【事件の表示】
　特許第３０３０７１０号「固相免疫検定用哺乳類細胞の乾燥法及びその物品」の請求項１ないし１５、２５ないし３１に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３０３０７１０号の請求項１ないし１４、２４ないし３０に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　本件特許第３０３０７１０号の請求項１ないし３１に係る発明の出願は、平成１年（１９８９年）１１月２日（パリ条約による優先権主張、１９８８年１１月４日、米国）に出願され、その発明についての特許が平成１２年２月１０日に設定登録された。
　その後、請求項１ないし１５及び請求項２５ないし３１に係る発明の特許について、申立人本田匠政より特許異議の申立てがなされ、請求項１ないし１５及び請求項２５ないし３１に係る特許に対して取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１３年７月１３日に訂正請求がなされ、これに対して訂正拒絶理由通知がなされ、特許権者は平成１４年５月２０日付けで意見書及び手続補正書を提出している。
　
２．訂正の適否について
（１）訂正の内容
　平成１３年７月１３日付け訂正請求書による訂正の内容は、次のとおりである。
＜訂正事項＞
（あ）特許請求の範囲の請求項１中の「哺乳類細胞を固相支持体へ固定化する工程；」を、
「哺乳類細胞の抗原性を実質的に完全のままにして置きながら、該哺乳類細胞を固相支持体へ固定化する工程；
　前記固定化された細胞を溶解する工程；」
と訂正する。
（い）訂正前の請求項２を削除する。
（う）訂正前の請求項２の削除に伴い、訂正前の請求項３〜３１の項番号及び引用する請求項番号を順次繰り上げる。
（え）特許請求の範囲の訂正前の請求項２５（訂正後の請求項２４）を「固定化および塩と単糖類、二糖類、三糖類又はシクリトールとの水性混合体からなる水溶液で乾燥された哺乳類細胞の単分子層を提供する固相表面を設ける工程」を、
  「溶解され、次に塩と、単糖類、二糖類、三糖類、またはシクリトールから成る群から選択される糖類との混合水溶液で乾燥された哺乳類細胞の単分子層を提供する固相表面を設ける工程；
　前記哺乳類細胞はそれらの細胞表面に実質的に完全な抗原性を提供する；」
と訂正し、
「該生物流体と前記固体化および乾燥化細胞の単分子層とを接触させる工程；」を、「生物流体と前記固体化、溶解および乾燥化細胞の単分子層とを接触させる工程；」と訂正し、さらに
「固体表面へ固定化および乾燥された哺乳類細胞に対して生物流体の免疫反応性成分の存在を試験するために固相検定を行う方法。」を、「固体表面へ固定化、溶解、および次に乾燥された哺乳類細胞に対して生物流体の免疫反応性成分の存在を試験するために固相検定を行う方法。」と訂正する。
（お）明細書１４頁１３〜１４行（特許公報７欄９行参照）の「マイクロタイター・プレート」を、「ミクロタイター・プレート」と訂正する。
（か）明細書２８頁末行、明細書２９頁４行、８行、明細書３１頁１５〜１６行、１７行、１８行、１９行、末行、３５頁８行、１１行、１９行（特許公報１２欄１４行、１８行、２２行、１３欄１２行、１３行、１５行、１６行、１４欄２４行、２６行、３３〜３４行参照）の「指示赤血球」を、「指示薬赤血球」と訂正する。
（き）明細書３１頁１４〜１５行（特許公報１３欄１１行参照）の「凹部」を、「凹所」と訂正する。
（く）明細書３２頁４〜５行、３５頁１５行（特許公報１３欄２０行、１４欄３０行参照）の「指示細胞」を、「指示薬細胞」と訂正する。
（け）明細書３２頁１０〜１１行（特許公報１３欄２６行参照）の「抗体の検出する」を、「抗体を検出する」と訂正する。
（こ）明細書３７頁３行（特許公報１５欄４行参照）の「添付直後」を、「添加直後」と訂正する。
（さ）明細書１０頁下から２行の「漏れた場合の可燃性」を「 濡れた場合の加熱性」と訂正する。
（し）明細書１４頁２〜５行の「使用する望ましい塩は塩化ナトリウムであるが、塩化カリウム及びリン酸ナトリウムのような他の塩類も同一の効果及び適当さを持って利用できる。」を、「使用する望ましい塩は塩化カリウムであるが、塩化ナトリウム及びリン酸ナトリウムのような他の塩類も同一の効果及び適当さを持って利用できる。」と訂正する。
（す）明細書１６頁１５〜１８行の「名称：Ａｎ　Ａｒｔｉｃｌｅ　ｆｏｒ　Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓｓａｙｓ　・・・Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　Ｓａｍｅ」を、「名称：Ａｎ　Ａｒｔｉｃｌｅ　ｆｏｒ　Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ　ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓｓａｙｓ　・・・Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　Ｓａｍｅ」と訂正する。
（せ）明細書１８頁１３行および１７行の「Ｉｍｍｕｃｏｒ」を、「ｌｍｍｕｃｏｒ」と訂正する。
（そ）明細書２６頁１０〜１１行の「免疫検定法」を「免疫検定方法」と訂正する。
（た）明細書２８頁１７行の「各凹所」を「凹所」と訂正する。
（ち）明細書２８頁１８行の「保存剤および着色用染料」を、「保存および着色用染料」と訂正する。
（つ）明細書２８頁１４行、明細書２９頁４行および８行の「抗−ＩｇＧコーテッド」を、「抗−ｌｇＧコーテッド」と訂正する。
（て）明細書３１頁４行の「２〜８℃」を、「２／８℃」と訂正する。
（と）明細書３１頁１３行および明細書３５頁５行の「対照試料」を、「照射試料」と訂正する。
（な）明細書３１頁１４〜１５行の「それらの凹部」を、「それらの凹所ブロック」と訂正する。
（に）明細書３３頁３行、および同頁末行〜３４頁１行の「行なう」を、「行う」と訂正する。
（ぬ）明細書３４頁３〜４行の「逆ＡＢＯグループ分け検定を行うのに適した固相支持体の調製に利用することができる。」を、「逆ＡＢＯグループ分け検定を行うのに固相支持体の調製に利用することができる。」と訂正する。
（ね）明細書３６頁７〜８行の「０．２％（ｖ／ｖ）懸濁液１００μｌ」を、「０．２％（ｖ／ｖ）懸濁液μｌ」と訂正する。
（の）明細書３６頁１６行の「塩化ナトリウム１００μｌ」を、「塩化ナトリウム１０μｌ」と訂正する。
（は）明細書３７頁１６〜１７行の「Ａ1赤血球を含有する凹所」を、「Ａ1赤血抗−Ａ抗体含有する凹所」と訂正する。
（ひ）明細書３８頁１０〜１１行の「既知抗原血液型表現型をもった塩溶液中の赤血球」を、「既知抗原血液型表現型をもつ塩溶液中の赤血球」と訂正する。
（ふ）明細書４０頁下から３行、末行、４１頁４行および１３行の「ヒトＩｇＧ」を、「ヒトｌｇＧ」と訂正する。
（へ）明細書４０頁下から２行の「酵素共役−ＩｇＧ溶液」を、「酵素共役−ｌｇＧ溶液」と訂正する。
（ほ）明細書４１頁１行および４行の「ＩｇＧ」を、「ｌｇＧ」と訂正する。
（ま）明細書４１頁７〜８行の「１０％ジメタノール−ｄＨ２Ｏ」を、「１０％ジメタノール−ＣＨ２Ｏ」と訂正する。
（み）明細書４１頁１６〜１７行の「抗−ＩｇＧ」を、「抗−ｌｇＧ」と訂正する。
　
（２）補正の内容
　平成１４年５月２０日付け手続補正書による補正の内容は、次のとおりである。
＜補正事項＞
（イ）訂正請求書における「６．請求の趣旨」の項を、補正前の「特許第３０３０７１０号の特許請求の範囲第１項及び第２５項の記載及び発明の詳細な説明の項の記載の訂正を求める。」から、「特許第３０３０７１０号の明細書を訂正請求書に添付した全文訂正明細書のとおりの訂正をすることを求める。」と補正する。
（ロ）訂正請求書における「７．請求の理由」の項を、補正前の「（１）平成１３年１月１６日付け取消理由により、・・・・・・」と該取消し理由の内容を示す（１）項と、「（２）よって、上記取消理由１及び２の解消、及び刊行物１〜刊行物１０の発明と本件特許発明との差違を明確にするために、明細書に記載された特許請求の範囲第１項及び第２５項の記載及び該訂正に伴う発明の詳細な説明の項の記載の訂正を別添付の訂正明細書に記載の通りに行った。
　これらの訂正は、訂正後の請求項１・・・・・誤記の訂正を行ったものである。
　これらの訂正によって、前記取消し理由（１）及び（２）は解消されたものと思量される。」との（２）項とからなるものから、
ロー１）「（１）設定登録の経緯
　　　　　　・・・・・・・
　（２）訂正の理由
　特許請求の範囲の減縮、誤記の訂正及び明りょうでない記載の釈明」という（１）項、（２）項に続いて、
ロ−２）「（３）訂正事項
（ａ）特許請求の範囲の請求項１中の「哺乳類細胞を固相支持体へ固定化する工程；」を、
「哺乳類細胞の抗原性を実質的に完全のままにして置きながら、該哺乳類細胞を固相支持体へ固定化する工程；
　前記固定化された細胞を溶解する工程；」と訂正する。
（ｂ）訂正前の請求項２を削除する。
（ｃ）訂正前の請求項２の削除に伴い、訂正前の請求項３〜３１の項番号及び引用する請求項番号を順次繰り上げる。
（ｄ）訂正前の請求項２５（訂正後の請求項２４）中の「固定化および塩と単糖類、二糖類、三糖類、またはシクリトールとの水性混合体からなる水溶液で乾燥された哺乳類細胞の単分子層を提供する固相表面を設ける工程；」を、「固定化され、溶解され、次に塩と、単糖類、二糖類、三糖類、またはシクリトールから成る群から選択される糖類との混合水溶液で乾燥された哺乳類細胞の単分子層を提供する固相表面を設ける工程；前記哺乳類細胞はそれらの細胞表面に実質的に完全な抗原性を提供する；」と訂正し、「該生物流体と前記固定化および乾燥化細胞の単分子層とを接触させる工程；」を、「生物流体と前記固定化、溶解および乾燥化細胞の単分子層とを接触させる工程；」と訂正し、さらに「固体表面へ固定化および乾燥された哺乳類細胞に対して生物流体の免疫反応性成分の存在を試験するために固相検定を行う方法。」を、「抗原性を実質的に完全のままにして置きながら、固体表面へ固定化、溶解および次に乾燥された哺乳類細胞に対して生物流体の免疫反応性成分の存在を試験するために固相検定を行う方法。」と訂正する。
（ｅ）明細書１４頁１３〜１４行（特許公報７欄９行参照）の「マイクロタイター・プレート」を、「ミクロタイター・プレート」と訂正する。
（ｆ）明細書２８頁末行、明細書２９頁４行、８行、明細書３１頁１５〜１６行、１７行、１８行、１９行、末行、３５頁８行、１１行、１９行（特許公報１２欄１４行、１８行、２２行、１３欄１２行、１３行、１５行、１６行、１４欄２４行、２６行、３３〜３４行参照）の「指示赤血球」を、「指示薬赤血球」と訂正する。
（ｇ）明細書３１頁１４〜１５行（特許公報１３欄１１行参照）の「凹部」を、「凹所」と訂正する。
（ｈ）明細書３２頁４〜５行、３５頁１５行（特許公報１３欄２０行、１４欄３０行参照）の「指示細胞」を、「指示薬細胞」と訂正する。
（ｉ）明細書３２頁１０〜１１行（特許公報１３欄２６行参照）の「抗体の検出する」を、「抗体を検出する」と訂正する。
（ｊ）明細書３７頁３行（特許公報１５欄４行参照）の「添付直後」を、「添加直後」と訂正する。」という（３）項、および
ロ−３）上記（３）項の訂正事項（ａ）〜（ｊ）について、訂正の目的、それらの訂正が新規事項でなく、実質上特許請求の範囲を拡張しまた変更するものでもないことを説明する「（４）請求の原因」、とからなるものに補正する。
　
（３）訂正請求に対する補正の適否について
３−１）補正事項（イ）について
　訂正請求書における「訂正の趣旨」の項を形式的に整える補正であって、請求の要旨を変更する補正ではない。
３−２）補正事項（ロ−１）について
　訂正請求書における「請求の理由」の項に必要な「設定登録の経緯」および「訂正の理由」を形式的に補充し整える補正であって、請求の要旨を変更する補正ではない。
３−３）補正事項（ロ−２）について
　当該補正において、訂正後の請求項２４についての上記訂正事項（え）を、その冒頭に「固定化され、」を追加して、訂正事項（ｄ）とする補正は、補正前の後続する「・・・固相表面を設ける工程；・・・前記固定化、溶解および乾燥化細胞の単分子層とを接触させる工程；・・・固体表面へ固定化、溶解および次に乾燥された哺乳類細胞に対して生物流体の免疫反応性成分の存在を試験するために固相検定を行う方法。」からみて誤記の補正であり、また、訂正事項（さ）〜（み）を削除する補正であるから、請求の要旨を変更するものではない。そして、添付した訂正明細書の内容に従い訂正した事項を箇条書き的に列挙して、訂正請求書における「請求の理由」の項に必要な「訂正事項」の項とすることは、記載形式を整える補正であって、それ自体、請求の要旨を変更する補正ではない。
３−４）補正事項（ロ−３）について
　補正後の訂正内容について、訂正の目的、それらの訂正が新規事項でなく、実質上特許請求の範囲を拡張しまた変更するものでもないことを説明する、訂正請求書における「請求の理由」の項に必要な「請求の原因」を形式的に補充し整える補正であって、請求の要旨を変更する補正ではない。
３−５）そうすると、これらの補正は、請求の要旨を変更するものではない。
　
（４）補正後の訂正の新規事項の有無、訂正の目的の適否、及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否
（４−１）訂正事項（ａ）について
　訂正事項（ａ）は、特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
　そして、「哺乳類細胞の抗原性を実質的に完全のままにして置きながら、該哺乳類細胞を固相支持体へ固定化する」ことは明細書１１頁、１３頁に記載されていた事項であり、「固定化された細胞を溶解する」ことは、訂正前の請求項２に記載されていた事項であるから、訂正事項（ａ）は、願書に添付された明細書に記載された事項の範囲内のものであるし、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。
　
（４−２）訂正事項（ｂ）について
　訂正事項（ｂ）は、請求項１の減縮に伴う訂正であって、特許請求の範囲の減縮を目的とし、願書に添付された明細書に記載された事項の範囲内のものであるし、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。
　
（４−３）訂正事項（ｃ）について
　訂正事項（ｃ）は、訂正事項（ｂ）に伴い、請求項１に関連した請求項を引用している訂正前の請求項３ないし１５についての訂正は、特許請求の範囲の減縮および特許請求の範囲の記載の整合性をとるための明りょうでない記載の釈明を目的とするものであり、請求項１とは関連のない訂正前の請求項１６ないし２４についての訂正は、特許請求の範囲の記載の整合性をとるための明りょうでない記載の釈明を目的とするものである。
　そして、これらの訂正は、願書に添付された明細書に記載された事項の範囲内のものであって、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。
　
（４−４）訂正事項（ｄ）について
　「固定化および塩と・・・・・・固相表面を設ける工程；」を、「固定化され、溶解され、次に塩と、単糖類、二糖類、三糖類、またはシクリトールから成る群から選択される糖類との混合水溶液で乾燥された哺乳類細胞の単分子層を提供する固相表面を設ける工程；前記哺乳類細胞はそれらの細胞表面に実質的に完全な抗原性を提供する；」と溶解工程を付加し、該「固相表面を設ける工程」が「前記哺乳類細胞はそれらの細胞表面に実質的に完全な抗原性を提供する；」ものであると特定する訂正、および生物流体との接触工程における「前記固定化、および乾燥化単分子層」を、「前記固定化、溶解および乾燥化細胞の単分子層」と「溶解」工程を経たものであることを付加する訂正、並びに固相検定を行う対象「哺乳類細胞」を、「抗原性を実質的に完全のままにして置きながら、固体表面へ固定化、溶解および次に乾燥された哺乳類細胞に対して」と特定する訂正は、特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
　そして、訂正事項（ｄ）は、訂正事項（ａ）と同様、願書に添付された明細書に記載された事項の範囲内のものであるし、実質上特許請求の範囲を拡張するものでもなく、又は、変更するものでもない。
　
（４−５）訂正事項（ｅ）〜（ｇ）について
　訂正事項（ｅ）〜（ｇ）は、いずれも、誤記の訂正を目的とするものであり、そして願書に添付された明細書に記載された事項の範囲内のものであるし、かつ実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。
　
（５）訂正についての検討結果 
　以上検討したところによれば、上記補正された訂正は、平成６年法律第１１６号附則第６条第１項の規定によりなお従前例によるとされる、特許法特許法１２０条の４第３項において準用する平成６年法律第１１６号による改正前の特許法第１２６条第１項ただし書、第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議申立てについての判断
（１）特許異議申立ての概要
　申立人本田匠政は、申立理由１として下記の刊行物１〜１０を甲第１〜１０号証として提出して、請求項１ないし１５及び請求項２５ないし３１に係る発明は、甲第１号証〜甲第１０号証に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明できたものであるから、特許法２９条の規定により特許を受けることができないものである旨主張するとともに、申立理由２として、請求項２５における「微生物流体」、「免疫反応性成分の存在を経験する」という文言は不明確であるから、請求項２５ないし３１の各発明に係る特許は、特許法３６条の要件を満たしていない特許出願に対してされたものであると主張している。
　刊行物１：特開昭６０−３５２６３号公報
　刊行物２：特公昭４９−２１０５２号公報
　刊行物３：米国特許第４，６０８，２４６号明細書（１９８６年（昭和６１年）８月２６日発行）
　刊行物４：特公昭６２−４４２２１号公報
　刊行物５：化学大辞典２縮刷版６３６頁『緩衝液』、１９６３年８月２５日共立出版（株）発行
　刊行物６：臨床検査技術全書第３巻　血液検査　２９４頁　１９７２年１０月１５日（株）医学書院発行
　刊行物７：特公平１−５７７４２号公報
　刊行物８：特公平７−４６１００号公報
　刊行物９：特開昭６２−２１２５６８号公報
　刊行物１０：特開昭５４−１２８３９６号公報
　
（２）本件訂正発明
　本件特許第３０３０７１０号の請求項１、請求項２〜請求項１４（旧請求項３〜旧請求項１５）及び請求項２４〜請求項３０（旧請求項２５〜旧請求項３１）に係る発明は、平成１４年５月２０日付け手続補正書により補正された訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１ないし１４及び請求項２４〜請求項３０に記載された次のとおりのものである。（以下、それぞれ、「訂正発明１」、「訂正発明２」・・・という。）
「【請求項１】
　哺乳類細胞の抗原性を実質的に完全のままにして置きながら、該哺乳類細胞を固相支持体へ固定化する工程；
　前記固定化された細胞を溶解する工程；
　前記固定化された細胞に塩と、単糖類、二糟類、三糖類、又はシクリトールとの水性混合体から成る乾燥用溶液を接触させることによって、前記固相支持体へ固定化された細胞を乾燥する工程；および
　前記固定化された細胞との接触から前記乾燥用溶液を取り除く工程、
から成ることを特徴とする固相免疫検定に使用する固相支持体上の哺乳類細胞の乾燥用液の使用を介して乾燥する方法。
【請求項２】
　前記溶解が、固定化された細胞へ溶解用溶液を添加することによって行われる特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
　前記溶解用溶液が脱イオン水又は塩溶液である特許請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】
　前記固相支持体が有機ポリマーまたはガラス製である特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項５】
　前記単糖類、二糖類、三糖類、又はシクリトールはＤ−（−）グルコース、スクロース、Ｄ−（−）Ｄ−（＋）リキソース、ミオ−イノシートール、Ｄ−（＋）セロビオース、およびＬ−（−）−ソルボースからなる群から選ぶ特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項６】
　前記単糖類がＤ−（−）グルコースである特許請求の範囲第６項記載の方法。
【請求項７】
　前記前記混合体における前記単糖類、二糖類、三糖類、またはシクリトールが０．１Ｍ〜３．０Ｍの濃度を有する特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項８】
　前記混合体中の塩が５０ｍＭ〜３７７ｍＭの濃度で存在する特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項９】
　前記塩は塩化ナトリウム、塩化カリウムまたはリン酸ナトリウムからなる群から選択される特許請求の範囲第８項記載の方法。
【請求項１０】
　前記混合体中の塩が１５４ｍＭの塩化ナトリウムである特許請求の範囲第９項記載の方法。
【請求項１１】
　前記乾燥用溶液は前記固相支持体へ前記固定化細胞を完全にカバーする量を添加する特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１２】
　前記取り除き工程がさらに、
　前記固相支持体から前記乾燥溶液をデカントする工程；および
　前記固相支持体を乾燥剤を内蔵した密封容器に入れる工程
から成る特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１３】
　前記哺乳類細胞は赤血球、血小板、白血球、リンパ球および組織細胞から成る群から選ぶ特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項１４】
　前記哺乳類細胞は赤血球又は血小板である特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項２４】
　固定化され、溶解され、次に塩と、単糖類、二糖類、三糖類、またはシクリトールから成る群から選択される糖類との混合水溶液で乾燥された哺乳類細胞の単分子層を提供する固相表面を設ける工程；
　前記哺乳類細胞はそれらの細胞表面に実質的に完全な抗原性を提供する；
　生物流体に存在する場合の免疫反応性成分を前記哺乳類細胞上の抗原へ結合させるように、生物流体と前記固体化、溶解および乾燥化細胞の単分子層とを接触させる工程；
　前記細胞に結合した免疫反応性成分は全てそのままにしながら、前記細胞との接触から前記生物流体を除去する工程；および
　固体支持体を分析して前記免疫反応成分の前記細胞への付着又は非付着を判定する工程、
から成ることを特徴とする、抗原性を実質的に完全のままにして置きながら、固体表面へ固定化、溶解および次に乾燥された哺乳類細胞に対して生物流体の免疫反応性成分の存在を試験するために固相検定を行う方法。
【請求項２５】
　前記哺乳類細胞が赤血球または血小板である特許請求の範囲第２４項記載の方法。
【請求項２６】
　前記固体表面を提供する工程が、複数の凹部を有するプレートを提供することから成り、前記哺乳類細胞の単分子層が赤血球または血小板の単分子層から成る特許請求の範囲第２４項記載の方法。
【請求項２７】
　前記接触工程が前記生物流体を前記凹所における細胞の単分子層と接触させることから成る特許請求の範囲第２６項記載の方法。
【請求項２８】
　前記接触工程が血漿、血清、赤血球溶液または血小板溶液を前記固定化および乾燥化細胞単分子層へ接触させることから成る特許請求の範囲第２４項記載の方法。
【請求項２９】
　既知抗血清を前記細胞表面上の相補的抗原へ結合させるために、前記接触工程の前に前記固定化および乾燥化細胞単分子層を既知抗血清で感作させる工程を含む特許請求の範囲第２４項記載の方法。
【請求項３０】
　前記分析工程が、赤血球付着法、酸素−結合免疫吸着検定法、放射線免疫検定法または免疫蛍光法によって前記付着または非不着を検出することから成る特許請求の範囲第２４項記載の方法。」
（３）本件発明の概要
　本件発明の概要は、本件明細書によれば、以下のとおりである。
（3．１）〔産業上の利用分野〕（明細書７頁１９行〜８頁２行、特許公報４欄４１〜４３行参照）
「この発明は一般に固相免疫検定法、特に固相免疫検定法に使用する固相支持体に吸着される哺乳類細胞を乾燥する方法および固体支持体を組み込んだ物品に関する。」
（3．2）〔従来の技術〕（明細書８頁４行〜９頁１０行、特許公報４欄４５行〜５欄１７行参照）
「固相免疫検定法は研究所の技術者がより便利にかつ容易に行える高感度で特異の免疫検定法を提供するために開発されてきた。固相検定法において、抗原または抗体のような免疫反応の一成分は固相支持体の表面に固定化される。・・・従つて、前記型式の細胞を含む免疫検定法は、血液群および感染性病原体、特に血液の細胞成分に直接作用するものの検定法において抗原または抗体の存在を決定するために開発されてきた。
　全細胞が固相免疫法に利用されるとき、これらの細胞を固相支持体へ固定化するために用いる現在の方法は細胞の表面上の官能基を固相支持体の表面上の官能基へ橋かけさせる化学剤を使用する。この目的に使用する典型的な化学剤はグルタルアルデヒドおよびジメチル・スベルイミダーテである。」
（3．3）〔発明が解決しようとする課題〕（明細書９頁１２行〜１１頁１０行、特許公報５欄１９行〜６欄３行参照）
「全哺乳類細胞を含む免疫検定のためのこれら化学剤の使用に伴う第１の問題点は、化学剤は細胞を支持体へ固定化するが、それらはまた抗原活性に対して責任のある反応性基のいくつかをブロックすることである。細胞の表面に見られる抗原決定子が極めて複雑で多数あるために、細胞膜の抗原性に影響を与えない単一の化学橋かけ剤は見出されていない。・・・しかしながら、患者の血清中の不規則抗体を検出するために用いる赤血球単分子層を利用する検定の場合のように、抗原決定子の全てを保持しなければならない場合には、それらは潜在的反応性基のいくつかをブロックする。
　また、全哺乳類細胞は細胞から水を抜き取る化学剤によって固定化することもできる。細胞から水を抜き取る、または細胞内の水を置換する典型的な化学剤はメタノール、アセトンおよびジメチル・スルホキシドである。メタノールおよびアセトンは顕微鏡検査用組織切片を固定するために使用されてきたがそれらは細胞、特に赤血球の表面上の抗原を破壊する傾向にあるためた赤血球、リンパ球または血小板のような細胞の被固定単分子層と併用することができない。メタノールおよびアセトンのような化学剤に伴う別の問題点は、危険な廃棄物処理の必要条件、それらの蒸気が研究室に漏れた場合の可燃性および毒性を伴う問題である。細胞内の水と置換するジメチル・スルホキシド、糖およびアミノ酸のような剤は懸濁細胞の保存用にも使用されてきたが、これらの細胞は凍結して貯蔵すると共に使用前に洗浄しなければならない。
　細胞を凍結貯蔵するときはいつでも、凍結−融解サイクル中に細胞膜を破壊し、従って細胞をロスする問題があることである。細胞の凍結を含む方法に伴う別の問題は凍結器のコスト、研究室スペースの損失および使用前の細胞の解凍および洗浄をしなければならない不便さである。」
（3．4）本件発明の目的（明細書１１頁１１行〜１３頁２行、特許公報６欄４行〜３０行参照）
「　従って、上記の問題点を取り除くために免疫学の分野においては、哺乳類細胞の単分子層を乾燥または免疫検定用の固相支持体へ固定化する方法の必要がある。
　従つて、本発明の主目的は、哺乳類細胞表面抗原の完全な抗原性を維持すると共に、乾燥した細胞の単層を有する固相支持体を室温で貯蔵して氷点下の温度における貯蔵の問題を回避するように、免疫検定法において使用する固相支持体上に吸着された哺乳類細胞の単分子層を乾燥する方法を提供することにある。
　本発明の別の目的は、乾燥させた哺乳類細胞を室温において少なくとも６ケ月貯蔵することができると共に高感度で免疫検定を行うことができるところの固相免疫検定法に使用する物品を提供することにある。
　さらに本発明の別の目的は、細胞単分子層の貯蔵寿命を伸ばすことによって免疫検定に含まれるコストを下げるところの免疫検定法に使用する固相支持体上に吸着された哺乳類細胞の単分子層を乾燥する方法を提供することにある。
　さらに本発明の目的は、乾燥用溶液が単分子層に有害でなく、かつ分析の性能を妨害しないところの免疫検定法に使用する固体支持体上に吸着された哺乳類細胞の単分子層を乾燥する方法を提供することにある。
　本発明の目的は、乾燥用溶液が単種類、二糖類、三糖類またはシクリトールと塩との水溶液から成るところの免疫検定法に使用する固相支持体上の赤血球、リンパ球、白血球および血小板のような哺乳類細胞の単分子層を乾燥する方法を提供することである。」
（3．5）〔課題を解決するための手段〕（明細書１３頁６行〜１４頁９行、特許公報６欄３４行〜７欄５行参照）
「我々は、単糖類、二糖類、三糖類またはシクリトールを含有する適当な低張性の塩溶液を使用して、細胞の完全な抗原活性を維持しながら固相支持体上に固定化した赤血球、白血球、リンパ球および血小板の単分子層を保存できることを見出した。本発明の方法を受けた被固定細胞の単分子層は精度や感度を余り失うことなく室温で少なくとも６ヶ月貯蔵することができる。主題の細胞を固相支持体へ固定化する好適な方法は正味正電荷を有する有機染料で前もって染色した固体支持体へ細胞を吸着させる方法である。この固定化細胞の単分子層に乾燥用溶液を添加する。
　乾燥用溶液における単種類、二糖類、三糖類またはシクリトールの望ましい濃度範囲は、・・・そして望ましい乾燥用溶液は１．０ モル／ｌのデキストロースと１５４ミリモル／ｌのＮａＣｌからなる。」
（3．6）固相支持体表面へ吸着（明細書１５頁７行〜１６頁１８行、特許公報７欄２２行〜４９行参照）
「本発明の目的を果たすには、細胞の単分子層を利用する哺乳類細胞の完全な抗原性をそのままにして置くように固相支持体表面へ吸着させることが望ましい。これは有機染料を有機重合体の表面へ吸着させることによって最適に達成される。各々が正味負の表面電荷を帯びるヒトの赤血球、リンパ球、白血球または血小板を固定化させるために、染料は正味正電荷をもたなければならない。細胞が染料と物理的に接触しているとき、細胞は非イオン結合−水素結合、ファンデルワールス力および疎水性力のような非結合相互作用によって染料へ吸着されることによつて固定化されることになる。このように被固定化細胞の単分子層が得られ続いて非結合細胞が洗い落される。次にその細胞の単分子層は、固相赤血球付着のように免疫検定に使用して、固定化された細胞の表面上に見られる抗原に対する抗体の検出をする。生物試験溶液中の特定の抗原を検出するために、細胞を単分子層の上へ特定の抗体を吸着させることもできる。
　哺乳類細胞を吸着するために最も有用であることがわかった染料は正味正電荷を有しかつ疎水性芳香族環構造を有する有機染料である。かかる正味正電荷を有し・・・において検討されている。」
　
（４）引用刊行物
　上記刊行物１〜刊行物６及び刊行物９〜刊行物１０は、本件特許の出願の優先日より前に頒布された刊行物である。上記刊行物７〜刊行物８は、本件特許の出願の優先日より後に頒布された刊行物であるが、それらに記載の発明の出願が、それぞれ、昭和５７年７月２２日（特開昭５７−１１８１６０号公報）、昭和６３年７月１２日（特開昭６３−１６８５６２号公報）に公開されているので、それらの公開公報に記載されている事項については、本件特許の出願の優先日前に頒布された刊行物の記載事項ということができるから、取消理由通知においては、刊行物７，８については、それぞれ上記公開公報を刊行物７，８として引用した。
（４−１）刊行物１
　刊行物１には、「担体上に固定保持された免疫活性物質を、糖類、蛋白質及び低級多価アルコールから成る群より選ばれた一種又は二種以上の溶液中に浸漬せしめることを特徴とする固定化免疫活性物資の安定化法。」（特許請求の範囲第１項）が記載され、担体上に固定保持される免疫活性物質としては抗原、抗体およびハプテン（薬物等）が挙げられ、抗原としてはインスリン、グルカゴン、成長ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、副腎皮質ホルモン、甲状腺刺激ホルモン等のホルモン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、α−フェトプロテイン、フェリチン、β２−ミクログロブリン、ＣＥＡなどの蛋白質、およびＨＢｓ抗原、風疹ウイルス抗原などのウイルス抗原が挙げられている（４頁左上欄〜右上欄）。
　また、用いられる糖類溶液としては、例えばリボース、グルコース、フラクトース、マンノース、ガラクトース、マルトース、乳糖、シヨ糖等の単糖類や少糖類、更にデキストラン、デキストリン等の多糖類が挙げられ、中でも乳糖、ショ糖、デキストリンが好ましく用いられること（４頁右上欄）、そして、糖類及び蛋白質を溶解せしめる溶媒として精製水あるいは緩衝液が挙げられ、特に緩衝液については、中性付近に緩衝作用を有する、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グツド緩衝液等が用いられること（４頁右下欄）が記載され、「担体上に固定保持された免疫活性物質を糖類及び蛋白質を含む溶液に浸漬処理し、乾燥化せしめる方法は、例えば担体を室温下にて２０〜４０分間、該水性物中に浸漬した後、担体を取り出し、濾紙等の上に静置し自然乾燥すれば良く、そのまま試薬として有用であるが、更に好ましくは窒素ガスシールあるいは減圧密栓して保存する。このように担体を糖類及び蛋白質を含む溶液中に浸漬処理することによって担体の自然乾燥操作中並びに該担体保存中に生じる免疫活性物質の抗原活性や抗体活性の低下を防ぐことが可能となる。」とその効果が記載され（４頁右下欄〜５欄左上欄）、実施例１には、抗インスリン抗体結合ガラスビーズについて、種々の処理液で浸漬後、室温下にてビーズを自然乾燥し、４０℃の恒温室に保存し苛酷試験したものと、対照ビーズ（参考例１で調製した、ビーズを１％ウシ血清アルブミン等を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．３に浸漬した状態で４℃に保存したもの）とを対比し活性保持率（％）を求め、安定化効果を確認したことが記載されている（７頁左上欄〜左下欄）。
（４−２）刊行物２
　刊行物２には、「天然の赤血球を１．５〜５．０容量パーセントのピルビンアルデヒドと接触させ、次いで１．５〜５．０容量パーセントのホルムアルデヒドと接触させて該赤血球を安定化させ次いで安定化された赤血球を約０．２乃至約１重量パーセントの血清アルブミンおよび蔗糖およびそれらの混合物から成る群から選択された約５乃至３重量パーセントの糖と接触させる工程から成る凍結乾燥に適した水性赤血球製剤を得る方法。」が記載されている。
（４−３）　刊行物３
　刊行物３には、血液型免疫反応検査について、「固相上に固相化された赤血球に、抗体を含有する血清又は全血を接触させて、前記抗体を赤血球上の抗原に結合せしめた後に非特異的抗体を除去し、最後に、特異的抗体の存在を検出する」ことが記載されている。
（４−４）刊行物４
　刊行物４には、「血球型判定及び適合性判定方法」が記載されており、固体基質に結合した細胞の単一層を開示するとともに、細胞を溶解ないし崩壊させる操作が開示されている。
（４−５）刊行物５
　刊行物５には、「緩衝液」に通常塩が含まれることが記載されている。
（４−６）刊行物６
　刊行物６には、「血液検査記赤血球を低張液で溶血させる操作」が記載されている。
（４−７）特開昭５７−１１８１６０号公報（刊行物７の公開公報）
　当該公開公報には、「イムノアツセイのための単一試験用組成物」が記載されており、「糖と塩を含む液に抗原を浸漬して安定化したイムノアッセイ用の乾燥試薬」が開示されている。
（４−８）特開昭６３−１６８５６２号公報（刊行物８の公開公報）
　当該公開公報には、「細胞固定・保存液」が記載されており、「食塩と蔗糖を含有する緩衝液から成る細胞固定・保存液」が開示されている。
（４−９）刊行物９
  刊行物９には、「糖鎖特異抗体アッセイプレート及びその製造方法」が記載されており、「乾燥剤の存在下でプレートを乾燥する乾燥工程」及び「塩基性ポリペプチドで吸着された糖ペプチドにアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ溶液を添加する工程」が開示されている。
（４−１０）刊行物１０
　刊行物１０には、「固相免疫試験用糖衣付き試薬」が記載されており、「糖類が抗原性の保存に対し効果があること」、「塩溶液中に抗原保存用の糖類を溶解し得ること」、及び「抗原被覆支持物を自然乾燥する工程」が開示されている。
　
（５）申立理由（１）についての検討
（５−１）訂正発明１について
（ｉ）本件請求項１発明と刊行物１に記載された発明とを対比する。
  刊行物１には、「担体上に固定保持された免疫活性物質を、糖類、蛋白質及び低級多価アルコールから成る群より選ばれた一種又は二種以上の溶液中に浸漬せしめることを特徴とする固定化免疫活性物資の安定化法。」が記載され、さらに、浸漬した後、自然乾燥し、免疫活性物質の抗原活性や抗体活性の低下を防ぐことが記載されている。
  また、糖類を溶解せしめる溶媒としては緩衝液が挙げられ、特に緩衝液については、リン酸緩衝液が特に好ましいことが記載されている。
　そうすると、訂正発明１と刊行物１記載の発明とは、
　（一致点）
「免疫活性物質を固相支持体へ固定化する工程；
　前記固定化された抗原に、塩と、単糖類、二糟類、三糖類、又はシクリトールとの水性混合体から成る乾燥用溶液を接触させることによって、前記固相支持体へ固定化された抗原を乾燥する工程；および
　前記固定化された免疫活性物質との接触から前記乾燥用溶液を取り除く工程、
から成ることを特徴とする固相免疫検定に使用する固相支持体上の免疫活性物質の乾燥用液の使用を介して乾燥する方法」
である点で一致しているが、両者は、次の点で相違している。
　（相違点１）
 訂正発明１では、 「免疫活性物質」が「哺乳類細胞」に限定されているのに対し、刊行物１には、「免疫活性物質」として、「哺乳類細胞」が記載されていない点。
　（相違点２）
  訂正発明１は、「固定化された細胞を溶解する工程」を有するのに対し、刊行物１には、「固定化された細胞を溶解する工程」が記載されていない点。
　（相違点３）
  訂正発明１は、「固定化工程」が「哺乳類細胞の抗原性を実質的に完全のままにして置きながら」行われるものであるのに対し、刊行物１には、「哺乳類細胞の抗原性を実質的に完全のままにして置きながら」行われることは記載されていない点。
　
（ii）相違点についての検討
　そこで、これらの相違点について検討する。
  本件明細書によれば、橋架け化学剤による固定化、あるいは、水抜取、または、水置換化学剤による固定化、などの従来技術の「哺乳類細胞」の固定化においては、「哺乳類細胞の抗原性」を損なう問題点を有していた（前記（3．3）参照）。
  そうすると、前記相違点３の構成の「固定化工程」が「哺乳類細胞の抗原性を実質的に完全のままにして置きながら」行われることは、従来技術の「哺乳類細胞」の「固定化」と異なるものであり、本件明細書に記載の「正味正電荷を有しかつ疎水性芳香族環構造を有する有機染料」等を使用することによる、従来用いられていない手段により「固定化」が行われるものであることを意味する（前記（3．6）参照）。
  刊行物１には、前述したように、「免疫活性物質」として「哺乳類細胞」に言及されておらず、「哺乳類細胞の抗原性を実質的に完全のままにして置きながら」固定化することは開示されていない。
  そして、刊行物２〜刊行物１０にも、「哺乳類細胞の抗原性を実質的に完全のままにして置きながら」固定化することは開示されていない。
　そうすると、訂正発明１は、上記刊行物１〜１０に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものということはできない。
（５−２）訂正発明２〜訂正発明１４について
　訂正発明２〜訂正発明１４は、訂正後の請求項１を引用するものであり、刊行物１記載の発明と、少なくとも訂正発明１についての上記相違点１〜相違点３において、相違する。
　そうすると、訂正発明２〜訂正発明１４は、訂正発明１について検討したのと同様に、上記刊行物１〜１０に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものということはできない。
　
（５−３）訂正発明２４〜訂正発明３０について
　訂正後の請求項２４には、「固相表面を設ける工程」における「哺乳類細胞」が「それらの細胞表面に実質的に完全な抗原性を提供するものである」という限定を付与されているから、訂正発明２４〜訂正発明３０も、刊行物１記載の発明と、少なくとも訂正発明１についての上記相違点１〜相違点３において、相違するものである。
　そうすると、訂正発明２〜訂正発明１４は、訂正発明１について検討したのと同様に、上記刊行物１〜１０に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものということはできない。
　
（５−４）申立理由（１）の検討結果
  したがって、前記申立理由（１）によっては、訂正発明１〜訂正発明１４及び訂正発明２４〜訂正発明３０に係る特許を取り消すことができない。
　
（６）申立理由（２）についての検討
  申立人の指摘する訂正前の請求項２５における「微生物流体」、「免疫反応性成分の存在を経験する」という文言は、本件特許第３０３０７１０号の特許公報における誤植であって、平成１１年１月１８日付け手続補正書により補正された特許明細書の特許請求の範囲の訂正前の請求項２５では、それぞれ、「該生物流体」、「免疫反応性成分の存在を試験する」という記載である。訂正後の請求項２４の記載は、上記（２）のとおりであって、申立人の指摘する記載不備はない。
  したがって、前記申立理由（２）によっては、訂正発明２４〜訂正発明３０に係る特許を取り消すことができない。
　
４．むすび
　したがって、特許異議申立ての理由及び証拠によっては、本件発明の特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１４年８月２０日（２００２．８．２０）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
（ａ）特許請求の範囲の請求項１中の「哺乳類細胞を固相支持体へ固定化する工程；」を、
「哺乳類細胞の抗原性を実質的に完全のままにして置きながら、該哺乳類細胞を固相支持体へ固定化する工程；
　前記固定化された細胞を溶解する工程；」と訂正する。
（ｂ）訂正前の請求項２を削除する。
（ｃ）訂正前の請求項２の削除に伴い、訂正前の請求項３〜３１の項番号及び引用する請求項番号を順次繰り上げる。
（ｄ）訂正前の請求項２５（訂正後の請求項２４）中の「固定化および塩と単糖類、二糖類、三糖類、またはシクリトールとの水性混合体からなる水溶液で乾燥された哺乳類細胞の単分子層を提供する固相表面を設ける工程；」を、固定化され、溶解され、次に塩と、単糖類、二糖類、三糖類、またはシクリトールから成る群から選択される糖類との混合水溶液で乾燥された哺乳類細胞の単分子層を提供する固相表面を設ける工程；前記哺乳類細胞はそれらの細胞表面に実質的に完全な抗原性を提供する；」と訂正し、「該生物流体と前記固定化および乾燥化細胞の単分子層とを接触させる工程；」を、「生物流体と前記固定化、溶解および乾燥化細胞の単分子層とを接触させる工程；」と訂正し、さらに「固体表面へ固定化および乾燥された哺乳類細胞に対して生物流体の免疫反応性成分の存在を試験するために固相検定を行う方法。」を、「抗原性を実質的に完全のままにして置きながら、固体表面へ固定化、溶解および次に乾燥された哺乳類細胞に対して生物流体の免疫反応性成分の存在を試験するために固相検定を行う方法。」と訂正する。
（ｅ）明細書１４頁１３〜１４行（特許公報７欄９行参照）の「マイクロタイター・プレート」を、「ミクロタイター・プレート」と訂正する。
（ｆ）明細書２８頁末行、明細書２９頁４行、８行、明細書３１頁１５〜１６行、１７行、１８行、１９行、末行、３５頁８行、１１行、１９行（特許公報１２欄１４行、１８行、２２行、１３欄１２行、１３行、１５行、１６行、１４欄２４行、２６行、３３〜３４行参照）の「指示赤血球」を、「指示薬赤血球」と訂正する。
（ｇ）明細書３１頁１４〜１５行（特許公報１３欄１１行参照）の「凹部」を、「凹所」と訂正する。
（ｈ）明細書３２頁４〜５行、３５頁１５行（特許公報１３欄２０行、１４欄３０行参照）の「指示細胞」を、「指示薬細胞」と訂正する。
（ｉ）明細書３２頁１０〜１１行（特許公報１３欄２６行参照）の「抗体の検出する」を、「抗体を検出する」と訂正する。
（ｊ）明細書３７頁３行（特許公報１５欄４行参照）の「添付直後」を、「添加直後」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
固相免疫検定用哺乳類細胞の乾燥法及びその物品
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　
哺乳類細胞の抗原性を実質的に完全のままにして置きながら
　
前記固定化された細胞を溶解する工程
　前記固定化された細胞に塩と、単糖類、二糖類、三糖類、または
シクリ−トール
　前記固定化された細胞との接触から前記乾燥用溶液を取り除く工程、から成ることを特徴とする固相免疫検定に使用する固相支持体上の哺乳類細胞を乾燥溶液の使用を介して乾燥する方法。
　【請求項
２
　【請求項
３
　【請求項
４
　【請求項
５
　【請求項
６
　【請求項
７
　【請求項
８
　【請求項
９
　【請求項
１０
　【請求項
１１
　【請求項
１２
前記固相支持体から前記乾燥溶液をデカントする工程；および
前記固相支持体を乾燥剤を内蔵した密封容器に入れる工程から成る特許請求の範囲第１項記載の方法。
　【請求項
１３
　【請求項
１４
　【請求項
１５
正味正電荷および前記支持体に吸着された疎水性芳香族環構造を有する有機染料の被膜；および
前記有機染料に固定化された免疫反応性全細胞の乾燥単分子層から成ることを特徴とする固相免疫検定を行うための物品。
　【請求項
１６
１５
　【請求項
１７
１６
　【請求項
１８
１７
　【請求項
１９
１５
　【請求項
２０
１９
　【請求項
２１
１９
　【請求項
２２
２０
　【請求項
２３
２２
　【請求項
２４
固定化され、溶解され
　
前記哺乳類細胞はそれらの細胞表面に実質的に完全な抗原性を提供する
　生物流体に存在する場合の免疫反応性成分を前記哺乳類細胞上の抗原へ結合させるように、生物流体と前記固定化、
溶解
　前記細胞に結合した免疫反応性成分は全てそのままにしながら、前記細胞との接触から前記生物流体を除去する工程；および
　固相支持体を分析して前記免疫反応成分の前記細胞への付着および非付着を判定する工程、から成ることを特徴とする、
抗原性を実質的に完全のままにして置きながら
溶解
　【請求項
２５
　【請求項
２６
２４
　【請求項
２７
２６
　【請求項
２８
２４
　【請求項
２９
２４
　【請求項
３０
２４
【発明の詳細な説明】
　【産業上の利用分野】
　この発明は一般に固相免疫検定法、特に固相免疫検定法に使用する固相支持体に吸着される哺乳類細胞を乾燥する方法および固体支持体を組み込んだ物品に関する。
　【従来の技術】
　固相免疫検定法は研究所の技術者がより便利にかつ容易に行える高感度で特異の免疫検定法を提供するために開発されてきた。固相検定法において、抗原または抗体のような免疫反応の一成分は固相支持体の表面に固定化される。抗体または抗原は技術的に周知の種々の方法によって固定支持体上に直接固定化される。抗原や抗体の外に、赤血球、白血球、リンパ球、血小板または他の哺乳類細胞のような細胞は全て、かかる細胞に特定の免疫検定を行うために固相支持体の表面へ固定化することができる。これらの種類の細胞の各々は分析せんとする生物流体試料中の抗体を検出するために使用することができる抗原をその細胞表面に提供する。特定の抗原または抗体は別の形式の免疫検定法のために細胞の表面に吸着させることができる。従って、前記型式の細胞を含む免疫検定法は、血液群および感染性病原体、特に血液の細胞成分に直接作用するものの検定法において抗原または抗体の存在を決定するために開発されてきた。
　全細胞が固相免疫法に利用されるとき、これらの細胞を固相支持体へ固定化するために用いる現在の方法は細胞の表面上の官能基を固相支持体の表面上の官能基へ橋かけさせる化学剤を使用する。この目的に使用する典型的な化学剤はグルタルアルデヒドおよびジメチル・スペルイミダーテである。
　【発明が解決しようとする課題】
　全哺乳類細胞を含む免疫検定のためこれらの化学剤の使用に伴う第１の問題点は、化学剤は細胞を支持体へ固定化するが、これらはまた抗原活性に対して責任のある反応性基のいくつかをブロックすることである。細胞の表面に見られる抗原決定子が極めて複雑で多数あるために、細胞膜の抗原性に影響を与えない単一の化学橋かけ剤は見出されていない。単一または少しの抗原決定子のみを保持すればよい場合の免疫決定においては、化学橋かけ剤は有効に利用することができる。しかしながら、患者の血清中の不規則抗体を検出するために用いる赤血球単分子層を利用する検定の場合のように、抗原決定子の全てを保持しなければならない場合には、それらは潜在的反応性基のいくつかをブロツクする。
　また、全哺乳類細胞は細胞から水を抜き取る化学剤によって固定化することもできる。細胞から水を抜き取る、または細胞内の水を置換する典型的な化学剤はメタノ−ル、アセトンおよびジメチル・スルホキシドである。メタノ−ルおよびアセトンは顕微鏡検査用組織切片を固定するために使用されてきたがそれらは細胞、特に赤血球の表面上の抗原を破壊する傾向にあるために赤血球、リンパ球または血小板のような細胞の被固定単分子層と併用することができない。メタノ−ルおよびアセトンのような化学剤に伴う別の問題点は、危険な廃棄物処理の必要条件、それらの蒸気が研究室に漏れた場合の可燃性および毒性を伴う問題である。細胞内の水と置換するジメチル・スルホキシド、糖およびアミノ酸のような剤は懸濁細胞の保存用にも使用されてきたが、これらの細胞は凍結して貯蔵すると共に使用前に洗浄しなければならない。
　細胞を凍結貯蔵するときはいつでも、凍結−融解サイクル中に細胞膜を破壊し、従って細胞をロスする問題があることである。細胞の凍結を含む方法に伴う別の問題は凍結器のコスト、研究室スペ−スの損失および使用前の細胞の解凍および洗浄をしなければならない不便さである。
　従って、上記の問題点を取り除くために免疫学の分野においては、哺乳類細胞の単分子層を乾燥または免疫検定用の固相支持体へ固定化する方法の必要がある。
　従って、本発明の主目的は、哺乳類細胞表面抗原の完全な抗原性を維持すると共に、乾燥した細胞の単層を有する固相支持体を室温で貯蔵して氷点下の温度における貯蔵の問題を回避するように、免疫決定法において使用する固相支持体上に吸着された哺乳類細胞の単分子層を乾燥する方法を提供することにある。
　本発明の別の目的は、乾燥させた哺乳類細胞を室温において少なくとも６ケ月貯蔵することができると共に高感度で免疫検定を行うことができるところの固相免疫検定法に使用する物品を提供することにある。
　さらに本発明の別の目的は、細胞単分子層の貯蔵寿命を伸ばすことによって免疫決定に含まれるコストを下げるところの免疫検定法に使用する固相支持上に吸着された哺乳類細胞の単分子層を乾燥する方法を提供することにある。
　さらに本発明の目的は、乾燥用溶液が単分子層に有害でなく、かつ分析の性能を妨害しないところの免疫検定法に使用する固体支持体上に吸着された哺乳類細胞の単分子層を乾燥する方法を提供することにある。
　本発明の目的は、乾燥用溶液が単糖類、二糖類、三糖類またはシクリト−ルと塩との水溶液から成るところの免疫検定法に使用する固相支持体上の赤血球、リンパ球、白血球および血小板のような哺乳類細胞の単分子層を乾燥する方法を提供することである。
　その他の目的は次の説明および特許請求の範囲から明白となるであろう。
　【課題を解決するための手段】
　我々は、単糖類、二糖類、三糖類またはシクリト−ルを含有する適当な低張性の塩溶液を使用して、細胞の完全な抗原活性を維持しながら固相支持体上に固定化した赤血球、白血球、リンパ球および血小板の単分子層を保存できることを見出した。本発明の方法を受けた被固定細胞の単分子層は精度や感度を余り失うことなく室温で少なくとも６ケ月貯蔵することができる。主題の細胞を固定支持体へ固定化する公的な方法は正味正電荷を有する有機染料で前もって染色した固体支持体へ細胞を吸着させる方法である。この固定細胞の単分子層に乾燥用溶液を添加する。
　乾燥用溶液における単糖類、二糖類、三糖類またはシクリト−ルの望ましい濃度範囲は、０．１〜３．０モル／ｌである。乾燥用溶液における塩の望ましい範囲は５０〜３７７ミリモル／ｌである。使用する望ましい塩は塩化ナトリウムであるが、塩化カリウムおよびリン酸ナトリウムのような他の塩類も同一の効果および適当さをもって利用できる。いずれの単糖類、二糖類、三糖類またはシクリト−ルも利用できるが、
好適な物質
　【実施例】
　固相免疫検定法は固相支持体として広いアレイの物品を利用する。その支持体はしばしば試験管、ビ−ド、シ−ト、ペトリ皿、膜または
ミクロタイタ−・プレ−ト
　固相はポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニルまたはナイロンのような有機重合体製にすることができる。さらに、哺乳類細胞の単分子層を結合することができる材料、例えばガラスも同様に適用することができる。
　本発明を実施するのに最適の固相支持体は複数の凹所くぼみを有するミクロタイタ−・プレ−トである。そのミクロタイタ−・プレ−トは有機重合体から成ることが望ましく、最適にはポリスチレン製である。
　本発明の目的を果すには、細胞の単分子層は利用する哺乳類細胞の完全な抗原性をそのままにして置くように固相支持体表面へ吸着させることが望ましい。これは有機染料を有機重合体の表面へ吸着させることによって最適に達成される。各々が正味負の表面電荷を帯びるヒトの赤血球、リンパ球、白血球または血小板を固定化させるために、染料は正味正電荷をもたなければならない。細胞が染料と物理的に接触しているとき、細胞は非イオン結合、水素結合、フアンデルワ−ルス力および疎水性力のような非結合相互作用によって染料へ吸着されることによって固定化されることになる。このように、被固定化細胞の単分子層が得られ、続いて非結合細胞が洗い落される。次にその細胞の単分子層は、固相赤血球付着のように免疫検定に使用して、固定化された細胞の表面上に見られる抗原に対する抗体の検出をする。生物試験液体中の特定の抗原を検出するために、細胞単分子層の上へ特定の抗体を吸着させることもできる。
　哺乳類細胞を吸着するために最も有用であることがわかった染料は正味正電荷を有しかつ疎水性芳香族環構造を有する有機染料である。かかる正味正電荷を有し固定支持体へ付着する疎水性芳香族環構造を有する染料は全て赤血球、リンパ球、白血球および血小板のような哺乳類細胞を固定できることがわかった。適用できる特定の染料および該染料を固相支持体へ吸着させる方法は、１９８８年７月５日付け米国特許第２１５，０４１号（発明の名称：Ａｎ　Ａｒｔｉｃｌｅ　ｆｏｒ　Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ　ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓｓａｙｓ　Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｄｙｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　Ｓａｍｅ）において検討されている。
　一般に、この目的に最適の染料はアルシアン・ブル−およびアルシアン・イエロ−であることがわかった。アルシアン・ブル−はフタロシアニンでありアルシアン・イエロ−アゾ染料であり、それぞれ正味正電荷を有する。使用可能である正味正電荷を有する他の染料はジアゾ染料、ポリアゾ染料、ジアゾニウムおよびテトラゾニウム塩類、テトラゾリウム塩類、トリフエニルメタン、キサンテンまたはアクリジン、キノリン染料、チアゾ−ル、インダミン、アジン、アミノアジン、サフロニン、チアジンおよびフタロシアニンを含む。
　アルシアン・ブル−を使用する場合には、それを最初に等張塩類溶液に１μｇ／ｍｌ〜１ｇ／ｍｌの濃度で溶解させる。望ましい濃度は０．１ｍｇ／ｍｌであって、固相支持体を完全に覆うべくその有機重合体の支持体に５０〜２５０μｌを塗布する。その染料は固相支持体に十分な接触をさせたまゝにした後、過剰の染料を洗い落す。大部分の染料に必要な接触時間は即時接触でよいが、他の染料のあるものには染料の固相支持体へ吸着させるために長時間を必要とする。アルシアン・ブル−を使用する場合には、それは水溶液に可溶性でないから１００％メタノ−ルの十分な量に溶解させなければならない。次に等体積の等張塩類溶液を溶解したアルシアン・イエロ−に添加して１μｇ／ｍｌ〜１ｇ／ｍｌ、最適には０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度範囲にする。再び５０〜２５０μｌのアルシアン・イエロ−溶液を固相支持体、望ましくはミクロタイタ−・プレ−トに塗布して、固相支持体上に染料を吸着させる。
　正味正電荷を帯びた有機染料で染色して固相支持体に細胞の単分子層を作るために、固定化させる細胞は最初汚染するタンパク質を含まないように洗浄しなければならない。赤血球に適当な洗浄溶液は等張塩類溶液、試薬赤血球希釈剤（Ｉｍｍｕｃｏｒ社製品）、またはリン酸塩緩衝化塩類溶液（ｐＨ）である。血小板には、オルシ−バ−溶液または改良オルシ−バ−溶液、或いは血小板洗浄および貯蔵溶液（Ｉｍｍｕｃｏｒ社製品）を使用することができる。
　本発明に利用される細胞は工業的に既知の標準供給源から得られる。細胞を洗浄後、典型的にそれらは等張塩類溶液に懸濁させる。本発明の目的のための懸濁液中の細胞の濃度は０．１〜０．４％（ｖ／ｖ）である。最も有用な範囲は０．１％〜０．２％（ｖ／ｖ）の範囲内である。
　洗浄した細胞懸濁液は染料を塗布した固相支持体へ添加して、細胞を沈降させる、または遠心分離さすことによって染料と接触させる。適当な期間、細胞を有機汚染と結合させた後、過剰の細胞溶液をデカントして、染料を塗布した固相支持体へ固定化した細胞の単層を後に残す。遠心分離法を用いる場合には、典型的に１〜５分を必要とし、重力によって細胞を沈降させる場合には４０〜６０分を要する。血小板のような小細胞を使用するときには、完全接触と細胞の均一単分子層の形成を確実にするためにはそれらを１晩沈降させることが最良である。
　一旦、細胞の単分子層を固相支持体へ吸着させたならば、本発明の乾燥用溶液を利用して細胞を乾燥または固相支持体へ固定化させる。赤血球を細胞の単分子層として利用するとき、乾燥用溶液の添加前に単分子層からなる細胞を適当な溶解溶液で溶解させることによって、さらに良好な結果が得られることがわかった。血小板、リンパ球および白血球に対しては、その溶解工程は必要ない。
　一般に、乾燥溶液は塩と、単糖類、二糖類、三糖類およびシクリト−ルからなる群から選んだ糖を含有する水溶液から成る。本発明に有用な単糖類、二糖類、三糖類またはシクリト−ルはＤ−（＋）ラフイノ−ス、Ｌ−（−）ソルボ−ス、Ｄ−（＋）トレハロ−ス、Ｄ−（＋）キシロ−ス、Ｄ−（−）グルコ−ス、Ｄ−（−）ソルビト−ル、スクロ−ス、Ｌ−（＋）アラビノ−ス、Ｄ−（−）セロビノ−ス、Ｄ−（−）フルクト−ス、Ｄ−（＋）ガラクト−ス、ミロ−イソシト−ル（シクリト−ル）、α−ラクト−ス、Ｄ−（＋）リキオ−ス、マルト−スおよびＤ−（＋）マンノ−スから成る群から選ぶことができる。さらに詳しくは、この群からの最も有用な物質はＤ−（−）グルコ−ス、スクロ−ス、Ｄ−（−）ソルビト−ル、Ｄ−（＋）リキオ−ス、ミオ−イノシ−ト−ル、Ｄ−（＋）ゼロビオ−ス、およびＬ−（−）ソルボ−スである。上記群からの最適の糖はデキストロ−スまたはＤ−（−）グルコ−ス（これはＦｉｓｈｅｒによれば化学式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６・Ｈ２Ｏを有する）である。上記の対応する鏡像体糖類も利用できると考えられる。乾燥用溶液は単糖類、二糖類、三糖類またはシクリト−ルの濃度０．１〜３．０モル／ｌを有するように調製される。最適濃度は１．０Ｍのテキストロ−スであって、この濃度は赤血球および血小板細胞の単分子層で最良に作用する。
　本発明に有用な塩類は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）およびリン酸ナトリウムから成る群からのものを含む。乾燥用溶液中の塩の望ましい濃度範囲は５０ミリモル／ｌ〜３７７ミリモル／ｌである。望ましい塩は１５４ｍＭの濃度で乾燥用溶液に存在する塩化ナトリウムである。
　乾燥用溶液は分析系に導入される全ての汚染するタンパク質を回避するためのきれいなガラス器具中において蒸留水または脱イオン水で調製する。
　乾燥用溶液を一旦調製したら、次にそれを試験管、さらに望ましくは凹所（くぼみ）を有するミクロタイタ−・プレ−トのような細胞単分子層を含む固相支持体の表面へ添加する。ミクロタイタ−・プレ−トの凹所を被覆するために添加する必要のある乾燥用溶液の体積は細胞単分子層を完全に被覆するのに十分なものでなければならない。２５〜１５０μｌが十分な量であるが、１００μｌが好適な量である。乾燥用溶液を細胞単分子層上に温置する最適時間および最適温置温度は試験する細胞単分子層の種類毎に決める必要がある。最適の時間および温置温度を決定するために利用できる１つの方法は、単一の細胞源で複数の凹所を調製し、同一量の乾燥用溶液を各凹所へ添加し、接触直後から４時間までの温度に至るデカンテイングの範囲内の時間間隔でそれらの井戸状凹所を検定のために除去させることである。他の全てのパラメ−タが一定に維持できるならば、検定結果の評価が最適の結果を得るのに必要な最適の温置時間を与える。同様の試験を温度のみを変えて行うことができる。乾燥用溶液をヒトの血小板、白血球、リンパ球および赤血球の単分子層に添加するのに最適の温置時間および温度は、室温で乾燥用溶液の即時の添加およびデカンテイングである。乾燥用溶液は流しの上のヘフリツキングまたは真空吸引によって細胞の単分子層から最良に除去される。乾燥用溶液を除去する他の方法も同様に適用できる。
　その試験管またはミクロタイタ−・プレ−トは次に中に乾燥剤を備えた箔パウチまたはパケットに入れて、密封する。パウチは極少または全く水を透過しないようにし、試験管またはミクロタイタ−・プレ−ト内の水は全て乾燥剤によって吸着させなければならない。この目的に望ましい乾燥材料は工業的に周知の供給源から得られる分子ふるい乾燥剤である。けい藻土およびシリカ粒子のような他の乾燥材料や真空乾燥も使用できるが、満足度は低下する。必要な乾燥剤の量は固相支持体に存在する量より多い水量を吸収する容量を有する量である。容量が２ｇの分子ふるい乾燥剤を使用する場合には、２〜３の該パケットの添加で十分である。密封パウチ内の乾燥剤による固相支持体上の吸収に必要な温度および時間の許容範囲は２〜８℃の温度において３〜８日、最適には５〜７日であることがわかった。ヒトの赤血球、リンパ球、白血球および血小板に最適の乾燥時間は２〜８℃において７日である。この吸収期間を過ぎた後、密封固相支持体は室温またに室温以下の温度で検定の精度または効率を下げることなく少なくとも６ケ月間貯蔵することができる。
　絶対に必要ではないけれども、細胞間の内容物を空にするために乾燥溶液の添加前に赤血球単分子層を溶解することが望ましい。これは、乾燥溶液を細胞の内部へよりアクセスさせることによって乾燥処理を助ける。溶解溶液は脱イオン水の溶液から１２０ｍＭ　ＮａＣｌ塩溶液に選ぶことができる。３００〜８００ｍＭのＮａＣｌの等張溶液も使用できる。最適の溶解溶液は８０ｍＭのＮａＣｌである。
　赤血球溶液を染色した固相支持体に接触させた後、過剰の細胞溶液をデカントし、溶解溶液を細胞単分子層へ直接添加して、１〜３０分間温置させる。温置時間は赤血球の場合１分であることがわかった。溶解溶液をデカントして、品物を等張溶液で２回洗浄する。次に乾燥用溶液を前述のように添加する。
　リン酸塩緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）、塩化カルシウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）および組成培地のようなＮａＣｌ以外の塩溶液も溶解溶液用に使用できる。
　上に乾燥した哺乳類細胞の単分子層を有する固相支持体を使用するために、パウチを開けて、試験する生物流体を試験管またはミクロタイタ−・プレ−トの井戸状凹所へ添加する。典型的に生物流体はヒトの血清又は血漿である。低イオン強度の添加物、例えば、約１９ｇ／ｌグリシン溶液をこの時点でその凹所に添加する。そのグリシン溶液はさらにチメロサ−ルのような保存剤と染料を含有することができる。適当な温置期間の後に、試験管またはミクロタイタ−・プレ−トの凹所を洗浄して未結合の血漿または血清成分を除去する。特に固定化された細胞単分子層に結合される抗体の存在は放射線免疫決定法、酵素結合免疫吸収剤検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫検定法または固相赤血球粘着法のような多数の既知方法によって検出される。
　本発明に従って調製された固相支持体は、ヒトの赤血球またはヒトの血小板へ向けられた予測されない抗体の検出をする抗体スクリ−ニング、種々の既知抗原パタ−ンを有する赤血球または血小板のパネルを使用することによって生物試料中の抗体の同一性を決定する抗体スクリ−ニング、逆ＡＢＯグル−プ分け、正ＡＢＯグル−プ分け、Ｄ−型決定、赤血球表現型決定および哺乳類の組織細胞に向けられた抗体の検出法を広範囲の免疫検定法に用途を要する。
　次の実施例は説明のためのみに与えるものであって、限定する性格を有するものではない。
実施例　１
　本発明の方法を利用してヒトの赤血球へ向けられた予測されない抗体を検出する免疫検定を行うために、複数の井戸状凹所を備えたミクロタイタ−・プレ−トを最初に全ての凹所がアルシアン・イエロ−溶液で覆われるようにアルシアン・イエロ−の十分な量で０．１ｍｇ／ｍｌの濃度において処理する。アルシアン・イエロ−溶液をミクロタイタ−・プレ−トと３０分間接触させたままして、過剰の染料溶液を除去する。それぞれの井戸状凹所当り塩溶液または試薬赤血球希釈液中にヒトのＲＢＣの０．２％（ｖ／ｖ）懸濁液１００μｌを添加することによって染色されたプレ−トにヒトの赤血球の単分子層が形成される。赤血球は室温で１時間重力によって沈降させる。それらの細胞は次に８０ｍＭ　ＮａＣｌの凹所当り１００μｌを添加することによって溶解される。この溶解溶液は凹所内で室温において１分間温置させて、次に吸込によって除去する。そのミクロタイタ−・プレ−トは自動洗浄装置または手動法によって等張塩溶液で少なくとも２回洗浄して未結合の赤血球を除去する。それぞれの凹所へ１．０Ｍのデキストロ−スおよび１５４ｍＭの塩化ナトリウムを含有する乾燥用溶液１００μｌを添加する。乾燥用溶液の添加後直ちに、各凹所を吸引して過剰の乾燥用溶液を全て除去する。そのミクロタイタ−・プレ−トは次に少なくとも２ｇの容量の分子ふるい乾燥剤パッケ−ジを内蔵する箔パウチまたはパケットに逆さまに入れる。このパウチを熱で密封して２〜８℃で７日間乾燥する。
　免疫検定にミクロタイタ−・プレ−トを使用するために、箔パウチを開けて、血清または血漿或いは対照試料のような生物流体１滴を各凹所へ添加する。保存剤および着色用染料と共にグリシンの１９ｇ／ｌ溶液２滴も各凹所へ添加する。これらの溶液を３７℃で１５分間それらの凹所内で温置される。温置後、ミクロタイタ−・プレ−トの凹所を望ましくは自動洗浄装置（例えば、ＢｉＯ−Ｔｅｋ　ＥＬ−４０２型）によって塩溶液で３回洗浄する。次にその各凹所へ抗−ＩｇＧコ−テッド指示薬の赤血球を添加する。そのミクロタイタ−・プレ−トを４５０×Ｇで１分間遠心分離する。そのプレ−トは次に赤血球単分子層への指示薬赤血球の付着性または非付着性を検査する。反応表面上への指示薬赤血球の付着によって陽性反応が見られる。陰性反応は凹所の底部に
指示薬赤血球
　従って、試験される生物流体が抗体を赤血球の単分子層に向けた場合には、それは赤血球の単分子層に結合する。抗−
Ｉ
指示薬赤血球
実施例　２
　本発明は、赤血球へ向けられた予測されない抗体の検出のために検定用抗体パネルを有するミクロタイタ−・プレ−トを調製することに利用することができる。ミクロタイタ−・プレ−トは、既知で種々の血液型抗原表現型をもつヒトの赤血球のパネルが染色されたミクロタイタ−・プレ−トの個々の凹所へ吸着されることを除いて、本質的に実施例１のように調製される、赤血球は実施例１で記載したように溶解、洗浄そして乾燥される。試験血清または血漿試料において予測されない抗体の検出および検出される特定抗体の決定のために、かかる血清または血漿の１滴をミクロタイタ−・プレ−ト上の乾燥した赤血球の各パネル凹所へ添加する。検定は実施例１で記載したように行う、そして次のそれぞれの凹所において陽性反応をもたらす試料中の抗体の特異性は陽性反応を示す個々の凹所のパネル構成員の表現型の判定によって決定される。
実施例　３
　本発明はヒトの血小板に向けられた予想されない抗体の検出のために抗体スクリ−ンとして有用なミクロタイタ−・プレ−トの調製に利用することができる。ミクロタイタ−・プレ−トは実施例１で記載したようにアルシアン・イエロ−で染色される。血小板細胞の単分子層はミクロタイタ−・プレ−トの各凹所へ血小板と改良されたオルシ−バ−溶液の０．１％（ｖ／ｖ）懸濁液１００μｌを添加することによって形成される。血小板は２〜８℃で２４時間重力によって沈降させる。過剰の血小板溶液をデカントして、そのプレ−トを等張塩溶液で２回洗浄する。１．０Ｍデキストロ−スと１５４ｍＭ　ＮａＣｌから成る乾燥用溶液１００μｌを各凹所に添加した直ちにデカントする。そのプレ−トを分子ふるい乾燥剤を備えた箔パックに入れて、２〜８℃で７日間乾燥させる。ヒトの生物流体中の予測されない抗体を試験するために、各凹所へ血清、血漿または対照試料の１滴を添加して凹所において３７℃で１５分間温置する。それらの
凹所
指示薬赤血球
指示薬赤血球
指示薬赤血球
指示薬赤血球
　従って、検定される生物流体が抗体を血小板へ向けた場合には、それは血小板の単分子層へ結合する。かかる抗体が生物流体に存在しない場合には、
指示薬細胞
実施例　４
　本発明に従って調製したミクロタイタ−・プレ−トはヒトの血小板へ向けられた予測されない
抗体を検出する
実施例　５
　実施例４の検定法は、乾燥溶液の添加前にＨＬＡ抗原のクロロキン除去によってＨＬＡ以外の特異の血小板抗体の同定に利用することができる。実施例４に示した方法を次のように改良する：一旦、血小板の単分子層を調製して、各凹所毎に２０ｍＭのＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ６．０）中に１００ｍｇ／ｍｌのクロロキン１００μｌの添加する。対照の凹所は２０ｍＭのＭＥＳ緩衝溶液のみを含有する。ミクロタイタ−・プレ−トは３７℃で１時間温置して、塩溶液で４回洗浄する。実施例４で記載した乾燥用溶液を添加し、ミクロタイタ−・プレ−トの最終調製および検定を実施例４で記載したように行なう。
実施例　６
　本発明は逆ＡＢＯグル−プ分け検定を行うのに適した固相支持体の調製に利用することができる。ミクロタイタ−・プレ−トを実施例１で記載したアルシアン・イエロ−で染色し、Ａ１の０．２％（ｖ／ｖ）懸濁液および塩溶液または試薬赤血球希釈液中のＢ赤血球の類似懸濁液の１００μｌを複数の個々の凹所へ添加する。その赤血球を室温で４０〜６０分間重力によって沈降させる。各所へ８０ｍＭの塩化ナトリウム１００μｌを添加して赤血球を溶解する。溶解溶液を凹所において室温で１分間温置させた後、吸引によって除去する。次にそのミクロタイタ−・プレ−トを自動洗浄装置を使用して等張塩溶液で２回洗浄する。１．０モル／ｌのデキストロ−スと１５４ミリモル／ｌの塩化ナトリウムから成る乾燥用溶液１００μｌを各凹所へ添加する。乾燥用溶液はそれを凹所へ添加した直後に吸引によって除去し、マイクロタイタ−・プレ−トを分子ふるい乾燥剤を内蔵する箔パウチに逆さまに入れる。そのパウチを熱で密封して、２〜８℃で５日間乾燥させる。
　逆ＡＢＯグル−プ分け検定を行うために、箔パックを開けて血清、血漿または対照試料の１滴を各凹所に添加して、３７℃で１５分間温置させた。ミクロタイタ−・プレ−トは自動洗浄装置で塩溶液を使用して３回洗浄した。Ａ１Ｂ
指示薬赤血球
指示薬赤血球
指示薬細胞
指示薬赤血球
実施例　７
　本発明は、正ＡＢＯグル−プ分けおよびＤ型を決定するための検定を行うのに有用な固相支持体の調製に利用される。実施例１で記載したようにアルシアン・イエロ−で染色したミクロタイタ−・プレ−トを調製して、塩溶液中にＡ１、ＢおよびＯ−Ｒｈ陽性赤血球のそれぞれ０．２％（ｖ／ｖ）懸濁液１００μｌをそれぞれの凹所へ添加する。赤血球を室温で１時間重力によって沈降させる。細胞を沈降させた後、過剰の細胞溶液をプレ−トからデカントさせる。次に細胞の単分子層を抗−Ａ抗体、抗−Ｂ抗体および抗−Ｄ抗体の適当な希釈液１００μｌを凹所に添加することによって感作させる。その凹所中で抗血清を３７℃で６０分間温置して、過剰の抗血清を吸引によって除去する。次に溶解用溶液として８０ｍＭの塩化ナトリウム１００μｌを各凹所へ添加して、室温で１分間温置させる。過剰の溶解用溶液は吸引で除去し、ミクロタイタ−・プレ−トは等張塩溶液で２回洗浄する。１．０モル／ｌのデキストロ−スおよび１５４ミリモル／ｌの塩化ナトリウムの１００μｌから成る乾燥用溶液を０．５％ブロメラインと共に各凹所へ添加する。その乾燥用溶液はそれを凹所へ
添加直後に
　上記のように調製したミクロタイタ−・プレ−トを利用して正ＡＢＯグル−プ分けおよびＤ型化を行うために、塩溶液中で希釈した試験用赤血球の０．２〜０．３％（ｖ／ｖ）懸濁液１滴を各凹所へ添加して、３７℃で１５分間温置させる。次にミクロタイタ−・プレ−トは４５０×Ｇで１分間遠心分離させる。そのプレ−トを検査して試験赤血球の感作赤血球単層への付着または非付着を判定する。試験赤血球が抗−Ａ抗体抗血清を有するＡ１　
赤血球
実施例　８
　本発明は赤血球の表現型を決定する検定に有用な固相支持体の調製に利用される。ミクロタイタ−・プレ−トを実施例１で記載したようにアルシアン・イエロ−で再び染色し、既知抗原血液型表現型をもった塩溶液中の赤血球の個々の溶液の１％（ｖ／ｖ）懸濁液１００μｌの添加によって、個々の凹所に細胞の単分子層を調製する。それらの細胞懸濁液は室温で１時間重力によって沈降させる。次に細胞単分子層を問題の抗血清の適当な希釈液１００μｌで増感して、３７℃で６０分間温置する。問題の抗血清は単分子層を形成する細胞上の特定既知抗原に特異の抗体である。次に細胞単分子層は８０ｍＭの塩化ナトリウム１００μｌ／凹所を添加することによって溶解させる、そして過剰な溶解用溶液は室温で１分間の温置に吸引によって除去する。次にそのプレ−トを適当な方法によって等張塩溶液で２回洗浄する。次に１．０モル／ｌデキスロ−スと１５４ミリモル／ｌ塩化ナトリウムから成る乾燥用溶液１００μｌを各凹所へ添加する。乾燥用溶液は直ちに吸引によって除去し、ミクロタイタ−・プレ−トを分子ふるい乾燥剤を有する箔パケットに逆さまに入れる。そのパケットを熱で密封して、４℃で７日間乾燥させる。
　赤血球表現型の検定を行うために、ミクロタイタ−・プレ−トを箔パックから取り出し、塩溶液中で予め希釈した試験赤血球の０．２〜０．３％（ｖ／ｖ）懸濁液の１滴を各凹所へ添加して、３７℃で１５分間温置する。そのミクロタイタ−・プレ−トを４５０×Ｇで１分間遠心分離した後、そのプレ−トを検査して試験赤血球の赤血球細胞単分子層への付着または非付着を判定する。陽性反応は反応表面上への細胞の付着によって見られ、試験赤血球が細胞単分子層へ増感された抗体に相補的抗原を含むことを示す。陰性反応は付着を示さない凹所の底部における赤血球の別個のボタンを形成する。このように、試験赤血球の表現型が決定される。
実施例　９
　本発明は、酵素−結合免疫吸着決定法（ＥＬＩＳＡ）によってヒトの赤血球へ向けられた予測されない抗体の検出のためのミクロタイタ−・プレ−トの調製に利用することができる。そのミクロプレ−トは実施例１のように調製する。試験血清または血漿試料中の予測されない抗体を検出するために、かかる血清または血漿の１滴を乾燥した赤血球の各凹所へ添加し、続いて低イオン強度溶液２滴を添加する。これらの溶液を凹所内で３７℃において４５分間温置させる。温置後、ミクロタイタ−・プレ−トの凹所を塩溶液で、望ましくは自動洗浄装置によって４回洗浄する。各凹所へアルカリ性のホスフアタ−ゼ共役抗−ヒトＩｇＧ溶液を添加する。その酵素共役−ＩｇＧ溶液を３７℃で１時間温置する。共役抗−ヒトｌｇＧはこれらの凹所で免疫学的に結合する。試験試料からのＩｇＧは乾燥化赤血球単分子層に結合している（陽性試験）そして次の洗浄工程で洗い落される。陰性凹所における共役抗−ヒトｌｇＧ（試験試料からのｌｇＧはいずれも乾燥化赤血球単分子層へ結合していない）は結合しなくて、次の洗浄工程で洗い落される。ミクロプレ−トの凹所は塩溶液で４回洗浄する。１０％ジエタノ−ル−ｄＨ２Ｏにｐ−ニトロフェノ−ル・ホスフア−ト（ＰＮＰＰ）の１．０ｍｇ／ｍｌから成る酵素基質の溶液１００μｌを凹所へ添加する。室温で３０分間温置した後、４０５ｎｍにおける凹所の吸光度をミクロプレ−ト分光光度計で測定する。陽性凹所において抗−ヒトＩｇＧへ共役されたアルカリ性ホスフアタ−ゼ酵素はＰＮＰＰ基質を酵素的に分解して、目で見ることができる黄緑色をもたらす。陰性凹所（アルカリ性ホスフアタ−ゼ共役抗−ＩｇＧが存在しない）においては、ＰＮＰＰ基質は酵素で分解されないので透明に見える。
　以上の記載から、本発明は前述の全ての目的を達成するのに適したものであることがわかる。
　本発明の範囲を逸脱することなく、多くの考えられる実施態様が可能であるから、本発明に示した全ての事項は説明のためのものであって、限定を意図するものではない。