(57)【要約】  Ｓ．ポンベを宿主として用い、糖鎖構造を特定の構造に制御したＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を得ることのできる形質転換体、該形質転換体の製造方法、および該形質転換体を得るための宿主、ならびにＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法を提供することを目的する。  ｏｍｈ１遺伝子が欠失または失活した染色体を有するＳ．ポンベからなる宿主であって、遺伝子工学的方法により異種蛋白質をコードする遺伝子を発現させ、さらに発現した異種蛋白質に糖鎖を結合させて、特定のＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を産生させるための宿主。また、該宿主を用いた形質転換体およびその製造方法、ならびに該形質転換体を用いたＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｏｍｈ１遺伝子が欠失または失活したシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）からなる宿主であって、遺伝子工学的方法により異種蛋白質をコードする遺伝子を発現させ、さらに発現した異種蛋白質に糖鎖を結合させて、Ｏ−Ｍａｎ−Ｇａｌなるジサッカライド構造のＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を産生させるための、宿主。
【請求項２】
ｏｍｈ１遺伝子が欠失または失活したシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、異種蛋白質をコードする遺伝子を含む形質転換体。
【請求項３】
さらに、前記異種蛋白質をコードする遺伝子の５’末端に結合した前記シゾサッカロミセス・ポンベ内で機能する分泌シグナルをコードする遺伝子を含む、請求項２に記載の形質転換体。
【請求項４】
前記異種蛋白質に対応する野生型蛋白質が、Ｏ−グリコシド型糖鎖を有している蛋白質である、請求項２または３に記載の形質転換体。
【請求項５】
ｏｍｈ１遺伝子が欠失または失活したシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、異種蛋白質をコードする遺伝子を前記宿主に組み込むことを特徴とする形質転換体の製造方法。
【請求項６】
前記異種蛋白質をコードする遺伝子の５’末端側にシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）内で機能する分泌シグナルをコードする遺伝子を有する、請求項５に記載の形質転換体の製造方法。
【請求項７】
前記異種蛋白質に対応する野生型蛋白質がＯ−グリコシド型糖鎖を有している異種蛋白質である、請求項５または６に記載の形質転換体の製造方法。
【請求項８】
請求項２〜４のいずれかに記載の形質転換体を培養し、産生されたＯ−Ｍａｎ−Ｇａｌなるジサッカライド構造を有するＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を取得することを特徴とするＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法。
【請求項９】
産生されるＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質の糖鎖が、当該異種蛋白質に対応する野生型異種蛋白質の糖鎖の有無や糖鎖構造にかかわりなく、Ｏ−Ｍａｎ−Ｇａｌなるジサッカライド構造を有する、請求項８に記載のＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法。
【請求項１０】
形質転換体を培養した培養液からＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を取得する、請求項８または９に記載のＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、宿主、形質転換体およびその製造方法、ならびにＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物における分泌蛋白質等のグリコシル化は、翻訳後修飾の中でも重要な過程の一つであり、小胞体やゴルジ体に関連する様々な酵素によって管理されている。グリコシル化により蛋白質に結合される糖鎖は、マンノース（Ｍａｎ）やガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチルグルコサミン等により形成される。蛋白質に結合する糖鎖には、アスパラギン残基のアミドの窒素原子に結合するＮ−グリコシド型糖鎖と、セリン残基やトレオニン残基の水酸基の酸素原子に結合するＯ−グリコシド型糖鎖の２種類がある。このような糖鎖は、蛋白質への安定性の付与や、細胞との相互作用に影響していると言われている。そのため、医薬品製造を目的として、Ｎ−グリコシド型糖鎖が結合された蛋白質を製造する技術の開発が試みられている（例えば、特許文献１および２参照）。【０００３】
Ｎ−グリコシド型糖鎖については、様々な知見が集積されているが、Ｏ−グリコシド型糖鎖については知見が少ない。通常、生体では様々な構造を有するＯ−グリコシド型糖鎖が結合した蛋白質が産生されるが、特に医薬品の製造においては、蛋白質に結合する糖鎖の構造を特定のものに制御することが重要である。そこで、Ｏ−グリコシド型糖鎖を有する蛋白質についても、特定の糖鎖構造を有するものを高い生産性で製造する技術が求められている。【０００４】
目的の蛋白質を高い生産性で製造する方法としては、目的の異種蛋白質（宿主が本来産生しない蛋白質）をコードする遺伝子を導入した形質転換体を用いる遺伝子工学的な製造方法が広く用いられている。宿主は、真核生物由来の蛋白質を製造する場合、真核生物である微生物を用いることが最も良いと考えられており、人体に悪影響を及ぼす物質を含まない点から、酵母が多く用いられている。なかでも、分裂酵母であるシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（以下、「Ｓ．ポンベ」という。）は、シゾサッカロミセス・セレビシエ（以下、「Ｓ．セレビシエ」という。）等の出芽酵母に比べて、細胞周期や染色体の構造、ＲＮＡスプライシング等が動物細胞のものにより類似していると言われ、産生される蛋白質の翻訳後修飾も動物細胞のそれに近いと考えられている。【０００５】
Ｓ．セレビシエにおけるＯ−グリコシド型糖鎖の合成は、ＰＭＴ遺伝子ファミリーがコードするＯ−マンノシルトランスフェラーゼにより、蛋白質のセリン残基またはトレオニン残基の酸素にマンノースが結合されることにより開始される（非特許文献１および２参照）。その後、糖鎖の伸長には、ＫＴＲ遺伝子ファミリーがコードするα１，２−マンノシルトランスフェラーゼと、ＭＮＮ１遺伝子ファミリーがコードするα１，３−マンノシルトランスフェラーゼが関与している（非特許文献３参照）。
一方、Ｓ．ポンベについてはＯ−グリコシド型糖鎖の伸長に関与する遺伝子は特定されていなかった。【０００６】
Ｓ．ポンベを用いた異種蛋白質の製造については、Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターや分泌シグナル遺伝子、マルチクローニングベクター等が開発されている。しかし、Ｓ．ポンベにおけるＯ−グリコシド型糖鎖の糖鎖修飾に関与する遺伝子については、よくわかっていなかったため、これまでＯ−グリコシド型糖鎖の構造を制御することはできなかった。
以上のことから、Ｓ．ポンベを用いて特定のＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を製造する方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００４−５０１６４２号公報
【特許文献２】特表２００５−５１４０２１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Strahl-Bolsinger S, Gentzsch M and Tanner W, Biochim Biophys Acta, 1426, 297-307 (1999).
【非特許文献２】Girrbach V and Strahl S, J Biol Chem, 278, 12554-12562 (2003)
【非特許文献３】Lussier M, Sdicu M and Bussey H, Biochim Biophys Acta, 1426, 323-334 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで本発明では、Ｓ．ポンベを宿主として用い、糖鎖構造をＯ−Ｍａｎ−Ｇａｌ（異種蛋白質の酸素原子に、マンノース、ガラクトースの順に結合した糖鎖）なるジサッカライド構造に制御したＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を得ることのできる形質転換体、および該形質転換体の製造方法を提供することを目的とする。また、この形質転換体を得るためのＳ．ポンベ宿主を提供することを目的とする。
さらに、本発明では、前記形質転換体を用いたＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の宿主は、ｏｍｈ１遺伝子が欠失または失活したＳ．ポンベからなる宿主であって、遺伝子工学的方法により異種蛋白質をコードする遺伝子を発現させ、さらに発現した異種蛋白質に糖鎖を結合させて、Ｏ−Ｍａｎ−Ｇａｌなるジサッカライド構造のＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を産生させるための、宿主である。
本発明の形質転換体は、ｏｍｈ１遺伝子が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、異種蛋白質をコードする遺伝子を含む。
また、本発明の形質転換体は、さらに、前記異種蛋白質をコードする遺伝子の５’末端に結合した前記シゾサッカロミセス・ポンベ内で機能する分泌シグナルをコードする遺伝子を含むことが好ましい。
さらに、本発明の形質転換体は、前記異種蛋白質に対応する野生型蛋白質が、Ｏ−グリコシド型糖鎖を有している蛋白質であることが好ましい。【００１１】
本発明の形質転換体の製造方法は、ｏｍｈ１遺伝子が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、異種蛋白質をコードする遺伝子を前記宿主に組み込むことを特徴とする。
また、本発明の形質転換体の製造方法は、前記異種蛋白質をコードする遺伝子の５’末端側にシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）内で機能する分泌シグナルをコードする遺伝子を有することが好ましい。
さらに、本発明の形質転換体の製造方法は、前記異種蛋白質に対応する野生型蛋白質がＯ−グリコシド型糖鎖を有している異種蛋白質であることが好ましい。【００１２】
本発明のＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法は、前記形質転換体を培養し、産生されたＯ−Ｍａｎ−Ｇａｌなるジサッカライド構造を有するＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を取得することを特徴とするＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を製造する方法である。
また、本発明のＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法では、産生されるＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質の糖鎖が、当該異種蛋白質に対応する野生型異種蛋白質の糖鎖の有無や糖鎖構造にかかわりなく、Ｏ−Ｍａｎ−Ｇａｌなるジサッカライド構造を有することが好ましい。
さらに、本発明のＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法では、形質転換体を培養した培養液からＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を取得することが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のＳ．ポンベの宿主は、Ｏ−Ｍａｎ−Ｇａｌなるジサッカライド構造のＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を産生させるための宿主として有用である。
本発明のＳ．ポンベを宿主とした形質転換体によれば、糖鎖構造をＯ−Ｍａｎ−Ｇａｌなるジサッカライド構造に制御したＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を得ることができる。
また、本発明の形質転換体の製造方法によれば、糖鎖構造をＯ−Ｍａｎ−Ｇａｌなるジサッカライド構造に制御したＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質が得られる形質転換体を製造することができる。
また、本発明によれば、前記形質転換体を用いて、糖鎖構造をＯ−Ｍａｎ−Ｇａｌなるジサッカライド構造に制御したＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＫＴＲファミリーおよびｏｍｈ遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列を示した図である。
【図２】例２において細胞形態を観察した結果を示す図である。
【図３】例３における培養後の結果を示した図である。
【図４】例４における酸性ホスファターゼの分析結果を示した非変性ＰＡＧＥの写真である。（レーン１）野生型Ｓ．ポンベ、（レーン２）ｏｍｈ１変異株、（レーン３）ｏｍｈ２変異株、（レーン４）ｏｍｈ３変異株、（レーン５）ｏｍｈ４変異株、（レーン６）ｏｍｈ５変異株、（レーン７）ｏｍｈ６変異株。
【図５】例５〜１２におけるキチナーゼを分析した結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。（レーン１）Ｓ．セレビシエ、（レーン２）野生型Ｓ．ポンベ、（レーン３）ｏｍｈ１変異株、（レーン４）ｏｍｈ２変異株、（レーン５）ｏｍｈ３変異株、（レーン６）ｏｍｈ４変異株、（レーン７）ｏｍｈ５変異株、（レーン８）ｏｍｈ６変異株。
【図６】例１３〜１９において糖鎖構造を順相ＨＰＬＣにより分析した結果を示した図である。（ａ）野生型Ｓ．ポンベ、（ｂ）ｏｍｈ１変異株、（ｃ）ｏｍｈ２変異株、（ｄ）ｏｍｈ３変異株、（ｅ）ｏｍｈ４変異株、（ｆ）ｏｍｈ５変異株、（ｇ）ｏｍｈ６変異株。
【図７】例２０における糖鎖構造の順相ＨＰＬＣ分析結果を示した図である。（ａ）ｐＲＥＰ４１−ＧＦＰ、（ｂ）ｐＲＥＰ４１−ｏｍｈ１−ＧＦＰ。
【図８】例２０における細胞の観察結果を示した図である。（ａ）ノマルスキー光学系搭載観察装置、（ｂ）蛍光顕微鏡（ＧＦＰ観察）、（ｃ）蛍光顕微鏡（ＲＦＰ観察）。
【図９】例２１および２２におけるキチナーゼを分析した結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。（レーン１）Ｓ．ポンベ野生株、（レーン２）ｏｍｈ１変異株。
【図１０】例２３および２４における糖鎖構造の順相ＨＰＬＣ分析結果を示した図である。（ａ）Ｓ．ポンベ野生株、（ｂ）ｏｍｈ１変異株。
【図１１】例２５における分取精製したジサッカライドの糖鎖構造の逆相ＨＰＬＣ分析結果である。（ａ）および（ｅ）標準糖鎖、（ｂ）〜（ｄ）Ｓ．ポンベ野生株、（ｆ）〜（ｈ）ｏｍｈ１変異株。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の宿主は、ｏｍｈ１遺伝子が欠失または失活したＳ．ポンベからなる宿主であり、本発明の形質転換体を製造するための宿主として有用である。異種蛋白質をコードする遺伝子（以下、「異種蛋白質遺伝子」ともいう。）をこの宿主に導入して、本発明の形質転換体が製造される。本発明の形質転換体は、Ｏ−Ｍａｎ−Ｇａｌなるジサッカライド構造のＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を産生し、本発明の蛋白質の製造方法では、産生されたこのＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を取得する。
本発明において「異種蛋白質」とは、宿主であるＳ．ポンベが本来産生しない（野生型のＳ．ポンベが、その蛋白質をコードする遺伝子を有しない）蛋白質を意味する。異種蛋白質は、産業的価値に優れる点から、ヒトや他の哺乳動物が産生する蛋白質であることが好ましい。「異種蛋白質の対応する野生型蛋白質」とは、異種蛋白質を産生する生物（Ｓ．ポンベ以外の生物）の細胞が産生する蛋白質をいう。本発明の形質転換体が産生する異種蛋白質は、この野生型蛋白質と糖鎖が異なっていてもよい。本発明の形質転換体が産生する異種蛋白質は、Ｏ−Ｍａｎ−Ｇａｌなるジサッカライド構造の糖鎖を有するＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質であり、Ｏ−Ｍａｎ−Ｇａｌなるジサッカライド構造以外のＯ−グリコシド型糖鎖を実質的に有しない異種蛋白質である。
異種蛋白質遺伝子としては、Ｏ−グリコシド型糖鎖の構造がＯ−Ｍａｎ−Ｇａｌ（酸素原子にマンノース、ガラクトースの順に糖が結合した糖鎖構造）に制御されたＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質が安定して得られやすい点から、野生型の蛋白質がＯ−グリコシド型糖鎖を有している蛋白質（糖蛋白質）をコードする遺伝子であることが好ましい。このような異種蛋白質としては、例えば、Ｓ．ポンベが産生しないキチナーゼ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などが挙げられる。
また、本発明の形質転換体では、野生型がＯ−グリコシド型糖鎖を有さない異種蛋白質であっても、Ｎ末端に分泌シグナルを融合させることにより、発現した異種蛋白質を小胞体やゴルジ体へ輸送することができるため、アミノ酸配列や、その蛋白質の二次構造や三時構造によっては、Ｏ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を得ることができる。野生型においてＮ末端に分泌シグナルを有さない蛋白質の場合は、適当な分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列を備えたキメラ配列としてもよい。
【００１６】
（宿主）
宿主として用いるＳ．ポンベは、シゾサッカロミセス属に属する酵母であり、他の酵母に比べて特に耐酸性に優れており、細胞周期や染色体の構造、ＲＮＡスプライシング等が動物細胞のものにより類似し、産生される蛋白質の翻訳後修飾も動物細胞のそれに近いと考えられる微生物である。本発明の宿主であるＳ．ポンベは、ｏｍｈ１遺伝子を欠失または失活させた染色体を有する変異型である。この変異型のＳ．ポンベは、上記特徴を維持しており、また、この宿主に異種蛋白質遺伝子を導入して得られる形質転換体も上記特徴を維持している。
【００１７】
ｏｍｈ１遺伝子（ＳＰＢＣ１９Ｃ７．１２ｃ、アクセッション番号：Ｏ６０１６０）は、Ｓ．ポンベ内でＯ−グリコシド型糖鎖を合成する酵素（蛋白質）である後述のｏｍｈ１ｐをコードする遺伝子の一つであり、特にその合成において主要な役割を果たす酵素の遺伝子である。なお、本明細書において、アクセッション番号とは、蛋白質データベースＵｎｉｐｒｏｔ（URL：http：／／www．Uniprot．org／）の登録番号を表わす。
Ｏ−グリコシド型糖鎖の合成は、シゾサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．セレビシエ）の場合と同様、ＰＭＴ遺伝子ファミリーから発現されるＯ−マンノシルトランスフェラーゼにより開始される。この遺伝子は酵母から多細胞生物まで高度に保存されており、Ｓ．ポンベにおいてもＰＭＴ遺伝子ファミリーがコードするＯ−マンノシルトランスフェラーゼにより、蛋白質中のセリン残基やトレオニン残基にマンノースが付加される。
【００１８】
蛋白質に１つ目のマンノースが付加された後、Ｓ．セレビシエでは、前述のようにＫＴＲ遺伝子ファミリーおよびＭＮＮ１遺伝子ファミリーによりコードされているα１，２−マンノシルトランスフェラーゼとα１，３−マンノシルトランスフェラーゼが糖鎖の伸長に関わる。これに対し、Ｓ．ポンベにおけるＯ−グリコシド型糖鎖の伸長に関与する酵素の遺伝子は、これまで特定されていなかった。
【００１９】
そこで本発明者等は、Ｓ．ポンベの染色体において、Ｓ．セレビシエのＯ−グリコシド型糖鎖の伸長反応に関与するＫＴＲ遺伝子（α１，２−マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子）ファミリーと相同性の高い遺伝子（ｏｍｈ遺伝子、Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  α１，２−ｍａｎｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）を調べた。その結果、Ｓ．ポンベ内でＯ−グリコシド型糖鎖の伸長に関与する酵素の６つの遺伝子、ＳＰＢＣ１９Ｃ７．１２ｃ（ｏｍｈ１遺伝子）、ＳＰＢＣ１６Ｈ５．０９ｃ（ｏｍｈ２遺伝子、アクセッション番号：Ｏ４２９４４）、ＳＰＣＣ７７７．０７（ｏｍｈ３遺伝子、アクセッション番号：Ｏ７４５４６）、ＳＰＢＣ１７７３．０８ｃ（ｏｍｈ４遺伝子、アクセッション番号：Ｏ９４５６５）、ＳＰＢＣ３２Ｈ８．０８ｃ（ｏｍｈ５遺伝子、アクセッション番号：Ｑ９６ＷＷ１）、およびＳＰＡＣ９５９．０４ｃ（ｏｍｈ６遺伝子、アクセッション番号：Ｑ９Ｐ４Ｘ２）を見つけた。また、前記ＭＮＮ１遺伝子と相同性の高い遺伝子は、Ｓ．ポンベにおいては見つからなかった。
図１に、Ｓ．セレビシエのＫＴＲ遺伝子ファミリーのＫｒｅ２遺伝子、Ｋｔｒ１遺伝子、Ｋｔｒ３遺伝子と、ｏｍｈ１遺伝子〜ｏｍｈ６遺伝子によりコードされるそれぞれの蛋白質のアミノ酸配列の比較を示す。
【００２０】
Ｓ．セレビシエのＫＴＲ遺伝子ファミリーのＫｒｅ２遺伝子、Ｋｔｒ１遺伝子、Ｋｔｒ３遺伝子のサブファミリーに対する、ｏｍｈ１遺伝子〜ｏｍｈ５遺伝子の塩基配列の相同性は３３〜５５％である。一方、ｏｍｈ６遺伝子は、ｏｍｈ１遺伝子〜ｏｍｈ５遺伝子に比べると相同性が低い。
【００２１】
Ｋｒｅ２遺伝子がコードするα１，２−マンノシルトランスフェラーゼ（以下、「Ｋｒｅ２ｐ」という。）は、公知の様々なグリコシルトランスフェラーゼが有するＤＸＤモチーフに相当するＥＰＤ（Ｇｌｕ２４７−Ｐｒｏ２４８−Ａｓｐ２４９）部位を有している（図１）。ｏｍｈ１遺伝子〜ｏｍｈ６遺伝子がコードするα１，２−マンノシルトランスフェラーゼ（以下、それぞれ「ｏｍｈ１ｐ」〜「ｏｍｈ６ｐ」という。）もこれに相当する部位を有しており、２４９位のアスパラギン酸残基はセリン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基に変化しているものもあるが、２４７位のグルタミン酸は高度に保存されている。このことから、ｏｍｈ１ｐ〜ｏｍｈ６ｐは、Ｋｒｅ２ｐと同じ機構で糖鎖の伸長に関与していると考えられる。すなわち、Ｋｒｅ２ｐは２４７位のグルタミン酸が２価のカチオンの配位により供与体の糖ヌクレオチド（ＧＤＰ−マンノース）のリン酸基と相互作用し、２２０位のチロシン残基（図１の○印）が前記供与体の糖ヌクレオチドと、受容体の末端のマンノースとの間の糖転移に重要な役割を果たしている。ｏｍｈ１ｐ〜ｏｍｈ６ｐについても、Ｋｒｅ２ｐと同様に、チロシン残基の寄与による糖転移が行われると考えられる。
【００２２】
また、Ｋｒｅ２ｐとｏｍｈ１ｐ〜ｏｍｈ６ｐとの間では、７つのシステイン残基（図１の●印）の位置も保存されている。その他にも、多くの部位でアミノ酸配列が高度に保存されている（図１の反転部分）。このとから、ｏｍｈ１ｐ〜ｏｍｈ６ｐは、Ｋｒｅ２ｐと同様の三次元構造を有していると考えられる。
また、Ｋｒｅ２ｐにおいて前記供与体および受容体に結合して活性部位となるアミノ酸配列（ＹＮＬＣＨＦＷＳＮＦＥＩ、図１下線部）も、ｏｍｈ１ｐ〜ｏｍｈ６ｐにおいて高度に保存されていることからも、ｏｍｈ１ｐ〜ｏｍｈ６ｐはＫｒｅ２ｐと同様の機構で糖鎖伸長を行うと考えられる。
【００２３】
これらのｏｍｈ遺伝子の中でもｏｍｈ１遺伝子は、Ｏ−グリコシド型糖鎖の伸長反応において重要な役割を担っている酵素をコードしている遺伝子である。本発明の形質転換体では、ｏｍｈ１遺伝子を欠失または失活させることで、ｏｍｈ１ｐが発現せず、形質転換体が産生する異種蛋白質に結合するＯ−グリコシド型糖鎖の構造がＯ−Ｍａｎ−Ｇａｌに制御される。
これは、ｏｍｈ１遺伝子がコードするｏｍｈ１ｐ（α１，２−マンノシルトランスフェラーゼ）が、蛋白質に結合した１つ目のマンノースに対し、２つめのマンノースを結合させる反応に寄与しているためであると考えられる。すなわち、ｏｍｈ１遺伝子を欠失または失活させることにより、１つ目のマンノースに２つ目のマンノースを結合させることができなくなるため、ガラクトシルトランスフェラーゼにより１つ目のマンノースにガラクトースが結合すると考えられる。
【００２４】
ｏｍｈ１遺伝子〜ｏｍｈ６遺伝子は、いずれもＳ．ポンベの生育に必須な遺伝子ではなく、またｏｍｈ１遺伝子を失活または欠失させても細胞の表現型は特に変化しない。そのため、本発明の形質転換体は、ｏｍｈ１遺伝子を失活または欠失させているが、Ｏ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質を安定して製造することができる。
【００２５】
また、Ｓ．ポンベでは、ｏｍｈ１遺伝子を欠失または失活させた場合に、ｏｍｈ１遺伝子の機能は、ｏｍｈ２遺伝子〜ｏｍｈ６遺伝子の過剰発現によっては補われない。また、ｏｍｈ２遺伝子〜ｏｍｈ５遺伝子のいずれか１つを破壊しても、野生型と同じＯ−グリコシド型糖鎖含有蛋白質が産生されることから、これらの遺伝子がコードする酵素は、いずれも３つ目のマンノースの付加に関わっているか、もしくは糖鎖の合成に余剰の機能を有していると考えられる。
【００２６】
ｏｍｈ１遺伝子を欠失または失活させる方法としては、公知の方法を用いることができる。具体的には、Ｌａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｒｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２００６）３４：ｅ１１、および国際公開第２００７／０６３９１９号パンフレット等に記載）を用いることにより遺伝子を欠失させることができる。また、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用したランダム変異法（ピーシーアール・メソッズ・アプリケーション（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．）、１９９２年、第２巻、ｐ．２８−３３．）等により遺伝子の一部に変異を導入することにより該遺伝子を失活させることができる。
【００２７】
（形質転換体）
本発明の形質転換体は、上記本発明のｏｍｈ１遺伝子を欠失または失活した宿主に異種蛋白質遺伝子を導入することにより得られる。異種蛋白質遺伝子は、目的異種蛋白質をコードする部分以外に分泌シグナルをコードする部分を有していてもよい。この分泌シグナルをコードする部分は、異種蛋白質を産生する生物（Ｓ．ポンベ以外）の細胞において機能する分泌シグナルをコードする部分であり、その細胞内でＮ末端に分泌シグナルを有する蛋白質が発現した後、細胞内で分泌シグナル部分が削除され、その後、細胞から分泌シグナルを有していない異種蛋白質が分泌される。異種蛋白質遺伝子が分泌シグナルをコードする部分を有している場合は、その分泌シグナルは、上記本発明の宿主においても機能する必要がある。その分泌シグナルが上記本発明の宿主において機能しない場合は、その機能しない分泌シグナルの代わりに、上記宿主において機能する分泌シグナルを使用することが好ましい。
上記本発明の宿主において機能する分泌シグナルとしては、Ｓ．ポンベが有する分泌シグナルが好ましい。このＳ．ポンベが有する分泌シグナルをコードする遺伝子を異種蛋白質遺伝子の５’末端側に結合させることにより、異種蛋白質のＮ末端側にこの分泌シグナルが結合した蛋白質が発現し、次いで上記本発明の宿主内で、この分泌シグナルが削除される。Ｓ．ポンベ内で機能する分泌シグナル遺伝子としては、国際公開第９６／２３８９０号パンフレット記載の分泌シグナル遺伝子が好ましい。特に、この文献記載の分泌シグナルＰ３をコードする遺伝子を使用することが好ましい。
【００２８】
宿主を形質転換するためには、異種蛋白質遺伝子を有する発現ベクターが使用される。異種蛋白質遺伝子が宿主内で機能する分泌シグナルの遺伝子を含まない場合は、宿主内で機能する分泌シグナルの遺伝子を含むことが好ましい。なお、異種蛋白質遺伝子が宿主内で機能しない分泌シグナルの遺伝子を含む場合は、その分泌シグナルの遺伝子を除去した異種蛋白質遺伝子を使用し、代わりに宿主内で機能する分泌シグナルの遺伝子を使用することが好ましい。ベクターには、さらに通常宿主内で機能するプロモーターを含み、さらにターミネーター、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。プロモーターは、宿主であるＳ．ポンベ内で機能して異種蛋白質を発現できるものであればよい。
本発明におけるプロモーターとしては、例えば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、および特開平１０−２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。そのほか、特開平１１−１９２０９４号公報、国際公開第２００７／２６６１７号パンフレットなどに記載のＳ．ポンベ内で機能しうるプロモーターとして知られている種々のプロモーターを使用できる。
【００２９】
異種蛋白質遺伝子を有する発現ベクターを使用してＳ．ポンベを形質転換する方法は、上記公知例をはじめ種々知られており、その公知の方法を使用できる。上記以外の具体例としては、例えば、特開２０００−２６２２８４号公報、特開２００３−３１０２６９号公報、特開２００５−１９８６１２号公報などに記載のベクターやそれを用いた形質転換方法を採用できる。異種蛋白質遺伝子は、発現ベクターの形で宿主の染色体外に導入して形質転換体を得ることができるばかりでなく、発現カセットの形で宿主の染色体に導入することができる。発現カセットは、異種蛋白質遺伝子とともに上記プロモーターや分泌シグナルなどを有し、通常、相同組換え法を使用して宿主の染色体に組み込む。発現カセットを使用して染色体に異種蛋白質遺伝子を組み込む方法でＳ．ポンベを形質転換する方法としては、上記特開２０００−２６２２８４号公報に記載の方法を用いることが好ましい。発現カセットが染色体に組み込まれていれば、形質転換体の培養中に発現カセットが細胞から脱落してＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の産生能が失われることを抑制しやすい。また、発現カセットをＳ．ポンベの染色体に組み込む場合には、Ｏ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の生産性が向上する点から、組み込まれる発現カセットは２個以上であることが好ましい。
【００３０】
以上説明したようなベクターをＳ．ポンベの細胞に導入して形質転換する。形質転換した形質転換体は、前記抗生物質耐性遺伝子や栄養要求性マーカーを用いて選択することができる。
抗生物質耐性遺伝子を有するベクターを用いた場合には、その抗生物質を含有する培地を用いることにより形質転換体を選択することができる。抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。また、栄養要求性マーカーとしては、例えば、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４遺伝子）や、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）が挙げられる。
栄養要求性マーカーを用いる場合は、例えば、ｕｒａ４遺伝子を欠失または失活させてウラシル要求性としたＳ．ポンベを宿主とし、ｕｒａ４遺伝子を有する前記ベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組み込まれた形質転換体を得ることができる。
【００３１】
選択する方法としては、例えば、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。次に、それらを別々に液体培養した後、それぞれの培養液における異種蛋白質の発現量を調べ、異種蛋白質の発現量がより多い形質転換体を選択する。また、それら選択した形質転換体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組み込まれた発現カセットの数を調べることができる。
【００３２】
［Ｏ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法］
本発明のＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法は、本発明の形質転換体を培養し、該形質転換体により産生されるＯ−グリコシド型糖鎖を有する異種蛋白質を取得する方法である。
培養液には、公知の酵母培養培地を用いることができ、Ｓ．ポンベが資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、Ｓ．ポンベの培養を効率良く行えるものであればよい。
培養液としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
【００３３】
炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース等の糖、デンプン等の炭水化物が挙げられる。中でも、グルコースまたはスクロースが好ましい。
窒素源としては、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキスが挙げられる。中でも、硫酸アンモニウムまたは酵母エキスが好ましい。
無機塩類としては、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムが挙げられる。中でも、リン酸マグネシウムが好ましい。
また、培養液にはプロテオリピドが含まれていてもよい。
【００３４】
培養は、振とう培養、攪拌培養等により行うことができる。
また、培養温度は、１６〜３７℃であることが好ましく、２５〜３２℃がより好ましい。また、培養時間は適宜決定することができる。
また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。
連続培養は、例えば、一定時間培養した培養液からＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質を取得するとともに培養上清を回収し、該培養上清に再び培養液を加えて培養することを繰り返して連続的に培養する方法が挙げられる。連続培養を行うことにより、Ｏ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の生産性がより向上する。
培養液からのＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の取得は、公知の蛋白質精製方法を用いることができる。
【００３５】
以上説明したように、本発明によれば、ｏｍｈ１遺伝子が欠失または失活した染色体を有するＳ．ポンベを宿主とした形質転換体を用いることで、Ｏ−グリコシド型糖鎖がＯ−Ｍａｎ−Ｇａｌに制御されたＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質を得ることができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。また、本実施例における形質転換は、酢酸リチウム法もしくはエレクトロポレーション法（Electroporation）により行った。
［例１］クローニングおよびｏｍｈ遺伝子の破壊
選択マーカーとしてｕｒａ４を用い、ｏｍｈ１遺伝子〜ｏｍｈ６遺伝子の破壊を行った。
表１に示すセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用い、野生型Ｓ．ポンベのゲノムＤＮＡから、ｏｍｈ１遺伝子、ｏｍｈ２遺伝子、ｏｍｈ３遺伝子の一部または全部をそれぞれ含む３つのＤＮＡ断片（１．３ｋｂ、１．６ｋｂ、１．２５ｋｂ）を増幅し、サブクローニングを行った。ベクターには、ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥａｓｙベクターおよびｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。【００３７】
サブクローニング後、ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩによる制限酵素処理によりベクターのｏｍｈ１遺伝子内で切断を起こし、その位置にｕｒａ４＋カセット（１．６ｋｂ）を挿入することにより、ｏｍｈ１遺伝子を破壊したベクターを得た。同様に、制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてｏｍｈ２遺伝子を破壊したベクター、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いてｏｍｈ３遺伝子を破壊したベクターを得た。
次に、破壊されたｏｍｈ１遺伝子をそれぞれ有するベクターを直線状にしたＤＮＡ断片を用い、ウラシル合成能が欠損したＳ．ポンベのＡＲＣ０３９株（一倍体）を形質転換し、ウラシル選択培地により選択することで、破壊されたｏｍｈ１遺伝子を有するｏｍｈ１変異株を得た。破壊されたｏｍｈ２遺伝子を有するｏｍｈ２変異株、および破壊されたｏｍｈ３遺伝子を有するｏｍｈ３変異株も同様の方法で構築した。所望のｏｍｈ１変異株、ｏｍｈ２変異株、ｏｍｈ３変異株が得られていることの確認は、サザンブロット法およびＰＣＲにより行った。【００３８】
ｏｍｈ４遺伝子〜ｏｍｈ６遺伝子の破壊には、ｌｏｘＰカセットベクター（ｐＢＳ  ｌｏｘＰ−ｕｒａ４−ｌｏｘＰ、Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ， ６８，５４５−５５０（２００４）に記載）を用いた。
ｏｍｈ４遺伝子の上流側の断片を、ＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素サイトをそれぞれ有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー（表１）によりＰＣＲで増幅し、下流側の断片を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの制限酵素サイトをそれぞれ有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー（表１）によりＰＣＲで増幅した。これらの増幅断片を、それぞれ適した制限酵素により処理した後、ｐＢＳ  ｌｏｘＰ−ｕｒａ４−ｌｏｘＰベクターに挿入し、ｌｏｘＰ−ｕｒａ４−ｌｏｘＰカセットの両側にｏｍｈ４遺伝子の上流側の断片と下流側の断片がそれぞれ位置するｏｍｈ４遺伝子破壊用のベクターを得た。また、表１に示すセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用い、同様の方法で、ｏｍｈ５遺伝子破壊用のベクターおよびｏｍｈ６遺伝子破壊用のベクターを得た。
これらのベクターを直線状にしたＤＮＡ断片を用い、ウラシル合成能が欠損したＳ．ポンベのＡＲＣ０３９株（一倍体）を形質転換し、ウラシル選択培地により選択することで、それぞれｏｍｈ４変異株、ｏｍｈ５変異株、ｏｍｈ６変異株を得た。【００３９】
【表１】
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【００４０】
［例２］細胞形態の観察
例１で得られたｏｍｈ１変異株〜ｏｍｈ６変異株を、ＹＥＳ培地（５ｍｌ）にて、３０℃および３７℃でそれぞれ一晩培養した後、ノマルスキー光学系を搭載した観察装置により、それらの細胞形態を観察した。
また、比較対象として、野生型Ｓ．ポンベについても各変異株と同様の培養を行い、細胞形態を観察した。結果を図２（ａ）〜（ｇ）に示す。図２において、（ａ）が野生型Ｓ．ポンベ、（ｂ）がｏｍｈ１変異株、（ｃ）がｏｍｈ２変異株、（ｄ）がｏｍｈ３変異株、（ｅ）がｏｍｈ４変異株、（ｆ）がｏｍｈ５変異株、（ｇ）がｏｍｈ６変異株における観察結果である。【００４１】
図２に示すように、ｏｍｈ１変異株〜ｏｍｈ６変異株の全ての変異株が生育可能であり、ｏｍｈ１遺伝子〜ｏｍｈ６遺伝子は、いずれも生育に必須の遺伝子ではないことがわかった。また、ｏｍｈ１変異株〜ｏｍｈ５変異株については、ｏｍｈ１遺伝子〜ｏｍｈ５遺伝子のうちいずれか一つが破壊されていても、細胞の表現型が野生型Ｓ．ポンベと同じであった。ｏｍｈ１変異株の表現型が野生型Ｓ．ポンベと同じであることは、ｏｍｈ１遺伝子がコードするｏｍｈ１ｐが、野生型Ｓ．ポンベの通常の細胞壁の構成や機能に必須の糖鎖構造の形成には関わっていないことを示している。
一方、ｏｍｈ６変異株では、野生型とは異なる表現型を示した。【００４２】
［例３］温度依存性および抗生物質耐性（ハイグロマイシンＢ）
例２の培養後の各々の培養液を、水によりＯＤ６００が０．５（細胞数１０７個／ｍｌに相当）となるように希釈した。さらに１０倍希釈（図３中の１０−１、一番左側の列）した後、そのうち７μｌをＹＥＳ培地（寒天培地）にストリークし、３０℃（図３（ａ））、および３７℃（図３（ｃ））の条件で３日間培養した。また、同様に、２０μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（０．００５質量％）を含有するＹＥＳ培地（５ｍｌ）でも３０℃でそれぞれ一晩培養した（図３（ｂ））。また、早期に急激な増殖が見られる場合は、更に１０倍ずつ希釈していき、同様の条件で培養を行った。図３（ａ）〜（ｃ）には、各条件において、左側から順にＯＤ６００が０．５のものを１０倍ずつ希釈（１０−１、１０−２、１０−３、１０−４）したものの培養結果を示す。【００４３】
図３に示すように、ｏｍｈ１変異株、ｏｍｈ２変異株、ｏｍｈ４変異株、およびｏｍｈ５変異株は、温度やハイグロマイシンＢの影響が小さく、野生型Ｓ．ポンベと大きく変らない速度で生育することがわかった。
一方、ｏｍｈ３変異株とｏｍｈ６変異株では、３７℃での培養、およびハイグロマイシンＢを含有する培地における培養において生育速度が低下した。【００４４】
［例４］酸性ホスファターゼの分析
ｏｍｈ１変異株〜ｏｍｈ６変異株における酸性ホスファターゼへの影響を分析することにより、ｏｍｈ１ｐ〜ｏｍｈ６ｐのＮ−グリコシド型糖鎖の伸長への影響を調べた。
ＡＲＣ０３９株およびｏｍｈ１変異株〜ｏｍｈ６変異株を、それぞれＹＥＳ培地（５ｍｌ）にて３０℃でＯＤ６００が１．５となるまで培養した後、遠心分離により１．５×１０８個の細胞を得て、さらに該細胞をＭＭＰ培地（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９４，７９５−８２３（１９９１）に記載のＭＭ培地を基礎とし、リン酸水素二ナトリウムおよびフタル酸水素カリウムの代わりに１４．６ｍＭ酢酸ナトリウムを含有する培地。
）の５ｍｌに再懸濁し、３０℃で３時間温置することにより酸性ホスファターゼの産生を誘導した。
次いで、得られた細胞を遠心分離して回収し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（６２．５ｍＭ、ｐＨ６．８）にて洗浄した後、氷冷した２００μｌの溶菌液（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、０．１ｍＭジチオスレイトール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）に懸濁して懸濁液を得た。
その後、ミニビーズビーター８（Ｍｉｎｉ  Ｂｅａｄ  Ｂｅａｔｅｒ−８、バイオスペック・プロダクツ社製）を用いて、直径０．５ｍｍのガラスビーズによる前記懸濁液の攪拌（４℃、３０秒間）を５度行い、細胞溶解物を得た。細胞溶解物を６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル（非変性）にて電気泳動し、活性染色（Ｙｅａｓｔ，１８，９０３−９０４（２００１）に記載の方法）を行った。結果を図４に示す。レーン１は野生型Ｓ．ポンベ、レーン２はｏｍｈ１変異株、レーン３はｏｍｈ２変異株、レーン４はｏｍｈ３変異株、レーン５はｏｍｈ４変異株、レーン６はｏｍｈ５変異株、レーン７はｏｍｈ６変異株における電気泳動の結果である。【００４５】
図４に示すように、電気泳動における酸性ホスファターゼの移動度は、ｏｍｈ１変異株〜ｏｍｈ６変異株と野生型Ｓ．ポンベとでは変化がなく、同等であった。この結果から、ｏｍｈ１ｐ〜ｏｍｈ６ｐは、Ｎ−グリコシド型糖鎖の伸長には関与していないことがわかった。【００４６】
＜異種発現した出芽酵母キチナーゼ（分泌蛋白質）の糖鎖構造解析（１）＞
［例５］
Ｓ．セレビシエのキチナーゼ（Ｃｔｓ１）遺伝子［５’末端側にＳ．セレビシエの分泌シグナル遺伝子を含有］とＳ．ポンベのｎｍｔ１プロモーターとを有するベクターｐＲＥＰ４１−ＳｃＣＴＳ１（文献：N. Tanaka et al., Biochem Biophys Res Commun (2005) 330:813-820.参照）を使用してｏｍｈ１変異株を形質転換（文献：T. Morita and K. Takegawa, Yeast (2004) 21:613-617.、および特開2005-198612号公報参照）した。次いで、ロイシンを含有していないＭＭ培地（５ｍｌ）を用いて定常期まで培養し、キチナーゼの発現培地（ＭＭ培地を基礎とし、２％（ｗ／ｖ）グルコースの代わりに０．１％（ｗ／ｖｖ）グルコースおよび２％（ｗ／ｖ）フルクトースを含有する。）の１０ｍｌに移して３０℃で３時間温置した。その後、培地の上澄みからキチナーゼを回収し、６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ（Sodium dodecyl sulfate）−ＰＡＧＥ（Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis）にてＯ−グリコシド型糖鎖の伸長を分析した。
培地からのキチナーゼの回収は、以下に示すように行った。培地にキチンビーズ（２０ｍｇ、シグマ）を加えた後、４℃で１２時間撹拌し、遠心してペレットとした。該ペレットをナトリウム緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ）で３回洗浄し、ＳＤＳサンプル緩衝液（５０μｌ）で５分間ボイル（ｂｏｉｌ）することによりキチナーゼを抽出した。ゲルの染色は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０により行った。【００４７】
［例６〜１２］
野生型Ｓ．ポンベ（例６）、ｏｍｈ２変異株〜ｏｍｈ６（例７〜１１）変異株について、例５と同様の方法でキチナーゼの分析を行った。また、Ｓ．セレビシエ（例１２）をＹＰＤ培地（１０ｍｌ）にて３０℃で培養し、例５と同様にして６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにてキチナーゼを分離した。結果を図５に示す。レーン１はＳ．セレビシエ、レーン２は野生型Ｓ．ポンベ、レーン３はｏｍｈ１変異株、レーン４はｏｍｈ２変異株、レーン５はｏｍｈ３変異株、レーン６はｏｍｈ４変異株、レーン７はｏｍｈ５変異株、レーン８はｏｍｈ６変異株における電気泳動の結果である。キチナーゼの分子量は、８３ｋＤａと１７５ｋＤａのマーカーを用いて決定した。【００４８】
図５に示すように、野生型Ｓ．ポンベ（例６、レーン２）およびＳ．セレビシエ（例１２、レーン１）におけるキチナーゼは、ほぼ同等の移動度（分子量約１３０ｋＤａに相当）であった。また、ｏｍｈ２変異株〜ｏｍｈ６変異株（例７〜例１１、レーン４〜８）におけるキチナーゼについても移動度は影響を受けず、Ｓ．セレビシエのキチナーゼとほぼ同等であった。これに対し、ｏｍｈ１変異株（例５、レーン３）においては、キチナーゼの分子量が約１００ｋＤａとなり、Ｏ−グリコシド型糖鎖の伸長が著しく損なわれていた。この結果から、ｏｍｈ１遺伝子が、Ｏ−グリコシド型糖鎖の伸長に深く関わっていることが確認された。【００４９】
次に、Ｏ−グリコシド型糖鎖の構造に関する更なる情報を得るため、野生型Ｓ．ポンベおよびｏｍｈ１変異株〜ｏｍｈ６変異株で得られた糖蛋白質（Ｏ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質）の糖鎖をヒドラジン分解し、ピリジルアミノ（ＰＡ）化してＨＰＬＣ（High performance liquid chromatography)により分析を行った。
［例１３］
ＹＥＳ培地によりｏｍｈ１変異株を３０℃で定常期まで培養し、そこから細胞表面のガラクトマンナンを抽出し、凍結乾燥状態のガラクトマンナンを得た（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１８５，４４０−４７０（１９９０）に記載の方法）。次に、凍結乾燥状態のガラクトマンナン２ｍｇを無水ヒドラジン０．２ｍｌとともに６０℃で６時間加熱し、ヒドラジンを蒸発させ、カチオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ−ｘ２（Ｈ＋））に通してナトリウムイオンを除去した。次に、得られたサンプルをピリジルアミノ化剤（２０μｌ）とともに９０℃で６０分加熱し、還元剤（２０μｌ）を加えて８０℃で３５分加熱することにより、糖鎖の還元末端に２−アミノピリジンを付加した。余分なピリジルアミノ化剤および還元剤は、フェノール／クロロホルム（体積比は５０／５０）抽出により除去した。
次に、得られたサンプルについて順相ＨＰＬＣ分析（カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×５０ｍｍ）、昭和電工社製）を行った。糖鎖の分子サイズは、ＰＡ（ピリジルアミノ）ラベルした標準マーカーであるＰＡ化マンノース、ＰＡ化マルトース、ＰＡ化イソマルトオリゴ糖（タカラバイオ社製）により決定した。【００５０】
［例１４〜１９］
野生型Ｓ．ポンベ（例１４）およびｏｍｈ２変異株〜ｏｍｈ６変異株（例１５〜１９）についても例１３と同様にして糖鎖の順相ＨＰＬＣ分析を行った。また、例１４では、検出された５つの主要なピークを回収し、ジャック豆αマンノシダーゼやコーヒー豆αガラクトシダーゼによる処理後、それらのピークがどのように変化するかを調べ、それら５つのピークにそれぞれ相当する糖鎖構造を確認した。
例１３〜１９の順相ＨＰＬＣ分析の結果を図６に示す。図６において、（ａ）は野生型Ｓ．ポンベ、（ｂ）はｏｍｈ１変異株、（ｃ）はｏｍｈ２変異株、（ｄ）はｏｍｈ３変異株、（ｅ）はｏｍｈ４変異株、（ｆ）はｏｍｈ５変異株、（ｇ）はｏｍｈ６変異株における順相ＨＰＬＣ分析の結果である。【００５１】
図６（ａ）に示すように、野生型Ｓ．ポンベでは、５つの主要なピーク（２Ｇ、２Ｍ、３Ｇ、３Ｍ、４ｉ）が確認された。ピーク２ＧはＧａｌ−Ｍａｎ−ＰＡ、ピーク２ＭはＭａｎ−Ｍａｎ−ＰＡ、ピーク３ＧはＧａｌ−Ｍａｎ−Ｍａｎ−ＰＡ、ピーク３ＭはＭａｎ−Ｍａｎ−Ｍａｎ−ＰＡであった。また、ピーク４ｉは４つの糖を有する糖鎖の混合物であった。
ｏｍｈ２変異株〜ｏｍｈ６変異株（図６（ｃ）〜（ｇ））における糖鎖は、野生型Ｓ．ポンベのもの（図６（ａ））とほぼ同等であり、変化がなかった。【００５２】
これに対し、ｏｍｈ１変異株では３つ以上の糖を有する糖鎖の量が極端に少なくなっており、そのほとんどがピーク２Ｇとなっていた（図６（ｂ））。また、ｏｍｈ１変異株で得られたピーク２Ｇをジャック豆αマンノシダーゼおよびコーヒー豆αガラクトシダーゼにより処理したところ、αマンノシダーゼによる処理では分解されず、αガラクトシダーゼにより分解されて、全てＭａｎ−ＰＡ（図６（ａ）のピークＭ１に相当）となった。
これらの結果から、ｏｍｈ１変異株では、１つ目のマンノースにα１，２結合で２つ目のマンノースが結合することが抑制されており、ｏｍｈ１遺伝子がＯ−グリコシド型糖鎖の伸長に重要な役割を果たしていることが示された。【００５３】
［例２０］
ｏｍｈ１遺伝子を、野生型Ｓ．ポンベのゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩの切断部位を導入して、それら制限酵素により処理した後、ベクターｐＲＥＰ４１−ＧＦＰ（ｐＲＥＰ４１から得たベクターｐＴＮ１９７、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ，１２，３９５５−３９７２（２００１）に記載）の相当する部位に挿入してクローニングすることにより、Ｃ末端にＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）が結合したｏｍｈ１ｐを発現する遺伝子を有するベクターｐＲＥＰ４１−ｏｍｈ１−ＧＦＰを得た。また、Ｙｅａｓｔ，１８，７４５−７５７（２００１）に記載の方法により、ＲＦＰ（赤色蛍光蛋白質）が結合したＧｍｓ１ｐ（Ｇｍｓ１遺伝子によりコードされるＵＤＰガラクトース輸送体）を発現する遺伝子を有するベクターｐＡＵ−Ｇｍｓ１−ＲＦＰを得た。【００５４】
ｏｍｈ１変異株を、ｐＲＥＰ４１−ＧＦＰまたはｐＲＥＰ４１−ｏｍｈ１−ＧＦＰで形質転換したものを、ロイシンを含有しないＭＭ培地により３０℃で定常期まで培養した。これを例１３と同様の方法で順相ＨＰＬＣ分析した結果を図７（ａ）（ｐＲＥＰ４１−ＧＦＰ）および（ｂ）（ｐＲＥＰ４１−ｏｍｈ１−ＧＦＰ）に示す。
また、ｏｍｈ１変異株を、ｐＲＥＰ４１−ｏｍｈ１−ＧＦＰまたはｐＡＵ−Ｇｍｓ１−ＲＦＰで形質転換したものを、ウラシルおよびロイシンを含有しないＭＭ培地により３０℃で培養した。その後、回収した細胞（ＯＤ６００＝０．５）を観察した。その結果を図８（ａ）〜（ｃ）に示す。図８（ａ）はノマルスキー光学系を搭載した観察装置により観察したもの、図８（ｂ）は蛍光顕微鏡によりｐＲＥＰ４１−ＧＦＰを観察したもの、図８（ｃ）はｐＡＵ−Ｇｍｓ１−ＲＦＰを観察したものである。【００５５】
図７（ａ）に示すように、ｐＲＥＰ４１−ＧＦＰを含むｏｍｈ１変異株では、確認されたピークは例１３と同様であり、３つ以上の糖を有する糖鎖は、ほとんど合成されていなかった。一方、図７（ｂ）に示すように、ｐＲＥＰ４１−ｏｍｈ１−ＧＦＰを含むｏｍｈ１変異株では、例１４の野生型Ｓ．ポンベと同様の５つの主要なピークが確認された。これは、導入したベクターからｏｍｈ１ｐが発現することで、１つ目のマンノースに２つ目のマンノースが結合することができるようになったためである。【００５６】
また、図８（ａ）〜（ｃ）に示すように、ｏｍｈ１ｐ−ＧＦＰ（ＧＦＰが結合したｏｍｈ１ｐ）は、Ｇｍｓ１ｐ−ＲＦＰ（ＲＦＰが結合したＧｍｓ１ｐ）と同じ場所に局在していた。Ｇｍｓ１ｐは、糖鎖の合成に必要なガラクトースを輸送する蛋白質であり、この結果からも、ｏｍｈ１遺伝子がＯ−グリコシド型糖鎖の合成に関与していることが確認された。【００５７】
＜異種発現した出芽酵母キチナーゼの糖鎖構造解析（２）＞
［例２１］
Ｓ．セレビジエのキチナーゼ（Ｃｔｓ１）遺伝子とＳ．ポンベのインベルターゼプロモーターとシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列とを有するベクターｐＦＭ１−１−ＳｃＣｔｓ１を使用して、Ｓ．ポンベの野生株を形質転換し、ロイシンを含有していないＭＭ培地（ただし、２％（ｗ／ｖ）グルコースの代わりに８％（ｗ／ｖ）グルコースを含有する。）１００ｍｌで定常期まで培養し、キチナーゼの発現培地（ＭＭ培地を基礎とし、２％（ｗ／ｖ）グルコースの代わりに０．０５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび３％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する。）の１００ｍｌに移して、３０℃で１２時間震盪培養を行った。その後、培地の上澄みからキチナーゼを回収し、６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにてキチナーゼの精製度を確認した。培地からのキチナーゼの回収は、以下のようにして行った。培地にキチン（４００ｍｇ、和光純薬社製）を加えた後、４℃で１２時間撹拌し、遠心してペレットとした。ペレットをナトリウム緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ）で３回洗浄し、ＳＤＳサンプル緩衝液（６３ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．００２％（ｗ／ｖ）ＢＰＢ、１ｍｌ）で５分間ボイルすることによりキチナーゼを抽出した。ゲルの染色はＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０により行った。【００５８】
［例２２］
ｏｍｈ１変異株について、例２１と同様の方法でキチナーゼの解析を行った。
例２１および２２の結果を図９に示す。レーン１は野生株Ｓ．ポンベ、レーン２はｏｍｈ１変異株の結果を示す。【００５９】
図９に示すように、レーン１およびレーン２において単一バンドが検出されており、Ｓ．ポンベ野生株およびｏｍｈ１変異株から回収したキチナーゼは、ともに単一タンパク質として精製されたことが確認された。また、例６（図５、レーン２）と同様に、ｏｍｈ１変異株では分子量の減少が見られた。【００６０】
次に、Ｏ−グリコシド型糖鎖の構造に関する更なる情報を得るため、Ｓ．ポンベ野生株およびｏｍｈ１変異株から精製したキチナーゼ（Ｏ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質）の糖鎖をヒドラジン分解により遊離し、還元末端をピリジルアミノ（ＰＡ）化してＨＰＬＣにより分析を行った。【００６１】
［例２３］
例２１においてキチンから抽出したキチナーゼからＳＤＳを除去するために、ＭｉｌｌｉＱ水（超純水）に対して透析を行った後、凍結乾燥を行った。Ｓ．ポンベ野生株から１ｍｇの凍結乾燥粉末を得た。
次に、凍結乾燥粉末のキチナーゼ０．３ｍｇをヒドラクラブＣ−２０６（Ｊオイルミルズ社製）を用いてヒドラジン分解を行った。次に、得られた遊離糖鎖サンプルをピリジルアミノ化剤（２０μｌ）とともに９０℃で６０分加熱し、次いで還元剤（２０μｌ）を加えて、８０℃で３５分加熱することにより、糖鎖の還元末端に２−アミノピリジンを付加した。余分なピリジルアミノ化剤および還元剤はフェノール／クロロホルム（体積比は５０／５０）抽出により除去した。
次に、得られたサンプルについて、順相ＨＰＬＣ分析（カラム：Ａｍｉｄｅ−８０  ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×７５ｍｍ）、東ソー社製）を行った。糖鎖の分子サイズは、ＰＡラベルした標準マーカーであるＰＡ化マンノース、ＰＡ化マルトース、ＰＡ化イソマルトオリゴ糖（タカラバイオ社製）により決定した。【００６２】
［例２４］
例２２においてキチンから抽出したキチナーゼからＳＤＳを除去するために、ＭｉｌｌｉＱ水に対して透析を行った後、凍結乾燥を行った。ｏｍｈ１変異株から０．５ｍｇの凍結乾燥粉末を得た。その後、例２３と同様にして、順相ＨＰＬＣ分析を行った。
例２３および２４の順相ＨＰＬＣ分析の結果を図１０に示す。図１０において、（ａ）はＳ．ポンベ野生株、（ｂ）はｏｍｈ１変異株の結果を示す。【００６３】
図１０（ａ）に示すように、Ｓ．ポンベ野生株では、主にジサッカライド（図１０の（Ｈｅｘ）２−ＰＡ）、テトラサッカライド（図１０の（Ｈｅｘ）４−ＰＡ）に相当するピークが確認された。これに対し、図１０（ｂ）に示すように、ｏｍｈ１変異株では、ほぼジサッカライドに相当するピークのみが確認された。【００６４】
［例２５］
Ｓ．ポンベ野生株（例２３）およびｏｍｈ１変異株（例２４）で確認されたジサッカライドのピークの構造を詳細に分析するために、ジサッカライドのピークを分取精製し、逆相ＨＰＬＣ分析（カラム：ＯＤＳ−８０Ｔｓ  ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）、東ソー社製）を行った。また、分取精製したジサッカライドに対してα−ガラクトシダーゼ（シグマ社製Ｇ８５０７、コーヒー豆由来）による消化、α−マンノシダーゼ（シグマ社製Ｍ７２５７、ジャック豆由来）による消化を行った後に、同様に逆相ＨＰＬＣ分析を行った。
逆相ＨＰＬＣ分析の結果を図１１に示す。図１１の（ａ）と（ｅ）は標準糖鎖であるＭａｎ−ＰＡとＭａｎ−Ｍａｎ−ＰＡ（Ｍａｎα１−２Ｍａｎ−ＰＡ）の保持時間を示す。また、図１１（ｂ）〜（ｄ）はＳ．ポンベ野生株の分析結果、図１１（ｆ）〜（ｈ）はｏｍｈ１変異株の分析結果を示しており、図１１の（ｂ）および（ｆ）が分取精製後、（ｃ）および（ｇ）がα−ガラクトシダーゼ消化後、（ｄ）および（ｆ）がα−マンノシダーゼ消化後の分析結果である。【００６５】
図１１（ｂ）、および（ｆ）に示すように、Ｓ．ポンベ野生株およびｏｍｈ１変異株のジサッカライドは、主に単一ピークからなることが確認され、Ｍａｎα１−２Ｍａｎ−ＰＡの標準糖鎖の保持時間とは異なることが確認された。また、両株のジサッカライドサンプルは、α−マンノシダーゼによる処理では分解されず（図１１の（ｄ）と（ｈ））、α−ガラクトシダーゼにより分解されて全てＭａｎ−ＰＡとなった（図１１の（ｃ）と（ｇ））。
これらの結果から、Ｓ．ポンベ野生株で発現させたキチナーゼのジサッカライドが主にＯ−Ｍａｎ−Ｇａｌからなること、ｏｍｈ１変異株で発現させたキチナーゼの全ての糖鎖がＯ−Ｍａｎ−Ｇａｌからなることが示され、異種タンパク質発現時にも、その糖鎖構造が細胞表面のガラクトマンナンと同様の糖鎖構造からなることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の形質転換体は、結合するＯ−グリコシド型糖鎖の構造を制御した異種蛋白質を製造することができる。そのため、該形質転換体を用いたＯ−グリコシド型糖鎖含有異種蛋白質の製造方法は、医療分野等に好適に使用できる。
なお、２００８年１０月１日に出願された日本特許出願２００８−２５６３５４号、及び２００９年５月１５日に出願された日本特許出願２００９−１１９２８０号の明細書、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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