(57)【要約】  多能性幹細胞を胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へと分化誘導する手段を提供することを課題とする。多能性幹細胞を胚体内胚葉系細胞へと分化させる第１誘導工程と、FGF8、FGF7、FGF10、BMP4及び塩化リチウムを併用することによって、胚体内胚葉系細胞から胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へと分化させる第２誘導工程とを行い、多能性幹細胞を胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へ分化誘導する。第２誘導工程では、培地にFGF8を添加し且つFGF7及びFGF10は添加しない条件下での第１培養に続いて、培地にFGF7及びFGF10を添加した条件下での第２培養を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へ分化誘導する方法であって、
多能性幹細胞を胚体内胚葉系細胞へと分化させる第１誘導工程と、
FGF8、FGF7、FGF10、BMP4及び塩化リチウムを併用することによって、胚体内胚葉系細胞から胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へと分化させる第２誘導工程と、を含み、
前記第２誘導工程において、培地にFGF8を添加し且つFGF7及びFGF10は添加しない条件下での第１培養に続いて、培地にFGF7及びFGF10を添加し且つFGF8は添加しない条件下での第２培養を行う、方法。
【請求項２】
第１誘導工程が、培地にアクチビン及び塩化リチウムを添加した条件下で細胞培養する工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培地中の塩化リチウムの濃度が約5mMである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第１培養が、培地にFGF8及び塩化リチウムを添加した条件下で細胞培養する工程である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第１培養が、培地にFGF8、塩化リチウム及びアクチビンを添加した条件下で細胞培養する工程である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第２培養が、培地にFGF7、FGF10、BMP4及び塩化リチウムを添加した条件下で細胞培養する工程である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第１誘導工程及び第２誘導工程に使用される培地が血清を含まない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第２誘導工程が、培地にRANKリガンド又はCD40リガンドを添加した条件下での第３培養を含み、該培養によって髄質胸腺上皮細胞が誘導される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
多能性幹細胞が胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は多能性幹細胞を特定の細胞系譜へ分化誘導する方法に関する。詳しくは、多能性幹細胞を胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へ分化誘導する方法に関する。本出願は、２００９年６月９日に出願された日本国特許出願第２００９−１３８６５６号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
免疫は微生物などによる外からの攻撃や、がんによる内からの破壊から個体を守る仕組みである。このような免疫を司る細胞の代表が食細胞とリンパ球であり、これらの細胞は血管やリンパ管を介して体全体に移動している。食細胞は好中球やマクロファージなどで構成されており、これらは抗原の侵入部位に動員される。また、１つのリンパ球は1つの抗原にのみ結合する抗体やレセプターを形成することから、抗原の数に見合った106を超える種類のリンパ球が一の個体に備わっていることとなる。免疫系はリンパ球や食細胞が発生・分化する胸腺や骨髄などの中枢リンパ組織と、そこで産生された細胞が移動して集まる脾臓やリンパ節などの末梢リンパ組織からなる。末梢組織に集まるリンパ球には胸腺由来のT細胞と骨髄由来のB細胞がある。免疫系の働きは、抗原の刺激を引き金として細胞間のシグナル交換によって起き、こうした細胞間のシグナル交換は抗原を異物として取り込んだマクロファージとT細胞、その結果活性化するT細胞とB細胞、活性化リンパ球と食細胞の間で起こる（参考文献３４、３７）。【０００３】
T細胞はウイルス感染細胞を破壊する細胞性免疫と、細菌防御の主役である特異的な抗体産生をするB細胞を助ける体液性免疫の両方に関与する。また、T細胞も血管とリンパ管を通って全身を循環している。そして、T細胞には抗原やMHC分子を認識する受容体であるTCRが存在し、このTCRは1つのT細胞に1種類しかなく、T細胞も無数の抗原提示に対応するため、無数のレパートリーを持っていなければならない。T細胞には大まかに分けて細胞表面にCD4のタンパクを有する細胞とCD8のタンパクを有する細胞の2種類がある。細胞表面にCD4を有するナイーブThやTh1、Th2などから構成されるヘルパーT細胞は抗原提示細胞を認識し、サイトカインを産出・放出することによって、他の免疫細胞の働きを調節する。Th2はB細胞を介した抗体産生による体液性免疫を司り、Th1はマクロファージの貪食した細菌に対してサイトカインを放出して殺作用を示す。細胞表面にCD8タンパクを有するキラーT細胞は、ウイルスに感染した自己の細胞をまるごと破壊することによって更なる感染を防ぐ細胞性免疫を司る。【０００４】
これらT細胞の分化やレパートリーをつくりだしている器官が胸腺である（１、３６、３７）。T細胞の分化は胸腺のストローマ上でおこなわれ、このストローマは胸腺上皮細胞や繊維芽細胞、マクロファージ、樹状細胞などのさまざまな細胞から構成されている。しかし、胸腺特異的な機能は主に胸腺上皮が担っており、マトリックスの大部分を胸腺上皮が占めている。このストローマ自体を組織学的に２つの領域である皮質（cortex）と髄質（medulla）に分けることができる。【０００５】
T細胞はいくつかの異なる表現型を通り分化する。CD4とCD8の発現の違いからDN（Double Negative）、DP（Double Positive）、SP（Single Positive）に分けることができ、さらにDNの段階では、CD44とCD25の発現の違いからさらに４つの段階であるDN1〜3そして４（pre-DP）に分けることができる。異なる分化段階にある胸腺T細胞は成熟した胸腺において空間的に異なる領域に存在しており、胸腺への移入から胸腺T細胞と胸腺上皮細胞がT細胞への分化に密接に関係していることが知られている。【０００６】
胸腺の皮質領域では、胸腺前駆細胞からDPの胸腺T細胞までの分化後、自己のMHCを認識する細胞が生き残る正の選択（Positive Selection）が行われる。そして、髄質領域では胸腺T細胞のDPからSPへの分化とその後に自己抗原を認識しない胸腺細胞だけが生き残る負の選択（Negative Selection）が行われ、自己の細胞に対する免疫寛容が成立する。そして、髄質胸腺上皮細胞（mTEC）で乱雑な遺伝子発現が起きていることは免疫寛容の誘導にとって重要な役割を担っていることを示唆する。また、in vitroの研究では、T細胞系統になる予定のマウス胎児肝臓造血前駆細胞からCD4＋CD8＋であるDP段階への連続分化がNotch-ligandであるデルタ１（Dll1）を遺伝子導入した骨髄ストローマ細胞であるOP9との共培養で実現した（参考文献１７）。しかし、成熟したSPのT細胞への分化については、胸腺組織を用いた培養でしか実現していない。【０００７】
T細胞の分化において重要な細胞である胸腺上皮細胞を再生することは、胸腺が関係する免疫機能の解明に繋がる。例えば、加齢に伴う免疫機能の低下が知られているが、この原因としてT細胞の構成や能力の変化があり、また、性ホルモンであるアンドロゲンやエストロゲンの変化によって、胸腺自体が思春期を過ぎると急激に萎縮をはじめることが知られている。このような胸腺の萎縮（老化）とT細胞の構成を含む免疫機能の低下の因果関係、そして、胸腺の発達、免疫寛容を起こす機構の解明に重要な知見をもたらすことが期待される。さらに、自己から作製したiPS細胞（Induced pluripotent stem cells：人工多能性幹細胞）を用いて胸腺上皮細胞を再生できれば、遺伝子疾患によって正常な胸腺をつくることができないDiGeorge症候群の治療やT細胞の異常による自己免疫疾患の治療、また、T細胞の再構成をin vitroで効率よく行い、減少したT細胞のレパートリーを移植する方法、さらにはin vitroで微生物もしくは微生物感染細胞や腫瘍細胞を攻撃できるT細胞に分化させ、移植する治療などの臨床応用も期待できる。【０００８】
尚、多能性幹細胞の分化誘導法に関する文献（特許文献１）を以下に示す。また、胸腺の発達に関与する因子に関する報告（非特許文献１〜５）を列挙する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００８−５０９６７６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ShinsukenTada,(2005) Characterization of mesendoderm: a diverging point of the definitive endoderm and mesoderm in embryonic stem cell differentiation culture, Development, 132: 4363-4374
【非特許文献２】Peter S. Klein, (1993) A molecular mechanism for the effect of lithium on development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8455-8459
【非特許文献３】Gina Balciunaite, (2002) Wnt glycoproteins regulate the expression of FoxN1, the gene defective in nude mice, Nature Immunology, 3. 11: 1102-1108
【非特許文献４】William E. Jenkinson, (2003), Differential Requirement for Mesenchyme in the Proliferation and Maturation of Thymic Epithelial Progenitors, J. Exp. Med, 198. 2: 325-332
【非特許文献５】Conrad C. Bleul, (2005) BMP Signaling Is Required for Normal Thymus Development, The Journal of Immunology, 175: 5213-5221
【非特許文献６】Deborah U. Frank . et al.(2002) An Fgf8 mouse mutant phenocopies human 22q11 deletion syndrome. Development, 129: 4591-4603.
【非特許文献７】Taishin Akiyama, (2008) The Tumor Necrosis Factor Family Receptors RANK and CD40 Cooperatively EsTablish the Thymic Medullary Microenvironment and Self-Tolerance, Immunity, 29: 423-437
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記の通り、胸腺を再生することは、各種胸腺障害に対する有効な治療法の確立を可能とし、さらには、胸腺の萎縮と老化に伴う免疫機能低下の関係性や胸腺の発達に必要な因子の解明にも繋がり、その意義は大きい。しかしながら、現在までのところ、iPS細胞等の多能性幹細胞を用いて胸腺の再生に成功したという報告はない。
そこで本発明は、胸腺の再生を目指し、多能性幹細胞を胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へと分化誘導する手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
近年まで、胸腺は二胚葉由来（皮質が外胚葉由来、髄質が内胚葉由来）であると考えられていたが、外胚葉と胸腺の分化には明らかな関連性が見つからなかったことが報告され、胸腺が内胚葉由来であることが証明された。また、その後の研究によって、胸腺の初期器官形成は副甲状腺と密に連携しており、この両方の器官はマウスのE11あたりで内胚葉である第3咽頭嚢から生じた器官原基から発達することがわかった。この段階の原基は胸腺と副甲状腺への前駆細胞を含んでおり、遺伝子発現の点から胸腺と副甲状腺の領域に分けられることが判明した。胸腺が内胚葉から生じた事実から、胸腺における皮質胸腺上皮細胞(cTEC)と髄質胸腺上皮細胞(mTEC)は同じ内胚葉由来であることが解明された。しかし、胸腺の形成・発達に関しては解明すべき事項が依然として多い。【００１３】
以上の背景の下、本発明者らは上記課題を解決すべく、ES細胞及びiPS細胞を用いて胸腺上皮の再生を試みた。内胚葉は前原腸胚の外と中の層を構成する近位（Visceral）内胚葉と胚盤胞の内部細胞塊由来である胚盤葉上層から成っており、原腸形成を行う前に、内胚葉は胚体外の卵黄嚢の近くに置き換わる。また、原腸胚形成時に胚盤胞細胞は原始線条（Primitive Streak）の後ろの区分を通って進入し、胚体（definitive）内胚葉を形成する。胚体外の近位内胚葉の運命とは対照的に、胚体内胚葉は消化管の形成や肝臓や膵臓のような腸と関連した内臓に分化する。胸腺は胚体内胚葉から発生していると考え、この分化方法を調べた。ES細胞を用いたこの2つの内胚葉への分化方法がすでに知られており、近位内胚葉への分化には特定の因子を必要とせず、細胞濃度を密にすることで誘導できる。そして胚体内胚葉への分化に関しては、発生初期における中胚葉誘導因子として知られているアクチビンＡ(AA)を用いる誘導方法が知られている。また、アクチビンＡは異なる濃度によって3胚葉全てに誘導ができることも知られている。アクチビンＡを用いた胚体内胚葉への分化誘導は内中胚葉を介したものであり、発生学上の原始線条を介した胚体内胚葉への分化と同様であることも証明されている（非特許文献１、２）。【００１４】
そこで、内中胚葉及び胚体内胚葉を経由して胸腺上皮前駆細胞へと分化誘導させる戦略を取ることにした。具体的には胚体内胚葉への分化誘導（第１誘導工程）の後、胸腺上皮前駆細胞へと分化誘導させる（第２誘導工程）という、２段階の培養によって多能性幹細胞を胸腺上皮へと分化誘導することにした。検討の結果、アクチビンだけを使うのではなく、Wntシグナル系であるWnt-βカテニン経路を刺激することができる塩化リチウム（LiCl）を併用することによって、胚体内胚葉誘導効率を上げることに成功した。また、効率的な分化誘導を可能にする、LiClの最適な添加濃度を見出すこともできた。次に、(1)胸腺の発達では、Wntは胸腺で重要な遺伝子であるFoxN1の発現を増加させ、LiClを用いてもFoxN1遺伝子の発現増加が確認されていること（非特許文献３）、(2) FGF（Fibroblast Growth Factor：線維芽細胞増殖因子）7とFGF10は胸腺原基周囲の間充組織から放出され、胸腺の発達と深く関わりがあることが示唆されていること（非特許文献４）、(3) BMP4は胸腺原基になる部位で発現があり、BMP（bone morphogenesis protein：骨形成因子）4欠損マウスでは胸腺が形成不全を起こすことが確認されていること（非特許文献５）、(4) FGF8欠損マウスにおいて、胸腺の形成不全を起こすことが確認されていること（非特許文献６）を参考にしつつ、独自の視点に基づき、胸腺上皮前駆細胞への分化誘導を試みた。試行錯誤の末、FGF8の存在下での培養に続いてFGF7及びFGF10の存在下で培養するという培養法を採用した。また、LiClを全培養工程に加えることにし、BMP4を培養後半（FGF7とFGF10を添加する際）に添加することにした。そして、細胞の経時的な変化をRT-PCRで調べた結果、胸腺上皮前駆細胞への分化が確認された。続いて、髄質胸腺領域の発達と自己寛容の構築に重要な因子としてRANKリガンドとCD40が示唆され、初期の髄質胸腺上皮細胞の構築に、RANKリガンドの重要であるとの報告（非特許文献７）に注目し、髄質胸腺上皮細胞への分化を促すために、RANKリガンドを添加することにした。その結果、髄質胸腺上皮細胞への分化が確認された。本発明は主として以上の成果に基づく。
［１］多能性幹細胞を胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へ分化誘導する方法であって、
多能性幹細胞を胚体内胚葉系細胞へと分化させる第１誘導工程と、
FGF8、FGF7、FGF10、BMP4及び塩化リチウムを併用することによって、胚体内胚葉系細胞から胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へと分化させる第２誘導工程と、を含み、
前記第２誘導工程において、培地にFGF8を添加し且つFGF7及びFGF10は添加しない条件下での第１培養に続いて、培地にFGF7及びFGF10を添加し且つFGF8は添加しない条件下での第２培養を行う、方法。
［２］第１誘導工程が、培地にアクチビン及び塩化リチウムを添加した条件下で細胞培養する工程である、［１］に記載の方法。
［３］培地中の塩化リチウムの濃度が約5mMである、［２］に記載の方法。
［４］第１培養が、培地にFGF8及び塩化リチウムを添加した条件下で細胞培養する工程である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］第１培養が、培地にFGF8、塩化リチウム及びアクチビンを添加した条件下で細胞培養する工程である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の方法。
［６］第２培養が、培地にFGF7、FGF10、BMP4及び塩化リチウムを添加した条件下で細胞培養する工程である、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］第１誘導工程及び第２誘導工程に使用される培地が血清を含まない、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］第２誘導工程が、培地にRANKリガンド又はCD40リガンドを添加した条件下での第３培養を含み、該培養によって髄質胸腺上皮細胞が誘導される、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］多能性幹細胞が胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】胚体内胚葉への分化誘導条件の検討。アクチビンA（10 ng/ml）を添加した無血清培地SF-O3でES細胞を４日間培養し、フローサイトメトリーで解析した。E-カドヘリンとPDGFR-αの両方が陽性の細胞群（内中胚葉）は13.2%存在した（左）。一方、E-カドヘリンとCXCR4の両方が陽性の細胞群（胚体内胚葉）は25.3%存在した（右）。
【図２】胚体内胚葉への分化誘導条件の検討（ES細胞を使用）。アクチビンAとLiClを併用した場合の効果をフローサイトメトリーで解析した。LiClの濃度によって内中胚葉への誘導効率が変化する。
【図３】胚体内胚葉への分化誘導条件の検討（iPS細胞を使用）。アクチビンAとLiClを併用した場合の効果をフローサイトメトリーで解析した。アクチビンAとLiClの併用によって、効率的に内中胚葉ヘ分化する（左）。
【図４】胸腺上皮前駆細胞への分化誘導法のプロトコル。培養４日目（D4）まではアクチビンAとLiClを添加した無血清培地で培養する。培養４日目（D4）〜培養７日目（D7）はFGF8とLiClを添加した無血清培地で培養する。そして、培養７日目（D7）以降はFGF7、FGF10、BMP10及びLiClを添加した無血清培地で培養する。
【図５】RT-PCRによる遺伝子発現の変化。培養０日目（D0）、４日目（D4）、７日目（D7）、９日目（D9）、１２日目（D12）及び１５日目（D15）に細胞を回収し、RT-PCRで各種遺伝子の発現状態を解析した。
【図６】培養１４日目の細胞を用いたフローサイトメトリーの結果。二つの細胞集団（上段、12%と58%）を認めた。小細胞集団（12%）にEpCAM1とMTS24が発現している。
【図７】髄質胸腺上皮細胞への分化誘導法のプロトコル。培養４日目（D4）まではアクチビンAとLiClを添加した無血清培地で培養する。培養４日目（D4）〜培養７日目（D7）はFGF8とLiClを添加した無血清培地で培養する。培養７日目（D7）〜培養１２日目（D12）はFGF7、FGF10、BMP10及びLiClを添加した無血清培地で培養する。培養１２日目（D12）以降はRANKリガンドとLiClを添加した無血清培地で培養する。
【図８】RT-PCRによる遺伝子発現の変化。培養０日目（D0）、４日目（D4）、１２日目（D12）及び１６日目（D16）に細胞を回収し、RT-PCRで各種遺伝子の発現状態を解析した。
【図９】リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析。培養０日目（D0）、１２日目（D12）及び１６日目（D16）に細胞を回収し、Pax1、FoxN1及びK5の発現状態を調べた。
【図１０】胸腺上皮前駆細胞への分化誘導法（改良法）のプロトコル。培養４日目（D4）まではアクチビンAとLiClを添加した無血清培地で培養する。培養４日目（D4）〜培養７日目（D7）はFGF8、LiCl及びアクチビンAを添加した無血清培地で培養する。そして、培養７日目（D7）以降はFGF7、FGF10、BMP10及びLiClを添加した無血清培地で培養する。
【図１１】改良法で分化誘導された細胞群の変化を示すH.E染色像。アクチビンAを添加しないで得られた細胞群（A-細胞群）とアクチビンAを添加して得られた細胞群（A+細胞群）の培養7日目の形態を比較した。スケールバーは200μm。
【図１２】改良法で分化誘導した細胞の遺伝子発現の変化（RT-PCRの結果）。培養０日目（D0）、７日目（D7）、１０日目（D10）及び１４日目（D14）に細胞を回収し、RT-PCRで各種遺伝子の発現状態を解析した。D14の細胞に胸腺上皮マーカーFoxN1の強い発現を認める。また、K5、Aire、Pax１などの発現も認められる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（略号）
本明細書では必要に応じて以下の略号を使用する。AA：Activin A、Bmp4：bone morphogenetic protein 4、Bmps：bone morphogenetic proteins、cad11：cadherin 11、cTEC：cortical thymic epithelial cell（皮質胸腺上皮細胞）、Dll1：delta-like 1、Dll4：delta-like 4、DN：double negative、DP：double positive、EB：Embryoid Body（胚様体）、E-cad（ECD)：E-cadherin、ES cell：embryonic stem cell（胚性幹細胞）、Eya1：eyes absent 1 homologue、FCM：Flow cytometry、Fgf10：fibroblast growth factor 10、Fgf7：fibroblast growth factor 7、Fgf8：fibroblast growth factor 8、Fgfr2-IIIb：Fgf receptor 2 isoform IIIb、Fgfs：fibroblast growth factors、FoxN1：forkhead box N1、FTOC：fetal thymic organ culture（胎児胸腺器官培養）、Gcm2：glial cells missing homologue 2、GSC：goosecoid、Hoxa3：homeobox A3、iPS cell：induced pluripotent stem cell、K5：cytokeratin 5、K8：cytokeratin 8、KGF：keratinocyte growth factor、mTEC：medullary thymic epithelial cell（髄質胸腺上皮細胞）、NCC：neural crest cell（神経冠細胞）、Pax1：paired box gene 1、Pax3：paired box gene 3、Pax9：paired box gene 9、PDGFR：platelet-derived growth factor receptor(血小板由来成長因子受容体)、RFTOC：reaggregate fetal thymic organ culture、RT-PCR：Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction、Shh：sonichedgehog homologue、Shh：Sonic hedgehog、Six1：sine oculis-related homeobox 1 homologue、SP：single positive、Tbx1：T-box1、TCR：：Tcell receptor（T細胞受容体）、TEC：Thymic epithelial cell（胸腺上皮細胞）、TEPC：Thymic epithelial progenitor cell（胸腺上皮前駆細胞）
【００１７】
本発明は多能性幹細胞を胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へ分化誘導する方法（以下、「本発明の分化誘導法」とも呼ぶ。）を提供する。本明細書において「多能性幹細胞」とは、様々な組織・器官に分化できる能力を持つ細胞をいう。多能性幹細胞の例はES細胞（胚性幹細胞）、EG細胞（胚性生殖細胞）及びiPS細胞（人工多能性幹細胞）である。多能性幹細胞は好ましくはヒトの細胞である。
【００１８】
多能性幹細胞は公知の方法に従って作製することができる。例えばES細胞の作製についてはStrelchenko N., et al. Reprod Biomed Online. 9: 623-629, 2004；Klimanskaya I., et al. Nature 444: 481-485, 2006；Chung Y., et al. Cell Stem Cell 2: 113-117, 2008；Zhang X., et al Stem Cells 24: 2669-2676, 2006；Wassarman, P.M. et al. Methods in Enzymology, Vol.365, 2003等が参考になる。また、iPS細胞の作製についてはTakahashi K., et al. Cell 131: 861-872, 2007；Yu J., et al. Science 318: 1917-1920, 2007.；Park IH., et al. Nature 451: 141-146, 2007等が参考になる。多能性幹細胞の中には公共の保存機関から入手可能なものもある。例えば、ヒトES細胞については京都大学再生医科学研究所付属幹細胞医学研究センター、WiCell Research Institute（マディソン、米国）、ES Cell International Pte Ltd（シンガポール）などから入手可能である。また、iPS細胞については国立大学法人京都大学又は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることができる。
【００１９】
近年、山中博士らによって作製されたiPS細胞は、従来の多能性幹細胞（ES細胞など）が抱える倫理的問題などを解決できる等、優れた特性を備える。そこで、好ましくは多能性幹細胞としてiPS細胞を採用する。
【００２０】
「胸腺上皮前駆細胞」とは、胸腺上皮細胞へと分化することが運命づけられた（即ち、適切な環境下におかれると胸腺上皮細胞へと分化する）増殖性細胞をいう。また、「髄質胸腺上皮細胞」とは胸腺の髄質を構成する上皮細胞である。胸腺の皮質領域を構成する細胞は皮質胸腺上皮細胞（cTEC）と呼ばれる。
【００２１】
「分化誘導する」とは、特定の細胞系譜に沿って分化するように働きかけることをいう。本発明では、胸腺上皮前駆細胞又は更に分化が進んだ髄質胸腺上皮細胞へと分化誘導する。
【００２２】
本発明の分化誘導法は２段階の誘導工程、即ち、多能性幹細胞を胚体内胚葉系細胞へと分化させる工程（第１誘導工程）と、FGF8、FGF7、FGF10、BMP4及び塩化リチウム（LiCl）を併用することによって、胚体内胚葉系細胞から胸腺上皮前駆細胞又は更に分化が進んだ髄質胸腺上皮細胞へと分化させる工程（第２誘導工程）を含む。以下、各工程の詳細を説明する。
【００２３】
（第１誘導工程）
この第１誘導工程では多能性幹細胞を培養し、胚体内胚葉系細胞へと分化させる。換言すれば、胚体内胚葉系細胞への分化を誘導する条件下で多能性幹細胞を培養する。多能性幹細胞として好ましくは倫理的問題の少ないiPS細胞が用いられるが、ES細胞など他の多能性幹細胞を用いることもできる。
【００２４】
過去に報告されたように（Development (2005) 132, Shinsuken Tada et al.）、発生初期には２つの内胚葉、即ち後に消化管と付属器官を形成する胚体内胚葉（definitive endoderm）と、後に卵黄嚢の上皮を形成することになる近位内胚葉（Visceral endoderm）への分化が可能である。胚体内胚葉は内中胚葉（mesendoderm）を経由して形成される。本発明では、胸腺は前腸にある咽頭から発生することを考慮し、内中胚葉を経由する胚体内胚葉から胸腺上皮前駆細胞へ分化させることを目指す。そのために第１誘導工程では、内中胚葉へ分化するように例えばアクチビン（好ましくはアクチビンＡ）と塩化リチウム（LiCl）を添加した培地で多能性幹細胞を培養する。この場合のアクチビン濃度は例えば1 ng/ml〜100 ng/ml、好ましくは5 ng/ml〜30 ng/mlとする。同様にLiClの濃度は例えば0.5 mM〜30 mMとする。誘導効率を向上させるため、LiClの濃度は好ましくは2 mM〜10 mM、更に好ましくは約5 mMとする。
【００２５】
内中胚葉から胚体内胚葉へは自然に（特別の誘導がなくても）分化することが知られている。従って、例えば上記の培養条件下（アクチビンとLiClを添加した培地を用いた培養）での培養を継続することによって胚体内胚葉系細胞が生ずることになる。
【００２６】
第１誘導工程の期間（培養期間）は例えば２日〜７日、好ましくは３日〜５日、更に好ましくは４日である。
【００２７】
多能性幹細胞が内中胚葉を経由して胚体内胚葉に分化する限り、以上で説明した培養条件を満たすこと以外、培養条件は特に限定されない。但し、好ましくは追加の培養条件として「血清を含まない培地を使用する」という培養条件を採用する。この態様の場合、好ましくは、アクチビンとLiClが添加された無血清培地を使用することになる。無血清培地を使用すると分化誘導の効率が高まる。
【００２８】
（第２誘導工程）
この工程では、FGF8、FGF7、FGF10、BMP4及びLiClを併用することによって、胚体内胚葉系細胞から胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞へと分化させる。このように当該工程は５種類の因子（FGF8、FGF7、FGF10、BMP4及びLiCl）を組み合わせて使用することに特徴を有する。但し、これらの因子は全てが同時に使用されるのではなく、添加順序が重要である。具体的には、本発明では培地にFGF8を添加し且つFGF7及びFGF10は添加しない条件下での培養（第１培養）を行った後、培地にFGF7及びFGF10を添加し且つFGF8は添加しない条件下での培養（第２培養）を行う。理論に拘泥する訳ではないが、第１培養ではFGF8の作用によって咽頭部内胚葉への分化が進み、第２培養ではFGF7及びFGF10の作用によって更に分化が進み、胸腺上皮前駆細胞が生ずることになる。LiClについては、第２誘導工程の全培養期間を通して培地に添加しておくことが好ましい。これによって分化を促進できる。BMP4については第２培養の際に培地に添加しておくことが好ましい。このようにBMP4は分化がある程度進んだ段階で添加するとよい。これによって、胸腺上皮への分化を決定づけるとともに分化を促進することができる。尚、LiClは、胸腺の発達において重要な遺伝子であるFoxN1の発現を増加させることが知れているWntと同様の作用を有する。また、FGF7やFGF10は胸腺原基周囲の間充組織から放出されている因子であり、胸腺の発達と深く関わりがある。骨形成因子でもあるBMP4については胸腺原基となる部位での発現が認められ、BMP4欠損マウスでは胸腺の形成不全が起こることが報告されている。FGF8の欠損マウスおいても同様に胸腺の形成不全が報告されている。本発明では、上記の規定通りの独自の組合せ及び使用時期によってこれらの因子を併用し、第１誘導工程によって胚体内胚葉系細胞へと分化した多能性幹細胞を胸腺上皮へと分化誘導する。
【００２９】
ここで、培地中の各因子の添加濃度の例を以下に示す。括弧内は好ましい濃度範囲である。
FGF8：0.4 ng/ml〜 40 ng/ml（2 ng/ml〜20 ng/ml）
FGF7：2 ng/ml〜200 ng/ml（10 ng/ml〜100 ng/ml）
FGF10：0.5 ng/ml〜50 ng/ml（2.5 ng/ml〜25 ng/ml）
BMP4：1 ng/ml〜100 ng/ml（5 ng/ml〜50 ng/ml）
LiCl：0.5 mM〜30 mM（2 mM〜10 mM）
【００３０】
第１培養の培養期間は例えば２日〜７日、好ましくは２日〜４日、更に好ましくは３日である。同様に第２培養の培養期間は例えば４日〜２０日、好ましくは６日〜１５日、更に好ましくは７日〜１０日である。
【００３１】
第１誘導工程によって生じた胚体内胚葉系細胞が髄質胸腺上皮細胞へと分化誘導される限りにおいて、以上で説明した培養条件を満たすこと以外、培養条件は特に限定されない。但し、第１誘導工程の場合と同様に第２誘導工程においても好ましくは追加の培養条件として「血清を含まない培地を使用する」という培養条件を採用する。無血清培地を使用すると分化誘導の効率が高まる。
【００３２】
一態様では、第２誘導工程において第１培養及び第２培養に続き、培地にRANKリガンド又はCD40リガンドを添加した条件下で培養（第３培養）する。この第３培養は、分化を進行させて髄質胸腺上皮細胞を誘導するために行われる。RANKリガンド又はCD40リガンドに加えてLiClを添加した培地を使用することが、より好ましい。従って好ましい一態様では、RANKリガンド又はCD40リガンドと、LiClとを添加した無血清培地を用いて培養する。また、第２培養の際に培地に添加する因子（FGF7、FGF10、BMP4）の一つ以上を併用することにしてもよい。RANKリガンドとCD40リガンドは排他的なものではなく、両者を併用することにしてもよい。RANKリガンド又はCD40リガンドの添加濃度は例えば1 ng/ml〜100 ng/ml、好ましくは5ng/ml〜15 ng/mlである。第３培養の培養期間は例えば２日〜２０日、好ましくは３日〜１５日、更に好ましくは４日〜１０日である。
【００３３】
RANKリガンドとCD40リガンドは、胸腺における髄質領域の発達と自己寛容の構築に重要な因子であり（参考文献１８）、これらを用いることにより、胸腺上皮前駆細胞から髄質胸腺上皮細胞を選択的に生じさせることができる。尚、初期の髄質領域の構築にはRANKリガンドがより重要であることが示唆されていることに鑑み（上掲の文献）、本発明では好ましくはRANKリガンドを使用する。
【００３４】
好ましい一態様では、第１培養をFGF8、LiCl及びアクチビンを添加した条件で行う。この条件を採用することにより、目的の細胞を効率良く得ることができる。また、後の培養においてRANKリガンド等を使用しなくとも、胸腺上皮細胞様の細胞群をより単一的な細胞群として得ることが可能となる。尚、この条件の採用と上記第３培養の採用は互いに排他的なものではない。即ち、この態様においても、上記第３培養を行うことにしてもよい。
【００３５】
典型的には、第１誘導工程を経て得られた細胞集団又はその一部を、選別することなく第２誘導工程に供する。一方で、第１誘導工程を経て得られた細胞集団の中から胚体内胚葉系細胞を選別した上で第２誘導工程を実施することにしてもよい。胚体内胚葉系細胞の選別は例えば、細胞表面マーカーを指標にしてフローサイトメーター（セルソーター）で行えばよい。
【００３６】
第２誘導工程によって胸腺上皮前駆細胞が得られる。即ち、細胞集団の少なくとも一部として胸腺上皮前駆細胞が認められることになる。胸腺上皮前駆細胞であることは例えばPax1、Pax9、Eya1、Six1等が発現していることで確認できる。第１培養及び第２培養に続いて第３培養も実施した場合には更に分化が進んだ髄質胸腺上皮細胞が得られる。即ち、細胞集団の少なくとも一部として髄質胸腺上皮細胞が認められることになる。一態様では、胸腺上皮前駆細胞と髄質胸腺上皮細胞が混在した状態の細胞集団となる。髄質胸腺上皮細胞であることは例えばケラチン5が発現する一方でケラチン8が発現していないこと（K5+,K8-）やFoxN1が発現していることで確認できる。
【００３７】
目的の細胞（胸腺上皮前駆細胞及び／又は髄質胸腺上皮細胞）のみからなる細胞集団又は目的の細胞が高比率（高純度）で含まれた細胞集団を得ようと思えば、目的の細胞に特徴的な細胞表面マーカーを指標にして培養後の細胞集団を選別・分取すればよい。
【００３８】
第１誘導工程及び／又は第２誘導工程の途中において継代培養を行ってもよい。例えばコンフルエント又はサブコンフルエントになった際に細胞の一部を採取して別の培養容器に移し、培養を継続する。分化を促進するために細胞密度を低く設定することが好ましい。例えば1×104個／cm2〜1×106個／cm2程度の細胞密度で細胞を播種するとよい。典型的には培養皿などを用いて二次元的に細胞を培養するが、ゲル状の培養基材などを用いた３次元培養を実施することにしてもよい。
【００３９】
第１誘導工程に使用する培地や第２誘導工程に使用する培地に含有させることができる他の成分としては、ウシ血清アルブミン（BSA）、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン等）、血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)など）、還元剤（2−メルカプトエタノールなど）等を例示することができる。基本培地には例えばSF-03（三光純薬株式会社）が利用できる。
【００４０】
培養温度等、その他の培養条件は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすればよい。即ち、例えば37℃、5%CO2の環境下で培養すればよい。
【実施例】
【００４１】
１．材料及び方法
（１）RT-PCR及びリアルタイム定量RT-PCR
RNAをTRIzol Reagent(invitrogen)とGlycogen(Roche)を用い、添付のプロトコルに従って培養細胞や組織から抽出した。次に0.5μgのmRNAをDeoxyribonuclease I, Amplification Grade(invitrogen)を用いDNase処理をし、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Applied Biosystems)を用い、添付のプロトコルに従ってcDNA合成をした。そしてTakara Ex Taq（TaKaRa）を用いPCRを行った。使用したプライマーは以下の通りである。β-アクチンFw（フォワード）(5'-agtgtgacgttgacatccgt-3'：配列番号１), β-アクチンRv（リバース）(5'-gcagctcagtaacagtccgc-3'：配列番号２), FoxN1 Fw(actcttcccaaagcccatct：配列番号３), FoxN1 Rv(agcaatggggtctttcctct：配列番号４), Pax1 Fw(gcagccggctacctatctc：配列番号５), Pax1 Rv(ggcagtccgtgtaagctacc：配列番号６), Pax3 Fw(ctgcactcaagggactcctc：配列番号７), Pax3 Rv(gttgtcacctgcttgggttt：配列番号８), Pax9 Fw(gctgccctacaaccacattt：配列番号９), Pax9 Rv (accagaaggagagcagcactgt：配列番号１０), Hoxa3 Fw(cacctggaactggagaccat：配列番号１１), Hoxa3 Rv(accgtagatcgctgagctgt：配列番号１２), Six1 Fw(ttaagaaccggaggcaaaga：配列番号１３), Six1 Rv(accaaactggaggtgagtgg：配列番号１４), Eya1 Fw(tgcatatgggcaaacacagt：配列番号１５), Eya1 Rv(gaactgttgaatccggagga：配列番号１６), Tbx1 Fw(tgaagaagaacccgaaggtg：配列番号１７), Tbx1 Rv(ttgtcatctacgggcacaaa：配列番号１８), AIRE Fw(caactctggcctcaaagagc：配列番号１９), AIRE RV(cctgactcaaacacctgctg：配列番号２０), K5 Fw(cctgactcaaacacctgctg：配列番号２１), K5 Rv(aactcattctcagccgtggt：配列番号２２), Dll1 Fw(ccggctgaagctacagaaac：配列番号２３), Dll1 Rv(taagtgttggggcgatcttc：配列番号２４), Dll4 Fw(tcagccaaatcatcatccaa：配列番号２５), Dll4 Rv(gtgggggatacattcattgc：配列番号２６), Bmi1 Fw(tgtgtcctgtgtggagggta：配列番号２７), Bmi1 Rv(tgcaacttctcctcggtctt：配列番号２８), p63 Fw(gagatccccagatgatgagc：配列番号２９), p63 Rv(tgaagtaggtgctggtgctg：配列番号３０), Plet1 Fw(cttccacacctgggactgtt：配列番号３１), Plet1 Rv(cgtcctccttcactgctttc：配列番号３２), FGFr2 Fw(caccgagaagatggagaagc：配列番号３３), FGFr2 Rv(gtctgacgggaccacacttt：配列番号３４), K8 Fw(atcgagatcaccacctaccg：配列番号３５), K8 Rv(agccagggctagtgagt：配列番号３６), CK18 Fw(cgaggcactcaaggaagaac：配列番号３７), CK18 Rv(ctgagccagcgcttcatact：配列番号３８), Oct3/4 Fw(ccaatcagcttgggctagag：配列番号３９), Oct3/4 Rv(ctgggaaaggtgtccctgta：配列番号４０), Nanog Fw(aagtacctcgacctccagca：配列番号４１), Nanog Rv(cgtaaggctgcagaaagtcc：配列番号４２), E-cad Fw(aaacttggggacagcaacatcag：配列番号４３), E-cad Rv(tcttttggtttgcagagacaggg：配列番号４４), GSC Fw(ctcggaggagtcagaaaacg：配列番号４５), GSC Rv(tcgactgtctgtgcaagtcc：配列番号４６) Brachyury(T) Fw(ctcctcatagcctcgtggac：配列番号４７), Brachyury(T) Rv(ggcaacaagggaggacatta：配列番号４８), Cad11 Fw(tcagggaacattcatgccac：配列番号４９), Cad11 Rv(ttctatgccgtctccatcaac：配列番号５０), Sox17 Fw(aagattgagaaaacacgcatgac：配列番号５１),Sox17 Rv(tttgtgtataagcccgagatgg：配列番号５２), Sox1 Fw(gcccaggaaaaccccgagatg：配列番号５３), Sox1 Rv(ccgttagcccagccgttgac：配列番号５４), PDGFRα Fw及びRv(桜井博士（京都大学）から供与された)【００４２】
（２）FACS解析
培養細胞を0.05%もしくは0.25％Trypsin-EDTA(GIBCO)で回収し、細胞を解離してから遠心処理を行った。上清を取り除き、0.1% BSAを含むHBSS(GIBCO)で懸濁し、細胞をカウントした。カウント後、目的の細胞数（解析の場合は2×105）を遠心チューブに移し、遠心後、上清を取り除いた。ブロッキング処理のため10%FBS/HBSSに懸濁した後、20分間氷上に静置した。遠心処理によって上清を取り除いた後、1次抗体を含むHBSSで細胞を懸濁し、氷上に15〜30分間静置した。2次抗体を使用する際には、1度HBSSを用いて洗浄した後に、1次抗体と同様の手順で染色した。その後、フローサイトメーター（FACSCalibur、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、日本）で検出した。解析にはFLOW JOソフトウエア（トミーデジタルバイオロジー株式会社、日本）を使用した。ラットモノクローナル抗体であるAPA5（抗PDGFR-α）抗体及びECCD2抗体は西川博士（理化学研究所発生科学研究センター幹細胞研究グループ）より供与された。フィコエリスリン標識ストレプタビジン（BD Pharmingen）をビオチン化APA5抗体の検出に使用した。アロフィコシアニン（APC）を使用する標準的な方法でECCD2モノクローナル抗体を標識化した。ビオチン化抗マウスEpCAM抗体をBioLegend社（カリフォルニア州、米国）から購入した。MTS24はBoyd, R.L.氏（Monash Immunology and Stem Cell Laboratories, Monash University, Australia）より供与を受けた。【００４３】
（３）In vitroにおける細胞の維持と分化誘導
（ａ）細胞の維持
CCE（ES）細胞は桜井博士（京都大学）から供与された。また、iPS(APS0001)細胞は理研細胞バンクから購入した。これらの細胞の維持は2 mM L-グルタミン(GIBCO)と0.1 mM Non-Essential MEM(GIBCO)、50ユニット/ml- 50 mg/mlペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO)、0.1 mM 2-メルカプトエタノール(Sigma Aldrich)、103ユニット/ml LIF（白血病抑制因子を含む15%FBS/KNOCKOUT DMEM（invitrogen）培地で行った。2日に1回の頻度で細胞を継代した。iPS細胞については培地交換を毎日行った。また、フィーダー細胞を用いずに維持するため、0.1% ブタ皮膚由来Ａ型ゼラチン（Gelatin from porcine skin,Type A）(SIGMA)/DWでコートした培養皿を使用した。細胞の多能性を維持するため、液体窒素に保存し、できるだけ解凍培養後早期の細胞を実験に使用した。細胞のパッセージの際には0.25％ Trypsin-EDTA(GIBCO)で細胞を解離させて回収した。遠心処理後、上清を取り除き、4×105個の細胞を10cm培養皿に蒔いた。【００４４】
（ｂ）分化誘導に用いた試薬
分化誘導には、0.2% BSAを含む無血清SF-03(三光純薬)を使用した。分化誘導に用いた因子はアクチビンA(R&D systems)、FGF8b(R&D systems)、FGF7(R&D systems)、FGF10(R&D systems)、BMP4(R&D systems)、LiCl(Sigma Aldrich)及び2-メルカプトエタノールである。また、分化誘導の際は、コラーゲンIV型(新田ゼラチン)でコートした培養皿を使用した。分化誘導の際の細胞数は2×105／10cm培養皿とした。【００４５】
（４）腎皮膜下へのコラーゲンスポンジの移植
in vitroでの分化誘導後の細胞をin vivoで培養する方法として、細胞を吸収させたコラーゲンスポンジを腎臓の皮膜下に移植した。まず、分化誘導後の細胞を0.25％Trypsin-EDTA(GIBCO)で回収した後、遠心処理に供した。上清を取り除いた後、無血清培地で洗浄し、続いてPBS(-)で2回洗い、1〜2×106の細胞を10μlのPBSに懸濁した。このようにして調製したサンプルを、3mm四方に切ったコラーゲンスポンジ(KOKEN)に吸収させ、ヌードマウスの腎皮膜下に移植した（参考文献１９）。【００４６】
（５）組織解析
（ａ）凍結切片の作製
移植したコラーゲンスポンジを3週間後に回収し、OCTコンパウンド(Sakura)に埋没させ、液体窒素で固めた。光顕用凍結ミクロトーム（CW3050-4、共通機器）を用いて5μm厚の凍結切片を作製し、APSコート付のスライドグラス(MATSUNAMI)に貼り付けた。【００４７】
（ｂ）ヘマトキシリン・エオジン(H.E)染色
凍結切片を乾燥させた後、100％エタノールで処理し、完全に乾いたのを確認した後、蒸留水（DW）で洗浄した。4% ホルムアルデヒド/PBSで固定した後、DWで洗浄した。続いてヘマトキシリン溶液(WAKO)で染色した後、流水で洗浄した。次に、エオジン(MERCK)で染色した後、流水で洗浄した。乾燥したことを確認した後、マリノール(MUTO PURE CHEMICALS co. LTD)で封入した。【００４８】
（６）蛍光免疫染色
凍結切片を乾燥させた後、冷アセトンで固定し、PBSで3回洗浄した。次にブロッキング液(1%(2次抗体の免疫動物の血清)と0.2% BSA、0.2% Triton X-100/PBS)を用い室温でブロッキング処理を行った後、1次抗体で染色し、4℃で一晩置いた。次の日にPBST(0.2% Triton X-100/PBS)で3回洗浄した後、2次抗体で染色し、4℃で一晩置いた。PBSで3回洗浄した後、蛍光用のMounting Medium(DAKO)で封入し、乾燥したことを確認した後、蛍光顕微鏡で観察した。【００４９】
（７）マウス
ヌードマウス(KSN Slc)(中部科学資材株式会社)を使用した。【００５０】
２．結果
（１）ES細胞及びiPS細胞の内胚葉系細胞への分化
ES細胞及びiPS細胞の分化誘導方法には大きく分けて2種類ある。1つがハンギング・ドロップなどの方法で培養するEB（Embryoid Body、胚様体）形成法である。この培養方法の利点は、球体状のEBを形成することによって三胚葉全てに分化し、ある程度の細胞にまで分化できることである。そのため、目的の細胞をEBから回収することも可能である。しかし、EBを形成してしまうと三胚葉全てに分化してしまうため、目的の細胞を効率よく誘導するのに限界がある。また、EBを形成すると3次元の複雑な構造となるため、培養中に加えた因子が全ての細胞に均一に作用しなくなる可能性も考えられる。もう１つの方法が単層培養法であり、この方法は単に培養皿の上に細胞を蒔いて培養する方法である。この方法では2次元（平面）の構造であるため、EBとは異なり全ての細胞に均一に因子が作用すると考えられ、特異的な細胞への分化誘導効率を上げることが可能である。また、一層培養法では、周りの細胞との相互作用が少なく、培地に加える因子を変えることによって、発生段階に必要な因子の決定も行うことができ、発生学の研究手段としても有用であると考えられる。そのため、本実験では単層培養法を採用した。【００５１】
目的の細胞群である内胚葉へ効率よく誘導することを目指し、胚発生における三胚葉の誘導に関わる因子を参考に検討した。誘導因子としては、初期胞胚から後期原腸胚で知られているNordalやアクチビン、BMPなどがある。アクチビンに関してはアクチビンAによる内中胚葉（mesendoderm）の誘導方法が実際に知られている（参考文献２、８）。また、Nordalを用いた分化誘導方法でも内中胚葉への分化は可能であるが、効率が良くないことが報告されている（参考文献２）。BMPに関してはBMP4を用いた、中胚葉への誘導系が知られている。これに加え、リチウムがGSK-3bの活性を抑制し、βカテニンを経由するカノニカルWnt経路（Wnt-βカテニン経路）を刺激し、この経路も初期発生の経路として知られている（参考文献２８）。【００５２】
そこで、内胚葉系の細胞に誘導するため、アクチビンAとLiClの併用を検討した。本実験では、コラーゲンIV型でコートした培養皿を用い、インスリンやトランスフェリンなどを含んだ無血清培地SF-03で培養し、分化誘導した。アクチビンA（10 ng/ml）と様々な濃度のLiClを添加した無血清培地SF-03でES細胞（CCE）を分化誘導した。内中胚葉の細胞はE-カドヘリンとPDGFR-αの両方が陽性の細胞であり、胚体（definitive）内胚葉はE-カドヘリンとCXCR4の両方が陽性の細胞であることが知られているため（参考文献２）、それぞれの抗体で免疫染色をし、FCM（フローサイトメトリー）で解析した。まず、アクチビンA（10 ng/ml）単独で内中胚葉、胚体内胚葉へ分化することを確認した（図１）。次に分化誘導の際の細胞濃度の違いによって分化効率に違いが生じるか検討した。コラーゲンIV型でコートした培養皿を用い、細胞濃度を4.5, 6.4, 8.2, 10×104／cm2でそれぞれ誘導した結果（アクチビンAの濃度は10 ng/ml）、面積あたりの細胞濃度が低いほうが効率よく分化し、細胞濃度が高くなるにつれ、内中胚葉と胚体内胚葉の細胞群の割合が減少した（結果を図示せず）。LiCl単独では内中胚葉、胚体内胚葉への分化が見られなかったが（結果を図示せず）、アクチビンA（10 ng/ml）とLiClを併用すると内中胚葉への分化が促進され、最適なLiCl濃度は5 mMであった（図２）。この条件のときには、内中胚葉の細胞群がアクチビンA単独(13.2%)のときに比較して約1.6倍に増加した（図１、図２）。iPS細胞を用いた場合も、アクチビンA（10 ng/ml）とLiCl（5 mM）の併用によって内中胚葉の細胞群が効率的に誘導された（図３）。アクチビンA含有の無血清培地に血清を加えた場合、内中胚葉と胚体内胚葉へ分化が起こらなかった（結果を図示せず）。この結果から、血清に含まれる成分がアクチビンAに対して抑制的に働いていることが示唆された。【００５３】
発生初期に関わるWntの刺激は背側の位置を決める因子であり、植物極側で発現した因子と協調してアクチビンやNordalを誘導し、内中胚葉を分化するため、LiClのみで内中胚葉の細胞に誘導できなかったことは発生学上正しいことと考えられる。また、アクチビンAとLiClの両方で誘導することによって、内中胚葉への分化が促進されたのはアクチビンによって内中胚葉を誘導するときに、発生初期でWntのシグナルも内中胚葉の分化に何らかの関わりがあることを示唆する。【００５４】
（２）内中胚葉、胚体内胚葉から胸腺上皮細胞への分化
胸腺のみならず、全ての器官形成はいくつかの異なる段階に分けることができる（参考文献１）。即ち、a「位置決め（臓器原基が胚のどの部位で発生するかを正確に決める）」、b「開始（臓器原基の明白な発達）」、c「突起と配置（原基の成長にともなう、異なる領域の発生）」、d「分化（空間的情報により異なる細胞型への分化）」である。これらの段階は厳密に調節され、そして正確な臓器形成を確かにするための調整がおこなわれている。胸腺の器官形成における初期段階では、間充細胞と上皮細胞の相互作用の必要性が知られている。胸腺の周りにある神経冠細胞（NCC）が胎児胸腺の発達に関わっており、胸腺の発達に重要なシグナルを出している考えは広く受け入れられているが、正確な役割やこのシグナルの性質についてはまだ解明されていない。内胚葉と間充細胞との間の相互シグナルが原基の位置決定(positioning)と突起(outgrowth)の制御を行い、また配置決定(patterning)も含むカスケードが予測されている。しかしながら、主な発達シグナル経路であるFGFsやWnt、BMPs、SHHを含むシグナル経路が胸腺の発達に関与することが示唆されているものの、その詳細は解明されていない。【００５５】
FGF8はE10.5での咽頭嚢内胚葉で発現しており、この発現はおそらく周りのNCC間充細胞へのシグナルと考えられている。FGFR2-IIIbは約E13.5からTECで発現しており、周りにある間充細胞が放出するFGF7とFGF10のシグナルを受け取ると考えられている（参考文献２４、２７、２９）。また、FGFR2-IIIbの発現はRT-PCRの結果、E14における間充細胞でも検出されている。いくつかの知見から内胚葉と間充細胞におけるFGF7とFGF10などのFGFシグナルが原基形成の初期段階に必要と考えられており、すくなくとも胸腺におけるFGFsの役割のいくつかは下流のBMP4シグナルとの関わりも示唆されている。BMP4もまた、FoxN1とFGFR2-IIIbの両方の発現を促進し、間充細胞からのFGF7とFGF10シグナルに対するTECの反応性が促進させるモデルが現在支持されている。Wntシグナルもまた、TEC自体の分化や胸腺T細胞の分化における機能が示唆されている（参考文献１１、１６）。そして、WntはFoxN1の発現を誘導し、TECでオートクリンやパラクリン機構の両方でFoxN1の発現を維持、調節を通してTECの分化を促進していると考えられている。胸腺の分化には中胚葉由来の間充組織との相互が重要であることが知られているため、ES細胞及びiPS細胞を内中胚葉へ誘導し、内胚葉だけを取り出すのではなく、両方を混在したまま分化誘導することによって胸腺再生を試みた。【００５６】
本実験では胸腺の発達に従った分化誘導を行い、胸腺上皮細胞を再生することを目指しているため、現在得られている知見を参考に分化誘導方法を考えた。in vivoではFGF8の発現がE9.5における第2や3，4咽頭嚢で確認され、他にもいくつかの部位（頭など）でも発現が確認されている。FGF8の機能は、間充細胞を第3咽頭嚢の周りに誘導すると考えられているが、オートクリン機構によって、自己に作用している可能性も考慮し、FGF8による分化誘導を行った。アクチビンA（10 ng/ml）とLiCl（5 mM）を加え、内中胚葉と胚体内胚葉へ分化誘導後、培養４日目から培養７日目にFGF8(4 ng/ml)とLiCl（5 mM）を加え、3日間培養した。【００５７】
BMP4はE9.5の第3咽頭嚢内胚葉では発現が見られないが、E10.5から第3咽頭嚢のanteriorの部分で発現が確認されている（参考文献４）。また、BMP4の抑制因子であるNogginの発現は異所的に発現し、胸腺原基ができる場所を限定していると考えられている。BMP4の発現が胸腺の発達において重要な因子であることはBMP4のノックアウトマウスの研究から知られている（参考文献２３）。また、FGF7とFGF10は胸腺原基の発達に関わっていることが知られており、FGF7とFGF10はE13.5における胸腺原基の周りにある間充細胞におけるRT-PCRの結果から発現が確認されている。またFGF7、FGF10の受容体であるFGFR2-IIIbが、同じ時期であるE13.5で胸腺原基部位での発現が確認されており、FGFR2-IIIbはFGF7やFGF10の刺激によって活性化される。本実験では、FGF8の発現がある咽頭嚢から胸腺原基の形成後にFGF7とFGF10の発現が起こることを利用し、FGF8とLiClを加えた培地で培養後（培養４日目（D4）〜７日目（D7））、BMP4とFGF7、FGF10と引き続きLiClを加えて培養した。【００５８】
iPS細胞を用い、各因子の添加濃度と分化誘導との関係を調べた。まず、FGF10の濃度のみを変化させ（2〜20 ng/ml）、その他の因子の濃度を一定にして７日目（D7）〜１２日目（D12）の培養を行った。結果、FGF10濃度が2〜10ng/mlで胸腺関連遺伝子の発現がみられた（結果を図示せず）。そこでFGF10の至適濃度は5ng/mlとした。次にBMP4の濃度のみを変化させ（1〜10 ng/ml）、その他の因子の濃度を一定にして同様の実験を施行した。BMP4の濃度に対応した変化はそれほど見られなかったが、Dll1の発現上昇が10ng/mlで認められたため（結果を図示せず）、この濃度を採用することにした。最後に、FGF7の濃度のみ変化させ（2〜50 ng/ml）、その他の因子の濃度を一定にして同様の実験を施行した。その結果、2 ng/mlではPax1とPax3の発現が低下したため（結果を図示せず）、20ng/mlを採用することにした。以上の結果を踏まえ、図４に示す分化誘導法を構築した。【００５９】
（３）分化誘導によるD0からD15までの経時的な変化
図４の分化誘導法におけるiPS細胞の遺伝子発現の経時的な変化をRT-PCRで調べた。胸腺の発達段階ではHoxa3、Pax1、Pax9、Eya1そしてSix1の順で発現することが知られている。Hoxa3 は培養４日目（D4）、Pax1は培養７日目（D7）、Pax9は培養９日目（D9）にそれぞれ発現が上昇し（図５）、発生学で知られている事実に則した結果になった。Eya1とSix1は未分化な細胞でも発現があるが（参考文献１，３，２１，２５，２６）、分化に従い発現が上昇した（図５）。さらに、胸腺細胞の分化に必要とされているDll1とDll4（参考文献３３）の発現も未分化でも弱く発現が見られたが、Dll4の発現は培養７日目（D7）から少し上昇した（結果を図示せず）。胸腺の発達上知られているほかの因子では、発生段階に関わるTbx1や幹細胞の維持に関わるp63、FGFsの受容体であるFGFR2、胸腺髄質のマーカーであるK5（参考文献９、１０、１６）の発現も分化誘導に従って上昇した（図５）。さらに、Nanogの発現が経時的に減少していることから分化が進んでいることが示唆され（図５）、また、NanogとOct3/4の発現が完全に消失せず、p63の発現が上昇したことから（結果を図示せず）、ES細胞以外の幹細胞でこれらが発現している可能性も示唆された。実際に分化誘導した細胞を血清入りの培地で継代を行うとコロニーが出現し、増殖したことからホロクローンと考えられ、さらに、この細胞は胸腺と関わる遺伝子も発現していた（結果を図示せず）。この結果から、分化誘導した細胞を継代することによって、増殖能が低い成熟した細胞を含んだ細胞から上皮幹細胞を回収できることが示唆された。また、継代した細胞を観察とFCMの結果から、完全に均一な細胞のみが存在するのではなく、いくつかの細胞群が混在していることが分かった。【００６０】
初期内胚葉系のマーカーであるSox17が培養４日目（D4）で強く発現していることから（結果を図示せず）、内胚葉系への分化が起きていることが確認された。また、E-カドヘリンの発現は常に一定であることから（結果を図示せず）、内胚葉系の細胞が一定の割合で存在している可能性が示唆された。胸腺原基の周りに存在する間充組織で発現が確認されているPDGFR-αの発現が培養４日目（D4）以降強くなっており（結果を図示せず）、また、中胚葉系のマーカーであるBrachyuryとCad11の発現も経時的に発現が強くなっていることから（結果を図示せず）、中胚葉由来の間充組織への分化が示唆された。そして、内中胚葉のマーカー遺伝子であるGSCの発現は培養４日目（D4）で一番強くなる一方でその後は発現がなくなり（結果を図示せず）、併せて外胚葉系のマーカー遺伝子であるSox1の発現がまったく確認されなかったことから（結果を図示せず）、外胚葉系への分化は起こっていないことが確認できた。【００６１】
次に、胸腺上皮細胞の表面マーカーであるEpCAM1と初期発生段階において胸腺上皮前駆細胞のサブポピュレーションを規定することで知られるMTS24の発現を培養１４日目の細胞について調べた。その結果、二つの細胞集団を認めた。この内、小細胞集団にEpCAM1とMTS24の発現を認めた（図６）。RT-PCRの結果を併せて総合判断すると、当該細胞集団が胸腺上皮前駆細胞であると考えられる。【００６２】
（４）髄質胸腺上皮細胞（mTEC）の誘導
胸腺上皮前駆細胞（TEPC）は皮質胸腺上皮細胞（cTEC）と髄質胸腺上皮細胞（mTEC）の前駆細胞である。そこで、上記の分化誘導法で生じた胸腺上皮前駆細胞を髄質胸腺上皮細胞へ分化させることを試みた。胸腺における髄質領域の発達と自己寛容の構築に重要な因子としてRANKリガンドとCD40リガンドの存在が報告されるとともに、初期の胸腺髄質領域の構築にはRANKリガンドがより重要であることが示唆された（参考文献１８）。そこで、髄質胸腺上皮細胞への分化を誘導するため、培養１２日目からRANKリガンド（10ng/ml）とLiCl（5mM）を添加した培地で培養した（図７）。その結果、今まで発現に変化がなかったFoxN1の発現が培養１６日目に顕著に増加し、ケラチン５の発現も同様に増加した（図８）。自己寛容に関わる遺伝子であるAIREとCrp、Sap１については、CrpとSap1の発現が増加していた（図８）。また、胸腺T細胞の分化に関わるDll1とDll4については、Dll4の発現が経時的に増加していた（図８）。リアルタイムPCRでPax1、FoxN1及びK5の発現を検出した結果、培養１６日目においてFoxN1及びK5が高発現しており、胸腺上皮細胞への分化が確認された（図９）。【００６３】
（５）in vivo実験（腎皮膜下へのコラーゲンスポンジの移植）
分化誘導した細胞がin vivoの環境下でどのような組織に分化をするかを解析するために、12日間分化誘導した細胞を小さく切ったコラーゲンスポンジに吸い込ませ、ヌードマウスの腎皮膜下に移植した。このサンプルを3週間後に回収し、解析した。移植したコラーゲンスポンジは移植前に比べて大きくなっていた。【００６４】
5mmの厚さに切った凍結切片をH.E染色した結果、コラーゲンスポンジの中には細胞が密に存在しており、部位によって細胞密度が異なるようであった。コラーゲンスポンジに存在する細胞が、移植した細胞由来のものであるか宿主由来の細胞であるかを確認するため、各種抗体を用いて解析した。その結果、E-cad陽性細胞と、PDGFR-α陽性細胞がそれぞれ異なる部位で密集して存在していた。E-cad陽性細胞群は内胚葉系由来の細胞であり、PDGFR-α陽性細胞群は中胚葉由来の細胞であると考えることができるため（参考文献３３，３４）、ここに採用した分化誘導法によって少なくとも内胚葉系細胞と中胚葉系細胞が分化し、それぞれが集団を形成したことが示唆された。【００６５】
（６）改良法の検討
考案した誘導方法を改良することによって目的の細胞集団を単一的に得ることができないか検討した。具体的には、培養４日目からの培養を、FGF8b(4ng/ml)及びLiCL(5mM)を含むSF-03培地に代えて、FGF8b(5ng/ml)、LiCL(5mM)及びアクチビンＡ(5ng/ml)を含むSF-03培地で行うことにした（図１０）。この改良法を採用した場合、培養７日目（D7）の段階で目的とする丸いコロニー群の割合を劇的に増加させることができた（図１１）。培養４日目（D4）から培養７日目（D7）までアクチビンＡを添加して得られた細胞群をＡ＋細胞群と呼ぶことにし、アクチビンＡを添加しない場合の細胞群をＡ−細胞群と呼ぶことにした。RT-PCRによりこのＡ＋細胞群は目的の遺伝子を強く発現していた（図１２）。さらに培養７日目（D7）からFGF7、FGF10、BMP4及びLiCLを含む培地に交換し７日間培養を続けることにより、胸腺発達に関わる多くの遺伝子発現が上昇し、胸腺上皮細胞のマーカーであるFoxN1の発現も著しく上昇した（図１２）。このように、RANKリガンドを用いずに胸腺上皮細胞と類似した細胞群をより単一的な細胞群として得ることに成功した。改良法では、アクチビンＡの添加によって、ほとんどの細胞群が内胚葉系の細胞群に誘導され、その結果、他の細胞からの因子が培地中に存在しない状態（即ち、添加したFGF7、FGF10、BMP4及びLiCLしか存在しない状態）が形成されたため、効率よく胸腺上皮細胞の方向へ分化が進んだのではないかと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の方法によれば、生体外（in vitro）で胸腺上皮前駆細胞又は髄質胸腺上皮細胞を調製できる。これらの細胞は胸腺障害に対する治療用の材料として利用され得る。また、本発明の方法によって得られる細胞を用いて胸腺様の組織・器官を構築し、これをT細胞の教育器官として利用することも期待される。【００６７】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。【００６８】
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【配列表フリーテキスト】
【００６９】
配列番号１〜５４：人工配列の説明：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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