(57)【要約】  本発明は、糞便中の核酸を、煩雑な操作を必要とせずに高純度に回収する方法、該方法により回収された核酸を用いて解析する方法、及び該方法に用いられる糞便試料処理装置の提供に関し、その方法は、（Ａ）採取された糞便を、水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸増幅反応阻害物質除去用溶液に添加して糞便試料を調製し、前記糞便試料を、所定時間保存することにより、核酸増幅反応阻害物質を溶出させる工程と、（Ｂ）工程（Ａ）の後、糞便試料から核酸増幅反応阻害物質除去用溶液を除去し、糞便由来固形分を回収する工程と、（Ｃ）工程（Ｂ）において回収された糞便由来固形分から核酸を回収する工程と、を有する。
2010010914.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便から核酸を高純度に回収する方法であって、
（Ａ）採取された糞便を、水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸増幅反応阻害物質除去用溶液中に添加して糞便試料を調製し、前記糞便試料を、所定時間保存することにより、核酸増幅反応阻害物質を溶出させる工程と、
（Ｂ）工程（Ａ）の後、糞便試料から核酸増幅反応阻害物質除去用溶液を除去し、糞便由来固形分を回収する工程と、
（Ｃ）工程（Ｂ）において回収された糞便由来固形分から核酸を回収する工程と、
を有することを特徴とする、糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項２】
採取された糞便を、懸濁液を作成することなく、すぐに酸増幅反応阻害物質除去用溶液中に添加して、糞便試料を調整する請求項１記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項３】
前記水溶性有機溶媒が、水溶性アルコール及び／又はケトン類である請求項１または請求項２に記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項４】
前記水溶性有機溶媒の濃度が３０％以上である請求項１〜３のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項５】
前記水溶性有機溶媒が、水溶性アルコールとして、エタノール、プロパノール、及びメタノールからなる群より選ばれる１以上を含む請求項３又は４に記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項６】
前記水溶性有機溶媒がエタノールである請求項１記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項７】
前記水溶性有機溶媒が、ケトン類として、アセトン及び／又はメチルエチルケトンを含む請求項３又は４に記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項８】
前記糞便と前記核酸増幅反応阻害物質除去用溶液の混合比率が、糞便容量１に対して核酸増幅反応阻害物質除去用溶液容量が１以上である請求項１〜７のいずれか記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項９】
前記工程（Ｂ）における糞便試料からの核酸増幅反応阻害物質除去用溶液の除去を、遠心分離法により行う請求項１〜８のいずれか記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項１０】
前記工程（Ａ）において糞便試料を保存する時間が、１時間以上である請求項１〜９のいずれか記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項１１】
前記工程（Ａ）において糞便試料を保存する時間が、１２時間以上である請求項１〜９のいずれか記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項１２】
前記工程（Ａ）において糞便試料を保存する時間が、２４時間以上である請求項１〜９のいずれか記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項１３】
前記工程（Ａ）において糞便試料を保存する時間が、７２時間以上である請求項１〜９のいずれか記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項１４】
前記工程（Ａ）において糞便試料を保存する温度が、４℃以上である請求項１〜１３のいずれか記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項１５】
前記工程（Ａ）において糞便試料を保存する温度が、２０℃以上である請求項１〜１３のいずれか記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項１６】
前記核酸増幅反応阻害物質除去用溶液が界面活性剤を含有する請求項１〜１５のいずれか記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項１７】
前記核酸増幅反応阻害物質除去用溶液が着色剤を含有する請求項１〜１６のいずれか記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項１８】
前記工程（Ｃ）が、工程（Ｂ）において回収された糞便由来固形分から、腸内常在菌由来の核酸と腸内常在菌以外の生物由来の核酸とを同時に回収する工程である請求項１〜１７のいずれか記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項１９】
前記腸内常在菌以外の生物が、哺乳細胞である請求項１８記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項２０】
前記工程（Ｃ）が、
（ａ）工程（Ｂ）において回収された糞便由来固形分中のタンパク質を変性させ、前記糞便由来固形分中の腸内常在菌及び腸内常在菌以外の生物から、核酸を溶出させる工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において溶出させた核酸を回収する工程と、
を有する請求項１〜１９のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項２１】
前記工程（ａ）の後、前記工程（ｂ）の前に、
（ｃ）前記工程（ａ）により変性させたタンパク質を除去する工程と、
を有する請求項２０に記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項２２】
前記工程（ａ）におけるタンパク質の変性が、カオトロピック塩、有機溶媒、及び界面活性剤からなる群より選ばれる１以上を用いて行われる請求項２０又は２１に記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項２３】
前記有機溶媒がフェノールである請求項２２に記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項２４】
前記工程（ｃ）における変性させたタンパク質の除去が、クロロホルムを用いて行われる請求項２１〜２３のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項２５】
前記工程（ｂ）における核酸の回収が、
（ｂ１）前記工程（ａ）において溶出させた核酸を無機支持体に吸着させる工程と、
（ｂ２）前記工程（ｂ１）において吸着させた核酸を無機支持体から溶出させる工程と、を有することを特徴とする請求項２０〜２４のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法により回収された核酸。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれかに記載の核酸回収方法を用いて糞便試料から回収された核酸を用いて、哺乳細胞由来の核酸を解析する核酸解析方法。
【請求項２８】
前記哺乳細胞が消化管細胞である請求項２７に記載の核酸解析方法。
【請求項２９】
前記哺乳細胞が大腸剥離細胞である請求項２７に記載の核酸解析方法。
【請求項３０】
前記哺乳細胞由来の核酸が、新生物性転化を示すマーカーである請求項２７〜２９のいずれかに記載の核酸解析方法。
【請求項３１】
前記哺乳細胞由来の核酸が、炎症性消化器疾患を示すマーカーである請求項２７〜２９のいずれかに記載の核酸解析方法。
【請求項３２】
前記解析が、ｍＲＮＡの発現解析、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異解析、及びＤＮＡのメチル化の解析からなる群より選択される１以上である、請求項２７〜３１のいずれかに記載の核酸解析方法。
【請求項３３】
採取された糞便を、水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸増幅反応阻害物質除去用溶液に浸漬させて所定時間保存した糞便試料から、前記核酸増幅反応阻害物質除去用溶液を除去する溶液除去機構を含む、糞便試料処理装置。
【請求項３４】
前記溶液除去機構が、遠心分離機構と、溶液吸引排出機構と、廃液回収部とを有する請求項３３に記載の糞便試料処理装置。
【請求項３５】
前記溶液吸引排出機構が溶液吸引排出ノズルであり、前記溶液吸引排出ノズルを洗浄する機構をさらに有する、請求項３４に記載の糞便試料処理装置。
【請求項３６】
核酸回収用糞便試料を調製するために用いられる溶液であって、水溶性有機溶媒を有効成分とし、回収される核酸中の核酸増幅反応阻害物質を低下させる、核酸増幅反応阻害物質除去用溶液。
【請求項３７】
前記水溶性有機溶媒が、水溶性アルコール及び／又はケトン類である請求項３６に記載の核酸増幅反応阻害物質除去用溶液。
【請求項３８】
前記水溶性有機溶媒の濃度が３０％以上である、請求項３７に記載の核酸増幅反応阻害物質除去用溶液。
【請求項３９】
請求項３６〜３８のいずれかに記載の核酸増幅反応阻害物質除去用溶液と、当該核酸増幅反応阻害物質除去用溶液を含有する採便容器と、を有する採便用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糞便試料から核酸を高純度に回収するための糞便試料からの核酸回収方法、該核酸回収方法により回収された核酸を用いた核酸解析方法、及び糞便試料処理装置に関する。
本願は、２００８年７月２３日に、日本に出願された特願２００８−１８９６８４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
欧米と同様に日本においても、大腸がんの患者数は、年々急激に増加しており、大腸がんが、がん死亡率の上位を占めている。これは、日本人の食生活が欧米型の肉食中心となったことに原因があると考えられる。具体的には、毎年約６万人程度が大腸がんに罹患しており、臓器別の死亡数でも、胃がん、肺がんに続く３番目の多さであり、今後更なる増加も予想されている。一方で、大腸がんは、他のがんと異なり、発症の初期に治療することにより、１００％近く治癒可能である。したがって、大腸がんを早期がん検診の対象とすることは極めて有意義であり、大腸がんの早期発見のための検査方法の研究・開発が盛んに行われている。【０００３】
大腸がんの早期発見のための検査方法として、例えば、注腸検査、大腸内視鏡検査等が行われている。注腸検査とは、大腸にバリウムを注入し、大腸の粘膜面に付着させ、Ｘ線を照射しその表面の凹凸の撮影を行い、大腸の表面を観察する検査である。一方、大腸内視鏡検査とは、内視鏡により直接大腸内部を観察する検査である。特に大腸内視鏡検査は、感度や特異性が高く、ポリープや早期がんの切除も可能であるという利点も有している。しかしながら、これらの検査方法は、コストが高い上に被験者への負担が大きく、合併症のリスクを伴うという問題がある。例えば、注腸検査には、Ｘ線被爆や腸閉塞の危険性がある。また、大腸内視鏡検査は、内視鏡を直接大腸内に投入するため侵襲的である。更に、内視鏡操作には熟練を要し、検査のできる施設が限られている。このため、これらの検査方法は、定期健診等の無症状の一般人を対象とした大腸がん検査に適していない。【０００４】
近年、大腸がんの一次スクリーニング法として、非侵襲的で低コストである便潜血検査が広く実施されている。便潜血検査は、糞便中に含まれる赤血球由来のヘモグロビンの有無を調べる検査であり、間接的に大腸がんの存在を予測する方法である。便潜血検査が広く利用される理由としては、便の採取や保存を常温で行うことができ、冷蔵・冷凍等の特別な保存条件も必要としないこと、及び、一般的な家庭で簡単に行うことができ、操作が非常に簡便であることが挙げられる。但し、便潜血検査では、感度が２５％程度と低く、大腸がんを見落とす確率が高いという問題がある。さらに、陽性の的中率も低く、便潜血検査陽性の被験者の中で実際に大腸がん患者である割合は１０％以下であり、多くの偽陽性を含んでいる。このため、より信頼性の高い新たな検査法の開発が強く望まれている。【０００５】
定期健診等にも適した、非侵襲的で簡便であり、かつ信頼性の高い新たな検査方法として、糞便中のがん細胞の有無やがん細胞由来遺伝子の有無を調べる検査が注目されている。これらの検査方法は、がん細胞やがん細胞由来遺伝子の有無を直接調べるため、大腸がんの罹患に伴い生じる消化管からの出血の有無を調べる間接的な大腸がん検査方法である便潜血検査法に比べて、より信頼性の高い検査法になると期待できる。【０００６】
糞便中のがん細胞等を精度よく検出するためには、糞便中のがん細胞由来核酸を効率よく回収することが重要である。特に、糞便中のがん細胞由来核酸は微量であり、かつ、糞便中には、消化残留物やバクテリアが大量に含まれているため、核酸は非常に分解されやすい。このため、糞便試料から核酸、特にヒト等の哺乳細胞由来の核酸を効率よく回収するためには、糞便中の核酸の分解を防止し、検査操作時まで安定して保存できるように糞便試料を調製することが重要である。このような糞便試料の調製方法として、例えば、採取された糞便から、大腸等の消化管から剥離したがん細胞を分離する方法がある。糞便からがん細胞を分離することにより、バクテリア等由来のプロテアーゼやＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ等の分解酵素による影響を抑えることができる。糞便からがん細胞を分離する方法として、例えば、（１）糞便から細胞を分離する方法であって、ａ）便をそのゲル氷点未満の温度に冷却する工程と、ｂ）便が実質的に完全な状態を残すように、便をそのゲル氷点未満の温度に維持しながら便から細胞を採取する工程と、を含む方法が開示されている（例えば特許文献１参照。）。その他、（２）通常周囲温度で、プロテアーゼ阻害物質、粘液溶解剤、殺菌剤を有する輸送培地に糞便を分散させた後、大腸剥離細胞を単離する方法が開示されている（例えば特許文献２参照。）。【０００７】
また、糞便中には、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等の核酸増幅反応に対して阻害作用を有する物質（例えば胆汁酸やその塩等）が含まれている（例えば、非特許文献１参照。）。例えば、大人の平均的な排泄糞便量は、約２００〜４００ｇ／日であるが、健常人ではその糞便中に２００〜６５０ｍｇ／日、また、回腸障害を伴う患者の場合は、その１０倍もの胆汁酸が、排泄されるという報告がある。すなわち、便１ｇあたりに換算した場合、健常人で約０．５ｍｇ〜３．２５ｍｇ、患者でその１０倍の胆汁酸が含まれる。
一方で、胆汁酸塩によるＰＣＲの阻害効果は、５０μｇ／ｍＬ程度の濃度で生じるとの報告もある。したがって、糞便から核酸を抽出し、それをＰＣＲ等で増幅する場合は、増幅効率を向上させるために、胆汁酸塩等の核酸増幅反応における阻害物質のキャリーオーバーを防止することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表平１１−５１１９８２号公報
【特許文献２】特表２００４−５１９２０２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ウィルソン（Wilson IG）、アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY）、１９９７年、第６３巻、第３７４１〜５１ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記（１）の方法においては、糞便試料を冷却しながら細胞を分離している。この分離操作を冷却せずに行うと、糞便試料の変質等により正しい検出結果を得ることができない。したがって、糞便試料の変質を効果的に防止するためには、採便直後に冷却することが重要である。しかしながら、検診等のように家庭において採便が行われる場合には、採取後速やかに糞便試料を冷却することは非常に困難であり、現実的ではない。また、糞便試料から細胞を分離する作業は煩雑であり、検査にかかる費用の拡大につながるという問題がある。
上記（２）の方法では、殺菌剤等を添加することにより、冷却操作を必要とせず、室温で糞便試料の調製や保存が可能であるものの、糞便から大腸剥離細胞を分離する作業を要するため、やはり作業性に劣り、結果、コストがかかるという問題がある。【００１１】
さらに、特許文献１及び２、並びに、非特許文献１には、糞便から核酸を回収する際の、胆汁酸や胆汁酸塩等の核酸増幅反応における阻害物質のキャリーオーバーを防止することについては、一切記載されていない。【００１２】
本発明は、糞便中の核酸を、胆汁酸等の核酸増幅反応における阻害物質のキャリーオーバーを低減し、煩雑な操作を必要とせずに高純度に回収する方法；その方法により回収された核酸を用いて解析する方法；並びにこの回収および解析方法に用いられる糞便試料処理装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決する為に、核酸抽出工程に先立って、採取された糞便を、水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸増幅反応における阻害物質除去用の溶液に浸漬させて所定時間保存することにより、糞便中に含まれている核酸増幅反応における阻害物質を溶出して除去し、糞便から核酸を高純度に回収できることを見出した。【００１４】
すなわち、本発明は、
（１）糞便から核酸を高純度に回収する方法であって、
（Ａ）採取された糞便を、水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸増幅反応における阻害物質の除去用溶液に添加して糞便試料を調製し、前記糞便試料を、所定時間保存することにより、核酸増幅反応阻害物質を溶出させる工程と、
（Ｂ）工程（Ａ）の後、糞便試料から核酸増幅反応における阻害物質の除去用溶液を除去し、糞便由来固形分を回収する工程と、
（Ｃ）工程（Ｂ）において回収された糞便由来固形分から核酸を回収する工程と、を有する糞便試料からの核酸回収方法；を含む。【００１５】
（２）上記（１）に記載の糞便試料からの核酸回収方法で採取された糞便を、懸濁液を作成することなく、すぐに核酸増幅反応阻害物質除去用溶液中に添加して、糞便試料を調整しても良い。【００１６】
（３）上記（１）または（２）に記載の糞便試料からの核酸回収方法で用いられる前記水溶性有機溶媒は、水溶性アルコール及び／又はケトン類であることが好ましい。【００１７】
（４）上記（１）〜（３）に記載の糞便試料からの核酸回収方法で用いられる前記水溶性有機溶媒の濃度は３０％以上であることが好ましい。【００１８】
（５）上記（３）又は（４）に記載の糞便試料からの核酸回収方法で用いられる前記水溶性有機溶媒は、水溶性アルコールとして、エタノール、プロパノール、及びメタノールからなる群より選ばれる１以上を含むことが好ましい。【００１９】
（６）上記（１）に記載の糞便試料からの核酸回収方法で用いられる前記水溶性有機溶媒がエタノールであることが好ましい。【００２０】
（７）上記（３）又は（４）に記載の糞便試料からの核酸回収方法で用いられる前記水溶性有機溶媒は、ケトン類として、アセトン及び／又はメチルエチルケトンを含むことが好ましい。【００２１】
（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法で用いられる前記糞便と前記核酸増幅反応阻害物質除去用溶液の混合比率が、糞便容量を１とすると、その１に対して核酸増幅反応阻害物質除去用溶液容量が１以上であることが好ましい。【００２２】
（９）上記（１）〜（８）のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法の前記工程（Ｂ）における糞便試料からの核酸増幅反応阻害物質除去用溶液の除去を、遠心分離法により行うことが好ましい。【００２３】
（１０）上記（１）〜（９）のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法の前記工程（Ａ）において糞便試料を保存する時間が、１時間以上であることが好ましい。【００２４】
（１１）上記（１）〜（９）のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法の前記工程（Ａ）において糞便試料を保存する時間が、１２時間以上であることが好ましい。【００２５】
（１２）上記（１）〜（９）のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法の前記工程（Ａ）において糞便試料を保存する時間が、２４時間以上であることが好ましい。【００２６】
（１３）上記（１）〜（９）のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法の前記工程（Ａ）において糞便試料を保存する時間が、７２時間以上であることが好ましい。【００２７】
（１４）上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法の前記工程（Ａ）において糞便試料を保存する温度が、４℃以上であることが好ましい。【００２８】
（１５）上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法の前記工程（Ａ）において糞便試料を保存する温度が、２０℃以上であることが好ましい。【００２９】
（１６）上記（１）〜（１５）のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法で用いられる前記核酸増幅反応阻害物質除去用溶液は界面活性剤を含有することが好ましい。【００３０】
（１７）上記（１）〜（１６）のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法で用いられる前記核酸増幅反応阻害物質除去用溶液は着色剤を含有することが好ましい。【００３１】
（１８）上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法の前記工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）において回収された糞便由来固形分から、腸内常在菌由来の核酸と腸内常在菌以外の生物由来の核酸とを同時に回収する工程であることが好ましい。【００３２】
（１９）上記（１８）に記載の糞便試料からの核酸回収方法で用いられる前記腸内常在菌以外の生物が、哺乳細胞であることが好ましい。【００３３】
（２０）上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法の前記工程（Ｃ）が、
（ａ）工程（Ｂ）において回収された糞便由来固形分中のタンパク質を変性させ、前記糞便由来固形分中の腸内常在菌及び腸内常在菌以外の生物から、核酸を溶出させる工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において溶出させた核酸を回収する工程と、を有することが好ましい。【００３４】
（２１）上記（２０）に記載の糞便試料からの核酸回収方法の前記工程（ａ）の後、前記工程（ｂ）の前に、
（ｃ）前記工程（ａ）により変性させたタンパク質を除去する工程と、を有することが好ましい。【００３５】
（２２）上記（２０）又は（２１）に記載の糞便試料からの核酸回収方法の前記工程（ａ）におけるタンパク質の変性が、カオトロピック塩、有機溶媒、及び界面活性剤からなる群より選ばれる１以上を用いて行われることが好ましい。【００３６】
（２３）上記（２２）に記載の糞便試料からの核酸回収方法で用いられる前記有機溶媒がフェノールであることが好ましい。【００３７】
（２４）上記（２１）〜（２３）のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法の前記工程（ｃ）における変性させたタンパク質の除去が、クロロホルムを用いて行われることが好ましい。【００３８】
（２５）上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載の糞便試料からの核酸回収方法の前記工程（ｂ）における核酸の回収が、
（ｂ１）前記工程（ａ）において溶出させた核酸を無機支持体に吸着させる工程と、
（ｂ２）前記工程（ｂ１）において吸着させた核酸を無機支持体から溶出させる工程と、を有することが好ましい。【００３９】
（２６）また、本発明は、前記（１）〜（２５）のいずれか記載の糞便試料からの核酸回収方法により回収された核酸である。【００４０】
（２７）また、本発明は、前記（１）〜（２６）のいずれか記載の核酸回収方法を用いて糞便試料から回収された核酸を用いて、哺乳細胞由来の核酸を解析する核酸解析方法である。【００４１】
（２８）上記（２７）に記載の核酸解析方法で用いられる前記哺乳細胞は、消化管細胞であることが好ましい。【００４２】
（２９）上記（２７）に記載の核酸解析方法で用いられる前記哺乳細胞は、大腸剥離細胞であることが好ましい。【００４３】
（３０）上記（２７）〜（２９）のいずれかに記載の核酸解析方法で解析される前記哺乳細胞由来の核酸は、新生物性転化を示すマーカーであることが好ましい。【００４４】
（３１）上記（２７）〜（２９）のいずれかに記載の核酸解析方法で解析される前記哺乳細胞由来の核酸は、炎症性消化器疾患を示すマーカーであることが好ましい。【００４５】
（３２）上記（２７）〜（３１）のいずれかに記載の核酸解析方法における解析が、ｍＲＮＡの発現解析、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異解析、及びＤＮＡのメチル化の解析からなる群より選択される１以上であることが好ましい。【００４６】
（３３）また、本発明は、採取された糞便を、水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸増幅反応阻害物質除去用溶液に浸漬させて所定時間保存した糞便試料から、前記核酸増幅反応阻害物質除去用溶液を除去する溶液除去機構と；を含む糞便試料処理装置である。【００４７】
（３４）上記（３３）に記載の糞便試料処理装置における前記溶液除去機構が、遠心分離機構と、溶液吸引排出機構と、廃液回収部と、を有することが好ましい。【００４８】
（３５）上記（３４）に記載の糞便試料処理装置における前記溶液吸引排出機構が溶液吸引排出ノズルであり、前記溶液吸引排出ノズルを洗浄する機構をさらに有することが好ましい。【００４９】
（３６）本発明は、核酸回収用糞便試料を調製するために用いられる溶液であって、水溶性有機溶媒を有効成分とし、回収される核酸中の核酸増幅反応阻害物質を低下させる核酸増幅反応阻害物質除去用溶液である。【００５０】
（３７）上記（３６）に記載の核酸増幅反応阻害物質除去用溶液中の前記水溶性有機溶媒が、水溶性アルコール及び／又はケトン類であることが好ましい。【００５１】
（３８）上記（３７）に記載の核酸増幅反応阻害物質除去用溶液中の前記水溶性有機溶媒の濃度が、３０％以上であることが好ましい。【００５２】
（３９）本発明は、前記（３６）〜（３８）のいずれか記載の核酸増幅反応阻害物質除去用溶液と、当該核酸増幅反応阻害物質除去用溶液を含有する採便容器と、を有する採便用キットである。
【発明の効果】
【００５３】
本発明の糞便試料からの核酸回収方法により、糞便に含まれている核酸増幅反応阻害物質を効率よく溶出除去し、糞便試料から純度の高い核酸を回収することができる。また、本発明によれば、糞便試料から、哺乳細胞等の検出の対象である生物又はその細胞等を分離するという煩雑な操作を必要としないため、多数の検体を処理する場合であっても、労力とコストを効果的に低減することができる。特に、本発明の糞便試料処理装置を用いることにより、より簡便に糞便試料から核酸を回収することが可能となる。
このように、本発明の糞便試料からの核酸回収方法、およびこの回収方法により回収された核酸を用いた核酸解析方法を用いることにより、糞便中の核酸を高感度かつ高精度に解析することができる。従って、本発明を用いることにより、大腸がんをはじめ、様々な症状や疾患の早期発見や診断、治療経過の観察、及び他の異常な容態の病理学的研究等に資することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の糞便試料処理装置の一実施形態を示した図である。
【図２】本発明の採便用キットに用いることができる採便容器Ａの一実施形態を示した図である。
【図３】本発明の採便用キットに用いることができる採便容器Ｂの一実施形態と、その使用方法の一例を示した図である。
【図４】実施例１において、抽出したＲＮＡ溶液１００μＬあたりの胆汁酸量を示した図である。
【図５】実施例２において、デオキシコール酸ナトリウム濃度を横軸とし、ＧＡＰＤＨ増幅量を縦軸として、測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明において、核酸増幅反応阻害物質とは、核酸増幅反応に対して阻害的に作用する物質であり、具体的には、胆汁酸、胆汁酸塩等が挙げられる。以下、核酸増幅反応阻害物質を略して阻害物質Ａと呼ぶ。なお、本発明において、核酸増幅反応とは、ＰＣＲ等のようなＤＮＡポリメラーゼによる核酸伸長を伴う増幅反応を意味する。
【００５６】
本発明の糞便試料からの核酸回収方法（以下、「本発明の核酸回収方法」ということがある。）は、採取された糞便を、水溶性有機溶媒を有効成分とする阻害物質Ａの除去用溶液に混合させた後、所定時間保存する。糞便を阻害物質Ａの除去用溶液に混合させた状態で所定時間保存することにより、糞便に含まれている胆汁酸や胆汁酸塩等の阻害物質Ａを効率よく溶出除去できる。これにより、糞便試料から回収される核酸への阻害物質Ａのキャリーオーバーが顕著に低減され、純度の高い核酸を回収できる。
【００５７】
水溶性有機溶媒による上述した阻害物質Ａ量の低減効果、すなわち、回収される核酸への阻害物質Ａのキャリーオーバーを低減できる効果は、水溶性有機溶媒に対する阻害物質Ａと核酸の溶解性の差に起因するものと推察される。すなわち、胆汁酸等の阻害物質Ａは、アルコール等の水溶性有機溶媒には溶解しやすいが、非極性有機溶媒には溶けにくい。一方、核酸はアルコール中では塩の効果で不溶化し、アルコール等の水溶性有機溶媒には溶解しにくい。したがって、糞便をアルコール等の水溶性有機溶媒に混合させると、阻害物質Ａを水溶性有機溶媒中に溶出させ、水溶性有機溶媒成分に不溶な核酸との分離が可能となるため、回収された核酸中の阻害物質Ａ量が低減されると推察される。
【００５８】
本発明の核酸回収方法は、具体的には、まず、工程（Ａ）として、採取された糞便を、水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸増幅反応阻害物質除去用溶液（以下、除去用溶液Ｓと略す）に添加して糞便試料を調製する。その後、調製された前記糞便試料を、所定時間保存することにより、阻害物質Ａを溶出させる。
【００５９】
本発明の核酸回収方法において用いられる除去用溶液Ｓは、水溶性有機溶媒が有効成分である。糞便等の生体試料は、通常多量の水分を含有しているが、除去用溶液Ｓは、水に対する溶解度が高い溶媒や、水と任意の割合で混合可能である水溶性有機溶媒を有効成分としている。そのため、糞便試料と速やかに混合することができ、より高い阻害物質Ａ量の低減効果を得ることができる。
【００６０】
本発明において水溶性有機溶媒とは、アルコール類又はケトン類であって、直鎖構造を有し、室温付近、例えば１５〜４０℃において液状である溶媒である。なお、本発明における水溶性有機溶媒には、有機酸は含まれない。直鎖構造を有する水溶性有機溶媒を有効成分とすることにより、ベンゼン環等の環状構造を有する有機溶媒を有効成分とするよりも、糞便との混合を素早く行うことができる。環状構造を有する有機溶媒は、一般的に水と分離しやすいため、糞便と混合しにくく、高い阻害物質Ａ量の低減効果を得ることは難しい。たとえ水にある程度溶解する環状構造を有する有機溶媒であったとしても、糞便を均一に分散させるためには、激しく混合したり、加温する必要がある。なお、糞便と環状構造を有する有機溶媒を混合しやすくするために、あらかじめ、有機溶媒と水の混合溶液を作製した後、糞便と該混合溶液を混合させることも考えられる。しかしながら、該混合溶液を作製するためには、環状構造を有する有機溶媒と水を激しく混合したり、加温する必要があり、好ましくない。
【００６１】
除去用溶液Ｓに含まれる水溶性有機溶媒としては、水に対する溶解度が１２重量％以上の水溶性有機溶媒であることが好ましく、より好ましくは、水に対する溶解度が２０重量％以上であり、更に好ましくは水に対する溶解度が９０重量％以上であり、水と任意の割合で混合可能である水溶性有機溶媒であることが特に好ましい。水と任意の割合で混合可能である水溶性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、アセトン等がある。
【００６２】
除去用溶液Ｓに含まれる水溶性有機溶媒は、上記定義を満たし、核酸の溶解性は低いが、阻害物質Ａが溶解する溶媒であれば特に限定されない。該水溶性有機溶媒として、例えば、アルコール類としては、水溶性アルコールであるメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、メルカプトエタノール等があり、ケトン類としては、アセトン、メチルエチルケトン（水に対する溶解度９０重量％）等がある。プロパノールは、ｎ−プロパノールでもよく、２−プロパノールでもよい。また、ブタノールは、１−ブタノール（水に対する溶解度２０重量％）でよく、２−ブタノール（水に対する溶解度１２．５重量％）でもよい。
【００６３】
除去用溶液Ｓに含まれる水溶性有機溶媒としては、アルコール類又はケトン類であることが好ましく、水溶性アルコール、アセトン、及びメチルエチルケトンからなる群より選択される１以上であることがより好ましい。これらの溶媒は、胆汁酸塩等の阻害物質Ａの溶解性が高く、より優れた阻害物質Ａ量の低減効果が得られる。更に、入手が容易であり、取り扱い易さ、安全性等の点から、水溶性アルコールがより好ましく、エタノール、プロパノール、メタノールがさらに好ましい。特にエタノールは、最も安全性が高く、家庭内でも容易に扱うことが可能であるため、定期健診等のスクリーニング検査において特に有用である。
【００６４】
除去用溶液Ｓ中の水溶性有機溶媒濃度は、阻害物質Ａ量の低減効果を奏することができる濃度であれば特に限定されるものではなく、水溶性有機溶媒の種類等を考慮して、適宜決定できる。例えば、有効成分として、水溶性アルコールやケトン類を用いる場合には、除去用溶液Ｓの水溶性有機溶媒濃度は３０％以上であることが好ましい。水溶性有機溶媒濃度が充分に高濃度であることにより、糞便と除去用溶液Ｓを混合した場合に、糞便に水溶性有機溶媒成分が迅速に浸透し、阻害物質Ａの除去効果を速やかに奏することができる。
なお、本発明及び本願明細書中においては、特に記載がない限り、「％」は「体積％」を意味する。
【００６５】
特に、有効成分として、水溶性アルコールを用いる場合には、除去用溶液Ｓの水溶性有機溶媒濃度は３０％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５０〜８０％であることがさらに好ましく、５０％以上７０％未満であることが特に好ましい。水溶性有機溶媒濃度が高ければ、水分含量の多い糞便に対しても少量の除去用溶液Ｓで済み、充分な阻害物質Ａ量の低減効果を奏することができる。
【００６６】
また、有効成分として、アセトン、メチルエチルケトンを用いる場合には、本発明の除去用溶液Ｓの水溶性有機溶媒濃度は３０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましい。
【００６７】
その他、本発明において用いられる水溶性有機溶媒は、１種類の水溶性有機溶媒のみの含有でもよく、２種類以上の水溶性有機溶媒の混合溶液であってもよい。例えば、２種類以上のアルコールの混合溶液でもよく、アルコールと他種類の水溶性有機溶媒との混合溶液でもよい。更に、阻害物質Ａ量の低減効率及び核酸回収効率がより改善されることから、アルコールとアセトンの混合溶液でも好ましい。
【００６８】
採取された糞便に添加される除去用溶液Ｓの容量は、特に限定されないが、糞便と除去用溶液Ｓの混合比率は、糞便容量を１とすると、その１に対して除去用溶液Ｓの容量が１以上であることが好ましい。除去用溶液Ｓ入りの採便容器に糞便を入れる場合に、糞便と等量以上の除去用溶液Ｓであれば、糞便の全周囲を除去用溶液Ｓに浸漬させることができ、本発明の効果を効率よく得られるためである。例えば、糞便と除去用溶液Ｓが等量である場合には、除去用溶液Ｓ入り採便容器の軽量化・小型化が可能となる。一方で、糞便に対して、５倍以上の容量の除去用溶液Ｓを添加することにより、除去用溶液Ｓ中への糞便の分散を迅速かつ効果的に行うことができる。さらに、この容量によって、糞便に含有されている水分による水溶性有機溶媒濃度の低下を抑えることもできる。除去用溶液Ｓ入りの採便容器の軽量化と糞便の分散性の向上との、両方の効果をバランス良く備える目的で、糞便と除去用溶液Ｓの混合比率が、１：１〜１：２０であることがより好ましく、１：３〜１：１０であることがさらに好ましく１：５程度であることがより好ましい。
【００６９】
なお、本発明の核酸回収方法に供される糞便は、動物のものであれば特に限定されないが、哺乳動物由来のものが好ましく、ヒト由来のものがより好ましい。例えば、定期健診や診断等のために採取されたヒトの糞便であることが好ましいが、家畜や野生動物等の糞便であってもよい。また、試料となる糞便は、採取後一定期間保存されたものでもよいが、採取直後のものが好ましい。さらに、採取される糞便は、排泄直後のものが好ましいが、排泄後時間を経たものでもよい。
【００７０】
本発明の核酸回収方法に供される糞便の量は、特に限定されないが、１０ｍｇ〜１ｇの範囲が好ましい。糞便量があまりに多くなってしまうと、採取作業に手間がかかり、採便容器も大きくなってしまうため、取り扱い性等が低下するおそれがある。逆に糞便量があまりに少量である場合には、糞便中に含まれる大腸剥離細胞等の哺乳細胞数が少なくなりすぎるため、必要な核酸量を回収できず、目的の核酸解析の精度が低下するおそれがある。また、糞便はヘテロジニアスである、つまり、多種多様な成分が不均一に存在しているため、哺乳細胞の局在の影響を避けるために、採糞時には、糞便の広範囲から採取することが好ましい。
【００７１】
除去用溶液Ｓは、水溶性有機溶媒を適宜希釈し、所望の濃度に調整することにより得られる。希釈に用いる溶媒は特に限定されないが、水又はＰＢＳ等の緩衝液であることが好ましい。また、除去用溶液Ｓは、水溶性有機溶媒成分による阻害物質Ａ量の低減効果を損なわない限り、水溶性有機溶媒以外にも、任意の成分を含んでいてもよい。例えば、カオトロピック塩を含有してもよく、界面活性剤を含有しても良い。カオトロピック塩や界面活性剤を含有することにより、糞便中の細胞活性や各種分解酵素の酵素活性をより効果的に阻害できる。
【００７２】
除去用溶液Ｓに含まれるカオトロピック塩としては、例えば、塩酸グアニジン、グアニジンイソチオシアネート、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びトリクロロ酢酸ナトリウム等がある。除去用溶液Ｓに含まれる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤であることが好ましい。この非イオン性界面活性剤としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ＣＨＡＰＳ（３−［３−コラミドプロピルジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホネート）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０等がある。カオトロピック塩や界面活性剤の種類や濃度は、阻害物質Ａ量の低減効果が得られる濃度であれば、特に限定されるものではなく、糞便量やその後の工程及び解析方法等を考慮して、適宜決定できる。
【００７３】
その他、除去用溶液Ｓには、適宜着色剤を添加してもよい。除去用溶液Ｓを着色することにより、誤飲防止、糞便の色が緩和される等の効果が得られる。その着色剤としては、食品添加物として使用される着色料が好ましく、青色や緑色等が好ましい。例えば、ファストグリーンＦＣＦ（緑色３号）、ブリリアントブルーＦＣＦ（青色１号）、インジゴカルミン（青色２号）等が挙げられる。また、複数の着色剤を混合して添加してもよく、単独で添加しても良い。
【００７４】
糞便を除去用溶液Ｓに添加した後、糞便と除去用溶液Ｓを混合させることにより、より高い阻害物質Ａ量の低減効果を得ることができる。糞便と除去用溶液Ｓとの混合は、十分に行われ、かつ採便者が簡便に行なえる方法が好ましい。糞便を十分に除去用溶液Ｓ中に分散させることにより、水溶性有機溶媒成分を糞便に十分に浸透させることができ、除去用溶液Ｓ中に、糞便中の阻害物質Ａを十分に溶出させるためである。なお、糞便と除去用溶液Ｓを混合する方法は、物理的手法により混合する方法であれば、特に限定されない。例えば、予め除去用溶液Ｓを入れておいた密閉可能な容器に、採取された糞便を投入して密閉した後、その容器を上下に転倒させることにより混合してもよく、その容器をボルテックス等の振とう機にかけることにより混合してもよい。また、糞便と除去用溶液Ｓを、混合用粒子の存在下で混合してもよい。この混合方法は、速やかにかつ十分に混合させる為に、振とう機を用いる方法や、混合用粒子を用いる方法が好ましい。特に、予め混合用粒子を含有させた採便容器を用いることにより、家庭等の特殊な装置のない環境においても簡便かつ十分に混合できる。
【００７５】
混合用粒子としては、水溶性有機溶媒成分による阻害物質Ａ量の低減効果を損なわない組成物であって、糞便と衝突することにより、糞便を迅速かつ十分に除去用溶液Ｓ中に分散させることができる硬度や比重を有する粒子であれば、特に限定されない。更に、混合用粒子は１種類の材質からなる粒子でもよく、２種類以上の材質からなる粒子でもよい。このような混合用粒子として、例えば、ガラス、セラミックス、プラスチック、ラテックス、金属等からなる粒子がある。その他、混合用粒子は、磁性粒子でもよく、非磁性粒子でもよい。
【００７６】
糞便を除去用溶液Ｓに添加し、糞便が除去用溶液Ｓに浸漬させた状態にすることにより、阻害物質Ａ量の低減効果は奏される。
このため、糞便除去用溶液Ｓに添加した直後に、糞便と除去用溶液Ｓを混合させることは必ずしも必要ではなくなる。さらに、糞便を除去用溶液Ｓに浸漬させた状態にすることにより、保存時に輸送される場合に、この輸送中の振動により混合される。
【００７７】
このように、糞便から阻害物質Ａを溶出させるため、除去用溶液Ｓに糞便を浸漬させて得られた糞便試料を、所定時間保存する。糞便試料を保存する時間は、阻害物質Ａ量の低減効果を奏することができる時間であれば、特に限定されるものではなく、水溶性有機溶媒の種類や濃度、糞便と除去用溶液Ｓとの混合比、保存温度等を考慮して適宜決定することができる。本発明の核酸回収方法においては、この糞便試料の保存時間は、１時間以上保存することが好ましく、１２時間以上保存することがより好ましく、２４時間以上保存することがさらに好ましく、７２時間以上保存することが特に好ましい。また、１６８時間以上保存してもよい。例えば、該糞便試料を少なくとも１時間以上保存することにより、一般的なＰＣＲの反応条件において、糞便からの阻害物質Ａのキャリーオーバーによる影響を十分に抑制し得る程度まで、阻害物質Ａ量を溶出できる。
【００７８】
水溶性有機溶媒による阻害物質Ａ量の低減効果は、糞便試料を保存する温度が低温の場合よりも、むしろ温度が高いほうが高い効果が得られる。具体的には、本発明においては、工程（Ａ）における糞便試料の保存温度は、４℃以上であることが好ましく、２０℃以上であることがより好ましい。但し、保存温度は、５０℃以下で行うことが好ましい。この理由は、５０℃以上の高温条件下で長期間保存することにより、揮発等により、その糞便試料中の水溶性有機溶媒の濃度が、阻害物質Ａ量の低減効果を奏するに充分な濃度よりも低下するおそれがあるためである。
【００７９】
本発明の核酸回収方法においては、糞便試料の保存温度は、４℃以上であれば阻害物質Ａ量の低減効果を奏することができる。すなわち、工程（Ａ）における保存は、恒温装置等を用いて温度制御された環境下で行ってもよいが、温度制御された特別な環境を必要とせず、室温で行ってもよい。また、通常糞便の採取や糞便試料の輸送等が行われる温度で行うこともできる。したがって、例えば、工程（Ａ）において調製された糞便試料を、温度非制御下で輸送する場合であっても、この輸送期間を保存期間とすることができる。より具体的には、定期健診等の場合のように、採便者が糞便試料を調製する場所と核酸抽出操作を行う場所とが離れており、調製された糞便試料が核酸抽出操作を行う場所に輸送される場合に、輸送時の温度が４〜５０℃であれば、温度制御の有無にかかわらず、この輸送時間を工程（Ａ）における保存時間とすることができる。
【００８０】
糞便から回収された核酸中の阻害物質Ａの量を低減させるためには、核酸抽出後に阻害物質Ａの溶出除去操作を行うことも可能である。しかしながら、臨床検体の検査を行なう場合、こうした検査工程の増加は、人件費の増加に直結する。
これに対して、本発明の核酸回収方法を用いた場合には、採便者が、採便後に、糞便をそのまま除去用溶液Ｓに浸漬させて、阻害物質を溶出除去する工程を、検査場における検査工程前に行うことが可能である。したがって、本発明の核酸回収方法は、臨床検査等におけるコストの削減にもつながることが期待できる。
【００８１】
また、上述したように、糞便中の核酸は非常に分解されやすい。このため、通常は、糞便試料は調製された後、速やかに核酸回収・解析工程に供される。また、糞便試料調製時と核酸回収・解析時との時間間隔が長い場合には、核酸分解の進行を抑制するために、糞便試料は冷凍・冷蔵等の低温環境下で保存される。しかしながら、本発明の核酸回収方法においては、糞便試料を調製後、室温等の比較的温度の高い環境下で長時間保存した場合であっても、その糞便試料から核酸を非常に効率よく回収できる。これは、糞便を、水溶性有機溶媒に混合させることにより、糞便中に含まれる核酸の分解等を防止し、核酸を安定して保持するためであり、水溶性有機溶媒によるこのような核酸を効率良く回収すること、すなわち、核酸の分解等を防止し、核酸を安定して保持し、効率良く回収することは、以下の理由により得られると推察される：
（１）水溶性有機溶媒成分が有する脱水作用により、哺乳細胞やウィルス等の検出対象である核酸を有する腸内常在菌以外の生物の細胞が活性される為、      
（２）腸内常在菌の細胞活性が顕著に低下して経時的な変化が抑制されるため、      
（３）水溶性有機溶媒成分が有するタンパク質変性作用により、糞便中のプロテアーゼ、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ等の各種分解酵素の活性が顕著に低下するためである。
【００８２】
すなわち、本発明の核酸回収方法においては、糞便試料を調製するために、水溶性有機溶媒を有効成分とする除去用溶液Ｓを用いる。そのため、調製した糞便試料を、阻害物質Ａを溶出するために十分な時間保存した場合であっても、糞便試料の保存の間、糞便試料中の核酸の分解を抑制し、その核酸を安定して保持することができる。したがって、その後の工程（Ｃ）において非常に効率よく核酸を回収できる。
【００８３】
糞便に含まれていた阻害物質Ａは、除去用溶液Ｓに優先的に溶出されるが、除去用溶液Ｓに対する溶解性の低い核酸は糞便由来固形分に残る。そこで、工程（Ａ）の後、工程（Ｂ）として、糞便試料から除去用溶液Ｓを除去し、糞便由来固形分を回収する。その後、工程（Ｃ）として、回収された糞便由来固形分から核酸を回収することにより、阻害物質Ａの含有量が低く高純度な核酸を回収できる。
【００８４】
工程（Ｂ）における糞便試料から除去用溶液Ｓを除去する方法は、液体成分と固体成分を分離する場合に通常用いられる分離方法から適宜選択して行うことができる。この分離方法は、糞便試料中の核酸を損なうことなく、糞便試料の液体成分である除去用溶液Ｓを、溶出された阻害物質Ａごと、固形成分である糞便由来固形分から分離し得る方法であれば、特に限定されない。例えば、遠心分離法により、上清を除去して沈殿である糞便由来固形分を回収してもよく、濾過法により糞便試料をフィルター濾過し、フィルター面上に残った糞便由来固形分を回収してもよい。本発明においては、特に、遠心分離法が好ましい。
【００８５】
工程（Ｃ）における核酸の回収方法は、特に限定されるものではなく、試料から核酸を回収する場合に通常用いられる方法であれば、いずれの方法によっても行うことができる。糞便由来固形分から回収する核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡの両方であってもよい。
【００８６】
糞便由来固形分中には、主に哺乳細胞等の腸内常在菌以外の生物（以下、哺乳細胞と称する）由来の核酸と、腸内常在菌由来の核酸が含まれている。糞便由来固形分からの核酸回収においては、哺乳細胞由来の核酸と腸内常在菌細胞由来の核酸を別々に回収してもよいが、同時に回収することが特に好ましい。哺乳細胞由来の核酸と腸内常在菌由来の核酸とを同時に回収することにより、糞便中に大量に存在する腸内常在菌由来の核酸がキャリアーとして機能する。その結果、少数である哺乳細胞由来の核酸を、哺乳細胞等を予め糞便から単離した後に核酸を回収する場合よりも、より効率的に核酸を回収できる。
【００８７】
例えば、工程（ａ）として、糞便由来固形分中のタンパク質を変性させ、前記糞便由来固形分中の哺乳細胞等及び腸内常在菌から、核酸を溶出させた後、工程（ｂ）として、溶出させた核酸を回収することにより、糞便由来固形分から哺乳細胞由来の核酸と腸内常在菌由来の核酸を同時に回収できる。
【００８８】
工程（ａ）における糞便由来固形分中のタンパク質の変性は、公知の手法で行うことができる。例えば、糞便由来固形分にカオトロピック塩、有機溶媒、界面活性剤等の、通常タンパク質の変性剤として用いられている化合物を添加することにより、糞便由来固形分中のタンパク質を変性させることができる。工程（ａ）において糞便由来固形分に添加されるカオトロピック塩や界面活性剤としては、除去用溶液Ｓに添加されるカオトロピック塩及び界面活性剤として挙げたものと同様のものを用いることができる。有機溶媒としては、フェノールであることが好ましい。フェノールは中性であってもよく、酸性であってもよい。酸性のフェノールを用いた場合には、ＤＮＡよりもＲＮＡを選択的に水層に抽出できる。なお、工程（ａ）において、糞便由来固形分にカオトロピック塩、有機溶媒、界面活性剤等を添加する場合には、１種類の化合物を添加してもよく、２種類以上の化合物を添加してもよい。
【００８９】
工程（ａ）と工程（ｂ）の間に、工程（ｃ）を設けて、工程（ａ）により変性させたタンパク質を除去してもよい。核酸を回収する前に、予め変性させたタンパク質を除去することにより、回収される核酸の品質を向上できる。工程（ｃ）におけるタンパク質の除去は、公知の手法で行うことができる。例えば、遠心分離により、変性タンパク質を沈殿させて上清のみを回収することにより、変性タンパク質を除去できる。また、クロロホルムを添加し、ボルテックス等により充分に攪拌混合させた後に遠心分離を行い、変性タンパク質を沈殿させて上清のみを回収しても良い。これにより、単に遠心分離を行う場合よりも、より完全に変性タンパク質を除去できる。
【００９０】
工程（ｂ）における溶出させた核酸の回収は、エタノール沈殿法や塩化セシウム超遠心法等の公知の手法で行うことができる。回収方法の例として、以下の工程（ｂ１）と工程（ｂ２）が挙げられる。工程（ａ）において溶出させた核酸を、工程（ｂ１）として、無機支持体に吸着させる。その後、工程（ｂ２）として、工程（ｂ１）において吸着させた核酸を無機支持体から溶出させる。これにより、核酸を回収できる。工程（ｂ１）で用いられる無機支持体は、核酸を吸着することができる公知の無機支持体を用いることができる。また、この無機支持体の形状も特に限定されるものではなく、粒子状であってもよく、膜状であってもよい。例えば、この無機支持体としては、シリカゲル、シリカ質オキシド、ガラス、珪藻土等のシリカ含有粒子（ビーズ）や、ナイロン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ニトロセルロース等の多孔質膜等がある。
工程（ｂ２）で用いられる溶媒は、回収する核酸の種類やその後の核酸解析方法等を考慮して、これらの公知の無機支持体から核酸を溶出するために通常用いられている溶媒を適宜用いることができる。例えば、この溶出用溶媒として、特に精製水であることが好ましい。なお、工程（ｂ１）の後、工程（ｂ２）の前に、核酸を吸着させた無機支持体を適当な洗浄バッファーを用いて洗浄することが好ましい。
【００９１】
糞便由来固形分が、哺乳細胞等から核酸を溶出するために充分な濃度のカオトロピック塩や界面活性剤を含む除去用溶液Ｓを用いて調製されている場合には、工程（Ｃ）における糞便由来固形分からの核酸の回収において、工程（ａ）を省略することもできる。
【００９２】
工程（Ｂ）において回収された糞便由来固形分に、カオトロピック塩等のタンパク質変性剤を直接添加してもよいが、一度適当な溶出用薬剤に懸濁させた後にタンパク質変性剤を添加することが好ましい。ＤＮＡを回収する場合には、この溶出用薬剤として、例えば、リン酸バッファーやトリスバッファー等を用いることができる。高圧蒸気滅菌等により、ＤＮａｓｅを失活させた薬剤であることが好ましく、さらにプロテイナーゼＫ等のタンパク質分解酵素を含有させた薬剤であることがより好ましい。一方、ＲＮＡを回収する場合には、この溶出用薬剤として、例えば、クエン酸バッファー等を用いることができる。しかしながら、ＲＮＡは非常に分解されやすい物質であるため、チオシアン酸グアニジンや塩酸グアニジン等のＲＮａｓｅ阻害剤を含有したバッファーを用いることが好ましい。なお、工程（Ｃ）の前に、予め、工程（Ｂ）において回収された糞便由来固形分をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等の適当なバッファーを用いて洗浄しておいてもよい。
【００９３】
その後の解析方法によっては、糞便由来固形分から核酸を抽出・精製せず、単に糞便由来固形分に適当な溶出用薬剤を添加して混合し、糞便由来固形分から核酸を溶出することによっても、核酸を回収することができる。例えば、糞便試料中に病原菌等が大量に存在している場合であって、これら病原菌由来の核酸を解析する場合には、糞便試料から固形成分のみを回収した後、プロテイナーゼＫ等のタンパク質分解酵素を含有するＰＢＳ等の溶出用薬剤を添加して混合する。これにより得た均一な糞便試料溶液を、そのまま核酸解析に用いることにより、病原菌由来の遺伝子等を検出できる。その他、糞便由来固形分からの核酸の回収は、核酸抽出キットやウィルス検出キット等の市販のキットを用いて行うこともできる。
【００９４】
本発明の核酸回収方法においては、採取された糞便を、水溶性有機溶媒を有効成分とする除去用溶液Ｓに浸漬させて所定時間保存する工程を、保管又は輸送時間に割り当てることが可能である。このため、本発明の核酸回収方法を用いて、採取された糞便から核酸を回収することにより、検診等のスクリーニング検査のように、糞便採取後から核酸解析時まで間がある場合や、糞便採取場所が核酸解析場所から離れているような場合であっても、核酸を安定的に保持することができる。また、それと同時に、阻害物質Ａを溶出させつつ、糞便試料を保管又は輸送することが可能である。また、冷蔵や冷凍のための特別な機器や保存温度条件を必ずしも設定する必要がなく、簡便に糞便試料中の阻害物質Ａを溶出させることができる。
【００９５】
本発明の核酸回収方法における工程（Ｂ）は、例えば、糞便試料から液体成分である除去用溶液Ｓを除去する溶液除去機構を含む処理装置を用いることにより、簡便且つ迅速に行うことができる。このような溶液除去機構は、一般的に固体成分と液体成分を分離できる固液分離機構であれば、特に限定されるものではないが、遠心分離機構であることが好ましい。また、遠心分離機構により分離された上清を吸引除去するための溶液吸引排出機構と廃液回収部とを備える装置であれば、複数の糞便試料に対して工程（Ｂ）を自動的に行うことが可能となる。溶液吸引排出機構としては、先端のノズルから上清を吸引する溶液吸引排出ノズルであることが好ましい。このような溶液吸引排出ノズルとしては、例えば、電動ピペット等が挙げられる。
【００９６】
溶液吸引排出機構として溶液吸引排出ノズルを備えている装置であって、さらに溶液吸引排出ノズルを洗浄する機構を備えている場合には、複数の糞便試料から上清を吸引除去する場合に、糞便試料ごとに溶液吸引排出ノズルを洗浄することができるため、糞便試料への外部からの雑菌等の混入（コンタミネーション）を回避することができる。なお、溶液吸引排出ノズルの先端部が着脱可能なチップ等である場合には、例えば、汎用されているチップ装着・除去装置を備えて、糞便試料ごとにチップ等を自動的に交換させることにより、溶液吸引排出ノズル洗浄機構を備えていない場合であっても、糞便試料中へのコンタミネーションを回避できる。
【００９７】
図１は、本発明の核酸回収方法における工程（Ｂ）を自動的に行うための糞便試料処理装置の一実施形態を示した図である。本実施形態における糞便試料処理装置１０１は、遠心分離機構１０２と、遠心分離機構１０２により分離された上清を吸引除去するための溶液吸引排出ノズル１０３と、廃液回収部１０４と、溶液吸引排出ノズル洗浄機構１０５とを備える。まず、採取された糞便を採便容器内の除去用溶液Ｓに浸漬させて所定時間保存する。糞便試料を、該糞便試料処理装置１０１の遠心分離機構１０２に採便容器の蓋を開けた状態で、設置する。この際、複数の糞便試料が一度に設置でき、遠心分離を行う。その後、溶液吸引排出ノズル１０３の先端を、遠心分離された糞便試料の上清に接触させ、上清を吸引して採便容器から除去する。溶液吸引排出ノズル１０３により吸引された上清を、廃液回収部１０４に廃棄した後、溶液吸引排出ノズル洗浄機構１０５により、溶液吸引排出ノズル中の上清に接触した部位が洗浄される。洗浄後は同様にして、別の糞便試料から上清を吸引除去する。このように、図１に示すような機構を備えた糞便試料処理装置を用いて、一度の遠心分離処理により処理された複数の糞便試料から、順次上清を吸引除去することにより、工程（Ｂ）を自動的に行うことができる。
【００９８】
本発明の核酸回収方法により、胆汁酸等の阻害物質Ａのキャリーオーバーが顕著に低減された純度の高い核酸を効率よく回収できる。したがって、本発明の核酸回収方法を用いて回収された核酸を解析することにより、信頼性の高い解析結果を得ることが期待できる。このため、本発明の核酸回収方法により回収された核酸は、様々な核酸解析に供することができる。特に、糞便中に大量に存在する腸内常在菌由来の核酸のみならず、糞便中により少量しか含まれていない腸内常在菌以外の生物由来の核酸の解析に非常に好適である。
【００９９】
なお、本発明の核酸回収方法における工程（Ｃ）において、哺乳細胞等の腸内常在菌以外の生物由来の核酸と、腸内常在菌由来の核酸とを同時に回収した場合には、腸内常在菌由来の核酸に比べてはるかに微量である哺乳細胞由来の核酸を、非常に効率よくかつ高純度に回収できる。このため、このように回収された核酸を用いて核酸解析を行うことにより、大腸がん等の特定の疾患マーカーを高感度かつ高精度に検出できる。
【０１００】
このような腸内常在菌以外の生物由来の核酸として、例えば、がん細胞由来の核酸等の哺乳細胞由来の核酸や、肝炎ウィルス等の感染症の初期または後期における該感染症の原因菌由来の核酸等がある。その他、寄生虫由来の核酸であってもよい。特に、糞便から回収される核酸であることから、本発明の核酸回収方法により回収された核酸は、大腸、小腸、胃等の消化管細胞由来の核酸の解析に供されることが好ましく、大腸剥離細胞由来の核酸の解析に供されることがより好ましい。
【０１０１】
なお、本発明において、腸内常在菌とは、糞便中に比較的大量に存在するバクテリア細胞であり、通常ヒト等の動物の腸内に生息する常在菌を意味する。該腸内常在菌として、例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属等の偏性嫌気性菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属等の通性嫌気性菌等がある。
【０１０２】
また、本発明の核酸回収方法により回収された核酸は、早期発見や精確性の要請の強い、がんの発症や感染症の罹患の有無を調べるための核酸解析にも好適である。また、大腸炎、小腸炎、胃炎、膵炎等の炎症性疾患の発症の有無を調べるための核酸解析に供されることも好ましい。その他、ポリープ等の隆起性病変の検査や胃潰瘍等の大腸、小腸、胃、肝臓、胆嚢、胆管の疾患の検査に供されてもよい。
【０１０３】
例えば、本発明の核酸回収方法により回収された核酸を用いて、がん細胞由来の核酸、すなわち、変異等が起こっている核酸を検出し解析することにより、大腸がんや膵臓がん等のがんの発症の有無を検査できる。また、感染症等の原因である病原菌由来の核酸、例えばウィルス由来の核酸や寄生虫由来の核酸等が検出されるかどうかを調べることにより、感染症の罹患の有無や寄生虫の存在の有無を調べることができる。特に、本発明の核酸回収方法により回収された核酸を用いて、Ａ型・Ｅ型肝炎ウィルス等の糞便中に排出される病原菌由来核酸の検出を行うことにより、非侵襲的かつ簡便に感染症検査を行うことができる。その他、腸内常在菌以外の病原バクテリア、例えば腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７等の食中毒菌や病原菌由来の核酸が検出されるかどうかを調べることにより、細菌感染症の罹患の有無を調べることもできる。
【０１０４】
特に、核酸解析により、新生物性転化を示すマーカーや炎症性消化器疾患を示すマーカーを検出することが好ましい。その新生物性転化を示すマーカーとして、例えば、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、シアリルＴｎ抗原（ＳＴＮ）等の公知のがんマーカーや、ＡＰＣ遺伝子、ｐ５３遺伝子、Ｋ−ｒａｓ遺伝子等の変異の有無等がある。また、ｐ１６、ｈＭＬＨＩ、ＭＧＭＴ、ｐ１４、ＡＰＣ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥＳＲ１、ＳＦＲＰ２等の遺伝子のメチル化の検出も、大腸疾患の診断マーカーとして有用である（例えば、Lind et al.、「A CpG island hypermethylation profile of primary colorectal carcinomas andcolon cancer cell lines」、Molecular Cancer、２００４年、第３巻第２８章参照。）。その他、糞便試料中のヘリコバクターピロリ菌由来のＤＮＡが、胃がんマーカーとして用いられることが既に報告されている（例えばNilsson et al.、Journal of ClinicalMicrobiology、２００４年、第４２巻第８号、第３７８１〜８ページ参照。）。一方、炎症性消化器疾患を示すマーカーとして、例えば、Ｃｏｘ−２遺伝子由来核酸等がある。
【０１０５】
本発明の糞便試料より回収された核酸は、公知の核酸解析方法を用いて解析することができる。この核酸解析方法として、例えば、ＰＣＲ等を用いて特定の塩基配列領域を検出する方法や核酸を定量する方法等がある。例えば、がん遺伝子等がコードされている塩基配列領域や、マイクロサテライトを含む塩基配列領域等の遺伝的変異の有無を検出することにより、がんの発症の有無を調べることができる。糞便試料から回収されたＤＮＡを用いた場合には、例えば、ＤＮＡ上のメチル化や、塩基の挿入、欠失、置換、重複、又は逆位等の変異を検出することができる。その他、ＲＮＡを回収した場合には、逆転写反応（ＲＴ：Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ)によりｃＤＮＡを合成した後、そのｃＤＮＡをＤＮＡと同様にして増幅解析に用いることができる。回収されたＲＮＡを用いた場合には、例えば、ＲＮＡ上の塩基の挿入、欠失、置換、重複、逆位、又はスプライシングバリアント（アイソフォーム）等の変異を検出できる。また、ＲＮＡ発現量を検出することもできる。特に、ｍＲＮＡの発現解析、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異解析、及びＤＮＡのメチル化の解析等を行うことが好ましい。なお、これらの解析は、当該分野において公知の方法により行うことができる。また、Ｋ−ｒａｓ遺伝子変異解析キット、メチル化検出キット等の市販の解析キットを用いてもよい。
【０１０６】
本発明は、予め除去用溶液Ｓを含有させた採便容器に糞便を採取することにより、より簡便かつ迅速に採取された糞便を調製することができる。また、本発明の除去用溶液Ｓと、除去用溶液Ｓを含有する採便容器と、を有する採便用キットを用いることにより、より簡便に本発明の核酸回収方法を行うことができる。なお、該採便用キットには、採便棒等の、除去用溶液Ｓ及びそれを含有する採便容器以外の構成物を適宜有してもよい。
【０１０７】
本発明で用いられる採便容器の形態や大きさ等は特に限定されるものではなく、溶媒を含むことができる公知の採便容器が用いられる。取り扱いが簡便であるため、採便容器の蓋と採便棒が一体化している採便容器が好ましい。また、採便量をコントロールできるため、採便棒が一定量の糞便を採取できるものがより好ましい。このような公知の採便容器としては、例えば、特公平６−７２８３７号公報に開示されている採便容器等がある。
【０１０８】
図２及び図３は、本発明の採便用キットに用いることができる採便容器ＡおよびＢの一実施形態をそれぞれ示した図である。なお、本発明の採便用キットに用いることができる採便容器は、これらの採便容器に限定されない。
【０１０９】
まず図２の採便容器について説明する。本実施形態の採便容器Ａは、採便棒３と一体化した蓋２と、容器本体１を有し、容器本体１の内部に除去用溶液Ｓを含有する。採便棒３の先端には糞便を一定量採取できるカップ３ａがあり、このカップ３ａの底部にはふるいとして網が張られている。一方、容器本体１の底部には、カップ３ａの形状と略同一で、カップ３ａの形状と重なり合う隆起部１ａがある。カップ３ａを隆起部１ａに嵌合させることにより、カップ３ａに採取された糞便は、カップ３ａの底部に張られた網から押し出されるため、除去用溶液Ｓに糞便を速やかに分散させることができる。
【０１１０】
図３に記載の採便容器は、先端が尖っている採便棒１３と一体化した蓋１２と、容器本体１１を有し、容器本体１１内部に、除去用溶液Ｓを含有する密封された袋１５を有する採便容器Ｂである。採便棒１３の先端側には、糞便Ｅを一定量採取し得る穴１３ａが空いている。また、採便棒１３上をスライドすることにより穴１３ａの蓋となる可動蓋１３ｂが採便棒１３の両側部に付いている。本採便容器Ｂの使用方法の一実施形態を、以下に説明する。
まず、図３ａに示すように、まず、採便棒１３を、可動蓋１３ｂを穴１３ａよりも蓋１２側に寄せて、穴１３ａが完全に開口している状態としたところで、採便棒１３を糞便Ｅに押し付ける。すると図３ｂに示すように、穴１３ａに糞便Ｅが充填される。この状態で、可動蓋１３ｂを採便棒１３の先端側にスライドさせて穴１３ａに蓋をすることにより、余分な糞便Ｅが分離されるため、糞便Ｅが穴１３ａの容量分、正確に採取することができる（図３ｃ）。その後、可動蓋１３ｂを元の位置に戻して穴１３ａが完全に開口している状態とした後に（図３ｄ）、蓋１２を容器本体１１に収納する（図３ｅ）。採便棒１３が容器本体１１に収納される際に、採便棒１３の尖った先端が除去用溶液Ｓを含有する袋１５を破ることにより、容器本体１１は、糞便Ｅを含んだ穴１３ａ以上の水位まで、除去用溶液Ｓにより満たされ、糞便Ｅと除去用溶液Ｓが直接接触する（図３ｆ）。この時、容器本体１１は蓋１２により栓をされているので、除去用溶液Ｓが漏れることはない。その後、運搬等により容器本体１１が動かされることで、容器１１内部の除去用溶液Ｓと糞便Ｅが混合される。このような採便容器Ｂは、採便棒１３を容器に入れて、その後初めて溶液が容器中に満たされるため、メタノールのような人体に有害な除去用溶液Ｓを用いる場合であっても、溶液漏れによる事故を回避することができ、家庭でも安全に取り扱うことが出来る。
【実施例】
【０１１１】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に記載が無い場合には、「％」は「体積％」を意味する。また、ＭＫＮ４５細胞及びＳＷ１１１６細胞は、常法により培養したものを用いた。【０１１２】
［実施例１］
本発明の核酸回収方法により糞便から回収したＲＮＡ溶液に存在する胆汁酸量を測定した。
健常人１名より採取された糞便を、７本の１５ｍＬのポリプロピレンチューブにそれぞれ１ｇずつ分取した。このうち１本に対して、分取直後、エタノールを加えずに、ＲＮＡ抽出操作を行った。具体的には、フェノール混合物「Ｔｒｉｚｏｌ」（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を添加・混合した後、クロロホルムを添加・混合し、遠心分離処理を行った。その遠心分離処理により上清（水層）を分離させた。その分離させた上清に、酢酸ナトリウムとエタノールを添加し、攪拌した。その後、この溶液に遠心分離処理を行い、上清のエタノールを除去し、沈殿を得た。この沈殿を室温で風乾させ、ＤＥＰＣ処理をした水に溶解させ、ＲＮＡ溶液を１００μＬ得た（１Ａ）。
残りの６本の糞便に対しては、分取直後に、１０ｍＬの９９．５％エタノール溶液（除去用溶液Ｓ）を加えた後、２０℃で、１２分（１Ｂ）、１時間（１Ｃ）、１２時間（１Ｄ）、２４時間（１Ｅ）、７２時間（１Ｆ）、１６８時間（１Ｇ）静置してこれら糞便試料を保存した。各保存時間の経過後、直ちに遠心し、上澄みであるエタノール（除去用溶液Ｓ）を除去して、糞便由来の固形分を得た。その後、得られた糞便由来の固形分に対して、（１Ａ）と同様にＲＮＡ抽出操作を行い、各１００μＬのＲＮＡ溶液を得た。
得られた各ＲＮＡ溶液に、内部標準としてＨｅｐｔａｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  （Ｃ１７：０）と２３ｎｏｒ−ｄｅｏｘｙｃｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ  （２３Ｎ−ＤＣＡ）を添加し、エーテルで抽出した。ついで胆汁酸のカルボキシル基をブチル化によりブチルエステルにした。また、胆汁酸のヒドロキシル基をアセチル化によりアセチルエステルとし、ブチル・アセチル誘導体とした。生成したブチル・アセチル誘導体をＯＶ−１７０１（ＧＬサイエンス社製）を用い、ＧＣＭＳ−ＱＰ５０５０システム（島津製作所製）にて、ガスクロマトグラフィー解析を行い、ＲＮＡ溶液中に残存する胆汁酸量を測定した。
図４は、測定した結果得られた、抽出したＲＮＡ溶液１００μＬあたりの胆汁酸量を示した図である。これらの結果より、１時間以上の間、糞便試料を除去用溶液Ｓに浸漬（保存）することにより、阻害物質Ａである胆汁酸を十分に除去できた。さらに、１時間から２４時間の間で、急激に胆汁酸が除去できた。また、糞便試料の除去用溶液Ｓ中への浸漬時間が７２時間を越えた試料は、ほとんど除去効率に変化が見られなかった。【０１１３】
［実施例２］
胆汁酸によるＲＴ−ＰＣＲの反応阻害を確認した。具体的には、培養細胞ＭＫＮ４５細胞から回収したＲＮＡを鋳型とし、ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）  ｍＲＮＡを増幅するＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの反応液に、胆汁酸の主要成分であるデオキシコール酸ナトリウムの希釈系列を添加し、デオキシコール酸ナトリウムによる阻害条件を確認した。
Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）の説明書に従いながら各試薬を混合し、デオキシコール酸ナトリウムの最終濃度が、０、１、２、４、１０、１５、２０μｇ／２５μＬとなるように反応液に添加し、４２℃で５分間、９５℃で１０秒間、の逆転写反応を行なった。その後、９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間からなる反応条件を４０サイクル繰り返すことによりＰＣＲを行った。この際、ＴａｑＭａｎ  ｐｒｉｍｅｒ及びｐｒｏｂｅは、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ， ＩｎｖｅｎｔｏｒｉｅｄのＧＡＰＤＨ検出用を用いた。
調製した試薬を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により解析して、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲでの増幅効率を確認した。阻害の評価は、既知濃度のプラスミドＤＮＡの示すＣＴ値からコピー数を算出し、これから得られる初期核酸量の推定値の低下の度合いで行なった。
図５は、デオキシコール酸ナトリウム濃度を横軸とし、ＧＡＰＤＨ増幅量を縦軸として、測定結果を示した図である。これらの結果から、デオキシコール酸ナトリウムの濃度が反応系に４μｇ／２５μＬ以上多く含まれる場合に、阻害物質Ａによる核酸増幅反応の阻害が確認された。
ここで、実施例１の条件で得られたＲＮＡ５μＬを鋳型とし、反応系を２５μＬとしてＲＴ−ＰＣＲを行った。この場合、保存時間が１時間のＲＮＡ（１Ｃ）を用いた場合には、反応液中の胆汁酸濃度は約３．７５μｇ／２５μＬとなり、保存時間が１２時間のＲＮＡ（１Ｄ）を用いた場合には、反応液中の胆汁酸濃度は約１．６μｇ／２５μＬとなった。つまり、保存時間１時間以上であれば、核酸回収時に糞便から持ち込まれる胆汁酸による核酸増幅反応に対する影響を効果的に抑制できることが明らかになった。また、糞便から回収された核酸の場合、その他の夾雑物の影響も考えられることから、１２時間保存したときの濃度（約１．６μｇ／２５μＬ）よりも少ない胆汁酸量によって阻害が生じることも考えられる。このため、１２時間以上保存することが、より好ましいことも分かった。【０１１４】
［実施例３］
健常人１名より採取された糞便を、３本の１５ｍＬのポリプロピレンチューブにそれぞれ１ｇずつ分取した。このうち１本に対して、分取直後、１０ｍＬの７０％エタノール溶液（除去用溶液Ｓ）を加えた後、室温（２０℃）で１分間静置し、糞便試料（３Ａ）とした。他の１本に対して、分取後、１０ｍＬの７０％エタノール溶液（除去用溶液Ｓ）を加えて糞便をよく分散させた後、室温で１８時間静置して保存し、糞便試料（３Ｂ）とした。残りの１本は、分取後、１０ｍＬの７０％エタノール溶液（除去用溶液Ｓ）を加えて糞便をよく分散させた後、室温で３６時間静置して保存し、これを糞便試料（３Ｃ）とした。各サンプルは、各保存時間経過後、直ちに、遠心し、上澄みであるエタノール（除去用溶液Ｓ）を除去して、糞便由来の固形分を得た。
また、随時、エタノールを除去した各糞便試料からＲＮＡを回収した。具体的には、各糞便由来の固形分に、フェノール混合物「Ｔｒｉｚｏｌ」（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を添加して混合した後、クロロホルムを添加、混合し、遠心分離処理を行った。その遠心分離処理により上清（水層）を得た。この上清に酢酸ナトリウムとエタノールを添加して、攪拌後、遠心分離処理を行った。この遠心分離処理により沈殿を得た後、この沈殿物を風乾させた。これらの沈殿物を、ＤＥＰＣ処理をした水に溶解させ、ＲＮＡ溶液を得た。
各ＲＮＡ溶液のうち、一部（５μＬ）を用い、逆転写反応用のキットであるＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｋｉｔを用い、ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型に、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ (Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、ヒトＧＡＰＤＨ用フォワードプライマー（配列番号１：５'−ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ−３'）と、ヒトＧＡＰＤＨ用リバースプライマー（配列番号２：５'−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ−３'）をそれぞれ最終濃度が反応液中に９００ｎｍｏｌとなるように添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。そのＰＣＲ溶液に対して、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によるＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎを用いたＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲの熱サイクルは、９５℃で１０分間の変性サイクルの後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を４５サイクルの条件で行った。定量は、濃度既知のスタンダードプラスミドによる希釈系列を鋳型として得られた蛍光強度の結果に基づいて行った。
サンプル（３Ａ）由来のＲＮＡを鋳型に用いた場合、サンプル（３Ｂ）に比べて約８０％以上の増幅効率の低下が見られた。また、サンプル（３Ｂ）とサンプル（３Ｃ）の差は、約１０％程度で、サンプル（１Ａ）とサンプル（１Ｂ）ほどの差は見られなかった。
すなわち、これらの結果から、糞便に除去用溶液Ｓを添加し浸漬させて一定時間保存する本発明の核酸回収方法を用いて得られた核酸は、核酸の増幅効率がよいことが分かった。これは、本発明の核酸回収方法により、回収された核酸中の糞便由来の阻害物質Ａの量を低減させることができたためである。なお、本実施例においては、除去用溶液Ｓにより溶出除去された物質が何であるかは確認していないが、回収された核酸の増幅効率が良好であることから、糞便中に含まれている胆汁酸以外の阻害物質Ａも溶出除去されたと推察される。【０１１５】
［実施例４］
健常人１名より採取された糞便を、３本の１５ｍＬのポリプロピレンチューブにそれぞれ１ｇずつ分取した。このうち１本に対して、分取直後、１０ｍＬの７０％エタノール溶液を加えた後、４℃で１分間静置し、糞便試料（４Ａ）とした。他の１本に対して、分取後、１０ｍＬの７０％エタノール溶液（除去用溶液Ｓ）を加えて糞便をよく分散させた後、４℃で１２時間静置して保存し、糞便試料（４Ｂ）とした。残りの１本は、分取後、１０ｍＬの７０％エタノール溶液（除去用溶液Ｓ）を加えて糞便をよく分散させた後、４℃で７２時間静置して保存し、これを糞便試料（４Ｃ）とした。各時間経過後、随時、遠心分離によってエタノールを除去し、続いて７ｍＬのＰＢＳを用い洗浄後、遠心によって上清のＰＢＳを除去した。
実施例３と同様にして、ＲＮＡを抽出し、逆転写反応を行った。続いて、細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子用フォワードプライマー（配列番号３：５'−ＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＡ−３'）と、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子用リバースプライマー（配列番号４：５'−ＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴ−３'）によるリアルタイムＰＣＲによって大腸菌の遺伝子を検出した。サンプル（４Ａ）由来のＲＮＡを鋳型に用いた場合、サンプル（４Ｂ）に比べて約７０％以上の増幅効率の低下が見られた。また、サンプル（４Ｂ）とサンプル（４Ｃ）の差は、約３０％程度であった。
すなわち、これらの結果から、保存時の温度が４℃の場合であっても、本発明の核酸回収方法を用いて得られた核酸は、核酸の増幅効率がよく、すなわち、胆汁酸塩をはじめとする阻害物質Ａが、回収された核酸から除去されていることが推測された。【０１１６】
［実施例５］
実施例１で用いたエタノールの代わりにメタノールを５５％、イソプロパノールを５％添加したアルコール溶液を作成した。このアルコール溶液を除去用溶液Ｓとして用い、アルコール溶液浸漬糞便サンプルを準備し、実施例１と同様に浸漬（保存）時間を変えたサンプルを作成した。すなわち、このうち１本に対して、分取直後に、１０ｍＬのアルコール溶液を加えて糞便をよく分散させた後、室温（２０℃）で１分間静置し、糞便試料（５Ａ）とした。他の１本に対して、分取後、１０ｍＬのアルコール溶液を加えて糞便をよく分散させた後、室温で１２時間静置して保存し、糞便試料（５Ｂ）とした。残りの１本は、分取後、１０ｍＬのアルコール溶液を加えて糞便をよく分散させた後、室温で３６時間静置して保存し、これを糞便試料とした（５Ｃ）。これらのサンプルから、随時、遠心分離によってアルコール溶液を除去して、糞便由来の固形分を得た。続いて、７ｍＬの９９．５％エタノールで糞便由来の固形分を洗浄し、遠心によって上清の９９．５％エタノールを除去して、糞便由来の固形分を風乾させた。次に、「Ｔｒｉｚｏｌ」とクロロホルムで、ＲＮＡを抽出した。得られた水層に対して、エタノールを加え、Ｖｏｒｔｅｘで、よく攪拌後、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）のＲＮＡ回収用カラム（シリカカラム）にその水層とエタノールの混合液を添加、遠心し、添付のプロトコールに従ってそのＲＮＡ回収用カラムの洗浄操作及びＲＮＡ溶出操作を行うことにより、ＲＮＡを回収した。
回収した各ＲＮＡ溶液のうち、一部を用い、実施例３と同様にして、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎを用いたＰＣＲ解析を行った。この結果、サンプル（５Ａ）由来のＲＮＡを鋳型に用いた場合、サンプル（５Ｂ）に比べて約４０％の増幅効率の低下が見られた。また、サンプル（５Ｂ）とサンプル（５Ｃ）の差は、約２０％程度で、サンプル（５Ａ）とサンプル（５Ｂ）の約半分の差であった。
すなわち、これらの結果から、エタノール以外のアルコールを除去用溶液Ｓとして用いた場合であっても、胆汁酸塩等の阻害物質Ａを抽出除去し、高純度の核酸を回収し得ることが明らかである。また、ＲＮＡを有機溶媒によって一旦抽出した後、シリカカラムでさらに精製することにより、糖類や核酸分解物等の物質を除去する。これによって、糞便からの核酸の増幅効率が上昇した。【０１１７】
［実施例６］
健常人の糞便４ｇにＫ−ｒａｓ遺伝子コドン１２がＧＣＴへ変異しているヒト大腸がん由来の培養細胞ＳＷ１１１６細胞を５．０×１０5ｃｅｌｌｓ混合させたものを、大腸がん患者擬似糞便とした。これを、６本の１５ｍＬのポリプロピレンチューブにそれぞれ０．５ｇずつ分取した。このうち２本に対して、分取直後、１０ｍＬの変性エタノール（５５％エタノールと５％イソプロパノールのアルコール溶液）を加えて糞便をよく分散させた後、室温（２０℃）で１分間静置し、糞便試料（６Ａ）とした。他の２本に対して、分取後、１０ｍＬの変性エタノール（除去用溶液Ｓ）を加えて糞便をよく分散させた後、室温で１２時間静置して保存し、糞便試料（６Ｂ）とした。残りの２本は、分取後、１０ｍＬの変性エタノール（除去用溶液Ｓ）を加えて糞便をよく分散させた後、室温で３６時間静置して保存し、これを糞便試料（６Ｃ）とした。
（６Ａ）、（６Ｂ）、（６Ｃ）の各サンプルは、各保存時間経過後、随時、遠心分離によって変性エタノールを除去して、糞便由来の固形分を得た。続いて、７ｍＬの９９．５％エタノールで糞便由来の固形分を洗浄し、遠心によって上清の９９．５％エタノールを除去し、この固形分を風乾させた。
また、随時、エタノールを除去した各糞便由来固形分からＤＮＡ溶液を回収した。すなわち、各糞便由来の固形分から、糞便からのＤＮＡ抽出キット「ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡの濃度を吸光度法により定量した結果、各糞便由来の固形分から、ほぼ同等量のＤＮＡを回収することができた。
回収されたＤＮＡを用いて、Ｋ−ｒａｓコドン１２のＧＣＴ変異配列を、ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ＰＣＲ法にて検出した。すなわち、センス鎖側のプライマーの３'末端をＧＣＴ変異配列にマッチするよう設計することにより、ＧＣＴ変異型アレルは増幅される。なお、アンチセンス鎖側のプライマーはイントロン部分の塩基配列に由来している。一反応あたり、Ｋ−ｒａｓコドン１２ ＧＣＴ変異型コドンに対応するフォワードプライマー（配列番号５：５'−ＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＣ−３'）及び、リバースプライマー（配列番号６：５'−ＣＴＣＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣ−３'）を各５０ｐｍｏｌと、１．２５ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ  Ｔａｑ(ＴａＫａＲａ社製)と、 １×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒと、２００μＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅと、鋳型核酸を１０ｎｇとを用いて、ＰＣＲを行なった。温度条件は、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間の３５サイクルとした。
ＰＣＲ反応後、３％ＮｕＳｉｅｖｅ(ＦＭＣ社製)で作成したアガロース電気泳動で、増幅産物を確認したところ、１７９ｂｐの増幅産物が確認された。その結果、サンプル（６Ａ）由来のＤＮＡを鋳型に用いた場合、２つのサンプルのうち、一つは、増幅が見られなかった。また、もうひとつも、サンプル（６Ｂ）由来のＤＮＡに比べて非常に薄いバンドになり、増幅効率の低下が見られた。また、２つのサンプル（４Ｂ）由来ＤＮＡと、２つのサンプル（６Ｃ）由来ＤＮＡは、いずれも良く増幅し、バンドの濃さの差はほとんど見られなかった。
以上の結果から、保存時間は、時間が長ければ長いほど核酸の増幅効率がよく、すなわち、核酸増幅の阻害をする胆汁酸塩等の除去効率がよいことが推測された。
本発明の核酸回収方法により回収されたＤＮＡを用いることにより、遺伝子変異等の高い正確性を要求される核酸解析であっても、精度よく核酸解析が行えることが明らかである。また本実施例ではイソプロパノールとエタノールを混合した変性エタノールを除去用溶液Ｓとして使用したが、アルコール濃度としては同じである、５０％のエタノール溶液を使用した場合にも同等の結果が得られた。【０１１８】
［実施例７］
図２に示すような採便容器Ａを用いて、糞便試料を調製し、核酸を回収した。この採便容器Ａは、採便棒３と一体化した蓋２と、容器本体１を有し、内部に除去用溶液Ｓとして５ｍＬの５９％エタノール溶液を含有する採便容器Ａである。また、採便棒３の先端には、直径３ｍｍの穴を４個有する０．５ｍＬの容量のカップ３ａを備える。
まず、採便棒３を用いてカップ３ａに約０．５ｇの糞便を採取し、その採便容器Ａに入れて蓋２をした。すると、容器本体１の底の隆起部１ａがカップ３ａにある穴からの糞便を押し出して、糸状の糞便が溶液中に分散した。このようにして調製された糞便試料を糞便試料（７Ａ）とした。
一方、糞便試料（７Ａ）と同様に糞便と除去用溶液Ｓの容量比が１：１０となるように、５ｍＬの５９％エタノール溶液を含有する１５ｍＬのポリプロピレンチューブに約０．５ｇの糞便を採取したものを、対照試料（７Ｂ）とした。
糞便試料（７Ａ）と対照試料（７Ｂ）を３０℃で２日間保存した後、実施例２と同様にしてＲＮＡを回収した。このとき、糞便試料（７Ａ）から除去されたエタノールは、対照試料（７Ｂ）から除去されたエタノールに比べて、より濃い茶褐色を示した。また、実施例３と同様に、ＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡを作成後、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の定量ＰＣＲを行った。サンプル（７Ｂ）由来のＲＮＡを鋳型に用いた場合、サンプル（７Ａ）由来のＲＮＡに比べて約４０％の増幅効率の低下が見られた。
この結果は、図２に示すような採便容器Ａを用いることにより、速やかに除去用溶液Ｓ中に糞便を分散させ、より高純度に核酸を回収することができたためと推察される。また、このような採便容器Ａを用いることにより、採便者が採便後、簡便かつ直ちに糞便試料の調製と保存を行うことができるため、検査工程オペレーターのレイバーコストの一部を削減できる。【０１１９】
［実施例８］
図３に示すような採便容器Ｂを用いて、糞便試料を調製し、核酸を回収した。この採便容器の採便棒１３は、先端が尖っており、２．５ｍＬ容量の穴１３ａを有する。また採便容器Ｂは、採便棒１３と一体化した蓋１２と、容器本体１１を有し、容器本体１１内部に、除去用溶液Ｓとして５９％メタノール溶液を含有する密封された袋１５を有する。
まず、袋１５内に５ｍＬの５９％メタノール溶液を含有している採便容器Ｂを用いて、図３の手順に従って約０．１ｇの糞便を採取し、袋１５内に２．５ｍＬの５９％メタノール溶液と糞便を混合させて糞便試料（８Ａ）を調製した。この糞便試料（８Ａ）を１８℃で３６時間静置して保存した後、実施例５と同様にしてＲＮＡを回収し、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎを用いたＰＣＲ解析を行ったところ、増幅効率が良好であることが確認された。
この結果からも明らかであるように、図３に示すような採便容器Ｂを用いて、本発明の核酸回収方法を行うことにより、高純度に核酸を回収することができるため、採便用キットの軽量化、小型化及び安全性の確保を図ることが可能となる。【０１２０】
［実施例９］
本発明の核酸回収方法における工程（Ｂ）を、図１に示すような糞便試料処理装置を用いて自動的に行い、糞便試料から核酸を回収した。
まず、実施例７と同様にして、図２に示すような採便容器Ａ内に、糞便と５９％エタノール溶液（除去用溶液Ｓ）を混合した糞便試料を２本調製した。この２本の糞便試料を室温で１２時間保存した後、採便容器の蓋部分を開けて、糞便試料処理装置中の遠心分離機構にセットした。セットした糞便試料は遠心分離工程によって、上清部分のエタノール溶液（除去用溶液Ｓ）と糞便由来の固形分に分離された。１本の糞便試料の上清部分を溶液吸引排出ノズルで吸引し、廃液回収部に廃棄した。廃棄後、ノズルを洗浄層で洗浄し、残りの糞便試料の上清の除去を同様にして行なった。
上清除去後、得られた糞便固形分から、実施例５と同様にしてＲＮＡを回収することができた。【０１２１】
［実施例１０］
健常人１名より採取された糞便を、８本の１５ｍＬのポリプロピレンチューブにそれぞれ１ｇずつ分取した。分取直後、６ｍＬの７０％エタノール溶液（除去用溶液Ｓ）を加えて糞便をよく分散させて糞便試料を調製した後、−４℃（１０Ａ）、０℃（１０Ｂ）、４℃（１０Ｃ）、８℃（１０Ｄ）、１２℃（１０Ｅ）、１６℃（１０Ｆ）、２０℃（１０Ｇ）、２４℃（１０Ｈ）の各条件で、調製した糞便試料を２４時間静置して保存した。
各サンプルは、各保存時間経過後、遠心し、上澄みであるエタノール溶液を除去して、糞便由来の固形分を得た。
次に、得られた糞便由来の固形分からＲＮＡを実施例１と同様に回収した。回収した各ＲＮＡ溶液のうち、一部を用い、実施例３と同様にして、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎを用いたＰＣＲ解析を行った。
ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎと反応した各糞便試料（サンプル）の解析結果を表１に示す。サンプル（１０Ａ）及び（１０Ｂ）由来ＲＮＡをそれぞれ鋳型に用いた場合には、増幅が確認されなかった。一方、サンプル（１０Ｃ）〜サンプル（１０Ｆ）由来ＲＮＡをそれぞれ鋳型に用いた場合には、増幅が確認された。また、サンプル（１０Ｇ）とサンプル（１０Ｈ）由来ＲＮＡでは、サンプル（１０Ｃ）〜サンプル（１０Ｆ）由来ＲＮＡの倍程度の増幅が見られた。
すなわち、保存温度は、４℃以上である場合に阻害物質Ａの除去の効率がよく、２０℃以上でさらによく除去されて核酸増幅効率が上昇していた。【０１２２】
【表１】
2010010914.tif 000003
【０１２３】
［実施例１１］
健常人１名より採取された糞便を、９本の１５ｍＬのポリプロピレンチューブにそれぞれ１ｇずつ分取した。分取直後、６ｍＬの７０％エタノール溶液（除去用溶液Ｓ）を加えて糞便をよく分散させて糞便試料を調製した後、保存時間を１分間（１１Ａ）、１０分間（１１Ｂ）、１時間（１１Ｃ）、１２時間（１１Ｄ）、２４時間（１１Ｅ）、３６時間（１１Ｆ）、４８時間（１１Ｇ）、７２時間（１１Ｈ）、１６８時間（１１Ｉ）の各条件で静置して保存した。尚、保存温度は、一定温度で２０℃である。
各サンプルは、各保存時間経過後、実施例１０と同様にしてＲＮＡを回収した後、定量ＰＣＲで解析を行った。解析結果を表２に示す。
サンプル（１１Ａ）及び（１１Ｂ）由来ＲＮＡをそれぞれ鋳型に用いた場合には、増幅が確認されなかったが、サンプル（１１Ｃ）由来ＲＮＡを鋳型に用いた場合には増幅が確認された。また、サンプル（１１Ｄ）由来ＲＮＡでは、サンプル（１１Ｃ）由来ＲＮＡの倍程度の増幅が見られた。サンプル（１１Ｅ）、（１１Ｆ）、（１１Ｇ）由来ＲＮＡでは、サンプル（１１Ｃ）由来ＲＮＡの３倍程度、サンプル（１１Ｈ）と（１１Ｉ）由来ＲＮＡは、サンプル（１１Ｄ）由来ＲＮＡの１．５倍程度の増幅が見られた。
すなわち、保存時間は、１時間以上である場合に阻害物質Ａの除去の効率がよく、２４時間以上でさらによく除去され、７２時間以上でさらに除去されており、１６８時間でも核酸増幅効率の落ち込みは見られなかった。【０１２４】
【表２】
2010010914.tif 000004
【０１２５】
［参考例１］
健常人１名より採取された糞便を、３本の１５ｍＬのポリプロピレンチューブにそれぞれ１ｇずつ分取した。このうち１本に対して、分取直後、速やかに液体窒素を用いて凍結処理を行い、糞便試料（１）とした。他の１本に対して、分取後、１０ｍＬの７０％エタノール溶液を加えて糞便をよく分散させた後、室温で１時間静置し、糞便試料（２）とした。残りの１本は、分取後、溶液等を添加せずに抽出工程に移行させ、これを糞便試料（３）とした。
その後、各糞便試料からＲＮＡを回収した。具体的には、各糞便試料に、３ｍＬのフェノール混合物「Ｔｒｉｚｏｌ」（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を添加し、３０秒以上ボモジナイザーで十分に混合した。その後、３ｍＬのクロロホルムを添加し、ボルテックスを用いて十分に混合した後、１２，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離処理を行った。その遠心分離処理により得た上清（水層）を、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）のＲＮＡ回収用カラムに通し、添付のプロトコールに従ってそのＲＮＡ回収用カラムの洗浄操作及びＲＮＡ溶出操作を行うことにより、ＲＮＡを回収した。ナノドロップ（ナノドロップ社製）を用いて、回収したＲＮＡの定量を行った。【０１２６】
本発明の除去用溶液Ｓであるエタノール溶液を用いて調製された糞便試料（２）からは、採取直後に凍結処理を行った糞便試料（１）から回収されたＲＮＡ量には若干及ばないものの、採取直後核酸抽出を行った糞便試料（３）に比べて、非常に多くのＲＮＡを回収することができた。これらの結果から、本発明の除去用溶液Ｓを用いて調製することにより、室温での調製であっても、非常に効率よく核酸を回収し得る糞便試料が得られることがわかった。検診等の場合のように、患者が自宅で採便する場合には、糞便試料の調製を室温付近で行えることが望まれるが、本発明の除去用溶液Ｓは、このような要請に充分に応えることが可能である。【０１２７】
［参考例２］
健常人１名より採取された糞便を、２本の１５ｍＬのポリプロピレンチューブにそれぞれ１ｇずつ分取した。このうち１本に対して、分取後、１０ｍＬの７０％エタノール溶液を加えて糞便をよく分散させた後、室温で１時間静置し、糞便試料（４）とした。その後、糞便試料（４）中のエタノールを除去し、続いて抽出作業を行った。残りの１本は、糞便試料の分取後、１０ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁させ、軽く遠心することで上清を回収し、細胞よりも大きな残渣を除いた。回収した上清は、３０００ｒｐｍで１５分間遠心し、沈澱として細胞を回収した。沈澱に７０％エタノールを９ｍＬ添加し、混和後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈澱物を糞便試料（５）とし、続いて抽出作業を行った。具体的には、各糞便試料に、３ｍＬのフェノール混合物「Ｔｒｉｚｏｌ」（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を添加し、３０秒以上ボモジナイザーで十分に混合した。その後、３ｍＬのクロロホルムを添加し、ボルテックスを用いて十分に混合した後、１２，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離処理を行った。その遠心分離処理により得た上清（水層）を、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）のＲＮＡ回収用カラムに通し、添付のプロトコールに従ってそのＲＮＡ回収用カラムの洗浄操作及びＲＮＡ溶出操作を行うことにより、ＲＮＡを回収した。ナノドロップ（ナノドロップ社製）を用いて、回収したＲＮＡの定量を行った。【０１２８】
各ＲＮＡ溶液の一部（５μＬ）を用い、逆転写反応用のキットであるＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｋｉｔを用い、ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型に、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ (Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、ヒトＧＡＰＤＨ用フォワードプライマー（配列番号１：５'−ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ−３'）と、ヒトＧＡＰＤＨ用リバースプライマー（配列番号２：５'−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ−３'）とを、それぞれ最終濃度が反応液中に９００ｎｍｏｌとなるように添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。そのＰＣＲ溶液に対して、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によるＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎを用いてＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲの熱サイクルは、９５℃で１０分間の変性サイクルの後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を４５サイクルの条件で行った。定量は、濃度既知のスタンダードプラスミドによる希釈系列を鋳型として得られた蛍光強度の結果に基づいて行った。
サンプル（５）由来のＲＮＡを鋳型に用いた場合、サンプル（４）に比べて約５０％以上の増幅効率の低下が見られた。
すなわち、これらの結果から、採取された糞便を、懸濁液を作成することなく、すぐに除去用溶液Ｓに浸漬させて一定時間保存する本発明の核酸回収方法を用いて得られた核酸は、一旦、糞便を縣濁液とする核酸の回収方法を用いて得られた核酸に比べて、阻害物質Ａが回収された核酸から除去され、且つ、回収ロスが少なく、核酸の増幅効率がよいことが分かった。【０１２９】
尚、上記実施例および参考例での核酸増幅反応は、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたPCR法が用いられたが、 ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いた逆転写反応を組合せた核酸増幅法であるＲＴ−ＰＣＲ法や、ＮＡＳＢＡ法、ならびにＴＲＣ法なども含んでも良い。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
本発明の核酸回収方法により、糞便に含まれている核酸増幅反応阻害物質を効率よく除去し、糞便試料から純度の高い核酸を効率よく回収することができるため、特に糞便試料を用いた定期健診等の臨床検査等の分野において利用が可能である。
【符号の説明】
【０１３１】
１…容器本体
１ａ…隆起部
２…蓋
３…採便棒
３ａ…カップ
Ｓ…核酸増幅反応阻害物質除去用溶液
１１…容器本体
１２…蓋
１３…採便棒
１３ａ…穴
１３ｂ…可動蓋
１５…袋
Ｅ…糞便
１０１…糞便試料処理装置
１０２…遠心分離機構
１０３…溶液吸引排出ノズル
１０４…廃液回収部
１０５…溶液吸引排出ノズル洗浄機構
【図１】
2010010914.tif 000005
【図２】
2010010914.tif 000006
【図３】
2010010914.tif 000007
【図４】
2010010914.tif 000008
【図５】
2010010914.tif 000009
【配列表】
2010010914000001.app
【国際調査報告】
2010010914.tif 000010
2010010914.tif 000011
2010010914.tif 000012
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