(57)【要約】  蛍光画像検出装置の検出能に係わる漏れ光を低減するために、蛍光側フィルタ部を干渉フィルタと吸収フィルタを蛍光の進行方向に直列配置する。ここで用いられる干渉フィルタ及び吸収フィルタは、蛍光に相当する波長帯域の光を十分に透過させながら、試料に照射される励起光に相当する波長帯域の光を遮光するものである。
2010032306.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の蛍光を励起する励起光源と、
前記試料から発せられる蛍光を検出するための二次元検出器と、
前記光源から試料までの間に配置される励起側フィルタと、
前記試料から二次元検出器までの間に配置され、試料から発せられた蛍光を取り出して前記二次元検出器に導くための蛍光側フィルタ部と、を備え、
前記励起側フィルタは、前記蛍光側フィルタ部の透過波長域の光を阻止する透過波長帯域を有するものであり、
前記蛍光側フィルタ部は干渉フィルタ及び吸収フィルタを含み、前記干渉フィルタ及び吸収フィルタは前記蛍光の進行方向に直列に配列され、前記干渉フィルタ及び吸収フィルタはそれらの組合せによる透過波長域に蛍光波長の少なくとも一部の波長を含むとともに前記励起側フィルタの透過波長帯域を含まないように組み合わされたものである蛍光画像検出装置。
【請求項２】
前記励起側フィルタの透過波長帯域における前記吸収フィルタの透過率は１０％以下である請求項１に記載の蛍光画像検出装置。
【請求項３】
前記励起光源は単色励起光源であり、
前記励起側フィルタの透過波長帯域は、前記単色励起光源の主波長の光を透過させるものであり、
前記蛍光側フィルタ部を構成する吸収フィルタは前記単色励起光源の主波長の波長域で１０％以下の低透過率を有するものである蛍光画像検出装置。
【請求項４】
前記光源は７８５ｎｍ±１０nmをピーク波長とする光を発する半導体レーザであり、前記吸収フィルタの５０％透過波長が８００nm〜８６０nmの範囲にある請求項３に記載の蛍光画像検出装置。
【請求項５】
前記光源は６９０ｎｍ±１０nmをピーク波長とする光を発する半導体レーザであり、前記吸収フィルタの５０％透過波長が７２０nm〜７８０nmの範囲にある請求項３に記載の蛍光画像検出装置。
【請求項６】
前記光源は６５８ｎｍ±１０nmをピーク波長とする光を発する半導体レーザであり、前記吸収フィルタの５０％透過波長が６９０nm〜７４０nmの範囲にある請求項３に記載の蛍光画像検出装置。
【請求項７】
前記光源は８０８ｎｍ±１０nmをピーク波長とする光を発する半導体レーザであり、前記吸収フィルタの５０％透過波長が８２０nm〜８７０nmの範囲に請求項３に記載の蛍光画像検出装置。
【請求項８】
試料の蛍光を励起する励起光源と、前記試料から発せられる蛍光を検出するための二次元検出器と、前記光源から試料までの間に配置される励起側フィルタと、前記試料から二次元検出器までの間に配置され、試料から発せられた蛍光を取り出して前記二次元検出器に導くための蛍光側フィルタ部と、を備えた蛍光画像検出装置を用いて蛍光画像を検出する方法において、
前記励起側フィルタとして、前記蛍光側フィルタ部の透過波長域の光を阻止する透過波長帯域をもつものを使用し、
前記蛍光側フィルタ部として干渉フィルタ及び吸収フィルタを前記蛍光の進行方向に直列に配列し、前記干渉フィルタ及び吸収フィルタとしてそれらの組合せによる透過波長域に蛍光波長の少なくとも一部の波長を含むとともに前記励起側フィルタの透過波長帯域を含まないようになるものを使用する蛍光画像検出方法。
【請求項９】
前記励起光源として単色励起光源を使用し、
前記励起側フィルタとして前記単色励起光源の主波長の光を透過させる透過波長帯域をもつものを使用し、
前記蛍光側フィルタ部の前記吸収フィルタとして前記単色励起光源の主波長の波長域における透過率が１０％以下となるものを使用する請求項８に記載の蛍光画像検出方法。
【請求項１０】
前記励起光源が７８５ｎｍ±１０nmをピーク波長とする光を発する半導体レーザであり、前記吸収フィルタの５０％透過波長が８００nm〜８６０nmの範囲にある請求項９に記載の蛍光画像検出方法。
【請求項１１】
前記励起光源が６９０ｎｍ±１０nmをピーク波長とする光を発する半導体レーザであり、前記吸収フィルタの５０％透過波長が７２０nm〜７８０nmの範囲にある請求項９に記載の蛍光画像検出方法。
【請求項１２】
前記励起光源が６５８ｎｍ±１０nmをピーク波長とする光を発する半導体レーザであり、前記吸収フィルタの５０％透過波長が６９０nm〜７４０nmの範囲にある請求項９に記載の蛍光画像検出方法。
【請求項１３】
前記励起光源が８０８ｎｍ±１０nmをピーク波長とする光を発する半導体レーザであり、前記吸収フィルタの５０％透過波長が８２０nm〜８７０nmの範囲にある請求項９に記載の蛍光画像検出方法。
【請求項１４】
前記試料としてインドシアニングリーンを蛍光色素として含む請求項９，１０又は１３に記載の蛍光画像検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光検出を用いる光バイオイメージング技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体中や細胞中の分子種がどのように分布しているかを画像化する手法は医学、生物学の重要な研究方法である。細胞レベルでは顕微鏡を使い蛍光色素を付着した分子プローブや遺伝子発現の分子プローブを用いて分子種を画像化する方法がひろく行われて来た。また細胞レベルからより大きな「臓器」やさらに「動物の個体」に対しても注目している分子種が分布している様子を生きたまま観察する装置が要求されている。【０００３】
例えばマウスなど個体におけるガン細胞に蛍光プローブが結合するようにして、注目するガン細胞の増殖の様子を画像化し、毎日とか毎週とかの経時変化として観測する技術である。従来の細胞レベル用の測定装置で動物個体内部のガン細胞の増殖を見るためには、動物を殺して所定の部分を染色したり、蛍光体を付けたりして観察することになるが、それでは１つの個体に対する長期間にわたる細胞の経時的な増殖を見ることができない。この理由で小動物個体の内部情報の分子種を、個体が生きたままの状態で観察できる装置の発達が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
図１０は典型的な蛍光画像検出装置の一例を示したものである。
この装置は、光源１６からの光のうち励起側フィルタ１１（Ｆex）によって選択された波長の光を励起光として生体試料に照射し、そこからの散乱光中の蛍光成分を蛍光側フィルタ１２（Ｆem）によって取り出し、結像レンズ３２によって二次元検出器であるＣＣＤカメラ３８上に結像することで、試料の蛍光画像を得るものである。【０００５】
このような装置では、試料に励起光を照射したとき、注目する蛍光分子からは励起光とは異なる波長、通常励起光より長い波長の光が放出されるので、試料から二次元検出器３８までの間の蛍光側フィルタ１２として励起光の波長成分を完全に遮断するようなフィルタを取りつけておけば、蛍光波長成分だけを感度よく検出できる。【０００６】
しかし、実際には、試料に照射される励起光のスペクトル中に僅かながら蛍光成分と同じ波長の光（迷光ともいう）が含まれていることが多く、この迷光が試料で反射して試料から放出された蛍光と重なり、蛍光の検出限界を悪化させる。また、仮に試料に照射される励起光に迷光が全く含まれなくても、蛍光側フィルタの能力が不足して励起光の波長成分を完全に除ききれていないと、試料で反射した励起光成分の一部が蛍光側フィルタを透過して試料からの蛍光成分と重なり、蛍光の検出限界を悪化させる。蛍光の検出限界が悪いと微弱な蛍光がノイズに埋没してしまい、画像として鮮明に捉えることができなくなる。生体試料の注目箇所に蛍光色素を付着させて観察する場合、注目箇所が生体試料の中心付近すなわち表面から遠い位置にあると、それだけ生体試料の表面から捉えられる蛍光の強度は弱くなる。蛍光の検出限界が悪いと、そのような微弱な蛍光成分を鮮明に捉えることができない。【０００７】
そこで本発明は、蛍光の検出限界を向上させて、微弱な蛍光でも感度よく検出できる蛍光画像検出装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
図１１は、図１０のような蛍光画像検出装置において試料が含む蛍光色素の励起スペクトル４５と蛍光スペクトル４６、及びそれらに対応して選択される励起側フィルタ１１（Ｆex）の透過特性４１と蛍光側フィルタ１２（Ｆem）の透過特性４２を示したものである。励起側フィルタ１１の透過波長帯域は励起スペクトル４５が強い強度を示す波長範囲に含まれるように選択される。蛍光スペクトル４６は励起スペクトル４５よりも長波長側にシフトしているので、それに対応して蛍光側フィルタ１２の透過特性４２も励起側フィルタ１１より長波長側にシフトした形になるように選択される。【０００９】
図１２は、励起側フィルタＦex、蛍光側フィルタＦemの具体的な透過特性の一例を示すグラフである。このグラフにおいて、横軸に波長（ｎｍ）、縦軸に透過率（対数）をとっている。縦軸の透過率は１（１.Ｅ＋００と表示）が最大、すなわち１００％の透過を意味する。励起側フィルタＦex、蛍光側フィルタＦemとして使用されるフィルタは通常、多層膜干渉フィルタである。多層膜干渉フィルタとは、透明な支持体に屈折率の異なる２種の誘電体薄膜を交互に数十層重ねた多層膜構成により、希望の波長の光だけを通し残りの波長の光を遮光する（反射させる）ものである。【００１０】
図１２において、励起側フィルタＦexは６３０ｎｍ〜６９０ｎｍに透過波長帯域を有するバンドパスフィルタ(透過波長帯域の幅Δλex)である。この励起側フィルタＦexについて、透過波長帯域の透過率だけを見れば９０％程度と十分高く問題はないが、光を遮光すべき波長域でも２×１０-6（×１０-6はＥ−０６と表示）程度の透過率が存在し、透過波長帯域以外の波長域において洩れ光が存在していることになる。この励起側フィルタＦｅｘの漏れ透過率を「ｔex」とする。【００１１】
一方、蛍光側フィルタＦemは７３０ｎｍ〜７８０ｎｍに透過波長帯域を有するバンドパスフィルタ(透過波長帯域の幅Δλem)である。この蛍光側フィルタＦemについても、透過波長帯域の透過率だけを見れば９０％程度と十分高く問題はないが、光を遮光すべき波長域でも１×１０-5程度の透過率が存在し、透過波長帯域以外の波長域において洩れ光が存在していることになる。この蛍光側フィルタＦemの漏れ透過率を「ｔem」とする。【００１２】
図１０の例で、図１２のフィルタＦex（透過特性４１）、Ｆem（透過特性４２）を使用し、光源１６としてタングステンヨウ素ランプのような連続波長光源を使用した場合について図１３を参照しながら考察する。
同図（ａ）に示されているように、光源１６からの光強度を全波長で均一なＩ（ｍＷ／ｎｍ）と仮定する。Ｆexの透過波長帯域の透過率を簡略化するために１（１００％）とみなせば、励起側フィルタＦexの透過波長帯域を透過する励起光強度は図では面積に相当するから、その強度は、
Ｉ・Δλex（ｍＷ）
となる。【００１３】
試料を、蛍光を全く発しないで励起光をそのまま散乱させる白色の散乱体と仮定すると、蛍光側フィルタＦemへ向かう散乱光の強度は、
Ｉ・Δλex・ｋ
となる。ｋは蛍光側フィルタＦemへ向かう散乱光の割合である。蛍光側フィルタＦemに入射した散乱光に対する洩れ光の割合を総合洩れ率ＬＦ（ＬＦ：Leak Factor）とすれば、二次元検出器３８に到達する洩れ光の強度は、
Ｉ・Δλex・ｋ・ＬＦ
となる。試料は蛍光を出さないと仮定しているので、ＬＦ＝０であればＣＣＤカメラ３８は真っ暗の像を撮影することになる。ｋは一定であるので、ＬＦを見積もるためには、図１３（ｂ）のように光源１６からの光の進行方向に励起側フィルタ１１と蛍光側フィルタ１２を直列に並べて、蛍光側フィルタ１２の透過光に含まれる洩れ光の割合を評価することに等しい。すなわち、ｋ＝１として考えればよい。【００１４】
図１３（ｂ）の配置で、蛍光側フィルタ１２からの洩れ光のスペクトルを測定すると、図１３（ｃ）のような２つの波長成分の山Ｓex，Ｓemが検出される。図の左側の成分Ｓexは、励起光に相当する波長の光が蛍光側フィルタ１２の能力不足のために完全には遮光されずに洩れたものであり、蛍光側フィルタ１２の漏れ率ｔemを用いれば、
Ｓex＝Ｉ・Δλex・ｔem
となる。図の右側の成分Ｓemについては、励起側フィルタ１１（洩れ率＝ｔex）の能力不足のために、蛍光側フィルタ１２には、Ｉ・ｔexの強度の洩れ光が到達しており、そのうち蛍光側フィルタ１２の透過波長帯域Δλem内にある波長の光がそのまま（透過波長帯域の透過率＝１としているため）蛍光側フィルタ１２を透過したものであるといえる。したがって、
Ｓem＝Ｉ・Δλem・ｔex
となる。【００１５】
二次元検出器３８へ入射してしまう最終的な漏れ光の強度は、上記の励起波長におけるＳexと蛍光検出波長におけるＳemの和である。したがって、総合漏れ率ＬＦは蛍光側フィルタＦemに入射した散乱光に対する洩れ光の割合であるから、
ＬＦ＝（Ｓem＋Ｓex）／（Ｉ・Δλex）
＝（ｔem・Δλex＋ｔex・Δλem）／Δλex      （１）
と定義することができる。励起側フィルタ１１と蛍光側フィルタ１２の透過波長帯域の幅ΔλexとΔλemがほぼ同じであれば、
ＬＦ＝ｔem＋ｔex
となる。すなわち、両フィルタ１１，１２の漏れ率ｔex，ｔemがどちらも１×１０-5程度であれば、総合もれ率ＬＦはその和であるからそれ以下になることはない。なお、励起側フィルタ、蛍光側フィルタとして一般的に用いられている多層膜干渉フィルタの洩れ率は１×１０-6程度が普通であり、良くても１×１０-7程度である。【００１６】
上述のように、蛍光画像検出装置ではフィルタ自身の洩れと光源を含めた総合洩れ率を区別して議論する必要があるが、これまでそのような視点からの両者を区別した記述がされていないようである。本発明はこの区別を行い、総合洩れ率を下げる手法を提示する。すなわち本発明の主たる目的は、フィルタとしては現在得られるものと同程度の性能の物を使いながら、従来よりも総合洩れ率ＬＦを低減した蛍光画像取得装置を提供することにある。【００１７】
本発明の蛍光画像取得装置は、試料の蛍光を励起する励起光源と、試料から発せられる蛍光を検出するための二次元検出器と、光源から試料までの間に配置される励起側フィルタと、試料から二次元検出器までの間に配置され、試料から発せられた蛍光を取り出して前記二次元検出器に導くための蛍光側フィルタ部と、を備えたものである。そして、励起側フィルタは、前記蛍光側フィルタ部の透過波長域の光を阻止する透過波長帯域を有するものである。蛍光側フィルタ部は多層膜干渉フィルタ及び吸収フィルタを含み、それらの多層膜干渉フィルタ及び吸収フィルタは蛍光の進行方向に直列に配列される。それらの多層膜干渉フィルタ及び吸収フィルタは蛍光側フィルタ部の透過波長域に蛍光波長の少なくとも一部の波長を含むとともに励起側フィルタの透過波長帯域を含まないように組み合わされたものである。
すなわち、励起側フィルタと蛍光側フィルタはお互いに透過波長域を共有しないことを確実にする手段として、蛍光側フィルタとして多層膜干渉フィルタと吸収フィルタを二重に機能させている。【００１８】
この蛍光画像検出装置では、蛍光側フィルタに起因する漏れ光強度Ｓexを低減する手法がなされている。すなわち、蛍光側フィルタ部として、従来から用いられている多層膜干渉フィルタに加えて吸収形のフィルタ（単に吸収フィルタともいう）を直列に配置する「吸収フィルタバックアップ法」が用いられている。多層膜干渉フィルタの洩れ率が例えば１×１０-5であるとすると、吸収フィルタを配置することによって洩れ率が３桁低減されれば１×１０-8の総合洩れ率ＬＦを実現することができる。【００１９】
吸収フィルタとは、例えば市販されている安価な「色ガラスフィルタ」である。このフィルタは、透明なガラスの中に光を吸収する物質を溶解しておき、その吸収部分で光の透過を遮光するものである。ガラスでなく、透明な樹脂又は波長によっては石英に所要の吸収物質を溶解し固めてもよい。【００２０】
理由は後述するが、同種の多層膜干渉フィルタをバックアップフィルタとして用いても、漏れ率の大幅な低減は不可能であるのに対し、多層膜干渉フィルタと性質の異なる吸収フィルタとを組み合わせることにより、両者の特徴が活かされて両者の漏れ率のかけ算による洩れ率の大幅な低減が可能となる。本発明は上記の特性を見出して総合漏れ率ＬＦの大幅な低減を図り、蛍光画像検出装置の蛍光の検出精度を向上させた点に特徴を有する。【００２１】
ここで、励起側フィルタの透過波長帯域における吸収フィルタの透過率は１０％以下であることが好ましい。これは、吸収フィルタの洩れ率が０.１（１×１０-1）以下であることを意味しているが、吸収フィルタの洩れ率が０.１以下であれば、多層膜干渉フィルタとの組合わせによって総合洩れ率を１桁以上低減することができる。後述するが、洩れ率が１×１０-5程度の多層膜干渉フィルタをバックアップフィルタとして用いても総合洩れ率を１桁程度しか低減されないことがわかっている。これに対し、洩れ率０.１以下の吸収フィルタを用いることにより、多層膜干渉フィルタをバックアップフィルタとして用いる場合よりも大きく総合洩れ率を低減することができる。【００２２】
さらに本発明では、光源として、励起側フィルタの透過波長帯域よりも狭い波長帯域の光を発する単波長光源を用いることが好ましい。そうすることで、以下の理由により励起側フィルタに起因した漏れ光強度Ｓemの低減を図ることができる。この場合、励起光の主波長（単波長光源の放射エネルギーが集中している波長域を意味する）とは異なる波長域にある蛍光側フィルタの透過波長域の光源放射光強度が、連続光源の放射強度を１としたときに例えば１×１０-4程度であるとすると、励起側フィルタの洩れ率が１×１０-5程度であっても、励起側フィルタからの洩れ光の強度は１×１０-9程度になる。すなわち、連続光源に代えて単波長励起光源を使えば、光源から発せられる光に蛍光側フィルタの透過波長帯域の光がほとんど含まれていないため、励起側フィルタから洩れる蛍光側フィルタの透過波長帯域の光が大幅に低減され、実質的に洩れ率が低減される。【００２３】
上記が実現可能である理由を図１３〜図１６を使ってもう少し詳しく説明する。
図１３（ｃ）ではｔemがかなり大きいのでＳexが目立って大きく現れている。これを減らすのに効果があるのが、吸収フィルタ１３を追加する方法（図１４（ｂ）を参照）である。吸収フィルタ１３の透過特性４３（図１４（ａ）を参照）では、励起側フィルタ１１の透過波長帯域Δλexにおいて透過率が小さくなっている。その透過率をｔaとし、例えば、ｔa＝０.００１（１×１０-3）とする。そうすると図１４（ｃ）に示される吸収フィルタ１３を通過した後の蛍光側フィルタ１２、１３に起因する洩れ光強度Ｓexは、
Ｓex＝Ｉ・ｔem・ｔa・Δλex＝Ｌ・ｔem・ｔa      （２）
となり、図１３（ｃ）の洩れ光強度Ｓexに比べてファクタｔaの分だけ小さくなる。ここで、Ｉ・Δλｅｘ（光源強度）＝Ｌとしている。【００２４】
図１４（ｃ）からも明らかなように、吸収フィルタ１３を追加することによってＳexは低減されたがＳemはほとんど低減されていない。これは励起側フィルタ１１中に蛍光側フィルタの透過波長域Δλem内の光の洩れがあることに起因する。Ｓemを低減するには、タングステンランプのような連続光源１６を、図１５に示されているように主波長帯幅の狭い光源（単波長光源）１５に代えることが効果的である。典型的な単波長光源としては、発光ダイオード（ＬＥＤ）や半導体レーザ（ＬＤ）が挙げられる。単波長光源１５と励起側フィルタ１１の組合せは、単波長光源１５の放射スペクトル５１のうち主波長帯５１a（波長幅をΔλLSと記述）が励起側フィルタ１１の透過波長帯域Δλexの中に入るように選択する。【００２５】
ただし、単波長光源といっても正確には、中心部の強い放射部分（主波長帯）５１aだけでなくその裾の部分にも弱い発光を伴なっている。その裾の部分が励起側フィルタ１１からの洩れ光Ｓemに関係している。単波長光源の主波長帯の放射強度、すなわち励起光強度をＬ（＝Ｉ×ΔλLS）、裾の部分の放射強度をＩにファクタｆを掛けた量として[Ｉ・ｆ]で表すと、励起側フィルタ１１に起因する洩れ光強度Ｓemは、
Ｓem＝Ｌ・ｆ・ｔex      （３）
となる。なお、“ｆ”は、例えば０．００１とか０.０００１などの小さい値である。したがって、総合漏れ率ＬＦは、
ＬＦ＝（Ｓex＋Ｓem）／Ｌ
＝ｔa・ｔem＋ｆ・ｔex      （４）
となる。上記（４）式を図示したものが図１５（ｃ）であり、左側の山Ｓexはｔaが掛かることで低減され、右側の山Ｓemはｆの効果で大きく減っている。例えば、ｔem，ｔexが１０-6のオーダーであり、ｔa，ｆが１０-3のオーダーであるなら、上記（４）式により、総合漏れ率ＬＦは１０-9のオーダーとなり大幅に低減されている。【００２６】
なお単波長光源１５としては、レーザ（固体レーザ・色素レーザ・半導体レーザ）などが使えるが、小型である点で半導体レーザ（ＬＤ）が特に好ましく、そのほか発光ダイオード（ＬＥＤ）も用いることができる。単波長光源１５として使用できるレーザやＬＥＤの特徴として、励起側フィルタ１１の透過波長帯域Δλex内に放射エネルギーが集中し、それから長波長側に向かって発光が十分弱ければ（３）式の議論が成立する。なお、蛍光側フィルタとして多層膜干渉フィルタと吸収フィルタを直列に配置したものを用いることに加えて、光源として単波長光源を用いるのが総合洩れ率ＬＦを低減するには最も効果的であるが、光源として連続光源を用いた場合でも、図１４（ｃ）に示したように、蛍光側フィルタに起因する洩れ光強度Ｓexの低減が図れ、その結果、総合洩れ率ＬＦの低減が図れる。特に、ｔemがｔexよりも相当大きい場合には総合的な洩れ光強度（Ｓex＋Ｓem）中に占める蛍光側フィルタに起因する洩れ光強度Ｓexの割合が大きいため、吸収フィルタを追加するだけでも大きな効果を得ることができる。【００２７】
単波長光源と吸収フィルタの組合せの例を挙げておく。
ここで使用する吸収フィルタはいわゆるシャープカットフィルタであって、短波長側で光を通さず、長波長に向かって透過率が右上がりになる特性をもち、その途中で透過率が５０％になる波長（以下５０％透過波長と言うことにする）で特性が記述される。この５０％透過波長をもちいて、組み合わせを列挙する。【００２８】
単波長光源の主波長帯が７８５ｎｍ付近である場合には、５０％透過波長が８３０nm±２０ｎｍである吸収フィルタ、単波長光源の主波長帯が６９０ｎｍ付近である場合には、５０％透過波長が７６０ｎｍ±２０ｎｍである吸収フィルタ、単波長光源の主波長帯が６５８ｎｍ付近である場合には、５０％透過波長が７２０ｎｍ±２０ｎｍである吸収フィルタ、単波長光源の主波長帯が８０８ｎｍ付近である場合には、５０％透過波長が８５０ｎｍ±２０ｎｍ以上である吸収フィルタをそれぞれ用いることが好ましい。なお、５０％透過波長は上記のものでなくても、さらに短波長または長波長に寄ったものでも有効であって、後述の表１の「吸収形フィルタの５０％透過波長の有効範囲」欄に記述する範囲も可能であることを追記する。【００２９】
また、検出対象である試料に含まれる蛍光色素のうち特に重要な物質としてインドシアニングリーンが挙げられる。【００３０】
ここで、本発明を特定する事項の代替性について検証する。
（１）蛍光側フィルタ部の吸収フィルタを多層膜干渉フィルタに代える
蛍光側フィルタ部において、多層膜干渉フィルタと吸収フィルタの直列配置に代えて多層膜干渉フィルタを２枚重ねることで、蛍光側フィルタ部の洩れ率は各多層膜干渉フィルタの漏れ率を掛け算した値になると予想されるが、実際には蛍光側フィルタ部の洩れ率は予想される値ほど小さくならない。【００３１】
図１６Ａ、図１６Ｂは上記の実験結果を示すグラフである。図１６Ａは光源としてタングステンランプを用いた場合、図１６Ｂは光源としてＬＤ（主波長帯７８５ｎｍ付近）を用いた場合である。どちらも、励起側の多層膜干渉フィルタは共通とし、蛍光側フィルタ部として洩れ率が１×１０-5の多層膜干渉フィルタ１枚を配置した場合（＝Ａ）、蛍光側フィルタ部として洩れ率が１×１０-5の多層膜干渉フィルタ２枚を直列配置した場合（＝Ｂ）、Ｃ＝蛍光側フィルタ部として洩れ率が１×１０-5の多層膜干渉フィルタ干渉フィルタ１枚と吸収フィルタ１枚を直列配置した場合（＝Ｃ）の漏れ光の分光スペクトルを測定したものである。図１６Ｂの右図は左図における主波長帯部分の一部の横軸を拡大したものであり、データとしては左図と同じである。【００３２】
光源がタングステンランプ、ＬＤのいずれの場合においても、多層膜干渉フィルタ１枚と吸収フィルタ１枚を直列配置した場合（グラフのＣを参照）には漏れ光が２桁から３桁の大幅な低減が見られるのに対し、多層膜干渉フィルタ２枚を直列配置した場合（グラフのＢを参照）では洩れ光の低減は見られるもののその低減幅は１桁程度である。上述のように全体の洩れ率が各フィルタの洩れ率の掛け算となるのであれば、各フィルタの洩れ率が１×１０-5であるから全体の洩れ率は１０-10程度にまで低減されるはずであるが、実際には僅か１桁の低減でしかない。【００３３】
上記の理由の１つは、多層膜干渉フィルタで遮光される波長の光のエネルギーはフィルタ内部で消える訳ではなく、表面で反射するのである。そのため、多層膜干渉フィルタ２枚を重ねると、バックアップフィルタで遮光された光が２枚のフィルタの間を多数回往復し、その都度、洩れ率に相当する分の光がバックアップフィルタを透過してしまうので、結局はバックアップフィルタの洩れ率以上の光がバックアップフィルタを透過しているのである。これに対して吸収フィルタは、遮光する光を反射するのではなく内部に吸収するため、多層膜干渉フィルタと直列配置してもそのような透過光の往復は発生しない。【００３４】
他の理由として、多層膜干渉フィルタは斜めの光に弱いことが挙げられる。例えば、図１に示されるような蛍光画像測定系において、結像レンズ３２の近くに設置される蛍光側フィルタ部Ｆemが試料３１を見込む視野の中心と視野の端でフィルタ１２を通過する角度が異なることに留意する必要がある。視野の中心では光線の傾きは０度であるが、視野角が２０度の場合、視野の端の光線はプラス・マイナス１０度の状態で斜めにフィルタを通過する。多層膜干渉フィルタは斜めに入射する光線に対して洩れが増える事は既知の事実である。また、非常に小さい粉塵による散乱光が必ず存在し、その散乱光が蛍光側フィルタ部Ｆemに対して斜めに入射して透過し、蛍光側フィルタ部Ｆemの洩れ率を高めてしまう。蛍光側フィルタ部Ｆemに吸収フィルタを組み合わせることにより、粉塵による散乱光の影響も小さくなる。【００３５】
（２）蛍光側フィルタ部を吸収フィルタのみで構成する
蛍光側フィルタ部を、多層膜干渉フィルタを全く使うことなく吸収フィルタ単独により、又は２枚を直列配置することにより構成した場合についての実験結果を図１７Ａ，図１７Ｂに示す。図１７Ａの曲線ＩＲ７６は吸収フィルタ（ＩＲ７６）の透過率曲線であり、曲線Ｆ６８９は多層膜干渉フィルタ（Ｆ６８９）の透過率特性である。縦軸は透過率（％）であり、横軸は波長（ｎｍ）である。図１７Ｂは光源としてタングステンランプを用いるとともに励起側フィルタとしてＦ６８９を用いて測定を行なった結果のグラフである。この図において、曲線“ＥＸ”は励起側フィルタＦ６８９のみを透過したタングステンランプからの光、すなわち励起光のスペクトル曲線であり、“ＩＲ７６×１”は蛍光側フィルタとして吸収フィルタ（ＩＲ７６）を１枚のみ用いたときの吸収フィルタを透過した光のスペクトル、“ＩＲ７６×２”は蛍光側フィルタとして吸収フィルタ（ＩＲ７６）を２枚直列配置したときの２枚の吸収フィルタを透過した光のスペクトルである。【００３６】
図１７Ｂによれば、波長域Ｐにおいて、ＩＲ７６×１の透過光強度はＥＸから４桁近く低減され、ＩＲ７６×２の透過光強度はそれよりもさらに３桁強下がっている。このことから、２枚のフィルタを直列配置することにより全体の洩れ率は各フィルタの洩れ率を掛け算した値に近くなっている。しかし、吸収フィルタＩＲ７６の透過光スペクトル（図１７Ａ参照）からわかるように、吸収フィルタの光透過特性は緩やかであり、多層膜干渉フィルタのようなシャープな光透過特性には全く及ばない。また、透過率５０％の波長７６０ｎｍから大幅に離れた６９０ｎｍあたりで４桁の遮光に達するものの、遮光すべき励起光波長帯域付近では２〜３桁程度しか低減できていない。さらに、一般に、吸収フィルタから蛍光が出ることがある（図１７Ｂの７４０ｎｍあたりの脹らみがその蛍光の影響の可能性がある）。このため吸収フィルタだけでの利用価値は小さい。蛍光を出さないためにも、予めシャープな光透過特性をもつ多層膜干渉フィルタで遮光すべき波長帯域の光量を低減した後で、洩れ率の掛け算が成り立つ吸収フィルタを補助的に用いることが最善である。【００３７】
以上のように、蛍光側フィルタ部全体での洩れ率を最も効果的に低減できるのは、多層膜干渉フィルタとバックアップフィルタである吸収フィルタの組合せである。この組合せでは、多層膜干渉フィルタの「反射光が強く斜め光に弱い」という欠点と吸収フィルタの「光遮断波長特性が緩やか過ぎること及び蛍光を発生する」という欠点を補うことができ、全体の洩れ率として両者の洩れ率の積に近い値を得ることができる。
これまでＦexとＦemを典型例である多層膜干渉フィルタとして説明してきたが、膜の数の少ない干渉フィルタであっても吸収フィルタを重ねる「遮光率向上効果」は認められ、本発明の適用は有効である。ただ膜数が少ないと、元々のＦexとＦemの遮光能力が低いので、吸収フィルタを重ねた最終的な阻止能力が同じ割合で下がるだけである。
【００３８】
なお、吸収フィルタを励起側フィルタのバックアップフィルタとして用いることは不可能である。例えば図１５（ａ）の曲線４３を見ればわかるように、吸収フィルタの透過光特性は右上がり、すなわち「長波長側透過」になっており、蛍光側フィルタ部に用いるには都合がよいが、励起側フィルタのバックアップフィルタとして用いるのであれば透過光特性が右下がり、すなわち「短波長側透過」でなければならない。ところが、そのような吸収フィルタは存在しない。【００３９】
また、フィルタに代えて分光器（いわゆるモノクロメータ）を用いることも考えられる。一般に、洩れ率のかけ算の機能を使う他の手法として、モノクロメータを多段に使って迷光を極度に小さくする手法は公知である。モノクロメータは回折格子を使って、特定の波長の光だけを通過させるので、これを多段に使うと洩れ率のかけ算が成り立つ。そのため、モノクロメータ２段のダブルモノクロメータ、３段のトリプルモノクロメータを使って、迷光を減らし弱い蛍光を検出することは可能である。しかしモノクロメータは、スリットを通す必要があるので、蛍光画像検出のような「面の光」を画像として取り出すことはできないので、蛍光側フィルタとして代用することは不可能である。なお、励起側フィルタをモノクロメータで代用することは可能であるが、モノクロメータはフィルタに比べ場所を取るという欠点がある。
【発明の効果】
【００４０】
本発明の蛍光画像検出装置は、蛍光側フィルタ部が蛍光の進行方向に直列に配列される、多層膜干渉フィルタと吸収フィルタで構成されているので、蛍光側フィルタ部全体の洩れ率が多層膜干渉フィルタの洩れ率と吸収フィルタの洩れ率の積に近い値となり、蛍光側フィルタ部に起因する洩れ光を大幅に低減することができる。すなわち、通常の技術で得られる１０-5〜１０-6レベルの洩れ率又はそれよりも悪い洩れ率をもつフィルタを使いながら、多層膜干渉フィルタと吸収フィルタの最適な組合せによって、装置全体の良好な総合漏れ率を有する高感度の蛍光画像検出装置を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】マクロ試料の蛍光測定系に本発明を適用する実施例である。
【図２Ａ】蛍光側フィルタの構成を示す説明図である。
【図２Ｂ】吸収フィルタ特性の選択が適当な場合の波形図である。
【図２Ｃ】吸収フィルタ特性の選択が不適当な場合の波形図である。
【図３】励起光照射装置の一実施例を示す斜視図である。
【図４】ミクロ試料の蛍光測定系に本発明を適用する実施例の概略構成図である。
【図５Ａ】連続光源を用いた場合の吸収フィルタの有無と漏れ光スペクトルを示す図で、左図は吸収フィルタがない場合、右図は吸収フィルタがある場合である。
【図５Ｂ】単色光源を用いた場合の吸収フィルタの有無と漏れ光スペクトルを示す図で、上図は光源スペクトル、左下図は吸収フィルタがない場合の漏れ光スペクトル、右下図は吸収フィルタがある場合の漏れ光スペクトルである。
【図６】吸収フィルタの効果の実例を示す画像データであり、（ａ）は吸収フィルタがない場合、（ｂ）は吸収フィルタがある場合、（ｃ）は（ａ）の中央部の横方向断面強度を示す図、（ｄ）は（ｂ）の中央部の横方向断面強度を示す図、（ｅ）は測定した試料を示す斜視図である。
【図７】蛍光色素ＩＣＧの波長特性ならびに、ＩＣＧを対象とするときの光源とフィルタの波長特性を示す波形図である。
【図８】利用できるＬＤの波長と実際の吸収フィルタとの組み合わせを示す波形図である。
【図９】単波長光源スペクトルと各フィルタの波長特性を示す波形図である。
【図１０】マクロ試料の蛍光測定系の概略構成図である。
【図１１】蛍光測定の励起スペクトルと蛍光スペクトルに対する各フィルタの波長特性を示す波形図である。
【図１２】励起側、蛍光側それぞれの多層膜干渉フィルタの典型的透過特性例を示す波形図である。
【図１３】従来方式の場合の多層膜干渉フィルタを通過した典型的漏れ光の波長分布を説明する図で、（ａ）は光源スペクトルと多層膜干渉フィルタの波長特性を示す波形図、（ｂ）は光源、励起側フィルタ及び蛍光側フィルタの配列を示す配置図、（ｃ）は両フィルタを通過した後の漏れ光の波長分布を示す波形図である。
【図１４】図１３の系に、吸収フィルタを追加した時の漏れ光の波長分布を説明する図で、（ａ）は光源スペクトルと多層膜干渉フィルタ及び吸収フィルタの波長特性を示す波形図、（ｂ）は光源、励起側フィルタ、蛍光側フィルタ及び吸収フィルタの配列を示す配置図、（ｃ）は全フィルタを通過した後の漏れ光の波長分布を示す波形図である。
【図１５】吸収フィルタを追加したうえで、さらに光源を単波長光源に変更したとき漏れ光の減少を説明するための図で、（ａ）は光源スペクトルと多層膜干渉フィルタ及び吸収フィルタの波長特性を示す波形図、（ｂ）は光源、励起側フィルタ、蛍光側フィルタ及び吸収フィルタの配列を示す配置図、（ｃ）は全フィルタを通過した後の漏れ光の波長分布を示す波形図である。
【図１６Ａ】連続光源を使用し、多層膜干渉フィルタを２枚重ねた場合の漏れ光の波長分布を示す波形図である。
【図１６Ｂ】単色光源を使用し、多層膜干渉フィルタを２枚重ねた場合の漏れ光の波長分布を示す波形図であり、右図は左図の横軸を拡大したものである。
【図１７Ａ】吸収フィルタ単独の透過波長特性を示す波形図及び、注目波長を選択するための多層膜干渉フィルタの透過波長特性を示す波形図である。
【図１７Ｂ】励起光スペクトルと吸収フィルタを１枚又は２枚透過した後のスペクトルを示す波形図である。
【符号の説明】
【００４２】
１１（Ｆex）    励起側フィルタ
ＦEM    蛍光側フィルタ部
１２    蛍光側多層膜干渉フィルタ
１３    吸収フィルタ
１５    単波長光源
１６    連続波長光源
２２    単波長励起光源の測方放射スペクトル
２８    単波長励起光源の主波長帯
３０    照射ユニット
３１    試料
３２    結像レンズ
３８    二次元検出器
４１    励起側多層膜干渉フィルタの透過波長特性
４２    蛍光側多層膜干渉フィルタの透過波長特性
４２a    蛍光側多層膜干渉フィルタの短波長側透過帯域
４３    吸収フィルタの透過波長特性
５０    連続光源の放射スペクトル
５１    単波長励起光源の放射スペクトル
５１a    単波長励起光源の中心部スペクトル
５１b    単波長励起光源の測方放射スペクトルのうち、蛍光検出フィルタの透過波長幅に含まれ部分
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
［実施例１］
図１は本発明の蛍光画像検出装置の一実施例を示したものである。
試料３１を励起して蛍光を発生させるための照射ユニット３０を備えている。照射ユニット３０は光源１５と光源１５からの光のうち励起光として用いない波長の光を除去するための励起側フィルタ１１を備えている。励起側フィルタ１１は例えば多層膜干渉フィルタであり、図１２に示されている光透過特性４１を有し、光源１５の主波長帯の光を十分よく通しながら、それよりも長波長側、特に蛍光に相当する波長帯域の光を遮光するように構成されたものである。励起側フィルタ１１の遮光すべき波長域での透過率は１０-6程度である。【００４４】
一方、試料から放出される蛍光は、蛍光側フィルタ部Ｆemを通って結像レンズ３２によってＣＣＤカメラなどからなる二次元検出器３８上に結像される。二次元検出器３８では目的の生体試料の蛍光画像が得られる。蛍光側フィルタ部Ｆemは多層膜干渉フィルタ１２と吸収フィルタ１３が蛍光の進行方向に対して直列に配列されてなるものである。多層膜干渉フィルタ１２は蛍光波長を含む波長帯域を透過波長帯域として有し、それ以外の波長帯域、特に励起光に相当する波長帯域の光を遮光するように構成されたものであり、その遮光波長帯域の透過率（洩れ率）は１×１０-6程度である。吸収フィルタ１３は蛍光に相当する波長帯域を含む長波長側の光を透過させ、それよりも短波長側で特に励起光に相当する波長帯域の光を遮光するように構成されている。その遮光波長帯域の透過率（洩れ率）は１×１０-3程度である。既述のように、多層膜干渉フィルタ１２と吸収フィルタ１３の直列配置により、蛍光側フィルタ部Ｆemの洩れ率はほぼ多層膜干渉フィルタ１２と吸収フィルタ１３の洩れ率の積となるから、蛍光側フィルタ部Ｆem全体で１０-9オーダーの洩れ率となる。【００４５】
蛍光側フィルタＦemは、図２Ａに示されているように、多層膜干渉フィルタ１２と吸収フィルタ１３からなり、多層膜干渉フィルタ１２は透明支持体１２ａと多層干渉膜１２ｂからなる。好ましい構成としては、試料からの光が矢印のように多層干渉膜１２ｂ、透明支持体１２ａ、吸収フィルタ１３の順に通過するように構成されていることが好ましい。この順序とすると透明支持体１２ａや吸収フィルタ１３が蛍光を発する時でも、多層干渉膜１２ｂで減光された光が透明支持体や吸収フィルタを通過するので、蛍光が弱められるためである。当然の事ながら透明支持体１２ａと吸収フィルタ１３の材質としては、自身の蛍光放出量が少ない物質が好ましい。吸収フィルタ１３としては、図２Ｂの透過波長特性４３として示されているように、光源１５の発光スペクトル５１の主波長帯２８の光透過率が十分小さいことが必要である。多層膜干渉フィルタ１２の光透過特性４２も、主波長帯２８の光透過率が十分小さくなっており、多層膜干渉フィルタ１２と吸収フィルタ１３で二重に励起光の散乱光が二次元検出器３８側に洩れることを防止している。なお、図２において、多層膜干渉フィルタ１２と吸収フィルタ１３は離れているが、接着剤で貼り合わせ合成した１つのフィルタでもよい。さらに透明支持体１２ａを使わず、吸収フィルタ自身に多層干渉膜１２ｂを蒸着する方法も可能である。また多層膜干渉フィルタ１２の後に吸収フィルタを２枚重ねてもよい。２枚重ねる効果は吸収フィルタの厚さを増やすことと等価であるあるが、蛍光波長での透過率が少し下がる。すなわち必要な阻止波長での阻止率の調節と蛍光捕捉効率を睨んだ良い妥協点を選ぶために吸収フィルタの厚さ・枚数の調節が可能である。
【００４６】
なお、図２Ｃの４４のような透過波長特性をもつ吸収フィルタを多層膜干渉フィルタに合成したフィルタが市販されているが、曲線４４から明らかなように、この吸収フィルタは光源１５の主波長帯の光をほとんど遮光しない。多層膜干渉フィルタには同図の４２aのような透過帯域が短波長側に現れることがあり、上記の吸収フィルタは、その透過帯域を「切り取る」ことを目的として多層膜干渉フィルタに合成されたものである。本発明の蛍光側フィルタ部Ｆemとして必要な吸収フィルタは、このような短波長側透過帯域の「切り取り」用のフィルタではなく、単波長光源の放射５１aを多層膜干渉フィルタと共に二重に遮光する特性である。【００４７】
なお、４３のような透過波長特性を有する吸収フィルタが、光源１５のスペクトル５１をどの程度減光すれば吸収フィルタの補強能力として有効かについて述べる。図１６の説明で既に述べたように、多層膜干渉フィルタを２枚直列配置した場合には蛍光側フィルタ部Ｆem全体の洩れ率を１桁程度しか低減できなかった。したがって、吸収フィルタの補強能力（洩れ率）が１０％以下であれば、多層膜干渉フィルタよりも大きな効果が得られる。      【００４８】
次に、光源１５の例について図３を参照しながら説明する。
光源装置３０は光源取付けベース７０に４つのＬＤ１５ａ〜１５ｄを備えている。光源取付けベース７０は試料である小動物の体軸に平行な方向に長く伸びた板状のホルダーであり、これら４つのＬＤ１５ａ〜１５ｄは小動物の体軸の方向に並んでいる。この例では、ＬＤ１５ａと１５ｃが同じ波長（例えば７８５ｎｍ）の光を発振し、残り２つのＬＤ１５ｂと１５ｄが同じ波長（例えば６９０ｎｍ）の光を発振する。これら４つのＬＤ１５ａ〜１５ｄのそれぞれに励起側フィルタ１１ａ〜１１ｄが重ねて取り付けられており、それらレーザダイオードと励起側フィルタの４つの組がそれぞれの励起光を試料に向けて照射することができる。【００４９】
既述のように、ＬＤは発振波長帯（主波長帯）の裾の波長帯域にも弱い強度の放射を伴なっていることが多いが、裾部分の放射強度は主波長帯域の放射強度に比べて０．００１（１０-3）倍（これをファクターｆと呼んでいる。）以下である。励起側フィルタの蛍光波長帯域における透過率が１×１０-6程度であれば、この蛍光波長帯域でのＬＤの発光強度が主波長帯のｆ倍以下であるから、励起側フィルタからの蛍光波長帯域の洩れ光強度は主波長帯域の透過光強度の１０-9倍以下に抑えることができる。【００５０】
また、図３の照射ユニット３０は、異なる位置に配置された複数のＬＤの点灯を別々に制御するようにすることで、機械的機構なしで励起光の波長の切替えや、複数の方向からの励起の切替え、また必要に応じ同時に励起するなど、自在に選ぶことができ、検出したい蛍光分子の存在場所の新たな知見を得ることも可能となる。ＬＤ及びそれと対になる励起側フィルタ１１の一般的な大きさは１ｃｍ角以下であるので、比較的狭い位置に多数の異なる光源を配置できるという利点もある。図３の照射光源３０においては、ＬＤに代えて安価なＬＥＤを用いることも可能である。レーザダイオード又は発光ダイオードは励起側の迷光を抑える効果のほか、無駄な波長域の発光が無い上、単位波長幅に対する強度が大きいので、ハロゲンランプに励起フィルタを組み合わせて波長選択する場合に比べ、強い励起光を得ることができ、測定時間の短縮や測定感度の向上に寄与するというさらに副次的な利点を有することも指摘できる。【００５１】
次に典型的な測定対象として蛍光色素インドシアニングリーン（以下、ＩＣＧ）を用いた場合の、光源、励起側フィルタ、蛍光側フィルタのそれぞれの波長特性の組み合わせについて図７を用いて説明する。
ＩＣＧは８００ｎｍ以上の近赤外域に蛍光を発する色素として良く知られているほか、肝臓機能の検査用にして注射液が売られているが、今後生体内の挙動を見るための蛍光標識薬としても利用され認知度がさらに高くなっていくと予想される。図７において４５はＩＣＧの励起スペクトル、４６はＩＣＧの蛍光スペクトル、５１は矢印で示されているがＬＤ（波長７８５ｎｍ）の発振スペクトルをイメージしたものである。４１は励起側フィルタの光透過スペクトルであり、ＬＤの発振スペクトル中に存在する８００ｎｍ以上の測方放射光を除去する。また、４２は蛍光側フィルタ部を構成する多層膜干渉フィルタの光透過スペクトル、４３は蛍光側フィルタ部を構成する吸収フィルタ（バックアップフィルタ）の光透過スペクトルである。４２と４３を合わせることでＬＤの発光波長の洩れ光を極度に小さく押さえている。４２と４３の合成透過域４６ｃはＩＣＧの蛍光スペクトル全体４６のなかの長波長側の一部であって全体の発光スペクトルの半分から４０％程度の捕捉範囲しかない。しかし、この範囲の漏れ光を完全に除去することが、蛍光の検出感度を高めるためには４６の蛍光全体を捕捉することより圧倒的に重要である。レーザの強度や検出器の感度は十分な（例えば２桁程度）余裕をもつから、蛍光スペクトルの捕捉率の多少の低下はこれらの能力で容易にカバーでき、問題とならないからである。この意味で、４６ｃを蛍光の発光スペクトル波長域の全体から４６を区別して、「色素の発光中の利用波長域」と言うことにする。この例では８３０ｎｍ〜８８０ｎｍである。【００５２】
同様にその他の色素に対して、図７のＩＣＧと同様な考察を行いまとめた、「光源、励起側フィルタ、蛍光側フィルタ」のそれぞれの波長特性の組み合わせを表１に示す。表１は、幾つかの色素についての本特許の適用例と言うことが出来る。この表中の半導体レーザ（ＬＤ）と吸収フィルタの波長特性を、図８に示す。【００５３】
【表１】
2010032306.tif 000003
【００５４】
ＬＤは４種類（ＬＤ６５８，ＬＤ６９０，ＬＤ７８５，ＬＤ８０８）を示している。これらはそれぞれ６５８ｎｍ帯、ＬＤ６９０帯，ＬＤ７８５帯，ＬＤ８０８帯の半導体レーザである。残念ながら実用化されているＬＤの波長は自由に選べる訳でなく、とびとびの波長のものが供給されている。その内、６５８ｎｍ±１０ｎｍ、ＬＤ６９０ｎｍ±１０ｎｍ，ＬＤ７８５ｎｍ±１０ｎｍ，ＬＤ８０８ｎｍ±１０ｎｍのものが安価で多く供給されているので、６５８ｎｍ帯、６９０ｎｍ帯等と言う表現で表１に記述した。また、吸収フィルタは、Ｒ７０、Ｒ７２，ＩＲ７６、ＩＲ８３、ＩＲ８５の５種類を記述した。これらはHOYA CANDEO OPTRONICS CORPORATION よりシャープカットフィルタとして供給されているガラスフィルターである。また同様のものがドイツショット社(Schott AG)からも供給されている。これらは、ＬＤ６５８がR72にＬＤ６９０がIR76にＬＤ７８５がIＲ83に、ＬＤ８０８がIＲ85に組み合わされる。ＬＤ６５８はR70に組み合わせる選択も可能である。これらのシャープカットフィルタは通常透過率が５０％となる波長で規定され、５０％透過波長が、ＸＸＸｎｍというようにして指定されるので、表１中では５０％透過波長で吸収フィルタを特定している。なお吸収フィルタの５０％透過波長の有効範囲は幅を持っており、短波長側はＬＤの波長を阻止出来る１０％透過の範囲、長波長側は表の最も右に欄に示す色素の蛍光発光波長の内の利用波長範囲で透過率が極度に下がらないという条件できまる。この考察から選択した有効範囲を「５０％透過波長の有効範囲」欄に記載した。  測定目的とする蛍光色素ともに、これらの組合わせを一覧表示した。【００５５】
図５Ａ及び図５Ｂは漏れ光低減効果について実際の測定データをグラフ化したものである。図５Ａは光源としてタングステンランプを用いた場合、図５Ｂは光源としてＬＤを用いた場合である。図５Ａの曲線Ａ１は励起光のスペクトルであり、Ａ２は蛍光側フィルタ部Ｆemに吸収フィルタが配置されていない場合、すなわち図１３（ｂ）のフィルタ１２を透過した光のスペクトルであり、Ａ３は蛍光側フィルタ部Ｆemに吸収フィルタを配置した場合、すなわち、図１４（ｂ）のフィルタ１３を透過した光のスペクトルである。図５Ｂの曲線Ｂ１は励起光のスペクトルであり、Ｂ２は蛍光側フィルタ部Ｆemに吸収フィルタが配置されていない場合に蛍光側フィルタ部Ｆemを透過した光のスペクトルであり、Ｂ３は蛍光側フィルタ部Ｆemに吸収フィルタを配置した場合、すなわち、図１５（ｂ）のフィルタ１３を透過した光のスペクトルである。【００５６】
曲線Ａ２にはＳexとＳemに相当する山ができている。Ｓexの山は励起光強度に比べて４〜５桁程度小さいが、それでも相当大きい洩れ量である。これに対し、Ｓemの山は励起光強度に比べて６桁程度小さく、Ｓexの３０分の１程度である。右側のＡ３はさらに吸収フィルタを通した図１４に相当する場合であって、吸収フィルタの遮光能力が良く効いてＳexが２桁以上低下して非常に小さくなっている。逆にＳemの方が目立つようになる。Ｓemが余り減らないのはＳemの波長域における連続光源の放射強度が強いためである。【００５７】
曲線Ｂ１は励起光のスペクトルであり、ピーク部分の大きさは１０10程度の大きな値となる。これが蛍光側の多層膜干渉フィルタを通ると、Ｂ２に示されるように１０4程度になっている。すなわち、多層膜干渉フィルタによって強度が６桁低下したことになる。それでもＳexの山はＳemに比べ３桁以上大きい。【００５８】
最後に吸収フィルタを追加して測定したＢ３ではレーザのピークが１０弱に下がっており、元の１０10に比べて９桁近く低下している。Ｓemが少しふくらんでＢ２の時より僅かに増えているのは、吸収フィルタ自身が放出した蛍光のためであると考えられるが、低いレベルである。図の各々の山Ｓex、Ｓemの面積を計算したものが表２であり、洩れ光強度のそれぞれの場合の数値を示している。この表によれば、吸収フィルタのない時のＳexが、タングステンランプ励起で３０００，ＬＤ励起で２２００程度と他に比べて大きな洩れである事がよくわかる。
【表２】
2010032306.tif 000004
【００５９】
表３はさらに表２から求めた洩れ率の計算例である。洩れ率は、Ａ１またはＢ１を積分して得られた光源の放射強度Ｌを分母とし、各漏れ光の強度を分子として求めた比率である。
【表３】
2010032306.tif 000005
【００６０】
吸収フィルタのない場合は、励起波長洩れ率ではタングステンランプ励起が５×１０-5、ＬＤ励起の場合で８×１０-7が吸収フィルタを入れることで、それぞれ２×１０-7、３×１０-9と改善され、総合洩れ率でも、１×１０-6、８×１０-9と改善している。タングステンランプを光源とするとき総合洩れ率が１×１０-6までの低減に留まるのは蛍光側が減らない事による。それでも吸収フィルタによって総合洩れ率が５０分の１になっているので、レーザを用いないときでもかなり有用であると言える。その理由は漏れ光の最大の要因が「励起側洩れ」であったからである。このように、まず吸収フィルタが効いて、総合洩れ率が下がり、単波長光源にすることでさらに下がる。【００６１】
次に、画像取得時に吸収のフィルタの効果を如実に示す例として図６を示す。ＬＤ光源を用いて励起側起因の洩れＳemを下げた条件において、吸収フィルタの有無に対する画像性能比較（蛍光側の遮光能力不足に起因する洩れの比較）を行ったものである。試料は同図(e)に示す円筒状の乳白色樹脂31aの中心少し左に蛍光色素であるＩＣＧ液を詰めた短いチューブ31bを埋め込んだ物で、乳白色樹脂自身の蛍光と中心左のＩＣＧの蛍光が検出されるはずである。【００６２】
図６上段の左図(ａ)は吸収フィルタを配置しなかった時の画像であり、右図(ｂ)は吸収フィルタを配置したときの画像である。左図(ａ)に示されているように、吸収フィルタを配置しなかった時は画面全体に漏れ光が多くデコボコのバックグランドが顕著に現れ,
乳白色樹脂の蛍光の輪郭を鮮明に捉えることができない。一方、右図(ｂ)では、洩れ光が少ないためにバックグランドが殆どゼロであり、乳白色樹脂の蛍光とＩＣＧの蛍光を鮮明に捉えることができる。これらの画像(ａ)，(ｂ)の下段のグラフ(c)，(d)は上段画像の中央断面の光検出強度を左右方向にプロットしたものである。左図(a)ではバックグランド（洩れ光）が中央の試料信号の２割にも及ぶのに対し、右図(ｂ)ではバックグランドがほとんどゼロレベルに落ちており、試料がバックグランドに埋もれることなく検出できている。【００６３】
［実施例２］
図４によって、顕微鏡を用いるミクロ試料に対して本発明を適用する場合を説明する。
この図は通常の蛍光顕微鏡とほとんど変わらない。蛍光顕微鏡で励起側と蛍光側の機能の要部はプリズム２個を貼り合わせた角形のビームスプリッター６１であって、その２つの面に対となる励起側フィルタ１１（Ｆex）と蛍光側フィルタ部（Ｆem）を配置している。これまでの蛍光顕微鏡と異なるのは、蛍光側フィルタ部（Ｆem）が多層膜干渉フィルタ１２と吸収フィルタ１３から構成されていることである。光源１５は単波長光源であるが、連続波長光源であってもよい。【００６４】
最後の強調点として、吸収フィルタに要求される遮光波長域について図９を用いて説明する。吸収フィルタは多層膜干渉フィルタと異なり、一般に物質の吸収を利用するので、波長を自由に選べないし、透過域から遮光域にいたる傾きをシャープにすることが難しい。そこで、吸収フィルタの波長の制約が緩い事が望ましいので、必要な制約について考察しておく。図９の単波長光源の放射光強度特性５１においては、光の大半が集まっている主波長帯２８と、その裾部分の波長域２９がある。吸収フィルタの透過特性４３の役割は励起光源の光５１aを多層膜干渉フィルタの透過特性４２と二重遮光によって通過させないようにすることである。【００６５】
ここで重要なポイントとして、二重遮光は励起側フィルタの透過域Δλexの全てにわたる必要はなく、その中の励起光源の主波長の範囲２８だけでよいことである。吸収フィルタの透過特性４３のスロープは一般に緩やかなので、図６の例では長波長側（図の右側）から左向きに徐々にさがって、主波長の範囲２８の僅かに長波長で、透過率がほぼゼロになっている。この範囲だけで例えば漏れ率１０-9を実現しておけばよい。主波長帯の裾の部分の放射強度は元々ｆ倍（３桁以上）弱いので、この部分の遮光は二重でなくても、蛍光側の多層膜干渉フィルタだけで十分である。【００６６】
こうして本方式の漏れ光遮光の手法を再度まとめる。蛍光側フィルタの不全による励起側の洩れは、４２と４３の特性によって９桁の遮光が行われる一方、励起側フィルタの不全による蛍光検出波長での洩れは、干渉多層膜フィルタ特性４１の６桁の遮光能力と測方波長域５１bで励起光源の元々の放射が３桁以上弱いｆ効果とで合わせて９桁遮光となり、励起側、蛍光側の双方で９桁が実現される。【００６７】
次に主波長の範囲２８が徐々に広くなって干渉多層膜フィルタ４１の透過幅λｅｘに近づく時（光源がＬＥＤの場合に相当する場合に相当する）、一部の放射が４３の特性の外側にはみ出すようになる。そうすると、はみ出した部分は二重遮光からはずれるから、９桁になるべき遮光能力が８桁に下がるなどやや悪い遮光率になる。さらに光源が広くなって連続光源になると、特性４２に掛かってしまうとき、４３は働かず、干渉フィルタの遮光特性の６桁だけになってしまう。したがって、この発明の二重遮光方式は主波長の波長幅ΔλLSがせまいＬＤが最も効果を上げやすく、ＬＥＤでも能力が下がるが有る程度機能し、連続光源になると遮光効果が減少すると言える。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【国際調査報告】
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