(57)【要約】  本発明は、マウス由来の抗AXL抗体をヒト化することでヒトにおける免疫原性を低下させることを目的とする。Ａｎｅｘｅｌｅｋｔｏ（ＡＸＬ）の特定の領域に結合することができる抗体、ならびにこの抗体に基づいて作成されたヒト化抗体が提供される。本発明の抗AXL抗体は、高い抗腫瘍活性を有し、ＡＸＬ発現量低下剤として、抗癌剤として、および癌の診断薬として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（６）のいずれかに記載の、AXLのFND1ドメインを認識する抗体；
（１）配列番号：３３〜３７に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：３８〜４８に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域を有する抗体、
（２）配列番号：２（H0）に記載の重鎖可変領域を有する抗体、
（３）配列番号：８４〜８９に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：９０に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を有する抗体、
（４）配列番号：６５（L0）に記載の軽鎖可変領域を有する抗体、
（５）（１）の重鎖可変領域および（３）の軽鎖可変領域を有する抗体、
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
【請求項２】
以下の（１）〜（６）のいずれかに記載の、AXLのFND1ドメインを認識するヒト化抗体；
（１）配列番号：３３〜３７に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：３８〜４８に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ配列番号：５１に記載のアミノ酸配列を有するFR1、配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を有するFR2、配列番号：１０９、５８に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するFR3、配列番号：６１に記載のアミノ酸配列を有するFR4を含む重鎖可変領域を有する抗体、
（２）配列番号：２（H0）に記載の重鎖可変領域を有する抗体、
（３）配列番号：８４〜８９に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：９０に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ配列番号：９３に記載のアミノ酸配列を有するFR1、配列番号：９６に記載のアミノ酸配列を有するFR2、配列番号：１０１に記載のアミノ酸配列を有するFR3、配列番号：１０３に記載のアミノ酸配列を有するFR4を含む軽鎖可変領域を有する抗体、
（４）配列番号：６５（L0）に記載の軽鎖可変領域を有する抗体、
（５）（１）の重鎖可変領域および（３）の軽鎖可変領域を有する抗体、
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
【請求項３】
重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる94位のアミノ酸残基がグリシンである、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
重鎖可変領域のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸残基のうち少なくとも一つを有する、請求項１〜３に記載のいずれかの抗体。
（１）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる31位のアミノ酸残基がアスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニン
（２）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる40位のアミノ酸残基がプロリン
（３）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる41位のアミノ酸残基がアルギニン
（４）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる43位のアミノ酸残基がグルタミン又はグルタミン酸
（５）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる44位のアミノ酸残基がアルギニン
（６）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる48位のアミノ酸残基がイソロイシン
（７）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる61位のアミノ酸残基がグルタミン酸、リジン又はアルギニン
（８）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる62位のアミノ酸残基がグルタミン酸
（９）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる64位のアミノ酸残基がグルタミン
（１０）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる65位のアミノ酸残基がアスパラギン酸
（１１）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる73位のアミノ酸残基がアスパラギン
（１２）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる105位のアミノ酸残基がグルタミン酸又はアルギニン
【請求項５】
重鎖可変領域のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸残基のうち少なくとも一つを有する、請求項１〜３に記載のいずれかの抗体。
（１）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる41位のアミノ酸残基がアルギニン
（２）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる43位のアミノ酸残基がグルタミン
（３）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる44位のアミノ酸残基がアルギニン
（４）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる61位のアミノ酸残基がアルギニン
（５）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる73位のアミノ酸残基がアスパラギン
【請求項６】
軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸残基のうち少なくとも一つを有する、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体。
（１）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる17位のアミノ酸残基がアルギニン
（２）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる24位のアミノ酸残基がグルタミン
（３）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる27位のアミノ酸残基がグルタミン酸又はアルギニン
（４）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる29位のアミノ酸残基がアラニン
（５）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる42位のアミノ酸残基がグルタミン酸又はグルタミン
（６）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる45位のアミノ酸残基がリジン
（７）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる100位のアミノ酸残基がアルギニン
（８）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる104位のアミノ酸残基がバリン
（９）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる107位のアミノ酸残基がグルタミン酸
【請求項７】
軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸残基のうち少なくとも一つを有する、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体。
（１）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる17位のアミノ酸残基がアルギニン
（２）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる24位のアミノ酸残基がグルタミン
（３）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる27位のアミノ酸残基がアルギニン
（４）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる29位のアミノ酸残基がアラニン
（５）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる45位のアミノ酸残基がリジン
（６）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる100位のアミノ酸残基がアルギニン
（７）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる104位のアミノ酸残基がバリン
（８）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる107位のアミノ酸残基がグルタミン酸
【請求項８】
少なくとも以下のいずれかの重鎖可変領域を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体。
（１）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：３８に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（２）配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：３８に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（３）配列番号：３５に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：３８に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（４）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：３９に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（５）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：４０に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（６）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：４１に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（７）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：４２に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（８）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：４３に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（９）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：４４に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（１０）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：４５に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（１１）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：４６に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（１２）配列番号：３６に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：３８に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（１３）配列番号：３７に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：３８に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（１４）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：４７に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（１５）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：４８に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
【請求項９】
以下の（１）〜（２５）からなる群より選択される請求項１〜７のいずれかに記載の抗体。
（１）それぞれ配列番号：33，38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２）それぞれ配列番号：33，38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：85，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（３）それぞれ配列番号：33，38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号：86，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（４）それぞれ配列番号：33，38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：87，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（５）それぞれ配列番号：33，38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：88，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（６）それぞれ配列番号：34，38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（７）それぞれ配列番号：35，38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（８）それぞれ配列番号：33，39および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（９）それぞれ配列番号：33，40および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１０）それぞれ配列番号：33，41および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１１）それぞれ配列番号：33，42および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１２）それぞれ配列番号：33，43および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１３）それぞれ配列番号：33，44および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１４）それぞれ配列番号：33，44および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：85，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１５）それぞれ配列番号：33，45および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１６）それぞれ配列番号：33，46および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１７）それぞれ配列番号：33，44および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：89，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１８）それぞれ配列番号：36，38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１９）それぞれ配列番号：37，38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２０）それぞれ配列番号：33，47および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２１）それぞれ配列番号：33，48および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２２）それぞれ配列番号：33，48および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：85，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２３）それぞれ配列番号：33，48および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：87，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２４）それぞれ配列番号：33，47および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：85，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２５）それぞれ配列番号：33，47および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：87，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
【請求項１０】
配列番号：２〜３２のいずれかに記載の重鎖可変領域と配列番号：６５〜８３のいずれかに記載の軽鎖可変領域を有する請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号：１に記載の重鎖可変領域と配列番号：６４に記載の軽鎖可変領域を有し、ヒト抗体由来の定常領域を有するキメラ抗体、或いは当該キメラ抗体において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、当該キメラ抗体と同等の活性を有する請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、Kabatナンバリングによる42位のアミノ酸残基がリジンである、請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体を有効成分とする医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体を有効成分とする抗癌剤。
【請求項１５】
癌が膵臓癌、胃癌、肺癌、骨肉腫、大腸癌、前立腺癌、メラノーマ、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮平滑筋腫、甲状腺癌、幹細胞癌、乳癌、膀胱癌、腎臓癌、グリオーマ、神経芽腫、または食道癌である請求項１４に記載の抗癌剤。
【請求項１６】
癌がグリオーマ、胃癌、子宮内膜癌、非小細胞肺癌、膵臓腺癌または乳癌である請求項１４に記載の抗癌剤。
【請求項１７】
癌が膵臓腺癌または乳癌である請求項１４に記載の抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗Anexelekto（AXL）抗体、ならびにかかる抗体を有効成分とする抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Anexelekto（AXL、UFO、ARKまたはTYRO7とも称される。以下、AXLという。）は、細胞膜上に存在する受容体チロシンキナーゼであり（非特許文献１）、リガンドであるGas6（growth arrest specific gene 6）の結合後生じる自身のリン酸化を通じて、下流分子へのシグナル伝達を担っているといわれている（非特許文献２）。【０００３】
AXLの分子機能としては、細胞増殖促進・アポトーシス抑制・細胞遊走・細胞接着への寄与が示唆されている。これら機能推定の根拠となった実験事実は、Gas6タンパク処理を施した細胞に生じる現象である。現在までに、ラット血管平滑筋の細胞死抑制ならびに増殖亢進（非特許文献３・４）、マウスNIH3T3細胞の血清飢餓後の細胞増殖亢進ならびに細胞死抑制（非特許文献５・６）、マウス心臓繊維芽細胞の増殖促進（非特許文献７）、ヒト前立腺癌由来細胞の増殖促進（非特許文献８）、ヒト胃癌由来細胞の増殖促進・細胞浸潤促進・細胞死抑制（非特許文献９）、ヒトおよびラット血管平滑筋細胞の細胞遊走能亢進（非特許文献１０）、マウス神経細胞の細胞遊走能亢進（非特許文献１１）、マウスAXL高発現細胞の細胞凝集（非特許文献１２）といった実験結果が報告されている。【０００４】
同様にGas6処理後の細胞内シグナル分子解析によって、PI3K-AktパスウェイならびにMAPKパスウェイがAXLを介したシグナル伝達の下流パスウェイとして機能しているといわれている（非特許文献２）。これら下流パスウェイに対する直接的分子間相互作用の存在を確認する実験として、AXLの細胞内領域をbaitとしたYeast two-hybrid法を用いた解析が行われ、GrbB2/PI3K/p55γ/SOCS-1/NcK2/RanBP2/C1-TENが同定されている（非特許文献１３）。これらタンパクとの相互作用は、AXLシグナル下流における上記細胞内シグナル伝達パスウェイの存在を示唆するとともに、AXLの想定分子機能である細胞増殖促進・アポトーシス抑制・細胞遊走・細胞接着への関与を支持している。加えて、AXLはIL-15によるマウス繊維芽細胞のTNFα誘導細胞死抑制時に高発現している遺伝子としても同定されており、AXLの発現抑制によるTNFα誘導細胞死抑制の解除、IL-15処理によるIL-15受容体およびAXLのリン酸化亢進といった実験事実から、IL-15受容体との共役を介したシグナル伝達の存在も示唆されている（非特許文献１４）。【０００５】
AXLのdominant negative体を過剰発現したヒトグリオーマ株では、Gas6によるAXLのリン酸化が抑制され、ヌードマウスでの造腫瘍性が消失するとの報告がある（非特許文献１５）。しかし、抗AXL抗体でリン酸化を阻害するものが存在するか否かについては、報告も示唆もされておらず不明であった。【０００６】
AXLは１回膜貫通型の受容体チロシンキナーゼであり、細胞外領域は、N末側から、２つのImmunogrobulin like domain（それぞれIgD1、IgD2という）と2つのFibronectin type III domain（それぞれFND1、FND2という）で構成されている（非特許文献１）。FNDは、細胞間接着に関与するNeural cell adhesion molecule やnephrin等の分子で発現していることが知られているが、AXLにおけるFNDの機能に関する詳細は不明である（非特許文献１６）。【０００７】
本来の細胞形質転換能を保持するオンコジーンとして同定されたAXLについては、癌化関連分子としての解析対象となっており、多くの発現解析がタンパク・mRNA量で報告されている。ヒト癌組織もしくはヒト癌細胞における発現確認事例として、肺癌（非特許文献１７）・乳癌（非特許文献１８）・卵巣癌（非特許文献１９）・甲状腺癌（非特許文献２０）・メラノーマ（非特許文献２０）・腎癌（非特許文献２１）・胃癌（非特許文献９）・グリオーマ（非特許文献２２）といった癌種において、AXLタンパクの高発現が確認されており、食道癌（非特許文献２３）・大腸癌（非特許文献２４）・急性骨髄性白血病（非特許文献２５）における高レベルのAXL mRNAの存在から、AXLタンパクの高発現が示唆されている。上記事実に加えて、HUVEC細胞におけるRNAiによるAXL抑制を介した管腔形成阻害（非特許文献２６）、恒常的AXL抑制によるヒト乳癌由来細胞のマウス内腫瘍形成能低下（非特許文献２６）、恒常的ドミナントネガティブ変異体高発現によるヒトグリオーマ細胞のマウス内腫瘍形成能低下（非特許文献２２）が報告されており、腫瘍増殖におけるAXLの分子機能関与が強く示唆されている。【０００８】
AXLの細胞外領域に対するポリクローナル抗体が高浸潤性乳癌細胞系の遊走抑制作用を有することが報告されている（特許文献１）。しかし、非臨床試験で癌細胞遊走抑制作用を示す薬物が必ずしも抗腫瘍活性を示すとは限らないことが知られている。例えば、Matrix metalloproteinase（以下、MMPという）は、腫瘍の浸潤、遊走を促進することが知られていることから、MMPの酵素活性を阻害する種々のMatrix metalloproteinase inhibitorが、抗癌剤の候補として注目され、Batimastat, Marimastat, Prinomastatなど様々な薬剤が治験入りした。しかし、臨床で抗腫瘍効果は認められなかった（非特許文献２７）。【０００９】
したがって、AXLの特定の領域に結合する抗体が、特にin vivoで抗腫瘍効果を有するか否か、あるいは該抗体がAXL発現量低下作用を有するか否か、又、該抗体が癌抑制作用を有するか否かについては、報告も示唆もされておらず不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO2004/008147
【特許文献２】WO2007/114319
【特許文献３】WO2009/041643
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】O'Bryanら  Mol Cell Biol 1991;11:5016-5031.
【非特許文献２】Varnumら  Nature 1995; 373:623-626.
【非特許文献３】Nakanoら  FEBS Lett 1996;387:78-80.
【非特許文献４】Nakanoら  J Biol Chem 1995;270:5702-5705.
【非特許文献５】Goruppiら  Mol Cell Biol 1997;17:4442-4453.
【非特許文献６】Bellostaら  Oncogene 1997;15:2387-2397.
【非特許文献７】Stenhoffら  Biochem Biophys Res Commun 2004;319:871-878.
【非特許文献８】Sainaghiら  J Cell Physiol 2005;204:36-44.
【非特許文献９】Sawabuら  Mol Carcinog 2007;46:155-164
【非特許文献１０】Fridellら  J Biol Chem 1998;273:7123-7126
【非特許文献１１】Allenら  Mol Cell Biol 2002;22:599-613.
【非特許文献１２】McCloskeyら  J Biol Chem 1997; 272:23285-23291.
【非特許文献１３】Hafiziら  Biochem Biophys Res Commun 2002;299:793-800.
【非特許文献１４】Budagianら  Embo J 2005;24:4260-4270.
【非特許文献１５】VajkoczyPら  Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103: 5799-5804.
【非特許文献１６】Yamagataら  Curr. Opin. Cell Biol 2003; 15:621-632.
【非特許文献１７】Shiehら  Neoplasia 2005;7:1058-1064
【非特許文献１８】Mericら  Clin Cancer Res 2002;8:361-367
【非特許文献１９】Sunら  Oncology 2004;66:450-457
【非特許文献２０】Itoら  Thyroid 2002;12:971-975
【非特許文献２１】Chungら  DNA Cell Biol 2003;22:533-540
【非特許文献２２】Vajkoczyら Proc Natl Acad Sci USA 2006;103:5799-5804
【非特許文献２３】Nemotoら  Pathobiology 1997;65:195-203
【非特許文献２４】Cravenら  Int J Cancer 1995; 60:791-797
【非特許文献２５】Neubauerら  Blood 1994;84:1931-1941
【非特許文献２６】Hollandら  Cancer Res 2005;65:9294-9303
【非特許文献２７】Pavlakiら  Cancer Metastasis Rev. 2003;22:177-203
【非特許文献２８】Vaisittiら  J Biol Regul Homeost Agents. 2005;19: 105-12
【非特許文献２９】Pardridgeら  J Pharmacol Exp Ther. 1998;286:548-54
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、抗Anexelekto（AXL）抗体、ならびにかかる抗体を有効成分とする抗癌剤の提供を課題とする。より詳細には、本発明はマウス由来の抗AXL抗体をヒト化することでヒトにおける免疫原性を低下させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、AXLに結合するある種の抗体が、in vitroでAXL発現量低下作用を有し、in vivoで抗腫瘍活性を有することを見出した。さらに、AXLのFND1領域に結合する抗体が、AXLの他の領域に結合する抗体より強い抗腫瘍活性を有することも見出した。【００１４】
また、本発明者らは、上記で取得した抗AXL抗体をヒト化することで、ヒト化抗AXL抗体の取得に成功した。【００１５】
これらヒト化抗体は、マウス由来の抗AXL抗体よりヒトにおける免疫原性が低下していることが期待される。【００１６】
即ち、本発明は以下に関する。
〔１〕  以下の（１）〜（６）のいずれかに記載の、AXLのFND1ドメインを認識する抗体；
（１）配列番号：３３〜３７に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：３８〜４８に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域を有する抗体、
（２）配列番号：２（H0）に記載の重鎖可変領域を有する抗体、
（３）配列番号：８４〜８９に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：９０に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む軽鎖可変領域を有する抗体、
（４）配列番号：６５（L0）に記載の軽鎖可変領域を有する抗体、
（５）（１）の重鎖可変領域および（３）の軽鎖可変領域を有する抗体、
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
〔２〕  以下の（１）〜（６）のいずれかに記載の、AXLのFND1ドメインを認識するヒト化抗体；
（１）配列番号：３３〜３７に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：３８〜４８に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ配列番号：５１に記載のアミノ酸配列を有するFR1、配列番号：５３に記載のアミノ酸配列を有するFR2、配列番号：１０９、５８に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するFR3、配列番号：６１に記載のアミノ酸配列を有するFR4を含む重鎖可変領域を有する抗体、
（２）配列番号：２（H0）に記載の重鎖可変領域を有する抗体、
（３）配列番号：８４〜８９に記載のいずれかのアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：９０に記載のアミノ酸配列を有するCDR2、配列番号：９１に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ配列番号：９３に記載のアミノ酸配列を有するFR1、配列番号：９６に記載のアミノ酸配列を有するFR2、配列番号：１０１に記載のアミノ酸配列を有するFR3、配列番号：１０３に記載のアミノ酸配列を有するFR4を含む軽鎖可変領域を有する抗体、
（４）配列番号：６５（L0）に記載の軽鎖可変領域を有する抗体、
（５）（１）の重鎖可変領域および（３）の軽鎖可変領域を有する抗体、
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
〔３〕  重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる94位のアミノ酸残基がグリシンである、〔１〕又は〔２〕に記載の抗体。
〔４〕  重鎖可変領域のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸残基のうち少なくとも一つを有する、〔１〕〜〔３〕に記載のいずれかの抗体。
（１）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる31位のアミノ酸残基がアスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニン
（２）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる40位のアミノ酸残基がプロリン
（３）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる41位のアミノ酸残基がアルギニン
（４）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる43位のアミノ酸残基がグルタミン又はグルタミン酸
（５）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる44位のアミノ酸残基がアルギニン
（６）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる48位のアミノ酸残基がイソロイシン
（７）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる61位のアミノ酸残基がグルタミン酸、リジン又はアルギニン
（８）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる62位のアミノ酸残基がグルタミン酸
（９）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる64位のアミノ酸残基がグルタミン
（１０）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる65位のアミノ酸残基がアスパラギン酸
（１１）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる73位のアミノ酸残基がアスパラギン
（１２）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる105位のアミノ酸残基がグルタミン酸又はアルギニン
〔５〕  重鎖可変領域のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸残基のうち少なくとも一つを有する、〔１〕〜〔３〕に記載のいずれかの抗体。
（１）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる41位のアミノ酸残基がアルギニン
（２）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる43位のアミノ酸残基がグルタミン
（３）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる44位のアミノ酸残基がアルギニン
（４）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる61位のアミノ酸残基がアルギニン
（５）重鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる73位のアミノ酸残基がアスパラギン
〔６〕  軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸残基のうち少なくとも一つを有する、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の抗体。
（１）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる17位のアミノ酸残基がアルギニン
（２）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる24位のアミノ酸残基がグルタミン
（３）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる27位のアミノ酸残基がグルタミン酸又はアルギニン
（４）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる29位のアミノ酸残基がアラニン
（５）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる42位のアミノ酸残基がグルタミン酸又はグルタミン
（６）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる45位のアミノ酸残基がリジン
（７）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる100位のアミノ酸残基がアルギニン
（８）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる104位のアミノ酸残基がバリン
（９）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる107位のアミノ酸残基がグルタミン酸
〔７〕  軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸残基のうち少なくとも一つを有する、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の抗体。
（１）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる17位のアミノ酸残基がアルギニン
（２）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる24位のアミノ酸残基がグルタミン
（３）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる27位のアミノ酸残基がアルギニン
（４）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる29位のアミノ酸残基がアラニン
（５）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる45位のアミノ酸残基がリジン
（６）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる100位のアミノ酸残基がアルギニン
（７）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる104位のアミノ酸残基がバリン
（８）軽鎖可変領域におけるKabatナンバリングによる107位のアミノ酸残基がグルタミン酸
〔８〕  少なくとも以下のいずれかの重鎖可変領域を有する、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の抗体。
（１）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：３８に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（２）配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：３８に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（３）配列番号：３５に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：３８に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（４）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：３９に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（５）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：４０に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（６）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：４１に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（７）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：４２に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（８）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：４３に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（９）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：４４に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（１０）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：４５に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（１１）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：４６に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（１２）配列番号：３６に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：３８に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（１３）配列番号：３７に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：３８に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（１４）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：４７に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
（１５）配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号：４８に記載ののアミノ酸配列を有するCDR2、及び配列番号：４９に記載のアミノ酸配列を有するCDR3を含む重鎖可変領域
〔９〕  以下の（１）〜（２５）からなる群より選択される〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の抗体。
（１）それぞれ配列番号：33，38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２）それぞれ配列番号：33，38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：85，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（３）それぞれ配列番号：33，38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域，およびそれぞれ配列番号：86，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（４）それぞれ配列番号：33，38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：87，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（５）それぞれ配列番号：33，38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：88，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（６）それぞれ配列番号：34，38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（７）それぞれ配列番号：35，38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（８）それぞれ配列番号：33，39および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（９）それぞれ配列番号：33，40および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１０）それぞれ配列番号：33，41および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１１）それぞれ配列番号：33，42および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１２）それぞれ配列番号：33，43および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１３）それぞれ配列番号：33，44および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１４）それぞれ配列番号：33，44および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：85，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１５）それぞれ配列番号：33，45および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１６）それぞれ配列番号：33，46および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１７）それぞれ配列番号：33，44および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：89，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１８）それぞれ配列番号：36，38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（１９）それぞれ配列番号：37，38および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２０）それぞれ配列番号：33，47および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２１）それぞれ配列番号：33，48および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：84，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２２）それぞれ配列番号：33，48および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：85，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２３）それぞれ配列番号：33，48および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：87，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２４）それぞれ配列番号：33，47および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：85，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体；
（２５）それぞれ配列番号：33，47および49に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号：87，90および91に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、2および3を有する軽鎖可変領域を含む抗体。
〔１０〕  配列番号：２〜３２のいずれかに記載の重鎖可変領域と配列番号：６５〜８３のいずれかに記載の軽鎖可変領域を有する〔１〕又は〔２〕に記載の抗体。
〔１１〕配列番号：１に記載の重鎖可変領域と配列番号：６４に記載の軽鎖可変領域を有し、ヒト抗体由来の定常領域を有するキメラ抗体、或いは当該キメラ抗体において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された抗体であって、当該キメラ抗体と同等の活性を有する〔１〕に記載の抗体。
〔１２〕軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、Kabatナンバリングによる42位のアミノ酸残基がリジンである、〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の抗体。
〔１３〕  〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の抗体を有効成分とする医薬組成物。
〔１４〕  〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の抗体を有効成分とする抗癌剤。
〔１５〕  癌が膵臓癌、胃癌、肺癌、骨肉腫、大腸癌、前立腺癌、メラノーマ、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮平滑筋腫、甲状腺癌、幹細胞癌、乳癌、膀胱癌、腎臓癌、グリオーマ、神経芽腫、または食道癌である〔１４〕に記載の抗癌剤。
〔１６〕  癌がグリオーマ、胃癌、子宮内膜癌、非小細胞肺癌、膵臓腺癌または乳癌である〔１４〕に記載の抗癌剤。
〔１７〕  癌が膵臓腺癌または乳癌である〔１４〕に記載の抗癌剤。【００１７】
さらに本発明は以下を提供する。
〔１８〕  〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の抗体を対象（例えば、ヒト等の哺乳動物）へ投与する工程を含む、癌の治療方法。
〔１９〕  〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の抗体の、抗癌剤の製造における使用。【００１８】
本発明者によって選択されたハイブリドーマ（受託番号FERM BP-10854）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
(a)寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号305-8566）
(b)受託日（寄託日）：２００７年７月５日
(c)受託番号：
AXL No.225 #070402 (Ax225)（受託番号  FERM BP-10854）【００１９】
該ハイブリドーマが産生する抗体の、重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号：１に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号：６４に示す。該重鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列を、配列番号：３３、配列番号：３８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５７および配列番号：６０に示す。また、該軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列を、配列番号：８４、配列番号：９０、配列番号：９１、配列番号：９２、配列番号：９５、配列番号：１００および配列番号：１０２に示す。【００２０】
本発明の好ましい抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、ならびにこれらのCDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3およびFR4のアミノ酸配列と、配列番号との対応を以下の表１および表２に示す。【００２１】
【表１】
2010131733.tif 000002
【００２２】
【表２】
2010131733.tif 000003
【００２３】
また、上述のいずれかに記載の抗体のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入され、かつその抗体と同等の活性を有する抗体も本発明の範囲内である。【００２４】
本発明で「同等の活性を有する抗体」とは、たとえば「少なくとも同等の結合活性あるいはin vivo活性を有する抗体」をいう。具体的には「H0及び／またはL0のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入され、かつH0/L0抗体と比較して、少なくとも同等の抗原結合活性あるいはin vivo活性を有する抗体」も本発明の範囲内である。ここで、in vivo活性としてはin vivo試験における抗腫瘍活性などを含み、具体的には本願の実施例６で採用した異種移植（xenograft）マウスモデル試験も含まれる。【００２５】
好ましくは、本発明の抗体はAXLのFND1領域に結合するヒト化抗体である。すなわち、別の観点においては、本発明はAXLに結合するヒト化抗体を提供する。【００２６】
さらに別の観点においては、本発明は、上述の本発明のいずれかの抗体を含む医薬組成物を提供する。好ましくは医薬組成物とは抗癌剤である。【００２７】
さらに別の観点においては、本発明は、上述の本発明のいずれかの抗体を含むAXL発現量低下剤、診断薬を提供する。
【発明の効果】
【００２８】
これらヒト化抗体は、マウス由来の抗AXL抗体よりヒトにおける免疫原性が低下していることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】抗AXL抗体の抗腫瘍活性および結合ドメインを示す図である。−：TGI(%)＜30、＋：TGI（％）＜60、＋＋：60＝＜TGI（％）。
【図２】Ax225抗体による癌細胞内AXLの分解誘導活性の評価実験の結果を示す写真である。該抗体は、AXLタンパク質の分解を誘導することが示された。
【図３】抗AXL抗体のヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルに対する抗腫瘍効果の測定結果を示すグラフである。
【図４】ヒト化Ax225抗体の発現量を示すグラフである。
【図５】ヒト化Ax225抗体の発現量を示すグラフである。
【図６】ヒト化Ax225抗体(H9/L0)の腫瘍の増殖抑制効果を示すグラフである。＊印は、p＜0.05であることを示す。
【図７】ヒト化抗AXL抗体(H47/L0、H47/L11、H50/L0、H50/L11)のヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルに対する抗腫瘍効果を示すグラフである。＊印は、p＜0.05であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
ヒト化抗体
本発明における抗体の好ましい態様の一つとして、AXLに結合するヒト化抗体を挙げることができる。ヒト化（humanized）抗体は既知の方法を用いて製造することができる。ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。
【００３１】
本発明において、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来抗体の相補性決定領域（CDR；complementarity determining region）と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR；framework region）およびヒト抗体由来の定常領域（Constant region）とから構成される。好ましくは、ヒト以外の動物由来抗体とは、受託番号FERM BP-10854として寄託されているハイブリドーマ（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター，日本国茨城県つくば市東１丁目１番１  中央第６，受託日（寄託日）：２００７年７月５日）により産生されるAx225抗体である（出願番号；PCT/JP2008/070739）。Ax225抗体の取得方法については参考例１に記載する。Ax225抗体がAXLのFND1領域に結合することについては参考例２に記載する。Ax225抗体がAXLの発現量低下活性を有することについては参考例３に記載する。
【００３２】
ヒト化抗体を作成するための一般的な遺伝子組換え手法についても知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、WO 96/02576 号公報参照）。得られたDNAをヒト抗体定常領域もしくはヒト抗体定常領域改変体をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより、ヒト化抗体が得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400、国際特許出願公開番号WO 96/02576参照）。
【００３３】
Ax225抗体のCDR領域とヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）とを連結したヒト化Ax225抗体は、以下のように作製可能である。まず、ヒト化Ax225抗体の重鎖（H鎖）、軽鎖（L鎖）それぞれの可変領域配列を設計し、これらの領域をコードする複数本の合成オリゴDNA断片を設計する。これらのオリゴDNA断片をアッセンブルPCR法によって連結し、可変領域全長をコードする遺伝子を作製する。（WO98/13388号公報に記載の方法を参照）。
【００３４】
CDRと連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、CDRが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換、欠失、付加および／または挿入等してもよい。
【００３５】
又、上述のCDR配列において１又は複数のアミノ酸を置換、欠失、付加および／または挿入等してもよい。１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入後のCDR配列は、結合活性、中和活性、安定性、免疫原性および／または薬物動態において改変前のCDR配列と同等以上の性質を有していることが好ましい。置換、欠失、付加および／または挿入されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１つのCDRにつき３アミノ酸以内、さらに好ましくは２アミノ酸以内、より好ましくは１アミノ酸である。
【００３６】
アミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入などは上述の方法により行うことも可能である。
【００３７】
又、本発明の抗体で用いられる定常領域は特に限定されず、如何なる定常領域が用いられてもよい。本発明の抗体で用いられる定常領域の好ましい例としては、ヒト抗体由来の定常領域（例えばH鎖では、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2およびCε、L鎖ではCκ、Cλなど）を挙げることができる。天然型のヒト抗体定常領域として特に好ましい例としては、IgG1、IgG2またはIgG4由来の定常領域が挙げられる。
【００３８】
本発明の抗体の定常領域がIgG1由来である場合、そのADCC活性やCDC活性により後述する本発明の抗体の抗腫瘍活性が増強されることが期待できる。
【００３９】
本発明の抗体の定常領域がIgG4由来である場合、本発明の抗体の副作用の低減が期待できる。
【００４０】
また、ヒト抗体由来の定常領域は、ヘテロジェニティーの低減、ADCC活性の増強、血漿中半減期の延長等の目的で１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されていてもよい。ここで1又は複数のアミノ酸とは、例えば３０個以下のアミノ酸であり、好ましくは１５個以下のアミノ酸であり、さらに好ましくは１０個以下のアミノ酸であり、特に好ましくは２個以下のアミノ酸である。
【００４１】
本発明の抗体には、AXL（好ましくはFND1領域）への結合活性および／または中和活性を有する限り、IgGに代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。本発明の抗体は、抗体の全長分子に限らず、AXLに結合する限り、低分子化抗体またはその修飾物であってもよい。
【００４２】
低分子化抗体は、全長抗体（whole antibody、例えばwhole IgG等）の一部分が欠損している抗体断片を含む抗体であり、AXLへの結合活性および／または中和活性を有する限り特に限定されない。本発明において低分子化抗体は、全長抗体の一部分を含む限り特に限定されないが、VH又はVLを含んでいることが好ましく、特に好ましくはVHとVLの両方を含む低分子化抗体である。又、本発明の低分子化抗体の他の好ましい例として、抗体のCDRを含む低分子化抗体を挙げることができる。低分子化抗体に含まれるCDRは抗体の６つのCDR全てが含まれていてもよいし、一部のCDRが含まれていてもよい。
【００４３】
本発明における低分子化抗体は、全長抗体よりも分子量が小さくなることが好ましいが、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーなどの多量体を形成すること等もあり、全長抗体よりも分子量が大きくなることもある。
【００４４】
抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single-chain Fv）、Diabody、sc(Fv)2（single-chain (Fv)2）などを挙げることができる。これら抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の低分子化抗体に含まれる。
【００４５】
抗体断片は、例えば、抗体を酵素で処理して抗体断片を生成させることによって得ることができる。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知である。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. and Horwitz, A. H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Plueckthun, A. and Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1989）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137参照）。
【００４６】
消化酵素は、抗体断片の特定の位置を切断し、次のような特定の構造の抗体断片を与える。このような酵素的に得られた抗体断片に対して、遺伝子工学的手法を利用すると、抗体の任意の部分を欠失させることができる。
【００４７】
上述の消化酵素を用いた場合に得られる抗体断片は以下のとおりである。
パパイン消化：F(ab)2またはFab
ペプシン消化：F(ab')2またはFab'
プラスミン消化：Facb
【００４８】
本発明における低分子化抗体は、AXLへの結合活性および／または中和活性を有する限り、任意の領域を欠失した抗体断片を含むことができる。
【００４９】
Diabodyは、遺伝子融合により構築された二価（bivalent）の低分子化抗体を指す（Holliger P et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、EP404,097号、WO93/11161号等）。Diabodyは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中でVL及びVHがリンカーにより結合されている。Diabodyにおける当該ポリペプチド鎖のリンカーは、一般に、VLとVHが互いに結合できない位に短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、2〜12残基が好ましく、さらに3〜10残基が好ましく、特には5残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは、単鎖可変領域フラグメントを形成できず、別の単鎖可変領域フラグメントと二量体を形成する。その結果、Diabodyは2つの抗原結合部位を有することとなる。
【００５０】
scFv抗体は、VH及びVLをリンカー等で結合して一本鎖ポリペプチドにした抗体である(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883、Plickthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」Vol.113, Resenburg 及び Moore編, Springer Verlag, New York, pp.269-315, (1994))。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、本明細書に記載されたいずれの抗体由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば３から２５残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。具体的には、たとえば後述のペプチドリンカー等を用いることができる。
【００５１】
両鎖のV領域は、例えば上記のようなPCR法によって連結することができる。PCR法によるV領域の連結のために、まず次のDNAのうち、全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするDNAが鋳型として利用される。
抗体のH鎖またはH鎖Ｖ領域をコードするDNA配列、および
抗体のL鎖またはL鎖Ｖ領域をコードするDNA配列
【００５２】
増幅すべきDNAの両端の配列に対応する配列を有するプライマーの一対を用いたPCR法によって、H鎖とL鎖のV領域をコードするDNAがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするDNAを用意する。ペプチドリンカーをコードするDNAもPCRを利用して合成することができる。このとき利用するプライマーの5'側に、別に合成された各V領域の増幅産物と連結できる塩基配列を付加しておく。次いで、［H鎖V領域DNA］−［ペプチドリンカーDNA］−［L鎖V領域DNA］の各DNAと、アセンブリーPCR用のプライマーを利用してPCR反応を行う。
【００５３】
アセンブリーPCR用のプライマーは、［H鎖V領域DNA］の5'側にアニールするプライマーと、［L鎖V領域DNA］の3'側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわちアセンブリーPCR用プライマーとは、合成すべきscFvの全長配列をコードするDNAを増幅することができるプライマーセットである。一方［ペプチドリンカーDNA］には各V領域DNAと連結できる塩基配列が付加されている。その結果、これらのDNAが連結され、さらにアセンブリーPCR用のプライマーによって、最終的にscFvの全長が増幅産物として生成される。一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞が常法に従って取得できる。また、その結果得られる組換え細胞を培養して該scFvをコードするDNAを発現させることにより、該scFvが取得できる。
【００５４】
結合されるVHとVLの順序は特に限定されず、どのような順序で並べられていてもよく、例えば、以下のような配置を挙げることができる。
［VH］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VH］
【００５５】
sc(Fv)2は、2つのVH及び2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson et al、J Immunol. Methods 1999；231：177-189）。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。
【００５６】
また２つのVH及び２つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましいが、2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］
【００５７】
低分子抗体中のVH又はVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。さらに、VHとVLを会合させた場合に、抗原結合活性を有する限り、一部を欠損させてもよいし、他のポリペプチドを付加してもよい。又、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。
【００５８】
本発明において、抗体の可変領域を結合するリンカーは、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー、例えば、Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996に開示されるリンカーを用いることができる。
【００５９】
本発明において好ましいリンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通常、1〜100アミノ酸、好ましくは3〜50アミノ酸、更に好ましくは5〜30アミノ酸、特に好ましくは12〜18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。
【００６０】
ペプチドリンカーのアミノ酸配列としては、例えば、以下のような配列を挙げることができる。
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：１１０）
Ser・Gly・Gly・Gly（配列番号：１１１）
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：１１２）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：１１３）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：１１４）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：１１５）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：１１６）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：１１７）
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号：１１２）)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号：１１３）)n
［nは1以上の整数である］等を挙げることができる。
【００６１】
ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。たとえば上記のペプチドリンカーの長さを決定するnは、通常１〜５、好ましくは１〜３、より好ましくは１または２である。
【００６２】
合成化合物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−EGS）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−DST）、ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ−BSOCOES）などであり、これらの架橋剤は市販されている。
【００６３】
4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となる。複数のリンカーは、同じでもよいし、異なるリンカーを用いることもできる。
【００６４】
本発明の抗体には、本発明の抗体のアミノ酸配列に１又は複数個のアミノ酸残基が付加された抗体も含まれる。また、これら抗体と他のペプチド又はタンパク質とが融合した融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチド又はポリペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein Cの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、GST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと融合させ、これにより調製された融合ポリヌクレオチドを発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
【００６５】
また本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）やヒアルロン酸などの高分子物質、放射性物質、蛍光物質、発光物質、酵素、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている（例えば、US5057313、US5156840）。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
【００６６】
また本発明の抗体には、糖鎖が改変された抗体も包含される。抗体の糖鎖を改変することにより抗体の細胞傷害活性を増強できることが知られている。糖鎖が改変された抗体としては、例えば、次のような抗体が公知である；
グリコシル化が修飾された抗体（WO99/54342など）、
糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体（WO00/61739、WO02/31140など））、
バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体（WO02/79255など）など。
【００６７】
さらに、本発明で使用される抗体は二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体を言う。本発明において、二重特異性抗体はAXL分子上の異なるエピトープを認識する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がAXLを認識し、他方の抗原結合部位が他の物質を認識する二重特異性抗体とすることもできる。さらに、別の観点からは、一方の抗原結合部位がAXLを認識し、他方の抗原結合部位がヒトエフェクター細胞の抗原を認識する二重特異性抗体とすることもできる。AXLを認識する本発明の抗体からなる二重特異性抗体の他方の抗原結合部位が結合する抗原としては、例えば、CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD25, CD28, CD33, CD30, CD44, CD44v6, CD52, VEGF, VEGFR, EGF, EGFR, EGFRvIII, HER-2 neu, HER-3, HER-4, cMET, EpCAM, IGF-1R, TRAIL-R2, Tie-1, PDGFR-alpha, NKG2D, CCR5, Gas6, Mer, Tyro3, NCAM, Transferin receptor, Folate binding protein, IL-15, IL-15R, CEA, CA125, MUC-1,ガングリオシドGD3, Glypican-3, GM2, Sonic Hedgehog(Shh)などが挙げられる。
【００６８】
AXLを認識する本発明の抗体からなる二重特異性抗体の他方の抗原結合部位が結合するAXL分子上の異なるエピトープとしては、例えば、IgD1,IgD2,FND2などが挙げられる。
【００６９】
二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれがH鎖とL鎖を有する１／２分子であっても良いし、H鎖のみからなる１／４分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。
【００７０】
本発明の抗体は、後述する抗体を産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が、本発明の抗体と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明で記載されているアミノ酸配列に含まれるアミノ酸は翻訳後に修飾（例えば、N末端のグルタミンのピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾は当業者によく知られた修飾である）を受ける場合もあるが、そのようにアミノ酸が翻訳後修飾された場合であっても当然のことながら本発明で記載されているアミノ酸配列に含まれる。また、本発明の抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明の抗体はこのような抗体も包含する。
【００７１】
本発明の抗AXL抗体などのポリペプチドは当業者に公知の方法により製造することが可能である。
【００７２】
例えば、得られた抗AXL抗体の配列を基に、当業者に公知の遺伝子組換え技術を用いて抗AXL抗体を作製することが可能である。具体的には、AXLを認識する抗体の配列を基に抗体をコードするポリヌクレオチドを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。
【００７３】
ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。本発明の抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア製）、「QIAexpress system」（キアゲン製）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
【００７４】
また、発現プラスミドのベクターには、抗体分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
【００７５】
大腸菌以外にも、例えば、本発明の抗体を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（インビトロゲン社製）や、pEF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
【００７６】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、発現プラスミドのベクターが細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
【００７７】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pSV2-dhfr（「Molecular Cloning 2nd edition」 Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)）など）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【００７８】
これにより得られた本発明の抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常の抗体の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる。
【００７９】
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えば、プロテインAを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose FF（GE Healthcare Biosciences）等が挙げられる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製された抗体も包含する。
【００８０】
得られた抗体のAXLに対する結合活性の測定は、当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、抗体の抗原結合活性を測定する方法として、Biacore、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、抗原をコーティングしたプレートに、抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、p-ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
【００８１】
AXL発現量低下剤
本発明はさらに抗AXL抗体を含むAXL発現量低下剤を提供する。AXL発現量低下剤は、AXLを発現する細胞内のAXL発現量を減少させるものである。AXLを発現する細胞は特に限定されないが、例えば癌細胞（Calu-1、MDA-MB-231、DU-145など）などを挙げることができる。
【００８２】
AXLの発現量の減少は、AXLの分解などにより既に存在しているAXLの量を減少させてもよいし、AXLの発現を抑制することにより新たに発現するAXLの量を減少させてもよい。
【００８３】
本発明の抗AXL抗体を含むAXL発現量低下剤は、抗AXL抗体を用いてAXLの発現量を低下させる方法とも表現できる。さらに、本発明の抗AXL抗体を含むAXL発現量低下剤は、AXL発現量低下剤の製造の為の抗AXL抗体の使用とも表現できる。
【００８４】
本発明の抗AXL抗体は、AXLの発現量を低下させることにより、血管新生阻害効果、腫瘍の増殖抑制効果などの効果が期待できる。
【００８５】
医薬組成物
本発明の細胞増殖抑制剤またはAXL発現量低下剤の投与方法は、経口、非経口投与のいずれかによって実施できる。特に好ましくは非経口投与による投与方法であり、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物が全身または局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000 mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
【００８６】
本発明の細胞増殖抑制剤またはAXL発現量低下剤は常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【００８７】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００８８】
以下本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。【００８９】
〔参考例１〕Ax225抗体の取得方法
１―１．抗原の調製
ハムスター卵巣細胞（CHO(dhfr-) cells）にヒトAXL細胞外領域とマウスIgG2aのFc領域を融合したFusion protein(hAXL-ECD-mIgG2aFc)発現ベクターを遺伝子導入し、G418 selection法により、hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質産生CHO細胞株をクローニングした。無血清培地（CHO-S-SFM II, GIBCO）を用いて回収したhAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白産生CHO細胞株の培養上清を、結合緩衝液（20 mM リン酸緩衝液, pH7.0）で平衡化したProtein Gカラム（HiTrap Protein G HP, GE Healthcare）に添加した。結合緩衝液で非結合蛋白を洗浄した後、溶出緩衝液（100 mM Glycine-HCl, pH2.7）を用いて、中和緩衝液(1 M Tris-HCl, pH9.0)を分注したチューブにhAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質の画分を回収し、分画分子量10 kDaの限外ろ過キット（Centricon（登録商標）, Millipore）を用いて、精製蛋白質の緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水（pH7.35-7.65, タカラバイオ）に緩衝液置換し、精製蛋白質を濃縮した。C.N. Pace et al., Prof. Sci. 4:2411-2423, (1995)の計算式に従い算出したモル吸光係数を用いて、280 nmの吸光度から精製蛋白質の濃度を算出した。【００９０】
１−２．受託番号FERM BP-10854として寄託されている抗AXL抗体産生ハイブリドーマの作製
BALB/cマウス（雄、免疫開始時6週齢、日本チャールズ・リバー）4匹およびMRL/lprマウス（雄、免疫開始時6週齢、日本チャールズ・リバー）2匹に、前項で作製した抗原（hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質）を以下の通り免疫した。初回免疫としてFCA（フロイント完全アジュバントH37 Ra（Difco laboratories））でエマルジョン化した抗原を40μg/head皮下投与した。2週間後にFIA（フロイント不完全アジュバント（Difco laboratories））でエマルジョン化した抗原を40μg/head皮下投与した。以後1週間間隔で追加免疫を3回行った。抗原に対する血清抗体価の上昇を、次項に示したELISA（Enzyme linked immunosorbent assay）で確認後、最終免疫としてリン酸緩衝生理食塩水（カルシウムイオン、マグネシウムイオンを含まないphosphate buffered saline（PBS(-)）、日水製薬）に希釈した抗原を10μg/head静脈内投与した。最終免疫の3日後、マウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞P3X63Ag8U.1（P3U1と称す、ATCC CRL-1597）を、PEG1500（Roche Diagnostics）を用いた常法に従い細胞融合した。10%FBS(Invitrogen)を含むRPMI1640培地（Invitrogen）(以下、10%FBS/RPMI1640と称す)にて融合細胞を培養した。融合の翌日に、融合細胞を半流動培地（StemCells）に懸濁し、ハイブリドーマの選択培養を行うと共に、ハイブリドーマのコロニー化を実施した。融合後9日目または10日目にハイブリドーマのコロニーをピックアップし、HAT選択培地（10%FBS/RPMI1640, 2 vol% HAT 50x concentrate（大日本製薬）, 5 vol% BM-Condimed H1（Roche Diagnostics））の入った96-ウェルプレートに、1ウェル当り1コロニーを播種した。3〜4日培養後、各ウェルの培養上清を回収し、次項に示したELISAにより、上記抗原、及びマウスIgG2aのFc領域を融合した対照蛋白に対する結合活性を測定することにより、ヒトAXL細胞外領域に結合活性を有するハイブリドーマを選択した。【００９１】
選択したハイブリドーマ上清の結合活性を表３に示す。【００９２】
【表３】
2010131733.tif 000004
【００９３】
本発明者によって選択されたハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
(a)寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番１  中央第６（郵便番号305-8566）
(b)受託日（寄託日）：２００７年７月５日
(c)受託番号：
AXL No.225 #070402 (Ax225)（受託番号  FERM BP-10854）【００９４】
１−３．ヒトAXLへの結合活性
Coating Buffer（100 mM sodium bicarbonate, pH9.6, 0.02% sodium azide）で1μg/mLに希釈した抗原（hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質）、またはマウスIgG2aのFc領域を融合した対照蛋白を、96-ウェルプレート（Nunc-ImmunoTM 96 MicroWellTM plates MaxiSorpTM（Nalge Nunc International））に、80μL/wellで分注後、4℃で一晩以上インキュベーションした。0.05 vol%のTween（登録商標）20を含むリン酸緩衝生理食塩水（tPBS(-)）で3回洗浄後、Diluent Buffer (BlockingOne, ナカライテスク)の1/5希釈液)にて、該プレートを、4℃で一晩以上ブロッキングした。緩衝液を除去後、該プレートに、Diluent Bufferで希釈したマウスの抗血清またはハイブリドーマの培養上清を80μL/well添加し、室温で1時間インキュベーションした。該プレートをtPBS(-)にて3回洗浄後、Diluent Bufferで1/5000に希釈したHRP標識抗マウスIgG抗体（Stressgen）を80μL/well添加し、室温で1時間インキュベーションした。該プレートをtPBS(-)にて5回洗浄後、発色基質Peroxidase Substrate（Kirkegaad & Perry Laboratories）を80μL/well添加し、室温で20分インキュベーションした。Peroxidase Stop Solution（Kirkegaad & Perry Laboratories）を80μL/well添加した後、405 nmにおける吸光度をMicroplate Reader Model 3550（Bio-Rad Laboratories）で測定した。【００９５】
１−４．ハイブリドーマ培養上清からの抗体精製
上記で得られたハイブリドーマを、FBSとしてlow IgG FBS（Invitrogen）を用いたHAT選択培地で培養した。該培養上清20 - 50 mLに、溶媒をWash Buffer (20 mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0) に置換したProtein Gビーズ（Pharmacia）を、該培養上清10 mL当たり50μL加え、4℃で一晩転倒混和した。Protein Gビーズを回収した後、Wash Bufferで洗浄後、溶出 Buffer (50 mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH3.3)にて抗体を溶出し、直ちに中和Buffer (トリス塩酸緩衝液、pH7.8)で中和した。精製抗体は、分画分子量10 kDaの限外ろ過キット（Amicon（登録商標）, Millipore）を用いて、リン酸緩衝生理食塩水（pH7.35-7.65, 日水製薬）への緩衝液置換及び濃縮を行い、0.22μmの滅菌フィルター（Millipore GV Millipore）にて滅菌した。【００９６】
〔参考例２〕ヒトAXL-FND1、ヒトAXL-IgD2への結合活性
２−１．ヒトAXL-FND1、ヒトAXL-IgD2への結合活性
抗AXLモノクローナル抗体のAXL-Fibronectin type 3 domain 1（AXL-FND1）、AXL Immunoglobulin family domain 2 (AXL-IgD2)への結合能力を試験した。【００９７】
２−２．ヒト組み換えAXL-FND1、ヒト組み換えAXL-IgD2の発現ベクターの調製
ヒト組み換えAXL-FND1は全長ヒトAXL cDNA（O'Bryanら，Mol. Cell. Biol. 1991; 11: 5016-5031）（GenBank#NM_021913）から、225番から331番目のアミノ酸に相当する領域をPCRにて増幅し、GST-tagとの融合タンパク質を発現するため、pET-41a(+)（Novagen）にクローニングし、pET-AXL-FND1を構築した。その他のドメインについては、137番から224番目のアミノ酸に相当する領域AXL-IgD2をPCRにて増幅し、GSTタグとの融合タンパク質を発現するため、pET-41a(+)にクローニングした。【００９８】
作製した各ベクター（5μL）をDH5α（東洋紡，Cat# DNA-903）にヒートショック法により形質転換し、SOC培地で培養後、カナマイシンを含むLBプレート上37度で終夜培養後、コロニーを選抜した。【００９９】
２−３．ヒト組み換えAXL-FND1、ヒト組み換えAXL-IgD2の精製
作製した各コロニーを、カナマイシンを含む20 mLのLB培地に終夜37度で前培養し、500 mLの培地に移し、A600=0.5±0.05まで培養しIPTGを0.5 mMとなるように添加した。37度で1時間培養後集菌し、Buffer A（50 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 1 mM DTT）にて懸濁後、液体窒素を用いて凍結融解を2回繰り返した。NP-40を0.5%となるように加え、超音波破砕機で破砕（30秒x5）後、244,000xG、30分遠心し、上清を回収した。【０１００】
得られた上清を用いて、以下のようにヒト組み換えAXL-FND1を精製した。可溶化した大腸菌上清とグルタチオンセファロースTM 4B Fast Flow（GEヘルスケア）を混合し、ローテーターで4度1時間攪拌した。500xG、5分遠心分離し、上清を捨てBuffer Aを加えてグルタチオンセファロースTM 4Bを洗浄した。この洗浄操作を3回繰り返した。洗浄したグルタチオンセファロースTM 4 Fast Flowからミニカラムに移し、ヒト組み換えAXL-FND1は、50 mM Tris-HCl, pH7.5, 25 mM グルタチオンでグルタチオンセファロースTM 4 Fast Flowから分離・溶出した。その他のAXLの各ドメインも同様の方法で発現・分離・溶出した。【０１０１】
２−４．ウエスタンブロッティング法による抗AXL抗体のAXL-FND1への結合活性の評価
グルタチオンセファロースTM4 Fast Flowから分離・溶出したヒト組み換えAXL-FND1をはじめ、AXL-IgD1、AXL-IgD2、AXL-FND2、AXL-IgD1+IgD2、AXL-IgD2+FND1、AXL-FND1+FND2はBIO-RAD Dc Protein Assayでタンパク定量し、1μgをNuPAGE(登録商標) Sample buffer（Invitrogen）と混合し、NuPAGE(登録商標) 10% Bis-Tris Gelで電気泳動を行った。電気泳動したGelはImmobilonTM-FL（Millipore）PVDF膜に転写した。転写したタンパク質を含むPVDF膜は、Odyssey(登録商標) Blocking Buffer（LI-COR）でブロッキング後、抗AXL抗体を5μg/mLとなるように希釈した一次抗体溶液に浸し、終夜4度でインキュベートした。一次抗体溶液に浸した転写したタンパク質を含むPVDF膜は、0.1% TBS-T [0.1% Tween-20を含むTBS（Tris-buffered Saline, TaKaRa)]で5分4回洗浄した。抗AXL抗体に浸したPVDF膜は、80 ng/mLに希釈したAlexa Fluor(登録商標) 680 goat anti-mouse IgG（H+L）（Invitrogen）二次抗体溶液に浸し、室温で1時間インキュベートした。二次抗体溶液に浸したPVDF膜は0.1% TBS-Tで5分3回洗浄後、0.01% SDSを含むTBS-Tで5分洗浄後、TBSで5分洗浄した。洗浄したPVDF膜は遠赤外線イメージングシステムOdyssey(登録商標)でスキャンして結合性を評価した。【０１０２】
２−５．結果
評価結果を図１に記載した。
受託番号FERM BP-10854として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗AXL抗体 (Ax225)は、AXLのFND1を認識することが明らかとなった（図１）。受託番号FERM BP-10857として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗AXL抗体 (Ax284)は、AXLのFND1およびIgD2を認識すると考えられた（図１）。受託番号FERM BP-10850として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗AXL抗体 (Ax7)、および受託番号FERM BP-10851として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗AXL抗体 (Ax51) は、AXLのIgD2を認識することが明らかとなった（図１）。【０１０３】
〔参考例３〕Ax225抗体によるAXLタンパク質分解誘導アッセイ
抗AXLモノクローナル抗体の癌細胞内AXLの分解を誘導する能力を試験した。ヒト非小細胞肺癌細胞株Calu-1を6-ウェルプレートに4 × 105 cells/wellの密度で播種し、24時間後に血清を除いた培地に交換し（serum starved）、一晩培養した。ついで、2μg/mLとなるように、上記で作製した抗AXLモノクローナル抗体を添加し、一方では陽性コントロールとして200 ng/mLとなるようにリコンビナントGAS6（R&D）を添加し、37℃で24時間インキュベーションした。ついで細胞をPBS(-)で洗浄し、上記細胞溶解バッファーで細胞からタンパク質を抽出した。市販の抗AXL抗体（SantaCruzTM）で免疫沈降した細胞溶解産物を7% NuPAGE（Invitrogen）を介して分離し、上記のウエスタンブロッティングおよびチロシンリン酸化アッセイで免疫ブロットした。【０１０４】
25μgの各タンパク質溶液をNuPAGE-LDSサンプルバッファー（Invitrogen）に懸濁し、70℃で10分加熱し、7% NuPAGE（Invitrogen）を用いて150 Vで1時間電気泳動した。電気泳動したゲルをNuPAGE-トランスファーバッファー（インビトロジェン（Invitrogen）および20 vol%メタノールを含む該バッファーにて30 mAで１時間かけて、0.45μmのポリビニリデンジフルオライドフィルター（Immobilon-FL, Millipore）に電気泳動的にトランスファーした。フィルターをTBS（50 mM Tris-HCl, pH7.6, 150 mM NaCl）で洗浄し、ODYSSEYブロッキングバッファー（Li-COR）で一晩インキュベーションすることによって遮断した。フィルターをTBSTで5分間4回洗浄し、抗AXL抗体（TBSTにて1:15,000希釈、SantaCruz）と抗アクチン抗体（TBSTにて1:5,000希釈）で室温にて2時間インキュベーションした。フィルターをTBSTにて5分間4回洗浄し、TBSTにて1:10,000希釈したAlexa680標識抗ウサギ第二抗体（Invitrogen）と、TBSTにて1:10,000希釈したIRDye800標識抗ヤギ第二抗体（Rockland）で1時間インキュベーションした。TBSTで5分間3回洗浄、さらにTBSで5分間1回洗浄後、フィルターを赤外線イメージングシステムODYSSEY（Li-COR）を用いてスキャンした。【０１０５】
AXLのブロットが、Ax225抗体をさらした後に減弱することが観察された（図２）。すなわち、これらAx225抗体はAXLタンパク質の分解を誘導することができる。【０１０６】
〔参考例４〕抗AXL抗体のヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルに対する抗腫瘍効果の測定
１．ヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルの作製
大日本製薬株式会社（現 大日本住友製薬株式会社）より入手したヒト膵臓腺癌細胞株PANC-1は、HBSSにて5×107個/mLになるように調製した。日本チャールズ・リバー株式会社より購入したCAnN.Cg-Foxn1<nu>/CrlCrlj  nu/nu（BALB-nu/nu）マウスのそけい部皮下へ、上記細胞懸濁液200μL（1×107個/マウス）を移植した。腫瘍容積（体積）の平均値がおよそ210 mm3になった時点でマウスを当該実験に供した。【０１０７】
２．抗体調製および投与
Ax225抗体はPBSで2 mg/mLになるように調製し、週２回、２週間、20 mg/kgにてヒト膵臓腺癌異種移植マウスの腹腔内へ投与した。陰性対照として、PBSを同様に投与した。陽性対照として、ジェムザール（日本イーライリリー株式会社）は生理食塩水で12 mg/mLになるように調製し、週２回、２週間、120 mg/kgにて腹腔内投与した。【０１０８】
３．抗腫瘍効果の評価
ヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果は、最終投与より４日後における陰性対照群の腫瘍増殖量との比較により腫瘍増殖抑制効果として算出した（図３）。【０１０９】
腫瘍増殖抑制効果（％）＝（１−抗体処理群の腫瘍増殖量／対照群の腫瘍増殖量）×100【０１１０】
４．統計処理
腫瘍容積（体積）は、平均値±標準偏差で表した。統計解析は、SAS前臨床パッケージVersion5.0を用いてLSD法による対照群と処置群の比較を実施した。また、95％の信頼度（＊；ｐ＜0.05）をもって有意とした。【０１１１】
５．結果
Ax225抗体は腫瘍の増殖を抑制し、抗腫瘍効果を有していた（図３）。【０１１２】
〔参考例５〕抗AXL抗体のヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルに対する抗腫瘍効果の測定（２）
１．ヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルの作製
大日本製薬株式会社（現 大日本住友製薬株式会社）より入手したヒト膵臓腺癌細胞株PANC-1は、HBSSにて5×107個/mLになるように調製した。日本チャールズ・リバー株式会社より購入したCAnN.Cg-Foxn1<nu>/CrlCrlj  nu/nu（BALB-nu/nu）マウスのそけい部皮下へ、上記細胞懸濁液200μL（1×107個/マウス）を移植した。腫瘍容積（体積）の平均値がおよそ270 mm3になった時点でマウスを当該実験に供した。【０１１３】
２．抗体調製および投与
Ax225抗体並びにAx225抗体と同様に取得しAx225抗体とエピトープが異なる抗AXL抗体をPBSで2 mg/mLになるように調製し、週２回、２週間、20 mg/kgにてヒト膵臓腺癌異種移植マウスの腹腔内へ投与した。陰性対照として、PBSを同様に投与した。陽性対照として、ジェムザール（日本イーライリリー株式会社）は生理食塩水で12 mg/mLになるように調製し、週２回、２週間、120 mg/kgにて腹腔内投与した。【０１１４】
３．抗腫瘍効果の評価
ヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果は、最終投与より４日後における陰性対照群の腫瘍増殖量との比較により腫瘍増殖抑制効果として算出した。【０１１５】
腫瘍増殖抑制効果（％）＝（１−抗体処理群の腫瘍増殖量／対照群の腫瘍増殖量）×100【０１１６】
４．結果
腫瘍増殖抑制効果を図１に示した。腫瘍増殖抑制効果（％）が30%より低い場合を"−"、30%以上を"＋"、60%以上を"＋＋"とした。
この結果から、FND-1に結合する抗体は、腫瘍容積（体積）の平均値がおよそ270 mm3となった時点で投与を開始しても、60%以上のTGI活性を示した。FND-1に結合する抗AXL抗体が、in vivoでこのような顕著な抗腫瘍効果を有することは、本検討で新たに発見されたものであり、全く予想外であった。【０１１７】
〔実施例１〕  キメラ抗体の作製
キメラ抗体発現ベクターの作製
ヒトIgG1定常領域とAx225抗体可変領域を融合させたキメラAx225抗体を作製するため、ヒトIgG1定常領域をコードするcDNA（H鎖：ヒトγ1、L鎖：ヒトκ）の5'末端とAx225抗体の可変領域をコードするcDNAの3'末端を融合するように合成オリゴDNAをH鎖、L鎖それぞれにつき、センス鎖、アンチセンス鎖の各2種類ずつを設計した。以下、H鎖センス融合プライマー(A)、H鎖アンチセンス融合プライマー(B)、L鎖センス融合プライマー（C）、L鎖アンチセンス融合プライマー(D)とする。各合成オリゴDNAを混和し、アッセンブルPCRによりキメラAx225抗体をコードする遺伝子を作製した。アッセンブルPCRによるキメラ抗体を発現する1段階目はAx225 cDNAのH鎖5'末端に制限酵素サイトとKozak配列を付加したセンス鎖(E)と上述(B)、Ax225 cDNAのH鎖3'末端の領域に制限酵素サイトを付加したアンチセンス鎖(F)と上述(A)、Ax225 cDNAのL鎖5'末端の領域に制限酵素サイトとKozak配列を付加したセンス鎖(G)と上述(D), Ax225 cDNAのL鎖3'末端の領域に制限酵素サイトを付加したアンチセンス鎖(H)と上述(C)、の4種類の組み合わせで以下の条件に従ってPCR法によって実施した。添付のPCR Buffer, dNTPs, PrimeSTAR, Ax225 H鎖、あるいはL鎖をコードする cDNAおよび1合成オリゴDNAからなる反応混合物を、98℃にて1分加熱した後、98℃にて10秒、55℃にて10秒、72℃にて1分から構成されるPCR反応サイクルを30回実施した。2回目のPCRは1回目のPCR反応で増幅された遺伝子断片、H鎖に関しては(E)(B)と(F)(A)のコンビネーションで増幅された断片を混合したもの、L鎖に関しては、(G)(D)と(H)(C)のコンビネーションで増幅された断片を混合したものを鋳型にして行われた。プライマーはH鎖は(E)と(F)、L鎖は(G)と(H)を用いた。98℃にて1分加熱した後、98℃にて10秒、55℃にて10秒、72℃にて1分30秒から構成されるPCR反応サイクルを30回実施した。【０１１８】
得られた増幅断片を動物細胞発現ベクターによりクローニングした。各DNA断片の塩基配列は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）を用い、DNAシークエンサーABI PRISM 3730xL DNA SequencerまたはABI PRISM 3700 DNA Sequencer（Applied Biosystems）にて、添付説明書記載の方法に従い決定した。【０１１９】
キメラ抗体の発現、精製
ヒト胎児腎癌細胞由来FreeStyleTM 293-F細胞（Invitrogen）をFreeStyleTM 293 Expression Medium（Invitrogen）へ懸濁し、1 × 106個 /mLの細胞密度で125 mL Flask(CORNING)へ30 mLずつ蒔きこんだ。調製したプラスミドDNA混合液（合計30μg）にOpti-MEM I Reduced Serum Medium(Invitrogen)を加え1 mLとした。また、293fectin(Invitrogen) 60 μLに、Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Invitrogen)を加え1 mLとし、プラスミドDNA混合液と混合した。混合液を室温にて20分静置し、細胞懸濁液に添加した。CO2インキュベーター（37℃、8% CO2）内で3〜6日培養した。培養上清を回収した後、遠心分離（約2000 g、5分間、室温）して細胞を除去し、さらに0.22μmフィルターMILLEX（登録商標）-GV（Millipore）を通した。各サンプルは使用するまで4℃で保存した。この上清からProtein A Sepharose（GE Healthcare）を用いて抗体を精製した。280 nmの吸光度をND-1000 Spectrophotometer（NanoDrop）で測定し、Paceらの方法（Protein Science (1995) 4: 2411-2423）にて濃度を算出した。【０１２０】
〔実施例２〕  Ax225抗体のヒト化
BiacoreによるAffinity測定
ヒト化Ax225抗体のスクリーニングを行うため、AXL-FND1への結合活性評価を、Biacoreを用いて下記の方法により実施した。【０１２１】
２−１．ヒト組み換えAXL-FND1の発現ベクターの調製
ヒト組み換えAXL-FND1は全長ヒトAXL cDNA（O'Bryanら，Mol. Cell. Biol. 1991; 11: 5016-5031）（GenBank#NM_021913）から、225番から331番目のアミノ酸に相当する領域をPCRにて増幅し、GST-tagとの融合タンパク質を発現するため、pET-41b (+)（Novagen）にクローニングし、pET-AXL-FND1を構築した。【０１２２】
作製した各ベクター（5μL）をBL21-CodonPlus(DE3)RIPL（Strategene，Cat# 230280）にヒートショック法により形質転換し、SOC培地で培養後、カナマイシンを含むLBプレート上37度で終夜培養後、コロニーを選抜した。【０１２３】
２−２．ヒト組み換えAXL-FND1の精製
作製した各コロニーを、カナマイシンを含む3 mLのMagicMedia (Invitrogen)培地に3時間、37度で前培養し、500 mLの培地に移し、25度、overnightで培養後集菌し、Buffer A（20 mM Tris-HCl(pH8),10 mM EDTA,30 mM NaCl, Protease inhibitor mixture (complete Mini, EDTA-free(Roche)にて懸濁後、終濃度2 mg/mLになるようにLysozyme溶液を加え、on iceで１時間incubation後、終濃度0.5%Triton-X100および、終濃度100 mMになるようにNaClを加えて、on iceで10min incubationした。超音波破砕機で破砕（30秒x5）後、244,000 x G、20分遠心し、上清を回収した。【０１２４】
得られた上清を用いて、以下のようにヒト組み換えAXL-FND1を精製した。グルタチオンセファロースTM 4B Fast Flow（GEヘルスケア）をPBSで洗浄後、可溶化した大腸菌上清と混合し、4℃で終夜結合させた。グルタチオンセファロースTM 4B Fast Flowを回収し、30 mLの洗浄バッファー(20 mM Tris-HCl (pH8), 500 mM NaCl, 1% Triton-X100, protease inhibitoｒ mixture)による洗浄操作を４回繰り返した。グルタチオンセファロースTM 4B Fast Flowをカラムに移し、さらに、5 mLの洗浄バッファーによる洗浄操作を行った。5 mLの溶出バッファー(100 mM Tris-HCl(pH8), 20 mM グルタチオン, 120 mM NaCl)による溶出操作を３回繰り返して、ヒト組み換えAXL-FND1を得て、グルタチオンセファロースTM 4B Fast Flowから分離・溶出した。【０１２５】
２−３．ProteinAを用いたBiacoreによるアフィニティー解析
Biacore T100 (BIACORE) を用いて、ヒト化AXL抗体の抗原抗体反応の速度論的解析を行った。センサーチップ上にrec-Protein A (Zymed) (以下、Protein A) を固定化し、そこに種々の抗体を結合させ、そこに抗原をアナライトとして流し、抗体と抗原の相互作用を測定した。抗原には種々の濃度に調整したヒト組み換えAXL-FND1（2-2において調製。以下、GST-FND1）を用いた。測定で得られたセンサーグラムから、カイネティクスパラメーターである結合速度定数 ka (1/Ms) 、および解離速度定数 kd (1/s) を算出し、その値をもとに KD (M) を算出した。各パラメーターの算出には Biacore T100 Evaluation Software(BIACORE) を用いた。【０１２６】
センサーチップは、アミンカップリング法により Protein AをCM5 (BIACORE) に約3000 RU 固定化することで作製した。作製したセンサーチップを用いて、Protein Aに結合させた抗体とGST-FND1との相互作用の速度論的解析を行った。ランニングバッファーには HBS-EP+ を用い、流速は30μL/min とした。各抗体は、ランニングバッファーにて、1μg/mLに調製し、2分間Protein Aに結合させた。アナライトとして用いたGST-FND1はHBS-EP+ を用いて、0.5、2.0μg/mLに調製した。測定はまず目的とする各種ヒト化AXL抗体もしくはキメラAXL抗体もしくはマウスAXL抗体をProtein Aに結合させ、そこへアナライト溶液を2分間相互作用させ、その後HBS-EP+(BIACORE) に切り替え2分間解離相を測定した。解離相の測定終了後、30μLの10 mM glycine-HCl (pH2.0) で洗浄し、センサーチップを再生した。この結合・解離・再生を分析の1サイクルとした。実験は全て25℃で行った。【０１２７】
各フレームワーク配列の選定
Ax225抗体のヒト化を行うため、Ax225抗体の可変領域配列とヒトのgermline配列を比較した。その中で、ヒト化のテンプレートとなるFR配列を表４にまとめた。ヒト化した可変領域として、H鎖は表４に記載されているFR1、FR2、FR3(2)、FR4からなる配列をH0（配列番号：２）とした。また、L鎖はFR1、FR2、FR3、FR4からなる配列をL0（配列番号：６５）とした。なお、CDR、FRの決定はKabat numberingに従って行われた。【０１２８】
なお、H鎖FR3の配列において、Kabat numbering 94番目の残基がCDR3の立体構造に大きな影響を与えることが報告されている（Moreaら  J. Mol. Biol. 1998;  275:269-294）。Ax225の当該残基はグリシン（G）であるが（配列番号：５７）、ヒト化を行うにあたって選択したgermline配列は表4のFR3(1)（配列番号：１０９）に示したとおり、当該残基がアルギニン（R）であることから、ヒト化によってアルギニンへと置換されてしまい、活性の低下が予想された。そこで、H鎖94番目についてはAx225の配列を残存させ、グリシンとしたFR3(2)の配列を用いた（配列番号：５８）。【０１２９】
【表４】
2010131733.tif 000005
【０１３０】
ヒト化Ax225可変領域H0およびL0の作製
ヒト化テンプレート配列のFR領域にAx225抗体のCDR領域を移植したヒト化Ax225抗体の可変領域を作製するため、合成オリゴDNAをH鎖、L鎖それぞれ設計した。各合成オリゴDNAを混和し、アッセンブルPCRによりヒト化Ax225の可変領域をコードする遺伝子を作成し、H鎖をH0、L鎖をL0とした。アッセンブルPCRはKOD-Plus（TOYOBO）を用いて行い、以下の条件に従ってPCR法によって実施した。添付のPCR Buffer,dNTPs,MgSO4, KOD-Plusおよび10 pmolの合成オリゴDNAからなる反応混合物を、94℃にて5分加熱した後、94℃にて2分、55℃にて2分、68℃にて2分から構成されるPCR反応サイクルを2回実施した後、可変領域の5'末端に制限酵素サイトとKozak配列を付加したプライマー、及び3'末端に制限酵素サイトを付加したプライマーをそれぞれ10 pmol添加し、94℃にて30秒、55℃にて30秒、68℃にて1分から構成されるPCR反応サイクルを35回実施し増幅断片を得た。得られた増幅断片を動物細胞発現ベクターによりクローニングし、定常領域と連結した。【０１３１】
ここで、IgG抗体のH鎖C末端配列由来のヘテロジェニティーとして、C末端アミノ酸のリジン残基の欠損、および、C末端の２アミノ酸のグリシン、リジン両方の欠損によるC末端アミノ基のアミド化が報告されている（Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83.）。これらのヘテロジェニティーを低減させる方法として、H鎖C末端の２アミノ酸、すなわちEU numbering 446番目のグリシンおよび447番目のリジンを欠損させる方法が知られている（特許文献４；WO2009/041613）。ヒト化Ax225抗体においても、H鎖C末端配列に由来するヘテロジェニティーは存在しないことが望ましいため、ヒトIgG1のEU numbering 446番目のグリシンおよび447番目のリジンを欠損させたIgG1配列（配列番号：１０６）を定常領域配列として用いた。一方、L鎖については天然型ヒトκ鎖（配列番号：１０７）を定常領域配列として用いた。【０１３２】
活性維持に不可欠なアミノ酸残基の発見
先述のとおり、Ax225のH鎖に存在するKabat numbering 94番目のグリシンは、AXLとの結合に重要な役割を果たしていることが予想された。【０１３３】
そこで、当該残基の活性への影響を評価するために、キメラ抗体のH鎖（chH：配列番号：１）のKabat numbering 94番目の残基をヒトGermline配列であるアルギニンへと置換した改変体（H6:配列番号：１０８）を作成した。変異体の作製はPCRを用いたAssemble PCRを行うことによって行われた。具体的には、改変部位を含むアミノ酸配列に基づいて設計された順鎖および逆鎖のオリゴDNAの合成を行った。改変部位を含む順鎖のオリゴDNAと改変を行う遺伝子が挿入されているベクターに結合する逆鎖のオリゴDNA、改変部位を含む逆鎖のオリゴDNAと改変を行う遺伝子が挿入されているベクターに結合する順鎖のオリゴDNAをそれぞれ組み合わせ、PrimeSTAR(TAKARA)を用いてPCRを行うことによって、改変部位を含む断片を5'末端側と3'末端側の2つを作製した。その2つの断片をAssemble PCRによりつなぎ合わせることによって、各変異体を作製した。作製された変異体を動物細胞において挿入遺伝子を発現可能ならしめる発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。【０１３４】
chH/L0（H鎖chH/配列番号：１、L鎖L0/配列番号：６５）およびH6/L0（H鎖H6/配列番号：１０８、L鎖L0/配列番号：６５）の発現および精製を実施例１の方法に従って行った。なお、chHおよびH6のKabat numbering 94番目以外の配列は両者において完全に同一であり、当該残基の影響のみを評価することが可能である。【０１３５】
chH/L0およびH6/L0のBiacoreによるaffinity評価の結果を表５に示す。H6/L0はchH/L0に比べて大幅なaffinityの低下が確認された。このことから、Ax225抗体およびヒト化Ax225抗体がAXL-FND1と結合するためには、H鎖Kabat numbering94番目の残基がグリシンであることが好ましく、アルギニンは不適切であることが示された。【０１３６】
【表５】
2010131733.tif 000006
【０１３７】
Affinityを向上したH鎖可変領域H9の作製
H0/L0のH鎖であるH0（配列番号：２）は、Kabat numbering 73番目のアミノ酸残基がスレオニン(T)であるが、立体構造モデルを基に考察したところ、この残基をAx225抗体の配列であるアスパラギン(N)に置換することにより、Affinityの向上が可能であると期待された。【０１３８】
そこで、H0（配列番号：２）のFR3に存在するKabat numberingの73番目のスレオニン(T)をアスパラギン(N)に置換し、H9（配列番号：３）を作製した。変異体の作製はPCRを用いたAssemble PCRを行うことによって行われた。具体的には、まず改変部位を含むアミノ酸配列に基づいて設計された順鎖および逆鎖のオリゴDNAの合成を行った。改変部位を含む順鎖のオリゴDNAと改変を行う遺伝子が挿入されているベクターに結合する逆鎖のオリゴDNA、改変部位を含む逆鎖のオリゴDNAと改変を行う遺伝子が挿入されているベクターに結合する順鎖のオリゴDNAをそれぞれ組み合わせ、PrimeSTAR(TAKARA)を用いてPCRを行うことによって、改変部位を含む断片を5'末端側と3'末端側の2つを作製した。その2つの断片をAssemble PCRによりつなぎ合わせることによって、各変異体を作製した。作製された変異体を動物細胞において挿入遺伝子を発現可能ならしめる発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。抗体の作製および精製は実施例１の方法に従って行った。【０１３９】
H9/L0のアフィニティー測定を実施例２に記載の方法で行い、結果を表６に示した。H9/L0はH0/L0に比べ、Affinityの向上が確認された。【０１４０】
【表６】
2010131733.tif 000007
【０１４１】
〔実施例３〕等電点を変化させる変異箇所の同定
変異箇所の同定
抗体の血漿中半減期を制御する方法の一つとして、抗体分子表面に露出するアミノ酸残基を改変し、抗体分子表面電荷をコントロールする方法が知られている（特許文献２および特許文献３）。具体的には、抗体が有する等電点（pI）の値を低下させることにより、抗体の血漿中半減期を伸長させることが可能であることが知られている。それとは逆に抗体の等電点が上昇することにより、血漿中半減期が短縮し、抗体の組織移行性が向上することが知られている（非特許文献２８および２９）。【０１４２】
以上のことから、等電点を変化させたヒト化Ax225抗体は、血漿中半減期の伸長あるいは組織移行性の向上により、より強い抗腫瘍活性が期待される。そこで、ヒト化Ax225抗体の抗原に対する結合活性や、その立体構造に影響を与えることなく、抗体分子表面の電荷を調節することによって抗体の薬物動態を制御することが可能であるアミノ酸残基の同定を行った。具体的には、H9/L0（H鎖H9/配列番号：３、L鎖L0/配列番号：６５）の可変領域に対して、Biacoreによるアフィニティーを大きく低下させることなく、等電点を変化させることのできる変異箇所の探索を行った。【０１４３】
ヒト化Ax225抗体の立体構造モデルを用いて、AXLへの結合を大きく低下させることなく可変領域の等電点を変化させられる変異箇所をスクリーニングした結果、幾つかの変異箇所を見出した。H鎖、L鎖において等電点を低下させる改変については表７および表８（H鎖の等電点低下のための改変箇所）、および表９（L鎖の等電点低下のための改変箇所）に、H鎖、L鎖において等電点を上昇させる改変については表１０および表１１（H鎖の等電点上昇のための改変箇所）、および表１２（L鎖の等電点上昇のための改変箇所）にそれぞれ示した。各改変体の作製、精製は実施例１に記載した方法で行った。【０１４４】
各改変体のBiacoreによるアフィニティーの評価を、実施例２に記載の方法で行った。表１３〜表１５に示したとおり、各改変体のアフィニティーはH9/L0のそれと比較して大きな低下は示されなかった。なお、各改変体のH鎖およびL鎖の配列番号についても、表１３〜表１５に示した。【０１４５】
【表７】
2010131733.tif 000008
【０１４６】
【表８】
2010131733.tif 000009
【０１４７】
表８は表７の続きである。【０１４８】
【表９】
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【０１４９】
【表１０】
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【０１５０】
【表１１】
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【０１５１】
表１１は表１０の続きである。【０１５２】
【表１２】
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【０１５３】
【表１３】
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【０１５４】
【表１４】
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【０１５５】
【表１５】
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【０１５６】
〔実施例４〕脱アミド化反応を抑制する変異の導入
医薬品に使用する抗体は、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られるモノクローナル抗体であるにも関わらず、ヘテロジェニティーが存在する。そのような抗体のヘテロジェニティーは酸化、脱アミド化などの修飾により起こり、長期間の保存中や熱ストレス、光ストレスといったストレス条件下にさらされることで増加することが知られている（参考文献：Heterogeneity of Monoclonal Antibodies:Journal of pharmaceutical sciences, vol.97,No.7,2426-2447）。しかしながら、抗体を医薬品として開発するにあたり、そのタンパク質の物性、中でも均一性と安定性は極めて重要であり、目的物質のヘテロジェニティーを低減し、可能な限り単一物質であることが望まれる。【０１５７】
脱アミド化反応とは、アスパラギン（N）およびグルタミン（Q）の側鎖において非酵素的に起こり、アスパラギンおよびグルタミンの側鎖に存在するアミドがカルボン酸へと変化する反応である。保存中に起こる脱アミド化反応は、上述したヘテロジェニティーの原因となることから、可能な限り抑制されることが望まれる。また、脱アミド化反応は、特にアスパラギン（N）とグリシン（G）が隣接した部位（・・・NG・・・）において起こりやすいことが報告されている（Geigerら、J. Biol. Chem. 1987; 262:785-794）。L0（配列番号：６５）のCDR1にアスパラギン（N）とグリシン（G）が隣接した配列が存在することから、この部位のアミノ酸置換により脱アミド化反応を抑制することが可能であると考えられた。【０１５８】
アミノ酸置換による脱アミド化反応の抑制は、具体的には以下のように行った。L0（配列番号：６５）のKabat numbering 29番に存在するグリシン（G）をアラニン（A）に置換することで、脱アミド化反応の抑制が可能であると考えられた。そこで、L0（配列番号：６５）のKabat numbering 29番に存在するグリシン（G）を、アラニン（A）に置換したL36（配列番号：８１）を作製した。同様に、L11（配列番号：７１）のKabat numbering 29番に存在するグリシン（G）をアラニン（A）に置換することで、脱アミド化反応の抑制が可能であると考えられた。そこで、L11（配列番号：７１）のKabat numbering 29番に存在するグリシン（G）を、アラニン（A）に置換したL21（配列番号：８３）を作製した。これらを用いて、H9/L36（H鎖：H9/配列番号：３、L鎖：L36/配列番号：８１）、H36/L36（H鎖：H36/配列番号：２２、L鎖：L36/配列番号：８１）H32/L21（H鎖：H32/配列番号：１８、L鎖：L21/配列番号：８３）を作製した。なお、これら改変体の作製、精製は実施例１に記載した方法で行った。
作製した改変体のAffinity測定を実施例２に記載の方法で実施した。結果を表１６に示す。いずれの改変体も、H9/L0に比べて顕著なaffinityの低下はなく、脱アミド化反応の抑制が可能であると考えられた。【０１５９】
【表１６】
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【０１６０】
〔実施例５〕抗体発現量を向上させる変異箇所の発見
抗体医薬品を製造する方法としては、哺乳動物細胞を用いて目的の抗体を産生する安定発現株を構築する方法が一般的に用いられている。ここで、安定発現株による抗体の発現量は、抗体医薬品の生産コストに結びつく重要な要素であることから、抗体の発現量は十分に高いことが望ましい。【０１６１】
そこで、Ax225抗体のヒト化による抗体発現量への影響を評価するために、キメラ抗体chH/chL（H鎖chH/配列番号：１、L鎖chL/配列番号：６４）、H鎖のみヒト化を行ったH0/chL（H鎖H0/配列番号：２、L鎖chL/配列番号：６４）、L鎖のみヒト化を行ったchH/L0（H鎖chH/配列番号：１、L鎖L0/配列番号：６５）、両鎖ともにヒト化を行ったH0/L0（H鎖H0/配列番号：２、L鎖L0/配列番号：６５）の4種の抗体を、実施例１の方法に従い発現した。【０１６２】
Biacore-Qによる培養上清中の抗体濃度定量
Biacore-Q (BIACORE) を用いた培養上清中の抗体濃度の定量を、以下の方法で行った。
センサーチップは、アミンカップリング法により recombinant Protein AをCM5 (GE Healthcare) に約5000 RU 固定化することで作製した。ランニングバッファーとしてHBS-EP、再生用バッファーとして10 mM glycine-HCl (pH1.5)を用い、流速は5μL/min とした。また、検量線作成のため、実施例１の方法により発現、精製したキメラ抗体あるいはヒト化抗体を、2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5 ng/mLの各濃度に調製した。【０１６３】
回収した培養上清については、HBS-EPにより適宜希釈を行い、検量線上に正しく乗る抗体濃度になるよう調製した。調製した培養上清および検量線作成のためのサンプルをBiacore-Qへ供し、BIACORE Q Control Software on COM1により測定および解析を行うことで、培養上清中の抗体濃度を算出した。
結果、L鎖をヒト化したことにより、Ax225抗体の発現量が２〜３倍向上することが見出された（図４）。【０１６４】
抗体発現量を向上させる変異箇所の同定
立体構造モデルから、L鎖FR2に存在する、Kabat numbering 42番の残基が発現量に大きく寄与することが推察された。具体的には、Kabat numbering 42番の残基をリジン（K）に置換することにより、発現量を向上させることが可能であると推察された。なお、この推察はキメラ抗体のL鎖（chL/配列番号：６４）のKabat numbering 42番の残基がグルタミン（Q）であるのに対し、ヒト化抗体のL鎖（L0/配列番号：６５）の当該残基はリジン（K）であることとも矛盾しないものである。【０１６５】
ここで、L鎖のKabat numbering 42番の残基が発現量に与える影響を評価するために、H32/L11（H鎖H32/配列番号：１８、L鎖L11/配列番号：７１）およびH32/L12（H鎖H32/配列番号：１８、L鎖L12/配列番号：７２）の発現を実施例１に記載の方法で行い、培養上清中の抗体濃度の測定を行った。ここで、用いている2種類のL鎖、L11とL12の差異は、先述のKabat numbering 42番目の残基がL11はリジン（K）であるのに対し、L12ではグルタミン酸（E）に置換されているというものである。なお、Kabat numbering 42番目以外の配列は両者において完全に同一であり、当該残基の影響のみを評価することが可能である。【０１６６】
結果を図５に示す。Kabat numbering 42番目がリジンであるH32/L11は、当該残基がグルタミン酸であるH32/L12に比較して、約3倍の発現量の向上が確認された。このことから、Kabat numbering 42番目の残基をリジンに置換することにより、発現量を大きく向上させることが可能であることが示された（図５）。【０１６７】
〔実施例６〕ヒト化Ax225抗体のヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルに対する抗腫瘍効果の測定（１）
６−１．ヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルの作製 
大日本製薬株式会社（現 大日本住友製薬株式会社）より入手したヒト膵臓腺癌細胞株PANC-1は、HBSSにて2.5×10７個/mLになるように調製した。日本チャールズ・リバー株式会社より購入したCAnN.Cg-Foxnl<nu>/CrlCrlj nu/nu (BALB-nu/nu)マウスのそけい部皮下へ、上記細胞懸濁液200μL (5×10６個/マウス)を接種した。腫瘍体積がおよそ240mm３になった時点でマウスを当該実験に供した。【０１６８】
６−２．抗体調製および投与 
抗体はPBSで1 mg/mLになるように調製し、週1回、2週間、10 mg/kgにてヒト膵臓腺癌異種移植マウスの腹腔内へ投与した。陰性対照として、PBSを同様に投与した。【０１６９】
６−３．抗腫瘍効果の評価 
ヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果は、最終投与より７日後における陰性対照群の腫瘍増殖量との比較により腫瘍増殖抑制効果として算出した。【０１７０】
腫瘍増殖抑制効果 (%)＝ (1-抗体処理群の腫瘍増殖量/対照群の腫瘍増殖量)×100【０１７１】
６−４．統計処理 
腫瘍体積は、平均値±標準偏差で表した。統計解析は、SAS前臨床パッケージVersion 5.0を用いてLSD法による対照群と処置群の比較を実施した。また、95%の信頼度(＊；p＜0.05)をもって有意とした。【０１７２】
６−５．結果
図６に示すように、ヒト化Ax225抗体(H9/L0)は、マウス抗体およびキメラ抗体と同様に、PBS投与群と比較して、有意な腫瘍の増殖抑制効果を示した。【０１７３】
〔実施例７〕ヒト化抗ＡＸＬ抗体のヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルに対する抗腫瘍効果の測定（２）
７−１．ヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルの作製
大日本製薬株式会社（現 大日本住友製薬株式会社）より入手したヒト膵臓腺癌細胞株ＰＡＮＣ−１は、ＨＢＳＳにて２．５×１０７個／ｍＬになるように調製した。日本チャールズ・リバー株式会社より購入したＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１＜ｎｕ＞／ＣｒｌＣｒｌｊ  ｎｕ／ｎｕ（ＢＡＬＢ−ｎｕ／ｎｕ）マウスのそけい部皮下へ、上記細胞懸濁液２００μＬ（５×１０６個／マウス）を接種した。腫瘍体積がおよそ２００ｍｍ３になった時点でマウスを当該実験に供した。【０１７４】
７−２．抗体調製および投与
抗体はヒスチジン緩衝液(20 mM Histidine-HCl, 150 mM NaCl, pH 6.0)で１ mg/mLになるように調製し、週１回、２週間、１０ mg/kgにてヒト膵臓腺癌異種移植マウスの尾静脈内へ投与した。陰性対照として、ヒスチジン緩衝液を同様に投与した。【０１７５】
７−３．抗腫瘍効果の評価
ヒト膵臓腺癌異種移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果は、最終投与より７日後における各抗体投与群の腫瘍体積と陰性対照群の腫瘍体積との比較により腫瘍増殖抑制効果を比較した。【０１７６】
７−４．統計処理
腫瘍体積は、平均値±標準偏差で表した。統計解析は、ＳＡＳ前臨床パッケージＶｅｒｓｉｏｎ５．０を用いてＬＳＤ法による対照群と処置群の比較を実施した。また、９５％の信頼度（＊；ｐ＜０．０５）をもって有意とした。【０１７７】
７−５．結果
図７に示すように、抗体投与群は、ヒスチジン緩衝液投与群と比較して、有意な腫瘍の増殖抑制効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
本発明者は、ヒト化抗AXL抗体の取得に成功した。本発明の抗AXL抗体は、高い抗腫瘍活性を有し、抗癌剤として、および癌の診断薬として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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