(57)【要約】  本発明は、Ａｕｒ−Ａに対するＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＣＴＬ由来のＴＣＲα鎖及びβ鎖のポリペプチド、ならびに該ポリペプチドをコードする核酸を提供する。当該核酸は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子及びＡｕｒ−Ａ２０７−２１５ペプチドを提示する細胞に対する細胞傷害活性をＴ細胞に付与できることから、Ａｕｒ−Ａを発現する癌の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとともにＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴ細胞レセプターを構成しうるポリペプチドをコードする核酸であって、
（１）配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸、
（２）配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸、
（３）配列表の配列番号６で示される塩基配列を含む核酸、及び
（４）配列表の配列番号６で示される塩基配列からなる核酸もしくはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸、
からなる群より選択される核酸。
【請求項２】
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとともにＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴ細胞レセプターを構成しうるポリペプチドをコードする核酸であって、
（１）配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸、
（２）配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸、
（３）配列表の配列番号８で示される塩基配列を含む核酸、及び
（４）配列表の配列番号８で示される塩基配列からなる核酸もしくはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸、
からなる群より選択される核酸。
【請求項４】
配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする、請求項３記載の核酸。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか１項記載の核酸にコードされるポリペプチド。
【請求項６】
請求項１又は２記載の核酸にコードされるポリペプチド及び請求項３又は４記載の核酸にコードされるポリペプチドで構成されてなる、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴ細胞レセプター。
【請求項７】
請求項１〜４いずれか１項記載の核酸を含有する組換え核酸。
【請求項８】
請求項７記載の組換え核酸が少なくとも１つ挿入されてなるベクター。
【請求項９】
請求項１又は２記載の核酸を含有する組換え核酸及び請求項３又は４記載の核酸を含有する組換え核酸の両方が挿入されてなるベクター。
【請求項１０】
請求項１又は２記載の核酸を含有する組換え核酸が挿入されてなるベクターと請求項３又は４記載の核酸を含有する組換え核酸が挿入されてなるベクターの組み合わせ。
【請求項１１】
請求項８又は９記載のベクター又は請求項１０記載のベクターの組み合わせが導入された、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴ細胞レセプターを発現する細胞。
【請求項１２】
Ｔ細胞もしくはＴ細胞に分化しうる細胞である、請求項１１記載の細胞。
【請求項１３】
請求項９記載のベクター又は請求項１０記載のベクターの組み合わせあるいは請求項１１又は１２記載の細胞を有効成分として含有する制がん剤。
【請求項１４】
請求項１３記載の制がん剤を投与する工程を包含する、癌の治療方法。
【請求項１５】
癌の治療での使用のための請求項９記載のベクター又は請求項１０記載のベクターの組み合わせあるいは請求項１１又は１２記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａｕｒ−Ａ２０７−２１５ペプチドに特異的なＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を構成するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、前記ポリペプチドで構成されるＴ細胞レセプター、前記核酸を含んでなる組換え核酸、該組換え核酸を含むベクター、前記核酸又はベクターが導入された細胞、ならびに前記のベクター又は細胞を有効成分として含んでなる制がん剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）には、主要組織適合性抗原遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｇｅｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ；以下、ＭＨＣと略す）にコードされる主要組織適合性抗原分子（ＭＨＣ分子、ヒトの場合ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎと呼ばれる；以下、ＨＬＡと略す）と抗原ペプチドとの結合物である複合体を特異的なＴ細胞レセプター（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；以下、ＴＣＲと略す）によって認識し、その複合体を細胞表面に提示している細胞を傷害することのできるものがある。したがって該細胞傷害反応が成立するためには、１）標的細胞のＨＬＡクラスＩのタイプに特異的なＴＣＲを持ったＣＴＬが存在すること、及び２）ＨＬＡ分子に結合して形成される複合体がＴＣＲによる認識を受けることができるような抗原ペプチドが存在することが必要である。【０００３】
このような抗原ペプチドは、例えば哺乳類細胞の細胞内で合成された抗原等が細胞質でプロセスされ、８〜１５アミノ酸よりなるペプチドへと分解されることにより生じる。このペプチドは、更にＨＬＡ分子と会合し、細胞表面に提示される。【０００４】
ＨＬＡクラスＩ分子は大きくＨＬＡ−Ａ、−Ｂ及び−Ｃのサブタイプに分類される。これらのＨＬＡ分子に結合して細胞表面に提示される抗原ペプチドは８〜１０個のアミノ酸よりなり、更に各々のＨＬＡ分子によって異なる一定の構造上の特徴があることが知られている。例えば、世界的に最も保有者の多いＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に結合するペプチドとして、Ｎ末端より２番目にＬｅｕ、及びＣ末端にＬｅｕ又はＶａｌを有する９〜１０個のアミノ酸よりなるペプチドが知られている。また、日本人を始めとするアジアの人種に多いＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するペプチドには、Ｎ末端より２番目にＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ又はＴｒｐのいずれか、及びＣ末端にＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ又はＰｈｅのいずれかを有する９〜１０個のアミノ酸よりなるペプチドがある。【０００５】
現在までに抗原ペプチドが同定されている腫瘍抗原には、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＥＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、β−カテニン（ｃａｔｅｎｉｎ）等があり、これらの抗原由来の、それぞれ１種もしくは複数種のサブタイプのＨＬＡ分子に結合するペプチドが知られている。これらの多くは、まず腫瘍細胞を認識するクラスＩ拘束性のＣＴＬを株化し、このＣＴＬの認識する腫瘍抗原を同定し、続いてＨＬＡクラスＩ分子への結合モチーフに関する情報を参照した遺伝子工学的方法により腫瘍抗原タンパク質中の最小単位ペプチドを決定するという操作で見出されている。また、まず前記のＨＬＡクラスＩ分子結合ペプチドに共通したモチーフ構造を基に腫瘍抗原タンパク質中のＨＬＡクラスＩ分子結合ペプチド候補を見出し、続いて抗原提示細胞とこの候補ペプチドとを利用して腫瘍細胞に対して傷害性を有するＣＴＬを誘導可能なものを選択する方法でも抗原ペプチドが決定されている。【０００６】
ＨＬＡクラスＩ分子サブタイプの分布は人種間で大きく異なり、世界的にはＨＬＡ−Ａ０２が最も多く、白色人種の４５％がＨＬＡ−Ａ０２陽性である。日本人ではＨＬＡ−Ａ０２陽性は４０％を占めるが、そのサブタイプを見ると白色人種と同じＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性は２０％で、残りの多くはＡ＊０２０６陽性である。従って、ＨＬＡ−Ａ０２拘束性の抗原ペプチドの発見は、腫瘍細胞特異的に作用するＣＴＬの誘導による、腫瘍治療に有用なＣＴＬの提供に重要な役割を示す。【０００７】
同じ抗原でも、ＨＬＡの違いに基づいて抗原ペプチドが異なるため、抗原ペプチドを利用したＣＴＬの誘導は煩雑である。この問題を解決するために色々な工夫がなされているが、まだ満足できる成果は得られていない。工夫されていることの一つは、患者自身（自家）由来の抗原提示細胞に抗原遺伝子を形質導入し、これを利用するＴ細胞誘導方法である。抗原提示細胞として、Ｂ細胞、マクロファージ及び樹状細胞が検討されており、プロフェッショナル抗原提示細胞として知られている樹状細胞を中心として、ワクチンのアジュバント等として使用する臨床試験が実施されている。しかし、これらの抗原提示細胞は、免疫誘導に必要な量を準備するのに労力を要することが課題である。Ｂ細胞はＥＢウイルスを用いた不死化による大量調製が可能であるが、ウイルスを使用している点から安全性上問題がある。【０００８】
腫瘍抗原特異的ＴＣＲ遺伝子としては、例えばＨＬＡ−Ａ０２拘束性のＭＡＲＴ１特異的ＴＣＲ〔非特許文献１〕、ＭＡＧＥ−Ａ３特異的ＴＣＲ〔非特許文献２〕、ｇｐ１００特異的ＴＣＲ〔非特許文献３〕、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＴＣＲ〔非特許文献４〕、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＷＴ１（Ｗｉｌｍｓ  ｔｕｍｏｒ  １）特異的ＴＣＲ〔非特許文献５〕、ＭＡＧＥ−Ａ４特異的ＴＣＲ〔特許文献１〕等の遺伝子がクローニングされている。【０００９】
ＴＣＲ遺伝子を任意のＣＴＬに導入することにより目的の抗原に特異的な細胞傷害活性を付与することが期待できる。この知見に基づき、ＭＡＲＴ１〔非特許文献６〕、ｇｐ１００〔非特許文献３〕及びｍＨＡＧ  ＨＡ−２抗原〔非特許文献７〕を標的としたＴＣＲ遺伝子による遺伝子治療が試みられている。【００１０】
Ａｕｒｏｒａ−Ａ  ｋｉｎａｓｅ（Ａｕｒ−Ａ）はセリン／スレオニンキナーゼファミリーに属し、主に細胞周期のＧ２／Ｍ期に発現して有糸分裂細胞の分裂を制御するタンパク質であって、様々ながんにおいて過剰発現しており、予後不良に関与している。Ａｕｒ−Ａの過剰発現は造血器腫瘍に広く観察され、過剰発現は染色体の中心体複製異常や本数異常、不安定性と関連している。また、Ａｕｒ−Ａの異所性過剰発現は高効率でげっ歯類の繊維芽細胞に不死化を招く。以上のことから、Ａｕｒ−Ａはがんワクチン療法の標的抗原として有望視されており、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５ペプチド特異的なＣＴＬクローンが取得されている〔非特許文献８〕。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００７／０３２２５５号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】カンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、第５４巻、第５２６５−５２６８頁（１９９４）
【非特許文献２】アンチカンサー  リサーチ（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、第２０巻、第１７９３−１７９９頁（２０００）
【非特許文献３】ジャーナル  オブ  イムノロジー、（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）第１７０巻、第２１８６−２１９４頁（２００３）
【非特許文献４】ジャーナル  オブ  イムノロジー、第１７４巻、第４４１５−４４２３頁（２００５）
【非特許文献５】ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第１０６巻、第４７０−４７６頁（２００５）
【非特許文献６】ジャーナル  オブ  イムノロジー、第１６３巻、第５０７−５１３頁（１９９９）
【非特許文献７】ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第１０３巻、第３５３０−３５４０頁（２００３）
【非特許文献８】ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第１１３巻、第６６−７４頁（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
腫瘍関連抗原に対するＨＬＡ−Ａ０２拘束性のＴＣＲ遺伝子としては、ＭＡＲＴ１又はＭＡＧＥ−Ａ４に対するものが知られているが、いろいろながんを効果的に治療する観点からは、腫瘍で特異的に発現している種々のがん抗原に対する新たなＴＣＲ遺伝子の発見が望まれる。【００１４】
生体内でＴＣＲを介した細胞傷害活性を担っている細胞は抗原特異的なＴＣＲを持つＣＴＬであるが、抗原特異的なＴＣＲを持つＣＴＬを体外で増殖させてがん等の疾患の治療に使用するには、これらの細胞の取り扱い、例えば採取、拡大培養等に問題を有している。したがって、所望の抗原特異性を有するＣＴＬを大量かつ容易に調製するための、腫瘍抗原等に特異的なＴＣＲの遺伝子を提供することが待ち望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、腫瘍抗原に対するＣＴＬについて鋭意研究した結果、腫瘍抗原であるＡｕｒ−Ａに対するＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のＣＴＬからＴＣＲα鎖及びβ鎖をコードするｃＤＮＡをクローニングすることに成功した。さらに、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を発現する細胞にＡｕｒ−Ａ２０７−２１５ペプチドを添加することにより、これらの細胞がＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５ペプチド特異的な細胞傷害性を示すことを見出し、本発明を完成した。【００１６】
本発明の第１の態様は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴ細胞レセプターを構成するポリペプチドをコードする核酸であって、前記レセプターの可変領域のポリペプチドをコードする塩基配列を有するものに関する。本発明の第１の態様の核酸としては、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとともにＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴ細胞レセプターを構成しうるポリペプチドをコードする核酸であって、
（１）配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸、
（２）配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸、
（３）配列表の配列番号６で示される塩基配列を含む核酸、及び
（４）配列表の配列番号６で示される塩基配列からなる核酸もしくはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸、
から選択される核酸が例示される。本発明の第１の態様には、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする上記核酸も含まれる。
また、本発明の第１の態様の核酸としては、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとともにＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴ細胞レセプターを構成しうるポリペプチドをコードする核酸であって、
（１）配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸、
（２）配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸、
（３）配列表の配列番号８で示される塩基配列を含む核酸、及び
（４）配列表の配列番号８で示される塩基配列からなる核酸もしくはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸、
から選択される核酸も例示される。本発明の第１の態様には、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする上記核酸も含まれる。【００１７】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の核酸にコードされるポリペプチドに関する。当該ポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴ細胞レセプターを構成し、該レセプターのα鎖又はβ鎖の可変領域のポリペプチドを有する。なお、本発明の第２の態様のポリペプチドで構成されてなるＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴ細胞レセプターもまた本発明に含まれる。【００１８】
本発明の第３の態様は、本発明の核酸を含んでなる組換え核酸に関する。【００１９】
本発明の第４の態様は、本発明の第３の態様の組換え核酸が少なくとも１つ挿入されてなるベクターに関する。
また、本発明の第４の態様は、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとともにＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴ細胞レセプターを構成しうるポリペプチドをコードする核酸であって、（１）配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸、（２）配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸、（３）配列表の配列番号６で示される塩基配列を含む核酸、及び（４）配列表の配列番号６で示される塩基配列からなる核酸もしくはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸からなる群より選択される核酸を含有する組換え核酸、あるいは配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする上記核酸を含有する組換え核酸、ならびに配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとともにＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴ細胞レセプターを構成しうるポリペプチドをコードする核酸であって、（１）配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸、（２）配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸、（３）配列表の配列番号８で示される塩基配列を含む核酸、及び（４）配列表の配列番号８で示される塩基配列からなる核酸もしくはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸からなる群より選択される核酸を含有する組換え核酸、あるいは配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする上記核酸を含有する組換え核酸の両方が挿入されてなるベクターに関する。
あるいは、本発明の第４の態様は、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとともにＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴ細胞レセプターを構成しうるポリペプチドをコードする核酸であって、（１）配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸、（２）配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸、（３）配列表の配列番号６で示される塩基配列を含む核酸、及び（４）配列表の配列番号６で示される塩基配列からなる核酸もしくはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸からなる群より選択される核酸を含有する組換え核酸、あるいは配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする上記核酸を含有する組換え核酸が挿入されてなるベクターと、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとともにＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴ細胞レセプターを構成しうるポリペプチドをコードする核酸であって、（１）配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸、（２）配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸、（３）配列表の配列番号８で示される塩基配列を含む核酸、及び（４）配列表の配列番号８で示される塩基配列からなる核酸もしくはその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸からなる群より選択される核酸を含有する組換え核酸、あるいは配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする上記核酸を含有する組換え核酸が挿入されてなるベクターの組み合わせに関する。【００２０】
本発明の第５の態様は、本発明の第４の態様のベクター又はベクターの組み合わせが導入された、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴＣＲを発現する細胞に関する。本発明の第５の態様の細胞としては、Ｔ細胞もしくはＴ細胞に分化しうる細胞が例示される。【００２１】
本発明の第６の態様は、本発明の第４の態様のベクターもしくはベクターの組み合わせ又は第５の態様の細胞を有効成分として含有することを特徴とする制がん剤に関する。【００２２】
本発明の第７の態様は、本発明の第６の態様の制がん剤を投与する工程を包含する、癌の治療方法に関する。
本発明の第８の態様は、癌の治療での使用のための本発明の第４の態様のベクターもしくはベクターの組み合わせ又は第５の態様の細胞に関する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴＣＲのα鎖及びβ鎖をそれぞれコードする核酸が提供される。また、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ではない、又はＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異性を有しないＴ細胞をエフェクター細胞として使用する腫瘍細胞傷害方法が提供される。前記のエフェクター細胞は、例えばがんの治療において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、Ａｕｒ−Ａ２０７−２１５でパルスしたＴ２細胞、ＴＣＲα鎖遺伝子及びβ鎖遺伝子導入ＣＤ８陽性細胞及びＣＤ８陽性細胞の細胞傷害活性を示す図である。
【図２】図２は、抗ヒトＣＤ８抗体及び抗ヒトＶｂ１２抗体と反応させた本発明のＴＣＲ遺伝子導入ヒトＣＤ８陽性リンパ球のフローサイトメトリー解析結果を示す図である。
【図３】図３は、本発明のＴＣＲ遺伝子導入ヒトＣＤ８陽性リンパ球のテトラマーアッセイの結果を示す図である。
【図４】図４は、本発明のＴＣＲ遺伝子導入ヒトＣＤ８陽性リンパ球のＡｕｒｏｒａ−Ａ特異的な細胞傷害活性を示す図である。
【図５】図５は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性白血病細胞株ＧＡＮＭＯ−１に対する本発明のＴＣＲ遺伝子導入ヒトＣＤ８陽性リンパ球の細胞数依存的な細胞傷害活性を示す図である。
【図６】図６は、ＰＢＭＣに対する本発明のＴＣＲ遺伝子導入ヒトＣＤ８陽性リンパ球の細胞傷害活性の解析結果を示す図である。
【図７】図７は、本発明のＴＣＲ遺伝子導入ヒトＣＤ８陽性リンパ球が、白血病細胞内のがん抗原Ａｕｒｏｒａ−Ａタンパク質に由来する標的Ａｕｒｏｒａ−ＡペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２０１に提示された複合体を正確に認識することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の第１の態様は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴ細胞レセプターを構成するポリペプチドをコードする核酸であって、前記レセプターの可変領域のポリペプチドをコードする塩基配列を有するものに関する。前記のポリペプチドには、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の２種があり、両鎖が組み合わされてＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴＣＲを構成する。
【００２６】
ここで、「ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴＣＲ」とは、配列表の配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するペプチド（Ａｕｒ−Ａ２０７−２１５、以下、Ｐ２０７と略す）とＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子との複合体を特異的に認識し、かつ、該ＴＣＲがＴ細胞表面に存在するときに該Ｔ細胞に標的細胞に対するＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のＰ２０７特異的な細胞傷害活性を付与しうるものである。Ｔ細胞が上記複合体を特異的に認識することは公知の方法によって確認すればよく、好適な方法として、例えばＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子とＰ２０７を用いたテトラマー解析又はインターフェロンガンマ産生アッセイが挙げられる。インターフェロンガンマ産生アッセイを行うことにより、該ＴＣＲを細胞表面に発現しているＴ細胞がＴＣＲにより標的細胞を認識し、そのシグナルが細胞内に伝達されたことを確認することができる。上記複合体がＴ細胞表面に存在するときに該Ｔ細胞に細胞傷害活性を付与しうることの確認も公知の方法を用いればよく、好適な方法として、例えばクロムリリースアッセイなどのＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性標的細胞に対する細胞傷害活性の測定が挙げられる。
【００２７】
前記α鎖ポリペプチドは、β鎖とともにＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴＣＲを形成しうるものであって、α鎖可変領域のポリペプチドとして、配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列のポリペプチド；配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチドから選択されるものを有するものを意味する。本発明における、ＴＣＲのα鎖由来のポリペプチドをコードする核酸は、前記のα鎖可変領域のアミノ酸配列もしくはこれに類似した配列をコードする塩基配列を必須の構成成分として含有するものである。定常領域を含有する、α鎖全体のアミノ酸配列もしくはこれに類似した配列、すなわち配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチドから選択されるポリペプチドをコードする核酸は本発明の好適な態様の一つである。
なお、本明細書において、「１〜数個」とは、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜９個を意味する。
【００２８】
また、前記β鎖ポリペプチドは、α鎖とともにＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴＣＲを形成しうるものであって、β鎖可変領域のポリペプチドとして、配列表の配列番号７に示されるアミノ酸配列のポリペプチド；配列表の配列番号７に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列表の配列番号７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチドから選択されるものを有するものを意味する。本発明における、ＴＣＲのβ鎖由来のポリペプチドをコードする核酸は、前記のβ鎖可変領域のアミノ酸配列もしくはこれに類似した配列をコードする塩基配列を必須の構成成分として含有するものである。定常領域を含有する、β鎖全体のアミノ酸配列もしくはこれに類似した配列、すなわち配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチドから選択されるポリペプチドをコードする核酸は本発明の好適な態様の一つである。
【００２９】
本発明を限定するものではないが、前記α鎖ポリペプチドをコードする核酸としては、配列表の配列番号３に示される塩基配列からなる核酸、ならびに前記塩基配列の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸が例示される。α鎖ポリペプチドの可変領域をコードする核酸としては、配列表の配列番号６に示される塩基配列からなる核酸、ならびに前記塩基配列の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつβ鎖とともにＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴＣＲを形成しうるポリペプチドをコードする核酸が例示される。また、前記β鎖ポリペプチドをコードする核酸としては、配列表の配列番号４に示される塩基配列からなる核酸、ならびに前記塩基配列の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつα鎖とともにＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴＣＲを形成しうる核酸が例示される。β鎖ポリペプチドの可変領域をコードする核酸としては、配列表の配列番号８に示される塩基配列からなる核酸、ならびに前記塩基配列の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸が例示される。
【００３０】
ここで、ストリンジェントな条件としては、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、Ｊ．サムブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編集、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．）等に記載された条件が例示される。具体的には、例えば０．５％  ＳＤＳ、５×デンハルツ溶液、０．０１％  変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ中、プローブとともに６５℃にて１２〜２０時間インキュベートする条件が挙げられる。プローブにハイブリダイズした核酸は、例えば０．５％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中、３７℃で洗浄して非特異的に結合したプローブを除去した後に検出することができる。
【００３１】
本明細書における核酸とは、１本鎖あるいは２本鎖の、ＤＮＡ、ＲＮＡあるいはＤＮＡ−ＲＮＡキメラ、又はＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ２本鎖を意味する。核酸の全部又は一部がＲＮＡである場合は、ＲＮＡ部分の配列については、本願明細書に記載の配列表におけるＴをＵと読み替えることとする。本発明の好適な態様としては、例えば、本発明のＴＣＲα鎖ポリペプチドをコードする核酸又はＴＣＲα鎖可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸と、ＴＣＲβ鎖ポリペプチドをコードする核酸又はＴＣＲβ鎖可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸の、２種の核酸の組合せが例示される。前記の核酸の組み合わせは、細胞においてＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴＣＲを発現させる目的に有用である。
【００３２】
本発明の核酸は、例えば次のようにして得ることができる。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＣＴＬ、例えば非特許文献８に記載のクローン＃ＡＵＲ−１から常法によりＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成する。これを鋳型とし、ＴＣＲα鎖及びβ鎖の定常領域をそれぞれコードする核酸に相補的なアンチセンスプライマーを用いて５’−ラピッド  アンプリフィケーション  オブ  ｃＤＮＡ  エンド（ＲＡＣＥ）を行う。５’−ＲＡＣＥは公知の方法により行えばよく、例えばＳＭＡＲＴ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）のような市販のキットを用いて行うことができる。前記手法により増幅されたＤＮＡをプラスミドベクターに組み込み、大腸菌を形質転換する。形質転換体からプラスミドを調製し、挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定する。
【００３３】
得られた塩基配列と既知のＴＣＲα鎖又はβ鎖の遺伝子の配列を比較することにより、５’−ＲＡＣＥにより増幅された、ＴＣＲ遺伝子とは無関係のＤＮＡを除外することができる。また、ＰＣＲの際に塩基配列に変異が生じたＤＮＡが増幅される可能性があるので、本発明では、複数の大腸菌クローンから配列を決定し、そのコンセンサス配列から推定される、前記ＣＴＬが本来有するＴＣＲα鎖遺伝子及びβ鎖遺伝子の配列を使用することが好ましい。
【００３４】
配列表の配列番号３で示される塩基配列を有する、配列番号１のアミノ酸配列のＴＣＲα鎖をコードする核酸、及び、配列表の配列番号４で示される塩基配列を有する、配列番号２のアミノ酸配列のＴＣＲβ鎖をコードする核酸は、上記の方法により得られたものである。
【００３５】
本発明には、上記の方法により得られたＤＮＡを使用してもよいし、同じ配列を有する核酸を化学合成して使用してもよい。さらに、前記のＤＮＡと同じアミノ酸配列をコードする、前記ＤＮＡとは異なる塩基配列のＤＮＡを作製して使用することもできる。前記ＤＮＡとは異なる塩基配列のＤＮＡの設計の際には、細胞におけるコドンの使用頻度やその他の目的に基づいて使用するコドンを選択することが可能である。
【００３６】
目的の抗原を認識するＴＣＲα鎖及びβ鎖をコードする核酸をＴ細胞に導入する場合に、当該Ｔ細胞が本来発現する内在性のＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の発現をｓｉＲＮＡによって抑制する事により、目的の抗原を認識するＴＣＲを高い比率で発現するＴ細胞を得る方法が知られている（国際公開第２００８／１５３０２９号パンフレット）。本発明の核酸を当該方法に適用する場合、本発明の核酸の塩基配列を、内在性のＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の発現を抑えるｓｉＲＮＡが作用するＲＮＡに対応する塩基配列とは異なる配列とすることにより、本発明のＴＣＲを高い比率で発現するＴ細胞を得ることができる。前記の塩基配列は、天然から取得された本発明の核酸へのサイレント変異の導入や、人為的に設計した核酸を化学的に合成することで作製することができる。
【００３７】
本発明の核酸のうち、ＴＣＲを構成する各鎖の可変領域に相当する部分をコードする核酸は、他の機能性分子、例えば抗体、レセプター等をコードする核酸のうち、定常領域、細胞内領域等をコードする領域に接続することができる。こうして構築された新規核酸は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的な結合活性が付与された、キメラ機能性分子の製造に有用である。
【００３８】
本発明の核酸を使用して、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴＣＲを構成するポリペプチドを遺伝子工学的に生産することができる。例えば、前記のα鎖ポリペプチドをコードする核酸、及びβ鎖ポリペプチドをコードする核酸の両方を細胞に導入して両ポリペプチド発現させることにより、当該細胞にＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴＣＲを発現させることができる。
【００３９】
すなわち、本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の核酸にコードされた、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴ細胞レセプターを構成するポリペプチドであって、前記レセプターのα鎖又はβ鎖の可変領域のポリペプチドを有するものに関する。
【００４０】
前記α鎖のポリペプチドは、β鎖とともにＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴＣＲを形成しうるものであって、α鎖可変領域のポリペプチドとして、配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列のポリペプチド；配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチドから選択されるものを有するものを意味する。定常領域を含有する、α鎖全体のアミノ酸配列もしくはこれに類似した配列、すなわち配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチドから選択されるポリペプチドは本発明の好適な態様の一つである。
【００４１】
前記β鎖ポリペプチドは、α鎖とともにＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴＣＲを形成しうるものであって、β鎖可変領域のポリペプチドとして、配列表の配列番号７に示されるアミノ酸配列のポリペプチド；配列表の配列番号７に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び配列表の配列番号７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％以上、より好ましくは９８％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチド；から選択されるものを有するものを意味する。定常領域を含有する、β鎖全体のアミノ酸配列もしくはこれに類似した配列、すなわち配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９３％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上のアミノ酸配列上の同一性を有するポリペプチド；から選択されるポリペプチドをコードする核酸は本発明の好適な態様の一つである。
【００４２】
さらに、本発明のポリペプチドにより構成されていることを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴＣＲも本発明に包含される。前記のＴＣＲは、特に本発明を限定するものではないが、例えば本発明の核酸を使用して、前記核酸にコードされているポリペプチドを人為的に発現させることにより、天然において付随している生体成分とは分離された形態で調製することができる。
【００４３】
本発明の第３の態様は、本発明の核酸を含んでなる組換え核酸である。前記の組換え核酸として、特に本発明を限定するものではないが、本発明の核酸を細胞に導入した場合に前記核酸にコードされているポリペプチドの翻訳を可能とする種々の要素を付加された核酸が例示される。
【００４４】
ＤＮＡからなる本発明の組換え核酸としては、プロモーター（例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、Ｘｉｓｔプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター等の哺乳類由来プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター、各種レトロウイルスのＬＴＲプロモーター等のウイルス由来プロモーター）、ターミネーター、エンハンサー、あるいはそのほかの転写制御領域を有するものが例示される。さらに、第１の発明の核酸にコードされたポリペプチドの翻訳に寄与する配列（Ｋｏｚａｋ配列等）を有していてもよい。前記の各要素が本発明の核酸からのＲＮＡの転写、又はポリペプチドの翻訳に適するように、機能的に連携する位置に配置されることは当然である。なお、組換え核酸がＲＮＡである場合には、転写の制御に関する要素を本発明の組換え核酸に付加しなくてもよい。
【００４５】
本発明の組換え核酸は後述するようにベクターに組み込んで使用する他、ＲＮＡである本発明の核酸を直接細胞に導入することによりＴＣＲの発現に使用することもできる。ＲＮＡの導入方法としては、公知の方法を用いれば良いが、例えば電気穿孔法が好適に使用できる。
【００４６】
本発明の第４の態様は、本発明の組換え核酸が少なくとも１つ挿入されてなるベクターに関する。前記のベクターは所望の細胞にＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴＣＲを発現させるうえで有用である。特に好適な態様としては、（１）本発明のＴＣＲα鎖ポリペプチド又はその可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸を含有する組換え核酸、及び本発明のＴＣＲβ鎖ポリペプチド又はその可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸を含有する組換え核酸の両方が挿入されてなるベクター、ならびに（２）本発明のＴＣＲα鎖ポリペプチド又はその可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸を含有する組換え核酸が挿入されてなるベクターと、本発明のＴＣＲβ鎖ポリペプチド又はその可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸を含有する組換え核酸が挿入されてなるベクターの組み合わせが例示される。前記の（１）の態様において、ＴＣＲα鎖ポリペプチドをコードする核酸とＴＣＲβ鎖ポリペプチドをコードする核酸はそれぞれ別のプロモーターにより転写、翻訳されてもよく、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）又は自己消化性２Ａペプチドを使用して一つのプロモーターで転写、翻訳されてもよい。
【００４７】
本発明のベクターは、Ｔ細胞が本来発現する内在性のＴＣＲα鎖及び／又はＴＣＲβ鎖の発現を抑えるためのｓｉＲＮＡの発現に寄与する配列をさらに有していてもよい。
【００４８】
本発明に使用されるベクターに特に限定はなく、プラスミドベクター、ウイルスベクターなど公知のベクターより目的に応じて適当なものを選択し、使用すればよい。たとえば、前記の組換え核酸をプラスミドベクターに組み込んだ場合には、細胞への導入にはリン酸カルシウム法、カチオニック・リピド法、リポソーム法、エレクトロポーレーション法等の遺伝子導入法を使用できる。
【００４９】
細胞に感染して外来ＤＮＡを導入する能力を有するウイルスベクターは、本発明に好適である。本発明には、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクター、シュードタイプベクター等を含む）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等の公知のウイルスベクターを使用することができる。本発明の組換え核酸を挿入されたウイルスベクターは、各ウイルスに適した条件で目的の細胞に感染させ、本発明の核酸を導入することができる。挿入された外来の核酸を染色体上に組み込む能力を有するレトロウイルスベクターは本発明に好適である。
【００５０】
本発明の第５の態様は、本発明の核酸が導入されていることを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴＣＲを発現する細胞に関する。ここで、本発明の核酸は、前記の本発明の組換え核酸もしくは本発明のベクターとして所望の細胞に導入されていてもよい。本発明の細胞の好適な態様としては、ＴＣＲα鎖ポリペプチド又はその可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸とＴＣＲβ鎖ポリペプチド又はその可変領域ポリペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸の両方が導入されている細胞又は本発明のベクターで形質転換されている細胞が例示される。さらに、前記の核酸が染色体ＤＮＡ上に組み込まれている細胞も本発明に包含される。
【００５１】
ＴＣＲはＴ細胞の抗原の認識に重要な役割を示すことから、好適な本発明の態様は本発明の核酸が導入されたＴ細胞である。生体より採取されたＴ細胞に、前記の手法により本発明の核酸を導入することにより、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴＣＲを発現するＴ細胞を得ることができる。さらに、本発明の好適な態様として、Ｔ細胞に分化しうる細胞に前記の核酸を導入し、その後に細胞をＴ細胞に分化させてもよい。Ｔ細胞に分化しうる細胞としては、例えば造血幹細胞、リンパ球系共通前駆細胞及びＴ細胞前駆細胞が例示される。なお、核酸が導入される導入対象細胞は単一の細胞種に分画されている必要はなく、前記の導入対象細胞を含有する細胞集団、例えば末梢血単核球を核酸導入の対象とすることができる。
【００５２】
導入対象細胞を含有する前記の細胞集団は、ヒトもしくは非ヒト哺乳動物の例えば末梢血、骨髄又は臍帯血より採取すればよい。必要に応じ、Ｔ細胞及び／又はＴ細胞に分化しうる細胞を分画もしくは富化して本発明に使用することができる。本発明のＴＣＲ遺伝子導入細胞をがんなどの治療に用いる場合には、当該細胞集団は治療対象となる患者本人、あるいは患者のＨＬＡタイプが一致したドナーから採取することが好ましい。
【００５３】
本発明の核酸を細胞に導入する方法に特に限定はなく、公知の方法を用いることができる。本発明の核酸又は本発明の組換え核酸を導入する場合には、例えばエレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、カチオニック・リピド法、又はリポソーム法を使用する方法を用いることができる。市販のトランスフェクション試薬〔例えば、ＴｒａｎｓＩＴシリーズ（ミラス社製）、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（ノバジェン社製）、ＲｉｂｏＪｕｉｃｅ（ノバジェン社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（インビトロジェン社製）〕を用いることにより、簡便かつ高効率に核酸を導入できる。本発明のベクターを用いる場合、ベクターがプラスミドベクターであれば、前記の核酸と同様の方法により細胞に導入することができる。一方、ベクターがウイルスベクターであれば、各々のウイルスベクターに適した感染方法を選択すればよい。特に、レトロウイルスベクターを用いる場合には、組換えフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ−２９６（タカラバイオ社製）を用いることにより、各種細胞、特にレトロウイルスベクターの感染効率が低い造血幹細胞に対して、高効率な遺伝子導入が可能となる。
【００５４】
本発明の第６の態様は、本発明の第４の態様のベクター又は第５の態様の細胞を有効成分として含有することを特徴とする制がん剤に関する。本発明の第５の態様により得られた、本発明の核酸を導入されたＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子及びＡｕｒ−Ａ２０７−２１５ペプチドを提示する細胞に対して細胞傷害活性を示す。したがって、前記の本発明のベクター及び細胞は、Ａｕｒ−Ａを発現する癌に対する制がん剤として使用することができる。
【００５５】
前記の本発明の制がん剤は、本発明のベクター又は細胞を有効成分として含有することを特徴とする。該制がん剤は、例えば前記のベクター又は細胞を医薬的に許容される希釈剤に懸濁した形で提供される。なお、ここで言う希釈剤とは例えば当該ベクター又は細胞の保存に適した培地、生理食塩水、又はリン酸緩衝生理食塩水である。培地としては、特に限定するものではないが、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ１０などの培地が一般的に挙げられる。また該制がん剤には医薬的に許容される担体、保存剤等が安定化の目的で添加されていてもよい。なおここで言う担体とはヒト血清アルブミン等である。本発明の細胞を有効成分として含有する制がん剤には前記の細胞を好ましくは１×１０４〜１×１０８個／ｍＬ、より好ましくは５×１０５〜５×１０７個／ｍＬ含有させ得る。
【００５６】
本発明の細胞を有効成分として含有する制がん剤をヒトに投与する場合には、例えば注射器で投与することができ、成人１人当たりの投与量としては、通常、前記の細胞数が好ましくは１×１０６〜１×１０１０個となるようにする。なお、前記の値は目安であり、これに限定されるものではない。また、本発明のベクターを有効成分として含有する制がん剤の場合、投与経路、ベクターの種類等により制がん剤中のベクター濃度及び投与量は大きく異なってもよい。
【００５７】
以上のとおり、本発明により癌の治療方法が提供される。前記治療方法は、本発明の第４の態様のベクターを有効成分として使用する場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療である。一方、本発明の細胞を有効成分として使用する場合、体外に摘出された細胞にＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性でＡｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＴＣＲをコードする核酸を導入した後にこれを患者に投与するｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療である。本発明の治療方法は、投与する個体（例えば、哺乳動物、好ましくはヒト）由来の細胞、もしくはＨＬＡのタイプが同一である個体由来の細胞に核酸を導入して使用することができるため、毒性は特に認められない。
また、本発明は、癌の治療での使用のための本発明の第４の態様のベクターもしくはベクターの組み合わせ又は第５の態様の細胞に関する。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００５９】
実施例１  Ａｕｒ−Ａ特異的ＣＴＬクローンＡＵＲ−１のＴＣＲα鎖及びβ鎖遺伝子のクローニングと配列決定
（１）ＡＵＲ−１からのＲＮＡ調製、５’−ＲＡＣＥ、クローニング
非特許文献８記載の、Ａｕｒ−Ａ２０７−２１５ペプチド（配列表の配列番号９、以下Ｐ２０７と略す）をパルスした標的細胞にＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性に細胞傷害活性を示すＣＴＬクローンであるＡＵＲ−１細胞を培養し、２×１０６個の細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＲＮＡを抽出した。このＲＮＡのうち４００ｎｇを鋳型に、ＣａｐＦｉｓｈｉｎｇ  Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｋｉｔ（シージーン社製）を用いて、キットの取扱説明書に従ってｃＤＮＡを合成した。なお、逆転写反応には、配列表の配列番号１０に示すオリゴｄＴアダプター、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｍ−ＭＬＶ（ＲＮａｓｅＨ  ｆｒｅｅ）（タカラバイオ社製）及び前記酵素に添付の反応用緩衝液を用いた。【００６０】
こうして得られた１本鎖ｃＤＮＡを鋳型に、上記キットを用いてＰＣＲを行った。５’側プライマーとしてはキット添付の５’−ＲＡＣＥプライマー（配列番号１１）を、３’側プライマーとしてはＴＣＲα鎖Ｃ領域に特異的な３−ＴＲα−Ｃプライマー（配列番号１２）、ＴＣＲβ鎖Ｃ１領域に特異的な３−ＴＲβ−Ｃ１プライマー（配列番号１３）又はＴＣＲβ鎖Ｃ２領域に特異的な３−ＴＲβ−Ｃ２プライマー（配列番号１４）を使用した。これらの反応を、それぞれＰＣＲ−α、ＰＣＲ−β１及びＰＣＲ−β２と呼ぶ。各反応液を９４℃で３分間保持した後で、９４℃で４０秒間、５８℃で４０秒間、７２℃で１分間のサイクルを３０回繰り返し、７２℃で５分間保持した。各反応産物の一部をアガロースゲル電気泳動により分析したところ、ＰＣＲ−α及びＰＣＲ−β１において約１ｋｂのＤＮＡが増幅されていた。【００６１】
ＰＣＲ−α及びＰＣＲ−β１の残りの反応産物中のＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって分離し、約１ｋｂのＤＮＡをゲルから回収した。これらをｐＭＤ２０（タカラバイオ社製）に挿入し、得られた組み換えプラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。【００６２】
（２）配列の決定、クラスタリング、及びクローンの選択
こうして得られたＰＣＲ−α又はＰＣＲ−β１に由来する形質転換体からそれぞれ９６個を選択してそのそれぞれからプラスミドを調製し、自動シークエンサーを用いてＤＮＡ塩基配列を決定した。配列データからｐＭＤ２０の配列を除去した後にクラスタリングを行ったところ、最も大きいコンティグのコンセンサス配列に含まれる最も長いオープンリーディングフレームの配列は、配列表の配列番号３及び配列番号４に示すとおりであった。これらの配列は、それぞれＡＵＲ−１細胞のＴＣＲα鎖遺伝子及びβ鎖遺伝子のｃＤＮＡ配列である。ｃＤＮＡ塩基配列から推定されるＴＣＲα鎖及びβ鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号１及び配列番号２に示す。上記のプラスミドの中からＴＣＲα鎖遺伝子又はβ鎖遺伝子ｃＤＮＡのコンセンサス配列をもつプラスミドを選択し、それぞれｐＭＤＴ−ＡＲ−ＴＣＲ−Ａ及びｐＭＤＴ−ＡＲ−ＴＣＲ−Ｂと命名した。なお、前記のα鎖、β鎖の可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号５及び７に、また、前記のα鎖、β鎖のｃＤＮＡ中の可変領域をコードする塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号６及び８に示す。【００６３】
実施例２  ＴＣＲα鎖遺伝子及びβ鎖遺伝子発現レトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入によるＡｕｒ−Ａ特異的ＴＣＲの発現
（１）ＴＣＲα鎖遺伝子及びβ鎖遺伝子発現レトロウイルスベクタープラスミドの構築
ｐＭＳＣＶｎｅｏ（クロンテック社製）を鋳型に、制限酵素Ｘｈｏ  Ｉの認識配列が付加された５’プライマー（配列番号１５）及び制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩの認識配列が付加された３’プライマー（配列番号１６）を用いてＰＣＲを行い、３’−ＬＴＲ部位を増幅してＸｈｏ  Ｉ（タカラバイオ社製）及びＥｃｏ  ＲＩ（タカラバイオ社製）で切断した。得られた断片をｐＭＴベクター［ジーンセラピー  第７巻、第７９７−８０４頁（２０００）に記載されるｐＭベクター］のＸｈｏ  Ｉ―Ｅｃｏ  ＲＩサイトにクローニングし、ｐＭＴ−ＭＳベクターを作製した。ｐＭＥＩ−５ベクター（タカラバイオ社製）を制限酵素Ｍｌｕ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉで切断して得られた約３４０ｂｐの断片を、ｐＭＴ−ＭＳベクターのＭｌｕ  Ｉ―Ｘｈｏ  Ｉサイトにクローニングし、ｐＭＳ３−ＭＣベクターを作製した。【００６４】
ｐＭＤＴ−ＡＲ−ＴＣＲ−Ａを鋳型として、配列番号１７及び配列番号１８にて示されるプライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＨＳ（タカラバイオ社製）を用いて、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で１分間のサイクルを３０回繰り返すＰＣＲを実施し、約１ｋｂの増幅断片を得た。反応液より精製したこの断片をＮｏｔ  Ｉ（タカラバイオ社製）及びＢａｍ  ＨＩ（タカラバイオ社製）にて消化し、Ａｕｒｏｒａ−ＴＣＲ−Ａ  ｉｎｓｅｒｔと命名した。また、ｐＭＤＴ−ＡＲ−ＴＣＲ−Ｂを鋳型として、配列番号１９及び配列番号２０にて示されるプライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＨＳを用いて、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で１分間のサイクルを３０回繰り返すＰＣＲを実施し、約１ｋｂの増幅断片を得た。反応液より精製したこの断片をＮｏｔ  Ｉ及びＢａｍ  ＨＩにて消化し、Ａｕｒｏｒａ−ＴＣＲ−Ｂ  ｉｎｓｅｒｔと命名した。Ａｕｒｏｒａ−ＴＣＲ−Ａ  ｉｎｓｅｒｔ及びＡｕｒｏｒａ−ＴＣＲ−Ｂ  ｉｎｓｅｒｔをそれぞれＮｏｔ  Ｉ及びＢａｍ  ＨＩにて消化したｐＭＳ３−ＭＣに挿入して得られたプラスミドをそれぞれ、ｐＭＳ３−ＡＲ−Ａ及びｐＭＳ３−ＡＲ−Ｂと命名した。【００６５】
ＰＧ１３細胞よりゲノムを抽出し、配列番号２１及び配列番号２２にて示されるプライマーにて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＨＳを用いて、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で３０秒間のサイクルを３０回繰り返すＰＣＲを実施した。反応産物中のＤＮＡを精製し、Ｂｇｌ  ＩＩ（タカラバイオ社製）及びＸｈｏ  Ｉにて消化し、ｍＰＧＫ−ＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩと命名した。ｐＭＳ３−ＡＲ−ＡをＮｏｔ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉにて消化して得られる約１ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって分離回収し、ＡＲ−ＴＣＲ−Ａ−ＮｏｔＩ／ＸｈｏＩと命名した。作製したｍＰＧＫ−ＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩ、ＡＲ−ＴＣＲ−Ａ−ＮｏｔＩ／ＸｈｏＩ、Ｂａｍ  ＨＩ及びＸｈｏ  Ｉにて消化したｐＭＳ３−ＡＲ−Ｂの３つを混合してライゲーションを行い、得られたプラスミドをｐＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａと命名した。【００６６】
（２）ＴＣＲα鎖遺伝子及びβ鎖遺伝子発現レトロウイルスベクターの作製
Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｅｃｏ（タカラバイオ社製）を用いて、Ｇ３Ｔ−ｈｉ細胞（タカラバイオ社製）にｐＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａをトランスフェクションし、一過性にエコトロピックレトロウイルス−ＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａを得た。得られたエコトロピックレトロウイルスをＰＧ１３細胞へ３回感染させることにより、バルクのＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａ産生細胞を作製した。作製したバルクのＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａ産生細胞により、ＧａＬＶエンベロープレトロウイルスであるＧａＬＶ−ＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａレトロウイルスを回収した。また、Ｇ３Ｔ−ｈｉ細胞にＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏ（タカラバイオ社製）を用いて、ｐＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａをトランスフェクションし、一過性にアンフォトロピックレトロウイルス−ＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａを得た。得られたレトロウイルス溶液は、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ  ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過し、使用するまで−８０℃超低温フリーザーで保存した。【００６７】
（３）細胞への遺伝子導入
レトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）をコートした２４ウェルプレートのウェルへアンフォトロピックレトロウイルス−ＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａの５倍希釈溶液を５００マイクロリットル添加し、３７℃で４時間静置した後、ウイルス溶液を除去してＰＢＳでウェルを洗浄した。そこへ、１×１０５個のＳｕｐＴ１細胞を添加し、ウイルス感染を行った。【００６８】
また、レトロネクチン（登録商標）をコートした２４ウェルプレートのウェルにＧａＬＶ−ＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａレトロウイルスを６００マイクロリットル添加した。３２℃、２０００×ｇで２時間遠心を行った後、ウイルス溶液を除去して１．５％  ＨＳＡ・ＰＢＳでウェルを洗浄した。洗浄後のウェルに、ヒト末梢血からＦｉｃｏｌｌ遠心法により分離し、ＯＫＴ−３及びＩＬ−２にて刺激した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を２×１０６個添加し、３２℃、１０００×ｇで１０分間遠心した。遠心後、プレートをＣＯ２インキュベーター中にて３７℃で４時間静置したのち、細胞を回収し、新たな２４ウェルプレートに１×１０６個／ｍＬとなるように再度播種した。翌日、同様の操作を行い、ＧａＬＶ−ＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａレトロウイルスへの２回目の感染を行った。この際、ＣＯ２インキュベーター中にて３７℃で４時間静置した後で、回収した細胞を新たな６ウェルプレートに２×１０５個／ｍＬとなるように再度播種した。【００６９】
（４）テトラマーアッセイ
上記アンフォトロピックレトロウイルス−ＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａ感染ＳｕｐＴ１細胞及び陰性対象として非感染ＳｕｐＴ１細胞を、感染３日後に１００μｇ／ｍＬのＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ａｕｒ−Ａ２０７−２１５テトラマーと３７℃で３０分間反応させた後で、細胞を洗浄した。洗浄した細胞を、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔＩＩ（ＢＤ社製）を用いてフローサイトメトリー解析を行った。【００７０】
その結果、テトラマー陽性率は、陰性対照の非感染ＳｕｐＴ１細胞では０．２％であったのに対して、ＭＳ−ＡＲ−ｂＰａ導入ＳｕｐＴ１細胞では７．８％であった。この結果から、＃ＡＵＲ−１細胞からクローニングしたＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の遺伝子産物は、Ａｕｒ−Ａ２０７−２１５とＨＬＡ−Ａ＊０２０１の複合体を認識することが明らかになった。【００７１】
（５）細胞傷害活性
Ｔ２細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、１×１０６個／ｍＬになるようにＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。この細胞懸濁液１ｍＬに終濃度２０μＭのＡｕｒ−Ａ２０７−２１５を加え、３７℃で１６時間インキュベートした。同様に、Ａｕｒ−Ａ２０７−２１５を加えないＴ２細胞懸濁液１ｍＬを、３７℃で１６時間インキュベートした。両細胞をＦＣＳ不含ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、１×１０６個の細胞を１０００μＬの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。細胞懸濁液に、１０μＬのＤＭＳＯに懸濁した２．５ｍＭ  Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁化学研究所社製）溶液を添加し、３７℃で１時間標識した。得られたサンプルを標的細胞として、細胞傷害活性の測定に使用した。【００７２】
ＧａＬＶ−ＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａレトロウイルス感染ＰＢＭＣ及び非感染ＰＢＭＣを、３×１０６個／ｍＬ、１×１０６個／ｍＬ、３×１０５個／ｍＬ又は１×１０５個／ｍＬとなるように１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し（エフェクター細胞）、その１００μＬを９６穴Ｖ底プレートのウェルに入れた。１×１０５個／ｍＬとなるように標的細胞を、標的細胞の２０倍量の非標識Ｋ５６２細胞を含む、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、エフェクター細胞の入ったウェルに１００μＬずつ添加した。３７℃で５時間反応させた後、遠心分離により上清を回収し、蛍光プレートリーダーにて上清の蛍光強度を測定（ｅｘ：４８５、ｅｍ：５３８ｎｍ）した。蛍光強度の測定値から、次の式により特異的細胞傷害活性を計算した：
【数１】
2010114129.tif 000002
【００７３】
上記の式において、自然放出とはエフェクター細胞を加えないウェルにおける蛍光強度であり、標的細胞からの自然遊離量を示す。また、完全放出とは、トリトンＸ−１００を標的細胞に加えて破壊したときの蛍光強度を示す。【００７４】
この結果を図１に示す。横軸はエフェクター細胞数／標的細胞数比（Ｅ／Ｔ比）を、縦軸は特異的細胞傷害活性（％）を示す。ＧａＬＶ−ＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａレトロウイルス感染ＰＢＭＣはＡｕｒ−Ａ２０７−２１５でパルスしたＴ２細胞に対して細胞傷害活性を示し、Ａｕｒ−Ａ２０７−２１５でパルスしないＴ２細胞に対して細胞傷害活性を示さなかった。また、非感染ＰＢＭＣはＡｕｒ−Ａ２０７−２１５でパルスしたＴ２細胞に対して細胞傷害活性を示さなかった。【００７５】
以上の結果から、＃ＡＵＲ−１細胞のＴＣＲα鎖及びβ鎖をコードする遺伝子は、Ａｕｒ−Ａ２０７−２１５特異的なＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性の細胞傷害活性を、ＣＴＬクローン及び末梢血由来ＣＤ８細胞に付与することが明らかになった。【００７６】
実施例３
（１）細胞への遺伝子導入
ＧａＬＶ−ＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａレトロウイルス感染ヒトＣＤ８陽性リンパ球を実施例２（３）と同様の方法により調製し、これをＴＣＲ遺伝子導入ヒトＣＤ８陽性リンパ球として以下の実験に用いた。【００７７】
（２）ＴＣＲ遺伝子導入ヒトＣＤ８陽性リンパ球のフローサイトメトリー解析
ＴＣＲ遺伝子導入ヒトＣＤ８陽性リンパ球を、抗ヒトＣＤ８抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）及びＴＣＲβ鎖Ｖ領域を特異的に認識する抗ヒトＶｂ１２抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）と反応させた後、フローサイトメトリー解析を行った。その結果を図２に示す。図２中、Ｘ軸はヒトＶｂ１２陽性率、Ｙ軸はヒトＣＤ８陽性率を示す。図２から明らかなように、本発明のＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性Ａｕｒｏｒａ−Ａ特異的ＴＣＲα／β遺伝子を導入したヒトＣＤ８陽性リンパ球は、その６７％がヒトＣＤ８陽性、ヒトＶｂ１２陽性であった。【００７８】
（３）テトラマーアッセイ
ＴＣＲ遺伝子導入ヒトＣＤ８陽性リンパ球を抗ヒトＣＤ８抗体及びＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ａｕｒ−Ａ２０７−２１５テトラマーと反応させた後に、フローサイトメトリー解析を行った。その結果を図３に示す。図３中、Ｘ軸はヒトＣＤ８陽性率、Ｙ軸はテトラマー陽性率を示す。図３から明らかなように、本発明のＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性Ａｕｒｏｒａ−Ａ特異的ＴＣＲα／β遺伝子を導入したヒトＣＤ８陽性リンパ球は、その１５％がヒトＣＤ８陽性、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ａｕｒ−Ａ２０７−２１５テトラマー陽性であった。本実施例の（２）及び（３）の結果から、本発明のＴＣＲ遺伝子をコードするベクターは優れた目的遺伝子導入効率を示し、さらにはテトラマー特異的な反応性をＴ細胞に付与できることが明らかとなった。【００７９】
（４）ＴＣＲ遺伝子導入ヒトＣＤ８陽性リンパ球のＡｕｒｏｒａ−Ａ特異的細胞傷害活性
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性のＢリンパ球細胞株であるＣ１Ｒ−Ａ２細胞５×１０３個に終濃度１μＭになるようにＡｕｒ−Ａ２０７−２１５ペプチドを添加した後に５７Ｃｒで標識し、これをターゲット細胞（Ｔ）とした。ＴＣＲ遺伝子導入ヒトＣＤ８陽性リンパ球をエフェクター細胞（Ｅ）として、エフェクター細胞とターゲット細胞とをその比がそれぞれＥ：Ｔ＝１０：１、５：１、及び２．５：１となるように混合した後に、３７℃で４時間インキュベートした。同様に、Ａｕｒ−Ａ２０７−２１５を加えないＣ１Ｒ−Ａ２細胞５×１０６個を５７Ｃｒで標識したものをターゲット細胞（Ｔ）として、ＴＣＲ遺伝子導入ヒトＣＤ８陽性リンパ球（Ｅ）とＥ：Ｔ＝１０：１、５：１、２．５：１になるように混合した後、３７℃で４時間インキュベートした。また、Ａｕｒ−Ａ２０７−２１５ペプチドを添加したＣ１Ｒ−Ａ２細胞又はＡｕｒ−Ａ２０７−２１５ペプチドを添加しないＣ１Ｒ−Ａ２細胞をエフェクター細胞と混合せずに３７℃で４時間インキュベートしたものを自然放出Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞とした。さらに、自然放出Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞を０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ―１００（和光純薬社製）で処理したものを完全放出Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞とした。自然放出Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞、完全放出Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞、及び各種の混合比でエフェクター細胞と混合したＣ１Ｒ−Ａ２細胞から放出される５７Ｃｒをγカウンターで測定し、測定値から次の式により特異的細胞傷害活性を計算した：
【数２】
2010114129.tif 000003
【００８０】
図４に、特異的細胞傷害活性の解析結果を示す。図４中、Ｘ軸は細胞傷害活性を示す。図４に示す通り、本発明のＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性Ａｕｒｏｒａ−Ａ特異的ＴＣＲα／β遺伝子を導入したヒトヒトＣＤ８陽性リンパ球は、Ｅ／Ｔ比１０：１、５：１、及び２．５：１で、それぞれ８３％、７０．７％、及び４９．２％という高い細胞傷害活性を示した。一方、Ａｕｒ−Ａ２０７−２１５を加えないＣ１Ｒ−Ａ２細胞に対する細胞傷害活性は示さなかった。このことから、本発明のＴＣＲα／β遺伝子により、Ａｕｒ−Ａ特異的な細胞傷害活性をＴ細胞に付与できることが明らかになった。【００８１】
実施例４
ＧａＬＶ−ＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａレトロウイルスの感染ヒトＣＤ８陽性リンパ球を実施例２（３）と同様の方法により調製し、これをエフェクター細胞とした。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性且つＡｕｒ−Ａ発現白血病細胞株であるＧＡＮＭＯ−１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陰性且つＡｕｒ−Ａ発現白血病細胞株であるＭＥＧ０１、ＫＡＺＺ、及びＯＵＮ−１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性且つＡｕｒ−Ａ非発現ヒトＰＢＭＣ、並びにＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性且つＡｕｒ−Ａを生理的にある程度発現しているヒトヒト末梢血リンパ球にＰｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＨＡ）１μｇ／ｍｌを添加して正常分裂周期にしたヒトＰＨＡ−Ｂｌａｓｔを、それぞれ５７Ｃｒで標識したものをターゲット細胞として、実施例３と同様の方法で細胞傷害活性を算出した。【００８２】
図５に白血病細胞株に対するＧａＬＶ−ＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａレトロウイルス感染ヒトＣＤ８陽性リンパ球の細胞傷害活性の解析結果を示す。図５中、Ｘ軸は細胞傷害活性を示す。本発明のＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性Ａｕｒｏｒａ−Ａ特異的ＴＣＲα／β遺伝子を導入したヒトＣＤ８陽性リンパ球は、Ａｕｒｏｒａ−Ａを過剰発現するＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性白血病細胞株ＧＡＮＭＯ−１に対してエフェクター細胞数依存性に有意な細胞傷害活性を示した。一方、Ａｕｒｏｒａ−Ａを過剰発現するがＨＬＡ−Ａ＊０２０１陰性の白血病細胞株ＭＥＧ０１、ＫＡＺＺ、ＯＵＮ−１に対しては細胞傷害活性を示さなかった。これらの結果から、本発明のＴＣＲα／β遺伝子を導入したＴ細胞がＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性に抗白血病細胞作用を示すことが明らかとなった。【００８３】
図６にＰＢＭＣに対するＧａＬＶ−ＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａレトロウイルス感染ヒトＣＤ８陽性リンパ球の細胞傷害活性の解析結果を示す。図６中、Ｘ軸は細胞傷害活性を示す。白血病細胞株に対する場合とは異なり、Ａｕｒｏｒａ−Ａを殆ど発現していないヒトＰＢＭＣ、及び生理的にある程度のＡｕｒｏｒａ−Ａの発現を認める正常分裂周期ヒトＰＨＡ−Ｂｌａｓｔに対しては細胞傷害活性を示さなかった。この結果から、本発明のＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性Ａｕｒｏｒａ−Ａ特異的ＴＣＲα／β遺伝子を導入したヒトヒトＣＤ８陽性リンパ球は、がん抗原Ａｕｒｏｒａ−Ａを過剰発現した腫瘍細胞のみをＨＬＡ拘束性に認識して攻撃するという安全性が確認された。【００８４】
実施例５
ＧａＬＶ−ＭＳ３−ＡＲ−ｂＰａレトロウイルス感染ヒトＣＤ８陽性リンパ球を実施例２（３）と同様の方法で調製し、これをエフェクター細胞とした。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陰性且つＡｕｒ−Ａ発現白血病細胞株であるＭＥＧ０１にＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子を導入したＭＥＧ０１−Ａ＊０２０１細胞株を作製し、さらに５７Ｃｒで標識してこれをターゲット細胞とし、実施例３と同様の方法で細胞傷害活性を算出した。なお、Ｅ／Ｔ比は２０：１、１０：１、及び５：１で行った。【００８５】
図７に細胞傷害活性の解析結果を示す。図７中、Ｘ軸は細胞傷害活性を示す。ＭＥＧ０１細胞株は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１が陽性になることで、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性Ａｕｒ−Ａ特異的ＴＣＲα／β遺伝子を導入したヒトＣＤ８陽性リンパ球の傷害活性に対する感受性を獲得した。このことから、本発明のＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性Ａｕｒｏｒａ−Ａ特異的ＴＣＲ−α／β遺伝子を導入したヒトＣＤ８陽性リンパ球は、白血病細胞内のがん抗原Ａｕｒｏｒａ−Ａタンパク質に由来する標的Ａｕｒｏｒａ−ＡペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２０１に提示された複合体を正確に認識して、抗白血病細胞作用を示すことが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明によりＡｕｒ−Ａに対するＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のＣＴＬ由来のＴＣＲα鎖及びβ鎖のポリペプチド、ならびに該ポリペプチドをコードする核酸が提供される。前記の核酸はＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子及びＡｕｒ−Ａ２０７−２１５ペプチドを提示する細胞に対する細胞傷害活性をＴ細胞に付与できることから、Ａｕｒ−Ａを発現する癌の治療に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００８７】
SEQ ID NO:10 ;Oligo dT adaptor.
SEQ ID NO:11 ;5'-RACE primer.
SEQ ID NO:12 ;Synthetic primer 3-TRalpha-C to amplify a DNA fragment encoding TCR alpha chain.
SEQ ID NO:13 ;Synthetic primer 3-TRbeta-C1 to amplify a DNA fragment encoding TCR beta chain.
SEQ ID NO:14 ;Synthetic primer 3-TRbeta-C2 to amplify a DNA fragment encoding TCR beta chain.
SEQ ID NO:15-22 ;Synthetic primer.
【図１】
2010114129.tif 000004
【図２】
2010114129.tif 000005
【図３】
2010114129.tif 000006
【図４】
2010114129.tif 000007
【図５】
2010114129.tif 000008
【図６】
2010114129.tif 000009
【図７】
2010114129.tif 000010
【配列表】
2010114129000001.app
【国際調査報告】
2010114129.tif 000011
2010114129.tif 000012
2010114129.tif 000013
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2010114129.tif 000015
2010114129.tif 000016