(57)【要約】α−グルコシダーゼをプロテアーゼ等で部分分解することにより、簡便かつ容易にα−グルコシダーゼの活性を向上させる方法及び活性の向上された酵素を得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−グルコシダーゼの活性中心よりＮ末端側の部分を切断することを特徴とするα−グルコシダーゼの製造方法。
【請求項２】
活性中心よりＮ末端側の部分の切断をプロテアーゼにより行うことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
α−グルコシダーゼがＡｓｐｅｒｕｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のものである請求の範囲第１項１又は第２項記載の方法。
【請求項４】
活性中心よりＮ末端側の切断箇所が、Ａｓｐｅｒｕｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来α−グルコシダーゼ配列の４８９残基以内である請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項５】
活性中心よりＮ末端側の切断箇所が、Ａｓｐｅｒｕｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来α−グルコシダーゼ配列の２６７〜４８９残基の間である請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項６】
プロテアーゼが、中性プロテアーゼ又はアルカリプロテアーゼであることを特徴とする請求の範囲第２項２乃至第５項の何れかに記載の方法。
【請求項７】
請求の範囲第１項１乃至第６項の何れかに記載の方法で製造されたα−グルコシダーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性の向上されたα−グルコシダーゼ及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−グルコシダーゼは、非還元末端α−１，４−グルコシド結合を加水分解し、α−グルコースを生成する酵素である。ちなみに、グルコアミラーゼはα−グルコシダーゼと類似の反応を起こすが、生成するグルコースはα−グルコースではなく、β−グルコースである。さらに、一部のα−グルコシダーゼは、水酸基を持つ適当な受容体がある場合、グルコースをα−１，４結合よりα−１，６結合へと転移させ、分岐糖を生成する糖転移活性を有するものがあり、そのような酵素はトランスグルコシダーゼと称される場合もある。工業的には、α−アミラーゼ等と組み合わせて澱粉の糖化用途に用いられ、一部のα−グルコシダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のトランスグルコシダーゼ）は分岐糖の製造に用いられている。また、培養制御や味質改善の目的で醸造用途にも用いられている（特開昭５４−１５７８９７号公報、特開平１−１７１４７２号公報）。また、最近では物性改良効果にも着目され、その用途での使用も広がっている（ＷＯ２００５／０９６８３９）。しかしながら、α−グルコシダーゼはα−アミラーゼやグルコアミラーゼ等と比べると値段が高く、それほど多くの用途に用いられていないのが現状である。
こうした高価格対策として、酵素の発現量を増加させる等の手段・研究が、従来から様々な微生物で種々の酵素を対象として行われてきた。これらの方法は非常に有用でありかつ効果的であることはこれまでに様々な報告があることからも推察できる。また、発現量は変わらないが酵素の一部のアミノ酸配列を変えることで、高活性化した酵素を得るという研究も報告されている（特開平７−１７７８９１号公報、特開平１１−２９９４８６号公報、特開平９−７５０８４号公報）。この方法は非常に煩雑でありかつ非常に難しいが、効果的であることはこれまでの報告から推察できる。
一方、我々は全く違う方法で酵素の活性を向上させる方法を見いだした。すなわち、酵素（α−グルコシダーゼ）タンパク質をある特定の部位にて切断、分解することにより酵素の活性が上昇するという知見を見出した。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は、活性を向上させたα−グルコシダーゼ及び本酵素の製造方法を提供することである。
本発明者等は、鋭意研究を行った結果、α−グルコシダーゼをある特定の範囲で切断、部分分解することにより上記目的を達成しうることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下の通りである。
（１）α−グルコシダーゼの活性中心よりＮ末端側の部分を切断することを特徴とするα−グルコシダーゼの製造方法。
（２）活性中心よりＮ末端側の部分の切断をプロテアーゼにより行うことを特徴とする（１）記載の方法。
（３）α−グルコシダーゼがＡｓｐｅｒｕｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来のものである（１）又は（２）記載の方法。
（４）活性中心よりＮ末端側の切断箇所が、Ａｓｐｅｒｕｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来α−グルコシダーゼ配列の４８９残基以内である（３）記載の方法。
（５）活性中心よりＮ末端側の切断箇所が、Ａｓｐｅｒｕｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来α−グルコシダーゼ配列の２６７〜４８９残基の間である（３）記載の方法。
（６）プロテアーゼが、中性プロテアーゼ又はアルカリプロテアーゼであることを特徴とする（２）乃至（５）の何れかに記載の方法。
（７）（１）乃至（６）の何れかに記載の方法で製造されたα−グルコシダーゼ。
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明のα−グルコシダーゼはその由来を問わないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ等の麹菌由来のものが例示され、トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」という商品名で天野エンザイム（株）より市販されている酵素が一例である。
α−グルコシダーゼの切断の方法は、プロテアーゼによる分解、酸やアルカリによる加水分解あるいは物理的な切断等いずれの方法を用いても構わないが、プロテアーゼによる分解が、酵素が活性を保ちやすく、また反応を制御しやすいという理由で好ましい。分解にはどのプロテアーゼを用いても構わないが、中性あるいはアルカリプロテアーゼが好ましい。本発明に用いることのできるプロテアーゼの例として、パパインＷ−４０や、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇという商品名で天野エンザイム（株）より市販されている酵素が挙げられる。プロテアーゼを用いる場合は、α−グルコシダーゼ溶液にプロテアーゼを添加し、各プロテアーゼの適正反応温度で、適切な時間反応させればよい。例えば、パパインＷ−４０であれば２０〜７０℃で１〜１２０分反応させればよい。反応停止は低温下（１０℃以下）でプロテアーゼを低活性化する、もしくは、プロテアーゼインヒビターを加えて活性を低下させることにより行う。分解されたα−グルコシダーゼとプロテアーゼの分画は分子量分画やイオン交換、アフィニテイークロマトなど種々の方法が考えられるが、膜やカラムによる分子量分画あるいは硫安やエタノール沈殿による分画が簡便である。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのα−グルコシダーゼの全配列は既に文献（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，５３，（１９９７）７５−８４  Ａ．Ｎａｋａｍｕｒａら）で明らかにされており、配列番号１に示すとおりである。その活性中心は４９０残基のアスパラギン酸（Ｄ（４９０）），４９３残基のグルタミン酸（Ｅ（４９３）），６６０の残基アスパラギン酸（Ｄ（６６０））であり、切断の位置は活性中心Ｄ（４９０）よりＮ末端側、すなわち、α−グルコシダーゼ配列の４８９残基以内であればどの場所でもかまわないが、２６７〜４８９残基の間のいずれかの位置が好ましく、４００〜４８９残基の間のいずれかの位置がより好ましく、４４５〜４８９残基の間のいずれかの位置がさらに好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、パパイン処理α−グルコシダーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である（実施例１）。
図２は、α−グルコシダーゼ及びその分解物の逆相ＨＰＬＣパターンを示す図である（実施例３）。
図３は、分取ピークのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である（実施例３）。
図４は、分解α−グルコシダーゼの酵素特性を示す図である（実施例４）。
図５は、炊飯米の物性評価結果を示す図である（実施例４）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。本発明は、この実施例により何ら限定されない。
【実施例１】
【０００６】
α−グルコシダーゼ（以下、ＡＧと略すことがある）として、天野エンザイム（株）より市販されているトランスグルコシダーゼＬ「アマノ」を用い、表１に示した６試験区のＡＧ酵素活性を測定した。まず、５０ｍｇ／ｍｌＡＧ酵素溶液０．５ｍｌに１０ｍｇ／ｍｌパパイン（天野エンザイム社製パパインＷ−４０以下ＰＷと略す）溶液もしくはミリＱ水０．１ｍｌを加え、さらにインヒビター溶液もしくはミリＱ水１０μｌを加え、４０℃３０ｍｉｎインキュベーションし、活性測定を行った。なお、パパイン活性を阻害するインヒビターとして株式会社ペプチド研究所製のａｎｔｉｐａｉｎとＥ−６４の２種類を用いた。
試験区１は「ＡＧ（５０ｍｇ／ｍｌ）」、試験区２は「ＡＧ＋パパイン（１ｍｇ／ｍｌ）」、試験区３は「ＡＧ＋熱失活パパイン」、試験区４は「ＡＧ＋パパイン＋パパインインヒビター１（ａｎｔｉｐａｉｎ）」、試験区５は「ＡＧ＋パパイン＋パパインインヒビター２（Ｅ−６４）」、試験区６は「パパイン」である。また表１中の○は溶液添加、○＊は熱失活（１００℃，１０ｍｉｎ加熱）溶液添加、×は溶液無添加を意味する。
活性測定結果を表２に示した。コントロール試験区１と比べると、ＰＷ添加区（試験区２）は活性が上昇し、熱失活ＰＷ添加区（試験区３）、ＰＷとインヒビター添加区（試験区４、５）では試験区１と差がなく、ＡＧが存在せずＰＷのみでは活性が全くないことから（試験区６）、ＰＷがＡＧに作用することで活性が上昇することが明らかとなった。
【表１】
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【表２】
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次に、ＰＷ濃度及び反応時間（反応温度４０℃）を種々変化させた時の活性値を測定した。反応条件と活性値を表３に示した。表３において、○は溶液添加、×は溶液無添加を意味する。また、試験区１〜７は「ＡＧ＋パパイン（１ｍｇ／ｍｌ）」、試験区８は「ＡＧ＋パパイン＋パパインインヒビター１（ａｎｔｉｐａｉｎ）」、試験区９は「ＡＧ＋パパイン＋パパインインヒビター２（Ｅ−６４）」である。
コントロール試験区１とＰＷ濃度を変化させた試験区２〜５を比較すると、ＰＷ濃度は０．１ｍｇ／ｍｌ以上で活性上昇効果が認められた。また、反応時間を変化させた試験区２、６、７の結果より反応時間は３０分までは効果が上昇するが、６０、２４０分では逆に低下する。インヒビターを添加して長時間反応させた試験区８、９では活性値が低下しないという結果とあわせると、パパインによりＡＧが適度に分解されることで活性が上昇し、過分解によって活性が低下すると推察された。
そこで、パパインで処理した時の、ＡＧの分子量変化をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した。結果を図１に示した。右のレーンから順に、コントロール（ＡＧ単体）、ＡＧ＋１０ｍｇ／ｍｌパパイン添加サンプル、ＡＧ＋１ｍｇ／ｍｌパパイン添加サンプル、コントロール、ＡＧ＋１０ｍｇ／ｍｌパパイン添加サンプル、ＡＧ＋１ｍｇ／ｍｌパパイン添加サンプルで各２レーンずつアプライした。右から６レーンは４０℃３０ｍｉｎ反応後サンプルで左６レーンは４０℃６０ｍｉｎ反応後サンプルである。本条件下では、パパイン処理によりＡＧはランダムに切断されるわけではなく、主に２つのピークに分解されていることが明らかとなった。
【表３】
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【実施例２】
【０００７】
表４に示したプロテアーゼを用い、実施例１と同様の方法で、パパイン同様の効果の有無について検証を行なった。併用した際の活性値を表４に示した。これより、種々のプロテアーゼによりパパインと同様に活性上昇効果が見られることが明らかとなった。なお、酵素はいずれも天野エンザイム（株）から市販されているものを用いた。
【表４】
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【実施例３】
【０００８】
ＡＧの全配列は既に文献（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，５３，（１９９７）７５−８４  Ａ．Ｎａｋａｍｕｒａら）で明らかにされており、配列番号１に示すとおりである。なお、ＡＧはＰ１、Ｐ２という２つのサブユニットから構成されており、Ｐ１ユニットは２６残基のセリン（Ｓ（２６））から２５２残基のグルタミン（Ｑ（２５２））まで、Ｐ２ユニットは２６７残基のセリン（Ｓ（２６７））以降の部分である。ＡＧは酵素製造（培養）過程でプロセッシングを受け、Ｐ１とＰ２を含むものと、Ｐ２のみを含むものが混在する。
そこで、ＡＧ分解物を逆相ＨＰＬＣに供し、分解ピークを分取し、そのままシーケンサーで解析した。逆相ＨＰＬＣのパターン及び、分取した各ピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた結果を図２，３に示した。ピーク２が目的とする高分子量体であった。シーケンス解析の結果、高分子量体の配列は「ＡＶＤＦＷＡＮ・・・」であった。既知のＡＧ全配列と照らし合わせると切断位置は４６６残基のリジン（Ｋ（４６６））と４６７残基のアラニン（Ａ（４６７））の間であることが判明した。また、低分子の方のＮ末端はＰ２のＮ末端と完全に一致した。また、他プロテアーゼのＡＧの分解位置も同様の方法にて調べたところ、ウマミザイムＧ分解物の配列は「ＳＬＹＩＧＡＶ・・・」であり、４４５残基のグリシン（Ｇ（４４５））と４４６残基のセリン（Ｓ（４４６））の間で切断が起こっていた。また、プロテアーゼＡでは分解物の配列は「ＶＦＰＤＷ・・・」であり、４５７残基のチロシン（Ｔ（４５７））と４５８残基のバリン（Ｖ（４５８））の間で切断が起こっていた。
【実施例４】
【０００９】
ＡＧをパパインで消化したサンプルをゲルろ過（ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム）にかけ、ＡＧ分解物とパパインを分離した。なお、ＡＧ分解物２種類はノンコバレントに結合しているためゲルろ過では分離されない。ＡＧ分解物（ｄｅｇＡＧ）が分解前のＡＧと同様の特性を持つかを検証した。検証は、酵素特性の確認と米飯への添加効果で行なった。
まず、分解によって安定性や至適条件といった酵素特性が変化するか確認した。結果を図４に示した。高温（６０℃以上）での温度安定性（２時間インキュベート後の活性値）が元のＡＧよりも低くなったが、それ以外の温度・ｐＨ依存性、ｐＨ安定性には差はなく、ほぼ同等の酵素特性を有していると考えられた。
次に、米飯への添加効果を確認した。検討したのはコントロール（酵素無添加）、ＡＧ添加（９Ｕ）、ＡＧ分解物添加（９Ｕ）の３区分で、炊飯は、きらら無洗米（１５０ｇ）に１．６倍量加水して行った。炊飯後室温まで３ｈｒ放冷し物性測定と官能評価を、その後、冷蔵１日保存し、室温に戻し再度物性測定を行った。物性測定の結果を図４に示した。図５は米飯全体の硬さと粘りを示す。左の６つの棒が３ｈｒ後の硬さと粘りを右の６つの棒が１日保存後の硬さと粘りを示す。分解ＡＧ（ｄｅｇＡＧ）はＡＧと同等以上の効果を示した。
配列表の説明
配列番号１：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのα−グルコシダーゼのアミノ酸配列
【産業上の利用可能性】
【００１０】
本発明によると、α−グルコシダーゼの活性を容易に上昇させることができるので、当該酵素を利用するオリゴ糖生成、あるいは食品加工分野において極めて有用である。
［配列表］
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【図２】
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【図４】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【国際調査報告】
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