【事件の表示】
　特願２０１６−５２６５４１「固形癌を患う患者の生存期間の予後判定のための方法」拒絶査定不服審判事件〔平成２７年　１月２２日国際公開、ＷＯ２０１５／００７６２５、平成２８年　９月２９日国内公表、特表２０１６−５３０５０５〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯
　本願は、２０１４年（平成２６年）７月１１日（パリ条約による優先権主張外国庁受理　２０１３年７月１５日　欧州特許庁）を国際出願日とする出願であって、平成３０年４月５日付けで拒絶理由が通知され、同年７月１７日に意見書及び手続補正書が提出されたが、同年１０月１５日付けで拒絶査定がされ、これに対して、平成３１年２月２２日に拒絶査定不服審判の請求がされたものである。
第２　本願発明
　本願の請求項に係る発明は、平成３０年７月１７日にされた手続補正により補正された特許請求の範囲の請求項１ないし１４に記載された事項により特定されるものであるところ、その請求項１に係る発明（以下「本願発明」という。）は、以下のとおりである。
「　　【請求項１】
　固形癌を患う患者の生存期間の予後判定のためのデータを提供するためのインビトロ方法であって、以下の段階：
ａ）患者からの腫瘍組織試料中のＣＤ８＋細胞の細胞密度を定量する段階、
ｂ）患者からの腫瘍誘導型リンパ構造中のＤＣ−ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度を定量する段階、
ｃ）段階ａ）及びｂ）で得られた細胞密度の値を、各位置で各細胞型について予め決定された参照値と比較する段階、並びに
ｄ）ＣＤ８＋細胞及びＤＣ−ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度が、予め決定された参照値よりも高い場合、患者に生存期間の予後良好を提供し、
ＣＤ８＋細胞及びＤＣ−ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度が、予め決定された参照値よりも低い場合、患者に生存期間の予後不良を提供し、又は
一方のマーカー細胞密度が、予め決定された参照値よりも高く、他方のマーカーの細胞密度が、予め決定された参照値よりも低い場合、患者に生存期間の予後中間を提供する段階を含み、ＴＮＭ病期分類と組み合わせて使用される、
方法。」
第３　原査定の拒絶の理由
　原査定の拒絶の理由の概要は、以下のとおりである。
　（進歩性）この出願の請求項１−１４に係る発明は、本願の優先権主張の日前に電気通信回線を通じて公衆に利用可能となった下記の引用文献１に記載された発明、本願の優先権主張の日前に頒布された刊行物である下記の引用文献２に記載された発明、並びに、下記の引用文献３及び４に記載された周知技術に基づいて、その出願前にその発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条２項の規定により特許を受けることができない。
引用文献１：Romain Remark, Marco Alifano, Isabelle Cremer, et al.，“Characteristics and clinical impacts of the immune environments in colorectal and renal cell carcinoma lung metastases: influence of tumor origin”，[online]，２０１３年６月１９日，Clinical Cancer Research，Vol.19, No.15，Paae.4079-4091
引用文献２：Marie-Caroline Dieu-Nosjean, Martine Antoine, Claire Danel, et al.，“Long-Term Survival for Patients With Non-Small-Cell Lung Cancer With Intratumoral Lymphoid Structures”，Journal of Clinical Oncology，米国，２００８年９月２０日，Vol.26, No.27，Page.4410-4417
引用文献３：特表２０１２−５１３０１６号公報
引用文献４：特表２０１１−５２１２４０号公報
第４　引用文献の記載及び引用発明
１　引用文献１について
（１）引用文献１には、次の事項が記載されている（表記上の制約により、発音区別符号は省略した。下線は当審において付加した。引用文献の記載において、以下同様。）。
（引１−ア）「Abstract
　Purpose: If immune cells are involved in tumor surveillance and have a prognostic impact in most primary tumors, little is known about their significance in metastases. Because patients’ survival is heterogeneous, even at metastatic stages, we hypothesized that immune cells may be involved in the control of metastases. We therefore characterized the tumor immune microenvironment and its prognostic value in colorectal and renal cell carcinoma (RCC) metastases, and compared it to primary tumors.
　Experimental Design: We analyzed by immunohistochemistry (n = 192) and qPCR (n = 32) the immune environments of colorectal carcinoma and RCC lung metastases.
　Results: Metastases from colorectal carcinoma and RCC have different immune infiltrates. Higher densities of DC-LAMP+ mature dendritic cells (P  0.0001) and lower densities of NKp46+ NK cells (P  0.0001) were observed in colorectal carcinoma as compared to RCC metastases, whereas densities of T cells were similar. High densities of CD8+ and DC-LAMP+ cells correlated with longer overall survival (OS) in colorectal carcinoma (P = 0.008) and shorter OS in RCC (P  0.0001). High NK-cell densities were associated with improved survival inRCC (P = 0.002) but not in colorectal carcinoma. Densities of immune cells correlated significantly from primary to relapsing metastases for the same patient. A TH1 orientation was found in colorectal carcinoma metastases, whereas a heterogeneous immune gene expression was found in RCC metastases.
　Conclusions: Our results show a major prognostic value of the immune pattern (CD8+ / DC-LAMP+ cell densities) in colorectal carcinoma and RCC, reproducible from primary to metastatic tumors, although with opposite clinical impacts, and highlight the role of the tumor cell in shaping its immune environment.」
（当審訳：要旨
　目的：免疫細胞が腫瘍監視に関与し、ほとんどの原発腫瘍の予後に影響があるとしても、転移におけるその重要性についてはほとんど知られていない。患者の生存率は、転移期であっても不均一であるため、免疫細胞が転移の制御に関与している可能性があるという仮説を立てた。したがって、我々は、結腸直腸及び腎細胞癌（RCC）転移における腫瘍免疫微小環境とその予後的価値を特徴づけ、それを原発腫瘍と比較した。
　実験計画：免疫組織化学（n = 192）とqPCR（n = 32）で、結腸直腸癌とRCCの肺転移における免疫環境を分析した。
　結果：結腸直腸癌とRCCからの転移には、異なる免疫浸潤がある。T細胞の密度が類似していたのに対し、RCC転移と比較して結腸直腸癌では、高密度（P 0.0001）のDC-LAMP+成熟樹状細胞及び低密度（P 0.0001）のNKp46+NK細胞が観察された。高密度のCD8+及びDC-LAMP+細胞は、結腸直腸癌のより長い（P = 0.008）全生存（OS）及びRCCのより短い（P 0.0001）OSと相関した。高いNK細胞密度は、RCCの生存率の改善と関連していた（P = 0.002）が、結腸直腸癌ではそうではなかった。免疫細胞の密度は、同じ患者の原発巣からの再発転移に有意に相関していた。結腸直腸癌の転移でTH1配向が見つかったが、RCCの転移では異種の免疫遺伝子発現が見つかった。
　結論：我々の結果は、結腸直腸癌及びRCCにおける免疫パターン（CD8+ / DC-LAMP+細胞密度）の主要な予後的価値を示し、原発腫瘍から転移腫瘍まで再現可能であり、臨床的影響は反対であるが、免疫環境を形成における腫瘍細胞の役割を強調する。）
（引１−イ）「Introduction
　Immune cells are found in human solid tumors, and the immune pattern of the tumor microenvironment is a major predictor of patient survival in a large array of primary tumors (1). Thus, a high density of T cells with a TH1 and CD8+ T cells cytotoxic orientation or of mature dendritic cells (DC) are beneficial in most cancers, especially in colorectal (2.4), lung (5), breast (6), gastric (7), pancreatic (8), urothelial (9), hepatocellular (10), esophageal (11), ovarian cancer (12) and melanoma (13), with the exception of renal cell carcinoma (RCC) in which high densities of CD8+ and CD45RO+ cells are associated with poor prognosis (14, 15).
　Even if metastatic spreading is the main cause of death by cancer (16), metastatic patients have heterogeneous survival (17). A classical view of cancer progression is that genetic modifications (18) may allow malignant cells to escape local and systemic immune control (19) and consequently invade and metastasize in distant organs. This hypothesis would predict that the immune microenvironment in metastatic sites should be poor and have no impact on clinical outcome. Only a limited number of studies have reported the presence of immune cells in metastatic lesions. They showed that high densities of CD8+ T cells were associated with longer survival in colorectal carcinoma (20) and ovarian cancer (21), and potential response to chemotherapy in liver metastases from colorectal carcinoma (22). Another question, which remains largely unanswered, concerns the respective roles of the malignant cells and the seeding organ in shaping the immune microenvironment.
　We therefore analyzed the immune environment of colorectal carcinoma and RCC metastases seeded in a same organ, the lung, compared coincident and relapsing metastases in the lung, and the primary tumor from the same patients, and determined their clinical impacts.
　We report that tumor cells induce a characteristic and reproducible immune pattern in the primary and metastatic tumors, supporting the hypothesis that themalignant cells, rather than the host organ, shape their microenvironment. We found that a high infiltration by DC-LAMP+ mature dendritic cells and CD8+ T cells is a major predictor of good survival in lung metastases from colorectal carcinoma, whereas it is associated with poor survival in lung metastases from RCC. This shows that the immune microenvironment pattern remains a major prognostic factor even in advanced cancer stages, but with different consequences depending on the origin of the primary tumor. Altogether our results suggest a strong influence of the tumor origin on the immune environment characteristics and clinical impact.」
（当審訳：はじめに
　免疫細胞はヒトの固形腫瘍に見られ、腫瘍微小環境の免疫パターンは、大規模な配列の原発腫瘍において、患者の生存の主要な予測因子である（1）。したがって、高密度なTH1を伴うT細胞及び細胞傷害性配向を伴うCD8+T細胞又は成熟樹状細胞（DC）は、ほとんどの癌、特に、結腸直腸（2-4）、肺（5）、乳房（6）、胃（7）、膵臓（8）、尿路上皮（9）、肝細胞（10）、食道（11）、卵巣癌（12）及び黒色腫（13）で有益である。腎細胞癌（RCC）は例外であり、高密度のCD8+及びCD45RO+細胞は、不良な予後に関係している（14、15）。
　たとえ転移による広がりが癌による死亡の主な原因であったとしても（16）、転移した患者の生存率は不均一である（17）。癌の進行に関する古典的な見解は、遺伝的修飾（18）により、悪性細胞が局所及び全身の免疫制御から逃れることができ（19）、その結果、遠隔臓器に侵入して転移するというものである。この仮説は、転移部位の免疫微小環境は貧弱であり、臨床結果に影響を与えないはずであると予測するだろう。限られた数の研究のみが、転移病変における免疫細胞の存在を報告している。それらは、高密度のCD8+T細胞が、結腸直腸癌（20）及び卵巣癌（21）の長い生存期間、並びに、結腸直腸癌からの肝転移（22）の化学療法に対する潜在的反応に関連することを示した。主に未回答のままである別の問題は、免疫微小環境の形成における悪性細胞及び播種臓器それぞれの役割に関するものである。
　したがって、同じ臓器、肺に播種された結腸直腸癌とRCCの転移における免疫環境を分析し、肺の同時転移と再発転移、及び同じ患者からの原発腫瘍を比較し、それらの臨床的影響を決定した。
　腫瘍細胞は原発及び転移腫瘍において特徴的かつ再現可能な免疫パターンを誘発することを報告し、宿主臓器ではなく悪性細胞が微小環境を形成するという仮説を支持する。DC-LAMP+成熟樹状細胞及びCD8+T細胞の高い浸潤は、結腸直腸癌からの肺転移における良好な生存率の主要な予測因子であり、RCCからの肺転移における生存率の低さと関連していることがわかった。これは、免疫微小環境パターンが進行した癌の段階でも主要な予後因子であるが、原発腫瘍の起源に応じて異なる結果をもたらすことを示している。全体的に、我々の結果は、免疫環境特性と臨床的影響に対する腫瘍の起源の強い影響を示唆している。）
（引１−ウ）「Patients and Methods
Patients
　We constituted a retrospective and unselected cohort of 140 patients with colorectal carcinoma lung metastasis operated at Hotel-Dieu hospital between 2000 and 2010 and 52 patients with RCC lung metastasis, operated at Hotel-Dieu or Laennec/Hopital Europeen Georges Pompidou hospitals between 1992 and 2010. In the RCC series, 51 of 52 patients were treated with radical nephrectomy and 1 with partial nephrectomy. None of the patients had signs of local recurrence of primary tumor. We also analyzed 25 colorectal carcinoma and 24 RCC primary tumors from the same patients, operated at Saint-Antoine, Cochin, or Necker-Enfants Malades hospitals between 1987 and 2008. In addition, 14 coincident and 12 recurrent colorectal carcinoma lung metastases from the same patients were studied. Altogether, 218 lung metastases from 192 patients were analyzed.
　Among these 192 patients, 32 frozen samples of lung metastases were available for patients with colorectal carcinoma (n = 19) or RCC (n = 13).
　Baseline characteristics of these patients are summarized in Supplementary Tables S1 and S2.
　All experiments were conducted with the agreement of the Ile de France II ethics committee (no. 2012-0612). 
Immunohistochemistry
　For each tumor, 2 observers (R. Remark and D. Damotte, A. Lupo, A. Cazes, L. Gibault, or V. Verkarre, expert pathologists) selected the tumor section containing the highest density of immune cells on hematoxylin and eosin stained slides. Serial 5-μm formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections were stained with autostainer Link 48 (Dako). Tissue sections were incubated with primary antibodies [CD3 polyclonal antibody (Dako), CD8 (SP16, Springbioscience), CD20 (L26, Dako), DC-LAMP (1010.01, Dendritics), granzyme B (11F1, Novocastra), NKp46 (195314, RD Systems), or PNAd (MECA-79, BD Pharmingen)] followed by secondary antibodies coupled with biotin or alkaline phosphatase. Biotinylated antibodies were coupled with streptavidin-peroxidase and peroxidase activity was revealed using 3-amino-9-ethylcarbazole substrate (Vector Laboratories). Alkaline phosphatase activity was revealed using alkaline phosphatase substrate III (Vector Laboratories).
　The density of DC-LAMP+ cells was manually counted on the entire section as previously described (23). CD3+ , CD8+ , granzyme B+ , and NKp46+ cells were counted in the center of the tumor and in the invasive margin of the tumor with the convergence to the mean method (24). For each slide, 40 to 100 high-power fields (1.37 - 3.43 mm2) were examined on each tumor zone. Both immunostaining and scoring were evaluated by 3 independent observers blinded to clinical data (R. Remark, L. Crozet, and A. Lupo, expert pathologist).」
（当審訳：患者と方法
患者
　2000年から2010年の間にHotel-Dieu病院で手術された結腸直腸癌肺転移患者140人と、1992年から2010年の間にHotel-Dieu又はLaennec/Hopital Europeen Georges Pompidou病院で手術されたRCC肺転移患者52人の回顧の非選択なコホートを構成した。RCCシリーズでは、52人の患者のうち51人が根治的腎摘除術で治療され、1人が腎部分切除術で治療された。原発腫瘍の局所再発の徴候を示した患者はいなかった。また、1987年から2008年の間にサンアントワーヌ、コーチン又はネッカー=エンファントマラデス病院で手術された、同じ患者からの25の結腸直腸癌と24のRCC原発腫瘍を分析した。さらに、同じ患者からの結腸直腸癌の14の同時及び12の再発肺転移が研究された。合計で、192人の患者からの218の肺転移が分析された。
　これらの192人の患者のうち、結腸直腸癌（n = 19）又はRCC（n = 13）の患者の32個の肺転移の凍結サンプルが利用可能だった。
　これらの患者のベースライン特性は、補足表S1及びS2に要約されている。
　すべての実験は、イル・ド・フランスII倫理委員会（no. 2012-0612）の同意を得て実施された。
免疫組織化学
　
各腫瘍について
ホルマリン固定及びパラフィン包埋組織切片
　
DC-LAMP
+
細胞の密度
CD8
+
免疫染色とスコアリング
（引１−エ）「Statistical analyses
　We used the Mann - Whitney test to compare the densities of infiltrating immune cells in the different tumors and DCt, and the Wilcoxon matched pairs test to compare the density of infiltrating immune cells in different tumors from the same patient. Because all gene expression comparisons were preplanned and the 51 genes clustered according to their immune functions before analysis, the P values were not corrected by Bonferroni or similar methods. Correlations were evaluated by the Spearman test. Overall survival (OS) curves were estimated by Kaplan.Meier method and differences between the groups of patients were calculated using the log-rank test. The start of follow-up for OS was the time of lung surgery. In addition to mature dendritic cells, CD8+ T cells, and NK cells densities, the following available clinical parameters were tested: initial stage (colorectal carcinoma), completeness of resection at pulmonary level, number of lung metastases, presence of extrathoracic metastases at time of lung surgery, thoracic lymph node invasion, carcinoembryonic antigen (CEA) level (colorectal carcinoma), initial Fuhrman nuclear grade (RCC), presence of metastases at presentation (RCC), time from lung metastasis diagnosis to surgery (RCC), disease-free interval (RCC), alkaline phosphatase, hemoglobin, neutrophils, and platelets levels (RCC). The lower limit of normal was used for hemoglobin (cutoff values: men = 13 g/dL and women = 12 g/dL) and the upper limit (ULN) was used for alkaline phosphatase (cutoff value: 80 U/L), neutrophils (cutoff value: 7500/mm3), and platelets (cutoff value: 400,000/mm3). With respect to immune cell densities and number of metastases, the minimum P value approach was used to determine the cutoff for the best separation of patients referring to their OS outcome (outcome-oriented approach). Because the P values obtained might be overestimated, OS log-rank P values were corrected using the formula proposed by Altman and colleagues (25) and using 10-fold crossvalidations as recommended by Faraggi and colleagues (26). The confidence interval was important around the optimal P value (Supplementary Table S3). We have also ensured that the significance established at the optimal cutoff remained valid at the quartiles (dataoriented approach). A P value less than 0.05 was considered statistically significant. Independent parameters identified at univariate analysis as possibly influencing outcome (P  0.1) were introduced in a multivariate Coxproportional hazards regression model. All analyses were conducted with Prism 5 (GraphPad), Statview (Abacus Systems), and the R (http://www.r-project.org/).」
（当審訳：統計分析
　Mann-Whitney検定を使用して、異なる腫瘍の浸潤免疫細胞の密度とΔCtを比較し、Wilcoxon一致ペア検定を使用して、同じ患者の異なる腫瘍の浸潤免疫細胞の密度を比較した。遺伝子発現の比較はすべて事前に計画されており、分析前に51の遺伝子が免疫機能に従ってクラスター化されていたため、P値はBonferroni又は同様の方法では修正されなかった。スピアマン検定により相関を評価した。全生存（OS）曲線はカプラン・マイヤー法によって推定され、患者のグループ間の差はログランク検定を使用して計算された。OSのフォローアップの開始は、肺手術の時間とした。成熟樹状細胞、CD8+T細胞及びNK細胞の密度に加えて、以下の利用可能な臨床パラメーターが試験された：初期ステージ（結腸直腸癌）、肺レベルでの切除の完全性、肺転移の数、肺手術時点での胸部外転移の存在、胸部リンパ節浸潤、癌胎児性抗原（CEA）レベル（結腸直腸癌）、初期ファールマン核悪性度（RCC）、診察時転移の存在（RCC）、肺転移診断から手術までの時間（RCC）、無病インターバル（RCC）、アルカリホスファターゼ、ヘモグロビン、好中球及び血小板レベル（RCC）。正常の下限はヘモグロビンに使用され（カットオフ値：男性= 13 g / dL及び女性= 12 g / dL）、上限（ULN）はアルカリホスファターゼ（カットオフ値：80 U / L）、好中球（カットオフ値：7500 / mm3）及び血小板（カットオフ値：400,000 / mm3）に使用された。免疫細胞密度と転移数に関して、「最小P値」アプローチを使用して、OSの結果を参照して患者を最良に分離するためのカットオフを決定した（結果指向アプローチ）。得られたP値は過大評価される可能性があるため、OSログランクP値は、Altmanと同僚が提案した式（25）と、Faraggiと同僚が推奨した10重の交差検証（26）を使用して修正した。信頼区間は、最適なP値の周りで重要だった（補足表S3）。また、最適なカットオフで確立された有意性が四分位数でも有効であることを確認した（データ指向アプローチ）。P値が0.05未満の場合、統計的に有意と見なされた。単変量解析で結果に影響を与える可能性がある（P 0.1）と特定された独立パラメーターは、多変量Cox比例ハザード回帰モデルに導入された。すべての分析は、Prism 5（GraphPad）、Statview（Abacus Systems）及びR（http://www.r-project.org/）で実施された。）
（引１−オ）「Results
The densities of immune cells correlate with OS in lung metastases from colorectal carcinoma
　Because densities of CD8+ T cells and DC-LAMP+ mature dendritic cells in primary tumors correlate with survival (1), we counted these cells in lung metastases from 140 colorectal carcinoma patients. We also quantified NKp46+ NK cells as a marker of innate immune response. High densities of infiltrating CD8+ T cells (Fig. 1A) and mature dendritic cells (Fig. 1B) were associated with prolongedOS(P = 0.039 and 0.001, respectively). Combination of these 2 immune parameters allowed to identify patients with better outcome (CD8high / DC-LAMPhigh ; Fig. 1C, P = 0.008). NKp46+ cell density did not predict clinical outcome (P = 0.12; Fig. 1d). Significance was established at the optimal cutoff, but remained valid at quartiles including the median (Supplementary Table S3). The quantification of CD8+ T cells separately in the center of the tumor and the invasive margin regions yielded similar results (Supplementary Fig. S1). Univariate analysis of other clinical and pathological parameters is reported in Table 1. At multivariate analysis (Table 1), immune pattern (CD8+ /DC-LAMP+ densities) of metastases was the strongest independent predictor of survival.
　As reported in colorectal carcinoma primary tumors (3), gene expression analyses revealed that a strong CD8+ and DC-LAMP+ cell infiltration was associated with a higher expression of genes linked to TH1 orientation, cytotoxicity, and lymphoid chemokines/chemokine receptors in lung metastases (Fig. 1e). Expressions of clusters of genes associated with TH2 orientation, inflammation, angiogenesis, or immunosuppression were not correlated with the CD8+ / DC-LAMP+ densities. However, individual gene expression of VEGF was inversely correlated with CD8+ /DC-LAMP+ infiltration, as reported in primary colorectal carcinoma (3, 27) whereas that of IL17 and CTLA4 were positively correlated (Fig. 1e).
The in situ immune pattern is reproduced from primary tumors to metastases in colorectal carcinoma
　To investigate whether the in situ immune pattern varies during the course of the metastatic disease for a given patient, we analyzed coincident colorectal carcinoma lung metastases occurring in the other lung side (n = 14) operated 1 to 9 months after the initial metastatic surgery, and/or relapsing metastasis occurring 14 to 52 months after surgical removal of the lung metastasis (n = 12; Fig. 2A). Densities of CD8+ (Fig. 2B), DC-LAMP+ (Fig. 2C), and NKp46+ (Fig. 2D) cells were not significantly different between 2 coincident metastatic sites or between the first lung metastasis and its relapse. We found correlations in the densities of immune cells between coincident and relapsing metastases (Fig. 2B-D).
　To address the question of the relationship between immune cell densities in the primary tumor andmetastasis, we compared immune infiltrates of primary tumors and lung metastases from the same individuals (n = 25; Fig. 2E). Primary colorectal carcinoma differed from lung metastases by significantly higher density of CD8+ T cells (P  0.05; Fig. 2F), but the density of each cell type was positively correlated between the primary and the metastatic tumors (Fig. 2F-H for CD8+ , DC-LAMP+ , and NKp46+ cells, respectively). We had access to a small number (n = 5) of matched hepatic metastases and the correlation was also found between primary colorectal carcinoma, lung, and liver metastases (data not shown).」
（当審訳：結果
免疫細胞の密度は結腸直腸癌からの肺転移におけるOSと相関する
　原発腫瘍におけるCD8+T細胞及びDC-LAMP+成熟樹状細胞の密度は生存率と相関するため（1）、140人の結腸直腸癌患者の肺転移におけるこれらの細胞を数えた。また、自然免疫応答のマーカーとしてNKp46+ NK細胞を定量化した。
高密度の浸潤CD8
+
 T細胞（図1A）及び成熟樹状細胞（図1B）は、OSの延長に関連していた（それぞれP = 0.039及び0.001）。これらの2つの免疫パラメーターの組み合わせは、転帰が良好な患者の特定を可能とした（CD8
high
 / DC-LAMP
high
、図1C、P = 0.008）。
多変量解析（表1）では、転移の免疫パターン（CD8
+
 / DC-LAMP
+
密度）が生存の最も強力な独立予測因子だった。
　結腸直腸癌原発腫瘍で報告されているように（3）、遺伝子発現解析により、強いCD8+及びDC-LAMP+細胞浸潤が、TH1配向、細胞毒性及びリンパ系ケモカイン/ケモカイン受容体に関連する遺伝子の肺転移におけるより高い発現と関連していることが明らかになった（ 図1e）。TH2配向、炎症、血管新生又は免疫抑制に関連する遺伝子クラスターの発現は、CD8+ / DC-LAMP+密度と相関していなかった。しかし、VEGFの個々の遺伝子発現はCD8+ / DC-LAMP+浸潤と逆相関があり、原発性結腸直腸癌で報告されている（3、27）ように、IL17とCTLA4の発現は正の相関があった（図1e）。
結腸直腸癌のin situ免疫パターンは、原発腫瘍から転移に再現される
　特定の患者において転移性疾患の過程でin situ免疫パターンが変化するかどうかを調べるために、最初の転移手術から1〜9ヵ月後に肺の他側（n = 14）で発生した結腸直腸癌の同時肺転移、及び／又は肺転移の外科的除去の14〜52ヵ月後に発生した再発転移（n = 12；図2A）を分析した。CD8+（図2B）、DC-LAMP+（図2C）及びNKp46+（図2D）細胞の密度は、2つの同時転移部位間又は最初の肺転移とその再発間で有意な差はなかった。同時転移と再発転移の間で免疫細胞の密度に相関関係が見つかった（図2B-D）。
　原発腫瘍と転移における免疫細胞密度の関係の問題に対処するために、同じ個体からの原発腫瘍と肺転移の免疫浸潤を比較した（n = 25；図2E）。原発性結腸直腸癌は、肺転移よりCD8+T細胞の密度が有意に高かった（P 0.05；図2F）が、各細胞型の密度は原発腫瘍と転移腫瘍の間で正の相関があった（CD8+、DC-LAMP+及びNKp46+細胞のそれぞれに対して図2F-H）。少数（n = 5）の一致した肝転移へアクセスし、原発性結腸直腸癌、肺及び肝転移の間にも相関が見つかった（データは示していない）。）
（引１−カ）「Discussion
　The objective of our study was to characterize the immune microenvironment of metastatic lesions and its clinical impact. If several clinical parameters have been reported to be associated with survival in metastatic patients, none has obtained general agreement (17, 28), justifying the search of new nonclinical prognostic markers.Wereport here a major prognostic value of the immunepattern (densities of mature dendritic cells and CD8+ T cells) in metastases from colorectal carcinoma and RCC, although with opposite impact on OS. In our cohorts of oligometastatic surgically treated patients, the strongest prognosticator was the immune pattern, that is CD8+ and DC-LAMP+ cell density combination, as reported for many primary tumors (1.13, 23, 27, 29.31). NK cells density had also a prognostic value in RCC. It seems that the immune pattern is a powerful prognostic factor and a potentially important parameter for metastatic patients’ management. Because of the incomplete data collection (especially for laboratory values which were difficult to collect in a retrospective analysis), conclusions remain difficult to draw on the prognostic value of the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (32) and Heng and colleagues (33) prognostic factor models. Our previous studies showed the highly clinical impact of the CD8+ cell densities in primary colorectal carcinoma up to stage III, that is without distant metastases at the time of diagnosis (2). In this study, the impact of the immune pattern on OS was lower in primary tumors (P = 0.15 and 0.01 for CD8+ and DC-LAMP+ cells, respectively; data not shown) than in lung metastases from colorectal carcinoma (P = 0.039 and 0.001 for CD8+ and DC-LAMP+ cells, respectively; data not shown).
　Clinical significance of CD8+ T cells density seems to be contrasted, according to primary tumor’s origin. Although we found similar densities of CD8+ T cells in both colorectal carcinoma and RCC metastases, the prognostic value of these cells was different. Similar conflicting observations about the prognostic role of immune infiltrate have been reported in primary colorectal carcinoma and RCC (2, 4, 15, 27) and one could hypothesize that the seeding organ (colon or kidney) may explain this variability in the outcome. Because it remains valid in the lung metastases, our data support the idea that the kind of primary tumor is essential in determining the prognostic value of the host immune infiltrate at metastatic level. This is in accordance with the fact that primary RCC seems as an exception to the well-documented general findings that TH1 / CD8 immune cell infiltrate and high density of mature dendritic cells correlate with favorable prognosis in the majority of solid tumors (1). The differential clinical impacts of the T cells might be due to their site of activation. Indeed, we have previously reported that TLS in early stages of non.small cell lung cancer may act as potential structures of antitumor T-cell generation (23, 34). We found more TLS, reflected by higher densities of mature dendritic cells and higher expression of CCL19 gene, a chemokine expressed in TLS (34), in colorectal carcinoma than in RCC metastases. Because TLS are scarce in RCC lung metastases and numerous in lung metastases from colorectal carcinoma, one may postulate that the T cells present in the former have not been educated in tumor-adjacent TLS (35) and reflect rather a chronic inflammatory reaction which is known to be deleterious for the host (36). Indeed, gene expression analyses revealed significant differences between lung metastases from colorectal carcinoma and RCC, which share a TH1 profile, but the latter exhibit also a TH2, inflammatory, and immunosuppressive pattern. The high expression of VEGF, IL-6, and M-CSF genes in RCC may also inhibit the differentiation of dendritic cells and induce monocyte differentiation to macrophages (37.39), which could initiate an impaired T-cell response in RCC, resulting in poor prognosis. Interestingly, VEGF gene expression was positively correlated with high CD8+ and DC-LAMP+ infiltration in RCC lung metastases and with low CD8+ and DC-LAMP+ infiltration in colorectal carcinoma lung metastases. Because it has been suggested that VEGF may induce non-coordinated immune responses (27), affect cytotoxic TH1 adaptive immune responses (39, 40) and contribute to the progression of malignant disease, the correlation between CD8+ /DC-LAMP+ densities and VEGF expression could be one explanation among others to explain the negative impact associated with this immune signature. Moreover, upregulation of IL6 and STAT3 genes in the CD8high / DC-LAMPhigh group could reflect the inflammatory milieu of the RCC microenvironment (41, 42). It could also explain the reasons that immunotherapies, which modify the acute/chronic inflammatory microenvironment, are often reported to have some efficacy in metastatic renal cell carcinoma (43).
　The Von Hippel Lindau phenotype, often found in RCC, may also be involved in the shaping of peculiar tumor microenvironments, through induction of hypoxia, production of VEGF, induction of regulatory immune circuits (44.47), and increased sensitivity of tumor cells to NK-cell lysis (48). It may also influence differently the stroma characteristics, the vascularization, or the collagen content which could also impact on the migration, organization, and functionality of intratumor immune cells (49). Together, these data may explain the negative clinical impact of the adaptive immune pattern at the primary and advanced stages of RCC.
　We found that colorectal carcinoma and RCC have a correlated pattern of DC-LAMP+ , CD8+ , and NKp46+ cells, from primary tumor to relapsing metastasis, which could reflect, either a potential imprinting of the immune microenvironment by the tumor cells or the possibility that the immune contexture in the primary tumor, results in educated immune cells that are recalled in the metastatic sites.
　Inconclusion,ourfindings highlight the fact thatduring all steps of cancer development, reciprocal interactions occur between immune and cancer cell and are critical for patients’ survival. The immune signature seems to be a phenotypic marker for the disease andis remarkably reproducedbetween primary andmetastatic sites inthe samepatient.The immune contexture affects OS in lung metastases from colorectal carcinoma and RCC, and the analysis of the immune pattern might be useful to guide therapeutics (50).」
（当審訳：討論
　我々の研究の目的は、転移性病変の免疫微小環境とその臨床的影響を特徴付けることであった。いくつかの臨床パラメータが転移患者の生存に関連すると報告されているとしても、一般的な同意を得たものはなく（17、28）、新しい非臨床予後マーカーの探索が正当化される。ここに、結腸直腸癌とRCCからの転移における免疫パターン（成熟樹状細胞及びCD8+T細胞の密度）の主要な予後的価値を報告する。ただし、それらのOSに対する影響は反対である。オリゴ転移性の外科的治療を受けた患者のコホートでは、多くの原発腫瘍で報告されている（1-13、23、27、29-31）ように、最も強力な予後因子は免疫パターン、つまりCD8+及びDC-LAMP+細胞密度の組み合わせであった。NK細胞密度は、RCCにおいて予後的価値があった。免疫パターンは強力な予後因子であり、転移患者の管理にとって潜在的に重要なパラメーターであると思われる。データの収集が不完全であるため（特に、回顧的分析において収集が困難な検査値について）、結論を引き出してメモリアルスローンケタリングがんセンター（32）並びにヘン及び同僚（33）の予後因子モデルの予後的価値に差し向けるのは依然として困難である。我々の以前の研究は、診断時に遠隔転移のないステージIIIまでの原発性結腸直腸癌におけるCD8+細胞密度の高い臨床的な影響を示した（2）。この研究では、OSに対する免疫パターンの影響は、原発腫瘍（CD8+及びDC-LAMP+細胞でそれぞれP = 0.15及び0.01；データは示していない）では、結腸直腸癌の肺転移よりも低かった（CD8+及びDC-LAMP+細胞でそれぞれP = 0.039及び0.001；データは示していない）。
　原発腫瘍の起源によると、CD8+T細胞密度の臨床的意義は対照的であるようだ。結腸直腸癌とRCC転移の両方で同様の密度のCD8+T細胞が見つかったが、これらの細胞の予後的価値は異なっていた。免疫浸潤の予後的役割についての同様の矛盾する観察結果が原発性結腸直腸癌及びRCCで報告されており（2、4、15、27）、播種臓器（結腸又は腎臓）が結果のこの変動を説明することができるという仮説を立てることができる。肺転移で有効であるため、我々のデータは、原発腫瘍の種類が、転移レベルでの宿主免疫浸潤の予後的価値を決定するのに不可欠であるという考えを支持している。これは、原発性RCCが、TH1 / CD8免疫細胞の浸潤及び高密度の成熟樹状細胞が大部分の固形腫瘍の良好な予後と相関するという十分に文書化された一般的な知見の例外と思われるという事実（1）と一致している。T細胞の臨床的影響の違いは、それらの活性化部位による可能性がある。実際、非小細胞肺癌の初期段階でのTLSは、抗腫瘍T細胞生成の潜在的な構造として作用する可能性があることを以前に報告している（23、34）。高密度の成熟樹状細胞とCCL19遺伝子の高い発現に反映されるより多くのTLSと、TLS中で発現したケモカイン（34）を、RCCよりも大腸癌転移で発見した。TLSはRCC肺転移に乏しく、結腸直腸癌肺転移に多数あるため、前者に存在するT細胞は腫瘍に隣接するTLSで教育を受けておらず（35）、むしろホストに対して有害であると知られている慢性炎症反応（36）を反映していると仮定することができる。実際、遺伝子発現解析により、結腸直腸癌とRCCからの肺転移の間の有意な差が明らかになった。それらはTH1プロファイルを共有するが、後者はTH2、炎症及び免疫抑制パターンも示す。RCCでのVEGF、IL-6及びM-CSF遺伝子の高発現は、樹状細胞の分化を阻害し、マクロファージへの単球分化を誘導する可能性があり（37-39）、RCCでT細胞応答の障害を引き起こし、予後不良になりうる。興味深いことに、VEGF遺伝子発現は、RCC肺転移における高いCD8+及びDC-LAMP+浸潤と、結腸直腸癌肺転移における低いCD8+及びDC-LAMP+浸潤と正の相関があった。VEGFは非協調免疫応答を誘発し（27）、細胞傷害性TH1適応免疫応答に影響を及ぼし（39、40）、悪性疾患の進行に寄与することが示唆されているため、CD8+ / DC-LAMP+密度とVEGF発現の相関は、この免疫サインに関連するマイナスの影響についての説明の1つになる。さらに、CD8high / DC-LAMPhighグループのIL6及びSTAT3遺伝子の上方制御は、RCC微小環境の炎症環境を反映している可能性がある（41、42）。また、急性／慢性炎症性微小環境を修正する免疫療法が、転移性腎細胞癌に有効性があることがしばしば報告されている（43）理由を説明することができる。
　RCCでよく見られるフォン・ヒッペル・リンダウ表現型は、低酸素症の誘導、VEGFの産生、調節免疫回路の誘導（44-47）、腫瘍細胞のNK細胞溶解への感受性増加（48）を通じて、特異な腫瘍微小環境の形成にも関与している可能性がある。また、間質の特性、血管新生、又は、腫瘍内免疫細胞の移動、組織化及び機能にも影響を与える可能性があるコラーゲン含有量（49）に異なる影響を与える可能性がある。合わせて、これらのデータは、RCCの初期及び進行期における適応免疫パターンの負の臨床的影響を説明するかもしれない。
　結腸直腸癌とRCCには、原発腫瘍から再発転移までのDC-LAMP+、CD8+及びNKp46+細胞の相関パターンがあることがわかった。これは、腫瘍細胞による免疫微小環境の潜在的な「刷り込み」、又は、原発腫瘍の免疫組織が、転移部位でリコールされる「教育された」免疫細胞をもたらす可能性のいずれかを反映している可能性がある。
　結論として、我々の調査結果は、癌発生のすべての段階で、免疫細胞と癌細胞の間で相互作用が発生し、患者の生存に重要であるという事実を強調している。免疫サインは、疾患の表現型マーカーであると思われ、同じ患者の原発部位と転移部位の間で著しく再現される。免疫状況は結腸直腸癌及びRCCからの肺転移のOSに影響し、免疫パターンの分析は治療法を導くのに役立つかもしれない（50）。）
（引１−キ）Ｆｉｇｕｒｅ　１　Ａ−Ｄ
「
Figure 1. Prognostic value of the densities of CD8+ T cells, DC-LAMPt mature dendritic cells, and NKp46+ NK cells in lung metastases from colorectal carcinoma. Kaplan.Meier curves for the duration ofOSaccording to a separated (A, B) and combined (C) analysis of CD8+ and DC-LAMP+ densities in colorectal carcinoma lung metastases. D, Kaplan.Meier curves for the duration of OS according to the densities of NKp46+ cells in colorectal carcinoma lung metastases (n = 84). The numbers of at risk patients according to a separated and combined analysis of CD8+ and DC-LAMP+ densities and NKp46+ cells densities were given. Statistical comparison was conducted by the log-rank test and all OS log-rank P values were corrected using the formula proposed by Altman and colleagues.」
（当審訳：図1。
結腸直腸癌からの肺転移におけるCD8
+
T細胞、DC-LAMP
+
成熟樹状細胞
密度の予後的価値
結腸直腸癌肺転移におけるCD8
+
及びDC-LAMP
+
密度の
組み合せ（C）分析による、OS期間
（引１−ク）「References
・・・
23. Dieu-NosjeanMC, AntoineM, Danel C, Heudes D, Wislez M, Poulot V, et al. Long-term survival for patients with non-small-cell lung cancer with intratumoral lymphoid structures. J Clin Oncol 2008;26:4410.7.」
イ　引用文献１に記載された発明の認定
（ア）引用文献１の記載において、「DC-LAMP+成熟樹状細胞」、「DC-LAMP+細胞」及び「DC-LAMP+」が、同じ細胞を意味することは明らかである。
（イ）引用文献１の記載において、「CD8+」、「CD8+細胞」及び「CD8+T細胞」が、同じ細胞を意味することは明らかである。
（ウ）　（引１−ウ）の「免疫組織化学
　
各腫瘍について
ホルマリン固定及びパラフィン包埋組織切片
　
DC-LAMP
+
細胞の密度
CD8
+
免疫染色とスコアリング
（エ）　（引１−オ）の「多変量解析（表1）では、転移の免疫パターン（CD8+ / DC-LAMP+密度）が生存の最も強力な独立予測因子だった。」との記載から、「転移の免疫パターン（CD8+T細胞密度 / DC-LAMP+成熟樹状細胞密度）」を生存の予測に利用できることが理解できる。
（オ）　（引１−キ）の図１Ｃから、結腸直腸癌肺転移の患者のOS期間は、CD8+T細胞密度及びDC-LAMP+成熟樹状細胞密度の双方が高い場合に相対的に長く、CD8+T細胞密度及びDC-LAMP+成熟樹状細胞密度の双方が低い場合に相対的に短く、CD8+T細胞密度及びDC-LAMP+成熟樹状細胞密度の一方が高く他方が低い場合に相対的に中間であることが見て取れる。
（カ）上記（ア）ないし（オ）を踏まえると、（引１−ア）ないし（引１−ク）の記載から、引用文献１には、
「　結腸直腸癌肺転移の患者に対して、転移の免疫パターン（CD8+T細胞密度 / DC-LAMP+成熟樹状細胞密度）を利用して生存の予測をすることであって、
　患者の腫瘍のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を用いた免疫染色により、CD8+T細胞密度及びDC-LAMP+成熟樹状細胞密度を求め、
　患者のOS期間は、CD8+T細胞密度及びDC-LAMP+成熟樹状細胞密度の双方が高い場合に相対的に長く、CD8+T細胞密度及びDC-LAMP+成熟樹状細胞密度の双方が低い場合に相対的に短く、CD8+T細胞密度及びDC-LAMP+成熟樹状細胞密度の一方が高く他方が低い場合に相対的に中間であると予測すること。」
の発明（以下「引用発明」という。）が記載されていると認められる。
２　引用文献２について
　引用文献２には、次の事項が記載されている（表記上の制約により、「以下」を表す記号を「≦」と表記する。）。
（引２−ア）第４４１０頁上段６〜３０行
「A B S T R A C T
Purpose
It has been established that the immune system plays an important role in tumor rejection. There is also compelling evidence that immune responses can develop independently of secondary lymphoid organs in tertiary lymphoid structures. We studied the presence and the correlation of tertiary lymphoid structures with clinical outcome in non.small-cell lung cancer (NSCLC), as the prognostic value of these structures in patients with cancer had not yet been established.
Patients and Methods
This retrospective study was performed by immunohistochemistry on paraffin-embedded tissue specimens from 74 patients with early-stage NSCLC.
Results
Tertiary lymphoid structures were detected in some tumors but not in nontumoral lungs. Thus we called these structures tumor-induced bronchus-associated lymphoid tissue (Ti-BALT). As in lymph nodes, Ti-BALTs were composed of mature dendritic cell (DC)/T-cell clusters adjacent to B-cell follicles and had features of an ongoing immune response. Because the quantitative counting of Ti-BALT was difficult to achieve, we used mature DCs that homed exclusively in Ti-BALT as a specific marker of these structures. Univariate analysis showed that the density of mature DCs was highly associated with a favorable clinical outcome (overall, disease-specific, and disease-free survival), suggesting that Ti-BALT may participate in antitumoral immunity. The density of tumorinfiltrating lymphocytes, in particular, CD4+ and T-bet+ Th1 T cells, was profoundly decreased in tumors weakly infiltrated by mature DCs.
Conclusion
The density of mature DCs was found to be a better predictor of clinical outcome than the other parameters tested. The number of tumor-infiltrating mature DCs may identify patients with early-stage NSCLC who have a high risk of relapse.」
（当審訳：要旨
目的
免疫系が腫瘍拒絶において重要な役割を果たすことが認識されている。また、免疫応答が二次リンパ器官とは別に三次リンパ構造で発生するという説得力のある証拠もある。癌患者における三次リンパ構造の予後的価値はまだ認識されていないため、非小細胞肺癌（NSCLC）におけるこれらの構造の存在と臨床転帰との相関関係を研究した。
患者と方法
この回顧的研究は、早期NSCLC患者74人のパラフィン包埋組織標本で免疫組織化学により実施された。
結果
三次リンパ構造は、腫瘍では検出されたものがあるが、非腫瘍性肺では検出されなかった。したがって、これらの構造を腫瘍誘発性気管支関連リンパ組織（Ti-BALT）と命名した。リンパ節と同様に、Ti-BALTはB細胞小胞に隣接する成熟樹状細胞（DC）/T細胞クラスターで構成され、進行中の免疫応答の特徴があった。Ti-BALTの定量的計数を達成することは困難であったため、これらの構造の特定マーカーとしてTi-BALTのみに存在する成熟DCを使用した。単変量解析では、成熟DCの密度が良好な臨床転帰（全体的、疾患特異的及び無病生存率）と強く関連していることが示され、Ti-BALTが抗腫瘍免疫に関与する可能性が示唆された。腫瘍浸潤リンパ球、特に CD4+及びT-bet+ Th1 T細胞の密度は、成熟DCによる浸潤が弱い腫瘍では大幅に減少した。
結論
成熟DCの密度は、テストした他のパラメーターよりも臨床転帰のより良い予測因子であることがわかった。腫瘍浸潤成熟DCの数は、再発のリスクが高い早期NSCLC患者を特定できる可能性がある。）
（引２−イ）第４４１０頁下段左欄１行〜第４４１１頁左欄２４行
「INTRODUCTION
Lung cancer is the most common cause of cancerrelated death in the world. Approximately 80% to 90% of cases involve non.small-cell lung cancer (NSCLC), which includes adenocarcinoma and squamous cell carcinoma. Only patients whose tumors can be completely resected have a significant chance of increased survival. However, as many as 30% of patients with stage I disease experience recurrence after surgery. The correlation between tumor-infiltrating immune cells and the prognosis of patients with lung cancer is controversial.
　Accumulating evidence indicates that adaptive immunity can be initiated independent of secondary lymphoid organs. For instance, splenectomized alymphoplastic mice can reject xenografts,1 clear viral infection,2 or mount an allergic airway inflammation after inhalation of allergens.3 The de novo formation of ectopic lymphoid structures (also called tertiary lymphoid structures) at the site of inflammation can arise in potentially all inflamed noncanonical lymphoid organs.4 Bronchusassociated lymphoid tissues (BALTs) have been described in the human fetus and infant lung.5 They disappear in the normal adult lung,6 in contrast with other organs such as the gut, where they are constitutively present (gut-associated lymphoid tissue).BALTshave been observed in several inflammatory lung diseases in humans (fibrosis, pneumonia, hypersensitivity pneumonitis, diffuse panbronchiolitis, and tobacco-induced inflammation),although it is still unclear whether these structures are simple lymphoid aggregates or functional immune structures.
　A tumor is composed of malignant, stromal, endothelial, and immune cells that form a heterogeneous network and exhibit complex interactions. Although tumor eradication by the immune system is often inefficient, there is evidence that many developing cancers are not ignored by the immune system.7 Spontaneous tumor regressions occurring concomitantly with autoimmune manifestations and the higher incidence of tumors in immunosuppressed patients are indications of the involvement of the immune system in tumor rejection. Mice deficient in immune functions spontaneously develop tumors. The density of tumorinfiltrating lymphocytes (TILs) with cytotoxic and memory phenotypes is highly predictive of good clinical outcome.8-14 However, although prognosis is related to the homing of effector immune cells, it is still unclear where the activation of the specific immune response takes place: in the tumor, the draining lymph node, or both.
　The presence of tertiary lymphoid structures has never been reported in lung cancer, and thus far, no studies have been performed investigating putative correlation with clinical outcome. Here we provide evidence that in certain tumors, immune cells are organized in tertiary lymphoid structures and that the density of mature dendritic cells (DCs), a cell population that is exclusively detected in BALT, is correlated with prolonged survival.」
（当審訳：はじめに
　肺癌は、世界で最も多いがん関連死の原因である。症例の約80％から90％は、腺がんと扁平上皮がんを含む非小細胞肺癌（NSCLC）が関与している。腫瘍を完全に切除できる患者のみが、生存率が大幅に向上する可能性がある。しかしながら、ステージIの患者の30％ほどが手術後に再発を経験する。腫瘍浸潤免疫細胞と肺癌患者の予後との相関関係は議論の余地がある。
　蓄積された証拠は、二次リンパ器官とは別に適応免疫が発生することを示している。例えば、脾臓摘出された異形成マウスは、異種移植片を拒絶し1、ウイルス感染をクリアし2、アレルゲンの吸入後にアレルギー性気道炎症を起こすことがある3。炎症部位での異所性リンパ構造（三次リンパ構造とも呼ばれる）の新規形成が、炎症を起こす可能性のあるすべての非標準リンパ器官で生じ得る4。気管支関連リンパ組織（BALT）は、人間の胎児及び乳児の肺に記述されている5。構成的に存在する腸（腸関連リンパ組織）などの他の器官とは対照的に、それらは正常な成人の肺では消失する6。BALTは、ヒトのいくつかの炎症性肺疾患（線維症、肺炎、過敏性肺炎、びまん性汎細気管支炎、及びタバコ誘発性炎症）で観察されているが、これらの構造が単純なリンパ凝集体であるか機能的な免疫構造であるかはまだ不明である。
　腫瘍は、悪性細胞、間質細胞、内皮細胞及び免疫細胞で構成され、異種ネットワークを形成し、複雑な相互作用を示す。免疫系による腫瘍の根絶はしばしば非効率的であるが、多くの発達中のがんが免疫系によって無視されないという証拠がある7。自己免疫の兆候に付随して起こる自然発生的な腫瘍退縮と免疫抑制患者での腫瘍発生率の増加は、腫瘍拒絶における免疫系の関与の兆候である。免疫機能が欠損したマウスは、自然に腫瘍を発症する。細胞障害性及び記憶の表現型を持つ腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の密度は、良好な臨床結果をもたらす予測が高い8-14。しかしながら、予後はエフェクター免疫細胞の帰還に関連するにもかかわらず、特定の免疫反応の活性がどこで起こるかはまだ不明である：腫瘍内、リンパ節の水切り、又はその両方。
　三次リンパ構造の存在は肺癌で報告されたことはなく、これまでのところ、臨床結果との推定相関を調査する研究は行われていない。ここでは、特定の腫瘍では免疫細胞が三次リンパ構造で組織化されており、BALTでのみ検出される細胞数である成熟樹状細胞（DC）の密度が生存期間の延長と相関しているという証拠を提供する。）
（引２−ウ）第４４１１頁左欄２５行〜第４４１２頁右欄５行
「PATIENTS AND METHODS
Patients
　Paraffin-embedded tumor biopsies with representative areas of tumor and adjacent lung parenchyma were retrieved retrospectively from 74 successive patients diagnosed between 1998 and 2002 with early-stage NSCLC.15 Lung biopsies from five patients taken either at a distance from the primary tumor or from a different lesion-free lobe were used as tissue references. Preoperative evaluation of patients included lung, brain, and adrenal computed tomography scan and liver ultrasound echography. All patients underwent complete surgical resection of their tumors, including multilevel lymph node sampling or lymphadenectomy, but none received preoperative chemotherapy or radiotherapy. Patients with an Eastern Cooperative Oncology Group performance status16 ≦ 1 were eligible. The main clinical and pathologic features of the patients are presented in Table 1. Patients with mixed histologic features, a T3 tumor, or pleural invasion were ineligible. At the completion of the study, the minimal clinical follow-up was 48 months for the last patient included in the cohort. The consent of all patients was obtained, even though French law does not require specific approval of an institutional review board or the consent of patients for retrospective observational, noninterventional analysis of medical records.
Immunohistochemistry
　Antibodies used are listed in Appendix Table A1 (online only). Paraffin-embedded lung tumors were sectioned for immunohistochemistry as described.19 Briefly, serial 5-μm tissue sections were deparaffinized, rehydrated, and pretreated in 10 mmol/L of citrate buffer pH6 for antigen retrieval. Sections were incubated with 5% human serum before adding primary antibodies followed by secondary antibodies. The binding of biotinylated antibodies was revealed by streptavidin-peroxidase, whereas alkaline phosphatase activity was revealed using alkaline phosphatase substrate III (SK-5300; Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA), and peroxidase activity was revealed using either 3-amino-9-ethylcarbazole substrate (SK-4200; Vector) or diaminobenzoate substrate (IM2394; Immunotech, Marseille, France). Negative controls were established by adding nonspecific isotype controls as primary antibodies.
Method for Cell Quantification
　Stained cells were counted semi-quantitatively (score 0, 1, 2, 3, and 4 for none, very low, weak, intermediate, and high density of positive cells, respectively) in each intermediate-power field (IPF) in the tumoral areas of the entire tissue section (from 19 to 76 fields, original magnification 100), and expressed as mean score per IPF, with SEMs calculated. The numbers of DC-Lamp+ mature DCs and Granzyme-B+ CD8+ T cells were lower than the number of cells described above, allowing us to realize a quantitative counting. Those stained cells were expressed as mean cells per IPF, with SEMs calculated. CD4, CD8, CD45ra, CD45ro, TIA-1 stainings were counted as a percentage of positive cells among CD3+ T cells. The necrosis and fibrosis were counted as the percentage of the positive areas among the whole tumor mass section. Both immunostaining and scoring were evaluated according to the criteria described above by four independent observers (M.-C.D.-N., M.A., V.P., and L.D.C.) who were blinded to clinical outcome. The investigators reviewed the few cases with conflicting results to reach a consensus.
Statistical Analysis
　The variables taken into account for statistical analysis included clinical (age, sex, smoking, tumor relapse, and vital status), histopathologic (histology, pathologic TNM [pTNM], tumor differentiation, localization of the primary tumor, necrosis, fibrosis, and proliferation of the tumor), and immunologic parameters (markers described above).Toperform univariate analysis, groups of patients were defined according to the bimodal distribution of the density of positive cells, appointed using the following cut-offs: CD3, 1.5 mean score/ tumor IPF; CD20, 1.5 mean score/tumor IPF; DC-Lamp, 1.65 mean cells/ tumor IPF.
　χ2 test with Yates correction and analysis of variance test (posthoc tests with Fisher’s and Bonferroni methods) were used for univariate analysis. Overall survival (OS), disease-specific survival (DSS), and disease-free survival (DFS) curves were estimated by Kaplan-Meier method, and significant differences between the groups of patients were evaluated using the log-rank test.An event affecting OS was defined as death from any cause, DSS as death from NSCLC, and DFS as relapse of the primary tumor. Statistical analysis was performed using StatView and JMP softwares (SAS Institute, Cary, NC). A P value less than .05 was considered statistically significant.」
（当審訳：患者と方法
患者
　腫瘍の代表的な領域と隣接する肺実質を含むパラフィン包埋腫瘍生検は、1998年から2002年にかけて早期NSCLCと診断された74人の連続した患者から回顧的に回収された15。原発腫瘍から離れた又は病変のない異なる葉から採取された5人の患者の肺生検を組織参照として使用した。患者の術前評価には、肺、脳及び副腎のコンピュータ断層撮影スキャンと肝臓超音波エコー検査が含まれた。すべての患者は、マルチレベルリンパ節サンプリング又はリンパ節郭清を含む腫瘍の完全な外科的切除を受けたが、術前化学療法又は放射線療法を受けた患者はいなかった。Eastern Cooperative Oncology Groupのパフォーマンスステータス16が1以下の患者が対象だった。患者の主な臨床的及び病理学的特徴を表1に示す。組織学的特徴が混在している患者、T3腫瘍又は胸膜浸潤の患者は対象外だった。研究の完了時、コホートに含まれた最後の患者の最短の臨床的追跡は48ヶ月だった。フランスの法律では、施設内治験審査委員会の具体的な承認や、医療記録の回顧的観察、非介入分析に対する患者の同意を必要としないが、すべての患者の同意が得られた。
免疫組織化学
　使用した抗体は、付録表A1に記載されている（オンラインのみ）。パラフィン包埋肺腫瘍は、記載されたように免疫組織化学のために切片化された19。手短に言えば、5μmの連続組織切片を脱パラフィンし、再水和し、抗原回復のために10mmol / Lクエン酸緩衝液pH6で前処理した。その後に二次抗体の追加が控えている一次抗体を追加する前に、切片を5％ヒト血清とともにインキュベートした。ビオチニル化抗体の結合はストレプトアビジン-ペルオキシダーゼによって明らかにされ、アルカリホスファターゼ活性はアルカリホスファターゼ基質III（SK-5300；Vector Laboratories Inc、Burlingame、CA）を使用して明らかにされ、ペルオキシダーゼ活性は3-アミノ-9- エチルカルバゾール基質（SK-4200；Vector）又はジアミノ安息香酸基質（IM2394；Immunotech、Marseille、France）。ネガティブコントロールは、一次抗体として非特異的アイソタイプコントロールを追加することにより確立した。
細胞の定量化の方法
　組織切片全体における腫瘍領域の各中倍率視野（IPF）（19から76視野、元の倍率x100）において、染色細胞を半定量的（陽性細胞がない、非常に低い、弱い、中間、及び高密度のそれぞれに対して、スコア0、1、2、3、及び4）にカウントし、計算したSEMとともに、IPFあたりの平均スコアとして表現した。DC-Lamp+成熟DC及びGranzyme-B+ CD8+ T細胞の数は、上記の細胞の数よりも少なく、定量的なカウントを実現できた。これらの染色された細胞は、計算されたSEMとともにIPFあたりの平均細胞として表現した。CD4、CD8、CD45ra、CD45ro、TIA-1染色は、CD3+ T細胞中の陽性細胞の割合として計数された。壊死及び線維症は、腫瘍塊全体の切片中の陽性領域の割合として計数された。免疫染色とスコアリングの両方を、臨床結果を知らない4人の独立した観察者（M.-C.D.-N.、M.A.、V.P.及びL.D.C.）が上記の基準に従って評価した。調査者は、矛盾する結果を伴う少数のケースについてコンセンサスを得るためにレビューした。
統計分析
　統計分析のために考慮される変数には、臨床（年齢、性別、喫煙、腫瘍再発及び生命状態）、組織病理学（組織学、病理学的TNM [pTNM]、腫瘍分化、原発腫瘍の局在、壊死、線維症、及び腫瘍増殖）、及び免疫学的パラメーター（上記のマーカー）が含まれる。単変量解析を行うために、患者のグループは、次のカットオフを使用して指定された、陽性細胞の密度のバイモーダル分布に従って定義された：CD3、1.5平均スコア/腫瘍IPF；CD20、1.5平均スコア/腫瘍IPF； DC-LAMP、1.65平均細胞/腫瘍IPF。
　Yates補正を伴うχ2検定と分散分析検定（Fisher及びBonferroniメソッドを使用した事後検定）が単変量解析に使用された。全生存期間（OS）、疾患特異的生存期間（DSS）、及び無病生存期間（DFS）曲線をカプラン・マイヤー法で推定し、ログランク検定を使用して患者グループ間の有意差を評価した。OSに影響を及ぼすイベントは、あらゆる原因による死亡、DSSはNSCLCによる死亡、DFSは原発腫瘍の再発と定義された。統計分析は、StatView及びJMPソフトウェア（SAS Institute、Cary、NC）を使用して実行されました。.05未満のP値は、統計的に有意であると見なされた。）
（引２−エ）第４４１２頁右欄６行〜第４４１４頁左欄４行
「RESULTS
Presence of Tumor-Induced BALT in Some Early- Stage Lung Cancers
　We first searched for the presence of tertiary lymphoid structures on paraffin-embedded sections of 74 early-stage NSCLCs (46 adenocarcinomas and 28 squamous cell carcinomas) and five nonpathologic lung biopsies. These lymphoid organizations have been found in many tumors (Fig 1A), whereas they had not yet been observed in nontumoral lung. Therefore, we called these lymphoid structures tumor-induced BALT (Ti-BALT). To evaluate the prognostic value of Ti-BALT, we tried to quantify these structures;unfortunately, their size was extremely variable and several Ti- BALT can colocalize, which makes quantification by counting uncertain (Fig 1B). Thus we decided to characterize the cellular composition of these lymphoid structures to identify a specific marker of Ti-BALT. We thus used immunohistochemistry to examine the localization of CD3+ T cells, CD20+ B cells, and DCLamp  mature DCs. The density of adaptive immune cells was heterogeneous between tumors, as well as within a given tumor. In some biopsies, CD3+ T lymphocytes were detected in clusters where DC-Lamp+ mature DCs exclusively homed (Fig 1C). The presence of mature DCs was confirmed by the expression of CD83, another marker of mature DCs (data not shown). These mature DC/T-cell clusters were often surrounded by CD20+ B-cell follicles (Fig 1D) characterized by the presence of both a CD21+ follicular dendritic cell network (Fig 1E) and Ki67+ proliferating germinal center (GC) B cells (Fig 1F).
　By statistical analysis, we confirmed that the density of mature DCs, T cells, and B cells were strongly correlated to each other in the tumor (DC-Lamp/CD3, P  .0001, r = 0.53; CD3/CD20, P  .0001, r = 0.55; CD20/DC-Lamp, P  .0010, r = 0.32).
　Taken together, the presence of Ti-BALT was very heterogeneous between tumors. These structures were composed of mature DCs, T cells, and B cells organized with a distribution reminiscent of the secondary lymphoid organs where mature DCs exclusively home.
Prognostic Value of Ti-BALT
　At the completion of the study, 54 patients were alive (73%) and 20 patients had died (27%; Table 1). Seven patients died as a result of postoperative complications at the hospital or within 1 month of leaving the hospital and were therefore considered as having died from cancer progression-unrelated causes. Nine deaths were NSCLC-related and four deaths were NSCLC-unrelated (myeloma, n = 1; sepsis, n = 1; vascular brain damage, n = 1; unknown cause, n = 1).
　We analyzed the prognostic value of Ti-BALT. As mentioned previously, as a result of the uncertainty associated with quantification by counting, this question was difficult to answer. As it had already been observed that DC-Lamp+ mature DCs are selectively detected in Ti-BALT, DC-Lamp was chosen as a specific marker of Ti-BALT. Except for five tumors, a trend was observed by statistical analysis between these two parameters (Fig 2A; R2 = 0.317 for 74 tumors and R2 = 0.488 for 69 tumors).
　We used univariate analysis to investigate the prognostic value of mature DCs. This was compared with the prognostic values of T and B cells, which were observed in (but not specific to) Ti-BALT, histologic and clinical features of the tumors (Table 2). The density of DC-Lamp+ mature DCs was the only parameter that was correlated with the three survival parameters (OS, DSS, and DFS). The hazard ratios of 4-year OS, DSS, and DFS rates for patients with DC-Lamp-low versus DC-Lamp-high tumors were 1.88 (P = .0058), 3.34 (P = .0007), and 2.11 (P = .0114), respectively. The median DFS was not reached for the patients characterized as having DC-Lamp-high tumors; however, median DFS was 44.2 months for the patients with DC-Lamp-low tumors (Fig 2B; P = .0056). There were no distinguishable clinical (sex and smoking history), tumor (tumor differentiation, pTNM staging, fibrosis, necrosis, and proliferating tumor cells), or histologic characteristics between the patients with DC-Lamp-high versus DC-Lamp-low tumors (Appendix Table A2, online only).
　T and B cells were also not associated with patient outcome. As expected, pTNM staging was predictive of DFS (Table 2 and Fig 2C), whereas age, sex, smoking history, and tumor differentiation were not associated with survival (data not shown).
　These results indicate that DC-Lamp, which is a specific marker of Ti-BALT, is the highest predictive marker for survival. Increased density of mature DCs is associated with a favorable clinical outcome for patients with early-stage NSCLC.」
（当審訳：結果
いくつかの早期肺癌における腫瘍誘発性BALTの存在
　最初に、74の初期NSCLC（46の腺癌及び28の扁平上皮癌）及び5つの非病理学的肺生検のパラフィン包埋切片で、三次リンパ構造の存在を捜した。これらのリンパ組織は多くの腫瘍で発見されているが（図1A）、非腫瘍性肺ではまだ観察されていなかった。したがって、我々はこれらのリンパ構造を腫瘍誘発性BALT（Ti-BALT）と命名した。Ti-BALTの予後的価値を評価するために、これらの構造の定量化を試みた。残念ながら、それらのサイズは非常に多様であり、いくつかのTi-BALTは共局在化する可能性があり、計数による定量化を不確実にする（図1B）。したがって、Ti-BALTの特有のマーカーを特定するために、これらのリンパ構造の細胞組成を特徴付けることにした。したがって、免疫組織化学を使用して、CD3+ T細胞、CD20+ B細胞、及びDC-Lamp+成熟DCの局在を調べた。適応免疫細胞の密度は、腫瘍間及び特定の腫瘍内で不均一だった。一部の生検では、DC-Lamp+成熟DCが排他的に存在するクラスターでCD3+ Tリンパ球が検出された（図1C）。成熟DCの存在は、成熟DCの別のマーカーであるCD83の発現によって確認された（データは示していない）。これらの成熟DC / T細胞クラスターは、CD21+濾胞樹状細胞ネットワーク（図1E）及びKi67+増殖胚中心（GC）B細胞（図1F ）双方の存在によって特徴付けられる、CD20+細胞濾胞でしばしば囲まれていた。
　統計分析により、成熟DC、T細胞、及びB細胞の密度が腫瘍内で互いに強く相関していることを確認した（DC-Lamp / CD3、P  .0001、r = 0.53；CD3 / CD20、P  .0001、r = 0.55；CD20 / DC-ランプ、P  .0010、r = 0.32）。
　総合すると、Ti-BALTの存在は腫瘍間で非常に不均一だった。これらの構造は、成熟DCが専ら存在する二次リンパ器官を連想させる分布で組織された、成熟DC、T細胞及びB細胞で構成されていた。
Ti-BALTの予後的価値
　この研究の完了時に、54人の患者が生存し（73％）、20人の患者が死亡した（27％；表1）。7人の患者は、病院での術後合併症の結果として、又は退院後1か月以内に死亡したため、癌の進行とは無関係の原因で死亡したとみなされた。9人の死亡がNSCLC関連で、4人の死亡がNSCLC非関連だった（骨髄腫、n = 1；敗血症、n = 1；血管脳損傷、n = 1；原因不明、n = 1）。
　Ti-BALTの予後的価値を分析した。前述のように、計数による定量化に関連する不確実性の結果として、この問題に答えることは困難だった。
DC-Lamp
+
成熟DCがTi-BALTで選択的に検出されることがすでに観察されていたため、DC-LampがTi-BALT特定マーカーとして選択された。
　単変量解析を使用して、成熟DCの予後的価値を調査した。これを、Ti-BALTで観察された（ただし特異的ではない）T及びB細胞、腫瘍の組織学的及び臨床的特徴の予後的価値と比較した（表2）。
DC-Lamp
+
成熟DCの密度は、3つの生存パラメーター（OS、DSS及びDFS）と相関する唯一のパラメーターだった。
　T細胞とB細胞も患者の転帰と関連していなかった。
予想どおり、pTNM病期分類はDFSを予測していた
　これらの結果は、Ti-BALTの特異的マーカーであるDC-Lampが、生存率の最も高い予測マーカーであることを示している。成熟DCの密度の増加は、初期NSCLC患者にとって好ましい臨床転帰と関連している。）
（引２−オ）４４１６頁左欄１５〜１７行
「・・・Finally, DC-Lamp, a marker of Ti-BALT, may have a direct application in the clinical setting, as it could be used to identify patients with early-stage NSCLC who have a high risk of relapse.」
（当審訳：・・・最後に、Ti-BALTのマーカーであるDC-Lampは、再発のリスクが高い初期NSCLCの患者を特定するために使用できるため、臨床現場で直接適用できる。）
（引２−カ）第４４１３頁　Ｆｉｇ　２
「
Fig 2. Evaluation of DC-Lamp as a marker of tumor-induced bronchusassociated lymphoid tissue (Ti-BALT) and its prognostic value. (A) Correlation between the density of Ti-BALT and the density of tumor-infiltrating DC-Lamp+  mature dendritic cells (DCs). Kaplan-Meier curves of disease-free survival for 74 patients with non.small-cell lung cancer depending on (B) the density of tumor-infiltrating DC-Lamp+ mature DCs and (C) the pathologic TNM stage.」
（当審訳：図2。DC-Lampの腫瘍誘発性気管支関連リンパ組織（Ti-BALT）及び予後的価値のマーカーとしての評価。（A）Ti-BALTの密度と腫瘍浸潤DC-Lamp+成熟樹状細胞（DC）の密度との相関。（B）腫瘍浸潤DC-Lamp+成熟DCの密度及び（C）病的TNMステージに応じた、非小細胞肺癌患者74人の無病生存率のカプラン・マイヤー曲線。）
３　引用文献３について
　引用文献３には、次の事項が記載されている。
（引３−ア）「【０００５】
　
癌の病期分類は
一般化が予後
について行われ得るように、癌患者を分類する
【０００６】
　CRCの種々の病期はデュークス病期A〜Dに従って分類されていた。今日、
TNMシステムは、癌の解剖学的程度の最も広く使用される分類である
（引３−イ）「【０１２０】
予後:
　予後インジケータは、一定の尤度で疾患結果を予測する癌患者およびその腫瘍の臨床的、病理学的または生化学的な特徴と定義され得る。その主な使用は、患者管理の合理的な計画を補助すること、すなわち、それぞれ急速進行性疾患の過少治療および無痛性疾患の過剰治療を回避することである。Molina R. et al.，Tumor Biol. 24 (2003) 209-218では、NSCLCにおけるCEA、CA 125、CYFRA21-1、SSCおよびNSEの予後値が評価された。彼らの研究では、マーカーNSE、CEA、およびLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)の異常血清レベルは、短い生存を示すように思われた。
【０１２１】
　ARMETは単独で、癌患者、例えばLCまたはCRC患者と健常対照の識別に有意に寄与するため、
ARMETは癌
患者の予後の評価を補助するものと期待されよう
ARMETのレベルは
TNM病期分類システムと組み合わされる
４　引用文献４について
　引用文献４には、次の事項が記載されている。
（引４−ア）「【０００４】
　後期病期で検出された場合、NSCLCも非常に乏しい予後を有する。癌の病期決定は程度、進行度、細胞の種類および腫瘍の等級に関する疾患の分類である。
予後
について一般化できるように、病期決定により癌患者を分類する
【０００５】
　今日では、
TNMシステムは癌の解剖学的な程度に基づいて最も広く使用されている分類システムである
（引４−イ）「【００９０】
予後:
　予後インジケータは、一定の尤度で疾患結果を予測する癌患者およびその腫瘍の臨床的、病理学的または生化学的な特徴と定義され得る。その主な使用は、患者管理の合理的な計画を補助すること、すなわち、それぞれ急速進行性疾患の過少治療および無痛性疾患の過剰治療を回避することである。Molina R. et al.，Tumor Biol. (2003)24:209-218では、NSCLCにおけるCEA、CA 125、CYFRA21-1、SSCおよびNSEの予後値が評価された。彼らの研究では、マーカーNSE、CEA、およびLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)の異常血清レベルは、短い生存を示すように思われた。
【００９１】
　ASCは単独で、LC患者と健常対照の識別に有意に寄与するため、
ASCはLCに苦しむ患者の予後の評価を補助するものと期待されよう
ASCのレベルは
TNM病期分類システムと組み合わされる
第５　対比
１　本願発明と引用発明とを対比する。
ア
（ア）引用発明の「結腸直腸癌肺転移の患者」は、本願発明の「固形癌を患う患者」に含まれる。
（イ）引用発明の「生存の予測」は、本願発明の「生存期間の予後判定」に相当する。
（ウ）引用発明の「転移の免疫パターン（CD8+T細胞密度 / DC-LAMP+成熟樹状細胞密度）」は、本願発明の「データ」に相当する。
（エ）引用発明の「患者の腫瘍のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を用いた免疫染色により、CD8+T細胞密度及びDC-LAMP+成熟樹状細胞密度を求め」ることが、インビトロで行われることは明らかである。
（オ）上記（ア）ないし（エ）を踏まえると、引用発明の「結腸直腸癌肺転移の患者に対して、転移の免疫パターン（CD8+T細胞密度 / DC-LAMP+成熟樹状細胞密度）を利用して生存の予測をすること」において「患者の腫瘍のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を用いた免疫染色により、CD8+T細胞密度及びDC-LAMP+成熟樹状細胞密度を求め」ることは、本願発明の「固形癌を患う患者の生存期間の予後判定のためのデータを提供するためのインビトロ方法」に相当する。
イ　引用発明の「患者の腫瘍のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を用いた免疫染色により、CD8+T細胞密度」「を求め」ることは、本願発明の「ａ）患者からの腫瘍組織試料中のＣＤ８＋細胞の細胞密度を定量する段階」に相当する。
ウ　引用発明の「患者の腫瘍のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を用いた免疫染色により、」「DC-LAMP+成熟樹状細胞密度を求め」ることと、本願発明の「ｂ）患者からの腫瘍誘導型リンパ構造中のＤＣ−ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度を定量する段階」とは、「ｂ）患者からの腫瘍関連組織中のＤＣ−ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度を定量する段階」で共通する。
エ
（ア）「CD8+T細胞密度及びDC-LAMP+成熟樹状細胞密度」の「高い」及び「低い」に基づいて「患者のOS期間」の長短を「予測する」引用発明において、「CD8+T細胞密度及びDC-LAMP+成熟樹状細胞密度」を転移における「CD8+T細胞密度及びDC-LAMP+成熟樹状細胞密度」の基準値と比較して「高い」又は「低い」を決定していることは明らかである。
（イ）上記（ア）を踏まえると、引用発明は、本願発明の「ｃ）段階ａ）及びｂ）で得られた細胞密度の値を、各位置で各細胞型について予め決定された参照値と比較する段階」に相当する構成を備えているといえる。
オ
（ア）引用発明の「OS期間は」「相対的に長」いこと、「OS期間は」「相対的に短」いこと及び「OS期間は」「相対的に中間である」ことは、それぞれ本願発明の「生存期間の予後良好」、「生存期間の予後不良」及び「生存期間の予後中間」に相当する。
（イ）上記（ア）を踏まえると、引用発明の「患者のOS期間は、CD8+T細胞密度及びDC-LAMP+成熟樹状細胞密度の双方が高い場合に相対的に長く、CD8+T細胞密度及びDC-LAMP+成熟樹状細胞密度の双方が低い場合に相対的に短く、CD8+T細胞密度及びDC-LAMP+成熟樹状細胞密度の一方が高く他方が低い場合に相対的に中間であると予測すること」は、本願発明の「ｄ）ＣＤ８＋細胞及びＤＣ−ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度が、予め決定された参照値よりも高い場合、患者に生存期間の予後良好を提供し、
ＣＤ８＋細胞及びＤＣ−ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度が、予め決定された参照値よりも低い場合、患者に生存期間の予後不良を提供し、又は
一方のマーカー細胞密度が、予め決定された参照値よりも高く、他方のマーカーの細胞密度が、予め決定された参照値よりも低い場合、患者に生存期間の予後中間を提供する段階」に相当する。
２　そうすると、本願発明と引用発明とは、
「　固形癌を患う患者の生存期間の予後判定のためのデータを提供するためのインビトロ方法であって、以下の段階：
ａ）患者からの腫瘍組織試料中のＣＤ８＋細胞の細胞密度を定量する段階、
ｂ）患者からの腫瘍関連組織中のＤＣ−ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度を定量する段階、
ｃ）段階ａ）及びｂ）で得られた細胞密度の値を、各位置で各細胞型について予め決定された参照値と比較する段階、並びに
ｄ）ＣＤ８＋細胞及びＤＣ−ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度が、予め決定された参照値よりも高い場合、患者に生存期間の予後良好を提供し、
ＣＤ８＋細胞及びＤＣ−ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度が、予め決定された参照値よりも低い場合、患者に生存期間の予後不良を提供し、又は
一方のマーカー細胞密度が、予め決定された参照値よりも高く、他方のマーカーの細胞密度が、予め決定された参照値よりも低い場合、患者に生存期間の予後中間を提供する段階を含む、
方法。」
の発明である点で一致し、以下の２点で相違する。
（相違点１）
　ＤＣ−ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度を定量する段階で使用する患者からの腫瘍関連組織が、本願発明においては、「腫瘍誘導型リンパ構造」であるのに対し、引用発明においては、「患者の腫瘍のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片」であるものの、「腫瘍誘導型リンパ構造」であることは特定されていない点。
（相違点２）
　本願発明は、「ＴＮＭ病期分類と組み合わせて使用される」ことが特定されているのに対し、引用発明は、そのような特定がされていない点。
第６　判断
１　上記各相違点について検討する。
（１）相違点１について
　（引１−ウ）に「
DC-LAMP
+
細胞の密度
　非小細胞肺癌（NSCLC）患者の臨床転帰に関する引用文献２は、（引２−エ）に「Ti-BALTの予後的価値・・・DC-Lamp+成熟DCがTi-BALTで選択的に検出されることがすでに観察されていたため、DC-LampがTi-BALT特定マーカーとして選択された。」と記載されているように、Ti-BALT特定マーカーとしてDC-Lamp+成熟DCを用いているが、「DC-Lamp+成熟DCがTi-BALTで選択的に検出されること」を開示するとともに、同じく（引２−エ）に「DC-Lamp+成熟DCの密度は、3つの生存パラメーター（OS、DSS及びDFS）と相関する唯一のパラメーターだった。」と記載されているように、DC-Lamp+成熟DCの密度が非小細胞肺癌（NSCLC）患者のOS期間に相関することを開示している。
　引用文献１及び２は、いずれも癌患者のOS期間とDC-Lamp+成熟樹状細胞密度との相関に関するものであり、引用文献１及び２に接した当業者であれば、引用発明の「DC-LAMP+成熟樹状細胞密度」として、Ti-BALT（本願発明の「腫瘍誘導型リンパ構造」に相当）中で求めたDC-LAMP+成熟樹状細胞密度を試し、OS期間との相関を調べることは、容易に想起し得ることである。
（２）相違点２について
ア　癌の診断において、ＴＮＭ病期分類により癌のステージを判定すること、ＴＮＭ病期分類により患者の予後を分類すること、及び、予後を評価できる因子をＴＮＭ病期分類と組み合わせることは、引用文献３及び４に記載されているように、本願優先日前において周知技術である。
　また、（引２−エ）に「予想どおり、pTNM病期分類はDFSを予測していた」と記載されているように、引用文献２にもＴＮＭ病期分類と予後の相関に関する記載がある。
イ　本願発明は、「ＴＮＭ病期分類と組み合わせて使用される」ことを特定しているが、ＴＮＭ病期分類をどのように組み合わせて使用するかについては、何ら特定していない。
　一方、「ｄ）」の段階において、ＣＤ８＋細胞及びＤＣ−ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度に基づいて予後良好、予後不良又は予後中間を提供することを特定していることから、「ＴＮＭ病期分類と組み合わせて使用される」ことは、ＴＮＭ病期分類におけるステージの情報を単に付加することや、ＴＮＭ病期分類のみから判断される予後の情報を付加することを包含するものと認められる。
ウ　してみると、結腸直腸癌肺転移の患者に対して生存の予測をする引用発明において、ＴＮＭ病期分類におけるステージの情報を付加することなどにより、ＴＮＭ病期分類と組み合わせて使用する程度のことは、当業者であれば容易に想起し得ることである。
２　本願発明の奏する作用効果
　本願発明によってもたらされる効果は、引用文献１及び２の記載事項並びに周知技術から当業者が予測し得る程度のものである。
３　したがって、本願発明は、引用発明、引用文献２の記載事項及び周知技術に基いて当業者が容易に発明をすることができたものである。
４　請求人の主張について
（１）請求人は、審判請求書の「３．本願発明が特許されるべき理由」において、「各マーカーを単独で使用することによって得られる予後の値を必然的に改善をもたらすことから、異なる公知のマーカーの組合せが自明であることを主張することができない。当業者が、一目瞭然に公知のバイオマーカーを組合せ、本発明に容易に想到すると考えることは、全くの
事後分析
　引用文献１を考慮すると、癌の転帰を予測するための改善された方法得ようとする当業者は、腫瘍内のＣＤ８＋（当審注：「ＣＤ８＋」は「ＤＣ−ＬＡＭＰ＋細胞」の誤記と思われる。）を特異的に定量することではなく
腫瘍誘導リンパ系構造内の
成功の合理的な期待
　本願、特に実施例において示されるとおり、本発明によるパラメーターの特定の組合せ（腫瘍内のＣＤ８＋細胞の定量及び腫瘍誘導リンパ系構造内のＤＣ−ＬＡＭＰ＋細胞の定量）は、患者の予後を決定するための
優れたパフォーマンス
癌の予後を予測するための極めて正確かつロバストな方法
　引用文献を考慮しても、固形癌を患う患者の予後を腫瘍内のＣＤ８＋細胞及び腫瘍誘導リンパ系構造内のＤＣ−ＬＡＭＰ＋細胞を定量することにより、そしてさらに
ＴＮＭ病期分類で得られた結果を組み合わせることにより
患者の予後を決定するための優れたパフォーマンス
（２）しかしながら、「腫瘍誘導リンパ系構造内のＤＣ−ＬＡＭＰ＋細胞を定量すること」及び「ＴＮＭ病期分類を」「ＣＤ８＋細胞及び」「ＤＣ−ＬＡＭＰ＋細胞の組合せの定量と組み合わせること」を当業者が容易に想起し得ることは、上記１で説示したとおりである。
　また、請求人が主張する「患者の予後を決定するための優れたパフォーマンス」が、「ＴＮＭ病期分類を腫瘍内のＣＤ８＋細胞及び腫瘍誘導リンパ系構造内のＤＣ−ＬＡＭＰ＋細胞の組合せの定量と組み合わせること」によって判定される予後を提供することにより得られるものだとしても、本願発明は「ＴＮＭ病期分類」、「腫瘍内のＣＤ８＋細胞」及び「腫瘍誘導リンパ系構造内のＤＣ−ＬＡＭＰ＋細胞」の組み合わせから判定される予後を提供することを特定するものではないから、当該主張は請求項の記載に基づいたものではない。
　よって、請求人の主張は採用できない。
第７　むすび
　以上のとおりであるから、本願発明は、特許法第２９条第２項の規定により、特許を受けることができない。
　したがって、その余の請求項に係る発明について検討するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。
　よって、結論のとおり審決する。