(57)【要約】 薬物代謝物の構造解析と定量分析の両方が可能であり、しかも標準品がない化合物や未知の化合物を含めて網羅的に分析できる方法および装置の提供。 代謝物のＲＩ定量分析と質量分析のマスクロマトグラムの定量分析を行い両分析結果の関係から、代謝物についての質量分析におけるイオン化効率を補正することにより、標準品の入手が困難な代謝物や未知代謝物について、質量分析により網羅的に代謝物を定量する方法及び本方法を実現するための装置を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むことを特徴とする、代謝物の定量分析方法。
工程１）ＲＩ標識化合物の代謝物を含む生物試料中の成分を分離する工程
工程２）工程１）で分離して得られる成分の放射能量を測定する工程
工程３）工程１）で分離して得られる成分の質量電荷比を測定し、質量分析強度を測定する工程
工程４）工程２）及び３）で得られる測定値から代謝物のイオン化効率に関する補正係数Ｉを求める工程
工程５）工程１）のＲＩ標識化合物又は該化合物のＲＩ非標識体、及び該化合物の代謝物を含む可能性のある、工程１）で使用した試料とは別異の生物試料中の成分を分離する工程
工程６）工程５）で分離して得られる代謝物の質量電荷比を測定し、質量分析強度を測定する工程
工程７）工程６）で得た質量分析強度と工程４）で求めた補正係数Ｉを使用して、工程５）で分離された代謝物の濃度を定量する工程
【請求項２】
工程５）により分離された代謝物の濃度Ｍｘを、以下の補正係数ＩＡ１を用いて下記式（Ａ１）により求める、請求項１に記載の定量分析方法。
補正係数ＩＡ１＝ＲＩＭｘ／Ｉｘ
ＲＩＭｘ：工程２）により得られる代謝物の放射能量
Ｉｘ：工程３）により得られる代謝物の質量分析強度
工程５）により分離された代謝物の濃度Ｍｘ＝ＵＩｘ×ＩＡ１×Ｒ・・・式（Ａ１）
ＵＩｘ：工程５）により分離された代謝物の質量分析強度
Ｒ：ＲＩ標識化合物の比放射能量
【請求項３】
工程５）により分離された代謝物の濃度Ｃｍ１を、以下の補正係数ＩＡ２を用いて下記式（Ａ２）により求める、請求項１に記載の定量分析方法。
補正係数ＩＡ２＝ｆｍ／ｆｕ
ｆｍ／ｆｕ＝（Ｍｍ／Ｍｕ）／（Ｒｍ／Ｒｕ）
ｆｍ／ｆｕ：未変化体（ｕ）と代謝物（ｍ）それぞれのイオン化効率の比
Ｍｍ：工程３）により得られる代謝物（ｍ）の質量分析強度
Ｍｕ：工程３）により得られる未変化体（ｕ）の質量分析強度
Ｒｍ：工程２）により得られる代謝物（ｍ）の放射能量
Ｒｕ：工程２）により得られる未変化体（ｕ）の放射能量
工程５）により分離された代謝物の濃度Ｃｍ１＝Ｍｍ１×ＩＡ２×Ｃｃａｌ・・・式（Ａ２）
Ｍｍ１：工程５）により分離された代謝物の質量分析強度
Ｃｃａｌ：未変化体（ｕ）の検量線より得られる、未変化体濃度（Ｃｕ）/未変化体質量分析強度（Ｍｕ)
【請求項４】
質量分析強度がマスクロマトグラムより得られるピーク面積値又はピーク面積比である請求項１又は２に記載の定量分析方法。
【請求項５】
工程１）〜４）があらかじめ行われて算出された補正係数Ｉがライブラリに保存されており、当該ライブラリよりＩを引用して、工程５）〜７）を行う請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
工程１）の分離がＨＰＬＣによるものである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程３）の質量電荷比の測定及び質量分析強度の測定がＬＣ／ＭＳ又はＬＣ／ＭＳｎ（液体クロマトグラフ−多段階タンデム質量分析）により行われるものである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＬＣ／ＭＳｎがＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフ−タンデム質量分析）である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
代謝物が未知の化合物又は標準品の無い化合物である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
代謝物が薬物動態試験により得られる代謝物である請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
薬物動態試験がマイクロドーズ試験である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
薬物動態試験が代謝物安全性試験（Safety Testing of Drug Metabolites）である請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
工程１）の分離が、放射能量測定用と質量電荷比測定用とで別々に行われる請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法を用いて、網羅的に代謝物の定量を行う分析方法。
【請求項１５】
生物試料が、動物の体液又は、動物の細胞、組織及び該細胞、組織の部分又は、動物由来の代謝酵素である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
以下の手段を含む代謝物の定量装置。
ａ）生物試料中の代謝物を分離するための分離手段
ｂ）前記分離手段により分離された代謝物の放射能量を測定するＲＩ検出手段
ｃ）前記分離手段により分離された代謝物の質量電荷比を測定し、当該代謝物の質量分析強度を測定する質量分析手段
ｄ）代謝物のイオン化効率に関する補正係数Ｉを使用して代謝物の濃度を求めるための演算処理手段
【請求項１７】
ｄ）の演算処理手段が、Ｍｘ＝ＵＩｘ×ＩＡ１×Ｒの数式により代謝物の濃度Ｍｘを求めるものである請求項１６に記載の定量装置。
ＵＩｘ：補正係数ＩＡ１を求めるための生物試料とは別異の生物試料中の成分を分離して得られる代謝物についてｃ）の質量分析手段により測定して得られた質量分析強度
補正係数ＩＡ１＝ＲＩＭｘ／Ｉｘ
ＲＩＭｘ：該ＲＩ標識化合物の代謝物を含む生物試料をａ）の分離手段により分離して得られる代謝物についてｂ）のＲＩ検出手段を用いて測定した放射能量
Ｉｘ：ＲＩＭｘを求める代謝物についてｃ）の質量分析手段により測定して得られた質量分析強度
Ｒ：ＲＩ標識化合物の比放射能量
【請求項１８】
ｄ）の演算処理手段が、Ｃｍ１＝Ｍｍ１×ＩＡ２×Ｃｃａｌの数式により代謝物の濃度Ｃｍ１を求めるものである請求項１６に記載の定量装置。
Ｍｍ１：補正係数ＩＡ２を求めるための生物試料とは別異の生物試料中の成分を分離して得られる代謝物についてｃ）の質量分析手段により測定して得られた質量分析強度
補正係数ＩＡ２＝ｆｍ／ｆｕ
ｆｍ／ｆｕ＝（Ｍｍ／Ｍｕ）／（Ｒｍ／Ｒｕ）
ｆｍ／ｆｕ：未変化体（ｕ）と代謝物（ｍ）それぞれのイオン化効率の比
Ｍｍ：ａ）の分離手段により分離して得られる代謝物（ｍ）についてｃ）の質量分析手段により分析して得られる質量分析強度
Ｍｕ：ａ）の分離手段により分離して得られる未変化体（ｕ）についてｃ）の質量分析手段により分析して得られる質量分析強度
Ｒｍ：Ｍｍを求める代謝物（ｍ）についてｂ）のＲＩ検出手段を用いて測定した放射能量
Ｒｕ：Ｍｕを求める未変化体（ｕ）についてｂ）のＲＩ検出手段を用いて測定した放射能量
Ｃｃａｌ：未変化体（ｕ）の検量線より得られる、未変化体濃度（Ｃｕ）/未変化体質量分析強度（Ｍｕ)
【請求項１９】
さらにｅ）補正係数Ｉを保存しておくライブラリを有する請求項１６〜１８のいずれかに記載の定量装置。
【請求項２０】
ａ）の分離手段が高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である請求項１６〜１９のいずれかに記載の定量装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物代謝物の定量分析方法及び分析装置に関する。特にＲＩ定量分析と質量分析とを組み合わせた新たな定量分析方法及び分析装置に関する。さらに、このような新規な定量分析方法を用いて薬物代謝物を網羅的に分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、メタボロミクスやマイクロドーズ（ＭＤ）臨床試験など生体内における代謝物の網羅的な分析が非常に重要となっている。
メタボロミクスとは、生体中の低分子化合物をはじめとする代謝物（メタボローム）の分析を行うことをいい、生体機能に関する価値ある情報が得られるとして研究がさかんに行われている。
ＭＤ臨床試験とは、ヒトにおいて薬理作用を発現すると推定される投与量の１／１００を超えない用量又は１００μｇのいずれか少ない用量の被験物質を、健康な被験者に単回投与することにより行われる臨床試験をいう。本試験に関して日本では、平成２０年６月３日に「マイクロドーズ臨床試験の実施に関するガイダンス」（薬食審査発第063001号）が、厚生労働省医薬食品局審査管理課長より各都道府県衛生主管部（局）長宛てに通知された。該ガイダンスは、厚生労働大臣の検討会報告書「有効で安全な医薬品を迅速に提供するための検討会報告書（平成１９年７月）」を受けて取りまとめられた指針であって、その目的は被験物質のヒトにおける薬物動態に関する情報を医薬品の臨床開発の初期段階に得ることとしている。そして、具体的には被験物質の吸収や血中動態、排泄特性、ヒトにおける代謝プロファイル等を明らかにすること、等と記載されている。
さらに、平成２０年２月にアメリカ食品医薬局（U.S. Food and Drug Administration；FDA）から’Safety Testing of Drug Metabolites（STDM）’のガイダンスが発令された。これによれば、新薬の研究開発の初期に、候補化合物の代謝物でヒトに特有の代謝物、又は、動物よりヒトで多くかつ未変化体のＡＵＣ（area under the blood concentration time curve；薬物血中濃度−時間曲線下面積）で１０％以上の代謝物、全てについて代謝物の４種類の毒性試験が必要であるとされている。
以上のように、生体内の薬物代謝物を分析する方法においては公知の代謝物のみならず、未知の代謝物についても、単なる存在の検出だけでなく、構造解析と定量分析が必要であり、しかも生体内における非常に微量な複数の未知代謝物の測定をより正確に、高感度で網羅的に分析できる方法の実用化が期待されている。【０００３】
現在、薬物代謝物の網羅的分析方法としては、本発明者らによるSRM datadependent exclusion measurement（非特許文献１）や測定データに基づき薬物代謝物を網羅的に検索し構造解析する方法（非特許文献２）、又は、質量分析機器メーカーが質量分析装置に付属するソフト、例えばMetworks（Thermo Fisher Scientific社；同社のホームページ：http://www.thermofisher.co.jp/05product1/c_ms/08metworks.htm）を用いて行う網羅的薬物代謝物の検索などが知られている。
これらの方法は、ミクロソームやヘパトサイトおよび組織スライス又はホモジネートを使ったin vitro代謝試験、動物の薬物動態試験および臨床試験での薬物代謝物を網羅的に検索し構造解析する際に使用されている。
また、ＭＤ臨床試験での薬物の血漿中濃度は、一般に数１００ｐｇ／ｍＬから数ｐｇ／ｍＬであり、現在、定量機器はＡＭＳ（加速器質量分析装置）、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフ−タンデム質量分析）、ＰＥＴ（ポジトロン断層法）が使用されている（非特許文献３）が、これらの中で、ＭＤ試験で薬物代謝物の構造解析ができるのはＬＣ／ＭＳ／ＭＳのみである。
このほかに、薬物代謝物の定量機器として、液体シンチレーション法に対応した放射性同位体（ＲＩ）標識化合物定量装置があげられる。これは、ＨＰＬＣとＲＩ（β線計数）検出器を組み合わせた装置であって、ＲＩ標識化合物を投与して得られる該ＲＩ標識化合物の代謝物を分離して得られるクロマトグラムのＲＩピーク強度から該代謝物の放射能量を測定することにより、該代謝物の濃度を求めることができる。
なお、本明細書では、「放射性同位体をＲＩ」と、「放射性同位体標識化合物をＲＩ標識化合物」と、「放射性同位体非標識化合物をＲＩ非標識化合物」と、「ＲＩ標識化合物又はＲＩ非標識化合物のいずれか一方を選択できる場合、ＲＩ標識化合物等」と、「放射性同位体定量装置をＲＩ定量装置（この場合、ＡＭＳ法やβ線計数法など定量方法のいかんを問わない）」と、それぞれいうことがある。    
【非特許文献１】Drug Metabol. Pharmacokin., 18(6):390-403 (2003)
【非特許文献２】Drug Metabol. Pharmacokin., 17(4):316-339 (2002)
【非特許文献３】Clin Eval., 33(3):649-677 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記従来の分析方法には、次のような問題があった。
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳは、イオン化された測定対象分子を２段階質量分析（本明細書において、液体クロマトグラフあるいは液体クロマトグラフィーをＬＣ、質量分析をＭＳということがある）で選別するため選択性が高く、高感度に定量することができ、構造解析にも用いられている。しかし、イオン化効率は化合物によって異なるため、質量分析のデータに基づき定量するためには、化合物それぞれの標準品を用いて化合物それぞれのイオン化効率が反映された検量線を作成する必要がある。従って、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを利用した定量分析には標準品が必要であるため、標準品が準備できない化合物や未知の代謝物の定量は出来ず、薬物代謝物の網羅的分析（定量）には向かないことになる。
一方、ＲＩ定量装置による定量は、代謝物量を放射能量として得ることができるため絶対的な濃度が得られるというメリットはあるものの、定量感度はＬＣ／ＭＳに比べて低く、また、代謝物の構造解析（定性）はできないため、こちらも薬物代謝物の網羅的な分析には向かないことになる。
このように、薬物代謝物の構造解析と定量分析の両方が可能であり、しかも標準品がない化合物や未知の化合物を含めて網羅的に分析できる方法および装置はこれまでに存在しなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ＲＩ定量分析と質量分析を組み合わせることで、標準品の入手が困難な代謝物や未知代謝物の構造解析と定量が簡便にできることを見出し、本発明を完成するに至った。
一般に、一つの未変化体から生成される一連の代謝物群は、質量分析において共通のｍ／ｚフラグメントイオンを有し類似のフラグメンテーションをする。本発明者らは、その特徴を利用して代謝物のＲＩ定量分析と質量分析のマスクロマトグラムの定量分析を行い両分析結果の関係から、代謝物についての質量分析におけるイオン化効率を補正することにより、標準品の入手が困難な代謝物や未知代謝物について、質量分析により網羅的に代謝物を定量する方法を確立した。
具体的には、本発明は以下の構成を有する。
＜１＞以下の工程を含むことを特徴とする、代謝物の定量分析方法。
工程１）ＲＩ標識化合物の代謝物を含む生物試料中の成分を分離する工程
工程２）工程１）で分離して得られる成分の放射能量を測定する工程
工程３）工程１）で分離して得られる成分の質量電荷比を測定し、質量分析強度を測定する工程
工程４）工程２）及び３）で得られる測定値から代謝物のイオン化効率に関する補正係数Ｉを求める工程
工程５）工程１）のＲＩ標識化合物又は該化合物のＲＩ非標識体、及び該化合物の代謝物を含む可能性のある、工程１）で使用した試料とは別異の生物試料中の成分を分離する工程
工程６）工程５）で分離して得られる代謝物の質量電荷比を測定し、質量分析強度を測定する工程
工程７）工程６）で得られた質量分析強度と工程４）で求めた補正係数Ｉを使用して、工程５）で分離された代謝物の濃度を定量する工程
＜２＞工程５）により分離された代謝物の濃度Ｍｘを、以下の補正係数ＩＡ１を用いて下記式（Ａ１）により求める、前記＜１＞に記載の定量分析方法。
補正係数ＩＡ１＝ＲＩＭｘ／Ｉｘ
ＲＩＭｘ：工程２）により得られる代謝物の放射能量
Ｉｘ：工程３）により得られる代謝物の質量分析強度
工程５）により分離された代謝物の濃度Ｍｘ＝ＵＩｘ×ＩＡ１×Ｒ    ・・・式（Ａ１）
ＵＩｘ：工程５）により分離された代謝物の質量分析強度
Ｒ：ＲＩ標識化合物の比放射能量
＜３＞工程５）により分離された代謝物の濃度Ｃｍ１を、以下の補正係数ＩＡ２を用いて下記式（Ａ２）により求める、前記＜１＞に記載の定量分析方法。
補正係数ＩＡ２＝ｆｍ／ｆｕ
ｆｍ／ｆｕ＝（Ｍｍ／Ｍｕ）／（Ｒｍ／Ｒｕ）
ｆｍ／ｆｕ：未変化体（ｕ）と代謝物（ｍ）それぞれのイオン化効率の比
Ｍｍ：工程３）により得られる代謝物（ｍ）の質量分析強度
Ｍｕ：工程３）により得られる未変化体（ｕ）の質量分析強度
Ｒｍ：工程２）により得られる代謝物（ｍ）の放射能量
Ｒｕ：工程２）により得られる未変化体（ｕ）の放射能量
工程５）により分離された代謝物の濃度Ｃｍ１＝Ｍｍ１×ＩＡ２×Ｃｃａｌ・・・式（Ａ２）
Ｍｍ１：工程５）により分離された代謝物の質量分析強度
Ｃｃａｌ：未変化体（ｕ）の検量線より得られる、未変化体濃度（Ｃｕ）/未変化体質量分析強度（Ｍｕ)
＜４＞質量分析強度がマスクロマトグラムより得られるピーク面積値又はピーク面積比である前記＜１＞又は＜２＞に記載の定量分析方法。
＜５＞工程１）〜４）があらかじめ行われて算出された補正係数Ｉがライブラリに保存されており、当該ライブラリよりＩを引用して、工程５）〜７）を行う前記＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の方法。
＜６＞工程１）の分離がＨＰＬＣによるものである前記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の方法。
＜７＞工程３）の質量電荷比の測定及び質量分析強度の測定がＬＣ／ＭＳ又はＬＣ／ＭＳｎ（液体クロマトグラフ−多段階タンデム質量分析）により行われるものである前記＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の方法。
＜８＞ＬＣ／ＭＳｎがＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフ−タンデム質量分析）である前記＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の方法。
＜９＞代謝物が未知の化合物又は標準品の無い化合物である前記＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の方法。
＜１０＞代謝物が薬物動態試験により得られる代謝物である前記＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の方法。
＜１１＞薬物動態試験がマイクロドーズ試験である前記＜１０＞に記載の方法。
＜１２＞薬物動態試験が代謝物安全性試験（Safety Testing of Drug Metabolites）である前記＜１０＞に記載の方法。
＜１３＞工程１）の分離工程が、放射能量測定用と質量電荷比測定用とで別々に行われる前記＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載の方法。
＜１４＞前記＜１＞〜＜１３＞のいずれかに記載の方法を用いて、網羅的に代謝物の定量を行う分析方法。
＜１５＞生物試料が、動物の体液又は、動物の細胞、組織及び該細胞、組織の部分又は、動物由来の代謝酵素である、前記＜１＞〜＜１４＞のいずれかに記載の方法。
＜１６＞以下の手段を含む代謝物の定量装置。
ａ）生物試料中の代謝物を分離するための分離手段
ｂ）前記分離手段により分離された代謝物の放射能量を測定するＲＩ検出手段
ｃ）前記分離手段により分離された代謝物の質量電荷比を測定し、当該代謝物の質量分析強度を測定する質量分析手段
ｄ）代謝物のイオン化効率に関する補正係数Ｉを使用して代謝物の濃度Ｍｘ又はＣｍ１を求めるための演算処理手段
＜１７＞ｄ）の演算処理手段が、Ｍｘ＝ＵＩｘ×ＩＡ１×Ｒの数式により代謝物の濃度Ｍｘを求めるものである前記＜１６＞に記載の定量装置。
ＵＩｘ：補正係数ＩＡ１を求めるための生物試料とは別異の生物試料中の成分を分離して得られる代謝物についてｃ）の質量分析手段により測定して得られた質量分析強度
補正係数ＩＡ１＝ＲＩＭｘ／Ｉｘ
ＲＩＭｘ：該ＲＩ標識化合物の代謝物を含む生物試料をａ）の分離手段により分離して得られる代謝物についてｂ）のＲＩ検出手段を用いて測定した放射能量
Ｉｘ：ＲＩＭｘを求める代謝物についてｃ）の質量分析手段により測定して得られた質量分析強度
Ｒ：ＲＩ標識化合物の比放射能量
＜１８＞ｄ）の演算処理手段が、Ｃｍ１＝Ｍｍ１×ＩＡ２×Ｃｃａｌの数式により代謝物の濃度Ｃｍ１を求めるものである前記＜１６＞に記載の定量装置。
Ｍｍ１：補正係数ＩＡ２を求めるための生物試料とは別異の生物試料中の成分を分離して得られる代謝物についてｃ）の質量分析手段により測定して得られた質量分析強度
補正係数ＩＡ２＝ｆｍ／ｆｕ
ｆｍ／ｆｕ＝（Ｍｍ／Ｍｕ）／（Ｒｍ／Ｒｕ）
ｆｍ／ｆｕ：未変化体（ｕ）と代謝物（ｍ）それぞれのイオン化効率の比
Ｍｍ：ａ）の分離手段により分離して得られる代謝物（ｍ）についてｃ）の質量分析手段により分析して得られる質量分析強度
Ｍｕ：ａ）の分離手段により分離して得られる未変化体（ｕ）についてｃ）の質量分析手段により分析して得られる質量分析強度
Ｒｍ：Ｍｍを求める代謝物（ｍ）についてｂ）のＲＩ検出手段を用いて測定した放射能量
Ｒｕ：Ｍｕを求める未変化体（ｕ）についてｂ）のＲＩ検出手段を用いて測定した放射能量
Ｃｃａｌ：未変化体（ｕ）の検量線より得られる、未変化体濃度（Ｃｕ）/未変化体質量分析強度（Ｍｕ)
＜１９＞さらにｅ）補正係数Ｉを保存しておくライブラリを有する前記＜１６＞〜＜１８＞のいずれかに記載の定量装置。
＜２０＞ａ）の分離手段が高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である前記＜１６＞〜＜１９＞のいずれかに記載の定量装置。  
【発明の効果】
【０００６】
本発明の定量分析方法によれば、代謝物の分析において、標準品の入手が困難な代謝物や未知の代謝物であっても、構造解析と定量の両方を行うことができ、代謝物の網羅的分析が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（測定原理）
本発明による未知代謝物の定量分析は、ＲＩ標識化合物又はＲＩ非標識化合物（以下、ＲＩ標識化合物等）を動物に投与して得られる代謝物を含む試料、又は、ＲＩ標識化合物等を細胞や組織（該細胞や組織を構成する成分、例えば、細胞膜や細胞質画分、更には酵素なども含む。以下、細胞等ということがある）に添加し、反応させて得られる代謝物を含む試料（以下、本明細書において、これらを生物試料という）を用い、以下の各工程を経て行われる。なお、本発明において未知代謝物とは、構造が未知である化合物のみならず、標準品が準備できない（入手困難な）化合物も含む（以下、同様）。本発明は、イオン化効率に関する補正係数Ｉを用いることにより、測定したい代謝物の質量分析強度を換算して定量値を得る方法である。具体的に以下の２つのアプローチを挙げて説明する。
なお、本明細書において「質量分析強度」あるいは「クロマトグラム強度」の語は、クロマトグラフィーにより分離され、質量分析において質量電荷比により同定された化合物の、マスクロマトグラムにおける存在量の指標、例えばピーク面積値又はピーク面積比等を指している。そして「質量分析強度比」あるいは「クロマトグラム強度比」と表記した場合には内標準法による比率を、「質量分析強度値」あるいは「クロマトグラム強度値」と表記した場合には、測定された強度それ自体を指している。また同様の意味で「ピーク面積比」あるいは「ピーク面積値」と表記する場合もある。  【０００８】
＜未知代謝物濃度（Ｍｘ）の定量分析方法：アプローチ１＞
本発明の定量分析方法の典型例の一つとして、後述する実施例の操作等に即して記載する。  【０００９】
工程（１）
未知代謝物放射能量（ＲＩＭｘ：ｄｐｍ／ｍＬ）の算出
生物試料（ここではＲＩ標識化合物を動物に投与又は細胞等に添加することにより得られた試料）を採取した後、液体シンチレーションカウンター（以下、ＬＳＣ）を用いて総放射能量を測定する（総ＲＩ：ここではｄｐｍ）。別途同一の生物試料を所望により前処理した後、放射能検出器付液体クロマトグラフ（以下、ＨＰＬＣ−ＲＡＤ）により分析し、定量対象とする代謝物（未知代謝物）のクロマトグラム上の％存在量（Ｃｘ）を算出する。次いで、該未知代謝物の放射能量（ＲＩＭｘ：ｄｐｍ／ｍＬ）を以下の式により算出する（式１）。
ＲＩＭｘ＝総ＲＩ×Ｃｘ×Ｆａ／１００・・・（式１）
（Ｆａ：試料前処理時の回収率、濃縮率、分析量により補正する項）  【００１０】
工程（２）
質量分析強度比（Ｉｘ）の算出
工程（１）で未知代謝物放射能量の算出に用いたのと同一の生物試料を前処理したのち、質量分析装置付液体クロマトグラフ（以下、ＬＣ／ＭＳ）により分析し、ＭＳ（もしくはＭＳ／ＭＳ）クロマトグラムを得る。測定は内標準法により行い、内標準物質のクロマトグラム強度値に対する定量対象とする代謝物のクロマトグラム強度値の比（Ｉｘ）を得る。
なお、前記内標準法により測定を行う場合は、あらかじめ、代謝物を含む生物試料に内標準物質を一定濃度になるように添加して、ＨＰＬＣで分離することになる。  【００１１】
工程（３）
補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比）の算出
工程（１）にて得られた未知代謝物放射能量（ＲＩＭｘ）を工程（２）にて得られた質量分析強度比（Ｉｘ）で除して、補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比）を得る（式２）。
ＩＡ１＝ＲＩＭｘ／Ｉｘ・・・（式２）
以上、工程（１）〜（３）が、工程（４）における実試料測定のための前工程である。
（なお、前工程の語句の意味するところは、工程（４）を実施する際に必要になる程度の意味であって、工程（４）を実施する前に完了していなければならないなどの限定を付すものではない。以下同様。）  【００１２】
工程（４）
ＬＣ／ＭＳによる実試料中の未知代謝物濃度（Ｍｘ）の定量
工程（１）のＲＩ標識化合物又は該化合物のＲＩ非標識体、及び該化合物の代謝物を含む可能性のある、工程（１）で使用した試料とは別異の生物試料（実試料）について、工程（２）と同様に分離・分析し、内標準物質のクロマトグラム強度値に対する定量対象とする代謝物（未知代謝物）のクロマトグラム強度値の比（ＵＩｘ）を算出する。得られたクロマトグラム強度値の比に工程（３）にて得られたＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比）を乗じて放射能量を算出し、さらにＲＩ標識化合物の比放射能量（Ｒ）を乗じることで未知代謝物の定量値（ｎｇ／ｍＬ、ｐｇ／ｍＬ等）を算出する（式３）。
Ｍｘ＝ＵＩｘ×ＩＡ１×Ｒ・・・（式３）  【００１３】
このようにすることにより、実試料中の未知代謝物について、該未知代謝物について検量線を作成することなく、定量することができる。すなわち、標準品の入手が困難な代謝物やイオン化効率が不明な代謝物であっても質量分析強度から、正確に濃度を測定することができる。  【００１４】
＜未知代謝物濃度（Ｃｍ１）の定量分析方法：アプローチ２＞
本発明の定量分析方法の典型例の一つとして、後述する実施例６の操作等に即して記載する。  【００１５】
工程（１）
未変化体と未知代謝物の放射能量（Ｒｕ、Ｒｍ）の測定
生物試料（ここではＲＩ標識化合物を動物に投与又は細胞等に添加することにより得られた試料）を採取し、該試料を所望により前処理した後、ＨＰＬＣ−ＲＡＤにより未変化体（ｕ）及び未知代謝物（ｍ）を分析し、それぞれの放射能量（Ｒｕ、Ｒｍ：ここでは計数率ｃｐｍ）を測定する。  【００１６】
工程（２）
未変化体と未知代謝物の質量分析強度（Ｍｕ、Ｍｍ）の測定
工程（１）で未知代謝物放射能量の測定に用いたのと同一の生物試料を前処理したのちＬＣ／ＭＳにより分析しＭＳ（もしくはＭＳ／ＭＳ）クロマトグラムを得る。得られたＭＳクロマトグラムから未変化体（ｕ）及び未知代謝物（ｍ）それぞれの質量分析強度（Ｍｕ、Ｍｍ：ここではピーク面積値）を得る。  【００１７】
工程（３）
未変化体と未知代謝物のイオン化効率の比（補正係数ＩＡ２：ｆｍ／ｆｕ）の算出
工程（１）、（２）の測定結果に基づき、未知代謝物（ｍ）と未変化体（ｕ）の放射能量の比（Ｒｍ／Ｒｕ）及び質量分析強度の比（Ｍｍ／Ｍｕ）を得、質量分析強度の比を放射能量の比で除して未知代謝物（ｍ）のイオン化効率ｆｍと未変化体（ｕ）のイオン化効率ｆｕの比（補正係数ＩＡ２：ｆｍ／ｆｕ）を算出する（式４）。
ｆｍ／ｆｕ＝（Ｍｍ／Ｍｕ）／（Ｒｍ／Ｒｕ）・・・（式４）
以上、工程（１）〜（３）が、工程（４）における実試料測定のための前工程である。【００１８】
工程（４）
ＬＣ／ＭＳによる実試料中の未知代謝物濃度（Ｃｍ１）の定量
工程（１）のＲＩ標識化合物又は該化合物のＲＩ非標識体、及び該化合物の代謝物を含む可能性のある、工程（１）で使用した生物試料とは別異の生物試料（実試料）について、工程（２）と同様に分離・分析し、定量対象とする代謝物（未知代謝物）の質量分析強度（Ｍｍ１：ここではピーク面積値）を測定する。Ｍｍ１に、ＩＡ２（ｆｍ／ｆｕ）及び検量線から得ることができる係数Ｃｃａｌ（(未変化体濃度：Ｃｕ）/（未変化体質量分析強度：Ｍｕ)）を乗じることで未知代謝物（ｍ１）の濃度（Ｃｍ１）を算出する（式５）。
Ｃｍ１＝Ｍｍ１×ＩＡ２×Ｃｃａｌ・・・（式５）  【００１９】
上記算出の工程を展開すると以下である。
Ｃｕ（未変化体濃度）＝Ｍｕ×ｆｕ×Ｆ
（Ｍｕ：未変化体の質量分析強度）
（ｆｕ：未変化体のイオン化効率）
（Ｆ：試料前処理時の回収率、濃縮率、分析量により補正する項）
Ｃｍ１＝Ｍｍ１×ｆｍ×Ｆ
＝Ｍｍ１×（ｆｍ／ｆｕ）×ｆｕ×Ｆ
＝Ｍｍ１×（ｆｍ／ｆｕ）×（Ｃｕ／Ｍｕ）
＝（ｆｍ／ｆｕ）×Ｍｍ１×Ｃｕ／Ｍｕ
（Ｍｍ１：実試料中の未知代謝物の質量分析強度）
（ｆｍ：未知代謝物のイオン化効率）【００２０】
このようにすることにより、実試料中の未知代謝物について、該未知代謝物の検量線を作成することなく、定量することができる。すなわち、標準品の入手が困難な代謝物やイオン化効率が不明な代謝物であっても質量分析強度から、正確に濃度を測定することができる。本アプローチ２によれば、生物試料中の未変化体及び代謝物の濃度を未変化体の検量線のみで定量することができる。【００２１】
上記アプローチ１の各パラメータをアプローチ２のパラメータに対照させて整理すると以下になる。
（アプローチ１）
Ｍｘ＝ＵＩｘ×ＩＡ１×Ｒ
をアプローチ２のパラメータに対照させると、
Ｃｍ１＝Ｍｍ１×（Ｒｍ／Ｍｍ）×ｕの分子量／ｕの放射比活性
（アプローチ２）
Ｃｍ１＝Ｍｍ１×（ｆｍ／ｆｕ）×Ｃｕ／Ｍｕ
このようにアプローチ１もアプローチ２も未知代謝物の質量分析強度に、イオン化効率を補正する係数を使用して濃度換算し、未知代謝物を定量することができる。【００２２】
先述したように、上記アプローチ１、アプローチ２の各記載は典型例として記載したものである。従って、各数式によって裏付けることが可能な定量分析方法はすべて本発明の範囲に含まれる。
上記のように各数式によって裏付けられることを限度として、本発明の定量分析方法に用いる未変化体や代謝物の測定数値は、単位や測定（算出）方法を適宜選択することができる（例えば、放射能量であれば、ｃｐｍ、ｄｐｍ、Ｂｑなど、質量分析強度であれば、ピーク面積値やピーク面積比など）。また前記測定数値は、本発明の定量分析方法において等価の意味を持つ別の数値に置き換えることも、当業者であれば当然に行い得る。
なお、本発明の定量分析方法の精度を担保する上で、アプローチ１，２のいずれにおいても、前工程：すなわち工程（１）〜（３）と、実試料測定のための工程：すなわち工程（４）における、質量分析は同一原理の同一装置で行うことが最も好ましい。前工程と実試料測定のための工程における質量分析を、別の原理の質量分析装置間で、あるいは同一原理であるが別の質量分析装置間で行う場合には、例えば測定間における未変化体のイオン化効率を比較するなどして、適切に測定値の補正を行う必要がある。  【００２３】
（対象試料）
本発明の分析対象試料としては、生物試料（薬物を動物に投与して得られる代謝物を含む試料、又は、薬物を細胞や組織に添加して反応処理して得られる代謝物を含む試料）が好適であるが、これに限定されない。前記動物以外に植物や微生物及びそれらの細胞や組織から得られる生物試料も本発明の分析対象試料である。
薬物を動物に投与して得られる代謝物を含む試料の代表的なものとして、動物の体液を挙げることができる。また、前記細胞の代表的なものとして、肝細胞（ヘパトサイト）や腫瘍細胞などを挙げることができる。これら細胞は新鮮採取されたものや凍結保存されたもの、さらには株化されたものであってもかまわず、この点は組織についても同様である。さらに該細胞や組織は、それらを構成する部分・成分、例えば、細胞であれば、細胞膜、ミクロソーム画分、細胞質画分など、組織であれば切片（組織スライス）などが使用可能である。またさらに前記細胞や組織を構成する部分・成分中に含有されている酵素なども本発明の分析対象となりうる。また、前記各分析対象は、ホモジネートや抽出物など、何らかの処理が施されたものであってもよい。  【００２４】
本発明において、代謝物とは、薬物を動物に投与して行うin vivo試験により得られる代謝物のほか、薬物を細胞、組織に添加して行うin  vitro試験により得られる代謝物も含み、また、発現系酵素などの酵素と薬物を反応させた反応産物もここでいう代謝物に含まれる。このように本発明では、薬物動態試験により得られる代謝物、例えば、マイクロドーズ試験や代謝物安全性試験（Safety Testing of Drug Metabolites）により得られる代謝物を好適な分析対象とすることができる。上記、代謝物が含まれる分析対象試料の具体例としては、全血、血清、血漿、尿、唾液、髄液、精液、前立腺液、胆汁、糞便などの動物の体液や、前記細胞、組織、酵素等によるin vitro試験の反応液を含む生物試料が好適である。本発明により分析して定量したい未知代謝物を含む生物試料と、該生物試料の定量を行うための前工程で使用する生物試料の関係をアプローチ１を例に説明すると以下になる。本発明を用いた定量の対象となる未知代謝物を含む生物試料と、その定量値（Ｍｘ）を算出するためにＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比）を求めるための代謝物を含む生物試料とは、異なる生物試料どうしであればよく、例えば、ヒトとヒト以外の動物、動物と動物、動物と動物の組織、動物と細胞もしくは酵素に投与・添加して得られる試料などのほか、同一動物から経時的に採取されたもの等も含む。
本発明を、植物の代謝物へ応用する場合には、農薬、落果剤等のＲＩ標識化合物を使用した薬物代謝、特定物質のＲＩ標識化合物を使用した植物のメタボロミクスに応用でき、微生物の代謝物へ応用する場合には、変異原物質（環境ホルモンなど）や遺伝子組み換えなどによって後天的に獲得することになった酵素の基質などの分析に応用することができる。  【００２５】
（薬物）
本発明でいう薬物とは、その代謝物を探索・同定・定量等をしたい薬物であり、新規医薬開発の候補化合物や、生物体内での代謝メカニズム研究に使用される化合物が挙げられる。これらの薬物は、放射性同位体により標識した化合物（ＲＩ標識化合物）あるいは非標識の化合物（非標識体）として動物に投与又は細胞、組織、酵素等に添加されて、その代謝物が分析される。前記したように本発明の薬物には、農薬、落下剤、変異原物質（環境ホルモンなど）、遺伝子組み換えなどによって後天的に獲得することになった酵素の基質等も含まれる。
本明細書において、未変化体あるいは代謝物の語の意味するところは、当業者が使用する通常の意味と同様である。表記の原則としては、動物に投与又は、細胞、組織に添加する時点の化学構造を有しているものを未変化体と表記し、投与又は添加された後に化学構造の一部が、酸化、加水分解、抱合などを受け未変化体と相違するに至った化合物を代謝物と表記しているが、未変化体及び代謝物が混在する場合などには両者を代表する語として代謝物の語を使用していることがある。また同様に「生物試料中の成分」などの語句中の「成分」の語も、未変化体及び代謝物を代表する語として使用していることがある。
また、未知代謝物の語は、化学構造が既知であったり、標準品が入手できるものであっても、本発明の概念を説明する上で、本発明の定量分析方法を使用して定量しようとする代謝物に相当するものにも付している。  【００２６】
（ライブラリ）
上記測定原理の説明で用いたアプローチ１のＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比）やアプローチ２のＩＡ２（ｆｍ／ｆｕ）は、あらかじめ求めておき、これをデータとしてライブラリに保存しておき、未知代謝物を定量する際にライブラリより該当データを引用して算出に用いることもできる。  【００２７】
（代謝物の分離）
本発明の定量分析方法で行われる代謝物の分離は、該分離工程に続く工程であるＲＩ定量分析や質量分析の工程に適用可能な状態に代謝物を他の成分と分離できる方法であればいずれでもよく、分離したい代謝物の特性に応じて、公知の各種クトマトグラフィー（ＧＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など）が使用できる。そのうちでもＨＰＬＣが望ましい。ここで、該分離工程に続く工程であるＲＩ定量分析や質量分析の工程に適用可能な状態に代謝物を分離できる、とは所望の精度でＲＩ定量分析や質量分析ができる程度に測定対象外の物質と分離されていることを意味し、分離されたものが、そのままＲＩ定量装置や質量分析装置に供しうることまでは要求しない。例えば、一旦フラクショネーションした後、該フラクションの溶媒の組成をＲＩ定量分析や質量分析に適合するものに変更させる等をしてもよい。ＨＰＬＣによる分離装置は、既存のＲＩ定量装置や質量分析装置における一部分として付帯されている場合が多いが、本発明では、ＲＩ定量装置のＲＩ検出部、質量分析装置の質量検出部とは別に１つの分離装置が用いられてもよい。つまり、分離装置は両分析に共通の装置であって、分離装置を出た代謝物が分岐管を通って一方はＲＩ検出部へ、もう一方は質量分析部へと導入されて測定されてもよい。分離工程を共通させずに、それぞれに設ける場合は、各分離工程で分離される代謝物の対応付けができるのであれば、分離条件を必ずしも同一にする必要はない。  【００２８】
（ＲＩ標識化合物）
本発明に用いられるＲＩ標識化合物の標識に用いられる放射性同位元素の核種としては３Ｈ、１４Ｃなど投与される動物に対する障害が許容されるものが挙げられる。
ＲＩ標識化合物の動物への投与量は、試験の目的に応じて適宜選択可能である。in vivo試験の場合、一般に最高無毒性用量以下であればよく、ＭＤ臨床試験であれば前述のとおり、ヒトにおいて薬理作用を発現すると推定される投与量の１／１００を超えない用量又は１００μｇのいずれか少ない用量が該当する。
また、ＲＩ標識化合物を組織、細胞、又は代謝酵素に添加して行うin vitro試験の場合も、試験の目的に応じて添加量を適宜選択可能である。  【００２９】
（ＲＩ定量装置）
本発明に用いられるＲＩ定量装置は、前記クロマトグラフィーにより分離されたＲＩ標識化合物を定量分析できるものであればいずれでもよく、ＨＰＬＣの検出器としてのＲＩ定量装置が挙げられる。ＲＩ定量装置の具体的な例としては、液体シンチレーション法に対応する装置、ＡＭＳに対応する装置を挙げることができる。  【００３０】
（質量分析装置）
本発明に用いられる質量分析装置は、前記クロマトグラフィーにより分離された成分の質量電荷比を測定し、質量電荷比で同定された化合物の質量分析強度に基づき定量分析ができるものであればいずれでもよいが、精密分析ができるものがより望ましく、例えばtriple stage quadorupole mass spectrometerのLC/MS/MS Precursor ion scan方式やMultiple Reaction Monitoring方式、LC LTQ Orbitrap（登録商標）のパラレルスキャン方式のものが挙げられる。ＭＤ臨床試験での被験薬物の血漿中濃度は一般に数１００ｐｇ／ｍＬから数ｐｇ／ｍＬであることを考慮すれば、定量限界は１ｐｇ／ｍＬ程度あることが望ましい。
またＬＣ／ＭＳあるいはＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフ−タンデム質量分析）、ＬＣ／ＭＳｎ（液体クロマトグラフ−多段階タンデム質量分析）のような多段階の質量分析を所望の定量感度や化学構造解析の精度に照らして適宜選択することができる。本明細書において、ＭＳｎの語は、ＭＳ／ＭＳを含む多段階タンデム質量分析の総称として使用することがある。【００３１】
本発明により試料中の代謝物を測定する場合、標準品が準備できる化合物と準備できない化合物が混在することがあるが、この場合、標準品が準備できる化合物については、従来の検量線を作成して定量する方法を採用し、標準品が準備できない化合物についてのみ本発明の定量分析方法を用いて測定することにより、代謝物を網羅的に定量分析することができる。また、代謝物すべてについて、本発明の定量分析方法を用いて測定することにより代謝物を網羅的に定量分析することもできる。アプローチ２で分析を行う場合には、未変化体の検量線を作成するのみでよく、また、前記未変化体に代えて代謝物で検量線を作成することも可能である。つまり、アプローチ２は、検量線を作成できる基準となる物質を用いて他の代謝物、特に未知の代謝物の濃度を定量する方法である。そのような基準となる物質としては、未変化体が最も好ましい例として挙げられるが、他に標準品の入手が容易な代謝物も本アプローチにおける基準となる物質に相当する。  【００３２】
（用途）
本発明の定量分析方法は、標準品の無い（入手することが困難な）化合物の定性及び定量分析に適しており、ＭＤ臨床試験やメタボロミクスなどの生体内における代謝物の網羅的な分析に用いられる。  【００３３】
（分析装置）
本発明の分析装置は、以下のａ）〜ｄ）の手段を有する装置であればよく、
ａ）試料中の代謝物を分離するための分離手段、
ｂ）前記分離手段により分離された代謝物の放射能量を測定するＲＩ検出手段、
ｃ）前記分離手段により分離された代謝物の質量電荷比を測定し、当該代謝物の質量分析強度を測定する質量分析手段、
ｄ）代謝物のイオン化効率に関する補正係数Ｉを使用して代謝物の濃度Ｍｘ又はＣｍ１を求めるための演算処理手段
これらは既存のＲＩ定量装置と質量分析装置と演算装置を組み合わせて作製することができる。例えば、既存の質量分析装置ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにＲＩ検出器を付帯してＨＰＬＣ分離後の代謝物成分のＲＩの定量ができるようにした、ＲＩ検出器付質量分析装置が該当する。【００３４】
（質量分析におけるマトリックス効果の軽減）
質量分析において、測定対象物（薬物の未変化体あるいは代謝物）の感度が、生物試料由来成分（例えば、タンパク質、核酸、培地など）を含む試料の場合に、生物試料由来成分を含まない試料（例えば、薬物や標準品が緩衝液などの溶媒に溶解されている標準試料）の場合と比較して、増大したり減少したりする現象が知られており、マトリックス効果（ｍａｔｒｉｘ  ｅｆｆｅｃｔ）と呼ばれている。このマトリックス効果は、測定対象物と共存する生物試料由来成分が、測定対象物のイオン化に影響をあたえることにより生ずると考えられており、例えば、検量線作成のための標準試料に、測定対象物を含まない生物試料由来成分（ブランク試料）を共存させるなどして、標準試料と実試料の組成を近づけることで軽減できる場合がある。本発明の方法においても、例えば、特表２００４−５１０９６１、特開２００８−０１４７４６などの記載を参照して適宜にマトリックス効果を軽減するための措置を行うことができる。
【実施例】
【００３５】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。  【００３６】
〔実施例１〕
補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比）の算出
ラットに１４Ｃ−トルブタミド（ＴＢ）を経口投与し、投与後に得た血漿及び尿中のＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物をＨＰＬＣ−ＲＡＤ及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析し、本発明の補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比）を算出した。  【００３７】
操作（１）
１４Ｃ−ＴＢ投与と採血、採尿
ＳＤ系雄性ラット（１匹）に１４Ｃ−ＴＢを３ｍｇ／ｋｇで経口投与した。１４Ｃ−ＴＢ投与４時間後、腹大動脈よりヘパリンナトリウム入り真空採血管（テルモ社製）を用いて血液を採取し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）して血漿を得た。また、１４Ｃ−ＴＢ投与直後（０時間）から４時間後までの蓄尿を採取した。  【００３８】
操作（２）
総放射能量（総ＲＩ）の測定
操作（１）で得た血漿０．０５ｍＬに、２ｍＬの組織溶解剤（ＳＯＬＵＥＮＥ−３５０、パーキンエルマ社製）を加えた後、１０ｍＬのシンチレーター（ＨＩＯＮＩＣ−ＦＬＵＯＲ、パーキンエルマ社製）を加え、液体シンチレーションカウンタ（ＬＳＣ）（２５００ＴＲ、パーキンエルマ社製）により総放射能量を測定した。
また、操作（１）で得た尿試料０．０５ｍＬに、１０ｍＬの前記シンチレーターを加え、前記ＬＳＣにより総放射能量を測定した。  【００３９】
操作（３）
ＨＰＬＣ−ＲＡＤによるＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物の放射能量（ＲＩＭｘ）測定
操作（１）で得た血漿１ｍＬに、３倍量のアセトニトリルを加え、十分攪拌した後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）して上清を採取し、ＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物（測定対象物群）を抽出した。次いで抽出残渣に対し、先と同容量（３ｍＬ）のアセトニトリルを加え、前記と同様に攪拌と遠心分離までの操作を２回繰り返して更に測定対象物群を抽出した。抽出採取して得られた３回分の遠心上清を合わせた後、アセトニトリルを加えて総量を１０ｍＬにし測定対象物抽出液とした。該測定対象物抽出液を減圧下で濃縮乾固し、３０％エタノール１５０μＬにより再溶解した後、さらに遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、５分）し、その上清を抽出試料とした。該抽出試料は後記する条件によりＨＰＬＣ−ＲＡＤで分析した。
また、操作（１）で得た尿は、上記血漿における抽出等の前処理をせず、そのままを遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）して上清を得、分析試料とした。該分析試料は後記する条件によりＨＰＬＣ−ＲＡＤで分析した。  【００４０】
［ＨＰＬＣ−ＲＡＤ条件］
ＨＰＬＣ：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所社製）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（粒子径：５μｍ、カラムサイズ：４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ）（ＧＬサイエンス社製）
移動相Ａ：０．１％酢酸水溶液
移動相Ｂ：アセトニトリル
移動相混合時間及び混合比率（Ｂ％）：０分（０％）→４０分（４０％）→４１分（９０％）→５０（９０％）
流速：１．０ｍＬ／分
分析時間：５０分
カラム温度：４０℃
ＲＡＤ：Ｒａｄｉｏｍａｔｉｃ６２５ＴＲ（パーキンエルマ社製）
セル容量：５００μＬ
シンチレーター：ＦＬＯ−ＳＣＩＮＴＩＩ（パーキンエルマ社製）
シンチレーター流量：３．０ｍＬ／分
スプリット比：１００％
アップデート時間：６秒  【００４１】
操作（４）
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物の質量分析（ピーク面積比Ｉｘの測定）
操作（１）で得た血漿０．０５ｍＬもしくは尿０．０５ｍＬに、それぞれ０．０５ｍＬメタノール及び内標準物質のアセトニトリル溶液（ヒドロキシトルブタミド−ｄ９及びカルボキシトルブタミド−ｄ９各２０ｎｇ／ｍＬを含む）０．１５ｍＬを加えて十分攪拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）した。得られた遠心上清をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析条件を以下に示す。【００４２】
［ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件］
ＨＰＬＣ：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵｌｔｒａＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬＣ（ウォーターズ社製）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ−Ｃ１８（粒子径：１．７μｍ、カラムサイズ：２．１ｍｍＩ．Ｄ．×５０ｍｍ）（ウォーターズ社製）
移動相Ａ：０．１％酢酸水溶液
移動相Ｂ：アセトニトリル
移動相混合時間及び混合比率（Ｂ％）：０分（０％）→２．５分（４０％）→３分（９０％）→３．５分（９０％）→３．６分（０％）→４分（０％）
流速：０．８ｍＬ／分
分析時間：４分
カラム温度：４０℃
ＭＳ／ＭＳ：４０００ＱＴｒａｐ（アプライドバイオシステムズ社製）
イオン化法：ＥＳＩ（電子スプレーイオン化法）
イオン極性：Ｎｅｇａｔｉｖｅ
検出モード：ＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）
ターボガス温度：６５０℃
イオンスプレー電圧：４５００Ｖ
モニターイオン（Ｑ１（ＭＳ１）→Ｑ３（ＭＳ２））
トルブタミド（ＴＢ）  ｍ／ｚ＝２６９．０→１６９．７
ヒドロキシトルブタミド（ＨＴＢ）  ｍ／ｚ＝２８５．０→１８５．７
カルボキシトルブタミド（ＣＴＢ）  ｍ／ｚ＝２９９．０→１９９．６
ＩＳ（ヒドロキシトルブタミド−ｄ９）ｍ／ｚ＝２９４．９→１８５．７
ＩＳ（カルボキシトルブタミド−ｄ９）ｍ／ｚ＝３０８．１→１９９．６
Ｍ１      ｍ／ｚ＝２１３．０→１６９．８
Ｍ２      ｍ／ｚ＝２８５．０→１６９．８
Ｍ３      ｍ／ｚ＝２８５．０→１６９．８
Ｍ４      ｍ／ｚ＝２８５．０→１６９．８
なお、操作（３）で得られるクロマトグラムにおける各ピークと本操作（４）で得られるクロマトグラムにおける各ピークの異同の確認は別途、常法により行った。【００４３】
結果（１）
血漿試料のＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比）の算出
ＨＰＬＣ−ＲＡＤクロマトグラムから得られたＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物（ＨＴＢ）それぞれの放射能量（ＲＩＭｘ）を、対応するＬＣ／ＭＳ／ＭＳのＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物（ＨＴＢ）それぞれのピーク面積比（Ｉｘ）で除し、ＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物（ＨＴＢ）それぞれの補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比）を求めた。結果を表１に示した。
なお、以降、本結果の補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比）をＲＩ／ＭＳ比（Ａ）と表記する。【００４４】
【表１】
2010041459.tif 000002
【００４５】
結果（２）
尿試料のＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比）の算出
ＨＰＬＣ−ＲＡＤクロマトグラムから得られたＴＢ未変化体、ＴＢ代謝物（ＨＴＢ、ＣＴＢ）、ＴＢ未知代謝物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４）それぞれの放射能量（ＲＩＭｘ）を、対応するＬＣ／ＭＳ／ＭＳのＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物（ＨＴＢ、ＣＴＢ）、ＴＢ未知代謝物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４）それぞれのピーク面積比（Ｉｘ）で除し、ＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物（ＨＴＢ、ＣＴＢ）、ＴＢ未知代謝物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４）それぞれの補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比）を求めた。結果を表２に示した。なお以降、本結果の補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比）をＲＩ／ＭＳ比（Ｂ）と表記する。【００４６】
【表２】
2010041459.tif 000003
【００４７】
〔実施例２〕
補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ａ））による血漿試料の定量
ラットに１４Ｃ−ＴＢを経口投与し、投与後経時的に得た血漿中のＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析し、実施例１の結果（１）で求めた補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ａ））からＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物の定量を実施した。【００４８】
操作（１）
１４Ｃ−ＴＢ投与と採血
ＳＤ系雄性ラット（各時点ｎ＝３：合計１５匹）に１ｍｇ／ｋｇの１４Ｃ−ＴＢを経口投与した。１４Ｃ−ＴＢ投与１、２、４、８、２４時間後に、腹大動脈よりヘパリンナトリウム入り真空採血管（テルモ社製）を用いて血液を採取し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）して血漿を得た。  【００４９】
操作（２）
ＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる質量分析（ＵＩｘの測定）
実施例１の操作（４）と同一の操作により実施した。  【００５０】
操作（３）
実施例１の結果（１）で求めた補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ａ））による定量
本実施例の操作（２）の測定結果について実施例１の結果（１）で求めた補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ａ））を用いてＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物の定量を行った。ここで、
ＴＢの放射比活性＝２２．９ＧＢｑ／ｍｍｏｌ
ＴＢの分子量＝２７０
ＨＴＢの分子量＝２８６
として計算した。結果を表３、４に示した。  【００５１】
【表３】
2010041459.tif 000004
【００５２】
【表４】
2010041459.tif 000005
【００５３】
〔実施例３〕
補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ａ））による定量の妥当性確認（血漿試料）
実施例２で算出した定量値とＨＰＬＣ−ＲＡＤ分析による実試料のＲＩ定量値を比較し、補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ａ））による定量の妥当性を確認した。  【００５４】
操作（１）
１４Ｃ−ＴＢ投与と採血
実施例２の血漿試料を使用した。  【００５５】
操作（２）
総放射能量の測定
実施例１の操作（２）と同一の操作で実施した。  【００５６】
操作（３）
ＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物のＨＰＬＣ−ＲＡＤによる放射能量（ＲＩＭｘ）測定
実施例１の操作（３）と同一の操作で実施した。  【００５７】
結果（１）
補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ａ））による定量の妥当性確認（血漿試料）
本実施例でＨＰＬＣ−ＲＡＤにより測定された放射能量から算出したＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物の濃度と補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ａ））を用いて算出したＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物の濃度（Ｍｘ）を比較した。結果を表５、６に示した。  【００５８】
本実施例でＨＰＬＣ−ＲＡＤにより測定された放射能量から算出したＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物の濃度と補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ａ））を用いて算出したＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物の濃度は、表５、６の回収率の欄にみる関係にあった。両定量値間に有意差は認めなかった。
以上より、本発明の補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ａ））を用いれば、標準品の入手が困難な代謝物やイオン化効率の不明な代謝物であってもＬＣ／ＭＳ／ＭＳのピーク面積比（ＵＩｘ）から測定対象の定量が可能である。【００５９】
【表５】
2010041459.tif 000006
【００６０】
【表６】
2010041459.tif 000007
【００６１】
〔実施例４〕
補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｂ））による尿試料の定量
ラットに１４Ｃ−ＴＢを経口投与し、投与直後（０時間）から２４時間後までの蓄尿中のＴＢ代謝物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析し、実施例１の結果（２）で求めた補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｂ））からＴＢ代謝物の定量を実施した。  【００６２】
操作（１）
１４Ｃ−ＴＢ投与と採尿
ＳＤ系雄性ラット（１時点ｎ＝３：合計３匹）に１ｍｇ／ｋｇの１４Ｃ−ＴＢを経口投与した。１４Ｃ−ＴＢ投与直後（０時間）から２４時間後までの蓄尿を採取した。  【００６３】
操作（２）
ＴＢ代謝物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる質量分析（ＵＩｘの測定）
実施例１の操作（４）と同一の操作により実施した。  【００６４】
操作（３）
実施例１の結果（２）で求めた補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｂ））による定量
本実施例の操作（２）の測定結果から実施例１の結果（２）で求めた補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｂ））を用いてＴＢ代謝物の定量を行った。結果を表７−１２に示した。各ＴＢ代謝物をイオン化効率の不明な代謝物に仮想して、本発明の方法を適用した。  【００６５】
【表７】
2010041459.tif 000008
【００６６】
【表８】
2010041459.tif 000009
【００６７】
【表９】
2010041459.tif 000010
【００６８】
【表１０】
2010041459.tif 000011
【００６９】
【表１１】
2010041459.tif 000012
【００７０】
【表１２】
2010041459.tif 000013
【００７１】
〔実施例５〕
補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｂ））による定量の妥当性確認（尿試料）
実施例４で得た定量値とＨＰＬＣ−ＲＡＤ分析による定量値を比較し、補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｂ））による定量の妥当性を確認した。  【００７２】
操作（１）
１４Ｃ−ＴＢ投与と採尿
実施例４の尿試料を使用した。  【００７３】
操作（２）
総放射能量の測定
実施例１の操作（２）と同一の操作で実施した。  【００７４】
操作（３）
ＴＢ代謝物のＨＰＬＣ−ＲＡＤによる放射能量（総ＲＩ）測定
実施例１の操作（３）と同一の操作で実施した。  【００７５】
結果（１）
補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｂ））による定量の妥当性確認（尿試料）
本実施例でＨＰＬＣ−ＲＡＤにより測定された放射能量から算出したＴＢ代謝物の濃度と、補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｂ））を用いて算出したＴＢ代謝物の濃度（Ｍｘ）を比較した。結果を表１３−１８に示した。各ＴＢ代謝物をイオン化効率の不明な代謝物に仮想して、本発明の方法を適用した。【００７６】
本実施例でＨＰＬＣ−ＲＡＤにより測定された放射能量から算出したＴＢ代謝物の濃度と補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｂ））を用いて算出したＴＢ代謝物の濃度は、表１３−１８の回収率の欄にみる関係にあった。両定量値間に有意差は認めなかった。
以上より、本発明の補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｂ））を用いれば、標準品の入手が困難な代謝物やイオン化効率の不明な代謝物であってもＬＣ／ＭＳ／ＭＳのピーク面積比から測定対象の定量が可能である。  【００７７】
【表１３】
2010041459.tif 000014
【００７８】
【表１４】
2010041459.tif 000015
【００７９】
【表１５】
2010041459.tif 000016
【００８０】
【表１６】
2010041459.tif 000017
【００８１】
【表１７】
2010041459.tif 000018
【００８２】
【表１８】
2010041459.tif 000019
【００８３】
〔実施例６〕
補正係数ＩＡ２を用いた定量
１４Ｃ−ＴＢ及びその代謝物のＲＩ定量分析と質量分析を行い、未変化体及び代謝物のイオン化効率を求め、代謝物のイオン化効率／未変化体イオン化効率の比を求めた。  
操作（１）
未知代謝物放射能量の分析（ＨＰＬＣ−ＲＡＤ）、質量分析強度の測定 
表１９の組成でヒト又はラットの肝ミクロソームと１４Ｃ−ＴＢ溶液を混合し、３７℃で ５分間インキュベーションした。次いで、５０ｍＭグルタチオン溶液（１００μＬ）及び２０Ｕ／ｍＬグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ溶液（２０μＬ）を添加して混和後、３７℃で６０分間インキュベーションした後、氷冷下、アセトニトリル（９００μＬ）を添加して反応を停止した。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）により不溶物を除去し、上清を半量ずつに分けて各々減圧下で濃縮乾固した。５０％エタノール（２５０μＬ）に溶解し、不溶物を遠心分離後（３，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）、上清をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ装置（ＬＣ−ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ：サーモフィッシャーサイエンティフィク社製）及び放射能検出器（β−ＲＡＭ：IN/US システムズ社製）で分析した。  【００８４】
【表１９】
2010041459.tif 000020
【００８５】
［ＬＣ条件］
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ‐３（粒子径：５μｍ、カラムサイズ：４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ）（ＧＬサイエンス社製）
流速：１ｍＬ／分（ｒａｄｉｏｄｅｔｅｃｔｏｒ／ＭＳ（４：１）となるように分岐させる）
移動相Ａ：酢酸／アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（０．１：５：９５）
移動相Ｂ：Ｈ２Ｏ／アセトニトリル（５：９５）  【００８６】
［ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定］
Ｆｕｌｌｓｃａｎ−ｄａｔａｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｃｌｕｓｉｏｎを測定後、フルスキャン時に測定した精密質量から代謝物を網羅的に検索した。代謝物のＭＳ／ＭＳリスト（代謝物の質量及び保持時間を入力した表）を利用してＭＳ／ＭＳ測定し、フラグメントから代謝物を推定した。  【００８７】
操作（２）
ＨＰＬＣ−ＲＡＤ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定結果の比較
１．ラットミクロソーム
ＨＰＬＣ−ＲＡＤより得られたクロマトグラムより３つのピークが検出された（ＲＴ＝１８．４８、２４．４８、３９．４２分）。ＬＣ／ＭＳ測定（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｉｏｎｍｏｄｅ）より、未変化体（ｍ／ｚ２７１）、水酸化体（４−ヒドロキシトルブタミド、ｍ／ｚ２８７）及びスルホンアミド体（ｍ／ｚ１７２）が、放射能のピークと一致する保持時間（各々ＲＴ＝３９．７５、２４．９２、１８．８７分）に検出された。また、ＬＣ／ＭＳ測定では、他に３種の水酸化体（ｍ／ｚ２８７）と二種のグルタチオン抱合体（ｍ／ｚ５７６）が検出された。  【００８８】
２．ヒトミクロソーム
放射能測定より得られたクロマトグラムより２つのピークが検出された（ＲＴ＝２４．４８、３９．４８分）。ＬＣ／ＭＳ測定（Ｐｏｓｉｔｉｖｅｉｏｎｍｏｄｅ）より、未変化体（ｍ／ｚ２７１）及び水酸化体（４−ヒドロキシトルブタミド，ｍ／ｚ２８７）が、放射能のピークと一致する保持時間（各々ＲＴ＝２４．９１、３９．８１分）に検出された。また、ＬＣ／ＭＳ測定では、他に３種の水酸化体（ｍ／ｚ２８７）と２種のグルタチオン抱合体（ｍ／ｚ５７６）が検出された。  【００８９】
操作（３）
補正係数ＩＡ２（ｆｍ／ｆｕ）の算出
１．ラットミクロソーム
放射能測定で観測された３本のピークの面積値（未変化体：Ｒｕ、水酸化体：Ｒｍ−ＯＨ、スルホンアミド体：Ｒｍ−ｓ）を以下に示した。
Ｒｕ＝４４６７．２ｃｐｍ
Ｒｍ−ＯＨ=８４４．８ｃｐｍ
Ｒｍ−ｓ=３３２．８ｃｐｍ
水酸化体及びスルホンアミド体の未変化体に対する比を以下に示した。
Ｒｍ−ＯＨ／Ｒｕ＝０．１８９１
Ｒｍ−ｓ／Ｒｕ＝０．０７４５
放射能ピークに対応するＭＳクロマトグラムの面積値（未変化体：Ｍｕ、水酸化体：Ｍｍ−ＯＨ、スルホンアミド体：Ｍｍ−ｓ）を以下に示した。ただし、ＭＳクロマトグラムは、各々の精密質量から５ｐｐｍのｔｏｌｅｒａｎｃｅで求めた。
Ｍｕ＝７６９７４８４０９
Ｍｍ−ＯＨ＝１０９２０３４３８
Ｍｍ−ｓ＝２９８５６
水酸化体及びスルホンアミド体の未変化体に対する比を以下に示した。
Ｍｍ−ＯＨ／Ｍｕ＝０．１４１９
Ｍｍ−ｓ／Ｍｕ＝０．００００３８７８６
補正係数ＩＡ２（ｆｍ／ｆｕ）＝（Ｍｍ−ＯＨ／Ｍｕ＝０．１４１９）／（Ｒｍ−ＯＨ／Ｒｕ＝０．１８９１）＝０．７５
水酸化体（ｍ−ＯＨ）のイオン化効率は未変化体（ｕ）のイオン化効率の０．７５倍であった。
補正係数ＩＡ２（ｆｍ／ｆｕ）＝（Ｍｍ−ｓ／Ｍｕ＝０．００００３８７８６）／（Ｒｍ−ｓ／Ｒｕ＝０．０７４５）＝５．２×１０−４
スルホンアミド体（ｍ−ｓ）のイオン化効率は未変化体（ｕ）のイオン化効率の５．２×１０−４倍であった。  【００９０】
上記で求められたイオン化効率を下記式に代入することにより、水酸化体（ｍ−ＯＨ）あるいはスルホンアミド体（ｍ−ｓ）を定量することが可能である。
水酸化体濃度＝０．７５×（ＴＢ濃度／ＴＢのＭＳピーク面積値）×水酸化体のＭＳピーク面積値
スルホンアミド体濃度＝５．２×１０−４×（ＴＢ濃度／ＴＢのＭＳピーク面積値）×スルホンアミド体のＭＳピーク面積値
＊（ＴＢ濃度／ＴＢのＭＳピーク面積値）は、検量線から求めることができる値である。【００９１】
なお、補正係数ＩＡ２（ｆｍ／ｆｕ）は、実施例２、４（ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比））を用いても、算出することができる。
Ｒｕ／Ｍｕ＝４４６７．２／７６９７４８４０９＝５．８０３×１０−６
Ｒｍ−ＯＨ／Ｍｍ−ＯＨ＝８４４．８／１０９２０３４３８＝７．７３６×１０−６
Ｒｍ−ｓ／Ｍｍ−ｓ＝３３２．８／２９８５６＝１．１１５×１０−２
未変化体に対する比を以下に示した。
補正係数ＩＡ２（ｆｍ／ｆｕ）＝（Ｒｕ／Ｍｕ）／（Ｒｍ−ＯＨ／Ｍｍ−ＯＨ）＝０．７５
補正係数ＩＡ２（ｆｍ／ｆｕ）＝（Ｒｕ／Ｍｕ）／（Ｒｍ−ｓ／Ｍｍ−ｓ）＝５．２×１０−４ 【００９２】
以上より、本発明の補正係数ＩＡ２（ｆｍ／ｆｕ）を用いれば、標準品の入手が困難な代謝物やイオン化効率の不明な代謝物であってもＬＣ／ＭＳ／ＭＳのピーク面積比から測定対象の定量が可能である。特に未変化体の検量線のみで未知代謝物の定量ができるので極めて簡便な定量分析方法である。  【００９３】
２．ヒトミクロソーム
放射能測定で観測された２本のピークの面積値（未変化体：Ｒｕ、水酸化体：Ｒｍ−ＯＨ）を以下に示した。
Ｒｕ＝５３２４．８ｃｐｍ
Ｒｍ−ＯＨ＝８８３．２ｃｐｍ
水酸化体の未変化体に対する比を以下に示した。
Ｒｍ−ＯＨ／Ｒｕ＝０．１６５９
放射能ピークに対応するＭＳクロマトグラムの面積値（未変化体：Ｍｕ、水酸化体：Ｍｍ−ＯＨ）を以下に示した。ただし、ＭＳクロマトグラムは、各々の精密質量から５ｐｐｍのｔｏｌｅｒａｎｃｅで求めた。
Ｍｕ=９０４２２８１１８
Ｍｍ−ＯＨ＝１２３８７６５６８
水酸化体の未変化体に対する比を以下に示した。
Ｍｍ−ＯＨ／Ｍｕ＝０．１３７０
補正係数ＩＡ２（ｆｍ／ｆｕ）＝（Ｍｍ−ＯＨ／Ｍｕ＝０．１３７０）／（Ｒｍ−ＯＨ／Ｒｕ＝０．１６５９）＝０．８２６
水酸化体（ｍ−ＯＨ）のイオン化効率は未変化体（ｕ）のイオン化効率の０．８２６倍である。  【００９４】
前記ラットミクロソームの場合と同様に本発明の定量分析方法により、水酸化体（ｍ−ＯＨ）を定量することが可能である。
水酸化体濃度＝０．８２６×（ＴＢ濃度／ＴＢのＭＳピーク面積値）×水酸化体のＭＳピーク面積値
＊（ＴＢ濃度／ＴＢのＭＳピーク面積値）は、検量線から求めることができる値である。【００９５】
なお、補正係数ＩＡ２（ｆｍ／ｆｕ）は、実施例２、４（ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比））を用いても、算出することができる。
Ｒｕ／Ｍｕ＝５３２４．８／９０４２２８１１８＝５．８８８×１０−６
Ｒｍ−ＯＨ／Ｍｍ−ＯＨ＝８８３．２／１２３８７６５６８＝７．１２９×１０−６
未変化体に対する比を以下に示めした。
補正係数ＩＡ２（ｆｍ／ｆｕ）＝（Ｒｕ／Ｍｕ）／（Ｒｍ−ＯＨ／Ｍｍ−ＯＨ）＝０．８２６  【００９６】
以上より、本発明の補正係数ＩＡ２（ｆｍ／ｆｕ）を用いれば、標準品の入手が困難な代謝物やイオン化効率の不明な代謝物であってもＬＣ／ＭＳ／ＭＳのピーク面積比から測定対象の定量が可能である。特に未変化体の検量線のみで未知代謝物の定量ができるので極めて簡便な定量分析方法である。 【００９７】
〔実施例７〕
補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比）の算出
ラットに１４Ｃ−トルブタミド（ＴＢ）を経口投与し、投与後に得た尿中のＴＢ代謝物を放射能検出器付高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ−ＲＡＤ）及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析し、本発明の補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比）を算出した。【００９８】
操作（１）
１４Ｃ−ＴＢ投与と採尿
ＳＤ系雄性ラット（合計１匹）に０．００１６７ｍｇ／ｋｇの１４Ｃ−ＴＢを経口投与した。１４Ｃ−ＴＢ投与直後（０時間）から２４時間後までの蓄尿を採取した。【００９９】
操作（２）
総放射能量の測定
操作（１）で得た尿試料１ｍＬに、１０ｍＬの前記シンチレーターを加え、前記ＬＳＣにより総放射能量を測定した。【０１００】
操作（３）  
ＴＢ代謝物のＨＰＬＣ−ＲＡＤによる放射能量（ＲＩＭｘ）測定
操作（１）で得た尿５ｍＬをあらかじめメタノール４ｍＬおよび水４ｍＬでプレコンディショニングした固相カラム（ＯＡＳＩＳ  ＨＬＢ，ウォーターズ社製）にアプライし、水３ｍＬで洗った後、メタノール４ｍＬで２回溶出し、ＴＢ代謝物を抽出した。該測定対象物抽出液を減圧下で濃縮乾固し、３０％エタノール２００μＬにより再溶解した後、さらに遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、５分）し、その上清を抽出試料とした。該抽出試料は後記する条件によりＨＰＬＣ−ＲＡＤで分析した。【０１０１】
［ＨＰＬＣ−ＲＡＤ条件］
実施例１と同じ条件で行った。【０１０２】
操作（４）  
ＴＢ代謝物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる質量分析（Ｉｘの測定）
操作（１）で得た尿０．０２ｍＬに、それぞれ０．０２ｍＬメタノール及び内標準物質のアセトニトリル溶液（ヒドロキシトルブタミド−ｄ９  ２０ｎｇ／ｍＬを含む）０．０６ｍＬを加えて十分攪拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）した。得られた遠心上清をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析条件を以下に示す。【０１０３】
［ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件］
ＨＰＬＣ：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵｌｔｒａＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬＣ（ウォーターズ社製）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ−Ｃ１８（粒子径：１．７μｍ、カラムサイズ：２．１ｍｍＩ．Ｄ．×５０ｍｍ）（ウォーターズ社製）
移動相Ａ：０．１％酢酸水溶液
移動相Ｂ：アセトニトリル
移動相混合時間及び混合比率（Ｂ％）：０分（０％）→２．５分（４０％）→３分（９０％）→３．５分（９０％）→３．６分（０％）→４分（０％）
流速：０．８ｍＬ／分、分析時間：４分、カラム温度：４０℃
ＭＳ／ＭＳ：ＡＰＩ４０００（アプライドバイオシステムズ社製）
イオン化法：ＥＳＩ（電子スプレーイオン化法）
イオン極性：Ｎｅｇａｔｉｖｅ
検出モード：ＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）
ターボガス温度：６５０℃
イオンスプレー電圧：４５００Ｖ
モニターイオン（Ｑ１（ＭＳ１）→Ｑ３（ＭＳ２））
ヒドロキシトルブタミド（ＨＴＢ）  ｍ／ｚ＝２８５．０→１８５．７
ＩＳ（ヒドロキシトルブタミド−ｄ９）ｍ／ｚ＝２９４．９→１８５．７
なお、操作（３）で得られるクロマトグラムにおける各ピークと本操作（４）で得られるクロマトグラムにおける各ピークの異同の確認は別途、常法により行った。【０１０４】
結果（１）  
尿試料のＲＩ／ＭＳ比の算出
ＨＰＬＣ−ＲＡＤクロマトグラムから得られたＴＢ代謝物（ＨＴＢ）の放射能量（ＲＩＭｘ）を、対応するＬＣ／ＭＳ／ＭＳのＴＢ代謝物（ＨＴＢ）のピーク面積比（Ｉｘ）で除し、ＴＢ代謝物（ＨＴＢ）の補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比）を求めた。結果を表２０に示した。なお以降、本結果の補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比）をＲＩ／ＭＳ比（Ｃ）と表記する。【０１０５】
【表２０】
2010041459.tif 000021
【０１０６】
〔実施例８〕  
補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｃ））による血漿試料の定量
ラットに１４Ｃ−ＴＢを経口投与し、投与後経時的に得た血漿中のＴＢ代謝物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析し、実施例７で算出した補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｃ））からＴＢ代謝物の定量を実施した。【０１０７】
操作（１）  
１４Ｃ−ＴＢ投与と採血
ＳＤ系雄性ラット（各時点ｎ＝３：合計１５匹）に０．００１６７ｍｇ／ｋｇの１４Ｃ−ＴＢを経口投与した。１４Ｃ−ＴＢ投与１、２、４、８時間後に、腹大動脈よりヘパリンナトリウム入り真空採血管（テルモ社製）を用いて血液を採取し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）して血漿を得た。
操作（２）  
ＴＢ代謝物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる質量分析（ＵＩｘ）
操作（１）で得た血漿０．０２ｍＬに、それぞれ０．０２ｍＬメタノール及び内標準物質のアセトニトリル溶液（ヒドロキシトルブタミド−ｄ９  ２０ｎｇ／ｍＬを含む）０．０６ｍＬを加えて十分攪拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）した。
また、ブランク血漿０．０２ｍLに０．０２ｍＬのヒドロキシトルブタミドメタノール溶液（１−３００００ｐｇ／ｍL）及び内標準物質のアセトニトリル溶液（ヒドロキシトルブタミド−ｄ９  ２０ｎｇ／ｍＬを含む）０．０６ｍＬを加えて十分攪拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）した。それぞれ得られた遠心上清をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析条件を以下に示す。【０１０８】
［ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件］
実施例７と同じ条件で行った。【０１０９】
操作（３）
実施例７の補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｃ））による定量
本実施例の操作（２）の測定結果について実施例７の補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｃ））を用いてＴＢ代謝物の定量を行った。ここで、
（ＴＢの放射比活性）＝２２．９ＧＢｑ／ｍｍｏｌ
（ＨＴＢの分子量）＝２８６
として計算した。結果を表２１に示した。【０１１０】
【表２１】
2010041459.tif 000022
【０１１１】
〔実施例９〕  
ＲＩ／ＭＳ比による定量の妥当性確認（血漿試料）
実施例８で算出した定量値と標準品を用いたＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析による実定量値を比較し、補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｃ））による定量の妥当性を確認した。【０１１２】
操作（１）  
１４Ｃ−ＴＢ投与と採血
実施例８の血漿試料を使用した。【０１１３】
操作（２）  
ＴＢ代謝物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる質量分析
ブランク血漿０．０２ｍLに０．０２ｍＬのヒドロキシトルブタミドメタノール溶液（１−３００００ｐｇ／ｍL）及び内標準物質のアセトニトリル溶液（ヒドロキシトルブタミド−ｄ９  ２０ｎｇ／ｍＬを含む）０．０６ｍＬを加えて十分攪拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）した。血漿試料は実施例８に従って前処理した。
それぞれ得られた遠心上清をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析条件を以下に示す。【０１１４】
結果（１）  
補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｃ））による定量の妥当性確認（血漿試料）
本実施例で標準品により定量されたＴＢ代謝物の濃度と補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｃ））を用いて算出したＴＢ代謝物の濃度（Ｍｘ）を比較した。結果を表２２に示した。【０１１５】
本実施例で標準品により定量されたＴＢ代謝物の濃度と補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｃ））を用いて算出したＴＢ未変化体及びＴＢ代謝物の濃度は、表２２の回収率の欄にみる関係にあった。両定量値間に有意差は認めなかった。
以上より、本発明の補正係数ＩＡ１（ＲＩ／ＭＳ比（Ｃ））を用いれば、標準品の入手が困難な代謝物やイオン化効率の不明な代謝物であってもＬＣ／ＭＳ／ＭＳのピーク面積比（ＵＩｘ）から測定対象の定量が可能である。【０１１６】
【表２２】
2010041459.tif 000023
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明の定量分析方法によれば、代謝物の分析において、標準品の無い代謝物や未知の代謝物であっても、構造解析と定量の両方を行うことができ、代謝物の網羅的分析が可能となった。本発明定量分析方法は、ＭＤ臨床試験に適用することができ、安全な医薬品開発及び医薬品開発にかかる費用と時間の節約に貢献することが期待できる。 
【手続補正書】
【提出日】平成22年1月25日(2010.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むことを特徴とする、代謝物の定量分析方法。
工程１）ＲＩ標識化合物の代謝物を含む生物試料中の成分を分離する工程
工程２）工程１）で分離して得られる成分の放射能量を測定する工程
工程３）工程１）で分離して得られる成分の質量電荷比を測定し、質量分析強度を測定する工程
工程４）工程２）及び３）で得られる測定値から代謝物のイオン化効率に関する補正係数Ｉを求める工程
工程５）工程１）のＲＩ標識化合物又は該化合物のＲＩ非標識体、及び該化合物の代謝物を含む可能性のある、工程１）で使用した試料とは別異の生物試料中の成分を分離する工程
工程６）工程５）で分離して得られる代謝物の質量電荷比を測定し、質量分析強度を測定する工程
工程７）工程６）で得た質量分析強度と工程４）で求めた補正係数Ｉを使用して、工程５）で分離された代謝物の濃度を定量する工程
【請求項２】
工程５）により分離された代謝物の濃度Ｍｘを、以下の補正係数ＩA1を用いて下記式（Ａ１）により求める、請求項１に記載の定量分析方法。
補正係数ＩA1＝ＲＩＭｘ／Ｉｘ
ＲＩＭｘ：工程２）により得られる代謝物の放射能量
Ｉｘ：工程３）により得られる代謝物の質量分析強度
工程５）により分離された代謝物の濃度Ｍｘ＝ＵＩｘ×ＩA1×Ｒ・・・式（Ａ１）
ＵＩｘ：工程５）により分離された代謝物の質量分析強度
Ｒ：ＲＩ標識化合物の比放射能量
【請求項３】
工程５）により分離された代謝物の濃度Ｃｍ１を、以下の補正係数ＩA2を用いて下記式（Ａ２）により求める、請求項１に記載の定量分析方法。
補正係数ＩA2＝ｆｍ／ｆｕ
ｆｍ／ｆｕ＝（Ｍｍ／Ｍｕ）／（Ｒｍ／Ｒｕ）
ｆｍ／ｆｕ：未変化体（ｕ）と代謝物（ｍ）それぞれのイオン化効率の比
Ｍｍ：工程３）により得られる代謝物（ｍ）の質量分析強度
Ｍｕ：工程３）により得られる未変化体（ｕ）の質量分析強度
Ｒｍ：工程２）により得られる代謝物（ｍ）の放射能量
Ｒｕ：工程２）により得られる未変化体（ｕ）の放射能量
工程５）により分離された代謝物の濃度Ｃｍ１＝Ｍｍ１×ＩA2×Ｃcal・・・式（Ａ２）
Ｍｍ１：工程５）により分離された代謝物の質量分析強度
Ｃcal：未変化体（ｕ）の検量線より得られる、未変化体濃度（Ｃｕ）/未変化体質量分析強度（Ｍｕ)
【請求項４】
質量分析強度がマスクロマトグラムより得られるピーク面積値又はピーク面積比である請求項１又は２に記載の定量分析方法。
【請求項５】
工程１）〜４）があらかじめ行われて算出された補正係数Ｉがライブラリに保存されており、当該ライブラリよりＩを引用して、工程５）〜７）を行う請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
工程１）の分離がＨＰＬＣによるものである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程３）の質量電荷比の測定及び質量分析強度の測定がＬＣ／ＭＳ又はＬＣ／ＭＳｎ（液体クロマトグラフ−多段階タンデム質量分析）により行われるものである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＬＣ／ＭＳｎがＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフ−タンデム質量分析）である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
代謝物が未知の化合物又は標準品の無い化合物である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
代謝物が薬物動態試験により得られる代謝物である請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
薬物動態試験がマイクロドーズ試験である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
薬物動態試験が代謝物安全性試験（Safety Testing of Drug Metabolites）である請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
工程１）の分離が、放射能量測定用と質量電荷比測定用とで別々に行われる請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法を用いて、網羅的に代謝物の定量を行う分析方法。
【請求項１５】
生物試料が、動物の体液又は、動物の細胞、組織及び該細胞、組織の部分又は、動物由来の代謝酵素である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
以下のａ）〜ｄ）の手段を含む代謝物の定量装置であって、
ａ）生物試料中の代謝物を分離するための分離手段
ｂ）前記分離手段により分離された代謝物の放射能量を測定するＲＩ検出手段
ｃ）前記分離手段により分離された代謝物の質量電荷比を測定し、当該代謝物の質量分析強度を測定する質量分析手段
ｄ）代謝物のイオン化効率に関する補正係数Ｉを使用して代謝物の濃度を求めるための演算処理手段
ｄ）の演算処理手段が、Ｍｘ＝ＵＩｘ×ＩA1×Ｒの数式により代謝物の濃度Ｍｘを求めるものである定量装置。
ＵＩｘ：補正係数ＩA1を求めるための生物試料とは別異の生物試料中の成分を分離して得られる代謝物についてｃ）の質量分析手段により測定して得られた質量分析強度
補正係数ＩA1＝ＲＩＭｘ／Ｉｘ
ＲＩＭｘ：該ＲＩ標識化合物の代謝物を含む生物試料をａ）の分離手段により分離して得られる代謝物についてｂ）のＲＩ検出手段を用いて測定した放射能量
Ｉｘ：ＲＩＭｘを求める代謝物についてｃ）の質量分析手段により測定して得られた質量分析強度
Ｒ：ＲＩ標識化合物の比放射能量
【請求項１７】
以下のａ）〜ｄ）の手段を含む代謝物の定量装置であって、
ａ）生物試料中の代謝物を分離するための分離手段
ｂ）前記分離手段により分離された代謝物の放射能量を測定するＲＩ検出手段
ｃ）前記分離手段により分離された代謝物の質量電荷比を測定し、当該代謝物の質量分析強度を測定する質量分析手段
ｄ）代謝物のイオン化効率に関する補正係数Ｉを使用して代謝物の濃度を求めるための演算処理手段
ｄ）の演算処理手段が、Ｃｍ１＝Ｍｍ１×ＩA2×Ｃcalの数式により代謝物の濃度Ｃｍ１を求めるものである定量装置。
Ｍｍ１：補正係数ＩA2を求めるための生物試料とは別異の生物試料中の成分を分離して得られる代謝物についてｃ）の質量分析手段により測定して得られた質量分析強度
補正係数ＩA2＝ｆｍ／ｆｕ
ｆｍ／ｆｕ＝（Ｍｍ／Ｍｕ）／（Ｒｍ／Ｒｕ）
ｆｍ／ｆｕ：未変化体（ｕ）と代謝物（ｍ）それぞれのイオン化効率の比
Ｍｍ：ａ）の分離手段により分離して得られる代謝物（ｍ）についてｃ）の質量分析手段により分析して得られる質量分析強度
Ｍｕ：ａ）の分離手段により分離して得られる未変化体（ｕ）についてｃ）の質量分析手段により分析して得られる質量分析強度
Ｒｍ：Ｍｍを求める代謝物（ｍ）についてｂ）のＲＩ検出手段を用いて測定した放射能量
Ｒｕ：Ｍｕを求める未変化体（ｕ）についてｂ）のＲＩ検出手段を用いて測定した放射能量
Ｃcal：未変化体（ｕ）の検量線より得られる、未変化体濃度（Ｃｕ）/未変化体質量分析強度（Ｍｕ)
【請求項１８】
さらにｅ）補正係数Ｉを保存しておくライブラリを有する請求項１６又は１７に記載の定量装置。
【請求項１９】
ａ）の分離手段が高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である請求項１６〜1８のいずれかに記載の定量装置。
【国際調査報告】
2010041459.tif 000024
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