(57)【要約】皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物の提供を目的として、鋭意研究を行った結果、マンゴスチン（Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａ  Ｌ．）果皮抽出物が皮膚障害を抑制する効果があることを見出した。本発明は、マンゴスチン果皮抽出物からなる皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物を提供する。
2010114149.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンゴスチン（Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａ  Ｌ．）の果皮から極性溶媒で抽出した抽出物からなる皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物。
【請求項２】
極性溶媒がエタノールまたはエタノール水溶液である請求項１の皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物。
【請求項３】
前記皮膚障害が活性酸素によるものである、請求項１または２の皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物。
【請求項４】
前記皮膚障害が紫外線照射によるものである、請求項１から３の皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物。
【請求項５】
紫外線照射による皮膚の水分量の減少を抑制することを特徴とする請求項１から４の皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物。
【請求項６】
紫外線照射による皮膚の損傷を抑制することを特徴とする請求項１から５の皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物。
【請求項７】
請求項１から６の皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物を含有する食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンゴスチンの果皮の抽出物からなる皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚のしわ、弾力性の低下、水分保持能力低下などの皮膚障害は、皮膚障害を持つ者を老けて見せたり、外観を損ねたりし、さらには、かゆみや痛みなどの不快感を生じる場合もある。このため、皮膚障害の治療又は予防が望まれる。
皮膚障害の原因は完全には解明されていないが、その多くは、活性酸素によると考えられる。活性酸素は、酸素が化学的に活性になった化学種を指し、非常に不安定で、強い酸化力を示す。活性酸素としてスーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシルラジカル、過酸化水素、一重項酸素などが知られる。一方、生体中にはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）やカタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼなどの諸酵素、さらにビタミンＥ、ビタミンＣ、β−カロテン、尿酸などの働きによって活性酸素を除去する抗酸化作用を備えている。しかし、活性酸素産生が過剰になると、生体が備える抗酸化作用を超える。このような状態を酸化ストレス状態といい、酸化ストレス状態においてはタンパク質、脂質、糖及び核酸などが酸化される。
皮膚組織においては、活性酸素により、表皮の角化細胞がダメージを受け、細胞外マトリックスの代謝が乱れ、その結果、角質厚の不均一化や角質層バリア機能の低下による乾燥、さらには、しわが導かれる。また、真皮では、活性酸素により、線維芽細胞がダメージを受け、真皮コラーゲン量の低下、コラーゲンの架橋形成が促進され、真皮の柔軟性や伸縮性が低下する。このような機構の詳細として次のようなものが考えられる。すなわち、活性酸素は表皮組織の細胞のレセプターやそのリガンドに影響を与え、表皮角化細胞や真皮線維芽細胞からのインターロイキン１（ＩＬ−１：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １）やＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α）などのサイトカイン産生を引き起こし、また、転写因子に影響を与え、ＡＰ−１（ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）やＮＦ−κβの活性化、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ：ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）産生増加を誘導する。特にＭＭＰｓの活性化は、しわを形成し、老化を促進すると考えられている。
皮膚組織において活性酸素を誘導する代表的なものとして、紫外線が知られる。紫外線は１０−４００ｎｍの不可視光線であり、ヒトや環境への影響の違いから、ＵＶＡ（３１５−４００ｎｍ）、ＵＶＢ（２８０−３１５ｎｍ）、ＵＶＣ（２８０ｎｍ以下）に分類される。一般的に人が日常的に浴びる紫外線は主に太陽光である。太陽光の中には、ＵＶＡ、ＵＶＢ、ＵＶＣの波長の紫外線が含まれる。そのうち、ＵＶＣはオゾン層に吸収され、ほとんど地表に到達しないが、ＵＶＡとＵＶＢの一部は地表に到達し、皮膚に様々な変化を及ぼす。紫外線の曝露により、皮膚組織ではハイドロゲンペルオキシド、スーパーオキサイドアニオン、一重項酸素などが産生される。紫外線の繰り返し、かつ長年の暴露は、皮膚の構造と機能に悪影響を及ぼす。このような現象を光老化という。また、紫外線照射による炎症、すなわちサンバーン（ｓｕｎ  ｂｕｒｎ）は、皮膚組織における活性酸素の生成をさらに導くことが知られる。紫外線曝露による真皮への影響については、一部が表皮により制御を受けていることも確認されている。
マンゴスチンは、マレー半島付近を原産地とする、オトギリソウ科（Ｇｕｔｔｉｆｅｒａｅ）フクギ属の常緑の高木で、タイやインド、スリランカ、マレーシアなどに広まり、果樹として栽培されている。それだけでなく、マンゴスチンは、古くから東南アジア地域で自然薬として使用されており、抗炎症作用や抗菌効果があることが知られ、解熱剤、感染症治療薬として、また、皮膚の炎症や傷の治療にマンゴスチンが用いられてきた。
マンゴスチンの抗酸化作用については以下のような報告がある。マンゴスチン果皮抽出物中には、多くの有効成分が含まれており、非常に強力な抗酸化作用をもつキサントンをはじめとして、カテキンやポリフェノール、ポリサッカライド、ミネラル、ビタミンなども豊富に含まれていることが知られている。なかでもポリフェノールの１つであるキサントンに関する研究が進んでおり、種々のキサントン類が報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５４：２０７７−２０８２，２００６）。マンゴスチン果皮に含まれる特有のキサントンとして、代表的なものにα−ｍａｎｇｏｓｔｉｎとγ−ｍａｎｇｏｓｔｉｎがあり、これらには脂質の酸化抑制作用があることが示されている。特にγ−ｍａｎｇｏｓｔｉｎには、α−トコフェロールやＢＨＡよりも強い酸化抑制作用や、α−トコフェロールと同等のラジカル除去作用があることが明らかになっている（ＹＡＫＵＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＩ  １１４（２）：１２９−１３３，１９９４）。一方、α−ｍａｎｇｏｓｔｉｎ及びγ−ｍａｎｇｏｓｔｉｎは、抗ヒスタミン効果あるいは抗セロトニン効果を有することも知られている（特許第３９６８４０５）。
一方、マンゴスチンの皮膚、肌の改善、治療等に関するものとして以下のような報告がある。特開２００７−３１２８７はパンダヌス果実成分を含有する化粧料を開示し、その中でマンゴスチン抽出物を配合することを開示する。特開２００２−４７１２５はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含有する皮脂分泌抑制剤を開示し、マンゴスチン抽出物がその阻害剤を含むことを開示する。また、特開平９−８７１５５はマンゴスチンを有効成分とする紫外線吸収剤を開示する。また、特願２００８−１３４２４６は、マンゴスチン抽出物が経口摂取によりアトピー性皮膚炎を治療、予防することを報告する。ただし、この報告は、対象はアトピー性皮膚炎に絞ったものである。すなわち、これらの報告では、いずれも、マンゴスチン抽出物が他の有効成分を含まずに皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物として用いられることは開示しない。
また、マンゴスチン果皮の抽出物においては種々の安全性試験が実施されている。特開平５−１７３６５の段落番号［００１５］ではマウスを用いて経口投与による急性毒性試験が行い、マンゴスチン果皮抽出物を１０ｇ／Ｋｇを投与しても死亡例は認めないことを示す。さらに特開平４−２４４００４の［００４７］に示される安全性試験では、ヒト皮膚にマンゴスチン果皮抽出物の塗布する刺激性試験を行い、刺激性がきわめて低く、その安全性が高いことが示されている。
一方、マンゴスチン以外で活性酸素の作用を低減または除去する成分として、例えば、緑茶ポリフェノールや、ブドウ種子中のプロアントシアニジンが知られる。（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １２２：１４８０−１４８７，２００４）緑茶ポリフェノールはヘアレスマウス皮膚において、ＵＶに起因する酸化ダメージやＭＭＰ発現を抑制する効果を持つことを報告している。（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ６（３）：９９５−１００５，２００７）はブドウ種子中のプロアントシアニジンがＵＶＢによる酸化ストレスを抑制し、ＭＡＰＫやＮＦ−κβの活性化を阻害するということを報告する。
【発明の開示】
【０００３】
上記いずれの文献においても、マンゴスチン抽出物が皮膚障害の治療及び／又は予防する効果があることは開示しない。本発明はマンゴスチン（Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａ  Ｌ．）の果皮から極性溶媒で抽出した抽出物からなる皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物の提供を目的とする。
課題を解決するための手段
本願発明者らは、マンゴスチン（Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａ  Ｌ．）の果皮から極性溶媒で抽出した抽出物からなる皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物の提供を目的として、鋭意研究を行った結果、マンゴスチンの果皮から極性溶媒で抽出したものが、皮膚障害の治療及び／又は予防することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、マンゴスチン（Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａ  Ｌ．）の果皮から極性溶媒で抽出した抽出物からなる皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物を提供する。
本発明は、前記皮膚障害が活性酸素によるものである、前記皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物を提供する。
本発明は、前記皮膚障害が紫外線照射によるものである、前記皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物提供する。
さらに、本発明は、前記、皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物を含有する食品を提供する。
本発明において、マンゴスチンの果皮は、マンゴスチン果実（生または乾燥品）から得られるものを使用することができる。マンゴスチンの果皮はそのまま使用できるが、抽出率の向上を考慮すると、破砕または粉末とした後に抽出するのが好適である。また、抽出の前にマンゴスチン果皮を非極性溶媒で脱脂することもできる。
本発明の抽出には極性溶媒であるメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、アセトン、酢酸エチル、および水からなる群から選択される極性溶媒の少なくとも１種の溶媒を適用して実施する。２種類以上の溶媒を組み合わせて実施することもできる。なお、経口投与剤又は飲食品として用いることを考慮すると、抽出溶剤として、エタノール、又は水とエタノールとの組み合わせを用いることが安全性の点において好ましい。抽出の温度は特に規定はしないが、抽出効率の点で、室温から溶媒の沸点温度の範囲が好適である。抽出時間は溶媒の種類、果皮の状態（生または乾燥品、粉砕物または粉末など）および抽出温度により変化するが、０．５〜２４時間の範囲が好適である。
抽出物は必要によりエバポレーターなどにより抽出溶剤を濃縮し、あるいは除去してもよい。また、抽出物は、必要により溶媒分画やクロマトグラフィーにより精製して用いることもできる。
本明細書中、皮膚とは肌に同義であり、動物の体の表面の層であり、表皮、真皮、皮下組織よりなる。本明細書では、皮膚の炎症、水分の減少、柔軟性の低下、しわの発生、の少なくとも１つを有する状態を皮膚障害という。
本明細書中、活性酸素とは、酸素が化学的に活性になった化学種を指し、非常に不安定で、強い酸化力を示すものをいい、例としては、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシルラジカル、過酸化水素、一重項酸素、一酸化窒素、二酸化窒素、オゾン、過酸化脂質を挙げることができる。
本明細書中、紫外線とは、１０−４００ｎｍの波長を有する光をいう。
本発明の皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物の投与方法は限定はされないが、好ましくは経口により摂取される。したがって、本発明の皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物は、清涼飲料、菓子、冷菓、乳製品、酒類および肉類等の食品に添加することができる。
皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物としてのマンゴスチン果皮抽出物の投与量は、投与方法および必要な治療によって変化し、一概に規定できないが、経口摂取する場合、抽出物は動物１ｋｇあたり６０〜２５０ｍｇ、ヒトには０．３ｍｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ体重／日、より好ましくは０．５ｍｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
本発明の皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物は、食品としての１日通常摂取量で上記の有効量を満たすよう配合量を規定することができる。１日あたりの量を数回に分けて摂取することも出来る。
発明の効果
本発明により、マンゴスチンの果皮の抽出物からなる皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物が提供された。
マンゴスチンはフルーツの女王といわれ、その果実は食用に供されており、知名度も高くイメージのよい素材である。したがってマンゴスチン果皮の抽出物からなる皮膚障害の治療及び／又は予防のための組成物は、消費者に受け入れられやすく、食品に添加する組成物として好ましく用いられる。さらに、本発明はマンゴスチンのうち、通常は廃棄されるべき果皮の抽出物であるため、原料を安価に入手でき、環境保護の観点においても望ましい。
また、本発明の抽出物は極性溶媒を用いてマンゴスチンより抽出され、さらなる精製をせずとも上記の効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、マンゴスチン果皮抽出物混餌投与実験の日程を示す。
図２は、ＵＶＢランプの分光分布を示す。
図３は、Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ  ＳＥＭ  ５７５における各種パラメーターについて説明する図である。
図４は、体重を示す。図４Ａは体重推移のグラフ図４Ｂは全データである。
図５は、食下量を示す。図５Ａは食下量推移のグラフ、図５Ｂは食下量データである。
図６は、皮膚水分量を示す。図６Ａは水分量の経時的な変化と測定時の湿度を図６Ｂは８週目の水分量を示す。
図７は、皮膚弾力性を示す。図７Ａは群分け時の皮膚弾力性図７Ｂは解剖時皮膚弾力性を示す。
図８は、背部皮膚の外観を示す。図８Ａはｃｏｎｔｒｏｌ（−）群のＮｏ．３ヘアレスマウス、図８Ｂはｃｏｎｔｒｏｌ（＋）群のＮｏ．２６ヘアレスマウス図８Ｃは０．１５％（＋）群のＮｏ．３６ヘアレスマウスの外観である。
図９は、光老化モデルヘアレスマウスのＨＥ染色標本を示す。（ａ）はｃｏｎｔｒｏｌ（−）群のＮｏ．９ヘアレスマウス（ｂ）は０．０７２％（−）群のＮｏ．１１ヘアレスマウス（ｃ）はｃｏｎｔｒｏｌ（＋）群のＮｏ．２５ヘアレスマウス（ｄ）は０．０７２％（＋）群のＮｏ．２９ヘアレスマウス（ｅ）は０．１５％（＋）群のＮｏ．４１ヘアレスマウス（ｆ）はＧｌｃＮ（＋）群のＮｏ．５０ヘアレスマウスの標本である。
図１０は、病理ＨＥ染色標本から求めた表皮の厚さを示す。
図１１は、皮膚抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
図１２は、Ｉ型コラーゲン検出のためのウエスタンブロッティングの結果を示す。図１２Ａは皮膚抽出物のウエスタンブロッティングの結果、図１２Ｂはデンシトメトリー解析によるバンド強度を示す。
図１３Ａはセルロースアセテート膜電気泳動によるＧＡＧの同定、図１３Ｂはデンシトメトリー解析によるバンド強度を示す。
図１４は、ＴＢＡ法による過酸化脂質の測定結果を示す。
図１５は、皮膚抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
図１６Ａはウエスタンブロッティングによるカルボニルタンパク質の検出結果を、図１６Ｂはデンシトメトリー解析によるバンド強度を示す。
図１７は、血漿過酸化脂質の測定を示す。
図１８は、マンゴスチン果皮抽出物経口強制投与実験の日程を示す。
図１９は、皮膚組織からの可溶性成分の抽出の工程を図示する。
図２０は、水分量を示す。図２０Ａは推移のグラフ、図２０Ｂは全データである。
図２１Ａは、皮膚弾力性を示す。
図２１Ｂは、Ｒ０：伸張性を示す。
図２１Ｃは、Ｒ１：本来の状態に戻る力を示す。
図２１Ｄは、Ｒ２：全体の弾力を示す。
図２１Ｅは、Ｒ３を示す。
図２１Ｆは、Ｒ４を示す。
図２１Ｇは、Ｒ５を示す。
図２１Ｈは、Ｒ６を示す。
図２１Ｉは、Ｒ７を示す。
図２１Ｊは、Ｒ８を示す。
図２２は、皮膚組織標本の見方を説明するための図である。（ａ）はＵＶ非照射標本を（ｂ）はＵＶ照射標本を示す。
図２３は、背部皮膚ＨＥ染色病理標本写真である。
図２４は、ＨＥ染色標本から求めた表皮の厚さを示す。
図２５は、Ｉ型コラーゲン検出のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにウエスタンブロッティングの結果を示す。図２５Ａは皮膚抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、図２５Ｂはウエスタンブロッティングの結果、図２５Ｃはデンシトメトリー解析による相対的バンド強度を示す。
図２６は、デコリン検出のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにウエスタンブロッティングの結果を示す。図２６Ａは皮膚抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、図２６Ｂはウエスタンブロッティングの結果、図２６Ｃはデンシトメトリー解析による相対的バンド強度を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下に本発明の例を挙げて説明するが、本発明の範囲は以下の例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
マンゴスチン果皮抽出物の調製（ＰＡＭ０７１２から引用）
マンゴスチン果皮抽出物は、以下の通り得られた。すなわち、マンゴスチンの未乾燥果皮１００ｇを粉砕し、１ｌの７０％エタノール中で１時間、８０℃で撹拌抽出した。これをろ過し、ろ液をエバポレーターで減圧乾燥し、２７．４ｇの抽出物を得た。
【実施例２】
【０００７】
マンゴスチン果皮抽出物入り混餌投与による皮膚障害の改善効果の確認実験材料及び実験方法
１．使用動物及び飼育環境
動物は、Ｈｏｓ：ＨＲ−１系ヘアレスマウス雄６週齢を５４匹、１週間の予備飼育の後、実験に使用した。以下に述べる飼料を使用して、自由摂取・自由飲水で２５℃環境下にて飼育を行った。また、皮膚水分量測定時に湿度計にて飼育室の湿度を測定した。実験は、すべて東京農工大学動物実験委員会の承認（Ｎｏ．１９−７６）のもとに行った。
２．投与サンプルの調製法
投与飼料の調製はオリエンタル酵母株式会社に依頼した。０．０７２％マンゴスチン果皮抽出物混餌、０．１５％マンゴスチン果皮抽出物混餌、また、ポジティブコントロールとして０．２４％グルコサミン混餌、ネガティブコントロールとしてＣＲＦ−１飼料を用いた。１日当たりのマンゴスチン果皮抽出物摂取量は０．０７２％群で１２０ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ、０．１５％で２５０ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔが目安となるようにした。
３．飼育スケジュール
試験スケジュールについては、図１に示す。試験期間は８週間とし、２００７年１０月から１２月にかけて実施した。動物は１週間の予備飼育の後、皮膚水分量と粘弾性をもとに偏りがないよう配慮して、ＵＶ非照射ＣＲＦ−１投与群（ｃｏｎｔｒｏｌ（−）群）、ＵＶ非照射０．０７２％マンゴスチン果皮抽出物混餌投与群（０．０７２％（−）群）、ＵＶ照射ＣＲＦ−１投与群（ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）群）、ＵＶ照射０．０７２％マンゴスチン果皮抽出物混餌投与群（０．０７２％（＋）群）、ＵＶ照射０．１５％マンゴスチン果皮抽出物混餌投与群（０．１５％（＋）群）、ＵＶ照射０．２４％グルコサミン（ＧｌｃＮ）混餌投与群（ＧｌｃＮ群）の６群に分けた。群分け後、ＵＶ照射群に対して週３回ＵＶ照射を行った。すなわち、１週目は１分、２週目は２分、３、４週目は３分、４週目から解剖終了時までは４分間のＵＶ照射を行った。総照射量は１．３５Ｊであった。また、週に２回水分量測定と食下量測定を行い、体重測定は、週に１回行った。
４．ＵＶ照射について
ＵＶ照射にはＵＶＢ  ｌｕｍｐ  ＧＬ２０ＳＥ（ＳＡＮＫＹＯ  ＤＥＮＫＩ）を用い、照射強度は０．３ｍＷ／ｃｍ２で行った。ＵＶＢランプの分光分布は図２に示すとおり、波長域２８０ｎｍ〜の光を放射し、ピーク波長は２８０ｎｍにある。照射強度は、デジタル紫外線強度計ＵＶ−３４０（アズワン）を用いて合わせた。照射の際は９ｃｍ×５ｃｍ×４ｃｍの個別ケージ内にマウスを１時間半おき、各ケージによる照射強度の違いを緩和させるため、毎回ローテーションさせて照射を行った。
５．皮膚水分量測定
ＣＯＲＮＥＯＭＥＴＥＲ（登録商標）  ＣＭ８２５（ＣＯＵＲＡＧＥ＋ＫＨＡＺＡＫＡ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ＧＭＢＨ社製）を用いて、週２回、ＵＶＢ照射前にマウス腰部にプローブを当てて測定を行った。５回測定を行い、その平均値を測定値とした。
６．皮膚粘弾性測定
ＣＵＴＯＭＥＴＥＲ（登録商標）  ＳＥＭ５７５（ＫＨＡＺＡＫＡ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ＧＭＢＨ社製）を用いて、群分け時と解剖時に測定を行った。
本機は、光センサーにより、プローブ吸引口に引き込まれた皮膚の高さを１／１００ｍｍ単位で測定する機械である。測定により、以下のｒ０〜ｒ９の１０個のパラメーターが得られる。図３に、それぞれの値の定義を示す。
ｒ０＝ｅ（ａ）：最初の波形の振幅最大値（Ｕｆ）
ｒ１＝ｅ（ａ＋ｂ）：最初の波形の振幅最小値、本来の状態に戻る能力（再変形能力）
ｒ２＝（ｅ（ａ）−ｅ（ａ＋ｂ））／ｅ（ａ）：（Ｕａ／Ｕｆ）
ｒ３＝ｅ（（ｒ×ａ）＋（（ｒ−１）×ｂ））：最大振幅と再変形能力の差（全体の弾力）
ｒ４＝ｅ（（ａ＋ｂ）×ｒ）
ｒ５＝（ｅ（ａ）−ｅ（ａ＋０．１））／ｅ（０．１）：粘性変形を含まない皮膚全体の弾性（Ｕｒ／Ｕｅ）
ｒ６＝（ｅ（ａ）−ｅ（０．１））／ｅ（０．１）：弾性膨張に対する粘性の割合（Ｕｖ／Ｕｅ）
ｒ７＝（ｅ（ａ）−ｅ（ａ＋０．１）／ｅ（０．１）：弾力性の部分を完全な波形（弾力性１００％）と比較した値（Ｕｒ／Ｕｆ）。
ｒ８＝ｅ（ｂ）：陰圧解除後、元に戻る力を示している。
ｒ９＝ｒ３−ｒ０：カーソル点における皮膚吸引高さ
本試験では吸引口が直径２ｍｍのプローブを使用し、３００ｍｂａｒの陰圧で１０秒間吸引した後、急激に陰圧を解除したのち、脱吸引時間１０秒間で測定を行った。３回測定し、その平均値を測定値とした。
７．背部皮膚写真撮影
マウスの背部皮膚状態を観察するため、デジタルカメラによる撮影を行った。背部写真は、群分け時と、解剖前の２回、マウスにイソフルランによってガス麻酔を施した後、撮影した。
８．皮膚組織の採取法
マウスの解剖は、飼育５７日目に行い、採血後、皮膚組織の採取を行った。８ｍｍ生検パンチを用いて病理解析用皮膚を採取した後、背部全域の皮膚を採取し、かま状メスの背を用いて、皮下組織を除去した。皮膚組織はＪＦＣ−３００型冷凍粉砕機（吉田製作所）を用いて液体窒素下で凍結粉砕し、−８０℃にて保存した。
９．組織学的解析法
上記のとおり採取した背部皮膚は、ろ紙に平らになるようにはさみ、４ｃｍｄｉｓｈに入れて、マイルドホルム  １０Ｎ（和光純薬工業社製）を数滴垂らすことにより固定を行った。その後、常法に従ってパラフィン包埋、切り出し、薄切を行い、ＨＥ染色を施し、病理組織標本作製を行った。標本作製は株式会社  札幌病理総合研究所に依頼した。
これらの標本の全視野を観察し、各個体の代表的な部分（切片の真ん中辺りで、組織にうねりのない部分）の写真撮影を実施した。また、ＨＥ標本を用いて表皮の厚さを各標本１０か所ずつ測定し、その平均を求めることで表皮厚の測定を行った。
１０．皮膚組織からのタンパク質抽出法
皮膚凍結粉砕物をメタノールにより、２４時間脱脂した後、プロテアーゼｉｎｈｉｂｉｔｏｒ入りＰＢＳ（−）を適量加え、ローテーターで攪拌させて２回洗浄し、血清成分等の除去を行った。その後、抽出ｂｕｆｆｅｒ（４Ｍ  ＧｕＨＣｌ／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１Ｍ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ベンズアミジン塩酸塩／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ／０．１Ｍ  アミノヘキサン酸（ｐＨ７．４））を皮膚組織湿重量の１０倍量添加し、４℃で７２時間振とうして抽出を行った。その後、４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行い、上清に対して、Ｒ０水で透析を行い、透析終了後は凍結乾燥した。この試料はコラーゲンの検出に使用した。
また、別のタンパク抽出液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１％  Ｔｒｉｏｎ  Ｘ−１００／７５ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ／５ｍＭ  ベンズアミジン塩酸塩／０．１Ｍ  アミノヘキサン酸）を皮膚湿重量に対して２倍量加え、抽出を行った。抽出後、４０００ｒｐｍで３０分遠心分離し、上清をフィルターろ過して、カルボニルタンパク検出に供した。
１１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング法による検出
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉらの方法に準じて行った。凍結乾燥物はＢｒａｄｆｏｒｄ法に基づいてタンパク定量を行い、各サンプルのタンパク質濃度を揃えた。１００℃で５分間加熱した後、急冷し、泳動用サンプルを作製した。電気泳動後、ＣＢＢ染色を行った。コラーゲンの検出の際は６％アクリルアミドゲルを用い、デコリンの検出（実施例３）の際には、７．５％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。泳動終了後、ゲル及びＰＶＤＦ膜をブロッティング用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１９０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ／０．０４％ＳＤＳ／２０％  Ｍｅｔｈａｎｏｌ）中で３０分間平衡化した。氷冷下でウエット式のブロッティング装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を使用し、０．０５Ａで１８時間通電し、ゲル中のタンパク質を膜に転写した。転写後、室温でＰＶＤＦ膜をブロッキング溶液中で１時間振とうさせた。コラーゲン検出にはブロッキング溶液は５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎを、デコリン検出には、５％スキムミルク／ＴＢＳ−ＴｗｅｅｎにコンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業社製）を０．０１Ｕ／ｍｌの割合で添加したものを使用した。その後、１次抗体溶液（１次抗体：５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ＝１：１０００）中、室温で１時間振とうさせた。次に、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで膜を５分×４回洗浄し、２次抗体溶液中で同様に室温中で１時間振とうし、洗浄を行った。抗原の検出には、ＨＲＰ反応を利用した化学発色法を用いた。化学反応試薬として、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を使用し、ＦＵＪＩ  ＭＥＤＩＣＡＬ  Ｘ  ＲＡＹ  ＦＩＬＭ（富士フィルム社製）に感光させた後、フィルムを現像した。現像したフィルムは、画像解析ソフトＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を用いてバンド強度を比較した。
なお、コラーゲンの検出には、１次抗体として抗Ｉ型コラーゲン（ブタ皮由来）ウサギ抗血清、２次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用いた。また、デコリンの検出には１次抗体として抗デコリンコアタンパク質ウサギ抗血清、２次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用いた。
１２．皮膚組織からのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）抽出法
凍結粉砕した皮膚は、４℃で１晩、エタノールにより脱脂した後、湿重量に対し、３０倍量の０．５Ｍ  ＮａＯＨを添加し、ローテーターで回転させながら４℃で２０時間反応させることにより、β脱離反応を起こしてＧＡＧをタンパク質から遊離させた。その後、添加したＮａＯＨの半分量の１Ｍ  ＨＣｌを加え、中和反応を行った。中和されているかどうかはｐＨ試験紙を用いて確認した。ここに、２×ｃｏｎｃ．のアクチナーゼ緩衝液を、ＮａＯＨの１．５倍量加え、１００℃で１０分間、熱変性させた。溶液が５０℃に戻ったら、防腐剤としてチモールを１かけら加え、最初に添加したＮａＯＨに対して１％（ｗ／ｖ）になるようにアクチナーゼを加えた。５０℃で振とう機を使用して２日間分解反応を行った。その際、反応開始から２４時間後に最初に加えたのと同量のアクチナーゼを再び添加した。反応終了後、終濃度が１０％になるようにトリクロル酢酸を添加し、４℃で１時間放置することで、タンパクを除去した。その後、０℃  ９０００ｇで１５分間遠心分離を行い、上清をＤＩＳＭＩＣ（登録商標）（アドバンテック東洋（株）社製）によってフィルターろ過し、透析を行った。透析終了後の液体は凍結乾燥し、凍結乾燥物をミリＱ水に溶かしてセルロースアセテート膜電気泳動に用いた。
１３．セルロースアセテート膜電気泳動によるＧＡＧ解析法
ヘアレスマウス皮膚中のグリコサミノグリカンの組成を同定するため、セルロースアセテート膜電気泳動はＨａｔａらの方法に準じて行った。上記の方法で調整したＧＡＧは、抽出皮膚湿重量１００ｍｇに対して５０μｌのミリＱ水に溶解して泳動用試料を作製した。セルロースアセテート膜に０．５μｌのサンプルをスポットし、０．１Ｍ  ピリジン／０．４７Ｍ  ギ酸ｂｕｆｆｅｒを使用して膜の幅１ｃｍあたり１ｍＡの定電流で泳動を行った。スタンダードには、ヒアルロン酸（ＨＡ）、デルマタン硫酸（ＤＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）を１ｍｇ／ｍｌで溶解したものを５０μｌずつ混合して使用した。泳動終了後、アルシアンブルー染色液（０．５％アルシアンブルー／２５％エタノール／１０％酢酸）で染色を行い、１０％酢酸で脱色を行った。
得られたスポットは、画像解析ソフトＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて解析を行った。
１４．ＴＢＡ法を用いた皮膚過酸化脂質測定法
ＴＢＡ法は、脂質過酸化によって生成する成分のほとんど、脂質ペルオキシド、マロンジアルデヒド及びその他アルデヒド、アルデヒドとタンパク質などの反応物を総合的に測定する方法として用いられており、チオバルビツール酸（ＴＢＡ）と試料から遊離するチオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）の反応で生じる赤色色素を定量することにより脂質の過酸化度を測定するものである。
皮膚過酸化脂質度の測定は、Ｏｈｋａｗａらの方法に準じて行った。まず、皮膚凍結粉砕物に、湿重量が１５％（ｗ／ｖ）になるように１．１５％ＫＣｌ水溶液を添加して、攪拌した。組織ホモジネート５０ｍｇに対して、８．１％  ＳＤＳ溶液１００μｌ、酢酸緩衝液０．７５ｍｌ、０．８％  ＢＨＴ酢酸溶液（酸化防止剤）２５μｌ、０．８％  ＴＢＡ水溶液０．７５ｍｌ、５ｍＭ  ＦｅＣｌ３  ３５０μｌの順番で加えて良く攪拌し、５℃で６０分保った後、沸騰水浴中で６０分間加熱した。冷却後、ミリＱ水０．５ｍｌ、ブタノール−ピリジン混合液（１５：１、ｖ／ｖ）２．５ｍｌを加えて振り混ぜ、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行った。上清液の５３２ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線からＴＢＡＲＳ量を求めた。その際、検量線スタンダードには１，１，３，３−テトラエトキシプロパン（生化学用：和光純薬工業）を使用し、皮膚凍結粉砕物の代わりに同量のＫＣｌ水溶液を添加してｂｌａｎｋを作製した。
１５．皮膚組織中酸化タンパク質の測定法
酸化タンパク質の１つであるカルボニルタンパク質は酸化ストレスのマーカーである。ＯｘｙｂｌｏｔＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ（登録商標）社製）を使用してカルボニルタンパク質の評価を行った。具体的な方法は以下の通りである。
各群のサンプルは、ＢＣＡ法によるタンパク定量を行い、タンパク濃度を１．１ｍｇ／ｍｌに揃えた。タンパク試料５μｌに対し、１２％ＳＤＳを５μｌ添加し、そこに、２，４−ジヒドロフェニルヒドラゾン（ＤＮＰＨ）溶液を１０μｌ添加して室温で１５分インキュベートすることにより、カルボニル基にＤＮＰＨを誘導した。その後、中和溶液を７．５μｌ添加して反応を終了させた。ＤＮＰＨ誘導化サンプルは、１０％ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質を分離し、ブロッティング装置を使用して、ＰＶＤＦ膜に対してブロッティングを行った。転写後の膜は、常温下で１時間、ブロッキングｂｕｆｆｅｒ（５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）に浸してブロッキングを行った後、常温下で１時間、１次抗体と反応させた。反応後はＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５分間×４回洗浄し、２次抗体と常温下で１時間反応させた。反応後、再び、５分間×４回洗浄を行った。抗原の検出には、ＨＲＰ反応を利用した化学発色法を用いた。化学反応試薬として、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用し、ＦＵＪＩ  ＭＥＤＩＣＡＬ  Ｘ  ＲＡＹ  ＦＩＬＭ（富士フィルム社製）に感光させた後、フィルムを現像した。現像したフィルムは、画像解析ソフトＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてバンド強度を比較した。
１６．血漿過酸化脂質（ＬＰＯ）の測定
日研ザイルに依頼した。
１７．統計処理
すべてのパラメーターについて、正規性があるかどうか、等分散かどうかを確認後、正規分布且つ等分散である場合はＴｕｋｅｙ−ｋｒａｍｅｒ  ｔｅｓｔを行い、そうでない場合はＳｃｈｅｆｆｅ’ｓ  Ｆ  ｔｅｓｔを行った。
結果
１．基礎データ
ＵＶ照射及び混餌投与のマウスに対する影響の有無を調べるため、体重測定及び食下量測定を行った。体重測定は、週１回測定を行った。食下量測定は、週に２回、各ケージごとに行った。それぞれの体重測定の結果を図４，食下量測定の結果を図５に示す。各群間において、体重の差は見られなかった。また、食下量に関しては、４週目以降、ＧｌｃＮ（＋）群において、他の群より食下量が多い傾向が見られたが、食下量の上昇が体重に影響することはなかった。
食下量測定より求められる各群の有効成分平均摂取量は０．０７２％（−）群で１２９ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、０．０７２％（＋）群で１２４ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、０．１５％（＋）群で２６９ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ／ｄａｙ、ＧｌｃＮ（＋）群で４３４ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙであった（図５Ｂ）。
２．皮膚水分量
ＵＶＢ照射及び、マンゴスチン果皮抽出物投与による皮膚水分量への影響について検証するため、ＣＯＲＮＥＯＭＥＴＥＲ  ＣＭ  ８２５を使用して皮膚水分量を測定した。結果を図６に示す。図６Ａは水分量の経時的な変化と測定時の湿度を、図６Ｂは８週目の水分量を示す。
ＵＶＢ照射群では、３週目辺りから水分量減少の傾向が見られ始めた。皮膚水分量は５週目までは各群間で有意差は検出されなかったが、６週目以降８週目まで継続して、ｃｏｎｔｒｏｌ（−）に対して、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）において有意な減少とｃｏｎｔｒｏｌ（＋）に対して０．０７２％（＋）で有意な増加が確認された（ｐ＜０．０５）。それに加え、７，８週目では、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）に対して、ＧｌｃＮ（＋）でも有意な増加が見られた。８週目における皮膚水分量は、ｃｏｎｔｒｏｌ（−）群で６６．５２±３．４４、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）群で５７．６０±６．７１、０．０７２％（＋）群で６２．８９±２．９２、ＧｌｃＮ（＋）群で６２．９６±２．７８であった。
３．皮膚弾力性
皮膚弾力性は、群分け時と試験終了時の２回、ＣＵＴＯＭＥＴＥＲ  ＳＥＭ５７５を使用して測定した。
測定は１個体につき、３回行い、その平均値を測定値として使用した。Ｒ０の皮膚の伸びに関しては、ｃｏｎｔｒｏｌ（−）に対して、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）で有意な減少が確認された。ＵＶ照射により、皮膚の伸びが低下するという結果が得られた。また、Ｒ１の皮膚の戻りに関しては、有意差は認められず、各群で変化はなかった。これらのデータを反映して皮膚全体の弾力性を示すＲ２の値については、ｃｏｎｔｒｏｌ（−）に対して、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）で有意な減少が見られた（図７）。
４．病理学的解析
シワ形成に対する影響を調べるため、マウス背部皮膚のシワの状態について観察した。イソフルランによるガス麻酔後、デジタルカメラにより撮影した背部の写真の抜粋を図８に示す。ｃｏｎｔｒｏｌ（−）群では、脊椎に対して平行な向きに走る線条が確認され（図８Ａ）、これは、マウスの動きによって消えたり現れたりした。ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）群では、脊椎に垂直な方向に線条が現れ（図８Ｂ）、皮膚の炎症が確認できる個体も存在した。また、０．１５％（＋）群では、脊椎に対し平行な向きのしわも、垂直な向きのしわも薄かった（図８Ｃ）。
さらに、ＨＥ染色標本を作製し、各群の表皮の厚さを測定した。表皮の厚さはＨＥ染色標本を用い、各標本のそれぞれ１０か所ずつ測定し、各群の平均値を求めた。ＨＥ染色標本の各群の代表的な図を図９に、表皮の厚さの測定結果を図１０に示す。表皮の厚さはｃｏｎｔｒｏｌ（−）で２３．２０±３．５６μｍ、０．０７２％（−）で２１．８８±５．１７μｍ、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）で３８．７２±７．５６μｍ、０．０７２％（＋）で４３．１７±８．６０μｍ、０．１５％（＋）で３６．７４±５．９２μｍ、ＧｌｃＮ（＋）で３９．４６±９．５６μｍであった。ｃｏｎｔｒｏｌ（−）に対してｃｏｎｔｒｏｌ（＋）、０．０７２％（＋）、０．１５％（＋）、ＧｌｃＮ（＋）では表皮の厚さが有意に増加し、肥厚化が確認された。ＵＶ照射により、基底層の細胞内浮腫や細胞間浮腫が増加し、顆粒細胞がｓｕｎ−ｂｕｒｎ  ｃｅｌｌ化している様子が確認された。表皮の肥厚は、特に有棘層の部分が肥厚していた。０．１５％（＋）では、有棘層の肥厚化は見られたが、細胞の状態は非照射群に近く、細胞内浮腫こそ見られるものの、０．０７２％（＋）と比較して細胞間浮腫は治療されていた。
５．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇによるＩ型コラーゲンの定量
各群の皮膚抽出物を試料として、分離ゲルとして６％ポリアクリルアミドＴｒｉｓ−ＨＣｌゲルを分離ゲルとして、３％ポリアクリルアミドＴｒｉｓ−ＨＣｌゲルを濃縮ゲルとして用い、電気泳動を行い、ＣＢＢ染色により確認した。マーカーにはＰｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｈｉｇｈ  Ｒａｎｇｅ  （Ｃｏｎｔｒｏｌ  ３１０００１９２０）を用いた。結果を図１１に示す。この結果より、各サンプルのタンパク量が等しいことを確認した。
ウエスタンブロッティングの結果を図１２Ａに示す。１１７ｋＤａ付近にＩ型コラーゲンα１鎖と推測されるバンドが見られ、２００ｋＤａ付近にβ鎖と思われるバンドが検出された。図１２Ｂは画像解析ソフトＳｃｉｏｎ  ＩｍａｇｅによりＡのバンド強度を定量化したものである。バンド強度は、ｃｏｎｔｒｏｌ（−）を１としたとき０．０７２％（−）で１．５６、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）で２．２９、０．１５％（＋）で２．１７、０．０７２％（＋）で１．２８、ＧｌｃＮ（＋）で１．２５（α鎖とβ鎖の平均値で示す）であった（図１２Ｂ）。
６．セルロースアセテート膜電気泳動によるＧＡＧの同定
ヘアレスマウス皮膚抽出物中のＧＡＧ、特に皮膚の水分保持に関与しているヒアルロン酸（ＨＡ）の量を同定するため、セルロースアセテート膜電気泳動を行った。結果を図１３Ａに示す。画像解析ソフトＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅにより各スポット濃度を解析した結果を図１３Ｂに示す。ＨＡのバンド強度は、ｃｏｎｔｒｏｌ（−）を１とすると、０．０７２％（−）で１．０３、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）で１．２５、０．０７２％（＋）で０．９３、０．１５％（＋）で０．８６、ＧｌｃＮ（＋）で０．５８となった。ＵＶ照射により、ＨＡ量が増えるが、Ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）と比較して皮膚水分量の有意な増加が認められた０．０７２％（＋）マンゴスチン果皮抽出物投与ではＨＡ量への変化はほとんど見られなかった。コンドロイチン硫酸（ＣＳ）に関しては検出されず、スタンダードの３種類とは異なるスポットがＣＳの下流に存在し、ｃｏｎｔｒｏｌ（−）で濃いスポットが確認された。このスポットはヘパラン硫酸（ＨＳ）である可能性が考えられるが、まだ同定を行っていない。
７．皮膚中過酸化脂質の定量
マンゴスチン果皮抽出物の皮膚に対する抗酸化効果を調べるため、ＴＢＡ反応による過酸化脂質の測定を行った。生体内に酸化ストレスが起こったとき、最も障害を受けやすいのは、高度不飽和脂肪酸を含む脂質である。生体の酸化ストレスマーカーとして、脂質ヒドロキシペルオキシド類とともに、チオバルビツール酸反応性物質（ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ  ａｃｉｄ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ：ＴＢＡＲＳ）が用いられ、この方法は脂質過酸化度を総合的に測定する有用な方法として理解されている。Ｏｈｋａｗａ法の反応においては、ＥＤＴＡやＦｅイオンの添加により、試料中のＴＢＡＲＳが何であるか知ることが可能である。アルケナール、アルカジエナール類からの赤色色素の生成は、ＥＤＴＡによって阻害され、Ｆｅイオンの添加により増強されることが知られている。
本試験においては、何も添加しなかった場合、ほとんど発色は見られなかったが、Ｆｅイオンを添加した場合に発色が見られたため、Ｆｅイオン添加の方法を採用した。
測定の結果は図１４に示す通りである。ＴＢＡＲＳ測定の結果、各群間で有意差は検出されなかった。
８．カルボニルタンパク質の定量
タンパク質も、酸化ダメージによる影響を受ける因子の１つで、光老化をうけた皮膚においては真皮上部タンパク質にＲＯＳに起因するダメージの蓄積が見られる（Ｓａｎｄｅｒ  ＣＳ，２００２）。タンパク質の酸化修飾とは、アルデヒドやケトンの側鎖構造（カルボニルタンパク質）、チロシン架橋構造、アミノ酸置換、アミノ酸の酸化、ペプチド結合の開裂などである。タンパク質の酸化ダメージは、例えば、酵素活性を変化させたり、構造タンパク質の機能を失活させたり、タンパク分解に対する感受性を変化させたりする（Ｓｈａｃｔｅｒ  Ｅ，２０００）。酸化修飾タンパク質のうち、代表的なものとしてカルボニルタンパクの定量がたびたび用いられている。
各群の皮膚組織からタンパク抽出液（１％  Ｔｒｉｏｎ  Ｘ−１００／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／７５ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ／５ｍＭ  ベンズアミジン塩酸塩／０．１Ｍ  アミノヘキサン酸）を用いて抽出物を得て、これらを試料として、電気泳動後、ＣＢＢ染色により各サンプルのタンパク量を確認した。分離ゲルとして１０％ポリアクリルアミドＴｒｉｓ−ＨＣｌゲルを分離ゲルとして、３％ポリアクリルアミドＴｒｉｓ−ＨＣｌゲルを濃縮ゲルとして用いた。マーカーにはＰｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｈｉｇｈ  Ｒａｎｇｅ（Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ３１０００１９２０）を用いた。結果を図１５に示す。この結果より、各サンプルのタンパク量が等しいことを確認した。
各サンプルのカルボニルタンパク質の評価は、前述した「皮膚組織中酸化タンパク質の測定法」に従い実施した。その評価法で得られた各サンプルのウェスタンブロッティングの結果は図１６Ａに示す。１次抗体として、Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−ＤＮＰ  Ａｎｔｉｂｏｄｙを、２次抗体として、Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）を用いた。分子量９７．４ｋＤａと６８ｋＤａのあたりで濃いバンドが検出された。また、バンド強度を図画像解析ソフトＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅを使用して濃さを定量化し、ｃｏｎｔｒｏｌ（−）を１としたときの相対強度を示した（図１６Ｂ）。ｃｏｎｔｒｏｌ（−）を１としたとき、０．０７２％（−）で１．１８、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）で３．１８、０．０７２％（＋）で１．３３、０．１５％（＋）で１．８６、ＧｌｃＮ（＋）で１．６３となり、バンド強度は０．０７２％（＋）ではｃｏｎｔｒｏｌ（＋）の約４２％であった。
９．血漿過酸化脂質の定量
血漿中の過酸化脂質濃度を測定したが、有意差は認められなかった（図１７）。
考察
以上より、ＵＶＢ照射により、対照群において皮膚水分量と皮膚弾力性は低下するが、マンゴスチン果皮抽出物投与により皮膚水分量が増加していることが確認できた。
マンゴスチンは、１３０種類以上の有効成分を含むことが知られる。本発明においては、複数の成分が総合的、相乗的に作用することによって、抗酸化作用を発揮し、さらには、抗酸化作用以外の効果が相乗し、皮膚障害の治療及び／又は予防が顕著に得られたと考えられる。
Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒでの測定域は、３０−４０μｍであり、ヘアレスマウスに用いた場合、角質層と表皮の一部の水分量を測定していると考えられる。病理学的解析の結果から、ＵＶ照射により、表皮、特に有棘層が肥厚し、基底細胞と有棘細胞に細胞内浮腫及び細胞間浮腫が現れることがわかった。浮腫の状態は０．０７２％マンゴスチン果皮抽出物投与群と比較して０．１５％マンゴスチン果皮抽出物投与群において治療効果が見られており、肥厚度も０．１５％の（＋）方が低かった。このことから、マンゴスチン果皮抽出物の経口摂取が、表皮への病理学的変化を治療する効果があることが示唆され、その効果は０．１５％混餌群の方が顕著であることが示された。しかし、水分量に関しては、０．０７２％混餌投与群において上昇が見られた。
皮膚水分量上昇に関与する因子として、皮膚中のヒアルロン酸（ＨＡ）、コラーゲンの定量を行ったところ、Ｉ型コラーゲンの定量においては、ＵＶ照射コントロール群では、ＵＶ非照射コントロール群と比較して約２．１倍のバンド強度が得られた。これは、ＵＶ照射初期は、生体内の防御機構が働いて、産生増加に傾くので、コラーゲンが増加したものと考えられる。マンゴスチン果皮抽出物投与により、コラーゲンの産生は減少しているが、これは、ＵＶ照射ダメージが軽減化されているためにコラーゲン増加には傾かない、と考えることができる。
カルボニルタンパク質の検出による酸化ストレスマーカーの測定結果から、ＵＶ照射によって酸化ストレスが増加し、マンゴスチン果皮抽出物摂取により減少する結果が得られ、マンゴスチン果皮抽出物の抗酸化作用が、皮膚状態の治療と深く関係していることが示唆された。
上記より、混餌投与の実験において、マンゴスチン果皮抽出物の経口摂取により水分量上昇が見られた。酸化ストレスマーカーの１つであるカルボニルタンパク質の検出結果より、マンゴスチン果皮抽出物投与による水分量上昇には、酸化ストレスの抑制が関与していると示唆される。
【実施例３】
【０００８】
マンゴスチン果皮抽出物経口強制投与による皮膚障害の改善効果の確認
１．投与サンプルの調製と経口投与
投与サンプルはマンゴスチン果皮製剤を用いた。すなわち、マンゴスチン果皮抽出物：アラビアガム＝１：１で製剤化したものを使用した。コントロールにはアラビアガムのみを、また、ポジコンとしてコラーゲンを使用した。各濃度の溶液を作製し、マウスに０．１ｍｌ／１０ｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔの溶液を、胃ゾンデを用いて、飼育期間中、毎日経口投与した。マンゴスチン果皮抽出物溶液は高濃度（２４ｍｇ／ｍｌ）、低濃度（１２ｍｇ／ｍｌ）の２種類、アラビアガム溶液は２４ｍｇ／ｍｌ、コラーゲン溶液は２０ｍｇ／ｍｌのものを作製した。
２．飼育スケジュール
試験スケジュールについては、図１８に示す。１週間の予備飼育の後、皮膚水分量と粘弾性をもとにして群分けを行い、ＵＶ非照射アラビアガム投与（ｃｏｎｔｒｏｌ（−）群：）、ＵＶ非照射マンゴスチン果皮抽出物溶液（２４ｍｇ／ｍｌ）投与（ｈｉｇｈ（−）群）、ＵＶ照射アラビアガム投与（ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）群）、ＵＶ照射マンゴスチン果皮抽出物溶液（２４ｍｇ／ｍｌ）投与（ｈｉｇｈ（＋）群）、ＵＶ照射マンゴスチン果皮抽出物溶液（１２ｍｇ／ｍｌ）投与（ｌｏｗ（＋）群）、ＵＶ照射コラーゲン投与（ｃｏｌｌａｇｅｎ（＋）群）の６群に分けた。週３回のＵＶＢ照射とゾンデによる強制経口投与を毎日行った。試験期間は８週間とし、２００７年５月から７月にかけて実施した。
３．ＵＶＢ照射について
ＵＶＢ照射は、週３回、ＵＶＢ  ｌｕｍｐ  ＧＬ２０ＳＥ（ＳＡＮＫＹＯ  ＤＥＮＫＩ）を用い、照射強度は０．３ｍＷ／ｃｍ２で行った。照射強度は、デジタル紫外線強度計ＵＶ−３４０（アズワン）を用いて合わせた。９ｃｍ×５ｃｍ×４ｃｍの個別ケージ内にマウスを１時間半おき、各ケージによる照射強度の違いを緩和させるため、毎回ローテーションさせて照射を行った。
照射時間は、１週目は１分、２週目は２分、３週目は３分と増やし、その後は３分で照射を行った。３８日目からは照射強度を上げ、４分にしたが、マウス皮膚に紅斑が見られたため、４３日目からは３分３０秒で照射を行った。総照射量は、１．２２４Ｊであった。
４．皮膚組織からのタンパク質抽出法
実施例２と同様に採取した皮膚組織は、秤量して各群ごとにまとめ、エタノールで２４時間脱脂を行い、はさみで細かく細切した後、プロテアーゼｉｎｈｉｂｉｔｏｒ入りＰＢＳ（−）（ＰＢＳ（−）に５ｍＭ  ベンズアミジン塩酸塩／１０ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ／０．１Ｍ  アミノヘキサン酸を溶かしたもの）で２回洗浄することで血清成分等を除去した。その後、タンパク抽出液（４Ｍ  グアニジン塩酸塩／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１Ｍ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ベンズアミジン塩酸塩／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ／０．１Ｍ  アミノヘキサン酸（ｐＨ７．４））を皮膚湿重量に対して１０倍量添加し、振とう機を用いて、４℃で７２時間振とうした。４０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、上清を採取して、７Ｍ  ｕｒｅａ／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／０．１Ｍ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ベンズアミジン塩酸塩／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ／０．１Ｍ  アミノヘキサン酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で透析を行った。透析後、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）  ＤＥＡＥ−６５０Ｓ（東ソー社製）を加え、４℃で２４時間振とうし、吸着画分（Ａ）と未吸着画分（Ｂ）に分けた。
Ａに対しては、溶出ｂｕｆｆｅｒ（７Ｍ  Ｕｒｅａ／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／２Ｍ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ベンズアミジン塩酸塩／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ／０．１Ｍ  アミノヘキサン酸（ｐＨ７．４））を添加し、４℃で７２時間振とう抽出を行い、その後Ｒ０水に対して透析を行った。Ｂに対してはそのままＲ０水に対して透析を行った。Ａ、Ｂ共に、透析後、凍結乾燥に供し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティング用のサンプルとして使用した。Ａはデコリン検出に、Ｂはコラーゲン検出に用いた。この工程を図１９に示す。
５．その他の実験は実施例２と同様に行った。
結果
１．皮膚水分量
ＵＶＢ照射及び、マンゴスチン果皮抽出物投与による皮膚水分量への影響について検証するため、ＣＯＲＮＥＯＭＥＴＥＲ  ＣＭ  ８２５を使用して皮膚水分量を測定した。結果を図２０Ａ及び図２０Ｂに示す。５週目までは各群間での差は検出されなかった。６週目になると、ｃｏｎｔｒｏｌ（−）に対して、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）で水分量減少の傾向が示された（ｐ＜０．１）。また、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）に対してｈｉｇｈ（＋）で有意な上昇がみられた。７週目においては、ｃｏｎｔｒｏｌ（−）に対して、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）で有意な減少（ｐ＜０．０５）、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）に対してｈｉｇｈ（＋）で有意な増加が検出された。有意差が見られた７週目での皮膚水分量は、ｃｏｎｔｒｏｌ（−）で７８．８３±１．９０、ｈｉｇｈ（−）で８２．４９±４．８９、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）で７３．２４±５．４１、ｈｉｇｈ（＋）で７７．４３±３．８６、ｌｏｗ（＋）で７４．２６±２．６３、ｃｏｌｌａｇｅｎ（＋）で６８．５４±２．９１であった。
２．皮膚弾力性
ＣＵＴＯＭＥＴＥＲ  ＳＥＭ５７５を使用して、ヘアレスマウス腰部皮膚の弾力性の測定を行った。結果は図２１ＡからＪに示した通りで、群分け時は、各群間で有意差は検出されなかった。解剖時に関しては、皮膚の伸びのパラメーターであるＲ０は各群間で有意差は見られなかったが、皮膚の戻りを示すＲ１については、ｃｏｎｔｒｏｌ（−）に対して、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）で有意な減少が確認された（ｐ＜０．０５）。また、皮膚全体の弾力性を示しているＲ２に関しては、ｃｏｎｔｒｏｌ（−）に対して、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）で有意な減少が（ｐ＜０．０１）、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）に対して、ｈｉｇｈ（＋）で有意な増加が確認された（ｐ＜０．０５）。また、ｈｉｇｈ（−）に対してｈｉｇｈ（＋）で有意な減少が確認された。
３．病理学的解析
背部皮膚ＨＥ染色標本で注目すべき所見を図２２を用いて説明する。図２２ではＵＶ非照射標本（ａ）では、基底細胞層の細胞内浮腫はほとんど見られないが、照射標本（ｂ）においては、基底細胞層の細胞内浮腫が観察される。さらにダメージを受けると、浮腫は細胞間にも見られるようになり、基底細胞層から有棘細胞層まで広がっていくこと、また、顆粒細胞にもｓｕｎ−ｂｕｒｎ  ｃｅｌｌ化した細胞が確認される。すなわち、具体的には、ＨＥ染色標本は（１）顆粒細胞のｓｕｎ−ｂｕｒｎ  ｃｅｌｌ化が見られるかどうか（２）基底細胞の細胞内、及び細胞間浮腫の有無（３）細胞間浮腫が有棘層まで伸びているかどうかの３つのポイントに注目した。浮腫については、ダメージの小さい場合は細胞内浮腫しか見られないが、ダメージが大きくなるほど細胞間浮腫が現れ、基底層の細胞間浮腫は有棘層まで広がっていく。
各群の病理的解析の結果を図２３に示す。図２３は各群の代表的な標本を示す。ｃｏｎｔｒｏｌ（−）では、ところどころに細胞内浮腫があるのが観察できた。ＵＶ照射群では細胞内浮腫に加えて、細胞間浮腫が広がっており、標本によっては細胞間浮腫は有棘層まで広がっていた。ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）と比べてｈｉｇｈ（＋）では明らかに浮腫の状態が改善していた。なお、図２３中、二重線により囲った箇所は顆粒細胞のｓｕｎ−ｂｕｒｎ  ｃｅｌｌ化を、一重線により囲った箇所は基底細胞の細胞内浮腫を、破線により囲った箇所は基底細胞の細胞間浮腫の病理所見を示している。
また、表皮の厚さを測定した結果を図２４に示す。これらの値は各標本１０ヵ所ずつ表皮の厚さを測定し、平均値を求めたものである。表皮の厚さはｃｏｎｔｒｏｌ（−）で２９．８７±１１．９４μｍ、ｈｉｇｈ（−）で２１．０３±２．４６μｍ、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）で５０．４２±１１．８９μｍ、ｈｉｇｈ（＋）で３９．６３±６．６３μｍとなり、ｃｏｎｔｒｏｌ（−）に対してｃｏｎｔｒｏｌ（＋）で、ｈｉｇｈ（−）に対してｈｉｇｈ（＋）で表皮の肥厚化が見られた（図２４）。
また、背部皮膚のしわ形成の様子について観察を行ったところ、ｃｏｎｔｒｏｌ（−）群に比べて、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）では深いシワが形成されていることが確認できた。ｈｉｇｈ（−）群とｈｉｇｈ（＋）群を比較した場合も同様の様子が観察できた。ｃｏｎｔｒｏｌ（−）群とｈｉｇｈ（−）群を見比べた場合、見た目による違いは観察できなかった。ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）群とｈｉｇｈ（＋）群を比べた場合、若干の違いは感じるものの、見た目の差としてあらわすまでの違いは観察できなかった。
４．Ｉ型コラーゲンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティング
分離ゲルとして６％ポリアクリルアミドゲル、濃縮ゲルとして３％ポリアクリルアミドゲルを用い、マーカーとしてＰｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｈｉｇｈ  Ｒａｎｇｅ（Ｃｏｎｔｒｏｌ  ３１０００１９２０）を用いて電気泳動を行い、ＣＢＢ染色により、各サンプルのタンパク量が等しいことを確認した。ウエスタンブロッティングの結果は図２５Ａ及びＢに示すとおりである。１１６ｋＤａ付近にＩ型コラーゲンα鎖と思われるバンドを確認することができ、ｃｏｎｔｒｏｌ（−）のバンド強度を１としたとき、ｈｉｇｈ（−）は１．６０、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）は１．５０、ｈｉｇｈ（＋）は２．８６であった（図２５Ｃ）。
５．デコリンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティング
分離ゲルとして７．５％ポリアクリルアミドゲルを、濃縮ゲルとして３％ポリアクリルアミドゲルを用い、マーカーとしてＰｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｈｉｇｈ  Ｒａｎｇｅ（Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ３１０００１９２０）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色に供して各サンプルのタンパク量が等しいことを確認した後、ウエスタンブロッティングを行った（図２６Ａ及びＢ）。バンド強度は、ｃｏｎｔｒｏｌ（−）を１としたとき、ｈｉｇｈ（−）では１．１５、ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）で１．５３、ｈｉｇｈ（＋）で１．２８となった（図２６Ｃ）。ＵＶ照射対照群では、非照射対照群と比較して、デコリンのバンドが低分子側にも高分子側にも広がっており、ｈｉｇｈ（＋）群においては、低分子側のバンドが消えていた。
考察
本実施例において、マンゴスチン果皮抽出物の投与は、ヘアレスマウスにおいて、ＵＶ照射により低下した皮膚水分量を改善させる、という結果を得ることができた。よって、マンゴスチン果皮抽出物は、皮膚の水分保持に効果的な物質であると考えられる。
また、ゾンデ試料の分散剤として、水分量改善効果はないと思われるアラビアガムを用いたが、ｃｏｎｔｒｏｌ群でも水分量の増加の傾向が見られた。単純化した角質層のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて、アラビアガムが脂質過酸化を抑制するという報告（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２９８：１５３−２６３，２００５）があり、アラビアガムがＵＶＢ照射によって産生される酸化ストレスを阻害する働きを示した可能性が示唆される。
また、皮膚弾力性については、ＵＶ照射によって皮膚全体の弾力性は低下するが、マンゴスチン果皮抽出物は、低下した弾力性を回復させる効果を持つことが示唆された。
ウエスタンブロッティングの結果より、コラーゲンのバンド強度は、ＵＶ照射により増加した。光老化モデルマウスにおいて、皮膚における総コラーゲン量は、紫外線照射によって必ずしも減少しないという報告があり、この結果はその報告と一致する。非照射・照射に関わらず、果皮抽出物投与で、浮腫をはじめとする病理所見の回復が見られることから、皮膚組織の回復機構と何らかの関係があって、コラーゲン産生が増加していると推測される。
デコリンのウエスタンブロッティング結果からは、ＵＶ照射によって産生された低分子・高分子量のデコリンが、果皮抽出物投与により減少する、という結果が得られた。デコリンは、約１００ｋＤａの分子量を持つプロテオグリカンであり、約４０ｋＤａのコアタンパク質に１本のコンドロイチン硫酸鎖もしくは、デルマタン硫酸鎖が共有結合している。コアタンパク質はロイシンに富む８−１０のアミノ酸繰り返し配列（ＬＲＲ）を持っている分子量の比較小さいプロテオグリカンである。デコリンは、コラーゲンや他の分子と相互作用し、結合組織の形成や機能において重要な役割を担っている。デコリン遺伝子を欠損したマウスは、野生型に比べ、皮膚が脆弱で弾力性に欠くことが報告されている。また、線維形成の調節においては、損傷している筋繊維に、デコリンを局所投与すると、過剰な繊維形成が抑制され、筋肉修復が改善されるという報告がある。これらの報告は、デコリンは、細胞外マトリックスの正常な構築に関与していることを示すものである。ＵＶ照射によって増加した、通常より低分子・高分子量のデコリンは、水分量・弾力のうちでは主に皮膚の弾力低下と関連しており、果皮抽出物投与でデコリン低分子側のバンドが消えて、弾力性も上昇していることから、低分子デコリンの増加は、皮膚弾力性を減少させる作用があり、果皮抽出物投与は、低分子デコリン産生を抑制する働きがあると考えられる。詳しいメカニズムについては、更なる検証が必要である。
以上のことから、マンゴスチン果皮抽出物の投与は、皮膚水分量、皮膚弾力性、表皮の肥厚化を回復する。また、ＵＶ照射による病理学的所見の悪化を改善させる。そのうち、皮膚弾力性の回復にはＵＶ照射による異常デコリン産生の抑制が関係していることが推測される。
【実施例４】
【０００９】
マンゴスチン抽出物を用いた食品の調製
実施例１で調製したマンゴスチン果皮抽出物を用いて、以下のとおりチューインガムを調製した。
ガムベース                                ２０．０％
砂糖                                      ５４．７
グルコース                                １４．５
水飴                                        ９．３
香料                                        ０．５
マンゴスチン果皮抽出物                      １．０
１００．０％
実施例１で調製したマンゴスチン果皮抽出物を用いて、以下のとおりキャンディを調製した。
砂糖                                      ５０．０％
水飴                                      ３３．４
クエン酸                                    １．０
香料                                        ０．２
マンゴスチン果皮抽出物                      １．０
水                                        １４．４
１００．０％
実施例１で調製したマンゴスチン果皮抽出物を用いて、以下のとおりグミゼリーを調製した。
ゼラチン                                  ６０．０％
水あめ                                    ２３．０
砂糖                                        ７．５
植物油脂                                    ４．５
マンニトール                                ３．０
レモン果汁                                  １．０
マンゴスチン果皮抽出物                      １．０
１００．０％
実施例１で調製したマンゴスチン果皮抽出物を用いて、以下のとおりチョコレートを調製した。
粉糖                                      ４０．８％
カカオビター                              ２０．０
全脂粉乳                                  ２０．０
カカオバター                              １７．０
マンニトール                                １．０
マンゴスチン果皮抽出物                      １．０
香料                                        ０．２
１００．０％
実施例１で調製したマンゴスチン果皮抽出物を用いて、以下のとおりシャーベットを調製した。
オレンジ果汁                              ２５．０％
砂糖                                      ２５．０
卵白                                      １０．０
マンゴスチン果皮抽出物                      ０．１
香料                                        ０．１
水                                        ３９．８
１００．０％
実施例１で調製したマンゴスチン果皮抽出物を用いて、以下のとおりアイスクリームを調製した。
脱脂粉乳                                  ５０．０％
生クリーム                                ２５．０
砂糖                                      １０．０
卵黄                                      １０．０
マンゴスチン果皮抽出物                      １．０
香料                                        ０．１
水                                          ３．９
１００．０％
実施例１で調製したマンゴスチン果皮抽出物を用いて、以下のとおりビスケットを調製した。
薄力粉１級                                ２５．０％
中力粉１級                                ２２．０
精白糖                                      ５．０
食塩                                        １．０
ブドウ糖                                    １．０
パームショートニング                      １２．０
炭酸水素ナトリウム                          ０．２
重亜硫酸ナトリウム                          ０．２
米粉                                        ２．０
全脂粉乳                                    １．０
代用粉乳                                    ０．６
マンゴスチン果皮抽出物                      １．０
水                                        ２９．０
１００．０％
実施例１で調製したマンゴスチン果皮抽出物を用いて、以下のとおり錠果を調製した。
砂糖                                      ７５．８％
グルコース                                １９．０
ショ糖脂肪酸エステル                        ０．２
香料                                        ０．２
マンゴスチン果皮抽出物                      ０．８
水                                          ４．０
１００．０％
実施例１で調製したマンゴスチン果皮抽出物を用いて、以下のとおり飲料を調製した。
オレンジ果汁                              ３０．０％
異性化糖                                  １５．１４
クエン酸                                    ０．１
ビタミンＣ                                  ０．０４
香料                                        ０．１
マンゴスチン果皮抽出物                      ０．２
水                                        ５４．４２
１００．０％
この出願は２００９年３月３１日に出願された日本国特許出願番号２００９−０８５４１１からの優先権を主張するものであり、その内容を引用してこの出願の一部とするものである。
【図１】
2010114149.tif 000003
【図２】
2010114149.tif 000004
【図３】
2010114149.tif 000005
【図４Ａ】
2010114149.tif 000006
【図４Ｂ】
2010114149.tif 000007
【図５Ａ】
2010114149.tif 000008
【図５Ｂ】
2010114149.tif 000009
【図６Ａ】
2010114149.tif 000010
【図６Ｂ】
2010114149.tif 000011
【図７Ａ】
2010114149.tif 000012
【図７Ｂ】
2010114149.tif 000013
【図１０】
2010114149.tif 000014
【図１２Ｂ】
2010114149.tif 000015
【図１３Ｂ】
2010114149.tif 000016
【図１４】
2010114149.tif 000017
【図１６Ｂ】
2010114149.tif 000018
【図１７】
2010114149.tif 000019
【図１８】
2010114149.tif 000020
【図１９】
2010114149.tif 000021
【図２０Ａ】
2010114149.tif 000022
【図２０Ｂ】
2010114149.tif 000023
【図２１Ａ】
2010114149.tif 000024
【図２１Ｂ】
2010114149.tif 000025
【図２１Ｃ】
2010114149.tif 000026
【図２１Ｄ】
2010114149.tif 000027
【図２１Ｅ】
2010114149.tif 000028
【図２１Ｆ】
2010114149.tif 000029
【図２１Ｇ】
2010114149.tif 000030
【図２１Ｈ】
2010114149.tif 000031
【図２１Ｉ】
2010114149.tif 000032
【図２１Ｊ】
2010114149.tif 000033
【図２４】
2010114149.tif 000034
【図２５Ｃ】
2010114149.tif 000035
【図２６Ｃ】
2010114149.tif 000036
【図８Ａ】
2010114149.tif 000037
【図８Ｂ】
2010114149.tif 000038
【図８Ｃ】
2010114149.tif 000039
【図９】
2010114149.tif 000040
【図１１】
2010114149.tif 000041
【図１２Ａ】
2010114149.tif 000042
【図１３Ａ】
2010114149.tif 000043
【図１５】
2010114149.tif 000044
【図１６Ａ】
2010114149.tif 000045
【図２２】
2010114149.tif 000046
【図２３】
2010114149.tif 000047
【図２５Ａ】
2010114149.tif 000048
【図２５Ｂ】
2010114149.tif 000049
【図２６Ａ】
2010114149.tif 000050
【図２６Ｂ】
2010114149.tif 000051
【国際調査報告】
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