【事件の表示】
　特許第２８６９４１７号「遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン」の請求項１ないし３に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２８６９４１７号の請求項１に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続きの経緯
　本件特許2869417号は、特願平4-253142号の特許出願の特許出願に係るものであって、平成11年1月8日に設定登録がされ、その後井坂紀子及びデルタ、バイオテクノロジー、リミテッドから特許異議の申立てがされたところ、当審において平成12年9月28日付で取消理由の通知がされ、その指定期間内に上申書が提出された後、平成13年1月10日になって訂正案及び先願に係る特願平9-440号を取り下げる旨が記載された意見書が提出された。その後合議体からの訂正案を了承したので手交により再度の取消理由が通知され、平成13年7月25日に上申書と共に訂正請求書が提出されたものである。なお、特許権者は当該上申書において、参考資料１〜７を添付して異議申立人デルタ、バイオテクノロジー、リミテッドの上申書に対する反論を記載している。
　
２．訂正の請求について
　本件訂正の要旨は、特許請求の範囲の減縮ならびに明瞭でない記載の釈明を目的として請求項１を訂正明細書に記載された下記の請求項１の通りに訂正すると共に、請求項２および３を削除することを求めるものである。
　当該訂正は、願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内において特許請求の範囲を減縮し、ならびに明瞭でない記載の釈明に相当するものであって、かつ特許請求の範囲を拡張又は変更するものでもないと認められる。
　
【請求項１】遺伝子操作により得られる以下の特徴を有するヒト血清アルブミン：
(i)ヒト血清アルブミンと産生宿主に由来するヒト血清アルブミン以外の抗原性を有する蛋白質及び多糖類との含量比によるヒト血清アルブミンの純度が多糖類換算で99.9999996％以上、蛋白質換算で99.99999996％以上であって、99.99999999％以下であり、
(ii)ヒト血清アルブミンと産生宿主に由来するヒト血清アルブミン以外の蛋白質及び多糖類の夾雑が酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）の検出限界未満であり、且つ
(iii)キレート樹脂と接触させる操作を行うことにより低減化された着色度が、HSA25％溶液の場合でＡ350／Ａ280が0.01〜0.05、Ａ450／Ａ280が0.001〜0.02、Ａ500／Ａ280が0.001〜0.005である。
　
　そして、後述する如く、上記訂正によって出願当初の明細書の要旨を変更するものではなくなったため出願日は繰り下がらず、刊行物１〜５はもはや本件出願以前の公知文献とはならない。また、訂正後の請求項１に記載される発明は刊行物６〜１１に記載された発明とも、本件と同一の出願人による先願発明に係る特願平9-440号（特許第2885212号公報）に記載された発明とも、実質的に区別ができるものである上に、他に特許を受けることができない理由を発見しないから、本件特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
  したがって、前記訂正は適法なものであると認められる。
　
 　　           　　　  記
刊行物１：特開平6-100592号公報
刊行物２：特開平5-317079号公報
刊行物３：特公平6-75513号公報
刊行物４：特開平6-245788号公報
刊行物５：特開平6-245789号公報
刊行物６：Biotecnology  of  plasma  proteins  Colloque  INSERM.  Vol.175,(1989)p.19-24
刊行物７：欧州特許第452,753号明細書
刊行物８：JOURNAL　of　APPLIED　BIOCHEMISTRY　5,p.282-292(1983)
刊行物９：米国特許第4,675,384号明細書
刊行物１０：Journal　of　Pharmaceutical　Sciences　p.11-16,Vol.80,No.1（Jan.1991)
刊行物１１：欧州特許第319,067号明細書
　
３．異議申立について：
（１）本件発明
　本件特許に係る発明は、前記特許明細書の訂正が認められることから、訂正明細書の請求項１に記載された事項により特定されたとおりのものである。（以下、本件発明という。）
　
（２）異議申立人井坂紀子による異議申立
（２−１）異議申立人井坂紀子は、(a)訂正前の本件明細書に記載不備があるため本願は特許法第36条に規定する要件を満たしておらず、(b)訂正前の請求項１〜３に記載された発明は先願である特願平9-440号（甲第１号証として特許第2885212号公報を提出）の請求項１に記載された発明と実質的に同一であるから同第39条第1項の規定に違反し、また、(c)本件特許出願は本願明細書の要旨を変更する手続補正書を提出した平成9年12月1日に出願したものとみなされるので、訂正前の請求項１〜３に記載された発明は本件に係る特許公開公報である甲第２号証（刊行物１）に記載された発明であるか甲第２号証の記載に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから同第29条第1項第3号又は第2項の規定に違反する旨を主張している。
　
（２−２）(a)について：
　異議申立人は請求項１における「ヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡという。）と産生宿主に由来するＨＳＡ以外の蛋白質及び多糖類の夾雑が酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）の検出限界未満であり」の記載中には「ＨＳＡと」の不要な用語があるため意味不明である旨主張しているが、当該用語は、ＥＩＡ法で測定したい対象がＨＳＡの純度であり、夾雑物を検出しようとする対象が、ＨＳＡを産生する形質転換酵母の培養上清精製物であるために、系のＨＳＡの存在を明記したものともいえる。異議申立人自身も正確に解釈しているように、当該用語が存在することで上記記載全体について本来の意味と別の解釈が成り立つわけではないから、不要な用語であるとしても特許法第36条上の瑕疵とまではいえない。
　また、異議申立人は請求項１における「抗原性」の用語が不明瞭である旨主張しているが、当該「抗原性」の用語は、訂正後の請求項１に記載された「ＨＳＡと産生宿主に由来するＨＳＡ以外の抗原性を有する蛋白質及び多糖類との含量比によるＨＳＡの純度」を規定するための夾雑蛋白質及び多糖類を表現するための用語であって、本件明細書で純度を決定するためにこれら夾雑物含量を測定する手段として用いた手法がＥＩＡ法で抗血清との反応性を見るものである。抗血清との反応性は通常「抗原性」と表現されることからみても、用いた「ＨＳＡには反応せず酵母培養上清由来の夾雑蛋白質及び多糖類には反応する」抗血清に対して「産生宿主に由来するＨＳＡ以外の抗原性を有する」と表現したことは十分首肯し得るものであって不明瞭なものではない。
　
（２−３）(b)について：
　本件発明においては、キレート樹脂と接触させる操作を行うことにより着色度を低減化する工程が必須の工程であって、【表４】によれば当該工程を設けることで少なくとも多糖類換算の夾雑物量が減少する効果が奏されることは明らかであるといえるから、当該工程を設けることが記載されていない先願の請求項１に記載された発明とは明確に区別されるものである。
　
（２−４）(c)について：
　前記訂正により、訂正前の請求項１中の、当初明細書に根拠のない「99.999％以上、99.99999999％以下」という数値範囲を「多糖類換算で99.9999996％以上、蛋白質換算で99.99999996％以上、99.99999999％以下」という数値範囲に減縮された。「多糖類換算で99.9999996％以上、蛋白質換算で99.99999996％以上」という数値は、実施例（【表４】）の記載から直ちに導かれる数値であり、「99.99999999％以下」という数値は理論値である100%ではないことを蛋白質換算時の有効数字の桁数で表したにすぎないものと認められるから、いずれも出願当初の明細書に記載されていた事項もしくはそれから自明な事項の範囲内であるので、平成5年法律第26号附則第2条第2項の規定によりなお従前の例によるとされる平成5年法改正前の特許法第40条の規定は適用されないから、当該主張はその前提を失った。
　
（２−５）したがって、異議申立人井坂紀子の主張(a)〜(c)はいずれも採用しない。　　     　            
　
（３）異議申立人デルタ、バイオテクノロジー、リミテッドによる異議申立
（３−１）　異議申立人デルタ、バイオテクノロジー、リミテッドは、甲第１〜２２号証を提出し、(a)本件特許出願は本願明細書の要旨を変更する手続補正書を提出した平成9年12月1日に出願したものとみなされるので、訂正前の請求項１〜３に記載された発明は本件に係る特許公開公報である甲第１号証（刊行物１）に記載された発明であるか、甲第１〜５号証（刊行物１〜５）の記載に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであり、または(b)訂正前の請求項１〜３に記載された発明は甲第６〜１１号証（刊行物６〜１１）の記載に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから同第29条第1項第3号又は第2項の規定に違反し、(c)訂正前の本件明細書に記載不備があるため本願は特許法第36条に規定する要件を満たしておらず、(d)訂正前の請求項１〜３に記載された発明は先願である特願平9-440号（甲第１３号証として特許第2885212号公報を提出）の請求項１に記載された発明と実質的に同一であるから同第39条第1項の規定に違反する旨主張している。
　
（３−２）(a)について：
　上記（２−４）で述べたと同様の理由で、当該主張は採用できない。
　
（３−３）(b)について：
  甲第６〜１１号証には、血漿由来もしくは組換えＨＳＡを各種精製方法で高純度まで濃縮することが記載されているが、組換えＨＳＡを精製後、さらに着色度を低減化させるためキレート樹脂と接触させる工程を設けることについては記載されていない。
　そして、本件発明においては、訂正明細書に記載されるように、そのことによりはじめて着色度が低減され「多糖類換算で99.9999996％以上、蛋白質換算で99.99999996％以上」という極めて高い精製度の組換えＨＳＡが取得できたものということができる。
　ところで、ＨＳＡを臨床用に用いる際には医薬品の安定剤もしくは担体などとして人体に大量に投与されることが多く、わずかな抗原性でも問題となる可能性があるから、特にヒトにとって明らかな抗原性のある宿主由来の夾雑物を有する組換えＨＳＡの場合は夾雑物をできるだけ除くことが周知の課題であり、本件発明は当該周知の課題を解決することを目的とするものであるといえる。
　そうであるから、本件発明においては末尾に「ＨＳＡ」という化学物質名を用いてはいるが、純度及び製造方法等で特定しているように、ある精製度のＨＳＡ含有組成物を表現しているものと見るのが妥当である。上述の如く本件発明において特定の工程を採用したことで初めて蛋白質換算で小数点以下の有効桁数が８桁で着色度も極めて少ない、という高い精製度が達成できたのであるから、当該効果は格別なものというべきである。
　なお、当該有効桁数の数値が妥当であることについては（３−４）で後述する通りである。
　したがって、本件発明は甲第１２、１４〜２２号証をさらに参酌しても、当業者が甲第６〜１１号証から容易に想到できたものとはいえない。
　
（３−４）(c)について：
　特許異議申立人は甲第２２号証を提出し、訂正前の請求項１〜３に記載されるＨＳＡの「純度」についての記載が科学的根拠を欠く不正確なものであるから、訂正前の特許明細書の記載が不備である旨主張している。
　本件訂正明細書【0042】には当該純度を算出するための手法について、「アルブミン非産生酵母の培養上清を本法と同様の方法で粗精製したものをウサギに免疫し、得られた抗血清を用いて精製ＨＳＡに存在する酵母由来成分の検出を試みた。」ことが記載されている。
　ところで、参考資料１〜７の記載からみて、形質転換宿主由来の微量不純物の免疫学的検出法は本件出願前に周知であったといえるから、当業者であれば、上記記載のみから「アルブミン非産生酵母」としては、本件発明で用いた「ＨＳＡ産生酵母」とはＨＳＡ遺伝子を組み込んでいない点でのみ異なるベクターで形質転換した酵母を用い、「ＨＳＡ産生酵母」の場合と同様の条件で培養した「培養上清」を、「本法と同様の方法で精製」する途中の「粗精製」段階のものをウサギに免疫して抗血清を得ることを指していることは理解し得ることと認められる。
　そうであるから、本件明細書【表4】の実験結果に基づく本件発明の純度の数値範囲が科学的根拠を欠く不正確なものとはいえず、実施例１は当業者が十分に追試可能な実験例であるということができるので、本件明細書記載に異議申立人が主張するような不備はない。                  
　
（３−５）(d)について：
　上記（２−３）で述べたと同様の理由で、当該主張は採用できない。
                
（３−６）したがって、異議申立人デルタ、バイオテクノロジー、リミテッドの主張(a)〜(d)はいずれも採用しない。　　     　     
　
４．結語
　以上のとおりであるから、いずれの特許異議申立人の申立て及び証拠によっても本件特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。       
【異議決定日】
平成１３年８月１３日（２００１．８．１３）
【訂正の要旨】
　特許請求の範囲の請求項１を、
「遺伝子操作により得られる以下の特徴を有するヒト血清アルブミン：
（ｉ）ヒト血清アルブミンと産生宿主に由来するヒト血清アルブミン以外の抗原性を有する蛋白質及び多糖類との含量比によるヒト血清アルブミンの純度が多糖類換算で９９．９９９９９９６％以上、蛋白質換算で９９．９９９９９９９６％以上であって、９９．９９９９９９９９％以下であり、
（ｉｉ）ヒト血清アルブミンと産生宿主に由来するヒト血清アルブミン以外の蛋白質及び多糖類の夾雑が酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）の検出限界未満であり、且つ
（ｉｉｉ）キレート樹脂と接触させる操作を行うことにより低減化された着色度が、ＨＳＡ２５％溶液の場合でＡ３５０／Ａ２８０が０．０１〜０．０５、Ａ４５０／Ａ２８０が０．００１〜０．０２、Ａ５００／Ａ２８０が０．００１〜０．００５である。」
と訂正し、請求項２および３を削除する。
（５４）【発明の名称】
遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　遺伝子操作により得られる以下の特徴を有するヒト血清アルブミン：
（ｉ）
多糖類換算で
９９９６
蛋白質換算で９９．９９９９９９９６％以上であって、
（ｉｉ）
であり、且つ
（ｉｉｉ）キレート樹脂と接触させる操作を行うことにより低減化された着色度が、ＨＳＡ２５％溶液の場合でＡ３５０／Ａ２８０が０．０１〜０．０５、Ａ４５０／Ａ２８０が０．００１〜０．０２、Ａ５００／Ａ２８０が０．００１〜０．００５である。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンに関する。
　【０００２】
　【従来の技術】
　アルブミン、特にヒト血清アルブミン（以下、「ＨＳＡ」ともいう。）は血漿の主要な蛋白構成成分である。この蛋白は肝臓中で作られ、主に血流中で正常な浸透圧を維持する責を負う。また種々の血清分子のキャリアーとしての機能を持っている。ＨＳＡは種々の臨床上の状況において投与される。例えば、ショックや熱傷患者では血液量を元に戻し、それにより外傷に関連するいくつかの症状を改善させるために、通常はＨＳＡの頻回投与を必要とする。低蛋白血症や胎児性赤芽球症に罹っている患者にもＨＳＡによる治療を必要とすることがある。
　従って、ＨＳＡを投与する基本的な治療上の意義は、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす低蛋白血症におけるがごとく、血管からの液体の損失がある様な状態を治療する点に存する。
　【０００３】
　現在、ＨＳＡは、主として採取した血液の分画からの産物として製造されている。この製造法の欠点は不経済であることと、血液の供給が困難であるということである。また、血液は肝炎ウイルスのように好ましくない物質を含んでいることがある。従って、ＨＳＡの代替の原料を開発することが有益となろう。
　【０００４】
　ところで、組換ＤＮＡ技術の出現によって、多種多様の有用なポリペプチドの微生物による生産が可能となり、多くの哺乳動物ポリペプチド類が既に種々の微生物により生産されている。ＨＳＡについても、遺伝子操作の技術により大量生産し、それを高度精製する技術が確立されつつある。
　【０００５】
　ところが、遺伝子操作においては、宿主である微生物を培養する際、さらにはＨＳＡを精製する際に、原料中のある種の着色成分あるいは微生物が分泌する物質が夾雑してくるため、これがＨＳＡと結合することによりＨＳＡそのものが着色してしまうものと思われる。しかもこれらの夾雑物質は、従来の血漿由来ＨＳＡの精製方法では充分に除去することができず、該夾雑物質を含まぬ遺伝子操作由来のＨＳＡは得られていないのが現状である。
　【０００６】
　【発明が解決しようとする課題】
　したがって、本発明の課題は、遺伝子操作により得られるＨＳＡに関し、産生宿主由来のＨＳＡ以外の蛋白質及び多糖類を実質的に含まず、かつ着色が充分に抑えられたＨＳＡを提供することにある。
　【０００７】
　【課題を解決するための手段】
　本発明者らは、上記事情に鑑みて鋭意研究を進めた結果、遺伝子操作により得られるＨＳＡを得るに際して、当該ＨＳＡの精製工程において、特に好ましくはその最後に当該ＨＳＡをキレート樹脂で処理することにより着色物質がキレート樹脂に吸着され、ＨＳＡの着色を減少できるとともに、産生宿主由来のＨＳＡ以外の蛋白質及び多糖類が充分に除去された高純度のＨＳＡを提供できることを見出し、本発明を完成した。
　【０００８】
　即ち、本発明は、遺伝子操作により得られる以下の特徴を有するＨＳＡ；ＨＳＡと産生宿主に由来するＨＳＡ以外の蛋白質及び多糖類との含量比によるＨＳＡの純度が９９．９９９９９９％以上。
　【０００９】
　上記特徴を有するＨＳＡは、遺伝子操作による得られるＨＳＡについて、その精製工程において、特に好ましくはその最後に、キレート樹脂、好ましくはポリオール基、ポリアミン基またはチオ尿素基から選ばれたキレート能を有する交換基をリガンドとして有するキレート樹脂で処理することにより得ることができる。
　【００１０】
　本発明は、遺伝子操作によって得られるＨＳＡに係わるものであり、当該ＨＳＡは遺伝子操作を経てＨＳＡを発現する菌体（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌、麹等）、動物細胞等を培養し、菌体外発現（分泌発現）により産生される。
　【００１１】
（１）遺伝子操作による得られるＨＳＡ
　本発明において用いられる遺伝子操作により調製されたＨＳＡ産生性宿主は、遺伝子操作を経て調製されたものであれば特に限定されず、既に公知文献記載のものの他、今後開発されるものであっても適宜利用することができる。具体的には、遺伝子操作を経てＨＳＡ産生性とされた菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等）、動物細胞などが挙げられる。特に、本発明においては、宿主として、酵母、就中サッカロマイセス属〔例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、もしくはピキア属〔例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）〕が使用されることが好ましい。また、栄養要求性株や抗生物質感受性株が使用できる。さらにまた、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株（ａ，ｈｉｓ４，ｌｅｕ２，ｃａｎ１）、ピキア・パストリスＧＴＳ１１５株（ｈｉｓ４）等が好適に用いられる。
　【００１２】
　これらのＨＳＡ産生性宿主の調製方法およびその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物からのＨＳＡの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準じた手法を採用することによって実施される。例えば、ＨＳＡ産生性宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法としては、例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方法（特開昭５８−５６６８４、同５８−９０５１５、同５８−１５０５１７号公報）、新規なヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５、特開平１−９８４８６号公報）、合成シグナル配列を用いる方法（特開平１−２４０１９１号公報）、血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０９５号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組込む方法（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士を融合させる方法（特開平３−５３８７７号公報）、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ２プロモーターを用いる方法（特願平３−６３５９８、同３−６３５９９号）、枯草菌によるＨＳＡの発現（特開昭６２−２５１３３号公報）、酵母によるＨＳＡの発現（特開昭６０−４１４８７、同６３−３９５７６、同６３−７４４９３号公報）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現（特開平２−１０４２９０号公報）等が例示される。
　【００１３】
　このうち、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法は具体的には以下のように行う。すなわち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵母、具体的にはＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）のＡＯＸ１遺伝子領域に常法によりＡＯＸ１プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラスミドを導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４２９０号公報を参照）。この形質転換体はメタノール培地中での増殖能は弱い。そこで、この形質転換体をメタノール含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能な菌株のみを回収する。この際、メタノール濃度としては、０．０００１〜５％程度が例示される。培地は人工培地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１５〜４０℃、１〜１０００時間程度が例示される。
　【００１４】
　また、ＨＳＡ産生性宿主の培養方法（すなわちＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載された方法の他に、フェッドバッチ培養により、高濃度のグルコースを適度に少量づつ供給し、産生菌体に対する高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る方法（特願平１−２１９５６１号）、培地中に脂肪酸を添加してＨＳＡの産生を増強する方法（特願平３−８１７１９号）等が例示される。
　さらにＨＳＡの分離採取方法としては、上記の各公報に記載された方法の他に加熱処理によるプロテアーゼの不活化（特開平３−１０３１８８号公報）、陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭からなる群より選ばれた少なくとも一を用いてＨＳＡと着色成分を分離することによる着色抑制方法（特開平４−５４１９８号公報）等が例示される。
　【００１５】
　形質転換宿主の培養に用いられる培地は、通常この分野で既知の培地に炭素数１０〜２６の脂肪酸またはその塩を添加したものが使用され、培養条件は一般的な常法に準じて実施される。培地は合成培地、天然培地のいずれでもよく、液体培地が好ましい。例えば、合成培地としては、一般に炭素源として各種糖類、窒素源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、微量栄養素として各種ビタミン、ヌクレオチドなどの他、無機塩としてＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕなどが例示される。ＹＮＢ液体培地〔０．７％イーストナイトロジエンのベース（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース〕などが挙げられる。また天然培地としては、ＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％バクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース〕が例示される。培地のｐＨは中性または弱塩基性、弱酸性でよい。またメタノール資化性宿主の場合は、メタノール含有培地を用いることができる。この場合メタノール濃度は０．０１〜５％程度である。
　【００１６】
　培養温度は、１５〜４３℃（酵母は２０〜３０℃、細菌は２０〜３７℃）が好ましい。培養時間は１〜１０００時間程度であり、培養は静置または振盪、攪拌、通気下に回分培養法や半回分培養法あるいは連続培養法により実施される。
　なお、当該培養に先立って前培養を行うことが好ましい。この際の培地としては、例えばＹＮＢ液体培地やＹＰＤ液体培地が使用される。前培養の培養条件は次の通りである。すなわち、培養時間は１０〜１００時間、温度は酵母では３０℃、細菌では３７℃程度が好ましい。
　【００１７】
　かくして培養終了後、ＨＳＡは培養濾液または菌体、細胞からそれぞれ公知の分離手段により採取される。
　【００１８】
（２）ＨＳＡの精製
　本発明のＨＳＡの精製工程としては、各種分画法、吸着クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過、密度勾配遠心分離法、透析等の公知の方法が採用される。
　当該精製工程としては、例えば以下の▲１▼〜▲７▼を含む工程が好適に挙げられる。
　▲１▼　ヒト血清アルブミンの産生宿主の培養上清を分画分子量１０万〜５０万、及び１０００〜５万の限外濾過膜を用いて処理する。
　▲２▼　５０〜７０℃で３０分〜５時間加熱処理する。
　▲３▼　ｐＨ３〜５で酸処理する。
　▲４▼　分画分子量１０万〜５０万の限外濾過膜を用いて処理する。
　▲５▼　ｐＨ３〜５、塩濃度０．０１〜０．２Ｍの条件下で陽イオン交換体に接触させた後にｐＨ８〜１０、塩濃度０．２〜０．５Ｍの条件下で溶出する。
　▲６▼　ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収する、そして
　▲７▼　ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍの条件下で陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する。
　また、前記工程▲６▼の代わりに、ｐＨ６〜８、塩濃度１〜３Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で溶出する工程、または前記工程▲７▼の代わりに、ｐＨ６〜８、塩濃度０．００１〜０．０５Ｍの条件下で陰イオン交換体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０５〜１Ｍの条件下で溶出する工程、さらには前記工程▲５▼と▲６▼の間、▲６▼と▲７▼の間、または▲７▼の後で、ｐＨ３〜５、塩濃度０．５〜３Ｍの条件下で塩析処理し、沈澱画分を回収する工程をさらに含むものであってもよい。
　【００１９】
（３）ＨＳＡの脱色
　本発明のＨＳＡの脱色工程は、上記精製工程において、特に好ましくはその最後に組み込まれ、特定のリガンド部を有するキレート樹脂とＨＳＡを接触することにより行われる。
　キレート樹脂の担体部分は疎水性を有する担体であることが好ましく、例えばスチレンとジビニルベンゼンの共重合体、アクリル酸とメタクリル酸の共重合体等が挙げられる。
　一方、リガンド部は、Ｎ−メチルグルカミン基等のポリオール基、イミノ基、アミノ基、エチレンイミノ基等を分子内に複数個有するポリアミン基（この中にはポリエチレンポリアミン等のポリアルキレンポリアミン基も含まれる）、およびチオ尿素基が挙げられる。上記担体部分とリガンド部を有するキレート樹脂の市販品としては、担体部分がいずれもスチレンとジビニルベンゼンの共重合体であるＤＩＡＩＯＮ　ＣＲＢ０２（リガンド部；Ｎ−メチルグルカミン基、三菱化成製）、ＤＩＡＩＯＮ　ＣＲ２０　（リガンド部；−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＨ、三菱化成製）、ＬＥＷＡＴＩＴ　ＴＰ（リガンド部；−ＮＨＣＳＮＨ２、バイエル製）、アンバライトＣＧ４０００好適に使用される。
　【００２０】
　当該キレート樹脂による処理条件は、好適には次の通りである。
　ｐＨ条件：酸性または中性（３〜９、好ましくは４〜７）
　時間：少なくとも１時間以上、好ましくは６時間以上
　イオン強度：５０ｍｍｈｏ以下、好ましくは１〜１０ｍｍｈｏ
　混合比：ＨＳＡ２５０ｍｇに対して樹脂０．１〜１００ｇ、好ましくは１〜１０ｇ（湿重量）
　【００２１】
　上記の工程（▲１▼〜▲７▼および塩析処理、さらにキレート樹脂処理を含む）を経て得られうるＨＳＡの着色度は、ＨＳＡ２５％溶液の場合でＡ５００ｎｍ／Ａ２８０ｎｍが０．００１〜０．００５程度である。キレート樹脂処理によりＨＳＡの着色度は１／２〜１／１０に低減される。特に吸収波長５００ｎｍ付近、すなわち赤色系の着色度が１／３〜１／１０に低減される。
　【００２２】
（４）製剤化
　本発明のＨＳＡは公知の手法（限外濾過、安定化剤の添加、除菌濾過、分注、凍結乾燥等）により製剤化することができる。こうして調製されたＨＳＡ製剤は注射剤として血漿由来ＨＳＡ製剤と同様に臨床上用いることができる。また、医薬品の安定化剤あるいは担体、運搬体としても利用可能である。
　【００２３】
（５）本発明の遺伝子操作由来のＨＳＡの性状
　本発明のＨＳＡは、分子量約６万７千、等電点４．６〜５．０の単一物質である。当該ＨＳＡは単量体からなり、実質的に二量体、重合体または分解物を含まない。具体的には、二量体、重合体および分解物の全含有量は０．０１％以下程度である。また本発明のＨＳＡは、産生宿主に由来する夾雑成分（ＨＳＡ以外の蛋白質及び多糖成分）を実質的に含まず、該夾雑成分との含量比から算出されるＨＳＡの純度は９９．９９９９９９％以上、好ましくは９９．９９９９９９９％以上である。具体的には、ＨＳＡ２５％溶液の場合で、ＨＳＡ以外の蛋白質成分が１ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ以下が例示される。また、同じく多糖成分が１０ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ以下が例示される。尚、本発明でいうＨＳＡの純度とは、産生宿主に由来する夾雑成分（ＨＳＡ以外の蛋白質及び多糖成分）との含量比から算出されるＨＳＡの純度を意味する。
　着色度はＨＳＡ２５％溶液の場合でＡ３５０／Ａ２８０が０．０１〜０．０５、Ａ４５０／Ａ２８０が０．００１〜０．０２、Ａ５００／Ａ２８０が０．００１〜０．００５程度が例示される。また、ＨＳＡに結合している脂肪酸量がＨＳＡ１分子当たり１分子以下、好ましくは０．１分子以下が例示される。
　【００２４】
　【発明の効果】
　本発明は産生宿主に由来する夾雑成分を実質的に含まないことを特徴とする遺伝子操作由来のＨＳＡであり、かかる本発明によれば、産生宿主が分泌する物質が夾雑していないがゆえに、これらがＨＳＡと結合することによって起こる着色および他の夾雑物の混在が充分に抑えられた高純度のＨＳＡを提供することができる。
　【００２５】
　【実施例】
　本発明をより詳細に説明するために、実施例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
　【００２６】
参考例１　ＨＳＡ産生宿主の培養
　（１）　使用菌株：Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　ＧＣＰ１０１株
　特開平２−１０４２９０号公報に述べられている方法により、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＴＳ１１５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ１遺伝子領域に、ＡＯＸ１プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つプラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔＩで切断した断片を置換して、ＰＣ４１３０が得られている。この株はＡＯＸ１遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。
　【００２７】
　ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イーストエキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコース）３ｍｌに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ５４０＝０．１となるようにＹＰＤ培地５０ｍｌに植菌した。３日間３０℃で培養後に初期ＯＤ５４０＝０．１となるようにＹＰＤ培地５０ｍｌに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰り返した。継代毎に菌体を１０７ｃｅｌｌｓ／ｐｌａｔｅになるように滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベースウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５％寒天末に塗布し、３０℃５日間培養してコロニーの有無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布した２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２０個のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株はほとんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すなわち、このプレートではコロニーが生じるということはメタノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が得られたことを示している。生じたコロニーの内の１つを適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。
　【００２８】
（２）菌株の培養
　（前々培養）
　グリセロール凍結ストック菌株１ｍｌを２００ｍｌのＹＰＤ培地（表１）を含むバッフル付１，０００ｍｌ容三角フラスコに植菌、３０℃にて２４時間振盪培養した。
　【００２９】
　【表１】
　【００３０】
　（前培養）
　ＹＰＤ培地５Ｌを含む１０Ｌ容ジャーファーメンターに前々培養液を植菌し、２４時間通気攪拌培養した。培養温度は３０℃、通気量は５Ｌ／分とした。また、前培養においてはｐＨの制御は実施しなかった。
　【００３１】
　（本培養）
　バッチ培養用培地（表２）２５０Ｌに前培養液を植菌し、１，２００Ｌ容ファーメンターを用いて通気攪拌培養した。槽内圧は０．５ｋｇ／ｃｍ２、最大通気量を８００Ｎ−Ｌ／ｍｉｎとして溶存酸素濃度が飽和溶存酸素濃度の５０％〜３０％程度を保持するように、攪拌速度を制御しながら回分培養を開始した。回分培養において培地中のグリセロールが消費された時点よりフィード培地（表３）の添加を開始した。このフィード培地の添加にはコンピュータを使用し、培地中にメタノールが蓄積しないように制御しながら高密度培養を実施した。ｐＨは２８％アンモニア水を添加することにより、ｐＨ５．８５に定値制御した。消泡は消泡剤（Ａｄｅｃａｎｏｌ、旭電化工業製）を回分培養開始時に０．３０ｍｌ／Ｌ添加しておき、その後は必要に応じて少量添加することで実施した。
　【００３２】
　【表２】
　【００３３】
　【表３】
　【００３４】
参考例２
　参考例１のＧＣＰ１０１株から単離したＡＯＸ２プロモーター［変異型。天然型ＡＯＸ２プロモーター（ＴＥＡＳＴ，５，１６７−１７７（１９８８）またはＭｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．，９，１３１６−１３２３（１９８９））中、開始コドン上流の２５５番目の塩基がＴからＣに変異したもの］を用いてＨＳＡ発現用プラスミドｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ４２−３株を得た（特願平３−６３５９９号）。参考例１に準じてこのＵＨＧ４２−３株を培養し、ＨＳＡを産生させた。
　【００３５】
参考例３　ＨＳＡの精製
［ｉ］培養上清の分離〜膜分画（ＩＩ）
　参考例１で得られた培養液約８００Ｌを圧搾することにより培養上清を分離した。培養上清を分画分子量が３０万の限外濾過膜で処理した。次いで、分画分子量が３万の限外濾過膜を用いて液量を約８０Ｌに濃縮した〔膜分画（Ｉ）〕。
　この濃縮液を６０℃、３時間の加熱処理後、急速に約１５℃に冷却し、ｐＨ４．５に調整し、再度分画分子量が３０万の限外濾過膜を用いて処理した〔膜分画（ＩＩ）〕。次いで、分画分子量が３万の限外濾過膜を用いてアルブンミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ４．５に交換した。
　【００３６】
［ｉｉ］陽イオン交換体処理
　５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ４．５で平衡化したＳ−セファロース充填カラムにアルブミンを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄したのち、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ９でアルブミンの溶出を行った。
　【００３７】
［ｉｉｉ］疎水性クロマト処理
　Ｓ−セファロース充填カラムから溶出されたアルブミン溶液を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化したフェニルセルロファインを充填したカラムに添加した。この条件でフェニルセルロファインを吸着することなく、カラムを通過した画分を回収した。
　カラムを通過したアルブミンは、分画分子量３万の限外濾過膜を用いて液量を約５０Ｌに濃縮するとともに、アルブミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．８に交換した。
　【００３８】
［ｉｖ］陰イオン交換体処理
　疎水クロマト処理後、濃縮及び緩衝液交換を行ったアルブミン溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースを充填したカラムに添加した。この条件ではアルブミンはＤＥＡＥ−セファロースに吸着することなく、カラムを通過した。
　【００３９】
［ｖ］ＨＳＡの塩析処理
　５％濃度のＨＳＡに塩化ナトリウムを添加して最終濃度１Ｍとした溶液を、酢酸でｐＨ３．５に調整し、ＨＳＡを沈澱させた。この沈澱を遠心により上清と分離し、不純物を除去した。
　【００４０】
［ｖｉ］脱色処理
　２５％濃度の精製ＨＳＡ１ｍｌにＤＩＡＩＯＮ　ＣＲＢ０２（担体部分はスチレン−ジビニルベンゼン共重合体、リガンド部分はＮ−メチルグルカミン基からなるキレート樹脂，三菱化成製）１ｇを加え、ｐＨ６．８、イオン強度５ｍｍｈｏの条件下、室温で２４時間攪拌した。樹脂を蒸留水で洗浄し、非吸着画分をＨＳＡとして回収した。
　【００４１】
実施例１　本発明の精製ＨＳＡの性状
（１）　精製工程のＨＰＬＣ分析
　疎水性クロマト処理までの精製工程を終了したＨＳＡをＨＰＬＣゲル濾過により分析した。ゲル濾過分析は下記の条件で行った。
　▲１▼カラム：ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ（東ソー社製）
　▲２▼展開液：０．１Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４／０．３Ｍ　ＮａＣｌ　緩衝液
　▲３▼検出：波長２８０ｎｍでの吸光度
　精製ＨＳＡはＨＳＡモノマーのシングルピークとなった。
　【００４２】
（２）　酵母由来成分分析
　アルブミン非産生酵母の培養上清を本法と同様の方法で粗精製したものをウサギに免疫し、得られた抗血清を用いて精製ＨＳＡに存在する酵母由来成分の検出を試みた。測定は酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）で行った。
　各サンプルについての酵母由来成分の検出結果を示す。サンプルはアルブミン濃度として２５０ｍｇ／ｍｌに調整したものを用いて測定した。
　【００４３】
　【表４】
　【００４４】
（３）　分子量
分子量測定は前述のＨＰＬＣゲル濾過法によった。本発明の精製ＨＳＡの分子量は約６７０００であり、血漿由来のＨＳＡと同程度であった。
　【００４５】
（４）　等電点
　等電点は薄層ポリアクリルアミドゲルを用い、Ａｌｌｅｎらの方法［Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，１４６，１（１９７８）］に準じて測定した。本発明の精製ＨＳＡの等電点は約４．９であり、血漿由来のＨＳＡと同程度であった。
　【００４６】
（５）　着色度
　着色度は２８０ｎｍ、３５０ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍでの吸光度を測定し、Ａ３５０／Ａ２８０、Ａ４５０／Ａ２８０、Ａ５００／Ａ２８０を算出した。本発明の精製ＨＳＡの着色度はＡ３５０／Ａ２８０は約０．０２、Ａ４５０／Ａ２８０は約０．０１、Ａ５００／Ａ２８０は約０．００２であり、血漿由来のＨＳＡと同程度であった。
　【００４７】
（６）　結合脂肪酸量
　測定には、ＮＦＥＡ−テストワコー（和光純薬社製）を用いた。その結果、キレート樹脂処理前は１．６モル（ＨＳＡ１モル当たり）であったが、処理後は０．０３７モル（ＨＳＡ１モル当たり）と大幅に減少した。
　【００４８】
実施例２
　参考例２で得た培養液を参考例３と同様に処理した。精製されたＨＳＡの性状は実施例１で開示した分子量・等電点および着色度、多糖体含量、ゲル濾過パターンおよび酵母由来成分量と同程度であった。