(57)【要約】  ヒスチジンペプチドに結合可能なアプタマーを提供する。下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの核酸を、ヒスチジンペプチドに結合可能なアプタマーとして使用する。（ａ）ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨで表わされる塩基配列を含む核酸ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わす。（ｂ）前記（ａ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記ヒスチジンペプチドに結合可能である核酸（ｃ）ＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣで表わされる塩基配列を含む核酸（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記ヒスチジンペプチドに結合可能である核酸
2010131748.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの核酸であることを特徴とする、ヒスチジンペプチドに結合可能なアプタマー。
（ａ）配列番号１７で表わされる塩基配列を含む核酸
ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨ  （配列番号１７）
ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わす。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記ヒスチジンペプチドに結合可能である核酸
（ｃ）配列番号１８で表わされる塩基配列を含む核酸
ＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ  （配列番号１８）
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記ヒスチジンペプチドに結合可能である核酸
【請求項２】
前記（ａ）の核酸が、下記（ａ１）の核酸である、請求の範囲１記載のアプタマー。
（ａ１）配列番号８９〜１０４のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
【請求項３】
前記（ａ１）の核酸が、下記（ａ１−１）の核酸である、請求の範囲２記載のアプタマー。
（ａ１−１）配列番号１〜１６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
【請求項４】
前記（ａ）の核酸が、下記（ａ２）の核酸である、請求の範囲１記載のアプタマー。
（ａ２）配列番号１０５〜１１４、配列番号１１６〜１２４および配列番号１２７〜１４６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
【請求項５】
前記（ａ２）の核酸が、下記（ａ２−１）の核酸である、請求の範囲４記載のアプタマー。
（ａ２−１）配列番号２６〜３５、配列番号３７〜４５、配列番号６５〜６８、配列番号１９〜２５および配列番号４８〜５６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
【請求項６】
前記（ａ）の核酸が、下記（ａ３）の核酸である、請求の範囲１記載のアプタマー。
（ａ３）配列番号１４７で表わされる塩基配列を含む核酸
ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ  （配列番号１４７）
ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わす。
【請求項７】
配列番号１４７で表わされる塩基配列が、配列番号１４８で表わされる塩基配列である、請求の範囲６記載のアプタマー。
ＧＧＵＡＵＡＵＵＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ  （配列番号１４８）
【請求項８】
前記（ａ３）の核酸が、下記（ａ３−１）の核酸である、請求の範囲６または７記載のアプタマー。
（ａ３−１）配列番号２、１２、１４、１５および５５のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
【請求項９】
前記（ａ）の核酸が、下記（ａ４）の核酸である、請求の範囲１記載のアプタマー。
（ａ４）配列番号１５８〜２３０２および配列番号２３０３〜２３１２のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
【請求項１０】
前記（ｃ）の核酸が、下記（ｃ１）の核酸である、請求の範囲１記載のアプタマー。
（ｃ１）配列番号２、１２、１４、１５および５５のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
【請求項１１】
前記ヒスチジンペプチドのヒスチジン個数が、６〜１０個である、請求の範囲１から１０のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項１２】
前記ヒスチジンペプチドが、ヒスチジンタグである、請求の範囲１から１１のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項１３】
請求の範囲１から１２のいずれか一項に記載のアプタマーを含むことを特徴とする、試薬。
【請求項１４】
請求の範囲１から１２のいずれか一項に記載のアプタマーを含むことを特徴とする、キット。
【請求項１５】
請求の範囲１から１２のいずれか一項に記載のアプタマーに相補的な塩基配列を含むことを特徴とする、請求の範囲１から１２のいずれか一項に記載のアプタマーを作製するためのアプタマー作製用核酸。
【請求項１６】
さらに、ベクターを含み、前記ベクターに、前記アプタマーに相補的な塩基配列が挿入されている、請求の範囲１５記載のアプタマー作製用核酸。
【請求項１７】
請求の範囲１から１２のいずれか一項に記載のアプタマーに相補的な塩基配列を含むことを特徴とする、請求の範囲１から１２のいずれか一項に記載のアプタマーに対するアンチセンス核酸。
【請求項１８】
下記（ｉ）工程〜（ｉｖ）工程を含むことを特徴とする、ターゲットに結合可能なアプタマーの同定方法。
（ｉ）ＲＮＡプールと、ターゲットとを混合する工程
（ｉｉ）前記ＲＮＡプールから、前記ターゲットと結合するＲＮＡを分離する工程
（ｉｉｉ）分離したＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡを合成する工程
（ｉｖ）前記ｃＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを合成する工程
【請求項１９】
前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである、請求の範囲１８記載の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドを認識するアプタマーに関し、詳細には、ヒスチジンペプチドを認識するアプタマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ターゲットを認識して特異的に結合する結合分子として、モノクローナル抗体等の抗体が、広く研究されている。抗体は、一般的に、動物への免疫により作製される。しかしながら、例えば、イオン原子およびペプチド等の低分子化合物、または生物種間で高度に保存された抗原に対する抗体は、作製が困難である。このため、必ずしも、前記ターゲットに特異的に結合する抗体が入手できるとは限らない。そこで、近年、抗体に代わり、前記ターゲットに特異的に結合する、ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡオリゴヌクレオチド等の核酸分子が注目されている。前記核酸分子は、一般的に、アプタマーと呼ばれる。アプタマーについては、例えば、前述のように、抗体を得ることが困難である低分子化合物等のターゲットに特異的に結合するものを取得可能であることが、報告されている（非特許文献１）。【０００３】
このように、抗体の作成が困難である前記ターゲットに対して、特異的に結合するアプタマーの取得が可能であることから、アプタマーは、例えば、以下に示すように、生化学および医療の分野における重要なツールとして利用が試みられている。【０００４】
アプタマーは、例えば、化学的に大量合成が可能である。また、アプタマーには、免疫原性が低く、ターゲットに対して抗体よりも強い結合能を示すものがある。このため、アプタマーは、優れた分子標的薬の候補となり得る（非特許文献２）。具体例として、ペガプタニブ（一般名Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ、商品名Ｍａｃｕｇｅｎ）は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合するアプタマーとして知られている。このアプタマーは、実際に、加齢黄斑変性症の治療薬として、米国、欧州および日本で承認されている（非特許文献３）。この他にも、現在、少なくとも５種類のアプタマーについて、米国で臨床治験が行われている。【０００５】
また、アプタマーを、新たな分子センサーとして利用するための研究も盛んに行われている。例えば、血清タンパク質（非特許文献４）、コカイン（非特許文献５）またはイオン（非特許文献６）等のターゲットに対するアプタマーは、前記ターゲットに結合することで、その高次構造が変化する。この特徴を活かした、前記ターゲットの測定法が開発されている（非特許文献７）。【０００６】
また、アプタマーを、例えば、タンパク質等のアフィニティー精製に使用することも試みられている。この方法によれば、例えば、抗体を使用する従来法に比べて、ペプチド等のタンパク質由来物質のコンタミネーションを、極めて低減できる。このため、この方法によれば、例えば、医学的および生化学的に、非常に価値の高い精製品が得られる（非特許文献８）。【０００７】
他方、従来、目的タンパク質を大量合成する際、数個から数十個のアミノ酸が連続したペプチドをタグとして、前記目的タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合させた、融合タンパク質を発現させる方法が知られている。この方法によれば、前記融合タンパク質の前記タグを手掛かりに、前記目的タンパク質の発現の確認および前記目的タンパク質の精製が可能である。前記タグは、例えば、数個のヒスチジンを含むヒスチジンペプチドが、いわゆるヒスチジンタグとして、広く用いられている。前記ヒスチジンタグを付加した融合タンパク質は、例えば、ニッケルイオンカラムまたは抗ヒスチジンタグ抗体等により精製可能である。しかし、前記ニッケルイオンカラムは非特異的吸着が多く、前記抗ヒスチジン抗体は高価である、等の問題点を有する。そこで、ヒスチジンタグを使用した前記目的タンパク質の精製において、新たな抗ヒスチジンタグ抗体または前記抗体に代わる結合分子の開発が進められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Mairal  T.ら,  「Anal.  Bioanal.  Chem.」,  2008年,  第390巻,  pp.989-1007
【非特許文献２】Bunka  D.H.およびStockley  P.G.,  「Nat.  Rev.  Microbiol.」,  2006年,  第4巻,  pp.588-596
【非特許文献３】Nimjee  S.M.ら,  「Trends  Cardiovasc.  Med.」,  2005年,  第15巻,  pp.41-45
【非特許文献４】Nimjee  S.M.ら,  「Annu.  Rev.  Med.」,  2005年,  第56巻,  pp.555-583
【非特許文献５】Ng  E.W.ら,  「Nat.  Rev.  Drug  Discov.」,  2006年,  第5巻,  pp.123-132
【非特許文献６】Huang  Y.C.ら,  「J.  Am.  Chem.  Soc.」,  2008年,  第130巻,  pp.8023-8029
【非特許文献７】Deng  C.ら,  「Anal.  Chem.」,  2009年,  第81巻,  pp.739-745
【非特許文献８】Xu  H.ら,  「Anal.  Chem.」,  2009年,  第81巻,  pp.669-675
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明の目的は、ヒスチジンペプチドに結合可能なアプタマーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のアプタマーは、ヒスチジンペプチドに結合可能なアプタマーであり、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの核酸であることを特徴とする。
（ａ）配列番号１７で表わされる塩基配列を含む核酸
ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨ  （配列番号１７）
ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わす。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記ヒスチジンペプチドに結合可能である核酸
（ｃ）配列番号１８で表わされる塩基配列を含む核酸
ＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ  （配列番号１８）
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記ヒスチジンペプチドに結合可能である核酸【００１１】
本発明の試薬は、前記本発明のアプタマーを含むことを特徴とする。本発明のキットは、前記本発明のアプタマーを含むことを特徴とする。【００１２】
本発明のアプタマー製造用核酸は、本発明のアプタマーを製造するための核酸であって、本発明のアプタマーに相補的な塩基配列を含む核酸である。【００１３】
本発明のアンチセンス核酸は、前記本発明のアプタマーに相補的な塩基配列を含むことを特徴とする。【００１４】
本発明の同定方法は、ターゲットに結合可能なアプタマーの同定方法であり、下記（ｉ）工程〜（ｉｖ）工程を含むことを特徴とする。
（ｉ）ＲＮＡプールと、ターゲットとを混合する工程
（ｉｉ）前記ＲＮＡプールから、前記ターゲットと結合するＲＮＡを分離する工程
（ｉｉｉ）分離したＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡを合成する工程
（ｉｖ）前記ｃＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを合成する工程
【発明の効果】
【００１５】
本発明のアプタマーは、例えば、ヒスチジンペプチドに結合する一般的な抗ヒスチジンペプチド抗体と比較して、前記ヒスチジンペプチドに対する結合力が優れている。このため、例えば、前記ヒスチジンペプチドの検出において、前記抗ヒスチジンペプチド抗体に代わって使用でき、且つ、より優れた精度での検出が可能となる。このように、本発明のアプタマーは、例えば、生物学的手法における前記ヒスチジンペプチドの検出に、極めて有用なツールである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の実施例における各種アプタマーのセンサーグラムである。
【図２】図２は、本発明の実施例におけるアプタマーｓｈｏｔ４７のセンサーグラムである。
【図３】図３は、本発明の実施例における各種アプタマーの推定二次構造を示す模式図である。
【図４】図４は、本発明の実施例におけるアプタマー＃４７ｓの二次構造を示す模式図である。
【図５】図５は、本発明の実施例における各種アプタマーのセンサーグラムである。
【図６】図６は、本発明の実施例における各種融合タンパク質の構造を示す模式図である。
【図７】図７は、本発明の実施例におけるアプタマーｓｈｏｔ４７の各種融合タンパク質への結合を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例におけるアプタマーｓｈｏｔ４７の融合タンパク質への結合を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施例における各種アプタマーの融合タンパク質への結合を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例におけるアプタマーｓｈｏｔ４７の各種融合タンパク質への結合を示すブロッティング写真である。
【図１１】図１１は、本発明の実施例におけるアプタマーｓｈｏｔ４７のＨｉｓ−ＭＩＦへの結合を示すブロッティング写真である。
【図１２】図１２は、本発明の実施例における各種アプタマーのセンサーグラムである。
【図１３】図１３は、本発明の実施例における各種アプタマーのセンサーグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明において、以下、ヒスチジンを「Ｈｉｓ」、ヒスチジンペプチドを「Ｈｉｓペプチド」という。Ｈｉｓペプチドは、前述のように、ヒスチジンタグとして使用できる。前記ヒスチジンタグを、以下、「Ｈｉｓ−ｔａｇ」という。前記Ｈｉｓペプチドは、以下、Ｈｉｓ−ｔａｇに読み替え可能である。前記Ｈｉｓペプチドに結合可能なアプタマーを、以下、「Ｈｉｓペプチドアプタマー」、「Ｈｉｓ−ｔａｇアプタマー」または「アプタマー」という。
【００１８】
本発明において、前記Ｈｉｓペプチドは、複数個のＨｉｓを有するペプチドを意味する。前記Ｈｉｓペプチドは、例えば、複数個の連続するＨｉｓのみからなるペプチド、すなわち、ポリＨｉｓペプチド（以下、「ポリＨｉｓ」という）でもよいし、前記ポリＨｉｓペプチドを含むペプチド、すなわち、前記ポリＨｉｓのＮ末端側およびＣ末端側の少なくとも一方に、さらに付加配列を有するペプチドでもよい。前記付加配列は、例えば、１個のアミノ酸残基でもよいし、２個以上のアミノ酸残基からなるペプチドであってもよい。また、前記Ｈｉｓペプチドは、例えば、不連続な複数個のＨｉｓを含むペプチド、すなわち、複数個のＨｉｓとその他のアミノ酸を含むペプチドであってもよい。本発明において、前記Ｈｉｓペプチドの長さは、特に制限されないが、アミノ酸残基数が、例えば、６〜３０個であり、好ましくは６〜１５個であり、より好ましくは８〜１５個である。前記ＨｉｓペプチドにおけるポリＨｉｓのヒスチジンの個数は、例えば、６〜１０個が好ましく、より好ましくは６〜８個である。
【００１９】
＜アプタマー＞
本発明のアプタマーは、前述のように、Ｈｉｓペプチドに結合可能なアプタマーであり、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの核酸であることを特徴とする。
（ａ）配列番号１７で表わされる塩基配列を含む核酸
ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨ  （配列番号１７）
ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わす。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸
（ｃ）配列番号１８で表わされる塩基配列を含む核酸
ＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ  （配列番号１８）
（ｄ）前記（ｃ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸
【００２０】
前記（ａ）のアプタマーは、配列番号１７で表わされる塩基配列を含む核酸であればよい。以下、配列番号１７で表わされる塩基配列を、「結合モチーフ配列」ともいう。配列番号１７で表わされる結合モチーフ配列において、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴを表わし、Ａ、Ｇ、ＣまたはＵが好ましく、Ｎｎのｎは、前記Ｎの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｙは、Ｕ、ＴまたはＣを表わし、ＵまたはＣが好ましく、Ｕｍのｍは、前記Ｕの個数であって、１〜３の整数を表わし、Ｈは、Ｕ、Ｔ、ＣまたはＡを表わし、Ｕ、ＣまたはＡが好ましい。前記結合モチーフ配列は、後述する配列番号１〜１６で表わされる塩基配列等に共通して見出されるコンセンサス配列である。前記結合モチーフ配列において、ＮｎにおけるＮの個数（ｎ）は、特に制限されず、例えば、１個（Ｎ）、２個（ＮＮ）または３個（ＮＮＮ）のいずれであってもよく、Ｎは、それぞれ同じ塩基でもよいし、異なる塩基でもよい。前記結合モチーフ配列において、ＵｍにおけるＵの個数（ｍ）は、特に制限されず、例えば、１個（Ｕ）、２個（ＵＵ）または３個（ＵＵＵ）のいずれであってもよい。
【００２１】
前記（ａ）のアプタマーは、例えば、下記（ａ１）の核酸があげられる。
（ａ１）配列番号８９〜１０４のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
【００２２】
これらの配列番号で表わされる塩基配列は、それぞれ、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列を有する。前記（ａ１）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸であってもよい。下記表１に、配列番号８９〜１０４で表わされる塩基配列を示す。下記表１において、下線部は、配列番号１７で表わされる結合モチーフ配列である。以下、本発明において、下記表１における各アプタマーは、配列の前に示す名称で示すこともある（以下、同様）。
【００２３】
【表１】
2010131748.tif 000003
【００２４】
前記（ａ１）のアプタマーは、具体例として、例えば、下記（ａ１−１）の核酸があげられる。
（ａ１−１）配列番号１〜１６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
【００２５】
配列番号１〜１６で表わされる塩基配列は、それぞれ、前述した配列番号８９〜１０４で表わされる塩基配列を含む。前記（ａ１−１）のアプタマーは、例えば、配列番号１〜１６のいずれかで表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれかの塩基配列を含む核酸であってもよい。下記表２に、配列番号１〜１６で表わされる塩基配列を示す。下記表２において、下線部が、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列である。以下、本発明において、下記表２における各アプタマーは、配列の前に示す名称で示すこともある（以下、同様）。
【００２６】
【表２】
2010131748.tif 000004
【００２７】
前記（ａ）のアプタマーは、この他に、具体例として、例えば、下記（ａ２）の核酸があげられる。
（ａ２）配列番号１０５〜１１４、配列番号１１６〜１２４および配列番号１２７〜１４６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
【００２８】
これらの配列番号で表わされる塩基配列は、それぞれ、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列を有する。前記（ａ２）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸であってもよい。下記表３および表４に、配列番号１０５〜１１４、配列番号１１６〜１２４、配列番号１２７〜１４６で表わされる塩基配列を示す。下記表３および表４において、下線部は、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列である。以下、本発明において、下記表３および表４における各アプタマーは、配列の前に示す名称で示すこともある（以下、同様）。
【００２９】
【表３】
2010131748.tif 000005
【表４】
2010131748.tif 000006
【００３０】
前記（ａ２）のアプタマーは、具体例として、例えば、下記（ａ２−１）の核酸があげられる。
（ａ２−１）配列番号２６〜３５、配列番号３７〜４５、配列番号６５〜６８、配列番号１９〜２５および配列番号４８〜５６のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
【００３１】
配列番号２６〜３５、配列番号３７〜４５、配列番号６５〜６８、配列番号１９〜２５および配列番号４８〜５６で表わされる塩基配列は、それぞれ、前述した配列番号１０５〜１１４、配列番号１１６〜１２４および配列番号１２７〜１４６で表わされる塩基配列を含む。前記（ａ２−１）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸であってもよい。下記表５および表６に、配列番号２６〜３５、配列番号３７〜４５、配列番号６５〜６８、配列番号１９〜２５および配列番号４８〜５６で表わされる塩基配列を示す。下記表５および表６において、下線部が、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列である。以下、本発明において、下記表５および表６における各アプタマーは、配列の前に示す名称で示すこともある（以下、同様）。
【００３２】
【表５】
2010131748.tif 000007
【表６】
2010131748.tif 000008
【００３３】
前記（ａ）のアプタマーは、この他に、具体例として、例えば、下記（ａ３）の核酸があげられる。
（ａ３）配列番号１４７で表わされる塩基配列を含む核酸
ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ  （配列番号１４７）
【００３４】
配列番号１４７で表わされる塩基配列において、「ＧＧＵＮｎＡＹＵｍＧＧＨ」は、前述した配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列であり、前述の通りである。また、配列番号１４７で表わされる塩基配列において、「ＧＧＨＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ」は、後述する配列番号１８で表わされる塩基配列（ここで、ＨはＣ）であり、後述の通りである。配列番号１８で表わされる塩基配列は、例えば、アプタマーにおいて、ステムループ構造を形成する領域の塩基配列であり、以下、「ステムループモチーフ配列」ともいう。配列番号１４７で表わされる塩基配列において、前記結合モチーフ配列の３’末端の３塩基と、前記ステムループモチーフ配列の５’末端の３塩基とは重複している。
【００３５】
配列番号１４７で表わされる塩基配列は、例えば、配列番号１４８で表わされる塩基配列があげられる。
ＧＧＵＡＵＡＵＵＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ  （配列番号１４８）
【００３６】
前記（ａ３）のアプタマーは、具体例として、例えば、下記（ａ３−１）の核酸があげられる。
（ａ３−１）配列番号２、１２、１４、１５および５５のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
【００３７】
配列番号２、１２、１４、１５および５５で表わされる塩基配列は、それぞれ、前述した配列番号１４７、具体的には、配列番号１４８で表わされる塩基配列を含む。前記（ａ３−１）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸であってもよい。下記表７に、配列番号２、１２、１４、１５および５５で表わされる塩基配列を示す。下記表７において、下線部が、配列番号１７で表わされる塩基配列であり、四角で囲んだ領域が、配列番号１８で表わされる塩基配列である。
【００３８】
【表７】
2010131748.tif 000009
【００３９】
前記（ａ）のアプタマーは、この他に、具体例として、例えば、下記（ａ４）の核酸があげられる。前記（ａ４）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸であってもよい。
（ａ４）配列番号１５８〜２３０２および配列番号２３０３〜２３１２のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
【００４０】
前記（ａ）のアプタマーは、さらに、この他に、具体例として、例えば、下記（ａ５）の核酸があげられる。前記（ａ５）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸であってもよい。
（ａ５）配列番号２３１３〜２３４７のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸
【００４１】
前記（ｂ）のアプタマーは、前述のように、前記（ａ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸である。「１または複数」とは、特に制限されないが、配列番号１７で表わされる塩基配列において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。また、前記（ｂ）のアプタマーは、例えば、前述した、前記（ａ）のアプタマーで列挙した各配列番号で表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸であってもよい。この場合、「１または複数」とは、特に制限されないが、前記塩基配列において、例えば、１〜１０個であり、好ましくは１〜５個であり、より好ましくは１〜４個であり、さらに好ましくは１〜３個であり、特に好ましくは１個または２個であり、最も好ましくは１個である。また、前記（ｂ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーの全長塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸であってもよい。この場合、「１または複数」とは、特に制限されないが、前記全長配列において、例えば、１〜１０個であり、好ましくは１〜５個であり、より好ましくは１〜４個であり、さらに好ましくは１〜３個であり、特に好ましくは１個または２個であり、最も好ましくは１個である。
【００４２】
置換、付加または挿入に使用する塩基は、特に制限されず、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＴがあげられ、この他にも、例えば、修飾塩基、人工塩基等があげられる。前記修飾塩基としては、例えば、２’−フルオロピリミジン、２’−Ｏ−メチルピリミジン等があげられる。また、塩基の置換、付加または挿入は、例えば、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いてもよいし、デオキシヌクレオシドまたはデオキシヌクレオチドを用いてもよく、この他に、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等を用いてもよい。
【００４３】
前記（ｂ）のアプタマーとしては、例えば、前記表３および表５に示す塩基配列を含む核酸があげられる。具体例としては、例えば、配列番号１１５（＃７３６）または配列番号３６（＃７３６）で表わされる塩基配列を含む核酸または前記塩基配列からなる核酸があげられる。配列番号３６で表わされる塩基配列は、配列番号１１５で表わされる塩基配列を含む。配列番号１２５（＃７００９）および配列番号４６（＃７００９）で表わされる塩基配列を含む核酸または前記塩基配列からなる核酸があげられる。配列番号４６で表わされる塩基配列は、配列番号１２５で表わされる塩基配列を含む。前記表３および表５において、これらの塩基配列の二重下線部は、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列に対応し、四角で囲んだ塩基は、配列番号１７で表わされる塩基配列と異なる置換塩基である。また、配列番号１２６（＃７０６２）および配列番号４７（＃７０６２）で表わされる塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸があげられる。前記表３および表５において、これらの塩基配列の二重下線部は、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列に対応し、四角で囲んだ塩基（ＵＵ）のいずれか一方が、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列のＡとは異なる置換塩基である。また、配列番号１４３（＃ＡＴ５−５）および配列番号５３（＃ＡＴ５−５）で表わされる塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸があげられる。
【００４４】
本発明のアプタマーとしては、例えば、下記（ｅ）または（ｆ）の核酸でもよい。
（ｅ）前記（ａ）の塩基配列において、６０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸
（ｆ）前記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸
【００４５】
前記（ｅ）において、前記相同性は、例えば、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。前記（ｅ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーにおける配列番号１７で表わされる塩基配列において、前記相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記（ｅ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーで列挙した前記各配列番号で表わされる塩基配列において、前記相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。また、前記（ｅ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーの全長塩基配列において、前記相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。
【００４６】
前記（ｆ）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７〜１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。１×ＳＳＣとは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなる。前記（ｆ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーにおける配列番号１７で表わされる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記（ｆ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーで列挙した前記各配列番号で表わされる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。また、前記（ｆ）のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーの全長塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。
【００４７】
また、本発明のアプタマーは、例えば、前記（ａ）のアプタマーで列挙した各配列の部分配列を含む核酸であり、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記部分配列は、例えば、連続する複数の塩基からなる配列であり、好ましくは、連続する５〜４０個、より好ましくは８〜３０個、特に好ましくは１０〜１２個の塩基配列である。
【００４８】
つぎに、前記（ｃ）のアプタマーは、前述のように、配列番号１８で表わされる塩基配列を含む核酸である。配列番号１８で表わされる塩基配列は、前述のように、例えば、前記アプタマーにおいて、ステムループ構造を形成する領域の塩基配列である。
ＧＧＣＧＣＣＵＵＣＧＵＧＧＡＡＵＧＵＣ  （配列番号１８）
【００４９】
前記（ｃ）のアプタマーとしては、例えば、配列番号２、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５および配列番号５５で表わされる塩基配列を含む核酸があげられる。前記（ｃ）のアプタマーは、例えば、これらの配列番号のうち、いずれの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸でもよいし、いずれの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸であってもよい。これらの塩基配列は、前記表７に示す通りである。
【００５０】
前記（ｄ）のアプタマーは、前述のように、前記（ｃ）の塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸である。「１または複数」とは、特に制限されないが、配列番号１８で表わされる塩基配列において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。また、前記（ｄ）のアプタマーは、例えば、前述した、配列番号２、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５および配列番号５５で表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸であってもよい。この場合、「１または複数」とは、特に制限されないが、前記塩基配列において、例えば、１〜１０個であり、好ましくは１〜５個であり、より好ましくは１〜４個であり、さらに好ましくは１〜３個であり、特に好ましくは１個または２個であり、最も好ましくは１個である。また、前記（ｄ）のアプタマーは、前記（ｃ）のアプタマーの全長塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸であってもよい。この場合、「１または複数」とは、特に制限されないが、前記全長配列において、例えば、１〜１０個であり、好ましくは１〜５個であり、より好ましくは１〜４個であり、さらに好ましくは１〜３個であり、特に好ましくは１個または２個であり、最も好ましくは１個である。前記（ｄ）のアプタマーは、例えば、配列番号１８で表わされる塩基配列により形成されるステムループ構造と実質的に同一のステムループ構造を有することが好ましい。
【００５１】
置換、付加または挿入に使用する塩基は、特に制限されず、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＴがあげられ、この他にも、例えば、修飾塩基、人工塩基等があげられる。前記修飾塩基としては、例えば、２’−フルオロピリミジン、２’−Ｏ−メチルピリミジン等があげられる。また、塩基の置換、付加または挿入は、例えば、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いてもよいし、デオキシヌクレオシドまたはデオキシヌクレオチドを用いてもよく、この他に、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等を用いてもよい。
【００５２】
前記（ｄ）のアプタマーとしては、例えば、配列番号１３、配列番号６５〜６８、配列番号１６、配列番号５４および配列番号５６で表わされる塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸等があげられる。これらの塩基配列を、前記表７に示す。前記表７に示す配列番号１３、配列番号６５〜６８、配列番号１６、配列番号５４および配列番号５６で表わされる塩基配列において、四角で囲んだ塩基が、配列番号１８で表わされるステムループモチーフ配列と比較して、同一部位であり、白抜きで示した塩基が、前記ステムループモチーフ配列と比較して、欠失または置換された部位である。前記表７において、欠失部位は、「−」で示す。前記（ｄ）のアプタマーは、例えば、配列番号１８で表わされるステムループモチーフ配列において、７番目および１１番目のＵならびに１５番目のＡが保存されていることが好ましい。
【００５３】
本発明のアプタマーとしては、例えば、下記（ｇ）または（ｈ）の核酸でもよい。
（ｇ）前記（ｃ）の塩基配列において、６０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸
（ｈ）前記（ｃ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能である核酸
【００５４】
前記（ｇ）において、前記相同性は、例えば、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記（ｇ）のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーにおける配列番号２、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５および配列番号５５で表わされる塩基配列において、前記相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記（ｇ）のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーで列挙した前記各配列番号で表わされる塩基配列において、前記相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。また、前記（ｇ）のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーの全長塩基配列において、前記相同性を有する塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記（ｇ）のアプタマーは、例えば、配列番号１８で表わされる塩基配列により形成されるステムループ構造と実質的に同一のステムループ構造を有することが好ましい。
【００５５】
前記（ｈ）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、前述の通りである。前記（ｈ）のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーにおける配列番号２、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５および配列番号５５で表わされる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記（ｈ）のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーで列挙した前記各配列番号で表わされる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。また、前記（ｈ）のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーの全長塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記（ｈ）のアプタマーは、例えば、配列番号１８で表わされる塩基配列により形成されるステムループ構造と実質的に同一のステムループ構造を有することが好ましい。
【００５６】
また、本発明のアプタマーは、例えば、前記（ｃ）のアプタマーで列挙した各配列の部分配列を含む核酸であり、且つ、前記Ｈｉｓペプチドに結合可能な核酸でもよい。前記部分配列は、例えば、連続する複数の塩基からなる配列であり、好ましくは、連続する５〜４０個、より好ましくは８〜３０個、特に好ましくは１０〜１２個の塩基配列である。
【００５７】
本発明のアプタマーの一例として、図３に、アプタマーｓｈｏｔ４７（配列番号２）、＃７０１（配列番号１）、＃７１６（配列番号３）、＃７１４（配列番号１０）および＃７４６（配列番号９）の予想される二次構造の模式図を示す。図３において、白抜きの文字で示された配列が、これらのコンセンサス配列であり、配列番号１７で表わされる前記結合モチーフ配列である。前記結合モチーフ配列は、図３において、ステムの折れ曲がった部分に位置する。本発明は、これには制限されない。
【００５８】
本発明のアプタマーの一例として、さらに、図４に、アプタマー＃４７ｓ（配列番号１２）の予想される二次構造の模式図を示す。図４において、白抜きの文字で示された１２番目から２２番目の配列が、前記コンセンサス配列、すなわち、配列番号１７の結合モチーフ配列である。図４において、前記結合モチーフ配列の３’領域における２０番目から、３８番目までの配列が、配列番号１８で表わされる前記ステムループモチーフ配列である。図４において、アプタマー＃４７ｓにおける前記ステムループモチーフ配列は、分子内アニーリングによって、ステムループ構造を形成している。また、図４において、前記結合モチーフ配列は、ステムの折れ曲がった部分に位置している。本発明は、これには制限されない。
【００５９】
本発明のアプタマーの形態は、特に制限されないが、一例として、例えば、Ｙ領域、Ｘ領域およびＹ’領域を含み、５’末端から前記Ｙ領域、前記Ｘ領域および前記Ｙ’領域が連結したアプタマーがあげられる。本形態のアプタマーにおいて、前記Ｘ領域が、例えば、前記（ａ）〜（ｈ）の核酸に含まれる前記塩基配列を有することが好ましい。具体例として、前記Ｘ領域は、例えば、前記表１、表３および表４に列挙したいずれかの配列番号で表わされる塩基配列、または、配列番号１５８〜２３０２、配列番号２３０３〜２３１２および配列番号２３１３〜２３４７のいずれかで表わされる塩基配列を有することが好ましい。
【００６０】
本形態のアプタマーは、例えば、前記Ｘ領域の５’側上流、すなわち前記Ｙ領域、および、前記Ｘ領域の３’側下流、すなわち前記Ｙ’領域の少なくとも一方に、プライマーがアニーリング可能なプライマー配列およびポリメラーゼが認識可能なポリメラーゼ認識配列を有することが好ましい。このように、例えば、プライマー配列およびポリメラーゼ認識配列を有することによって、例えば、プライマーおよびポリメラーゼ等を用いた逆転写反応および／または核酸増幅反応により、本発明のアプタマーを増幅できる。前記ポリメラーゼ認識配列は、例えば、核酸増幅で使用するポリメラーゼの種類に応じて適宜決定できる。前記ポリメラーゼの認識配列は、例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識配列（以下、「ＲＮＡポリメラーゼ認識配列」ともいう）が好ましく、具体例としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの認識配列であるＴ７プロモーター等があげられる。本形態のアプタマーがＲＮＡの場合、例えば、５’末端側の前記Ｙ領域は、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識配列と前記プライマー配列（以下、「５’末端側プライマー配列」ともいう）とを、この順序で有することが好ましい。そして、前記Ｙ領域の３’末端側に、前記Ｘ領域が連結されていることが好ましい。さらに、前記Ｘ領域の３’末端側に、前記Ｙ’領域が連結され、前記Ｙ’領域が、前記プライマー配列（以下、「３’末端側プライマー配列」ともいう）を有することが好ましい。前記ＲＮＡにおける前記５’末端側プライマー配列とは、例えば、前記ＲＮＡを鋳型として合成したＤＮＡアンチセンス鎖の３’末端に対して相補的な配列、つまり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合可能なプライマーと同様の配列であることが好ましい。また、本形態のアプタマーは、例えば、前記Ｙ領域と前記Ｘ領域、および、前記Ｘ領域と前記Ｙ’領域が、それぞれ、直接隣接してもよいし、介在配列を介して間接的に隣接してもよい。前記Ｙ領域およびＹ’領域は、特に制限されず、例えば、当業者であれば、使用するプライマーおよびポリメラーゼの種類に応じて、適宜設定できる。
【００６１】
前記Ｙ領域およびＹ’領域の塩基配列は、それぞれ、特に制限されず、任意に決定できる。前記Ｙ領域の一例としては、例えば、配列番号１４９で表わされる塩基配列からなる領域または前記塩基配列を含む領域があげられる。また、前記Ｙ’領域の一例としては、例えば、配列番号１５０で表わされる塩基配列からなる領域または前記塩基配列を含む領域があげられる。これらの配列は一例であって、本発明を制限するものではない。
ＧＧＧＡＣＧＣＵＣＡ  ＣＧＵＡＣＧＣＵＣＡ  （配列番号１４９）
ＵＣＡＧＵＧＣＣＵＧ  ＧＡＣＧＵＧＣＡＧＵ  （配列番号１５０）
【００６２】
前記Ｙ領域、前記Ｘ領域および前記Ｙ’領域を有するアプタマーの具体例は、例えば、前記表２、表５および表６に列挙したいずれかの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸または前記塩基配列を含む核酸があげられる。前記各表において、例えば、５’末端側の小文字の配列が、配列番号１４９で表わされる塩基配列からなる前記Ｙ領域、大文字の配列が、前記Ｘ領域、３’末端側の小文字の配列が、配列番号１５０で表わされる塩基配列からなる前記Ｙ’領域となる。また、前記Ｙ領域、前記Ｘ領域および前記Ｙ’領域を有するアプタマーの具体例は、例えば、前記Ｙ領域が、配列番号１４９で表わされる塩基配列からなる前記Ｙ領域であり、前記Ｘ領域が配列番号１５８〜２３０２、配列番号２３０３〜２３１２および配列番号２３１３〜２３４７のいずれかで表わされる塩基配列であり、前記Ｙ’領域が、配列番号１５０で表わされる塩基配列であり、前記Ｘ領域の５’末端に前記Ｙ領域を有し、前記Ｘ領域の３’末端に前記Ｙ’領域を有する核酸があげられる。
【００６３】
前記Ｘ領域の塩基数は、特に制限されないが、例えば、１０〜６０塩基であり、好ましくは１５〜５０塩基であり、より好ましくは２０〜４０塩基である。前記Ｙ領域およびＹ’領域の塩基数は、特に制限されないが、それぞれ、例えば、１０〜５０塩基であり、好ましくは１５〜４０塩基であり、より好ましくは２０〜３０塩基である。本発明のアプタマーの全塩基数は、特に制限されないが、例えば、２０〜１６０塩基であり、好ましくは３０〜１２０塩基であり、より好ましくは４０〜１００塩基である。
【００６４】
本発明において、「Ｈｉｓペプチドに結合可能である」とは、例えば、前記Ｈｉｓペプチドに対する結合能を有している、または、前記Ｈｉｓペプチドに対する結合活性（Ｈｉｓペプチド結合活性）を有しているということもできる。前記アプタマーと前記Ｈｉｓペプチドとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用解析等により決定でき、例えば、ビアコアＸ(商品名、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．)を用いて決定できる。
【００６５】
本発明のアプタマーの前記Ｈｉｓペプチドに対する結合活性は、例えば、前記アプタマーと前記Ｈｉｓペプチドとの解離定数で表わすことができる。本発明のアプタマーの解離定数は、例えば、１．０×１０−９ｍｏｌ／Ｌ以下である。一般的に、Ｈｉｓペプチドに対する抗体の解離定数（Ｋｄ）は、１．０×１０−９ｍｏｌ／Ｌを超える。このため、本発明のアプタマーは、抗体よりも優れた結合性を有している。また、本発明のアプタマーの解離定数は、好ましくは、５．０×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ以下であり、さらに好ましくは、１．０×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ以下である。本発明のアプタマーは、例えば、Ｈｉｓペプチドとの解離定数が１．０×１０−９ｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とするアプタマーである。
【００６６】
本発明のアプタマーは、例えば、単独のＨｉｓペプチドに結合する他、Ｈｉｓペプチドを含む融合ペプチドに、前記Ｈｉｓペプチドを介して結合可能である。前記融合ペプチドは、例えば、Ｎ末端側にＨｉｓペプチドを含む融合ペプチド、Ｃ末端側にＨｉｓペプチドを含む融合ペプチド、内部にＨｉｓペプチドを含む融合ペプチド等があげられる。前記融合ポリペプチドは、例えば、Ｈｉｓペプチドと、他のペプチドを含んでもよい。前記他のペプチドは、例えば、タンパク質であってもよい。前記融合ペプチドは、例えば、融合タンパク質の意味も含む。また、前記融合ペプチドは、例えば、ＨｉｓペプチドであるＨｉｓ−ｔａｇと他のタグとを含む融合タグペプチドを含んでもよい。前記他のタグとしては、例えば、Ｔ７  ｇｅｎｅ  １０  ｌｅａｄｅｒ配列、ＸｐｒｅｓｓＴＭＥｐｉｔｏｐｅ（以下、「Ｘｐｒｅｓｓ  ｔａｇ」ともいう）等のアミノ酸配列があげられる。前記融合タグペプチドは、例えば、Ｎ末端から、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｔ７  ｇｅｎｅ  １０  ｌｅａｄｅｒ配列およびＸｐｒｅｓｓ  ｔａｇを含んでもよいし、Ｎ末端から、Ｈｉｓ−ｔａｇおよびＴ７  ｇｅｎｅ  １０  ｌｅａｄｅｒ配列を含んでもよい。
【００６７】
本発明のアプタマーは、例えば、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸であってもよい。前記一本鎖核酸は、例えば、一本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡがあげられる。前記二本鎖核酸は、例えば、ＲＮＡの二本鎖、ＤＮＡの二本鎖、ＲＮＡとＤＮＡとの二本鎖（ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド）があげられる。本発明のアプタマーが前記二本鎖核酸の場合、例えば、一方の一本鎖核酸は、前述した核酸であり、他方の一本鎖核酸は、前記一本鎖核酸の一部または全部に相補的な核酸である。前記二本鎖核酸は、例えば、使用に先立って、変性等により一本鎖にすることが好ましい。また、前記一本鎖核酸は、例えば、前述のように、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、配列中に、ＤＮＡの構成単位であるデオキシリボヌクレオチドと、ＲＮＡの構成単位であるリボヌクレオチドの両方を含んでもよい。本発明のアプタマーは、例えば、ＲＮＡが好ましく、特に一本鎖ＲＮＡが好ましい。
【００６８】
本発明のアプタマーにおいて、塩基は、例えば、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、チミン（ｔ）およびウラシル（ｕ）という天然塩基（非人工塩基）には制限されず、例えば、前記天然塩基と同様の機能を有する修飾塩基または改変塩基等の非天然塩基（人工塩基）であってもよい。前記同様の機能を有する人工塩基とは、例えば、グアニン（ｇ）に代えて、シトシン（ｃ）に結合可能な人工塩基、シトシン（ｃ）に代えて、グアニン（ｇ）に結合可能な人工塩基、アデニン（ａ）に代えて、チミン（ｔ）またはウラシル（ｕ）に結合可能な人工塩基、チミン（ｔ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基、ウラシル（ｕ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基等があげられる。前記修飾塩基としては、例えば、２’−フルオロウラシル、２’−アミノウラシル、２’−Ｏ−メチルウラシル、２−チオウラシル等があげられる。また、本発明のアプタマーの構成単位は、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド等のヌクレオチドの他に、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等であってもよい。
【００６９】
本発明のアプタマーは、例えば、Ｈｉｓペプチドの検出において使用する抗Ｈｉｓペプチド抗体と同様にして使用できる。前記Ｈｉｓペプチドの検出方法は、特に制限されず、例えば、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡ等の蛍光分析をはじめとする、生化学的な各種分析方法があげられる。前記分析方法において、本発明のアプタマーは、例えば、前記抗Ｈｉｓ抗体に代えて使用できる。本発明のアプタマーは、例えば、分析方法に応じて、前記核酸に、必要な試薬を適宜付加できる。本発明のアプタマーにおいて、前記核酸に付加する試薬としては、特に制限されないが、例えば、蛍光物質、放射線物質、酵素等があげられる。
【００７０】
本発明のアプタマーは、例えば、Ｈｉｓペプチドを含む前記融合タンパク質の検出、回収および精製等に使用できる。具体的には、例えば、本発明のアプタマーを固相に固定化し、Ｈｉｓペプチドを付加した融合タンパク質を含むサンプルを接触させる。その結果、前記サンプル中の前記融合タンパク質は、そのＨｉｓペプチドを介して、前記固相に固定化された本発明のアプタマーに結合する。続いて、前記固相を洗浄して、前記固定化された本発明のアプタマーに結合していない前記サンプル中の成分を除去する。そして、前記固相に固定化された本発明のアプタマーから、結合した前記融合タンパク質を解離することによって、前記融合タンパク質を回収することが可能である。前記融合タンパク質の検出方法は、特に制限されず、例えば、ノースウエスタンブロッティング、プルダウンアッセイ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー等があげられ、例えば、抗Ｈｉｓ抗体に代えて、本発明のアプタマーを使用すればよい。
【００７１】
本発明のアプタマーは、例えば、塩基配列の情報に基づき、公知の方法により製造できる。前記公知の方法は、特に制限されず、例えば、自動合成装置を用いた化学合成法、各種ポリメラーゼを用いた酵素反応による合成法、ＤＮＡテンプレートからのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写による合成等があげられる。
【００７２】
本発明のアプタマーは、例えば、公知のＳＥＬＥＸ法により調製できる。また、本発明のアプタマーは、例えば、以下に示す、本発明者が新たに確立した、アプタマーの同定方法により、調製することもできる。本発明は、以下の方法には、何ら制限されない。
【００７３】
＜アプタマーの同定方法＞
本発明のアプタマーの同定方法は、例えば、下記（ｉ）工程〜（ｉｖ）工程を含む。
（ｉ）ＲＮＡプールと、ターゲットとを混合する工程
（ｉｉ）前記ＲＮＡプールから、前記ターゲットと結合するＲＮＡを分離する工程
（ｉｉｉ）分離したＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡを合成する工程
（ｉｖ）前記ｃＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを合成する工程
【００７４】
本発明のアプタマーの同定方法によれば、例えば、ＲＮＡプールから、効率よく、前記ターゲットに結合可能なＲＮＡをアプタマーとして選択できる。このため、本発明の同定方法は、例えば、アプタマーの選択方法ともいえる。本発明のアプタマーの同定方法を、以下、改良ＳＥＬＥＸ法（ＳＥＬＥＸ−Ｔ法）という。
【００７５】
公知のＳＥＬＥＸ法について、例えば、ターゲットに対して、より低い解離定数を示すアプタマーを取得可能な方法への改良が望まれている。本発明のＳＥＬＥＸ−Ｔ法は、前述のように、主に、ＲＮＡポリメラーゼを用いた前記（ｉｖ）工程により、ＲＮＡを合成することによって、前述のような、より低い解離定数を示すアプタマーの取得が可能である。これは、例えば、ＰＣＲによるバイアス、すなわち、ＲＮＡプールの配列偏向が抑制されたＳＥＬＥＸ法が可能になったためと考えられる。
【００７６】
前記ＲＮＡプールとは、例えば、ランダム配列を含むＲＮＡの集団である。前記ランダム配列は、例えば、Ｎ（Ａ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＴ）が１０〜６０個、好ましくは３０〜５０個からなる配列である。
【００７７】
前記ターゲットは、特に制限されず、例えば、イオン原子、アミノ酸、ペプチド等の低分子化合物、ウイルス、タンパク質、細胞等があげられる。前述のように、Ｈｉｓペプチドに結合可能なアプタマーを同定する場合、前記ターゲットは、例えば、Ｈｉｓペプチドでもよいし、Ｈｉｓペプチドが付加された物質であってもよい。後者のターゲットとしては、例えば、Ｈｉｓペプチドが他のペプチドに付加された融合ポリペプチド等があげられる。
【００７８】
前記（ｉｉｉ）工程において、前記ｃＤＮＡは、例えば、逆転写反応により合成できる。前記逆転写反応による合成方法は、例えば、プライマーと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼとを用いる方法があげられる。また、例えば、ＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成し、さらに、合成したｃＤＮＡを鋳型として、核酸増幅により、前記ｃＤＮＡを増幅させてもよい。この場合、前記（ｉｉｉ）工程は、例えば、逆転写（ＲＴ）−ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）により、ｃＤＮＡを合成することが好ましい。前記（ｉｉｉ）工程で得られるｃＤＮＡは、例えば、ＤＮＡ産物ということもできる。本発明においては、合成したｃＤＮＡを鋳型とする核酸増幅において、増幅反応のサイクル数を低減することが好ましい。
【００７９】
前記（ｉｖ）工程において、前記ＲＮＡは、例えば、プライマーと、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼとを用いた反応により合成できる。
【００８０】
前記（ｉｉｉ）工程および（ｉｖ）工程において、前述のようにプライマーを使用する場合、前記ＲＮＡプールは、例えば、前記ランダム配列の両端に、所定のプライマー配列を、機能的に連結したものが好ましい。また、前記ＲＮＡプールは、例えば、前記ランダム配列の両端に、さらに、プロモーター配列またはこれらの相補配列を、機能的に連結したものが好ましい。前記ＲＮＡプールについて、例えば、前記プライマー配列および前記プロモーター領域は、公知のＳＥＬＥＸ法に基づいて、設定できる。
【００８１】
以下に、ＳＥＬＥＸ−Ｔ法の一例について説明する。
【００８２】
まず、前記ＲＮＡプールと前記ターゲットを準備する。前記ＲＮＡプールは、例えば、核酸の自動合成装置を用いて化学的に合成してもよいし、ＤＮＡテンプレートからｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により合成することもできる。前記ターゲットは、例えば、市販品、化学合成したもの、生物学的サンプルから単離したもの等があげられる。前記ターゲットが、例えば、ペプチドおよびタンパク質等の場合、例えば、生物学的サンプルから単離したものでもよいし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写および翻訳により合成したものでもよい。
【００８３】
次いで、前記ＲＮＡプールと前記ターゲットとを混合する。この際、例えば、前記ターゲットを、担体または支持体等の固相に固定化してもよい。前記固定化は、例えば、前記ＲＮＡプールと前記ターゲットとを混合する前に行ってもよいし、前記両者を混合した後に行ってもよい。前記ターゲットの固定化には、例えば、ビオチン−アビジン結合、Ｎｉ２＋−［Ｈｉｓ−ｔａｇ］結合またはＣｏ２＋−［Ｈｉｓ−ｔａｇ］結合、化学架橋剤による共有結合、核酸ハイブリダイゼーション等を利用できる。前記固相は、例えば、ビーズ、チップ、レジン等があげられる。前記ＲＮＡプールと前記ターゲットとの混合条件は、特に制限されず、例えば、前記ＲＮＡと前記ターゲットとが特異的に結合する条件であればよい。前記条件の具体例として、温度が、例えば、４〜４０℃、好ましくは２０〜３７℃、ｐＨが、例えば、ｐＨ５．０〜９．０、好ましくはｐＨ６．５〜７．５、塩濃度が、例えば、５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１００〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、処理時間は、例えば、１０分〜１８時間、好ましくは３０分〜２時間である。
【００８４】
前記両者を混合した後、形成された前記ＲＮＡと前記ターゲットとの複合体を、洗浄、溶出、精製等に供し、前記ターゲットに結合したＲＮＡを分離する。洗浄は、例えば、一般的なＳＥＬＥＸ法と比較して緩和な条件で行うことが好ましい。これにより、例えば、ＰＣＲによるバイアス、すなわち、ＲＮＡプールの配列偏向を抑制でき、その結果、より低い解離定数を示すアプタマーの取得が可能となる。洗浄方法としては、例えば、前記複合体を固定化した固相を沈殿させて、上清を除去する方法、また、前記上清の除去後、前記複合体を固定化した固相を、洗浄バッファーで洗浄する方法があげられる。前記洗浄バッファーの量は、特に制限されず、例えば、前記固相の１００倍体積が例示できる。前記洗浄用バッファーによる洗浄回数は、特に制限されないが、例えば、１回である。前記洗浄バッファーは、例えば、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウムおよび０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）等が使用できる。前記溶出は、例えば、所定濃度のイミダゾールを使用して行うことができる。具体的には、溶出溶媒として、例えば、１００〜３００ｍｍｏｌ／Ｌのイミダゾール等が使用できる。また、精製手段としては、例えば、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿等があげられる。
【００８５】
つぎに、精製したＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲに供し、ｃＤＮＡを合成する。具体例としては、例えば、前記ＲＮＡを、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ、所定のプライマー、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼ等を含む反応液に添加し、ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲに供する。ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔが使用できる。ＲＴ−ＰＣＲの条件は、例えば、５０℃で３０分、９５℃で１０分の処理を行った後、９４℃で１分、５６℃で１分、７２℃で１分の処理を１サイクルとして、合計５サイクル行い、さらに、７２℃で５分の処理があげられる。前記ＳＥＬＥＸ−Ｔ法では、例えば、ＰＣＲによるバイアス、すなわち、ＲＮＡプールの配列偏向を抑制すべく、通常のＳＥＬＥＸ法に比べて、ＲＴ−ＰＣＲのサイクル数を減少することが好ましい。具体的に、通常のＳＥＬＥＸ法のサイクル数が、例えば、１５〜３０サイクルであるのに対して、前記ＳＥＬＥＸ−Ｔ法のサイクル数は、例えば、１〜１０サイクル、好ましくは４〜８サイクル、より好ましくは４〜６サイクルが好ましく、さらに好ましくは４〜５サイクルである。本発明においては、例えば、ＰＣＲサイクルを全行程に渡って極端に抑制し、クローンの増幅を、主にＲＮＡ転写によって行うことが好ましい。これによって、例えば、各クローンの増幅効率を、ほぼ一定に保つことができ、ターゲットに対する結合力を反映した選別が可能になると考えられる。
【００８６】
次いで、合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ、すなわち、ＲＮＡアプタマーを合成する。ＲＮＡポリメラーゼは、特に制限されず、例えば、公知のポリメラーゼが使用可能であり、適宜選択できる。具体例としては、例えば、耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＳｃｒｉｐｔＭＡＸ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、東洋紡社）等があげられる。前記耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用する場合、例えば、ＲＮＡプールの作製において、前記ランダム配列の一末端にＴ７プロモーターを連結することが好ましい。これによって、例えば、前記耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成できる。ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成条件としては、特に制限されず、例えば、３７℃〜５０℃で、２時間〜６時間があげられる。
【００８７】
そして、ＲＮＡ合成後、得られたＲＮＡを分離して、精製する。前記ＲＮＡの精製方法は、特に制限されず、例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理、ゲル濾過、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿等があげられる。このようにして、Ｈｉｓペプチドに結合可能なアプタマーを得ることができる。
【００８８】
得られたＲＮＡについて、さらに、前記ターゲットと混合する前記（ｉ）工程から、ＲＮＡを合成する前記（ｉｖ）工程まで、反復して行ってもよい。反復回数、すなわちラウンド数は、特に制限されないが、例えば、５〜１０回、好ましくは６〜８回である。得られたＲＮＡアプタマーと前記ターゲットとの結合能は、例えば、ＢｉａｃｏｒｅＸ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．社）を用いた表面プラズモン共鳴分子間相互作用解析等により決定できる。
【００８９】
得られたＲＮＡアプタマーについて、さらに、塩基配列を決定する。この塩基配列の情報に基づけば、例えば、公知の方法により、前記ＲＮＡアプタマーを産生できる。
【００９０】
前記ＳＥＬＥＸ−Ｔ法は、例えば、特殊な機器を必要とせず、効率的且つ安価に、ＲＮＡアプタマーの取得が可能である。
【００９１】
＜試薬・キット＞
本発明の試薬は、本発明のアプタマーを含むことを特徴とする。本発明のキットは、本発明のアプタマーを含むことを特徴とする。
【００９２】
本発明の試薬またはキットによれば、例えば、前記Ｈｉｓペプチドの検出が可能であり、さらに、前記Ｈｉｓペプチドを付加した融合ペプチドの検出または精製等を容易に行うことができる。このため、本発明の試薬およびキットは、例えば、Ｈｉｓペプチド検出用試薬およびＨｉｓペプチド検出用キットといえる。
【００９３】
本発明のキットは、例えば、必要に応じて、反応用バッファーおよび洗浄用バッファー等のバッファー、磁性ビーズ等の担体、使用説明書等を含んでもよい。
【００９４】
＜アプタマー製造用核酸＞
本発明の核酸は、本発明のアプタマーに相補的な塩基配列を含む核酸であることを特徴とする。本発明の核酸は、本発明のアプタマーを製造するための核酸であって、本発明のアプタマー製造用核酸といえる。本発明のアプタマーがＲＮＡの場合、本発明のアプタマー製造用核酸は、例えば、本発明のアプタマーに相補的な塩基配列を含むＤＮＡであることが好ましい。
【００９５】
本発明のアプタマー製造用核酸によれば、例えば、これを鋳型として相補的な塩基配列を合成することで、容易且つ簡便に、本発明のアプタマーを製造できる。具体例としては、本発明のアプタマー製造用核酸を用いて、例えば、ＰＣＲ等の核酸増幅により、本発明のアプタマーを製造できる。
【００９６】
本発明のアプタマー製造用核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。本発明において、センス鎖またはアンチセンス鎖という用語を使用するが、これは、本発明のアプタマー製造用核酸を二本鎖に限定するものではなく、例えば、配列について、転写の鋳型となるアンチセンス鎖として説明するか、その相補鎖として説明するかを明確にするためである。
【００９７】
本発明のアプタマーがＲＮＡアプタマーの場合、例えば、前記アプタマーに相補的なＤＮＡを、前記アプタマー製造用核酸とし、鋳型として使用する。以下、ＲＮＡアプタマーの鋳型となるＤＮＡをアンチセンス鎖ともいい、前記ＲＮＡアプタマーのウラシル（ｕ）をチミン（ｔ）に置換した配列を有するＤＮＡをセンス鎖ともいう。鋳型となる前記ＤＮＡは、例えば、アンチセンス鎖として、前記ＲＮＡアプタマーの相補鎖のウラシル（ｕ）をチミン（ｔ）に置換した配列を有するＤＮＡまたは前記配列からなるＤＮＡ、および、センス鎖として、前記ＲＮＡアプタマーのウラシル（ｕ）をチミン（ｔ）に置換した配列を有するＤＮＡまたは前記配列からなるＤＮＡのいずれか一方を含むことが好ましい。これらのＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸増幅を行った後、得られたＤＮＡ増幅産物を鋳型として、さらに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを転写することにより、ＲＮＡアプタマーを増幅できる。また、例えば、前記ＲＮＡアプタマーを鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＤＮＡの核酸増幅を行い、得られたＤＮＡ増幅産物を鋳型として、さらに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡアプタマーを転写することにより、ＲＮＡアプタマーを増幅してもよい。また、本発明のアプタマーが、例えば、ＤＮＡアプタマーの場合、例えば、前記ＤＮＡアプタマーをポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法等によって、増幅できる。
【００９８】
本発明のアプタマー製造用核酸は、さらにベクターを有し、前記ベクターに、本発明のアプタマーに相補的な前記塩基配列が挿入されていることが好ましい。この場合、本発明のアプタマー製造用核酸は、本発明のアプタマー発現ベクターということもできる。
【００９９】
前記ベクターは、特に制限されず、公知のベクターが使用でき、プラスミドベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＣｏｌｄシリーズ（商標、タカラバイオ社）、ｐＥＴシリーズ（Ｍｅｒｃｋ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社他）、ｐＲＳＥＴシリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＡＤシリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐｃＤＮＡシリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＥＦシリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等の大腸菌由来プラスミドベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等の枯草菌由来のプラスミドベクター；ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等の酵母由来のプラスミドベクター等があげられる。また、前記ウイルスベクターとしては、例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等のλファージベクター；Ｍ１３ＫＥ、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ等の繊維状ファージベクター；Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔシリーズ等のＴ７ファージベクター；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等の動物ＤＮＡウイルスベクターまたはＲＮＡウイルスベクター；バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター；植物ウイルスベクター等があげられる。
【０１００】
前記アプタマー発現ベクターは、例えば、以下のようにして、本発明のアプタマーの製造に使用できる。具体的には、例えば、前記アプタマー発現ベクターを導入した宿主を培養し、培養後、得られた形質転換体から、核酸を回収することによって、本発明のアプタマーを得ることができる。
【０１０１】
前記宿主の種類は、特に制限されず、例えば、前記ベクターの種類等に応じて、適宜設定できる。前記宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属の細菌；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母があげられる。また、前記宿主としては、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞；Ｓｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞等も使用できる。培養の条件は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。培養した前記形質転換体からのＲＮＡアプタマーの回収方法は、特に制限されず、例えば、前記形質転換体を破砕すること等によって行える。
【０１０２】
また、前記アプタマー発現ベクターを、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写し、得られた核酸を、本発明のアプタマーとして回収することもできる。
【０１０３】
＜アンチセンス核酸＞
本発明のアンチセンス核酸は、本発明のアプタマーに相補的な塩基配列を含む核酸である。本発明のアプタマーが、例えば、ＲＮＡの場合、本発明のアンチセンス核酸は、本発明のアプタマーに相補的な塩基配列を含むＤＮＡであることが好ましい。本発明のアンチセンス核酸によれば、例えば、必要に応じて、本発明のアプタマーのＨｉｓペプチドに対する結合を抑制できる。本発明のアンチセンス核酸は、例えば、Ｈｉｓペプチドに対する本発明のアプタマーの結合阻害核酸ということもできる。
【実施例】
【０１０４】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。【０１０５】
［実施例１］
アプタマーを作製し、その結合能を確認した。【０１０６】
１．材料と方法
（１）試薬
モノクローナル抗体については、抗ＧＦＰ抗体（ＪＬ−８）は、タカラバイオ社より、抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体は、ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ社より、抗ＭＩＦ抗体（ＭＡＢ２８９）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ社より購入した。ＨＲＰ−抗ＭＩＦ抗体は、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．社より購入した。【０１０７】
（２）ＲＮＡアプタマー
前記表２および表５における、配列番号１〜１２および配列番号２６〜４７で表わされる配列からなるＲＮＡアプタマーを合成した。前記表２および表５において、以下、小文字で示す配列を、共通配列といい、大文字で示す配列を、ランダム配列という。【０１０８】
前記ＲＮＡアプタマーについて、予想された二次構造の模式図を、図３および図４に示す。図３は、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７（配列番号２）、＃７０１（配列番号１）、＃７１４（配列番号１０）、＃７１６（配列番号３）および＃７４６（配列番号９）の図であり、図４は、小型化アプタマー＃４７ｓ（配列番号１２）の図である。これらの二次構造は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣソフトウェアによって予測した。図３および図４において、配列番号１７で表わされるコンセンサス配列を、文字が白抜きの黒四角で示した。図３および図４に示すように、これらのＲＮＡアプタマーにおいては、ステムが折れ曲がった部分に、前記コンセンサス配列を有していると推測される。【０１０９】
さらに、前記各アプタマーの二次構造、特に、図３に示すｓｈｏｔ４７と＃７１４の情報に基づいて、表２、表５および表６における、配列番号１２〜１６、配列番号５４〜５６および配列番号６５〜６８で表わされる、小型化したＲＮＡアプタマー（以下、「小型化ＲＮＡアプタマー」という）を合成した。【０１１０】
（３）標的タンパク質
標的タンパク質として、図６に示す、タグ領域とマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ：Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ）とを含む融合タンパク質、および、タグ領域とＧＦＰとを含む融合タンパク質を準備した。図６は、調製した６種類の融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦ、ＨＴＸ、ＨＴ、Ｈ、ＴＸおよびＴの構造の概略を示す図である。同図において、「Ｈｉｓ」は、６個のＨｉｓが連結したポリＨｉｓを含むＨｉｓ−ｔａｇ（１１アミノ酸残基）であり、「Ｔ」は、１０アミノ酸残基のＴ７  ｇｅｎｅ  １０  ｌｅａｄｅｒを含むペプチドタグ（１１アミノ酸残基）、「Ｘｐｒｅｓｓ」は、１４アミノ酸残基のＸｐｒｅｓｓＴＭＥｐｉｔｏｐｅ（以下、「Ｘｐｒｅｓｓ  ｔａｇ」ともいう）であり、これら全体をタグ領域という。また、同図において、「ＭＩＦ」は、１１５アミノ酸残基のＭＩＦであり、「ＧＦＰ」は、２４２アミノ酸残基のＧＦＰである。「Ｘｐｒｅｓｓ」の配列は、Ｎ末端から９番目と１０番目のアミノ酸の間で、エンテロキナーゼにより切断可能である。また、図６に示す各融合タンパク質のＮ末端領域のアミノ酸配列および対応する塩基配列、具体的には、タグ領域とＭＩＦまたはＧＦＰとの塩基配列およびアミノ酸配列を、下記表８に示す。下記表８において、ＭＩＦまたはＧＦＰの塩基配列およびアミノ酸配列は、５’末端の９塩基長およびＮ末端の３アミノ酸残基のみを記載した。【０１１１】
【表８】
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【０１１２】
Ｈｉｓ−ｔａｇとＭＩＦとの融合ポリペプチドであるＨｉｓ−ＭＩＦは、ＡＴＧｅｎ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．社(Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−ｄｏ，  Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ)より購入した。Ｈｉｓ−ｔａｇを有さないＭＩＦは、前記Ｈｉｓ−ＭＩＦを、エンテロキナーゼ(Ｎｏｖａｇｅｎ，ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．，社、ＵＳＡ)で処理し、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ切断することによって作製した。【０１１３】
ＧＦＰを含む融合タンパク質（ＨＴＸ、ＨＴ、Ｈ、ＴＸおよびＴ）は、それぞれ以下の方法により調製した。まず、Ｈｉｓ−ｔａｇのコードＤＮＡ、Ｔ７  ｇｅｎｅ  １０  ｌｅａｄｅｒのコードＤＮＡおよびＸｐｒｅｓｓ  ｔａｇのコードＤＮＡを有するｐＲＳＥＴ発現ベクター(インビトロゲン社、ＵＳＡ)を鋳型として、プライマーセットを用いたＰＣＲにより、前記表８に示す各融合タンパク質のタグ領域のＤＮＡ断片を増幅した。得られた各ＤＮＡ断片とＧＦＰ遺伝子(タカラバイオ社、日本)とを、ｐＣｏｌｄ  ＩＶ発現ベクター(タカラバイオ社、日本)に組み込み、この組換えベクターを、さらに、大腸菌ＢＬ２１スター(ＤＥ３)(インビトロゲン社)に導入して、形質転換を行った。そして、前記ｐＣｏｌｄ  ＩＶ発現ベクターの標準的な使用方法に従って、大腸菌の形質転換体を、１ｍｍｏｌ／Ｌ  イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドを含む培地において、１５℃で１８時間培養し、融合タンパク質を発現させた。培養後、菌体を遠心分離(５，０００×ｇ、１０分)により回収し、１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）に懸濁した。この懸濁液について、凍結融解を２回繰り返して行った後、３００ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウムおよび０．２ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を等量加え、遠心分離(１４，０００×ｇ、１０分)を行った。そして、得られた上清を、融合タンパク質溶液とした。融合タンパク質溶液における融合タンパク質の濃度は、段階希釈した試料および抗ＧＦＰ抗体を用いたウェスタンブロットの結果から推定した。【０１１４】
（４）分子間相互作用解析
各ＲＮＡアプタマーと融合タンパク質との分子間相互作用、すなわち、前記ＲＮＡアプタマーの融合タンパク質に対する結合能を、表面プラズモン共鳴により解析した。前記結合能の解析には、ＢｉａｃｏｒｅＸ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．社）を使用し、使用説明書に従って行った。具体的には、まず、ＲＮＡアプタマーの３’末端に２０塩基のポリアデニンを付加して、ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーを調製し、これを９５℃で５分間加熱した後、氷上で急冷した。そして、５’末端をビオチン化した２０塩基のビオチン化ポリチミンを結合させたストレプトアビジンチップ（Ｓｅｎｓｏｒ  ｃｈｉｐ  ＳＡ，  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）のフローセルに、ランニングバッファーを用いて、前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーを導入した。ここで、前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーのポリＡと、前記ビオチン化ポリチミンのポリチミンとの相補的な結合により、前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーを、前記ビオチン化ポリチミンを介して、前記チップに固定化した。前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーは、共鳴単位ＲＵ（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｕｎｉｔ；１ＲＵ＝１ｐｇ／ｍｍ２）が７００ＲＵになるまで、結合させた。続いて、所定濃度の融合タンパク質を含むＨＢＳ（Ｈｅｐｅｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）を、前記ランニングバッファーを用いて、前記チップに導入し、シグナル（ＲＵ）の測定を行った。前記ランニングバッファーの組成は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸マグネシウム、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ｐＨ７．２）とした。また、コントロールとして、前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーを固定化していない、前記ビオチン化ポリチミンを結合させた前記チップを使用し、前述と同様にして、融合タンパク質の導入ならびにシグナル測定を行った。【０１１５】
（５）ＲＮＡアプタマーを用いたＥＬＩＳＡ改良法
各種抗体（抗ＧＦＰ抗体、抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体または抗ＭＩＦ抗体）を９６穴プレート(Ｉｗａｋｉ、ＡＧＣテクノガラス社、日本)に吸着させ、１％のウシ血清アルブミンでブロッキングを行った。次いで、前記プレートに、５０μＬの融合タンパク質(１μｇ／ｍＬ)、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウムおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００を加えて、室温で３時間インキュベートし、前記プレートに前記融合タンパク質を結合させた。インキュベート後、前記プレートをＨＢＳ−Ｔで３回洗浄した。コントロールとしては、５０μＬの融合タンパク質に代えて、５０μＬの前記ＨＢＳ−Ｔを添加して、同様に、インキュベートならびに洗浄を行った。【０１１６】
次いで、ＲＮＡアプタマーの３’末端に２０塩基のポリアデニン（ポリＡ）を付加して、ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーを調製した。前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーを変性した後、５’末端をビオチン化した２０塩基のビオチン化ポリチミン(７４０ｎｍｏｌ／Ｌ)、ｔＲＮＡ（１００μｇ／ｍＬ）およびＲＮａｓｅインヒビター(０．１６ｕｎｉｔｓ／ｍＬ)と混合してから、前記ポリアデニン付加ＲＮＡアプタマーのポリＡと、前記ビオチン化ポリチミンのポリチミンとの相補的な結合により、ビオチン標識ＲＮＡアプタマーを作製した。このビオチン標識ＲＮＡアプタマーを、前記プレートに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。続いて、前記プレートを洗浄し、０．１μｇ／ｍＬのＨＲＰ−ストレプトアビジン(Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，社、ＵＳＡ）を添加した。さらに、前記プレートを洗浄した後、１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ基質(Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，社、ＵＳＡ)を加えて発色させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。【０１１７】
（６）プルダウンアッセイ
前記（５）と同様にして、ビオチン標識ＲＮＡアプタマーを作製した。前記ビオチン標識ＲＮＡアプタマー（５０μＬ）と、融合タンパク質を含む溶液とを、同量で混合し、４℃で１５分間インキュベートした。これによって、前記ビオチン標識ＲＮＡアプタマーと、前記融合タンパク質を含むサンプルとを結合させた。前記融合タンパク質を含むサンプルとしては、Ｈｉｓ−ＭＩＦを終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加した前記ＨＢＳ−Ｔ（２００μｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡを含む)、Ｈｉｓ−ＭＩＦを終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加したウサギの腎由来細胞株（ＲＫ−１３細胞株）の培養上清（５％ウシ胎児血清含有）、Ｈｉｓ−ＧＦＰ（ＨＴ）を発現させた大腸菌の抽出液を使用した。次いで、前記混合液に、ストレプトアビジン−セファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）５μＬを加えて、４℃で１時間インキュベートし、前記ビオチン標識ＲＮＡアプタマーを前記セファロースに結合させた。インキュベート後、前記セファロースを前記ＨＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動用のサンプルバッファーを加え、９５℃で５分間の熱処理を行うことにより、ストレプトアビジンとビオチンとの結合を介して前記セファロースに結合していた融合タンパク質を溶出した。前記溶出したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、前記タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。転写後の前記膜を５％スキムミルクでブロッキングし、１μｇ／ｍＬの抗体を加えて、室温で３時間結合させた。前記抗体としては、抗ＭＩＦ抗体または抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体を使用した。さらに、前記膜を洗浄した後、ＨＲＰ−抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を結合させた。そして、洗浄した後、ＥＣＬ化学発光試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、前記融合タンパク質の存在を確認した。【０１１８】
（７）ノースウェスタンブロッティング
段階希釈した融合タンパク質を非還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、前記（６）と同様にして、前記融合タンパク質をＰＶＤＦ膜にブロッティングした後、前記膜のブロッキングを行った。そして、前記膜に、前記（６）と同様にして準備したビオチン標識ＲＮＡアプタマーを、前記抗体（抗ＭＩＦ抗体または抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体）の代わりに添加した。さらに、ＨＲＰ−ストレプトアビジンを加えて、前記（６）と同様にして、ＥＣＬ化学発光試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、前記融合タンパク質の存在を確認した。【０１１９】
２．結果
（１）分子間相互作用解析
（１−１）各種ＲＮＡアプタマーのＨｉｓ−ＭＩＦへの結合
前記チップに導入する前記ＨＢＳ−ＴにおけるＨｉｓ−ＭＩＦ濃度を６００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記分子間相互作用解析により、融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦに対するＲＮＡアプタマーの結合能を解析した。前記ＲＮＡアプタマーとしては、５’側および３’側に２０塩基長の共通配列を有する配列番号１〜１１、配列番号２６〜４７を使用した。これらのうち、ＲＮＡアプタマー＃７０１（配列番号１）、ｓｈｏｔ４７（配列番号２）、＃７１６（配列番号３）、＃７２７（配列番号４）、＃７０４（配列番号５）、＃７１３（配列番号６）、＃７０８（配列番号７）、＃７１８（配列番号８）、＃７４６（配列番号９）、＃７１４（配列番号１０）、＃７３３（配列番号１１）を用いた結果を、図１に示す。図１は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて検出したシグナルのセンサーグラムであり、図１において、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、０秒〜４５秒が、前記融合タンパク質を導入した時期である。また、図１には、比較例として、前記ＲＮＡアプタマーに代えて、後述する実施例３で調製したラウンド０のＲＮＡプール（以下、「Ｎ４０」という）を使用した結果を、あわせて示す。前記Ｎ４０は、後述するように、５’側および３’側に、前記ＲＮＡアプタマーと同じ２０塩基長の共通配列を有し、前記共通配列の間に４０塩基長のランダム配列を有するＲＮＡのプールとした。【０１２０】
図１に示すように、いずれのＲＮＡアプタマーも、Ｈｉｓ−ＭＩＦに対する結合能を示し、中でも、ｓｈｏｔ４７は、極めて優れた結合能を示した。なお、図示していないが、この他、配列番号２６〜４７のＲＮＡアプタマーについても、Ｈｉｓ−ＭＩＦに対する結合能が確認できた。【０１２１】
（１−２）ｓｈｏｔ４７の結合能
前記チップに導入する前記ＨＢＳ−ＴにおけるＨｉｓ−ＭＩＦの濃度を、０、１９、３８、７５、１５０、３００および６００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前述と同様にして、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７（配列番号２）について、分子間相互作用解析を行った。また、比較例として、前記ＲＮＡアプタマーに代えて、前記Ｎ４０を使用した以外は、同様にして分子間相互作用解析を行った。そして、これらの結果から、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７について、結合速度定数（Ｋａ）、解離速度定数（Ｋｄ）ならびに解離定数（ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａ）を求めた。これらの結果を、図２に示す。図２は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて検出したシグナルのセンサーグラムであり、縦軸および横軸は、前記図１と同様である。【０１２２】
同図に示すように、分子間相互作用解析により、ｓｈｏｔ４７の結合速度定数（Ｋａ）が２．０２×１０４ｍｏｌ／Ｌ−１ｓ−１、解離速度定数（Ｋｄ）が７．６４×１０−８ｓ−１ならびに解離定数（ＫＤ）が３．７８×１０−１２ｍｏｌ／Ｌであることがわかった。ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７は、市販のＨｉｓ−ｔａｇに対する抗体の解離定数が１×１０−９ｍｏｌ／Ｌ（QIAexpress  Detection  and  Assay  Handbook,  QIAGEN  GmbH,  Hilden,  Germany,  Oct,  2002,  p．15．）であることから、極めて結合力に優れるアプタマーであることがわかった。【０１２３】
（１−３）小型化ＲＮＡアプタマーのＨｉｓ−ＭＩＦへの結合
前記分子間相互作用解析により、融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦに対する小型化ＲＮＡアプタマーの結合能を解析した。前記小型化ＲＮＡアプタマーとしては、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７（配列番号２）を小型化した、＃４７ｓ（配列番号１２）、＃４７ｓＴ（配列番号１３）、ｓｈｏｔ４７ｓｓｓ（配列番号１４）、＃４７ｓｓｓＴ（配列番号１６）を使用した。これらの結果を、図５に示す。図５は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて検出したシグナルのセンサーグラムであり、縦軸および横軸は、前記図１と同様である。また、同図には、小型化していないＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７を使用した結果を、あわせて示す。【０１２４】
図５に示すように、いずれの小型化ＲＮＡアプタマーも、Ｈｉｓ−ＭＩＦに対する結合能を示した。中でも、＃４７ｓおよびｓｈｏｔ４７ｓｓｓは、図３に示すｓｈｏｔ４７のステムループ構造を壊さないように設計された小型化アプタマーであり、ｓｈｏｔ４７と同等の効果を示した。このことから、前記ステムループ構造が、アプタマーにとって、重要な構造であると推測される。また、＃４７ｓおよびｓｈｏｔ４７ｓｓｓは、その他の小型化ＲＮＡアプタマーよりも優れた結合能を示した。その他の小型化ＲＮＡアプタマー、＃４７ｓＴ（配列番号１３）、＃４７ｓｓｓＴ（配列番号１６）は、前記表７に示すように、＃４７ｓの塩基配列の四角で囲んだ配列番号１８の配列において、７番目のＵ、１１番目のＵ、および、１５番目のＡのいずれかが欠失または置換されている。このため、配列番号１８において、ループ構造における７番目のＵ、１１番目のＵ、および、図４に示すように、ステム構造の折れ曲がり部分の１５番目のＡが保存されていることが重要であると推測される。【０１２５】
（２）ＥＬＩＳＡ改良法
（２−１）ｓｈｏｔ４７のＨｉｓ−ＧＦＰにおける結合部位
ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７が、融合タンパク質のどの部位に結合するかを、前述のＥＬＩＳＡ改良法により確認した。融合タンパク質としては、前述した図６に示す融合タンパク質のうち、ＧＦＰを含むＨＴＸ、ＨＴ、Ｈ、ＴＸ、Ｔの５種類の融合タンパク質を使用した。また、前記ＥＬＩＳＡ改良法における前記プレートには、抗ＧＦＰ抗体を固定化した。また、比較例として、前記ｓｈｏｔ４７に代えて、前記Ｎ４０を使用した以外は、同様にして、結合を確認した。【０１２６】
これらの結果を、図７に示す。図７は、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７の融合タンパク質に対する結合能を示すグラフである。図７において、縦軸は、結合能（ＲＮＡアプタマーの結合）を示す４５０ｎｍの吸光度であり、３回の測定に基づく平均値±偏差（ＳＤ）を示す。横軸は、融合タンパク質の種類を示し、白抜きバーは、Ｎ４０の結果であり、黒いバーは、ｓｈｏｔ４７の結果である。また、図７内の右上の写真は、使用した融合タンパク質のウェスタンブロットの結果であり、前述のような形質転換体からの調製により、各種タンパク質が得られていることは、確認済みである。【０１２７】
図７のグラフに示すように、ｓｈｏｔ４７は、Ｈｉｓ−ｔａｇを有する融合タンパク質（ＨＴＸ、ＨＴおよびＨ）には、結合能を示したが、Ｈｉｓ−ｔａｇを有していない融合タンパク質（ＴＸおよびＴ）には、結合しなかった。前記融合タンパク質は、すべてＧＦＰを有することから、ｓｈｏｔ４７は、ＧＦＰに結合しているのではないことが明らかとなった。融合タンパク質のうちＨＴは、Ｘｐｒｅｓｓ（ＸｐｒｅｓｓＴＭＥｐｉｔｏｐｅ）を欠損し、Ｈは、Ｔ（Ｔ７  ｇｅｎｅ  １０  ｌｅａｄｅｒ）を欠損した融合タンパク質であることから、ｓｈｏｔ４７が、Ｈｉｓ−ｔａｇに結合していることが明らかとなった。また、ｓｈｏｔ４７の結合能は、ＨＴＸ≒ＨＴ＞Ｈとなることから、Ｈｉｓ−ｔａｇの他に、Ｘｐｒｅｓｓ（ＸｐｒｅｓｓＴＭＥｐｉｔｏｐｅ）またはＴ（Ｔ７  ｇｅｎｅ  １０  ｌｅａｄｅｒ）等のタグをさらに有するほど、結合能が高いことがわかった。【０１２８】
（２−２）ｓｈｏｔ４７のＨｉｓ−ＭＩＦへの結合
ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７の融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦおよびＨｉｓ−ｔａｇを有さないＭＩＦに対する結合能を、前述のＥＬＩＳＡ改良法により確認した。前記ＥＬＩＳＡ改良法における前記プレートには、抗ＭＩＦ抗体および抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体を固定化した。比較例として、前記ｓｈｏｔ４７に代えて、前記Ｎ４０を使用した以外は、同様にして、結合を確認した。コントロールとして、Ｈｉｓ−ＭＩＦの前記プレートへの結合を確認するため、前記ＲＮＡアプタマーに代えてＨＲＰ標識抗ＭＩＦポリクローナル抗体（抗ＭＩＦｐＡｂ）を添加し、同様に基質を添加して、４５０ｎｍにおける吸光度の測定を行った。【０１２９】
これらの結果を、図８に示す。図８は、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７の融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦに対する結合能を示すグラフである。同図において、縦軸は、ＲＮＡアプタマーの結合能を示す４５０ｎｍの吸光度であり、３回の測定に基づく平均値±偏差（ＳＤ）を示す。同図において、白抜きバーは、Ｎ４０の結果であり、黒いバーは、ｓｈｏｔ４７の結果であり、グレーのバーは、ＨＲＰ標識抗ＭＩＦポリクローナル抗体で検出した結果である。また、左側は、抗ＭＩＦ抗体を固定化したプレートにおけるＨｉｓ−ＭＩＦの結果であり、中央は、抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体を固定化したプレートにおけるＨｉｓ−ＭＩＦの結果であり、右側は、抗ＭＩＦ抗体を固定化したプレートにおけるＭＩＦの結果である。また、図８において、前記グラフの下に、結合形態の模式図を示す。【０１３０】
同図に示すように、固定化抗ＭＩＦ抗体と、Ｈｉｓ−ｔａｇを有さないＭＩＦとを結合させた結果、抗ＭＩＦポリクローナル抗体でＨｉｓ−ｔａｇを有さないＭＩＦが検出されていることから、固定化ＭＩＦ抗体にＭＩＦが結合していることは確認できたが、ｓｈｏｔ４７の結合は確認されなかった。これに対して、固定化抗ＭＩＦ抗体と、融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦとを結合させた結果、ｓｈｏｔ４７の結合が確認された。この結果から、ｓｈｏｔ４７は、Ｈｉｓ−ｔａｇを認識しており、このため、Ｈｉｓ−ｔａｇを有する融合タンパク質であれば、ｓｈｏｔ４７による検出が可能であることがわかった。また、固定化抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体と、融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦとを結合させた結果、前記固定化抗ＭＩＦ抗体を使用した場合と比較して、ｓｈｏｔ４７の結合が低下した。これは、固定化抗ＭＩＦ抗体が、ｓｈｏｔ４７がターゲットとするＨｉｓ−ｔａｇに結合しているため、ｓｈｏｔ４７が結合し難くなったためと考えられる。【０１３１】
（２−３）ｓｈｏｔ４７およびｓｈｏｔ４７ｓｓｓのＨＴへの結合
ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７およびｓｈｏｔ４７ｓｓｓについて、Ｈｉｓ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｔ（Ｔ７  ｇｅｎｅ  １０  ｌｅａｄｅｒ）およびＧＦＰからなる融合タンパク質ＨＴの結合能を、前述のＥＬＩＳＡ改良法により確認した。前記ＥＬＩＳＡ改良法における前記プレートには、抗ＧＦＰ抗体を固定化した。また、比較例として、前記ｓｈｏｔ４７に代えて、前記Ｎ４０を使用した以外は、同様にして、結合を確認した。【０１３２】
これらの結果を、図９に示す。図９は、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７およびｓｈｏｔ４７ｓｓｓの融合タンパク質ＨＴに対する結合能を示すグラフである。同図において、縦軸は、結合能（ＲＮＡアプタマーの結合）を示す４５０ｎｍの吸光度であり、３回の測定に基づく平均値±偏差（ＳＤ）を示す。横軸は、ＲＮＡアプタマーの種類を示し、白抜きバーは、Ｎ４０の結果であり、黒いバーは、ｓｈｏｔ４７の結果であり、グレーのバーは、ｓｈｏｔ４７ｓｓｓの結果である。【０１３３】
図９のグラフに示すように、ｓｈｏｔ４７およびｓｈｏｔ４７ｓｓｓは、ともに、Ｈｉｓ−ｔａｇを有する融合タンパク質ＨＴに、結合能を示した。【０１３４】
（３）プルダウンアッセイ
（３−１）ｓｈｏｔ４７の融合タンパク質への結合
ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７について、融合タンパク質Ｈｉｓ-ＭＩＦおよびＨｉｓ-ＧＦＰとの結合を、前述のプルダウンアッセイおよびノースウェスタンブロッティングにより確認した。また、比較例として、前記ｓｈｏｔ４７に代えて、前記Ｎ４０を使用した以外は、同様にして、結合を確認した。【０１３５】
プルダウンアッセイの結果を、図１０に示す。図１０は、ｓｈｏｔ４７と融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦおよびＨＴとの結合を示すプルダウンアッセイの写真である。同図において、「バッファー中」とは、Ｈｉｓ−ＭＩＦ含有ＨＢＳ−Ｔを使用した結果であり、「５％ＦＢＳ中」とは、Ｈｉｓ−ＭＩＦ含有培養上清を使用した結果であり、「細胞溶解物中」とは、ＨＴを発現させた大腸菌の抽出液を使用した結果である。また、同図のアプタマーの欄において、「Ｎ」は、ＲＮＡアプタマーＮ４０の結果であり、「４７」は、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７の結果であり、Ｈｉｓ−ＭＩＦの欄において、「＋」は、前記サンプル中の融合タンパク質がＨｉｓ−ＭＩＦであることを示し、「ＨＴ」は、前記サンプル中の融合タンパク質がＨＴであることを示し、「−」は、前記サンプル中に両融合タンパク質を含まないことを示す。図１０に示すように、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７により、融合タンパク質Ｈｉｓ−ＭＩＦおよびＨＴをプルダウンできた。また、図１０の「細胞溶解物中」の結果に示すように、大腸菌のホモジェネートからでも、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７により、ＨＴをプルダウン可能であった。【０１３６】
ノースウェスタンブロッティングの結果を、図１１に示す。図１１において、各レーンの数値は、Ｈｉｓ−ＭＩＦのレーンあたりの濃度（μｇ／レーン）を示す。図１１に示すように、ブロッティングした融合タンパク質についても、ＲＮＡアプタマーｓｈｏｔ４７により、ノースウェスタンブロッティングによる検出が可能であった。【０１３７】
［実施例２］
ＲＮＡアプタマーＨｉｓ＿１、Ｈｉｓ＿２、Ｈｉｓ＿３、Ｈｉｓ＿４、Ｈｉｓ＿５、Ｈｉｓ＿６およびＨｉｓ＿１０を合成した。これらのアプタマーは、５’側から、Ｙ領域、Ｘ領域およびＹ’領域が連続する配列とした（Ｙ領域−Ｘ領域−Ｙ’領域）。各アプタマーにおいて、前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域の配列は、共通する。これらの配列を、以下に示す。また、各アプタマーにおいて、前記Ｘ領域は、それぞれ異なるランダム配列である。各アプタマーのＸ領域の配列、すなわちランダム配列（Ｈｉｓ＿１、Ｈｉｓ＿２、Ｈｉｓ＿３、Ｈｉｓ＿４、Ｈｉｓ＿５、Ｈｉｓ＿６およびＨｉｓ＿１０）を、以下に示す。
Ｙ領域  （配列番号１４９）
GGGACGCUCA CGUACGCUCA  
Ｙ’領域  （配列番号１５０）
UCAGUGCCUG GACGUGCAGU
ランダム配列
Ｈｉｓ＿１  （配列番号２３０３）
GGUGAACUGGUCCGCAUUUAGCUUUCUUAUUUGCGGGUAU
Ｈｉｓ＿２  （配列番号２３０４）
GGUGAAUUGGCCGCCGUUCUUUCCGUGGAAUGACGCGAUG
Ｈｉｓ＿３  （配列番号２３０５）
GGUGUACUGGCACUACUGAAAUUUCAUUUGAGUAGGUCUG
Ｈｉｓ＿４  （配列番号２３０６）
UAAGGGUGUACUGGCGAUUGUUGGGACGCACUUCAAUUUG
Ｈｉｓ＿５  （配列番号２３０７）
GAACCCGUAUUGGUCACAGGUGGAUUGGUCUAUAUUGUUA
Ｈｉｓ＿６  （配列番号２３０８）
GGUGUAUUGGAUUUGCUCCGAGGGUGUAGACCCCACAGAU
Ｈｉｓ＿１０  （配列番号２３１２）
UUAGCUUAGCUUCAUGCCCGGGUGUACUGGAGAUCUCUUA【０１３８】
これらのＲＮＡアプタマーについて、前記実施例１の「１.（４）分子間相互作用解析」と同様にして、前記Ｈｉｓ−ＭＩＦに対する結合能を、表面プラズモン共鳴により解析した。前記チップに導入する前記ＨＢＳ−ＴにおけるＨｉｓ−ＭＩＦ濃度は、６００ｎｍｏｌ／Ｌとした。これらの結果を、図１２に示す。図１２は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて検出したシグナルのセンサーグラムであり、図１２において、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、０秒〜６０秒が、前記融合タンパク質を導入した時期である。また、図１２には、比較例として、前記ＲＮＡアプタマーに代えて、前記Ｎ４０を使用した結果を、あわせて示す。【０１３９】
図１２に示すように、いずれのＲＮＡアプタマーも、Ｈｉｓ−ＭＩＦに対する結合能を示し、中でも、アプタマーＨｉｓ＿１は、極めて優れた結合能を示した。なお、図示していないが、この他、前記Ｙ領域（配列番号１４９）−Ｘ領域−Ｙ’領域（配列番号１５０）で表わされ、前記Ｘが配列番号２３０９〜２３１２および配列番号２３１３〜２３４７で表わされるランダム配列である、各ＲＮＡアプタマーについても、Ｈｉｓ−ＭＩＦに対する結合能が確認できた。【０１４０】
［実施例３］
公知のＳＥＬＥＸ法は、ＰＣＲによる増幅時のバイアスが、目的のアプタマーの取得の効率を低下させている要因の一つと予想した。すなわち、ＰＣＲのサイクル数が多い場合、ターゲットに結合するＲＮＡの濃縮よりも、ＰＣＲによって増幅されやすい配列の増加が急速に進むと考えた。そこで、各ラウンドで行うＲＮＡ分子の増幅を、ＰＣＲではなく、主にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼにより行う前記ＳＥＬＥＸ−Ｔ法によって、Ｈｉｓ−ＭＩＦに対するアプタマーを作製した。【０１４１】
１．材料と方法
（１）ＲＮＡライブラリー
２０塩基長の固定配列、４０塩基長のランダム配列、２０塩基長の固定配列およびＴ７プロモーターの相補配列を、５’側からこの順序で含む、配列番号１５１で表わされる一本鎖ＤＮＡライブラリーを合成した。
ＤＮＡライブラリー（配列番号１５１）
ACTGCACGTCCAGGCACTGA  N40  TGAGCGTACGTGAGCGTCCC  TATAGTGAGTCGTATTA【０１４２】
前記一本鎖ＤＮＡ（５０ｐｍｏｌ、３×１０１３分子）と、配列番号１５２で表わされるＴ７プロモーター配列（２５０ｐｍｏｌ）とを混合し、９５℃で５分間加熱した後、急冷した。そして、前記一本鎖ＤＮＡのＴ７プロモーターの相補配列に、前記Ｔ７プロモーター配列がハイブリッドした二本鎖ＤＮＡを、ＲＮＡ合成用のテンプレートとした。
Ｔ７プロモーター配列（配列番号１５２）
TAATACGACTCACTATAGGG【０１４３】
耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼにより、前記テンプレートからＲＮＡを転写し、ＤＮａｓｅ  Ｉにより前記テンプレートを分解した後、精製処理によって、精製ＲＮＡを得た。精製処理は、ゲルろ過、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行った。前記ゲルろ過は、Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−ｓｐｉｎ  ３０Ｃｏｌｕｍｎｓ（商品名、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用した。【０１４４】
前記精製ＲＮＡを変性して、ＨＢ−Ｔ、終濃度０．４ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＲＮａｓｅインヒビター（Ｔｏｙｏｂｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）および終濃度０．５ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡを加え、合計５０μＬとした。これをＲＮＡプールとした。前記ＨＢ−Ｔの組成は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウムおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ７．２）とした。【０１４５】
前記ＲＮＡプールは、以下のＳＥＬＥＸ−Ｔ法に供する前に、前処理を行った。まず、前記ＲＮＡプールを、２０μＬのレジン（商品名ＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ、タカラバイオ社、以下同様）と、室温で３０分間混合した。この混合物を、フィルター（商品名Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ、５μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に供して、レジンおよびそれに結合するＲＮＡを除いた。この前処理後のＲＮＡプールを、ラウンド０のＲＮＡプールとして、以下のＳＥＬＥＸ−Ｔ法に供した。【０１４６】
（２）ＳＥＬＥＸ−Ｔ法
Ｈｉｓ−ＭＩＦと前記ＲＮＡプールとを混合し、室温で１５分間結合させた。前記Ｈｉｓ−ＭＩＦは、Ｈｉｓ−ｔａｇとＭＩＦとの融合ポリペプチドであり、ＡＴＧｅｎ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．社（Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−ｄｏ，  Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ)より購入した。そして、前記混合物に、２．５μＬのレジン（商品名ＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ）を加え、前記融合タンパク質とＲＮＡとの複合体を固定化した。前記レジンを前記ＨＢ−Ｔで洗浄した後、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  イミダゾールを用いて、溶出を行った。前記ＨＢ−Ｔを用いた洗浄回数を、下記表９に示す。そして、得られた溶出液を、フェノールクロロホルム抽出および共沈剤（商品名エタチンメイト、和光純薬）を加えたエタノール沈澱に供し、ＲＮＡを精製した。前記精製ＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲに供し、Ｔ７プロモーターを含むＤＮＡテンプレートを作製した。前記ＲＴ−ＰＣＲは、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）の反応液２０μＬを使用した。前記反応液に含まれる、ＳＥＬＥＸ用フォワードプライマーおよびＳＥＬＥＸ用リバースプライマーの配列を以下に示す。前記反応液におけるプライマーの濃度は、それぞれ１０μｍｏｌ／Ｌとした。また、ＲＴ−ＰＣＲ条件は、５０℃で３０分、９５℃で１５分の処理を行った後、９４℃で１分、５３℃で１分および７２℃で１分を、１サイクルとして、所定のサイクル数行った。各ラウンドのサイクル数は、下記表９に示す。
ＳＥＬＥＸ用リバースプライマー  (配列番号１５３)
TAATACGACTCACTATAGGGACGCTCACGTACGCTCA
ＳＥＬＥＸ用リバースプライマー  (配列番号１５４)
ACTGCACGTCCAGGCACTGA【０１４７】
得られたＰＣＲ産物をテンプレートとして、耐熱性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼとＴプロモーター用プライマーとを用いて、ＲＮＡを合成し、ＤＮａｓｅ  Ｉにより前記テンプレートを分解した後、精製処理によって、精製ＲＮＡを得た。前記Ｔ７プロモーター用プライマーの配列を以下に示す。精製処理は、ゲルろ過、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行った。前記ゲルろ過は、Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−ｓｐｉｎ  ３０Ｃｏｌｕｍｎｓ（商品名、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用した。得られた精製ＲＮＡを、次ラウンドのＲＮＡプールとした。以上の工程を、７ラウンド繰り返し行った。各ラウンドにおける条件を下記表９に示す。
Ｔ７プロモーター用プライマー
TAATACGACTCACTATA  (配列番号１５５)【０１４８】
（３）塩基配列の決定
ＳＥＬＥＸ−Ｔ法で得られた６ラウンドのＲＮＡプール（０．１μｇ）と７ラウンドのＲＮＡプール（０．１μｇ）を、ＲＴ−ＰＣＲに供し、制限酵素サイトを含むｃＤＮＡを作製した。前記ＲＴ−ＰＣＲは、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。プライマーは、以下に示すシークエンス用フォワードプライマーおよびシークエンス用リバースプライマーを使用した。ＲＴ−ＰＣＲの反応液におけるプライマーの濃度は、それぞれ１０μｍｏｌ／Ｌとした。
シークエンス用フォワードプライマー  (配列番号１５６)
TCGACCTCGAGAAAAAAAAAAGGGACGCTCACGTACGCTCA
シークエンス用リバースプライマー  (配列番号１５７)
GAGTCGCGGCCGCTTTTTTTTTTACTGCACGTCCAGGCACTGA【０１４９】
得られたＰＣＲ産物を、ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）で精製した後、制限酵素Ｘｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化し、塩基配列決定用のプラスミドベクターに組み込んだ。前記プラスミドを、大腸菌（ＤＨ５αコンピテントセル、Ｔｏｙｏｂｏ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．）に導入した。その結果、６ラウンドのＲＮＡ由来ｃＤＮＡから１１３クローン、７ラウンドのＲＮＡ由来ｃＤＮＡから１０５クローンを得た。得られたクローンを、Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて増幅した後、塩基配列を決定した。また、ＳＥＬＥＸ−Ｔ法で得られた２ラウンドから５ラウンドのＲＮＡプールは、前記シークエンス用ＰＣＲプライマーを用いてｃＤＮＡを作製した後、Ｒｏｃｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  ｓｙｓｔｅｍにより塩基配列を決定した。【０１５０】
（４）分子間相互作用解析
各ラウンドのＲＮＡプールについて、前記実施例１の「１.（４）分子間相互作用解析」と同様にして、前記Ｈｉｓ−ＭＩＦに対する結合能を、表面プラズモン共鳴により解析した。前記チップに導入する前記ＨＢＳ−ＴにおけるＨｉｓ−ＭＩＦ濃度は、６００ｎｍｏｌ／Ｌとした。また、７ラウンドのＲＮＡプールから得た１０５クローンのうち、配列を決定したＲＮＡアプタマーについて、解析を行った。前記Ｎ４０（対照ＲＮＡ）についても、同様に解析を行った。【０１５１】
２．結果
下記表９に、各ラウンドについて、前記ＲＮＡプール（開始ＲＮＡ）の量、前記ＲＮＡプールと混合したＨｉｓ−ＭＩＦの量、前記複合体の洗浄回数、ＰＣＲのサイクル数、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼにより合成して得られたＲＮＡ（増幅ＲＮＡ）の量、前記ＲＮＡプールのＨｉｓ−ＭＩＦに対する結合数、および、Ｈｉｓ−ＭＩＦに結合するアプタマーに共通する配列番号１７で表わされる保存配列を有するＲＮＡの前記ＲＮＡプールにおける割合を示す。【０１５２】
【表９】
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【０１５３】
前記ＳＥＬＥＸ−Ｔ法によれば、比較的早いラウンド（ラウンド４）から、結合数の増加、ならびに、前記保存配列を有するクローンが占める割合の増加が確認された。【０１５４】
また、前記表９に示すように、ラウンド７まで行うことによって、ＲＮＡプールの結合能が上昇した。ラウンド７により得られた、配列決定されたＲＮＡアプタマーを、下記表１０に示す。下記表１０に示す、ラウンド７で得られたＲＮＡアプタマーは、全て、前記表２および表５に示すように、配列番号１７に示す保存配列およびそれとほぼ同等の配列を含んでいた。
【０１５５】
【表１０】
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【０１５６】
ラウンド７のＲＮＡプール、および、前記表１０に示すＲＮＡアプタマーのうち、＃７０１（配列番号１）、ｓｈｏｔ４７（配列番号２）、＃７１６（配列番号３）、＃７２７（配列番号４）、＃７０４（配列番号５）、＃７１３（配列番号６）、＃７０８（配列番号７）、＃７１８（配列番号８）、＃７４６（配列番号９）、＃７１４（配列番号１０）、＃７３３（配列番号１１）について、分子間相互作用解析の結果を、図１３に示す。図１３は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて検出したシグナルのセンサーグラムであり、図１３において、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、０秒〜４５秒が、前記融合タンパク質を導入した時期である。また、図１３には、前記ＲＮＡアプタマーに代えて、前記Ｎ４０を使用した結果を、あわせて示す。同図に示すように、ラウンド７において、ＲＮＡプールの結合能が著しく向上している。また、ラウンド７のＲＮＡプールに含まれる各ＲＮＡアプタマーが、全て、結合能を有していることが示された。この結果から、ＳＥＬＥＸ−Ｔ法は、実用性が高いと考えられる。【０１５７】
つぎに、各ラウンドについて、代表的なクローンの割合（％）を、下記表１１に示す。【０１５８】
【表１１】
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【０１５９】
スタート時のラウンド０のＲＮＡプールには、理論的に、前記保存配列を含むクローンが、約０．１４％存在すると考えられる。ラウンド３では、前記保存配列を含むクローンが５０．３％にまで上昇し、前記表９に示すように、結合能の上昇も見られた。なお、前記表１１に示すように、ラウンド３では、特定のクローンが優勢になってはいなかった。一方、ラウンド６では、前記表９に示すように合成した増幅ＲＮＡの量が上昇し、さらに、前記表１１に示すように、特定の配列として＃７０１が約２０％を越えていた。さらに、ラウンド７では、特定のクローンとして＃７０１、ｓｈｏｔ４７および＃７１６が優勢となり、中でも、２番目に優勢な１０．５％を占めた２番目に優勢なｓｈｏｔ４７が、Ｈｉｓ−ＭＩＦに対して、最も強く結合した。
【産業上の利用可能性】
【０１６０】
本発明のアプタマーは、例えば、Ｈｉｓペプチドに結合する一般的な抗Ｈｉｓペプチド抗体と比較して、前記Ｈｉｓペプチドに対する結合力が優れている。このため、例えば、Ｈｉｓペプチドの検出において、前記抗Ｈｉｓペプチド抗体に代わって使用でき、且つ、より優れた精度での検出も可能となる。このように、本発明のアプタマーは、例えば、生物学的手法におけるＨｉｓペプチドの検出に、極めて有用なツールである。【０１６１】
以上、実施形態および実施例を参照して、本発明を説明したが、本発明は、上記発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。【０１６２】
本出願は、２００９年５月１５日に出願された日本出願特願２００９−１１９２６９を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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