(57)【要約】軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用しそれらの細胞の軟骨分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こすＲＡＮＫＬ結合分子を有効量投与することにより軟骨細胞の増殖・分化を誘導し、あるいは軟骨基質産生を増加させる方法及び軟骨細胞の増殖・分化を誘導し、あるいは軟骨基質産生を増加させるための医薬品組成物の提供。  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生増加の少なくとも１つを引き起こす化合物を有効成分として含む、軟骨謝疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
2010038610.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物を有効成分として含む、軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項２】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物が、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞上のＲＡＮＫＬに作用する、請求項１記載の軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項３】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物がＲＡＮＫ、ＲＡＮＫの変異体若しくは断片ペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似したペプチド、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似したペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似した化学物質、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似した化学物質、ＯＰＧ、ＯＰＧの変異体若しくは断片ペプチド、ＯＰＧに構造が類似したペプチド、ＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似したペプチド、ＯＰＧに構造が類似した化学物質、並びにＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、請求項１記載の軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項４】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物がＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬに作用し得るＲＡＮＫの変異体若しくは断片ペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得る化学物質、ＲＡＮＫＬに作用し得るＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似した化学物質、ＯＰＧ、ＲＡＮＫＬに作用し得るＯＰＧの変異体若しくは断片ペプチド、ＯＰＧに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＯＰＧに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得る化学物質、並びにＲＡＮＫＬに作用し得るＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、請求項２記載の軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項５】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物が配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩である、請求項１又は２に記載の軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項６】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物が配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩とアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１６）又はＤＹＬＤＤＤＤＬ（配列番号１７）で表されるＦｌａｇ、ＧＳＴ又はＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質である、請求項１又は２に記載の軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項７】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物が抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能的断片である、請求項１又は２に記載の軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項８】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生増加の少なくとも１つを引き起こす化合物を有効成分として含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項９】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物を有効成分として含む、軟骨細胞増殖・分化誘導剤。
【請求項１０】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物が、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞上のＲＡＮＫＬに作用する、請求項９記載の軟骨細胞増殖・分化誘導剤。
【請求項１１】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物がＲＡＮＫ、ＲＡＮＫの変異体若しくは断片ペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似したペプチド、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似したペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似した化学物質、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似した化学物質、ＯＰＧ、ＯＰＧの変異体若しくは断片ペプチド、ＯＰＧに構造が類似したペプチド、ＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似したペプチド、ＯＰＧに構造が類似した化学物質、並びにＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、請求項９記載の軟骨細胞増殖・分化誘導剤。
【請求項１２】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物がＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬに作用し得るＲＡＮＫの変異体若しくは断片ペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得る化学物質、ＲＡＮＫＬに作用し得るＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似した化学物質、ＯＰＧ、ＲＡＮＫＬに作用し得るＯＰＧの変異体若しくは断片ペプチド、ＯＰＧに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＯＰＧに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得る化学物質、並びにＲＡＮＫＬに作用し得るＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、請求項１０記載の軟骨細胞増殖・分化誘導剤。
【請求項１３】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物が配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩である、請求項９又は１０に記載の軟骨細胞増殖・分化誘導剤。
【請求項１４】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物が配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩とアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１６）又はＤＹＬＤＤＤＤＬ（配列番号１７）で表されるＦｌａｇ、ＧＳＴ又はＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質である、請求項９又は１０に記載の軟骨細胞増殖・分化誘導剤。
【請求項１５】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物が抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能的断片である、請求項９又は１０に記載の軟骨細胞増殖・分化誘導剤。
【請求項１６】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生の増加の少なくとも１つを引き起こす化合物を有効成分として含む、軟骨基質産生増加剤。
【請求項１７】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生の増加の少なくとも１つを引き起こす化合物が、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞上のＲＡＮＫＬに作用する、請求項１６記載の軟骨基質産生増加剤。
【請求項１８】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生の増加の少なくとも１つを引き起こす化合物がＲＡＮＫ、ＲＡＮＫの変異体若しくは断片ペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似したペプチド、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似したペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似した化学物質、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似した化学物質、ＯＰＧ、ＯＰＧの変異体若しくは断片ペプチド、ＯＰＧに構造が類似したペプチド、ＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似したペプチド、ＯＰＧに構造が類似した化学物質、並びにＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、請求項１６記載の軟骨基質産生増加剤。
【請求項１９】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生の増加の少なくとも１つを引き起こす化合物がＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬに作用し得るＲＡＮＫの変異体若しくは断片ペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得る化学物質、ＲＡＮＫＬに作用し得るＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似した化学物質、ＯＰＧ、ＲＡＮＫＬに作用し得るＯＰＧの変異体若しくは断片ペプチド、ＯＰＧに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＯＰＧに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得る化学物質、並びにＲＡＮＫＬに作用し得るＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、請求項１７記載の軟骨基質産生増加剤。
【請求項２０】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生の増加の少なくとも１つを引き起こす化合物が配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩である、請求項１６又は１７に記載の軟骨基質産生増加剤。
【請求項２１】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生の増加の少なくとも１つを引き起こす化合物が配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩とアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１６）又はＤＹＬＤＤＤＤＬ（配列番号１７）で表されるＦｌａｇ、ＧＳＴ又はＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質である、請求項１６又は１７に記載の軟骨基質産生増加剤。
【請求項２２】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生の増加の少なくとも１つを引き起こす化合物が抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能的断片である、請求項１６又は１７に記載の軟骨基質産生増加剤。
【請求項２３】
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩を有効成分として含む、軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項２４】
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩とアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１６）又はＤＹＬＤＤＤＤＬ（配列番号１７）で表されるＦｌａｇ、ＧＳＴ又はＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質を有効成分として含む、軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項２５】
軟骨疾患が、軟骨欠損、離断性骨軟骨炎、関節リウマチ、変形性関節症、先天性軟骨疾患及び軟骨損傷からなる群から選択される、請求項２３又は２４記載の軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項２６】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物を、ＲＡＮＫＬを発現している軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞と接触させ、候補化合物が軟骨細胞に分化し得る細胞の分化又は増殖を促進した場合に、候補化合物が軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物であると判断することを含む、スクリーニング方法。
【請求項２７】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物が、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞上のＲＡＮＫＬに作用する、請求項２６記載のスクリーニング方法。
【請求項２８】
軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生増加の少なくとも１つを引き起こす化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物を、ＲＡＮＫＬを発現している軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞と接触させ、候補化合物が軟骨細胞に分化し得る細胞の分化又は増殖を促進した場合に、候補化合物が軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、に（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生増加の少なくとも１つを引き起こす化合物であると判断することを含む、請求項２６又は２７に記載のスクリーニング方法。
【請求項２９】
さらに、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質の少なくとも１つを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質がＴＧＦ−β３及び／又はＢＭＰ−２である、請求項２９記載の医薬組成物。
【請求項３１】
さらに、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質の少なくとも１つを含む、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の軟骨細胞増殖・分化誘導剤。
【請求項３２】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質がＴＧＦ−β３及び／又はＢＭＰ−２である、請求項３１記載の軟骨細胞増殖・分化誘導剤。
【請求項３３】
さらに、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質の少なくとも１つを含む、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の軟骨基質産生増加剤。
【請求項３４】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質がＴＧＦ−β３及び／又はＢＭＰ−２である、請求項３３記載の軟骨基質産生増加剤。
【請求項３５】
さらに、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質の少なくとも１つを含む、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質がＴＧＦ−β３及び／又はＢＭＰ−２である、請求項３５記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化・成熟を増強するＲＡＮＫＬ結合分子を含む、軟骨形成を刺激する軟骨細胞増殖及び分化誘導剤あるいは軟骨基質産生増加剤に関する。また、本発明は該誘導剤を用いて軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞を分化させ、あるいは軟骨基質産生を増加させる方法に関する。さらに本発明はＲＡＮＫＬに結合し、シグナルを伝え、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞を分化・増殖させる物質あるいは軟骨基質産生を増加させる物質のスクリーニング方法、及びこれにより得られた物質、及び得られた物質を含有する医薬品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨は、軟骨細胞と多量の細胞間軟骨基質から形成される。軟骨は軟骨基質の性状の違いにより胎児期の骨格原基や関節軟骨の多くを構成する硝子軟骨、基質にＩ型コラーゲンを含む線維軟骨、耳介及び喉頭蓋に存在する弾性軟骨の３種類に分類される（非特許文献１及び２を参照）。
構成物の１つである軟骨細胞の起源は多能性未分化間葉系幹細胞であり、未分化間葉系幹細胞は転写因子Ｓｏｘ（ＳＲＹ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＨＭＧ  ｂｏｘ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ）９により凝集を起こし、前軟骨細胞となる。前軟骨細胞はＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン及びプロテオグリカン等の軟骨基質となるべき基質群を分泌し、軟骨基質の増加に従い細胞は個別化し、さらにＳｏｘ５及びＳｏｘ６といった転写因子と協調的に作用することにより軟骨芽細胞へ分化していく。さらに未熟な軟骨芽細胞に対し転写因子Ｒｕｎｘ２（ｒｕｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ２）の発現が抑制され、ＥＲＧ／Ｃ−１−１（ｅｔｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ）の発現が増加することにより永久軟骨細胞へ分化が進む（非特許文献３及び４を参照）。なお、軟骨細胞が肥大化するとＸ型コラーゲンの発現が亢進することが報告されている。
軟骨が成長する過程には２つのパターンがあり、その１つである間質成長では、一旦軟骨細胞に分化し、周囲を軟骨基質で取り囲まれた細胞が細胞分裂により増殖し、各軟骨細胞が基質を分泌することにより軟骨組織が拡大する。
もう１つは軟骨膜による付加成長がある。軟骨組織は、関節軟骨の関節面を除き、軟骨膜で覆われており、その強靭な軟骨膜は線維芽細胞から構成されるが、内層では軟骨細胞に似た形を呈するようになり、その境界が不明瞭になっている。内層の軟骨膜細胞も次第に円形に変化しながら増殖し、さらに軟骨基質を分泌して外側に成長する。
一般に軟骨組織において、軟骨膜の外側は血管や神経に富む結合組織に接しているが、その内部は血管や神経を含まない。その為、内部で軟骨の損傷が起こった場合に、未分化な幹細胞やサイトカイン等による修復ができない。さらに軟骨細胞自身が修復のための分裂増殖能力に乏しく、自己修復が非常に難しい。
関節軟骨の修復には、軟骨基質の局所へ注入、骨髄細胞を利用しその中に含まれる間葉系幹細胞を培養し自家軟骨細胞を作製、移植する方法、マトリックスディスクに軟骨細胞増殖因子を染み込ませ移植する方法などが報告されている。
軟骨細胞の増殖を誘導する因子としては、ＴＧＦ−β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：形質転換増殖因子）、ＩＧＦ−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：インスリン様成長因子）、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：塩基性繊維芽細胞成長因子）、ＰＴＨのＮ末端１３アミノ酸と相同性が高いＰＴＨｒＰ（ＰＴＨ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ：副甲状腺ホルモン関連タンパク）、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：肝細胞増殖因子）、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する骨形成タンパクＢＭＰ（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）等が報告されている。しかしながら、ＢＭＰやＴＧＦ−βのように軟骨細胞増殖作用以外にも、未分化間葉系幹細胞の凝集、軟骨細胞最終分化抑制作用などの重要な機能を有している因子もあり、移植後に骨化し、軟骨としての機能を失ってしまう可能性も含んでいる。
破骨細胞分化因子（ＲＡＮＫＬ；ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｌｉｇａｎｄ）は、骨吸収因子によって骨芽細胞／間質細胞上に誘導される腫瘍壊死因子（ＴＮＦ；ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）ファミリーに属する膜結合タンパク質で、破骨細胞分化・成熟に必須の因子である（非特許文献５及び６を参照）。その受容体であるＲＡＮＫ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ）及びおとり受容体のＯＰＧ（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）を含めたＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ／ＯＰＧを軸とした研究により、破骨細胞分化・成熟の調節メカニズムの解明が生体レベルで進み、これら３分子と骨代謝疾患との関わりも明らかになってきている（非特許文献７を参照）。
ＲＡＮＫＬと軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化・増殖との関連については、知られていない。
【非特許文献１】新骨の科学  須田立雄ら  編著  医歯薬出版
【非特許文献２】硬組織研究ハンドブック  松本歯科大大学院硬組織研究グループ
【非特許文献３】骨・軟骨代謝と注目の骨疾患  松本俊夫編  羊土社
【非特許文献４】ＩｎａｄａらＤｅｖ．Ｄｙｎ  ２１４：２７９，１９９９
【非特許文献５】ＹａｓｕｄａらＰｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：３５９７，１９９８
【非特許文献６】Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ  ９３：１６５，１９９８
【非特許文献７】Ｓｕｄａら、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ，２０：３４５，１９９９
【発明の開示】
【０００３】
本発明は軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、それらの細胞の軟骨分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こすＲＡＮＫＬ結合分子を有効量投与することにより軟骨細胞の増殖・分化を誘導し、あるいは軟骨基質産生を増加させる方法及び軟骨細胞の増殖・分化を誘導し、あるいは軟骨基質産生を増加させるための医薬品組成物の提供を目的とする。
本発明者等は、ＲＡＮＫＬに作用する分子として用いられる様々なタンパク質やペプチドなどを軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞上のＲＡＮＫＬに作用させることにより、軟骨細胞が増殖・分化し、あるいは軟骨基質産生を増加させることを見出した。すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物を有効成分として含む、軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
［２］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物が、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞上のＲＡＮＫＬに作用する、［１］の軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
［３］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物がＲＡＮＫ、ＲＡＮＫの変異体若しくは断片ペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似したペプチド、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似したペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似した化学物質、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似した化学物質、ＯＰＧ、ＯＰＧの変異体若しくは断片ペプチド、ＯＰＧに構造が類似したペプチド、ＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似したペプチド、ＯＰＧに構造が類似した化学物質、並びにＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、［１］の軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
［４］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物がＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬに作用し得るＲＡＮＫの変異体若しくは断片ペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得る化学物質、ＲＡＮＫＬに作用し得るＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似した化学物質、ＯＰＧ、ＲＡＮＫＬに作用し得るＯＰＧの変異体若しくは断片ペプチド、ＯＰＧに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＯＰＧに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得る化学物質、並びにＲＡＮＫＬに作用し得るＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、［２］の軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
［５］  軟骨細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物が配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩である、［１］又は［２］の軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
［６］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物が配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩とアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１６）又はＤＹＬＤＤＤＤＬ（配列番号１７）で表されるＦｌａｇ、ＧＳＴ又はＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質である、［１］又は［２］の軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
［７］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物が抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能的断片である、［１］又は［２］の軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
［８］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生増加の少なくとも１つを引き起こす化合物を有効成分として含む、［１］〜［７］のいずれかの軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
［９］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物を有効成分として含む、軟骨細胞増殖・分化誘導剤。
［１０］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強及び（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物が、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞上のＲＡＮＫＬに作用する、［９］の軟骨細胞増殖・分化誘導剤。
［１１］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物がＲＡＮＫ、ＲＡＮＫの変異体若しくは断片ペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似したペプチド、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似したペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似した化学物質、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似した化学物質、ＯＰＧ、ＯＰＧの変異体若しくは断片ペプチド、ＯＰＧに構造が類似したペプチド、ＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似したペプチド、ＯＰＧに構造が類似した化学物質、並びにＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、［９］の軟骨細胞増殖・分化誘導剤。
［１２］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物がＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬに作用し得るＲＡＮＫの変異体若しくは断片ペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得る化学物質、ＲＡＮＫＬに作用し得るＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似した化学物質、ＯＰＧ、ＲＡＮＫＬに作用し得るＯＰＧの変異体若しくは断片ペプチド、ＯＰＧに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＯＰＧに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得る化学物質、並びにＲＡＮＫＬに作用し得るＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、［１０］の軟骨細胞増殖・分化誘導剤。
［１３］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物が配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩である、［９］又は［１０］の軟骨細胞増殖・分化誘導剤。
［１４］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物が配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩とアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１６）又はＤＹＬＤＤＤＤＬ（配列番号１７）で表されるＦｌａｇ、ＧＳＴ又はＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質である、［９］又は［１０］の軟骨細胞増殖・分化誘導剤。
［１５］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物が抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能的断片である、［９］又は［１０］の軟骨細胞増殖・分化誘導剤。
［１６］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生の増加の少なくとも１つを引き起こす化合物を有効成分として含む、軟骨基質産生増加剤。
［１７］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生の増加の少なくとも１つを引き起こす化合物が、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞上のＲＡＮＫＬに作用する、［１６］の軟骨基質産生増加剤。
［１８］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生の増加の少なくとも１つを引き起こす化合物がＲＡＮＫ、ＲＡＮＫの変異体若しくは断片ペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似したペプチド、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似したペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似した化学物質、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似した化学物質、ＯＰＧ、ＯＰＧの変異体若しくは断片ペプチド、ＯＰＧに構造が類似したペプチド、ＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似したペプチド、ＯＰＧに構造が類似した化学物質、並びにＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、［１６］の軟骨基質産生増加剤。
［１９］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生の増加の少なくとも１つを引き起こす化合物がＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬに作用し得るＲＡＮＫの変異体若しくは断片ペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得る化学物質、ＲＡＮＫＬに作用し得るＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似した化学物質、ＯＰＧ、ＲＡＮＫＬに作用し得るＯＰＧの変異体若しくは断片ペプチド、ＯＰＧに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＯＰＧに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得る化学物質、並びにＲＡＮＫＬに作用し得るＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似した化学物質からなる群から選択される化合物である、［１７］の軟骨基質産生増加剤。
［２０］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生の増加の少なくとも１つを引き起こす化合物が配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩である、［１６］又は［１７］の軟骨基質産生増加剤。
［２１］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生の増加の少なくとも１つを引き起こす化合物が配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩とアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１６）又はＤＹＬＤＤＤＤＬ（配列番号１７）で表されるＦｌａｇ、ＧＳＴ又はＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質である、［１６］又は［１７］の軟骨基質産生増加剤。
［２２］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生の増加の少なくとも１つを引き起こす化合物が抗ＲＡＮＫＬ抗体又はその機能的断片である、［１６］又は［１７］の軟骨基質産生増加剤。
［２３］  配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩を有効成分として含む、軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
［２４］  配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩とアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１６）又はＤＹＬＤＤＤＤＬ（配列番号１７）で表されるＦｌａｇ、ＧＳＴ又はＩｇＧのＦｃ領域との融合タンパク質を有効成分として含む、軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
［２５］  軟骨疾患が、軟骨欠損、離断性骨軟骨炎、関節リウマチ、変形性関節症、先天性軟骨疾患及び軟骨損傷からなる群から選択される、［２４］の軟骨疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
［２６］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物を、ＲＡＮＫＬを発現している軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞と接触させ、候補化合物が軟骨細胞に分化し得る細胞の分化又は増殖を促進した場合に、候補化合物が軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物であると判断することを含む、スクリーニング方法。
［２７］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、並びに（ｅ）軟骨細胞の増殖の少なくとも１つを引き起こす化合物が、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞上のＲＡＮＫＬに作用する、［２６］のスクリーニング方法。
［２８］  軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生増加の少なくとも１つを引き起こす化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物を、ＲＡＮＫＬを発現している軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞と接触させ、候補化合物が軟骨細胞に分化し得る細胞の分化又は増殖を促進した場合に、候補化合物が軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、に（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生増加の少なくとも１つを引き起こす化合物であると判断することを含む、［２６］又は［２７］のスクリーニング方法。
［２９］  さらに、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質の少なくとも１つを含む、［１］〜［８］のいずれかの医薬組成物。
［３０］  ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質がＴＧＦ−β３及び／又はＢＭＰ−２である、［２９］の医薬組成物。
［３１］  さらに、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質の少なくとも１つを含む、［９］〜［１５］のいずれかの軟骨細胞増殖・分化誘導剤。
［３２］  ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質がＴＧＦ−β３及び／又はＢＭＰ−２である、［３１］の軟骨細胞増殖・分化誘導剤。
［３３］  さらに、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質の少なくとも１つを含む、［１６］〜［２２］のいずれかの軟骨基質産生増加剤。
［３４］  ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質がＴＧＦ−β３及び／又はＢＭＰ−２である、［３３］の軟骨基質産生増加剤。
［３５］  さらに、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質の少なくとも１つを含む、［２３］〜［２５］のいずれかの医薬組成物。
［３６］  ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質がＴＧＦ−β３及び／又はＢＭＰ−２である、［３５］の医薬組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００８−２５４１５３号、２００８−３１４８６６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１Ａは、アルシアンブルー染色により、ペプチドＤによるヒト間葉系幹細胞からの軟骨細胞分化誘導を示す写真である。
図１Ｂは、アルシアンブルー染色された細胞から色素を溶出し吸光度を測定することによって、ペプチドＤによるヒト間葉系幹細胞からの軟骨細胞分化誘導を示すグラフ図である。
図２は、アルシアンブルー染色により、ペプチドＤによるＡＴＤＣ５細胞からの軟骨細胞分化誘導を示す図である。
図３Ａは、ＲＴ−ＰＣＲによりペプチドＤ添加後７日目のマウスＡＴＤＣ５細胞における各因子の発現を示す写真である。
図３Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによりペプチドＤ添加後７日目のマウスＡＴＤＣ５細胞における各因子の発現をＧＡＰＤＨで標準化したものを示すグラフ図である。
図４Ａは、ＲＴ−ＰＣＲによりペプチドＤ添加後１４日目のマウスＡＴＤＣ５細胞における各因子の発現を示す写真である。
図４Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによりペプチドＤ添加後１４日目のマウスＡＴＤＣ５細胞における各因子の発現をＧＡＰＤＨで標準化したものを示すグラフ図である。
図５は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析によりペプチドＤを添加したマウスＡＴＤＣ細胞における各因子の発現の増減を示す図である。
図６は、抗ＲＡＮＫＬ抗体によるマウスＡＴＤＣ５細胞の細胞増殖活性の上昇を示す図である。
図７は、抗ＲＡＮＫＬモノクローナル抗体によるマウスＡＴＤＣ５細胞の軟骨細胞への分化を示す写真である。
図８は、ペプチドＤにより形成されたヒト間葉系幹細胞からの３次元培養ペレットの写真である。
図９は、ペプチドＤにより形成されたヒト間葉系幹細胞からの３次元培養ペレットのスライド標本を、アルシアンブルー染色およびサフラニンＯ染色した像を示す写真である。
図１０は、ヒト間葉系幹細胞からの３次元培養ペレット形成における、ペプチドＤとＴＧＦ−β３との相乗効果を示す写真である。
図１１は、ペプチドＤとＴＧＦ−β３との相乗効果を示すヒト間葉系幹細胞からの３次元培養ペレットのスライド標本を、アルシアンブルー染色およびサフラニンＯ染色した像を示す写真である。
図１２は、ヒト間葉系幹細胞からの３次元培養ペレット形成における、ペプチドＤとＢＭＰ−２との相乗効果を示す写真である。
図１３は、ペプチドＤとＢＭＰ−２との相乗効果を示すヒト間葉系幹細胞からの３次元培養ペレットのスライド標本を、アルシアンブルー染色およびサフラニンＯ染色した像を示す写真である。
図１４は、ヒト間葉系幹細胞にＴＧＦ−β３、ペプチドＤおよびペプチドＤとＴＧＦ−β３を添加した際のＲＮＡを用いたＧｅｎｅＣｈｉｐ解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
ＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｌｉｇａｎｄ）は、ＴＮＦ  スーパーファミリーのメンバーであるＲＡＮＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ）のリガンドであり、細胞内ドメイン（ＲＡＮＫのＮ末端から第１番目から４８番目のアミノ酸からなるドメイン）、膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを有する２型貫通タンパク質である（特表２００２−５０９４３０号公報、国際公開第ＷＯ９８／４６６４４号パンフレット、後者は現在特許公報３５２３６５０号となっている）。ＲＡＮＫＬは骨吸収因子の刺激を受けて骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞上に発現する。ここで、骨芽細胞に分化し得る細胞には、骨芽細胞に分化し得る限りあらゆる細胞が含まれ、例えば、軟骨前駆細胞、骨芽前駆細胞、間葉系幹細胞、間質細胞、筋芽細胞等が挙げられる。細胞外ドメイン中、Ｎ末端から第１５２番目以降のアミノ酸からなるドメインは、ＴＮＦリガンドファミリー相同性ドメインである。ヒト由来のＲＡＮＫＬの全長塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び２に示す。ＲＡＮＫの全長塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３及び４に示す。
ＯＰＧ（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）は、構造がＲＡＮＫに類似したタンパク質であり、ＲＡＮＫＬに作用し得る。ＯＰＧの全長塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５及び６に示す。
本発明は、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用しそれらの細胞の軟骨分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こし、あるいは軟骨基質産生を増加させる化合物、すなわち軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生の増加の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ又はすべてを引き起こす化合物を有効成分として含む医薬組成物である。前記の（ａ）〜（ｆ）の２つ以上の組合せとしては、（ａ）と（ｂ）、（ａ）と（ｃ）、（ａ）と（ｄ）、（ａ）と（ｅ）、（ａ）と（ｆ）、（ｂ）と（ｃ）、（ｂ）と（ｄ）、（ｂ）と（ｅ）、（ｂ）と（ｆ）、（ｃ）と（ｄ）、（ｃ）と（ｅ）、（ｃ）と（ｆ）、（ｄ）と（ｅ）、（ｄ）と（ｆ）、（ｅ）と（ｆ）、（ａ）と（ｂ）と（ｃ）、（ａ）と（ｂ）と（ｄ）、（ａ）と（ｂ）と（ｅ）、（ａ）と（ｂ）と（ｆ）、（ａ）と（ｃ）と（ｄ）、（ａ）と（ｃ）と（ｅ）、（ａ）と（ｃ）と（ｆ）、（ａ）と（ｄ）と（ｅ）、（ａ）と（ｄ）と（ｆ）、（ａ）と（ｅ）と（ｆ）、（ａ）と（ｂ）と（ｃ）と（ｄ）、（ａ）と（ｂ）と（ｃ）と（ｅ）、（ａ）と（ｂ）と（ｃ）と（ｆ）、（ａ）と（ｂ）と（ｄ）と（ｅ）、（ａ）と（ｂ）と（ｄ）と（ｆ）、（ａ）と（ｂ）と（ｅ）と（ｆ）、（ａ）と（ｃ）と（ｄ）と（ｅ）、（ａ）と（ｃ）と（ｄ）と（ｆ）、（ａ）と（ｃ）と（ｅ）と（ｆ）、（ａ）と（ｄ）と（ｅ）と（ｆ）、（ｂ）と（ｃ）と（ｄ）と（ｅ）、（ｂ）と（ｃ）と（ｄ）と（ｆ）、（ｂ）と（ｃ）と（ｅ）と（ｆ）、（ｂ）と（ｄ）と（ｅ）と（ｆ）、（ｃ）と（ｄ）と（ｅ）と（ｆ）、（ａ）と（ｂ）と（ｃ）と（ｄ）と（ｅ）、（ａ）と（ｂ）と（ｃ）と（ｄ）と（ｆ）、（ａ）と（ｂ）と（ｃ）と（ｅ）と（ｆ）、（ａ）と（ｂ）と（ｄ）と（ｅ）と（ｆ）、（ａ）と（ｃ）と（ｄ）と（ｅ）と（ｆ）、（ｂ）と（ｃ）と（ｄ）と（ｅ）と（ｆ）、（ａ）と（ｂ）と（ｃ）と（ｄ）と（ｅ）と（ｆ）がある。該医薬組成物として、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用しそれらの細胞の軟骨分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟膏の増殖を引き起こし、あるいは軟骨基質産生を増加させる化合物を有効成分として含む医薬組成物が挙げられる。有効成分としては、例えば、ＲＡＮＫＬに作用し、ＲＡＮＫＬから軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞にシグナルを伝達し、それらの細胞の分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こし、あるいは軟骨基質産生を増加させる化合物が挙げられる。前記化合物がＲＡＮＫＬに作用する場合、作用し得るＲＡＮＫＬの由来動物種は限定されず、ヒト由来ＲＡＮＫＬ、マウス由来ＲＡＮＫＬ、ラット由来ＲＡＮＫＬ等あらゆる動物種由来のＲＡＮＫＬが対象となる。ここで、ＲＡＮＫＬに作用するとは、ＲＡＮＫＬに作用してＲＡＮＫＬから軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞にシグナルを伝達することをいい、例えば、ＲＡＮＫＬに結合し、ＲＡＮＫＬから軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞にシグナルを伝達する。
ＲＡＮＫＬに作用し、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、それらの細胞の分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こし、あるいは軟骨基質産生を増加させる化合物として、あらゆる動物種由来のあらゆるＲＡＮＫＬ作用化合物が挙げられる。該化合物は、天然及び非天然ペプチドや化学合成あるいは微生物由来などの低分子化合物を含む。
本発明の軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用しそれらの細胞の分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こし、あるいは軟骨基質産生を増加させる化合物として、ＲＡＮＫの変異体若しくは断片ペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似しているペプチド、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似しているペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似している化学物質、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似した化学物質等が挙げられる。このような化合物として、例えば、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬに作用し得るＲＡＮＫの変異体若しくは断片ペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＲＡＮＫに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得る化学物質、ＲＡＮＫＬに作用し得るＲＡＮＫの断片ペプチドに構造が類似した化学物質等が挙げられる。
また、化学物質とは、ペプチド及びタンパク質以外の化合物をいう。ＲＡＮＫは膜型ＲＡＮＫも可溶型ＲＡＮＫも含む。膜型ＲＡＮＫとは、細胞表面に結合している状態の膜貫通領域を有するＲＡＮＫをいい、天然型ＲＡＮＫを発現している細胞やリコンビナントＲＡＮＫを発現しているヒト細胞等の動物細胞を用いることができる。また、ＲＡＮＫＦｃも含まれる。ここで、ＲＡＮＫＦｃはヒトＲＡＮＫの細胞外領域にヒトＩｇＧのＦｃ領域を結合させた融合タンパク質（Ｆｃ融合タンパク質）である。
また、本発明において、構造が類似しているとは、例えば、ＲＡＮＫＬに作用し得る部分の立体構造が類似していることをいう。ペプチドやタンパク質の場合、通常アミノ酸配列で表される１次構造も類似しているが、アミノ酸配列が類似しておらず、立体構造が類似しており、ＲＡＮＫＬに作用し得る化合物も含まれる。
さらに、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用しそれらの細胞の分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こし、あるいは軟骨基質産生を増加させる化合物として、ＯＰＧ、ＯＰＧの変異体若しくは断片ペプチド、ＯＰＧに構造が類似しているペプチド、ＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似しているペプチド、ＯＰＧに構造が類似している化学物質、ＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似した化学物質等が挙げられる。このような化合物として、例えば、ＲＡＮＫＬに作用し、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用しそれらの細胞の分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こし、あるいは軟骨基質産生を増加させる化合物として、ＯＰＧ、ＲＡＮＫＬに作用し得るＯＰＧの変異体若しくは断片ペプチド、ＯＰＧに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得るペプチド、ＯＰＧに構造が類似しＲＡＮＫＬに作用し得る化学物質、ＲＡＮＫＬに作用し得るＯＰＧの断片ペプチドに構造が類似した化学物質等が挙げられる。
また、化学物質とは、ペプチド及びタンパク質以外の化合物をいう。ＯＰＧは膜型ＯＰＧも可溶型ＯＰＧも含む。膜型ＯＰＧとは、Ｃ末端領域などで細胞表面に結合している状態のＯＰＧをいい、天然型ＯＰＧを発現している細胞やリコンビナントＯＰＧを発現しているヒト細胞等の動物細胞を用いることができる。また、ＯＰＧＦｃも含まれる。ここで、ＯＰＧＦｃとは、ＯＰＧにヒトＩｇＧのＦｃ領域を結合させた融合タンパク質（Ｆｃ融合タンパク質）である。
ＲＡＮＫ又はＯＰＧの類似体として、例えば、ＲＡＮＫ若しくはＯＰＧ又はそれらの断片ペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＲＡＮＫ又はＯＰＧの活性を有するタンパク質若しくはペプチドを含む。ここで、１又は数個とは１〜９個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１若しくは２個である。
ＲＡＮＫのＲＡＮＫＬに結合する部位の構造に似せたペプチドとして、例えば、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチドＤ）が挙げられる。これらのペプチドは、２番目のＣｙｓと８番目のＣｙｓがジスルフィド結合で結ばれた環状ペプチドである。
さらに、上記のＲＡＮＫのＲＡＮＫＬに結合する部位の構造に似せたペプチド塩も用い得る。ペプチド塩は、薬学的に許容できる塩であれば限定されないが、たとえば、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、酢酸、リンゴ酸、コハク酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩、酒石酸又はクエン酸等の有機酸との塩、塩酸、硫酸、硝酸又はリン酸等の無機酸との塩が挙げられる。また塩基付加塩としては、ナトリウム若しくはカリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム若しくはマグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アンモニウム若しくはトリエチルアミン等のアミン類との塩等が挙げられる。この中でも、酢酸塩が好ましく、特に配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの酢酸塩が好ましい。
また、上記のＲＡＮＫのＲＡＮＫＬに結合する部位の構造に似せたペプチドとＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）又はヒトＩｇＧのＦｃ領域等とを結合させた融合タンパク質（ＧＳＴ融合タンパク質又はＦｃ融合タンパク質）も用いることができる。このような融合タンパク質として、例えばペプチドＤとアミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１６）又はＤＹＬＤＤＤＤＬ（配列番号１７）で表されるＦｌａｇ、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）又はヒトＩｇＧのＦｃ領域を結合させた融合タンパク質（Ｆｌａｇ融合タンパク質、Ｆｃ融合ペプチドＤ又はＧＳＴ融合ペプチドＤ）が挙げられる。これらの融合タンパク質は、生体内での安定性が増し、血中半減期が長くなる。また、ＧＳＴとＦｃ領域の他のエピトープタグとの融合タンパク質も用いることができる。他のエピトープタグとしては、２〜１２個、好ましくは４個以上、さらに好ましくは４〜７個、さらに好ましくは５個若しくは６個のヒスチジンからなるポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＨＱタグ、ＨＡタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９、ＣｒｕｚＴａｇ２２、ＣｒｕｚＴａｇ４１、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ、ＫＴ３タグ、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、βガラクトシダーゼ等が挙げられる。
本発明において、ＲＡＮＫＬに作用し、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用しそれらの細胞の分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こし、あるいは軟骨基質産生を増加させる化合物を、ＲＡＮＫＬに対するアゴニスト物質ということがある。
さらに、抗ＲＡＮＫＬ抗体であって、ＲＡＮＫＬに作用することにより、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用しそれらの細胞の分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こし、あるいは軟骨基質産生を増加させる抗体又はその機能的断片も含まれる。本発明において、これらの抗体をＲＡＮＫＬに対するアゴニスト抗体ということがある。抗ＲＡＮＫＬ抗体は、公知の方法により、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることができ、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、及び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、公知の手法により、以下のようにして作製できる。すなわち、膜型若しくは可溶型ＲＡＮＫＬ又はその断片ペプチドを感作抗原として用いて、公知の免疫方法により免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、公知のスクリーニング法により、モノクローナル抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって作製することができる。ＲＡＮＫＬを免疫する際、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン等のキャリアタンパク質と結合させて用いてもよい。モノクローナル抗体としては、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０；１９２：７６７−７７５．参照）。この際、抗体重鎖（Ｈ鎖）又は軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖及びＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ９４／１１５２３号公報参照）。また、トランスジェニック動物を使用することにより、組換え型抗体を産生することもできる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９４；１２：６９９−７０２）。
本発明の抗ＲＡＮＫＬ抗体は、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体をも含む。このような抗体としてはキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体が挙げられ、いずれも公知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡを得て、ヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体ともいう。ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、公知の方法により作製することができる（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３号公報、ＷＯ９６／０２５７６号公報参照）。キメラ抗体及びヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
ヒト抗体は、例えばヒト抗体遺伝子座を導入し、ヒト由来抗体を産生する能力を有するトランスジェニック動物に抗原を投与することにより得ることができる。該トランスジェニック動物としてマウスが挙げられ、ヒト抗体を産生し得るマウスの作出方法は、例えば、国際公開第ＷＯ０２／４３４７８号パンフレットに記載されている。
抗ＲＡＮＫＬ抗体は、完全抗体だけでなく、その機能的断片も含む。抗体の機能的断片とは、抗体の一部分（部分断片）であって、抗体の抗原への作用を１つ以上保持するものを意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、及びこれらの重合体等が挙げられる［Ｄ．Ｊ．Ｋｉｎｇ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，１９９８  Ｔ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ］。
また、モノクローナル抗体を用いる場合、１種類のみのモノクローナル抗体を用いてもよいが、認識するエピトープが異なる２種類以上、例えば２種類、３種類、４種類又は５種類のモノクローナル抗体を用いてもよい。
上記の化合物が、ＲＡＮＫＬに対してシグナル伝達を促進させるアゴニスト活性を有するか否かは、例えば、抗体をＲＡＮＫＬを発現する軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に投与し、ＲＡＮＫＬに作用させ、これらの細胞が分化、増殖し、軟骨形成し、あるいは軟骨基質産生が増加するかを検定することにより、決定することができる。分化、増殖は、例えば細胞のＩＩ型コラーゲンα１鎖の発現上昇を指標に決定することができる。また、軟骨基質はアルシアンブルーにより青く染まるので、アルシアンブルー染色により、軟骨が形成されたか否か、軟骨基質産生が増加したか否かを決定することができる。
本発明は、さらに、上記の軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用しそれらの細胞の軟骨分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こし、あるいは軟骨基質産生を増加させる化合物、すなわち軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用し、（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生の増加の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ又はすべてを引き起こす化合物とＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質の少なくとも１つを組合せて含む医薬組成物を包含する。上記化合物とＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質の少なくとも１つを組合せて投与することにより（ａ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の分化の促進、（ｂ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の増殖の促進、（ｃ）軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞の成熟の促進、（ｄ）軟骨細胞分化の増強、（ｅ）軟骨細胞の増殖、並びに（ｆ）軟骨基質産生の増加に対して相乗的効果を発揮し、あるいは軟骨基質産生増加効果を発揮することができる。
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質としては、ＢＭＰ２、４、７、ＧＤＦ（ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ）−５，６，７等を含むＢＭＰファミリー、アクチビン、インヒビン、さらにＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１〜３、ＬＴＢＰ（ｌａｔｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含むＴＧＦファミリーがある（ＢｉｌｅｚｉｌｉａｎらＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｃｈａｐｔｅｒ５３）。これらの１種又は数種を組合せて用いてもよい。例えば、上記化合物とＴＧＦ−β３及び／又はＢＭＰ−２を組合せて用いればよい。
本発明の組成物は、軟骨形成を増強し、あるいは軟骨基質産生を増加させ得、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで研究用試薬として用いることもでき、またｉｎ  ｖｉｖｏで医薬組成物として用いることもできる。
本発明の医薬組成物は、軟骨形成を増強し、あるいは軟骨基質産生を増加させる医薬組成物として用いることができる。対象とする軟骨は、肥大軟骨（成長軟骨）及び永久軟骨（関節軟骨）を含む。本発明の医薬組成物は、軟骨細胞増殖・分化誘導剤又は軟骨形成促進剤である。また、本発明の医薬組成物は、軟骨疾患の予防又は治療のために用いることができる。軟骨疾患としては、外傷、外科的処置などによる軟骨欠損、離断性骨軟骨炎、関節リウマチ、変形性関節症、先天性軟骨疾患（軟骨無形成症等）、半月板損傷などの軟骨損傷等が挙げられる。対象となる被験動物はヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス等の哺乳動物である。
本発明の医薬組成物の投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、１日約０．０１ｍｇ〜１００００ｍｇであり、これらを１回、又は数回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、損傷又は欠損した軟骨や上記の軟骨疾患患者の軟骨に対して局所投与してもよい。
本発明の医薬組成物は、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含んでいてもよい。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
本発明は、さらに軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用しそれらの細胞の分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こし、あるいは軟骨基質産生を増加させる化合物、例えばＲＡＮＫＬに作用し、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用しそれらの細胞の分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こし、あるいは軟骨基質産生を増加させる化合物のスクリーニング方法を包含する。
該スクリーニング方法は、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に候補化合物を投与し、候補化合物が、上記細胞の分化、増殖を促進するかを検定すればよい。例えば、ＲＡＮＫＬを表面に発現している軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞と同様の性質を有する細胞に候補化合物を投与し、候補化合物がＲＡＮＫＬに作用し、上記細胞の分化、増殖を促進するかを検定すればよい。分化、増殖は、例えば細胞のＩＩ型コラーゲンα１鎖の発現上昇やアルシアンブルーによる染色により決定することができる。分化、増殖を促進する場合、候補化合物を軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用しそれらの細胞の分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こし、あるいは軟骨基質産生を増加させる化合物、例えばＲＡＮＫＬに作用し、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用しそれらの細胞の分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こし、あるいは軟骨基質産生を増加させる化合物であると判断することができる。
また、例えば候補化合物をマウス、例えばＣ５７ＢＬ／６ＣｒｊＣｒｌｊの局所に投与し、軟骨細胞の増殖が認められるか否かを指標に、該候補化合物が軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用しそれらの細胞の分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こし、あるいは軟骨基質産生を増加させる化合物、例えばＲＡＮＫＬに作用し、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用しそれらの細胞の分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こし、あるいは軟骨基質産生を増加させる化合物であるか否かを判断することができる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
ヒト間葉系幹細胞の分化誘導
試薬
実験には合成ペプチドを使用した。合成ペプチドＤは配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、９アミノ酸から構成され、二つのシステイン残基がジスルフィド結合により結合した環状ペプチドである。合成ペプチドＤはＲＡＮＫＬに結合することが報告されている（Ａｏｋｉら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１６：１５２５，２００６）。
培養細胞
ヒト間葉系幹細胞はＬｏｎｚａ社から購入した。専用の継代培地はＬｏｎｚａ社製品を使用した。
ヒト間葉系幹細胞の分化誘導
ヒト間葉系幹細胞を、５×１０４個／ウェルずつ４８ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ）に播種した。２４時間後に培養上清を除去し、軟骨細胞分化誘導培地（Ｌｏｎｚａ）に切換え、３〜４日毎に培地を交換した。
同時に１００μＭの濃度でペプチドＤを添加した（ペプチドＤ投与群）。さらに１００μＭのペプチドＤ及び１ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４（Ｒ＆Ｄ）が共添加群についても検討を行った。陽性対照群には１ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ−４を添加した。培地交換を繰り返しながら、１４日間培養を行った後、１０％ホルマリン中性緩衝液にて細胞の固定を行った。固定後、アルシアンブルー液にて４時間染色を行い、色素を洗浄後にプレートの写真を撮影し、さらに６Ｍグアニジン塩酸溶液を用いて、色素の溶出を行った。溶出液１００μＬを９６ウェルプレートに移し、各ウェルの６２０ｎｍにおけるＯＤ値をマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）にて測定した。
・アルシアンブルー液（ｐＨ２．５）
Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ  ８ＧＸ          １ｇ
酢酸                                    ３ｍｌ
蒸留水                                ９７ｍｌ
その結果図１Ａに示したように、対照群に対しペプチドＤ添加によりアルシアンブルー染色陽性細胞が増えていることが示され、さらに溶出液の６２０ｎｍにおける吸光度を測定したところ、ペプチドＤ添加により有意な吸光度の上昇が認められた（図１Ｂ）。これはペプチドＤによりヒト間葉系幹細胞が軟骨細胞に分化したことを示す。一方でＢＭＰ−４との相乗効果は認められなかった。
【実施例２】
【０００７】
ペプチドＤによる軟骨前駆細胞の分化誘導
培養細胞
軟骨細胞マウスＥＣ（胚性がん腫）由来のクローン化細胞株ＡＴＤＣ５は京都大学再生医学研究所の開先生・宿南先生から供与頂いた。継代培地は５％ＦＢＳ（ニチレイ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ｃｅｌｌｇｒｏ）を用いた。
軟骨前駆細胞ＡＴＤＣ５細胞の分化誘導
ＡＴＤＣ細胞を、２×１０４個／ウェルずつ４８ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ）に播種した。２４時間後に培養上清を除去し、１０ｎｇ／ｍＬインスリン（Ｒｏｃｈｅ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を添加した。３〜４日毎に培地を交換した。
同時に２５、１００μＭの濃度でペプチドＤを添加した。陽性対照として１及び５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４（Ｒ＆Ｄ）を添加した。さらにペプチドＤとＢＭＰ−４の相乗効果を確認するため、２５μＭのペプチドＤと１ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４を共添加した。培地交換を繰り返しながら、１４日間培養を行った後、１０％ホルマリン中性緩衝液にて細胞の固定を行った。固定後、アルシアンブルー液にて４時間染色を行い、色素を洗浄後にプレートを乾燥させ、写真を撮影した。
マウス軟骨前駆細胞ＡＴＤＣ５細胞においてもペプチドＤ添加により、アルシアンブルー陽性ノジュール形成が確認され、濃度依存的にその数は増加した（図２）。これはペプチドＤによりＡＴＤＣ５細胞が軟骨細胞に分化したことを示す。
ＡＴＤＣ５細胞を用いた場合でも、ＢＭＰ−４との相乗効果は認められなかった。
【実施例３】
【０００８】
ペプチドＤ添加時のマウスＡＴＤＣ５細胞における各因子の発現
ＲＴ−ＰＣＲ解析
６ｃｍ  ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）に５×１０４個のマウス軟骨前駆細胞ＡＴＤＣ５を播種し、１０ｎｇ／ｍＬのインスリンを含む軟骨分化誘導培地存在下で７及び１４日間培養した。ペプチドＤ添加群には２００μＭのペプチドＤを添加し、陽性対照群には５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４を添加した。培養後に細胞をＰＢＳで洗浄し、ＴＲＩＺＯＬ（ＱＩＡＧＥＮ）１ｍＬに細胞を溶解させ、溶液を回収した。室温で５分間溶液を放置後に０．２ｍＬのクロロホルム（Ｗａｋｏ）を添加し、激しく転倒混和させてから、４℃、１２０００×ｇの条件で１５分間遠心を行い、上清を新しいチューブに移し、０．５ｍＬのイソプロパノールを加えて転倒混和し、室温で１０分間放置した。４℃、１２０００×ｇの条件で１０分間遠心を行い、上清を除去後、７０％エタノールにて脱塩処理を行った。乾燥後に８７．５μＬＤＥＰＣ水にＲＮＡを溶解し、１０μＬ  ＲＤＤ  ｂｕｆｆｅｒ、２．５μＬ  ＤＮａｓｅを加え室温で１０分間放置した。ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてＲＮＡ  ｓａｍｐｌｅを処理し、得られたＲＮＡの濃度をナノドロップにて測定した。得られたＲＮＡ２５０ｎｇを１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、ＲＮＡ分解の有無を確認し、分解のないＲＮＡそれぞれ２５０ｎｇをＲＴ−ＰＣＲに供した。ＲＴ−ＰＣＲはＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒを用いて行った。
ｃＤＮＡ合成後に、マウスＩＩ型コラーゲンα１鎖（ｍＣｏｌ  ２α１）、マウスＸ型コラーゲン（ｍＣｏｌ  Ｘ）及びマウスアグリカン（ｍＡｇｇｒｅｃａｎ）特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。標準化用にマウスＧＡＰＤＨ特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。用いたＰＣＲプライマー配列は下に記載した。Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）を用いて以下の条件でＰＣＲを行った。
マウスＩＩ型コラーゲンα１鎖（ｍＣｏｌ  ２α１）は９５℃で３分初期熱変性を行った後、９５℃で１０秒、４８℃で１５秒、６８℃で３０秒を３７サイクル行い、６８℃で１０分間伸長反応を行った。
マウスＸ型コラーゲン（ｍＣｏｌ  Ｘ）は、９５℃で３分初期熱変性を行った後、９５℃で１０秒、５４℃で１５秒、６８℃で３０秒を３４サイクル行い、６８℃で１０分間伸長反応を行った。
マウスアグリカン（ｍＡｇｇｒｅｃａｎ）は、９５℃で３分初期熱変性を行った後、９５℃で１０秒、５４℃で１５秒、６８℃で３０秒を４０サイクル行い、６８℃で１０分間伸長反応を行った。
マウスＧＡＰＤＨは、９５℃で３分初期熱変性を行った後、９４℃で１０秒、５８℃で１５秒、６８℃で３０秒を２３サイクル行い、６８℃で１０分間伸長反応を行った。
なお、ｄａｙ１４のｍＣｏｌ  Ｘについては３７サイクルでデータを採取した。
ＰＣＲプライマー配列
2010038610.tif 000003
ＰＣＲ反応後得られたサンプルは、２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、エチジウムブロマイドを用いて、ＵＶ下で特異的なバンドが形成されていることを確認した（図３Ａ及び図４Ａ）。得られた画像は、ＣＳＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡＴＴＯ）を用いて解析した。また、ＧＡＰＤＨの発現量で標準化し、図３Ｂ及び図４Ｂに示した。
その結果、ペプチドＤ添加によりＡＴＤＣ５細胞において７日目にアグリカンの発現が増加し、ＩＩ型コラーゲンα鎖の発現が顕著に増加した（図３Ａ及びＢ）。また１４日目になるとペプチドＤ添加により特にＸ型コラーゲンの発現が増加した。（図４Ａ及びＢ）これらの結果は、ペプチドＤによりＡＴＤＣ５細胞において軟骨細胞分化に特有の遺伝子発現が上昇していることを示す。
【実施例４】
【０００９】
ＡＴＤＣ細胞を用いたＧｅｎｅＣｈｉｐ解析
試薬／培養細胞
実施例１に記載したペプチドを使用した。培養細胞は実施例２に記載したＡＴＤＣ５を使用した。
ＡＴＤＣ細胞を、１×１０５個／ウェルずつ６ｃｍ  ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ）に播種した。７２時間後に培養上清を除去し、１０ｎｇ／ｍＬインスリン（Ｒｏｃｈｅ）及び１０ｎｇ／ｍＬトランスフェリン（Ｒｏｃｈｅ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を添加した。３〜４日毎に培地を交換した。
同時に１００μＭの濃度でペプチドＤを添加した。分化誘導後４日目及び７日目において培地を除去し、ＰＢＳで細胞を洗浄後にａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＲＮＡ抽出を行った。このＲＮＡを用いてＧｅｎｅＣｈｉｐ解析（アフィメトリックス法：クラボウ）を行った。ペプチドＤ添加により発現が検定により有意に増加若しくは低下している各因子について、ペプチドＤ添加群のシグナル値を対照群のシグナル値で割った値を算出した。
その結果を図５に示した。軟骨の基質であるＩＩ、ＩＸ、ＸＩ型コラーゲンα鎖の発現が増加し、分化誘導に関与すると報告されているＣＴＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ１、ファイブロモデュリン等の因子や、それらの受容体であるＰＤＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２などの発現も増加していた。また軟骨細胞分化を誘導するＢＭＰ−７の発現が上昇していた。
さらに変形性関節症の悪化に関与していると報告のあったアスポリン、ＩＧＦｂｐ２、ＩＧＦｂｐ６やＡＤＡＭＴＳ５の発現がペプチドＤ添加により抑制されたことも確認できた。これらからペプチドＤ添加によりＡＴＤＣ細胞は軟骨細胞に分化していることが遺伝子発現からも確認できた。
【実施例５】
【００１０】
ＡＴＤＣ細胞を用いた抗体による細胞増殖活性
試薬／培養細胞
培養細胞は実施例２に記載したＡＴＤＣ５を使用した。抗体は抗ＲＡＮＫＬモノクローナル抗体ｍｍＢ（クローン１２Ａ６６８，サンタクルズ）、１−１２Ｈ（クローン１−１２Ｈ，オリエンタル酵母）、ｍｈ２（クローン７０５１３，Ｒ＆Ｄ）、ｓｃ５５（クローン４ｉ１６７，サンタクルズ）、ｓｃ７２（クローン５００−Ｍ４６，サンタクルズ）及びモノクローナル抗体ＦＬ３１７（サンタクルズ）を用いた。陽性対照として２ｘ１０−８ＭのＦＧＦ２（フィブラストスプレー，科研製薬）を用いた。
ＡＴＤＣ５細胞４ｘ１０３個を９６ウェルプレートに播種し、細胞が接着後に無血清培地に交換した。１６時間後に各抗体を５μｇ／ｍＬの濃度で添加し、７２時間後に１００μＬ当たり１０μＬのＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ）を添加し、３７℃でインキューベートしながら１〜４時間の間に経時的に４５０ｎｍでの吸光度（参照波長５９５ｎｍ）についてマイクロプレートリーダーを用いて測定した。
その結果、抗ＲＡＮＫＬポリクローナル抗体ＦＬ３１７、ＲＡＮＫＬモノクローナル抗体１−１２Ｈ、ｍｍＢおよびｍｈ２添加により、ＡＴＤＣ５の増殖活性が有意に上昇したことが明らかとなった（図６）。
【実施例６】
【００１１】
抗体による軟骨前駆細胞の分化誘導
試薬／培養細胞
培養細胞は実施例２に記載したＡＴＤＣ５を使用した。抗体は実施例４に記載のｍｍＢ抗体および抗ＲＡＮＫＬモノクローナル抗体ｍｍＣ（クローン１２Ａ３８０、ＡＬＥＸＩＳ）を用いた。
ＡＴＤＣ５細胞を、２×１０４個／ウェルずつ４８ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ）に播種した。７２時間後に培養上清を除去し、実施例４に記載した分化誘導培地に切換え、３〜４日毎に培地を交換した。同時に０．５μｇ／ｍＬの濃度でｍｍＢ抗体およびｍｍＣ抗体を添加し、１４日間培養を行った後、１０％ホルマリン中性緩衝液にて細胞の固定を行った。固定後、実施例２に記載の方法でアルシアンブルー染色を行い、ノジュール形成を観察した。
その結果を図７に示した。ｍｍＢ抗体添加により明らかにアルシアンブルー染色陽性細胞が増え、ノジュール形成が増加することが示された。以上から、ｍｍＢ抗体添加によりＡＴＤＣ５細胞の軟骨細胞への分化が促進したことが明らかとなった。
【実施例７】
【００１２】
ヒト間葉系幹細胞を用いた３次元培養
試薬／培養細胞
実施例１に記載したペプチドを使用した。ヒト間葉系幹細胞はＬｏｎｚａ社から購入した。専用の継代培地はＬｏｎｚａ社製品を使用した。
ヒト間葉系幹細胞の３次元培養
軟骨細胞を２次元で培養すると脱分化が起こることが知られている。より自然に近い軟骨細胞の培養系として、３次元培養という手法が採用されている。ヒト間葉系幹細胞を、２．５×１０５個ずつ１５ｍＬチューブ（ＴＰＰ製）に分注し、１０００ｒｐｍで４分間室温にて遠心を行った。上清を除去し、軟骨細胞分化誘導培地（Ｌｏｎｚａ）に１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β３（Ｒ＆Ｄ）を添加したもの０．５ｍＬに交換した。３〜４日毎に培地を交換した。同時に５０μＭおよび１５０μＭの濃度でペプチドＤを添加した（低用量および高用量ペプチドＤ群）。１４日目に培養を終了し、４％ＰＦＡ（Ｗａｋｏ）で固定後、顕微鏡下で写真撮影を行った（図８）。このペレットをパラフィン包埋後、標本を作製し、アルシアンブルー染色およびサフラニンＯ染色を行った（図９）。その結果を図８および９に示した。ペプチドを添加することにより、濃度依存的にペレットの大きさが増大することがわかった。またペプチド添加により増大した部分はアルシアンブルーやサフラニンＯ染色で陽性となっており、軟骨基質が産生されていることが確認された。３次元培養においてペレットの大きさを増大させたことから、より自然に近い軟骨を形成し、軟骨基質産生を増加させる能力をペプチドＤが有していることが示唆された。
次にペプチドＤとＴＧＦ−β３との相乗効果についても検討を行った。軟骨分化誘導培地を用いて、ヒト間葉系幹細胞２．５×１０５個に対し、４０μＭのペプチドＤおよび１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β３の共存下で培地交換を繰り返しながら、２１日間培養を行い、３次元ペレットを作製した。４％ＰＦＡ固定後に顕微鏡下で写真撮影を行い、ペレットの大きさを確認した（図１０）。さらにペレットをパラフィン包埋後、標本を作製し、アルシアンブルー染色およびサフラニンＯ染色を行った（図１１）。その結果を図１０および１１に示した。ＴＧＦ−β３単独ではペレットの大きさはコントロール群と比して変化はみられなかった。４０μＭのペプチドＤをＴＧＦ−β３と共に添加することにより、ペレット自体の大きさが増大していた。さらに軟骨特異的なアルシアンブルーやサフラニンＯ染色で強い陽性となっており、ＴＧＦ−β３とペプチドＤが軟骨細胞分化や軟骨基質が産生において相乗効果を示すことが確認された（図１１）。
さらにペプチドＤとＢＭＰ−２との相乗効果についても検討を行った。軟骨分化誘導培地を用いて、ヒト間葉系幹細胞２．５×１０５個に対し、４０μＭのペプチドＤおよび１００ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ）の共存下で培地交換を繰り返しながら、２１日間培養を行い、３次元ペレットを作製した。４％ＰＦＡ固定後に顕微鏡下で写真撮影を行い、ペレットの大きさを確認した（図１２）。さらにペレットをパラフィン包埋後、標本を作製し、アルシアンブルー染色およびサフラニンＯ染色を行った（図１３）。その結果を図１２および１３に示した。ＢＭＰ−２単独ではペレットの大きさは、コントロール群と比して変化がみられなかった。４０μＭのペプチドＤをＢＭＰ−２と共に添加した場合にも、ペプチドＤ単独で形成されたペレットの大きさと変わりはなかった（図１２）。しかしながら、ペレットの標本染色を観察した結果、ペプチドとＢＭＰ−２を共添加した群では、アルシアンブルーおよびサフラニンＯ陽性となっていた。ペレットの大きさには効果はみられないが、ＢＭＰ−２とペプチドＤが軟骨細胞分化や軟骨基質が産生において相乗効果を示すことが確認された。
【実施例８】
【００１３】
ヒト間葉系幹細胞を用いたＧｅｎｅＣｈｉｐ解析
試薬／培養細胞
実施例１に記載したペプチドを使用した。ヒト間葉系幹細胞はＬｏｎｚａ社から購入した。専用の継代培地はＬｏｎｚａ社製品を使用した。
ヒト間葉系幹細胞を、１×１０５個／ウェルずつ６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に播種し、９６時間後に培養上清を除去し、軟骨分化誘導培地を２ｍＬ添加した。コントロール群、４０μＭのペプチドＤを添加したペプチドＤ群、１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β３を添加したＴＧＦ−β３群、および４０μＭのペプチドＤおよび１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β３の共存培養を行った群（ペプチドＤ＋ＴＧＦβ３）の４群を用意した。培養後２４時間および９６時間で培地を除去し、ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１ｍＬに細胞を溶解させ、ＲＮＡ抽出を行った。このＲＮＡを用いてＧｅｎｅＣｈｉｐ解析（アフィメトリックス法：クラボウ）を行った。各因子の添加により発現が検定により有意に増加もしくは低下している各因子について、各因子添加群のシグナル値を対照群のシグナル値で割った値を算出した。
その結果を図１４に示した。
軟骨基質であるアグリカンの発現はペプチドＤ投与群によって２４時間後に上昇し、９６時間後にもその発現上昇は維持されていた。一方で、ＴＧＦβ３群ではアグリカンの発現は２４時間後の発現は対照群と同レベルであったが、９６時間後には対照群より発現が低下していた。ペプチドＤ＋ＴＧＦβ３群ではＴＧＦβ３による発現低下の影響を受けて、アグリカンの発現低下が示された。また、軟骨細胞分化に関与しているＳｏｘ９（ＳＲＹ（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ）−ｂｏｘ  ９）の発現は、２４時間および９６時間後において３群共に対照群に比して上昇していた。２４時間後にはＩＧＦ２Ｒおよびバーシカンの上昇が、さらに９６時間後にはＩＧＦ−１、ＬＴＢＰ２、及びＴＧＦβ１の発現上昇がペプチドＤ群で確認された。
なお、図１４中の略語については以下に記載した。
ＡＣＡＮ：ａｇｇｒｅｃａｎ
ＩＧＦ１：ｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １
ＬＴＢＰ２：ｌａｔｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２
ＳＯＸ９：ＳＲＹ（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ）−ｂｏｘ  ９
ＶＣＡＮ：ｖｅｒｃｉｃａｎ
【産業上の利用可能性】
【００１４】
実施例に示すように膜型ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ類似ペプチド、抗ＲＡＮＫＬ抗体、可溶型ＲＡＮＫ、ＯＰＧ及びそれらの変異体、類似物などのＲＡＮＫＬに作用する分子による膜型ＲＡＮＫＬへの作用により、軟骨前駆細胞及び間葉系幹細胞が軟骨細胞へ分化・増殖し、あるいは軟骨基質が増加する。
膜型ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ類似ペプチド、抗ＲＡＮＫＬ抗体、可溶型ＲＡＮＫ、ＯＰＧ及びそれらの変異体、類似物、さらに天然あるいは合成の低分子化合物などの軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用しそれらの細胞の分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こし、あるいは軟骨基質産生を増加させる化合物、例えばＲＡＮＫＬ作用分子により、軟骨細胞の分化・増殖が誘導されるので、上記化合物を軟骨疾患の予防又は治療のための医薬品として用いることができる。また、軟骨前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞に作用しそれらの細胞の分化、増殖、成熟を促進し、軟骨細胞分化を増強し、軟骨細胞の増殖を引き起こし、あるいは軟骨基質産生を増加させる化合物、例えばＲＡＮＫＬ作用分子をスクリーニングすることにより、新しい軟骨細胞分化・増殖誘導剤、軟骨基質産生増加剤を探索、開発することに利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００１５】
配列番号７  合成ペプチド
配列番号８〜１５  プライマー
配列番号１６、１７タグ配列
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
2010038610.tif 000004
2010038610.tif 000005
2010038610.tif 000006
2010038610.tif 000007
2010038610.tif 000008
2010038610.tif 000009
2010038610.tif 000010
2010038610.tif 000011
2010038610.tif 000012
2010038610.tif 000013
2010038610.tif 000014
2010038610.tif 000015
2010038610.tif 000016
2010038610.tif 000017
2010038610.tif 000018
2010038610.tif 000019
2010038610.tif 000020
2010038610.tif 000021
2010038610.tif 000022
2010038610.tif 000023
2010038610.tif 000024
2010038610.tif 000025
2010038610.tif 000026
2010038610.tif 000027
2010038610.tif 000028
【図１Ｂ】
2010038610.tif 000029
【図３Ｂ】
2010038610.tif 000030
【図４Ｂ】
2010038610.tif 000031
【図５】
2010038610.tif 000032
【図１４】
2010038610.tif 000033
【図１Ａ】
2010038610.tif 000034
【図２】
2010038610.tif 000035
【図３Ａ】
2010038610.tif 000036
【図４Ａ】
2010038610.tif 000037
【図６】
2010038610.tif 000038
【図７】
2010038610.tif 000039
【図８】
2010038610.tif 000040
【図９】
2010038610.tif 000041
【図１０】
2010038610.tif 000042
【図１１】
2010038610.tif 000043
【図１２】
2010038610.tif 000044
【図１３】
2010038610.tif 000045
【国際調査報告】
2010038610.tif 000046
2010038610.tif 000047
2010038610.tif 000048
2010038610.tif 000049
2010038610.tif 000050
2010038610.tif 000051
2010038610.tif 000052
2010038610.tif 000053
2010038610.tif 000054
2010038610.tif 000055
2010038610.tif 000056
2010038610.tif 000057