(57)【要約】【課題】  ＲＷＶを用いた回転培養技術をもとに細胞播種、培養液交換、品質管理等を自動化することができるとともに、培養液交換時に培養細胞に擾乱を与えずにエア抜きも同時に行うことができる回転培養ベッセル及びそれを用いた自動細胞培養装置を提供する。【解決手段】  細胞と培養液を内部に入れて回転培養装置の水平な回転軸に装着し、３次元培養するために用いる回転培養ベッセルであって、偏平円筒形の培養容器１８の適所に、初期に細胞と培養液を投入し、また培養した細胞を取り出すための単又は複数の出入口１９，２０，２１を設け、培養容器１８の外周円筒面に、培養液交換用の供給口２２と排出口２３とを少なくとも一対設け、この対となった供給口と排出口は互いに１８０°反対向きに配向させ且つ、排出口２３の中心線は回転中心を通り、供給口２２の中心線は回転中心に対して偏心させた。【選択図】        図１６
2010143651.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞と培養液を内部に入れて回転培養装置の水平な回転軸に装着し、細胞を無重力に近い微小重力環境で３次元培養するために用いる回転培養ベッセルであって、偏平円筒形の培養容器の適所に、初期に細胞と培養液を投入し、また培養した細胞を取り出すための単又は複数の出入口を設けるとともに、培養容器の外周円筒面に、培養液交換用の供給口と排出口とを少なくとも一対設け、この対となった供給口と排出口は互いに１８０°反対向きに配向させるとともに、前記排出口の中心線は回転中心を通り、前記供給口の中心線は回転中心に対して偏心させたことを特徴とする回転培養ベッセル。
【請求項２】
前記培養容器の培養空間の半径をｒとしたとき、前記供給口の中心線と回転中心との距離を０．５ｒ〜０．９ｒに設定した請求項１記載の回転培養ベッセル。
【請求項３】
前記供給口と排出口の対を前記培養容器の外周円筒面に３対設けるとともに、各供給口と各排出口は等角間隔毎に設けている請求項１又は２記載の回転培養ベッセル。
【請求項４】
前記供給口と排出口はセプタムシール構造とし、培養液交換のために用いる供給シリンジと排出シリンジはそれぞれ先端に前記セプタムシールを貫通可能な注射針を有し、前記供給シリンジから新しい培養液を注入しながら前記排出シリンジで古い培養液を吸入するとともにエア抜きをすることを可能とした請求項１〜３何れかに記載の回転培養ベッセル。
【請求項５】
前記培養容器の外周円筒面に、細胞と培養液からなる細胞液を注入する細胞液注入口を設けるとともに、前記培養容器の回転軸に直交する正面にエア抜き口と細胞取出口を設け、前記細胞液注入口とエア抜き口とはセプタムシール構造とし、前記細胞取出口は開口が大きなゴムキャップ構造とした請求項１〜４何れかに記載の回転培養ベッセル。
【請求項６】
前記セプタムシール構造の各口は、セプタムシールの背後に注射針を受け入れる直径の大きな導入流路と、該導入流路と前記培養容器の培養空間との間に直径の小さなオリフィス流路を設けた請求項４又は５記載の回転培養ベッセル。
【請求項７】
請求項１〜６何れかに記載した前記回転培養ベッセルを用い、細胞を無重力に近い微小重力環境で３次元培養するための自動細胞培養装置であって、空調機能を備えた密閉筐体内の中段に回転培養装置のインキュベータボックスを配置するとともに、下段に培養液を供給する供給シリンジを収納する供給用保冷庫、上段に培養液を回収する排出シリンジを収納する排出用保冷庫を配置し、前記インキュベータボックス、供給用保冷庫及び排出用保冷庫の前面には自動開閉扉が設けられ、前記回転培養装置には前記インキュベータボックス内に設けられた水平な回転軸をその軸方向に前後移動する軸方向移動手段を備え、該回転軸の端部に前記回転培養ベッセルを着脱可能に装着し、前記供給用保冷庫の前面には供給用ＸＹＺ軸駆動機構を配置するとともに、該機構で駆動される供給可動部に前記供給シリンジを上向きに保持する固定チャックとピストンを押し上げる押上手段とを備え、前記排出用保冷庫の前面には排出用ＸＹＺ軸駆動機構を配置するとともに、該機構で駆動される排出可動部に前記排出シリンジを下向きに保持する固定チャックとピストンを引き上げる引上手段とを備え、前記各開閉扉を開き、前記軸方向移動手段を駆動して前記インキュベータボックス内から回転培養ベッセルを前面側に出現させるとともに、前記供給口を下側、前記排出口を上側に向けて停止し、前記供給用ＸＹＺ軸駆動機構と固定チャックを駆動して前記供給用保冷庫内から供給シリンジを取り出して前記回転培養ベッセルの下側に位置させる一方、前記排出用ＸＹＺ軸駆動機構と固定チャックを駆動して前記排出用保冷庫内から排出シリンジを取り出して前記回転培養ベッセルの上側に位置させ、前記供給用ＸＹＺ軸駆動機構と排出用ＸＹＺ軸駆動機構を駆動して前記供給シリンジと排出シリンジを前記供給口と排出口に同時に気密状態で接続した後、前記押上手段と引上手段を同調して駆動し、前記回転培養ベッセル内の培養液を交換することを特徴とする自動細胞培養装置。
【請求項８】
前記供給用保冷庫と排出用保冷庫の内部には、ステッピングモータで制御される鉛直方向の回転軸を備えた回転レボルバー式のスタッカを備え、該スタッカの周囲に前記シリンジを鉛直方向に向けた状態で側方から弾性的に着脱可能なホルダーを複数設けている請求項７記載の自動細胞培養装置。
【請求項９】
前記回転培養装置には、共通の軸方向移動手段で前後移動する複数の回転軸が上下方向に重なることなく並設されているとともに、各回転軸に前記回転培養ベッセルを装着した際に、隣接する回転培養ベッセルが互いに干渉しないように、前記回転軸の端部の前後位置をずらせて設定している請求項７又は８記載の自動細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、回転培養ベッセル及びそれを用いた自動細胞培養装置に係わり、更に詳しくは培養液の自動交換に適した回転培養ベッセル及び自動培養液交換機能を備えた自動細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から自動細胞培養装置は各種提供されている。例えば、本出願人の先願に係る特許文献１には、培養皿を収容した複数の培養カセットを取り扱い、分注作業等の際にロボットアームで自動的に移動させることが可能であるとともに、インキュベータ内のガス濃度や温度、湿度等の雰囲気を管理することが可能であり、インキュベータ内の汚染は勿論のこと、分注作業等で培養皿を移送する際にも汚染を確実に防止できる自動細胞培養システムが開示されている。【０００３】
また、特許文献２，３には、２次元培養装置において培養液の交換作業等を汎用の多関節型ロボットで行うことにより自動化した自動細胞培養装置が記載されている。しかし、この自動細胞培養装置は、人の出入りを極力少なくして雑菌の侵入を防ぐという意味では効果的であるが、高価な汎用の産業用ロボットを用いて人と同等な作業を行わせるだけであり、装置コストの高騰は避けられないのである。しかも、通常の２次元細胞培養装置の域を脱せず、３次元培養を実現するための装置ではない。【０００４】
ところで、骨髄に由来する間葉系幹細胞は、骨、軟骨、脂肪、靭帯などの組織に分化する多分化能を持つが、生体外での通常の培養では、細胞は地球重力によってシャーレの底に沈み、２次元シートしか作らず本来の細胞の形質を失うことが知られている。そこで、無重力に近い微小重力環境での３次元培養を実現するために開発されたのが、ＲＷＶ（Rotating wall vessel）バイオリアクターによる培養方法であり、適切な分化誘導因子のもとで３次元培養を行うと細胞本来の組織に分化する。ＲＷＶを用いた培養装置は、シンセコン社から発売されており、その構造はガス透過膜を裏側に備えた偏平円筒形のベッセルが、回転制御装置の水平な回転軸への取付部を中心に回転するものである。ベッセルが回転することにより、細胞に及ぼす重力の方向が絶えず変化し、時間平均すると、地上重力の１００分の１という微小重力環境を作り出すことができ、それにより細胞塊が沈降せずふわふわと浮いた状態で培養できるのである。この装置を一般的に回転培養装置と称する。【０００５】
しかし、従来の回転培養装置に用いるＲＷＶには、回転軸と直交する正面に、細胞液投入取出口と、一対の細胞液の供給口と排出口を備えたものであり、手作業で培養液の交換を行うものである。つまり、培養液の交換作業には、ＲＷＶを回転軸から外して供給口と排出口を上向きに静置し、供給口のゴムキャップを外して新しい培養液が入った供給シリンジの先端を前記供給口に密嵌し、他方空の排出シリンジの先端を前記排出口に密嵌した後、供給口と排出口のコックを開き、一方の手で供給シリンジのピストンを押し込んでベッセル内に培養液を供給し、それと同時に他方の手で排出シリンジのピストンを引き抜いてベッセル内の古い培養液を吸い出すのである。通常、細胞の培養期間は２週間程度である場合が多く、数日毎に培地を交換する必要があるため、前述の煩雑で熟練を要する培地交換作業をその都度行わなければならない。この手作業による培地交換作業は、非常に手間と時間を要し、多数のＲＷＶを稼動させている場合には大変な負担となるばかりでなく、培地交換作業中に予期せぬ環境汚染が生じる恐れもある。また、ベッセルの正面に、細胞液投入口や、供給口と排出口が設けられているので、内部の細胞の様子を確認する際に視野が狭まるといった不都合がある。【０００６】
そこで、本出願人は、特許文献４に記載されるような自動細胞培養装置を提案した。即ち、この自動細胞培養装置は、密閉筐体内に、水平な回転軸を有する円筒形培養容器に、細胞液投入口と、培養液交換用のセプタムシール構造の供給口と排出口とが設けられた回転培養装置を備え、前記供給口と排出口は対となって前記培養容器の外周円筒面で回転中心に対して互に１８０°の回転角度離れた位置に半径方向へ向けて設け、該供給口と排出口を鉛直線上に配置し且つ供給口を上に位置させた状態で、前記供給口に新しい培養液が入った供給シリンジの注射針を挿脱するとともに、前記排出口に空の排出シリンジの注射針を挿脱するシリンジ移動手段と、前記供給シリンジを供給口に挿入し且つ前記排出シリンジを排出口に挿入した状態で、供給シリンジのピストンを押し込むと同時に、排出シリンジのピストンを引き抜く操作を行うピストン駆動手段とを備えたものである。【０００７】
それにより、ＲＷＶを用いた回転培養装置において、自動的に培養液を交換する機能を備えているので、研究者等の培養作業従事者の負担を大幅に低減し、細胞培養の効率化を図ることができるとともに、培養中における汚染の可能性を極力少なくすることができる。また、培養期間と培養液の交換回数に応じて、前記供給口と排出口の対を前記培養容器の外周円筒面に等角間隔毎に複数対設けることにより、培養液の交換実施に際して常に新しい供給口と排出口を使うことができるので、培養液交換時の汚染を極力抑制することができるといった利点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−０１４６７５号公報
【特許文献２】特開２００６−１１５７９８号公報
【特許文献３】特開２００６−１４９２６８号公報
【特許文献４】特開２００８−２３７２０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、特許文献４に記載された自動細胞培養装置にも若干の課題が残っている。つまり、初期の細胞液投入の際にエアが完全に置換されずにベッセル中に残ることもあるが、培養中に背面の透過膜を通してエアがベッセル中に入ってくることもある。ベッセル中にガス溜まりが存在すると、回転培養中に培養液に乱れを誘発し、細胞に不規則な負荷がかかるのでエア抜きは必須である。従来の培養液の交換は、ベッセルの培養液供給口と排出口を鉛直方向に向け、且つ供給口が上になるように位置させた状態で、上から供給シリンジで培養液を注入し、下から排出シリンジで吸引するので、ベッセルの上部に溜まったガスを抜くことができない。【００１０】
そこで、本発明が前述の状況に鑑み、解決しようとするところは、ＲＷＶを用いた回転培養技術をもとに細胞播種、培養液交換、品質管理等を自動化することができるとともに、培養液交換時に培養細胞に擾乱を与えずにエア抜きも同時に行うことができる回転培養ベッセル及びそれを用いた自動細胞培養装置を提供する点にある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、前述の課題解決のために、細胞と培養液を内部に入れて回転培養装置の水平な回転軸に装着し、細胞を無重力に近い微小重力環境で３次元培養するために用いる回転培養ベッセルであって、偏平円筒形の培養容器の適所に、初期に細胞と培養液を投入し、また培養した細胞を取り出すための単又は複数の出入口を設けるとともに、培養容器の外周円筒面に、培養液交換用の供給口と排出口とを少なくとも一対設け、この対となった供給口と排出口は互いに１８０°反対向きに配向させるとともに、前記排出口の中心線は回転中心を通り、前記供給口の中心線は回転中心に対して偏心させたことを特徴とする回転培養ベッセルを構成した（請求項１）。【００１２】
ここで、前記培養容器の培養空間の半径をｒとしたとき、前記供給口の中心線と回転中心との距離を０．５ｒ〜０．９ｒに設定することがより好ましい（請求項２）。【００１３】
また、前記供給口と排出口の対を前記培養容器の外周円筒面に３対設けるとともに、各供給口と各排出口は等角間隔毎に設けていることも好ましい（請求項３）。【００１４】
更に、前記供給口と排出口はセプタムシール構造とし、培養液交換のために用いる供給シリンジと排出シリンジはそれぞれ先端に前記セプタムシールを貫通可能な注射針を有し、前記供給シリンジから新しい培養液を注入しながら前記排出シリンジで古い培養液を吸入するとともにエア抜きをすることを可能とすることが好ましい（請求項４）。【００１５】
更に、前記培養容器の外周円筒面に、細胞と培養液からなる細胞液を注入する細胞液注入口を設けるとともに、前記培養容器の回転軸に直交する正面にエア抜き口と細胞取出口を設け、前記細胞液注入口とエア抜き口とはセプタムシール構造とし、前記細胞取出口は開口が大きなゴムキャップ構造とした（請求項５）。【００１６】
また、前記セプタムシール構造の各口は、セプタムシールの背後に注射針を受け入れる直径の大きな導入流路と、該導入流路と前記培養容器の培養空間との間に直径の小さなオリフィス流路を設けた（請求項６）。【００１７】
そして、本発明は、前述の回転培養ベッセルを用い、細胞を無重力に近い微小重力環境で３次元培養するための自動細胞培養装置であって、空調機能を備えた密閉筐体内の中段に回転培養装置のインキュベータボックスを配置するとともに、下段に培養液を供給する供給シリンジを収納する供給用保冷庫、上段に培養液を回収する排出シリンジを収納する排出用保冷庫を配置し、前記インキュベータボックス、供給用保冷庫及び排出用保冷庫の前面には自動開閉扉が設けられ、前記回転培養装置には前記インキュベータボックス内に設けられた水平な回転軸をその軸方向に前後移動する軸方向移動手段を備え、該回転軸の端部に前記回転培養ベッセルを着脱可能に装着し、前記供給用保冷庫の前面には供給用ＸＹＺ軸移動機構を配置するとともに、該機構で駆動される供給可動部に前記供給シリンジを上向きに保持する固定チャックとピストンを押し上げる押上手段とを備え、前記排出用保冷庫の前面には排出用ＸＹＺ軸移動機構を配置するとともに、該機構で駆動される排出可動部に前記排出シリンジを下向きに保持する固定チャックとピストンを引き上げる引上手段とを備え、前記各開閉扉を開き、前記軸方向移動手段を駆動して前記インキュベータボックス内から回転培養ベッセルを前面側に出現させるとともに、前記供給口を下側、前記排出口を上側に向けて停止し、前記供給用ＸＹＺ軸移動機構と固定チャックを駆動して前記供給用保冷庫内から供給シリンジを取り出して前記回転培養ベッセルの下側に位置させる一方、前記排出用ＸＹＺ軸移動機構と固定チャックを駆動して前記排出用保冷庫内から排出シリンジを取り出して前記回転培養ベッセルの上側に位置させ、前記供給用ＸＹＺ軸移動機構と排出用ＸＹＺ軸移動機構を駆動して前記供給シリンジと排出シリンジを前記供給口と排出口に同時に気密状態で接続した後、前記押上手段と引上手段を同調して駆動し、前記回転培養ベッセル内の培養液を交換することを特徴とする自動細胞培養装置を構成した（請求項７）。【００１８】
更に、前記供給用保冷庫と排出用保冷庫の内部には、ステッピングモータで制御される鉛直方向の回転軸を備えた回転レボルバー式のスタッカを備え、該スタッカの周囲に前記シリンジを鉛直方向に向けた状態で側方から弾性的に着脱可能なホルダーを複数設けている（請求項８）。【００１９】
また、前記回転培養装置には、共通の軸方向移動手段で前後移動する複数の回転軸が上下方向に重なることなく並設されているとともに、各回転軸に前記回転培養ベッセルを装着した際に、隣接する回転培養ベッセルが互いに干渉しないように、前記回転軸の端部の前後位置をずらせて設定していることも好ましい（請求項９）。
【発明の効果】
【００２０】
以上にしてなる本発明の回転培養ベッセルは、偏平円筒形の培養容器の適所に、初期に細胞と培養液を投入し、また培養した細胞を取り出すための単又は複数の出入口を設けるとともに、培養容器の外周円筒面に、培養液交換用の供給口と排出口とを少なくとも一対設け、この対となった供給口と排出口は互いに１８０°反対向きに配向させるとともに、前記排出口の中心線は回転中心を通り、前記供給口の中心線は回転中心に対して偏心させたので、前記供給口を下向き、排出口を上向きに停止させ、新しい培養液の入った供給シリンジを供給口の接続するとともに、排出シリンジを排出口に接続し、供給シリンジのピストンを押し上げて培養容器内に新しい培養液を注入すると同時に排出シリンジのピストンを引き上げて古い培養液を吸入して培養液を交換することができるが、この際に培養容器の上部に溜まったガスを排出シリンジで吸い出すことができ、更に供給口の中心線が回転中心に対して偏心しているので、培養中の細胞塊が沈降して培養容器の下部に位置する場合でも、供給口が細胞塊を避けた位置にあるので、培養液の注入時の流れで細胞塊がバラバラになるのを防ぐことができる。特に、前記培養容器の培養空間の半径をｒとしたとき、前記供給口の中心線と回転中心との距離を０．５ｒ〜０．９ｒに設定した場合には、その効果は大きい。また、培養容器の正面には、視界を遮る供給口と排出口が存在しないので、培養経過の観察が非常にやり易くなるのである。【００２１】
また、記供給口と排出口の対を前記培養容器の外周円筒面に３対設けることにより、培養初期に投入する培養液と３回の培養液の交換が可能になるので、通常の２週間程度の細胞培養期間をカバーすることができ、更に培養液の交換時に常に新しい供給口と排出口を用いることができるので、汚染の発生を最小限に抑制できる。また、各供給口と各排出口は等角間隔毎に設けた場合には、供給口と排出口の停止位置の位置決めが容易且つ正確になる。【００２２】
前記供給口と排出口はセプタムシール構造とし、培養液交換のために用いる供給シリンジと排出シリンジはそれぞれ先端に前記セプタムシールを貫通可能な注射針を有する場合には、注射針をセプタムシールに貫通させると気密状態で接続することができ、それにより前記供給シリンジから新しい培養液を注入しながら前記排出シリンジで古い培養液を吸入するとともにエア抜きをすることができる。また、注射針をセプタムシールから抜くと、注射針で開けられた穴は自己修復して閉じるので、供給口や排出口に特別な開閉操作のための構造を必要とせず、供給口や排出口を小型化でき、それにより培養容器の外周円筒面に３対設けることができるのである。【００２３】
前記培養容器の外周円筒面に、細胞と培養液からなる細胞液を注入する細胞液注入口を設けるとともに、前記培養容器の回転軸に直交する正面にエア抜き口と細胞取出口を設けたので、培養容器の正面を上に向けて水平に保ち、細胞液注入口に細胞液供給シリンジを接続するとともに、エア抜き口にエア排出シリンジを接続し、細胞液供給シリンジから細胞液を注入すると同時にエア排出シリンジで培養容器内のエアを吸引し、培養容器内のエアを細胞液で置換して初期の培養準備をすることができる。特に、前記細胞液注入口とエア抜き口とはセプタムシール構造とすれば、シリンジの注射針をセプタムシールに突き刺すだけで簡単に気密状態で接続することができ、マニュアル作業が簡単になる。また、前記細胞取出口は開口が大きなゴムキャップ構造としたので、培養後の細胞塊を取り出すのが容易になる。【００２４】
前記セプタムシール構造の各口は、セプタムシールの背後に注射針を受け入れる直径の大きな導入流路と、該導入流路と前記培養容器の培養空間との間に直径の小さなオリフィス流路を設けたので、セプタムシールに注射針を突き刺す位置が多少ずれても注射針を導入流路に受け入れることができ、また供給シリンジから培養液を、オリフィス流路を通して培養空間に供給するので、培養液の流れによる培養空間内の擾乱を最小限に抑制することができ、また導入流路に残ったエアが回転培養中にオリフィス流路を通って培養空間に入ることを抑制することもできるのである。更に、培養空間の円周壁面にはオリフィス流路の小さな孔のみが開口されているので、回転培養中に培養液に擾乱が生じない。【００２５】
また、本発明の自動細胞培養装置は、ＲＷＶを用いた回転培養技術を前提として、自動的に培養液を交換する機能を備えているので、研究者等の培養作業従事者の負担を大幅に低減し、細胞培養の効率化を図ることができるとともに、培養中における汚染の可能性を極力少なくすることができ、ＧＭＰ対応のＣＰＣを持たない医療機関でも再生医療の臨床適応を目指すことができるようになり、再生医療を飛躍的に普及させることができる。本発明は、回転培養ベッセルの培養容器に、供給口から供給シリンジで新しい培養液を注入すると同時に、排出口から排出シリンジで古い培養液を吸い出すといった従来から手作業で実績のある培養液交換作業を、完全に自動化することができるのである。そして、下向きの供給口から供給シリンジで新しい培養液を回転培養ベッセルの培養空間に注入すると同時に、上向きの排出口から排出シリンジで古い培養液を吸引するとともに、エア抜きを行うことができるのである。また、供給口の中心線が回転中心に対して偏心しているので、細胞塊がバラバラになるのを防ぐことができることは前述の通りである。また、排出シリンジに吸引された古い培養液は、排出用保冷庫に保存するので、後で汚染を検査することができる。【００２６】
また、通常は供給口と排出口は培養液の交換時に一度きり使用するが、回転培養ベッセルは、小さいもので培養空間の容積が１０ｍｌ、大きいものでも２０ｍｌといったように比較的小さいので、その外周部に設ける供給口と排出口の対の数には制限があるので、長期間培養する場合には、供給口と排出口を複数回使用することも想定され、その場合には供給シリンジと排出シリンジは供給口の数以上の本数が必要になるが、周囲に複数のホルダーを設けた回転レボルバー式のスタッカを用いることにより、供給シリンジと排出シリンジを供給、保管することができる。【００２７】
また、供給口と排出口を培養液の交換時に一度きりしか使用しない場合でも、回転培養装置に複数の回転軸を備え、その端部に回転培養ベッセルを装着して、複数の回転培養ベッセルで同時に培養する場合には、ベッセルの数に供給口と排出口の対の数を掛けただけの供給シリンジと排出シリンジの本数が必要になるが、その場合にも周囲に複数のホルダーを設けた回転レボルバー式のスタッカを用いることで対応することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明に係る自動細胞培養装置の外カバーの一部を省略した全体斜視図である。
【図２】同じく自動細胞培養装置の内部構造を示す側面図である。
【図３】同じく自動細胞培養装置の内部構造を示す正面図である。
【図４】軸方向移動手段を備えた回転培養装置の機構部を示す斜視図である。
【図５】供給用ＸＹＺ軸移動機構を示す斜視図である。
【図６】排出用ＸＹＺ軸移動機構を示す斜視図である。
【図７】回転レボルバー式のスタッカを備えた供給用保冷庫の斜視図である。
【図８】回転レボルバー式のスタッカを備えた排出用保冷庫の斜視図である。
【図９】本発明に係る回転培養ベッセルの正面側から見た斜視図である。
【図１０】同じく回転培養ベッセルの背面側から見た斜視図である。
【図１１】回転培養ベッセルの正面図である。
【図１２】回転培養ベッセルの左側面図である。
【図１３】回転培養ベッセルの背面図である。
【図１４】図１１のＡ−Ａ線断面図である。
【図１５】図１１のＢ−Ｂ線断面図である。
【図１６】供給口と排出口の第１対を用いた培養液の交換作業中の状態を示す説明図である。
【図１７】供給口と排出口の第２対を用いた培養液の交換作業中の状態を示す説明図である。
【図１８】供給口と排出口の第３対を用いた培養液の交換作業中の状態を示す説明図である。
【図１９】本発明の自動細胞培養装置（自動培養）と従来の回転培養装置（手動培養）によって、日本白色兎の骨髄細胞を用いた軟骨組織構築実験を行った結果を示す軟骨組織の外観を示す図面代用写真である。
【図２０】軟骨基質ＧＡＧの生産量を比較した結果を示すグラフである。
【図２１】アルシアンブルー染色した軟骨組織の顕微鏡写真である。
【図２２】トルイジンブルー染色した軟骨組織の顕微鏡写真である。
【図２３】ＨＥ染色した軟骨組織の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
次に、添付図面に示した実施形態に基づき、本発明を更に詳細に説明する。図１〜図８は本発明の自動細胞培養装置を示し、図９〜図１５は本発明の回転培養ベッセルを示し、図中符号１は自動細胞培養装置、２は回転培養ベッセル、３は回転培養装置、４は供給用保冷庫、５は排出用保冷庫、６は軸方向移動手段、７は供給用ＸＹＺ軸移動機構、８は排出用ＸＹＺ軸移動機構をそれぞれ示している。
【００３０】
本発明の自動細胞培養装置１は、回転培養ベッセル２を用い、細胞を無重力に近い微小重力環境で３次元培養するものであり、空調機能を備えた密閉筐体９内の中段に、回転培養ベッセル２を単又は複数個装着して培養する回転培養装置３のインキュベータボックス１０を配置するとともに、下段に培養液を供給する供給シリンジ１１を収納する供給用保冷庫４、上段に培養液を回収する排出シリンジ１２を収納する排出用保冷庫５を配置し、前記インキュベータボックス１０、供給用保冷庫４及び排出用保冷庫５の前面には自動開閉扉（図示せず）が設けられ、前記回転培養装置３には前記インキュベータボックス１０内に設けられた水平な回転軸１３をその軸方向に前後移動する軸方向移動手段６を備え、該回転軸１３の端部に前記回転培養ベッセル２を着脱可能に装着し、前記供給用保冷庫４の前面には供給用ＸＹＺ軸移動機構７を配置するとともに、該機構で駆動される供給可動部に前記供給シリンジ１１を上向きに保持する固定チャック１４とピストン１１Ａを押し上げる押上手段１５とを備え、前記排出用保冷庫５の前面には排出用ＸＹＺ軸移動機構８を配置するとともに、該機構で駆動される排出可動部に前記排出シリンジ１２を下向きに保持する固定チャック１６とピストン１２Ａを引き上げる引上手段１７とを備えたものである。本実施形態では、前記回転軸１３の軸方向をＸ軸、それと直交する水平方向をＹ軸、鉛直方向をＺ軸として説明する。
【００３１】
本実施形態では、共通の軸方向移動手段６でＸ軸方向へ前後移動する複数の回転軸１３，…が上下方向に重なることなく並設されているとともに、各回転軸１３に前記回転培養ベッセル２を装着した際に、隣接する回転培養ベッセル２，２が互いに干渉しないように、前記回転軸１３，…の端部の前後位置をずらせて設定している。本実施形態では、２本の回転軸１３，１３を平行に並設して、同時に二つの回転培養ベッセル２，２で培養することができるようにしている。
【００３２】
次に、前記回転培養ベッセル２の詳細を図９〜図１５に基づいて説明する。前記回転培養ベッセル２は、偏平円筒形の培養容器１８の外周円筒面に、細胞と培養液からなる細胞液を注入する細胞液注入口１９を設けるとともに、前記培養容器１８の前記回転軸１３に直交する正面にエア抜き口２０と細胞取出口２１を設け、そして前記培養容器１８の外周円筒面に、培養液交換用の供給口２２と排出口２３とを少なくとも一対設け、この対となった供給口２２と排出口２３は互いに１８０°反対向きに配向させるとともに、前記排出口２３の中心線は回転中心を通り、前記供給口２２の中心線は回転中心に対して偏心させている。
【００３３】
本実施形態では、供給口２２と排出口２３を前記培養容器１８の外周円筒面に３対設けているので、それらをＡ，Ｂ，Ｃで区別することにする。また、各供給口２２Ａ，２２Ｂ，２２Ｃと各排出口２３Ａ，２３Ｂ，２３Ｃは等角間隔毎に設けている。本実施形態では、細胞液注入口１９と細胞取出口２１を別々に設けたが、これを一つの口で供用することも可能である。ここで、前記培養容器１８の培養空間の半径をｒとしたとき、前記供給口２２の中心線と回転中心との距離を０．５ｒ〜０．９ｒに設定している。
【００３４】
更に、前記回転培養ベッセル２は、背面側の中心部に、前記回転培養装置３の回転軸１３の端部に着脱可能に装着する取付部２４を突設している。この取付部２４の構造は、前記回転軸１３の端部に対して常に同じ回転位置で取付けることができるようになっている。また、本実施形態の回転培養ベッセル２の容積は、培養液が高価であることから１０〜２０ｍｌを想定しているが、それらは培養する細胞塊の大きさに応じて決定すべきである。
【００３５】
また、図１０、図１３、図１４及び図１５に示すように、前記回転培養ベッセル２の背面側で取付部２４の周囲には、空気の取入口２５を設け、その内側に設けたガス透過膜２６を通して培養液中に酸素を供給し、二酸化炭素を排出できるようになっており、また正面側は内部を透視可能なように観察窓２７となっている。
【００３６】
更に、図１５に示すように、前記供給口２２と排出口２３はセプタムシール構造とし、培養液交換のために用いる供給シリンジ１１と排出シリンジ１２はそれぞれ先端に前記セプタムシール２８を貫通可能な注射針１１Ｂ，１２Ｂを有し、前記供給口２２を下向き、前記排出口２３を上向きとし、前記供給シリンジ１１から新しい培養液を下側から注入しながら前記排出シリンジ１２で古い培養液を上側から吸入するとともにエア抜きをすることができるようになっている。前記供給口２２と排出口２３をセプタムシール構造としたことにより、前記供給シリンジ１１と排出シリンジ１２の先端に装着した注射針１１Ｂ，１２Ｂをセプタムシール２８に貫通させて気密状態で接続することができ、また注射針１１Ｂ，１２Ｂを抜いてもその弾性復元によって貫通穴が塞がり、気密状態を維持することができるようになっている。
【００３７】
更に詳しくは、前記供給口２２と排出口２３は、図１５に示すように、同じ断面構造となっておいる。前記供給口２２は、前記培養容器１８の外周円筒面の回転中心から偏心して培養空間に連通するように接続したポート２９の端部内に、シリコンゴムからなるセプタムシール２８を配置し、該セプタムシール２８の外周部を、前記ポート２９に螺合した押えキャップ３０で押圧して密閉した構造となっている。一方、前記排出口２３は、前記培養容器１８の外周円筒面の回転中心を通る半径方向に向けて培養空間に連通するように接続したポート２９の端部内に、シリコンゴムからなるセプタムシール２８を配置し、該セプタムシール２８の外周部を、前記ポート２９に螺合した押えキャップ３０で押圧して密閉した構造となっている。更に、前記セプタムシール構造の前記供給口２２と排出口２３を構成するポート２９の内部で、前記セプタムシール２８の背後に注射針１１Ｂ又は１２Ｂを受け入れる直径の大きな導入流路３１と、該導入流路３１と前記培養容器１８の培養空間との間に直径の小さなオリフィス流路３２を設けている。
【００３８】
そして、前記供給口２２のセプタムシール２８を貫通させた前記供給シリンジ１１の注射針１１Ｂの先端部は、前記ポート２９内の導入流路３１に受け入れられるので、前記注射針１１Ｂの位置がセプタムシール２８の中心から多少ずれていても、該注射針１１Ｂの先端がポート２９に接触することがなく、全く問題なく使用することができる。そのため、前記供給用ＸＹＺ軸移動機構７の位置決め精度に対する要求が低くなるので、安価なアクチュエータを用いて構成できる。また、前記オリフィス流路３２を設けたので、前記導入流路３１に注入された培養液は、直径の小さなオリフィス流路３２を通って培養空間に導入されるので、培養空間内に生じる擾乱を最小限に抑制することができる。また、前記排出口２３のプタムシール２８を貫通させた前記排出シリンジ１２の注射針１２Ｂの先端部も前記ポート２９内の導入流路３１に受け入れられ、吸引することによりオリフィス流路３２を通して古い培養液と、内部に溜まったエアを抜くことができる。尚、前記導入流路３１にエアが溜まっていても、培養液の表面張力によって回転培養中はエアがオリフィス流路３２を通して培養空間に流入することはない。
【００３９】
また、前記細胞液注入口１９とエア抜き口２０は、図１４に示すように、前記同様のセプタムシール構造とし、前記細胞取出口２１は開口が大きなゴムキャップ構造とした。つまり、前記細胞液注入口１９は、前記排出口２３と同様に、回転中心を通る半径方向に向けて培養空間に連通するように接続したポート２９の端部内に、シリコンゴムからなるセプタムシール２８を配置し、該セプタムシール２８の外周部を、前記ポート２９に螺合した押えキャップ３０で押圧して密閉した構造となっている。前記エア抜き口２０と細胞取出口２１は、前記培養容器１８の正面で回転中心に対して反対側の周縁部にそれぞれ設けている。前記エア抜き口２０は、培養容器１８の正面に突設したポート３３の端部内に、シリコンゴムからなるセプタムシール３４を配置し、該セプタムシール３４の外周部を、前記ポート３３に螺合した押えキャップ３５で押圧して密閉した構造となっている。そして、前記細胞液注入口１９のポート２９の内部とエア抜き口２０のポート３３の内部にも、前記同様に導入流路３１とオリフィス流路３２を設けている。更に、前記エア抜き口２０のオリフィス流路３２が培養空間に開口した内部には、前記回転培養ベッセル２を水平に置いたときに、内部のエアを溜める凹部３６を形成している。また、前記細胞取出口２１は、内径の大きなポート３７の内部にゴムキャップ３８が密嵌し、該ゴムキャップ３８の先端面は、回転培養中に培養液に擾乱が生じないように、培養空間の内壁と面一にしている。
【００４０】
そして、前記回転培養ベッセル２に細胞と培養液を注入するには、該回転培養ベッセル２の観察窓２７を上側にして回転軸を鉛直方向に向けて静置し、前記細胞液注入口１９のセプタムシール２８に細胞と培養液の入った細胞液注入用シリンジ（図示せず）の注射針を突き刺し、前記エア抜き口２０のセプタムシール３４に空のエア抜き用シリンジ（図示せず）の注射針を突き刺し、細胞液注入用シリンジから細胞液を培養空間に注入しながら、エア抜き用シリンジでエアを吸い出すのである。この際に、前記培養空間のエアは最後に凹部３６に溜まり、該凹部３６に溜まったエアも培養空間から抜き去られる。
【００４１】
次に、前記回転培養ベッセル２を用いて、培養液を自動的に交換しながら細胞を培養する自動細胞培養装置１の詳細を図１〜図８、図１６〜図１８に基づいて説明する。前記密閉筐体９は、図１に示すように、正面と一側面に開閉扉を設けてあり、正面には前記回転培養装置３、供給用保冷庫４及び排出用保冷庫５に対応して３枚の点検扉３９，…を設けている。尚、前記密閉筐体９の正面パネルは、透明にして内部を透視している。また、前記密閉筐体９の側面には、一枚の作業扉４０を設け、一連の培養を行うための準備作業、あるいは培養後の処理において、該作業扉４０を開放して前記回転軸１３に回転培養ベッセル２を着脱し、また供給用保冷庫４の内部に供給シリンジ１１，…を着脱するとともに、排出用保冷庫５の内部に排出シリンジ１２，…を着脱する。尚、前記作業扉４０は、透明にして内部を透視している。そして、前記密閉筐体９の天井部には、フィルター機能を備えた空調機４１を設け、内部を適温に保つとともに、空気を清浄化している。
【００４２】
前記回転培養装置３は、図１〜図４に示すように、温度管理が可能な前記インキュベータボックス１０内に、水平な回転軸１３を設けるとともに、背後に該回転軸１３を所定の回転数で駆動する回転制御機構４２を備え、前記回転軸１３を回転制御機構４２とともに軸方向に前後移動する軸方向移動手段６を備えている。前記インキュベータボックス１０は、前面に自動開閉扉を設け、前記作業扉４０を設けた側の側面に手動で開閉する扉４３を設けている。本実施形態では、２本の回転軸１３，１３が水平位置に平行に配置され、それぞれが円筒状の軸受４４，４４で回転可能且つ軸方向スライド可能に支持されている。また、前記軸方向移動手段６は、前記インキュベータボックス１０の後部に設けたリニアガイド４５に沿って可動部４６が前後方向へ移動する構造である。そして、前記インキュベータボックス１０の後面から後方へ延びた前記回転軸１３，１３の端部を、前記軸方向移動手段６の可動部４６に取付けられた回転制御機構４２に、タイミングベルトを介して連動させている。ここで、前記回転制御機構４２は、前記回転軸１３，１３をそれぞれ独立して回転制御可能なように２系列独立してあり、回転数と回転位置を精確に制御できるように、ステッピングモータあるいはサーボモータで駆動し、回転軸１３に固定したマーカーをセンサーで読み取る等により回転位置を制御している。また、前記回転軸１３，１３の先端位置は、前述のように、前後にずらせており、それぞれに細胞液を満たした回転培養ベッセル２を手作業で着脱するのである。
【００４３】
また、前記供給用保冷庫４は、図１〜図３及び図７に示すように、温度管理が可能なボックスの前面に自動開閉扉を設け、前記作業扉４０を設けた側の側面に手動で開閉する扉４７を設け、内部に回転レボルバー式のスタッカ４８を備えている。前記スタッカ４８は、ステッピングモータ４９で制御される鉛直方向の回転軸５０を備え、該スタッカ４８の周囲に前記供給シリンジ１１を、注射針１１Ｂを上側にして鉛直方向に向けた状態で側方から弾性的に着脱可能なホルダー５１，…を複数設けている。前記スタッカ４８のホルダー５１は、前記供給シリンジ１１の上下部を受け入れて係止するＵ字溝を備えるとともに、弾性的に両側から挟んで保持する挟持部を備えたものであり、側方から供給シリンジ１１を押し込めば自動的に保持され、また供給シリンジ１１を掴んで側方へ引き出せば簡単に取り出せるようになっている。
【００４４】
また、前記排出用保冷庫５は、図１〜図３及び図８に示すように、前記供給用保冷庫４と略同じ構造であるが、温度管理が可能なボックスの前面に自動開閉扉を設け、前記作業扉４０を設けた側の側面に手動で開閉する扉５２を設け、内部に回転レボルバー式のスタッカ５３を備えている。前記スタッカ５３は、ステッピングモータ５４で制御される鉛直方向の回転軸５５を備え、該スタッカ５３の周囲に前記排出シリンジ１２を、注射針１２Ｂを下側にして鉛直方向に向けた状態で側方から弾性的に着脱可能なホルダー５６，…を複数設けている。このスタッカ５３の前記スタッカ４８と略同じ構造である。
【００４５】
次に、前記供給シリンジ１１を搬送する供給用ＸＹＺ軸移動機構７を、図２、図３及び図５に基づいて説明する。前記供給用ＸＹＺ軸移動機構７は、前記密閉筐体９内で供給用保冷庫４の前面に設けられ、密閉筐体９内の底部に固定されたＹ軸移動機構５７と、該Ｙ軸移動機構５７の可動部に固定されたＺ軸移動機構５８と、該Ｚ軸移動機構５８の可動部に固定されたＸ軸移動機構５９とを備え、更に該Ｘ軸移動機構５９の可動部に前記供給シリンジ１１を上向きに保持する固定チャック１４とピストン１１Ａを押し上げる押上手段１５とを備えている。前記Ｙ軸移動機構５７、Ｚ軸移動機構５８及びＸ軸移動機構５９は、リニアガイドとボールねじ駆動のステッピングモータで構成されているが、特に限定されない。また、前記固定チャック１４は、前記供給シリンジ１１のシリンダーのフランジ部を係止するＵ字溝板６０と側面を挟持するエア駆動のハンド６１とで構成されている。また、前記押上手段１５は、前記固定チャック１４とともに前記Ｘ軸移動機構５９の可動部に固定したＺ軸移動機構６２の可動部に、前記ピストン１１Ａの下端に当接する押上板６３を突設した構造である。
【００４６】
最後に、前記排出シリンジ１２を搬送する排出用ＸＹＺ軸移動機構８を、図２、図３及び図６に基づいて説明する。前記排出用ＸＹＺ軸移動機構８は、前記密閉筐体９内で排出用保冷庫５の前面に設けられ、密閉筐体９内の前側上部に固定されたＹ軸移動機構６４と、該Ｙ軸移動機構６４の可動部に固定されたＺ軸移動機構６５と、該Ｚ軸移動機構６５の可動部に固定されたＸ軸移動機構６６とを備え、更に該Ｘ軸移動機構６６の可動部に前記排出シリンジ１２を下向きに保持する固定チャック１６とピストン１２Ａを引き上げる引上手段１７とを備えている。前記固定チャック１６は、前記排出シリンジ１２のシリンダーのフランジ部を係止するＵ字溝板６７と側面を挟持するエア駆動のハンド６８とで構成されている。また、前記引上手段１７は、前記固定チャック１６とともに前記Ｘ軸移動機構６６の可動部に固定したＺ軸移動機構６９の可動部に、前記ピストン１２Ａの上端のフランジ部に係止して引き上げる引上板７０を突設した構造である。
【００４７】
本発明に係る自動細胞培養装置１を用いて細胞を培養する手順を以下に示す。先ず、前記密閉筐体９の作業扉４０を開き、前記供給用保冷庫４の扉４７を開いて、前記スタッカ４８に所定数の供給シリンジ１１，…を装填し、扉４７を閉じる。また、前記排出用保冷庫５の扉５２を開いて、前記スタッカ５３に前記供給シリンジ１１，…と同数の排出シリンジ１２，…を装填し、扉５２を閉じる。一方、前記回転培養装置３のインキュベータボックス１０の扉４３を開いて、前記回転軸１３の端部に、細胞液を充填した前記回転培養ベッセル２の取付部２４を装着し、扉４３を閉じる。この際、前記回転軸１３に対して回転培養ベッセル２は常に精確な回転位置に固定される。それから、前記作業扉４０を閉じ、密閉筐体９の内部をインキュベータボックス１０の内部とともに所定温度に維持する。これは、培養液を交換する際に、前記インキュベータボックス１０の前面の自動開閉扉を開いたときに、インキュベータボックス１０の内部の温度が急激に変化して、培養条件が変化することを防止するためである。また、前記供給用保冷庫４と排出用保冷庫５の内部の温度は、インキュベータボックス１０の内部の温度よりも低く設定し、使用前の新しい培養液と使用後の古い培養液を、状態を変化させることなく保存するためである。
【００４８】
そして、前記回転制御機構４２を駆動して所定回転数で回転培養ベッセル２を回転させて細胞を培養する。それから、一定期間培養した後、前記回転制御機構４２を制御して前記回転培養ベッセル２の第１の前記供給口２２Ａが鉛直方向下向き、前記排出口２３Ａが鉛直方向上向きの状態で停止させる。そして、前記インキュベータボックス１０の前面の自動開閉扉を開いて、前記軸方向移動手段６を駆動して前方へ移動させ、前記回転培養ベッセル２をインキュベータボックス１０の前側空間に位置させる。それと同時に、又は前後して、前記供給用保冷庫４と排出用保冷庫５の前面の自動開閉扉を開き、前記供給用ＸＹＺ軸移動機構７と排出用ＸＹＺ軸移動機構８をそれぞれ独立して駆動し、前記固定チャック１４を供給用保冷庫４の内部に進入させ、所定回転位置にあるスタッカ４８に保管されている供給シリンジ１１を該固定チャック１４で保持した後、供給用保冷庫４の前面空間に取り出すとともに、前記固定チャック１６を排出用保冷庫５の内部に進入させ、所定回転位置にあるスタッカ５３に保管されている排出シリンジ１２を該固定チャック１６で保持した後、排出用保冷庫５の前面空間に取り出す。
【００４９】
そして、前記回転培養ベッセル２の第１の前記供給口２２Ａの直下に供給シリンジ１１を位置させる一方、前記排出口２３Ａの直上に前記排出シリンジ１２を位置させる。そして、図１６に示すように、前記供給用ＸＹＺ軸移動機構７のＺ軸移動機構５８と、前記排出用ＸＹＺ軸移動機構８のＺ軸移動機構６５を同調させて駆動し、前記供給シリンジ１１の注射針１１Ｂを供給口２２Ａのセプタムシール２８を貫通させると同時に、前記排出シリンジ１２の注射針１２Ｂを排出口２３Ａのセプタムシール２８を貫通させて接続する。この状態を維持しながら、前記押上手段１５の押上板６３を上昇させて供給シリンジ１１のピストン１１Ａを押し上げて、新しい培養液を回転培養ベッセル２の培養空間内に注入すると同時に、前記引上手段１７の引上板７０を上昇させて排出シリンジ１２のピストン１２Ａを引き上げて、回転培養ベッセル２の培養空間内から古い培養液を吸い出し、この際に培養中に培養空間内に溜まったエアも同時に吸い出すのである。こうして、前記回転培養ベッセル２の培養液を交換した後、前記供給用ＸＹＺ軸移動機構７のＺ軸移動機構５８と、前記排出用ＸＹＺ軸移動機構８のＺ軸移動機構６５を同調させて駆動し、前記供給シリンジ１１の注射針１１Ｂを供給口２２Ａから抜き去ると同時に、前記排出シリンジ１２の注射針１２Ｂを排出口２３Ａから抜き去る。そして、前記供給用ＸＹＺ軸移動機構７と排出用ＸＹＺ軸移動機構８を駆動して、使用済の供給シリンジ１１と排出シリンジ１２をそれぞれ、前記スタッカ４８とスタッカ５３の元の位置に装填し、固定チャック１４と固定チャック１６を開いて供給用保冷庫４と排出用保冷庫５から引き出し、初期位置に待機させる。その一方で、前記軸方向移動手段６を駆動して前記回転培養ベッセル２をインキュベータボックス１０の内部に格納し、それぞれの自動開閉扉を閉じた後、前記回転制御機構４２を駆動して所定回転数で回転培養ベッセル２を回転させて細胞を培養する。
【００５０】
上記の培養液交換作業を、前記回転培養ベッセル２の供給口２２Ｂと排出口２３Ｂの対を用いて図１７に示すように行い、その後、供給口２２Ｃと排出口２３Ｃの対を用いて図１８に示すように繰り返し行うのである。その場合、前記スタッカ４８とスタッカ５３は、順次新しい供給シリンジ１１と排出シリンジ１２が、正面側に来るように所定角度だけ回転させておくのである。
【００５１】
本発明で採用している回転培養装置３は、回転培養ベッセル２の内部で細胞は沈降することなく浮遊状態に維持することができるので、三次元集合体を形成することができること、攪拌ストレスによる壊死を回避することができること、効率的に分化誘導物質を作用させることができること、老廃物の除去・養分の供給が可能であること、といった利点がある。本発明では、複数の供給シリンジ１１，…を用いて順次培養液を供給することができるので、細胞の培養ステージに応じて最適な成分配合の培養液を用いることもできる。
【００５２】
また、培養期間中に、培養の状況を確認することは重要である。培養の状況としては、（１）培養中にｐＨの変化や培地添加物の消費、老廃物の蓄積等による培地の色の変化の確認、（２）コンタミネーションによる培地の濁りの有無、（３）浮遊細胞から三次元の組織が形成されたかどうかの確認等が挙げられる。本発明では、前記回転培養ベッセル２の正面には観察窓２７を設けているので、該観察窓２７に向けて配置した撮像カメラや各種の分析機器を通して内部の状況を観察することができ、また画像処理によって現状を分析し、それに基づいて回転制御機構４２をフィードバック制御したり、培養液の交換タイミングを自動的に探るといったことも可能となる。
【実施例】
【００５３】
次に、本発明の自動細胞培養装置と、比較対象として手培養（Synthecon社製RCCS-4Dを用いて目視にて回転数を調整）による回転培養を行った。日本白色兎の骨髄細胞を用いた軟骨組織構築実験を行って両者を比較した。実験手順を以下に示す。【００５４】
（実験の手順）
（１）日本白色兎１０日令２匹の長骨より骨髄細胞を採取し、２０ｍｌのstandard mediumに懸濁した。
・Standard Medium: DMEM (Dulbeccco’s Modified Eagles Medium (DMEM, Sigma, St Louis MO) + 10% FBS (fetal bovine serum) + antibiotic-antimicotic(Invitrogen, Carlsbad, CA)
（２）次に７５Ｔフラスコ（ＢＤ）に１５ｍｌのstandard mediumとともに播種し、５％ＣＯ2,３７℃で３週間培養した。
（３）次にトリプシンにより細胞を剥がし、bioreactor mediumに懸濁し、５０ｃｃベッセルに移した。
・Bioreactor Medium： DMEM + 50μg/ml ascorbic acid (WAKO) +   40μg/ml L-proline +ITS culture suppleent (BD Biosciences), 10-7 dexamethasone (Sigma), 10ng/ml TGF-β3 (Sigma) and abtibiotic-antimicotic (BD)
・実施例で使用した５０ｃｃベッセルは、図９〜図１５に示したものである。
・使用した細胞数は、自動細胞培養装置による培養（実施例）、手動培養（比較例）とも同じである。
（４）２週間培養し、組織を取りだし、肉眼所見観察、切片を作製し、組織化学的手法により評価した。【００５５】
本発明の自動細胞培養装置による培養液の交換時に、細胞組織がベッセルの壁面に衝突することはなかった。また、供給シリンジ及び排出シリンジの注射針とセプタムシールから培養液の漏れはなかった。そして、ベッセル中の古い培養液が、下から順に新しい培養液へ交換されることが確認できた。また、培養液交換後にベッセルの上部にガス溜まりは存在しなかった。【００５６】
（培養結果）
図１９に培養によって構築した軟骨組織の外観を示している。図１９の左側は自動培養（実施例）の結果を示し、右側は手動培養（比較例）の結果を示している。培養した軟骨組織の肉眼所見では、自動培養より手動培養による組織の方が大きいという結果が得られた。【００５７】
図２０は、軟骨基質ＧＡＧの生産量を比較した結果を示すグラフである。この回の培養では自動培養の方が高い値を示している。数回の実験で、軟骨基質ＧＡＧの生産量は、自動培養が手動培養に比べ、同じか、高い値を示していた。【００５８】
最後に、培養によって構築した軟骨組織の組織学的評価を行った結果を図２１〜図２３に示す。図２１は、軟骨組織をアルシアンブルー染色した結果を示す顕微鏡写真である。両者とも、軟骨基質が水色に染色され、豊富に軟骨基質が産生されていることが確認できた。ここで、軟骨基質が水色に染色された部分は、図２１中では濃い色で表示されている。【００５９】
図２２は、軟骨組織をトルイジンブルー染色した結果を示す顕微鏡写真である。両者とも軟骨基質が青紫色に染色され、豊富に軟骨基質が産生されていることが確認できた。この場合も、軟骨基質が青紫色に染色された部分は、図２２中では濃い色で表示されている。【００６０】
図２３は、軟骨組織をＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）した結果を示す顕微鏡写真である。軟骨組織はヘマトキシリンによって青紫色に染色され、自動培養、手動培養のいずれも青紫色に染色された成熟軟骨様細胞が見られた。この場合も、青紫色に染色された部分は、図２３中では濃い色で表示されている。しかし、エオシンによって、細胞質、軟部組織の結合組織、赤血球、線維素、内分泌顆粒などが明るい赤、あるいは青藍色に染まるので、モノトーンで表示した場合には、同じく濃い色で表示されるので、濃淡のみでは軟骨組織と区別ができない。【００６１】
以上のように、本発明の自動細胞培養装置を用いた場合と手動にて回転制御を行いながら培養した場合を比較した。兎骨髄細胞をＲＷＶベッセルによる回転培養装置により培養した結果では、自動培養が品質面において手動培養に比べ少なくとも同等以上の品質を与えることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の自動細胞培養装置は、ＧＭＰ（Good Manufacturing Practice）対応のＣＰＣ（セルプロセッシングセンター）を持たない医療機関でも再生医療の臨床適応を目指すことができるようになり、再生医療を飛躍的に普及させることができる。代表的にはヒト骨髄細胞から移植可能な軟骨組織を構築するために使用することができる。更に、軟骨再生以外にも再生医療の研究は、網膜剥離症や白内障などを対象とした角膜再生、骨欠損や骨粗しょう症を対象とした骨再生、糖尿病などを対象とした膵臓（ラ氏島）再生、拡張型心筋症などを対象とする心筋再生、パーキンソン病やアルツハイマー症を対象とする神経再生などにも及んでいるので、これら軟骨再生以外の再生医療においても、本発明の自動細胞培養装置が有効であると考えられる。本発明の自動細胞培養装置は、将来的には軟骨再生医療のみならず再生医療全般に適応され得るものであり、再生医療の普及のための必須かつ重要な基盤技術となるものと確信する。
【符号の説明】
【００６３】
１  自動細胞培養装置、        ２  回転培養ベッセル、
３  回転培養装置、            ４  供給用保冷庫、
５  排出用保冷庫、            ６  軸方向移動手段、
７  供給用ＸＹＺ軸移動機構、  ８  排出用ＸＹＺ軸移動機構、
９  密閉筐体、                １０  インキュベータボックス、
１１  供給シリンジ、          １１Ａ  ピストン、
１１Ｂ  注射針、              １２  排出シリンジ、
１２Ａ  ピストン、            １２Ｂ  注射針、
１３  回転軸、                １４  固定チャック、
１５  押上手段、              １６  固定チャック、
１７  引上手段、              １８  培養容器、
１９  細胞液注入口、          ２０  エア抜き口、
２１  細胞取出口、
２２，２２Ａ，２２Ｂ，２２Ｃ  供給口、
２３，２３Ａ，２３Ｂ，２３Ｃ  排出口、
２４  取付部、                ２５  取入口、
２６  ガス透過膜、            ２７  観察窓、
２８  セプタムシール、        ２９  ポート、
３０  キャップ、              ３１  導入流路、
３２  オリフィス流路、        ３３  ポート、
３４  セプタムシール、        ３５  キャップ、
３６  凹部、                  ３７  ポート、
３８  ゴムキャップ、          ３９  点検扉、
４０  作業扉、                ４１  空調機、
４２  回転制御機構、          ４３  扉、
４４  軸受、                  ４５  リニアガイド、
４６  可動部、                ４７  扉、
４８  スタッカ、              ４９  ステッピングモータ、
５０  回転軸、                ５１  ホルダー、
５２  扉、                    ５３  スタッカ、
５４  ステッピングモータ、    ５５  回転軸、
５６  ホルダー、              ５７  Ｙ軸移動機構、
５８  Ｚ軸移動機構、          ５９  Ｘ軸移動機構、
６０  Ｕ字溝板、              ６１  ハンド、
６２  Ｚ軸移動機構、          ６３  押上板、
６４  Ｙ軸移動機構、          ６５  Ｚ軸移動機構、
６６  Ｘ軸移動機構、          ６７  Ｕ字溝板、
６８  ハンド、                ６９  Ｚ軸移動機構、
７０  引上板。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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