【事件の表示】
　特許第３１７４６１１号「免疫賦活組成物」の請求項１ないし９に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３１７４６１１号の請求項１ないし９に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　特許第３１７４６１１号の請求項１ないし９に係る発明についての出願は、平成４年２月２８日に特許出願され、平成１３年３月３０日にその特許権の設定登録がなされ、その後、株式会社ヤクルト本社より特許異議の申立てがなされ、取消しの理由が通知され、その指定期間内に訂正請求がなされ、その後、再度の取消しの理由が通知され、その指定期間内に前記の訂正請求に代えて再度訂正請求がなされたものである。
　
２．訂正の適否についての判断
（１）訂正の内容
ア．訂正事項ａ
　特許請求の範囲の請求項１に「【請求項１】乳酸菌の菌体の破砕後、遠心分離によって細胞壁画分を除去して得られた上清もしくはその処理物を含有することを特徴とする免疫賦活剤。」とある記載を、
「【請求項１】乳酸菌の菌体の破砕後、遠心分離によって細胞壁画分を除去して得られた上清（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）もしくは上清の処理物（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）を有効成分とすることを特徴とする免疫賦活剤。」と訂正する。
イ．訂正事項ｂ
  特許請求の範囲の請求項２に「【請求項２】上清の処理物が、上清を希釈、濃縮、分画、精製、及び／又は乾燥してなるものであることを特徴とする請求項１に記載の免疫賦活剤。」とある記載を、
「【請求項２】その上清の処理物（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）が、上清を希釈、濃縮、分画、精製、及び／又は乾燥してなるものであることを特徴とする請求項１に記載の免疫賦活剤。」と訂正する。
ウ．訂正事項ｃ
　特許請求の範囲の請求項４に「【請求項４】乳酸菌の菌体の破砕後、遠心分離によって細胞壁画分を除去して得られた上清もしくはその処理物を含有することを特徴とする免疫賦活用飲食品。」とある記載を、
「【請求項４】乳酸菌の菌体の破砕後、遠心分離によって細胞壁画分を除去して得られた上清（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）もしくはその上清の処理物（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）を配合することを特徴とする免疫賦活用飲食品。」と訂正する。
エ．訂正事項ｄ
　特許請求の範囲の請求項５に「【請求項５】上清の処理物が、上清を希釈、濃縮、分画、精製、及び／又は乾燥してなるものであることを特徴とする請求項４に記載の免疫賦活用飲食品。」とある記載を、
「【請求項５】その上清の処理物（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）が、上清を希釈、濃縮、分画、精製、及び／又は乾燥してなるものであることを特徴とする請求項４に記載の免疫賦活用飲食品。」と訂正する。
オ．訂正事項ｅ
　特許請求の範囲の請求項９に「【請求項９】上清もしくはその処理物の含有において、１．０×１０６〜１．０×１０１２個の乳酸菌菌体由来の細胞質画分を粉乳１ｇ当たりに含有せしめることを特徴とする請求項８に記載の免疫賦活用飲食品。」とある記載を、
「【請求項９】上清（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）もしくはその上清の処理物（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）の含有において、１．０×１０６〜１．０×１０１２個の乳酸菌菌体由来の細胞質画分を粉乳１ｇ当たり配合せしめることを特徴とする請求項８に記載の免疫賦活用飲食品。」と訂正する。
カ．訂正事項ｆ
　明細書の段落【００１３】の全文を削除する。
キ．訂正事項ｇ
　明細書の段落【００３０】に記載の「【実施例６】」を「【参考例１】」と訂正する。
ク．訂正事項ｈ
　明細書の段落【００３１】に記載の「【実施例７】」を「【参考例２】」と訂正する。
ケ．訂正事項ｉ
　明細書の段落【００３３】に記載の「【実施例８】」を「【実施例６】」と訂正する。
コ．訂正事項ｊ
　明細書の段落【００３５】に記載の「【実施例９】」を「【実施例７】」と訂正する。
サ．訂正事項ｋ
　明細書の段落【００３７】に記載の「【実施例１０】」を「【実施例８】」と訂正する。
シ．訂正事項ｌ
　明細書の段落【００３９】に記載の「【実施例１１】」を「【実施例９】」と訂正する。
ス．訂正事項ｍ
　明細書の段落【００４０】に記載の「【実施例１２】」を「【実施例１０】」と訂正する。
セ．訂正事項ｎ
　明細書の段落【００４１】に記載の「【実施例１３】」を「【実施例１１】」と訂正する。
ソ．訂正事項ｏ
　明細書の段落【００４４】に記載の「【実施例１４】」を「【実施例１２】」と訂正する。
タ．訂正事項ｐ
　図面の簡単な説明に「【図６】Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ菌体経口投与時の細胞増進の促進（実施例８）を示した図である。」とある記載を、
「【図６】Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ菌体経口投与時の細胞増進の促進（実施例６）を示した図である。」と訂正する。
　
（２）訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
  上記訂正事項ａないしｅは、請求項１、２、４、５、及び９にそれぞれ記載の「上清」及び「その処理物」から、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものを除く訂正であるから、特許請求の範囲の減縮を目的とした明細書の訂正に該当する。
　また、上記訂正事項ｆないしｐは、上記訂正事項ａないしｅと整合を図るものであるから、明りょうでない記載の釈明を目的とした明細書の訂正に該当する。
　そして、上記訂正事項ａないしｐは、いずれも新規事項の追加に該当せず、実質上特許請求の範囲を拡張又は変更するものではない。
　
（３）むすび
　したがって、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項において準用する第１２６条第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議の申立てについての判断
（１）本件発明
　上記２．で示したように上記訂正が認められるから、本件請求項１ないし９に係る発明は、上記訂正に係る訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１ないし９に記載された事項により特定されるとおりのものである。
　
（２）申立ての理由の概要
　異議申立人　株式会社ヤクルト本社は、下記の甲第１号証ないし甲第１１号証を提出して、
（ｉ）訂正前の本件請求項１ないし９に係る発明は、甲第１号証乃至甲第１０号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、当該発明の特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してなされたものである、
（ｉｉ）本件明細書の発明の詳細な説明の記載は、当業者が容易にその実施をすることができる程度に記載されておらず、また、請求項１、４及び９に係る発明は、特許を受けようとする発明の構成に欠くことができない事項のみを記載したものではないから、本件請求項１ないし９に係る発明の特許は、特許法第３６条第４項、第５項及び第６項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してなされたものである、
旨主張している。
　　　　　　　　　　　　　　記
  甲第１号証：Ｂｉｆｉｄｕｓ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｊｕ
　　　　　　　ｎｅ，１９９１，２５−２６、第１１回学術集会特集号
　甲第２号証：Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，１：８９−９５，１９８９
　甲第３号証：Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８　　　　　　　５），１３１，２５０１ー２５０３
　甲第４号証：薬理と治療、１８（１）、１９９０年１月、５１−５７
　甲第５号証：Ｍｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，（１９８４　　　　　　　），１７３：１１３ー１２５
　甲第６号証：Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ，（１９８４）１６６：
　　　　　　　１９９ー２１４
　甲第７号証：Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，（１９８８）２９　　　　　　　：２７５−２７７
  甲第８号証：Ｊ．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，
　　　　　　　４３，４８３−４９７，１９７３
　甲第９号証：乳酸菌の科学と技術、（１９９６）、第６５頁〜第７４頁
　甲第１０号証：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３３，５２３ー５３０
　　　　　　　　（１９８３）
　甲第１１号証：甲第１号証乃至甲第５号証に記載の画分分離工程の比較表
　
（３）当審の判断
　＜２９条２項違反について＞
（請求項１に係る発明について）
　本件請求項１に係る発明は、乳酸菌の菌体の破砕後、遠心分離によって細胞壁画分を除去して得られた上清もしくは上清の処理物中に、細胞質膜やリポテイコ酸とは異なる新しい免疫賦活成分が含有されているとの発見に基づきなされたものである。
　本件請求項１において特定する上記上清もしくはその上清の処理物中には、細胞質膜やリポテイコ酸が含まれていないことは、請求項１の「上清」及び「その上清の処理物」の後にそれぞれ「ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く」と明記されていることからも明らかである。
　
　これに対して、甲第１号証には、ビフィドバクテリウム・ブレーベを用いて、クライオ・クリーン・ブラスターで全菌体を粉砕して細胞壁画分を得、また菌体をＮーアセチルムラミダーゼで処理して、細胞質膜とリポティコ酸（ＬＴＡ）を分画したこと、及びビフィドバクテリウム・ブレーベ　ＹＩＴ４０６４のＩｇＡ抗体産生誘導活性は、主に菌体の細胞質膜部分に担われているものと考えられることが、甲第２号証には、ラクトバチルス・カゼイの菌体を、酵素処理して細胞壁成分（ＣＷＩ）と細胞質成分（ＣＹＴＩ）とに分画し、細胞質成分からフェノール処理することによってリポテイコ酸を抽出すること、また一方、同じ菌体を押し潰して粉砕し、細胞壁成分（ＣＷＩＩ）と細胞質成分（ＣＹＴＩＩ）とに分画したこと、及びマウス・サイトメガロウィルス感染に対する抗菌活性を調べたところ、対照群と比較してＬＴＡ投与群及びＣＹＴＩＩ投与群には抗菌活性があることが、甲第３号証には、ラクトバチルス属の菌体から、フェノール処理によってリポテイコ酸が単離され、得られたリポテイコ酸にはシュードモナス属の細菌に対する抗細菌活性があることが、甲第４号証には、ラクトバチルス・カゼイをＮーアセチルムラミダーゼ処理した後に遠心洗浄して、凍結乾燥することにより、細胞質画分（プロトプラスト）を得たこと、及び該プロトプラストを加えることにより、対照群に較べて腫瘍が２０％弱程度小さくなり、従って該プロトプラストには抗腫瘍活性があることが、甲第５号証には、ラクトバチルス・カゼイをＮーアセチルムラミダーゼ（Ｍー１）処理して、細胞壁とプロトプラストとに分けること、及び該プロトプラストには、細胞単独の対照群と比較して抗腫瘍活性が存在することが、甲第６号証には、リポテイコ酸は抗体反応の活性化の刺激作用やリンパ球に対するインターロイキン形成の活性化といった免疫促進効果を有するものであることが、それぞれ記載されている。
　これらの記載からみて、甲第１号証乃至甲第６号証には、乳酸菌由来の細胞質膜画分、リポテイコ酸、及びプロトプラストのそれぞれに免疫賦活活性が存在することが教示されていると認めることはできる。
　しかしながら、前記プロトプラストは、細胞壁を取り除いた細胞質膜で包まれた細胞であり、従って、前記プロトプラストに免疫賦活活性があることをもって、直ちに細胞質膜を除く細胞質部分に免疫賦活成分が存在するとの事項を導き出すことができず、乳酸菌の菌体の破砕後、遠心分離によって細胞壁画分を除去して得られた、細胞質膜及びリポテイコ酸を含有していない上清もしくはその上清の処理物に免疫賦活成分が存在することが甲第１号証乃至甲第６号証に教示されているということはできない。
　また、甲第７号証には、リポテイコ酸が細胞質膜の外側にあって、細胞質膜から細胞壁にわたって存在し得ることが、甲第８号証には、ラクトバチルス属菌の細胞におけるリポテイコ酸に関し、リポテイコ酸分子が、その糖脂質部分と膜の脂質又はタンパク質との疎水的相互作用によって、細胞質膜の中或いはその上に保持されていることが、甲第９号証には、リポテイコ酸が、末端に糖脂質が結合して疎水結合によって細胞質膜に会合していることが、甲第１０号証には、菌体を破砕機で超音波振とうした後に静置させて、細胞壁成分を除去し、フェノール処理して、細胞質成分のリポテイコ酸を単離することが記載されているが、これら刊行物には、乳酸菌の菌体の破砕後、遠心分離によって細胞壁画分を除去して得られた、細胞質膜及びリポテイコ酸を含有していない上清もしくはその上清の処理物に免疫賦活成分が存在することを教示する記載は何もない。
　してみると、甲第１１号証に記載の「甲第１号証乃至甲第５号証に記載の画分分離工程の比較表」を参酌するも、乳酸菌の菌体の破砕後、遠心分離によって細胞壁画分を除去して得られた、細胞質膜及びリポテイコ酸を含有していない上清もしくはその上清の処理物を免疫賦活剤として使用することが、甲第１号証乃至甲第１０号証の記載に基づいて当業者が容易に想到し得ることであるということはできず、本件請求項１に係る発明は、甲第１号証乃至甲第１０号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとすることはできない。
　
（請求項２及び３に係る発明について）
　本件請求項２及び３に係る発明は、請求項１を引用する発明であるから、請求項１と同様の理由により、甲第１号証乃至甲第１０号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとすることはできない。
　
（請求項４に係る発明について）
  先に記載したとおり、乳酸菌の菌体の破砕後、遠心分離によって細胞壁画分を除去して得られた、細胞質膜及びリポテイコ酸を含有していない上清もしくはその上清の処理物に免疫賦活成分が存在することが、甲第１号証乃至甲第１０号証に教示されていない以上、当該上清もしくはその上清の処理物を配合して免疫賦活用飲食品とすることは、甲第１号証乃至甲第１０号証の記載に基づいて当業者が容易に想到し得ることではない。
　してみると、甲第１１号証の記載を参酌するも、本件請求項４に係る発明は、甲第１号証乃至甲第１０号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとすることはできない。
　
（請求項５ないし９に係る発明について）
　本件請求項５ないし９に係る発明は、請求項４を引用する発明であるから、請求項４と同様の理由により、甲第１号証乃至甲第１０号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとすることはできない。
　
　
　
　＜３６条４項、５項及び６項違反について＞
  異議申立人は、下記（ａ）ないし（ｃ）の点で、本件明細書には記載不備が存在する旨主張する。
（ａ）機械的に菌体を破砕すれば、破砕条件によって、細胞壁のみの断片の他に、細胞壁と細胞質膜が結合した断片や細胞質膜の断片のみも生じ得ると思われる。また、遠心分離は、その物体の沈降係数に従って分画されるため、遠心分離条件が異なれば、異なる物体が沈殿することになる。しかしながら、本件明細書には、破砕条件及び遠心分離条件は一切記載されていない。
　このため、遠心分離に供される試料がどのような状態であるか不明であり、細胞壁画分を除去する程度の遠心分離だとしても、細胞壁成分の他に細胞質膜が結合したような断片や、細胞質膜のみで構成される断片が、細胞壁のみの断片と共に沈殿物として除去されているのか不明である。従って、本件明細書の詳細な説明は、本件特許に係る細胞壁を除去して得られる上清もしくはその処理物を当業者が容易に得られるように記載されているとはいえない。
（ｂ）本件特許明細書には、「細胞壁画分」及び「細胞質画分」との用語が認められるが、この両者の間に介在し得る細胞質膜画分については何ら記載されていない。このため、機械的粉砕とこれに続く遠心分離によって、細胞質膜がいずれに含まれることとなるのか明確にされていない。このため、請求項１ないし９に係る発明の外延が不明確となっている。
（ｃ）請求項１乃至請求項８には細胞壁を除去した上清もしくはその処理物に関するものである一方で、請求項９では細胞質画分に関する発明となっているが、前記「細胞壁を除去した上清もしくはその処理物」と「細胞質画分」との関係が不明瞭となっている。
　
  上記主張について検討する。
（ａ）について
　菌体の破砕条件及び遠心分離条件に関し、本件明細書の実施例１には、「……………培養終了後、遠心分離により菌体を回収し、冷却した生理食塩水で３回洗浄し、蒸留水に懸濁した。この懸濁液を出力１００Ｗの超音波破砕機で２０分間処理し、処理液を１０００Ｇの遠心分離にかけ、未破壊の菌体を沈殿として除去した。次に上清を３００００Ｇの遠心分離にかけ、上清（細胞質画分）と沈殿（細胞壁画分）に再度かけた。上清はそのまま凍結乾燥して細胞質画分とし、……………」と記載されており、当業者ならば上記破砕条件及び遠心分離条件を採用することにより、本件請求項１ないし９において特定する「上清（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）もしくはその上清の処理物（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）」を容易に得ることができるものと認められるので、上記（ａ）の点に異議申立人が主張するような記載不備はない。
　
（ｂ）について
　上記訂正により、本件請求項１ないし９に記載の「上清もしくはその上清の処理物」には細胞質膜が含まれないことが明確になった結果、上記（ｂ）の点にもはや異議申立人が主張する記載不備は存在しない。
　
（ｃ）について
　訂正後の本件明細書の記載からみて、請求項９に記載の「細胞質画分」は、請求項１ないし８において特定する「 細胞壁画分を除去して得られた上清（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）もしくはその上清の処理物（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）」を意味することは明らかであり、上記（ｃ）の点に異議申立人が主張するような記載不備はない。
　
（４）むすび
　以上のとおりであるから、異議申立ての理由及び提出した証拠方法によっては、本件請求項１ないし９に係る特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件請求項１ないし９に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１４年８月２６日（２００２．８．２６）
【訂正の要旨】
＜訂正の要旨＞
ア．訂正事項ａ
　特許請求の範囲の請求項１に「【請求項１】乳酸菌の菌体の破砕後、遠心分離によって細胞壁画分を除去して得られた上清もしくはその処理物を含有することを特徴とする免疫賦活剤。」とある記載を、
「【請求項１】乳酸菌の菌体の破砕後、遠心分離によって細胞壁画分を除去して得られた上清（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）もしくは上清の処理物（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）を有効成分とすることを特徴とする免疫賦活剤。」と訂正する。
イ．訂正事項ｂ
　特許請求の範囲の請求項２に「【請求項２】上清の処理物が、上清を希釈、濃縮、分画、精製、及び／又は乾燥してなるものであることを特徴とする請求項１に記載の免疫賦活剤。」とある記載を、
「【請求項２】その上清の処理物（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）が、上清を希釈、濃縮、分画、精製、及び／又は乾燥してなるものであることを特徴とする請求項１に記載の免疫賦活剤。」と訂正する。
ウ．訂正事項ｃ
　特許請求の範囲の請求項４に「【請求項４】乳酸菌の菌体の破砕後、遠心分離によって細胞壁画分を除去して得られた上清もしくはその処理物を含有することを特徴とする免疫賦活用飲食品。」とある記載を、
「【請求項４】乳酸菌の菌体の破砕後、遠心分離によって細胞壁画分を除去して得られた上清（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）もしくはその上清の処理物（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）を配合することを特徴とする免疫賦活用飲食品。」と訂正する。
エ．訂正事項ｄ
　特許請求の範囲の請求項５に「【請求項５】上清の処理物が、上清を希釈、濃縮、分画、精製、及び／又は乾燥してなるものであることを特徴とする請求項４に記載の免疫賦活用飲食品。」とある記載を、
「【請求項５】その上清の処理物（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）が、上清を希釈、濃縮、分画、精製、及び／又は乾燥してなるものであることを特徴とする請求項４に記載の免疫賦活用飲食品。」と訂正する。
オ．訂正事項ｅ
　特許請求の範囲の請求項９に「【請求項９】上清もしくはその処理物の含有において、１．０×１０６〜１．０×１０１２個の乳酸菌菌体由来の細胞質画分を粉乳１ｇ当たりに含有せしめることを特徴とする請求項８に記載の免疫賦活用飲食品。」とある記載を、
「【請求項９】上清（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）もしくはその上清の処理物（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）の含有において、１．０×１０６〜１．０×１０１２個の乳酸菌菌体由来の細胞質画分を粉乳１ｇ当たり配合せしめることを特徴とする請求項８に記載の免疫賦活用飲食品。」と訂正する。
カ．訂正事項ｆ
　明細書の段落【００１３】の全文を削除する。
キ．訂正事項ｇ
　明細書の段落【００３０】に記載の「【実施例６】」を「【参考例１】」と訂正する。
ク．訂正事項ｈ
　明細書の段落【００３１】に記載の「【実施例７】」を「【参考例２】」と訂正する。
ケ．訂正事項ｉ
　明細書の段落【００３３】に記載の「【実施例８】」を「【実施例６】」と訂正する。
コ．訂正事項ｊ
　明細書の段落【００３５】に記載の「【実施例９】」を「【実施例７】」と訂正する。
サ．訂正事項ｋ
　明細書の段落【００３７】に記載の「【実施例１０】」を「【実施例８】」と訂正する。
シ．訂正事項ｌ
　明細書の段落【００３９】に記載の「【実施例１１】」を「【実施例９】」と訂正する。
ス．訂正事項ｍ
　明細書の段落【００４０】に記載の「【実施例１２】」を「【実施例１０】」と訂正する。
セ．訂正事項ｎ
　明細書の段落【００４１】に記載の「【実施例１３】」を「【実施例１１】」と訂正する。
ソ．訂正事項ｏ
　明細書の段落【００４４】に記載の「【実施例１４】」を「【実施例１２】」と訂正する。
タ．訂正事項ｐ
　図面の簡単な説明に「【図６】Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ菌体経口投与時の細胞増進の促進（実施例８）を示した図である。」とある記載を、
「【図６】Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ菌体経口投与時の細胞増進の促進（実施例６）を示した図である。」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
免疫賦活組成物
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　乳酸菌の菌体の破砕後、遠心分離によって細胞壁画分を除去して得られた上清
（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）
上清の
（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）
有効成分と
　【請求項２】　
その
（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）
　【請求項３】　乳酸菌が、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の各属に属する１種または２種以上であることを特徴とする請求項１〜請求項２のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。
　【請求項４】　乳酸菌の菌体の破砕後、遠心分離によって細胞壁画分を除去して得られた上清
（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）
上清の
（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）
配合
　【請求項５】　
その
（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）
　【請求項６】　乳酸菌が、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の各属に属する１種または２種以上であることを特徴とする請求項４〜請求項５のいずれか１項に記載の免疫賦活用飲食品。
　【請求項７】　免疫賦活用飲食品が乳製品であることを特徴とする請求項４〜請求項６のいずれか１項に記載の免疫賦活用飲食品。
　【請求項８】　乳製品が育児用乳及び／又は育児用粉乳であることを特徴とする請求項７に記載の免疫賦活用飲食品。
　【請求項９】　上清
（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）
上清の
（ただし、リポテイコ酸又は細胞質膜を含むものは除く）
配合
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は、免疫賦活組成物に関するものであり、更に詳細には、乳酸菌菌体の細胞質画分及び／又はその含有物を含有してなる、生体内の免疫系を賦活せしめる能力にすぐれた組成物に関するものである。
　【０００２】
　本発明に係る組成物は、免疫賦活剤として医薬タイプで使用するほか、免疫賦活用の飲料、食品、栄養食品、機能性食品、特定保健用食品、ドリンク剤等飲食品タイプで使用し、食物アレルゲンや常在細菌フローラ等の抗原性物質、あるいは、ウィルスや病原菌等の感染性微生物に対する生体防御能を生体に付与するのに広く利用することができる。
　【０００３】
　【従来の技術】
　乳酸菌の生体免疫賦活作用については近年様々な報告がなされており、免疫賦活の機作や菌種による生理活性の差などが徐々に明らかにされている（廣田哲二、Ｎｅｗ　Ｆｏｏｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１０，Ｐ９（１９９０））。しかし、これらの報告のほとんどはまだ、乳酸菌菌体が生体に与える影響をｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏで解析しただけのものであり、乳酸菌菌体中の有効成分について検討した研究は数少ない。さらに、これらの数少ない研究においても対象とされているのは、菌体の細胞壁画分や菌体の生産する多糖体である（Ｃ．Ｉ．Ｐａｒｋら、Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ、
４６
７４
１０８
４０
　【０００４】
　一方母乳は分泌型ＩｇＡ、ラクトフェリン、リゾチーム、補体等の感染防御物質を多数含有しており、このことが腸管免疫系の未発達な新生児にとって母乳が最良の栄養源であるといわれる理由の１つになっている。母乳が不足したり、与えられない場合にその代用品として使用される育児用調製粉乳についても、生体防御機能の付与を目的として近年ラクトフェリンなどの物質が添加されている。
　【０００５】
　乳酸菌もこのような背景から添加が試みられている物質の１つであり、ロシアのＢａｋｈｔｉｙａｒｏｖａらは、ビフィズス菌を添加した調製粉乳を授乳された新生児は、その糞便中のＩｇＡ抗体量およびリゾチーム含有量が菌体を添加しない調製粉乳を授乳された新生児に比べて２倍以上になったことを報告している（Ｉｚｖｅｓｔｉｙａ　Ｖｙｓｓｈｉｋｈ　Ｕｃｈｅｂｎｙｋｈ　Ｚａｖｅｄｅｎｉｉ、Ｐｉｓｈｃｈｅｖａｙａ　Ｔｅｋｈｎｏｌｏｇｉｙａ　Ｎｏ．１，Ｐ３５（１９８８））。しかし、Ｂａｋｈｔｉｙａｒｏｖａらが調製粉乳に用いたビフィズス菌は耐熱性のビフィズス菌（すなわち、ビフィズス菌の生菌）と記されているだけで、菌体中の有効成分はもちろん、ビフィズス菌の使用菌株についても何ら明らかにされていない。一方、国内でもビフィズス菌含有ミルクの使用例は報告されているが、マクロファージの非特異的貧食細胞に及ぼす影響や赤血球系造血能に及ぼす影響を検討しているだけであって、投与した菌体の腸管免疫系に与える影響および菌体中の有効成分は全く不明である（関根ら、治療学、Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．５，Ｐ６９１（１９８５））。
　【０００６】
　【発明が解決しようとする課題】
　上記のように乳酸菌の生理作用の有効成分としては、細胞壁あるいは分泌多糖のみがこれまで重視されており、それらを分画する過程で生じる細胞質画分については特に注目されてこなかった。しかし、菌体全体から見ると細胞質の占める割合は細胞壁より多く、その有効的な活用が問題である。
　【０００７】
　実際上、先に述べたようなビフィズス菌に代表される乳酸菌を育児用粉乳に応用して新生児に生体防御能を賦与させようとする試みの中でも、菌体中の何が実際に腸管免疫系に作用しているのか十分解明されないままになっている。これでは乳酸菌の育児用粉乳その他へのより一層の利用を図ることには自ら限度がある。
　【０００８】
　【課題を解決するための手段】
　本発明は、乳酸菌を更に有効に利用するためになされたものであって、本発明者らは、各種乳酸歯の菌体を細胞壁と細胞質に分画し、各画分の免疫担当細胞に与える影響を鋭意研究したところ、細胞質画分が細胞壁画分と同等以上の免疫賦活作用を示すことを見い出し、本発明を完成するに至った。
　【０００９】
　すなわち、本発明者らは、乳酸菌菌体を生体に経口投与した場合、腸管免疫系の要であるパイエル板リンパ細胞を賦活化する乳酸菌菌体中の活性画分について鋭意研究した。その結果、菌体の細胞質画分が特に高い活性を示すことを見いだすと同時に、菌体を投与された生体の腸管（小腸内容物および小腸壁）において、菌体非投与の場合に比べて有意に高いＩｇＡ抗体が産生されることを見いだし本発明を完成するに至った。
　【００１０】
　本発明は、乳酸菌菌体の細胞質画分について、上記のような免疫賦活に関する有用性をはじめて発見し、この新知見に基づき更に研究の結果完成されたものであって、乳酸菌菌体の細胞質画分を有効成分とする免疫賦活組成物をその基本的技術思想とするものである。
　【００１１】
　本発明の乳酸菌菌体の細胞質画分を得るには、細胞壁分解酵素を菌体に作用させるか、フレンチプレスあるいは超音波破砕装置などで菌体を機械的に処理し、遠心分離後上清を回収すればよい。この場合、細胞質画分を分画する前の乳酸菌は生菌でも死菌でもよい。なおさらにトリクロロ酢酸処理や塩析処理により細胞質画分中の蛋白質、ペプチド、あるいはそれらを構成成分の１つとして含む化合物（糖蛋白質、リポ蛋白質など）を精製できれば一層望ましい。本発明において、細胞質画分としては、上記した乳酸菌菌体の破砕からその分画、精製に至る各段階における生成物がすべて包含されるほか、細胞質画分含有物も、本組成物の構成成分のひとつとして使用できる。
　【００１２】
　前者においては、乳酸菌菌体を破砕し、これを遠心分離して得られる上清、これを更に遠心分離して得られる上清、これを凍結乾燥してなる狭義の細胞質画分、これを分画、精製、トリクロロ酢酸処理、塩析処理等して得られる蛋白質複合体（蛋白質、リポ蛋白質、糖蛋白質等）、同じくペプチド複合体（ペプチド、糖ペプチド等）等が、細胞質画分の具体例として挙げられる。また、狭義及び広義の細胞質画分を希釈、濃縮、乾燥処理したものも自由に使用することができる。
　【００１４】
　本発明において、乳酸菌としては乳酸菌に属する微生物であれば特に限定されることなくすべての微生物が使用可能であって、市販菌や乳酸菌使用飲食品ないし医薬に使用されている乳酸菌も適宜使用できる。本発明において使用可能な乳酸菌の非限定例としては、次のものが挙げられる：ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＡＴＣＣ　１１５０６，Ｌ．ｌａｃｔｉｓ　ＩＦＯ　１２５２２等）；ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　ＡＴＣＣ　１５７０８等）；ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＴＣＣ　８０４２等）；ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ　ＡＴＣＣ　８０４３等）；ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　ＩＦＯ　３４２６等）その他。
　【００１５】
　本発明に係る免疫賦活組成物は、上記した細胞質画分及び／又はその含有物を一種又は二種以上有効成分としてなるものであって、飲食品または医薬として用いるものである。これらの有効成分を食品として使用する場合には、それ（ら）をそのまま添加したり、他の食品ないしは食品成分と併用したりして適宜常法にしたがって使用できる。また、医薬として使用する場合には、経口又は非経口投与することができる。経口投与の場合には、例えば常法にしたがい、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤、散剤とすることができ、又、非経口投与の場合には、例えば注射薬製剤、点滴剤、坐剤等として使用することができる。
　【００１６】
　本発明に係る有効成分は、天然起源であるために毒性が全くないか又は極めて低く、きわめて安全である（ＬＤ５０＞３０００ｍｇ／ｋｇ皮下、＞５０００ｍｇ／ｋｇ経口：いずれもラット）。
　【００１７】
　以下、本発明を実施例により更に詳しく説明する。
　【００１８】
　【実施例１】
　ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ　１５７０８をＥＧ液体培地（光岡知足著“腸内菌の世界”（叢文社１９８０））に接種し、嫌気条件下、３７℃で１８時間培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を回収し、冷却した生理食塩水で３回洗浄し、蒸留水に懸濁した。この懸濁液を出力１００Ｗの超音波破砕機で２０分間処理し、処理液を１，０００Ｇの遠心分離にかけ、未破壊の菌体を沈澱として除去した。次に上清を３０，０００Ｇの遠心分離にかけ、上清（細胞質画分）と沈澱（細胞壁画分）に再度かけた。上清はそのまま凍結乾燥して細胞質画分とし、沈澱はトリプシンおよびＤＮＡ、ＲＮＡ分解酵素で処理した後、遠心洗浄し、凍結乾燥して、細胞壁画分とした。
　【００１９】
　このようにして得られた双方の画分について、マイトジェン活性を次のようにして測定した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス脾細胞を採取、洗浄した後、同系マウス血清１％を含むＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させた。これらの細胞を９６穴平底プレートを用い、上記細胞質および細胞壁画分の存在下（１〜１００μｇ／ｗｅｌｌ）、１％同系マウス血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で５％ＣＯ２／Ａｉｒ条件下、３７℃７２時間それぞれ培養した（５×１０５個／ｗｅｌｌ）。次に１．０μＣｉ３Ｈ−チミジンを添加し、２０時間後３Ｈ−チミジンの細胞への取り込みをシンチレーションカウンターで測定した。コントロールは培地に何も物質を添加しなかった場合の細胞の３Ｈ−チミジン取り込みカウント数（ｃｐｍ）とし、これを各サンプルのｗｅｌｌのカウント数（ｃｐｍ）から引いた値（△ｃｐｍ）で結果（図１）を表わした。
　【００２０】
　本発明によれば図１に示すように、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍの細胞質にも細胞壁と同等以上のマイトジェン活性が見られた。なお、卵白アルブミン（ＯＶＡ）はネガティブコントロールである。
　【００２１】
　【実施例２】
　実施例１と同様の方法で、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ　１５７０７、ラクトバチルス・アシドフィラスＩＦＯ　３９５３、ラクトバチルス・デルブリッキ・サブスピーシズ・ラクティスＡＴＣＣ　１２３１５の菌体を培養し、超音波破砕、遠心処理を施して各菌株の細胞質画分を得た。
　【００２２】
　これらの菌株の細胞質画分の卵白アルブミン感作Ｔ細胞に対する細胞増殖活性を次のように測定した。ＢＡＬＢ／ｃマウスにＫｕｒｉｓａｋｉらの方法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１６，Ｐ２３６，１９８６）で卵白アルブミン（ＯＶＡ）を皮下免疫し、ＯＶＡ感作Ｔ細胞を得た。これらの細胞を、実施例１と同様の方法で各菌株の細胞質画分の存在下（２〜１００μｇ／ｍｌ）培養し、細胞増殖を３Ｈ−チミジンの取り込みにより調べた。結果は、培地に何も物質を添加しなかったｗｅｌｌのカウント数（コントロールのカウント数）を１とした場合の各サンプルのｗｅ１１のカウント数（刺激係数：ＳＩ）で表わした。
　【００２３】
　本発明によれば、図２に示すように、各菌株の細胞質はネガティブコントロールとして用いたβ−ラクトグロブリン（β−ＬＧ〉に比べて有意に高い細胞増殖活性を示した。特にビフィドバクテリウム・ロンガムの２菌株はポジテイブコントロールとして用いたグラム陰性菌由来の免疫賦活物質であるリポ多糖類（ＬＰＳ）にほぼ匹敵する活性を示した。
　【００２４】
　【実施例３】
　ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ　１５７０８を２．０×１０１１個／ｇ含有する菌体粉末を５％含有する乳清蛋白質（ＷＰＩ）固型飼料を作製し、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、５Ｗ、雌）８匹を飼育した（ＷＰＩ固型飼料の組成はＡＩＮ−７６に準拠）。２週間後にパイエル板をマウスの小腸から無菌的に取り出し、スライドガラスで緩やかにティースしてｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌとした。これらの細胞を９６穴平底プレートを用い実施例１で調製したビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ　１５７０８の細胞質および細胞壁画分の存在下（１〜１００μｇ／ｍｌ）、３７℃４８時間培養した（その他の条件は実施例１と同じ）。次に１．０μＣｉ３Ｈ−チミジンを添加し、２０時間後３Ｈ−チミジンの細胞への取り込みをシンチレーションカウンターで測定した。その結果を図３に示した。結果の表示は図１と同じ形式によった。
　【００２５】
　本発明によれば、図３に示すように菌体の細胞質画分はパイエル板リンパ細胞に対して強い細胞増殖活性を有した。これに対し、菌体の細胞壁画分は細胞増殖活性を示さず、ネガティブコントロールの卵白アルブミンによる応答（△ｃｐｍ）とほぼ同じ応答であった。このことから菌体が経口投与された場合その細胞質が腸管免疫系を強く刺激することが明らかとなった。
　【００２６】
　【実施例４】
　実施例３と同様にして、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ　１５７０８を２週間経口投与したＢＡＬＢ／ｃマウスよりパイエル板リンパ細胞を得た。これらの細胞をビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ　１５７０８の細胞質のトリプシン分解物（０、１、５、２４時間分解）の存在下、実施例３と同様の条件で培養し、細胞増殖を３Ｈ−チミジンの取り込みにより調べた。細胞質のトリプシン分解物は、ｐＨ８．５の緩衝液中で所定の時間（０〜２４時間）トリプシン（Ｓｉｇｍａ）をＥ／Ｓ比１：１００で作用させ、トリプシンを加熱失活後、脱塩、凍結乾燥することにより調製した。細胞質のトリプシン処理に伴う活性の変化を図４に示した。結果の表示は図１と同じ形式によった。
　【００２７】
　本発明によれば、図４に示すように、細胞質の細胞増殖活性は、トリプシン処理時間の延長とともに低下した。このことより、細胞質中の蛋白質およびペプチド、あるいはそれらの各種複合体（糖蛋白質、リポ蛋白質など）が本免疫賦活剤の活性の主体であることが明らかとなった。
　【００２８】
　【実施例５】
　実施例４で使用したトリプシンの代わりにキモトリプシン（Ｓｉｇｍａ）を用い、細胞質のキモトリプシン処理に伴う活性の変化を調べた。ただし、酵素処理時間は、０、５、２４時間とした。その結果を図５に示した。
　【００２９】
　本発明によれば、図５に示すように、細胞質の細胞増殖活性はキモトリプシン処理時間の延長とともに低下した。このことにより、実施例４と同様に、細胞質中の蛋白質およびペプチド、あるいはそれらの各種複合体（糖蛋白質、リポ蛋白質など）が本免疫賦活剤の活性の主体であることが明らかとなった。
　【００３０】
　【
参考例１
　高濃度培養法によりビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ　１５７０８を増殖させた培養液を４０００Ｇで２．０×１０１１個／ｍｌにまで遠心濃縮し、得られた沈澱画分に遠心前と同量の脱イオン水を加え、均一に沈澱を分散させた後、ＨＴＳＴ殺菌を行った。その後再び遠心分離を行い、沈澱画分を回収し、凍結乾燥菌体粉末を得た。粉末中のＢ．ｌｏｎｇｕｍ菌体数は約８．０×１０１１個／ｇ相当であった。この粉末を市販の育児用調製粉乳（明治乳業（株）製）に０．１％配合した。
　【００３１】
　【
参考例２
　高濃度培養法によりラクトバチルス・アシドフィルスＩＦＯ　３９５３を増殖させた培養液を３０００Ｇで１．５×１０１１個／ｍｌにまで遠心濃縮し得られた沈澱画分をＨＴＳＴ殺菌後、凍結乾燥した。この凍結乾燥菌体粉末中のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ菌体数は約４．０×１０１１個／ｇ相当であった。この粉末を市販の育児用調製粉乳（明治乳業（株）製）に０．０５％配合した。
　【００３２】
　なお、本発明に係る免疫賦活育児用粉乳を製造するに当り、乳酸菌菌体由来の細胞質画分は、上記した使用量を１例として使用することができるが、本発明においては、粉乳１ｇ当り、１．０×１０４個以上、好ましくは１．０×１０６〜１０×１０１２個の乳酸菌菌体由来の細胞質画分を使用すればよい。しかしながら、該細胞質画分は天然物由来のものであるので安全であり、したがって上記範囲よりも多量に使用しても何ら差し支えはないし、また、予防ないし保健を目的とする場合は、上記範囲よりも少量使用してもよい。また、育児用粉乳以外の飲食品を調製する場合も、上記範囲を参考にして細胞質画分の使用量を定めればよい。
　【００３３】
　【実施例
６
　ラクトバチルス・アシドフィラスＩＦＯ　３９５３の加熱死菌体を５×１０１０個／飼料１ｇ含有する乳清蛋白質（ＷＰＩ）固型飼料を作製し、実施例３と同様にして菌体投与マウスのパイエル板リンパ細胞に対するＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＩＦＯ　３９５３の細胞壁および細胞質画分の細胞増殖活性を菌体経口投与開始後２週間目に調べた。
　【００３４】
　その結果が図６である。本発明のとおり、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　ＩＦＯ　３９５３の細胞質画分はパイエル板リンパ細胞に対し強い増殖活性を示した。一方、細胞壁画分はｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌとして用いたＯＶＡより若干強い活性しか示さなかった。
　【００３５】
　【実施例
７
　実施例３で調製したＢ．ｌｏｎｇｕｍ　ＡＴＣＣ　１５７０８を含有する乳清蛋白質（ＷＰＩ）固型飼料でマウス７匹（ＢＡＬＢ／ｃ、５Ｗ、雌）を飼育した。４週間後にマウスから小腸部分を取り出し、露木らの方法（光岡知足編、“腸内フローラの研究方法論”、Ｐ．１５７（学会出版センター１９８９））に従って小腸内容物および小腸壁抽出液を得た。これらの試料中のＩｇＡ抗体価を抗マウスＩｇＡモノクローナル抗体（関東化学）を用いてＥＬＩＳＡ法で測定した。また対照としてＢ．ｌｏｎｇｕｍ　ＡＴＣＣ　１５７０８を含まないだけで他は同一組成のＷＰＩ固型飼料で上記と同様に飼育したマウスより得た小腸内容物および小腸壁抽出液中のＩｇＡ抗体価を同様に調べた。
　【００３６】
　その結果が図７である。本発明により、乳酸菌菌体の細胞質画分によるパイエル板リンパ細胞の活性化の結果、腸管でのＩｇＡ抗体価が対照に比べ高まっていることが明らかになった。
　【００３７】
　【実施例
８
　マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、５Ｗ、雌）２１匹を７匹ずつ３群に分け、実施例３および実施例
６
７
　【００３８】
　その結果が、図８である。本発明の通り、乳酸菌菌体の細胞質画分によるパイエル板リンパ細胞の活性化の結果、ＷＰＩ中の食物アレルゲンと言われるβ−ラクトグロブリン、および大腸菌などのグラム陰性菌のＬＰＳに対する腸管でのＩｇＡ抗体価が対照に比べて高まっていることが明らかになった。
　【００３９】
　【実施例
９
　ビタミンＣ２０ｇ、グラニュー糖５０ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物３０ｇに、実施例１で得た細胞質画分を５０ｇ加えて充分に混合した。混合物を１００等分して袋に詰め、１袋１．５ｇのスティック状免疫賦活用栄養健康食品を１００袋製造した。
　【００４０】
　【実施例
１０
　実施例１において微生物としてビフィドバクテリウム属菌にかえてペディオコッカス・セレビシエ−ＡＴＣＣ８０４２を用いて得た細胞質画分を用い、またビタミンＣ２０ｇにかえてビタミンＣとクエン酸の等量混合物２０ｇを用いたほかは、実施例
９
　【００４１】
　【実施例
１１
　次の配合により免疫賦活剤を製造した。
　（１）実施例１においてビフィドバクテリウム属菌にかえてストレプトコッカス・ファエシウムＡＴＣＣ８０４３を用いて得た細胞質画分の硫安塩析処理物の凍結乾燥物５０ｇ、（２）ラクトース９０ｇ、（３）コーンスターチ２９ｇ、（４）ステアリン酸マグネシウム１ｇ。
　【００４２】
　先ず、（１）、（２）、及び（３）（但し１７ｇ）を混合し、（３）（但し７ｇ）から調製したペーストとともに顆粒化した。得られた顆粒に（３）（但し５ｇ）と（４）を加えてよく混合し、この混合物を圧縮錠剤機により圧縮して、１錠あたり細胞質画分を１０ｍｇ含有する錠剤１０００個を製造した。
　【００４３】
　投与量は、患者の症状、年令によっても異なるが、０．１〜１５００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで１日１〜４回投与する。本発明において用いる細胞質画分は本来食品由来のものであるので、既述のように安全性にはほとんど問題はなく、したがって上記用量をこえて投与しても差し支えはない。また、健康の維持、増進、保健、栄養剤等としてこれを利用する場合は、上記用量よりも少ない量を長期間に亘って服用すればよい。また、既述のように本発明に係る錠剤は、経口投与以外の方法でも投与することができるが、静脈投与および筋肉投与の場合は０．０１〜１２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙである。
　【００４４】
　【実施例
１２
　次の配合を用意した。（１）実施例１で得た細胞質画分１０ｇ、（２）塩化ナトリウム８ｇ、（３）クロロブタノール４ｇ、（４）炭酸水素ナトリウム１ｇ。
　【００４５】
　全成分を蒸留水１０００ｍｌに溶解し、これを５００ｍｌの点滴ビン２本に分注し、免疫賦活輸液を製造した。
　【００４６】
　【発明の効果】
　本発明の免疫賦活組成物は、乳酸菌菌体の免疫賦活作用の活性主体として従来から研究されてきた細胞壁画分や菌体の分泌する多糖体と異なり、細胞質画分を有効成分とする。したがって、各種免疫担当細胞への作用メカニズムも従来から研究されてきた上記各物質とは異なる可能性が大であり、乳酸菌由来の安全性の高い免疫賦活剤として食品および医薬品へ広く応用できる。
　【００４７】
　また、本発明によって、食物アレルゲンや常在細菌フローラなどの抗原性物質、あるいはウィルスや病原菌などの感染性微生物に対して生体防御能を高める乳酸菌菌体の細胞質画分を有効成分として飲食品として直接用いたり、あるいは飲食品に配合することにより、これらの抗原性物質あるいは感染性微生物によって引き起こされる各種疾病の予防ないし治療に役立つ飲食品を供給することができる。例えば細胞質画分を育児用粉乳に配合することによって、これらの抗原性物質あるいは感染性微生物によって引き起こされる人工栄養児等の各種疾病の予防にきわめて有効な育児用粉乳を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ菌体の細胞質および細胞壁画分のマイトジェン活性を比較した図である。
　【図２】
　各種乳酸菌菌体の細胞質画分による卵白アルブミン感作Ｔ細胞の細胞増殖の促進を示した図である。
　【図３】
　Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ菌体経口投与時の細胞増殖の促進（実施例３）を示した図である。
　【図４】
　Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ菌体経口投与時の細胞増殖の促進に与える細胞質画分のトリプシン処理の影響を示した図である。
　【図５】
　Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ菌体経口投与時の細胞増殖の促進に与える細胞質画分のキモトリプシン処理の影響を示した図である。
　【図６】
　Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ菌体経口投与時の細胞増殖の促進（実施例
６
　【図７】
　Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ菌体経口投与による腸管ＩｇＡ産生の誘導を示した図である。
　【図８】
　菌体経口投与による抗原性物質に対する腸管ＩｇＡ産生の誘導を示した図である。
　【符号の説明】
　Ｂ：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ菌体投与群
　Ｌ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ菌体投与群
　Ｃ：対照群