(57)【要約】  培養状態評価装置は、画像読込部と、特徴値演算部と、度数分布演算部と、評価情報生成部とを備える。画像読込部は、培養容器内で培養される複数の細胞を時系列に撮像した複数の画像を読み込む。特徴値演算部は、画像に含まれる各々の細胞について、細胞の形態的な特徴を示す特徴値を画像からそれぞれ求める。度数分布演算部は、各々の画像に対応する特徴値の度数分布をそれぞれ求める。評価情報生成部は、画像間での度数分布の変化に基づいて、培養容器における細胞の培養状態を評価する評価情報を生成する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器内で培養される複数の細胞を時系列に撮像した複数の画像を読み込む画像読込部と、
前記画像に含まれる各々の前記細胞について、前記細胞の形態的な特徴を示す特徴値を前記画像からそれぞれ求める特徴値演算部と、
各々の前記画像に対応する前記特徴値の度数分布をそれぞれ求める度数分布演算部と、
前記画像間での前記度数分布の変化に基づいて、前記培養容器における前記細胞の培養状態を評価する評価情報を生成する評価情報生成部と、
を備えることを特徴とする培養状態評価装置。
【請求項２】
請求項１に記載の培養状態評価装置において、
前記評価情報生成部は、前記画像間での前記度数分布の差分を用いて、前記評価情報を生成することを特徴とする培養状態評価装置。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の培養状態評価装置において、
前記特徴値演算部は、各々の前記撮像について複数種類の前記特徴値を求め、
前記度数分布演算部は、前記特徴値の種類ごとにそれぞれ前記度数分布を求め、
前記評価情報生成部は、複数種類の前記度数分布の変化の情報を用いて、前記評価情報を生成することを特徴とする培養状態評価装置。
【請求項４】
請求項３に記載の培養状態評価装置において、
前記度数分布演算部は、各々の前記度数分布における度数の区分を、前記特徴値の種類ごとの標準偏差を用いてそれぞれ正規化することを特徴とする培養状態評価装置。
【請求項５】
請求項３または請求項４に記載の培養状態評価装置において、
前記評価情報生成部は、前記画像の撮影時間および前記特徴値の種類がそれぞれ異なる複数の前記度数分布の組み合わせのうちから、前記評価情報の生成に用いる前記度数分布の組み合わせを抽出し、前記評価情報の計算モデルを求めることを特徴とする培養状態評価装置。
【請求項６】
請求項５に記載の培養状態評価装置において、
前記評価情報生成部は、教師付き学習により前記計算モデルを求めることを特徴とする培養状態評価装置。
【請求項７】
培養容器内で培養される複数の細胞を時系列に撮像した複数の画像を読み込む画像読込部と、
前記画像に含まれる各々の前記細胞について、前記細胞の形態的な特徴を示す特徴値を前記画像からそれぞれ求める特徴値演算部と、
複数の前記画像間での前記特徴値の変化を用いて、前記培養容器における未来の前記細胞の培養状態を予測した評価情報を生成する評価情報生成部と、
を備えることを特徴とする培養状態評価装置。
【請求項８】
細胞を培養する培養容器を収納するとともに、所定の環境条件に内部を維持可能な恒温室と、
前記恒温室内で前記培養容器に含まれる前記細胞の画像を撮像する撮像装置と、
請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の培養状態評価装置と、
を備えることを特徴とするインキュベータ。
【請求項９】
コンピュータを、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の培養状態評価装置として機能させることを特徴とするプログラム。
【請求項１０】
培養容器内で培養される複数の細胞を時系列に撮像した複数の画像を読み込む画像読込処理と、
前記画像に含まれる各々の前記細胞について、前記細胞の形態的な特徴を示す特徴値を前記画像からそれぞれ求める特徴値演算処理と、
各々の前記画像に対応する前記特徴値の度数分布をそれぞれ求める度数分布演算処理と、
前記画像間での前記度数分布の変化に基づいて、前記培養容器における前記細胞の培養状態を評価する評価情報を生成する評価情報生成処理と、
を備えることを特徴とする培養状態評価方法。
【請求項１１】
培養容器内で培養される複数の細胞を時系列に撮像した複数の画像を読み込む画像読込処理と、
前記画像に含まれる各々の前記細胞について、前記細胞の形態的な特徴を示す特徴値を前記画像からそれぞれ求める特徴値演算処理と、
複数の前記画像間での前記特徴値の変化を用いて、前記培養容器における未来の前記細胞の培養状態を予測した評価情報を生成する評価情報生成処理と、
を備えることを特徴とする培養状態評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の培養状態の評価を行う培養状態評価装置、培養状態評価方法、インキュベータおよびプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の培養状態を評価する技術は、再生医療などの先端医療分野や医薬品のスクリーニングを含む幅広い分野での基盤技術となっている。例えば、再生医療分野では、インビトロで細胞を増殖、分化させるプロセスが存在する。そして、上記のプロセスでは、細胞の分化の成否、細胞の癌化や感染の有無を管理するために、細胞の培養状態を的確に評価することが不可欠となる。一例として、特許文献１には、マーカーとして転写因子を用いたがん細胞の評価方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−１９５５３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、上記の従来技術では、評価対象の各細胞に予めマーカーを導入する前処理が必要となるため非常に煩雑である。そのため、比較的簡易な手法で画像から細胞の培養状態を精度よく評価することがなお要請されている。【０００５】
そこで、本発明の目的は、比較的簡易な手法で画像から細胞の培養状態を精度よく評価するための手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一の態様の培養状態評価装置は、画像読込部と、特徴値演算部と、度数分布演算部と、評価情報生成部とを備える。画像読込部は、培養容器内で培養される複数の細胞を時系列に撮像した複数の画像を読み込む。特徴値演算部は、画像に含まれる各々の細胞について、細胞の形態的な特徴を示す特徴値を画像からそれぞれ求める。度数分布演算部は、各々の画像に対応する特徴値の度数分布をそれぞれ求める。評価情報生成部は、画像間での度数分布の変化に基づいて、培養容器における細胞の培養状態を評価する評価情報を生成する。【０００７】
他の態様の培養状態評価装置は、画像読込部と、特徴値演算部と、評価情報生成部とを備える。画像読込部は、培養容器内で培養される複数の細胞を時系列に撮像した複数の画像を読み込む。特徴値演算部は、画像に含まれる各々の細胞について、細胞の形態的な特徴を示す特徴値を画像からそれぞれ求める。評価情報生成部は、複数の画像間での特徴値の変化を用いて、培養容器における未来の細胞の培養状態を予測した評価情報を生成する。【０００８】
なお、上記の培養状態評価装置を組み込んだインキュベータや、コンピュータを上記の培養状態評価装置として機能させるプログラムおよびプログラム記憶媒体や、上記の培養状態評価装置の動作を方法のカテゴリで表現したものも、本発明の具体的態様として有効である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】一の実施形態におけるインキュベータの概要を示すブロック図
【図２】一の実施形態におけるインキュベータの正面図
【図３】一の実施形態におけるインキュベータの平面図
【図４】インキュベータでの観察動作の一例を示す流れ図
【図５】計算モデルの生成処理の一例を示す流れ図
【図６】各特徴値の概要を示す図
【図７】（ａ）〜（ｃ）：「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の経時的変化の例を示すヒストグラム、（ｄ）〜（ｆ）：「Ｆｉｂｅｒ  Ｌｅｎｇｔｈ」の経時的変化の例を示すヒストグラム
【図８】（ａ）〜（ｃ）：正常な細胞群をタイムラプス観察した顕微鏡画像を示す図
【図９】（ａ）〜（ｃ）：正常な細胞にがん細胞を混在した細胞群をタイムラプス観察した顕微鏡画像を示す図
【図１０】ＡＮＮの概要を示す図
【図１１】ＦＮＮの概要を示す図
【図１２】ＦＮＮにおけるシグモイド関数を示す図
【図１３】培養状態評価処理の動作例を示す流れ図
【図１４】（ａ）、（ｂ）筋芽細胞の培養状態例を示す図
【図１５】筋芽細胞の培養時における「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の経時的変化を示すヒストグラム
【図１６】筋芽細胞の培養時における「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の経時的変化を示すヒストグラム
【図１７】実施例の第１の予測モデルでの各サンプルの予測結果を示すグラフ
【図１８】実施例の第２の予測モデルでの各サンプルの予測結果を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜一の実施形態の構成例＞
以下、図面を参照しつつ、一の実施形態の培養状態評価装置を含むインキュベータの構成例を説明する。図１は、一の実施形態のインキュベータの概要を示すブロック図である。また、図２，図３は、一の実施形態のインキュベータの正面図および平面図である。
【００１１】
一の実施形態のインキュベータ１１は、上部ケーシング１２と下部ケーシング１３とを有している。インキュベータ１１の組立状態において、上部ケーシング１２は下部ケーシング１３の上に載置される。なお、上部ケーシング１２と下部ケーシング１３との内部空間は、ベースプレート１４によって上下に仕切られている。
【００１２】
まず、上部ケーシング１２の構成の概要を説明する。上部ケーシング１２の内部には、細胞の培養を行う恒温室１５が形成されている。この恒温室１５は温度調整装置１５ａおよび湿度調整装置１５ｂを有しており、恒温室１５内は細胞の培養に適した環境（例えば温度３７℃、湿度９０％の雰囲気）に維持されている（なお、図２，図３での温度調整装置１５ａ、湿度調整装置１５ｂの図示は省略する）。
【００１３】
恒温室１５の前面には、大扉１６、中扉１７、小扉１８が配置されている。大扉１６は、上部ケーシング１２および下部ケーシング１３の前面を覆っている。中扉１７は、上部ケーシング１２の前面を覆っており、大扉１６の開放時に恒温室１５と外部との環境を隔離する。小扉１８は、細胞を培養する培養容器１９を搬出入するための扉であって、中扉１７に取り付けられている。この小扉１８から培養容器１９を搬出入することで、恒温室１５の環境変化を抑制することが可能となる。なお、大扉１６、中扉１７、小扉１８は、パッキンＰ１，Ｐ２，Ｐ３によりそれぞれ気密性が維持されている。
【００１４】
また、恒温室１５には、ストッカー２１、観察ユニット２２、容器搬送装置２３、搬送台２４が配置されている。ここで、搬送台２４は、小扉１８の手前に配置されており、培養容器１９を小扉１８から搬出入する。
【００１５】
ストッカー２１は、上部ケーシング１２の前面（図３の下側）からみて恒温室１５の左側に配置される。ストッカー２１は複数の棚を有しており、ストッカー２１の各々の棚には培養容器１９を複数収納することができる。なお、各々の培養容器１９には、培養の対象となる細胞が培地とともに収容されている。
【００１６】
観察ユニット２２は、上部ケーシング１２の前面からみて恒温室１５の右側に配置される。この観察ユニット２２は、培養容器１９内の細胞のタイムラプス観察を実行することができる。
【００１７】
ここで、観察ユニット２２は、上部ケーシング１２のベースプレート１４の開口部に嵌め込まれて配置される。観察ユニット２２は、試料台３１と、試料台３１の上方に張り出したスタンドアーム３２と、位相差観察用の顕微光学系および撮像装置（３４）を内蔵した本体部分３３とを有している。そして、試料台３１およびスタンドアーム３２は恒温室１５に配置される一方で、本体部分３３は下部ケーシング１３内に収納される。
【００１８】
試料台３１は透光性の材質で構成されており、その上に培養容器１９を載置することができる。この試料台３１は水平方向に移動可能に構成されており、上面に載置した培養容器１９の位置を調整できる。また、スタンドアーム３２にはＬＥＤ光源３５が内蔵されている。そして、撮像装置３４は、スタンドアーム３２によって試料台３１の上側から透過照明された培養容器１９の細胞を、顕微光学系を介して撮像することで細胞の顕微鏡画像を取得できる。
【００１９】
容器搬送装置２３は、上部ケーシング１２の前面からみて恒温室１５の中央に配置される。この容器搬送装置２３は、ストッカー２１、観察ユニット２２の試料台３１および搬送台２４との間で培養容器１９の受け渡しを行う。
【００２０】
図３に示すように、容器搬送装置２３は、多関節アームを有する垂直ロボット３４と、回転ステージ３５と、ミニステージ３６と、アーム部３７とを有している。回転ステージ３５は、垂直ロボット３４の先端部に回転軸３５ａを介して水平方向に１８０°回転可能に取り付けられている。そのため、回転ステージ３５は、ストッカー２１、試料台３１および搬送台２４に対して、アーム部３７をそれぞれ対向させることができる。
【００２１】
また、ミニステージ３６は、回転ステージ３５に対して水平方向に摺動可能に取り付けられている。ミニステージ３６には培養容器１９を把持するアーム部３７が取り付けられている。
【００２２】
次に、下部ケーシング１３の構成の概要を説明する。下部ケーシング１３の内部には、観察ユニット２２の本体部分３３や、インキュベータ１１の制御装置４１が収納されている。
【００２３】
制御装置４１は、温度調整装置１５ａ、湿度調整装置１５ｂ、観察ユニット２２および容器搬送装置２３とそれぞれ接続されている。この制御装置４１は、所定のプログラムに従ってインキュベータ１１の各部を統括的に制御する。
【００２４】
一例として、制御装置４１は、温度調整装置１５ａおよび湿度調整装置１５ｂをそれぞれ制御して恒温室１５内を所定の環境条件に維持する。また、制御装置４１は、所定の観察スケジュールに基づいて、観察ユニット２２および容器搬送装置２３を制御して、培養容器１９の観察シーケンスを自動的に実行する。さらに、制御装置４１は、観察シーケンスで取得した画像に基づいて、細胞の培養状態の評価を行う培養状態評価処理を実行する。
【００２５】
ここで、制御装置４１は、ＣＰＵ４２および記憶部４３を有している。ＣＰＵ４２は、制御装置４１の各種の演算処理を実行するプロセッサである。また、ＣＰＵ４２は、プログラムの実行によって、特徴値演算部４４、度数分布演算部４５、評価情報生成部４６としてそれぞれ機能する（なお、特徴値演算部４４、度数分布演算部４５、評価情報生成部４６の動作については後述する）。
【００２６】
記憶部４３は、ハードディスクや、フラッシュメモリ等の不揮発性の記憶媒体などで構成される。この記憶部４３には、ストッカー２１に収納されている各培養容器１９に関する管理データと、撮像装置で撮像された顕微鏡画像のデータとが記憶されている。さらに、記憶部４３には、ＣＰＵ４２によって実行されるプログラムが記憶されている。
【００２７】
なお、上記の管理データには、（ａ）個々の培養容器１９を示すインデックスデータ、（ｂ）ストッカー２１での培養容器１９の収納位置、（ｃ）培養容器１９の種類および形状（ウェルプレート、ディッシュ、フラスコなど）、（ｄ）培養容器１９で培養されている細胞の種類、（ｅ）培養容器１９の観察スケジュール、（ｆ）タイムラプス観察時の撮像条件（対物レンズの倍率、容器内の観察地点等）、などが含まれている。また、ウェルプレートのように複数の小容器で同時に細胞を培養できる培養容器１９については、各々の小容器ごとにそれぞれ管理データが生成される。
【００２８】
＜一の実施形態での観察動作の例＞
次に、図４の流れ図を参照しつつ、一の実施形態におけるインキュベータ１１での観察動作の一例を説明する。この図４は、恒温室１５内に搬入された培養容器１９を、登録された観察スケジュールに従ってタイムラプス観察する動作例を示している。
【００２９】
ステップＳ１０１：ＣＰＵ４２は、記憶部４３の管理データの観察スケジュールと現在日時とを比較して、培養容器１９の観察開始時間が到来したか否かを判定する。観察開始時間となった場合（ＹＥＳ側）、ＣＰＵ４２はＳ１０２に処理を移行させる。一方、培養容器１９の観察時間ではない場合（ＮＯ側）には、ＣＰＵ４２は次の観察スケジュールの時刻まで待機する。
【００３０】
ステップＳ１０２：ＣＰＵ４２は、観察スケジュールに対応する培養容器１９の搬送を容器搬送装置２３に指示する。そして、容器搬送装置２３は、指示された培養容器１９をストッカー２１から搬出して観察ユニット２２の試料台３１に載置する。なお、培養容器１９が試料台３１に載置された段階で、スタンドアーム３２に内蔵されたバードビューカメラ（不図示）によって培養容器１９の全体観察画像が撮像される。
【００３１】
ステップＳ１０３：ＣＰＵ４２は、観察ユニット２２に対して細胞の顕微鏡画像の撮像を指示する。観察ユニット２２は、ＬＥＤ光源３５を点灯させて培養容器１９を照明するとともに、撮像装置３４を駆動させて培養容器１９内の細胞の顕微鏡画像を撮像する。
【００３２】
このとき、撮像装置３４は、記憶部４３に記憶されている管理データに基づいて、ユーザーの指定した撮像条件（対物レンズの倍率、容器内の観察地点）に基づいて顕微鏡画像を撮像する。例えば、培養容器１９内の複数のポイントを観察する場合、観察ユニット２２は、試料台３１の駆動によって培養容器１９の位置を逐次調整し、各々のポイントでそれぞれ顕微鏡画像を撮像する。なお、Ｓ１０３で取得された顕微鏡画像のデータは、制御装置４１に読み込まれるとともに、ＣＰＵ４２の制御によって記憶部４３に記録される。
【００３３】
ステップＳ１０４：ＣＰＵ４２は、観察スケジュールの終了後に培養容器１９の搬送を容器搬送装置２３に指示する。そして、容器搬送装置２３は、指示された培養容器１９を観察ユニット２２の試料台３１からストッカー２１の所定の収納位置に搬送する。その後、ＣＰＵ４２は、観察シーケンスを終了してＳ１０１に処理を戻す。以上で、図４の流れ図の説明を終了する。
【００３４】
＜一の実施形態での培養状態評価処理＞
次に、一の実施形態における培養状態評価処理の一例を説明する。この一の実施形態では、培養容器１９をタイムラプス観察して取得した複数の顕微鏡画像を用いて、培養容器１９の培養細胞におけるがん細胞の混在率を制御装置４１が推定する例を説明する。
【００３５】
この培養状態評価処理での制御装置４１は、上記の顕微鏡画像から細胞の形態的な特徴を示す特徴値の度数分布を求める。そして、制御装置４１は、この度数分布の経時的な変化に基づいて、がん細胞の混在率を推定した評価情報を生成する。なお、制御装置４１は、得られた評価情報を教師付き学習によって予め生成された計算モデルに適用することで、上記の評価情報を生成する。
【００３６】
（計算モデルの生成処理の例）
以下、図５の流れ図を参照しつつ、培養状態評価処理の前処理である計算モデルの生成処理の一例を説明する。この計算モデルの生成処理では、画像の撮影時間および特徴値の種類がそれぞれ異なる複数の度数分布の組み合わせから、評価情報の生成に用いる度数分布の組み合わせを、制御装置４１が決定する。
【００３７】
この図５の例では、がん細胞が混在した細胞群を培養した培養容器１９をインキュベータ１１によって同一視野を同一の撮影条件でタイムラプス観察し、サンプルの顕微鏡画像群を予め用意する。なお、上記のサンプルの顕微鏡画像において、各画像に含まれる細胞の総数とがん細胞の数とは、画像からではなく実験的にカウントされてそれぞれ既知となっている。
【００３８】
図５の例では、培養容器１９のタイムラプス観察は、培養開始から８時間経過後を初回として、８時間おきに７２時間目まで行う。そのため、図５の例において、培養容器１９および観察ポイントが共通するサンプルの顕微鏡画像が、９枚分（８ｈ，１６ｈ，２４ｈ，３２ｈ，４０ｈ，４８ｈ，５６ｈ，６４ｈ，７２ｈ）を１セットとして取得されることとなる。なお、図５の例では、複数の培養容器１９をそれぞれタイムラプス観察して、上記のサンプルの顕微鏡画像を複数セット分用意するものとする。また、同じ培養容器１９の複数ポイント（例えば５点観察または培養容器１９の全体）を同じ観察時間帯で撮影した複数の顕微鏡画像を、タイムラプス観察の１回分の画像として扱うようにしてもよい。
【００３９】
ステップＳ２０１：ＣＰＵ４２は、予め用意されたサンプルの顕微鏡画像のデータを記憶部４３から読み込む。なお、Ｓ２０１でのＣＰＵ４２は、各画像に対応する細胞の総数およびがん細胞の数を示す情報もこの時点で取得するものとする。
【００４０】
ステップＳ２０２：ＣＰＵ４２は、上記のサンプルの顕微鏡画像（Ｓ２０１）のうちから、処理対象となる画像を指定する。ここで、Ｓ２０２でのＣＰＵ４２は、予め用意されているサンプルの顕微鏡画像のすべてを処理対象として順次指定してゆくものとする。
【００４１】
ステップＳ２０３：特徴値演算部４４は、処理対象の顕微鏡画像（Ｓ２０２）について、画像内に含まれる細胞を抽出する。例えば、位相差顕微鏡で細胞を撮像すると、細胞壁のように位相差の変化の大きな部位の周辺にはハロが現れる。そのため、特徴値演算部４４は、細胞壁に対応するハロを公知のエッジ抽出手法で抽出するとともに、輪郭追跡処理によってエッジで囲まれた閉空間を細胞と推定する。これにより上記の顕微鏡画像から個々の細胞を抽出することができる。
【００４２】
ステップＳ２０４：特徴値演算部４４は、Ｓ２０３で画像から抽出した各細胞について、細胞の形態的な特徴を示す特徴値をそれぞれ求める。Ｓ２０４での特徴値演算部４４は、各細胞について以下の１６種類の特徴値をそれぞれ求める。
【００４３】
・Ｔｏｔａｌ  ａｒｅａ（図６の（ａ）参照）
「Ｔｏｔａｌ  ａｒｅａ」は、注目する細胞の面積を示す値である。例えば、特徴値演算部４４は、注目する細胞の領域の画素数に基づいて「Ｔｏｔａｌ  ａｒｅａ」の値を求めることができる。
【００４４】
・Ｈｏｌｅ  ａｒｅａ（図６の（ｂ）参照）
「Ｈｏｌｅ  ａｒｅａ」は、注目する細胞内のＨｏｌｅの面積を示す値である。ここで、Ｈｏｌｅは、コントラストによって、細胞内における画像の明るさが閾値以上となる部分（位相差観察では白に近い状態となる箇所）を指す。例えば、細胞内小器官の染色されたリソソームなどがＨｏｌｅとして検出される。また、画像によっては、細胞核や、他の細胞小器官がＨｏｌｅとして検出されうる。なお、特徴値演算部４４は、細胞内における輝度値が閾値以上となる画素のまとまりをＨｏｌｅとして検出し、このＨｏｌｅの画素数に基づいて「Ｈｏｌｅ  ａｒｅａ」の値を求めればよい。
【００４５】
・ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｈｏｌｅ  ａｒｅａ（図６の（ｃ）参照）
「ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｈｏｌｅ  ａｒｅａ」は、「Ｈｏｌｅ  ａｒｅａ」の値を「Ｔｏｔａｌ  ａｒｅａ」の値で除した値である（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｈｏｌｅ  ａｒｅａ＝Ｈｏｌｅ  ａｒｅａ／Ｔｏｔａｌ  ａｒｅａ）。この「ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｈｏｌｅ  ａｒｅａ」は、細胞の大きさにおける細胞内小器官の割合を示すパラメータであって、例えば細胞内小器官の肥大化や核の形の悪化などに応じてその値が変動する。
【００４６】
・Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ（図６の（ｄ）参照）
「Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ」は、注目する細胞の外周の長さを示す値である。例えば、特徴値演算部４４は、細胞を抽出するときの輪郭追跡処理により「Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ」の値を取得することができる。
【００４７】
・Ｗｉｄｔｈ（図６の（ｅ）参照）
「Ｗｉｄｔｈ」は、注目する細胞の画像横方向（Ｘ方向）での長さを示す値である。
【００４８】
・Ｈｅｉｇｈｔ（図６の（ｆ）参照）
「Ｈｅｉｇｈｔ」は、注目する細胞の画像縦方向（Ｙ方向）での長さを示す値である。
【００４９】
・Ｌｅｎｇｔｈ（図６の（ｇ）参照）
「Ｌｅｎｇｔｈ」は、注目する細胞を横切る線のうちの最大値（細胞の全長）を示す値である。
【００５０】
・Ｂｒｅａｄｔｈ（図６の（ｈ）参照）
「Ｂｒｅａｄｔｈ」は、「Ｌｅｎｇｔｈ」に直交する線のうちの最大値（細胞の横幅）を示す値である。
【００５１】
・Ｆｉｂｅｒ  Ｌｅｎｇｔｈ（図６の（ｉ）参照）
「Ｆｉｂｅｒ  Ｌｅｎｇｔｈ」は、注目する細胞を擬似的に線状と仮定した場合の長さを示す値である。特徴値演算部４４は、下式（１）により「Ｆｉｂｅｒ  Ｌｅｎｇｔｈ」の値を求める。
【００５２】
【数１】
2010098105.tif 000003
【００５３】
但し、本明細書の式において「Ｐ」はＰｅｒｉｍｅｔｅｒの値を示す。同様に「Ａ」はＴｏｔａｌ  Ａｒｅａの値を示す。
【００５４】
・Ｆｉｂｅｒ  Ｂｒｅａｄｔｈ（図６の（ｊ）参照）
「Ｆｉｂｅｒ  Ｂｒｅａｄｔｈ」は、注目する細胞を擬似的に線状と仮定した場合の幅（Ｆｉｂｅｒ  Ｌｅｎｇｔｈと直交する方向の長さ）を示す値である。特徴値演算部４４は、下式（２）により「Ｆｉｂｅｒ  Ｂｒｅａｄｔｈ」の値を求める。
【００５５】
【数２】
2010098105.tif 000004
【００５６】
・Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ（図６の（ｋ）参照）
「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」は、注目する細胞の円形度（細胞の丸さ）を示す値である。特徴値演算部４４は、下式（３）により「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の値を求める。
【００５７】
【数３】
2010098105.tif 000005
【００５８】
・Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍ  Ｆａｃｔｏｒ（図６の（ｌ）参照）
「Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍ  Ｆａｃｔｏｒ」は、「Ｌｅｎｇｔｈ」の値を「Ｂｒｅａｄｔｈ」の値で除した値（Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍ  Ｆａｃｔｏｒ＝Ｌｅｎｇｔｈ／Ｂｒｅａｄｔｈ）であって、注目する細胞の細長さの度合いを示すパラメータとなる。
【００５９】
・Ｉｎｎｅｒ  ｒａｄｉｕｓ（図６の（ｍ）参照）
「Ｉｎｎｅｒ  ｒａｄｉｕｓ」は、注目する細胞の内接円の半径を示す値である。
【００６０】
・Ｏｕｔｅｒ  ｒａｄｉｕｓ（図６の（ｎ）参照）
「Ｏｕｔｅｒ  ｒａｄｉｕｓ」は、注目する細胞の外接円の半径を示す値である。
【００６１】
・Ｍｅａｎ  ｒａｄｉｕｓ（図６の（ｏ）参照）
「Ｍｅａｎ  ｒａｄｉｕｓ」は、注目する細胞の輪郭を構成する全点とその重心点との平均距離を示す値である。
【００６２】
・Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｒａｄｉｕｓ（図６の（ｐ）参照）
「Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｒａｄｉｕｓ」は、注目する細胞と同面積の円の半径を示す値である。この「Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｒａｄｉｕｓ」のパラメータは、注目する細胞を仮想的に円に近似した場合の大きさを示している。
【００６３】
ここで、特徴値演算部４４は、細胞に対応する画素数に誤差分を加味して上記の各特徴値を求めてもよい。このとき、特徴値演算部４４は、顕微鏡画像の撮影条件（撮影倍率や顕微光学系の収差など）を考慮して特徴値を求めるようにしてもよい。なお、「Ｉｎｎｅｒ  ｒａｄｉｕｓ」、「Ｏｕｔｅｒ  ｒａｄｉｕｓ」、「Ｍｅａｎ  ｒａｄｉｕｓ」、「Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｒａｄｉｕｓ」を求めるときには、特徴値演算部４４は、公知の重心演算の手法に基づいて各細胞の重心点を求め、この重心点を基準にして各パラメータを求めればよい。
【００６４】
ステップＳ２０５：特徴値演算部４４は、処理対象の顕微鏡画像（Ｓ２０２）について、各細胞の１６種類の特徴値（Ｓ２０４）をそれぞれ記憶部４３に記録する。
【００６５】
ステップＳ２０６：ＣＰＵ４２は、全ての顕微鏡画像が処理済み（全てのサンプルの顕微鏡画像で各細胞の特徴値が取得済みの状態）であるか否かを判定する。上記要件を満たす場合（ＹＥＳ側）には、ＣＰＵ４２はＳ２０７に処理を移行させる。一方、上記要件を満たさない場合（ＮＯ側）には、ＣＰＵ４２はＳ２０２に戻って、未処理の他の顕微鏡画像を処理対象として上記動作を繰り返す。
【００６６】
ステップＳ２０７：度数分布演算部４５は、各々の顕微鏡画像について特徴値の種類ごとにそれぞれ特徴値の度数分布を求める。したがって、Ｓ２０７での度数分布演算部４５は、１回の観察で取得される顕微鏡画像に対して１６種類の特徴値の度数分布を求めることとなる。また、各々の度数分布において、特徴値の各区分に対応する細胞の数を頻度（％）として求めるものとする。
【００６７】
また、Ｓ２０７での度数分布演算部４５は、上記の度数分布における度数の区分を、特徴値の種類ごとの標準偏差を用いて正規化する。ここでは一例として、「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布での区分を決定する場合を説明する。
【００６８】
まず、度数分布演算部４５は、各々の顕微鏡画像から求めた全ての「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の値の標準偏差を算出する。次に、度数分布演算部４５は、上記の標準偏差の値をＦｉｓｈｅｒの式に代入して、「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布における度数の区分の基準値を求める。このとき、度数分布演算部４５は、全ての「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の値の標準偏差（Ｓ）を４で除するとともに、小数点以下３桁目を四捨五入して上記の基準値とする。なお、一の実施形態での度数分布演算部４５は、度数分布をヒストグラムとして図示する場合、２０級数分の区間をモニタ等に描画させるものとする。
【００６９】
一例として、「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の標準偏差Ｓが２５９のとき、２５９／４＝６４．７５０から「６４．７５」が上記の基準値となる。そして、注目する画像の「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布を求めるとき、度数分布演算部４５は、「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の値に応じて０値から６４．７５刻みで設定された各クラスに細胞を分類し、各クラスでの細胞の個数をカウントすればよい。
【００７０】
このように、度数分布演算部４５が、特徴値の種類毎に標準偏差で度数分布の区分を正規化するため、異なる特徴値の間でも度数分布の傾向を大局的に近似させることができる。よって、一の実施形態では、異なる特徴値間で細胞の培養状態と度数分布の変化との相関を求めることが比較的容易となる。
【００７１】
ここで、図７（ａ）は、がん細胞の初期混在率が０％のときの「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の経時的変化を示すヒストグラムである。図７（ｂ）は、がん細胞の初期混在率が６．７％のときの「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の経時的変化を示すヒストグラムである。図７（ｃ）は、がん細胞の初期混在率が２５％のときの「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の経時的変化を示すヒストグラムである。
【００７２】
また、図７（ｄ）は、がん細胞の初期の混在率が０％のときの「Ｆｉｂｅｒ  Ｌｅｎｇｔｈ」の経時的変化を示すヒストグラムである。ただし、この図では理解しやすさのため、ヒストグラムをＦｉｂｅｒ  Ｌｅｎｇｔｈ＝323までで省略してある。図７（ｅ）は、がん細胞の初期の混在率が６．７％のときの「Ｆｉｂｅｒ  Ｌｅｎｇｔｈ」の経時的変化を示すヒストグラムである。図７（ｆ）は、がん細胞の初期の混在率が２５％のときの「Ｆｉｂｅｒ  Ｌｅｎｇｔｈ」の経時的変化を示すヒストグラムである。
【００７３】
ステップＳ２０８：評価情報生成部４６は、特徴値の種類ごとにそれぞれ上記の度数分布の経時的変化を求める。
【００７４】
Ｓ２０８での評価情報生成部４６は、１セット分の顕微鏡画像から取得した度数分布（９×１６）のうち、特徴値の種類が同じで撮影時間の異なる２つの度数分布を組み合わせる。一例として、評価情報生成部４６は、特徴値の種類が同じで撮影時間の異なる９つの度数分布について、８時間目および１６時間目の度数分布と、８時間目および２４時間目の度数分布と、８時間目および３２時間目の度数分布と、８時間目および４０時間目の度数分布と、８時間目および４８時間目の度数分布と、８時間目および５６時間目の度数分布と、８時間目および６４時間目の度数分布と、８時間目および７２時間目の度数分布とをそれぞれ組み合わせる。つまり、１セット分における１種類の特徴値に注目したとき、その特徴値の度数分布につき、計８通りの組み合わせが発生する。
【００７５】
そして、評価情報生成部４６は、上記８通りの組み合わせについて、以下の式（４）により度数分布の変化量（画像間での度数分布の差分の絶対値を積分したもの）をそれぞれ求める。
【００７６】
【数４】
2010098105.tif 000006
【００７７】
但し、式（４）において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は初期状態の度数分布（８時間目）における１区間分の度数（細胞数）を示す。また、「Ｓａｍｐｌｅ」は、比較対象の度数分布における１区間分の度数を示す。また、「ｉ」は、度数分布の区間を示す変数である。
【００７８】
評価情報生成部４６は、特徴値の種類ごとに上記演算を行うことで、すべての特徴値についてそれぞれ８通りの度数分布の変化量を取得できる。すなわち、１セット分の顕微鏡画像について、１６種類×８通りで１２８の度数分布の組み合わせをとることができる。以下、本明細書では、上記の度数分布の組み合わせの１つを単に「指標」と表記する。なお、Ｓ２０８での評価情報生成部４６は、複数の顕微鏡画像のセットにおいて、各指標に対応する１２８の度数分布の変化量をそれぞれ求めることはいうまでもない。
【００７９】
ここで、一の実施形態において度数分布の経時的変化に注目する理由を説明する。図８は、正常な細胞群（がん細胞の初期混在率０％）をインキュベータ１１で培養してタイムラプス観察したときの顕微鏡画像をそれぞれ示す。なお、図８の各顕微鏡画像から求めた「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布を示すヒストグラムは、図７（ａ）で示している。
【００８０】
この場合、図８の各画像では時間の経過に伴って細胞の数は増加するものの、図７（ａ）に示す「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」のヒストグラムでは、各画像に対応する度数分布はいずれもほぼ同じ形状を保っている。
【００８１】
一方、図９は、正常な細胞群に予めがん細胞を２５％混在させたものをインキュベータ１１で培養してタイムラプス観察したときの顕微鏡画像をそれぞれ示す。なお、図９の各顕微鏡画像から求めた「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布を示すヒストグラムは、図７（ｃ）で示している。
【００８２】
この場合、図９の各画像では時間の経過に伴って、正常細胞と形状の異なるがん細胞（丸みを帯びた細胞）の比率が増加する。これにより、図７（ｃ）に示す「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」のヒストグラムでは、時間の経過に応じて各画像に対応する度数分布の形状に大きな変化が現れる。よって、度数分布の経時的変化が、がん細胞の混在と強い相関を有することが分かる。本発明者らは、上記知見に基づいて、度数分布の経時的変化の情報から培養細胞の状態を評価するものである。
【００８３】
ステップＳ２０９：評価情報生成部４６は、１２８の指標のうちから、細胞の培養状態をよく反映する指標を多変量解析により１以上指定する。この指標の組合せの選択は、後述するファジーニューラルネットワークと同等の非線形モデル以外にも、細胞とその形態の複雑性に応じて線形モデルの利用も有効である。このような指標の組合せの選択と共に、評価情報生成部４６は、上記の指定された１以上の指標を用いて、顕微鏡画像からがん細胞の数を導出する計算モデルを求める。
【００８４】
ここで、Ｓ２０９での評価情報生成部４６は、ファジーニューラルネットワーク（Ｆｕｚｚｙ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ：ＦＮＮ）解析によって上記の計算モデルを求める。
【００８５】
ＦＮＮとは、人工ニューラルネットワーク（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ：ＡＮＮ）とファジィ推論とを組み合わせた方法である。このＦＮＮでは、ファジイ推論の欠点であるメンバーシップ関数の決定を人間に頼るという部分を回避すべく、ＡＮＮをファジィ推論に組み込んでその自動決定を行う。学習機械のひとつであるＡＮＮ（図１０参照）は、生体の脳における神経回路網を数学的にモデル化したものであり、以下の特徴を持つ。ＡＮＮにおける学習は、目的の出力値（教師値）をもつ学習用のデータ（入力値：Ｘ）を用いて、バックプロパゲーション（Ｂａｃｋ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ：ＢＰ）法により教師値と出力値（Ｙ）との誤差が小さくなるように、ノード（図１０において丸で示す）間をつなぐ回路における結合荷重を変え、その出力値が教師値に近づくようにモデルを構築する過程である。このＢＰ法を用いれば、ＡＮＮは学習により自動的に知識を獲得することができる。そして、最終的に学習に用いていないデータを入力することにより、そのモデルの汎用性を評価できる。従来、メンバーシップ関数の決定は、人間の感覚に頼っていたが、上で述べたようなＡＮＮをファジイ推論に組み込むことで自動的なメンバーシップ関数の同定が可能になる。これがＦＮＮである。ＦＮＮでは、ＡＮＮと同様に、ＢＰ法を用いることによりネットワークに与えられた入出力関係を、結合荷重を変化させることで自動的に同定しモデル化できる。ＦＮＮは、学習後のモデルを解析することでファジィ推論のように人間に理解しやすい言語的なルール（一例として図１１の右下の吹き出しを参照）として知識を獲得できるという特徴をもっている。つまり、ＦＮＮは、その構造、特徴から、細胞の形態的特徴を表した数値のような変数の組み合わせにおける最適なファジィ推論の組み合わせを自動決定し、予測目標に関する推定と、予測に有効な指標の組み合わせを示すルールの生成を同時に行うことができる。
【００８６】
ＦＮＮの構造は、「入力層」、シグモイド関数に含まれるパラメータＷｃ、Ｗｇを決定する「メンバーシップ関数部分（前件部）」、Ｗｆを決定するとともに入力および出力の関係をルールとして取り出すことが可能な「ファジィルール部分（後件部）」、「出力層」の４層から成り立っている（図１１参照）。ＦＮＮのモデル構造を決定する結合荷重にはＷｃ、Ｗｇ、Ｗｆがある。結合荷重Ｗｃは、メンバーシップ関数に用いられるシグモイド関数の中心位置、Ｗｇは中心位置での傾きを決定する（図１２参照）。モデル内では、入力値がファジィ関数により、人間の感覚的に近い柔軟性を持って表現される（一例として図１１の左下の吹き出しを参照）。結合荷重Ｗｆは各ファジイ領域の推定結果に対する寄与を表しており、Ｗｆよりファジィルールを導くことができる。即ち、モデル内の構造はあとから解読でき、ルールとして書き起こすことができる（一例として図１１中右下の吹き出しを参照）。
【００８７】
ＦＮＮ解析におけるファジィルールの作成には結合荷重のひとつであるＷｆ値が用いられる。Ｗｆ値が正の値で大きいと、そのユニットは「予測に有効である」と判定されることに対する寄与が大きく、そのルールに当てはまった指標は「有効である」と判断される。Ｗｆ値が負の値で小さいと、そのユニットは「予測に有効でない」と判定されることに対する寄与が大きく、そのルールに当てはまった指標は「有効でない」と判断される。
【００８８】
より具体的な例として、Ｓ２０９での評価情報生成部４６は、以下の（Ａ）から（Ｈ）の処理により、上記の計算モデルを求める。
【００８９】
（Ａ）評価情報生成部４６は、１２８の指標のうちから１つの指標を選択する。
【００９０】
（Ｂ）評価情報生成部４６は、（Ａ）で選択された指標による度数分布の変化量を変数とした計算式により、各々の顕微鏡画像のセットでのがん細胞の数（予測値）を求める。
【００９１】
仮に、１つの指標からがん細胞の数を求める計算式を「Ｙ＝αＸ１」（但し、「Ｙ」はがん細胞の計算値（例えばがん細胞の増加数を示す値）、「Ｘ１」は上記の選択された指標に対応する度数分布の変化量（Ｓ２０８で求めたもの）、「α」はＸ１に対応する係数値、をそれぞれ示す。）とする。このとき、評価情報生成部４６は、αに任意の値を代入するとともに、Ｘ１に各セットにおける度数分布の変化量をそれぞれ代入する。これにより、各セットでのがん細胞の計算値（Ｙ）が求められる。
【００９２】
（Ｃ）評価情報生成部４６は、各々の顕微鏡画像のセットについて、（Ｂ）で求めた計算値Ｙと、実際のがん細胞の数（教師値）との誤差をそれぞれ求める。なお、上記の教師値は、Ｓ２０１で読み込んだがん細胞の数の情報に基づいて、評価情報生成部４６が求めるものとする。
【００９３】
そして、評価情報生成部４６は、各顕微鏡画像のセットでの計算値の誤差がより小さくなるように、教師付き学習により上記の計算式の係数αを修正する。
【００９４】
（Ｄ）評価情報生成部４６は、上記の（Ｂ）および（Ｃ）の処理を繰り返し、上記（Ａ）の指標について、計算値の平均誤差が最も小さくなる計算式のモデルを取得する。
【００９５】
（Ｅ）評価情報生成部４６は、１２８の各指標について、上記（Ａ）から（Ｄ）の各処理を繰り返す。そして、評価情報生成部４６は、１２８の各指標における計算値の平均誤差を比較し、その平均誤差が最も低くなる指標を、評価情報の生成に用いる１番目の指標とする。
【００９６】
（Ｆ）評価情報生成部４６は、上記（Ｅ）で求めた１番目の指標と組み合わせる２番目の指標を求める。このとき、評価情報生成部４６は、上記の１番目の指標と残りの１２７の指標とを１つずつペアにしてゆく。次に、評価情報生成部４６は、各々のペアにおいて、計算式でがん細胞の予測誤差を求める。
【００９７】
仮に、２つの指標からがん細胞の数を求める計算式を「Ｙ＝αＸ１＋βＸ２」（但し、「Ｙ」はがん細胞の計算値、「Ｘ１」は１番目の指標に対応する度数分布の変化量、「α」はＸ１に対応する係数値、「Ｘ2」は、選択された指標に対応する度数分布の変化量、「β」はＸ２に対応する係数値、をそれぞれ示す。）とする。そして、評価情報生成部４６は、上記の（Ｂ）および（Ｃ）と同様の処理により、計算値の平均誤差が最も小さくなるように、上記の係数α、βの値を求める。
【００９８】
その後、評価情報生成部４６は、各々のペアで求めた計算値の平均誤差を比較し、その平均誤差が最も低くなるペアを求める。そして、評価情報生成部４６は、平均誤差が最も低くなるペアの指標を、評価情報の生成に用いる１番目および２番目の指標とする。
【００９９】
（Ｇ）評価情報生成部４６は、所定の終了条件を満たした段階で演算処理を終了する。例えば、評価情報生成部４６は、指標を増やす前後の各計算式による平均誤差を比較する。そして、評価情報生成部４６は、指標を増やした後の計算式による平均誤差が、指標を増やす前の計算式による平均誤差より高い場合（または両者の差が許容範囲に収まる場合）には、Ｓ２０９の演算処理を終了する。
【０１００】
（Ｈ）一方、上記（Ｇ）で終了条件を満たさない場合、評価情報生成部４６は、さらに指標の数を１つ増やして、上記（Ｆ）および（Ｇ）と同様の処理を繰り返す。これにより、上記の計算モデルを求めるときに、ステップワイズな変数選択によって指標の絞り込みが行われることとなる。
【０１０１】
ステップＳ２１０：評価情報生成部４６は、Ｓ２０９で求めた計算モデルの情報（計算式に用いる各指標を示す情報、計算式で各々の指標に対応する係数値の情報など）を記憶部４３に記録する。以上で、図５の説明を終了する。
【０１０２】
ここで、上記の計算モデルの指標として、『「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の８時間目、７２時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ」の８時間目、２４時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｌｅｎｇｔｈ」の８時間目、７２時間目の度数分布の組み合わせ』との３つを用いた場合、がん細胞の予測精度が９３．２％となる計算モデルを得ることができた。
【０１０３】
また、上記の計算モデルの指標として、『「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の８時間目、７２時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｆｉｂｅｒ  Ｂｒｅａｄｔｈ」の８時間目、５６時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｈｏｌｅ  ａｒｅａ」の８時間目、７２時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の８時間目、２４時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｂｒｅａｄｔｈ」の８時間目、７２時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｂｒｅａｄｔｈ」の８時間目、６４時間目の度数分布の組み合わせ』との６つを用いた場合、がん細胞の予測精度が９５．５％となる計算モデルを得ることができた。
【０１０４】
（培養状態評価処理の例）
次に、図１３の流れ図を参照しつつ、培養状態評価処理の動作例を説明する。
【０１０５】
ステップＳ３０１：ＣＰＵ４２は、評価対象となる複数の顕微鏡画像のデータを記憶部４３から読み込む。ここで、評価対象の顕微鏡画像は、細胞群を培養した培養容器１９をインキュベータ１１によって同一視野を同一の撮影条件でタイムラプス観察して取得されたものとする。また、この場合のタイムラプス観察は、図５の例と条件を揃えるために、培養開始から８時間経過後を初回として８時間おきに７２時間目まで行うものとする。
【０１０６】
ステップＳ３０２：ＣＰＵ４２は、記憶部４３の計算モデルの情報（図５のＳ２１０で記録されたもの）を読み込む。
【０１０７】
ステップＳ３０３：特徴値演算部４４、度数分布演算部４５および評価情報生成部４６は、上記の計算モデルの変数に対応する各指標について、それぞれ度数分布の変化量を求める。このＳ３０３の処理は、図５のＳ２０３、Ｓ２０４、Ｓ２０７、Ｓ２０８に対応するため重複説明は省略する。
【０１０８】
ステップＳ３０４：評価情報生成部４６は、Ｓ３０３で求めた各指標の度数分布の変化量を、Ｓ３０２で読み出した計算モデルに代入して演算を行う。そして、評価情報生成部４６は、上記の演算結果に基づいて、評価対象の顕微鏡画像におけるがん細胞の混在率を示す評価情報を生成する。その後、評価情報生成部４６は、この評価情報を不図示のモニタ等に表示させる。以上で、図１３の説明を終了する。
【０１０９】
一の実施形態によれば、制御装置４１は、タイムラプス観察で取得した顕微鏡画像を用いて、特徴値の度数分布の経時的変化からがん細胞の混在率を精度よく予測できる。また、一の実施形態の制御装置４１は、ありのままの細胞を評価対象にできるので、例えば医薬品のスクリーニングや再生医療の用途で培養される細胞を評価するときに極めて有用である。
【０１１０】
なお、一の実施形態では、顕微鏡画像からがん細胞の混在率を評価する例を説明したが、例えば、制御装置４１は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の分化誘導の度合いの評価に用いることも可能である。また、一の実施形態で求めた評価情報は、評価対象の培養細胞群における分化・脱分化・腫瘍化・活性劣化・細胞のコンタミネーション等の異常検出手段や、評価対象の培養細胞群の品質を工学的に管理するときの手段として用いることができる。
【０１１１】
＜実施例＞
以下、一の実施形態の１実施例として、筋芽細胞の分化予測の例を説明する。この筋芽細胞の分化予測は、例えば、心臓病治療の一つとして行われる筋芽細胞シート移植での品質管理や、筋組織の再生治療での品質管理などで応用が期待されている。
【０１１２】
筋芽細胞の培養時に血清濃度の低下により培地の成分を変化させると、筋芽細胞から筋管細胞への分化が起こり、筋肉組織を作ることができる。図１４（ａ）は筋芽細胞の培養状態の一例を示し、図１４（ｂ）は筋芽細胞を分化させた状態の例を示している。
【０１１３】
また、図１５、図１６は、筋芽細胞の培養時における「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の経時的変化を示すヒストグラムである。図１５は、筋芽細胞に分化が認められた場合（血清４％）における０時間目および１１２時間目の「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布をそれぞれ示している。図１６は、筋芽細胞に分化が認められない場合（高血清状態）における０時間目および１１２時間目の「Ｓｈａｐｅ  Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布をそれぞれ示している。なお、図１５、図１６では、０時間目の度数分布をそれぞれ破線で示し、１１２時間目の度数分布をそれぞれ実線で示す。
【０１１４】
図１５の２つのヒストグラムを比較すると、両者の形状は大きな変化を示す。一方、図１６の２つのヒストグラムを比較すると、両者の形状にはさほど大きな変化はみられない。そのため、筋芽細胞の分化度（分化する筋芽細胞の混在率）の変化に応じて、ヒストグラムにも変化が生じることが分かる。
【０１１５】
ここで、実施例では、一の実施形態のインキュベータによって、筋芽細胞の７２個のサンプルについてそれぞれ８時間間隔で５日目までタイムラプス観察を行った。そして、制御装置（培養状態評価装置）は、以下の２段階の処理によって筋芽細胞の分化予測を行った。
【０１１６】
第１段階では、上記の計算モデルの生成処理に準拠して、筋芽細胞の分化の有無を二者択一的に判別する２群判別モデルを制御装置に生成させた。具体的には、制御装置は、観察開始後８時間目から３２時間目までの顕微鏡画像から得られる全指標のうちから指標を選択し、筋芽細胞の分化度を求める第１判定モデルと、第１判定モデルで求めた分化度から閾値で分化の有無を判別する第２判定モデルとを構築した。そして、制御装置は、上記の第１判定モデルおよび第２判定モデルによる判別分析で、７２個のサンプルをそれぞれ分化の有無に応じて２つのグループに分別した。その結果、制御装置は、７２個のサンプルで分化の有無をいずれも正しく判別できた。
【０１１７】
第２段階では、上記の計算モデルの生成処理に準拠して、筋芽細胞の５日目（１２０時間目）の分化度を予測する予測モデルを制御装置に生成させた。実施例では、７２個のサンプルのうち、第１段階の処理で「分化する」と判別された４２個のサンプルのみを用いて、制御装置により２種類の予測モデル（第１の予測モデル、第２の予測モデル）を構築した。
【０１１８】
第１の予測モデルは、『「Ｂｒｅａｄｔｈ」の８時間目、４８時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｂｒｅａｄｔｈ」の８時間目、３２時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｉｎｎｅｒ  ｒａｄｉｕｓ」の８時間目、２４時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｌｅｎｇｔｈ」の８時間目、１０４時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｈｏｌｅ  ａｒｅａ」の８時間目、９６時間目の度数分布の組み合わせ』との５つの指標を用いた予測モデルである。
【０１１９】
図１７は、実施例における第１の予測モデルでの各サンプルの予測結果を示すグラフである。図１７の縦軸は、第１の予測モデルが予測した５日目のサンプルの分化度を示している。図１７の横軸は、５日目の時点でサンプルの分化度を熟練者が評価した値（見かけの分化度）を示している。そして、図１７では、１つのサンプル毎に１つの点がグラフ上にプロットされる。なお、図１７において、グラフの右上から左下に延びる直線の近くに点がプロットされるほど、予測の精度が高いこととなる。この第１の予測モデルでは、分化の予測精度（正答率）が９０．５％（誤差±５％）となった。
【０１２０】
また、第２の予測モデルは、『「Ｂｒｅａｄｔｈ」の８時間目、４８時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｂｒｅａｄｔｈ」の８時間目、３２時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｉｎｎｅｒ  ｒａｄｉｕｓ」の８時間目、２４時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ（細胞配向性）」の８時間目、１６時間目の度数分布の組み合わせ』と、『「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ（細胞の向きのバラツキ度）」の８時間目、２４時間目の度数分布の組み合わせ』との５つの指標を用いた予測モデルである。
【０１２１】
なお、上記の「Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ」は、各細胞の長軸と画像の水平方向（Ｘ軸）とがなす角度を示す特徴値である。この「Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ」の値が同じであれば、細胞は同じ方向に配向していることとなる。また、上記の「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ」は、フィルタリングにより画像内の細胞をデフォルメした状態で各細胞の角度を数値化し、そのバラツキを算出した特徴値である。この「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ」の値は、細胞の角度が多様であるほど大きな値を示す特性をもつ。
【０１２２】
図１８は、実施例における第２の予測モデルでの各サンプルの予測結果を示すグラフである。この図１８の見方については、図１７と同様であるので重複説明は省略する。この第２の予測モデルでは、２日目（４８時間目）までの観察結果に基づいて分化の予測を行い、その予測精度が８５．７％（誤差±５％）となった。したがって、本実施例での第２の予測モデルによれば、通常では非常に困難な筋細胞の分化予測を、２日目までの観察結果によって高い精度で定量予測できた。
【０１２３】
＜実施形態の補足事項＞
（１）上記の一の実施形態では、インキュベータ１１の制御装置４１に培養状態評価装置を組み込んだ例を説明したが、本発明の培養状態評価装置は、インキュベータ１１から顕微鏡画像を取得して解析を行う外部の独立したコンピュータで構成されていてもよい（この場合の図示は省略する）。
【０１２４】
（２）上記の一の実施形態では、特徴値演算部、度数分布演算部、評価情報生成部の各機能をプログラムでソフトウェア的に実現する例を説明したが、これらの処理をＡＳＩＣによってハードウエア的に実現しても勿論かまわない。
【０１２５】
（３）上記の一の実施形態では、評価情報の計算モデルとその指標を制御装置４１がＦＮＮによって求める例を説明した。しかし、本発明の培養状態評価装置は、例えば、重回帰分析などの他の多変量解析によって、評価情報の計算モデルとその指標を求めるものでもよい。
【０１２６】
さらに、本発明の培養状態評価装置は、複数の計算モデルを組み合わせて、これらの計算モデルによる演算結果の多数決（あるいは重み付け平均）によって、最終的な評価情報を生成するようにしてもよい。この場合には、例えば、混在率の低いデータではＭＲＡが強く、混在率の高いデータにはＦＮＮが強いというように、一方の計算モデルでは精度の低い状況を他のモデルによってカバーすることができ、評価情報の精度をより高めることができる。
【０１２７】
（４）また、培養状態評価装置は、評価情報の計算モデルを求めるときに、最初に複数の指標を組み合わせでの計算結果を演算し、変数増減法により指標を増減させるようにしてもよい。また、データの精度が高ければ指標を全て用いても良い。
【０１２８】
（５）上記の一の実施形態では、２つの度数分布の差分の絶対値和を用いて、度数分布の変化量を求める例を説明したが、２つの度数分布の差分の二乗和から度数分布の変化量を求めてもよい。また、上記の一の実施形態で示した計算式はあくまで一例に過ぎず、例えば２次以上のｎ次方程式などであってもよい。
【０１２９】
（６）上記の実施形態や実施例に示した特徴値はあくまで一例にすぎず、評価対象の細胞の種類などに応じて他の特徴値のパラメータを採用することも勿論可能である。
【０１３０】
以上の詳細な説明により、実施形態の特徴点および利点は明らかになるであろう。これは、特許請求の範囲が、その精神および権利範囲を逸脱しない範囲で前述のような実施形態の特徴点および利点にまで及ぶことを意図するものである。また、当該技術分野において通常の知識を有する者であれば、あらゆる改良および変更に容易に想到できるはずであり、発明性を有する実施形態の範囲を前述したものに限定する意図はなく、実施形態に開示された範囲に含まれる適当な改良物および均等物によることも可能である。
【符号の説明】
【０１３１】
１１…インキュベータ、１５…恒温室、１９…培養容器、２２…観察ユニット、３４…撮像装置、４１…制御装置、４２…ＣＰＵ、４３…記憶部、４４…特徴値演算部、４５…度数分布演算部、４６…評価情報生成部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図８】
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【図９】
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【図１４】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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