(57)【要約】本発明は、肥満症またはＩＩ型糖尿病の治療・予防のための医薬組成物および治療法を提供することを目的とする。本発明のＡｃｓｌ−１阻害剤を有効成分として含む医薬組成物は、肥満症またはＩＩ型糖尿病の予防・治療に有用である。
2010079819.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｃｓｌ−１阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする肥満症またはＩＩ型糖尿病を予防及び／又は治療するための医薬組成物。
【請求項２】
前記阻害剤が、Ａｃｓｌ−１の発現を抑制する機能性核酸である請求項１の組成物。
【請求項３】
前記機能性核酸が、ｓｉＲＮＡである請求項２の組成物。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡが、脂肪滴蓄積抑制効果を有するものである請求項３の組成物。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡが、Ａｃｓｌ−１の遺伝子発現を８０％以上抑制できるものである請求項３の組成物。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡが、ＲＮＡにおいて配列番号１７〜４９からなる群より選択されるいずれかの配列を有するｓｉＲＮＡである請求項５の組成物。
【請求項７】
哺乳類に、Ａｃｓｌ−１阻害剤を有効量投与することを特徴とする肥満症及び／またはＩＩ型糖尿病の治療方法。
【請求項８】
前記阻害剤が、Ａｃｓｌ−１の発現を抑制する機能性核酸である請求項７の治療方法。
【請求項９】
前記機能性核酸が、ｓｉＲＮＡである請求項８の治療方法。
【請求項１０】
Ａｃｓｌ−１の発現及び／または作用を阻害することを指標とする肥満症またはＩＩ型糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１１】
ＲＮＡが配列番号１７〜４９からなる群より選択されるいずれかの配列を有するｓｉＲＮＡもしくはその誘導体。
【請求項１２】
３'末端のオーバーハングをさらに含む、請求項１１記載のｓｉＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａｃｓｌ−１の新規用途に関する。より詳細には、本発明は、Ａｃｓｌ−１を用いた肥満症またはＩＩ型糖尿病の予防・治療薬を探索するためのスクリーニング方法、肥満症またはＩＩ型糖尿病の治療方法および肥満症（肥満症における体重管理も含む）またはＩＩ型糖尿病の予防・治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は脂肪組織が全身的に増加した状態をいい、長期間にわたり摂取するエネルギー量が消費するエネルギー量よりも多いときに起きる。肥満は、内臓脂肪型肥満と皮下脂肪型肥満とに分類できる。内臓脂肪型肥満は、大網、腸間膜周囲に存在する腹腔内脂肪の蓄積量が増加する肥満で、糖尿病（特に、インスリン抵抗性を伴うＩＩ型糖尿病）、動脈硬化症、肝臓病、心臓病等を引き起こす元凶の一つとされ、現代社会において大きな問題となっている。【０００３】
糖尿病は、持続的高血糖状態を伴う疾患であり、多くの環境因子と遺伝的因子とが作用した結果に生じるとされている。体内における血糖の主要な調整因子はインスリンであり、高血糖は、インスリン欠乏、または、その作用を阻害する諸因子（例えば、遺伝的素因、運動不足、肥満、ストレスなど）が過剰となって生じる。糖尿病には主として２つの種類があり、自己免疫疾患などによる膵インスリン分泌機能の低下によって生じるＩ型糖尿病と、持続的な高インスリン分泌に伴う膵疲弊による膵インスリン分泌機能の低下が原因であるＩＩ型糖尿病とに分類される。日本人の糖尿病患者の９５%以上はＩＩ型糖尿病と言われており、今日、生活様式の変化に伴う患者数の増加が問題となっている。【０００４】
アシル−ＣｏＡ合成酵素ファミリーに属する酵素（以下、ＡＣＳと略記する）は、長鎖脂肪酸からアシルＣｏＡへ変換する酵素である。アシルＣｏＡは、細胞内脂質合成および脂肪酸分解・伸長反応における基質となることから、ＡＣＳは、細胞内の脂質代謝さらには脂質による細胞内シグナル伝達において中心的な役割を担う。またＡＣＳは、脂肪外脂肪酸の取込みにも関与する（非特許文献１参照）【０００５】
ＡＣＳは、現在までに基質選択性や細胞内局在の異なる５つのアイソザイム（ＡＣＳ１、３、４、５、６）が同定されている（非特許文献２参照）。このファミリーに属する酵素の一つであるＡｃｓｌ−１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ_００１９９５）は、主に肝臓や脂肪組織で発現しており、トリグリセリド（ＴＧ）の合成を触媒する。Ａｃｓｌ−１は、Ａｃｓ１と標記されることもある。【０００６】
ＡＣＳの阻害剤としてＴｒｉａｃｓｉｎＣが知られており、この化合物は５つのアイソザイムのうち１、３、４を阻害することが報告されている（非特許文献３参照）。この化合物については、この他にヒト肝癌細胞株であるＨｕＨ７細胞においてＴＧ蓄積を阻害すること（非特許文献４参照）やヒト正常皮膚繊維芽細胞であるＣＣＤ細胞でジアシルグリセロール、コレステロールエステル、リン脂質合成を阻害することが報告されている（非特許文献５参照）。【０００７】
Ａｃｓｌ−１は、各種癌との関係が報告されており（例えば、特許文献１〜３参照）他に肝硬変や肝繊維性障害（特許文献４参照）、気管支喘息（特許文献５参照）のバイオマーカーになることも報告されている。【０００８】
さらに、特許文献６には、Ａｃｓｌ−１をターゲットとしたアンチセンス化合物について開示されている。明細書中には、この化合物が糖尿病や肥満の治療に有用であることが記載されているが、これはＡｃｓｌ−１が脂肪酸を細胞内へ捕捉する酵素であることから、この酵素の欠損は、脂肪酸輸送タンパク質（ＦＡＴＰ１）と同様の表現型を有するだろうという期待に基づくものである。また、記載の実施例を参照すれば、アンチセンスの設計方法やその活性の確認方法が記載されていることに留まっており、この遺伝子をノックアウト、あるいはノックダウンすることによって、どのような薬理効果が見られるのかまでは確認されていない。【０００９】
しかし、この分野の当業者においては常識であるが、ターゲットの機能とそのインビボ効果は必ず一致するわけではなく、実際には薬理評価によって初めて明らかになるものである。【００１０】
例えば、ＳＣＤ−１（Ｓｔｅａｒｏｙｌ−ＣｏＡ  Ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ−１）は、Ａｃｓｌ−１と代謝マップ上において隣接した脂質代謝に関連する酵素であるが、この酵素を肝臓特異的にノックアウトさせたマウスでも、体重減少の効果が確認できなかったことが示されている（非特許文献６参照）。【００１１】
さらに、マウス肝臓にＡｃｓｌ−１を過剰発現させた場合、肝臓のトリグリセライド量や脂肪酸の蓄積が亢進するものの、体重、摂餌量、肝重量、脂肪重量には変化がないことが報告されていた（非特許文献７参照）。この過剰発現により体重変動が見られないという結果から、今回の知見は予想外であるといえる。 
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第０７／０１０６２８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０７／１１７０３８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／３００４９８９号パンフレット
【特許文献４】特開２００７−２５２３６６号
【特許文献５】特開２００４−１２１２１８号
【特許文献６】国際公開第０４／０１６７４９号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｉｃａｌ．Ｊ、第３２３巻、１−１２ページ、１９９７年
【非特許文献２】Ｊ．Ｎｕｔｒ、第１３２巻、２１２３−２１２６ページ、２００４年
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４４巻、１６３５−１６４２ページ、２００５年
【非特許文献４】Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ第４８巻、１２８０−１２９２ページ、２００７年
【非特許文献５】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ、第３２４巻、５２９−５３４ページ、１９９７年
【非特許文献６】Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  第６巻、４８４−４９６ページ、２００７年
【非特許文献７】Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  第２９１巻  ７３７−７４４ページ、２００６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、肥満症またはＩＩ型糖尿病の治療・予防のための医薬組成物、肥満症またはＩＩ型糖尿病の治療方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、肝臓のＡｃｓｌ−１の発現を抑制することによって体重の増加の抑制および血糖値を降下させることを初めて見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至った。【００１６】
すなわち本発明は、
（１）Ａｃｓｌ−１阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする肥満症及び／またはＩＩ型糖尿病を予防又は治療するための医薬組成物、
（２）前記阻害剤が、Ａｃｓｌ−１の発現を抑制する機能性核酸である上記（１）記載の組成物、
（３）前記機能性核酸が、ｓｉＲＮＡである上記（２）記載の組成物、
（４）前記ｓｉＲＮＡが、脂肪滴蓄積抑制効果を有するものである上記（３）記載の組成物
（５）前記ｓｉＲＮＡが、Ａｃｓｌ−１の遺伝子発現を８０％以上抑制できるものである上記（３）の組成物、
（６）前記ｓｉＲＮＡが、ＲＮＡにおいて配列番号１７〜４９からなる群より選択されるいずれかの配列を有するｓｉＲＮＡである上記（５）の組成物、
（７）哺乳類に、Ａｃｓｌ−１阻害剤を有効量投与することを特徴とする肥満症またはＩＩ型糖尿病の治療方法、
（８）前記阻害剤が、Ａｃｓｌ−１の発現を抑制する機能性核酸である上記（７）記載の治療方法、
（９）前記機能性核酸が、ｓｉＲＮＡである上記（８）記載の治療方法、
（１０）Ａｃｓｌ−１の発現及び／または作用を阻害することを指標とする肥満症またはＩＩ型糖尿病治療薬のスクリーニング方法、
（１１）ＲＮＡが配列番号１７〜４９からなる群より選択されるいずれかの配列を有するｓｉＲＮＡもしくはその誘導体、
（１２）３'末端のオーバーハングをさらに含む、上記（１１）記載のｓｉＲＮＡ、
（１３）肥満症及び／またはＩＩ型糖尿病を予防又は治療するため医薬組成物を製造するためのＡｃｓｌ−１阻害剤の使用、
（１４）前記阻害剤が、Ａｃｓｌ−１の発現を抑制する機能性核酸である上記（１３）の使用、
（１５）前記機能性核酸が、ｓｉＲＮＡである上記（１４）の使用、
（１６）前記ｓｉＲＮＡが、脂肪滴蓄積抑制効果を有するものである上記（１５）の使用
（１７）前記ｓｉＲＮＡが、Ａｃｓｌ−１の遺伝子発現を８０％以上抑制できるものである上記（１５）の使用、および
（１８）前記ｓｉＲＮＡが、ＲＮＡにおいて配列番号１７〜４９からなる群より選択されるいずれかの配列を有するｓｉＲＮＡもしくはその誘導体である上記（１７）の使用、
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、Ａｃｓｌ−１阻害剤を投与することによって高い予防・治療効果を得ることができるため本発明の医薬組成物や治療法は、肥満症またはＩＩ型糖尿病の予防・治療に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】マウスＡｃｓｌ−１  ｖａｒｉａｎｔ  ３  ＯＲＦおよびｓｈＲＮＡの設計のために選択した２７個の配列の位置を示した。
【図２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡｃｓｌ−１発現抑制効果を比較（ｓｈＲＮＡスクリーニング）した結果を示す。ネガティブコントロールを導入した場合を１００％として、各ｓｈＲＮＡを導入したときのＡｃｓｌ−１発現抑制率を示した。内部コントロールレポーターとしてＳＥＡＰ活性を測定することで遺伝子導入効率を補正した。横軸には、ｓｈＲＮＡの種類を示した。
【図３】肝臓Ａｃｓｌ−１の発現解析をした結果を示す。ＨＤ−Ａｄを投与したＤＩＯマウスにおける肝臓Ａｃｓｌ−１発現をｍＲＮＡレベル（定量ＰＣＲ）と蛋白質レベル（ウエスタンブロット）で解析した。ｍＲＮＡレベルは内部標準としてＧＡＰＤＨを定量して補正し、Ｃｏｎｔｒｏｌを１００％として算出したときの発現量を示している。実験１とはＨＤ−Ａｄ−Ｕ６（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＨＤ−Ａｄ−Ｕ６−Ａｃｓｌ１−Ｉ１２（Ａｃｓｌ１−Ｉ１２）を投与した実験、実験２とはＨＤ−Ａｄ−Ｕ６（Ｃｏｎｔｒｏｌ）ＨＤ−Ａｄ−Ｕ６−Ａｃｓｌ１−Ｉ１６（Ａｃｓｌ１−Ｉ１６）を投与した実験を示す（以下、同じ）。
【図４】Ａｃｓｌ−１発現抑制による体重増加抑制効果を示す。ＨＤ−Ａｄを投与したＤＩＯマウスの体重（左図）と体重増加率（右図）の経時変化をグラフにした。グラフの縦軸に体重または体重増加率、横軸にウイルス投与後日数を示した。体重増加率はウイルス投与３日後の体重を１００％として算出した。
【図５】Ａｃｓｌ−１発現抑制による摂餌量への影響を示す。ＨＤ−Ａｄを投与したＤＩＯマウス摂餌量の経時変化をグラフにした。グラフの縦軸に摂餌量を、横軸にウイルス投与後日数を示した。摂餌量とは１日に摂取した餌量をマウスの体重で除した値である。
【図６】Ａｃｓｌ−１発現抑制による高血糖改善効果を示す。ＨＤ−Ａｄ投与前と投与４週間後におけるＤＩＯマウスの血糖値をグラフにした。
【図７】Ａｃｓｌ−１発現抑制によるＧＯＴへの影響を示す。ＨＤ−Ａｄ投与前と投与４週間後におけるＤＩＯマウスのＧＯＴ値をグラフにした。
【図８】Ａｃｓｌ−１発現抑制によるインスリン抵抗性改善を示す。ＨＤ−Ａｄ投与前と投与４週間後におけるＤＩＯマウスの血中インスリン値をグラフにした。
【図９】Ａｃｓｌ−１発現抑制による血中総コレステロールの低下を示す。ＨＤ−Ａｄ投与前と投与４週間後におけるＤＩＯマウスの血漿中総コレステロール値をグラフにした。
【図１０】Ａｃｓｌ−１発現抑制による脂肪肝の改善を示す。ＨＤ−Ａｄ投与４週間後におけるＤＩＯマウス肝臓トリグリセライドの値をグラフにした。
【図１１】ＨＤ−Ａｄ投与４週間後におけるＤＩＯマウスの肝臓遊離コレステロールの値をグラフにした。
【図１２】ＨＤ−Ａｄ投与４週間後におけるＤＩＯマウスの肝臓遊離脂肪酸の値をグラフにした。
【図１３】ヒトＡｃｓｌ−１のｍＲＮＡとマウスＡｃｓｌ−１のｍＲＮＡにおける共通配列リスト。
【図１４】ヒトＡｃｓｌ−１のｍＲＮＡとマウスＡｃｓｌ−１のｍＲＮＡにおける共通配列リスト。
【図１５】ヒトＡｃｓｌ−１のｍＲＮＡとマウスＡｃｓｌ−１のｍＲＮＡにおける共通配列リスト。
【図１６】ヒトＡｃｓｌ−１のｍＲＮＡとマウスＡｃｓｌ−１のｍＲＮＡにおける共通配列リスト。
【図１７】ヒトＡｃｓｌ−１のｍＲＮＡとマウスＡｃｓｌ−１のｍＲＮＡにおける共通配列リスト。
【図１８】ＨｅｐＧ２における合成Ａｃｓｌ−１  ｓｉＲＮＡの抑制効果を比較した結果を示す。Ａｃｓｌ−１  ｍＲＮＡ発現が赤点線より下回る合成ｓｉＲＮＡ（＃４１、５３、５６、６４、２０２，２０７）はＨｓ＿ＡＣＳＬ１＿４＿ＨＰ  ｓｉＲＮＡ（Ａｃｓｌ−１  ＰＣ）以上の抑制効率を示し、抗肥満および高血糖治療薬として期待できると考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
（A）本発明の医薬組成物及び治療法
【００２０】
本発明の一つの態様としては、「Ａｃｓｌ−１阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする肥満症またはＩＩ型糖尿病を予防又は治療するための医薬組成物」および「Ａｃｓｌ−１阻害剤を有効量投与することを特徴とする肥満症またはＩＩ型糖尿病の治療方法」が挙げられる。ここで「Ａｃｓｌ−１」は公知のタンパク質である（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ_００１９９５）。Ａｃｓｌ−１のＤＮＡ配列を配列表の配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に記載する。本発明における「Ａｃｓｌ−１」は、これらの配列に限定されるものではなく、配列番号２で表されるポリペプチドの機能が保持される限り、アミノ酸やＤＮＡの変異数や変異部位に制限はないものとする。
【００２１】
本発明において「Ａｃｓｌ−１阻害剤」とは、Ａｃｓｌ−１遺伝子（特にヒトＡｃｓｌ−１遺伝子）の発現またはその遺伝子産物の活性を阻害しうる物質を意味する。ここで、阻害剤の例としては遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼす物質や遺伝子産物の活性に影響を及ぼす物質などである。Ａｃｓｌ−１阻害剤には、またＡｃｓｌ−１プロモーター阻害剤も含まれるものとする。こうした阻害剤の例としては核酸、たとえばアンチセンス、ｓｉＲＮＡまたはそれらを含むベクターなど; ポリペプチド、たとえば優性阻害体（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）、抗体(配列番号２において示される連続したアミノ酸配列を含むポリペプチド内のエピトープと特異的に結合する抗体など)、または酵素など; 触媒型ＲＮＡ、たとえばリボザイムなど;アプタマー; 低分子量(たとえば分子量２０００Ｄａ未満の)の化学分子などである。これらの阻害剤は、例えば本明細書で開示するスクリーニング方法により選別することができる。
【００２２】
本発明において「Ａｃｓｌ−１阻害剤」の好ましい形態は、「機能性核酸」である。ここで「機能性核酸」とは、細胞内のＤＮＡやｍＲＮＡなどの内在性遺伝子の発現抑制の他、ＤＮＡやｍＲＮＡが有する転写や翻訳などタンパク質を合成する一連の過程において作用して本来有する機能を抑制できる核酸を意味する。例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムまたはこれらを含む発現ベクターなどである。本発明の機能性核酸は、Ａｃｓｌ−１の発現を抑制しうる核酸である。ここで、発現の抑制とは、対照群と比較した場合に、本来のｍＲＮＡやタンパク質の発現量の７０％以上を、好ましくは８０％以上を抑制することを意味する。
【００２３】
本発明において「機能性核酸」の好ましい形態は、アンチセンスである。より具体的には配列番号:１のヌクレオチド配列内の任意の部位とハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、かつＡｃｓｌ−１の発現を阻害するものである。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号:１のヌクレオチド配列の少なくとも約15個の連続したヌクレオチドに対するものである。上記の少なくとも15個の連続したヌクレオチドにおいて開始コドンを含む、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、さらにより好ましい。
【００２４】
本明細書で用いる「アンチセンス核酸」という用語は、標的配列に完全に相補的なヌクレオチド、およびアンチセンス核酸が標的配列に特異的にハイブリダイズし得る限り、1つまたは複数のヌクレオチドのミスマッチを有するヌクレオチドの両方を包含する。例えば、本発明のアンチセンス核酸には、少なくとも15個の連続したヌクレオチドの範囲にわたって、少なくとも約70％またはそれ以上、好ましくは少なくとも約80％またはそれ以上、より好ましくは少なくとも約90％またはそれ以上の相同性を有するポリヌクレオチドが含まれる。相同性の決定には、当技術分野において公知のアルゴリズムを使用することができる。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体または修飾産物を、本発明でアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることもできる。そのような修飾産物の例には、メチル-ホスホネート型またはエチル-ホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾物、ホスホロチオエート修飾物、およびホスホロアミデート修飾物が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明において「機能性核酸」の別の好ましい形態は、ｓｉＲＮＡである。本発明のｓｉＲＮＡとは、Ａｃｓｌ−１の遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡをさす。具体的には、対照群と比較してＡｃｓｌ−１の遺伝子発現を７０％以上抑制できるｓｉＲＮＡを、好ましくは８０％以上抑制できるｓｉＲＮＡをいう。なぜなら、このような抑制率を有するｓｉＲＮＡは、体重変動抑制効果、血糖値上昇抑制効果および脂肪滴蓄積抑制効果を有していると考えられるからである。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉と呼ばれる配列特異的な遺伝子発現の抑制を誘導することが知られている。ｓｉＲＮＡは、一般的に二本鎖ＲＮＡ部分と、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３'末端のオーバーハング部分から構成される。ただし、３'末端のオーバーハング部分については必須ではなく、オーバーハング部分をもたない二本鎖ｓｉＲＮＡ（ブラントエンド型）も本発明に含まれる。
【００２６】
前記３'末端のオーバーハングとは、５'末端から１９ｍｅｒが相補的な配列である２本の２１ｍｅｒのＲＮＡ鎖が対合して二本鎖を形成したとき１９塩基対の両端から突出する３'末端の部分をいう。構成するヌクレオチドの個数は特に、限定されないが２個程度が好ましい。本発明のｓｉＲＮＡの３'末端オーバーハングの２塩基の配列は、例えば、両端ともＴＴ（チミン・チミン）が好ましい。なお、前記３'オーバーハングの２塩基の配列は、これに制限されず、遺伝子発現を抑制する効果や体重変動抑制効果、血糖値上昇抑制効果および脂肪滴蓄積抑制効果などに実質的に影響を及ぼさない範囲であれば、任意の天然核酸塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシシル）、並びに、天然及び人工の公知の修飾塩基であってもよい。また、前記３'末端オーバーハング部分のヌクレオチドは、通常、リボヌクレオチドを使用できるがこれに制限されず、遺伝子発現を抑制する効果や体重変動抑制効果、血糖値上昇抑制効果および脂肪滴蓄積抑制効果などに実質的に影響を及ぼさない範囲であれば、デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、その他の公知のヌクレオチド類似体を使用してもよい。さらに、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、必要に応じて、前記３'末端オーバーハングに代えて、５'末端オーバーハングとしてもよい。
【００２７】
ｓｉＲＮＡは、当業者にとって公知である方法によって設計することができる。例えば、選択したＤＮＡ配列（１９〜２１塩基が望ましい）をそのままＲＮＡ配列に変換したもの(センス鎖)とそのアンチセンス鎖を組み合わせて二本鎖ＲＮＡ部分とし、オーバーハング部を付加する。本発明のｓｉＲＮＡは、Ａｃｓｌ−１、好ましくはヒトのＡｃｓｌ−１のＤＮＡ配列（配列番号１）に基づいて設計され、Ａｃｓｌ−１の発現を抑制できるｓｉＲＮＡであれば、特に限定されるものではない。発現の抑制は、Ａｃｓｌ−１に特異的であることが望ましい。ここで、「特異的」とは、オフターゲット効果が抑制され、好ましくはオフターゲット効果がないことをいう。すなわち、Ａｃｓｌ−１遺伝子以外の遺伝子にＲＮＡｉ効果を好ましくは及ぼすことがない、非常に高い特異性を示すことをいう。特異的であるかどうかは、一般公開されているＢＬＡＳＴ検索を実施することにより確認できる。
【００２８】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡに含まれる核酸配列としては、下記表１（又は図１３〜１７）に記載のNo.４１、５３、５６、６４、８１、９８、１００、１０１、１０２、１１１、１１２、１１７、１１８、１１９、１２１、１２５、１２６、１３７、１３８、１３９、１５０、１５３、１６１、１６３、１６４、１６５、１６６、１７８、１９０、１９５、２０１、２０２及び２０７（それぞれ、配列表の配列番号１７〜４９の配列）の３３種類が使用されるのが好ましく、５３、１００、１１８、１１９、１２５、１６５、１３９、及び１６３がより好ましい。
【００２９】
本発明には、ｓｉＲＮＡの「誘導体」も包含される。ｓｉＲＮＡの「誘導体」とは、Ａｃｓｌ−１遺伝子特異的な遺伝子発現を抑制できる範囲において、単一または複数、例えば少なくとも２個、少なくとも４個、または少なくとも６個、および好ましくは３個まで、４個まで、５個まで、６個まで、１０個まで、１５個まで、または２０個までのヌクレオチド置換、欠失および／または付加が、前記核酸中に存在することを意味する。さらにまた、「誘導体」という用語には、ヌクレオチド塩基、糖またはリン酸基における核酸の化学的誘導体も含まれる。
【００３０】
本明細書で用いる場合、用語「ＲＮＡ」は、少なくとも一つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボ−フラノース部分の２'位にヒドロキシル基を持つヌクレオチドを意味する。この用語は改変ＲＮＡも包含する。そのような改変として、例えばＲＮＡの末端への、または内部、例えばＲＮＡの一または二個以上のヌクレオチドに、非ヌクレオチド物質を付加することを含むことができる。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、例えば自然発生しないヌクレオチドまたは化学合成ヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなども含むことができる。
【００３１】
本発明のｓｉＲＮＡの製造方法は、インビトロで化学的又は酵素的に合成しても、又は、インビボで合成してもよく、その製法は特に制限されないが、なかでも、従来公知の方法により化学合成して製造することが好ましい。合成二本鎖ｓｉＲＮＡであれば、濃度調節が容易となり臨床応用に際してインターフェロン応答の回避が容易となる。また、コンタミネーションの防止が容易であり安全性においても利点がある。例えば、本発明の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡのNo.４１を製造する場合、まず、配列表の配列番号１７の配列の３'末端に２塩基のオーバーハングを加えた２１ｍｅｒのＲＮＡ鎖、及び、前記配列番号１７の配列の相補配列の３'末端に２塩基のオーバーハングを加えた２１ｍｅｒのＲＮＡ鎖をそれぞれ化学合成する。次に、前記２本のＲＮＡ鎖が対合する条件で対合させ、本発明の２１塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡを得る。使用に際しては、必要に応じて、従来公知の方法により適宜精製することが好ましい。
【００３２】
また本発明のｓｉＲＮＡには、投与対象内で本発明のｓｉＲＮＡと同じ効果を有する任意の分子も含まれる。このような分子としては、例えば、ｓｈＲＮＡが挙げられる。ｓｈＲＮＡとはショートヘアピン構造型のＲＮＡであり、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するＲＮＡ分子である。二本鎖ＲＮＡ部分が、本発明のｓｉＲＮＡと同一構造を有するｓｈＲＮＡも本発明のｓｉＲＮＡに含まれる。他には、投与対象に投与することによって本発明のｓｉＲＮＡを発現することができるようなＤＮＡも本発明のｓｉＲＮＡに含まれる。このようなＤＮＡは、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを発現ベクター（例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなどのベクター）に組み込んで構築して使用される。
【００３３】
本発明者らは、Ａｃｓｌ−１阻害剤として、Ａｃｓｌ−１の発現を抑制できるｓｉＲＮＡを哺乳類に投与して体重増加率の抑制や血糖値の降下が見られることを確認した。さらに、Ａｃｓｌ−１の発現を抑制できるｓｉＲＮＡは、脂肪滴蓄積抑制効果があることを確認した。ここで、脂肪滴蓄積抑制とは脂肪細胞、肝臓、骨格筋において過剰な脂肪蓄積を抑制できることであり、この現象によって肥満の改善やインスリン抵抗性の改善が期待できる）。これらの知見は、Ａｃｓｌ−１阻害剤を有効量投与することや、Ａｃｓｌ−１阻害剤を有効成分として含む医薬組成物が、肥満症（特に内臓脂肪型肥満症）や糖尿病（特にＩＩ型糖尿病）の治療・予防に有効であることを示唆するものである。
【００３４】
本明細書において、「肥満症」とは内臓又は皮下に脂肪が蓄積する肥満をいう。本発明の阻害剤は、特に、例えば大網、腸間膜周囲等の内臓周囲に脂肪が蓄積する内臓脂肪型肥満症に対して顕著な効果を有する。内臓等の脂肪が増加すると、脂肪細胞から放出されるＴＮＦα（腫瘍壊死因子）や遊離脂肪酸が末梢細胞におけるインスリンの作用を減弱させてインスリン抵抗性となり、血糖が上昇しＩＩ型糖尿病を誘発し得る。また、内臓脂肪型肥満症では血中の脂質も増加し、動脈硬化症を併発し得る。本発明のＡｃｓｌ−１阻害剤は、肥満症の予防又は治療と同時に、肥満症における体重管理、肥満症に伴う、糖尿病（特にインスリン抵抗性を伴うＩＩ型糖尿病）や動脈硬化症に対しても有用である。
【００３５】
Ａｃｓｌ−１阻害剤の有効成分が、機能性核酸である場合については、その治療効果を改善するための修飾、あるいはリポソームなどの輸送担体に含包することが望ましい。機能性核酸の治療薬としての効果を改善するには、ヌクレオチドの修飾または類似体を導入することができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性の向上および/または細胞透過性の向上などである。ヌクレアーゼ耐性は、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび/またはリボザイムの生理活性を妨げないような技術上周知の任意の方法によりもたらされる。ヌクレアーゼ耐性の向上を目的にオリゴヌクレオチドに加えることができる修飾の例としては、リン酸骨格中のヘテロ原子のリンまたは酸素の修飾である。例えば、メチルリン酸、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびモルホリノオリゴマーなどである。また、技術上周知の他の修飾により、生理活性は維持したまま、ヌクレアーゼに対する安定性を大幅高めるようにしてもよい。
【００３６】
Ａｃｓｌ−１阻害剤の有効成分が、機能性核酸である場合については、ｉｎ  ｖｉｖｏ発現、特に本発明の治療を必要とする患者体内での発現に際しては、発現ベクター、特に哺乳動物発現ベクターを使用するのが望ましい。発現ベクターは技術上周知であり、好ましくはプラスミド、コスミド、ウイルス発現系を含む。好ましいウイルス発現系の例としてはアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスなどである。また細胞や組織にベクターを導入する方法は技術上周知である。好ましい例としては、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、および組み換えウイルスベクターによる感染などである。
【００３７】
肥満症またはＩＩ型糖尿病の治療においては、上記のＡｃｓｌ−１阻害剤をそのまま用いてもよいが、通常は、製剤学的に許容しうる１又は２種以上の製剤用添加物を用いて該阻害剤を有効成分として含む医薬組成物を製造して投与することが好ましい。Ａｃｓｌ−１阻害剤を医薬組成物として使用する場合は、通常行われる手段に従って、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして、あるいは無菌性溶液、懸濁液剤、凍結乾燥製剤などの注射剤とすることができる。
【００３８】
Ａｃｓｌ−１阻害剤の投与方法は経口投与でも非経口投与でもよく、非経口投与の形態も特に限定されず、静脈投与、筋肉内投与、腹腔内投与、または皮下投与などを行うことができる。
【００３９】
Ａｃｓｌ−１阻害剤の投与量は、投与対象、投与方法等により異なるが、例えば経口投与の場合は、患者（６０ｋｇ）に対して、一日約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口投与する場合は、例えば、患者（６０ｋｇ）に対して、一日約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射することができる。
（Ｂ）本発明のスクリーニング方法
【００４０】
本発明の別の態様として、Ａｃｓｌ−１の発現及び／または作用を阻害することを指標とする肥満症またはＩＩ型糖尿病治療薬のスクリーニング方法が挙げられる。前述したように、本発明者らは、Ａｃｓｌ−１遺伝子の発現の抑制が、肥満やＩＩ型糖尿病に深く関わっていることを見出した。このことから、Ａｃｓｌ−１が肥満またはＩＩ型糖尿病の進行に関わっており、Ａｃｓｌ−１遺伝子の発現（ｍＲＮＡ発現）を抑制してＡｃｓｌ−１の産生量を低下する作用を有する物質、またはＡｃｓｌ−１の作用を低下する作用を有する物質は、肥満症またはＩＩ型糖尿病の予防または治療に有効な成分として有用であると考えられる。
【００４１】
下記に説明する本発明のスクリーニング方法は、被験物質の中から、（Ｂ−１）Ａｃｓｌ−１遺伝子の発現（ｍＲＮＡ発現）を抑制する作用を有する物質、（Ｂ−２）Ａｃｓｌ−１の産生量を低下する作用を有する物質、または（Ｂ−３）Ａｃｓｌ−１の作用を低下する作用を有する物質、を探索することによって、肥満症またはＩＩ型糖尿病の治療・予防剤（以下、これらを総称して「抗肥満剤等」ともいう）の有効成分を取得しようとするものである。
【００４２】
なお、抗肥満剤等の有効成分となりえる候補物質としては、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物（低分子化合物、高分子化合物を含む）、無機化合物などを挙げることができる。本発明のスクリーニング方法は、これらの候補物質を含む試料を対象として実施することができる（これらを総称して「被験物質」という）。ここで、候補物質を含む試料には、細胞抽出物、遺伝子ライブラリーの発現産物、微生物培養上清、および菌体成分などが含まれる。
【００４３】
(Ｂ−１) Ａｃｓｌ−１遺伝子の発現を抑制する作用を有する物質のスクリーニング方法
当該スクリーニングは、被験物質の中から、Ａｃｓｌ−１遺伝子の発現を抑制する作用を有する物質を、Ａｃｓｌ−１ ｍＲＮＡの発現量を指標として探索し、抗肥満剤等の有効成分として取得する方法である。
【００４４】
当該方法は、具体的には下記の工程（１）〜（３）を行うことによって実施することができる。
（１）被験物質とＡｃｓｌ−１遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のＡｃｓｌ−１遺伝子の発現量を測定する工程、及び
（３）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞のＡｃｓｌ−１遺伝子の発現量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【００４５】
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、天然または組み換え体の別を問わず、Ａｃｓｌ−１遺伝子を発現し得る細胞であればよい。なおＡｃｓｌ−１遺伝子の由来も特に制限されず、ヒト由来であっても、またヒト以外のマウスなどの哺乳類やその他の生物種に由来するものであってもよいが、好ましくはヒト由来のＡｃｓｌ−１遺伝子である。
【００４６】
また、定法に従って、Ａｃｓｌ−１遺伝子のｃＤＮＡを有する発現ベクターを導入してＡｃｓｌ−１  ｍＲＮＡを発現可能な状態に調製された形質転換細胞を使用することもできる。なお、スクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
【００４７】
本発明のスクリーニング方法（Ｂ−１）の工程（１）において、被験物質とＡｃｓｌ−１遺伝子発現可能細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、当該細胞が死滅せず、且つＡｃｓｌ−１遺伝子が発現し得る培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択することが好ましい。
【００４８】
候補物質の選別は、例えば上記条件で被験物質とＡｃｓｌ−１遺伝子発現可能細胞とを接触させて、Ａｃｓｌ−１遺伝子の発現を抑制させてそのｍＲＮＡの発現量を低下させる物質を探索することによって行うことができる。具体的には、被験物質存在下でＡｃｓｌ−１遺伝子発現可能細胞を培養した場合のＡｃｓｌ−１  ｍＲＮＡの発現量が、被験物質非存在下で上記に対応するＡｃｓｌ−１遺伝子発現可能細胞を培養した場合に得られるＡｃｓｌ−１  ｍＲＮＡの発現量（対照発現量）よりも小さいことを指標として、細胞と接触させた当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【００４９】
Ａｃｓｌ−１  ｍＲＮＡの発現量の測定（検出、定量）は、Ａｃｓｌ−１遺伝子発現可能細胞のＡｃｓｌ−１  ｍＲＮＡの発現量を、当該Ａｃｓｌ−１  ｍＲＮＡの塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドなどを利用したノーザンブロット法やＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイム定量ＰＣＲ法などの公知の方法、またはＤＮＡアレイを利用した測定方法を実施することなどにより行うことができる。
【００５０】
(Ｂ−２) Ａｃｓｌ−１の産生を低下させる作用を有する物質のスクリーニング方法
当該スクリーニングは、被験物質の中から、Ａｃｓｌ−１の産生を低下させる作用を有する物質を、Ａｃｓｌ−１の産生量を指標として探索し、抗肥満剤等の有効成分として取得する方法である。
【００５１】
当該方法は、具体的には下記の工程（１’）〜（３’）を行うことによって実施することができる。
（１’）被験物質とＡｃｓｌ−１を産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
（２’）被験物質を接触させた細胞または細胞画分のＡｃｓｌ−１の産生量を測定する工程、及び
（３’）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞（Ａｃｓｌ−１を産生可能な細胞）または被験物質を接触させない細胞画分（Ａｃｓｌ−１を産生可能な細胞から調製）のＡｃｓｌ−１の産生量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【００５２】
かかるスクリーニングに用いられる細胞（対照細胞を含む）としては、天然または組み換え体の別を問わず、Ａｃｓｌ−１遺伝子が発現してＡｃｓｌ−１を産生し得る細胞であればよい。なおＡｃｓｌ−１遺伝子の由来も特に制限されず、ヒト由来であっても、またヒト以外のマウスなどの哺乳類やその他の生物種に由来するものであってもよいが、好ましくはヒト由来のＡｃｓｌ−１遺伝子である。
【００５３】
また、定法に従って、Ａｃｓｌ−１遺伝子のｃＤＮＡを有する発現ベクターを導入してＡｃｓｌ−１を産生可能な状態に調製された形質転換細胞を使用することもできる。なお、スクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
【００５４】
本発明のスクリーニング方法（Ｂ−２）の工程（１’）において、被験物質とＡｃｓｌ−１産生可能細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、当該細胞が死滅せず、且つＡｃｓｌ−１遺伝子が発現し且つＡｃｓｌ−１が産生し得る培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択することが好ましい。
【００５５】
候補物質の選別は、例えば上記条件で被験物質とＡｃｓｌ−１産生可能細胞またはその細胞画分とを接触させて、Ａｃｓｌ−１の産生量を低下させる物質を探索することによって行うことができる。具体的には、被験物質存在下でＡｃｓｌ−１産生可能細胞またはその細胞画分を培養した場合のＡｃｓｌ−１産生量が、被験物質非存在下で上記に対応するＡｃｓｌ−１産生可能細胞またはその細胞画分を培養した場合に得られるＡｃｓｌ−１の産生量（対照産生量）よりも小さいことを指標として、細胞または細胞画分と接触させた当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【００５６】
Ａｃｓｌ−１産生量の測定（検出、定量）は、Ａｃｓｌ−１産生可能細胞またはその細胞画分から得られるＡｃｓｌ−１の量を、当該Ａｃｓｌ−１に対する抗体（抗Ａｃｓｌ−１抗体）を利用してウエスタンブロット法や免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ等の公知の方法を行うことによって実施することができる。
【００５７】
(Ｂ−３)Ａｃｓｌ−１の作用を低下させる作用を有する物質のスクリーニング方法
当該スクリーニングは、被験物質の中から、Ａｃｓｌ−１の作用を低下させる作用を有する物質を、Ａｃｓｌ−１の作用を指標として探索し、抗肥満剤等の有効成分として取得する方法である。
【００５８】
当該方法は、具体的には下記の工程（１”）〜（３”）を行うことによって実施することができる。
（１”）被験物質とＡｃｓｌ−１を産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分を接触させる工程、
（２”）被験物質を接触させた細胞または細胞画分のＡｃｓｌ−１の作用を検出する工程、及び
（３”）上記の検出した作用が、被験物質を接触させない対照細胞（Ａｃｓｌ−１を産生可能な細胞）または細胞画分（Ａｃｓｌ−１を産生可能な細胞から調製）のＡｃｓｌ−１の作用よりも低い被験物質を選択する工程。
【００５９】
当該スクリーニングで用いられる細胞、並びに工程(２”)において被験物質と接触させ
る方法や条件は、前述する（Ｂ−２）のスクリーニング方法にて記載したものを同様に使用することができる。
【００６０】
候補物質の選別は、上記条件で被験物質とＡｃｓｌ−１産生可能細胞またはその細胞画分とを接触させて、Ａｃｓｌ−１の作用を低下させる物質を探索することによって行うことができる。具体的には、被験物質存在下でＡｃｓｌ−１産生可能細胞またはその細胞画分を培養した場合に生じるＡｃｓｌ−１の作用が、被験物質非存在下で上記に対応するＡｃｓｌ−１産生可能細胞または細胞画分を培養した場合に得られるＡｃｓｌ−１の作用（対照作用）よりも低いことを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【００６１】
ここで、Ａｃｓｌ−１の作用としては、例えば、アシル−ＣｏＡ合成酵素活性が挙げられる。この測定自体は公知の方法（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２５６、５７０２−５７０７、１９８１年）に従って測定することができる。
【００６２】
上記（Ｂ−１）〜（Ｂ−３）のスクリーニング方法で選別された物質は、細胞においてＡｃｓｌ−１遺伝子の発現を抑制してＡｃｓｌ−１の産生を低下させるか、またはＡｃｓｌ−１の作用を低下させる作用を有するものであり、肥満症またはＩＩ型糖尿病やその進行を予防する組成物または肥満症またはＩＩ型糖尿病を改善する組成物の有効成分として使用することが可能である。上記のスクリーニング方法によって選別された候補物質は、さらに肥満症またはＩＩ型糖尿病を有する病態非ヒト動物を用いてスクリーニングにかけることもできる。かくして選別される候補物質は、さらに肥満症またはＩＩ型糖尿病を有する病態非ヒト動物を用いた薬効試験、安全性試験、さらに肥満症またはＩＩ型糖尿病を有する患者（ヒト）もしくはその前状態にある患者（ヒト）への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的な肥満症またはＩＩ型糖尿病の予防または治療用組成物の有効成分を選別取得することができる。
【００６３】
このようにして選別された物質は、必要に応じて構造解析を行った後、その物質の種類に応じて、化学的合成、生物学的合成（発酵を含む）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができ、肥満症またはＩＩ型糖尿病予防・治療用組成物の創製に使用することができる。
【００６４】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、実施例は本発明をより良く理解するために例示するものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されることを意図するものではない。
【実施例１】
【００６５】
ｓｈＲＮＡ設計と二本鎖オリゴＤＮＡの作製
以下のとおり、マウスＡｃｓｌ−１  ｖａｒｉａｎｔ  ３  ＯＲＦ（Ｒｅｆｓｅｑ  ＩＤ  ＸＭ＿９９１２２８）に対してｓｈＲＮＡを設計した。まず、センスターゲット配列として、３’末端側の７塩基のうち４塩基がアデニンまたはチミンであること、およびチミンが連続して４塩基つながっていないことを条件として、上記遺伝子に連続して１９塩基が完全一致する配列を２７個選択した（図１）。これらの各センスターゲット配列に対する相補配列をアンチセンスターゲット配列とする。次に、センスターゲット配列とアンチセンスターゲット配列間にループ配列（ＴＴＣＡＡＧＡＧＡまたはＡＴＣＡＡＧＡＧＡ）を挿入し、アンチセンスターゲット配列の３’末端側にＰｏｌ IIIターミネーター配列であるＴＴＴＴＴＴ配列を連結させたｔｏｐ  ｓｔｒａｎｄ  ｏｌｉｇｏ  ＤＮＡを設計した。さらに５’末端側にＢａｍＨＩ制限酵素部位と３’末端側にＮｏｔＩ制限酵素部位を導入しｔｏｐ  ｓｔｒａｎｄ  ｏｌｉｇｏ  ＤＮＡ−ＢＮ とした。このｔｏｐ  ｓｔｒａｎｄ  ｏｌｉｇｏ  ＤＮＡ−ＢＮと相補的な配列をｂｏｔｔｏｍ  ｓｔｒａｎｄ  ｏｌｉｇｏ  ＤＮＡ−ＮＢとした。ｔｏｐ  ｓｔｒａｎｄ  ｏｌｉｇｏ  ＤＮＡ−ＢＮとｂｏｔｔｏｍ  ｓｔｒａｎｄ  ｏｌｉｇｏ  ＤＮＡ−ＮＢを１００μＭとなるようにＴＥ緩衝液〔組成：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ８．０）〕に溶解し、各１０μＬずつをマイクロチューブへ入れ、さらに最終濃度０．１ＭとなるようにＮａＣｌを添加した。この混合液が入ったマイクロチューブを１００度に設定したヒートブロックへ入れ、４分加熱した後、室温に戻し冷却するまで放置し、二本鎖オリゴＤＮＡを調製した（アニーリング）。
【実施例２】
【００６６】
マウスＡｃｓｌ−１遺伝子のクローニングと発現ベクターの構築
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ(日本チャールスリバー)肝臓からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ)を用いて添付マニュアルに従いＤＮａｓｅ  Ｉ処理した後、全ＲＮＡを回収した。続いてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔIII Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ (ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ) を用いて添付マニュアルに従いｃＤＮＡ合成を行った。このｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしてＡｃｓｌ−１クローニング用プライマー（配列番号３、４）とＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ(ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ)を用いて９８℃  １０秒、６８℃  １０秒、７２℃  １分を１０回繰り返す条件でＰＣＲを行うことにより、５'末端側にＮｏｔＩ制限酵素部位を３'末端側にＸｈｏＩ制限酵素部位を導入したマウスＡｃｓｌ−１(ｖａｒｉａｎｔ３)遺伝子の断片を得た。得られた断片をＮｏｔＩとＸｈｏＩ処理した後、予めＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ処理したｐＣＲ３．１(ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)へ連結させて発現ベクター（ｐＣＲ３．１−Ａｃｓｌ−１）を作製した。
【実施例３】
【００６７】
ｓｈＲＮＡ発現ベクターの構築
ｐＳｈｕｔｔｌｅベクター（クロンテック）をＸｂａＩとＳｐｅＩ消化して、ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ領域を除いた後、ｈｕｍａｎ  Ｕ６  ｐｒｏｍｏｔｅｒを挿入しｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｕ６とした。このｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｕ６をＢａｍＨＩとＮｏｔＩで処理し、実施例１に示す方法で作製した二本鎖オリゴＤＮＡを組み込み、ｓｈＲＮＡ発現ベクターを作製した。
【実施例４】
【００６８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡｃｓｌ−１発現抑制効果の検討（ｓｈＲＮＡスクリーニング）
実施例２で作製したマウスＡｃｓｌ−１発現ベクター（ｐＣＲ３．１−Ａｃｓｌ−１）と実施例３で作製したｓｈＲＮＡ発現ベクターまたはネガティブコントロールとしてｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｕ６をＨＥＫ２９３細胞へｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、Ａｃｓｌ−１の ｍＲＮＡ量を測定することでｓｈＲＮＡ配列によるＡｃｓｌ−１発現抑制率を比較した。１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下でＨＥＫ２９３細胞を培養した。トランスフェクション前日にＨＥＫ２９３細胞を１２ウェルプレートに播種し、２４時間培養後、ＦｕＧｅｎｅ(ロシュ)を用いてｓｈＲＮＡ発現ベクター４００  ｎｇとＡｃｓｌ−１発現ベクターまたはｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｕ６ ６００  ｎｇと内部コントロールレポーターとして分泌型アルカリフォスファターゼを発現するベクター１００  ｎｇを添付マニュアルに従い、ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。トランスフェクションから４日後に、培地を回収してＢＤ  ＧｒｅａｔＥｓｃＡｐｅ  ＳＥＡＰ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて添付マニュアルに従いＳＥＡＰ活性を測定した。続いて細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ)を用いて添付マニュアルに従いＤＮａｓｅ  Ｉ処理した後、全ＲＮＡを回収し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔIII Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ (ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ) を用いて添付マニュアルに従いｃＤＮＡ合成を行った。合成したｃＤＮＡを鋳型としてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉによるリアルタイム定量ＰＣＲを行ない、Ａｃｓｌ−１ ｍＲＮＡ量を定量した。リアルタイム定量ＰＣＲは反応試薬としてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （ＡＢＩ）を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００リアルタイムＰＣＲシステム(ＡＢＩ)を用いて測定を実施した。このとき使用したリアルタイム定量ＰＣＲ用プライマーの配列を配列番号５、６に示す。【００６９】
結果の一部を図２に示す。この実験の結果、抑制率が優れていた（例えば、５０％以上）ｓｈＲＮＡ配列をＨｅｌｐｅｒ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓベクター（ＨＤ−Ａｄベクター）に搭載して使用する。
【実施例５】
【００７０】
ＨＤ−Ａｄベクターの構築と調製
ｐＣ４ＨＳＵベクター（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）をＡｓｃＩ処理し、ＰＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ制限酵素部位を含むリンカーを導入してｐＣ４ＨＳＵ−ＰＩＳｃｅＩ−ＩＣｅｕＩを作製した。ｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｕ６、図１の１２番目に示す塩基配列を基に作製したｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｕ６−Ａｃｓｌ１−Ｉ１２、および図１の１６番目に示す塩基配列を基に作製したｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｕ６−Ａｃｓｌ１Ｉ１６をＰＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ処理し、Ｕ６プロモーターとｓｈＲＮＡ配列を含む領域を切り出し、予めＰＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ処理したｐＣ４ＨＳＵ−ＰＩＳｃｅＩ−ＩＣｅｕＩベクターへ組み、ｐＣ４ＨＳＵ−Ｕ６、ｐＣ４ＨＳＵ−Ｕ６−Ａｃｓｌ１−Ｉ１２、およびｐＣ４ＨＳＵ−Ｕ６−Ａｃｓｌ１−Ｉ１６を作製した。このベクターを用いて添付マニュアルに従いＨＤ−Ａｄ−ベクターを調製した。ＨＤ−Ａｄ−Ｕ６−Ａｃｓｌ１−Ｉ１２は、肝臓内でＵＧＣＣＵＵＧＣＡＡＵＵＡＵＧＵＡＡＡ（配列番号７）の塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡを含むｓｉＲＮＡを発現することができる。一方、ＨＤ−Ａｄ−Ｕ６−Ａｃｓｌ１−Ｉ１６については肝臓内でＡＵＧＧＣＡＣＣＵＵＧＡＡＧＡＵＵＡＵ（配列番号８）の塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡを含むｓｉＲＮＡを発現することができる。
【実施例６】
【００７１】
マウス肝臓特異的なＡｃｓｌ−１発現抑制の実験方法
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ(日本チャールスリバー)７週齢・雄へ高脂肪食（６０％ｋｃａｌ脂肪：ＴｅｓｔＤｉｅｔ社製）を７週間以上与えることで食餌誘導性肥満（ＤＩＯ）マウスを作製した。ＨＤ−Ａｄ投与前のデータとしてＤＩＯマウス（１４週齢：高脂肪食負荷７週）の体重、１日あたりの摂餌量、血糖値（６時間絶食時）を測定し、血漿成分（６時間絶食時）を回収した。血糖値の測定はグルコカードダイアメーター（アークレイ）を用いて添付マニュアルに従い測定した。血漿成分は、全血５０μＬへ０．５Ｍ  ＥＴＤＡを２μＬ添加して９０００ｒｐｍ、１分遠心分離して上清を回収することで得た。続いて、投与前データをとったＤＩＯマウス（１５週齢：高脂肪食負荷８週）へＨＤ−Ａｄ  ９Ｘ１０１１  ｖｐずつマウス尾静脈内注射して投与した。投与後４週間、体重と摂餌量の測定を行った。ＨＤ−Ａｄ投与から４週間後、６時間絶食させたＤＩＯマウス尾静脈から採血して血糖値を測定した。その直後、心採血により血漿成分を回収し、続いて肝臓組織を回収した。肝臓からのＲＮＡ回収、Ａｃｓｌ−１  ｍＲＮＡ発現定量は実施例４の細胞からの回収・定量と同様に行った。肝臓のＡｃｓｌ−１蛋白質発現はウエスタンブロットにより解析した。ウエスタンブロットにはＡｃｓｌ−１抗体（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ｓｃ−４９００８）とＨＲＰ−Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＺＹＭＥＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。以上の実験をＡｃｓｌ−１−ｓｈＲＮＡごとに独立して２回に分けて行った。【００７２】
実験１ではＡｃｓｌ−１発現抑制群としてＨＤ−Ａｄ−Ｕ６−Ａｃｓｌ１−Ｉ１２（ｎ＝６）、ネガティブコントロール群としてＨＤ−Ａｄ−Ｕ６（ｎ＝６）を投与して評価した。実験２ではＡｃｓｌ−１発現抑制群としてＨＤ−Ａｄ−Ｕ６−Ａｃｓｌ１−Ｉ１６（ｎ＝７）、ネガティブコントロール群としてＨＤ−Ａｄ−Ｕ６（ｎ＝８）を投与して評価した。【００７３】
肝臓Ａｃｓｌ−１発現解析した結果、ｍＲＮＡレベルはＨＤ−Ａｄ−Ｕ６−Ａｃｓｌ１−Ｉ１２投与群において９５％、ＨＤ−Ａｄ−Ｕ６−Ａｃｓｌ１−Ｉ１６投与群において９２％発現抑制されていた。蛋白質レベルは両Ａｃｓｌ−１  ｓｈＲＮＡ投与群ともに検出不可能な程度まで発現抑制されていた。以上より、肝臓Ａｃｓｌ−１発現抑制に成功したことが確認できた（図３）。体重と摂餌量を経時的に測定した結果を図４、５に示す。コントロール群と比較して摂餌量に差がないのにも関わらずＡｃｓｌ−１抑制群で体重増加抑制が確認された（体重：実験１  ｐ＜０．００５，実験２  ｐ＜０．０５、体重増加率：実験１  ｐ＜０．００５，実験２  ｐ＜０．０５）。続いて血糖値測定結果を図６に示す。ＨＤ−Ａｄ投与４週間後のデータが示すようにＡｃｓｌ−１抑制により血糖値の低下がみられた（実験１  ｐ＜０．０５，実験２  ｐ＜０．００１）。以上のとおり、何れも有意差が見られることから、Ａｃｓｌ−１発現抑制によって抗肥満効果および高血糖改善効果が確認された。
【実施例７】
【００７４】
Ｇｌｕｔａｍｉｃ−Ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ（ＧＯＴ）測定
ウイルス投与による肝炎への影響を調べるために、血漿成分のＧＯＴを測定した。ＧＯＴはトランスアミナーゼＣＩＩ―テストワコー（和光純薬）を用いて添付マニュアルに従って測定した。測定結果より、コントロール群、Ａｃｓｌ−１発現抑制群（Ａｃｓｌ１I１２・I１６投与群）全群でウイルス投与前よりＧＯＴの上昇が若干見られたが体重へ影響を及ぼす数値ではなく、各群でＧＯＴ値に差はなかった。従って、ウイルス投与ならびにＡｃｓｌ−１発現抑制によって肝炎は生じておらず、体重増加抑制の原因が肝炎ではないことが確認できた（図７）。
【実施例８】
【００７５】
血漿インスリン濃度の定量
レビスインスリン−マウス（シバヤギ）を用いて添付マニュアルに従い定量した。定量結果を図８に示す。ＨＤ−Ａｄ投与４週間後のデータが示すように、Ａｃｓｌ−１発現抑制によってコントロール群と比較して血中インスリン値が低下し、インスリン抵抗性が改善された（実験１  ｐ＜０．００５、実験２  ｐ＜０．００１）。
【実施例９】
【００７６】
肝臓から脂質成分の抽出
Ｆｏｌｃｈ法を基に行った。肝臓０．５ｇをホモジナイズしマイクロチューブへ入れ、０．１Ｍ ＫＣｌを加えて１．４ｍＬにメスアップし、よく攪拌して１５ｍＬファルコンチューブへ移す。次に、ＣＨＣｌ３とＭｅＯＨ混合液（２：１）６ｍＬを入れ、室温で１時間攪拌する。２ｍＬの滅菌水を加えてよく攪拌し、５分間放置する。３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、下層（有機層）を７２０μＬ回収する。２０分間エバポレーションを行って有機溶媒を除去すると黄透明な脂質成分が得られる。
【実施例１０】
【００７７】
血漿または肝臓の脂質成分の定量
トリグリセリドはトリグリセライド E-テストワコー（ＧＰＯ・ＤＡＯＳ法：和光純薬）を用いて添付マニュアルに従い測定した。コレステロールはコレステロール E-テストワコー（コレステロールオキシダーゼ・ＤＡＯＳ法：和光純薬）  を用いて添付マニュアルに従い測定した。遊離脂肪酸はＮＥＦＡ  Ｃ−テストワコー（ＡＣＳ・ＡＣＯＤ法：和光純薬）を用いて添付マニュアルに従い測定した。血漿総コレステロール定量結果を図９、肝臓トリグリセライド測定結果を図１０、肝臓遊離コレステロール測定結果を図１１、肝臓遊離脂肪酸測定結果を図１２に示す。測定結果より、コントロール群と比較してＡｃｓｌ−１発現抑制によって肝臓トリグリセライドの低下（実験１  ｐ＜０．００１，実験２  ｐ＜０．０５）、肝臓遊離脂肪酸の低下（実験１  ｐ＜０．００５，実験２  ｐ＜０．００５）、肝臓遊離コレステロールが低下し（実験１  ｐ＜０．０５，実験２  ｐ＜０．００１）、脂肪肝の改善が見られた。さらに、Ａｃｓｌ−１発現抑制によってコントロール群に比べ血中総コレステロールの低下（実験１  ｐ＜０．００５）も見られた。以上より、Ａｃｓｌ−１発現抑制によってメタボリックシンドローム改善効果が確認された。
【実施例１１】
【００７８】
ヒト肝臓細胞株Ａｃｓｌ−１遺伝子発現抑制による脂肪滴蓄積への影響
方法
ヒトＡｃｓｌ−１に対するｓｉＲＮＡであるＨｓ＿ＡＣＳＬ１＿４＿ＨＰ  ｓｉＲＮＡ（ＳＩ００２９１２２８）とＨｓ＿ＡＣＳＬ１＿５＿ＨＰ  ｓｉＲＮＡ（ＳＩ０４２４４９８２）をＱＩＡＧＥＮより購入した。また、本実験のポジティブコントロールとして中性脂肪合成酵素であるジアシルグリセロール  アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）を用いるため、ヒトＤＧＡＴ１に対するｓｉＲＮＡであるＨｓ＿ＤＧＡＴ１＿８＿ＨＰ  ｓｉＲＮＡ（ＳＩ０３２４６７５４）、ヒトＤＧＡＴ２に対するｓｉＲＮＡであるＨｓ＿ＤＧＡＴ２＿１＿ＨＰ  ｓｉＲＮＡ（ＳＩ００３６３０９７）をＱＩＡＧＥＮより購入した。ネガティブコントロール（ＮＣ）ｓｉＲＮＡはＳＡＭＣＨＵＬＬＹより購入した。１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下でヒト肝臓由来細胞株であるＨｅｐＧ２細胞を培養した。トランスフェクション直前にＨｅｐＧ２細胞を６ウェルプレートに播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｓｉＲＮＡ（最終濃度５０μＭ）を添付マニュアルに従いリバーストランスフェクションした。このとき使用したｓｉＲＮＡはＨｓ＿ＡＣＳＬ１＿４＿ＨＰ  ｓｉＲＮＡ、ＮＣ  ｓｉＲＮＡ、Ｈｓ＿ＤＧＡＴ１＿８＿ＨＰ  ｓｉＲＮＡとＨｓ＿ＤＧＡＴ２＿１＿ＨＰ  ｓｉＲＮＡを混合したものであった。オレイン酸とＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）をモル比５：１で混合したコンジュゲートを調製し、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした翌日に細胞へ添加した（オレイン酸最終濃度０．２  ｍＭ）。ｓｉＲＮＡトランスフェクション３日後（オレイン酸添加２日後）、ＨｅｐＧ２に蓄積した脂肪滴をトリグリセライド蓄積測定試薬であるＡｄｉｐｏ  Ｒｅｄ（三光純薬）を用いて添付マニュアルに従い染色した。染色後、ＨｅｐＧ２を培養ｄｉｓｈから剥離して２等分し、一方はＡｄｉｐｏ  Ｒｅｄで染色した細胞内脂肪滴をＦＡＣＳ（ＢＤ）により定量し、もう一方はＲＮＡを回収してリアルタイム定量ＰＣＲによりＡｃｓｌ−１、ＤＧＡＴ１および２のｍＲＮＡ量を定量した。このとき使用したＡｃｓｌ−１とＤＧＡＴ１およびに２対するリアルタイム定量ＰＣＲ用プライマーの配列を配列番号１１〜１６に示す（細胞からのＲＮＡ回収やｍＲＮＡ定量方法は実施例４を参照）。【００７９】
ＨｅｐＧ２におけるＡｃｓｌ−１、ＤＧＡＴ１および２発現を解析した結果、Ａｃｓｌ−１  ｍＲＮＡレベルはＨｓ＿ＡＣＳＬ１＿４＿ＨＰ  ｓｉＲＮＡにより８５％抑制されており、ＤＧＡＴ１および２のｍＲＮＡレベルはＨｓ＿ＤＧＡＴ１＿８＿ＨＰ  ｓｉＲＮＡとＨｓ＿ＤＧＡＴ２＿１＿ＨＰ  ｓｉＲＮＡによりそれぞれ６７％と５０％抑制されていた。このように各遺伝子が抑制された条件においてＨｅｐＧ２の脂肪滴量を定量してＮＣと比較した結果、Ａｃｓｌ−１抑制によって２７％、ＤＧＡＴ１および２抑制によって３３％脂肪滴蓄積が抑制されていた。以上の結果から、Ａｃｓｌ−１阻害剤はＤＧＡＴ阻害剤と同程度の脂肪蓄積抑制が期待できると考えられる。さらに、Ｈｓ＿ＡＣＳＬ１＿５＿ＨＰ  ｓｉＲＮＡを用いた解析でも同様の結果であったことから、この脂肪滴蓄積抑制効果がオフターゲット効果によるものではないことが示唆された。
【実施例１２】
【００８０】
Ａｃｓｌ−１ｓｉＲＮＡの設計と合成
ヒトＡｃｓｌ−１  ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００１９９５、配列番号９）とマウスＡｃｓｌ−１  ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００７９８１、配列番号１０）において共通の連続して１９塩基完全一致した配列を選択して（図１３〜１７）以下の試験を行った。選択した配列のセンス鎖３’オーバーハングはチミン２塩基（ｄＴｄＴ）、アンチセンス鎖３’オーバーハングはＡｃｓｌ−１  ＤＮＡ配列と一致する２塩基としてｓｉＲＮＡを合成した。ｓｉＲＮＡ合成はシグマアルドリッチジャパンに委託した。ネガティブコントロールとしてＡｌｌＳｔａｒ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡをＱＩＡＧＥＮより購入した。
【実施例１３】
【００８１】
Ａｃｓｌ−１ｓｉＲＮＡの抑制効果の確認
１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含有するＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下でヒト肝臓由来細胞株であるＨｅｐＧ２細胞を培養した。トランスフェクション直前にＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルプレートに播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施例１２で合成したｓｉＲＮＡ、ＡｌｌＳｔａｒ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ、ポジティブコントロールとして実施例１１で使用したＨｓ＿ＡＣＳＬ１＿４＿ＨＰ  ｓｉＲＮＡを添付マニュアルに従いリバーストランスフェクションした（ｓｉＲＮＡ最終濃度５０μＭ）。ｓｉＲＮＡトランスフェクション３日後、ＦａｓｔＬａｎｅ  Ｃｅｌｌ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＧＥＮ）とリアルタイム定量ＰＣＲを用いて添付マニュアルに従ってＨｅｐＧ２細胞のＡｃｓｌ―１  ｍＲＮＡ量を定量し、各ｓｉＲＮＡのＡｃｓｌ−１遺伝子発現抑制効率を算出した。その結果の一部を図１８に示した。この中でＨｓ＿ＡＣＳＬ１＿４＿ＨＰ  ｓｉＲＮＡと同等以上の抑制効率を示したもの（例えば、図１３〜１７のＮｏ．４１、５３、５６、６４、２０２、２０７に示す配列をもとにして作製したｓｉＲＮＡ）は、Ａｃｓｌ−１発現抑制効率に優れ、脂肪滴蓄積を抑制できると考えられる。また、これらＡｃｓｌ−１発現抑制効率に優れたｓｉＲＮＡを含む医薬組成物は抗肥満および高血糖治療薬として期待できると考えられる。同様にして、種々の配列のｓｉＲＮＡについて抑制効果を調べた結果、以下に示す配列をＲＮＡ部分のセンス鎖に有するｓｉＲＮＡは、その効果が優れていることがわかった。【００８２】
（ｓｅｎｓｅ配列５’→３’、U:ウリジン、A:アデノシン、G:グアノシン、C:シチジンを示す）
Ｎｏ．４１、AUUUGUUUCACAAGUGGAA （配列番号１７）
Ｎｏ．５３、AGUGGAACUACAGGCAACC（配列番号１８）
Ｎｏ．５６、GGAACUACAGGCAACCCCA（配列番号１９）
Ｎｏ．６４、AGGCAACCCCAAAGGAGCA（配列番号２０）
Ｎｏ．８１、GCCUCUCGCCCAUAUGUUU（配列番号２１）
Ｎｏ．９８、GUAAUGCUGUGUCAUGGAG（配列番号２２）
Ｎｏ．１００、AAUGCUGUGUCAUGGAGCU（配列番号２３）
Ｎｏ．１０１、AUGCUGUGUCAUGGAGCUA（配列番号２４）
Ｎｏ．１０２、UGCUGUGUCAUGGAGCUAA（配列番号２５）
Ｎｏ．１１１、CCAAGGAGAUAUCAGGCUG（配列番号２６）
Ｎｏ．１１２、CAAGGAGAUAUCAGGCUGC（配列番号２７）
Ｎｏ．１１７、GAAACAACAGCCUGUGGGA（配列番号２８）
Ｎｏ．１１８、GAUGUGGAAGAAAUGAAUU（配列番号２９）
Ｎｏ．１１９、AUGUGGAAGAAAUGAAUUA（配列番号３０）
Ｎｏ．１２１、GAAAAGAUUGAAAAUAUCU（配列番号３１）
Ｎｏ．１２５、AGGUGUUUGUCCACGGAGA（配列番号３２）
Ｎｏ．１２６、GGUGUUUGUCCACGGAGAA（配列番号３３）
Ｎｏ．１３７、GAACUAUUUCAGGUCGCAG（配列番号３４）
Ｎｏ．１３８、AACUAUUUCAGGUCGCAGA（配列番号３５）
Ｎｏ．１３９、ACUAUUUCAGGUCGCAGAU（配列番号３６）
Ｎｏ．１５０、UCUCCAUGCAGUCAGUGGA（配列番号３７）
Ｎｏ．１５３、AAGUUAAUUUGGGAAAUUA（配列番号３８）
Ｎｏ．１６１、GGGGUUUUGAAUGUUUGCU（配列番号３９）
Ｎｏ．１６３、GGUUUUGAAUGUUUGCUUU（配列番号４０）
Ｎｏ．１６４、AGUGUUGGCUAUUUCUAUG（配列番号４１）
Ｎｏ．１６５、GUGUUGGCUAUUUCUAUGU（配列番号４２）
Ｎｏ．１６６、UGUUGGCUAUUUCUAUGUU（配列番号４３）
Ｎｏ．１７８、CUAUGUUUUAUAAACCAAA（配列番号４４）
Ｎｏ．１９０、AAAACAAUGAAGGAAACCA（配列番号４５）
Ｎｏ．１９５、AAUGAAGGAAACCAAAAUA（配列番号４６）
Ｎｏ．２０１、GGAAACCAAAAUAAAUAUU（配列番号４７）
Ｎｏ．２０２、GAAACCAAAAUAAAUAUUU（配列番号４８）
Ｎｏ．２０７、CAAAAUAAAUAUUUCUGCA（配列番号４９）【００８３】
各配列の抑制効果は以下の通りである。ＮＣ  ｓｉＲＮＡのＡｃｓｌ−１  ｍＲＮＡ発現量を１００として、各ｓｉＲＮＡを導入した際のＡｃｓｌ−１  ｍＲＮＡ発現量を算出して表にした。
【表１】
2010079819.tif 000003
【図１】
2010079819.tif 000004
【図２】
2010079819.tif 000005
【図３】
2010079819.tif 000006
【図４】
2010079819.tif 000007
【図５】
2010079819.tif 000008
【図６】
2010079819.tif 000009
【図７】
2010079819.tif 000010
【図８】
2010079819.tif 000011
【図９】
2010079819.tif 000012
【図１０】
2010079819.tif 000013
【図１１】
2010079819.tif 000014
【図１２】
2010079819.tif 000015
【図１３】
2010079819.tif 000016
【図１４】
2010079819.tif 000017
【図１５】
2010079819.tif 000018
【図１６】
2010079819.tif 000019
【図１７】
2010079819.tif 000020
【図１８】
2010079819.tif 000021
【配列表】
2010079819000001.app
【国際調査報告】
2010079819.tif 000022
2010079819.tif 000023
2010079819.tif 000024
2010079819.tif 000025
2010079819.tif 000026
2010079819.tif 000027
2010079819.tif 000028
2010079819.tif 000029