(57)【要約】【課題】  本発明は、間質性膀胱炎、特に潰瘍型間質性膀胱炎の診断マーカーおよび検出方法を提供することを課題とする。【解決手段】    潰瘍型間質性膀胱炎患者と非間質性膀胱炎患者との膀胱組織における遺伝子発現量を詳細に比較した結果、８個の遺伝子について潰瘍型間質性膀胱炎において著しく発現量に差があることを見出した。その８遺伝子とは、ＴＮＦＳＦ１４、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ２、ＡＺＧＰ１およびＯＶＯＬ１である。その中から選択される少なくとも１種の遺伝子をマーカーとすることにより、間質性膀胱炎、特に潰瘍型間質性膀胱炎を検出する事ができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦＳＦ１４、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ２、ＡＺＧＰ１およびＯＶＯＬ１から選択される少なくとも１種の遺伝子をマーカーとする間質性膀胱炎を検出する方法。
【請求項２】
間質性膀胱炎が、潰瘍性間質性膀胱炎である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＴＮＦＳＦ１４、ＣＸＣＬ１０、ＡＺＧＰ１およびＯＶＯＬ１から選択される少なくとも１種の遺伝子をマーカーとする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記マーカー遺伝子から転写されるｍＲＮＡを調製する工程を含む、請求項１〜３の何れか一項記載の方法。
【請求項５】
ｍＲＮＡから変換されるｃＤＮＡを調製する工程を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ｃＤＮＡから転写される標識化されたｃＲＮＡを調製する工程を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
標識化されたｃＲＮＡをフラグメント化する工程を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記マーカー遺伝子を検出するためのプローブを用いる工程を含む、請求項１〜３の何れか一項記載の方法。
【請求項９】
標識化されたｃＲＮＡのフラグメントとプローブとをハイブリダイズさせる工程を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
標識化されたｃＲＮＡのフラグメントの発現量をＤＮＡマイクロアレイにより測定する工程を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＴＮＦＳＦ１４、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ２、ＡＺＧＰ１およびＯＶＯＬ１から選択される少なくとも１種以上の遺伝子を検出するためのプローブを含む、間質性膀胱炎の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間質性膀胱炎、特に潰瘍型間質性膀胱炎を検出する為に有用なマーカーおよびその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間質性膀胱炎（Interstitial Cystitis、以下ＩＣと略すこともある）は、頻尿、尿意切迫感および膀胱疼痛を主訴とする疾患である。重症患者では、灼熱痛、刺痛、疼痛及びそれらに起因する極度の頻尿症状を呈し、極めて重症患者においては膀胱摘出に至る事さえある。一方、間質性膀胱炎の原因および病態については不明な点が多い。そのため、間質性膀胱炎の確定診断に至るまでには多くの除外診断が必要であり、間質性膀胱炎を直接的に診断する方法はない。そのため、間質性膀胱炎の確定診断ができるまでの期間が発症から数年にも及び、その間、患者は間質性膀胱炎の為の適切な治療を受けることができない。
現在、間質性膀胱炎の確定診断は、多くの除外診断の後に行われる水圧拡張時膀胱鏡検査（以下膀胱鏡検査）により行われる。膀胱鏡検査とは、麻酔下膀胱に水を注入して強制的に膀胱を拡張した後、ハンナー潰瘍または点状出血の有無を確認する検査である。ハンナー潰瘍と点状出血のうちハンナー潰瘍は間質性膀胱炎に特異的な所見であり、必須診断所見の１つである。しかし、ハンナー潰瘍確認のための唯一の方法である膀胱鏡検査は極めて専門的検査であり、医師の熟練度・経験により診断結果が左右され得る客観性、正確性に欠ける診断方法である。さらに、膀胱鏡検査の合併症として膀胱破裂という重篤な事例が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、間質性膀胱炎と類似疾患である膀胱上皮内癌とは膀胱鏡所見において類似点が多い為、膀胱鏡検査を行っても膀胱内皮癌であるリスクを内包する（例えば、非特許文献２参照）。
したがって、間質性膀胱炎の診断マーカー、特にハンナー潰瘍を伴う重篤な間質性膀胱炎（潰瘍型間質性膀胱炎）の診断マーカーとして、低侵襲で合併症がなく、直接的かつ特異的な診断マーカーの開発が切望されている。【０００３】
このような背景の中、間質性膀胱炎のマーカーとしては、いくつかの報告がある。
抗増殖因子ＡＰＦ（antiproliferative factor）は、間質性膀胱炎患者群と対照群との重なりが最も少ない為、現在、間質性膀胱炎の最も有望なマーカーとして報告されている（例えば、非特許文献３参照）。ＡＰＦをマーカーとして利用する場合、ＡＰＦの活性を膀胱上皮細胞の増殖抑制活性で検出する必要がある（例えば、非特許文献４参照）。しかし、このような検出方法は細胞培養系で測定する必要がある。そのため、活性値が間接的に測定されること、測定方法が煩雑であること、測定値がばらつくという問題がある。
この他のマーカーとしてアズール顆粒、ウロプラキンが挙げられる。
アズール顆粒をマーカーとする方法は、尿中の好中球エラスターゼまたはミエロペルオキシダーゼの量を測定する方法である。アズール顆粒は、間質性膀胱炎患者の痛みの有無に相関するため、間質性膀胱炎の症状改善マーカーとして利用されうる。しかし、間質性膀胱炎の類型、即ち潰瘍型・非潰瘍型を判別するものではない（例えば、特許文献１参照）。
ウロプラキン（ＵＰ）をマーカーとする方法は、膀胱生検組織中のウロプラキン遺伝子発現量を定量する方法である。ウロプラキンＩＩＩ（ＵＰＩＩＩ）が間質性膀胱炎患者で有意に発現量が増加している為、ウロプラキンは間質性膀胱炎を検出する為に利用できると開示されている（例えば、特許文献２参照）。
しかし、いずれの報告例においても、潰瘍型間質性膀胱炎を感度良く、特異的に検出するマーカー遺伝子の報告は未だ無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開２００５／１１４１９６号
【特許文献２】特開２００６−１０６３３号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「間質性膀胱炎診療ガイドライン」日本間質性膀胱炎研究会、ガイドライン作成委員会編, Blackwell Publishing, 2007年, p.41
【非特許文献２】「間質性膀胱炎診療ガイドライン」日本間質性膀胱炎研究会、ガイドライン作成委員会編, Blackwell Publishing, 2007年, p.25
【非特許文献３】Deborah R. Erickson, et al., 「J. Urol.」, 2002年, 167巻, p.2461-2469
【非特許文献４】S. Keay, et al., 「J. Urol.」, 1996年，156巻，p.2073-2078
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、間質性膀胱炎、特に潰瘍型間質性膀胱炎の診断マーカーおよび検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、潰瘍型間質性膀胱炎患者と非間質性膀胱炎患者との膀胱組織における遺伝子発現量を詳細に比較した。その結果、８個の遺伝子について潰瘍型間質性膀胱炎に著しく発現量に差があることを見出し、本発明をなすに至った。【０００８】
即ち、前記課題を解決する為の手段は下記の通りである。
（１）ＴＮＦＳＦ１４、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ２、ＡＺＧＰ１およびＯＶＯＬ１から選択される少なくとも１種の遺伝子をマーカーとする間質性膀胱炎を検出する方法。
（２）間質性膀胱炎が、潰瘍性間質性膀胱炎である、〔１〕記載の方法。
（３）ＴＮＦＳＦ１４、ＣＸＣＬ１０、ＡＺＧＰ１およびＯＶＯＬ１から選択される少なくとも１種の遺伝子をマーカーとする、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
（４）前記マーカー遺伝子から転写されるｍＲＮＡを調製する工程を含む、〔１〕〜〔３〕の何れか一項記載の方法。
（５）ｍＲＮＡから変換されるｃＤＮＡを調製する工程を含む、〔４〕記載の方法。
（６）ｃＤＮＡから転写される標識化されたｃＲＮＡを調製する工程を含む、〔５〕記載の方法。
（７）標識化されたｃＲＮＡをフラグメント化する工程を含む、〔６〕記載の方法。
（８）前記マーカー遺伝子を検出するためのプローブを用いる工程を含む、〔１〕〜〔３〕の何れか一項記載の方法。
（９）標識化されたｃＲＮＡのフラグメントとプローブとをハイブリダイズさせる工程を含む、〔８〕記載の方法。
（１０）標識化されたｃＲＮＡのフラグメントの発現量をＤＮＡマイクロアレイにより測定する工程を含む、〔９〕記載の方法。
（１１）ＴＮＦＳＦ１４、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ２、ＡＺＧＰ１およびＯＶＯＬ１から選択される少なくとも１種以上の遺伝子を検出するためのプローブを含む、間質性膀胱炎の検査キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のマーカー遺伝子を利用する事により、間質性膀胱炎、特に潰瘍型間質性膀胱炎を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】潰瘍型ＩＣ群および対照群の検体（ヒト膀胱粘膜上皮組織）におけるＴＮＦＳＦ１４の遺伝子発現量（ＧＡＰＤＨ正規化後）を示す図である。マーカー遺伝子ＴＮＦＳＦ１４のプローブにハイブリダイズしたＣｙ３標識化されたｃＲＮＡのフラグメントの蛍光強度をマイクロアレイにより測定し、この測定値を各マーカー遺伝子の発現量を示す蛍光強度（ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌ）とした。検体におけるマーカー遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の蛍光強度（ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌ）を測定した。得られたマーカー遺伝子の蛍光強度（ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌ）とハウスキーピング遺伝子の蛍光強度（ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌ）の中央値との比を求め、マーカー遺伝子の蛍光強度を正規化（ノーマライゼーション）した。横軸に潰瘍型間質性膀胱炎群および対照群をおき、縦軸にＴＮＦＳＦ１４の正規化された蛍光強度（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌ）をとり、検体個々の値をプロットした。棒線（bar）は、潰瘍型ＩＣ群および対照群それぞれにおけるＴＮＦＳＦ１４の遺伝子発現量の平均値を示した。
【図２】潰瘍型ＩＣ群および対照群の検体（ヒト膀胱粘膜上皮組織）におけるＣＸＣＬ９の遺伝子発現量（ＧＡＰＤＨ正規化後）を示す図である。縦軸にＣＸＣＬ９の正規化された蛍光強度（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌ）をとり、検体個々の値をプロットした。棒線（bar）は、潰瘍型ＩＣ群および対照群それぞれにおけるＣＸＣＬ９の遺伝子発現量の平均値を示した。
【図３】潰瘍型ＩＣ群および対照群の検体（ヒト膀胱粘膜上皮組織）におけるＣＸＣＬ１０の遺伝子発現量（ＧＡＰＤＨ正規化後）を示す図である。縦軸にＣＸＣＬ１０の正規化された蛍光強度（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌ）をとり、検体個々の値をプロットした。棒線（bar）は、潰瘍型ＩＣ群および対照群それぞれにおけるＣＸＣＬ１０の遺伝子発現量の平均値を示した。
【図４】潰瘍型ＩＣ群および対照群の検体（ヒト膀胱粘膜上皮組織）におけるＣＸＣＬ１１の遺伝子発現量（ＧＡＰＤＨ正規化後）を示す図である。縦軸にＣＸＣＬ１１の正規化された蛍光強度（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌ）をとり、検体個々の値をプロットした。棒線（bar）は、潰瘍型ＩＣ群および対照群それぞれにおけるＣＸＣＬ１１の遺伝子発現量の平均値を示した。
【図５】潰瘍型ＩＣ群および対照群の検体（ヒト膀胱粘膜上皮組織）におけるＣＸＣＲ３の遺伝子発現量（ＧＡＰＤＨ正規化後）を示す図である。縦軸にＣＸＣＲ３の正規化された蛍光強度（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌ）をとり、検体個々の値をプロットした。棒線（bar）は、潰瘍型ＩＣ群および対照群それぞれにおけるＣＸＣＲ３の遺伝子発現量の平均値を示した。
【図６】潰瘍型ＩＣ群および対照群の検体（ヒト膀胱粘膜上皮組織）におけるＣＣＲ２の遺伝子発現量（ＧＡＰＤＨ正規化後）を示す図である。縦軸にＣＣＲ２の正規化された蛍光強度（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌ）をとり、検体個々の値をプロットした。棒線（bar）は、潰瘍型ＩＣ群および対照群それぞれにおけるＣＣＲ２の遺伝子発現量の平均値を示した。
【図７】潰瘍型ＩＣ群および対照群の検体（ヒト膀胱粘膜上皮組織）におけるＡＺＧＰ１の遺伝子発現量（ＧＡＰＤＨ正規化後）を示す図である。縦軸にＡＺＧＰ１の正規化された蛍光強度（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌ）をとり、検体個々の値をプロットした。棒線（bar）は、潰瘍型ＩＣ群および対照群それぞれにおけるＡＺＧＰ１の遺伝子発現量の平均値を示した。
【図８】潰瘍型ＩＣ群および対照群の検体（ヒト膀胱粘膜上皮組織）におけるＯＶＯＬ１の遺伝子発現量（ＧＡＰＤＨ正規化後）を示す図である。縦軸にＯＶＯＬ１の正規化された蛍光強度（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌ）をとり、検体個々の値をプロットした。棒線（bar）は、潰瘍型ＩＣ群および対照群それぞれにおけるＯＶＯＬ１の遺伝子発現量の平均値を示した。
【図９】潰瘍型ＩＣ群および対照群の検体（ヒト膀胱粘膜上皮組織）におけるＵＰＫ３Ｂの遺伝子発現量（ＧＡＰＤＨ正規化後）を示す図である。縦軸にＵＰＫ３Ｂの正規化された蛍光強度（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌ）をとり、検体個々の値をプロットした。棒線（bar）は、潰瘍型ＩＣ群および対照群それぞれにおけるＵＰＫ３Ｂの遺伝子発現量の平均値を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書における用語について説明する。
【００１２】
「遺伝子」または「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを含有する。また、その長さによって特に制限されるものではない。したがって、遺伝子（ＤＮＡ）とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）ならびに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらのフラグメントの何れもが含まれる。
なお、遺伝子またはＤＮＡは、機能領域の別を問うものではなく、例えば、発現制御領域、コード領域、エキソンまたはイントロンを含むことができる。
【００１３】
「ＲＮＡ」とは、ＤＮＡを鋳型にしてＤＮＡの情報が転写された１本鎖ポリヌクレオチドを全て意味する。即ち、ＲＮＡには、たんぱく質の合成に関与するＲＮＡおよびタンパク質合成に関与しないＲＮＡの双方が含まれる。具体的には、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｎｃＲＮＡおよび合成ＲＮＡが含まれる。
【００１４】
「マーカー遺伝子」とは、間質性膀胱炎または潰瘍型間質性膀胱炎に対する患者の罹患の有無を検出する為に利用されるものである。例えば、間質性膀胱炎の罹患および潰瘍の有無などの類型に関連して生体内での発現が変動（増加または減少）する遺伝子、およびその遺伝子から調製されるポリヌクレオチドが包含される。
【００１５】
「ポリヌクレオチド」とは、プリン又はピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰまたはＴＭＰ；またはｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＵＭＰ）が３’位と５’位とで結合した分子を意味する。これらには、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。これらには、ｃＤＮＡ、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｃＲＮＡのいずれも含まれる。
【００１６】
「フラグメント」とは、タンパク質をコードする遺伝子を規定する核酸または該核酸の一部を含むポリヌクレオチドを意味する。
【００１７】
「プローブ」とは、被検体由来の検体中に発現しているマーカー遺伝子のｍＲＮＡまたはｍＲＮＡから調製されるｃＤＮＡ、ｃＲＮＡまたはそのフラグメントと特異的に結合して検体のマーカー遺伝子をコードするポリヌクレオチドの発現を検出することができるポリヌクレオチドを意味する。プローブは、修飾又は標識化されていてもよい。修飾または標識化には、ビオチン化、蛍光標識化または放射標識化が含まれる。
【００１８】
「ハイブリダイズ」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡが相補的に複合体を形成する事を意味する。これは、核酸分子に含まれる塩基がＡとＴまたはＵ、ＧとＣとが相補的に結合する性質を利用する複合体の形成を言う。
【００１９】
「相補鎖」とは、塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を意味する。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限らず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％以上の塩基配列の同一性を有することである。
【００２０】
「感度」および「特異度」とは、疾患を検出する為のマーカーがどれだけ精度良く検出できるかを表す指標の１つである。「感度」とは、陽性の被験者を正しく陽性と判定できる確率であり、疾患群の陽性率を示す指標である。「特異度」とは、陰性の被験者を正しく陰性と判定できる確率であり、非疾患群の陰性率を示す指標である。
【００２１】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００２２】
（Ａ）間質性膀胱炎または潰瘍型間質性膀胱炎を検出する為のマーカー遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびｃＲＮＡ
【００２３】
本発明のマーカー遺伝子は、ＴＮＦＳＦ１４、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ２、ＡＺＧＰ１およびＯＶＯＬ１から選択される少なくとも１種の遺伝子からなる。これらマーカー遺伝子は、表１記載の配列番号に対応する塩基配列を有する。
【００２４】
【表１】
2010047317.tif 000002
【００２５】
本発明のマーカー遺伝子としては、ＴＮＦＳＦ１４、ＣＸＣＬ１０、ＡＺＧＰ１およびＯＶＯＬ１から選択される少なくとも１種の遺伝子が好ましい。ＴＮＦＳＦ１４およびＯＶＯＬ１から選択される少なくとも１種の遺伝子がより好ましい。
【００２６】
本発明のマーカー遺伝子には、配列番号１〜８記載の全てまたはその一部の塩基配列を有するものおよびその相補的な塩基配列が含まれる。
【００２７】
本発明の間質性膀胱炎を検出する為のｍＲＮＡは、本発明のマーカー遺伝子によって発現される少なくとも１種のポリヌクレオチドからなる。
【００２８】
本発明の間質性膀胱炎を検出する為のｃＤＮＡは、前記ｍＲＮＡから変換されるポリヌクレオチドからなる。
【００２９】
本発明の間質性膀胱炎を検出する為のｃＲＮＡは、前記ｃＤＮＡから調製されるポリヌクレオチドからなる。
【００３０】
本発明の間質性膀胱炎を検出する為のｃＲＮＡのフラグメントは、前記のｃＲＮＡのフラグメント化により得られるポリヌクレオチドからなる。
【００３１】
本発明のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、これらのフラグメントおよび相補鎖は、検出する為の各種修飾および標識化されたポリヌクレオチドを含む。各種修飾および標識化は、ビオチン化、蛍光標識化および放射標識化が含まれる。標識化されたポリヌクレオチドとして好ましくは、標識化されたｃＲＮＡおよび標識化されたｃＲＮＡのフラグメントである。
【００３２】
（Ｂ）間質性膀胱炎を検出する方法
【００３３】
本発明の間質性膀胱炎を検出する方法は、次の工程により実施される。
被験者から検体を得、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製する。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡから本発明のマーカー遺伝子由来のポリヌクレオチドを調製する。調製されたポリヌクレオチドをプローブとハイブリダイズさせる。その結果得られるマーカー遺伝子の発現量を測定し、マーカー遺伝子の定量をする。マーカー遺伝子の発現量により間質性膀胱炎を検出する。
【００３４】
（Ｂ１）検体の調製方法
【００３５】
被験者から得る検体としては、膀胱上皮細胞、尿剥離細胞、血液および尿などが挙げられる。被験者から得る検体としては、膀胱上皮細胞および尿剥離細胞が好ましく、膀胱上皮細胞がより好ましい。膀胱上皮細胞の採取箇所としては膀胱上皮であれば特に限定されるものではなく、非出血部分または非潰瘍部分のいずれも含まれる。
【００３６】
プローブとハイブリダイズさせるためのｔｏｔａｌ  ＲＮＡから調製されるポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびｃＲＮＡのいずれでもよい。ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡは、フラグメント化されていてもよい。このようなポリヌクレオチドとしては、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡまたはｃＲＮＡのフラグメントが好ましい。ｃＲＮＡまたはｃＲＮＡのフラグメントがより好ましい。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのフラグメントは、修飾又は標識化されていても良い。
【００３７】
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡおよびｍＲＮＡは、J. Sambrook, et al., 「Molecular Cloning 2nd edition」, 1989年に記載の以下の方法に従って調製できる。採取した検体（組織サンプル）をグアニジウム含有緩衝液中でホモジナイズすることにより、組織ライセートを調製する。組織ライセートに界面活性剤を添加し、室温で遠心分離することにより上清を得る。上清に塩化セシウム水溶液を加え、超遠心法により一晩遠心分離することにより得られた沈殿物を洗浄、乾燥する。さらにエタノール沈殿法により、目的とするｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得ることができる。必要に応じてｔｏｔａｌ  ＲＮＡからｍＲＮＡを調製することもでき、以下のように調製することができる。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをオリゴｄTカラムクロマトグラフィーを用いて精製し、ポリＡ配列を有するＲＮＡ分画（すなわちｍＲＮＡ）を濃縮する。得られた濃縮物を洗浄した後、緩衝液を用いて溶出することによりｍＲＮＡを得ることができる。
【００３８】
ｃＤＮＡは、J. Sambrook, et al., 「Molecular Cloning 2nd edition」, 1989年に記載の以下の方法に従って調製できる。ｃＤＮＡ、すなわちｍＲＮＡに相補的なＤＮＡは、１２塩基から１８塩基のデオキシチミジンヌクレオチドのポリマーからなるoligo(dT) primerあるいは６塩基以上のデオキシチミジン、デオキシアデニン、デオキシシチジン、デオキシグアニンが無作為に配列されたrandom oligo primerのいずれか、または混合したプライマーを利用して、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡあるいはｍＲＮＡを鋳型にしてdNTPs（deoxyribonucleoside triphosphates）の存在下において逆転写酵素の働きによってＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドとして合成される。
【００３９】
ｃＲＮＡは、J. Sambrook, et al., 「Molecular Cloning 2nd edition」, 1989年に記載の以下の方法に従って調製できる。ｃＲＮＡ、すなわちｃＤＮＡに相補的なＲＮＡは、oligo(dT) primerにバクテリオファージT7 promoterを配置したプライマーを用いて調製したｃＤＮＡを鋳型として、NTPs（ribonucleoside triphosphates）の存在下においてT7 RNA polymeraseによって相補鎖を合成させることによって調製する。このとき混合するNTPにCyanine 3-CTPを添加して、蛍光標識化ｃＲＮＡとして合成することも可能である。
【００４０】
（Ｂ２）プローブとハイブリダイズさせる方法
【００４１】
本発明のマーカー遺伝子を検出するプローブとしては表２に示したポリヌクレオチドが例示される。
【００４２】
【表２】
2010047317.tif 000003
【００４３】
本発明に使用されるＤＮＡチップは、本発明のマーカー遺伝子によって調製されるポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるプローブを備える。
【００４４】
本発明のマーカー遺伝子を用いた間質性膀胱炎を検出する為に使用するＤＮＡチップは、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＲＮＡのフラグメントの塩基配列またはその相補的配列からなるポリヌクレオチドを備えるＤＮＡチップである。このようなＤＮＡチップとしては、ＤＮＡマイクロアレイが好ましい。ＴＮＦＳＦ１４、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ２、ＡＺＧＰ１およびＯＶＯＬ１から選択される少なくとも１種の遺伝子を検出することができるプローブを備えるＤＮＡマイクロアレイがより好ましい。このようなマイクロアレイとしては、アジレントテクノロジーズ社のＷｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４４Ｋ、アフィメトリクス社のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＨＧ−Ｕ１３３およびイルミナ社のＨｕｍａｎＷＧ−６等を挙げることができる。本発明のマーカー遺伝子を検出する為のマイクロアレイとしては、アジレントテクノロジーズ社のＷｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４４Ｋを使用するのが好ましい。
【００４５】
また、本発明のマーカー遺伝子を検出するプローブと本発明のマーカー遺伝子によって調製されるポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる方法としては、ＤＮＡチップのほか、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であってもよい。ＰＣＲのために本発明のマーカー遺伝子によって調製されるポリヌクレオチドとしては、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが好ましい。
【００４６】
プローブを使用するＰＣＲとしては、ＴａｑＭａｎ法、サイクリングプローブ法またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ法等の蛍光プローブ法を挙げることができる。
【００４７】
蛍光プローブ法以外のＰＣＲとしては、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  Ｉ等を用いるインターカレーター法も挙げることができる。
【００４８】
インターカレーター法において用いることができるプライマーとしては、表３に示したポリヌクレオチドが例示される。
【００４９】
【表３】
2010047317.tif 000004
【００５０】
また、ＰＣＲは、当該技術分野において周知である。ＰＣＲの方法およびそのプロトコールの総説は、例えば、Ｍ．Ｔｅｖｆｉｋ Ｄｏｒａｋ編集、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ （ＢＩＯＳ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ）」Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ社、２００６年に記載されている。ＰＣＲ試薬およびそのプロトコールは、タカラバイオ社等から入手可能である。
【００５１】
このようなＰＣＲは、当該技術分野において周知である。ＰＣＲの方法およびそのプロトコールの総説は、例えば、Ｍ．Ｔｅｖｆｉｋ Ｄｏｒａｋ編集、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ （ＢＩＯＳ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ）」Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ社、２００６年に記載されている。ＰＣＲのための試薬およびプロトコールを含むキットは、市販されており、例えば、タカラバイオ社等から入手可能である。
【００５２】
（Ｂ３）マーカー遺伝子の発現量の定量
【００５３】
本発明のマーカー遺伝子を用いた間質性膀胱炎を検出する方法において、マーカー遺伝子の定量は１細胞あたりの絶対量または相対量のいずれで測定してもよい。マーカー遺伝子発現量は、測定操作が簡便かつ正確なことから、相対量として測定することが好ましい。前記相対量は、内部標準となる遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）を設定し、マーカー遺伝子発現量とハウスキーピング遺伝子発現量との比較によって相対量を算出することができる。ハウスキーピング遺伝子としては、ＧＡＰＤＨおよびβアクチンが好ましく、ＧＡＰＤＨがより好ましい。
【００５４】
間質性膀胱炎を検出する方法としては、本発明のマーカー遺伝子の絶対量、マーカー遺伝子とハウスキーピング遺伝子との比または間質性膀胱炎患者の膀胱上皮細胞と非間質性膀胱炎患者の膀胱上皮細胞とのマーカー遺伝子の比などを用いることができる。間質性膀胱炎患者のマーカー遺伝子と正常細胞のマーカー遺伝子との発現量の比較は、健常者または非間質性膀胱炎患者の細胞を対照とすることにより行うことができる。
【００５５】
間質性膀胱炎を検出する為には、遺伝子発現量比変化（発現量フォールド変化）を求めるか、またはカットオフ値を設定することにより行うことができる。
【００５６】
ここで「遺伝子発現量比変化（発現量フォールド変化）」とは、正常膀胱粘膜組織と間質性膀胱炎患者の膀胱粘膜組織における任意の遺伝子の発現量の相対的変化量を示すものである。具体的には、ある遺伝子の間質性膀胱炎患者の膀胱粘膜組織の発現量を正常膀胱粘膜組織の発現量で除した値、すなわち正常膀胱粘膜組織の発現量を１とした場合の間質性膀胱炎患者の膀胱粘膜組織における遺伝子の相対的変化量を示す。
【００５７】
ここで「カットオフ値」とは、被験者が当該の疾患であるかを判断する目安となる値である。間質性膀胱炎罹患時に増加する遺伝子においては、マーカー遺伝子の測定値が所定のカットオフ値を上回る場合、間質性膀胱炎である可能性が高いと判断される。間質性膀胱炎罹患時に減少する遺伝子においては、マーカー遺伝子の測定値が所定のカットオフ値を下回る場合、間質性膀胱炎である可能性が高いと判断される。一方、測定値が正常を示す範囲の値（正常値）の範囲内である場合、被験者が当該の疾患ではない可能性が高いと判断される。
【００５８】
本発明のマーカー遺伝子のカットオフ値としては、マーカー遺伝子とハウスキーピング遺伝子との比を用いることができる。検体のマーカー遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の遺伝子発現強度を測定する。得られた検体の発現強度（シグナル強度）は、ハウスキーピング遺伝子のシグナル強度平均値との比を計算し、正規化（ノーマライゼーション）する。間質性膀胱炎患者群と対照群とにおいて、それぞれの正規化されたシグナル強度を比較して、両群を分離する事が可能な値を任意に設定する事によりカットオフ値とする事ができる。両群を分離する事が可能なカットオフ値としては、設定されたカットオフ値により、間質性膀胱炎患者群と対照群との間の感度または特異性が６５％以上で有ることが好ましく、８０％以上がより好ましく、９５％以上が更に好ましい。
【００５９】
このようなカットオフ値の設定例としては、マイクロアレイを用いた方法を例示する事ができる。検体のマーカー遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の蛍光強度をマイクロアレイで測定する。得られた検体の蛍光強度（シグナル強度）は、ハウスキーピング遺伝子のシグナル強度平均値との比を計算し、正規化（ノーマライゼーション）する。間質性膀胱炎患者群と対照群とにおいて、それぞれの正規化されたシグナル強度を比較して、両群を分離する事が可能な値を設定する事によりカットオフ値とする事ができる。両群を分離する事が可能なカットオフ値としては、間質性膀胱炎患者群のシグナル強度平均値と対照群のシグナル強度平均値との間の範囲から１つの値を設定する事ができる。間質性膀胱炎罹患時に増加する遺伝子においては、間質性膀胱炎患者群の最小値と対照群のシグナル最大値との間の範囲から１つの値を設定する事もできる。間質性膀胱炎罹患時に減少する遺伝子においては、間質性膀胱炎患者群の最大値と対照群のシグナル最小値との間の範囲から１つの値を設定する事もできる。
【００６０】
マーカー遺伝子がＴＮＦＳＦ１４、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ２である場合、測定された遺伝子発現量がカットオフ値以上であれば、被験者が間質性膀胱炎である可能性が高いことを示す。これらのマーカー遺伝子において、正規化されたシグナル強度を用い、カットオフ値を設定するための好ましい範囲を、間質性膀胱炎患者群のシグナル強度平均値と対照群のシグナル強度平均値との間の範囲、間質性膀胱炎患者群の最小値と対照群のシグナル最大値との間の範囲の順にそれぞれのマーカー遺伝子について以下に示した。
【００６１】
ＴＮＦＳＦ１４のカットオフ値としては、以下の何れかの範囲に設ける事が出来る１つの値を設定する事ができる。カットオフ値を選ぶ事ができる範囲としては、５５０〜３８００が好ましく、８００〜２３００がより好ましい。
【００６２】
ＣＸＣＬ９のカットオフ値としては、以下の何れかの範囲に設ける事が出来る１つの値を設定する事ができる。カットオフ値を選ぶ事ができる範囲としては、１８００〜２４０００が好ましく、３８００〜８２００がより好ましい。
【００６３】
ＣＸＣＬ１０のカットオフ値としては、以下の何れかの範囲に設ける事が出来る１つの値を設定する事ができる。カットオフ値を選ぶ事ができる範囲としては、３５０〜６１００が好ましく、６９０〜２５００がより好ましい。
【００６４】
ＣＸＣＬ１１のカットオフ値としては、以下の何れかの範囲に設ける事が出来る１つの値を設定する事ができる。カットオフ値を選ぶ事ができる範囲としては、２８０〜６６００が好ましく、７９０〜１８００がより好ましい。
【００６５】
ＣＸＣＲ３のカットオフ値としては、以下の何れかの範囲に設ける事が出来る１つの値を設定する事ができる。カットオフ値を選ぶ事ができる範囲としては、３８００〜２１０００が好ましく、６０００〜１００００がより好ましい。
【００６６】
ＣＣＲ２のカットオフ値としては、以下の何れかの範囲に設ける事が出来る１つの値を設定する事ができる。カットオフ値を選ぶ事ができる範囲としては、９９０〜８７００が好ましく、１７００〜５１００がより好ましい。
【００６７】
マーカー遺伝子がＡＺＧＰ１およびＯＶＯＬ１である場合、測定された遺伝子発現量がカットオフ値以下であれば、被験者が間質性膀胱炎である可能性が高いことを示す。これらのマーカー遺伝子において、正規化されたシグナル強度を用い、カットオフ値を設定するための好ましい範囲を、間質性膀胱炎患者群のシグナル強度平均値と対照群のシグナル強度平均値との間の範囲、間質性膀胱炎患者群の最大値と対照群のシグナル最小値との間の範囲の順にそれぞれのマーカー遺伝子について以下に示した。
【００６８】
ＡＺＧＰ１のカットオフ値としては、以下の何れかの範囲に設ける事が出来る１つの値を設定する事ができる。カットオフ値を選ぶ事ができる範囲としては、９７〜７９０が好ましく、２１０〜４６００がより好ましい。
【００６９】
ＯＶＯＬ１のカットオフ値としては、以下の何れかの範囲に設ける事が出来る１つの値を設定する事ができる。カットオフ値を選ぶ事ができる範囲としては、５９０〜９８００が好ましく、９１０〜６４００がより好ましい。
【００７０】
また別の本発明のマーカー遺伝子のカットオフ値としては、本発明のマーカー遺伝子の発現量と正常細胞の遺伝子発現量との比も用いることもできる。被験者から得た検体のマーカー遺伝子の発現量が正常細胞の遺伝子発現量に比較して、その比の変動量が大きいほど間質性膀胱炎の可能性が高くなる。間質性膀胱炎罹患時に高発現する遺伝子においては、遺伝子発現量比変化としては、４倍以上が好ましい。間質性膀胱炎罹患時に低発現する遺伝子においては、遺伝子発現量比変化としては、１／４以下が好ましい。すなわち、マーカー遺伝子がＴＮＦＳＦ１４、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ２である場合、測定された遺伝子発現量比変化が４倍以上であれば、被験者が間質性膀胱炎である可能性が高いことを示す。マーカー遺伝子がＡＺＧＰ１およびＯＶＯＬ１である場合、測定された遺伝子発現量が１／４以下であれば、被験者が間質性膀胱炎である可能性が高いことを示す。
【００７１】
さらに別の本発明のマーカー遺伝子のカットオフ値としては、受信者操作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を作成する事により、カットオフ値を設定する事もできる。ＲＯＣ曲線を基にしたカットオフ値の求め方は、「生物試料分析」２００５年，２８巻，ｐｐ．１３３〜１３９記載の方法に従って設定する事ができる。
【００７２】
本発明のマーカー遺伝子のカットオフ値は、前述遺伝子発現量比変化（発現量フォールド変化）およびＲＯＣ曲線を基にしたカットオフ値に限定されるものでなく、適宜変更することができる。すなわち、マーカー遺伝子の組み合わせ、マーカー遺伝子の定量方法および比較方法、早期診断、早期治療または治療効果の評価などの臨床上の使用目的など所望する感度や特異度などの条件に応じてカットオフ値や遺伝子量比変化を設定することができる。
【００７３】
（Ｃ）間質性膀胱炎を検出する為のキット
本発明のマーカー遺伝子を用いての間質性膀胱炎を診断する為のｃＲＮＡを定量する為のキットは、ｃＲＮＡフラグメントを得る為の試薬、ＤＮＡマイクロアレイ、説明書等を含む。ｃＲＮＡフラグメントを得る為の試薬としては、反応試薬、酵素および緩衝液等が含まれる。
【００７４】
（Ｄ）間質性膀胱炎動物モデルの評価
本発明のマーカー遺伝子を検出することによる間質性膀胱炎の検出方法は、各種間質性膀胱炎動物モデルの評価に用いることもできる。間質性膀胱炎動物モデルとしては、マウス、ラット、イヌ、サル、チンパンジーなどの哺乳動物が挙げられる。これらの動物の膀胱組織を採取し、前記（Ｂ）間質性膀胱炎を検出する方法に記載の方法でマーカー遺伝子の発現量を測定する。遺伝子発現量の変化量を指標として、間質性膀胱炎、特に潰瘍型間質性膀胱炎の動物モデルとしての妥当性評価を行うことができる。
なお、前記（１）および（２）記載の遺伝子は、ヒト由来の遺伝子配列である為、動物モデルにおいては使用する種のヒト遺伝子に相当する遺伝子をマーカーとして用いる。このような遺伝子としては、表４に示した遺伝子を利用することができる。
【００７５】
【表４】
2010047317.tif 000005
【００７６】
なお、各動物種におけるマーカー遺伝子とヒトにおけるマーカー遺伝子との対応は、Ｔｎｆｓｆ１４がＴＮＦＳＦ１４、Ｃｘｃｌ９がＣＸＣＬ９、Ｃｘｃｌ１０がＣＸＣＬ１０、Ｃｘｃｌ１１がＣＸＣＬ１１、Ｃｘｃｒ３がＣＸＣＲ３、Ｃｃｒ２がＣＣＲ２、Ｏｖｏｌ１がＯＶＯＬ１、Ａｚｇｐ１がＡＺＧＰ１にそれぞれ相当する。
【００７７】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００７８】
実施例１
検体
潰瘍型ＩＣ患者（間質性膀胱炎患者の膀胱の非潰瘍部位）における膀胱粘膜の遺伝子発現変動プロファイルを検討するため、潰瘍型ＩＣ患者６例と対照５例（膀胱ガン患者の非腫瘍部位）の検体（膀胱粘膜生検サンプル）を収集した。膀胱粘膜生検サンプル（生検サンプル）は、当該研究への臨床検体の使用に関するインフォームドコンセントに基づき、患者本人または代理人の同意を得た上で採取されたものである。採取後の生検サンプルを速やかに十分量のＲＮＡｌａｔｅｒ試薬（キアゲン社）に浸漬し、−８０℃で安定的に保存した。適宜膀胱粘膜からＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてキアゲン社のプロトコルに従いｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡの濃度を常法に従って測定した後、−３０℃にて冷凍保存した。【００７９】
実施例２
ＤＮＡマイクロアレイ法
アジレントテクノロジーズ社の試薬キット（Ｌｏｗ  ＲＮＡ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、製品番号５１８８−５３３９）を用い、プロトコル（Ｌｏｗ  ＲＮＡ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ対応プロトコル）に従ってマイクロアレイ実験を行った。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（２００−１，０００  ｎｇ）を用い、Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒおよびＭＭＬＶ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅの存在下において４０℃、２時間反応させることにより相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。さらに得られたｃＤＮＡをもとにシアニン３（Ｃｙ３）−ＣＴＰおよびＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの存在下において４０℃、２時間反応させることにより、Ｃｙ３ラベル化相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を合成した。得られたｃＲＮＡ（１６５０ｎｇ）をフラグメンテーション緩衝液中で６０℃、３０分反応させることによりフラグメント化した後、Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４４Ｋ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（製品番号Ｇ４１１２Ｆ）に６５℃で１７時間ハイブリダイズさせた。その後Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ１、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ２（製品番号５１８８−５３２７）およびアセトニトリル中で適宜洗浄した後、アジレント・マイクロアレイスキャナを用いて画像データを取得した。さらに画像解析ソフトＦｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｖｅｒ.８．５（アジレントテクノロジーズ社）により、発現量の定量データを算出した。【００８０】
実施例３
データ解析
個々のサンプルに対応する発現量の定量データファイルをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ｖｅｒ.７．３（アジレントテクノロジーズ社）に取り込み、発現データを解析することによって、潰瘍型ＩＣ患者群において遺伝子発現に変化の認められる遺伝子の同定を試みた。具体的には潰瘍型ＩＣ群と対照群の二群の比較はＰｅｒ  Ｃｈｉｐ（各サンプルのｒａｗ  ｓｉｇｎａｌの中央値による）正規化後、Ｐｅｒ  Ｇｅｎｅ（各プローブのｒａｗ  ｓｉｇｎａｌの中央値による）正規化を行い、Ｖｏｌｃａｎｏ  Ｐｌｏｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓにより、潰瘍型ＩＣ群の定量データを対照群の定量データで除することにより算出された相対的な遺伝子発現量比変化（発現量フォールド変化）及びｔ−ｔｅｓｔにおける有意差（ｐ−ｖａｌｕｅ）に基づき、それぞれ発現量フォールド変化を４倍以上、ｐ−ｖａｌｕｅ  ｃｕｔｏｆｆを０．００１以下に設定することによって９７遺伝子に対応するプローブを抽出した。さらにＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ｖｅｒ.７．３を用い、前記９７遺伝子について階層的クラスタリング解析を行った。さらに目視による検討（マニュアル・インスペクション）を加えた。マニュアル・インスペクションによる選択の条件としては、次の４条件とした。１）正常な膀胱組織で安定して発現する遺伝子、２）潰瘍型間質性膀胱炎の膀胱組織中で安定して発現する遺伝子、３）相対的な遺伝子発現量が潰瘍型ＩＣ患者群において全例増加または対照群において全例低下している遺伝子、４）相対的な遺伝子発現量が潰瘍型ＩＣ患者群において全例低下または対照群において全例増加している遺伝子とした。その結果、潰瘍型ＩＣ患者群と対照群とを分離するマーカー遺伝子として表５に示したＴＮＦＳＦ１４、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ２、ＡＺＧＰ１およびＯＶＯＬ１が見出された。【００８１】
【表５】
2010047317.tif 000006
【００８２】
個々の遺伝子の発現データ（ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌ）はハウスキーピング遺伝子Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）の発現データ（ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌ）を用いて正規化した。さらに、グラフ解析ソフトＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒ.４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ.）を用いてＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔによる統計処理を行い、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と潰瘍型ＩＣ群（ＩＣ（Ｕｌｃｅｒ））のマイクロアレイ発現データ（ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌ）のグラフとして図１〜８に示した。また、特許文献２記載の公知のマーカー遺伝子であるウロプラキンＩＩＩ（ＵＰＫ３Ｂ）についても同様に解析した結果を図９に示した。【００８３】
実施例４
マーカー遺伝子の感度および特異性による評価
実施例３で見出したマーカー遺伝子について、カットオフ値を選定可能な範囲からマーカー遺伝子評価の為の任意の値（評価用カットオフ値）を求め、感度および特異度を指標としてマーカー遺伝子としての有用性を評価した。以下、評価の一例を示した。
実施例３で見出したマーカー遺伝子の評価用カットオフ値は、次の通り設定した。マイクロアレイにより、検体のマーカー遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の蛍光強度をマイクロアレイで測定して得られた検体の蛍光強度（Ｒａｗ  ｓｉｇａｎｌ強度）は、ハウスキーピング遺伝子の蛍光強度中央値との比を計算し、正規化（ノーマライゼーション）した。ＴＮＦＳＦ１４、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ２については、間質性膀胱炎患者群における正規化された蛍光強度の最小値と対照群の正規化された蛍光強度の最大値との平均値を計算し、これを評価用カットオフ値とした。また、ＡＺＧＰ１およびＯＶＯＬ１については、間質性膀胱炎患者群における正規化された蛍光強度の最大値と対照群の正規化された蛍光強度の最小値との平均値を計算し、これを評価用カットオフ値とした。各マーカー遺伝子における正規化された蛍光強度による評価用カットオフ値とその設定値から期待される感度および特異度を表６に示した。また、比較例として特許文献２記載の公知マーカー遺伝子であるウロプラキンＩＩＩ（ＵＰＫ３Ｂ）についても、感度および特異度を本発明のマーカー遺伝子と同様に算出し、表６に示した。【００８４】
【表６】
2010047317.tif 000007
【００８５】
本発明マーカー遺伝子であるＴＮＦＳＦ１４、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ２、ＡＺＧＰ１およびＯＶＯＬ１は、潰瘍型間質性膀胱炎を感度良く、特異的に検出できることが分かった。【００８６】
よって、本発明において見出されたマーカー遺伝子であるＴＮＦＳＦ１４、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ２、ＡＺＧＰ１およびＯＶＯＬ１は、間質性膀胱炎、特に潰瘍型間質性膀胱炎を検出する為のマーカー遺伝子として有用であり、潰瘍型間質性膀胱炎を感度および特異度が高く検出する事ができる。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明のマーカー遺伝子は、間質性膀胱炎、特に潰瘍型間質性膀胱炎を検出する為に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００８８】
＜配列表１＞配列番号１は、ヒトＴＮＦＳＦ１４のＤＮＡの配列である。
＜配列表２＞配列番号２は、ヒトＣＸＣＬ９のＤＮＡの配列である。
＜配列表３＞配列番号３は、ヒトＣＸＣＬ１０のＤＮＡの配列である。
＜配列表４＞配列番号４は、ヒトＣＸＣＬ１１のＤＮＡの配列である。
＜配列表５＞配列番号５は、ヒトＣＸＣＲ３のＤＮＡの配列である。
＜配列表６＞配列番号６は、ヒトＣＣＲ２のＤＮＡの配列である。
＜配列表７＞配列番号７は、ヒトＡＺＧＰ１のＤＮＡの配列である。
＜配列表８＞配列番号８は、ヒトＯＶＯＬ１のＤＮＡの配列番号である。
＜配列表９＞配列番号９は、本発明のマーカー遺伝子の１つであるＴＮＦＳＦ１４を検出する為のプローブの配列である。
＜配列表１０＞配列番号１０は、本発明のマーカー遺伝子の１つであるＣＸＣＬ９を検出する為のプローブの配列である。
＜配列表１１＞配列番号１１は、本発明のマーカー遺伝子の１つであるＣＸＣＬ１０を検出する為のプローブの配列である。
＜配列表１２＞配列番号１２は、本発明のマーカー遺伝子の１つであるＣＸＣＬ１１を検出する為のプローブの配列である。
＜配列表１３＞配列番号１３は、本発明のマーカー遺伝子の１つであるＣＸＣＲ３を検出する為のプローブの配列である。
＜配列表１４＞配列番号１４は、本発明のマーカー遺伝子の１つであるＣＣＲ２を検出する為のプローブの配列である。
＜配列表１５＞配列番号１５は、本発明のマーカー遺伝子の１つであるＡＺＧＰ１を検出する為のプローブの配列である。
＜配列表１６＞配列番号１６は、本発明のマーカー遺伝子の１つであるＯＶＯＬ１を検出する為のプローブの配列である。
＜配列表１７＞配列番号１７は、ラットＴｎｆｓｆ１４のＤＮＡの配列である。
＜配列表１８＞配列番号１８は、ラットＣｘｃｌ９のＤＮＡの配列である。
＜配列表１９＞配列番号１９は、ラットＣｘｃｌ１０のＤＮＡの配列である。
＜配列表２０＞配列番号２０は、ラットＣｘｃｌ１１のＤＮＡの配列である。
＜配列表２１＞配列番号２１は、ラットＣｘｃｒ３のＤＮＡの配列である。
＜配列表２２＞配列番号２２は、ラットＣｃｒ２のＤＮＡの配列である。
＜配列表２３＞配列番号２３は、ラットＡｚｇｐ１のＤＮＡの配列である。
＜配列表２４＞配列番号２４は、ラットＯｖｏｌ１のＤＮＡの配列である。
＜配列表２５＞配列番号２５は、マウスＴｎｆｓｆ１４のＤＮＡの配列である。
＜配列表２６＞配列番号２６は、マウスＣｘｃｌ９のＤＮＡの配列である。
＜配列表２７＞配列番号２７は、マウスＣｘｃｌ１０のＤＮＡの配列である。
＜配列表２８＞配列番号２８は、マウスＣｘｃｌ１１のＤＮＡの配列である。
＜配列表２９＞配列番号２９は、マウスＣｘｃｒ３のＤＮＡの配列である。
＜配列表３０＞配列番号３０は、マウスＣｃｒ２のＤＮＡの配列である。
＜配列表３１＞配列番号３１は、マウスＡｚｇｐ１のＤＮＡの配列である。
＜配列表３２＞配列番号３２は、マウスＯｖｏｌ１のＤＮＡの配列である。
【図１】
2010047317.tif 000008
【図２】
2010047317.tif 000009
【図３】
2010047317.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010047317.tif 000014
【図８】
2010047317.tif 000015
【図９】
2010047317.tif 000016
【配列表】
2010047317000001.app
【国際調査報告】
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