(57)【要約】  センチネルリンパ節内において転移癌細胞が存在し得る部位を精度よく検出する。  生体内の癌付近に量子ドットを注入し、蛍光によりセンチネルリンパ節の位置を特定し、センチネルリンパ節を摘出する。量子ドットが注入された状態で摘出されたセンチネルリンパ節に対して、１分子観察用の共焦点蛍光顕微鏡を用いた精密蛍光測定によって構造解析を行う。具体的には、センチネルリンパ節内の複数の部位のそれぞれについて蛍光強度を測定し、測定された複数の部位のうち蛍光強度が最も高いものから順に一又は複数の部位を輸入リンパ管流入部として検出する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
量子ドットが注入された摘出後のセンチネルリンパ節内の複数の部位のそれぞれについて蛍光強度を測定し、
前記測定された複数の部位のうち蛍光強度が最も高いものから順に一又は複数の部位を輸入リンパ管流入部として検出する、
輸入リンパ管流入部検出方法。
【請求項２】
前記センチネルリンパ節内の複数の部位のそれぞれについて、１分子観察用の共焦点蛍光顕微鏡により取得された画像を画像解析することにより、蛍光強度を測定する、
請求項１に記載の輸入リンパ管流入部検出方法。
【請求項３】
前記量子ドットは、特定細胞に対して特異的な抗体が結合された量子ドットを含み、
前記センチネルリンパ節内の蛍光に基づいて前記特定細胞を同定する、
請求項１又は２に記載の輸入リンパ管流入部検出方法。
【請求項４】
前記特定細胞は、Ｔリンパ球である、
請求項３に記載の輸入リンパ管流入部検出方法。
【請求項５】
前記特定細胞は、癌細胞である、
請求項３に記載の輸入リンパ管流入部検出方法。
【請求項６】
特定細胞に対して特異的な抗体が結合された量子ドットを含む量子ドットが注入された摘出後のセンチネルリンパ節内の複数の部位のそれぞれについて蛍光強度を測定し、
前記測定された複数の部位のうち蛍光強度が最も高いものから順に一又は複数の部位を輸入リンパ管流入部として検出し、
前記検出された輸入リンパ管流入部の蛍光に基づいて前記特定細胞を同定する、
特定細胞同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、輸入リンパ管流入部検出方法及び特定細胞同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、癌の切除手術においては、病変部だけでなく、癌の転移が疑われるリンパ節を切除する場合が多い。近年では、リンパ節の切除を最小限にとどめるために、センチネルリンパ節生検が行われている。【０００３】
センチネルリンパ節（Sentinel Lymph Node；ＳＬＮ）は、各臓器から最初にリンパ流を受けるリンパ節と定義されており、癌の手術においては、センチネルリンパ節に癌の転移がなければ定型的リンパ節郭清が不要である、というセンチネルリンパ節理論が広く認容されている。センチネルリンパ節生検は、無駄な手術侵襲を減らすことを可能とし、患者の病気の状態に応じて細かく手術法を選択する、オーダーメイド医療の確立に寄与するものである。【０００４】
センチネルリンパ節生検を行ううえでは、手術中における真のセンチネルリンパ節の検出感度を向上させること、及び、摘出したセンチネルリンパ節の内部に癌の転移があるか否かの診断精度を向上させることが重要な課題となる。【０００５】
現在、手術中にセンチネルリンパ節を同定するトレーサーとして臨床で用いられている材料は、色素（パテントブルー・墨汁等）やラジオアイソトープ（ＲＩ）コロイド（99mＴｃ等）であるが、両者には欠点も多い。例えば、色素の場合、（１）生体内のリンパ節に非特異的に炭粉沈着等の汚れがある場合、センチネルリンパ節かどうかの評価が不能となる、（２）リンパ節を郭清する領域が色素で汚染され、手術の邪魔になる、（３）色素に対するアレルギー（アナフィラキシー反応）がある、等の問題がある。一方、ＲＩコロイドの場合、（１）コロイドの粒径が数百ｎｍ〜数十μｍであり、色素（数ｎｍ）や量子ドット（数十ｎｍ）に比べ大きく、リンパ系への移行が悪いため、リアルタイムにリンパ流の観察を行うことができない、（２）解像度が低いため、センチネルリンパ節がコロイド局注部の近傍にある場合見逃すおそれがある（shine-through現象）、（３）使用に関して規制があり、適応施設の拡大が難しい、等といった問題がある。【０００６】
また、乳癌・皮膚癌といった比較的単純なリンパ流を有する部位の癌に比べて、リンパ流が多方向で複雑な消化器癌では、リアルタイムのリンパ流の観察が困難なため、センチネルリンパ節生検法の適用が遅れている。【０００７】
以上の理由から、検出感度に優れた新たなトレーサーの開発が期待されており、蛍光色素を用いたセンチネルリンパ節の検出方法が提案されている（特許文献１、特許文献２参照）。特に、量子ドット（Quantum Dots；ＱＤｓ）は、優れた検出感度を有するセンチネルリンパ節のトレーサーになり得る可能性があると考えられている。【０００８】
センチネルリンパ節生検における最大の目的は、手術中にセンチネルリンパ節に転移癌細胞が存在するか否かを診断することにある。現在センチネルリンパ節の癌転移の有無の診断は、摘出組織を薄切し、ヘマトキシリン・エオジン染色等で染めた後、顕微鏡で行われているが、摘出したリンパ節組織のごく一部しか観察できないため、微小な転移は見逃してしまう危険がある。例えば、径５ｍｍ程度のリンパ節の場合、１〜３断面を検査したとして全体の0.01％に過ぎない。【０００９】
癌の有無の診断能力の向上を図るために、（１）数種類の免疫染色を組み合わせた多重染色法、（２）リンパ節組織全体からＲＮＡを抽出しＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction）を行い、組織内部の癌細胞を検出する手法等が試みられている。しかし、多重染色法では、通常染色法と同様に組織スライドを作成する段階で転移細胞を見逃すおそれがある。また、ＲＴ−ＰＣＲ法では、癌細胞の検出能力は高いが、検査が煩雑で時間がかかり手術中の迅速診断には適さない、組織全体の平均化された情報しか得られない、確実に微小な転移を見つけるためには組織全てを検査する必要があり、病理標本が作れなくなってしまう、等といった欠点がある。【００１０】
したがって、センチネルリンパ節生検における病理診断において、センチネルリンパ節内部の癌転移部位を高感度・高精度に特定する手法の開発が必要と考えられる。【００１１】
非特許文献１では、マウス耳介のメラノーマ腫瘍が所属リンパ節に転移する様子が報告されており、それによると、癌のリンパ節転移は輸入リンパ管の流入部付近より生じるとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００６−１４８６８号公報
【特許文献２】特開２００４−２６９４３９号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】T.Hoshida、他８名、「Imaging Steps of Lymphatic Metastasis Reveals That Vascular Endothelial Growth Factor-C Increases Metastasis by Increasing Delivery of Cancer Cells to Lymph Nodes:Therapeutic Implications」、Cancer Research 2006、（米国）、Waverly Press、2006年8月15日、第66巻、第16号、p.8065-8075
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかし、従来の技術では、量子ドットをセンチネルリンパ節のトレーサーとして用いた場合でも、摘出したセンチネルリンパ節の評価においては、その組織が光っているか否かの定性的な観察のみにとどまっていた。これは蛍光計測技術の精度の低さに起因していると思われる。【００１５】
本発明は上記の従来技術における問題に鑑みてなされたものであって、センチネルリンパ節内において転移癌細胞が存在し得る部位を精度よく検出することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、量子ドットが注入された摘出後のセンチネルリンパ節内の複数の部位のそれぞれについて蛍光強度を測定し、前記測定された複数の部位のうち蛍光強度が最も高いものから順に一又は複数の部位を輸入リンパ管流入部として検出する、輸入リンパ管流入部検出方法である。【００１７】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の輸入リンパ管流入部検出方法において、前記センチネルリンパ節内の複数の部位のそれぞれについて、１分子観察用の共焦点蛍光顕微鏡により取得された画像を画像解析することにより、蛍光強度を測定する。【００１８】
請求項３に記載の発明は、請求項１又は２に記載の輸入リンパ管流入部検出方法において、前記量子ドットは、特定細胞に対して特異的な抗体が結合された量子ドットを含み、前記センチネルリンパ節内の蛍光に基づいて前記特定細胞を同定する。【００１９】
請求項４に記載の発明は、請求項３に記載の輸入リンパ管流入部検出方法において、前記特定細胞は、Ｔリンパ球である。【００２０】
請求項５に記載の発明は、請求項３に記載の輸入リンパ管流入部検出方法において、前記特定細胞は、癌細胞である。【００２１】
請求項６に記載の発明は、特定細胞に対して特異的な抗体が結合された量子ドットを含む量子ドットが注入された摘出後のセンチネルリンパ節内の複数の部位のそれぞれについて蛍光強度を測定し、前記測定された複数の部位のうち蛍光強度が最も高いものから順に一又は複数の部位を輸入リンパ管流入部として検出し、前記検出された輸入リンパ管流入部の蛍光に基づいて前記特定細胞を同定する、特定細胞同定方法である。
【発明の効果】
【００２２】
請求項１に記載の発明によれば、センチネルリンパ節内の蛍光強度が高い部位を輸入リンパ管流入部として検出するので、センチネルリンパ節内において転移癌細胞が存在し得る部位を精度よく検出することができる。【００２３】
請求項２に記載の発明によれば、１分子観察用の共焦点蛍光顕微鏡により取得された画像を画像解析することにより、複数の部位のそれぞれについて精度よく蛍光強度を測定することができる。【００２４】
請求項３に記載の発明によれば、特定細胞の検出精度を向上させることができる。【００２５】
請求項４に記載の発明によれば、Ｔリンパ球の検出精度を向上させることができる。【００２６】
請求項５に記載の発明によれば、癌細胞の検出精度を向上させることができる。【００２７】
請求項６に記載の発明によれば、センチネルリンパ節内において転移癌細胞が存在し得る部位を精度よく検出することができるとともに、特定細胞の検出精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】蛍光計測システムの構成図である。
【図２】内視鏡型蛍光計測装置の外観構成図である。
【図３】顕微鏡システムの構成図である。
【図４】実験の流れを説明するための図である。
【図５】量子ドット濃度と蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図６Ａ】手術野での内視鏡型蛍光計測装置による計測の様子を撮影した撮影画像である。
【図６Ｂ】内視鏡型蛍光計測装置で取得した手術野情報を画像解析装置で解析して得られた蛍光画像である。
【図７Ａ】胃体部の小弯側後壁の撮影画像である。
【図７Ｂ】胃体部の小弯側後壁を内視鏡型蛍光計測装置で撮影し画像解析装置で解析して得られた蛍光画像である。
【図８Ａ】量子ドット注入後３分経過時の輸入リンパ管の蛍光画像である。
【図８Ｂ】量子ドット注入後１０分経過時の輸入リンパ管の蛍光画像である。
【図８Ｃ】量子ドット注入後３０分経過時の輸入リンパ管の蛍光画像である。
【図８Ｄ】量子ドット注入後６０分経過時の輸入リンパ管の蛍光画像である。
【図８Ｅ】輸入リンパ管の模式図である。
【図９Ａ】量子ドット注入後３分経過時のセンチネルリンパ節の蛍光画像である。
【図９Ｂ】量子ドット注入後１０分経過時のセンチネルリンパ節の蛍光画像である。
【図９Ｃ】量子ドット注入後３０分経過時のセンチネルリンパ節の蛍光画像である。
【図９Ｄ】量子ドット注入後６０分経過時のセンチネルリンパ節の蛍光画像である。
【図９Ｅ】センチネルリンパ節の模式図である。
【図１０】輸入リンパ管における蛍光シグナル強度を定量解析したグラフである。
【図１１】センチネルリンパ節における蛍光シグナル強度を定量解析したグラフである。
【図１２Ａ】センチネルリンパ節の撮影画像である。
【図１２Ｂ】センチネルリンパ節の蛍光画像である。
【図１２Ｃ】センチネルリンパ節の一部を１分子蛍光顕微鏡で撮影して得られた蛍光画像である。
【図１３Ａ】センチネルリンパ節以外のリンパ節の撮影画像である。
【図１３Ｂ】センチネルリンパ節以外のリンパ節の蛍光画像である。
【図１３Ｃ】センチネルリンパ節以外のリンパ節の一部を１分子蛍光顕微鏡で撮影して得られた蛍光画像である。
【図１４】センチネルリンパ節、センチネルリンパ節以外のリンパ節の内部の蛍光強度を示すグラフである。
【図１５Ａ】センチネルリンパ節に対して励起レーザー光を照射直後（０分）の蛍光画像である。
【図１５Ｂ】センチネルリンパ節に対して励起レーザー光を３０分照射した後の蛍光画像である。
【図１５Ｃ】センチネルリンパ節に対して励起レーザー光を６０分照射した後の蛍光画像である。
【図１６Ａ】センチネルリンパ節以外のリンパ節に対して励起レーザー光を照射直後（０分）の蛍光画像である。
【図１６Ｂ】センチネルリンパ節以外のリンパ節に対して励起レーザー光を３０分照射した後の蛍光画像である。
【図１６Ｃ】センチネルリンパ節以外のリンパ節に対して励起レーザー光を６０分照射した後の蛍光画像である。
【図１７】センチネルリンパ節、センチネルリンパ節以外のリンパ節の標本群における励起レーザー光の照射による蛍光の褪色を示すグラフである。
【図１８】図１７のグラフを相対値で表現したグラフである。
【図１９】センチネルリンパ節サンプル内の量子ドット１粒子の蛍光シグナル強度の経時変化を示すグラフである。
【図２０Ａ】センチネルリンパ節の撮影画像である。
【図２０Ｂ】センチネルリンパ節の蛍光画像である。
【図２１】センチネルリンパ節内の解析部位Ａ〜Ｆの位置を示す図である。
【図２２Ａ】解析部位Ａの組織を１分子蛍光顕微鏡で撮影して得られた蛍光画像である。
【図２２Ｂ】解析部位Ｂの組織を１分子蛍光顕微鏡で撮影して得られた蛍光画像である。
【図２２Ｃ】解析部位Ｃの組織を１分子蛍光顕微鏡で撮影して得られた蛍光画像である。
【図２２Ｄ】解析部位Ｄの組織を１分子蛍光顕微鏡で撮影して得られた蛍光画像である。
【図２２Ｅ】解析部位Ｅの組織を１分子蛍光顕微鏡で撮影して得られた蛍光画像である。
【図２２Ｆ】解析部位Ｆの組織を１分子蛍光顕微鏡で撮影して得られた蛍光画像である。
【図２３】解析部位Ａ〜Ｆにおける蛍光強度の定量解析結果である。
【図２４】解析部位Ａ〜Ｆにおける蛍光強度相対値を示すグラフである。
【図２５Ａ】センチネルリンパ節の組織をヘマトキシリン・エオジン染色した標本の顕微鏡画像である。
【図２５Ｂ】図２５Ａの一部を拡大した画像である。
【図２６Ａ】センチネルリンパ節の組織をリンパ節内のＴ細胞に特異的なＣＤ３抗体をＤＡＢで染色した免疫染色顕微鏡画像である。
【図２６Ｂ】図２６Ａの一部を拡大した画像である。
【図２７Ａ】センチネルリンパ節の撮影画像である。
【図２７Ｂ】センチネルリンパ節の蛍光画像である。
【図２７Ｃ】センチネルリンパ節の免疫染色画像である。
【図２７Ｄ】センチネルリンパ節の免疫染色画像である。
【図２７Ｅ】Ｔリンパ球が多く存在する領域の組織を605ｎｍ用の吸収フィルタを用いて撮影した蛍光画像である。
【図２７Ｆ】Ｔリンパ球が多く存在する領域の組織を705ｎｍ用の吸収フィルタを用いて撮影した蛍光画像である。
【図２８】センチネルリンパ節の検出結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
［装置構成］
以下、図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。
まず、装置の構成について説明する。
図１に、蛍光計測システム１の構成を示す。図１に示すように、蛍光計測システム１は、内視鏡型蛍光計測装置１０、画像解析装置２０、レーザー光励起装置３０を備える。蛍光計測システム１は、手術中の術野での蛍光解析を行うものであり、トレーサーとして量子ドットが注入された生体からセンチネルリンパ節の位置を特定する際に用いられる。
【００３０】
量子ドットは、径15-20ナノメートル（ｎｍ）の半導体のクラスターであり、その粒径に応じて様々な蛍光を放出する特性を持った粒子である。量子ドットは、その中心であるカドミウム・セレンのコア、コアを覆うシェル、ポリマーコーティング等により構成される。量子ドットをセンチネルリンパ節のトレーサーとして用いる場合、以下のような特徴がある。
（１）蛍光強度が強く褪色し難いため長時間の観察が可能である。
（２）様々な放出波長の粒子があり可視領域よりも長波長の蛍光粒子を使用した場合、肉眼的に術野を汚すことはない。
（３）蛍光強度が強く、リアルタイムでリンパ流の方向を同定可能である。
（４）様々な放出波長の粒子を同一波長の励起光で検出することができ、放出波長により識別が可能である。
（５）ＲＩを使用する際のような規制はほとんどない。
（６）粒子の数と蛍光強度が比例関係にあり、蛍光強度の定量化が可能である。
（７）病理組織切片に作成される段階でも蛍光が失活せず、病理評価に応用できる。
【００３１】
内視鏡型蛍光計測装置１０は、内視鏡手術用の高感度蛍光計測装置である。図２に、内視鏡型蛍光計測装置１０の外観構成を示す。内視鏡型蛍光計測装置１０は、ＥＭＣＣＤカメラ１１、レンズ１２、蛍光フィルタ１３、ライトガイド１４、内視鏡部１５、ハンドル１６等を備えて構成される。
【００３２】
内視鏡部１５は、レーザー光励起装置３０により発せられた励起光を生体に対して照射するとともに、生体からの蛍光を受ける機能部である。ＥＭＣＣＤカメラ１１は、内視鏡手術用の高感度のＣＣＤカメラであって、内視鏡部１５、蛍光フィルタ１３及びレンズ１２を介して導かれた蛍光を受光し、画像データを画像解析装置２０に出力する。
【００３３】
画像解析装置２０は、図１に示すように、ＣＰＵ（Central Processing Unit）２１、ＲＯＭ（Read Only Memory）２２、ＲＡＭ（Random Access Memory）２３、通信部２４、操作部２５、表示部２６、記憶部２７等を備えて構成され、各部はバス２８により接続されている。
【００３４】
ＣＰＵ２１は、ＲＯＭ２２に記憶されている各種処理プログラムを読み出して、ＲＡＭ２３内に形成されたワークエリアに展開し、該プログラムに従って画像解析装置２０の各部を制御する。
【００３５】
ＲＯＭ２２は、ＣＰＵ２１により実行されるシステムプログラム、各種処理を行うための各種プログラム、及びこれらのプログラムの実行に必要なデータ等を記憶する。
【００３６】
ＲＡＭ２３は、ＣＰＵ２１により実行制御される各種処理において、ＲＯＭ２２から読み出された各種処理プログラム、入力若しくは出力データ、及びパラメータ等を一時的に格納する。
【００３７】
通信部２４は、内視鏡型蛍光計測装置１０から蛍光画像の画像データを受信する。
【００３８】
操作部２５は、カーソルキー、文字入力キー、及び各種機能キー等を備えたキーボードと、マウス等のポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードに対するキー操作やマウス操作により入力された指示信号をＣＰＵ２１に出力する。
【００３９】
表示部２６は、ＬＣＤ（Liquid Crystal Display）等のモニタにより構成され、ＣＰＵ２１から入力される表示信号の指示に従って、観察対象画像や操作画面等を表示する。
【００４０】
記憶部２７は、ハードディスクや不揮発性の半導体メモリ等により構成され、各種データを記憶する。例えば、記憶部２７は、内視鏡型蛍光計測装置１０から受信した画像データのファイル（ＡＶＩファイル）等を記憶する。
【００４１】
ＣＰＵ２１は、内視鏡型蛍光計測装置１０により取得された蛍光画像の画像データに基づいて観察対象画像を表示部２６に表示させるとともに、当該画像データを画像解析して蛍光強度を算出する。
【００４２】
レーザー光励起装置３０は、生体に照射するための励起レーザー光（632.8ｎｍ）を発する装置である。
【００４３】
図３に、顕微鏡システム２の構成を示す。図３に示すように、顕微鏡システム２は、１分子蛍光顕微鏡４０、画像解析装置５０を備える。顕微鏡システム２は、生体から摘出された組織について、より精密に蛍光解析を行うものであり、センチネルリンパ節内の構造を解析する際に用いられる。
【００４４】
１分子蛍光顕微鏡４０は、１分子観察用の共焦点蛍光顕微鏡であり、１分子（蛍光１粒子）レベルでの観察が可能な共焦点蛍光顕微鏡装置である。１分子蛍光顕微鏡４０は、光源により励起レーザー光（532ｎｍ）を照射し、検査対象組織からの蛍光画像を画像データとして画像解析装置５０に出力する。
【００４５】
画像解析装置５０は、図３に示すように、ＣＰＵ５１、ＲＯＭ５２、ＲＡＭ５３、通信部５４、操作部５５、表示部５６、記憶部５７等を備えて構成され、各部はバス５８により接続されている。
【００４６】
ＣＰＵ５１は、ＲＯＭ５２に記憶されている各種処理プログラムを読み出して、ＲＡＭ５３内に形成されたワークエリアに展開し、該プログラムに従って画像解析装置５０の各部を制御する。
【００４７】
ＲＯＭ５２は、ＣＰＵ５１により実行されるシステムプログラム、各種処理を行うための各種プログラム、及びこれらのプログラムの実行に必要なデータ等を記憶する。
【００４８】
ＲＡＭ５３は、ＣＰＵ５１により実行制御される各種処理において、ＲＯＭ５２から読み出された各種処理プログラム、入力若しくは出力データ、及びパラメータ等を一時的に格納する。
【００４９】
通信部５４は、１分子蛍光顕微鏡４０から画像データを受信する。
【００５０】
操作部５５は、カーソルキー、文字入力キー、及び各種機能キー等を備えたキーボードと、マウス等のポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードに対するキー操作やマウス操作により入力された指示信号をＣＰＵ５１に出力する。
【００５１】
表示部５６は、ＬＣＤ等のモニタにより構成され、ＣＰＵ５１から入力される表示信号の指示に従って、観察対象画像や操作画面等を表示する。
【００５２】
記憶部５７は、ハードディスクや不揮発性の半導体メモリ等により構成され、各種データを記憶する。例えば、記憶部５７は、１分子蛍光顕微鏡４０から受信した画像データのファイル（ＡＶＩファイル）等を記憶する。
【００５３】
ＣＰＵ５１は、１分子蛍光顕微鏡４０により取得された蛍光画像の画像データに基づいて観察対象画像を表示部５６に表示させるとともに、当該画像データを画像解析して蛍光強度を算出する。
【００５４】
［センチネルリンパ節生検］
次に、センチネルリンパ節生検について説明する。
生体から癌を切除する手術が行われる際に、生体内の癌の近くにセンチネルリンパ節のトレーサーとして量子ドットが注入される。量子ドットはリンパ管を流れてセンチネルリンパ節に到達する。蛍光計測システム１により、術野に対して励起光が照射され、蛍光に基づいてセンチネルリンパ節が同定される。そして、生体からセンチネルリンパ節が摘出される。
【００５５】
ここで、量子ドットが注入された状態で摘出されたセンチネルリンパ節に対し、顕微鏡システム２により、より精密な蛍光解析が行われる。具体的には、センチネルリンパ節内の複数の部位のそれぞれについて蛍光強度が測定され、測定された複数の部位のうち蛍光強度が最も高いものから順に一又は複数の部位が輸入リンパ管流入部として検出される。蛍光強度は、１分子蛍光顕微鏡４０により取得された画像を、画像解析装置５０において画像解析することにより、測定される。なお、輸入リンパ管流入部を検出する際に、センチネルリンパ節内の複数の部位のうち蛍光強度が最も高いものから順に予め定められた個数の部位を輸入リンパ管流入部として検出することとしてもよいし、複数の部位のうち蛍光強度が予め定められた基準値以上の部位を輸入リンパ管流入部として検出することとしてもよい。本発明は、センチネルリンパ節の構造解析に利用されるものである。
【００５６】
検出された輸入リンパ管流入部の組織が採取され、癌細胞があるか否かを診断する病理組織検査が行われる。輸入リンパ管流入部に癌の転移がない場合には、それ以上リンパ節を切除する必要はない。
【００５７】
［実験の流れ］
次に、図４を参照して、実験の流れを説明する。図４は、生体として大型動物モデルの代表であるブタを用い、胃癌を想定した場合の例である。ブタは、２〜３カ月齢のランドレース・ヨークシャー交雑種の雄性去勢ブタ（平均体重26.7ｋｇ）を使用した。
【００５８】
まず、ブタに全身麻酔をかけ、胃内視鏡６０の局注針を用い、ブタの胃体下部小弯側後壁の粘膜下層に２μＭの量子ドットを500μＬ局注した。
【００５９】
量子ドットとして、Invitrogen（登録商標）社で販売されているQdot（登録商標）705を用いた。粒子の径は約20ｎｍであり、放出波長は702（700-715）ｎｍである。近赤外領域の放出波長の蛍光粒子を選択した理由は、生体の自家蛍光との干渉が少ない点を考慮したためである。
【００６０】
量子ドットの局注後、胃とそれに続くリンパ網での量子ドットの蛍光の拡がりを内視鏡型蛍光計測装置１０を用いてリアルタイムに観察した。蛍光によりセンチネルリンパ節の位置を特定し、蛍光をガイドにセンチネルリンパ節を摘出した。
【００６１】
次に、摘出されたセンチネルリンパ節について、１分子蛍光顕微鏡４０を用いた精密蛍光測定によって構造解析を行った。
【００６２】
［実験結果］
＜量子ドット濃度と蛍光強度の関係＞
図５に、量子ドットの濃度（ＱＤｓ濃度）と蛍光強度の関係を示す。図５に示すグラフは、様々な濃度の量子ドットをブタの胃壁内に注入し、内視鏡型蛍光計測装置１０を用いて蛍光強度を測定した結果である。横軸は量子ドット濃度（ｎＭ）、縦軸はgray-value／mm2である。すなわち、画像解析装置２０では、内視鏡型蛍光計測装置１０により取得された蛍光画像の濃淡により、蛍光強度を算出している。
【００６３】
図５に示すように、量子ドットの濃度と蛍光強度とは比例関係にあることが確認された。したがって、内視鏡型蛍光計測装置１０により蛍光強度の定量的解析が可能であることが分かった。
【００６４】
＜手術野での蛍光検出＞
図６Ａは、手術野での内視鏡型蛍光計測装置１０による計測の様子を撮影した撮影画像である。内視鏡型蛍光計測装置１０の内視鏡部１５の先端から生体の観察対象部位に対して励起光が照射される。注射部７０は、量子ドットが注入された位置である。
【００６５】
図６Ｂは、内視鏡型蛍光計測装置１０で取得した手術野情報を画像解析装置２０で解析して得られた蛍光画像である。図６Ａの撮影画像の注射部７０に対応する位置である注射部７０ａは、蛍光を示している。すなわち、量子ドットが注入された位置において、蛍光が検出された。
【００６６】
＜量子ドットの流入観察＞
図７Ａは、胃体部の小弯側後壁の撮影画像である。胃の内側の注射部８０から注入された量子ドットは、センチネルリンパ節８１に流れ込み、センチネルリンパ節以外のリンパ節８２には流れ込まない。
【００６７】
図７Ｂは、胃体部の小弯側後壁を内視鏡型蛍光計測装置１０で撮影し画像解析装置２０で解析して得られた蛍光画像である。広範囲の視野においても、注射部８０ａとセンチネルリンパ節８１ａの部分で蛍光シグナルが認識可能であった。なお、センチネルリンパ節以外のリンパ節８２ａについては、蛍光シグナルを示さなかった。
【００６８】
＜蛍光シグナル強度の時間変化＞
図８Ａ〜図８Ｄは、内視鏡型蛍光計測装置１０で取得した輸入リンパ管（図７Ｂに示す輸入リンパ管８３ａ）の蛍光シグナルの経時変化を示す蛍光画像である。輸入リンパ管は、リンパ節にリンパ液を注ぐ部分のリンパ管である。図８Ａは量子ドット注入後３分経過時の画像であり、図８Ｂは量子ドット注入後１０分経過時の画像であり、図８Ｃは量子ドット注入後３０分経過時の画像であり、図８Ｄは量子ドット注入後６０分経過時の画像である。図８Ｅは、図８Ａ〜図８Ｄに対応する輸入リンパ管の模式図である。
【００６９】
図９Ａ〜図９Ｄは、内視鏡型蛍光計測装置１０で取得したセンチネルリンパ節（図７Ｂに示すセンチネルリンパ節８１ａ）の蛍光シグナルの経時変化を示す蛍光画像である。図９Ａは量子ドット注入後３分経過時の画像であり、図９Ｂは量子ドット注入後１０分経過時の画像であり、図９Ｃは量子ドット注入後３０分経過時の画像であり、図９Ｄは量子ドット注入後６０分経過時の画像である。図９Ｅは、図９Ａ〜図９Ｄに対応するセンチネルリンパ節の模式図である。
【００７０】
図８Ａ〜図８Ｄに示すように、輸入リンパ管では、その蛍光シグナルの強さはほとんど変化しなかった。また、図９Ａ〜図９Ｄに示すように、センチネルリンパ節では、時間とともにその蛍光シグナルが強くなった。蛍光シグナルがリンパ管やリンパ節の周辺に漏れ出ることはなく、センチネルリンパ節に続くリンパ節（センチネルリンパ節以外のリンパ節）に蛍光が認められることはなかった。
【００７１】
図１０は、内視鏡型蛍光計測装置１０で取得された輸入リンパ管における蛍光シグナル強度を定量解析したグラフである。図１１は、内視鏡型蛍光計測装置１０で取得されたセンチネルリンパ節における蛍光シグナル強度を定量解析したグラフである。図１０及び図１１において、横軸は時間（分）、縦軸はgray-value／mm2である。輸入リンパ管では、時間とともに蛍光強度が変化せず、センチネルリンパ節では、時間とともに蛍光強度が増加しているデータが得られた。
【００７２】
＜摘出リンパ節の蛍光観察＞
図１２Ａは、摘出後のセンチネルリンパ節の撮影画像である。図１２Ｂは、このセンチネルリンパ節を内視鏡型蛍光計測装置１０で撮影して得られた蛍光画像である。図１２Ｃは、図１２Ｂに示す領域９０の組織を１分子蛍光顕微鏡４０で撮影して得られた組織固定後の蛍光画像である。センチネルリンパ節では、摘出後も蛍光が認められ、１分子蛍光顕微鏡４０における観察ではリンパ節組織内部に量子ドットに特有の明滅する蛍光シグナルが認められた。
【００７３】
図１３Ａは、摘出後のセンチネルリンパ節以外のリンパ節の撮影画像である。図１３Ｂは、図１３Ａに示すセンチネルリンパ節以外のリンパ節を内視鏡型蛍光計測装置１０で撮影して得られた蛍光画像である。図１３Ｃは、図１３Ｂに示す領域９１の組織を１分子蛍光顕微鏡４０で撮影して得られた組織固定後の蛍光画像である。センチネルリンパ節以外のリンパ節では、内視鏡型蛍光計測装置１０の観察においても、１分子蛍光顕微鏡４０の観察においても、蛍光シグナルが認められなかった。
【００７４】
図１４に、内視鏡型蛍光計測装置１０及び画像解析装置２０により定量解析されたセンチネルリンパ節（ＳＬＮ）、センチネルリンパ節以外のリンパ節（Ｎｏｎ−ＳＬＮ）の内部の蛍光強度（gray-value／mm2）を示す。蛍光強度はセンチネルリンパ節において明らかに高く、センチネルリンパ節に量子ドットが存在することが示された。センチネルリンパ節以外のリンパ節において計測された蛍光シグナルは組織の自家蛍光に由来すると思われる。
【００７５】
＜自家蛍光の影響＞
組織サンプル内の量子ドットの蛍光の定量解析を正確に行うためには、組織の自家蛍光の影響が問題になる。発明者等が使用した近赤外領域は生体の自家蛍光が比較的少ない波長域ではあるが、それを極力低く抑えるために１分子蛍光顕微鏡４０の励起レーザー光(波長：532nm、照射面出力：80pW/μm2)による組織の自家蛍光の褪色を検討した。
【００７６】
図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃは、センチネルリンパ節に対して、１分子蛍光顕微鏡４０で同視野に励起レーザー光を照射し続けた際の照射直後（０分）、３０分経過後、６０分経過後のそれぞれの時点での蛍光シグナルを示す蛍光画像である。
【００７７】
同様に、図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃは、センチネルリンパ節以外のリンパ節に対して、１分子蛍光顕微鏡４０で同視野に励起レーザー光を照射し続けた際の照射直後（０分）、３０分経過後、６０分経過後のそれぞれの時点での蛍光シグナルを示す蛍光画像である。
【００７８】
図１５Ａ〜図１５Ｃ、図１６Ａ〜図１６Ｃに示すように、リンパ節組織の自家蛍光は時間とともに褪色したが、センチネルリンパ節組織内部の量子ドットの蛍光シグナル（明滅する粒子の信号）は６０分の励起レーザー光の照射後も失活しなかった。
【００７９】
図１７は、センチネルリンパ節（ＳＬＮ）、センチネルリンパ節以外のリンパ節（Ｎｏｎ−ＳＬＮ）の標本群における１分子蛍光顕微鏡４０の励起レーザー光の照射による蛍光の褪色を定量評価にて示したグラフである。横軸は時間（分）、縦軸はgray-value／μm2である。すなわち、画像解析装置５０では、１分子蛍光顕微鏡４０により取得された蛍光画像の濃淡により、蛍光強度を算出している。
【００８０】
図１８は、センチネルリンパ節（ＳＬＮ）、センチネルリンパ節以外のリンパ節（Ｎｏｎ−ＳＬＮ）のレーザー光照射による蛍光の褪色について、図１７のグラフを相対値で表現したものである。センチネルリンパ節、センチネルリンパ節以外のリンパ節のそれぞれについて、０分におけるgray-valueを１としている。図１８に示すように、センチネルリンパ節、センチネルリンパ節以外のリンパ節ともに励起レーザー光の照射により蛍光が褪色している結果が得られた。
【００８１】
次に、センチネルリンパ節サンプル内の量子ドット１粒子の輝点に注目して励起レーザー光照射による蛍光シグナル強度の変化を解析した。図１９は、センチネルリンパ節サンプル内の量子ドット１粒子の蛍光シグナル強度の経時変化を示すグラフである。図１９は、サンプル数n=20の量子ドットについて、量子ドット１粒子の輝点それぞれを中心とした周囲576×576nmのエリアで蛍光の解析を行った結果（１粒子当たりのgray-value、及び、０分におけるgray-valueを１とした場合の相対値）を示している。この結果、量子ドットの蛍光シグナルは１５分まで増加し、その後６０分まで保たれた。このことから、図１７及び図１８で得られたリンパ節サンプルの蛍光シグナルの減少はリンパ節組織の自家蛍光に由来するものであり、量子ドットの蛍光は６０分の励起レーザー光の照射では褪色しないことが示された。
【００８２】
以上の結果から、センチネルリンパ節以外のリンパ節の蛍光（組織の自家蛍光）は、励起レーザー光の照射により無視できるレベル（３０分で16％、６０分で10％）まで軽減されることが示された。一方、センチネルリンパ節では、内部の自家蛍光は軽減されたが、量子ドットの蛍光は１時間保たれることが示された。このデータより、組織切片を１分子蛍光顕微鏡４０で観察する際に、３０分程度の励起レーザー光の照射を加えることで、組織の自家蛍光の大部分を褪色させ、正確な量子ドットの蛍光強度を定量解析可能となることがわかった。
【００８３】
＜センチネルリンパ節内部における量子ドットの不均一分布（heterogeneity）＞
センチネルリンパ節において蛍光シグナルは不均一であり、センチネルリンパ節内部の量子ドットの分布に由来するものと考えられる。
図２０Ａは、摘出したセンチネルリンパ節の撮影画像であり、図２０Ｂは、内視鏡型蛍光計測装置１０で取得されたセンチネルリンパ節の蛍光画像である。
【００８４】
センチネルリンパ節の標本の各部位における蛍光強度（量子ドットの存在個数に比例）を１分子蛍光顕微鏡４０で解析した。図２１に、センチネルリンパ節内の解析部位Ａ〜Ｆの位置を示す。蛍光の定量評価を正確に行うため、組織の自家蛍光を低減すべく、1分子蛍光顕微鏡４０にて３０分励起レーザー光を照射した後、観察を行った。
【００８５】
図２２Ａ〜図２２Ｆに、解析部位Ａ〜Ｆのそれぞれの組織を１分子蛍光顕微鏡４０で撮影して得られた蛍光画像を示す。図２２Ａ及び図２２Ｂに示すように、解析部位Ａ及びＢには、量子ドットが多数存在していた。
【００８６】
図２３に、画像解析装置５０において画像解析することにより、解析部位Ａ〜Ｆにおける蛍光強度を定量解析した結果を示す。蛍光強度相対値は、解析部位Ｆの蛍光強度を「１」とした場合の、解析部位Ａ〜Ｆにおける蛍光強度の相対値である。サンプル数：ｎ＝１０とは、一つの標本スライド内で解析部位Ａ〜Ｆの領域の中から１０か所ずつ顕微鏡観察したという意味である。
【００８７】
図２４は、解析部位Ａ〜Ｆにおける蛍光強度相対値をグラフ化したものである。図２３と同様、解析部位Ｆの蛍光強度を「１」としている。蛍光の定量評価により、センチネルリンパ節内の各部位における量子ドットの存在個数を精密に評価することが可能となった。
【００８８】
図２５Ａは、摘出したセンチネルリンパ節の組織をヘマトキシリン・エオジン染色した標本の顕微鏡画像である。図２５Ａの領域１０２は、図２０Ａの領域１００及び図２０Ｂの領域１０１に対応する部分である。図２５Ｂは、図２５Ａの領域１０２の拡大画像である。染色により、輸入リンパ管流入部１０３，１０４の位置が確認できる。
【００８９】
図２６Ａは、摘出したセンチネルリンパ節の組織をリンパ節内のＴ細胞に特異的なＣＤ３抗体をＤＡＢで染色した免疫染色顕微鏡画像である。図２６Ａの領域１０５は、図２０Ａの領域１００及び図２０Ｂの領域１０１に対応する部分である。図２６Ｂは、図２６Ａの領域１０５の拡大画像である。図２６Ｂにおいて、免疫染色で染まらない数個のリンパ濾胞に囲まれた部分が輸入リンパ管流入部１０６，１０７である。
【００９０】
図２１、図２２Ａ〜図２２Ｆ、図２３及び図２４に示した蛍光解析結果と、図２５Ａ、図２５Ｂ、図２６Ａ及び図２６Ｂに示した顕微鏡解析結果とを合わせて考えると、センチネルリンパ節において高い蛍光強度を示した部位（解析部位Ａ及びＢ）は、輸入リンパ管流入部の近傍に一致していた。
【００９１】
すなわち、量子ドットの注射部からのリンパ流を受ける輸入リンパ管流入部付近には量子ドットが多数存在していた。一方、同じリンパ節内でも輸入リンパ管流入部以外のところでは解析部位Ａ、Ｂほどの高い蛍光強度を示さなかった。また、摘出されたセンチネルリンパ節において、輸入リンパ管は、解析部位Ａ、Ｂの他にも存在したが、蛍光を示していなかった。他の輸入リンパ管は、量子ドットの注射部以外の胃壁からのリンパ流を受けるリンパ管（リンパ節内の別のセグメント）であった。
【００９２】
以上より、摘出したセンチネルリンパ節において、センチネルリンパ節のトレーサーとして用いた量子ドットのセンチネルリンパ節内での分布を精細に定量解析することにより、センチネルリンパ節での輸入リンパ管流入部を検出することが可能となった。輸入リンパ管流入部付近は癌転移の危険度が高い部位であり、この蛍光解析法で得られたデータを指標に重点的に病理組織検査を行うことにより、センチネルリンパ節における転移癌細胞の検出能が飛躍的に向上することが期待される。
【００９３】
＜抗体結合量子ドット＞
次に、センチネルリンパ節のトレーサーとして量子ドットを単独で用いた場合と、ある細胞に対して特異的な抗体が結合された抗体結合量子ドットを同時に用いた場合とで、量子ドットのセンチネルリンパ節内での局在の違い（トレーサーとしての挙動の違い）について観察した。
【００９４】
センチネルリンパ節のトレーサーとして、量子ドット（蛍光波長705ｎｍ）だけでなく、リンパ節内に存在する細胞（ここではＴリンパ球）に特異的なＣＤ３抗体が結合された量子ドット（蛍光波長605ｎｍ）を同時に使用し、その挙動の違いを確認した。ＣＤ３抗体が結合された量子ドット（ＣＤ３ａｂ−ＱＤ）と量子ドットは蛍光波長が異なるため、同波長励起（532ｎｍ）であっても顕微鏡の吸収フィルタを変えるだけでそれぞれの蛍光波長を分けて評価することが可能である。
【００９５】
結果として、ＣＤ３ａｂ−ＱＤは、量子ドット単独の場合と同様にセンチネルリンパ節の輸入リンパ管流入部に局在したのに加え、抗体がターゲットとしているＴ細胞周囲にも存在し、細胞の特異的な標識が可能であった。
【００９６】
図２７Ａは、摘出したセンチネルリンパ節の撮影画像であり、図２７Ｂは、内視鏡型蛍光計測装置１０により取得された同センチネルリンパ節の蛍光画像である。
図２７Ｃは、図２７Ａの撮影画像の領域１１０の組織の免疫染色画像であり、図２７Ｄは、図２７Ｃの領域１１１の免疫染色画像である。図２７Ｃ及び図２７Ｄにおいて、染まっている細胞がＴリンパ球である。
【００９７】
図２７Ｅは、図２７ＤにおいてＴリンパ球が多く存在する領域１１２の組織を１分子蛍光顕微鏡４０及び画像解析装置５０で蛍光解析した蛍光画像であり、605ｎｍ用の吸収フィルタ（565-625ｎｍのバンドパスフィルタ）を用いたものである。Ｔリンパ球に相当する部分１１３，１１４が蛍光を示している。図２７Ｆは、図２７ＤにおいてＴリンパ球が多く存在する領域１１２の組織を、１分子蛍光顕微鏡４０及び画像解析装置５０で蛍光解析した蛍光画像であり、705ｎｍ用の吸収フィルタ（690-730ｎｍのバンドパスフィルタ）を用いたものである。リンパ管流入部付近で量子ドット（705ｎｍ）が一定量存在し得る場所において、Ｔリンパ球周囲にＣＤ３ａｂ−ＱＤ（605ｎｍ）が局在し、Ｔ細胞を標識することが確認された。このように、センチネルリンパ節内の蛍光に基づいてＴリンパ球を同定することができ、Ｔリンパ球の検出精度を向上させることができる。
【００９８】
この方法を応用して、様々な腫瘍マーカー（抗体）を量子ドットに結合させることにより、センチネルリンパ節内の癌細胞を特異的に標識することが可能であり、発明者等が開発したセンチネルリンパ節の内部構造解析技術を更に発展させることができる。すなわち、癌細胞に対して特異的な抗体が結合された量子ドットを用いることにより、癌細胞の検出精度を向上させることができる。
【００９９】
＜センチネルリンパ節検出結果＞
図２８に、センチネルリンパ節の検出結果を示す。具体的には、６頭のブタのそれぞれの体重、注射部で蛍光が検出されたか否か、リンパ管で蛍光が検出されたか否か、センチネルリンパ節の数、センチネルリンパ節を検出するまでの時間を示す。すべての実験例で１０分以内にセンチネルリンパ節を検出可能であった。
【０１００】
［結論］
以上の実験結果から、センチネルリンパ節内において、蛍光強度が高い部位、すなわち、量子ドットが局在する部位は、輸入リンパ管流入部であることが確認された。癌細胞のリンパ節転移は輸入リンパ管流入部付近から始まると考えられるため、センチネルリンパ節内の転移開始部位は量子ドットのセンチネルリンパ節内での局在部位と一致する。したがって、センチネルリンパ節内での量子ドットの分布を高感度・高精度に検出することにより、癌転移の危険度の高い部位を精度よく検出することが可能となる。
【０１０１】
発明者等が開発した手法によれば、量子ドットをセンチネルリンパ節のトレーサーとして用いるだけでなく、１分子蛍光顕微鏡４０によるセンチネルリンパ節の構造解析に用いることができる。センチネルリンパ節内の量子ドットの蛍光強度を高精度で定量評価し、蛍光分布を精細に解析することにより、センチネルリンパ節を、より精密なリンパ節内微小区域（microscopic area）として捉えることができる。具体的には、１分子レベルで観察可能な１分子蛍光顕微鏡４０を用いて、量子ドットが注入された状態で摘出されたセンチネルリンパ節内の複数の部位のそれぞれについて蛍光強度を測定し、測定された複数の部位のうち蛍光強度が最も高いものから順に一又は複数の部位を輸入リンパ管流入部として検出する。したがって、センチネルリンパ節内の蛍光強度が高い部位を輸入リンパ管流入部として検出するので、センチネルリンパ節内において転移癌細胞が存在し得る部位を精度よく検出することができる。
【０１０２】
また、１分子蛍光顕微鏡４０により取得された画像を、画像解析装置５０において画像解析することにより、複数の部位のそれぞれについて精度よく蛍光強度を測定することができる。
【０１０３】
このように、センチネルリンパ節における量子ドットの蛍光分布を指標に、精度よく病理診断箇所の狙いを定めることが可能となる。転移危険度の高い部位に対して集中した病理組織診断を行うことで偽陰性（癌の転移の見逃し）が減少し、転移診断能が飛躍的に向上することが期待される。また、病理組織診断に必要な切片数を最小限にすることも可能となる。
【０１０４】
また、センチネルリンパ節生検を行う際に、リンパ節内の細胞に特異的に反応する抗体が結合された量子ドットを用いることにより、標的に対する能動性の付与が可能であることが示された。癌細胞に対して特異的に反応する抗体が結合された量子ドットを用いることにより、最終的にセンチネルリンパ節内の癌細胞の存在をつきとめることができ、癌細胞の検出精度を向上させることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明に係る輸入リンパ管流入部検出方法及び特定細胞同定方法は、癌細胞が存在し得る部位を検出する医療分野において利用可能性がある。
【符号の説明】
【０１０６】
１  蛍光計測システム
２  顕微鏡システム
１０  内視鏡型蛍光計測装置
１１  ＥＭＣＣＤカメラ
１２  レンズ
１３  蛍光フィルタ
１４  ライトガイド
１５  内視鏡部
１６  ハンドル
２０  画像解析装置
２１  ＣＰＵ
２２  ＲＯＭ
２３  ＲＡＭ
２４  通信部
２５  操作部
２６  表示部
２７  記憶部
２８  バス
３０  レーザー光励起装置
４０  １分子蛍光顕微鏡
５０  画像解析装置
５１  ＣＰＵ
５２  ＲＯＭ
５３  ＲＡＭ
５４  通信部
５５  操作部
５６  表示部
５７  記憶部
５８  バス
【図１】
2010150578.tif 000003
【図２】
2010150578.tif 000004
【図３】
2010150578.tif 000005
【図４】
2010150578.tif 000006
【図５】
2010150578.tif 000007
【図６Ａ】
2010150578.tif 000008
【図６Ｂ】
2010150578.tif 000009
【図７Ａ】
2010150578.tif 000010
【図７Ｂ】
2010150578.tif 000011
【図８Ａ】
2010150578.tif 000012
【図８Ｂ】
2010150578.tif 000013
【図８Ｃ】
2010150578.tif 000014
【図８Ｄ】
2010150578.tif 000015
【図８Ｅ】
2010150578.tif 000016
【図９Ａ】
2010150578.tif 000017
【図９Ｂ】
2010150578.tif 000018
【図９Ｃ】
2010150578.tif 000019
【図９Ｄ】
2010150578.tif 000020
【図９Ｅ】
2010150578.tif 000021
【図１０】
2010150578.tif 000022
【図１１】
2010150578.tif 000023
【図１２Ａ】
2010150578.tif 000024
【図１２Ｂ】
2010150578.tif 000025
【図１２Ｃ】
2010150578.tif 000026
【図１３Ａ】
2010150578.tif 000027
【図１３Ｂ】
2010150578.tif 000028
【図１３Ｃ】
2010150578.tif 000029
【図１４】
2010150578.tif 000030
【図１５Ａ】
2010150578.tif 000031
【図１５Ｂ】
2010150578.tif 000032
【図１５Ｃ】
2010150578.tif 000033
【図１６Ａ】
2010150578.tif 000034
【図１６Ｂ】
2010150578.tif 000035
【図１６Ｃ】
2010150578.tif 000036
【図１７】
2010150578.tif 000037
【図１８】
2010150578.tif 000038
【図１９】
2010150578.tif 000039
【図２０Ａ】
2010150578.tif 000040
【図２０Ｂ】
2010150578.tif 000041
【図２１】
2010150578.tif 000042
【図２２Ａ】
2010150578.tif 000043
【図２２Ｂ】
2010150578.tif 000044
【図２２Ｃ】
2010150578.tif 000045
【図２２Ｄ】
2010150578.tif 000046
【図２２Ｅ】
2010150578.tif 000047
【図２２Ｆ】
2010150578.tif 000048
【図２３】
2010150578.tif 000049
【図２４】
2010150578.tif 000050
【図２５Ａ】
2010150578.tif 000051
【図２５Ｂ】
2010150578.tif 000052
【図２６Ａ】
2010150578.tif 000053
【図２６Ｂ】
2010150578.tif 000054
【図２７Ａ】
2010150578.tif 000055
【図２７Ｂ】
2010150578.tif 000056
【図２７Ｃ】
2010150578.tif 000057
【図２７Ｄ】
2010150578.tif 000058
【図２７Ｅ】
2010150578.tif 000059
【図２７Ｆ】
2010150578.tif 000060
【図２８】
2010150578.tif 000061
【国際調査報告】
2010150578.tif 000062
2010150578.tif 000063
2010150578.tif 000064
2010150578.tif 000065