(57)【要約】  ポリアルギニンとシステイン１残基からなるペプチドで蛋白質を修飾することにより、不溶性蛋白質の可溶化効率を向上させることができ、さらに細胞内への取り込み効率も向上させることができる。本発明の修飾剤を用いることにより、従来の技術のように、蛋白質を発現する際にポリアルギニンを遺伝子に組み込む必要がなく、より簡便な操作で蛋白質の細胞内への導入効率を向上させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアルギニンとシステインとで構成されるポリペプチドを含む、蛋白質の修飾剤。
【請求項２】
前記システインが前記ポリアルギニンのカルボキシル基末端にペプチド結合していることを特徴とする請求項１に記載の修飾剤。
【請求項３】
前記ポリアルギニンが、６乃至１２個のアルギニンで構成されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の修飾剤。
【請求項４】
前記ポリアルギニンが８個のアルギニンで構成されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の修飾剤。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、カルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の修飾剤。
【請求項６】
前記ポリペプチドがオクタアルギニンのカルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の修飾剤。
【請求項７】
前記修飾剤が蛋白質の可溶性を向上させることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の修飾剤。
【請求項８】
前記修飾剤の細胞内導入効率を向上させることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の修飾剤。
【請求項９】
前記蛋白質がシステイン残基を２つ以上有していることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一つに記載の修飾剤。
【請求項１０】
不溶性蛋白質の可溶化方法であって、
不溶性蛋白質と変性剤とを同一の溶液内で混合して蛋白質の溶液を作製する工程と、
該溶液にポリアルギニンとシステインとで構成されるポリペプチドを含む蛋白質の修飾剤を添加する工程と、
該溶液から変性剤を除去する工程と、
からなる蛋白質の可溶化方法。
【請求項１１】
前記システインが前記ポリアルギニンのカルボキシル基末端にペプチド結合していることを特徴とする請求項１０に記載の蛋白質の可溶化方法。
【請求項１２】
前記ポリアルギニンが、６乃至１２個のアルギニンで構成されていることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の蛋白質の可溶化方法。
【請求項１３】
前記ポリアルギニンが、８個のアルギニンで構成されていることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載の可溶化方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、カルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする請求項１０乃至１３のいずれか一項に記載の蛋白質の可溶化方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドがオクタアルギニンのカルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする請求項１０乃至１４のいずれか一項に記載の蛋白質の可溶化方法。
【請求項１６】
前記蛋白質が、天然由来の蛋白質、遺伝子組換え技術によって作製される蛋白質、又は化学合成した蛋白質であることを特徴とする請求項１０乃至１５のいずれか一項に記載の蛋白質の可溶化方法。
【請求項１７】
前記変性剤が、尿素及び／又はグアニジン塩酸であることを特徴とする請求項１０乃至１６のいずれか一項に記載の蛋白質の可溶化方法。
【請求項１８】
前記蛋白質と変性剤を同一の溶液中で混合する工程において、さらに還元剤を添加することを特徴とする請求項１０乃至１７のいずれか一項に記載の蛋白質の可溶化方法。
【請求項１９】
前記還元剤が、ジチオスレイトール又は２−メルカプトエタノールであることを特徴とする請求項１０乃至１８のいずれか一項に記載の蛋白質の可溶化方法。
【請求項２０】
前記蛋白質がシステイン残基を２つ以上有していることを特徴とする、請求項１０乃至１９のいずれか一つに記載の蛋白質の可溶化方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドの使用量が前記不溶性タンパク質に含まれるシステイン残基に対して、１モル倍以上であることを特徴とする請求項２０に記載の蛋白質の可溶化方法。
【請求項２２】
蛋白質の細胞内への導入方法であって、
蛋白質と、ポリアルギニンとシステインとで構成されたポリペプチドを含む蛋白質の修飾剤とを混合する工程と、
得られた蛋白質溶液を、蛋白質を導入したい細胞と接触させる工程と、
からなる蛋白質の細胞内への導入方法。
【請求項２３】
前記システインが前記ポリアルギニンのカルボキシル基末端にペプチド結合していることを特徴とする請求項２２に記載の蛋白質の細胞内への導入方法。
【請求項２４】
前記ポリアルギニンが、６乃至１２個のアルギニンで構成されていることを特徴とする請求項２２又は２３に記載の蛋白質の細胞内への導入方法。
【請求項２５】
前記ポリアルギニンが８個のアルギニンで構成されていることを特徴とする請求項２２乃至２４のいずれか一項に記載の蛋白質の細胞内への導入方法。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが、カルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする請求項２２乃至２５のいずれか一項に記載の蛋白質の細胞内への導入方法。
【請求項２７】
前記ポリペプチドがオクタアルギニンのカルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする請求項２２乃至２６のいずれか一項に記載の蛋白質の細胞内への導入方法。
【請求項２８】
前記蛋白質が、天然由来蛋白質、遺伝子組換え技術によって作製される蛋白質、又は化学合成した蛋白質であることを特徴とする請求項２２乃至２７のいずれか一項に記載の蛋白質の細胞内への導入方法。
【請求項２９】
前記蛋白質がシステイン残基を２つ以上有していることを特徴とする請求項２２乃至２８のいずれか一項に記載の蛋白質の細胞内への導入方法。  
【請求項３０】
細胞への導入を２５℃〜４℃の温度範囲で実施する請求項２２乃至２９の一項に記載の蛋白質の細胞内への導入方法。
【請求項３１】
前記細胞が生体由来動物細胞又は培養細胞由来動物細胞である請求項２２乃至３０の一項に記載の蛋白質の細胞内への導入方法。
【請求項３２】
ポリアルギニンとシステインとで構成されるポリペプチド。
【請求項３３】
前記システインが前記ポリアルギニンのカルボキシル基末端にペプチド結合していることを特徴とする請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記ポリアルギニンが６乃至１２個のアルギニンから構成されることを特徴とする請求項３２又は３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記ポリアルギニンが８個のアルギニンから構成されることを特徴とする請求項３２乃至３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記ポリペプチドがカルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする請求項３２乃至３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記ポリペプチドがオクタアルギニンのカルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする請求項３２乃至３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
請求項２２乃至３１のいずれか一項に記載の蛋白質の細胞内への導入方法により蛋白質を導入された細胞を、ヒトを含む哺乳動物に投与すること含む、治療もしくは予防方法。
【請求項３９】
前記細胞が樹状細胞であり、治療もしくは予防対象ががん及び／又は感染症である、請求項３８に記載の治療もしくは予防方法。
【請求項４０】
前記樹状細胞が単球由来である、請求項３９に記載の治療もしくは予防方法。
【請求項４１】
請求項２２乃至３１のいずれか一項に記載の蛋白質の細胞内への導入方法により蛋白質を導入された細胞を主成分として含有する医薬組成物。
【請求項４２】
前記細胞が樹状細胞であり、治療もしくは予防対象ががん及び／又は感染症である、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記樹状細胞が単球由来である、請求項４２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質の修飾剤に関する。また、該蛋白質の修飾剤を用いた不溶性蛋白質の可溶化方法、及び蛋白質の細胞内への導入方法に関する。さらに、該蛋白質が導入された細胞、該細胞の作製方法、該細胞を用いた治療方法及び予防もしくは治療剤に関する。また、該細胞が樹状細胞由来である、不溶性抗原を提示する抗原提示細胞の作製方法、該作製方法により作製された抗原提示細胞、該抗原提示細胞を用いた細胞傷害性Ｔ細胞誘導方法および細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤、並びに該抗原提示細胞を用いたがん及び／又は感染症予防もしくは治療方法及び予防もしくは治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質は細胞内で合成され、様々な機能を発揮する物質であるが、蛋白質を人為的に細胞内に導入し、細胞に機能を付加する研究が種々行われている。【０００３】
免疫細胞療法の分野では、樹状細胞等の抗原提示細胞に抗原蛋白質（例えば、がん抗原）を導入する。導入された蛋白質は、細胞内でプロセシングをうけ、エピトープと呼ばれる断片になり、ＭＨＣクラスＩと複合体を形成し、細胞膜表面に提示される。作製された抗原提示細胞が患者に投与されると、体内に存在するリンパ球は抗原提示細胞膜表面に提示されたエピトープを認識し、同じ抗原蛋白質を発現している細胞を傷害し、腫瘍の増大を防ぎ、腫瘍を縮小させる。【０００４】
再生医療の分野では、ｉＰＳ細胞の作製に蛋白質の導入が利用されている。開発された当初、ｉＰＳ細胞は４種の遺伝子を強制発現することで作製されていた。しかし、遺伝子を細胞内で強制発現させ続けるとがん化しやすいことから、導入する遺伝子の数を減らす研究が行われていたが、２００９年に遺伝子産物である蛋白質を直接細胞に導入することでｉＰＳの作製に成功したとの報告がされている（非特許文献１）。この蛋白質導入による形質転換の効率は蛋白質の導入効率に依存しており、細胞に対して毒性がなく、かつ細胞内に高効率で導入する技術の開発が求められている。【０００５】
細胞内に蛋白質を導入するためには生理的な溶液に可溶化していなければならないが、大腸菌等に発現させた蛋白質は封入体（インクルージョンボディ）等の生体内ではとりえない立体構造をとり、不溶性になってしまうことが多い。また、正常な立体構造をとった天然の蛋白質であっても疎水性を示すものがあり、生理的な溶媒に不溶性の蛋白質が存在する。【０００６】
従来、組換え蛋白質等の不溶性蛋白質を生理的な溶液中で可溶化するには、尿素等の変性剤に該蛋白質を一度溶解させ、還元した後、任意のジスルフィド結合の形成を抑制する目的でグルタチオンを添加して、生理的な溶液に対して透析する方法が一般的に行われてきた（非特許文献２）。しかし、グルタチオン修飾（グルタチオン化）するだけでは可溶化できない場合が多い。【０００７】
可溶化した蛋白質を細胞内に導入する技術としては、ＨＩＶ  ｔａｔの配列を利用したペプチドと、可溶性の蛋白質で複合体を形成させ、該蛋白質を細胞内に導入させる技術（非特許文献３）、オクタアルギニンペプチド（以下、Ｒ８とも記す）を化学的、非可逆的に蛋白質に結合させ細胞に導入する技術（非特許文献５）、Ｒ８が表面に固相化されたリポソームを用いて遺伝子を導入する技術（非特許文献６）、同リポソームを用いて蛋白質を導入する技術（非特許文献７）が知られていた。また、オクタアルギニンペプチドとシステインで構成された細胞透過性キャリアペプチドを蛋白質に付加し、目的とする蛋白質を細胞内へ導入する方法が公知となっている（特許文献１）。しかしながら、不溶性蛋白質を可溶化しつつ、細胞内への導入効率を高める方法については記載されていない。【０００８】
蛋白質を可溶化し、さらに細胞内への導入効率を高める方法としてはＴＡＰＳ−ｓｕｌｆａｔｅが公知となっている。ＴＡＰＳ−ｓｕｌｆａｔｅは人工的に合成した化学物質で、不溶性蛋白質のＳＨ基とジスルフィド結合し、可溶化の効率を向上させる。また、細胞内への導入効率が上昇し、導入された蛋白質は細胞内でリフォールディングされることが知られている（非特許文献４）。【０００９】
しかしながら、ＴＡＰＳ−ｓｕｌｆａｔｅは人工的に合成した化学物質であるが故に、細胞毒性等の安全性が確立されていないため、現在でも不溶性蛋白質を可溶化し、かつ安全に、細胞内に高効率で導入する技術の開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４（５）：３８１−４（２００９）
【非特許文献２】Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９；３０９：２１７−２３６
【非特許文献３】Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００１；１９（１２）：１１７３−１１７６
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００６；４５（１９）：６１２４−６１３２
【非特許文献５】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２００４；１５（３）４７５−４８１
【非特許文献６】Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００７；１４（８）：６８２−６８９
【非特許文献７】Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００８；１６（８）：１５０７−１５１４
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許第３８５４９９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、不溶性蛋白質を可溶化し、更に蛋白質の細胞内への導入効率を向上させる技術を提供するものである。さらに、該蛋白質が導入された細胞、該細胞の作製方法、該細胞を用いた治療方法及び予防もしくは治療剤を提供するものである。また、該細胞が樹状細胞由来である、不溶性抗原を提示する抗原提示細胞の作製方法、該作製方法により作製された抗原提示細胞、該抗原提示細胞を用いた細胞傷害性Ｔ細胞誘導方法および細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤、並びに該抗原提示細胞を用いたがん及び／又は感染症予防もしくは治療方法及び予防もしくは治療剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、これらの課題を解決するため、様々な研究を行い、ポリアルギニンとシステイン１残基からなるペプチドで蛋白質を修飾することにより、不溶性蛋白質の可溶化効率を向上させることができ、さらに細胞内への取り込み効率も向上させることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。【００１４】
（１）ポリアルギニンとシステインとで構成されるポリペプチドを含む、蛋白質の修飾剤；
（２）前記システインが前記ポリアルギニンのカルボキシル基末端にペプチド結合していることを特徴とする（１）に記載の修飾剤；
（３）前記ポリアルギニンが、６〜１２個のアルギニンで構成されていることを特徴とする（１）又は（２）に記載の修飾剤；
（４）前記ポリアルギニンが８個のアルギニンで構成されることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか一つに記載の修飾剤；
（５）前記ポリペプチドが、カルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする（１）〜（４）のいずれか一つに記載の修飾剤；
（６）前記ポリペプチドがオクタアルギニンのカルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする（１）〜（５）のいずれか一つに記載の修飾剤；
（７）前記修飾剤が蛋白質の可溶性を向上させることを特徴とする（１）〜（６）のいずれか一つに記載の修飾剤；
（８）前記修飾剤の細胞内導入効率を向上させることを特徴とする（１）〜（７）のいずれか一つに記載の修飾剤；
（９）前記蛋白質がシステイン残基を２つ以上有していることを特徴とする、（１）〜（８）のいずれか一つに記載の修飾剤。【００１５】
（１０）不溶性蛋白質の可溶化方法であって、不溶性蛋白質と変性剤とを同一の溶液内で混合して蛋白質の溶液を作製する工程と、該溶液にポリアルギニンとシステインとで構成されるポリペプチドを含む蛋白質の修飾剤を添加する工程と、該溶液から変性剤を除去する工程と、からなる蛋白質の可溶化方法；
（１１）前記システインが前記ポリアルギニンのカルボキシル基末端にペプチド結合していることを特徴とする（１０）に記載の蛋白質の可溶化方法；
（１２）前記ポリアルギニンが、６〜１２個のアルギニンで構成されていることを特徴とする（１０）又は（１１）に記載の蛋白質の可溶化方法；
（１３）前記ポリアルギニンが、８個のアルギニンで構成されていることを特徴とする（１０）〜（１２）のいずれか一つに記載の可溶化方法；
（１４）前記ポリペプチドが、カルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする（１０）〜（１３）のいずれか一つに記載の蛋白質の可溶化方法；
（１５）前記ポリペプチドがオクタアルギニンのカルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする（１０）〜（１４）のいずれか一つに記載の蛋白質の可溶化方法；
（１６）前記蛋白質が、天然由来の蛋白質、遺伝子組換え技術によって作製される蛋白質、又は化学合成した蛋白質であることを特徴とする（１０）〜（１５）のいずれか一つに記載の蛋白質の可溶化方法；
（１７）前記変性剤が、尿素及び／又はグアニジン塩酸であることを特徴とする（１０）〜（１６）のいずれか一つに記載の蛋白質の可溶化方法；
（１８）前記蛋白質と変性剤を同一の溶液中で混合する工程において、さらに還元剤を添加することを特徴とする（１０）〜（１７）のいずれか一つに記載の蛋白質の可溶化方法；
（１９）前記還元剤が、ジチオスレイトール又は２−メルカプトエタノールであることを特徴とする（１０）〜（１８）のいずれか一つに記載の蛋白質の可溶化方法；
（２０）前記蛋白質がシステイン残基を２つ以上有していることを特徴とする、（１０）〜（１９）のいずれか一つに記載の蛋白質の可溶化方法；
（２１）前記ポリペプチドの使用量が前記不溶性タンパク質に含まれるシステイン残基に対して、１モル倍以上であることを特徴とする（２０）に記載の蛋白質の可溶化方法。【００１６】
（２２）蛋白質の細胞内への導入方法であって、蛋白質と、ポリアルギニンとシステインとで構成されたポリペプチドを含む蛋白質の修飾剤とを混合する工程と、得られた蛋白質溶液を、蛋白質を導入したい細胞と接触させる工程と、からなる蛋白質の細胞内への導入方法；
（２３）前記システインが前記ポリアルギニンのカルボキシル基末端にペプチド結合していることを特徴とする（２２）に記載の蛋白質の細胞内への導入方法；
（２４）前記ポリアルギニンが、６〜１２個のアルギニンで構成されていることを特徴とする（２２）又は（２３）に記載の蛋白質の細胞内への導入方法；
（２５）前記ポリアルギニンが８個のアルギニンで構成されていることを特徴とする（２２）〜（２４）のいずれか一つに記載の蛋白質の細胞内への導入方法；
（２６）前記ポリペプチドが、カルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする（２２）〜（２５）のいずれか一つに記載の蛋白質の細胞内への導入方法；
（２７）前記ポリペプチドがオクタアルギニンのカルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする（２２）〜（２６）のいずれか一つに記載の蛋白質の細胞内への導入方法；
（２８）前記蛋白質が、天然由来蛋白質、遺伝子組換え技術によって作製される蛋白質、又は化学合成した蛋白質であることを特徴とする（２２）〜（２７）のいずれか一つに記載の蛋白質の細胞内への導入方法；
（２９）前記蛋白質がシステイン残基を２つ以上有していることを特徴とする（２２）〜（２８）のいずれか一つに記載の蛋白質の細胞内への導入方法。
（３０）細胞への導入を２５℃〜４℃の温度範囲で実施する（２２）〜（２９）の一つに記載の蛋白質の細胞内への導入方法；
（３１）前記細胞が生体由来動物細胞又は培養細胞由来動物細胞である（２２）〜（３０）の一つに記載の蛋白質の細胞内への導入方法。【００１７】
（３２）ポリアルギニンとシステインとで構成されるポリペプチド；
（３３）前記システインが前記ポリアルギニンのカルボキシル基末端にペプチド結合していることを特徴とする（３２）に記載のポリペプチド；
（３４）前記ポリアルギニンが６〜１２個のアルギニンから構成されることを特徴とする（３２）又は（３３）に記載のポリペプチド；
（３５）前記ポリアルギニンが８個のアルギニンから構成されることを特徴とする（３２）〜（３４）のいずれか一つに記載のポリペプチド；
（３６）前記ポリペプチドがカルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする（３２）〜（３５）のいずれか一つに記載のポリペプチド；
（３７）前記ポリペプチドがオクタアルギニンのカルボキシル基末端側に有するシステイン同士で結合して二量体を形成していることを特徴とする（３２）〜（３６）のいずれか一つに記載のポリペプチド。【００１８】
（３８）（２２）〜（３１）のいずれか一つに記載の蛋白質の細胞内への導入方法により蛋白質を導入された細胞を、ヒトを含む哺乳動物に投与すること含む、治療もしくは予防方法；
（３９）前記細胞が樹状細胞であり、治療もしくは予防対象ががん及び／又は感染症である、（３８）に記載の治療もしくは予防方法； 
（４０）前記樹状細胞が単球由来である、（３９）に記載の治療もしくは予防方法。【００１９】
（４１）（２２）〜（３１）のいずれか一つに記載の蛋白質の細胞内への導入方法により蛋白質を導入された細胞を主成分として含有する医薬組成物；
（４２）前記細胞が樹状細胞であり、治療もしくは予防対象ががん及び／又は感染症である、（４１）に記載の医薬組成物； 
（４３）前記樹状細胞が単球由来である、（４２）に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の蛋白質の修飾剤を用いることにより、不溶性蛋白質を可溶化することができる。また、本発明の修飾剤で蛋白質を修飾することにより細胞内への導入効率を向上させることができる。さらに、本発明の具体的な利用方法としては、該修飾剤を用いて蛋白質を細胞へ導入したことによる、効率よく形質転換された細胞の作製方法；該細胞を用いたヒトを含む動物の治療もしくは予防方法；該細胞を活性成分とする医薬組成物；不溶性抗原を提示する抗原提示細胞の作製方法；免疫反応医薬品の作製及び試薬の調製等への応用；可溶化した蛋白質抗原を含む蛋白質ワクチン、ペプチドワクチン；及び樹状細胞ワクチン等の医薬を提供することが挙げられる。【００２１】
本発明の修飾剤で修飾された蛋白質は細胞内に導入された後、リフォールディングされ、蛋白質の機能が回復するため、遺伝子導入しなくても安全に細胞機能を修飾することができる。【００２２】
従来であれば、オクタアルギニンのようなポリアルギニンを蛋白質導入のためのベクターとして用いる場合、蛋白質を発現させる際にオクタアルギニンの遺伝子を連結させて組み込み、蛋白質とポリアルギニンの融合蛋白質を作製し、利用していた。しかしこれでは蛋白質の末端に一分子しか結合できず、また種々の蛋白質に用いる場合には、それぞれの蛋白質について融合蛋白質の遺伝子を作製する必要があった。【００２３】
システインを付加したことにより、それぞれの蛋白質の溶液に添加するだけで、蛋白質中に含まれるシステインとジスルフィド結合により蛋白質に結合するため、蛋白質を発現する際にポリアルギニンを遺伝子に組み込む必要がなく、より簡便な操作で蛋白質の細胞内への導入効率を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、組換えＧＦＰ、およびＧＦＰ−Ｒ８融合蛋白質の構造を表した模式図である。
【図２】図２は、ＧＦＰとＧＦＰ−Ｒ８を発現させた大腸菌をそれぞれＰＢＳに懸濁して破砕した後の上清と沈殿を試料としてウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【図３】図３は、Ｃｏｓ−７細胞へＧＦＰ又はＧＦＰ−Ｒ８を添加し、蛍光顕微鏡によりＧＦＰが細胞内に導入されたかを確認した図である。
【図４】図４は、ヒト樹状細胞へＧＦＰ又はＧＦＰ−Ｒ８を添加し、共焦点蛍光顕微鏡によりＧＦＰが細胞内へ導入されたかを確認した図である。
【図５】図５は、ＢＳＡをＲ８又はＧＳＳＧを用いて可溶化し、可溶性画分中に含まれる蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した結果を示す図である。
【図６】図６は、ＯＶＡをＲ８又はＧＳＳＧを用いて可溶化し、可溶性画分中に含まれる蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した結果を示す図である。
【図７】図７は、ＨｅＬａ細胞をＲ８−ＯＶＡで処理した後、細胞を回収、ついで溶解し、細胞に付着又は細胞内に導入されたＯＶＡをウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す図である。
【図８】図８は、Ｕ９３７細胞をＲ８−ＯＶＡで処理した後、細胞を回収、ついで溶解し、細胞に付着又は細胞内に導入されたＯＶＡをウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す図である。
【図９】図９は、ＣＨＯ細胞をＲ８−ＯＶＡで処理した後、細胞を固定し、抗ＯＶＡ抗体、二次抗体によりＯＶＡが細胞に導入されているかを確認した図である。左が可視画像、右が蛍光画像を示している。
【図１０】図１０は、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞をＲ８−βＧａｌで処理し、細胞を固定し、Ｘ−Ｇａｌ染色を行った結果を示す図である。
【図１１】図１１は、ＣＨＯ細胞をＲ８−βＧａｌで処理し、細胞を固定し、Ｘ−Ｇａｌ染色を行った結果を示す図である。
【図１２】図１２ａは、ｒＵｂ−ＰＡＰ：Ｒ８Ｃ＝１：１０〜１：１００の混合モル比で作製したＲ８−Ｕｂ−ＰＡＰを、還元下、及び非還元下においてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。図１２ｂは、ｒＵｂ−ＰＡＰ：Ｒ８Ｃ＝１：１０〜１：１００の混合モル比で作製したＲ８−Ｕｂ−ＰＡＰを、ＩＥＦ（等電点電気泳動）で解析した結果を示す図である。
【図１３】図１３は、ｒＵｂ−ＰＡＰ：Ｒ８Ｃ＝１：１００の混合モル比で作製したＲ８−Ｕｂ−ＰＡＰの溶媒をＰＢＳに置換した後の可溶性について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果を示す図である。
【図１４】図１４は、Ｒ８−Ｕｂ−ＰＡＰをＣＨＯ細胞に導入した後、導入されたＵｂ−ＰＡＰをＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇで検出した結果を示す図である。
【図１５】図１５ａは、ＯＶＡ：Ｒ８Ｃ＝１：１及び１：１００の混合モル比で作製したＲ８−ＯＶＡをＩＥＦで解析した結果を示す図である。図１５ｂは、ＯＶＡ：Ｒ８Ｃ＝１：１００の混合モル比で作製したＲ８−ＯＶＡの溶媒をＰＢＳに置換した後の可溶性について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果を示す図である。
【図１６】図１６は、Ｒ８−ＯＶＡをＣＨＯ細胞に導入した後、導入されたＯＶＡをＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇで検出した結果を示す図である。
【図１７】図１７は、等量の天然型ＯＶＡ及びＲ８−ＯＶＡをＣＨＯ細胞の培養液に添加し、３７℃で導入を試みた後、ＯＶＡを蛍光標識抗体で検出した結果を示す図である。ＵＶ照射及びＣｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅで標識ＯＶＡが検出されている。
【図１８】図１８は、等量の天然型ＯＶＡ及びＲ８−ＯＶＡをＣＨＯ細胞の培養液に添加し、４℃で導入を試みた後、ＯＶＡを蛍光標識抗体で検出した結果を示す図である。ＵＶ照射及びＣｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅで標識ＯＶＡが検出されている。
【図１９】図１９ａは、Ｒ８−ＴＲＰ−２を作製した後、ＩＥＦで解析した結果を示す図である。図１９ｂは、Ｒ８−ＴＲＰ−２及びＲ８−Ｕｂ−ＴＲＰ−２を作製し、溶媒をＰＢＳに置換した後の可溶性について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果を示す図である。
【図２０】図２０は、Ｒ８−ＴＲＰ−２及びＲ８−Ｕｂ−ＴＲＰ−２をＣＨＯ細胞に導入した後、導入されたＴＲＰ−２及びＵｂ−ＴＲＰ−２をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇで検出した結果を示す図である。
【図２１】Ｒ８−ＯＶＡ、Ｒ８Ｃ−ＣＲ８とＮａｔｉｖｅ  ＯＶＡの混合液、若しくはＲ８ＣモノマーとＮａｔｉｖｅ  ＯＶＡの混合液をＣＨＯ細胞培養系に添加し、３７℃で２時間の導入操作を行った。その後回収した細胞に導入されているＯＶＡをＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇで検出した結果を示す図である。
【図２２】図２２ａは、ＴＲＰ−２テトラマーによってＴＲＰ−２ペプチド特異的ＣＴＬを検出したフローサイトメーターの結果を示す図である。図２２ｂは、Ｎｏｒｍａｌの値を基準値（０）として、各抗原を添加したＤＣにより誘導されたＣＴＬの増加量を百分率で比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を実施する為の形態を説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、様々なる態様で実施しうるものである。
【００２６】
まず、本発明に係る蛋白質の修飾剤（以下、本発明の修飾剤とも記す）について説明する。
【００２７】
本明細書において、「修飾剤」とは蛋白質を修飾する試薬もしくは薬剤のことをいい、「蛋白質を修飾する」とは蛋白質に結合し、新たに機能を付加することをいう。
【００２８】
本明細書において「不溶性」とは、蛋白質の特性を説明するためのものであり、液体に溶解して均一な混合液を形成せず、特に水または生理的溶媒に溶解できない、もしくは溶解しにくいという特性を指す。本明細書に説明する種類の不溶性の蛋白質は、その蛋白質が水、水および塩、水およびその蛋白質を変性しない生理的溶媒中にある際、１５，１００×ｇで一時間遠心した後に、実質的に大部分が沈殿画分に回収される場合に、不溶性と呼ぶ。
【００２９】
ここでいう「蛋白質」とは、ペプチド、ポリペプチド等を含み、自然界に存在する天然由来の蛋白質に限定されず、遺伝子導入等により形質転換した細胞由来の組換え蛋白質、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで無細胞蛋白質発現系を用いて発現させた蛋白質、また、有機合成化学的に作製する合成蛋白質も含まれる。さらに、蛋白質を構成するアミノ酸の一部又は全部がアセチル化、リン酸化、メチル化等の官能基が付加されたもの、糖類、蛋白質、脂質等で修飾されたものであっても構わない。
【００３０】
ここでいう「不溶性蛋白質」とは、室温において、水や生理的溶媒中に攪拌しても溶解せずもしくは溶解しにくく、例えば変性剤を用いることで溶解しても、生理的溶媒に置換すると沈殿を生ずる蛋白質を指す。また、元来天然型が可溶性の蛋白質であっても、組換え蛋白質として異種生物を用いて発現させた場合（例えば、遺伝子組換え技術を用いて大腸菌での発現系を構築した場合等）、目的蛋白質はインクルージョンボディ（封入体）として回収される場合、その目的蛋白質も不溶性蛋白質と言う。
【００３１】
本明細書において「可溶化」とは、不溶性蛋白質を、アミノ酸配列を維持したまま生理的溶媒中に溶解させることをいい、変性剤によって溶解した不溶性蛋白質を含む溶液を生理的溶媒に置換し、遠心した際に、該不溶性蛋白質が遠心後に上清に回収される量を増加させることをいう。
【００３２】
本発明の修飾剤は、ポリアルギニンとシステインとで構成されていることを特徴とする。ポリアルギニンとは、アルギニンがペプチド結合により複数個結合したポリペプチドであり、（Ａｒｇ）ｎで表すことができる。本発明の修飾剤に用いるポリアルギニンのｎは特に限定されないが、６〜１２であることが好ましい。さらに好ましくはｎ＝８のオクタアルギニンである。
【００３３】
本発明の修飾剤は、ポリアルギニンとシステインとで構成されていることを特徴とする。このシステインにより、蛋白質中のシステイン残基とジスルフィド結合を形成する。これにより同一蛋白質（分子）内のシステイン残基や、複数の蛋白質（分子間）のシステイン残基間でのジスルフィド結合の形成を防ぐことができる。ポリアルギニン中でシステインが挿入される位置はどこであっても構わないが、ポリアルギニンのカルボキシル基末端にペプチド結合していることが好ましい。カルボキシル基側のシステインが蛋白質中のシステインとジスルフィド結合を形成し、一次構造上アミノ基が蛋白質から離れた位置でフリーとなり、アルギニンの側鎖を含め、電荷がカチオンで統一されるためである。
【００３４】
本発明の修飾剤は、前述の通り、蛋白質中のシステイン残基と結合するため、対象とする蛋白質にはシステイン残基が含まれることが好ましい。蛋白質中に含まれるシステイン残基はいくつであっても構わないが、１蛋白質分子につき２つ以上であることが好ましい。また、蛋白質分子中にシステイン残基が含まれていない場合であっても、組換え蛋白質として発現させる際に、アミノ基末端及び／又はカルボキシル基末端にシステイン残基を付加することで、本来の構造を崩すことなく、ポリアルギニンを結合させることもできる。
【００３５】
本発明の修飾剤においては、ポリアルギニンのカルボキシル基末端にシステインがペプチド結合したポリペプチドが好ましく、特にポリアルギニンのカルボキシル基末端のシステイン同士がジスルフィド結合し、二量体を形成しているポリペプチドが好ましい。二量体を形成していることにより、蛋白質のＳＨ基と接触した際に、交換反応が起こるため、蛋白質に結合しやすくなるという利点がある。
【００３６】
オクタアルギニンとシステインから構成されるＲ８Ｃモノマー（配列番号１１）は通常のペプチド合成機で合成することができる。Ｒ８Ｃモノマーから二量体のＲ８Ｃ−ＣＲ８を得るには、通常使用される酸化剤を添加すれば容易に合成することができる。過酸化水素、酸素（オゾン）、過マンガン酸カリウム、塩素酸カリウム、二クロム酸カリウム等、適切な濃度で添加すればよく、安全性や価格を考慮して好ましくは０．１Ｍ〜１．０Ｍの過酸化水素を添加すれば、ジスルフィド結合によって共有結合した二量体を得ることができる。本発明の他のポリペプチド及びその二量体も同様にして合成することが出来る。
反応後に残存している可能性のある単量体と酸化剤を除去する為には、一般的なゲル濾過や透析を行うことで可能である。
【００３７】
本発明の蛋白質の修飾剤は、不溶性蛋白質の生理的溶媒に対する溶解度を向上させることができるため、不溶性蛋白質の可溶化剤として用いることができる。
【００３８】
また、本発明の蛋白質の修飾剤は、ポリアルギニンにより細胞膜に結合することで、細胞内への取り込み効率を向上させることができる。従って、蛋白質の細胞内導入剤として用いることができる。
【００３９】
次いで、本発明の蛋白質の可溶化方法（以下、本発明の可溶化方法とも記す）について説明する。
本発明の可溶化方法は、不溶性蛋白質と変性剤とを同一の溶液内で混合して蛋白質の溶液を作製する工程と、該溶液にポリアルギニンとシステインで構成されるポリペプチドを含む蛋白質の修飾剤を添加する工程と、該溶液から変性剤を除去する工程と、からなる。
【００４０】
不溶性蛋白質としては、特に制限はされないが、システイン残基を２つ以上含んでいることが好ましい。また、蛋白質分子中にシステイン残基が含まれていない場合であっても、組換え蛋白質として発現させる際に、アミノ基末端及び／又はカルボキシル基末端にシステイン残基を付加することで、本来の構造を崩すことなく、ポリアルギニンを結合させることもできる。
【００４１】
変性剤としては、一般的に尿素、グアニジン塩酸、界面活性剤等で、不溶性の立体構造を形成しているイオン結合、水素結合、疎水性相互作用等を切断する性質を持つものを指す。それら変性剤は、水溶液に溶解した状態で用いられ、例えば、ｐＨ調整が可能なリン酸ナトリウム水溶液等の緩衝液に溶解して用いることが好ましい。
【００４２】
変性剤と還元剤で一度可溶化することにより、不溶性の原因であるジスルフィド結合や折りたたみを解除することができる。
【００４３】
次いで、ポリアルギニンとシステインで構成されるポリペプチドを添加する。このポリペプチドを添加するタイミングとしては特に限定されないが、蛋白質を変性剤と混合し、蛋白質の溶液を作製してから添加することが好ましい。
【００４４】
添加されたポリアルギニンとシステインで構成されるポリペプチドは二量体を形成していることが好ましい。変性剤と還元剤の混合によって露出した蛋白質中のシステイン残基のＳＨ基とポリアルギニンとシステインで構成されるポリペプチドが接触すると、蛋白質中のシステイン残基のＳＨ基とポリアルギニンとシステインで構成されるポリペプチドで形成された二量体のＳ＝Ｓ結合の間で交換反応が起こり、蛋白質とポリアルギニンがジスルフィド結合を形成する。親水性のアルギニン（カチオン性）が複数結合することにより蛋白質の溶解性が向上することになる。従って、変性剤を除去しても、蛋白質は溶解したままとなる。
【００４５】
本発明の可溶化方法において、変性剤を含む蛋白質の溶液から変性剤を除去する方法としては、透析やゲルろ過により溶媒を置換する方法等が挙げられる。特に操作の簡便さから透析を行うことが好ましい。置換するために用いる溶媒は変性剤を含まない溶媒であればよく、例えば、水や生理的溶媒等を用いることができる。特に、蛋白質の溶液を細胞の培養液に添加する場合や、生体に投与する場合には、生理的溶媒で置換することが好ましく、生理的溶媒として例えばＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）や生理食塩水等が好ましい。
また、本発明の可溶化方法においては、ポリアルギニンとシステインで構成されるポリペプチドの使用量はポリアルギニンを不溶性タンパク質に多く結合させるために、不溶性タンパク質よりも多いことが好ましく、具体的には該ポリペプチドを、可溶化するタンパク質に含まれるシステイン残基数に対して、1モル倍比以上、より好ましくは２モル倍比以上である。
【００４６】
次いで、本発明の蛋白質の細胞内への導入方法（以下、本発明の導入方法とも記す）について説明する。
本発明の導入方法は、蛋白質とポリアルギニンとシステインで構成されるポリペプチドを含む蛋白質の修飾剤とを混合する工程と、得られた蛋白質溶液を、蛋白質を導入したい細胞と接触させる工程と、からなる。この混合する工程により、不溶性タンパク質はポリアルギニン化されて可溶化する。接触させる工程は通常ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。ここでいう「細胞」とは動物細胞を指し、生体由来動物細胞又は培養細胞株由来動物細胞のいずれであってもよい。
【００４７】
導入する蛋白質は不溶性であっても、可溶性であっても構わない。蛋白質が不溶性である場合には、上述した本発明の可溶化方法により該蛋白質を可溶化すれば、導入用の溶液が作製されることとなる。蛋白質が可溶性である場合には、該蛋白質を生理的溶媒に溶解し、ポリアルギニンとシステインで構成されるポリペプチドを添加して、導入用の溶液を作製してもよい。また、可溶性蛋白質であっても不溶性蛋白質と同様の上述した可溶化方法により導入用の溶液を作製してもよい。
また、細胞に導入する際には、３７℃−４℃の範囲で実施するのが好ましく、特に２５℃−４℃の範囲が好ましい。
【００４８】
上記した導入用の溶液中に含まれる可溶化した蛋白質にはポリアルギニンがシステイン残基を経由して共有結合しており、結合したポリアルギニンが細胞膜に吸着し、蛋白質とともに細胞内へ取り込まれる。
【００４９】
例えば、細胞として樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ：ＤＣ）をはじめとする抗原提示細胞を、蛋白質としてがん抗原蛋白質や感染症抗原蛋白質を用いれば、がん抗原や感染症抗原に特異的なＣＴＬを誘導する機能をもつ抗原提示細胞を作製することができる。また、がん抗原蛋白質や感染症抗原蛋白質を本修飾剤で修飾し、体内に投与することによりがんワクチン、感染症ワクチンとして用いることができる。
【００５０】
本発明の導入方法により導入された蛋白質は、細胞内でポリアルギニンがはずれ、リフォールディングされ、蛋白質の本来の機能を発揮させることもできる。
【００５１】
例えば、細胞としてｉＰＳ細胞を誘導できる細胞に、ｉＰＳ細胞を誘導させる為に必要な蛋白質（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃのタンパク質）を導入すれば、他の導入方法に較べて、より効率よくｉＰＳ細胞の誘導が可能となる。これらの蛋白質のシステイン残基数は、Ｏｃｔ４では４残基、Ｓｏｘ２では１残基、Ｋｌｆ４では１４残基、ｃ−Ｍｙｃでは１０残基となっている。Ｓｏｘ２のようにシステインが１残基しかない蛋白質であっても、組換え蛋白質として発現させる際に、Ｎ末端及び／又はＣ末端にシステイン残基を付加させれば、本方法を使用することが可能となる。
【００５２】
例えば、細胞としてｉＰＳ細胞をはじめとする分化全能を有する細胞を、蛋白質として細胞の分化を誘導する蛋白質を用いれば、様々な体細胞をより効率よく分化誘導することが可能となる。このように分化誘導された細胞は再生医療を初め様々な用途で、医薬組成物として用いられ、もしくはヒトを含む哺乳動物の体内に投与されることにより、治療又は予防に用いられる。このように治療又は予防に用いられる細胞は、投与される生体（ヒトを含む哺乳動物）由来であってもよく、違う生体あるいは培養細胞株由来であってもかまわない。
さらに細胞として、リンパ球や樹状細胞等の抗原提示細胞、より好ましくは単球由来の樹状細胞を用い、導入するタンパク質として抗原蛋白質を用いた場合は、このようにして作製された抗原提示細胞は、導入された抗原を細胞内で分解し、ＭＨＣクラスＩに提示するため、その抗原に対する特異的なＣＴＬを誘導することができる。特に蛋白質を導入した場合には配列中に含まれる複数のエピトープが提示されるため、その抗原に対する複数のタイプのＣＴＬを活性化することができる。また、ＭＨＣクラスＩＩのエピトープも提示されるため、Ｔｈ１細胞が活性化され、さらにＣＴＬの活性化を促進することができる。
従って、このように作製された抗原提示細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞誘導方法、細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤、がん及び/又は感染症予防もしくは治療方法、がん及び/又は感染症予防もしくは治療剤に用いることができる。より具体的には、例えば、がん患者から採取した腫瘍組織または腫瘍細胞の破砕物から不溶性画分を取得し、あるいは、ウイルス感染症患者と同じウイルスの破砕物から不溶性画分を取得し、または病原性細菌感染症患者と同じ病原性細菌の破砕物から不溶性画分を取得し、それらの不溶性画分を、本発明の可溶化方法に付して、可溶化させ、可溶化させたものを、同じ患者から採取したリンパ球や樹状細胞などの抗原提示細胞に添加して培養して抗原提示細胞を誘導し、誘導した抗原提示細胞を同じ患者に投与することによって、腫瘍細胞、ウイルスまたは病原性細菌に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するこができ、それによって、がんやウイルス感染症などの疾患の予防もしくは治療を行うことができる。また、組換え蛋白質や合成蛋白質などを、本発明の可溶化方法に付して、可溶化させ、可溶化させたものを、患者から採取したリンパ球や樹状細胞などの抗原提示細胞に添加して培養して抗原提示細胞を誘導し、誘導した抗原提示細胞を、同じ患者に投与することもできる。誘導された抗原提示細胞は、通常の方法によって患者に投与すればよく、例えば、そのまま患者に投与してもよく、通常の注射剤などの製剤の形態にして投与してもよく、また、通常のワクチン製剤として投与してもよい。また、抗原提示細胞の投与量は、患者の症状や疾患の種類などにより、予防のためには、予防しようとする疾患、対象者などに応じて任意に決めることができる。また、作製した抗原提示細胞を利用して、患者から採取したリンパ球と抗原提示細胞を培養し、体外でＣＴＬを誘導することもできる。
【００５３】
以下、実施例及び参考例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものではないことは言うまでもない。
【参考例１】
【００５４】
製造元が記載されていない試薬は和光純薬製のものを使用した。
＜オクタアルギニン（Ｒ８）融合蛋白質の溶解度＞
Ｃ末端にＲ８が融合した緑色蛍光蛋白質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）（図１下、ＧＦＰ−Ｒ８と記す；配列番号２）と、Ｒ８をもたないＧＦＰ（図１上；配列番号１）を組換え蛋白質として大腸菌（Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ：Ｎｏｖａｇｅｎ社製、＃７１３５２−３）で発現させた。
【００５５】
夫々のＧＦＰを発現した大腸菌を湿重量で１０％となるようにＰＢＳで懸濁し、超音波破砕機（ＴＯＭＹ社製、＃ＵＤ−２０１）で破砕した後、Ｍ−Ｘ１００遠心機、ＴＭＰ−１１ローター（ＴＯＭＹ社製）で１５，１００×ｇ、４℃、１時間の遠心を行い、上清と沈澱に分画した。不溶性の蛋白質は沈澱に回収され、可溶性の蛋白質は上清に回収される。
【００５６】
各々の上清は５μＬずつ、５μＬの２ｘ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  サンプル緩衝液（トリスＳＤＳβＭＥサンプル処理液：第一化学薬品社、＃４２３４３７）と混和させた。夫々の沈澱は１０μＬの１ｘ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  サンプル緩衝液で溶解させた。可溶性画分と不溶性画分を夫々１０μＬずつ、１３％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、ＢＩＯ−ＲＡＤ社のＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ  Ｃｅｌｌを用いて、ＩＭＭＵＮ−Ｂｌｏｔ  ＰＶＤＦ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社、＃１６２−０１７６）に蛋白質を転写した。
【００５７】
転写後、ＰＶＤＦ膜をＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｉｎ  ＴＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ社、＃３７５３５）中で３０分間、室温で振とうさせブロッキングを行った。以下、抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社、＃ＯＢ０５）、ビオチン化抗マウスＩｇ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社：ＧＥ、＃ＲＰＮ１００１−２ＭＬ）、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼコンジュゲート（ＧＥ社、＃ＲＰＮ１２３４Ｖ１）と発色基質溶液ＢＣＩＰ／ＮＢＴ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＷＡＫＯ、＃５４７−０１９４１）を用いたウエスタンブロッティング行い、可溶性画分（上清；図２のＳ）と不溶性画分（沈澱；図２のＰ）中のＧＦＰ量を見積もった。
【００５８】
図２に示したように、ＧＦＰ単独では上清と沈澱に含まれるＧＦＰの量は同等であったが（図２のＧＦＰのレーン）、ＧＦＰ−Ｒ８では明らかに上清中のＧＦＰ量の方が多かった（ＧＦＰ−Ｒ８のレーン）。従って、蛋白質にＲ８を付加すると溶解度が上昇することが明らかとなった。
【００５９】
＜オクタアルギニン（Ｒ８）融合蛋白質の精製＞
大腸菌で発現させたＧＦＰ及びＧＦＰ−Ｒ８の可溶性画分から、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ液体クロマトグラフィーシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｓｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、ニッケルアフィニティ（Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  ＨＰカラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｓｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、＃１７−５２４７−０１）とゲルろ過クロマトマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２  ＨＲカラム、Ａａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｓｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、＃１７−０５３８−０１）を利用し、夫々の精製を行った。
【００６０】
精製後、２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）と３９５ｎｍの吸光度（Ａ３９５）の割合で蛋白質量あたりの蛍光強度（比蛍光強度）を見積もった。表１に示したように、ＧＦＰでもＧＦＰ−Ｒ８でも同等の比蛍光強度であった。この結果より、同量（モル数）のＧＦＰがあれば、Ｒ８がペプチド結合した融合タンパク質であっても同じ蛍光量を発することが確認された。
【００６１】
【表１】
2010150708.tif 000002
【００６２】
＜オクタアルギニン（Ｒ８）融合蛋白質の細胞内導入＞
〔１〕Ｃｏｓ−７細胞
１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、＃１１８８５−０８４）で継代培養をしておいたＣｏｓ７を１×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｍＬ／ｗｅｌｌで２４穴プレート（ＳＵＭＩＬＯＮ社、＃ＭＳ−０８２４０）に播種した。
【００６３】
一晩培養後、血清を含まないＤＭＥＭで付着した細胞を洗浄し、血清を含まないＤＭＥＭで０．５ｍＬ／ｗｅｌｌとした。そこに精製ＧＦＰまたはＧＦＰ−Ｒ８を５００ｎＭで加え、３７℃で１時間静置した。
【００６４】
その後、培養液を除去し、４℃で冷却しておいたＰＢＳで洗浄して、蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社、ＩＸ７１）でＧＦＰの蛍光を観察した。図３に示したように、ＧＦＰではほとんど蛍光が観察されなかったが、ＧＦＰ−Ｒ８では多数の細胞から蛍光が観察された。従って、Ｒ８を付加（融合）させることで、細胞内への取り込み量が増加したと考えられた。
【００６５】
〔２〕ヒト樹状細胞
健常人ボランティアから末梢血を採取し、比重遠心法にて末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得た。このＰＢＭＣから、ＭＡＣＳ及びＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙ  ＢＩＯＴＥＣＨ社、１３０−０５０−２）を利用して、ＣＤ１４陽性（ＣＤ１４＋）画分を分取した。ＣＤ１４＋細胞をＧＭ−ＣＳＦ（５００  ＩＵ／ｍＬ、ＢＥＲＬＥＸ社、８７−８９５）とＩＬ−４（５００  ＩＵ／ｍＬ、Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ社）を含むＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ社製、２００１）で５日間培養し、５日目にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ社、１００６）及びプロスタグランジンＥ２（１μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社、Ｐ６５３２）を含むＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ  Ｍｅｄｉｕｍへ交換し、培養を継続して成熟樹状細胞（ｍａｔｕｒｅ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ：ｍＤＣ）に分化誘導した。
【００６６】
培養７日目にｍＤＣを回収し、培地をＡＩＭ−Ｖに交換した後、５００ｎＭでＧＦＰまたはＧＦＰ−Ｒ８を加えて、３７℃で３０分間静置した。細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄後、サイトスピン（Ｔｈｅｒｍｏ社、ＣＹＴＯＳＰＩＮ４）でスライドグラスに固定させた。その後、共焦点蛍光顕微鏡で蛍光を観察した。
【００６７】
結果を図４に示す。ＧＦＰを添加したものとＧＦＰ−Ｒ８を添加したものは、Ｃｏｓ−７細胞の場合とは異なり、ほぼ同等の蛍光を発していた。この結果から、ＤＣの場合にはエンドサイトーシスによる取り込みが強く、Ｒ８による細胞内導入を介することなく、細胞内に十分に取り込まれてしまうため、蛋白質１分子あたりＲ８ペプチド１分子のみでは取り込みの差が見られなかったと推察された。
【実施例１】
【００６８】
＜Ｒ８Ｃペプチドの合成とＲ８Ｃの２量体（Ｒ８Ｃ−ＣＲ８）の作製＞
参考例１の細胞内導入〔２〕ＤＣの場合には、ＧＦＰの細胞内導入量の増加が観察されなかった。蛋白質１分子あたりＲ８ペプチドが１分子付加されただけでは、細胞内の取り込みに影響しないのではないかと考え、複数のＲ８分子を１分子の蛋白質に付加させる技術を確立することとした。【００６９】
従来から蛋白質の分子間ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を妨害する目的で、システイン残基のチオール基にグルタチオンを結合させる技術が使用されてきた。この原理を応用し、Ｒ８分子に１残基のシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）を結合させたＲ８Ｃペプチドの二量体（以下、Ｒ８Ｃ−ＣＲ８とも記す）を用いれば、Ｓ−Ｓ交換反応で、蛋白質のＣｙｓ残基にＲ８を共有結合させることが可能であろうと考えた。【００７０】
先ず、Ｃｙｓ残基をＣ末端に配したＲ８ＣペプチドをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社に依頼して合成した。合成Ｒ８Ｃペプチドを１ｍｇ／ｍＬで蒸留水に溶解させ、過酸化水素を１Ｍになるように加えて、室温で１時間静置（酸化）し、Ｒ８Ｃ−ＣＲ８を作製した。その後、透析膜にＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＣＥ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（ＭＷＣＯ：３５００）を用いて、４℃で一晩、ＰＢＳで透析を行った。【００７１】
回収したサンプル及び反応前のサンプルについて２１５ｎｍの吸光度（Ａ２１５）を測定したところ、表２の結果を得た。表２に示す数値は、Ａ２１５の数値に液量（ｍＬ）を乗じた数値であり、溶液中に含まれるペプチドの量を示す数値である。この結果から回収率は８３％と見積もられた。【００７２】
【表２】
2010150708.tif 000003
【００７３】
また、透析後に未反応で残存しているチオール基の量を確認する為、５，５’−Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）：ＤＴＮＢ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社、＃Ｄ０２９）による比色定量を行った。【００７４】
標準液にシステインのＰＢＳ溶液を用い１０００、２００、４０、８、０μＭと系列希釈した。また透析後サンプルはＰＢＳで２倍希釈して、各々３０μＬずつ、９６穴プレート（ＳＵＭＩＬＯＮ社、＃ＭＳ−８０９６Ｆ）に入れた。各穴に、さらに７０μＬのＰＢＳを加え混和した後、５ｍＭ  ＤＴＮＢ（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２）をＰＢＳで１０倍希釈して２０μＬずつ加えて混和した。【００７５】
室温で５分間反応させた後、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社のＭｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｃｅｎｔプレートリーダーで４１２ｎｍの吸光度を測定した。システイン標準液の吸光度に基づき作成した検量線から、透析後のチオール基の濃度を定量したところ、４０μＭとなった。酸化前の濃度は７１９μＭであったことから、９４％が酸化されＲ８Ｃ−ＣＲ８となっていると見積もられた。
【実施例２】
【００７６】
＜Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）のＲ８化＞
乾燥ＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ社、＃１０  ７３５  ０８６  ００１）を秤量し、５ｍｇ／ｍＬの濃度で６Ｍ  Ｕｒｅａ−ＰＢＳに溶解させ、Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ、Ｓｉｇｍａ社、＃Ｄ−９７７９）を５ｍＭになるように加えて穏やかに攪拌した後、１時間静置することで還元を行った。この反応液を６Ｍ  Ｕｒｅａ−ＰＢＳで透析して、余分なＤＴＴを除いて還元型変性ＢＳＡとした。ＢＳＡのアミノ酸配列中には３５個のシステインが含まれている。【００７７】
還元型変性ＢＳＡを０．１ｍＬずつに分注し、ＰＢＳ、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を終濃度５ｍＭで、またはＲ８Ｃ−ＣＲ８を終濃度で１１μＭとなるように、各々２μＬずつ加えて穏やかに混和した。室温で１時間反応させ、その後ＰＢＳで透析を行った。【００７８】
回収した各サンプルについてＯＤ５００ｎｍで濁度を測定し、沈澱の割合を比較した。表３にその結果を示した。ＰＢＳを添加したものは０．４７０でＧＳＳＧを添加したものは１．６６１であった。この結果は、変性状態から天然の可溶性の立体構造にリフォールディングする際に、ＧＳＳＧを添加した場合にはリフォールディングに阻害がかかり、ほとんどが沈澱したものと考えられた。しかし、Ｒ８Ｃ−ＣＲ８を添加したものはＰＢＳを添加した場合の濁度より低く０．２４７であった。Ｒ８Ｃ−ＣＲ８はＧＳＳＧと同様にリフォールディングを阻害していると思われるが、それ自体の溶解度が高く、沈澱をほとんど生じなかったと考えられた。【００７９】
また、可溶性で回収される蛋白量を比較する為、濁度の低かったＰＢＳ及びＲ８Ｃ−ＣＲ８を添加したサンプルについて、１５，１００×ｇ、４℃で１時間遠心し上清を回収（可溶化されたＢＳＡが回収される）して、ＢＣＡ法（ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ社、＃２３２２５）で蛋白定量を行った。【００８０】
表３に示した様に、濁度に比例し、Ｒ８Ｃ−ＣＲ８を添加した場合の方が高濃度で可溶性画分に回収されていた。ＧＳＳＧを添加したサンプルについてはほぼ全量が沈殿していたため、ＢＣＡによる測定を行わなかった。【００８１】
【表３】
2010150708.tif 000004
【００８２】
さらに、ここで回収された可溶化ＢＳＡ（ＰＢＳまたはＲ８Ｃ−ＣＲ８添加のもの）と、別に調製したＧＳＳＧ添加で上清に回収された可溶化ＢＳＡを各５μｇずつ、５−２０％グラジエントアクリルアミドゲル（アトー株式会社、ｅ−ＰＡＧＥＬ、＃Ｅ−Ｔ５２０Ｌ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。【００８３】
図５の左側は還元剤である２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）を含んだサンプル処理液（第一化学薬品、＃４２３４３７）で前処理を行ったもの（＋）、右側は２ＭＥを含んでいないサンプル処理液で前処理を行ったもの（−）を夫々泳動し、クーマシーブリリアントブルーＲ２５（ＣＢＢ  Ｒ２５０）で染色した結果である。図中、ＬＭＷはＬｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ（ＧＥ社、＃１７−０４４６−０１）をＨＭＷはＨｉｇｈ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ（ＧＥ社、＃１７−０６１５−０１）を示している。２ＭＥ（＋）で泳動したものはすべて６７ｋ  Ｄａｌｔｏｎ（ｋＤａ）の位置に泳動されているが、２ＭＥ（−）で泳動した場合には、Ｒ８化したものに最も多くのブロードなバンドが検出されている（＊印）。これはＢＳＡ１分子に複数分子のＲ８Ｃペプチドが結合していることを現しているものと考えられた。
【実施例３】
【００８４】
＜オブアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；ＯＶＡ）のＲ８化＞
乾燥ＯＶＡ（ＩｍｍｕｎｏＯ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社、＃９５０５１）を秤量し、２．５ｍｇを８Ｍ  Ｕｒｅａ−ＰＢＳに溶解させ、ＯＶＡ溶液を５００μＬ作製した（５ｍｇ／ｍＬ）。そこに終濃度１０ｍＭでＤＴＴを加え混和し、室温で１時間還元を行った。その後６Ｍ  Ｕｒｅａ−ＰＢＳで透析を行い、余分なＤＴＴを除いて変性ＯＶＡとした。ＯＶＡのアミノ酸配列中には６残基のシステインが含まれている。【００８５】
変性ＯＶＡを分注し、そこにＧＳＳＧが終濃度１０ｍＭとなるように添加したサンプル、ＧＳＳＧを終濃度１０ｍＭと還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を終濃度１ｍＭとなるように添加したサンプル、Ｒ８Ｃ−ＣＲ８をＯＶＡ：Ｒ８Ｃ−ＣＲ８＝１：１となるように添加したサンプル、Ｒ８Ｃ−ＣＲ８とＲ８ＣをＯＶＡ：Ｒ８Ｃ−ＣＲ８：Ｒ８Ｃ＝１：１：０．１となるように添加したサンプルを準備し、室温で１時間反応させた後、ＰＢＳで透析を行った。【００８６】
回収した各サンプルについてＯＤ５００ｎｍで濁度を測定し、沈澱の割合を比較した。表４にその結果を示した。ＧＳＳＧを加えたものはいずれもＯＤが１を超えており、大量の沈澱が観察された。一方、Ｒ８Ｃ−ＣＲ８を加えたものはＯＤが０．０１０であり、Ｒ８Ｃ−ＣＲ８とＲ８Ｃを加えたものは０．０２７であり、いずれも肉眼で観察される沈澱は生じていなかった。【００８７】
また各サンプルについて実施例２と同様に遠心を行い、可溶性画分を回収した。Ｒ８Ｃ−ＣＲ８を加えてＲ８化したサンプルの可溶性画分については、ＢＣＡ法で蛋白定量を行った。何れもサンプル液量は５５０μＬであり、定量値は２．９ｍｇ／ｍＬと算出された（表４）。【００８８】
【表４】
2010150708.tif 000005
【００８９】
さらに実施例２と同様に各可溶性画分を２．４μＬずつ、１０．５％アクリルアミドによるＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した（図６）。ＭはＨＭＷである。左側は２ＭＥ（＋）で泳動しており、Ｒ８Ｃ−ＣＲ８を添加して可溶化したものは、どちらも４４ｋＤａに明らかなＯＶＡ単量体のバンドが観察されたが、ＧＳＳＧを添加したものはどちらもほとんど検出できない量であった。また右側の２ＭＥ（−）で泳動した場合にはＲ８化によってブロードなパターンが観察された（＊印）。これもまた、１分子のＯＶＡに複数分子のＲ８Ｃペプチドが結合していることを現しているものと考えられた。
【実施例４】
【００９０】
＜Ｒ８化ＯＶＡの細胞内導入＞
〔１〕付着性の細胞
１０％ＦＢＳを含んだＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）で継代培養していたＨｅＬａ細胞を７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ／ｄｉｓｈで３５ｍｍ培養用シャーレ（ＳＵＭＩＬＯＮ、＃１０３５０）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で一晩培養して付着させた。【００９１】
導入する蛋白質サンプルとして、Ｒ８Ｃを共有結合させたＯＶＡ（Ｒ８−ＯＶＡ）または乾燥ＯＶＡをＰＢＳに溶解させたものをＢＣＡ法の定量値で６．２５μｇと、Ｃｈａｒｉｏｔキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社、＃３００２５）添付の方法に従い、６２５ｎｇのＯＶＡとＣｈａｒｉｏｔでコンプレックスを形成させたもの（Ｃｈａｒｉｏｔ−ＯＶＡ）を準備した。【００９２】
付着させたＨｅＬａ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、各ＯＶＡ溶液を２１０μＬずつ速やかに添加した。その後ＦＢＳを含んでいないＤＭＥＭを４２０μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１時間静置した。次に１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを１ｍＬずつ加え、１０分、３０分、２時間または６時間同様に静置した（Ｃｈａｒｉｏｔ−ＯＶＡは２時間のみ、ＯＶＡは６時間のみ）。【００９３】
培養上清を廃棄し、ＰＢＳで３回洗浄した後、１．５ｘ  ＳＤＳサンプル処理液０．１ｍＬずつで細胞を溶解させ、回収した。回収したサンプルは超音波槽（ＳＨＡＲＰ社、＃ＵＴ−１０５Ｓ）で２０分間超音波処理した後、常法にて各２０μＬずつを１０．５％アクリルアミドによるＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ＯＶＡ抗体（マウスＩｇＧ１、ａｂｃａｍ社、＃ａｂ１７２９３）、ビオチン化抗マウスＩｇ、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼコンジュゲートと発色基質溶液ＢＣＩＰ／ＮＢＴ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いたウエスタンブロッティングで導入量を見積もった。【００９４】
結果を図７に示す。ＭはＬＭＷである。左側は転写後のゲルをＣＢＢ  Ｒ２５０で染色したもので、いずれの条件でもほぼ等量の細胞由来蛋白質が泳動されていると判断される。右側がＩｍｍｕｎｏ−ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果で、乾燥ＯＶＡをＰＢＳに溶解させたものを添加した場合（ＯＶＡ）にはＯＶＡのバンドがほとんど検出されていないが、それ以外はＣｈａｒｉｏｔ−ＯＶＡでもＲ８−ＯＶＡのいずれの条件でもほぼ等量のＯＶＡのバンドが検出されており、ＯＶＡが細胞内に導入されたことを示唆するものと思われた。【００９５】
〔２〕浮遊性の細胞
１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、＃１１８７５−０９３）培地で継代培養していたＵ９３７細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬ／ｗｅｌｌで２４穴プレートに播種した。そこにＲ８−ＯＶＡまたは乾燥ＯＶＡをＰＢＳに溶解させたものをＢＣＡ法の定量値で６．２５μｇ（５０μＬ）ずつ、２穴ずつに加え、さらにＦＢＳを含んでいないＲＰＭＩ１６４０を０．２ｍＬずつ加えて３７℃、５％ＣＯ２存在下で１時間または２時間静置した。その後１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ１６４０を０．５ｍＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１５分間静置した。【００９６】
培養上清を廃棄し、ＰＢＳで３回洗浄した後、１．５ｘ  ＳＤＳサンプル処理液０．１ｍＬずつで細胞を溶解させ、回収した。回収したサンプルは超音波槽で２０分間超音波処理した後、常法にて各２０μＬずつを１０．５％アクリルアミドによるＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、〔１〕の付着性の細胞の場合と同様にウエスタンブロッティングでＯＶＡの検出を試みた。【００９７】
その結果を図８に示した。左側は転写後のゲルをＣＢＢ  Ｒ２５０で染色したもので、いずれの条件でもほぼ等量の細胞由来蛋白質が泳動されていると判断される。右側がＩｍｍｕｎｏ−ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果で、血清添加前の時間は１時間でも２時間でも同様の結果であり、いずれもＲ８−ＯＶＡを添加したもののバンドの方が濃いことが確認された。〔１〕及び〔２〕の結果より、付着性の細胞でも浮遊性の細胞でも、本開示方法でＲ８化された蛋白質は、容易に細胞内に導入できるということを示唆するものと思われた。【００９８】
〔３〕細胞内外のＯＶＡの検出
Ｒ８−ＯＶＡが細胞内に導入されるという現象を確実に証明する目的で、さらに実験を追加した。〔１〕の実験と同様に、１０％ＦＢＳ−Ｆ１２倍地で継代培養しておいたＣＨＯ細胞をシャーレ４枚に播種した。すべてのシャーレにつき、細胞が付着した後に培地を除き、ＰＢＳで洗浄した。洗浄後、表５のように条件検討を行った。【００９９】
【表５】
2010150708.tif 000006
【０１００】
３枚にはＲ８−ＯＶＡを、１枚にはＯＶＡ−ＰＢＳ溶液を添加し、すべてのシャーレに無血清Ｆ−１２を加えて２時間と１０％ＦＢＳ−Ｆ１２を添加して２時間静置することでＣＨＯ細胞にＯＶＡの導入を試みた。【０１０１】
ＰＢＳで洗浄した後、１０％パラホルムアルデヒド及び０．０１％グルタルアルデヒドを添加したＰＢＳ溶液でＣＨＯ細胞を固定した。ＣＨＯ細胞を固定した後、１０ｍＭグリシンを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｇ）で２回洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ（細胞内ＯＶＡ検出用、Ｒ８−ＯＶＡを添加した一枚を除く）、またはＰＢＳ（細胞表面付着ＯＶＡ検出用、Ｒ８−ＯＶＡを添加したもの一枚）を添加した。５分間の静置後、ＰＢＳ−Ｇで３回洗浄し、３％ＢＳＡを含むＰＢＳを添加し、室温で１０分間静置し、ブロッキングを行った。【０１０２】
１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ）で一回洗浄した後、抗ＯＶＡ抗体（Ｒ８−ＯＶＡを添加し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の処理を行った一枚を除く）またはＰＢＳ（Ｒ８−ＯＶＡを添加し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の処理を行ったもの一枚）を添加した。【０１０３】
室温一時間の反応後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３回洗浄した。次にＧｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ  ＦＩＴＣコンジュゲート（日本ベクトン・ディッキンソン社、＃３４９０３１）をすべてに添加し室温で３０分間反応させた。【０１０４】
最後にＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社、＃Ｕ−ＴＢ１９０）で可視画像と蛍光画像を取得した。【０１０５】
結果を図９に示す。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で膜透過処理を行い、１次および２次抗体で反応させたもの（Ｒ８−ＯＶＡ  ｉｎｔｒａ：条件Ａ）では蛍光スポットが多数観察されるが、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の膜透過処理を行わず細胞表面を反応させたもの（Ｒ８−ＯＶＡ  ｓｕｒｆａｃｅ：条件Ｂ）では蛍光スポットがほとんど観察されていない。またＯＶＡ−ＰＢＳ溶液を添加して膜透過処理を行い、１次および２次抗体で反応させたもの（ＯＶＡ：条件Ｃ）でも、「Ｒ８−ＯＶＡ  ｉｎｔｒａ」と同様に操作を行い、１次抗体を添加しなかったもの（Ｒ８−ＯＶＡ  ｉｎｔｒａ／２ｎｄ  Ａｂ：条件Ｄ）でも蛍光スポットはほとんど観察されていないことから、条件Ａで観察された蛍光スポットは細胞内ＯＶＡを検出していると判断された。
【実施例５】
【０１０６】
＜変性蛋白質の細胞内リフォールディング＞
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｗａｋｏ、＃０７２−０４１４１、以下βＧａｌとも記す）を用いて、実施例３及び４と同様にＲ８−βＧａｌを作製した。β−Ｇａｌのアミノ酸配列中には１６残基のシステインが含まれている。【０１０７】
１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで継代培養していたＨｅｐＧ２細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、２ｍＬ／Ｄｉｓｈで３５ｍｍ培養用シャーレに播種した。その後、３７℃、５％ＣＯ２存在下で一晩培養して細胞を付着させ、ＰＢＳで３回洗浄した。【０１０８】
実施例４と同様に１μｇのβＧａｌとＣｈａｒｉｏｔでコンプレックスを作製したもの（Ｃｈａｒｉｏｔ）、１μｇのＲ８−βＧａｌ（Ｒ８）または１μｇのβＧａｌがＰＢＳに溶解したもの（ＰＢＳ）を夫々０．２ｍＬずつ添加し、ＤＭＥＭを０．４２ｍＬずつ加えて３７℃、５％ＣＯ２存在下で一時間静置した。ここに１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを１ｍＬずつ加え、さらに２時間静置した後、常法にてＸ−Ｇａｌ染色を行った。【０１０９】
培地を除去した後、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、固定液（２％ホルムアルデヒド、０．２％グルタルアルデヒドを添加したＰＢＳ）を加えて、５分間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、染色液（ＰＢＳにそれぞれ４ｍＭフェリシアン化カリウム、４ｍＭフェロシアン化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍｇ／ｍＬ  Ｘ−ｇａｌとなるよう添加した溶液）を加え、３７℃で２時間染色を行った。染色した標本の画像を図１０に示す。【０１１０】
図１０に示したように、ＨｅｐＧ２細胞に、ＰＢＳに溶解させたβＧａｌを添加した場合（右）には染色された細胞が検出されなかったが、Ｃｈａｒｉｏｔ−βＧａｌ（左）またはＲ８−βＧａｌ（中）を添加した場合には、Ｘ−Ｇａｌ染色による発色が認められた。
この結果より、変性βＧａｌはＲ８化することにより細胞内に導入可能で、かつ細胞内でリフォールディングされることが確認された。【０１１１】
同様の実験をＣＨＯ細胞で行い、リフォールディングに必要な時間（ＦＢＳ添加後の時間）を見積もった。予備検討から、２時間でもＸ−Ｇａｌ染色で陽性の細胞が認められていたが、４時間の方が明瞭な染色像が得られていた。そこで４時間と６時間の比較を行い、その結果を図１１に示した。いずれの場合にもＸ−Ｇａｌ染色による明瞭な発色が認められ、６時間以内にリフォールディングが完了されると考えられた。【０１１２】
以上から、Ｒ８ＣまたはＲ８Ｃ−ＣＲ８で不溶性蛋白質をＲ８化すると、蛋白質やペプチド（１分子内にＣｙｓを２残基以上もつ蛋白質、ペプチドについて）１分子につき複数分子のＲ８Ｃが結合し、ＰＢＳ等の生理的な溶媒中でも可溶性になること、かつＲ８化蛋白質やＲ８化ペプチドは容易に細胞内に導入されることが確認された。【０１１３】
これまでは、Ｒ８化蛋白質作製過程において、Ｒ８化反応の際、蛋白質とＲ８Ｃペプチドの混合モル比は１：１のみで行っていたが、それがＲ８化する為に効率のよい比率であるのか判断は出来ていなかった。また、不溶性の組換え蛋白質でもＲ８化が行えることを確認する目的で、組換え型ヒトＰｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＰＡＰ）及び、組換え型マウスＴｙｒｏｓｉｎａｓｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２（ＴＲＰ−２）を作製することとした。
【実施例６】
【０１１４】
＜組換え型ヒトＰＡＰ蛋白質の作製＞
１）ＰＡＰ  ｃＤＮＡのクローニング
ＬＮｃａｐ細胞株（ヒト前立腺がん）からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製し、ｏｌｉｇｏ  ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡの鋳型を調製した。このｃＤＮＡと配列番号３および４に記載の合成ＤＮＡオリゴマーを用いてＰＣＲ反応を行い、１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＳｐｈＩで消化し、ｐＱＥ３２ベクターのＢａｍＨＩとＳｐｈＩサイトに挿入し、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。コロニーＰＣＲにより１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が挿入されているクローンを選択した後、シークエンスを確認し、全長ＰＡＰ  ｃＤＮＡ（配列番号５）が挿入されているクローンをｐＱＥ／ＰＡＰとした。【０１１５】
５’−ＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＣＡＴＧＡＧＡＧＣＴＧＣＡＣ−３’（ｈＰＡＰ／Ｆ；配列番号３）
５’−ＴＡＡＧＣＡＴＧＣＡＣＡＣＴＡＡＴＣＴＧＴＡＣＴＧＴＣＣ−３’（ｈＰＡＰ／Ｒ；配列番号４）【０１１６】
２）ＰＡＰ発現プラスミドの構築
ｐＱＥ３２／ＰＡＰを鋳型にＰＣＲを行い、再びＰＡＰ  ｃＤＮＡの断片を得た。また、それとは別にユビキチン（以下、Ｕｂとも記す）ｃＤＮＡ断片として配列番号６のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを単離した。これらのｃＤＮＡ断片をｐＥＴ１９ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入し、Ｈｉｓ  ｔａｇ−Ｕｂ−ＰＡＰというユビキチン融合型組換え蛋白質（ｒＵｂ−ＰＡＰ；配列番号７）を発現するプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ１９ｂ／Ｕｂ−ＰＡＰ）を構築した。また同様にユビキチン断片が融合していないＨｉｓ  ｔａｇ−ＰＡＰという組換え蛋白質（ｒＰＡＰ；配列番号８）を発現するプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ１９ｂ／ＰＡＰ）を構築した。ｒＵｂ−ＰＡＰとｒＰＡＰのアミノ酸配列中には、夫々６残基のシステインが含まれている。ユビキチン断片のアミノ酸配列中にはシステインは含まれていない。【０１１７】
３）ｒＵｂ−ＰＡＰとｒＰＡＰの発現
ｐＥＴ１９ｂ／Ｕｂ−ＰＡＰ若しくはｐＥＴ１９ｂ／ＰＡＰ夫々で大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を形質転換し、各々の組換え大腸菌を作製した。
各組換え大腸菌を４クローンずつ選択し、小スケールの５０μｇ／ｍＬアンピシリン（Ａｍｐ）と１２．５μｇ／ｍＬテトラサイクリン（Ｔｅｔ）を含むＬＢ培地で培養し、ＩＰＴＧ添加で組換え蛋白質の誘導を試みた。夫々の組換え大腸菌から最も発現量の多いクローンを選択し、グリセロールストック（マスターストック）を作製した。各々の組換え蛋白質が発現していることは、抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社、＃ＯＢ０５）と抗ＰＡＰ抗体（Ｓｉｇｍａ社、Ｃｌｏｎｅ：ＰＡＰ−１２、＃Ｐ５６８７）を用いたウエスタンブロッティングで確認した。
各組換え体マスターストックを５０μｇ／ｍＬ  Ａｍｐと１５μｇ／ｍＬ  Ｔｅｔを含むＬＢ培地１００ｍＬで培養し、ＯＤが０．１になるように６００ｍＬの同培地に植菌した。ＯＤが０．５から０．６の間で終濃度が０．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、３時間の発現誘導を行った。
回収した大腸菌をＰＢＳに懸濁させ、超音波で破砕した後、１５，１００×ｇ、４℃、１時間の遠心分離（以下、遠心）を行い、上清と沈殿に分画した。両分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ、ｒＵｂ−ＰＡＰとｒＰＡＰはいずれも沈殿画分に回収されていた。【０１１８】
４）ｒＵｂ−ＰＡＰとｒＰＡＰの精製
沈殿は、３Ｍ尿素／ＰＢＳに溶解し、１５，１００×ｇ、４℃、１時間の遠心を行い、上清と沈殿に分画した。沈殿を、更に８Ｍ尿素／ＰＢＳに溶解し、１５，１００×ｇ、４℃、１時間の遠心を行い、上清と沈殿に分画した。上清は、ＭＩＬＬＥＸ−ＨＶ  ＰＶＤＦ  ０．４５μｍ  ３３ｍｍ（ミリポア社、＃ＳＬＨＶ０３３ＲＳ）を通した後、２０ｍＭイミダゾール含有８Ｍ尿素／ＰＢＳから５００ｍＭイミダゾール含有８Ｍ尿素／ＰＢＳ濃度勾配を利用したＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰニッケルカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、＃１７−５２４８−０２）を使って分画した。更に、６Ｍ尿素／ＰＢＳを利用したＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００  ＧＬゲルろ過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、＃１７−５１７２−０１）を使って分画した。以上の工程により、ｒＵｂ−ＰＡＰ蛋白質は２．１ｇの大腸菌から５２２０μｇを、ｒＰＡＰ蛋白質は３．０ｇの大腸菌から９７２μｇを、６Ｍ尿素／ＰＢＳに溶解している精製蛋白質として取得した。
【実施例７】
【０１１９】
＜Ｒ８化Ｕｂ−ＰＡＰとＲ８化ＰＡＰの作製＞
６Ｍ尿素／ＰＢＳに溶解している精製ｒＵｂ−ＰＡＰ蛋白質に、Ｒ８Ｃ−ＣＲ８をＲ８Ｃペプチドとしての混合モル比で１：１０から１：１００となるように加え（以降、混合モル比についてはＲ８Ｃペプチドとしての比率で記す）、室温で１時間反応させた後、各反応液の等容積をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した（図１２ａ）。その結果、還元条件下ではいずれの混合モル比でも同等のｒＵｂ−ＰＡＰのバンドが検出され、非還元条件下では混合モル比が高いほど高分子側にシフトしたバンドが高濃度で検出された。また、同じサンプルを用いて等電点電気泳動（ＩＥＦ）で解析を試みたところ、混合モル比が高いほど塩基性側にシフトしたバンドの割合が増加することが確認された（図１２ｂ）。以上より、Ｒ８化蛋白質を作製する為にはＲ８Ｃ−ＣＲ８の混合モル比を高くする方が効率がよいと判断された。【０１２０】
１：１００の混合モル比で反応させたＲ８化Ｕｂ−ＰＡＰをＰＢＳで透析し、遠心により上清（可溶性画分：Ｓ）と沈殿（不溶性画分：Ｐ）に分画した。沈殿は上清と等容積の２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を含まない２ｘＳＤＳサンプル処理液で溶解させた後、１／２ずつに分け、その片方には２−ＭＥを加えた。上清にも２−ＭＥ有無の２ｘＳＤＳサンプル処理液を夫々加え、共にＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ、ほとんどの蛋白質が可溶性画分に回収されていた。また非還元下で電気泳動した場合に、上清にはＲ８化によってシフトされたバンドが確認された（図１３）。この結果より、ｒＵｂ−ＰＡＰはＲ８化によって可溶性が付与されたと考えられた。
またｒＰＡＰについても同様に１：１００の混合モル比で作製したところ、遠心後、可溶性画分にほとんど回収された。可溶性画分に回収されたものをＲ８−Ｕｂ−ＰＡＰ若しくはＲ８−ＰＡＰとして以下の実験を行った。
【実施例８】
【０１２１】
＜Ｒ８−Ｕｂ−ＰＡＰ、Ｒ８−ＰＡＰの細胞導入＞
２×１０５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞（以下、ＣＨＯとも記す）あたり、Ｒ８−Ｕｂ−ＰＡＰをＰＡＰの重量で１５μｇ培養液中に添加し、３７℃で２時間静置することで導入を行った。その後ＰＢＳで３回洗浄し、セルスクレーパーで細胞を剥がし、ＰＢＳ懸濁液として回収した。回収した細胞は２ｘＳＤＳサンプル処理液で溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで蛋白質を分離して、抗ＰＡＰ抗体（ＰＡＰ−１２、ＳＩＧＭＡ、Ｐ−５６８７）によるＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。その結果、Ｒ８−Ｕｂ−ＰＡＰを加えていない細胞抽出液からはＵｂ−ＰＡＰのバンドは検出されず（Ｓｏｌ）、Ｒ８−Ｕｂ−ＰＡＰを加えたそれからはＵｂ−ＰＡＰのバンドが検出された（Ｒ８−Ｕｂ−ＰＡＰ）（図１４）。
【実施例９】
【０１２２】
＜Ｒ８化効率による細胞導入への影響＞
ｒＵｂ−ＰＡＰを使用した実験（実施例７）により、Ｒ８化蛋白質の作製に適したＲ８Ｃ−ＣＲ８との混合モル比が解ったが、それが細胞導入への効率に影響するかを確認することとした。この検討には、実験系を確立しておいたＯＶＡを利用した。【０１２３】
モル比において、ＯＶＡ：Ｒ８Ｃ＝１：１、１：１０、１：３０または１：１００となるように還元型変性ＯＶＡにＲ８Ｃ−ＣＲ８を加え、６Ｍ尿素／ＰＢＳ中で一時間反応させた。１：１及び１：１００で混合させたサンプルの反応液を反応前のＯＶＡ尿素溶液と共にＩＥＦで解析した。その結果１：１で僅かに塩基性側にシフトしたパターンが認められ、１：１００ではさらに塩基性側にシフトしたバンドが多数認められた（図１５ａ）。さらに各サンプルを回収後、１５，１００×ｇ、１時間、４℃で遠心し上清と沈殿に分画した。沈殿は上清と等容積の２ｘＳＤＳサンプル処理液で溶解させた。１：１００で反応させた上清と沈殿を等容積ずつＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ、ほとんどの蛋白質が可溶性画分に回収されていた（図１５ｂ）。
このように可溶性で回収された複合体をＲ８−ＯＶＡとして以下の実験で使用した。【０１２４】
２×１０５個のＣＨＯあたり、各反応比で作製したＲ８−ＯＶＡをＯＶＡの重量で３μｇずつ、または天然ＯＶＡ（ＩｍｍｕｎｏＯ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社、＃９５０５１）をＰＢＳで溶解させたもの（Ｎａｔｉｖｅ  ＯＶＡ）を同量培養液中に添加し３７℃で２時間静置することで導入を試みた。その後ＰＢＳで３回洗浄し、セルスクレーパーで細胞を剥がし、ＰＢＳ懸濁液として回収した。この細胞懸濁液を１，０００×ｇ、５分間、４℃で遠心し、沈殿として回収した。回収した細胞は２ｘＳＤＳサンプル処理液で溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで蛋白質を分離して、抗ＯＶＡ抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。その結果、ＮａｔｉｖｅではＯＶＡのバンドは検出されず、Ｒ８−ＯＶＡではＲ８Ｃの混合モル比を高くする程、導入効率が高まることが確認された（図１６）。
【実施例１０】
【０１２５】
＜細胞内ＯＶＡの共焦点顕微鏡による確認＞
実施例８と同様に３７℃（ＣＯ２インキュベータ内）と４℃（冷蔵庫内）の条件で、培養ＣＨＯ細胞にＮａｔｉｖｅ  ＯＶＡまたはＲ８−ＯＶＡ（混合モル比１：１００）の導入を行った。導入した後、洗浄操作を行い、その後、細胞を１０％パラホルムアルデヒド、０．０１％グルタルアルデヒドＰＢＳ溶液で固定した。その後１０ｍＭグリシンを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｇ）で２回洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳの処理を室温で５分間行った。その後ＰＢＳ−Ｇで３回洗浄し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（３７５３５  Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を加えて３０分間静置することで、抗体反応の為のブロッキングを行った。ブロッキング後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで一回洗浄し、抗ＯＶＡ抗体（６Ｃ８、ａｂｃａｍ、＃ａｂ１７２９３）を加えて室温で６０分間静置した。洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、＃Ａ１１００１）を加えて室温で６０分間静置した。洗浄後、スライドガラス上にカバーガラスを使用し細胞を封入してプレパラートを作製した。【０１２６】
これらのプレパラートを蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社、＃ＩＸ７１）で、可視光（Ｖｉｓｉｂｌｅ）及びＵＶ照射による撮影を行った。図１７に示したように、３７℃でＯＶＡを添加しなかった標本（Ｆ−１０）とＮａｔｉｖｅ  ＯＶＡを添加した標本（ＯＶＡ）では、ＵＶ照射による蛍光は観察されなかった。一方、Ｒ８−ＯＶＡを添加した標本では、明らかな蛍光が観察された。また、ＵＶ撮影で蛍光が観察されたＲ８−ＯＶＡの標本中の一細胞を共焦点顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社、ＦＬＵＯＶＩＥＷ  ＦＵ１０ｉ）で撮影したところ、細胞内に蛍光が観察され、Ｒ８化によって確実に細胞内に導入されていることが確認された（表中、Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅと記す）。同様に、４℃でＲ８−ＯＶＡを導入した場合の撮影像を図１８に示した。３７℃で導入した場合とほとんど同様な結果が得られたが、ＵＶ照射で撮影したときに４℃の方が細胞質へ拡散している蛍光が多く観察され、ＯＶＡが細胞質内へ移行していることが確認された。【０１２７】
導入する蛋白質が抗原である場合には、導入された抗原蛋白質は、細胞質内へ移行することにより、ＭＨＣクラスＩの抗原提示経路にのるため、抗原特異的なＣＴＬの誘導効率の向上が見込まれる。
また、導入した蛋白質が細胞内で機能することを目的とした場合でも、導入した蛋白質が細胞質内へ移行することが重要である。
従って、蛋白質を導入する場合には３７℃よりも低い温度、好ましくは室温（２５度）以下、より好ましくは４℃で導入することが望ましい。細胞質への移行と温度の関係については、先行技術文献（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６，５８３６−５８４０，２００１、及びＢｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ４０３，  ３３５−３４２，  ２００７）の報告と同様であり、本技術についても４℃だけでなく室温においても反応を行うことができることが推察される。
【実施例１１】
【０１２８】
＜マウスｒＴＲＰ−２蛋白質及びｒＵｂ−ＴＲＰ−２の作製＞
不溶性蛋白質として組換え型マウスＴｙｒｏｓｉｎａｓｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２（以下、ＴＲＰ−２とも記す）を用いて、Ｒ８化による可溶化方法の検討を行った。
先ず、組換え型マウスＴＲＰ−２（ｒＴＲＰ−２；配列番号９）を作製した。ｒＴＲＰ−２はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースのＡＣ  Ｎｏ．Ｐ２９８１２に記載のアミノ酸配列に基づき、Ｎ末端から５６残基目のグルタミン酸（Ｅ）から４７２残基目のセリン（Ｓ）までをコードするｃＤＮＡを単離し、ｐＥＴ１９ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入し発現プラスミドとした（ｐＥＴ１９ｂ／ｍｄＴ）。このｒＴＲＰ−２のアミノ酸配列中には１２個のシステインが含まれている。ｐＥＴ１９ｂ／ｍｄＴで大腸菌（Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ：Ｎｏｖａｇｅｎ社、＃７１３５２−３）を形質転換し、発現させるとＮ末端にヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を有する組換え蛋白質が得られる。この組換え蛋白質は大腸菌内でインクルージョンボディ（封入体）を形成し、不溶性であった。【０１２９】
この不溶性画分を８Ｍ尿素／ＰＢＳ／５ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨ８．５）または、８Ｍ尿素／ＰＢＳ／１０ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨ８．０）に溶解させ、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  液体クロマトグラフィーシステム（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｓｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、ニッケルアフィニィティー（Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  ＨＰカラム、ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｓｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ、＃１７−５２４７−０１）とゲルろ過クロマトマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ  ２６／６０Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００  ＨＲカラム、ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｓｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ、＃１７−１１９６−０１）で部分精製を行った。精製したサンプルの溶媒を生理的な緩衝液に置換する為ＰＢＳで透析したが、遠心後、ほぼ全量が沈殿した。【０１３０】
次に、Ｎ末端にヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）が付加された、ユビキチン断片とＴＲＰ−２からなる組換え型融合蛋白質（以下、ＵＴとも記す）を作製した。Ｕｂは配列番号６のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを単離、ＴＲＰ−２はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースのＡＣ  Ｎｏ．Ｐ２９８１２に記載のアミノ酸配列に基づき、Ｎ末端から５６残基目のグルタミン酸（Ｅ）から４７２残基目のセリン（Ｓ）までをコードするｃＤＮＡを単離し、ｐＥＴ１９ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入して発現プラスミドとした（ｐＥＴ１９ｂ／ＵＴ）。ｐＥＴ１９ｂ／ＵＴで大腸菌（Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ：Ｎｏｖａｇｅｎ社、＃７１３５２−３）を形質転換し、組換え蛋白質を発現させた場合、ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｕｂｉ−ＴＲＰ−２−ＣＯ２Ｈという配列（配列番号１０）の融合蛋白質（ｒＵｂ−ＴＲＰ−２、ＵＴ蛋白質）が産生されるが、インクルージョンボディ（封入体）を形成し不溶性であった。【０１３１】
ｒＵｂ−ＴＲＰ−２を発現させた大腸菌を、プロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、Ｒｏｃｈｅ社、＃０４  ６９３  １３２  ００１）を添加したＰＢＳに懸濁させ、超音波装置で破壊した後、Ｍ−Ｘ１００遠心機、ＴＭＰ−１１ローター（ＴＯＭＹ）で１５，１００×ｇ、４℃、１時間の遠心分離を行った。遠心分離後の不溶性画分（沈殿）を４Ｍ尿素／ＰＢＳに懸濁させ、１時間室温で撹拌し、１５，１００×ｇ、４℃、１時間の遠心分離を行った。
この遠心分離後の不溶性画分（沈殿）を
１）８Ｍ尿素／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ＤＴＴ／２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）に溶解し、
２）ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  液体クロマトグラフィーシステム（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｓｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、ニッケルアフィニィティー（Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  ＨＰカラム、ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｓｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ、＃１７−５２４７−０１）と、
３）６Ｍ尿素／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ＤＴＴ／２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）を使用して、ゲルろ過クロマトマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２  ＨＲカラム、ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｓｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ、＃１７−０５３８−０１）で組換え蛋白質の部分精製を行った。精製したサンプルの溶媒を生理的な緩衝液に置換する為ＰＢＳで透析したが、遠心後、ほぼ全量が沈殿した。
【実施例１２】
【０１３２】
＜ｒＴＲＰ−２とｒＵｂ−ＴＲＰ−２のＲ８化＞
ｒＴＲＰ−２とｒＵｂ−ＴＲＰ−２のアミノ酸配列中には、夫々１２残基のシステインが含まれている。
ゲルろ過精製後の６Ｍ尿素に溶解しているサンプルの蛋白濃度をブラッドフォード法で定量したところ、ｒＴＲＰ−２は４５２μｇ／ｍＬでｒＵｂ−ＴＲＰ−２は２１７μｇ／ｍＬであった。これらのＡ２８０ｎｍを測定した後、５ｍＭになるようにＤＴＴを添加して１時間反応後、６Ｍ尿素／ＰＢＳで透析を行い、未反応のＤＴＴを除いた。そこにＲ８Ｃ−ＣＲ８を蛋白質：Ｒ８Ｃ＝１：５０のモル比となるように加え、一時間反応させたのち、実施例７と同様に透析、遠心を行った。上清（可溶性画分：Ｓ）と沈殿（不溶性画分：Ｐ）を分画し、上清のＡ２８０ｎｍから蛋白濃度を見積もったところ、Ｒ８−ＴＲＰ−２は２００μｇ／ｍＬで、Ｒ８−Ｕｂ−ＴＲＰ−２は１７２μｇ／ｍＬであった。各画分の等容積をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果、いずれの蛋白質においても明らかに可溶性画分に回収される蛋白質の方が多く（図１９ａ）、Ｒ８化によって可溶性が付与されたことが確認された。またＲ８−ＴＲＰ−２をＩＥＦで解析したところ、塩基性側にシフトしたバンドが確認された（図１９ｂ）。
【実施例１３】
【０１３３】
＜ＴＲＰ−２蛋白質導入の確認＞
２×１０５個のＣＨＯあたり、Ｒ８−Ｕｂ−ＴＲＰ−２及びＲ８−ＴＲＰ−２をＴＲＰ−２の重量で１０μｇ、または溶媒のみを等容積で培養液中に添加し４℃で２時間静置することで導入を試みた。その後ＰＢＳで３回洗浄し、セルスクレーパーで細胞を剥がし、ＰＢＳ懸濁液として回収した。この細胞懸濁液を１，０００×ｇ、５分間、４℃で遠心し、沈殿として回収した。回収した細胞は２ｘＳＤＳサンプル処理液で溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで蛋白質を分離して、抗ＴＲＰ−２抗体（ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、ａｂｃａｍ社、＃ａｂ７４０７３）によるＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。またこの時、抗原の陽性対象として６Ｍ尿素／ＰＢＳに溶解しているｒＵｂ−ＴＲＰ−２を同時に電気泳動させた。その結果、溶媒のみ（Ｓｏｌ）ではＴＲＰ−２由来のバンドは検出されず、陽性対照ではＵｂ−ＴＲＰ−２のバンドが、Ｒ８−Ｕｂ−ＴＲＰ−２を添加した場合にはＵｂ−ＴＲＰ−２のバンドが、Ｒ８−ＴＲＰ−２を添加した場合にはＴＲＰ−２のバンドが検出された（図２０）。本実験の結果から、マウスＴＲＰ−２でもＲ８化することによって、効率よく細胞に導入されると考えられた。
【実施例１４】
【０１３４】
蛋白質をＲ８化する際のＲ８ＣモノマーとＲ８Ｃダイマー（Ｒ８Ｃ−ＣＲ８）の効果を比較するため、実施例３と同様の実験を行った。２ｍｇ／ｍＬで６Ｍ尿素−ＰＢＳに溶解しているＯＶＡに終濃度１０ｍＭのＤＴＴを加え室温で一時間静置した後、６Ｍ尿素−ＰＢＳで透析した。回収したサンプルを遠心し、上清を以下の実験に用いた。【０１３５】
変性ＯＶＡ溶液にＲ８ＣペプチドまたはＲ８Ｃ−ＣＲ８を混合モル比で、ＯＶＡ：Ｒ８Ｃペプチド＝１：５０となるように添加し（Ｒ８Ｃ−ＣＲ８はＲ８Ｃペプチドの量として５０となるように添加した）、室温で一時間静置した後、ＰＢＳで透析してサンプルを回収した。回収したサンプルについてＯＤ５００ｎｍで濁度を測定し、沈殿の割合を比較した。その後遠心を行い、回収した上清のＡ２８０ｎｍを測定した。Ｒ８Ｃペプチドのみを添加した場合では、ＯＤ５００ｎｍが０．５８４であり、大量の沈殿が確認された。また上清のＡ２８０ｎｍは０であった。一方、Ｒ８Ｃ−ＣＲ８を添加した場合には肉眼で沈殿は観察されず、ＯＤ５００ｎｍは０であった。また回収した上清のＡ２８０ｎｍは０．１６９であった（表６）。【０１３６】
従って、Ｒ８Ｃ−ＣＲ８のみの添加でＲ８化は可能であり、Ｒ８Ｃモノマーのみの添加よりも好ましいと判断された。【０１３７】
【表６】
2010150708.tif 000007
【実施例１５】
【０１３８】
＜細胞導入におけるＲ８と蛋白質の共有結合の重要性＞
Ｒ８化蛋白質を細胞内に取り込ませる際に、遊離状態で存在しているＲ８Ｃ−ＣＲ８が導入効率に影響を及ぼすか確認する為、Ｒ８Ｃまたは、Ｒ８Ｃ−ＣＲ８と蛋白質を混合させ、細胞導入を試みた。【０１３９】
ＰＢＳ中でＯＶＡ：Ｒ８Ｃ＝１：１または１：１００となるように天然ＯＶＡにＲ８ＣまたはＲ８Ｃ−ＣＲ８を混合した。これらの混合液、若しくはＯＶＡ：Ｒ８Ｃ＝１：１または１：１００の混合モル比で作製したＲ８−ＯＶＡ、または天然ＯＶＡを２×１０５個のＣＨＯあたり、ＯＶＡの重量で３μｇを培養液中に添加し３７℃で２時間静置することで導入を試みた。その後ＰＢＳで３回洗浄し、セルスクレーパーで細胞を剥がし、ＰＢＳ懸濁液として回収した。この細胞懸濁液を１，０００×ｇ、５分間、４℃で遠心し、沈殿として回収した。回収した細胞は２ｘＳＤＳサンプル処理液で溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで蛋白質を分離して、抗ＯＶＡ抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。その結果、Ｒ８−ＯＶＡ以外のＲ８Ｃと共有結合していないＯＶＡは、細胞内に取り込まれないことが解った（図２１）。また、この結果から、細胞にＲ８−ＯＶＡを導入する際に、遊離しているＲ８Ｃ−ＣＲ８が存在していても阻害は起こらないと判断された。
以上のことから、Ｒ８Ｃペプチドを蛋白質に共有結合させるには蛋白質を還元型に変性させておき、Ｒ８Ｃ−ＣＲ８で反応させてジスルフィド結合を形成させるのが好ましく、また蛋白質とＲ８Ｃの間でジスフィド結合（共有結合）を形成させることにより、効率のよい細胞導入が行い得ると考察される。
【実施例１６】
【０１４０】
＜Ｒ８−ＴＲＰ−２導入樹状細胞の抗腫瘍免疫誘導能＞
８週齢で購入したＣ５７ＢＬ／６の雄をＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｆｒｅｅ）環境で飼育しておき、９週目以降に骨髄細胞を採取した。採取した骨髄細胞をＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、０８７−０１１２ＤＫ）培地で培養用フラスコに播種し、１０ｎｇ／ｍＬマウスＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、＃２１４−１４）と２０ｎｇ／ｍＬマウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、＃３１５−０３）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養開始から３日後、新鮮な同培地を等容積加えた。その後一日おきに半量の培地交換を行った。培養を開始してから９日目に０．２％正常Ｃ５７ＢＬ／６血清を含んだ培地に交換し、ＬＰＳを１．０μｇ／ｍＬになるよう加えた。さらに一日培養し、浮遊した細胞を成熟ＤＣとして使用した。回収したＤＣは毎回ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現量を確認した。【０１４１】
ＤＣを無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁させ、２×１０６個あたりＴＲＰ−２の重量で１００μｇのＲ８−ＴＲＰ−２、若しくは等容積の溶媒を添加した。添加後４℃で２時間静置することで導入を行った。また陽性対象としては、４×１０６個のＤＣをＡＩＭ−Ｖ培地４ｍＬに懸濁させ、ＴＲＰ−２ペプチド（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）を１．０μｇ／ｍＬになるように添加して６時間培養を行った。これら抗原蛋白質導入ＤＣおよびペプチドパルスＤＣを０．２％正常Ｃ５７ＢＬ／６血清を含んだＰＢＳで洗浄し、夫々１×１０６個／マウスで腹腔投与した。この操作を一週間ごと計３回行うことで、一群１匹から２匹ずつのマウスを免疫した。【０１４２】
最終投与の一週間後に全マウスから脾細胞を回収し、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ−１６４０コンプリート培地に懸濁し、終濃度１０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、３０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ、及びＴＲＰ−２ペプチドを１．０μｇ／ｍＬになるように添加して３日間培養することで、ペプチドによる再刺激を行った（図２２のＮｏｒｍａｌ、ＤＣ  ａｌｏｎｅにはペプチドを添加していない）。培養後の脾細胞を用いて、Ｈ−２Ｋｂ  ＴＲＰ−２テトラマー  −ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ−（ＭＢＬ、＃ＴＳ−５００４−１）と抗ＣＤ８ａ抗体−ＦＩＴＣ、Ｃｌｏｎｅ  ５３−６．７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃５５３０３０）によるＣＴＬの検出を試みた。この時、テトラマーの陰性対象としてＨ−２Ｋｂ  ＯＶＡテトラマー  −ＳＩＩＮＦＥＫＬ−（ＢＣＩ，＃ＴＳ−５００１−１）を、アイソタイプコントロールとしてＲａｔ  ＩｇＧ２ａ，ｋ  ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｃｌｏｎｅ  Ｒ３５−９５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃５５３９２９）を使用した。また脾細胞の陰性対象として、ＤＣ投与をなされていないマウス由来脾細胞も使用した。【０１４３】
その結果、いずれのマウス由来脾細胞でもＯＶＡテトラマー陽性のＣＤ８＋細胞は検出されなかった。またＴＲＰ−２テトラマーを用いたフローサイトメーターの解析結果を図２２ａに、その結果を統計的に処理したものを図２２ｂに示した（エラーバーはＳＤ）。【０１４４】
ＤＣを投与されていないマウス由来脾細胞（Ｎｏｒｍａｌ）でも０．１３％のテトラマー陽性のＣＤ８＋細胞が検出された。これはもともとマウス体内にＴＲＰ−２を認識するＣＴＬプレカーサーが存在していることを示すものと考えられた。抗原をパルスしていないＤＣを投与したマウス由来脾細胞（ＤＣ  ａｌｏｎｅ）では、Ｎｏｒｍａｌより１．４３％多いテトラマー陽性のＣＤ８＋細胞が検出された。この効果は、ＤＣから産生されるサイトカインによる非特異的な効果と考えられた。ペプチドパルスＤＣを投与したマウス由来脾細胞（ｐｅｐｔｉｄｅ）では、ＤＣ  ａｌｏｎｅより平均で０．３６％多いテトラマー陽性のＣＤ８＋細胞が検出され、この効果がペプチド特異的な抗原刺激によるものと考えられた。Ｒ８−ＴＲＰ−２導入ＤＣを投与したマウス由来脾細胞（Ｒ８−ＴＲＰ−２）では、ｐｅｐｔｉｄｅより平均で２．６７％多いテトラマー陽性のＣＤ８＋細胞が検出され、この効果はｐｅｐｔｉｄｅによるＣＴＬ誘導効率と比較して有意（Ｐ＝０．０３９）に増強されていた。エピトープの量として考えた場合、ＤＣに導入されたＴＲＰ−２蛋白質の１００μｇ中に含まれるＳＶＹＤＦＦＶＷＬエピトープは、ＤＣにパルスされた２μｇのペプチドと同量であるにも関わらず、ＴＲＰ−２蛋白質を導入したほうがＣＴＬ誘導効率は高かった。【０１４５】
以上の結果から、Ｒ８化することにより不溶性の抗原蛋白質を可溶化することができ、培地にＲ８化した抗原蛋白質を添加するだけで、ＤＣへ抗原蛋白質を導入できることが明らかとなった。このように調製した抗原蛋白質導入ＤＣは、ペプチドパルスＤＣよりもＣＴＬ誘導効果が高く、この機構として体内におけるヘルパーＴ細胞への刺激も加わったものと理解される。そのため、従来法よりも強力な抗腫瘍免疫を宿主に与えることが可能になると判断された。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明の蛋白質の修飾剤を用いることにより、不溶性蛋白質を含む様々な蛋白質を効率よく細胞内に導入することができる。本発明を利用することで、がん、ウイルス感染や細胞内に感染することで発症する疾病のワクチンの製造、樹状細胞ワクチンの作製、抗原特異的ＣＴＬの誘導、ｉＰＳ細胞への誘導、ｉＰＳ、ＥＳ（Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  Ｓｔｅｍ）細胞またはＥＣ（Ｅｍｂｙｏｎａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）から様々な細胞の分化誘導を行うことが考えられる。また、蛋白質可溶化試薬、蛋白質可溶化キット、蛋白質の細胞内導入試薬、及び蛋白質の細胞内導入キットの製造に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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