(57)【要約】  有効成分として、ムスカリンレセプター活性化物質、好ましくは配列：ＸＸＸＰ（１番目のＸ＝Ｗ，Ｒ、２番目のＸ＝Ｙ，Ｈ，Ｒ、３番目のＸ＝Ｔ，Ｒ，Ｉ）で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体を含有するメラニン産生抑制剤又は美白化粧料を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムスカリンレセプター活性化物質を有効成分として含む、メラニン産生抑制剤。
【請求項２】
前記ムスカリンレセプター活性化物質が、配列番号２１で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である、請求項１に記載のメラニン産生抑制剤。
【請求項３】
前記ムスカリンレセプター活性化物質が、配列番号２２で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である、請求項１又は２に記載のメラニン産生抑制剤。
【請求項４】
前記ムスカリンレセプター活性化物質が、配列番号２３で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のメラニン産生抑制剤。
【請求項５】
配列番号２２又は２３で表されるアミノ酸配列が、配列番号８、配列番号１５、配列番号１９、又は配列番号２０である、請求項３又は４に記載のメラニン産生抑制剤。
【請求項６】
配列番号２１における１番目のアミノ酸Ｘ、配列番号２２における２番目のアミノ酸Ｘ、又は配列番号２３における３番目のアミノ酸Ｘが、Ｗである、請求項２〜４のいずれか一項に記載のメラニン産生抑制剤。
【請求項７】
ムスカリンレセプター活性化物質、又は請求項１〜６のいずれか一項に記載のメラニン産生抑制剤を含む、美白化粧料。
【請求項８】
ムスカリンレセプター活性化物質の、メラニン産生抑制剤又は美白化粧料を製造するための使用。
【請求項９】
前記ムスカリンレセプター活性化物質が、配列番号２１で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記ムスカリンレセプター活性化物質が、配列番号２２で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である、請求項８又は９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ムスカリンレセプター活性化物質が、配列番号２３で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
配列番号２２又は２３で表されるアミノ酸配列が、配列番号８、配列番号１５、配列番号１９、又は配列番号２０である、請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１３】
配列番号２１における１番目のアミノ酸Ｘ、配列番号２２における２番目のアミノ酸Ｘ、又は配列番号２３における３番目のアミノ酸Ｘが、Ｗである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
ムスカリンレセプター活性化物質を、メラニン産生抑制又は美白が必要な対象に、有効量で投与することを含む、メラニン産生抑制又は美白方法。
【請求項１５】
前記ムスカリンレセプター活性化物質が、配列番号２１で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ムスカリンレセプター活性化物質が、配列番号２２で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ムスカリンレセプター活性化物質が、配列番号２３で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
配列番号２２又は２３で表されるアミノ酸配列が、配列番号８、配列番号１５、配列番号１９、又は配列番号２０である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号２１における１番目のアミノ酸Ｘ、配列番号２２における２番目のアミノ酸Ｘ、又は配列番号２３における３番目のアミノ酸Ｘが、Ｗである、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号２１で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体を有効成分として含む、ムスカリンレセプター活性化剤。
【請求項２１】
前記有効成分が、配列番号２２で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である、請求項２０に記載のムスカリンレセプター活性化剤。
【請求項２２】
前記有効成分が、配列番号２３で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である、請求項２０に記載のムスカリンレセプター活性化剤。
【請求項２３】
配列番号２２又は２３で表されるアミノ酸配列が、配列番号８、配列番号１５、配列番号１９、又は配列番号２０である、請求項２１又は２２に記載のムスカリンレセプター活性化剤。
【請求項２４】
配列番号２１における１番目のアミノ酸Ｘ、配列番号２２における２番目のアミノ酸Ｘ、又は配列番号２３における３番目のアミノ酸Ｘが、Ｗである、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のムスカリンレセプター活性化剤。
【請求項２５】
配列番号２１で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体の、ムスカリンレセプター活性化剤を製造するための使用。
【請求項２６】
前記ペプチド又はその誘導体が、配列番号２２で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記ペプチド又はその誘導体が、配列番号２３で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２８】
配列番号２２又は２３で表されるアミノ酸配列が、配列番号８、配列番号１５、配列番号１９、又は配列番号２０である、請求項２６又は２７に記載の使用。
【請求項２９】
配列番号２１における１番目のアミノ酸Ｘ、配列番号２２における２番目のアミノ酸Ｘ、又は配列番号２３における３番目のアミノ酸Ｘが、Ｗである、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
配列番号２１で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体を、ムスカリンレセプター活性化が必要な対象に、有効量で投与することを含む、ムスカリンレセプター活性化方法。
【請求項３１】
前記ペプチド又はその誘導体が、配列番号２２で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ペプチド又はその誘導体が、配列番号２３で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
配列番号２２又は２３で表されるアミノ酸配列が、配列番号８、配列番号１５、配列番号１９、又は配列番号２０である、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
配列番号２１における１番目のアミノ酸Ｘ、配列番号２２における２番目のアミノ酸Ｘ、又は配列番号２３における３番目のアミノ酸Ｘが、Ｗである、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
配列番号２１〜２３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、構成アミノ酸数が１００以下である、ペプチド、又はその誘導体。
【請求項３６】
請求項３５に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３７】
請求項３６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニン産生抑制剤及び美白化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラニンの産生を抑制することで肌の美白を目的とした各種化粧品が販売されている。メラニン産生を抑制する物質として活性酸素を消去する抗酸化物質であるビタミンＣやカロテン、チロシナーゼ活性を抑制するコウジ酸やアルブチンなどがある。また様々な植物抽出物にもメラニン産生抑制効果があることが確認されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、新規のメラニン産生抑制剤及び美白化粧料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前記課題は、本発明による、ムスカリンレセプター活性化物質を有効成分として含む、メラニン産生抑制剤により解決することができる。
本発明のメラニン産生抑制剤の好ましい態様によれば、前記ムスカリンレセプター活性化物質が、配列番号２１（ＸＸＸＰ；１番目のＸ＝Ｗ，Ｒ、２番目のＸ＝Ｙ，Ｈ，Ｒ、３番目のＸ＝Ｔ，Ｒ，Ｉ）で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である。【０００５】
本発明のメラニン産生抑制剤の別の好ましい態様によれば、前記ムスカリンレセプター活性化物質が、配列番号２２（ＸＸＸＸＰ；１番目のＸ＝Ｔ，Ｌ，Ｈ，Ｆ，Ｓ、２番目のＸ＝Ｗ，Ｒ、３番目のＸ＝Ｙ，Ｈ，Ｒ、４番目のＸ＝Ｔ，Ｒ，Ｉ）で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である。
本発明のメラニン産生抑制剤の更に別の好ましい態様によれば、前記ムスカリンレセプター活性化物質が、配列番号２３（ＸＸＸＸＸＰ；１番目のＸ＝Ｙ，Ｆ、２番目のＸ＝Ｔ，Ｌ，Ｈ，Ｆ，Ｓ、３番目のＸ＝Ｗ，Ｒ、４番目のＸ＝Ｙ，Ｈ，Ｒ、５番目のＸ＝Ｔ，Ｒ，Ｉ）で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である。【０００６】
本発明のメラニン産生抑制剤の更に別の好ましい態様によれば、配列番号２２又は２３で表されるアミノ酸配列が、
ＹＴＷＹＴＰ（配列番号８）、
ＹＳＷＹＴＰ（配列番号１５）、
ＨＷＨＴＰ（配列番号１９）、又は
ＹＨＲＨＴＰ（配列番号２０）
である。
本発明のメラニン産生抑制剤の更に別の好ましい態様によれば、配列番号２１における１番目のアミノ酸Ｘ、配列番号２２における２番目のアミノ酸Ｘ、又は配列番号２３における３番目のアミノ酸Ｘが、Ｗである。【０００７】
また、本発明は、ムスカリンレセプター活性化物質を、あるいは、前記の本発明のメラニン産生抑制剤を含む、美白化粧料（又は美白剤）に関する。【０００８】
更に、本発明は、ムスカリンレセプター活性化物質（好ましくは配列番号２１で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体）を、メラニン産生抑制又は美白が必要な対象に、有効量で投与することを含む、メラニン産生抑制又は美白方法に関する。
また、本発明は、ムスカリンレセプター活性化物質（好ましくは配列番号２１で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体）の、メラニン産生抑制剤又は美白化粧料（又は美白剤）を製造するための使用に関する。【０００９】
また、本発明は、配列番号２１（ＸＸＸＰ；１番目のＸ＝Ｗ，Ｒ、２番目のＸ＝Ｙ，Ｈ，Ｒ、３番目のＸ＝Ｔ，Ｒ，Ｉ）で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体を有効成分として含む、ムスカリンレセプター活性化剤に関する。【００１０】
本発明のムスカリンレセプター活性化剤の好ましい態様によれば、前記有効成分が、配列番号２２（ＸＸＸＸＰ；１番目のＸ＝Ｔ，Ｌ，Ｈ，Ｆ，Ｓ、２番目のＸ＝Ｗ，Ｒ、３番目のＸ＝Ｙ，Ｈ，Ｒ、４番目のＸ＝Ｔ，Ｒ，Ｉ）で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である。
本発明のムスカリンレセプター活性化剤の別の好ましい態様によれば、前記有効成分が、配列番号２３（ＸＸＸＸＸＰ；１番目のＸ＝Ｙ，Ｆ、２番目のＸ＝Ｔ，Ｌ，Ｈ，Ｆ，Ｓ、３番目のＸ＝Ｗ，Ｒ、４番目のＸ＝Ｙ，Ｈ，Ｒ、５番目のＸ＝Ｔ，Ｒ，Ｉ）で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、又はその誘導体である。【００１１】
本発明のムスカリンレセプター活性化剤の更に別の好ましい態様によれば、配列番号２２又は２３で表されるアミノ酸配列が、
ＹＴＷＹＴＰ（配列番号８）、
ＹＳＷＹＴＰ（配列番号１５）、
ＨＷＨＴＰ（配列番号１９）、又は
ＹＨＲＨＴＰ（配列番号２０）
である。
本発明のムスカリンレセプター活性化剤の更に別の好ましい態様によれば、配列番号２１における１番目のアミノ酸Ｘ、配列番号２２における２番目のアミノ酸Ｘ、又は配列番号２３における３番目のアミノ酸Ｘが、Ｗである。【００１２】
また、本発明は、前記ペプチド又はその誘導体を、ムスカリンレセプター活性化が必要な対象に、有効量で投与することを含む、ムスカリンレセプター活性化方法に関する。
また、本発明は、前記ペプチド又はその誘導体の、ムスカリンレセプター活性化剤を製造するための使用に関する。【００１３】
また、本発明は、配列番号２１〜２３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、構成アミノ酸数が１００以下である、ペプチド、又はその誘導体に関する。
更に、本発明は、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、新規のメラニン産生抑制剤及び美白化粧料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｂ１６メラノーマにＭ２ＡＧ６ペプチドを添加したときのメラニン産生細胞数に与える影響を示すグラフである。
【図２】Ｂ１６Ｆ１０メラノーマにＭ２ＡＧ６ペプチドを添加したときのメラニン産生抑制効果を示すグラフである。
【図３】Ｂ１６Ｆ１０メラノーマにＭ２ＡＧ６Ｔペプチドを添加したときのメラニン産生抑制効果を示すグラフである。
【図４】Ｂ１６Ｆ１０メラノーマにカルバコールを添加したときのメラニン産生抑制効果を示すグラフである。
【図５】Ｂ１６Ｆ１０メラノーマにα−アルブチンを添加したときのメラニン産生抑制効果を示すグラフである。
【図６】１２ＡＡペプチド（配列番号１）の濃度を変化させた場合の、Ｍ２−Ｇｉ１ａ融合ポリペプチドへのＧＴＰ−Ｅｕの取り込み量の変化を示すグラフである。
【図７】公知アゴニスト（カルバコール）存在下において、Ｍ２ＡＧ６ペプチド（配列番号１の第３〜８番）の濃度を変化させた場合の、Ｍ２−Ｇｉ１ａ融合ポリペプチドへの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの取り込み量の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のメラニン産生抑制剤又は美白化粧料は、有効成分として、ムスカリンレセプター活性化物質、好ましくは、配列番号２１で表されるアミノ酸配列、若しくは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド、あるいはその誘導体を含む。
本発明において有効成分として好適に用いることのできる前記のペプチド又はその誘導体それ自体は、本発明者らが初めて見出した化合物であり、それらの配列と、前記ペプチドが有するムスカリンレセプターに対する活性化作用が、特願２００８−４４６４１号明細書に開示されている。また、本発明者は、今回、後述の実施例に具体的に示すように、前記ペプチドだけでなく、ムスカリンレセプターアゴニストとして公知のカルバコールも、メラニン産生抑制作用を示すことを初めて見出した。ムスカリンレセプターを活性化する物質がメラニン産生抑制作用を示すことは、本発明者の知る限り、これまで具体的に示された報告はなく、本発明は、このような新規知見に基づくものである。
【００１７】
以下、本発明において有効成分であるムスカリンレセプター活性化物質として用いることのできる前記ペプチド及びそれらの誘導体を総称して「ムスカリンレセプター活性化ペプチド」と称する。なお、本明細書における用語「ペプチド」には、オリゴペプチド及びポリペプチドの両方が含まれる。
【００１８】
本発明において有効成分として用いることのできるムスカリンレセプター活性化物質としては、種々の化合物がムスカリンレセプター活性化作用を示すことが知られており、例えば、カルバコール、アセチルコリン、ベタネコール、ピロカルピン等が公知である。
【００１９】
本明細書において「ムスカリンレセプター活性化作用」とは、ムスカリンレセプターに結合してアゴニスト活性を示す作用を意味する。前記ムスカリンレセプターには、各種哺乳動物、例えば、ヒト、ウマ、ヒツジ、ウサギ、モルモット、ヤギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、マウス等由来のムスカリンレセプターが含まれ、特に好ましくはヒトムスカリンレセプターである。また、前記ムスカリンレセプターには、ムスカリンレセプターの各種サブタイプ、すなわち、Ｍ１〜Ｍ５が含まれ、特に好ましくはＭ２である。
【００２０】
或るペプチドがムスカリンレセプター活性化作用を有するか否かは、公知方法により容易に判定することができる。例えば、ムスカリンレセプターを適当な担体（例えば、ＥＬＩＳＡプレート又はビーズ担体）に固定化し、前記ムスカリンレセプターへの結合の有無を分析する方法（例えば、後述の参考例１参照）、あるいは、ムスカリンレセプターとＧｉとの融合ポリペプチドを調製し、標識ＧＴＰの前記融合ポリペプチドへの取り込み量を測定する方法（例えば、後述の参考例２又は３参照）により、或るペプチドがムスカリンレセプター活性化作用を有するか否かを容易に判定することができる。
【００２１】
本発明において、ムスカリンレセプター活性化ペプチドを構成するアミノ酸残基数は、ムスカリンレセプター活性化作用を示す限り、特に限定されるものではないが、例えば、４〜１００個、好ましくは４〜５０個、より好ましくは４〜３０個、更に好ましくは４〜２０個、更に好ましくは４〜１２個、特に好ましくは４〜６個である。前記アミノ酸配列は、それ単独でムスカリンレセプター活性化作用を示すアミノ酸配列（基本配列）のみからなることもできるし、その繰り返し配列からなることもできる。繰り返し配列からなる場合には、１種類の基本配列のみの繰り返し配列であることもできるし、２種類以上の基本配列の組合せであることもできる。
【００２２】
本明細書において、「配列番号Ｘ（例えば、配列番号２１〜２３）で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド」には、例えば、
配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド；又は
配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド
が含まれる。
【００２３】
配列番号２１で表されるアミノ酸配列は、
ＸＸＸＰ（配列番号２１）
［配列中、１番目のアミノ酸ＸはＷ，Ｒ（好ましくはＷ）であり、２番目のアミノ酸ＸはＹ，Ｈ，Ｒであり、３番目のアミノ酸ＸはＴ，Ｒ，Ｉ（好ましくはＴ）である］
である。
【００２４】
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む配列としては、例えば、
ＸＸＸＸＰ（配列番号２２）
［配列中、１番目のアミノ酸ＸはＴ，Ｌ，Ｈ，Ｆ，Ｓであり、２番目のアミノ酸ＸはＷ，Ｒ（好ましくはＷ）であり、３番目のアミノ酸ＸはＹ，Ｈ，Ｒであり、４番目のアミノ酸ＸはＴ，Ｒ，Ｉ（好ましくはＴ）である］
ＸＸＸＸＸＰ（配列番号２３）
［配列中、１番目のアミノ酸ＸはＹ，Ｆ（好ましくはＹ）であり、２番目のアミノ酸ＸはＴ，Ｌ，Ｈ，Ｆ，Ｓであり、３番目のアミノ酸ＸはＷ，Ｒ（好ましくはＷ）であり、４番目のアミノ酸ＸはＹ，Ｈ，Ｒであり、５番目のアミノ酸ＸはＴ，Ｒ，Ｉ（好ましくはＴ）である］
を挙げることができる。
【００２５】
配列番号２１〜２３で表されるアミノ酸配列としては、例えば、
ＹＴＷＹＴＰ（配列番号８；配列番号１の第３〜８番のアミノ酸からなる配列）
ＹＬＷＨＴＰ（配列番号９；配列番号２の第３〜８番のアミノ酸からなる配列）
ＹＨＷＨＴＰ（配列番号１０；配列番号３の第１〜６番のアミノ酸からなる配列）
ＹＴＷＨＴＰ（配列番号１１；配列番号４の第１〜６番のアミノ酸からなる配列）
ＹＨＷＨＲＰ（配列番号１２；配列番号５の第１〜６番のアミノ酸からなる配列）
ＦＦＷＨＴＰ（配列番号１３；配列番号６の第７〜１２番のアミノ酸からなる配列）
ＦＦＷＲＴＰ（配列番号１４；配列番号７の第５〜１０番のアミノ酸からなる配列）
ＹＳＷＹＴＰ（配列番号１５）
ＹＬＷＨＩＰ（配列番号１７）
ＨＷＨＴＰ（配列番号１９）
ＹＨＲＨＴＰ（配列番号２０）
を挙げることができる。
【００２６】
「配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端（好ましくはＣ末端）に、適当なアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列からなり、且つムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド」において、Ｎ末端及び／又はＣ末端に付加することができる前記アミノ酸配列としては、例えば、リンカー配列、マーカー配列、ポリペプチド配列、又は別のムスカリンレセプター活性化ペプチド配列を挙げることができる。
【００２７】
前記リンカー配列としては、例えば、ペプチドを担体に担持させるための配列、例えば、チオール基を有するアミノ酸［例えば、システイン（Ｌ体システイン又はＤ体システイン）又はホモシステイン）又はアミノ基と反応しない官能基（例えば、マレイミド基）を側鎖に有するアミノ酸１個からなるリンカー配列、あるいは、少なくとも一方の末端が、チオール基を有するアミノ酸又はアミノ基と反応しない官能基を有するアミノ酸であるリンカー配列を挙げることができる。
【００２８】
前記マーカー配列としては、例えば、ペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
【００２９】
前記ポリペプチド配列としては、例えば、精製用ポリペプチド［例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の全部又は一部］、検出用ポリペプチド［例えば、ヘムアグルチニン又はβ−ガラクトシダーゼαペプチド（ＬａｃＺ  α）の全部又は一部］、又は発現用ポリペプチド（例えば、シグナル配列）などを挙げることができる。
【００３０】
「配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチド」において、欠失、置換、及び／又は付加することのできるアミノ酸の個数は、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜８個、更に好ましくは１〜６個、更に好ましくは１〜４個、更に好ましくは１〜３個、更に好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個である。
【００３１】
本明細書において、ペプチドの機能を維持するために置換されるアミノ酸は、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、以下に示すような各グループに属するアミノ酸は、そのグループ内で互いに似た性質を有するアミノ酸である。これらのアミノ酸をグループ内の他のアミノ酸に置換しても、タンパク質の本質的な機能は損なわれないことが多い。このようなアミノ酸の置換は、保存的置換と呼ばれ、ポリペプチドの機能を保持しつつアミノ酸配列を変換するための手法として公知である。
非極性アミノ酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、及びTrp
中性アミノ酸：Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、及びGln
酸性アミノ酸：Asp及びGlu
塩基性アミノ酸：Lys、Arg、及びHis
【００３２】
本発明において有効成分として用いることのできる「配列番号２１〜２３で表されるアミノ酸配列、あるいは、前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示すペプチドの誘導体」は、前記ペプチドの誘導体であって、且つ、ムスカリンレセプター活性化作用を示す限り、特に限定されるものではない。このような誘導体としては、例えば、ペプチドの安定性を向上させる各種修飾を施したペプチド誘導体を挙げることができる。前記修飾としては、例えば、Ｌ体アミノ酸のＤ体化（例えば、Ｎ末端アミノ酸のＤ体化、Ｃ末端アミノ酸のＤ体化、Ｎ末端及びＣ末端以外のアミノ酸のＤ体化）、Ｎ末アミノ基のアセチル化、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化、天然型アミノ酸の（性質の類似した）非天然型アミノ酸への置換、又はこれらの組合せを挙げることができる。
【００３３】
本発明においては、ムスカリンレセプター活性化物質、好ましくはムスカリンレセプター活性化ペプチドを、例えば、それ自体を単独で、あるいは、所望により化粧品又は医薬部外品に規定されている化粧品原料と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００３５】
《実施例１：Ｂ１６メラノーマにおけるＭ２ＡＧ６ペプチドのメラニン産生細胞数に与える影響の確認》
本実施例では、配列番号８で表されるアミノ酸配列（ＹＴＷＹＴＰ）からなるペプチド（以下、Ｍ２ＡＧ６ペプチドと称する）を合成し、以下の手順に従って、Ｂ１６メラノーマに前記ペプチドを添加したときのメラニン産生細胞数に与える影響を評価した。
Ｂ１６Ｆ１メラノーマ（東北大学山本研究室より入手。東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センター、ＩＤ：ＴＫＧ  ０３４７）を５×１０５個／ｍＬとなるように培地［ＤＭＥＭ培地（GIBCO）に１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したもの］で調整し、２４ウエルプレート（コーニング）に１ｍＬ／ウエルずつ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件でＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した後、所定濃度（６０μｍｏｌ／Ｌ、１２０μｍｏｌ／Ｌ、２４０μｍｏｌ／Ｌ）のＭ２ＡＧ６ペプチドを含む新しい培地に交換し、同条件にて更に４日間培養した。なお、対照として、Ｍ２ＡＧ６ペプチドを含有しない培地での培養も実施した。メラニンを産生している細胞の数は、顕微鏡下にて計測した。【００３６】
結果を図１に示す。各濃度におけるサンプル数は、それぞれ３（ｎ＝３）である。Ｍ２ＡＧ６ペプチドを添加することにより、濃度依存的に、メラニン産生細胞数が減少することが確認された。
なお、前記効果がＭ２ＡＧ６ペプチドの細胞毒性効果に基づくものでないことを確認するために、６０μｍｏｌ／Ｌ、１２０μｍｏｌ／Ｌ、２４０μｍｏｌ／Ｌ、４８０μｍｏｌ／Ｌの各ペプチド濃度における２４時間培養後の細胞生存率をＭＴＴ法により確認したが、４８０μｍｏｌ／Ｌの高濃度であっても細胞の生死に影響を与えなかった。【００３７】
《実施例２：Ｂ１６Ｆ１０メラノーマにおける各種ペプチド及び公知メラニン産生抑制剤のメラニン産生抑制作用の確認》
本実施例では、実施例１とは別の細胞を使用し、本発明で用いることのできる各種ペプチドと、公知のメラニン産生抑制剤のメラニン産生抑制作用を評価した。前記ペプチドとしては、実施例１で使用したＭ２ＡＧ６ペプチドに加えて、配列番号１５で表されるアミノ酸配列（ＹＳＷＹＴＰ）からなるペプチド（以下、Ｍ２ＡＧ６Ｔペプチドと称する）を使用した。また、公知のメラニン産生抑制剤としては、α−アルブチン（チロシナーゼ活性阻害剤）を使用し、ペプチドと同作用のある公知のムスカリンレセプターアゴニストとしてはカルバコールを使用した。【００３８】
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ（東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センター、ＩＤ：ＴＫＧ  ０３４８）を５×１０３個／ｍＬとなるように培地［ＤＭＥＭ培地（GIBCO、11885）に１０％非働化ＦＢＳ（BIO WEST、S1820）を添加したもの］で調整し、２４ウエルプレートに１ｍＬ／ウエルずつ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件でＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した後、所定濃度（６０μｍｏｌ／Ｌ、１２０μｍｏｌ／Ｌ、２４０μｍｏｌ／Ｌ、４８０μｍｏｌ／Ｌ）の各種評価用試薬を含む新しい培地に交換し、同条件にて更に４日間培養した。なお、対照として、評価用試薬を含有しない培地での培養も実施した。【００３９】
培地を捨てＰＢＳ（−）で洗浄後、０．０５％トリプシンで処理して細胞を回収した。５０００ｒｐｍ、４℃にて、３分間遠心して上清を捨てたところに、ＰＢＳ（−）１００μＬを添加し、超音波処理を実施した。４ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨを１００μＬ添加して６０℃で２時間加熱処理した後、９６ウエルプレートに１００μｇ／ｍＬ添加して４５０ｎｍの吸光度を測定し、メラニン量とした。
また、残ったサンプルをＨＣｌで中和し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の検量線を利用するＢｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質量を算出した。【００４０】
Ｍ２ＡＧ６ペプチドに関する結果を図２に示し、同様に、Ｍ２ＡＧ６Ｔペプチド、カルバコール、α−アルブチンに関する結果を、それぞれ、図３〜図５に示す。図２〜図５における縦軸は、タンパク質１μｇ当たりのメラニン量（４５０ｎｍの吸光度）（以下、相対的メラニン量と称する）である。各濃度におけるサンプル数は、それぞれ３（ｎ＝３）である。
図２〜図５に示す相対的メラニン量に基づいて、対照（試薬無添加時）を基準とした場合のメラニン産生抑制率を算出し、その結果を表１に示す。【００４１】
【表１】
2010035575.tif 000002
【００４２】
表１に示すように、本発明で用いたペプチドは、いずれも、公知のα−アルブチンと同等以上のメラニン産生抑制効果を示した。
なお、前記効果がペプチド又はα−アルブチンの細胞毒性効果に基づくものでないことを確認するために、６０μｍｏｌ／Ｌ、１２０μｍｏｌ／Ｌ、２４０μｍｏｌ／Ｌ、４８０μｍｏｌ／Ｌの各ペプチド濃度における２４時間培養後の細胞生存率を、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３（ID =11625-019; GIBCO）を用いて、ＭＴＴ法により確認したが、４８０μｍｏｌ／Ｌの高濃度であっても細胞の生死に影響を与えなかった。【００４３】
《参考例１：ファージディスプレイ法によるムスカリンレセプター２（Ｍ２）結合ペプチドのスクリーニング》
（１）Ｍ２とＧｉ１ａとの融合ポリペプチドを含む細胞膜画分の調製
本参考例では、特開２００５−３２５０５５号公報の実施例１に記載のヒトｈＧＰＣＲ４４−Ｇｉα融合ポリペプチドを含む細胞膜画分の調製方法に準じて、ヒトＭ２（Gene Accession Number NM_000739）のＣ末端とヒトＧｉ１ａサブユニット（Gene Accession Number NM_002069）のＮ末端とを連結したムスカリンＭ２−Ｇｉ１ａ融合ポリペプチドを、昆虫細胞Ｓｆ９において産生させた後、細胞膜画分を回収することにより、前記融合ポリペプチドを含有する細胞膜画分を調製した。【００４４】
具体的には、ヒトＭ２遺伝子とヒトＧｉ１ａサブユニット遺伝子との融合遺伝子（Ｍ２−Ｇｉ１ａ融合遺伝子）を、組み換え体バキュロウイルス作製用のベクターｐＦＡＳＴＢａｃ１（インビトロジェン製）のマルチクローニングサイトに挿入し、作成されたベクターを用いて、バキュロウイルスのゲノムをバクミド（Ｂａｃｍｉｄ）として保持する大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃ（インビトロジェン製）を形質転換し、Ｍ２−Ｇｉ１ａ融合遺伝子が挿入されたバクミドを単離した。単離された組み換え体バクミド（バキュロウイルスゲノム）を昆虫細胞Ｓｆ９（インビトロジェン製）にトランスフェクションし、Ｍ２−Ｇｉ１ａ融合遺伝子をもつ組み換え体バキュロウイルスを得た。この組み換え体ウイルスを新鮮なＳｆ９細胞に感染させ、培養後、細胞を回収し、細胞を破砕後、更に、細胞膜画分を回収することにより、Ｍ２−Ｇｉ１ａ融合ポリペプチドを含有する細胞膜画分を取得した。なお、前記の形質転換、バクミド単離、トランスフェクション、及び感染は、添付のプロトコールに従って実施した。【００４５】
（２）ペプチド呈示ファージライブラリーからのＭ２結合ペプチドのスクリーニング
続いて、得られた細胞膜画分を使用し、ファージディスプレイ法により、ヒトＭ２に結合性を有するペプチドのスクリーニングを行った。
具体的な操作は、特開２００５−３２５０５５号公報の実施例２に記載のスクリーニング方法に準じて実施した。また、ファージディスプレイ法で用いるライブラリーとして、Ｍ１３ファージの表面のマイナータンパク質ｐIIIのＮ末端にペプチドがランダムに呈示されるライブラリー（呈示されるランダムアミノ酸数が７個又は１２個のペプチドライブラリー）を、Smith, G. P., Science, 288, 1315-1317（1985）、J. K. Scott and G. P. Smith, Science, 249, 386-390（1990）の記載に基づいて作製した。また、ファージライブラリーのターゲット（Ｍ２）に対する結合性は、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）により判定した。【００４６】
スクリーニングの結果、ヒトＭ２に結合性を示すアミノ酸配列として、下記に示す配列番号１〜配列番号７で表される７種類のアミノ酸配列が得られた。
ＮＡＹＴＷＹＴＰＥＶＬＳ  （配列番号１；１２アミノ酸）
ＴＳＹＬＷＨＴＰＡＥＶＰ  （配列番号２；１２アミノ酸）
ＹＨＷＨＴＰＥ        （配列番号３；  ７アミノ酸）
ＹＴＷＨＴＰＶ        （配列番号４；  ７アミノ酸）
ＹＨＷＨＲＰＰ        （配列番号５；  ７アミノ酸）
ＨＳＴＱＮＴＦＦＷＨＴＰ          （配列番号６；１２アミノ酸）
ＳＨＳＥＦＦＷＲＴＰＬＰ      （配列番号７；１２アミノ酸）【００４７】
これらの配列の中で相同性の高い上記下線部の各配列に関して、ＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool）による相同性検索を実施したところ、７０％以上の相同性を有する配列として、公知タンパク質のアミノ酸配列から下記の相同配列が得られた。なお、相同配列中の下線部は、不一致のアミノ酸を示す。また、スペースの下線部「 」は、Ｎ末端又はＣ末端の配列であるため、該当するアミノ酸が存在しないことを意味する。
［１］  ＹＴＷＹＴＰ（配列番号８；配列番号１の第３〜８番）
８３％  ＹＳＷＹＴＰ  トマト（Lycopersicon esculentum）アルデヒドオキシダーゼ［配列番号１５］
８３％  ＹＴＷＹＴ   シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ＣＫＩ１（CYTOKININ-INDEPENDENT 1）［配列番号１６］
［２］  ＹＬＷＨＴＰ（配列番号９；配列番号２の第３〜８番）
８３％  ＹＬＷＨＩＰ  シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）エクソストシンファミリータンパク質（exostosin family protein）［配列番号１７］
８３％  ＹＬＷＨＴ   イネ（Oryza sativa）発現タンパク質（expressed protein）［配列番号１８］
［３］  ＹＨＷＨＴＰ配列番号１０；配列番号３の第１〜６番）
８３％   ＨＷＨＴＰ  ニコチアナ（Nicotiana langsdorffii）ネクタリンIII（nectarin III ）等［配列番号１９］
８３％  ＹＨＲＨＴＰ  イネ（Oryza sativa）ホメオドメイン転写因子（homeodomain transcription factor）等［配列番号２０］【００４８】
《参考例２：１２ＡＡペプチド（配列番号１）のアゴニスト活性の確認》
参考例１で得られた７種類のアミノ酸配列の内、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、１２ＡＡペプチドと称する）を合成し、Ｍ２に対するアゴニスト活性を確認した。
前記アゴニスト活性は、表２に示す反応条件下で、ユーロピウム標識ＧＴＰ（ＧＴＰ−Ｅｕ）のＭ２−Ｇｉ１ａ融合ポリペプチドへの取り込み量を、時間分解蛍光測定法で測定することにより評価した。なお、１２ＡＡペプチドの濃度は、４段階（１ｎｍｏｌ／Ｌ、１００ｎｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ）で実施した。【００４９】
【表２】
2010035575.tif 000003
【００５０】
結果を図６に示す。図６の縦軸は、蛍光強度（単位：カウント）である。
図６から明らかなとおり、１２ＡＡペプチドの濃度の増加に伴って、Ｍ２−Ｇｉ１ａ融合ポリペプチドへのＧＴＰ−Ｅｕの取り込み量が増加しており、１２ＡＡペプチドがＭ２に対するアゴニスト活性を有することが確認された。【００５１】
《参考例３：Ｍ２ＡＧ６ペプチド（配列番号１の第３〜８番）のアゴニスト活性の確認》
本参考例では、配列番号１における第３〜８番のアミノ酸からなる配列のペプチド（以下、Ｍ２ＡＧ６ペプチドと称する）を合成し、Ｍ２に対するアゴニスト活性を確認した。
本参考例は、ペプチド呈示ファージの代わりに前記合成ペプチドを用いること以外は、特開２００５−３２５０５５号公報の実施例３に記載の活性測定方法に準じて実施した。具体的には、表３に示す反応条件下で、３０℃にて３０分間反応させた後、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳのＭ２−Ｇｉ１ａ融合ポリペプチドへの取り込み量を測定することにより評価した。なお、カルバコールはムスカリンレセプターの公知アゴニストであり、Ｍ２ＡＧ６ペプチドの濃度は、８段階（１０−２〜１０−９ｍｏｌ／Ｌ）で実施した。【００５２】
【表３】
2010035575.tif 000004
【００５３】
結果を図７に示す。
図７から明らかなとおり、Ｍ２ＡＧ６ペプチドの濃度の増加に伴って、Ｍ２−Ｇｉ１ａ融合ポリペプチドへの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの取り込み量が増加しており、Ｍ２ＡＧ６ペプチドがＭ２に対するアゴニスト活性を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明のメラニン産生抑制剤は、例えば、美白化粧料の用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列表の配列番号１〜１４、２１〜２３の配列で表される各アミノ酸配列は、Ｍ２結合ペプチドである。
配列表の配列番号２１の配列で表されるアミノ酸配列において、１番目のアミノ酸「Xaa」はＷ，Ｒであり、２番目のアミノ酸「Xaa」はＹ，Ｈ，Ｒであり、３番目のアミノ酸「Xaa」はＴ，Ｒ，Ｉである。
配列表の配列番号２２の配列で表されるアミノ酸配列において、１番目のアミノ酸「Xaa」はＴ，Ｌ，Ｈ，Ｆ，Ｓであり、２番目のアミノ酸「Xaa」はＷ，Ｒであり、３番目のアミノ酸「Xaa」はＹ，Ｈ，Ｒであり、４番目のアミノ酸「Xaa」はＴ，Ｒ，Ｉである。
配列表の配列番号２３の配列で表されるアミノ酸配列において、１番目のアミノ酸「Xaa」はＹ，Ｆであり、２番目のアミノ酸「Xaa」はＴ，Ｌ，Ｈ，Ｆ，Ｓであり、３番目のアミノ酸「Xaa」はＷ，Ｒであり、４番目のアミノ酸「Xaa」はＹ，Ｈ，Ｒであり、５番目のアミノ酸「Xaa」はＴ，Ｒ，Ｉである。
【図１】
2010035575.tif 000005
【図２】
2010035575.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2010035575.tif 000010
【図７】
2010035575.tif 000011
【配列表】
2010035575000001.app
【国際調査報告】
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2010035575.tif 000013
2010035575.tif 000014
2010035575.tif 000015
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