(57)【要約】  本発明は、組織（特に、心臓組織）を非侵襲的に、且つ、リアルタイムにイメージングする方法及び装置を提供することを目的とする。  本発明は、以下の工程（１）〜（３）：（１）心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料に励起光を照射する工程；（２）該試料からのラマン散乱光を検出する工程；（３）該検出されたラマン散乱光を、心筋細胞と赤血球及び／又はコラーゲンに特徴的なラマン散乱スペクトルとを指標として解析し、画像化する工程；を含む、心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料をイメージングする方法を提供する。
2010103661.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）〜（３）：
（１）心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料に励起光を照射する工程；
（２）該試料からのラマン散乱光を検出する工程；
（３）該検出されたラマン散乱光を、心筋細胞と赤血球及び／又はコラーゲンに特徴的なラマン散乱スペクトルとを指標として解析し、画像化する工程；
を含む、心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料をイメージングする方法。
【請求項２】
ラマン散乱光検出手段により検出された、心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料からのラマン散乱光を、心筋細胞と赤血球及び／又はコラーゲンに特徴的なラマン散乱スペクトルとを指標として解析し、画像処理する工程を含む、心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料をイメージングする方法。
【請求項３】
該試料が、虚血を起こした心臓又はその一部である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
心筋細胞に特徴的なラマン散乱スペクトルが、シトクロムに起因するラマン散乱スペクトルである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
赤血球に特徴的なラマン散乱スペクトルが、ヘモグロビンに起因するラマン散乱スペクトルである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ヘモグロビンに起因するラマン散乱スペクトルが、酸素化型ヘモグロビン及び／又は脱酸素化型ヘモグロビンに起因するラマン散乱スペクトルである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
励起光が、５３２ｎｍの波長を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
（Ａ）心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む領域を含む試料に励起光を照射する手段、（Ｂ）前記試料からのラマン散乱光を検出する手段、（Ｃ）該検出したラマン散乱光を心筋細胞と赤血球及び／又はコラーゲンに特徴的なラマン散乱スペクトルを指標として画像処理する手段、を備える心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料をイメージングするためのイメージング装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織からのラマン散乱スペクトルを利用して生体組織をイメージングする方法に関する。また本発明は、ラマン散乱スペクトルを利用した生体組織のイメージングするための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織イメージングは、その組織を構成する様々な細胞やその他のコンポーネントの分布を知る上で不可欠である。従来、心筋の組織像を評価する手段として心筋生検がある。しかし、心筋生検では、標本の固定、染色が必要であり、そのためにリアルタイムに解析して像を作ることは不可能である。また、心臓組織を傷つけてしまうという問題もある。磁気共鳴画像（ＭＲＩ）法は心臓の機能や構造に関する情報を得るために使用されるが、組織像の変化に基づいた情報ではない。例えば、正常な心筋細胞からなる領域と虚血により心筋細胞が壊死して線維組織によって置換された領域とを明確に識別することはできない。【０００３】
一方、ラマン分光法は振動型分光法の一形態であり、分子中の化学結合の直接の情報を提供する。ラマン分光法では、入射光により誘起される振動の特異的なエネルギー変化をスペクトルとしてプロットすることができ、これによって無染色で物質を特定することができる。このようなラマン分光法の特性を利用したイメージング方法や装置が開発されている（特許文献１及び２）。医療分野におけるラマン分光法を使った最近の研究では、がん（非特許文献１）、アテローム性動脈硬化症（非特許文献２）、ヘモグロビンの酸素飽和（非特許文献３）の診断などの組織診断に焦点があてられてきた。しかし、これらの研究は、単に標的組織のラマンスペクトルを解析するに留まり、病変部位を視覚的に識別するためにイメージングを試みたものではない。このようにラマン分光法を利用したイメージングに関する研究は進められているものの、内臓組織を構成する様々な細胞のコンポーネントを分析可能なイメージングに応用した例は報告されていない。
【特許文献１】特開２０００−５５８０９号公報
【特許文献２】特開２００７−１４７３５０号公報
【非特許文献１】Haka, A.S. et al. (2006)., Cancer Res. Vol. 66, 3317-22.
【非特許文献２】Motz, J.T. et al. (2006)., J. Biomed. Opt. vol. 11, 021003.
【非特許文献３】Torres Filho, I.P., et al., (2008)., J. Appl. Physiol. 104, 1809-17.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
かかる現状の下、本発明は、組織（特に、心臓組織）を非侵襲的に、且つ、リアルタイムにイメージングする方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ね、（１）ラマン分光法により心臓における心筋細胞と血球とを、各々に固有のスペクトルパターンに基づいて識別することが可能であり、心筋細胞からなる領域と血管とを含む試料について、両組織を明瞭に区別したイメージングが可能であること、（２）酸素化型の赤血球と脱酸素化型の赤血球とを各々に固有のラマンスペクトルに基づいて識別することができ、これらを明瞭に区別してイメージングすることが可能であること、（３）心筋梗塞を起こした心臓の組織から得られるラマン散乱光を解析することにより、心筋細胞が壊死して線維組織化した領域と正常な心筋細胞からなる領域とを明瞭に区別してイメージングすることが可能であることを見出した。これらの知見に基づき、本発明者らは更なる検討を重ね、非侵襲的、且つ、リアルタイムに、正常な心筋細胞からなる領域とコラーゲンリッチな領域と血管とを視覚的に識別可能な状態で明瞭にイメージングすることを可能にし、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の態様の発明を提供する。【０００６】
項１．以下の工程（１）〜（３）：
（１）心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料に励起光を照射する工程；
（２）該試料からのラマン散乱光を検出する工程；
（３）該検出されたラマン散乱光を、心筋細胞と赤血球及び／又はコラーゲンに特徴的なラマン散乱スペクトルとを指標として解析し、画像化する工程；
を含む、心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料をイメージングする方法。【０００７】
項２．ラマン散乱光検出手段により検出された、心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料からのラマン散乱光を、心筋細胞と赤血球及び／又はコラーゲンに特徴的なラマン散乱スペクトルとを指標として解析し、画像処理する工程を含む、心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料をイメージングする方法。【０００８】
項３．該試料が、虚血を起こした心臓又はその一部である、項１又は２に記載の方法。【０００９】
項４．心筋細胞に特徴的なラマン散乱スペクトルが、シトクロムに起因するラマン散乱スペクトルである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。【００１０】
項５．赤血球に特徴的なラマン散乱スペクトルが、ヘモグロビンに起因するラマン散乱スペクトルである、項１〜３のいずれかに記載の方法。【００１１】
項６．ヘモグロビンに起因するラマン散乱スペクトルが、酸素化型ヘモグロビン及び／又は脱酸素化型ヘモグロビンに起因するラマン散乱スペクトルである、項４に記載の方法。【００１２】
項７．励起光が、５３２ｎｍの波長を有する、請求項１に記載の方法。【００１３】
項８．（Ａ）心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む領域を含む試料に励起光を照射する手段、（Ｂ）前記試料からのラマン散乱光を検出する手段、（Ｃ）該検出したラマン散乱光を心筋細胞と赤血球及び／又はコラーゲンに特徴的なラマン散乱スペクトルを指標として画像処理する手段、を備える心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料をイメージングするためのイメージング装置。【００１４】
項９．血管を含む試料から得られたラマン散乱光について、酸素化型赤血球に固有のラマンスペクトルと脱酸素化型赤血球に固有なラマンスペクトルとを指標として解析する工程を含む、当該試料を動脈と静脈とを視覚的に区別してイメージングする方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、非侵襲的に、且つ、リアルタイムに、正常な心筋細胞からなる領域とコラーゲンリッチな領域と血管とを明確に区別して心臓の組織をイメージングすることが可能である。よって、本発明のイメージング方法を用いることにより、虚血に陥った心臓において、正常に機能する領域と心筋細胞が壊死して線維化した領域とを的確に見分けることが可能となる。また、本発明により、心臓における血管の存在を明瞭に判別することができる。よって、本発明の方法を用いて、心筋梗塞を起こした心臓における血管の有無を調べることが可能であり、それを治療の手段や計画の決定に役立てることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、代表的な生きたままの心筋細胞の細胞質とヘムタンパク質のラマンスペクトルの測定に関する。図１Ａは、摘出した心臓全体と光学系のセッティングの模式図を示す。図１Ｂは、心外膜下領域の自家蛍光イメージを示す。図１Ｃは、図1Ｂ中のアスタリスクで示された（ａ）心筋細胞(レーザーパワー；２０ｍＷ、照射時間；５秒)、（ｂ）還元型シトクロムｂ５（５０μＭ）及び（ｃ）還元型シトクロムｃ（１２５μＭ）のラマンスペクトル(レーザーパワー；５ｍＷ、照射時間；１０秒)を示す。ここで、ＣＭは心筋細胞であり、a.u.は任意の単位を示す。
【図２】図２は、生きたex-vivo心臓の心筋細胞と血管のラマンイメージに関する。図２Ａは、（ａ）心筋細胞、（ｂ）酸素化型赤血球及び（ｃ）脱酸素化型赤血球のラマンスペクトルを示す。赤血球のラマンスペクトルはレーザーパワー２ｍＷで照射時間３秒で得られた。図２Ｂは、代表的試料中で心臓表面から得られた自己蛍光イメージを示す。四角で囲まれた領域はラマンイメージが得られた領域を示している。図２Ｃは、ラマンバンドイメージを示す。図２Ｄは、（ａ）第１、（ｂ）第２、（ｃ）第３主成分スコアイメージ（左：５６ｘ９６ピクセル）と各々の主成分スペクトル（右）を示す。イメージのための試料はレーザーパワー２０ｍＷで５６ラインで照明された。それぞれのラインの照射時間は５秒で全体の照射時間は２８０秒である。スケールバーは２０μｍ。ＣＭは心筋細胞を示し、ＢＶは血管を示し、a.u. は任意の単位を示す。
【図３】図３は、心筋梗塞領域の代表的な凍結融解セクション中の心筋細胞とコラーゲンのラマンイメージに関する。図３Ａは、凍結融解セクションのヘマトキシリンエオシン染色を示す。図３Ｂは、マッソントリクロム染色による心筋梗塞の境界領域のイメージを示す。図３Ｃは、図３Ａのボックスで囲まれた領域の高解像イメージを示す。図３Ｄは、図３Ｃと同じ領域の白色光イメージを示す。図３Ｅは、図３Ｄのアスタリスクに示す線維性の組織（上）とＩ型コラーゲンのラマンスペクトル（下）を示す。図３Ｆは、第２主成分スコアイメージ（左）（１０８ｘ１７９ピクセル）とその主成分スペクトル（右）を示す。このイメージは図３Ｄで示された領域をレーザーパワー１００ｍＷで１０８ラインに照明されることで得られた。それぞれのラインの照射時間は５秒で全体の照射時間は５４０秒であった。スケールバーは５０μｍ（Ａ，Ｂ）；２０μｍ（Ｃ，Ｄ，Ｆ）である。ＣＭは心筋細胞を示し、ＦＴは線維化した組織を示し、ＣＮは、コラーゲンを示し、a.u.は 任意の単位を示す。
【図４】図４は、生きたまま調製された心筋梗塞領域における心筋細胞とコラーゲンのラマンイメージを示す。図４Ａは、第２主成分スコアイメージ（６０ｘ１５０ピクセル）と同じ代表的な試料の白色光イメージとの融合写真を示す。ドットで示されたラインは心筋細胞の輪郭を示している。図４Ｂは、第2主成分スペクトルを示す。試料はレーザーパワー１００ｍＷで６０ラインに照明された。それぞれのラインの照射時間は５秒で全体の照射時間は３００秒である。ＣＭ、心筋細胞。ＦＴは線維化した組織を示し、スケールバーは２０μｍである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は、以下に説明される特定の実施形態に限定されるものではない。また当業者であれば、以下に説明する実施形態の各要素を本発明の範囲内において容易に変更することが可能である。【００１８】
一実施形態において、本発明は、以下の工程（１）〜（３）を含む、心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料をイメージングする方法である。
（１）心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料に励起光を照射する工程；
（２）該試料からのラマン散乱光を検出する工程；
（３）該検出されたラマン散乱光を、心筋細胞と赤血球及び／又はコラーゲンに特徴的なラマン散乱スペクトルとを指標として解析し、画像化する工程。【００１９】
本実施形態における、イメージング対象は、心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料である。好ましくは、当該試料は心臓の全体又は一部である。本発明の方法は、主として正常な心筋細胞からなる領域と心筋細胞が壊死した領域とを明瞭に区別することができるため、虚血に陥った心臓の診断に役立てることができる。このような観点から、イメージングに供する試料は、虚血を起こした心臓の全体又は一部である。具体的には、虚血により狭心症、心筋梗塞、心不全、及び不整脈を起こした心臓である。心臓の一部をイメージングの対象とする場合、その部分は当業者が適宜決定することができる。例えば、心電図やＭＲＩの結果から決定された部位をイメージングすることができる。  【００２０】
コラーゲンリッチ領域とは、心筋細胞が壊死して線維化した結果、正常に機能する心筋細胞から成る領域と比較してコラーゲンの存在比率が高い領域である。線維化の程度に関する定義については、議論のあるところではあるが、本発明においてはＭＲＩにおいて心室壁内５０％以上が線維に置換されているところをコラーゲンリッチ領域と定義することができる。よって、コラーゲンリッチ領域とは、心臓において心筋細胞が脱落し、心筋組織がその機能を失った領域である。これに対し、正常領域とは心臓において正常な心筋細胞が機能している領域を意味する。また、血管とは心筋内を走行する任意の血管を意味し、動脈及び静脈のいずれも含まれる。特に、心筋細胞近傍に存在する小血管のイメージングは組織細胞レベルの代謝を見る上で重要である。【００２１】
該試料は、心筋組織と血管とを含むものであっても、心筋組織とコラーゲンリッチ領域を含むものであってもよい。好ましい一実施形態において、該試料は、心筋組織、血管及びコラーゲンリッチ領域を含む。また、他の実施形態において、該試料は、血管とコラーゲンリッチ領域を含むものであってもよい。該試料には、心筋組織、コラーゲンリッチ領域及び血管の他に、他の細胞や組織が含まれていてもよい。例えば、炎症細胞、脂肪組織が含まれてもよい。【００２２】
本実施形態のイメージング方法は、上記のような試料に励起光を照射する工程を含む。励起光は、試料に照射することによって試料を構成する物質に固有のラマン散乱光を生じるレーザ光である。励起光は、当該技術分野において使用される任意の励起光を使用することができ、心筋細胞と血管とコラーゲンとを識別するために適したラマンスペクトルを得る観点から適宜選択することができる。よって、励起光の波長は特に制限されないが、好ましくはヘム蛋白の共鳴波長４００〜６００ｎｍであり、より好ましくは５００〜６００ｎｍである。特に好ましくは、５３２ｍｍのＮｄ：ＹＡＧレーザを使用することができる。【００２３】
試料に励起光を照射するための手段は、ラマン分光法において通常用いられる、レーザ光を発する手段であれば特に制限なく使用することができる。【００２４】
本実施形態のイメージング方法は、次いで、試料から発せられるラマン散乱光を検出する工程を含む。ラマン散乱光を検出する手段は、ラマン散乱光を検出し、それを画像化処理するための信号に変換することが可能なものであれば特に制限されず、当該分野において公知の検出手段を適宜選択して使用することができる。例えば、受光素子がマトリクス上に配列されたエリアセンサを検出手段として使用することができる。より具体的には、画素がアレイ状に配置された二次元ＣＣＤをラマン散乱光の検出手段として好適に使用することができる。【００２５】
好ましい実施形態においては、試料からのラマン散乱光は、その検出に先立って、ダイクロイックフィルタ等により励起光と同じ波長を有する反射光と分離される。さらに、分離されたラマン散乱光は、回折格子やプリズムから成る分光素子によって光の波長に応じて空間的に分光される。分光されたラマン散乱光は上述のような検出手段においてラマンスペクトルを表す信号に変換され、パーソナルコンピュータ等の解析手段に出力される。【００２６】
本実施形態のイメージング方法は、さらに検出されたラマン散乱光から得られたスペクトル情報を、パーソナルコンピュータ等の解析手段に記憶された心筋細胞、赤血球及び／又はコラーゲンに特徴的なラマンスペクトルを指標として解析され、画像化される。解析及び画像化は、当該技術分野に公知のソフトウェアを用いてパーソナルコンピュータ等によって処理される。例えば、ＭＡＴＬＡＢ（Mathworks社）を用いて解析し画像化することができる。【００２７】
心筋細胞に特徴的なラマンスペクトルとは、心筋細胞に対して励起光を照射して得られる、心筋細胞に固有のラマン散乱光のスペクトルである。同様に、赤血球に特徴的なラマンスペクトルとは、赤血球に対して励起光を照射して得られる、赤血球に固有のラマン散乱光のスペクトルであり、コラーゲンに特徴的なラマンスペクトルとは、コラーゲンに励起光を照射して得られる、コラーゲンに固有なラマン散乱光のスペクトルである。赤血球は、酸素化型赤血球と脱酸素化型赤血球とのいずれであってもよい。試料に含まれる血管について、動脈か静脈かを識別する場合は、酸素化型赤血球及び脱酸素化型赤血球に特徴的なラマンスペクトルを各々の指標として使用することができる。【００２８】
心筋細胞に特徴的なラマンスペクトルを指標として解析するとは、心筋細胞に特徴的なスペクトルと合致するラマンスペクトルを示すラマン散乱光が得られるか否かによって、そのラマン散乱光を発する試料中の部位が心筋細胞であるか判定するということである。同様に、試料中の特定の部位が血管に相当するかどうかは、試料からのラマン散乱光が赤血球に固有のラマンスペクトルを示すか否かによって判定される。コラーゲンリッチ領域についても同様に、コラーゲンに特徴的なスペクトルを示すラマン散乱光を放つか否かによって判定される。【００２９】
心筋細胞に特徴的なラマンスペクトルの一例は、実施例１（図１）に示される。図１に示されるように、心筋細胞を５３２ｎｍのレーザ光で励起した場合のラマンシフト７５１／ｃｍ、１１３０／ｃｍ、及び１５８２／ｃｍにおけるピークを指標とすることができる。実施例１に記載されるように、前記のラマンシフトのピークパターンは、心筋細胞中のシトクロムに起因するものである。酸素化型赤血球及び脱酸素化型赤血球に特徴的なラマンスペクトルの一例は、実施例２（図２）に示される。図２に示されるように、酸化型赤血球を５３２ｎｍのレーザ光で励起した場合のラマンシフト１３７１／ｃｍ、１５８２／ｃｍ及び１６３７／ｃｍにおけるピークを指標とすることができる。また、還元型赤血球を５３２ｎｍのレーザ光で励起した場合のラマンシフト１３５５／ｃｍ、１５４５／ｃｍ及び１６０１／ｃｍにおけるピークを指標とすることもできる。これらのラマンシフトのピークパターンは、赤血球中のヘモグロビンの存在に起因している。コラーゲンに特徴的なラマンスペクトルの一例は、実施例３（図３）に示される。本発明では、これらのスペクトルを使用することにより、正常な心筋組織と血管とコラーゲンリッチな領域とを明瞭に区分けしてイメージングすることができる。【００３０】
イメージングの対象となる試料全体から得られるラマンスペクトルの分布は、解析手段として主成分分析を用いて実施される。【００３１】
主成分分析は多変量解析の一つであり、複数の観測変数から、それを要約する合成変数（主成分と呼ぶ）を作り出す分析法である。従って、ラマンスペクトルの解析においては、イメージング対象から得られる複数のラマンスペクトルから、その試料のいくつかの成分を特徴づけるスペクトル形体を抽出する目的で使用することができる。主成分の計算原理としては、（1）全ての変数を標準化する、（2）情報のロスを最小限にするために、主成分の分散値が最大になるように、主成分の軸を設定し、さらに主成分同士の相関を０にする、（3）決定された主成分の分散が大きい順に第１主成分、第２主成分、第３主成分とする、（4）主成分の軸に対応する重み係数を最小二乗法を用いて計算する。このようにして得られた主成分スペクトルに対する、個々のラマンスペクトルの得点（主成分スコア）を計算し、この値をプロットし画像化する。【００３２】
以上に説明した、試料への励起光の照射、試料からのラマン散乱光の検出、検出されたラマン散乱光のラマンスペクトル信号への変換、及びラマンスペクトルの解析及び画像化とう一連の工程は、例えば、特開２００７−１４７３５７に記載される方法や市販されているラマン分光イメージング装置（例えば、ナノフォトン社製のラマン顕微鏡）を用いて行うことができる。【００３３】
一実施形態において本発明は、ラマン散乱光検出手段により検出された、心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料からのラマン散乱光を、心筋細胞と赤血球及び／又はコラーゲンに特徴的なラマン散乱スペクトルとを指標として解析し、画像処理する工程を含む、心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料をイメージングする方法である。本実施形態の方法は、ラマン散乱光として得られる情報を解析処理して、当該光の発信源である試料を画像として表示する方法である。本実施形態における方法は、上述する実施形態の説明に従って実施することができる。【００３４】
一実施形態において、本発明は、（Ａ）心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む領域を含む試料に励起光を照射する手段、（Ｂ）前記試料からのラマン散乱光を検出する手段、（Ｃ）該検出したラマン散乱光を心筋細胞と赤血球及び／又はコラーゲンに特徴的なラマン散乱スペクトルを指標として画像処理する手段、を備える心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料をイメージングするためのイメージング装置である。本発明のイメージング装置における（Ａ）励起光照射手段、（Ｂ）ラマン散乱光検出手段、及び（Ｃ）画像処理手段は、基本的には当該技術分野において公知のラマン分光法を領したイメージング装置において用いられる手段をそのまま又は適宜改良を加えて使用することができる。好ましくは、（Ａ）励起光照射手段及び（Ｂ）ラマン散乱光検出手段は、外科手術時に心臓に対してレーザ光の照射し、心臓からのラマン散乱光を検出するという観点から、いずれも細長いアームの先端でレーザ光の放出及びラマン散乱光の検出ができる形状を有する。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を参照して本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の特定の実施例に限定されるものではない。【００３６】
試験例：心筋梗塞を起こした心臓モデルの調製
後述する実施例で使用した検体は、次のようにして作成された。心臓全体の検体（ｎ＝１２）は、１００％酸素供給下で全身麻酔の下、若い成体ウィスターラット（体重２５０−３００ｇ、雌）から取り出された。下大静脈から塩化カリウム（０．２ｍＥｑ）を投与して心筋細胞の収縮を止めた後、心臓からのすべての血管を結紮し、血液で冠状血管を満たして心臓を摘出した。心臓はタイロード溶液（４℃、ｐＨ７.4）に静置し摘出後の代謝分解を最小限にした。酸素化型の血液及び脱酸素化型の血液は、各々３匹のラットの左心房及び右心房から得た。【００３７】
心筋梗塞は３３匹のラットの左下行冠状動脈を完全に結紮することで作製された。２８日後に２０匹の生存ラットから心臓を慎重に摘出した。１２個の心臓を即座に液体窒素で凍結し、検証まで−８０℃で保存した。残る８つの心臓は生きたまま調製された。凍結サンプルは５μｍの厚さのセクションにクリオスタット（LEICA, Wetzler,Germany）でスライスした。ラマン分析のサンプルは０．１７ｍｍの厚さの石英ガラス（Matsunami、大阪、日本）に載せられ、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で湿った状態に保たれた。へマトキシリンエオシン染色とマッソントリクロム染色を用いて切片の組織を確認した。生きた心臓は横方向に切られ梗塞領域は肉眼で確認された。それらは１〜２ｍｍの厚さのスライスに切断された。生きた試料を用いた後述の試験は、摘出後１時間以内に完了した。【００３８】
実施例１：心筋細胞の細胞質のラマンスペクトル
生きたまま調製された損傷のないex-vivo心臓の心外膜下から得られた心筋細胞の細胞質のラマンスペクトルをレーザーラマンコンフォーカル顕微鏡（RAMAN-１１; Nanophoton、大阪、日本）を用いて測定した。取り出された心臓を顕微鏡のステージ上の石英基盤の上に置いた後、心筋細胞を確認するために、自家蛍光画像を利用した。自家蛍光は、３３０〜３８０ｎｍ波長で励起し、４２０ｎｍ波長以上で検出した（図１Ａ）。これにより心筋細胞を同定し、焦点を合わせた後、フィルターを変更しラマンスペクトルを採取した（図１Ｃ）。レーザー強度は２０ｍW、照射時間は５秒であった。使用した顕微鏡の構造は、Harada, Y. et al., 2008, Proc. SPIE 、vol. 6853,685308に図示されている。心筋細胞のラマンスペクトルは、いくつかのラマンバンドを含み、主として600, 643, 690, 751, 1003, 1130, 1171, 1307, 1336, 1356, 1396, 1450, 1582, 1657, 2854 及び 2932 cm-1である(図１Ａ)。その中で、751 (ν 15 mode)、1130 (ν 22 mode) 及び 1582 (ν 19 mode) cm-1がヘムタンパク質の中心にあるポルフィリン環から生じた特定の振動モードと考えられる。ヘムタンパク質の中でも、還元型のシトクロムｂ５及びｃのピークが心筋細胞のピークとよく対応する。シトクロムｂ５及びｃは、代表的なヘムタンパク質で電子吸収帯の一つであるβバンドを５２０〜５３０ｎｍ波長にもつ。ミオグロビンは本実施例の条件下では心筋細胞のスペクトルにほとんど寄与していないと考えられる。なぜなら、光乖離現象によってオキシミオグロビンのラマンスペクトルを得ることが難しいことと、デオキシミオグロビンはスペクトルのパターンに違いがあるからである。【００３９】
実施例２：生きたex-vivo心臓の心筋細胞と血管のラマン組織イメージ
シトクロムのラマンスペクトルは、ヘモグロビンのラマンスペクトルと多くの共通点を有する。ヘモグロビンによる心筋細胞のシトクロムの検出に干渉する可能性を除外するためには、心臓組織中の二つのヘムタンパク質を分別する必要がある。酸素化型及び脱酸素化型赤血球は、それぞれ左心房及び右心房から、ヘパリン入りシリンジに採取した。それぞれ少量を石英基盤上に滴下し、自家蛍光画像で赤血球の形態を確認し、ラマンスペクトルを採取した。図２Ａは心筋細胞、酸素化型赤血球及び脱酸素化型赤血球についてのラマンスペクトルを示す。これらの特徴的なラマンバンドは、報告されている５３２ｎｍの励起光を使った生理学的条件下で得られたスペクトルとよく対応する。特にν４モード（酸素化マーカーバンド、1350-1380 cm-1 レンジ）及びν１９とν１０モード（1500-1650 cm-1レンジ）に対応したバンドである。これらのラマンバンドは赤血球中のヘモグロビンから生じている。図２Bは心外膜下の心筋細胞とその近傍の小血管の自家蛍光画像である。自家蛍光は、３３０〜３８０ｎｍ波長で励起し、４２０ｎｍ波長以上で検出した。図２Ｃは図２Ｂで示された心外膜下領域から得られたそれぞれの特徴的なラマンバンドでのラマンバンドイメージを示している。心筋細胞を表す1130 (ν22) cm-1とオキシヘモグロビンを表す 1582 (ν19)及び 1637 (ν10) cm-1とは、別々にイメージされ得るが、デオキシヘモグロビン単独でイメージすることは、オキシヘモグロビンの1582 cm-1 でのバンドの裾の部分で邪魔されるため不可能である。オキシ及びデオキシヘモグロビンの両者が1545 cm-1のバンドを指標とすることで画像化される。【００４０】
スペクトルの差異を同定し、同定された多数のバンドを化学マッピングのために使用するため、同じ領域から得られた５２６４（５６ｘ９４ピクセル）個のラマンスペクトルについて主成分分析（ＰＣＡ）が行われた。ＰＣＡは、MATLAB (Mathworks, Natick, Mass)とNanophotonソフトウェアを用いて行われ、大きなイメージデータの中から意味のある内在する変数を同定した。それぞれの主成分（ＰＣ）スペクトルに対応するＰＣスコアを、イメージ中の個々のラマンスペクトルにおいて計算した。そのスコアを正と負で分離し、空間情報を与えプロットし、画像化を図った。このスコアイメージはイメージ処理ソフトウェア（Image J; National Institutes of Health）を用いて行った。第１主成分が心筋細胞のスペクトルを抽出し、そのスコアイメージは心筋細胞それ自体の存在を示した。第２主成分スコアイメージと主成分スペクトルに示されるように、還元型のｂ及びｃ型シトクロム(751及び 1130 cm-1)を含んでいる心筋細胞とヘモグロビン(1545, 1582, 1601, 及び 1637 cm-1) (図2Db)で満たされた周りにある小さな血管を同定することができた。興味深いことに第３主成分スコアイメージと主成分スペクトルは異なる状態のヘモグロビンを表していた。オキシ(1371, 1582, 及び 1637 cm-1)及びデオキシ(1355, 1545, 及び 1603 cm-1)ヘモグロビンを同定することができた。即ち、心筋細胞に近接する小動脈と小静脈のラマンイメージを得ることに成功した(図2Dc)。【００４１】
実施例３：心筋梗塞領域のラマン組織イメージ
通常の組織学的検証方法（図3A-C）と合わせて心筋梗塞領域の凍結融解セクションについてラマン解析を行った。組織学的検証は、ラマン解析用との連続凍結切片におけるヘマトキシリンエオジン染色およびマッソントリクロム染色を用いて行った。これらの染色法により、線維組織で置換された心筋梗塞領域を同定することができた。図3Eは線維性組織（図3Dにアスタリスクで表示されている）から得られた代表的なラマンスペクトルを示している。そのラマンスペクトルはＩ型コラーゲンのものと非常に一致している。ＰＣＡが図3Dで示された領域から得られた１９，３３２（１０８ｘ１７９ピクセル）個のラマンスペクトルについて行われ、心筋細胞と線維性組織のそれぞれの特徴的なラマンバンドが得られた。第２主成分スコアイメージ（図3F）は、心筋細胞とそれを取り巻くコラーゲンをはっきりと映し出し、それは連続するヘマトキシリンエオジン染色のイメージ（図３C）とよく合致していた。第２主成分スペクトルにおける正のバンドは、還元型ｂ及びｃ型シトクロム(751, 1130, 及び 1582 cm-1)及び脂質(2854 cm-1, CH2 伸縮モード)に関連するものである。一方負のバンドはＩ型コラーゲン(857, 1250, 1687, 及び2945 cm-1)の存在に関連性のあるものである。【００４２】
凍結融解試料の結果に基づき、その方法を生きた心臓サンプルに適応した。心筋梗塞を作成したラットから取り出した心臓を輪切りにし、肉眼的に心筋梗塞部位を同定、その部位を含めて、１−２ｍｍの厚さに切り試料を作成した。顕微鏡ステージ上の石英基盤に試料を載せ、白色光イメージを見ながら焦点を合わせた後、ラマンイメージデータを取得した。取得した9,000（60x150ピクセル）個のラマンスペクトルにおいてPCAを行った。得られた第２主成分スペクトル（図４Ａ及び図４Ｂ）に対する個々のラマンスペクトルの主成分スコアを画像化することで、心筋細胞とコラーゲン分子のラマンイメージングを行うことに成功した。凍結融解試料(図３Ｆ)と生きたままの試料（図４Ｂ）から得られた第２主成分は良く合致していた。
【図１】
2010103661.tif 000003
【図２】
2010103661.tif 000004
【図３】
2010103661.tif 000005
【図４】
2010103661.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成23年1月13日(2011.1.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料に励起光を照射する手段、（Ｂ）前記試料からのラマン散乱光を検出する手段、（Ｃ）該検出したラマン散乱光を心筋細胞と赤血球及び／又はコラーゲンに特徴的なラマン散乱スペクトルを指標として画像処理する手段、心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域を区別して表示する表示手段を備える心筋組織と血管及び／又はコラーゲンリッチ領域とを含む試料をイメージングするためのイメージング装置。
【請求項２】
前記血管が動脈と静脈を含み、前記装置が動脈と静脈を区別して表示する表示手段を備える、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記コラーゲンリッチ領域が心臓において心筋細胞が脱落して心筋組織がその機能を失った領域を意味し、前記装置が正常な心筋組織と心筋組織がその機能を失った領域を区別して表示する表示手段を備える、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記励起光を照射する手段が５３２ｎｍの波長を有する励起光を照射する手段であり、前記画像処理する手段が
（ｉ）心筋細胞をラマンシフト７５１／ｃｍ、１１３０／ｃｍ、及び１５８２／ｃｍにおけるピークを指標とし、
（ｉｉ）酸素化赤血球または動脈をラマンシフト１３７１／ｃｍ、１５８２／ｃｍ及び１６３７／ｃｍにおけるピークを指標とし、
（ｉｉｉ）脱酸素化赤血球又は静脈をラマンシフト１３５５／ｃｍ、１５４５／ｃｍ及び１６０１／ｃｍにおけるピークを指標とし、
（ｉｖ）心筋組織がその機能を失った領域をＩ型コラーゲンのラマンスペクトルを指標として画像処理する手段である、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
外科手術時に心臓に対してレーザ光の照射し、心臓からのラマン散乱光を検出し、正常な心筋組織、機能を失った心筋組織領域、静脈及び動脈を表示することができる、請求項１〜４のいずれかに記載の装置。
【国際調査報告】
2010103661.tif 000007
2010103661.tif 000008
2010103661.tif 000009
2010103661.tif 000010
2010103661.tif 000011
2010103661.tif 000012
2010103661.tif 000013