(57)【要約】  【課題】ヒトＧＰＲ８７に対するモノクローナル抗体の提供。悪性腫瘍の新規な診断・治療手段の提供。  【解決手段】ヒトＧＰＲ８７に対するモノクローナル抗体を提供する。この抗体は、細胞膜上に立体構造を保持した状態で発現したヒトＧＰＲ８７を認識でき、エピトープが、ヒトＧＰＲ８７全長のうち、細胞外領域に存在し、かつ細胞に内在性に発現するＧＰＲ８７を認識できる。従って、ＧＰＲ８７の生化学的解析などに有用なほか、扁平上皮癌の免疫組織学的診断などにも有用であり、また、扁平上皮癌のＰＥＴ診断、治療用抗体などにも有用な可能性がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその部分ペプチドに対するモノクローナル抗体。
【請求項２】
ＡＤＣＣ活性（抗体依存性細胞障害活性）を有する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
細胞に内在性に発現する前記タンパク質を認識する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
配列番号２〜５のいずれかのアミノ酸配列に存在するエピトープを認識する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列に存在するエピトープを認識する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
配列番号６記載のアミノ酸配列に存在するエピトープを認識する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
ＩｇＧ１である請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−６６８、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−６６９、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−６７３のいずれかのハイブリドーマにより産生された抗体である請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
下記（１）〜（３）のいずれかである請求項１記載のモノクローナル抗体。
（１）Ｈ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列にそれぞれ配列番号２０、２１、２２に記載の配列を有し、Ｌ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列にそれぞれ配列番号２３、２４、２５に記載の配列を有する抗体。
（２）Ｈ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列にそれぞれ配列番号２６、２７、２８に記載の配列を有し、Ｌ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列にそれぞれ配列番号２９、３０、３１に記載の配列を有する抗体。
（３）Ｈ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列にそれぞれ配列番号３２、３３、３４に記載の配列を有し、Ｌ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列にそれぞれ配列番号３５、３６、３７に記載の配列を有する抗体。
【請求項１０】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−６６８、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−６６９、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−６７３のいずれかのハイブリドーマ。
【請求項１１】
請求項１記載のモノクローナル抗体を含有する医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１記載のモノクローナル抗体を含有する腫瘍診断剤。
【請求項１３】
ＰＥＴ用腫瘍診断剤である請求項１２記載の腫瘍診断剤。
【請求項１４】
請求項１記載のモノクローナル抗体を含有する抗腫瘍剤。
【請求項１５】
前記モノクローナル抗体が、抗腫瘍剤又は放射性同位元素によって化学的又は遺伝子工学的に修飾されている請求項１４記載の抗腫瘍剤。
【請求項１６】
請求項１記載のモノクローナル抗体を用いる腫瘍診断方法。
【請求項１７】
放射性同位元素で標識化した前記抗体を用いてＰＥＴ診断を行う手順を含む請求項１６記載の腫瘍診断方法。
【請求項１８】
請求項１記載のモノクローナル抗体を有効量投与する腫瘍治療方法。
【請求項１９】
前記腫瘍が皮膚癌、頭頚部癌、肺癌、食道癌、子宮頚癌、子宮癌、膵臓癌、乳癌、腎癌、尿管癌、膀胱癌のいずれかである請求項１８記載の腫瘍治療方法。
【請求項２０】
前記腫瘍が皮膚の有棘上皮癌、基底細胞癌、又はメラノーマ、舌癌、咽頭の扁平上皮癌又は悪性リンパ腫、喉頭の扁平上皮癌、肺の扁平上皮癌又は小細胞癌、食道の扁平上皮癌、子宮頚の扁平上皮癌、子宮腺癌、膀胱の移行上皮癌又は扁平上皮癌、腎盂又は尿管の移行上皮癌のいずれかである請求項１８記載の腫瘍治療方法。
【請求項２１】
抗腫瘍剤製造のための、配列番号１のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその部分ペプチドに対するモノクローナル抗体の使用。
【請求項２２】
配列番号１のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその部分ペプチドに対するモノクローナル抗体の作製方法であって、
ＤＮＡ免疫及び／又は細胞免疫を行う手順を少なくとも含むモノクローナル抗体の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＧＰＲ８７（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ８７）に対するモノクローナル抗体、それらの作製方法、ハイブリドーマ、腫瘍診断薬、抗腫瘍剤、腫瘍診断・治療方法、その抗体の使用などに関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍（がん、肉腫など）は、異常細胞の浸潤性増殖や転移により、生体の生命維持に重大な支障を引き起こす疾患であり、罹患した際の死亡率が非常に高い疾患である。一般的には、結腸がん、乳がん、胃がん、肺がん、骨肉腫などのように、発生した臓器・組織ごとに分類されることが多い。組織学的には、腺癌、扁平上皮癌、移行上皮癌、未分化癌などに分類される。【０００３】
各研究機関などにおいて、各種悪性腫瘍に対する有効な診断・治療技術の開発が進められている。しかし、多くの悪性腫瘍で、有効な診断・治療技術は確立されていない。【０００４】
扁平上皮癌は、扁平上皮の細胞又は扁平上皮化生した細胞が悪性腫瘍化した癌である。口腔、舌、声帯、食道、気管・気管支、肺、咽頭、喉頭、女性の外陰、膣、子宮頚部、子宮膣部、皮膚、肛門などの癌でみられ、比較的発生頻度が高い。例えば、肺癌の３０％程度、食道癌の９０％程度が扁平上皮癌である。また、子宮癌の８０％近くが子宮頚癌であり、そのほとんどが扁平上皮癌である。【０００５】
移行上皮癌は、移行上皮組織に由来する細胞が悪性腫瘍化した癌である。腎盂・尿管、膀胱などの癌で見られる。【０００６】
腺癌は、腺組織に由来する細胞が悪性腫瘍化した癌である。乳腺、胃、大腸、肺、胆嚢・胆管、腎臓、前立腺、十二指腸、膵臓、卵巣、子宮、膣などの癌で見られる。【０００７】
皮膚癌では基底細胞癌、有棘細胞癌（扁平上皮癌）、悪性黒色腫（メラノーマ）の順で出現頻度が高い。頭頚部癌のうち、舌癌では扁平上皮癌がほとんどであり、咽頭癌では扁平上皮癌及び悪性リンパ腫の出現頻度が高く、喉頭癌では扁平上皮癌がほとんどである。肺癌では腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌の順で出現頻度が高い。食道癌では扁平上皮癌がほとんどであり、胃癌・大腸がんでは腺癌がほとんどであり、膵臓癌では管状腺癌がほとんどである。子宮癌では腺癌がほとんどであり、子宮頚癌では扁平上皮癌がほとんどであり、乳癌では腺癌がほとんどである。腎癌・尿管癌では腎細胞癌（腺癌）、腎盂・尿管癌（移行上皮癌）の順で出現頻度が高く、膀胱癌ではほとんどが移行上皮癌であり、一部が扁平上皮癌などである。【０００８】
各癌の診断は、病理組織学的検査（生検、細胞診、組織診など）、ＣＴ（コンピュータ断層撮影）、ＰＥＴ（ポジトロン断層法）、超音波内視鏡検査などにより行われているが、浸潤・転移の有無、癌部・非癌部の境界の明瞭化など、より高精度な診断技術が確立されることが好ましい。また、各扁平上皮癌の治療においても、罹患者に対し、手術療法、化学療法、放射線療法などが施されるが、多くのケースで充分な治療効果は得られていない。【０００９】
ＧＰＣＲ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；Ｇタンパク質共役型受容体）は、７回膜貫通領域を有する膜タンパク質であり、１，０００種類近くのスーパーファミリーを形成すると推測されている。リガンドは、外来刺激(光・匂い・味・フェロモン)、脂質、ホルモン、オータコイド、神経伝達物質、ヌクレオチドなど、多種多様である。なお、現在市販されている薬の半数以上がＧＰＣＲに作用すると考えられている。【００１０】
ＧＰＲ８７（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ８７）は、ＧＰＣＲファミリーに属するタンパク質であり、一部のＰ２Ｙ受容体タンパク質の遺伝子と相同性があるが、機能などはほとんど分かっていない。非特許文献１では、ＥＳＴデータマイニングにより、ＧＰＲ８７遺伝子を同定したことが報告された。非特許文献２では、ＧＰＲ８７のリガンドがリゾホスファチジン酸であることが、報告された。【００１１】
マイクロアレイ解析によって、ＧＰＲ８７が、ＲＮＡ転写レベルにおいて、ヒト正常組織では、皮膚、胎盤、ヒト正常細胞では、小気道上皮細胞、気管支・気管上皮細胞、表皮角化細胞、ヒト前立腺上皮細胞、癌組織では、肺癌（扁平上皮癌）、膵臓癌、癌セルラインでは、ヒト食道癌由来細胞株、ヒト胃癌由来細胞株、ヒト膵臓癌由来細胞株、ヒト肺癌由来細胞株、ヒト卵巣癌由来細胞株、ヒト子宮頚癌由来細胞株で、それぞれ比較的高発現していることが公知である。【００１２】
非特許文献３では、ＧＰＲ８７が肺の扁平上皮癌で高発現していることが報告された。非特許文献４では、ＧＰＲ８７が、肺扁平上皮癌、肺腺癌、頭頚部癌、咽頭扁平上皮癌、喉頭扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、子宮頚部扁平上皮癌で発現しており、癌細胞の生存能力に寄与している可能性があることが報告された。【００１３】
特許文献１には、リアルタイムＰＣＲにより取得したＧＰＲ８７の発現プロファイルが開示されている。なお、同文献には、抗ＧＰＲ８７モノクローナル抗体、そのキメラ抗体、その一本鎖抗体などについて一部言及されているが、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの実際の樹立については開示されていない。【００１４】
特許文献２には、がん治療用の抗ＧＰＲ８７抗体が開示されている。なお、同文献には、抗ＧＰＲ８７モノクローナル抗体、その改変抗体、そのキメラ抗体、そのヒト化抗体などについて言及されている。しかし、同グループが実際に作製・使用した抗体はウサギのポリクローナル抗体のみであり、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの実際の樹立については開示されていない。【００１５】
現在までに、抗ＧＰＲ８７抗体は、Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社（ドイツ）、Ａｂｃａｍ社（イギリス）、ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社（アメリカ）、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社（アメリカ）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（アメリカ）、ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（アメリカ）、ＧｅｎｅＴｅｘ社（アメリカ）、ＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（アメリカ）、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社（アメリカ）、Ｉｍｇｅｎｅｘ社（アメリカ）などから販売されている。これらの抗体のいくつかは、非特許文献３、非特許文献４中の実験でも使用されている。しかし、これらの抗体は、いずれもウサギのポリクローナル抗体である。現在まで、抗ＧＰＲ８７モノクローナル抗体を実際に作製したという報告はない。【００１６】
その他、非特許文献５には、ＤＮＡ免疫について記載されている。非特許文献６及び７には、モノクローナル抗体作製方法の例が記載されている。非特許文献８にはキメラ抗体について、非特許文献９にはヒト化抗体について、非特許文献１０及び１１にはｓｃＦｖについて、それぞれ記載されている。なお、非特許文献５〜１１は、引用することにより本出願に組み込まれるものとする。また、これらの文献の引用は、本発明の先行技術であることを自認するためのものではない。
【特許文献１】国際公開第２００４／０８２５７２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００８／０３１８４２号パンフレット
【非特許文献１】T. Wittenberger et al, “An ExpressedSequence Tag (EST) Data Mining Strategy Succeeding in the Discovery of NewG-Protein Coupled Receptors”; J. Mol.Biol. (2001) 307,799-813
【非特許文献２】K. Tabata et al, “The orphan GPCR GPR87 wasdeorphanized and shown to be a lysophosphatidic acid receptor”; Biochemical and Biophysical Research Communications 363 (2007)861-866
【非特許文献３】M. Gugger et al, “GPR87 is an overexpressedG-protein coupled receptor in squamous cell carcinoma of the lung”; Disease Markers 24 (2008) 41-50
【非特許文献４】S. Glatt et al, “hGPR87 contributes toviability of human tumor cells”; Int. J. Cancer 122,2008-2016 (2008)
【非特許文献５】K. K. Peachman et al, “Immunization with DNAthrough the skin”; Methods 31 (2003) 232-242
【非特許文献６】G. Galfre and C. Milstein, “Preparation ofMonoclonal Antibodies: strategies and Procedures”;Methods in Enzymology 73 (1981） 3-46
【非特許文献７】St. Groth et al, “Production of MonoclonalAntibodies: Strategy and Tactics”; Journal ofImmunological Methods 35 (1980) 1-21
【非特許文献８】S. L. Morrison et al, “Chimeric human antibody molecules: Mouseantigen-binding domains with human constant region domains”; Proc. Natl. Acad.Sci. USA 81 (1984) 6851-6855
【非特許文献９】M. Verhoeyen et al, “Reshaping human antibodies: Grafting an antilysozymeactivity”; Science 239 (1988) 1534-1536
【非特許文献１０】RE Bird et al, “Single-chain antigen-binding proteins” Science 242(1988) 423-426
【非特許文献１１】J. S. Huston et al, “Protein engineering of antibody binding sites:recovery of specific activity in an antidigoxin single-chain Fv analogueproduced in Escericia coli”; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、ヒトＧＰＲ８７に対するモノクローナル抗体を提供すること、悪性腫瘍の新規な診断・治療手段を提供することなどを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、ＤＮＡ免疫と細胞免疫を組み合わせてマウスに免疫を行った結果、ヒトＧＰＲ８７に対する抗体を産生するハイブリドーマの樹立に成功した。【００１９】
そこで、本発明では、ＧＰＲ８７（配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質）又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはその部分ペプチドに対するモノクローナル抗体を提供する。【００２０】
本発明者らは、ＧＰＲ８７の部分ペプチドを用いた免疫ではなく、ＤＮＡ免疫及び細胞免疫で免疫を行った。即ち、抗原が細胞膜上に発現した状態で免疫を行った。従って、これらの抗体は、細胞膜上に立体構造を保持した状態で発現したＧＰＲ８７を認識できる。【００２１】
また、本発明者らは、ＤＮＡ免疫及び細胞免疫により、抗原が細胞膜上に発現した状態で免疫を行った。従って、これらの抗体は、ＧＰＲ８７全長のうち、膜貫通領域や細胞内領域ではなく、細胞外領域を認識できる。【００２２】
加えて、ＧＰＲ８７を強制発現させた細胞だけでなく、細胞に内在性に発現するＧＰＲ８７を認識できる抗体、即ち、抗原に対する親和性の高い抗体の作製に成功した。【００２３】
一方、癌組織切片の免疫染色を行った結果、これらの抗体が、扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌などの癌組織を癌特異的に染色できることがわかった。【００２４】
従って、本発明に係る抗体は、ＧＰＲ８７の生化学的解析などに有用なほか、各種癌の免疫組織学的診断などにも有用であり、また、各種癌のＰＥＴ診断、抗体医薬などにも有用な可能性がある。【００２５】
その他、一般的に、モノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体と比較して、エピトープが単一であり抗原特異性が高い、化学構造を厳密に定義できる、高純度かつ安定的な大量生産が可能である、抗体改変が可能である、改変抗体の大量生産が可能である、などの点で有利性がある。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、ヒトＧＰＲ８７に対するモノクローナル抗体を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
＜ＧＰＲ８７のアミノ酸配列について＞
ＧＰＲ８７の全長のアミノ酸配列（３５８アミノ酸）を配列番号１に示す。本発明において、「ＧＰＲ８７」は、配列番号１のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、及び、配列番号１のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。ここで、「実質的に同一」とは、アミノ酸配列が、少なくとも８０％以上、さらに好適には９０％以上の同一性を有するものをいう。【００２８】
ＧＰＲ８７はＧＰＣＲであり、７回膜貫通型タンパク質である。従って、アミノ酸配列中に、７箇所の膜貫通領域、４箇所の細胞外領域、４箇所の細胞内領域を有する。【００２９】
４箇所の細胞外領域のアミノ酸配列を、Ｎ末端側から順に配列番号２〜５に示す。配列番号２のアミノ酸配列は、最もＮ末端側の細胞外領域の配列であり、全長中、１〜４１番目のアミノ酸配列である。配列番号３のアミノ酸配列は、Ｎ末端側から２番目の細胞外領域の配列であり、全長中、１０１〜１１８番目のアミノ酸配列である。配列番号４のアミノ酸配列は、Ｎ末端側から３番目の細胞外領域の配列であり、全長中、１８２〜２０６番目のアミノ酸配列である。配列番号５のアミノ酸配列は、Ｎ末端側から４番目の細胞外領域の配列であり、全長中、２８０〜２９８番目のアミノ酸配列である。【００３０】
配列番号６のアミノ酸配列（１５アミノ酸）は、最もＮ末端側の細胞外領域の配列中に含まれる部分であり、全長中、９〜２３番目のアミノ酸配列である。【００３１】
＜本発明に係るモノクローナル抗体及びその製造方法について＞
本発明において、「ヒトＧＰＲ８７に対するモノクローナル抗体」は、ヒトＧＰＲ８７又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはそれらの部分ペプチド、と特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、並びにそれらの改変抗体を意味し、かつそれらを全て包含する。本発明に包含される改変抗体の詳細については後述する。【００３２】
これらの抗体は、性質・特徴などにより狭く限定されないが、生化学的解析・腫瘍診断・腫瘍治療などに用いる場合、細胞膜上に立体構造を保持した状態で発現したＧＰＲ８７を認識できるものである方がより好適である。【００３３】
抗体のエピトープは、特に限定されないが、生化学的解析・腫瘍診断・腫瘍治療などに用いる場合、ヒトＧＰＲ８７全長のうち、細胞外領域（配列番号２〜５のいずれかのアミノ酸配列）に存在する方がより好適である。【００３４】
これらの抗体は、生化学的解析・腫瘍診断・腫瘍治療などに用いる場合、ＧＰＲ８７を強制発現させた細胞だけでなく、細胞に内在性に発現するＧＰＲ８７を認識でき、抗原に対する親和性の高いものである方がより好適である。【００３５】
これらの抗体は、腫瘍治療などに用いる場合、細胞障害活性、例えば、ＡＤＣＣ活性（抗体依存性細胞障害活性）又はＣＤＣ活性（補体依存性細胞障害活性）を有するものである方がより好適である。【００３６】
抗体のクラスは特に限定されない。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡなどが好適であり、ＩｇＧが最も好適である。【００３７】
抗体のアイソタイプも特に限定されない。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ２などが好適であり、ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を有する可能性が最も高いという点で、ＩｇＧ１がより好適である。【００３８】
本発明に係るモノクローナル抗体として、例えば、以下の受託番号で表されるハイブリドーマ株により産生される抗体がある。【００３９】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−６６８（寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター、所在地：日本国千葉県２９２−０８１８木更津市かずさ鎌足２−５−８、原寄託日：２００８年１１月１３日）、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−６６９（寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター、所在地：日本国千葉県２９２−０８１８木更津市かずさ鎌足２−５−８、原寄託日：２００８年１１月１３日）、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−６７３（寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター、所在地：日本国千葉県２９２−０８１８木更津市かずさ鎌足２−５−８、原寄託日：２００８年１１月１３日）。【００４０】
なお、以下、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−６６８株の産生抗体を「Ｃ０８０４抗体」、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−６６９株の産生抗体を「Ｃ０８１２抗体」、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−６７３株の産生抗体を「Ｃ０８１５抗体」とする。【００４１】
これらの抗体は、全て細胞膜上に立体構造を保持した状態で発現したヒトＧＰＲ８７を認識できる。また、これらの抗体のエピトープは、全て、ヒトＧＰＲ８７全長のうち、細胞外領域（配列番号２〜５のいずれかのアミノ酸配列）に存在する。【００４２】
Ｃ０８０４抗体、Ｃ０８１２抗体、Ｃ０８１５抗体は、ＧＰＲ８７を強制発現させた細胞だけでなく、細胞に内在性に発現するＧＰＲ８７を認識でき、抗原に対する親和性が高い。【００４３】
これらの抗体は、全てＡＤＣＣ活性（抗体依存性細胞障害活性、以下同じ）を有する。【００４４】
Ｃ０８０４抗体のＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列にそれぞれ配列番号２０、２１、２２に、Ｌ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列にそれぞれ配列番号２３、２４、２５に示す。
Ｃ０８１２抗体のＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列にそれぞれ配列番号２６、２７、２８に、Ｌ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列にそれぞれ配列番号２９、３０、３１に示す。
Ｃ０８１５抗体のＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列にそれぞれ配列番号３２、３３、３４に、Ｌ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列にそれぞれ配列番号３５、３６、３７に示す。【００４５】
なお、本発明に係る抗体は、それらの抗体を化学的又は遺伝子工学的に修飾した修飾抗体も広く包含する。抗体に対する修飾物として、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチンなどの各種分子、放射性同位元素、蛍光剤、酵素、細胞毒性物質、抗腫瘍剤、それらによって修飾された二次抗体などが挙げられる。抗体の修飾は既知の方法により行うことができる。【００４６】
放射性同位元素としては、例えば、１８Ｆ、１５Ｏ、１３Ｎ、１１Ｃ、８２Ｒｂ、６８Ｇａ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１１Ａｔ、４７Ｓｃ、１０３Ｐｂ、１０９Ｐｂ、２１２Ｐｂ、７１Ｇｅ、７７Ａｓ、１０５Ｒｈ、１１３Ａｇ、１１９Ｓｂ、１２１Ｓｎ、１３１Ｃｓ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１７７Ｌｕ、１９１Ｏｓ、１９３Ｐｔ、１９７Ｈｇなどが挙げられる。放射性同位体は、既知の方法により、直接又はキレート化剤などを介して間接的に、抗体に結合又は修飾できる。【００４７】
キレート化剤としては、既知のものを利用できる。例えば、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＤＯＴＡ（1,4,7,10-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,7,10-四酢酸）、ＤＦＯ（デフェロキサミン）などを利用可能である。【００４８】
蛍光剤としては、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ＯＰＡ（ｏ−フタルアルデヒド）、フルオレサミンなどが挙げられる。【００４９】
酵素としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられる。【００５０】
細胞毒性物質としては、例えば、ジフテリアＡ鎖、緑膿菌外毒素Ａ、百日咳毒素、リシンＡ鎖、アブリンａ、モデッシン毒素、α−サルシン、ジアンチン、クルシン、クロチン、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセン、トリコサンチン、サイトカラシンＢ、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、エメチン、コルヒチン、サポリンなどが挙げられる。【００５１】
抗腫瘍剤としては、特に限定されないが、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、抗腫瘍性植物成分、ＢＲＭ（生物学的応答性制御物質）、血管新生阻害剤、細胞接着阻害剤、マトリックス・メタロプロテアーゼ阻害剤などが挙げられる。【００５２】
アルキル化剤として、例えば、クロロエチルアミン系アルキル化剤（ナイトロジェンマスタード、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド、イホスファミド、メルファラン、シクロホスファミド、クロラムブシルなど）、アジリジン系アルキル化剤（例えば、カルボコン、チオテパなど）、エポキシド系アルキル化剤（ディブロモマンニトール、ディブロモダルシトールなど）、ニトロソウレア系アルキル化剤（カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ニムスチンハイドロクロライド、クロロゾトシン、ラニムスチンなど）、スルホン酸エステル類（ブスルファン、トシル酸インプロスルファン、ピポスルファンなど）、ダカルバジン、プロカルバジンなどが挙げられる。【００５３】
代謝拮抗剤としては、例えば、プリン代謝拮抗剤（６−メルカプトプリン、アザチオプリン、６−チオグアニン、チオイノシンなど）、ピリミジン代謝拮抗剤（フルオロウラシル、テガフール、テガフール・ウラシル、カルモフール、ドキシフルリジン、ブロクスウリジン、シタラビン、エノシタビンなど）、葉酸代謝拮抗剤（メトトレキサート、トリメトレキサートなど）、それらの塩もしくは複合体などが挙げられる。【００５４】
抗腫瘍性抗生物質としては、例えば、アントラサイクリン系（ダウノルビシン、アクラルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、エピルビシンなど）、アクチノマイシン系（アクチノマイシンＤなど）、クロモマイシン系（クロモマイシンＡ３など）、マイトマイシン系（マイトマイシンＣなど）、ブレオマイシン系（ブレオマイシン、ペプロマイシンなど）、それらの塩もしくは複合体などが挙げられる。【００５５】
その他の抗腫瘍剤として、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ドセタキセル、パクリタキセル、ゲムシタビン、イリノテカン、ゲフィチニブ、タモキシフェン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセブラトン、シゾフィラン、ピシバニール、ウベニメクス、クレスチン、それらの塩もしくは複合体などが挙げられる。【００５６】
抗腫瘍性植物成分としては、例えば、植物アルカロイド類（カンプトテシン、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチンなど）、エピポドフィロトキシン類（エトポシド、テニポシドなど）、酒石酸ビノレルビン、それらの塩もしくは複合体などが挙げられる。また、ピポブロマン、ネオカルチノスタチン、ヒドロキシウレアなども含まれる【００５７】
ＢＲＭとしては、例えば、腫瘍壊死因子、インドメタシン、それらの塩もしくは複合体などが挙げられる。【００５８】
本発明に係る抗体（改変抗体を含む）の種類は特に制限されず、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、トリ抗体などを全て包含する。【００５９】
本発明に係る抗体（改変抗体を含む）は、すべて、抗腫瘍剤製造のために使用できる。【００６０】
続いて、本発明に係るモノクローナル抗体の作製方法の例を以下に示す。なお、改変抗体の作製方法については後述する。【００６１】
モノクローナル抗体は、例えば、（１）動物への免疫、（２）ハイブリドーマの樹立、（３）抗体の精製などの手順で作製できる。【００６２】
（１）動物への免疫
ＤＮＡ免疫及び／又は細胞免疫を行う手順を少なくとも含む方法で免疫を行うことにより、ペプチド免疫などと比較して、抗ＧＰＲ８７モノクローナル抗体を効率的に取得できる。【００６３】
免疫する動物として、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどが挙げられるが、好適にはマウスが用いられる。【００６４】
ＤＮＡ免疫の原理・手法などは、例えば、非特許文献５に記載されている。例えば、遺伝子銃を用いて、ヒトＧＰＲ８７を組み込んだ発現ベクターを、一回当たり０．０１〜１００μｇ、２〜１０日おきに計５〜３０回程度、対象動物の皮下・皮内に直接打ち込み、動物体内で抗原を発現させ、免疫する。【００６５】
発現ベクターは、ヒトＧＰＲ８７遺伝子を組み込むことができ、かつ動物細胞で発現するものであればよく、公知のものを採用できる。例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーター、ＣＡＧプロモーターなどを有するプラスミドベクターを利用できる。例えば、ＧＰＲ８７をコードするＤＮＡを適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結して組換えベクターを作製し、用いる。【００６６】
細胞免疫は、例えば、ヒトＧＰＲ８７の定常発現細胞を樹立し、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）、生理食塩水などでその細胞を適当量に希釈・懸濁し、対象動物にその細胞を、一回当たりの細胞数１×１０３〜１×１０８程度、１〜２０回程度、尾静脈内又は腹腔内投与して行う。また、免疫をＤＮＡ免疫で複数回行った後、最終免疫を細胞免疫で行ってもよい。【００６７】
細胞は、ヒトＧＰＲ８７を定常発現させることができるものであればよく、公知のものを採用できる。例えば、ＣＯＳ−７細胞（サル腎臓由来細胞株）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞由来細胞株）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、マウス３Ｔ３細胞、ＡｔＴ−２０細胞（マウス脳下垂体由来細胞株）、ＡＴＤＣ５細胞（マウス前駆軟骨細胞株）、マウスミエローマ細胞、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト腎臓由来細胞株）、ＦＬ細胞（ヒト羊膜由来細胞株）、２９３細胞、Ｃ１２７細胞（マウス線維芽細胞由来細胞株）、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞（マウス胎児由来細胞株）、Ｓｐ−２／Ｏ細胞、ＧＨ３細胞（ラット下垂体前葉細胞由来細胞株）、Ｂａ／Ｆ３細胞（マウスプロＢ細胞由来細胞株）などの動物細胞を利用できる。【００６８】
それらの細胞のいずれかを用いて、ヒトＧＰＲ８７定常発現株を樹立し、細胞免疫に用いる。【００６９】
ヒトＧＰＲ８７の定常発現細胞を樹立する方法として、既知の方法を用いることができる。例えば、動物細胞にヒトＧＰＲ８７発現ベクターを導入し、薬剤選択などを行い、ヒトＧＰＲ８７の定常発現細胞を樹立する。【００７０】
発現ベクターの細胞への導入方法として、例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法など、既知の方法を用いることができる。発現ベクターは、上記と同様のものを利用できる。【００７１】
なお、本発明に係るモノクローナル抗体は、ＤＮＡ免疫又は細胞免疫による方法で取得できたものに狭く限定されず、他の既知の方法により取得されたものを広く包含する。一般的には、モノクローナル抗体を作製する場合、精製タンパク質又は合成ペプチドなどを用いて免疫を行うことが多い。本発明もこれらの方法で取得されたモノクローナル抗体を排除しない。ペプチド免疫の手順の例を以下に示す。【００７２】
まず、抗原（合成ペプチド）を、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）、生理食塩水などで適当量に希釈・懸濁し、通常のアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバントなど）を適量混合し、乳化し、それを哺乳動物に４−２１日毎に計２〜１０回皮下又は腹腔内投与する。また、抗原免疫時に適当な担体を使用してもよい。【００７３】
但し、多くの場合、ＧＰＣＲは、他のタンパク質と比較して、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することが難しい。ＧＰＣＲは動物種間で配列が保存されており免疫寛容になりやすく、また、ＧＰＣＲは立体構造が複雑かつ不安定で抗原として認識されにくい。そのため、ＧＰＣＲの部分ペプチドを合成して免疫しても免疫原性が弱い場合が多い。加えて、ＧＰＣＲは他のタンパク質と比較して発現量が低いため、細胞に内在性に発現するＧＰＣＲを認識する抗体を取得することが難しく、また、目的の抗体を得るためのスクリーニング系の構築が難しい。本発明者らも合成ペプチドを抗原として免疫を試みたが、抗体産生ハイブリドーマを樹立できなかった。なお、一般的にＧＰＣＲは精製タンパク質の調製が難しいため、本発明の場合、精製タンパク質は抗原として必ずしも適当ではない。【００７４】
それに対し、ＤＮＡ免疫及び／又は細胞免疫により免疫を行うことで、抗体産生ハイブリドーマを複数株樹立することに成功した。即ち、本発明に係る抗体の場合、通常のペプチド免疫ではなく、ＤＮＡ免疫・細胞免疫により免疫を行うことにより、効率的に抗体産生ハイブリドーマを取得できる。【００７５】
なお、本発明に係る抗体がＤＮＡ免疫を行うことにより比較的効率的に作製できる理由のひとつは、次の通りであると推測する。上述の通り、マイクロアレイ解析の結果では、ＧＰＲ８７は皮膚で高発現している。ＤＮＡ免疫を遺伝子銃などで行う場合、皮膚細胞に発現ベクターを直接打ち込み、その細胞膜上にＧＰＲ８７を発現させ、それを抗原とする。従って、ＤＮＡ免疫を行った場合、ＧＰＲ８７は皮膚細胞で発現しやすいため、効率的に免疫できた。【００７６】
（２）ハイブリドーマの樹立
例えば、動物の血清中の抗体レベルが各種免疫により上昇するのを確認した後、最終免疫を行い、その免疫の２〜５日後に免疫した動物の脾臓又はリンパ節を採取し、その細胞とミエローマ細胞とを融合し、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製する。【００７７】
細胞融合は、例えば、非特許文献６及び７に記載の方法などに準じ、公知の方法で行うことができる。例えば、免疫した動物から採取した抗体産生細胞（脾臓、リンパ節などの細胞）とミエローマ細胞とを培養液中で１：１〜１０：１程度の割合でよく混合し、ＰＥＧ溶液（例えば、平均分子量１，０００〜６，０００程度のもの）を３７℃に加温し、両細胞にＰＥＧを３０〜６０％（ｗ/ｖ）の濃度で添加し、混合し、両細胞を融合する。ＰＥＧを除去した後、融合細胞を所定濃度で播種する。【００７８】
マウス由来のミエローマ細胞株として、例えば、Ｐ３（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８）、Ｐ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）、Ｘ６３．６５３（Ｘ６３Ａｇ８．６５３）、ＳＰ２（Ｓｐ２／０−Ａｇ１４）、ＦＯ、ＮＳ−１（ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１）、ＮＳＯ／１、ＦＯＸ−ＮＹなどが、ラット由来のミエローマ細胞株として、例えば、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＹＢ２／０、ＩＲ９８３Ｆなどが、好適に使用される。【００７９】
次に、例えば、ＨＡＴ選択培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培養液）などで数日〜数週間培養し、ハイブリドーマ以外の細胞を死滅させてハイブリドーマを選択培養する。【００８０】
次に、選択培養液で生存したハイブリドーマの中から、目的の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。スクリーニング方法は特に限定されないが、例えば、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、ラジオイムノアッセイ法などの系で抗原とハイブリドーマ培養上清中の抗体との結合性の有無を調べることにより、目的のハイブリドーマ株を選抜できる。そして、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選抜し、必要に応じてモノクローニングし、抗体産生ハイブリドーマを樹立する。【００８１】
（３）抗体の精製
樹立したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を回収し、分離・精製する。【００８２】
例えば、樹立したハイブリドーマを培養し、その培養上清として得ることにより、または、ハイブリドーマを哺乳動物の腹腔に投与して増殖させ、その腹水として得ることにより、ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得できる。【００８３】
モノクローナル抗体の分離・精製は、通常の免疫グロブリンの分離精製法などにより、行うことができる。【００８４】
例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相又は活性吸着剤（プロテインＡ、プロテインＧなど）を用いた方法などにより、抗体を分離・精製できる。【００８５】
＜本発明に係る改変抗体及びその作製方法について＞
本発明において、「改変抗体」は、ヒトＧＰＲ８７に対する前記いずれかのモノクローナル抗体のＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；相補性決定領域、以下同じ）のアミノ酸配列を保持しつつ改変された抗体、又は、ＣＤＲのアミノ酸配列を保持した抗体断片を意味し、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ化抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２化抗体断片、Ｆａｂ’化抗体断片、ｓｃＦｖ（一本鎖抗体）、ｄｓＦｖ（ジスルフィド安定化Ｖ領域断片）などを全て包含する。【００８６】
例えば、ＩｇＧ抗体の場合、２本のＨ鎖（重鎖）と２本のＬ鎖（軽鎖）が集合して左右対称の一量体の抗体分子が形成される。Ｈ鎖とＬ鎖は、ともに、Ｖ領域（Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ；可変領域、以下同じ）とＣ領域（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ；定常領域、以下同じ）を有する。ＣＤＲは、高い頻度でアミノ酸配列が変化する領域であり、重鎖・軽鎖それぞれのＶ領域（Ｈ鎖のＶ領域（ＶＨ）とＬ鎖のＶ領域（ＶＬ））に三箇所ずつ存在する。ＣＤＲのアミノ酸配列が抗原特異性を決定する。なお、Ｖ領域中、ＣＤＲ以外の部分をフレームワーク領域という。【００８７】
キメラ抗体は、マウス抗体由来のＶ領域とヒト抗体由来のＣ領域を有する改変抗体である。【００８８】
キメラ抗体は、Ｈ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域の配列情報に基づき、公知技術により作製できる。抗体のＨ鎖Ｖ領域アミノ酸をコードする塩基配列を有する遺伝子断片、及び、Ｌ鎖Ｖ領域アミノ酸をコードする塩基配列を有する遺伝子断片を作製する。このＶ領域遺伝子をヒト抗体のＣ領域遺伝子と連結し、キメラ抗体遺伝子を作製する。このキメラ抗体遺伝子を適当な発現ベクターに連結し、培養細胞中に導入する。この培養細胞を培養して培養上清からキメラ抗体を得ることができる（例えば、非特許文献８参照）。【００８９】
ヒト化抗体は、ＣＤＲ以外をヒト由来抗体に置き換えた抗体である。なお、ヒト化抗体は、ＣＤＲ以外に、フレームワーク領域のアミノ酸配列の一部が改変（置換、挿入、欠失、付加）されていてもよい。【００９０】
ヒト化抗体は、Ｈ鎖ＣＤＲ及びＬ鎖ＣＤＲの配列情報に基づき、公知技術により作製できる。マウスなどの抗体のＨ鎖ＣＤＲアミノ酸をコードする塩基配列を有する遺伝子断片、及び、Ｌ鎖ＣＤＲアミノ酸をコードする塩基配列を有する遺伝子断片を作製する。このＣＤＲ遺伝子をヒト抗体のフレームワーク領域及びＣ領域の遺伝子と連結し、ヒト化抗体遺伝子を作製する。このヒト化抗体遺伝子を適当な発現ベクターに連結し、培養細胞中に導入する。この培養細胞を培養して培養上清からヒト化抗体を得ることができる（例えば、非特許文献９参照）。【００９１】
ヒト化抗体におけるＣＤＲの由来は特に限定されず、どの動物種由来でもよい。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体などのＣＤＲ配列を用いることが可能である。モノクローナル抗体の作製が他の動物種と比べ比較的容易な点から、マウス抗体のＣＤＲ配列を用いることが好適である。例えば、配列番号２０〜３７のＣＤＲアミノ酸配列を用いて、公知技術によりヒト化抗体を作製してもよいし、配列番号１４〜１９に記載されたＣＤＲ及びその近傍のアミノ酸配列を用いて、公知技術によりヒト化抗体を作製してもよい。【００９２】
Ｆａｂ化抗体断片は、ＩｇＧをパパイン（タンパク質分解酵素）で処理して得られる断片のうち、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した抗原結合活性を有する抗体断片である。例えば、本発明に係る抗体を、パパインで処理することにより取得できる。【００９３】
Ｆ（ａｂ’）２化抗体断片は、ＩｇＧをペプシンで処理して得られる断片のうち、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合した抗原結合活性を有する抗体断片である。例えば、Ｆａｂ’は、本発明に係る抗体を、ペプシンで処理することにより取得できる。【００９４】
Ｆａｂ’化抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２化抗体断片のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した抗原結合活性を有する抗体断片である。例えば、Ｆ（ａｂ’）２化抗体断片を、還元剤ジチオスレイトール処理することにより取得できる。【００９５】
なお、これらの抗体断片は、例えば、それらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、原核生物用発現ベクターもしくは真核生物用発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物もしくは真核生物に導入して発現することによっても製造することができる。【００９６】
ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、一本の重鎖Ｖ領域（ＶＨ）と軽鎖のＶ領域（ＶＬ）とを適当なペプチドリンカーを用いて連結し、抗原との結合性を保持した単鎖可変領域フラグメントである。【００９７】
ｓｃＦｖは、Ｈ鎖ＣＤＲ及びＬ鎖ＣＤＲの配列情報などに基づき、公知技術により作製できる。例えば、抗体のＨ鎖Ｖ領域（ＶＨ）のアミノ酸をコードする塩基配列を有する遺伝子断片、及び、Ｌ鎖Ｖ領域（ＶＬ）のアミノ酸をコードする塩基配列を有する遺伝子断片を作製し、ペプチドリンカーをコードする塩基配列で両遺伝子を連結してｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、これを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを原核生物又は真核生物に導入して発現させることにより作製できる（例えば、非特許文献１０、１１参照）。【００９８】
ｓｃＦｖにおけるＣＤＲの由来は特に限定されず、どの動物種由来でもよい。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体などのＣＤＲ配列を用いることが可能である。モノクローナル抗体の作製が他の動物種と比べ比較的容易な点から、マウス抗体のＣＤＲ配列を用いることが好適である。例えば、配列番号２０〜３７のＣＤＲアミノ酸配列を用いて、公知技術によりｓｃＦｖを作製してもよいし、配列番号１４〜１９に記載されたＣＤＲ及びその近傍のアミノ酸配列を用いて、公知技術によりｓｃＦｖを作製してもよい。【００９９】
ｄｓＦｖ（ジスルフィド安定化Ｖ領域断片）は、Ｈ鎖Ｖ領域（ＶＨ）及びＬ鎖のＶ領域（ＶＬ）中のそれぞれ一アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをシステイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。【０１００】
ｄｓＦｖは、Ｈ鎖ＣＤＲ及びＬ鎖ＣＤＲの配列情報などに基づき、公知技術により作製できる。例えば、抗体のＨ鎖Ｖ領域（ＶＨ）のアミノ酸をコードする塩基配列を有する遺伝子断片、及び、Ｌ鎖Ｖ領域（ＶＬ）のアミノ酸をコードする塩基配列を有する遺伝子断片を作製し、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片をコードするＤＮＡを構築し、これを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを原核生物又は真核生物に導入して発現させることにより作製できる。【０１０１】
ｄｓＦｖにおけるＣＤＲの由来は特に限定されず、どの動物種由来でもよい。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体などのＣＤＲ配列を用いることが可能である。モノクローナル抗体の作製が他の動物種と比べ比較的容易な点から、マウス抗体のＣＤＲ配列を用いることが好適である。例えば、配列番号２０〜３７のＣＤＲアミノ酸配列を用いて、公知技術によりｄｓＦｖを作製してもよいし、配列番号１４〜１９に記載されたＣＤＲ及びその近傍のアミノ酸配列を用いて、公知技術によりｄｓＦｖを作製してもよい。【０１０２】
なお、本発明に係る改変抗体は、上記と同様、それらの改変抗体を化学的又は遺伝子工学的に修飾した修飾抗体も広く包含する。抗体に対する修飾物として、上記と同様のものが全て包含される。抗体の修飾は既知の方法により行うことができる。【０１０３】
＜本発明に係る生化学的解析について＞
本発明に係る抗体は、抗体を用いた生化学的な実験・解析などに利用できる。【０１０４】
抗体を用いた既知の方法として、例えば、免疫染色法、免疫組織染色法、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法、ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｓｐｏｔ）法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、フローサイトメトリー法、ＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）法、抗体を用いたアフィニティー精製法などがある。本発明に係る抗体は、これらの生化学的解析に利用可能性がある。【０１０５】
＜本発明に係る医薬組成物について＞
本発明に係る医薬組成物は、少なくとも上記抗体のいずれかを含有していればよい。【０１０６】
本発明に係る医薬組成物の剤型は特に限定されない。例えば、固形製剤（錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤など）、液状製剤（シロップ剤、注射剤など）などとして用いることができる。【０１０７】
本発明に係る抗体を医薬組成物に配合する際、薬理学的に許容される担体を用いてもよい。担体として、製剤素材として慣用されている各種有機あるいは無機担体物質を用いることができる。【０１０８】
固形製剤の場合、本発明に係る抗体及びその担体に、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などを適宜配合してもよい。液状製剤の場合、本発明に係る抗体及びその担体に、例えば、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などを適宜配合してもよい。その他、必要に応じ、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を適宜配合してもよい。【０１０９】
賦形剤の好適な例として、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などを用いることができる。【０１１０】
滑沢剤の好適な例として、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどを用いることができる。【０１１１】
結合剤の好適な例として、例えば、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどを用いることができる。【０１１２】
崩壊剤の好適な例として、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどを用いることができる。【０１１３】
溶剤の好適な例として、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などを用いることができる。【０１１４】
溶解補助剤の好適な例として、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどを用いることができる。【０１１５】
懸濁化剤の好適な例として、例えば、界面活性剤（ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなど）、親水性高分子（ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなど）などを用いることができる。【０１１６】
等張化剤の好適な例として、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどを用いることができる。【０１１７】
緩衝剤の好適な例として、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液などを用いることができる。【０１１８】
無痛化剤の好適な例として、例えば、ベンジルアルコールなどを用いることができる。【０１１９】
防腐剤の好適な例として、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などを用いることができる。【０１２０】
抗酸化剤の好適な例として、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸などを用いることができる。【０１２１】
本発明に係る医薬組成物は、ＰＥＴ用腫瘍診断剤、抗腫瘍剤などに適用可能性がある。なお、この医薬組成物は、これらの用途に用いる場合のみに狭く限定されない。即ち、本発明は、他の全ての疾患に用いる場合を広く包含する。【０１２２】
＜本発明に係る腫瘍診断剤及び腫瘍診断方法について＞
上記の通り、本発明者らが作製した抗体は、扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌などの癌組織を癌特異的に染色できる。従って、本発明に係る抗体は、腫瘍診断に有用な可能性がある。【０１２３】
例えば、被験者から試料を採取し、パラフィン切片又は凍結切片を作製し、本発明に係る抗体を含有する腫瘍診断剤を用いて免疫組織染色することにより、腫瘍を検出・診断できる可能性がある。【０１２４】
試料は、例えば、生体組織、癌患者の喀痰などをバイオプシーなどで採取することにより、また、癌摘出手術、検査手術などで癌組織を摘出などすることにより、取得できる。【０１２５】
本発明に係る腫瘍診断剤は、本発明に係る抗体を含有していればよく、他の成分などによって狭く限定されない。例えば、免疫組織染色に好適な組成物、抗原賦活剤、抗体安定化剤などを含有していてもよい。また、この腫瘍診断剤は、免疫組織染色に必要な試薬などとともに、キット化してもよい。【０１２６】
パラフィン切片又は凍結切片の作製手順、免疫組織染色手順などは、公知の技術を用いることができる。【０１２７】
本発明に係る腫瘍診断は、例えば、皮膚癌、頭頚部癌、肺癌、食道癌、子宮頚癌、子宮癌、膵臓癌、乳癌、腎癌、尿管癌、膀胱癌、特に、皮膚の有棘上皮癌、基底細胞癌、又はメラノーマ、舌癌、咽頭の扁平上皮癌又は悪性リンパ腫、喉頭の扁平上皮癌、肺の扁平上皮癌又は小細胞癌、食道の扁平上皮癌、子宮頚の扁平上皮癌、子宮腺癌、膀胱の移行上皮癌又は扁平上皮癌、腎盂又は尿管の移行上皮癌などに適用可能性がある。【０１２８】
＜本発明に係るＰＥＴ用腫瘍診断剤及びＰＥＴ診断方法について＞
本発明に係る抗体は、ＰＥＴ（ポジトロン断層法）を用いた腫瘍診断に適用できる可能性がある。【０１２９】
上記の通り、ＧＰＲ８７は広範な扁平上皮癌で特異的に発現している可能性が高い。従って、例えば、本発明に係る抗体を放射性同位元素で修飾し、それを体内に投与し、ＰＥＴ装置でその放射線を検出し、イメージングなどすることにより、ＰＥＴ診断に応用できる可能性がある。また、プレターゲティング法により、ビオチンなどで修飾した抗体を先に体内に投与し、次に、放射性同位体で修飾されたアビジンなどを投与し、ＰＥＴ装置でその放射線を検出し、イメージングなどすることによっても、ＰＥＴ診断を行うことができる可能性がある。【０１３０】
これらの方法で腫瘍部を高感度に検出・イメージングすることにより、浸潤・転移の有無、癌部・非癌部の境界の明瞭化など、より高精度な診断ができる可能性がある。また、放射線内用療法、外部照射、超音波治療、温熱療法などと組み合わせることにより、腫瘍治療成績を向上できる可能性がある。【０１３１】
本発明に係るＰＥＴ用腫瘍診断剤は、少なくとも、上記いずれかの抗体を放射性同位元素で修飾した組成物を含有する。また、プレターゲティング法に用いるＰＥＴ用腫瘍診断剤は、少なくとも、上記いずれかの抗体をビオチンなどの各種分子で修飾した組成物を含有する。【０１３２】
ＰＥＴ診断に用いる抗体には、細胞膜上に立体構造を保持した状態で発現したヒトＧＰＲ８７を認識でき、エピトープが、ヒトＧＰＲ８７全長のうち、細胞外領域（配列番号２〜５のいずれかのアミノ酸配列）に存在し、かつ細胞に内在性に発現するＧＰＲ８７を認識できるものが好適である。【０１３３】
ＰＥＴ診断に用いる放射性同位元素は、公知のものを用いることができ、特に限定されない。ＰＥＴに適用可能な放射性同位元素として、例えば、１８Ｆ、１５Ｏ、１３Ｎ、１１Ｃ、８２Ｒｂ、６８Ｇａ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕなどが挙げられる。半減期などを考慮すると、８２Ｒｂ、６８Ｇａ、６４Ｃｕが好適であり、６４Ｃｕが最も好適である。【０１３４】
上述の通り、放射性同位体は、既知の方法により、直接又はキレート化剤などを介して間接的に、抗体に接合できる。キレート化剤としては、上述と同様のものを利用できるが、例えば、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＤＯＴＡ（1,4,7,10-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,7,10-四酢酸）などが好適である。【０１３５】
本発明に係るＰＥＴ用腫瘍診断剤の剤型は特に限定されない。例えば、固形製剤（錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤など）、液状製剤（シロップ剤、注射剤など）などとして用いることができる。【０１３６】
本発明に係る放射性標識化抗体をＰＥＴ用腫瘍診断剤に配合する際、上記と同様、薬理学的に許容される担体を用いてもよい。また、上記と同様、固形製剤の場合、本発明に係る抗体及びその担体に、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などを適宜配合してもよい。同様に、液状製剤の場合、本発明に係る抗体及びその担体に、例えば、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などを適宜配合してもよい。その他、必要に応じ、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を適宜配合してもよい。【０１３７】
本発明に係るＰＥＴ診断は、例えば、皮膚癌、頭頚部癌、肺癌、食道癌、子宮頚癌、子宮癌、膵臓癌、乳癌、腎癌、尿管癌、膀胱癌、特に、皮膚の有棘上皮癌、基底細胞癌、又はメラノーマ、舌癌、咽頭の扁平上皮癌又は悪性リンパ腫、喉頭の扁平上皮癌、肺の扁平上皮癌又は小細胞癌、食道の扁平上皮癌、子宮頚の扁平上皮癌、子宮腺癌、膀胱の移行上皮癌又は扁平上皮癌、腎盂又は尿管の移行上皮癌などに適用可能性がある。【０１３８】
このＰＥＴ用腫瘍診断剤は、例えば、錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤、顆粒剤などとして経口的に、又は、注射剤、坐剤、ペレットなどとして非経口的に投与できる。非経口投与には、静脈内、筋肉内、皮下、臓器内、鼻腔内、皮内、点眼、脳内、直腸内、膣内、腹腔内、腫瘍内部、腫瘍の近位などへの投与あるいは直接病巣への投与が含まれる。【０１３９】
本発明に係るＰＥＴ用腫瘍診断剤の投与量は、投与ルート、症状、年齢などによって異なるが、例えば、非経口投与（静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与など）の場合、１回当たり０．００１ｍｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇ×体重、経口投与の場合、１日当たり０．００１ｍｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇ×体重、好適には、非経口投与で、１回当たり０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ×体重である。【０１４０】
＜本発明に係る抗腫瘍剤及び腫瘍治療方法について＞
本発明に係る抗腫瘍剤は、本発明に係る抗体（改変抗体を含む）を少なくとも含有していればよい。【０１４１】
上記の通り、本発明者らが作製した抗体は、癌組織の免疫染色において、扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌などの癌組織を癌特異的に染色できる。従って、本発明に係る抗体は、腫瘍治療にも有用な可能性がある。【０１４２】
腫瘍治療に用いる抗体は、細胞膜上に立体構造を保持した状態で発現したヒトＧＰＲ８７を認識でき、エピトープが、ヒトＧＰＲ８７全長のうち、細胞外領域（配列番号２〜５のいずれかのアミノ酸配列）に存在し、かつ細胞に内在性に発現するＧＰＲ８７を認識できるものが好適である。【０１４３】
腫瘍治療に用いる抗体は、細胞障害活性、例えば、ＡＤＣＣ活性（抗体依存性細胞障害活性）又はＣＤＣ活性（補体依存性細胞障害活性）を有するものである方がより好適である。なお、細胞障害活性を有しない抗体であっても、放射性同位元素、細胞毒性物質、抗腫瘍剤などで抗体を修飾することにより、抗腫瘍効果を得られる可能性がある。それらの修飾抗体には、例えば、上述のものを適用できる。【０１４４】
本発明に係る抗腫瘍剤の剤型は特に限定されない。例えば、固形製剤（錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤など）、液状製剤（シロップ剤、注射剤など）などとして用いることができる。【０１４５】
本発明に係る抗体を抗腫瘍剤に配合する際、上記と同様、薬理学的に許容される担体を用いてもよい。また、上記と同様、固形製剤の場合、本発明に係る抗体及びその担体に、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などを適宜配合してもよい。同様に、液状製剤の場合、本発明に係る抗体及びその担体に、例えば、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などを適宜配合してもよい。その他、必要に応じ、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を適宜配合してもよい。【０１４６】
この抗腫瘍剤は、他の活性成分、例えば、上述において例示した他の抗腫瘍剤などを同時に含有したものも全て包含する。例えば、本発明に係る抗体と他の抗腫瘍剤とを混合配合することにより、相加・相乗的な抗腫瘍効果を得られる可能性がある。【０１４７】
本発明に係る抗腫瘍剤は、例えば、皮膚癌、頭頚部癌、肺癌、食道癌、子宮頚癌、子宮癌、膵臓癌、乳癌、腎癌、尿管癌、膀胱癌、特に、皮膚の有棘上皮癌、基底細胞癌、又はメラノーマ、舌癌、咽頭の扁平上皮癌又は悪性リンパ腫、喉頭の扁平上皮癌、肺の扁平上皮癌又は小細胞癌、食道の扁平上皮癌、子宮頚の扁平上皮癌、子宮腺癌、膀胱の移行上皮癌又は扁平上皮癌、腎盂又は尿管の移行上皮癌などに適用可能性がある。【０１４８】
この抗腫瘍剤は、例えば、錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤、顆粒剤などとして経口的に、又は、注射剤、坐剤、ペレットなどとして非経口的に投与できる。非経口投与には、静脈内、筋肉内、皮下、臓器内、鼻腔内、皮内、点眼、脳内、直腸内、膣内、腹腔内、腫瘍内部、腫瘍の近位などへの投与あるいは直接病巣への投与が含まれる。【０１４９】
本発明に係る抗腫瘍剤の投与量は、投与ルート、症状、年齢などによって異なるが、例えば、非経口投与（静脈投与、筋肉投与、皮下投与など）の場合、１回当たり０．００１ｍｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇ×体重、経口投与の場合、１日当たり０．００１ｍｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇ×体重である。例えば、この量を１回又は数回に分けて投与する。【０１５０】
なお、この抗腫瘍剤は、目的・用途・症状などに応じて、単独で用いてもよいし、他の抗腫瘍剤などと併用して用いてもよい。他の抗腫瘍剤としては、例えば、上述において例示したものを利用できる。
【実施例１】
【０１５１】
＜ｈＧＰＲ８７安定発現細胞株の樹立＞
実施例１では、全長ヒトＧＰＲ８７を安定発現するＣＨＯ細胞株を樹立した。【０１５２】
ヒトＧＰＲ８７のｃＤＮＡクローン（東洋紡績株式会社製）を購入し、ＧＰＲ８７をコードする塩基配列のＮ末端にＦＬＡＧタグの配列をつけたＤＮＡを作製し、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰベクター（クローンテック社製）のマルチクローニングサイトにその配列を組み込み、目的の組換えベクターを作製した。【０１５３】
次に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社製）を用いて、ＣＨＯ細胞にその組換えベクターをトランスフェクトし、Ｇ４１８（インビトロジェン社製）を最終濃度１ｍｇ／ｍＬ添加して選抜し、限界希釈法でクローニングし、安定発現細胞株を樹立した。樹立細胞株について、ＥＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡で確認するとともに、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウエスタンブロットを行い、ヒトＧＰＲ８７の発現を確認した。
【実施例２】
【０１５４】
＜ハイブリドーマの樹立＞
実施例２では、抗ＧＰＲ８７抗体産生ハイブリドーマを樹立した。【０１５５】
ＧＰＲ８７をコードする塩基配列のＮ末端にＨＡタグの配列をつけたＤＮＡを作製し、その配列をｐＣＸＮ２．１（−）ベクターのマルチクローニングサイトに組み込み、ＤＮＡ免疫用の組換えベクターを作製した。【０１５６】
次に、遺伝子銃（商品名「Ｈｅｌｉｏｓ  Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ（Ｈｅｌｉｏｓは登録商標）」、バイオ−ラッド  ラボラトリーズ  インコーポレイテッド製）を用いて、マウスにその組換えベクターをＤＮＡ免疫した。付属プロトコルに従って、組換えベクターのＤＮＡ量が１μｇ／ｓｈｏｔになるようにカートリッジを作製し、各免疫２ｓｈｏｔずつ、計７〜１５回、ほぼ４日ごとに免疫した。【０１５７】
次に、実施例１で作製したヒトＧＰＲ８７安定細胞株を用いて、細胞免疫を行った。１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬにその細胞を調製し、２０μＬをマウスに尾静脈投与した（一匹当たりの投与細胞数２×１０５ｃｅｌｌｓ）。【０１５８】
次に、細胞免疫から３日後、免疫マウスから脾臓を摘出し、ポリエチレングリコールを用いてその脾臓細胞とミエローマ細胞（ＮＳ−１、大日本製薬株式会社より購入）とを融合し、ＨＡＴ選抜し、抗ＧＰＲ８７抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。スクリーニングは、実施例１で作製したヒトＧＰＲ８７安定細胞株を用いて、フローサイトメトリー（「ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ」、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製、以下同じ）で行った。【０１５９】
そして、スクリーニングでポジティブだった株をモノクローニングし、最終的に、複数の抗ＧＰＲ８７抗体産生ハイブリドーマを樹立した。【０１６０】
寄託したハイブリドーマ株を以下に示す。
（１）ＮＩＴＥ  ＢＰ−６６８
（２）ＮＩＴＥ  ＢＰ−６６９
（３）ＮＩＴＥ  ＢＰ−６７３【０１６１】
そして、各ハイブリドーマを培養し、ＨＰＬＣ（「ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅ  １００」、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を用いてプロテインＧカラム（「Ｈｉ  Ｔｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ」、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）でその培養上清を精製し、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．７）で溶出し、各精製抗体を得た。【０１６２】
以下、
（１）ＮＩＴＥ  Ｐ−６６８株から得られた抗体を「Ｃ０８０４抗体」と、
（２）ＮＩＴＥ  Ｐ−６６９株から得られた抗体を「Ｃ０８１２抗体」と、
（３）ＮＩＴＥ  Ｐ−６７３株から得られた抗体を「Ｃ０８１５抗体」と、また、その他の樹立したハイブリドーマ株から得られた抗体を、それぞれ、「Ｃ０８０６抗体」、「Ｃ０８０７抗体」、「Ｃ０８１４抗体」と記載する。
【実施例３】
【０１６３】
＜抗体特異性の検討＞
実施例３では、フローサイトメトリーを用いて、実施例２で得た各精製抗体の特異性を調べた。【０１６４】
９６ウエルプレートに、実施例１で樹立したヒトＧＰＲ８７安定発現細胞株を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウエルずつ播種し、一次抗体として各精製抗体を各濃度加え、４℃で１時間インキュベートした。【０１６５】
上清を除去し、洗浄した後、二次抗体（「ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７−Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ」、インビトロジェン社製）を最終濃度５μｇ／ｍＬ加え、４℃、遮光条件下で３０分間インキュベートした。【０１６６】
上清を除去し、洗浄した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで調製し、フローサイトメトリーで測定した。【０１６７】
Ｃ０８０４抗体を用いた場合におけるフローサイトメトリーの結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。なお、本実施例ではゲートをかけていない（本実施例において以下同じ）。【０１６８】
図１Ａは実施例１で樹立したヒトＧＰＲ８７安定発現細胞株を用いた場合におけるフローサイトメトリーの結果を、図１ＢはヒトＧＰＲ８７安定発現細胞株の代わりにＣＨＯ細胞の野生株を用いた場合におけるフローサイトメトリーの結果（コントロール）を、それぞれ示す。【０１６９】
両図中、横軸は蛍光強度（対数表示）を、縦軸は各蛍光強度を示した細胞数を、それぞれ表す。両図において、符号１は一次抗体を加えなかった場合の結果（コントロール）を、符号２は一次抗体を最終濃度０．０１μｇ／ｍＬ加えた場合の結果を、符号３は一次抗体を最終濃度０．１μｇ／ｍＬ加えた場合の結果を、符号４は一次抗体を最終濃度１μｇ／ｍＬ加えた場合の結果を、符号５は一次抗体を最終濃度１０μｇ／ｍＬ加えた場合の結果を、それぞれ表す。【０１７０】
図１Ａ及び図１Ｂが示す通り、ヒトＧＰＲ８７安定発現細胞株を用いた場合、蛍光の強い細胞の細胞数が増加し、蛍光強度のグラフが濃度依存的に右側にシフトしたのに対し、ＣＨＯ細胞の野生株を用いた場合は、シフトが見られなかった。この結果は、Ｃ０８０４抗体がヒトＧＰＲ８７に特異的に結合することを示す。【０１７１】
Ｃ０８１２、Ｃ０８０６、Ｃ０８０７、Ｃ０８１４、Ｃ０８１５の各抗体についても、同様にフローサイトメトリーで測定し、Ｃ０８０４抗体と同様の結果が得られた。【０１７２】
各精製抗体を用いたフローサイトメトリーの測定結果として、蛍光強度の相乗平均値（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｅａｎ）を以下に示す。【０１７３】
Ｃ０８０４抗体に関して、ｈＧＰＲ８７安定発現細胞株を用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値１８．３６、一次抗体濃度が０．０１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値２８．９３、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１０９．９８、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値５７７．６６、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１２３８．６２。
Ｃ０８０４抗体に関して、ＣＨＯ細胞野生株を用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値４．７３、一次抗体濃度が０．０１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．４９、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．５１、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．４８、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値５．５２。【０１７４】
Ｃ０８１２抗体に関して、ｈＧＰＲ８７安定発現細胞株を用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値１８．３６、一次抗体濃度が０．０１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値２２．７３、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値６１．７３、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値３３９．６８、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１１５２．３８。
Ｃ０８１２抗体に関して、ＣＨＯ細胞野生株を用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値４．７３、一次抗体濃度が０．０１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．１８、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．２６、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．１３、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．８５。【０１７５】
Ｃ０８０６抗体に関して、ｈＧＰＲ８７安定発現細胞株を用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値１８．３６、一次抗体濃度が０．０１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値２０．９３、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値５１．０３、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値２６９．５０、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値９１０．２１。
Ｃ０８０６抗体に関して、ＣＨＯ細胞野生株を用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値４．７３、一次抗体濃度が０．０１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．２６、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．３５、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．２７、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値５．３８。【０１７６】
Ｃ０８０７抗体に関して、ｈＧＰＲ８７安定発現細胞株を用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値１８．３６、一次抗体濃度が０．０１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１９．０２、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値３８．４１、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１４３．１３、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値７１５．０３。
Ｃ０８０７抗体に関して、ＣＨＯ細胞野生株を用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値４．７３、一次抗体濃度が０．０１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．４０、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．３９、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．３９、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値５．５２。【０１７７】
Ｃ０８１４抗体に関して、ｈＧＰＲ８７安定発現細胞株を用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値１８．３６、一次抗体濃度が０．０１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１９．４５、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値２８．３２、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１０２．７７、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４９４．１２。
Ｃ０８１４抗体に関して、ＣＨＯ細胞野生株を用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値４．７３、一次抗体濃度が０．０１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．４３、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．３６、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．２０、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．８０。【０１７８】
Ｃ０８１５抗体に関して、ｈＧＰＲ８７安定発現細胞株を用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値１８．３６、一次抗体濃度が０．０１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値２６．８８、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値９１．５９、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４９５．５７、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１２９０．５３。
Ｃ０８１５抗体に関して、ＣＨＯ細胞野生株を用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値４．７３、一次抗体濃度が０．０１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．３８、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．４１、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値４．２９、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値５．１６。
【実施例４】
【０１７９】
＜内在性に発現するＧＰＲ８７を認識できるかどうかの検討＞
実施例４では、フローサイトメトリーを用いて、実施例２で得た各精製抗体が、強制発現系で発現しているヒトＧＰＲ８７だけでなく、内在性に発現しているヒトＧＰＲ８７を認識できるかどうか、検討した。【０１８０】
Ｍｅ１８０細胞（子宮頸癌細胞株）に、ヒトＧＰＲ８７に対するｓｉＲＮＡ（インビトロジェン製、配列番号７）又はコントロールｓｉＲＮＡ（商品名「Ｓｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＬＯ」、インビトロジェン製）をトランスフェクションし、２４時間培養した。【０１８１】
トランスフェクションの２４時間後、９６ウエルプレートに、それらの細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウエルずつ播種し、一次抗体として各精製抗体を各濃度加え、４℃で１時間インキュベートした。【０１８２】
上清を除去し、洗浄した後、二次抗体（「ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７−Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ」、インビトロジェン社製）を最終濃度５μｇ／ｍＬ加え、４℃、遮光条件下で３０分間インキュベートした。【０１８３】
上清を除去し、洗浄した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで調製し、フローサイトメトリーで測定した。【０１８４】
Ｃ０８０４抗体を用いた場合におけるフローサイトメトリーの結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。なお、これは生細胞にゲートをかけた結果である（本実施例において以下同じ）。【０１８５】
図２ＡはコントロールｓｉＲＮＡをＭｅ１８０細胞にトランスファクションした場合におけるフローサイトメトリーの結果を、図２ＢはヒトＧＰＲ８７に対するｓｉＲＮＡをＭｅ１８０細胞にトランスフェクションし、ヒトＧＰＲ８７の発現を抑制した場合におけるフローサイトメトリーの結果を、それぞれ示す。【０１８６】
なお、同時に、ＭＥ１８０細胞におけるヒトＧＰＲ８７発現量をリアルタイムＰＣＲで測定したところ、ヒトＧＰＲ８７に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合のヒトＧＰＲ８７発現量は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスファクションした場合の５．９％であった。即ち、ヒトＧＰＲ８７に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションすることにより、ＲＮＡレベルで、ＧＰＲ８７発現量を通常の５．９％にまで抑制できた。【０１８７】
両図中、横軸は蛍光強度（対数表示）を、縦軸は各蛍光強度を示した細胞数を、それぞれ表す。両図において、符号１は一次抗体を加えなかった場合の結果（コントロール）を、符号２は一次抗体を最終濃度０．１μｇ／ｍＬ加えた場合の結果を、符号３は一次抗体を最終濃度１μｇ／ｍＬ加えた場合の結果を、符号４は一次抗体を最終濃度１０μｇ／ｍＬ加えた場合の結果を、それぞれ表す。【０１８８】
図２Ａ及び図２Ｂが示す通り、通常のＭｅ１８０細胞の場合（コントロールｓｉＲＮＡをＭｅ１８０細胞にトランスファクションした場合）、蛍光の強い細胞の細胞数が増加し、蛍光強度のグラフが濃度依存的に右側にシフトしたのに対し、ヒトＧＰＲ８７の発現を抑制した場合（ヒトＧＰＲ８７に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合）、シフトが抑制された。この結果は、Ｃ０８０４抗体がヒトＧＰＲ８７に特異的に結合すること、及び、Ｃ０８０４抗体が強制発現系で発現するヒトＧＰＲ８７だけでなく、内在性に発現するヒトＧＰＲ８７を認識できることを示す。【０１８９】
Ｃ０８１２、Ｃ０８０６、Ｃ０８０７、Ｃ０８１４、Ｃ０８１５の各抗体についても、同様にフローサイトメトリーで測定し、Ｃ０８０４抗体と同様の結果が得られた。【０１９０】
各精製抗体を用いたフローサイトメトリーの測定結果として、蛍光強度の相乗平均値（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｅａｎ）を以下に示す。【０１９１】
Ｃ０８０４抗体に関して、コントロールｓｉＲＮＡを用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値１０．７１、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１２．９４、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値２４．５９、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値６３．４７。
Ｃ０８０４抗体に関して、ＧＰＲ８７に対するｓｉＲＮＡを用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値１０．１６、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１０．２６、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１２．９５、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値２０．５７。【０１９２】
Ｃ０８１２抗体に関して、コントロールｓｉＲＮＡを用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値１０．７１、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１１．３１、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１６．８７、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値３７．１０。
Ｃ０８１２抗体に関して、ＧＰＲ８７に対するｓｉＲＮＡを用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値１０．１６、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値９．６７、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１０．２３、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１１．３４。【０１９３】
Ｃ０８０６抗体に関して、コントロールｓｉＲＮＡを用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値１０．７１、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１１．０３、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１１．８９、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１５．８４。
Ｃ０８０６抗体に関して、ＧＰＲ８７に対するｓｉＲＮＡを用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値１０．１６、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値９．３８、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値９．５２、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１０．１８。【０１９４】
Ｃ０８０７抗体に関して、コントロールｓｉＲＮＡを用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値１０．７１、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１０．９３、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１１．４９、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１６．３５。
Ｃ０８０７抗体に関して、ＧＰＲ８７に対するｓｉＲＮＡを用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値１０．１６、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値９．４０、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値９．３７、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１０．３５。【０１９５】
Ｃ０８１４抗体に関して、コントロールｓｉＲＮＡを用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値１０．７１、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１０．６８、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１１．０４、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１２．２７。
Ｃ０８１４抗体に関して、ＧＰＲ８７に対するｓｉＲＮＡを用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値１０．１６、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値９．７５、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値９．８３、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値９．９４。【０１９６】
Ｃ０８１５抗体に関して、コントロールｓｉＲＮＡを用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値１０．７１、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１３．３０、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値２８．８１、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値６０．５２。
Ｃ０８１５抗体に関して、ＧＰＲ８７に対するｓｉＲＮＡを用いた場合の結果：
一次抗体を加えなかった時の相乗平均値１０．１６、一次抗体濃度が０．１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１０．１４、一次抗体濃度が１μｇ／ｍＬの時の相乗平均値１３．５８、一次抗体濃度が１０μｇ／ｍＬの時の相乗平均値２２．３９。
【実施例５】
【０１９７】
＜エピトープマッピング＞
実施例５では、ウエスタンブロットにより、エピトープマッピングを行った。【０１９８】
上述の通り、ＧＰＲ８７はＧＰＣＲであり、４箇所の細胞外領域が存在する（配列番号２〜５参照）。そこで、各細胞外領域のアミノ酸配列を有するポリペプチドとＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）との融合タンパク質を作製し、ウエスタンブロットを行い、各作製抗体のエピトープを検討した。【０１９９】
各細胞外領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成し、ＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターのマルチクローニングサイトにそのＤＮＡを組み込んだ。大腸菌をその組換えベクターで形質転換し、５ｍＬカルチャーでその大腸菌を一晩培養した。それを１０倍希釈して１ｍＬカルチャーで２時間培養し、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を最終濃度０．５ｍＭ添加して２時間培養し、ＧＳＴ融合タンパク質を発現誘導した。【０２００】
そして、そのＧＳＴ融合タンパク質を発現した大腸菌を遠心して集め、サンプルバッファーを加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、実施例２で作製した抗体を一次抗体としてウエスタンブロットを行った。【０２０１】
結果を図３に示す。【０２０２】
図中、「レーンＭ」はＧＳＴをアプライした場合のウエスタンブロットの結果（コントロール）を、「レーン１」は配列番号２のアミノ酸配列（ヒトＧＰＲ８７全長中、１〜４１番目のアミノ酸配列）を有するポリペプチドとＧＳＴとの融合タンパク質をアプライした場合のウエスタンブロットの結果を、「レーン２」は配列番号３のアミノ酸配列（ヒトＧＰＲ８７全長中、１０１〜１１８番目のアミノ酸配列）を有するポリペプチドとＧＳＴとの融合タンパク質をアプライした場合のウエスタンブロットの結果を、「レーン３」は配列番号４のアミノ酸配列（ヒトＧＰＲ８７全長中、１８２〜２０６番目のアミノ酸配列）を有するポリペプチドとＧＳＴとの融合タンパク質をアプライした場合のウエスタンブロットの結果を、「レーン４」は配列番号５のアミノ酸配列（ヒトＧＰＲ８７全長中、２８０〜２９８番目のアミノ酸配列）を有するポリペプチドとＧＳＴとの融合タンパク質をアプライした場合のウエスタンブロットの結果を、それぞれ表す。【０２０３】
図中、「αＧＳＴ」は一次抗体に抗ＧＳＴ抗体を用いたことを、「Ｃ０８０４」は一次抗体にＣ０８０４抗体を用いたことを、「Ｃ０８１２」は一次抗体にＣ０８１２抗体を用いたことを、「Ｃ０８１５」は一次抗体にＣ０８１５抗体を用いたことを、「Ｃ０８０６」は一次抗体にＣ０８０６抗体を用いたことを、「Ｃ０８０７」は一次抗体にＣ０８０７抗体を用いたことを、「Ｃ０８１４」は一次抗体にＣ０８１４抗体を用いたことを、それぞれ表す。【０２０４】
その結果、図３に示す通り、Ｃ０８０４抗体、Ｃ０８１２抗体、Ｃ０８１５抗体、Ｃ０８０６抗体、Ｃ０８０７抗体、Ｃ０８１４抗体を用いた場合、レーン１でバンドが確認できた。【０２０５】
この結果は、Ｃ０８０４抗体、Ｃ０８１２抗体、Ｃ０８１５抗体、Ｃ０８０６抗体、Ｃ０８０７抗体、Ｃ０８１４抗体の各抗体が、ヒトＧＰＲ８７の細胞外領域を認識する抗体であること、及び、各抗体のエピトープが、ヒトＧＰＲ８７全長中、１〜４１番目のアミノ酸配列のいずれかの位置に存在することを示す。
【実施例６】
【０２０６】
＜エピトープマッピング＞
実施例６では、配列番号６のアミノ酸配列（１５アミノ酸）を有する合成ポリペプチドを用いて、ドットブロットを行い、エピトープを検討した。【０２０７】
上述の通り、配列番号６のアミノ酸配列は、最もＮ末端側の細胞外領域の配列中に含まれる部分であり、全長中、９〜２４番目のアミノ酸配列である。【０２０８】
この合成ポリペプチドをＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）とコンジュゲートさせ、ニトロセルロースメンブレンに濃度を振って滴下した。そして、実施例２で作製した抗体を一次抗体としてドットブロットを行った。【０２０９】
結果を図４に示す。【０２１０】
図中、「レーン１」は配列番号６のアミノ酸配列を有する合成ポリペプチドを滴下した場合のドットブロットの結果を、「レーン２」は１５アミノ酸の他の合成ポリペプチドを滴下した場合のドットブロットの結果（コントロール）を、それぞれ表す。【０２１１】
図中、「Ｃ０８０４」は一次抗体にＣ０８０４抗体を用いたことを、「Ｃ０８１２」は一次抗体にＣ０８１２抗体を用いたことを、「Ｃ０８１５」は一次抗体にＣ０８１５抗体を用いたことを、「Ｃ０８０６」は一次抗体にＣ０８０６抗体を用いたことを、「Ｃ０８０７」は一次抗体にＣ０８０７抗体を用いたことを、「Ｃ０８１４」は一次抗体にＣ０８１４抗体を用いたことを、それぞれ表す。【０２１２】
図中、「１μｇ」、「０．１μｇ」、「０．０１μｇ」は、それぞれ、ＫＬＨでコンジュゲートした合成ペプチドの滴下量を表す。【０２１３】
図中、「ポンソーＳ」は、合成ポリペプチドを滴下したニトロセルロースメンブレンを、ドットブロットを行う前に、ポンソーＳ染色した結果であることを表す。「ドットブロット」は、ドットブロットを行った結果であることを表す。【０２１４】
その結果、図４に示す通り、Ｃ０８０４抗体、Ｃ０８１２抗体、Ｃ０８１５抗体、Ｃ０８０６抗体、Ｃ０８０７抗体、Ｃ０８１４抗体を用いた場合、レーン１（配列番号６のアミノ酸配列を有する合成ポリペプチドを滴下したレーン）で濃度依存的なドットを確認した。【０２１５】
この結果は、Ｃ０８０４抗体、Ｃ０８１２抗体、Ｃ０８１５抗体、Ｃ０８０６抗体、Ｃ０８０７抗体、Ｃ０８１４抗体の各抗体のエピトープが、ヒトＧＰＲ８７全長中、９〜２３番目のアミノ酸配列のいずれかの位置に存在することを示す。
【実施例７】
【０２１６】
＜免疫組織染色＞
実施例７では、癌組織切片の免疫染色を試みた。【０２１７】
各癌組織のパラフィン切片を、オートクローブ処理により抗原賦活化し、ｐＨ６．５に調整し、ＤＡＢ免疫染色法により、免疫染色を行った。一次抗体には、Ｃ０８０４抗体を４０μｇ／ｍＬに調整して用いた。【０２１８】
肺扁平上皮癌における免疫染色の結果を図５に示す。【０２１９】
図５に示す通り、本発明に係る抗体を用いることにより、肺扁平上皮癌の組織切片で強陽性の染色像を観察できた。【０２２０】
その他、皮膚の有棘上皮癌（扁平上皮癌）、舌癌（扁平上皮癌）、咽頭の扁平上皮癌、咽頭の悪性リンパ腫、喉頭の扁平上皮癌、膀胱の扁平上皮癌において強陽性の染色像が、皮膚の基底上皮癌、皮膚のメラノーマ、肺の小細胞癌、食道の扁平上皮癌、食道の腺癌、膵臓の管状腺癌、子宮頚癌（扁平上皮癌）、膀胱の移行上皮癌、腎盂・尿管癌（移行上皮癌）、子宮癌（腺癌）、乳癌（腺癌）において陽性の染色像が、肺の腺癌、胃癌（腺癌）、大腸癌（腺癌）において弱陽性の染色像が、それぞれ観察された。
【実施例８】
【０２２１】
＜ＡＤＣＣ活性＞
実施例８では、実施例２で得た各精製抗体のＡＤＣＣ活性を調べた。【０２２２】
まず、標的細胞２×１０６個を培地２００μＬに懸濁し、５１Ｃｒ（１８５ＭＢｑ／ｍＬ；パーキンエルマー社より購入）を１６μＬ加え、３７℃条件下で１．５時間インキュベートし、５１Ｃｒを細胞内に取り込ませた後、９６ウエルプレートの各ウエルに、該細胞を１×１０４個（５０μＬ）ずつ入れた。標的細胞には、実施例１で樹立した安定発現細胞株、及び、比較例としてＣＨＯ細胞の野生株を用いた。【０２２３】
次に、実施例２で得た抗体６種類を、最終濃度がそれぞれ０．００１、０．０１、０．１、１、１０μｇ／ｍＬになるように調製し、各ウエルに５０μＬ加えた。コントロールでは、抗体の代わりに同量の培地を加えた。【０２２４】
次に、エフェクター細胞を１×１０５個（１００μＬ）加えた。そして、３７℃条件下で４時間インキュベートした。エフェクター細胞には、マウスから骨髄細胞を採取し、ＧＭ−ＣＳＦ（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）を添加した培地で６日間培養したものを用いた。【０２２５】
ＡＤＣＣ活性により標的細胞が破壊されると、５１Ｃｒが培養上清中に放出される。そこで、インキュベート後、各ウエルの培養上清を回収し、ガンマカウンターで測定した。【０２２６】
同時に、細胞内に取り込まれた５１Ｃｒ量の値として、標的細胞１×１０４個に５１Ｃｒを取り込ませた後、２％ＮＰ−４０を添加して全標的細胞を破壊し、その培養上清を回収し、ガンマカウンターで測定した。【０２２７】
そして、各抗体を加えた場合におけるガンマカウンターの測定値から抗体の代わりに培地を同量加えた場合における同測定値を減し（Ａ）、一方、細胞内に取り込まれた５１Ｃｒ量の測定値から抗体の代わりに培地を同量加えた場合における同測定値を減し（Ｂ）、次に、（Ａ）を（Ｂ）で除し、その１００倍の値をＡＤＣＣ活性の値（％）とした。【０２２８】
結果を図６に示す。図６は、ＡＤＣＣ活性の測定結果を示すグラフである。グラフ中、横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を、縦軸はＡＤＣＣ活性（％）を表す。「ｓｔａｂｌｅ  ＣＨＯ（実線の折れ線グラフ）」は標的細胞に実施例１で樹立した安定発現細胞株を用いた場合におけるＡＤＣＣ活性を、「ｗｉｌｄ  ＣＨＯ（破線の折れ線グラフ）」は標的細胞にＣＨＯ細胞の野生株を用いた場合におけるＡＤＣＣ活性を、「Ｃ０８０４」、「Ｃ０８１２」、「Ｃ０８１５」、「Ｃ０８０６」、「Ｃ０８０７」、「Ｃ０８１４」は、それぞれの抗体を入れた場合におけるＡＤＣＣ活性を、それぞれ表す。【０２２９】
図６に示す通り、いずれの抗体も、実施例１で樹立した安定発現細胞株を用いた場合におけるＡＤＣＣ活性の値が、ＣＨＯ細胞の野生株を用いた場合に比べ、高かった。即ち、実施例２で得た各精製抗体は、いずれもＡＤＣＣ活性を有することが分かった。
【実施例９】
【０２３０】
＜ＰＥＴ＞
実施例９では、本発明に係る抗体がｉｎ  ｖｉｖｏにおいても癌組織に集積するか、ｍｉｃｒｏＰＥＴを用いて調べた。【０２３１】
本発明に係る抗体を放射性同位元素で修飾し、それを担癌モデルマウスに投与し、ｍｉｃｒｏＰＥＴ装置でその放射線を検出し、イメージングした。【０２３２】
ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、５週齢、メス）の右肩部にＭＥ１８０細胞を１×１０７ｃｅｌｌｓ皮下移植し、４週間飼育し、担癌モデルマウスを作製した。移植の４週間後における腫瘍の大きさは約１，０００ｍｍ３であった。【０２３３】
上述のＣ０８０４抗体とＳ−２−（４−Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｂｅｎｚｙｌ）−１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社製、以下、「ＤＯＴＡ」とする。）を１：１０（モル比）で混合し、２４時間室温で静置して、抗体をＤＯＴＡ化した。次に、その抗体のＤＯＴＡ部分に６４Ｃｕを配位結合させ、抗体を放射性同位元素で修飾させた。修飾後の抗体濃度は４０５．０μｇ／ｍＬ、放射能濃度は４３．１ＭＢｑ／ｍＬだった。【０２３４】
作製した担癌マウスに放射性同位元素修飾抗体を５ＭＢｑ投与し、その７２時間後に、ｍｉｃｒｏＰＥＴで撮像した。イソフルラン麻酔下で、装置に「Ｉｎｖｅｏｎ  ＰＥＴ（ＳＩＥＭＥＮＳ社製）」を用いて、抗体投与の７２時間後から１８０分間、撮像（エミッションスキャン）を行い、収集データを３Ｄ−ＭＡＰ法（ＯＳＥＭ  ３Ｄ／ＭＡＰ；３Ｄ−Ｏｒｄｅｒｅｄ  Ｓｕｂｓｅｔ−Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ／Ｍａｘｉｍｕｍ  Ａ  Ｐｒｉｏｒｉ)で再構成した。【０２３５】
結果を図７に示す。図７は、担癌モデルマウスに放射性同位元素修飾抗体を投与した際のＰＥＴイメージングデータである。このデータはマウスを背側（上側）からみた状態に再構成されており、同図中、上側が前方（頭側）、下側が後方（尾部側）である。【０２３６】
図７に示す通り、担癌マウスに放射性同位元素修飾抗体を投与した結果、癌部（右肩部、図中の矢印参照）に、特異的な放射性同位元素修飾抗体の集積が検出された。【０２３７】
この結果は、本発明に係る抗体がｉｎ  ｖｉｖｏにおいても癌組織に特異的に集積すること、即ち、ＧＰＲ８７を高発現する各種腫瘍の診断・治療に有効であることを示す。
【実施例１０】
【０２３８】
＜ＣＤＲの解析＞
実施例１０では、実施例２で得た各精製抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を決定した。【０２３９】
実施例２で樹立したハイブリドーマから、「ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）」を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに変換した後、「Ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ−  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）」を用いてＰＣＲを行い、それぞれ、各抗体のＨ鎖、Ｌ鎖のＮ末端近傍をコードするＤＮＡを増幅した。【０２４０】
次に、増幅したＤＮＡをゲル精製した後、Ｔベクターに組み込み、そのシークエンスを測定した。【０２４１】
Ｃ０８０４抗体のＨ鎖から取得した塩基配列を配列番号８に、Ｃ０８０４抗体のＬ鎖から取得した塩基配列を配列番号９に、Ｃ０８１２抗体のＨ鎖から取得した塩基配列を配列番号１０に、Ｃ０８１２抗体のＬ鎖から取得した塩基配列を配列番号１１に、Ｃ０８１５抗体のＨ鎖から取得した塩基配列を配列番号１２に、Ｃ０８１５抗体のＬ鎖から取得した塩基配列を配列番号１３に、それぞれ示す。なお、これらの配列は、開始コドンから始まる５’末端側の部分長配列である。【０２４２】
この配列情報に基づき翻訳した、Ｃ０８０４抗体のＨ鎖のＮ末端からの部分長アミノ酸配列を配列番号１４に、Ｃ０８０４抗体のＬ鎖のＮ末端からの部分長アミノ酸配列を配列番号１５に、Ｃ０８１２抗体のＨ鎖のＮ末端からの部分長アミノ酸配列を配列番号１６に、Ｃ０８１２抗体のＬ鎖のＮ末端からの部分長アミノ酸配列を配列番号１７に、Ｃ０８１５抗体のＨ鎖のＮ末端からの部分長アミノ酸配列を配列番号１８に、Ｃ０８１５抗体のＬ鎖のＮ末端からの部分長アミノ酸配列を配列番号１９に、それぞれ示す。【０２４３】
この配列情報から推測されるＣ０８０４抗体のＨ鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号２０に、ＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号２１に、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号２２に、それぞれ示す。同じくＣ０８０４抗体のＬ鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号２３に、ＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号２４に、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号２５に、それぞれ示す。
同じくＣ０８１２抗体のＨ鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号２６に、ＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号２７に、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号２８に、それぞれ示す。同じくＣ０８１２抗体のＬ鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号２９に、ＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号３０に、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号３１に、それぞれ示す。
同じくＣ０８１５抗体のＨ鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号３２に、ＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号３３に、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号３４に、それぞれ示す。同じくＣ０８１５抗体のＬ鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号３５に、ＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号３６に、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号３７に、それぞれ示す。
【産業上の利用可能性】
【０２４４】
本発明に係る抗体は、ＧＰＲ８７の生化学的解析、腫瘍の免疫組織学的診断などに有用であり、また、腫瘍のＰＥＴ診断、治療用抗体などにも有用な可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１Ａ】実施例３において、細胞に実施例１で樹立したヒトＧＰＲ８７安定発現細胞株を、一次抗体にＣ０８０４抗体を、それぞれ用いて行ったフローサイトメトリーの結果を示す図。
【図１Ｂ】実施例３において、細胞にＣＨＯ細胞の野生株を、一次抗体にＣ０８０４抗体を、それぞれ用いて行ったフローサイトメトリーの結果（コントロール）を示す図。
【図２Ａ】実施例４において、細胞にコントロールｓｉＲＮＡをトランスファクションしたＭｅ１８０細胞を、一次抗体にＣ０８０４抗体を、それぞれ用いて行ったフローサイトメトリーの結果（コントロール）を示す図。
【図２Ｂ】実施例４において、細胞にヒトＧＰＲ８７に対するｓｉＲＮＡをトランスファクションしたＭｅ１８０細胞を、一次抗体にＣ０８０４抗体を、それぞれ用いて行ったフローサイトメトリーの結果を示す図。
【図３】実施例５において、ウエスタンブロットの結果を示す図面代用写真。
【図４】実施例６において、ドットブロットの結果を示す図面代用写真。
【図５】実施例７において、肺扁平上皮癌の免疫組織染色の結果を示す図面代用写真。
【図６】実施例８において、ＡＤＣＣ活性の測定結果を示すグラフ。
【図７】実施例９において、担癌モデルマウスに放射性同位元素修飾抗体を投与した際のＰＥＴイメージングデータ。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
2010095461000001.app
【国際調査報告】
2010095461.tif 000011
2010095461.tif 000012
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