【事件の表示】
　特許第３１０７３５８号「環状構造を有するグルカンおよびその製造方法」の請求項１〜２６に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３１０７３５８号の請求項１〜２６に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続きの経緯
　本件特許第３１０７３５８号の請求項１〜２６に係る発明は、平成７年７月３１日（平成６年９月１３日の特許出願に基づく優先権主張）に特許出願され、平成１２年９月８日に特許権の設定の登録がされた。その後、加太和博により特許異議の申立てがされ、特許取消し理由が通知された後、意見書提出の指定期間内である平成１３年１２月１０日に、明細書の訂正請求がされた。
　     　
２．訂正請求について
（１）訂正の内容
訂正事項ａ
特許請求の範囲の請求項１０の記載中の
「重合度が５０以上であるグルカンの製造方法」
を、
「重合度が５０から５０００であるグルカンの製造方法」
に訂正する。
　
訂正事項ｂ
　特許請求の範囲の請求項１０の記載中の「反応させることを含み、」の後に改行して、
「ここで、Ｄ酵素またはサイクロデキストリングルカントランスフェラーゼを反応させる場合には、該方法は、該糖類と該酵素との反応生成物を精製することをさらに含み、」
を挿入する。
　
訂正事項ｃ
　特許請求の範囲の請求項１３の記載中の
「Ａ　１ｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ」
を、
「Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ」
に訂正する。
　
訂正事項ｄ
　特許請求の範囲の請求項１８の記載中の
「重合度が５０以上であるグルカンの製造方法」
を、
「重合度が５０から５０００であるグルカンの製造方法」
に訂正する。
　
訂正事項ｅ
特許請求の範囲の請求項１９の記載中の
「重合度が５０以上であるグルカンの製造方法」
を、
「重合度が５０から５０００であるグルカンの製造方法」
に訂正する。
　
訂正事項ｆ
　特許請求の範囲の請求項１９の記載中の「反応させることを含み、」の後に改行して、
「ここで、Ｄ酵素またはサイクロデキストリングルカントランスフェラーゼを応させる場合には、該方法は、該糖類と該酵素との反応生成物を精製することさらに含み、」
を挿入する。
　
訂正事項ｇ
　特許請求の範囲の請求項２の記載中の
「前記内分岐環状構造部分の重合度が、１０から１００の範囲である」
を、
「前記内分岐環状構造部分の重合度が、１６から１００の範囲である」
に訂正する。
　
（４）請求の適否について
　訂正事項ａ、ｄ及びｅは、特許明細書の特許請求の範囲１０、１８及び１９に記載された「重合度が５０以上」の上限を規定して、「重合度が５０から５０００」に限定しようとするものであるので、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当する。
　本発明の方法で得られるグルカンの重合度が最も好ましくは５０〜５０００であることは特許明細書第００７６段落に記載されているので、上記訂正は明細書に記載した事項の範囲内でされたものである。
　
　訂正事項ｂ及びｆは、許明細書の特許請求の範囲１０及び１９に記載された方法においてＤ酵素またはサイクロデキストリングルカントランスフエラーゼを反応させる場合に、該方法は、「該糖類と該酵素との反応生成物を精製すること」をさらに含むという限定を加えるものであり、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当する。
　本発明の方法にＤ酵素またはサイクロデキストリングルカントランスフエラーゼを使用する場合には精製工程が行なわれ得ることは、特許明細書第００７３段落の「上記反応で得られた種々の環状構造を有するグルカンは、・・・（中略）・・・精製され得る。」との記載、及び第００７４段落の「Ｄ酵素、あるいはＣＧＴａｓｅを用いる場合には、環状構造のみを有するグルカンも生産されるが、これらは、・・・（中略）・・・目的の分岐構造を有する環状グルカンから分離され得る。」と記載されているので、上記訂正は明細書に記載した事項の範囲内でされたものである。
　
　訂正事項ｃは、特許明細書の特許請求の範囲１３に記載された「Ａ　ｌｋａｌｉｐｈｉｌｉｃ」を、「Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ」に訂正するものであって、誤記の訂正を目的とする訂正に該当し、明細書に記載した事項の範囲内の訂正であることが明らかである。
　
　訂正事項ｇは、特許明細書の特許請求の範囲の請求項２において内分岐環状構造部分の重合度の下限を１６以上に限定しようとするものであるので、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当する。また、本発明のグルカンの内分岐環状構造部分の重合度が、１６以上であり得ることは、本件特許明細書第０１２５段落の「重合度１６〜３８の環状グルカンにナトリウムイオンが付加したピークが検出された。」と記載されているので、上記訂正は明細書に記載した事項の範囲内でされたものである。
　
　また、上記訂正事項ａ〜ｇは、いずれも実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
　
  したがって、本件訂正は、特許法第１２０条の４第２項但し書き並びに同条第３項において準用する同法第１２６条第２項及び第３項の規定に適合するので、訂正を認める。
　
３．特許異議の申立てについて
（１）本件発明
  上記２．に示したように本件訂正は認められるから、本件特許の請求項１〜２６に係る発明は、訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１〜２６に記載された事項により特定された次のとおりのものである。
　
【請求項１】内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０から５０００の範囲にあるグルカンであって、
　ここで内分岐環状構造部分とはα‐１，４−グルコシド結合とα−１，６‐グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、グルカン。
【請求項２】前記内分岐環状構造部分の重合度が、１６から１００の範囲である、請求項１に記載のグルカン。
【請求項３】前記外分岐構造部分の重合度が、４０以上である、請求項１または２に記載のグルカン。
【請求項４】前記外分岐構造部分の各単位鎖の重合度が、平均で１０から２０である、請求項３に記載のグルカン。
【請求項５】内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する重合度が５０から５０００の範囲にあるグルカンと、α‐１，４‐グルコシド結合のみを有する環状構造を有するグルカンとの、飲食用組成物としての混合物であって、
　ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４‐グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、混合物。
【請求項６】内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する重合度が５０から５０００の範囲にあるグルカンと、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造を有するグルカンとの、食品添加用組成物としての混合物であって、
　ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４‐グルコシド結合とα‐１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、混合物。
【請求項７】内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する重合度が５０から５０００の範囲にあるグルカンと、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造を有するグルカンとの、輸液としての混合物であって、
　ここで、内分岐環状構造部分とはα‐１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、混合物。
【請求項８】内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する重合度が５０から５０００の範囲にあるグルカンと、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造を有するグルカンとの、接着用組成物としての混合物であって、
　ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、混合物。
【請求項９】内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する重合度が５０から５０００の範囲にあるグルカンと、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造を有するグルカンとの、老化防止剤としての混合物であって、
　ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα‐１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、混合物。
【請求項１０】内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０から５０００であるグルカンの製造方法であって、
　該方法は、α−１，４−グルコシド結合とα−１，６‐グルコシド結合とを有する糖類と、枝作り酵素、Ｄ酵素、およびサイクロデキストリングルカントランスフエラーゼからなる群より選択される酵素とを反応させることを含み、
　ここで、Ｄ酵素またはサイクロデキストリングルカントランスフェラーゼを反応させる場合には、該方法は、該糖類と該酵素との反応生成物を精製することをさらに含み、
　ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である方法。
【請求項１１】前記糖類が澱粉である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】前記糖類がアミロペクチンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】前記サイクロデキストリングルカントランスフエラーゼが、Ａｌｋａｌｏｐｈiｌiｃ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ  Ａ２−５ａ由来の酵素である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】前記グルカンの重合度が５０から５０００の範囲にある、請求項１０から１３いずれかの項に記載の方法。
【請求項１５】前記内分岐環状構造部分の重合度が、１０から１００の範囲である，請求項１０ないし１４いずれかの項に記載の方法。
【請求項１６】前記外分岐構造部分の重合度が、４０以上である、請求項１０ないし１５いずれかの項に記載の方法。
【請求項１７】前記外分岐構造部分の各単位鎖の重合度が、平均で１０から２０である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０から５０００であるグルカンの製造方法であって、
　該方法はα−１，４‐グルコシド結合のみを有する糖類と、枝作り酵素とを反応させることを含み、
　ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４‐グルコシド結合とα‐１，６−グルコシド結合とで形成される現状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、方法。
【請求項１９】内分鼓環状構造部分と外分岐構造部分とを有する重合度が５０から５０００であるグルカンとα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造を有するグルカンとの混合物の製造方法であって、
　該方法は、α−１，４‐グルコシド結合とα−１，６‐グルコシド結合とを有する糖類と、枝作り酵素、Ｄ酵素、およびサイクロデキストリングルカントランスフェラーゼからなる群より選択される酵素とを反応させることを含み、
　ここで、Ｄ酵素またはサイクロデキストリングルカントランスフェラーゼを反応させる場合には、該方法は、該糖類と該酵素との反応生成物を精製することをさらに含み、　ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα‐１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、方法。
【請求項２０】前記糖類が澱粉である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】前記糖類がアミロペクチンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】請求項１に記載のグルカンを含有する、飲食用組成物。
【請求項２３】請求項１に記載のグルカンを含有する、食品添加用組成物。
【請求項２４】請求項１に記載のグルカンを含有する、輸液。
【請求項２５】請求項１に記載のグルカンを含有する、接着用組成物。
【請求項２６】請求項１に記載のグルカンを含有する、老化防止剤。
  
（２）異議申立の理由の概要
　特許異議申立人加太和博は、以下の理由により本件特許は取り消されるべきである旨を主張している。
１）請求項１〜２６に係る発明は、特許を受けようとする発明が明確でないので、
本件特許は特許法第３６条第６項第２号の要件を満たしていない特許出願に対してされたものであり、特許法第１１３条第１項第４号に該当する。
２）請求項１〜２６に係る発明は、単なる発見であって、産業上利用することができる発明に該当しないので、本件特許は特許法第２９条柱書に違反してされたものであり、特許法１１３条第１項第２号に該当する。
３）請求項１〜２６に係る発明は、甲第１〜５号証に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明できたものであるので、本件特許は特許法第２９条第２項に違反してされたものであり、特許法第１１３号第１項第２号に該当する。
　
（３）判断
１）特許法第３６条第６項第２号について
　特許異議申立人は、本件特許明細書の特許請求の範囲の記載における「重合度５０から５０００の範囲にある」との数値限定に関し、以下のａ〜ｆの理由により、請求項１〜２６に係る発明は明確でないから、特許法第３６条第６項第２号の規定に違反している旨を主張をしている。
　
ａ．限定された数値範囲内の技術的意義、即ち、規定された下限値及び上限値の臨界的意義が不明確であり、当業者であっても本発明の技術的意義を理解することができない。
　
ｂ．本願特許発明のグルカンの特徴を構成する「重合度５０から５０００」なる数値限定を特定した技術的意義を出願当初明細書において明確にすべきである。
　
ｃ．本件特許発明に係るグルカンの特定範囲の重合度がこの重合度範囲外のグルカンに比して、本願発明の目的を達成するためになぜ好適なのか、その具体的な理由が全く不明である。
　
ｄ．本件特許明細書の特許請求の範囲請求項１０とこれに従属する請求項１１〜１７並びに請求項１８、請求項１９とこれに従属する請求項２０〜２１の記載における「重合度が５０以上である」との数値限定は、下限値のみを表しているので、不明確である。
　
ｅ．本件特許明細書には特許発明の好適な実施態様が重合度５０以上、重合度５０から５０００である旨が記載されているが、本願発明の目的と関連する作用・効果の点で、真に好適であるか否かは実証されていない。特許を受けようとする発明に数個限疋を含める以上、当該数当該数値限定範囲内外での作用・効果の顕著な差異を示す必要がある。
　
ｆ．詳細に説明に具体的に開示されたＤ酵素又はサイクロデキストリングルカントランスフェラーゼを用いた反応により得られた、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有するグルカンの重合度は、１８５であって、請求項１０、請求１９等に記載された数値限定である「重合度５０以上」とは一致しないから、「重合度５０以上」の臨界的意義が不明であり、請求項１０とこれに従属する請求項１１〜１７並びに請求項１８
〜２１に記載された製造方法は、特許を受けようとする発明の外延が不明確である。
　
主張ａ〜ｃ及びｅについて
　上記主張ａ〜ｃ及びｅは、要するに、「重合度５０から５０００の範囲にある」との数値限定が、その範囲以外のものに比べての技術的意義・臨界的意義が明確でないというものである。しかしながら、一般に数値限定の技術的意義・臨界的意義は、新規性・進歩性との関連において問題となる事項であり、発明特定事項としての「重合度５０から５０００の範囲にある」との記載自体の意味するところは当業者に明らかであって、上記数値範囲の技術的意義が明確か否かに拘わらす、発明に属する具体的な事物を把握できるので、発明の範囲を不明確にするものとはいえない
　なお、ａ〜ｃ及びｅの主張は特許法第３６条第４項において委任する経済産業省令（特許法施行規則第２４条の２）に規定する要件にも関連するものであるが、この要件についても、本件明細書は、例えば、特許明細書の段落番号００１８の、「本願発明は、既存の澱粉と比較して、水に対する溶解度が高く、かつ溶解した溶液の粘度が低く、そして通常の澱粉に観察される老化が起こらないという優れた性質を有する環状グルカンであって、澱粉の代替物質として有用な物質の新規な製造方法を提供することを目的とする。」等の記載により、充足している。
　
主張ｄについて
　上記主張ｄは、「重合度が５０以上である」との数値限定は下限値のみを表しているので不明確であるというものであるが、訂正請求によって特許請求の範囲における本件発明のグルカンの重合度に関する記載は「重合度５０から５０００の範囲」に訂正されたので、下限値だけを示すことによる不明確さの問題は生じない。
　
主張ｆについて
　上記主張ｆは、発明の詳細な説明に開示された生成物の重合度が特許請求の範囲に規定された重合度範囲の下限値と一致していないというものであるが、特許請求の範囲に含まれるすべての範囲について発明の具体的な実施の形態を示す必要はなく、本件発明について特許請求の範囲に規定された重合度の範囲のものが、具体的形態として示された重合度のものと同様に製造・使用できないとすべき格別の理由もないので、これにより発明が不明確になっているとはいえない。
　
２）特許法第２９条柱書について
　特許異議申立人は、本件特許発明は、周知の酵素の備える作用を公知の製造工程に適用する製造方法とこの製造方法から得られる結果物に含まれる予測可能な物を提供することに留まるものであって、公知の製造方法によって得られる結果物に含まれる所望の重合度を、本発明に係る環状グルカンを当業者において常套手段である糖の構造決定手段を用いて見出したものである。よって、本件特許発明は、実証技術レベルの単なる発見に留まるものであるとともに特許請求の範囲で規定された当該重合度の有利性も不明であるから、技術的思想の創作である発明とは言い難く、特許法第２９条柱書に違反していると主張している。
   しかしながら、上記主張の前提である本件発明のグルカンが「公知の製造方法から得られる結果物に含まれる予測可能な物」といえるかどうかは、発明の新規性・進歩性の問題であり、この前提自体が本件発明に該当しないことは、下記３）に示すとおりであるので、本件発明が「単なる発見に留まり技術思想の創作とはいえない」との主張は採用できない。
　
３）特許法第２９条第２項について
ｉ．甲第１号証〜甲第４号証に記載された発明
　特許異議申立人が提出した甲第１号証〜甲第４号証には、それぞれ以下の事項が記載されている。
　
（Ｉ）甲第１号証：特開昭６０−７５２９５号公報
ａ．「糊化澱粉質に技作り酵素を作用させて得られる生成物から水溶性面分を採取することを特徴とする水溶性澱粉質の製造法１（特許請求の範囲第１項）
ｂ．「飲食物の製造に関し、糊化澱粉質に枝作り酵素を作用させて得られる生成物から採取した水溶性澱粉質を含有せしめることを特徴とする飲食物の製造法」（特許請求の範囲第２項）
ｃ．「澱粉を糊料としてさらに広く利用する目的て、澱粉を低分子化することなく物性を変化させる研究を実施した。その結果、澱粉のα−１，４−結合をα‐１，６−緒合に転移させる酵素（Ｑ−酵素、ＥＣ２．４．４．１８）、即ち枝作り酵素を澱粉に充分に作用させて、その可溶性区分を集めると高分子ではあるが、非常に水への溶解性の高い糖質を生成することを発見し、これに基づいて本発明を完成した。」（第１頁右欄８〜１６行）
ｄ．「本水溶性澱粉質は、原料澱粉に比較し水に極めて溶けやすく、低粘度ではあるが，還元力の増加はみられないこと，さらにゲル濾過（セフアデックスＧ−１００，ファルマシア社製）ではじめに溶出してくることから原料澱粉と同程度の分子量を有する高分子物質であると認められる。」（第３頁上段右欄１３〜１８行）
ｅ．「実施例２ワキシーコーンス夕ーチ１ｋｇに水３３Ｌを加え、水懸濁液とし、水酸化ナトリウムでｐＨ７５に調製し、沸騰水溶中で６５℃達温後１０分加熱糊化し、流水中で糊化液を４０℃以下に冷却後、バチルス・メガテリウム１０−５株を用いて得た枝作り酵素をコーンスターチ１ｇ当たり５単位添加し、室温で１晩反応させた。反応液を７０℃まで加熟して酵素を失活させた後、遠心分離液で５０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、水不溶性画分を除去した水可溶性画分液約３１Ｌにエチルアルコール約３０Ｌを加え、水可溶性画分を沈殿させた。その沈殿物を室温で減圧乾燥して、スピードカッター（ナショナルＭＫ−１２２型）で粉砕し１００メッシュの篩を通過する白色の水溶性澱粉質８５０ｇを得た。」（公開公報第４頁下段左欄１３〜右欄８行）
　
（II）甲第２号証：特開平６−６２８８３公報
ａ．「澱粉類にサイクロデキストリン合成酵素を作用させて得たサイクロデキストリン製品から内分岐大環状サイクロデキストリンを含むサイクロデキストリン混合物を製造する方法。」(特許請求の範囲第１項)
ｂ．「分岐ＣＤについては、特にＣＤ環内にα−１，６結合を持つ内分岐ＣＤは、古くはフレンチらによる内分岐α−及び内分岐β−の存在が予想されている。」(段落番号０００４)
ｃ．「そこで、本発明者らはαからγ−ＣＤには内分岐ＣＤは存在せず環に歪みがかかる大環状ＣＤにその存在の可能性を予想し、さらにプルラナーゼを用いず、グルコアミラーゼのみを用いた大環状ＣＤの調製を試み、グルコアミラーゼの作用を受けず、枝切り酵素の作用によりグルコース９個以上のα−１，４グルカンを産生することを確認し、内分岐大環状ＣＤの存在を明確にして本発明を完成したのである。」(段落番号０００７)
ｄ．「したがって、Ｅ’はＧ１０であり、Ｅはプルラナーゼで切断されない環状糖(ε−ＣＤ）と、環内にα−１，６結合を１個もつ内分岐大環状ＣＤ（ＩＢｒ−ε−ＣＤ〕の混合物であることが明らかにされた。」（段落番号００１８）
ｅ．「環内にα−１，６結合が２個以上ある大環状内複分岐ＣＤは未だ発見されていないが、その存在も予想できる。」（段落番号００２０）
ｆ．「本発明の方法では、ＣＤ合成酵素により生産されたＣＤ製品からグルコアミラーゼを用いることにより、内分岐大環状ＣＤを含むＣＤ混合物を製造することができる。さらに、酵母を作用させることによりグルコースとマルトースは資化されるので、α−，β−，γ−ＣＤを含む大環状ＣＤ混合物が得られる。用途によってはこの状態でも商品化できるが、大環状ＣＤ含有量を高めた製品を生産するには、ＯＤＳカラムを用いる。すなわち、水溶出によりε環以上のＣＤが得られるので、これを濃縮して製品化すればよい。」　（段落番号００２９）
ｇ．「大環状ＣＤの利用法としては、クロロフィル、ステロイド、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、その他の分子量が大きい疎水性物質の包接、普通環ＣＤでは包接し難い不快臭の包接などがあり、さらに溶解性にも優れているので、可溶化にも利用できる。その他普通環ＣＤ、分岐ＣＤと同様に、医薬、化粧品、化学工業等への用途も考えられる。」（段落番号００３０）
　
（III）甲第３号証：特開平１−１９９５７５号公報
ａ，「ＣＧＴａｓｅは、デンプン、アミロース、アミロぺクチン、グリコーゲンなどのα−１，４−グルカン及びそれらの部分加水分解物中のα−１，４−グルコピラノシド結合に作用してサイクロデキストリン類を生成するＣＤ生成反応、そしてサイクロデキストリン類を開環して蔗糖やマルトースなどの糖残基受容体に転移するカップリング反応及び種々の重合度を異にするマルトオリゴ糖を生成する不均化反応を触媒する酵素である。」（第２頁所上段右欄１６行へ同第２頁下段左欄５行）
ｂ．当該公開公報に開示された第３表及び第１図には、サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを糖に作用させたときの生成物に関する記載がある。
　
(IV)甲第４号証：「澱粉科学ハンドブック」二國二郎監修、朝倉書店、昭和５２年７月２０日初版
ａ．「さらに高重合度（〜１２）までのサイクロデキストリンが分離されているが、重合度１０以上のものは環状分子に側鎖が縮合したものと考えられる。（Ｐ６７）
ｂ．「アミロペクチンから形成したサイクロデキストリンのなかにはα−１，６−結合
を含むものもある。」（Ｐ４７２）
　
（Ｖ）甲第５号証：「澱粉科学」第３０巻、第２号、１９８３年刊行
ａ．「枝作り酵素(branching enzyme)は、α−１，４グルカンに作用し、その結合を切断グルカン鎖を同一分子内または他の分子にα−１，６結合で転移させる作用を解媒する酵素である。」　（Ｐ２２３）
ｂ．「澱粉を含む食品加工において澱粉の老化は保存性の低下や消化率の減少をもたらす等、大きな問題点となっているが、その原因の大半は、澱粉中に含まれるアミロースの老化に起因している。したがって、branching enzymeを用いて、食品中の澱粉分子に更に枝分れさせることができれば澱粉の老化防止や、食品の物性の改善などに有効と考えられ、その応用途は非常に広いものと予想される。」　（Ｐ２２３）     　
　
ｉｉ．対比・判断
ａ．請求項１に係る発明について
　はじめに、甲第１号証に記載された水溶性澱粉質が、本件特許の請求項１に記載されたグルカン（以下、本件グルカンという。）に相当する構造を有する物質であるか否かについて検討する。
　本件グルカンの製法を示した本件実施例１の記載と、甲第１号証の水溶性澱粉質製法を示した甲第１号証の実施例２の記載を対比すると、両者はいずれもワキシコーンスターチを微アルカリ性条件下（ｐＨ７．５）で加熱して糊化し、冷却後に枝作り酵素を添加して反応させ、酵素失活、遠心分離後に、可溶性画分にエタノールを加えて沈殿させ、凍結乾燥して、粉末生成物を得る工程から構成されている点で一致しているが、本件グルカンの製法では、使用する枝作り酵素の使用量が、「基質１ｇ当たり約５０〜１００００単位である。」［００６９欄］とされ、実施例１においても１ｇ当たり４００単位が使用されているのに対し、甲第１号証の製法では、１ｇ当たり５ｇが使用されているに過ぎない点で相違している。そして、甲第１号証における生成物は、「原料澱粉と同程度の分子量を有する高分子物質である」と記載されており、これに反して本件グルカンと同程度の重合度範囲までに低分子化していると考えるべき根拠は見出せない。　また、甲第１号証を精査しても、澱粉に枝作り酵素を作用させることによって、本件グルカンの特徴的な構造である内分岐環状部分を形成する反応が生じることについても何らの記載も示唆もなく、甲第１号証に記載された水溶性澱粉質が内分岐環状部分を有すると理解できる根拠も見出せない。
　そうすると、甲第１号証に記載された水溶性澱粉質が、本件特許の請求項１に記載されたグルカン（以下、本件グルカン）に相当する内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する構造を有する物質とすることはできないし、重合度の点でも本件グルカンで規定している範囲内のものとは認めることができない。
　
  次に、甲第２号証に記載された、内分岐環状構造を有する大環状シクロデキストリン（ＣＤ）が、本件グルカンに相当する構造を有するか否かについて検討する。
　甲第２号証には、上記大環状ＣＤについて、「利用法としては、・・・普通環ＣＤでは包接し難い不快臭の包接」。「枝切り酵素の作用によりグルコース９個以上の以上のα−１，４グルカンを産出」、「水溶出によりε環以上のＣＤが得られるので、これを濃縮して製品化すればよい」と記載されており、その製法及びこれらの記載からみて、α〜γＣＤに比べて相対的には大環状であるとしても、本件グルカンのような重合度５０を超えるようなものまでも示唆しているとは認めることができない。また、甲第２号証には、大環状ＣＤが内分岐環状構造部分と共に外分岐構造部分を有することを示唆する記載もない。
　そうすると、甲第２号証に記載された大環状ＣＤが、本件特許の請求項１に記載されたグルカン（以下、本件グルカン）に相当する内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する構造を有する物質とすることはできないし、重合度の点でも本件グルカンで規定している範囲内のもの認めることができない。
　
　また、甲第３〜４号証のいずれにも、本件グルカンのような重合度５０を超えるようなものまでも示唆する記載も、内分岐環状構造部分と共に外分岐構造部分を有することを示唆する記載も見出せない。
　
　甲第５号証は、本件グルカンの製造に使用される酵素についての一般的な事項が記載されているだけであり、該酵素の作用により本件グルカンが生成するについては記載も示唆もされていない。
　
　以上に述べたように、本件グルカンは甲第１号証〜甲第５号証のいずれにも記載も示唆もされていない物質であるし、甲第１号証〜甲第５号証の記載を組み合わせても、当業者が本件グルカンを想到し、製造することができるということはできない。
　
  したがって、本件特許の請求項１に係る発明は、刊行物１〜５に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明できたものと認めることができない。
　
ｂ．請求項２〜２６項に係る発明について
　請求項２〜４に係る発明は本件グルカンをさらに限定したものであり、請求項５〜９に係る発明は本件グルカンを含む混合物であり、請求項１０〜１９に係る発明は本件グルカン又はそれを含む混合物の製造方法であり、請求項２０〜２６に係る発明は本件グルカンを含有する用途発明であるので、上に述べたと同様の理由によって、当業者が容易に発明できたものと認めることができない。
 　
４．むすび
　以上のとおりであるから、特許異議申立ての理由及び証拠によっては、本件特許の請求項１〜２６に係る発明についての特許を取り消すことができない。
　また、他に本件特許の請求項１〜２６に係る発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１４年１月３１日（２００２．１．３１）
【訂正の要旨】
訂正の要旨について
訂正事項ａ
　特許請求の範囲の減縮を目的として、特許請求の範囲の請求項１０の記載中の
「重合度が５０以上であるグルカンの製造方法」
を、
「重合度が５０から５０００であるグルカンの製造方法」
に訂正する。
訂正事項ｂ
　特許請求の範囲の減縮を目的として、特許請求の範囲の請求項１０の記載中の「反応させることを含み、」の後に改行して、
「ここで、Ｄ酵素またはサイクロデキストリングルカントランスフェラーゼを反応させる場合には、該方法は、該糖類と該酵素との反応生成物を精製することをさらに含み、」
を挿入する。
訂正事項ｃ
　誤記の訂正を目的として、特許請求の範囲の請求項１３の記載中の
「Ａ　１ｋａｌｏｐｈｉｌｌｃ」
を、
「Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｌｃ」
に訂正する。
訂正事項ｄ
　特許請求の範囲の減縮を目的として、　特許請求の範囲の請求項１８の記載中の
「重合度が５０以上であるグルカンの製造方法」
を、
「重合度が５０から５０００であるグルカンの製造方法」
に訂正する。
訂正事項ｅ
　特許請求の範囲の減縮を目的として、　特許請求の範囲の請求項１９の記載中の
「重合度が５０以上であるグルカンの製造方法」
を、
「重合度が５０から５０００であるグルカンの製造方法」
に訂正する。
訂正事項ｆ
　特許請求の範囲の減縮を目的として、　特許請求の範囲の請求項１９の記載中の「反応させることを含み、」の後に改行して、
「ここで、Ｄ酵素またはサイクロデキストリングルカントランスフェラーゼを応させる場合には、該方法は、該糖類と該酵素との反応生成物を精製することさらに含み、」
を挿入する。
訂正事項ｇ
　特許請求の範囲の減縮を目的として、特許請求の範囲の請求項２の記載中の
「前記内分岐環状構造部分の重合度が、１０から１００の範囲である」
を、
「前記内分岐環状構造部分の重合度が、１６から１００の範囲である」
に訂正する。
（５４）【発明の名称】
環状構造を有するグルカンおよびその製造方法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０から５０００の範囲にあるグルカンであって、
　ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、
グルカン。
　【請求項２】　前記内分岐環状構造部分の重合度が、
１６
　【請求項３】　前記外分岐構造部分の重合度が、４０以上である、請求項１または２に記載のグルカン。
　【請求項４】　前記外分岐構造部分の各単位鎖の重合度が、平均で１０から２０である、請求項３に記載のグルカン。
　【請求項５】　内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する重合度が５０から５０００の範囲にあるグルカンと、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造を有するグルカンとの、飲食用組成物としての混合物であって、
　ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、混合物。
　【請求項６】　内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する重合度が５０から５０００の範囲にあるグルカンと、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造を有するグルカンとの、食品添加用組成物としての混合物であって、
　ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、
混合物。
　【請求項７】　内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する重合度が５０から５０００の範囲にあるグルカンと、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造を有するグルカンとの、輸液としての混合物であって、
　ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、
混合物。
　【請求項８】　内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する重合度が５０から５０００の範囲にあるグルカンと、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造を有するグルカンとの、接着用組成物としての混合物であって、
　ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、
混合物。
　【請求項９】　内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する重合度が５０から５０００の範囲にあるグルカンと、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造を有するグルカンとの、老化防止剤としての混合物であって、
　ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、
混合物。
　【請求項１０】　内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０
から５０００
　該方法は、α−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とを有する糖類と、枝作り酵素、Ｄ酵素、およびサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素とを反応させることを含み、
　
ここで、Ｄ酵素またはサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを反応させる場合には、該方法は、該糖類と該酵素との反応生成物を精製することをさらに含み、
　ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、方法。
　【請求項１１】　前記糖類が澱粉である、請求項１０に記載の方法。
　【請求項１２】　前記糖類がアミロペクチンである、請求項１０に記載の方法。
　【請求項１３】　前記サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼが、
Ａｌ
　【請求項１４】　前記グルカンの重合度が５０から５０００の範囲にある、請求項１０から１３いずれかの項に記載の方法。
　【請求項１５】　前記内分岐環状構造部分の重合度が、１０から１００の範囲である、請求項１０ないし１４いずれかの項に記載の方法。
　【請求項１６】　前記外分岐構造部分の重合度が、４０以上である、請求項１０ないし１５いずれかの項に記載の方法。
　【請求項１７】　前記外分岐構造部分の各単位鎖の重合度が、平均で１０から２０である、請求項１６に記載の方法。
　【請求項１８】　内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０
から５０００
　該方法は、α−１，４−グルコシド結合のみを有する糖類と、枝作り酵素とを反応させることを含み、
　ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、方法。
　【請求項１９】　内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する重合度が５０
から５０００
　該方法は、α−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とを有する糖類と、枝作り酵素、Ｄ酵素、およびサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼからなる群より選択される酵素とを反応させることを含み、
　
ここで、Ｄ酵素またはサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを反応させる場合には、該方法は、該糖類と該酵素との反応生成物を精製することをさらに含み、
　ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、方法。
　【請求項２０】　前記糖類が澱粉である、請求項１９に記載の方法。
　【請求項２１】　前記糖類がアミロペクチンである、請求項１９に記載の方法。
　【請求項２２】　請求項１に記載のグルカンを含有する、飲食用組成物。
　【請求項２３】　請求項１に記載のグルカンを含有する、食品添加用組成物。
　【請求項２４】　請求項１に記載のグルカンを含有する、輸液。
　【請求項２５】　請求項１に記載のグルカンを含有する、接着用組成物。
　【請求項２６】　請求項１に記載のグルカンを含有する、老化防止剤。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【発明が属する技術分野】
　本願発明は、澱粉加工工業における原料、飲食用組成物、食品添加用組成物、糊料あるいは生物崩壊性プラスチック用の澱粉の代替物質として有用な、グルカンあるいはその誘導体、およびその製造方法に関する。
　【０００２】
　更に詳しくは、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０以上であるグルカンおよびその製造方法に関する。
　【０００３】
　【従来の技術】
　澱粉は、マルトース、水飴類、またはサイクロデキストリンなどの製造のための原料、飲食用組成物、食品添加用組成物、糊料あるいは生物崩壊性プラスチック用素材として用いられている高分子物質である。しかし、既存の澱粉には、溶解性が低いこと、老化しやすいこと、および高い粘度を有すること、という問題点がある。具体的には、澱粉は、一般的に水に対する溶解度が低い。従って、澱粉を溶解するためには、加熱処理、または、有機溶媒、酸、あるいはアルカリなどにより処理を行うことが必要である。
　【０００４】
　溶解した澱粉もしくは糊化した澱粉は、迅速に老化し、不溶性の沈澱を形成する。澱粉の老化は、澱粉溶液の粘弾性、澱粉の接着性などの物性を変化させる、あるいは、澱粉質を含有する食品においては、保水性、保形性、冷凍耐性、または消化性を低下させるなどの問題を引き起こしている。
　【０００５】
　さらに、糊化した澱粉は、高い粘度を有する。これは、澱粉中のアミロペクチンが、房状構造が多数連なった非常に長い分子であることに起因する。高粘度であるため、澱粉を、マルトースあるいはサイクロデキストリンなどを製造するための原料として用いる場合、取り扱いが困難であるという問題がある。例えば、一定濃度以上の糊化した澱粉を用いた場合には、製造時に輸送用のパイプが詰まることがある。
　【０００６】
　このように、既存の澱粉が有する上記性質（溶解性の低さ、老化性、および高粘度）は、食品およびその他の産業において、澱粉の利用を制限するものであった。
　【０００７】
　そこで、これらの澱粉を低分子化させることにより、溶解性および耐老化性を向上させる研究が行われ、ある程度は、老化を防止し得るようになった。しかし、過剰な分子量低下を抑えることは困難であり、高分子である本来の澱粉の持つ固有の性質を失うという問題が生じた。さらに、これらの方法では、澱粉の還元力が増加するため、タンパク質やアミノ酸などと混合して加熱した際に、これらの物質との反応により、澱粉が着色してしまうため、その用途は制限されていた。一方で、これらの澱粉を低分子化することなく、溶解性を向上させる研究が行われ、澱粉のα−１，４−結合を切断し、α−１，６−結合を転移反応により合成する酵素（Ｑ−酵素、ＥＣ　２．４．１．１８）、すなわち枝作り酵素を澱粉に反応させて、水溶性澱粉が得られている（特開昭６０−７５２９５号公報）。しかし、この方法で得られた水溶性澱粉は、原料として用いた澱粉と同程度の分子量を有する高分子物質であり、上記澱粉が有する問題点を解決するものではなかった。
　【０００８】
　他方、上記澱粉の代替物として、Ｄ−グルコースからなる環状の糖類、すなわち環状グルカンを使用することが考えられる。
　【０００９】
　この環状グルカンとしては、サイクロデキストリン類が既に知られている。サイクロデキストリン類は、通常、澱粉等にサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（以下、ＣＧＴａｓｅという）を反応させて製造されている。
　【００１０】
　澱粉にＣＧＴａｓｅを作用させることによりサイクロデキストリン（ＣＤ）を合成すると、通常６から８の重合度を有するサイクロデキストリン（α−ＣＤ、β−ＣＤ、およびγ−ＣＤ）が生産される。このα−、β−あるいはγ−ＣＤでは、澱粉の代替物とはなり得ないため、さらに重合度の大きいサイクロデキストリンが必要となる。
　【００１１】
　重合度が９から１３のサイクロデキストリン類が、澱粉にＣＧＴａｓｅを作用させて合成されている（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　ｖｏｌ．１１１　１５３−１６５（１９６５）が、その収量は極めて低い。さらに重合度が大きい環状のグルカンについては、開示されていない。
　【００１２】
　特開平６−６２８８３は、高重合度のＣＤを開示しているが、その重合度は、最高２８程度である。しかも、内分岐ＣＤを含まないε−（重合度１０）、η−（重合度１２）、θ−（重合度１３）のＣＤにマルトースを過剰に加えてプルラナーゼを作用させて製造され得るという可能性を示唆しているにすぎない。
　【００１３】
　ところで、上記Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　ｖｏｌ．１１１　１５３−１６５（１９６５）には、α−１，４−グルコシド結合からなる環状構造内部にα−１，６−結合を有するグルカン（内分岐グルカン、あるいは内分岐ＣＤ）、あるいは、環状α−１，４−グルカンの外部にα−１，６−結合を有するグルカン（外分岐グルカン、あるいは外分岐ＣＤ）が副産物として生産されることが記載されている。
　【００１４】
　内分岐グルカンは、特開平６−６２８８３に、内分岐構造を有するサイクロデキストリンとしてその構造が記載されている。この公開公報には、内分岐サイクロデキストリンは、環に大きなひずみがかかる重合度１０から１３の大環状サイクロデキストリンにのみ存在すること、および環内に存在するα−１，６−結合の個数は、多数個の可能性も示唆されているものの、分析した範囲ではすべて１個であったことが記載されている。
　【００１５】
　外分岐グルカンについては、その製法と構造が、特開昭６３−４６２０１および特開昭６４−７４９９７に記載されている。これらの公開公報には、分岐デキストリンとサイクロデキストリンとを混合し、枝きり酵素を作用させて、外分岐サイクロデキストリンを製造したことが記載されている。しかし、反応に使用したサイクロデキストリンが内分岐環状構造を有していないので、内分岐環状構造部分と外分岐構造とを有するグルカンは、開示されていない。さらに、環状構造部分は、重合度６−８であり、分岐構造部分は、せいぜい重合度６のマルトオリゴ糖あるいは分岐マルトオリゴ糖が結合しているものにすぎない。
　【００１６】
　以上のように、上記澱粉の代替物として、サイクロデキストリンを使用することが考えられたが、いずれも重合度は小さく、代替物となり得ない。また、内分岐あるいは外分岐を有するＣＤも開示されているが、重合度が小さく、澱粉の代替物としては、使用できない。さらに、内分岐あるいは外分岐構造を有するＣＤも開示されているが、重合度の高いＣＤの生産は極めて微量であるから、澱粉の代替物としての環状グルカンを大量に生産することはきわめて困難であるというのが現状である。
　【００１７】
　従って、澱粉の代替となり得る分子量の大きい環状グルカンの簡易な製造方法が望まれていた。
　【００１８】
　【発明が解決しようとする課題】
　本願発明は、上記問題点を解決することを目的とするものである。本願発明は、既存の澱粉と比較して、水に対する溶解度が高く、かつ溶解した溶液の粘度が低く、そして通常の澱粉に観察される老化が起こらないという優れた性質を有する環状グルカンであって、澱粉の代替物質として有用な物質の新規な製造方法を提供することを目的とする。
　【００１９】
　【課題を解決するための手段】
　本願発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、従来、環状化反応を触媒するとは考えられなかった１，４−α−グルカン分枝酵素（枝作り酵素、Ｑ酵素）および４−α−グルカノトランスフェラーゼ（Ｄ酵素、不均化酵素）が、澱粉に作用して環状グルカンを合成し得ることを初めて見いだし、本願発明に至ったものである。さらに、本願発明者らは、ＣＧＴａｓｅの反応機構として、従来知られていた機構とは異なる反応機構を見いだした。その反応機構に基づいて、ＣＧＴａｓｅを用いて、分岐を有する環状グルカンを合成し得ることを発見し、これを利用して本願発明を完成させたものである。
　【００２０】
　本願発明は、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０以上であるグルカン（以下、本願発明のグルカンという）に関する。
　【００２１】
　好適な実施態様においては、前記グルカンの重合度が５０から５０００の範囲にある。
　【００２２】
　好適な実施態様においては、前記グルカンの内分岐環状構造部分の重合度が、１０から１００の範囲である。
　【００２３】
　好適な実施態様においては、前記グルカンの外分岐構造部分の重合度が、４０以上である。
　【００２４】
　好適な実施態様においては、前記外分岐構造部分の各単位鎖の重合度が、平均で１０から２０である。
　【００２５】
　さらに、本願発明は、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する重合度が５０以上であるグルカンと、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造を有するグルカンとの混合物に関する。
　【００２６】
　さらに、本願発明は、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０以上であるグルカンの製造方法であって、該方法は、α−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とを有する糖類と、該糖類に作用して環状構造を形成し得る酵素とを反応させることを含む。
　【００２７】
　好適な実施態様においては、前記糖類が澱粉、あるいはアミロペクチンである。好適な実施態様においては、前記酵素が枝作り酵素、Ｄ酵素、あるいはサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼである。
　【００２８】
　さらに好適な実施態様においては、前記サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼが、Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ２−５ａ由来の酵素である。
　【００２９】
　好適な実施態様においては、前記グルカンの重合度が５０から５０００の範囲にある。
　【００３０】
　好適な実施態様においては、前記グルカンの内分岐環状構造部分の重合度が、１０から１００の範囲である。
　【００３１】
　好適な実施態様においては、前記グルカンの外分岐構造部分の重合度が、４０以上である。
　【００３２】
　好適な実施態様においては、前記外分岐構造部分の各単位鎖の重合度が、平均で１０から２０である。
　【００３３】
　本願発明は、さらに、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０以上であるグルカンの製造方法であって、該方法は、α−１，４−グルコシド結合のみを有する糖類と、枝作り酵素とを反応させることを含む。
　【００３４】
　本願発明は、また、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する重合度が５０以上であるグルカンと、α−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造を有するグルカンとの混合物の製造方法であって、該方法は、α−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とを有する糖類と、該糖類に作用して環状構造を形成し得る酵素とを反応させることを含む。
　【００３５】
　好適な実施態様においては、前記糖類が澱粉、あるいは、アミロペクチンである。
　【００３６】
　好適な実施態様においては、前記酵素がＤ酵素あるいはサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼである。
　【００３７】
　本願発明は、さらに、上記グルカンを含有する、飲食用組成物、食品添加用組成物、輸液、接着用組成物および澱粉の老化防止剤に関する。
　【００３８】
　本願発明の方法により、上記目的が達成され得る。
　【００３９】
　【発明の実施の形態】
　以下、本願発明を詳細に説明する。
　【００４０】
（本願発明の概略）
　図１は、本願発明の、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０以上のグルカンの製造方法のひとつを示す模式図である。図１において、水平の直線および曲線は、α−１，４−グルコシド結合でつながったグルカンの鎖を示し、垂直の矢印は、α−１，６−グルコシド結合を示す。図１の２１は還元末端を示す。白ぬり三角は酵素がアッタクしたグルコシド結合を、黒ぬり三角は酵素作用により新たに合成されたグルコシド結合を示す。（以下の模式図における水平の直線、曲線、および垂直の矢印、白ぬり三角、および黒ぬり三角も同様である）。
　【００４１】
　本願発明は、α−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とを有するアミロペクチンに、ＣＧＴａｓｅ、枝作り酵素（ＢＥと表す）、あるいはＤ酵素（ＤＥと表す）を作用させると、図１の２、５、および６で示される内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０以上のグルカンが得られることを発見して完成されたものである。図２は、図１で得られた反応生成物のゲル濾過パターンである。いわゆる大環状ＣＤといわれる図１の３、内分岐ＣＤといわれる図１の８、外分岐ＣＤといわれる図１の９、そしてＣＤ（図１の４）等よりも分子量が大きいが、原料よりは明らかに分子量が小さい。
　【００４２】
　図１における２、５、あるいは６で示されるように、内分岐環状構造部分とその環状構造に結合した外分岐構造部分とからなり、重合度が５０以上のグルカンが、本願発明の方法で得られたグルカンである。その態様は、図３に示される。
　内分岐環状構造部分とは、本願明細書においては、α−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分をいう。
　【００４３】
　外分岐構造部分とは、本願明細書においては、前記内分岐環状構造に結合した非環状構造部分をいう。
　【００４４】
　なお、本願発明においては、上記グルカンという用語には、グルカンの誘導体が含まれる。さらに、本願発明の方法においては、原料という用語には誘導体化された原料が含まれる。
　【００４５】
（酵素）
　本願発明に使用し得る酵素としては、α−１，４−グルコシド結合および少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を有する糖類に作用して、重合度が５０以上であって、環状構造を有するグルカンを形成し得る酵素であれば、いずれをも使用し得る。使用し得る酵素としては、１，４−α−グルカン分枝酵素（枝作り酵素、Ｑ酵素）、４−α−グルカノトランスフェラーゼ（Ｄ酵素、アミロマルターゼ、不均化酵素）、サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　【００４６】
　これらの酵素が、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０以上のグルカンを生産することは、従来知られている酵素の作用機構を考慮すると、驚くべきことである。
　【００４７】
　枝づくり酵素は、澱粉系の糖類のα−１、４−グルカン鎖の一部を６位に転移して分枝を作る酵素である。従って、この枝作り酵素が、環状構造を形成し得るとは全く予想が出来ないものである。
　【００４８】
　さらに、Ｄ酵素（ディスプロポーショネーティングエンザイム）（ＥＣ　２．４．１．２５）は、マルトオリゴ糖の糖転移反応（不均一化反応）を触媒する酵素であり、供与体分子の非還元末端からグルコシル基あるいは、マルトシルもしくはマルトオリゴシルユニットを受容体分子の非還元末端に転移する酵素である。従って、酵素反応の結果、最初に与えられたマルトオリゴ糖の重合度の不均一化がおこる。この不均一反応は、例えば、可溶性澱粉あるいはアミロース等の高分子量の澱粉を供与体とし、グルコースあるいはマルトオリゴ糖を受容体としたときにおこることが知られている。従って、このＤ酵素を澱粉に作用させた場合、重合度の異なる糖類が生じることは予想し得ても、枝作り酵素と同様に、環状化糖を形成し得るとは全く予想ができないものである。
　【００４９】
　また、ＣＧＴａｓｅも、従来とは異なる反応機構を有するものであることが明らかとなり、本願発明に至ったものである。従って、本願発明は、従来、重合度が高く、かつ環状構造を有するグルカンを生産することが不可能と思われていた酵素を用いて、環状グルカンの新たな製造方法を提供するものである。以下、ＣＧＴａｓｅの新たな反応について説明する。
　【００５０】
　従来考えられていたＣＧＴａｓｅの反応を図４を用いて説明する。図４Ａに示すように、アミロース１１の様なα−１，４−グルカンにＣＧＴａｓｅを作用させた場合、本酵素はアミロース分子の非還元末端から６から８個のグルコース鎖を認識してこの部分を環状化させるように転移反応を行い、元の基質からの最終的な産物は、重合度６−８の環状マルトオリゴ糖（α−、β−およびγ−ＣＤ）１２と少量の非環状オリゴ糖１３になると考えられていた。
　【００５１】
　また、図４Ｂに示すように、ＣＧＴａｓｅをアミロペクチン１４に作用させた場合も、アミロペクチン側鎖の非還元末端の６から８個のグルコース鎖を認識してこの部分を環状化させるように転移反応を行い、重合度６−８のＣＤ１２と非環状リミットデキストリン１５になると考えられていた。
　【００５２】
　他方、本願発明者らは、ＣＧＴａｓｅをアミロペクチンに作用させた際の、生産物のゲルろ過クロマトグラフィーの溶出パターンの変化を検討した。図５にその結果を示す。ボイドボリュームの位置に溶出されていたアミロペクチンは、酵素反応の経過とともに、低分子化し、主として２つの低分子ピーク（ＩおよびＩＩ）を生じた。このうちピークＩＩは低分子のＣＤ（α−およびβ−ＣＤ）であった。またＩとＩＩの間の小さなピークは、重合度９〜１４程度の大環状ＣＤ、内分岐ＣＤ、外分岐ＣＤ、リニアなマルトオリゴ糖の混合物のピークであった。一方、ピークＩはこれらのＣＤよりも明らかに高分子であるが、アミロペクチンよりは明らかに小さい。これらの結果は、図４Ｂのメカニズムでは説明ができず、より大きな環状化反応（図６）を考えることにより説明がつく。
　【００５３】
　もし、このような環状化反応が起こっている場合、環状構造部分はグルコアミラーゼにより分解されないため、グルコアミラーゼに耐性を示すグルカンが生じているはずである。
　【００５４】
　そこで、図５の各反応時間の生産物中のＣＤ量、ＣＤ以外のグルコアミラーゼ耐性グルカン量を求めた。なおここで反応液中のＣＤ量は、α、β、γ−ＣＤをそれぞれＨＰＬＣ法により定量して求めた。グルコアミラーゼ耐性グルカン量はグルコアミラーゼにより分解されないグルコース量を測定して求めた。ＣＤ以外のグルコアミラーゼ耐性グルカン量はグルコアミラーゼ耐性グルカンの全量からＣＤ量を差し引くことにより求めた。図７に示したように、ＣＧＴａｓｅを作用させることにより、明らかにＣＤ以外のグルコアミラーゼ耐性グルカンがつくられていることがわかった。従って、図５でみられた、アミロペクチンの低分子化産物ピークＩは、図６のような大きな環状化反応により起こっていることが考えられる。
　【００５５】
　そこで、低分子化反応物ピークＩを分取し、これをさらに分析したところ、この物質がα−１，６−結合を含む環状構造を有するグルカンであることが証明できた。このことは、ＣＧＴａｓｅをアミロペクチンに作用させた場合にも、これまで知られていたような、ＣＤ合成反応以外に、α−１，６−結合を含む環状化反応を触媒する事が証明されたことを示している。
　【００５６】
　以上のように、本願発明は、糖類に作用する種々の酵素に、環状構造を形成し得る能力があることを見いだして本願発明を完成させたものであり、環状構造を形成し得る能力がある酵素はすべて、本願発明に含まれ得る。
　【００５７】
（枝作り酵素）
　枝づくり酵素は、種々の植物、動物、細菌等の微生物に存在しており、その起源は問わない。反応最適温度が高い点から、好熱性細菌由来の枝作り酵素遺伝子をクローン化した大腸菌から精製された枝作り酵素が、あるいは、大量の酵素が得易い点から、馬鈴薯由来の枝作り酵素が好ましい。
　【００５８】
（Ｄ酵素）
　Ｄ酵素としては、種々の植物、あるいは微生物に由来するものが使用され得、市販の酵素も使用され得る。Ｄ酵素は最初、馬鈴薯から発見されたが、馬鈴薯以外にも、種々の植物および大腸菌などの微生物に存在することが知られている。この酵素は、植物に由来する場合にはＤ酵素、微生物に由来する場合にはアミロマルターゼと呼ばれている。従って、Ｄ酵素はその起源は問わず、植物由来の酵素をコードする遺伝子を大腸菌などの宿主を用いて発現させたものであっても使用し得る。
　【００５９】
（ＣＧＴａｓｅ）
　ＣＧＴａｓｅとしては、周知の微生物由来のＣＧＴａｓｅ、あるいは市販のＣＧＴａｓｅが用いられ得る。微生物由来のＣＧＴａｓｅとしては、好適には、市販のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所、岡山）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ由来のＣＧＴａｓｅ（商品名：コンチザイム、天野製薬株式会社、名古屋）、あるいはＡｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ２−５ａ由来のＣＧＴａｓｅが用いられ得る。より好適には、Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ２−５ａ由来のＣＧＴａｓｅが用いられ得る。Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　Ａ２−５ａは、特開平７−１０７９７２号に開示されているアルカリ域で高い活性を有するＣＧＴａｓｅを産生する株であり、出願人によって、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１３８６４）として寄託されている。
　【００６０】
　上記枝作り酵素、Ｄ酵素、あるいはＣＧＴａｓｅは、澱粉分子内のα−１，４−またはα−１，６グルコシド−結合を加水分解するエンド型のアミラーゼ類の酵素活性が検出されなければもしくは非常に弱ければ、精製段階の粗酵素であっても、本願発明のグルカンの製造に使用し得る。
　【００６１】
　また、本願発明に用いる酵素は、精製酵素、粗酵素を問わず、固定化されたものでも反応に使用し得、反応の形式は、バッチ式でも連続式でもよい。固定化の方法としては、担体結合法、（たとえば、共有結合法、イオン結合法、あるいは物理的吸着法）、架橋法あるいは包括法（格子型あるいはマイクロカプセル型）等、当業者に周知の方法が使用され得る。
　【００６２】
（使用する原料：基質）
　本願発明に使用する原料としては、α−１，４−グルコシド結合および少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を有する糖類が用いられ得る。このような糖類としては、澱粉、澱粉の部分分解物、アミロペクチン、グリコーゲン、ワキシー澱粉、ハイアミロース澱粉、可溶性澱粉、デキストリン、澱粉加水分解物、ホスホリラーゼによる酵素合成アミロペクチンなどが挙げられる。
　【００６３】
　澱粉としては、通常市販されている澱粉であればどのような澱粉でも用いられ得る。例えば、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、くず澱粉、タピオカ澱粉などの地下澱粉、コーンスターチ、小麦澱粉、米澱粉などの地上澱粉が用いられ得る。
　【００６４】
　澱粉の部分分解物としては、上記澱粉を酵素や酸などで部分的に加水分解したもの、澱粉の枝切り物が挙げられる。
　【００６５】
　アミロペクチンとしては、特にアミロペクチン１００％からなるワキシーコーンスターチが、製造されるグルカンの分子量分布がより均一となるため、好適に用いられ得る。例えば、重合度が約６００程度以上のアミロペクチンが原料として用いられ得る。
　【００６６】
　また、枝作り酵素を用いる場合には、α−１，４−結合のみを有するグルカンも原料として用いられ得る。α−１，４−グルコシド結合のみを有する糖類としては、アミロース、澱粉の部分分解物、澱粉枝切り物、ホスホリラーゼによる酵素合成アミロース、マルトオリゴ糖などが挙げられる。重合度が約４００以上のアミロースが好適に用いられ得る。
　【００６７】
　また、原料としては、上記澱粉あるいは澱粉の部分分解物等の誘導体も用いられ得る。例えば、上記澱粉のアルコール性の水酸基の少なくとも１つが、グリコシル化、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化、あるいはリン酸化された誘導体なども用いられ得る。さらに、これらの２種以上の混合物も原料として用いられ得る。
　【００６８】
（酵素と原料との反応）
　本願発明のグルカンの製造方法における、上記原料と上記酵素とを反応させる工程は、本願発明のグルカンが生成するｐＨ、温度などの反応条件であれば、いずれもが用いられ得る。上記原料の濃度（基質濃度）も、反応条件等を考慮して決定され得る。
　【００６９】
　酵素が枝作り酵素である場合には、反応のｐＨは、通常約３から約１１である。反応速度、効率、酵素の安定性などの点から、好ましくは約４から約１０、さらに好ましくは約７から約９である。温度は、約１０℃から約１１０℃、反応速度、効率、酵素の安定性などの点から、好ましくは約２０℃から約９０℃である。基質濃度は、通常約０．０５％から約６０％程度、反応速度、効率、基質溶液の取り扱い易さなどの点から、好ましくは約０．１％から約３０％程度である。使用する酵素量は、基質１ｇあたり、通常約５０〜１０，０００単位である。
　【００７０】
　酵素がＤ酵素である場合には、反応のｐＨは、通常、約３から約１０、反応速度、反応効率、酵素の安定性などの点から、好ましくは約４から約９、さらに好ましくは、約６から約８である。温度は、約１０℃から約９０℃、反応速度、反応効率、酵素の安定性などの点から、好ましくは約２０℃から約６０℃、さらに好ましくは、約３０℃から約４０℃の範囲である。耐熱性の微生物などから得られる酵素を用いる場合は、約５０℃から約１１０℃の高温で使用し得る。原料の濃度（基質濃度）も、反応条件等を考慮して決定し得る。通常、約０．１％から約５０％程度、反応速度、効率、基質溶液の取り扱い易さなどの点から、好ましくは約０．１％から約３０％、溶解度などを考慮すると、さらに好ましくは、約０．１％から約２０％である。使用する酵素の量は、反応時間、基質の濃度との関係で決定され、通常は、約１時間から約４８時間で反応が終了するように酵素量を選ぶのが好ましい。基質１ｇあたり、通常約５００〜約１００，０００単位、好ましくは約７００〜約２５，０００単位、より好ましくは約２，０００〜約２０，０００単位である。
　【００７１】
　酵素がＣＧＴａｓｅである場合、反応時のｐＨは、通常約４から約１１である。反応速度、効率、酵素の安定性などの点から、好ましくは約４．５から約１０、さらに好ましくは約５から約８である。反応温度は、約２０℃から約１１０℃、反応速度、効率、酵素の安定性などの点から、好ましくは約４０℃から約９０℃である。基質濃度は、通常約０．１％から約５０％程度、反応速度、効率、基質溶液の取り扱い易さなどの点から、好ましくは、約０．１％から約３０％程度である。使用する酵素量は、基質１ｇあたり、通常約１から約１０、０００単位、好ましくは約１から約１、０００単位、より好ましくは約１から約５００単位である。
　【００７２】
　なお、各酵素の単位の決定法は、実施例で述べる。
　【００７３】
（生成物の単離、精製）
　上記反応で得られた種々の環状構造を有するグルカンは、当業者に周知の分離方法、例えば、クロマト分離（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）膜分離等で分離され、溶媒（例えば、メタノール、エタノール）を用いる沈澱等の方法を、単独で、あるいは組み合わせて用いて精製され得る。
　【００７４】
　本願発明の方法で、原料の澱粉からの本願グルカンの収率は非常に高く、特に、枝作り酵素を用いた場合にはほぼ１００％である。Ｄ酵素、あるいはＣＧＴａｓｅを用いる場合には、環状構造のみを有するグルカンも生産されるが、これらは、例えば、セファデックスを用いるゲル濾過により、容易に、目的の分岐構造を有する環状グルカンから分離され得る。
　【００７５】
　また、分離された環状グルカンは、ＨＰＬＣ等のゲル濾過で分子量に応じて分離され得る。
　【００７６】
（反応生成物）
　本願発明の方法で製造されるグルカンは、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有し、重合度が５０以上の、環状構造を有するグルカンである。重合度は、好ましくは約５０〜約１０、０００、より好ましくは約５０〜約７、０００　最も好ましくは、約５０〜約５、０００である。
　【００７７】
　本願発明の方法により製造されるグルカンに存在する、上記内分岐環状構造における重合度は、好ましくは、約１０〜約５００、さらに好ましくは、約１０〜約１００である。
　【００７８】
　本願発明の方法により製造されるグルカンに存在する、上記内分岐環状構造部分のα−１，６−グルコシド結合は少なくとも１個あればよく、通常１個〜約２００、好ましくは、約１〜約５０個である。
　【００７９】
　反応生成物の重合度は、ゲル濾過によって、重合度既知のアミロースの溶出位置から示差屈折計を用いて測定され得る。さらに、示差屈折計と低角度レーザー光散乱光度計を併用して、次の原理により重合度が決定され得る。示差屈折計の出力はグルカンの濃度に比例し、低角度レーザー光散乱計の出力はグルカンの重合度と濃度の積に比例する。従って、両検出器の出力の比を測定することにより、グルカンの重合度が決定され得る。
　【００８０】
（環状構造を有することの確認）
　本願発明の製造方法により得られるグルカンが、内分岐環状構造を有することの確認は、エキソ型のグルコアミラーゼを用いて行い得る。
　【００８１】
　エキソ型グルコアミラーゼは、澱粉などのグルカンの非還元末端から順次α−１，４−グルコシド結合を加水分解する酵素である。速度は遅いが、非還元末端からα−１，６−グルコシド結合を加水分解し得ることが知られている。図８に示したように、環状構造を有しないアミロースおよびアミロペクチンは、エキソ型グルコアミラーゼによリ完全にグルコース２７にまで分解される。しかし、分子内に環状構造を有するグルカン２５および２３は、その非環状構造部分のみがグルコアミラーゼにより分解され、環状構造部分は、グルコアミラーゼでは分解を受けない物質（以下、グルコアミラーゼ耐性成分という）として残る。
　【００８２】
　このグルコアミラーゼ耐性成分（環状構造部分）が、内分岐構造を有するか否かは、α−１，６−結合を切断する枝切り酵素に対する感受性によって決定することができる。
　【００８３】
　内分岐環状構造（α−１，６−グルコシド結合）を有する環状グルカン２６は、枝きり酵素とグルコアミラーゼの併用で、グルコース２７にまで完全に分解される。
　【００８４】
　他方、内分岐環状構造を有しない（α−１，４−グルコシド結合のみを有する）環状構造のグルカン２３は、枝切り酵素およびエキソ型グルコアミラーゼの併用によって分解されない。この環状グルカン２３は、エンド型α−アミラーゼとグルコアミラーゼを併用することにより完全にグルコースまで分解され得る。
　【００８５】
　これらの性質を利用することにより、グルカンの内分岐環状構造部分、外分岐（非環状）構造部分、およびα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造部分を定量することが可能となる。
　【００８６】
　本願発明で製造されるグルカンが、内分岐環状構造を有していることは、以下の▲１▼から▲６▼の性質で確認され得る。
　【００８７】
　▲１▼還元性末端数は、原料（澱粉など）と比較して増加しない。すなわち、還元末端を検出することができない。上記還元末端数の定量は、Ｈｉｚｕｋｕｒｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．９４：２０５−２１３（１９８１）の改変パークジョンソン法により行い得る。
　【００８８】
　▲２▼エキソ型アミラーゼであるグルコアミラーゼを作用させると、グルコアミラーゼ耐性成分が残る。その成分は脱リン酸化酵素（シグマ社）を作用させた後にさらにグルコアミラーゼを作用させても分解されない。
　【００８９】
　▲３▼上記グルコアミラーゼ耐性成分は、澱粉中のα−１，６−グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼ（株式会社林原生化学研究所製）により分解され、グルコアミラーゼの作用を受けるようになる。
　【００９０】
　▲４▼上記グルコアミラーゼ耐性成分は、澱粉中のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するエンド型α−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製）により分解され、グルコアミラーゼの作用を受けるようになる。
　【００９１】
　▲５▼▲４▼のエンド型α−アミラーゼによる加水分解により、イソマルトシルマルトース（ＩＭＭ）を生じる。α−１，６−グルコシド結合を有するグルカンにエンド型α−アミラーゼを作用させた場合の最小のリミットデキストリンは、ＩＭＭである（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ａｍｙｌａｓｅ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｅｍｚｙｍｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、ｐ４０−４５（１９８８））との記載と一致する。
　【００９２】
　▲６▼上記グルコアミラーゼ耐性成分の分子量をレーザーイオン化ＴＯＦ−ＭＳ装置（島津社製）で分析すると、得られた分子量の値は、環状グルカンの理論値に一致し、非環状のグルカンの理論値に一致しない。
　【００９３】
　内分岐環状構造部分の確認のために用いる、前記グルコアミラーゼ耐性成分の検出は、次のように行い得る。例えば、上記反応で生成したグルカンにグルコアミラーゼを添加し、例えば、約４０℃で一夜反応させる。この反応物を１００℃で１０分間加熱し、不溶物を遠心分離により除去した後、１０倍量のエタノールを添加し、残存する多糖を遠心分離による沈澱として回収する。この操作をもう一度繰り返して、グルコアミラーゼ耐性成分を得る。ただし、２回目のグルコアミラーゼの処理時間は、短時間（例えば、１から２時間）で十分である。
　【００９４】
　本願発明で使用する原料が一部リン酸基により修飾されている澱粉などの場合には、グルコアミラーゼ耐性成分の検出には前処理が必要である。例えば、反応生成物を１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および０．３ｍＭのＺｎＣｌ２を含む）に溶解し、脱リン酸化酵素を添加して反応させた後、１０倍量エタノールを添加し、沈澱を回収する。この沈殿に上記の方法を適用して、グルコアミラーゼ耐性成分を得ることができる。
　【００９５】
　グルコアミラーゼ耐性成分の重合度および構成成分は、上記▲１▼から▲６▼に記載のように、グルコアミラーゼ耐性成分と糖の加水分解酵素とを反応させて生じた糖を分析することによって、決定し得る。加水分解は、グルコアミラーゼ単独、グルコアミラーゼとイソアミラーゼとの組み合わせ、あるいはグルコアミラーゼとα−アミラーゼとの組み合わせが挙げられる。反応は、例えば、グルコアミラーゼ耐性成分を０．２％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に溶解後、上記分解酵素をそれぞれ適当量加えて、３０−４５℃で適当な時間（例えば１時間）反応させる。このグルコアミラーゼ耐性成分分解物を、Ｄｉｏｎｅｘ社製の糖分析システム（送液システム：ＤＸ３００、検出器：ＰＡＤ−２、カラム：Ｃａｒｂｏ　Ｐａｃ　ＰＡ１００）にかけ、分析する。溶出は、例えば、流速：１ｍｌ／分、ＮａＯＨ濃度：１５０ｍＭ、酢酸ナトリウム濃度：０分−５０ｍＭ、２分−５０ｍＭ、３７分−３５０ｍＭ、４５分−８５０ｍＭ、４７分−８５０ｍＭの条件で行う。この分析により、グルコアミラーゼ耐性成分の重合度、および分解により生じる糖が決定され得る。
　【００９６】
（重合度の調整）
　本願発明の方法で得られる内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有するグルカンの重合度も調整し得る。例えば、得られたグルカンにエキソ型のアミラーゼ、例えばグルコアミラーゼを作用させて、外分岐構造部分の糖鎖を切断し、重合度がより低いグルカンにし得る。この方法も、本願発明に含まれる。
　【００９７】
（本願発明のグルカンの用途等）
　本願発明のグルカンおよび本願発明で得られるグルカンは、種々の澱粉の用途に使用され得、特に、飲食用組成物、食品添加用組成物、輸液、接着用組成物、および澱粉の老化防止剤として、使用され得る。これら用途において、本願発明のグルカンは、それぞれの用途に適した濃度となるように使用され得る。
　【００９８】
　以下に実施例をあげて本願発明を説明するが、本願発明はこの実施例にのみ限定されるものではない。
　【００９９】
　【実施例】
Ａ　使用する酵素の調製および酵素活性の測定
　Ａ−１：枝作り酵素の調製：馬鈴薯からの精製および酵素活性の測定
　馬鈴薯塊茎を５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む適当な緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離して、孔径０．４５μｍの膜を通した後、Ｑ−セファロースカラム（上述）にかけ、５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（緩衝液Ｄ）に１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む緩衝液Ｅで洗浄する。そして、緩衝液Ｄに４５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ｆで枝作り酵素を溶出する。これを透析し、５００ｍＭの硫酸アンモニウムを含むフェニルトヨパール６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ製）カラムにかけ、緩衝液Ｄ中の硫酸アンモニウム濃度を５００ｍＭから０ｍＭに変化させることにより溶出を行い、枝作り酵素画分を集め、緩衝液Ｄに対して透析を行う。透析内液を緩衝液Ｄで平衡化したＰＬ−ＳＡＸカラム（Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製（Ｕ．Ｋ．））にかけ、緩衝液Ｄ中のＮａＣｌ濃度を１５０ｍＭから４００ｍＭに変化させることにより溶出させて、枝作り酵素画分を集めた。
　【０１００】
　酵素活性は、５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０５％（ｗ／ｖ）アミロース、および酵素を含む１００μｌの反応液を３０℃、３０分間反応させた後、ヨウ素溶液（１ｍｇ／ｍｌ　ＫＩ，０．１ｍｇ／ｍｌ　Ｉ２，３．８ｍＭ　ＨＣｌを含む）２ｍｌを添加して反応を停止し、波長６６０ｎｍにおける吸光度測定して、定量した。１分間に吸光度を１％低下させる酵素量を１単位とした。
　【０１０１】
　Ａ−２：枝作り酵素の調製−２　大腸菌からの組換え枝作り酵素の精製
　バチルス　ステアロサーモフィラス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
　【０１０２】
　バチルス　ステアロサーモフィラスＴＲＢＥ１４株を、１００ｍｌのＬ培地を含む５００ｍｌフラスコ中で、一夜、５０℃で培養した。培養終了後、遠心分離して菌体を集めた。この集めた菌体から染色体ＤＮＡをフェノール法（斎藤、三浦、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ，
７２
　【０１０３】
　大腸菌Ｐ２３９２を、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を加えたＮＺＹ培地（１％ＮＺアミン、０．５％イーストエキス、０．５％ＮａＣｌ）で３７℃、一夜、振とう培養した。培養終了後、集菌し、１０ｍＭのＭｇＣｌ２１０ｍｌに懸濁して、組換えλ−ファージ懸濁液と混合した。混合液を３７℃で２０分間保温した後、ＮＺＹ寒天培地に重層し、３７℃で一晩保温して、溶菌斑が点在するプレートを得た。
　【０１０４】
　この組換えλ−ファージの中から、目的の遺伝子を持つファージを選択するためのプローブを作製した。数種の枝作り酵素のアミノ酸配列中には、α−アミラーゼなどに既に見出されている４つの保存領域（保存領域１、２、３、および４）が存在することが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７、１８４４７（１９９２年））。図９に示す保存領域１の配列に対応する配列（５’ＧＡＹＴＧＧＧＴＮＣＣＮＧＳＮＣＡＹＴＴＹ　３’：配列番号：１）および４付近の配列に対応する配列（ＷＳＮＧＴＲＣＴＲＣＴＹＣＡＮＣＡＮＧＴＲ：配列番号：２）に対応する２種のＤＮＡプライマーを合成した。この合成プライマーと上記で得られた１０ｋｂ以上の染色体ＤＮＡとを、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡（株）製）を用いて反応させ、上記の２つの合成プライマーにはさまれる領域のＤＮＡ断片を増幅した。反応は、９４℃、１分；４５℃、１分；７２℃、１分を１サイクルとして、３０サイクル繰り返した。増幅されたＤＮＡ断片は、約５６０ｂｐであった。この増幅したＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＵＣ１９に連結し、組換えプラスミドｐＴＢＥ３を得た。この得られた組換えプラスミドｐＴＢＥ３から、マルチプライム法ＤＮＡラベリングキット（ファルマシア社製）を用いて、放射能ラベルされた枝作り酵素遺伝子の単離のためのプローブを作製した。
　【０１０５】
　上記で作製した組換えλ−ファージの溶菌斑が点在するプレートにナイロンフィルター（アマーシャム社製）を密着させ、アルカリ処理して、溶菌斑中の組換えλ−ファージＤＮＡを変性させ、フィルターに固定した。このフィルターを上記で作製した放射能ラベルしたプローブの溶液に浸し、６５℃で１６時間、ハイブリダイゼーションを行った。フィルターをよく洗い、乾燥後、Ｘ線フィルムに密着させ、枝作り酵素遺伝子を含む組換えλ−ファージを選択した。この得られた組換えλ−ファージをλ−ＴＢＥ１０２と命名した。λ−ＴＢＥ１０２の制限酵素地図を、図１０に示した。
　【０１０６】
　枝作り酵素の遺伝子を含むプラスミドは、図１１に示す方法で作製した。まず、λ−ＴＢＥ１０２からＤＮＡ断片を回収し、ＳａｌＩで切断し、アガロースゲル電気泳動した。常法により、ＤＮＡをニトロセルロースフィルターに移動させ、上記プローブを用いて、６５℃、１６時間ハイブリダイズさせた。ＳａｌＩの４Ｋｂの断片がハイブリダイズした。この４ｋｂＳａｌＩ断片を単離し、ｐＢＲ３２２のＳａｌＩ部位に組み込んで、ｐＴＢＥ３１を作製した。
　【０１０７】
　次に、ｐＴＢＥ３１から１．４ｋｂのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片を単離し、ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ処理したプラスミドｐＵＣ１１８に連結して、ｐＵＣ１１８ＳＥを作製した。ｐＵＣ１１８ＳＥをＥｃｏＲＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで切断部位を平滑末端とし、ＨｉｎｄＩＩＩリンカーを導入して、ｐＵＣ１１８ＳＥＨを作製した。
　【０１０８】
　他方、上記４ｋｂＳａｌＩ断片を含む約５ｋｂのＸｈｏＩＤＮＡ断片をｐＢＲ３２２のＳａｌＩ部位に導入し、ｐＴＢＥ５１を作製した。このｐＴＢＥ５１から、ＳａｌＩ−Ａｏｒ５１ＨＩＤＮＡ断片を切り出し、ＳｍａＩ−ＳａｌＩで切断したｐＵＣ１１８に連結し、ｐＵＣ１１８ＡＳを作製した。
　【０１０９】
　このｐＵＣ１１８ＡＳから、約１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩＤＮＡ断片を単離し、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ処理したｐＵＣ１１８ＳＥＨに連結して、ｐＴＢＥ８２１を得た。このプラスミドｐＴＢＥ８２１は、枝作り酵素のアミノ酸配列をコードしていた（配列番号：３）。
　【０１１０】
　このプラスミドｐＴＢＥ８２１を常法に従い、大腸菌ＴＧ−１に形質転換した。
　【０１１１】
　プラスミドｐＴＢＥ８２１で形質転換された大腸菌ＴＧ−１株を培養し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ，５分）して菌体を得た。この菌体を、５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）（緩衝液Ａ）に懸濁し、超音波により細胞を破壊した。そして、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，１０分）により不溶物を除き、６０℃で１５分間加熱し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，１０分）により変性したタンパク質などを沈澱として除いた。得られた上清を緩衝液Ａに対して透析した後、Ｑ−セファロースカラム（ファルマシア製）にかけ、５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）（緩衝液Ａ）に１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂで洗浄した。そして、緩衝液Ａに２００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ｃで枝作り酵素を溶出した。これに終濃度１７０ｍＭになるように硫酸アンモニウムを添加し、これをフェニルトヨパール６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ製）カラムにかけ、緩衝液Ａにより枝作り酵素を溶出させ、枝作り酵素を得た。
　【０１１２】
　酵素活性の測定は、反応温度を５０℃にする以外は、馬鈴薯枝作り酵素の場合と同様に行った。
　【０１１３】
　Ａ−３：Ｄ酵素の調製および活性の測定
　Ｔａｋａｈａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２６８．１３９１‐１３９６（１９９３）に記載されている方法でＤ酵素を精製した。まず、馬鈴薯塊茎を５ｍ１Ｍの２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液（緩衝液Ａ）中でホモジナイスし、遠心分離して、０．４μｍのメンブレンを通した後、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（１６Ｘ１００ｍｍファルマシア）にかけ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで洗浄した。Ｄ酵素は、４５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａに溶出した。溶出後、緩衝液Ａに対して透析し、最終濃度が５００ｍＭとなるように硫酸アンモニウムを加えた．この溶液をＰｈｅｎｙｌ　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｍ（Ｔｏｓｏ）カラム（１０Ｘ１００ｍｍ）にロードし、緩衝液Ａ中の硫酸アンモニウム濃度を５００ｍＭから０ｍＭに変化させることにより溶出を行った。Ｄ酵素活性画分を集め、緩衝液Ａに対して透析を行い、透析液をＡｍｉｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　３０マイクロコンセントレーターを用いて濃縮し、ＰＬ‐ＳＡＸＨＰ１Ｃカラム（Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｕ．Ｋ）にかけ、緩衝液Ａ中１５０‐４００ｍＭのＮａＣｌ直線濃度勾配をかけて溶出し、活性画分を集めて上記Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　３０マイクロコンセントレーターで濃縮した。
　【０１１４】
　酵素活性の測定は、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ２‐メルカプトエタノール、１％（Ｗ／Ｖ）マルトトリオース、および酵素を含む１００μｌの反応混合液を３７℃、１０分間、反応させ、反応液を沸騰水中で３分間加熱して、反応を停止し、反応によリ遊離したグルコースをグルコースオキシダーゼを用いる方法（Ｂａｒｈａｍ　ｅｔ　ａｌ．，（１９７２）Ａｎａｌｙｓｔ　９７：１４２）によリ定量した。１分間に１μｍｏｌのグルコースを生じる酵素量を１単位とした。
　【０１１５】
　Ａ−４：ＣＧＴａｓｅの調製
　Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ２−５ａ（以下、Ａ２−５ａ株という）由来のＣＧＴａｓｅを用いた。このＣＧＴａｓｅの生産株Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ａ２−５ａは、特開平７−１０７９７２号にその性質等が開示されており、出願人によって、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１３８６４）として寄託されている。
　【０１１６】
　Ａ２−５ａ株由来ＣＧＴａｓｅの精製方法は以下の通りである。Ａ２−５ａ株をＡＬ液体培地（１％可溶性澱粉、４％コーンスティープリカー、０．１％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０２％ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、１％Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ＝１０．０）で、３３℃、２４時間培養後、遠心分離して培養液から菌体を除去した培養上清を集めた。この培養上清１．６Ｌにデンプン２０ｇを添加し、４℃で１６時間攪はんし、ＣＧＴａｓｅをデンプン粒子に吸着させた。これをカラムにつめ、カラムを１００ｍｌの２２．８％硫酸アンモニウム溶液で５回洗浄後、１００ｍｌの３３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４でＣＧＴａｓｅを５回溶出させた。この溶出液に終濃度で５７％となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈澱を回収後、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に対し透析した。この溶液全量を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したＱ−セファロースカラム（８ｍｌ）にロードし、０．４Ｍ　ＮａＣｌを含む同緩衝液５０ｍｌで洗浄した後、同緩衝液中のＮａＣｌ濃度を０．４Ｍから１Ｍに変化させることによりＣＧＴａｓｅを溶出した。活性画分を集めてＡ２−５ａ株由来の精製ＣＧＴａｓｅを得た。
　【０１１７】
　Ａ−５：固定化ＣＧＴａｓｅの調製
　蒸留水で洗浄した酵素固定化用担体キトパールＢＣＷ‐３５０３（富士紡績（株））１ｇと、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含むＣＧＴａｓｅ酵素液１００単位（５ｍｌ）を室温で２時間緩やかに攪はんしながらインキュベートし、ＣＧＴａｓｅを担体に吸着させた。この懸濁液をろ過してから、ろ液のＣＧＴａｓｅ活性を測定したところ、ＣＧＴａｓｅ活性はほとんど検出されなかったため、大部分のＣＧＴａｓｅは担体に結合したものと考えられた。このＣＧＴａｓｅ結合担体を、反応に使用した。
　【０１１８】
　なお、ＣＧＴａｓｅの活性は、１．５％可溶性澱粉溶液（２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーでｐＨ５．５に調整）をあらかじめ４０℃に設定した恒温槽にいれ、次いで、この溶液にＣＧＴａｓｅを加えて反応を開始させる。１０分間の反応の後、この反応溶液（０．２５ｍｌ）に０．５ｍｌの０．５Ｎ酢酸−０．５ＮＨＣｌ（５：１、ｖ／ｖ）溶液を添加し反応を停止させる。この反応液０．１ｍｌをとり、０．００５％Ｉ２および０．０５％ＫＩを含有する溶液を加え、攪はんし室温に２０分間放置する。この溶液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定する。このときＣＧＴａｓｅを添加しないものをブランクとして調製し、同様の操作を行う。この条件下、１分間に１０％の６６０ｎｍにおける吸光度の減少を生じる酵素量を１単位とした。
　【０１１９】
Ｂ．枝作り酵素を用いるグルカンの製造
（実施例１：グルカンの調製）
　市販のワキシーコーンスターチ（平均重合度３０，０００以上）５ｇを４０ｍｌの５ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、１００℃の湯浴中で糊化させて、約５０℃まで放冷した。この糊液に、組み換え法で精製した枝作り酵素２０００単位を添加し、５０℃で６時間反応させた。
　【０１２０】
　この反応液を１００℃で２０分間加熱し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１５分）により変性した酵素タンパク質を除いた。上清に２倍量のエタノールを添加し、沈澱させた。この沈澱を凍結乾燥し、粉末のグルカン約４．８ｇを得た。
　【０１２１】
（実施例２：重合度の測定）
　示差屈折計と低角度レーザー光散乱光度計を併用して、ゲルクロマトグラフィーを行い、重合度を測定した。上記反応で得られたグルカンを０．６％（Ｗ／Ｖ）となるように、１．５％アセトニトリルおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）に溶解した。この溶液２００μｌをＡｓａｈｉｐａｋ　ＧＳ５２０、Ａｓａｈｉｐａｋ　ＧＳ３２０（いずれも旭化成製）、およびＴＳＫ−Ｇ２０００ＰＷ（東ソー製）を連結したカラムにかけた。
　【０１２２】
　溶出パターンを図１２に示す。図１２に示したように、製造されたグルカンの重合度は、約５０〜５，０００の範囲にあり、ピークＳおよびＬはそれぞれ、４６０および７７０であった。重量平均重合度は９００であった。
　【０１２３】
（実施例３：実施例１で得られたグルカンの構造決定）
　３−１：還元性末端の定量
　実施例１で得られたグルカンの還元性末端の定量を、Ｈｉｚｕｋｕｒｉらの改変パークジョンソン法により行った。原料であるワキシーコーンスターチと比較し、還元性末端数の増加は検出できなかった。還元性末端を増加させることなく、原料を低分子化するには環状化反応しかないことから、これらのグルカンは、少なくとも１個のα−１，６−グルコシト結合を持つ環状構造を分子内に１つ有すると考えられる。
　【０１２４】
　３−２：グルコアミラーゼ耐性成分の取得
　エキソ型グルコアミラーゼ耐性成分の検出を以下のように行った。実施例１で得られたグルカン５００ｍｇを５００μｌのＤＭＳＯに完全に溶解させた。このグルカン溶液に、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）５００μｌ、蒸留水３ｍｌおよび、５０単位／ｍｌのグルコアミラーゼ（１ｍｌ）を添加し、４０℃で３時間反応させた。この反応物を１００℃で１０分間加熱し、不溶物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分）により除去した。上清に１０倍量のエタノールを添加し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して沈殿を回収した。得られた沈殿を乾燥後、１ｍｌの蒸留水に溶解した。この溶解液に再度５０単位のグルコアミラーゼを添加し、４０℃で３時間反応させた。１００℃で１０分間加熱し、不溶物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分）により除去した。上清に１０倍量エタノールを添加し、遠心分離して沈殿を回収した。得られた沈殿を乾燥し、粉末のグルコアミラーゼ耐性成分１３ｍｇを得た。このことから、実施例１で得られたグルカンは、環状構造を有していることが示唆された。
　【０１２５】
　３−３：グルコアミラーゼ耐性成分の重合度測定
　得られたグルコアミラーゼ耐性成分を、示差屈折計と低角度レーザー光散乱計を併用したゲル濾過クロマトグラフィーに供することにより、その平均重合度を求めると４９であった。この値は、分解前の平均重合度９００よりも小さくなっており、グルコアミラーゼで分解される外分岐構造部分が存在していることを示唆する。このグルコアミラーゼ耐性成分の中から、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、低分子部分を取得した。これを島津社製レーザーイオン化ＴＯＦ−ＭＳ装置Ｋｏｍｐａｃｔ　Ｍａｌｄｉに供し、分子量測定を行った。図１３に示したように、１０数本のピークが観察された。それらの分子量は、重合度が１づつ異なる環状構造を有するグルカンにナトリウムイオンが付加した物質の理論値によく一致した。その誤差は、装置の誤差範囲内（±０．２％）であった。環状構造を有しないグルカンの理論値には一致しなかった。図１３において、最も小さいピークの分子量は２４５５であり、これは、重合度１５の環状グルカンに、ナトリウムイオンが付加したものの分子量と一致する。このほか、重合度１６〜３６の環状グルカンにナトリウムイオンが付加したピークが検出された。
　【０１２６】
　３−４：グルコアミラーゼ耐性成分の各種糖質分解酵素による消化
　上記のようにして得られたグルコアミラーゼ耐性成分を０．４％（ｗ／ｖ）になるように蒸留水に溶解後、５０μｌとり、図１４に示した糖質分解酵素をそれぞれ図１４に示した濃度になるように加えて６０μｌとし、４０℃で一晩反応させた。この反応液を１００℃で５分加熱後、変性したタンパク質を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，５分）により除き、反応物を、Ｄｉｏｎｅｘ社製の糖分析システムにかけた。条件は上記と同じである。
　【０１２７】
　このグルコアミラーゼ耐性成分は、図１４に示されるように、グルコアミラーゼ単独によっては分解されなかったが、澱粉分子内部のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するエンド型アミラーゼであるα−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製）により分解され、ＩＭＭが検出された。また澱粉中のα−１，６−グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼ（林原生物化学研究所製）とグルコアミラーゼとの併用により分解された。また、図１４に示されるように、グルコアミラーゼ耐性成分は、イソアミラーゼ単独で一部分解され、重合度３以上のオリゴ糖を生成した。
　【０１２８】
　以上のことから、得られたグルコアミラーゼ耐性成分は、環状のグルカンであること、および、少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を含むものであることがわかった。
　【０１２９】
　３−５：実施例１で得られたグルカンの構造
　実施例１のグルカン中に外分岐構造が存在することの証明として、グルコアミラーゼ耐性成分中にグルコシルスタッブが存在することを確認した。ここで、グルコシルスタッブとは、グルコアミラーゼで処理したときに残る、外分岐構造部分と環状構造との結合部分のグルコース残基をいう。Ｈｉｚｕｋｕｒｉら（１９７８）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ：６３：２６１‐２６４の迅速スミス分解法により、グルコアミラーゼ耐性成分の非還元末端を定量することにより、グルコアミラーゼ耐性成分の全グルコシル基の１９％が、環状構造に結合したグルコシルスタッブであることがわかった。従って、グルコアミラーゼ耐性成分の平均重合度４９のうち約９個のグルコースは、外分岐構造より由来したグルコシルスタッブであり、残り約４０個のグルコースが、内分岐環状構造を形成していると考えられた。以上のことから、実施例１のグルカンは、内分岐環状構造に加えて複数個の外分岐構造部分を有することがわかった。
　【０１３０】
　以上から、本願発明の方法で製造されたグルカンは、外分岐構造部分と内分岐環状構造部分とを有すること、および、重合度が約５０以上であることがわかった。また、本願発明の方法で製造されたグルカンは、全体の平均重合度が約９００、内分岐構造部分の平均重合度が約４０であったことから、外分岐構造部分の重合度は約８６０であると推測された。従って、枝作り酵素により生産された本願発明のグルカンは、平均的には内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを約１：２０の割合で含んでいることを示唆している。
　【０１３１】
　（実施例４：環状グルカンの重合度の調節）
　実施例１で得られたグルカン５００ｍｇ（平均重合度９００）を、５００μｌのＤＭＳＯに完全に溶解させた。これに１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）５００μｌ、蒸留水３ｍｌ、および１０単位／ｍｌのエキソ型グルコアミラーゼ（東洋紡（株）製）１ｍｌを添加して、４０℃、３時間反応させた。１００℃、１０分間加熱した後、変性した酵素タンパクを遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分）して除いた。上清のグルコース量を、グルコスタット法により定量した。実施例１で得られたグルカン中のグルコシル残基のうち、約７０％が切除されたことがわかった。この上清に、１０倍量のエタノールを添加することにより、グルカンを沈澱させ、外分岐構造部分が短くなったグルカンを得た。得られたグルカンの平均重合度は２７０であった。
　【０１３２】
Ｃ．Ｄ酵素を用いる製造方法
（実施例５）
　５−１：Ｄ酵素を用いる製造
　市販のワキシーコーンスターチ４０ｍｇを２ｍｌのＤＭＳＯに懸濁した。この懸濁液に、精製したＤ酵素６８０単位を含む２０ｍＭ　クエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１８ｍｌを添加し、３０℃で４０時間反応させた。
　【０１３３】
　反応液を１００℃で１０分間加熱した後、遠心分離して、変性した酵素タンパクを除去した。上清に１０倍量のエタノールを添加し、グルカンを沈澱させた。次いで、得られた沈殿を凍結乾燥し、グルカンの粉末約４０ｍｇを得た。
　【０１３４】
　得られた沈澱をゲル濾過クロマトグラフィーで分画した。沈澱を２５０μｌの蒸留水に溶解し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６（φ１ｃｍ×３０ｃｍ、ファルマシア製）とＳｕｐｅｒｄｅｘ３０（φ１ｃｍ×３０ｃｍ、ファルマシア製）とを連結したカラムにその全量をロードした。次いで、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液を用いて流速１ｍｌ／分で溶出を行った。図１５に示すように、ボイドボリュームに溶出されていたアミロペクチンはＤ酵素の反応によリ低分子化され、平均分子量が約３０，０００であるピークＩおよび平均分子量が約３，０００であるピークＩＩの２種類の成分が生成した。なお、環状グルカンの分子量は、酵素合成アミロースをスタンダードとして用いて算出した値である。
　【０１３５】
　ピークＩおよびＩＩの画分をそれぞれ分取した。ピークＩの画分に１０倍量のエタノールを加えてグルカンを沈澱させた。沈澱を遠心分離して回収後、凍結乾燥して、２０ｍｇのグルカンを得た。同様にして、ピークＩＩから沈殿を回収し、凍結乾燥して、５ｍｇを得た。
　【０１３６】
　この分離したピークＩおよびＩＩの構造を解析した。
　【０１３７】
　５−２：ピークＩの構造解析
　ピークＩのグルカンの還元性末端は、検出されず、還元末端数も原料であるワキシーコーンスターチと比較して、増加しなかった。
　【０１３８】
　ピークＩのグルカンを、実施例３の３−２と同様の条件で、グルコアミラーゼ処理したところ、グルコアミラーゼ耐性成分が得られた。このグルコアミラーゼ耐性成分の平均分子量は上記と同様、酵素合成アミロースをスタンダードとして用いて算出した値で、約５，０００であり、グルコアミラーゼ処理前と比較して小さくなっていることも認められた。
　【０１３９】
　さらに、得られたグルコアミラーゼ耐性成分を実施例３：３−４と同じ方法で各種糖質分解酵素により消化した結果、グルコアミラーゼ単独によっては分解されなかったが、澱粉分子内部のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するエンド型アミラーゼであるα−アミラーゼにより分解され、ＩＭＭが検出された。また澱粉中のα−１，６−グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼとグルコアミラーゼとの併用により分解された。また、グルコアミラーゼ耐性成分は、イソアミラーゼ単独で一部分解され、重合度３以上のオリゴ糖を生成した。
　【０１４０】
　以上のことから、得られたグルコアミラーゼ耐性成分は、少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を含む環状構造であることがわかった。
　【０１４１】
　さらに、グルコアミラーゼ耐性成分中に、グルコシルスタッブが存在することを確認した。従って、ピークＩのグルカンは内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有するグルカンであると結論した。
　【０１４２】
　５−３：ピークＩＩの構造解析
　ピークＩＩのグルカンは、還元性末端が検出されなかった。ピークＩＩの大部分のグルカンをグルコアミラーゼで処理しても分子量が減少しなかった。ピークＩＩのグルカンはエンド型アミラーゼであるα−アミラーゼにより完全に分解され、ＩＭＭがほとんど検出されなかった。さらに、α−１，６−グルコシド結合を切断するイソアミラーゼで大部分が分解されなかった。
　【０１４３】
　これらのことから、ピークＩＩは、α−１，６−グルコシド結合を含まず、かつ外分岐構造を有しない、およびα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状グルカンを主成分とすると結論した。
　【０１４４】
　５−４：実施例５で得られたグルカン
　従って、実施例５で得られたグルカンは、α−１，４−グルコシド結合のみを有するグルカンと、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有するグルカンとの混合物であると結論した。
　【０１４５】
　（実施例６：実施例５のピークＩのグルカンの構造）
　ピークＩは、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有するグルカンであることが確認された。このうち、外分岐構造部分は、グルコアミラーゼにより完全にグルコースにまで分解され、内分岐環状構造部分（グルコアミラーゼ耐性成分）が残る。さらにこのグルコアミラーゼ耐性成分は、枝切り酵素とグルコアミラーゼの併用によって分解される。これらの性質を利用して、グルカン中の非環状構造部分、α−１，６−結合を含む環状構造部分及びα−１，６−結合を含まない環状構造部分を定量することが可能となる。
　【０１４６】
　実施例５で得られたピークＩを１０ｍｇ、およびアミロペクチン１０ｍｇを、それぞれ、１ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、直ちに、８ｍｌの１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を加えて希釈した。この希釈液を９００μｌずつ４本のチューブに分注した。ついで、それぞれのチューブに（１）蒸留水、（２）グルコアミラーゼ液、（３）枝きり酵素とグルコアミラーゼとの混合液、および（４）エンド型α−アミラーゼとグルコアミラーゼとの混合液を１００μｌ加えて、４０℃、４時間反応させた。反応終了後、生成したグルコースの量を、市販のグルコース定量キットを用いて測定した。そして、試料グルカン中の外分岐構造部分、内分岐環状構造部分およびα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造部分をそれぞれ以下の式により求めた。
　【０１４７】
　【数１】
　【０１４８】
　ここで、ｃ、ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ、上記（１）、（２）、（３）および（４）の反応液から生じたグルコース量である。結果を表１に示す。
　【０１４９】
　【表１】
　【０１５０】
　この結果は、実施例５で得られたピークＩのグルカンが、少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を含んでいること、および、平均的には、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを約１：７の割合で含んでいることを示唆している。
　【０１５１】
Ｄ．ＣＧＴａｓｅを用いるグルカンの製造
（実施例７：ＣＧＴａｓｅを用いるグルカンの製造方法）
　原料として市販のワキシーコーンスターチ４０ｍｇを、１８ｍｌの１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ５．５）に加熱溶解した。他方、精製したＣＧＴａｓｅを０．２単位／ｍｌとなるように、１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ５．５）に溶解した。この酵素溶液２ｍｌを上記原料の溶解液に添加し、４０℃で２時間反応させた。
　【０１５２】
　反応液を１００℃で１０分間加熱したのち、遠心分離により変性した酵素タンパクを除いた。上清に１０倍量のアセトンを添加し、グルカンを沈澱させた。
　【０１５３】
（実施例８：実施例７で得られたグルカンの構造解析）
　得られた沈澱をゲルろ過クロマトグラフィーで分析した。沈澱を２５０μｌの蒸留水に溶解し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６（φ１ｃｍ×３０ｃｍ、ファルマシア製）とＳｕｐｅｒｄｅｘ３０（φ１ｃｍ×３０ｃｍ、ファルマシア製）を連結したカラムにその全量をロードし、１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ５．５）により、流速１ｍｌ／分で溶出させた。図１６に示したように、ボイドボリュームに溶出されていたアミロペクチンはＣＧＴａｓｅの反応により低分子化され、主として、ピークＩＩＩおよびピークＩＶの２種類の成分が生成された。これらのピークＩＩＩおよびＩＶは、分取され、アセトンによる沈澱を経て、回収され、凍結乾燥されて、それぞれ粉末として、１６ｍｇおよび１３ｍｇを得た。
　【０１５４】
　ピークＩＩＩの平均分子量は３０，０００であった。ピークＩＶは、非常に低分子であり、本法では測定不可能であった。
　【０１５５】
　８−１　ピークＩＩＩの構造解析
　分取したピークＩＩＩの画分に１０倍量のエタノールを加えて沈澱を生じさせた。沈澱を遠心分離して回収し、凍結乾燥した。粉末のグルカン１６ｍｇを得た。
　【０１５６】
　ピークＩＩＩのグルカンの還元性末端は、検出されず、還元末端数も原料であるワキシーコーンスターチと比較して、増加しなかった。
　【０１５７】
　ピークＩＩＩのグルカンを、実施例３の３−２と同様の条件で、グルコアミラーゼ処理したところ、グルコアミラーゼ耐性成分が得られた。このグルコアミラーゼ耐性成分の平均分子量は上記と同様、酵素合成アミロースをスタンダードとしたゲル濾過クロマトグラフィーから算出した値で、約５，０００であり、グルコアミラーゼ処理前と比較して小さくなっていることも認められた。
　【０１５８】
　さらに、得られたグルコアミラーゼ耐性成分を上記実施例３：３−４と同じ方法で各種糖質分解酵素により消化した結果、グルコアミラーゼ単独によっては分解されなかったが、澱粉分子内部のα−１，４−グルコシド結合を加水分解するエンド型アミラーゼであるα−アミラーゼにより分解され、ＩＭＭが検出された。また澱粉中のα−１，６−グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼとグルコアミラーゼとの併用により分解された。また、グルコアミラーゼ耐性成分は、イソアミラーゼ単独で一部分解され、重合度３以上のオリゴ糖を生成した。さらに、グルコアミラーゼ耐性成分中に、グルコシルスタッグが存在することを確認した。
　【０１５９】
　以上のことから、得られたグルコアミラーゼ耐性成分は、少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を含む環状構造であることがわかった。
　【０１６０】
　従って、ピークＩＩＩのグルカンは内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有するグルカンであると結論した。
　【０１６１】
　８−２　ピークＩＶの構造解析
　ピークＩＶのグルカンは、還元性末端が検出されなかった。ピークＩＶのグルカンをグルコアミラーゼで処理しても分子量が減少しなかった。ピークＩＶのグルカンはα−１，６−グルコシド結合を切断するイソアミラーゼで分解されなかった。これらのことから、ピークＩＶは、α−１，６−グルコシド結合を含まず、かつ外分岐構造を有しない、およびα−１，４−グルコシド結合のみを有する環状構造であると結論した。
　【０１６２】
　他方で、ピークＩＶのグルカンを、アミノカラムを用いたＨＰＬＣにより分析したところ、２本のピークが確認された。それぞれのピークは、重合度が６，７の環状α１，４グルカンつまりα−ＣＤおよびβ−ＣＤと溶出位置が完全に一致した。従ってピークＩＶは、従来から知られているα−ＣＤとβ−ＣＤの混合物であると結論された。
　【０１６３】
　８−３：実施例７で得られたグルカンの構造
　以上から、実施例７で得られたグルカンは、α−１，４−グルコシド結合のみを有するα−ＣＤおよびβ−ＣＤと、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有するグルカンとの混合物であると結論した。
　【０１６４】
（実施例９：実施例７のピークＩＩＩのグルカンの構造）
　実施例６と同様にして、実施例７で得られたピークＩＩＩのグルカンの内分岐環状構造部分、および外分岐構造部分の構造を検討した。結果を表２に示した。
　【０１６５】
　【表２】
　【０１６６】
　この結果は、実施例７で得られたピークＩＩＩのグルカンが、実施例５のピークＩのグルカンとほぼ同様なグルカンであることを示している。つまり、ピークＩＩＩのグルカンは、少なくとも１個のα−１，６−グルコシド結合を含んでいること、および、平均的には、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを約１：７の割合で含んでいることを示唆している。
　【０１６７】
　以上のことから、枝作り酵素、Ｄ酵素、あるいはＣＴＧａｓｅを用いて、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有するグルカンを製造し得、かつ、酵素が異なっても、ほぼ同じグルカンが製造され得ることが確認された。
　【０１６８】
（実施例１０：本願発明の方法で得られたグルカンの溶解性）
　実施例１、実施例５のピークＩ、実施例７のピークＩＩＩのグルカン、比較としてワキシーコーンスターチ、および可溶性澱粉（和光純薬製）を、それぞれ１０％（Ｗ／Ｖ）となるように蒸留水に懸濁し、ｖｏｒｔｅｘミキサーにて激しく攪拌した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分）し、上清に溶解した糖濃度を測定した。その結果を表３に示す。
　【０１６９】
　【表３】
　【０１７０】
　従来のワキシーコーンスターチおよび可溶性澱粉に比べ、本願発明の方法で得られたグルカンの溶解性が顕著に高いことが示された。
　【０１７１】
（実施例１１：各実施例で得られたグルカンの老化性）
　実施例１、実施例５のピークＩ、実施例７のピークＩＩＩで得られたグルカン、比較として従来のワキシーコーンスターチ、および可溶性澱粉（和光純薬製）を、それぞれ２００ｍｇとり、スクリューバイアルに入れ蒸留水１０ｍｌを加えた後、沸騰湯浴中で加熱することにより溶解した。但し、ウキシーコーンスターチは溶解性が悪いため、５０ｍｇをとり、同様に処理した。これらを４℃に放置し、一定時間後それぞれのサンプル１ｍｌをとり、その６６０ｎｍにおける濁度を測定し、老化性の指標とした。その結果を表４に示す。
　【０１７２】
　【表４】
　【０１７３】
　従来のワキシーコーンスターチおよび可溶性澱粉に比べ、実施例で得られたグルカンの老化性が顕著に低いことが示された。
　【０１７４】
（実施例１２：実施例で得られたグルカンの糊液の粘性）
　実施例１、実施例５のピークＩ、実施例７のピークＩＩＩで得られたグルカン、比較として従来のワキシーコーンスターチ、および可溶性澱粉（和光純薬製）、およびパインデックス（Ｐｉｎｅｄｅｘ）＃１（松谷化学株式会社製）を、それぞれ１．６ｇとり、バイアルに入れ、蒸留水８ｍｌを加えて分散させた後、ジメチルスルフォキシド７２ｍｌを加え、室温で十分に攪拌することにより溶解した。それぞれの粘度を、Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ　ＤＶＬ−Ｂ（ＴＯＫＹＯ　ＫＥＩＫＩ製、ローター：Ｎｏ．１、回転数：６０ｒｐｍ、１０秒間測定）により測定した。対象として、蒸留水８ｍｌにジメチルスルフォキシド７２ｍｌを加えた溶液（９０％ＤＭＳＯ溶液）についても測定した。その結果を表５に示す。なお、ここで用いたパインデックス＃１は、上記可溶性澱粉よりも強く酸で加水分解した澱粉である。
　【０１７５】
　【表５】
　【０１７６】
　従来のワキシーコーンスターチ比べて、各実施例で得られたグルカンを溶解した糊液の粘性が顕著に低く、パインデックス＃１および可溶性澱粉と同様の粘性を示すことがわかった。
　【０１７７】
（実施例１３：実施例で得られたグルカンの反応性）
　実施例１、実施例５のピークＩ、実施例７のピークＩＩＩで得られたグルカン、比較として従来の可溶性澱粉（和光純薬製）、およびパインデックス（Ｐｉｎｅｄｅｘ）＃１（松谷化学株式会社製）を、それぞれ２０ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解させ、還元力をジニトロサリチル酸法（福井作蔵著、生物化学実験法１　還元糖の定量法、学会出版センター）により、グルコースを標準として調べた。その結果を表６に示す。
　【０１７８】
　【表６】
　【０１７９】
　従来のパインデックス＃１および可溶性澱粉から還元糖が検出されたのに対し、各実施例から得られたグルカンからは、還元糖が検出されなかった。
　【０１８０】
　着色が生じる糖とアミノ酸との反応（アミノ・カルボニル反応）は、糖の還元基とアミノ酸との反応である（五十嵐修著、食品化学、弘学出版社）。従って、上記各実施例で得られたグルカンは、還元糖の量が少ない（検出されない）、すなわち還元基が少ないことから、従来のパインデックス＃１および可溶性澱粉に比べて、反応性が低いということがわかった。
　【０１８１】
（実施例１４：リン酸化したグルカンの誘導体の調整）
　実施例１で得られたグルカン８ｍｇをジメチルホルムアミド１ｍｌ中に懸濁し、オキシ塩化リン４６ｍｇとを反応させ、この反応液にアセトン９ｍｌを加えて、リン酸化したグルカンの誘導体８ｍｇを得た。
　【０１８２】
（実施例１５：実施例１のグルカンによる、澱粉の老化抑制効果）
　完全に加熱糊化した４％可溶性澱粉水溶液を４℃に保存すると、可溶性澱粉は速やかに老化し、糊液は白濁する。この系を用いて本願発明で得られるグルカンの、澱粉老化抑制効果について検討した。実施例１で得られたグルカンをそれぞれ終濃度で、０％、２％、および４％となるように、４％の可溶性澱粉水溶液に添加し、これを４℃に保存した。一定時間にサンプリングを行い、６６０ｎｍの吸光度で白濁度を測定した。結果を、図１７に示す。
　【０１８３】
　実施例１のグルカンは、澱粉の老化抑制効果を有することが示された。
　【０１８４】
（実施例１６：本願発明のグルカンを含むスポーツドリンク）
　実施例１で得られたグルカンを用いて、以下の成分を以下の割合で配合したスポーツドリンクを作製した。なお、単位は重量部である。
　【０１８５】
　　　　　　食塩　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．３
　　　　　　ビタミンＣ　　　　　　　　　　　　　　　０．０２
　　　　　　ビタミンＢ１ソーダ　　　　　　　　　　　０．０２
　　　　　　塩化マグネシウム　　　　　　　　　　　　０．２
　　　　　　乳化カルシウム　　　　　　　　　　　　　０．２
　　　　　　クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　　２．０
　　　　　　クエン酸ソーダ　　　　　　　　　　　　　１．５
　　　　　　ブドウ糖　　　　　　　　　　　　　　　５０
　　　　　　水　　　　　　　　　　　　　　　　１０００
　　　　　　実施例１の環状グルカン　　　　　　　１００
　得られたスポーツドリンクは消化性に優れ、エネルギー変換効率の高い飲料であった。
　【０１８６】
（実施例１７：本願発明のグルカンを含む接着性組成物）
　実施例５のピークＩのグルカン４０部に水６０部を加え、加熱溶解させた。この溶液は、良好な接着性を示した。
　【０１８７】
　【発明の効果】
　本願発明の方法により、従来用いることが考えられなかった酵素を用いて、本願発明のグルカンが生産され得る。本願発明の製造方法は、原料であるα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とを有する糖類と、該糖類に作用して環状構造を形成し得る酵素とを反応させる工程を包含すればよい。従って、非常に容易に、本願発明のグルカンを製造し得る。
　【０１８８】
　本願発明のグルカンは、既存の澱粉などの上記原料と比較して、水に対する溶解度が非常に高く、溶解した糊液の粘度が低く、また通常の澱粉に観察される老化が起こらないという優れた性質を有する。さらに、本願発明のグルカンまたはその誘導体は、反応性が低いため、タンパク質やアミノ酸と混合して加熱したとき、既存の水飴およびデキストリンと比較して、着色しにくいという優れた性質を有している。
　【０１８９】
　このように、本願発明のグルカンは、水に対する溶解度が非常に高いため、粉末化基剤、コーヒー、醤油、たれ、麺類のつゆ、ソース、ダシの素、シチューの素、スープの素、複合調味料、カレーの素、ゼリー、キャラメル、ガム、チョコレート、クッキー、クラッカー、アイスクリーム、シャーベット、ジュース、粉末ジュース、入浴剤、飲み薬、粉末薬、塗料、接着剤、増粘剤、糊料などに、好適に使用され得る。
　【０１９０】
　本願発明のグルカンは、老化が起こらないため、和生菓子、洋生菓子、冷凍食品、冷蔵食品、餅、おにぎりなどに好適に使用しされ得る。
　【０１９１】’
　本願発明のグルカンまたはその誘導体は、溶解した糊液の粘度が低いため、生物崩壊性プラスチックの原料や、澱粉からサイクロデキストリンなどを製造する際の中間物質、澱粉加工工業における原料などに好適に使用され得る。
　【０１９２】
　また、本願発明のグルカンは、良好な接着性を有し、接着用組成物として好適に使用され得る。
　【０１９３】
　また、本願発明のグルカンは、環状構造を除けば、通常の澱粉と同じ基本的構造を持つことから、生体内の酵素により容易にグルコースに分解されることができるため、消化性に優れている。そのため、スポーツ飲料、スポーツ食品などにも使用され得る。
　【０１９４】
　【配列表】
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　本願発明の内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有するグルカンの製造方法のひとつを示す模式図である。
　【図２】
　図１で得られた反応生成物のゲル濾過パターンである。
　【図３】
　本願発明の方法により得られるグルカンの態様を示す模式図である。
　【図４】
　従来考えられていたＣＧＴａｓｅの反応を示す模式図である。図４Ａは、アミロースに作用させた場合、図４Ｂは、アミロペクチンに作用させた場合を示す模式図である。
　【図５】
　ＣＧＴａｓｅをアミロペクチンに作用させた際の、生産物のゲルろ過クロマトグラフィーの溶出パターンの変化を示す図である。
　【図６】
　新たなＣＴＧａｓｅの作用機構を示す図である。
　【図７】
　ＣＧＴａｓｅを作用させることにより、ＣＤ以外の高分子環状グルカンがつくられていることを示す図である。
　【図８】
　本願発明の方法で得られるグルカンの構造決定をするための、各酵素によるグルカンの分解を示す模式図である。
　【図９】
　各種アミラーゼ間の保存領域１および４の配列、および、この配列に対応する枝作り酵素のクローニングのためのプライマーを示す図である。
　【図１０】
　枝作り酵素遺伝子を含むλ−ＴＢＥ１０２の制限酵素地図を示す図である。
　【図１１】
　枝作り酵素の遺伝子を含むプラスミドの作製方法を示す図である。
　【図１２】
　実施例１で調製されたグルカンのカラムからの溶出パターンを示す図である。
　【図１３】
　グルコアミラーゼ耐性成分の分子量測定を行った結果を示す図である。
　【図１４】
　グルコアミラーゼ耐性成分の各種糖質分解酵素による消化の結果、生じる糖を示す図である。
　【図１５】
　Ｄ酵素を用いて得られたグルカンの、ゲル濾過クロマトグラフィーを示す図である。
　【図１６】
　ＣＧＴａｓｅを用いて得られたグルカンの、ゲル濾過クロマトグラフィーを示す図である。
　【図１７】
　実施例１で得られたグルカンが、澱粉の老化抑制効果を有することを示す図である。
　【符号の説明】
　１　アミロペクチン
　２　内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有するグルカン
　３　大環状ＣＤ
　４　ＣＤ
　５　内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有するグルカン
　６　内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有するグルカン
　７　環状α１，４グルカン
　８　内分岐ＣＤ
　９　外分岐ＣＤ
　１１　アミロース
　１２　α−、β−およびγ−ＣＤ
　１３　非環状オリゴ糖
　１４　アミロペクチン
　１５　非環状リミットデキストリン
　２１　還元末端
　２３　分子内に環状構造を有するグルカン
　２５　分子内に環状構造を有するグルカン
　２６　環状グルカン
　２７　グルコース