(57)【要約】本明細書の開示は、より実用的なオリゴヌクレオチド誘導体、ラベル化剤及びその利用を提供する。本明細書の開示によれば、以下の式（１）で表される、複数のヌクレオチド誘導体単位を備えるラベル化剤を用いる。【化１３】2010055789.tif 000015（ただし、式（１）中、Ｚは、窒素原子又はＣＨを表し、Ｙは、縮合していない芳香族系炭化水素基又は縮合多環系炭化水素基を表し、Ｘ1は、Ｏ、Ｓ又はＳｅを表し、Ｘ2は、ＳＨ（若しくはＳ−）、Ｓ又はＳｅ−、炭素数１〜４個のアルキル基又はモルホリノ基を表す。）
2010055789.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（１）で表される、複数のヌクレオチド誘導体単位を備えるラベル化剤。
【化７】
2010055789.tif 000009
（ただし、式（１）中、Ｚは、窒素原子又はＣＨを表し、Ｙは、縮合していない芳香族系炭化水素基又は縮合多環系炭化水素基を表し、Ｘ1は、Ｏ、Ｓ又はＳｅを表し、Ｘ2は、ＳＨ（若しくはＳ−）、Ｓ又はＳｅ−、炭素数１〜４個のアルキル基又はモルホリノ基を表す。）
【請求項２】
前記Ｙは、縮合多環系炭化水素基である、請求項１に記載のラベル化剤。
【請求項３】
前記Ｙは、ナフタレン、フェナントレン、ピレン及びペリレンからなる群から選択される、請求項２に記載のラベル化剤。
【請求項４】
複数の前記ヌクレオチド誘導体単位を連続して備える、請求項１〜３のいずれかに記載のラベル化剤。
【請求項５】
複数の前記ヌクレオチド誘導体単位をリンカー単位を介して備える、請求項１〜３のいずれかに記載のラベル化剤。
【請求項６】
複数の前記ヌクレオチド単位は、前記Ｙが互いに同一又は異なる２つのヌクレオチド誘導体単位であり、これらを連続して備える、請求項１〜５のいずれかに記載のラベル化剤。
【請求項７】
以下の式（１）で表される、複数のヌクレオチド誘導体単位；
【化８】
2010055789.tif 000010
（ただし、式（１）中、Ｚは、窒素原子又はＣＨを表し、Ｙは、縮合していない芳香族系炭化水素基又は縮合多環系炭化水素基を表し、Ｘ1は、Ｏ、Ｓ又はＳｅを表し、Ｘ2は、ＳＨ（若しくはＳ−）、Ｓ又はＳｅ−、炭素数１〜４個のアルキル基又はモルホリノ基を表す。）
を備え、前記複数のヌクレオチド誘導体単位が有する前記Ｙの配列が互いに異なる２種以上のラベル化剤を含む、ラベル化剤のセット。
【請求項８】
さらに、上記式（１）で表される１個のヌクレオチド誘導体単位を備える、ラベル化剤を含む、請求項７に記載のラベル化剤のセット。
【請求項９】
以下の式（１）で表される複数のヌクレオチド誘導体単位を備えるオリゴヌクレオチド誘導体。
【化９】
2010055789.tif 000011
（ただし、式（１）中、Ｚは、窒素原子又はＣＨを表し、Ｙは、縮合していない芳香族系炭化水素基又は縮合多環系炭化水素基を表し、Ｘ1は、Ｏ、Ｓ又はＳｅを表し、Ｘ2は、ＳＨ（若しくはＳ−）、Ｓ又はＳｅ−、炭素数１〜４個のアルキル基又はモルホリノ基を表す。）
【請求項１０】
前記複数のヌクレオチド誘導体単位を、その３’末端側又は５’末端側に備える、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項１１】
以下の式（１）で表される、複数のヌクレオチド誘導体単位を備えるオリゴヌクレオチドプローブ。
【化１０】
2010055789.tif 000012
（ただし、式（１）中、Ｚは、窒素原子又はＣＨを表し、Ｙは、縮合していない芳香族系炭化水素基又は縮合多環系炭化水素基を表し、Ｘ1は、Ｏ、Ｓ又はＳｅを表し、Ｘ2は、ＳＨ（若しくはＳ−）、Ｓ又はＳｅ−、炭素数１〜４個のアルキル基又はモルホリノ基を表す。）
【請求項１２】
前記複数のヌクレオチド誘導体単位を、その３’末端側又は５’末端側に備える、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１３】
以下の式（１）で表される、複数のヌクレオチド誘導体単位；
【化１１】
2010055789.tif 000013
（ただし、式（１）中、Ｚは、窒素原子又はＣＨを表し、Ｙは、縮合していない芳香族系炭化水素基又は縮合多環系炭化水素基を表し、Ｘ1は、Ｏ、Ｓ又はＳｅを表し、Ｘ2は、ＳＨ（若しくはＳ−）、Ｓ又はＳｅ−、炭素数１〜４個のアルキル基又はモルホリノ基を表す。）
を備え、前記複数のヌクレオチド誘導体単位が有する前記Ｙの配列が互いに異なる２種以上のオリゴヌクレオチドプローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１４】
さらに、上記式（１）で表される１個のヌクレオチド誘導体単位を備える、ラベル化剤を含む、請求項に記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１５】
以下の式（１）で表される、複数のヌクレオチド誘導体単位を備える、ＲＮＡ干渉剤。
【化１２】
2010055789.tif 000014
（ただし、式（１）中、Ｚは、窒素原子又はＣＨを表し、Ｙは、縮合していない芳香族系炭化水素基又は縮合多環系炭化水素基を表し、Ｘ1は、Ｏ、Ｓ又はＳｅを表し、Ｘ2は、ＳＨ（若しくはＳ−）、Ｓ又はＳｅ−、炭素数１〜４個のアルキル基又はモルホリノ基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチド誘導体、ラベル化剤及びその利用に関する。
（関連出願のクロスリファレンス）
本出願は、２００８年１１月１４日に出願された日本国特許出願である特願２００８−２９２８１５に基づく優先権を主張するものであり、これらに記載される内容を引用によりここに組み込むものである。
【背景技術】
【０００２】
ピレンやペリレンのような蛍光色素で塩基部分に置き換えたオリゴヌクレオチドが知られている（非特許文献１）。かかるオリゴヌクレオチドは、蛍光色素をヌクレオチド骨格に沿って配列させたものであり、蛍光色素の集積体といえる。同種又は異種の複数の蛍光色素からなる配列を有するオリゴマーは、単一の励起波長で励起したとき、それを構成するモノマーよりも長い波長域の蛍光を発したり、蛍光色素の配列により蛍光波長が変化することも知られている。このため、異なる蛍光色素の配列を有する複数の集積体を蛍光標識として用いることで、単一励起波長で、異なる検出対象を異なる蛍光発色により検出することができると考えられている。【０００３】
【非特許文献１】Ｋｏｏｌ et al., Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．１２９，１５４２６（２００７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、非特許文献１に記載の集積体は、ヌクレオチドのリボースの炭素原子にピレン等の蛍光色素を結合させるものであり、効率的に合成するのが困難であった。また、蛍光波長の長波長化、すなわち、検出する蛍光波長の多様化も困難であることがわかった。さらにまた、蛍光色素の集積状態が不安定であって、蛍光強度の増強も困難であることがわかった。したがって、現状において、これらを満たすことができる蛍光色素集積体は得られていない。【０００５】
加えて、一層、生体内で安定なオリゴヌクレオチド誘導体も求められている。例えば、耐ヌクレアーゼ耐性が一層高められたオリゴヌクレオチド誘導体も求められている。【０００６】
そこで、本発明は、より実用的なオリゴヌクレオチド誘導体、蛍光色素集積体及びその利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、本発明者らが既に開発したベンゼン−リン酸骨格に沿って蛍光色素を配列することを試みたところ、骨格中のベンゼン炭素原子に対して蛍光色素を連結することで蛍光色素が効果的に集積（スタック）し、安定したエキシマー及び／又はエキシプレックスを形成することができるという知見を得た。また、こうしたヌクレオチド誘導体単位を備えることで、ヌクレアーゼ耐性が向上することも見出した。本発明者らは、これらの知見に基づき本発明を完成した。本明細書の開示によれば以下の手段が提供される。【０００８】
本明細書の開示によれば、以下の式（１）で表される、複数のヌクレオチド誘導体単位を備えるラベル化剤が提供される。
【化１】
2010055789.tif 000003
（ただし、式（１）中、Ｚは、窒素原子又はＣＨを表し、Ｙは、縮合していない芳香族系炭化水素基又は縮合多環系炭化水素基を表し、Ｘ1は、Ｏ、Ｓ又はＳｅを表し、Ｘ2は、ＳＨ（若しくはＳ−）、Ｓ又はＳｅ−、炭素数１〜４個のアルキル基又はモルホリノ基を表す。）【０００９】
本明細書に開示のラベル化剤においては、前記Ｙは、縮合多環系炭化水素基であることが好ましく、また、前記Ｙは、ナフタレン、フェナントレン、ピレン及びペリレンからなる群から選択されることがより好ましい。さらに、複数の前記ヌクレオチド誘導体単位を連続して備えていてもよいし、複数の前記ヌクレオチド誘導体単位をリンカー単位を介して備えていてもよい。また、複数の前記ヌクレオチド単位は、前記Ｙが互いに同一又は異なる２つのヌクレオチド誘導体単位であり、これらを連続して備えていてもよい。【００１０】
本明細書の開示によれば、上記式（１）で表される、複数のヌクレオチド誘導体単位を備え、前記複数のヌクレオチド誘導体単位が有する前記Ｙの配列が互いに異なる２種以上のラベル化剤を含む、ラベル化剤のセットが提供される。本明細書に開示されるラベル化剤のセットは、さらに、上記式（１）で表される１個のヌクレオチド誘導体単位を備える、ラベル化剤を含んでいてもよい。【００１１】
本明細書の開示によれば、上記式（１）で表される複数のヌクレオチド誘導体単位を備えるオリゴヌクレオチド誘導体が提供される。前記複数のヌクレオチド誘導体単位を、その３’末端側又は５’末端側に備えることができる。【００１２】
本明細書の開示によれば、上記式（１）で表される、複数のヌクレオチド誘導体単位を備え、前記複数のヌクレオチド誘導体単位が有する前記Ｙの配列が互いに異なる２種以上のオリゴヌクレオチドプローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセットが提供される。さらに、上記式（１）で表される１個のヌクレオチド誘導体単位を備える、ラベル化剤を含むこともできる。【００１３】
本明細書の開示によれば、上記式（１）で表される、複数のヌクレオチド誘導体単位を備える、ＲＮＡ干渉剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本明細書に開示のラベル化剤の一態様を示す図である。
【図２】ベンゼンアナログの合成スキームを示す図である。
【図３】ナフタレンアナログの合成スキームを示す図である。
【図４】フェナントレンアナログの合成スキームを示す図である。
【図５】ピレンアナログの合成スキームを示す図である。
【図６】ベンゼン及びナフタレンについてフルオロシド化による蛍光スペクトルの変化を比較する図である。
【図７】フェナントレン及びピレンについてフルオロシド化による蛍光スペクトルの変化を比較する図である。
【図８】実施例７で合成したオリゴヌクレオチドの配列を示す図である。
【図９】実施例７で合成したオリゴヌクレオチド誘導体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる分子量の測定結果の表を示す図である。
【図１０】ピレンアナログを各１つ備えるオリゴヌクレオチド誘導体の各温度における吸光スペクトルを示す図である。
【図１１】ピレンアナログを各２つ備えるオリゴヌクレオチド誘導体の各温度における吸光スペクトルを示す図である。
【図１２】ピレンアナログを各３つ備えるオリゴヌクレオチド誘導体の各温度における吸光スペクトルを示す図である。
【図１３】ピレンアナログを各１つ備えるオリゴヌクレオチド誘導体の単鎖状態と二重鎖状態との蛍光スペクトルを示す図である。
【図１４】ピレンアナログを各２つ備えるオリゴヌクレオチド誘導体の単鎖状態と二重鎖状態との蛍光スペクトルを示す図である。
【図１５】ピレンアナログを各３つ備えるオリゴヌクレオチド誘導体の単鎖状態と二重鎖状態との蛍光スペクトルを示す図である。
【図１６】各二重鎖状態のおける蛍光スペクトルを比較する図である。
【図１７】各二重鎖の融解温度のグラフ及び表を示す図である。
【図１８】実施例９で合成したペリレンアナログの合成スキームを示す図である。
【図１９】実施例１０で合成したオリゴヌクレオチド誘導体の配列及び構造を示す図である。
【図２０】実施例１０で合成したオリゴヌクレオチド誘導体の吸光スペクトルと蛍光スペクトルを示す図である。
【図２１】実施例１０で合成したオリゴヌクレオチド誘導体の吸光スペクトルと蛍光スペクトルを示す図である。
【図２２】実施例１０で合成したオリゴヌクレオチド誘導体の吸光スペクトルと蛍光スペクトルを示す図である。
【図２３】実施例１０で合成したオリゴヌクレオチド誘導体の吸光スペクトルと蛍光スペクトルを示す図である。
【図２４】実施例１１の結果と非特許文献１の結果と対比する図である。
【図２５】実験例１０で合成したオリゴヌクレオチド誘導体の水溶液を、３６５ｎｍの波長の光を照射した結果を示す図である。
【図２６】モレキュラービーコン型プローブの消光−発光状態を示す図である。
【図２７】ｓｉＲＮＡの耐ヌクレアーゼ性を示す図である。
【図２８】ベンゼン／ピリジンーリン酸誘導体単位を例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書の開示は、上記式（１）で表される複数のヌクレオチド誘導体単位を有するラベル化剤及びその利用に関する。本明細書に開示のラベル化剤の一態様を図１に示す。  
【００１６】
本明細書の開示のラベル化剤によれば。蛍光色素が効果的にスタックできるため、蛍光発色の安定性及び蛍光強度増強効果及び蛍光波長の長波長側へのシフトが容易に実現されるようになる。また、本明細書の開示のラベル化剤でオリゴヌクレオチド等をラベル化することにより、上記の効果を奏することのできるオリゴヌクレオチドプローブ、ＲＮＡハイブリダイズ試薬、ＲＮＡ干渉剤が提供される。さらに、こうした試薬等を用いたオリゴヌクレオチド等の検出方法も提供される。
【００１７】
以下、本発明の実施の形態であるラベル化剤及びそのセット、オリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチドプローブ及びそのセット、ＲＮＡハイブリダイズ試薬及びＲＮＡ干渉剤並びにこれらの用途について詳細に説明する。なお、本発明に関する当業者の技術の範囲内である分子生物学および核酸化学の従来の技術は、文献中で説明されている。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Cold SPring Harbor, New York, 1989年；Gait, M.J., OligonucleotideSynthesis,編集（1984年）；Hames, B.D.およびHiggins, S.J.、Nucleic Acid Hybridization, 編集（1984年）；および一連のMethods in Enzymology, Academic Press, Inc.を参照することができる。
【００１８】
（ラベル化剤及びそのセット）
本発明のラベル化剤は、式（１）で表される化合物である。これらの化合物において、Ｚは、炭素原子（ＣＨ）又は窒素原子を表している。また、式（１）においてＺを含む環の水素原子は置換されていてもよい。
【００１９】
Ｙは、縮合していない芳香族系炭化水素基又は縮合多環炭化水素基を表す。縮合していない芳香族系炭化水素基としては、芳香族性を有する単環の不飽和有機置換基が挙げられる。例えば、芳香族炭化水素基が挙げられ、典型的にはベンゼンを含む置換基が挙げられる。また、単環の複素環置換基であってもよい。なお、こうした単環の不飽和有機置換基の芳香族性の単環上のいずれかの炭素原子が、式（１）におけるベンゼン環上の炭素原子に連結される。また、こうした置換基の単環上の水素原子は、置換されていてもよい。置換基としては、特に限定されないが、スタックの安定性を低下させたり蛍光強度を低下させないものであることが好ましい。  
【００２０】
また、縮合多環系炭化水素基における環状化合物は、芳香族化合物であってもよいし非芳香族であってもよいが、好ましくは芳香族化合物である。縮合多環系炭化水素基としては、ナフタレン、アズレン、へプライマータレン、ビフェニレン、フェナントレン、アントラセン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、テトラセン、ピセン、ペリレン、ペンタフェン、ペンタセン等が挙げられる。なかでも、ナフタレン、フェナントレン、ピレン及びペリレンから選択される縮合芳香族化合物の置換基を備えることが好ましい。これらは入手容易であるとともに、安定したスタックを形成するのに都合がよいからである。縮合多環系炭化水素基における水素原子は、置換されていてもよい。縮合多環系炭化水素基はその縮合した縮合環のいずれかの炭素原子が式（１）で表されるベンゼン環上の炭素原子に連結される。
【００２１】
なお、このような縮合してない芳香族系炭化水素基及び縮合多環炭化水素基は、いずれも、公知の蛍光色素を包含することができる。例えば、フルオレセイン系色素、ローダミン系色素、アレクサ（Ａｌｅｘａ）系色素等が挙げられる。
【００２２】
式（１）において、Ｘ1は、Ｏ、Ｓ又はＳｅを表し、Ｘ2は、ＳＨ（若しくはＳ−）、Ｓ又はＳｅ−、炭素数１〜４個のアルキル基又はモルホリノ基を表す。このようなホスホジエステル基としては、以下の式（２）に記載の各種基が挙げられる。
【００２３】
【化２】
2010055789.tif 000004
【００２４】
本発明のラベル化剤においては、上記ヌクレオチド誘導体単位は、複数個備えられる。本発明のラベル化剤に備えられるヌクレオチド誘導体単位の個数、含まれる置換着Ｙの種類、置換基Ｙの配列は、得ようとする蛍光波長、用いる励起波長等によって決定される。例えば、上記ヌクレオチド誘導体単位の個数が増えるほど蛍光波長が長波長側にシフトする傾向があり、励起波長は、複数個の置換基Ｐの少なくとも一つを励起する波長を用いることが好ましいことなどが考慮される。ラベル化剤に備えられるヌクレオチド誘導体単位の数は、その組み合わせにもよるが、２個以上から１０個以下の範囲で組み合わせすることが好ましい。より好ましくは２個以上５個以下の範囲である。
【００２５】
蛍光波長は、隣り合ってスタックされる置換基Ｙの距離によっても異なる。距離が長すぎるとスタックの形成が困難になり蛍光強度も増強されず、蛍光波長の長波長側へのシフトも抑制される。一定範囲あるいは網羅的に各種の蛍光色素の配列を設計し合成して、単一の励起波長光を照射することで、各合成ラベル化剤の蛍光波長を知ることもできる。
【００２６】
複数個のヌクレオチド誘導体単位は、式（１）で表される骨格に沿って連続して備えることができる。連続して備えることで、置換基Ｙの距離を短くすることができて、置換基Ｙを効果的にスタックでき、蛍光強度の増強及び長波長側へのシフトを促進できる。また、複数個のヌクレオチド誘導体単位は、リンカー単位を介して備えることもできる。リンカー単位を介して複数個のヌクレオチド誘導体を備えることで、置換基Ｙのスタック距離を調整できるとともに、リン酸基等により負電荷を供給することができ、蛍光波長のシフト程度や蛍光強度の増強程度を調節でき、多様な蛍光発色を生じさせることができるようになる。リンカー単位は、少なくとも、上記式（１）中のホスホジエステル結合可能であって、かつ、置換基Ｙ及びこれに替わる核酸塩基等を備えていない単位であることが好ましい。典型的には、以下の式（３）で表される単位が挙げられる。式（３）中、Ｘ３は、Ｏ、Ｓ又はＳｅを表し、Ｘ４は、ＳＨ（若しくはＳ−）、Ｓ又はＳｅ−、炭素数１〜４個のアルキル基又はモルホリノ基を表している。また、Ｒは、炭素数が２以上５以下程度のアルキレン鎖を表し、より好ましくは炭素数が３以上４以下のアルキレン鎖を表す。アルキレン鎖は、置換基Ｙのスタック効果を低下させない範囲で炭素数１〜５程度の低級アルキル基、水酸基及びハロゲン原子等で置換されていてもよい。
【００２７】
【化３】
2010055789.tif 000005
【００２８】
複数のヌクレオチド誘導体単位を少なくとも1個のリンカー単位を介して備えるとき、ヌクレオチド誘導単位間に介在されるリンカー単位は、４個以下であることが好ましい。５個以上であると、スタック効果を得ることが困難になるからである。より好ましくは３個以下である。
【００２９】
複数のヌクレオチド誘導体単位は、隣接するヌクレオチド誘導体単位の置換基Ｙが同一であってもよいし異種であってもよい。同一の場合には、スタックによりエキシマーを形成し、異種の場合には、エキシコンプレックスを形成することができる。
【００３０】
リンカー単位は、ヌクレオチド誘導体単位を、ラベルをする対象である被ラベル化合物に連結するための連結部位として備えることもできる。上記式（３）で表されるリンカー単位は、オリゴヌクレオチドに連結するのに好ましく用いることができる。なお、ラベル化剤は、被ラベル化合物の種類に応じて、必要な連結基を備えることができる。例えば、タンパク質に結合させる場合には、タンパク質のアミノ基、カルボキシル基及びＳＨ基等と共有結合可能な連結基を備えることもできる。
【００３１】
本明細書に開示のラベル化剤によれば、ベンゼン環−リン酸を骨格とし、ベンゼン環に直接Ｙが結合していることから、置換基Ｙを効果的にスタックできる。すなわち、従来のごとくリボース環に対して置換基Ｙを結合した場合に比べて強固なスタック状態を容易に得ることができる。このため、非特許文献１に記載の蛍光色素集積体に比較してより長波長側へ蛍光波長をシフトでき、また蛍光強度がより増強される。さらに、上記ヌクレオチド誘導体単位間にリンカー単位を含めてもなおスタック効果による長波長シフト及び蛍光強度の増強効果を得ることができて、蛍光波長の多様性及び検出容易性を向上させることができる。以上のことから、同一の励起波長により複数の検出対象を検出するためのラベル化剤として、より利用性に優れたラベル化剤であるといえる。
【００３２】
ラベル化剤は、複数のヌクレオチド誘導体単位を含むものであると、それ自体でスタック効果を発現し、蛍光波長の長波長側へのシフト、蛍光強度の増強、多様な蛍光波長のデザイン等の効果を得ることができるが、単一の上記ヌクレオチド誘導体単位を含むものであっても、蛍光波長の長波長側へのシフトや蛍光強度の増強を部分的に得ることができる。また、このようなラベル化剤を、複数のヌクレオチド誘導体単位を含むラベル化剤と組み合わせてセットとして用いることでラベル化剤の蛍光波長の多様性をさらに向上させることができる。
【００３３】
本明細書に開示のラベル化剤のセットは、複数のヌクレオチド誘導体単位が有する複数の置換基Ｙの配列が互いに異なる２種以上のラベル化剤を含むことができる。ここで配列が異なるとは、異なる順序又は異なる種類の置換基Ｙで配列が構成されているほか、配列に含まれるリンカー単位の位置、数、リンカー単位の種類が相違する場合も配列が異なるものとする。リンカー単位の態様が異なれば、蛍光波長等が相違するからである。
【００３４】
上述のように、ラベル化剤のセットは、複数の上記ヌクレオチド誘導体単位を含むラベル化剤のほか、単一の上記ヌクレオチド誘導体単位を含むラベル化剤を含んでいてもよい。
【００３５】
ラベル化剤に適用される励起波長は、ラベル化剤を構成するヌクレオチド誘導体単位の置換基Ｙの種類によって決定される。例えば、ピレン（単独での励起波長：３４２ｎｍ）及びペリレン（単独での励起波長：約４５０ｎｍ）の２種類を置換Ｙとして用いる場合には、これらのいずれか一方を励起する波長光を照射すればよい。
【００３６】
ラベル化剤は、例えば、以下のスキームに示すように、水酸基を保護したベンゼン骨格のボロン酸誘導体を準備し、置換基Ｙのハロゲン化誘導体をパラジウム触媒の存在で縮合することにより、容易にその基本骨格を合成することができる。さらに、この縮合体の水酸基保護基を除去したのち、ＤＭＴｒＣｌで処理してＤＭＴｒＣｌ化して、さらに、Ｎ−エチルジイソプロピルアミンを加え、さらにアミダイト試薬を用いて、固相合成に用いうる化合物（アミダイト体）を得ることができる。こうした化合物を用いたオリゴヌクレオチドの固相合成は当業者において周知である。
【００３７】
【化４】
2010055789.tif 000006
【００３８】
なお、非特許文献１に記載の方法では、デオキシリボースのグリコシルハライド体と蛍光色素のカドミウム誘導体とを縮合して、２種類の異性体を取得し、これをさらに処理して得ることができるものであり、異性化を避けることができないため、非効率的な合成法となっていた。  
【００３９】
ラベル化剤は、固相合成用等に好適であるように、以下の式（４）で表される化合物であってもよい。なお、式（４）におけるＺ及びＹ等の定義は、式（１）におけるのと同義である。
【００４０】
【化５】
2010055789.tif 000007
【００４１】
式（４）において、Ｗ１は水素原子又は水酸基保護基を表すことができる。水酸基保護基としては、水酸基を意図しない反応から保護する基であればよい。こうした水酸基保護基としては、特に限定しないで従来公知の各種の水酸基保護基を用いることができる。本発明の好ましい保護基は、フルオレニルメトキシカルボニル基（ＦＭＯＣ基）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ基）、四級ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ基）、モノメトキシトリチル基、トリフルオロアセチル基、レブリニル基、またはシリル基である。好ましい保護基は、トリチル基であり、例えば、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）及び四級ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ基）から選択される。
【００４２】
また、Ｗ２は、水酸基保護基、ホスホルアミダイト基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。Ｗ２がホスホルアミダイト基である化合物（アミダイト化合物）は、ホスホルアミダイト法によるホスホルアミダイト試薬として用いて、オリゴヌクレオチドを合成するのに用いることができる。なお、本発明において、ホスホルアミダイト基は、以下の式（５）で表すことができる。
【００４３】
【化６】
2010055789.tif 000008
（式（５）中、各Ｑ１は独立して、同一であっても異なっていてもよく、分枝状又は直鎖状の炭素数１〜５個のアルキル基を表し、Ｑ２は、分枝状又は直鎖状の炭素数１〜５個のアルキル基又は置換されていてもよいアルコキシル基を表す。）
【００４４】
上記式（５）において、Ｑ１は、特に限定しないがイソプロピル基が好ましいものとして挙げられ、また、Ｑ２としては、−ＯＣＨ３、−ＯＥｔＣＮ、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２等が挙げられる。
【００４５】
また、式（４）においてＷ２が固相担体に結合される連結基である化合物は、当該連結基とアミノ基など固相担体上の所定の官能基とを結合させることにより、固相担体に保持される。そして、式（４）において、Ｗ２が固相担体に結合された連結基である化合物は、連結基を介して本発明のヌクレオチド誘導体が固相担体に結合されているため、各種の核酸固相合成法の出発材料として用いることができる。この出発材料を用いることで、式（１）で表されるユニットを有するオリゴヌクレオチドを製造することができる。
【００４６】
ここで、固相担体とは、一般に高分子担体が用いられ、例えば、ＣＰＧ（controlled pored glass）やＨＣＰ（highly cross-linked polystyrene）、ある種のゲルなどが挙げられる。また、固相担体には適切なスペーサーを有していてもよい。連結基は、固相担体と本化合物とを連結するリンカーである。こうした連結基としては、公知のコハク酸エステルリンカー、シュウ酸エステルリンカー、シランジイルリンカー、シリルリンカーなどを用いることができる。
【００４７】
以上説明したラベル化剤は、任意の被ラベル化合物に連結されて、被ラベル化合物と他の化合物との相互作用（タンパク質−タンパク質、タンパク質−オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド間、オリゴヌクレオチド−タンパク質等における相互作用）の検出、分析、各種生体分子や人工構築物のＲＮＡ干渉等の機能解析、それらの細胞や組織等における局在の解析に用いられる。
【００４８】
ラベル化剤は、被ラベル化合物のいずれかの箇所に何らかの作用により結合されるものであればよく、被ラベル化合物による検出を妨げない限りいずれの箇所に結合されるように構成されていてもよい。
【００４９】
被ラベル化合物は、オリゴヌクレオチド、タンパク質又はペプチド等とすることができる。被ラベル化合物がオリゴヌクレオチドの場合、ラベル化剤でラベル化した化合物は、特異的ハイブリダイズを検出するためのプローブ、ＰＣＲ反応におけるプライマー、アンチセンス試薬、ｓｉＲＮＡ試薬（ＲＮＡ干渉剤）ほか、各種マイクロＲＮＡ試薬等が挙げられる。また、予めプローブが固定されたアレイなどに対して、試料中のオリゴヌクレオチドを標識するのに用いるラベル化剤としても用いることができる。
【００５０】
また、プローブは、モレキュラービーコンの形態を採ってもよい。この場合、モレキュラービーコンのステムの片側（３‘側又は５’側）にラベル化剤の複数個のヌクレオチド誘導体単位を備えるようにし、別の片側にＢＨＱやＤａｂなどのクエンチャーを備えるようにすることが好ましい。こうした形態によれば、モレキュラービーコンがターゲット配列にハイブリダイズしないときは、クエンチャーにより蛍光を発しないが、モレキュラービーコンがターゲット配列にハイブリダイズしてステムが開いたときには、ヌクレオチド誘導体単位に基づく蛍光を観察することができる。また、モレキュラービーコンの３’末端及び５’末端の双方に備えることもできる。
【００５１】
本明細書において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドとは、ヌクレオチドをモノマー単位として該モノマー単位を複数有するポリマーを意味するものとし、オリゴヌクレオチドは、通常数個以上１００個以下程度までのヌクレオチドのポリマーを含むものとする。なお、オリゴヌクレオチドが有するモノマー単位は、デオキシリボヌクレオチドであってもよいし、リボヌクレオチドであってもよい。また、その両者のキメラであってもよい。また、オリゴヌクレオチドは、通常単鎖を意味するが、相補鎖との二重鎖の形態も包含している。二重鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡのほか、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッドであってもよい。
【００５２】
オリゴヌクレオチドは、天然の塩基やリボース以外の改変されたヌクレオチドを備えていてもよい。改変されたヌクレオチドとは、ヌクレオチドの各種部分、すなわち、塩基、糖部分及びリン酸エステル部分において何らかの化学修飾が施されていることをいうものとする。
【００５３】
被ラベル化合物としてのオリゴヌクレオチドは、用途に応じた長さとすることができるが、オリゴヌクレオチドの合成を考慮すると、１０以上３５以下とすることが好ましい。上記プローブやプライマーは、典型的にはデオキシリボヌクレオチドをモノマー単位とするオリゴヌクレオチドが被ラベル化合物である。また、アンチセンス試薬、ｓｉＲＮＡ試薬等は、典型的にはリボヌクレオチドをモノマー単位とするオリゴヌクレオチドが被ラベル化合物である。
【００５４】
被ラベル化合物がペプチド又はたんぱく質の場合、例えば、ラベル化化合物は、標識抗体や標識二次抗体として用いることができる。なお、本明細書に開示のラベル化剤は、細胞表層に結合され又は現れた適当な介在物質を介して細胞等をラベル対象としてもよい。
【００５５】
本明細書に開示のラベル化剤又はそのセットは、アレイなど適当なデバイスを含む分析、診断のためのキットとして提供されていてもよい。この場合、ラベルに必要な１種又は２種以上の試薬（例えば、ラベル化剤と被ラベル化合物とを結合させるための試薬等）を含むことができる。
【００５６】
（オリゴヌクレオチド誘導体）
本明細書に開示のオリゴヌクレオチド誘導体は、上記式（１）で表される複数のヌクレオチド誘導体単位を備えるオリゴヌクレオチド誘導体である。本明細書に開示のオリゴヌクレオチド誘導体における上記式（１）中の各種表示は、ラベル化剤にて定義し各種態様を例示したものと同一の意義を有するものとする。本明細書に開示のオリゴヌクレオチド誘導体は、典型的には、本明細書に開示のラベル化剤で非ラベル化合物としてのオリゴヌクレオチドをラベルしたものである。
【００５７】
オリゴヌクレオチド誘導体における上記ヌクレオチド誘導体単位の位置も特に限定されない。５’末端を含んでいてもよい５'末端側、３’末端を含んでいてもよい３’末端側及びそれ以外部分のいずれにも備えることができる。なお、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体において５’末端には水酸基が結合されていてもよいし、リン酸基（ＰＯ4）が結合されていてもよい。また、同様に、本オリゴヌクレオチドの３’末端には、水酸基が結合されていてもよいし、リン酸基（ＰＯ4）が結合されていてもよい。その他５’末端及び３’末端はそれぞれ必要に応じて適切な構造を採ることができる。なお、本明細書に開示のヌクレオチド誘導体単位は、ＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）耐性が良好である。したがって、当該ヌクレオチド誘導体単位を、ＲＮａｓｅの標的部位に備えることによりＲＮａｓｅ耐性が向上したオリゴヌクレオチド誘導体(オリゴリボヌクレオチド誘導体)を得ることができる。特に、ｓｉＲＮＡやマイクロＲＮＡなどの末端にこれらのオリゴヌクレオチド誘導体単位を備えることが好ましい。
【００５８】
例えば、ｓｉＲＮＡのパッセンジャーストランドの５’末端には、本明細書に開示されるヌクレオチド誘導体単位を１個又は２個以上備えることが好ましい。そして、より好ましくは、このパッセンジャー鎖に対合するガイド鎖の対合部位（ガイド鎖の３’末端側）において、本明細書に開示されるヌクレオチド誘導体１個又は２個以上備えることが好ましい。こうすることで、パッセンジャー鎖とガイド鎖とが対合した状態において、本明細書に開示されるヌクレオチド誘導体単位同士がスタック構造を形成することによりヌクレオチド誘導体を導入した領域が熱的、熱力学的に安定化され、その結果、ｓｉＲＮＡの活性が向上すると共に、ガイド鎖のヌクレアーゼ耐性が向上される。パッセンジャー鎖の５’末端とガイド鎖の３’末端側で対合する本明細書に開示されるヌクレオチド誘導体単位は、少なくとも１対あればよい。すなわち、パッセンジャー鎖及びガイド鎖のそれぞれに少なくとも一つの前記ヌクレオチド誘導体単位を有していればよい。
【００５９】
ガイド鎖の３’末端の前記ヌクレオチド誘導体単位のさらに３’末端側には、例えば、図２７に示すような単位、すなわち、本明細書に開示されるヌクレオチド誘導体単位においてのベンゼンあるいはピリジン骨格において置換基−Ｙを含まない単位（以下、ベンゼン／ピリジン−リン酸誘導体単位という。）（本発明者らによりWO2007/094135に開示されている。具体的には図２８参照）を１又は２以上備えていることが好ましい。こうすることで、ヌクレアーゼ耐性を効果的に向上させることができる。また、パッセンジャー鎖の３’末端は、１又は２以上の、好ましくは２以上のベンゼン−リン酸誘導体単位を備えることができる。こうすることで、パッセンジャー鎖のヌクレアーゼ耐性を高めることができる。なお、ベンゼン／ピリジン−リン酸誘導体単位は図２８の上段に示すように、リン酸エステル基を介して、隣接するヌクレオチド単位等と接続されるＡ（図２８の2a〜２g）を含むユニットが例示される。なお、2aにおいてＺは、Ｃ又はＮである。好ましくは、Ａは、2a、2bであり、より好ましくは、2aである。Ａを含むユニットは、オリゴヌクレオチド誘導体の末端においても両側のヌクレオチド単位とリン酸エステルを介して連結される。なお、３’末端及び５’末端において、Ｒ1及びＲ2は水素原子又はヒドロキシル保護基等とすることができる。
【００６０】
なお、こうした本明細書に開示されるヌクレオチド誘導体単位及びベンゼン−リン酸誘導体単位のｓｉＲＮＡ等における配置は、想定されるヌクレアーゼに応じて設定される。例えば、上記した態様は、３’末端を主として攻撃対象とするヌクレアーゼに対する耐性を高めるものである。したがって、５’末端を攻撃するエキソヌクレアーゼやエンドヌクレアーゼに対しては、当該部位に本明細書に開示されるヌクレオチド誘導体単位の対合を少なくとも一対備えることが好ましい。
【００６１】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、本発明のヌクレオチド誘導体単位以外にリボヌクレオチド単位及び／又はデオキシリボヌクレオチド単位を備えることができる。本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、上記ヌクレオチド誘導体単位を含んでいれば、既に説明した各種の形態を採ることができる。
【００６２】
本明細書に開示のオリゴヌクレオチド誘導体は、既に説明したリンカー単位も必要に応じて備えることができる。なお、本発明によれば当然に、本発明のヌクレオチド誘導体単位を備えるポリヌクレオチドも提供される。
【００６３】
本明細書に開示のオリゴヌクレオチド誘導体は、既に説明したような方法で合成アミダイトを用いて合成できる。
【００６４】
本明細書に開示のオリゴヌクレオチド誘導体は、上記ヌクレオチド誘導体単位を備えているため、蛍光波長がより長波長側にシフトされまた蛍光強度も増強されたものとなっている。そして、異なる置換基Ｙの配列を有するヌクレオチド誘導体単位を備える単位を備える２種類以上のオリゴヌクレオチド誘導体を組み合わせて用いることで、一つの励起波長で多様な色を発色させることができる。
【００６５】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、プローブ及びプライマーとして用いることができる。特に、こうした複数のオリゴヌクレオチド誘導体をプローブセット又はプライマーセットとして用いたとき、複数の特異的ハイブリダイズ対象を一つの励起波長で容易に検出できる。こうした検出方法は、ＤＮＡやＲＮＡの機能解析、各種分析、診断に極めて有用である。さらに、これらオリゴヌクレオチド誘導体をチップやビーズ等の固相担体等に保持したものは、検査装置や診断装置又はこれらの一部として利用することができる。
【００６６】
プローブは、設計または選択により、ターゲット核酸に特異的に規定された塩基配列を有しており、所定のストリンジェンシーの下で、ターゲット核酸とハイブリダイズするようにするに取得されたオリゴヌクレオチドである。典型的にはデオキシリボヌクレオチドを単位としている。上記したことから、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、特に、細胞内のＲＮＡ検出、特にリアルタイム検出用に好ましく用いることができる。また、プライマーは、ＰＣＲ法により増幅しようとするターゲット核酸の一部に特異的に規定された塩基配列を有しており、所定のストリンジェンシー（ＰＣＲ反応条件）の下で、ターゲット核酸とハイブリダイズするようにするに取得されたオリゴヌクレオチドである。典型的にはデオキシリボヌクレオチドを単位としている。
【００６７】
プローブやプライマーは、典型的には、検査試薬や診断試薬等としてもちいることができる。さらに、これらオリゴヌクレオチド誘導体をチップやビーズ等の固相担体等に保持したものは、検査装置や診断装置又はこれらの一部として利用することができる。さらには、こうした検査試薬や診断薬は、他の試薬薬や診断薬あるいは装置等と組み合わせた検査用又は診断用キットとしても用いることができる。
【００６８】
本明細書に開示のオリゴヌクレオチド誘導体は、各種の遺伝子発現制御剤の形態を採ることができる。すなわち、アンチジーン、アンチセンス、アプタマー、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムに用いることができる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、リボザイム及びアプタマーに用いることもできる。かかるオリゴヌクレオチド誘導体は、典型的にはリボヌクレオチドを単位としている。
【００６９】
本明細書の開示によれば、上記オリゴヌクレオチド誘導体をプローブとして用いた、ＳＮＰや変異などのターゲット核酸の検出方法、上記オリゴヌクレオチド誘導体をｓｉＲＮＡやアンチセンス等として機能する遺伝子発現抑制剤として用いた、遺伝子発現の抑制方法、遺伝子の機能解析方法も提供される。
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００７０】
（実験例１）ベンゼンアナログの合成
図２に示すスキームに従い、ホウ酸誘導体を出発原料として、パラジウム存在下でヨードベンゼンとカップリングし化合物（1）を合成した。続いて脱シリル化により化合物（2）を2step収率88％で合成した。トリチル化により化合物（3）を収率38％で合成し、さらにアミダイト化することで目的化合物（4）を定量的に合成した。具体的には以下のようにした。【００７１】
6-(3,5-bis-tert-butyldimethylsilyloxymethylphenyl)-benzene(1)の合成
lodobenzene0.498g（2.44mmol）にTHF/H2O 12mlを加えたものに、暗室においてPdcl2(dppf) 0.122g（5mol%）を加えた。3,5-bis-tert-butyldimethylsilyloxymethyl phenylboronic acid 1g（2.44mmol）をTHF/H2O 12mlに溶解したものを加え、2N NaOHaq 3.66ml（3eq）を投入して遮光下の65℃オイルバスで反応を開始し、6日間撹拌した。TLC（Hexのみ）では目的物と原料のlodobenzeneが重なってしまうため反応の終了を確認できなかった。EtOAcで抽出し有機層をH2O、satNaHCO3aq とsatNaClaqで洗浄した後、無水NaSO4を加え乾燥させた。その後、溶媒を減圧留去で飛ばし、シリカゲルクロマトグラフィー（Hex:EtOAc=5:1）で目的物とlodobenzeneの混合物1.1651gを得た。【００７２】
3-(3,5-bis-tert-butyldimethylsilyloxymethylPhenyl)-benzene(2)の合成
Ar雰囲気下で混合物(1)1.1651gにTHF7.92mlを加えて、1MTBAF7.92ml（7.92mmol、3eq）を滴下した。Ar雰囲気下で72時間撹拌した。溶媒を減圧留去で飛ばし、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム:メタノール=50:1）で化合物(2)0.4596g（2.15mmol、2step88%）を単離した。
１H NMR (400MHz) (CDCl3) δ : 7.60 (2H, s, ベンゼン環), 7.53 (1H, s, ベンゼン環), 7.45 (3H, s, H-2.3.4 ), 7.37 (2H, s, H-1.5 ), 4.78 (4H, s, CH2), 1.80 (2H, s, OH).
元素分析 : H=6.46%, C=78.29%    calculated, H=6.59%, C=78.48
Mass : C14H14O2= 241.09998      calculated, 214.09938【００７３】
1-(3-hydroxymethyl-5-(4,4’-dimethoxytrityloxy)methylphenyl)-benzene(3)の合成
Ar雰囲気下で化合物(2)0.4596gにPyrizine10.7mlを加えて溶解し、DMTrCl0.9547g（2.80mmol、1.3eq）を加えた。Ar雰囲気下で96時間撹拌した。クロロホルムで抽出し有機層をH2O、satNaHCO3aq とsatNaClaqで洗浄した後、無水NaSO4を加え乾燥させた。その後、溶媒を減圧留去で飛ばし、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム:メタノール=100:1）で化合物(3)0.4231g（0.82mmol、38%）を単離した。
１H NMR (400MHz) (CDCl3) δ : 7.60 (2H, s, ベンゼン環), 7.53 (1H, s, ベンゼン環), 7.45 (3H, s, H-2.3.4 ), 6.85 (2H, s, H-1.5 ), 7.26 (13H, m, DMTr), 4.77 (2H, s, CH2), 4.25 (2H, s, CH2), 3.79 (6H, s, OCH3) 1.69 (1H, s, OH).【００７４】
1-(3-(4,4’-dimethoxytrityloxy)methyl-5-O-{(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)}-Phosphoamidicmethylphenyl)-benzene(4)の合成
化合物(4)0.42g(0.82mmol)を実験器具とともに十分乾燥し、Ar置換したグローブバックを用いて、THF8.2mlをアルゴン下において加え、さらにHunigBase0.53ml(4.10mmol、5.0eq)存在下、亜リン酸化試薬0.39 ml(1.64mmol、2.0eq)を加え室温で30分間撹拌した。クロロホルムで抽出し有機層をH2O、satNaHCO3aqとsatNaClaqで洗浄した後、無水NaSO4を加え乾燥させた。その後、溶媒を減圧留去で飛ばし、シリカゲルクロマトグラフィー（EtOAcのみ）で混合物(4)0.678gを定量的に得た。
31PNMR (400MHz, CDCl3)δ[ppm]: 149.89 ppm.
148.97 ppm【００７５】
（実験例２）ナフタレンアナログの合成
図３に示すスキームに従い、ホウ酸誘導体を出発原料として、パラジウム存在下でヨードナフタレンとカップリングし化合物（5）合成した。続いて脱シリル化により化合物（6）を2step収率84％で合成した。トリチル化により化合物（7）を収率37％で合成し、さらにアミダイト化することで目的化合物（8）を収率85％で合成した。具体的には以下のようにした。【００７６】
6-(3,5-bis-tert-butyldimethylsilyloxymethylPhenyl)- naphthalene (5)の合成
lodonaphthalene0.6199g（2.44mmol）にTHF/H2O 12mlを加えたものに、暗室においてPdcl2(dppf) 0.122g（5mol%）を加えた。3,5-bis-tert-butyldimethylsilyloxymethyl Phenylboronic acid 1g（2.44mmol）をTHF/H2O 12mlに溶解したものを加え、2N NaOHaq 3.66ml（3eq）を投入して遮光下の65℃オイルバスで反応を開始し、24時間撹拌した。TLC（Hexのみ）では目的物と原料のlodonaphthaleneが重なってしまうため反応の終了を確認できなかった。また肉眼で蛍光を確認した。EtOAcで抽出し有機層をH2O、satNaHCO3aq とsatNaClaqで洗浄した後、無水NaSO4を加え乾燥させた。その後、溶媒を減圧留去で飛ばし目的物とlodonaphthaleneの混合物1.6530gを得た。【００７７】
3-(3,5-bis-tert-butyldimethylsilyloxymethylPhenyl)- naphthalene (6)の合成
Ar雰囲気下で混合物(5)1.653gにTHF7.32mlを加えて、1MTBAF7.32ml（7.32mmol、3eq）を滴下した。Ar雰囲気下で72時間撹拌した。溶媒を減圧留去で飛ばし、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム:メタノール=50:1）で化合物(6)0.5448g（2.06mmol、2step84%）を単離した。
１H NMR (400MHz) (CDCl3) δ : 7.90 (4H, s, H-6,7,8,9), 7.53 (2H, s, ベンゼン環), 7.51 (1H, s, ベンゼン環), 7.42 (1H, s, H-3 ), 7.41 (2H, s, H-2,4 ), 4.79 (4H, s, CH2), 1.35 (2H, s, OH).
元素分析 : H=6.13%, C=80.96%    calculated, H=6.10%, C=81.79%
Mass : C18H16O2= 264.11455      calculated,264.11503【００７８】
1-(3-hydroxymethyl-5-(4,4’-dimethoxytrityloxy)methylphenyl)- naphthalene (7)の合成
Ar雰囲気下で化合物(6)0.5448gにPyrizine10.3mlを加えて溶解し、DMTrCl0.909g（2.68mmol、1.3eq）を加えた。Ar雰囲気下で18時間撹拌した。クロロホルムで抽出し有機層をH2O、satNaHCO3aq とsatNaClaqで洗浄した後、無水NaSO4を加え乾燥させた。その後、溶媒を減圧留去で飛ばし、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルムのみ→クロロホルム:メタノール=15:1）で化合物(7)0.4293g（0.75mmol、37%）を単離した。
１H NMR (400MHz) (CDCl3) δ : 7.92 (4H, s, H-6,7,8,9), 7.53 (2H, s, ベンゼン環), 7.51 (1H, s, ベンゼン環), 7.42 (1H, s, H-3 ), 7.41 (2H, s, H-2,4 ), 7.41 (13H, m, DMTr), 6.83 (6H, s, OCH3), 4.80 (2H, s, CH2), 4.27 (2H, s, CH2), 1.60 (1H, s, OH).【００７９】
1-(3-(4,4’-dimethoxytrityloxy)methyl-5-O-{(2-cyanoethyl)-(N,N-diisoropyl)}-phosphoamidicmethylphenyl)-naphthalene(8)の合成
化合物(7)0.43g(0.75mmol)を実験器具とともに十分乾燥し、Ar置換したグローブバックを用いて、THF7.5mlをアルゴン下において加え、さらにHunigBase0.48ml(3.75mmol、5.0eq)存在下、亜リン酸化試薬0.35ml(1.50mmol、2.0eq)を加え室温で30分間撹拌した。クロロホルムで抽出し有機層をH2O、satNaHCO3aqとsatNaClaqで洗浄した後、無水NaSO4を加え乾燥させた。その後、溶媒を減圧留去で飛ばし、シリカゲルクロマトグラフィー（EtOAcのみ）で化合物(8)0.513g（0.64mmol、85%）を得た。
31PNMR (400MHz, CDCl3)δ[ppm]: 149.00 PPm.【００８０】
(実験例３)フェナントレンアナログの合成
図４に示すスキームに従い、ホウ酸誘導体を出発原料として、パラジウム存在下でヨードフェナントレンとカップリングし化合物（9）合成した。続いて脱シリル化により化合物（10）で合成した。トリチル化により化合物（11）を3step収率23％で合成し、さらにアミダイト化することで目的化合物（12）を収率70％で合成した。具体的には以下のようにした。【００８１】
6-(3,5-bis-tert-butyldimethylsilyloxymethylphenyl)-phenanthrene (9)の合成
暗室においてlodophenanthrene0.742g（2.44mmol）にPdcl2(dppf) 0.122g（5mol%）を加え、THF/H2O 12mlで溶解した。3,5-bis-tert-butyldimethylsilyloxymethyl Phenylboronic acid 0.90g（2.19mmol）をTHF/H2O 12mlに溶解したものを加え、2N NaOHaq 3.66ml（3eq）を投入して遮光下の65℃オイルバスで反応を開始し、24時間撹拌した。TLC（Hex：EtOAc＝1：1）では目的物と原料のlodophenanthreneが重なってしまうため反応の終了を確認できなかった。また肉眼で蛍光を確認した。EtOAcで抽出し有機層をH2O、satNaHCO3aq とsatNaClaqで洗浄した後、無水NaSO4を加え乾燥させた。その後、溶媒を減圧留去で飛ばし目的物とlodophenanthreneの混合物1.2749gを得た。【００８２】
3-(3,5-bis-tert-butyldimethylsilyloxymethylphenyl)- phenanthrene (10)の合成
Ar雰囲気下で混合物(9)1.2749gにTHF6.57mlを加えて、1MTBAF6.57ml（6.57mmol、3eq）を滴下した。Ar雰囲気下で2日間撹拌した。溶媒を減圧留去で飛ばし、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム:メタノール=50:1）で化合物(10)0.9324gをTBAF残留で分離した。
１H NMR (400MHz) (DMSO) δ : 8.90 (4H, d, H-4,5,6,7) 7.90 (4H, d, H-10,11,12,13), 7.39 (1H, s, ベンゼン環), 7.33 (2H, s, ベンゼン環), 5.26 (2H, s, OH), 4.60 (4H, s, CH2).
元素分析 : H=5.86%, C=83.14%    calculated, H=5.77%, C=84.05%
Mass : C22H18O2= 314.13148      calculated,314.13068【００８３】
1-(3-hydroxymethyl-5-(4,4’-dimethoxytrityloxy)methylphenyl)-phenanthrene (11)の合成
Ar雰囲気下で化合物(10)0.932gにpyrizine14.5mlを加えて溶解し、DMTrCl1.27g（3.77mmol、1.3eq）を加えた。Ar雰囲気下で27時間撹拌した。クロロホルムで抽出し有機層をH2O、satNaHCO3aq とsatNaClaqで洗浄した後、無水NaSO4を加え乾燥させた。その後、溶媒を減圧留去で飛ばし、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルムのみ→クロロホルム:メタノール=100：1）で化合物(11)0.3473g（0.56mmol、3step 23%）を単離した。
１H NMR (400MHz) (DMSO) δ : 8.90 (4H, d, H-4,5,6,7) 7.90 (4H, d, H-10,11,12,13), 7.39 (1H, s, ベンゼン環), 7.33 (2H, s, ベンゼン環), 7.25 (13H, m, DMTr), ??? (1H, s , OH ), 4.78 (2H, d, J=5.6, CH2), 4.27 (2H, s, CH2), 3.78 (6H, s, OCH3).【００８４】
1-(3-(4,4’-dimethoxytrityloxy)methyl-5-O-{(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)}-phosphoamidicmethylphenyl)- Phenanthrene (12)の合成
化合物(11)0.35g(0.56mmol)を実験器具とともに十分乾燥し、Ar置換したグローブバックを用いて、THF5.6mlをアルゴン下において加え、さらにHunigBase0.36ml(2.80mmol、5.0eq)存在下、亜リン酸化試薬0.26ml(1.12mmol、2.0eq)を加え室温で30分間撹拌した。クロロホルムで抽出し有機層をH2O、satNaHCO3aqとsatNaClaqで洗浄した後、無水NaSO4を加え乾燥させた。その後、溶媒を減圧留去で飛ばし、シリカゲルクロマトグラフィー（EtOAcのみ）で化合物(12)0.335g（0.39mmol、70%）を得た。
31P NMR (400MHz, CDCl3)δ[ppm]: 148.97 ppm.【００８５】
（実験例４）ピレンアナログの合成
図５に示すスキームに従い、ホウ酸誘導体を出発原料とし、パラジウム存在下でブロモピレンとカップリングし化合物（13）合成した。続いて脱シリル化により化合物（14）を合成した。トリチル化により化合物（15）を3steP収率30％で合成し、さらにアミダイト化することで目的化合物（16）を定量的に合成した。具体的には以下のようにした。【００８６】
6-(3,5-bis-tert-butyldimethylsilyloxymethylphenyl)-pyrene (13)の合成
暗室において1-Bromopyrene0.686g（2.44mmol）にPdcl2(dppf) 0.122g（5mol%）を加え、THF/H2O 12mlで溶解した。3,5-bis-tert-butyldimethylsilyloxymethyl Phenylboronic acid 1.0g（2.19mmol）をTHF/H2O 12mlに溶解したものを加え、2N NaOHaq 3.66ml（3eq）を投入して遮光下の65℃オイルバスで反応を開始し、24時間撹拌した。TLC（Hex：EtOAc＝5：1）により肉眼で強い蛍光を確認した。EtOAcで抽出し有機層をH2O、satNaHCO3aq とsatNaClaqで洗浄した後、無水NaSO4を加え乾燥させた。その後、溶媒を減圧留去で飛ばし目的物と加水分解物の混合物1.5203gを得た。【００８７】
3-(3,5-bis-tert-butyldimethylsilyloxymethylphenyl)- pyrene (14)の合成
Ar雰囲気下で混合物(13)1.5203gにTHF7.32mlを加えて、1MTBAF7.32ml（7.32mmol、3eq）を滴下した。Ar雰囲気下で2日間撹拌した。溶媒を減圧留去で飛ばし、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム:メタノール=50:1）で化合物(14)0.9324gをTBAF残留で分離した。
１H NMR (400MHz) (DMSO) δ : 8.32 (5H, d, H-6,8,9,10,12) 8.22 (2H, d, H-5,13), 8.14 (2H, d, H-2,3), 8.09 (1H, s, ベンゼン環), 8.00 (2H, s, ベンゼン環), 5.30 (2H, s, OH), 4.63 (4H, s, CH2).
元素分析 : H=5.37%, C=84.21%    calculated, H=5.36%, C=85.18%
Mass : C24H18O2= 338.13123      calculated,338.13068【００８８】
1-(3-hydroxymethyl-5-(4,4’-dimethoxytrityloxy)methylphenyl)- pyrene (15)の合成
Ar雰囲気下で化合物(14)0.932gにpyrizine14.5mlを加えて溶解し、DMTrCl1.27g（3.77mmol、1.3eq）を加えた。Ar雰囲気下で27時間撹拌した。クロロホルムで抽出し有機層をH2O、satNaHCO3aq とsatNaClaqで洗浄した後、無水NaSO4を加え乾燥させた。その後、溶媒を減圧留去で飛ばし、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルムのみ→クロロホルム:メタノール=100：1）で化合物(15)0.4632g（0.72mmol、3step30%）を単離した。
１H NMR (400MHz) (DMSO) δ : 8.56 (5H, d, H-6,8,9,10,12) 8.22 (2H, d, H-5,13), 8.18 (2H, d, H-2,3), 8.09 (1H, s, ベンゼン環), 8.02 (2H, s, ベンゼン環), 7.25 (13H, m, DMTr), 5.32 (1H, s , OH ), 4.65 (2H, d, J=5.6, CH2), 4.23 (2H, s, CH2), 3.16 (6H, s, OCH3).【００８９】
1-(3-(4,4’-dimethoxytrityloxy)methyl-5-O-{(2-cyanoethyl)-(N,N-diisoproPyl)}-phosphoamidicmethylphenyl)- pyrene(16)の合成
化合物(15)0.46g(0.72mmol)を実験器具とともに十分乾燥し、Ar置換したグローブバックを用いて、THF7.2mlをアルゴン下において加え、さらにHunigBase0.46ml(3.60mmol、5.0eq)存在下、亜リン酸化試薬0.34ml(1.44mmol、2.0eq)を加え室温で30分間撹拌した。クロロホルムで抽出し有機層をH2O、satNaHCO3aqとsatNaClaqで洗浄した後、無水NaSO4を加え乾燥させた。その後、溶媒を減圧留去で飛ばし、シリカゲルクロマトグラフィー（EtOAcのみ）で混合物(16)0.7091gを定量的に得た。
31PNMR (400MHz, CDCl3)δ[ppm]: 149.01 ppm.【００９０】
（実験例５）吸光度測定
それぞれの原料と合成したベンゼンタイプ-フルオロシドのノルマル体との吸光度と蛍光強度を解析し、比較検討した。すなわち、それぞれの試料（2）（6）（10）（14）とそれぞれの原料を5mg取り、1mlのMeOHに溶解する。それを元に2stepで0.03μmol/mlに調製した。吸光度計でピーク時の値が1以下であることを確認し、蛍光測定をおこなった。結果を図６及び図７に示す。【００９１】
図６に示すように、ベンゼン・ナフタレンの比較結果から原料よりベンゼン・ナフタレンアナログのフルオロシドが格段に高い蛍光強度を示した。また、図７に示すように、それぞれフェナントレン・ピレンの比較結果から、同様に原料よりフェナントレン・ピレンアナログのフルオロシドが格段に高い蛍光強度を示した。これによりベンゼンタイプ-フルオロシドによるフルオロシドオリゴマーを合成した場合に、より高い蛍光強度が得られることがわかった。【００９２】
以上のことから、π電子密充填型であるベンゼン‐リン酸骨格に蛍光性の化合物を導入したフルオロシドを開発することにより、そのπ電子密充填型が光誘起電子移動により電子密度が下がり、励起・蛍光波長の変化とさらなる蛍光強度の強化等の蛍光特性の変化が得られることがわかった。なお、ベンゼン−リン酸骨格は、ヌクレアーゼ耐性を向上させることができる。【００９３】
（実験例６）ピレンアナログの合成
6-(3,5-bis-tert-butyldimethylsilyloxymethylPhenyl)-pyrene(1)の合成
図５に示すスキームに従い、暗室において1-Bromopyrene ( 0.686g, 2.44mmol )にPdcl2(dppf)( 0.122g, 5mol% )を加え、THF/H2O ( 12ml)で溶解した。3,5-bis-tert-butyldimethylsilyloxymethyl phenylboronic acid ( 1.0g, 2.19mmol )をTHF/H2O ( 24ml )に溶解したものを加え、2N NaOHaq ( 3.66ml, 3eq）を投入して遮光下の65℃オイルバスで反応を開始し、2日間撹拌した。TLC（Hex：EtOAc＝5：1）により肉眼で強い蛍光を確認した。反応を確認後、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加え乾燥させた。その後、溶媒を減圧留去し目的物をmixture として( 1.28 g) 得た。【００９４】
3-(3,5-bis-tert-butyldimethylsilyloxymethylphenyl)- pyrene (2)の合成
Ar雰囲気下で混合物(1) (1.29 g)にTHF (22.7 ml),CH2Cl2 (22.7ml)を加えて、TBAF (1.14ml, 1.14 mmol, 0.5eq)を滴下した。Ar雰囲気下で45分間撹拌した。TLC (クロロホルム：メタノール＝10：1)により反応を確認した。反応を確認後、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加え乾燥させた。溶媒を減圧除去し、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム:メタノール=15:1〜10:1）で化合物(2) (0.416 g, 1.23 mmol, 54.2% 2steps)を得た。１H NMR (400MHz) (DMSO) δ : 8.32 (5H, d, H-6,8,9,10,12) 8.22 (2H, d, H-5,13), 8.14 (2H, d, H-2,3), 8.09 (1H, s, ベンゼン環), 8.00 (2H, s, ベンゼン環), 5.30 (2H, s, OH), 4.63 (4H, s, CH2).【００９５】
1-(3-hydroxymethyl-5-(4,4’-dimethoxytrityloxy)methylPhenyl)- Pyrene (3)の合成
Ar雰囲気下で化合物(2) (0.41 g, 1.21 mmol)にピリジン( 9.06ml)を加えて溶解し、DMTrCl ( 0.46 g, 1.36 mmol, 1.1eq)を加えた。Ar雰囲気下で4時間撹拌し、反応をTLC ( クロロホルム：メタノール＝10：1)で確認した。反応を確認後、クロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加え乾燥させた。溶媒を減圧除去し、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール=50：1〜10：1）で化合物(3)(0.4478 g, 0.699 mmol, 57.8%)、 原料 ( 0.113 g, 0.334 mmol, 27.7%)を得た。
１H NMR (400MHz) (DMSO) δ : 8.56 (5H, d, H-6,8,9,10,12) 8.22 (2H, d, H-5,13), 8.18 (2H, d, H-2,3), 8.09 (1H, s, ベンゼン環), 8.02 (2H, s, ベンゼン環), 7.25 (13H, m, DMTr), 5.32 (1H, s , OH ), 4.65 (2H, d, J=5.6, CH2), 4.23 (2H, s, CH2), 3.16 (6H, s, OCH3)【００９６】
1-(3-(4,4’-dimethoxytrityloxy)methyl-5-O-{(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)}-phosphoamidicmethylphenyl)- pyrene(4)の合成
グローブバック中(アルゴン下、完全無水)、RNA条件下で反応させた。
化合物(3)(0.44 g, 0.688 mmol)をTHF (3.43 ml)に溶解させHunig’s Base ( N-Ethyl diisopropylamine )（0.565 ml, 3.44 mmol, 5eq）を加え、更にアミダイト試薬(0.307 ml, 1.38 mmol, 2eq)を撹拌しながらゆっくり加えた。グローブバックから取り出し30分撹拌した後、クロロホルムに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去しシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：アセトン＝2：1）で単離精製し化合物(4)(0.539 g, 0.615 mmol, 89.3％)を得た。
31PNMR (400MHz, CDCl3)δ[ppm]: 149.25 ppm【００９７】
（実験例７）オリゴヌクレオチドの合成
常法に従い、図８に示すオリゴヌクレオチドの塩基に対応するアミダイト体を準備し、以下の配列のオリゴヌクレオチド誘導体を固相合成法により合成した。なお、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（図９）にて分子量を確認した。【００９８】
（実験例８）吸光スペクトル、蛍光スペクトル及び融解温度の測定
これらのオリゴヌクレオチドにつき、Bufferとして10 mM Tris-HCl ( ｐH=7.2) , 100 mM NaClを使用して図１０〜図１２に示す各温度で吸光スペクトルを測定した。また、室温にて蛍光スペクトルを測定した。さらに、融解温度及び／又は単鎖の状態でそれぞれ測定した。励起波長は、３４２ｎｍとした。結果を図１０〜図１７に示す。【００９９】
図１０〜図１２に示すように、３４０ｎｍがピレン固有の吸収であるが、これらのスペクトルから、低温ではピレン同士がスタックし、温度が上昇して二重鎖が解離するとともに、ＵＶ吸収が増大する傾向が確認された。また、図１３〜図１６に示すように、励起波長光を照射すると、二重鎖の状態では最も強く特有のエキシマー由来の蛍光が観察されることがわかった。また、単鎖であってもスタック効果によりエキシマー由来の蛍光が観察された。また、これらの図によれば、少なくとも２つ以上のピレンアナログがスタックされることによりアナログモノマーに由来すると考えられる蛍光（３９０ｎｍ）が観察されなくなることがわかった。【０１００】
また、図１７に示すように、天然の二重鎖のＴｍが約６４℃であるのに対し、Ｄ１では７３℃、Ｄ２では７７℃、Ｄ３では、７６℃であった。二重鎖の安定性に寄与する水素結合の数がピレンアナログの導入によって減少するにも関わらず、熱安定性が向上していることがわかった。【０１０１】
以上の結果によれば、これらのオリゴヌクレオチドにおけるピレンアナログのスタックが効率的に形成され、かつ、安定であることがわかった。【０１０２】
（実施例９）ペリレンアナログの合成
3-Bromoperylene (1) の合成
図１８に示すスキームに従い、Perylene(252mg ,1mmol)をDMF(45ml)に溶解し、そこへ 、NBS(178mg) をDMF(10ml)により溶解させた溶液をゆっくり加えた。24時間室温で撹拌した。H2O(200ml)を加え、生成物を沈殿させ吸引ろ過した。生成物をヘキサンにより再結晶した。黄褐色化合物(1)(187mg, (mixture))を得た。【０１０３】
3-(3,5-bis-tert-butyldimethylsilyloxymethylPhenyl)Perylene(2) の合成
暗室において3-BromoPerylene(0.150g, 0.453mmol, 1.3eq.）にPdCl2(dPPf) (17.4mg, 5mol%）を加えた。そこに3,5-bis-tert-butyldimethylsilyloxymethyl Phenylboronic acid (0.143g, 0.348mmol, 1eq.）をTHF/H2O (5:1)(3.6ml)に溶解したものを加え、2N NaOHaq. 3.66ml（3eq）を投入して遮光下の65℃オイルバスで反応を開始し、30時間撹拌した。TLC（Hex：EtOAc＝5：1）により反応を確認した。NH4Cl aq.で中和し、セライトろ過を行った。EtOAcで抽出し有機層をH2O、sat.NaHCO3 aq. とsat.NaCl aq.で洗浄した後、無水Na2SO4を加え乾燥させた。その後、溶媒を減圧留去で飛ばし目的物を3-BromoPeryleneとの混合物(0.192g)で得た。【０１０４】
3- (3-hydroxymethyl-5-tert-butyldimethylsilyloxymethylPhenyl) Perylene(3) の合成
予め真空乾燥させておいた化合物(1)、(2)、(3)の混合物(2.37 g)をTHF(38.5 ml)、ジクロロメタン( 38.5 ml)に溶解させ、TBAF(2 ml, 2 mmol,)を滴下した。TLC（クロロホルム:メタノール＝1:1）にて反応の進行状況を分刻みで細かく観察しながら、3時間半後に反応を停止した。クロロホルムで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加え乾燥させた。溶媒を減圧除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン:酢酸エチル＝10:1〜1:1）で精製し、化合物(3) (0.447g, 0.889 mmol, 11%)を赤色個体として得た。
１H NMR (400MHz) (CDCl3) δ : 8.09-7.12 (14H, m, aromatic Protons), 4.72-4.66 (4H, m, CH2), 0.81 (9H, s, t-butyl ), 0.0079 (6H, s, TBDMS).【０１０５】
3- (3-hydroxymethyl-5-(4,4’-dimethoxytrityloxy)methylPhenyl) Perylene(4)の合成
化合物(3)(0.411 g, 0.818 mmol)にピリジン(8.2 ml)を加え溶解させ、そこにアルゴン雰囲気下でDMTrCl(0.556 g, 1.64 mmol, 2 eq)を加え室温で18時間撹拌した。TLCにて、原料の消失を確認し、クロロホルムと水で分液した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、トルエン洪沸によりピリジンを除去してそのまま次の反応へ進んだ。濃縮物をTHF(8.2 ml)に溶解させ、アルゴン雰囲気下でTBAF(1.64 ml, 1.64 mmol, 2 eq)を加え室温で5時間撹拌し、TLCにて反応の終了を確認した。クロロホルムと水で分液し、有機層を飽和NaHCO3水溶液と飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去しシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝5:1〜1：1）でTBAF残留の化合物(4)を得た。その混合物を再結晶（クロロホルムとn-ヘキサン）により黄色固体の化合物(4)(0.410g, 0.593mmol, 72%(2 steps))を得た。
１H NMR (400MHz) (CDCl3) δ : 8.25-6.83 (27H, m, aromatic protons), 4.80 (2H, d, J=6.1 Hz,CH2), 4.29(2H, s, CH2O-DMTr), 3.78 (6H, s, OCH3), 1.72(1H, t, J=6.0Hz,OH).【０１０６】
3-3-(4,4’-dimethoxytrityloxy)methyl-5-O-{(2-cyanoethyl)-(N,N-diisoPropyl)}-PhosPhoamidicmethylPhenyl) Perylene(5)の合成
化合物(4)(0.406g, 0.588 mmol)を実験器具とともに十分乾燥し、Ar置換したグローブバックを用いて、THF (3 ml)をアルゴン下において加え、さらにHunig’s base (0.514 ml, 2.94 mmol, 5.0 eq)存在下、亜リン酸化試薬(0.263 ml, 1.18 mmol, 2.0 eq)を加え室温で1時間撹拌した。反応をTLC（酢酸エチル:アセトン＝20:1）にて確認し、飽和NaHCO3 水溶液を少量加え反応を停止し、そのままクロロホルムで分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、溶媒を減圧留去した後、中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:アセトン＝30:1)にて分離精製し、黄色泡状化合物(5)(0.348 g, 0.391 mmol, 66％)を得た。 31PNMRにより、亜リン酸基の導入を確認した。
31P NMR (400MHz, CDCl3)δ[ppm]: 149.09 【０１０７】
（実験例１０）オリゴヌクレオチド誘導体の合成
実施例６において既に合成したピレンアナログのアミダイト体及び実施例９で合成したペリレンアナログのアミダイト体を用い、さらに、図１９に示すリンカー（Ｓ）を準備して、同じく図１９に示す配列のラベル化剤をポリＴ（チミジンデオキシリボヌクレオチド１０個）の５’側に備えるオリゴヌクレオチドを合成した。なお、リンカーのアミダイト体は、ブタンジオールの一つの水酸基をDMTr化、続いてもう一方の水酸基を亜リン酸化することにより合成した。なお、本実験例で得られるオリゴヌクレオチド誘導体は、本明細書に開示のオリゴヌクレオチド誘導体に相当する。【０１０８】
（実験例１１）
オリゴヌクレオチドについての吸光スペクトル及び蛍光スペクトルの測定
実験例１０で合成した合計１１種のオリゴヌクレオチドにつき、吸光スペクトル及び蛍光スペクトルを測定した。結果を図２０〜図２３に示す。なお、蛍光スペクトルを測定するのにあたり、ピレンの励起波長である３５０ｎｍ付近とペリレンの励起波長である４５５ｎｍ付近のそれぞれを用いた。【０１０９】
図２０〜図２３に示すように、ピレンアナログ及び／又はペリレンアナログを含むオリゴヌクレオチド誘導体のスタック効果は、明らかであった。また、図２４に示すように、非特許文献１の結果と対比すると、本明細書に開示のオリゴヌクレオチド誘導体は、蛍光波長がより大きく長波長側へシフトされているとともに、スタック時におけるモノマー由来の蛍光スペクトルの出現が抑制されていることがわかった。【０１１０】
実験例１０で合成したオリゴヌクレオチド誘導体の水溶液を、３６５ｎｍの波長の光を照射した結果を図２５に示す。図２５に示すように、図中左から右に向かって紫、青、緑、黄、赤にわたって全１１色を発色させることができた。【０１１１】
（実施例１２）
本実施例では、３’末端にクエンチャーとしてＢＨＱ又はＤａｂを有し、置換基Ｙとしてピレンアナログとペリレンアナログと有する本明細書に開示されるヌクレオチド誘導単位をリンカー（図２６参照）を介して５’末端に有する所定配列のモレキュラービーコンを以上の実施例に準じて作製した（図２６参照）。これらのモレキュラービーコンについて、１塩基のみがミスマッチであるターゲットＲＮＡであるＲＮＡ１と完全マッチ配列のターゲットＲＮＡであるＲＮＡ２とハイブリダイゼーションを行って消光−発光を観察した。モレキュラービーコンの濃度は、３μＭ（Na-リン酸緩衝液ｐＨ７．０、１００ｍＭＮａＣｌ）とし、ＵＶ（波長３６５ｎｍ）で励起して観察した。結果を図２６に示す。【０１１２】
図２６に示すように、ヌクレオチド誘導体単位の数が増えるごとに蛍光が長波長側にシフトする傾向を観察した。また、ミスマッチよりも完全マッチ配列のＲＮＡとのハイブリダイズ時においてより強い蛍光を観察した。以上のことから、本明細書に開示されるヌクレオチド誘導体単位は、クエンチャーで有効に消光されるとともに、ターゲット核酸とハイブリダイズ時には、確実に蛍光を発することができることを確認できた。【０１１３】
（実施例１３）
本実施例では、本明細書に開示されるヌクレオチド誘導体単位（Ｙはナフタレン）を末端に備える各種ｓｉＲＮＡを合成し（図２７参照）、タンパク質発現抑制効果を確認した。すなわち、本実施例では、合成した3’末端化学修飾Renilla siRNAのタンパク発現抑制効果を評価するために0.1,0.5,1,5,10nMの濃度でLuc Assay（Dual Luciferase Assayによる3’末端化学修飾siRNAのタンパク発現抑制効果の評価）を行なった。操作は以下のようにして行った。【０１１４】
（Luc Assay）
HeLa細胞を4000 cell / mLになるように調整し、96 well plateの各wellに
100μLずつ入れ24時間培養した。合成したsiRNAのそれぞれの鎖をTE buffer （100mM NaCl） に溶解し、95℃で3分間過熱後、1時間放置し常温に戻した。このsiRNA各量、培地（OPTI-MEM)各量、0.2μg/μL psi-CHECK(Fire fly、Renilla各々のseqenceを持つベクター） 1μL、transfast （トランスフェクション試薬） 3μLを総量350μLになるように混合し、培地を吸い出した96 well plateの各wellに35μLずつ入れ、1時間後培地を100μL加えて24時間培養した。lysis bufferを各wellに100μLずつ加え振とうした。発光測定用の96 well plateにサンプル24μLを移し、Dual glo substrate （Fire flyの基質） 24μLを加え10分放置後、Fire fly luciferaseを測定した。その後、Stop and glo substrate 24μLを加え10分放置後、Renilla luciferaseを測定した。Renilla luciferaseの値をFire fly luciferaseの値で割り、％ of controlを用いて比較した。なお、luciferase測定には、Luminescenser JNRIIを使用した。なお、siRNAをトランスフェクションしていない状態をコントロールとし100％とした。結果を図２７に示す。【０１１５】
図２７に示すように、Dual Luciferase Assayの結果、今回合成したsiRNAはいずれも低濃度でnormal typeのsiRNA（図２７におけるｄＴｄＴ）よりも活性を示すことが分かった。なかでも、ＢＮタイプ（ガイド鎖の３’末端に単位Ｂ及び単位Ｎをそれぞれ１個を有し、パッセンジャー鎖の５’末端に単位Ｎ１個、３’末端に単位Ｂを２個備えるｓｉＲＮＡ）が極めて良好なｓｉＲＮＡ効果を示した。このことは、ＢＮタイプ及びＮＮタイプのｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を意味しているものと考えられた。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２８】
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【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２０】
2010055789.tif 000036
【図２１】
2010055789.tif 000037
【図２２】
2010055789.tif 000038
【図２３】
2010055789.tif 000039
【図２４】
2010055789.tif 000040
【図２５】
2010055789.tif 000041
【図２６】
2010055789.tif 000042
【図２７】
2010055789.tif 000043
【手続補正書】
【提出日】平成22年10月15日(2010.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（１）で表される複数のヌクレオチド誘導体単位を備えるラベル化剤。
【化７】
2010055789.tif 000044
（ただし、式（１）中、Ｚは、窒素原子又はＣＨを表し、Ｙは、縮合していない芳香族系炭化水素基又は縮合多環系炭化水素基（ただし、ピリミジン骨格又はプリン骨格を含む天然塩基を除く。）を含む蛍光色素を表し、Ｘ１は、Ｏ、Ｓ又はＳｅを表し、Ｘ２は、ＳＨ（若しくはＳ−）、Ｓ又はＳｅ−、炭素数１〜４個のアルキル基又はモルホリノ基を表す。）
【請求項２】
前記Ｙは、縮合多環系炭化水素基である、請求項１に記載のラベル化剤。
【請求項３】
前記Ｙは、ナフタレン、フェナントレン、ピレン及びペリレンからなる群から選択される、請求項２に記載のラベル化剤。
【請求項４】
複数の前記ヌクレオチド誘導体単位を連続して備える、請求項１〜３のいずれかに記載のラベル化剤。
【請求項５】
複数の前記ヌクレオチド誘導体単位をリンカー単位を介して備える、請求項１〜３のいずれかに記載のラベル化剤。
【請求項６】
複数の前記ヌクレオチド単位は、前記Ｙが互いに同一又は異なる２つのヌクレオチド誘導体単位であり、これらを連続して備える、請求項１〜５のいずれかに記載のラベル化剤。
【請求項７】
以下の式（１）で表される、複数のヌクレオチド誘導体単位；
【化８】
2010055789.tif 000045
（ただし、式（１）中、Ｚは、窒素原子又はＣＨを表し、Ｙは、縮合していない芳香族系炭化水素基又は縮合多環系炭化水素基（ただし、ピリミジン骨格又はプリン骨格を含む天然塩基を除く。）を含む蛍光色素を表し、Ｘ１は、Ｏ、Ｓ又はＳｅを表し、Ｘ２は、ＳＨ（若しくはＳ−）、Ｓ又はＳｅ−、炭素数１〜４個のアルキル基又はモルホリノ基を表す。）
を備え、前記複数のヌクレオチド誘導体単位が有する前記Ｙの配列が互いに異なる２種以上のラベル化剤を含む、ラベル化剤のセット。
【請求項８】
さらに、上記式（１）で表される１個のヌクレオチド誘導体単位を備える、ラベル化剤を含む、請求項７に記載のラベル化剤のセット。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
以下の式（１）で表される、複数のヌクレオチド誘導体単位を備える、ラベル化されたオリゴヌクレオチドプローブ。
2010055789.tif 000046
［化１０］
（ただし、式（１）中、Ｚは、窒素原子又はＣＨを表し、Ｙは、縮合していない芳香族系炭化水素基又は縮合多環系炭化水素基（ただし、ピリミジン骨格又はプリン骨格を含む天然塩基を除く。）を含む蛍光色素を表し、Ｘ１は、Ｏ、Ｓ又はＳｅを表し、Ｘ２は、ＳＨ（若しくはＳ−）、Ｓ又はＳｅ−、炭素数１〜４個のアルキル基又はモルホリノ基を表す。）
【請求項１２】
前記複数のヌクレオチド誘導体単位を、その３’末端側又は５’末端側に備える、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１３】
以下の式（１）で表される、複数のヌクレオチド誘導体単位；
【化１１】
2010055789.tif 000047
（ただし、式（１）中、Ｚは、窒素原子又はＣＨを表し、Ｙは、縮合していない芳香族系炭化水素基又は縮合多環系炭化水素基（ただし、ピリミジン骨格又はプリン骨格を含む天然塩基を除く。）を含む蛍光色素を表し、Ｘ１は、Ｏ、Ｓ又はＳｅを表し、Ｘ２は、ＳＨ（若しくはＳ−）、Ｓ又はＳｅ−、炭素数１〜４個のアルキル基又はモルホリノ基を表す。）
を備え、前記複数のヌクレオチド誘導体単位が有する前記Ｙの配列が互いに異なる２種以上のラベル化されたオリゴヌクレオチドプローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１４】
さらに、上記式（１）で表される１個のヌクレオチド誘導体単位を備える、ラベル化剤を含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
【手続補正書】
【提出日】平成23年5月13日(2011.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（１）で表される複数のヌクレオチド誘導体単位を備えるラベル化剤。
【化７】
2010055789.tif 000048
（ただし、式（１）中、Ｚは、窒素原子又はＣＨを表し、Ｙは、縮合していない芳香族系炭化水素基又は縮合多環系炭化水素基（ただし、ピリミジン骨格又はプリン骨格を含む天然塩基を除く。）を含む蛍光色素を表し、Ｘ1は、Ｏ、Ｓ又はＳｅを表し、Ｘ2は、ＳＨ（若しくはＳ−）、Ｓ又はＳｅ−、炭素数１〜４個のアルキル基又はモルホリノ基を表す。）
【請求項２】
前記Ｙは、縮合多環系炭化水素基である、請求項１に記載のラベル化剤。
【請求項３】
前記Ｙは、ナフタレン、フェナントレン、ピレン及びペリレンからなる群から選択される、請求項２に記載のラベル化剤。
【請求項４】
複数の前記ヌクレオチド誘導体単位を連続して備える、請求項１〜３のいずれかに記載のラベル化剤。
【請求項５】
複数の前記ヌクレオチド誘導体単位をリンカー単位を介して備える、請求項１〜３のいずれかに記載のラベル化剤。
【請求項６】
複数の前記ヌクレオチド単位は、前記Ｙが互いに同一又は異なる２つのヌクレオチド誘導体単位であり、これらを連続して備える、請求項１〜５のいずれかに記載のラベル化剤。
【請求項７】
以下の式（１）で表される、複数のヌクレオチド誘導体単位；
【化８】
2010055789.tif 000049
（ただし、式（１）中、Ｚは、窒素原子又はＣＨを表し、Ｙは、縮合していない芳香族系炭化水素基又は縮合多環系炭化水素基（ただし、ピリミジン骨格又はプリン骨格を含む天然塩基を除く。）を含む蛍光色素を表し、Ｘ1は、Ｏ、Ｓ又はＳｅを表し、Ｘ2は、ＳＨ（若しくはＳ−）、Ｓ又はＳｅ−、炭素数１〜４個のアルキル基又はモルホリノ基を表す。）
を備え、前記複数のヌクレオチド誘導体単位が有する前記Ｙの配列が互いに異なる２種以上のラベル化剤を含む、ラベル化剤のセット。
【請求項８】
さらに、上記式（１）で表される１個のヌクレオチド誘導体単位を備える、ラベル化剤を含む、請求項７に記載のラベル化剤のセット。
【請求項９】
以下の式（１）で表される、複数のヌクレオチド誘導体単位を備える、ラベル化されたオリゴヌクレオチドプローブ。
【化１０】
2010055789.tif 000050
（ただし、式（１）中、Ｚは、窒素原子又はＣＨを表し、Ｙは、縮合していない芳香族系炭化水素基又は縮合多環系炭化水素基（ただし、ピリミジン骨格又はプリン骨格を含む天然塩基を除く。）を含む蛍光色素を表し、Ｘ1は、Ｏ、Ｓ又はＳｅを表し、Ｘ2は、ＳＨ（若しくはＳ−）、Ｓ又はＳｅ−、炭素数１〜４個のアルキル基又はモルホリノ基を表す。）
【請求項１０】
前記複数のヌクレオチド誘導体単位を、その３’末端側又は５’末端側に備える、請求項９に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１１】
以下の式（１）で表される、複数のヌクレオチド誘導体単位；
【化１１】
2010055789.tif 000051
（ただし、式（１）中、Ｚは、窒素原子又はＣＨを表し、Ｙは、縮合していない芳香族系炭化水素基又は縮合多環系炭化水素基（ただし、ピリミジン骨格又はプリン骨格を含む天然塩基を除く。）を含む蛍光色素を表し、Ｘ1は、Ｏ、Ｓ又はＳｅを表し、Ｘ2は、ＳＨ（若しくはＳ−）、Ｓ又はＳｅ−、炭素数１〜４個のアルキル基又はモルホリノ基を表す。）
を備え、前記複数のヌクレオチド誘導体単位が有する前記Ｙの配列が互いに異なる２種以上のラベル化されたオリゴヌクレオチドプローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１２】
さらに、上記式（１）で表される１個のヌクレオチド誘導体単位を備える、ラベル化剤を含む、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドプローブセット。
【国際調査報告】
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