【事件の表示】
　特許第２９７２２４１号「全イムノグロブリンクラスの抗原特異的抗体を測定するための１段階イムノアツセイ」の請求項１に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２９７２２４１号の請求項１に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　本件特許第２９７２２４１号の請求項１に係る発明の出願は、平成１年（１９８９年）１１月６日（パリ条約による優先権主張、１９８８年１１月５日、ドイツ）に出願され、平成１１年８月２７日に設定登録された。
　その後、申立人小林美弥子より特許異議の申立てがあり、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１３年１月２９日に訂正請求がなされ、これに対して訂正拒絶理由通知がなされ、特許権者は平成１３年１０月２５日付けで意見書及び手続補正書を提出している。
　
２．　訂正の適否について
（１）訂正及び補正の内容
　平成１３年１月２９日付け訂正請求書による訂正の内容、及び平成１３年１０月２５日付け手続補正書による補正の内容は、次のとおりである。
＜訂正事項＞
　  特許請求の範囲の請求項１の「ことからなる生物学的体液検体中の抗原−特異的抗体の測定方法」を、
「ことからなり、前記抗原が、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）、Ｂ型肝炎エンべロープ抗原（ＨＢｅ）、ＨＩＶ１抗原、ＨＩＶ２抗原、Ａ型肝炎ウイルス抗原または非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス抗原である、生物学的体液検体中の抗原−特異的抗体の測定方法」と訂正する。
＜補正事項＞
　訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１の
「ことからなり、前記抗原が、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）、Ｂ型肝炎エンべロープ抗原（ＨＢｅ）、ＨＩＶ１抗原、ＨＩＶ２抗原、Ａ型肝炎ウイルス抗原または非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス抗原である、生物学的体液検体中の抗原−特異的抗体の測定方法」を、
「ことからなり、前記抗原が、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）またはＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）である、生物学的体液検体中の抗原−特異的抗体の測定方法」と補正する。
　
（２）訂正請求に対する補正の適否について
  上記補正事項は、測定に使用する抗原を、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）、Ｂ型肝炎エンべロープ抗原（ＨＢｅ）、ＨＩＶ１抗原、ＨＩＶ２抗原、Ａ型肝炎ウイルス抗原または非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス抗原と訂正する訂正請求から、測定に使用する抗原をＢ型肝炎エンべロープ抗原（ＨＢｅ）、ＨＩＶ１抗原、ＨＩＶ２抗原、Ａ型肝炎ウイルス抗原または非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス抗原と訂正することを削除する補正であるから、請求の要旨を変更するものではなく、特許法第１２０条の４第３項で準用する特許法第１３１条第２項の規定に適合する。
　
（３）補正後の訂正の新規事項の有無、訂正の目的の適否、及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否
 　測定に使用する抗原を「Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）」または「Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）」とすることは、本件特許の願書に添付された明細書の実施例１、実施例２にそれぞれ具体的に記載されている。
　そして、請求項１についての上記訂正事項の、測定に使用する抗原をＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）またはＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）と限定する訂正は、特許請求の範囲の減縮を目的とするものであり、かつ実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。
　
（４）訂正についての検討結果
　以上検討したところによれば、上記補正された訂正は、平成６年法律第１１６号附則第６条第１項の規定によりなお従前例によるとされる、特許法特許法１２０条の４第３項において準用する平成６年法律第１１６号による改正前の特許法第１２６条第１項ただし書、第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議申立てについての判断
（１）特許異議申立ての概要
　　申立人小林美弥子は、下記の甲第１，２号証を提出して、請求項１に係る発明は、甲第１号証及び甲第２号証に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明できたものであるから、請求項１に係る発明は、特許法２９条第２項の規定により特許を受けることができないものである旨主張している。
　甲第１号証：
　　石川栄治外２名編「酵素免疫測定法」、医学書院、第３版、４３頁〜４９頁（１９８７）
  甲第２号証：
　　ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ　ＬＥＴＴＥＲＳ、１６（Ｂ１６）、１３０３−１３１９（１９８３）
　
（２）本件発明
　本件特許第２９７２２４１号の請求項１に係る発明は、平成１３年１０月２５日付け手続補正書により補正された訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１に記載された次のとおりのものである。（以下、「本件発明」という。）
「１）ａ）被測定抗体に特異的な抗原を担体に結合させ、
　ｂ）上記結合抗原を生物学的体液の検体と接触させ、
　ｃ）同時に担体に結合したものと同じ抗原であって標識された抗原を
　　上記結合抗原と検体との混合物に加え、
　ｄ）得られた混合物をインキュベーションし、
　ｅ）液相と固相とを分離し、そして　
  ｆ）結合した抗原の標識を測定する
ことからなり、前記抗原が、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）またはＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）である、生物学的体液検体中の抗原−特異的抗体の測定方法。」
　
（３）甲号証刊行物の記載事項
３−１）甲第１号証
　甲第１号証には、下記の事項が記載されている。（なお、丸数字は括弧付き数字に書き換えてある。）
（１ａ）  抗体測定サンドイッチ法（４９頁１２行〜２０行）
「Ｂ．抗体測定　
　・・・
　２．非競合法
　　ａ．サンドイッチ法
　　Ａ−２−ａ−１）項（４４頁）および図９で示した抗原測定法において抗原と抗体を入れ換え、固相化抗原と、酵素標識抗原を用いることにより抗体を測定できる。」
（１ｂ） 抗原測定法 Ａ−２−ａ−１）項（４４頁下から１０行〜４６頁下から５行）
「ａ．　Ｂ／Ｆ分離法（ヘテロジニアス　heterogeneous ＥＩＡ）
１）サンドイッチ法sandwich method：本法は抗体測定のために開発されたものなので、以下に述べるような抗原測定の場合は、two site immunoenzymometric assayとも呼ばれる。
　まず図９（１）のように抗体を固相化しておき、これに非標識抗原（標準または被検体）を加える。その結果（２）のように抗原抗体反応が起こり、抗原は固相化抗体に結合するのでその後上清を除いてしまう。この段階は、いわば固相化抗体を用いて、抗原を抽出するような形となる。次に（３）で示すように、酵素を標識した抗体を入れる。すると（４）のように再び抗原抗体反応が起こり、この標識抗体は先に固相化抗体に付いている抗原の上に結合する。そこで（５）のように上清、すなわち抗原と結合しなかった酵素標識抗体を除く。その後（６）のように酵素反応を行う。　　・・・
　さて、前項で述べた競合反応法・・・・・なお、図９のようにまず固相化抗体と抗原とを反応させてから標識抗体を入れる方式をforward sandwdch EIAと呼び、始めに抗原と酵素標識抗体とを反応させてから固相化抗体を入れる方式をreverse sandwich EIAとよび、両者を併せて二段階法という。さらに ３ 者を同時に入れる方式をsimultaneous sandwich EIA　（１段階サンドイッチ法）と呼ぶ。」
　
３−２）甲第２号証
　甲第２号証は、「ヒト血清中の抗チログロブリン自己抗体のための１段階酵素結合免疫測定法」という表題の学術論文であって、甲第２号証には、下記の事項が記載されている。
（２ａ）　要約（１３０３頁下から６〜２行）
「ヒト血清中の抗チログロブリン自己抗体の測定のための「１段階」酵素結合免疫測定法が研究され、これは、ヒトチログロブリン被覆シリコーンゴムロッド、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ又は西洋ワサビパーオキシダーゼを結合したヒトチログロブリン、及び、血清検体を同時に混合するものである。」
（２ｂ）  イントロダクション（１３０４頁９〜２２行）
「我々は、ポリクローナルウサギ抗−ＨＴｇ抗体を使用するヒトチログロブリン（ＨＴｇ）用の１段階酵素結合免疫測定法について前回述べた。1　この測定法は、簡単で、迅速で、高感度で、そして、再現性に優れていた。2　このＨＴｇの１段階測定法による測定の成功は、抗原抗体反応の反応段階の簡素化によるものであった。そして、たくさんの抗原決定基を有するＨＴｇの分子量が高分子量であることによるものであった。しかしながら、１段階測定法が低分子量の抗原及び抗原特異的抗体の測定に適しているかどうかは、知られていなかった。
　本論文では、ＨＴｇ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼコンジュゲート又はＨＴｇ−西洋ワサビパーオキシダーゼコンジュゲートを使用する、抗−ＨＴｇ自己抗体用の１段階測定法について述べる。」
（２ｃ）  「フォワードサンドイッチ」測定法（１３０８頁８〜末行）
「抗−ＨＴｇ抗体に対する酵素結合免疫測定法の構築
　ＨＴｇ被覆シリコーンゴムロッド、及び、ＨＴｇ−β−Ｄ−Ｇａｌコンジュゲート又はＨＴｇ−ＨＲＰコンジュゲートのいずれか、を使用して２つの測定法を構築した。第１の測定方法においては、ＨＴｇ被覆シリコーンゴムロッドを全容量０．１５ｍ１の抗ＨＴｇ抗体標準品又は血清検体を含有する試験管に加え、この混合物を３７℃１０時間インキュベートした。・・・
インキュベーション後、このシリコーンゴムロッドを緩衝液Ａ（又は緩衝液Ｂ）１ｍｌで２回洗浄し、０．０８〜１０ｍＵのＨＴｇ−β−Ｄ−Ｇａｌコンジュゲート（又は２３．４〜２９２５ＵのＨＴｇ−ＨＲＰコンジュゲート）と全容量０．１５ｍｌの緩衝液Ａ（又は緩衝液Ｂ）中で３７℃１０時間インキュベートした（「フォワードサンドイッチ」測定法）。」
（２ｄ）　「１段階」測定法（１３０９頁１〜７行）
「第２の測定法においては、ＨＴｇ（ヒトチログロブリン）被覆シリコーンゴムロッド、０．０８〜１０ｍＵのＨＴｇ−β−Ｄ−Ｇａｌコンジュゲート（又は２３．４〜２，９２５ＵのＨＴｇ−ＨＲＰコンジュゲート）、及び、５ μ１の血清検体又は抗ＨＴｇ抗体標準品を同時に添加し、３７℃にて３〜２４時間インキュベートした（「１段階」測定法）。続いて、シリコーンゴムロッドを緩衝液Ａ（又は緩衝液Ｂ）ｌｍｌで２回洗浄し、結合した酵素活性を上記のようにして測定した。」
（２ｅ）　迅速、高感度、再現性（１３１８頁７行以下）　
「しかし、実験的には、０．４ｍＵ／試験管のＨＴｇ−β−Ｇａｌコンジュゲートを使用して６時間以内の測定を行った場合に、抗ＨＴｇ抗体の１段階測定法を構築することに成功した。この測定法は、迅速で、高感度で、かつ、再現性に優れていた。この１段階測定法の感度は、フォワードサンドイッチ測定法の感度よりずっと高かった。」　
（２ｆ）  不一致（１３１８頁２４行〜１３１９頁９行、１３１６頁図５）
「１段階測定法により測定された濃度値とフォワードサンドイッチ測定法によるものとの間での比較において、予期しない結果が得られた。図５に見られるように、両測定法により測定された濃度値において、かなりの不一致が観察される。これらの不一致を両測定法の方法論的偏差で説明することは困難である。というのは、フォワードサンドイッチ測定法は前回報告したように高度に再現性があるからである。したがって、一つの可能な説明は、抗−ＨＴｇ自己抗体の異種混交性に由来する不一致である。この抗−ＨＴｇ自己抗体は、固相に固定化したＨＴｇに対する親和性、及び、酵素に結合したＨＴｇに対する親和性が、種々異なるようにふるまうであろう。 さらに解析を実行中である。」
　図５には、「図５　１段階測定法およびフォワードサンドイッチ測定法による抗−ＨＴｇ抗体の並行測定の比較。　グレーブズ病患者（ＧＤ、●）および橋本甲状腺炎患者（ＨＴ、○）からの７３血清中の抗−ＨＴｇ抗体濃度が、０．４ｍＵ／試験管のＨＴｇ−β−Ｇａｌコンジュゲートを使用して２０時間内の両測定法で定量された。」という説明と共に、横軸を「１段階測定法（μｇ／ｍｌ）」、縦軸を「フォワードサンドイッチ測定法（μｇ／ｍｌ）」としたグラフが図示され、●印のものも○印のものも、共に濃度に関わらず、両測定法による測定結果が一致しないことが図示されている。
　
（４）本件発明と甲号証記載の発明との対比、判断
　本件発明は、前記（２）のとおり、固定化抗原と被測定抗体と標識抗原との３者を同時に加え接触させる１段階サンドイッチ法によるＨＢｓ抗原−特異的抗体またはＨＢｃ抗原−特異的抗体の測定方法である。
　甲第１号証には、なるほど抗原測定のためのサンドイッチ法としては、１段階サンドイッチ法があることが記載されている（前記（１ｂ）参照）。しかしながら、抗体の測定法としては、「Ａ−２−ａ−１）項（４４頁）および図９で示した抗原測定法において抗原と抗体を入れ換え、固相化抗原と、酵素標識抗原を用いることにより抗体を測定できる。」と、フォワードサンドイッチ測定法が使用できることを記載しているにとどまるものであって（前記（１ａ）参照）、ＨＢｓ抗原−特異的抗体またはＨＢｃ抗原−特異的抗体という特定抗体の測定に１段階サンドイッチ法が使用できることはもちろんのこと、抗体の測定に１段階サンドイッチ法が使用できることも記載されていない。
　また、甲第２号証に記載された「ヒト血清中の抗チログロブリン自己抗体のための１段階酵素結合免疫測定法」は、前記（２ａ）、（２ｄ）に記載の如く、１段階サンドイッチ法による抗体の測定方法である点で本件発明と共通するものの、測定対象が抗チログロブリン自己抗体である点で、本件発明と相違するものである。しかも、該抗体の１段階サンドイッチ法による測定は、１段階サンドイッチ法であることにより迅速化等が図られるものの、前記（２ｆ）に記載の如く、高度に再現性のあるフォワードサンドイッチ測定法による結果との一致性がないことが記載されている。
　一方、測定対象抗体の異なる本件発明は、ＨＢｓ抗原−特異的抗体の測定に関する実施例１の明細書第２０〜２１頁の「ｆ）得られた結果の例」の記載（特許公報第４欄１３〜１６行、第１表、第３欄３１〜４１行参照）、およびＨＢｃ抗原−特異的抗体の測定に関する実施例２の明細書２６頁１〜２行の記載（特許公報第５欄１７〜１８行参照、なお特許公報の「実施例２」中の記載「ＨＢｓ」はすべて「ＨＢｃ」の誤植である。）にも記載されているように、甲第２号証記載の抗チログロブリン自己抗体の測定の場合とは異なり、従来の二段階法のフォワードサンドイッチ測定法や競合法の結果とよく一致するという効果を奏するものである。そして、そのような結果が、明細書第２０〜２１頁の第１表に具体的に記載されているように、従来の二段階サンドイッチ測定法では１８〜２５時間のアッセイ時間を要するのに対し、本件発明によればわずか９０分のアッセイ時間で達成できるということは、別異の抗原特異的抗体の１段階サンドイッチ法によるアッセイ時間の短縮化について記載されている甲第２号証の記載からも、予測できない効果である。
　また、サンドイッチ法による測定対象としてみれば、一般に抗体との結合部位である抗原決定基を様々な位置に複数有する抗原を固定化抗体と標識抗体とでサンドイッチ化する抗原の場合と、抗原との結合部位が抗体のＹ字状構造の特定部位（抗原結合部位）にしか存在しない抗体の場合とでは、固定化試薬成分と標識試薬成分とが反応できる立体的制約等、抗原抗体反応条件が全く同じであるとは考えられない状況が存在する。しかも、甲第２号証には「１段階測定法が低分子量の抗原及び抗原特異的抗体の測定に適しているかどうかは、知られていなかった。」と記載してあるところである（前記（２ｂ）参照）。
　そうすると、ＨＢｓ抗原−特異的抗体またはＨＢｃ抗原−特異的抗体を１段階サンドイッチ法でフォワードサンドイッチ測定法や競合法の結果とよく一致するように測定するという本件発明が、甲第１号証および甲第２号証に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものとすることはできない。
　
４．　むすび
　したがって、特許異議申立ての理由及び証拠によっては、本件発明の特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年１１月１５日（２００１．１１．１５）
【訂正の要旨】
　訂正の要旨
＜訂正事項＞
　特許請求の範囲の請求項１の「ことからなる生物学的体液検体中の抗原−特異的抗体の測定方法」を、特許請求の範囲の減縮を目的として、
「ことからなり、前記抗原が、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）、Ｂ型肝炎エンベロープ抗原（ＨＢｅ）、ＨＩＶＩ抗原、ＨＩＶ２抗原、Ａ型肝炎ウイルス抗原または非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス抗原である、生物学的体液検体中の抗原−特異的抗体の測定方法」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
全イムノグロブリンクラスの抗原特異的抗体を測定するための１段階イムノアッセイ
（５７）【特許請求の範囲】
　１）ａ）被測定抗体に特異的な抗原を担体に結合させ、
　　ｂ）上記結合抗原を生物学的体液の検体と接触させ、
　　ｃ）同時に担体に結合したものと同じ抗原であって標識された抗原を上記結合抗原と検体との混合物に加え、
　　ｄ）得られた混合物をインキュベーションし、
　　ｅ）液相と固相とを分離し、そして
　　ｆ）結合した抗原の標識を測定する
　ことからなり、前記抗原が、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）またはＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）である、生物学的体液検体中の抗原−特異的抗体の測定方法。
【発明の詳細な説明】
　本発明は特定の抗原に対して特異的でありかつ全イムノグロブリンクラスを包含する抗体を検出および測定するための免疫化学的方法に関する。
　イムノグロブリンは外来物質（抗原例えば病原体のタンパク質、細菌性ポリサッカライド）に対してのみならず内因性の血清タンパク質および組織タンパク質に対して身体の免疫系により産生される抗体である。
　抗原特異的なイムノグロブリンの測定は寄生虫、細菌またはウイルスによる特定の疾患を検出するのに特に重要である。イムノグロブリンの測定に関して多数の免疫学的方法が知られている。クラスに従いイムノグロブリンを物理的に分離する方法、例えば免疫拡散法、免疫電気泳動法または密度勾配遠心法は煩雑で不正確でかつ妨害を受け易い。
　いわゆるイムノアッセイ法を用いる直接法においては抗原特異的なイムノグロブリンを測定することができる。この方法では抗原を固形担体に結合させて反応性の固相を得る。抗原特異的イムノグロブリンを含有する体液をこの固相と接触させて抗原特異的イムノグロブリンを固相に結合させ、固相と液相を分離し、次にこの固相を、溶液中に存在しておりかつ固相上の抗原と同じ特異性を有する標識された抗原と接触させ、再び固相と液相を分離し、そして固相上もしくは液相中の標識を測定する。かかる方法は米国特許第４，０１６，０４３号の実施例ＩＩＩに記載されている。
　標識化には例えば、蛍光性および発色性物質、または放射性同位元素または酵素が用いられる。
　前記した方法では、検出すべき抗体を含有する検体を固相と反応（インキュベーション）させた後かつ標識抗原と反応させる前に非結合物質を洗浄により除去することが必須要件である。それゆえこれらの方法は「２段階法」と呼ばれる。
　このことは予め調製された固相を用いるアッセイは少くとも３つの反応段階、すなわち
（１）検体の添加、
（２）標識抗原の添加、および
（３）検出反応用の試薬の添加、
を必要とし、そして各反応段階につき少くとも２回の洗浄工程が必要となる。
　そこでこのアッセイをもっと短縮するという課題があった。今、驚くべきことに、抗原を含有する固相、抗体を含有する検体および標識抗原を、検体の添加と標識抗原の添加との間で洗浄することなく接触できることが判明した。
　かかる「１段階法」を実施可能ならしめる試薬は、担体に結合された抗原の量および液相中に存在する標識抗原の濃度が特定の被分析物質の濃度範囲にうまく適合しかつ抗原用に選択された担体例えばミクロアッセイプレートまたは試験管中のビーズ、アッセイ容量、およびインキュベーション条件例えばインキュベーション時間にうまく適合してはじめて製造可能となった。
　それゆえ本発明は、
ａ）連続希釈的に溶解された抗原を担体と接触させ、結合されなかった抗原は緩衝液で洗浄することにより除去しかくして相互に異なる量の抗原を含有する多数の固相を調製し、
ｂ）種々の量または希釈度を有する多数の検体を同じ特異性を有する標識抗原の連続希釈物と接触させて混合物を得、それらの全てを
ｃ）前記ａ）項記載のようにして調製された固相と接触させ、
ｄ）固相を液相から分離し、
ｅ）固相の標識を測定し、そして
ｆ）その標識がシグナルを生成するような反応混合物を選択するものとし、ここで該反応混合物とは固相を初めに検体と接触させ、次に固相を液相と分離し、次に固相を前記ｂ）項に記載されるような連続希釈から得られる標識抗原の希釈物と接触させ、再び固相と液相を分離しそして固相の標識を測定する、
ことにより抗原特異的イムノグロブリンを測定するための試薬を製造する方法に関する。
　本発明はさらに、固相として抗原を負荷された担体、および該固相の抗原と同じ特異性を有する標識された抗原を含有しており、それらの量および濃度が前記製造法において相互に適合していることからなる試薬にも関する。
　本発明はまた検体と標識された抗原とを同時に固相と接触させ、次に固相を液相から分離し、そして固相上の標識を測定することからなる抗原特異的抗体の測定法へのかかる試薬の使用にも関する。
　固相に適する担体物質はプラスチック例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミドまたはその他の合成ポリマー、天然ポリマー例えば、酢酸セルロースまたはニトロセルロース、ならびにガラス、特にガラス繊維である。
　これら担体はビーズ状、棒状、チューブ状およびマイクロアッセイプレートの形態をとることができる。紙片、小プレートおよび膜のようなシート様構造物も同様に適する。これら担体の表面は水溶液に対して透過性でも不透過性でもよい。マイクロアッセイプレートが好ましい担体である。
　本発明による方法に適する固相は抗原調製物を不可逆的に担体に結合させることにより調製される。
　本明細書における「固相」なる用語は免疫化学的反応体が結合された担体を意味する。
　本明細書で意味する不可逆的結合は例えば以下の場合に存在する、すなわち
　（１）その方法で用いられる試薬例えば標識された免疫学的試薬、または希釈溶液または緩衝溶液により分解されない吸着的結合、
　（２）免疫化学的に（高アフィニティ抗体）、または非免疫化学的に結合するスペーサーにより仲介されるバイオアフィニティ結合、この場合スペーサーはビオチンおよびアビジンから、またはその他のレセプターとリガンドの対から成ることができるものとし、
　（３）共有による直接結合、または
　（４）化学的二官能性スペーサーにより仲介された共有結合。
　水透過性担体が用いられる場合は共有結合が好ましく、また水透過性のみならず水非透過性担体が用いられる場合は吸着的結合が好ましい。
　ガンマ線処理された、担体としてのポリスチレンに抗原調製物を直接吸着結合させるのが特に好ましい。
　固相用および標識抗原調製用の抗原としては古典的な精製タンバク、合成ペプチドまたは遺伝子操作により調製された（製法は文献にある）タンパク質が適当である。
　一般に、標識抗原の調製に用いられる抗原は担体への結合に用いられたと同じ抗原である。標識化は、その標識に関し従来法記載の方法により行われる。
　標識化には例えば蛍光性および発色性物質または放射性同位元素、酵素、または免疫成分を負荷した赤血球もしくはラテックス粒子のような粒子が用いられる。
　酵素が好ましく用いられる。
　本発明による試薬は例えばサイトメガロウイルス、風疹、ヘルペスシンプレックスウイルス、水痘、帯状疱疹ウイルス、麻疹およびムンプス、トキソプラズマ、トレポネマ、ＡおよびＢ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ｃおよびｅ抗原、クラミジア、エプスタイン−バールウイルス、パーボウイルス、ロータウイルスに対する抗体、および獣医の診断にあたり重要な病原体例えばアウジエスキー病、ウシ白血病またはブルセラ症の病原体に対する抗体を検出および測定するのに用いられる。
　本発明による試薬はＢ型肝炎コアタンパク、Ａ型肝炎ウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、風疹またはサイトメガロウイルス抗原、または梅毒トレポネマもしくはトキソプラズマ抗原に対する抗体を測定するのに使用するのが好ましい。
　その方法に必要な全ての試薬を乾燥形で含有する１個のエレメントからなるかかる薬剤も好ましい。
　ここに記載される本発明の１段階イムノアッセイは原則的には既にこれ迄に記載されている直接的および間接的多段階アッセイと同様に使用できる。本発明による新規方法は従来法に比べ３点で相異するところが好都合である。すなわち被分析物質を含有する検体と標識された免疫学的試薬とを同時にインキュベーションしうることによりインキュベーション工程と洗浄工程が省略でき、それによりアッセイ操作がかなり単純化される。
　実施例から明らかなように、この１段階法により全アッセイ期間がかなり減縮され、このことはこの方法が操作上実際的であるという主なる長所に加えて急性感染を臨床上速やかに検出できるので大へん重要である。
　下記実施例により本発明の態様を説明するが本発明はそれらに限定されるものではない。
実施例１
ヒト血清または血漿中におけるＢ型肝炎表面抗原特異的イムノグロブリンの測定
Ａ．Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）の調製
　ａｄｗまたはａｄｙ亜分類型のＢ型肝炎抗原を高濃度に含有するヒト血清からＨＢｓタンパクを調製した。従来法のクロマトグラフィーおよび遠心分離法（Ｇｅｒｌｉｃｈ他，１９７５，Ｄｅｖｅ１ｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ　
３０
１１５
Ｂ．セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用いるＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）の標識付け
　ヒト血清から得られたＨＢｓ調製物を燐酸塩緩衝食塩水ｐＨ７．２中４ｍｇ／ｍｌに再構成したのちＮａｋａｎｅ他の、１９７４、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．
２２
含有するＰＯＤフラクションを４ｍｇ／ｍｌのＨＢｓと反応させた。水素化硼素ナトリウムの添加に続いて再びゲル濾過しそしてＰＯＤおよびＨＢｓを含有するフラクションをタンパク含量１ｍｇ／ｍｌおよびＰＯＤ：ＨＢｓ比１．５：１〜２．０：１を有するＰＯＤ−ＨＢｓ接合体として得た。
　このフラクションに２０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンおよび１ｍｇ／ｍｌフェノールを加えた。Ｂｅｈｒｉｎｇ　ｗｅｒｋｅ　ＡＧの市販品でポリゼリンと呼ばれる、ヘキサメチレンジイソシアネート架橋５ｇ／ｌ水解ゼラチンの接合緩衝液と呼ばれる溶液、およびＨＣｌでｐＨ７．４に調整した５０ミリモル／ｌトリスがそれ以後の希釈に用いられた。
　従来法である実施例Ｄ法および本発明による１段階法である実施例Ｅの両方にとっての接合体希釈物を確立するために、２倍および５倍連続希釈物を調製し、全希釈物を表に示される血漿、陰性対照および、それぞれすべてをミクロアッセイプレートの種々の量のＨＢｓで被覆されたウエルと２方法に従い接触させた。
　１：５０接合体希釈物および０．４μｇ／ｍｌ　ＨＢｓ（実施例ＣおよびＤ参照）溶液で被覆されたウエルにより、１段階法の１：２０接合体希釈物および１．０μｇ／ｍｌ　ＨＢｓ溶液で被覆されたウエルに等しい結果が２段階法で得られることが判明した（実施例ＣおよびＥ参照）。
ｃ．ＨＢｓを用いるミクロアッセイプレートの被覆
　ミクロアッセイプレート、すなわち丸底イムノプレートＩＩ９６Ｆ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，デンマーク，Ｃａｔ．Ｎｏ．２６２１６２）を燐酸塩緩衝食塩水ｐＨ７．５中の１．６、１．０、０．８、０．４、０．２および０．１μｇ／ｍｌ　ＨＢｓ抗原を含有する溶液１ウエル当たり１２５μｌずつと室温で数時間インキュベーションした。次にこのプレートを吸引により空にし、燐酸塩緩衝食塩水で洗い、シリカゲルで乾燥しそして空気および湿気を通さない包装を行った。
Ｄ．従来法による２段階法におけるＨＢｓ抗原特異的抗体の測定
　ａ）検査すべき未希釈血清検体２００μｌを０．４μｇ／ｍｌ　ＨＢｓ溶液で被覆されたマイクロアッセイプレートの各ウエルに加えた。対照として、ＨＢｓ抗原に対する抗体を含有しない未希釈ヒト血清（陰性対照）ならびにＨＢｓ抗原に対する抗体を含有する検体の連続希釈物２００μｌを加え、
　ｂ）アッセイプレートを覆いそして１８〜２５℃で１６〜２４時間インキュベーションし、
　ｃ）次に内容物を吸引して出し、ツイーン２０を０．１ｍｌ含有する燐酸塩緩衝食塩水で３回洗い、
　ｄ）１：５０接合体希釈物１００μｌを各ウエルに加え、
　ｅ）アッセイプレートを被覆しそして４０℃で１時間インキュベーションし、
　ｆ）再び燐酸塩緩衝食塩水ｐＨ７．５で３回洗ったのち、各ウエルに色原体溶液（ドイツ特許３，５４１，９７９実施例１記載のテトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）基質調製物）１００μｌずつを加えて室温で３０分間インキュベーションし、
　ｇ）基質の酵素による変換を停止させるために各ウエルに１Ｎ硫酸１００μｌずつを加え、そしてこの溶液を４５０ｎｍで測定する。
Ｅ．本発明の１段階法によるＨＢｓ抗原特異的抗体の測定
　ａ）１μｇ／μｌ　ＨＢｓ溶液で被覆されたマイクロタイタープレートの各ウエルに１：２０接合体希釈物２５μｌずつを均一に加え、
　ｂ）測定すべき未希釈血清検体１００μｌを加えた。対照としてＨＢｓ抗原に対する抗体を含有しない未希釈ヒト血清（陰性対照）ならびにＨＢｓ抗原に対する抗体の既知量を含有する検体の連続希釈物１００μｌを加え、
　ｃ）アッセイプレートを覆いそして３７℃で１時間インキュベーションし、
　ｄ）次に内容物を吸引して出し、ツイーン２０を１ｍｌ含有する燐酸塩緩衝食塩水で３回洗い、色原体溶液（ＴＭＢ基質調製物）１００μｌを加えて室温で３０分間インキュベーションし、
　ｅ）基質の酵素による変換を停止させるために各ウエルに１Ｎ硫酸１００μｌずつを加え、そしてこの溶液を４５０ｎｍで測定する。
　ｆ）得られた結果の例
　これら検体はまた前記Ｄａ）−Ｄｇ）項記載の２段階法によってもアッセイした。これら１種類の方法で得られた結果を第１表に示す。
　その吸光度が陰性対照の数字＋０．０５０Ｅより高い検体を陽性と査定した。
　ヒト検体中のＨＢｓ抗原に特異的な抗体の含量測定値を示すこれら吸光度の結果から、１段階法は抗体含量既知標準物による定量において２段階法に等しい結果を生ずることが明らかである。
　第１表に列記されるヒト検体に加え、陰性の血清および血漿５００例およびＨＢｓ抗体を含有する血清および血漿１５０例が２種のアッセイで一致してそれぞれ陰性および陽性と判明した。２種の方法で測定された抗体含量ＩＵ／ｍｌは非常によく一致した。
　従って、ここに記載される１段階法によるＨＢｓ抗原特異的抗体の検出は２段階法と全く同様の感度を有する。しかしながら多段階アッセイ法と比較して前記のおよびその他の抗体の検出はより迅速かつ簡単であり、このことは前記Ｄ項およびＥ項に示される２方法に関わる操作を比較することにより明らかである。
実施例２
Ｂ型肝炎コア抗原特異的イムノグロブリンの測定
Ａ．Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）の調製
　Ｂ型肝炎コア抗原はＳｔａｈ１他のＰｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７９，１６０６−１６１０（１９８２）に記載れるようにしてＤＮＡ技術を用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）で調製した。
Ｂ．ＨＢｃ抗原の酵素標識
　ＨＢｃ抗原はＨＢｓ抗原に関して実施例１Ｂ項に記載されると同様にして標識した。アッセイに使用するのにＨＢｃ−ＰＯＤ接合体の最適な希釈度はチェッカーボード滴定により相当して判定された。
Ｃ．ＨＢｃ抗原を用いるマイクロアッセイプレートの被覆
　実施例１Ｃ項にＨＢｓタンパクについて記載されると同様にして被覆した。しかしながら、この被覆溶液はＨＢｃ抗原に加え１μｇ／ｍｌのゼラチンをも含有した。
Ｄ．従来法による競合アッセイにおけるＨＢｃ抗原特異的抗体（抗ＨＢｃ）の測定
　検体２５μｌそして次に抗ＨＢｃ−ＰＯＤ接合体１００μｌをマイクロアッセイプレートの各ウエルにピペットで加えた。検体は濃度範囲０〜５Ｕ／ｍｌを有するパウル−エールリッヒ（Ｐａｕ１−Ｅｈｒｌｉｃｈ）インスチチュートから得られた抗−ＨＢｃ標準物質の連続希釈物であった。水浴上３７℃で１時間インキュベートする間に、検体中の抗ＨＢｃ抗体が固相上の結合部位を抗−ＨＢｃ−ＰＯＤ接合体と競合する。
　ウエルを洗浄後、西ドイツ特許３，５４１，９７９号実施例１のＴＭＢ基質調製物より高濃度のテトラメチルベンチジン溶液１００μｌを加えて室温で３０分間インキュベーションした。
　次に１Ｎ硫酸１００μｌの添加により反応を停止させ、そしてこの溶液を４５０ｎｍで測定した。
　この競合原理は、抗ＨＢｃを含有しない検体は高いシグナルを生じ、一方抗ＨＢｃ抗体を有する検体は含有量に応じてシグナルを阻害することを意味する。従って、シグナルの高さは抗ＨＢｃ濃度に反比例する。
　陰性対照に比較してシグナルが５０％以下に低下した場合にその検体は抗ＨＢｃ陽性であると査定された。
Ｅ．本発明の１段階法によるＨＢｃ抗原特異的抗体の測定
　ＨＢｃ−ＰＯＤ接合体１００μｌをマイクロアッセイプレートの各ウエルにピペットで加え、次に検体２５μｌを加えた。検体は濃度範囲０〜５Ｕ／ｍｌを有するバウル−エールリッヒインスチチュートから得られた抗−ＨＢｃ標準物質の連続希釈物であった。
　続いて水浴上３７℃で１時間インキュベートする間に、抗ＨＢｃを含有する検体の場合に固相ＨＢｃ、抗ＨＢｃおよびＨＢｃ−ＰＯＤ接合体との間でサンドイッチ複合物が形成された。
　ウエルを洗浄後、ＴＭＢ基質調製物１００μｌを加えて室温で３０分間インキュベーションした。
　次に１Ｎ硫酸１００μｌの添加により反応を停止させ、そしてこの溶液を４５０ｎｍで測定した。
　このサンドイッチ原理は、抗ＨＢｃを含有しない検体は何らシグナルを生成せず（またはバックグラウンドシグナルのみ）、一方抗ＨＢｃ抗体を含有する検体は含有量に応じて増大するシグナルを生成することを意味する。従って、シグナルの高さは抗ＨＢｃ濃度に正比例する。
　その吸光度が陰性対照のシグナルより０．０２５Ｅ以上高い場合にその検体は抗ＨＢｃ陽性であると査定された。
　本発明により得られた結果は競合法の結果と一致した。