(57)【要約】本発明は、熱耐性及び有機溶媒耐性を有するP450モノオキシゲナーゼ系を提供することを課題とする。また、本発明は、熱耐性及び有機溶媒耐性を有するP450モノオキシゲナーゼ系を利用することにより、高温環境下で、又は有機溶媒系において酸化物を生産する方法を提供することも別の課題とする。本発明はかかる課題の解決手段として、Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼを提供する。さらに当該融合モノオキシゲナーゼを利用する酸化物の生産方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼ。
【請求項２】
Thermus 属の高度好熱性細菌がThermus thermophilus である請求項１に記載の融合モノオキシゲナーゼ。
【請求項３】
P450が次の(A)又は(B)のポリペプチドである請求項１に記載の融合モノオキシゲナーゼ：
(A) 配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド； 
(B) (A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、当該ポリペプチド、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すものである、ポリペプチド。
【請求項４】
フェレドキシンレダクターゼが次の(A)又は(B)のポリペプチドである請求項１に記載の融合モノオキシゲナーゼ：
(A) 配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド； 
(B) (A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、P450、当該ポリペプチド、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すものである、ポリペプチド。
【請求項５】
フェレドキシンが次の(A)又は(B)のポリペプチドである請求項１に記載の融合モノオキシゲナーゼ：
(A) 配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド； 
(B) (A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、P450、フェレドキシンレダクターゼ、及び当該ポリペプチドをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すものである、ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載の融合モノオキシゲナーゼをコードするDNA。
【請求項７】
請求項６記載のDNAを導入した微生物。
【請求項８】
請求項７記載の微生物、又はその微生物から得られる培養物から融合モノオキシゲナーゼを採取する工程を含む、融合モノオキシゲナーゼの生産方法。
【請求項９】
請求項１に記載の融合モノオキシゲナーゼを用いて基質に酸素を添加することによりその酸化物を得る工程を含む、酸化物の生産方法。
【請求項１０】
基質がβ−カロテン、テストステロン又はアミノピリンである請求項９に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合モノオキシゲナーゼに関する。また本発明は、融合モノオキシゲナーゼを用いて基質に酸素を添加することにより水酸化物など一酸素原子付加物を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チトクロームP450（cytochrome P450；本明細書において、「P450」ということもある。）は、還元して一酸化炭素（CO）を結合させた時に450nm付近に特異的な吸収帯（ソーレー帯）を示すプロトヘムIX含有タンパク質の総称である。動物、植物、細菌、酵母に至るまで広く生物界に存在する、ヘムを有するモノオキシゲナーゼである（非特許文献１）。【０００３】
P450は、あらゆる生物に見られ、真核生物では細胞内のミトコンドリア内膜又はミクロソームに局在し、原核生物では細胞質に存在している。P450は、（１）生理活性物質であるコレステロール、ステロイドホルモン、胆汁酸、及び活性型ビタミンDの生合成、（２）ヘム、脂肪酸、及びエイコサノイドの代謝、並びに（３）医薬品や内分泌かく乱物質のような脂溶性の外来異物の解毒代謝等に関与している。【０００４】
各反応系においてP450はいずれもNAD（P）Hから供給される2個の電子と分子状酸素を利用して基質の水酸化、エポキシ化、O-脱メチル反応、N-メチル反応、スルホキシド反応、脱アルキル、及びジオール間の開裂反応等を触媒する、いわゆる一原子酸素添加反応（モノオキシゲナーゼ反応）を行う（非特許文献２及び３）。これらの反応にはP450に電子を供給する電子伝達系が必要である。P450及びこれらの電子伝達系はいわゆる複合酵素系を構成することでその機能を発揮する（特許文献１及び２）。この複合酵素系はP450モノオキシゲナーゼ系とも呼ばれる。【０００５】
P450モノオキシゲナーゼ系により行われるモノオキシゲナーゼ反応は、生理活性物質であるプロスタグランジン類若しくはステロイド類等の有用物質を生産し、又はダイオキシン若しくはPCB等の環境汚染物質を分解すること等に利用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表2008-521448
【特許文献２】WO2003/087381
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Biochemical and Biophysical Research Communications 339 (2006) pp. 331-336
【非特許文献２】Ortiz de M. Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. (1995), pp. 3-48
【非特許文献３】Gunsalus IC., Pederson TC.,and Sligar SG. Annu. Rev. Biochem. 44, 377 (1975)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来のP450モノオキシゲナーゼ系は熱耐性を有さず、それらを用いて反応を行う場合には反応温度が制限されてしまうという問題がある。また、従来のP450モノオキシゲナーゼ系は有機溶媒中で不安定なため水溶媒系においてのみ利用されるに止まっており、難水溶性の有機化合物の合成及び代謝の効率が低いという問題がある。【０００９】
したがって、本発明の目的は、熱耐性及び有機溶媒耐性を有するP450モノオキシゲナーゼ系を提供することにある。【００１０】
また、本発明の別の目的は、熱耐性及び有機溶媒耐性を有するP450モノオキシゲナーゼ系を利用することにより、高温環境下で、又は有機溶媒系において酸化物を生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するために、まず、本発明者が新たに同定した高度好熱性細菌由来のP450モノオキシゲナーゼ系を利用することを考えた。このP450モノオキシゲナーゼ系はP450、フェレドキシンレダクターゼ及びフェレドキシンから構成される。このP450モノオキシゲナーゼ系においては、NADPHから供給された電子がフェレドキシンレダクターゼ、フェレドキシン、そしてP450の順に伝達される。【００１２】
本発明者は、このP450モノオキシゲナーゼ系を構成する酵素群を互いに連結した融合タンパク質を利用することによって上記課題を解決できるのではないかとの着想のもと鋭意検討を行った。その結果、P450、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で連結してできた融合タンパク質（融合モノオキシゲナーゼ）が熱耐性及び有機溶媒耐性を有しているだけでなく、これらの酵素を単に組み合わせて用いた場合に比べても、また他の連結順で連結したものに比べても際立って優れたモノオキシゲナーゼ活性を有していることを見出した。このように、電子が伝達される順番と無関係に連結した融合モノオキシゲナーゼのほうが、電子が伝達される順番に連結したものよりもより優れたモノオキシゲナーゼ活性を有していようなどとは、従来技術からは全く予測することができかった。本発明者は、この驚くべき結果をもとに本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の通りである。【００１３】
１．融合モノオキシゲナーゼ
〈１−１〉  Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−２〉  Thermus 属の高度好熱性細菌がThermus thermophilus である〈１−１〉に記載の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−３〉  P450が次の(A)又は(B)のポリペプチドである〈１−１〉又は〈１−２〉に記載の融合モノオキシゲナーゼ：
(A) 配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド； 
(B) (A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、当該ポリペプチド、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すものである、ポリペプチド。
〈１−４〉  P450が配列番号１のアミノ酸配列において、65〜72番目のアミノ酸領域、150〜157番目のアミノ酸領域、176〜198番目のアミノ酸領域、207〜240番目のアミノ酸領域及び269〜276番目のアミノ酸領域からなる群より選択される少なくとも1種のアミノ酸領域に属する1個又は複数個のアミノ酸が、より嵩の低いアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、
当該ポリペプチドは、当該ポリペプチド、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すポリペプチドである〈１−１〉又は〈１−２〉に記載の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−５〉  P450が〈１−４〉のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、当該ポリペプチド、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すポリペプチドである〈１−１〉又は〈１−２〉に記載の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−６〉  P450が配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ酸配列において67番目のグルタミン酸及び68番目のチロシンをそれぞれグリシン及びイソロイシンに置換したポリペプチドである、〈１−１〉又は〈１−２〉に記載の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−７〉  P450が配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ酸配列において269番目のトリプトファン及び270番目のイソロイシンをそれぞれフェニルアラニン及びアラニンに置換したポリペプチドである、〈１−１〉又は〈１−２〉に記載の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−８〉  P450が配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ酸配列において269番目のトリプトファン及び270番目のイソロイシンをそれぞれフェニルアラニン及びアラニンに置換し、かつ269番目のトリプトファン及び270番目のイソロイシンをそれぞれフェニルアラニン及びアラニンに置換したポリペプチドである、〈１−１〉又は〈１−２〉に記載の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−９〉  フェレドキシンレダクターゼが次の(A)又は(B)のポリペプチドである〈１−１〉又は〈１−２〉に記載の融合モノオキシゲナーゼ：
(A) 配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド； 
(B) (A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、P450、当該ポリペプチド、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すものである、ポリペプチド。
〈１−１０〉  フェレドキシンが次の(A)又は(B)のポリペプチドである〈１−１〉又は〈１−２〉に記載の融合モノオキシゲナーゼ：
(A) 配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド； 
(B) (A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、P450、フェレドキシンレダクターゼ、及び当該ポリペプチドをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すものである、ポリペプチド。
〈１−１１〉  P450のC末端側にフェレドキシンレダクターゼのN末端側が連結されている、〈１−１〉〜〈１―１０〉の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−１２〉  フェレドキシンレダクターゼのC末端側にフェレドキシンのN末端側が連結されている、〈１−１〉〜〈１―１１〉の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−１３〉  リンカーが２〜２０個のアミノ酸残基からなるペプチドである、〈１−１〉〜〈１―１１〉の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−１４〉  リンカーが２〜１０個のアミノ酸残基からなるペプチドである、〈１−１〉〜〈１―１１〉の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−１５〉  リンカーが３〜７個のアミノ酸残基からなるペプチドである、〈１−１〉〜〈１―１１〉の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−１６〉  リンカーが、親水性アミノ酸が構成アミノ酸の半数以上を占めるペプチドである、〈１−１〉〜〈１―１５〉の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−１７〉  親水性アミノ酸が、アスパラギン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、トレオニン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、チロシン、及びシステインからなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸である、〈１−１６〉の融合モノオキシゲナーゼ。【００１４】
２．融合モノオキシゲナーゼをコードするDNA等
〈２−１〉  １．のいずれかに記載の融合モノオキシゲナーゼをコードするDNA。
〈２−２〉  〈２−１〉のDNAを導入した微生物。
〈２−３〉  〈２−２〉の微生物、又はその微生物から得られる培養物から融合モノオキシゲナーゼを採取する工程を含む、融合モノオキシゲナーゼの生産方法。【００１５】
３．酸化物の生産方法
〈３−１〉  １．のいずれかに記載の融合モノオキシゲナーゼを用いて基質に対して酸素を添加することによりその酸化物を得る工程を含む、酸化物の生産方法。
〈３−２〉  基質がβ−カロテンである〈３−１〉の生産方法。
〈３−３〉  基質がテストステロンである〈３−１〉の生産方法。
〈３−４〉  基質がアミノピリンである〈３−１〉の生産方法。
〈３−５〉  基質がアラキドン酸である〈３−１〉の生産方法。
〈３−６〉  基質がポリ塩化ビフェニル（PCB）である〈３−１〉の生産方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の融合モノオキシゲナーゼは、高度好熱性細菌由来のP450、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンを連結した融合モノオキシゲナーゼであり、高いモノオキシゲナーゼ活性を有するだけでなく同時に熱耐性及び有機溶媒耐性を備えている。【００１７】
また、本発明の融合モノオキシゲナーゼをコードするDNA等は、上記のような融合モノオキシゲナーゼを提供することができる。【００１８】
さらに、本発明の酸化物の生産方法は、上記のような融合モノオキシゲナーゼを利用することにより、効率性に優れた酸化物の生産方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】高度好熱性細菌由来のCYP175A1とラット由来のCYP1A1について、様々な濃度のDMSO存在下における有機溶媒耐性を調べた結果を示すグラフである。
【図２】実施例１で作製された融合モノオキシゲナーゼ175RFをSDS-PAGEに供した結果を示す図面に変わる写真である。
【図３】比較例１で作製された融合モノオキシゲナーゼ175FRをSDS-PAGEに供した結果を示す図面に変わる写真である。
【図４】融合モノオキシゲナーゼ175RF、175FR、及び再構成系を用いてそれぞれβ−カロテンの水酸化反応を行わせ、その速度論的解析を行った結果を示すグラフである。
【図５】融合モノオキシゲナーゼ175RF、175FR、及び再構成系を用いてそれぞれβ−カロテンの水酸化反応を行わせ、その酵素濃度とモノオキシゲナーゼ活性との関係を解析した結果を示すグラフである。
【図６】融合モノオキシゲナーゼ175RF、及び175FRを用いてそれぞれβ−カロテンの水酸化反応を行わせ、そのモノオキシゲナーゼ活性のpH依存性を解析した結果を示すグラフである。
【図７】融合モノオキシゲナーゼ175RFの熱耐性を解析した結果を示すグラフである。
【図８】融合モノオキシゲナーゼ175RF、及び変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉をそれぞれ用いてテストステロンの水酸化反応を行わせ、その水酸化物の水酸化部位を解析した結果を示すクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
１．融合モノオキシゲナーゼ
本発明の融合モノオキシゲナーゼは、以下の通りである：
Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼ。
【００２１】
本明細書において「高度好熱性細菌」とは、約75℃以上で生育可能な好熱性細菌をいう。生育至適温度が60℃以上である細菌が含まれる。
【００２２】
Thermus 属の高度好熱性細菌としては、例えばThermus thermophilus、Thermus aquaticus、Thermus flavus、Rhodothermus marinus、Thermus aquaticus及びThermus marinusのいずれかの種に属する高度好熱性細菌等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
Thermus 属の高度好熱性細菌としては、産生される酵素の熱耐性という点では、とりわけThermus thermophilusが好ましい。Thermus thermophilusの菌株としては、例えば、HB8やHB27等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
Thermus thermophilus以外のThermus属の種の細菌であっても、高度好熱性細菌であれば本発明に用いることができる。とりわけ、ゲノムDNA配列が既に少なくとも部分的に解析されており、通常の方法に従って塩基配列の相同性を検索することによってP450を取得することができる状態となっている細菌であれば好ましい。そのような細菌としては、例えば、全ゲノム配列が明らかとなっているThermus aquaticus Y51MC23等が挙げられる。
【００２５】
P450は、還元して一酸化炭素（CO）を結合させた時に450nm付近に特異的な吸収帯（ソーレー帯）を示すプロトヘムIX含有タンパク質である。機能的にはモノオキシゲナーゼ活性を有するものをいう。
【００２６】
本明細書において「モノオキシゲナーゼ」とは、酸素分子のうち１原子の酸素を還元して１分子の水を作るとともに、残りの酸素原子を様々な基質に添加することにより水酸化物などの一酸素原子付加物、すなわち酸素化化合物（以下、単に「酸化物」ということがある。）を得る反応を触媒する酵素のことをいう。また、この触媒活性のことを「モノオキシゲナーゼ活性」という。また、本明細書において「融合モノオキシゲナーゼ」とは、P450モノオキシゲナーゼ系に属する酵素群が互いに連結したものであって、かつモノオキシゲナーゼ活性を有するものをいう。
モノオキシゲナーゼ活性は、例えば本願明細書の実施例２のような方法によって測定することができる。P450の種類によっても異なるが、例えば、β−カロテン（β-carotene）、テストステロン（testosterone）、アミノピリン、アラキドン酸、及び多環芳香族等が基質となりうる。多環芳香族としては、例えばポリ塩化ビフェニル（PCB）、ダイオキシン、及びベンゾピレン等が基質となりうる。
P450として例えばThermus thermophilus由来のCYP175A1を用いる場合は、β−カロテンが基質となりうる（Blasco F, Kauffmann I & Schmid RD (2004) Appl Microbiol Biotechnol 64, 671-674、Momoi K, Hofmann U, Schmid RD & Urlacher VB (2006) Biochem Biophys Res Commun 339, 331-336）。具体的には、β−カロテンの3-及び3’-位を水酸化する。
【００２７】
P450としては、Thermus 属の高度好熱性細菌に由来する野生型のP450を用いてもよいし、改変を加えた改変型のP450を用いてもよい。限定されないが、改変としては例えば、野生型のP450のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、当該ポリペプチド、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すポリペプチドを挙げることができる。このようなポリペプチドを用いることで、本発明の効果を奏する融合モノオキシゲナーゼを構成することができる。
【００２８】
また、野生型のP450に適当なアミノ酸変異を導入すること等によってその基質特異性を変化させ、野生型では基質となりえなかった物質を新たに基質とするような変異型のP450を生産することもできる。そのような変異型のP450も野生型のP450と同様に本発明においてP450として用いることができる。
【００２９】
そのような変異としては、例えばP450の基質認識部位中の適当な１個又は複数個のアミノ酸に対してアミノ酸変異を導入することが挙げられる。基質認識部位は、例えば本発明においてP450としてCYP175A1を用いる場合、B’ helix (65〜72番目のアミノ酸領域)、F helix (150〜170番目のアミノ酸領域)、G helix (176〜198番目のアミノ酸領域)、I helix (207〜240番目のアミノ酸領域)、及びβ-strand 1〜4 (269〜276番目のアミノ酸領域）である。
【００３０】
基質特異性を変化させる方法としては例えば、基質認識部位のポケット様構造をより拡張することにより基質認識特異性を変化させることが挙げられる。具体的には、基質認識部位中の適当なアミノ酸に対して、より嵩の低いアミノ酸に置換すること等が挙げられる。比較的嵩の高いアミノ酸分子をより嵩の低いアミノ酸に置換することが好ましい。置換部位としては、B’ helix及びβ-strandに含まれるアミノ酸が好ましく、それらの領域中のグルタミン酸、チロシン、トリプトファン及びイソロイシンがさらに好ましい。置換部位としては、P450としてCYP175A1を用いる場合、例えば、67番目のグルタミン酸、68番目のチロシン、269番目のトリプトファン及び270番目のイソロイシン等が挙げられる。置換により新たに導入するアミノ酸としては、グリシン、アラニン、フェニルアラニン及びイソロイシン等が挙げられる。
【００３１】
例えば、CYP175A1において(i) 67番目のグルタミン酸及び68番目のチロシンをそれぞれグリシン及びイソロイシンに置換した変異型CYP175A1（Q67G、Y68I）、(ii) 269番目のトリプトファン及び270番目のイソロイシンをそれぞれフェニルアラニン及びアラニンに置換した変異型CYP175A1（W269P、I270A）、及び(iii) 67番目のグルタミン酸及び68番目のチロシンをそれぞれグリシン及びイソロイシンに、かつ269番目のトリプトファン及び270番目のイソロイシンをそれぞれフェニルアラニン及びアラニンに置換した変異型CYP175A1（Q67G、Y68I、W269P、I270A）では、野生型では基質とならない、テストステロン、アミノピリン等を代謝できるようになる。具体的には、これらの変異型CYP175A1（Q67G、Y68I）、変異型CYP175A1（W269P、I270A）及び変異型CYP175A1（Q67G、Y68I、W269P、I270A）はテストステロンの２β位での水酸化やアミノピリンのジメチルアミノ基のメチル基脱離を触媒することができる。
【００３２】
また、変異型CYP175A1（Q67G、Y68I）及び変異型CYP175A1（Q67G、Y68I、W269P、I270A）は野生型では基質とならないテストステロンを代謝できるようになる。具体的には、この変異型CYP175A1（Q67G、Y68I）及び変異型CYP175A1（Q67G、Y68I、W269P、I270A）はテストステロンの6β位、16α位、及び2β位を水酸化することができる。
【００３３】
様々な物質を代謝することができ、比較的基質認識特異性が元来低いと思われる特定のP450の基質認識部位の構造に近付けることによっても、基質認識特異性を変化させることができる。例えば、常温細菌由来のP450であるP450BM3は様々な物質を代謝できることで知られる。例えば本発明においてP450としてCYP175A1を用いる場合、P450BM3とCYP175A1の基質認識部位を互いに対比すると、大きく相違しているアミノ酸として67番目のグルタミン酸及び68番目のチロシンが挙げられる。これらアミノ酸をそれぞれグリシン及びイソロイシンに置換した変異型CYP175A1（Q67G、Y68I）では、野生型では基質とならないテストステロン及びアミノピリンを代謝できるようになる。具体的には、この変異型CYP175A1（Q67G、Y68I）はテストステロンの6β位、16α位、及び2β位を水酸化することができる。また、この変異型CYP175A1（Q67G、Y68I）はアミノピリンのメチル基を脱離することができる。
【００３４】
また、ラット由来のP450であるCYP1A1に関する報告ではあるが、240番目のフェニルアラニンをアラニンに置換することによって野生型では基質とならない2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin（2,3,7,8-TetraCDD）を代謝できるようになったという報告もある（Shinkyo et al. (2006) Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 584-590）。
【００３５】
Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450としては、Thermus thermophilus HB27由来のP450であるCYP175A1を好ましく用いることができる。このCYP175A1のアミノ酸配列を配列番号１に、それをコードする核酸配列を配列番号２に示す。
【００３６】
Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450としては、CYP175A1のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、当該ポリペプチド、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すポリペプチドも用いることができる。このようなポリペプチドを用いることで、CYP175A1を用いた場合と同様に、本発明の効果を奏する融合モノオキシゲナーゼを構成することができる。
【００３７】
フェレドキシンレダクターゼ（FdR）は、酸化型フェレドキシンを還元することにより還元型フェレドキシンを生成することができる酵素である。この生成反応にはNADPHなどが必要である。
【００３８】
フェレドキシンレダクターゼとしては、特に限定されないが、Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するもの等を用いることができる。また、野生型フェレドキシンレダクターゼの他、野生型フェレドキシンレダクターゼにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチドであって、P450、当該ポリペプチド、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示す改変型フェレドキシンレダクターゼも用いることができる。このようなポリペプチドを用いることで、野生型フェレドキシンレダクターゼを用いた場合と同様に本発明の効果を奏する融合モノオキシゲナーゼを構成することができる。
【００３９】
フェレドキシンレダクターゼの由来は、特に限定されないが、P450の由来と同一であれば好ましい。
【００４０】
フェレドキシン（Fdx）は、補欠分子族として非ヘム鉄と無機硫黄からなる酸化還元中心を持ち、電子伝達体として機能する鉄−硫黄タンパク質の総称である。
【００４１】
フェレドキシンとしては、特に限定されないが、Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するもの等を用いることができる。また、野生型フェレドキシンの他、野生型フェレドキシンにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチドであって、P450、フェレドキシンレダクターゼ、及び当該ポリペプチドをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示す改変型フェレドキシンも用いることができる。このようなポリペプチドを用いることで、野生型フェレドキシンを用いた場合と同様に本発明の効果を奏する融合モノオキシゲナーゼを構成することができる。
【００４２】
フェレドキシンの由来は、特に限定されないが、P450の由来と同一であれば好ましい。
【００４３】
本発明者は、Thermus 属の代表的種であるThermus thermophilus由来のフェレドキシンレダクターゼ及び同由来のフェレドキシンが、同由来のCYP175A1に電子を供給する電子伝達系として機能することをはじめて明らかにしている。本発明においては、このThermus thermophilus由来のフェレドキシンレダクターゼ及び同由来のフェレドキシンを、CYP175A1との組み合わせにおいて好ましく用いることができる。このThermus thermophilus由来のフェレドキシンレダクターゼのアミノ酸配列を配列番号３に、それをコードする核酸配列を配列番号４に示す。同由来のフェレドキシンのアミノ酸配列を配列番号５に、それをコードする核酸配列を配列番号６に示す。
【００４４】
フェレドキシンレダクターゼとしては、Thermus thermophilus由来のフェレドキシンレダクターゼのアミノ酸配列（配列番号３）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、P450、当該ポリペプチド、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すポリペプチドもCYP175A1若しくはその改変体との組み合わせにおいて好ましく用いることができる。このようなポリペプチドを用いることで、Thermus thermophilus由来のフェレドキシンレダクターゼを用いた場合と同様に本発明の効果を奏する融合モノオキシゲナーゼを構成することができる。
【００４５】
また、フェレドキシンとしては、Thermus thermophilus由来のフェレドキシンのアミノ酸配列（配列番号５）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、P450、フェレドキシンレダクターゼ、及び当該ポリペプチドをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すポリペプチドもCYP175A1若しくはその改変体との組み合わせにおいて好ましく用いることができる。このようなポリペプチドを用いることで、Thermus thermophilus由来のフェレドキシンを用いた場合と同様に本発明の効果を奏する融合モノオキシゲナーゼを構成することができる。
【００４６】
P450、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で連結してなる融合モノオキシゲナーゼは、好ましくはP450のC末端側にフェレドキシンレダクターゼのN末端側が、そして、フェレドキシンレダクターゼのC末端側にフェレドキシンのN末端側が、それぞれ連結したものである。しかしながら、モノオキシゲナーゼ活性を有する限り、P450のC末端側にフェレドキシンレダクターゼのC末端側が連結している融合モノオキシゲナーゼであってもよい。また、これと同様に、フェレドキシンレダクターゼとフェレドキシンの連結においても、連結により構成される融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を有する限り、フェレドキシンレダクターゼのいずれのペプチド末端側にフェレドキシンのいずれのペプチド末端側が連結されていてもよい。
【００４７】
P450、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンを直接連結してなる融合モノオキシゲナーゼとは、これらのポリペプチドが互いに他のアミノ酸、ペプチドその他の構造を介することなく直接に連結している融合モノオキシゲナーゼのことをいう。
【００４８】
リンカーは、融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を有する限り、いかなる構造であってもよい。融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を発揮する上では、連結される各ポリペプチドが比較的自由に動くことができることが好ましい。したがって、リンカーとしては各ポリペプチドが比較的自由に動くことができるような構造が好ましい。例えば、ペプチド、アミノ酸、炭素鎖、その他の化学構造であってもよい。
【００４９】
融合モノオキシゲナーゼの生産のし易さという観点では、リンカーはペプチドであることが好ましい。リンカーをペプチドとし、融合モノオキシゲナーゼを全体としてポリペプチドとして構成すれば、それをコードする遺伝子を微生物に導入し大量発現させることにより当該ポリペプチドを容易に生産することができる。リンカーとしてペプチドを用いる場合、当該ペプチドのアミノ酸残基数は融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を有する限り、いくらであってもよい。各ポリペプチドの動きやすさという観点では、アミノ酸残基数は２〜２０個が好ましく、２〜１０個がより好ましく、３〜７個がさらにより好ましい。また、各ポリペプチドの動きやすさという観点では、リンカーとなるペプチドが、親水性アミノ酸が構成アミノ酸の半数以上を占めるものであることが好ましい。親水性アミノ酸とは、アスパラギン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、トレオニン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、チロシン、及びシステインをいう。    
【００５０】
２．融合モノオキシゲナーゼをコードするDNA等
本発明の融合モノオキシゲナーゼをコードするDNAは、上で説明した融合モノオキシゲナーゼのうち、全体としてポリペプチドとして構成されている融合モノオキシゲナーゼをコードするDNAである。
【００５１】
本発明の、融合モノオキシゲナーゼをコードするDNAを導入した微生物は、そのDNAで形質転換された微生物である。形質転換は、例えば、DNAを一過的に又は安定的に発現させる発現ベクターを用いて行うことができる。発現ベクターの作製、導入対象となる微生物の選択、及び導入方法は、公知の手法に従い行うことができる（例えば、Sambrook, J., Russel, D. W., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd edition, CSHL Press, 2001等を参照。）。例えば発現ベクターとしては、ファージ、ファージミドベクター、又はプラスミドベクターを用いることができる。また、導入対象となる微生物としては、発現ベクターが機能するものであればよく特に限定されないが、例えば、細菌、放線菌、又は酵母等を用いることができる。細菌としては、扱いやすさ等の観点から、大腸菌、又は枯草菌が好ましい。
【００５２】
本発明の、融合モノオキシゲナーゼの生産方法は、上記の通り融合モノオキシゲナーゼをコードするDNAを導入した微生物、又はその微生物から得られる培養物から融合モノオキシゲナーゼを採取する工程を含む、融合モノオキシゲナーゼの生産方法である。
【００５３】
採取する工程は、前記DNAを導入した微生物を粉砕した後、通常の方法に従って行うことができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー、若しくはアフィニティークロマトグラフィー等の、タンパク質精製の分野において汎用されている方法に従って精製することができる。
【００５４】
本発明の融合モノオキシゲナーゼは、精製工程における活性低下を回避するため精製せずに使用することもできる。酵素活性の高さを重視する反応においては、未精製で使用するのが好ましい。
【００５５】
３．酸化物の生産方法
本発明の、酸化物の生産方法は、本発明の融合モノオキシゲナーゼを用いて基質に酸素を添加することによりその酸化物を得る工程を含む方法である。
【００５６】
P450の種類によっても異なるが、例えば、β−カロテン（β-carotene）、テストステロン（testosterone）、アミノピリン、アラキドン酸、及び多環芳香族等が基質となりうる。多環芳香族としては、例えばポリ塩化ビフェニル（PCB）、ダイオキシン、及びベンゾピレン等が基質となりうる。
【００５７】
反応条件は、P450の種類によって適宜決定することができる。pHに関しては好ましくはpH2〜11であり、より好ましくはpH4〜9であり、さらにより好ましくはpH5〜8である。温度に関しては好ましくは20〜100℃であり、より好ましくは20〜80℃であり、さらにより好ましくは20〜70℃である。また、電子供与体として例えばNADPHまたはNADHが必要である。長時間反応させる場合などに、P450をより安定化させる観点から、グリセロール存在下で反応させることもできる。この場合、グリセロールの濃度は好ましくは1〜40容量％であり、より好ましくは5〜30容量％であり、さらにより好ましくは10〜20容量％である。グリセロールの不存在下でも、反応を行うことができる。
有機溶媒の存在下で反応を行う場合は、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、及びDMSO等を使用できる。有機溶媒濃度は、好ましくは1〜50容量％であり、より好ましくは3〜30容量％であり、さらにより好ましくは5〜20容量％である。
【実施例】
【００５８】
以下に試験例及び実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の例にのみ限定されるものではない。【００５９】
試験例１：Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450の有機溶媒耐性
［目的］Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450の有機溶媒耐性を評価した。【００６０】
［方法］Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450として、Thermus thermophilus由来のCYP175A1を使用した。CYP175A1のアミノ酸配列を配列番号１に、CYP175A1をコードするDNAの塩基配列を配列番号２に示す。
また、対照としてラット由来P450であるCYP1A1を使用した。
まず、10% グリセロールを含んだ50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) 中にCYP175A1タンパク質またはCYP1A1タンパク質を加えた後、0%から90%になるようにDMSO（和光純薬工業株式会社）をそれぞれ加え (total volume: 100 μl)、25℃で30分間インキュベートした。
次に、インキュベートしたサンプルを50μlずつ2本の試験管に分注し、それぞれ950μlの10% グリセロールを含んだ50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) を加えてCO差スペクトルを測定した。
最後に、各DMSO濃度における450 nmの吸光度を測定することで有機溶媒耐性を評価した。DMSO濃度が0%の時の450 nmの吸光度を100%として、DMSO濃度を段階的に上げていき、各濃度における残存活性を算出した。【００６１】
［考察］結果を図１に示す。ラット由来P450のCYP1A1は20%のDMSO存在下で活性が50%にまで低下した。これに対して、Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450であるCYP175A1はDMSO濃度を70%まで上昇させたときに初めて50%まで低下した。これらの結果より、CYP175A1がCYP1A1よりも極めて高い有機溶媒耐性を持ち、高濃度の有機溶媒中でも活性を保つことができることが明らかとなった。【００６２】
実施例１：融合モノオキシゲナーゼの作製
本発明の融合モノオキシゲナーゼを次の通り作製した。【００６３】
（１）融合モノオキシゲナーゼをコードするDNAの設計
Thermus thermophilus由来のCYP175A1に、同由来のフェレドキシンレダクターゼ（FdR）、及び同由来のフェレドキシン（Fdx）をN末端側からこの順で連結させて融合タンパク質（本明細書において、「融合モノオキシゲナーゼ175RF」、又は単に「175RF」ということもある。）を作製した。各タンパク質の移動が自由に行えるようにするため、比較的小さな側鎖を持ち、さらに、親水的な性質を持つアミノ酸5つから構成されたリンカー配列で各タンパク質同士を連結した。FdRとFdxとの間はリンカー配列としてThr-Ser-Gly-Asp-Alaを用い、CYP175A1とFdx又はFdRとの間はリンカー配列としてAla-Asp-Gly-Thr-Serを用いた。【００６４】
（２）大腸菌発現ベクターの構築
表１に示したプライマーを用いて融合モノオキシゲナーゼ175RFを作製した。FdRからstop codonを除去し、さらに、そのC末端側にリンカー配列を挿入するため、pET-FdRを鋳型として、primer 8 (forward primer) 及びprimer 9 (reverse primer) を用いてPCRを行った。PCR産物をNdeI及びBamHIで切断後、pET-21aベクターに挿入した(pET-FdR-TS)。次に、FdRのC末端側にFdxを融合させた酵素(RF)を作製するため、pET-Fdxを鋳型として、primer 10 (forward primer) 及びprimer 11 (reverse primer) を用いてPCRを行った。PCR産物をSpeI及びBamHIで切断後、pET-FdR-TSに挿入した (pET-FdR-Fdx)。作製したFdR-FdxのN末端側にリンカー配列を挿入するため、pET-FdR-Fdxを鋳型として、 primer 12 (forward primer) 及びprimer 11 (reverse primer) を用いてPCRを行った。PCR産物をBamHIで切断後、pET-21aベクターに挿入した(pET-GTS-FdR-Fdx)。リンカー配列を挿入しFdR-FdxのN末端側にCYP175A1を融合させた酵素(融合モノオキシゲナーゼ175RF)を作製するため、pET-CYP175A1を鋳型としてprimer 6 (forward primer) 及びprimer 7 (reverse primer) を用いてPCRを行った。、PCR産物をNdeI及びKpnIで切断し、pET-GTS- FdR-Fdxに挿入した (pET-175RF)。全てのPCRはKOD Plus DNA polymeraseを用いて、94 ℃、5分→(94 ℃・30秒、55 ℃・30秒、68 ℃・2分)×30サイクルの条件で行った。【００６５】
【表１】
2010095721.tif 000002
【００６６】
（３）融合モノオキシゲナーゼの精製
（２）で作製した大腸菌用発現ベクター（pET-175RF）を用いて、E. coli BL21 (DE3) Codon Plusを形質転換した。この形質転換体を50 μg/ml ampicillin（和光純薬工業株式会社）及び34 μg/ml chloramphenicol（和光純薬工業株式会社）を含むLB培地にて一晩振盪培養した。この培養液50 mlを50 μg/ml ampicillin及び34 μg/ml chloramphenicolを含んだ2×YT培地1Lに植菌し、OD600が0.8〜1.0になるまで37℃で振盪培養後、終濃度1.0 mMとなるようにIPTG（和光純薬工業株式会社）を添加した。さらに25℃で24時間振盪培養を行った後、5000×g、4℃にて15分間遠心を行い集菌し、得られた菌体は-80℃で保存した。【００６７】
得られた菌体を1 mM PMSF（和光純薬工業株式会社）を含んだbuffer A (50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.4, 10%グリセロール) に懸濁後、1 mg/mlになるようにリゾチームを加え4℃で30分間処理を行った。細胞懸濁液を超音波破砕した後、50,000×g、4℃にて30分間遠心分離を行い、細胞断片を沈殿させた。上清を硫酸アンモニウムを用いて分画(20-35%) した。ペレットを10%グリセロール、1 mM PMSF及び0.1% Emulgen 911（花王）を含んだ50 mM Tris-HCl (pH 8.5)に懸濁後、この懸濁液を1.0 Mの硫酸アンモニウムを含んだ buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10%グリセロール) で2倍希釈した。【００６８】
この希釈溶液を0.5 Mの硫酸アンモニウムを含んだbuffer Bで平衡化したbutyl Sepharose 4 Fast Flow column (Amersham Biosciences) に供した。カラムを0.5 M及び0.2 Mの硫酸アンモニウムを含んだbuffer Bで洗浄後、2.0%コール酸を含んだbuffer Bで融合酵素を溶出させた。Amicon Ultra（Millipore）を用いて10 mlまで濃縮後、濃縮液にEmulgen 911を最終濃度0.1%になるように加えた。この溶液をbuffer C (50 mM potassium phosphate buffer, pH 6.3, 10%グリセロール) に対して透析した。【００６９】
透析したサンプルを0.1% Emulgen 911を含んだbuffer Cで平衡化したMono S HR5/5 column（Amersham Biosciences）に供した。流速1 ml/minでKCl濃度を100 mMから600 mMまで直線勾配にて上昇させ、目的タンパク質を溶出させた。【００７０】
この溶出タンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
SDS化したサンプルは10% ポリアクリルアミドゲルにアプライし、SDS-PAGE泳動Buffer(25mM Tris, 192mM Glysine, 0.1% SDS)にて250V、20mA（定電流）で100分間電気泳動を行った。
このSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の電気泳動写真を図２に示す。レーン１は分子量マーカー、レーン２はE. coli粗抽出液、レーン３は硫酸アンモニウム分画（20〜35%）後の沈殿、レーン４はbutyl-sepharose溶出画分、そしてレーン５は Mono S溶出画分である。【００７１】
比較例１：融合モノオキシゲナーゼ〈対照〉の作製
融合モノオキシゲナーゼ175RFの対照（本明細書において、「融合モノオキシゲナーゼ〈対照〉」ということがある。）として、P450、フェレドキシン（Fdx）、及びフェレドキシンレダクターゼ（FdR）をN末端側からこの順で連結してなる融合モノオキシゲナーゼ（本明細書において、「融合モノオキシゲナーゼ175FR」、又は単に「175FR」ということもある。）を作製した。
表１に示したプライマーを用いて融合モノオキシゲナーゼ175FRを作製した。Fdxからstop codonを除去し、さらに、そのC末端側にリンカー配列を挿入するため、pET-Fdxを鋳型として、primer 1 (forward primer) 及びprimer 2 (reverse primer) を用いてPCRを行った。PCR産物をNdeI及びBamHIで切断後、pET-21aベクターに挿入した。次に、FdxのC末端側にFdRを融合させた酵素(FR)を作製するため、pET-FdRを鋳型として、primer 3 (forward primer) 及びprimer 4 (reverse primer) を用いてPCRを行った。PCR産物をSpeI及びBamHIで切断後、pET-Fdx-TSに挿入した (pET-Fdx-FdR)。作製したFdx-FdRのN末端側にリンカー配列を挿入するため、pET-Fdx-FdRを鋳型として、primer 5 (forward primer) 及びprimer 4 (reverse primer) を用いてPCRを行った。PCR産物をBamHIで切断後、pET-21aベクターに挿入した(pET-GTS-Fdx-FdR)。リンカー配列を挿入したFdx-FdRのN末端側にCYP175A1を融合させた酵素(融合モノオキシゲナーゼ175FR)を作製するため、pET-CYP175A1を鋳型としてprimer 6 (forward primer) 及びprimer 7 (reverse primer) を用いてPCRを行った。PCR産物をNdeI及びKpnIで切断後、pET-GTS- Fdx-FdRに挿入した (pET-175FR)。全てのPCRはKOD Plus DNA polymeraseを用いて、94 ℃、5分→(94 ℃・30秒、55 ℃・30秒、68 ℃・2分)×30サイクルの条件で行った。
このようにして作製した発現ベクターを用いて、実施例１と同様な方法で、大腸菌を形質転換し、菌の培養を行い、得られた菌体からタンパク質を精製工程に付し、目的融合モノオキシゲナーゼ〈対照〉タンパク質を溶出させた。【００７２】
さらにこの溶出タンパク質を実施例１と同様な条件で、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
このSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の電気泳動写真を図３に示す。レーン１は分子量マーカー、レーン２はE. coli粗抽出液、レーン３は硫酸アンモニウム分画（20〜35%）後の沈殿、レーン４はbutyl-sepharose溶出画分、そしてレーン５は Mono S溶出画分である。【００７３】
実施例２：融合モノオキシゲナーゼを用いた水酸化物の生産
実施例１で作製した融合モノオキシゲナーゼ175RFを用いて基質を水酸化することにより、その水酸化物を得た。
なお、本実施例では基質としてβ−カロテンを用いた。【００７４】
（１）融合モノオキシゲナーゼを用いた水酸化物の生産
β−カロテン（1〜80 μM）、融合モノオキシゲナーゼ175RF（15〜120nM）、NADPH（1 mM）、及び10% グリセロールを含んだ50 mM potassium phosphate buffer (pH5〜8) 中で水酸化反応を行った。反応は65℃で2分間行った。【００７５】
（２）水酸化物の抽出及び分析
（１）の水酸化反応を行ったサンプルに対して25倍量の氷冷したアセトニトリルを加え、5分間氷上で静置した。続いて、12,000 rpmで10分間遠心後、上清を直接HPLCに注入し、分析を行った。HPLCによる分析はODS-100S (150 x 4.6 mm, 東ソー)を装着したProminence (島津)を用いて行った。その条件として、流速1.0 ml/minでacetonitrile/methanol/isopropanol (85/10/5)を移動相として用い、検出は454 nmにて行った。【００７６】
試験例２〜４に示す通り、実施例２の方法に従って融合モノオキシゲナーゼを用い水酸化物を生産することができた。【００７７】
比較例２―１：融合モノオキシゲナーゼ〈対照〉を用いた水酸化物の生産
比較例１で作製した融合モノオキシゲナーゼ175FRを用いて基質を水酸化することにより、その水酸化物を得た。
生産方法は実施例２に準じて行った。【００７８】
比較例２−２：再構成系を用いた水酸化物の生産
融合モノオキシゲナーゼを用いずに、P450、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをそれぞれ個別に用いて水酸化物を生産した（本明細書において、この系のことを「再構成系」ということもある。）。
β−カロテン（1〜80 μM）、CYP175A1(15〜120 nM)、フェレドキシンレダクターゼ(15〜120 nM)、フェレドキシン(15〜120nM)、NADPH (1 mM)、及び10% グリセロールを含んだ50mM potassium acetate buffer (pH 5.0)中で反応を行った。反応は65℃で2分間行った。【００７９】
試験例２：β―カロテン水酸化反応の速度論的解析
［目的］融合モノオキシゲナーゼ175RFによるβ―カロテン水酸化反応に関して、速度論的解析を行った。【００８０】
［方法］実施例２の方法に従い、融合モノオキシゲナーゼ175RFを用いてβ−カロテンの水酸化物を生産した。ただし、融合モノオキシゲナーゼ175RFの添加濃度は30nMとし、50 mM potassium phosphate buffer はpH7.4のものを用いた。
対照として、融合モノオキシゲナーゼ175FR、及び再構成系を用いてそれぞれβ−カロテンの水酸化物を生産した。
融合モノオキシゲナーゼ175FRを用いた反応は比較例２−１に従って行った。ただし、融合モノオキシゲナーゼ175FRの添加濃度は60nMとし、50 mM potassium phosphate buffer はpH7.4のものを用いた。
二種類の再構成系を用意して反応を行った。再構成系を用いた反応は比較例２−２に従って行った。ただし、CYP175A1、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンの添加濃度はいずれも30nMとした。【００８１】
［考察］結果を図４及び表２に示す。また、融合モノオキシゲナーゼ（融合モノオキシゲナーゼ175FR 及び融合モノオキシゲナーゼ175RF）並びに再構成系の間で基質であるβ―カロテンに対する親和性 (Km値)にはほとんど変化がなかった。【００８２】
【表２】
2010095721.tif 000003
【００８３】
一方、Vmax を比較したところ、融合モノオキシゲナーゼ175FRでは再構成系の場合よりも値が減少していたが、融合モノオキシゲナーゼ175RFでは再構成系の場合に比べてはるかに高い値を示した。このことから、融合モノオキシゲナーゼ175FRでは各タンパク質間の相互作用がうまく行かず、電子の伝達が正常に行われなかったため、活性が低かったと考えられる。一方、融合モノオキシゲナーゼ175RFでは各タンパク質間で適した相互作用が行われており、電子の伝達が効率良く行われたため、高い活性を示したと考えられる。【００８４】
試験例３：融合モノオキシゲナーゼ濃度とモノオキシゲナーゼ活性との関係
［目的］融合モノオキシゲナーゼ175RFによるβ―カロテン水酸化反応に関して、融合モノオキシゲナーゼ濃度と活性との関係を解析した。【００８５】
［方法］実施例２の方法に従い、融合モノオキシゲナーゼ175RFを用いてβ−カロテンの水酸化物を生産した。ただし、50 mM potassium phosphate buffer はpH7.4のものを用いた。
対照として、融合モノオキシゲナーゼ175FR、及び再構成系を用いてそれぞれβ−カロテンの水酸化物を生産した。
融合モノオキシゲナーゼ175FRを用いた反応は比較例２−１に従って行った。ただし、50 mM potassium phosphate buffer はpH7.4のものを用いた。
再構成系を用いた反応は比較例２−２に従って行った。【００８６】
［考察］結果を図５に示す。分子間で電子の伝達が行われている場合、酵素濃度が増えるにつれて活性は対数的に増加するはずであるが、分子内で電子の伝達が行われている場合、酵素濃度が増えるにつれて活性は直線的に増加するはずである。再構成系では酵素濃度が増えるにつれて、活性が対数的に増加しており、分子間で電子の伝達が行われていることが確認できた。一方、融合酵素では酵素濃度が増えるにつれて、活性は直線的に増加しており、融合酵素ではその分子内で電子の伝達が行われていることが分かった。【００８７】
試験例４：融合モノオキシゲナーゼ活性のｐＨ依存性
［目的］融合モノオキシゲナーゼ175RFによるβ―カロテン水酸化反応に関して、ｐＨ依存性を解析した。【００８８】
［方法］実施例２の方法に従い、融合モノオキシゲナーゼ175RFを用いてβ−カロテンの水酸化物を生産した。ただし、融合モノオキシゲナーゼ175RFの添加濃度は30nMとし、pH 5.0〜6.0の範囲では10% glycerolを含んだ50 mM potassium acetate buffer を用いて測定を行い、pH 6.0〜8.0の範囲では10% glycerolを含んだ50 mM potassium phosphate buffer を用いて測定を行った。
対照として、融合モノオキシゲナーゼ175FRを用いてそれぞれβ−カロテンの水酸化物を生産した。
融合モノオキシゲナーゼ175FRを用いた反応は比較例２−１に従って行った。ただし、融合モノオキシゲナーゼ175FRの添加濃度は30nMとし、pH 5.0〜6.0の範囲では10% glycerolを含んだ50 mM potassium acetate buffer を用いて測定を行い、pH 6.0〜8.0の範囲では10% glycerolを含んだ50 mM potassium phosphate buffer を用いて測定を行った。【００８９】
［考察］結果を図６に示す。再構成系 (単独) の場合はpH5.0を最適pHとしていたが、融合モノオキシゲナーゼ (融合モノオキシゲナーゼ175RF及び融合モノオキシゲナーゼ175FR) では最適pHが7.0-7.4であることが分かった。【００９０】
試験例５：融合モノオキシゲナーゼの熱安定性
［目的］融合モノオキシゲナーゼ175RFの熱安定性を評価した。【００９１】
［方法］10%グリセロールを含んだ50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) 中で融合モノオキシゲナーゼ175RF (60 nM)を10分間各温度でインキュベート後、氷上で5分静置することで、熱処理を停止させた。そして、β-carotene (80 μM) 及びNADPH (1 mM) の存在下でβ-carotene水酸化活性を測定した。グラフは50℃における活性を100%とした時の相対値を示している。【００９２】
［考察］結果を図７に示す。融合モノオキシゲナーゼ175RFは80℃においても50%の活性を維持しており、高い熱耐性を持つことが分かった。【００９３】
実施例３：変異型融合モノオキシゲナーゼの作製（１）
変異型のP450を含む本発明の融合モノオキシゲナーゼを次の通り作製した。
CYP175A1の67番目のグルタミン酸及び68番目のチロシンをそれぞれグリシン及びイソロイシンに置換した変異型CYP175A1（本明細書において、「変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉」、又は単に「175RF〈Q67G、Y68I〉」ということもある。）をコードするDNAを次のようにして作製した。【００９４】
CYP175A1をコードするDNAを鋳型にして、プライマー（primer 13）5’-AAGGCCACCTTCGGGTTACGGGCCCTCCT-3’（配列番号１９；下線部は変異導入箇所を示す）を用いてmegaprimer法により変異体をコードするDNAを作製した。１回目のPCRではprimer 13 (forward primer) 及び表１に示したprimer 7 (reverse primer) 及びKOD Plus DNA polymeraseを用いて、CYP175A1をコードするDNAを鋳型にして94 ℃、5分→(94 ℃・30秒、55 ℃・30秒、68 ℃・2分)×30サイクルの条件でPCRを行った後、PCR産物をゲル抽出した。２回目のPCRではゲル抽出後のPCR産物(reverse primer)、表１に示したprimer 6 (forward primer)、そして、CYP175A1をコードするDNAを鋳型にして94 ℃、5分→(94 ℃・30秒、50 ℃・1分、68 ℃・2分)×30サイクルの条件でPCRを行った。そして、実施例１と同様の方法でpET-GTS-RFにPCR産物を挿入し、変異型CYP175A1と電子伝達系の融合酵素発現用ベクターを作製した。大腸菌における融合酵素の発現及び菌体からの目的融合酵素の精製を実施例１と同様の条件で行い、変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉を得た。【００９５】
実施例４：変異型融合モノオキシゲナーゼを用いた水酸化物の生産（１）
実施例３で作製した変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉を用いて、野生型P450（CYP175A1）では基質とはならないテストステロンを水酸化することにより、その水酸化物を得た。【００９６】
テストステロン（500 μM）、変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉（1μM）、NADPH（1 mM）、及び10% グリセロールを含んだ50 mM potassium phosphate buffer (pH7.4) 中（総量400μl）で水酸化反応を行った。
60℃で15分間反応させた後、2mlの酢酸エチルを添加することで反応産物を抽出した。抽出物を遠心濃縮機を用いて乾固させ、残渣を50％のメタノールに溶解させ、HPLCを用いて分析した。カラム（ODS-100Z）を40℃に加温し、流速1.0ml/minで水：メタノール：アセトニトリル=62:36:2から30:64:6まで20分間で直線的に濃度変化させることで分析を行った。その結果を図８に示す。【００９７】
その結果、この変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉を用いることで、P450が野生型のP450（CYP175A1）である融合モノオキシゲナーゼ175RFでは基質となり得ないテストステロンを水酸化してその水酸化物を生産できることが明らかになった。具体的には、テストステロンの6β位、16α位、及び2β位を水酸化することができることが明らかになった。【００９８】
実施例５：融合モノオキシゲナーゼを用いた有機溶媒中における水酸化物の生産
実施例３で得た変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉を用い、有機溶媒中において水酸化物を生産した。【００９９】
基質としてはテストステロンを用いた。NADPH (1 mM)、変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉(1 μM)、10%グリセロールを含んだ50 mM potassium phosphate buffer (pH7.4)中で行った。
また、メタノール濃度が1%の時は50 mMテストステロン、5%の時は10 mMテストステロン、10%の時は5 mMテストステロンをそれぞれ最終濃度が500 μMになるよう加えた。反応時間及び代謝産物の分析は実施例４と同様に行った。【０１００】
その結果を表３に示す。この変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉は、有機溶媒の存在下においても水酸化物を生産できることが明らかになった。【０１０１】
【表３】
2010095721.tif 000004
【０１０２】
実施例６：変異型融合モノオキシゲナーゼの作製（２）
変異型のP450を含む本発明の融合モノオキシゲナーゼを次の通り作製した。
CYP175A1の269番目のトリプトファン及び270番目のイソロイシンをそれぞれフェニルアラニン及びアラニンに置換した変異型CYP175A1（本明細書において、「変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈W269P、I270A〉」、又は単に「175RF〈W269P、I270A〉」ということもある。）をコードするDNAを次のようにして作製した。【０１０３】
CYP175A1をコードするDNAを鋳型にして、プライマー（primer 14）5’-TCTACCCCCCCGCCCCGGCCCTCACCCGGA-3’（配列番号２０；下線部は変異導入箇所を示す）を用いてmegaprimer法により変異体をコードするDNAを作製した。１回目のPCRではprimer 14 (forward primer) 及び表１に示したprimer 7 (reverse primer) 及びKOD Plus DNA polymeraseを用いて、CYP175A1をコードするDNAを鋳型にして94 ℃、5分→(94 ℃・30秒、55 ℃・30秒、68 ℃・2分)×30サイクルの条件でPCRを行った後、PCR産物をゲル抽出した。２回目のPCRではゲル抽出後のPCR産物(reverse primer)、表１に示したprimer 6 (forward primer)、そして、CYP175A1をコードするDNAを鋳型にして94 ℃、5分→(94 ℃・30秒、50 ℃・1分、68 ℃・2分)×30サイクルの条件でPCRを行った。そして、実施例１と同様の方法でpET-GTS-RFにPCR産物を挿入し、変異型CYP175A1と電子伝達系の融合酵素発現用ベクターを作製した。大腸菌において融合酵素を発現させた。菌体からの目的融合酵素の精製を実施例１と同様の条件で行い、目的変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈W269P、I270A〉を得た。なお、次の実施例８、９においてこの融合酵素は精製工程を経ることなく、直接基質との反応に付し、分光学的に測定した。【０１０４】
実施例７：変異型融合モノオキシゲナーゼの作製（３）
変異型のP450を含む本発明の融合モノオキシゲナーゼを次の通り作製した。
CYP175A1の67番目のグルタミン酸及び68番目のチロシンをそれぞれグリシン及びイソロイシンに、並びに269番目のトリプトファン及び270番目のイソロイシンをそれぞれフェニルアラニン及びアラニンに置換した変異型CYP175A1（本明細書において、「変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I、W269P、I270A〉、又は単に「175RF〈Q67G、Y68I、W269P、I270A〉」ということもある。）をコードするDNAを次のようにして作製した。【０１０５】
変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈W269P、I270A〉をコードするDNAを鋳型にして、プライマー（primer 15）5’-AAGGCCACCTTCGGGTTACGGGCCCTCTC-3’（配列番号２１；下線部は変異導入箇所を示す）を用いてmegaprimer法により変異体をコードするDNAを作製した。１回目のPCRではprimer 15 (forward primer) 及び表１に示したprimer 7 (reverse primer) 及びKOD Plus DNA polymeraseを用いて、CYP175A1をコードするDNAを鋳型にして94 ℃、5分→(94 ℃・30秒、55 ℃・30秒、68 ℃・2分)×30サイクルの条件でPCRを行った後、PCR産物をゲル抽出した。２回目のPCRではゲル抽出後のPCR産物(reverse primer)、表１に示したprimer 6 (forward primer)、そして、CYP175A1をコードするDNAを鋳型にして94 ℃、5分→(94 ℃・30秒、50 ℃・1分、68 ℃・2分)×30サイクルの条件でPCRを行った。そして、実施例１と同様の方法でpET-GTS-RFにPCR産物を挿入し、変異型CYP175A1と電子伝達系の融合酵素発現用ベクターを作製した。大腸菌において、目的変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I、W269P、I270A〉を発現させた。これらは実施例１と同様の方法で精製を行った。なお、次の実施例８、９においてこの融合酵素は精製工程を経ることなく、直接基質との反応に付し、分光学的に測定した。【０１０６】
実施例８：変異型融合モノオキシゲナーゼを用いた水酸化物の生産（２）
実施例３及び７でそれぞれ作製した変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉及び175RF〈Q67G、Y68I、W269P、I270A〉（上述のように未精製品）を用いて、野生型P450（CYP175A1）では基質とはならないテストステロンを水酸化することにより、その水酸化物を得た。【０１０７】
テストステロン（500 μM）と175RF、175RF〈Q67G、Y68I〉又は175RF〈Q67G、Y68I、W269P、I270A〉（1μM）、NADPH（1 mM）及び10% グリセロールを含んだ50 mM potassium phosphate buffer (pH7.4) 中（総量400μl）で水酸化反応を行った。
60℃で15分間反応させた後、2mlの酢酸エチルを添加することで反応産物を抽出した。抽出物を遠心濃縮機を用いて乾固させ、残渣を50％のメタノールに溶解させ、HPLCを用いて分析した。カラム（ODS-100Z）を40℃に加温し、流速1.0ml/minで水：メタノール：アセトニトリル=62:36:2から30:64:6まで20分間で直線的に濃度変化させることで分析を行った。その結果を表４に示す。【０１０８】
【表４】
2010095721.tif 000005
【０１０９】
その結果、この変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉又は175RF〈Q67G、Y68I、W269P、I270A〉を用いることで、P450が野生型のP450（CYP175A1）である融合モノオキシゲナーゼ175RFでは基質となり得ないテストステロンを水酸化してその水酸化物を生産できることが明らかになった。本実施例では、具体的には、テストステロンの2β位が水酸化されることを確認した。【０１１０】
また、これら融合モノオキシゲナーゼは、未精製のものを直接用いたことにより、失活乃至活性低下が回避でき、高い活性を示すことも分かった。【０１１１】
実施例９：変異型融合モノオキシゲナーゼを用いた水酸化物の生産（３）
実施例３、６及び７でそれぞれ作製した変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉、175RF〈W269P、I270A〉及び175RF〈Q67G、Y68I、W269P、I270A〉を用いて、野生型P450（CYP175A1）では基質とはならないアミノピリンのジメチルアミノ基のメチル基を一つ脱離し、モノメチルアミノ体を得た。【０１１２】
アミノピリン5mMと175RF、175RF〈Q67G、Y68I〉、175RF〈W269P、I270A〉又は175RF〈Q67G、Y68I、W269P、I270A〉（いずれも未精製品）0.25 μM及び0.1 M Tris Hcl バッファー(pH7.5)を混合し、さらにNADPH 0.2mMを添加した上（総量2000μl）で60℃、15分間インキュベートすることにより脱メチル化反応を行った。
その後、20 % トリクロロ酢酸（TCA）を1 ml添加することで反応を停止した。4,000 rpm、4℃で10分間遠心分離し、上清をチューブに移した。このチューブにNash試薬（酢酸アンモニウム9 gとアセチルアセトン120 μlに蒸留水を添加して総量30 mlとしたもの）を1 ml添加してボルテックスし、さらに60℃にて30分間インキュベートした。これを波長415 nmで分光学的に測定した。その結果を表５に示す。【０１１３】
【表５】
2010095721.tif 000006
【０１１４】
その結果、この変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉、175RF〈W269P、I270A〉又は175RF〈Q67G、Y68I、W269P、I270A〉を用いることで、P450が野生型のP450（CYP175A1）である融合モノオキシゲナーゼ175RFでは基質となり得ないアミノピリンのメチル基を脱離することが明らかになった。【０１１５】
また、これら融合モノオキシゲナーゼは、未精製のものを直接用いたことにより、失活乃至活性低下が回避でき、高い活性を示すことも分かった。
【図１】
2010095721.tif 000007
【図２】
2010095721.tif 000008
【図３】
2010095721.tif 000009
【図４】
2010095721.tif 000010
【図５】
2010095721.tif 000011
【図６】
2010095721.tif 000012
【図７】
2010095721.tif 000013
【図８】
2010095721.tif 000014
【配列表】
2010095721000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月8日(2010.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｈｅｒｍｕｓ属の高度好熱性細菌に由来するＰ４５０、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをＮ末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなり、
Ｐ４５０が次の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである融合モノオキシゲナーゼ：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ）（Ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、当該ポリペプチド、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをＮ末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すものである、ポリペプチド。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
フェレドキシンレダクターゼが次の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである請求項１に記載の融合モノオキシゲナーゼ：
（Ａ）配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ）（Ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、Ｐ４５０、当該ポリペプチド、及びフェレドキシンをＮ末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すものである、ポリペプチド。
【請求項５】
フェレドキシンが次の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドである請求項１に記載の融合モノオキシゲナーゼ：
（Ａ）配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（Ｂ）（Ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、Ｐ４５０、フェレドキシンレダクターゼ、及び当該ポリペプチドをＮ末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すものである、ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載の融合モノオキシゲナーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６記載のＤＮＡを導入した微生物。
【請求項８】
請求項７記載の微生物、又はその微生物から得られる培養物から融合モノオキシゲナーゼを採取する工程を含む、融合モノオキシゲナーゼの生産方法。
【請求項９】
請求項１に記載の融合モノオキシゲナーゼを用いて有機溶媒の存在下で基質に酸素を添加することによりその酸化物を得る工程を含む、酸化物の生産方法。
【請求項１０】
基質がβ−カロテン、テストステロン又はアミノピリンである請求項９に記載の生産方法。
【請求項１１】
有機溶媒の存在下で酸化物を得る前記工程を、有機溶媒を５〜５０容量％含む溶液中で行う請求項９に記載の生産方法。
【請求項１２】
有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、又はＤＭＳＯである請求項９に記載の生産方法。
【国際調査報告】
2010095721.tif 000015
2010095721.tif 000016
2010095721.tif 000017
2010095721.tif 000018