(57)【要約】本発明は、特異的プロモーターの転写活性を上昇させ、標的遺伝子の特異的発現を増大させるシステムの提供を目的とし、本発明は、特異的プロモーターの下流にＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ、ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及びＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡがこの順で融合したＤＮＡを連結した第１の発現カセットであって、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）とポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）が挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）と転写活性化ドメインの融合タンパク質である転写因子を発現し得る第１の発現カセット、並びに前記転写因子に応答性であり、ＧＡＬ４結合部位を含む誘導性プロモーター（ＧＡＬ４／ＴＡＴＡ）の下流に標的遺伝子を連結した第２の発現カセットを含む、前記特異的プロモーターの転写活性を上昇させるためのシステムである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的プロモーターの下流にＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ、ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及びＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡがこの順で融合したＤＮＡを連結した第１の発現カセットであって、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）とポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）が挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）と転写活性化ドメインの融合タンパク質である転写因子を発現し得る第１の発現カセット、並びに前記転写因子に応答性であり、ＧＡＬ４結合部位を含む誘導性プロモーター（ＧＡＬ４／ＴＡＴＡ）の下流に標的遺伝子を連結した第２の発現カセットを含む、前記特異的プロモーターの転写活性を上昇させるためのシステム。
【請求項２】
第１の発現カセットの下流に第２の発現カセットが１つのＤＮＡ構築物中に連結されている、請求項１記載のシステム。
【請求項３】
第１の発現カセットと第２の発現カセットを異なるＤＮＡ構築物として含む、請求項１記載のシステム。
【請求項４】
特異的プロモーターが、ＮｋＸ２．５  プロモーター、ＧＡＴＡ４プロモーター、ＭＬＣ（ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）２ｖ  プロモーター、ｃａｒｄｉａｃ  ａｎｋｉｒｉｎ  ｒｅｐｅａｔ  プロモーター、ＡＮＦ  プロモーター、ＢＮＰ（ｂｒａｉｎ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）プロモーター、ＡＮＰ（ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）プロモーター、ｓｙｎａｐｓｉｎ  １プロモーター、ｔｕｂｕｌｉｎ  α１プロモーター、ＳＣＧ１０  プロモーター、ＧＦＡＰ  プロモーター、
ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ  プロモーター、ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅプロモーター、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ（ＰＤＧＦ−β）ｃｈａｉｎプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモーター、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーター、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）プロモーター及びチロシナーゼプロモーターからなる群から選択される組織特異的又は腫瘍特異的プロモータである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５】
標的遺伝子がレポーター遺伝子又は疾患の治療に用い得る治療用遺伝子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６】
治療用遺伝子が腫瘍の治療に用い得る癌抑制遺伝子である請求項５記載のシステム。
【請求項７】
癌抑制遺伝子がＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子である、請求項６記載のシステム。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のシステムを保持したベクター。
【請求項９】
アデノ随伴ウイルスベクターである請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
外殻に標的細胞特異的結合ペプチドが挿入され、該標的細胞特異的結合ペプチドを発現する細胞に対する指向性を有する外殻改変ウイルスベクターである、請求項９記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項１１】
標的細胞特異的結合ペプチドがＲＧＤ、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号３６）、ＮＧＲ、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３７）、ＣＬＳＳＲＬＤＡＣ（配列番号４０）、ＣＮＳＲＬＨＬＲＣ（配列番号４１）、ＣＥＮＷＷＧＤＶＣ（配列番号４２）、ＷＲＣＶＬＲＥＧＰＡＧＧＣＡＷＦＮＲＨＲＬ（配列番号４３）、ＣＬＰＶＡＳＣ（配列番号４４）、ＣＧＡＲＥＭＣ（配列番号４５）、ＣＫＳＴＨＤＲＬＣ（配列番号４６）、ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号４７）、ＡＰＲＰＧ（配列番号４８）、ＫＱＡＧＤＶ（配列番号４９）、ＬＤＶ、ＫＲＬＤＧＳ（配列番号５０）及びＤＧＥＡ（配列番号５１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか１項に記載のベクターを含む疾患検出又は治療用製剤。
【請求項１３】
治療用遺伝子がＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子であり、標的細胞特異的結合ペプチドが、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号３６）で現されるアミノ酸配列を有する、請求項１２記載の腫瘍治療用製剤。
【請求項１４】
ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ、ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及びＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡがこの順で融合したＤＮＡからなる転写因子をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。
【請求項１５】
配列番号２２で表される配列からなるＤＮＡを含む、請求項１４記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１６】
特異的プロモーターの下流にＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ、ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及びＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡがこの順で融合したＤＮＡを連結した第１の発現カセットであって、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）とポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）が挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）と転写活性化ドメインの融合タンパク質である転写因子を発現し得る第１の発現カセット、並びに前記転写因子に応答性であり、ＧＡＬ４結合部位を含む誘導性プロモーター（ＧＡＬ４／ＴＡＴＡ）の下流に標的遺伝子を連結した第２の発現カセットを上記特異的プロモーターが活性である細胞に導入することにより、特異的プロモーターの活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで上昇させる方法。
【請求項１７】
特異的プロモーターが、ＮｋＸ２．５  プロモーター、ＧＡＴＡ４プロモーター、ＭＬＣ（ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）２ｖ  プロモーター、ｃａｒｄｉａｃ  ａｎｋｉｒｉｎ  ｒｅｐｅａｔ  プロモーター、ＡＮＦ  プロモーター、ＢＮＰ（ｂｒａｉｎ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）プロモーター、ＡＮＰ（ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）プロモーター、ｓｙｎａｐｓｉｎ  １プロモーター、ｔｕｂｕｌｉｎ  α１プロモーター、ＳＣＧ１０  プロモーター、ＧＦＡＰ  プロモーター、ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ  プロモーター、ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅプロモーター、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ（ＰＤＧＦ−β）ｃｈａｉｎプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモーター、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーター、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）プロモーター及びチロシナーゼプロモーターからなる群から選択される組織特異的又は腫瘍特異的プロモーターである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
標的遺伝子がレポーター遺伝子又は疾患の治療に用い得る治療用遺伝子である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
治療用遺伝子が腫瘍の治療に用い得る癌抑制遺伝子である請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍等の疾患の検出、治療に関する。本発明は特に特異的プロモーターの転写活性を特定の組織、細胞で特異的に上昇させ得るシステムを利用した疾患の検出、治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の遺伝子治療はレトロウイルスやアデノウイルス、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ）を中心とする遺伝子治療用ベクターが使用されてきた。そして投与対象の組織及び癌特異的に遺伝子を発現させるために組織又は癌特異的プロモーターが用いられてきたが、プロモーター活性が低く十分な遺伝子発現及び治療効果が達成できない欠点があった。
組織又は癌特異的遺伝子発現に関しては特異的プロモーターが使用されているが、その活性の弱さが大きな問題となっている。組織特異性を保ちつつプロモーター活性を上昇させる手段としてＧＡＬ４−ＶＰ１６融合蛋白を用いたｔｗｏ  ｓｔｅｐ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｙｓｔｅｍ（ＴＳＴＡ）があり（特許文献１及び２並びに非特許文献１〜３を参照）、近年その有用性がｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇや治療において検討されている。しかし、癌細胞に関してはアンドロゲン反応性をもつプロモーターを用いてアンドロゲン依存性前立腺癌（ＬＮＣａｐ細胞）において検討しているのみであり、腫瘍全般に有効性のあるものではなく、その汎用性は低いと判断される。
レトロウイルスによるヒトへのＸ−ＳＣＩＤ遺伝子治療（幹細胞を用いたｅｘ  ｖｉｖｏ治療）では白血病を誘発し、アデノウイルスによるヒトへのオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）遺伝子治療では、アデノウイルスベクターを肝静脈に注入し肝細胞で遺伝子発現をさせるものであったが、重篤な肝不全を引き起こし死亡者が出るという問題があった。レトロウイルスに関しては遺伝子翻訳開始領域にＤＮＡ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎを起してしまい、ｏｎｃｏｇｅｎｅ（ＬＭＯ２）を活性化してしまうことが原因となり白血病が発症したと考えられている。アデノウイルスにおいては投与直後の非特異的免疫活性（ＩＬ−６やＩＬ−８）及びウイルス蛋白（一部導入遺伝子蛋白）に対する細胞性・液性免疫の活性化が肝不全を引き起こしたことが報告されている。これらの方法を解決するためにはＤＮＡ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎが少ない、そして免疫原性の弱いウイルスベクターを用いた遺伝子導入が望ましく、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ；ＡＡＶ）がそのようなウイルスベクターである。一方、腫瘍の局所内投与は対象患者に大きな侵襲を与えるものであり、非侵襲的な遺伝子ベクター投与法つまり血管内投与が可能でなくてはならない。そのためには血管内投与後、腫瘍のみに治療用ベクターが導入され且つ腫瘍細胞のみで遺伝子発現が起こるように感染向性・遺伝子発現が制御する必要があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００５−５０２６４５号公報
【特許文献２】特表２００７−５３５３１５号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｉｙｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００１  Ｄｅｃ  ４；９８（２５）：１４５９５−６００
【非特許文献２】Ｉｙｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００４  Ｓｅｐ；１０（３）：５４５−５２．
【非特許文献３】Ｉｌａｇａｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６  Ｎｏｖ  １５；６６（２２）：１０７７８−８５．
【発明の概要】
【０００５】
組織や腫瘍特異的である特異的プロモーターの転写活性を上昇させ、標的遺伝子の特異的発現を増大させるシステムの提供並びに上記システムを保持した、診断又は治療用ウイルス製剤の提供を目的とする。
本発明者は、上記の遺伝子治療に関わる問題点を克服すべく、新たなシステムの開発について鋭意検討を行った。本発明者は、プロモーターの活性を上昇させるシステムであるＴＳＴＡシステムにおいて、プロモーターとして組織や腫瘍に異的な特異的プロモーターを用い、さらに、転写活性化因子をコードするＤＮＡとして、酵母の転写活性化因子であるＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）をコードするＤＮＡ、ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたラットグルココルチコイドレセプター（Ｒａｔ  ＧＲ）をコードするＤＮＡ及びＨＳＶ１（単純ヘルペスウイルス）の転写制御因子であるＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡがこの順で融合したＤＮＡを用いたところ、特異的プロモーターの転写活性が飛躍的に高まり、標的遺伝子の発現量が増大することを見出し、改良型ＴＳＴＡシステムの開発に成功した。
さらに、上記の改良型ＴＳＴＡシステムをアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに組込み、アデノ随伴ウイルスの外殻に標的特異的ペプチドを挿入することにより、該標的特異的ペプチドと上記の改良型ＴＳＴＡシステムの作用で、ウイルスベクターを特定の組織、細胞へデリバリーし感染させ、該細胞中で特異的にプロモーターの活性を上昇させ、診断又は治療用標的遺伝子の発現を増大させ得ることを見出した。標的特異的ペプチドとして腫瘍細胞特異的ペプチドを用い、特異的プロモーターとして腫瘍特異的プロモーターを用いた場合、ＡＡＶベクターは腫瘍のみに導入され、かつ腫瘍細胞のみで遺伝子発現が制御された。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  特異的プロモーターの下流にＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ、ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及びＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡがこの順で融合したＤＮＡを連結した第１の発現カセットであって、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）とポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）が挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）と転写活性化ドメインの融合タンパク質である転写因子を発現し得る第１の発現カセット、並びに前記転写因子に応答性であり、ＧＡＬ４結合部位を含む誘導性プロモーター（ＧＡＬ４／ＴＡＴＡ）の下流に標的遺伝子を連結した第２の発現カセットを含む、前記特異的プロモーターの転写活性を上昇させるためのシステム。
［２］  第１の発現カセットの下流に第２の発現カセットが１つのＤＮＡ構築物中に連結されている、［１］のシステム。
［３］  第１の発現カセットと第２の発現カセットを異なるＤＮＡ構築物として含む、［１］のシステム。
［４］  特異的プロモーターが、ＮｋＸ２．５  プロモーター、ＧＡＴＡ４プロモーター、ＭＬＣ（ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）２ｖ  プロモーター、ｃａｒｄｉａｃ  ａｎｋｉｒｉｎ  ｒｅｐｅａｔ  プロモーター、ＡＮＦ  プロモーター、ＢＮＰ（ｂｒａｉｎ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）プロモーター、ＡＮＰ（ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）プロモーター、ｓｙｎａｐｓｉｎ  １プロモーター、ｔｕｂｕｌｉｎ  α１プロモーター、ＳＣＧ１０  プロモーター、ＧＦＡＰ  プロモーター、ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ  プロモーター、ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅ  プロモーター、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ（ＰＤＧＦ−β）ｃｈａｉｎプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモーター、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーター、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）プロモーター及びチロシナーゼプロモーターからなる群から選択される組織特異的又は腫瘍特異的プロモーターである、［１］〜［３］のいずれかのシステム。
［５］  標的遺伝子がレポーター遺伝子又は疾患の治療に用い得る治療用遺伝子である、［１］〜［４］のいずれかのシステム。
［６］  治療用遺伝子が腫瘍の治療に用い得る癌抑制遺伝子である［５］のシステム。
［７］  癌抑制遺伝子がＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子である、［６］のシステム。
［８］  ［１］〜［７］のいずれかのシステムを保持したベクター。
［９］  アデノ随伴ウイルスベクターである［８］のベクター。
［１０］  外殻に標的細胞特異的結合ペプチドが挿入され、該標的細胞特異的結合ペプチドを発現する細胞に対する指向性を有する外殻改変ウイルスベクターである、［９］のアデノ随伴ウイルスベクター。
［１１］  標的細胞特異的結合ペプチドがＲＧＤ、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号３６）、ＮＧＲ、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３７）、ＣＬＳＳＲＬＤＡＣ（配列番号４０）、ＣＮＳＲＬＨＬＲＣ（配列番号４１）、ＣＥＮＷＷＧＤＶＣ（配列番号４２）、ＷＲＣＶＬＲＥＧＰＡＧＧＣＡＷＦＮＲＨＲＬ（配列番号４３）、ＣＬＰＶＡＳＣ（配列番号４４）、ＣＧＡＲＥＭＣ（配列番号４５）、ＣＫＳＴＨＤＲＬＣ（配列番号４６）、ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号４７）、ＡＰＲＰＧ（配列番号４８）、ＫＱＡＧＤＶ（配列番号４９）、ＬＤＶ、ＫＲＬＤＧＳ（配列番号５０）及びＤＧＥＡ（配列番号５１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、［１０］のアデノ随伴ウイルスベクター。
［１２］  ［７］〜［１１］のいずれかのベクターを含む疾患検出又は治療用製剤。
［１３］  治療用遺伝子がＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子であり、標的細胞特異的結合ペプチドが、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号３６）で現されるアミノ酸配列を有する、［１２］の腫瘍治療用製剤。
［１４］  ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ、ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及びＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡがこの順で融合したＤＮＡからなる転写因子をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。
［１５］  配列番号２２で表される配列からなるＤＮＡを含む、［１４］のＤＮＡ構築物。
［１６］  特異的プロモーターの下流にＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ、ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及びＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡがこの順で融合したＤＮＡを連結した第１の発現カセットであって、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）とポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）が挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）と転写活性化ドメインの融合タンパク質である転写因子を発現し得る第１の発現カセット、並びに前記転写因子に応答性であり、ＧＡＬ４結合部位を含む誘導性プロモーター（ＧＡＬ４／ＴＡＴＡ）の下流に標的遺伝子を連結した第２の発現カセットを上記特異的プロモーターが活性である細胞に導入することにより、特異的プロモーターの活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで上昇させる方法。
［１７］  特異的プロモーターが、ＮｋＸ２．５  プロモーター、ＧＡＴＡ４プロモーター、ＭＬＣ（ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）２ｖ  プロモーター、ｃａｒｄｉａｃ  ａｎｋｉｒｉｎ  ｒｅｐｅａｔ  プロモーター、ＡＮＦ  プロモーター、ＢＮＰ（ｂｒａｉｎ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）プロモーター、ＡＮＰ（ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）プロモーター、ｓｙｎａｐｓｉｎ  １プロモーター、ｔｕｂｕｌｉｎ  α１プロモーター、ＳＣＧ１０  プロモーター、ＧＦＡＰ  プロモーター、ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ  プロモーター、ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅプロモーター、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ（ＰＤＧＦ−β）ｃｈａｉｎプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモーター、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーター、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）プロモーター及びチロシナーゼプロモーターからなる群から選択される組織特異的又は腫瘍特異的プロモーターである、［１６］の方法。
［１８］  標的遺伝子がレポーター遺伝子又は疾患の治療に用い得る治療用遺伝子である、［１６］又は［１７］の方法。
［１９］  治療用遺伝子が腫瘍の治療に用い得る癌抑制遺伝子である［１８］の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００９−８２３５８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、本発明の改良型ＴＳＴＡシステムの概要を示す図である。図１Ａは従来のｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｅｐ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍに用いる構築物の構造を、図１Ｂは従来のｔｗｏ  ｓｔｅｐ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍに用いる構築物の構造を、図１Ｃに本発明の改良型ｔｗｏ  ｓｔｅｐ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍに用いる構築物の構造を示す。
図２は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターの構造を示す図である。図２Ａは特異的プロモーターとしてｈＴＥＲＴを含み特異的遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターに導入したＤＮＡ構築物である発現カセット（ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃ）の構造図を示し、図２Ｂが特異的プロモーターとしてｈＴＥＲＴを含み特異的遺伝子としてヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターに導入したＤＮＡ構築物である発現カセット（ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ｈＲＥＩＣ）の構造図を示す。図２Ａの発現カセットの用途は全身の（微小）癌診断・モニター用ウイルス製剤であり、図２Ｂの発現カセットの用途は全身の（微小）癌治療用ウイルス製剤である。
図３は、本発明の発現カセットであるＤＮＡ構築物及びアデノ随伴ウイルスベクターの製造工程を示す図である。
図４は、本発明の発現カセットであるＤＮＡ構築物及びアデノ随伴ウイルスベクターの製造において用いたプライマー配列を示す図である。
図５は、本発明の改良型ＴＳＴＡシステムを用いときの癌細胞におけるプロモータ活性の上昇を示す図である。
図６は、本発明の改良型ＴＳＴＡシステムを用いたときの癌細胞における標的遺伝子の発現の上昇を示す図である。図６Ａは各種癌細胞の結果を示し、図６ＢはＬＮＣａＰ細胞のグラフを拡大したものを示す。
図７は、アデノ随伴ウイルスの外殻への標的特異的ペプチドの挿入方法を示す図である。
図８は、外殻へ標的特異的ペプチドを挿入したアデノ随伴ウイルスベクターの腫瘍細胞への導入効率を示す図である。図８ＡはＨＵＶＥＣの結果を、図８ＢはＳＫＯＶ−３の結果を、図８ＣはＫ５６２の結果を示す。
図９は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃ）を用いた、同所性肝臓癌モデルマウスにおける原発巣の検出の結果を示す図である。図９Ａに検討のスケジュールの概要及びＩＶＩＳ像を示し、図９Ｂに腫瘍塊の写真を示す。
図１０は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣ）を用いた、同所性肝臓癌モデルマウスにおける肝臓癌治療スケジュールを示す図である。
図１１は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣ）を用いた、同所性肝臓癌モデルマウスにおける肝臓癌治療効果を示す図である。図１１ＡにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＡＦＰを投与した群（コントロール群）におけるＩＶＩＳシグナル及び組織Ｔｕｎｎｅｌの結果（ｄａｙ３０）を示し、図１１ＢにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣを投与した群におけるＩＶＩＳシグナル及び組織Ｔｕｎｎｅｌの結果（ｄａｙ３０）を示す。
図１２は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃ）を用いた、腎臓癌血行性肺転移モデルマウスにおける転移巣の検出スケジュールを示す図である。
図１３は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃ）を用いた、腎臓癌血行性肺転移モデルマウスにおける転移巣の検出の結果を示す図である。図１３Ａにコントロール群におけるＩＶＩＳシグナル及びマクロ病理の観察結果（ｄａｙ３０）を示し、図１３ＢにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃを投与した群におけるＩＶＩＳシグナル及びマクロ病理の観察結果（ｄａｙ３０）を示す。
図１４は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣ）を用いた、腎臓癌血行性肺転移モデルマウスにおける転移巣の治療スケジュールを示す図である。
図１５は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣ）を用いた、腎臓癌血行性肺転移モデルマウスにおける転移巣の治療効果を示す図である。図１５ＡにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＡＦＰを投与した群（コントロール群）におけるＩＶＩＳシグナル及び組織Ｔｕｎｎｅｌの結果（ｄａｙ３０）を示し、図１５ＢにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣを投与した群におけるＩＶＩＳシグナル及び組織Ｔｕｎｎｅｌの結果（ｄａｙ３０）を示す。
図１６は、本発明の改良型ＴＳＴＡシステムを用いたときの各種癌細胞における標的遺伝子の発現の上昇を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
ＴＳＴＡ（Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）システムは、酵母のＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインであるＧＡＬ４−ＤＢＤ（ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｍａｉｎ）と強力な転写活性を有するＨＳＶ由来のＶＰ１６タンパク質の転写活性化ドメインを応用した哺乳類細胞２ハイブリッドアッセイシステムを改良したものである。図１Ｂに概要を示す（図１においては、ＧＡＬ４−ＤＢＤは、ＧＡＬ４とのみ表示してある）。具体的には組織又は癌特異的プロモーターの下流に酵母ＧＡＬ４とＶＰ１６を結合させた融合タンパク質遺伝子の下流にＧＡＬ４結合配列があり、そこにＧＡＬ４−ＶＰ１６融合タンパク質が結合することにより活性化するＴＡＴＡ最小プロモーター（ｍｉｎｉｍａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が最終的に該プロモーター下流に存在する遺伝子を翻訳する。ＴＳＴＡについては、Ｉｙｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００１  Ｄｅｃ  ４，９８（２５），ｐ．１４５９５−６００；  Ｉｙｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２００４  Ｓｅｐ，１０（３），ｐ．５４５−５２；  Ｉｌａｇａｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００６  Ｎｏｖ  １５，６６（２２），ｐ．１０７７８−８５；特表２００５−５０２６４５号公報；特表２００７−５３５１５号公報等に記載されている。
本発明の改良型ＴＳＴＡ（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）システムは、特異的プロモーターの下流に転写因子をコードするＤＮＡ配列が連結したＤＮＡ構築物を含む、転写因子を発現し得る第１の発現カセットとＧＡＬ４タンパク質結合部位の下流に最小プロモーターと標的遺伝子が連結したＤＮＡ構築物を含む第２の発現カセットを含む。第２の発現カセットは、第１の発現カセットにより発現した転写因子の作用で標的遺伝子を発現し得る。また、本発明は上記の第１の発現カセット及び第２の発現カセットを含むＤＮＡ構築物でもある。本発明のシステムにおいては、第１の発現カセットと第２の発現カセットは異なる別々のＤＮＡ構築物として含まれていてもよく、第１の発現カセットと第２の発現カセットが連結した１つのＤＮＡ構築物として含まれていてもよい。
特異的プロモーターは選択的プロモーターともいい、現在までに知られている、あるいは今後報告され得るあらゆる特異的プロモーターが含まれる。例えば、組織若しくは器官特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、発生若しくは分化特異的プロモーター等が挙げられ、それぞれ特定の組織又は器官でプロモーター活性を有するプロモーター、細胞等の特定の発生段階でプロモーター活性を有するプロモーター、腫瘍細胞においてプロモーター活性を有するプロモーターである。この中でも組織若しくは器官特異的プロモーター及び腫瘍特異的プロモーターが好ましい。組織、器官特異的プロモーターとしてはＮｋＸ２．５、ＧＡＴＡ４、ＭＬＣ（ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）２ｖ、ｃａｒｄｉａｃ  ａｎｋｉｒｉｎ  ｒｅｐｅａｔ、ＡＮＦ、ＢＮＰ（ｂｒａｉｎ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、ＡＮＰ（ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）などの心臓特異的プロモーターやＳＣＧ１０、ＧＦＡＰプロモーター、ｓｙｎａｐｓｉｎ  １プロモーター、ｔｕｂｕｌｉｎ  α１プロモーター、ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ  プロモーター、ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅプロモーター、ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ）−β  ｃｈａｉｎプロモーター等の脳特異的プロモーターが挙げられる。また腫瘍特異的プロモーターとしては、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）のプロモーター、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモーター、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーター、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）プロモーター、チロシナーゼプロモーター等が挙げられる。プロモーターはプロモーター活性を有する最小配列からなるコアプロモーターの部分を用いればよい。コアプロモーターとは、正確な転写開始を導く働きをもつプロモーター領域をいい、ＴＡＴＡボックスを含むことがある。ｈＴＥＲＴのコアプロモーターの配列を配列番号２に示す。通常、特異的プロモーターは転写活性が低く、特異的な標的遺伝子の発現量を増大させることは困難であったが、本発明の改良型ＴＳＴＡシステムにより、現在までに知られている、あるいは今後報告され得るあらゆる特異的プロモーターの活性を増大させることができる。
第１の発現カセットは、酵母の転写活性化因子であるＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）をコードするＤＮＡ、ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及びＨＳＶ１（単純ヘルペスウイルス）の転写制御因子であるＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡがこの順で融合したＤＮＡを含む。従来のＴＳＴＡシステムにおいては、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡとＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡの融合ＤＮＡが用いられるが、本発明においては、これらのＤＮＡの間にポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）又はポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（Ｒａｔ  ＧＲ）をコードするＤＮＡが挿入される。グルココルチコイドレセプターの由来生物種は限定されないが、例えば、ラット由来のものが用いられる。グルココルチコイドレセプター中に挿入されるポリグルタミンのグルタミン残基又はポリプロリンのプロリン残基の数は１０〜８０、好ましくは２０〜７０、さらに好ましくは３０〜５０、特に好ましくは４０である。グルタミンはＣＡＡ又はＣＧＡでコードされ、ポリグルタミンをコードするＤＮＡは、ＣＡＡのみ又はＣＧＡのみを含んでいてもよいし、両者を含んでいてもよい。また、プロリンはＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡ又はＣＣＧでコードされ、ポリプロリンをコードするＤＮＡは、これらのトリプレットのうち、１種、２種、３種又は４種を含み得る。また、ポリグルタミン又はポリプロリンはグルココルチコイドレセプター中のどの部分に挿入されてもよい。例えば、グルココルチコイドレセプターのアミノ酸配列の４番目のＴｙｒの後に挿入される。
ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインはＧＡＬ４タンパク質のアミノ酸１〜１４７の断片であり、例えば、ＧＡＬ４結合ドメインをコードするＤＮＡの塩基配列は配列番号４に示される。また、例えばポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡは配列番号５に示される。さらに、例えばＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡは配列番号６に示される。
第２の発現カセットは、ＧＡＬ４応答エレメントであるＧＡＬ４結合部位（ＧＡＬ４  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）の下流に最小プロモーターと標的遺伝子が連結した構造を有する。ＧＡＬ４結合部位（ＧＡＬ４  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）の下流に最小プロモーターが連結したものをＧＡＬ４結合部位を含む誘導性プロモーターともいい、ＧＡＬ４／ＴＡＴＡで表される。ＧＡＬ４結合部位は、５〜２０個、好ましくは５〜１０個、さらに好ましくは５個連結させる。ＧＡＬ４結合ドメインの下流に位置するプロモーターは、第１の発現カセットにより発現される転写因子に応答性である誘導性プロモーターであり、ＧＡＬ４反応性プロモーター、ＴＡＴＡ最小プロモーター、アデノウイルスＥＩＩｂ最小プロモーターを用いることができる。例えば、ＧＡＬ４結合部位をコードするＤＮＡの塩基配列は配列番号７に示され、最小プロモーターの塩基配列は配列番号８に示される。
標的遺伝子は、本発明の改良型ＴＳＴＡシステムにより最終的に発現させようとする標的遺伝子であり、癌などの疾患の診断に用い得るレポーター遺伝子又は癌などの疾患の治療に用い得る治療用遺伝子が挙げられる。
第１の発現カセットであるＤＮＡ構築物及び第２の発現カセットであるＤＮＡ構築物において、プロモーター等は作動可能に連結され、さらに、エンハンサー、ターミネーター、ポリＡ配列等の制御配列を含んでいてもよい。
レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子（配列番号１０）、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）等の蛍光タンパク質遺伝子、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子等が挙げられる。また、ヘルペスウイルスサイミジンカイネース（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等のＰＥＴ（ポジトロン断層撮影）レポーター遺伝子を用いることもできる。特定の疾患の治療に用い得る治療用遺伝子としては、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３（配列番号２１）、ｐ５３、Ｒｂ等の腫瘍抑制遺伝子、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子等の生理活性物質をコードする遺伝子、ＲＮＡ干渉作用を有するｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡ等が挙げられる。
上記の第１の発現カセット及び第２の発現カセットを特定の組織の細胞や腫瘍細胞に導入することにより、特異プロモーターが作動し、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）とポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）又はポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）が挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）と転写活性化ドメインの融合タンパク質である転写因子が発現する。該転写因子は第２の発現カセットのＧＬＡ４結合部位に結合し、ＧＡＬ４応答性エレメントを含むプロモーターが作動し、下流に存在する標的遺伝子の発現が起こる。２段階の反応により、標的遺伝子の発現が増幅される。すなわち、改良形ＴＳＴＡシステムが作用し、特異的プロモーターの転写活性が上昇し、該細胞内で目的遺伝子が高効率で発現される。この結果、標的遺伝子としてレポーター遺伝子を用いた場合、発光やＰＥＴ（ポジトロン断層撮影）等により特定の標的組織や標的細胞を検出することができる。また、標的遺伝子をして治療用遺伝子を用いた場合、疾患に関連する癌細胞等の特定の細胞や組織で治療用遺伝子が発現し、治療効果を発揮する。第１の発現カセット及び第２の発現カセットは例えばベクターに挿入し、ベクターを介して細胞内に導入することができる。本発明において、第１の発現カセット及び第２の発現カセットを含むベクターを、第１の発現カセットと第２の発現カセットを含むシステムを保持したベクターという。ベクターとしては、プラスミド、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等のウイルスベクターや生分解性ポリマーなどの非ウイルスベクターが挙げられる。上記発現カセットを導入したベクターを、感染等により細胞に導入すればよい。
第１の発現カセット及び第２の発現カセットを連結し、１つのＤＮＡ構築物として製造することもできる。該ＤＮＡ構築物は特異的プロモーター、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）をコードするＤＮＡ、ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及びＨＳＶ１（単純ヘルペスウイルス）の転写制御因子であるＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡがこの順で融合したＤＮＡ、ＧＡＬ４結合部位、最小プロモーター及び標的遺伝子が上流からこの順序で連結した構造を有する。この場合、第１の発現カセットと第２の発現カセットを含むＤＮＡ構築物を１つのベクターに導入する。
本発明の第１の発現カセット及び第２の発現カセットを含むＤＮＡ構築物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞を用いた実験に用いることも、非ヒト動物に導入して動物実験に用いることもでき、ヒトに導入して疾患の検出や治療に用いることもできる。
なお、配列番号１４に表される塩基配列において、配列番号１４に表される塩基配列の１〜３７３８番目の塩基からなる配列、すなわち配列番号１（配列番号１４の１〜６番目の塩基に相当）、配列番号２（ｈＴＥＲＴコアプロモーター配列；配列番号１４の７〜４６１番目の塩基に相当）、配列番号３（配列番号１４の４６２〜４６７番目の塩基に相当）、配列番号４（ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の４６８〜９１１番目の塩基に相当）、配列番号５（ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）をコードするＤＮＡが挿入されたラットグルココルチコイドレセプター（Ｒａｔ  ＧＲ）をコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の９１２〜１１６３番目の塩基に相当）、配列番号６（ＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の１１６４〜１２９８番目の塩基に相当）、配列番号７（ＧＡＬ４結合部位をコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の１２９９〜１４６３番目の塩基に相当）、配列番号８（最小プロモーター配列；配列番号１４の１４６４〜１４７４番目の塩基に相当）、配列番号９（配列番号１４の１４７５〜１５９３番目の塩基に相当）、配列番号１０（ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の１５９４〜３２４６番目の塩基に相当）、配列番号１１（配列番号１４の３２４７〜３２５９番目の塩基に相当）及び配列番号１２（ｐｏｌｙＡ配列；配列番号１４の３２６０〜３７３８番目の塩基に相当）を連結したものは、特異的プロモーターとしてｈＴＥＲＴを含み、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含む上記の改良型ＴＳＴＡシステムの第１の発現カセットと第２の発現カセットを連結したＤＡＮ構築物の塩基配列に相当する。このうち、配列番号１４に表される塩基配列の１〜１２９８番目の塩基からなる配列が第１の発現カセットに含まれ、１２９９〜３２４６番目の塩基からなる配列が第２の発現カセットに含まれる。
また、配列番号２０に表される塩基配列の１〜３１２２番目の塩基からなる配列、すなわち配列番号１（配列番号２０の１〜６番目の塩基に相当）、配列番号２（ｈＴＥＲＴコアプロモーター配列；配列番号２０の７〜４６１番目の塩基に相当）、配列番号３（配列番号２０の４６２〜４６７番目の塩基に相当）、配列番号４（ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ配列；配列番号２０の４６８〜９１１番目の塩基に相当）、配列番号５（ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）をコードするＤＮＡが挿入されたラットグルココルチコイドレセプター（Ｒａｔ  ＧＲ）をコードするＤＮＡ配列；配列番号２０の９１２〜１１６３番目の塩基に相当）、配列番号６（ＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡ配列；配列番号２０の１１６４〜１２９８番目の塩基に相当）、配列番号７（ＧＡＬ４結合部位をコードするＤＮＡ配列；配列番号２０の１２９９〜１４６３番目の塩基に相当）、配列番号８（最小プロモーター配列；配列番号２０の１４６４〜１４７４番目の塩基に相当）、配列番号１５（配列番号２０の１４７５〜１５４４番目の塩基に相当）、配列番号１６（ヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子ＤＮＡ配列に６×ＨｉｓをコードするＤＮＡ配列を付加した配列；配列番号２０の１５４５〜２６２１番目の塩基に相当）、配列番号１７（配列番号２０の２６２２〜２６４３番目の塩基に相当）及び配列番号１８（ｐｏｌｙＡ配列；配列番号２０の２６４４〜３１２２番目の塩基に相当）を連結したものは、特異的プロモーターとしてｈＴＥＲＴを含み、レポーター遺伝子としてヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子を含む上記の改良型ＴＳＴＡシステムの第１の発現カセットと第２の発現カセットを連結したＤＡＮ構築物の塩基配列に相当する。このうち、配列番号２０に表される塩基配列の１〜１２９８番目の塩基からなる配列が第１の発現カセットに含まれ、１２９９〜２６２１番目の塩基からなる配列が第２の発現カセットに含まれる。
本発明は、さらに、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）をコードするＤＮＡ、ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及びＨＳＶ１（単純ヘルペスウイルス）の転写制御因子であるＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡがこの順で融合した融合ＤＮＡであって、転写活性化因子をコードするＤＮＡ構築物を含む。該ＤＮＡ構築物は例えば、配列番号２２に表される塩基配列からなる。
本発明の改良型ＴＳＴＡシステムはあらゆる特異的プロモーターの転写活性を上昇させることができる。本発明は、改良型ＴＳＴＡシステムを用いて特異的プロモーターの転写活性を上昇させる方法をも包含する。該方法においては、上記の第１の発現カセット及び第２の発現カセットを特異的プロモーターが活性である細胞に導入する。該細胞内で、特異的プロモーターが作動し、転写因子が発現し、転写因子がＧＡＬ４応答性エレメントに結合し、該エレメント下流に位置する標的遺伝子の発現が増幅され、特異的プロモーターの活性が上昇する。本発明の改良型ＴＳＴＡシステムを利用することにより、特異的プロモーター活性は、従来型のＴＳＴＡシステムを利用した場合に対して、少なくとも５％以上、好ましくは１０％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは２倍以上上昇する。プロモーター活性は後記の実施例に記載の方法で測定することができる。
本発明は、さらに、上記改良型ＴＳＴＡシステム用ＤＮＡ構築物である第１の発現カセット及び第２の発現カセットを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。該ベクターは、癌等の疾患の特異的診断又は治療を可能とする。該ベクターはアデノ随伴ウイルスに上記の第１の発現カセットと第２の発現カセットを挿入して作製することができる。この際、第１の発現カセットと第２の発現カセットを連結したＤＮＡ構築物を挿入してもよい。また、２種類の別々のアデノ随伴ウイルスベクターに挿入してもよく、この場合は細胞に２種類のベクターを導入すればよい。
アデノ随伴ウイルスは、パルボウイルス属１本鎖ＤＮＡウイルスであり、（１）遺伝子長期発現、（２）低毒性、（３）分裂及び非分裂細胞に遺伝子導入が可能という特性を有する。コンカタマー（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ；１本鎖ＤＮＡが連結した複合体）の形成が遺伝子長期発現の原因とされている。毒性に関してはアデノウイルスで知られるような肝毒性は少ない。
本発明においては、アデノ随伴ウイルスベクターの外殻（カプシド）遺伝子に特定の細胞に特異的に発現するタンパク質に対する指向性を有し該細胞に結合する標的細胞特異的結合ペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、外殻を改変する。このようなペプチドを挿入することにより、該カプシド改変型アデノ随伴ウイルスベクターは特定のタンパク質を発現する特定の細胞を指向し該細胞に到達、結合し、感染し取り込まれ、細胞内で発現系が作用し、細胞内で標的遺伝子が発現し、診断や治療に用いることができる。アデノ随伴ウイルスの外殻遺伝子に挿入するＤＡＮがコードするペプチドは、腫瘍細胞や特定の組織若しくは器官の細胞に選択的に発現するタンパク質に結合することができ該細胞を指向する標的特異的ペプチドである。このようなペプチドとしては、例えば、腫瘍血管内皮細胞に対して指向性を有するペプチドが挙げられ、アミノ酸配列ＲＧＤ又はＮＧＲで表されるアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。ＲＧＤを含むペプチドとしては、ＲＧＤ配列を含みかつ細胞表面のインテグリンに対する結合親和性を有するペプチドが挙げられる。例えば、ＲＧＤを含めて５〜２０個のアミノ酸からなるペプチドである。このようなペプチドとして、例えば、４Ｃ−ＲＧＤペプチド（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ：配列番号３６）が挙げられる。ペプチドとして４Ｃ−ＲＧＤペプチドを用いた場合、該ペプチドはインテグリンと結合親和性を有するので、例えば、ＣＨＯ細胞、気道上皮細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、造血幹細胞、樹状細胞、インテグリンを細胞表面に有する癌細胞（例えばヒトグリオーマ細胞ＬＮ４４４）等も指向する。ＮＧＲを含むペプチドとしては、ＮＧＲ配列を含みかつ細胞表面のアミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）に対する結合親和性を有するペプチドが挙げられる。例えば、ＮＧＲを含めて５〜２０個のアミノ酸からなるものが好ましく、具体的には、例えば、ＮＧＲ関連ペプチド（ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ：配列番号３７）を挙げることができる。ペプチドとしてＮＧＲ関連ペプチドを用いた場合、該ペプチドはアミノペプチダーゼＮ／ＣＤ１３と結合親和性を有するので、例えば癌新生血管等のＣＤ１３発現細胞（例えばヒトグリオーマ細胞ＬＮ４４４）等も指向する。その他、臓器を指向するペプチドとして、脳を指向するＣＬＳＳＲＬＤＡＣ（配列番号４０）、ＣＮＳＲＬＨＬＲＣ（配列番号４１）、ＣＥＮＷＷＧＤＶＣ（配列番号４２）、ＷＲＣＶＬＲＥＧＰＡＧＧＣＡＷＦＮＲＨＲＬ（配列番号４３）等、腎臓を指向するＣＬＰＶＡＳＣ（配列番号４４）、ＣＧＡＲＥＭＣ（配列番号４５）等、（関節の）滑膜を指向するＣＫＳＴＨＤＲＬＣ（配列番号４６）等、ｔｕｍｏｒ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃｓを指向するＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号４７）等、血管新生している血管内皮細胞を指向するＡＰＲＰＧ（配列番号４８）などの細胞の表面に存在するインテグリン（インテグリンは総称で、複数の種類がある）を指向するＫＱＡＧＤＶ（配列番号４９）、ＬＤＶ、ＫＲＬＤＧＳ（配列番号５０）、ＤＧＥＡ（配列番号５１）等が挙げられる。これらのペプチドは、標的遺伝子を導入し、発現させようとする細胞に応じて適宜選択すればよい。これら���ペプチドをコードする遺伝子を外殻遺伝子に挿入する場合、図７に示すように、配列番号３８で表される外殻の５８６番目から５９４番目のアミノ酸配列で表される部分に、リンカーＡＳ部及びＡＬＳ部を介して配列番号３９で表されるアミノ酸配列を挿入するようにすればよい。例えば、アデノ随伴ウイルスの外殻としてｔｙｐｅ１を用いて、リンカーとして上記のＡＳ部（制限酵素ＮｈｅＩ）とＡＬＳ部（制限酵素ＡｆｌＩ）を用いて、該リンカーを介して標的特異的ペプチドを自由に変更できるようにすればよい。
アデノ随伴ウイルスベクターは、公知の方法で製造することができる。例えば、米国特許第５，８５８，３５１号には、遺伝子治療に用い得る組換えアデノ随伴ウイルスの作製方法等が記載されている（Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３〜８０１；Ｂｅｒｎｓ「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、Ｆｉｅｌｄｓ＆Ｋｎｉｐｅ編等）。
図２に本発明の改良型ＴＳＴＡシステムにより標的遺伝子を発現し得るアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの模式図及び該ベクターに導入したＤＮＡ構築物である発現カセットの構造図を示す。図２Ａが特異的プロモーターとしてｈＴＥＲＴを含み特異的遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターに導入したＤＮＡ構築物である発現カセットの構造図を示し、図２Ｂが特異的プロモーターとしてｈＴＥＲＴを含み特異的遺伝子としてヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターに導入したＤＮＡ構築物である発現カセットの構造図を示す図である。これらのＤＮＡ構築物はＩＴＲ（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）で挟まれたアデノ随伴ウイルスの外殻に挿入する。
配列番号１４に図２Ａに構造を示すルシフェラーゼ遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターの外殻中に含まれる塩基配列を示し、配列番号２０に図２Ｂに構造を示すヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターの外殻中に含まれる塩基配列を示す。配列番号１４に表される塩基配列は、配列番号１（配列番号１４の１〜６番目の塩基に相当）、配列番号２（ｈＴＥＲＴコアプロモーター配列；配列番号１４の７〜４６１番目の塩基に相当）、配列番号３（配列番号１４の４６２〜４６７番目の塩基に相当）、配列番号４（ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の４６８〜９１１番目の塩基に相当）、配列番号５（ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）をコードするＤＮＡが挿入されたラットグルココルチコイドレセプター（Ｒａｔ  ＧＲ）をコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の９１２〜１１６３番目の塩基に相当）、配列番号６（ＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の１１６４〜１２９８番目の塩基に相当）、配列番号７（ＧＡＬ４結合部位をコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の１２９９〜１４６３番目の塩基に相当）、配列番号８（最小プロモーター配列；配列番号１４の１４６４〜１４７４番目の塩基に相当）、配列番号９（配列番号１４の１４７５〜１５９３番目の塩基に相当）、配列番号１０（ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ配列；配列番号１４の１５９４〜３２４６番目の塩基に相当）、配列番号１１（配列番号１４の３２４７〜３２５９番目の塩基に相当）、配列番号１２（ｐｏｌｙＡ配列；配列番号１４の３２６０〜３７３８番目の塩基に相当）及び配列番号１３（配列番号１４の３７３９〜６６６４番目の塩基に相当）を連結したものに相当する。また、配列番号２０に表される塩基配列は、配列番号１（配列番号２０の１〜６番目の塩基に相当）、配列番号２（ｈＴＥＲＴコアプロモーター配列；配列番号２０の７〜４６１番目の塩基に相当）、配列番号３（配列番号２０の４６２〜４６７番目の塩基に相当）、配列番号４（ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ配列；配列番号２０の４６８〜９１１番目の塩基に相当）、配列番号５（ポリグルタミン（Ｐｏｌｙ  Ｑ）をコードするＤＮＡが挿入されたラットグルココルチコイドレセプター（Ｒａｔ  ＧＲ）をコードするＤＮＡ配列；配列番号２０の９１２〜１１６３番目の塩基に相当）、配列番号６（ＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡ配列；配列番号２０の１１６４〜１２９８番目の塩基に相当）、配列番号７（ＧＡＬ４結合部位をコードするＤＮＡ配列；配列番号２０の１２９９〜１４６３番目の塩基に相当）、配列番号８（最小プロモーター配列；配列番号２０の１４６４〜１４７４番目の塩基に相当）、配列番号１５（配列番号２０の１４７５〜１５４４番目の塩基に相当）、配列番号１６（ヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子ＤＮＡ配列に６×ＨｉｓをコードするＤＮＡ配列を付加した配列；配列番号２０の１５４５〜２６２１番目の塩基に相当）、配列番号１７（配列番号２０の２６２２〜２６４３番目の塩基に相当）、配列番号１８（ｐｏｌｙＡ配列；配列番号２０の２６４４〜３１２２番目の塩基に相当）及び配列番���１９（配列番号２０の３１２３〜６０４８番目の塩基に相当）を連結したものに相当する。
本発明において上記配列番号の塩基配列で表されるＤＮＡは、それぞれのＤＮＡが有する活性又はそれぞれのＤＮＡがコードするタンパク質若しくはポリペプチドが有する活性を有している限り、塩基配列に変異を有していてもよい。例えば、それぞれの配列番号で表される塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、それぞれの配列番号で表される塩基配列と、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有しているＤＮＡ、又は前記ＤＮＡによりコードされるタンパク質若しくはポリペプチドのアミノ酸配列に対して１又は複数若しくは数個（１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１個若しくは２個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質若しくはポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡ構築物の構築に用いることができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、３７℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．５ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡを単離を期待し得る。ただし、上記のＳＳＣ、ＳＤＳ及び温度の条件の組み合わせは例示であり、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間などを適宜組み合わせることにより、必要なストリンジェンシーを実現することが可能である。
これらのアデノ随伴ウイルスベクターにおいて、指向する細胞に合わせて特異的プロモーター配列を変更することができ、この場合、配列番号１４又は配列番号２０のｈ−ＴＥＲＴコアプロモーター配列を別のプロモーター配列に置換すればよい。また、診断に用いるレポーター遺伝子や治療に用いる遺伝子も適宜変更することができ、この場合、配列番号１４又は配列番号２０の遺伝子を別の遺伝子に置換すればよい。
本発明の改良型ＴＳＴＡシステムにより標的遺伝子を発現し得るアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、疾患検出又は疾患治療に用い得る。疾患としては、癌等が挙げられ、アデノ随伴ウイルスベクターの外殻に挿入された特定の細胞に発現しているタンパク質に選択的に結合するＲＧＤ等のペプチドにより該細胞を指向し、該細胞に感染し、細胞内で改良型ＴＳＴＡシステムが作用し、標的遺伝子が発現する。標的遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子の場合、特定の細胞を発光等により検出することができる。特定の細胞が癌細胞の場合、被験体に投与することにより、被験体中の癌細胞を検出し、該被験体が癌に罹患していることを診断することができる。本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは細胞１個を検出することができるので、例えば微小癌の検出に用いることができる。
また、標的遺伝子が治療用遺伝子の場合、特定の細胞中で標的遺伝子が発現し、治療効果を発揮し得る。例えば、特定の細胞が癌細胞であり、ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子等の癌抑制遺伝子を用いた場合、被験体に投与することにより、被験体の癌細胞に癌治療用遺伝子がデリバリーされ、癌細胞中で遺伝子が発現し、治療効果を発揮する。本発明は、このようなアデノ随伴ウイルスベクターを含む診断又は治療用ウイルス製剤を包含する。治療用遺伝子として、ヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子等の癌抑制遺伝子を用いた場合の治療対象となる癌としては、本発明の治療対象となる癌としては、例えば、脳・神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、リンパ腫・白血病、結腸癌、膵癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫等が挙げられる。本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは原発性癌の治療にも転移性癌の治療にも用いることができる。
本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、遺伝子治療の分野において使用可能な方法、例えば、静脈内投与や動脈内投与などの血管内投与、経口投与、腹腔内投与、気管内投与、気管支内投与、皮下投与、経皮投与等により投与することができる。特に、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは特定の組織、細胞への指向性が大きく、標的遺伝子を効率的に特定の組織、細胞へデリバリーすることができるので、血管内投与によっても、効率的に診断、治療を行うことができる。
アデノ随伴ウイルスベクターは、治療上有効量を投与すればよい。治療上の有効量は、遺伝子治療分野の当業者であれば容易に決定することができる。さらに、投与量は、被験者の病態の重篤度、性別、年齢、体重、習慣等によって適宜変更することができる。例えば、アデノ随伴ウイルススベクターを、０．５×１０１１〜２．０×１０１２ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅ／ｋｇ体重、好ましくは１．０×１０１１〜１．０×１０１２ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅ／ｋｇ体重、さらに好ましくは１．０×１０１１〜５．０×１０１１ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅ／ｋｇ体重の量で投与すればよい。ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅは、アデノ随伴ウイルスのゲノムの分子数（ウイルス粒子数）を表し、ｐａｒｔｉｃｌｅということもある。製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００８】
改良型ＴＳＴＡ（ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）システムの創出
（１）  改良型ＴＳＴＡ（ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）システムの創出
ＴＳＴＡシステムは、酵母のＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインであるＧＡＬ４−ＤＢＤ（ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｍａｉｎ）（図１においては、ＧＡＬ４とのみ表示）と強力な転写活性を有するＨＳＶ由来のＶＰ１６タンパク質の転写活性化ドメインを応用した哺乳類細胞２ハイブリッドアッセイシステムを改良したものである。具体的には組織又は癌特異的プロモーターの下流に酵母ＧＡＬ４とＶＰ１６を結合させた融合タンパク質遺伝子の下流にＧＡＬ４結合配列があり、そこにＧＡＬ４−ＶＰ１６融合タンパク質が結合することにより活性化するＴＡＴＡ最小プロモーター（ｍｉｎｉｍａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が最終的に該プロモーター下流に存在する遺伝子を翻訳する。ＴＳＴＡについては、Ｉｙｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００１  Ｄｅｃ  ４，９８（２５），ｐ．１４５９５−６００；  Ｉｙｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２００４  Ｓｅｐ，１０（３），ｐ．５４５−５２；  Ｉｌａｇａｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００６  Ｎｏｖ  １５，６６（２２），ｐ．１０７７８−８５；特表２００５−５０２６４５号公報；特表２００７−５３５１５号公報等に記載されている。
本実施例では、ＧＡＬ４−ＶＰ１６融合遺伝子間に４０個のグルタミンをグルココルチコイドレセプター（ラット）の間に挟みこんだもの（ＧＲ  ｍｏｉｅｔｙ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙＱと表示）を挿入した。ＴＳＴＡにおいて、ＧＡＬ４−ＶＰ１６融合遺伝子間に４０個のグルタミンをグルココルチコイドレセプター（ラット）の間に挟みこんだもの（ＧＲ  ｍｏｉｅｔｙ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙＱと表示）を挿入するシステムを改良型ＴＳＴＡシステムという。図１に従来のｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｅｐ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（図１Ａ）、従来のｔｗｏ  ｓｔｅｐ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（図１Ｂ）及び本発明の改良型ｔｗｏ  ｓｔｅｐ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（図１Ｃ）に用いる構築物の構造を示す。図１Ｃに示すように、改良型ＴＳＴＡシステムにおいては、組織又は癌特異的プロモーターの下流にＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡとＨＳＶ１（単純ヘルペスウイルス）の転写制御因子であるＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡの融合ＤＮＡであって、両ＤＮＡの間にラットのグルココルチコイドレセプターをコードするＤＮＡの間に４０個のグルタミンをコードするＤＮＡを挟んだＤＮＡが挿入されたＤＮＡが存在し、さらにその下流に５個のＧＡＬ４結合ドメインをコードするＤＮＡが存在し、さらにその下流にアデノウイルスの最小プロモーターが存在し、さらにその下流にレポーター遺伝子が存在する。
本実施例においては、プロモーターとして腫瘍細胞特異的に活性をもつヒトテロメアーゼのプロモーターであるｈＴＥＲＴプロモーターを用いた。
上記の改良型ＴＳＴＡシステム用ＤＮＡ構築物を含むアデノ随伴ウイルスベクターを作製し用いた。発現させる遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子（配列番号１０）又は癌抑制遺伝子であるヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子（配列番号２１）を用いた。
改良型ＴＳＴＡシステム用ＤＮＡ構築物を含むアデノ随伴ウイルスベクターは図３に示す工程により作製した。図４に図３の工程で用いたプライマーの配列を示す。
【実施例２】
【０００９】
各種癌細胞を用いての検討
プロモーターとして、ｈＴＥＲＴプロモーターを含みレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含む、改良型ＴＳＴＡシステム用ＤＮＡ構築物を含むｐＧＬ３  ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を各種癌細胞（ＰＣ３、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、ＬＮＣａＰ、ＨｅＬａ）及び正常細胞（ＯＵＭＳ、ＰｒＥＣ）に感染させた。
（１）ｈＴＥＲＴ活性
Ｔｅｌ  ＴＡＧＧＧテロメラーゼＰＣＲ  ＥＲＩＳＡＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ社）によりｈＴＥＲＴ活性を直接測定した。
図５に、相対的ｈＴＲＥＴ活性（各種癌細胞におけるｈＴＥＲＴ活性）を測定した結果を示す。ＰＣ３（前立腺癌）を１．０としたときの値をｂａｒ  ｇｒａｐｈで示す。正常細胞（ＯＵＭＳ：線維芽細胞、ＰｅＥＣ：前立腺細胞）では著しく低いが、各種癌細胞では著しくｈＴＥＲＴ活性が高かった。
（２）ルシフェラーゼ発現
各癌細胞における、ルシフェラーゼの発現を公知のルミノメーターによるアッセイ法により測定した。この際、ＴＳＴＡシステムを利用せずに、ｈＴＥＲＴプロモーターのみによるルシフェラーゼ活性（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｅｐ（ｈＴＥＲＴのみ））、ｈＴＥＲＴプロモーターを用いた従来のＴＳＴＡシステムによるルシフェラーゼ活性（ｔｗｏ  ｓｔｅｐ（ｈＴＥＲＴ＋ＴＳＴＡ））及びｈＴＥＲＴプロモーターを用いた本発明の改良型ＴＳＴＡシステムによるルシフェラーゼ活性（ｔｗｏ  ｓｔｅｐ＋ｐｏｌｙＱ（ｈＴＥＲＴ＋ａｄＴＳＴＡ））によるルシフェラーゼ活性を測定した。
図６Ａに、結果を示す。各細胞においてｈＴＥＲＴのみのルシフェラーゼ活性を１．０とした。図６ＢはＬＮＣＣａＰの結果を示す。ｈＴＥＲＴ＋ＴＳＴＡはある種の癌細胞（ＬＮＣａｐやＨｅＬａ）ではｈＴＥＲＴプロモーターより転写活性が低くなることがあったが、改良型ＴＳＴＡ＝ｈＴＥＲＴ＋ａｄＴＳＴＡでは全ての癌細胞でｈＴＥＲＴプロモーターのみの場合より転写活性が高くなった。正常細胞では、転写活性はほぼ変化が無かった。
【実施例３】
【００１０】
ＲＧＤを外殻に含むアデノウイルス随伴ベクターの腫瘍細胞への感染効率の検討
αｖ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ（腫瘍血管に多く発現）のリガンドとなるＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）ペプチド７をＡＡＶ外殻に挿入し、その腫瘍特異的集積を検討した。アデノ随伴ウイルスベクターはｈＴＥＲＴプロモーターを含む改良型ＴＳＴＡシステム用ＤＮＡ構築物を含むものを用いた。また、レポーター遺伝子としては、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を用いた。この際、コントロールとしてＲＧＤを挿入しないものを用いた。ＲＧＤを挿入したアデノ随伴ウイルスベクターをａｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ１−ＲＧＤ）とし、ＲＧＤを挿入しないアデノ随伴ウイルスベクターをａｄＴＳＴＡ−ＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ１）とする。ＲＧＤは４Ｃ−ＲＧＤ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ：配列番号３６）を用い、リンカーとしてＡＳ及びＡＬＳを用いた（図７）。
５×１０５個のＲＧＤのリガンドであるαｖ  ｉｎｔｅｇｒｉｎが強発現している細胞（ＨＵＶＥＣ、ＳＫＯＶ−３及びＫ５６２）を２４ｗｅｌｌプレートに播き２４時間後に２０ＭＯＩのａｄＴＳＴＡ−ＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ１）又はａｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ１−ＲＧＤ）に感染させ、７２時間後にＧＦＰ陽性細胞率を判定した。
結果を図８に示す。図８Ａ、Ｂ及びＣはそれぞれ、ＨＵＶＥＣ、ＳＫＯＶ−３及びＫ５６２の結果を示す。３種類の細胞でａｄＴＳＴＡ−ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＧＦＰによる有意な感染効率の上昇が認められ、それらは培養液中に添加されたＲＧＤ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ＲＧＤＳ，Ｓｉｇｍａ：２００ｇ／ｍｌ）で中和された。
これらはａｄＴＳＴＡ−ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＧＦＰによる感染効率の上昇がＲＧＤ−αｖ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ結合に由来することを示しており、ウイルス表面のＲＧＤが確実に機能していることを強く示唆している。
【実施例４】
【００１１】
同所性肝臓癌モデルマウスにおける原発巣の診断
同所性肝臓癌モデルマウスを用いて、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターを用いた原発性癌モニターに関する検討を行った。
アデノ随伴ウイルスベクターはｈＴＥＲＴプロモーターを含む改良型ＴＳＴＡシステム用ＤＮＡ構築物を含み外殻にＲＧＤを挿入したものを用いた。また、レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼを用いた。該アデノ随伴ウイルスベクターをａｄＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃという。
５００万個のヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ３ＢをＢａｌｂｃヌードマウスの肝臓に移植し（ｄａｙ０）、その５日後に１０１０  ｐａｒｔｉｃｌｅのａｄＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃを尾静脈より投与した（ｄａｙ５）。その後定期的（ｄａｙ８、ｄａｙ２０及びｄａｙ３０）に、ＩＶＩＳ  ＳＰＥＣＴＲＵＭ（ＸＥＮＯＧＥＮ社）（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）にて観察した。
図９Ａに検討のスケジュールの概要及びＩＶＩＳ像を示す。
ｄａｙ８で剣状突起周囲に一点のＩＶＩＳシグナルを認めた。そのシグナルは徐々に増大し、ｄａｙ３０にはＩＶＩＳ上で認めたシグナルに一致して肝臓表面に１５×５ｍｍ大の腫瘍塊を認めた。
これらは、ａｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃが植込み直後のＨｅｐ３Ｂ（微小癌と考えられる）に取り込まれルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）遺伝子を発現し、その後Ｌｕｃを発現しているＨｅｐ３Ｂ細胞が増殖、腫瘍塊を形成したと考えられる。図９Ｂに腫瘍塊の写真を示す。本実施例は、ａｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃが微小癌のモニターに用いることができることを示している。
本実施例で用いたモデルマウスはあくまでも原発性微小癌の一例であり、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、腫瘍組織に効率的に取り込まれ、且つ腫瘍細胞でしか遺伝子を発現しない特性を有することから、あらゆる原発性微小癌の診断及びモニターに有用である。
【実施例５】
【００１２】
同所性肝臓癌モデルマウスにおける肝臓癌治療効果の検討
実施例４で用いた遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子からヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子（癌抑制遺伝子）に変更し、アデノ随伴ウイルスベクターの治療効果を検討した。アデノ随伴ウイルスベクターをＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣという。
肝臓に植え込む細胞としては、ルシフェラーゼ遺伝子を恒常発現しているＨｅｐ３Ｂ／Ｌｕｃ細胞を使用した。この場合、ＩＶＩＳシグナルはＨｅｐ３Ｂ／Ｌｕｃの細胞数に比例する。
細胞移植５日後に１０１０  ｐａｒｔｉｃｌｅのＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣを尾静脈より投与した。コントロール群ではヒトＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３遺伝子の代わりにＡＦＰ（αフェトプロテイン）遺伝子を含むＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＡＬＰを投与した。
図１０に治療スケジュールを示す。また、図１１ＢにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣを投与した群におけるＩＶＩＳシグナル及び組織Ｔｕｎｎｅｌの結果（ｄａｙ３０）を示す。また、図１１ＡにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＡＦＰを投与した群（コントロール群）におけるＩＶＩＳシグナル及び組織Ｔｕｎｎｅｌの結果（ｄａｙ３０）を示す。図より明らかな通り、ＲＥＩＣ治療群ではｄａｙ３０でシグナルがほぼ消失しているが、コントロール群ではシグナルが明らかに増大していた。
組織Ｔｕｎｎｅｌ（アポトーシス検知）より、アポトーシスが治療効果の大きな原因と考えられた。本実施例により、ａｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣが同所性肝臓癌に対して治療効果があることが証明された。
本実施例で用いたモデルマウスはあくまでも原発性微小癌の一例であり、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、腫瘍組織に効率的に取り込まれ且つ腫瘍細胞でしか遺伝子を発現しない特性を有すること、またＲＥＩＣ遺伝子の持つ広範な腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果から、あらゆる原発性癌の治療に有用であると考えられる。
【実施例６】
【００１３】
腎臓癌血行性肺転移モデルマウスにおける転移巣の診断
腎臓癌ＲＥＮＣＡ細胞肺転移モデルマウスを使用し、血行性肺転移モデルにおける、診断・治療効果の検討を行った。用いたアデノ随伴ウイルスベクターは実施例４で用いたものと同じであった。
５万個のＲＥＮＣＡ細胞をＢａｌｂｃヌードマウスの尾静脈から血行性に肺に移植した（ｄａｙ０）。
その５日後に１０１０  ｐａｒｔｉｃｌｅのＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃを尾静脈より投与した（ｄａｙ５）。コントロール群ではＰＢＳを投与した。その後定期的（ｄａｙ８、ｄａｙ２０、ｄａｙ３０）にＩＶＩＳにて観察した。
実験スケジュールを図１２に示す。また、図１３ＢにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃを投与した群におけるＩＶＩＳシグナル及びマクロ病理の観察結果（ｄａｙ３０）を示す。また、図１３Ａにコントロール群におけるＩＶＩＳシグナル及びマクロ病理の観察結果（ｄａｙ３０）を示す。
３０日目におけるＩＶＩＳ画像より明らかなように、ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕ投与群において明らかに肺転移巣に一致したシグナルを認めた。
この結果は、ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−Ｌｕｃが血行性肺転移のモニターに用いることができることを示す。
本実施例で用いたモデルマウスはあくまでも腎臓癌血行性肺転移の一例であり、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、腫瘍組織に効率的に取り込まれ、且つ腫瘍細胞でしか遺伝子を発現しない特性を有することから、あらゆる血行性転移癌のモニターに有用であると考えられる。
【実施例７】
【００１４】
腎臓癌血行性肺転移モデルマウスにおける転移巣の治療効果の検討
実施例５で用いたＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣを用い、治療効果の検討を行った。血行性に肺に植え込む細胞としては、ルシフェラーゼ遺伝子を恒常発現しているＲＥＮＣＡ／Ｌｕｃ細胞を使用した。この場合、ＩＶＩＳシグナルはＲＥＮＣＡ／Ｌｕｃの細胞数に比例する。
細胞移植５日後に１０１０  ｐａｒｔｉｃｌｅのＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣを尾静脈より投与した。コントロール群ではＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＡＬＰを投与した。
図１４に治療スケジュールを示す。また、図１５ＢにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣを投与した群におけるＩＶＩＳシグナル及び組織Ｔｕｎｎｅｌの結果（ｄａｙ３０）を示す。また、図１５ＡにＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＡＦＰを投与した群（コントロール群）におけるＩＶＩＳシグナル及び組織Ｔｕｎｎｅｌの結果（ｄａｙ３０）を示す。
図より明らかな通り、ＲＥＩＣ治療群ではｄａｙ３０でシグナルがほぼ消失しているが、コントロール群ではシグナルが明らかに増大していた。
組織Ｔｕｎｎｅｌ（アポトーシス検知）より、アポトーシスが治療効果の大きな原因と考えられた。本実施例は、ＡｄＴＳＴＡ／ＲＧＤ−ＡＡＶ−ＲＥＩＣが腎臓癌血行性肺転移に対して治療効果があることを示す。
本実施例で用いたモデルマウスはあくまでも血行性転移癌の一例であり、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、腫瘍組織に効率的に取り込まれ且つ腫瘍細胞でしか遺伝子を発現しない特性を有すること、またＲＥＩＣ遺伝子の持つ広範な腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果から、あらゆる血行性転移癌の治療に有用であると考えられる。
【実施例８】
【００１５】
実施例２と同様に、各種癌細胞を用いて検討を行った。用いた癌細胞は、ＮＣＣＩＴ（精巣腫瘍細胞）、ＭＤＡ２３１（乳癌細胞）、Ａ５４９（肺癌細胞）、Ｈ２８（悪性中皮腫細胞）、ＫＰＫ１（腎臓癌細胞）、２１１Ｈ（悪性中皮腫細胞）、Ｊ８２（膀胱癌細胞）及びＡ４３１（類表皮癌細胞）であった。図１６に結果を示す。各細胞においてｈＴＥＲＴのみのルシフェラーゼ活性を１．０とした。ｈＴＥＲＴ＋ＴＳＴＡはある種の癌細胞（Ａ５４９、Ｈ２８、２１１Ｈ、Ｊ８２、Ａ４３１）ではｈＴＥＲＴプロモーターより転写活性が低くなることがあったが、改良型ＴＳＴＡ＝ｈＴＥＲＴ＋ａｄＴＳＴＡでは全ての癌細胞でｈＴＥＲＴプロモーターのみの場合より転写活性が高くなった。本実施例の結果は、実施例２の結果を併せて、本発明のシステムが癌細胞全般において有用であることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
実施例に示すように、本発明の改良型ＴＳＴＡシステムは、従来のＴＳＴＡシステムに比べ飛躍的に特異的プロモーター活性を上昇させ、特定の組織や細胞での所定の標的遺伝子の発現を増大させる。標的遺伝子として、疾患の検出や治療に用い得る遺伝子を用いることにより、優れた検出、治療システムとして利用することができる。また、上記改良型ＴＳＴＡシステムを組込み外殻に標的特異的ペプチドを挿入したアデノ随伴ウイルスベクターは特定の組織、細胞を強く指向し、該組織、細胞に到達し、該組織細胞中での特異的プロモーターの活性が上昇し、所定の標的遺伝子の発現を増大させる。本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、疾患の検出用又は治療用ウイルス製剤として用いることができる。
従来のＴＳＴＡシステムを用いたプラスミドでの癌治療の検討や癌治療例は散見されるがウイルスベクターでの成功例は少なく（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ，ＨＳＶ，ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓなどで若干例）、アデノ随伴ウイルスでの成功例は世界発である。
【配列表フリーテキスト】
【００１７】
配列番号１〜２０及び２２〜５１  合成
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010114143.tif 000043
【図８】
2010114143.tif 000044
【図１０】
2010114143.tif 000045
【図１２】
2010114143.tif 000046
【図１４】
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【図１６】
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【図１】
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【図２】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年1月27日(2011.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
（削除）
【請求項２０】
（ｉ）  ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ、
（ｉｉ）  ポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及び
（ｉｉｉ）  ＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡ、
が（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の順で、（ｉｉ）のＤＮＡが（ｉ）と（ｉｉｉ）のＤＮＡの間に挟みこまれて融合したＤＮＡをｈＴＥＲＴプロモーターの下流に連結した第１の発現カセットであって、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）とポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）が挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）と転写活性化ドメインの融合タンパク質である転写因子を発現し得る第１の発現カセット、並びに前記転写因子に応答性であり、ＧＡＬ４結合部位を含む誘導性プロモーター（ＧＡＬ４／ＴＡＴＡ）の下流に標的遺伝子を連結した第２の発現カセットを含む、前記特異的プロモーターの転写活性を上昇させるためのシステム。
【請求項２１】
（ｉｉ）のＤＮＡにおいて、ポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが、グルココルチコイドレセプターのアミノ酸配列の４番目のＴｙｒの後に挿入された融合タンパク質をコードする、配列番号５に表される塩基配列からなる、請求項２０記載のシステム。
【請求項２２】
第１の発現カセットの下流に第２の発現カセットが１つのＤＮＡ構築物中に連結されているか、又は第１の発現カセットと第２の発現カセットを異なるＤＮＡ構築物として含む、請求項２０又は２１に記載のシステム。
【請求項２３】
標的遺伝子がレポーター遺伝子又は疾患の治療に用い得る治療用遺伝子である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２４】
請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のシステムを保持したベクター。
【請求項２５】
アデノ随伴ウイルスベクターである請求項２４記載のベクター。
【請求項２６】
外殻に標的細胞特異的結合ペプチドが挿入され、該標的細胞特異的結合ペプチドを発現する細胞に対する指向性を有する外殻改変ウイルスベクターである、請求項２５記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項２７】
標的細胞特異的結合ペプチドがＲＧＤ、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号３６）、ＮＧＲ、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（配列番号３７）、ＣＬＳＳＲＬＤＡＣ（配列番号４０）、ＣＮＳＲＬＨＬＲＣ（配列番号４１）、ＣＥＮＷＷＧＤＶＣ（配列番号４２）、ＷＲＣＶＬＲＥＧＰＡＧＧＣＡＷＦＮＲＨＲＬ（配列番号４３）、ＣＬＰＶＡＳＣ（配列番号４４）、ＣＧＡＲＥＭＣ（配列番号４５）、ＣＫＳＴＨＤＲＬＣ（配列番号４６）、ＣＧＮＫＲＴＲＧＣ（配列番号４７）、ＡＰＲＰＧ（配列番号４８）、ＫＱＡＧＤＶ（配列番号４９）、ＬＤＶ、ＫＲＬＤＧＳ（配列番号５０）及びＤＧＥＡ（配列番号５１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２６記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項２８】
請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のベクターを含む疾患検出又は治療用製剤。
【請求項２９】
（ｉ）  ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ、
（ｉｉ）  ポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及び
（ｉｉｉ）  ＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡ
が（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の順で、（ｉｉ）のＤＮＡが（ｉ）と（ｉｉｉ）のＤＮＡの間に挟みこまれて融合したＤＮＡからなる転写因子をコードするＤＮＡ配列をｈＴＥＲＴプロモーターの下流に連結した構造を有するＤＮＡ構築物。
【請求項３０】
配列番号２２で表される配列からなるＤＮＡを含む、請求項２９記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３１】
（ｉ）  ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ、
（ｉｉ）  ポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をコードするＤＮＡ及び
（ｉｉｉ）  ＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードするＤＮＡ、
が（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の順で、（ｉｉ）のＤＮＡが（ｉ）と（ｉｉｉ）のＤＮＡの間に挟みこまれて融合したＤＮＡをｈＴＥＲＴプロモーターの下流に連結した第１の発現カセットであって、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）とポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）が挿入されたグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）と転写活性化ドメインの融合タンパク質である転写因子を発現し得る第１の発現カセット、並びに前記転写因子に応答性であり、ＧＡＬ４結合部位を含む誘導性プロモーター（ＧＡＬ４／ＴＡＴＡ）の下流に標的遺伝子を連結した第２の発現カセットを上記特異的プロモーターが活性である細胞に導入することにより、特異的プロモーターの活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで上昇させる方法。
【請求項３２】
（ｉｉ）のＤＮＡにおいて、ポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）若しくはポリプロリン（ＰｏｌｙＰ）をコードするＤＮＡが、グルココルチコイドレセプターのアミノ酸配列の４番目のＴｙｒの後に挿入された融合タンパク質をコードする、配列番号５に表される塩基配列からなる、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
標的遺伝子がレポーター遺伝子又は疾患の治療に用い得る治療用遺伝子である、請求項３１又は３２に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成23年9月28日(2011.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)  GAL4のDNA結合ドメインをコードするDNA、
(ii)  ポリグルタミン（Poly Q)若しくはポリプロリン（PolyP)をコードするDNAが挿入されたグルココルチコイドレセプター（GR)をコードするDNA及び
(iii)  VP16の転写活性化ドメインをコードするDNA、
が(i)、(ii)及び(iii)の順で、(ii）のDNAが(i)と(iii)のDNAの間に挟みこまれて融合したDNAをhTERTプロモーターの下流に連結した第１の発現カセットであって、GAL4のDNA結合ドメイン(GAL4 DBD)とポリグルタミン（Poly Q)若しくはポリプロリン（PolyP)が挿入されたグルココルチコイドレセプター（GR)と転写活性化ドメインの融合タンパク質である転写因子を発現し得る第１の発現カセット、並びに前記転写因子に応答性であり、GAL4結合部位を含む誘導性プロモーター(GAL4/TATA)の下流に標的遺伝子を連結した第２の発現カセットを含む、前記特異的プロモーターの転写活性を上昇させるためのシステム。
【請求項２】
(ii)のDNAにおいて、ポリグルタミン（Poly Q)若しくはポリプロリン（PolyP)をコードするDNAが、グルココルチコイドレセプターのアミノ酸配列の４番目のTyrの後に挿入された融合タンパク質をコードする、配列番号５に表される塩基配列からなる、請求項１記載のシステム。
【請求項３】
第１の発現カセットの下流に第２の発現カセットが１つのDNA構築物中に連結されているか、又は第１の発現カセットと第２の発現カセットを異なるDNA構築物として含む、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項４】
標的遺伝子がレポーター遺伝子又は疾患の治療に用い得る治療用遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステムを保持したベクター。
【請求項６】
アデノ随伴ウイルスベクターである請求項５記載のベクター。
【請求項７】
外殻に標的細胞特異的結合ペプチドが挿入され、該標的細胞特異的結合ペプチドを発現する細胞に対する指向性を有する外殻改変ウイルスベクターである、請求項６記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項８】
標的細胞特異的結合ペプチドがRGD、CDCRGDCFC（配列番号３６）、NGR、CNGRCVSGCAGRC（配列番号３７）、CLSSRLDAC（配列番号４０）、CNSRLHLRC（配列番号４１）、CENWWGDVC（配列番号４２）、WRCVLREGPAGGCAWFNRHRL（配列番号４３）、CLPVASC（配列番号４４）、CGAREMC（配列番号４５）、CKSTHDRLC（配列番号４６）、CGNKRTRGC（配列番号４７）、APRPG（配列番号４８）、KQAGDV（配列番号４９）、LDV、KRLDGS（配列番号５０）及びDGEA（配列番号５１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載のベクターを含む疾患検出又は治療用製剤。
【請求項１０】
(i)  GAL4のDNA結合ドメインをコードするDNA、
(ii)  ポリグルタミン（Poly Q)若しくはポリプロリン（PolyP)をコードするDNAが挿入されたグルココルチコイドレセプター（GR)をコードするDNA及び
(iii)  VP16の転写活性化ドメインをコードするDNA
が(i)、(ii)及び(iii)の順で、(ii）のDNAが(i)と(iii)のDNAの間に挟みこまれて融合したDNAからなる転写因子をコードするDNA配列をhTERTプロモーターの下流に連結した構造を有するDNA構築物。
【請求項１１】
配列番号２２で表される配列からなるDNAを含む、請求項１０記載のDNA構築物。
【請求項１２】
(i)  GAL4のDNA結合ドメインをコードするDNA、
(ii)  ポリグルタミン（Poly Q)若しくはポリプロリン（PolyP)をコードするDNAが挿入されたグルココルチコイドレセプター（GR)をコードするDNA及び
(iii)  VP16の転写活性化ドメインをコードするDNA、
が(i)、(ii)及び(iii)の順で、(ii）のDNAが(i)と(iii)のDNAの間に挟みこまれて融合したDNAをhTERTプロモーターの下流に連結した第１の発現カセットであって、GAL4のDNA結合ドメイン(GAL4 DBD)とポリグルタミン（Poly Q)若しくはポリプロリン（PolyP)が挿入されたグルココルチコイドレセプター（GR)と転写活性化ドメインの融合タンパク質である転写因子を発現し得る第１の発現カセット、並びに前記転写因子に応答性であり、GAL4結合部位を含む誘導性プロモーター(GAL4/TATA)の下流に標的遺伝子を連結した第２の発現カセットを上記特異的プロモーターが活性である細胞に導入することにより、特異的プロモーターの活性をin vitroで上昇させる方法。
【請求項１３】
(ii)のDNAにおいて、ポリグルタミン（Poly Q)若しくはポリプロリン（PolyP)をコードするDNAが、グルココルチコイドレセプターのアミノ酸配列の４番目のTyrの後に挿入された融合タンパク質をコードする、配列番号５に表される塩基配列からなる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
標的遺伝子がレポーター遺伝子又は疾患の治療に用い得る治療用遺伝子である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【国際調査報告】
2010114143.tif 000055
2010114143.tif 000056
2010114143.tif 000057
2010114143.tif 000058
2010114143.tif 000059
2010114143.tif 000060
2010114143.tif 000061