(57)【要約】  体細胞数測定装置は、センサと装置本体とからなっている。センサは、生乳を保持するための検査室（２０）と、作用極（３１）及び対極（３３）とを有している。作用極（３１）及び対極（３３）には、検査室（２０）の内部空間に臨む第１電極部（３１ａ）及び第２電極部（３３ａ）がそれぞれ設けられている。第１電極部（３１ａ）上には、生乳中に含まれる活性酸素と反応する酵素試薬（４）が固定化されている。装置本体は、作用極（３１）と対極（３３）との間に電圧を印加したときに流れる電流に基づいて生乳中に含まれる体細胞数を算出する。
2010013757.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生乳を保持するための検査室、前記検査室の内部空間に臨む第１電極部を有し、前記第１電極部上に前記生乳中に含まれる活性酸素と反応する酵素試薬が固定化された作用極、及び前記検査室の内部空間に臨む第２電極部を有する対極、を含むセンサと、
前記作用極と前記対極との間に電圧を印加したときに流れる電流に基づいて前記生乳中に含まれる体細胞数を算出する装置本体と、
を備える体細胞数測定装置。
【請求項２】
前記センサは、前記検査室の内部空間に臨む先端を有し、基準極として使用される参照極をさらに含む、請求項１に記載の体細胞数測定装置。
【請求項３】
前記センサは、前記作用極、前記対極、及び前記参照極を支持するベースプレートと、前記作用極、前記対極、及び前記参照極を挟んで前記ベースプレートに固定され、前記ベースプレートと共に前記検査室を形成するカバープレートと、をさらに含む、請求項２に記載の体細胞数測定装置。
【請求項４】
前記ベースプレートと直交する方向から見たときの前記第１電極部の面積は、０．７〜５００ｍｍ2である、請求項３に記載の体細胞数測定装置。
【請求項５】
前記ベースプレートは、微小凹凸が形成された表面を有し、この微小凹凸の上に前記作用極、前記対極、及び前記参照極が形成されている、請求項４に記載の体細胞数測定装置。
【請求項６】
前記第１電極部の表面は、複数の突起又は複数の窪みによって凹凸形状とされており、
前記複数の突起又は前記複数の窪みの密度は２００〜１５０００個／ｍｍ2であり、前記複数の突起の高さ又は前記複数の窪みの深さは２〜５００μｍであり、前記突起の幅に対する高さのアスペクト比又は前記窪みの幅に対する深さのアスペクト比は０．２〜１０である、請求項４に記載の体細胞数測定装置。
【請求項７】
前記凹凸形状は、前記ベースプレートに形成された凹凸構造に前記第１電極部が沿わされることにより形成されている、請求項６に記載の体細胞数測定装置。
【請求項８】
前記複数の突起における隣り合う突起の間の距離又は前記窪みの幅は４〜８０μｍである、請求項６に記載の体細胞数測定装置。
【請求項９】
前記カバープレートには、前記ベースプレートに沿って当該カバープレートの端面に開口する溝が形成されており、前記溝及び前記ベースプレートの表面によって前記検査室が構成されている、請求項３に記載の体細胞数測定装置。
【請求項１０】
前記溝の幅は１〜５０ｍｍ、深さは０．０５〜５ｍｍ、長さは２〜１００ｍｍである、請求項９に記載の体細胞数測定装置。
【請求項１１】
前記活性酸素は、前記生乳中の好中球から放出されたスーパーオキシドアニオンである、請求項１に記載の体細胞数測定装置。
【請求項１２】
前記検査室に保持された生乳を所定温度に加熱するためのヒータをさらに備える、請求項１に記載の体細胞数測定装置。
【請求項１３】
前記酵素試薬は、ＳＯＤ、シトクロームｃ、ヘミン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、チロシナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、及びラッカーゼよりなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素を含む、請求項１に記載の体細胞数測定装置。
【請求項１４】
前記酵素試薬は、酵素保護剤を含む、請求項１に記載の体細胞数測定装置。
【請求項１５】
前記酵素試薬は、前記第１電極部上に、厚さ０．１ｎｍ〜１０μｍの有機層によって固定化されている、請求項１に記載の体細胞数測定装置。
【請求項１６】
前記酵素試薬上には、白血球活性化剤を含む表層が積層されている、請求項１に記載の体細胞数測定装置。
【請求項１７】
前記検査室に保持された生乳にエネルギーを与える手段をさらに備える、請求項１に記載の体細胞数測定装置。
【請求項１８】
前記エネルギーが、電磁波、剪断応力、圧力、超音波、電場、磁場、マイクロ波、赤外線および可視光線の少なくとも１つである、請求項１７に記載の体細胞数測定装置。
【請求項１９】
生乳を保持するための検査室と、
前記検査室の内部空間に臨む第１電極部を有し、前記第１電極部上に前記生乳中に含まれる活性酸素と反応する酵素試薬が固定化された作用極と、
前記検査室の内部空間に臨む第２電極部を有する対極と、
先端が前記検査室の内部空間に臨む参照極と、
前記作用極、前記対極、及び前記参照極を支持するベースプレートと、
前記作用極、前記対極、及び前記参照極を挟んで前記ベースプレートに固定され、前記ベースプレートと共に前記検査室を形成するカバープレートと、
を備えるセンサ。
【請求項２０】
前記第１電極部の表面は、複数の突起又は複数の窪みによって凹凸形状とされており、
前記複数の突起又は前記複数の窪みの密度は２００〜１５０００個／ｍｍ2であり、前記複数の突起の高さ又は前記複数の窪みの深さは２〜５００μｍであり、前記突起の幅に対する高さのアスペクト比又は前記窪みの幅に対する深さのアスペクト比は０．２〜１０である、請求項１９に記載のセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生乳中の体細胞数を測定する装置に関する。また、本発明は、前記装置に用いられるセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
家畜の高能力化のための育種選抜、多頭羽飼育、あるいは集約管理等、家畜の生産性を高度に追及することによって起こる疾病を生産病という。生産病には、代謝障害に加えて、繁殖障害、泌乳障害、運動器障害等があり、さらには、日和見感染症の側面を持つ子牛や子豚の消化器病や呼吸器病等もその範疇に入る。生産病は、口蹄疫、ＢＳＥ、豚コレラ、鶏の高病原性インフルエンザ等のように、国家防疫上の緊急性や危険性をはらんだ感染疾病と異なり、一般消費者にとって比較的馴染みのうすい病気ではある。しかし、畜産現場では、日常的に頻発し生産農家の経営を圧迫している最重要疾病の一つである。【０００３】
問題となっている主な生産病を品種別、あるいは動物種別にみると次のようになる。乳牛では、代謝障害（ルーメンアシドーシス、脂肪肝やケトーシス等の肝機能障害）、繁殖障害（卵胞発育障害、卵巣嚢腫）、運動器障害、泌乳障害（臨床性乳房炎、潜在性乳房炎、慢性乳房炎）があげられる。肉牛では、代謝障害（ルーメンアシドーシス、肝機能障害、ビタミン欠乏症）、畜舎環境由来の慢性呼吸器病、消化器病があげられる。豚及び鶏では、畜舎環境由来の慢性呼吸器病、暑熱や寒冷環境による栄養障害、呼吸器感染等があげられる。【０００４】
潜在性生産病とは、肉眼では異常が検出できず、血液や乳汁等の体液成分検査等によって、病態の進行が初めて検出される生産病である。近年の畜産学関連分野における栄養管理技術や家畜管理学の進展、及びこれらを取り組んだ生産獣医療の取り組みによって、臨床症状を伴う生産病は減少してきている。しかし、潜在性の生産病については解決したとはいえず、むしろ深く広く蔓延しつつある状況にある。潜在性生産病は、臨床症状を伴わないので見過ごされる場合が多い。潜在性生産病は、繁殖機能や免疫機能へも悪影響を及ぼし、経済的被害額は、臨床性生産病の数倍にのぼるといわれている。【０００５】
潜在性の生産病の一つに、潜在性乳房炎が挙げられる。乳房炎は、乳用牛の死廃傷病事故のなかで最大の問題になっている。乳房炎は、罹りやすい上に極めて治りにくい病気のため、世界的に共通して、最難治疾病の一つとされている。乳房炎に罹患した乳用牛の生乳中の体細胞数は、正常な乳用牛が約３０万個／ｍＬ以下であるのに対し、３０万個／ｍＬ以上となり、なかには３００万個／ｍＬ以上の慢性乳房炎に至る場合も少なくない。酪農検査協会等によって、サンプリングした生乳中の体細胞数が規定値以上であることが発覚した場合、生乳がタンク単位で廃棄されることになり、その年間被害額は、日本全体で８００億円〜１０００億円と試算されている。【０００６】
乳房炎被害額の７割〜８割は、発熱、発赤、腫脹、疼痛といった臨床症状を示さずに生乳中の体細胞数が増加する、いわゆる潜在性乳房炎によるとされており、酪農家にとって潜在性乳房炎による経済的被害は甚大である。特に、黄色ブドウ球菌によって起こる潜在性乳房炎は、乳房組織内に微小膿瘍や肉芽腫を形成して慢性化の経過をたどりやすい。【０００７】
従来の乳房炎の診断方法には、体細胞数法、ＣＭＴ（カリフォルニア・マスティティス・テスト）法、電気伝導度法等がある。体細胞数法は、細菌侵入後から中度乳房炎までの診断に有効であり、ＣＭＴ法及び電気伝導度法は、軽度乳房炎から重度乳房炎までの診断に有効である。【０００８】
体細胞数法は、好中球、好酸球等の貪食細胞、乳腺上皮細胞、リンパ球、単球、プラズマ細胞等、乳汁中の細胞数を直接的に測定するものであり、感染初期から中度までの乳房炎を検出することができるものである。しかしながら、自動細胞数測定機器による体細胞数法は、極めて高額である問題点があった。また、光学顕微鏡による塗沫測定では、手間がかかりすぎるという問題点があった。特に、初乳は乳を塗沫固定することが難しく、乳房炎が亢進すると、細菌に多数の白血球が吸着して団子状になるため、測定が不可能になる問題点があった。【０００９】
ＣＭＴ法は、生乳中に界面活性剤を加えると、体細胞数に応じて凝集反応の程度が異なることを利用して、体細胞数を推定する方法である。ｐＨ測定用にＢＴＢ試薬も入っているので、乳房炎時の血管透過性の亢進、白血球と細菌との戦いの亢進等によって、生乳の塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩類が増し、アルカリ性に近づくことを利用して色調が黄→緑→青と変化し、乳房炎の判定指標とするものである。誰にでも手軽に測定でき、乳房炎か否かの概略が判定できること、価格が非常に安いことが特徴である。しかしながら、ＣＭＴ法は、白血球と細菌との戦いの後、あるいは血管透過性亢進後といった、反応が起こってからでないと診断が難しいとともに、判定は人の主観的判断にゆだねられるため、診断法としては、あくまで目安程度にしかならないという問題点があった。特に、生乳中の体細胞数が、３０万個／ｍＬ以下になると判定は難しく、乳房炎を初期段階で診断するには適さない問題点があった。【００１０】
電気伝導度法は、乳房炎乳では乳腺組織の炎症反応により、血管の透過性が亢進し、血漿成分のナトリウム、塩素等の電解質成分が増加するため、正常乳よりも電気が通りやすくなることを利用するものである。電気伝導度の数値化により、定量的な値が得られる利点がある。しかしながら、電気伝導度法は、生乳中の体細胞数が増加し、細菌が侵入して白血球との戦いの後の炎症反応による変化を見ているため、乳房炎を初期段階で診断するには適さない問題点があった。また、正常乳でも各分房、あるいは各牛によって電解質成分や濃度にかなりの違いがあるので、再現性が良くなく、乳房炎の判定率は低くなる問題点があった。【００１１】
これらの問題を改良した方法として、生乳中の体細胞の中で体勢を占める好中球等の貪食白血球が、感染時の初期反応（機敏性）が優れていることに着目し、生乳中の貪食白血球機能をルミノール化学発光法で測定することが提案されている（特許文献１参照）。【００１２】
ルミノール化学発光法について説明すると、乳房が細菌の侵入を受け始めると、それを食い止めようとして、貪食殺菌能力のある好中球が生乳中に集まってくる。好中球は、細菌侵入後の機動性が高く、圧倒的な数によって細菌侵入を食い止めようとして働く。好中球は、細菌を殺すために、活性酸素を放出する。ルミノール化学発光法は、ルミノール試薬によって、好中球から放出された活性酸素を励起し、その化学発光量を検出して、増幅・定量化する方法である。細菌侵入に連動して集まる好中球数を、感染初期の細菌侵入開始段階から、重度乳房炎まで広範囲にわたって、高感度で検出可能な技術である。【００１３】
しかしながら、ルミノール化学発光法による乳房炎診断装置は、装置が高額となり、一定の光量を得るまでに時間を必要とするため、研究試験用、又は体細胞数の検定用には優れるものの、搾乳の現場で要求される迅速性に課題を有していた。好中球から放出された活性酸素を、ルミノール化学発光試薬で発光させ、その微弱な光量を検出するには、光電子増倍管（Photomultiplier）が使用される。光電子増倍管は、光電効果を利用して光エネルギーを電気エネルギーに変換する光電管を基本に、電流増幅機能を付加した高感度光検出器で、微弱な光量を検出できる反面、高コストとなる課題を有していた。光電子増倍管のサイズも大きいため、装置が大きくなり、酪農家の現場で使用するには、持ち運び性に課題を有していた。【００１４】
また、特許文献１に記載されているように、ルミノール化学発光試薬による発光ピークを短時間で得るため、好中球の刺激剤としてザイモザンを生乳サンプルに添加することも試みられている。しかし、定量性を有する発光ピークを得るための時間は、５分〜１５分となるため、酪農家の現場で使用するには、迅速性に課題を有していた。【００１５】
この問題を改良した方法として、好中球から放出された活性酸素の存在を電流として検出することが提案されている。この提案は、ルミノール化学発光法と同じく、生乳中の体細胞の中で体勢を占める好中球等の貪食白血球が、感染時の初期反応（機敏性）が優れていることに着目し、好中球等から放出される活性酸素量を定量化することを試みている。例えば特許文献２には、円筒状の絶縁部材の内周面に作用極が形成され、外周面に対極が形成されたニードル状の活性酸素センサを備える乳房炎診断装置が開示されている。この乳房炎診断装置は、活性酸素センサによって活性酸素の濃度を測定し、その濃度に基づいて乳房炎に罹っているか否かを判定するものである。作用極及び対極は、導電性部材の表面に金属ポルフィリン錯体の重合膜が形成されたものであり、活性酸素の測定原理は次のとおりである。【００１６】
活性酸素センサを活性酸素（例えば、スーパーオキシドアニオン：Ｏ2-）の存在する生乳中に漬けると、金属ポルフィリン錯体中の金属が活性酸素により還元される（例えば、Ｆｅ3+→Ｆｅ2+）。そこで、作用極と対極との間にある程度の電圧を印加すると、還元された金属が再酸化され（例えば、Ｆｅ2+→Ｆｅ3+）、電流が流れる。このときの電流値は、活性酸素の濃度と対応しているため、その電流値から活性酸素の濃度を検出することができる。【００１７】
ルミノール化学発光法では、ルミノール化学発光試薬による、発光ピークを短時間で得るため、好中球の刺激剤としてザイモザンを生乳サンプルに添加する必要があり、現場の酪農家にとっては、大きな負担になることが予測された。活性酸素センサを使用した乳房炎診断装置では、好中球の刺激剤を生乳サンプルに添加することなく、活性酸素量を測定できることが期待されていた。【００１８】
しかしながら、活性酸素センサを使用した乳房炎診断装置は、金属ポルフィリン錯体中の金属の還元及び酸化を利用するものであるため、活性酸素の検出感度を高めることが難しい課題を有していた。【００１９】
生乳の生産において、体細胞数の管理目標値は、３０〜５０万個／ｍＬ以下に設定されている。乳房炎に感染した、生乳中の体細胞数に占める好中球の比率は、８割〜９割と報告されており、体細胞数が３０〜５０万個／ｍＬの場合、好中球数は２７〜４５万個／ｍＬと推定される。このような生乳中の好中球数は、健康な牛の血液中の好中球数の約１／１０程度であり、乳房炎への感染を早期に発見するには低い好中球数を再現性よく測定できることが望まれる。【００２０】
ところが、電極に金属ポルフィリン錯体の重合膜を用いた活性酸素センサの場合、好中球数がそれほど増加しない乳房炎の初期段階では、金属ポルフィリン錯体の重合膜表面からの反応によって得られる電流値の増加量は非常に小さく、乳房炎を初期段階で診断することが困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】特開２０００−０４１６９６号公報
【特許文献２】特開２００５−１０６４９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
従来の乳房炎の診断方法である、光学顕微鏡による体細胞数法では、手間がかかりすぎるという問題点があった。【００２３】
ＣＭＴ法は、乳房炎に感染した乳用牛の症状が亢進してからでないと診断が難しいとともに、判定は人の主観的判断にゆだねられるため、診断法としては、あくまで目安程度にしかならないという問題点があった。【００２４】
電気伝導度法は、生乳中の体細胞数が増加し、細菌が侵入して白血球との戦いの後の炎症反応による変化を見ているため、乳房炎を初期段階で診断することには適さない問題点があった。また、正常乳でも各分房、あるいは各牛によって電解質成分や濃度にかなりの違いがあるので、再現性が良くなく、乳房炎の判定率は低くなる問題点があった。【００２５】
ルミノール化学発光法による乳房炎診断装置は、装置が高額となり、一定の光量を得るまでに時間を必要とするため、研究試験用、又は体細胞数の検定用には優れるものの、搾乳の現場で要求される迅速性には課題を有していた。また、光電子増倍管を使用するため、装置が比較的大きくなり、酪農家の現場で使用するには、持ち運び性に課題を有していた。【００２６】
電極に金属ポルフィリン錯体の重合膜を用いた活性酸素センサを備える乳房炎診断装置では、金属ポルフィリン錯体の重合膜表面からの反応によって得られる電流値の変化量が非常に小さいために、乳房炎を初期段階で診断することが困難であった。【００２７】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、酪農家による生乳の生産現場において、タンク単位での生乳の廃棄を防止するために乳房炎を初期段階で診断することを可能とする体細胞数装置及びこの体細胞数測定装置に用いられるセンサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
前記目的を達成するために、本発明は、生乳を保持するための検査室、前記検査室の内部空間に臨む第１電極部を有し、前記第１電極部上に前記生乳中に含まれる活性酸素と反応する酵素試薬が固定化された作用極、及び前記検査室の内部空間に臨む第２電極部を有する対極、を含むセンサと、前記作用極と前記対極との間に電圧を印加したときに流れる電流に基づいて前記生乳中に含まれる体細胞数を算出する装置本体と、を備える体細胞数測定装置を提供する。【００２９】
また、本発明は、生乳を保持するための検査室と、前記検査室の内部空間に臨む第１電極部を有し、前記第１電極部上に前記生乳中に含まれる活性酸素と反応する酵素試薬が固定化された作用極と、前記検査室の内部空間に臨む第２電極部を有する対極と、先端が前記検査室の内部空間に臨む参照極と、前記作用極、前記対極、及び前記参照極を支持するベースプレートと、前記作用極、前記対極、及び前記参照極を挟んで前記ベースプレートに固定され、前記ベースプレートと共に前記検査室を形成するカバープレートと、を備えるセンサを提供する。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、酪農家による生乳の生産現場において、乳房炎を初期段階で診断することが可能となる。これにより、タンク単位での生乳の廃棄を効果的に防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の第１実施形態に係る体細胞数測定装置を示す平面図である。
【図２】図１に示した体細胞数測定装置を構成するセンサを示す斜視図である。
【図３】図２のIII−III線断面図である。
【図４】カバープレートを省略したセンサを示す平面図である。
【図５】第１電極部の表面に形成された突起を示す斜視図である。
【図６】突起の配置の変形例を示す平面図である。
【図７】突起の拡大断面図である。
【図８】センサの変形例を示す斜視図である。
【図９】図９Ａ〜図９Ｃは、作用極、参照極、及び対極のパターンの変形例を示す模式図である。
【図１０】図１に示した体細胞数測定装置のブロック図である。
【図１１】本発明の第２実施形態に係る体細胞数測定装置を示す平面図である。
【図１２】本発明の第３実施形態に係る体細胞数測定装置を示す平面図である。
【図１３】体細胞数と電流値の関係を示すグラフ（散布図）である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の体細胞数測定装置は、小型化及び低コスト化が可能であり、簡易かつ迅速に体細胞数を精度よく測定できる。この体細胞数測定装置は、活性酸素測定センサと装置本体からなり、例えば、自動搾乳機のミルカーに搭載したり携帯型としたりすることができる。この特徴により、酪農家の搾乳現場での使用や検定員等によるバッチ測定への利用が可能になり、体細胞数異常の生乳を早期に検出でき、タンク単位での生乳の廃棄を防止できる。自動搾乳機搭載型又は携帯型のいずれの場合も、活性酸素測定センサを装置本体に着脱可能にしておいて、活性酸素測定センサを使い捨てとすることが好ましい。
【００３３】
本発明の特徴の一つは、生乳中の好中球から放出される活性酸素に着目し、この活性酸素を酵素によって電流として検出することである。健常牛と乳房炎に感染している乳牛では、生乳中に含まれる体細胞の成分が大きく異なる。生乳中には、乳腺上皮細胞、好中球、好酸球等の貪食細胞リンパ球、単球、プラズマ細胞等が存在している。乳房炎に感染すると、それを食い止めようとして、貪食殺菌能力のある好中球が生乳中に集まり、好中球の比率が飛躍的に高まる。
【００３４】
本発明の他の特徴では、作用極と参照極を用い、細菌を殺すために好中球から放出される活性酸素を、作用極に配置された酵素によって選択的に検出することで、塩素、カリウム等の他の成分による影響を受けることなく、生乳中の体細胞数を測定することが可能となる。活性酸素には、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシルラジカル、過酸化水素、一重項酸素、一酸化窒素、二酸化窒素、オゾン、過酸化脂質等が含まれる。
【００３５】
本発明の他の特徴は、活性酸素測定センサがプレートタイプであることである。プレートタイプの活性酸素測定センサには、生乳を保持するための検査室、酵素試薬が固定化された第１電極部を有する作用極、第１電極部と離間する第２電極部を有する対極等が設けられている。プレートタイプとすることで、活性酸素と酵素との反応による酸化還元電流値を高めるためのレイアウトを最適化することが可能となる。例えば、酵素が配置された第１電極部の面積は、最大感度を得るために、拡大することが極めて容易となる。作用極と対極、及び絶縁材（プレート）のレイアウト設計においても、例えば、第１電極部の周囲を第２電極部が取り囲む等、最大感度を得るための設計が可能となる。
【００３６】
酵素試薬を作用極の第１電極部に固定化する方法は、第１電極部上に酵素試薬をそのまま塗布して乾燥させてもよいが、電子伝搬性のある有機層によって固定化することが好ましい。このようにすれば、第１電極部上に酵素試薬を強固に保持することができ、感度を安定化させることができる。また、酵素の立体構造を維持して酵素の活性劣化を抑制する効果もある。
【００３７】
前記有機層は、薄すぎると酵素の構造維持が困難となり、厚すぎると電子伝搬性が低下するため、有機層の厚さは０．１ｎｍ〜１０μｍが好ましく、０．５ｎｍ〜１μｍがより好ましい。
【００３８】
有機層による酵素試薬の固定化方法としては、例えば第１電極部上に有機皮膜を形成して、その上に酵素試薬を塗布又は共有結合によって固定する方法や、酵素試薬を含有する有機ポリマーゲルを第１電極部上に塗布する方法等が挙げられる。特に、均質な有機皮膜を簡単に形成することができ、かつ、膜厚や酵素試薬固定化量を制御することが容易な自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を用いることが好ましい。さらに、ＳＡＭとしては、金や白金上で容易に強固な皮膜を形成するチオール基又はジスルフィド基を有する化合物によって形成されたＳＡＭであることが好ましい。そのような化合物としては、例えば、ベンゼンチオール、４−アミノチオフェノール、４−メルカプトピリジン、４，４’−ジチオビスピリジン、メチオニン、ｐ−メチルチオフェノール、２−メルカプトピリジン、ブタンチオール、２−アミノエタンチオール、イソシステイン、２−（アセチルアミノ）エタンチオール、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、Ｎ−システイニルグリシン、システイン、Ｌ−システイン、Ｄ，Ｌ−ホモシステイン、３−メルカプトプロピオン酸、メルカプトウンデカン酸、メルカプトこはく酸、チオ乳酸、ジチオビス（スクシンイミジルオクタネート）、ジチオビス（スクシンイミジルヘキサネート）等が挙げられる。
【００３９】
活性酸素測定センサから検出された酸化還元電流は、例えば電流電圧変換素子等を内蔵する装置本体によって体細胞数に換算されて表示される。体細胞数の表示方法は、酸化還元電流値、直流電圧値、体細胞数、アラーム、ＬＥＤ表示、音声であっても良く、限定されるものではない。
【００４０】
活性酸素と酵素試薬の反応は、測定の温度環境下で大きく異なる。通常、室温付近の２３℃よりも高い、３７℃付近であるほうが反応性は高まり、酸化還元電流値は高い値を示す。体細胞数測定装置に、検査室に保持された生乳を所定温度に加熱するためのヒータを設ければ、活性酸素と酵素試薬の反応性を高めることで、精度の高い測定が可能となる。
【００４１】
実際の測定は、乳用牛の搾乳と同時に計測する場合や、サンプルとして生乳を採取後、検定員がバッチ測定する場合等が考えられる。測定を行う生乳の温度は、測定の形態によって異なることが推測される。生乳を採取後、放置時間が経過した場合、例えば、３７℃まで生乳を加温することは、測定に時間を要することになる。同一の生乳については温度環境の違いがあっても出力する体細胞数が変化しないように、活性酸素測定センサで検出された酸化還元電流に基づいて算出された体細胞数を生乳温度に応じて補正する体細胞数測定装置であってもよい。
【００４２】
プレートタイプの活性酸素測定センサは、電極の配置等が容易に最適化できることに加え、１つのセンサに複数の検査部（検査室とこれに望む電極）を設けることが可能である。乳用牛の乳房は４つあり、例えば、１つのセンサに４つの検査部を設けることで、効率よく分房別の体細胞数を測定することができ、更なる低コスト化と迅速測定が可能になる。
【００４３】
複数の活性酸素測定センサを備えている場合、または１つの活性酸素測定センサに複数の検査部が設けられている場合は、装置本体は、複数の系統を有する体細胞数の検出回路を有していてもよいし、例えば、一つの体細胞数の検出回路において自動切換えスイッチにより各生乳の酸化還元電流値を計測するようにしてもよい。また、測定された生乳中の体細胞数を装置本体が内蔵する無線タグによって自動的にデータ管理するようにすれば、酪農家や検定員の手間を極力抑えることが可能になる。
【００４４】
生乳中の体細胞数は、３０万個／ｍＬを管理範囲の上限と定めている検査機関が中心となっている。潜在性乳房炎を早期に発見するには、できるだけ感染初期で診断できることが望ましく、体細胞数が５万個／ｍＬを超えているかどうかの検出感度を持つことが望ましい。
【００４５】
生乳中の体細胞数は、前絞り、中絞り、後絞りによっても変動し、搾乳時間が長くなる後絞りが、体細胞が多くなることが知られている。健常な乳用牛においても、後絞りでは、体細胞数は、２００万個／ｍＬを超える場合があり、乳房炎に感染した乳用牛では、５００万個／ｍＬを超える場合がある。したがって、体細胞数測定装置が検出可能な体細胞数は、５万個／ｍＬ以上５００万個／ｍＬ以下が好ましく、１０万個／ｍＬ以上３００万個／ｍＬ以下がより好ましい。
【００４６】
体細胞数測定装置における装置本体は、装置の製造コストを下げるために、汎用の電流電圧素子、電圧増幅素子等で構成することが好ましい。近年の電子素子の絶縁性、分解能、増幅能が高まったことにより、ｎＡ単位の電流値であれば、汎用の素子にて、電流電圧変換を行い、電圧増幅が可能となっている。
【００４７】
体細胞数測定装置の製造コストを下げ、かつ、測定精度を有する体細胞数を計測可能にするためには、活性酸素測定センサが検出する電流値が１ｎＡから１０００ｎＡの範囲であることが好ましく、５ｎＡから５００ｎＡの範囲であることがより好ましい。
【００４８】
また、活性酸素測定センサは、暗所又は冷所に保管するよう定めたり、アルミニウム等の金属をコートした包装袋に入れる等、適宜、最適な保管形態を行うことが望ましい。
【００４９】
本発明の体細胞数測定装置は、工業技術として確立された電極の形成法を活用することにより、寸法精度を満足させることができる。例えば、年間１,０００万個以上の活性酸素測定センサを製造する場合において、寸法精度を満足することによって、製造ロット間等のバラツキをなくし、再現性を有する値を得ることができる。
【００５０】
作用極上への酵素試薬の固定化に加え、ヒータの設置、白血球活性化剤を含む表層の形成、第１電極部への複数の突起の形成等によって、活性酸素測定センサの検出感度を飛躍的に高めることが可能となる。この高感度化によって、生乳中の体細胞数を定量化するために必要な測定時間は、２分以内とすることができ、好ましくは１分以内とすることができる。
【００５１】
生乳中の体細胞数測定が低コストで迅速に実施できることは、酪農家による現場使用、又は検定員等によるバッチ測定において、体細胞数異常を早期に把握することができ、タンク単位での生乳の廃棄防止が可能になる。
【００５２】
生乳中の体細胞数測定においては、検査すべき生乳量を一定にすることで、同一生乳であれば検査対象の生乳中に含まれる体細胞数を同じにすることができる。活性酸素測定センサの検査室によって、測定に使用する生乳量は一定となり、同一生乳における体細胞数測定値の再現性を高めることが可能となる。生乳の検査室への導入方法は、例えば毛細管現象を利用して、生乳を検査室に自動的に導入させてもよい。
【００５３】
乳房炎の病原菌が乳頭口より乳房に侵入し、定着と増殖（感染）が起きると、細菌の直接的な攻撃や産生される毒素は、乳腺細胞にダメージを与える。その結果、ダメージを受けた乳腺細胞から炎症を開始させる物質が放出され、血管の透過性が高まり、白血球が遊走し、血漿成分と共に生乳中に漏出する。腺腔内へ剥がれ落ちた乳腺上皮細胞や、血管から遊走してきた白血球は、生乳と共に外へ排出され、これらが体細胞と呼ばれる。
【００５４】
生乳中に認められる体細胞の種類は、以前は、上皮細胞が主であるとされてきたが、検査技術の発達により、正常乳と潜在性乳房炎に感染した乳では、体細胞の種類が異なることが報告されている。
【００５５】
正常乳中にはマクロファージが多い（６０％〜７０％）のに対し、潜在性乳房炎に感染した牛の生乳中では、９０％以上が好中球であると報告されている。好中球は、乳房に炎症が起きると、血液中から大量に乳腺腔へ遊走し、活性酸素を放出することで貪食殺菌し、病原菌の排除に寄与する。
【００５６】
また、生乳中の体細胞数は、正常乳であっても、前搾り、中搾り、後搾りによって変動し、後搾りの生乳中の体細胞数が多くなることが報告されている。体細胞数測定装置は、好中球から放出される活性酸素に基づいて体細胞数を算出するものであるので、体細胞数測定装置が測定した体細胞数から好中球の比率の増減を把握することができる。このため、測定された体細胞数を記録すれば、この体細胞数の推移から、生乳が搾取された乳牛について、乳房炎、臨床性乳房炎、潜在性乳房炎、慢性乳房炎の感染の有無を早期に診断することが可能となる。
【００５７】
白血球、なかでも好中球の活性化の度合いは、数の増減、サイズの違い、材料面への粘着性の違いによっても確認が可能である。好中球のサイズが大きくなったり好中球が材料面に粘着するようになると、好中球が活性化していることが予測される。例えば、顕微鏡観察を使用した、好中球のサイズ、粘着性の度合いを測定することによっても、乳房炎、臨床性乳房炎、潜在性乳房炎、慢性乳房炎の簡易診断が可能である。
【００５８】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。説明の明確化のため、以下の記載及び図面は、適宜、省略、及び簡略化がなされている。
【００５９】
（第１実施形態）
図１に、本発明の第１実施形態に係る体細胞数測定装置１Ａを示す。この体細胞数測定装置１Ａは、搾乳と同時に体細胞数を測定する連続測定に適したものであり、乳用牛の分房数に対応した４つの活性酸素測定センサ（以下、単に「センサ」という。）２と、これらのセンサ２とケーブル７１によって接続された装置本体（体細胞数表示器）６とからなる。装置本体６には、各センサ２に対応した４つの表示部６１と各種の押しボタン６ａ〜６ｃが設けられている。
【００６０】
体細胞数測定装置１Ａは、搾乳機に搭載される。搾乳機には、ミルカー又はその周辺に、生乳のサンプリング容器が乳房毎に付属されており、各サンプリング容器にセンサ２がそれぞれセットされている。センサ２は、ケーブル７１の先端に設けられたコネクタ７に着脱自在に取り付けられており、これによりセンサ２を容易に交換できるようになっている。センサ２は、先端が生乳に浸された状態で装置本体６により電圧が印加されることにより、電気信号を出力する。センサ２が出力した電気信号は、ケーブル７１を経由して装置本体６に伝達される。装置本体６は、その電気信号に基づいて生乳中の体細胞数を算出し、表示部６１に表示する。算出された生乳中の体細胞数は、その都度、現場で管理することが難しい場合、装置本体６に無線タグを装備し、パソコン等に送信することにより、酪農家の手間をかけることなく、自動管理することも可能である。
【００６１】
＜センサ＞
次に、図２〜図４を参照して、センサ２の構成について詳細に説明する。このセンサ２は、生乳を保持するための検査室２０を有する略長方形状のプレートタイプのものであり、検査室２０には毛細管現象により生乳が導入される。検査室２０の容積は、０．０１〜５ｍＬが好ましく、０．０５〜１ｍＬがより好ましい。さらに好ましい検査室２０の容積は、０．１〜０．３ｍＬである。
【００６２】
具体的に、センサ２は、略長方形状のベースプレート２１と、このベースプレート２１の一方面（厚み方向の片側の面）２１ａに支持された、作用極３１、参照極３２、および対極３３の３つの電極と、これらの電極３１〜３３を挟んでベースプレート２１の一方面２１ａに固定された略長方形状のカバープレート２２とを有している。なお、以下では、説明の便宜のために、ベースプレート２１の長手方向の一方（図２では右上方向）を前方、他方（図２では左下方向）を後方というとともに、ベースプレート２１の短手方向の一方（図２では右下方向）を右方、他方（図２では左上方向）を左方という。
【００６３】
［ベースプレート及びカバープレート］
カバープレート２２の幅は、ベースプレート２１の幅と同じであるが、カバープレート２２の長さは、ベースプレート２１の一方面２１ａの後端部を露出させるようにベースプレート２１の長さよりも短く設定されている。ベースプレート２１のサイズは、例えば、長さ６０ｍｍ、幅３０ｍｍ、厚み１ｍｍであり、カバープレート２２のサイズは、例えば、長さ５０ｍｍ、幅３０ｍｍ、厚み３ｍｍである。
【００６４】
ベースプレート２１及びカバープレート２２の材質は、絶縁性のものであれば特に制限されるものではないが、例えば、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル−スチレン系共重合樹脂（ＭＳ樹脂）、ポリカーボネート系樹脂、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン−ビニルアルコール系共重合樹脂、スチレン系エラストマーなどの熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、ポリジメチルシロキサンなどのシリコーン樹脂、酢酸ビニル系樹脂、ポリビニルブチラール系樹脂等を挙げることができる。ベースプレート２１の材質としては、後述する電極材料との接着性を考慮して適宜選択することが好ましく、カバープレート２２の材質としては、ベースプレート２１との接着性を考慮して適宜選択することが好ましい。
【００６５】
カバープレート２２には、ベースプレート２１に沿ってカバープレート２２の端面に開口する溝２３が形成されており、溝２３とベースプレート２１の一方面２１ａによって検査室２０が構成されている。そして、検査室２０には、開口２３ａから毛細管現象により生乳が自動的に充填される。すなわち、溝２３の開口２３ａは、検査室２０への導入口を構成している。毛細管現象を利用するには、溝２３の幅は１〜５０ｍｍ、深さは０．０５〜５ｍｍ、長さは２〜１００ｍｍであることが好ましく、より好ましくは、溝２３の幅は３〜３０ｍｍ、深さは、０．１〜３ｍｍ、長さは１０〜７０ｍｍである。例えば、溝２３の幅を１０ｍｍ、深さを０．５ｍｍ、長さを４０ｍｍとしてもよい。
【００６６】
溝２３の形成は、機械切削加工や射出成型等により行うことができ、ベースプレート２１とカバープレート２２との接合は、熱融着、レーザー融着、溶液接着技術等により行うことができる。このような工業生産技術として確立された方法を適用することにより、検査室２０の容積の精度、すなわちセンサ２への生乳導入量の精度を高めることができる。これにより、同一生乳であれば検査室２０内の好中球の数を一定とすることができ、体細胞数の測定精度を高めることが可能になる。
【００６７】
本実施形態では、毛細管現象を利用しているため、センサ２の開口２３ａ側の端部を生乳に浸すだけで、短時間で、例えば５秒以内に生乳を検査室２０に充填させることができる。
【００６８】
［電極］
作用極３１、参照極３２、及び対極３３は、左右方向に並んでおり、それぞれがベースプレート２１の後端部から所定位置まで前後方向に直線状に延びている。本実施形態では、作用極３１の先端に円形状の第１電極部（正極部）３１ａが設けられ、対極３３の先端に第１電極部３１ａよりも大きな円形状の第２電極部（負極部）３３ａが設けられている。また、参照極３２の先端３２ａも小さな円形状になっている。第１電極部３１ａ及び第２電極部３３ａ並びに参照極３２の先端３２ａは全て検査室２０の内部空間に臨んでいる。また、各電極３１〜３３におけるカバープレート２２で覆われていない部分は、幅広の端子部３１ｂ〜３３ｂを構成しており、これらの端子部３１ｂ〜３３ｂが、センサ２がコネクタ７に差し込まれて取り付けられたときに、コネクタ７の端子（図示せず）と電気的に接続される。
【００６９】
第１電極部３１ａの表面３１ｃ上には、生乳中に含まれる活性酸素と反応する酵素試薬４が固定化されており、さらにその上には白血球活性化剤を含む表層５が積層されている（図７参照）。参照極３２は、基準極として使用される。作用極３１と対極３３との間及び参照極３２と対極３３との間には、例えば直流１Ｖの電圧が均等に印加される。その上で、作用極３１に重畳的に例えば０．３Ｖの追加電圧が印加されると、第１電極部３１ａ上で酵素試薬４による活性酸素の酸化分解（正確には生乳中の好中球から放出されたスーパーオキシドアニオンの酸化分解：Ｏ2-→Ｏ2＋ｅ-）が発生するとともに、第１電極部３１ａ上から溶け出した酵素が第２電極部３３ａ上で還元されて、作用極３１と対極３３との間に電流が流れる。作用極３１と対極３３との間に流れる電流量を測定することにより、好中球から放出される活性酸素量、ひいては生乳中の体細胞数を測定することが可能となる。なお、第１電極部３１ａ上での酸化分解に対する還元電流を効率よく検出するために、第２電極部３３ａの面積は第１電極部３１ａの面積よりも大きくなっていることが好ましい。ここで、「第２電極部３３ａの面積」及び「第１電極部３１ａの面積」とは、第２電極部３３ａ及び第１電極部３１ａをベースプレート２１と直交する方向から見たときの面積をいう。第１電極部３１ａの面積は、０．７〜５００ｍｍ2であることが好ましく、４〜２５０ｍｍ2であることがより好ましい。
【００７０】
電極３１〜３３の形成法は、蒸着、スパッタリング、電解メッキ、無電解メッキ、シルクスクリーン印刷、金属ペーストのインジェクション法等を用いることができる。このような工業的に確立された方法を採用することにより、電極３１〜３３を高精度に形成することが可能となり、大量生産において、測定値の再現性を高めることが可能となる。電極に用いられる導電性材料としては金、銀、塩化銀、白金、銅、アルミニウム等を挙げることができる。本実施形態では、活性酸素として好中球から放出されるスーパーオキシドアニオンを主に検出するので、作用極３１を金、参照極３２を銀／塩化銀、対極３３を白金で構成している。
【００７１】
好ましくは、各電極３１〜３３の幅は５０〜５０００μｍ、長さは５〜１００ｍｍ、厚みは０.００３〜３００μｍであり、より好ましくは、各電極３１〜３３の幅は１００〜２０００μｍ、長さは１０〜５０ｍｍ、厚みは０.０２〜２００μｍである。
【００７２】
なお、ベースプレート２１の一方面２１ａには微小凹凸が形成されていて、この微小凹凸の上に作用極３１、参照極３２、及び対極３３が形成されていることが好ましい。このようになっていれば、アンカー効果によりベースプレート２１と電極３１〜３３の接着性を向上させることができる。
【００７３】
微小凹凸は、一方面２１ａの算術平均粗さ（Ｒａ：ＪＩＳ  Ｂ０６０１）が２０ｎｍ〜２０μｍの範囲内に入る程度のものであることが好ましく、一方面２１ａの算術平均粗さが１００ｎｍ〜２μｍの範囲内に入る程度のものであることがより好ましい。
【００７４】
ベースプレート２１の一方面２１ａに上記のような微小凹凸を形成するには、ベースプレート２１の一方面２１ａを例えばプラズマエッチングやサンドブラストで処理すればよい。あるいは、ベースプレート２１を成形する際に、表面が所定の表面粗さに粗面化された金型を用いることで、ベースプレート２１の一方面２１ａに微小凹凸を形成してもよい。
【００７５】
［酵素試薬］
第１電極部３１ａ上に固定化する酵素試薬４としては、複数種類のものを使用することができる。例えば、酵素試薬４は、ＳＯＤ（スーパーオキサイドジスムターゼ）、シトクロームｃ、ヘミン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、チロシナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、及びラッカーゼよりなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素を含む。なかでも、長期安定性（耐候性）、工業的に品質が安定していること、コストの観点から、ＳＯＤを用いることが好ましい。また、必要に応じて、酵素試薬４に酵素活性化剤が添加されていてもよい。
【００７６】
酵素試薬４の厚さは、０．００５〜１μｍが好ましく、０．０２〜０．１μｍがより好ましい。
【００７７】
酵素試薬４は、酸化劣化、加水分解、光分解、熱分解等によって品質が劣化しないよう、メーカーが保障する期間（例えば、６ヶ月間）、安定であることが好ましい。品質を安定させるため、酵素試薬４にトレハロース等の酵素保護剤が添加されていてもよい。
【００７８】
酵素試薬４の固定方法の１例としては、金からなる第１電極部３１ａ上にシステイン自己組織化単分子膜４０（図７参照）を固定化させた後、その上にディッピング法、インクジェット法、インジェクション法等を用いて酵素試薬４を塗布し、これを硬化させることにより、固定化することが可能である。このように第１電極部３１ａ上にシステイン自己組織化単分子膜４０を介して酵素試薬４を塗布することにより、酵素試薬４から第１電極部３１ａへの電子伝搬性を向上させることができる。なお、システイン自己組織化単分子膜４０を設けない場合には、作用極３１を例えば白金で構成し、第１電極部３１ａ上に直接的に酵素試薬４を塗布してもよい。
【００７９】
また、酵素試薬４を第２電極部３３ａ上に固定化せずに第１電極部３１ａ上のみに固定化している理由は、作用極３１と対極３３との間に流れる電流値を測定する際、作用極３１以外の電極に電流値が発生すると、これがノイズとなり、測定精度が低下するためである。なお、酵素試薬４は、他の電極３２，３３に重ならないように第１電極部３１ａ上に固定化されていればよく、例えば、第１電極部３１ａよりも一回り大きな領域に配置されていてもよい。
【００８０】
［白血球活性化剤］
乳房炎に感染した乳用牛は、白血球、なかでも好中球の貪食能が高まり、活性酸素を放出する。酵素試薬４の上に積層された表層５に白血球活性化剤が含まれていれば、好中球の貪食能がさらに高まり、活性酸素の放出量が増加することで高感度化が可能となる。
【００８１】
好中球の貪食能が高くなると、活性酸素の放出量が増加すると同時に、好中球の表面に擬似足場を形成し、血管の内側に粘着することが知られている。酵素試薬４上に好中球の活性化剤があれば、酵素試薬４上に好中球が付着し易くなり、さらなる高感度化が期待できる。
【００８２】
白血球活性化剤は、生理活性物質として表現されてもよい。白血球の遊走能は、生理活性物質の有無、又は濃度差によって異なることが知られている。第１電極部３１ａ上又はその周辺に生理活性物質を配置し、好中球を第１電極部３１ａ上に遊走させることで、第１電極部３１ａ上に好中球を積極的に付着させ、さらなる高感度化が可能となる。
【００８３】
定量化された白血球活性化剤が予め酵素試薬４上に担持されることで、酪農家又は検定員等の測定者が白血球活性化剤を計量して生乳に添加する必要が無くなり、作業性及び迅速性が向上する。
【００８４】
白血球、なかでも好中球の活性化剤としては、例えば、ケモカイン、エイコサノイド、ロイコトリエン、ＦＭＬＰ、ザイモザン、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、コンカナバリンＡ、遊離脂肪酸、界面活性剤、金属微粒子、ポリマー微粒子等があげられる。金属微粒子に接着した好中球は、磁力によって電極近傍へ集積させてもよく、またポリマー微粒子に接着した好中球は重力、あるいは浮力で電極近傍へ集積させてもよい。
また、通常特に制限はないが、活性化因子として活性化剤を用いる場合の好適な量は検査室又は生乳の体積に対して１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである。
【００８５】
表層５の形成は、凍結乾燥法により白血球活性化剤を調製し、これを酵素試薬４上に配置することで行うことが好ましい。凍結乾燥とは、水分を含んだ食品や食品原料を、マイナス３０℃程度で急速に凍結し、さらに減圧して真空状態で水分を昇華させて乾燥する方法である。乾燥による収縮や亀裂などの形態の変化が少なく、ビタミンなどの栄養成分や風味の変化が少なく、多孔質で水や熱湯が侵入しやすいので溶解性が良いことが特徴である。このようにすれば、白血球活性化剤が生乳中に良好に溶け出すため、白血球活性化剤と生乳との混合度合いが大きく改善し、感度アップが期待できる。
【００８６】
一般的に円管内を流れる流体の場合は、レイノルズ数が２,０００程度以下で層流、２,０００〜４,０００程度が層流、乱流が変化する領域とされている。なお、レイノルズ数とは、慣性力と摩擦力（粘性による）との比で定義され、飛行機の翼による空気の流れやカルマン渦などに使われている。レイノルズ数（Ｒｅ＝Ｕ×Ｌ／ν）は、流体の種類と状態（ν：ｍ2／ｓ）、注目部分の流速（Ｕ：ｍ／ｓ）、注目部分の長さ（Ｌ：ｍ）が決まると定まる。
【００８７】
効率よく、第１電極部３１ａ上（正確には酵素試薬４上）の白血球活性化剤と生乳とを混合するには、第１電極部３１ａ上に生乳を滴下するよりも、例えば、生乳が導入される溝２３に白血球活性化剤をコートしておくことで、混合度合いが向上することが期待できる。しかし、細い流路内の流速、及び長さは乱流の領域とならず、レイノルズ数は２,０００以下の層流となり、大幅な混合状態の改善にはならないことが予測される。
【００８８】
表層５は、白血球活性化剤のみで構成されていてもよいが、これと疎水性有機材料との混合物で構成されていてもよい。生乳中の好中球から放出される活性酸素量は、好中球が第１電極部３１ａ上の酵素試薬４に近接している又は付着している方が、高い感度で検出することが可能となる。
【００８９】
生乳中の好中球を第１電極部３１ａ上の酵素試薬４に近接又は付着させるためには、第１電極部３１ａ上で検査室２０に保持された生乳に接触する表層５の表面の水に対する接触角が４０°以上１１０°以下となっていることが好ましく、５０°以上１００°以下となっていることがより好ましい。これを実現するためには、表層５に疎水性有機材料が含まれていてもよい。活性酸素は有機材料を通過可能であるため、このようにしても感度に問題はない。
【００９０】
なお、表層５を設けない場合には、第１電極部３１ａ上で検査室２０に保持された生乳に接触する酵素試薬４の表面の水に対する接触角が４０°以上１１０°以下となっていることが好ましい。
【００９１】
また、活性化剤と同様の効果を得るための方法として、生乳へエネルギーを与える方法がある。そこで、体細胞数測定装置１Ａは、検査室２０に保持された生乳にエネルギーを与える手段を備えていてもよい。前記エネルギーは、好中球の細胞膜上にある活性酸素産生酵素であるＮＡＤＰＨオキシダーゼを活性化させる作用を持つものであれば通常特に制限はない。例えば、電磁波、剪断応力、圧力、超音波、電場、磁場、マイクロ波、赤外線、可視光線が挙げられ、これらのうちの１つを前記エネルギーとしてもよいし、これらを任意に組み合わせたものを前記エネルギーとしてもよい。すなわち、前記エネルギーは、電磁波、剪断応力、圧力、超音波、電場、磁場、マイクロ波、赤外線および可視光線の少なくとも１つであってもよい。
【００９２】
活性化の機構について述べる。まず、好中球が細胞外の刺激を感知して細胞内シグナル伝達系が開始される。その結果、細胞内カルシウムイオン濃度が上昇する。そして、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの構成成分がサイトゾルから細胞膜上へ移行し、会合が起きると、ＮＡＤＰＨオキシダーゼが活性化状態となり、活性酸素産生量が増大すると考えられている。
すなわち、好中球を活性化して活性酸素産生量を増大させるには、生乳にエネルギーを与えることによって好中球が細胞外の刺激を感知する、又は生乳にエネルギーを与えることによって細胞膜構造を柔軟化させて細胞内カルシウムイオン濃度を上昇しやすくする、あるいはＮＡＤＰＨオキシダーゼの構成成分がサイトゾルから細胞膜上へ移行しやくすることで可能となる。
【００９３】
生乳にエネルギーを与える方法によれば、工業技術上確立された素子を使用して安価かつ高精度にエネルギーを与えることができるため、体細胞測定装置の製造コストを安価にすることが可能である。また、生乳にエネルギーを与える方法は、薬剤刺激と比較して長期安定性があり、しかも体細胞測定装置が設置された環境温度および湿度に影響を受け難いため、使用年数が経過しても精度の高い測定値を再現することが可能となる。
【００９４】
好中球に細胞外の刺激を感知させるという観点からは、前記エネルギーとして電磁波を用いる方法があげられる。この場合、細胞核に作用する０．０１〜０．４μｍの波長の紫外線を生乳に照射することが好ましい。より好ましい紫外線の波長は、０．１〜０．３μｍである。
同様に、好中球に細胞外の刺激を感知させるという観点からは、生乳に剪断応力を加える方法があげられる。この場合、剪断応力は１０〜１００００ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2であることが好ましく、５０〜５０００ｄｙｎｅｓ／ｃｍ2であることがより好ましい。
【００９５】
細胞膜構造を柔軟化させるという観点からは、前記エネルギーとして圧力を用いる方法があげられる。
圧力を用いて細胞膜構造を柔軟化させるには、浸透圧を用いて好中球を膨潤させてもよい。この場合、浸透圧の範囲は、１０〜２５０ｍＯｓｍであることが好ましく、２０〜１００ｍＯｓｍの範囲であることがより好ましい。
また、圧力には空気圧、水圧、真空圧のいずれを用いてもよい。活性化因子として空気圧、水圧、真空圧を用いる場合は、白血球が破壊されない程度の加圧、減圧を行えばよく、その圧力は通常特に制限はないが、０．０１Ｐａ〜１０ＭＰａの範囲であることが好ましく、０．１Ｐａ〜１ＭＰａの範囲であることがより好ましい。
【００９６】
また、圧力以外の方法で細胞膜構造を柔軟化させる方法としては、細胞膜構成分子を振動させて細胞膜を柔軟化させる、超音波、電場、もしくは磁場を用いた方法、あるいは細胞内の水の分子運動を高めて細胞膜を柔軟化させる、マイクロ波、赤外線、もしくは可視光線を用いた方法などが挙げられる。
通常特に制限はないが、超音波の範囲は１０〜２００ｋＨｚが好ましく、２０〜１００ｋＨｚがより好ましい。電場においては、０．００１〜１０Ｖ／ｃｍの範囲が好ましく、０．０１〜５Ｖ／ｃｍの範囲がより好ましい。磁場においては、０．０５〜３０ｍＴの範囲が好ましく、０．１〜２０ｍＴの範囲がより好ましい。さらに前記の電場及び磁場は、２０Ｈｚ〜１０ＭＨｚのパルス状に印加してもよい。
マイクロ波においては、１〜１０ＧＨｚの範囲が好ましく、２〜４ＧＨｚの範囲がより好ましい。赤外線においては、０．７〜１０００μｍの範囲が好ましく、２．０〜５００μｍの範囲がより好ましい。可視光においては、３８０〜７５０ｎｍの範囲が好ましく、４３０〜６００ｎｍの範囲がより好ましい。
【００９７】
［第１電極部］
次に、第１電極部３１ａについて、さらに詳しく説明する。
【００９８】
第１電極部３１ａの表面は、フラットであってもよいが、複数の点状の突起又は複数の点状の窪みによって凹凸形状とされていることが好ましい。通常、第１電極部３１ａの面積が大きくなると、体細胞の付着面積が増大することで、作用極３１から対極３３に流れる電流量が多くなり、検出感度が向上する。一方、第１電極部３１ａの面積が大きくなりすぎると、第１電極部３１ａ上での電流が生乳中にも拡散するようになり、作用極３１から対極３３に流れる電流量は低下し、検出感度が低下する結果となる。
【００９９】
体細胞から放出された活性酸素による電流値をＳ（信号）、作用極３１から対極３３に流れるベース電流値をＮ（ノイズ）とすると、Ｓ／Ｎ比を高めることで検出感度は高まる。Ｓ／Ｎ比の向上のため、電流値の生乳中への拡散を極力抑え、作用極３１から対極３３に流れる電流値を低くするために、小さな電極を複数配置する方法が考えられるが、小さな電極を複数有することは、電極の造形精度が求められ、収率低下による生産性が低下する。
【０１００】
第１電極部３１ａの表面に、複数の突起又は窪みを配置することで、電流の生乳中への拡散を抑制し、電流密度の増大による、Ｓ／Ｎ比の向上が期待できる。第１電極部３１ａ上に複数の突起又は窪みを有することで、凹凸形状の先端面（突起の場合は突起の頂面又は窪みの場合は窪み以外の面）で発生した電流は生乳中に拡散するものの、凹凸形状の先端面以外の表面で発生した電流は生乳中に拡散することなく、作用極３１から対極３３に電流を流すことが可能となり、Ｓ／Ｎ比を飛躍的に高めることが可能となる。
【０１０１】
好ましい突起又は窪みの密度は、２００〜１５０００個／ｍｍ2が好ましく、５００〜１００００個／ｍｍ2がより好ましい。突起又は窪みは、例えば柱形であり、その断面形状は円形であっても多角形であってもよい。突起又は窪みの密度が２００個／ｍｍ2を下回る場合、電流が拡散しやすくなり、Ｓ／Ｎ比を高めることは困難な場合がある。一方１５０００個／ｍｍ2を上回る場合、造形精度を維持するために製造タクトタイムが長くなる等、工業生産における難易度が高くなり、高コストとなる場合がある。なお、「密度」とは、ベースプレートと直交する方向から見たときの面積あたりの突起又は窪みの個数をいう。
【０１０２】
生乳中には、固形分である脂質粒子が、好中球数の１００倍以上存在している。また、脂質粒子の粒子径は、乳用牛の育種、飼料の内容等によって異なり、２μｍ〜３０μｍの広い範囲となっている。隣り合う突起の間の距離又は窪みの幅は、生乳中の脂質粒子による閉塞を考慮し、４〜８０μｍが好ましく、１０〜６０μｍがより好ましい。
好ましい突起の高さ又は窪みの深さは、０．５〜１０００μｍであり、より好ましくは２〜５００μｍである。突起の高さ又は窪みの深さが２μｍを下回る場合、平坦な作用極と変わらず、Ｓ／Ｎ比の向上が困難となる場合がある。一方５００μｍを上回る場合、造形精度を維持するために製造タクトタイムが長くなる等、工業生産における難易度が高くなり、高コストとなる場合がある。特に好ましい突起の高さ又は深さは、５〜５００μｍである。
【０１０３】
一方、突起の幅に対する高さのアスペクト比又は窪みの幅に対する深さのアスペクト比は、大きくなるほど好中球が付着する可能性が高くなるが、同時に工業技術の観点で難易度が高くなり、生産性が低下する可能性があることから、０．２〜１０の範囲から選択することが好ましく、０．５〜５の範囲から選択することがより好ましい。
【０１０４】
本実施形態では、図５に示すように、第１電極部３１ａの表面３１ｃは、複数の突起３１ｄによって凹凸形状とされている。好中球が生乳中に浮遊している状態よりも第１電極部３１ａに近接している又は付着している状態の方が活性酸素と酵素試薬４との反応が高くなり、好中球から放出される活性酸素量を高い感度で検出することが可能となる。第１電極部３１ａの表面３１ｃに突起３１ｄを形成することにより、好中球が付着しやすい構造とすることができる。さらに、突起３１ｄにより、第１電極部３１ａの大きさを、ひいてはセンサ２の外形寸法を変えることなく、第１電極部３１ａの面積を例えば２倍以上高めることができ、高感度化と低コスト化の両立が可能となる。
【０１０５】
好ましい突起３１ｄの幅（太さ）は、１〜１０００μｍであり、より好ましくは５〜５００μｍである。
【０１０６】
具体的に第１電極部３１ａの表面３１ｃの凹凸形状は、図７に示すように、ベースプレート２１に形成された凹凸構造２１ｂに第１電極部３１ａが沿わされることにより形成されている。そして、その上に、上述したシステイン自己組織化単分子膜４０、酵素試薬４、及び表層５がこの順に積層されている。
【０１０７】
凹凸構造２１ｂの形成方法は、特に限定されないが、例えば、射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、ホットエンボス成形、押出成形によるロール転写法等を挙げることができる。なかでも、生産性及び型転写性の観点から、射出成形が好ましく用いられる。
【０１０８】
突起３１ｄは、図５に示すようにマトリクス状に配置されていてもよいし、図６に示すように千鳥状に配置されていてもよい。例えば、高さ１０μｍ、直径５μｍの突起３１ｄが縦横に２０μｍのピッチで並んでいてもよいし（約２４００個／ｍｍ2でマトリクス状に配置）、高さ３０μｍ、直径１０μｍの突起３１ｄが縦横に３０μｍのピッチで、かつ、縦横のどちらかに半ピッチずつずらしながら並んでいてもよい（約１０００個／ｍｍ2で千鳥状に配置）。また、突起３１ｄは、規則的に並んでいる必要はなく、ランダムに配置されていてもよい。
【０１０９】
隣り合う突起３１ｄの間の距離Ｌは、生乳中の好中球を効率的に付着させるという観点から、４〜８０μｍが好ましく、６〜５０μｍがより好ましい。すなわち、隣り合う突起３１ｄの間の距離Ｌが好ましい範囲に収まるように、突起３１ｄのピッチおよび太さを決定すればよい。ここで、隣り合う突起３１ｄの間の距離Ｌとは、突起３１ｄが並ぶ方向における突起３１ｄ同士の離間距離であり、その並び方向とは、図５に示すマトリクス状の場合は縦方向及び横方向であり、図６に示す千鳥状の場合は横方向（又は縦方向）及び斜め方向である。
【０１１０】
＜センサの変形例＞
なお、センサ２は、必ずしも毛細管現象を利用したものである必要はなく、例えば図８に示すような構造のものであってもよい。図８に示すセンサ２’は、生乳のスポッテング方式に対応したものである。このセンサ２’では、カバープレート２２に当該カバープレート２２を厚み方向に貫通する略矩形状の貫通穴２４が設けられており、この貫通穴２４が下方からベースプレート２１の一方面２１ａで塞がれることにより、上方に大きく開口する検査室２０が構成されている。センサ２’の外形寸法は、１例として、長さ４０ｍｍ、幅３０ｍｍ、高さ４ｍｍとすることが可能である。検査室２０は、１例として、長さ２０ｍｍ、幅２０ｍｍ、深さ３ｍｍとすることが可能である。
【０１１１】
この構成の場合、１個のセンサ２’に複数の検査室２０を設けるとともに、検査室２０の数と同じ数だけ各電極３１〜３３をそれぞれ設けて、複数箇所で生乳を検査できるようにしてもよい。この場合、複数個のピペットを用い、それぞれの検査室２０に生乳をスポッテングすることで、一度に大量の生乳について体細胞数を測定することができる。
【０１１２】
また、電極３１〜３３のパターンは、生乳の導入経路、酵素試薬４の配置領域等に応じて最適なレイアウトとなるように適宜選定可能である。例えば、図９Ａに示すように、作用極３１の第１電極部３１ａを矩形状とし、対極３３の第２電極部３３ａを、第１電極部３１ａの周囲を取り囲むように配置してもよい。このようにすれば、第１電極部３１ａ上での酸化分解に対する酵素の還元による電流をより効率的に検出することができる。
【０１１３】
あるいは、図９Ｂに示すように、作用極３１の第１電極部３１ａを、互いに平行に並ぶ線状の電極指３１ｅで構成して、作用極３１と対極３３との間に流れる基準電流量を抑制してもよい。この場合、図９Ｂ中に一点鎖線で示すように、全ての電極指３１ｅに跨るように酵素試薬４を配置すればよい。
【０１１４】
作用極３１と対極３３との間には、酸化還元電流が流れるだけでなく、作用極３１に印加された追加電圧に応じた基準電流が流れている。この基準電流量が過大になって酸化還元電流量よりも大きくなると、Ｓ／Ｎ（信号となる酸化還元電流量／ノイズとなる基準電流量）比が低下し、検出感度を低下させる可能性がある。
【０１１５】
電流量（Ｉ）は、抵抗値（Ｒ）に反比例（Ｉ＝Ｖ／Ｒ）するので、作用極３１に流れる電流量を小さくするには、作用極３１のパターンを微細化し、作用極３１の抵抗値を高くすることで可能となる。具体的に、電極指３１ｅは、幅２〜１００μｍ、長さ１００〜５０００μｍ、厚さ０．００３〜１μｍであることが好ましく、幅５〜５０μｍ、長さ５００〜３０００μｍ、厚さ０．０１〜０．１μｍであることがより好ましい。
【０１１６】
あるいは、図９Ｃに示すように、第２電極部３３ａも互いに平行に並ぶ線状の電極指３３ｃで構成し、第１電極部３３ａの電極指３１ｅと第２電極部３３ａの電極指３３ｃとを交互に並べるようにしてもよい。
【０１１７】
＜装置本体＞
次に、図１０を参照して、装置本体６の構成について詳細に説明する。装置本体６は、作用極３１と対極３３との間に電圧を印加したときに流れる電流に基づいて生乳中に含まれる体細胞数を算出するものである。具体的に、装置本体６は、電源６５と、作用極３１と対極３３との間及び参照極３２と対極３３との間に電圧を印加して、それらの間に流れる電流を検出する電流検出回路６２と、検出された電流を電圧に変換する電流電圧変換回路６３と、電圧値から体細胞数を算出する演算部６４とを備えており、演算部６４で算出された体細胞数が表示部６１に表示される。
【０１１８】
電源６５は、電池やバッテリー等の内部電源であってもよいし、家庭用電源等の外部電源であってもよい。電流検出回路６２は、スイッチング素子等で構成されている。電流電圧変換回路６３は、電流電圧変換素子や電圧を増幅するオペアンプ等で構成されている。演算部６４は、ＣＰＵや記憶部（ＲＯＭ及びＲＡＭ）等からなっている。記憶部には、電圧値と体細胞数とを関係づける検量線が記憶されており、演算部６４は、電流電圧変換回路６３から送られる電圧値に応じた体細胞数を算出する。なお、感度の異なる複数種類のセンサ２を使用する場合には、センサ２毎に検量線を記憶部に記憶させておけばよい。
【０１１９】
本実施形態では、参照極３２が設けられているので、体細胞数を算出する際の電圧値は、参照極３２を考慮した値である。すなわち、装置本体６は、作用極３１と対極３３との間に電圧を印加したときに流れる電流を電圧に変換して作用電圧値を得るとともに、参照極３２と対極３３との間に電圧を印加したときに流れる電流を電圧に変換して参照電圧値を得る。そして、装置本体６は、体細胞数を算出する際には、作用電圧値から参照電圧値を控除した電圧値から体細胞数を算出する。このようにすれば、生乳中に含まれる活性酸素と酵素試薬４との反応に基づく電圧値を正確に得ることができる。
【０１２０】
＜使用要領＞
次に、体細胞数測定装置１Ａを使用して体細胞数を測定する方法を説明する。生乳のサンプリング容器に配置された各コネクタ７に、センサ２を取り付ける。次に、入ボタン６ａを押して、電源スイッチをＯＮにする。搾乳が開始される際には、測定ボタン６ｃを押して測定可能な状態にしておく。サンプリング容器内に生乳が満たされると、毛細管現象により、センサ２の開口２３ａから検査室２０に生乳が充填される。そうすると、検査室２０に保持された生乳中の体細胞、なかでも好中球が放出する活性酸素と酵素試薬４が反応し、その酸化還元電流が装置本体６に送られて、体細胞数が算出される。算出された体細胞数は、分房別に表示部６１に表示される。なお、装置本体６に予め基準体細胞数を入力しておき、算出した体細胞数が基準体細胞数を超えたときには、ランプを点灯させたり、音声で報知したりすることも可能である。
【０１２１】
搾乳及び体細胞数の測定が完了すると、ミルカー等と生乳サンプリング容器を洗浄した後、次の測定に備え、測定に使用したセンサ２を新しいセンサ２と交換する。
【０１２２】
本実施形態の体細胞数測定装置１Ａでは、小型化及び低コスト化が可能であり、簡易かつ迅速に体細胞数を精度よく測定できることができる。従って、酪農家による生乳の生産現場において、乳房炎を初期段階で診断することが可能になる。これにより、タンク単位での生乳の廃棄を効果的に防止することができる。
【０１２３】
（第２実施形態）
図１１に、本発明の第２実施形態に係る体細胞数測定装置１Ｂを示す。なお、本第２実施形態及び後述する第３実施形態では、第１実施形態と同一構成部分には同一符号を付して、その説明を省略する。
【０１２４】
第２実施形態の体細胞数測定装置１Ｂは、バッチ測定に適したものであり、酪農家がサンプリングした生乳、検定協会等に集配された生乳、タンク単位でサンプリングされた生乳等を、検定員等が迅速測定する際に効果を発揮する。体細胞数測定装置１Ｂは、携帯性に優れるように、外形寸法を例えば高さ１２０ｍｍ、幅８０ｍｍとし、重量を３００ｇ程度とすることが可能である。センサ２を取り付けるコネクタ７は、装置本体６に直接設けられており、第１実施形態のようなケーブル７１が不要となっている。
【０１２５】
また、体細胞数測定装置１Ｂには、検査室２０に保持された生乳を所定温度に加熱するためのヒータ８が設けられている。第１実施形態の連続測定式の体細胞数測定装置１Ａは、搾乳中の生乳が測定対象となるため、生乳温度が３０℃〜３７℃と高く、生乳中の好中球から放出される活性酸素とセンサ２の酵素試薬４の反応性が高く、十分な検出感度を得ることが予測される。バッチ測定式の体細胞数測定装置１Ｂにおいては、サンプリングした生乳の温度が、室温付近、例えば２３℃程度まで低くなっていることが予測される。このように生乳の温度が低い場合は、体細胞数が例えば３０万個／ｍＬ以下と少ないと、十分な検出感度が得られない可能性がある。このような場合、ヒータ８を装備し、例えば３７℃付近まで生乳を昇温することによって、生乳中の好中球が放出する活性酸素と酵素試薬４との反応性を高め、十分な検出感度を得ることができる。
【０１２６】
ヒータ８を有するバッチ測定式の体細胞数測定装置１Ｂでは、センサ２の検査室２０に保持される生乳量は１ｍＬ以下であることが好ましい。センサ２がプレート式であるため、プレート型のヒータ８を装備すれば、１分以内の昇温及び測定が可能となる。消費する電力量も抑制ででき、携帯性を損なうことなく使用が可能となる。
【０１２７】
例えば、ヒータ８は、装置本体６の入ボタン６ａが押されて電源スイッチが入ると同時に、設定された温度、例えば３７℃まで昇温されるようになっていてもよい。
【０１２８】
（第３実施形態）
図１２に、本発明の第３実施形態に係る体細胞数測定装置１Ｃを示す。この体細胞数測定装置１Ｃは、４つの生乳サンプルの体細胞数が測定可能なバッチ測定式のものであり、ケーブル７１により装置本体６と接続された４つのコネクタ７と、各コネクタ７に付設された４つのヒータ８と、ヒータ８を連結する連結板９とを備えている。
【０１２９】
この構成であれば、バッチ測定においても一度に複数の生乳について体細胞数を測定することができる。
【実施例】
【０１３０】
以下に実施例を説明する。本実施例で示した体細胞数測定装置は一例であり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【０１３１】
［生乳サンプル中の体細胞数検査法］
生乳サンプルをスライドグラスの上の一定面積に塗抹し、乾燥、染色、鏡検して、細胞数を数えた結果と、顕微鏡（油浸レンズ観察）の視野の面積との関係によって、生乳サンプル中に存在する体細胞数を算出した。なお、代表視野は１６視野以上計測し、視野全ての有核体細胞数を計測した。体細胞数検査には、オリンパス光学工業株式会社の検査用顕微鏡（型式：ＢＸ４１）を使用した。【０１３２】
２頭の健常牛（ａ、ｂ）及び５頭の乳房炎に感染した牛（ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ）から生乳のサンプリングを実施したところ、生乳中の体細胞数は、ａ：９万個／ｍＬ、ｂ：２２万個／ｍＬ、ｃ：３８万個／ｍＬ、ｄ：６２万個／ｍＬ、ｅ：８８万個／ｍＬ、ｆ：１６５万個／ｍＬ、ｇ：２１０万個／ｍＬであった。【０１３３】
［活性酸素測定センサの製造］
［実施例１］
アクリル樹脂（クラレ社製、パラペットＧＨ−Ｓ）を使用し、射出成形法により、長さ６０ｍｍ、幅３０ｍｍ、厚み１ｍｍのベースプレートを形成した。次に、ベースプレートにマスキングを施し、蒸着装置〔（株）アルバック社製、型式：ＵＥＰ〕を用い、作用極（金）、参照極（銀／塩化銀）、対極（白金）を図４に示すパターンで形成した。具体的に、第１電極部の直径は４ｍｍであり、第２電極部の直径は８ｍｍである。【０１３４】
次に、作用極（金）にシステイン溶液を浸漬させ、自己組織化単分子膜を形成させた後、浸漬法により酵素試薬（ＳＯＤ）を塗布して固定した。酵素試薬の厚みは、０．０２μｍである。【０１３５】
次に、アクリル樹脂（クラレ社製、パラペットＧＨ−Ｓ）を使用し、射出成形法により、長さ４０ｍｍ、幅１０ｍｍ、深さ０．５ｍｍの溝を有する、長さ５０ｍｍ、幅３０ｍｍ、厚み３ｍｍのカバープレートを形成した。【０１３６】
次に、レーザー樹脂溶着機（ミヤチテクノス社製、型式：ＭＬ−５２２０Ｂ）を使用し、ベースプレートとカバープレートとを溶着し、活性酸素測定センサを得た。【０１３７】
［実施例２］
アクリル樹脂（クラレ社製、パラペットＧＨ−Ｓ）を用いて射出成形法により長さ６０ｍｍ、幅３０ｍｍ、厚み１ｍｍのベースプレートを形成する際に、スタンパーを使用して、ベースプレートの一方面における第１電極部を形成する領域に、高さ１０μｍ、直径５μｍの凸部を縦横に２０μｍのピッチで形成し、その上に作用極を形成することで第１電極部の表面に複数の突起を形成した以外は実施例１と同様にして活性酸素測定センサを得た。【０１３８】
［実施例３］
酵素試薬の上に、さらに白血球活性化剤（ＦＭＬＰ）を固定化して表層を形成した以外は実施例２と同様にして活性酸素測定センサを得た。【０１３９】
［実施例４］
酵素試薬の上に、さらに白血球活性化剤（ＰＭＡ）を固定化して表層を形成した以外は実施例２と同様にして活性酸素測定センサを得た。【０１４０】
［実施例５］
アクリル樹脂（クラレ社製、パラペットＧＨ−Ｓ）を用いて射出成形法により長さ６０ｍｍ、幅３０ｍｍ、厚み１ｍｍのベースプレートを形成する際に、表面が所定の表面粗さに粗面化された金型を使用して、ベースプレートの一方面に微小凹凸を形成し、その上に作用極、参照極及び対極を形成した以外は実施例１と同様にして活性酸素測定センサを得た。なお、微小凹凸が形成されたベースプレートの一方面の算術平均粗さは、１１０ｎｍであった。【０１４１】
［実施例６］
アクリル樹脂（クラレ社製、パラペットＧＨ−Ｓ）を用いて射出成形法により長さ６０ｍｍ、幅３０ｍｍ、厚み１ｍｍのベースプレートを形成する際に、スタンパーを使用して、ベースプレートの一方面における第１電極部を形成する領域に、高さ４０μｍ、直径２０μｍの凸部を縦横に３５μｍのピッチで形成し、その上に作用極を形成することで第１電極部の表面に複数の突起を形成し、かつ、第１電極部の直径を６ｍｍとした以外は実施例１と同様にして活性酸素測定センサを得た。【０１４２】
［実施例７］
ベースプレートに形成する凸部の高さを４０μｍから８０μｍに変更した以外は実施例６と同様にして活性酸素測定センサを得た。【０１４３】
［実施例８］
ベースプレートに形成する凸部の高さを４０μｍから１μｍに変更し、かつ、直径を２０μｍから２μｍに変更した以外は実施例６と同様にして活性酸素測定センサを得た。【０１４４】
［実施例９］
ベースプレートに形成する凸部の高さを４０μｍから２μｍに変更した以外は実施例６と同様にして活性酸素測定センサを得た。【０１４５】
［実施例１０］
ベースプレートに形成する凸部のピッチを３５μｍから２００μｍに変更した以外は実施例６と同様にして活性酸素測定センサを得た。【０１４６】
［実施例１１］
アクリル樹脂（クラレ社製、パラペットＧＨ−Ｓ）を用いて射出成形法により長さ６０ｍｍ、幅３０ｍｍ、厚み１ｍｍのベースプレートを形成する際に、スタンパーを使用して、ベースプレートの一方面における第１電極部を形成する領域に、深さ６０μｍ、直径２０μｍの凹部を縦横に３５μｍのピッチで形成し、その上に作用極を形成することで第１電極部の表面に複数の窪みを形成し、かつ、第１電極部の直径を６ｍｍとした以外は実施例１と同様にして活性酸素測定センサを得た。【０１４７】
［比較例１］
システイン単分子膜及び酵素試薬を設けない、すなわち第１電極部が露出していること以外は実施例１と同様にして活性酸素測定センサを得た。【０１４８】
［比較例２］
システイン単分子膜及び酵素試薬を設けない、すなわち第１電極部が露出していること以外は実施例２と同様にして活性酸素測定センサを得た。【０１４９】
［比較例３］
第１電極部上に、システイン単分子膜及び酵素試薬の代わりに金属ポルフィリン錯体の重合膜を形成した以外は実施例１と同様にして活性酸素測定センサを得た。【０１５０】
［活性酸素測定センサが検出する電流値の測定］
上述した各牛ａ〜ｇから搾取した生乳について、実施例及び比較例の活性酸素測定センサを用いて電流を検出し、その電流値を測定した。電流値の測定は、ポテンシオスタット・ガルバノスタット（北斗電工株式会社、型式：ＨＡ―１５１）を使用した。【０１５１】
作用極と参照極に直流１Ｖを印加した後、作用極に０．３Ｖの追加電圧を印加した。作用極上で酸化分解が発生すると同時に、対極には酵素の還元が起こり、作用極と対極との間に電流が流れた。その電流値を測定した。電流値の測定は、活性酸素測定センサを、３７℃に設定されたプレート式のヒータ上に固定して行った。【０１５２】
測定結果は、表１及び表２並びに図１３に示すとおりであった。【０１５３】
【表１】
2010013757.tif 000003
【０１５４】
【表２】
2010013757.tif 000004
【０１５５】
表１及び表２から、比較例１〜３では、乳房炎に罹っているが生乳中の体細胞数が３８万個／ｍＬと低い牛ｃと健常牛の牛ｂとで電流値の差がほとんどなく、乳房炎を初期段間で診断することが困難であることが分かる。これに対し、実施例１〜１１では、牛ｃと牛ｂとで電流値に大きな差ができ、乳房炎を初期段間で診断することができる。【０１５６】
また、図１３のグラフから、実施例１〜１１では、生乳中の体細胞数の増加に従い、活性酸素測定センサが検出する電流値が大きく増大し、生乳中の体細胞数と電流値との相関関係が良好であることが確認できる。なかでも、実施例２の第１電極部が所定の大きさの複数の突起を有する場合、電流値が高くなることが確認できた。実施例３および実施例４の酵素試薬上に白血球活性化剤を設けた場合は、さらに電流値が高くなることがわかる。さらに、突起の大きさ（幅及び高さ）を実施例２よりも大きくした実施例６，７では、電流値が格段に高くなった。【０１５７】
なお、実施例２及び実施例６〜１０での突起の寸法をまとめると、表３のようになる。【０１５８】
【表３】
2010013757.tif 000005
【０１５９】
表３を表１及び表２と組み合わせて見ると、突起の高さが２μｍを下回る実施例８やアスペクト比が０．２を下回る実施例９では、突起のない実施例１と同程度の電流値しか得られないことが分かる。また、実施例６と実施例１０を比較すると、同じ大きさの突起でも突起同士の間隔が適切に設定されていれば、より高い電流値が得られることが分かる。
【図１】
2010013757.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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