(57)【要約】【課題】日内リズムに関連して高血圧の原因となる遺伝子を解明することにより、高血圧治療薬等を提供する。【解決手段】高血圧治療薬は、下記の特定物質を有効成分として含む。特定物質とは、副腎皮質における日内リズムをつかさどる第１の遺伝子、該第１の遺伝子の挙動に影響を受ける，副腎皮質ホルモンの産生にかかわる第２の遺伝子、および上記第１の遺伝子と第２の遺伝子をつなぐシグナル伝達に関する第３の遺伝子のうち、少なくともいずれか１つの遺伝子の発現、もしくは、当該遺伝子の産物の活性、に作用するものである。特定物質を与えることにより、血圧の変化が生じることが確認された。また、第１〜第３の遺伝子を含む特定細胞を用いて、高血圧治療薬のスクリーニングを行うことができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
副腎皮質における日内リズムをつかさどる第１の遺伝子、該第１の遺伝子の挙動に影響を受ける，副腎皮質ホルモンの産生にかかわる第２の遺伝子、および上記第１の遺伝子と第２の遺伝子をつなぐシグナル伝達に関する第３の遺伝子のうち、少なくともいずれか１つの遺伝子の発現、もしくは、当該遺伝子の産物の活性、に作用する特定物質を有効成分として含有する、高血圧治療薬。
【請求項２】
請求項１記載の高血圧治療薬において、
上記第１の遺伝子は、Cry遺伝子である、高血圧治療薬。
【請求項３】
請求項１記載の高血圧治療薬において、
上記第２の遺伝子は、m-Hsd3b6またはh-Hsd3b1である、高血圧治療薬。
【請求項４】
請求項１記載の高血圧治療薬において、
上記第３の遺伝子は、Cry1，Cry2，PER1，PER2，BMAL1，CLOCK，DBP，Rev-erbaおよびE4BP4のうち少なくともいずれか１つである、高血圧治療薬。
【請求項５】
請求項１記載の高血圧治療薬において、
上記特定物質は、
Cry1もしくはCry2の発現または当該遺伝子の産物の活性を亢進する第１の薬剤、
m-Hsd3b6もしくはh-Hsd3b1の発現を抑制または酸素活性を阻害する第２の薬剤、
DBP，BMAL1もしくはCLOCKの発現を抑制または当該遺伝子の産物の活性を抑制、あるいは、PER1，PER2，E4BP4もしくはRev-erbaの発現を亢進または当該遺伝子の産物の活性を亢進する第３の薬剤、
のうち、少なくともいずれか１つである、高血圧治療薬。
【請求項６】
請求項１〜６のうちいずれか１つに記載の高血圧治療薬を用いた高血圧治療方法。
【請求項７】
副腎皮質における日内リズムをつかさどる第１の遺伝子、該第１の遺伝子の挙動に影響を受ける，副腎皮質ホルモンの産生にかかわる第２の遺伝子、および上記第１の遺伝子と第２の遺伝子をつなぐシグナル伝達に関する第３の遺伝子のうち少なくともいずれか１つの遺伝子、ならびに、その発現に関与する遺伝子構造の多型を解析することにより、高血圧発症の個人差を予測する過程を含む、高血圧診断方法。
【請求項８】
副腎皮質における日内リズムをつかさどる第１の遺伝子、該第１の遺伝子の挙動に影響を受ける，副腎皮質ホルモンの産生にかかわる第２の遺伝子、および上記第１の遺伝子と第２の遺伝子をつなぐシグナル伝達に関する第３遺伝子のうち、少なくともいずれか１つの遺伝子を含む特定細胞もしくは該特定細胞を有する特定生体に、被検試料を接触させる工程（ａ）と、
上記工程（ａ）の後、上記特定細胞の日内リズムに影響を与える物質を選択する工程（ｂ）と、
を含む高血圧治療薬のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項８記載の高血圧治療薬のスクリーニング方法において、
上記工程（ａ）では、上記特定細胞として、Cry1，Cry2，PER1，PER2，BMAL1，CLOCK，DBP，Rev-erbaおよびE4BP4のうち少なくともいずれか１つの遺伝子と、蛍光発色蛋白質との融合遺伝子を導入した細胞を用い、
上記工程（ｂ）では、上記特定細胞内の蛋白量の変動、または、核内移行の変動を測定する、高血圧治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項８記載の高血圧治療薬のスクリーニング方法において、
上記工程（ａ）では、上記特定細胞として、副腎皮質のアルドステロン産生細胞の初代培養細胞または株化細胞を用い、
上記工程（ｂ）では、上記第１〜第３の遺伝子のうち少なくともいずれか１つの遺伝子の発現変化をＲＴ−ＰＣＲで測定する、高血圧治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項８記載の高血圧治療薬のスクリーニング方法において、
上記工程（ａ）では、上記特定細胞として、Cry1，Cry2ダブルノックアウトマウスより分離した副腎皮質のアルドステロン産生細胞の初代培養細胞または株化細胞を用い、
上記工程（ｂ）では、m-Hsd3b6発現を抑制する物質、または、m-Hsd3b6またはh-Hsd3b1の持つ酵素活性の阻害を測定する、高血圧治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の高血圧治療薬のスクリーニング方法において、
上記工程（ａ）では、上記特定細胞として、Cry1，Cry2ダブルノックアウトマウスおよび野生型マウスより分離した副腎皮質のアルドステロン産生細胞の初代培養細胞または株化細胞を用い、
上記工程（ｂ）では、上記２種類の初代培養細胞または株化細胞における、m-Hsd3b6発現を抑制する物質、または、m-Hsd3b6またはh-Hsd3b1の持つ酵素活性の阻害を比較する、高血圧治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項８記載の高血圧治療薬のスクリーニング方法において、
上記工程（ａ）では、上記特定生体として、上記特定細胞であってCry1およびCry2が欠損した細胞を有するノックアウト動物を用い、
上記工程（ｂ）では、上記ノックアウト動物の血圧変化を測定することにより、上記特定細胞の日内リズムに影響を与える物質を選択する、高血圧治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の高血圧治療薬のスクリーニング方法において、
上記工程（ａ）では、上記特定生体として、上記特定細胞であってCry1およびCry2が欠損した細胞を有するノックアウト動物と、上記特定細胞であってCry1およびCry2が欠損していない細胞を有する比較用動物とを用い、
上記工程（ｂ）では、上記ノックアウト動物と上記比較用動物との血圧変化を相互に比較することにより、上記特定細胞の日内リズムに影響を与える物質を選択する、高血圧治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４記載の高血圧治療薬のスクリーニング方法において、
上記ノックアウト動物として、Cry1，Cry2ダブルノックアウトマウスを用いる、高血圧治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高血圧治療薬，高血圧治療方法，高血圧診断方法および高血圧治療薬のスクリーニング方法に係り、特に、日内リズムを考慮したものに関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類は昼夜の明暗変化を感知して、生体の生理機能が２４時間周期のリズム（日内リズム）を持っていることが知られている。哺乳類の生体リズムを制御する遺伝子（時計遺伝子)としてclock,  Per1, Per2, Bmal1, Cryなどが知られている。また、中枢の視交叉上核においても、これら遺伝子発現の日内リズムが存在しており、ここでは、自律的に視覚からの明暗刺激なしで日内リズムが形成されると考えられている。末梢の肝臓、皮膚などにも日内リズムが存在し、それらの生理機能のリズムを形成している。【０００３】
日内リズムと医療の関連については、以下のことが知られている。
（１）  日内リズムを考慮して医薬品を投与すると、その効果が顕著になる。あるいは副作用を軽減できる。
（２）  日内リズムが減弱すると、睡眠障害、消化活動障害、痴呆、徘徊等の障害が生じるために、日内リズムを惹起する薬剤の開発が進められている。
（３）  旅行による時差や、活動時間帯の変化によるいわゆる時差ぼけを解消する薬剤の開発が進められている。
一般の人でも生活習慣が不規則であったり、旅行等で時差を経験することが多いと、日内リズムが崩れ、正常なリズムを刻まなくなる。異常な日内リズムが継続すると、多くの疾患を誘発することが推測される。特に、日内リズムが崩れやすい人、崩れたリズムが回復しにくい人はすみやかに日内リズムを回復する薬剤が健康維持に有効であると思われる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1999 Oct 12;96(21):12114-9
【非特許文献２】Nature 1999, 398: 627-30
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、高血圧は高齢者の５０％に及ぶ疾患であり、脳溢血、心筋梗塞、動脈瘤等の致死的な疾患と関連している。これら循環器疾患は死亡率第一位となっている。
しかるに、高血圧を日内リズムの観点から治療するための有効な手段は未だ開発されていないのが現状である。
本発明者は、日内リズムは特定の疾患に関与するばかりでなく、高血圧や循環器疾患、肥満や糖尿病など多くの一般の疾患に影響をあたえていると推測している。【０００６】
本発明の目的は、日内リズムに関連して高血圧の原因となる遺伝子を解明することにより、高血圧治療薬，高血圧治療方法，高血圧診断方法および高血圧治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の高血圧治療薬は、下記の特定物質を有効成分として含むものである。
本発明の特定物質とは、副腎皮質における日内リズムをつかさどる第１の遺伝子、該第１の遺伝子の挙動に影響を受ける，副腎皮質ホルモンの産生にかかわる第２の遺伝子、および上記第１の遺伝子と第２の遺伝子をつなぐシグナル伝達に関する第３の遺伝子のうち、少なくともいずれか１つの遺伝子の発現を抑制するものである。【０００８】
本発明者達は、日内リズムの研究において、これまでに知られていなかった高血圧の原因を発見した。即ち、以下の（１）〜（３）の遺伝子である。
（１）副腎皮質における日内リズムをつかさどる遺伝子
（２）この遺伝子の挙動に影響を受ける、副腎皮質ホルモンの産生にかかわる遺伝子、（３）日内リズムをつかさどる遺伝子と副腎皮質ホルモンの生産にかかわる遺伝子をつなぐシグナル伝達に関する遺伝子【０００９】
高血圧症はホルモン異常などによる原因のはっきりしている二次性高血圧と患者数の多いが原因が特定できない本態性高血圧に分類される。本発明のもとになる動物モデルはホルモン異常による食塩感受性高血圧（食塩負荷により血圧が上昇する高血圧症）に関すものである。直接の原因はホルモン異常であるが、その上位にホルモンの日内変動異常が存在すると予測されるために、本態性高血圧も含む食塩感受性高血圧における広範囲な高血圧症に関連することが考えられる。日内リズムに関係する分子が高血圧の発症に関与することを発見したことにより、高血圧治療に関する新しい展開を行うことができる。【００１０】
上述の３つのカテゴリーに属する遺伝子が新たに発見されたことにより、以下のような高血圧治療薬，高血圧治療方法，高血圧診断方法および高血圧治療薬のスクリーニング方法の提供が可能になった。
１．高血圧治療薬
上記遺伝子産物の機能やこれら遺伝子の発現、もしくは、当該遺伝子の産物の活性、に作用する物質は高血圧治療に用いることができる。
２．高血圧治療薬のスクリーニング方法
これら遺伝子を用いてこれら遺伝子の発現、もしくは、当該遺伝子の産物の活性、に作用する物質をスクリーニングすることができる。
３．高血圧診断方法
これら遺伝子およびその発現に関与する遺伝子構造の多型を解析することにより高血圧発症の個人差を予測することができる。
４．高血圧治療方法
これら遺伝子およびその発現産物を測定することにより、高血圧発症や病状診断を行い適切な治療法を提供することができる。【００１１】
（１）のカテゴリーの遺伝子として、日内リズムを制御しているとして知られているＣryが存在することがわかった。
実施例１に示すように、両遺伝子（Cry1遺伝子およびCry2遺伝子）のホモ欠損マウス、Cry1-/-Cry2-/-（Cryホモ欠損マウス（非特許文献１および非特許文献２）は食塩負荷により高血圧を呈した。一方、ＷＴ（ワイルドタイプ）は食塩負荷を行っても高血圧を起こさない。これよりCryの働きが抑制されると、高血圧をおこしやすくなると考えられる。【００１２】
（２）のカテゴリーの遺伝子として、Hsd3b6がある。
Hsd3b6とはhydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta- and steroid delta-isomerase 6のことで、アルドステロン合成経路に位置する酵素である。この酵素のアイソタイプがいくつか知られており、それぞれのマウス遺伝子とそのヒトカウンターパート（マウス遺伝子ともっとも構造・機能が近いヒト遺伝子）が知られている。遺伝子の命名が交錯しているので、以下に整理する。以下の記述で、マウス遺伝子とヒト遺伝子を厳密に区別する必要があるときは、マウス遺伝子名の前にm-, ヒト遺伝子の名の前にh-と付記する。厳密に区別する必要のない遺伝子名にはm-, h-の付記を施さないこととする。
【表１】
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実施例２では血中のアルドステロンおよび副腎からのアルドステロン放出量の日内変動において、ＷＴに比してCry1-/-Cry2-/-は数倍の高いレベルであることを示した。アルドステロンは以下の機序で血圧を上昇させる働きがあり、高血圧症の原因の一端を担うことはよく知られている。即ち、アルドステロンは腎臓に働きかけ、塩分（ナトリウム）を保持させ、カリウムを排出させる。ナトリウムは水分を貯留させるため、血液量が増加して血圧が上昇する。よって、Cryノックアウトによる高血圧の発症は血中アルドステロン分泌の異常高値によることが解った。
また、実施例３ではアルドステロンを産生する副腎皮質におけるステロイドホルモン合成酵素の遺伝子発現を、ＷＴとCry1-/-Cry2-/-で比較したものである。この結果ステロイド合成に関与する酵素の内、m-Hsd3b6のみが、ＷＴに比してCry1-/-Cry2-/-で高い発現を示した。実施例４ではＷＴに比してCry1-/-Cry2-/-でm-Hsd3b6蛋白質の発現およびm-Hsd3b6酵素活性が亢進していることを示した。【００１３】
（３）のカテゴリーの遺伝子として、Cry1, Cry2, PER1, PER2, BMAL1, CLOCK, DBP, Rev-erba, E4BP4などがある。
実施例６の結果よりこれら遺伝子がm-Hsd3b6発現を亢進する過程を示した。【００１４】
以上のことから、高血圧治療薬の具体例としては、
Cry1もしくはCry2の発現または当該遺伝子の産物の活性を亢進する第１の薬剤、
m-Hsd3b6もしくはh-Hsd3b1の発現を抑制または酸素活性を阻害する第２の薬剤、
DBP，BMAL1もしくはCLOCKの発現を抑制または当該遺伝子の産物の活性を抑制、あるいは、PER1，PER2，E4BP4もしくはRev-erbaの発現を亢進または当該遺伝子の産物の活性を亢進する第３の薬剤、
が考えられる。【００１５】
特に、m-Hsd3b6の発現を直接抑制する薬剤、または酵素活性を特異的に抑制する薬剤や、副腎で日内リズムが乱れている患者を治療するためのCry1またはCry2の特異的発現促進剤が特に有望と思われる。【００１６】
ここで述べるm-Hsd3b6はマウス遺伝子であり、本遺伝子の人ホモログ(カウンターパート)はh-Hsd3b1である。よって、治療薬開発は、h-Hsd3b1の特異的発現抑制または活性阻害剤が高血圧治療剤となる。【００１７】
高齢者や、生活のリズムが不規則な職業を行う人は中枢の日内リズムが乱れる傾向にあり、よって中枢の日内リズムに支配される末梢のリズムが乱れる。恒常的、日内リズムの乱れは、本発明で示したように、高血圧を誘導する。よって、日内リズムの正常化は高血圧の治療、予防となる。日内リズムの正常化は薬剤の投与に限らず、明暗リズムを意図的に与える療法、たとえば光、熱、運動、音、摂食などのリズムを強制的、意図的に与えることも高血圧の治療となる可能性がある。本発明において、日内リズムと高血圧の関係を分子レベルで解明したことにより、高血圧の新たな治療法、予防法開発の道が開けた。【００１８】
本発明の高血圧治療薬のスクリーニング方法は、副腎皮質における日内リズムをつかさどる第１の遺伝子、該第１の遺伝子の挙動に影響を受ける，副腎皮質ホルモンの産生にかかわる第２の遺伝子、および上記第１の遺伝子と第２の遺伝子をつなぐシグナル伝達に関する第３遺伝子のうち、少なくともいずれか１つの遺伝子を含む特定細胞もしくは該特定細胞を有する特定生体に、被検試料を接触させ、上記特定細胞の日内リズムに影響を与える物質を選択する方法である。
新しい高血圧治療剤のスクリーニング法の一例を、以下に示す。
Cry(Cry1およびCry2) (Mol Cell Biol, 2001, 21: 6651-6659)、PER(PER1およびPER2)（Genes Dev. 2000, 14:1353-63）、BMAL1 (Genes Cells, 2003,8:973-983), CLOCK(EMBO Rep,2007 8:366-371), DBP (Cell 1990 63:1257-66) およびE4BP4(Curr Biol 2004 14:975-80) は核内移行することがわかっている。そこで、GFP遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などの蛍光発色蛋白質との融合遺伝子を導入した細胞を用いて、Cry、BMAL1, CLOCK, DBP, PER1, PER2およびE4BP4の細胞内蛋白量の変動や、核内移行の変動を測定することにより、これら分子の活動の変化を測定することができる。
すなわち特定細胞としては、Cry1，Cry2，PER1，PER2，BMAL1，CLOCK，DBP，Rev-erbaおよびE4BP4のうち少なくともいずれか１つの遺伝子と、蛍光発色蛋白質との融合遺伝子を導入した細胞があり、これらの特定細胞内の蛋白量の変動、または、核内移行の変動を測定することにより、高血圧治療薬を効率よくスクリーニングすることができる。【００１９】
また、上記特定細胞として、副腎皮質のアルドステロン産生細胞の初代培養細胞または株化細胞（副腎皮質由来細胞株）、例えばNCI-H295RやY1（Mol Cell Endcrinol. 2004, 2287:23-38）を用いて、培養液に薬剤や天然物を加え、m-Hsd3b6、h-Hsd3b1、DBP、Rev-erba、PER1、PER2、E4BP4、BMAL1 またはCLOCK等の遺伝子発現変化をＲＴ−ＰＣＲで測定することで、これらの発現に影響をあたえる物質をスクリーニングできる。【００２０】
特に、特定細胞として、Cry1，Cry2ダブルノックアウトマウス（以下、「Cry1-/-Cry2-/-」とも表記する）より分離した副腎皮質のアルドステロン産生細胞の初代培養細胞または株化細胞を用いて、m-Hsd3b6発現を抑制する物質をスクリーニングする方法も有効である。高速スクリーニングとしては、m-Hsd3b6またはh-Hsd3b1の持つ酵素活性の阻害を測定することは、効率よく薬剤をスクリーニングできる。
m-Hsd3b6蛋白質またはh-Hsd3b1蛋白質は、delta-3β-hydrosteroid をホルモン活性を持つdelta-ketosteroidに転換する酵素で、アルドステロン合成経路における必須の酵素である。
実施例４に示したm-Hsd3b6酵素活性測定法により、この酵素活性阻害物を高速スクリーニングすることができる。本酵素活性を持つHsd3bの他のサブタイプには作用せず、m-Hsd3b6にのみ作用する物質をスクリーニングすることで、副作用のない降圧剤の開発が行えると考えられる。
具体的には、特定細胞として、Cry1，Cry2ダブルノックアウトマウスおよび野生型マウス（以下、「ＷＴ」とも表記する）より分離した副腎皮質のアルドステロン産生細胞の初代培養細胞または株化細胞を用い、これらの２種類の初代培養細胞または株化細胞における、m-Hsd3b6発現を抑制する物質、または、m-Hsd3b6またはh-Hsd3b1の持つ酵素活性の阻害を比較する方法がある。【００２１】
実施例５では、Hsd3b酵素阻害剤をCry1-/-Cry2-/-に投与すると血中アルドステロンが低下することを示した。また、実施例１で、アルドステロン拮抗剤がCry1-/-Cry2-/-の食塩依存性高血圧を改善することを示した。
この２つの実施例から考えると、cryの働きが低下している、あるいは副腎における日内リズムの異常に起因する高血圧症に対して、h-Hsd3b1（ヒトの場合）の酵素活性抑制剤が降圧剤となることが本発明により初めて示された。
また、ヒトにおいて、アルドステロン合成経路において必要なHsd3bにはh-Hsd3b1とh-Hsd3b2の２種のサブタイプが知られている。広い阻害スペクトラムを持つステロド合成阻害剤はすでに存在しているが、本発明はh-Hsd2b1の酵素活性を特異的に阻害する薬剤を開発することが副作用の少ない降圧剤を提供する手段であることを初めて示した点で、価値が高いといえる。【００２２】
実施例１では、Cry1-/-Cry2-/-が欠損していないＷＴ（野生型マウス）とCry1-/-Cry2-/-（Cry1，Cry2ダブルノックアウトマウス）の動脈における血圧変化を比較し、ＷＴは高血圧を呈さないのに対して、Cry1-/-Cry2-/-は明らかに血圧が上昇することを示した。アルドステロン拮抗剤を投与すると、この高血圧が抑制されることから、Cry1-/-Cry2-/-が呈する高血圧は、血中アルドステロンの高値に起因すると考えられる。
したがって、スクリーニング方法としては、上記特定生体として、上記特定細胞であってCry1およびCry2が欠損した細胞を有するノックアウト動物を用い、ノックアウト動物の血圧変化を測定することにより、上記特定細胞の日内リズムに影響を与える物質を選択することができる。
特定生体は、Cry1，Cry2ダブルノックアウトマウスに限られるものではなく、ラット、ウサギ、サルなど、マウス以外の動物でもよい。【００２３】
具体的には、実施例１のように、上記特定生体として、上記特定細胞であってCry1およびCry2が欠損した細胞を有するノックアウト動物と、上記特定細胞であってCry1およびCry2が欠損していない細胞を有する比較用動物とを用い、ノックアウト動物と上記比較用動物との血圧変化を相互に比較することにより、上記特定細胞の日内リズムに影響を与える物質を確実に選択することができる。
ただし、基準となる血圧変化がすでにわかっている場合は、Cry1およびCry2が欠損していない細胞を有する比較用動物を必ずしも用いる必要はなく、Cry1およびCry2が欠損した細胞を有するノックアウト動物の血圧変化を測定するだけでも、簡便にスクリーニングを行うことができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によると、  日内リズムに関連して高血圧の原因となる遺伝子を解明することにより、高血圧治療薬，高血圧治療方法，高血圧診断方法および高血圧治療薬のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例１の結果を示すデータであって、５日間のＷＴとCry1-/-Cry2-/-の動脈における血圧を示す図である。
【図２】（ａ）〜（ｃ）は、実施例1のデータを示す図であって、Pair-wise comparisionを行った結果を示す図である。
【図３】（ａ），（ｂ）は、実施例2の結果を示すデータであって、血中のアルドステロン量をWTおよびCry1-/-Cry2-/-において求めたデータを示す図である。
【図４】実施例2の結果を示すデータであって、副腎からのアルドステロン放出量をWTおよびCry1-/-Cry2-/-において求めたデータを示す図である。
【図５】実施例３の結果を示し、WTおよびCry1-/-Cry2-/-の副腎の遺伝子発現をDNA microarrayにより測定したデータを表で示す図である。
【図６】実施例３におけるマウスのHsd3bのアイソタイプのうちいずれが発現増加しているかを調べたデータを示す図である。
【図７】（ａ）〜（ｃ）は、実施例３におけるm-Hsd3b6およびm-Hsd3b1のＰＣＲ測定のデータを示す図である。
【図８】実施例３におけるWTおよびCry1-/-Cry2-/-の副腎における発現を調べたデータを示す顕微鏡写真図である。
【図９】実施例３におけるWTおよびCry1-/-Cry2-/-の副腎におけるZG細胞（球状層細胞）を示す顕微鏡写真図である。
【図１０】実施例３におけるRT-PCRでアルドステロン合成酵素遺伝子発現を測定したデータを示す図である。
【図１１】実施例４のデータであって、ＷＴおよびCry1-/-Cry2-/-の副腎からのミクロソーム蛋白質を抽出し、イミュノブロッティングを行なった結果を示す図である。
【図１２】（ａ），（ｂ）は、実施例４におけるprogestroneおよびandrostenedioneの生成データを示す図である。
【図１３】実施例５のデータであって、ステロイド合成阻害剤の投与によるＷＴおよびcry-/cryにおける血中アルドステロン量の変化を示す図である。
【図１４】実施例６におけるプロモーターアッセイのデータを示す図である。
【図１５】（ａ）〜（ｃ）は、実施例６におけるDBP, E4BP4およびm-Hsd3b6についての特異的RT-PCR測定の結果を示す図である。
【図１６】本明細書で記述した遺伝子の公式のGene name とGene IDを表にして示す図である。
【図１７】サブタイプ特異的定量的ＰＣＲプローブ（Taqman MGB probe）の設計表を示す図である。
【図１８】h-Hsd3b1，h-Hsd3b2の発色の測定結果を示す図である。
【図１９】腎皮質、球状層（adrenal zona glomerulosa）細胞で増複したＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動図を示す図である。
【図２０】ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列測定結果を示す図である。
【図２１】h-Hsd3b1，h-Hsd3b2の発現特性を、顕微鏡写真図と共に示す図である。
【図２２】ヒトにおけるh-Hsd3b1とh-Hsd3b2サブタイプおよびそれぞれのマウスカウンターパート、m-Hsd3b6とm-Hsd3b1の存在部位を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００２６】
−Cry1，Cry2ダブルノックアウトマウス（Cry1-/-Cry2-/-）における食塩感受性高血圧の発症−
図１は、実施例１の結果を示すデータであって、１５日間のＷＴ（野生型マウス）とCry1-/-Cry2-/-（Cry1，Cry2ダブルノックアウトマウス）の動脈における血圧を示す図である。マウスは自由行動とし、テレメトリーシステムで血圧を測定した。恒暗（常に暗い）条件下においてマウスを飼育し、通常食塩含有食（NS），高食塩含有食（HS）または、上市されているアルドステロン拮抗剤eplerenone（Phizer New York, NY）(Epl)含有の高食塩食（Epl-HS）を与えた。Eplはミネラロコルチコイド受容体に作用し、アルドステロンの機能を拮抗阻害する。
与えた餌の種類を図１中の矢印中の四角内に示す。同図において、日を示す数字の上の灰色と黒のバーは灰色が本来昼にあたる時間帯(8am-8pm)を、黒が本来夜にあたる時間帯(8pm-8am)を示す。血圧は、３０秒間測定を５分おきに１時間測定し、平均値をプロットした。さらに、２４時間の平均値を□(白ぬき四角)としてプロットした。横線は正常食のday1-4の平均値を示した。
なお、餌（CREA Japan）に含まれるNa+成分は、NSでは0.2%、HSでは3.15%となるように調製した。elerenoneの含有量は、1.0mg/g餌である。推定では、100mg/kg/日の摂取量である。【００２７】
図２（ａ）〜（ｃ）は、実施例1のデータを示す図であって、Pair-wise comparisionを行った結果を示す図である。 図２（ａ）は、ＨＳ食を与える前後の血圧の変化を示している。図２（ｂ）は、ＨＳ食下でEplを与える前後の血圧の変化を示している。図２（ｃ）は、ＨＳ食下でEplを与えた場合とEplを与えない場合の血圧の相違を示している。
図２（ａ）〜（ｃ）のデータは、各個体（ＷＴ、n=3, Cry1-/-Cry2-/- n=5, 内2匹のCry1-/-Cry2-/-をEpl非投与対照として用いた）の血圧をプロットしたものである。
（数値は、一日の平均値（±s.e.m）（standard error of mean,標準誤差）、***印のデータ：Cry1-/-Cry2-/-に於ける処置後の検定ではP＜0.001、以下、「***P＜0.001」のように表示する。）
実施例１の結果から、以下のことがわかる。
高食塩食により、ＷＴは高血圧を呈さないのに対して、Cry1-/-Cry2-/-は明らかに血圧が上昇する。
アルドステロン拮抗剤を投与すると、この高血圧が抑制されることから、Cry1-/-Cry2-/-が呈する高血圧は、血中アルドステロンの高値に起因すると考えられる。
【実施例２】
【００２８】
−Cry1，Cry2ダブルノックアウトマウス（Cry1-/-Cry2-/-）におけるアルドステロン産生異常−
図３（ａ），（ｂ）および図４は、実施例2の結果を示すデータであって、WTおよびCry1-/-Cry2-/-における血中アルドステロン量および副腎からのアルドステロン放出量を示す図である。
図３（ａ），（ｂ）および図４において、横軸は、明期へ入ってからの時間(明期から経過した時間をＣＴで表したものである。図３（ａ）の縦軸は、０時間(CT＝0) および１２時間(CT=12)において血漿中のアルドステロン量をRIA(Coat-A-Count Aldosteone kit <Diagnostic Products>)で測定したものである。その際、CT＝0において、WT n=11, Cry1-/-Cry2-/- n=10, CT＝12において  WT n=5, Cry1-/-Cry2-/- n=5を測定した。図３（ｂ）の縦軸は、WTの血中アルドステロン量の日内変動を測定した。それぞれのポイントでn=5で測定したものである。その際、アルドステロンの測定法は、図３（ａ）のデータ取得時と同様である。
図４のデータは、CT=0およびCT=12におけるWTおよびCry1-/-Cry2-/-から採取した副腎切片を血清無し培地で６０分、３７℃で培養し、培養液中のアルドステロン量を測定したものである。アルドステロンの測定法は、図３（ａ）のデータの測定法と同様である。
（CT=0におけるWT, n=6, Cry1-/-Cry2-/-n=6, CT=12におけるWT, n=12, Cry1-/-Cry2-/-, n=10を測定、図３（ａ），（ｂ），図４における数値は平均値±s.e.m., * P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001）【００２９】
実施例２の結果から、ＷＴにおいて、血中アルドステロン量は日内リズムをもって変動するが、Cry1-/-Cry2-/-の血中アルドステロン量はＷＴの数倍量であった。個体から切り出した副腎を用いた実験で、この血中アルドステロン量は副腎からのアルドステロン放出に起因することがわかった。
【実施例３】
【００３０】
−Cry1-/-Cry2-/-においてアルドステロン合成酵素遺伝子、m-Hsd3b6の異常発現が副腎アルドステロン産生細胞に存在することの検証−
図５は、実施例３の結果を示し、WTおよびCry1-/-Cry2-/-の副腎の遺伝子発現をDNA microarray（GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array, Affymetrix社）により測定したデータを表で示す図である。ここでは、２４時間にわたるステロイド合成に関与する遺伝子の発現変化を、CT＝0からCT＝24までWTに対するCry1-/-Cry2-/-の変化率で表示した。測定した遺伝子において、m-Hsd3b6のみがCry1-/-Cry2-/-において大きく発現増加した。【００３１】
図６は、実施例３におけるマウスのHsd3bのアイソタイプのうちいずれが発現増加しているかを調べたデータを示す図である。
マウスのHsd3bはアイソタイプが６種ある（m-Hsd3b1〜6）。このうちいずれが発現増加しているかを調べた。この実験では、ＷＴまたはCry1-/-Cry2-/-の副腎からtotal RNAを抽出し、６種のアイソタイプの遺伝子いずれも増幅するプライマーを用いてRT−PCRを行った。この増複産物を各アイソタイプの遺伝子構造から、それぞれを特異的に切断する制限酵素で切断した。用いた制限酵素は、
m-Hsd3b1同定用：AccI
m-Hsd3b2同定用：HindIII
m-Hsd3b3同定用：BstBI
m-Hsd3b4およびHsd3b5:同定用：AvaI
m-Hsd3b6同定用：NdeI
である。分解産物をアガロースゲルで分離した。ＭはDNA分子量マーカーである。【００３２】
図６に示すように、m-Hsd3b1とm-Hsd3b6のみ分解断片が検出された。すなわち、副腎にはm-Hsd3b1とm-Hsd3b6のみが発現していることがわかった。【００３３】
図７（ａ）〜（ｃ）は、実施例３におけるm-Hsd3b6およびm-Hsd3b1のＰＣＲ測定のデータを示す図である。
この実験では、CT=2〜22において、ＷＴおよびCry1-/-Cry2-/-の副腎からtotal RNAを抽出し、m-Hsd3b6およびm-Hsd3b1のＰＣＲ測定をおこなった。Tbp遺伝子をhouse keeping gene（発現変動しない遺伝子）としてm-Hsd3b6、m-Hsd3b1遺伝子の量を表示している。
（値は平均値±s.e.m  (それぞれn=４ または5)、*P<0.05, **P<0.01）【００３４】
この実験の結果、m-Hsd3b1の発現はWTおよびCry1-/-Cry2-/-において有意な差がないのに対して、m-Hsd3b6の発現はWTに対してCry1-/-Cry2-/-は５倍以上の発現が見られた。ＷＴにおいてはm-Hsd3b6遺伝子発現はCT=14をピークに日内変動があることがわかった。ＷＴは、Cryが働いているために副腎のm-Hsd3b6発現に日内変動が存在すると思われる。一方、Cry1-/-Cry2-/-ではm-Hsd3b6発現は高値であるが、有意な日内変動は見られなかった。【００３５】
図８は、実施例３におけるWTおよびCry1-/-Cry2-/-の副腎におけるステロイド合成系遺伝子の発現部位を調べたデータを示す顕微鏡写真図である。
この実験では、CT=0におけるm-Hsd3b6,  m-Hsd3b1,  Cyp11b1,  Cyp11b2の発現をin situ hybridizationにより測定した。【００３６】
図８に示されるように、m-Hsd3b1とCyp11b1は副腎皮質全体に発現しているのに対し、m-Hsd3b6とCyp11b2は副腎皮質のなかでも特に球状層（ZG）細胞に発現している。m-Hsd3b6のみWTとCry1-/-Cry2-/-で大きな発現の差が認められた。【００３７】
図９は、実施例３におけるWTおよびCry1-/-Cry2-/-の副腎におけるZG細胞（球状層細胞）を示す顕微鏡写真図である。図１０は、実施例３におけるRT-PCRでアルドステロン合成酵素遺伝子発現を測定したデータを示す図である。
この実験では、WTおよびCry1-/-Cry2-/-の副腎におけるZG細胞（球状層細胞）をLaser microdissectionし（図９参照）、RT-PCRでアルドステロン合成酵素遺伝子発現を測定した（図１０参照）。このときの、測定ポイントはCT=0およびCT=12。ＺＧ細胞は副腎皮質切片をToluidine blueで染色した（別の実験で副腎においてZG細胞が特異的にm-Hsd3b6を発現していることを確かめている）。
また、遺伝子発現が一定している、36B4遺伝子を対照遺伝子とした。
（C: capsule  ZG, ZF, ZR: zona reticularias）【００３８】
図９および図１０の結果から、Cry1-/-Cry2-/-におけるアルドステロン産生異常は、副腎皮質のアルドステロン産生細胞における、アルドステロン合成系上の唯一m-Hsd3b6遺伝子の異常発現によることが明らかになった。
【実施例４】
【００３９】
−Cry1，Cry2ダブルノックアウトマウスにおけるm-Hsd3b6酵素活性の亢進−
図１１は、実施例４のデータであって、ＷＴおよびCry1-/-Cry2-/-の副腎からのミクロソーム蛋白質を抽出し、イミュノブロッティングを行なった結果を示す図である。
この実験では、m-Hsd3b6蛋白質および対照として、CYP11A1蛋白質に対する抗体を用いて、ＷＴおよびCry1-/-Cry2-/-のCT=0における副腎からのミクロソーム蛋白質を抽出し、イミュノブロッティングを行った。【００４０】
図１１に示されるように、ＷＴとCry1-/-Cry2-/-の副腎において、CYP11A1蛋白質の量は同等であるが、m-Hsd3b6蛋白質はWTに比してCry1-/-Cry2-/-の副腎において、顕著に増加した。【００４１】
図１２（ａ），（ｂ）は、実施例４におけるプロゲステロン（progesterone）およびアンドロステンジオン（androstenedione）の生成データを示す図である。
この実験では、m-Hsd3b6酵素活性として、3H-pregnenoloneからのprogestrone生成（図１２（ｂ））および3H-dehydroepiandrosteroneからのandrostenedioneの生成（図１２（ｂ））を測定した。サンプルはＷＴおよびCry1-/-Cry2-/-、CT=0 およびCT=12における副腎からの全蛋白質抽出物をもちいた。
いずれの酵素反応も、CT=およびCT=12において、Cry1-/-Cry2-/-がＷＴより酵素活性が顕著に高かった。
（数値は平均値±s.e.m (それぞれN=10) *P<0.05. ***P<0.001）
【実施例５】
【００４２】
−Hsd3b酵素阻害剤の降圧効果−
この実験では、Hsd3b酵素阻害剤として、上市されているステロイド合成阻害剤トリロスタン（trilostane：持田製薬）を、ＷＴとCry1-/-Cry2-/-（CT=0）とに、７日間、連日投与した。投与量は、1.6または8mg/kg/dayである。血中アルドステロン量を測定した。図１３は、実施例５のデータを示す図である。【００４３】
図１３に示されるように、ＷＴにおいては血中アルドステロン量の変化はないが、Cry1-/-Cry2-/-では顕著に血中アルドステロン量が低下した。
よって、Cryの働きが低下したことによる高血圧症がHsd3b活性阻害剤投与で治療できることが示された。
なお、本実験に用いたトリロスタンはm-Hsd3b6に特異的阻害剤ではなく、Hsd3bのサブタイプに対して広い阻害スペクトラムを持つ物質である。m-Hsd3b6、ヒトの場合はh-Hsd3b1に対する特異的阻害剤が副作用の少ない新規降圧剤となると思われる。
【実施例６】
【００４４】
−Cryノックアウトが引き起こすHsd3b6発現異常に関連する遺伝子−
図１４は、実施例６におけるプロモーターアッセイのデータを示す図である。
この実験では、m-Hsd3b6遺伝子のプロモーター活性をマウス胎児由来3T3細胞において測定した。具体的には、Hsd3b6のプロモーター領域（D-boxを含む転写開始点上流1.2kb）をルシフェラーゼ遺伝子につないだレポーターを作成し、3T3細胞に導入した。【００４５】
図１４に示されるように、DBPを共に発現させた場合にはその濃度に応じてルシフェラーゼの活性が上昇し、E4BP4を共発現させると低下した。つまり、m-Hsd3b6のプロモーター領域にはD-boxが存在し、D-boxに作用することが知られている転写促進因子のDBPと転写抑制因子のE4BP4がm-Hsd3b6の発現をそれぞれ正と負に制御することが分かった（図１４のプロモーターアッセイの結果に相当、n=3）。【００４６】
図１５（ａ）〜（ｃ）は、DBP, E4BP4およびm-Hsd3b6についての特異的RT-PCR測定の結果を示す図である。
この実験では、CT=2〜22において、ＷＴおよびCry1-/-Cry2-/-の副腎からtotal RNAを抽出し、DBP（図１５（ａ））, E4BP4（図１５（ｂ））およびm-Hsd3b6（図１５（ｃ））に関して、それぞれ特異的RT-PCR測定をおこなった。N=3【００４７】
本来、E4BP4はWTの副腎においては夜高の日内変動を示すことが知られているが、Cry1-/-Cry2-/-の副腎では変動が消失し、発現は中程度のレベルに維持された。これに対し、DBPの発現は、WTにおいて昼高の日内変動を示し、Cryノックアウトでは常に高いレベルに維持された。
つまり、転写促進因子として機能するDBPの発現がCry1-/-Cry2-/-では恒常的に上昇し、転写抑制因子E4BP4の発現が亢進しないために、DBPの発現促進効果によりm-Hsd3b6発現が上昇したと考えられる。【００４８】
DBP自体の発現の調節は、時計因子であるCLOCK, BMAL1, CRY1, CRY2, PER1, PER2によって行われる（Mol Cell Biol. 2000 Jul;20(13):4773-81）。すなわち、DBPのプロモーター領域にはE-boxが存在し、E-boxに作用することが知られている転写促進因子CLOCK, BMAL1と転写抑制因子のCRY1, CRY2, PER1, PER2がDBPの発現をそれぞれ正と負に制御する。Cry1，Cry2ダブルノックアウトマウスでは、転写抑制因子のCRY1およびCRY2が欠失しているため、DBPの発現が上昇したと考えられる（Mol Cell Biol. 2000 Jul;20(13):4773-81）。
以上より、m-Hsd3b6の発現を調節する遺伝子群は、DBP, E4BP4, CLOCK, BMAL1, CRY1, CRY2, PER1, PER2と考えられる。【００４９】
図１６は、本明細書で記述した遺伝子の公式のGene name とGene IDを表にして示す図である。【００５０】
次に、m-Hsd3b6のヒトでの機能的カウンターパートである遺伝子h-Hsd3b1がヒト副腎皮質、球状層（adrenal zona glomerulosa）細胞で発現していることを証明したので、その根拠データについて説明する。【００５１】
−証明実験−
図１７は、サブタイプ特異的定量的ＰＣＲプローブ（Taqman MGB probe）の設計表を示す図である。ヒトのHsd3b遺伝子には、Type I（h-Hsd3b1）およびType II (h-Hsd3b2)とよばれる２種のサブタイプが存在し、それらh-Hsd3b1とh-Hsd3b2の塩基配列は93.6%のホモロジーがある。
Taqman MGB （Minor Groove Binder） probe法とは、SNPs測定や遺伝子サブタイプのような、構造の似た遺伝子の微妙な変化を識別する方法である。
同図に示すように、酵素の脱水素反応に関わる重要なY−X−X−X−K  モチーフ内のアミノ酸配列の相違（ヒスチジンとチロシンの相違）に対応する、h-Hsd3b1とh-Hsd3b2を識別できるＤＮＡシークエンスに関して、Type I プローブとType II プローブを設計した。Type I プローブにはレポーター蛍光色素FAM（Applied biosystems ）、Type II プローブにはレポーター蛍光色素VIC（Applied biosystems）を結合した。
図１７のリバースプライマーＲ１（５３３〜５５５）（薄いドットハッチンが施された領域）およびリバースプライマーＲ２（５２８〜５５２）（濃いドットハッチングが施された領域）は、それぞれh-Hsd3b1とh-Hsd3b2に対応するプライマーである。Ｆ０（４２９〜４５２）（破線ハッチングが施された領域）はh-Hsd3b1とh-Hsd3b2の両者に対応するフォワードプライマーである。これらのプライマーを用いてPCRを行い、増幅断片をType I プローブおよびType II プローブによって検出した。【００５２】
h-Hsd3b1特異的Taqman MGB probeを用いて、ヒト副腎皮質球状層細胞に発現するh-Hsd3b1を検出した。インフォームドコンセントを得て、2人の患者より、副腎摘出手術により癌化していない副腎を採取した。laser-microdissection(LCM)により副腎皮質、球状層（adrenal zona glomerulosa）細胞を調製して、これよりcDNAを作成し、ＰＣＲに供するサンプルとした。h-Hsd3b1を測定するプライマーとしてＲ１とＦ０を用いてPCRを行い、増幅産物をＦＡＭでラベルしたType I プローブおよびVICでラベルしたType II プローブを用いて検出した。両プローブセットは同じ反応チューブの中で同時に反応させることができ、発現する蛍光波長が異なるために、h-Hsd3b1とh-Hsd3b2を同時に測定することができる。
図１８は、Type Iプローブによるh-Hsd3b1遺伝子発現の検出を示す図である。同図に示すように、副腎皮質球状層（adrenal zona glomerulosa）細胞から調製したcDNAをh-Hsd3b1に特異的なプライマーセット(F0-R1)で増幅させた場合、TypeIプローブによる発色の増加は認められるが、TypeIIプローブによる発色は認められなかった。このことは、副腎皮質球状層細胞においてh-Hsd3b1が発現していることを示している。【００５３】
図１９は、上記発色特性を測定する操作において、副腎皮質球状層（adrenal zona glomerulosa）細胞で増複したＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動図を示す図である。図２０は、その産物のＤＮＡ配列測定結果を示す図である。h-Hsd3b1からの増複産物は127bpで想定通りであった。そのDNA配列はh-Hsd3b1からの増複産物として想定通りであった。よって、副腎皮質、球状層（adrenal zona glomerulosa）細胞にh-Hsd3b1が発現していることが証明された。【００５４】
次に、副腎皮質、球状層（ZG）細胞と束状層（zona fasciculate：ZF)細胞を、副腎皮質よりLCMで切りだして、total RNAを調製し、cDNAとして、上述のプローブセットでh-Hsd3b1とh-Hsd3b2の発現を測定した。
図２１は、h-Hsd3b1，h-Hsd3b2の発現特性を、顕微鏡写真図と共に示す図である。図２１に示すデータは、２人の患者サンプルより、各３回のcDNA調製を行って測定した平均値を示している。同図に示すように、ＺＧではh-Hsd3b1がh-Hsd3b2より比較的多く発現し、ZFではh-Hsd3b2がh-Hsd3b1より比較的多く発現していた。【００５５】
以上をまとめると、ヒトにおけるh-Hsd3b1とh-Hsd3b2サブタイプおよびそれぞれのマウスカウンターパート、m-Hsd3b6とm-Hsd3b1の存在部位は、図２２に示す通りである。本発明により、初めて、副腎皮質、球状層に、ヒトではh-Hsd3b1が、マウスではそのカウンターパートであるm-Hsd3b6が発現することが示された。【００５６】
上記開示された本発明の実施の形態の構造は、あくまで例示であって、本発明の範囲はこれらの記載の範囲に限定されるものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲の記載によって示され、さらに特許請求の範囲の記載と均等の意味及び範囲内でのすべての変更を含むものである。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、高血圧の治療，診断の他、高血圧治療薬の開発に利用することができる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図１】
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【図６】
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【図８】
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【国際調査報告】
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