(57)【要約】【課題】アルクチゲニンを高含量に含むゴボウシエキス及びその製造方法を提供し、膵臓癌治療に供する。【解決手段】ゴボウシに内在する酵素であるβ-グルコシダーゼにより、アルクチインをアルクチゲニンに酵素変換し、エタノールを加えて抽出、濃縮した後、凍結乾燥又は噴霧乾燥することによりアルクチゲニンを高濃度に含有するゴボウシエキスを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルクチゲニンを３％以上含有するアルクチゲニン高含有ゴボウシエキス。
【請求項２】
ゴボウシに内在するβ-グルコシダーゼにより、アルクチインをアルクチゲニンに酵素変換して抽出することを特徴とするアルクチゲニン高含有ゴボウシエキスの製造方法。
【請求項３】
請求項２記載の製造方法において、アルクチインをアルクチゲニンに酵素変換した後、エタノールを加えて抽出することを特徴とする請求項２記載のアルクチゲニン高含有ゴボウシエキスの製造方法。
【請求項４】
請求項２又は３のいずれかに記載の製造方法において、抽出後、濃縮し、凍結乾燥又は噴霧乾燥して製造することを特徴とする請求項２又は３に記載のアルクチゲニン高含有ゴボウシエキスの製造方法。
【請求項５】
請求項２〜４いずれかに記載の製造方法において、抽出後、濃縮し、デキストリンを添加して噴霧乾燥することを特徴とする請求項２〜４に記載のアルクチゲニン高含有ゴボウシエキスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルクチゲニンを高含量に含むゴボウシエキス及びその抽出・製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ゴボウシは日局１５でゴボウ Arctum lappaLinne (Compositae)の果実であると規定されており、銀翹散、駆風解毒湯、消風散などに処方される生薬で、専ら医薬品として使用される成分本質に分類される。【０００３】
ゴボウシは、リグナン配糖体に分類されるアルクチインを約７％、及びそのアグリコンであるアルクチゲニンを約０．６％含む。【０００４】
近年、ＰＡＮＣ−１、ＡｓＰＣ−１、ＢｘＰＣ−１、ＫＰ−３のような膵臓癌由来の細胞は、極度の栄養飢餓状態においても強い耐性が見られ、その耐性を解除することが癌治療における新しい生化学的アプローチとなる可能性が報告されている(特許文献１)。【０００５】
更に膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ−１を用いて、低栄養状態における腫瘍細胞の生存能力を解除できる物質のスクリーニングを行ったところ、アルクチゲニンが有効であることが報告されている。（非特許文献１）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−０６５２９８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】S. Awale, J. Lu, S. K. Kalauni, Y. Kurashima, Y. Tezuka, S. Kadota, H. Esumi，Cancer Res．，2006，66(3)，1751-1757)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在知られているゴボウシは、ゴボウシ中のアルクチゲニン含量が約０．６％と低く、かつ水に溶け難い。このため、従来より行われている熱水抽出法では、アルクチゲニンを高含量に含むエキス製造は極めて困難であった。【０００９】
そのため、実際に生体に投与可能な形態で、かつアルクチゲニンを高含量に含むゴボウシエキスの提供が望まれていた。【００１０】
そこで本発明の課題は、アルクチゲニンを高含量に含むゴボウシエキス及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、生薬に内在する酵素であるβ-グルコシダーゼに着目し、この酵素反応を利用してアルクチインをアルクチゲニンに変換する技術、変換したアルクチゲニンを効率よく抽出する技術、およびアルクチゲニンを高含量に含むゴボウシエキスを見い出した。【００１２】
第１の発明は、アルクチゲニンを３％以上含有するアルクチゲニン高含有ゴボウシエキスである。
第２の発明は、ゴボウシに内在するβ-グルコシダーゼにより、アルクチインをアルクチゲニンに酵素変換して抽出することを特徴とするアルクチゲニン高含有ゴボウシエキスの製造方法である
第３の発明は、上記発明のいずれかにおいて、アルクチインをアルクチゲニンに酵素変換した後、エタノールを加えて抽出することを特徴とするアルクチゲニン高含有ゴボウシエキスの製造方法である。
第４の発明は、上記発明のいずれかにおいて、抽出後、濃縮し、凍結乾燥又は噴霧乾燥して製造することを特徴とするアルクチゲニン高含有ゴボウシエキスの製造方法である。
第５の発明は、上記発明のいずれかにおいて、抽出後、濃縮し、デキストリンを添加して噴霧乾燥することを特徴とするアルクチゲニン高含有ゴボウシエキスの製造方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、抗腫瘍効果を有するアルクチゲニンを高含量に有するゴボウシエキスの提供が可能となった。特に膵臓癌患者に投与することで、腫瘍の増殖抑制や抗腫瘍効果を期待できる。また製造時の生産性も向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】酵素変換有効性結果の分析クロマトグラム
【図２】培養細胞（ＣＡＰＡＮ−１）を用いた細胞毒性の評価
【図３】培養細胞（ＰＡＮＣ−１）を用いた細胞毒性の評価
【図４】培養細胞（ＰＳＮ−１）を用いた細胞毒性の評価
【図５】腫瘍モデル動物（ＣＡＰＡＮ−１  Xenografts）における抗腫瘍性の評価
【図６】腫瘍モデル動物（ＰＳＮ−１  Xenografts）における抗腫瘍性の評価
【図７】ヒト血中アルクチゲニン（ＡＧ）の血中濃度推移
【図８】ヒト血中アルクチゲニングルクロン酸抱合体（ＡＧＧ）の血中濃度推移
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について詳細に説明する。開示する条件は一例であり、これに限定されるものではない。
本願発明のゴボウシエキスは、生薬切裁工程・抽出工程・固液分離工程・濃縮工程・乾燥工程を経て製造される。
【００１６】
(生薬切裁工程)
原料とするゴボウシを抽出に適した大きさに切裁する。原料となる生薬は、植物の様々な部位や鉱物、動物など種々の大きさ、形状、固さがあり、その特質に応じた切裁が必要となる。粒度は細かいほど酵素反応が促進され、エキス収率も上昇するが、その反面、酵素反応が速過ぎてプロセス管理が困難になったり、後工程で正確な固液分離に支障が生じることがある。そのため、本発明に用いる生薬の粒度は、細切り程度が望ましい。
【００１７】
（抽出工程）
抽出工程は漢方エキス粉末製造工程中で、品質上最も重要な工程であり、ここで漢方エキス粉末の品質が決まる。本願発明では、抽出工程を酵素反応工程と有機溶媒抽出工程の２段階に分けて実施する。
【００１８】
（酵素反応工程）
本願発明が見い出した最も重要な工程で、ゴボウシに含まれているアルクチインをアルクチゲニンに酵素変換する工程である。
前工程で準備したゴボウシ細切１ｋｇに水７リットルを加え、２０〜４０℃で攪拌するなどして約１時間経過させる。この工程によりアルクチインがアルクチゲニンに酵素変換され、アルクチゲニンの含有量が飛躍的に上昇する。当該抽出方法を冷浸抽出という。
なお、反応速度の観点でみれば、酵素反応のピーク温度である３７〜４０℃が望ましいが、品質制御面でみると反応速度が速すぎてプロセス管理が困難になることもある。
したがって小スケールでは２０〜２５℃で約１時間の抽出が望ましいが、工業スケールでは攪拌装置の能力や温度制御の能力に応じて、３０℃で３０分間、３７℃で１５分間など適宜設定すればよい。尚、６０℃を超えると酵素が失活するので、それ以上の温度となる従来の熱水加熱法は使用できない。
【００１９】
（有機溶媒抽出工程）
アルクチゲニンが高含量となった状態で、加熱還流し、ゴボウシエキスを抽出する工程である。ここでアルクチゲニンは水難溶性であることから、溶媒を添加することで収率を向上させることができる。
具体的には酵素反応工程を終えた溶液（ゴボウシ細切１ｋｇ＋水７リットル）に、溶媒３リットル加え、更に１時間加熱還流する。ここで溶媒は安全性の面で、エタノールが望ましい。
エタノール量は多いほどアルクチゲニンの溶解度が高くなり収率も向上するが、不要な油脂類が多く溶け出し、濃縮工程の負荷が大きくなるので、投入量は状況に応じて適宜決めればよい。なおこの工程での加熱還流は、滅菌・殺菌も兼ねている。
【００２０】
（固液分離工程）
抽出の終わった生薬を抽出液から分離する工程である。固液分離方式にはろ過法，沈降法などがあり、工業的には遠心分離方式が望ましい。
【００２１】
（濃縮工程） 
乾燥に先立ち抽出液中の溶媒を除去する工程である。得られたエキスの抽出液が更に高温に長時間曝されることがないように減圧濃縮法を用いる。この工程では，次工程の乾燥が適正に行え、かつ乾燥エキス粉末を製剤した場合に適切な製剤特性を得られるような濃度まで濃縮を行う。
なお、アルクチゲニンは水難溶性であるため、乾燥工程の製造装置内に付着する量が多く、最終的な収率が大幅に低下する。そこでデキストリンを添加することで、製造装置への付着が防止できる。添加量は濃縮液の固形分に対し、２０％程度が望ましい。
【００２２】
（乾燥工程）
抽出したエキスを粉末状に仕上げる工程である。乾燥法には凍結乾燥と噴霧乾燥が知られているが、実験室レベルであれば前者、量産レベルであれば後者を用いるのが一般的である。
【００２３】
以上の製造プロセスにより、アルクチゲニン高含有のゴボウシエキスを得ることができる。
【００２４】
（ゴボウシエキス粉末配合製剤）
このようにして得られたエキス粉末はそのままの形で使用することもできるが、通常、食品及び／又は医薬品に使用される通常の賦形剤（例えば、結晶セルロース、ショ糖脂肪酸エステル、乳糖等）を加え、例えば、乾式造粒法或は湿式造粒法により造粒して製造し、このようにした造粒物をそのまま使用することもできるが、それらをさらに打錠機を用いた圧縮成形物として使用することもできる。
【００２５】
また、エキス粉末が特有のえぐみを有することから、エキス粉末をマスキングする製剤が服用上好ましく、被覆剤で被覆するフィルムコート剤とすることもできる。また、成分の安定性の観点や簡単に摂取できる形態として、前述のエキス粉末又は上記造粒物をそのままハードカプセルやソフトカプセルに充填し摂取してもよい。
【００２６】
（試験）アルクチゲニンの酵素変換有効性試験
抽出工程の酵素反応工程（冷浸抽出）において、アルクチインがアルクチゲニンに酵素変換されているか否かの評価を実施した。
［比較例１］
ゴボウシ粗末(18号篩通過)０．１ｇをとり、５０％メタノール５０ｍＬを加えて１時間加熱した後、ろ過する。
［試験例１］
ゴボウシ粗末(18号篩通過) ０．１ｇをとり、水２５ｍＬを加えて振り混ぜ、室温（２０℃）に１時間放置した後、メタノール２５ｍＬを加えて、ろ過する。
試験例１と比較例１で得た濃縮液を以下の分析条件でＨＰＬＣ法により、測定を行った。
【００２７】
［アルクチゲニン含量測定方法］
カラム：YMC-Pack ProC18 AS−307−3（3μm，4.6mmID×7.5cm)
カラム温度：３０℃
検出：ＵＶ２８０ｎｍ（上段)，ＵＶ２３０ｎｍ(下段)
流量：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：５、１０μＬ
移動相：Ａ液／０．０５Ｍ リン酸二水素ナトリウム溶液:アセトニトリル混液(５：１)、
Ｂ液／０．０５Ｍ リン酸二水素ナトリウム溶液:アセトニトリル混液(１：１)
gradient 条件：０〜１０ｍｉｎ／Ｂ液２０％、１０〜２５ｍｉｎ／Ｂ液４０％
【００２８】
［比較例１］表１に示すように、原料生薬中のアルクチイン及びアルクチゲニンの含量はそれぞれ６．８８％及び０．５８％で、アルクチゲニン/アルクチイン含量比（以下、ＡＧ／Ａという）＝０．０８であった。
［試験例１］表１に示すように。アルクチイン及びアルクチゲニン含量はそれぞれ０．１５％及び３．８０％で、ＡＧ／Ａ比＝２５．３３で、アルクチゲニン含量は明らかに上昇した。また図１に示すように原料生薬中のアルクチインは、ほぼ定量的にアルクチゲニンに変換した。
【００２９】
【表１】
2010109961.tif 000002
【実施例】
【００３０】
［実施例１］（刻み、冷浸抽出によるゴボウシエキスの製造）
ゴボウシ細切３００ｇを水（２２℃）１．５Ｌに加えて１時間攪拌した後、更に１時間加熱還流する。同様にろ過し、水０．５Ｌで洗浄し、合せた抽出液（１．５Ｌ）を凍結乾燥した。
表２に示すように、生薬の刻みを冷浸抽出したエキスは、アルクチイン及びアルクチゲニン含量 はそれぞれ、１０．１％及び４．８％でＡＧ／Ａ比＝０．４８であった。【００３１】
［実施例２］（刻み、冷浸抽出、エタノール添加によるゴボウシエキスの製造）
ゴボウシ細切２００ｇを水（２２℃）１Ｌに加えて１時間攪拌した後、エタノール０．４５Ｌを加えて更に１時間加熱還流する。ガーゼ４枚(金網１００ｍｅｓｈ)でろ過し、３０％エタノール０．５Ｌで洗浄し、合せた抽出液（１．５Ｌ）を凍結乾燥した。
表２に示すように、生薬の刻みを冷浸抽出したエキスは、アルクチイン及びアルクチゲニン含量がそれぞれ、１３．３％及び１１．４％で、ＡＧ／Ａ比＝０．８６
であった。実施例１よりもアルクチゲニン含量が大幅に上昇したのは、エタノール添加によりアルクチゲニンが溶解できたためと推測できる。【００３２】
［実施例３〜６］（中間スケール、噴霧乾燥によるゴボウシエキスの製造）
ゴボウシ細切２ｋｇを水（３７℃）１４Ｌに加えて１時間攪拌した後、エタノール６Ｌを加えて更に１時間加熱還流する。この液を遠心分離し、得られた抽出液約１６Ｌを減圧濃縮し、エキス固形分に対してデキストリン０〜５０％を加えて、噴霧乾燥した。【００３３】
アルクチゲニンは水に溶け難いため、噴霧乾燥工程で付着による損失が大きく、エキス収率が５％に低下した。（実施例３）
このため、デキストリンを添加（実施例３〜６）することにより、機械への付着が防止され、流動性に優れた噴霧乾燥エキスを調製できた。エキス収率は５％から２０％程度に向上した。
添加量として、濃縮液の固形分に対して２０％程度の添加が望ましい。【００３４】
［実施例７］（中間スケール、噴霧乾燥によるゴボウシエキスの製造）
ゴボウシ細切２ｋｇを水（２２℃）１４Ｌに加えて１時間攪拌した後、エタノール６Ｌを加えて更に１時間加熱還流する。この液を遠心分離し、得られた抽出液約１６Ｌを減圧濃縮し、エキス固形分に対してデキストリン２０％を加えて、噴霧乾燥した。
アルクチイン及びアルクチゲニン含量はそれぞれ７．１％及び６．３％でＡＧ／Ａ比＝０．８９となり、実験室での結果が再現でき、大量のエキスが得られた。【００３５】
［実施例８］（工業スケール、噴霧乾燥によるゴボウシエキスの製造）
ゴボウシ細切８０ｋｇを３０℃に保温した水５６０Ｌに加えて３０分間攪拌した後、エタノール２６５Ｌを加えて８５℃に昇温し、更に３０分間加熱抽出した。この液を遠心分離し、得られた抽出液を得た。この操作を２回繰り返して得られた抽出液を合わせて、減圧濃縮し、エキス固形分に対してデキストリン２０％を加えて、噴霧乾燥した。
アルクチイン及びアルクチゲニン含量はそれぞれ６．８％及び５．９％でＡＧ／Ａ比＝０．８７となり、中間スケールでの結果が再現でき、３１.５ｋｇのエキス粉末（デキストリン２０％含有）が得られた。【００３６】
［比較例２］
（刻み、熱水抽出によるゴボウシエキスの製造）
ゴボウシ細切（8.6号通過）３００ｇを熱水（８０℃）１．５Ｌに加えて１時間加熱還流した後、熱時、ガーゼ４枚(金網１００ｍｅｓｈ)でろ過した。水０．５Ｌで洗浄し、合せた抽出液（１．４Ｌ）を凍結乾燥した。
本原料生薬を通常行われる水を抽出溶媒とし、加熱抽出して得られた熱水抽出エキス中のアルクチイン及びアルクチゲニン含量はそれぞれ２９．２％及び０．９２％で、ＡＧ／Ａ比０．０３であった。ＡＧ／Ａ比率がさらに小さくなっていることからアルクチゲニンはエキスに移行し難いことが確認できた。
【００３７】
【表２】
2010109961.tif 000003
【００３８】
[実施例９]（ゴボウシエキス粉末配合顆粒剤）
（１）実施例８のゴボウシエキス粉末                ３３.３％
（２）乳糖                                        ６５.２％
（３）ヒドロキシプロピルセルロース                 １.５％
合  計                                             １００％【００３９】
（製造方法）
「日局」製剤総則、顆粒剤の項に準じて顆粒剤を製する。すなわち上表に記載の、ゴボウシエキス粉末からヒドロキシプロピルセルロースまでの成分をとり、顆粒状に製し、これを１.５ｇずつアルミラミネートフィルムに充填し１包あたりゴボウシエキス粉末を０.５ｇ含有する実施例９の顆粒剤を得た。【００４０】
[実施例１０]（ゴボウシエキス粉末配合錠剤）
（１）実施例８のゴボウシエキス粉末                ３７.０％
（２）結晶セルロース                              ４５.１％
（３）カルメロースカルシウム                      １０.０％
（４）クロスポピドン                                ３.５％
（５）含水二酸化ケイ素                              ３.４％
（６）ステアリン酸マグネシウム                      １.０％
合  計                                             １００％【００４１】
（製造方法）
「日局」製剤総則、錠剤の項に準じて錠剤を製する。すなわち上表に記載の、ゴボウシエキス粉末からステアリン酸マグネシウムまでの成分をとり、実施例１０の錠剤を得た。【００４２】
［試験例２］（培養細胞を用いた細胞毒性の評価）
（試験方法）
膵臓がん細胞株ＣＡＰＡＮ−１、ＰＡＮＣ−１およびＰＳＮ−１を９６穴プレートに播種し、通常栄養状態のDMEM培地中で３７℃，５％
ＣＯ２／９５％ Ａｉｒで２４時間前培養した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、通常栄養状態のＤＭＥＭ培地（グラフ中：末尾がＤ）及び栄養飢餓培地であるＮＤＭ培地（グラフ中：末尾がＩ）に抽出方法の異なるエキス（グラフ中：実施例２及び比較例２）を、アルクチゲニン濃度を一定にして添加したものを各ウェルに加えて２４時間インキュベーションした。細胞を再びＰＢＳで洗浄し、１０％ＷＳＴ−８を含むＤＭＥＭ培地
１００μＬを加えて２時間反応させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定し、細胞の生存状態を評価した。【００４３】
評価の結果、ゴボウシエキスは、図２〜４に示すごとく、栄養飢餓培地中のすい臓がん細胞株に対して、いずれも顕著な選択的細胞毒性を示した。また、その効果は、エキスにおいてもアルクチゲニンの濃度に依存した、精製アルクチゲニンと同等の抗腫瘍効果を持つことが明らかになった。また、アルクチゲニン（グラフ中：ＡＧ）の前駆体であるアルクチイン（グラフ中：Ａ）には、いずれの条件においても抗腫瘍性は見られなかった。【００４４】
［試験例３］（腫瘍モデル動物における抗腫瘍性の評価）
(試験方法)
腫瘍モデル動物は、ドナーとなるヌードマウス（BALB-cAJ
nu/nu; 日本クレア）の背皮下にヒトすい臓がん細胞株ＣＡＰＡＮ−１もしくは、ＰＳＮ−１を播種し、得られたドナーマウスの腫瘍塊をレシピエントマウスの背皮下に移植することによって作製した。アルクチゲニン(ＡＧ)、アルクチイン（Ａ）およびゴボウシエキス(実施例２)は、ＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したものを生理食塩水で希釈し、マウス1匹あたり５０μｇを１週間に５回、胃内に経口投与した。抗腫瘍性は、背皮下の腫瘍塊のサイズを経時的に計測することによって評価した。【００４５】
投与開始後１ケ月で、コントロールに比べて薬剤投与群に顕著な腫瘍の増殖抑制効果が認められた。また、精製アルクチゲニンの投与群においても抗腫瘍効果が得られたが、前駆体であるアルクチインをともに含んだゴボウシエキス（実施例２）の方が、より強い抗腫瘍効果が見られた（図５、６）。【００４６】
[試験例４]（血中濃度）
（試験方法）
健常男性ボランティア１名を対象に、実施例９の顆粒剤２包（ゴボウシエキス粉末１ｇ）を服用後、経時的（服用前３０分)、０.５時間、１時間、１.５時間、２時間、３時間、４時間、７時間、２４時間）に静脈から約５ｍＬの血液を採取し、血漿サンプルを得た。このようにして得られた血漿サンプル５００μＬに０.１ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム溶液５００μＬ及び内標準溶液(ＩＳ)１００μＬを加えた。これを試験管に移し、メタノール６ｍＬを加えて振り混ぜた後、遠心分離してメタノール層をとり、減圧下乾固し、残留物に７０％アセトニトリル２５０μＬを加えて試料溶液とした。これを以下の条件を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法によって測定し、内標準物質に対するピーク高さ比からアルクチゲニン（ＡＧ）とアルクチゲニンのグルクロン酸抱合体（ＡＧＧ）の濃度をそれぞれ算出した。【００４７】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：ＹＭＣ−ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ−３１２
移動相：０．２％リン酸含有の０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸に水素ナトリウム溶液／アセトニトリル混液（７３．５：２６．５）
カラム温度：４０℃
流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
注入量：１０μＬ
内標準溶液
4-ヒドロキシ安息香酸イソプロピル１０ｍｇを５０％メタノールに溶かし５０ｍＬとし、この液１ｍＬに５０％メタノールを加えて１００ｍＬとし、内標準溶液とする。【００４８】
（試験結果）
ヒト血漿中のＡＧ及びＡＧＧの濃度推移をそれぞれ図７及び８に示した。
図７及び８から明らかなように、本発明のゴボウシエキス粉末の服用により、血中に検出される主な成分はＡＧＧであった。ＡＧ濃度（ＣＡＧ）は、１時間と２時間に２峰性のピークが検出され、最大濃度（Ｃｍａｘ）は０．１５μｇ／ｍＬであった。また、血中からの消失が緩やかであることから、腸―肝循環による影響があることが考えられる。ＡＧＧの血中濃度（ＣＡＧＧ）は１．５時間にピークが認められ、Ｃｍａｘは１０．７μｇ／ｍＬであった。また、２４時間後においても３．６μｇ／ｍＬと血中からの消失は緩やかであり、同様に腸-肝循環による影響が考えられる。このように、本発明のゴボウシエキス粉末の服用により、血中に長時間ＡＧ及びＡＧＧ濃度が維持されることから、生体内での効果が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2010109961.tif 000009
【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年1月18日(2012.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゴボウシに内在するβ-グルコシダーゼにより、アルクチインをアルクチゲニンに酵素変換して抽出することを特徴とする、アルクチゲニンを３％以上含有するアルクチゲニン高含有ゴボウシエキスの製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の製造方法において、アルクチインをアルクチゲニンに酵素変換した後、エタノールを加えて抽出することを特徴とする請求項１に記載のアルクチゲニン高含有ゴボウシエキスの製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の製造方法において、抽出後、濃縮し、凍結乾燥又は噴霧乾燥して製造することを特徴とする請求項１又は２に記載のアルクチゲニン高含有ゴボウシエキスの製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法において、抽出後、濃縮し、デキストリンを添加して噴霧乾燥することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のアルクチゲニン高含有ゴボウシエキスの製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
（試験）アルクチゲニンの酵素変換有効性試験
抽出工程の酵素反応工程（冷浸抽出）において、アルクチインがアルクチゲニンに酵素変換されているか否かの評価を実施した。
［比較例１］
ゴボウシ粗末(18号篩通過)０．１ｇをとり、５０％メタノール５０ｍＬを加えて１時間加熱した後、ろ過する。
［試験例１］
ゴボウシ粗末(18号篩通過) ０．１ｇをとり、水２５ｍＬを加えて振り混ぜ、室温（２２℃）に１時間放置した後、メタノール２５ｍＬを加えて、ろ過する。
試験例１と比較例１で得た濃縮液を以下の分析条件でＨＰＬＣ法により、測定を行った。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2010109961.tif 000012
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2010109961.tif 000013
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2010109961.tif 000014
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2010109961.tif 000015
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
2010109961.tif 000016
【国際調査報告】
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2010109961.tif 000018
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