(57)【要約】本発明は、細胞内安定性や正常細胞への機能障害などから副作用を避けることができる抗がん剤またはＤＤＳとして使用可能な物質を提供することを課題とする。本発明は、Ｈｓｐ９０は単独で機能を担うのではなく、パートナータンパク質の一つであるＨｏｐが結合することで、サービビンなどのタンパク質の折りたたみを補助するシャペロン機能を発揮することができることを見出し、Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドと、細胞透過性ペプチドとを有するキメラペプチドとすることによって、かかる課題を解決した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈｓｐ９０  ＴＰＲ（ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｐｅａｔ）ドメイン結合ペプチドと、細胞透過性ペプチドとを有するキメラペプチド。
【請求項２】
前記Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドは、アミノ酸配列ＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号４；ここで、アルファベットは、アミノ酸の１文字表示である。）またはその改変配列を有するものである、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項３】
前記Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドは、
アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号１）を有するものであって、ここで
Ｘ１は、Ｋまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ａまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｙまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ａまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｒまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｉまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ｇまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｎまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｓまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ１０は、Ｙまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ１１は、Ｆまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ１２は、Ｋまたはそれに類似するアミノ酸であるか、あるいは
ＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＫＹＫ（配列番号４３）であり、
ここで、アミノ酸表記は１文字表記によるものである、
請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項４】
前記Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドは、
アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号１）を有するものであって、ここで
Ｘ１は、Ｋであり；
Ｘ２は、ＡまたはＧであり；
Ｘ３は、ＹまたはＬであり；
Ｘ４は、ＡまたはＧであり；
Ｘ５は、ＲまたはＡであり；
Ｘ６は、ＩまたはＡであり；
Ｘ７は、ＧまたはＡであり；
Ｘ８は、ＮまたはＱであり；
Ｘ９は、ＳまたはＹであり；
Ｘ１０は、ＹまたはＳであり；
Ｘ１１は、ＦまたはＹであり；
Ｘ１２は、ＫまたはＲであるか、あるいは
ＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＫＹＫ（配列番号４３）である、
請求項３に記載のキメラペプチド。
【請求項５】
前記Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドにおいて、
Ｘ２は、Ｇであり；
Ｘ４は、Ｇであり；
Ｘ７は、Ａであり；
Ｘ４は、Ｑであり；
Ｘ９は、Ｙであり；
Ｘ１０は、Ｓであり；
Ｘ１１は、Ｙであり；または
Ｘ１２は、Ｒである、
ものを含む、
請求項３に記載のキメラペプチド。
【請求項６】
前記Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドにおいて、
Ｘ４は、Ｇであり；
Ｘ９は、Ｙであり；または
Ｘ１１は、Ｙである、
ものを含む、
請求項３に記載のキメラペプチド。
【請求項７】
前記Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドは、アミノ酸配列ＫＡＹＡＲ（配列番号３）を有するものである、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項８】
前記Ｈｓｐ９０  ＴＲＰドメイン結合ペプチドは、アミノ酸配列ＫＡＹＡＲＸａＸｂＸｃＸｄＺ１Ｚ２Ｚ３（配列番号２）を有するものであって、ここで、Ｘａ、Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄは独立して任意のアミノ酸であり、Ｚ１Ｚ２Ｚ３はヘリックスを形成、維持するのに重要なアミノ酸である、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項９】
Ｚ１はＹまたはＨであり、Ｚ２はＦ、Ｅ、Ｍ、ＬまたはＳであり、Ｚ３はＫ、Ａ、Ｌ、ＱまたはＳである、
前記Ｚ１Ｚ２Ｚ３は、（Ｙ／Ｈ）（Ｆ／Ｅ／Ｍ／Ｌ／Ｓ）（Ｋ／Ａ／Ｌ／Ｑ／Ｓ）である、請求項７に記載のキメラペプチド。
【請求項１０】
前記Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドは、ＫＡＹＡＲ（配列番号３）またはＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号４）である、請求項１に記載のキメラペプチド
【請求項１１】
前記細胞透過性ペプチドは、アンテナペディアホメオボックス配列（Ａｎｔｐ）であるＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５）、ＴＡＴであるＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号６）、またはＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号７）あるいはそれらの改変配列である、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項１２】
前記細胞透過性ペプチドは、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５）またはその改変配列であって、該改変配列は、アミノ酸配列Ｙ１Ｙ２Ｙ３Ｙ４Ｙ５Ｙ６Ｙ７Ｙ８Ｙ９Ｙ１０Ｙ１１Ｙ１２Ｙ１３Ｙ１４Ｙ１５Ｙ１６（配列番号８）を有するものであって、ここで
Ｙ１は、Ｒまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ２は、Ｑまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ３は、Ｉまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ４は、Ｋまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ５は、Ｉまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ６は、Ｗまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ７は、Ｆまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ８は、Ｑまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ９は、Ｎまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ１０は、Ｒまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ１１は、Ｒまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ１２は、Ｍまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ１３は、Ｋまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ１４は、Ｗまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ１５は、Ｋまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ１６は、Ｋまたはそれに類似するアミノ酸である、
配列を有するものである、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項１３】
前記細胞透過性ペプチドは、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５）またはその改変配列であって、該改変配列は、アミノ酸配列Ｙ１Ｙ２Ｙ３Ｙ４Ｙ５Ｙ６Ｙ７Ｙ８Ｙ９Ｙ１０Ｙ１１Ｙ１２Ｙ１３Ｙ１４Ｙ１５Ｙ１６（配列番号８）を有するものであって、ここで
Ｙ１は、ＲまたはＫであり；
Ｙ２は、ＱまたはＮであり；
Ｙ３は、ＩまたはＬであり；
Ｙ４は、ＫまたはＲであり；
Ｙ５は、ＩまたはＬであり；
Ｙ６は、ＷまたはＹであり；
Ｙ７は、ＦまたはＹであり；
Ｙ８は、ＱまたはＮであり；
Ｙ９は、ＮまたはＱであり；
Ｙ１０は、ＲまたはＫであり；
Ｙ１１は、ＲまたはＫであり；
Ｙ１２は、ＭまたはＣであり；
Ｙ１３は、ＫまたはＲであり；
Ｙ１４は、ＷまたはＹであり；
Ｙ１５は、ＫまたはＲであり；
Ｙ１６は、ＫまたはＲである、
配列を有するものである、請求項１２に記載のキメラペプチド。
【請求項１４】
前記細胞透過性ペプチドにおいて
Ｙ２は、Ｎであり；
Ｙ４は、Ｒであり；
Ｙ８は、Ｎであり；
Ｙ９は、Ｑであり；
Ｙ１０は、Ｋであり；
Ｙ１１は、Ｋであり；
Ｙ１２は、Ｃであり；
Ｙ１３は、Ｒであり；
Ｙ１４は、Ｙであり；
Ｙ１５は、Ｒであり；または
Ｙ１６は、Ｒである、
配列を有するものである、請求項１２に記載のキメラペプチド。
【請求項１５】
前記細胞透過性ペプチドにおいて
Ｙ４は、Ｒであり；
Ｙ９は、Ｑであり；
Ｙ１２は、Ｃであり；または
Ｙ１６は、Ｒである、
配列を有するものである、請求項１２に記載のキメラペプチド。
【請求項１６】
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号９）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＲＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号１０）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＡＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号１１）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＧＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号１２）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＬＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号１３）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＧＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号１４）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＫＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号１５）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＲＧＮＳＹＦＫ（配列番号１６）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＡＮＳＹＦＫ（配列番号１７）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＱＳＹＦＫ（配列番号１８）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＹＹＦＫ（配列番号１９）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＳＦＫ（配列番号２０）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＹＫ（配列番号２１）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＲ（配列番号２２）、
ＫＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号２３）、
ＲＮＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号２４）、
ＲＱＬＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号２５）、
ＲＱＩＲＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号２６）、
ＲＱＩＫＬＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号２７）、
ＲＱＩＫＩＹＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号２８）、
ＲＱＩＫＩＷＹＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号２９）、
ＲＱＩＫＩＷＦＮＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３０）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＱＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３１）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＫＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３２）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＫＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３３）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＣＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３４）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＲＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３５）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＹＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３６）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＲＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３７）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＲＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３８）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３９）、または
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号４０）、の配列を有するものである、請求項１に記載のキメラペプチド
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のキメラペプチドをコードする核酸。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれかに記載のキメラペプチドをコードする核酸を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれかに記載のキメラペプチドをコードする核酸を含む細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１６に記載のキメラペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１６に記載のキメラペプチドを含む抗がん剤。
【請求項２２】
前記がんは、固形がんおよび血液がんを含む、請求項２１に記載の抗がん剤。
【請求項２３】
前記がんは、固形がんである、請求項２１に記載の抗がん剤。
【請求項２４】
前記がんは、血液がんである、請求項２１に記載の抗がん剤。
【請求項２５】
請求項１〜１６に記載のキメラペプチドの、医薬組成物の製造のための使用。
【請求項２６】
請求項１〜１６に記載のキメラペプチドの、抗がん剤の製造のための使用。
【請求項２７】
前記がんは、固形がんおよび血液がんを含む、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記がんは、固形がんである、請求項２６に記載の使用。
【請求項２９】
前記がんは、血液がんである、請求項２６に記載の使用。
【請求項３０】
請求項１〜１６に記載のキメラペプチドを投与する工程を包含する治療方法。
【請求項３１】
請求項１〜１６に記載のキメラペプチドを投与する工程を包含するがんの治療方法。
【請求項３２】
前記がんは、固形がんおよび血液がんを含む、請求項３１に記載の治療方法。
【請求項３３】
前記がんは、固形がんである、請求項３１に記載の治療方法。
【請求項３４】
前記がんは、血液がんである、請求項３１に記載の治療方法。
【請求項３５】
Ｈｓｐ９０のＴＰＲドメイン内のアミノ酸配列を用いる、医薬のスクリーニング方法。
【請求項３６】
前記Ｈｓｐ９０のＣ末端配列（ＥＥＶＤ）に結合するＴＰＲドメイン内のアミノ酸配列は、ＡＬＫＥＫＥＬＧＮＤＡＹＫＫＫＤＦＤＴＡＬＫＨＹＤＫＡＫＥＬＤＰＴＮＭＴＹＩＴＮＱＡＡＶＹＦＥＫＧＤＹＮＫＣＲＥＬＣＥＫＡＩＥＶＧＲＥＮＲＥＤＹＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＫＹＫＤＡＩＨＦＹＮＫＳＬＡＥＨＲＴＰＤＶＬＫＫＣＱＱＡＥＫＩＬＫＥＱＥＲＬＡ（配列番号４１）である、請求項３５に記載のスクリーニング方法。
【請求項３７】
Ｈｓｐ９０のＴＰＲドメイン内のアミノ酸配列を用いる、抗がん剤のスクリーニング方法。
【請求項３８】
前記がんは、固形がんおよび血液がんを含む、請求項３７に記載のスクリーニング方法。
【請求項３９】
前記がんは、固形がんである、請求項３７に記載のスクリーニング方法。
【請求項４０】
前記がんは、血液がんである、請求項３７に記載のスクリーニング方法。
【請求項４１】
前記Ｈｓｐ９０のＣ末端配列（ＥＥＶＤ）に結合するＴＰＲドメイン内のアミノ酸配列は、ＡＬＫＥＫＥＬＧＮＤＡＹＫＫＫＤＦＤＴＡＬＫＨＹＤＫＡＫＥＬＤＰＴＮＭＴＹＩＴＮＱＡＡＶＹＦＥＫＧＤＹＮＫＣＲＥＬＣＥＫＡＩＥＶＧＲＥＮＲＥＤＹＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＫＹＫＤＡＩＨＦＹＮＫＳＬＡＥＨＲＴＰＤＶＬＫＫＣＱＱＡＥＫＩＬＫＥＱＥＲＬＡ（配列番号４１）である、請求項３５または３６に記載のスクリーニング方法。
【請求項４２】
Ｈｓｐ９０  ＴＰＲ（ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｐｅａｔ）ドメイン結合ペプチドおよび目的物質を含む、がん細胞の調節のための組成物。
【請求項４３】
前記がんは、固形がんおよび血液がんを含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記がんは、固形がんである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４５】
前記がんは、血液がんである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４６】
前記目的物質は、抗がん剤である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４７】
前記Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドは、ビヒクル上に存在するものである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ビヒクルは、リポソームである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４９】
Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドを含む、目的物質のがん細胞への送達剤。
【請求項５０】
前記Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドと前記目的物質とが互いに結合してまたは結合しないで含まれる、請求項４９に記載の送達剤。
【請求項５１】
前記Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドと前記目的物質とが互いに結合した融合物質である、請求項４９に記載の送達剤。
【請求項５２】
前記融合物質はペプチドである、請求項４９に記載の送達剤。
【請求項５３】
前記Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドと前記目的物質とが互いに結合しないで分散して含まれる、請求項４９に記載の送達剤。
【請求項５４】
前記Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドは、ビヒクル上に含まれる、請求項４９に記載の送達剤。
【請求項５５】
前記ビヒクルは、リポソームである、請求項５４に記載の送達剤。
【請求項５６】
前記Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドは、ビヒクル上に含まれ、前記目的物質は、ビヒクル内に含まれる、請求項４９に記載の送達剤。
【請求項５７】
前記ビヒクルは、リポソームである、請求項５６に記載の送達剤。
【請求項５８】
標的結合ペプチドと細胞殺傷性の溶解性ペプチド成分とを含むペプチド毒素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｈｓｐ９０を標的にした薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物または細菌の毒素に結合させた、がん細胞表面上に過剰発現されるタンパク質に対する免疫毒素、モノクローナル抗体またはリガンドは、抗がん剤としてのその使用可能性について、広く研究されている（非特許文献１）。多数の免疫毒素が、前臨床試験および臨床試験において試験されており、インターロイキン−２−ジフテリア毒素（ＩＬ２−ＤＴ；Ｏｎｔａｋ（登録商標）、エーザイ）が、慢性Ｔ細胞リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の処置について米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に認可されている（非特許文献２；非特許文献３）。さらに、インターロイキン−４−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素［ＩＬ４（３８−３７）−ＰＥ３８ＫＤＥＬ］およびインターロイキン−１３−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ）を含めたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素ベースの免疫毒素が、臨床試験で試験中である（非特許文献４；非特許文献５）。ジフテリア毒素およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素は共に、リソソーム中に取り込まれ、活性化され、そして、サイトゾルへとトランスロケーションした後、リボソーム複合体中の延長因子２を触媒的に不活性化することによって作用する。この作用機構は、免疫毒素が、休止状態の非複製腫瘍細胞を効率的に破壊することを可能にする。【０００３】
細菌毒素ベースの免疫毒素を利用してがんに向けてターゲティングするアプローチは魅力的ではあるが、細菌毒素に起因する肝毒性と、毒素タンパク質により引き起こされる免疫原性とに、その制約が見出される（非特許文献２；非特許文献４；非特許文献６）。さらに、免疫毒素の分子サイズは、一般に、化合物またはフラグメント抗体薬物に比べて大きく、薬物が、ヒトの体内の腫瘍塊へと効率的に浸透することを妨げ得る。この問題を克服するために、進化したアプローチを有する新世代の免疫毒素が、決定的に必要とされる。【０００４】
熱ショックタンパク質（Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の一つであるＨｓｐ９０タンパク質は、あらゆる細胞に広く存在し、細胞の機能調節に欠くことのできない重要なタンパク質の一つである。近年、がん細胞で多く発現する抗アポトーシス（ａｎｔｉ−ａｐｏｔｏｓｉｓ）タンパク質（細胞がアポトーシスをおこすのを妨げる）の一つであるサービビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）がこのＨｓｐ９０によって正しく折りたたまれて、機能することからＨｓｐ９０の活性阻害によって抗がん作用を示す化合物、ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）の研究が広く発表されている。しかしながら、化合物によるタンパク質の機能阻害は、化合物が細胞内で安定であること、および化合物が正常細胞へ与えうる機能障害などから副作用を避けることは非常に難しい。【０００５】
Ｈｓｐ９０は正常細胞にも多く含まれていることから、Ｈｓｐ９０阻害薬は正常細胞にも作用する可能性があり、副作用が問題となりうる。ゲルダナマイシンの毒性は許容されなかったため、ゲルダナマイシンと同様にＨｓｐ９０阻害効果があり、腎、肝毒性を軽減した誘導体に１７−アリルアミノゲルダナマイシン（１７−ａｌｌｙｌａｍｉｎｏｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ；１７−ＡＡＧ）（タネスピマイシン（Ｔａｎｅｓｐｉｍｙｃｉｎ）とも呼ばれる）である。【０００６】
Ｈｓｐ９０に関しては、シェファーディン（ｓｈｅｐｈｅｒｄｉｎ）という抗がん剤候補が提唱されている（非特許文献７、非特許文献８）。しかし、このシェファーディンは、サービビンとＨｓｐ９０との間の結合を直接阻害するものであり、ＡＴＰポケットとの接触により、結合すべきタンパク質等が不安定化され、本来の機能を果たさなくなるというものであるが、in vivoにおける効果は、効果的であるといえない。また、in vitroの結果を併せてみてもまだ改善の余地があるという問題があった。【０００７】
したがって、当該分野において、がん細胞に選択性の高く、かつ、in vitroでも効果的な新たな構造の抗がん剤を設計することが望まれている。【０００８】
また、当該分野において、Ｈｓｐをターゲットにした新しい薬剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐａｓｔａｎ  Ｉ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９７；１３３３：Ｃ１−６
【非特許文献２】Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｋ，Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｏ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ｎａｇａｉ  Ｒ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｒｅｃｔ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ．Ｔｈｅ  Ｓｃｉ  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  ２００６；６：７８１−９０
【非特許文献３】Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ＲＪ．Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．ＡＡＰＳ  Ｊ  ２００６；８：Ｅ５３２−５１
【非特許文献４】：Ｒａｎｄ  ＲＷ，Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ＲＪ，Ｐａｔｒｏｎａｓ  Ｎ，Ｖａｒｒｉｃｃｈｉｏ  Ｆ，Ｐａｓｔａｎ  Ｉ，Ｐｕｒｉ  ＲＫ．Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ  ｐｅｒｍｕｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  ｇｌｉｏｍａ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００；６：２１５７−６５
【非特許文献５】：Ｋｕｎｗａｒ  Ｓ，Ｐｒａｄｏｓ  ＭＤ，Ｃｈａｎｇ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｎｔｒｅｄｅｋｉｎ  Ｂｅｓｕｄｏｔｏｘ  Ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｉｎｔｒｅｄｅｋｉｎ  ｂｅｓｕｄｏｔｏｘ  （ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ）  ｉｎ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ：ａ  ｒｅｐｏｒｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｃｉｎｔｒｅｄｅｋｉｎ  Ｂｅｓｕｄｏｔｏｘ  Ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００７；２５：８３７−４４
【非特許文献６】Ｆｒａｎｋｅｌ  ＡＥ，Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ＲＪ，Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ  ＥＡ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏｘｉｎｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００；６：３２６−３４
【非特許文献７】Ｐｌｅｓｃｉａ  Ｊ，Ｓａｌｚ  Ｗ，Ｘｉａ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｓｈｅｐｈｅｒｄｉｎ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００５；７：４５７−６８．
【非特許文献８】Ｇｙｕｒｋｏｃｚａ  Ｂ，Ｐｌｅｓｃｉａ  Ｊ，Ｒａｓｋｅｔｔ  ＣＭ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｈｅｐｈｅｒｄｉｎ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｓｐ９０  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ２００６；９８：１０６８−７７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、細胞内安定性や正常細胞への機能障害などから副作用を避けることができる抗がん剤またはＤＤＳとして使用可能な物質を提供することを課題とする。特に、正常細胞との選択性を持ち、しかもin vivoで低用量で抗がん活性を有し、副作用が少なく、効率、効果の高い、新たな構造の抗がん剤を設計することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、Ｈｓｐ９０は単独で機能を担うのではなく、パートナータンパク質の一つであるＨｏｐが結合することで、サービビンなどのタンパク質の折りたたみを補助するシャペロン機能を発揮することができることを見出した。そこで、本発明では、ＨｏｐがＨｓｐ９０に結合するのに重要なＴＰＲ（テトラトリコペプチド反復；ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｐｅａｔ）ドメイン内のアミノ酸に着目し、このアミノ酸と従来までに報告されている細胞透過性ペプチドＡｎｔｐを組み合わせ、細胞内にこのキメラペプチドを導入することでがん細胞のみ特異的に殺傷能力を有する新規ペプチドを発明、その効用を実際に実験によって証明した。また、本発明は、Ｈｓｐ９０に関する従来技術の知見では予想できなかったがん細胞に対する選択性を持ちつつ、in vivo、特に全身投与でも数（１〜５）ｍｇ／ｋｇ単位という定量で抗がん効果が見られるようなペプチド抗がん剤を作製しうることが判明した。【００１２】
また、ＴＰＲペプチドのみでは、細胞殺傷効果がまったく観察されずＴＰＲペプチド自体が細胞内に入る必要性があることは、実験で確かめられていることから、本発明は、薬物送達系（ＤＤＳ）として、Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドを含む、目的物質のがん細胞への送達剤を提供する。このようなＤＤＳの概念は、たとえば、トランスフェクション試薬、たとえばリポソーム化したもの全体でＤＤＳは、実験としてはトランスフェクション試薬（リポソーム化して導入）を用いて、ＴＰＲペプチドとスクランブルペプチド（「ｓｃｒａｍｂｌｅ（ペプチド）」とも表記）を同濃度細胞に導入して細胞殺傷効果を観察することによって確認される。【００１３】
したがって、本発明は、以下を提供する。【００１４】
１つの局面において、本発明は、Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドを含む、目的物質のがん細胞への送達剤および関連する薬物送達技術（ＤＤＳ）を提供する。【００１５】
１つの実施形態において、本発明において使用されるＨｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドと前記目的物質とは、互いに結合してまたは結合しないで含まれる。【００１６】
１つの実施形態において、本発明において使用されるＨｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドと前記目的物質とは、互いに結合した融合物質である。【００１７】
１つの好ましい実施形態において、本発明において使用される上記融合物質はペプチドである。【００１８】
１つの実施形態において、本発明において使用されるＨｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドと前記目的物質とは、互いに結合しないで分散して含まれる。【００１９】
１つの実施形態において、本発明において使用されるＨｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドは、ビヒクル上に含まれる。【００２０】
１つの実施形態において、本発明において使用されるＨｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドは、ビヒクル上に含まれ、前記目的物質は、ビヒクル内に含まれる。【００２１】
１つの好ましい実施形態において、本発明において使用されるビヒクルは、リポソームである。【００２２】
別の局面において、本発明は、Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドおよび目的物質とを含む、がん細胞の調節のための医薬に関する。この医薬は１つの実施形態では、組成物である。【００２３】
１つの実施形態において、本発明において使用される目的物質は、抗がん剤である。【００２４】
１つの実施形態において、本発明において使用されるＨｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドは、ビヒクル上に存在するものである。【００２５】
１つの実施形態において、本発明において使用されるビヒクルは、リポソームである。【００２６】
また別の局面において、本発明は、標的結合ペプチドと細胞殺傷性の溶解性ペプチド成分とを含むペプチド毒素を提供する。【００２７】
さらに別の局面において、本発明は、Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドと、細胞透過性ペプチドとを有するキメラペプチドを提供する。【００２８】
１つの実施形態において、本発明において使用されるＨｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドは、アミノ酸配列ＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号４；ここで、アルファベットは、アミノ酸の１文字表示である。）またはその改変配列を有するものである。【００２９】
１つの好ましい実施形態において、本発明において使用されるＨｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドは、
アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号１）を有するものであって、ここで
Ｘ１は、Ｋまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ａまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｙまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ａまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｒまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｉまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ｇまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｎまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｓまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ１０は、Ｙまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ１１は、Ｆまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ１２は、Ｋまたはそれに類似するアミノ酸であるか、あるいは
ＴＰＲペプチドを延長させたＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＫＹＫ（配列番号４３）であり、
ここで、アミノ酸表記は１文字表記によるものである。【００３０】
１つの実施形態では、本発明において使用されるＨｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドは、
アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号１）を有するものであって、ここで
Ｘ１は、Ｋ、ＲまたはＡであり（好ましくは、Ｋであり）；
Ｘ２は、ＡまたはＧであり；
Ｘ３は、ＹまたはＬであり（好ましくは、Ｙであり）；
Ｘ４は、ＡまたはＧであり；
Ｘ５は、Ｒ、ＡまたはＫであり（好ましくは、Ｒであり）；
Ｘ６は、Ｉ、ＡまたはＲであり（好ましくは、Ｒであり）；
Ｘ７は、ＧまたはＡであり；
Ｘ８は、ＮまたはＱであり；
Ｘ９は、ＳまたはＹであり；
Ｘ１０は、ＹまたはＳであり；
Ｘ１１は、ＦまたはＹであり；および／または
Ｘ１２は、ＫまたはＲであるか、あるいは
ＴＰＲペプチドを延長させたＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＫＹＫ（配列番号４３）である。【００３１】
１つの実施形態では、本発明は、Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドにおいて、
Ｘ２は、Ｇであり；
Ｘ４は、Ｇであり；
Ｘ７は、Ａであり；
Ｘ４は、Ｑであり；
Ｘ９は、Ｙであり；
Ｘ１０は、Ｓであり；
Ｘ１１は、Ｙであり；および／または
Ｘ１２は、Ｒである、ものを含む。【００３２】
１つの実施形態では、本発明は、Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドにおいて、
Ｘ４は、Ｇであり；
Ｘ９は、Ｙであり；
Ｘ１１は、Ｙである、
ものを含む。【００３３】
１つの実施形態において、本発明において使用されるＨｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドは、アミノ酸配列ＫＡＹＡＲ（配列番号３）を有するものである。【００３４】
１つの実施形態において、本発明において使用されるＨｓｐ９０  ＴＲＰドメイン結合ペプチドは、アミノ酸配列ＫＡＹＡＲＸａＸｂＸｃＸｄＺ１Ｚ２Ｚ３（配列番号２）を有するものであって、ここで、Ｘａ、Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄは独立して任意のアミノ酸であり、Ｚ１Ｚ２Ｚ３はヘリックスを形成、維持するのに重要なアミノ酸である。【００３５】
好ましい実施形態では、このＺ１Ｚ２Ｚ３は、（Ｙ／Ｈ）（Ｆ／Ｅ／Ｍ／Ｌ／Ｓ）（Ｋ／Ａ／Ｌ／Ｑ／Ｓ）（すなわち、Ｚ１はＹまたはＨであり、Ｚ２はＦ、Ｅ、Ｍ、ＬまたはＳであり、Ｚ３はＫ、Ａ、Ｌ、ＱまたはＳ）である。【００３６】
１つの実施形態において、本発明において使用されるＨｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドは、ＫＡＹＡＲ（配列番号３）またはＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号４）である。【００３７】
１つの実施形態において、本発明において使用される細胞透過性ペプチドは、アンテナペディアホメオボックス配列（Ａｎｔｐ）であるＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５）、ＴＡＴであるＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号６）、またはＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号７）あるいはそれらの改変配列である。【００３８】
１つの実施形態において、本発明において使用される細胞殺傷性ペプチドは、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５）またはその改変配列であって、該改変配列は、アミノ酸配列Ｙ１Ｙ２Ｙ３Ｙ４Ｙ５Ｙ６Ｙ７Ｙ８Ｙ９Ｙ１０Ｙ１１Ｙ１２Ｙ１３Ｙ１４Ｙ１５Ｙ１６（配列番号８）を有するものであって、ここで
Ｙ１は、Ｒまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ２は、Ｑまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ３は、Ｉまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ４は、Ｋまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ５は、Ｉまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ６は、Ｑまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ７は、Ｆまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ８は、Ｑまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ９は、Ｎまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ１０は、Ｒまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ１１は、Ｒまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｙ１２は、Ｍまたはそれに類似するアミノ酸である、
Ｙ１３は、Ｋまたはそれに類似するアミノ酸である、
Ｙ１４は、Ｋまたはそれに類似するアミノ酸である、
Ｙ１５は、Ｋまたはそれに類似するアミノ酸である、
Ｙ１６は、Ｋまたはそれに類似するアミノ酸である、
を有するものである。【００３９】
１つの実施形態において、本発明において使用される細胞殺傷性ペプチドは、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５）またはその改変配列であって、該改変配列は、アミノ酸配列Ｙ１Ｙ２Ｙ３Ｙ４Ｙ５Ｙ６Ｙ７Ｙ８Ｙ９Ｙ１０Ｙ１１Ｙ１２Ｙ１３Ｙ１４Ｙ１５Ｙ１６（配列番号８）を有するものであって、ここで
Ｙ１は、ＲまたはＫであり；
Ｙ２は、ＱまたはＮであり；
Ｙ３は、ＩまたはＬであり；
Ｙ４は、ＫまたはＲであり；
Ｙ５は、ＩまたはＬであり；
Ｙ６は、ＷまたはＹであり；
Ｙ７は、ＦまたはＹであり；
Ｙ８は、ＱまたはＮであり；
Ｙ９は、ＮまたはＱであり；
Ｙ１０は、ＲまたはＫであり；
Ｙ１１は、ＲまたはＫであり；
Ｙ１２は、ＭまたはＣであり；
Ｙ１３は、ＫまたはＲであり；
Ｙ１４は、ＷまたはＹであり；
Ｙ１５は、ＫまたはＲであり；および／または
Ｙ１６は、ＫまたはＲである、
配列を有するものである。【００４０】
好ましい実施形態において、本発明は、前記細胞透過性ペプチドにおいて
Ｙ２は、Ｎであり；
Ｙ４は、Ｒであり；
Ｙ８は、Ｎであり；
Ｙ９は、Ｑであり；
Ｙ１０は、Ｋであり；
Ｙ１１は、Ｋであり；
Ｙ１２は、Ｃであり；
Ｙ１３は、Ｒであり；
Ｙ１４は、Ｙであり；
Ｙ１５は、Ｒであり；および／または
Ｙ１６は、Ｒである、
配列を有するものを包含する。【００４１】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明の細胞透過性ペプチドにおいて
Ｙ４は、Ｒであり；
Ｙ９は、Ｑであり；
Ｙ１２は、Ｃであり；および／または
Ｙ１６は、Ｒである、
配列を有するものを包含する。【００４２】
好ましい実施形態において、本発明のキメラペプチドは、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号９）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＲＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号１０）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＡＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号１１）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＧＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号１２）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＬＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号１３）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＧＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号１４）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＫＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号１５）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＲＧＮＳＹＦＫ（配列番号１６）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＡＮＳＹＦＫ（配列番号１７）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＱＳＹＦＫ（配列番号１８）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＹＹＦＫ（配列番号１９）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＳＦＫ（配列番号２０）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＹＫ（配列番号２１）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＲ（配列番号２２）、ＫＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号２３）、ＲＮＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号２４）、ＲＱＬＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号２５）、ＲＱＩＲＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号２６）、ＲＱＩＫＬＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号２７）、ＲＱＩＫＩＹＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号２８）、ＲＱＩＫＩＷＹＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号２９）、ＲＱＩＫＩＷＦＮＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３０）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＱＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３１）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＫＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３２）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＫＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３３）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＣＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３４）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＲＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３５）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＹＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３６）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＲＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３７）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＲＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３８）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号３９）、またはＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号４０）の配列を有するキメラペプチドである。【００４３】
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドを含む医薬、好ましくは医薬組成物を提供する。【００４４】
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドを含む抗がん剤を提供する。【００４５】
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドの、医薬組成物の製造のための使用に関する。【００４６】
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドの、抗がん剤の製造のための使用に関する。【００４７】
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドを投与する工程を包含する治療方法に関する。【００４８】
別の局面において、本発明は、本発明のキメラペプチドを投与する工程を包含するがんの治療方法に関する。【００４９】
別の局面において、本発明は、Ｈｓｐ９０のＴＰＲドメイン内のアミノ酸配列を用いる、医薬のスクリーニング方法に関する。【００５０】
別の局面において、本発明は、Ｈｓｐ９０のＴＰＲドメイン内のアミノ酸配列を用いる、抗がん剤のスクリーニング方法に関する。【００５１】
好ましい実施形態において、本発明において使用されるＨｓｐ９０のＣ末端配列（ＥＥＶＤ（配列番号６３））に結合するＴＰＲドメイン内のアミノ酸配列は、ＡＬＫＥＫＥＬＧＮＤＡＹＫＫＫＤＦＤＴＡＬＫＨＹＤＫＡＫＥＬＤＰＴＮＭＴＹＩＴＮＱＡＡＶＹＦＥＫＧＤＹＮＫＣＲＥＬＣＥＫＡＩＥＶＧＲＥＮＲＥＤＹＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＫＹＫＤＡＩＨＦＹＮＫＳＬＡＥＨＲＴＰＤＶＬＫＫＣＱＱＡＥＫＩＬＫＥＱＥＲＬＡ（配列番号４１）またはそのアナログ（好ましくは、保存的置換を有するアナログ）である。【００５２】
これらのすべての局面において、本明細書に記載される各々の実施形態は、適用可能である限り、他の局面において適用されうることが理解される。
【発明の効果】
【００５３】
本発明は、がん細胞にのみ効果を示し、正常細胞にはあまり効果がないということで、がん特異的な新規の薬剤を提供しうる点が挙げられる。また、これは、現在臨床の場で問題となっております抗ガン剤の副作用の問題を解決できることが、大いに期待できる。また、さらに予想外なことは、たった５アミノ酸、好ましくは１２アミノ酸でも、がん細胞殺傷効果が出たということもまた顕著な効果であるといえる。【００５４】
以上のように、本発明により、細胞内での安定性を維持し、正常細胞への機能障害などによる副作用を回避し、がんに対する高い選択性を実現しつつ、かつ、効率、効果の高い抗がん剤またはＤＤＳとして使用可能な物質が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）構成タンパク質（Ｈｏｐ）の模式図（Ａ）およびＨｏｐのＨｓｐ９０との結合に不可欠な領域の立体構造図（Ｂ、Ｃ）を示す。図１（Ａ）は、２つの独立したＴＰＲドメインＴＲＰ１およびＴＰＲ２Ａを示すＨｏｐタンパク質の模式図を示し、これらのＴＰＲ１およびＴＰＲ２Ａは、それぞれ、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０のＣ末端テイルと相互作用する。矢印は、ＴＰＲ２ＡとＨｓｐ９０との相互作用を示す。図１（Ｂ）および図１（Ｃ）は、Ｈｓｐ９０との結合に必要不可欠な領域に関して、立体構造表示ソフトウェア（Ｒａｓ  Ｍｏｌ  ｖｅｒ  ２．７  ｆｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｔｏｓｈ（フリーソフト、http://www.openrasmol.org/）を用いて解析した図を示す。図１（Ｂ）は、報告されているＨｏｐのＴＰＲドメインとＨｓｐ９０のＣ末端配列ＭＥＥＶＤ（配列番号６４）（中央白色）との複合体の立体構造図。この立体構造図（Ｂ）において、Ｈｓｐ９０との結合に重要なヘリックスの一つ（矢印）が今回設計に用いた領域であり、図１（Ｃ）が予測されるペプチド（左）とＨｓｐ９０のＣ末端配列ＭＥＥＶＤ（配列番号６４）（右）との複合体の立体構造図である。
【図２】図２は、ＢＩＡＣＯＲＥ（生体分子間相互作用解析装置）を用いて、センサーチップに固定化されたＨｓｐ９０と新規に設計されたＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチドとの相互作用解析を行った結果を示す。図２のようにペプチドの濃度依存的に結合することが判明した。また、親和定数（Ｋｄ）が２．０９ｘ１０−６であることも判明した。
【図３】図３に、Ａｎｔｐ−ＴＰＲならびに、Ａｎｔｐ−ＴＰＲ変異体ペプチドによる細胞障害活性を示す。図３Ａは、Ａｎｔｐ−ＫＡＹＡＲ（配列番号４２）の結果、図３Ｂは、Ａｎｔｐ−ＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号９）の結果、図３Ｃは、ＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号４）の結果、図３Ｄは、ＴＡＴ−ＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号５０）の結果を示す。図３Ｅおよび図３Ｆは、変異体（ｍｕｔａｎｔ）１および２（Ａｎｔｐ−ＫＡＹＡＡＡＧＮＳＹＦＫ（配列番号４４）およびＡｎｔｐ−ＫＡＹＡＲＩＧＮＳＧＧＧ（配列番号４５））の結果をそれぞれ示す。ここで、Ａｎｔｐは配列番号５に示す配列を有する。各々、縦軸は細胞生存率（％）、横軸はペプチド濃度（μＭ）を表す。
【図４】図４は、殺傷効果が高かった細胞に関するウェスタンブロッティングの結果を示す。（Ａ）Ａｎｔｐ−ＴＰＲペプチド（６８μＭ）とともに４８時間インキュベートしたＴ４７Ｄ細胞におけるクライアントタンパク質の発現量を、特異的な抗体を用いてウェスタンブロッティングにより解析した。左からＡｎｔｐ−ＴＰＲの無・有の場合の、（上から）Ｈｓｐ９０、ＣＤＫ４、Ａｋｔ、サービビン、βアクチン（コントロール）の発現量を示す。Ａｎｔｐ−ＴＰＲペプチドによって（Ｂ）左からＨＥＫ細胞、Ｃａｋｉ−１細胞、Ｂｘｐｃ細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、Ａ５４９細胞に対する、（上から）Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、サービビン、βアクチン（コントロール）の発現量を確認した。なお、図中の「α−」は、ウェスタンブロッティングを行った際の抗体を意味する。
【図５】図５は、ＴＰＲにおいて各アミノ酸をそれぞれ、図に示すアミノ酸配列に変異させて得られた活性相関図である。Ａｎｔｐ−ＴＰＲ変異体ペプチドによる細胞障害活性を示す。
【図６】図６は、ＴＰＲ野生型とｓｌｏｎｇという延長型およびＲ１１を代わりに用いて行った変異体ペプチドによるＣａｋｉ−１に対する細胞障害活性を示す。
【図７】図７は、センサーチップ上に固定化されたＴＰＲ２Ａドメインタンパク質に対して、前もってＨｓｐ９０とＴＰＲペプチド、ＴＰＲ  ｓｃｒａｍｂｌｅ、ＴＰＲ  ｍｕｔａｎｔ  １、あるいはＴＰＲ  ｍｕｔａｎｔ  ２ペプチドをそれぞれ混合させておき、Ｈｓｐ９０に十分に結合させておいてからＴＰＲ２Ａとの相互作用を確認することで、阻害効果を確認した実験である。センサーグラムとグラフで示されるように、ＴＰＲペプチドではその濃度増加によりＨｓｐ９０とＴＰＲ２Ａとの相互作用に影響を与えるが、ＴＰＲ  ｓｃｒａｍｂｌｅ、ＴＰＲ  ｍｕｔａｎｔ  １、あるいはＴＰＲ  ｍｕｔａｎｔ  ２ペプチドでは高濃度を前もって添加しておいてもその完全阻害は見受けられない。（Ａ）は固定化されたＴＰＲ２Ａに対してＨｓｐ９０のみあるいは、前もって種々の濃度（１．４μＭ、１４μＭ、１４０μＭ、２８０μＭ、７００μＭおよび１ｍＭ）のＴＰＲペプチドを混合させておいたものを添加した時のセンサーグラムであり、Ｈｓｐ９０のみを添加した時に比べて、ＴＰＲペプチドを濃度依存的に前もって混合しておいたものを添加すると濃度依存的にセンサーグラムが下降、つまり、結合が減少していること示す。（Ｂ）は、（Ａ）の実験を同様にＴＰＲ  ｓｃｒａｍｂｌｅペプチドを用いて行った時のセンサーグラムであり、高濃度のＴＰＲ  ｓｃｒａｍｂｌｅペプチドを前もって添加しておいてもセンサーグラムが下降しておらず、結合に変化がないことを示す。（Ｃ）は、（Ａ）の実験を同様にＴＰＲ  ｓｃｒａｍｂｌｅ（四角）、ＴＰＲ  ｍｕｔａｎｔ  １（三角）、ＴＰＲ  ｍｕｔａｎｔ  ２（×印）を用いて行い、それぞれのペプチド濃度に対する、ＴＰＲ２ＡとＨｓｐ９０との結合力の減少度合いを示したものである。図のように、１０００μＭの濃度では、ＴＰＲペプチド（菱形）以外は、高濃度のペプチドを添加してもＴＰＲ２ＡとＨｓｐ９０の相互作用を完全阻害できないことがわかる。
【図８Ａ】図８Ａは、細胞透過性ペプチドにおいて各アミノ酸をそれぞれ、図に示すアミノ酸配列に変異させて得られた活性相関図である。Ａｎｔｐ−ＴＰＲ変異体ペプチドによる細胞障害活性を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡｎｔｐ−ＴＰＲの局所投与による固形がんに対する効果を示す。膵臓がん細胞Ｂｘｐｃ３移植後、ＰＢＳ投与群（黒丸）とＡｎｔｐ−ＴＰＲ（５ｍｇ／ｋｇ）を局所投与した群（三角）（いずれもＮ＝３で行った。）とを比較した。横軸は、移植後の日数を示し、矢印は投与した日を示す。縦軸は、腫瘍容積（ｍｍ３）を示す。Ａｎｔｐ−ＴＰＲペプチド投与群で明らかに抗がん作用が見受けられる。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡｎｔｐ−ＴＰＲの静脈内投与による固形がんに対する効果を示す。膵臓がん細胞Ｂｘｐｃ３移植後、ＰＢＳ投与群（黒丸）とＡｎｔｐ−ＴＰＲ（１ｍｇ／ｋｇ（三角）または５ｍｇ／ｋｇ（四角））を静脈内投与した群（いずれもＮ＝６で行った。）を比較した。横軸は、移植後の日数を示し、矢印は投与した日を示す。縦軸は、腫瘍容積（ｍｍ３）を示す。実験は２連で行い、データは平均±ＳＤとして表す。Ａｎｔｐ−ＴＰＲペプチド投与群で明らかに抗がん作用が見受けられる。
【図９】図９は、ＦＡＣＳを用いたハイブリッドＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチドによるがん細胞殺傷効果の検討を示す。がん細胞Ｔ４７Ｄおよび正常細胞のＨＥＫ２９３Ｔをそれぞれの培地で６−ウェルディッシュ（ＮｕｎｃＴＭ）で２４時間培養した後、６８μＭのＡｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドを添加してさらに２４時間培養した。培養後、それぞれの細胞懸濁液に対して、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色（Ａ〜Ｆ）、アネキシンＶ標識（Ａ〜Ｄ）（いずれもＷａｋｏより入手）、あるいは、カスパーゼ３，７標識（Ｅ、Ｆ）（ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより入手）を行いマルチパラメトリックフローサイトメトリーによって、アネキシンＶ標識またはカスパーゼ３，７活性およびＰＩ染色について、同時に解析した結果を示す。各四半分パネルの細胞の百分率を示す。Ａは正常細胞ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にペプチドを添加していない場合である。Ｂは正常細胞ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチド６８μＭを添加した場合である。ＣおよびＥは乳がん細胞Ｔ４７Ｄにペプチドを添加していない場合である。ＤおよびＦは乳がん細胞Ｔ４７ＤにＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチド６８μＭを添加した場合である。正常細胞ＨＥＫ２９３ＴにＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチドを加えても影響を与えないが、がん細胞Ｔ４７Ｄにペプチドを加えた場合、アネキシンＶ陽性またはカスパーゼ３，７陽性の細胞集団の増加が見受けられる。このことから、加えられたペプチドがアポトーシス性の機構によりがん細胞の死を特異的に誘導していることが示唆された。
【図１０】図１０は、トランスフェクション実験の結果を示す。Ｎｏｎｅは何も処理していない場合（この値を１００％とセットした。）、Ｌｉｐｏｓｏｍｅは、トランスフェクション試薬のみを導入した場合、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ＋ＴＰＲ６８ｕＭは、ＴＰＲペプチドをトランスフェクション試薬で導入した場合、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ＋ＴＰＲ  ｓｃｒａｍｂｌｅ  ６８μＭは、ＴＰＲ  ｓｃｒａｍｂｌｅペプチドをトランスフェクション試薬で導入した場合である。矢印の部分、つまりＴＰＲペプチドを導入した場合のみ、殺傷効果が見受けられた。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬でＴＰＲペプチドのみをがん細胞Ｃａｋｉ−１に導入した場合、ＴＰＲペプチドのみ殺傷効果が見受けられた。
【図１１】図１１は、２種のＨｓｐ９０阻害剤と本発明のＡｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドによる細胞傷害活性を示す。（Ａ）〜（Ｃ）：Ｈｓｐ９０阻害剤であるゲルダナマイシン（Ａ）、１７−ＡＡＧ（Ｂ）、Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチド（Ｃ）による白血病細胞株（Ｕ９３７、Ｋ５６２、ＴＨＰ−１、ＨＬ−６０）に対する殺細胞効果を示すグラフである。（Ｄ）：固形がん細胞株（ＢＴ２０、ＯＥ１９、ＭＣＦ−７）に対するＡｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドの殺細胞効果のグラフである。
【図１２】図１２は、白血病細胞株に関するウェスタンブロッティングの結果を示す。左から、Ｕ９３７細胞、Ｋ５６２細胞、ＴＨＰ−１細胞、ＨＬ−６０細胞の各々に対する、（上から）Ｈｓｐ９０、サービビン、βアクチン（コントロール)の発現量を確認した。
【図１３Ａ】図１３は、Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドの急性骨髄性白血病細胞株Ｕ９３７を用いた透過実験の結果を示す。（Ａ）：ＴＡＭＲＡ標識されたＡｎｔｐ−ＴＰＲは細胞内に透過することが確認されたが、ＴＰＲペプチドでは、細胞内に透過されていないことが確認された。図の矢印は、それぞれペプチドが透過した細胞を示す。
【図１３Ｂ】図１３は、Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドの急性骨髄性白血病細胞株Ｕ９３７を用いた透過実験の結果を示す。（Ｂ）：Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドが細胞内に透過した後も、カルセイン（緑色）の流入が見受けられないことから、細胞膜を破壊することなく透過していることも判明した。さらに、ペプチドが透過しても膜は破壊されていない。図の矢印は、それぞれペプチドが透過した細胞を示す。
【図１４】図１４は、Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドによる白血病細胞株Ｕ９３７におけるがん細胞殺傷効果の検討結果を示す。（Ａ）：Ｕ９３７細胞を５０μＭのＡｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドとともに一晩３７℃でインキュベートし、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を行い、アネキシンＶ標識およびＰＩ染色についてマルチパラメトリックフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。Ａｎｔｐ−ＴＰＲ処理を行ったものについて、グラフ中右上の四半分パネルに見られるようなアネキシンＶ陽性の細胞の増加が観察された。（Ｂ）：（Ａ）と同様にキメラペプチドで処理したＵ９３７細胞をＪＣ−１で１５分間処理し、緑色および赤色の蛍光についてマルチパラメトリックフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。Ａｎｔｐ−ＴＰＲ処理を行ったものについて、グラフ中右下の四半分パネルに見られるようなミトコンドリア膜電位変化が観察された。（Ｃ）：（Ａ）と同様にキメラペプチドで処理したＵ９３７細胞に対して、カルボキシフルオレセインＦＬＩＣＡカスパーゼ３，７アッセイを用いて、カスパーゼ活性およびＰＩ染色についてマルチパラメトリックフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。Ａｎｔｐ−ＴＰＲ処理を行ったものについて、グラフ中右上の四半分パネルに見られるようなカスパーゼ3 & 7の活性細胞の増加が観察された。
【図１５】図１５は、Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドによるＨｓｐ９０クライアントタンパク質の消失を示す。Ｕ９３７細胞をＡｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドとともに、一晩３７℃でインキュベートし、その後、細胞抽出液に対して、それぞれ示されるタンパク質に対する抗体でウェスタンブロッティングを行ったところ、Ａｎｔｐ−ＴＰＲ（＋）では、Ａｎｔｐ−ＴＰＲ（−）よりも各タンパク質の発現量が減少しており、Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドが、白血病細胞株Ｕ９３７に対して、Ｈｓｐ９０のクライアントタンパク質のフォールディングに影響を与えていることが予想され、そしてその結果、各タンパク質の減退が起こっていることが分かった。なお、図中の「α−」は、ウェスタンブロッティングを行った際の抗体を意味する。
【図１６】図１６は、Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドの各アミノ酸の変異によるＵ９３７細胞株に対する、殺細胞効果の影響を示す。示されるアミノ酸変異を導入したキメラペプチドの各々について、Ｕ９３７に対する殺細胞効果を調べた結果が示される。各アミノ酸の変異導入部分の結果から、それぞれの位置に保存的アミノ酸の変異を導入しても、なお、殺細胞能力を有していることが分かった。
【図１７】図１７は、種間での殺細胞効果の検討結果を示す。（Ａ）マウスの末梢血から採取した正常リンパ球を含む末梢血単核白血球細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣｓ）、ヒト正常Ｂ細胞、マウス白血病細胞株ＥＬ４に対する、Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドの殺細胞効果を示す。Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドは、マウスＰＢＭＣｓまたはヒト正常Ｂ細胞に対しては殺細胞効果を示さないこと、さらに、マウスの白血病細胞株に対しても殺細胞効果を有することが分かった。（Ｂ）ヒト、マウス、ラット、ウシ間のＨｓｐ９０のＣ末端側アミノ酸配列、ならびに、ＨＯＰ中のＴＰＲ２Ａドメインのアミノ酸配列比較を示す。Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドが抗がん作用を示すのに重要な部分の配列（Ｈｓｐ９０のＣ末端配列ＭＥＥＶＤ（配列番号６４）およびＨＯＰ中のＴＰＲ２Ａドメイン配列ＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号４））が、ヒト、マウス、ラット、ウシの種間で完全に保存されている。
【図１８】図１８は、Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドのマウス白血病細胞株ＥＬ４およびＰＢＭＣｓに対する透過実験の結果を示す。マウスの細胞株にもＡｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドが透過されており、また、透過しても正常細胞ＰＢＭＣｓには殺細胞効果を示さず、マウス白血病細胞株には殺細胞効果を示している様子が観察された。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
以下、本発明に関して、発明の実施の形態を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００５７】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００５８】
本明細書において「Ｈｓｐ９０」とは、熱ショックタンパク質のひとつであり、真核細胞の中でもっとも多量に存在している分子量が約９万（９０ｋＤａ）の分子シャペロンである。その構造は、ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＭ＿００１０１７９６３（ヒト）またはＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ３３２０に記載される配列に代表され、これらのホモログもＨｓｐの代表例の機能を保持する限り包含される。
【００５９】
ヒトＨｓｐ９０は、ヒトＨｓｐ９０遺伝子配列ｃＤＮＡクローン（ＡＢ１１４４＿Ｈ１０，ＯＲＩＧＥＮＥＴＥＣＮＯＬＯＧＩＥＳ，ＩＮＣ．，ＲＯＣＫＶＩＬＬＥ，ＭＤ）を、ＧＡＴＥＷＡＹシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）により、ヒスチジンタグのついた大腸菌用発現ベクターを構築し、作成した発現ベクター（ｐＤＥＳＴ１７−Ｈｓｐ９０）を大腸菌ＢＬ２１株に形質転換し、Ｈｓｐ９０の発現を確認後、ニッケルカラム（Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ：Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、現ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、Ｈｓｐ９０を精製することができる。
【００６０】
Ｈｓｐ９０は多数の細胞内タンパク質と相互作用してその正確なフォールディングおよび機能を保証する役割を有する。Ｈｓｐ９０と相互作用するタンパク質としては、たとえば、プロテインキナーゼ、ステロイドホルモン受容体等の細胞増殖または分化に重要な役割を果たすシグナル伝達分子が多数挙げられる。細胞がストレスを受けた時に発現量が増加する。しかし、細胞のストレス状況下だけでなく、通常時も細胞質に多く存在していることから、Ｈｓｐ９０を破壊すると正常な機能まで失われる。
【００６１】
本明細書において「Ｈｓｐ９０  ＴＰＲ（テトラトリコペプチド反復；ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｐｅａｔ）ドメイン」とは、ＨｏｐがＨｓｐ９０に結合するのに重要な役割を果たすドメインであり、代表的には、その構造は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＭＮ＿００６８１９およびＧｅｎｅ  ＩＤ  １０９６３に代表される。
【００６２】
代表的な例は、ＡＬＫＥＫＥＬＧＮＤＡＹＫＫＫＤＦＤＴＡＬＫＨＹＤＫＡＫＥＬＤＰＴＮＭＴＹＩＴＮＱＡＡＶＹＦＥＫＧＤＹＮＫＣＲＥＬＣＥＫＡＩＥＶＧＲＥＮＲＥＤＹＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＫＹＫＤＡＩＨＦＹＮＫＳＬＡＥＨＲＴＰＤＶＬＫＫＣＱＱＡＥＫＩＬＫＥＱＥＲＬＡ（配列番号４１）またはそのアナログ配列を挙げることができる。アナログを設計するにおいて、たとえば、ＴＰＲ２ＡドメインとＨｓｐ９０のＣ末端ペプチドとの複合体構造の立体構造（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＥＬＲ）を解明することによって、重要なペプチドを設計することができる。本発明者らは、Ｈｓｐ９０は単独で機能を担うのではなく、パートナータンパク質の一つであるＨｏｐが結合することで、サービビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）などのタンパク質の折りたたみを補助するシャペロン機能を発揮することができることも見出している。
【００６３】
本明細書において「Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチド」とは、Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメインに結合することができるペプチドであり、本発明において、ＴＰＲペプチドのみでは、細胞殺傷効果がまったく観察されなかったことから、Ａｎｔｐ−ＴＰＲペプチド自体が細胞内に入ると考えられる。
【００６４】
代表的なＨｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドとしては、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号１）を有するものであって、ここで
Ｘ１は、Ｋまたはそれに類似する同じ親水性アミノ酸のＲ、Ａなどのアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ａまたはそれに類似する脂肪族系側鎖のＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉなどのアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｙまたはそれに類似する疎水性アミノ酸Ｌなどのアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ａまたはそれに類似する脂肪族系側鎖のＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉなどのアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｒまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｉまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ｇまたはそれに類似する他のＴＰＲドメインで見受けられるＡなどのアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｎまたはそれに類似する他のＴＰＲドメインで見受けられるＱなどのアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｓまたはそれに類似するＯＨ基を有するＴ、Ｙなどのアミノ酸であり；
Ｘ１０は、Ｙまたはそれに類似するＯＨ基を有するＳ、Ｔなどのアミノ酸であり；
Ｘ１１は、Ｆまたはそれに類似する芳香族を有するＹなどのアミノ酸であり；
Ｘ１２は、Ｋまたはそれに類似する塩基性のＲなどのアミノ酸であり、Ｘ１〜Ｘ１２は任意の組み合わせ有効でありうることが理解される。
【００６５】
ここで、「他のＴＰＲドメインで見受けられるアミノ酸配列」とは以下のようなものを指すがこれに限定されない：ＫＡＬＦＲＲＡＫＡＨＥＫ（ｈｕｍａｎ  Ｔｏｍ  ７０；配列番号４６）、ＫＡＦＹＲＲＡＱＡＨＡＫ（Ｔｏｍ  ３４；配列番号４７）、ＫＧＬＦＲＲＧＥＡＨＬＡ（ＦＫＢＰ５２；配列番号４８）、ＫＡＬＹＲＲＡＱＧＷＱＧ（ＣＹＰ４０；配列番号４９）等。
【００６６】
１つの実施形態では、上記アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号１）を有するものであって、ここで
Ｘ１は、Ｋ、ＲまたはＡであり、好ましくはＫであり；
Ｘ２は、ＡまたはＧであり；
Ｘ３は、ＹまたはＬであり、好ましくはＹであり；
Ｘ４は、ＡまたはＧであり；
Ｘ５は、Ｒ、ＡまたはＫであり、好ましくはＲであり；
Ｘ６は、Ｉ、ＡまたはＲであり、好ましくはＩまたはＡであり；
Ｘ７は、ＧまたはＡであり；
Ｘ８は、ＮまたはＱであり；
Ｘ９は、ＳまたはＹであり；
Ｘ１０は、ＹまたはＳであり；
Ｘ１１は、ＦまたはＹであり；
Ｘ１２は、ＫまたはＲであるか、あるいは
ＴＰＲペプチドを延長させて得られる
ＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＫＹＫ（配列番号４３）であり、Ｘ１〜Ｘ１２は任意の組み合わせ有効でありうることが理解される。
【００６７】
好ましくは、上記アミノ酸配列において、
Ｘ２は、Ｇであり；
Ｘ４は、Ｇであり；
Ｘ７は、Ａであり；
Ｘ４は、Ｑであり；
Ｘ９は、Ｙであり；
Ｘ１０は、Ｓであり；
Ｘ１１は、Ｙであり；
Ｘ１２は、Ｒである、
ものを含み、これらの好ましい置換は任意の組み合わせが有効でありうることが理解される。本発明において、これらの置換によって、効果の維持または増強が見出されたからである。
【００６８】
より好ましくは、上記アミノ酸配列において、
Ｘ４は、Ｇであり；
Ｘ９は、Ｙであり；
Ｘ１１は、Ｙである、
ものを含み、これらの好ましい置換は任意の組み合わせが有効でありうることが理解される。これらの置換によって、効果の増強が見出されたからである。
【００６９】
なお、これらの変異は一つ導入されても複数導入されてもよいことが理解される。
【００７０】
あるいはその延長産物である「Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  ｓｌｏｎｇ」すなわちＡｎｔｐ−ＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＫＹＫ」（配列番号３９）を挙げることができる。延長しても、効果の減少がなかったことから、本発明はそのアミノ酸の長さにかかわりなく、使用することができ、当業者は、本明細書の記載をもとに種々の配列および長さを調製することができることが理解される。
【００７１】
しかし、「Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチド」は、Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメインと結合しうる能力を有する限りこれらの配列でなくても本発明において使用されうることが理解される。代表的なＨｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドとしては、アミノ酸配列ＫＡＹＡＲを有するペプチド、アミノ酸配列ＫＡＹＡＲＸａＸｂＸｃＸｄＺ１Ｚ２Ｚ３（配列番号２。ここで、Ｚ１Ｚ２Ｚ３は、（Ｙ／Ｈ）（Ｆ／Ｅ／Ｍ／Ｌ／Ｓ）（Ｋ／Ａ／Ｌ／Ｑ／Ｓ）でありうる）を有するものであって、ここで、Ｘａ、Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄは独立して任意のアミノ酸であり、Ｚ１Ｚ２Ｚ３はヘリックスを形成、維持するのに重要なアミノ酸であるもの、ＫＡＹＡＲ（配列番号３）自体またはＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号４）自体、などを挙げることができる。
【００７２】
本明細書において実証されたことに基づけば、ＴＰＲ（１２アミノ酸）領域の変異に関して、以下のことが理解される。
【００７３】
野生型より効果の増加が見受けられるもの（以下の記号は、元のアミノ酸の一文字記号、アミノ酸の位置番号、変異後のアミノ酸の一文字記号をいう。）：Ａ２Ｇ，Ａ４Ｇ，Ｉ６Ａ，Ｎ８Ｑ，Ｓ９Ｙ，Ｆ１１Ｙ
野生型に比べてほぼ同程度といえるもの：Ｇ７Ａ，Ｙ１０Ｓ，Ｋ１２Ｒ
野生型に比べて効果はあるが減少するものである：Ｋ１Ａ，Ｋ１Ｒ，Ｙ３Ｌ，Ｒ５Ｋ，Ｒ５Ａ，Ｉ６Ｒ。
【００７４】
本明細書において「細胞透過性ペプチド」とは、細胞の膜を通過して、細胞内部に侵入しうるペプチドをいう。あるペプチドが「細胞透過性ペプチド」であるかどうかは、以下の試験によって評価することができる。
【００７５】
本明細書において、Ａｎｔｐに関しては、公知の方法（Ｄｅｒｏｓｓｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１，１８１８８−１８１９３．）でビオチン化したＡｎｔｐペプチドを細胞に添加してその後、ストレプトアビジン化学標識化合物を添加し、蛍光顕微鏡で細胞内局在を確認することができる。
【００７６】
あるいは、ストレプトアビジン結合抗体で反応後同様に化学標識された抗体を蛍光顕微鏡で同様に局在を確認することで細胞内に進入していることを確認することができる。
【００７７】
細胞透過性ペプチドとしては、たとえば、アンテナペディアホメオボックス配列（Ａｎｔｐ）であるＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５）、ＴＡＴであるＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）（配列番号６）、またはＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号７）またはその改変体などを挙げることができる。代表的には、その構造は、たとえば、Ｇｅｎｅ  ＩＤ  １５５８７１（ＴＡＴタンパク質自体）を挙げることができる。本発明では、Ｒ１１でもＴＡＴでも細胞殺傷効果を実証することができたことから、ＴＰＲの前に結合される細胞透過性ペプチドとしては、任意のものが使用されることが理解される。
【００７８】
代表的な細胞透過性ペプチドは、以下の構造を有している。
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５）またはその改変配列であって、該改変配列は、アミノ酸配列Ｙ１Ｙ２Ｙ３Ｙ４Ｙ５Ｙ６Ｙ７Ｙ８Ｙ９Ｙ１０Ｙ１１Ｙ１２Ｙ１３Ｙ１４Ｙ１５Ｙ１６（配列番号８）を有するものであって、ここで
Ｙ１は、Ｒまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｋなどのアミノ酸であり；
Ｙ２は、Ｑまたはそれに類似するアミド系のＮ、Ｇｌｘ（本明細書において「Ｇｌｘ」とは、ＧｌｎおよびＧｌｕを包含して称する。）としてＥなどのアミノ酸であり；
Ｙ３は、Ｉまたはそれに類似する脂肪族系のＬなどのアミノ酸であり；
Ｙ４は、Ｋまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｒなどのアミノ酸であり；
Ｙ５は、Ｉまたはそれに類似する脂肪族系のＬなどのアミノ酸であり；
Ｙ６は、Ｗまたはそれに類似する芳香族を有するＹなどのアミノ酸であり；
Ｙ７は、Ｆまたはそれに類似する芳香族を有するＹなどのアミノ酸であり；
Ｙ８は、Ｑまたはそれに類似するアミド系のＮ、ＧｌｘとしてＥなどのアミノ酸であり；
Ｙ９は、Ｎまたはそれに類似するアミド系のＱなどのアミノ酸であり；
Ｙ１０は、Ｒまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｋなどのアミノ酸であり；
Ｙ１１は、Ｒまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｋなどのアミノ酸であり；
Ｙ１２は、Ｍまたはそれに類似するＳ含有アミノ酸のＣなどのアミノ酸であり；
Ｙ１３は、Ｋまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｒなどのアミノ酸であり；
Ｙ１４は、Ｗまたはそれに類似する芳香族を有するＹなどのアミノ酸であり；
Ｙ１５は、Ｋまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｒなどのアミノ酸であり；
Ｙ１６は、Ｋまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｒなどのアミノ酸である、
ものを有するものであり、Ｙ１〜Ｙ１６は任意の組み合わせ有効でありうることが理解される。
【００７９】
ここで、他の配列において、上記置換の参考となる配列としては保存的置換なども挙げることができる。
【００８０】
好ましい実施形態では、上記アミノ酸配列において、Ｙ１は、ＲまたはＫであり；
Ｙ２は、ＱまたはＮであり；
Ｙ３は、ＩまたはＬであり；
Ｙ４は、ＫまたはＲであり；
Ｙ５は、ＩまたはＬであり；
Ｙ６は、ＷまたはＹであり；
Ｙ７は、ＦまたはＹであり；
Ｙ８は、ＱまたはＮであり；
Ｙ９は、ＮまたはＱであり；
Ｙ１０は、ＲまたはＫであり；
Ｙ１１は、ＲまたはＫであり；
Ｙ１２は、ＭまたはＣであり；
Ｙ１３は、ＫまたはＲであり；
Ｙ１４は、ＷまたはＹであり；
Ｙ１５は、ＫまたはＲであり；
Ｙ１６は、ＫまたはＲである、
配列を有するものであり、Ｙ１〜Ｙ１６は任意の組み合わせ有効でありうることが理解される。
【００８１】
好ましい実施形態では、本発明における、細胞透過性ペプチドは、上記アミノ酸配列において、Ｙ２は、Ｎであり；
Ｙ４は、Ｒであり；
Ｙ８は、Ｎであり；
Ｙ９は、Ｑであり；
Ｙ１０は、Ｋであり；
Ｙ１１は、Ｋであり；
Ｙ１２は、Ｃであり；
Ｙ１３は、Ｒであり；
Ｙ１４は、Ｙであり；
Ｙ１５は、Ｒであり；および／または
Ｙ１６は、Ｒである、
配列を有するものを含み、これらの好ましい置換は任意の組み合わせ有効でありうることが理解される。これらの置換によって、効果の維持または増強が見出されたからである。
【００８２】
さらに好ましい実施形態では、本発明における、細胞透過性ペプチドは、上記アミノ酸配列において、Ｙ４は、Ｒであり；
Ｙ９は、Ｑであり；
Ｙ１２は、Ｃであり；あるいは
Ｙ１６は、Ｒである、
配列を有するものを含み、これらの好ましい置換は任意の組み合わせ有効でありうることが理解される。これらの置換によって、効果の増強が見出されたからである。
【００８３】
本明細書では、Ａｎｔｐ（細胞透過ペプチド部位）領域の変異に関して、以下のようなことが理解される。
【００８４】
野生型より効果の増加が見受けられるもの（表記は、ＴＲＰと同じである。）：Ｋ４Ｒ，Ｎ９Ｑ，Ｍ１２Ｃ，Ｋ１６Ｒ
野生型に比べほぼ同程度のもの：Ｑ２Ｎ，Ｑ８Ｎ，Ｒ１０Ｋ，Ｒ１１Ｋ，Ｋ１３Ｒ，Ｗ１４Ｙ，Ｋ１５Ｒ
野生型に比べて効果は保持されるが減少するもの：Ｒ１Ｋ，Ｉ３Ｌ，Ｉ５Ｌ，Ｗ６Ｙ，Ｆ７Ｙ。
【００８５】
なお、これらの変異は一つ導入されても複数導入されてもよいことが理解される。理論に束縛されることを望まないが、ある変異が許容されることが理解されると、もとの活性型の立体構造および対象となる生物学的標的との相互作用などでの活性が保持または増強されることが理解されることから、これらを複数組み合わせても、同様の効果を有すると期待されるからである。ところで、ＴＰＲドメイン内の配列は、相同性が高いが、厳格にパートナータンパク質（Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０等）との組み合わせを認識していることは、すでに判明している。本発明の場合、一アミノ酸置換で活性が変化したものに関しては、そのパートナータンパク質との相互作用に影響を与えたことが予測されるが、本件の最終目的である、抗がん活性という観点からは、保持していることからこれらアミノ酸の置換を組み合わせても同様の効果が得られると期待できる。これは、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０がともにがん細胞内でその増殖、生育に重要な役割を果たしているからである。
【００８６】
好ましくは、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号９）の配列を有するものが使用される。あるいは、ＴＡＴという名称で呼ばれるＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号６）も使用されうる。Ｒを１１つなげた、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号７）という配列が細胞透過することが知られており、これも使用することができる。また、当業者は、適宜、好ましい細胞透過性ペプチドとＴＰＲドメイン結合ペプチドとの組み合わせを決定することができる。好ましくは、Ａｎｔｐとの組み合わせの方を使用することができる。
【００８７】
本明細書において「ヘリックスを形成、維持するのに重要なアミノ酸」とは、ヘリックスを形成、維持するのに重要な働きを担う任意のアミノ酸配列を言う。代表的には、ＴＰＲドメインについては、（Ｙ／Ｈ）（Ｆ／Ｅ／Ｍ／Ｌ／Ｓ）（Ｋ／Ａ／Ｌ／Ｑ／Ｓ）を挙げることができるがこれに限定されない。
【００８８】
本明細書において「キメラペプチド」とは、二つ以上の異なった遺伝子型の部分（ペプチド）から作られた１個のペプチドをいう。融合タンパク質ともいう。タンパク質のドメインの機能を吟味したり，目的とする蛋白質の発現を検出するために用いられる。
【００８９】
本明細書において「類似するアミノ酸」とは、代表的には、保存的置換の関係にあるアミノ酸を含み、以下のアミノ酸が該当する。
Ａ：Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｌ
Ｃ：Ｍ（含Ｓアミノ酸）
Ｄ：Ｎ、ＱまたはＥ
Ｅ：Ｎ、ＱまたはＤ
Ｆ：Ｙ、Ｓ、Ａなど
Ｇ：Ａ
Ｈ：Ｗなど
Ｉ：Ａ、Ｌ、Ｖ、（Ｇ）
Ｋ：Ｒ
Ｌ：Ａ、Ｉ、Ｖ、（Ｇ）
Ｍ：Ｓなど
Ｎ：Ｅ、ＤまたはＱ
Ｐ：ＨｙＰ
Ｑ：Ｎ、ＥまたはＤ
Ｒ：Ｋ
Ｓ：Ｔ、Ｙ
Ｔ：Ｓ、Ｙ
Ｖ：Ｉ、Ｌ、Ａ、（Ｇ）
Ｗ：Ｈ
Ｙ：Ｆ、Ｓ、Ｔ。
【００９０】
これらのアミノ酸の間の置換は、本明細書において「保存的置換」ともいう。
【００９１】
なお、「類似するアミノ酸」としては、類似の機能を有する他の配列において頻繁に見出されるものを用いてもよい。置換可能なことが実物を持って実証されているからである。また、具体的には、類似するアミノ酸は、本明細書において他の場所において記載されているものを採用してもよい。具体的に記載されている類似するアミノ酸は、特定の例において、効果が保持されうることが実証されたかあるいはその実証例から理解されうる範囲であるからである。
【００９２】
本明細書においてＴＰＲペプチドに頻繁に見出される「アミノ酸」は、種々のＴＰＲペプチドにおいて頻度が高く見出されるものをいい、代表的には、保存的置換の関係にあるアミノ酸が含まれ、以下のアミノ酸が該当する。
アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号１）を有するものであって、ここで
Ｘ１は、Ｋまたはそれに類似する同じ親水性アミノ酸のＲ、Ａなどのアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ａまたはそれに類似する脂肪族系側鎖のＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉなどのアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｙまたはそれに類似する疎水性アミノ酸Ｌなどのアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ａまたはそれに類似する脂肪族系側鎖のＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉなどのアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｒまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｉまたはそれに類似するアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ｇまたはそれに類似する他のＴＰＲドメインで見受けられるＡなどのアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｎまたはそれに類似する他のＴＰＲドメインで見受けられるＱなどのアミノ酸）であり；
Ｘ９は、Ｓまたはそれに類似するＯＨ基を有するＴ、Ｙなどのアミノ酸であり；
Ｘ１０は、Ｙまたはそれに類似するＯＨ基を有するＳ、Ｔなどのアミノ酸であり；
Ｘ１１は、Ｆまたはそれに類似する芳香族を有するＹなどのアミノ酸であり；
Ｘ１２は、Ｋまたはそれに類似する塩基性のＲなどのアミノ酸である。
【００９３】
本明細書において細胞透過性ペプチドに頻繁に見出されるアミノ酸の具体的な配列は、種々の細胞透過性ペプチドにおいて頻度が高く見出されるものをいい、代表的には、保存的置換の関係にあるアミノ酸が含まれ、以下のアミノ酸が該当する。
【００９４】
すなわち、そのような配列としては、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５）またはその改変配列であって、該改変配列は、アミノ酸配列Ｙ１Ｙ２Ｙ３Ｙ４Ｙ５Ｙ６Ｙ７Ｙ８Ｙ９Ｙ１０Ｙ１１Ｙ１２Ｙ１３Ｙ１４Ｙ１５Ｙ１６（配列番号８）を有するものであって、ここで
Ｙ１は、Ｒまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｋなどのアミノ酸であり；
Ｙ２は、Ｑまたはそれに類似するアミド系のＮ、ＧｌｘとしてＥなどのアミノ酸であり；
Ｙ３は、Ｉまたはそれに類似する脂肪族系のＬなどのアミノ酸であり；
Ｙ４は、Ｋまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｒなどのアミノ酸であり；
Ｙ５は、Ｉまたはそれに類似する脂肪族系のＬなどのアミノ酸であり；
Ｙ６は、Ｗまたはそれに類似する芳香族を有するＹなどのアミノ酸であり；
Ｙ７は、Ｆまたはそれに類似する芳香族を有するＹなどのアミノ酸であり；
Ｙ８は、Ｑまたはそれに類似するアミド系のＮ、ＧｌｘとしてＥなどのアミノ酸であり；
Ｙ９は、Ｎまたはそれに類似するアミド系のＱなどのアミノ酸であり；
Ｙ１０は、Ｒまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｋなどのアミノ酸であり；
Ｙ１１は、Ｒまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｋなどのアミノ酸であり；
Ｙ１２は、Ｍまたはそれに類似するＳ含有アミノ酸のＣなどのアミノ酸であり；
Ｙ１３は、Ｋまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｒなどのアミノ酸であり；
Ｙ１４は、Ｗまたはそれに類似する芳香族を有するＹなどのアミノ酸であり；
Ｙ１５は、Ｋまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｒなどのアミノ酸であり；
Ｙ１６は、Ｋまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｒなどのアミノ酸である、
を有するものであり得る。
【００９５】
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
【００９６】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００９７】
本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。あるいは、対立遺伝子変異体もこの範囲内に入る。
【００９８】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００９９】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでも目的とする機能が保持される限りいずれでもよい。
【０１００】
本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子（たとえば、Ｈｓｐ９０など）には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
【０１０１】
本明細書において、特定の遺伝子配列にハイブリダイズする核酸配列も、機能を有する限り使用することができる。ここで、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して類似性または相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして類似性または相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐａｒｔ  Ｉ、第２章  「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出される。
【０１０２】
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ  Ｎａ＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。
【０１０３】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【０１０４】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【０１０５】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【０１０６】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【０１０７】
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、Ｈｓｐ９０）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヒトの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【０１０８】
本明細書において「断片」または「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
【０１０９】
本明細書において、「改変体」、「改変配列」または「アナログ」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。
【０１１０】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【０１１１】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【０１１２】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加および／または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加および／または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、目的とする機能（例えば、ＴＰＲドメインへの結合など）が保持される限り、この核酸分子の５’末端もしくは３’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在する。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ＴＰＲドメインへの結合など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、または１５０個以下、１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【０１１３】
（ペプチドの製法および分析）
本発明のペプチド（たとえば、キメラペプチド）は、当該分野で周知の方法（例えば、化学合成、以下に考察される一般的な工学技術）により得られ、または産生され得る。例えば、所望の領域もしくはドメインを含むペプチドの一部と一致するペプチドか、またはインビトロで所望の活性を媒介するペプチドは、ペプチド合成機の使用により合成され得る。ペプチドはまた、ペプチドの疎水性領域および親水性領域を同定するために使用され得る親水性分析（例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３８２４〜３８２８を参照のこと）により分析され得、従って実験操作（例えば、結合実験、抗体合成）のための物質の設計において助けとなる。二次構造分析はまた、特定の構造的モチーフを確立するペプチドの領域を同定するために行われ得る（例えば、ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３：２２２〜２２３を参照のこと）。操作、翻訳、二次構造の予想、親水性および疎水性プロファイル、オープンリーディングフレームの予想およびプロッティング、ならびに配列の相同性の決定は、当該分野で利用可能なコンピューターソフトプログラムを使用して達成され得る。構造分析の他の方法として、例えば、Ｘ線結晶解析（例えば、Ｅｎｇｓｔｒｏｍ、１９７４．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  １１：７〜１３を参照のこと））；質量分析およびガスクロマトグラフィー（例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ、１９９７．Ｊ．ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹを参照のこと）が挙げられ、そしてコンピュータモデリング（例えば、ＦｌｅｔｔｅｒｉｃｋおよびＺｏｌｌｅｒ、編、１９８６．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ：ＣＵＲＲＥＮＴ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照のこと）もまた使用され得る。
【０１１４】
本発明はさらにＬ型アミノ酸を有する本発明のペプチドをコードする核酸に関する。本発明のペプチドをコードする核酸の適切な供給源はヒトゲノム配列を含む。他の供給源としては、ラットゲノム配列が挙げられ、そしてタンパク質配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋから入手可能であり、これらはその全体が本明細書中で参考として援用される。ペプチドをコードする核酸は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、配列の３’−および５’−末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅により、および／またはｃＤＮＡもしくは所定の遺伝子配列に対して特異的なオリゴヌクレオチド配列を使用するゲノムライブラリーからのクローニングにより）により得られ得る。
【０１１５】
ペプチドの組換え体の発現のために、ペプチドをコードする核酸配列の全てまたは一部分を含む核酸が、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたペプチドコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクター）に挿入され得る。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、異種（すなわち、ネイティブ遺伝子プロモーターでない）である。あるいは、必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルはまた、遺伝子および／またはそれらの隣接する領域についてネイティブなプロモーターにより供給され得る。種々の宿主ベクター系は、ペプチドをコードする配列を発現するために利用され得る。これらは以下を含むが、限定ではない：（ｉ）ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどに感染した哺乳動物細胞系；（ｉｉ）バキュロウイルスなどに感染した昆虫細胞系；（ｉｉｉ）酵母ベクターを含む酵母または（ｉｖ）バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌。利用される宿主細胞系により、多数の適する転写エレメントおよび翻訳エレメントの任意の１つが使用され得る。
【０１１６】
発現ベクター中のプロモーター／エンハンサー配列は、本発明において提供される植物、動物、昆虫、または真菌の調節配列を利用し得る。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメントは、酵母および他の真菌（例えば、ＧＡＬ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター）から使用され得る。発現ベクターまたはそれらの誘導体としては、例えば、ヒトまたは動物ウイルス（例えば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス）；昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルス）；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、λファージ）；プラスミドベクターおよびコスミドベクターが挙げられる。
【０１１７】
宿主細胞株は、挿入された目的の配列の発現を調節するか、または所望される特定の手段において、この配列によりコードされる発現されたペプチドを改変するか、もしくは処理するか選択され得る。さらに、特定のプロモーター由来の発現は、選択された宿主細胞株における特定のインデューサーの存在下で増強され得る；従って、一般的に設計されたペプチドの発現の制御を容易にする。さらに、異なる宿主細胞は、翻訳プロセスおよび翻訳後のプロセスならびに発現されたペプチドの改変（例えば、グリコシル化、リン酸化など）に対する特定の特徴付けられたメカニズムを有する。従って、適切な細胞株または宿主系は、外来のペプチドの所望される改変およびプロセスが達成されたことを保証するために選択され得る。例えば、細菌系でのペプチド発現は、グリコシル化されていないコアペプチドを産生するために使用され得る；一方、哺乳動物細胞での発現は、異種のペプチドの「ネイディブ」グリコシル化を保証する。
【０１１８】
ペプチドの誘導体、フラグメント、ホモログ、アナログおよび変異体、ならびにこれらのペプチドをコードする核酸を含む。核酸に関しては、本明細書中で提供される誘導体、フラグメントおよびアナログが、少なくとも６個の（隣接する）核酸配列として規定され、そしてこれらは特異的なハイブリダイゼーションをさせるに十分な長さを有する。アミノ酸に関して、本明細書中で提供される誘導体、フラグメントおよびアナログは少なくとも４個の（隣接する）アミノ酸配列として規定され、エピトープに特異的な認識をさせるに十分な長さである。
【０１１９】
改変体の設計には、Ｓｃｈｅｕｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０１，１９９−２１０（２０００）の文献に記載された他のＴＰＲドメインの配列の情報に基づき、類似の細胞透過性ペプチドを設計することができる。そのような改変としては、保存的置換が挙げられるがこれに限定されない。
【０１２０】
また、細胞透過性ペプチドの改変についても、従来の知見を参考にして本明細書の記載に基づき改変することができる。たとえば、Ｄａｎｉｅｌｅ  Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２７１，Ｎｏ．３０，Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｊｕｌｙ  ２６，ｐｐ．１８１８８−１８１９３，１９９６は、Ａｎｔｐに関して、そのメカニズムおよび一部変異を加えた改変体に関する知見を提供する。これらには、細胞透過に重要な部位が記載されており、本発明の改変体、アナログを生産する際に参照することができ、この文献は、その全体を参考として本明細書中で援用する。
【０１２１】
他の文献としては、Ｇｅｎｅｖｉｅ  Aｖｅ  Ｄｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．２，５５６−５６１；Ｗｅｎｙｉ  Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎ  Ｏ．Ｓｍｉｔｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００５，４４，１０１１０−１０１１８；およびＩｓａｂｅｌｌｅ  Ｌｅ  Ｒｏｕｘ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．９０，ｐｐ．９１２０−９１２４，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９９３は、細胞貫通メカニズムおよび変異についての情報を提供しており、これらの文献もまた、本発明の改変体、アナログを生産する際に参照することができ、これらの文献は、その全体を参考として本明細書中で援用する。
【０１２２】
（医薬）
本発明の化合物または本発明の範囲内であるその製薬上許容される塩もしくは溶媒和は、そのまま単独で投与することも可能であるが、通常各種の医薬製剤として提供するのが好ましい。また、それら医薬製剤は、動物および人に使用される。
【０１２３】
本発明で使用されうる投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口または例えば、直腸内、口腔内、皮下、筋肉内、静脈内等の非経口をあげることができる。投与形態としては、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤等がある。経口投与に適当な、例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビット、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造できる。また、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。
【０１２４】
発明で使用されうる非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性製剤からなる。例えば、注射剤の場合、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。
【０１２５】
発明で使用されうる局所製剤は、活性化合物を１種もしくはそれ以上の媒質、例えば鉱油、石油、多価アルコール等または局所医薬製剤に使用される他の基剤中に溶解または懸濁させて調製する。発明で使用されうる腸内投与のための製剤は、通常の担体、例えばカカオ脂、水素化脂肪、水素化脂肪カルボン酸等を用いて調製し、座剤として提供される。
【０１２６】
本発明では、非経口剤においても、経口剤で例示したグリコール類、油類、フレーバー類、防腐剤（抗酸化剤を含む）、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤等から選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
【０１２７】
本発明の化合物またはその製薬上許容される塩もしくは溶媒和の有効用量および投与回数は、投与形態、患者の年令、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度等により異なるが、通常、投与量は、１日当たり０．０１〜１０００ｍｇ／人、好ましくは５〜５００ｍｇ／人であり、投与回数は、１日１回または分割して投与するのが好ましい。
【０１２８】
本発明はまた、本発明の医薬組成物を製造するシステム、装置、キットにも関する。そのようなシステム、装置、キットの構成要件は、当該分野において公知のものを利用することができ、当業者は適宜設計することができることが理解される。
【０１２９】
本発明はまた、本発明の化合物、その製薬上許容される塩もしくは溶媒和、またはそれらの水和物等プロドラッグを使用するシステム、装置、キットにも関する。そのようなシステム、装置、キットの構成要件は、当該分野において公知のものを利用することができ、当業者は適宜設計することができることが理解される。
【０１３０】
（ＤＤＳ）
本明細書において「送達剤」または「送達媒体」とは、目的の物質の送達を媒介する担体（ビヒクル）をいう。送達される物質が薬物であれば、「薬物送達媒体」という。薬物送達システム（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＤＤＳ）とは、ドラッグデリバリーシステムとも呼ばれ、吸収制御型ＤＤＳ、放出制御型ＤＤＳ、標的指向型ＤＤＳに分類することもある。理想的なＤＤＳは、薬物を「体内の必要な部位に」、「必要な量を」、「必要な時間だけ」送り込むシステムである。ターゲティングＤＤＳは、パッシブ・ターゲティングＤＤＳとアクティブ・ターゲティングＤＤＳとに分類される。前者はキャリア（薬物運搬体）の粒子径や親水性など物理化学的性質を利用して体内挙動を制御する方法である。後者はこれらに特殊な仕組みを付け加えて積極的に標的組織への指向性を制御しようとする方法であり、例えば、標的組織を構成する特定細胞の標的分子への特異的分子認識機能を有する抗体（たとえば、本発明のＴＰＲ結合ペプチド）などを結合したキャリアを利用する方法があり「ミサイルドラッグ」と呼ばれることもある。
【０１３１】
本明細書において「薬物送達媒体」とは、所望の薬物を送達するためのビヒクルをいう。
【０１３２】
本明細書において「目的物質」とは、特に、送達媒体により細胞内に送達されることが所望される物質をいう。
【０１３３】
本明細書において「リポソーム」とは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。代表的に使用されるリン脂質のほか、コレステロール、糖脂質などを組み込ませることも可能である。リポソームは内部に水を含んだ閉鎖小胞であるため、水溶性の薬剤などを小胞内に保持させることも可能である。したがって、このようなリポソームによって、細胞膜を通過しえない薬物または遺伝子などを細胞内に送達するのに使われる。また、生体適合性も良いのでＤＤＳ用のナノ粒子性キャリア材料としての期待が大きい。本発明において、リポソームは、修飾基を付するために、リンカーまたは架橋剤等を必要に応じて使用することによって、エステル結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、糖脂質、ガングリオシド、ホスファチジルグリセロールなど）またはペプチド結合を付与する官能基を有する構成単位（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）として、有させることができる。
【０１３４】
リポソームの調製は、当該分野において公知の任意の手法により製造することができる。例えば、その中でもコール酸透析法による方法が挙げられる。コール酸透析法では、ａ）脂質と界面活性剤の混合ミセルの調製、およびｂ）混合ミセルの透析により製造を実施する。次に本発明において使用される糖鎖リポソームにおいて好ましい実施形態では、リンカーとしてタンパク質を使用することが好ましく、タンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質のリポソームへのカップリングは、以下の２段階反応によって行うことができる。ａ）リポソーム膜上のガングリオシド部分の過ヨウ素酸酸化、およびｂ）還元的アミノ化反応による酸化リポソームへの糖タンパク質のカップリングである。このような手法によって望ましい糖鎖を含む糖タンパク質をリポソームに結合することができ、所望の糖鎖を有する多種多様な糖タンパク質・リポソームコンジュゲートを得ることができる。リポソームの純度や安定性を見るために粒子径サイズ分布を調べることが非常に重要である。その方法として、ゲル濾過クロマト法（ＧＰＣ）、走査型電顕（ＳＥＭ）、動的光散乱法（ＤＬＳ）などを使うことができる。
【０１３５】
本明細書において「リンカー」とは、表面結合分子（たとえば、Ｈｓｐ９０  ＴＲＰ結合ペプチド）とリポソーム表面との結合を介在する分子である。本発明において使用される糖鎖修飾リポソームにおいて、ペプチドはリンカーを介してリポソーム表面に結合してもよい。リンカーは、当業者が適宜選択することができるが、生体適合性であるものが好ましく、より好ましくは、薬学的に受容可能である。本明細書において「リンカータンパク質」とは、リンカー分子のうち、タンパク質、ペプチド、アミノ酸のポリマーをいう。
【０１３６】
本明細書において「リンカー（タンパク質）基」とは、リンカー（タンパク質）が別の基と結合したときに付される名称である。リンカー（タンパク質）基は場合に応じて一価または二価のものを指す。例えば、哺乳動物由来タンパク質基、ヒト由来タンパク質基、ヒト血清タンパク質基、血清アルブミン基が挙げられる。リンカー（タンパク質）基は「ヒト」由来が好ましい。ヒト投与において適合性が高いと考えられるからである。また、免疫原性がないタンパク質が好ましい。
【０１３７】
本明細書において「架橋基」とは、橋をかけるように，鎖式高分子の分子間で化学結合を形成させる基をいう。代表的には、脂質、タンパク質、ペプチド、糖鎖などの高分子と他の分子（例えば、脂質、タンパク質、ペプチド、糖鎖）との間に作用し、分子内または分子間で、共有結合のなかったところを結ぶ共有結合を形成させる基をいう。本明細書において架橋基は、架橋を目的とする標的によって変動し、例えば、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、カルボジイミド類、イミドエステル類など挙げることができるがそれらに限定されない。アミノ基含有物質を架橋する場合、アルデヒド含有基、例えば、グルタルアルデヒドを用いることができる。
【０１３８】
本明細書において「生体適合性」とは、毒性、免疫反応、損傷などを生じることなく生体組織または臓器と適合する性質をいう。生体適合性緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、トリス緩衝液、炭酸緩衝液（ＣＢＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノプロパンスルホン酸緩衝液（ＴＡＰＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシルエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、その他のグット緩衝液（例えば、２−モルホリノエタンスルホン酸，モノヒドレート（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン（Ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、コラミンクロリド、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、アミノアセトアミド（グリシンアミド）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）およびＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ））などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
以上のように、本発明は、Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドを含む、目的物質のがん細胞への送達剤を提供する。目的物質は、Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドと結合していても結合していなくてもよい。結合した場合は融合物質となり、ペプチドの場合はキメラペプチドと呼ばれる。本発明のキメラペプチドは、この実施形態であるということもできる。このような物質は、媒体（ビヒクル）によって複合剤を形成してもよい。このような媒体としては、リポソームを使用することができ、目的物質は、リポソームの外側にあっても内部に包含されていてもよい。
【０１４０】
リポソーム化したもの全体でＤＤＳという概念を証明するための実験の系の具体的なプロトコールは、以下のとおりである。
【０１４１】
ＴＰＲペプチドあるいは、ＴＰＲ  ｓｃｒａｍｂｌｅペプチドを市販のトランスフェクション試薬（たとえば、Ｐｒｏｆｅｃｔ−Ｐ２（ナカライテスク）あるいは、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＬＴＸ（インビトロジェン）など）と混合して（たとえば、２０分常温で静置して）リポソームを形成し、その後この複合体をがん細胞（たとえば、Ｃａｋｉ−１（腎臓がん））に添加、その後、細胞の生存率をＷＳＴ−８溶液（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ；ナカライテスク株式会社）を用いて測定しＴＰＲ  ｓｃｒａｍｂｌｅペプチド添加の場合と比較して確認することで本発明において設計されたＴＰＲペプチドが細胞に導入された場合、殺傷効果を示すかどうかを確認できる。
【０１４２】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１４３】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記実施形態にも下記実施例にも限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１４４】
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、この実施例等により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。以下に示した実施例において使用した試薬は、特に言及しない限り和光純薬、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ等から得ることができる。また、動物実験は、京都大学において規定される基準に基づき動物愛護の精神をもって行った。【０１４５】
（実施例１：Ｈｓｐ９０  ＴＲＰ結合ペプチド−Ａｎｔｐキメラペプチドの生産および生物活性の測定）
本発明のキメラペプチドが、固形がん細胞株において殺細胞効果、抗腫瘍効果を示すかどうかを検討した。【０１４６】
（材料および方法）
（細胞株）
ヒト乳がん細胞株（ＢＴ−２０およびＴ４７Ｄ）、肺がん細胞株（Ｈ３２２およびＨ４６０）、前立腺がん細胞株（ＬＮＣａｐ）、神経膠腫細胞株（Ｕ２５１）、腎臓がん細胞株（Ｃａｋｉ−１）および肺線維芽細胞の細胞株（ＭＲＣ−５）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。ヒト膵臓がん細胞株（ＢＸＰＣ−３）を、Ｅｕｒｏｐｉｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ；Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から購入した。ヒト胚性腎臓細胞株（ＨＥＫ２９３）を、ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（つくば市）から購入した。細胞は、１０％  ＦＢＳ（ＢｉｏＷｅｓｔ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）、１００μｇ／ｍｌ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（ナカライテスク株式会社、京都市）を含有する、ＲＰＭＩ  １６４０（ＢＴ−２０、Ｔ４７Ｄ、Ｈ３２２、Ｈ４６０、ＬＮＣａｐ、Ｕ２５１およびＢＸＰＣ−３）、ＭＥＭ（ＭＡＲＣ−５）またはＤ−ＭＥＭ（ＨＥＫ２９３、Ｃａｋｉ−１）中で培養した。【０１４７】
（ペプチド）
以下のペプチドをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから購入したか、あるいは、ペプチド合成機（たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：Ｍｏｄｅｌ  ４３３Ａ  ペプチドシンセサイザ）で合成した。
１．キメラペプチド：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  ｗｉｌｄ；配列番号９）
ここで、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５）は、本明細書においてＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（Ａｎｔｐ）と称することがある。【０１４８】
上記したキメラペプチドに加え、種々の改変ペプチドを作成した。【０１４９】
合成したペプチドは以下のとおりである。
２．キメラペプチド：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＫＡＹＡＲ（配列番号４２）
３．ペプチド：ＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＴＰＲペプチド；配列番号４）
４．キメラペプチド：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＫＡＹＡＡＡＧＮＳＹＴＦＫ（Ｍｕｔａｎｔ  １；配列番号４４）
５．キメラペプチド：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＫＡＹＡＲＩＧＮＳＧＧＧ（Ｍｕｔａｎｔ  ２；配列番号４５）
また、以下も合成した。
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＲＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｋ１Ｒ；配列番号１０）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＡＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｋ１Ａ；配列番号１１）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＧＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ａ２Ｇ；配列番号１２）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＬＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｙ３Ｌ；配列番号１３）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＧＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ａ４Ｇ；配列番号１４）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＫＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｒ５Ｋ；配列番号１５）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＲＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｉ６Ｒ；配列番号１６）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＡＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｇ７Ａ；配列番号１７）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＱＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｎ８Ｑ；配列番号１８）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＹＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｓ９Ｙ；配列番号１９）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＳＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｙ１０Ｓ；配列番号２０）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＹＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｆ１１Ｙ；配列番号２１）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＲ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｋ１２Ｒ；配列番号２２）。
また、細胞溶解性に関する変異のものも合成した。
ＫＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＲ１Ｋ−ＴＰＲ；配列番号２３）、
ＲＮＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＱ２Ｎ−ＴＰＲ；配列番号２４）、
ＲＱＬＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＩ３Ｌ−ＴＰＲ；配列番号２５）、
ＲＱＩＲＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＫ４Ｒ−ＴＰＲ；配列番号２６）、
ＲＱＩＫＬＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＩ５Ｌ−ＴＰＲ；配列番号２７）、
ＲＱＩＫＩＹＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＷ６Ｙ−ＴＰＲ；配列番号２８）、
ＲＱＩＫＩＷＹＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＦ７Ｙ−ＴＰＲ；配列番号２９）、
ＲＱＩＫＩＷＦＮＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＱ８Ｎ−ＴＰＲ；配列番号３０）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＱＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＮ９Ｑ−ＴＰＲ；配列番号３１）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＫＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＲ１０Ｋ−ＴＰＲ；配列番号３２）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＫＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＲ１１Ｋ−ＴＰＲ；配列番号３３）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＣＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＭ１２Ｃ−ＴＰＲ；配列番号３４）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＲＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＫ１３Ｒ−ＴＰＲ；配列番号３５）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＹＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＷ１４Ｙ−ＴＰＲ；配列番号３６）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＲＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＫ１５Ｒ−ＴＰＲ；配列番号３７）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＲＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＫ１６Ｒ−ＴＰＲ；配列番号３８）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  ｓｌｏｎｇ；配列番号３９）、
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ｒ１１−ＴＰＲ；配列番号４０）
これらのペプチドを、化学的に合成し、そして、高速液体クロマトグラフィーにより精製して、その後、水に溶解した。【０１５０】
（細胞生存性アッセイ）
１ウェルあたり合計３×１０３細胞を、９６ウェルプレートに播種し、１０％  ＦＢＳを含有する培地中で２４時間培養し、１００μｌにおいて漸増濃度のペプチドと共に、３７℃にて４８〜７２時間インキュベートした。細胞の生存率を、ＷＳＴ−８溶液（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ；ナカライテスク株式会社）を用いて測定した。【０１５１】
（フローサイトメトリーアッセイ）
Ａｎｔｐ−ＴＰＲペプチドががん細胞においてアポトーシスを誘導するかどうかを検討するために、アネキシンＶまたはカスパーゼ３，７およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の二重染色を用いて、フローサイトメトリーアッセイを行った。【０１５２】
（プロトコール）
がん細胞Ｔ４７Ｄおよび正常細胞のＨＥＫ２９３Ｔをそれぞれの培地で６−ｗｅｌｌディッシュ（ＮｕｎｃＴＭ）で２４時間培養した後、６８μＭのＡｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドを添加してさらに２４時間培養した。培養後、それぞれの細胞懸濁液に対して、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色、アネキシンＶ標識（いずれもＷａｋｏ）、あるいは、カスパーゼ３，７標識を行いマルチパラメトリックフローサイトメトリーによって、アネキシンＶ標識またはカスパーゼ３，７標識およびＰＩ染色について、同時に解析した。【０１５３】
（結果）
結果を図９に示す。正常細胞ＨＥＫ２９３ＴにＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチドを加えても影響を与えないが、がん細胞Ｔ４７Ｄにペプチドを加えた場合、アネキシンＶ陽性またはカスパーゼ３，７陽性の細胞集団の増加が観察された。【０１５４】
このことから、加えられたペプチドがアポトーシス性の機構によりがん細胞の死を特異的に誘導していることが示唆された。【０１５５】
すなわち、正常細胞ＨＥＫ２９３ＴにＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチドを加えても影響を与えないが、がん細胞Ｔ４７Ｄにペプチドを加えた場合アネキシンＶ陽性またはカスパーゼ３，７陽性の細胞数の増加が見受けられる。このことから、がん細胞Ｔ４７Ｄにおいてこのペプチドの添加により細胞が死滅するか、あるいは、死滅した細胞が、アポトーシスを起こしていることがわかる。いずれにしても、本発明のペプチドにより細胞死の増加が見られ、おそらくは、その細胞死はアポトーシスを介した機構であることが示唆され、本発明は、従来の手法より好ましい治療方法でありうることが示される。【０１５６】
（生体分子の相互作用）
ＢＩＡＣＯＲＥバイオセンサーシステム３０００（ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｉｎｃ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を行った。製造業者の説明書にしたがって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド活性化化学により約５０００ＲＵのＨｓｐ９０をＣＭ５センサーチップの表面に固定した。非特異的な結合のコントロールとしてなにも固定していないセンサーチップの反応していないカルボキシメチル基を、エタノールアミンでブロックした。アッセイの間に非特異的な結合を防ぐために、ＨＢＳ緩衝液（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、３ｍＭ  ＥＤＴＡ［ｐＨ７．４］）を泳動緩衝液として用いた。組換えヒトＨｓｐ９０のＴＰＲ結合ドメイン−細胞溶解性ペプチドキメラペプチドとの相互作用解析を、以下のように行った：上述のように、約５０００ＲＵのＨｓｐ９０をＣＭ５のセンサーチップ上に固定し、次いで、いくつかの濃度のペプチドをこのセンサーチップの上に注入した。これらの実験において用いた全てのタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ＭＭ．Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９７６；７２：２４８−５４）により決定した。データの解析は、ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｖｅｒ．３．２ソフトウェア（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用いて行った。【０１５７】
（殺傷効果が高かった細胞に関するウェスタンブロッティング）
細胞殺傷効果の見受けられたがん細胞と正常細胞をそれぞれの培地で６−ｗｅｌｌ（ＮｕｎｃＴＭ）で２４時間培養した後、上清をリン酸緩衝化緩衝液（ＰＢＳ）で最低二回洗浄後、Ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をそれぞれのウェルに３００ｕｌずつ添加し、細胞を溶解、これを細胞抽出総タンパク質（ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とした。この抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、セミドライ法でメンブレンに転写した。１０％スキムミルク溶液をリン酸緩衝化緩衝液（ＰＢＳ）で調製し、１時間３０分ブロッキングした後、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、サービビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、アクチン（ａｃｔｉｎ）に対する抗体液（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ，ＳＩＧＭＡ）中で一晩反応させ、その後、二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と反応させたのち、ＥＣＬキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  ｓｃｉｅｎｃｅ）で化学発色させ、Ｌａｓ３０００  ｓｙｓｔｅｍでバンドを検出した。【０１５８】
（Ｈｓｐ９０への結合に関する実験結果）
新規に設計されたペプチド配列の野生型は、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号９）である。ここで、Ｎ末端側のペプチドは、細胞透過性ペプチドＡｎｔｐであり、Ｃ末端側のペプチドは、図１（Ａ）に示されるように、ＴＰＲペプチド（ＨｏｐのＴＰＲ２Ａドメイン内にあるＨｓｐ９０のＣ末端側に結合するのに重要なへリックスの一部分の配列。）に結合する、Ｈｓｐ９０  ＴＲＰ結合ペプチドである。【０１５９】
Ｈｓｐ９０との結合に必要不可欠な領域に関して、立体構造表示ソフトウェア（Ｒａｓ  Ｍｏｌ  ｖｅｒ  ２．７  ｆｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｔｏｓｈ(フリーソフト、http://www.openrasmol.org/）を用いて解析した。図１（Ｂ）は、報告されているＨｏｐのＴＰＲドメインとＨｓｐ９０のＣ末端配列ＭＥＥＶＤ（配列番号６４）（中央白色）との複合体の立体構造図である。この立体構造図（Ｂ）において、Ｈｓｐ９０との結合に重要なヘリックスの一つ（矢印）が今回設計に用いた領域であり、図１（Ｃ）が予測されるペプチドとＨｓｐ９０のＣ末端配列ＭＥＥＶＤ（配列番号６４）（右）との複合体の立体構造図である。ソフトウェアで表示される図上、この領域のへリックスのみで十分にＨｓｐ９０に結合できることが予測された。【０１６０】
図２には、ＢＩＡＣＯＲＥ（生体分子間相互作用解析装置）を用いて、センサーチップに固定化されたＨｓｐ９０と新規に設計されたＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチドとの相互作用解析を行った結果、ペプチドの濃度依存的に結合することが判明したことを示す。また、親和定数（Ｋｄ）が２．０９ｘ１０−６であることも判明した。【０１６１】
（細胞生存性アッセイの結果）
図３および以下の表に、その結果としてＡｎｔｐ−ＴＰＲならびに、Ａｎｔｐ−ＴＰＲ変異体ペプチドによる細胞障害活性を示す。【０１６２】
【表１】
2010055929.tif 000002
【０１６３】
新規に設計したペプチドの細胞障害活性を調べた結果（Ａ）、（Ｂ）のように細胞透過性ペプチドＡｎｔｐとのキメラペプチドでは、正常細胞である、ＨＥＫ、ＭＲＣ５には影響を及ぼさなかったが、がん細胞であるＣａｋｉ−１、（腎がん）、Ｂｘｐｃ３（すい臓がん）、Ｔ４７Ｄ（乳がん）、Ａ５４９（肺がん）には影響を与えること、ＫＡＹＡＲ（配列番号３）の５アミノ酸より伸長させたＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号４）の方が効果が高いこと、またＴＰＲペプチドのみ（Ｃ）では、いずれの細胞にも障害活性は、見受けられなかった。さらに、細胞障害活性のデータから、ＩＣ５０値を算出した結果、細胞透過性ペプチドＡｎｔｐと組み合わせた結果、正常細胞には、影響せずがん細胞にのみ殺傷能力を示し、ＩＣ５０値２０μＭ〜６０μＭの範囲でがん細胞に影響を与えることが判明した（表１Ａ：Ａｎｔｐ−ＴＰＲペプチドの阻害濃度（ＩＣ５０））。【０１６４】
【表１Ａ】
2010055929.tif 000003
【０１６５】
（変異体での試験）
設計したＴＰＲペプチドが、サービビンを含むいくつかのがん原性タンパク質のがん細胞における正確なフォールディングに必須なＨｓｐ９０とＨｏｐのＴＰＲ２Ａドメインとの相互作用と特異的に競合できるかどうかを検討した。図７および以下の表は、センサーチップ上に固定化されたヒトＨｏｐのＴＰＲ２Ａドメインタンパク質に対して、前もってＨｓｐ９０とＴＰＲペプチド、ＴＰＲ  ｓｃｒａｍｂｌｅ、ＴＰＲ  ｍｕｔａｎｔ  １、あるいはＴＰＲ  ｍｕｔａｎｔ  ２ペプチドをそれぞれ混合させておき、Ｈｓｐ９０に十分に結合させておいてからＴＰＲ２Ａとの相互作用を確認することで、阻害効果を確認した実験である。センサーグラムとグラフで示されるように、ＴＰＲペプチドではその濃度増加によりＨｓｐ９０とＴＰＲ２Ａとの相互作用に影響を与える（図７ＡおよびＣ）が、ＴＰＲ  ｓｃｒａｍｂｌｅ、ＴＰＲ  ｍｕｔａｎｔ  １、あるいはＴＰＲ  ｍｕｔａｎｔ  ２ペプチドでは高濃度を前もって添加しておいてもその完全阻害は見受けられない（図７ＢおよびＣ）。【０１６６】
さらに、ＴＰＲペプチドの特異性を調べるために、重要と予測されるアミノ酸に変異を加えたｍｕｔａｎｔ  １、ｍｕｔａｎｔ  ２はいずれも障害活性を保持していたが、その障害活性が低下した（図７ＡおよびＣ）。【０１６７】
これらの結果から、設計したＴＰＲペプチドは、Ｈｓｐ９０とＨｏｐのＴＰＲ２Ａドメインとの相互作用を阻害し得る特異的な競合因子であり、変異体による実験において標的としたアミノ酸が、このタンパク質相互作用が生じるために重要であることが示された。【０１６８】
【表２】
2010055929.tif 000004
【０１６９】
（Ａｎｔｐ−ＴＰＲペプチドによるＨｓｐ９０クライアントタンパク質の消失）
Ａｎｔｐ−ＴＰＲペプチドを細胞に添加した後のＨｓｐ９０クライアントタンパク質のレベルを検討したところ、Ａｎｔｐ−ＴＰＲで処理したＴ４７Ｄ細胞は、サービビン、ＣＤＫ４およびＡｋｔを含む複数のＨｓｐクライアントペプチドの消失を示した。対照的に、Ａｎｔｐ−ＴＰＲペプチドは、Ｈｓｐ９０自体のレベルには影響しなかった（図４（Ａ））。これらの結果は、今回設計したＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチドが、Ｈｓｐ９０クライアントタンパク質の正確なフォールディングに必須のコシャペロン補充と競合することによってがん細胞における細胞生存経路に影響を及ぼすようである。【０１７０】
（各タンパク質の発現量）
特に殺傷効果が高かった細胞に関して、ウェスタンブロッティングにより各Ｈｓｐ９０クライアントタンパク質の発現量を調べたところ、図４（Ｂ）に示すようにサービビンの発現量が特に多いことが判明した。このことから、今回新規に設計したペプチドががん細胞の中でも特にサービビンの発現量が多いものに効果的であることが判明した。【０１７１】
また、図９に示されるフローサイトメトリーの結果からＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチドで処理したがん細胞はアネキシンＶ陽性かつカスパーゼ３，７陽性であり、さらに、図４（Ａ）に示されるようにＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチドはまたサービビンの消失を引き起こしたことから、Ａｎｔｐ−ＴＰＲペプチドは、アポトーシス性の機構によって、サービビンの発現に依存性のがん細胞の大幅な殺傷を引き起こすようである。【０１７２】
（考察）
以上のように、今回新規に設計したペプチドは、Ｈｓｐ９０に特異的に結合すること、単独では機能せず、細胞透過性ペプチドとキメラ化することで、細胞内に取り込まれたときに、がん細胞特異的に殺傷効果を示すこと、特にサービビンが高発現しているがん細胞に効果的であることから、実際に治療が困難ながんの新規治療薬への応用が大いに期待できる。従来の化合物を用いてＨｓｐ９０を標的とした手法と大きく異なりペプチドを用いていることと、正常細胞に実際に影響を示さなかったことから、がんの治療で問題となる副作用もクリアできることが考えられる。今後は、上記配列のアミノ酸を一つずつ置換すること、あるいは他の細胞透過性ペプチドとの組み合わせを試みることにより、今回設計された配列よりもさらにがん細胞特異的であり、殺傷能力の強い配列を設計できることが大いに期待できる。さらに、このようなペプチドを組み合わせた新規治療薬は、がんだけでなく、ペプチドを用いて炎症性サイトカイン等を抑制することにより、炎症性疾患、間質性肺炎などの難治性疾患にも大いに応用できることが期待される。【０１７３】
（実施例２：ＴＲＰドメイン結合ペプチドの網羅的解析）
本実施例では、Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドのアナログ（アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号１）；式中
Ｘ１は、Ｋ、ＲまたはＡであり；
Ｘ２は、ＡまたはＧであり；
Ｘ３は、ＹまたはＬであり；
Ｘ４は、ＡまたはＧであり；
Ｘ５は、Ｒ、ＡまたはＫであり；
Ｘ６は、ＩまたはＲであり；
Ｘ７は、ＧまたはＡであり；
Ｘ８は、ＮまたはＱであり；
Ｘ９は、ＳまたはＹであり；
Ｘ１０は、ＹまたはＳであり；
Ｘ１１は、ＦまたはＹであり；
Ｘ１２は、ＫまたはＲであるか、あるいは
ＴＰＲペプチドを延長させたＡｎｔｐ−ＴＰＲ  ｓｌｏｎｇ（Ａｎｔｐ−ＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＫＹＫ；配列番号３９）ものが使用可能であるかどうかを決定するための実験を行った。また、ＴＰＲに代えてＲ１１を使用したものを用いた実験も行った。【０１７４】
ペプチド配列が異なること以外は、すべてのプロトコールは実施例１に準じた。使用したペプチドは以下のとおりである。
配列番号９：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ｗｉｌｄ）
配列番号１０：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＲＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−Ｋ１Ｒ）
配列番号１１：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＡＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−Ｋ１Ａ）
配列番号１２：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＧＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−Ａ２Ｇ）
配列番号１３：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＬＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−Ｙ３Ｌ）
配列番号１４：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＧＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−Ａ４Ｇ）
配列番号１５：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＫＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−Ｒ５Ｋ）
配列番号１６：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＲＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−Ｉ６Ｒ）
配列番号１７：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＡＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−Ｇ７Ａ）
配列番号１８：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＱＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−Ｎ８Ｑ）
配列番号１９：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＹＹＦＫ（Ａｎｔｐ−Ｓ９Ｙ）
配列番号２０：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＳＦＫ（Ａｎｔｐ−Ｙ１０Ｓ）
配列番号２１：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＹＫ（Ａｎｔｐ−Ｆ１１Ｙ）
配列番号２２：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＲ（Ａｎｔｐ−Ｋ１２Ｒ）
（プロトコール）
それぞれの変異体ペプチドに関して、細胞生存性アッセイを行った。具体的には１ウェルあたり合計Ｃａｋｉ−１（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を３×１０３細胞、９６ウェルプレート（ＮｕｎｃＴＭ）に播種し、１０％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清；Ｂｉｏｗｅｓｔ）を含有する培地（ＤＭＥＭ（ナカライテスク株式会社））中で２４時間培養し、１００μｌにおいて漸増濃度のペプチドと共に、３７℃にて４８〜７２時間インキュベートした。細胞の生存率を、ＷＳＴ−８溶液（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ；ナカライテスク株式会社）を用いて測定するこの時に、野生型のＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチドと比較した。【０１７５】
（結果）
結果を図５および以下の表に示す。表中の数値野生型を１００％としたときの相対値を示す。【０１７６】
【表３】
2010055929.tif 000005
【０１７７】
以上のすべての数値は、ポジティブと判断できる。なぜなら、非常に活性が高い野生型の１（％）程度が残存すれば、「抗がん活性」はあると判断可能であるからである。【０１７８】
以上から、Ａ４Ｇ（配列番号１４），Ｓ９Ｙ（配列番号１９），Ｆ１１Ｙ（配列番号２１）について、野生型より効果の増加が観察され、Ａ２Ｇ（配列番号１２），Ｇ７Ａ（配列番号１７），Ｎ８Ｑ（配列番号１８），Ｙ１０Ｓ（配列番号２０），Ｋ１２Ｒ（配列番号２２）について、野生型に比べてほぼ同程度の効果が観察された。これら以外についても、少ないが殺傷効果が維持されたことが見出された殺傷ペプチドとしての効果を発揮することができることが見出された。【０１７９】
以上の結果、以下のような改変が許容されるようであることがわかる。
アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号１）；
Ｘ１は、Ｋまたはそれに類似する同じ親水性アミノ酸のＲ、Ａなどのアミノ酸であり、好ましくは、Ｋであり、；
Ｘ２は、Ａまたはそれに類似する脂肪族系側鎖のＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉなどのアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｙまたはそれに類似する疎水性アミノ酸Ｌなどのアミノ酸であり、好ましくは、Ｙであり、；
Ｘ４は、Ａまたはそれに類似する脂肪族系側鎖のＧ、Ｖ、Ｌ、Ｉなどのアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｒまたはそれに類似するＫ、Ａなどのアミノ酸であり、好ましくはＲであり；
Ｘ６は、Ｉまたはそれに類似するＲなどのアミノ酸であり、好ましくはＩ（または別途実施例からＩもしくはＡであり）；
Ｘ７は、Ｇまたはそれに類似する他のＴＰＲドメインで見受けられるＡなどのアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｎまたはそれに類似する他のＴＰＲドメインで見受けられるＱなどのアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｓまたはそれに類似するＯＨ基を有するＴ、Ｙなどのアミノ酸であり；
Ｘ１０は、Ｙまたはそれに類似するＯＨ基を有するＳ、Ｔなどのアミノ酸であり；
Ｘ１１は、Ｆまたはそれに類似する芳香族を有するＹなどのアミノ酸であり；
Ｘ１２は、Ｋまたはそれに類似する塩基性のＲなどのアミノ酸である。【０１８０】
全般的に保存的置換が許容されることが明らかになったが、図１に示すような三次元モデルからは、Ｘ１、Ｘ５では、厳密に側鎖の構造が抗がん活性に影響するようであることがわかった。したがって、保存的置換を行う場合は、これら以外のアミノ酸位に導入されるべきことがわかる。なお、Ｘ６においてＲへの置換は保存的置換ではなく、実施例８、表９における結果からも明らかなように保存的置換であるＡへの置換では活性が保持されていることから、側鎖の構造は抗がん活性にそれほど厳密に影響を与えるものではないものと考えられる。本発明のペプチドは、活性を野生型以上にしようとする場合、好ましくは、Ｘ１およびＸ５以外の残基を変異させることが有利であるがこれに限定されない。【０１８１】
また、好ましいパターンとしては、以下を認めることができる。【０１８２】
すなわち、上記アミノ酸配列において、Ｘ２は、Ｇであり；Ｘ４は、Ｇであり；Ｘ７は、Ａであり；Ｘ４は、Ｑであり；Ｘ９は、Ｙであり；Ｘ１０は、Ｓであり；Ｘ１１は、Ｙであり；および／またはＸ１２は、Ｒである、もの、これらの好ましい置換は任意の組み合わせが有効でありうる。【０１８３】
より好ましくは、上記アミノ酸配列において、Ｘ４は、Ｇであり；Ｘ９は、Ｙであり；Ｘ１１は、Ｙであるもの、これらの好ましい置換は任意の組み合わせがさらに有効でありうる。【０１８４】
これらの結果から、殺傷効果が維持された変異を複数組み合わせても殺傷効果が維持されることが期待されることが理解される。【０１８５】
また、以下のような付加・挿入配列あるいは欠失も許容されることがわかる。すなわち、Ａｎｔｐ−ＲＡＹＡＲ（配列番号６５）、Ａｎｔｐ−ＡＡＹＡＲ（配列番号６６）、Ａｎｔｐ−ＫＧＹＡＲ（配列番号６７）、Ａｎｔｐ−ＫＡＬＡＲ（配列番号６８）、Ａｎｔｐ−ＫＡＹＧＲ（配列番号６９）なども効果があるものと理解することができる。つまり、Ａｎｔｐ−ＫＡＹＡＲ（配列番号４２）でも殺傷効果が出ていることから、同じような置換もまた、同様に効果のあるものとして使用されうることが理解される。【０１８６】
（実施例３：他の細胞透過性ペプチドの試験）
本実施例では、Ａｎｔｐペプチド以外の細胞透過性ペプチドが使用可能か調べた。【０１８７】
使用するペプチドは以下のとおりである。細胞透過性ペプチドのペプチド配列が異なること以外は、すべてのプロトコールは実施例１に準じた。【０１８８】
具体的には、ＴＰＲペプチドを延長させたＡｎｔｐ−ＴＰＲ  ｓｌｏｎｇ（Ａｎｔｐ−ＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＫＹＫ；配列番号３９）、ＴＰＲに代えてＲ１１（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ；配列番号７）を使用したものを用いた実験を行った。【０１８９】
細胞透過性ペプチドのペプチド配列が異なること以外は、すべてのプロトコールは実施例１に準じた。
ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＴＡＴ  配列番号６）
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（Ｒ１１  配列番号７）
製造した配列は、以下のとおりである。【０１９０】
Ｒ１１−ＴＰＲ（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ；配列番号４０）
ＴＡＴ−ＴＰＲ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ；配列番号５０）
（結果）
ＴＡＴについては、図３Ｄに、Ｒ１１については、図６および以下の表にその結果を示す。Ｒ１１−ＴＰＲについてもＡｎｔｐ−ＴＰＲの野生型と同等の効果を示したことから、Ｒ１１でも効果の多少の違いはあれ、細胞殺傷効果があるといえる。Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  ｓｌｏｎｇは、野生型の効果を保持した。したがって、長さを変動させても、抗がん活性は消失しないことが実証された。また、ＴＡＴでも同様の効果が示された（図３Ｄ）ことから、ＴＰＲの前に、細胞透過性ペプチドを組み合わせることで、効果を発揮できるペプチドであることを証明できたといえ、本発明の汎用性が立証された。【０１９１】
【表４】
2010055929.tif 000006
【０１９２】
（実施例４：細胞透過性ペプチドの改変）
本実施例では、細胞透過性ペプチド（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５））のアナログ（アミノ酸配列Ｙ１Ｙ２Ｙ３Ｙ４Ｙ５Ｙ６Ｙ７Ｙ８Ｙ９Ｙ１０Ｙ１１Ｙ１２Ｙ１３Ｙ１４Ｙ１５Ｙ１６（配列番号８）を有するものであって、ここで
Ｙ１は、Ｒまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｋなどのアミノ酸であり；
Ｙ２は、Ｑまたはそれに類似するアミド系のＮ、ＧｌｘとしてＥなどのアミノ酸であり；
Ｙ３は、Ｉまたはそれに類似する脂肪族系のＬなどのアミノ酸であり；
Ｙ４は、Ｋまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｒなどのアミノ酸であり；
Ｙ５は、Ｉまたはそれに類似する脂肪族系のＬなどのアミノ酸であり；
Ｙ６は、Ｗまたはそれに類似する芳香族を有するＹなどのアミノ酸であり；
Ｙ７は、Ｆまたはそれに類似する芳香族を有するＹなどのアミノ酸であり；
Ｙ８は、Ｑまたはそれに類似するアミド系のＮ、ＧｌｘとしてＥなどのアミノ酸であり；
Ｙ９は、Ｎまたはそれに類似するアミド系のＱなどのアミノ酸であり；
Ｙ１０は、Ｒまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｋなどのアミノ酸であり；
Ｙ１１は、Ｒまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｋなどのアミノ酸であり；
Ｙ１２は、Ｍまたはそれに類似するＳ含有アミノ酸のＣなどのアミノ酸である、
Ｙ１３は、Ｋまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｒなどのアミノ酸である、
Ｙ１４は、Ｗまたはそれに類似する芳香族を有するＹなどのアミノ酸である、
Ｙ１５は、Ｋまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｒなどのアミノ酸である、
Ｙ１６は、Ｋまたはそれに類似する親水性アミノ酸Ｒなどのアミノ酸であるものである）を使用することができるかどうかを調べた。ペプチド配列が異なること以外は、すべてのプロトコールは実施例１に準じた。【０１９３】
（プロトコール）
それぞれの変異体ペプチドに関して、細胞生存性アッセイを行う、具体的には１ウェルあたり合計Ｃａｋｉ−１（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））を３×１０３細胞、９６ウェルプレート（ＮｕｎｃＴＭ）に播種し、１０％  ＦＢＳを含有する培地中で２４時間培養し、１００μｌにおいて漸増濃度のペプチドと共に、３７℃にて４８〜７２時間インキュベートした。細胞の生存率を、ＷＳＴ−８溶液（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ；ナカライテスク株式会社）を用いて測定するこの時に、野生型のＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチドと比較する。【０１９４】
（結果）
結果を図８Ａおよび以下の表に示す。表中の数値は、野生型を１００％としたときの相対値を示す。【０１９５】
【表５】
2010055929.tif 000007
【０１９６】
以上のすべての数値は、ポジティブと判断できる。なぜなら、非常に活性が高い野生型の１（％）程度が残存すれば、「抗がん活性」はあると判断可能であるからであり、上記では、すべて約３０％以上の活性が残存していたからである。【０１９７】
以上から、Ｋ４Ｒ（配列番号２６），Ｑ８Ｎ（配列番号３０），Ｎ９Ｑ（配列番号３１），Ｒ１０Ｋ（配列番号３２），Ｒ１１Ｋ（配列番号３３），Ｍ１２Ｃ（配列番号３４），Ｋ１３Ｒ（配列番号３５），Ｋ１５Ｒ（配列番号３７）およびＫ１６Ｒ（配列番号３８）については野生型より効果の増加が観察された。また、Ｑ２Ｎ（配列番号２４），Ｗ１４Ｙ（配列番号３６），についても、野生型に比べてほぼ同程度の効果が見出された。これら以外の変異でも、少ないながらも殺傷効果が維持されていることが示された。したがって、細胞透過性ペプチドに関して細胞透過性さえ維持されれば、本発明のがん細胞殺傷効果が保持されることが実証された。【０１９８】
以上のように、細胞透過性ペプチドへの変異についても、細胞透過性の効果が維持されていることが理解される。【０１９９】
（実施例５：治療法）
本実施例では、実際の治療への応用を確認した。【０２００】
ここでは、薬物送達システム（＝Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ、ＤＤＳ）を用いた体内動態安定化及び徐放化等の検討とともに担がん動物モデルでの抗腫瘍効果を研究する。【０２０１】
（ＤＤＳ）
アテロコラーゲン（ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ；高研）とＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチドを混合して（Ａｎｔｐ−ＴＰＲペプチド（配列番号９）４００μｇ／ｍｌ濃度中にアテロコラーゲンが０．３％になるように混合）、その安定化をＨＰＬＣで測定する、具体的には、ペプチドのみの波形を測定し、アテロコラーゲンとペプチドの混合物を測定したときに、ペプチドの位置の波形が時間ごとにどの程度検出されるかで、アテロコラーゲンからの放出の度合いを知ることができると同時に、ペプチドの安定性を確認することができる。また混合物を下記のように作成した固形がんを移植した動物に投与することで、その治療効果を検討した。【０２０２】
（担がん動物モデルでの局所投与による抗腫瘍効果）
ヒトすい臓がん細胞（Ｂｘｐｃ３）、５．０×１０６個の細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）１５０μｌに懸濁し、ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕ）に皮下移植した。５日後、固形がんに対してＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチドを１ｍｇ／ｋｇ−５ｍｇ／ｋｇの濃度で１５０μｌずつＰＢＳに懸濁し固形がんに一日おきに計９回局所投与してその縮小効果を検討した。腫瘍径は、カリパスを用いて測定し、そして、腫瘍容積（ｍｍ３）は、式：長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）２×０．５を用いて計算した。【０２０３】
（担がん動物モデルでの静脈内投与による抗腫瘍効果）
ヒトすい臓がん細胞（Ｂｘｐｃ３）、５．０×１０６個の細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）１５０μｌに懸濁し、７〜９週齢のヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕ）（体重１７〜２１ｇ）の側腹部領域に皮下移植した。腫瘍容積が２０〜５０ｍｍ３に到達した時点でマウスを無作為に３群（ｎ＝６／群）に分け、そして、ＰＢＳ（コントロール）またはＡｎｔｐ−ＴＰＲ（１または５ｍｇ／ｋｇ）を、週に３回、計９回静脈内注射（５０μｌ／注射）して、腫瘍の縮小効果を検討した。腫瘍径の測定および腫瘍容積の計算は、局所投与の場合と同様にして行った。【０２０４】
（結果）
結果を図８Ｂ（局所投与による抗腫瘍効果）および図８Ｃ（静脈内投与による抗腫瘍効果）に示す。【０２０５】
図８Ｂから明らかなように、局所投与による実験において、ＰＢＳ投与群に対して、Ａｎｔｐ−ＴＰＲペプチドを投与したマウスのがんの縮小効果が見受けられた。また、このときの投与痕やその後の行動を見る限り（通常の行動をしており、食欲減退など見受けられない）、マウスに対する毒性はほとんど見受けられなかった。【０２０６】
また、図８Ｃから明らかなように、静脈内投与による実験でも、ＰＢＳを投与したコントロール群に対して、Ａｎｔｐ−ＴＰＲペプチドを投与したマウスのがんの縮小効果が見受けられた。具体的には、コントロール群が漸進的な腫瘍の増殖を示し、５８日目には腫瘍容積が７４９ｍｍ３に達したのに対し、Ａｎｔｐ−ＴＰＲペプチド（１または５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与したマウスは、腫瘍の増殖が顕著に抑制された。平均腫瘍容積は、５８日目には、１ｍｇ／ｋｇ投与群では３７１ｍｍ３、そして、５ｍｇ／ｋｇ投与群では２０４ｍｍ３（コントロール群のマウスに対してＰ＜０．０５）であった。【０２０７】
これらの結果は、本願発明のＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチドがインビボでがん細胞の死を効果的に誘導することを示唆するものである。【０２０８】
そして、これらの結果およびインビトロでの結果から、インビトロでＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチドと同様の効果を示した変異体は、インビボでも同様の結果を示すことが期待され、同様に半分程度のものであれば、半分程度と期待されるところ、インビトロで半分程度の効果があったものでもインビボで従来のシェファーディンの５倍以上の活性を見積もられることから、本発明は、全体にわたり従来の抗がん剤、ペプチド抗がん剤よりも優れた活性を有するものと期待される。【０２０９】
（実施例６：ＦＡＣＳによるがん細胞殺傷効果の検討）
本実施例では、本発明のＤＤＳとしてのがん細胞に対する特異性を確認する目的で、がん細胞殺傷効果を検討した。【０２１０】
（プロトコール）
がん細胞Ｔ４７Ｄおよび正常細胞のＨＥＫ２９３Ｔをそれぞれの培地で６−ｗｅｌｌディッシュ（ＮｕｎｃＴＭ）で２４時間培養した後、６８μＭのＡｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドを添加してさらに４８時間培養した。培養後、それぞれの細胞懸濁液に対して、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色、あるいは、アネキシンＶ標識（いずれもＷａｋｏ）を行いマルチパラメトリックフローサイトメトリーによって、アネキシンＶ標識およびＰＩ染色について、同時に解析した。【０２１１】
（結果）
結果を図９に示す。正常細胞ＨＥＫ２９３ＴにＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチドを加えても影響を与えないが、がん細胞Ｔ４７Ｄにペプチドを加えた場合、アネキシンＶ陽性またはカスパーゼ３，７陽性の細胞集団の増加が観察された。【０２１２】
このことから、加えられたペプチドがアポトーシス性の機構によりがん細胞の死を特異的に誘導していることが示唆された。【０２１３】
すなわち、正常細胞ＨＥＫ２９３ＴにＡｎｔｐ−ＴＰＲペプチドを加えても影響を与えないが、がん細胞Ｔ４７Ｄにペプチドを加えた場合ＰＩとアネキシンＶ陽性またはカスパーゼ３，７陽性の細胞数の増加が見受けられる。このことから、がん細胞Ｔ４７Ｄにおいてこのペプチドの添加により細胞が死滅するか、あるいは、死滅した細胞が、アポトーシスを起こしているようであることがわかる。【０２１４】
（実施例７：トランスフェクション試薬としての利用）
ＴＰＲペプチドあるいは、ＴＰＲ  ｓｃｒａｍｂｌｅペプチドを市販のｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Ｐｒｏｆｅｃｔ−Ｐ２あるいは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ）などと混合して、２０分常温で静置して、リポソームを形成し、その後この複合体をがん細胞（Ｃａｋｉ−１（腎臓がん細胞））に添加、その後、細胞の生存率をＷＳＴ−８溶液（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ；ナカライテスク株式会社）を用いて測定しＴＰＲ  ｓｃｒａｍｂｌｅペプチドおよびリポソームのみ添加の場合と比較した。【０２１５】
（結果）
結果を図１０および以下の表に示す。図１０からも明らかなように、リポソーム単独およびＴＰＲ  ｓｃｒａｍｂｌｅでは効果がなく、ＴＰＲペプチドを導入した場合のみ、殺傷効果が見受けられた。【０２１６】
トランスフェクション試薬でＴＰＲペプチドのみをがん細胞Ｃａｋｉ−１に導入した場合、ＴＰＲペプチドのみ殺傷効果が観察された。【０２１７】
【表６】
2010055929.tif 000008
【０２１８】
したがって、ＴＰＲペプチドは、特異的送達（ＤＤＳ）の因子として使用することができることが理解できる。【０２１９】
（実施例８：Ｈｓｐ９０  ＴＲＰ結合ペプチド−Ａｎｔｐキメラペプチドの生産および生物活性の測定）
本発明のキメラペプチドが、血液がん細胞、特に、白血病由来細胞株においても同様に殺細胞効果、抗腫瘍効果を示すかどうかを検討した。【０２２０】
（材料および方法）
（細胞株）
ヒト白血病由来細胞株：Ｕ９３７（単芽球性白血病）、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病）、ＴＨＰ−１（単球性白血病）、ＨＬ−６０（骨髄芽球性白血病）、ヒト正常Ｂ細胞（ＲＰＭＩ１７８８）をヒューマンサイエンス振興財団（東京、日本）から購入した。ヒト胚性腎臓細胞株（ＨＥＫ２９３）を、ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（つくば市、日本）から購入した。ヒト肺正常上皮細胞（ＷＩ３８）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入した。ヒト正常すい臓上皮細胞（ＰＥ）をＤＳファーマ、バイオメディカルから購入した。細胞は、１０％  ＦＢＳ（ＢｉｏＷｅｓｔ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ，ＵＳＡ）、１００μｇ／ｍｌ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（ナカライテスク株式会社、京都市、日本）を含有する、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｕ９３７、Ｋ５６２、ＴＨＰ−１、ＨＬ−６０、ＲＰＭＩ１７８８）、ＣＳＣ（ＰＥ）、ＭＥＭ（ＷＩ３８）またはＤ−ＭＥＭ（ＨＥＫ２９３）中で培養した。【０２２１】
（ペプチド）
以下のペプチドをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡから購入したか、あるいは、ペプチド合成機（たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ  ＵＳＡ：Ｍｏｄｅｌ  ４３３Ａ  ペプチドシンセサイザ）で合成した：
キメラペプチドＡｎｔｐ−ＴＰＲ：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号９）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＲＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｋ１ＲまたはＡｎｔｐ−Ｋ１Ｒ；配列番号１０）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＡＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｋ１ＡまたはＡｎｔｐ−Ｋ１Ａ；配列番号１１）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＧＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ａ２ＧまたはＡｎｔｐ−Ａ２Ｇ；配列番号１２）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＬＡＲＩＧＮＳＹＦＫを（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｙ３ＬまたはＡｎｔｐ−Ｙ３Ｌ；配列番号１３）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＧＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ａ４ＧまたはＡｎｔｐ−Ａ４Ｇ；配列番号１４）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＫＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｒ５ＫまたはＡｎｔｐ−Ｒ５Ｋ；配列番号１５）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＲＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｉ６ＲまたはＡｎｔｐ−Ｉ６Ｒ；配列番号１６）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＡＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｇ７ＡまたはＡｎｔｐ−Ｇ７Ａ；配列番号１７）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＱＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｎ８ＱまたはＡｎｔｐ−Ｎ８Ｑ；配列番号１８）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＹＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｓ９ＹまたはＡｎｔｐ−Ｓ９Ｙ；配列番号１９）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＳＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｙ１０ＳまたはＡｎｔｐ−Ｙ１０Ｓ；配列番号２０）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＹＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｆ１１ＹまたはＡｎｔｐ−Ｆ１１Ｙ；配列番号２１）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＲ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｋ１２ＲまたはＡｎｔｐ−Ｋ１２Ｒ；配列番号２２）、
ＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＫＹＫ（延長型ＴＰＲペプチド；配列番号４３）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＡＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−Ｒ５Ａ；配列番号５１）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＡＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−Ｉ６Ａ；配列番号５２）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＧＹＧＲＩＧＮＹＹＹＫ（Ａｎｔｐ−Ａ２Ｇ，Ａ４Ｇ，Ｓ９Ｙ，Ｆ１１Ｙ；配列番号５３）、
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＲＫＦＳＡＡＩＧＹＮＫＹ（Ａｎｔｐ−スクランブルペプチド；配列番号５４）。【０２２２】
これらのペプチドを、化学的に合成し、そして、高速液体クロマトグラフィーにより精製して、その後、水に溶解した。【０２２３】
（細胞生存性アッセイ）
１ウェルあたり合計３×１０３細胞を、９６ウェルプレートに播種し、１０％  ＦＢＳを含有する培地中に、１００μｌにおいて段階希釈したペプチドと共に、３７℃にて４８〜７２時間インキュベートした。細胞の生存率を、ＷＳＴ−８溶液（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ；ナカライテスク株式会社）を用いて測定した。【０２２４】
（ウェスタンブロッティング）
白血病細胞株をそれぞれの培地で６−ｗｅｌｌ（ＮｕｎｃＴＭ）で２４時間培養した後、上清をリン酸緩衝化緩衝液（ＰＢＳ）で最低二回洗浄後、Ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をそれぞれのウェルに３００ｕｌずつ添加し、細胞を溶解、これを細胞抽出総タンパク質（ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とした。この抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、セミドライ法でメンブレンに転写した。１０％スキムミルク溶液をリン酸緩衝化緩衝液（ＰＢＳ）で調製し、１時間３０分ブロッキングした後、Ｈｓｐ９０，サービビン，アクチンに対する抗体液（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ，ＳＩＧＭＡ）で一晩反応させ、その後、二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）を反応させたのち、ＥＣＬキットで（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  ｓｃｉｅｎｃｅ）で化学発色させ、Ｌａｓ３０００  ｓｙｓｔｅｍでバンドを検出した。【０２２５】
（蛍光顕微鏡解析）
Ｕ９３７細胞、マウス白血病細胞株ＥＬ４、または、マウス末梢血から調整された末梢血単核白血球細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣｓ）、１×１０６細胞に対して、ＴＰＲ−ＴＡＭＲＡ（ＴＡＭＲＡ標識体）あるいは、Ａｎｔｐ−ＴＰＲ−ＴＡＭＲＡ（ＴＡＭＲＡ標識体）を用いて、最終濃度１０μＭになるように添加し、一時間培養したのち、細胞内に取り込まれたペプチドの様子あるいは、ペプチド透過による細胞への培地の流入をカルセインを培地に添加したものを用いて、コンフォーカル顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００（Ｏｌｙｍｐｕｓ））を用いて観察した。【０２２６】
（フローサイトメトリーアッセイ）
白血病細胞株Ｕ９３７細胞の５０μＭのＡｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドによるがん細胞殺傷効果を決定するために、ペプチドで処理した培養物を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色、あるいは、マルチパラメトリックフローサイトメトリーによって、アネキシンＶ標識およびＰＩ染色について、同時に解析した。【０２２７】
ミトコンドリアの電位変化の測定には、上記処理後の細胞をさらに蛍光カチオン色素試薬ＪＣ−１を含む培地で１５分インキュベートし、その後ＰＢＳで洗った後、マルチパラメトリックフローサイトメトリーによって、測定した。【０２２８】
カスパーゼ３，７測定には、同様に上記処理後の細胞をカルボキシフルオレセインＦＬＩＣＡカスパーゼ３，７アッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＮ，ＵＳＡ）を用いてカスパーゼ活性およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色について、マルチパラメトリックフローサイトメトリーによって測定した。【０２２９】
（細胞生存性アッセイの結果）
図１１および以下の表に、細胞生存性アッセイの結果としてＡｎｔｐ−ＴＰＲによる細胞障害活性を示す。【０２３０】
（Ａ）〜（Ｃ）はＨｓｐ９０阻害剤である低分子化合物ゲルダナマイシン（Ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）（Ａ）、１７−ＡＡＧ（Ｂ）、Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチド（Ｃ）による白血病細胞株（Ｕ９３７、Ｋ５６２、ＴＨＰ−１、ＨＬ−６０）に対する殺細胞効果であり、（Ｄ）は、固形がん細胞株（ＢＴ２０、ＯＥ１９、ＭＣＦ−７）に対するＡｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドの殺細胞効果を示す。【０２３１】
【表７】
2010055929.tif 000009
【０２３２】
図１１の結果から、本発明のキメラペプチドＡｎｔｐ−ＴＰＲが、Ｈｓａｐ９０阻害剤であるゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧと同様に、急性骨髄性白血病細胞株に対して殺細胞効果があること、また、これら殺細胞効果があった細胞株いずれもサービビンが高発現していることが判明した。また、図１１（Ｄ）に示される結果から固形がん細胞株と同様の殺細胞様式を示すことも判明した。【０２３３】
さらに、細胞障害活性のデータからＩＣ５０値を算出した結果、ゲルダナマイシンと１７−ＡＡＧは、正常細胞、急性骨髄性白血病細胞株いずれにも殺細胞効果を示した（いずれも低いＩＣ５０濃度）のに対し、Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドは、正常細胞にはほとんど効果がなく、白血病細胞株にのみ殺細胞能力を示し、ＩＣ５０値２０μＭ〜６０μＭの範囲で白血病細胞株に影響を与えることが判明した（表８：正常細胞ならびに急性骨髄性白血病細胞株に対するゲルダナマイシン（Ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）、１７−ＡＡＧ、Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドの殺細胞効果（ＩＣ５０））。【０２３４】
【表８】
2010055929.tif 000010
【０２３５】
（各タンパク質の発現量）
各白血病細胞株（Ｕ９３７、Ｋ５６２、ＴＨＰ−１、ＨＬ−６０）に関して、ウェスタンブロッティングにより各タンパク質（Ｈｓｐ９０、サービビン、βアクチン（コントロール））の発現量を調べたところ、図１２に示されるように、Ｕ９３７およびＴＨＰ−１においてサービビンの発現量が多いことが判明した。このことから、Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドは、白血病細胞株においても、固形がん細胞と同様、サービビンの発現量が多いものに効果的であることが分かった。【０２３６】
（Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドの急性骨髄性白血病細胞株Ｕ９３７に対する透過実験）
Ｕ９３７細胞１×１０６細胞に対して、ＴＰＲ−ＴＡＭＲＡ（ＴＡＭＲＡ標識体）あるいはＡｎｔｐ−ＴＰＲ−ＴＡＭＲＡ（ＴＡＭＲＡ標識体）を、最終濃度１０μＭになるように添加し、一時間培養したのち、細胞内に取り込まれたペプチドの様子あるいは、ペプチド透過による細胞への培地の流入を、カルセイン含有培地を用いて、コンフォーカル顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００（Ｏｌｙｍｐｕｓ））を用いて観察した。【０２３７】
図１３（Ａ）に示されるように、ＴＡＭＲＡ標識されたＡｎｔｐ−ＴＰＲは細胞内に透過することが確認されたが、ＡｎｔｐなしのＴＰＲペプチドは、細胞内に透過されていないことが確認された。また、図１３（Ｂ）に示されるように、Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドが細胞内に透過した後もカルセイン（緑色）の流入が見受けられないことから、Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドは、細胞膜を破壊することなく透過していることも分かった。さらに、ペプチドが透過した後も、膜は破壊されていない。図中の矢印は、それぞれペプチドが透過した細胞を示す。【０２３８】
（Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドによる白血病細胞株Ｕ９３７におけるがん細胞殺傷効果の解析）
図１４にフローサイトメトリーアッセイの結果を示す。【０２３９】
Ｕ９３７細胞を５０μＭのＡｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドとともに一晩３７℃でインキュベートし、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を行い、アネキシンＶ標識およびＰＩ染色についてマルチパラメトリックフローサイトメトリーにより解析した結果を図１４（Ａ）に示す。Ａｎｔｐ−ＴＰＲ処理を行ったものについて、グラフ中右上の四半分パネルに見られるようなアネキシンＶ陽性の死細胞の増加が観察された。【０２４０】
また、同様にキメラペプチドで処理したＵ９３７細胞をＪＣ−１で１５分間処理し、緑色および赤色の蛍光についてマルチパラメトリックフローサイトメトリーにより解析した結果を図１４（Ｂ）に示す。Ａｎｔｐ−ＴＰＲ処理を行ったものについて、グラフ中右下の四半分パネルに見られるようなミトコンドリア膜電位変化が観察された。【０２４１】
さらに、同様にキメラペプチドで処理したＵ９３７細胞に対して、カルボキシフルオレセインＦＬＩＣＡカスパーゼ３，７アッセイを用いて、カスパーゼ活性およびＰＩ染色についてマルチパラメトリックフローサイトメトリーにより解析した結果を図１４（Ｃ）に示す。Ａｎｔｐ−ＴＰＲ処理を行ったものについて、グラフ中右上の四半分パネルに見られるようなカスパーゼ3 & 7の活性細胞の増加が観察された。【０２４２】
以上の結果から、Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドは、白血病細胞株Ｕ９３７に対して、カスパーゼ３，７の活性化を介してアポトーシスを誘導すること、また、この際ミトコンドリアの膜電位の変化を起こしていることが分かった。【０２４３】
（Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドによるＨｓｐ９０クライアントタンパク質の消失）
Ｕ９３７細胞をＡｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドとともに一晩３７℃でインキュベートし、その後、細胞抽出液に対して、それぞれ示されるタンパク質に対する抗体でウェスタンブロッティングを行った。図１５に示されるように、Ａｎｔｐ−ＴＰＲ（＋）では、Ａｎｔｐ−ＴＰＲ（−）よりも各タンパク質の発現量が減少しており、Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドが、白血病細胞株Ｕ９３７に対して、Ｈｓｐ９０のクライアントタンパク質のフォールディングに影響を与えていることが予想され、そしてその結果、各タンパク質の減退が起こっていることが分かった。【０２４４】
（Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドの各アミノ酸の変異によるＵ９３７細胞株に対する殺細胞効果の影響）
図１６に示すアミノ酸変異を導入したキメラペプチドの各々について、Ｕ９３７に対する殺細胞効果を調べた。その結果、それぞれの位置に保存的アミノ酸の変異を導入してもなお、殺細胞能力を有していることが分かった。また、以下の表には、野生型の数値を１００％としたときの相対値を示す。また、評価のために、細胞生存率の低下を数値化したもの、およびがん細胞を死傷させた比率を数値化した抗がん活性を提示する。野生型より強いものについては、細胞生存率の低下を検討することで、よりその抗がん剤としての活性の改善が評価されうる。【０２４５】
【表９】
2010055929.tif 000011
【０２４６】
以上のすべての数値は、ポジティブと判断できる。なぜなら、非常に活性が高い野生型の１（％）程度が残存すれば、「抗がん活性」はあると判断可能であるからであり、またｓｃｒａｍｂｌｅより高ければ、活性増強効果が見られるというべきであり、上記では、すべてこの基準を満たすからである。【０２４７】
また、Ａｎｔｐ−Ａ２Ｇ（配列番号２）、Ａｎｔｐ−Ｉ６Ａ（配列番号５２）、Ａｎｔｐ−Ｇ７Ａ（配列番号１７）、Ａｎｔｐ−Ｎ８Ｑ（配列番号１８）、Ａｎｔｐ−Ｓ９Ｙ（配列番号１９）、Ａｔｎｐ−Ｆ１１Ｙ（配列番号２１）、Ａｎｔｐ−Ｋ１２Ｒ（配列番号２２）およびＡｔｎｐ−Ａ２Ｇ，Ａ４Ｇ，Ｓ９Ｙ，Ｆ１１Ｙ（配列番号５３）については、野生型より効果の増加が観察された。これらのペプチドは、細胞生存率の低下を指標とした場合、実に２０００％を超える活性増強すら見いだされた。また、Ａｎｔｐ−Ｙ１０Ｓ（配列番号２０）についても野生型に比べてほぼ同程度の効果が見出された。これら以外の変異でも、少ないながらも殺傷効果が維持されていることが示された。したがって、細胞透過性ペプチドに関して細胞透過性さえ維持されれば、本発明のがん細胞殺傷効果が保持されることが実証された。そして、その例示として、活性のあるペプチドに基づき保存的置換等の性質の類似したアミノ酸置換が有効であることも実証された。【０２４８】
以上のように、この細胞透過性ペプチドへの変異についても、細胞透過性の効果が維持されていることが理解される。【０２４９】
（種間での殺細胞効果の検討）
マウスの末梢血から採取した正常リンパ球を含む末梢血単核白血球細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣｓ）、ヒト正常Ｂ細胞、マウスの白血病細胞株ＥＬ４に対して、Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドの殺細胞効果を検討した。【０２５０】
結果を図１７（Ａ）および以下の表に示す。Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドは、マウスＰＢＭＣｓまたはヒト正常Ｂ細胞に対しては殺細胞効果を示さないこと、さらに、マウスの白血病細胞株に対しても殺細胞効果を有することが分かった。【０２５１】
【表１０】
2010055929.tif 000012
【０２５２】
また、（Ｂ）に示すように、ヒト、マウス、ラット、ウシ間のＨｓｐ９０のＣ末端側アミノ酸配列、ならびに、ＨＯＰ中のＴＰＲ２Ａドメインのアミノ酸配列を比較すると、このキメラペプチドが抗がん作用を示すのに重要な部分の配列（Ｈｓｐ９０のＣ末端配列ＭＥＥＶＤ（配列番号６４）およびＨＯＰ中のＴＰＲ２Ａドメイン配列ＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（配列番号４））は、ヒト、マウス、ラット、ウシの種間で完全に保存されていることが分かる。以上の結果から、本発明のＡｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドは、種を超えて殺細胞効果を示すといえる。【０２５３】
（Ａｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドのマウス白血病細胞株ＥＬ４およびＰＢＭＣｓに対する透過実験）
マウス白血病細胞株ＥＬ４、またはマウス末梢血単核白血球細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ：ＰＢＭＣｓ）１×１０６細胞に対して、ＴＰＲ−ＴＡＭＲＡ（ＴＡＭＲＡ標識体）あるいはＡｎｔｐ−ＴＰＲ−ＴＡＭＲＡ（ＴＡＭＲＡ標識体）を、最終濃度１０μＭになるように添加し、一時間培養したのち、細胞内に取り込まれたペプチドの様子あるいは、ペプチド透過による細胞への培地の流入を、カルセイン含有培地を用いて、コンフォーカル顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００（Ｏｌｙｍｐｕｓ））を用いて観察した。【０２５４】
図１８に示されるように、マウスの細胞株にもＡｎｔｐ−ＴＰＲキメラペプチドが透過されていること、また、透過しても正常細胞ＰＢＭＣｓには殺細胞効果を示さず、マウス白血病細胞株には殺細胞効果を示していることから、血液がん細胞においても固形がん細胞と同様に、正常、がん細胞の選択性を有しているペプチドであることが証明された。【０２５５】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。【０２５６】
本願は、日本国で２００８年１１月１４日に出願された特願2008-292849に対する優先権を主張する。特願2008-292849の内容は、その全体が本明細書において援用され、本明細書の一部を構成するものとみなされることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２５７】
本発明により、副作用が軽減された抗がん剤が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０２５８】
配列番号１は、Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドであるアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２を示す。
配列番号２は、ＴＲＰドメイン結合ペプチドであるＫＡＹＡＲＸａＸｂＸｃＸｄＺ１Ｚ２Ｚ３を示す（ここで、Ｘａ、Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄは独立して任意のアミノ酸である）。
配列番号３は、Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチドであるＫＡＹＡＲを示す。
配列番号４は、Ｈｓｐ９０  ＴＰＲドメイン結合ペプチド（ＴＰＲペプチドとも称する）であるＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫを示す。
配列番号５は、アンテナペディアホメオボックス配列（Ａｎｔｐ）であるＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫを示す。
配列番号６は、ＴＡＴであるＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを示す。
配列番号７は、Ｒ１１とも称するＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲを示す。
配列番号８は、細胞透過性ペプチドの改変配列であるアミノ酸配列Ｙ１Ｙ２Ｙ３Ｙ４Ｙ５Ｙ６Ｙ７Ｙ８Ｙ９Ｙ１０Ｙ１１Ｙ１２Ｙ１３Ｙ１４Ｙ１５Ｙ１６を示す。
配列番号９は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  ｗｉｌｄ）を示す。
配列番号１０は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＲＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｋ１Ｒ）を示す。
配列番号１１は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＡＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｋ１Ａ）を示す。
配列番号１２は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＧＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ａ２Ｇ）を示す。
配列番号１３は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＬＡＲＩＧＮＳＹＦＫを（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｙ３Ｌ）示す。
配列番号１４は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＧＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ａ４Ｇ）を示す。
配列番号１５は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＫＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｒ５Ｋ）を示す。
配列番号１６は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＲＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｉ６Ｒ）を示す。
配列番号１７は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＡＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｇ７Ａ）を示す。
配列番号１８は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＱＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｎ８Ｑ）を示す。
配列番号１９は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＹＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｓ９Ｙ）を示す。
配列番号２０は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＳＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｙ１０Ｓ）を示す。
配列番号２１は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＹＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｆ１１Ｙ）を示す。
配列番号２２は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＲ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  Ｋ１２Ｒ）を示す。
配列番号２３は、本発明のキメラペプチドＫＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＲ１Ｋ−ＴＰＲ）を示す。
配列番号２４は、本発明のキメラペプチドＲＮＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＱ２Ｎ−ＴＰＲ）を示す。
配列番号２５は、本発明のキメラペプチドＲＱＬＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＩ３Ｌ−ＴＰＲ）を示す。
配列番号２６は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＲＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＫ４Ｒ−ＴＰＲ）を示す。
配列番号２７は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＬＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＩ５Ｌ−ＴＰＲ）を示す。
配列番号２８は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＹＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＷ６Ｙ−ＴＰＲ）を示す。
配列番号２９は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＹＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＦ７Ｙ−ＴＰＲ）を示す。
配列番号３０は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＮＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＱ８Ｎ−ＴＰＲ）を示す。
配列番号３１は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＱＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＮ９Ｑ−ＴＰＲ）を示す。
配列番号３２は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＫＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＲ１０Ｋ−ＴＰＲ）を示す。
配列番号３３は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＫＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＲ１１Ｋ−ＴＰＲ）を示す。
配列番号３４は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＣＫＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＭ１２Ｃ−ＴＰＲ）を示す。
配列番号３５は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＲＷＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＫ１３Ｒ−ＴＰＲ）を示す。
配列番号３６は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＹＫＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＷ１４Ｙ−ＴＰＲ）を示す。
配列番号３７は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＲＫＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＫ１５Ｒ−ＴＰＲ）を示す。
配列番号３８は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＲＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（ＡｎＫ１６Ｒ−ＴＰＲ）を示す。
配列番号３９は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−ＴＰＲ  ｓｌｏｎｇ）を示す。
配列番号４０は、本発明のキメラペプチドＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫ（Ｒ１１−ＴＰＲ）を示す。
配列番号４１は、Ｈｓｐ９０のＣ末端配列（ＥＥＶＤ（配列番号６３））に結合するＴＰＲドメイン内のアミノ酸配列であるＡＬＫＥＫＥＬＧＮＤＡＹＫＫＫＤＦＤＴＡＬＫＨＹＤＫＡＫＥＬＤＰＴＮＭＴＹＩＴＮＱＡＡＶＹＦＥＫＧＤＹＮＫＣＲＥＬＣＥＫＡＩＥＶＧＲＥＮＲＥＤＹＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＫＹＫＤＡＩＨＦＹＮＫＳＬＡＥＨＲＴＰＤＶＬＫＫＣＱＱＡＥＫＩＬＫＥＱＥＲＬＡを示す。
配列番号４２は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＫＡＹＡＲ（Ａｎｔｐ−ＫＡＹＡＲ）を示す。
配列番号４３は、ＴＰＲペプチドを延長させたＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＫＹＫである。
配列番号４４は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＫＡＹＡＡＡＧＮＳＹＴＦＫ（Ａｎｔｐ−変異体（ｍｕｔａｎｔ）１）を示す。
配列番号４５は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＫＡＹＡＲＩＧＮＳＧＧＧ（Ａｎｔｐ−変異体（ｍｕｔａｎｔ）２）を示す。
配列番号４６は、ｈｕｍａｎ  Ｔｏｍ  ７０の配列ＫＡＬＦＲＲＡＫＡＨＥＫである。
配列番号４７は、Ｔｏｍ  ３４の配列ＫＡＦＹＲＲＡＱＡＨＡＫである。
配列番号４８は、ＦＫＢＰ５２の配列ＫＧＬＦＲＲＧＥＡＨＬＡである。
配列番号４９は、ＣＹＰ４０の配列ＫＡＬＹＲＲＡＱＧＷＱＧである。
配列番号５０は、ＴＡＴ−ＴＰＲの配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫである。
配列番号５１は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＡＩＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−Ｒ５Ａ）である。
配列番号５２は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＡＲＡＧＮＳＹＦＫ（Ａｎｔｐ−Ｉ６Ａ）である。
配列番号５３は、本発明のキメラペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＧＹＧＲＩＧＮＹＹＹＫ（Ａｎｔｐ−Ａ２Ｇ，Ａ４Ｇ，Ｓ９Ｙ，Ｆ１１Ｙ）である。
配列番号５４は、Ａｎｔｐ−スクランブルペプチドＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＲＫＦＳＡＡＩＧＹＮＫＹである。
配列番号５５は、ヒトＨｓｐ９０のＣ末端のアミノ酸７１９〜７３２の配列：ＬＥＧＤＤＤＴＳＲＭＥＥＶＤである。
配列番号５６は、マウスＨｓｐ９０のＣ末端のアミノ酸７２０〜７３３の配列：ＬＥＧＤＤＤＴＳＲＭＥＥＶＤである。
配列番号５７は、ラットＨｓｐ９０のＣ末端のアミノ酸７２０〜７３３の配列：ＬＥＧＤＤＤＴＳＲＭＥＥＶＤである。
配列番号５８は、ウシＨｓｐ９０のＣ末端のアミノ酸７２０〜７３３の配列：ＬＥＧＤＤＤＴＳＲＭＥＥＶＤである。
配列番号５９は、ヒトＨＯＰのＴＰＲ２Ａドメイン（アミノ酸２９６〜３２５）の配列：ＹＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＫＹＫＤＡＩＨＦＹＮＫである。
配列番号６０は、マウスＨＯＰのＴＰＲ２Ａドメイン（アミノ酸２９６〜３２５）の配列：ＹＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＫＹＫＤＡＩＨＦＹＮＫである。
配列番号６１は、ラットＨＯＰのＴＰＲ２Ａドメイン（アミノ酸２９６〜３２５）の配列：ＹＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＲＹＫＤＡＩＨＦＹＮＫである。
配列番号６２は、ウシＨＯＰのＴＰＲ２Ａドメイン（アミノ酸２９６〜３２５）の配列：ＹＲＱＩＡＫＡＹＡＲＩＧＮＳＹＦＫＥＥＫＹＫＤＡＩＨＦＹＮＫである。
配列番号６３は、Ｈｓｐ９０のＣ末端配列ＥＥＶＤである。
配列番号６４は、Ｈｓｐ９０のＣ末端配列ＭＥＥＶＤである。
配列番号６５は、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＲＡＹＡＲ（Ａｎｔｐ−ＲＡＹＡＲ）である。
配列番号６６は、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＡＡＹＡＲ（Ａｎｔｐ−ＡＡＹＡＲ）である。
配列番号６７は、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＧＹＡＲ（Ａｎｔｐ−ＫＧＹＡＲ）である。
配列番号６８は、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＬＡＲ（Ａｎｔｐ−ＫＡＬＡＲ）である。
配列番号６９は、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＫＡＹＧＲ（Ａｎｔｐ−ＫＡＹＧＲ）である。
配列番号７０は、ＫＡＹＡＡＡＧＮＳＹＴＦＫ（ＴＰＲ  変異体（ｍｕｔａｎｔ）１）である。
配列番号７１は、ＫＡＹＡＲＩＧＮＳＧＧＧ（ＴＰＲ  変異体（ｍｕｔａｎｔ）２）である。
配列番号７２は、ＲＫＦＳＡＡＩＧＹＮＫＹ（スクランブルペプチド（ＴＰＲ  ｓｃｒａｍｂｌｅ））である。
【図５】
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【図８Ａ】
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【図９】
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【図１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
2010055929.tif 000021
【図７】
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【図８Ｂ】
2010055929.tif 000023
【図８Ｃ】
2010055929.tif 000024
【図１０】
2010055929.tif 000025
【図１１】
2010055929.tif 000026
【図１２】
2010055929.tif 000027
【図１３Ａ】
2010055929.tif 000028
【図１３Ｂ】
2010055929.tif 000029
【図１５】
2010055929.tif 000030
【図１６】
2010055929.tif 000031
【図１７】
2010055929.tif 000032
【図１８】
2010055929.tif 000033
【配列表】
2010055929000001.app
【国際調査報告】
2010055929.tif 000034
2010055929.tif 000035
2010055929.tif 000036
2010055929.tif 000037
2010055929.tif 000038
2010055929.tif 000039
2010055929.tif 000040
2010055929.tif 000041
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