(57)【要約】この発明は、哺乳動物由来の体細胞から、１つもしくは複数の核初期化因子をコードするＤＮＡを個々にまたは組み合わせて含む１つもしくは複数の発現ベクターを使用して人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製する方法において、該発現ベクターが該体細胞の内在ゲノムに挿入されないベクターであり、該方法が、該発現ベクターを該体細胞に導入してｉＰＳ細胞を誘導し、該ｉＰＳ細胞中の該発現ベクターの機能を消失させることを含む、外来性核初期化因子をコードするＤＮＡを含まないかまたは該ＤＮＡを発現する能力をもたないｉＰＳ細胞の作製方法、ならびに、核初期化因子の発現が不能にされたｉＰＳ細胞に関する。
2010038904.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来の体細胞から、１つもしくは複数の核初期化因子をコードするＤＮＡを個々にまたは組み合わせて含む１つもしくは複数の発現ベクターを使用して人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製する方法において、該発現ベクターが該体細胞の内在ゲノムに挿入されないベクターであり、該方法が、該発現ベクターを該体細胞に導入してｉＰＳ細胞を誘導し、該ｉＰＳ細胞中の該発現ベクターの機能を消失させることを含む、外来性核初期化因子をコードするＤＮＡを含まないかまたは該ＤＮＡを発現する能力をもたないｉＰＳ細胞の作製方法。
【請求項２】
前記内在ゲノムに挿入されないベクターが人工染色体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記人工染色体が哺乳類人工染色体、酵母人工染色体または細菌人工染色体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳類人工染色体がヒト人工染色体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳類人工染色体がマウス人工染色体である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記１つもしくは複数の核初期化因子が少なくともＯｃｔ３／４を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の核初期化因子が、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃからなる群から選択される１もしくは複数の因子をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ベクターの機能の消失が、該ベクター中のＤＮＡの発現を不能にすること、該ベクターを含む細胞を破壊すること、あるいは該ベクターを脱落させることである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ベクター中のＤＮＡの発現を不能にすることが、該ベクターが体細胞特異的な発現制御領域を含み、これによって体細胞の核初期化に伴い該ＤＮＡの発現を不能にすることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクターを含む細胞の破壊が、該ベクターがチミジンキナーゼをコードするＤＮＡを含み、ｉＰＳ細胞の誘導後、シクロビル、ガンシクロビル、またはそれらと同等の機能をもつ化合物の存在下で該チミジンキナーゼを発現する細胞を破壊することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターの脱落が、前記ベクターが哺乳類セントロメアを含み、該セントロメアのＣＥＮＰ−Ｂ  ｂｏｘがＤＮＡ結合タンパク質認識配列によって置換されており、これによって、ＤＮＡ結合タンパク質の存在下で染色体凝縮を阻害し、人工染色体の脱落を起こすことを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ベクターの脱落が、前記の誘導されたｉＰＳ細胞クローンのサブクローニングによって行われることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ベクターがチミジンキナーゼをコードするＤＮＡを含み、ならびに、前記サブクローンによって得られたｉＰＳ細胞サブクローンをさらに、シクロビル、ガンシクロビル、またはそれらと同等の機能をもつ化合物の存在下で培養し、これらの化合物に耐性なサブクローンを選択することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベクターに含まれる前記核初期化因子をコードする各ＤＮＡのコピー数が１もしくは複数コピーである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
外来性核初期化因子またはそれをコードするＤＮＡを含まないことを特徴とする哺乳動物由来のｉＰＳ細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法で作製された、請求項１３に記載のｉＰＳ細胞。
【請求項１７】
前記哺乳動物が霊長類、げっ歯類、ペット動物または有蹄類である、請求項１５または１６に記載のｉＰＳ細胞。
【請求項１８】
前記哺乳動物がヒト、マウスまたはラットである、請求項１７に記載のｉＰＳ細胞。
【請求項１９】
哺乳動物由来の体細胞から、１つもしくは複数の核初期化因子をコードするＤＮＡの複数コピーを含む発現ベクターを使用してｉＰＳ細胞を誘導する方法において、該発現ベクターが該体細胞の内在ゲノムに挿入されない人工染色体であり、該方法が、該人工染色体を該体細胞に導入してｉＰＳ細胞を誘導することを含む、該人工染色体を含むｉＰＳ細胞の誘導方法。
【請求項２０】
前記人工染色体が哺乳類人工染色体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つもしくは複数の核初期化因子が少なくともＯｃｔ３／４を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数の核初期化因子が、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃからなる群から選択される１もしくは複数の因子をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃを含む核初期化因子をコードするＤＮＡ、あるいはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４を含む核初期化因子をコードするＤＮＡ、の複数コピーを含むヒト人工染色体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘導後にもはや外来性核初期化因子またはそれをコードするＤＮＡを含まない、あるいは該ＤＮＡを発現する能力をもたない、人工多能性幹細胞（以下、「ｉＰＳ細胞」と称する）およびその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉＰＳ細胞の誘導に必要な核初期化因子としてＫｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４の組み合わせ、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４の組合せ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４の組合せ等が知られており、これまでレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターを用いてｉＰＳ細胞が作製されている（特許文献１、非特許文献１〜４）。
レトロウイルスベクターの場合、各トランスジーンは３〜８コピーずつ宿主細胞ゲノムに組み込まれていたと報告されている（非特許文献１および８）。宿主細胞ゲノムへの組み込み効率の低い変異型レンチウイルスベクターを用いた報告もあるが、獲得できたｉＰＳ細胞のゲノムには、やはり同じようにトランスジーンが組み込まれていた（非特許文献５）。宿主細胞ゲノムへのベクターの挿入により、挿入部位周辺の遺伝子発現制御が撹乱される危険性も予想されている。事実、レトロウイルスベクターを用いたＳＣＩＤ−Ｘ１遺伝子治療の臨床例において、挿入部位下流の遺伝子活性化による白血病の発症が報告されている（非特許文献６）。また、宿主細胞ゲノムに挿入されたトランスジーンは、ｉＰＳ細胞化の過程で宿主細胞のエピジェネティック制御機構を用いてサイレンシングされているが、不可逆的なものではなく、長期継代培養によりトランスジーンが再活性化する危険性も指摘されている（非特許文献７）。
ゲノム非挿入型ベクターの場合、プラスミド系ベクターにしろ、ウイルス系ベクターにしろ、エピソーマルに存在するため、分裂を繰り返すことにより、コピー数が減少してしまい、導入遺伝子の発現が一過性であることが、もうひとつの問題としてあげられている。この欠点のため、未だゲノム非挿入型ベクターを用いた遺伝子治療は十分な成功を収めていない。
ｉＰＳ細胞作製の場合でも、２〜３週間にわたりトランスジーンが高発現することが必要であることから、ゲノム挿入型ベクターを用いることがｉＰＳ細胞の作製には必要であろうと考えられている（非特許文献８および９）。
さらにまた、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃという増殖関連遺伝子は形質転換に関わっていることから、長期にわたる高発現は正常なｉＰＳ細胞に悪影響を及ぼすかもしれないし、また、最近になり、５−アザシチジン、バルプロ酸、トリコスタチンＡ等の阻害剤を用いることによるｉＰＳ細胞の作製効率の向上が報告されている（非特許文献１０および１１）が、いずれの化合物も細胞毒性が強く、例えば患者由来の細胞から作製したｉＰＳ細胞を用いた細胞再生療法やｉＰＳ細胞バンキングを考えた場合、現実的に応用できる方法ではないと予想される。
このように、ｉＰＳ細胞の作製には、安全性や安定性の観点から、実際にヒトへの利用を実現するには解決すべき課題が多く存在しており、そのような課題の解消が、ｉＰＳ細胞を用いた細胞再生療法を成功させるために全世界で待望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．およびＹａｍａｎａｋａ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ  １２６：６６３−６７６（２００６）
【非特許文献２】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ら，Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２（２００７）
【非特許文献３】Ｙｕ，Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９１７−１９２０（２００７）
【非特許文献４】Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１−１０６（２００８）
【非特許文献５】Ｍａｌｉ，Ｐ．ら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２６：１９９８−２００５（２００８）
【非特許文献６】Ｓ．Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２：４１５−４１９（２００３）
【非特許文献７】Ｇ．Ｎａｒａｚａｋｉら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１８：４９８−５０６（２００８）
【非特許文献８】Ｏｋｉｔａ，Ｋ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４４８：３１３−７（２００７）
【非特許文献９】Ｂｒａｍｂｒｉｎｋ，Ｔ．ら，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２：１５１−９（２００８）
【非特許文献１０】ＴＳ．Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ４５４：４９−５５（２００８）
【非特許文献１１】Ｄ．Ｈｕａｎｇｆｕら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：７９５−７９７（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、今回、ｉＰＳ細胞の作製において、所望する時期、期間に限り複数の核初期化因子のトランスジーンを高発現させられる、そして該トランスジーンの発現を必要でなくなった時期に不能にすることができるゲノム非挿入型ベクターを構築することによって、上記課題を解決することを提案する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、要約すると以下の特徴を含む。
第１の態様において、本発明は、哺乳動物由来の体細胞から、１つもしくは複数の核初期化因子をコードするＤＮＡを個々にまたは組み合わせて含む１つもしくは複数の発現ベクターを使用して人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製する方法において、該発現ベクターが該体細胞の内在ゲノムに挿入されないベクターであり、該方法が、該発現ベクターを該体細胞に導入してｉＰＳ細胞を誘導し、該ｉＰＳ細胞中の該発現ベクターの機能を消失させることを含む、外来性核初期化因子をコードするＤＮＡを含まないかまたは該ＤＮＡを発現する能力をもたないｉＰＳ細胞の作製方法を提供する。
本明細書で使用する「内在ゲノムに挿入されない」とは、ベクターが細胞本来（ｎａｔｉｖｅ）の内在ゲノムに組み込まれずに、内在染色体から独立して存在することを意味する。
本明細書で使用する「ＤＮＡ」なる用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどのデオキシリボ核酸に対して使用される。
その実施形態において、上記内在ゲノムに挿入されないベクターは人工染色体である。人工染色体の具体例は、哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）または細菌人工染色体（ＢＡＣまたはＰＡＣ）である。好ましい哺乳類人工染色体はヒト人工染色体（ＨＡＣ）、マウス人工染色体などである。
別の実施形態において、上記１つもしくは複数の核初期化因子が少なくともＯｃｔ３／４を含み、該核初期化因子はさらに、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃからなる群から選択される１もしくは複数の因子を含むことができる。
本明細書中、遺伝子名「Ｏｃｔ３／４」、「Ｓｏｘ２」、「Ｋｌｆ４」および「ｃ−Ｍｙｃ」は、マウスやヒトを含めた任意の哺乳動物に対して使用する用語である。
別の実施形態において、上記ベクターの機能の消失が、該ベクター中のＤＮＡの発現を不能にすること、該ベクターを含む細胞を破壊すること、あるいは該ベクターを脱落させることである。
別の実施形態において、上記ベクター中のＤＮＡの発現を不能にすることが、該ベクターが体細胞特異的な発現制御領域を含み、これによって体細胞の核初期化に伴い該ＤＮＡの発現を不能にすることを含む。
本明細書で使用する「核初期化」（「初期化」とも称する）という用語は、分化した体細胞において胚性幹（ＥＳ）細胞のような分化多能性を誘導する核の再プログラム化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）を指す。また、この再プログラム化を誘導する因子が「核初期化因子」（「初期化因子」とも称する）である。
また別の実施形態において、上記ベクターを含む細胞の破壊が、上記ベクターがチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードするＤＮＡを含み、ｉＰＳ細胞の誘導後、シクロビル、ガンシクロビル、またはそれらと同等の機能をもつ化合物の存在下で該チミジンキナーゼを発現する細胞を破壊することを含む。
さらに別の実施形態において、上記ベクターの脱落が、上記ベクターが、哺乳類セントロメアを含み、該セントロメアのＣＥＮＰ−Ｂ  ｂｏｘがＤＮＡ結合タンパク質認識配列によって置換されており、これによって、ＤＮＡ結合タンパク質の存在下で染色体凝縮を阻害し、ベクターの脱落を起こすことを含む。
さらに別の実施形態において、上記ベクターの脱落が、誘導されたｉＰＳ細胞クローンのサブクローニングによって行われる。ここで好適なベクターは、人工染色体ベクター、好ましくは哺乳類人工染色体ベクター、より好ましくはヒト人工染色体ベクターである。
さらに別の実施形態において、この場合、上記ベクターがチミジンキナーゼをコードするＤＮＡを含み、ならびに、上記サブクローンによって得られたｉＰＳ細胞サブクローンをさらに、シクロビル、ガンシクロビル、またはそれらと同等の機能をもつ化合物の存在下で培養し、これらの化合物に耐性なサブクローンを選択することを含む。この選択によって、ベクターが脱落した目的の細胞のみが得られる。
上記の３つの手法によって、誘導後のｉＰＳ細胞は、複数の核初期化因子をコードするＤＮＡを発現する能力を喪失する。
別の実施形態において、上記発現ベクターに含まれる上記ＤＮＡのコピー数は、１つもしくは複数のコピー、好ましくは１〜６コピー、より好ましくは２〜５コピーである。
本明細書で使用する「コピー数」という用語は、発現すべき個々のＤＮＡを含む同一発現ユニットの数を意味する。ユニット数依存的に外来ＤＮＡの発現レベルを増大させることが可能になる。
第２の態様において、本発明は、外来性（すなわち、外来的に導入された）核初期化因子またはそれをコードするＤＮＡを含まないことを特徴とする哺乳動物由来のｉＰＳ細胞を提供する。すなわち、この細胞は、ｉＰＳ細胞の誘導後に役割を終えた上記ＤＮＡが発現されないため、ｉＰＳ細胞の利用に際して核初期化因子による悪影響が回避されることを特徴とする。
その実施形態において、上記ｉＰＳ細胞が上記方法で作製されるものである。
別の実施形態において、上記哺乳動物が霊長類、げっ歯類、ペット動物または有蹄類である。哺乳動物は、例えばヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシなどを含み、好ましくはヒトであるが、これらに限定されない。
第３の態様において、本発明はさらに、哺乳動物由来の体細胞から、１つもしくは複数の核初期化因子をコードするＤＮＡの複数コピーを含む発現ベクターを使用してｉＰＳ細胞を誘導する方法において、該発現ベクターが該体細胞の内在ゲノムに挿入されない人工染色体であり、該方法が、該人工染色体を該体細胞に導入してｉＰＳ細胞を誘導することを含む、該人工染色体を含むｉＰＳ細胞の誘導方法を提供する。ここで、複数コピーは、２以上のコピー、好ましくは２〜５コピーである。
その実施形態において、上記人工染色体が哺乳類人工染色体である。哺乳類人工染色体の例は、ヒト人工染色体、マウス人工染色体などを含み、好ましくはヒト人工染色体である。
別の実施形態において、上記１つもしくは複数の核初期化因子が少なくともＯｃｔ３／４を含み、該核初期化因子が、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃからなる群から選択される１もしくは複数の因子をさらに含む。
第４の態様において、本発明は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃを含む核初期化因子をコードするＤＮＡ、あるいはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４を含む核初期化因子をコードするＤＮＡ、の複数コピーを含むヒト人工染色体を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、核初期化因子をコードするＤＮＡを含む人工染色体を含むｉＰＳ細胞の誘導後に、ｉＰＳ細胞の利用において外来の該ＤＮＡによる影響を実質的に排除することができる。このことは、ｉＰＳ細胞から分化誘導される安全性のより高い細胞や組織を再生医療のために提供できることを意味する。さらにまた、人工染色体をｉＰＳ細胞の誘導に使用することによって、体細胞のゲノムへのランダムな組み込みによる不均質なｉＰＳ細胞の生成を避けることができる。すなわち、本発明で使用する人工染色体は、細胞ゲノムに組み込まれないため、人工染色体プロモーターが安定であり、これによりクローン間での発現レベルのバラツキが少なくなるため、バラツキの少ない、かつ内在未分化因子の発現が均一な（図１６）、ｉＰＳ細胞を生成することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図１は、マウス由来のｍＫｌｆ４、ｍｃ−Ｍｙｃ、ｍＳｏｘ２、ｍＯｃｔ３／４をそれぞれ１コピーずつ持ったＰＡＣ発現ベクターを示す図（ＰＡＣ−ＫＭＳＯ）である。このプラスミドはＣＡＧプロモーターとウサギβ−グロビンポリＡ配列を持ち、それぞれのトランスジーン発現ユニットはチキンβ−グロビンＨＳ４インスレーターに挟み込んでいる。このプラスミドは、ｌｏｘＰ配列、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子のエクソン３〜エクソン９に相当する配列も含有しており、Ｃｒｅ組換え酵素により２１ＨＡＣベクターにも挿入可能である。
図２は、２１ＨＡＣベクターの構造を示す図である。ここで、ｃｅｎはセントロメア、ｔｅｌはテロメア、ＰＧＫ  ｐｕｒｏはＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーターの制御下のピューロマイシン耐性遺伝子、ＣＡＧ  ＥＧＦＰはＣＡＧプロモーター制御下の改変型緑色蛍光タンパク質遺伝子、ＣＭＶ  ＢｓｄはＣＭＶ（サイトメガロウイルス）エンハンサーの制御下のブラストシジンＳ耐性遺伝子、ＰＧＫ  ｈｙｇｒｏはＰＧＫプロモーターの制御下のハイグロマイシン耐性遺伝子、ＭＣ１  ＴＫはＭＣ１プロモーターの制御下のチミジンキナーゼ遺伝子、β−アクチン  ｈｉｓＤはβ−アクチンプロモーターの制御下のヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子をそれぞれ示す。
図３は、マウス由来のｍＫｌｆ４、ｍｃ−Ｍｙｃ、ｍＳｏｘ２、ｍＯｃｔ３／４をそれぞれ１コピーずつ持ったＰＡＣ発現ベクターＰＡＣ−ＫＭＳＯを挿入した２１ＨＡＣベクター（２１ＨＡＣ−ＫＭＳＯ）である。ＣＡＧ−ＰはＣＡＧプロモーター、ＨＳ４はチキンβ−グロビンＨＳ４インスレーター、ｐＡはウサギβ−グロビンポリＡ配列、ＨＰＲＴ３−９はＨＰＲＴ遺伝子のエクソン３〜エクソン９、ＨＰＲＴ１−２はＨＰＲＴ遺伝子のエクソン１〜エクソン２、ＴＫはチミジンキナーゼ遺伝子、ＥＧＦＰは改変型緑色蛍光タンパク質遺伝子をそれぞれ示す。
図４は、Ｃｒｅ組換え酵素によりＰＡＣ−ＫＭＳＯが挿入された２１ＨＡＣベクター（２１ＨＡＣ−ＫＭＳＯ）を持つＣＨＯ細胞クローンＫＭＳＯ１０のＦＩＳＨ像である。
図５は、Ｃｒｅ組換え酵素によりＰＡＣ−ＫＭＳＯを挿入した２１ＨＡＣベクター（２１ＨＡＣ−ＫＭＳＯ）を持つＣＨＯ細胞クローンＫＭＳＯ１０、ＫＭＳＯ１３におけるトランスジーンの発現様式を示す図である。ここでＧＡＰＤＨは、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を表す。
図６は、ＰＡＣ−ＫＭＳＯをリポフェクション法によりマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）に導入後、得られたｉＰＳクローンの形態（クローン＃１）（２０日目、３４日目）を示す図である。１ヶ月以上にわたり、継代可能であり、マウスＥＳ細胞様の形態を維持した。
図７は、２１ＨＡＣ−ＫＭＳＯを微小核細胞融合法によりＭＥＦに導入後、得られたｉＰＳクローンの形態（クローンＫＭ１０−１、ＫＭ１０−２）（３６日目）を示す図である。また、１ヶ月以上にわたり、継代可能であり、マウスＥＳ細胞様の形態を維持した。２１ＨＡＣベクター上にはＥＧＦＰ遺伝子が組み込んであり、２１ＨＡＣ保持細胞は緑色蛍光を発している。
図８は、２１ＨＡＣ−ＫＭＳＯ導入クローンＫＭ１０−１のＦＩＳＨ解析の図である。ヒト特異的繰り返し配列ｃｏｔＩにより２１ＨＡＣベクターを赤色蛍光で、ＰＡＣ−ＫＭＳＯを緑色蛍光で検出している。
図９は、獲得したクローン＃１、ＫＭ１０−１、ＫＭ１０−２、ならびに、それらの継代細胞の未分化マーカーの発現状態を示す図である。
図１０は、獲得したクローン＃１、ＫＭ１０−１、ＫＭ１０−２、ならびに、それらの継代細胞のトランスジーンの発現状態を示す図である。
図１１は、獲得したクローン＃１により形成された奇形腫の図である。
図１２は、マウス由来のｍＫｌｆ４、ｍｃ−Ｍｙｃ、ｍＳｏｘ２、ｍＯｃｔ３／４をそれぞれ２コピーずつ持ったＰＡＣ発現ベクターＰＡＣ−２ＣＡＧ−ＫＭＳＯを挿入した２１ＨＡＣベクターの図（２１ＨＡＣ−２ＣＡＧ−ＫＭＳＯ）である。ＣＡＧ−ＰはＣＡＧプロモーター、ＨＳ４はチキンβ−グロビンＨＳ４インスレーター、ｐＡはウサギβ−グロビンポリＡ配列、Ｈｙｇはハイグロマイシン耐性遺伝子、ＥＧＦＰは改変型緑色蛍光タンパク質遺伝子、ＨＰＲＴ３−９はＨＰＲＴ遺伝子のエクソン３〜エクソン９、ＨＰＲＴ１−２はＨＰＲＴ遺伝子のエクソン１〜エクソン２、ＴＫはチミジンキナーゼ遺伝子をそれぞれ示す。
図１３は、Ｃｒｅ組換え酵素によりＰＡＣ−２ＣＡＧ−ＫＭＳＯが挿入された２１ＨＡＣベクター（２１ＨＡＣ−２ＣＡＧ−ＫＭＳＯ）を持つＣＨＯ細胞クローン２ＣＡＧＥ０５、２ＣＡＧＥ０７、２ＣＡＧＥ１５、２ＣＡＧＥ１６、２ＣＡＧＥ１７、２ＣＡＧＥ１９におけるトランスジーンの発現様式を示す。ここでＭｉｌｌｉＱは純水を表す。
図１４は、２１ＨＡＣ−２ＣＡＧ−ＫＭＳＯを微小核細胞融合法によりＭＥＦに導入後、得られたｉＰＳクローンの形態（サブクローン２ＣＡＧ７−１ｓ１、２ＣＡＧ７−４ｓ１、２ＣＡＧ７−６ｓ１）を示す図である。
図１５は、２１ＨＡＣ−２ＣＡＧ−ＫＭＳＯ導入ｉＰＳクローンのサブクローンである２ＣＡＧ７−６ｓ１、２ＣＡＧ７−４ｓ１および２ＣＡＧ５−６ｓ３のＦＩＳＨ像である。矢印は２１ＨＡＣベクターを示す。２ＣＡＧ７−４ｓ１は２１ＨＡＣベクターを保持した細胞と脱落した細胞が混在していたが、２ＣＡＧ７−６ｓ１、２ＣＡＧ５−６ｓ３では２１ＨＡＣベクターを全く検出できなかった。これらのことは、２１ＨＡＣ−２ＣＡＧ−ＫＭＳＯ導入ｉＰＳクローンのサブクローニングの間に２１ＨＡＣベクターが自然に脱落する細胞が得られることを示している。
図１６は、獲得したクローン２ＣＡＧ７−１ｓ１〜ｓ６、２ＣＡＧ７−４ｓ１、２ＣＡＧ７−６ｓ１の未分化マーカーの発現状態を示す図である。ここで、ｍ−ｉＰＳ２０Ｄ１７およびｍＥＳＴＴ２−Ｆは陽性対照であり、ＭＥＦは陰性対照である。また、Ｎａｔ１はＮ−アセチルトランスフェラーゼ１遺伝子を表す。
図１７は、２ＣＡＧ７−４ｓ１をガンシクロビル存在下で培養後、得られたガンシクロビル耐性ｉＰＳクローンの形態（７日目）を示す図である。このクローンは、マウスＥＳ細胞様の形態を維持していた。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下で、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、上記のとおり、哺乳動物由来の体細胞から、１つもしくは複数の核初期化因子をコードするＤＮＡを個々にまたは組み合わせて含む１つもしくは複数の発現ベクターを使用してｉＰＳ細胞を作製する方法において、該発現ベクターが該体細胞の内在ゲノムに挿入されないベクターであり、該方法が、該発現ベクターを該体細胞に導入してｉＰＳ細胞を誘導し、該ｉＰＳ細胞中の該発現ベクターの機能を消失させることを含む、外来性核初期化因子をコードするＤＮＡを含まないかまたは該ＤＮＡを発現する能力をもたないｉＰＳ細胞の作製方法を提供する。
本発明の特徴は、第１に、核初期化因子をコードするＤＮＡを含む発現ベクターとして、核初期化される体細胞の内在ゲノムに挿入されないベクターであること、ならびに、第２に、ｉＰＳ細胞の誘導後に発現ベクターの機能を消失させること、これによって核初期化因子をコードするＤＮＡが非存在となるかまたは該ＤＮＡの発現が不能になることである。
本明細書で使用する「発現ベクターの機能を消失させる」という用語は、ｉＰＳ細胞内で、ｉＰＳ細胞の誘導のために仕えた核初期化因子をコードするＤＮＡの発現が不能にされるか、または、ベクターを含む細胞のみが破壊されるか、あるいは、ベクターを脱落させる（言い換えれば、ベクターを含む細胞を脱落させる）ことを意味する。また、「脱落」とは、内在性染色体から独立して存在する上記ベクターが、染色体分配の過程で取り残されて該ベクターの全体が娘細胞に受け継がれない（しかし、細胞本来の内在性染色体は維持される）ことを意味する。
１．ベクター
本発明方法で使用されるベクターは、宿主細胞ゲノムに組み込まれないゲノム非挿入型ベクターである。そのようなベクターとしては、非限定的に、プラスミド、例えば２Ａプラスミド（Ｏｋｉｔａ，Ｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２：９４９，２００８；Ａｄｄｇｅｎｅ社）、人工染色体、例えば哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣまたはＰＡＣ）などがあげられる。哺乳類人工染色体の例は、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、マウス人工染色体などである。本発明の実施形態では、ベクターは線状または環状のいずれの形態であってもよい。好ましいベクターは、人工染色体であり、より好ましくはＭＡＣであり、最も好ましくはＨＡＣである。人工染色体は、体細胞からｉＰＳ細胞を誘導可能であるかぎり、その構造および構成エレメントは制限されないものとする。
本発明では、上記ベクターは、体細胞からｉＰＳ細胞を誘導するための核初期化因子をコードするＤＮＡを含む。核初期化因子は哺乳動物由来のものであり、好ましくは体細胞と同じ哺乳動物由来の核初期化因子である。すなわち、体細胞がヒト由来であれば、核初期化因子もヒト由来のものが好ましい。核初期化因子としては、以下のものに限定されないが、例えばＯｃｔ３／４（Ｏｃｔ３もしくはＯｃｔ４とも呼ばれる）、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃからなる組み合わせ；Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４からなる組み合わせ；Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８からなる組み合わせ；あるいは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８からなる組み合わせなどが知られている（Ｋ．ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＳ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ  １２６：６６３−６７６（２００６）；国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６；Ｍ．Ｎａｋａｇａｗａら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１−１０６（２００８）；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２（２００７）；Ｊ．Ｙｕら．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９１７−１９２０（２００７）；Ｊ．Ｌｉａｏら，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１８，６００−６０３（２００８））。もし体細胞が上記因子の少なくとも１つを発現しうる細胞であれば、その因子を、因子の組み合わせから省くことができる。例えば、神経幹細胞はＳｏｘ２を発現しているため、Ｏｃｔ３／４とＫｌｆ４のみでｉＰＳ細胞を誘導することができるし（Ｊ．Ｂ．Ｋｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ  ４５４：６４６−６５０（２００８））、あるいは、Ｏｃｔ３／４のみでｉＰＳ細胞を誘導することができるという報告もある（ＪＢＫｉｍ  ら，Ｎａｔｕｒｅ  ０８４３６（２００９））。上記核初期化因子は、ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）にアクセスすることによって、それらのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を得ることができる。例えばヒトおよびマウス由来の核初期化因子に関する登録番号は以下のとおりである。
Ｏｃｔ３／４（ＰＯＵ  ｃｌａｓｓ  ５  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １）：ヒト  ＮＭ＿２０３２８９  またはＮＭ＿００２７０１；マウスＮＭ＿０１３６３３
Ｓｏｘ２（ＳＲＹ（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ）−ｂｏｘ  ２）：ヒトＮＭ＿００３１０６；マウスＮＭ＿０１１４４３
Ｋｌｆ４（Ｋｒｕｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ  ４）：ヒトＮＭ＿００４２３５；マウスＮＭ＿０１０６３７
ｃ−Ｍｙｃ（ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ）：ヒトＮＭ＿０１０８４９；マウスＮＭ＿００２４６７
Ｎａｎｏｇ（Ｎａｎｏｇ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ）：ヒトＮＭ＿０２４８６５；マウスＮＭ＿０２８０１６
Ｌｉｎ２８（ｌｉｎ−２８  ｈｏｍｏｌｏｇ）：ヒトＮＭ＿０２４６７４；マウスＮＭ＿１４５８３３
本発明ではさらに、ｉＰＳ細胞の誘導効率を高めるために、核初期化因子をコードするＤＮＡと同じベクターかまたはそれと異なるベクター（例えば人工染色体、プラスミドなど）に、ｍｉＲ−２９４，ｍｉＲ−２９５，ｍｉＲ−２９１−３ｐなどのｍｉＲＮＡ、ｐ５３（ヒトでＴＰ５３、マウスでＴｒｐ５３とも称する。）のｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡなどのＲＮＡをコードするＤＮＡを挿入し、体細胞の初期化の際に、該初期化と実質的に同時に該ＲＮＡを生成するようにすることができる（Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：４５９−４６１，２００９；Ｈ．Ｈｏｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ４６０：１１３２−１１３５，２００９）。
ＢＡＣベクターは、大腸菌Ｆプラスミドの複製系を利用した環状ＤＮＡベクターであり、挿入可能なインサートのサイズは１００〜３５０ｋｂである。ＢＡＣベクターとしては、例えばｐＢｅｌｏＢＡＣ１１、ｐＥＣＢＡＣ１、ｐＣＬＤ０４５０１、ｐＢｉＢＡＣｌａｃ１、ＢｉＢＡＣ２、Ｖ４１、ｐＢＡＣ１０８Ｌ（ＡＴＣＣ  Ｕ５１１１４０）、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１（ＡＴＣＣ  Ｕ５１１１３）などが挙げられる（特開２００３−２７４９６１）。外来ＤＮＡの挿入位置は特に制限されず任意であるが、例えば種々の制限酵素部位から構成されるマルチクローニングサイトをあらかじめベクターに配置しておくことによってその位置に外来ＤＮＡを挿入することができる。
ＰＡＣベクターは、バクテリオファージＰ１由来人工染色体であり、挿入可能なインサートのサイズは、最高３００ｋｂ程度である。Ｐ１プラスミドとも称される。ＰＡＣベクターとしては、例えばｐＣＹＰＡＣ２、ｐＰＡＣ４などが挙げられる（特開２００３−２７４９６１）。外来ＤＮＡの挿入位置については、ＢＡＣベクターと同様である。
ＹＡＣベクターは、酵母由来の、テロメア、セントロメアおよび自律複製配列または複製起点を含むベクターであり、挿入可能なインサートのサイズは１００〜３０００ｋｂである（ＤＴ  Ｂｕｒｋｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：８０６−８１２（１９８７））。テロメアは、染色体末端の安定化と完全な複製のために必要であり、セントロメアは、染色体の均等な分配のために必要であり、自律複製配列および複製開始点はＤＮＡの複製のために必要である。ＹＡＣベクターとしては  、例えばｐＹＡＣ２、ｐＹＡＣ３、ｐＹＡＣ４、ｐＹＡＣＮｅｏなどが挙げられる（特開２００３−２７４９６１）。
ＭＡＣベクターは、哺乳類由来のテロメアおよびセントロメアもしくはその機能性断片を含むベクターである。このベクターは、哺乳動物由来の染色体から長腕遠位および短腕遠位を削除し、その両端に哺乳動物由来のテロメアを結合することによって作製することができる。得られたベクターは、哺乳動物細胞の内因性染色体を破壊することなく外来ＤＮＡを導入することができる。ここで、遠位とは、長腕または短腕においてセントロメアから遠い領域、すなわちテロメア側をいい、一方、近位とは、長腕または短腕においてセントロメアに近い領域、すなわちセントロメア側をいう。本発明では、染色体上の切断点は、好ましくは、内在遺伝子を含まないようにセントロメア側に存在するべきである。
機能性セントロメア断片には、セントロメアサテライト（アルフォイド）に存在する１７ｂｐの塩基配列（ＣＥＮＰ−Ｂ  ｂｏｘ；共通配列５’−ＮＴＴＣＧＮＮＮＮＡＮＮＣＧＧＧＮ−３’（ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧのいずれかである。）（配列番号１６））を含むことが好ましい（特開２００７−３０６９２８；特開２００８−５４５０１；Ｍａｓｕｍｏｔｏら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０９：１９６３−１９７３（１９８９）；Ｍｕｒｏら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１６：５８５−５９６（１９９２）；Ｋｉｐｌｉｎｇら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４００９−４０２０（１９９５）；Ｙｏｄａら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：５１６９−５１７７（１９９６））。また、テロメア配列は、哺乳類、酵母等の染色体の末端に位置し、繰り返し配列（テロメアの繰り返し単位は、ヒトを含む哺乳動物の場合５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’、酵母の場合例えば５’−ＴＧ１−３−３’である。）からなる。テロメア配列の長さは、例えば約０．５〜約２５ｋｂである。
ＨＡＣベクターは、本発明で好ましく使用可能な哺乳類人工染色体であり、その特徴はＭＡＣベクターに記載したとおりであるがテロメアおよびセントロメアもしくはその機能性断片はヒト１〜２２番染色体（例えば２１番染色体、１４番染色体など）由来のものである。本発明では、好ましくは、ＨＡＣは内在遺伝子を含まない。そのためには、ヒト染色体の長腕（ｑ）および短腕（ｐ）においてセントロメアに近い領域で切断されるべきである。そのようなＨＡＣベクターの例は、ヒト２１番染色体由来のベクター（「２１ＨＡＣ」ベクター）（図２）であり、該染色体の長腕遠位がＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＰ００１６５７において、また、短腕遠位がＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ１６３２０１において削除されたヒト２１番染色体断片に同種または異種染色体由来のテロメア配列を結合して得られたベクターである（特開２００７−２９５８６０）。ここで異種染色体由来のテロメア配列は、ヒト２１番染色体由来のＨＡＣと、２１番染色体以外の他のヒト染色体由来のＨＡＣとの間でのテロメアトランケーション（例えば、国際公開ＷＯ００／１０３８３号）によって作製されうる。２１ＨＡＣベクターは、ヒト、マウス、ハムスターを初めとする哺乳動物細胞に移入可能なこと、移入した宿主細胞内で独立した染色体として自律複製、分配されること、一定のコピー数で維持されること、外来遺伝子をヒト正常細胞に導入した場合、長期間にわたり該遺伝子が持続発現されることなどの特徴を有する。
ＨＡＣベクターは、例えば次の（ａ）〜（ｃ）の工程によって作製しうる。
（ａ）ヒト染色体を保持する細胞を得る工程
（ｂ）ヒト染色体の長腕遠位および／または短腕遠位を削除する工程
（ｃ）長腕近位および／または短腕近位似１つ以上のＤＮＡ配列挿入部位を挿入する工程
工程（ａ）では、ヒト染色体は、ヒト染色体を保持するＡ９雑種細胞（ＪＣＲＢ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｓｅｓ）での登録番号ＪＣＲＢ２２２１）から入手しうる。この雑種細胞ライブラリーから目的の染色体を含むクローンを選択し、比較的相同組換え率の高い細胞、例えばニワトリＤＴ４０細胞（Ｄｉｅｋｅｎら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：１７４−１８２，１９９６）に目的染色体を移入し、該染色体を保持する細胞を得る。
工程（ｂ）では、ヒト染色体を保持する上記細胞において、該染色体の長腕遠位および／または短腕遠位を削除する。このとき、テロメアトランケーションを利用して人工テロメア配列を相同組換えにより置換挿入し、染色体の長腕遠位または短腕遠位を削除する。このとき、上述したように、染色体の内在遺伝子がすべて除去されるように長腕遠位または短腕遠位を削除することが好ましい。
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で得られた人工染色体にＤＮＡ配列挿入部位を挿入する。ＤＮＡ配列挿入部位として、組換え酵素認識配列が好ましく使用される。この特定の認識部位をある種の酵素が特異的に認識し外来ＤＮＡの組換えを起こす。
組換え酵素認識配列の例は、ｌｏｘＰ配列、ＦＲＴ（Ｆ１ｐ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔａｒｇｅｔ）配列、ａｔｔＢ／ａｔｔＰ配列などを含み、これらの配列を特異的に認識する組換え酵素はそれぞれＣｒｅ酵素、ＦＬＰ酵素、φＣ３１インテグラーゼである。組換え酵素認識配列は外来ＤＮＡを挿入するために使用することができる。人工染色体における組換え酵素認識配列の組込み位置は、通常、長腕側のセントロメアとテロメアの間の任意の位置である。一般に、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系、またはＦＬＰ−ＦＲＴ系を利用することができる。
ＨＡＣベクターはまた、ＹＡＣベクターをベースに、そのセントロメアおよびテロメア配列をヒト由来のものに置換することによっても作製可能である。
本発明の上記ベクターはさらに、選択マーカー、必要であればレポーター遺伝子、を含むことができる。選択マーカーの例は、薬剤耐性遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子もしくはＧ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子など、ネガティブ選択遺伝子、例えば単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＤＶ−ＴＫ）遺伝子、ジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子などを含む。また、レポーター遺伝子の例は、蛍光タンパク質遺伝子、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＤＮＡ、改変型ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）をコードするＤＮＡ、などを含む。
本発明の上記ベクターはさらに、外来遺伝子間にインスレーター配列を含むことができる。インスレーター配列は、隣接する遺伝子の発現が互いに影響されないようにする役割をもつ。インスレーター配列の例は、ヒトβ−グロビンＨＳ１〜５、ニワトリβ−グロビンＨＳ４、ヒトＴ細胞受容体α／δの阻害因子α／δなどを含む。
本発明の上記ベクターはさらに、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ配列、外来ＤＮＡ挿入部位（例えば組換え酵素認識配列）などを適宜含むことができる。
プロモーターおよびエンハンサーの例は、サイトメガロウイルスエンハンサーニワトリβ−アクチンプロモーター、これらのエンハンサーおよびプロモーターとウサギβ−グロビンのスプライシングアクセプターとからなるハイブリットプロモーター（ＣＡＧプロモーター）などを含む。
ポリＡ配列の例は、哺乳動物由来の遺伝子のポリＡ配列、例えばウサギβ−グロビンポリＡ配列、ウシ成長因子ポリＡ配列などを含む。
本発明のベクターは、１つもしくは複数の核初期化因子をコードするＤＮＡを個々にまたは組み合わせて含むことができる。その組み合わせの例は、上記のとおりであり、例えば図３に示すように、５’側から順番に、インスレーター配列、エンハンサー／プロモーター配列、第１核初期化因子をコードするＤＮＡ配列およびポリＡ配列からなる第１配列、インスレーター配列、エンハンサー／プロモーター配列、第２核初期化因子をコードするＤＮＡ配列およびポリＡ配列からなる第２配列、インスレーター配列、エンハンサー／プロモーター配列、第３核初期化因子をコードするＤＮＡ配列およびポリＡ配列からなる第３配列、インスレーター配列、エンハンサー／プロモーター配列、第４核初期化因子をコードするＤＮＡ配列およびポリＡ配列からなる第４配列、というように各配列を配置してなるカセットを作製し、このカセットを外来ＤＮＡ挿入部位（例えば組換え酵素認識配列部位）に組み込むことができる。この場合、複数の核初期化因子をコードするＤＮＡ配列はいかなる順番であってもよい。また、核初期化因子をコードする各ＤＮＡのコピー数は単一コピーでもよいし、複数コピー、例えば２〜３コピーまたはそれ以上、２〜４コピーまたはそれ以上、２〜５コピーまたはそれ以上、または２〜６コピーまたはそれ以上でもよい（図１３）。核初期化因子をコードする各ＤＮＡのコピー数が複数、すなわち２以上であるときには、体細胞の未分化性が高まる、すなわち未分化マーカー（すなわちＥＳ細胞マーカー）の発現レベルが増大する。
本発明の方法では、ｉＰＳ細胞の誘導後に、細胞においてベクターの機能が消失される。ベクターの機能の消失には、例えば、該ベクター中の上記複数の核初期化因子をコードするＤＮＡの発現を不能にすること、該ベクターを含む細胞を破壊すること、あるいは該ベクターを脱落させることが含まれる。
ベクター中の上記ＤＮＡの発現を不能にするために、該ベクターは体細胞特異的な発現制御領域を含むことができる。これによって体細胞の核初期化に伴い上記核初期化因子をコードするＤＮＡを発現する能力を喪失させることが可能になる。体細胞特異的な発現制御領域は、例えば、プロテオグリカン遺伝子（例えばルミカンおよびデコリン）の各エンハンサー／プロモーター領域、インスリン成長因子結合タンパク質３および７遺伝子の各エンハンサー／プロモーター領域、コラーゲンファミリータイプＩα２、ＩＩＩα１およびＶＩα３遺伝子の各エンハンサー／プロモーター領域などである（Ｓ．Ａｓｓｏｕら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２５：９６１−９７３（２００７））。上記例示の発現制御領域は、線維芽細胞特異的であり、胚性幹（ＥＳ）細胞では機能しないことが知られている。そのため、ベクター中の核初期化因子をコードするＤＮＡの発現制御領域を体細胞特異的とすることによって、ｉＰＳ細胞への変換後には、それが未分化細胞であるために、該ＤＮＡの発現が不能になる。
あるいは、ベクターを含む細胞の破壊のために、該ベクターはチミジンキナーゼをコードするＤＮＡを含むことができる。これによってｉＰＳ細胞の誘導後、シクロビル、ガンシクロビル、またはそれらと同等の機能をもつ化合物の存在下で該チミジンキナーゼを発現する細胞を破壊することができる。チミジンキナーゼの好適例は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）である。シクロビル、ガンシクロビル、またはそれらと同等の機能をもつ化合物は、発現されたチミジンキナーゼによって細胞傷害性物質に変換されるため、チミジンキナーゼ発現細胞が破壊される。しかし、本発明の方法では、０．０１％〜０．００１％の割合（概ね齧歯類細胞で０．０１％、霊長類細胞で０．００１％）でベクターが脱落した細胞が生成する。そのため、ベクターを含む細胞のみを破壊することによって、ベクター不含有の高増殖性ｉＰＳ細胞のみを残すことができる。ここで、「同等の機能」とは、本来細胞傷害性でない化合物が、チミジンキナーゼ酵素の作用によって細胞傷害性物質に変換されることを意味する。
あるいは、ベクターの脱落のために、該ベクターは、哺乳類セントロメアを含み、該セントロメアのＣＥＮＰ−Ｂ  ｂｏｘがＤＮＡ結合タンパク質認識配列によって置換されている。これによって、ＤＮＡ結合タンパク質の存在下で染色体凝縮が阻害され、人工染色体の脱落が起こる。これは、セントロメア上のＤＮＡ結合タンパク質認識配列にＤＮＡ結合タンパク質が結合し、これによって染色体凝縮が阻害されることによる。ＤＮＡ結合タンパク質認識配列の例は、テトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）（Ｍ．Ｎａｋａｎｏら，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  １４（４）：５０７−５２２（２００８））、エクジソン応答配列（Ｄ．Ｎｏら，ＰＮＡＳ  ９３：３３４６−３３５１（１９９６）、タモキシフェン特異的エストロゲンレセプター変異体応答配列（ＰＳ．Ｄａｎｉｅｌｉａｎら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７：２３２−２４０（１９９３））などである。
２．ｉＰＳ細胞の作製
最初に、上記ベクターを哺乳動物由来の体細胞に作用することによってｉＰＳ細胞を誘導する。このとき、該ベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれないことを特徴とする。従来、体細胞からｉＰＳ細胞を誘導するとき、核初期化因子をコードするＤＮＡを発現するためにレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが主に使用されてきたが、該ＤＮＡがゲノムに組み込まれることが指摘されてきた。そのため、ｉＰＳ細胞において核初期化因子がサイレンシングされる割合が低い（例えば４因子で誘導する場合、ｉＰＳコロニー数は全コロニー数の１０％未満である。非ｉＰＳ細胞群の約５０％はサイレンシングが不十分であると考えられる（Ｍ．Ｎａｋａｇａｗａら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１−１０６（２００８）；Ｍ．Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２：２３０−２４０（２００８）））こと、腫瘍形成などの危険性があることなどが問題となっている。本発明のベクターは、少なくとも細胞ゲノムに組み込まれることがないという点で上記の問題を回避できる可能性をもたらす。実際、本発明の方法によってｉＰＳ細胞中のベクターの機能を消失させるときには、後述の実施例２で例証されるように、４因子ＨＡＣ上の核初期化因子がサイレンシングされた割合は２クローン中、２クローン（すなわち、１００％）であった。
本発明の方法で使用される体細胞は、成体および胎児性体細胞のいずれでもよいが、例えば核初期化因子がＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４の組み合わせ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の組み合わせ、Ｏｃｔ３／４およびＫｌｆ４の組み合わせ、などの場合には成体の体細胞であっても初期化されうる。成体の体細胞で使用可能な核初期化因子は、その適用範囲が広いため、本発明では特に好ましい。本発明で使用可能な核初期化因子の組み合わせは上で例示したとおりである。
体細胞は、哺乳動物において生殖細胞およびＥＳ細胞以外の細胞を指し、以下のものに制限されないが、ヒトを含む哺乳動物由来のあらゆる組織や器官由来の細胞を含み、例えば皮膚細胞、臓器細胞（例えば肝細胞、胃細胞、腎細胞、膵細胞、脳細胞、肺細胞、脾細胞、腸細胞など）、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、筋細胞、線維芽細胞、リンパ球、骨細胞などが挙げられる。細胞はまた、初代培養細胞、継代細胞、株化細胞、前駆細胞、幹細胞などを例示的に含む。これらの細胞の培養条件は、文献等に記載された公知の条件を利用できる。
体細胞からｉＰＳ細胞を誘導するときには、体細胞へのベクターの導入は、当業界で公知のいずれの方法でも可能であり、そのような方法の例は、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、微小核細胞融合法などである。
リポフェクション法は、リポフェクタミンなどのカチオン性リポソーム内に上記ベクターを封入し、得られたリポソームを体細胞と融合させ、これによって上記ベクターを体細胞内に導入することを含む。細胞は、通常、その表面がアニオン性となっているため、カチオン性リポソームを引き寄せる。リポソームとして、糖、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの分子で修飾したリポソームも知られており、本発明の方法で利用しうる。
エレクトロポレーション法は、上記ベクターおよび体細胞を含む懸濁液に電気パルスをかけることによって細胞膜に微小な孔を開け、ベクターを細胞の中に導入することを含む。
微小核細胞融合法は、上記ベクターを含みかつ微小核形成能を有する哺乳動物細胞（例えばマウスＡ９細胞（ＡＴＣＣ  ＶＡ２０１１０−２２０９））を倍数体誘発剤（例えばコルセミド、コルヒチンなど）で処理して微小核多核細胞を形成し、次いで、サイトカラシン処理により微小核体を形成し、遠心分離等で回収し、得られた微小核体を体細胞と融合させ、これによって上記ベクターを体細胞内に導入することを含む。
上記ベクターを導入した体細胞を、ｉＰＳ細胞に誘導可能な培養条件を用いる培養にかける。例示的には、マイトマイシンＣ処理したマウス胎仔線維芽細胞株（例えばＳＴＯ）をフィーダー細胞とし、このフィーダー細胞層上でＥＳ細胞用培地を用いて、ベクター導入体細胞（約１０４〜１０５細胞／ｃｍ２）を約３７℃の温度で培養する。フィーダー細胞は必ずしも必要ではない（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ら，Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２（２００７））。基本培地は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ−１２培地、それらの混合培地などである。ＥＳ細胞用培地は、マウスＥＳ細胞用培地、霊長類ＥＳ細胞用培地などを使用することができる（特開２００３−１１６５２７；リプロセル社製（日本））。特にヒトｉＰＳ細胞の誘導および継代の場合には、霊長類ＥＳ細胞用培地が好ましく使用できる。培養培地は、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）混合培地に２−メルカプトエタノール、ＥＳＧＲＯ（白血球阻害因子）、１０〜１５％ＦＣＳ（牛胎仔血清）、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）などを任意に組み合わせて補充した培地であり、継代用培地は、例えば、２０％ＫＳＲ（ノックアウト血清リプレースメント；ＧＩＢＣＯ社製）、１ｍＭＣａＣｌ２、０．２５％トリプシンを含むＰＢＳ、または１ｍｇ／ｍｌＩＶ型コラゲナーゼを含むＤＭＥＭなどである（特開２００３−１１６５２７）。
培養の間に培地交換、トリプシン剥離、フィーダー細胞層上での継代培養を行いながら、培養開始後約３〜４週間又はそれ以上でｉＰＳ細胞コロニーが出現する。本発明の方法で作製された細胞は、未分化マーカーであるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、アルカリフォスファターゼ遺伝子などを発現すること、奇形腫を形成することなどから、目的のｉＰＳ細胞としての特徴を有する。この細胞はさらに、導入したベクターが宿主染色体と独立して存在するという特徴を有する。
上記方法によって中間段階で得られる、人工染色体を含むｉＰＳ細胞、およびその誘導方法も本発明の範囲に包含されるものとする。すなわち、本発明はさらに、哺乳動物由来の体細胞から、１もしくは複数の核初期化因子をコードするＤＮＡの複数コピーを含む発現ベクターを使用してｉＰＳ細胞を誘導する方法において、該発現ベクターが該体細胞の内在ゲノムに挿入されない人工染色体であり、該方法が、該人工染色体を該体細胞に導入してｉＰＳ細胞を誘導することを含む、該人工染色体を含むｉＰＳ細胞の誘導方法を提供する。
上記誘導方法で使用される人工染色体は、上記例示のものであるが、好ましくは哺乳類人工染色体、より好ましくはヒト人工染色体である。また、核初期化因子は少なくともＯｃｔ３／４を含み、該核初期化因子はさらに、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃからなる群から選択される１もしくは複数の因子、ＮａｎｏｇとＬｉｎ２８からなる因子などを含むことができる。
本発明はさらに、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃを含む核初期化因子をコードするＤＮＡ、あるいはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４を含む核初期化因子をコードするＤＮＡ、の複数コピーを含むヒト人工染色体を提供する。
ヒト人工染色体上の核初期化因子をコードするＤＮＡの順序は任意であり、適切な発現制御配列を含み、適切なインスレーター配列を配置することによって互いのＤＮＡの発現を妨害しないようにすべきである。また、人工染色体には、上記のような選択マーカーを含むことが望ましいし、さらには、ｉＰＳ細胞の誘導後に該ＤＮＡの発現を不能にするための、（ａ）体細胞特異的な発現制御配列の挿入、（ｂ）チミジンキナーゼをコードするＤＮＡの挿入、および／または（ｃ）セントロメア上のＣＥＮＰ−Ｂ  ｂｏｘのＤＮＡ結合タンパク質認識配列による置換を含むことができる。そのようなヒト人工染色体の例は、図３に記載のような構造を有する人工染色体（ここで、マウス由来の核初期化因子をコードするＤＮＡは、ヒトなどの他の哺乳動物由来のものに置き換えることができる。）であり、これは２１ＨＡＣベクターをベースにしたｉＰＳ細胞誘導用の新規の人工染色体であり、本発明に含まれるものとする。
３．ｉＰＳ細胞における核初期化因子をコードするＤＮＡの発現の不能化
本発明方法はさらに、上記のように誘導されたｉＰＳ細胞からベクターを除去するか、または該ベクターの機能を不能にする工程を含む。これによって核初期化因子をコードするＤＮＡの発現が不能にされたｉＰＳ細胞が得られる。
第１の手法では、核初期化因子をコードするＤＮＡの発現を制御する配列を、体細胞特異的な発現制御配列とすることによって、ｉＰＳ細胞の誘導後には、核初期化因子をコードするＤＮＡの発現が不能になる。上記のとおり、体細胞特異的な発現制御領域は知られているので、この領域（エンハンサー／プロモーター領域）を本発明に応用することによって、目的の発現制御が可能になる。
この手法で核初期化因子の機能を消失させることができるが、ｉＰＳ細胞から作製されうる種々の分化細胞や組織では、体細胞特異的な発現制御が目覚めて、核初期化因子による影響が生じる可能性が全くないという保証はないかもしれない。そこで、好ましくは、ｉＰＳ細胞からベクターを完全に除去することが望ましい。そのための手法の例が、以下の第２および第３の手法である。
第２の手法では、シクロビル、ガンシクロビル、またはそれらと同等の機能をもつ化合物の存在下でチミジンキナーゼを発現させると、これらの物質がチミジンキナーゼによって細胞傷害性物質に変換されるため、これによってベクターを含む細胞が破壊される。この手法が本発明で有用であるのは、誘導されたｉＰＳ細胞のうち０．０１％〜０．００１％の割合でベクターが脱落した細胞が生成することに基づく。この現象を利用して、誘導されたｉＰＳ細胞クローンのサブクローニングによってベクターの脱落を生じさせ、さらに、ベクター含有ｉＰＳ細胞とベクター不含有ｉＰＳ細胞が混在する場合、例えば、チミジンキナーゼ／シクロビルもしくはガンシクロビル系でベクターを含む細胞のみを破壊すると、ベクター不含有ｉＰＳ細胞のみが選択的に残存するため、ｉＰＳ細胞の高増殖能を利用して目的の細胞のみを増殖することが可能である。このようにベクターを含まない生きたｉＰＳ細胞を増殖し、必要であれば破壊した細胞から遠心分離等により目的の細胞を分離し精製することができる。
第３の手法は、ベクター、特にヒト人工染色体においてセントロメアのＣＥＮＰ−Ｂ  ｂｏｘをＤＮＡ結合タンパク質認識配列によって置換することによって、ＤＮＡ結合タンパク質の存在下で染色体凝縮を阻害し、人工染色体を脱落させることを含む。ＤＮＡ結合タンパク質認識配列は、具体的には転写活性化因子又は転写抑制因子の標的配列であり、ＤＮＡ結合タンパク質はそれぞれに特異的なリガンド依存的に標的配列に結合する。セントロメアの特定の部位、すなわちＣＥＮＰ−Ｂ  ｂｏｘをこのような因子で置換することによってセントロメアが不活性化され、その機能が消失する（（Ｍ．Ｎａｋａｎｏら，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  １４（４）：５０７−５２２（２００８））。染色体凝縮、すなわち染色体の正常な分配が阻害された人工染色体は、娘細胞に受け継がれないため、娘細胞には人工染色体が含まれない。このような細胞を脱落した細胞という。すなわち、ｉＰＳ細胞誘導後、ＤＮＡ結合タンパク質認識配列と結合可能なＤＮＡ結合タンパク質を活性化するリガンドを培地に添加することによって、セントロメアを不活性化し、人工染色体を脱落させる。ＤＮＡ結合タンパク質認識配列の例は、ｔｅｔＯ、エクジソン応答配列、エストロジェンレセプター変異体応答配列などであり、それらに対応するＤＮＡ結合タンパク質の例はそれぞれ、テトラサイクリンリプレッサー／ＶＰ１６複合体、エクジソン／グルココルチコイド・キメラ受容体、エストロジェンレセプター変異体などである。
このように、本発明によれば、外来的に導入された核初期化因子の発現が不能にされた哺乳動物由来のｉＰＳ細胞の作製のために、体細胞の中では高発現を持続し初期化に伴い外来遺伝子発現を不能にするゲノム非挿入型ベクターの発現制御系、ならびに、初期化に伴いゲノム非挿入型ベクターを除去するベクター消失系を利用することによって達成可能である。
作製されたｉＰＳ細胞は、体細胞の初期化のために使用された核初期化因子の発現が不能にされている、好ましくは、該核初期化因子を全く含まないが、ｉＰＳ細胞本来の染色体は無傷で維持されていることを特徴とする。
このようなｉＰＳ細胞は、哺乳動物の体細胞から誘導されるが、哺乳動物は、ｉＰＳ細胞を誘導することができる限り限定されないものとし、例えば霊長類（例えばヒト、サル、チンパンジーなど）、げっ歯類（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスターなど）、ペット動物（例えばイヌ、ネコなど）、有蹄類（例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなど）などを含み、好ましい哺乳動物はヒトである。
上記の方法で作製されたｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と同様に、あらゆる体細胞やその前駆細胞へ分化誘導する性質を有しているため、再生医療に応用可能であるし、あるいは、遺伝子改変した、または未改変の、ｉＰＳ細胞を胚盤胞（もしくは８細胞期胚）に導入し、仮親非ヒト哺乳動物の子宮や卵管に移植してトランスジェニック動物を作出し、疾患モデル動物として病因の解明、治療法の発見など医学分野のために、また、家畜などの有用クローン動物の作出、品種改良などの農業分野のためなどに、使用可能である。
【実施例】
【００１０】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって制限されないものとする。
実施例１
（初期化因子発現ベクター（ＰＡＣ−ＫＭＳＯ）の作製）
ＰＡＣ−ＫＭＳＯの作製は大別して２つのステップに別れる。即ち、ｐＵＣ系プラスミドへ各因子（マウス由来の、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４）の発現ユニット（１コピーまたは２コピー初期化因子含有）を挿入するステップと、こうして作製した各々の発現ユニットをインスレーターで挟みＰＡＣベクターへ挿入・連結するステップである。以下に各ステップについて説明する。
ｐＵＣ系プラスミドへの発現ユニットの挿入
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（スタラタジーン）にチキンβグロビンＨＳ４由来インスレーター断片１．２ｋｂ（ＪＨ．Ｃｈｕｎｇら  Ｃｅｌｌ  ７４：５０５−５１４（１９９３））を２コピータンデムに挿入し、その下流に更に発現ユニットを挿入した。この際、発現ユニットとしては、サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、およびウサギβ−グロビンのスプライシングアクセプターからなるハイブリットプロモーター（ＣＡＧプロモーター）（特開平３−１６８０８７）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列のセット、あるいはモロニー白血病ウイルスのＬＴＲ配列のセット、いずれかを用いた。４種の初期化因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４）の組み合わせ（但し、本実施例では、これらの因子の組み合わせは単に例示を目的としたものであり、実施例に記載された手法は、他の初期化因子の組み合わせ、例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の組み合わせ、Ｏｃｔ３／４およびＫｌｆ４の組み合わせ、その他の初期化因子の組み合わせなどにも同様に適用可能である。）については、それぞれ個別に発現ユニットに挿入するか、ピコルナウイルス由来ＩＲＥＳ配列や２Ａ配列を用いてシストロニックに発現ユニットに挿入した。ＰＡＣベクターへの挿入の為にＡｓｃＩ、ＮｈｅＩ、ＳｐｅＩ、ＡｖｒＩＩ、ＦｓｅＩなどの制限酵素サイトを付加した。
１コピー初期化因子発現ユニットのＰＡＣベクターへの挿入および連結
ＰＡＣベクターはｐＰＡＣ４を用いた。ＢｓｔＩＩ制限酵素サイトを平滑化し、新たにｌｏｘＰ配列、ＨＰＲＴエクソン３〜エクソン９までの断片を挿入した。その際に、発現ユニットを挿入するためのサイトとしてＦｓｅＩサイトを付加した。ＰＡＣ−ＫＭＳＯ構築（図１）の場合は、まずＯｃｔ３／４発現ユニットのポリＡ配列の下流のＡｖｒＩＩサイト、ＦｓｅＩサイトに（１）で述べたチキンＨＳ４断片２コピーを再度導入し、発現ユニットをＡｓｃＩ、ＦｓｅＩで切り出した後、改変したＰＡＣベクターのＡｓｃＩ、ＦｓｅＩ断片とライゲーションすることにより、ＰＡＣベクターにＯｃｔ３／４発現ユニットを組み込んだ。このベクター中のＡｓｃＩサイト、ＮｈｅＩサイトに、次のＳｏｘ２発現ユニットのＡｓｃＩ、ＡｖｒＩＩ切断断片を挿入した。ＮｈｅＩ切断端とＡｖｒＩＩ切断端は相補性があるためライゲーション可能であった。これを繰り返すことにより、このＰＡＣベクターに、ＨＳ４インスレーターに挟まれたＫｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４の各発現ユニットをタンデムに構築した。
２コピー初期化因子発現ユニットをもつＰＡＣベクターの作製
ＰＡＣ−ＫＭＳＯベクターのＡｓｃＩ、ＡｖｒＩＩ切断断片を、ＰＡＣ−ＫＭＳＯベクターのＡｓｃＩサイト、ＮｈｅＩサイトに挿入することにより、上記と同様に作製された初期化因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４）の発現ユニットをそれぞれ２コピーずつもつ（すなわち、２つの該発現ユニットがタンデムに連結された）ＰＡＣベクター２ＣＡＧ−ＫＭＳＯ（図１２中の挿入体）を作製した。
実施例２
（初期化因子ＨＡＣベクターの作製）
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターとしてはヒト２１番染色体由来の内在遺伝子を含まないヒト人工染色体ベクター（特開２００７−２９５８６０）を用いた。この２１ＨＡＣベクターには外来遺伝子挿入部位としてのｌｏｘＰ配列と組換え挿入体選別の為のＨＰＲＴエクソン１〜エクソン２までのゲノム断片の他にＥＧＦＰ遺伝子が組み込んであり、２１ＨＡＣベクターを保持する細胞を緑色蛍光でモニター出来るように工夫してある（図２）。２１ＨＡＣベクターのｌｏｘＰ配列部位に上記のＰＡＣ−ＫＭＳＯまたは２ＣＡＧ−ＫＭＳＯベクター由来の初期化因子発現ユニットを挿入した（図３および図１２）。このとき、ｌｏｘＰ配列での部位特異的組換え挿入体の選別はＨＰＲＴ遺伝子の再構築によるＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）耐性の獲得を指標とした。また、ＨＰＲＴ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞ＣＨＯ／ＨＧＰＲＴ株（ＪＣＲＢ０２１８）を２１ＨＡＣベクターの供与細胞として用いた。
ＰＡＣ−ＫＭＳＯのトランスフェクションと組換え挿入体の単離
２１ＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ／ＨＧＰＲＴ株（以下ＣＨＯ−２１ＨＡＣ）をトリプシン処理し、５×１０６細胞を０．８ｍｌの生理食塩水含有リン酸バッファー（ＰＢＳ）に懸濁した。３０μｇの実施例１で作製した初期化４因子発現ベクターＰＡＣ−ＫＭＳＯと２μｇのＣｒｅ組換え酵素発現ベクターＰＢＳ１８５（ライフテック）存在下でジーンパルサー（バイオラッド社）を用いてエレクトロポレーションを行った。容量５００μＦのコンデンサに４５０Ｖで印加し、電極間距離４ｍｍのエレクロポレーションキュベットを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を１０％ＦＣＳ添加したＦ１２培地に懸濁し、φ１００ｍｍディッシュ５枚に播種した。２日後に１×ＨＡＴを含む培地に置き換え、以後週２回ＨＡＴ培地で培地交換した。２〜３週間後には耐性コロニーが出現し、その頻度はＣＨＯ−２１ＨＡＣ細胞５×１０６個あたり１５個であった。クローニングシリンジを用いて耐性コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
組換え挿入体の確認
ｌｏｘＰ配列部位特異的組換え挿入体を確認するため、ｌｏｘＰ配列部位を挟むように２１ＨＡＣベクター上及びＰＡＣ−ＫＭＳＯベクター上にプライマーを設計し、ゲノムＰＣＲ増幅を行った。以下にＰＣＲ増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列を示す。
2010038904.tif 000003
これらのプライマーはプラスミドベクターｐＫＯ  ＳｅｌｅｃｔＨＰＲＴ（タカラバイオ）の塩基配列を基にして設計した。
ｌｏｘＰ配列部位特異的組換え挿入体においてのみ約４００ｂｐの増幅産物が得られる。その結果、１５クローン全てにおいて予想される増幅が検出され、全てがｌｏｘＰ配列への部位特異的組換え挿入体であることが確認された。
次に、これら１５クローンの中からランダムに６クローンを選出し、ＦＩＳＨ解析を行った。ヒト特異的反復配列からなるｃｏｔ１  ＤＮＡ（ｈｃｏｔ１、ロシュ社）をローダミン標識プローブとして用いて上記組換え挿入体を解析することにより、ヒト２１番染色体由来の２１ＨＡＣベクターの存在を確認した。解析した６クローン全てで、２１ＨＡＣベクターが検出され、各クローンにおける２１ＨＡＣベクターの保持率は８２〜９９％であった。結果を表１に示す。
【表１】
2010038904.tif 000004
図４にクローンＫＭＳＯ１０のＦＩＳＨ像を示した。ローダミン標識ｈｃｏｔＩに加えて、ＦＩＴＣ標識ＰＡＣ−ＫＭＳＯをプローブとした２カラーＦＩＳＨを行った。その結果、ＣＨＯ細胞の染色体とは独立した１コピーの２１ＨＡＣベクターが検出された。さらに緑色蛍光像は２１ＨＡＣベクターに由来する赤色蛍光像の上のみに観察され、ＰＡＣ−ＫＭＳＯはｌｏｘＰ配列を介して２１ＨＡＣベクターにのみ挿入されていることが確認された。
２１ＨＡＣベクターに挿入された初期化因子の発現
単離したＨＡＴ耐性クローンのうちＦＩＳＨ解析で１コピーの２１ＨＡＣベクター保持率が高かったＫＭＳＯ１０、ＫＭＳＯ１３について、挿入した４因子すなわちＫｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。対照としてＣＨＯ−２１ＨＡＣ細胞を用いた。その結果を図５に示したが、２クローンとも全ての導入遺伝子の発現が確認されたのに対して、４因子が挿入されていないＣＨＯ−２１ＨＡＣ細胞ではいずれの遺伝子の発現も認められなかった。
以上の結果から、ｌｏｘＰ配列を介して初期化４因子が挿入された２１ＨＡＣベクター（以下２１ＨＡＣ−ＫＭＳＯ）を保持するＣＨＯ細胞において、挿入された４因子の発現が確認された。
２ＣＡＧ−ＫＭＳＯのトランスフェクションと組換え体の単離
上記の方法と同様にして、２１ＨＡＣ−２ＣＡＧ−ＫＭＳＯベクター（図１２）によるＣＨＯ細胞の組換え体クローンの単離と、組換え挿入体の、上記と同様のＦＩＳＨ法による確認を行った。
ＦＩＳＨ解析の結果を表２に示す。
【表２】
2010038904.tif 000005
２１ＨＡＣベクターに挿入された初期化因子の発現
単離したＨＡＴ耐性クローンは全て、ＦＩＳＨ解析では１コピーの２１ＨＡＣベクター保持率が高かった。そこで、挿入した４因子すなわちＫｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法により比較した。対照としてＫＭＳＯ１０細胞を用いた。その結果を図１３に示したが、２ＣＡＧ０７、２ＣＡＧ１５においてＫＭＳＯ１０に比べて導入遺伝子の高い発現が確認された。
以上の結果から、各々２コピーの初期化４因子が挿入された２１ＨＡＣベクター（２１ＨＡＣ−２ＣＡＧ−ＫＭＳＯ）（図１２）を保持するＣＨＯ細胞においては、各々１コピーの初期化４因子が挿入された２１ＨＡＣ−ＫＭＳＯを保持するＣＨＯ細胞に比べて、挿入された４因子の発現が高いことが確認された。
実施例３
（ＰＡＣ−ＫＭＳＯによるＭＥＦの初期化）
ＰＡＣ−ＫＭＳＯを環状プラスミドの状態で２１ＨＡＣベクターを保持するＭＥＦに導入し、ＭＥＦが初期化されるか検討した。
微小核細胞融合法による２１ＨＡＣベクターのＭＥＦへの導入
染色体供与細胞として、２１ＨＡＣベクターを保持するＣＨＯ細胞ｋｋｐｑ２−１２株を用いた。ここで用いた２１ＨＡＣベクターは実施例２で用いたベクターと同じ構造であるが、ＥＧＦＰ遺伝子は挿入されていない。２５ｃｍ２遠心用培養フラスコ（ヌンク社）２４本にｋｋｐｑ２−１２細胞を播種し、５０〜６０％細胞密度まで培養した後、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを含む２０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地で３日間培養することにより微小核を形成させた。微小核を回収するために、コルセミド含有培地を吸引除去後、１０μｇ／ｍｌのサイトカラシンを含むＦ１２培地をフラスコ一杯に充填し、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心分離を行った。微小核の沈殿を血清無添加のＤＭＥＭに縣濁し、ポアサイズ８μｍ、５μｍ、３μｍのフィルター（ワットマン社）を用いて濾過精製した。精製した微小核の縣濁液に、最終濃度１００μｇ／ｍｌになるようにフィトヘムアグルチニンＰを加えた。予めφ１００ｍｍディッシュに９０％細胞密度まで培養したＭＥＦ（ネオマイシン耐性）を染色体受容細胞とした。培養液を除いた後、微小核縣濁液を加え、３７℃にて１５分間静置した。ＭＥＦに吸着しなかった微小核を吸引除去した後、４５％ＰＥＧ１５００（ロシュ社）／１０％ＤＭＳＯの混液を細胞表面に静かに加え、１分間反応させ、微小核とＭＥＦを融合させた。ＰＥＧ／ＤＭＳＯの混液を洗浄除去した後、１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ培地で１日間培養した。
ＰＡＣ−ＫＭＳＯのトランスフェクション
微小核細胞融合の翌日、５０μｇのＰＡＣ−ＫＭＳＯと１０μｇのＣｒｅ発現ベクターを混合し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社）を用いて、リポフェクション法でトランスフェクションを行った。
ｉＰＳ様細胞のクローニング
トランスフェクションして一晩培養後、ＭＥＦをトリプシン処理し、１０％ＦＣＳ添加したＤＭＥＭ培地に懸濁した後、マイトマイシンＣ処理したＳＴＯ細胞をフィーダー細胞とするφ１００ｍｍディッシュ５枚に播き直した。２日後、標準的なＥＳ細胞用培地に交換し、以後２日に一回の割合で同培地で培地交換した。トランスフェクション２３日後に、ＥＳ細胞様の形態を示すコロニー１つを実体顕微鏡を用いて単離し、増殖させ、クローンとして樹立した（クローン＃１）。図６にクローン＃１の形態を示した。
クローン＃１はＥＳ細胞と同様の形態を示し、長期継代が可能であった。
以上の実験より、２１ＨＡＣベクターを保持するＭＥＦにプラスミドＰＡＣ−ＫＡＭＳＯをトランスフェクションすることによりｉＰＳ細胞の誘導が可能なことが確かめられた。
実施例４
（ＨＡＣ−ＫＭＳＯによるＭＥＦの初期化）
微小核細胞融合及びｉＰＳ様細胞のクローニング
染色体供与細胞として、実施例２で得られたクローンＫＭＳＯ１０細胞を用いた。ＫＭＳＯ１０細胞をＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ培地に交換して継代培養後、最終的に８μｇ／ｍｌのブラシトシジンを含む１０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地で培養した。２５ｃｍ２遠心用培養フラスコ（ヌンク）２４本にＫＭＳＯ１０細胞を播種し、５０〜６０％細胞密度まで培養した後、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを含む２０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地で３日間培養することにより微小核を形成させた。微小核を回収するために、コルセミド含有培地を吸引除去後、１０μｇ／ｍｌのサイトカラシンを含むＦ１２培地をフラスコ一杯に充填し、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心分離を行った。微小核の沈殿を血清無添加のＤＭＥＭに懸濁し、ポアサイズ８μｍ、５μｍ、３μｍのフィルター（ワットマン）を用いて濾過精製した。精製した微小核の懸濁液に、最終濃度１００μｇ／ｍｌになるようにフィトヘムアグルチニンＰを加えた。予めφ１００ｍｍディッシュに９０％細胞密度まで培養したＭＥＦ（ネオマイシン耐性）を染色体受容細胞とした。培養液を除いた後、微小核懸濁液を加え、３７℃にて１５分間静置した。ＭＥＦに吸着しなかった微小核を吸引除去した後、４５％ＰＥＧ１５００（ロシュ）／１０％ＤＭＳＯの混液を細胞表面に静かに加え、１分間反応させ、微小核とＭＥＦを融合させた。ＰＥＧ／ＤＭＳＯの混液を洗浄除去した後、１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ培地で２日間培養した。その後、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（インビトロジェン）を含む培地に交換し、１２日後にトリプシン処理により剥離し、マイトマイシンＣ処理したＳＴＯ細胞をフィーダー細胞とするφ１００ｍｍディッシュ３枚に播き直した。翌日、標準的なＥＳ細胞用培地に交換し、以後２日に一回の割合で同培地で培地交換した。微小核融合後２６日目に、ＥＳ細胞様の形態を示すコロニー２つを実体顕微鏡を用いて単離し、増殖させ、クローンハして樹立した（クローンＫＭ１０−１、ＫＭ１０−２）。図７にクローンの形態（初期化因子導入後３６日）を示した。２１ＨＡＣ−ＫＭＳＯ上にはＥＧＦＰ遺伝子が組込んであるので、２１ＨＡＣ−ＫＭＳＯを保持する細胞は緑色蛍光を示すが、実際、ＫＭ１０−１、ＫＭ１０−２は緑色蛍光を発していた。
ＫＭ１０−１、ＫＭ１０−２はＥＳ細胞と同様に長期継代が可能であった。継代の過程で、ＥＳ細胞様の形態を維持している細胞をさらにサブクローニングし、ＫＭ１０−１ｓ、ＫＭ１０−１ｓ３、ＫＭ１０−２ｓ、ＫＭ１０−２ｓ３を獲得した。
移入染色体の確認
得られた２クローンについて、実施例２に示したローダミン標識ｈｃｏｔＩプローブを用いてＦＩＳＨ解析を行った。結果を表２に示す。ＫＭ１０−１、ＫＭ１０−２とも２１ＨＡＣベクターの移入が確認され、２１ＨＡＣベクターの保持率は間期核においてそれぞれ９６％、８７％であった。また、いずれのクローンにおいても２コピーの２１ＨＡＣベクターを保持する細胞が半数以上であった。分裂像の観察の結果、ＫＭ１０−１では２１ＨＡＣベクターは宿主染色体に独立して維持されていた（図８）。一方、ＫＭ１０−２では多くの細胞で、宿主染色体に転座していた。
【表３】
2010038904.tif 000006
実施例２と同様に、ローダミン標識ｈｃｏｔＩプローブとＦＩＴＣ標識ＰＡＣ−ＫＭＳＯプローブを用いた２カラーＦＩＳＨの代表的な分裂像を図８に示した。ＫＭ１０−１ではＰＡＣ−ＫＭＳＯが挿入された２１ＨＡＣベクターが２コピー、宿主染色体に独立して存在することが確認された。
以上の実験より、ＭＥＦより得られたｉＰＳ様クローンには、２１ＨＡＣ−ＫＭＳＯが保持されていることが確かめられた。
実施例５
（ｉＰＳ様細胞クローンの遺伝子発現パターン）
外来遺伝子の発現
実施例３及び実施例４で得られたｉＰＳ様クローン＃１、ＫＭ１０−１，ＫＭ１０−２のサブクローンについて、ＰＡＣ−ＫＭＳＯベクターあるいは２１ＨＡＣ−ＫＭＳＯベクターを介して導入された外来遺伝子（Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４）の発現をＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。外来遺伝子のポリＡ配列は全てウシ成長因子ポリＡ配列由来であるので、ＰＣＲ用プライマーの片側にはこの配列を用いた。以下に用いたプライマーの配列を示す。
2010038904.tif 000007
外来遺伝子のうち、Ｏｃｔ３／４の発現は全てのクローン、ｃ−Ｍｙｃの発現はＫＭ１０−１ｓ１を除いたクローンにおいて発現が認められたが、Ｋｌｆ４，Ｓｏｘ２の発現は逆にＫＭ１０−１ｓ１を除いたクローンで検出限界レベルまで発現は低下していた（図１０）。完全ではないが、外来遺伝子のサイレンシングが確認された。
次に内在性未分化マーカーであるＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１の発現を調べた。以下に用いたプライマーの配列を示す。
2010038904.tif 000008
2010038904.tif 000009
陽性対照として山中らのグループ（Ｏｋｉｔａ，Ｋ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４４８：３１３−７（２００７））が樹立したマウスｉＰＳ細胞クローン２０Ｄ−１７（ｍ−ｉＰＳ  ２０Ｄ−１７）、陰性対照としてＭＥＦを用いた。クローン＃１は全ての未分化マーカーが２０Ｄ−１７細胞と同程度発現していた。ＫＭ１０−１、ＫＭ１０−２については、サブクローンも含めて、Ｓｏｘ２は全てのクローンで発現誘導が認められ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｒｅｘ１についても弱いながら一部のクローンで発現誘導が認められた（図９）。
以上の結果からＥＳ細胞様形態に変化したクローン＃１、ＫＭ１０−１、ＫＭ１０−２では、導入した外来遺伝子がサイレンシングされ、内在性の未分化性マーカーの発現が誘導されており、ｉＰＳ細胞の特徴を有していることが確かめられた。
実施例６
（奇形腫形成）
実施例３で得られたクローン＃１をヌードマウスに移植し、分化多能性の指標である奇形腫を形成するか検証した。φ１００ｍｍディッシュに培養したクローン＃１をトリプシン処理により剥離後、ＥＳ細胞用培地に懸濁し、単一細胞懸濁液とした。１×１０７個／ｍｌになるように１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ培地で調整し、０．５ｍｌをヌードマウス下腿部に皮下移植した。１ヶ月後、形成された腫瘍槐を外科的に摘出し、１０％ホルマリン／ＰＢＳ中で固定した。切片作製後、ヘマトキシレンエオシン染色により腫瘍の組織型を解析した。結果を図１１に示す。外胚葉に由来する神経様細胞、内胚葉に由来する上皮性細胞からなる腺管構造、などが検出された。
以上の実験により、クローン＃１は分化多能性をもつことが示された。
上記の実験は、本発明方法を利用した、マウス由来の４つの核初期化因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ）によるマウス体細胞からのマウスｉＰＳ細胞の誘導例を示したが、ヒト体細胞からのヒトｉＰＳ細胞の誘導も、ヒト由来の３つおよび４つの核初期化因子（例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４；ならびにＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ）を用いて同様に行うことができる。
以下の実施例７、ならびに、参考実施例１および２には、上記の実施例に記載の方法で作製されたｉＰＳ細胞における核初期化因子の発現の不能化の例を示す。
実施例７
（２１ＨＡＣベクターが脱落したｉＰＳ細胞クローンの作製）
２１ＨＡＣ−２ＣＡＧ−ＫＭＳＯによるＭＥＦの初期化
染色体供与細胞として、２ＣＡＧＥ０５、２ＣＡＧＥ０７、２ＣＡＧＥ１５、２ＣＡＧＥ１７細胞を用いた。染色体供与細胞をＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ培地に交換して継代培養後、最終的に８μｇ／ｍｌのブラシトシジンを含む１０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地で培養した。２５ｃｍ２遠心用培養フラスコ（ヌンク社）２４本に供与細胞を播種し、５０〜６０％細胞密度まで培養した後、０．１μｇ／ｍｌコルセミドを含む２０％ＦＣＳ添加Ｆ１２培地で３日間培養することにより微小核を形成させた。微小核を回収するために、コルセミド含有培地を吸引除去後、１０μｇ／ｍｌのサイトカラシンを含むＦ１２培地をフラスコ一杯に充填し、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心分離を行った。微小核の沈殿を血清無添加のＤＭＥＭに縣濁し、ポアサイズ８μｍ、５μｍ、３μｍのフィルター（ワットマン社）を用いて濾過精製した。精製した微小核の縣濁液に、最終濃度１００μｇ／ｍｌになるようにフィトヘムアグルチニンＰを加えた。予めφ６０ｍｍディッシュ２枚に９０％細胞密度まで培養したＭＥＦを染色体受容細胞とした。培養液を除いた後、微小核縣濁液を加え、３７℃にて１５分間静置した。ＭＥＦに吸着しなかった微小核を吸引除去した後、４５％ＰＥＧ１５００（ロシュ社）／１０％ＤＭＳＯの混液を細胞表面に静かに加え、１分間反応させ、微小核とＭＥＦを融合させた。ＰＥＧ／ＤＭＳＯの混液を洗浄除去した後、１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ培地で培養した。翌日、トリプシン処理により剥離し、マイトマイシンＣ処理したＳＴＯ細胞をフィーダー細胞とするφ６０ｍｍディッシュ６枚に播き直した。４日後、標準的なＥＳ細胞用培地に交換し、以後２日に一回の割合で同培地で培地交換した。微小核融合後１４日目以降に、ＥＳ細胞様の形態を示すコロニー５つを実体顕微鏡を用いて単離し、増殖させ、クローンとして樹立した（クローン２ＣＡＧ７−１、２ＣＡＧ７−３、２ＣＡＧ７−４、２ＣＡＧ７−６、２ＣＡＧ５−６）。全てのクローンはＥＳ細胞と同様に長期継代が可能であった。継代の過程で、ＥＳ細胞様の形態を維持している細胞をさらにサブクローニングした。図１４にサブクローンの形態（初期化因子導入後１８日から２４日）を示した。
移入染色体脱落の確認
得られた各々のサブクローンについて、実施例２に示したローダミン標識ｈｃｏｔＩプローブを用いてＦＩＳＨ解析を行った。２ＣＡＧ７−３および２ＣＡＧ７−４のサブクローン（２ＣＡＧ７−３ｓ２、２ＣＡＧ７−４ｓ１）では２１ＨＡＣベクターの移入が確認された。一方、２ＣＡＧ７−１、２ＣＡＧ７−６、２ＣＡＧ５−６のサブクローン（２ＣＡＧ７−１ｓ１〜ｓ６、２ＣＡＧ７−６ｓ１、２ＣＡＧ５−６ｓ３）については２１ＨＡＣベクターに由来するｈｃｏｔＩプローブのシグナルは検出されなかった。サブクローニングの過程を通して、２１ＨＡＣベクターが脱落したクローンを獲得することができた。２ＣＡＧ７−４ｓ１、２ＣＡＧ７−６ｓ１および２ＣＡＧ５−６ｓ３のＦＩＳＨ像を図１５に示す。２ＣＡＧ７−４ｓ１および２ＣＡＧ７−６ｓ１は、細胞分裂の間期の状態であり、核は丸い形をしており、ＣＡＧ７−４ｓ１には２１ＨＡＣベクター（矢印）が残っているが、２ＣＡＧ７−６ｓ１には該ベクターが存在しない。２１ＨＡＣベクターをもつＣＡＧ７−４ｓ１は、後述のようにガンシクロビルで処理することによって選択的に除去される。２ＣＡＧ５−６ｓ３は、中期（メタフェーズ）の染色体像を示しており、分裂期であっても２１ＨＡＣベクターは存在していない。
ｉＰＳ様細胞クローンの遺伝子発現パターン
ｉＰＳ様細胞クローン２ＣＡＧ７−１、２ＣＡＧ７−４、２ＣＡＧ７−６について内在性未分化マーカーであるＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１の発現を実施例５と同様の方法で調べた。陽性対照として山中らのグループ（Ｏｋｉｔａ，Ｋ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４４８：３１３−７（２００７））が樹立したマウスｉＰＳ細胞クローン２０Ｄ−１７（ｍ−ｉＰＳ  ２０Ｄ−１７）およびマウスＥＳ細胞ＴＴ２−Ｆ、陰性対照としてＭＥＦを用いた。２ＣＡＧ７−１ｓ１、ｓ２、ｓ３、ｓ４、ｓ５、ｓ６および２ＣＡＧ７−４ｓ１では全ての未分化マーカーが２０Ｄ−１７細胞、ＴＴ２−Ｆ細胞と同じレベルで発現していた。２ＣＡＧ７−６ｓ１についてもＮａｎｏｇの発現は陽性対照と同じレベルであった。初期化因子の発現ユニット数を２倍に増やし、初期化因子の発現量を増強することにより、より完全な未分化状態をもたらすことに成功した（図１６）。
ガンシクロビルによる２１ＨＡＣベクター保持細胞の選択的除去
ｉＰＳ様クローンのうち２１ＨＡＣベクターを保持していた２ＣＡＧ７−４ｓ１を６μｇ／ｍｌガンシクロビル存在下で培養したところ、１週間後にガンシクロビル耐性コロニーを得た。耐性コロニーはＥＳ細胞様の形態を維持していた（図１７）。また、この処理により、たとえ２１ＨＡＣベクターが存在していても、２１ＨＡＣベクターが脱落した細胞を選択することができた。
参考実施例１
（ガンシクロビルによる２１ＨＡＣベクター保持細胞の選択的除去）
実施例４で得られたｉＰＳ様クローンを用いて、６μｇ／ｍｌでガンシクロビルを添加し（例えば、実施例４に記載のｉＰＳ細胞培養条件で）培養すると、約１週間後にはガンシクロビル耐性コロニーが得られる。耐性コロニー出現頻度は約１×１０５〜１０６個の細胞あたり１つの割合である。これらのコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行う。
ＦＩＳＨ解析
実施例２で用いたヒトｃｏｔＩ  ＤＮＡをプローブとしてＦＩＳＨ解析を行う。単離したコロニーでは全て２１ＨＡＣベクターは検出されない。また、導入したホスト細胞の染色体にも異常は観察されない。
サザン解析
単離したコロニーからゲノムＤＮＡを抽出し、５μｇのゲノムＤＮＡを制限酵素消化する。アガロースゲルを用いて電気泳動後、サザントランファーによりナイロン膜に転写する。ＰＡＣベクター断片あるいはトランスジーン断片をランダムプライム法により３２Ｐ−ｄＣＴＰラベルし、ハイブリダイズする。単離コロニーでは、ＰＡＣベクター断片からはシグナルが検出されず、トランスジーン断片からは、相当する内在性遺伝子ゲノムのシグナルのみが検出される。
このようにして、ｉＰＳ様クローンから２１ＨＡＣベクターが完全に除去されたことを確認する。
参考実施例２
（染色体凝縮阻害による２１ＨＡＣベクター保持細胞の選択的除去）
染色体凝縮を阻害し、２１ＨＡＣベクターを選択的に細胞から除去するため、ＣＥＮＰ−Ｂ  ｂｏｘ配列をエクジソン応答配列に置換した２１ＨＡＣベクターを作製する。エクジソンによる制御はテトラサイクリン制御に比較して、反応バックグラウンドが低く、迅速に応答することから、より効率よく２１ＨＡＣベクターが除去されるだろう。
２１アルフォイドＤＮＡベクターの改変
ヒト２１番染色体由来アルファサテライトＩ配列を１１個含む２１アルフォイドＤＮＡベクターｐ１１−４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄ２９７５０）を制限酵素ＥｃｏＲＩ消化し、アルファサテライトＩ配列２個を含む断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（ストラタジーン）のマルチクローニングサイトを改変したｐＢ６ベクターにサブクローニングする。アルファサテライトＩ配列２個のうち片方にはＣＥＮＰ−Ｂ  ｂｏｘ配列が存在する。ＣＥＮＰ−Ｂ  ｂｏｘ配列のないアルファサテライトＩ配列の一部をｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲによりエクジソン応答配列（ストラタジーン、ｐＥＧＳＨ）に置換する。
ｐＢ６ベクターのマルチクローニングサイトにあるＡｓｃＩ、ＮｈｅＩ、ＡｖｒＩＩの制限酵素を用いて、断片を切り出し、コンカテマーを作製する。ｐＢ６ベクターを用いて６４ｍｅｒまで作製した後、ｐＰＨ−ＢＳベクターを用いて、５１２ｍｅｒまで作製する。続いてゼオシン耐性遺伝子と約３ｋｂの２１ＨＡＣベクターとの相同配列（２１ＨＡＣベクターのセントロメア近傍の配列、例えばＡＬ１６３２０１またはＡＰ００１６５７）を連結させ、相同組換え用のベクターとする。ＡｓｃＩ、ＦｓｅＩで切断し、５１２ｍｅｒの改変アルファサテライトＩ断片を調製する。
２１ＨＡＣベクターの改変
２１ＨＡＣベクターを保持するＤＴ４０細胞に、上記５１２ｍｅｒの改変アルファサテライトＩ断片を導入する。１×１０７個のＤＴ４０細胞を０．５ｍｌのＲＰＭＩ培地に懸濁し、３０μｇのＤＮＡ存在下でジーンパルサーを用いてエレクトロポレーションを行う。容量２５μＦのコンデンサに５５０Ｖで印加、電極間距離４ｍｍのエレクトロポレーションキュベットを用いて放電する。エレクトロポレーションした細胞を１０％ＦＣＳ、１％トリ血清、０．１ｍＭ  ２−ＭＥを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、９６穴プレート２０枚に播種する。２４時間後に最終濃度５００μｇ／ｍｌとなるようにゼオシンを加え、２〜３週間後に耐性コロニーが出現する。薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、以下の解析を行う。
（１）ＦＩＳＨ解析
ｐＢ６ベクターにクローニングされた改変アルファサテライトＩをプローブとしてＦＩＳＨ解析を行う。アルファサテライトＩの一部が改変された２１ＨＡＣベクターが特異的に検出される。
（２）サザン解析
耐性コロニーよりゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ５μｇを制限酵素ＸｂａＩで消化し、パルスフィールドゲル電気泳動を行った後、ナイロン膜に転写する。ｐＢ３ベクターにクローニングされた改変アルファサテライトＩをプローブとして３２Ｐラベルする。耐性クローンでは約８０ｋｂのシグナルが検出される。
以上の解析により、セントロメア領域のＣＥＮＰ−Ｂ  ｂｏｘ近傍にエクジソン応答配列が挿入された２１ＨＡＣベクターが完成する。このようにして得られる改変２１ＨＡＣベクターを２１ＨＡＣ−Ｅｃｄベクターという。
ＣＨＯ細胞への２１ＨＡＣ−Ｅｃｄベクター移入
２１ＨＡＣ−Ｅｃｄベクターを保持するＤＴ４０細胞を染色体供与細胞として、微小核細胞融合法により、ＣＨＯ／ＨＧＰＲＴ細胞に２１ＨＡＣ−Ｅｃｄベクターを移入する。約１０９個のＤＴ４０細胞をコルセミド（０．０５μｇ／ｍｌ）を含む培養液で１３〜１８時間培養して微小核を誘導する。遠心分離により細胞を回収して無血清ＤＭＥＭに再懸濁し、予めポリＬ−リジンでコーティングした２５ｃｍ２遠心用培養フラスコ１２本に播種する。３７℃、１時間静置し細胞が付着した後培養液を除去し、１０μｇ／ｍｌのサイトカラシンを含むＤＭＥＭ培地をフラスコ一抔に充填する。以後、実施例４と同様の操作で微小核細胞を精製し、ＣＨＯ／ＨＧＰＲＴ細胞と融合させる。翌日、トリプシン処理により細胞を剥離し、φ１００ｍｍディッシュ５枚に播き直す。２４時間後にゼオシンを含む選択培地（１０％ＦＣＳ、Ｆ１２）で培養する。約２週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性コロニーを単離する（ＣＨＯ−２１ＨＡＣ−Ｅｃｄ）。ＦＩＳＨ解析（ローダミン標識ｈｃｏｔＩプローブ）により２１ＨＡＣ−Ｅｃｄベクターの存在を確認する。
２１ＨＡＣ−Ｅｃｄベクターの選択的除去の確認
ＣＨＯ−２１ＨＡＣ−Ｅｃｄ細胞に、合成エクジソン受容体発現ベクター（ｐＥＲＶ３、ストラタジーン）をリポフェクタミン２０００（インビトロジェン）により一過性に導入する。翌日、最終濃度１０μＭのエクジソン誘導体ポナステロンＡ（Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ  Ａ）を添加し、１週間培養する。更に６μｇ／ｍｌのガンシクロビルを添加した培地で１週間培養することにより、２１ＨＡＣ−Ｅｃｄベクターの脱落したクローンのみを選択的に得る。
２１ＨＡＣ−Ｅｃｄ−初期化因子ベクターの作製及びｉＰＳ細胞の作製
ＣＨＯ細胞においてポナステロンＡ添加により選択的な脱落が確認された２１ＨＡＣ−Ｅｃｄベクターに初期化４因子あるいは３因子を、実施例２と同様の方法で挿入する。作製できた２１ＨＡＣ−Ｅｃｄ−初期化因子ベクターを実施例３と同様に微小核細胞融合法により、ＭＥＦおよびヒト線維芽細胞に導入し、マウスｉＰＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞を作製する。ｉＰＳ細胞として単離できたクローンには、ＣＨＯ−２１ＨＡＣ−Ｅｃｄ細胞と同様に、合成エクジソン受容体発現ベクターをリポフェクションにより一過性に導入し、翌日より最終濃度１０μＭのエクジソン誘導体ポナステロンＡ（Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ  Ａ）で１週間培養する。更に６μｇ／ｍｌのガンシクロビルを添加した培地で１週間培養することにより、２１ＨＡＣ−Ｅｃｄベクターが脱落する、すなわち外来性遺伝子を全く持たないｉＰＳ細胞を同定する。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
本発明は、体細胞からｉＰＳ細胞を誘導するとき使用された核初期化因子の影響が排除された、好ましくは外来の核初期化因子を含まない、ｉＰＳ細胞を提供するものであり、ｉＰＳ細胞を再生医療に応用する際に格別にその安全性を向上させることに導くことができる。
【配列表フリーテキスト】
【００１２】
配列番号１〜１５  プライマー
配列番号１６      ＣＥＮＰ−Ｂボックス
［配列表］
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【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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