(57)【要約】  エンドセリン活性抑制剤を含む、ＳＩＲＳ処置用医薬組成物並びに強毒性インフルエンザ処置用医薬組成物を提供する。エンドセリン活性抑制剤としては、ＡＬＳＶＤ(Ｘ)Ｙ(Ｘ)ＡＶＡＳ（式中、Ｘはいずれかのアミノ酸を示す）の配列を有するもの、特にＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＳＲＶＩ−ＮＨ2の配列を有するものが好適に用いられる。本発明の医薬組成物は、ゼプシス、敗血症を含むＳＩＲＳを発症している患者およびＳＩＲＳを発症することが予測される状況にある患者、強毒性インフルエンザに感染している患者、並びに強毒性インフルエンザに感染する可能性が高い患者において有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドセリン活性抑制剤を含む、ＳＩＲＳ処置用医薬組成物。
【請求項２】
エンドセリン活性抑制剤が、エンドセリン−１の活性を抑制する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
エンドセリン活性抑制剤が、
ＡＬＳＶＤ(Ｘ)Ｙ(Ｘ)ＡＶＡＳ  （配列番号１０）
（式中、Ｘはいずれかのアミノ酸を示す）
のアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
エンドセリン活性抑制剤が、配列番号４〜９および１１〜１８何れかに記載のペプチドである、請求項２記載の組成物。
【請求項５】
エンドセリン活性抑制剤が、配列番号１１記載のペプチドである、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
ＳＩＲＳがゼプシスである、請求項１〜５何れかに記載の組成物。
【請求項７】
ＳＩＲＳが強毒性インフルエンザウイルス感染に起因するものである、請求項１〜５何れかに記載の組成物。
【請求項８】
強毒性インフルエンザウイルスがＨ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスである、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
ヒトの処置に用いられる、請求項１〜８何れかに記載の組成物。
【請求項１０】
鳥類の処置に用いられる、請求項１〜８何れかに記載の組成物。
【請求項１１】
エンドセリン活性抑制剤を含む、強毒性インフルエンザウイルス感染症処置用組成物。
【請求項１２】
エンドセリン活性抑制剤が、エンドセリン−１の活性を抑制する、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
エンドセリン活性抑制剤が、
ＡＬＳＶＤ(Ｘ)Ｙ(Ｘ)ＡＶＡＳ  （配列番号１０）
（式中、Ｘはいずれかのアミノ酸を示す）
のアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１１記載の組成物。
【請求項１４】
エンドセリン活性抑制剤が、配列番号４〜９および１１〜１８何れかに記載のペプチドである、請求項１１記載の組成物。
【請求項１５】
エンドセリン活性抑制剤が、配列番号１１記載のペプチドである、請求項１１記載の組成物。
【請求項１６】
強毒性インフルエンザウイルスがＨ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスである、請求項１１〜１５何れかに記載の組成物。
【請求項１７】
鳥類を処置するためのものである、請求項１１〜１６何れかに記載の組成物。
【請求項１８】
ヒトを処置するためのものである、請求項１１〜１６何れかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＩＲＳ処置のための組成物に関する。本発明はまた、強毒性インフルエンザ感染症、特にＨ５Ｎ１トリインフルエンザ感染症処置のための組成物に関する。本発明はさらに、ＳＩＲＳ並びに強毒性インフルエンザ感染症の処置のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゼプシスを含む全身性炎症反応症候群(ＳＩＲＳ) は、北米において毎年300,000名の患者の死因である致死的な疾患であり、いまだに有効な治療剤が存在しない。米国では年間７５万人にゼプシスが発症し、２２万人が死亡しているが特効救命薬がない。活性化プロテインC（APC)を用いても３０％の死亡率を２４％に改善できるに過ぎない。ゼプシスでは既に体内に病原細菌が増加しており、抗生物質で細菌を抑制しても菌体内毒素（LPS）を取り除くことは出来ず、抗生物質投与とヘパリンやステロイドなどの対症療法での治療にとどまっているのが現状である。【０００３】
ゼプシスは全身性炎症反応症候群(ＳＩＲＳ)の一種であり、ＳＩＲＳは播種性血管内凝固(DIC)および多臓器不全 (MOF)を引き起こし、これらは非常に致死的である。補体の第５成分(C5) から補体活性化の際に生じるC5 コンバターゼによって放出される74-アミノ酸ペプチドのC5a アナフィラトキシンのＳＩＲＳにおける中心的役割が提唱されている(非特許文献１および２)。【０００４】
ここで本発明者らが先に公表したC5aのアミノ酸37〜53(RAARISLGPRCIKAFTE)（配列番号１）は、C5a 受容体 (C5aR)のアンチセンスホモロジーボックス(AHB) ペプチド(非特許文献３)に対するアンチセンスペプチドであり、PL37と称されている(非特許文献４)。C5aのこの領域はC5aR 刺激のための可能性のある部位であると推定されている(非特許文献５)。本発明者らはコンピュータプログラム、MIMETIC (非特許文献６−８）を用いて、PL37に対する相補性ペプチドASGAPAPGPAGPLRPMF（配列番号２）を作成し、これがC5a アナフィラトキシンに結合し、補体に媒介される致死的なショックをラットにおいて防止することを確認し、PepAと名付けた(特許文献１、非特許文献９) 。特許文献１の系では、全身症状の発症誘導前にPepAまたはPepAのN-末端アラニンのアセチル化したペプチドであるAcPepA（配列番号３）を投与してゼプシスの発症そのものを予防的に抑えることに成功している。【０００５】
インフルエンザウイルスにはＡ、ＢおよびＣの３つの型がある。世界的な流行を起こし、多くの死者が出るのは主にＡ型である。Ａ型インフルエンザウイルスは更にウイルス表面のタンパク質であるヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼの抗原性により多くの亜型に分類される。これまでに少なくともＨＡに１６種類、ＮＡに９種類の変異が見つかっており、その組み合わせの数の亜型が存在し得る。これら亜型の違いはＨ１Ｎ１〜Ｈ１６Ｎ９といった略称で表現されている。【０００６】
インフルエンザウイルスは、ヒトを含む哺乳類および鳥類に感染する。従来は種の壁があるためヒトにはヒトインフルエンザ、鳥類にはトリインフルエンザのみが感染すると考えられてきたが、近年ヒトおよびトリの両方に感染するインフルエンザウイルスが出現している。これらの中で、特にＨ５Ｎ１は高病原性トリインフルエンザウイルスと呼ばれ（日本では家畜伝染病予防法で規定されている）、これに感染した場合は、ヒトおよびトリの両者で極めて致死率が高い。例えばＨ５Ｎ１トリインフルエンザに感染し、インフルエンザを発症するとニワトリは２日以内に死亡するといわれている。【０００７】
エンドセリンは、最初ブタ大動脈内皮細胞の培養上清から単離されたペプチドであり、前駆体から酵素で切断されて成熟ペプチドに変換されると強力な血管収縮作用を獲得する。これは既存の物質中最も強力な血管平滑筋収縮作用および血圧上昇作用であることが知られており、現在脚光を浴びている生理活性物質のひとつである。血管収縮作用だけではなく、強心作用、腎メサンギウム収縮作用など多岐にわたる生理作用を有することが報告されており、また、少なくとも３つのアイソフォーム（エンドセリン−１、エンドセリン−２、エンドセリン−３）が報告されている。
一方、エンドセリンレセプターとしてはエンドセリン−１に特異的なＡ型受容体とエンドセリンの３種のイソペプチドに対して非特異的なＢ型受容体の２種類が知られており、ｃＤＮＡのクローニングによりそのアミノ酸配列も推定されている。
しかし、かかる多岐にわたる生理活性を有するエンドセリンについては、ＳＩＲＳ並びに強毒性インフルエンザ感染症におけるその役割に関する報告は全く見当たらない。【０００８】
本発明者等は先にエンドセリン受容体Ａ型のアンチセンスホモロジーボックスペプチドを同定し（非特許文献３、特許文献２）、該ペプチドがエンドセリン受容体Ａ型を介して生じるエンドトキシンショック、出血性ショック等の炎症応答を減弱化し、ヒスタミン放出等の作用を抑制することを報告している。今回、発明者らは、鋭意検討した結果、エンドセリン活性抑制剤がＳＩＲＳ並びに強毒性インフルエンザ感染症の処置に極めて有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−２６９５２０号公報
【特許文献２】特許３９２３５１５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】J. Immunol. 172、6382-6387 (2004)
【非特許文献２】Immunopharmacology、38: 3-15(1997）
【非特許文献３】Nature Med. 1、894-901 (1995)
【非特許文献４】J. Immunol. 157、4591-4601 (1996)
【非特許文献５】Neuroscience  86、903-911 (1998)
【非特許文献６】Microbiol. Immunol. 46、211-215 (2002)
【非特許文献７】Biochem. Biophys. Res. Comm. 324, 236-240 (2004)
【非特許文献８】Microbiol. Immunol. 47、241-245 (2003)
【非特許文献９】J. Immunol. 172、6382-6387 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＳＩＲＳ処置のための医薬組成物を提供することを目的とする。本発明はまた、強毒性インフルエンザウイルス感染症の処置のための医薬組成物を提供することを目的とする。本発明は更に、強毒性インフルエンザウイルス感染症の処置並びにＳＩＲＳ処置のための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、エンドセリン活性抑制剤を含有する、ＳＩＲＳ処置のための医薬組成物を提供する。【００１３】
本発明はまた、エンドセリン活性抑制剤を含有する、強毒性インフルエンザウイルス感染症、例えば高病原性トリインフルエンザ感染症の処置のための医薬組成物を提供する。【００１４】
別の観点において、本発明はＳＩＲＳ処置の必要な患者へエンドセリン活性抑制剤の有効量を投与することを含む、ＳＩＲＳ処置方法を提供する。また、強毒性インフルエンザウイルス感染症の処置が必要な患者へエンドセリン活性抑制剤の有効量を投与することを含む、強毒性インフルエンザ感染症の処置方法を提供する。【００１５】
更に別の観点において、本発明はエンドセリン活性抑制剤の、ＳＩＲＳ処置のための医薬組成物の製造における使用を提供する。本発明はまた、エンドセリン活性抑制剤の、強毒性インフルエンザ感染症処置のための医薬組成物の製造における使用を提供する。【００１６】
本発明において、エンドセリン活性抑制剤としては特に限定されないが、配列表の配列番号４〜１８のペプチド、特に配列番号１１に記載のペプチドが好適に用いられる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の医薬組成物により、ＳＩＲＳ並びに強毒性インフルエンザウイルス感染症を効果的に処置することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１の結果を示すグラフである。
【図２】実施例２の生存期間を示すグラフである。ETR-P1/fl群（■）、CLP群（●）およびシャム群（点線）の生存期間を示す。平均生存期間はＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群はＣＬＰ群より有意に長かった：１８．９±２．３（ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ）対９．０±０．８（ＣＬＰ）ｐ＜０．００５， Mann-Whitney test。ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群の２匹（３３．３％）は２４時間の時点で生存していた。シャム群は全て２４時間生存した。
【図３Ａ】ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群（△）、ＣＬＰ群（●）およびシャム群（○）のＭＡＰ(Mean Arterial Pressure)比の変化を示す。６時間、９時間においてＭＡＰはＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群においてＣＬＰのみの群より有意に高い値を維持していた（ｐ＜０．０１）。図中、§：ｐ＜０．０５対シャム群、¶：ｐ＜０．０５対ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群、各値は平均±ＳＥＭにて示した。以下図３および図４において同じ記号を用いた。
【図３Ｂ】ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群（△）、ＣＬＰ群（●）およびシャム群（○）のｍＰＡＰ比の変化を示す。
【図３Ｃ】ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群（△）、ＣＬＰ群（●）およびシャム群（○）の心拍数（ＨＲ）の変化を示す。６時間、９時間において、ＣＬＰ群では他の群と比して有意に高い心拍数が認められた（ｐ＜０．０５）。
【図３Ｄ】ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群（△）、ＣＬＰ群（●）およびシャム群（○）のｍＰＡＰ／ＭＡＰ比の変化を示す。ｍＰＡＰ／ＭＡＰは９時間においてＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群では上昇しなかった。
【図４Ａ】ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群（△）、ＣＬＰ群（●）およびシャム群（○）の血清中のＴＮＦ−αレベルの変化を示す。
【図４Ｂ】ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群（△）、ＣＬＰ群（●）およびシャム群（○）の血清中のＨＭＧＢ−１量の変化を示す。
【図４Ｃ】ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群（△）、ＣＬＰ群（●）およびシャム群（○）の血清中のＮＯｘ量の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の医薬組成物において、エンドセリン活性抑制剤としては、エンドセリン−１の活性を抑制するものであればよく、より好ましくはエンドセリン受容体Ａ型を介するエンドセリン−１の作用を抑制するものであれば特に限定的ではない。
【００２０】
エンドセリンとエンドセリン受容体で拮抗する化合物として、ＥＰ−Ａ−５５２４８９、ＥＰ−Ａ−５２８３１２、ＥＰ−Ａ−４９９２６６、ＷＯ９１／１３０８９、ＥＰ−Ａ−４３６１８９、ＥＰ−Ａ−４５７１９５、ＥＰ−Ａ−５１０５２６、ＷＯ９２／１２９９１、特開平４−２８８０９９、特開平４−２４４０９７、特開平４−２６１１９８、ＥＰ−Ａ−４９６４５２、ＥＰ−Ａ−５２６７０８、ＥＰ−Ａ−５２６６４２、ＥＰ−Ａ−５１０５２６、ＥＰ−Ａ−４６０６７９、ＷＯ９２／２０７０６、ＥＰ−Ａ−６２６１７４、ＥＰ−Ａ−６５５４６３、ＥＰ−Ａ−７１４９０９、特開平７−１７３１６１などが提案されている。また、エンドセリン受容体、特にエンドセリン受容体Ａ型の拮抗作用を有する物質として、ボセンタン(bosentan)、シタキセンタン(sitaxsentan)、アンブリセンタン(ambrisentan)、アトラセンタン（atrasentan）、S-139、テゾセンタン(tezosentan)、BMS-193884、ドラウセンタン（drausentan）およびエントラセンタン(entrasentan)等の化合物が知られている。
【００２１】
本発明の医薬組成物において特に好適に用いられるのは、ヒトのエンドセリン前駆体のｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列とヒトのエンドセリンレセプターのｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列とを比較し、アミノ酸レベルでセンスアミノ酸・アンチセンスアミノ酸の対応関係で少なくとも８０％相補的な関係になっている部分のヒトエンドセリンレセプターのアミノ酸配列を含有するペプチド、その類縁体である。かかるペプチドとしては特許第３９２３５１５号に開示されており、特に下記アミノ酸配列を含有するペプチドが例示される：
Ｃ１：ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＳＲＶＩ（配列番号４）
Ｃ２：ＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＧＩＰＬＩＴＡＩＥＩ（配列番号５）
Ｃ３：ＱＧＩＧＩＰＬＩＴＡＩＥＩ（配列番号６）
Ｃ４：ＩＡＤＮＡＥＲＹＳＡＮＬＳＳＨＶ（配列番号７）
Ｃ５：ＦＬＧＴＴＬＲＰＰＮＬＡＬＰ（配列番号８）
Ｃ６：ＬＮＲＲＮＧＳＬＲＩＡＬＳＥＨＬＫＮＲＲＥＶＡ（配列番号９）
【００２２】
本願発明の医薬組成物において用いられる好ましいエンドセリン活性抑制剤としては、Ｃ１ペプチドの末端をアミド体としたペプチド、および当該末端アミド体の配列中、特定のアミノ酸のいずれか１つをグリシンで置換したペプチドが挙げられる。具体的には以下の配列が好適に用いられる：
Ｃ１１：ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＳＲＶＩ−ＮＨ2（配列番号１１）
Ｃ１２：ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＧＳＲＶＩ−ＮＨ2（配列番号１２）
Ｃ１３：ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＲＹＧＡＶＡＳＷＳＲＶＩ−ＮＨ2（配列番号１３）
Ｃ１４：ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＧＹＲＡＶＡＳＷＳＲＶＩ−ＮＨ2（配列番号１４）
Ｃ１５：ＶＬＮＬＧＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＳＲＶＩ−ＮＨ2（配列番号１５）
上記式および以下の式において、「−ＮＨ2」はＣ末端のカルボキシル基がアミド化された化合物を示す。また、Ｃ１ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端のアミノ酸を除去したペプチド、およびその配列中のアミノ酸の一部を置換したものも好適に用いられる。具体的には以下に示す配列が例示される。
Ｃ１６：ＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷ−ＮＨ２（配列番号１６）
Ｃ１７：ＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＣ−ＮＨ２（配列番号１７）但し、１位と１５位のシステインはジスルフィド結合を形成している。
Ｃ１８：ＶＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷ−ＮＨ２（配列番号１８）
【００２３】
上記Ｃ１〜６並びにＣ１１〜１８のペプチドはいずれも、エンドセリン−１によるマウス３Ｔ３細胞内カルシウムイオン濃度増加およびエンドセリン−１によるラット大動脈平滑筋血管収縮のいずれかの試験においてエンドセリン−１の作用を抑制することが確認されたものである（特許第３９２３５１５号）。
【００２４】
即ちこれらのペプチドの骨格となる配列：
ＡＬＳＶＤ（Ｘ）Ｙ（Ｘ）ＡＶＡＳＷ（配列番号１０）
（式中、Ｘはいずれかのアミノ酸を示す）
を含有するペプチドはエンドセリンの活性を抑制する効果を示し、本願において好適に用いられる。
【００２５】
本発明においては、特にＣ１１（配列番号１１）のペプチドが好適に用いられる。
【００２６】
本発明の医薬組成物の投与方法並びに投与経路は特に限定されないが、経腸または経口形態で、たとえば錠剤、糖衣錠、ゼラチンカプセル、乳剤、液剤または懸濁剤として、噴霧剤などの経鼻形態で、あるいは坐剤などの経直腸形態で、投与できる。本発明の医薬組成物はまた、注射剤として、静脈投与または筋肉内投与してもよい。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、エンドセリン活性抑制剤に加えて、塩、希釈剤、担体、バッファー、結合剤、界面活性剤、保存剤のような生理的に許容される他の成分を含有していてもよい。非経口的投与製剤は、滅菌水溶液又は生理学的に許容される溶媒との懸濁液アンプル、または生理学的に許容される希釈液で用時希釈して使用しうる滅菌粉末、例えばエンドセリン活性抑制剤がペプチドである場合には通常ペプチド溶液を凍結乾燥して得られる粉末、を含有するアンプルとして提供される。
【００２８】
本発明の医薬組成物の投与量としては限定的でなく、患者の年齢、体重、性別、症状、所望の効果等により適宜決定すればよい。
【００２９】
本発明の医薬組成物は、ＳＩＲＳの処置に好適に用いられる。
【００３０】
本明細書および請求の範囲において「ＳＩＲＳ（Systemic Inflammatory Response Syndrome」とは、過剰な炎症反応が全身性に起こり、炎症により種々の臓器障害を誘起する致命的な病態を意味する。「ＳＩＲＳ」は、米国において下記診断基準を満たす症状を示すものと定義づけられており、本明細書においてもかかる定義に従うものとする：
【００３１】
【表１】
2011004843.tif 000003
【００３２】
ＳＩＲＳと診断された病態のなかで感染症が原因となっているものがゼプシスあるいは敗血症であると診断される。感染症が原因であるか否かは病原微生物による感染巣の確認やＣＲＰの異常上昇（１０以上）により判定される。
【００３３】
本願明細書並びに請求の範囲において、「ＳＩＲＳの処置」とは、ＳＩＲＳの誘因となる菌血症、真菌血症、寄生虫血症、ウイルス血症、外傷、熱傷、膵炎、手術などの種々の侵襲を受けた患者においてＳＩＲＳの発症を予防すること、ＳＩＲＳ発症の程度を減弱化あるいはＳＩＲＳの発症による死亡を阻止することを含む。また、さらにＳＩＲＳの処置には既に上記診断基準によるＳＩＲＳが発症した患者において死亡を防止することを含む。
【００３４】
従って、本発明の医薬組成物は、ＳＩＲＳを発症している患者のみならず、ＳＩＲＳを発症することが予測される状況にある患者、具体的には、菌血症、真菌血症、寄生虫血症、ウイルス血症、外傷、熱傷、膵炎、手術などの種々の侵襲を受けている患者におけるＳＩＲＳの処置に好適に用いられる。また、強毒性インフルエンザウイルス感染症による死亡はＳＩＲＳを発症することによるものであることが知られている。従って、本発明の医薬組成物は、症状の発現の有無、その強弱を問わず強毒性インフルエンザウイルスに感染した患者の処置に好適に用いられる。
【００３５】
本発明はまた、強毒性インフルエンザウイルス感染症患者の処置に好適に用いられる。ここで「強毒性インフルエンザウイルス感染症」とは、インフルエンザ感染によりＳＩＲＳを発症して死亡する可能性が高いことが知られているインフルエンザウイルスによる感染症を意味する。かかるインフルエンザウイルスとして、現在知られているものではＨ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスがあるが、該ウイルス、あるいはその他のウイルスが突然変異により強毒性となったものいずれも含むものとする。
【００３６】
本発明の医薬組成物は、症状の発現の前後を問わず、強毒性インフルエンザウイルスに感染している患者、あるいは該感染の疑われる患者の処置に有用である。「強毒性インフルエンザウイルス感染症の処置」とは、強毒性インフルエンザウイルスに起因する症状の発症の抑制、発症する症状の軽減化並びに既に発症した場合の症状の治療のいずれをも含むものとする。さらに、本発明においては、強毒性インフルエンザウイルスに起因する重篤な肺炎やＳＩＲＳ症状が既に発症した患者を死から救うためにも好適に用いられる。
【００３７】
本発明の医薬組成物は強毒性インフルエンザウイルス、例えばＨ５Ｎ1トリインフルエンザウイルス感染症に感染した鳥類の治療並びに感染拡大防止のために有効に用いることができる。例えば、鶏舎内でインフルエンザウイルスに感染した鶏が発生した場合に、該感染鶏へ本発明の医薬組成物を投与することによって治癒させて感染拡大を防ぐことができる。また、感染鶏が生じた同一鶏舎や近隣の鶏舎に飼われている鶏に予め本発明の医薬組成物を投与することにより、インフルエンザウイルス感染拡大を防ぐことができる。
【００３８】
本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
使用ペプチド：
エンドセリン活性抑制剤ＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１
ＶＬＮＬＣＡＬＳＶＤＲＹＲＡＶＡＳＷＳＲＶＩ−ＮＨ2（配列番号１１）
AcePepA（参考）：
ＡＳＧＡＰＡＰＧＰＡＧＰＬＲＰＭＦ（配列番号３）N末端アセチル化
アナフィラトキシンＣ５ａ不活化ペプチド。ヒトＣ５ａのアミノ酸３７−５３位をターゲットとして得られたアンチセンスペプチドであり、ゼプシスショックを抑制する作用を有する（特開２００４−２６９５２０およびMol. Immunol. 45:4113(2008))。
【実施例１】
【００３９】
新生仔ブタ腹膜炎モデルにおけるETR-P1/f1の作用（１）
実際のゼプシス感染病態に近い、新生仔ブタ腹膜炎モデルにおいて本発明の医薬組成物の効果を確認した。
新生仔ブタを吸入麻酔下で開腹し、回盲部を桔札して１８ゲージの注射針で孔を開け糞便が漏れ出るようにしたあと腸管を腹腔内に戻し、腹壁を縫合した。この処置はCLP (Cecal Ligation and Puncture) と呼ばれる腹膜炎モデルであり、ＣＬＰを施された新生仔ブタは全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ:Systemic Inflammatory Response Syndrome）を起こして死亡する。
このＣＬＰ処置３０分後から０．０５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの量のＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌを静脈内に連続投与した。シャム手術群、ＣＬＰ手術群およびＣＬＰ手術後ＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１投与群それぞれの生存期間を調べた。なお、全動物は２４時間後に安楽死させた。試験は無処置群８頭、ＣＬＰ手術群１０頭、ＣＬＰ手術後ＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１投与群７頭にて行った。結果を図１に示す。
ＣＬＰ手術のみ実施した群では１８時間までに全例が死亡し、平均生存期間はＣＬＰ処置後約１０時間（１０．２４±１ｈｒ）であった。一方ＥＴＲ−Ｐ１／ｆ１投与群では生存期間は術後２４時間目でも７頭中２頭が生存しており、平均生存期間は約１８時間（１８±２．０５ｈｒ）まで延長された。したがって、本発明の医薬組成物はＳＩＲＳを抑制することがわかる。
【実施例２】
【００４０】
新生仔ブタ腹膜炎モデルにおけるETR-P1/f1の作用（２）
実施例１と同様の新生仔ブタ腹膜炎モデルにおいて本発明の医薬組成物の作用の詳細を観察した。【００４１】
使用動物
米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）の実験動物取り扱い指針に従い試験を行った。試験プロトコルは名古屋市立大学大学院医学研究科の倫理委員会の承認を得た。１８匹の生後３日目の雑種新生仔ブタを近隣農家より入手した。新生仔ブタは６匹ずつ３群に分けた：
１）ＣＬＰ（Ｃｅｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｎｃｔｕｒｅ）群
２）ＥＴＲ−Ｐ１／ｆl群：ＣＬＰ処置３０分後からＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌを静脈内に連続投与。
３）シャム群：ＣＬＰ処置と同様に開腹し、一旦回盲部を引き出した後腹腔内に戻し腹壁を縫合した。【００４２】
新生仔ブタは母ブタと共に飼育し、処置時にのみ隔離した。新生仔ブタの体重は１４５０〜２２００ｇの間、中央値は１７１５ｇであった。【００４３】
仔ブタへ１０ｍｇ／ｋｇ塩化ケタミンを筋肉内投与した。その後５％グルコース水溶液中のペントバルビタールナトリウムを末梢血管より５ｍｇ／ｋｇ／ｈの速度で処置期間中投与して麻酔を維持した。各仔ブタは気管内へ内径４ｍｍの管を挿管して乳児用人工呼吸器（ＩＶ−１００，Sechrist Industries, Anaheim, CA, USA）にて人工呼吸を行った。開始時の吸気・呼気圧を１４／４ｃｍＨ２Ｏとし、吸気時間を０．５秒とした。人工呼吸には室内の空気を用いた。その後呼吸圧をＰａＣＯ２が３０−５０ｍｍＨｇを維持するよう調節した。カットダウン法により４Ｆポリビニルカテーテルを左側大腿動脈へ挿入して血液サンプルの取得、平均動脈圧（ＭＡＰ）および心拍数（ＨＲ）の測定に用いた。４−Ｆｒベルマン血管造影用カテーテル（American Edwards Laboratories, Irvine, CA, USA）を蛍光透視した右側外顎静脈より挿入し、肺主動脈へ設置してｍＰＡＰの測定に用いた。さらに４Ｆポリビニルカテーテルを左外顎静脈より挿入して上大静脈へ到達させ、中心大静脈圧の測定に用いた。平均動脈圧（ＭＡＰ）、平均肺動脈圧（ｍＰＡＰ）および心拍数（ＨＲ）は新生児用モニター（model 78801 B, Hewlett Packard, Andover, MA, USA）にて測定し、データをMacLab/8s system (ADI Instruments, Mountain View, CA, USA）にて集めた。体温は直腸温をモニターし、温熱パッドおよびポリビニルカバーを用いて維持した。【００４４】
ＣＬＰ処置（ＣＬＰ群）
ＣＬＰ処置は下記のとおり行った。新生仔ブタの腹部へ盲腸および回腸末端（約４ｃｍ）を暴露可能なように切開部を作成した。回盲部動脈を確認し、盲腸近傍で結紮して盲腸の遠端への血流を止めた。約１ｃｍの切れ目を抗腸間膜側へ作成した。盲腸から糞便を腹腔内へ穏やかに絞り出した後、腹部切開部を綴じた。【００４５】
シャム処置（シャム群）
シャム群においては、新生仔ブタの腹部切開後、盲腸および回腸末端を２分間外部へ暴露した後に腹腔内へ戻し、腹部切開部を閉じた。【００４６】
ＣＬＰ処置＋ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ投与（ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群）
ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ投与はＣＬＰ処置の３０分後に開始した。ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌの５％グルコース中溶液をＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ投与量が０．０５ｍｇ／ｋｇ／ｈとなるよう、中心静脈内へ投与した。静脈投与の溶液量は５ｍＬ／ｋｇ／ｈとなるよう調節した。【００４７】
各動物は死亡するまで、または２４時間観察した。２４時間生存した動物はナトリウムフェノバルビタール致死量を投与して殺した。【００４８】
試験プロトコル
各群において、血液サンプルを無菌下で大腿動脈カテーテルより採取して、動脈血液ガス(arterial blood gases)、血清ＴＮＦ−α、ＮＯ代謝物、ＨＭＧＢ−１を測定した。血液サンプルはＣＬＰまたはシャム処置前、および処置１、３、６および９時間後に採取した。サンプリングはＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群およびシャム群では１２時間後にも行った。全てのサンプルは滅菌チューブに保存した。【００４９】
測定
動脈血液ガスは標準分析器（モデル１２４８； CIBA Corning, Medfield, MA, USA）を用いて測定した。血清ＴＮＦ−αはブタＴＮＦ−α用イムノアッセイキット（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)を用いて測定した。ＮＯ代謝物は血中NO2- + NO3- (NOx)濃度を測定して評価した。NOx濃度は全窒素並びに窒素ＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を用いて測定した。ＨＭＧＢ−１はＨＭＧＢ−１用ＥＬＩＳＡキット(Shino-Test Corporation, Sagamihara, Japan)を用いて測定した。【００５０】
拍出量の測定
Ｍ−モード心エコー試験を５．０ＭＨｚのトランスデューサーを有するＳＯＮＯＳ５００（ヒューレットパッカード社）を用いて、ＣＬＰまたはシャム処置前、および処置後１、３、６および９時間後に行った。ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群およびシャム群についてはＣＬＰ／シャム処置１２時間後にも測定を行った。心尖部長軸像より左心室の二次元Ｍモード測定を行い、拍出量を計算した。測定は各測定時にそれぞれ３回行い、各測定時の平均値を算出した。第１及び第２生存ターゲットをそれぞれＣＬＰ群の生存時間および２×ＳＥＭ、ＣＬＰ群の生存時間および２×ＳＤとして算出した。第３の生存ターゲットはＣＬＰ手術後２４時間の試験終了時とした。【００５１】
統計分析
データの分布はShapiro-Wilk testにて分析した。ＣＬＰ手術後９時間迄は、各群の測定値の平均をそれぞれの測定時間においてＡＮＯＶＡ検定に基づいて比較し、その後Bonferroni post hoc testを行った。データが正規分布ではない場合にはKrusal-Wallis testを用い有意差が見出された場合にはMann-Whitney testを用いて分析した。９時間以降は非対象Student’s t-testを用いた。データが正規分布でない場合にはMann-Whitney test を用いてETR-P1/fl群のデータとシャム群のデータを比較した。３つの群間の生存期間の相違は Kaplan-Meier testを用いて計算し、Kruskal-Wallis test 次いでMann-Whitney testを用いて比較した。データは平均±SEMで示した。差が危険率０．０５未満の場合に有意差であると認定した。全てのデータ分析は市販の統計分析ソフトウエアパッケージSPSS(Statistical Package for Social Sciences, Chicago, Illinois, USA)を用いて行った。【００５２】
結果
各測定結果を表２、表３、および図２〜４に示す。
【表２】
2011004843.tif 000004
【００５３】
【表３】
2011004843.tif 000005
【００５４】
動物の状態並びに生存期間
ＣＬＰ群、シャム群、およびＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群の体重に有意差は無く、それぞれ１６４６±８８ｇ、１７１８±５０ｇおよび１８５０±１０６ｇであった。【００５５】
ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群の生存期間はＣＬＰ群より有意に長かった（１８．９±２．３ｈ対９．０±０．８ｈ、Ｐ＝０．００５）。９５％信頼区間として、ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群では１４．４時間から２３．４時間の間、ＣＬＰ群では７．５時間から１０．５時間の間であった。ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群では８３．３％（ｎ＝５）、５０％（ｎ＝３）および３３．３％（ｎ＝２）の動物がそれぞれ、第１、第２および第３生存ターゲットに到達した。対してＣＬＰ群では１匹も第１生存ターゲットに到達できなかった（図２）。シャム群の動物は全て２４時間生存した。【００５６】
血液ｐＨおよび過剰塩基への作用
シャム群では血液ｐＨ値の変化は無かったが、ＣＬＰ群では６から９時間の間に血液ｐHは顕著に下がった（表２）。ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群においては、血液ｐＨのレベルはシャム群のレベルに相当するものであった。６時間と９時間において、ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群の血液ｐＨレベルはＣＬＰ群と比し有意に高かった（それぞれ７．３５±０．０３対７．２５±０．０２、ｐ＝０．０２（６時間）；７．３３±０．０４対７．１８±０．０３、ｐ＝０．０１（９時間））（表２）。【００５７】
ＣＬＰ群およびＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群における動脈過剰塩基（ＢＥ）値は低下した。ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群のＢＥレベルはＣＬＰ群より高く維持されていたが、その差は有意ではなかった（表２）。【００５８】
血圧への作用
ＣＬＰ／シャム処置３時間後まで３つの群の間で相対平均動脈圧（ＭＡＰ）に差はなかった（図３―Ａ）。ＣＬＰ群では相対ＭＡＰ値が徐々に下がり６時間後には６０％、９時間では７５％下がった。ＣＬＰ群の動物の相対ＭＡＰ値はＣＬＰ処置前より有意に低かった（０．３７±０．０３［６ｈ］および０．２４±０．０１［９ｈ］いずれもｐ＜０．０１）が、シャム群の相対ＭＡＰは試験期間中ほとんど変化がなかった。ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群の動物における相対ＭＡＰ値においては有意ではないがゆっくりとした減少が認められ、６時間並びに９時間においてはＣＬＰ群より有意に高かった（０．７５±０．１０対０．３７±０．０３［６ｈ］、０．７６±０．１１対０．２４±０．０１［９ｈ］；いずれもｐ＜０．０１）（図３Ａ）。試験期間中、ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群とシャム群の間で相対ＭＡＰ値の差は無かった。【００５９】
６時間後の相対平均肺動脈圧（ｍＰＡＰ）値はＣＬＰ群ではシャム群より高かった：１．３０±０．０９（ＣＬＰ群）対０．９０±０．０８（シャム群）、ｐ＜０．０５（図３Ｂ）。９時間後においてもＣＬＰ群の相対ｍＰＡＰ値はシャム群より高かったが、その差は有意なものではなくなった。ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群の相対ｍＰＡＰ値はシャム群に近いものであったが、ＣＬＰ群との有意差はなかった。【００６０】
相対ｍＰＡＰ／ＭＡＰ値はＣＬＰ群で徐々に上昇し、９時間においてはシャム群並びにＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群に比して有意に高かった：０．７３±０．０８（ＣＬＰ群）対０．４６±０．０７（シャム群）および０．５０±０．０５８（ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群）、両者ｐ＜０．０５（図３Ｃ）。ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群の相対ｍＰＡＰ／ＭＡＰ値はシャム群と近いものであった。【００６１】
心拍数、拍出量並びに体温への作用
ＣＬＰ群において、心拍数（ＨＲ）はＣＬＰ処置後３時間において増加した：１８４．８±１３．０拍／分［ＣＬＰ前］、２３７．８±１５．５拍／分［１ｈ］、２７２．２±１４．０拍／分［３ｈ］、それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１。そして、ＣＬＰ処置後１時間並びに３時間のＣＬＰ群のＨＲはシャム群並びにＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群より高かった：［１ｈ＝２３７．８±１５．５拍／分（ＣＬＰ）１８５．５±１１．１拍／分（シャム群）１７６．９±１５．８拍／分（ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群）］、［３ｈ＝２７２．２±１４．０拍／分（ＣＬＰ）２１０．３±１５．６拍／分（シャム群）、２１０．２±２２．２拍／分（ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群）］（全件ｐ＜０．０５）（図３Ｄ）。試験期間を通じてＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群のＨＲはシャム群と近い値を維持していた。【００６２】
ＣＬＰ群において、相対拍出量（ＣＯ）は３、６及び９時間においてかなりの低下を示し、またシャム群より有意に低かった（表２）。ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群の相対拍出量は徐々に低下したが、ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群とシャム群の間の差は有意とはならなかった。【００６３】
試験期間全体において３群間で体温については差は無かった（表３）。【００６４】
炎症性メディエーター
ＣＬＰ群の血清ＴＮＦ−αレベルは急速に上昇し（１ｈ）、１、３、６および９時間の何れの時点においてもシャム群より高かった：１ｈ＝２５３．２±４４．２ｐｇ／ｍＬ（ＣＬＰ群）９．２±３．０ｐｇ／ｍＬ（シャム群）、３ｈ＝１８７．７±２６．６ｐｇ／ｍＬ（ＣＬＰ群）７．０±１．８ｐｇ／ｍＬ（シャム群）、６ｈ＝１３８．７±２５．４ｐｇ／ｍＬ（ＣＬＰ群）、１３．６±２．６ｐｇ／ｍＬ（シャム群）、９ｈ＝１２６．０±３１．９ｐｇ／ｍＬ（ＣＬＰ群）３１．７±８．２ｐｇ／ｍＬ（シャム群）（全件ｐ＜０．０１）。ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群においてはこれに対し、血清ＴＮＦ−αレベルはシャム群と同程度の値を保ち、１，３および６時間の時点でＣＬＰ群より低かった：ｈ＝±０．０ｐｇ／ｍＬ，３ｈ＝２±１６．１ｐｇ／ｍＬ，６ｈ＝３５．５±１９．５ｐｇ／ｍＬ（全件ｐ＜０．０１）（図４Ａ）。【００６５】
ＨＭＧＢ−１はＣＬＰ群において３、６および９時間において検出可能な値を示し、ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群およびシャム群より有意に高かった（図４Ｂ）。血清ＨＭＧＢ−１はシャム群では全く検出されなかったが、ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群およびシャム群の間で血清ＨＭＧＢ−１レベルの有意差は無かった。【００６６】
ＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群とシャム群の血清ＮＯｘレベルは試験期間を通して同程度であった。両群において、試験開始前と同程度のＮＯｘレベルを保っていた。ＣＬＰ群のＮＯｘレベルは一方で、ＣＬＰ手術後１時間より増加しはじめ、３，６および９時間ではＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群並びにシャム群より高かった（図４Ｃ）。【００６７】
１２時間から２４時間の間にはＥＴＲ−Ｐ１／ｆｌ群とシャム群の間で相対ＭＡＰ、相対ｍＰＡＰおよびｍＰＡＰ／ＭＡＰについての差は無かった（表３）。【００６８】
実施例１および２の結果より本願発明の組成物がＳＩＲＳの処置に有用であることがわかる。また、本発明の組成物がゼプシスの早い時期に生じる炎症性メディエーターであるＴＮＦ−α、およびゼプシス後期に生じる炎症性メディエーターであるＨＭＧＢ−１の両方の上昇を抑える。敗血症患者において、血漿中ＴＮＦ−αの上昇は内毒素血症の重篤度と相関する。ＨＭＧＢ―１は核転写因子としてのみ知られていたタンパク質であるが、現在は遅延型エンドトキシン致死および全身性炎症と関連するメディエーターであると考えられている。ＨＭＧＢ−１レベルはＴＮＦ−αレベルと同様敗血症性ショックの重篤度と相関する。従って、ＨＭＧＢ−１のレベルの低下は敗血症の治療の有効性を測る指標となる
【実施例３】
【００６９】
Ｈ５Ｎ1トリインフルエンザウイルス感染症に対するETR-P1/flの効果
Ｈ５Ｎ1 トリインフルエンザウイルス感染症に対するETR-P1/fl並びにAcePepAの効果を調べた。AcePepAがサルや豚でＳＩＲＳに対する救命効果を発揮することについては、本願発明者らが先に報告している（特開2004-269520およびPCT/JP2009/061872 ）。
105.3 TCID50のH5N1インフルエンザウイルス（H5N1 IV）０．２ｍｌを雄の１０日齢のニワトリのヒナ（体重約８０ｇ）へ経鼻感染させた。
AcePepA投与群では、ウイルス感染３０分後、１日後及び２日後に該ペプチド（２ｍｇ／ｍｌ生理食塩水中）０．０８ｍｌを筋肉内投与した。
ETR-P1/f1投与群（１）では、ウイルス感染３０分後、該ペプチド（０．２ｍｇ／ｍｌ生理食塩中）０．０８ｍｌを筋肉内投与した。
ETR-P1/f1投与群（２）では、ウイルス感染３０分間後、１日後、及び２日後に該ペプチド（０．２ｍｇ／ｍｌ生理食塩中）０．０８ｍｌを筋肉内投与した。結果を表４に示す。【００７０】
【表４】
2011004843.tif 000006
* H5N1 influenza virus (H5N1 IV) preparation at 105.3 TCID50 was the culture supernatant of MDCK cells infected in GIT medium.【００７１】
無処置群並びにAcePepA投与群では２日目までに全例が死亡した。これに対して、ETR-P1/f1投与群では初日のみに投与した場合も初日、１日、２日目に投与した場合も同様に全例が３日目まで生存していた。【００７２】
上記結果より、エンドセリン活性抑制剤であるETR-P1/f1が強毒性インフルエンザウイルスであるＨ５Ｎ１トリインフルエンザウイルス感染症に対して強力な治療効果を有することが示される。かかる治療効果は、高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１の感染拡大に対する防疫法としての用途も併せて示すものである。
【図１】
2011004843.tif 000007
【図２】
2011004843.tif 000008
【図３Ａ】
2011004843.tif 000009
【図３Ｂ】
2011004843.tif 000010
【図３Ｃ】
2011004843.tif 000011
【図３Ｄ】
2011004843.tif 000012
【図４Ａ】
2011004843.tif 000013
【図４Ｂ】
2011004843.tif 000014
【図４Ｃ】
2011004843.tif 000015
【配列表】
2011004843000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年5月2日(2011.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
ＡＬＳＶＤ（Ｘ）Ｙ（Ｘ）ＡＶＡＳ  （配列番号１０）
（式中、Ｘはいずれかのアミノ酸を示す）
のアミノ酸配列を有するペプチド含む、強毒性インフルエンザウイルス感染症処置用組成物。
【請求項１４】
ペプチドが配列番号４〜９および１１〜１８何れかに記載のペプチドである、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
ペプチドが配列番号１１記載のペプチドである、請求項１３記載の組成物。
【請求項１６】
強毒性インフルエンザウイルスがＨ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスである、請求項１３〜１５何れかに記載の組成物。
【請求項１７】
鳥類を処置するためのものである、請求項１３〜１６何れかに記載の組成物。
【請求項１８】
ヒトを処置するためのものである、請求項１３〜１６何れかに記載の組成物。
【国際調査報告】
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