【事件の表示】
　特許第２７８００２０号「ヒトＴ細胞白血病ウイルス抗原及び該抗原を用いる検出方法」の第１及び第２発明に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２７８００２０号の特許請求の範囲に記載された第１及び第２発明についての特許を維持する。
【理　由】
１．手続きの経緯
　本件特許2,780,020号は、1984年4月13日付でなされた国際特許出願PCT/US84/00561（特願昭59-502043号、優先権主張1983年4月27日、ＵＳ）に係るものであり、平成10年5月15日に特許権の設定登録がなされたところ、安富康男から特許異議申立がなされ、その後、当審において取消理由が通知され、その期間に意見書と訂正請求書が提出された。次いで再度訂正拒絶理由を兼ねた取消理由が通知され、平成13年9月3日に意見書と共に新たな訂正請求がなされ、あわせて先の訂正請求が取り下げられものである。
　
２．訂正の適否についての判断
　上記訂正請求は、特許請求の範囲の減縮を目的として、特許請求の範囲第１項及び第６項を、それぞれ下記の通りに訂正することを求めるものであり、当該訂正は、願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内において特許請求の範囲の減縮に相当するものであって、特許請求の範囲を拡張又は変更するものでもないと認められる。
「１．約６１，０００ダルトンの分子量を有し、その４６，０００〜４８，０００ダルトンがその非グリコシル化成分の分子量である糖蛋白質若しくはその非グルコシル化蛋白質であり、該糖蛋白質がヒトＴ細胞白血病ウイルスに感染した細胞表面に存在することを特徴とする蛋白質。
６．ＨＴＬＶ感染細胞に対する抗体の存在の有無について生物学的試料を分析するに際し、該生物学的試料を、約６１，０００ダルトンの分子量を有し、その４６，０００〜４８，０００ダルトンがその非グリコシル化成分の分子量である糖蛋白質若しくはその非グルコシル化蛋白質であり、該糖蛋白質がヒトＴ細胞白血病ウイルスに感染した細胞表面に存在することを特徴とする蛋白質と共に培養し、前記試料と前記蛋白質またはポリペプチドとの間に免疫複合体が形成されるかどうかを判定する工程を含むことを特徴とする、生物学的試料の分析方法。」
　
　ところで、　訂正後の特許請求の範囲第１項及び第６項に記載される発明はいずれも前記優先権主張の基礎となる米国特許出願明細書（以下、優先明細書という。）に記載された範囲内のものであって当該優先権の主張を享受できるものであるから、もはや刊行物３〜５は本件出願前に頒布された刊行物とはいえず先の訂正拒絶理由は解消した。
  また、訂正後の特許請求の範囲第１項及び第６項に記載される発明は、刊行物２に記載されたgp46及びその断片についての発明を包含していないので刊行物２に記載された発明であるとも、刊行物２の記載事項から容易に想到できたものともいえない。そして、他に特許を受けることができない理由を発見しないから、本件特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
  したがって、前記訂正は適法なものであると認められる。
  　        
    　　　　　　　　　　     記
                   
刊行物２：癌と化学療法　１０（２）PART.II（1983年2月）pp.674-679（甲第２号証）                     
刊行物３：Virology　132,1-11(1984.1月）（甲第３号証）
刊行物４：LEUKEMIA  REVIEWS  INTERNATIONAL Vo.1(1983)p.46-47（1983年７月米国で開催されたSymposium　on　Comparative　Leukemia　Research予稿集、甲第１号証）
刊行物５：Int.J.Cancer　32,281-287(1983)（甲第７号証）
　
３．特許異議申立について
(a)本件発明：
　本件特許に係る発明の要旨は、前記特許明細書の訂正が認められることから、訂正明細書の特許請求の範囲第１項及び第６項に記載されたとおりのものと認められる。（以下、それぞれを本件第１発明及び本件第２発明という。）
　
(b)特許異議申立人の主張：
　特許異議申立人は、（イ）訂正前の特許請求の範囲第１項等に記載された「蛋白質またはポリペプチド」のうち(1)「分子量45〜52kdの糖蛋白質又はその非グリコシル化蛋白質」及び(2)「分子量65〜68kdの糖蛋白質又はその非グリコシル化蛋白質」については、前記優先明細書には記載されておらず国際出願時に明細書中に追加された事項であるから優先権主張が享受できないこと、また(3)「それらの断片で抗原性を有するもの」については平成10年1月22日付手続補正書での補正は出願当初の明細書の要旨を変更するものであって本件出願の出願日が同日に繰り下がることを指摘し、これらの点を前提として、訂正前の特許請求の範囲第１項及び第６項に記載された発明が甲第１〜３号証、甲第７号証（上記刊行物１〜４）もしくは本件特許出願の国際公開公報（WO84/04327）に記載された発明であるか、これらの記載事項に基づいて容易に想到できたものである旨主張すると共に、（ロ）上記(1)の蛋白質についてはたとえ優先権主張が享受できたとしても、甲第４号証（Z.Naturforsch.37c,731-732(1983)）に記載された発明であるか、甲第４号証の記載に基づいて当業者が容易に想到できたものである旨主張している。
　
(c)主張（イ）について：
　本件第１発明及び本件第２発明においては、(1)〜(3)の「蛋白質またはポリペプチド」をもはや包含していないから、優先権主張を享受できるものであり、出願当初の要旨を変更するものでもないから、その前提を失った。
  したがって、主張（イ）は採用できない。
　
(d)主張（ロ）について：
  (c)で述べたように、本件第１発明及び本件第２発明においては、(1)の蛋白質をもはや包含していないから、主張（ロ）も採用できない。
　
(e)まとめ：
　したがって、異議申立人の主張（イ）（ロ）はいずれも採用しない。
　
４．結語
　以上のとおりであるから、特許異議の申立て及び証拠によっては本件特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年９月１１日（２００１．９．１１）
【訂正の要旨】
（３）訂正の要旨
訂正事項１：
　本件特許請求の範囲第１項に
「１．１）６１，０００〜６８，０００ダルトンの分子量を有し、その４６，０００〜４８，０００ダルトンがその非グリコシル化成分の分子量である糖蛋白質若しくはその非グリコシル化蛋白質、または２）４５，０００〜５２，０００ダルトンの分子量を有する糖蛋白質若しくはその非グリコシル化蛋白質、またはそれらの断片で抗原性を有するものからなり、該糖蛋白質がヒトＴ細胞白血病ウイルスに感染したヒトＴ細胞の細胞表面に存在することを特徴とする蛋白質またはポリペプチド。」
とあるのを、特許請求の範囲の減縮を目的として、
「１．
約６１，０００
であり、
訂正事項２：
　特許請求の範囲第６項に
「６．ＨＴＬＶ感染細胞に対する抗体の存在の有無について生物学的試料を分析するに際し、該生物学的試料を、１）６１，０００〜６８，０００ダルトンの分子量を有し、その４６，０００〜４８，０００ダルトンがその非グリコシル化成分の分子量である糖蛋白質若しくはその非グリコシル化蛋白質、または２）４５，０００〜５２，０００ダルトンの分子量を有する糖蛋白質若しくはその非グリコシル化蛋白質、またはそれらの断片で抗原性を有するものからなり、該糖蛋白質がヒトＴ細胞白血病ウイルスに感染したヒトＴ細胞の細胞表面に存在することを特徴とする蛋白質またはポリペプチドと共に培養」前記試料と前記蛋白質またはポリペプチドとの間に免疫複合体が形成されるかどうかを判定する工程を含むことを特徴とする、生物学的試料の分析方法。」
とあるのを、同じく、特許請求の範囲の減縮を目的として、
「６．ＨＴＬＶ感染細胞に対する抗体の存在の有無について生物学的試料を分析するに際し、該生物学的試料を、約
６１，０００
であり、
と訂正する。
（５４）【発明の名称】
ヒトＴ細胞白血病ウイルス抗原及び該抗原を用いる検出方法
【発明の詳細な説明】
　本発明は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスに感染した細胞の細胞表面膜に見い出される糖蛋白質の新規な精製形態に関し、さらにこの糖蛋白質に存在する抗原決定基に対する抗体の存在を生物学的試料中で検出するための分析に関するものである。
　ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）は、特定種類のヒト白血病、すなわち成人におけるＴ細胞型と密接に関連することが知られている。さらに、人体がこのウイルスに対する抗体を有するヒトは全て、明らかにこのウイルスに潜在的に感染していることも示されている〔エセックス（Ｅｓｓｅｘ）、Ｊ．Ｎ．Ｃ．Ｉ．第６９巻、第９８１−５頁（１９８２）〕。このウイルスの主たるコア蛋白質が研究されかつ感染細胞に対する抗体の免疫螢光分析法が記載されており、この方法は、たとえばＭＴ１又はＭＴ２のような感染ヒト細胞の細胞系統からの細胞を固定し、これら固定された細胞と分析すべき試験血清とを接触させ、かつ細胞表面に対する血清の結合が、生じたかどうかをヒトＩｇＧに対する蛍光標識された抗体とその後に接触させることにより判定することからなっている〔ヒヌマ（Ｈｉｎｕｍａ）等、プロシーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス、第７８巻、第６４７６−６４８０号（１９８１）〕。この分析は面倒かつ使用困難である。何故なら、固定細胞の僅か１〜５％のみが、必要な抗原特性を示すに過ぎないからである。さらに、若干類似した細胞表面免疫螢光分析法を使用することも提案されており、この分析法においては培養感染細胞を試験血清と共に培養し、次いで蛍光標識されたヒトＩｇＧに対するウサギ抗体と共に培養して、細胞に対する血清の結合が生じたかどうかを決定する〔ロバート−グロフ（Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ）等、サイエンス、第２１５巻、第９７５−９７８頁（１９８２）〕。ＨＴＬＶの核蛋白質の２種であるｐ２４及びｐ１９に対する抗体の放射線免疫分析も記載されている〔ポスナー（Ｐｏｓｎｅｒ）等、ジャーナル・エキスペリメンタル・メソツド、第１５４巻、第３３３−３４４頁（１９８１）。しかしながら、この分析は、感染性ウイルスに露呈され、したがって危険状態にあるが、これら２種の抗原に対する検出可能なレベルの抗体を持たない全ての個人について陽性の結果を与えない。
発明の要点
　今回、ＨＴＬＶに感染したヒトＴ細胞の細胞表面に存在する特定のポリペプチド若しくは糖蛋白質は、精製しかつ単離すると、ＨＴＬＶに感染したヒト細胞、ヒトＴ細胞の白血病細胞及び（又は）ＨＴＬＶに対する抗体に対し高度の感受性と免疫特典性とを示す抗原決定基を有することが見い出された。したがって、これらのほぼ純粋な糖蛋白又はその非グリコシル化成分は、ＨＴＬＶにより感染されている細胞を有するかどうかを決定するため生物学的試料を分析する診断用具として有用である。免疫学的に交叉反応性の抗原決定基を有する他のポリペプチドも同じ目的に有用である。「免疫学的に交叉反応性の抗原決定基を有するポリペプチド」という表現は、所定の抗体が反応する抗原決定基を共通して有するポリペプチドを意味する。この種の他のポリペプチドは、糖蛋白質の非グリコシル化成分を含有する。必要な免疫学的決定基を有する他の有用なポリペプチド若しくは蛋白質は、合成ポリペプチドを包含する。さらに、これらは本発明の糖蛋白質における活性な決定基に対し抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）である抗体又はその断片をも包含する。近年、抗イディオタイプのモノクローナル抗体は、この抗イディオタイプ抗体におけると同じ又はほぼ同じ抗原決定基を有する感染性生物による感染に対し免疫応答を誘発し、かつこの感染に対し保護しうることが示された〔フイールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）等、ネイチヤー、第３００巻、第１９−２３頁（１９８２）；サツクス（Ｓａｃｋｓ）等、ジヤーナル・エキスペリメンタル・メソツド、第４巻、第１１０８−１１１９頁（１９８２）〕。さらに、抗イディオタイプの試薬は、抗体上の部位と免疫学的に交叉反応性の部位をもつた抗原を検出するための診断用具として有用であることも示されている〔ポトニヤツク（Ｐｏｔｏｃｎｊａｋ）等、サイエンス、第２１５巻、第１６３７−１６３９頁（１９８２）。これを参照するためにここに引用する〕。かくして、ＨＴＬＶの分析は、本発明の糖蛋白質における抗原部位と免疫学的に類似した抗原部位を有する抗イディオタイプの抗体、又はその免疫学上活性な断片を用いて行なうことができる。この種の抗イディオタイプ抗体は、本発明の糖蛋白質における抗原部位に対し特異性を有する第１の抗体に対し生ぜしめることができる（すなわち、抗イディオタイプ抗体は抗一抗体である）。好ましくは、モノクローナルの抗イディオタイプ抗体を使用する。
　ＨＴＬＶ感染の分析は、このウイルスが抗体陽性型のヒト末梢血液白血球から抗体陰性型のヒトの白血球へこれら２種の白血球を一緒に培養すると容易に移行し得るので重要である〔ポポビツク（Ｐｏｐｏｖｉｃ）等、サイエンス、第２１９巻、第８５６−８５９頁（１９８３）〕。したがって、輸血される血液が感染細胞を含有すれば、全血輸血には感染の危険が高いと思われる。さらに、この分析は、後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を示す個人からの生物学的試料がこの新規な糖蛋白質の抗原決定基に対する抗体に関し陽性の試験結果を与え、したがつてこの病気の診断を容易化させるので重要である。
　したがつて、さらに本発明は、ＨＴＬＶ感染細胞に対する抗体の存在に関する生物学的試料の分析方法をも包含し、この方法は前記試料を分子量約６１，０００〜６８，０００ダルトンの糖蛋白質、分子量約４６，０００−４８，０００ダルトンの非グリコシル化成分又は分子量約４５，０００〜５２，０００ダルトンの糖蛋白質（これら糖蛋白質はＨＴＬＶに感染した細胞の細胞表面に生ずる）と免疫学的に交叉反応性である抗原決定基を有するポリペプチドと共に培養し、かつ前記抗体と前記ポリペプチドとの間に免疫複合体が形成されるかどうかを判定することからなつている。
　さらに、本発明は、分子量６１，０００〜６８，０００ダルトン又は４５，０００〜５２，０００ダルトンの糖蛋白質の決定基と免疫学上交叉反応性である抗原決定基の存在につき生物学的試料を分析する方法をも包含する。分析すべき決定基は、上記糖蛋白質自身、或いは他のポリペプチドに生じうる。これらは、体液又はリンパ球において自由に循環することができる。この分析は、上記糖蛋白質に見い出される抗原決定基に対し、免疫反応性を有するモノクローナル又はポリクローナルな抗体を用いて公知の免疫分析法により行なうことができる。たとえば、競合免疫分析又はイムノメトリック（サンドイツチ）分析を使用することができる。
　本発明の糖蛋白質は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル電気泳動により測定して約６１，０００〜６８，０００ダルトン及び約４５，０００〜５２，０００ダルトンの分子量を有し、０．１５Ｍ塩化ナトリウムと、０．０５Ｍトリス塩酸塩（ｐＨ７．２）と、１％トリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウムと０．１％ドデシル硫酸ナトリウムとｌｍＭ弗化フエニルメチルスルホニルとよりなるＳＤＳ緩衝液に可溶性である。トリトンＸ−１００は非イオン性表面活性剤（オクチルフエノキシポリエトキシ（９−１０）エタノール）である。６１，０００〜６８，０００ダルトンの糖蛋白質の非グリコシル化成分は約４６，０００〜４８，０００ダルトンの分子量を有し、糖蛋白質自身とほぼ同じ抗原決定基を含有する。
　また、本発明において、抗原性を有する断片は、化学的分解（例えば、「Ｎｉｋｏｄｅｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９７（１９７９）ｐ．３８２−３８６」参照）若しくは酵素的分解（例えば「Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２（１９７７）Ｐ．１１０２−１１０６」参照）によってタンパク質を切断することによって得ることができる。
　この糖蛋白質はＨＴＬＶ感染細胞から得ることができる。ＨＴＬＶが永久的かつ持続的に感染した各種の細胞系統が調製されており、それらのうちＭＪ，Ｃ５−ＭＪ，Ｃ９１ＰＬ及びＨＵＴ−１０２を挙げることができる。恐らく、この新規な糖蛋白質の正確な寸法は種々異なる細胞系統において僅かに異なっているが、これら糖蛋白質の共通する免疫学的に交叉反応性の部分は細胞系統に関係なく同じである。何故なら、これはＨＴＬＶにより誘発された蛋白質であるからである。したがつて、ウイルスを有する任意の細胞を、この新規な糖蛋白質の適当な原料とすることができる。ウイルスを有する任意の感染細胞からこの蛋白質を得るには、細胞を代謝的に標識し（たとえば、３５Ｓ−メチオニンにより）かつＨＴＬＶ感染した患者から得られる抗体で免疫沈降させる。次いで、新規な糖蛋白質をゲル電気泳動により検出し、かつ単離することができる。本発明で使用される「ＨＴＬＶ」という用語は、このウイルスを総称的に包含することを意味する。したがつて、全ゆる形態、亜型又は変種のウイルスが包含される。
　たとえば、これら糖蛋白質は培養ヒトＴ細胞白血病細胞ＭＪ．Ｃ５−ＭＪ．Ｃ９１ＰＬ及びＨＵＴ−１０２の細胞表面に存在する。ＭＪ及びＣ５−ＭＪの試料は１９８３年４月２６日付けでアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンにそれぞれＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−８２９４及びＣＲＬ−８２９３として寄託されている。これら糖蛋白質は、これら細胞系統の細胞からその溶菌及びＳＤＳゲル電気泳動により容易に分離することができる。
　この精製されかつ単離された糖蛋白質或いはそれに対し免疫学的に交叉反応性の抗原は、これに対して特異的な抗体の生物学的試料中の存在を検出する任意の慣用の分析法において標準抗原として使用することが出来、それ故に、ＨＴＬＶに感染した細胞の試料中の存在及び（又は）ＡＩＤＳの徴候の存在を検出する任意の慣用分析法において標準抗原として使用することが出来る。この種のＨＴＬＶ抗原に対し特異的な抗体は、たとえばＨＴＬＶ感染を伴なわない肝炎のような病気に羅患した患者では見られない。
　この糖蛋白質又はそれと免疫学的に交叉反応性のポリペプチドは、常法によって放射線免疫分析に使用するために１２５Ｉ若しくは３５Ｓ若しくは３Ｈで標識することができ、或いは螢光免疫分析のためにフルオレセインで標識し、或いは酵素免疫分析法のために酵素で標識し、或いはビオチン−アビジン結合分析のためにビオチンで標識することができる。それは競合免疫分析並びに２種の抗体を使用する二重抗体分析において、所望に応じて標識したものでも或いは標識されないものでも使用することができ、様々なイディオタイプ：抗イディオタイプ、より詳細には抗−Ｆｃ抗体を使用する第２抗体型、或いは他の分析法のいずれで使用することもできる。
　代案として、この新規な糖蛋白質又はこれと免疫学的に交叉反応性のポリペプチドは、たとえば不溶性樹脂のような不溶相に固定化することができ、かつ抗−糖蛋白質抗体の検出をこの不溶相に対するその結合を測定して行なう。不溶相はさらにラテックス粒子をも包含する。これは新規な糖蛋白質又はその免疫学的に交叉反応性のポリペプチドで被覆し、かつ抗−糖蛋白質抗体に露呈すると凝固する。さらに他の不溶相は試験管、壜、滴定穴などをも包含し、これらに新規な糖蛋白質又はその免疫学的に交叉反応性のポリペプチドを結合させ、その抗体を二重抗体技術又は蛋白質−Ａ依存性技術により検出することができる。
　ＨＴＬＶに対する抗体の分析は、それぞれ分子量６１，０００−６８，０００ダルトン及び４６，０００−５２，０００ダルトンの糖蛋白質を粗製型で使用することができ、これら蛋白質を実質的に純粋な形態で使用することに限定されない。たとえば、この糖蛋白質は先ず最初に実質的に精製し、次いでこれらを混合することができる。或いは、粗製混合物を使用することもできる。１具体例において、ＨＴＬＶに対する抗体の存在に関する分析は、試料中の付加的抗体、たとえばＨＴＬＶコア蛋白質ｐ１９、ｐ２４又はこれら両者の混合物に対する抗体の検出を包含する。この具体例において、その方法は試料を１）本発明の一方若しくは両方の糖蛋白質（すなわち６１，０００〜６８，０００ダルトン及び（又は）４６，０００〜５２，０００ダルトン又はその免疫学的に交叉反応性のポリペプチド）と、必要に応じ２）ＨＴＬＶコア蛋白質ｐ２４若しくはｐ１９又はその両者とからなる試薬と共に培養し、かつ試料中の抗体とこの試薬との間で免疫複合体が形成されるかどうかを判定することからなつている。
　上記診断法を実施するのに必要な要素をキツトに組み入れることができる。この種のキットは、そこに１種若しくはそれ以上の容器を収容する分室化されたキャリヤを備え、前記容器のそれぞれは試験を実施するのに必要な１種若しくはそれ以上の要素を含む。
　たとえば、第１の容器は精製された糖蛋白質又はその免疫学的に交叉反応性のポリペプチドの一方若しくは両方を、検出可能に標識され或いは不溶化された形態で含有することができる。
　第２の容器は、二重抗体結合分析に有用な抗ＩｇＧ抗体（ポリクローナル若しくはモノクローナル）、すなわち糖蛋白質又はその免疫学的に交叉反応性のポリペプチドにおける標識の検出に必要とされる要素（たとえば発色性基質）を含むことができる。
　他の容器は、糖蛋白質又はその免疫学的に交叉反応性のポリペプチドの一つを種々異なる量で含み、これを使用して標準曲線を作成し、これに実験結果を内挿させることができる。これら材料自身は溶液、凍結乾燥状態で或いはたとえば不活性蛋白質などの他の不活性材料と混合してキット中に存在させることができる。
　試験する生物学的試料は血液、血清、リンパ球、尿、組織、唾液、大便などを包含する。特に興味のあるものは、血液がＨＴＬＶで汚染されていないことを確証するための血液銀行における血液のスクリーニングである。血液から得られる物質、たとえばワクチンのスクリーニングも本発明の方法で行なうことができる。
　以下、特定例により本発明をさらに充分説明するが、これらのみに限定されない。
例１
標識された糖蛋白質の作成
Ａ．　２種の細胞系統ＭＪ及びＣ５−ＭＪからのヒトＴ細胞白血病細胞を、別々に対数増殖期の際に収穫した。メチオニンを含まないマツコイの（ＭｃＣｏｙ′ｓ）５Ａ培地で１回洗浄した後、細胞の各試料をメチオニンを含有しないマツコイ５Ａと１０％リン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）と透析したウシ胎児血清と３５Ｓ−メチオニン１００μＣｉ／ｍｌとよりなる標識用培地に再懸濁させた。２〜４時間パルスラベルした後、放射線標識した細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞ペレットを０．６〜１．０ｍｌの冷溶菌緩衝液（ＲＩＰＡ）（０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５Ｍトリス−塩酸塩（ｐＨ７．２）、１％トリトンＸ−１００湿潤剤、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム及び１ｍＭ弗化フエニルメチルスルホニル）で溶菌させた。間けつ的に１０分間回転振動（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）させた後、混合物を４℃にて１００，００×ｇで１時間遠心分離した。溶菌物を上澄液から、蛋白質−Ａで被覆された炭水化物ビーズ（セフアロースＣＬ−４Ｂ）に対する４℃で１時間の吸収により非特異性結合成分を予備除去した。
Ｂ．　細胞表面蛋白質の標識は、ラクトペルオキシダーゼで触媒される放射性沃素化により行なう。９９％より大きい生存性を有する各細胞系統につき５×１０６個の細胞よりなる３つのアリコートを、それぞれ別々に１ｍＣｉのキヤリアを別含有しないＮａ１２５Ｉにより５０μｌのキヤリア支持されたラクトペルオキシダーゼとグリコシダーゼ（エンチモビーズ、ビオーラド・ラボラトリーズ社）及び２５μｌの１％β−Ｄ−グルコースとの存在下で沃素化させた。反応が終了した後、沃素化細胞の前記３つのアリコートを集めて、上記（Ａ）に記載したと同じ溶菌及び予備除去法にかけた。
Ｃ．　対数増殖期のピークにおけるＭＪ及びＣ５−ＭＪ細胞を別々に回収し、次いで１ｍｇ／ｍｌのピルビン酸ナトリウムが補充されたグルコースを含有しないＲＰＭＩ−１６４０培地に２時間再懸濁した。このグルコース飢餓の後、これら細胞を１００μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−グルコサミン（ニュー・イングランド・ヌクレア社）で５〜６時間標識した。この方法により、細胞中に存在する糖蛋白質のみのトリチウム標識が得られた。次いで、これらの標識細胞を上記（Ａ）に記載したと同じ溶菌及び予備除去処理にかけた。
糖蛋白質の標識非グリコシル化成分の作成
Ｄ．　対数増殖期のピークにおけるＭＪ及びＣ５−ＭＪ細胞を別々に収穫し、かつ１０％ウシ胎児血清と、１％抗生物質−抗菌物質混合物と、２０μｇ／ｍｌのツニカマイシンとが補充されたマツコイ５Ａ培地に２時間再懸濁させた。このトリミング工程の後、細胞を２０μｇ／ｍｌのツニカマイシンの存在下に１００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンで２瞬間標識した。この標識した材料を、次いで上記（Ａ）で記載したと同じ溶菌及び予備除去処理をかけた。
蛋白質−抗体複合体の形成
Ｅ．　蛋白質−Ａで被覆されたビーズの各アリコートに、（ａ）ＨＴＬＶに感染した細胞に対する抗体を有することが知られた個人の陽性比較血清と、（ｂ）感染していない個人からの陰性比較血清と、（ｃ）試験すべき未知の個人から得られた血清とを結合させた。次いで、被覆ビーズの各アリコートを上記（Ａ）からのＭＪ及びＣ５−ＭＪから得られた各予備除去溶菌物のアリコートと４℃にて１〜２時間反応させて、結合溶菌蛋白質と血清中に存在する抗体との間で複合体形成又は免疫沈降を生ぜしめた。反応終了後、これらビーズを緩衝液（ＲＩＰＡ）で４回及び０．０５Ｍトリス−塩酸塩ｐＨ７．２と０．１５Ｍ塩化ナトリウムとを含有する緩衝液で１回洗浄して、複合体化していない溶菌蛋白質を除去した。
　次いで、これらビーズを試料緩衝液（０．１Ｍクレランド試薬、２％ドデシル硫酸ナトリウム、０．０８Ｍトリス塩酸塩ｐＨ６．８、１０％グリセリン及び０．２％プロムフエノールブルー）中に浸漬し、かつ１００℃で２分間沸とうさせて蛋白質をビーズから溶出させると共に、複合体を解離させた。
蛋白質の特性化
Ｆ．　上記手順（Ａ）からの各試料を電気泳動により分析し、この蛋白質を３．５％の層ゲルを有する１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにてレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝系を用いて分離した。同時に平行させたカラムで分子量マーカーを泳動した。使用したマーカーは、１４Ｃマーカーされたホスホリラーゼｂ（９２，５００）と、牛血清アルブミン（６８，０００）と、オバブミン（４６，０００）と、カルボニックアンヒドラーゼ（３０，０００）と、チトクロームＣ（１２，０００）とを包含していた。フルオログラフィーにより可視化するため、これらのゲルを先ず１０％酢酸、１０％トリクロル酢酸及び３０％メタノールで１時間固定し、次いでエンハンサー（Ｅｎｈａｎｃｅｒ）溶液に１時間浸漬した。蒸留水で洗浄しかつ減圧乾燥した後、これらゲルをコダックＳＢ−５フイルムに露出させて、オートラジオグラフを作成した。
　精製されかつ単離された６１，０００〜６８，０００ダルトンの分子量を有する糖蛋白質及び４５，０００〜５２，０００ダルトンの分子量を有する糖蛋白質のスポットが全ての血清（ａ）のカラムに顕著に出現したが、血清（ｂ）のカラムには出現しなかった。これに対し、コア蛋白質ｐ１９及びｐ２４は、全ての血清（ａ）の試料に出現しなかった。未知の血清（ｃ）における糖蛍白質の出現は、ＨＴＬＶに感染した細胞の血清における存在を示した。ＡＩＤＳを示す個人からの血清も、この方法で６１，０００〜６８，０００ＭＷの糖蛋白質に対する抗体の顕著な証拠を示した。
　上記Ａにおける標識糖蛋白質の代りに上記Ｂ又はＣの糖蛋白質のいずれかを用いても同様な結果が得られた。さらに、この代りの上記Ｄにおける標識非グリコシル化成分を使用することもでき、この場合は精製されかつ単離された標識成分が、分子量４６，０００〜４８，０００に対応する位置においてゲルカラムに出現した。標識されていない糖蛋白質及び標識されていない非グリコシル化成分は、上記手順において標識工程を省略することにより得られる。
　ＭＪ又はＣ５−ＭＪの代りに細胞系統Ｃ９１ＰＬ又はＨＵＴ−１０２を用いて同様な結果が得られた。
　アミノ酸配列分析。〔３５Ｓ〕システイン標識された分子量約６１，０００ダルトン及び４５，０００〜４６，０００ダルトンをそれぞれ有する糖蛋白質を、５ｍＣｉの〔３５Ｓ〕システイン（比活性１０１１．２Ｃｉ／ｍＭ、ニュー・イングランド・ヌクレア社）で代謝的に標識された３６×１０６個のＨＵＴ１０２細胞から、１５％ウシ胎児血清（グランド・アイランド・バイオロジカル・カンパニー社）を含有する３０ｍｌのシステインを含有しないＲＰＭＩ−１６４０培地において１０時間にわたり沈殿させた。２種の糖蛋白質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルから切出し、次いで個々に０．０１％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する５０ｍＭトリス酢酸塩ｐＨ７．８緩衝液の存在下で１２−１６時間にわたり電気泳動溶出にかけた。これら試料を０．００２％のドデシル硫酸ナトリウムを含有する重炭酸アンモニウム緩衝液１０ｍＭにて１２−１６時間にわたり１回透析した。さらに、ドデシル硫酸ナトリウムを含有しない１０ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液により１２−１６時間にわたって、さらに１回透析を行なった。次いで、各試料を凍結乾燥させ、そしてアミノ酸配列分析をコリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）等によりジヤーナル・イミユーノロジカル・メソツド、第４７巻、第１−１１頁（１９８１）及びメソッド・エンチモロジー、第９１巻、第４１３−４３４頁（１９８３）に記載された方法により行なった。要約すれば、放射線標識したペプチドの自動化エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解を、改変冷トラツプと０．１Ｍクアドロール（Ｑｕａｄｒｏｌ）プログラム１２１０７８とを備えたベツクマン８９０Ｃ型配列決定装置を用いて行なった。各配列決定段階からの塩化ブチル抽出物を、７．０ｍｌのシンチレーシヨン小壜においてＮ２蒸発を恥いて乾燥させた。ビオフルオール（Ｂｉｏｆｌｕｏｒ）（ＮＥＮ）を添加した後、ベツクマンＬＳ９０８０型液体シンチレーシヨンカウンターにより放射能を測定した。〔３５Ｓ〕ピークが残基６、７、２１及び２８に見られ、これは６１，０００〜６８，０００ダルトンの糖蛋白質の蛋白質配列におけるこれらの位置にシステインが存在することを示す。この配列の再現性は８８％であり、これは全ての残基が同じ配列中にあることを示している。位置４および１３における小さいピークは、恐らく少量（５％未満）の汚染性の蛋白質からのものと思われる。これらの結果は、６１，０００〜６８，０００ｍｗの糖蛋白質が少なくとも部分的にＨＴＬＶのｅｎｖ遺伝子によりコードされ、かつｅｎｖ遺伝子のリーダー配列が２０個の残基よりなっていることを示す。
　〔３５Ｓ〕システイン標識された約６７，０００ダルトン及び５０，０００〜５２，０００ダルトンの分子量をそれぞれ有する糖蛋白質につき同様な分析を行なった。最初の２２個のＮＨ２末端残基を分解した際、位置６、７及び２１にシステイン残基が検出された。このことは、この糖蛋白質も少なくとも部分的にｅｎｖ遺伝子の同じＮＨ２−末端によりコードされることを示している。
（５７）【特許請求の範囲】
１．
約６１，０００
であり、
２．検出可能に標識された請求の範囲１記載の蛋白質。
３．標識が放射線標識、蛍光標識、酵素標識又はビオチン標識よりなる群から選択される請求の範囲１記載の蛋白質。
４．不溶相に結合された請求の範囲１記載の蛋白質。
５．不溶相がラテックス粒子又は不溶性樹脂である請求の範囲４記載の蛋白質。
６．ＨＴＬＶ感染細胞に対する抗体の存在の有無について生物学的試料を分析するに際し、該生物学的試料を、
約６１，０００
であり、
７．蛋白質を標識する工程を含む請求の範囲６記載の方法。
８．標識が、放射線標識、蛍光標識、酵素標識又はビオチン標識よりなる群から選択される請求の範囲７記載の分析方法。
９．ラテックス粒子凝固分析である請求の範囲６記載の方法。
１０．二重抗体免疫分析である請求の範囲６記載の方法。