(57)【要約】  ＸＡＧＥ−１ｂの機能を明らかにするとともに、ＸＡＧＥ−１ｂに基づくがんワクチン療法を開発すること。（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチド、あるいは、（ｆ）〜（ｋ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドを用いて、肺癌におけるＸＡＧＥ−１ｂに対する液性免疫または細胞性免疫を誘導する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる、ペプチド（ただし、International Journal of Oncology 30: 835-840, 2007およびMicrobiol. Immunol., 51(8), 755-762, 2007に記載のペプチドを除く。）：
（ａ）配列番号１の１−２５位のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の１５−３９位、２９−５３位、２１−４８位、２１−３６位、２５−４０位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列；および
（ｅ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の４３−６７位、５７−８１位、５７−７２位または６５−８１位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含んでいることを特徴とする肺癌を診断するための組成物：
（ａ）配列番号１の１−２５位のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の１５−３９位、２９−５３位、２１−４８位、２１−３６位、２５−４０位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列；および
（ｅ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の４３−６７位、５７−８１位、５７−７２位または６５−８１位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列。
【請求項３】
上記肺癌が、非小細胞肺癌または肺腺癌であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
被験体由来の試料において、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体のレベルを測定する抗体測定工程を包含することを特徴とする肺癌診断方法：
（ａ）配列番号１の１−２５位のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の１５−３９位、２９−５３位、２１−４８位、２１−３６位、２５−４０位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列；および
（ｅ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の４３−６７位、５７−８１位、５７−７２位または６５−８１位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドが被験体由来の試料中に存在するレベルを測定するペプチド測定工程を包含することを特徴とする肺癌診断方法：
（ａ）配列番号１の１−２５位のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の１５−３９位、２９−５３位、２１−４８位、２１−３６位、２５−４０位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列；および
（ｅ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の４３−６７位、５７−８１位、５７−７２位または６５−８１位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含んでいることを特徴とする肺癌に対する液性免疫を誘導するための組成物。
：
（ａ）配列番号１の１−２５位のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の１５−３９位、２９−５３位、２１−４８位、２１−３６位、２５−４０位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列；および
（ｅ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の４３−６７位、５７−８１位、５７−７２位または６５−８１位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列。
【請求項７】
上記肺癌が、非小細胞肺癌または肺腺癌であることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
以下の（ｆ）〜（ｋ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる、ペプチド（ただし、International Journal of Oncology 30: 835-840, 2007およびMicrobiol. Immunol., 51(8), 755-762, 2007に記載のペプチドを除く。）：
（ｆ）配列番号１の１−３９位のアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号１の１−３９位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の１−２５位、１５−３９位、１３−３６位、１３−２８位、１７−３２位、２１−３６位、９−２４位または２１−２９位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列；
（ｈ）配列番号１の２９−５３位のアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号１の２９−５３位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の２９−４８位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列；
（ｊ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列；および
（ｋ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の４３−６７位、５７−８１位、５３−６８位、４９−６４位、５０−６０位または５１−５９位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列。
【請求項９】
以下の（ｆ）〜（ｋ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含んでいることを特徴とする肺癌に対する細胞性免疫を誘導するための組成物：
（ｆ）配列番号１の１−３９位のアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号１の１−３９位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の１−２５位、１５−３９位、１３−３６位、１３−２８位、１７−３２位、２１−３６位、９−２４位または２１−２９位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列；
（ｈ）配列番号１の２９−５３位のアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号１の２９−５３位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の２９−４８位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列；
（ｊ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列；および
（ｋ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の４３−６７位、５７−８１位、５３−６８位、４９−６４位、５０−６０位または５１−５９位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列。
【請求項１０】
上記肺癌が、非小細胞肺癌または肺腺癌であることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんワクチン療法の開発に関し、より詳細には、肺癌におけるＸＡＧＥ−１ｂに対する液性免疫および細胞性免疫を誘導するペプチドおよびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国のがんの罹患率は年々増加しており、現在死亡原因の第１位となっている。がんの標準的治療法である、外科療法、化学療法、放射線療法に加えて、新たな治療法の開発が急務である。中でも、がん細胞を的確に標的化でき、また副作用が少ない免疫療法は新しいがん治療法として期待されている。特に宿主免疫系にとって免疫原性が高いがん特異抗原をワクチンとして用いたワクチン療法の開発に向けての努力が、国内外で行われている。【０００３】
がん抗原として同定された抗原の中でも、がん・精巣（ＣＴ）抗原は、様々ながん組織に発現しており、正常組織では精巣にのみ発現することが知られている。このように、ＣＴ抗原はがん特異性が非常に高いため、がんワクチンの標的抗原として有望であると考えられている（非特許文献１〜２等参照）。【０００４】
国内外の多くの施設で、ＣＴ抗原を標的としたがんワクチンの臨床試験が行われ、一部にその有用性が示されている（非特許文献３〜４等参照）。例えば、岡山大学病院および大阪大学医学部附属病院において、食道癌患者、前立腺癌患者および悪性黒色腫患者を対象として実施された臨床試験において、ＣＴ抗原であるＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質を用いたがんワクチンは、腫瘍の縮小や増殖の停止等に対して一定の効果があることが認められている（非特許文献５参照）。【０００５】
これまでに、本発明者らは、肺癌患者の血清を用いたＳＥＲＥＸ（serological analysis of cancer antigens by recombinant cDNA expression cloning）法を行い、新規ＣＴ抗原であるＸＡＧＥ−１ｂを同定した。ＸＡＧＥ−１ｂは、これまでに行われたがん組織および正常組織における発現解析の結果から、がん組織では肺癌、肝細胞癌、前立腺癌、胃癌、悪性黒色腫、正常組織では精巣に特異的に発現することが明らかになっている（非特許文献６〜１０）。【０００６】
さらにＸＡＧＥ−１ｂとＨＬＡクラスＩの共発現が見られる症例では生存期間の延長が見られるということを報告し、ＸＡＧＥ−１ｂと予後との関わりも明らかになってきつつある（非特許文献１３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Boon T, et al. Curr Opin Immunol. 1; 9(5): 681-3. 1997
【非特許文献２】Scanlan MJ, et al. Immunol Rev. 188; 22-32. 2002
【非特許文献３】Jager E, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 26; 103(39): 14453-8. 2006
【非特許文献４】Dutoit V, et al. J Clin Invest 110:1813-22. 2002
【非特許文献５】Uenaka A, et al. Cancer Immun. 19; 7: 9. 2007
【非特許文献６】Ali Eldib AM, et al. Int J Cancer. 10; 108(4): 558-63. 2004
【非特許文献７】Nakagawa K, et al. Clin Cancer Res. 1; 11(15): 5496-503. 2005
【非特許文献８】Sato S, et al. Cancer Immun. 5; 7: 5. 2005
【非特許文献９】Kawabata R, et al. Int J Cancer. 15; 120(10): 2178-84. 2007
【非特許文献１０】Tsuji K, et al. Cancer Immunol Immunother. 57(10): 1429-37. 2008
【非特許文献１１】Scanlan MJ, et al. Cancer Immun. 23; 4:1. 2004
【非特許文献１２】Stockert E, et al. J Exp Med. 20; 187(8): 1349-54. 1998
【非特許文献１３】Kikuchi E,et al. Cancer Immun. 28; 8: 13. 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
確かに、ＣＴ抗原はがんワクチンの標的抗原として有望であり、ＣＴ抗原であるＸＡＧＥ−１ｂががんワクチンの標的抗原としての機能を有していることが期待される。しかしながら、すべてのＣＴ抗原が液性免疫反応を誘導するわけではない。例えば、ＭＡＧＥやＳＳＸなどのＣＴ抗原は様々ながん種で発現しているが、液性免疫反応はほとんど確認されていない（非特許文献１１〜１２参照）。このように、過去に報告されているＣＴ抗原は、がん患者の血清中に抗体が存在する頻度が極めて低い。また、ＸＡＧＥ−１ｂは核内抗原であることが確認されているため、がんの縮小や治療に有効な程度の液性免疫を誘導するとは考えづらい。【０００９】
また、非特許文献１３には、確かに、ＸＡＧＥ−１ｂとＨＬＡクラスＩ分子の共発現が見られる肺腺癌患者では生存期間が延長することが報告されているが、ＨＬＡクラスＩ分子の発現が低下した患者では、ＸＡＧＥ−１ｂが発現していたとしても生存期間の延長が認められない。このため、一部の肺腺癌患者において、ＸＡＧＥ−１ｂとＨＬＡクラスＩ分子が共発現すると予後がよいことが示されたからといって、ＸＡＧＥ−１ｂが発現する全てのがんにおいて、ＸＡＧＥ−１ｂががんの縮小や治療に有効であるとは考えづらい。【００１０】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＸＡＧＥ−１ｂの機能を明らかにするとともに、ＸＡＧＥ−１ｂに基づくがんワクチン療法を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、上記課題を解決するために、本発明者らの創意工夫のもとで完成されたものである。すなわち、本発明は、ＸＡＧＥ−１ｂの特定のフラグメントおよびその利用を提供する。【００１２】
本発明は、肺癌を診断するに有用なペプチド、および該ペプチドを含有する組成物を提供する。上記ペプチドは、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなることを特徴としている：
（ａ）配列番号１の１−２５位のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の１５−３９位、２９−５３位、２１−４８位、２１−３６位、２５−４０位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列；および
（ｅ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の４３−６７位、５７−８１位、５７−７２位または６５−８１位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列。上記肺癌は、非小細胞肺癌または肺腺癌であってもよい。【００１３】
本発明はまた、上記ペプチド、または該ペプチドに対する抗体を用いた肺癌診断方法を提供する。本発明にかかる肺癌診断方法は、上記ペプチドが被験体由来の試料中に存在するレベルを測定するペプチド測定工程、あるいは、被験体由来の試料において、上記ペプチドに特異的に結合する抗体のレベルを測定する抗体測定工程を包含することを特徴としている。【００１４】
上記ペプチドはまた、肺癌に対する液性免疫を誘導するに有用である。すなわち、本発明は上記ペプチドを含有する、肺癌に対する液性免疫を誘導するための組成物を提供する。【００１５】
本発明はさらに、肺癌に対する細胞性免疫を誘導するに有用なペプチド、および該ペプチドを含有する組成物を提供する。上記ペプチドは、以下の（ｆ）〜（ｋ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなることを特徴としている：
（ｆ）配列番号１の１−３９位のアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号１の１−３９位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の１−２５位、１５−３９位、１３−３６位、１３−２８位、１７−３２位、２１−３６位、９−２４位または２１−２９位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列；
（ｈ）配列番号１の２９−５３位のアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号１の２９−５３位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の２９−４８位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列；
（ｊ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列；および
（ｋ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の４３−６７位、５７−８１位、５３−６８位、４９−６４位、５０−６０位または５１−５９位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列。上記肺癌は、非小細胞肺癌または肺腺癌であってもよい。【００１６】
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、がんの検査または診断、がん予防またはがん治療が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】非小細胞肺癌におけるＸＡＧＥ−１のＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す図である。（ａ）は、非小細胞肺癌における、ＸＡＧＥ−１ｂの細胞株と組織での発現の違いを示す。（ｂ）は、細胞株においても、ＸＡＧＥ−１ｂタンパク質が存在することを示す。
【図２】非小細胞肺癌患者におけるＸＡＧＥ−１ｂタンパク質に対する抗体応答を示す図であり、（ａ）は非小細胞肺癌患者、（ｂ）は健常人におけるＥＬＩＳＡの吸光度（ＯＤ値）を表している。
【図３】非小細胞肺癌患者におけるＸＡＧＥ−１ｂタンパク質に対する抗体応答の各領域を示す図である。
【図４】エピトープ解析に用いたＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
【図５】ＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチドに対する抗体認識を示す図である。
【図６】血清抗体陽性患者（ｎ＝２０）における、抗ＸＡＧＥ−１ｂ抗体によって認識されるＸＡＧＥ−１ｂ領域を示す図である。
【図７】特異的Ｔ細胞の誘導手順を示す図である。
【図８】血清抗体陽性患者においてＸＡＧＥ−１ｂ特異的Ｔ細胞が誘導されたことを示す図である。（ａ）は、血清抗体陽性患者の中で、抗原特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞の誘導に成功したことを示し、（ｃ）は、血清抗体陽性患者の中で、抗原特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導に成功したことを示す。（ｂ）および（ｄ）は、血清抗体陰性患者５名もしくは、健常人５名では抗原特異的な反応がみられないことを示す。
【図９】特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ｎ＝１４）によって認識されるＸＡＧＥ−１ｂ領域を示す図である。
【図１０】ＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチドに対するＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ｎ＝１４）が認識する主要エピトープ領域を示す図である。
【図１１】特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ｎ＝６）によって認識されるＸＡＧＥ−１ｂ領域を示す図である。
【図１２】ＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ｎ＝６）によって認識される主要エピトープ領域を示す図である。
【図１３】ＸＡＧＥ−１ｂ特異的抗体、ＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞、またはＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される主要エピトープ領域を示す図である。
【図１４】ＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識する主要エピトープ領域とＨＬＡとの関係を示す。
【図１５】症例ＫＬＵ１８７から樹立したクローンＴ細胞（８Ｃ１８７−１）の性質を示す図である。（ａ）は、樹立できたＴ細胞が、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の４５位−６４位のアミノ酸配列を認識することを示し、（ｂ）は、このＴ細胞は、ＨＬＡ  ｃｌａｓｓＩ拘束性、ＣＤ８拘束性であることを示す。（ｃ）は、このＣＤ８陽性Ｔ細胞（８Ｃ１８７−１）は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性であることを示す。
【図１６】ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性のＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識されるＸＡＧＥ−１ｂの最小ペプチド領域はＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５０位−６０位であることを示す図である。（ａ）および（ｂ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される最小エピトープを検討した結果を示し、（ｃ）は、最小エピトープ領域はＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５０位−６０位であることを示す。
【図１７】症例ＫＬＵ１８７から樹立したクローンＴ細胞（８Ｃ１８７−２）の性質を示す図である。（ａ）は、樹立できたＴ細胞が、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の４９位−６４位のアミノ酸配列を認識することを示し、（ｂ）は、このＴ細胞は、ＨＬＡ  ｃｌａｓｓＩ拘束性、ＣＤ８拘束性であることを示す。（ｃ）は、このＣＤ８陽性Ｔ細胞（８Ｃ１８７−２）は、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２拘束性であることを示す。
【図１８】ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２拘束性のＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識されるＸＡＧＥ−１ｂの最小ペプチド領域はＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５１位−５９位であることを示す図である。（ａ）および（ｂ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される最小エピトープを検討した結果を示し、（ｃ）は、エピトープ領域はＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５１位−５９位であることを示す。
【図１９】症例ＫＬＵ１８７から樹立したクローンＴ細胞（８Ｃ１８７−４）の性質を示す図である。（ａ）は、樹立できたＴ細胞が、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の２１位−３６位のアミノ酸配列を認識し、（ｂ）は、このＴ細胞は、ＨＬＡ  ｃｌａｓｓＩ拘束性、ＣＤ８拘束性であることを示す。（ｃ）は、このＣＤ８陽性Ｔ細胞（８Ｃ１８７−４）は、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０１拘束性であることを示す。
【図２０】ＨＬＡ−Ｂ＊３５０１拘束性のＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識されるＸＡＧＥ−１ｂの最小ペプチド領域はＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の２１位−２９位であることを示す図である。（ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される最小エピトープを検討した結果を示し、（ｂ）は、エピトープ領域はＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の２１位−２９位であることを示す。
【図２１】症例ＫＬＵ２３７から樹立したクローンＴ細胞（８Ｃ２３７−２２）の性質を示す図である。（ａ）は、樹立できたＴ細胞が、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の２１位−３６位のアミノ酸配列を認識することを示し、（ｂ）は、このＴ細胞は、ＨＬＡ  ｃｌａｓｓＩ拘束性、ＣＤ８拘束性であることを示す。（ｃ）は、このＣＤ８陽性Ｔ細胞（８Ｃ２３７−２２）は、ＨＬＡ−Ｂ＊４００２拘束性であることを示す。
【図２２】ＨＬＡ−Ｂ＊４００２拘束性のＣＤ８Ｔ細胞によって認識されるＸＡＧＥ−１ｂの最小ペプチド領域はＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の２１位−２９位であることを示す図である。（ａ）は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される最小エピトープを検討した結果を示し、（ｂ）は、エピトープ領域はＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の２１位−２９位であることを示す。
【図２３】得られたＣＤ４クローンＴ細胞（４Ｃ１８７−１）が、自然エピトープを認識していることを示す図である。
【図２４】得られたＣＤ８クローンＴ細胞（８Ｃ１８７−４）が、自然エピトープを認識していることを示す図である。（ａ）は、８Ｃ１８７−４が、ＸＡＧＥ−１ｂタンパク質および２５ｍｅｒのＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチドを認識していることを示し、（ｂ）は、８Ｃ１８７−４は、ＸＡＧＥ−１ｂのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトしたＢ＊３５０１陽性の腫瘍細胞を特異的に認識していることを示す。
【図２５】抗原と細胞との反応時間に応じた、ＸＡＧＥ−１ｂに対する特異的免疫反応の誘導を示す図である。（ａ）はＩＬ−２およびＩＬ−７存在下、（ｂ）および（ｃ）はＩＬ−７およびＩＬ−１５存在下における結果を示す図である。
【図２６】ＸＡＧＥ−１ｂの長鎖ペプチドのアミノ酸配列を示す図である
【図２７】ＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチドが、抗原提示細胞（Ｕ９３７）に取り込まれたことを示す図である。
【図２８】ＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチドは、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩによって抗原提示されることを示す図である。
【図２９】ＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチドは、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩによって抗原提示されることを示す図である。
【図３０】反応が見られた代表的な２症例（ＫＬＵ３４およびＫＬＵ３８）における２回刺激培養後のＸＡＧＥ−１ｂペプチドに対するＣＤ４陽性Ｔ細胞の応答を示す図である。（ａ）は、フローサイトメトリーの結果を表し、（ｂ）は患者の血清抗体価ＥＬＩＳＡの結果を表している。
【図３１】血清抗体価陽性患者（ＫＬＵ３８）におけるＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞によって認識されるＸＡＧＥ−１ｂ領域を示す図である。
【図３２】ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識されるＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性のＸＡＧＥ−１ｂ領域を示す図である。（ａ）は血清存在下、（ｂ）は血清非存在下における結果を示す図である。
【図３３】ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識されるＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性のＸＡＧＥ−１ｂ領域を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の実施の形態について説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２０】
〔１．本発明に係るペプチド〕
本発明に係るペプチドは、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチド、あるいは、以下の（ｆ）〜（ｋ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴としている：
（ａ）配列番号１の１−２５位のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の１５−３９位、２９−５３位、２１−４８位、２１−３６位、２５−４０位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の４３−６７位、５７−８１位、５７−７２位または６５−８１位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列；
（ｆ）配列番号１の１−３９位のアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号１の１−３９位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の１−２５位、１５−３９位、１３−３６位、１３−２８位、１７−３２位、２１−３６位、９−２４位または２１−２９位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列；
（ｈ）配列番号１の２９−５３位のアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号１の２９−５３位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の２９−４８位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列；
（ｊ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列；および
（ｋ）配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の４３−６７位、５７−８１位、５３−６８位、４９−６４位、５０−６０位または５１−５９位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列。
【００２１】
尚、配列番号１の２１−４０位、２１−４４位、２５−４４位、２５−４８位および２９−４８位のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドも、上記（ｃ）に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに包含される。また、配列番号１の１３−３２位または１７−３６位に示されるアミノ酸配列からなるペプチドも、上記（ｇ）に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに包含される。
【００２２】
本発明に係るペプチドは、肺癌におけるＸＡＧＥ−１ｂに対する液性免疫および細胞性免疫を誘導し得る。尚、本明細書では、１５個未満のアミノ酸からなるペプチドを「短鎖ペプチド」と称し、１５個以上のアミノ酸からなるペプチドを「長鎖ペプチド」と称して区別する場合がある。
【００２３】
また、本発明に係るペプチドは、従来公知のペプチド合成方法によって調製することができる。例えば、固相ペプチド合成法等の有機化学的合成法、あるいは、ペプチドをコードする核酸を調製し、組換えＤＮＡ技術を用いて調製することが可能である。
【００２４】
また、本発明に係るペプチドには、ＸＡＧＥ−１ｂに対する液性免疫および細胞性免疫を誘導することができれば、１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、または挿入等の変異が導入されたものも含まれる。
【００２５】
尚、本明細書において、用語「ペプチド」は、ポリペプチドおよびタンパク質と交換可能に用いられ、ペプチドを構成するアミノ酸の数によって限定されるものではない。
【００２６】
International Journal of Oncology 30: 835-840, 2007（非特許文献１４）には、ＸＡＧＥ−１ｂのフラグメントとして、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の３３−４９位または２５−４０位のアミノ酸配列からなるポリペプチドが開示されている（非特許文献１４の図３（ｂ））。また、Microbiol. Immunol., 51(8), 755-762, 2007（非特許文献１５）には、ＸＡＧＥ−１ｂのフラグメントとして、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の９−２４位、１３−２８位、１７−３２位、２１−３６位、２５−４０位、２９−４４位、４９−６４位、５３−６８位、５７−７２位または６５−８１位のアミノ酸配列からなるポリペプチドが開示されている（非特許文献１５の図２Ａ）。
【００２７】
本願において「ペプチド」として権利請求される範囲にこれらのペプチドが含まれることは意図されない。すなわち、一実施形態において、本発明に係るペプチドは、上記非特許文献１４および上記非特許文献１５に開示されたペプチドを除くペプチドであり得る。１つの局面において、本実施形態に係るペプチドは、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、上記非特許文献１４および上記非特許文献１５に開示されたペプチドを除く）であり、他の局面において、本実施形態に係るペプチドは、上記（ｆ）〜（ｋ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、上記非特許文献１４および上記非特許文献１５に開示されたペプチドを除く）である。
【００２８】
また、上記文献には、本発明に係るペプチドの機能が記載も示唆もされていない。よって、以下に説明する、本発明に係るペプチドの利用においては、上記文献に開示されたペプチドを本発明の範囲から除外することは意図されない。すなわち、一実施形態において、本発明に係るペプチドは、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチド、あるいは、上記（ｆ）〜（ｋ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００２９】
１つの局面において、本実施形態に係るペプチドは、(i) 配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列からなるペプチド、であることを特徴としている。他の局面において、本実施形態に係るペプチドは、(ii) 配列番号１の１５−３９位（配列番号２０）、２９−５３位（配列番号２１）、２１−４８位（配列番号２）、２１−３６位（配列番号３）、２５−４０位（配列番号４）、２９−４４位（配列番号５）または３３−４８位（配列番号６）のアミノ酸配列からなるペプチド、であることを特徴としている。
【００３０】
また、配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列からなるペプチドの効果を、配列番号１の１５−３９位、２９−５３位、２１−４８位、２１−３６位、２５−４０位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列からなるペプチドが維持していることから、配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列からなるペプチドのフラグメント（部分断片）であって配列番号１の１５−３９位、２９−５３位、２１−４８位、２１−３６位、２５−４０位、２９−４４位または３３−４８位のいずれかのアミノ酸配列を含むものもまた、本発明の範囲内に含まれ得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。すなわち、本実施形態に係るペプチドは、(iii) 配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の１５−３９位、２９−５３位、２１−４８位、２１−３６位、２５−４０位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列を含んでいるアミノ酸配列からなるペプチド、でもあり得る。
【００３１】
さらに、配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、配列番号１の１５−３９位、２９−５３位、２１−４８位、２１−３６位、２５−４０位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列が保持されていれば、それ以外の領域のアミノ酸配列が多少異なっていてもよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。すなわち、本実施形態に係るペプチドは、(iv) 配列番号１の１５−５３位のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されているアミノ酸配列またはその部分配列からなり、当該部分配列が、配列番号１の１５−３９位、２９−５３位、２１−４８位、２１−３６位、２５−４０位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列を含んでいるアミノ酸配列からなるペプチドであり得る。
【００３２】
尚、配列番号１の１５−５３位、１５−３９位、２９−５３位、２１−４８位、２１−３６位、２５−４０位、２９−４４位および３３−４８位のアミノ酸配列は、「配列番号１の３３−３６位」を共通のアミノ酸配列として有する。このことから、配列番号１の３３−３６位のアミノ酸配列が、上記(i)〜(iv)のペプチドが機能するための主要な領域であることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００３３】
同様に、１つの局面において、本実施形態に係るペプチドは、(i)' 配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列からなるペプチド、であることを特徴としている。他の局面において、本実施形態に係るペプチドは、(ii)' 配列番号１の４３−６７位（配列番号２２）、５７−８１位（配列番号２３）、５７−７２位（配列番号７）または６５−８１位（配列番号８）のアミノ酸配列からなるペプチド、であることを特徴としている。なおさらに、本実施形態に係るペプチドは、(iii)' 配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の４３−６７位、５７−８１位、５７−７２位または６５−８１位のアミノ酸配列を含んでいるアミノ酸配列からなるペプチド、でもあり得、(iv)' 配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されているアミノ酸配列またはその部分配列からなり、当該部分配列が、配列番号１の４３−６７位、５７−８１位、５７−７２位または６５−８１位のアミノ酸配列からなるプチドであり得る。
【００３４】
尚、配列番号１の４３−８１位、４３−６７位、５７−８１位、５７−７２位および６５−８１位のアミノ酸配列は、「配列番号１の６５−６７位」を共通のアミノ酸配列として有する。このことから、配列番号１の６５−６７位のアミノ酸配列が、上記(i)'〜(iv)'のペプチドが機能するための主要な領域であることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００３５】
同様に、１つの局面において、本実施形態に係るペプチドは、(i)'' 配列番号１の１−３９位のアミノ酸配列からなるペプチド、であることを特徴としている。他の局面において、本実施形態に係るペプチドは、(ii)'' 配列番号１の１−２５位（配列番号１９）、１５−３９位（配列番号２０）、１３−３６位（配列番号９）、１３−２８位（配列番号１０）、１７−３２位（配列番号１１）、２１−３６位（配列番号３）、９−２４位（配列番号１４）または２１−２９位（配列番号１５）のアミノ酸配列からなるペプチド、であることを特徴としている。なおさらに、本実施形態に係るペプチドは、(iii)'' 配列番号１の１−３９位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の１−２５位、１５−３９位、１３−３６位、１３−２８位、１７−３２位、２１−３６位、９−２４位または２１−２９位のアミノ酸配列を含んでいるアミノ酸配列からなるペプチド、でもあり得、(iv)'' 配列番号１の１−３９位のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されているアミノ酸配列またはその部分配列からなり、当該部分配列が、配列番号１の１−２５位、１５−３９位、１３−３６位、１３−２８位、１７−３２位、２１−３６位、９−２４位または２１−２９位のアミノ酸配列を含んでいるアミノ酸配列からなるペプチドであり得る。
【００３６】
尚、配列番号１の１−３９位、１−２５位、１５−３９位、１３−３６位、１３−２８位、１７−３２位、２１−３６位、９−２４位および２１−２９位のアミノ酸配列は、「配列番号１の２１−２４位」を共通のアミノ酸配列として有する。このことから、配列番号１の２１−２４位のアミノ酸配列が、上記(i)''〜(iv)''のペプチドが機能するための主要な領域であることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００３７】
同様に、１つの局面において、本実施形態に係るペプチドは、(i)''' 配列番号１の２９−５３位のアミノ酸配列からなるペプチド、であることを特徴としている。他の局面において、本実施形態に係るペプチドは、(ii)''' 配列番号１の２９−４８位（配列番号１２）、２９−４４位（配列番号５）または３３−４８位（配列番号６）のアミノ酸配列からなるペプチド、であることを特徴としている。なおさらに、本実施形態に係るペプチドは、(iii)''' 配列番号１の２９−５３位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の２９−４８位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列を含んでいるアミノ酸配列からなるペプチド、でもあり得、(iv)''' 配列番号１の２９−５３位のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されているアミノ酸配列またはその部分配列からなり、当該部分配列が、配列番号１の２９−４８位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列からなるペプチドであり得る。
【００３８】
尚、配列番号１の２９−５３位、２９−４８位、２９−４４位および３３−４８位のアミノ酸配列は、「配列番号１の３３−４４位」を共通のアミノ酸配列として有する。このことから、配列番号１の３３−４４位のアミノ酸配列が、上記(i)'''〜(iv)'''のペプチドが機能するための主要な領域であることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００３９】
同様に、１つの局面において、本実施形態に係るペプチドは、(i)'''' 配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列からなるペプチド、であることを特徴としている。他の局面において、本実施形態に係るペプチドは、(ii)'''' ４３−６７位（配列番号２２）、５７−８１位（配列番号２３）、５３−６８位（配列番号１３）、４９−６４位（配列番号１６）、５０−６０位（配列番号１７）または５１−５９位（配列番号１８）のアミノ酸配列からなるペプチド、であることを特徴としている。なおさらに、本実施形態に係るペプチドは、(iii)'''' 配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の４３−６７位、５７−８１位、５３−６８位、４９−６４位、５０−６０位または５１−５９位のアミノ酸配列からなるペプチド、でもあり得、(iv)'''' 配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されているアミノ酸配列またはその部分配列からなり、当該部分配列が、配列番号１の４３−６７位、５７−８１位、５３−６８位、４９−６４位、５０−６０位または５１−５９位のアミノ酸配列を含んでいるアミノ酸配列からなるペプチドであり得る。
【００４０】
尚、配列番号１の４３−８１位、４３−６７位、５７−８１位、５３−６８位、４９−６４位、５０−６０位および５１−５９位のアミノ酸配列は、「配列番号１の５７−５９位」を共通のアミノ酸配列として有する。このことから、配列番号１の５７−５９位のアミノ酸配列が、上記(i)''''〜(iv)''''のペプチドが機能するための主要な領域であることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００４１】
さらに、実施例にて後述するように、配列番号１の２１−３６位、２５−４０位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列からなるペプチドは、肺癌に対する液性免疫を誘導する機能を有している。このことから、配列番号１の２１−３６位、２５−４０位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列を含む、配列番号１の１５−５３位、１５−３９位、２９−５３位または２１−４８位のアミノ酸配列からなるペプチドについても、同様の機能を有し、これらのペプチドも本発明の範囲内に含まれ得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。また、配列番号１の２１−４０位、２１−４４位、２５−４４位、２５−４８位および２９−４８位のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドについても、配列番号１の２１−４８位のアミノ酸配列からなるペプチドと同様の機能を有し、これらのペプチドも本発明の範囲内に含まれ得る。
【００４２】
同様に、肺癌に対する液性免疫を誘導する機能を有することが実証されている、配列番号１の５７−７２位または６５−８１位のアミノ酸配列を含む、配列番号１の４３−８１位、４３−６７位または５７−８１位のアミノ酸配列からなるペプチドについても、同様の機能を有し、これらのペプチドも本発明の範囲内に含まれ得る。
【００４３】
また、実施例にて後述するように、配列番号１の１３−２８位、１７−３２位、２１−３６位、９−２４位または２１−２９位のアミノ酸配列からなるペプチドは、肺癌に対する細胞性免疫を誘導する機能を有している。このことから、配列番号１の１３−２８位、１７−３２位、２１−３６位、９−２４位または２１−２９位のアミノ酸配列を含む、配列番号１の１−３９位、１−２５位、１５−３９位または１３−３６位のアミノ酸配列からなるペプチドについても、同様の機能を有し、これらのペプチドも本発明の範囲内に含まれ得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。また、１３−３２位または１７−３６位に示されるアミノ酸配列からなるペプチドについても、配列番号１の１３−３６位のアミノ酸配列からなるペプチドと同様の機能を有し、これらのペプチドも本発明の範囲内に含まれ得る。
【００４４】
同様に、肺癌に対する細胞性免疫を誘導する機能を有することが実証されている、配列番号１の２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列を含む、配列番号１の２９−５３位または２９−４８位のアミノ酸配列からなるペプチドについても、同様の機能を有し、これらのペプチドも本発明の範囲内に含まれ得る。
【００４５】
同様に、肺癌に対する細胞性免疫を誘導する機能を有することが実証されている、５３−６８位、４９−６４位、５０−６０位または５１−５９位のアミノ酸配列を含む、配列番号１の４３−８１位、４３−６７位または５７−８１位のアミノ酸配列からなるペプチドについても、同様の機能を有し、これらのペプチドも本発明の範囲内に含まれ得る。
【００４６】
〔２．本発明に係る肺癌を診断するための組成物〕
本発明に係る肺癌を診断するための組成物（以下、「本発明に係る組成物１」または「組成物１」と称する）は、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含んでいる。上記「ペプチド」としては、上記「１．本発明に係るペプチド」で説明したとおりである。本発明に係る組成物１は、肺癌を診断するために、上記ペプチドの内の１つを単独で含んでいてもよいし、２つ以上のペプチドを組み合わせて含んでいてもよい。
【００４７】
本発明に係る組成物１を用いて肺癌を診断する方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫検定法）、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、免疫組織化学法、抗体アレイ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法等を挙げることができる。従って、本発明に係る組成物１には、上記ペプチド以外に、上述した診断方法に通常使用されている緩衝剤、塩類、界面活性剤等が含まれていてもよい。
【００４８】
また、本発明に係る組成物１を用いて非小細胞肺癌または肺腺癌を診断してもよい。
【００４９】
〔３．本発明に係る肺癌診断方法〕
本発明に係る肺癌診断方法は、肺癌を診断する方法であって、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドが被験体由来の試料中に存在するレベルを測定するペプチド測定工程、あるいは、被験体由来の試料において、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体のレベルを測定する抗体測定工程を包含する。上記「ペプチド」としては、上記「１．本発明に係るペプチド」で説明したとおりである。
【００５０】
上記「被験体」は、特に限定されるものではなく広く動物一般を含むが、ヒトであることが好ましい。被験体がヒトである場合、がん患者やがんを有する疑いのある患者のみでなく、健常人も被験体となり得る。被験体の性別、年齢等は特に限定されない。上記「試料」としては、例えば、血液（血清、血漿、血球等）、尿、糞便、喀痰、胸・腹水、気管支肺胞洗浄液、腹腔洗浄液、生検組織、外科的に切除された検体等を挙げることができる。上記「ペプチドが被験体由来の試料中に存在するレベル」とは、ペプチドが被験体由来の試料中に存在する量を意図している。上記「抗体のレベル」とは、抗体の量を意図している。
【００５１】
本発明に係る肺癌診断方法は、後述するペプチド測定工程または抗体測定工程において、被験体由来の試料に上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはこれらのペプチドに特異的に結合する抗体が存在するか否かを検出することにより決定することができる。また、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはこれらのペプチドに特異的に結合する抗体が、被験体由来の試料存在する量を測定し、この量をコントロール（例えば、正常な健康個体由来の試料に存在する量）と比較することによりがんを診断することができる。
【００５２】
また、本発明に係る肺癌診断方法では、肺癌の中でも、非小細胞肺癌または肺腺癌を好適に診断することができる。
【００５３】
ここで、上記「ペプチド測定工程」および上記「抗体測定工程」について説明する。
【００５４】
（３−１．ペプチド測定工程）
ペプチド測定工程は、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドが被験体由来の試料中に存在する量を測定する工程である。ペプチドの量を測定する方法としては、当該分野において公知の手法を用いて測定することができる。例えば、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドを特異的に認識する抗体を用いて、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫検定法）、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、免疫組織化学法、抗体アレイ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法等を行うことによって測定することができるが、本発明はこれに限定されない。なお、上記ペプチドの量の測定に用いる試料は、血清であることが好ましいが、ペプチドの量の測定が可能な試料であれば特に限定されない。
【００５５】
被験体由来の試料中に存在する上記ペプチドの量が、コントロール（例えば、正常な健康個体（健常人）由来の試料中に存在する上記ペプチドの量）よりも高い場合に、被験体はがんを有していると判定することが可能である。コントロールは、正常な健康個体に由来する試料をペプチド測定工程と同時に測定されることにより得られてもよく、背景データとして蓄積されているデータが用いられてもよい。
【００５６】
（３−２．抗体測定工程）
抗体測定工程は、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体のレベルを測定する工程である。抗体の濃度を測定する方法としては、特定の抗原に対する抗体力価のレベルを測定する方法や、目的の抗体に対する抗体を用いる方法であれば特に限定されず、当該分野において公知の手法を用いて測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴ法、免疫沈降法、アフィニティーカラム法等によって測定することができるが、本発明はこれに限定されない。なお、上記抗体のレベルの測定に用いる試料は、血清であることが好ましいが、抗体レベルの測定が可能な試料であれば特に限定されない。
【００５７】
抗体の力価測定に用いる抗原タンパク質は、生体試料から精製して取得することも可能であるが、組換えタンパク質として取得することが好ましい。組換えタンパク質は、例えば、ＸＡＧＥ−１ｂ遺伝子または、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレチドを挿入した発現ベクターを宿主に導入して発現させ、精製することにより取得することができる。
【００５８】
被験体由来の試料中に存在する上記抗体の量が、コントロール（例えば、正常な健康個体（健常人）由来の試料中に存在する上記抗体の量）よりも高い場合に、被験体はがんを有していると判定することが可能である。コントロールは、正常な健康個体に由来する試料を抗体測定工程と同時に測定されることにより得られてもよく、背景データとして蓄積されているデータが用いられてもよい。例えば、３００倍に希釈した血清を用いてＥＬＩＳＡを行った場合、健常人（コントロール）は反応しない。このため、波長４９０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ値）が１．０を超えれば統計学的に陽性であると判断し、被験体はがんを有していると判定することができる。血清の希釈倍率等の反応条件が異なれば陽性と判断できるＯＤ値は変わるので、反応条件に応じて適宜設定することができる。
【００５９】
尚、本発明に係る肺癌診断方法は、肺癌の可能性を診断するためのデータを取得する方法であり得る。この場合、本発明は医師による判断工程を含むことを意図しない。
【００６０】
〔４．本発明に係る肺癌に対する液性免疫を誘導するための組成物〕
本発明に係る肺癌に対する液性免疫を誘導するための組成物（以下、「本発明に係る組成物２」または「組成物２」と称する）は、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含んでいる。上記「ペプチド」としては、上記「１．本発明に係るペプチド」で説明したとおりである。
【００６１】
上記組成物２は、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも１種類で含んでいれば、肺癌に対する液性免疫を誘導することができるが、複数のペプチドを組み合わせて含むことによって、肺癌に対する液性免疫をより効率よく誘導することができる。
【００６２】
また、本発明に係る組成物２は、上記のペプチドの生理活性を阻害しない、ペプチド以外の他の成分（例えば、薬学的に受容可能なキャリア等）をさらに含有してもよい。
【００６３】
本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」（以下、単に「キャリア」ともいう）とは、医薬、または動物薬のような農薬を製造するときに、処方を補助することを目的として用いられる物質であって、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。さらに、本発明にかかる薬学的組成物を受容した個体において毒性が無く、且つキャリア自体は有害な抗体の産生を誘導しないものが意図される。
【００６４】
上記キャリアとしては、製剤素材として使用可能な各種有機または無機のキャリア物質が用いられ、後述する薬学的組成物の投与形態および剤型に応じて適宜選択することができる。例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等；防腐剤；抗酸化剤；安定剤；矯味矯臭剤等として配合されるが、本発明はこれらに限定されない。
【００６５】
本発明に係る組成物２は、医薬品分野で通常用いられるアジュバントの存在下または非存在下において、経口的または非経口的に投与することによって、肺癌に対する液性免疫を誘導することができる。なお、本明細書中において、上記「非経口」とは、脳室内、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【００６６】
本発明に係る組成物２は、肺癌の中でも、非小細胞肺癌または肺腺癌に対する液性免疫を好適に誘導することができる。
【００６７】
〔５．本発明に係る肺癌に対する細胞性免疫を誘導するための組成物〕
本発明に係る肺癌に対する細胞性免疫を誘導するための組成物（以下、「本発明に係る組成物３」または「組成物３」と称する）は、上記（ｆ）〜（ｋ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含んでいる。上記「ペプチド」としては、上記「１．本発明に係るペプチド」で説明したとおりである。
【００６８】
（i） 配列番号１の１−３９位のアミノ酸配列、（ii） 配列番号１の１−３９位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の１−２５位、１５−３９位、１３−３６位、１３−２８位、１７−３２位もしくは２１−３６位のアミノ酸配列を含んでいるアミノ酸配列、(iii) 配列番号１の２９−５３位のアミノ酸配列、(iv) 配列番号１の２９−５３位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の２９−４８位、２９−４４位または３３−４８位のアミノ酸配列を含んでいるアミノ酸配列、(v) 配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列、または(vi) 配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の４３−６７位、５７−８１位もしくは５３−６８位のアミノ酸配列を含んでいるアミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物３は、ＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞を誘導することができる。また、（vii） 配列番号１の１−３９位のアミノ酸配列、（viii） 配列番号１の１−３９位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の配列番号１の１−２５位、１５−３９位、２１−３６位、９−２４位もしくは２１−２９位のアミノ酸配列を含んでいるアミノ酸配列、(ix) 配列番号１の２９−５３位のアミノ酸配列、(x) 配列番号１の２９−５３位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の２９−４４位のアミノ酸配列を含んでいるアミノ酸配列、(xi) 配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列、または(xii) 配列番号１の４３−８１位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の４３−６７位、５７−８１位、４９−６４位、５０−６０位もしくは５１−５９位のアミノ酸配列を含んでいるアミノ酸配列のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物３は、ＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導することができる。特に、配列番号１の５０−６０位のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号１７）を含む組成物３は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性のＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導することができる。また、配列番号１の５１−５９位のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号１８）を含む組成物３は、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２拘束性のＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導することができる。また、配列番号１の２１−２９位のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号１５）に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物３は、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０１拘束性のＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞およびＨＬＡ−Ｂ＊４００２拘束性のＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導することができる。
【００６９】
上記組成物３は、上記（ｆ）〜（ｋ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも１種類で含んでいれば、肺癌に対する細胞性免疫を誘導することができるが、複数のペプチドを組み合わせて含むことによって、肺癌に対する細胞性免疫をより効率よく誘導することができる。
【００７０】
また、本発明に係る組成物３は、上記のペプチドの生理活性を阻害しない、ペプチド以外の他の成分（例えば、薬学的に受容可能なキャリア等）をさらに含有してもよい。当該「薬学的に受容可能なキャリア」については、上記「本発明に係る肺癌に対する液性免疫を誘導するための組成物」で説明したので省略する。
【００７１】
本発明に係る組成物３は、医薬品分野で通常用いられるアジュバントの存在下または非存在下において、経口的または非経口的に投与することによって、肺癌に対する細胞性免疫を誘導することができる。
【００７２】
また、肺癌患者の末梢血から単核細胞分画を採取し、上記（ｆ）〜（ｋ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含む上記組成物と共培養し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導することができる。これらの誘導されたＸＡＧＥ−１ｂ特異的Ｔ細胞を肺癌患者の血液中に戻すことによっても、肺癌の予防または治療が可能となる。なお、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＸＡＧＥ−１ｂ特異的Ｔ細胞を誘導する場合、細胞の濃度、上記組成物３の濃度等の培養条件は適宜設定することができる。
【００７３】
本発明に係る組成物３は、肺癌の中でも、非小細胞肺癌または肺腺癌に対する液性免疫を好適に誘導することができる。
【００７４】
後述する実施例に示すように、ＸＡＧＥ−１ｂの解析では、特異的抗体、特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞、または特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識されるＸＡＧＥ−１ｂの部位には特異性がある傾向が認められるものの、特異的抗体、特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞、または特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識する部位は、ＸＡＧＥ−１ｂの全長にわたって存在する。このため、低コストで、タンパク質と同等の抗原提示を誘導できる長鎖ペプチドを用いて、ＨＬＡに問わずワクチンを施行するためには、ＸＡＧＥ−１ｂの全長をカバーするように長鎖ペプチドを組み合わせて投与することが好ましい。
【００７５】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。【００７７】
〔実施例１〕
実施例１ではＸＡＧＥ−１ｂ抗原について免疫原性の詳細な解析を行い、新規がんワクチン療法の標的がん抗原としての有用性を検討した。【００７８】
＜実験材料および実験方法＞
〔ａ．患者血清、胸水および末梢血単核球〕
本発明の実施例において使用した血清、胸水および末梢血単核球は、検体提供者すべてにおいてインフォームドコンセントのもとに検体提供を受けた。【００７９】
〔ｂ．細胞の分離方法〕
患者の末梢血から比重遠心法によって単核球分画を得た。次いで、抗ＣＤ４抗体結合ビーズ、抗ＣＤ８抗体結合ビーズおよび抗ＣＤ１９抗体結合ビーズ（ミリテニーバイオテク社製）を用いて、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ、ミリテニーバイオテク社製）によって、順次ＣＤ８陽性分画、ＣＤ４陽性分画、ＣＤ１９陽性分画およびＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ１９−分画を分離した。【００８０】
〔ｃ．ＸＡＧＥ−１ｂタンパク質およびペプチド〕
ＸＡＧＥ−１ｂタンパク質（８１個のアミノ酸、配列番号１）は、ＧＬバイオケム社（上海、中国）で合成されたものを使用した。合成したＸＡＧＥ−１ｂタンパク質は、ＨＰＬＣカラムで精製を行い、純度が９０％以上であることを確認している。【００８１】
また、ＸＡＧＥ−１ｂタンパク質の全長をカバーする１６ｍｅｒまたは１７ｍｅｒのオーバーラップペプチド（以下、「ＯＬＰ」とも略す）（１−１６、５−２０、９−２４、１３−２８、１７−３２、２１−３６、２５−４０、２９−４４、３３−４８、３７−５２、４１−５６、４５−６０、４９−６４、５３−６８、５７−７２、６１−７６、および６５−８１）は、Ｆｍｏｃ固相法によってマルチプルペプチド合成機（AMS422; ABIMED, Langenfeld Germany）を用いて岡山大学共同研究室において合成したものを使用した。【００８２】
〔ｄ．ＥＬＩＳＡ〕
１μｇ／ｍｌの濃度の全長ＸＡＧＥ−１ｂタンパク質（炭酸バッファー、ｐＨ９．６）を４℃オーバーナイトで９６穴プレート（ヌンク社製）に固相化した後に、洗浄液（ＰＢＳ／０．１％ＴＷＥＥＮ）で９６穴プレートを洗浄し、５％ＦＣＳ／ＰＢＳを加えて、３７℃で１時間ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、１００倍、３００倍、９００倍、または２７００倍に希釈した血清を加えて、３７℃で２時間反応させた。次いで、洗浄液で洗浄した後に、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（５０００倍希釈）（ジャクソン社製）を加えて、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、洗浄液で洗浄し、過酸化水素を加えた基質溶液（オルトフェニレンジアミンを０．０５Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）に溶解した溶液）を加えて発色させた。発色後、６Ｎ硫酸を加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）を用いて吸光度（波長４９０ｎｍ）を測定した。【００８３】
〔ｅ．ＩＦＮ−γキャッチアッセイ〕
ＩＦＮ−γキャッチアッセイについて、図６を参照しながら説明する。図６は、ＩＦＮ−γキャッチアッセイの手順を示す図である。【００８４】
（１）ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＸＡＧＥ−１ｂ特異的反応の誘導
ＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞と、抗原提示細胞（図中、「ＡＰＣ」と表す）として、同数のＸ線照射（７０Ｇｙ）ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞とを、ＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチド（ＯＬＰ）各１μＭ存在下において、２４ウェルプレートまたは９６ウェルプレートを用いてＣＯ２インキュベーター内で１０〜１４日間培養した。Ｔ細胞を培養するための培地としては、特に記載がない場合は、５％プール血清／ＡＩＭ−Ｖ（ＩＬ−２  ２５ＩＵ／ｍｌ、ＩＬ−７  ５ｎｇ／ｍｌ）を用い、必要に応じてＩＬ−１５  ５μｇ／ｍｌをさらに添加した。【００８５】
必要に応じ、２回目の刺激は、培養１０〜１４日後に、培養培地の半分を新しい培養培地に交換し、１μＭになるようにＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチド添加して、同様に行った。【００８６】
１回目または２回目の刺激後１０〜1４日後に、Ｔ細胞によって産生された抗原特異的ＩＦＮ−γの量を下記のＥＬＩＳＡ法によって測定した。【００８７】
（２）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ
エフェクター細胞（ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性Ｔ細胞）の刺激培養上清１００μｌを、マウス抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体（１−Ｄ１Ｋ，ＢＤ社製，５００倍希釈）をオーバーナイトで固相化した後にブロッキングしたプレートに加えて、３７℃で１時間反応させた。その後、ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）を用いてプレートを洗浄し、ウサギ抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（自家製，６００倍希釈）を加えて、３７℃で１時間反応させた。【００８８】
洗浄液で洗浄後に、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＭＢＬ製，２０００倍希釈）を加えて、３７℃で１時間反応させた。反応後に洗浄液で洗浄し、その後、基質溶液（ｏ−フェニレンジアミン（o-phenylenediamine，ＯＰＤＡ）（和光製））を加えて発色させた。発色後、６Ｎ硫酸を加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）を用いて吸光度（波長４９０ｎｍ）を測定した。オーバーラップペプチドで刺激を行わなかったウェルと比べてＩＦＮ−γの産生量が多かったウェルを陽性ウェルとした。陽性ウェルについて、翌日、抗原特異的にＩＦＮ−γを産生する細胞の存在を確認した。【００８９】
（３）ＩＦＮ−γ産生細胞の検出
オーバーラップペプチドを添加して刺激培養した後の細胞と、これと同数の自己のＥＢＶ−Ｂ細胞（エプスタイン・バール・ウイルス感染Ｂ細胞）（ＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチドで予め刺激したものまたは刺激しなかったもの）とを３７℃で４時間または８時間、ＣＯ２インキュベーター内で反応させ、ヒトＩＦＮ−γキャッチ抗体（ミリテニーバイオテク社製）２μｌを用いて培養細胞を標識した。【００９０】
その後、１〜１０ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁し、ローテーター（マックスミックス、ミリテニーバイオテク社製）を用いて懸濁しながら３７℃で４５分間、ＣＯ２インキュベーター内で反応させた。細胞を洗浄した後に、ＰＥ標識ヒトＩＦＮ−γ抗体（ミリテニーバイオテク社製）２μｌ、７ＡＡＤ（ＢＤ社製）２μｌ、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４抗体またはＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８抗体（ミリテニーバイオテク社製）１μｌを加えて染色した。【００９１】
染色後、ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒ（１％ＦＣＳ／ＰＢＳ，０．０２％アジ化ナトリウム）を加えて細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ社製）を用いてフローサイトメトリーを行い、ＩＦＮ−γ産生細胞を検出した。ＩＦＮ−γ産生細胞の頻度は、データ解析ソフト（ＦｌｏｗＪｏ，Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ社製）を用いて解析した。【００９２】
図１は、非小細胞肺癌におけるＸＡＧＥ−１のｍＲＮＡの発現を示す図である。図１の（ａ）は、肺腺癌の手術検体（組織）１０例と肺癌細胞株１２例におけるＸＡＧＥ−１の４つのスプライシングバリアントであるＸＡＧＥ−１ａ、１ｂ、１ｃおよび１ｄのｍＲＮＡの発現を調べた図である。図１の（ａ）に示すように、肺癌細胞株では、ＸＡＧＥ−１のすべてで強発現（１ｃ、１ｄが優位）が認められるが、肺癌組織ではＸＡＧＥ−１ｂおよび１ｄの発現のみが認められる。非特許文献７および８では、ＸＡＧＥ−１ｂと１ｄとでは、肺癌においてＸＡＧＥ−１ｂが有意であることが証明されている。このため、ワクチンの候補として、ＸＡＧＥ−１ｂを標的とすることが望ましいといえる。肺癌細胞株と組織におけるＸＡＧＥ−１の発現の差は原因不明であるが、ＸＡＧＥ−１の機能に関与する可能性がある。【００９３】
また、図１の（ｂ）は、肺癌細胞株におけるＸＡＧＥ−１ｂタンパク質が存在することを証明した図である。具体的には、ｍＲＮＡ陽性肺癌細胞株においてウエスタンブロットでタンパク質の存在を証明した。尚、肺癌細胞株と肺癌組織との発現の量の違いについてはこれまで検討されておらず、本発明者等が初めで明らかにした。また、肺癌組織と比較して、肺癌細胞株では、ＸＡＧＥ−１ｂタンパク質の発現量が非常に少ないため、免疫沈降法を用いなければそのタンパク質の同定はできなかった。【００９４】
〔実験例１〕
２００５年から２００９年の間に、川崎医科大学附属病院を受診した非小細胞肺癌２００例（進行期肺腺癌６９例含む）および対照群として健常人５０例において、ＸＡＧＥ−１ｂに対する液性免疫応答の有無を検討した。【００９５】
具体的には、肺癌患者から採取した血清におけるＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＩｇＧ抗体の有無をＥＬＩＳＡ法によって確認した。【００９６】
ＥＬＩＳＡの結果を図２および３に示す。図２は、非小細胞肺癌患者におけるＸＡＧＥ−１ｂタンパク質に対する抗体応答を示す図であり、（ａ）は非小細胞肺癌患者、（ｂ）は健常人の血清を１００倍、３００倍、９００倍および２７００倍で希釈した場合のＥＬＩＳＡの吸光度（ＯＤ値）を表している。図３は、非小細胞肺癌患者におけるＸＡＧＥ−１ｂタンパク質に対する抗体応答の各領域を示す図である。【００９７】
図２および図３に示すように、肺癌患者は、対照群（健常人）と比較して血清抗体価が高い順に、強陽性群、陽性群、弱陽性群、境界群の４つの領域に分類された。そのうち弱陽性以上の肺癌患者を血清抗体価陽性患者とした。【００９８】
非小細胞肺癌患者全体では、ＸＡＧＥ−１ｂ血清抗体価陽性例は２０／２００例（１０．０％）であった。また、表１に示すように、進行期（ｓｔａｇｅ３Ｂ／４期）肺腺癌患者に限れば、ＸＡＧＥ−１ｂ血清抗体価陽性例は１３／６９例（１８．８％）であった。【００９９】
【表１】
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一方、健常人５０名でも同様の実験を行ったが、図２の（ｂ）に示すように、ＸＡＧＥ−１ｂに対する抗体反応は認められなかった。これらの結果から、肺癌患者の中でも、非小細胞肺癌患者、特に肺腺癌患者では、ＸＡＧＥ−１ｂに対する液性免疫が高頻度に誘導されていることが明らかになった。【０１００】
なお、非特許文献１３には、肺腺癌では３２．５％がＸＡＧＥ−１ｂに対する免疫組織染色陽性であることが報告されている。このことから、進行期肺腺癌においてＸＡＧＥ−１ｂに対する免疫組織染色が陽性であれば約６０％の高い頻度でＸＡＧＥ−１ｂに対する液性免疫が誘導され得ると予想できる。【０１０１】
〔実験例２〕
血清抗体価陽性を示した患者の血清を用いて、血清中に含まれる抗ＸＡＧＥ−１ｂ抗体が認識するＸＡＧＥ−１ｂのエピトープを調べた。図４は、エピトープ解析に用いたＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチドのアミノ酸配列を示す図である。【０１０２】
図４に示す、１７種類のＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチドを、それぞれ１μｇ／ｍｌの濃度でプレートに固相化し、血清抗体価陽性患者の血清を加えて、抗原抗体反応の有無をＥＬＩＳＡ法によって調べた。血清は、３００倍に希釈したものを用いた。【０１０３】
血清抗体価陽性患者２０例におけるＥＬＩＳＡの結果を図５および図６に示す。図５は、ＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチドに対する抗体認識を示す図である。図５のグラフに記載した破線は、抗体価（Ｏ.Ｄ.（４９０ｎｍ））が０．１であることを表している。図６は、抗ＸＡＧＥ−１ｂ抗体によって認識されるＸＡＧＥ−１ｂ領域を示す図である。図６は、図５で抗体価が０．１以上であった患者の数をペプチド毎にプロットしている。【０１０４】
図５に示すように、抗ＸＡＧＥ−１ｂ抗体が認識する領域には個人差があるが、図６に示すように、抗ＸＡＧＥ−１ｂ抗体の主要認識部位は、ＸＡＧＥ−１ｂの全長アミノ酸配列の、２１−４８位（配列番号２）、５７−７２位（配列番号７）、６５−８１位（配列番号８）の３領域であることが明らかになった。【０１０５】
〔実験例３〕
末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるＸＡＧＥ−１ｂに対する反応を検討した。血清抗体価陽性患者１６名から分離した末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞（１×１０６個）を、これと同数の放射線照射したＣＤ４−ＣＤ８−細胞と共に、ＸＡＧＥ−１ｂの全長をカバーするようにプールしたオーバーラップペプチドの存在下で、１０〜１４日間刺激培養した（刺激培養は、必要に応じ１０〜１４日ごとに２回施行）。次いで、１×１０４個のＣＤ４陽性Ｔ細胞と、同数のＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチドパルスまたは非パルスのＰＦＡ処理した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞とを３７℃で４時間反応させ、ＩＦＮ−γキャッチアッセイを行った。【０１０６】
その結果、図８の（ａ）および（ｂ）に示すように、血清抗体価陽性患者１６名のうち１４名（８７．５％）において、ＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチドで刺激したＣＤ４陽性Ｔ細胞の中に、ＸＡＧＥ−１ｂ特異的にＩＦＮ−γを産生する細胞が検出された。特異的Ｔ細胞の検出は、ＣＤ４で８７．５％（１４／１６）であった。【０１０７】
図３０は反応が見られた代表的な２症例におけるＸＡＧＥ−１ｂペプチドに対するＣＤ４陽性Ｔ細胞の応答を示す図である。図３０の（ａ）は、フローサイトメトリーの結果を表し、（ｂ）は患者の血清抗体価ＥＬＩＳＡの結果を表している。また、図３０の（ａ）に示すように、症例ＫＬＵ３４では、ネット値で１．１１％のＩＦＮ−γ産生細胞が検出された。また、症例ＫＬＵＮ３８では、ネット値で０．９４％のＩＦＮ−γ産生細胞が検出された。尚、上記「ネット値」は、ペプチド（＋）におけるＩＦＮ−γ産生細胞の割合からペプチド（−）におけるＩＦＮ−γ産生細胞の割合を減じた値を表している。【０１０８】
〔実験例４〕
実験例３においてＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞が検出された１４名の患者において、その特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞が認識するＸＡＧＥ−１ｂの領域を検討した。先の実験で得られた１×１０４個のＣＤ４陽性Ｔ細胞と、抗原提示細胞として、各ＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチドを５μｇ／ｍｌパルスまたは非パルスの、ＣＤ４陽性Ｔ細胞と同数のＰＦＡ処理した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞とを用い、３７℃で４時間反応させ、ＩＦＮ−γキャッチアッセイまたはＥＬＩＳＡを行った。【０１０９】
結果を図３１に示す。図３１は、血清抗体価陽性患者（ＫＬＵ３８）における刺激培養後のＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞によって認識されるＸＡＧＥ−１ｂ領域を示す図である。図３１に示すように、ペプチド４（１３−２８位のアミノ酸領域、配列番号１０）またはペプチド６（２１−３６位のアミノ酸領域、配列番号３）を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞を刺激すると、ＸＡＧＥ−１ｂ特異的にＩＦＮ−γを産生する細胞が高頻度に検出された。このことから、症例ＫＬＵ３８のＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＸＡＧＥ−１ｂの１３−３６位のアミノ酸領域および２１−３６位のアミノ酸領域を認識していることが明らかになった。【０１１０】
血清抗体価陽性患者の残りの１３症例についても同様に解析を行った。結果を図９および図１０に示す。図９は、特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ｎ＝１４）によって認識されるＸＡＧＥ−１ｂ領域を示す図である。図９では、特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応が特に強いペプチドに星印を付している。図１０は、ＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチドに対するＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ｎ＝１４）が認識する主要エピトープ領域を示す図である。図１０は、図９の星印の数をペプチド毎にプロットしている。図９および図１０に示すＸＡＧＥ−１ｂ抗体陽性１４症例の検討結果から、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の１３−３６位（配列番号９）、２９−４８位（配列番号１２）、５３−６８位（配列番号１３）がＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞によって高頻度に認識されることが明らかになった。さらに、ＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞によって認識される主要な部位は１３−２８位のアミノ酸領域（配列番号１０）および３３−４８位のアミノ酸領域（配列番号６）であることが明らかになった。【０１１１】
〔実験例５〕
ＣＤ８陽性Ｔ細胞のＸＡＧＥ−１ｂ認識領域を検討するために、末梢血ＣＤ８陽性Ｔ細胞を用いてＩＦＮ−γキャッチアッセイおよびＥＬＩＳＡを行った。具体的には、血清抗体陽性患者から採取した末梢血ＣＤ８陽性Ｔ細胞１×１０４個と、同数のＣＤ４−ＣＤ８−細胞とを、１μｇ／ｍｌのＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチド存在下において共培養した。培養後１０〜１４日目に、ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって産生されたＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡ法によって測定した。ＩＦＮ−γキャッチアッセイの結果、血清抗体価陽性患者９例のうち６例（６６．７％）においてＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応が認められた。図８の（ｃ）および（ｄ）は、ＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が誘導されたことを示す図である。【０１１２】
〔実験例６〕
ＸＡＧＥ−１ｂにおけるＣＤ８陽性Ｔ細胞の認識領域を検討するため、反応がみられた６症例について、各ＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチド１μｇ／ｍｌをパルスした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を抗原提示細胞として用いてＥＬＩＳＡを行った。結果を図１１に示す。図１１は、特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ｎ＝６）によって認識されるＸＡＧＥ−１ｂ領域を示す図である。図１１では、特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応が特に強いペプチドに星印を付している。図１２は、ＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ｎ＝６）によって認識される主要エピトープ領域を示す図である。図１２は、図１１の星印の数をペプチド毎にプロットしている。図１１および図１２に示すＸＡＧＥ−１ｂ抗体陽性６症例の検討結果から、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の９−２４位（配列番号１４）、２１−３６位（配列番号３）、２９−４４位（配列番号５）、４９−６４位（配列番号１６）がＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって高頻度に認識されることが明らかになった。【０１１３】
図１３は、血清抗体価陽性患者における、ＸＡＧＥ−１ｂ特異的抗体、ＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞、またはＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される主要エピトープ領域を示す図である。図１３に示すように、ＸＡＧＥ−１ｂの解析では、特異的抗体、特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞、または特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識されるＸＡＧＥ−１ｂの部位には特異性がある傾向が認められるものの、特異的抗体、特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞、または特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識する部位は、ＸＡＧＥ−１ｂの全長にわたって存在することが示された。この結果から、ＸＡＧＥ−１ｂの全長をカバーするように、複数のペプチドを組み合わせて投与することによって、被験体のＨＬＡの種類を問わずＸＡＧＥ−１ｂワクチンを施行し得ると考えられた。【０１１４】
図１４は、ＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識する主要エピトープ領域とＨＬＡとの関係を示している。【０１１５】
図１４は、ＸＡＧＥ−１ｂ特異的Ｔ細胞を検出し得た１５症例のＨＬＡおよび特異的Ｔ細胞が認識するオーバーラップペプチドの領域を示す。黒はＣＤ４陽性Ｔ細胞、灰色はＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識する領域を示す。我々が目指すがんワクチンは被験者のＨＬＡに問わず施行することである。ＸＡＧＥ−１ｂに対する特異的な反応は先述したようにＸＡＧＥ−１ｂ全長にわたっており、その中でも抗体、ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ陽性細胞が認識する主要な領域が存在することを提示してきた。また後述するように今回数種のＨＬＡに拘束されるエピトープペプチドの同定に成功したわけであるが、図１４に示すようにヒトのＨＬＡは多種多様であり、各ＨＬＡに対するエピトープをそれぞれ同定する作業は非常に困難を極める。そのため、図１４で示す各対象者のＨＬＡと主要認識領域の対応表は、新規エピトープペプチドの推測に有用である。将来的にはＨＬＡの組み合わせによっては、非常に効率よく特異的な反応を誘導できうる領域が明らかになる可能性がある。【０１１６】
図１５の（ａ）はＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡの結果を表し、８Ｃ１８７−１によるペプチド認識の結果を表している。図１５の（ａ）に示すように、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の４５−６０位のアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチド４５−６０）または４９−６４位のアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチド４９−６４）を用いてＣＤ８陽性Ｔ細胞（８Ｃ１８７−１）を刺激すると、ＩＦＮ−γの産生がみられた。このことから、症例ＫＬＵ１８７から樹立したクローンＴ細胞（８Ｃ１８７−１）は、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の４５−６０位および４９−６４位のアミノ酸配列を認識していることが明らかになった。また、図１５の（ｂ）は抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ｃｌａｓｓＩ抗体、または抗ｃｌａｓｓＩＩ抗体を添加して、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡを行った結果を表している。図１５の（ｂ）に示すように、このＴ細胞は、ＣＤ８拘束性、ｃｌａｓｓＩ拘束性にペプチドを認識していることが明らかとなった。【０１１７】
さらに、ＣＤ８陽性Ｔ細胞がどの種類のＨＬＡによって提示されたペプチドを認識しているか検討するために、抗原提示細胞として様々な種類のＥＢＶ−Ｂ細胞を用い、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の４９−６４位のアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチド４９−６４）についてＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡを行った。結果を図１５の（ｃ）に示す。図１５の（ｃ）は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６に拘束されるＣＤ８陽性Ｔ細胞クローンがこのペプチドを認識することを示す。図１５の（ｃ）に示すように、抗原提示細胞として、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６を発現するＥＢＶ−Ｂ細胞（ＫＬＵ１８７の自己のＥＢＶ−Ｂ細胞およびＯＳ−ＰＯ７  ＥＢＶ−Ｂ細胞）を用いて、ＫＬＵ１８７の抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞からクローン化したＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（８Ｃ１８７−１）を刺激すると、ＸＡＧＥ−１ｂ特異的にＩＦＮ−γを産生する細胞が検出された。この結果から、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性のＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（８Ｃ１８７−１）は、ペプチド４９−６４を認識することが明らかになった。【０１１８】
さらに、ペプチド４５−６０および４９−６４について、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性のＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される最小エピトープ領域を決定するため、図１６に示す種々のペプチド（４８−６１、４９−６１，５０−６１、５１−６１、５２−６１、５３−６１、４９−６４、４８−６１、４８−６０、４８−５９、４８−５８、４８−５７および４８−５６）を合成し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡを行った。【０１１９】
結果を図１６に示す。図１６は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性のＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識されるＸＡＧＥ−１ｂ領域を示す図である。図１６の（ａ）および（ｂ）に示すように、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡの結果から、ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される最小エピトープは１１個のアミノ酸からなることが予想された。【０１２０】
血清中にはタンパク質分解酵素等が含まれているため、血清に含まれる様々な成分や酵素によってペプチドが修飾を受けることが考えられる。そこで、血清非存在下においても同様の検討を行った。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡの条件は、以下のとおりである：
ＫＬＵ１８７ ＣＤ８（８Ｃ１８７−１）  １×１０４個
ペプチド：ＸＡＧＥ−１ｂペプチド  各１μＭ。【０１２１】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡの結果を図３２に示す。図３２の（ｂ）に示すように、タンパク分解酵素などを含まない血清非存在下（ＡＩＭ−Ｖ）においてもＰ５０−６０が最も反応することから、エピトープ領域はやはりＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５０位−６０位であることが明らかになった。また、図３２の（ａ）に示す結果では、血清存在下（５％ＰＳ／ＡＩＭ−Ｖ）においては、あたかもエピトープがＰ５０−６１であるかのように思われるが、血清非存在下ではＰ５０−６１の反応は低下した。一方、血清非存在下においてもＰ５０−６０の反応は有意であった。この結果から、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５０位−６０位（配列番号１７）がエピトープであろうと推測された。【０１２２】
さらに、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６に提示されるエピトープ領域を決定するために、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６とＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２とのみを共有する非自己の抗原提示細胞（Ｍｉ−ＥＢＶ−Ｂ）を用いて、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡを行った。血清非存在下ではＴ細胞の反応が低下することが考えられた。このため、Ｔ細胞の活性を維持するために、ＡＩＭ−Ｖ培地にはＩＬ―２を添加した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡの条件は、以下のとおりである：
ＫＬＵ１８７ ＣＤ８（８Ｃ１８７−１）  １×１０４個
ペプチド：ＸＡＧＥ−１ｂペプチド  各１μＭ。【０１２３】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡの結果を図３３に示す。図３３に示すように、Ｐ５０−６０を用いて刺激するとＩＦＮ−γが産生されることから、このＣＤ８陽性Ｔ細胞クローンはＨＬＡ−Ａ＊０２０６上に提示されたＰ５０−６０を認識していると判断できる。図１５の（ｃ）に示したように、このＣＤ８陽性Ｔ細胞クローンは、（Ｏｋａｚａｋｉ ＥＢＶ−Ｂ）ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２によって提示されるペプチドは認識しないことが明らかになっている。このため、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６とＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２とのみを共有する抗原提示細胞（Ｍｉ−ＥＢＶ−Ｂ）において、ＣＤ８陽性Ｔ細胞クローンが認識しているのは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６によって提示されたペプチドであると証明することができた。【０１２４】
後述する図１８示すように、一般的にＣＤ８陽性Ｔ細胞に認識されるペプチドは、９個のアミノ酸からなるものが多い。そこで、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５０−６０位のアミノ酸を含む９〜１２個のアミノ酸からなるペプチド（Ｐ５０−６１、Ｐ５０−６０、Ｐ５１−６１およびＰ５１−６０）を作製し、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５０−６０位の１１個のアミノ酸配列が真に最小エピトープであるかを確認した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡの結果を図１６の（ｃ）に示す。【０１２５】
図１６の（ｃ）に示すように、血清非存在下において、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５０−６０位（配列番号１７）を含むペプチドによってＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激すると、ペプチドの濃度依存的にＩＦＮ−γ産生量が増加することが明らかになった。また、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５０−６０位のアミノ酸配列を有するペプチドによってＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激した場合は、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５０−６０位のアミノ酸配列を有するペプチドによってＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激した場合と比較して、ＩＦＮ−γ産生に与える効果が顕著であった。ペプチドが低濃度であってもＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応が維持されることから、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６によって提示されるペプチドは、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５０−６０位の１１個のアミノ酸配列であることが明らかになった。【０１２６】
さらに、ＫＬＵ１８７の抗原特異的Ｔ細胞からクローン化した別のＴ細胞クローン（８Ｃ１８７−２）の、ＣＤ８拘束性、ｃｌａｓｓＩ拘束性を確認したのち、同様の手法で最小エピトープを決定した。【０１２７】
図１７は、ペプチド４５−６０およびペプチド４９−６４がＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２拘束性のＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（８Ｃ１８７−２）によって認識されるペプチドであることを示す図である。図１７の（ａ）はＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡの結果を表し、８Ｃ１８７−２によるペプチド認識の結果を表している。図１７の（ｂ）は抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ｃｌａｓｓＩ抗体、または抗ｃｌａｓｓＩＩ抗体を添加して、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡを行った結果を表している。図１７の（ｃ）は、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２に拘束されるＣＤ８陽性Ｔ細胞クローンがこのペプチドを認識することを表している。【０１２８】
図１７に示すように、抗原提示細胞として、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２を発現するＥＢＶ−Ｂ細胞を用いて、ＫＬＵ１８７からクローン化したＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（８Ｃ１８７−２）を刺激すると、ＸＡＧＥ−１ｂ特異的なＩＦＮ−γの産生が検出された。この結果から、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２拘束性のＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（８Ｃ１８７−２）は、ペプチド４９−６４を認識することが明らかになった。【０１２９】
さらに、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２拘束性のＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（８Ｃ１８７−２）によって認識される最小エピトープ領域を決定するため、図１８に示す数種類のペプチド（５０−６１、５１−６１、５２−６１、５０−６０、５０−５９および５０−５８）を合成し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡを行った。【０１３０】
結果を図１８に示す。図１８は、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２拘束性のＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識されるＸＡＧＥ−１ｂ領域を示す図である。図１８の（ｃ）はＣＤ８陽性Ｔ細胞によって産生されるＩＦＮ−γ量がペプチドの濃度依存的に増加することを示す図である。【０１３１】
ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２拘束性のＴ細胞が認識するＸＡＧＥ−１ｂペプチド領域は、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５１−５９位（配列番号１８）であることが予想された。しかし、Ｐ５１−６１に対するＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応が非常に強いことから、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６とＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２とのみを共有する抗原提示細胞（Ｍｉ−ＥＢＶ−Ｂ）を用いて、図１８の（ｃ）に示す４種類のペプチド（５１−６１、５１−６０、５１−５９および５０−５９）の濃度によるＣＤ８陽性Ｔ細胞クローンの反応を調べた。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡの結果を図１８の（ｃ）に示す。【０１３２】
図１８の（ｃ）に示すように、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２拘束性のペプチドの最小単位であるＰ５１−５９を含み、且つＣ末端のアミノ酸を追加したＰ５１−６０またはＰ５１−６１を用いて刺激した場合は、Ｐ５１−５９によって刺激した場合と同様、ペプチドの濃度依存的にＩＦＮ−γ産生量が増加することが明らかになった。このことから、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２によって提示される最小エピトープは、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５１−５９位（配列番号１８）であることが証明された。ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２によって提示されるペプチド領域は複数個存在するが、コアになる部分はＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５０位のアミノ酸を含まない５１−５９位のアミノ酸配列（配列番号１８）であると考えられた。【０１３３】
図１９は、ペプチド２１−３６がＴ細胞クローン（８Ｃ１８７−４）によって認識されるペプチドであることを示す図である。図１９の（ａ）はＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡの結果を表し、８Ｃ１８７−４によるペプチド認識の結果を表している。図１９の（ｂ）は抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ｃｌａｓｓＩ抗体、または抗ｃｌａｓｓＩＩ抗体を添加して、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡを行った結果を表している。図１９の（ｃ）は、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０１に拘束されるＣＤ８陽性Ｔ細胞クローンがこのペプチドを認識することを表している。【０１３４】
図１９の（ｂ）はＫＬＵ１８７の抗原特異的Ｔ細胞からクローン化した別のＴ細胞クローン（８Ｃ１８７−４）の、ＣＤ８、ｃｌａｓｓＩ拘束性を確認したのち同様の手法で最小エピトープを決定した。図１９の（ｃ）に示すように、抗原提示細胞として、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０１を発現するＥＢＶ−Ｂ細胞を用いて、ＫＬＵ１８７からクローン化したＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（８Ｃ１８７−４）を刺激すると、ＸＡＧＥ−１ｂ特異的なＩＦＮ−γの産生が検出された。この結果から、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０１拘束性のＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（８Ｃ１８７−４）は、ペプチド２１−３６を認識することが明らかになった。【０１３５】
さらに、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０１拘束性のＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（８Ｃ１８７−４）によって認識される最小エピトープ領域を決定するため、図２０に示す複数のペプチド（１７−３２、２１−３６、１７−３１、１８−３１、１９−３１、２０−３１、２１−３１、２１−３０、２１−２９および２２−３２）を合成し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡを行った。【０１３６】
結果を図２０に示す。ＨＬＡ−Ｂ＊３５０１拘束性のＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（８Ｃ１８７−４）によって認識される最小エピトープ領域は、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の２１位−２９位であることを同定した。【０１３７】
図２１は、ペプチド２１−３６がＴ細胞クローン（８Ｃ２３７−２２）によって認識されるペプチドであることを示す図である。図２１の（ａ）はＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡの結果を表し、８Ｃ２３７−２２によるペプチド認識の結果を表している。図２１の（ｂ）は抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ｃｌａｓｓＩ抗体、または抗ｃｌａｓｓＩＩ抗体を添加して、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡを行った結果を表している。図２１の（ｃ）は、ＨＬＡ−Ｂ＊４００２に拘束されるＣＤ８陽性Ｔ細胞クローンがこのペプチドを認識することを表している。【０１３８】
図２１の（ｂ）は、ＫＬＵ２３７の抗原特異的Ｔ細胞からクローン化した別のＴ細胞クローン（８Ｃ２３７−２２）の、ＣＤ８拘束性、ｃｌａｓｓＩ拘束性を確認したのちに、同様の手法で最小エピトープを決定した。図２１の（ｃ）に示すように、抗原提示細胞として、ＨＬＡ−Ｂ＊４００２を発現するＥＢＶ−Ｂ細胞を用いて、ＫＬＵ１８７からクローン化したＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（８Ｃ２３７−２２）を刺激すると、ＸＡＧＥ−１ｂ特異的なＩＦＮ−γの産生が検出された。この結果から、ＨＬＡ−Ｂ＊４００２拘束性のＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（８Ｃ２３７−２２）は、ペプチド２１−３６を認識することが明らかになった。【０１３９】
さらに、ＨＬＡ−Ｂ＊４００２拘束性のＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（８Ｃ２３７−２２）によって認識される最小エピトープ領域を決定するため、図２２に示す数類のペプチド（１７−３２、２１−３６、１７−３１、１８−３１、１９−３１、２０−３１、２１−３１、２１−３０、２１−２９および２２−３２）を合成し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡを行った。【０１４０】
結果を図２２に示す。ＨＬＡ−Ｂ＊４００２拘束性のＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（８Ｃ２３７−２２）によって認識される最小エピトープ領域は、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の２１位−２９位（配列番号１５）であることを同定した。【０１４１】
図２３は、樹立したＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞（４Ｃ１８７−１）は、ＸＡＧＥ−１ｂタンパク質、ＸＡＧＥ−１ｂプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のライセートおよび自己肺癌組織のライセートのそれぞれを貪食させた自己樹状細胞を用いて刺激した結果、抗原特異的ＩＦＮ−γ産生反応を示したことを示す。【０１４２】
図２４は、ＨＬＡ−Ｂ＊３５拘束性のＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（８Ｃ１８７−４）は、ＸＡＧＥ−１ｂタンパク質、５種類の２５ｍｅｒのＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチド（具体的なアミノ酸配列は図２６を参照）を貪食させた自己樹状細胞で刺激した結果、抗原特異的ＩＦＮ−γ産生反応を示したことを示す。また、２５ｍｅｒの長鎖ペプチドを用いることによって樹立したＴ細胞が反応しうることを証明したことは、のちに解説する長鎖ペプチドの有用性を証明している。また図２４の（ｂ）は、８Ｃ１８７−４は、ＸＡＧＥ−１ｂのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトしたＢ＊３５０１陽性の腫瘍細胞を特異的に認識していることを示す。【０１４３】
図２４に示すように、抗ＸＡＧＥ−１ｂ抗体陽性患者より得られたＴ細胞が自然エピトープペプチドを認識し、抗原陽性の腫瘍細胞に特異的な細胞傷害活性を有することが明らかになった。このことは、ＸＡＧＥ−１ｂが強い免疫原性を有し、非小細胞肺癌患者において、ＸＡＧＥ−１ｂを標的としたがんワクチン療法が有用であることを示唆している。【０１４４】
ＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性クローンＴ細胞の誘導は、世界的にも誰も成功しておらず、本発明者等が初めて成功した。また、ＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するペプチド領域も明らかではなかったが、本発明によって初めて明らかになった。【０１４５】
さらに、ＸＡＧＥ−１ｂに対する特異的免疫反応の誘導するために必要とされる抗原とＣＤ８陽性Ｔ細胞との反応時間について検討した。図２５は、抗原と細胞との反応時間に応じた、ＸＡＧＥ−１ｂに対する特異的免疫反応の誘導を示す図である。図２５の（ａ）はＩＬ−２およびＩＬ−７存在下、（ｂ）および（ｃ）はＩＬ−７およびＩＬ−１５存在下における結果を表している。また、（ｂ）はＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチドによって刺激したＥＢＶ−Ｂ細胞と共培養８時間後に、ＸＡＧＥ−１ｂ特異的にＩＦＮ−γを産生するＣＤ８陽性Ｔ細胞が誘導されることを示す図である。（ｃ）は抗原特異的Ｔ細胞クローンにおいても同様に８時間の共培養で反応が得られたことを示す。図２５の（ａ）〜（ｃ）のそれぞれのＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡの条件は、以下のとおりである：
図２５の（ａ）
Ｅｆｆｅｃｔｏｒ：ＫＬＵ１８７ ＣＤ８  １×１０４個
Ｔａｒｇｅｔ：ＫＬＵ１８７ ＥＢＶ−Ｂ（自己）  ２×１０３個
ペプチド：ＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチド  １μｇ／ｍｌ
３回刺激培養後（ＩＶＳ×３）
図２５の（ｂ）
Ｅｆｆｅｃｔｏｒ：ＫＬＵ１８７ ＣＤ８  １×１０４個
Ｔａｒｇｅｔ：ＫＬＵ１８７ ＥＢＶ−Ｂ（自己）  １×１０４個
ペプチド：ＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチド  １μｇ／ｍｌ
図２５の（ｃ）
Ｅｆｆｅｃｔｏｒ：ＫＬＵ１８７  ＣＤ８クローン  ８Ｃ１８７−１  １×１０４個
Ｔａｒｇｅｔ：ＫＬＵ１８７ ＥＢＶ−Ｂ（自己）  ２×１０３個
ペプチド：ＸＡＧＥ−１ｂオーバーラップペプチド  １μｇ／ｍｌ
３回刺激培養後（ＩＶＳ×３）。【０１４６】
図２５に示すように、ＩＬ−１５を添加することによってＣＤ８陽性Ｔ細胞をさらに活性化したり抗原提示能力を増強したりしたとしても、ワクチン未施行のがん患者においてＸＡＧＥ−１ｂ特異的な細胞免疫を誘導するには、抗原とＣＤ８陽性Ｔ細胞との反応時間を８時間程度に設定する必要があることが明らかになった。【０１４７】
公知のＣＴ抗原であるＮＹ−ＥＳＯ−１についても、刺激培養後のＣＤ８陽性Ｔ細胞と同数のＮＹ−ＥＳＯ−１オーバーラップペプチドでパルスあるいは非パルスの自己のＥＢＶ−Ｂ細胞とを、３７℃で４時間、ＣＯ２インキュベーター内で反応させてＩＦＮ−γキャッチアッセイを行い、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞の検出が可能であることを確認した（図示しない）。【０１４８】
このような抗原とＣＤ８陽性Ｔ細胞との反応時間の違いは、ペプチドの構造やＸＡＧＥ−１ｂの抗原性など様々な要因が推測されるが、種々のがん抗原に対するＴ細胞の反応機序の違いも考えられる。【０１４９】
＜まとめ＞
〔結論〕
〔１：液性免疫反応〕
非小細胞肺癌患者２００例について、がん精巣抗原の一つであるＸＡＧＥ−１ｂに対する免疫反応を詳細に検討した。その結果、
（１）：非小細胞肺癌全体で２０／２００（１０．０％）に抗体陽性例が認められた．
（２）：ｓｔａｇｅ３Ｂ／４の進行期肺腺癌に限定すると１３／６９（１８．８％）と高い頻度で抗体陽性例が認められた．
（３）：比較検討のためにＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体反応を検討した結果、肺癌全体で６．７％、ｓｔａｇｅ３／４の非小細胞肺癌では９．７％が抗体陽性であった．
（４）：以上より、ＸＡＧＥ−１ｂに対する抗体反応陽性率は、ＣＴ抗原の中でも高い免疫原性を有し、すでにワクチンの標的抗原として臨床試験も行われているＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体陽性率と比較できるものであり、肺癌患者に対するワクチンの標的抗原の候補となり得ることが判明した．
（５）：抗体が認識する部位は、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の２１−４８位（配列番号２）、５７―７２位（配列番号７）、６５−８１位（配列番号８）の３領域であることを明らかにした．
（６）：さらに抗体検出感度を上げることにより、肺癌診断に応用可能である。【０１５０】
〔２：細胞性免疫反応〕
ＸＡＧＥ−１ｂ特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞、およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の免疫反応をさらに検討した結果、
（１）：血清抗体価陽性患者１６名の検討で、１４名（８７．５％）でＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞の検出に成功した．
（２）：特異的な反応が見られた、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が認識する部位は、ＣＤ４が認識する領域は、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の１３−３６位（配列番号９）、２９−４８位（配列番号１２）、５３−６８位（配列番号１３）であり、さらに主要な部位は１３−２８位（配列番号１０）および３３−４８位（配列番号６）であることを明らかにした．
（３）：さらにＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導にも成功し、その検出法を確立した．
（４）：血清抗体価陽性患者６例の検討で、４例（６６．７％）でＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の検出に成功した．
（５）：特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性のエピトープ領域はＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５０−６０位（配列番号１７）であり、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２拘束性のエピトープ領域はＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５１−５９位（配列番号１８）であることを明らかにした。また、特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するＨＬＡ−Ｂ＊３５０１拘束性のエピトープ領域および特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するＨＬＡ−Ｂ＊４００２拘束性のエピトープ領域はＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の２１−２９位（配列番号１５）であることを明らかにした．
（６）：特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するエピトープ領域を同定したことは、これらの領域を含むペプチドは、がん・ペプチドワクチンの候補となり、より効率に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導出来得る。【０１５１】
〔考察〕
本発明において、
（１）：肺癌患者におけるＸＡＧＥ−１ｂに対する特異的な液性、細胞性免疫応答を確認した．
（２）：ＸＡＧＥ−１ｂ抗体陽性例は非小細胞肺癌全体で２０／２００例（１０．０％）、進行期（Ｓｔａｇｅ３Ｂ／４）肺腺癌に限れば１３／６９例（１８．８％）で液性免疫が誘導されている．
（３）：抗ＸＡＧＥ−１ｂ抗体の認識部位は、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の２１−４８位（配列番号２）、５７−７２位（配列番号７）、６５−８１位（配列番号８）の３領域であった．
（４）：ＸＡＧＥ−１ｂに対する特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞は１４／１６例（８７．５％）で誘導され、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が認識する部位は、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の１３−３６位（配列番号９）、２９−４８位（配列番号１２）、５３−６８位（配列番号１３）であり、さらに主要な部位は１３−２８位（配列番号１０）および３３−４８位（配列番号６）である．
（５）ＸＡＧＥ−１ｂに対する特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞は４／６例（６６．７％）で誘導され、ＣＤ８が認識する領域は、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の９−２４位（配列番号１４）、２１−３６位（配列番号３）、２９−４４位（配列番号５）、４９−６４位（配列番号１６）である．
（６）：特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の反応はＮＹ−ＥＳＯ−１などと比べ、反応時間を要し、従来の検出法では困難を要する．
（７）：ＸＡＧＥ−１ｂに対するＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性の特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するペプチド領域はＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５０−６０位（配列番号１７）である．
（８）：ＸＡＧＥ−１ｂに対するＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２拘束性の特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するペプチド領域はＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５１−５９位（配列番号１８）である．
（９）：ＸＡＧＥ−１ｂに対するＨＬＡ−Ｂ＊３５０１拘束性の特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞およびＸＡＧＥ−１ｂに対するＨＬＡ−Ｂ＊４００２拘束性の特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するペプチド領域は、ＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の２１−２９位（配列番号１５）である．
（１０）：ＸＡＧＥ−１ｂ特異的抗体が認識する部位を明らかにしたことは、肺癌診断に応用可能である．
（１１）：ＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識する領域を明らかにしたことは、同領域を含むペプチドが、がんワクチン療法のペプチド（抗原）候補となる．
（１２）：ＸＡＧＥ−１ｂ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識する領域を明らかにしたことは、同部位が細胞傷害性Ｔ細胞を誘導できうる免疫原生の強いペプチドであり、がんワクチン療法を含む、がん治療に応用可能である。【０１５２】
〔実施例２〕
実施例２では、ＸＡＧＥ−１ｂの長鎖ペプチドを作製した。図２６は、ＸＡＧＥ−１ｂの長鎖ペプチドのアミノ酸配列を示す図である。図２６に示すように、実施例２で作製したＸＡＧＥ−１ｂの長鎖ペプチドは、８１個のアミノ酸からなるＸＡＧＥ−１ｂの全長をカバーするように設計された、２５個のアミノ酸からなる以下の５種類のペプチドである．
ペプチド１−２５（配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）
ペプチド１５−３９（配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）
ペプチド２９−５３（配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）
ペプチド４３−６７（配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）
ペプチド５７−８１（配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）。【０１５３】
ここで、ＸＡＧＥ−１ｂと同じがん精巣抗原であるＮＹ−ＥＳＯ−１を標的としたペプチドワクチンの解析結果を示す。【０１５４】
ＮＹ−ＥＳＯ−１ワクチンに関しては、タンパク質（ＮＹ−ＥＳＯ−１全長ペプチド）ワクチンが既に施行されている。しかし、ＮＹ−ＥＳＯ−１のタンパク質ワクチンは、
（ｉ）非常にコストがかかる、
（ｉｉ）タンパク質は非常に大きな物質であるので、適切なアジュバント（免疫賦活剤）を使用しなければ抗原提示細胞に貪食されにくい、および
（ｉｉｉ）外来物質であるため、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に対して充分に抗原提示されにくい（ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩを介して抗原提示されにくい）、
と予想される。そこで、現在は、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の免疫原性の高い部位（特異的抗体、特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞、または特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識している頻度が高い部位）を予測して、その部位を含む長鎖ペプチドのワクチン（ＮＹ−ＳＯ−１ｆペプチドワクチン）が施行されている。【０１５５】
しかし、ｆペプチド（２０個のアミノ酸からなる長鎖ペプチド）をワクチンとして使用する場合に、
（Ａ）ｆペプチドが抗原提示され得るのか、および
（Ｂ）ｆペプチドワクチンはタンパク質ワクチンと同じ効果を奏するのか、
は不明であった。【０１５６】
そこで、まず、上記（Ａ）に関して検討を行った。具体的には、ヒト単球白血病株であるＵ９３７を用い、２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡを用いてプライミングしたＵ９３７を、ＦＡＭＴＭをコンジュゲイトしたＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチドを用いて培養した。Ｕ９３７におけるＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチドの局在は、蛍光色素であるＦＡＭＴＭの蛍光を観察することによって確認した。【０１５７】
結果を図２７に示す。図２７は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチドが、抗原提示細胞（Ｕ９３７）に取り込まれたことを示す図である。図２７のＷＧＡ（Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉ）は、細胞膜が染色されていることを示す。【０１５８】
図２７に示すように、培養３時間後に、ＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチドが細胞に取り込まれていることが確認された。この結果から、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質（ＮＹ−ＥＳＯ−１全長ペプチド）よりも短いＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチド（２０アミノ酸）は、抗原提示細胞に取り込まれ得ることが明らかになった。【０１５９】
また、ＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチドは、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩによって抗原提示されることが確認された（図２８）。具体的には、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞クローン（Ｅ−８Ａ１）について、抗原提示細胞として自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を用いて、ペプチドＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチド存在下において、４℃または３７℃の温度条件下でＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡを行った。【０１６０】
図２８は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチドは、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩによって抗原提示されることを示す図である。図２８の横軸の「E/T ratio」は、Effector（Ｔ細胞）とTarget（ＥＢＶ−Ｂ細胞）の共培養比率を表している。図２８に示すように、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩによるＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチドの提示は、温度の影響を受けることも明らかになった。この結果は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチドは、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩによって抗原提示されるが、ＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチドの取込みが低温によって阻害されることによって、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対する反応が低下することを示している。【０１６１】
さらに、ＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチドは、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩによっても抗原提示される、すなわちクロスプレゼンテーションされることが確認された（図２９）。具体的には、１μＭのＮＹ−ＥＳＯ−１９２−１００短鎖ペプチド、１μＭのＮＹ−ＥＳＯ−１９１−１１０ｆペプチドまたは１０μｇ／ｍｌの組換えタンパク質を含有している無血清ＡＩＭ−Ｖ培地中で、１０μＭのサイトカラシンＢの存在下または非存在下において、樹状細胞（５×１０５個／ｍｌ）を培養し、抗原をパルスした。細胞を洗浄した後に、ＣＤ８陽性Ｔ細胞クローン（ＴＫ−ｆ０１  ２Ｈ１０）（５×１０３個）を、それぞれの抗原でパルスした樹状細胞（５×１０３個）と３７℃において２４時間、共培養した。抗原刺激によるＩＦＮ−γの産生量はＥＬＩＳＡによって測定した。【０１６２】
図２９は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチドは、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩによって抗原提示されることを示す図である。図２９に示すように、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩによるＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチドの提示は、サイトカラシンＢの影響を受けることも明らかになった。この結果は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチドは、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩによって抗原提示されるが、ＮＹ−ＥＳＯ−１ｆペプチドの取込みがサイトカラシンＢによって阻害されることによって、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に対する反応が低下することを示している。【０１６３】
外来抗原（タンパク質およびペプチド）が抗原提示細胞に取り込まれた場合は、基本的にＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩ経路（ＣＤ４陽性Ｔ細胞の誘導に関与する経路）を介して抗原提示される。これに対して、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ経路（ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導に関与する経路）は内在性抗原を抗原提示するための経路である。しかし、外来抗原がＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ経路を介して抗原提示される場合がある。これは、クロスプレゼンテーションとして知られている。【０１６４】
ＮＹ−ＥＳＯ−１のｆペプチド（長鎖ペプチド）は、抗原提示細胞に取り込まれ、外来抗原を抗原提示するための本来の経路であるＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩ経路を介してＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化し得、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ経路を介してクロスプレゼンテーションされてＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化し得ることが確認された。また、図２９の結果は、適切なアジュバントを使用しなければ、タンパク質は、クロスプレゼンテーションによってＣＤ８陽性Ｔ細胞を充分に誘導できないことを示唆している。これらの結果は、長鎖ペプチドが、ワクチンとしてタンパク質と同様の機能を有することを証明するものである。【０１６５】
尚、短鎖ペプチドワクチン（ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ経路の場合、最小エピトープは、およそ９個〜１１個のアミノ酸からなる。例えば、東京大学、中村祐輔教授指導のワクチンなど）は、被験体のＨＬＡの種類に制限される。これに対して、タンパク質ワクチンは、抗原全長をカバーするので被験体のＨＬＡの種類を問わない。【０１６６】
具体的に説明すると、短鎖ペプチドワクチンは、特定のＨＬＡに拘束されるペプチドを使用するため、それ以外のＨＬＡ拘束性のＴ細胞は基本的には認識できない。例えば、ＸＡＧＥ−１ｂの場合、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２拘束性のエピトープペプチドはＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５１−５９位に対応するアミノ酸配列を有するペプチド（配列番号１８で表される９個のアミノ酸からなるペプチド）である。しかし、この短鎖ペプチドワクチンは、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２拘束性の免疫を誘導することはできるが、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性の免疫を誘導することはできない。これは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性の最小エピトープはＸＡＧＥ−１ｂのアミノ酸配列の５０−６０位に対応するアミノ酸配列を有するペプチド（配列番号１７で表される１１個のアミノ酸からなるペプチド）であり、配列番号１８で表される９個のアミノ酸からなるペプチドでは短すぎるためである。このため、配列番号１８で表される９個のアミノ酸からなる短鎖ペプチドのワクチンは、Ｃｗ０１０２というＨＬＡを有する被験体にしか使用できない。【０１６７】
一方、例えば、配列番号１７で表される１１個のアミノ酸からなる短鎖ペプチドワクチンは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性の免疫を誘導することができる。さらに、この短鎖ペプチドワクチンは、抗原提示細胞に取り込まれ、適切に処理されて、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０１０２拘束性の免疫をも誘導し得る。つまり、特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞または特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞がそれぞれ認識する部位（可能ならばエピトープペプチド）を同定し、そして認識の頻度を調べることによって、タンパク質ワクチンと同様に被験体のＨＬＡの種類に関係なく、低コストで、且つ有効なワクチンとなり得る長鎖ペプチドを作製することができる。【０１６８】
図１３に示したように、ＸＡＧＥ−１ｂの解析では、特異的抗体、特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞、または特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識されるＸＡＧＥ−１ｂの部位には特異性がある傾向が認められるものの、特異的抗体、特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞、または特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識する部位は、ＸＡＧＥ−１ｂの全長にわたって存在する。このため、ＸＡＧＥ−１ｂの全長をカバーするように、複数の長鎖ペプチドを組み合わせて投与することによって、被験体のＨＬＡの種類を問わずＸＡＧＥ−１ｂワクチンを施行し得ると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
本発明は、がんの検査または診断、がん予防またはがん治療などに利用され得るものであり、がんを対象とした医学、医療の発展に寄与するだけでなく、臨床検査薬産業、試薬産業等において利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年4月22日(2011.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
以下の（ｆ）〜（ｌ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる、ペプチド（ただし、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３０：８３５−８４０，２００７およびＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５１（８），７５５−７６２，２００７に記載のペプチドを除く。）：
（ｆ）配列番号１の１５−３９位のアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号１の１５−３９位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の１７−３２位、２１−２９位または２１−３６位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列；
（ｈ）配列番号１の３３−４８位のアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号１の９−２４位のアミノ酸配列；
（ｊ）配列番号１の２９−４４位のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号１の４９−６４位のアミノ酸配列；および
（ｌ）配列番号１の４９−６４位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の５０−６０位または５１−５９位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列。
【請求項９】
以下の（ｆ）〜（ｌ）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含んでいることを特徴とする肺癌に対する細胞性免疫を誘導するための組成物：
（ｆ）配列番号１の１５−３９位のアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号１の１５−３９位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の１７−３２位、２１−２９位または２１−３６位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列；
（ｈ）配列番号１の３３−４８位のアミノ酸配列；
（ｉ）配列番号１の９−２４位のアミノ酸配列；
（ｊ）配列番号１の２９−４４位のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号１の４９−６４位のアミノ酸配列；および
（ｌ）配列番号１の４９−６４位のアミノ酸配列の部分配列であり、当該部分配列が、配列番号１の５０−６０位または５１−５９位のアミノ酸配列を含んでいる、アミノ酸配列。
【請求項１０】
上記肺癌が、非小細胞肺癌または肺腺癌であることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【国際調査報告】
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