(57)【要約】  (１)pH7.4における溶解度(25℃)が1mg/mL以上である、及び(２)血管新生抑制作用を有する、を満たすポリエチレングリコールが結合してなるバソヒビン修飾体。本発明のバソヒビン修飾体は、中性付近における溶解性が高いことから、血管新生抑制効果を要する疾患の治療等に好適に用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(１)及び(２)を満たす、ポリエチレングリコールが結合してなるバソヒビン修飾体。
(１)pH7.4における溶解度(25℃)が1mg/mL以上である
(２)血管新生抑制作用を有する
【請求項２】
Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールと、バソヒビンとを反応させてなる、請求項１記載のバソヒビン修飾体。
【請求項３】
Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールと、バソヒビンとを酸性条件下で反応させてなる、請求項２記載のバソヒビン修飾体。
【請求項４】
酸性条件がpH3.0〜4.0である、請求項３記載のバソヒビン修飾体。
【請求項５】
Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールとバソヒビンをモル比(ポリエチレングリコール／バソヒビン)350/1〜450/1で反応させる、請求項２〜４いずれか記載のバソヒビン修飾体。
【請求項６】
Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールの平均分子量が4000〜6000である、請求項２〜５いずれか記載のバソヒビン修飾体。
【請求項７】
Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールが、式(Ｉ)：
【化１】
2010074082.tif 000006
(式中、Ｘは２価の有機基を示し、ｎは正の整数を示す)
で表わされる化合物である、請求項２〜６いずれか記載のバソヒビン修飾体。
【請求項８】
バソヒビン1分子に対して、ポリエチレングリコールが2分子〜7分子結合してなる、請求項２〜７いずれか記載のバソヒビン修飾体。
【請求項９】
ポリエチレングリコールが結合する位置が、配列番号２の５、６、７９、８３、９０、１０３、１４５、１４６、１５８、１６２、１６８、１９４、２２９、２５５、２５６、２５８、２７６、２９２、３０４、３０７、３１６、３１９、３２０、３４７、３４８及び３５３番目のリジン残基ならびにＮ末端のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求項２〜８いずれか記載のバソヒビン修飾体。
【請求項１０】
マウス血中での半減期が1時間以上である請求項１〜９いずれか記載のバソヒビン修飾体。
【請求項１１】
Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールと、バソヒビンとを酸性条件下で反応させる工程を含む、請求項２〜１０いずれか記載のバソヒビン修飾体の製造方法。
【請求項１２】
酸性条件がpH3.0〜4.0である、請求項１１記載のバソヒビン修飾体の製造方法。
【請求項１３】
Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールと、バソヒビンをモル比(ポリエチレングリコール／バソヒビン)350/1〜450/1で反応させる、請求項１１又は１２記載のバソヒビン修飾体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜１０いずれか記載のバソヒビン修飾体を含有してなる、バソヒビン修飾体調製物。
【請求項１５】
アルデヒド基を有するポリエチレングリコールと、バソヒビンとを反応させてなる、請求項１記載のバソヒビン修飾体。
【請求項１６】
アルデヒド基を有するポリエチレングリコールの平均分子量が35000以下である、請求項１５記載のバソヒビン修飾体。
【請求項１７】
アルデヒド基を有するポリエチレングリコールが、式(II)：
ＣＨ３Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｍ−Ｙ−ＣＨＯ               (II)
(式中、Ｙは２価の有機基を示し、ｍは正の整数を示す)
で表わされる化合物である、請求項１５又は１６記載のバソヒビン修飾体。
【請求項１８】
ポリエチレングリコールが、バソヒビンのＮ末端のアミノ酸残基にのみ結合してなる請求項１５〜１７いずれか記載のバソヒビン修飾体。
【請求項１９】
請求項１〜１０、１５〜１８いずれか記載のバソヒビン修飾体を含有してなる、医薬組成物。
【請求項２０】
血管新生抑制作用を要する疾患の治療に用いられる請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１０、１５〜１８いずれか記載のバソヒビン修飾体、請求項１４記載のバソヒビン修飾体調製物、請求項１９又は２０記載の医薬組成物のいずれかを投与することを特徴とする血管新生抑制作用を要する疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バソヒビン修飾体に関する。より詳しくは、特定の活性型ポリエチレングリコールを用いて修飾されたバソヒビン修飾体、その製造方法、及び該バソヒビン修飾体を含有する修飾体調製物、医薬組成物、ならびに、該バソヒビン修飾体、修飾体調製物、医薬組成物を投与することを特徴とする血管新生抑制作用を要する疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリエチレングリコール(polyethylene glycol：PEG)は、無毒性かつ非免疫原性の高分子であり、用途に応じてサイズや側鎖構造を変化させることができるという特徴を有する。この特徴を利用して、近年、生体内での安定性が悪いタンパク質の薬物動態特性や免疫特性を改善する方法として、目的タンパク質へのPEG修飾が注目されている。【０００３】
例えば、非特許文献１には、FDAに認可されたり、臨床試験が行われたりしている種々のPEG修飾薬物が報告されている。また、非特許文献２には、タンパク質のPEG修飾に関する種々の方法が記載されており、そのうち、非特許文献３には、N-succinimide(Ｎ-スクシンイミジル基)を有するPEG(NHS-PEG)を用いるＮ-アシル化反応によるPEG修飾が記載されている。具体的には、pH8.4の中性領域の緩衝液中で、Ｎ-スクシンイミジル基を有するPEGと抗体とを、1、3、6の各モル比(抗体／PEG)で反応させてPEG修飾を行っている。また、非特許文献４のようにアルデヒド基を官能基として有するPEG(CHO-PEG)を用いて還元的アミノ化反応によりタンパク質を修飾する例も報告されている。【０００４】
バソヒビンは、腫瘍細胞や間質細胞、マクロファージなどから分泌される血管新生促進因子(ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２等)の刺激により血管内皮細胞に発現し(特許文献１参照)、内皮細胞自身にオートクライン的に作用して、血管新生を抑制する作用を有するポリペプチドである。従って、バソヒビンは、生体内における抗血管新生阻害効果、ひいては抗腫瘍効果を奏する薬物として、適用が期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ０２／０９０５４６号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】C. Simone. Fishburn、Journal of Pharmaceutical Sciences、2008、10、p1-17
【非特許文献２】M. J. Roberts, et al.、Advanced Drug Delivery Reviews、2002、54、p459-476
【非特許文献３】Eizo Sada, et al.、Journal of Fermentation and Bioengineering、1991、71、No.2、p137-139
【非特許文献４】O. Kinstler, et al.、Advanced Drug Delivery Reviews、2002、54、p477-485
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らはバソヒビンを調製する過程において、バソヒビンの中性域での溶解性が著しく低いことを見出した。中性pH域での溶解性が悪い場合には不溶化や凝集が発生するリスクが高く、これに伴う投与量の制限や抗原性の問題により医薬品としての応用が困難であり、解決する必要が生じた。【０００８】
また、バソヒビンは中性付近での溶解性が低いため、各種ポリエチレングリコールのなかでもＮ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールによるバソヒビン修飾は、常法に従って行うことが困難であることが判明した。【０００９】
本発明の課題は、中性付近における溶解性が向上し、生体内において優れた血管新生阻害効果及び抗腫瘍効果を発揮する、ポリエチレングリコールが結合しているバソヒビン修飾体、その製造方法、及び該バソヒビン修飾体を含有する修飾体調製物、医薬組成物、ならびに、該バソヒビン修飾体、修飾体調製物、医薬組成物を投与することを特徴とする血管新生抑制作用を要する疾患の治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールとバソヒビンとの反応を、酸性領域で、かつ、ポリエチレングリコールを大過剰で反応させることにより、ポリエチレングリコールが結合したバソヒビン修飾体が得られ、当該修飾によりバソヒビンの生理活性を維持しつつ中性付近での溶解性及び生体内での安定性が著しく向上することを見出した。また、アルデヒド基を有するポリエチレングリコールとバソヒビンとを反応させることにより、Ｎ末端にのみ特異的にポリエチレングリコールが結合したバソヒビン修飾体が得られ、当該修飾によりバソヒビンの生理活性を維持しつつ中性付近での溶解性が著しく向上することを見出した。これらの修飾がバソヒビンを医薬品として用いるのに極めて優れた上記性質を付与することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
即ち、本発明は、
〔１〕  下記(１)及び(２)を満たす、ポリエチレングリコールが結合してなるバソヒビン修飾体、
(１)pH7.4における溶解度(25℃)が1mg/mL以上である
(２)血管新生抑制作用を有する
〔２〕  Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールと、バソヒビンとを反応させてなる、前記〔１〕記載のバソヒビン修飾体、
〔３〕  Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールと、バソヒビンとを酸性条件下で反応させる工程を含む、前記〔２〕記載のバソヒビン修飾体の製造方法、
。
〔４〕  前記〔１〕又は〔２〕記載のバソヒビン修飾体を含有してなる、バソヒビン修飾体調製物、
〔５〕  アルデヒド基を有するポリエチレングリコールと、バソヒビンとを反応させてなる、前記〔１〕記載のバソヒビン修飾体、
〔６〕  前記〔１〕、〔２〕、又は〔５〕いずれか記載のバソヒビン修飾体を含有してなる、医薬組成物、ならびに
〔７〕  前記〔１〕、〔２〕、又は〔５〕記載のバソヒビン修飾体、前記〔４〕記載のバソヒビン修飾体調製物、前記〔６〕記載の医薬組成物のいずれかを投与することを特徴とする血管新生抑制作用を要する疾患の治療方法
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のバソヒビン修飾体は、中性付近における溶解性が向上し、生体内において優れた血管新生阻害効果及び抗腫瘍効果を発揮することができるという優れた効果を奏する。また、前記修飾体のなかでも、Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコールによる修飾体は、前記特性に加えて、血中安定性も向上するという優れた効果も奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、PEG(NHS)-Vh1のゲルろ過精製画分についてSDS-PAGE分析を行った結果を示す図である。Mは分子量マーカー、Lはゲルろ過ロード液、番号はフラクションNo.を示す。
【図２】図２は、Vh1とPEG(NHS)-Vh1のMALDI-TOF MS分析を行った結果を示す図である。上段がVh1、下段がPEG(NHS)-Vh1のマスクロマトグラフであり、下段におけるピークトップの数値は分子量を示し、左から、PEGが2分子結合した修飾体(分子量:56664)、3分子結合した修飾体(分子量:67388)、4分子結合した修飾体(分子量:67388)、5分子結合した修飾体(分子量:72200)、6分子結合した修飾体(分子量:78188)、7分子結合した修飾体(分子量:83441)を示す。
【図３】図３は、Vh1、PEG(NHS)-Vh1による角膜内血管新生阻害評価の結果を示す図である。
【図４】図４は、PEG(NHS)-Vh1の血中安定性評価の結果を示す図である。
【図５】図５は、Vh1とPEG(CHO)-Vh1のMALDI-TOF MS分析を行った結果を示す図である。上段がVh1、下段が分子量5,000のCHO-PEGを反応させて得られたPEG(CHO)-Vh1のマスクロマトグラフであり、下段におけるピーク1はPEGが1分子結合した修飾体、ピーク2はPEGが2分子結合した修飾体を示す。
【図６】図６は、PEG(CHO)-Vh1のSDS-PAGE分析結果を示す。Mは分子量マーカー、5-40KはPEG(CHO)-Vh1についてVh1の修飾に用いたCHO-PEGの分子量でレーンを示した。b40Kには分岐型で平均分子量40,000のCHO-PEGを用いて修飾したVh1のレーンを示した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のバソヒビン修飾体は、バソヒビンにポリエチレングリコールが結合したものであり、
(１)pH7.4における溶解度(25℃)が1mg/mL以上である
(２)血管新生抑制作用を有する
の特性を有する。このような中性付近における溶解性に優れ、血管新生抑制作用を有するバソヒビン修飾体としては、具体的には、バソヒビンとＮ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコール(以下、NHS-PEGと記載することもある)とを、酸性領域で特定のモル比(バソヒビン／NHS-PEG)で反応させることにより得られるもの(態様１のバソヒビン修飾体)、及び、バソヒビンとアルデヒド基を有するポリエチレングリコール(以下、CHO-PEGと記載することもある)とを反応させることにより得られるもの(態様２のバソヒビン修飾体)が挙げられる。なお、本明細書において「バソヒビン修飾体」とはポリエチレングリコールが結合したバソヒビンを意味し、態様１及び２のバソヒビン修飾体が例示される。「バソヒビン未修飾体」とはフリーのバソヒビンのことを意味する。
【００１５】
本発明において、バソヒビン修飾体の「pH7.4における溶解度(25℃)が1mg/mL以上である」とは、バソヒビン修飾体がタンパク質換算で、25℃におけるpH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(Phosphate buffered saline、PBS)に1mg/mL以上の濃度で溶解することを意味する。バソヒビン修飾体の溶解液のタンパク質濃度は例えばブラッドフォード法、BCA法、ローリー法、紫外吸光法などの公知のタンパク質の定量方法により測定できる。なお、pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(Phosphate buffered saline、PBS)とは、pH7.35〜7.44範囲内のいずれかのpHを示すPBSが好ましく、pH7.40のPBSがより好ましい。
【００１６】
本発明において、血管新生抑制活性は、マウスの角膜を用いた抗血管新生アッセイで評価することができる。具体的には、後述の実施例の試験例１に示すように、マウスの角膜に、緩衝液のみ、VEGFのみ、VEGFとバソヒビン未修飾体、VEGFと態様１のバソヒビン修飾体(蛋白質換算でバソヒビン未修飾体と等量)をそれぞれ投与した場合の角膜内に新生した血管面積を測定する。VEGFのみを投与した場合の血管面積から、VEGFとバソヒビン未修飾体を投与した場合の血管面積を差し引いた値をバソヒビン未修飾体の血管新生抑制活性とする。一方、VEGFのみを投与した場合の血管面積から、VEGFと態様１のバソヒビン修飾体を投与した場合の血管面積を差し引いた値を態様１のバソヒビン修飾体の血管新生抑制活性とする。バソヒビン未修飾体の血管新生抑制活性を100％とした場合の、バソヒビン修飾体の血管新生抑制活性(％)が20％以上である場合に、態様１のバソヒビン修飾体は血管新生抑制活性を有すると判断する。なお、態様１のバソヒビン修飾体の血管新生抑制活性(％)は、50％以上が好ましく、80％以上がより好ましい。
【００１７】
また、血管新生抑制活性は、マウスにおける腫瘍増殖抑制アッセイにより評価することもできる。具体的には、後述の実施例の試験例３に示すように、BALB/cマウスの背皮内に、マウス腎癌株(Renca)を90％のマトリジェルと、10％の態様２のバソヒビン修飾体(最終濃度50μg/mL)又はネガティブコントロールであるヒト血清アルブミン(最終濃度50μg/mL)を含有する組成物で予め混和したものを背部皮内に0.05mL(1×106個)移植を行い、移植後13日目に腫瘍を採取し重量の測定を行なう。コントロール投与群の腫瘍重量から態様２のバソヒビン修飾体投与群における腫瘍重量を差し引いた値を用いて、コントロール投与群の腫瘍増殖抑制活性を0％、投与後の腫瘍重量が0mgとなる腫瘍増殖抑制活性を100％とした場合の腫瘍増殖抑制活性(％)を算出して血管新生抑制活性(％)とする。バソヒビン修飾体の有意な腫瘍増殖抑制活性が認められる場合に、バソヒビン修飾体は血管新生抑制活性を有すると判断する。なお、態様２のバソヒビン修飾体の血管新生抑制活性(％)は、35％以上が好ましく、45％以上がより好ましく、60％以上がさらに好ましい。
【００１８】
NHS-PEGを用いたタンパク質のPEG修飾は、通常、反応液のpHを中性付近にすることにより活性化したNHS-PEGの電子供与基の求核反応が主にタンパク質のリジン残基のε-アミノ基又はＮ末端アミノ酸残基のα-アミノ基に対して行われて、それにより、Ｎ-スクシンイミジル基が脱離したPEGとタンパク質の複合体が形成される。また、PEGの修飾数は、NHS-PEGの添加量によってコントロールすることができ、例えば、タンパク質1分子に対するPEGの修飾数が1〜7分子である場合、反応に供されるNHS-PEGとタンパク質のモル比(NHS-PEG／タンパク質)は、20/1〜1/1程度である。しかし、本発明では、バソヒビンの中性付近での溶解性が低い(pH7.4での溶解度：0.01mg/mL以下)ことから、NHS-PEGとタンパク質間の前記反応を、バソヒビンの溶解度が高い酸性領域において、バソヒビン1モルに対して、NHS-PEGを100モル以上添加混合して行うことにより、バソヒビン1分子に対してPEGが2〜7分子結合したバソヒビンが得られた。
【００１９】
一方、CHO-PEGを用いたタンパク質のPEG修飾は、タンパク質のアミノ基に対して還元的アミノ化反応により行うことができ、Ｎ末端アミノ基とリジン側鎖のアミノ基とのｐＫａの差を利用することで行うことができる。例えば、低pH域で反応を行えば、アルデヒド基とＮ末端アミノ基とが、選択的に還元的アミノ化反応を起こしてPEGによるＮ末端特異的修飾も可能である。
【００２０】
態様１及び２のバソヒビン修飾体におけるバソヒビン(Vasohibin)としては、バソヒビン１(Vasohibin-１)及びバソヒビン２(Vasohibin-２)が挙げられるが、本明細書において、バソヒビンとは、バソヒビン１のことをいう。なお、ＷＯ０２／０９０５４６、ＷＯ２００６／０７３０５２等に開示されているようにバソヒビン１とバソヒビン２は、異なる染色体上に存在する別の遺伝子であるが、それらの遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は５８％の相同性を有している。バソヒビン１は配列番号１の３８６番目のＡから１４８０番目のＣで表される塩基配列からなるバソヒビン１ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるバソヒビン１ポリペプチドのことをいう。
【００２１】
バソヒビン１ポリヌクレオチドとしては、配列番号１に表される塩基配列からなるポリヌクレオチド以外に、前記ポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうるポリヌクレオチドが例示される。
【００２２】
ここでいう「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうるポリヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドの断片をプローブとして、当該分野において周知慣用な手法、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ(Ｓａｌｉｎｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ：１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム)溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ(１９８９)(Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ)、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ(１９９４)(Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ)、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ(１９９５)(Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ)などに記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２３】
本明細書において「ハイブリダイズしうるポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。そのようなポリヌクレオチドとして、具体的には、配列番号１で表されるバソヒビン１ポリヌクレオチドと少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書において、相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら(Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０(１９９０))の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、スコアで類似度を算出することができる。
【００２４】
上記ポリヌクレオチドは、公知の方法に準じて調製することができ、例えば、ＷＯ０２／０９０５４６に開示された方法に従って調製することができる。また、アミノ酸配列に基づいて、バソヒビン１ポリペプチドをコードするＤＮＡを化学合成することによっても調製することができる。ＤＮＡの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２などを用いて行うことができる。
【００２５】
バソヒビン１ポリペプチドとしては、配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド以外に、前記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチド、及びそれらの誘導体、ならびにそれらの塩が例示される。
【００２６】
本明細書中において、「ポリペプチドの誘導体」とは、例えば、アセチル誘導体、パルミトイル誘導体、ミリスチル誘導体、アミド誘導体、アクリル誘導体、ダンシル誘導体、ビオチン誘導体、リン酸誘導体、サクシニル誘導体、アニリド誘導体、ベンジルオキシカルボニル誘導体、ホルミル誘導体、ニトロ誘導体、スルフォン誘導体、アルデヒド誘導体、環状化誘導体、グリコシル誘導体、モノメチル誘導体、ジメチル誘導体、トリメチル誘導体、グアニジル誘導体、アミジン誘導体、マレイル誘導体、トリフルオロアセチル誘導体、カルバミル誘導体、トリニトロフェニル誘導体、ニトロトロポニル誘導体、又はアセトアセチル誘導体等が挙げられる。
【００２７】
本明細書において、「塩」とは、ポリペプチド又はそれらの誘導体の薬理学的に許容される任意の塩(無機塩及び有機塩を含む)をいい、例えば、ポリペプチド又はそれらの誘導体のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、燐酸塩、有機酸塩(酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩、ピクリン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等)等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、ナトリウム塩、カリウム塩、燐酸塩が望ましい。
【００２８】
上記ポリペプチドは、公知の方法に準じて調製することができ、例えば、ＷＯ０２／０９０５４６、ＷＯ２００６／０７３０５２等に開示された方法に従って調製することができる。
【００２９】
また、上記ポリペプチドの誘導体は、当該分野で公知の方法により、作製され得る。また、上記ポリペプチドの塩も、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって容易に作製され得る。
【００３０】
本願明細書において、「ポリエチレングリコール」とは、エチレングリコールが重合した構造〔(−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−)の重合体〕を有する高分子化合物をいう。
【００３１】
態様１におけるＮ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコール(NHS-PEG)としては、ポリエチレングリコールの末端にＮ-スクシンイミジル基を有するものであれば特に限定はないが、合成の容易さ及び品質の観点から、式(I):
【００３２】
【化１】
2010074082.tif 000002
【００３３】
(式中、Ｘは２価の有機基を示し、ｎは正の整数を示す)
で表わされる化合物が好ましい。
【００３４】
式(I)中のＸは２価の有機基を示し、得られるPEG修飾体に種々の物性を付与する観点から、各種官能基とすることができる。具体的には、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２−、−(ＣＨ２)５−等が挙げられるが、安定性の観点から、−(ＣＨ２)５−が好ましい。
【００３５】
式(I)中のｎは、平均分子量の観点から、好ましくは100〜120の整数である。
【００３６】
かかる式(I)で表される化合物としては、モノメトキシPEG−スクシニル−NHS、モノメトキシPEG−グルタリル−NHS、モノメトキシPEG−カルボキシメチル−NHS、モノメトキシPEG−カルボキシヘプチル−NHS等が挙げられ、これらは単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３７】
式(I)で表される化合物の平均分子量は、2000〜20000が好ましく、4000〜6000がより好ましく、4500〜5500がさらに好ましい。なお、本明細書において、ポリエチレングリコールの平均分子量は、ゲルろ過クロマトグラフィー(GPC)等により測定される。
【００３８】
式(I)で表される化合物は、公知の方法で製造されたものを用いることできるが、市販品を用いてもよい。市販品としては、NOF社のSUNBRIGHT(登録商標)CSシリーズ、GSシリーズ、ASシリーズ、HSシリーズ等が挙げられる。
【００３９】
態様２におけるアルデヒド基を有するポリエチレングリコール(CHO-PEG)としては、ポリエチレングリコールの末端にアルデヒド基を有するものであれば特に限定はないが、合成の容易さ及び品質の観点から、式(II):
ＣＨ３Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｍ−Ｙ−ＣＨＯ               (II)
(式中、Ｙは２価の有機基を示し、ｍは正の整数を示す)
で表わされる化合物が好ましい。
【００４０】
式(II)中のＹは２価の有機基を示し、得られるPEG修飾体に種々の物性を付与する観点から、各種官能基とすることができる。Ｙは２価の有機基であれば特に限定されないが、安定性の観点から、−ＣＨ２ＣＨ２−が好ましい。
【００４１】
式(II)中のｍは、平均分子量の観点から、好ましくは100〜800の整数である。
【００４２】
かかる式(II)で表される化合物の好適例としては、モノメトキシPEG−エチレンアルデヒド等が挙げられる。
【００４３】
式(II)で表される化合物の平均分子量は、血管新生抑制作用を保持する観点から、35000以下が好ましく、4500〜35000がより好ましく、4750〜32500がさらに好ましく、5000〜30000がさらに好ましい。
【００４４】
式(II)で表される化合物は、公知の方法で製造されたものを用いることできるが、市販品を用いてもよい。市販品としては、NOF社のSUNBRIGHT(登録商標)ALシリーズ等が挙げられる。
【００４５】
次に、バソヒビンとNHS-PEGとの反応について説明する。
【００４６】
反応は、酸性条件下で行われ、具体的には、好ましくはpH3.0〜4.0、より好ましくはpH3.00〜4.00、さらに好ましくはpH3.25〜3.75、さらに好ましくはpH3.40〜3.60で行われる。
【００４７】
なお、上記範囲のpH条件下で反応を行うために使用する緩衝液としては、酢酸緩衝液(酢酸溶液／酢酸ナトリウム溶液)、クエン酸緩衝液(クエン酸／クエン酸ナトリウム溶液)、リン酸−クエン酸緩衝液(リン酸水素二ナトリウム／クエン酸)等が挙げられる。これらの緩衝液において、バソヒビンは高い溶解性〔溶解度(25℃、pH3.5)：3mg/mL以上〕を示し、また、NHS-PEGも高い溶解性を示す。なお、緩衝液の濃度は特に限定はないが、緩衝作用と以後の精製操作の容易さの観点から、25〜50mMが好ましい。
【００４８】
反応温度は、特に限定はないが、20〜50℃が好ましく、30〜40℃がより好ましい。反応時間は、反応条件によって一概には決定できないが、例えば、30〜40℃で反応を行う場合、好ましくは１〜４時間、より好ましくは３〜４時間である。
【００４９】
NHS-PEGとバソヒビンのモル比(NHS-PEG／バソヒビン)は、350/1〜450/1が好ましく、375/1〜425/1がより好ましく、390/1〜410/1がさらに好ましい。なお、PEGの修飾数、即ち、バソヒビン1分子に対するPEGの付加分子数は、NHS-PEGの添加量、バソヒビン濃度等によってコントロールすることができることから、修飾数を増加させる場合には、NHS-PEGの添加量を増加、即ち、前記モル比を大きくしたり、バソヒビン濃度を高くしたりすればよい。また、修飾数を低減させる場合には、NHS-PEGの添加量を低減、即ち、前記モル比を小さくしたり、バソヒビン濃度を低くしたりすればよい。
【００５０】
バソヒビンとNHS-PEGとの反応後には、公知の方法に従って精製、分画、希釈、濃縮等を行ってもよい。
【００５１】
次に、バソヒビンとCHO-PEGとの反応について説明する。
【００５２】
本発明においては、均一な修飾体を得る観点から、さらに部位特異的なPEG化によるバソヒビンへの影響をコントロールする観点から、反応は、バソヒビンのＮ末端アミノ基とリジン側鎖のアミノ基とのｐＫａの差を利用してＮ末端に特異的に修飾を行うために低pH域で行われる。具体的には、好ましくはpH3.0〜6.0、より好ましくはpH3.00〜6.00、さらに好ましくはpH4.00〜6.00、さらに好ましくはpH4.75〜5.25で行われる。
【００５３】
なお、上記範囲のpH条件下で反応を行うために使用する緩衝液としては、酢酸緩衝液(酢酸溶液／酢酸ナトリウム溶液)、クエン酸緩衝液(クエン酸／クエン酸ナトリウム溶液)、リン酸−クエン酸緩衝液(リン酸水素二ナトリウム／クエン酸)等が挙げられる。これらの緩衝液において、バソヒビンは高い溶解性〔溶解度(25℃、pH5.0)：1mg/mL以上〕を示し、また、CHO-PEGも高い溶解性を示す。なお、緩衝液の濃度は特に限定はないが、緩衝作用と以後の精製操作の容易さの観点から、25〜200mMが好ましい。また還元的アミノ化反応のために、ホウ化水素シアン酸ナトリウム(sodium cyanoborohydride)等の還元剤が添加されることが好ましい。
【００５４】
反応温度は、特に限定はないが、3〜25℃が好ましく、3〜5℃がより好ましい。反応時間は、反応条件によって一概には決定できないが、例えば、3〜5℃で反応を行う場合、好ましくは10〜20時間、より好ましくは15〜17時間である。
【００５５】
CHO-PEGとバソヒビンのモル比(CHO-PEG／バソヒビン)は、200/1〜4/1が好ましく、50/1〜15/1がより好ましい。なお、PEGの修飾数、即ち、バソヒビン1分子に対するPEGの付加分子数は、CHO-PEGの添加量、バソヒビン濃度等によってコントロールすることができることから、修飾数を増加させる場合には、CHO-PEGの添加量を増加、即ち、前記モル比を大きくしたり、バソヒビン濃度を高くしたりすればよい。また、修飾数を低減させる場合には、CHO-PEGの添加量を低減、即ち、前記モル比を小さくしたり、バソヒビン濃度を低くしたりすればよい。なお、前記低pH域で反応が行われるのであれば、かかるモル比で反応することで、バソヒビンのＮ末端アミノ基にPEG化を行うことができる。
【００５６】
バソヒビンとCHO-PEGとの反応後には、公知の方法に従って精製、分画、希釈、濃縮等を行ってもよい。
【００５７】
かくしてバソヒビンにPEGが結合したバソヒビン修飾体が得られる。
【００５８】
NHS-PEGは、タンパク質のリジン残基のε-アミノ基又はＮ末端アミノ酸残基のα-アミノ基に対して結合することから、得られた態様１の修飾体においてPEGが結合している位置は、具体的には、バソヒビン１ポリペプチドのアミノ酸配列のうち、配列番号２の５、６、７９、８３、９０、１０３、１４５、１４６、１５８、１６２、１６８、１９４、２２９、２５５、２５６、２５８、２７６、２９２、３０４、３０７、３１６、３１９、３２０、３４７、３４８及び３５３番目のリジン残基ならびにＮ末端のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つである。なお、PEGの結合位置は、ペプチドマッピング法などの従来から知られた方法により分かる。
【００５９】
本発明の態様１のバソヒビン修飾体は、バソヒビン1分子に対するPEGの結合分子数によって、例えば、PEGが2分子結合した修飾体、3分子結合した修飾体、4分子結合した修飾体、5分子結合した修飾体、6分子結合した修飾体、7分子結合した修飾体等が挙げられ、これらは、単独で、又は２種以上組み合わせて使用してもよい。なお、本明細書において、態様１のバソヒビン修飾体におけるPEGの結合分子数は、後述の実施例に記載の方法により算出される。
【００６０】
また、CHO-PEGは、Ｎ末端アミノ基とリジン側鎖のアミノ基に対して結合するが、本発明においては、態様２の修飾体を得る反応を低pH域で行うため、態様２の修飾体においてPEGが結合している位置は、Ｎ末端アミノ酸残基のみである。
【００６１】
本発明のバソヒビン修飾体は、態様１及び２のバソヒビン修飾体のいずれもが中性付近での溶解性が向上することから、pH7.4におけるバソヒビン修飾体の溶解度(25℃)は、タンパク質換算で1mg/mL以上であり、5mg/mL以上であることが好ましい。
【００６２】
また、態様１のバソヒビン修飾体は、PEG化による分子量の増大に起因して糸球体ろ過効率や細胞間を通過する効率が減少することや、プロテアーゼに対する耐性が獲得されるために、血中安定性が良好である。具体的には、例えば、マウス血中での半減期が好ましくは1時間以上であり、より好ましくは4時間以上である。なお、マウス血中での半減期は以下の手順により測定することができる。まず、マウスの尾静脈より、態様１のバソヒビン修飾体をタンパク量で0.1mg(0.3〜0.4mL)投与し、投与直後から経時的に心臓より採血を行う。バソヒビンを定量できるELISA法により血漿中のバソヒビン量を算出し、投与直後のバソヒビン量を100％とした場合の残存率を求め、60分後における残存率が50％以上である場合に、マウス血中での半減期が１時間以上であると判断する。同様に240分後における残存率が50％以上である場合、マウス血中の半減期は4時間以上であると判断する。
【００６３】
本発明は、また、Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコール(NHS-PEG)と、バソヒビンとを酸性条件下で反応させる工程を含む、バソヒビン修飾体の製造方法を提供する。
【００６４】
上記工程の具体例としては、例えば、酢酸緩衝液(pH3.50)を用いて0.6〜0.9mg/mL濃度のバソヒビン含有溶液を調製し、そこに、Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコール(NHS-PEG)をバソヒビン1モルあたり400モル添加して、37℃において、１〜４時間攪拌して反応させる態様が挙げられる。得られた反応物は、ゲルろ過精製を行ったり、濃縮したりしてもよい。なお、バソヒビン含有溶液の調製には、NHS-PEGとバソヒビンとの反応が酸性条件下となるよう、好ましくはpH3.0〜4.0、より好ましくはpH3.00〜4.00、さらに好ましくはpH3.25〜3.75、さらに好ましくはpH3.40〜3.60の緩衝液を用いることが望ましい。
【００６５】
また、本発明の別の態様として、１分子に結合するPEGの分子数が異なった複数の態様１のバソヒビン修飾体からなるバソヒビン修飾体調製物を提供する。バソヒビン修飾体調製物の具体例としては、NHS-PEGとバソヒビンをモル比(NHS-PEG／バソヒビン)400/1で反応させることで得られる、タンパク質1分子に対して2〜7分子のPEGが修飾した態様１のバソヒビン修飾体からなるバソヒビン修飾体調製物が挙げられる。このようにして得られたバソヒビン修飾体調製物は、ゲル濾過、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、塩析、結晶化、加熱等の公知の方法による分画、精製等を行うことで、所望のバソヒビン修飾体を得る事が出来る。
【００６６】
また、バソヒビン修飾体は、ポリエチレングリコールによる修飾を受けているため、生体内での安定性が向上する。それにより、生体内において、バソヒビンが有する血管新生抑制効果をより発揮することができると推定されることから、血管新生抑制作用を要する疾患に好適に用いられる。従って、本発明は、さらに、本発明のバソヒビン修飾体を含有する医薬組成物を提供する。
【００６７】
本発明の医薬組成物としては、本発明のバソヒビン修飾体を公知の医薬用担体と組み合わせて製剤化したものが挙げられる。なお、バソヒビン修飾体としては、態様１のバソヒビン修飾体単独で、態様２のバソヒビン修飾体単独で、又は態様１及び２のバソヒビン修飾体を組み合わせて用いてもよい。
【００６８】
本発明の医薬組成物の製造は、通常、本発明のバソヒビン修飾体を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合することにより行われ、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤や、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品や、その他、外用剤とすることもできる。なお、医薬用担体は、医薬組成物の投与形態及び製剤形態に応じて選択することができ、特に限定はない。
【００６９】
上記のような各種製剤形態での医薬組成物は、それぞれ公知の医薬用担体などを利用して、適宜、常法により製造することができる。また、かかる医薬組成物における本発明のバソヒビン修飾体の含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、本発明の所望の効果の発現が得られ得るような量であればよく、特に限定されるものではない。本発明の医薬組成物中の本発明のバソヒビン修飾体の含有量としては通常１〜１００重量％程度である。
【００７０】
本発明の医薬組成物は、製剤形態に応じた適当な投与方法で投与される。投与方法も特に限定はなく、例えば内用、外用及び注射により投与することができる。本発明の医薬組成物を注射により投与する場合は、たとえば静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内などに投与し得、外用により投与する場合は、たとえば、座剤等の外用剤として、その適する投与方法により投与すればよい。
【００７１】
本発明の医薬組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及び当該組成物の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。また、投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、又は数回に分けて行ってもよい。投与期間も任意である。
【００７２】
血管新生抑制作用を要する疾患としては、血管新生の進展を抑制することにより治療効果がみられる疾患であれば特に限定はないが、例えば、動脈硬化、リュウマチ、加齢黄斑変性症、血管新生が関連する糖尿病性網膜症又は癌が例示される。
【００７３】
本発明はまた、被験体に、有効量のバソヒビン修飾体を投与することを含む、血管新生抑制作用を要する疾患の治療方法を提供する。
【００７４】
本明細書中において被験体とは、好ましくは血管新生抑制作用を必要とするヒトであるが、ペット動物等であってもよい。
【００７５】
また、本明細書中において有効量とは、バソヒビン修飾体を上記被験体に投与した場合に、バソヒビン修飾体を投与していない被験体と比較して、血管新生抑制作用を発揮するバソヒビン修飾体の量である。具体的な有効量としては、投与形態、投与方法、使用目的及び被験体の年齢、体重、症状等によって適宜設定され一定ではない。
【００７６】
本発明の血管新生抑制作用を要する疾患の治療方法においては、有効量のバソヒビン修飾体をそのまま上記被験体に投与してもよく、また、上記のようなバソヒビン修飾体調製物や医薬組成物等の医薬として投与してもよい。また、投与方法にも限定はなく、例えば、上記の医薬組成物と同様に、経口投与や注射等により投与すればよい。
【００７７】
本発明の治療方法によれば、前記の本発明の医薬組成物の対象となる疾患を治療することができ、例えば、血管新生によって進展する疾患の治療を行う効果が発揮され得る。
【実施例】
【００７８】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。なお、これらの実施例において、室温とは、特に断りのない限り、２５℃を意味する。【００７９】
調製例１．バソヒビン１の調製
＜バソヒビン１発現株の構築＞
バソヒビン１ポリヌクレオチド(配列番号１の３８６番目から１４８０番目の塩基配列)を基に当業者にとって周知な方法(Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４９４−５００(１９９５)、等)により大腸菌での発現に適したコドンに変更したバソヒビン１(Vh1)遺伝子をthioredoxin(Trx)融合発現用のpET-32 LIC/Xaベクター(Novagen社製)に導入し、Escherichia coli BL21(DE3)を形質転換した(BL21(DE3)/TrxVh1-pET32)。形質転換株は単一コロニーを単離した後、LB培地(1.0％ Bacto tryptone、0.5％ Bacto yeast extract、0.5％ NaCl、50μg/mL ampicillin、pH7.0)を用いて試験管で37℃、16h培養した。培養後、30％ glycerolを等量添加して-80℃で保管した(バソヒビン発現株保存液)。【００８０】
＜Vh1発現株の発酵・培養＞
50mLのLB培地を仕込んだ500mL容三角フラスコに、バソヒビン発現株保存液500μLを添加し、37℃、9h前培養を行った。その後3Lの本培養培地(4.0％glycerol、2.4％ Bacto yeast extract、1.2％ Bacto tryptone、1.25％ K2HPO4、0.23％ KH2PO4、500μg/mL polypropylene glycol #2000、50μg/mL ampicillin、pH7.0)を仕込んだ5L培養槽に前培養した培養液を1％植菌し、37℃で22h培養した。培養開始後OD650値が4〜5になれば最終濃度が1mMとなるようにisopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)を添加した。培養中のpHは28％アンモニア水と35％りん酸を用いてpH7.0に制御した。培養終了後の培養液をサンプリングし、SDS-PAGE分析によってthioredoxin(Trx)とVh1との融合タンパク質であるTrxVh1の発現を確認した。【００８１】
＜TrxVh1の調製＞
培養終了液を遠心分離(10,000g、30min)によって集菌し、懸濁緩衝液(20mM sodium phosphate、0.5M NaCl、1mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)、pH7.6)で洗浄した。高圧ホモジナイザーを用いて菌体を破砕(55Pa、5回)した後、遠心分離(10,000g、30min)を行い、さらに同緩衝液で洗浄して不溶性画分を取得した。得られた画分を可溶化緩衝液(20mM sodium phosphate、0.5M NaCl、1mM PMSF、5mM 2-mercaptoethanol、60mM imidazole、7M Guanidine-HCl、pH8.0)で可溶化し、不溶性画分を遠心分離(72,000g、30min)によって除去した後、予め同可溶化緩衝液で平衡化したNi Chelating Sepharose column(φ16mm×125mm)に供した。非吸着画分を洗浄緩衝液(20mM sodium phosphate、0.5M NaCl、1mM PMSF、5mM 2-mercaptoethanol、60mM imidazole、8M Urea、pH8.0)で洗い流した後、溶出緩衝液(20mM sodium phosphate、0.5M NaCl、1mM PMSF、5mM 2-mercaptoethanol、300mM imidazole、8M Urea、pH8.0)で溶出した。吸着、洗浄、溶出時の流速は1.0 mL/min、操作はすべて室温で実施した。溶出画分をSDS-PAGEでモニタリングし、TrxVh1画分を捕集した。【００８２】
＜Vh1の調製＞
上記のようにして得られたTrxVh1をグリシン緩衝液(20mM Glycine-HCl、pH3.5)に対して透析した後、Factor Xa(Novagen社製)切断用緩衝液(最終濃度：50mM Tris-HCl、100mM NaCl、5mM CaCl2、pH8.0)で希釈して0.5mg/mLとした。Factor Xaを最終濃度2U/mLとなるように添加し、限定分解を25℃で1h実施した。反応終了時に現れる沈殿画分を遠心分離(70,000g、30min)で回収後、可溶化緩衝液(20mM sodium phosphate、0.5M NaCl、1mM PMSF、5mM 2-mercaptoethanol、60mM imidazole、7M Guanidine-Cl、pH8.0)で可溶化し、予め同可溶化緩衝液で平衡化したNi Chelating Sepharose column(φ16mm×125mm)に供した。非吸着画分を洗浄緩衝液(20mM sodium phosphate、0.5M NaCl、1mM PMSF、5mM 2-mercaptoethanol、60mM imidazole、8M Urea、pH8.0)で洗い流した後、溶出緩衝液(20mM sodium phosphate、0.5M NaCl、1mM PMSF、5mM 2-mercaptoethanol、300mM imidazole、8M Urea、pH8.0)で溶出した。吸着、洗浄、溶出時の流速は1.0mL/min、操作はすべて室温で実施した。溶出画分をSDS-PAGEで分析し、Vh1画分を捕集後、20mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)で透析し、再沈殿化精製した。さらに沈殿化Vh1をイオン交換カラム用緩衝液(25mM sodium phosphate、4M Urea、pH7.2)で溶解し、同緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラム(Q Sepharose、φ16mm×140mm)に供した。Vh1の溶出は、溶出緩衝液(25mM sodium phosphate、4M Urea、1M NaCl、pH7.2)によってグラジェント溶出した。流速は2.0mL/min、操作はすべて室温で実施した。溶出画分はSDS-PAGEで分析し、Vh1画分を捕集後、酢酸緩衝液(20mM sodium acetate、pH3.5)に対して透析を行った。【００８３】
実施例１．Polyethylene glycol(PEG)修飾Vh1(態様１の修飾体)の調製〔Ｎ-スクシンイミジル基を有するポリエチレングリコール(NHS-PEG)によるVh1の修飾〕
＜PEG(NHS)-Vh1の調製＞
調製例１で得られたVh1の酢酸緩衝液溶液を、最終濃度が0.6〜0.9mg/mLになるようにした。このVh1溶液に平均分子量5000のNHS-PEG〔SUNBRIGHT(登録商標)ME-050HS、NOF社製〕をVh1に対してモル比でそれぞれ10、100、400倍添加し、37℃、４時間反応させた(反応液pH3.50)。反応終了液は、直ちに酢酸緩衝液(20mM sodium acetate、pH3.5)で平衡化したSephacryl S200充填カラム(カラムサイズ：φ16mm×600mm(120mL)、流速：1.0mL/min)に供してゲルろ過精製を行った。【００８４】
＜PEG(NHS)-Vh1生成の確認＞
得られた溶出画分について、SDS-PAGE分析を行った。結果を図１に示す。図１より、Vh1に対してNHS-PEGをモル比400倍濃度で反応させた場合には、高分子量の反応物が得られていることが分かる。一方、Vh1に対してNHS-PEGをモル比10、100倍濃度で反応させた場合には、高分子量の生成物以外に、未反応のVh1が残存することが確認された。【００８５】
＜PEG(NHS)-Vh1画分の捕集＞
次に、Vh1に対してNHS-PEGをモル比400倍濃度で反応させて得られた反応液について、紫外吸収測定(Abs 280nm)とSDS-PAGE分析を実施して、NHS-PEGと反応して得られたVh1〔PEG(NHS)-Vh1とする。〕画分を捕集した。捕集したPEG(NHS)-Vh1は、リン酸緩衝液(phosphate-buffered saline、PBS)に対して透析を行い、限外ろ過膜によってタンパク濃縮をした。【００８６】
＜PEG(NHS)-Vh1のPEG付加分子数＞
得られたPEG(NHS)-Vh1を、MALDI-TOF MS分析〔Ultraflex II (Bruker社製)、マトリックス：Sinapinic acid〕に供することによってPEG付加分子数を確認した。結果を図２に示す。図２より、反応物には、バソヒビン1分子に対して、PEGが2分子、3分子、4分子、5分子、6分子、7分子それぞれ結合した修飾体が含まれていることが分かった。【００８７】
＜PEG-Vh1の溶解性＞
PEG(NHS)-Vh1の溶解性はブラッドフォード法を用いるタンパク質定量によって測定した。その結果、pH7.4(PBS)において6.5mg/mL以上の溶解度(25℃)を示した。なお、参照例として、Vh1(未修飾体)の溶解性もブラッドフォード法で測定した。結果、pH7.4(PBS)で透析するとVh1のほとんどが沈殿し、遠心分離(70,000g、30min)の上清液のタンパク質濃度は0.01mg/mLの検出限界以下であった。【００８８】
試験例１、PEG(NHS)-Vh1の評価(in vitro)
＜血管新生抑制活性＞
マウスの角膜を用いた抗血管新生アッセイで評価した。本方法は、マウスの角膜に対して血管新生を誘導する血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor、VEGF)を投与し、その時、同時に加えたVh1(未修飾体)、PEG(NHS)-Vh1がこの血管新生の領域をどこまで抑制するかで血管新生抑制効果を評価するモデルである。【００８９】
日本チャールス・リバー社より購入したBALB/cマウスの角膜に、VEGF(80ng)のみ、VEGF(80ng)とVh1(4ng)もしくはVEGF(80ng)と実施例１で得られたPEG(NHS)-Vh1(タンパク換算で4ng)を染み込ませたhydron pellet(IFN Science社製)を麻酔下で移植した。移植７日後に角膜を剥離し、角膜内に新生した血管面積をフォトメーターで測定した。対照群には、酢酸緩衝液(20 mM Sodium acetate、pH3.5)を投与した。結果を図３に示す。【００９０】
図３より、VEGFのみを投与した場合では、対照と比較し、明らかな血管新生の亢進が確認されるが、VEGFとVh1及びVEGFとPEG(NHS)-Vh1を投与した場合では、強く血管新生抑制効果が観察され、PEG修飾体においても活性が保持されていることが示された。なお、Vh1を投与した場合の血管新生抑制活性を100％とした場合、PEG(NHS)-Vh1を投与した場合の血管新生抑制活性(％)は98％であった。【００９１】
＜血中安定性＞
日本チャールス・リバー社より購入したC57BL/6(♀、13週齢)の尾静脈より、Vh1及び実施例１で得られたPEG(NHS)-Vh1をタンパク量で各0.1mg(0.3〜0.4mL)投与し、投与直後、10分後、30分後、60分後、240分後にエーテル麻酔下においてEDTA-2K処理した注射筒にて心臓より採血を行った。対照マウスには20mM酢酸緩衝液(pH3.5)を0.3mL投与した(n=3)。【００９２】
マウスより採血した血漿中のバソヒビン量は、ELISA法を用いて算出した。具体的には、あらかじめアッセイバッファー(0.5％ BSA、0.05％Tween 80、10μg/mL γ-globullin及び0.1％ProClin150を含む、100mM PBS、pH7.0)を、抗バソヒビン抗体(VR1-12E7、文献：BBRC 2006、342、p640-646)固相イムノプレートに、各ウェル25μL添加した。次に、血漿サンプルあるいはアッセイバッファーで調製した標準用のバソヒビンを25μLずつ添加した後、HRP標識抗バソヒビン抗体(VC-12F6)Fab'を添加し、プレートを攪拌した。4℃にて終夜静置した後、各ウェルを0.01％ Tween20及び0.05％ ProClin150を含む生理食塩水で３回洗浄し、各ウェル100μLのTMB溶液(Colorburst Blue、ALerCHEK社製)を添加し、攪拌後室温にて15分間静置した。0.5N 硫酸を50μL添加することにより反応停止し、450nmにおける吸光度を測定した。各標準バソヒビン(2000、667、222、74、24.7、0fmol/mL)の吸光度から標準曲線を作製して血漿中のバソヒビン量を算出し、投与直後のバソヒビン量を100％とした場合の残存率を求めた。結果を図４に示す。【００９３】
図４より、PEG(NHS)-Vh1はVh1に比較して血中での安定性が大きく改善され、240分経過後においてもほぼ投与時の濃度が維持され、残存率は60分経過後で91％、240分経過後においても91％であり、血中半減期が４時間以上であった。【００９４】
試験例２、PEG(NHS)-Vh1の評価(in vivo)
＜腫瘍増殖抑制活性(１)＞
日本チャールス・リバー社より購入したBALB/cマウス(♀、7〜9週齢)に、90％マトリジェル(BD Biosciences社より購入)と、10％の実施例１で得られたPEG(NHS)-Vh1(最終タンパク濃度で0.8、8、80μg/mL)又は10％ PBSを含有する組成物であらかじめ混和したマウス腎癌株(Renca)を背部皮内に0.05mL(1×106個)移植を行い、移植後11日目に腫瘍を採取し重量の測定を行なった(各群6匹)。10％ Vh1(未修飾体)を含有する組成物についても同様の方法での調製を試みたが、Vh1の殆どが沈殿し、サンプルを調製する事が出来ず、Vh1(未修飾体)についての腫瘍増殖抑制活性の測定は出来なかった。得られた測定値の平均値から、PBS投与群の腫瘍増殖抑制活性を0％、投与後の腫瘍重量が0mgとなる腫瘍増殖抑制活性を100％として、腫瘍増殖抑制活性(％)を算出した。結果を表１に示す。なお、PBS投与群を基準とした有意差検定の結果も併せて示す。【００９５】
【表１】
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【００９６】
表１より、PEG(NHS)-Vh1を混ぜて移植した群においては濃度依存的に腫瘍増殖抑制効果が示されており、なかでも80μg/mLのタンパク濃度でPEG(NHS)-Vh1を投与した群においては53％の増殖抑制効果が認められた。【００９７】
＜腫瘍増殖抑制活性(２)＞
日本クレア社より購入したBDF1マウス(♀、7〜9週齢)に、90％マトリジェル(BD Biosciences社より購入)と、10％の実施例１で得られたPEG(NHS)-Vh1(最終タンパク濃度で0.8、8、80μg/mL)又は10％ PBSを含有する組成物であらかじめ混和したマウス肺癌株(Lewis)を背部皮内に0.05mL(1×106個)移植を行い、移植後8日目に腫瘍を採取し重量の測定を行なった(各群5匹)。10％ Vh1(未修飾体)を含有する組成物についても同様の方法での調製を試みたが、Vh1の殆どが沈殿し、サンプルを調製する事が出来ず、Vh1(未修飾体)についての腫瘍増殖抑制活性の測定は出来なかった。得られた測定値の平均値から、PBS投与群の腫瘍増殖抑制活性を0％、投与後の腫瘍重量が0mgとなる腫瘍増殖抑制活性を100％として、腫瘍増殖抑制活性(％)を算出した。結果を表２に示す。なお、PBS投与群を基準とした有意差検定の結果も併せて示す。【００９８】
【表２】
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【００９９】
表２より、Lewisに対する増殖抑制効果はRencaに比べ若干弱いものの、PEG(NHS)-Vh1の80μg/mLのタンパク濃度においては45％の有意な増殖抑制効果を示した。【０１００】
これらの結果より、PEG(NHS)-Vh1は血管新生抑制活性を有すると判断することができる。【０１０１】
実施例２．Polyethylene glycol(PEG)修飾Vh1の調製(態様２の修飾体)〔アルデヒド基を持ったPEG(CHO-PEG)によるVh1の修飾〕
事前にVh1に対するCHO-PEGによる修飾反応時のpHを検討した結果、pH5.0付近において最も特異的にVh1のＮ末端をPEG修飾することが可能であることを確認した。【０１０２】
調製例１で得られたVh1を用いてPEG修飾を行った。PEG修飾反応は、最終濃度が25μM Vh1、100mM sodium acetate(pH5.0)、1mM CHO-PEG、8mM sodium cyanoborohydrideの溶液を4℃、16時間反応させた。反応停止は50mM sodium acetate(pH 5.0)に対して透析することにより行った。その後50mM sodium acetate(pH 5.0)で平衡化したCM sepharoseカラム(GEヘルスケア社製)へロードし、NaCl濃度を30分間かけて0.0Mから0.8Mまで変化させ、PEG修飾Vh1〔PEG(CHO)-Vh1〕を溶出させた。得られたPEG(CHO)-Vh1はPBSに対して透析を行い、最終サンプルとした。また用いたCHO-PEGは、分子量5,000(5K-CHO-PEG)、10,000(10K-CHO-PEG)、20,000(20K-CHO-PEG)、30,000(30K-CHO-PEG)、40,000(40K-CHO-PEG)、branch type 40,000(b40K-CHO-PEG)それぞれSUNBRIGHT ME-050AL、SUNBRIGHT ME-100AL、SUNBRIGHT ME-200AL、SUNBRIGHT ME-300AL、SUNBRIGHT ME-400AL2、GL2-400AL3全てNOF社製)の6種類で、反応精製条件は全て上記と同一で行った。【０１０３】
＜PEG(CHO)-Vh1生成の確認＞
実施例２で得られたCHO-PEGと反応して得られた修飾Vh1〔PEG(CHO)-Vh1〕におけるＮ末端へのPEGの特異的修飾はMALDI-TOF MS分析〔Ultraflex II(Bruker社製)、マトリックス：Sinapinic acid〕により、1分子修飾体への収束(図５)とペプチドマッピングによるＮ末端フラグメントの消失により確認した。さらに、精製したPEG(CHO)-Vh1はSDS-PAGE分析によって予想される分子量を示すことを確認した(図６)。いずれについてもバンドは1本に収束した。【０１０４】
＜PEG(CHO)-Vh1の溶解性＞
実施例２で得られたPEG(CHO)-Vh1の溶解性はブラッドフォード法を用いるタンパク質定量によって測定した。その結果、調製したPEG化体はいずれもpH7.4(PBS)において1mg/mL以上の溶解度(25℃)を示した。【０１０５】
試験例３、PEG(CHO)-Vh1の評価(in vivo)
＜腫瘍増殖抑制活性＞
日本チャールス・リバーより購入したBALB/cマウス(♀、7〜9週齢)に、90％マトリジェル(BD Biosciences社より購入)と、10％の実施例２で得られたPEG(CHO)-Vh1(最終タンパク濃度50μg/mL)又は10％のヒト血清アルブミン(最終濃度50μg/mL)を含有する組成物であらかじめ混和したマウス腎癌株(Renca)を背部皮内に0.05mL(1×106個)移植を行い、移植後13日目に腫瘍を採取し重量の測定を行ない、試験例２の(１)と同様にして評価を行った(各群5匹、但しPEG(40K-CHO)の群は4匹)。結果を表３に示す。なお、HSA投与群を基準とした有意差検定の結果も併せて示す。【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
対照群であるHSAを混ぜて移植した場合の腫瘍重量に比べ、分子量5K〜30KのCHO-PEGで修飾したVh1を混ぜて移植した群において有意な腫瘍増殖抑制効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明のバソヒビン修飾体は、中性付近における溶解性が高いことから、血管新生抑制効果を要する疾患の治療等に好適に用いられる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０９】
配列表の配列番号１は、バソヒビン１ポリヌクレオチド及びそこにコードされているポリペプチドである。
配列表の配列番号２は、バソヒビン１ポリペプチドである。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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