(57)【要約】  この発明に係るＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡは、ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２０〜３０塩基、好ましくは２３〜２７塩基の配列のセンスＲＮＡおよび該配列と相補的な配列のアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡまたは該センスＲＮＡと該アンチセンスＲＮＡとをループ配列で結合した２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）からなるｓｈＲＮＡである。  この発明のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡは、ＺＦＡＴ遺伝子の発現を抑制することにより、癌細胞等の細胞増殖率を減少すると共に、癌細胞等の細胞のアポトーシスを誘導し。またＺＦＡＴ遺伝子の発現抑制により、免疫応答の阻害をする。したがって、この発明のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡは、特に癌細胞に対する分子標的治療薬または免疫抑制剤の開発に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２０〜３０塩基の配列のセンスＲＮＡおよび該配列と相補的な配列のアンチセンスＲＮＡを含む２本鎖ＲＮＡからなることを特徴とするＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡにおいて、前記センスＲＮＡの塩基配列がＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２３〜２７塩基からなることを特徴とするＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡにおいて、前記２本鎖ＲＮＡが、そのそれぞれの鎖の３’端に１〜６個のヌクレオチドを付加した２本鎖ＲＮＡであることを特徴とするＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡ。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡにおいて、前記ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡが、ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２０〜３０塩基の配列のセンスＲＮＡおよび該配列と相補的な配列のアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡまたは該センスＲＮＡと該アンチセンスＲＮＡとをループ配列で結合したｓｈＲＮＡであることを特徴とするＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡにおいて、前記センスＲＮＡの塩基配列がＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２３〜２７塩基からなることを特徴とするＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡ。
【請求項６】
請求項４または５に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡにおいて、前記ループ配列が１〜６塩基のスペーサーオリゴヌクレオチドからなり、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとを結合し、ヘアピン構造を形成していることを特徴とするＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡ。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡにおいて、前記２本鎖が、配列番号１および２でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、配列番号３および４でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、配列番号５および６でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、もしくは配列番号７および８でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡとからなるヒトＺＦＡＴ遺伝子（ｈＺＦＡＴ）ｓｉＲＮＡ、または配列番号１７および１６でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、配列番号１９および１８でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡもしくは配列番号２１および２０でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなるｍＺＦＡＴ  ｓｉＲＮＡであることを特徴とするＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡ。
配列番号１：５’−Ａ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＵＣＵ  ＵＵＡ  ＵＧＵ  ＧＵＡ  ＡＡＵ  ＧＵＵ−３’
配列番号２：５’−  Ａ  ＡＣＡ  ＵＵＵ  ＡＣＡ  ＣＡＵ  ＡＡＡ  ＧＡＵ  ＧＧＣ  ＣＧＵ−３’
配列番号３：５’−  Ｃ  ＣＵＵ  ＡＧＧ  ＣＣＵ  ＣＵＧ  ＡＧＵ  ＡＣＡ  ＣＣＵ  ＧＡＡ−３’
配列番号４：５’−  Ｕ  ＵＣＡ  ＧＧＵ  ＧＵＡ  ＣＵＣ  ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＣＵＡ  ＡＧＧ−３’
配列番号５：５’−  Ｇ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＡＧＵ  ＵＵＡ  ＡＧＵ  ＧＣＡ  ＣＧＧ  ＵＧＵ−３’
配列番号６：５’−  Ａ  ＣＡＣ  ＣＧＵ  ＧＣＡ  ＣＵＵ  ＡＡＡ  ＣＵＧ  ＣＵＵ  ＣＣＣ−３’
配列番号７：５’−  Ｕ  ＧＧＣ  ＵＵＧ  ＡＡＧ  ＧＵＧ  ＧＵＧ  ＧＡＡ  ＡＵＵ  ＧＡＵ−３’
配列番号８：５’−  Ａ  ＵＣＡ  ＡＵＵ  ＵＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＵＵＣ  ＡＡＧ  ＣＣＡ−３’
配列番号１７：５’−ＣＡＧＵＣＡＧＡＡＣＵＣＧＵＧＡＣＣＣＡＣＧＵＵＵ−３’
配列番号１８：５’−ＡＡＡＣＧＵＧＧＧＵＣＡＣＧＡＧＵＵＣＵＧＡＣＵＧ−３’
配列番号１９：５’−ＣＡＧＣＧＵＧＧＵＣＵＵＡＡＣＵＧＣＵＣＡＵＧＡＡ−３’
配列番号２０：５’−ＵＵＣＡＵＧＡＧＣＡＧＵＵＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＵＧ−３’
配列番号２１：５’−ＣＣＧＣＵＧＵＧＡＡＵＡＵＣＣＵＧＣＡＧＣＡＧＡＵ−３’
配列番号２２：５’−ＡＵＣＵＧＣＵＧＣＡＧＧＡＵＡＵＵＣＡＣＡＧＣＧＧ−３’
【請求項８】
請求項４ないし６のいずれか１項に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡにおいて、前記ｓｈＲＮＡが、配列番号２７および２６でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンス  ＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡとからなることを特徴とするＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡ。
配列番号２７：
５’−ＣＡＣＣＧＣＡＡＧＣＡＣＡＴＣＴＧＣＡＴＣＡＴＴＧＣＧＡＡＣＡＡＴＧＡＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣ−３’
配列番号２８：
５’−ＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＡＴＣＴＧＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＣＧＣＡＡＴＧＡＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣ−３’
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡを発現することを特徴とする発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは請求項９に記載の発現ベクターを細胞に導入することにより、該細胞中のＺＦＡＴ遺伝子の発現を抑制することを特徴とするＺＦＡＴ遺伝子発現抑制方法。
【請求項１１】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは請求項９に記載の発現ベクターを細胞に導入することにより、該細胞の増殖を抑制することを特徴とする細胞増殖抑制方法。
【請求項１２】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは請求項９に記載の発現ベクターを細胞に導入することにより、該細胞のアポトーシスを誘導することを特徴とするアポトーシス誘導方法。
【請求項１３】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは請求項９に記載の発現ベクターを細胞に導入することにより、生体内における免疫応答を阻害することを特徴とする免疫抑制方法。
【請求項１４】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは請求項９に記載の発現ベクターを有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは請求項９に記載の発現ベクターが、細胞増殖を抑制またはアポトーシスの誘導により、または免疫応答阻害により、癌などの疾患の治療もしくは予防をすることができる有効成分として含有されていることを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡに関し、更に詳細には、細胞の増殖抑制またはアポトーシス（細胞死）を誘導するＺＦＡＴ遺伝子の発現抑制ＲＮＡならびにそれを含む発現ベクター、およびそれらを用いたＺＦＡＴ遺伝子の発現抑制方法ならびにＺＦＡＴ遺伝子発現抑制による細胞の増殖抑制方法またはアポトーシス誘導方法、およびＺＦＡＴ遺伝子の発現抑制ＲＮＡを含む医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞の増殖・アポトーシス・分化などに関わる分子の同定および分子機序の理解は、細胞の悪性化とその細胞病態の理解に通じるものがある。特定の遺伝子あるいはシグナル経路を絞った分子機能改変（分子標的）は、細胞の動態を人為的に制御し、病態を正常化する方法の一つである。【０００３】
これまで抗がん剤としては天然物質や化合物などが使用されているが、欠点としては、がん細胞ばかりではなく、正常細胞にも作用することにより引き起こされる重篤な副作用が挙げられる。近年では、副作用軽減のための分子標的薬の臨床応用が試みられているが、未だ効果・副作用の面から充分な薬剤は開発されていないのが現状である。【０００４】
自己免疫甲状腺疾患関連遺伝子として同定された遺伝子ＺＦＡＴ（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎ；別名ＺＮＦ４０６）は、１２４３アミノ酸残基からなる蛋白質をコードし、１個のＡＴフックドメインと１８個のＺｎフィンガードメインを有するＺｎフィンガー蛋白質である。マウス組織におけるＺＦＡＴ蛋白質の分布は、胸腺と脾臓に強く発現し、発現細胞はＢリンパ球とＴリンパ球に限られているという特徴がある（非特許文献１）。しかし、ＺＦＡＴ蛋白質の機能については未だ明らかとなっていない。【０００５】
有効な遺伝子機能解析方法としてＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）が注目されている。このＲＮＡｉは、遺伝子と相同な、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）が、その遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）相同部分を破壊し、それと同じ配列を持つ遺伝子の発現、つまりタンパク質合成を抑制する現象である（例えば、非特許文献２、３，４参照）。つまり、このＲＮＡｉは、配列が知られている標的遺伝子のｍＲＮＡをノックアウト（破壊）することによりその遺伝子の機能を探索することができる画期的な方法といえる。【０００６】
また、このＲＮＡｉは、細胞レベルで確認できるため、動物を使用して確認する従来の遺伝子ノックアウト法に比べ、非常に簡単でかつ安価であり、その上短時間で結果が得られるという大きな利点がある。さらに、ＲＮＡｉ法は、その他にも、低濃度でも効果が期待でき、またｍＲＮＡを破壊するだけであるので、ゲノム遺伝子そのものには全く影響を及ぼさない、などの利点もある。
【非特許文献１】Ｋｏｙａｎａｇｉ，  Ｍ．，  Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ，  Ｋ．，  Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，  Ｔ．，  Ｇｕ，  Ｎ．，  Ｂａｂａ，  Ｉ．，  Ｔａｋａｓｈｉｍａ，  Ｙ．，  Ｄｏｉ，  Ｋ．，  Ｈａｒａｄａ，  Ｈ．，  Ｋａｔｏ，  Ｎ．，  Ｓａｓａｚｕｋｉ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｓｈｉｒａｓａｗａ，  Ｓ．  （２００８）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ９１，  ４５１−４５７
【非特許文献２】Ｆｉｒｅ，  Ａ／，  ｅｔ  ａｌ：  Ｎａｔｕｒｅ  （１９９８）  ３９１：８０６−８１１
【非特許文献３】Ｕｉ−Ｔｅｉ，  Ｋ．，  ，ｅｔ  ａｌ：ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  （２０００）  ４７９：７９−８２
【非特許文献４】Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ  （２００１）  ４１１：４９４−４９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明者らは、ＺＦＡＴ遺伝子について鋭意検討・研究した結果、ＺＦＡＴ蛋白質が、ヒト白血病細胞株および免疫応答時（芽球化刺激時）に強く発現していることから、癌および免疫反応に重要な機能を果たすという仮定のもと、ＲＮＡｉの手法を利用してさらなる解析を行った。そこで、本発明者らは、ＺＦＡＴ遺伝子と相同なセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとからなる２本鎖ＲＮＡであるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を調製して、そのｓｉＲＮＡがＺＦＡＴ遺伝子の発現抑制をすることを見出した、また、このＺＦＡＴ遺伝子の発現を抑制することにより、癌細胞においてアポトーシスを誘導するとともに、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞における免疫応答を阻害することを見出した。これらの結果、本発明者らは、このＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡは、ＺＦＡＴ遺伝子の量と機能を抑制することによって、より選択性の高い分子標的治療剤または免疫抑制剤として使用できる可能性があることを見出して、この発明を完成した。【０００８】
したがって、この発明は、ＺＦＡＴ遺伝子と相同なセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡであるＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡを提供することを目的としている。【０００９】
この発明は、その好ましい態様として、ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２０〜３０塩基、好ましくは２３〜２７塩基の配列のセンスＲＮＡおよび該配列と相補的な配列のアンチセンスＲＮＡを含む２本鎖ＲＮＡまたは該センスＲＮＡと該配列と相補的な配列のアンチセンスＲＮＡとをスペーサーオリゴヌクレオチドで結合し、ヘアピン構造を形成するｓｈＲＮＡを含むＺＦＡＴ  遺伝子発現抑制ＲＮＡが提供することを目的としている。【００１０】
この発明は、その別の形態として、上記ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡを発現する発現ベクターを提供することを目的としている。【００１１】
また、この発明は、その別の形態として、上記ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは上記発現ベクターを細胞に導入することにより、細胞中のＺＦＡＴ遺伝子の発現を抑制することからなるＺＦＡＴ遺伝子発現抑制方法を提供することを目的としている。【００１２】
さらに、この発明は、その別の形態として、上記ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは上記発現ベクターを細胞に導入することにより、がん細胞などの細胞の増殖を抑制することからなる細胞増殖抑制方法およびがん細胞などの細胞のアポトーシスを誘導することからなるアポトーシス誘導方法を提供することを目的としている。【００１３】
さらにまた、この発明は、その別の形態として、上記ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは上記発現ベクターを細胞に導入することにより、上記ＺＦＡＴ遺伝子発現を抑制することにより、細胞における免疫応答を阻害することから、生体に対する免疫抑制方法をを提供することを目的としている。【００１４】
また、この発明は、上記ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは上記発現ベクターを有効成分として含有する医薬組成物およびがん細胞の増殖を抑制もしくはアポトーシスを誘導することにより、また細胞における免疫応答を阻害することにより、癌などの疾患の治療もしくは予防に有効な医薬組成物を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
これらの目的を達成するために、この発明は、ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２０〜３０塩基、好ましくは２３〜２７塩基の配列からなるセンスＲＮＡおよび該配列と相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡを含む２本鎖ＲＮＡからなるＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡが提供することを目的としている。【００１６】
なお、本明細書において「２本鎖ＲＮＡ」とは、ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２０〜３０塩基、好ましくは２３〜２７塩基の配列からなるセンスＲＮＡおよび該配列と相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡおよび該センスＲＮＡと該センスＲＮＡと相補的な配列のアンチセンスＲＮＡとをスペーサーオリゴヌクレオチドからなるループ配列で結合し、ヘアピン構造を形成するｓｈＲＮＡばかりではなく、該ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含むｄｓＲＮＡをも包含する意味で使用されているものと理解すべきである。したがって、本明細書において、用語「ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡ」、「２本鎖ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「ｓｈＲＮＡ」およびこれらに関連する用語は互換的な意味で使用していて、これらの用語を単独にもしくはいくつかと組み合わせて使用した場合でも、特に限定する必要がある場合を除いて、これらの用語を全て包含した意味で使用されているものと理解すべきである。【００１７】
この発明は、その別の好ましい態様として、上記ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡが、そのそれぞれの鎖の３’端に１〜６個のヌクレオチドを付加した２本鎖ＲＮＡからなるＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡを提供する。【００１８】
この発明は、その更に好ましい態様として、ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡが、ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２０〜３０塩基、好ましくは２３〜２７塩基の配列のセンスＲＮＡおよび該配列と相補的な配列のアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡまたは該センスＲＮＡと該アンチセンスＲＮＡとをループ配列で結合した２本鎖ＲＮＡからなるｓｈＲＮＡであるＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡを提供する。【００１９】
この発明は、別の好ましい態様として、上記ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡが、配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６もしくは配列番号７と８で表される塩基配列を有するヒトＺＦＡＴ遺伝子（ｈＺＦＡＴ）ｓｉＲＮＡ  または配列番号１７と１６、配列番号１９と１８、もしくは配列番号２１と２０で表される塩基配列を有するマウスＺＦＡＴ遺伝子（ｍＺＦＡＴ）ｓｉＲＮＡからなるＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡを提供する。【００２０】
この発明は、別の形態として、上記ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡを発現する発現ベクターを提供する。【００２１】
この発明は、別の形態として、上記ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは上記発現ベクターを細胞に導入することにより、細胞中のＺＦＡＴ遺伝子の発現を抑制することからなるＺＦＡＴ遺伝子発現抑制方法を提供する。【００２２】
この発明は、更に別の形態として、上記ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは上記発現ベクターを細胞に導入することにより、細胞の増殖を抑制することからなる細胞増殖抑制方法および細胞のアポトーシスを誘導することからなるアポトーシス誘導方法を提供する。【００２３】
この発明は、更に別の形態として、上記ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは上記発現ベクターを細胞に導入することにより、ＺＦＡＴ遺伝子の発現抑制により、生体内における免疫応答を阻害すること免疫抑制方法を提供する。【００２４】
この発明は、更に別の形態として、上記ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは上記発現ベクターを有効成分として含有する医薬組成物およびがん細胞の増殖抑制またはアポトーシス誘導により、または生体における免疫応答阻害により、癌などの疾患の治療もしくは予防に有用な医薬組成物を提供する。
【発明の効果】
【００２５】
この発明に係るＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたはその発現ベクターは、生体内において、ＺＦＡＴ遺伝子の発現抑制をするとともに、その発現抑制により、がん細胞などの細胞増殖抑制、もしくはアポトーシス誘導、または免疫応答阻害という効果を有している。したがって、この発明は、がん細胞などの細胞の増殖抑制効果、もしくはアポトーシス誘導効果、または免疫抑制効果を有する医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ヒトＺＦＡＴ遺伝子のｓｉＲＮＡの配列を示す説明図。
【図２】細胞内におけるヒトＺＦＡＴ蛋白質発現を示す図（図２Ａ）およびｓｉＲＮＡによる発現抑制を示す図（図２Ｂ）。
【図３】細胞内におけるヒトＺＦＡＴ遺伝子発現抑制による細胞増殖率を示す図。
【図４】プロピジウムヨーダイド染色でｓｉＲＮＡの細胞周期に対する影響を示した図。
【図５】細胞内におけるヒトＺＦＡＴ遺伝子発現抑制によるアポトーシス誘導を示す図。
【図６】細胞内におけるヒトＺＦＡＴ遺伝子発現抑制によるアポトーシス誘導に対するカスパーゼ３（ｃａｓｐａｓｅ  ３）の活性化を示す図。
【図７】細胞内におけるヒトＺＦＡＴ遺伝子発現抑制によるアポトーシス誘導に対するカスパーゼ８（ｃａｓｐａｓｅ  ８）およびカスパーゼ９（ｃａｓｐａｓｅ  ９）の活性化を示す図。
【図８】カスパーゼ抑制剤でのＺＦＡＴ遺伝子発現抑制によるアポトーシス誘導抑制を示す図。
【図９】細胞におけるＺＦＡＴ遺伝子発現抑制時での細胞周期への影響を示す図。
【図１０】マウスＺＦＡＴ遺伝子のｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの配列を示す説明図。
【図１１】マウスＺＦＡＴ遺伝子のｓｈＲＮＡを導入したｓｈＲＮＡレンチウイルスの構造を示すマップ図。
【図１２】図１１のｓｈＲＮＡレンチウイルスによるＺＦＡＴ遺伝子発現抑制を示す図。
【図１３】ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制によるカスパーゼ９の活性誘導を示す図。
【図１４】ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制によるＣＤ３抗体／ＣＤ２８抗体刺激後のＴ細胞数の減少を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
この発明に係るＺＦＡＴ遺伝子の発現抑制ＲＮＡは、ＺＦＡＴ遺伝子と相同なセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとからなる２本鎖ＲＮＡからなるオリゴヌクレオチドから構成されている。具体的には、この発明のＺＦＡＴ遺伝子の発現抑制ＲＮＡは、ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する塩基配列からなるセンスＲＮＡおよび該センスＲＮＡと相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡを含む２本鎖ＲＮＡからなるＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡである。【００２８】
つまり、この発明のＺＦＡＴ遺伝子の発現抑制ＲＮＡは、ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する塩基配列からなるセンスＲＮＡおよび該センスＲＮＡと相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡを含む２本鎖ＲＮＡからなるｓｉＲＮＡまたは該センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとがループ配列を介して連結しているステムループ構造を有し、かつ該センスＲＮＡの３’末端とアンチセンスＲＮＡの５’末端がループ配列（ヘアピンループ配列）を介して連結されている構造をしているとともに、生体内において生体内酵素により切断されてｓｉＲＮＡを産生できるｓｈＲＮＡを包含するものとする。さらに、この発明のＺＦＡＴ遺伝子の発現抑制ＲＮＡは、該ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）をも包含しているものとする。【００２９】
更に具体的には、この発明のＺＦＡＴ遺伝子の発現抑制ＲＮＡは、基本的には、互いに相補の２本鎖ＲＮＡからなるオリゴヌクレオチドであり、この一方のセンスＲＮＡは、標的となるＺＦＡＴ遺伝子の構造遺伝子部分に対応するｍＲＮＡ中の塩基配列における、任意の配列からなる領域を含んでいる。この領域の選定においては、ＧＣ含量が、例えば、３０〜６０％程度、好ましくは５０％程度以下になる領域を選定するのがよく、またセンスＲＮＡの塩基長は、例えば、ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの２０〜３０塩基、好ましくは２３〜２７塩基の連続する配列を選定するのがよい。これに対して、そのＲＮＡの他方のアンチセンスＲＮＡは、上記センスＲＮＡと相補の塩基配列を有し、このセンスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは、その３’末端に１〜６個までの塩基の付加配列を有していてもよい。【００３０】
図１に示すように、この発明に係るＺＦＡＴ遺伝子の発現抑制ＲＮＡであるｓｉＲＮＡは、例えば、ヒトＺＦＡＴ遺伝子（ＮＭ＿０２０８６３）の塩基配列２００番目から連続する２５個の塩基配列に相同の２５塩基長のセンス  ＲＮＡ（配列番号１）とアンチセンスＲＮＡ（配列番号２）とからなる２本鎖ＲＮＡ（ＺＦＡＴ  ＃１）、３１９番目から連続する２５個の塩基配列に相同の２５塩基長のセンスＲＮＡ（配列番号３）とアンチセンスＲＮＡ（配列番号４）とからなる２本鎖ＲＮＡ（ＺＦＡＴ  ＃２）、３０６２番目から連続する２５個の塩基配列に相同の２５塩基長のセンスＲＮＡ（配列番号５）とアンチセンスＲＮＡ（配列番号６）とからなる２本鎖ＲＮＡ（ＺＦＡＴ  ＃４）または３３６７番目から連続する２５個の塩基配列に相同の２５塩基長のセンスＲＮＡ（配列番号７）とアンチセンスＲＮＡ（配列番号８）とからなる２本鎖ＲＮＡ（ＺＦＡＴ  ＃５）から選択するのが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡは、上記配列に限定されるものではなく、ｓｉＲＮＡとしての作用効果を発揮するものであればいずれも使用することができ、かつ、この発明の範囲に包含されるものである。【００３１】
上記配列番号１〜８のそれぞれで表されるｓｉＲＮＡの塩基配列は下記の通りである。
配列番号１：５’−Ａ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＵＣＵ  ＵＵＡ  ＵＧＵ  ＧＵＡ  ＡＡＵ  ＧＵＵ−３’
配列番号２：５’−  Ａ  ＡＣＡ  ＵＵＵ  ＡＣＡ  ＣＡＵ  ＡＡＡ  ＧＡＵ  ＧＧＣ  ＣＧＵ−３’
配列番号３：５’−  Ｃ  ＣＵＵ  ＡＧＧ  ＣＣＵ  ＣＵＧ  ＡＧＵ  ＡＣＡ  ＣＣＵ  ＧＡＡ−３’
配列番号４：５’−  Ｕ  ＵＣＡ  ＧＧＵ  ＧＵＡ  ＣＵＣ  ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＣＵＡ  ＡＧＧ−３’
配列番号５：５’−  Ｇ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＡＧＵ  ＵＵＡ  ＡＧＵ  ＧＣＡ  ＣＧＧ  ＵＧＵ−３’
配列番号６：５’−  Ａ  ＣＡＣ  ＣＧＵ  ＧＣＡ  ＣＵＵ  ＡＡＡ  ＣＵＧ  ＣＵＵ  ＣＣＣ−３’
配列番号７：５’−  Ｕ  ＧＧＣ  ＵＵＧ  ＡＡＧ  ＧＵＧ  ＧＵＧ  ＧＡＡ  ＡＵＵ  ＧＡＵ−３’
配列番号８：５’−  Ａ  ＵＣＡ  ＡＵＵ  ＵＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＵＵＣ  ＡＡＧ  ＣＣＡ−３’【００３２】
なお、コントロールとして、それぞれ対応するｓｉＲＮＡ配列と異なる、下記の構造を有するスクランブル配列を調製した。配列番号１および２で表されるＺＦＡＴ  ＃１に対するコントロール配列として、それぞれ配列番号９および１０で表されるＳｃｒａｍｂｌｅ  ＃１、配列番号３および４で表されるＺＦＡＴ  ＃２に対するコントロール配列として、それぞれ配列番号１１および１２で表されるＳｃｒａｍｂｌｅ  ＃２、配列番号５および６で表されるＺＦＡＴ  ＃４に対するコントロール配列として、それぞれ配列番号１３および１４で表されるＳｃｒａｍｂｌｅ  ＃４、配列番号７および８で表されるＺＦＡＴ  ＃５に対するコントロール配列として、それぞれ配列番号１５および１６で表されるＳｃｒａｍｂｌｅ  ＃５を合成した。【００３３】
配列番号９：  ５’−  Ａ  ＣＧＡ  ＣＣＵ  ＵＵＡ  ＵＧＵ  ＧＵＡ  ＵＡＡ  ＵＣＧ  ＧＵＵ−３’
配列番号１０：５’−  Ａ  ＡＣＣ  ＧＡＵ  ＵＡＵ  ＡＣＡ  ＣＡＵ  ＡＡＡ  ＧＧＵ  ＣＧＵ−３
配列番号１１：５’−  Ｃ  ＣＵＣ  ＣＧＧ  ＧＵＣ  ＵＡＵ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＵＡＵ  ＧＡＡ−３’
配列番号１２：５’−  Ｕ  ＵＣＡ  ＵＡＧ  ＵＧＧ  ＵＣＡ  ＵＡＧ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＧＧ−３’．
配列番号１３：５’−  Ｇ  ＧＧＡ  ＣＧＵ  ＵＧＡ  ＡＵＧ  ＵＧＣ  ＡＣＧ  ＧＡＡ  ＵＧＵ−３’
配列番号１４：５’−  Ａ  ＣＡＵ  ＣＣＣ  ＧＵＧ  ＣＡＣ  ＡＵＵ  ＣＡＡ  ＣＧＵ  ＣＣＣ−３’
配列番号１５：５’−  Ａ  ＵＣＧ  ＡＡＵ  ＡＵＵ  ＣＣＣ  ＡＡＣ  ＣＣＵ  ＵＡＣ  ＣＣＡ−３’
配列番号１６：５’−  Ｕ  ＧＧＧ  ＵＡＡ  ＧＧＧ  ＵＵＧ  ＧＧＡ  ＡＵＡ  ＵＵＣ  ＧＡＵ−３’【００３４】
また、この発明には、マウスＺＦＡＴ遺伝子（ＮＭ＿１９８６４４）からのｓｉＲＮＡも含まれ、例えば、図１０に示すように、マウスＺＦＡＴ遺伝子の塩基配列２３１番目からの塩基配列に相同のセンスＲＮＡ（２３１  Ｓｅｎｓｅ（５’−３’）：配列番号１７）  とアンチセンスＲＮＡ（２３１  Ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  （５’−３’）：配列番号１８）とからなるｓｉＲＮＡ（ｍＺＦＡＴ  ２３１ｓｉＲＮＡ）、塩基配列７４０番目からの塩基配列に相同のセンスＲＮＡ（７４０  Ｓｅｎｓｅ  （５’−３’）：配列番号１９）  とアンチセンスＲＮＡ（７４０  Ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  （５‘−３’）：配列番号１８）とからなるｓｉＲＮＡ（ｍＺＦＡＴ  ７４０ｓｉＲＮＡ）、塩基配列７４０番目からの塩基配列に相同のセンスＲＮＡ（７４０  Ｓｅｎｓｅ  （５’−３’）：配列番号２０）とアンチセンスＲＮＡ（７４０  Ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ（５’−３’）：配列番号１８）とからなるｓｉＲＮＡ（ｍＺＦＡＴ  ７４０ｓｉＲＮＡ）、または塩基配列３４６９番目からの塩基配列に相同のセンスＲＮＡ（３４６９  Ｓｅｎｓｅ  （５’−３’）：配列番号２１）とアンチセンスＲＮＡ（３４６９  Ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ（５’−３’）：配列番号２２）とからなる  ｓｉＲＮＡ（ｍＺＦＡＴ  ３４６９ｓｉＲＮＡ）なとが挙げられる。【００３５】
配列番号１７〜２２で表されるマウスＺＦＡＴ遺伝子からのｓｉＲＮＡの塩基配列は下記の通りである。
配列番号１７：  ５’−ＣＡＧＵＣＡＧＡＡＣＵＣＧＵＧＡＣＣＣＡＣＧＵＵＵ−３’
配列番号１８：  ５’−ＡＡＡＣＧＵＧＧＧＵＣＡＣＧＡＧＵＵＣＵＧＡＣＵＧ−３’
配列番号１９：  ５’−ＣＡＧＣＧＵＧＧＵＣＵＵＡＡＣＵＧＣＵＣＡＵＧＡＡ−３’
配列番号２０：  ５’−ＵＵＣＡＵＧＡＧＣＡＧＵＵＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＵＧ−３’
配列番号２１：  ５’−ＣＣＧＣＵＧＵＧＡＡＵＡＵＣＣＵＧＣＡＧＣＡＧＡＵ−３’
配列番号２２：  ５’−ＡＵＣＵＧＣＵＧＣＡＧＧＡＵＡＵＵＣＡＣＡＧＣＧＧ−３’【００３６】
これらのうち、配列番号１７〜２０で表されるｍＺＦＡＴ  ｓｉＲＮＡに対するそれぞれ対応するネガティブコントロールとして、下記塩基配列を有するコントロールセンスＲＮＡ（配列番号２３および２５）とアンチセンスＲＮＡ（配列番号２４および２６）を調製した。
配列番号２３：  ５’−ＣＡＧＡＧＡＡＣＵＣＧＵＧＡＣＣＣＡＣＧＵＣＵＵＵ−３’
配列番号２４：  ５’−ＡＡＡＧＡＣＧＵＧＧＧＵＣＡＣＧＡＧＵＵＣＵＣＵＧ−３’
配列番号２５：  ５’−ＣＡＧＵＧＧＵＡＵＵＣＧＵＣＡＡＣＵＣＵＧＣＧＡＡ−３’
配列番号２６：  ５’−ＵＵＣＧＣＡＧＡＧＵＵＧＡＣＧＡＡＵＡＣＣＡＣＵＧ−３’【００３７】
上記に示したように、この発明のＺＦＡＴ遺伝子の発現抑制ＲＮＡは、生体内において細胞内酵素（ダイサー）で切断されてｓｉＲＮＡを産生する低分子二重鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を包含する。このｓｈＲＮＡは、２本鎖部分を含みセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡがループ配列を介して連結しているステムループ構造を有するとともに、センス  ＲＮＡの３’末端とアンチセンスＲＮＡの５’末端がループ配列（ヘアピンループ配列）を介して連結されている構造をしている。なお、ヘアピンループ配列は限定されないが、約４〜７塩基からなる配列、例えばＣＧＡＡなどが挙げられる。【００３８】
この発明のｓｈＲＮＡとしては、例えば、図１０に示すように、マウスＺＦＡＴ遺伝子の塩基配列５５６番目からの塩基配列に相同のセンスＲＮＡ（５５６  Ｔｏｐ（５’−３’）：配列番号２７）とアンチセンスＲＮＡ（５５６  Ｂｏｔｔｏｍ（５’−３’）：配列番号２８）とからなる  ｓｈＲＮＡ（ｍＺＦＡＴ  ｓｈＲＮＡ  ＃１）なとが挙げられる。また、そのネガティブコントロールとして、センスＲＮＡ（Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔｏｐ（５’−３’）：配列番号２９）とアンチセンスＲＮＡ（Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｂｏｔｔｏｍ（５’−３’）：配列番号３０）とからなるｓｈＲＮＡを調製した。【００３９】
この発明のマウス  ＺＦＡＴ遺伝子のｓｉＲＮＡ  としては、例えば、図１０に示すように、マウスＺＦＡＴ遺伝子の塩基配列５５６番目からの塩基配列に相同のセンスＲＮＡ（５５６  Ｔｏｐ：配列番号２７）とアンチセンスＲＮＡ（５５６  Ｂｏｔｔｏｍ：配列番号２８）とからなるｓｉＲＮＡ（ｍＺＦＡＴ  ｓｉＲＮＡ１）なとが挙げられる。また、そのネガティブコントロールとして、下記塩基配列を有するコントロールセンスＲＮＡ（５５６  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔｏｐ：配列番号２９）とコントロールアンチセンスＲＮＡ（５５６  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｂｏｔｔｏｍ：配列番号３０）とからなるｓｉＲＮＡ（ｍＺＦＡＴ  ｓｈＲＮＡ２）を調製した。【００４０】
上記  ｓｈＲＮＡ（配列番号２７および２８）ならびにそのネガティブコントロール２本鎖ＲＮＡ（配列番号２９および３０）の塩基配列は下記の通りである。
配列番号２７：
５’−ＣＡＣＣＧＣＡＡＧＣＡＣＡＴＣＴＧＣＡＴＣＡＴＴＧＣＧＡＡＣＡＡＴＧＡＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣ−３’
配列番号２８：
５’−ＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＡＴＣＴＧＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＣＧＣＡＡＴＧＡＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣ−３’
配列番号２９：
５’−ＣＡＣＣＡＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＧＴＣＴＴ−３’
配列番号３０：
５’−ＡＡＡＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＴＴＣＧＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＧＴＣＴＴ−３’【００４１】
上記塩基配列中、左側の下線部分の塩基配列はセンスＤＮＡを表し、左側の下線部分の塩基配列はアンチセンスＤＮＡを表し、センスＤＮＡとアンチセンスＤＮＡ間の塩基配列はループ配列を表し、センスＤＮＡの５’側末端の配列はＢｓｍＢ１結合配列を表している。【００４２】
上記塩基配列で表されるこの発明に係るＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡは、例えば、上記センスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡをそれぞれ当該技術分野で公知の方法で化学合成し、化学合成したセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを公知の方法でアニーリングし、精製することによって調製することができる。【００４３】
この発明に係るＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡは、ＺＦＡＴ遺伝子の発現抑制しようとする生体内、例えば、細胞、組織、個体などにＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡを発現できる発現ベクターによって導入することができる。かかる発現ベクターで生体内に導入されたＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡは、生体内において発現されてＺＦＡＴ遺伝子の発現を抑制する。なお、この発明のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡは、そのまま細胞などの生体に導入することができるか、持続的効果の点では、発現ベクターによる導入が好ましい。【００４４】
この発明に係る発現ベクターは、常法に従って調製することができる。タンデムタイプの発現ベクター場合は、ＰＣＲによってセンスならびにアンチセンス配列を含むプライマーによりプロモーター部分を増幅し、増幅断片を制限酵素で切断後、ベクターのプロモーター、例えばＵ６プロモーターの下流に挿入することにより調製することができる。このタンデムタイプのｓｉＲＮＡ発現ベクターは、細胞内で２つのＵ６プロモーターからセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとが転写される。一方、ステムループの発現ベクターの場合、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡに対応するＤＮＡをそれぞれ合成し、該センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとをループ配列で連結した構造を有するセンス−ループ−アンチセンス配列を含むオリゴヌクレオチドからなる２本鎖ＲＮＡのテンプレートＤＮＡを合成アニールし、このテンプレートＤＮＡを発現ベクターのプロモーター、例えばＵ６プロモーター、Ｈ１プロモーター等のＰｏｌＩＩＩ系プロモーターの下流に挿入することにより調製することができる。このようにして発現ベクターに組み込まれたテンプレートＤＮＡは、細胞内でＲＮＡポリメラーゼによりショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が転写されて、細胞内酵素でプロセシングを受けてｓｉＲＮＡを産生することができる。また、ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどのベクターを用いることができる。プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＢＡｓｉベクター、ｐＳＵＰＥＲベクターなどを用いるのがよく、ウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを用いるのがよい。【００４５】
この発明においては、上記センスとアンチセンスＤＮＡを、それぞれ異なる発現ベクターに導入し、細胞内で別々に発現させて、細胞内においてアニールさせｓｉＲＮＡを生成させるようにしてもよい。これらの発現ベクターを用いる場合には、生体内あるいは細胞内で持続的にｓｉＲＮＡを産生させることが可能になりより好ましい。【００４６】
この発明に係るＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡがＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）により標的遺伝子の発現を抑制（サイレンシング）する程度は、該ＲＮＡを導入しない場合に比べて、標的遺伝子のｍＲＮＡまたは蛋白質の発現量が、１００％抑制されるのが特に好ましいが、１００％抑制されない場合であっても、その目的や用途などによっては、その標的遺伝子の発現が抑制されていると判断できる程度であればよいので、特にその程度は限定されるものではない。なお、ｍＲＮＡも蛋白質も、その発現量は常法に従って測定することができ、例えば、ｍＲＮＡの場合には、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＴなど、また蛋白質の場合には、ウェスタンブロッテイング、ＥＬＩＳＡなどによって測定できる。【００４７】
この発明に係るＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡは、癌細胞においてＺＦＡＴ蛋白質の発現を抑制するとともに（図２Ｂ）、ＺＦＡＴ遺伝子の発現抑制により癌細胞の細胞増殖率が低下していることから癌細胞増殖を抑制することができる（図３）。このように癌細胞におけるＺＦＡＴ遺伝子の発現が抑制されることにより、アポトーシスが引き起こされ（図５〜８）、また細胞周期に影響を及ぼし、フローサイトメトリーにおけるｓｕｂＧ１ならびにｅａｒｌｙＳ分画の増加を惹起している（図４、９）。【００４８】
また、この発明において、ＺＦＡＴ  ｓｉＲＮＡの標的部位により、アポトーシスおよび細胞周期に対する効果に違いが認められる（図１〜９）ことから、この発明のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡは、ＺＦＡＴ遺伝子の量と機能を抑制することができる抑制剤として、より高い選択性を有する癌の分子標的治療剤として使用できることを示している。【００４９】
さらに、この発明に係るＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡは、マウス末梢血のナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞において、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体により、免疫応答時（芽球化刺激を与えた時）に、ＺＦＡＴ遺伝子発現を抑制すると、コントロールに対してアポトーシスを誘導するカスパース（ｃａｓｐａｓｅ）９を著しく活性化することを示している（図１２、１３）。その後、この細胞の生存細胞数が、コントロールに対して著しく減少する（図１４）ことから、活性化誘導性Ｔ細胞アポトーシスに対する感受性が増大していることが示唆されている。この結果から、この発明のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡは、ＺＦＡＴ遺伝子の量と機能を抑制することができる免疫抑制剤として使用できることを示している。【００５０】
したがって、この発明は、別の実施形態として、この発明のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡを有効成分として含有するＺＦＡＴ遺伝子発現を抑制することができる分子標的治療剤や免疫抑制剤などの医薬組成物を提供する。また、この発明の医薬組成物は、ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡを有効成分として含有するという観点から、かかるＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡを導入したＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡ発現ベクターもその範疇に包含される。【００５１】
この発明に係るＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたはそれを発現する発現ベクターを分子標的治療剤や免疫抑制剤などの医薬組成物として適用する場合には、この発明のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたはそれを発現するベクターは、様々な製剤形態で経口投与または非経口投与することが可能である。経口投与のための製剤形態としては。例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤など、また非経口投与のための製剤形態としては、例えば、注射剤、外用剤、坐剤などが挙げられる。経口投与または非経口投与にするかどうかは、その用途などにより適宜選択するのがよい。かかる医薬製剤は、公知の薬学的に許容される担体、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、クエン酸、酢酸、リン酸、乳酸、乳酸ナトリウム、硫酸、水酸化ナトリウム等の希釈剤、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等のｐＨ調整剤ならびに緩衝剤、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸等の安定化剤などを適宜選択して使用することによって製剤化することができる。さらに、等張性の溶液を調製するに十分な量の食塩、ブドウ糖、マンニトールまたはグリセリンをさらに含有していてもよい。また、グルコース等の単糖類、サッカロース、マルトース等の二糖類、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール、塩化ナトリウム等の中性塩、グリシン等のアミノ酸、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等の非イオン系界面活性剤、ヒトアルブミン等を安定化剤として使用してこともできる。投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、通常、１日投与用量として、数ｍｇ〜２ｇ程度、好ましくは数１０ｍｇ程度を、１日１回から数回に分けて投与することができる。【００５２】
この発明の医薬組成物は、生体内での安定性や体内へのデリバリー方法として、リポソームなどのデリバリー担体、部位特異的な抗体または細胞種特異的な機能性ペプチドとの結合などの技術を応用して、製剤化することができる。また、細胞内への取り込みを促進するため、この発明のＲＮＡまたはその発現ベクターを、該ＲＮＡまたはベクターを含むリポソームとして調製して用いることもできる。【００５３】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、この実施例は、この発明を具体的に説明するための例示だけに過ぎす、この発明を一切限定するものではない。
【実施例１】
【００５４】
ヒトＺＦＡＴ（ＮＭ＿０２０８６３）およびマウスＺＦＡＴ（ＮＭ＿１９８６４４）における二本鎖ＲＮＡは次のようにして調製した。まず、その２本鎖ＲＮＡを構成するセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとを、リボヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトを用いて、市販のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３９４型）でオリゴリボヌクレオチドそれぞれ化学合成した。合成終了後、合成したオリゴヌクレオチドが結合したＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ）を濃アンモニア水：エタノール（３：１ｖ／ｖ）混液で室温２時間処理してオリゴリボヌクレオチドをＣＰＧ樹脂から切り出し、更に５５℃で１６時間加温した。その後、溶媒を留去し、残渣に１Ｍ  ＴＢＡＦ（テトラブチルアンモニウムフルオリド）／ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）溶液を加え、３７℃で１６時間攪拌した。これに０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ  ７．０）を添加後、５％  −  ４０％アセトニトリル、５０ｍＭトリエチルアンモニウムビカルボネート水溶液の溶媒を用いた濃度勾配によりカラムクロマトグラフィーで分離した。約３０％濃度のアセトニトリルで溶出されるジメトキシトリチルの発色を有するフラクションを集め、これに０．０１Ｎ塩酸を加え攪拌し、ジメトキシトリチル基を除去した。続いて、０．１Ｎアンモニア水で中和し、水層を酢酸エチルで洗浄し、溶媒留去後、滅菌水に溶解した。この画分中のオリゴリボヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣで分離して分取後、さらにイオン交換ＨＰＬＣで分離・分取し、精製した。得られたオリゴヌクレオチドを後述の実験に供した。なお、その配列は、Ｂｌｏｃｋ−ｉｔ  ＲＮＡｉ  ｄｅｓｉｎｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて決定し、常法に従ってアニーリングおよび精製をして各配列番号で表される塩基配列を持つｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを調製した。
【実施例２】
【００５５】
図１１で示すｓｈＲＮＡ発現ベクターは次のようにして構築した。ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−Ｄｅｓｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．ｎｏ．４３−０３１５）のＣｌａＩとＳａｌＩサイトにヒトＵ６プロモーター（Ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｍ１４４８６  ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ６５−３２９）を挿入し、ＳａｌＩとＭｌｕＩ  サイトにＵ６−ｔｅｒｍを挿入し、ｐＬｅｎｔｉ６−Ｕ６＋ｔｅｒｍとした。さらにＢｓｍＢＩで切断することで２本鎖合成オリゴヌクレオチドＤＮＡのクローニングサイトとした。ＢｓｍＢ１切断部位とアニーリングしたオリゴヌクレオチドを結合させるため各オリゴヌクレオチドにはＴｏｐ鎖の５’側にＣＡＣＣ配列を、Ｂｏｔｔｏｍ鎖の５’側にＡＡＡＡ  配列を付した。ループ配列（５’−ＣＧＡＡ−３’）を挟んでセンスＲＮＡ  とアンチセンスＲＮＡ（各２１塩基）を配し、配列決定にはＢｌｏｃｋ−ｉＴ  Ｕ６  ＲＮＡｉ  Ｅｎｔｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．ｎｏ．Ｋ４９４４−００）のマニュアルを参照した。ＴｏｐおよびＢｏｔｔｏｍ配列をアニーリング後、Ｔ４リガーゼにてライゲーションし、サブクローニングした。なお、ネガティブコントロールとしては、Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔｏｐ配列（配列番号２９）およびＣｏｎｔｒｏｌ  Ｂｏｔｔｏｍ配列（配列番号３０）からなるｅＧＦＰｓｈＲＮＡを使用した。
【実施例３】
【００５６】
ヒト末梢血から分離されたＢリンパ球ならびにＴリンパ球および、その他の白血球画分から抽出された蛋白質をウェスタンブロット解析で調べた。
ヒト末梢血をフィコール遠心分離にかけ、白血球を回収し、さらにＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）のヒトＣＤ１９磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）およびヒトＣＤ３磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）  でそれぞれＢならびにＴリンパ球を連続的に分離した。素通り画分を非ＢならびにＴ細胞とした。これらの細胞のウェスタンブロット解析の結果、ＺＦＡＴ蛋白質がヒト末梢血由来のＢリンパ球およびＴリンパ球で発現していることを確認した（図２Ａ）。
【実施例４】
【００５７】
ＭＯＬＴ−４細胞に実施例で作製したｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド２種（ＺＦＡＴ＃１ならびにＺＦＡＴ＃２）およびその対照ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド２種（Ｓｃｒａｍｂｌｅ＃１ならびにＳｃｒａｍｂｌｅ＃２）  を導入し、２４時間後時点および４８時間後時点で抽出した蛋白質をウェスタンブロット解析で調べた。ＭＯＬＴ−４細胞はＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ）に１０％ウシ血清を添加した培地中で３７℃、５％  ＣＯ２存在下で培養した。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの導入は、ＭｉｃｒｏＰｏｒａｔｏｒ  ＭＰ−１００（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｂｉｏ）を使用して行い、細胞１×１０６個に１００ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを導入した。蛋白質抽出は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、０．５％デオキシコレート（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、０．１％  ＳＤＳ、プロテアーゼ・インヒビター・カクテルを用いて行なった。また、抗体は非特許文献１で作成された抗ＺＦＡＴウサギポリクローナル抗体を使用した。このウェスタンブロット解析の結果、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド２種  （ＺＦＡＴ＃１ならびにＺＦＡＴ＃２）によって、ＭＯＬＴ−４細胞においてＺＦＡＴ発現が抑制されていることを確認した（図２Ｂ）。
【実施例５】
【００５８】
ＺＦＡＴ発現抑制によってＭＯＬＴ−４細胞増殖率の低下が見られるかどうかを調べた。
実施例１で作製したｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＺＦＡＴ＃１，  ＺＦＡＴ＃２，  Ｓｃｒａｍｂｌｅ＃１，  Ｓｃｒａｍｂｌｅ＃２）をＭＯＬＴ−４細胞にそれぞれ導入後、２４ウエルプレートに５×１０４個／ウエルで播種し、細胞数をｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（ＤＯＪＩＮ）で経時的（２４、４８ならびに７２時間時点）に測定した。その結果を図３に示す。図中の結果から、ＺＦＡＴ発現抑制群は、対照と比較して細胞増殖率が低下していることを確認した。
【実施例６】
【００５９】
ＺＦＡＴ発現抑制細胞における細胞周期の解析（Ｓｕｂ−Ｇ１期の増加）を行った。
実施例１で作製したｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＺＦＡＴ＃１，  ＺＦＡＴ＃２，  Ｓｃｒａｍｂｌｅ＃１，  Ｓｃｒａｍｂｌｅ＃２）をＭＯＬＴ−４細胞にそれぞれ導入後、４８時間時点で、７０％エタノール固定（４８時間、−２０℃）した。細胞を１μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅにて３７℃で１時間処理後、プロピジウムヨーダイド（１０μｇ／ｍｌ、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）染色し、フローサイトメーターでＤＮＡ量を測定して細胞周期解析を行った。その結果、ＺＦＡＴ発現抑制細胞群は、対照と比較してＳｕｂ−Ｇ１期の割合が増加していたが、その他の細胞周期には差は認められなかった（図４）。
【実施例７】
【００６０】
本実施例では、ＺＦＡＴ発現抑制細胞におけるアポトーシス誘導について調べた。実施例１で作製したｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＺＦＡＴ＃１，  ＺＦＡＴ＃２，  Ｓｃｒａｍｂｌｅ＃１，  Ｓｃｒａｍｂｌｅ＃２）をＭＯＬＴ−４細胞にそれぞれ導入後、２４時間および４８時間時点でアネキシンＶ染色を行い、ＴＡＣＳ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  Ｋｉｔ（ＴＲＥＶＩＧＥＮ）を用いてアネキシンＶ陽性細胞をフローサイトメーターでアポトーシス陽性細胞数を測定した。その結果、図５に示すように、ＺＦＡＴ発現抑制細胞群は、対照と比較して有意なアポトーシスの増加が認められた。
【実施例８】
【００６１】
本実施例では、ＺＦＡＴ発現抑制細胞における活性型カスパーゼ３（ｃａｓｐａｓｅ３）が検出されるかどうかを調べた。
実施例１で作製したｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＺＦＡＴ＃１ならびに  ＺＦＡＴ＃２）およびそれらのそれぞれのスクランブル配列（Ｓｃｒａｍｂｌｅ＃１ならびにＳｃｒａｍｂｌｅ＃２）をＭＯＬＴ−４細胞にそれぞれ導入後、２４および４８時間時点で細胞を回収し、抗活性型カスパーゼ３抗体による染色を行い、Ａｃｔｉｖｅ  Ｃａｓｐａｓｅ−３  ＰＥ  ＭＡｂ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いてカスパーゼ３陽性細胞をフローサイトメーターで検出した。ＺＦＡＴ発現抑制細胞群は、対照と比較して陽性細胞数の増加が認められた（図６）。この結果、ＺＦＡＴ発現抑制細胞における活性型カスパーゼ３が検出されたことから、細胞にアポトーシスを誘導するシグナル伝達経路が存在することが認められた。このことから、ＺＦＡＴ発現抑制細胞におけるアポトーシスは、カスパーゼ３の活性化を介して誘導されていることが確認された。
【実施例９】
【００６２】
本実施例では、ＺＦＡＴ発現抑制細胞におけるカスパーゼ８（ｃａｓｐａｓｅ  ８）活性およびカスパーゼ９（ｃａｓｐａｓｅ  ９）活性を測定した。
実施例１で作製されたｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＺＦＡＴ＃１ならびにＺＦＡＴ＃２）およびそれらのそれぞれのスクランブル配列（Ｓｃｒａｍｂｌｅ＃１ならびに  Ｓｃｒａｍｂｌｅ＃２）をＭＯＬＴ−４細胞にそれぞれ導入後、４８時間時点でＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ８  Ａｓｓａｙ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）または  Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ９  Ａｓｓａｙ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてカスパーゼ８（図７Ａ）またはカスパーゼ９（図７Ｂ）の活性を測定した。その結果、ＺＦＡＴ発現抑制細胞群は、対照と比較してｃａｓｐａｓｅ  ８およびｃａｓｐａｓｅ  ９の活性の増加が認められた。このことから、ＺＦＡＴ発現抑制によるアポトーシスは、カスパーゼ８およびカスパーゼ９の活性化を介して誘導されることが顕著に確認された。
【実施例１０】
【００６３】
本実施例では、ＺＦＡＴ発現抑制によって引き起こされるアポトーシスは、カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤによって阻害されるかどうかを調べた。
カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤあるいはその対照としてのＤＭＳＯ存在下において実施例１で作製されたｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＺＦＡＴ＃２またはＳｃｒａｍｂｌｅ＃２）をＭＯＬＴ−４細胞に導入し、２４時間時点でアネキシンＶ染色によるアポトーシス陽性細胞測定を行った。その結果、カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤの存在下においてアポトーシスは有意に抑制されていることが観察された（図８Ａ）。【００６４】
カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤあるいはその対照としてのＤＭＳＯ存在下において実施例１で作製されたｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＺＦＡＴ＃１，ＺＦＡＴ＃２，Ｓｃｒａｍｂｌｅ＃１，Ｓｃｒａｍｂｌｅ＃２）をそれぞれＭＯＬＴ−４細胞に導入し、細胞数をｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（ＤＯＪＩＮ）で経時的に測定した。その結果、ＺＦＡＴ発現抑制による増殖抑制は、Ｚ−ＶＡＤにより完全に阻害されていることが観察された（図８Ｂ）。
【実施例１１】
【００６５】
本実施例では、ＺＦＡＴのＣ末端領域を標的としたＺＦＡＴ  ｓｉＲＮＡによるＺＦＡＴ抑制時での細胞周期解析を行った。
ＺＦＡＴのＣ末端領域を標的とした実施例１で作製したｈＺＦＡＴ  ｓｉＲＮＡ  ＃５（コントロールとしてＳｃｒａｍｂｌｅ配列）をそれぞれＭＯＬＴ４細胞に導入し、４８時間後、抗ＺＦＡＴ抗体（Ｍ１６）を用いて免疫染色し、ＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した結果、ＺＦＡＴ  ｓｉＲＮＡによるＺＦＡＴの発現抑制が確認された（図９Ａ）。免疫染色は、ＺＦＡＴ特異的抗体（Ｍ１６）にて免疫染色（１：１００）し、抗ラットａｌｅｘａ  ４８８抗体にて検出した（１：２００）。【００６６】
また、ＺＦＡＴのＣ末端領域を標的としたＺＦＡＴ  ｓｉＲＮＡ  ＃５（コントロールとしてＳｃｒａｍｂｌｅ配列）をそれぞれＭＯＬＴ４細胞に導入し、４８時間後にＢｒｄＵ  Ｆｌｏｗ  ｋｉｔ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）による細胞周期解析を行った。この解析結果は、ＺＦＡＴ抑制時ではコントロールに対して、早期Ｓ期への移行を抑制することを示している（図９Ｂ）。
【実施例１２】
【００６７】
本実施例は、実施例２で構築したｓｈＲＮＡ発現ベクターの形質導入について調べたものである。実施例１で合成したオリゴヌクレオチドＤＮＡをアニーリングにより２本鎖合成オリゴヌクレオチドＤＮＡに調製後、構築したベクター（ｐＬｅｎｔｉ６−Ｕ６＋ｔｅｒｍ）にクローニングし、ＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭパッケージングプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに  リオフェクタミンＴＭ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトした。４８時間後にウイルスを含む培養上清を回収し、タイターを測定後、ＣＤ４陽性細胞に形質導入した。ＣＤ４陽性細胞は、マウスＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）磁気ビーズを用いてマウス脾細胞から分離した。
分離したＣＤ４陽性細胞は、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ＦＣＳ、５０μＭ  ２−ＭＥ）にて７２時間培養後、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）８ｕｇ／ｍｌで３時間処理し、ＭＯＩ＝１のウイルス上清にて形質導入した。ＩＬ−７は継続して投与した。さらに７２時間後に抗ＣＤ３抗体（１４５−２Ｃ１１；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でコーテイング（１ｕｇ／ｍｌ）したプレートにＣＤ４陽性細胞を播種し、抗ＣＤ２８抗体（３７．５１；  ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）芽含まれるＲＰＭＩ−１６４０にて刺激を開始した。
【実施例１３】
【００６８】
本実施例では、実施例２で作成したｓｈＲＮＡ発現ベクターによるＺＦＡＴ発現抑制を調べた。ＣＤ４陽性細胞にｓｈＲＮＡ発現ベクターの形質導入４８時間後、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体刺激し、２日後の抗ＺＦＡＴ抗体（ｍ１６）による免疫染色像とＤＡＰＩ像による核染色を行った。コントロール（ｅＧＦＰ  ｓｈＲＮＡ）に対して、ＺＦＡＴ  ｓｈＲＮＡではＺＦＡＴの発現が抑制された（図１２）。ＺＦＡＴの発現部位は主に核であり、細胞質のほとんどのシグナルは非特異的であると考えられる。コントロールでは核のシグナルが観察されたのに対して、ＺＦＡＴ  ｓｈＲＮＡでは核のシグナルはほとんど観察されなかった。
【実施例１４】
【００６９】
本実施例では、ＣＤ４陽性細胞の抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体刺激時における実施例２で作成したｓｈＲＮＡ発現ベクターによるＺＦＡＴ発現抑制の影響を調べた。ＣＤ４陽性細胞にｓｈＲＮＡ発現ベクターの形質導入７２時間後、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体刺激し、０．２４時間後のＤＡＰＩ像および免疫染色像を調べた（図１３）。コントロール（ｅＧＦＰ  ｓｈＲＮＡ）では刺激後カスパーゼ９（ｃａｓｐａｓｅ  ９）の活性は誘導されなかったが、ＺＦＡＴ  ｓｈＲＮＡでは、２４時間後に明らかなカスパーゼ９の活性化が認められた。このことから、ＺＦＡＴ  ｓｈＲＮＡは、ＺＦＡＴの発現・機能の抑制が活性化誘導性Ｔ細胞アポトーシスに対する感受性を増大することが示唆される。なお、ＣＤ４陽性細胞は、マウスＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて、マウス脾細胞から分離した。また、ＣＤ４  陽性細胞の抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体による刺激は、抗ＣＤ３抗体（１４５−２Ｃ１１；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をプレートにコーティング（１ｕｇ／ｍｌ）した後、ＰＢＳ（−）で洗浄し、ＣＤ４陽性細胞を抗ＣＤ２８抗体（３７．５１；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（５ｕｇ／ｍｌ）が含まれるＲＰＭＩ−１６４０（１０％ＦＣＳ、５０μＭ  ２−ＭＥ）にて、３７℃で培養して行った。なお、免疫染色は、ＣＹＴＯＳＰＩＮ４（Ｔｈｅｒｍｏ）にて浮遊細胞をスライドグラスに塗沫後、１０％ホルマリン固定した。ＺＦＡＴ特異的抗体（Ｍ１６）およびｃａｓｐａｓｅ−９  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｎｔｉ−ｖｉｍｅｎｔｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）にて免疫染色（１：２００）し、抗ラットａｌｅｘａ  ４８８抗体および抗ラビットａｌｅｘａ  ５４６抗体にて検出した（１：２００）。核染色はＤＡＰＩ（１：２００）にて行った。
【実施例１５】
【００７０】
本実施例では、実施例１２と同様のＣＤ４陽性細胞の抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体刺激時における実施例２で作成したｓｈＲＮＡ発現ベクターによるＺＦＡＴ発現抑制のＴ細胞数に対する影響を調べた。ＣＤ４陽性細胞にｓｈＲＮＡ発現ベクターの形質導入後、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激し、７２時間後の光学顕微鏡像を調べた。その結果、コントロールに比べ、ＺＦＡＴ  ｓｈＲＮＡでは細胞数が減少しており、ＺＦＡＴ発現抑制によりアポトーシスが誘導されることが示唆された（図１４）。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
この発明に係るＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡおよびそれを含む発現ベクターは、例えば、細胞、組織、個体などの発現を抑制しようとする生体内に導入することによって、ＺＦＡＴ遺伝子の発現を抑制するとともに、アポトーシスを誘導することができる。したがって、この発明のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡは、ＺＦＡＴ遺伝子の発現抑制により、癌などの病気の予防や治療用医薬組成物としてばかりではなく、選択性がより高い分子標的治療剤または免疫抑制剤としても使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年7月8日(2010.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２０〜３０塩基の配列のセンスＲＮＡおよび該配列と相補的な配列のアンチセンスＲＮＡを含む２本鎖ＲＮＡからなることを特徴とするＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡにおいて、前記センスＲＮＡの塩基配列がＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２３〜２７塩基からなることを特徴とするＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡにおいて、前記２本鎖ＲＮＡが、そのそれぞれの鎖の３’端に１〜６個のヌクレオチドを付加した２本鎖ＲＮＡであることを特徴とするＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡ。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡにおいて、前記ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡが、ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２０〜３０塩基の配列のセンスＲＮＡおよび該配列と相補的な配列のアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡまたは該センスＲＮＡと該アンチセンスＲＮＡとをループ配列で結合したｓｈＲＮＡであることを特徴とするＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡにおいて、前記センスＲＮＡの塩基配列がＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２３〜２７塩基からなることを特徴とするＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡ。
【請求項６】
請求項４または５に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡにおいて、前記ループ配列が１〜６塩基のスペーサーオリゴヌクレオチドからなり、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとを結合し、ヘアピン構造を形成していることを特徴とするＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡ。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡにおいて、前記２本鎖が、配列番号１および２でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、配列番号３および４でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、配列番号５および６でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、もしくは配列番号７および８でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡとからなるヒトＺＦＡＴ遺伝子（ｈＺＦＡＴ）ｓｉＲＮＡ、または配列番号１７および１６でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、配列番号１９および１８でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡもしくは配列番号２１および２０でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなるｍＺＦＡＴ  ｓｉＲＮＡであることを特徴とするＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡ。
2010026660.tif 000016
【請求項８】
請求項４ないし６のいずれか１項に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡにおいて、前記ｓｈＲＮＡが、配列番号２７および２６でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡとからなることを特徴とするＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡ。
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2010026660.tif 000018
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡを発現することを特徴とする発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは請求項９に記載の発現ベクターを細胞に導入することにより、該細胞中のＺＦＡＴ遺伝子の発現を抑制することを特徴とするＺＦＡＴ遺伝子発現抑制方法。
【請求項１１】
ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２０〜３０塩基の配列のセンスＲＮＡおよび該配列と相補的な配列のアンチセンスＲＮＡを含む２本鎖ＲＮＡからなるＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは該ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡを発現する発現ベクターを細胞に導入することにより、該細胞の増殖を抑制することを特徴とする細胞増殖抑制方法。
【請求項１２】
ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２０〜３０塩基の配列のセンスＲＮＡおよび該配列と相補的な配列のアンチセンスＲＮＡを含む２本鎖ＲＮＡからなるＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは該ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡを発現する発現ベクターを細胞に導入することにより、該細胞のアポトーシスを誘導することまたは生体内における免疫応答を阻害することを特徴とするアポトーシス誘導方法。
【請求項１３】
ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２０〜３０塩基の配列のセンスＲＮＡおよび該配列と相補的な配列のアンチセンスＲＮＡを含む２本鎖ＲＮＡからなるＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは該ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡを発現する発現ベクターを細胞に導入することにより、生体内における免疫応答を阻害することを特徴とする免疫抑制方法。
【請求項１４】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２０〜３０塩基の配列のセンスＲＮＡおよび該配列と相補的な配列のアンチセンスＲＮＡを含む２本鎖ＲＮＡからなるＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは請求項９に記載の発現ベクターを有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１５】
ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２０〜３０塩基の配列のセンスＲＮＡおよび該配列と相補的な配列のアンチセンスＲＮＡを含む２本鎖ＲＮＡからなるＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡまたは該ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡを発現する発現ベクターが、細胞増殖を抑制またはアポトーシスの誘導により、または免疫応答阻害により、癌などの疾患の治療もしくは予防をすることができる有効成分として含有されていることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１１に記載の細胞増殖抑制方法であって、前記センスＲＮＡの塩基配列がＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２３〜２７塩基からなることを特徴とする細胞増殖抑制方法。
【請求項１７】
請求項１１または１６に記載の細胞増殖抑制方法であって、前記２本鎖ＲＮＡが、そのそれぞれの鎖の３’端に１〜６個のヌクレオチドを付加した２本鎖ＲＮＡであることを特徴とする細胞増殖抑制方法。
【請求項１８】
請求項１１、１６または１７に記載の細胞増殖抑制方法であって、前記ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡが、ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２０〜３０塩基の配列のセンスＲＮＡおよび該配列と相補的な配列のアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡまたは該センスＲＮＡと該アンチセンスＲＮＡとをループ配列で結合したｓｈＲＮＡであることを特徴とする細胞増殖抑制方法。
【請求項１９】
請求項１１および請求項１６ないし１８のいずれか１項に記載の細胞増殖抑制方法であって、前記センスＲＮＡの塩基配列がＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２３〜２７塩基からなることを特徴とする細胞増殖抑制方法。
【請求項２０】
請求項１１および請求項１６ないし１９のいずれか１項に記載の細胞増殖抑制方法であって、前記ループ配列が１〜６塩基のスペーサーオリゴヌクレオチドからなり、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとを結合し、ヘアピン構造を形成していることを特徴とする細胞増殖抑制方法。
【請求項２１】
請求項請求項１１および請求項１６ないし２０のいずれか１項に記載の細胞増殖抑制方法であって、前記２本鎖が、配列番号１および２でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、配列番号３および４でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、配列番号５および６でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、もしくは配列番号７および８でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡとからなるヒトＺＦＡＴ遺伝子（ｈＺＦＡＴ）ｓｉＲＮＡ、または配列番号１７および１６でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、配列番号１９および１８でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡもしくは配列番号２１および２０でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなるｍＺＦＡＴ  ｓｉＲＮＡであることを特徴とする細胞増殖抑制方法。
2010026660.tif 000019
【請求項２２】
請求項１１および請求項１６ないし２１のいずれか１項に記載の細胞増殖抑制方法であって、前記ｓｈＲＮＡが、配列番号２７および２８でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡとからなることを特徴とする細胞増殖抑制方法。
2010026660.tif 000020
2010026660.tif 000021
【請求項２３】
請求項１２に記載のアポトーシス誘導方法であって、前記センスＲＮＡの塩基配列がＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２３〜２７塩基からなることを特徴とするアポトーシス誘導方法。
【請求項２４】
請求項１２または２３に記載のアポトーシス誘導方法であって、前記２本鎖ＲＮＡが、そのそれぞれの鎖の３’端に１〜６個のヌクレオチドを付加した２本鎖ＲＮＡであることを特徴とするアポトーシス誘導方法。
【請求項２５】
請求項１２、２３または２４に記載のアポトーシス誘導方法であって、前記ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡが、ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２０〜３０塩基の配列のセンスＲＮＡおよび該配列と相補的な配列のアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡまたは該センスＲＮＡと該アンチセンスＲＮＡとをループ配列で結合したｓｈＲＮＡであることを特徴とするアポトーシス誘導方法。
【請求項２６】
請求項１２および請求項２３ないし２５のいずれか１項に記載のアポトーシス誘導方法であって、前記センスＲＮＡの塩基配列がＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２３〜２７塩基からなることを特徴とするアポトーシス誘導方法。
【請求項２７】
請求項１２および請求項２３ないし２６のいずれか１項に記載のアポトーシス誘導方法であって、前記ループ配列が１〜６塩基のスペーサーオリゴヌクレオチドからなり、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとを結合し、ヘアピン構造を形成していることを特徴とするアポトーシス誘導方法。
【請求項２８】
請求項１２および請求項２３ないし２７のいずれか１項に記載のアポトーシス誘導方法であって、前記２本鎖が、配列番号１および２でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、配列番号３および４でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、配列番号５および６でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、もしくは配列番号７および８でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡとからなるヒトＺＦＡＴ遺伝子（ｈＺＦＡＴ）ｓｉＲＮＡ、または配列番号１７および１６でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、配列番号１９および１８でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡもしくは配列番号２１および２０でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなるｍＺＦＡＴ  ｓｉＲＮＡであることを特徴とするアポトーシス誘導方法。
2010026660.tif 000022
【請求項２９】
請求項１２および請求項２３ないし２８のいずれか１項に記載のアポトーシス誘導方法であって、前記ｓｈＲＮＡが、配列番号２７および２８でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡとからなることを特徴とするアポトーシス誘導方法。
2010026660.tif 000023
【請求項３０】
請求項１３に記載の免疫抑制方法であって、前記センスＲＮＡの塩基配列がＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２３〜２７塩基からなることを特徴とする免疫抑制方法。
【請求項３１】
請求項１３または３０に記載の免疫抑制方法であって、前記２本鎖ＲＮＡが、そのそれぞれの鎖の３’端に１〜６個のヌクレオチドを付加した２本鎖ＲＮＡであることを特徴とする免疫抑制方法。
【請求項３２】
請求項１３、３０または３１に記載の免疫抑制方法であって、前記ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡが、ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２０〜３０塩基の配列のセンスＲＮＡおよび該配列と相補的な配列のアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡまたは該センスＲＮＡと該アンチセンスＲＮＡとをループ配列で結合したｓｈＲＮＡであることを特徴とする免疫抑制方法。
【請求項３３】
請求項１３および請求項３０ないし３２のいずれか１項に記載の免疫抑制方法であって、前記センスＲＮＡの塩基配列がＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２３〜２７塩基からなることを特徴とする免疫抑制方法。
【請求項３４】
請求項１３および請求項３０ないし３３のいずれか１項に記載の免疫抑制方法であって、前記ループ配列が１〜６塩基のスペーサーオリゴヌクレオチドからなり、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとを結合し、ヘアピン構造を形成していることを特徴とする免疫抑制方法。
【請求項３５】
請求項１３および請求項３０ないし３４のいずれか１項に記載の免疫抑制方法であって、前記２本鎖が、配列番号１および２でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、配列番号３および４でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、配列番号５および６でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、もしくは配列番号７および８でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡとからなるヒトＺＦＡＴ遺伝子（ｈＺＦＡＴ）ｓｉＲＮＡ、または配列番号１７および１６でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、配列番号１９および１８でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡもしくは配列番号２１および２０でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなるｍＺＦＡＴ  ｓｉＲＮＡであることを特徴とする免疫抑制方法。
2010026660.tif 000024
【請求項３６】
請求項１３および請求項３０ないし３５のいずれか１項に記載の免疫抑制方法であって、前記ｓｈＲＮＡが、配列番号２７および２８でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡとからなることを特徴とする免疫抑制方法。
2010026660.tif 000025
【請求項３７】
請求項１５に記載の医薬組成物であって、前記センスＲＮＡの塩基配列がＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２３〜２７塩基からなることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３８】
請求項１５または３７に記載の医薬組成物であって、前記２本鎖ＲＮＡが、そのそれぞれの鎖の３’端に１〜６個のヌクレオチドを付加した２本鎖ＲＮＡであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３９】
請求項１５，３７または３８に記載の医薬組成物であって、前記ＺＦＡＴ遺伝子発現抑制ＲＮＡが、ＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２０〜３０塩基の配列のセンスＲＮＡおよび該配列と相補的な配列のアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡまたは該センスＲＮＡと該アンチセンスＲＮＡとをループ配列で結合したｓｈＲＮＡであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４０】
請求項１５および請求項３７ないし３９のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、前記センスＲＮＡの塩基配列がＺＦＡＴ  ｍＲＮＡの連続する２３〜２７塩基からなることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４１】
請求項１５および請求項３７ないし４０のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、前記ループ配列が１〜６塩基のスペーサーオリゴヌクレオチドからなり、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとを結合し、ヘアピン構造を形成していることを特徴とする医薬組成物。
【請求項４２】
請求項１５または３７ないし４１のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、前記２本鎖が、配列番号１および２でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、配列番号３および４でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、配列番号５および６でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、もしくは配列番号７および８でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡとからなるヒトＺＦＡＴ遺伝子（ｈＺＦＡＴ）ｓｉＲＮＡ、または配列番号１７および１６でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ、配列番号１９および１８でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡもしくは配列番号２１および２０でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡからなるｍＺＦＡＴ  ｓｉＲＮＡであることを特徴とする医薬組成物。
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【請求項４３】
請求項１５または３７ないし４２のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、前記ｓｈＲＮＡが、配列番号２７および２８でそれぞれ表される下記塩基配列を有するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡとからなることを特徴とする医薬組成物。
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【国際調査報告】
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