(57)【要約】  帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数の蛍光色素を溶液に混入させ、該溶液を測定対象面に流し、前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた複数色の蛍光強度分布を生成させ、前記蛍光の複数色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子を用いて、測定対象面の蛍光強度を測定することにより、前記複数色の蛍光強度の比を計算し、あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度との関係式を使って、壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の２次元分布に変換する。これにより、壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の２次元分布や表面修飾をリアルタイムに可視化し、更に定量的に評価可能とする。
2010041560.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の分布の定量的評価に際して、
帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数の蛍光色素を溶液に混入するステップと、
該溶液を測定対象面に流すステップと、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた複数色の蛍光強度分布を生成させるステップと、
前記蛍光の複数色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子を用いて、測定対象面の蛍光強度を測定するステップと、
前記複数色の蛍光強度の比を計算するステップと、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の２次元分布に変換するステップと、
を備えたことを特徴とする壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の分布の定量的評価方法。
【請求項２】
前記蛍光強度比と壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の関係を較正することを特徴とする請求項１に記載の壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の分布の定量的評価方法。
【請求項３】
壁面におけるゼータ電位の分布を得る際に、前記複数の蛍光色素として、陽イオンである赤色発光のジクロロトリ（１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）ハイドレート（Dichlorotris(1,10-phenanthroline)ruthenium(II)hydrate）と、陰イオンである緑色発光のAlexa  Fluor（登録商標）488を用いることを特徴とする請求項１に記載の壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の分布の定量的評価方法。
【請求項４】
壁面におけるｐＨ又は温度の分布を得る際に、前記複数の蛍光色素として、ＬＤＳ６９８（登録商標）及びフルオロセインを用いることを特徴とする請求項１に記載の壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の分布の定量的評価方法。
【請求項５】
前記２次元撮像素子が、一台の３ＣＣＤカメラであることを特徴とする請求項１に記載の壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の分布の定量的評価方法。
【請求項６】
帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数の蛍光色素を溶液に混入する手段と、
該溶液を測定対象面に流す手段と、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた複数色の蛍光強度分布を生成させる手段と、
前記蛍光の複数色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子と、
該２次元撮像素子を用いて測定した複数色の蛍光強度の比を計算する手段と、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の２次元分布に変換する手段と、
を備えたことを特徴とする壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の分布の定量的評価装置。
【請求項７】
帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数の蛍光色素を溶液に混入するステップと、
該溶液を、表面修飾によってゼータ電位、ｐＨ、又は温度が局所的に分布している測定対象面に流すステップと、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた複数色の蛍光強度分布を得るステップと、
前記蛍光の複数色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子を用いて、測定対象面の蛍光強度を測定するステップと、
前記複数色の蛍光強度の比を計算するステップと、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の２次元分布に変換することにより、表面修飾パターンを可視化するステップと、
を備えたことを特徴とする表面修飾の定量的可視化方法。
【請求項８】
前記表面修飾が、オクタデシルトリクロロシランによって行われたものである請求項７に記載の表面修飾の定量的可視化方法。
【請求項９】
帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数色の蛍光色素を溶液に混入する手段と、
該溶液を、表面修飾によってゼータ電位、ｐＨ又は温度が局所的に分布している測定対象面に流す手段と、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた複数色の蛍光強度分布を生成させる手段と、
前記蛍光の複数色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子と、
該２次元撮像素子を用いて測定した複数色の蛍光強度の比を計算する手段と、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の２次元分布に変換することにより、表面修飾パターンを可視化する手段と、
を備えたことを特徴とする表面修飾の定量的可視化装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の分布の定量的評価方法、装置、及び、表面修飾の定量的可視化方法、装置に係る。特に、細胞生物分野、電気化学分野、マイクロ・ナノスケール熱流体工学分野に用いるのに好適な、壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の分布の定量的評価方法、装置、及び、これを利用した表面修飾の定量的可視化方法、装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
表面科学の分野において、吸着性や濡れ性といった物質表面の性質について多くの研究が行われてきた。更にＳＡＭｓ(Self-assembled  monolayers)（Whitesides, G. M. et al., Annu. Rev. Biomed. Eng., 3, 335-373, 2001.［以下、非特許文献１］参照）と呼ばれる、有機物の単分子膜を物質表面に形成させる表面修飾技術が考案され、物質表面の性質を能動的に変化させる試みも多く行われてきた。【０００３】
近年、試料の分離・混合・反応・検出といった機能を集積化したマイクロ流体デバイスの発展に伴い、固液界面の電位であるゼータ電位（Kirby, B. J. et al., Electrophoresis, 25, 187-202, 2004.［以下、非特許文献２］参照）が、これらの動電学を利用したデバイスの性能を決定する重要なパラメータの一つとなった。電気化学、生物化学の分野では、マイクロ流体デバイス内に表面修飾をパターン状に施し、濡れ性や物質吸着性を制御する研究が盛んに行われている。【０００４】
こうした物質表面に関する研究を受けて、表面の性質を評価しようとする計測技術が考案されてきた。電子顕微鏡を用いて物質表面の構造を可視化した手法（Lopez, G. P. et al., Langmuir, 9, 1513-1516, 1993.［以下、非特許文献３］参照）、ＳＡＭｓの膜厚や内部に含まれる分子の種類によって表面修飾を評価する手法（Yang, X. M. et al., Appl. Phys. Lett., 69(26):4020-4022, 1996.［以下、非特許文献４］参照）、あるいは、濡れ性を用いて表面の性質を評価した手法（Lopez, G. P. et al., Science, 260, 647-649, 1993.［以下、非特許文献５］参照）などが提案されてきた。【０００５】
前記のようなマイクロ流体デバイスの性能評価や最適設計に向けて、デバイス内流路表面のゼータ電位の定量的な計測が有効である。即ち、デバイス内流路の壁面に施された表面修飾パターンや、液体試料混合により発生するゼータ電位の２次元分布を定量的に可視化すれば、デバイス性能への寄与を評価することが可能となる。【０００６】
従来までのマイクロ流動場におけるゼータ電位の計測法としては流動電位法（Oldham, I. B. et al., J. Colloid Sci., 18, 328-336, 1963.［以下、非特許文献６］参照）、電流モニタリング法（Sze, A. et al., J. Colloid Interface Sci., 261, 402-410, 2003.［以下、非特許文献７］参照）、あるいは、電気浸透流速度を計測してHelmholtz-Smoluchowskiの式を用いて算出する方法（Sinton, D. et al., J. Colloid Interface Sci., 254, 184-189, 2002.［以下、非特許文献８］参照）などが考案されてきたが、いずれも流路全体の平均としてのゼータ電位の計測法であった。【０００７】
一方、発明者のうち二人が開発したナノ・レーザ誘起蛍光法（Kazoe, Y. and Sato, Y., Anal. Chem., 79, 6727-6733, 2007.［以下、非特許文献９］参照）によって、初めてデバイス内におけるゼータ電位の２次元分布の計測が可能となった。このナノ・レーザ誘起蛍光法は、水溶液中で陰イオン化する蛍光色素（赤色）、および屈折率の異なる界面における光の全反射によって発生するエバネッセント波（Axelrod, D. et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 13, 247-268, 1984.［以下、非特許文献１０］、特開２００７−８５９１５号公報［以下、特許文献１］参照）を用いている。エバネッセント波は，強度が界面からの距離に対して指数関数的に減衰するため、これを流路壁面において発生させることにより、壁面からの距離数百ナノメートル程度の壁近傍の範囲を照明することができる。蛍光色素を水溶液に混入して流路内に流入すると、負極に帯電した蛍光色素の壁面近傍の濃度分布は、壁面ゼータ電位に依存して変化する。よって、エバネッセント波により励起した際の蛍光強度もゼータ電位に依存する。従って、蛍光強度の分布からゼータ電位分布を知ることができる。【０００８】
なお、ゼータ電位以外にも、ｐＨの分布を得る技術が、J. Coppeta et al., Experiments in Fluids 1-15, 1998［以下非特許文献１１］に記載され、温度の分布を得る技術が、Y. Sato et al., Meas. Sci. Technol. 14, 114-121, 2003［以下、非特許文献１２］に記載されている。【０００９】
前記ナノ・レーザ誘起蛍光法によりゼータ電位の２次元分布を取得するためには、ＣＣＤカメラにより蛍光強度画像を取得するが、取得画像は励起光強度の分布に起因する蛍光強度分布を含んでいるため、リファレンス画像を取得して補正を行う必要がある。そのため、ＣＣＤカメラで撮像される画像自体からはゼータ電位の２次元的な分布を可視化することは困難であり、リアルタイムでの計測には不向きである。また計測位置や流路形状が異なる際においても再度補正を行う必要があり、位置のずれに起因する計測誤差や、計測手法の煩雑さなどに難点があった。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、前記従来の問題点を解消するべくなされたもので、マイクロ流体デバイス内等における壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の２次元的分布や表面修飾を、リアルタイムに可視化し、更に、定量的に評価可能とすることを課題とする。
【００１１】
本発明は、壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の分布の定量的評価に際して、
帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数の蛍光色素を溶液に混入するステップと、
該溶液を測定対象面に流すステップと、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた複数色の蛍光強度分布を生成させるステップと、
前記蛍光の複数色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子を用いて測定対象面の蛍光強度を測定するステップと、
前記複数色の蛍光強度の比を計算するステップと、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の２次元分布に変換するステップと、
を備えるようにして、前記課題を解決したものである。
【００１２】
本発明は、又、
帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数の蛍光色素を溶液に混入する手段と、
該溶液を測定対象面に流す手段と、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた複数色の蛍光強度分布を生成させる手段と、
前記蛍光の複数色を強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子と、
該２次元撮像素子を用いて測定した複数色の蛍光強度の比を計算する手段と、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の２次元分布に変換する手段と、
を備えたことを特徴とする壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の分布の定量的評価装置を提供するものである。
【００１３】
ここで、前記蛍光強度比と壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の関係を較正することができる。
【００１４】
又、壁面におけるゼータ電位の分布を得る際に、前記複数の蛍光色素として、陽イオンである赤色発光のジクロロトリ（１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）ハイドレート（Dichlorotris(1,10-phenanthroline)ruthenium(II)hydrate）と、陰イオンである緑色発光のAlexa  Fluor（登録商標）488を用いることができる。
【００１５】
又、壁面におけるｐＨ又は温度の分布を得る際に、前記複数の蛍光色素として、ＬＤＳ６９８（登録商標）及びフルオロセインを用いることができる。
【００１６】
又、前記２次元撮像素子を、一台の３ＣＣＤカメラとすることができる。
【００１７】
本発明は、又、
帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数の蛍光色素を溶液に混入するステップと、
該溶液を、表面修飾によってゼータ電位、ｐＨ、又は温度が局所的に分布している測定対象面に流すステップと、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた複数色の蛍光強度分布を得るステップと、
前記蛍光の複数色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子を用いて、測定対象面の蛍光強度を測定するステップと、
前記複数色の蛍光強度の比を計算するステップと、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の２次元分布に変換すことにより、表面修飾パターンを可視化するステップと、
を備えたことを特徴とする表面修飾の定量的可視化方法を提供するものである。
【００１８】
本発明は、又、
帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数色の蛍光色素を溶液に混入する手段と、
該溶液を、表面修飾によってゼータ電位、ｐＨ又は温度が局所的に分布している測定対象面に流す手段と、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた複数色の蛍光強度分布を生成させる手段と、
前記蛍光の複数色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子と、
該２次元撮像素子を用いて測定した複数色の蛍光強度の比を計算する手段と、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の２次元分布に変換することにより、表面修飾パターンを可視化する手段と、
を備えたことを特徴とする表面修飾の定量的可視化装置を提供するものである。
【００１９】
ここで、前記表面修飾が、オクタデシルトリクロロシランによって行われるものとすることができる。
【００２０】
本発明によれば、発明者の一人が開発したナノ・レーザ誘起蛍光法に、帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数の蛍光色素、及び、該蛍光の複数色を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子を導入することにより、より簡易な方法で、マイクロ流体デバイス内等における表面修飾等によるゼータ電位、ｐＨ又は温度の２次元分布を可視化して、定量的計測をリアルタイムで行うことが可能になる。
【００２１】
又、従来手法に比較して、計測手順の大幅な軽減や、計測過程における計測誤差の低減をもたらすことができる。
【００２２】
更に、本発明を用いることによって、マイクロ流体デバイス内等において、表面修飾パターンや液体試料の混合・反応によって起こる複雑なイオン挙動の２次元分布等を定量的に可視化することができる。そのため、マイクロ熱流体システム内等の複雑な流動場についての様々な知見を得ることができる。例えば、ゼータ電位に依存して形成される電気浸透流動場は、ゼータ電位分布を把握することにより解析することができる。又、細胞やたん白質の吸着性の制御、あるいは、壁面の濡れ性の制御等を目的としたデバイスの性能評価や最適設計の際に有用である。その他にも、細胞生物分野や電気化学、更にはマイクロ流体工学分野等の幅広い分野にわたる応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の原理を示す図
【図２】本発明を実施するための計測システムの一例の全体構成図
【図３】図２の計測流路部分を拡大して示す斜視図
【図４】本発明の実施形態における蛍光強度比とゼータ電位の関係の例を示す図
【図５】同じく（Ａ）３ＣＣＤカメラにより撮像した、ＯＴＳパターンを１００×１００μｍのタイル状に表面修飾した石英ガラスのゼータ電位分布の例と、（Ｂ）較正曲線を用いたゼータ電位分布の定量的評価の例を示す図
【図６】同じく（Ａ）３ＣＣＤカメラにより撮像した、ＯＴＳパターンを一辺５０μｍの正三角形状に表面修飾した石英ガラスのゼータ電位分布の例と、（Ｂ）較正曲線を用いたゼータ電位分布の定量的評価の例を示す図
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下図面を参照して、本発明の実施形態を詳細に説明する。【００２５】
壁面におけるゼータ電位分布を求める際に適用した本実施形態で用いた蛍光色素は、水溶液中で陽イオン化する赤色の蛍光色素としてのジクロロトリ（１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）ハイドレート（Dichlorotris(1,10-phenanthroline)ruthenium(II)hydrate）（励起波長４４９ｎｍ、蛍光５８２ｎｍ）、および、陰イオン化する緑色の蛍光色素としてのAlexa  Fluor（登録商標）488（励起波長４９５ｎｍ、蛍光５１９ｎｍ）である。【００２６】
２種の蛍光色素を含む溶液（溶液中濃度はジクロロトリ（１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）ハイドレート：５０μｍｏｌ／ｌ、Alexa  Fluor（登録商標）488：５μｍｏｌ／ｌ）を流路内に流入すると、それぞれの蛍光色素の壁面近傍の濃度分布は壁面ゼータ電位に依存する。負の値を有する壁面ゼータ電位の絶対値が比較的大となる場合、図１（Ａ）に例示する如く、陽イオンである赤色発光の蛍光色素の壁面近傍濃度が、緑色発光の蛍光色素のそれと比して大となる。逆に壁面ゼータ電位の絶対値が比較的小となる場合、図１（Ｂ）に例示する如く、相対的に緑色発光の蛍光色素の壁面近傍の濃度が大となる。【００２７】
従って、表面修飾によってゼータ電位が局所的に分布している流路壁面近傍をエバネッセント波によって励起することにより、２色の蛍光色素の濃度分布に応じた蛍光強度分布が得られる。この蛍光を、例えば３ＣＣＤカメラを用いて撮像することにより、赤・緑２色の蛍光強度比の分布として壁面ゼータ電位の２次元分布を可視化することができる。これによって表面修飾パターンを可視化することができる。【００２８】
壁面ゼータ電位は、２色の色素の蛍光強度比で一意に決定するため、励起光強度の分布に依存することなくリファレンス画像による補正は不必要になる。そのため、３ＣＣＤカメラの画像によってリアルタイムに表面修飾のパターンを可視化することが可能となる。またリファレンス画像を取得する際に発生する位置ずれに起因する計測誤差を除去することができ、更に計測手法の簡易化にもつながる。【００２９】
上述のエバネッセント波光学計測を実現するために、図２に示すような計測システムを構築した。このシステムでは、レーザー１０から発振される例えば波長λ＝４８８ｎｍのレーザー光を、光軸中心近傍の光を使って強度分布を一様に近づけるためのピンホール１２及びミラー１４を経て、図３に詳細に示す如く、プリズム１６を介して計測流路１８の壁面のガラス１８ａ内に入れ、界面における全反射によって流路内にエバネッセント波を発生させた。エバネッセント波によって励起された蛍光色素からの蛍光は、例えば倍率２０倍、開口０．４５の対物レンズ３０によって拡大し、蛍光以外のバックグラウンド光を除くためのフィルター３２、ミラー３４、及び、例えば、１．４倍の拡大レンズ３６を通して３ＣＣＤカメラ３８により撮像した。【００３０】
図において、２０は、ガラス表面でレーザーが乱反射することにより発生する散乱光を防止するため、ガラス１８ａの厚さの違いに対応するレーザーの出射光路を作るための可動式プリズムである（特許文献１参照）。【００３１】
更に、計測される２色の蛍光色素の蛍光強度比および壁面ゼータ電位の較正を行うことにより、表面修飾による壁面ゼータ電位分布を定量的に評価することが可能となる。表１（較正に用いた溶液）および表２（較正に用いた流路壁面の材質）に示したように、溶液中のイオン種や壁面の材質を様々に変えた条件において蛍光強度比および壁面ゼータ電位を計測し、その関係を図４に示した。【００３２】
【表１】
2010041560.tif 000003
【００３３】
【表２】
2010041560.tif 000004
【００３４】
図４から、非特許文献９に記載した従来のナノ・レーザ誘起蛍光法では不可能であった広い範囲にわたり良好な直線性が得られていることが分かる。従って、図４のグラフから、例えば、最小二乗法により近似曲線を用いて較正曲線を引き、蛍光強度比および壁面ゼータ電位の関係を求めることにより、蛍光強度比の２次元分布から壁面ゼータ電位分布を定量的に算出することができる。ゼータ電位の計測には、直径５００ｎｍの蛍光粒子を溶液中に混入し、壁面近傍での電気浸透流速度を計測することによって、以下に示す（１）式 (Helmholtz-Smoluchowskiの式)を用いて壁面ゼータ電位を算出した。
【数１】
2010041560.tif 000005
ここで、ζ はゼータ電位[V]、μは粘性係数[Pa・s]、εは誘電率[C/V・m]、Eは電界強度[V/cm]、ueofは電気浸透流速度[m/s]を表す。
【実施例】
【００３５】
図５に、オクタデシルトリクロロシラン（ＯＴＳ）を１００×１００μｍのタイル状に表面修飾した石英ガラスに本計測法を適用して、ゼータ電位のリアルタイムの可視化および、定量的評価を行った結果を示す。本手法により、図５（Ａ）に示す如く、ガラス壁面に施した表面修飾によって形成されたゼータ電位の２次元分布の可視化が可能となった。更に較正曲線を適用して、図５（Ｂ）に示す如く、ゼータ電位の２次元的な分布を定量的に評価することが可能となった。【００３６】
図６（Ａ）（Ｂ）に、ＯＴＳを一辺５０μｍの正三角形状のパターンに表面修飾した例を示す。【００３７】
なお前記実施形態においては、陽イオンの色素として、赤色発光のジクロロトリ１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）ハイドレートを用い、陰イオンの色素として、緑色発光のAlexa Fluor（登録商標）488を用いたが、イオンの種類はこれに限定されず、例えば陰イオンの色素として、フルオレセイン(Fluorescein)（励起波長４９４ｎｍ、蛍光波長５１８ｎｍ）を用いることも可能である。【００３８】
又、蛍光色の組合せも赤と緑に限定されず、他の２色又は３色以上の組合せを用いることができる。【００３９】
更に、２次元撮像素子も３ＣＣＤカメラに限定されず、ＭＯＳを用いたカメラや、例えばフィルタを用いて各色を分離撮像可能とした複数台のカメラを用いることも可能である。色数も３色に限定されず、蛍光色に対応する色数（実施形態では２色）を分離して撮像可能であれば良い。【００４０】
又、各色素の励起波長に合わせて、レーザーを複数台設けることも可能である。【００４１】
更に、本発明の評価／可視化対象は、ゼータ電位分布に限定されず、非特許文献１１に記載されたｐＨ分布を得る技術や、非特許文献１２に記載された温度分布を得る技術に、本発明による２色の比を用いる技術を適用して、ｐＨ分布や温度分布を評価／可視化することも可能である。これらの場合には、例えば赤い蛍光色を得るための色素としてＬＤＳ６９８（登録商標）を、緑の蛍光色を得るための色素としてフルオレセインを用いることができる。これらの他、非特許文献１１の１２頁表２に記載されたＨＰＴＳ、ルシファーイエロー、ローダミンＢ、Sulforhodamine、Kiton Red、フロキシン Ｂ、１−４ＤＨＰＮ等を用いることもできる。
【産業上の利用の可能性】
【００４２】
本発明は、細胞生物分野、電気化学分野、マイクロ・ナノスケール熱流体工学分野における壁面におけるゼータ電位、ｐＨ又は温度の分布の定量的評価、及び、表面修飾の定量的可視化に用いることができる。
【図２】
2010041560.tif 000006
【図３】
2010041560.tif 000007
【図４】
2010041560.tif 000008
【図１】
2010041560.tif 000009
【図５】
2010041560.tif 000010
【図６】
2010041560.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成22年2月2日(2010.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価に際して、
帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数の蛍光色素を溶液に混入するステップと、
該溶液を測定対象面に流すステップと、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた複数色の蛍光強度分布を生成させるステップと、
前記蛍光の複数色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子を用いて、測定対象面の蛍光強度を測定するステップと、
前記複数色の蛍光強度の比を計算するステップと、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位の２次元分布に変換するステップと、
を備えたことを特徴とする壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価方法。
【請求項２】
前記蛍光強度比と壁面におけるゼータ電位の関係を較正することを特徴とする請求項１に記載の壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価方法。
【請求項３】
壁面におけるゼータ電位の分布を得る際に、前記複数の蛍光色素として、陽イオンである赤色発光のジクロロトリ（１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）ハイドレート（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉｓ（１，１０−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｈｙｄｒａｔｅ）と、陰イオンである緑色発光の３，６−ジアミノ−９−［２，４−ビス（リチオオキシカルボニル）フェニル］−４−（リチオオキシスルホニル）−５−スルホナトキサンチリウム／３，６−ジアミノ−９−［２，５−ビス（リチオオキシカルボニル）フェニル］−４−（リチオオキシスルホニル）−５−スルホナトキサンチリウム（３，６−Ｄｉａｍｉｎｏ−９−［２，４−ｂｉｓ（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−４−（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｓｕｌｆｏｎｙｌ）−５−ｓｕｌｆｏｎａｔｏｘａｎｔｈｙｌｉｕｍ／３，６−ｄｉａｍｉｎｏ−９−［２，５−ｂｉｓ（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−４−（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｓｕｌｆｏｎｙｌ）−５−ｓｕｌｆｏｎａｔｏｘａｎｔｈｙｌｉｕｍ）（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）を用いることを特徴とする請求項１に記載の壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価方法。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
前記２次元撮像素子が、一台の３ＣＣＤカメラであることを特徴とする請求項１に記載の壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価方法。
【請求項６】
帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数の蛍光色素を溶液に混入する手段と、
該溶液を測定対象面に流す手段と、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた複数色の蛍光強度分布を生成させる手段と、
前記蛍光の複数色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子と、
該２次元撮像素子を用いて測定した複数色の蛍光強度の比を計算する手段と、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位の２次元分布に変換する手段と、
を備えたことを特徴とする壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価装置。
【請求項７】
帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数の蛍光色素を溶液に混入するステップと、
該溶液を、表面修飾によってゼータ電位が局所的に分布している測定対象面に流すステップと、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた複数色の蛍光強度分布を得るステップと、
前記蛍光の複数色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子を用いて、測定対象面の蛍光強度を測定するステップと、
前記複数色の蛍光強度の比を計算するステップと、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位の２次元分布に変換することにより、表面修飾パターンを可視化するステップと、
を備えたことを特徴とする表面修飾パターンの定量的可視化方法。
【請求項８】
前記表面修飾が、オクタデシルトリクロロシランによって行われたものである請求項７に記載の表面修飾パターンの定量的可視化方法。
【請求項９】
帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数色の蛍光色素を溶液に混入する手段と、
該溶液を、表面修飾によってゼータ電位が局所的に分布している測定対象面に流す手段と、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた複数色の蛍光強度分布を生成させる手段と、
前記蛍光の複数色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子と、
該２次元撮像素子を用いて測定した複数色の蛍光強度の比を計算する手段と、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位の２次元分布に変換することにより、表面修飾パターンを可視化する手段と、
を備えたことを特徴とする表面修飾パターンの定量的可視化装置。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
技術分野
［０００１］
本発明は、壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価方法、装置、及び、表面修飾パターンの定量的可視化方法、装置に係る。特に、細胞生物分野、電気化学分野、マイクロ・ナノスケール熱流体工学分野に用いるのに好適な、壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価方法、装置、及び、これを利用した表面修飾パターンの定量的可視化方法、装置に関する。
背景技術
［０００２］
表面科学の分野において、吸着性や濡れ性といった物質表面の性質について多くの研究が行われてきた。更にＳＡＭｓ（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，３，３３５−３７３，２００１．［以下、非特許文献１］参照）と呼ばれる、有機物の単分子膜を物質表面に形成させる表面修飾技術が考案され、物質表面の性質を能動的に変化させる試みも多く行われてきた。
［０００３］
近年、試料の分離・混合・反応・検出といった機能を集積化したマイクロ流体デバイスの発展に伴い、固液界面の電位であるゼータ電位（Ｋｉｒｂｙ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２５，１８７−２０２，２００４．［以下、非特許文献２］参照）が、これらの動電学を利用したデバイスの性能を決定する重要なパラメータの一つとなった。電気化学、生物化学の分野では、マイクロ流体デバイス内に表面修飾をパターン状に施し、濡れ性や物質吸着性を制御する研究が盛んに行われている。
［０００４］
こうした物質表面に関する研究を受けて、表面の性質を評価しようとする計測技術が考案されてきた。電子顕微鏡を用いて物質表面の構造を可視化し
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
壁面において発生させることにより、壁面からの距離数百ナノメートル程度の壁近傍の範囲を照明することができる。蛍光色素を水溶液に混入して流路内に流入すると、負極に帯電した蛍光色素の壁面近傍の濃度分布は、壁面ゼータ電位に依存して変化する。よって、エバネッセント波により励起した際の蛍光強度もゼータ電位に依存する。従って、蛍光強度の分布からゼータ電位分布を知ることができる。
［０００８］
［０００９］
前記ナノ・レーザ誘起蛍光法によりゼータ電位の２次元分布を取得するためには、ＣＣＤカメラにより蛍光強度画像を取得するが、取得画像は励起光強度の分布に起因する蛍光強度分布を含んでいるため、リファレンス画像を取得して補正を行う必要がある。そのため、ＣＣＤカメラで撮像される画像自体からはゼータ電位の２次元的な分布を可視化することは困難であり、リアルタイムでの計測には不向きである。また計測位置や流路形状が異なる際においても再度補正を行う必要があり、位置のずれに起因する計測誤差や、計測手法の煩雑さなどに難点があった。
発明の開示
［００１０］
本発明は、前記従来の問題点を解消するべくなされたもので、マイクロ流体デバイス内等における壁面におけるゼータ電位の２次元的分布や表面修飾パターンを、リアルタイムに可視化し、更に、定量的に評価可能とすることを課題とする。
［００１１］
本発明は、壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価に際して、
帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数の蛍光色素を溶液に混入するステップと、
該溶液を測定対象面に流すステップと、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた複数色の蛍光強度分布を生成させるステップと、
前記蛍光の複数色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子を用いて測定対象面の蛍光強度を測定するステップと、
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
前記複数色の蛍光強度の比を計算するステップと、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位の２次元分布に変換するステップと、
を備えるようにして、前記課題を解決したものである。
［００１２］
本発明は、又、
帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数の蛍光色素を溶液に混入する手段と、
該溶液を測定対象面に流す手段と、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた複数色の蛍光強度分布を生成させる手段と、
前記蛍光の複数色を強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子と、
該２次元撮像素子を用いて測定した複数色の蛍光強度の比を計算する手段と、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位の２次元分布に変換する手段と、
を備えたことを特徴とする壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価装置を提供するものである。
［００１３］
ここで、前記蛍光強度比と壁面におけるゼータ電位の関係を較正することができる。
［００１４］
又、壁面におけるゼータ電位の分布を得る際に、前記複数の蛍光色素として、陽イオンである赤色発光のジクロロトリ（１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）ハイドレート（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉｓ（１，１０−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｈｙｄｒａｔｅ）と、陰イオンである緑色発光の３，６−ジアミノ−９−［２，４−ビス（リチオオキシカルボニル）フェニル］−４−（リチオオキシスルホニル）−５−スルホナトキサンチリウム／３，６−ジアミノ−９−［２，５−ビス（リチオオキシカルボニル）フェニル］−４−（リチオオ
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
キシスルホニル）−５−スルホナトキサンチリウム（３，６−Ｄｉａｍｉｎｏ−９−［２，４−ｂｉｓ（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−４−（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｓｕｌｆｏｎｙｌ）−５−ｓｕｌｆｏｎａｔｏｘａｎｔｈｙｌｉｕｍ／３，６−ｄｉａｍｉｎｏ−９−［２，５−ｂｉｓ（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−４−（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｓｕｌｆｏｎｙｌ）−５−ｓｕｌｆｏｎａｔｏｘａｎｔｈｙｌｉｕｍ）（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）を用いることができる。
［００１５］
［００１６］
又、前記２次元撮像素子を、一台の３ＣＣＤカメラとすることができる。
［００１７］
本発明は、又、
帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数の蛍光色素を溶液に混入するステップと、
該溶液を、表面修飾によってゼータ電位が局所的に分布している測定対象面に流すステップと、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた複数色の蛍光強度分布を得るステップと、
前記蛍光の複数色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子を用いて、測定対象面の蛍光強度を測定するステップと、
前記複数色の蛍光強度の比を計算するステップと、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位の２次元分布に変換すことにより、表面修飾パターンを可視化するステップと、
を備えたことを特徴とする表面修飾パターンの定量的可視化方法を提供するものである。
［００１８］
本発明は、又、
帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数色の蛍光色素を溶液に混入する手段と、
該溶液を、表面修飾によってゼータ電位が局所的に分布している測定対象面に流す手段と、
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた複数色の蛍光強度分布を生成させる手段と、
前記蛍光の複数色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子と、
該２次元撮像素子を用いて測定した複数色の蛍光強度の比を計算する手段と、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位の２次元分布に変換することにより、表面修飾パターンを可視化する手段と、
を備えたことを特徴とする表面修飾パターンの定量的可視化装置を提供するものである。
［００１９］
ここで、前記表面修飾が、オクタデシルトリクロロシランによって行われるものとすることができる。
［００２０］
本発明によれば、発明者の一人が開発したナノ・レーザ誘起蛍光法に、帯電量ないし帯電特性が異なり、且つ、蛍光波長の異なる複数の蛍光色素、及び、該蛍光の複数色を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子を導入することにより、より簡易な方法で、マイクロ流体デバイス内等における表面修飾等によるゼータ電位の２次元分布を可視化して、定量的計測をリアルタイムで行うことが可能になる。
［００２１］
又、従来手法に比較して、計測手順の大幅な軽減や、計測過程における計測誤差の低減をもたらすことができる。
［００２２］
更に、本発明を用いることによって、マイクロ流体デバイス内等において、表面修飾パターンや液体試料の混合・反応によって起こる複雑なイオン挙動の２次元分布等を定量的に可視化することができる。そのため、マイクロ熱流体システム内等の複雑な流動場についての様々な知見を得ることができる。例えば、ゼータ電位に依存して形成される電気浸透流動場は、ゼータ電位分布を把握することにより解析することができる。又、細胞やたん白質の吸着性の制御、あるいは、壁面の濡れ性の制御等を目的としたデバイスの性
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
能評価や最適設計の際に有用である。その他にも、細胞生物分野や電気化学、更にはマイクロ流体工学分野等の幅広い分野にわたる応用が期待される。
図面の簡単な説明
［００２３］
［図１］本発明の原理を示す図
［図２］本発明を実施するための計測システムの一例の全体構成図
［図３］図２の計測流路部分を拡大して示す斜視図
［図４］本発明の実施形態における蛍光強度比とゼータ電位の関係の例を示す図
［図５］同じく（Ａ）３ＣＣＤカメラにより撮像した、ＯＴＳパターンを１００×１００μｍのタイル状に表面修飾した石英ガラスのゼータ電位分布の例と、（Ｂ）較正曲線を用いたゼータ電位分布の定量的評価の例を示す図
［図６］同じく（Ａ）３ＣＣＤカメラにより撮像した、ＯＴＳパターンを一辺５０μｍの正三角形状に表面修飾した石英ガラスのゼータ電位分布の例と、（Ｂ）較正曲線を用いたゼータ電位分布の定量的評価の例を示す図
発明を実施するための最良の形態
［００２４］
以下図面を参照して、本発明の実施形態を詳細に説明する。
［００２５］
壁面におけるゼータ電位分布を求める際に適用した本実施形態で用いた蛍光色素は、水溶液中で陽イオン化する赤色の蛍光色素としてのジクロロトリ（１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）ハイドレート（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉｓ（１，１０−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｈｙｄｒａｔｅ）（励起波長４４９ｎｍ、蛍光５８２ｎｍ）、および、陰イオン化する緑色の蛍光色素としての３，６−ジアミノ−９−［２，４−ビス（リチオオキシカルボニル）フェニル］−４−（リチオオキシスルホニル）−５−スルホナトキサンチリウム／３，６−ジアミノ−９−［２，５−ビス（リチオオキシカルボニル）フェニル］−４−（リチオオキシスルホニル）−５−スルホナトキサンチリウム（３，６−Ｄｉａｍｉｎｏ−９−［２，４−ｂｉｓ（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−４−（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｓｕｌｆｏｎｙｌ）−５−ｓｕｌｆｏｎａｔｏｘａｎｔｈｙｌｉｕｍ／３，６−ｄｉａｍｉｎｏ−９−［２，５−ｂｉｓ（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−４−（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｓｕｌｆｏｎｙｌ）−５−ｓｕｌｆｏｎａｔｏｘａｎｔｈｙｌｉｕｍ）（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）（励起波長４９５ｎｍ、蛍光５１９ｎｍ）である。
［００２６］
２種の蛍光色素を含む溶液（溶液中濃度はジクロロトリ（１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）ハイドレート：５０μｍｏｌ／ｌ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８：５μｍｏｌ／ｌ）を流路内に流入すると、それぞれの蛍光色素の壁面近傍の濃度分布は壁面ゼータ電位に依存する。負の値を有する壁面ゼータ電位の絶対値が比較的大となる場合、図１（Ａ）に例示する如く、陽イオンである赤色発光の蛍光色素の壁面近傍濃度が、緑色発光の蛍光色素のそれと比して大となる。逆に壁面ゼータ電位の絶対値が比較的小となる場合、図１（Ｂ）に例示する如く、相対的に緑色発光の蛍光色素の壁
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
実施例
［００３５］
図５に、オクタデシルトリクロロシラン（ＯＴＳ）を１００×１００μｍのタイル状に表面修飾した石英ガラスに本計測法を適用して、ゼータ電位のリアルタイムの可視化および、定量的評価を行った結果を示す。本手法により、図５（Ａ）に示す如く、ガラス壁面に施した表面修飾によって形成されたゼータ電位の２次元分布の可視化が可能となった。更に較正曲線を適用して、図５（Ｂ）に示す如く、ゼータ電位の２次元的な分布を定量的に評価することが可能となった。
［００３６］
図６（Ａ）（Ｂ）に、ＯＴＳを一辺５０μｍの正三角形状のパターンに表面修飾した例を示す。
［００３７］
なお前記実施形態においては、陽イオンの色素として、赤色発光のジクロロトリ１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）ハイドレートを用い、陰イオンの色素として、緑色発光のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を用いたが、イオンの種類はこれに限定されず、例えば陰イオンの色素として、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（励起波長４９４ｎｍ、蛍光波長５１８ｎｍ）を用いることも可能である。
［００３８］
又、蛍光色の組合せも赤と緑に限定されず、他の２色又は３色以上の組合せを用いることができる。
［００３９］
更に、２次元撮像素子も３ＣＣＤカメラに限定されず、ＭＯＳを用いたカメラや、例えばフィルタを用いて各色を分離撮像可能とした複数台のカメラを用いることも可能である。色数も３色に限定されず、蛍光色に対応する色数（実施形態では２色）を分離して撮像可能であれば良い。
［００４０］
又、各色素の励起波長に合わせて、レーザーを複数台設けることも可能である。
［００４１］
産業上の利用の可能性
［００４２］
本発明は、細胞生物分野、電気化学分野、マイクロ・ナノスケール熱流体工学分野における壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価、及び、表面
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
修飾パターンの定量的可視化に用いることができる。
【手続補正書】
【提出日】平成22年10月13日(2010.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価に際して、
水溶液中で陽イオン化する第１の蛍光色素、及び、水溶液中で陰イオン化し、且つ、前記第１の蛍光色素とは蛍光波長の異なる第２の蛍光色素を溶液に混入するステップと、
該溶液を測定対象面に流すステップと、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた２色の蛍光強度分布を生成させるステップと、
前記蛍光の２色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子を用いて、測定対象面の蛍光強度を測定するステップと、
前記２色の蛍光強度の比を計算するステップと、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位の２次元分布に変換するステップと、
を備えたことを特徴とする壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価方法。
【請求項２】
前記蛍光強度比と壁面におけるゼータ電位の関係を較正することを特徴とする請求項１に記載の壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価方法。
【請求項３】
前記第１の蛍光色素として、赤色発光のジクロロトリ（１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）ハイドレート（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉｓ（１，１０−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｈｙｄｒａｔｅ）を用い、前記第２の蛍光色素として、緑色発光の３，６−ジアミノ−９−［２，４−ビス（リチオオキシカルボニル）フェニル］−４−（リチオオキシスルホニル）−５−スルホナトキサンチリウム／３，６−ジアミノ−９−［２，５−ビス（リチオオキシカルボニル）フェニル］−４−（リチオオキシスルホニル）−５−スルホナトキサンチリウム（３，６−Ｄｉａｍｉｎｏ−９−［２，４−ｂｉｓ（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−４−（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｓｕｌｆｏｎｙｌ）−５−ｓｕｌｆｏｎａｔｏｘａｎｔｈｙｌｉｕｍ／３，６−ｄｉａｍｉｎｏ−９−［２，５−ｂｉｓ（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−４−（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｓｕｌｆｏｎｙｌ）−５−ｓｕｌｆｏｎａｔｏｘａｎｔｈｙｌｉｕｍ）（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）を用いることを特徴とする請求項１に記載の壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価方法。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
前記２次元撮像素子が、一台の３ＣＣＤカメラであることを特徴とする請求項１に記載の壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価方法。
【請求項６】
水溶液中で陽イオン化する第１の蛍光色素、及び、水溶液中で陰イオン化し、且つ、前記第１の蛍光色素とは蛍光波長の異なる第２の蛍光色素を溶液に混入する手段と、
該溶液を測定対象面に流す手段と、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた２色の蛍光強度分布を生成させる手段と、
前記蛍光の２色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子と、
該２次元撮像素子を用いて測定した２色の蛍光強度の比を計算する手段と、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位の２次元分布に変換する手段と、
を備えたことを特徴とする壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価装置。
【請求項７】
水溶液中で陽イオン化する第１の蛍光色素、及び、水溶液中で陰イオン化し、且つ、前記第１の蛍光色素とは蛍光波長の異なる第２の蛍光色素を溶液に混入するステップと、
該溶液を、表面修飾によってゼータ電位が局所的に分布している測定対象面に流すステップと、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた２色の蛍光強度分布を得るステップと、
前記蛍光の２色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子を用いて、測定対象面の蛍光強度を測定するステップと、
前記２色の蛍光強度の比を計算するステップと、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位の２次元分布に変換することにより、表面修飾パターンを可視化するステップと、
を備えたことを特徴とする表面修飾パターンの定量的可視化方法。
【請求項８】
前記表面修飾が、オクタデシルトリクロロシランによって行われたものである請求項７に記載の表面修飾パターンの定量的可視化方法。
【請求項９】
水溶液中で陽イオン化する第１の蛍光色素、及び、水溶液中で陰イオン化し、且つ、前記第１の蛍光色素とは蛍光波長の異なる第２の蛍光色素を溶液に混入する手段と、
該溶液を、表面修飾によってゼータ電位が局所的に分布している測定対象面に流す手段と、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた２色の蛍光強度分布を生成させる手段と、
前記蛍光の２色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子と、
該２次元撮像素子を用いて測定した２色の蛍光強度の比を計算する手段と、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位の２次元分布に変換することにより、表面修飾パターンを可視化する手段と、
を備えたことを特徴とする表面修飾パターンの定量的可視化装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
壁面において発生させることにより、壁面からの距離数百ナノメートル程度の壁近傍の範囲を照明することができる。蛍光色素を水溶液に混入して流路内に流入すると、負極に帯電した蛍光色素の壁面近傍の濃度分布は、壁面ゼータ電位に依存して変化する。よって、エバネッセント波により励起した際の蛍光強度もゼータ電位に依存する。従って、蛍光強度の分布からゼータ電位分布を知ることができる。
［０００８］
［０００９］
前記ナノ・レーザ誘起蛍光法によりゼータ電位の２次元分布を取得するためには、ＣＣＤカメラにより蛍光強度画像を取得するが、取得画像は励起光強度の分布に起因する蛍光強度分布を含んでいるため、リファレンス画像を取得して補正を行う必要がある。そのため、ＣＣＤカメラで撮像される画像自体からはゼータ電位の２次元的な分布を可視化することは困難であり、リアルタイムでの計測には不向きである。また計測位置や流路形状が異なる際においても再度補正を行う必要があり、位置のずれに起因する計測誤差や、計測手法の煩雑さなどに難点があった。
発明の開示
［００１０］
本発明は、前記従来の問題点を解消するべくなされたもので、マイクロ流体デバイス内等における壁面におけるゼータ電位の２次元的分布や表面修飾パターンを、リアルタイムに可視化し、更に、定量的に評価可能とすることを課題とする。
［００１１］
本発明は、壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価に際して、
水溶液中で陽イオン化する第１の蛍光色素、及び、水溶液中で陰イオン化し、且つ、前記第１の蛍光色素とは蛍光波長の異なる第２の蛍光色素を溶液に混入するステップと、
該溶液を測定対象面に流すステップと、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた２色の蛍光強度分布を生成させるステップと、
前記蛍光の２色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子を用い
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
て測定対象面の蛍光強度を測定するステップと、
前記２色の蛍光強度の比を計算するステップと、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位の２次元分布に変換するステップと、
を備えるようにして、前記課題を解決したものである。
［００１２］
本発明は、又、
水溶液中で陽イオン化する第１の蛍光色素、及び、水溶液中で陰イオン化し、且つ、前記第１の蛍光色素とは蛍光波長の異なる第２の蛍光色素を溶液に混入する手段と、
該溶液を測定対象面に流す手段と、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた２色の蛍光強度分布を生成させる手段と、
前記蛍光の２色を強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子と、
該２次元撮像素子を用いて測定した２色の蛍光強度の比を計算する手段と、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位の２次元分布に変換する手段と、
を備えたことを特徴とする壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価装置を提供するものである。
［００１３］
ここで、前記蛍光強度比と壁面におけるゼータ電位の関係を較正することができる。
［００１４］
又、前記第１の蛍光色素として、赤色発光のジクロロトリ（１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）ハイドレート（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉｓ（１，１０−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｈｙｄｒａｔｅ）を用い、前記第２の蛍光色素として、緑色発光の３，６−ジアミノ−９−［２，４−ビス（リチオオキシカルボニル）フェニル］−４−（リチオオキシスルホニル）−５−スルホナトキサン
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
チリウム／３，６−ジアミノ−９−［２，５−ビス（リチオオキシカルボニル）フェニル］−４−（リチオオキシスルホニル）−５−スルホナトキサンチリウム（３，６−Ｄｉａｍｉｎｏ−９−［２，４−ｂｉｓ（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−４−（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｓｕｌｆｏｎｙｌ）−５−ｓｕｌｆｏｎａｔｏｘａｎｔｈｙｌｉｕｍ／３，６−ｄｉａｍｉｎｏ−９−［２，５−ｂｉｓ（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−４−（ｌｉｔｈｉｏｏｘｙｓｕｌｆｏｎｙｌ）−５−ｓｕｌｆｏｎａｔｏｘａｎｔｈｙｌｉｕｍ）（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）を用いることができる。
［００１５］
［００１６］
又、前記２次元撮像素子を、一台の３ＣＣＤカメラとすることができる。
［００１７］
本発明は、又、
水溶液中で陽イオン化する第１の蛍光色素、及び、水溶液中で陰イオン化し、且つ、前記第１の蛍光色素とは蛍光波長の異なる第２の蛍光色素を溶液に混入するステップと、
該溶液を、表面修飾によってゼータ電位が局所的に分布している測定対象面に流すステップと、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた２色の蛍光強度分布を得るステップと、
前記蛍光の２色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子を用いて、測定対象面の蛍光強度を測定するステップと、
前記２色の蛍光強度の比を計算するステップと、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位の２次元分布に変換すことにより、表面修飾パターンを可視化するステップと、
を備えたことを特徴とする表面修飾パターンの定量的可視化方法を提供するものである。
［００１８］
本発明は、又、
水溶液中で陽イオン化する第１の蛍光色素、及び、水溶液中で陰イオン化
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
し、且つ、前記第１の蛍光色素とは蛍光波長の異なる第２の蛍光色素を溶液に混入する手段と、
該溶液を、表面修飾によってゼータ電位が局所的に分布している測定対象面に流す手段と、
前記測定対象面をエバネッセント波によって励起することにより、各蛍光色素の濃度分布に応じた２色の蛍光強度分布を生成させる手段と、
前記蛍光の２色の強度を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子と、
該２次元撮像素子を用いて測定した２色の蛍光強度の比を計算する手段と、
あらかじめ作成しておいた、前記蛍光強度の比と壁面におけるゼータ電位との関係式を使って、前記蛍光強度の比の分布を、壁面におけるゼータ電位の２次元分布に変換することにより、表面修飾パターンを可視化する手段と、
を備えたことを特徴とする表面修飾パターンの定量的可視化装置を提供するものである。
［００１９］
ここで、前記表面修飾が、オクタデシルトリクロロシランによって行われるものとすることができる。
［００２０］
本発明によれば、発明者の一人が開発したナノ・レーザ誘起蛍光法に、水溶液中で陽イオン化する第１の蛍光色素、及び、水溶液中で陰イオン化し、且つ、前記第１の蛍光色素とは蛍光波長の異なる第２の蛍光色素を導入すると共に、該蛍光の２色を各色に分離して取得可能な２次元撮像素子を導入することにより、より簡易な方法で、マイクロ流体デバイス内等における表面修飾等によるゼータ電位の２次元分布を可視化して、定量的計測をリアルタイムで行うことが可能になる。
［００２１］
又、従来手法に比較して、計測手順の大幅な軽減や、計測過程における計測誤差の低減をもたらすことができる。
［００２２］
更に、本発明を用いることによって、マイクロ流体デバイス内等において、表面修飾パターンや液体試料の混合・反応によって起こる複雑なイオン挙動の２次元分布等を定量的に可視化することができる。そのため、マイクロ熱流体システム内等の複雑な流動場についての様々な知見を得ることができる。例えば、ゼータ電位に依存して形成される電気浸透流動場は、ゼータ電位分布を把握することにより解析することができる。又、細胞やたん白質の吸着性の制御、あるいは、壁面の濡れ性の制御等を目的としたデバイスの性
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
実施例
［００３５］
図５に、オクタデシルトリクロロシラン（ＯＴＳ）を１００×１００μｍのタイル状に表面修飾した石英ガラスに本計測法を適用して、ゼータ電位のリアルタイムの可視化および、定量的評価を行った結果を示す。本手法により、図５（Ａ）に示す如く、ガラス壁面に施した表面修飾によって形成されたゼータ電位の２次元分布の可視化が可能となった。更に較正曲線を適用して、図５（Ｂ）に示す如く、ゼータ電位の２次元的な分布を定量的に評価することが可能となった。
［００３６］
図６（Ａ）（Ｂ）に、ＯＴＳを一辺５０μｍの正三角形状のパターンに表面修飾した例を示す。
［００３７］
なお前記実施形態においては、陽イオンの色素として、赤色発光のジクロロトリ１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）ハイドレートを用い、陰イオンの色素として、緑色発光のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を用いたが、イオンの種類はこれに限定されず、例えば陰イオンの色素として、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（励起波長４９４ｎｍ、蛍光波長５１８ｎｍ）を用いることも可能である。
［００３８］
又、蛍光色の組合せも赤と緑に限定されず、他の２色の組合せを用いることができる。
［００３９］
更に、２次元撮像素子も３ＣＣＤカメラに限定されず、ＭＯＳを用いたカメラや、例えばフィルタを用いて各色を分離撮像可能とした複数台のカメラを用いることも可能である。色数も３色に限定されず、蛍光色に対応する色数（２色）を分離して撮像可能であれば良い。
［００４０］
又、各色素の励起波長に合わせて、レーザーを複数台設けることも可能である。
［００４１］
産業上の利用の可能性
［００４２］
本発明は、細胞生物分野、電気化学分野、マイクロ・ナノスケール熱流体工学分野における壁面におけるゼータ電位の分布の定量的評価、及び、表面
【国際調査報告】
2010041560.tif 000012
2010041560.tif 000013
2010041560.tif 000014
2010041560.tif 000015