(57)【要約】  ケラタン硫酸−Iとケラタン硫酸−IIとに対する相対的反応特異性が、ＩＣ５０ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩとして０．４〜５である抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体を、生体試料に接触させ、これにより得られるシグナルにより、当該生体試料中のケラタン硫酸を検出する、ケラタン硫酸の免疫学的測定方法を提供し、これを基にして、関節疾患の検知方法と関節疾患の治療薬ないしその候補物質の評価物質の効果の判定方法を提供する。これらの方法により、試料中の微量のケラタン硫酸、特に従来の方法では測定が難しかったケラタン硫酸−Ｉを含む全ケラタン硫酸を高感度且つ特異的に測定することができ、関節疾患の検知方法および関節疾患治療薬若しくはその候補物質の効果の判定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケラタン硫酸−Iとケラタン硫酸−IIとに対する相対的反応特異性が、ＩＣ５０ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩとして０．４〜５である抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体を、生体試料に接触させ、これにより得られるシグナルにより、当該生体試料中のケラタン硫酸を検出する、ケラタン硫酸の免疫学的測定方法。
ただし、ＩＣ５０ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩは、ケラタン硫酸−Iの競合的免疫測定方法での５０％阻害濃度（ｎｇ／ｍＬ）をケラタン硫酸−IIの競合的免疫測定方法での５０％阻害濃度（ｎｇ／ｍＬ）で除した値を示す。
【請求項２】
ケラタン硫酸−Iとケラタン硫酸−IIとに対する相対的反応特異性が、ＩＣ５０ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩとして０．４〜５である抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体は、BCD-4、BCD-7、BC-261、BC-703、MK-172、MK-202、および、EFG-11からなる群から選ばれる１種または２種以上のモノクローナル抗体である、請求項１に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法。
【請求項３】
下記工程を含む、請求項１または２に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法。
工程１：ケラタン硫酸−Iとケラタン硫酸−IIとに対する相対的反応特異性が、ＩＣ５０ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩとして０．４〜５である抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体を固着させた固相、および、標識された当該抗体を、一緒に若しくは先後別々に生体試料に接触させ、当該抗体と生体試料中のケラタン硫酸の免疫複合体を当該固相上に形成させる工程；
工程２：当該免疫複合体における標識のシグナルにより得られる検出値により、生体試料中のケラタン硫酸を測定する工程。
【請求項４】
固相に固着させる抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体はMK-172またはBCD-4であり、標識抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体は標識BCD-4または標識MK-172である、請求項３に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法。
【請求項５】
固相に固着させる抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体はBCD-7またはEFG-11であり、標識抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体は標識BCD-7または標識EFG-11である、請求項３に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法。
【請求項６】
生体試料が動物由来の試料である、請求項１〜５のいずれか1項に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法。
【請求項７】
動物が、ウサギ、モルモット、ラットまたはマウスである、請求項６に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法。
【請求項８】
生体試料がヒト由来の試料である、請求項１〜５のいずれか1項に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法。
【請求項９】
生体試料が血液試料または関節液である、請求項１〜８のいずれか1項に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法。
【請求項１０】
前記生体試料は、プロテアーゼ処理が施されている生体試料である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法。
【請求項１１】
前記プロテアーゼは、プロナーゼ、ズブチリシン、パパイン、および、トリプシン、からなる群のプロテアーゼから選ばれる１種または２種以上のプロテアーゼである、請求項１０に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法に使用するためのキットであって、抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体としてBCD-4、BCD-7、BC-261、BC-703、MK-172、MK-202、および、EFG-11からなる群から選択される１または２以上を含む、ケラタン硫酸測定用キット。
【請求項１３】
前記キットに含まれる抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体は、BCD-4およびMK-172である、請求項１２に記載のケラタン硫酸測定用キット。 
【請求項１４】
前記キットに含まれる抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体は、BCD-７およびEFG-11である、請求項１２に記載のケラタン硫酸測定用キット。 
【請求項１５】
下記の工程を含む、関節疾患の検知方法。
工程１：請求項１〜１１のいずれかに記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法によって、被検体中のケラタン硫酸を測定する工程；
工程２：工程１により測定される被検体中のケラタン硫酸量と、正常検体中のケラタン硫酸量、および／または、時間をおいて複数回にわたり測定される被検体中のケラタン硫酸量とを比較する工程；
工程３：工程２における比較に基づいて、被検体中のケラタン硫酸量が、正常検体中のケラタン硫酸量よりも増加している場合を、関節疾患について陽性であると判定し、あるいは、複数回の測定により検出された被検体中のケラタン硫酸量が、前の回の測定値よりも増加している場合を関節疾患は進行傾向にあると判定する工程。
【請求項１６】
関節疾患が、変形性関節症または外傷性関節症である、請求項１５に記載の関節疾患の検知方法。
【請求項１７】
関節疾患が、Ｘ線によっては検知できない変形性関節症である、請求項１６に記載の関節疾患の検知方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の関節疾患の検知方法に使用するためのキットであって、抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体として、BCD-4、BCD-7、BC-261、BC-703、MK-172、MK-202、および、EFG-11からなる群から選択される１または２以上を含む、関節疾患の検知用キット。
【請求項１９】
前記キットに含まれる抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体は、BCD-4およびMK-172である、請求項１８に記載の関節疾患の検知用キット。
【請求項２０】
前記キットに含まれる抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体は、BCD-７およびEFG-11である、請求項１８に記載の関節疾患の検知用キット。
【請求項２１】
下記の工程を含むことを特徴とする関節疾患治療薬またはその候補物質の治療効果の判定方法。
工程１：請求項１〜１１のいずれかに記載のケラタン硫酸の免疫学的測定方法によって、関節疾患治療薬またはその候補物質の投与前の被検体と、投与後の被検体中のケラタン硫酸を測定する工程；
工程２：工程１により得られた関節疾患治療薬またはその候補物質の投与前の被検体中のケラタン硫酸量と、投与後の被検体中のケラタン硫酸量を比較する工程；
工程３：工程２における比較に基づいて、関節疾患治療薬またはその候補物質の投与前のケラタン硫酸量から、投与後のケラタン硫酸量への正常方向への変化の度合いを検出し、これを指標として上記治療薬またはその候補物質の効果を判定する工程。
【請求項２２】
請求項２１に記載の関節疾患治療薬またはその候補物質の治療効果の判定方法に使用するためのキットであって、抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体として、BCD-4、BCD-7、BC-261、BC-703、MK-172、MK-202、および、EFG-11からなる群から選択される１または２以上を含む、治療効果の判定用キット。
【請求項２３】
前記キットに含まれる抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体は、BCD-4およびMK-172である、請求項２２に記載の治療効果の判定用キット。
【請求項２４】
前記キットに含まれる抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体は、BCD-７およびEFG-11である、請求項２２に記載の治療効果の判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の微量のケラタン硫酸を高感度且つ特異的に測定することが可能なケラタン硫酸の測定方法およびこれに用いる測定用キットに関し、さらに、当該測定方法を用いる関節疾患の検知方法およびこれに用いる検知用キット、並びに、関節疾患治療薬またはその候補物質の薬剤効果の判定方法および判定用キットに関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
ケラタン硫酸はグリコサミノグリカンの一種であり、軟骨、角膜など比較的限定された組織にアグリカン、ケラトカン、ルミカンなどのプロテオグリカンあるいはケラタン硫酸プロテオグリカンの側鎖として存在している。ケラタン硫酸はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−ガラクトースからなる二糖の繰り返し構造を基本糖鎖構造として有する酸性多糖であり、様々な程度の硫酸化により修飾されている。ケラタン硫酸は、角膜では角膜透明性の維持を担う重要な成分であり、軟骨ではその構造維持に重要な細胞外マトリックスであるアグリカンの構成成分である。特に、関節疾患では、変形性関節症、関節リウマチなどの患者における血清中のケラタン硫酸レベルの変動が知られており、関節疾患のマーカーとして注目されている分子である。【０００３】
ケラタン硫酸には、角膜、サバ魚皮に由来するケラタン硫酸−Ｉと軟骨、椎間板、髄核に由来するケラタン硫酸−IIがあり、ケラタン硫酸とコア蛋白質との結合様式は、ケラタン硫酸−Ｉではアスパラギン酸残基と糖鎖がＮ−グリコシド結合し、ケラタン硫酸−IIではセリンあるいはトレオニン残基にＮ−アセチルガラクトサミンがＯ−グリコシド結合（生化学辞典（第３版），（株）東京化学同人発行）した形であり、両者の結合様式は異なる。また、これらのケラタン硫酸の構造は、ケラタン硫酸−Ｉは４糖に対し３つの硫酸基を含む構造が主構造であり、ケラタン硫酸−IIは４糖に対し４つの硫酸基を含む構造が主構造と認識されており、ケラタン硫酸−Ｉはケラタン硫酸−IIより硫酸含量が低い。【０００４】
このようなケラタン硫酸に対する抗体としては、５Ｄ４（クローン名）が知られており、本抗体の認識最小単位は６糖あたり５硫酸基を含む構造と報告されており（非特許文献１）、比較的硫酸含量の多いケラタン硫酸と反応することが認識されている。また、本抗体は生化学工業株式会社から販売されており、研究分野で広く使用されている。【０００５】
現在用いられているケラタン硫酸の検出方法としては、セルロースアセテート膜電気泳動、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）、免疫学的測定法（ＥＬＩＳＡ法等）がある。セルロースアセテート膜電気泳動法は感度が低く、試料中の微量のケラタン硫酸を検出するには不利な方法である。ＨＰＬＣ法としては宮内らの方法（特許文献１）などが知られている。ＨＰＬＣ法は、ケラタン硫酸を特異的に分解するケラタナーゼで試料中のケラタン硫酸を消化し、生じたケラタン硫酸の二糖を分析する方法である。ＨＰＬＣ法は、特異性が高く且つより高感度ではあるものの、プロテアーゼ消化、粗精製、ケラタナーゼ消化等の試料の前処理が必要であり、一般に多検体を処理するには不利な方法である。より多検体処理に適し、操作性に優れているＥＬＩＳＡ法では、５Ｄ４を用いた競合ＥＬＩＳＡ法（特許文献２）およびサンドイッチＥＬＩＳＡ法（特許文献３）が知られている。【０００６】
競合ＥＬＩＳＡ法は、使用する抗体が１種類のため測定系の特異性が低い場合があり、また、試料中の共存物質の影響を受けやすい方法とされており、特異性の点ではサンドイッチＥＬＩＳＡ法の方が優れている。サンドイッチＥＬＩＳＡ法による５Ｄ４を用いたケラタン硫酸測定法は、試料中のケラタン硫酸検出に有用とのことから、本方法を用いたヒト、イヌ、ウマもしくはウサギの血清または関節液およびモルモット関節液での測定報告はあるが、ケラタン硫酸量が非常に少ないと考えられているラットおよびマウス由来の試料での測定報告は殆どない状態である。このように、現在でもケラタン硫酸の測定が困難であり、ケラタン硫酸の存在が明確でない生体由来試料も多いのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−５７９００
【特許文献２】特公平６−８４９７１
【特許文献３】ＷＯ９０／０７１２０
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５７，３８５−４９１（１９８７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、試料中の微量のケラタン硫酸、特に従来の方法では測定が難しかったケラタン硫酸−Iを含む全ケラタン硫酸を高感度且つ特異的に測定することが可能なケラタン硫酸の測定方法およびこれに用いる測定用キット、さらに、当該測定方法を用いる関節疾患の検知方法およびこれに用いる検知用キット、並びに、関節疾患治療薬またはその候補物質の薬剤効果の判定方法および判定用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ケラタン硫酸に対する抗体の反応特異性に着目し、硫酸含量の少ないケラタン硫酸−Ｉ、および、硫酸含量の多いケラタン硫酸−ＩＩに対し十分に反応し、ケラタン硫酸−Ｉとケラタン硫酸−ＩＩに対する反応特異性の差が少ない抗ケラタン硫酸抗体を用いることにより、試料中の微量のケラタン硫酸を高感度に簡便且つ特異的に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、ケラタン硫酸−Iとケラタン硫酸−IIとに対する相対的反応特異性が、ＩＣ５０ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩとして０．４〜５である抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体を、生体試料に接触させ、これにより得られるシグナルにより、当該生体試料中のケラタン硫酸を検出する、ケラタン硫酸の免疫学的測定方法（以下、本発明の測定法ともいう）を提供する発明である。【００１２】
ただし、ＩＣ５０ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩは、ケラタン硫酸−Iの競合的免疫測定方法での５０％阻害濃度（ｎｇ／ｍＬ）をケラタン硫酸−IIの競合的免疫測定方法での５０％阻害濃度（ｎｇ／ｍＬ）で除した値を示す。上記において、ケラタン硫酸−Iの競合的免疫測定方法での５０％阻害濃度およびケラタン硫酸−IIの競合的免疫測定方法での５０％阻害濃度とは、それぞれ後述する実施例１に記載の方法により測定される濃度を意味する。上記のケラタン硫酸−Iとケラタン硫酸−IIとしては、後述する実施例１に記載の通り、それぞれＫＳ（ＢＣ）（生化学工業株式会社販売）、ＫＰＳ−１（生化学工業株式会社製）を用いることができ、これらは典型的には下記の性質を有する。【００１３】
KS-I：  二糖分析での分析値: （Gal6S-GN6S）/ total = 36〜44 %
GPC法での分析値: 13kDa〜15kDa
KS-II： 二糖分析の分析値: （Gal6S-GN6S） /total = 95〜100 %
GPC法での分析値: 12kDa〜14kDa
上記の分析値は下記（１）および（２）の方法で得ることができる。測定結果の具体例と合わせて下記に示す。【００１４】
（１）  KS-IおよびKS-IIの二糖組成比
KS-IおよびKS-IIの二糖構成単位である、
2-acetamido-2-deoxy-4-O-(b-D-glucopyranosyl)-6-O-sulfo-D-gulcose (Gal-GN6S)
および
2-acetamido-2-deoxy-4-O-(6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-6-O-sulfo-D-gulcose (Gal6S-GN6S)
の組成比を、Analytical method to determine keratan sulfate in the serum using HPLC. Kurahashi Y, Masuda H, Miyazaki K. Rinsho Byori (2008) 56(5), 373-378に記載の方法に基づきHPLC法で分析した。その結果を、表１に示した。結果は、２種類の二糖単位の総和に占める各成分の割合で示した。【００１５】
【表１】
2010074123.tif 000002
【００１６】
（２）  KS-IおよびKS-IIの分子量分析
KS-IおよびKS-IIの分子量を、Identification and functions of chondroitinsulfate in the milieu of neural stem cells. Ida M, ShuoT, Hirano K, Tokita Y, Nakanishi K, Matsui F, Aono S, Fujita H, Fujiwara Y, KajiT, Oohira A. J. Biol. Chem. (2006) 281(9), 5982-5991に記載の方法に基づきGPC法で分析した。分析の標準品としては、Evaluation of Molecular Weights of Hyaluronate Prfeparations by Multi-Angle Laser Light Scattering. Chikako Yomota Bull. Natl. Health Sci. (2003) 121, 030-033に記載の方法で分子量を定めた５種のコンドロイチン硫酸を使用した。その結果を、表２に示した。結果は、ピーク分子量で示した。【００１７】
【表２】
2010074123.tif 000003
【００１８】
上記生体試料は、血液試料または関節液であることが好適である。血液試料とは、例えば、血清、血漿、全血等を意味するものである。【００１９】
上記の「ＩＣ５０ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩとして０．４〜５である抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体」としては、BCD-4、BCD-7、BC-261、BC-703、MK-172、MK-202、または、EFG-11（後述する）が挙げられる。【００２０】
本発明の測定法では、固相体に抗ケラタン硫酸抗体が固定化された固相化抗ケラタン硫酸抗体、または、標識物質が抗ケラタン硫酸抗体に結合した標識抗ケラタン硫酸抗体、を用いることを好適な態様の一つとして挙げられる。【００２１】
例えば、下記工程を含む、ケラタン硫酸の免疫学的測定方法が挙げられる。
［工程１］ケラタン硫酸−Iとケラタン硫酸−IIとに対する相対的反応特異性が、ＩＣ５０ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩとして０．４〜５である抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体を固着させた固相、および、標識された当該抗体を、一緒に若しくは先後別々に生体試料に接触させ、当該抗体と生体試料中のケラタン硫酸の免疫複合体を当該固相上に形成させる工程。
［工程２］当該免疫複合体における標識のシグナルにより得られる検出値により、生体試料中のケラタン硫酸を測定する工程。【００２２】
本発明の測定法の当該好適態様においては、固相化抗ケラタン硫酸抗体と標識抗ケラタン硫酸抗体が、互いに同一の抗ケラタン硫酸抗体であっても、異なる抗ケラタン硫酸抗体であってもよい。【００２３】
また、本発明は、上記のような本発明の測定法を行うための測定用キット、すなわち、試料中に存在するケラタン硫酸を免疫学的測定法により測定するために用いるキットであって、抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体として、BCD-4、BCD-7、BC-261、BC-703、MK-172、MK-202、および、EFG-11からなる群から選択されるモノクローナル抗体を含んでなる、ケラタン硫酸測定用キット（以下、本発明の測定用キットともいう）を提供する発明である。【００２４】
さらに、本発明は、BCD-4およびMK-172の組み合わせ、またはBCD-７およびEFG-11の組み合わせからなるモノクローナル抗体を含む、上記本発明の測定用キットを提供する発明である。【００２５】
さらに、本発明は、下記の工程を含む、関節疾患の検知方法（以下、本発明の疾患の検知法ともいう）を提供する発明である。
［工程１］本発明の測定法によって、被検体中のケラタン硫酸を測定する工程。
［工程２］工程１により測定される被検体中のケラタン硫酸量と、正常検体中のケラタン硫酸量、および／または、時間をおいて複数回にわたり測定される被検体中のケラタン硫酸量とを比較する工程。
［工程３］工程２における比較に基づいて、被検体中のケラタン硫酸量が、正常検体中のケラタン硫酸量よりも増加している場合を、関節疾患について陽性であると判定し、あるいは、複数回の測定により検出された被検体中のケラタン硫酸量が、前の回の測定値よりも増加している場合を関節疾患は進行傾向にあると判定する工程。【００２６】
本発明の疾患の検知法は、特に、被検体を、本発明の測定法に準じて、血液検体（血液試料と同意義）または関節液とすることにより、関節疾患を判定することが可能である。【００２７】
関節疾患は、例えば、変形性関節症または外傷性関節症が挙げられる。特に、本発明の疾患の検知法は、Ｘ線によっては検知できない変形性関節症変形性を容易に検知することができる。【００２８】
なお、本明細書においてＸ線によっては検知できない変形性関節症変形性とは、Kellgren and Lawrenceの方法（Ann. Rheum. Dis. 1957, 16, 494-502）に従って関節症の診断を行った場合に、Ｘ線所見ではGrade０あるいはgradeＩであるが、疼痛、腫脹等何らかの症状が認められ、且つ関節内視鏡により関節軟骨の色調変化、けば立ち、粗造化等の変性あるいは損傷が認められる状態をいう。【００２９】
また、本発明は、上記のような本発明の疾患の検知法を行うための検知用キットであって、抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体として、BCD-4、BCD-7、BC-261、BC-703、MK-172、MK-202、および、EFG-11からなる群から選択されるモノクローナル抗体を含んでなる、関節疾患検知用キット（以下、本発明の検知用キットともいう）を提供する発明である。【００３０】
さらに、本発明は、BCD-4およびMK-172の組み合わせ、またはBCD-７およびEFG-11の組み合わせからなるモノクローナル抗体を含む、上記関節疾患検知用キットを提供する発明である。【００３１】
また、本発明は、下記の工程を含むことを特徴とする関節疾患治療薬またはその候補物質の治療効果の判定方法（以下、本発明の薬剤効果判定法ともいう）を提供する発明である。
［工程１］本発明の測定法によって、関節疾患治療薬またはその候補物質（以下、治療薬等ともいう）の投与前の検体と、投与後の検体中のケラタン硫酸を測定する工程。
［工程２］工程１により得られた治療薬等の投与前の被検体中のケラタン硫酸量と、投与後の被検体中のケラタン硫酸量を比較する工程。
［工程３］工程２における比較に基づいて、治療薬等の投与前のケラタン硫酸量から、投与後のケラタン硫酸量への正常方向への変化の度合いを検出し、これを指標として上記治療薬等の効果を判定する工程。【００３２】
また、本発明は、上記のような本発明の疾患の薬剤効果判定法を行うための判定用キットであって、抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体として、BCD-4、BCD-7、BC-261、BC-703、MK-172、MK-202、および、EFG-11からなる群から選択されるモノクローナル抗体を含んでなる、薬剤効果判定用キット（以下、本発明の薬剤効果判定用キットともいう）を提供する発明である。【００３３】
さらに、本発明は、BCD-4およびMK-172の組み合わせ、またはBCD-７およびEFG-11の組み合わせからなるモノクローナル抗体を含む、上記本発明の薬剤効果判定用キットを提供する発明である。【００３４】
本明細書において、免疫学的測定法とは抗原抗体反応を利用した測定法を全て包含する意味で使用し、イムノアッセイ（immunoassay）と同義である。また、競合的免疫測定法とは、標識抗原と抗体が存在する系に、測定すべき物質（被検抗原）を存在させて、標識抗原と被検抗原を抗体に対して競合的あるいは阻害的に反応させ、適当な方法でＢ／Ｆ分離を行い、標識物質のシグナルを測定する方法を意味する。また、サンドイッチ法とは固相化抗体と抗原と標識抗体との免疫複合体を測定系中で形成させ、適当な方法でＢ／Ｆ分離を行い、標識物質のシグナルを測定する方法で、固相法による非競合的な免疫学的測定法（イムノメトリックアッセイ）である。このうち、標識物質として酵素を使用する方法をサンドイッチＥＬＩＳＡ法という。また、プロテアーゼとは、蛋白質分解酵素(proteolyticenzyme、peptide hydrolase)であり、ペプチド結合を分解する酵素類の総称である。これらの用語の詳細な定義については「バイオテクノロジー事典（１９８９年、(株)シーエムシー発行）」または「生化学辞典  第３版（１９９８年）」等を参照されたい。
【発明の効果】
【００３５】
本発明の測定法および測定用キットを用いることにより、従来測定が困難であったケラタン硫酸−Ｉも感度良く検出することができ、生体試料中の微量のケラタン硫酸を高感度に簡便且つ特異的に検出することができる。また、従来検出困難であった各種動物試料中の極めて微量のケラタン硫酸を特異的に検出することが可能となり、多様な試料中のケラタン硫酸の検出への応用が可能となる。これにより、生物学および医学上、特には、関節領域において、動物モデルあるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでのエビデンスをベースとした医薬品開発、検査薬開発が可能となり、極めて有用な研究開発および検査ツールを提供することができる。【００３６】
また、本発明の疾患の検知法および検知用キットでは、従来は検知不可能であった、被検体中の微量のケラタン硫酸の動向を関節疾患と関連付けて、新たな関節疾患についての有用な指標を与えるものである。具体的には、例えば、膝関節等における軟骨の損傷を鋭敏に検出することができる。さらに、本発明の薬剤効果の判定法および判定用キットでは、確立した関節疾患の治療薬の臨床における効果、または、当該治療薬の候補物質のスクリーニングに際しての効果を、被検体中のケラタン硫酸量を鋭敏に検出することで判定することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】各抗ケラタン硫酸抗体におけるケラタン硫酸−ＩとIIとの反応性について検討した結果を示している。
【図２】サンドイッチＥＬＩＳＡ法におけるケラタン硫酸の反応曲線である。
【図３】ＢＣＤ−４／ＭＫ１７２測定系で、プロナーゼ無処理血清及び当該処理血清を試料として測定したケラタン硫酸濃度と、ＨＰＬＣで測定したケラタン硫酸濃度との間の相関を示している。
【図４】ＥＧＦ１１／ＥＧＦ１１測定系で、プロナーゼ無処理血清及び当該処理血清を試料として測定したケラタン硫酸濃度と、ＨＰＬＣで測定したケラタン硫酸濃度との間の相関を示している。
【図５】ラット半月板切除モデルでの肉眼スコアである。
【図６】ラット半月板切除モデルにおける関節液のケラタン硫酸レベルを示している。
【図７】アジュバント誘発関節炎のラットの関節液におけるケラタン硫酸レベルを示している。
【図８】アジュバント誘発関節炎のラットにおける血漿中のケラタン硫酸レベルを示している。
【図９】パパイン誘発ウサギモデルにおける血清中ＫＳレベルを示している。
【図１０】健康人群、ＯＡ群およびＴＡ群における血中ＫＳレベルを示している。
【図１１】健康人群とＯＡ群とにおける血中ＫＳレベルのＲＯＣ曲線を示している。
【図１２】健康人群とＴＡ群とにおける血中ＫＳレベルのＲＯＣ曲線を示している。
【図１３】健康人群と早期ＯＡ群における血中ＫＳレベルを示している。
【図１４】健康人群と早期ＯＡ群における血中ＫＳレベルのＲＯＣ曲線を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
【００３９】
［測定法およびキット］
本発明の測定法は、ケラタン硫酸−Ｉ（以下、「ＫＳ−Ｉ」ともいう）およびケラタン硫酸−ＩＩ（以下、「ＫＳ−ＩＩ」ともいう）の２種類のケラタン硫酸への反応性を十分に有し、かつ、ＫＳ−ＩとＫＳ−ＩＩとの反応特異性の差が少ない抗ケラタン硫酸抗体、すなわち、ＫＳ−ＩとＫＳ−ＩＩとに対する相対的反応特異性が、ＩＣ５０ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩとして０．４〜５、好ましくは、０．４〜３．８である抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体を用いることを特徴とするものである。なお、上述したように、「ＩＣ５０ＫＳ−Ｉ」は、競合的免疫測定法、（例えば、競合ＥＬＩＳＡ法）を用いて測定した際に、抗ケラタン硫酸抗体のビオチン標識ＫＳ−Ｉに対する反応がＫＳ−Ｉによって５０％阻害される濃度であり、「ＩＣ５０ＫＳ−ＩＩ」は、同抗ケラタン硫酸抗体のビオチン標識ＫＳ−Ｉに対する反応がＫＳ−ＩＩによって５０％阻害される濃度を意味するものである。
【００４０】
このようなＫＳ−ＩとＫＳ−ＩＩとの反応性の差が少ない抗ケラタン硫酸抗体の製造法は、前記の抗体が得られる方法であれば特に限定されず、公知の方法を適宜応用することにより製造することができる。たとえば、軟骨、角膜などに由来するマトリックス成分、プロテオグリカン、アグリカン、ルミカン、ケラトカンなどのケラタン硫酸プロテオグリカンあるいは精製ケラタン硫酸、ケラタン硫酸誘導体を抗原として、ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫、細胞工学的手法または遺伝子工学的手法等により抗体を製造することができる（J. of Biological Chemistry 258, 8848-8854 (1993)、Biochem. J., 234, 31-41 (1986)）。
【００４１】
すなわち、本発明の測定法に用いるＫＳ−ＩとＫＳ−ＩＩとの反応性の差が少ない抗ケラタン硫酸抗体は、抗体を産生するハイブリドーマを作成し、このハイブリドーマを培養し、または、動物の体内で増殖させることによって製造することができる。また、抗体産生細胞から得られたｍＲＮＡを用いてファージ・ディスプレイ法によって遺伝子工学的に抗体を製造することもできる。
【００４２】
本発明の測定法に用いる抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体を製造する工程は、基本的には（１）ヒト関節軟骨等の免疫原の異種動物への免疫、（２）異種動物から抗体産生細胞の分離、（３）抗体産生細胞とミエローマ細胞の細胞融合、（４）ハイブリドーマの選択、（５）ハイブリドーマの増殖、（６）抗体の分離・精製、からなる。
【００４３】
（１）免疫
使用する免疫原は、軟骨、プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、アグリカン、また、これらのコンドロイチナーゼＡまたはＡＢＣの消化物あるいは未消化物が好ましい。免疫原の由来する動物種は、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ブタ、ウサギ、サル、ハト、ニワトリなどいずれであっても良く、特にヒト、ウシ、ブタなどの比較的大型の動物の使用が好都合である。免疫原を調製する材料は、前述の動物の角膜、関節軟骨など免疫原を含む組織から免疫原を調製するのが好ましい。
【００４４】
免疫原を投与する異種動物（ヒト以外の動物）としては、免疫原とは異なる動物種であればよく、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ブタ、ウサギ、サル、ハト、ニワトリなどいずれであってもよく、特にマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどが使用上好都合であり、特には、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）が最も一般的な免疫動物である。
【００４５】
このような動物への免疫原の投与は常法に従って行えばよく、たとえば、完全フロインドアジュバンド、不完全フロインドアジュバンド、ミョウバンアジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳菌アジュバント、ＴｉＴｅｒ  Ｍａｘ、Ｔｉｔｅｒ  Ｍａｘ  Ｇｏｌｄ、ＲＩＢＩアジュバントシステムなどの各種アジュバントと上述の免疫原との懸濁液を調製し、これを上記動物の静脈内、腹腔内、足蹠、脾臓、リンパ節、皮下または皮内等に投与すればよい。
【００４６】
投与量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであるが、免疫動物としてマウスを使用する場合には免疫原量として０．０１〜１０ｍｇ／匹程度が好適である。
【００４７】
初回投与後、１〜４週間おきに１〜５回程度の上記と同様の追加免疫を行うことにより、動物体内でケラタン硫酸に対する抗体産生を誘導する。
【００４８】
免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価が目標レベルに達したら、免疫原をアジュバント、生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液あるいはＰＢＳ）などに溶解したものを静脈内、腹腔内、脾臓、足蹠等に注射し、最終免疫とする。
【００４９】
（２）異種動物から抗体産生細胞の分離
免疫を獲得した動物からの脾細胞、リンパ節細胞、末梢血リンパ球などの抗体産生細胞を常法により取得する。取得する抗体産生細胞としては脾細胞、リンパ節細胞が好ましい。
【００５０】
（３）抗体産生細胞とミエローマ細胞の細胞融合
抗体産生細胞（本項目では、免疫後に取得した脾細胞、リンパ節細胞を示す）と融合させるミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ヒトなどの種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。通常、８−アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株はヒポキサンチン−グアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（Hypoxanthine guaninephosphoribosyl transferase）を欠損し、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（HAT）培地で生育できない。また細胞の性質として免疫グロブリンを分泌しない、いわゆる非分泌型の細胞株であることが好ましい。
【００５１】
ミエローマ細胞株の具体例としては、P3x63Ag8（ATCC TIB−９）（Nature,256495−497（1975））、P3x63Ag8U.1（P3-U1）（ATCC CRL−1597）（Current Topics in Microbiology and Immunology,81,1−７（1978））、P3x63Ag8.653（ATCC CRL−1580）（J.Immunology.123.1548−1550（1979））、P2/NSI/1−Ag4−１（ATCC TIB−18）（Europian J.Immunology.6,511−519（1976））、Sp2/O−Ag14（ATCC CRL−1581）Nature,276,269−270（1978））などのマウスミエローマ細胞株、210.RCY.Agl.2.3（Y3−Ag1.2.3）（ATCC CRL−1631）（Nature.277,131−133（1979））などのラットミエローマ細胞株、Ｕ−266−AR1（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77,5429（1980））、GM1500（Nature,288,488（1980））、KR−４（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,79,6651（1982））などのヒトミエローマ細胞株を例示することができる。
【００５２】
細胞融合にあたっては、抗体産生細胞に適合したミエローマ細胞を選定する。細胞融合は、イーグルの最少必須培地（MEM）、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、RPMI−1640培地などの動物細胞培養用培地中で１０６〜１０８個／ｍＬのミエローマ細胞と抗体産生細胞を混合比１：１〜１０に混合し、３７℃で１〜１０分間細胞同士を接触させることにより効率よく融合を行うことができる。細胞融合を促進させるために、平均分子量1,000〜6,000のポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニールアルコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を使用することができる。また、電気パルスを利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合させることもできる。
【００５３】
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する手段としては、選択的培地における細胞の選択的増殖を利用する方法を用いることができる。たとえば、細胞懸濁液を１０〜２０％ウシ胎児血清（FCS）含有RPMI−1640培地などで適当に希釈後、マイクロプレート上に１０３〜１０６個（抗体産生細胞数として）/ウェル程度まき、各ウェルに選択培地（たとえば、HAT培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。ミエローマ細胞として８−アザグアニン耐性株、選択培地としてHAT培地を用いた場合は、未融合のミエローマ細胞は培養７〜１４日目ぐらいまでに死滅し、正常細胞である抗体産生細胞もインビトロ（in vitro）では長期間生育できないので、培養７〜１４日目から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００５４】
（４）ハイブリドーマの選択（スクリーニング）
ケラタン硫酸を認識する抗体を産生するハイブリドーマの検索は、酵素免疫測定法（EIA、ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）などによって行うことができる。たとえば、ケラタン硫酸あるいはケラタン硫酸誘導体を固相に固定化させた96ウェルELISA用マイクロプレートにモノクローナル抗体を含む培養上清を添加し、ハイブリドーマが産生した抗体とケラタン硫酸とを反応させ、次いで結合した特異抗体に酵素標識抗免疫グロブリン抗体を反応させるか、あるいはビオチン標識抗免疫グロブリン抗体を反応させたのちアビジンあるいはストレプトアビジン−酵素標識体を反応させ、次いでいずれの場合とも各ウェルに酵素基質を加えて発色させる。ケラタン硫酸を固定化したウェルのみで発色する培養上清を選別することにより、ケラタン硫酸と特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択（スクリーニング）することができる。
【００５５】
ハイブリドーマのクローニングは、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法などにより行うことができる。
【００５６】
（５）ハイブリドーマの増殖
このようにして取得したハイブリドーマを増殖させ、抗体を生産させる方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法などが採用されうる。
【００５７】
細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０〜２０％FCS含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、無血清培地などの動物細胞培養用培地中で通常の培養方法あるいは高密度状態での培養方法により培養し、その培養上清液から抗体を取得することができる。
【００５８】
腹水から回収する方法では、ハイブリドーマと腫瘍組織適合性が一致する動物に、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内に投与した後、たとえばマウスの場合にはハイブリドーマを約１０６〜１０７個／匹腹腔内投与する。ハイブリドーマは７日〜１ヶ月程腹水腫瘍で形成し、血清および腹水中に高濃度に抗体を生産する。このようにして得られた腹水を採取する。
【００５９】
（６）抗体の分離・精製
抗体を含有する培養上清、腹水などから抗体の精製が必要である場合には、硫安塩析法、DEAEセルロースなどの陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡ−セファロースなどを用いるアフィニティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択し、組み合わせることにより、培養上清、腹水などからそれらに含まれる抗体を精製することができる。
【００６０】
また、市販されている抗体も利用することができる。使用する上記抗体の種類は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等特に制限されないが、特異性の点から、モノクローナル抗体が好ましい。例えば、Biochem. J. (1986) 234, 31-41、in vivo 4:149-152(1990)、Cancer Immunol Immunother.(1990)32:132-142、Biochem. J. (1986) 236, 71-75、The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. Vol.39, No.9, pp.1175-1187 (1991)またはARTHRITIS&RHEUMATISM. Vol.38, No.5, pp.660-668 (1995)に記載されたモノクローナル抗体を利用することができる。
【００６１】
上記抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体としては、ＥＦＧ−１１、ＢＣＤ−４、ＢＣＤ−７、ＢＣ−２６１、ＢＣ−７０３、ＭＫ−１７２またはＭＫ−２０２（全てモノクローナル抗体のクローン名）を例示することができる。
【００６２】
これらの抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体は、後述する実施例１（表４）にて示すように、全て、ＩＣ５０ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩが、０．４〜５の範囲内のＫＳ−ＩとＫＳ−ＩＩとの反応性の差が少ない抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体である。
【００６３】
なお、これらの抗ケラタン硫酸モノクローナル抗体の典型的な特徴は下記の通りである。
【００６４】
１）ＥＧＦ−１１（コスモ・バイオ株式会社およびCHEMICON INTERNATIONAL INC. カタログ品番：ＭＡＢ２０２２）
免疫原：コンドロイチナーゼＡＢＣで消化したヒト関節軟骨プロテオグリカン
免疫動物：マウス
抗体クラス：ＩｇＧ２ｂ
交差する動物種：ヒト、マウス、ウシ、犬、豚、羊
特異性：骨格由来（Ｔｙｐｅ Ｉ）および角膜由来（Ｔｙｐｅ  ＩＩ）のケラタン硫酸鎖（単独またはプロテオグリカン結合体のどちらか）の２−３の二糖単位を認識
【００６５】
２）ＢＣ−２６１（コスモ・バイオ株式会社およびCHEMICON INTERNATIONAL INC. カタログ品番：ＭＡＢ２０２０）
免疫原：ウシ角膜由来ケラタン硫酸プロテオグリカン
免疫動物：マウス
交差する動物種：ヒト、ウシ
抗体クラス：ＩｇＧ１
特異性：ヒトおよびウシの角膜由来ケラタン硫酸プロテオグリカンと高密度軟骨プロテオグリカンに存在する蛋白質関連エピトープと反応 
【００６６】
３）ＢＣ−７０３（コスモ・バイオ株式会社およびCHEMICON INTERNATIONAL INC. カタログ品番：ＭＡＢ２０２５）
免疫原：ウシ角膜由来ケラタン硫酸プロテオグリカン
免疫動物：マウス
交差する動物種：ヒト、ウシ
抗体クラス：ＩｇＧ３
特異性：様々な動物種の軟骨および角膜プロテオグリカンのＯ−結合オリゴ糖と結合する蛋白質関連エピトープと反応
【００６７】
４）ＭＫ−１７２（コスモ・バイオ株式会社およびCHEMICON INTERNATIONAL INC. カタログ品番：ＭＡＢ２００５）
免疫原：コンドロイチナーゼＡ消化胎児性ヒト関節軟骨
免疫動物：マウス
交差する動物種：ヒト、ウシ、犬
抗体クラス：ＩｇＧ３
特異性：異なる種の高密軟骨プロテオグリカンのコンドロイチン硫酸鎖の結合領域と結合する蛋白質関連エピトープを認識
【００６８】
５）ＭＫ−２０２
免疫原：コンドロイチナーゼＡ消化胎児性ヒト関節軟骨
免疫動物：マウス
抗体クラス：ＩｇＧ１
特異性：異なる種の高密軟骨プロテオグリカンのコンドロイチン硫酸鎖の結合領域と結合する蛋白質関連エピトープを認識
【００６９】
６）ＢＣＤ−４
免疫原：ヒト関節プロテオグリカンA1D1フラクションおよび／またはコンドロイチナーゼABC消化したヒトプロテオグリカン
免疫動物：マウス
抗体クラス：ＩｇＧ１
特異性：プロテオグリカンモノマーのケラタン硫酸あるいはケラタン硫酸様構造が結合しているペプチド部分を認識
【００７０】
７）ＢＣＤ−７
免疫原：ヒト関節プロテオグリカンA1D1フラクションおよび／またはコンドロイチナーゼABC消化したヒトプロテオグリカン
免疫動物：マウス
抗体クラス：ＩｇＧ１
特異性：プロナーゼ、パパイン、アルカリ処理による切断に敏感で、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、オリゴ糖を含まない部分を認識
【００７１】
本発明では、新たに見出された反応特異性、すなわち、硫酸含量の少ないケラタン硫酸−Ｉ、および、硫酸含量の多いケラタン硫酸−ＩＩに対し反応性を十分に有し、さらに好適には、ＫＳ−ＩとＫＳ−ＩＩとの反応特異性の差が少ないという特徴を有する抗ケラタン硫酸抗体を使用することにより、初めて試料中の微量のケラタン硫酸、特に従来の方法では測定が難しかったケラタン硫酸−Ｉを含む全ケラタン硫酸を特異的に測定することが可能となった。
【００７２】
上記のモノクローナル抗体のうち、ＢＣＤ−４を産生するハイブリドーマ・セルラインとして、マウス−マウス・ハイブリドーマ（Mouse-Mouse Hybridoma）ＢＣＤ−４が、ＭＫ−１７２を産生するハイブリドーマ・セルラインとしてマウス−マウス・ハイブリドーマ（Mouse-Mouse Hybridoma）ＭＫ−１７２が、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１）に国内寄託され（寄託日：２００７年９月１３日、受託番号：それぞれ、ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３６４、ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３６５）、その後、国内寄託から国際寄託に移管された（移管申請受領日：２００９年１２月１５日、受領番号：それぞれ、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１２１０、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１２１１）。
【００７３】
また、上記のモノクローナル抗体のうち、ＥＦＧ−１１を産生するハイブリドーマ・セルラインとして、マウス−マウス・ハイブリドーマ（Mouse-Mouse Hybridoma）ＥＦＧ−１１が、上記特許生物寄託センターに国内寄託され（寄託日：２００８年１２月３日、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７４１）、その後、国内寄託から国際寄託に移管された（移管申請受領日：２００９年１２月１５日、受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１２１２）。さらに、ＢＣＤ−７を産生するハイブリドーマ・セルラインとして、マウス−マウス・ハイブリドーマ（Mouse-Mouse Hybridoma）ＢＣＤ−７もまた、上記特許生物寄託センターに国内寄託され（寄託日：２００９年２月１７日、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７７３）、その後、国内寄託から国際寄託に移管された（移管申請受領日：２００９年１２月１５日、受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１２１３）。
【００７４】
本発明の測定法は、上述のような抗体を使用し、免疫学的測定法により試料中のケラタン硫酸を測定するものである。免疫学的測定法としては、競合法、サンドイッチ法等が挙げられるが、特異性の点からサンドイッチ法が好ましい。
【００７５】
その中でも競合法、サンドイッチ法とも標識物質として酵素を使用する方法（競合ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法）が取り扱い等の点で好ましい。
【００７６】
本発明の測定法において、サンドイッチ法を用いる場合、基本的には、従来用いられている方法、手順等と同様に行うことができる。例えば、抗ケラタン硫酸抗体を固相体に固定化させた後、ケラタン硫酸を含み得る試料を添加し、例えば、常温（１５〜２５℃）で２０〜１２０分間反応させることにより、「固相化抗ケラタン硫酸抗体」と「ケラタン硫酸」との複合体（「固相化抗ケラタン硫酸抗体−ケラタン硫酸」を形成させる。続いて、「固相化抗ケラタン硫酸抗体−ケラタン硫酸」中のケラタン硫酸に、検出に用いる標識物質が抗ケラタン硫酸抗体に結合した標識抗ケラタン硫酸抗体を添加し、例えば、常温（１５〜２５℃）で２０〜１２０分間静置あるいは攪拌させることにより、「固相化抗ケラタン硫酸抗体−ケラタン硫酸」と「標識抗ケラタン硫酸抗体」との免疫複合体（「固相化抗ケラタン硫酸抗体−ケラタン硫酸−標識抗ケラタン硫酸抗体」）を形成させる。次いで、固相と液相の分離（Ｂ／Ｆ分離）を行い、当該固相中または液相中の標識物質のシグナルを測定し、当該シグナルを、試料におけるケラタン硫酸の、定量的または定性的検出の指標とすることができる。なお、上記の例において、先に試料中に含まれ得るケラタン硫酸と標識抗ケラタン硫酸を反応させ、「ケラタン硫酸−標識抗ケラタン硫酸抗体」との免疫複合体を形成させた後に、当該免疫複合体を含む液相において固相化抗ケラタン硫酸を反応させて、「固相化抗ケラタン硫酸抗体−ケラタン硫酸−標識抗ケラタン硫酸抗体」免疫複合体を形成させた後に、固相と液相の分離を行うことも可能である。さらに、試料中に含まれ得るケラタン硫酸と固相化抗ケラタン硫酸抗体、および、標識抗ケラタン硫酸抗体を一緒に反応系に共存させて、「固相化抗ケラタン硫酸抗体−ケラタン硫酸−標識抗ケラタン硫酸抗体」免疫複合体を形成させた後に、固相と液相の分離を行うことも可能である。
【００７７】
すなわち、本発明の測定法を、サンドイッチＥＬＩＳＡ法にて行う場合には、例えば、「生体試料に対し、（１）抗ケラタン硫酸抗体が固定化された固相化抗ケラタン硫酸抗体、および、（２）標識物質が抗ケラタン硫酸抗体に結合した標識抗ケラタン硫酸抗体を、一緒に、または、先後別々に反応させて、当該試料中に存在するケラタン硫酸と（１）および（２）で構成される免疫複合体の形成工程を行った後、固相と液相を分離し、当該固相または液相中の標識物質のシグナルを測定し、当該シグナルを、生体試料におけるケラタン硫酸の、定量的または定性的検出の指標とすることを特徴とする、本発明の測定法。」として規定される。
【００７８】
さらに、本発明の測定法を、競合ＥＬＩＳＡ法を用いて行う場合には、例えば、固相体にケラタン硫酸または抗ケラタン硫酸抗体を固定化し、生体試料と標識物質が結合した標識抗ケラタン硫酸抗体または標識ケラタン硫酸を加え、固相体に固定化したケラタン硫酸または抗ケラタン硫酸抗体に競合的に結合した標識抗ケラタン硫酸抗体または標識ケラタン硫酸の標識物質を前記の方法により検出することにより、生体試料中のケラタン硫酸を測定することができる。
【００７９】
固相体に固定化される抗ケラタン硫酸抗体は、上述した通り、ＩＣ５０ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩの値が０．４〜５、好ましくは０．４〜３．８である抗体である。具体的には、上述のＥＦＧ−１１、ＢＣＤ−４、ＢＣＤ−７、ＢＣ−２６１、ＢＣ−７０３、ＭＫ−１７２またはＭＫ−２０２を例示することが可能である。
【００８０】
また、標識抗ケラタン硫酸抗体を構成する抗ケラタン硫酸抗体もまた、ＩＣ５０ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩの値が０．４〜５、好ましくは０．４〜３．８である抗体である。具体的には、上述の、ＥＦＧ−１１、ＢＣＤ−４、ＢＣＤ−７、ＢＣ−２６１、ＢＣ−７０３、ＭＫ−１７２またはＭＫ−２０２を例示することが可能である。
【００８１】
さらに具体的な固相化抗ケラタン硫酸抗体と、標識抗ケラタン硫酸抗体の組み合わせとしては、後述するモルモット、ラット、マウス、ウサギ等の小型動物由来の試料中のケラタン硫酸を測定対象とする場合には、各種生体試料中のケラタン硫酸をより高感度に検出できる故に、後述する実施例に示される通り、ＢＣＤ−４またはＭＫ−１７２から選択される抗ケラタン硫酸抗体を用いることがより好ましく、固相化抗ケラタン硫酸抗体としてＢＣＤ−４を用い、標識抗ケラタン硫酸抗体としてＭＫ−１７２を用いる組み合わせが最も好ましい。
【００８２】
一方、ヒト由来の試料中のケラタン硫酸を測定対象とする場合には、固相化抗ケラタン硫酸抗体としてＥＦＧ−１１またはＢＣＤ−７を用い、標識抗ケラタン硫酸抗体としてはＢＣＤ−７またはＥＦＧ−１１を用いることがより好ましい。
【００８３】
抗ケラタン硫酸抗体を固定化させる固相体としては、一般に抗体を固定化し得る担体であればよく、特に限定はされないが、例えば、プレート、チューブ、ボール、ビーズ、メンブレン、ラテックス、ゲル、磁性微粒子等を例示することができ、プレート、ボール、ビーズ、ラテックス、プレートが好ましい。その中でも、プレート、特に複数のウェルを有するマイクロプレートは、多数の検体の同時検出を容易にするためより好ましい。材質としては、ガラス、セラミックス、シリコンラバー、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ナイロン、アクリル樹脂、ゴム等を例示することができる。
【００８４】
上記固相体に抗ケラタン硫酸抗体またはケラタン硫酸を固定化させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法または包括法等、固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、１９７５年、講談社発行、第９〜７５頁参照）を採用することができるが、物理的吸着は操作が簡便な点で好ましい。
【００８５】
また、上記固定化は固相体に抗ケラタン硫酸抗体を直接結合させることによって行ってもよく、両物質の間に他の物質を介して行ってもよい。
【００８６】
例えば、抗ケラタン硫酸抗体をｐＨ７〜９程度の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、炭酸緩衝液等）に溶解して固相体（例えばマイクロプレートのウェル）に加え、３７℃程度で１〜２時間保存するか、４℃程度で一晩保存して直接固定化させる方法等を挙げることができる。このように得られた固相化抗ケラタン硫酸抗体は、試料中のケラタン硫酸や他の分子種等の固相体表面への非特異的結合を抑制するため、ブロッキング剤を添加して抗ケラタン硫酸抗体が固定化していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング剤としては、動物由来の血清アルブミン、カゼイン、ミルク蛋白、あるいは、植物由来のタンパクまたはその加水分解物であるペプチド等が挙げられ、また、ブロッキング剤として市販されているもの、例えば、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ（生化学工業株式会社販売）等を使用することもできる。ブロッキングの方法としては、例えば、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ、ウシ血清アルブミン等のブロッキング剤を固相体に添加して、３７℃程度で３０分〜２時間静置するか、常温（１５〜２５℃） で１〜２時間保存して、固相体の該抗ケラタン硫酸抗体が固定化していない部分を被覆しておく。なお、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏのように抗体が固定化された乾燥プレートに適用可能なブロッキング剤においては、ブロッキング溶液を十分に除去した後、３５〜４０℃でプレートを乾燥することにより、所望する抗ケラタン硫酸抗体固相化プレートを得ることができる。
【００８７】
また、固相体に固定化された抗ケラタン硫酸抗体に試料中のケラタン硫酸を結合させた後、固相体の表面を洗浄液で洗浄して非特異吸着物を除去することが好ましい。洗浄液としては、例えば、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ） 系界面活性剤等の界面活性剤を添加した緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス塩酸緩衝液）等を使用することができる。
【００８８】
検出に用いられる抗ケラタン硫酸抗体に結合される標識物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、マイクロパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等の酵素類、例えば、[１２５Ｉ]、[１３１Ｉ]、[３Ｈ]、[９９ｍＴｃ]、[14Ｃ]等の放射性同位元素 、例えば、クマリン、ナフチルアミン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等の蛍光性物質、例えば、ルミノール、イソルミノール等の化学発光物質、ハプテン、ビオチン、アビジン（例えば、ストレプトアビジン等）等を例示することができるが、通常タンパク質の標識に可能なものであればよく、特に限定されない。
【００８９】
なお、ここで標識物質とは、ビオチンのようにそれ自体を直接検出せず、その物質と特異的結合能を有する物質（例えば、アビジン等）に検出可能な標識を結合したものを組み合わせて用いる方法に使用する物質も包含する。
【００９０】
前記抗体の標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、酵素を標識する際にはグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法等、放射性同位元素で標識する際にはクロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法等（続生化学実験講座２「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人、１９８７年発行参照）から適宜選択することができる。また、市販の標識キット、例えば、ペルオキシダーゼ標識キット（商品名：Ｑｕｉｃｋ  Ｌａｂｅｌｅｒ−Ｐｒｏ  ＮＨ２、生化学工業株式会社販売）を用いて標識することも可能である。
【００９１】
標識物質の検出法、すなわち標識物質のシグナルを測定する方法としては、用いる標識物質により異なるが、例えば、標識物質にビオチンを使用する場合には、ストレプトアビジン等を結合させた酵素を添加し、このストレプトアビジン等を介してペルオキシダーゼ等の酵素を、標識物質としてビオチンを含む免疫複合体へ結合させ、該酵素の基質としてテトラメチルベンジジン等の発色基質および過酸化水素水を加え、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で測定する方法等を挙げることができる。また、例えば、標識物質として蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられる。
【００９２】
本発明の測定法において、試料中のケラタン硫酸の濃度は、予め既知濃度のケラタン硫酸標準液を用いてケラタン硫酸濃度と標識物質のシグナルの検出結果との関係について検量線を作成し、未知濃度の検体についての検出結果と前記検量線とを用いる方法により定量することができる。
【００９３】
また、本発明の測定法で用いる生体試料は、ケラタン硫酸を含有し得るものであれば特に限定されず、例えば、ヒトを含む各種動物の関節液、血液、血清、血漿、尿、骨髄液、組織（軟骨、角膜等）の抽出液等を例示することができるが、前述のように、血液試料または関節液が好適である。
【００９４】
ヒトを除く動物由来の試料としては、特に、モルモット、ラット、マウス、ウサギ等の小型動物由来の試料が好ましいものとして例示される。
【００９５】
さらに、本発明の測定法で用いる生体試料は、プロテアーゼ処理を施すことで、測定の確度をいっそう向上させることができる。生体試料中において、ケラタン硫酸は、アグリコンのコア蛋白に結合しており、その一方で、標準品として用いられるケラタン硫酸は、当該コア蛋白には結合していない。よって、生体試料にプロテアーゼ処理を施して、予め、ケラタン硫酸のアグリコンのコア蛋白への結合を切断することにより、生体試料中のケラタン硫酸と標準品のケラタン硫酸の状態を、より近似させることにより、本発明の測定法の確度をいっそう向上させることが可能となる。ここで用いられるプロテアーゼは、特に限定されないが、基質蛋白への反応特異性が低く、また、ケラタン硫酸自体の安定性に影響せず、測定時のｐＨへの影響が少ない中性域の至適ｐＨを有するプロテアーゼを用いることが好ましい。このような好適なプロテアーゼとしては、例えば、プロナーゼ、ズブチリシン(subtilisin)、パパイン、トリプシン等が挙げられる。これらの中で特に好ましいものとして、プロナーゼ、ズブチリシンが挙げられ、極めて好ましいものとして、プロナーゼが挙げられる。プロナーゼは、放線菌Streptomyces griseusの産生するプロテアーゼであり、市販品として、例えば、アクチナーゼシリーズ（アクチナーゼＥ、Ａ、ＡＳ、ＡＦ：科研製薬株式会社）、Sigma-Aldrich社のプロナーゼ（カタログ番号：P9811）、ロッシュ社のプロナーゼ等が挙げられる。また、用いられるプロテアーゼは、一種を選択して用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。二種以上を組み合わせる場合には、少なくとも一種がプロナーゼであることが好適である。プロテアーゼは、その至適ｐＨおよび至適温度等の至適条件近傍にて、生体試料に反応させることが好ましいことは明らかである。また、その使用量は、選択されたプロテアーゼの性質や力価によっても異なり、一様に規定されるものではなく、用いるプロテアーゼが、十分にケラタン硫酸のアグリコンのコア蛋白を分解することができる量であればよい。この具体的なプロテアーゼの使用量は、当業者であれば、容易に個別に決定することが可能であり、その決定のために過度の試行錯誤を行う必要はない。また、具体例は、後述する実施例において開示されている。
【００９６】
ケラタン硫酸の測定に用いる、本発明の測定用キットは、上述の測定法を実施するためのものであり、少なくとも上述の抗ケラタン硫酸抗体、ＥＦＧ−１１、ＢＣＤ−４、ＢＣＤ−７、ＢＣ−２６１、ＢＣ−７０３、ＭＫ−１７２およびＭＫ−２０２から選ばれる１種または２種以上、を構成として含むものが好ましい。
【００９７】
より好ましい態様としての、具体的な固相化抗ケラタン硫酸抗体と標識抗ケラタン硫酸抗体の組み合わせについては、前述と同様である。
【００９８】
本発明の測定用キットには、非標識および／または標識された上記抗体の他に、必要により、検量線作成のための標準となる既知濃度のケラタン硫酸標準品、標識物質の検出試薬、抗ケラタン硫酸抗体を標識する試薬、前記ブロッキング剤、前記洗浄液、検体希釈液、酵素反応停止液等を適宜選択し、添付することができる。また、この本発明の測定用キットの基本的な構成は、本発明の検知用キット、および、本発明の判定用キットにおいても同様である。ただし、本発明の検知用キットや本発明の判定用キットには、関節疾患の効率的な検知や被験薬剤の効率的な効果判定に資する要素、例えば、被検体における本発明の測定法による健常人の標準的なケラタン硫酸の測定値等のデータが記載された測定用マニュアル等が含まれることが好適である。
【００９９】
［疾患の検知法］
上述のように、本発明の測定法では、検体におけるケラタン硫酸を、簡便且つ鋭敏に定量的または定性的に検出することができるが、当該測定法を、ヒトを含む動物の検体に対して用いて、主にはその定量値を指標とすることにより関節疾患の検知を行うことが可能である。
【０１００】
すなわち、前述のように、本発明の疾患の検知法は、
１）本発明の測定方法によって、被検体中のケラタン硫酸を測定する工程（第一工程）。
２）第一工程により測定される被検体中のケラタン硫酸量と、正常検体中のケラタン硫酸量、および／または、時間をおいて複数回にわたり測定される被検体中のケラタン硫酸量とを比較する工程（第二工程）。
３）第二工程における比較に基づいて、被検体中のケラタン硫酸量が、正常検体中のケラタン硫酸量よりも増加している場合を、関節疾患について陽性であると判定し、あるいは、複数回の測定により検出された被検体中のケラタン硫酸量が、前の回の測定値よりも増加している場合を関節疾患は進行傾向にあると判定する工程（第三工程）。
の３工程を含む関節疾患の検知方法である。
【０１０１】
第１工程において、被検体は、関節液、血液検体（血清、血漿、全血）、尿検体等が挙げられるが、患部の関節液または血清若しくは血漿が好適に用いられる。採取方法や処理方法は常法に従う。また、検体提供対象は、関節疾患の診察・治療の対象となるヒトを含む動物である。以下の記載は、ヒトを対象に説明するが、ヒト以外の動物に関してもヒトと実質的に同様の内容にて、本発明の疾患の判定法を行うことができる。
【０１０２】
第２工程において、「正常検体中のケラタン硫酸量」は、検体提供者の健常時の対象検体中のケラタン硫酸量とすることが可能であり、厳密にはこれが好適であるが、現実的には、健常人の対象検体中における平均的なケラタン硫酸量を好ましいものとして用いることができる。この平均的ケラタン硫酸量は、本発明の測定法による健常人の対象検体におけるケラタン硫酸の定量値を複数の被検者から得て、これを平均化処理することにより得られる値である。この平均値は、国レベルでも地域レベルでも診療機関レベルでも行うことが可能であり、ボランティアが集まれば、当業者において過度の努力を行うことなく算出することができる。
【０１０３】
第３工程において、「被検体中のケラタン硫酸量が、正常検体中のケラタン硫酸量よりも増加する」とは、被検体中のケラタン硫酸量が、正常検体中のケラタン硫酸量と比較すると明らかに増加している状態を意味するものである。
【０１０４】
なお、後述する実施例に示すように、関節の炎症においては、関節液と血液検体における、本発明の測定法により得られるケラタン硫酸量は増加する。
【０１０５】
特に、本発明の疾患判定法により、軟骨の損傷が認められるか否かを判定することが可能である。例えば、膝関節の疾患のうち、軟骨の損傷が懸念される代表的な疾患に、変形性関節症が挙げられる。変形性関節症は、原因疾患が特にないもの（一次性）と、先天性（内反/外反変形など）、外傷性（骨折、半月板切除など）、内分泌性（肥満など）、リウマチ性など先行する原因疾患を基盤として発症するもの（二次性）がある。通常軟骨は関節組織において主に衝撃吸収と潤滑を担っており、長年使用しても骨がすり減ったりすることなく、円滑に動かせる構造になっている。しかし変形性関節症では、軟骨組織を構成しているコラーゲン（結合組織を構成する弾力性のある線維性タンパク質）やプロテオグリカン（弾力性を与える物質）を合成する軟骨細胞が異常をきたし、コラーゲンやプロテオグリカンの合成能が低下するため、本来なめらかでツルツルとした関節軟骨の表面がザラザラになり、小さなくぼみがたくさんでき、外部からの衝撃を吸収できなくなる。こうなると関節のすべての構成体である骨、関節包、滑膜組織、腱、靭帯などが変形し、最も深刻な状態では、歩行困難となる場合もある。その反面、軟骨の損傷の初期はそれほどの痛みとなって顕れない傾向があるため、気がつかないケースも多く、気づいた時には軟骨の重篤な損傷が判明して関節置換術を余儀なくされることもある。膝関節において軟骨の損傷が認められる場合には、適切な治療を施す必要がある。現在、軟骨の損傷の確実な確認は、関節鏡を用いて行われるが、これはかなり手間がかかり、熟練も必要な手技である。よって、高感度且つ簡便な軟骨の損傷の判定手段が求められるところである。
【０１０６】
具体的には、本発明の疾患検知法による、例えば、膝関節における軟骨の損傷の判定は、被検体を関節液または血液検体として、被検体中のケラタン硫酸量が正常検体中のケラタン硫酸量よりも増加している場合、あるいは、時間を置いた複数回の検出における２回目以降の検出において、被検体中のケラタン硫酸が、前回の定量値よりも増加傾向である場合に、軟骨の損傷が認められると判定することができる。
【０１０７】
この軟骨の損傷の判定法において、検体提供者の前回の判定時（例えば、初診時）は、検体提供者の膝関節液におけるケラタン硫酸量は未知であるとの前提で、上述した「正常検体中のケラタン硫酸量」を基に、検体提供者における膝関節の軟骨の損傷について判定することができる。また、２回目以降の判定において（例えば、継続診の場合）には、前回の膝関節液におけるケラタン硫酸量と、新たなケラタン硫酸量を比較して、新たに軟骨の損傷を起こした場合や当該損傷の程度が増悪した場合には、新たなケラタン硫酸量は前回よりも増加傾向にある。このように、本発明によって、膝関節の軟骨の損傷を的確に検知することが可能である。
【０１０８】
本発明の疾患の検知法によると、上述のように、変形性膝関節症を確度良く検知することができる。特に、Ｘ線によっては検知できない、または、検知困難な、例えば、罹患初期の変形性膝関節症を検知可能であることが、従来には認められなかった、本発明の著しい効果である。加えて、本発明の疾患の検知法によると、外傷性関節症も的確に検知することが可能である。
【０１０９】
本発明は、上述のように、本発明の疾患の検知法を行うための、検知用キットをも提供するものである。
【０１１０】
本発明の疾患の検知方法または検知用キットにおいて用いる抗ケラタン硫酸抗体としては、上述の本発明の測定法と同様、ＥＦＧ−１１、ＢＣＤ−４、ＢＣＤ−７、ＢＣ−２６１、ＢＣ−７０３、ＭＫ−１７２およびＭＫ−２０２が例示される。
【０１１１】
より好ましい態様としての、具体的な固相化抗ケラタン硫酸抗体と標識抗ケラタン硫酸抗体の組み合わせについても前述と同様であるが、特に、ヒトの変形性関節症または外傷性関節症の検知を行う場合には、後述する実施例に示す通り極めて高い効率で疾患を判定することができる故に、固相化抗ケラタン硫酸抗体としてＥＦＧ−１１またはＢＣＤ−７用い、標識抗ケラタン硫酸抗体としてＥＦＧ−１１またはＢＣＤ−７を用いること、あるいは、固相化抗ケラタン硫酸抗体としてＢＣＤ−４またはＭＫ−１７２を用い、標識抗ケラタン硫酸抗体としてＢＣＤ−４またはＭＫ−１７２を用いることが最も好ましい。この場合の具体的な組み合わせとしては下記１）〜６）が例示される。
【０１１２】
１）固相化抗ケラタン硫酸抗体：ＢＣＤ−７、標識抗ケラタン硫酸抗体：ＢＣＤ−７
２）固相化抗ケラタン硫酸抗体：ＢＣＤ−７、標識抗ケラタン硫酸抗体：ＥＦＧ−１１
３）固相化抗ケラタン硫酸抗体：ＥＦＧ−１１、標識抗ケラタン硫酸抗体：ＢＣＤ−７
４）固相化抗ケラタン硫酸抗体：ＥＦＧ−１１、標識抗ケラタン硫酸抗体：ＥＦＧ−１１
５）固相化抗ケラタン硫酸抗体：ＢＣＤ−４、標識抗ケラタン硫酸抗体：ＭＫ−１７２
６）固相化抗ケラタン硫酸抗体：ＭＫ−１７２、標識抗ケラタン硫酸抗体：ＢＣＤ−４
【０１１３】
［薬剤効果の判定法］
本発明の測定法において、検体中のケラタン硫酸を高感度で測定することが可能であることから、これを、投薬した関節疾患の治療薬の効果の判定や、関節疾患の治療薬の候補物質のスクリーニングに用いることが可能である。
【０１１４】
本発明の薬剤効果の判定法は、上述のように、下記の工程を含むことを特徴とする関節疾患治療薬またはその候補物質の治療効果の判定方法である。
１）本発明の測定法によって、治療薬またはその候補物質（治療薬等）の投与前の検体と、投与後の検体中のケラタン硫酸を測定する工程（第１工程）
２）１）により得られた治療薬等の投与前の検体中のケラタン硫酸量と、投与後の検体中のケラタン硫酸量を比較する工程（第２工程）
３）２）における比較に基づいて、治療薬等の投与前のケラタン硫酸量から、投与後のケラタン硫酸量への正常方向への変化の度合いを検出し、これを指標として上記関節疾患治療薬等の効果を判定する工程（第３工程）
【０１１５】
第１工程において、治療薬の効果の判定を行う場合には、検体提供対象は、ヒトまたは薬剤治療対象となる動物である。薬剤スクリーニングを行う場合には、検体提供対象は、通常は、関節疾患を惹起された実験動物（好適には、上述したモルモット、ラット、マウス等の小型動物）を用いることができる。検体は、必要に応じて、関節液、血液検体（血清、血漿、全血）、尿検体等から選択することが可能である。
【０１１６】
用いる抗ケラタン硫酸抗体については、前述の本発明の疾患の検知法における説明と同様である。
【０１１７】
これらの工程において、治療薬等の投与前の検体におけるケラタン硫酸量と、投与後の検体中のケラタン硫酸量の比較を、本発明の測定法を用いて行うことで、投与した治療薬等の効果、または、被検物質の関節疾患に対する治療効果の検討を行うことができる。
【０１１８】
すなわち、臨床において、関節疾患治療薬の投与後の本発明の測定法により得られるケラタン硫酸の定量値が、健常人における定量値の方向、すなわち、正常方向へと変化していれば、顕在的または潜在的に治療対象となっている関節疾患における投薬効果が認められることを示している。このように、本発明により、関節疾患治療薬の投薬の効果を判定することができる。なお、ここで、顕在的効果とは、臨床的な効果が認められることを示し、潜在的な効果とは、臨床的な効果は即時には認められないが、生化学的な検査値が好転していることを示す。
【０１１９】
また、関節疾患を惹起された実験動物におけるケラタン硫酸の定量値が、被検物質の投与後に正常方向へと向かっていれば、当該被検物質において、関節疾患の治療作用が認められることを示す。このように、本発明により、関節疾患治療薬のスクリーニングを行うことができる。
【０１２０】
本発明は、上述のように、本発明の薬剤効果の判定法を行うための、判定用キットをも提供するものである。
【実施例】
【０１２１】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。【０１２２】
なお、実施例で使用する略号は以下の通りである。
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン
ＫＳ：ケラタン硫酸
ＫＳＰＧ：ケラタン硫酸プロテオグリカン
ＨＡ：ヒアルロン酸
Ｃｈ：コンドロイチン
ＣＳ−ＡまたはＣＳＡ：コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳ−Ａ（Ｓ）またはＣＳＡ（Ｓ）：サメ由来コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳ−Ａ（Ｗ）またはＣＳＡ（Ｗ）：クジラ由来コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳ−ＢまたはＣＳＢ：コンドロイチン硫酸Ｂ
ＣＳ−ＣまたはＣＳＣ：コンドロイチン硫酸Ｃ
ＣＳ−ＤまたはＣＳＤ：コンドロイチン硫酸Ｄ
ＣＳ−ＥまたはＣＳＥ：コンドロイチン硫酸Ｅ
ＥＤＣ：１−メチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＨＥＰ：ヘパリン
ＨＲＰ：ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＨＳ：ヘパラン硫酸
Ｔｒｉｓ：２−アミノ−２−ハイドロキシメチル−１，３−プロパンジオールＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＥＤＣ：Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＴＭＢ：３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン
Ｂｉ：ビオチン
ＭＥＳ：２−モルホリノエタンスルホン酸
ＥＬＩＳＡ法：酵素免疫測定法（ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ法；ＥＬＩＳＡ法）
競合ＥＬＩＳＡ法：競合法を利用した酵素免疫測定法【０１２３】
［参考例１］  ビオチン標識ＧＡＧ（以下、「Ｂｉ−ＧＡＧ」）の調製
各種ＧＡＧ（ＨＳ、ＨＡ、ＨＥＰ、Ｃｈ、ＣＳ−Ａ（Ｓ）、ＣＳ−Ａ（Ｗ）、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ、ＫＳ）を０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解して、１０ｍｇ／ｍＬ のＧＡＧ溶液を調製した。１ｍＬの各ＧＡＧ溶液に、ジメチルスルホキシド（和光純薬工業社製）で２０ｍＭに調製したビオチン-ＬＣ-ヒドラジド（ＰＩＥＲＣＥ社製）を２５μＬ 添加した。続いて、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で１００ｍｇ／ｍＬに調製したＥＤＣ（ＰＩＥＲＣＥ社製）溶液を１２．５μＬ添加した。よく撹拌した後、常温（１５℃〜２５℃）で１６〜２４時間撹拌反応を行った。【０１２４】
反応終了後、この反応物を、透析液としてリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２〜７．５、カルシウムイオン等の２価イオン不含：以下、「ＰＢＳ（−）」ともいう）等を用い、透析膜（カットオフ分子量１０，０００以下）で十分に遊離のビオチンを除去した。透析終了後、Ｂｉ−ＧＡＧ濃度を５ｍｇ／ｍＬ に調製し、凍結保存した。【０１２５】
上記の方法により、各種Ｂｉ−ＧＡＧ（Ｂｉ−ＨＳ、Ｂｉ−ＨＡ、Ｂｉ−ＨＥＰ、Ｂｉ−Ｃｈ、Ｂｉ−ＣＳＡ（Ｓ）、Ｂｉ−ＣＳＡ（Ｗ）、Ｂｉ−ＣＳＢ、Ｂｉ−ＣＳＣ、Ｂｉ−ＣＳＤ、Ｂｉ−ＣＳＥ、Ｂｉ−ＫＳ）を得た。【０１２６】
尚、ＨＥＰはＳＰＬ社製、その他のＧＡＧは生化学工業株式会社製を用いた。【０１２７】
［参考例２］  ストレプトアビジン固相化プレートの作製
ストレプトアビジン（ＶＥＣＴＯＲ社製）をＰＢＳ（−）で２０μｇ／ｍＬに希釈し、マキシソープ（登録商標）９６ウェルマイクロプレート（ナルジェヌンク社製）の各ウェルに５０μＬずつストレプトアビジン溶液を加え、４℃で１４〜１８時間保存することにより、均一にコーティングした。このプレートをＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ウェルのストレプトアビジンでコーティングされていない部分をブロッキングするため、ブロッキング剤として、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ（登録商標）（使用希釈率５倍、生化学工業株式会社製）および防腐剤として０．０５％プロクリン（登録商標）９５０（ＳＵＰＥＬＣＯ社製）を含むリン酸緩衝液（上記ＰＢＳ（−）のうち、塩化ナトリウム、塩化カリウム不含、ｐＨ７．２〜７．５：以下、「ＰＢ」という）を加え、常温で２時間静置した。静置後、ブロッキング溶液を十分に除去し、３７℃で２時間乾燥させることにより、所望する固相化ストレプトアビジンプレートを得た。プレートは乾燥剤とともにアルミラミネート袋に封入し、冷蔵保存した。【０１２８】
［参考例３］  Ｂｉ−ＧＡＧ固相化プレートの作製
参考例１で調製したＢｉ−ＧＡＧを、添加剤としてＡｐｐｌｉｅＤｕｏ（登録商標）（使用希釈率２０倍、生化学工業株式会社製）、０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（０．０５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ＩＣＩ社  Ｔｗｅｅｎ２０相当品、和光純薬工業社製）および防腐剤として０．０５％のプロクリン（登録商標）９５０とを含むＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸塩、ｐＨ７．３〜７．８）（以下、「反応液Ａ」ともいう）に溶解し、１μｇ／ｍＬ溶液を調製した。参考例２で作製した固相化ストレプトアビジンプレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０および防腐剤として０．０５％のプロクリン（登録商標）９５０を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸塩（ｐＨ７．３〜７．８）（Ｔ−ＴＢＳ、以下、「洗浄液」ともいう）３００μＬで４回洗浄し、各ウェルにＢｉ−ＧＡＧ溶液を１００μLずつ加え、常温で３０分静置して、固相化ストレプトアビジンにＢｉ−ＧＡＧを固定化した（以下、「Ｂｉ−ＧＡＧ」固相化プレート」といい、各ＧＡＧを固相化したものを個々に示すときは「Ｂｉ−ＧＡＧ」の「ＧＡＧ」を各ＧＡＧ名に代えた略称を使用する）。【０１２９】
［参考例４］  抗体精製
表４に示した各ＫＳ抗体を含む各腹水（入手先：Ｒｕｓｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）から、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーで、常法に従って精製した。【０１３０】
［参考例５］  ペルオキシダーゼ標識抗体の作製
参考例４で得られた８種の精製抗体０．２ｍｇをＱｕｉｃｋ  ｌａｂｅｌｅｒ  Ｐｒｏ−ＰＯ  ＮＨ２（生化学工業株式会社販売）を用い、その操作方法に従って、ペルオキシダーゼ標識抗体を調製した。【０１３１】
［参考例６］  抗ＫＳ抗体固相化プレートの作製
ストレプトアビジンの代わりに参考例４で精製した各抗ＫＳ抗体を用いること以外は参考例２記載の方法と同じ方法で各抗ＫＳ抗体固相化プレートを作製した。【０１３２】
［参考例７］  関節疾患患者検体の採取
病院施設の倫理委員会の承認を受けた上で、被験者からのインフォームドコンセントのもとに、変形性膝関節症（ＯＡ）患者２９名、膝関節にスポーツや事故などによる外傷を受け来院し、関節内視鏡検査または手術時に直視で関節軟骨の変性または損傷が認められた外傷性膝関節症（ＴＡ）患者１７名および健常者１８名から血液を採取した。血液は市販の血清分離用採血管で採取し、血清を分離した後、血清を−２０℃で保管した。【０１３３】
［実施例１］  各種抗ＫＳ抗体におけるＫＳ−ＩとＫＳ−ＩＩとの反応性の検討
各種抗ＫＳ抗体におけるＫＳ−ＩとＫＳ−ＩＩとの反応性を、抗ＫＳ抗体とビオチン標識ＫＳ−I（以下、「Ｂｉ−ＫＳ」という）との結合をＫＳ−ＩあるいはＫＳ−ＩＩを存在させて阻害させる、いわゆる競合ＥＬＩＳＡ法を用いて評価した。【０１３４】
参考例３の方法で作製したＢｉ−ＫＳ固相化プレートを洗浄液で４回洗浄した後、各ウェルにＫＳ−ＩあるいはＫＳ−ＩＩ溶液（ともに濃度１００〜０ｎｇ／ｍＬ、５倍希釈系列）を１００μＬずつ加え、続いて各抗ＫＳ抗体溶液（５Ｄ４は精製抗体希釈溶液、その他の抗体は腹水希釈溶液を用いた。なお、用いた抗ＫＳ抗体の試験希釈率または試験濃度は表３に示した通り。）を１００μＬずつ加え、これを常温で６０分間静置して抗原抗体反応させた。なお、ブランクはＢｉ−ＫＳを添加していないウェルとした。反応終了後、洗浄液で４回洗浄し、各ウェルにＨＲＰ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を反応液で２０００倍希釈した二次抗体溶液を１００μＬずつ加え、これを常温で６０分間静置して抗原抗体反応させた。反応終了後、このプレートを洗浄液で４回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてＴＭＢ溶液（商品名：ＴＭＢ  １  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ＢｉｏＦＸ社製）を１００μＬずつ加え、常温で３０分間反応させ、発色させた。プレートに反応停止液（ＢｉｏＦＸ社製）を１００μＬずつ 加えて反応を停止させた後、ＴＭＢ分解によって増加する波長４５０nmの吸光度（対照波長６３０nm）をウェルリーダーＳＫ−６０３（登録商標；生化学工業株式会社販売）で測定した。抗体の反応性は、阻害物質を用いた場合の阻害率から、ＩＣ５０を算出し、ＫＳ−ＩおよびＫＳ−ＩＩの反応性を評価した。【０１３５】
なお、阻害物質としては、ＫＳ−ＩにはＫＳ（ＢＣ）（生化学工業株式会社販売）、ＫＳ−ＩＩにはＫＰＳ−１（生化学工業株式会社製）を用い、試験濃度は１００〜０ｎｇ／ｍＬ（５倍希釈系列）とした。【０１３６】
更に、各ＫＳ抗体のＫＳ−ＩとＫＳ−ＩＩとの反応性の差を評価するために、各ＫＳ抗体におけるＫＳ−ＩのＩＣ５０とＫＳ−ＩＩのＩＣ５０の比（ＩＣ５０ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩ）を算出した。なお、ＩＣ５０ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩは、１に近い方がＫＳ−ＩとＫＳ−ＩＩとの反応性の差が少ない、すなわち、抗ケラタン硫酸抗体のＫＳの反応性における硫酸含量の依存性が低いことを示す。【０１３７】
また、阻害率は、各ウェルの吸光度からブランクの吸光度を減じた吸光度差を算出し、Ｂｉ−ＫＳのみのウェルにおける吸光度差（最大吸光度差）に対する各阻害物質濃度における吸光度差を減じた残存吸光度差の百分率を阻害率とした。【０１３８】
【表３】
2010074123.tif 000004
【０１３９】
結果を表４および図１に示す。【０１４０】
【表４】
2010074123.tif 000005
【０１４１】
５Ｄ４におけるＫＳ−ＩおよびＫＳ−ＩＩのＩＣ５０は、それぞれ、１４．４７、１．４０ｎｇ／ｍＬであった。その他7種のＫＳ抗体におけるＫＳ−ＩのＩＣ５０は、いずれも５Ｄ４の１４．４７ｎｇ／ｍＬより低く、これら７種のＫＳ抗体は５Ｄ４よりＫＳ−Ｉとの反応性は高いと判明した。また、ＫＳ−ＩＩでのＩＣ５０は、ＢＣＤ−７、ＢＣ−７０３、ＥＦＧ−１１では５Ｄ４より低く、これら３種の抗体は５Ｄ４よりＫＰＳ−１との反応性が高かった。【０１４２】
また、５Ｄ４におけるＩＣ５０ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩは１０．４であり、ＫＳ−Ｉとの反応性はＫＳ−ＩＩの反応性と比較しておよそ１／１０であった。その他７種の抗ＫＳ抗体のＩＣ５０ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩはいずれも５Ｄ４より低く、７種の抗体はいずれも５Ｄ４と比較して、抗原抗体反応における硫酸含量依存性が低い抗ＫＳ抗体であると判明した。【０１４３】
［実施例２］  サンドイッチＥＬＩＳＡ法
５Ｄ４を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法は、市販のケラタン硫酸測定キット（生化学工業販売）を用い、その操作方法に従ってアッセイした。【０１４４】
本発明の測定法でのアッセイ法は以下の通りである。【０１４５】
抗ＫＳ抗体固相化プレートとしては、参考例６の方法で作製した抗ＫＳ抗体固相化プレートを用いた。また、検出用の抗ＫＳ抗体としては、参考例５の方法で調製したＨＲＰ標識抗ＫＳ抗体を用いた。なお、検討した固相化抗体と検出用抗体の組み合わせは、以下の１２種類である。【０１４６】
１）固相化：ＢＣＤ−４  検出：ＢＣＤ−４
２）固相化：ＢＣＤ―４  検出：ＭＫ−１７２
３）固相化：ＭＫ−１７２  検出：ＭＫ−１７２
４）固相化：ＭＫ−１７２  検出：ＢＣＤ−４
５）固相化：ＥＦＧ−１１  検出：ＥＦＧ−１１
６）固相化：ＢＣＤ−７  検出：ＢＣＤ−７
７）固相化：ＥＦＧ−１１  検出：ＢＣＤ−７
８）固相化：ＭＫ−２０２  検出：ＭＫ−２０２
９）固相化：ＢＣＤ−７  検出：ＥＦＧ−１１
１０）固相化：ＢＣ−２６１  検出：ＢＣ−２６１
１１）固相化：ＢＣ−７０３  検出：ＢＣ−７０３【０１４７】
各種抗ＫＳ抗体固相化プレートの各ウェルに参考例３で用いた反応液Ａを１００μＬ添加した。続いて、表５のケラタン硫酸を含む試験溶液あるいはブランク溶液を２０μＬ添加し、緩やかにプレートを撹拌後、１５−２５℃で１時間静置した（第一反応）。第一反応終了後、反応液を除去し、洗浄液（３００μＬ／ウェル）で４回洗浄した。洗浄後、ＨＲＰ標識抗ＫＳ抗体 (８００倍希釈)を各ウェルに１００μＬ添加し、１５−２５℃で１時間静置した（第二反応）。第二反応終了後、先と同様に洗浄液で４回洗浄した。洗浄後、ＨＲＰの基質としてＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦＸ社製）を１００μＬ 加え、常温で３０分間遮光下静置反応させ、発色させた（発色反応）。発色後、プレートに１Ｎ−ＨＣｌを１００μＬ加えて反応を停止させ、ＴＭＢの分解による着色液の波長 ４５０ｎｍでの吸光度（対照波長６３０nm）をウェルリーダー（商標）ＳＫ６０３（生化学工業株式会社販売）にて測定した。サンドイッチＥＬＩＳＡ法における評価は、各試験溶液における吸光度とブランク溶液との吸光度差とした。【０１４８】
ＫＳ（ＢＣ）（ＫＳ−Ｉ）とＫＰＳ−１（ＫＳ−ＩＩ）の濃度依存性の試験では、表５記載の抗体の組合せにて、試験物質としてＫＳ（ＢＣ）およびＫＰＳ−１を表５記載の試験濃度で用いて測定し、反応曲線を比較した。結果を図２に示す。【０１４９】
【表５】
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【０１５０】
５Ｄ４を用いた測定系では、吸光度１．０を示すＫＳ（ＢＣ）およびＫＰＳ−１の濃度は、それぞれ、９２１．７ｎｇ／ｍＬおよび２５．５ｎｇ／ｍＬであった。本発明の測定法を用いた場合のＫＰＳ−１での当該濃度は、検討したいずれの組合せの測定方法も従来の５Ｄ４法より低く、５Ｄ４法より高感度と判明した。また、本発明の測定法を用いた場合のＫＳ（ＢＣ）での当該数値は、固相化：ＢＣＤ−７／検出：ＢＣＤ−７（「固相化抗KS抗体」として「ＢＣＤ−７（「／」の左記）」を、「検出抗KS抗体」として「ＢＣＤ−（「／」の右記）」を用いたことを示す。以下同様にして、用いた抗体を略記することがある）の組合せを除く９種の組合せにおいて、５Ｄ４法より低く、５Ｄ４より高感度と判明した。固相化：ＢＣＤ−７／検出：ＢＣＤ−７の組合せにおける反応性は、他の９種の組合せとは例外的に５Ｄ４と同程度若しくは若干高感度と推測された。【０１５１】
また、各種組み合わせによるＫＳの検出能を評価するために、各グラフの濃度依存性曲線から算出される吸光度差１．０を示すＫＳ（ＢＣ）、ＫＰＳ−１の濃度（それぞれ、ＫＳ（ＢＣ）（１．０）、ＫＰＳ−１（１．０）と表記する。）およびその検出能比（ＫＳ（ＢＣ）（１．０）／ＫＰＳ−１（１．０）、以下、「検出能比ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩ」ともいう）を算出した。結果を表６に示す。【０１５２】
【表６】
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【０１５３】
５Ｄ４を用いた測定系では、検出能比ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩは３６．１であり、ＫＳ（ＢＣ）の検出能はＫＰＳ−１の検出能と比較しておよそ１／３６であった。検討した抗体の組合せのうち固相化：ＢＣＤ−７／検出：ＢＣＤ−７の組合せを除く９種の組合せでは、検出能比ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩは２．７〜２０．２と、５Ｄ４法での数値より低く、５Ｄ４法に比べ、硫酸含量に影響されずにＫＳを検出できる測定法であることが判明した。一方で、ＢＣＤ−７単独でのＩＣ５０ＫＳ（ＢＣ）／ＫＰＳ−１は５Ｄ４より低いものの、固相化：ＢＣＤ−７／検出：ＢＣＤ−７の組合せでは、検討した組合せの中では例外的に検出能比ＫＳ−Ｉ／ＫＳ−ＩＩが５５．６以上と５Ｄ４より高いと推測された。【０１５４】
更に、各種検体の検出能の試験では、表７に記載の各試料を測定し、検出能を評価した。【０１５５】
【表７】
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【０１５６】
結果を表８および表９に示す。なお、表８および表９では、試験に用いた試料が異なる。【０１５７】
【表８】
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【０１５８】
表８の試験では、５Ｄ４による測定系において、ヒト血清では１０倍希釈での吸光度差が０．９１３であった。ＢＣＤ−４とＭＫ−１７２との組合せによる４種の測定系では、未確認の固相化：ＭＫ−１７２／検出：ＢＣＤ−４の組み合わせを除き、４８００倍希釈にて充分な吸光度差が得られ、５Ｄ４を用いた測定系に比べてより高感度にＫＳを検出した。【０１５９】
その他のウサギ、モルモット、ラット、マウスの試料では、５Ｄ４はウサギ血清、モルモット関節液のみ検出されたが、吸光度差が０．１３６、０．１と低レベルであり、その他の試料中ＫＳは検出不能であった。【０１６０】
一方、表８記載の４種の組合せの測定系では、固相化：ＭＫ−１７２／検出：ＢＣＤ−４がその他の３種と比較して検出能が低いが、固相化：ＭＫ−１７２／検出：ＢＣＤ−４以外の他の３種の測定系ではいずれの検体も５Ｄ４よりも高感度にＫＳを検出した。特に、固相化：ＢＣＤ−４／検出：ＭＫ−１７２の組み合わせがより高感度にＫＳを検出できることが判明した。【０１６１】
【表９】
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【０１６２】
表９の試験では、５Ｄ４法におけるウサギおよびモルモット血清の吸光度差は、それぞれ０．１５０、０．２３０と検出されるものの低レベルであり、ラットおよびマウス血清では表８と同様に検出不能であった。【０１６３】
一方、表９記載の４種の組合せの測定系では、固相化：ＢＣＤ−７／検出：ＢＣＤ−７、固相化：ＥＦＧ−１１／検出：ＢＣＤ−７がその他の２種の組合せと比較して検出能が低いが、４種の組合せともにウサギ、モルモット血清は十分に検出し、５Ｄ４法では検出できないラット血清を検出した。表８記載の４種の組合せでは、５Ｄ４法と同様にマウス血清は検出できなかったものの、当該４種の組合せは、５Ｄ４法よりも高感度にＫＳを検出可能であることが判明した。【０１６４】
表８および表９に示すように、本発明測定系は、従来の５Ｄ４法より各種試料中のＫＳを高感度に検出し、従来法では検出できない微量のＫＳをも検出可能と判明した。特に、固相化：ＢＣＤ−４／検出：ＭＫ−１７２の組み合わせでは、マウス血清中の極めて微量のＫＳを検出することができた。【０１６５】
［実施例３］
プロナーゼで血清中たんぱく質を消化した検体と、プロナーゼ処理を行わなかった検体を生体試料として、ＢＣＤ−４／ＭＫ１７２の測定系とＥＦＧ１１／ＥＦＧ１１の測定系で、血清中のＫＳ濃度を測定し、ＨＰＬＣで測定したＫＳ濃度との相関を比較した。検体は参考例７で採取したサンプルの一部で、健常者１５名、および、ＯＡ患者２０名の血清である。プロナーゼ処理検体は、血清２０μＬに、精製水１８０μＬおよび２．０％アクチナーゼＥ溶液（科研製薬株式会社）を加え、５５℃で一夜、酵素処理を行った。反応液を精製水で８ｍＬに希釈した後、１００℃で１０分加熱することにより酵素反応を止めた試料を測定試料とした。また、プロナーゼ無処理検体は、血清を精製水で希釈したものを測定試料とした。ＥＬＩＳＡ測定は実施例２と同様に行った。【０１６６】
ＢＣＤ−４／ＭＫ１７２測定系で、アクチナーゼ無処理血清およびプロナーゼ処理血清を試料として測定したＫＳ濃度とＨＰＬＣで測定したＫＳ濃度との相関は、図３に示したように、それぞれ、Ｒ２＝０．７０３４およびＲ２＝０．７８１３で、プロナーゼ処理によりＨＰＬＣ測定値との相関は向上した。【０１６７】
同様に、ＥＦＧ１１／ＥＦＧ１１測定系でも、図４に示したようにプロナーゼ無処理のＲ２＝０．４３４３から、プロナーゼ処理のＲ２＝０．７７０９に相関係数が向上した。【０１６８】
プロナーゼ処理により、両測定系ともＨＰＬＣ測定値との相関が向上し、測定値の正確度が高まったことを示している。【０１６９】
［実施例４］  半月板切除モデル動物での検討
動物には７週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄ラット(日本チャールスリバー、ＳＰＦ)を用いた。【０１７０】
小動物用麻酔装置（Ｂｉｏ  Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ、ＴＫ−５）に充填したイソフルラン（商品名：フォーレン、大日本製薬）吸入麻酔下（濃度２．０％、流量３．０ｌ／ｍｉｎ）にラットの左後肢膝関節周囲を除毛し、内側を約１ｃｍ切開後、血管を避けて内側側副靱帯を切断し、内側半月板を露出した。次いでニューロブレイド・カーブメス（Ｆｅａｔｈｅｒ、Ｋ−５４１０）を用いて半月板中央部を真横に切断し、また半月板を繋いでいる末梢側の靱帯を切断し、半月板を半摘出した。Ｓｈａｍ群については内側側副靱帯のみを切断した。【０１７１】
施術後、切開部は縫合糸で縫合した。術後２８日にエーテル（和光純薬工業）麻酔下に安楽的に放血致死させた後、左後肢膝関節組織を採取し、関節腔内を生理食塩液で洗浄し、０．３ｍＬを回収した。関節液は３，０００回転で１０分間遠心分離し、無処置対照群、Ｓｈａｍ群、半月板切除群での術後２８日目における関節液中ＫＳレベルを既存ＫＳ測定キット（５Ｄ４測定系）および本発明ＫＳ測定系で測定した。なお、本発明ＫＳ測定系には、「固相化：ＢＣＤ−４、検出：ＨＲＰ標識ＭＫ−１７２」の系を用い、実施例２と同様の方法により測定した。【０１７２】
測定時の試料の希釈率は、既存ＫＳ測定キット（５Ｄ４測定系）が５倍希釈、本発明のＫＳ測定系では６０倍希釈とした。また、肉眼所見については、脛骨軟骨面にインディアンインクを塗布し、デジタルカメラ（＊ｉｓｔＤ、ペンタックス）で撮影後、表面粗造化の程度を０〜４点（０：異常なし、１：軽度粗造化、２：重度粗造化、３：軽度びらん、４：重度びらん）の５段階スコアで評価した。さらに関節辺縁部に骨棘形成がみられた場合には＋１点を加点した。【０１７３】
（１）関節の状態
Ｓｈａｍ群、半月板切除群での術後２８日目における肉眼所見による関節の状態（肉眼スコア）を図５に示す。半月板切除群の肉眼スコアはＳｈａｍ群に比べて有意に高く、関節の状態が悪化していることが確認された。【０１７４】
（２）関節液中のＫＳレベル
ラット半月板切除モデルにおける各群の関節液ＫＳは、既存ＫＳ測定キットでは検出不能であったが、本発明ＫＳ測定系では検出可能であった。本発明ＫＳ測定系での結果のみを図６に示す。半月板切除群の関節液ＫＳはＳｈａｍ群より有意に高レベルであった。このように、本発明ＫＳ測定系では既存ＫＳ測定キットで検出不能である試料を検出可能であることが確認できた。また、ラット半月板切除モデルでも術後２８日目における関節液ＫＳレベルが増加していることが新たに判明した。さらに、本発明ＫＳ測定系でラット半月板切除モデルにおける関節液ＫＳレベルを測定することにより、関節の状態を把握しうる可能性が示された。【０１７５】
ここに示した結果は、上述したように、本発明の疾患判定法により、膝関節における軟骨の損傷の判定を行うことが可能であることを示している。【０１７６】
［実施例５］  アジュバント誘発関節炎モデル動物（ＡＩＡ）での検討
動物には６週齢Ｌｅｗｉｓ系雄ラット(日本チャールスリバー、ＳＰＦ)を用いた。アジュバントとしてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍの乾燥菌体（ＤＩＦＣＯ）をメノウ乳鉢でよく研磨後、６ｍｇ／ｍＬの濃度に流動パラフィン（和光純薬工業）に懸濁したものを用いた。非麻酔下にラットの右後肢足蹠皮下にアジュバント（０．３ｍｇ／ｐａｗ）を投与し、その１４日後に群分けした。無処置正常群のラットには流動パラフィンのみを同様に投与した。Ｉｎｃａｄｒｏｎａｔｅ（ビスフォナール（登録商標）注射液１０ｍｇ、アステラス製薬）は群分け時より１ｍｇ／ｋｇの用量で、剖検日前日まで１日１回連日皮下投与した。無処置正常群とＡＩＡ対照群のラットには、ＰＢＳを剖検日前日まで1日1回静脈内投与した。左後肢足蹠浮腫容積は浮腫測定装置（ＴＫ−１０１ＣＭＰ、ＵＮＩＣＯＭ）により測定した。アジュバント感作後３５日にエーテル麻酔下に腹部大静脈より採血（ヘパリン加）した後、ラットは安楽的に放血致死させた。血液は３，０００回転で１０分間遠心分離し、無処置正常群、ＡＩＡ対照群、Ｉｎｃａｄｒｏｎａｔｅ投与群でのアジュバント投与後３５日目における血漿中ＫＳレベルを既存ＫＳ測定キット（５Ｄ４測定系）および本発明ＫＳ測定系で測定した。本発明ＫＳ測定系には、「固相化：ＢＣＤ−４、検出：ＨＲＰ標識ＭＫ−１７２」の系を用い、実施例２と同様の方法により測定した。ラット血漿の希釈率は、既存ＫＳ測定キットでは５倍（×５）、本発明ＫＳ測定系では１２０倍（×１２０）であった。【０１７７】
（１）関節の状態
無処置正常群、ＡＩＡ対照群、Ｉｎｃａｄｒｏｎａｔｅ（ビスフォスフォネート製剤）投与群（アジュバント投与＋インカドロネート投与）でのアジュバント投与後３５日目における左足浮腫容積（Ｌｅｆｔ  Ｐａｗ  ｖｏｌｕｍｅ）の結果を図７に示す。ＡＩＡ対照群の左足浮腫容積は無処置正常群に比べて有意に高く、関節状態の悪化が確認された。Ｉｎｃａｄｒｏｎａｔｅ投与群ではＡＩＡ対照群と比較して浮腫容積が低下し、治療薬の効果（浮腫改善効果）が認められた。【０１７８】
（２）血漿中のＫＳレベル
ラットＡＩＡモデルにおける各群の血漿中ＫＳは既存ＫＳ測定キットでは検出不能であったが、本発明ＫＳ測定系では検出可能であった。本発明ＫＳ測定系での結果のみを図８に示す。ＡＩＡ群の血漿ＫＳは無処置正常群より高レベルであり、浮腫の増加と同様の変動を示した。Ｉｎｃａｄｒｏｎａｔｅ群ではＡＩＡ対照群より低下し、浮腫の低下（改善）と同様の変動を示した。このように、本発明ＫＳ測定系により、ラットＡＩＡモデルではアジュバント投与後３５日目において血漿ＫＳレベルが増加し、そのレベルはＩｎｃａｄｒｏｎａｔｅによる治療により低下することが新たに判明した。このＫＳレベルの変動は浮腫の変動と一致することから、本発明ＫＳ測定系でラットＡＩＡモデルにおける血漿ＫＳレベルを測定することにより、関節の状態を把握し、治療による効果を評価しうることが示された。【０１７９】
ＡＩＡは慢性関節リウマチ（ＲＡ）のモデルであり、ここに示した結果は、本発明の方法により、ＲＡの判定を行うことができるとともに、ＲＡ治療薬の効果を判定できることを示している。【０１８０】
［実施例６］  パパイン誘発ウサギ関節炎モデルにおける血中ＫＳレベルの測定
ウサギ左後肢膝関節腔内に、生理食塩水で２５ｍｇ／ｍｌに溶解したパパイン溶液（パパイン：ＳＩＧＭＡ社製）を関節あたり１５０μｌで投与し、その１週間後に、同量のパパイン溶液を再投与した。対照群の左後肢膝関節腔内には生理食塩液を同様に投与した。初回パパイン投与後４９日目に血清を採取し、血清中ＫＳレベルを測定した。ＫＳ測定には、既存ＫＳ測定キットおよび本発明ＫＳ測定系で測定した。本発明ＫＳ測定系には、「固相化：ＢＣＤ−４、検出：ＨＲＰ標識ＭＫ−１７２」の系を用い、実施例２と同様の方法により測定した。既存KS測定キットによる測定系には、「固相化：５D4、検出：ビオチン標識５D4」の系を用いた。ウサギ血清の希釈率は、既存ＫＳ測定キットでは５倍（測定時：５倍希釈）、本発明ＫＳ測定系では２０倍（測定時：１２０倍希釈）であった。結果を図９に示す。【０１８１】
既存ＫＳ測定キットでは、５倍希釈ウサギ血清にて殆どの試料が測定範囲の下限以下であり、パパイン投与群におけるＫＳレベルは対照群より若干高レベルであるが、実質的に十分な判定ができない状態であった。【０１８２】
一方、本発明のＢＣＤ−４／ＭＫ−１７２の系においては、２０倍希釈ウサギ血清にて十分に測定可能且つパパイン投与群におけるＫＳレベルが対照群より明確に高レベルであると判定できた。【０１８３】
このように本発明ＫＳ測定系は、高感度であるために、既存ＫＳ測定キットで測定できないＫＳを検出することができ、且つ生体試料中のＫＳの変化をより鋭敏に検出しうることが示された。【０１８４】
［実施例７］  関節疾患患者における血中ＫＳレベルの測定
変形性膝関節症（ＯＡ）患者血清（ｎ＝２９）、外傷性膝関節症（ＴＡ）患者血清（ｎ＝１７）および健康人血清（ｎ＝１８）は参考例７で採取したサンプルを用いた。【０１８５】
測定は、市販の５Ｄ４を用いたＫＳ測定キットおよび表１０記載の組合せ法で行った。また、表１０記載の希釈率で希釈した試料をそれぞれの測定系に用いた。なお、本発明測定系での測定は、実施例２と同様に行った。各群における中央値および４分位偏差を表１１に、測定結果のグラフを図１０に示す。なお、有意差検定は健康人に対するＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いた。また、健康人群に対する各疾患群におけるＲｅｃｉｅｖｅｒ−Ｏｐａｒａｔｉｏｎ  Ｃｕｒｖｅ（ＲＯＣ曲線）を算出した。図１１には健康人群とＯＡ群との結果を、図１２には健康人群とＴＡ群との結果を示す。ＲＯＣ曲線の評価は、曲線下面積（ＡＵＣ）とした。ＡＵＣは最小値が０．５、最大値が１．０であり、数値が高いほど診断効果が高いことを示す。【０１８６】
【表１０】
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【０１８７】
【表１１】
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【０１８８】
既存ＫＳ測定キット（５Ｄ４／５Ｄ４）におけるＫＳレベル（中央値、ｎｇ／ｍｌ）は、健康人群では１７３、ＯＡ群では２４０、ＴＡ群では２０５と、ＯＡ群およびＴＡ群ともに健康人群より高値であった。検討した組合せにおけるＫＳレベルはいずれも、既存ＫＳ測定キットと同様に、ＯＡ群およびＴＡ群ともに健康人群より高値であった。検討した組合せにおける測定値は、健康人群、ＯＡ群、ＴＡ群ともに既存ＫＳ測定キットより高値でとなった。【０１８９】
健康人に対するＯＡ群およびＴＡ群の有意差（Ｐ値）は、既存ＫＳ測定キットではそれぞれ０．００７３、０．２０４で、健康人群とTA 群間には有意な差はみられなかった。検討した９種の組合せでは、いずれも既存ＫＳ測定キットより低く、有意性が改善した。【０１９０】
既存ＫＳ測定キット（５Ｄ４／５Ｄ４）のＲＯＣ曲線において、健康人群のＫＳレベルに対するＯＡ群のＫＳレベルのＡＵＣは０．７３５であり、健康人群のＫＳレベルに対するＴＡ群のＫＳレベルのＡＵＣは０．６３６であった。検討した９種の組合せのＡＵＣは、ＯＡ群およびＴＡ群ともに、既存ＫＳ測定キットのＡＵＣより高値であった。このように、本発明測定系では、既存ＫＳ測定キットより関節疾患に対する診断効果が改善した。【０１９１】
さらに、得られたＯＡ群のうち、Ｘ線にて所見の認められないあるいは認められにくい早期ＯＡ群（grade０あるいはgradeＩ）を対象に、前述と同様の解析を行った。各群における中央値および４分位偏差を表１２に、測定結果のグラフを図１３に示す。また、健康人群に対する早期ＯＡ群におけるＲＯＣ曲線を図１４に示す。【０１９２】
【表１２】
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【０１９３】
既存ＫＳ測定キット（５Ｄ４／５Ｄ４）におけるＫＳレベル（中央値、ｎｇ／ｍｌ）は、健康人群では１７３、早期ＯＡ群では２４０と、早期ＯＡ群は健康人群より高値であった。検討した組合せにおけるＫＳレベルはいずれも、既存ＫＳ測定キットと同様にＯＡ群およびＴＡ群ともに健康人群より高値であった。【０１９４】
健康人に対する早期ＯＡ群の有意差（Ｐ値）は、既存ＫＳ測定キットでは０．０１１であり、有意性が認められた。検討した９種の組合せにおけるＰ値はいずれも、既存ＫＳ測定キットより極めて低く、有意性が著しく向上した。【０１９５】
既存ＫＳ測定キット（５Ｄ４／５Ｄ４）のＲＯＣ曲線において、健康人群対する早期ＯＡ群のＡＵＣは０．７８５であった。検討した９種の組合せのＡＵＣはいずれも０．８５以上と、既存ＫＳ測定キットＡＵＣより高値であった。このように、本発明測定系では、既存ＫＳ測定キットより早期ＯＡに対しても診断効果が改善した。【０１９６】
これらの関節疾患での臨床的性能から、本発明測定系は、既存ＫＳ測定キットより優れた関節疾患検査用ツールとなり得ることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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