(57)【要約】  植物成長促進剤として有用なフェニルアルキルコハク酸アミドの新たな製法の提供。  一般式（１）（式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルコキシ基又はアルキル基を示し、Ｒ3は水素原子又はカルボキシル基を示し、ｎは０〜３の数を示す）で表されるフェニルアルキルアミン類を含有する培地中で、フェニルアルキルコハク酸アミド合成能を有するバチルス・チューリンゲンシス又はバチルス・セレウスに属する微生物を培養することを特徴とする、一般式（２）（式中、Ｒ1、Ｒ2及びｎは前記と同じ）で表されるフェニルアルキルコハク酸アミド化合物又はその塩の製造法。2010079762.tif 0000142010079762.tif 000015
2010079762.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2010079762.tif 000012
（式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルコキシ基又はアルキル基を示し、Ｒ3は水素原子又はカルボキシル基を示し、ｎは０〜３の数を示す）
で表されるフェニルアルキルアミン類を含有する培地中で、フェニルアルキルコハク酸アミド合成能を有するバチルス・チューリンゲンシス又はバチルス・セレウスに属する微生物を培養することを特徴とする、一般式（２）
【化２】
2010079762.tif 000013
（式中、Ｒ1、Ｒ2及びｎは前記と同じ）
で表されるフェニルアルキルコハク酸アミド化合物又はその塩の製造法。
【請求項２】
Ｒ1及びＲ2がそれぞれ独立して水素原子又は水酸基であり、ｎが１である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
培地中にマンガンイオン（Ｍｎ2+）を１〜２０００ｐｐｍ含有せしめることを特徴とする請求項１又は２記載の製造法。
【請求項４】
培地中に有機酸又はその塩を含有せしめることを特徴とする請求項１〜３いずれかに記載の製造法。
【請求項５】
請求項１記載の一般式（１）で表されるフェニルアルキルアミン類を生合成する植物体、その種子、該植物体栽培用水又は土壌に、フェニルアルキルコハク酸アミド合成能を有するバチルス属に属する微生物を施用し、一般式（２）で表されるフェニルアルキルコハク酸アミド化合物を生合成させることを特徴とする植物成長調整方法。
【請求項６】
バチルス属に属する微生物が、バチルス・チューリンゲンシス又はバチルス・セレウスに属する微生物である請求項５記載の方法。
【請求項７】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）Ｂ-３（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６８９）株又はバチルス・セレウス（Bacillus cereus）Ｂ−６（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６９０）株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物成長調整剤として有用なフェニルアルキルコハク酸アミド化合物の微生物を利用した製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発根促進活性が高く、植物の成長を促進する成分は、農業及び林業分野において強く望まれており、数多くの研究がなされている。そのような状況下、下記一般式（ａ）【０００３】
【化１】
2010079762.tif 000003
【０００４】
（式中、Ａｒは置換基を有していてもよいフェニル、ナフチル又はインドリル基を示し、ｎは０〜３の数を示す）
で表されるコハク酸アミド化合物又はその塩が優れた発根促進作用を有し、植物成長調整剤として有用であることが知られている（特許文献１及び２）。【０００５】
このコハク酸アミド化合物は特許文献１及び２記載のように化学合成によって得ることもできるが、Ｎ−(フェネチル)コハク酸アミドに限ってはバチルス属に属する微生物によっても生産されることが知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１−２５５６０７号公報
【特許文献２】特開２００１−１３９４０５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】副島ら１９９９．新規発根促進物質Ｎ−（フェネチル）コハク酸アミドの精製と単離．植物化学調節学会第３４回大会講演要旨集，７５−７６ページ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在、市場に流通している植物成長調整剤のほとんどは化学合成によって製造されているが、消費者の間には物質自体の安全性に疑念をもつ風潮も未だに強い。このことは、有機農産物や減農薬栽培農産物がもてはやされていることからも裏付けられる。この点を鑑みると、植物成長調整剤を含む農薬としては、天然由来のものが好ましく、化学合成により得られるものでなく、微生物によって生産されるものが望まれている。
しかしながら、微生物による生産法である前記非特許文献１の方法による生産は、Ｎ−(フェネチル)コハク酸アミドのみを０．８ｍｇ／Ｌ生産するものであり、生産物の化学種も単一でしかも生産量が低いため、工業的に満足できるものではなかった。
また、Ｎ−(フェネチル)コハク酸アミド以外のフェニルアルキルコハク酸アミド化合物類を微生物により製造する方法は知られていない。【０００９】
従って、本発明の課題は、植物成長促進剤として有用なフェニルアルキルコハク酸アミド化合物類の微生物による新たな製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで本発明者は、フェニルアルキルコハク酸アミド化合物の生産能を有する新たな微生物を探索したところ、バチルス・チューリンゲンシス及びバチルス・セレウスに属する微生物がフェニルアルキルカルボキシアミン類又はフェニルアルキルアミン類からフェニルアルキルコハク酸アミド化合物を効率良く生産することを見出し、本発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は、一般式（１）【００１２】
【化２】
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【００１３】
（式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルコキシ基又はアルキル基を示し、Ｒ3は水素原子又はカルボキシル基を示し、ｎは０〜３の数を示す）
で表されるフェニルアルキルアミン類を含有する培地中で、フェニルアルキルコハク酸アミド合成能を有するバチルス・チューリンゲンシス又はバチルス・セレウスに属する微生物を培養することを特徴とする、一般式（２）【００１４】
【化３】
2010079762.tif 000005
【００１５】
（式中、Ｒ1、Ｒ2及びｎは前記と同じ）
で表されるフェニルアルキルコハク酸アミド化合物又はその塩の製造法を提供するものである。【００１６】
また、本発明は、上記の一般式（１）で表されるフェニルアルキルアミン類を生合成する植物体、その種子、該植物体栽培用水又は土壌に、フェニルアルキルコハク酸アミド合成能を有するバチルス属に属する微生物を施用し、一般式（２）で表されるフェニルアルキルコハク酸アミド化合物を生合成させることを特徴とする植物成長調整方法を提供するものである。【００１７】
さらに、本発明は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）Ｂ−３（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６８９）株又はバチルス・セレウス（Bacillus cereus）Ｂ−６（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６９０）株を提供するものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明方法によれば、バチルス・チューリンゲンシス又はバチルス・セレウス属に属する微生物の培養により、植物成長調整剤として有用なフェニルアルキルコハク酸アミド化合物又はその塩が、従来のバチルス属微生物を用いた方法の数倍もの高収率で得られる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書において、質量％とは(wt／vol)％を意味し、容量％とは(vol／vol)％を意味する。
【００２０】
本発明のフェニルアルキルコハク酸アミド化合物の製造法に用いられる微生物は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）及びバチルス・セレウス（Bacillus sereus）に属し、フェニルアルキルコハク酸アミド合成能を有するものであれば特に制限されないが、好適な具体例としては、バチルス・チューリンゲンシスＪＣＭ２０３８６株、同Ｂ−３（郵便番号292-0818 日本国 千葉県 木更津市 かずさ鎌足2-5-8（独）製品評価技術基板機構特許微生物寄託センター ＮＩＴＥ ＡＰ−６８９）株、同Ｂ−９株、同Ｂ−１０株；バチルス・セレウスＢ−５株、同Ｂ−６（ＮＩＴＥ ＡＰ−６９０）株、同Ｂ−７株、同Ｂ−８株、同Ｂ−１１株、同Ｂ−１２株、同Ｂ−１４株、同Ｂ−１５株等が挙げられる。
なお、寄託日は平成２０年（２００８）年１２月５日である。
このうち、フェニルアルキルコハク酸アミド合成能の点で、バチルス・チューリンゲンシスＪＣＭ２０３８６株、同Ｂ−３株、同Ｂ−９株、同Ｂ−１０株；バチルス・セレウスＢ−５株、同Ｂ−６株、同Ｂ−７株、同Ｂ−８株、同Ｂ−１１株、同Ｂ−１４株、同Ｂ−１５株が好ましく、バチルス・チューリンゲンシスＪＣＭ２０３８６株、同Ｂ−９株、同Ｂ−１０株；バチルス・セレウスＢ−５株、同Ｂ−６株、同Ｂ−７株、同Ｂ−８株、同Ｂ−１１株、同Ｂ−１４株、同Ｂ−１５株がより好ましく、バチルス・チューリンゲンシスＪＣＭ２０３８６株；バチルス・セレウスＢ−６株、同Ｂ−７株、同Ｂ−１５株がさらに好ましい。
上記のうちバチルス・チューリンゲンシスＪＣＭ２０３８６株は独立行政法人  理化学研究所から購入できる菌株である。またその他の菌株は、土壌から分離されたものである。
【００２１】
これらの微生物を用いて一般式（２）のフェニルアルキルコハク酸アミド化合物又はその塩を製造するには、培地中に一般式（１）で表されるフェニルアルキルアミン類を添加する。
【００２２】
Ｒ1及びＲ2としては、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基が挙げられる。ここでＣ1-6アルキル基としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基等が挙げられる。Ｃ1-6アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、イソプロピルオキシ基等が挙げられる。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
【００２３】
一般式（１）及び（２）中、ｎは０〜３の数を示すが、０〜２、特に１が好ましい。
【００２４】
一般式（１）及び（２）中、Ｒ1及びＲ2としては水素原子、水酸基が特に好ましく、ｎは１が特に好ましい。
【００２５】
フェニルアルキルアミン類（１）としては、フェニルアルキルアミン（Ｒ3＝Ｈ）でもよいし、フェニルアルキルカルボキシアミン（Ｒ3＝ＣＯＯＨ）でもよいが、フェネチルアミン（Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝１、Ｒ3＝Ｈ）、フェニルアラニン（Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝１、Ｒ3＝ＣＯＯＨ）又はチラミン（Ｒ1＝ＯＨ、Ｒ2＝Ｈ、ｎ＝１、Ｒ3＝Ｈ若しくはＲ1＝Ｈ、Ｒ2＝ＯＨ、ｎ＝１、Ｒ3＝Ｈ）、あるいはこれらを併用するのが収率向上の点で特に好ましい。
【００２６】
培地中のフェニルアルキルアミン類（１）の濃度は、フェニルアルキルコハク酸アミド化合物の生産性の点から０．００１〜１０質量％、さらに０．００１〜５質量％、特に０．０１〜５質量％が好ましい。
また、培地中のフェニルアルキルアミン類（１）が液体の場合の濃度は、フェニルアルキルコハク酸アミド化合物の生産性の点から０．００１〜１０容量％、さらに０．００１〜５容量％、特に０．０１〜５容量％が好ましい。また、当該フェニルアルキルアミン類（１）は、反応系に一括又は連続的に加えることができる。
【００２７】
培地中にはマンガンイオン（Ｍｎ2+）を含有させることによりフェニルアルキルコハク酸アミド化合物をさらに効率よく生産させることができる。マンガンイオンを添加する場合は硫酸マンガン、塩酸マンガン、炭酸マンガン、ＥＤＴＡマンガン等いずれでも可能であり、これらを１種又は２種以上用いることができるが、硫酸マンガンが特に好ましい。
培地中の含有量はマンガンイオン（Ｍｎ2+）として、１〜２０００ｐｐｍが好ましく、１〜１０００ｐｐｍがより好ましく、２〜１００ｐｐｍが特に好ましい。なお、マンガンイオン（Ｍｎ2+）は、反応系に一括又は連続的に加えることができる。
【００２８】
また、培地中には有機酸又はその塩を含有させることによりフェニルアルキルコハク酸アミド化合物をさらに効率よく生産させることができる。有機酸としてはリンゴ酸、フマル酸、コハク酸、クエン酸、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、オキサロ酢酸等が挙げられ、これらを１種又は２種以上用いることができる。このうち、フェニルアルキルコハク酸アミド化合物産生効率の点で、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸が好ましく、Ｌ−リンゴ酸、Ｄ−リンゴ酸、フマル酸がより好ましく、Ｄ−リンゴ酸が特に好ましい。
これらの有機酸の培地中の濃度は０．１〜１０質量％が好ましく、０．２〜１質量％がより好ましい。なお、これらの有機酸は、反応系に一括又は連続的に加えることができる。
【００２９】
本発明の製造法において、前記微生物の培養は、フェニルアルキルアミン類（１）、必要によりマンガンイオンや有機酸又はその塩を培地に添加する以外は、通常のバチルス属微生物が増殖する条件で行えばよい。
培地には、バチルス属微生物の増殖に必要な炭素源、窒素源、ビタミン源、ミネラル源等を添加するのが好ましい。炭素源としては、グルコース、水飴、可溶性デンプンなどが用いられる。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カゼイン、カゼイン消化物、肉エキス、コーンスチープリカー、アミノ酸液、大豆粕、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を用いることができるが、フェニルアラニン含量の高いカゼイン、カゼイン消化物、酵母エキス、コーンスチープリカー、大豆粕等が好ましいことは言うまでもない。ミネラル源としては、マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩などを用いることができる。
また、これらを総合的に含有する培地としては、チーズホエイ、大豆ホエイ等を用いることができる。培養方法としては、液体培地を用いて、振盪培養、撹拌培養を行えばよい。
【００３０】
培養条件としては好気的条件で、８〜４５℃、ｐＨ３．２〜９．５が好ましい。培養時間は、２４〜７２０時間でよい。
【００３１】
前記培養により、培養液中にフェニルアルキルコハク酸アミド化合物（２）又はその塩が蓄積するので、常法によりフェニルアルキルコハク酸アミド化合物（２）又はその塩を採取すればよい。この培養液は、そのまま植物成長調整剤や肥料として用いることもできるが、当該培養液からフェニルアルキルコハク酸アミド化合物（２）又はその塩を精製してもよい。精製法としては、培養液の濃縮、沈殿化、有機溶媒による抽出、各種クロマトグラフィー等を採用することができる。なお、この培養液には植物成長調整作用をもつフェニル酢酸やインドール酢酸が含まれる場合がある（Kimら２００４.Current Microbiology誌４８巻３１２−３１７ページ及びWillkinsonら１９９４.Plant and Soil誌159巻２９１−２９５ページ）。その場合は、目的に応じて混合物のまま使用してもよいし、それぞれを分取して使用しても良い。
【００３２】
また、植物は一般にフェニルアラニンを生合成でき、トマトなど一部の植物ではフェネチルアミンも生合成することが証明されている（Tiemanら２００６．Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America誌１０３巻８２８７−８２９２ページ）。そしてそれらの一部は植物体表面、特に根面から分泌されていることが知られている。このため、これらの植物体、その種子、該植物体栽培用水又は土壌に、当該微生物株を施用又は接種すれば、植物体内乃至植物体表面でフェニルアルキルコハク酸アミドを生合成するので、植物の成長調節が可能になる。
具体的には、接種源としては、当該菌株を通常のバチルス属微生物が増殖する条件で培養することによって得られた菌体及び／又は芽胞を含む培養液そのものや、遠心分離・膜分離などによって菌体及び／又は芽胞を濃縮したもの、あるいはさらに菌体及び／又は芽胞を水又は通常用いられる緩衝液で洗浄したものを用いることができる。これらの接種源はそのまま使用することもできるし、その乾燥物、凍結乾燥物を使用することもできる。また、ベントナイト、ゼオライト、クレーなどの無機物質担体、ピートモス、活性炭などの有機物担体に保持させて使用することもできる。
接種する対象としては植物体全般、水、土壌に使用することができるが、当該化合物の発根促進活性が高いことを利用する場合は、種子、根、挿し木の切り口断面などが好ましい。接種濃度としては接種源１ｇあたり菌数が１×１０4〜１×１０11個となるようにした上で接種すればよい。
【実施例】
【００３３】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００３４】
実施例１
３Ｌ容ジャーに１容量％フェネチルアミンを添加し、オートクレーブ滅菌したＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製、以下ＮＢ）を２．５Ｌ×３本添加し、あらかじめＮＢで前培養したBacillus thuringiensis Ｂ−３株（北海道別海町土壌由来、（独）製品評価技術基板機構特許微生物寄託センター受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６８９）を接種した。温度２７℃、撹拌回転数１００rpmで１０日間ジャーファーメンター（ＴＳ−Ｍ３Ｌ型ミニジャーファーメンターシステム、株式会社  高杉製作所製）を用い、培養した。【００３５】
得られた培養液は以下の通り粗精製した。培養液を６，５００rpm、３０分で遠心分離し、上澄みを塩酸でpH３．０に調整した。別途、スチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着樹脂ダイヤイオンＨＰ−２０をメタノールで洗浄した後、カラム（内径４５０mm×長さ５５０mm）に充填し、pH３．０酢酸水を通液して調整した。本カラムに上記上澄み液を流すことによって、Ｎ−フェネチルコハク酸アミド（以下ＰＥＳＡ）を吸着した。カラムは１０容量％イソプロパノール１Ｌで洗浄した後、３０容量％イソプロパノール１ＬでＰＥＳＡを溶出した。溶出液はエバポレータで約５００mLに濃縮し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH８．０に調整して、酢酸エチルで３回抽出を行い、酢酸エチル層は棄却した。残った水相は塩酸を用いてpH２．５とし、酢酸エチル抽出を３回行った。得られた酢酸エチル層は無水硫酸マグネシウムを用いて脱水した後、溶媒を減圧下で除去した。残渣は少量の１Ｎ酢酸水で溶解し、別途メタノールで洗浄後、１Ｎ酢酸水を通液して調整したSepPak  Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）に通過させることにより、ＰＥＳＡを吸着した。カートリッジは６０容量％メタノール２０mLで溶出し、溶出液は減圧下、乾固した。【００３６】
このサンプルはＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ Ｐａｃｋ Ｃ８内径２０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５５容量％メタノール；流速、６．０mL／分）を用いて精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１９〜２５分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｈｅ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間８．５〜１１．５分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＯＤＳ-Ａ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１１．５〜１３．５分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、Ｐｏｌａｒ ＲＰ  内径１０mm×長さ２５０mm（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）；移動相、１容量％酢酸含有３０容量％アセトニトリル；流速、３．０mL／分）で精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１１〜１３分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、Ｆｕｓｉｏｎ ＲＰ  内径１０mm×長さ２５０mm（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）；移動相、１容量％酢酸含有３０容量％アセトニトリル；流速、３．０mL／分）で精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１１．５〜１３．５分）を単一ピークとして分取した。得られた画分は減圧下で濃縮後、五酸化二リン存在下、デシケータ内で減圧乾燥した結果、ＰＥＳＡの結晶６．２mgを得た。この結晶についてグリセロールを用いた質量分析（ＭＳ−ＦＡＢ）によって分析したところ、（Ｍ＋Ｈ）+が２２２として検出され、さらにＮａＣｌを添加して分析したところ（Ｍ＋Ｎａ）+が２４４として検出され、化学合成品と一致した。さらに、1Ｈ−ＮＭＲでの帰属も化学合成品と一致した（表１）。これらの結果から、本菌株は培養液中に０．８３mg／ＬのＰＥＳＡが生産されていたことが確認された。【００３７】
【表１】
2010079762.tif 000006
【００３８】
実施例２
５００mL容バッフル付き三角フラスコに０．１容量％フェネチルアミンを添加したＮＢを３００mL×２本準備し、オートクレーブ滅菌後、あらかじめＮＢで前培養したBacillus thuringiensis ＪＣＭ２０３８６株、同Ｂ−３株、同Ｂ−９株（北海道長沼町土壌由来）、同Ｂ−１０株（北海道別海町土壌由来）及びB. cereus Ｂ−５株（北海道由仁町土壌由来）、同Ｂ−６株（北海道別海町由来、（独）製品評価技術基板機構特許微生物寄託センター受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６９０）、同Ｂ−７株（北海道長沼町土壌由来）、同Ｂ−８株（北海道弟子屈町土壌由来）、同Ｂ−１１株（北海道弟子屈町土壌由来）、同Ｂ−１４株（北海道由仁町土壌由来）、同Ｂ−１５株（北海道長沼町土壌由来）をそれぞれ接種した。培養温度は２７℃とし、回転数８０rpmで１０日間振とう培養した。培養液はダイヤイオンＨＰ−２０カラムのサイズを内径２００mm×長さ３００mm、１０容量％イソプロパノールによる洗浄液量を５００mL、３０容量％イソプロパノールによる溶出液量を５００mLと変更した以外は実施例１と同様に粗精製を行った。【００３９】
なお、上記菌株中、土壌より分離した菌株については、以下の手順で１６ｓ  ｒＤＮＡ配列による遺伝子同定を行った。ＮＢにて３７℃・２日間、好気培養したＢ６株培養液から遠心分離で菌体を回収し、ＰｒｅｐＭａｎ  Ｕｌｔｒａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にてＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ溶液５μＬ、１６ｓ  ｒＤＮＡ内部配列より作成したプライマー８Ｆ（ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣ：配列番号１）及び１４９２Ｒ（ＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ：配列番号２）の１０pmol／μＬ溶液を各１μＬ、滅菌水５．５μＬ、Ｐｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａｒａ）１２．５μＬを０．２mLマイクロチューブにて混和し、ＧｅｎｅＡｍｐTM ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは９４℃・４分反応後、９４℃・３０秒、５０℃・３０秒、７２℃・１分を３５サイクル行い、最後に７２℃・５分反応した。ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて増幅物を精製し、増幅断片の部分シーケンス解析をＳＩＧＭＡ  Ｇｅｎｏｓｙｓに依頼した。解析された約７００ｂｐについて、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）ホームページ（http://fasta.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）にてＦＡＳＴＡ検索を行い、相同性が最も高かった菌種と同定した。【００４０】
粗精製したサンプルはＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｈｅ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間８．５〜１１．０分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ  ＯＤＳ−Ａ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）で精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１１．５〜１３．５分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、Ｐｏｌａｒ ＲＰ  内径１０mm×長さ２５０mm（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）；移動相、１容量％酢酸含有３０容量％アセトニトリル；流速、３．０mL／分）で分析した。ピークは１２．１分に認められ、これは化学合成したＰＥＳＡとほぼ一致した。このピークの紫外部吸光スペクトルを測定したところ、２５９nmに吸光極大が認められ、化学合成したＰＥＳＡと一致した。２６０nmで測定したピーク面積を化学合成したＰＥＳＡによって作成した検量線と比較し、培養液中から得られたＰＥＳＡ濃度を算出した。結果は表２に示した。この結果から、上記の菌株は培養液中に非特許文献１に記載されている０．８mg／Ｌを超えるＰＥＳＡ量を生産していたことが証明された。【００４１】
また、上記分析時にＢ−６（ＮＩＴＥ  ＡＰ−６９０）株の培養液についてはＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１１−１３分）を分取し、さらにＨＰＬＣ（カラム、Ｐｕｒｅｓｉｌ Ｃ１８  内径４．６mm×長さ２５０mm（Ｗａｔｅｒｓ社製）；カラム温度、４０℃；移動相、１容量％酢酸含有２５容量％アセトニトリル；流速、０．８mL／分）で精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１１．５〜１３．５分）を分取した。得られた画分は実施例１と同様に減圧乾燥した結果、ＰＥＳＡの結晶３．２mgを得た。この結晶についてグリセロールを用いた質量分析（ＭＳ−ＦＡＢ）によって分析したところ、（Ｍ＋Ｈ）+が２２２として検出され、さらにＮａＣｌを添加して分析したところ（Ｍ＋Ｎａ
）+が２４４として検出され、化学合成品と一致した。さらに、1Ｈ−ＮＭＲでの帰属も化学合成品と一致した（表３）。【００４２】
【表２】
2010079762.tif 000007
【００４３】
【表３】
2010079762.tif 000008
【００４４】
実施例３
５００mL容バッフル付き三角フラスコに１質量％フェニルアラニンを添加したＮＢを３００mL×２本準備し、さらに硫酸マンガン（II）五水和物（和光純薬社製）を１０ppm（マンガンイオン濃度として２ppm）、３０ppm（同７ppm）、１００ppm（同２３ppm）、３００ppm（同６８ppm）それぞれ添加したものと無添加のものを調整し、オートクレーブ滅菌後、あらかじめＮＢで前培養したBacillus thuringiensisＢ−３株を接種した。培養温度は２７℃とし、回転数８０rpmで１０日間振とう培養した。培養液は実施例２と同様に粗精製を行った。
粗精製したサンプルはＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｈｅ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間８．５〜１１．０分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ  ＯＤＳ−Ａ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）で精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１１．５〜１４分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、Ｐｏｌａｒ ＲＰ  内径１０mm×長さ２５０mm（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）；移動相、１容量％酢酸含有３０容量％アセトニトリル；流速、３．０mL／分）で分析した。ピークは１２．０分に認められ、これは化学合成したＰＥＳＡとほぼ一致した。このピークの紫外部吸光スペクトルを測定したところ、２５９nmに吸光極大が認められ、化学合成したＰＥＳＡと一致した。２６０nmで測定したピーク面積を用いて実施例２と同様にＰＥＳＡ濃度を算出した。結果は表４に示した。この結果から、本菌株はフェニルアラニンからもＰＥＳＡを生産し、その生産量は培地中にマンガンを添加することで著しく向上することが証明された。【００４５】
【表４】
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【００４６】
実施例４
Bacillus thuringiensis Ｂ−３株（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６８９）をＮＢ１０mL中、２７℃、３日間培養し、培養液を１５，０００rpm、１０分遠心分離した。上澄を棄却した後、１０mLの滅菌水を加え、よく懸濁し、再度遠心分離することにより菌体の洗浄を行った。この洗浄をさらに２回繰り返したものに、滅菌水１０mLを加え、十分懸濁し、接種源とした。一方、トマト品種ハウス桃太郎（タキイ種苗）種子を８０容量％エタノールに1分浸漬し、ついで滅菌水で洗浄し、ついで１容量％次亜塩素酸ナトリウムに５分浸漬し、ついで滅菌水で２回洗浄することで種子消毒を行ったのち、あらかじめ滅菌したゲルライト（和光純薬社製）１質量％を含む培地表面に播種した。２７℃で３日間培養した後、発芽が確認された種子５粒を接種源に１０秒間浸漬した後、あらかじめゲルライト１質量％培地１００mLを外径４０mm×高さ１３０mmの植物培養試験管（旭テクノグラス社製）に入れて滅菌、固化したものに置床した（３反復）。蛍光灯による連続光下（２２００ルックス、２０℃）で１４日間栽培したのち、総根長をルートスキャナー（Ｃｏｍａｉｒ社製）で測定した。結果は表５に示した。Ｂ−３株の処理によって総根長が明らかに増加しているほか、目視による観察でも側根数の増加が認められた。【００４７】
【表５】
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【００４８】
実施例５
タンパク質濃縮ホエイパウダーＷＰＣ３４Ｃ（ホエイ中タンパク質を膜濃縮後、スプレードライ乾燥したもの；雪印乳業（株）製）３質量％、食塩（ＮａＣｌ）０．５質量％、リン酸水素二カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）０．２５質量％、ブドウ糖０．２５質量％、硫酸マンガン五水和物０．３質量％（マンガンイオン濃度として684ppm）を蒸留水に溶解したものをホエイタンパク質基礎培地とした。この基礎培地に、Ｌ−リンゴ酸０．３質量％、Ｄ−リンゴ酸０．３質量％、フマル酸０．３質量％をそれぞれ添加したものも調製し、すべてｐＨ ７．２とした。これらの培地は５００mL容バッフル付き三角フラスコ２本に３００ｍＬずつ添加した後、オートクレーブ滅菌後、あらかじめＮＢで前培養したBacillus thuringiensisＢ−３株を接種し、実施例３と同様に培養した。培養液については実施例２と同様に粗精製を行った。【００４９】
粗精製したサンプルはＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｐｈｅ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間７．５〜１０．５分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ  ＯＤＳ−Ａ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）で精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１１．５〜１３．５分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、Ｐｏｌａｒ ＲＰ  内径１０mm×長さ２５０mm（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）；移動相、１容量％酢酸含有３０容量％アセトニトリル；流速、３．０mL／分）で精製し、ＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１１〜１２．５分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、Ｐｕｒｅｓｉｌ  Ｃ１８ 内径４．６mm×長さ２５０mm（Ｗａｔｅｒｓ社製）；移動相、１容量％酢酸含有２５容量％アセトニトリル；流速、０．８mL／分）で分析した。ピークは１２．１分に認められ、これは化学合成したＰＥＳＡとほぼ一致した。２６０nmで測定したピーク面積を用いて実施例２と同様にＰＥＳＡ濃度を算出した。結果は表６に示した。この結果から、ホエイタンパク質といった天然物からもＰＥＳＡを生産することができることが証明された。【００５０】
【表６】
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【００５１】
実施例６
０．１容量％フェネチルアミンと硫酸マンガン五水和物０．３質量％（マンガンイオン濃度として684ppm）を添加したＮＢを３００mL調製し、ｐＨ６．８とした。これにＢ−３株を接種し、実施例２と同様に培養、粗精製を行い、実施例３と同様にＨＰＬＣによる精製、分析を行った。分析の結果、培養液中に２．１４４mg／ＬのＰＥＳＡが生産されていたことが確認された。【００５２】
実施例７
０．１容量％フェネチルアミンを０．１質量％チラミン（４−ヒドロキシフェネチルアミン）に置換し、菌株をＢ−３株及びＢ−６株のみとする以外は実施例２と同様にして、培養し、遠心分離後、ダイヤイオンＨＰ−２０カラムへの吸着を行った。
このカラムは１０容量％イソプロパノール５００mLでN-(4-水酸化フェネチル)コハク酸アミド（以下４ＨＰＥＳＡ）を溶出し、溶出液は実施例１と同様に溶媒抽出を行った。得られたサンプルは少量の１０容量％メタノールに溶解し、別途メタノールで洗浄後、１０容量％メタノールを通液して調整したSepPak ｔC18カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を通過させ、さらに１０容量％メタノール２０mLで溶出することにより精製した。【００５３】
上記粗精製したサンプルはＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ  ＯＤＳ−Ａ 内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有３０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、４ＨＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１３．５〜１６．５分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ  Ｐｈｅ 内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有３０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、４ＨＰＥＳＡ保持時間相当画分（保持時間１０〜１２．５分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＯＤＳ−Ａ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有２０容量％アセトニトリル；流速、３．０mL／分）で分析した。
ピークは９．５分に認められ、これは化学合成した４ＨＰＥＳＡとほぼ一致した。また、ピークの吸光極大は２７７nmと化学合成した４ＨＰＥＳＡと一致しており、２３５〜４００nmの吸光スペクトルも化学合成した４ＨＰＥＳＡとほぼ一致した。２８０nmで測定したピーク面積を用いて実施例２と同様に４ＨＰＥＳＡ濃度を算出した結果、Ｂ−３株は２５．９８６mg／Ｌ、Ｂ−６株は６．２７６mg／Ｌの４ＨＰＥＳＡを生産したことが明らかとなった。
このことから、Ｂ−３株又はＢ−６株によってチラミンを基質として対応するコハク酸アミド体を生産させることができることが明らかとなった。
すなわち、本法によれば、置換基を有する基質を選択することによって、Ｎ−(フェネチル)コハク酸アミド以外のフェニルアルキルコハク酸アミドを微生物的に製造できることが明らかとなった。
【配列表】
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【国際調査報告】
2010079762.tif 000016
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