(57)【要約】ジヒドロピリミジン脱水素酵素阻害剤を含まない欧米における５−フルオロウラシルを含む標準的療法より高い延命効果を有する新規な抗腫瘍剤を開発する。進行胃癌患者に対してジヒドロピリミジン脱水素酵素を指標として患者を選択することにより、ジヒドロピリミジン脱水素酵素阻害剤を含まない欧米における５−フルオロウラシルを含む標準的療法より優れた延命効果を発揮することができる、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びシスプラチンからなる抗腫瘍剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）〜（２）を含む、胃癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とシスプラチンの併用化学療法に対する治療効果を予測する方法：
（１）患者から採取された癌細胞を含み得る生体試料に含まれるジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の発現量を測定する工程、
（２）上記工程（１）で得られた発現量が、予め設定した対応するカットオフポイントと比較して高い場合、患者が当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
【請求項２】
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤における各有効成分のモル比が、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム＝１：０．４：１である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法により、患者が当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に当該併用化学療法を実施することを特徴とする、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びシスプラチンからなる抗腫瘍剤。
【請求項４】
請求項１又は２記載の方法により当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に当該併用化学療法を実施することを特徴とする、胃癌の治療方法。
【請求項５】
請求項１又は２記載の方法により当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に当該併用化学療法を実施するための、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びシスプラチンからなる抗腫瘍剤の使用。
【請求項６】
ジヒドロピリミジン脱水素酵素の発現量測定用のプライマー対であって、配列番号１のフォワードプライマーと配列番号２のリバースプライマー、又は配列番号７のフォワードプライマーと配列番号８のリバースプライマーを含む、プライマー対。
【請求項７】
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を含む化学療法に対する治療効果の予測に用いるための、請求項６記載のプライマー対。
【請求項８】
胃癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とシスプラチンの併用化学療法に対する治療効果の予測に用いるための、請求項７記載のプライマー対。
【請求項９】
配列番号１のフォワードプライマーと配列番号２のリバースプライマー、又は配列番号７のフォワードプライマーと配列番号８のリバースプライマーからなるジヒドロピリミジン脱水素酵素の発現量測定用のプライマー対を含む、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を含む化学療法に対する治療効果を予測するためのキット。
【請求項１０】
胃癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とシスプラチンの併用化学療法に対する治療効果を予測するための、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
さらに、配列番号３又は９のプローブを含む、請求項１０記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とシスプラチンの併用化学療法に対する治療効果を予測する方法、当該併用化学療法に高い延命効果を示すと予測された患者に投与するための抗腫瘍剤、プライマー対及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
進行胃癌に対する化学療法として、国内外において５−フルオロウラシル（以下、５−ＦＵと称す。）、シスプラチン、イリノテカン、ドセタキセル、テガフール・ウラシル配合剤（商品名：ユーエフティー（登録商標））、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（商品名：ティーエスワン（登録商標）、以下、テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウムがモル比１：０．４：１で配合された製剤をＴＳ−１と称す。）などの抗腫瘍剤が単剤でもしくは併用にて臨床応用されている。欧米においては５−ＦＵとシスプラチンの併用化学療法が標準的療法となっているが、延命効果においてはまだ満足できるものではなく、より高い延命効果を示す併用化学療法としてＴＳ−１とシスプラチンの併用化学療法が期待されている（非特許文献１および２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  ２００７；１０９：３３−４０．
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ  ２００６；２４：６６３−６６７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、進行胃癌患者に対して、ジヒドロピリミジン脱水素酵素阻害剤を含まない欧米における５−ＦＵを含む標準的療法（例えば、５−ＦＵとシスプラチンの併用化学療法など）に比し高い治療効果（特に延命効果）を奏する併用化学療法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、進行胃癌に対する化学療法について研究を重ねた結果、ジヒドロピリミジン脱水素酵素（以下、ＤＰＤと称すことがある。）の発現量（ｍＲＮＡ量または酵素量）が高い患者において、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とシスプラチンの併用化学療法がジヒドロピリミジン脱水素酵素阻害剤を含まない欧米における５−ＦＵを含む標準的療法（例えば、５−ＦＵとシスプラチンの併用化学療法など）に比して高い延命効果を示すことを見出し、本発明は完成に至った。なお、ジヒドロピリミジン脱水素酵素は５−ＦＵの分解酵素であり、従来から５−ＦＵの治療効果規定因子として知られているが、ＴＳ−１には、ジヒドロピリミジン脱水素酵素の阻害剤であるギメラシルが配合されており、ジヒドロピリミジン脱水素酵素はＴＳ−１の治療効果規定因子とはならないことが知られている（例えば、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１１９，１９２７−１９３３（２００６））。また、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とシスプラチンの併用化学療法がジヒドロピリミジン脱水素酵素阻害剤を含まない欧米における５−ＦＵを含む標準的療法（例えば、５−ＦＵとシスプラチンの併用化学療法など）に比し高い延命効果を示す患者層の予測にジヒドロピリミジン脱水素酵素の発現産物（ｍＲＮＡ、酵素）量を指標にできることは全く知られていない。【０００６】
すなわち本発明は、以下のテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とシスプラチンの併用化学療法に対する治療効果を予測する方法、抗腫瘍剤、プライマー対及びキットを提供するものである。
項１．
下記工程（１）〜（２）を含む、胃癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とシスプラチンの併用化学療法に対する治療効果を予測する方法：
（１）患者から採取された癌細胞を含み得る生体試料に含まれるジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の発現量を測定する工程、
（２）上記工程（１）で得られた発現量が、予め設定した対応するカットオフポイントと比較して高い場合、患者が当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
項２．
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤における各有効成分のモル比が、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム＝１：０．４：１である、項１記載の方法。
項３．
項１又は２記載の方法により、患者が当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に当該併用化学療法を実施することを特徴とする、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びシスプラチンからなる抗腫瘍剤。
項４．
項１又は２記載の方法により当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に当該併用化学療法を実施することを特徴とする、胃癌の治療方法。
項５．
項１又は２記載の方法により当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に当該併用化学療法を実施するための、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びシスプラチンからなる抗腫瘍剤の使用。
項６．
ジヒドロピリミジン脱水素酵素の発現量測定用のプライマー対であって、配列番号１のフォワードプライマーと配列番号２のリバースプライマー、又は配列番号７のフォワードプライマーと配列番号８のリバースプライマーを含む、プライマー対。
項７．
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を含む化学療法に対する治療効果の予測に用いるための、項６記載のプライマー対。
項８．
胃癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とシスプラチンの併用化学療法に対する治療効果の予測に用いるための、項７記載のプライマー対。
項９．
配列番号１のフォワードプライマーと配列番号２のリバースプライマー、又は配列番号７のフォワードプライマーと配列番号８のリバースプライマーからなるジヒドロピリミジン脱水素酵素の発現量測定用のプライマー対を含む、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を含む化学療法に対する治療効果を予測するためのキット。
項１０．
胃癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とシスプラチンの併用化学療法に対する治療効果を予測するための、項９記載のキット。
項１１．
さらに、配列番号３又は９のプローブを含む、項１０記載のキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の予測方法は、胃癌患者においてジヒドロピリミジン脱水素酵素阻害剤を含まない欧米における５−ＦＵを含む標準的療法より高い治療効果（特に延命効果）を有する有効な化学療法の選択を可能にするものである。つまり、胃癌患者に対し高い治療効果（特に延命効果）を示す併用化学療法を的確に提供することができ、不要な化学療法を省くことができることから、医療経済的にも好ましい。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の予測方法は、患者のジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の発現量に基づき、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とシスプラチンの併用化学療法を選択するのに十分な治療効果（特に延命効果）を示す可能性が高い患者を予測するものである。
【０００９】
本発明において「テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とシスプラチンの併用化学療法」とは、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とシスプラチンの両方の抗腫瘍剤を併用して投与する化学療法を意味する。なお、前記配合剤とシスプラチンを併用投与する場合、配合剤とシスプラチンは同時に投与してもよく、一定の間隔をあけて投与してもよい。
【００１０】
本発明において、「併用化学療法を選択するのに十分な治療効果」とは、欧米などで使用されている５−ＦＵを含む標準療法（例えば、５−ＦＵとシスプラチンの併用化学療法）より優れた治療効果を示すことを意味する。このような高い治療効果を示すか否かは、ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の発現量がカットオフポイント以上か否かで判断でき、ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の発現量がカットオフポイント以上であれば、併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を有すると判断される。
【００１１】
本発明における治療効果は、延命効果や腫瘍縮小効果として判定することができるが、延命効果として判定することが好ましい。延命効果は、生存期間の中央値（期間が長いほど延命効果が高い）、１年生存率及び２年生存率（割合が大きいほど延命効果が高い）、ハザード（ある瞬間での死亡率）などにより評価することができる。
【００１２】
本発明における有効成分であるテガフール（一般名、化学名：５−フルオロ−１−（２−テトラヒドロフリル）−２，４−（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン）は、公知の化合物であり、生体内で活性化を受けて抗腫瘍活性の本体である５−ＦＵを放出する薬剤である。テガフールは、公知の方法、例えば特公昭４９−１０５１０号に記載されている方法に従って製造できる。
【００１３】
本発明における有効成分であるギメラシル（一般名、化学名：２，４−ジヒドロキシ−５−クロロピリジン）も、公知の化合物であり、それ自身全く抗腫瘍活性を有さないものであるが、５−ＦＵが生体内において代謝されて不活性化されることを抑制するものであり、抗腫瘍効果を増強させることができる。
【００１４】
本発明における有効成分であるオテラシルカリウム（一般名、化学名：モノポタシウム  １，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−１，３，５−トリアジン−６−カルボキシレート）も公知の化合物であり、それ自身は抗腫瘍活性を有さないが、主に消化管に分布してその部位での５−ＦＵの活性化を抑制することにより消化管障害を抑制するものである。
【００１５】
本発明における有効成分であるシスプラチン（一般名、化学名：（ＳＰ−４−２）ジアミンジクロロプラチナム）は公知の白金錯体化合物であり、ＤＮＡ合成阻害作用により抗腫瘍効果を奏することが知られている。なお、シスプラチンは公知の方法により製造でき、さらにブリプラチン（登録商標、ブリストル・マイヤーズ社製）等の市販医薬品を用いても良い。
【００１６】
本発明において投与されるテガフール、ギメラシル及びオテラシルカリウムの割合は、それぞれの配合目的を奏する範囲であれば特に制限されず、例えば、特許第２６１４１６４号公報に記載されている公知の配合剤と同様の範囲で良く、テガフール１モルに対して、ギメラシルを０．１〜５モル程度、好ましくは０．２〜１．５モル程度とすればよく、オテラシルカリウムを０．１〜５モル程度、好ましくは０．２〜２モル程度とすればよい。特に好ましくは、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム（モル比）＝１：０．４：１である。
【００１７】
本発明において投与されるシスプラチンの割合は、抗腫瘍効果を奏する範囲であれば特に制限されず、例えば、１日量としてテガフール１モルに対して、シスプラチンを０．０１〜５．０モル程度、好ましくは０．１〜２．０モル程度、特に好ましくは０．２〜１．５モル程度とすればよい。
【００１８】
本発明における各有効成分の投与量は、用法、患者の年齢、性別、病期、転移の有無、治療暦、他の抗腫瘍剤の有無などの条件により適宜選択されるが、テガフールの量が０.１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日程度、好ましくは０．２〜４０ｍｇ／ｋｇ／日程度、より好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日程度、ギメラシルの量が、０.０２〜３０ｍｇ／ｋｇ／日程度、好ましくは０．０５〜１２ｍｇ／ｋｇ／日程度、より好ましくは０．１〜６ｍｇ／ｋｇ／日程度、オテラシルカリウムの量が０.１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日程度、好ましくは０．２〜４０ｍｇ／ｋｇ／日程度、より好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日程度、シスプラチンの量が０．０８〜２００ｍｇ／ｋｇ／日程度、好ましくは０．１５〜８０ｍｇ／ｋｇ／日程度、より好ましくは０．４〜４０ｍｇ／ｋｇ／日程度の範囲となる量を目安とするのが良い。また、各有効成分は１日に１回又は複数回に分けて投与される。また、各有効成分は同時又は間隔を空けて投与され、その投与順序は特に制限されない。
【００１９】
本発明において、テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウムは、一の剤型に製剤化した配合剤として提供される。また、本発明において、シスプラチンは、それだけを製剤化した単剤であってもよく、テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウムと併せて一の剤型に製剤化した配合剤であってもよい。好ましくは、それぞれ一の剤型に製剤化した単剤である。
【００２０】
本発明の製剤は、各有効成分が併用投与される限り、上記製剤ごとにそれぞれ個別に製造・包装・流通されるものでよく、また上記製剤のすべて又は一部を併用投与に適した単一のパッケージ（キット製剤）として製造・包装・流通されるものでもよい。
【００２１】
本発明における製剤の投与形態としては特に制限は無く、具体的には経口剤（錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤など）、注射剤、坐剤、貼付剤、軟膏剤等が例示できる。本発明の各有効成分を複数の剤型に製剤化する場合は、当該製剤はそれぞれ異なる投与形態であっても同一の投与形態であってよい。例えば、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤は経口剤、シスプラチンを含有する製剤は注射剤とすることが好ましい。
【００２２】
本発明の製剤は、薬理学的に許容される担体を用いて、それぞれの投与形態において通常公知の製剤化方法により製造される。かかる担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を例示できる。
【００２３】
賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、イノシトール、デキストラン、ソルビトール、アルブミン、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００２４】
滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００２５】
結合剤としては、例えば、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００２６】
崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００２７】
希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００２８】
安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００２９】
等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ホウ酸、ブドウ糖、グリセリン及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００３０】
ｐＨ調整剤及び緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００３１】
無痛化剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００３２】
着色剤としては、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。
【００３３】
矯味・矯臭剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
【００３４】
溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。
【００３５】
懸濁化剤としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム等が挙げられる。
【００３６】
本発明における投与スケジュールは、患者の年齢、性別、病期、転移の有無、治療暦などの条件により適宜選択されるが、例えば、本発明の併用化学療法は、４週間のうちに、テガフール、ギメラシル及びオテラシルカリウムを２１日間連続投与し、その最初の投与日（１日目）にシスプラチンを投与することを１サイクルとして１回又は複数回行うことが好ましい。
【００３７】
本発明の予測方法の対象となる患者は、胃癌を有する患者であるが、原発巣が胃癌であり、胃以外の臓器、組織に転移した胃癌を有する患者であっても良い。
【００３８】
本発明において、対象となる胃癌患者の組織型は、未分化型（Ｄｉｆｆｕｓｅ型）でも分化型（Ｎｏｎ−Ｄｉｆｆｕｓｅ型）でもよいが、ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の発現量が高いと報告（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００４；１１２：９６７−９７３．）されている未分化型（Ｄｉｆｆｕｓｅ型）が、より好ましい。
【００３９】
本発明のジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の発現量測定において用いることができる生体試料としては、癌細胞を含む可能性がある試料であれば特に限定されず、体液（血液、尿等）、組織、その抽出物及び採取した組織の培養物などが例示できる。また、生体試料の採取方法は、生体試料の種類や癌種に応じた方法により適宜選択することができる。生体試料からのＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質の調製は、通常公知の方法により行うことができる。組織としては、特に胃が挙げられるが、胃から他の臓器や腹膜などに転移した場合には、転移した部位が対象の組織となる。
【００４０】
ジヒドロピリミジン脱水素酵素は、ウラシルとチミンの分解経路の初期段階で働く律速酵素であり、５−ＦＵの分解酵素としても知られている。なお、ヒトのジヒドロピリミジン脱水素酵素の遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列は公知である（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９（３７）：２３１９２−６（１９９４））。
【００４１】
本発明の予測方法は、ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の発現量を指標とするが、その発現量としてはｍＲＮＡの発現量であっても、タンパク質の発現量であってもよい。ここでｍＲＮＡの発現量は、ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子と特異的にハイブリダイズするプローブ又はプライマーを用いて、ノーザンブロット法、定量的又は半定量的ＰＣＲ法（例えばＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダーゼーション法など公知の遺伝子発現量の測定法に従い測定することができる。前記発現量は、常に一定範囲の量を発現しているタンパク質／遺伝子（例えばβアクチンなどのハウスキーピング遺伝子又はその発現タンパク質）を基準として、比により評価することができる。
【００４２】
また、タンパク質発現量は、ジヒドロピリミジン脱水素酵素を特異的に認識する抗体を用いて、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法、蛍光免疫測定法、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタン・ブロッティング法、免疫組織化学染色法など公知の免疫学的測定法を行うことにより測定することができる。
【００４３】
ノーザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダーゼーション法などの遺伝子発現量の測定法に用いられるプローブは、ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の塩基配列内の少なくとも１５塩基長〜全塩基長、好ましくは２０塩基長〜全塩基長、より好ましくは３０塩基長〜全塩基長の連続した塩基配列と特異的にハイブリダイズするように、通常公知のプローブ設計方法に従い上記各塩基長を有するポリヌクレオチドとして設計される。
【００４４】
ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法などの定量的又は半定量的ＰＣＲ法に用いられるプライマー、プローブの設計は、例えば以下のようにして行うことができる。
【００４５】
本発明のプライマー及びプローブは、ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の塩基配列内の少なくとも１０塩基長〜全塩基長、好ましくは１０〜１００塩基長、より好ましくは１０〜５０塩基長、さらに好ましくは１０〜３５塩基長の連続した塩基配列と特異的にハイブリダイズするように、通常公知のプライマー及びプローブ設計方法に従い上記各塩基長を有するポリヌクレオチドとして設計される。例えば、ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の発現産物検出用のプライマー、すなわちＰＣＲのフォワードプライマー及びリバースプライマーは、ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子のうちエキソン領域から設計及び合成することができる。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の各エキソン領域のうち、一方を上流側のエキソン領域の塩基配列に基づき設計し（フォワードプライマー）、他方をその下流側のエキソン領域の塩基配列に基づき設計する（リバースプライマー）。例えば、ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子のプライマーをエキソン１〜３に基づき設計する際において、フォワードプライマーをエキソン１領域の配列に基づいて設計する場合は、リバースプライマーは、その下流側のエキソン２又はエキソン３領域の配列に基づいて設計する。リバースプライマーは、ジヒドロピリミジン脱水素酵素のｍＲＮＡの配列に相補的となるように設計する。また、このプライマーとしては、各エキソン領域を含むジヒドロピリミジン脱水素酵素のｍＲＮＡの塩基配列の全て及びその一部の配列を用いることができるが、それぞれのエキソン領域からＰＣＲによる増幅効率を考慮してプライマーを設計するのが望ましい。より具体的には、ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の発現産物検出用のフォワードプライマーとしては、配列番号１又は７で示すプライマーが好ましく、リバースプライマーとしては、配列番号２又は８で示すプライマーが好ましい。ゲノム上のＤＮＡを測定せずに、ｍＲＮＡのみを測定するという点から、フォワードプライマーとしては、配列番号は７で示すプライマーが特に好ましく、リバースプライマーとしては、配列番号８で示すプライマーが特に好ましい。
【００４６】
ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の発現産物検出用プローブとしては、上記プライマーを使用してＰＣＲ反応により、増幅されるジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の各一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズ可能なものであれば特に制限されない。ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の全エキソンの塩基配列あるいはその一部と相補的な配列を有するかあるいはストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なものであればよい。より具体的には、ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の発現産物検出用のプローブとしては、配列番号３又は９で示すプローブが好ましく、ゲノム上のＤＮＡを測定せずに、ｍＲＮＡのみを測定するという点から配列番号９で示すプローブが特に好ましい。
【００４７】
なお、当該プローブは、ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子と特異的にハイブリダイズするものであれば、完全に相補的である必要はない。かかるポリヌクレオチドとして、好ましくはジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補ポリヌクレオチドと比較して、塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチドである。
【００４８】
なお、本発明において「特異的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されないことをいう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、通常公知の方法に従ってハイブリッドを形成する核酸の融解温度（Ｔｍ）などに基づいて決定することができる。具体的なハイブリダイズ状態を維持できる洗浄条件として通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件、より厳格には「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度の条件、さらに厳格には「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件が挙げられる。
【００４９】
また、ヒトにおけるジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の塩基配列が公知であるため、当該プローブ又はプライマーは、その塩基配列に基づいて、通常公知の合成方法、例えば市販のヌクレオチド合成機によって作製することができる。また、その塩基配列を鋳型としてＰＣＲ法によって調製することもできる。
【００５０】
また、当該プローブ又はプライマーは、ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子を容易に検出できるように、通常慣用されている放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、または酵素で標識されていてもよい。
【００５１】
本発明の抗体は、ジヒドロピリミジン脱水素酵素を特異的に認識するものであれば特に制限されず、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよく、Ｆａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片などの抗体断片であってもよい。また、当該抗体は、通常公知の方法に従って製造することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７），  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．１２−１１．１３）。
【００５２】
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とシスプラチンの併用化学療法による治療を実施すべきか否か予測する工程において、ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の発現量が、予め設定した各カットオフポイントと比較して、高い場合、患者が当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する。
【００５３】
本発明におけるカットオフポイントは、測定対象や測定方法の種類などの諸条件により変動するものであるため、条件に合わせて予め設定する必要がある。カットオフポイントは、測定対象（患者の数、年齢、性別、体重、健康状態、疾患の状態）や測定方法（遺伝子とタンパク質のいずれの発現産物を測定対象とするか、測定条件（例えば遺伝子発現産物（ｍＲＮＡ）の測定におけるプライマー、プローブの配列、標識の種類、発現産物がタンパク質の場合の抗体の種類及び感度など）、統計的手法などにより変動するため、本発明は、これらの諸条件により変動し得る任意のカットオフポイントを用いた発明を広く包含し、特定の値に限定されない。ここでカットオフポイントは、予め測定しておいたジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の発現量から種々の統計解析手法により求めることができる。例えば、ＴＳ−１／シスプラチン併用群あるいは５−ＦＵ／シスプラチンの併用化学療法を受けた患者におけるジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の発現量の平均値や中央値；５−ＦＵ／シスプラチン併用群に対するＴＳ−１／シスプラチン併用群のハザード比（ある瞬間における死亡率の比）が最小となる値；ＴＳ−１／シスプラチン併用群と５−ＦＵ／シスプラチン併用群の２年生存率の差が最大となる値；５−ＦＵ／シスプラチン併用群に対するＴＳ−１／シスプラチン併用群のハザード比がある値以下（例えば，ハザード比が０．７以下（ＴＳ−１／シスプラチン併用群が５−ＦＵ／シスプラチン併用群に比べ死亡リスクを３０％以上軽減する））；５−ＦＵ／シスプラチン併用群とＴＳ−１／シスプラチン併用群の生存期間におけるログランク検定でＰ値が最小となる値及びＰ値がある水準未満になる値（例えば、Ｐ値が０．１未満になる値、Ｐ値が０．０５未満になる値）となる値が例示できる。
【００５４】
その結果、本併用化学療法におけるジヒドロピリミジン脱水素酵素の遺伝子発現量のカットオフポイント（ベータアクチンに対する比）は、例えばリアルタイムＰＣＲ法では０．３５×１０−３〜４．３３×１０−３が好ましく、０．８３×１０−３〜２．２３×１０−３がより好ましい。また配列番号１〜６で示すプライマー及びプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法を行う場合では、０．８３×１０−３〜２．３３×１０−３が好ましく、０．９６×１０−３〜１．４９×１０−３がより好ましく、１．４９×１０−３が特に好ましい。配列番号７〜１２で示すプライマー及びプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法を行う場合では、０．３５×１０−３〜４．３３×１０−３が好ましく、０．３５×１０−３〜１．８６×１０−３がより好ましく、１．０６×１０−３〜１．８６×１０−３が特に好ましい。これらのカットオフポイントに対応するジヒドロピリミジン脱水素酵素の遺伝子発現量が低値の例数の比率は、配列番号１〜６で示すプライマー及びプローブを用いた場合は８．１％〜３９．４％、配列番号７〜１２で示すプライマー及びプローブを用いた場合は２５．０％〜９２．９％であり、これらの比率を基にカットオフポイントを求めることもできる。
【００５５】
本発明のジヒドロピリミジン脱水素酵素の発現量測定用のプライマー対は、配列番号１のフォワードプライマーと配列番号２のリバースプライマー、又は配列番号７のフォワードプライマーと配列番号８のリバースプライマーを含むものであり、ゲノム上のＤＮＡを測定せずに、ｍＲＮＡのみを測定するという点から、配列番号７のフォワードプライマーと配列番号８のリバースプライマーを含むものが好ましい。また本発明のジヒドロピリミジン脱水素酵素の発現量測定用のキットは、上記プライマー対を含むものであり、好ましくはさらに配列番号３又は９のプローブを含むものであり、ゲノム上のＤＮＡを測定せずに、ｍＲＮＡのみを測定するという点から、配列番号９のプローブを含むものが特に好ましい。
【００５６】
本発明のジヒドロピリミジン脱水素酵素の発現量測定用のプライマー対及びキットは、ジヒドロピリミジン脱水素酵素の発現量を正確に測定することができ、５−ＦＵ系抗腫瘍剤を含む化学療法に対する治療効果の予測に用いることができる。５−ＦＵ系抗腫瘍剤を含む化学療法としては、５−ＦＵ又はその誘導体を含むものであれば特に制限されず、例えば５−ＦＵ、テガフール・ウラシル配合剤、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を含む化学療法が例示でき、このうち好ましくはテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を含む化学療法、特に好ましくはテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とシスプラチンの併用化学療法である。治療効果の予測を行う対象となる癌腫としては特に限定されないが、好ましくは胃癌、結腸・直腸癌、頭頸部癌、肺癌、乳癌、膵癌、胆道癌であり、特に好ましくは胃癌である。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
【実施例１】
【００５８】
ジヒドロピリミジン脱水素酵素の遺伝子発現量測定
コーカシア人の未治療の進行胃癌患者を対象としたＴＳ−１／シスプラチン併用療法と５−ＦＵ／シスプラチン併用療法の臨床試験においてバイオマーカー研究（ジヒドロピリミジン脱水素酵素の遺伝子発現量の測定）を実施した。【００５９】
ＴＳ−１／シスプラチン併用療法は、ＴＳ−１をテガフール換算量で２５ｍｇ／ｍ２（体表面積あたり）を１日２回２１日間連日絶食時に経口投与し、その後７日間休薬した。シスプラチンはＴＳ−１投与開始日（Ｄａｙ１）のＴＳ−１の最初の投与後、７５ｍｇ／ｍ２を１〜３時間かけて静脈内投与した。この４週間（２８日間）毎の投与スケジュールを１サイクルとし、最大６サイクル繰り返し投与した。【００６０】
５−ＦＵ／シスプラチン併用療法は、５−ＦＵを１０００ｍｇ／ｍ２／２４時間を５日間持続的静脈内投与し、その後２３日間休薬した。シスプラチンは５−ＦＵ投与開始日（Ｄａｙ１）に５−ＦＵ投与前、１００ｍｇ／ｍ２を１〜３時間かけて静脈内投与した。この４週間（２８日間）毎の投与スケジュールを１サイクルとし、最大６サイクル繰り返し投与した。【００６１】
生存期間はランダム化の日を起算日とし、死亡日までの期間とした。解析時点で死亡の確認が取れない、または生存している患者に関しては、最新の観察日をもって打ち切りとした。【００６２】
ジヒドロピリミジン脱水素酵素の遺伝子発現量は、薬剤の投与以前に得られた手術検体またはバイオプシー検体の腫瘍組織のホルマリン固定パラフィン包埋切片からトータルＲＮＡを抽出し、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ法によりベータアクチンに対する比として定量した。なお、ジヒドロピリミジン脱水素酵素の遺伝子発現量測定用のプライマー及びプローブとして、以下の配列番号１〜３で示すプライマー及びプローブを用いた。さらに、ベータアクチン遺伝子発現量の測定には、以下の配列番号４〜６で示すプライマー及びプローブを用いた。【００６３】
【表１】
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【００６４】
上記表１記載のプライマー及びプローブ以外に、公知のジヒドロピリミジン脱水素酵素の遺伝子配列のオープンリーディングフレームをもとにして種々のフォワードプライマー、リバースプライマー、プローブを設計できる。プライマー、プローブの配列、標識の種類などを変更するとカットオフポイントが多少変化し得るが、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とシスプラチンの併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示すか否かを予測できる本発明の効果に実質的な影響はない。
【実施例２】
【００６５】
カットオフポイントの算出
カットオフポイントは、実施例１で測定した各患者のジヒドロピリミジン脱水素酵素の遺伝子発現量を次のような統計解析手法により求めた。
（１）５−ＦＵ／シスプラチン併用群に対するＴＳ−１／シスプラチン併用群のハザード比が最小となるカットオフポイントを算出したところ、１．４９×１０−３であった。
（２）ＴＳ−１／シスプラチン併用群と５−ＦＵ／シスプラチン併用群の２年生存率の差が最大になるカットオフポイントを算出したところ、０．９６×１０−３であった。
（３）５−ＦＵ／シスプラチン併用群に対するＴＳ−１／シスプラチン併用群のハザード比が０．７以下になるカットオフポイントを算出したところ、０．８３×１０−３〜２．２３×１０−３であった。
なお、カットオフポイントは、ジヒドロピリミジン脱水素酵素の遺伝子発現量のベータアクチンに対する比を表す。
【実施例３】
【００６６】
ジヒドロピリミジン脱水素酵素を指標にして選択された患者での併用療法における治療効果
実施例２で算出したカットオフポイント値を用いてジヒドロピリミジン脱水素酵素の高発現群のハザード比と２年生存率を算出した。結果を表２〜表５に示す。【００６７】
【表２】
2010134588.tif 000003
【００６８】
【表３】
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【００６９】
【表４】
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【００７０】
【表５】
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【００７１】
腫瘍組織中ジヒドロピリミジン脱水素酵素の遺伝子発現量の高い患者では、５−ＦＵ／シスプラチン併用療法に対するＴＳ−１／シスプラチン併用療法のハザード比が０．６５〜０．６９と顕著に低く、高い延命効果を示した。
【実施例４】
【００７２】
ジヒドロピリミジン脱水素酵素の遺伝子発現量測定
実施例１で用いたプライマー及びプローブの代わりに、下記の配列番号７〜１２のプライマー及びプローブを用いて、ほぼ同一の検体におけるジヒドロピリミジン脱水素酵素の遺伝子発現量を実施例１と同様の手法により測定した。なお、配列番号７〜１２で示すプライマー及びプローブは、スプライシング部位に配列を設定することにより、ゲノム上のＤＮＡを測定せずに、ｍＲＮＡのみを測定するよう設計したものである。【００７３】
【表６】
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【実施例５】
【００７４】
カットオフポイントの算出
カットオフポイントは、実施例４で測定した各患者のジヒドロピリミジン脱水素酵素の遺伝子発現量を次のような統計解析手法により求めた。
（１）５−ＦＵ／シスプラチン併用群に対するＴＳ−１／シスプラチン併用群のハザード比が０．７以下になるカットオフポイントを算出したところ、０．３５×１０−３〜４．３３×１０−３であった。
（２）５−ＦＵ／シスプラチン併用群とＴＳ−１／シスプラチン併用群の生存期間におけるログランク検定のＰ値が０．０５未満になるカットオフポイントを算出したところ、１．０６×１０−３〜１．８６×１０−３であった。
なお、カットオフポイントは、ジヒドロピリミジン脱水素酵素の遺伝子発現量のベータアクチンに対する比を表す。
【実施例６】
【００７５】
ジヒドロピリミジン脱水素酵素を指標にして選択された患者での併用療法における治療効果
実施例５で算出したカットオフポイント値を用いてジヒドロピリミジン脱水素酵素の高発現群のハザード比と２年生存率を算出した。結果を表７〜表９に示す。【００７６】
【表７】
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【００７７】
【表８】
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【００７８】
【表９】
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【００７９】
腫瘍組織中ジヒドロピリミジン脱水素酵素の遺伝子発現量の高い患者では、５−ＦＵ／シスプラチン併用療法に対するＴＳ−１／シスプラチン併用療法のハザード比が０．３９〜０．７０と顕著に低く、高い延命効果を示した。【００８０】
以上のように、ジヒドロピリミジン脱水素酵素遺伝子の発現量を指標として胃癌患者を選択することにより、ＴＳ−１／シスプラチン併用療法はジヒドロピリミジン脱水素酵素阻害剤を含まない５−ＦＵ／シスプラチン併用療法に比べ高い延命効果を期待できることが明らかになった。
【配列表】
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【国際調査報告】
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