(57)【要約】本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を有効成分として含む局所投与用筋肉修復促進剤を提供する。本発明の筋肉修復促進剤は特に筋肉内投与するときに、低用量で効果を奏する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を有効成分として含む局所投与用筋肉修復促進剤。
【請求項２】
局所投与が筋肉内投与である請求項１記載の筋肉修復促進剤。
【請求項３】
筋肉損傷後２−１０日に投与される請求項１または２記載の筋肉修復促進剤。
【請求項４】
投与間隔が４日間隔である請求項１〜３のいずれかに記載の筋肉修復促進剤。
【請求項５】
上記投与期間内で合計０．２−５０μｇ／ｋｇが投与される請求項１〜４のいずれかに記載の筋肉修復促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は筋肉修復促進剤に関する。本発明の筋肉修復促進剤は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を有効成分として含む。
【背景技術】
【０００２】
成体の骨格筋には自身の幹細胞が存在し、病理学的・生理学的な状態においては、サテライト細胞と呼ばれる筋肉特異的幹細胞を元にして新たな筋肉が生成される。それゆえ成体の骨格筋には、ある程度の再生力が備わっている（非特許文献１）。しかしながら、骨格筋ジストロフィー、筋障害、重症の外傷や廃用症候群のような不治の骨格筋疾患が数多く存在する（非特許文献２）。そのため、骨格筋再生のメカニズムを解明し、これを利用した再生療法を開発することができれば極めて有用である。骨格筋の発生・再生は数多くの成長因子やサイトカインによって正確に調節されているが、骨格筋細胞の再生は十分に制御し得るものではない（非特許文献３）。これまでに本発明者らは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）からの心筋細胞の分化について体液性因子および受容体をスクリーニングしてきた（非特許文献４）。【０００３】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は造血系サイトカインとして同定され、臨床では造血幹細胞の動員に使用されてきた（非特許文献５、６、７）。この他にもＧ−ＣＳＦは、細胞の分化、増殖および生存において様々な役割を担っている（非特許文献８）。【０００４】
さらに、Ｇ−ＣＳＦが骨格筋損傷を受けたラットの筋細胞を増殖し、筋肉の回復を増強する作用があることが報告されている（非特許文献９）。しかしながら、Ｇ−ＣＳＦが骨格筋の再生に関与するとした場合、いかなるメカニズムが関与しているのか、また実際にＧ−ＣＳＦを筋肉修復促進剤として用いるにあたっての適切な投与方法、回数、投与量などについては報告がない。【０００５】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｅ  Ｇｒａｎｄ，Ｆ．＆  Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，Ｍ．Ａ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９，６２８−６３３（２００７）．
【非特許文献２】Ｓｈｉ，Ｘ．＆  Ｇａｒｒｙ，Ｄ．Ｊ．Ｍｕｓｃｌｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０，１６９２−１７０８，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇａｄ．１４１９４０６（２００６）．
【非特許文献３】Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，Ｍ．＆  Ｍｏｎｔａｒｒａｓ，Ｄ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １８，３３０−３３６（２００８）．
【非特許文献４】Ｙｕａｓａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｎｏｇｇｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３，６０７−６１１（２００５）．
【非特許文献５】Ｗｅｌｔｅ，Ｋ．，Ｇａｂｒｉｌｏｖｅ，Ｊ．，Ｂｒｏｎｃｈｕｄ，Ｍ．Ｈ．，Ｐｌａｔｚｅｒ，Ｅ．＆  Ｍｏｒｓｔｙｎ，Ｇ．Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ（ｒ−ｍｅｔＨｕＧ−ＣＳＦ）：ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  １０  ｙｅａｒｓ．Ｂｌｏｏｄ  ８８，１９０７−１９２９（１９９６）．
【非特許文献６】Ｄｅｍｅｔｒｉ，Ｇ．Ｄ．＆  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊ．Ｄ．Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ  ７８，２７９１−２８０８（１９９１）．
【非特許文献７】Ｍｅｔｃａｌｆ，Ｄ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  １１１，４８５−４９１，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００７−０３−０７９６８１（２００８）．
【非特許文献８】Ａｖａｌｏｓ，Ｂ．Ｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ  ８８，７６１−７７７（１９９６）．
【非特許文献９】Ｓｔｒａｔｏｓ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ，Ｊ．ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１０３，１８５７−１８６３（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、Ｇ−ＣＳＦを含有する筋肉修復促進剤を提供することを目的とする。特に、Ｇ−ＣＳＦが損傷した筋肉に及ぼす効果、メカニズムを解明し、さらにＧ−ＣＳＦを筋肉修復促進剤として用いるにあたっての適切な投与方法、回数、投与量を求めて実用に供しうる筋肉修復促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、Ｇ−ＣＳＦが損傷した筋肉に及ぼす効果、メカニズムについて検討した。その結果、マウス胚の体節でＧ−ＣＳＦレセプターが発現しており、またＧ−ＣＳＦを投与すると筋芽細胞の増殖が促進されること、また骨格筋損傷後４〜７日においてＧ−ＣＳＦレセプターが強く発現すること、またこの時期にＧ−ＣＳＦを局所投与することにより低用量のＧ−ＣＳＦで骨格筋の再生が顕著に促進されることを見いだして本発明を見出した。本発明はこの知見に基づき完成したものである。【０００９】
すなわち、本発明は以下のものを提供する。
［１］顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を有効成分として含む局所投与用筋肉修復促進剤。
［２］局所投与が筋肉内投与である請求項１記載の筋肉修復促進剤。
［３］筋肉損傷後２−１０日に投与される請求項１または２記載の筋肉修復促進剤。
［４］投与間隔が４日間隔である請求項１〜３のいずれかに記載の筋肉修復促進剤。
［５］上記投与期間内で合計０．２−５０μｇ／ｋｇが投与される請求項１〜４のいずれかに記載の筋肉修復促進剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の筋肉修復促進剤は、局所投与、特に筋肉内投与することにより、低用量で極めて顕著な筋肉修復促進効果を示した。本発明の筋肉修復促進剤は様々な筋肉損傷の治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、妊娠中期以降の発生途上の体節におけるＧ−ＣＳＦＲの発現を示す写真である。ａ．ｃ−ｍｅｔ、ｐａｘ３、ｍｙｏｄ、ｍｒｆ４およびｃｓｆ３ｒに対するホールマウント・インサイチュ・ハイブリダイゼーション、並びに、ｍｙｆ５  ｋｎｏｃｋ  ｉｎマウスのＥ１０．５胚におけるＬａｃＺ染色を示す。ｃｓｆ３ｒはＥ１０．５において体節で発現した。ｂ．Ｅ８．５、Ｅ９．５、Ｅ１０．５およびＥ１１．５マウス胚におけるＧ−ＣＳＦＲおよびＤＡＰＩの免疫染色（水平断面）。Ｇ−ＣＳＦＲ（緑色）はＥ９．５〜Ｅ１０．５において体節で明らかに発現した。ｃ．Ｅ１０．５胚におけるＰａｘ３、Ｐａｘ７、Ｇ−ＣＳＦＲの三重免疫蛍光染色。Ｇ−ＣＳＦＲ（緑色）、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７（赤色）、核（ＤＡＰＩ、青色）を示す。ｄ．Ｅ１０．５胚におけるＭｙｏＤおよびＭｙｏｇｅｎｉｎ、Ｄｅｓｍｉｎ、Ｇ−ＣＳＦＲの三重免疫蛍光染色を示す。ｅ．Ｇ−ＣＳＦ（緑色）、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７（赤色）、核（ＤＡＰＩ、青色）の三重免疫染色を示す。ｆ．Ｅ１０．５胚におけるＭｙｏＤおよびＭｙｏｇｅｎｉｎ、Ｄｅｓｍｉｎ、Ｇ−ＣＳＦ（緑色）の三重免疫蛍光染色を示す。Ｇ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦＲの双方とも、同一の細胞で発現した点に注目されたい。
【図２】図２は、Ｇ−ＣＳＦによる筋芽細胞増殖の増加を示す図である。ａ．分化前後のＣ２Ｃ１２細胞におけるＧ−ＣＳＦＲおよびα−アクチニンの位相差写真および免疫蛍光写真。ｂ．分化後の各時点におけるＣ２Ｃ１２細胞のウェスタンブロット分析。α−アクチニンの発現は徐々に増加したが、Ｇ−ＣＳＦＲは分化後徐々にダウンレギュレートされた。ｃ．Ｃ２Ｃ１２細胞の増殖に対するＧ−ＣＳＦの作用。Ｃ２Ｃ１２細胞の数がＧ−ＣＳＦによって用量依存的に増加することが観察された。ｄ．Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＢｒｄＵの取り込みに対するＧ−ＣＳＦの作用。ｅ．血清誘導型のＣ２Ｃ１２細胞増殖に対する抗Ｇ−ＣＳＦブロッキング抗体の作用。血清介在型の増殖が抗Ｇ−ＣＳＦブロッキング抗体によって用量依存的に阻害された。ｆ．Ｃ２Ｃ１２細胞における代表的なシグナリング分子（ＳＴＡＴ３、ＡＫＴ、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ等）のリン酸化のウェスタンブロット分析。ＳＴＡＴ３、ＡＫＴ、ＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化がＧ−ＣＳＦによって経時的に誘導された。ｇ．Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＡＰＲＥルシフェラーゼ活性がＧ−ＣＳＦによって用量依存的に活性化された。
【図３】図３は、成体における再生途上の骨格筋細胞におけるＧ−ＣＳＦ受容体の発現を示す図である。ａ．心臓毒傷害モデルおよび組織学的分析の時点。ｂ．心臓毒による傷害を受けた骨格筋の組織学的分析。大腿直筋のＨＥ染色。骨格筋傷害およびその再生過程が明らかである。ｃ、ｄ．傷害前の骨格筋（ｃ、０日目）および傷害後の骨格筋（ｄ、５日目）におけるＧ−ＣＳＦＲ（緑色）、ラミニン（赤色）、核（ＤＡＰＩ、青色）の三重免疫染色を示す。Ｇ−ＣＳＦＲは０日目には発現せず、傷害後５日目に、再生途上の小型円形の中心核を有する筋細胞で強く発現した。ｅ．再生途上の骨格筋細胞におけるＧ−ＣＳＦＲ発現の推移。１、５、８および１４日目における傷害骨格筋の免疫蛍光染色を示す。ｆ．Ｇ−ＣＳＦＲ陽性細胞および中心核細胞をカウント。中心核細胞に対するＧ−ＣＳＦＲ陽性細胞の割合をカウントした。Ｇ−ＣＳＦＲ陽性の再生途上の骨格筋細胞は傷害後３〜８日目に観察された。
【図４】図４は、内因性および外因性双方のＧ−ＣＳＦによる骨格筋再生の増強を示す図である。ａ．心臓毒による骨格筋傷害に対するＧ−ＣＳＦの静脈内（ｉ．ｖ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）投与の作用。心臓毒注射後７日目の傷害大腿直筋のＨＥ染色を示す。中心核を有する骨格筋細胞がかなり増加しており、外因性Ｇ−ＣＳＦの投与によって再生が促進された。ｉ．ｍ．投与はｉ．ｖ．投与よりも効率的であった。ｂ．中心核を有する細胞の数を定量した。Ｇ−ＣＳＦによって、中心核を有する再生骨格筋細胞が有意に増加した。ｃ．再生後の大腿直筋の直径を測定した。再生にはＧ−ＣＳＦの筋肉内投与が効率的であった。ｄ．心臓毒傷害後の握力測定。心臓毒傷害骨格筋の筋力はＧ−ＣＳＦによって有意に向上した。ｅ．骨格筋再生に対する内因性Ｇ−ＣＳＦシグナルの役割。７日目の傷害大腿直筋のＨＥ染色を示す。３日目に抗Ｇ−ＣＳＦ中和抗体を投与すると、自発的な骨格筋細胞の再生が用量依存的に低下する。ｆ．中心核を有する細胞の数をカウントした。抗Ｇ−ＣＳＦ中和抗体により、中心核を有する再生骨格筋細胞が有意に減少した。ｇ．傷害後の大腿直筋の直径も、抗Ｇ−ＣＳＦ中和抗体によって有意に減少した。
【図５】図５は、ｃｓｆ３ｒ−／−マウスにおける骨格筋の発生・再生の低下を示す図である。ａ．野生型およびｃｓｆ３ｒ−／−マウスの大腿直筋のＨＥ染色を示す。ｃｓｆ３ｒ−／−マウスにおける各筋細胞の断面直径は、野生型よりも大きかった。ｂ．骨格筋細胞断面積の定量的分析を、野生型およびｃｓｆ３ｒ−／−マウスで測定。ｃ．大腿直筋の直径を示す。ｃｓｆ３ｒ−／−マウスでは、大腿直筋の有意なサイズ減少が見られる。ｄ．野生型およびｃｓｆ３ｒ−／−マウスにおける７日目および１４日目の心臓毒傷害骨格筋のＨＥ染色。ｃｓｆ３ｒ−／−マウスでは筋肉の再生過程が顕著に遅れた。ｅ．野生型およびｃｓｆ３ｒ−／−マウスにおいて、７日目または１４日目の再生途上の骨格筋における中心核を有する筋細胞の数を測定。ｃｓｆ３ｒ−／−マウスでは、筋肉再生が著しく妨害された。ｆ．野生型およびｃｓｆ３ｒ−／−マウスにおける、心臓毒による筋肉傷害に対する外因性Ｇ−ＣＳＦ投与の作用。心臓毒注射後７日目の傷害骨格筋のＨＥ染色。ｇ．心臓毒による骨格筋細胞傷害に対する外因性Ｇ−ＣＳＦ投与の作用を、中心核を有する筋細胞の数で測定。ｃｓｆ３ｒ−／−マウスでは、外因性のＧ−ＣＳＦによる筋肉再生の加速は見られなかった。ｈ．心臓毒を注射したｃｓｆ３ｒ−／−マウスを、Ｇ−ＣＳＦで処置した場合と処置しなかった場合で、握力測定も行った。ｃｓｆ３ｒ−／−マウスでは、Ｇ−ＣＳＦによる機能回復の向上は見られなかった。
【図６】図６は、骨格筋の再生に対するＧ−ＣＳＦＲ発現造血細胞の役割を示す図である。ａ．骨髄移植を利用した実験モデル１。ＧＦＰトランスジェニックマウスから骨髄を単離し、ｃｓｆ３ｒ−／−マウスへ移植した。心臓毒を大腿直筋へ注射し、Ｇ−ＣＳＦを４日目および６日目に投与した。ｂ．骨髄細胞の移植前（左）および移植後（右）の造血細胞のキメリズムをＦＡＣＳで分析。ｃ、ｄ．野生型骨髄を移植されたｃｓｆ３ｒ−／−マウス（ＧＦＰ−Ｔｇマウス）における、心臓毒による骨格筋細胞傷害時の握力（ｃ）および大腿直筋直径（ｄ）に対するＧ−ＣＳＦの作用。ｅ．骨髄移植実験モデル２。骨髄をｃｓｆ３ｒ−／−マウスから単離し、野生型（ｃｓｆ３ｒ＋／＋）マウスへ移植した。ｆ、ｇ．ｃｓｆ３ｒ−／−マウス骨髄を移植された野生型マウス（ＧＦＰ−Ｔｇマウス）における、心臓毒による骨格筋細胞傷害時の握力（ｆ）および大腿直筋直径（ｇ）に対するＧ−ＣＳＦの作用。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において、筋肉修復促進とは、損傷された筋肉に含まれる筋芽細胞の増大および／または分裂を、促進することを意味し、結果として、筋肉を再生させ、筋肉本来の機能に近づける，筋肉本来の機能を越えさせる，または筋肉の痛みを軽減する、ことを意味する。また、筋肉の機能とは、筋肉の収縮力、柔軟性、異化能力、グリコーゲンの蓄積能力、をいう。
【００１３】
本発明の治療剤が対象とする筋肉損傷は特に限定されず、肉離れ、筋損傷、筋断裂、打撲、筋肉に至る裂傷・刺傷、重度の筋肉痛（遅発性筋肉痛）、薬剤刺激による筋肉の損傷を含む。肉離れとは、急激に筋肉が収縮した結果、筋膜や筋繊維の一部が損傷する疾患を言う。また、上記の損傷は、筋肉、筋組織、筋芽細胞のいずれに起きたものであっても本発明の対象とする。
【００１４】
具体的な適用部位は、腹、背、首、指、手首、上腕、肩、腰、胸、下肢、膝、太もも、ハムストリングス、ふくらはぎなどを含み、対象となる筋肉には、上腕二頭筋、上腕三頭筋、大腿筋、僧帽筋、大臀筋、大腿四頭筋、ハムストリングス、腓腹筋、下腿伸筋、母指伸筋、棘上筋、腹直筋、大腿内転筋、指伸筋などを含む。
【００１５】
本発明の筋肉修復促進剤は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を有効成分とする。
【００１６】
本発明の筋肉修復促進剤の有効成分であるＧ−ＣＳＦは、どのようなＧ−ＣＳＦでも用いることができるが、好ましくは高度に精製されたＧ−ＣＳＦであり、より具体的には、哺乳動物Ｇ−ＣＳＦ、特にヒトＧ−ＣＳＦと実質的に同じ生物学的活性を有するものである。Ｇ−ＣＳＦの由来は特に限定されず、天然由来のＧ−ＣＳＦ、遺伝子組換え法により得られたＧ−ＣＳＦなどを用いることができるが、好ましくは遺伝子組換え法により得られたＧ−ＣＳＦである。遺伝子組換え法により得られるＧ−ＣＳＦには、天然由来のＧ−ＣＳＦとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸を欠失、置換、付加等したもので、天然由来のＧ−ＣＳＦと同様の生物学的活性を有するもの等であってもよい。アミノ酸の欠失、置換、付加などは当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ，Ｈ．Ｊ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２，４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸に適宜変異を導入することにより、Ｇ−ＣＳＦと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。一般的に、置換されるアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００；Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．���ｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
【００１７】
又、Ｇ−ＣＳＦと他のタンパク質との融合タンパク質を用いることも可能である。融合ポリペプチドを作製するには、例えば、Ｇ−ＣＳＦをコードするＤＮＡと他のタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。本発明のＧ−ＣＳＦとの融合に付される他のタンパク質としては、特に限定されない。
【００１８】
又、化学修飾したＧ−ＣＳＦを用いることも可能である。化学修飾したＧ−ＣＳＦの例としては、例えば、糖鎖の構造変換・付加・欠失操作を行ったＧ−ＣＳＦや、ポリエチレングリコール・ビタミンＢ１２等、無機あるいは有機化合物等の化合物を結合させたＧ−ＣＳＦなどを挙げることができる。
【００１９】
本発明で用いるＧ−ＣＳＦは、いかなる方法で製造されたものでもよく、例えば、ヒト腫瘍細胞やヒトＧ−ＣＳＦ産生ハイブリドーマの細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したＧ−ＣＳＦ、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、昆虫細胞、などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したＧ−ＣＳＦなどを用いることができる。本発明において用いられるＧ−ＣＳＦは、遺伝子工学的手法により製造されたＧ−ＣＳＦが好ましく、哺乳動物細胞（特にＣＨＯ細胞）を用いて製造されたＧ−ＣＳＦが好ましい（例えば、特公平１−４４２００号公報、特公平２−５３９５号公報、特開昭６２−１２９２９８号公報、特開昭６２−１３２８９９号公報、特開昭６２−２３６４８８号公報、特開昭６４−８５０９８号公報）。
【００２０】
本発明の筋肉修復促進剤には、その投与方法や剤型に応じて必要により、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を適宜添加することができる。
【００２１】
懸濁剤の例としては、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０，ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができる。
【００２２】
溶液補助剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０，ニコチン酸アミド、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができる。
【００２３】
安定化剤としては、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができる。
【００２４】
等張化剤としては例えば、Ｄ−マンニトール、ソルビート等を挙げることができる。
【００２５】
保存剤としては例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができる。
【００２６】
吸着防止剤としては例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。
【００２７】
界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチエレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のＨＬＢ６〜１８を有するもの；陰イオン界面活性剤、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。本発明の製剤には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。好ましい界面活性剤は、ポリソルベート２０，４０，６０又は８０などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート２０及び８０が特に好ましい。また、ポロキサマー（プルロニックＦ−６８（登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましい。
【００２８】
含硫還元剤としては例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。
【００２９】
酸化防止剤としては例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。
【００３０】
さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてもよい。
【００３１】
本発明の筋肉修復促進剤は、局所投与用注射剤（皮下、皮内、筋肉内など）に適した剤形として投与することが可能である。局所投与が筋肉内投与であることが特に好ましい。
【００３２】
注射剤とする場合には、上記の成分をリン酸緩衝液（好ましくはリン酸一水素ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム系）及び／又はクエン酸緩衝液（好ましくはクエン酸ナトリウムの緩衝液）及び／又は酢酸緩衝液などの溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製する。緩衝液の濃度は一般には１〜５００ｍＭであり、好ましくは５〜１００ｍＭであり、さらに好ましくは１０〜２０ｍＭである。また、注射剤は溶液製剤であっても凍結乾燥製剤であってもよい。
【００３３】
本発明のＧ−ＣＳＦを有効成分とする筋肉修復促進剤の投与量、投与時期、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して当業者が適宜決定することができるが、筋肉損傷後２−１０日に投与することが好ましく、筋肉損傷後３−８日に投与することがより好ましく、また筋肉損傷後４−７日に投与することが特に好ましい。
【００３４】
本発明の筋肉修復促進剤の投与間隔は４日間隔であることが好ましく、３日間隔であることがより好ましく、２日間隔であることが特に好ましい。
【００３５】
また、本発明の筋肉修復促進剤は、局所投与した場合に、マウスにおいて０．５μｇ／ｂｏｄｙ（約２１μｇ／ｋｇ）の低投与量でも十分にその効果が確認されている（実施例５）。一般に、ヒトＧ−ＣＳＦによる効果はヒトとマウスで約２０倍程度異なる。例えば、ヒトでは１０μｇ／ｋｇのヒトＧ−ＣＳＦを連続投与することによって幹細胞が動員され、ＷＢＣも増加することが知られている（Ｂｒ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｗａｔｔｓ  １９９７  ９８  ４７４−４７９）。一方、マウスでは、ヒトＧ−ＣＳＦを２００μｇ／ｋｇで５日間投与した場合に末梢好中球数が増加すること（Ｂｌｏｏｄ  ８９：２７３６，１９９７）、マウスにヒトＧ−ＣＳＦを２５０μｇ／ｋｇで５日間投与した場合にＷＢＣが増加したこと（Ｂｌｏｏｄ．１９９７  Ｍａｙ  １；８９（９）：３１８６−９１．）が確認されている。よって、ヒトに投与する場合、副作用をを抑えつつ本発明の筋肉修復効果を得るには、一回の投与で０．１−１０μｇ／ｋｇ投与することが好ましく、０．５−５μｇ／ｋｇ投与することがより好ましく、１−２．５μｇ／ｋｇ投与することが特に好ましい。また、上記投与期間内で合計０．２−５０μｇ／ｋｇ投与することが好ましく、１．０−２５μｇ／ｋｇ投与することがより好ましく、２．０−１２．５μｇ／ｋｇ投与することがより好ましい。
【００３６】
しかし、本発明はヒトＧ−ＣＳＦの用量によって限定されるものではない。
【００３７】
また、本発明の筋肉修復促進剤は、他の薬剤と併用してもよい。
【００３８】
本発明のメカニズムの考察
本発明は特定の理論に拘束されるものではないが、本願発明者は本発明のメカニズムについて以下のように考察している。
【００３９】
本発明では、骨格筋細胞の発生・再生において、Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦＲが筋芽細胞の増殖を介して中心的な役割を担うことが確認された。興味深いことに、このメカニズムは、胚における骨格筋細胞の発生と成体における骨格筋細胞の再生との間で保存されている。Ｇ−ＣＳＦＲは、発生途上の体節内で増殖中の筋細胞において、一過性ではあるものの強く発現する。Ｇ−ＣＳＦＲノックアウトマウスでは大腿直筋の直径が減少し、このことは、Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦＲシグナリングが骨格筋の適正な発生にとって不可欠であることを意味している。Ｇ−ＣＳＦＲは再生途上の筋細胞でも発現する。Ｇ−ＣＳＦはこのようなＧ−ＣＳＦＲ発現筋芽細胞を刺激し、骨格筋傷害後の骨格筋再生を促進する。Ｇ−ＣＳＦＲノックアウトマウスでは、自発的な骨格筋再生が低下した。Ｇ−ＣＳＦはよく知られた造血系サイトカインであり、造血細胞を動員することができる。Ｇ−ＣＳＦ注射による骨格筋再生に対する造血細胞の作用の関与を除外するため、野生型骨髄をＧ−ＣＳＦＲノックアウトマウスへ移植した。このようなマウスでは、骨格筋細胞はＧ−ＣＳＦＲを発現しなかったが、造血細胞はＧ−ＣＳＦＲを発現し、かつ、Ｇ−ＣＳＦに対して正常な応答を示す。造血細胞が骨格筋再生に寄与するのであれば、このようなマウスでは正常な再生能が認められると考えられる。しかしながら、これらの骨髄移植Ｇ−ＣＳＦＲノックアウトマウスでは、Ｇ−ＣＳＦを投与しても骨格筋再生の向上は見られなかった。
【００４０】
Ｇ−ＣＳＦは造血幹細胞を骨髄から末梢循環へと動員する。再生途上の筋肉に対する骨髄細胞の寄与は、文献にも報告されている（Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｓｃｌｅ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｙｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９，１５２８−１５３０，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．２７９．５３５６．１５２８（１９９８）．など）。そこで、本発明者らは、骨格筋再生におけるＧ−ＣＳＦが骨髄細胞に依存性であるか否かを解明し、かつ、Ｇ−ＣＳＦＲ発現骨髄細胞を移植しても、Ｇ−ＣＳＦＲノックアウトマウスでは骨格筋再生の助けにならないことを明らかにした。その結果、骨格筋に対するＧ−ＣＳＦの作用が、骨格筋細胞に対する直接的な作用であることを確認した。臨床においては、免疫抑制化学療法に起因する好中球減少症、重篤な先天性好中球減少症、生命を脅かす細菌感染症の患者に、また、幹細胞の回収に、Ｇ−ＣＳＦを使用している。筋肉痛は、ヒトにおけるＧ−ＣＳＦ投与の注意すべき主要な副作用の一つである（Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｈａｓｔｅｎｓ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ［ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｅｒｒａｔｕｍ  ａｐｐｅａｒｓ  ｉｎ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９０  Ｍａｒ；８（３）：５６７］．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ７，１７９１−１７９９（１９８９））。このメカニズムは、Ｇ−ＣＳＦ注射によって骨格筋芽細胞が刺激されて、爆発的な骨格筋細胞の増殖によって筋肉痛が引き起こされるため、と推測できる。これまでのＧ−ＣＳＦの臨床使用の面から、その安全性と副作用は正確に調査されている。本研究の結果からは、新たな治療の可能性と骨格筋の発生・再生の作用機構に関する考察が得られ、骨格筋再生療法におけるＧ−ＣＳＦの使用が加速するものと期待される。
【００４１】
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
【実施例】
【００４２】
実施例で用いた実験方法は以下の通りである。
ホールマウント・インサイチュ・ハイブリダイゼーション
野生型のＩＣＲ妊娠マウスから胎齢１０．５日目にマウス胚を摘出した。ホールマウント・インサイチュ・ハイブリダイゼーションを既報の通り行った（非特許文献４）。マウスｃ−ｍｅｔ、ｐａｘ３、ｍｙｏｄおよびｍｒｆ４の完全長ｃＤＮＡ（受託番号ＮＭ＿００８５９１、ＮＭ＿００１１５９５２０、ＮＭ＿０１０８６６、ＮＭ＿００８６５７）は、Ｍ．Ｅ．Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ教授（パスツール研究所発生生物学部門）から恵与された。マウスｃｓｆ３ｒの完全長ｃＤＮＡ（受託番号ＮＭ＿００７７８２）は、長田重一教授（大阪大学遺伝学教室）から恵与された（Ｆｕｋｕｎａｇａ，Ｒ．，Ｓｅｔｏ，Ｙ．，Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．＆  Ｎａｇａｔａ，Ｓ．Ｔｈｒｅｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｍＲＮＡｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８７，８７０２−８７０６，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．８７．２２．８７０２（１９９０）．）。プローブは、Ｔ３またはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを利用して作製した。【００４３】
Ｍｙｆ５  ｎｌａｃＺマウス
Ｍｙｆ５  ｎｌａｃＺマウスは、Ｓｈａｈｒａｇｉｍ  Ｔａｊｂａｋｈｓｈ博士（パスツール研究所発生生物学部門）から恵与された（Ｔａｊｂａｋｈｓｈ，Ｓ．，Ｒｏｃａｎｃｏｕｒｔ，Ｄ．＆  Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，Ｍ．Ｍｕｓｃｌｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆａｉｌｉｎｇ  ｔｏ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｔｏ  ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｕｅｓａｄｏｐｔ  ｎｏｎ−ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｆａｔｅｓ  ｉｎ  ｍｙｆ−５  ｎｕｌｌ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８４，２６６−２７０（１９９６））。【００４４】
免疫蛍光
胎齢８．５、９．５、１０．５、１１．５および１２．５日目のマウス胚を４％パラホルムアルデヒド中で３時間固定し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ（サクラファインテック社、東京中央区）を用いて凍結切片用に包埋した。サンプルをＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と共に５分間室温でインキュベートし、次いで洗浄し、以下の一次抗体と共にインキュベートした：抗Ｇ−ＣＳＦ受容体（サンタクルーズバイオテクノロジー社（ｓｃ−９１７３）、１：５０）、抗Ｐａｘ３（ＡＴＣＣ、１：２００）、抗Ｐａｘ７（Ｒ＆Ｄシステムズ社（ＭＡＢ１６７５）、１：５０）、抗ＭｙｏＤ（ダコ社（Ｍ３５１２）、１：５０）、抗Ｍｙｏｇｅｎｉｎ（サンタクルーズバイオテクノロジー社（ｓｃ−１２７３２）、１：５０）、抗Ｄｅｓｍｉｎ（ダコ社（Ｍ０７６０）、１：２００）、抗Ｇ−ＣＳＦ（サンタクルーズバイオテクノロジー社（ｓｃ−９３５１）、１：５０）、抗α−アクチニン（シグマ社（Ａ７８１１）、１：１０００）および抗ＧＡＰＤＨ（サンタクルーズバイオテクノロジー社（ｓｃ−２０３５７）、１：２００）、いずれも購入品。一晩インキュベートした後、結合した抗体を、Ａｌｅｘａ４８８またはＡｌｅｘａ５４６（モレキュラー・プローブ社、東京港区）で標識した二次抗体で可視化した。４’，６−ジアミジン−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ；インビトロジェン社（Ｄ２１４９０））で核を染色した。ＢｒｄＵ染色には、ＢｒｄＵ標識キット（１２９６７３６、ロシュ社、バーゼル、スイス）を使用した。ヒストＶＴ  ワン（Ｌ６Ｆ９５８７、ナカライテスク社、京都中京区）を用いて抗原を回復し、ブロッキングを行った後、ＢｒｄＵをプロトコールに記載の通り染色した。【００４５】
Ｃ２Ｃ１２細胞培養
Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞（ＡＴＣＣ）をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。分化状態では、培地を分化用のＤＭＥＭ／２％ウマ血清（ＧＩＢＣＯ）と交換した。組換えマウスＧ−ＣＳＦ（４１４−ＣＳ、Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、ＭＮ）を所定の日に添加した。Ｇ−ＣＳＦＲ中和抗体（ＡＦ−４１４−ＮＡ、Ｒ＆Ｄシステムズ社）を投与してシグナル阻害分析を行った。【００４６】
ウェスタンブロット
Ｃ２Ｃ１２細胞にＧ−ＣＳＦを作用させた。Ｇ−ＣＳＦ刺激の０、５、１０、１５、３０、４５および６０分後に細胞抽出物を単離した。タンパク質溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜へ転写した。次いで、抗リン酸化ＳＴＡＴ３抗体（９１３１）、抗リン酸化ＡＫＴ抗体（９２７１）、抗リン酸化ＥＲＫ抗体（９１０１）、抗リン酸化ＪＮＫ抗体（９２５１Ｓ）、抗リン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ抗体（９２１１Ｓ）（いずれもセル・シグナリング・テクノロジー社、ベヴァリー、ＭＡより購入）および西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ＩｇＧでイムノブロットを行い、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光試薬（ピアス社、ロックフォード、ＩＬ）で発色させた。同膜を回収し、抗ＳＴＡＴ３抗体（９１３２）、抗ＡＫＴ抗体（９２７２）、抗ＥＲＫ抗体（９１０２）、抗ＪＮＫ抗体（９２５２）、抗ｐ３８ＭＡＰＫ抗体（９２１２）（いずれもセル・シグナリング・テクノロジー社より購入）でそれぞれ再ブロットした。【００４７】
ルシフェラーゼ分析
ＤＭＥＭ中で培養したＣ２Ｃ１２細胞を、説明書に従ってリポフェクトアミン（インビトロジェン社）でトランスフェクトした。ＡＰＲＥルシフェラーゼプラスミドは、吉村教授（慶応大学免疫学教室）のご好意でご提供いただいた。１００ｎｇのＡＰＲＥレポーターを使用した。記号で表したＧ−ＣＳＦの投与量は、それぞれ、３７．５、１２５、３７５ｐｇ／ｍｌを示す。ＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを内部対照として用い、トランスフェクション効率のばらつきを標準化した。ウェスタンブロットで確認したところ、いずれのタンパク質も非常に似通ったレベルで発現した。【００４８】
動物実験
実験方法およびプロトコールは全て、慶応大学動物実験委員会の承認を受けており、ＮＩＨ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｉｍａｌｓに従った。【００４９】
骨格筋傷害モデル
１００μｌのＰＢＳで希釈した心臓毒（ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ：Ｎａｊａｍｏｓｓａｍｂｉｃａ  ｍｏｓｓａｍｂｉｃａ、希釈後濃度１０μＭ；シグマ・アルドリッチ社、セントルイス、ＭＯ）を、２７ゲージ針と１ｍｌシリンジを用いてＢＬ６／Ｊマウスの大腿直筋へ１００μｌ注射した。針を膝から長手方向に深く大腿直筋へ挿入し、筋肉の長さに沿って心臓毒を注入した。対照群のマウスには１００μｌのＰＢＳを注射した。マウス（処置群および対照群）を心臓毒注射後に屠殺し、血液サンプル（各マウスから１．０〜１．５ｍｌ）をヘパリン処理シリンジへ回収した。【００５０】
ｃｓｆ３ｒ−／−マウス
ｃｓｆ３ｒ−／−マウスは、ダニエル  Ｃ．リンク博士（ワシントン大学医学部、セントルイス）から恵与された（Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｍ．Ｋ．，Ｌｉｕ，Ｆ．，Ｉｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ａｋａｓｈｉ，Ｋ．＆  Ｌｉｎｋ，Ｄ．Ｃ．Ｐｉｖｏｔａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｂｌｏｏｄ  １０２，３５６２−３５６８，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００３−０２−０５９３（２００３））。【００５１】
握力測定試験
５段階の訓練期間を設け、握力測定装置（室町機械株式会社）のバーに向き合うよう動物を保持し、前脚を実験者によって軽く拘束した。拘束されていない後脚が握力測定装置のバーに接触したら、動物にバーを握らせ、次いで装置からゆっくりと引き離した。次いで、動物がバーを離れる前の最大握力を握力測定装置で測定した。【００５２】
骨髄移植
８週齢のＥＧＦＰトランスジェニックマウスから骨髄細胞を採取した。９．０Ｇｙを単回照射した後、分画していないＥＧＦＰ＋骨髄細胞（１×１０６細胞）を尾静脈注射した。キメリズムを評価するため、レシピエントマウスから骨髄移植後８週目に末梢血細胞を回収し、塩化アンモニウムで溶血して赤血球を除去した後、末梢血有核細胞に占めるＥＧＦＰ＋細胞の頻度を蛍光活性化細胞選別装置（ベクトン・ディッキンソン社、サンノゼ、カリフォルニア）で求めた。【００５３】
統計的分析
データはＳｔａｔＶｉｅｗ  Ｊ−４．５ソフトウェアを用いて分析した。値は平均±ＳＤで表す。群間比較は一元配置分散分析によって行った。ＳｃｈｅｆｆｅのＦ検定を用いて有意水準を求めた。有意と認められる確率水準はＰ＜０．０５とした。
実施例１【００５４】
発生途上のマウス胚におけるｃｓｆ３ｒの発現パターンをホールマウント・インサイチュ・ハイブリダイゼーションにより試験した。【００５５】
ｃｓｆ３ｒが体節内の何処で発現するのかを明らかにするため、複数の骨格筋細胞分化マーカーを比較した（図１ａ）。肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に対するチロシンキナーゼ受容体をコードするＣ−ｍｅｔは、皮筋板において発現し、筋肉前駆細胞の剥離／遊走にとって不可欠である。Ｃ−ｍｅｔの発現は体節の腹側部分に制限され、ｃｓｆ３ｒの発現パターンは、ｃ−ｍｅｔとは類似していなかった（Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｍ．，Ｖｏｇａｎ，Ｋ．，Ｇｒｏｓ，Ｐ．＆  Ｐａｒｋ，Ｍ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｏｍｉｔｅｓ  ａｎｄ  ｌｉｍｂｓ  ｉｓ  ａｂｓｅｎｔ  ｉｎ  Ｓｐｌｏｔｃｈ  ｍｉｃｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２，２１６３−２１７１（１９９６））。骨格筋細胞の発生は筋原性転写因子によって細かく調整されている。Ｐａｘ３は前体節中胚葉でまず発現し、皮筋板の体節上皮で発現する。次いで、皮筋板由来細胞が筋原性転写因子を活性化するのに伴い、Ｐａｘ３とＰａｘ７の発現が抑制される。Ｐａｘ３の発現パターンは、ｃｓｆ３ｒの発現パターンと同一ではなかった。筋原性ｂＨＬＨ遺伝子も、骨格筋の分化発生段階において独特の発現パターンを示す。ＭｙｏＤおよびｍｙｆ５は、増殖途上の未分化筋芽細胞で発現し（Ｔａｐｓｃｏｔｔ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．ＭｙｏＤ１：ａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ  ａ  Ｍｙｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｒｅｇｉｏｎ  ｔｏ  ｃｏｎｖｅｒｔ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，４０５−４１１，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．３１７５６６２（１９８８）；Ｓａｒａ  Ｊ．Ｖｅｎｔｅｒｓ，Ｓ．ｖ．Ｔ．ｔ．Ｍ．Ｊ．Ｄ．Ｅａｒｌｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｙｏｔｏｍｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ２１６，２１９−２３２（１９９９））、一方、ｍｒｆ４は分化プログラムの後期まで発現しない（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｓ．Ｊ．＆  Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ，Ｓ．Ｆ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＲＦ４：ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３，２０５０−２０６１，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇａｄ．３．１２ｂ．２０５０（１９８９）；Ｂｏｂｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅ，Ｍｙｆ−６，ｈａｓ  ａ  ｂｉｐｈａｓｉｃ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅａｒｌｙ  ｍｏｕｓｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１３，１２５５−１２６５，ｄｏｉ：１０．１０８３／ｊｃｂ．１１３．６．１２５５（１９９１））。これらのマーカーの発現パターンと比較すると、ｃｓｆ３ｒの発現パターンはｍｙｆ５およびｍｙｏｄの発現パターンに類似している。後期分化マーカーであるｍｒｆ４は、ｃｓｆ３ｒの発現パターンと同一ではない。【００５６】
分化発生段階にある胚の断面の免疫蛍光染色からは、体節におけるＧ−ＣＳＦＲの発現がＥ９．５〜１０．５に限定されることが明らかになった。Ｅ９．５以前ではＧ−ＣＳＦＲは体節では観察されず、Ｅ１１．５以降ではＧ−ＣＳＦＲの発現は消失する（図１ｂ）。【００５７】
以上の結果から、Ｇ−ＣＳＦが未分化の増殖性筋芽細胞の発生に関与している可能性が判明した。
実施例２【００５８】
複数の分化段階における骨格筋細胞の未成熟および成熟マーカーの免疫染色から、どの段階の骨格筋細胞がＧ−ＣＳＦＲを発現するのかを明らかにした。骨格筋前駆細胞は皮筋板の中央部に由来し、Ｐａｘ３とＰａｘ７を同時に発現し、胚形成中に骨格筋線維に分化することができる（Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｇ．＆  Ｃｏｓｓｕ，Ｇ．Ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｆｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ：ａ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐａｘ３  ａｎｄ  Ｐａｘ７．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２３，９０２−９０５，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇａｄ．１７９７００９（２００９））。Ｐａｘ３とＰａｘ７は筋原性前駆体において一部重複する独自の機能を有し、双方とも、筋原性調節因子（ＭＲＦ）の発現に続いて筋原性分化時にダウンレギュレートされる。Ｐａｘ３とＰａｘ７を発現している筋原性前駆細胞はＧ−ＣＳＦＲを発現しなかった（図１ｃ）。しかしながら、Ｐａｘ３とＰａｘ７が減少している細胞のうち、ＭｙｏＤとＭｙｏｇｅｎｉｎを発現し始めた細胞では、Ｇ−ＣＳＦＲの発現が見られた（図１ｄ）。Ｇ−ＣＳＦＲの発現パターンに関するこれまでの報告と同様に、定常状態条件では、Ｇ−ＣＳＦＲに対する免疫反応性は細胞膜および細胞質に局在化していた（Ａａｒｔｓ，Ｌ．Ｈ．Ｊ．，Ｒｏｏｖｅｒｓ，Ｏ．，Ｗａｒｄ，Ａ．Ｃ．＆  Ｔｏｕｗ，Ｉ．Ｐ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ２  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ＣＯＯＨ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｍｏｔｉｆｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｇ−ＣＳＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０３，５７１−５７９，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００３−０７−２２５０（２００４））。このような細胞では、骨格筋に発現する中間径フィラメントであるデスミンも発現していた。【００５９】
Ｇ−ＣＳＦＲのリガンドであるＧ−ＣＳＦも、同様に免疫染色で検討した。Ｇ−ＣＳＦの発現は、Ｐａｘ３とＰａｘ７を発現している筋原性前駆細胞では検出されなかった（図１ｅ）。Ｇ−ＣＳＦＲ発現細胞の場合と同様に、Ｐａｘ３とＰａｘ７が減少している細胞のうち、ＭｙｏＤとＭｙｏｇｅｎｉｎを発現し始めた細胞でも、Ｇ−ＣＳＦの発現が見られた（図１ｆ）。Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦＲの二重免疫染色からは、Ｇ−ＣＳＦＲ発現細胞においてもＧ−ＣＳＦが発現することが判明した。これらの結果から、早期に骨格筋細胞へと分化する細胞がオートクライン的にＧ−ＣＳＦシグナリングを有することが明らかとなった。【００６０】
本実験により、Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ受容体は分化途上の骨格筋細胞で発現することが確認された。
実施例３【００６１】
筋原性細胞におけるＧ−ＣＳＦの役割を解明するため、筋芽細胞をインビトロで分析した。【００６２】
Ｇ−ＣＳＦおよび抗Ｇ−ＣＳＦ中和抗体の添加時期および添加濃度は以下の通りである。【００６３】
Ｇ−ＣＳＦ
添加時期：細胞を捲種後１日目はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳでＤｉｓｈに接着させ、２日目にＷａｓｈし、ＤＭＥＭ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）およびＤＭＥＭ＋Ｇ−ＣＳＦを投与し、この２日目を図２ｃではＤａｙ０とした。投与はこのＤａｙ０のみの単回投与である。
Ｇ−ＣＳＦ添加濃度：図２ｃのグラフの下から０μｇ／ｍｌ、３７．５ｐｇ／ｍｌ、１２５ｐｇ／ｍｌ、３７５ｐｇ／ｍｌ。【００６４】
抗Ｇ−ＣＳＦ中和抗体
添加時期：細胞を捲種後１日目はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳでＤｉｓｈに接着させ、２日目にＷａｓｈし、ＤＭＥＭ（Ｓｅｒｕｍ−）、ＤＭＥＭ＋０．１％ＨＳ（Ｓｅｒｕｍ＋）、ＤＭＥＭ＋０．１％ＨＳ＋抗Ｇ−ＣＳＦ中和抗体を投与し、この２日目を図２ｅではＤａｙ０とした。投与はこのＤａｙ０のみの単回投与である。
抗Ｇ−ＣＳＦ中和抗体濃度：０．１５ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、１．５ｎｇ／ｍｌ。【００６５】
Ｃ２Ｃ１２細胞株は、成体マウスの再生大腿筋から樹立したＣ２細胞のサブクローンであり、筋芽細胞株として広く使用されている（Ｂｌａｕ，Ｈ．Ｍ．，Ｃｈｉｕ，Ｃ．−Ｐ．＆  Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｃ．Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｓｔａｂｌｅ  ｈｅｔｅｒｏｃａｒｙｏｎｓ．Ｃｅｌｌ  ３２，１１７１−１１８０（１９８３））。低血清培養条件では、Ｃ２Ｃ１２細胞は互いに融合して多核筋管細胞へと分化する（図２ａ）。Ｇ−ＣＳＦＲおよびα−アクチニンの免疫染色からは、未成熟Ｃ２Ｃ１２細胞ではアクチニンが発現せず、Ｇ−ＣＳＦＲが発現し、一方、成熟融合筋管細胞ではα−アクチニンが明らかに発現し、α−アクチニン陽性細胞ではＧ−ＣＳＦＲが一切発現しないことが判明した。ウェスタンブロット分析からは、分化が進むにつれてα−アクチニンの発現が徐々に増加し、Ｇ−ＣＳＦＲが減少することが確認された（図２ｂ）。【００６６】
筋細胞に対するＧ−ＣＳＦの役割を明らかにするため、Ｇ−ＣＳＦＲの発現時にＧ−ＣＳＦをＣ２Ｃ１２細胞へ投与した。Ｇ−ＣＳＦ投与により、用量依存的にＣ２Ｃ１２細胞数が有意に増加した（図２ｃ）。図２ｃで行った実験の最高投与量である３７５ｐｇ／ｍｌを０日目で添加し、４日目に測定を行った、ＢｒｄＵの取り込み実験からも、細胞数の増加がＧ−ＣＳＦによる細胞増殖に起因することが判明した（図２ｄ）。また、中和抗体を用いて内在性のＧ−ＣＳＦシグナリングを阻害することで、Ｇ−ＣＳＦがＣ２Ｃ１２細胞の増殖にとって不可欠であるか否かを解明した。Ｇ−ＣＳＦの中和抗体によって、血清依存性のＣ２Ｃ１２細胞の増殖が阻害された（測定は４日目に実施した）（図２ｅ）。【００６７】
Ｇ−ＣＳＦの受容体への結合は、造血細胞において、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）タンパク質といった様々なシグナルを活性化することが報告されている（Ａｖａｌｏｓ，Ｂ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ  ８８，７６１−７７７（１９９６））。Ｇ−ＣＳＦがＣ２Ｃ１２細胞において経時的にＳＴＡＴ３、ＡＫＴ、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８ＭＡＰＫを活性化することを確認した。本実験ではＧ−ＣＳＦを３７５ｐｇ／ｍｌ添加した（図２ｆ）。これらのうち、ＳＴＡＴ３は、筋細胞前駆細胞の増殖に寄与することが報告されている（Ｓｅｒｒａｎｏ，Ａ．Ｌ．，Ｂａｅｚａ−Ｒａｊａ，Ｂ．，Ｐｅｒｄｉｇｕｅｒｏ，Ｅ．，Ｊａｒｄｉ，Ｍ．＆  Ｍｕｎｏｚ−Ｃａｎｏｖｅｓ，Ｐ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｉｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ７，３３−４４（２００８）；Ｌｙｎｎ  Ａ．Ｍｅｇｅｎｅｙ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌ．Ｓ．Ｐｅｒｒｙ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｅ．Ｌｅｃｏｕｔｅｒ  ＆  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｒｕｄｎｉｃｋｉ．ｂＦＧＦ  ａｎｄ  ＬＩＦ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＳＴＡＴ３  ｉｎ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９，１３９−１４５（１９９６）．）。Ｃ２Ｃ１２細胞培養培地へＧ−ＣＳＦを投与すると、ＳＴＡＴ３の活性化に応答するＡＰＲＥルシフェラーゼの活性が増加した（測定は１日目に実施した）（図２ｇ）。これらの結果から、Ｇ−ＣＳＦがＧ−ＣＳＦＲを介してＣ２Ｃ１２筋芽細胞における増殖を促進することが明らかとなった。
実施例４【００６８】
傷害後の再生途上の骨格筋細胞でＧ−ＣＳＦＲが発現するか否かを検討した。心臓毒は筋線維の形質膜を損傷するが、基底板、サテライト細胞および神経は損傷しないことが知られており、迅速な筋肉再生を再現することができる（Ｈｏｓａｋａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．｛ａｌｐｈａ｝１−Ｓｙｎｔｒｏｐｈｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５８，１０９７−１１０７，ｄｏｉ：１０．１０８３／ｊｃｂ．２００２０４０７６（２００２））。【００６９】
本発明者らは心臓毒を直接大腿筋へ注射し、２８日目まで定期的に組織学的分析を行った（図３ａ）。心臓毒を注射した後、傷害を受けた筋肉の自発的な再生を観察した（図３ｂ）。１〜２日目より、かなりの炎症性細胞が傷害筋肉へ浸潤しており、傷害を受けた筋管細胞が吸収された。サテライト細胞またはＴＡ細胞（ｔｒａｎｓｉｔ  ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ｃｅｌｌ）は３日目から増加し始め、中心核を持つ初期筋細胞は５日目から明らかに同定された。これらの細胞は互いに融合し、その後直径が急速に増加した。傷害領域は７日目より、再生された筋管細胞（中心核を有し、成熟筋管細胞よりも直径が小さい）で満たされた。２８日目には、再生された筋管細胞が中心核を有するものの、傷害を受けていない筋管細胞とほぼ同じくらいの直径となった。【００７０】
ラミニン、Ｇ−ＣＳＦＲおよびＤＡＰＩの三重免疫染色からは、傷害を受けていない骨格筋ではＧ−ＣＳＦＲ陽性細胞は観察されなかった（図３ｃ）。これに対し、再生途上の筋細胞では、心臓毒注射後５日目にＧ−ＣＳＦＲが明らかに発現した（図３ｄ）。Ｇ−ＣＳＦＲ陽性細胞の大きさは、見たところ、浸潤した炎症性細胞よりも大きく、かつ、円形で中心核を有し、ラミニンで完全に包囲されており、このことから、Ｇ−ＣＳＦＲ陽性細胞は再生途上の初期筋細胞であって、Ｇ−ＣＳＦＲを発現することが明らかとなった。一連の免疫蛍光染色分析から、Ｇ−ＣＳＦＲ発現細胞は、骨格筋細胞傷害後３〜８日目にのみ見られることが判明した（図３ｅ、ｆ）。【００７１】
筋肉の修復は、不連続な再生段階を特徴とする。この期間、サテライト細胞の活性化、サテライト細胞またはＴＡ細胞の増殖・分化・成熟といった骨格筋の再生が進行する（Ｓｈｉ，Ｘ．＆  Ｇａｒｒｙ，Ｄ．Ｊ．Ｍｕｓｃｌｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０，１６９２−１７０８，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇａｄ．１４１９４０６（２００６））。Ｇ−ＣＳＦＲの発現日は、骨格筋前駆細胞の増殖日に相当していた。
実施例５【００７２】
再生途上の筋細胞に対するヒトＧ−ＣＳＦの作用を解明するため、心臓毒による骨格筋傷害モデルへヒトＧ−ＣＳＦを注射した。Ｇ−ＣＳＦは、Ｇ−ＣＳＦＲが強く発現する４日目および６日目に静脈内へ投与するか、または、傷害を受けた筋肉内へ直接注射し、７日目に骨格筋の再生を観察した。
最終添加濃度：０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌをそれぞれ１００μｌずつ投与。
投与時期・経路・回数・部位：骨格筋傷害した日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ４とＤａｙ６に尾静脈注射および傷害させた大腿直筋へ局所注射した。
実験動物数：ｎ＝５
マウス平均体重：２４．１ｇ【００７３】
また、抗Ｇ−ＣＳＦ中和抗体については、ヒトＧ−ＣＳＦと同様の条件で、単回、Ｄａｙ３に大腿直筋へ局所注射した。【００７４】
Ｇ−ＣＳＦの投与量が高い場合、ＰＢＳ投与と比較して、骨格筋の再生には静脈内投与が有効であった。筋肉内投与は、Ｇ−ＣＳＦを低投与量で投与する際に静脈内投与よりも有効であった（図４ａ）。中心核を有する細胞は、再生された骨格筋細胞に相当する（Ｓｈｉ，Ｘ．＆  Ｇａｒｒｙ，Ｄ．Ｊ．Ｍｕｓｃｌｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０，１６９２−１７０８，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇａｄ．１４１９４０６（２００６））。中心核を有する細胞の数は、Ｇ−ＣＳＦの投与によって有意に増加し、Ｇ−ＣＳＦを筋肉内へ投与すると、骨格筋の再生が有意に増強された（図４ｂ）。傷害筋肉の直径を測定したところ、Ｇ−ＣＳＦの投与によって再生後の筋肉の直径が有意に増加した。大腿直筋の直径も筋肉内投与によって増加し、静脈内投与よりも顕著であった（図４ｃ）。機能回復を握力の測定により評価したところ、Ｇ−ＣＳＦ（投与量：５０μｇ／ｍｌを１００μｌ）によって、骨格筋傷害後５日目および７日目には、ＰＢＳ投与に比べて機能回復が有意に向上した（図４ｄ）。【００７５】
内在性のＧ−ＣＳＦシグナリングが骨格筋細胞の適正な再生にとって必要であるか否かを解明するため、心臓毒による骨格筋傷害後に抗Ｇ−ＣＳＦ中和抗体を投与した。抗Ｇ−ＣＳＦ中和抗体を投与したところ、抗Ｇ−ＣＳＦ中和抗体の用量に依存して自発的な骨格筋細胞の再生が低下した（図４ｅ）。再生途上の筋細胞に相当する中心核を有する細胞は、抗Ｇ−ＣＳＦ中和抗体の添加によって激減した（図４ｆ）。傷害筋肉の直径も、ＰＢＳと比べて抗Ｇ−ＣＳＦ中和抗体の投与によって有意に減少した（図４ｇ）。これらの結果から、外因性のＧ−ＣＳＦが骨格筋細胞の再生を増強し、生理学的な内在性Ｇ−ＣＳＦシグナリングが骨格筋細胞の適正な再生にとって必須の役割を果たすことが明らかとなった。【００７６】
また、ヒトＧ−ＣＳＦの投与は低投与量でも骨格筋細胞の再生効果が得られること、および筋肉内投与の方が静脈内投与よりも効果が高いことが判明した。
実施例６【００７７】
骨格筋細胞におけるＧ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ受容体シグナリングの役割を明らかにするため、遺伝子工学的にＧ−ＣＳＦシグナリングを不活性化したＧ−ＣＳＦＲノックアウト（ｃｓｆ３ｒ−／−）マウスを検討した。ｃｓｆ３ｒ−／−マウスは、主に血液学的見地からの検討に使用した。ｃｓｆ３ｒ−／−マウスで分娩されるマウス数は少なく、野生型（ｃｓｆ３ｒ＋／＋）マウスのおよそ半分であった。正常に分娩されたｃｓｆ３ｒ−／−マウスでは、外見上有意な差異は見られなかった。十分に成長した時点では、その体長は、ｃｓｆ３ｒ＋／＋よりも僅かではあるが有意に小さかった。ｃｓｆ３ｒ−／−マウスの骨格筋の組織学的分析からは、一見したところ、ｃｓｆ３ｒ＋／＋マウスと比べて有意な差異は見られなかった（図５ａ）。しかしながら、骨格筋の断面においては、各筋細胞の大きさが、ｃｓｆ３ｒ＋／＋マウスに比べてｃｓｆ３ｒ−／−マウスでは僅かではあるが有意に大きかった（図５ｂ）。また、大腿直筋の直径は野生型よりも有意に小さかった（図５ｃ）。これらの知見から、ｃｓｆ３ｒ−／−マウスでは、発生段階において骨格筋の増殖が低下しており、各骨格筋細胞が代償として肥大することが示唆された。【００７８】
内在性のＧ−ＣＳＦＲが骨格筋細胞の適正な再生にとって必要であるか否かを解明するため、ｃｓｆ３ｒ−／−マウスに心臓毒による骨格筋傷害を生じさせた。ｃｓｆ３ｒ−／−マウスでは、心臓毒による傷害後７日目および１４日目には骨格筋の再生が低下した（図５ｄ）。再生途上の骨格筋における中心核を有する筋細胞の数は、ｃｓｆ３ｒ−／−マウスでは有意に減少し、Ｇ−ＣＳＦＲが骨格筋の再生にとって不可欠であることが示唆された（図５ｅ）。Ｇ−ＣＳＦの作用がＧ−ＣＳＦＲを介するものであることを確認するため、Ｇ−ＣＳＦをｃｓｆ３ｒ−／−マウスへ投与した。Ｇ−ＣＳＦ（投与量：５０μｇ／ｍｌをそれぞれ１００μｌ）は、４日目および６日目に傷害させた大腿直筋へ局所投与した。Ｇ−ＣＳＦが他の受容体を介して作用するのであれば、Ｇ−ＣＳＦはｃｓｆ３ｒ−／−マウスにおいても骨格筋の再生を向上させるはずであるが、外因性のＧ−ＣＳＦを投与した場合には、骨格筋の再生を向上させることはできなかった（図５ｆ）。再生途上の骨格筋における中心核を有する筋細胞の数を測定したところ、Ｇ−ＣＳＦの投与によって、ｃｓｆ３ｒ＋／＋マウスでは再生後の筋肉の直径が有意に増加したものの、ｃｓｆ３ｒ−／−マウスでは効果が見られなかった（図５ｇ）。機能回復を握力の測定により評価したところ、Ｇ−ＣＳＦを投与しても、骨格筋傷害後５日目および７日目に機能回復は認められなかった（図５ｈ）。
実施例７【００７９】
Ｇ−ＣＳＦＲノックアウトマウスにおける骨格筋再生の低下に対する造血細胞の関与を明らかにするために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を構成的に発現するｃｓｆ３ｒ＋／＋マウス由来の骨髄を、心臓毒傷害の６０日前にｃｓｆ３ｒ−／−マウスへ移植した（図６ａ）。いずれのマウスにおいても、骨髄細胞が安定して生着し、キメリズムが少なくとも８０％を超えることを、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析によって確認した（図６ｂ）。心臓毒を大腿直筋へ注射し、Ｇ−ＣＳＦ（投与量：５０μｇ／ｍｌをそれぞれ１００μｌ）を４日目および６日目に投与した。心臓毒を注射後、ｃｓｆ３ｒ＋／＋マウスの骨髄を移植したｃｓｆ３ｒ−／−マウスでは、Ｇ−ＣＳＦを投与しても握力試験に何ら向上は見られなかった（図６ｃ）。また、大腿直筋の直径もＧ−ＣＳＦでは向上しなかった（測定は７日目に実施した）（図６ｄ）。【００８０】
次いで、骨髄移植実験を逆にして行った。ｃｓｆ３ｒ−／−マウスの骨髄をｃｓｆ３ｒ＋／＋マウスへ移植した。これらのマウスを用いて骨格筋傷害を生じさせたところ、Ｇ−ＣＳＦによって再生が誘導された（図６ｅ）。握力試験からは、Ｇ−ＣＳＦによってその強度が顕著に向上し（図６ｆ）、大腿直筋の直径も増加することが判明した（測定は７日目に実施した）（図６ｇ）。【００８１】
本実験からＧ−ＣＳＦ受容体を発現する造血細胞では、Ｇ−ＣＳＦ受容体ノックアウトマウスにおける骨格筋再生能を回復できないことが確認された。よって、これらの結果から、骨格筋再生に関するＧ−ＣＳＦの作用は骨格筋に対する直接的な作用であり、骨髄細胞を介さないことが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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