(57)【要約】  生物学的材料の非特異性吸着を抑制する生体適合性ポリマーを、マイクロ流路デバイスの流路内を含む基板上でミクロンオーダーの高精度でパターンニングする方法を開発すること。  本発明は生体適合性ポリマーのパターンニング方法を提供する。前記生体適合性ポリマーのパターンニング方法は、生体適合性ポリマーの層を形成するステップと、前記生体適合性ポリマーの層の上に樹脂の層を形成するステップと、前記生体適合性ポリマーの層と樹脂の層とが除去されて基板が露出した、スポットを形成するステップと、前記樹脂の層を除去するステップとを含む。本発明は、基板と、本発明の方法によってパターンニングされた生体適合性ポリマーの層及び前記スポットとを含む、構造体及びマイクロ流路デバイスを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性ポリマーの層を形成するステップと、
前記生体適合性ポリマーの層の上に樹脂の層を形成するステップと、
前記生体適合性ポリマーの層と前記樹脂の層とが除去されて基板が露出した、スポットを形成するステップと、
前記樹脂の層を除去するステップとを含むことを特徴とする、生体適合性ポリマーのパターンニング方法。
【請求項２】
生体適合性ポリマーの層を形成するステップと、
前記生体適合性ポリマーの層の上に第１樹脂の層を形成するステップと、
前記生体適合性ポリマーの層と第１樹脂の層とが除去されて基板が露出した、第１スポットを形成するステップと、
残存する第１樹脂の層と、第１スポットの場所の基板との上に第２樹脂の層を形成するステップと、
前記生体適合性ポリマーの層と、第１樹脂の層と、第２樹脂の層とが除去されて基板が露出した、第２スポットを形成するステップと、
第２樹脂の層を除去するステップとを含むことを特徴とする、生体適合性ポリマーのパターンニング方法。
【請求項３】
前記生体適合性ポリマーは、生物学的材料との非特異性吸着を抑制する両親媒性ポリマーであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の生体適合性ポリマーのパターンニング方法。
【請求項４】
前記生体適合性ポリマーは２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンであることを特徴とする、請求項３に記載の生体適合性ポリマーのパターンニング方法。
【請求項５】
前記基板は光透過性を有することを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかに記載の生体適合性ポリマーのパターンニング方法。
【請求項６】
前記基板はガラスであることを特徴とする、請求項５に記載の生体適合性ポリマーのパターンニング方法。
【請求項７】
前記樹脂はポリパラキシリレンであることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれかに記載の生体適合性ポリマーのパターンニング方法。
【請求項８】
前記スポットを形成するステップはドライエッチング法により実行されることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれかに記載の生体適合性ポリマーのパターンニング方法。
【請求項９】
基板と、該基板上に形成される、請求項１ないし８のいずれかに記載の方法によってパターンニングされた生体適合性ポリマーの層及び前記スポットとを含むことを特徴とする、構造体。
【請求項１０】
前記基板を支持部を介して切断可能なように保持する基材を含むことを特徴とする、請求項９に記載の構造体。
【請求項１１】
前記支持部で前記基材から前記基板が切断することによって生じる前記基板の切断面を含み、該切断面は前記基板が露出していることを特徴とする、請求項１０に記載の構造体。
【請求項１２】
前記基板上に設けられたマイクロ流路を含み、該マイクロ流路は前記スポットを通ることを特徴とする、請求項９ないし１１のいずれかに記載の構造体。
【請求項１３】
前記マイクロ流路はポリジメチルシロキサンで作成されることを特徴とする、請求項１２に記載の構造体。
【請求項１４】
前記スポットに結合した生物学的材料を含むことを特徴とする、請求項９ないし１３のいずれかに記載の構造体。
【請求項１５】
基板と、該基板上に形成される、請求項２に記載の方法によってパターンニングされた生体適合性ポリマーの層、第１スポット及び第２スポットとを含むことを特徴とする、構造体。
【請求項１６】
第１スポットに結合した第１生物学的材料と、第２スポットに結合した第２生物学的材料とを含むことを特徴とする、請求項１５に記載の構造体。
【請求項１７】
前記生物学的材料の少なくとも１つは細胞であることを特徴とする、請求項１４ないし１６のいずれかに記載の構造体。
【請求項１８】
前記スポットのそれぞれに１個の細胞が配置されることを特徴とする、請求項１７に記載の構造体。
【請求項１９】
前記生物学的材料の少なくとも１つは特異的結合パートナーであることを特徴とする、請求項１４ないし１７のいずれかに記載の構造体。
【請求項２０】
第１生物学的材料は第１特異的結合パートナーで、第２生物学的材料は第２特異的結合パートナーであることを特徴とする、請求項１５に記載の構造体。
【請求項２１】
基板と、該基板上に形成される生体適合性ポリマーの層と、該生体適合性ポリマーの層が除去されて前記基板が露出した第１及び第２スポットと、前記スポットを通るマイクロ流路と、第１及び第２スポットのそれぞれに結合した第１及び第２特異的結合パートナーと、第１及び第２特異的結合パートナーと特異的に結合する第１及び第２細胞とを含むことを特徴とする、マイクロ流路デバイス。
【請求項２２】
第１及び第２スポットのそれぞれに第１及び第２細胞が１個配置されることを特徴とする、請求項２１に記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項２３】
前記生物学的材料の少なくとも１つは運動可能なオルガネラであることを特徴とする、請求項１４ないし１６のいずれかに記載の構造体。
【請求項２４】
前記運動可能なオルガネラは単離された鞭毛であることを特徴とする、請求項２３に記載の構造体。
【請求項２５】
前記スポットのそれぞれに前記単離された鞭毛が１個配置されることを特徴とする、請求項２４に記載の構造体。
【請求項２６】
基板と、該基板上に形成される生体適合性ポリマーの層と、該生体適合性ポリマーの層が除去されて前記基板が露出したスポットと、該スポットを通るマイクロ流路と、前記スポットに配置された運動可能なオルガネラとを含むマイクロ流路デバイスであって、前記オルガネラの運動は前記マイクロ流路を潅流するバッファーを変えることによって制御されることを特徴とする、マイクロ流路デバイス。
【請求項２７】
前記オルガネラは単離された鞭毛であることを特徴とする、請求項２２に記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項２８】
基板上に形成された生体適合性ポリマーの層が除去されて前記基板が露出したスポットに配置された鞭毛を含み、該鞭毛を回転させることによって前記スポットを通るマイクロ流路内を潅流する液体を輸送又は撹拌することを特徴とする、マイクロ流路デバイス。
【請求項２９】
前記スポットのそれぞれに１個の鞭毛が配置されることを特徴とする、請求項２７又は２８に記載のマイクロ流路デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体適合性ポリマーのパターンニング方法と、該方法によってパターンニングされた生体適合性ポリマーの層を含む構造体及びマイクロ流路デバイスとに関し、より具体的には、パリレン樹脂の引き剥がし法を用いて生体適合性ポリマーをマイクロ流路デバイスの流路内でミクロンオーダーの高精度でパターンニングする方法と、該方法によってパターンニングされた生体適合性ポリマーの層と、該生体適合性ポリマーの層が除去されて前記基板が露出したスポットと、該スポットに選択的に吸着された生物学的材料を含む構造体及びマイクロ流路デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、シリコン、ガラス、ポリマー等の基板上に微細加工を施して、細胞、特に単一細胞のパターンニングを行う技術の開発が進んでいる。かかる技術は、再生医療などの分野で細胞の機能解析や培養環境の最適条件を知るうえで重要な技術である。また、細胞、タンパク質、ＤＮＡ等の生物学的材料を基板上にパターンニングし、マイクロ流路と組み合わせて、生物学的材料の分析化学システムやセンサーに応用する研究も盛んにおこなわれるようになってきた。従来のパターンニング方法には、例えば、リン脂質極性基を側鎖に有する２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、「ＭＰＣ」という。）のような生体適合性ポリマーを利用し、基板表面をマイクロパターン化し、生物学的材料の非特異性吸着を抑制する方法が用いられている。しかし、基板上でミクロンオーダーの高精度でパターンニングする方法と、マイクロ流路デバイスの流路内でパターンニングする方法とはいずれも確立されていない。
【非特許文献１】Ｓ．Ｔａｋｅｕｃｈｉら、ＭＥＭＳ２００４、ｐｐ２０８−２１０、（２００４）
【非特許文献２】Ｂ．Ｌｌｉｃら、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ、２、４、３１７−３２２、（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、生物学的材料の非特異性吸着を抑制する生体適合性ポリマーを、マイクロ流路デバイスの流路内を含む基板上でミクロンオーダーの高精度でパターンニングする方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は生体適合性ポリマーのパターンニング方法を提供する。前記生体適合性ポリマーのパターンニング方法は、生体適合性ポリマーの層を形成するステップと、前記生体適合性ポリマーの層の上に樹脂の層を形成するステップと、前記生体適合性ポリマーの層と樹脂の層とが除去されて基板が露出した、スポットを形成するステップと、前記樹脂の層を除去するステップとを含む。【０００５】
本発明の生体適合性ポリマーのパターンニング方法は、生体適合性ポリマーの層を形成するステップと、前記生体適合性ポリマーの層の上に第１樹脂の層を形成するステップと、前記生体適合性ポリマーの層と第１樹脂の層とが除去されて基板が露出した、第１スポットを形成するステップと、残存する第１樹脂の層と、第１スポットの場所の基板との上に第２樹脂の層を形成するステップと、前記生体適合性ポリマーの層と、第１樹脂の層と、第２樹脂の層との全てが除去されて基板が露出した、第２スポットを形成するステップと、第２樹脂の層を除去するステップとを含む場合がある。【０００６】
本発明の生体適合性ポリマーのパターンニング方法において、前記生体適合性ポリマーは、生物学的材料との非特異性吸着を抑制する両親媒性ポリマーの場合がある。【０００７】
本発明の生体適合性ポリマーのパターンニング方法において、前記生体適合性ポリマーは２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの場合がある。【０００８】
本発明の生体適合性ポリマーのパターンニング方法において、前記基板は光透過性を有する場合がある。【０００９】
本発明の生体適合性ポリマーのパターンニング方法において、前記基板はガラスの場合がある。【００１０】
本発明の生体適合性ポリマーのパターンニング方法において、前記樹脂はポリパラキシリレンの場合がある。【００１１】
本発明の生体適合性ポリマーのパターンニング方法において、前記生体適合性ポリマー及び樹脂の層の一部を除去して基板が露出したスポットを形成するステップは、ドライエッチング法により実行される場合がある。【００１２】
本発明は、基板と、本発明の方法によってパターンニングされた生体適合性ポリマーの層及び前記スポットとを含む、構造体を提供する。【００１３】
本発明の構造体は、前記基板を支持部を介して切断可能なように保持する基材を含む場合がある。【００１４】
本発明の構造体は、前記支持部で前記基材から前記基板が切断することによって生じる前記基板の切断面を含み、該切断面は前記基板が露出している場合がある。【００１５】
本発明の構造体は、前記基板上に設けられたマイクロ流路を含み、該マイクロ流路は前記スポットを通る場合がある。【００１６】
本発明の構造体において、前記マイクロ流路はポリジメチルシロキサンで作成される場合がある。【００１７】
本発明の構造体は、前記スポットに結合した生物学的材料を含む場合がある。【００１８】
本発明の構造体は、基板と、該基板上に形成される、本発明の方法によってパターンニングされた生体適合性ポリマーの層、第１スポット及び第２スポットとを含む場合がある。前記生体適合性ポリマーの層、第１スポット及び第２スポットは、生体適合性ポリマーの層を形成するステップと、前記生体適合性ポリマーの層の上に第１樹脂の層を形成するステップと、前記生体適合性ポリマーの層と、第１樹脂の層とが除去されて基板が露出した、第１スポットを形成するステップと、第１樹脂の層の上に第２樹脂の層を形成するステップと、前記生体適合性ポリマーの層と、第１樹脂の層と、第２樹脂の層とが除去されて基板が露出した、第２スポットを形成するステップと、第２樹脂の層を除去するステップとを含む方法によってパターンニングされる。【００１９】
本発明の構造体は、第１スポットに結合した第１生物学的材料と、第２スポットに結合した第２生物学的材料とを含む場合がある。【００２０】
本発明の構造体において、前記生物学的材料の少なくとも１つは細胞の場合がある。【００２１】
本発明の構造体において、前記スポットのそれぞれに１個の細胞が配置される場合がある。【００２２】
本発明の構造体において、前記生物学的材料の少なくとも１つは特異的結合パートナーの場合がある。【００２３】
本発明の構造体において、第１生物学的材料は第１特異的結合パートナーで、第２生物学的材料は第２特異的結合パートナーの場合がある。【００２４】
本発明はマイクロ流路デバイスを提供する。前記マイクロ流路デバイスは、基板と、該基板上に形成される生体適合性ポリマーの層と、該生体適合性ポリマーの層が除去されて前記基板が露出した第１及び第２スポットと、前記スポットを通るマイクロ流路と、第１及び第２スポットのそれぞれに結合した第１及び第２特異的結合パートナーと、第１及び第２特異的結合パートナーと特異的に結合する第１及び第２細胞とを含む。【００２５】
本発明のマイクロ流路デバイスにおいて、第１及び第２スポットのそれぞれに第１及び第２細胞が１個配置される場合がある。【００２６】
本発明の構造体において、前記生物学的材料の少なくとも１つは運動可能なオルガネラの場合がある。【００２７】
本発明の構造体において、前記運動可能なオルガネラは単離された鞭毛の場合がある。【００２８】
本発明の構造体において、前記スポットのそれぞれに前記単離された鞭毛が１個配置される場合がある。【００２９】
本発明はマイクロ流路デバイスを提供する。前記マイクロ流路デバイスは、基板と、該基板上に形成される生体適合性ポリマーの層と、該生体適合性ポリマーの層が除去されて前記基板が露出したスポットと、該スポットを通るマイクロ流路と、前記スポットに配置された運動可能なオルガネラとを含むマイクロ流路デバイスであって、前記オルガネラの運動は前記マイクロ流路を潅流するバッファーを変えることによって制御される。【００３０】
本発明のマイクロ流路デバイスにおいて、前記オルガネラは単離された鞭毛の場合がある。【００３１】
本発明はマイクロ流路デバイスを提供する。前記マイクロ流路デバイスは、基板上に形成された生体適合性ポリマーの層が除去されて前記基板が露出したスポットに配置された鞭毛を含み、該鞭毛を回転させることによって前記スポットを通るマイクロ流路内を潅流する液体を輸送又は撹拌する。【００３２】
本発明のマイクロ流路デバイスにおいて、前記スポットのそれぞれに１個の鞭毛が配置される場合がある。【００３３】
本発明の生体適合性ポリマーのパターンニング方法は、第Ｎ−１樹脂の層の上に第Ｎ樹脂の層を形成するステップ（Ｎは３以上の自然数）と、前記生体適合性ポリマーの層と、第１樹脂の層ないし第Ｎ樹脂の層とが除去されて基板が露出した、第Ｎスポットを形成するステップと、第Ｎ−１樹脂の層を除去するステップとを含む場合がある。本発明の構造体及び／又はマイクロ流路デバイスは、基板と、該基板上に形成される、前記方法によってパターンニングされた生体適合性ポリマーの層、第１スポット、第２スポット、・・・、第Ｎスポットとを含む場合がある。また本発明の構造体及び／又はマイクロ流路デバイスは、第１スポットに結合した第１生物学的材料と、第２スポットに結合した第２生物学的材料と、・・・、第Ｎスポットに結合した第Ｎ生物学的材料とを含む場合がある。さらに、第Ｎ生物学的材料が第Ｎ特異的結合パートナーであって、第１特異的結合パートナー、第２特異的結合パートナー、・・・、第Ｎ特異的結合パートナーがそれぞれ異なる特異性をもって結合するため、Ｎ種類の異なる細胞の懸濁液に前記構造体及び／又はマイクロ流路デバイスを接触させることにより、一度にＮ種類の細胞が所望のパターンで配置された構造体及び／又はマイクロ流路デバイスを作成することができる。以下、本明細書では樹脂の層及びスポットが１種類又は２種類の場合について説明するが、本発明の範囲は３種類以上の樹脂の層及びスポットを有する場合を排除しない。すなわち、３種類以上の樹脂の層及びスポットを有する場合であっても、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載された発明に該当する場合には本発明の範囲に属する。【００３４】
本明細書において、生体適合性ポリマーとは、細胞、細胞内オルガネラ及び／又は生体分子のような生物学的材料を含むマイクロ流路デバイスに用いられるときに前記生物学的材料に対して特に有害な影響を及ぼさない高分子化合物をいう。本発明の生体適合性ポリマーは、生物学的材料との非特異性吸着を抑制する場合がある。かかる生体適合性ポリマーが本発明の構造体又はマイクロ流路デバイスの基板上にコーティングされ、該生体適合性ポリマーの層が形成されるとき、生物学的材料は前記構造体又はマイクロ流路デバイスに固着せず、容易に洗浄除去することができる。生体適合性ポリマーは、生物学的材料との非特異性吸着を抑制する両親媒性ポリマーが好ましく、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンがより好ましい。また、生物学的材料が細胞外オルガネラ又は生体分子の場合には、ウシ血清アルブミンのようなタンパク質を生体適合性ポリマーとしいて用いることができる。【００３５】
本明細書における生物学的材料とは、生物に由来するいずれかの材料を指し、生物個体、臓器、組織及び細胞と、鞭毛、繊毛、ミトコンドリア、葉緑体、染色体、分裂装置、リソソーム、ゴルジ体等の細胞内オルガネラと、ウイルス、ＤＮＡ複製酵素複合体、転写／ＲＮＡプロセッシング複合体、リボソーム、イオンチャンネル、細胞表面レセプター複合体等の分子集合体と、核酸、タンパク質、炭水化物等の生体高分子と、ホルモン、セカンドメッセンジャー、酵素基質、代謝中間体等の他の生物学的材料と相互作用を起こす全ての化合物とを含むが、これらに限定されない。【００３６】
本発明の運動可能なオルガネラは、鞭毛と、繊毛と、分裂装置と、仮足又は偽足とを含むが、これらに限られない、形態又は位置が変化する全てのオルガネラをいう。好ましい運動可能なオルガネラは鞭毛であり、クラミドモナス鞭毛が特に好ましい。【００３７】
本発明で用いられる特異的結合パートナーは、レクチンと、レクチンの可溶性断片と、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体と、該抗体の抗原結合断片と、該抗原結合断片を含むキメラ抗体又は組換え抗体とからなるグループから選択される場合がある。抗体の抗原結合断片は、抗原結合に参加する抗体の部分を指す。前記抗原結合部位は、重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖のＮ末端の可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基によって形成される。【００３８】
抗体は、当業者に知られたさまざまな技術によって調製される場合がある。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照せよ。【００３９】
本発明で用いられるポリクローナル抗体は、細胞表面抗原マーカーか、これらの断片かを免疫原として、ほ乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ又はヤギ）又は鳥類（例えばニワトリ）のいずれかの動物宿主に注射される。細胞表面抗原マーカーの断片を免疫原とする場合には、ウシ血清アルブミン又はスカシ貝ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ）のような担体タンパク質と連結される場合に優れた免疫応答が誘発される場合がある。前記免疫原は、１回又は２回以上のブースター免疫を取り込んだ予め定められたスケジュールに従って、前記動物宿主に注射されることが好ましい。前記免疫原は、完全又は不完全フロイントアジュバントその他の免疫増強剤に混合して前記動物宿主に注射される場合がある。本発明のポリクローナル抗体は、かかる抗血清から、例えば適当な固体支持体に結合された細胞表面抗原マーカーか、これらの断片かを用いるアフィニティクロマトグラフィーによって精製される場合がある。【００４０】
本発明で用いられるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９、１９７６の技術と、その改良技術を用いて調製される場合がある。これらの方法は、所望の特異性を有する抗体を産生できる不死性細胞株の調製を伴う。かかる細胞株は上記のとおり免疫された動物宿主由来の脾臓細胞から作成される場合がある。前記脾臓細胞は、さまざまな方法で不死化され、抗体産生能を有する不死化細胞株が調製される。前記脾臓細胞は、例えば、前記免疫された動物と同種かあるいは異種の動物由来のミエローマ細胞との融合によって不死化される。当業者に周知のさまざまな融合技術を用いる場合がある。例えば、前記脾臓細胞とミエローマ細胞とは非イオン性界面活性剤と数分間混合され、それからハイブリッド細胞の増殖は支持するがミエローマ細胞の増殖は支持しない選択培地に低濃度でプレートされる。好ましい選択技術はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いる。通常約１ないし２週間の十分な時間の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。シングルコロニーが選択され、その培養上清が前記ポリペプチドに対する結合活性についてテストされる。反応性及び特異性が高いハイブリドーマが好ましい。限界希釈法によるクローニングを繰り返すことにより、反応性及び特異的が高い抗体を安定的に大量に産生するハイブリドーマのクローンが選択される。モノクローナル抗体は増殖中の選択されたハイブリドーマクローン由来の細胞株のコロニーの上清から単離される場合がある。さらに、マウスのような適当な脊椎動物宿主の腹腔内に前記ハイブリドーマ細胞株を注射するような、収率を向上させるためのさまざまな技術が用いられる場合がある。モノクローナル抗体は前記ハイブリドーマ細胞腹水又は血液から回収される場合がある。汚染物は、クロマトグラフィー、ゲルろ過、沈殿及び抽出のような従来技術によって前記抗体から除去される場合がある。【００４１】
本発明で用いられる抗体の抗原結合断片は、それぞれタンパク質分解酵素パパイン又はペプシンでインタクトなポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を分解して得られるＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片の他、天然抗体分子の抗原認識能及び結合能の多くを保持する抗原結合部位を含む非共有結合的なＶＨ及びＶＬ領域のヘテロ２量体を含むＦｖ断片を含む。【００４２】
本発明で用いられる組換え抗体は、適当な細菌宿主への形質転換か、適当なほ乳類細胞宿主へのトランスフェクションかを含む抗体遺伝子の発現クローニングによって調製される場合がある。本発明で用いられるキメラ抗体は、前記本発明の組換え抗体の抗原結合部位が細胞表面抗原マーカーと特異的に結合できるように同種又は異種の抗体の定常ドメインによって支持された融合タンパク質である。本発明で用いられるキメラ抗体には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）に操作可能に連結された抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む短鎖可変部抗体（ｓｃＦｖ）と、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマを含む）の動物が産生する軽鎖がないＩｇＧのクラスであるラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）又はその重鎖可変部ドメイン（ＶＨＨ）とを含む。本発明の組換え抗体は原核生物及び真核生物由来の遺伝子発現システムを用いて大量に調製することができる。【００４３】
本明細書において、生体適合性ポリマー、樹脂等の層を形成する際には、スピン塗布法、真空蒸着法その他当業者に周知のいかなる方法によって、適用、塗布、蒸着又はコーティングされてもかまわない。【００４４】
本明細書において、生体適合性ポリマーの層の上に形成される樹脂の層は、本発明のスポットを形成するステップにおいて、該スポットで露出される場所以外の前記基板の上の前記生体適合性ポリマーの層を保護することが可能であること、及び、その後必要に応じて、前記樹脂の層を除去することが可能であることを条件として、いかなる材料でできていてもかまわない。本発明の第１樹脂の層の上に第２樹脂の層を形成するステップを含む、生体適合性ポリマーのパターンニング方法においては、第２スポットに第２生物学的材料が結合した後、第２生物学的材料と、残存する第１樹脂及び前記生体適合性ポリマーの層と、第１スポットの基板の表面とにいかなる影響を与えることなく第２樹脂の層を除去することができることが望ましい。また、第２樹脂の層を除去してから、第１スポットに第１生物学的材料が結合した後で、第１生物学的材料と、残存する前記生体適合性ポリマーの層とにいかなる影響を与えることなく第１樹脂の層を除去することができることが望ましい。前記樹脂の層を除去することは、前記樹脂の層を引き剥がすこと（リフトオフ）によって実行される場合がある。好ましい樹脂はポリパラキシリレン（商品名：パリレン）である。第１樹脂と第２樹脂とは、同一の物質の場合もあれば、異なる物質の場合もある。【００４５】
本発明の生体適合性ポリマー及び樹脂の層が除去されて基板が露出したスポットを形成するステップは、光リソグラフィ法、ドライエッチング法その他当業者に周知のいかなる方法のいかなる組み合わせによって実行されてもかまわない。好ましいやり方は、Ｏ２プラズマを用いるドライエッチング法である。【００４６】
本明細書において、スポットとは、基板の上にいったん形成された生体適合性ポリマーの層が除去されて、基板が露出した場所をいう。前記スポットと、該スポットが形成された後に残存する生体適合性ポリマーの層とは、本発明のパターンニング方法を利用して、所望の数、形状及び／又は寸法にすることができる。前記スポット及び／又は生体適合性ポリマーの層の寸法は１μｍ以上のいかなる寸法でも作成することができる。これによって、細菌、動植物細胞その他の生物学的材料をその寸法に近い間隔（例えば、数μｍないし十μｍ）で本発明の構造体及び／又はマイクロ流路デバイス上に配置することができるので、細胞を高密度でパターンニングすることが可能になる。第１スポットは、第１樹脂及び生体適合性ポリマーの層が除去されて形成されるが、いったん露出した基板はその後第２樹脂の層に覆われ、第２スポットが形成されてから第２樹脂の層が除去されて、もう一度基板が露出する。これに対し第２スポットは、露出した基板が樹脂の層に覆われることは起こらない点でのみ第１スポットと異なる。第１スポットと第２スポットとの区別は、スポットの位置、形状及び／又は寸法によるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明のパターンニング方法の手順を示す模式図。
【図２】本発明の別のパターンニング方法の手順を示す模式図。
【図３】本発明のパターンニング方法を利用するマイクロ流路デバイスの作成の手順を示す模式図。
【図４】ＭＰＣポリマー層による非特異的な鞭毛吸着の抑制を示すグラフ。
【図５】ＭＰＣポリマーのパターンニングの精度を示す蛍光写真。
【図６】異なる直径の円形のスポットが除去されたパターンニングを施されたＭＰＣポリマー層を含む構造体上での培養細胞の配置を示す光学顕微鏡写真。
【図７】異なる幅の帯状のスポットが除去されたパターンニングを施されたＭＰＣポリマー層を含む構造体上での培養細胞の配置を示す光学顕微鏡写真。
【図８】１本の鞭毛の回転を撮影した連続写真。
【図９】スポットのサイズと吸着した鞭毛のうち回転しているものの割合との関係を示すグラフ。
【図１０】マイクロ流路デバイス中の流路を潅流する溶液変換による鞭毛の回転速度の制御を示すグラフ。
【符号の説明】
【００４８】
１、１１    基板
２、１２    生体適合性ポリマーの層
３    樹脂の層
４    スポット
１０、２０    構造体
１３    第１樹脂の層
１４    第１スポット
１５    第２樹脂の層
１６    第２スポット
１７    第２生物学的材料
１８    第１生物学的材料
【発明を実施するための形態】
【００４９】
図１を参照して、本発明のある実施態様を説明する。図１は本発明のパターンニング方法の手順を示す模式図である。図１（Ａ）には、基板１の上に生体適合性ポリマーの層２が形成され、生体適合性ポリマーの層２の上に樹脂の層３が形成された構造体１０が示される。所望のパターンでスポット４が形成されて生体適合性ポリマーの層２が残存するように、生体適合性ポリマーの層２と、前記樹脂の層３とが除去され、基板の一部が露出し、スポット４が形成される（図１（Ｂ））。その後、樹脂の層３が除去されて（図１（Ｃ））、生体適合性ポリマーの層２と、スポット４とが所望のパターンで基板上に配置された構造体１０が作成される。
【００５０】
図２を参照して、本発明の別の実施態様を説明する。図２は本発明のパターンニング方法の別の手順を示す模式図である。図２（Ａ）には、基板１１の上に生体適合性ポリマーの層１２が形成され、生体適合性ポリマーの層１２の上に第１樹脂の層１３が形成された構造体が示される。所望のパターンで第１スポット１４が形成されるように、生体適合性ポリマーの層１２と、第１樹脂の層１３とが除去され、基板１１の一部が露出し、第１スポット１４が形成される（図２（Ｂ））。その後、第１スポット１４を埋めるように第１スポット１４の場所の基板と、残存した第１樹脂の層１３との上に第２樹脂の層１５が形成される（図２（Ｃ））。
【００５１】
つぎに、所望のパターンで第２スポット１６が形成されるように、生体適合性ポリマーの層１２と、第１樹脂の層１３と、第２樹脂の層１５とが除去される。このようにして基板１１が露出した第２スポット１６が形成される（図２（Ｄ））。この段階で第２スポット１６に第２生物学的材料１７が適用される場合がある（図２（Ｅ））。図２（Ｅ）及び（Ｇ）では生物学的材料がピペットで滴下されるように描かれるが、これは例示にすぎず、当業者に周知のいかなる方法によって実行されてもかまわない。適用する場所を正確に指定することができないやり方、例えば、蒸着、噴霧その他のやり方では、第２スポットだけしか基板が露出していない図２（Ｅ）の段階で第２生物学的材料１７を適用することが好ましい。第２樹脂の層１５の上に堰堤（図示されない）を設けて、該堰堤で囲まれた領域全体を液溜めとして第２生物学的材料を含む流体を流し込むことによって第２生物学的材料を第２スポットの基板と接触させる場合もある。第２スポット１６に第２生物学的材料１７を適用した後で、第２樹脂の層１５が除去される（図２（Ｆ））。すると、第２樹脂の層で覆われていた第１スポット１４の場所の基板がふたたび露出する。
【００５２】
図２（Ｇ）の段階で第１生物学的材料１８を第１スポット１４に適用する場合がある。第２生物学的材料の適用の場合と同じく第１生物学的材料の適用においても、当業者に周知のいかなる方法によって実行されてもかまわない。その後、第１樹脂の層１３が除去される（図２（Ｈ））と、生体適合性ポリマーの層１２と、第１スポット１４と、第２スポット１６とが所望のパターンで基板上に配置された構造体２０が作成される（図２（Ｉ））。
【００５３】
第１樹脂の層１３が除去されてから、第１生物学的材料を第１スポット１４に適用する場合も考えられる。適用する場所を正確に指定することができないやり方で第１生物学的材料が適用される場合には、第２スポット１７の第２生物学的材料に第１生物学的材料が混入する可能性がある。このような適用方法を採用する場合には、例えば、第２生物学的材料に、第１生物学的材料を中和又は不活性化する成分を添加しておくことで混入による影響を軽減又は解消することができる。第１生物学的材料がレクチンの場合には、該レクチンと特異的に結合する糖を第２生物学的材料に含めることが好ましい。第１生物学的材料が抗体の場合には、該抗体と特異的に結合する抗原を第２生物学的材料に含めることが好ましい。
【００５４】
図３を参照して、本発明のパターンニング方法を利用するマイクロ流路デバイスの作成の手順を示す模式図である。ガラス製基板の上に生体適合性ポリマー（ＭＰＣポリマー）の層が形成され（図３（Ａ）（i））、該生体適合性ポリマーの層の上に、樹脂（ポリパラキシリレン）の層が形成される（図３（Ａ）（ii））。その上にアルミニウム及び光犠牲層が形成される（図３（Ａ）（iii））。アルミニウム及び光犠牲層の上からＯ２プラズマが照射されることによって、アルミニウム及び光犠牲層で保護されていない部分の樹脂及び生体適合性ポリマーの層が除去され、ガラス基板が露出したスポットが形成される（図３（Ａ）（iv））。ポリパラキシリレンの樹脂の層が剥ぎ取られ（図３（Ａ）（ｖ））、生体適合性ポリマー（ＭＰＣポリマー）のパターンが形成されたガラス基板が露出する。一方で、従来の微細加工技術によるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）によるマイクロ流路が用意され、Ｏ２プラズマが照射された後、（図３（Ａ）（ｖ））、生体適合性ポリマー（ＭＰＣポリマー）のパターンが形成されたガラス基板に永久的に、かつ、水密に貼り付けられる（図３（Ｂ））。このようにして、マイクロ流路の潅流のために、マイクロシリンジ等の送液手段を介して１個又は２個以上の液体供給源に接続されるインレットと、廃液溜めに接続されるアウトレットとを更に備えた、本発明のマイクロ流路デバイスが作成される。図３（Ｃ）は完成した本発明のマイクロ流路デバイスに細胞その他の生物学的材料を添加した様子を示す。図３（Ｃ）上のＡ−Ｂ間の断面模式図が図３（Ｃ）下である。マイクロシリンジを通じて細胞の懸濁液をデバイス内部に流入させると、生体適合性ポリマー（ＭＰＣポリマー）層は細胞の基質接着を阻害するため、該生体適合性ポリマー（ＭＰＣポリマー）層の上に細胞が付着することはできない。そこで、前記生体適合性ポリマー（ＭＰＣポリマー）層が存在せずガラス基板が露出した部分にのみ細胞が付着する。このようにして作成されるマイクロ流路デバイス内のスポットに細胞その他の生物学的材料が配置される。なお、前記マイクロ流路デバイスに細胞懸濁液を添加する前に、フィブロネクチン、コラーゲン等の細胞−基質間接着を促進する物質を前記マイクロ流路デバイスに適用する場合もある。
【００５５】
以下に実施例を示すが、これらは実施態様の例示を意図しており本発明の範囲を限定することは意図しない。
【実施例１】
【００５６】
ＭＰＣポリマーによるガラス基板への生物学的材料の非特異性吸着の抑制
ガラス基板への生物学的材料の非特異性吸着をＭＰＣポリマーがどの程度抑制するかを検討するために、さまざまな回転速度でスピン塗布されたＭＰＣポリマー及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でコーティングされたガラス表面と、無処理で露出したガラス表面とにクラミドモナス鞭毛を適用した。前記クラミドモナス鞭毛は、３−４日液体培養したクラミドモナスにジブカイン−塩酸を添加した後、超遠心により回収した（Ｓ．Ａｏｙａｍａら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ．、８９：３２６１−３２６８（２００５））。その結果、図３に示すとおり、ＢＳＡではスピン塗布する回転速度が低いほど鞭毛の吸着が減少した。ＭＰＣポリマーでは、回転速度が最高の条件でもいかなる条件のＢＳＡよりも鞭毛の吸着が少なかった。この結果からＭＰＣポリマーは、生物学的材料の吸着を抑制する活性が強力であることがわかった。そこで、ＭＰＣポリマーのパターンニングによって生物学的材料を所望のパターンで配置できることが期待される。
【実施例２】
【００５７】
パリレン樹脂リフトオフ法によるＭＰＣポリマーの高精度パターンニング
スピン塗布法によりガラス基板の表面にＭＰＣポリマー層を形成した。つぎに、前記ＭＰＣポリマーの上に２μｍ厚のパリレン層を蒸着した。そして、ドライエッチングのマスクとしてフォトレジスト及びアルミニウムを用い、Ｏ２プラズマにより所望の位置の前記パリレン層及びＭＰＣポリマー層を除去した。その後、パリレン層を引き剥がしてＭＰＣポリマー層を露出させた。ＭＰＣポリマーは生物学的材料の基板への非特異性吸着を抑制するため、生物学的材料はＭＰＣポリマー層が除去されてガラス基板が露出したスポットに優占的に保持される。ガラス基板が露出した前記部位をマイクロ流路デバイスの流路内に配置する場合には、常法に従ってポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を前記ガラス基板上に積層して、前記部位を通過するマイクロ流路を形成する。【００５８】
図５は、予めローダミンを添加したＭＰＣポリマーを用いてパターンニングした結果を示す蛍光写真である。ＭＰＣポリマーの幅が１．５μｍまでの精度でパターンニングすることができた。本発明では光リソグラフィ法で生体適合性ポリマーの層及び樹脂の層を除去するため、ＭＰＣポリマーは、光リソグラフィ法と同じ精度でパターンニングすることができる。
【実施例３】
【００５９】
培養細胞のパターンニング
使用された細胞は、ウシ血管内皮細胞である。１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｆ７５２４、ＳＩＧＭＡ）と、５％のペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ｐ４３３３、ＳＩＧＭＡ）とを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、１１８８５、Ｇｉｂｃｏ）を用いて３７°Ｃ、５％ＣＯ２雰囲気下で培養された。【００６０】
さまざまなパターンでパターンニングされたＭＰＣポリマー層を含む構造体にウシ血管内皮細胞を播種して培養後、構造体上での細胞の配置パターンを観察した。図６は、各フレームに記載された直径のスポットが除去されたパターンニングを施されたＭＰＣポリマー層を含む構造体上での培養４時間後の細胞の配置を示す光学顕微鏡写真である。図６に示すとおり、ＭＰＣポリマー層の上では細胞がほとんど存在せず、ＭＰＣポリマーが除去されたスポットにだけ細胞が配置された。直径２００μｍ（左上）及び１００μｍ（右上）のスポット内では、細胞はほぼ均一に分布していた。スポットの直径が小さいほどスポットあたりの細胞数は減少し、直径２０μｍ（右下）では各スポットに１個ずつの細胞が配置された。この状態では、細胞は基質接着によって伸展することができず、丸くなっていることが観察された。【００６１】
図７は、各フレームに記載された幅の帯状のスポットが除去されたパターンニングを施されたＭＰＣポリマー層を含む構造体上での培養３日後の細胞の配置を示す光学顕微鏡写真である。図７に示すとおり、ＭＰＣポリマーが除去されたスポットにだけ細胞が配置された。スポットの幅が５０μｍ（下のフレーム）では細胞がスポットの長手方向に、４ないし５個ずつ並んで配向した。スポットの幅が５μｍになると、細胞が１個ずつ１列に並んで配向した。スポットの幅が３μｍになると、細胞が細長く伸張して配向した。そこで、本発明のパターンニング処理を施された環境で細胞が所望の配向パターンに配置された状態で良好に培養増殖することが示された。
【実施例４】
【００６２】
マイクロ流路デバイスの流路内での鞭毛アレイの作成
ＭＰＣポリマー層をパターンニングしたガラス基板に前記クラミドモナス鞭毛を適用して鞭毛のアレイを作成した。鞭毛が吸着したスポットを通るマイクロ流路にＡＴＰ及びカルシウムイオンを含むバッファーを潅流させると、鞭毛の回転が観察された。図８は１本の鞭毛の回転を撮影した連続写真である。図９は、ガラス基板が露出したスポットのサイズと、吸着した鞭毛のうち回転しているものの割合との関係を示すグラフである。スポットのサイズが小さいほど回転する鞭毛の割合が多くなり、スポットの直径が５μｍのときには７３％の鞭毛が回転した。スポットに吸着した鞭毛の回転速度は０．５ないし３．０ｒｐｓであった。【００６３】
図１０は、マイクロ流路デバイス中の流路を潅流する溶液変換による鞭毛の回転速度の制御を示すグラフである。回転速度の変化を比較しやすくするため、どちらもＳｔｅｐ１での平均回転速度を１として正規化した。Ｓｔｅｐ２において、バッファーを変換しなかった鞭毛は回転速度が２割程上がったのに対し、バッファー変換した鞭毛は元の半分以下まで回転速度が下がった。このことより，バッファー中のＣａイオン濃度が高くなると基板に固定されている鞭毛の回転速度は下がるということがいえる。なお、回転速度の実測値は、Ｓｔｅｐ１において平均２．０ｒｐｓ、Ｓｔｅｐ２において平均０．８ｒｐｓであった。Ｓｔｅｐ３では、バッファー変換しなかった鞭毛も最初の６割程度まで回転速度が下がった。これは、時間の経過によって鞭毛の活性が落ちたためだと考えられる。逆にバッファー変換した鞭毛は，Ｓｔｅｐ２とＳｔｅｐ３との間で回転速度の低下は見られなかった。これは、時間経過によって回転速度は下がっていったが，Ｃａイオン濃度が上昇したためその影響で鞭毛運動は活性化され、結果として同じ程度の回転速度を保ったためだと考えられる。以上の結果より、Ｃａイオン濃度の異なるバッファー変換によって、固定された鞭毛の回転速度を変えることができるという結論が導かれる。このことは、鞭毛をアクチュエータとして用いる際に、その回転速度や移動速度をコントロールできる可能性があるということを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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