(57)【要約】本発明は、新たなグルクロン酸転移酵素、およびそれをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号：７で表される塩基配列の第１番目〜第１３６２番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド）などを提供する。これにより、基質特異性の広い、新たなグルクロン酸転移酵素などが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号：７で表される塩基配列の第１番目〜第１３６２番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列において１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列に対して、８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：７で表される塩基配列の第１番目〜第１３６２番目の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；または
（ｆ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の（ｇ）〜（ｊ）のいずれかである請求項１に記載のポリヌクレオチド：
（ｇ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列において１０個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列に対して、９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号：７で表される塩基配列の第１番目〜第１３６２番目の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；または
（ｊ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：７で表される塩基配列の第１番目〜第１３６２番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
【請求項９】
請求項７に記載のベクターが導入された形質転換体。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の形質転換体を用いる請求項６のタンパク質の製造方法。
【請求項１１】
請求項６に記載のタンパク質を触媒として、ＵＤＰ−グルクロン酸と糖受容体基質からグルクロン酸抱合体を生成する、グルクロン酸抱合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルクロン酸転移酵素、それをコードするポリヌクレオチド、それを含有するベクター、形質転換体などに関する。
【背景技術】
【０００２】
フラボノイドはフェニルプロパノイド系の植物二次代謝産物の総称であり、その一種であるアントシアニンは主に赤、橙〜青紫色の花色を決定する主要な色素である。同じくフラボノイドの一種であるフラボンやフラボノールの配糖体はそれ自身で薄い黄色を呈するものの、アントシアニン色素と複合体を形成することで花の色調に大きな影響を与えることから、補助色素（コピグメント）と呼ばれる。一般にコピグメントによる花色の青色波長側へのシフトはコピグメンテーションと呼ばれる。
シソ目ゴマノハグサ科キンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）の花弁にはフラボンの一種であるアピゲニンの７位グルクロナイド（グルクロン酸配糖体、あるいはグルクロン酸抱合体ともいう）が蓄積しており、これがコピグメントとして機能していると考えられる（文献１：Ａｓｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１，２７３９−２７４１．１９７２）。また、キク目キク科ヤグルマギク（Ｃｅｎｔａｕｒｅａ  ｃｙａｎｕｓ）の青色花弁の色素は金属錯体を形成しているが、その錯体中においてもフラボン７位グルクロナイドが見出されている（文献２：Ｓｈｉｏｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３６，７９１−７９２．２００５）。
シソ目シソ科コガネバナ属コガネバナ（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ）の根にはバイカリンと呼ばれる消炎作用のあるフラボン７位グルクロナイドが蓄積しており、その根は健胃効果のある漢方（オウゴン）として利用されている（文献３：Ｇａｏ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４７２，６４３−６５０．１９９９）。コガネバナの根からバイカレインの７位に対してグルクロン酸を転移する酵素としてＳｂＵＢＧＡＴ（Ｓｂ７ＧＡＴともいう）が精製されており（文献４：Ｎａｇａｓｈｉｍａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３，５３３−５３８，２０００）、このＳｂ７ＧＡＴに対応する遺伝子はＧｅｎＢａｎｋに登録されている（アクセショ  Ｎｏ．ＡＢ０４２２７７）が、その機能については確認されていない。また、日常に食している同科シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）の葉にも多様なフラボンの７位グルクロナイドが蓄積していることも近年明らかになっており、そのヒトの健康における機能性が期待されている（文献５：Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６２，９８７−９９８．２００３）。
このようにフラボン７位グルクロナイドは花色および健康食品分野において非常に注目される植物二次代謝産物であるにも関わらず、その生合成酵素（例えば、グルクロン酸転移酵素）については未知な部分が多い。
［文献］
１．Ａｓｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１，２７３９−２７４１．１９７２
２．Ｓｈｉｏｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３６，７９１−７９２．２００５
３．Ｇａｏ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４７２，６４３−６５０．１９９９
４．Ｎａｇａｓｈｉｍａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３，５３３−５３８，２０００
５．Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６２，９８７−９９８．２００３
【発明の開示】
【０００３】
このような状況の下、基質特異性の広い、新たなグルクロン酸転移酵素、およびそれをコードする遺伝子を同定することが求められていた。
本発明は上記状況に鑑みてなされたものであり、下記に示す、グルクロン酸転移酵素、それをコードするポリヌクレオチド、ならびに、それを含有するベクター、および形質転換体などを提供する。
（１）以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号：７で表される塩基配列の第１番目〜第１３６２番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列において１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列に対して、８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号：７で表される塩基配列の第１番目〜第１３６２番目の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；または
（ｆ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（２）以下の（ｇ）〜（ｊ）のいずれかである請求項１に記載のポリヌクレオチド：
（ｇ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列において１０個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列に対して、９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号：７で表される塩基配列の第１番目〜第１３６２番目の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；または
（ｊ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（３）配列番号：７で表される塩基配列の第１番目〜第１３６２番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する、上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する、上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）ＤＮＡである、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
（６）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
（７）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（８）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
（９）上記（７）に記載のベクターが導入された形質転換体。
（１０）上記（８）又は（９）に記載の形質転換体を用いる上記（６）のタンパク質の製造方法。
（１１）上記（６）に記載のタンパク質を触媒として、ＵＤＰ−グルクロン酸と糖受容体基質からグルクロン酸抱合体を生成する、グルクロン酸抱合体の製造方法。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、形質転換体に導入されることによって、新たなグルクロン酸転移酵素の製造に有用である。本発明の好ましい態様のグルクロン酸転移酵素は、基質特異性が広く、多様な糖受容体基質をグルクロン酸化する活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、大腸菌発現タンパク質を確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。Ｍ：サイズマーカー、Ｐ：ペレット画分、Ｃ：粗酵素画分、ＦＴ：非吸着画分、５０：５０ｍＭイミダゾール溶出画分、２００：２００ｍＭイミダゾール溶出画分、５００：５００ｍＭイミダゾール溶出画分、矢印：大腸菌発現させた目的のタンパク質（ＶｐＦ７ＧＡＴ）。
図２（Ａ）は、アピゲニンのＨＰＬＣ分析の結果を示すチャートである。図２（Ｂ）は、酵素反応液（アピゲニンとＵＤＰ−グルクロン酸）のＨＰＬＣ分析の結果を示すチャートである。図２（Ｃ）は、アピゲニンの７位グルクロナイドのＨＰＬＣ分析の結果を示すチャートである。図２（Ｄ）は、酵素反応液（アピゲニンとＵＤＰ−グルクロン酸）のＴＯＦ−ＭＳによる測定の結果を示すチャートである。
図３は、ＶｐＦ７ＧＡＴの糖受容体基質の基質特異性を解析した結果を示すグラフである。
図４は、定量ＲＴ−ＰＣＲによるＶｐＦ７ＧＡＴ遺伝子の器官別の発現解析の結果を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【０００５】
配列番号：１：合成ＤＮＡ
配列番号：２：合成ＤＮＡ
配列番号：３：合成ＤＮＡ
配列番号：４：合成ＤＮＡ
配列番号：５：合成ＤＮＡ
配列番号：６：合成ＤＮＡ
配列番号：９：合成ＤＮＡ
配列番号：１０：合成ＤＮＡ
配列番号：１１：合成ＤＮＡ
配列番号：１２：合成ＤＮＡ
配列番号：１３：合成ＤＮＡ
配列番号：１４：合成ＤＮＡ
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下に、本発明のグルクロン酸転移酵素、それをコードするポリヌクレオチド、それを含有するベクター、形質転換体などを詳細に説明する。
青い花を形成するシソ目ゴマノハグサ科のクワガタソウ属に属するオオイヌノフグリ（Ｖｅｒｏｎｉｃａ  ｐｅｒｓｉｃａ）の主アントシアニン色素はデルフィニジン３−Ｏ−（３−Ｏ−（６−Ｏ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−ｇｌｕｃｏｓｙｌ）−６−Ｏ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ−５−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅであり、主フラボンはアピゲニン７−Ｏ−（３−Ｏ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌ）−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅである（類家美穂、東洋大学修士論文、平成１５年度）。このアピゲニンを骨格とするフラボン７位グルクロナイドは主アントシアニン色素に対して顕著なコピグメント効果を示すことからオオイヌノフグリの花色に関与していると考えられる。本発明者らは、オオイヌノフグリ花弁由来ｃＤＮＡからＰＣＲによるフラボノイド７位グルクロン酸転移酵素（Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ７−Ｏ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：Ｆ７ＧＡＴ）遺伝子を単離し、本発明の一つの態様のポリヌクレオチド（配列番号７）を得た。
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、（ａ）配列番号：７で表される塩基配列の第１番目〜第１３６２番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド（具体的には、ＤＮＡ、以下、これらを単に「ＤＮＡ」とも称する）；及び（ｂ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。本発明で対象とするＤＮＡは、上記のグルクロン酸転移酵素をコードするＤＮＡに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のＤＮＡを含む。
機能的に同等なタンパク質としては、例えば、（ｃ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列において１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列において、例えば、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
また、機能的に同等なタンパク質としては、例えば、（ｄ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列に対して、８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質も挙げられる。このようなタンパク質としては、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列に対して、約８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
ここで、「ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性」とは、フラボノイド、スチルベンおよびリグナン等の糖受容体基質の水酸基をグルクロン酸化し（例えばフラボノイドをその７位の水酸基でグルクロン酸化し）、グルクロン酸抱合体を生じる反応を触媒する活性をいう。
ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性は、例えば、ＵＤＰ−グルクロン酸と糖受容体基質（例えば、フラボン）を評価対象となる酵素の存在下で反応させ、得られる反応物をＨＰＬＣ等で分析することによって測定することができる（より具体的には、後述の実施例の記載を参照）。
また、本発明は、（ｅ）配列番号：７で表される塩基配列の第１番目〜第１３６２番目の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び（ｆ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。好ましくは、ＤＮＡである。
本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号：７で表される塩基配列の第１番目〜第１３６２番目の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば“Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１”、“Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９８７−１９９７”などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。
上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号：７で表される塩基配列の第１番目〜第１３６２番目の塩基配列のＤＮＡ、または配列番号：８で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡと約６０％以上、約７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
なお、アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７２２６４−２２６８，１９９０；ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法または公知の合成手法によって取得することが可能である。
２．本発明のタンパク質
本発明は、さらに別の実施形態において、上記本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質も提供する。本発明のある態様のタンパク質は、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明の別の態様のタンパク質は、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明のさらに別の態様のタンパク質は、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列において１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質は、“Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１”、“Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９８７―１９９７”、“Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）”、“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）”、“Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）”、“Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）”、“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において１以上（例えば１〜１５個、好ましくは１０個以下）のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸；Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
また、本発明のタンパク質は、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
ここで、本発明のタンパク質は、グルクロン酸転移酵素である。「グルクロン酸転移酵素」は、糖供与体から糖受容体基質にグルクロン酸残基を転移し、グルクロン酸抱合体を生じる反応を触媒する。本発明において、糖受容体基質は、例えばフラボノイド、スチルベン、クマリン、およびリグナンである。また、糖供与体は、例えばＵＤＰ−グルクロン酸である。本発明のある態様のタンパク質は、ＵＤＰ−グルクロン酸から糖受容体基質にグルクロン酸残基を転移し、グルクロン酸抱合体とＵＤＰとを生じる反応を触媒する。
糖受容体基質のフラボノイドには、フラボン、フラボノール、フラバノン、イソフラボン、フラボンＣ配糖体、オーロン、およびカテキン等が含まれる。このうち、フラボンとしては、例えば、バイカレイン、スクテラレイン、アピゲニン、ルテオリン、トリセチン、ジオスメチン、およびクリソエリオールを挙げることができる。フラボノールとしては、例えば、ケルセチン、ミリセチン、およびケンフェロールを挙げることができる。フラバノンとしては、例えば、ナリンゲニンを挙げることができる。イソフラボンとしては、例えば、ジェニステイン、ダイゼインおよびホルモノネチンを挙げることができる。フラボンＣ配糖体としては、例えば、ビテキシン、イソビテキシンおよびオリエンチンを挙げることができる。オーロンとしては、例えば、オーレウシジンを挙げることができる。カテキンとしては、例えば、カテキンおよびエピガロカテキンガレートを挙げることができる。
スチルベンには、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）およびその配糖体のピセイド（ｐｉｃｅｉｄ）等が含まれる。
リグナンには、（＋）−ピノレジノール（（＋）−Ｐｉｎｏｒｅｓｉｎｏｌ）、（＋）−ピペリトール（（＋）−Ｐｉｐｅｒｉｔｏｌ）、（＋）−セサミノール（（＋）−Ｓｅｓａｍｉｎｏｌ）、（＋）−セコイソラリシレジノール（（＋）−Ｓｅｃｏｉｓｏｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌ）、（＋）−セサミンカテコール１（（＋）−Ｓｅｓａｍｉｍ  ｃａｔｅｃｏｌ１）（ＳＣ１）、（＋）−セサミンカテコール２（（＋）−Ｓｅｓａｍｉｍ  ｃａｔｅｃｏｌ２）（ＳＣ２）、（＋）−エピセサミンカテコール２（（＋）−Ｅｐｉｓｅｓａｍｉｍ  ｃａｔｅｃｏｌ２）（ＥＣ２）、およびマタイレジノール（ｍａｔａｉｒｅｓｉｎｏｌ）等が含まれる。
本発明のある態様では、糖受容体基質はフラボノイドである。本発明の別の態様では、糖受容体基質は、Ｂ環４’基に水酸基を有するフラボンである。本発明のさらに別の態様では、糖受容体基質は、スクテラレイン、アピゲニン、ルテオリン、ジオスメチン、クリソエリオール、ケンフェロール、およびナリンゲニンからなる群から選択される少なくとも１つの糖受容体基質である。
そして、例えば、配列番号：８のアミノ酸配列からなるグルクロン酸転移酵素（ＶｐＦ７ＧＡＴ）は、糖受容体基質が、スクテラレイン、バイカレイン、アピゲニン、ルテオリン、ジオスメチン、およびクリソエリオール等のフラボン、ケルセチンおよびケンフェロール等のフラボノール、ならびにナリンゲニン等のフラバノンのときに活性を示し、特に、スクテラレイン、アピゲニン、ルテオリン、ジオスメチン、クリソエリオール、ケンフェロール、およびナリンゲニンのときに他の糖受容体基質と比較して強い活性を示す。
３．ベクター及びこれを導入した形質転換体
本発明はまた、別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチド（例えば、前記（ａ）〜（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチド）を含有する。好ましくは、本発明の発現ベクターは、前記（ｇ）〜（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチドを含有する。さらに好ましくは、本発明の発現ベクターは、配列番号：７で表される塩基配列の第１番目〜第１３６２番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は、配列番号：８で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有する。
本発明のベクターは、通常、（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；（ｉｉ）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド（例えば、前記（ａ）〜（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチド）；及び（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。このように構築されるベクターは、宿主細胞に導入される。発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ｕｒａ５、ｎｉａＤ）、薬剤耐性マーカー（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｅ、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，３３７  １９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，ＰＤＲ４）（それぞれ猪腰淳嗣ら，生化学，６４，６６０，１９９２；Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｇｅｎｅ，１０１，１４９，１９９１）などが利用可能である。
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、前記（ａ）〜（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチド）が導入された形質転換体を提供する。
形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。ここで用いられる宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物が挙げられる。
宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法（Ｍａｃｋｅｎｘｉｅ  Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６，４６５５−４６６１，２０００）、パーティクルデリバリー法（特開２００５−２８７４０３「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５  ｐ１９２９（１９７８））、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，ｐ１６３（１９８３））、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５  ｐ１９２９（１９７８）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００  Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌなどに記載の方法）で実施可能であるが、これらに限定されない。
本発明の別の態様において、形質転換体は、植物形質転換体であり得る。本実施形態に係る植物形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように植物中に導入することによって取得される。
組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明に係るポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクター、または外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。
植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知である。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（１９９０）２７〜３１頁、講談社サイエンティフィック、東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、６７、３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎら、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞または植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター（ｐＢＩ１２１またはｐＰＺＰ２０２など）を使用することができる。
また、遺伝子を直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。遺伝子銃を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物または試料によって異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。
遺伝子が導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターを遺伝子銃、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
本発明に係るポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、本発明に係るポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。
また、種々の植物に対する形質転換方法が既に報告されている。本発明に係る形質転換体植物としては、例えば、ゴマ、イネ、タバコ、オオムギ、コムギ、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシ、カリフラワー、バラ、キク、カーネーション、キンギョソウ、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、レンギョウ、シロイヌナズナ、およびミヤコグサなどが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明のある態様によれば、形質転換植物体は機能性食品材料用植物体である。
本発明の別の態様によれば、形質転換植物体は花色が改変された植物体である。好ましくは、花色が改変された植物体は、花色が青色に改変された植物体である。
４．本発明のタンパク質の製造方法
本発明はまた、別の実施形態において、上記の形質転換体を用いる本発明のタンパク質の製造方法を提供する。
具体的には、上記形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を分離・精製することによって、本発明のタンパク質を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体もしくは培養細胞、または培養菌体もしくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明のタンパク質の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
具体的には、本発明のタンパク質が培養菌体内もしくは培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体もしくは細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により本発明のタンパク質の粗抽出液を得ることができる。本発明のタンパク質が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体もしくは細胞と培養上清とを分離することにより、本発明のタンパク質を含む培養上清を得ることができる。
このようにして得られた抽出液もしくは培養上清中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。
５．グルクロン酸抱合体の製造方法
さらに、本発明は、本発明のタンパク質を用いてグルクロン酸抱合体を製造する方法を提供する。本発明のタンパク質は、糖受容体基質（例えば、フラボノイド、スチルベン、またはリグナン）に糖供与体（例えば、ＵＤＰ−グルクロン酸）からグルクロン酸を転移する反応を触媒するので、本発明のタンパク質を用いることにより、糖受容体基質および糖供与体を原料として、グルクロン酸抱合体を製造することができる。糖受容体基質は、好ましくは、フラボノイドである。
例えば、１ｍＭの糖受容体基質、２ｍＭの糖供与体、５０ｍＭのリン酸カルシウムバッファー（ｐＨ７．５）、および２０μＭの本発明のタンパク質を含む溶液を調製し、３０℃で、３０分間反応させることにより、グルクロン酸抱合体を製造することができる。この溶液から、グルクロン酸抱合体は、公知の方法により分離・精製することができる。具体的には、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。
このようにして得られるグルクロン酸抱合体は、機能性食品の材料、その生体内での機能を調べるための試薬、あるいは、抗酸化剤などとして有用である（Ｇａｏ，Ｚ．，Ｈｕａｎｇ，Ｋ．，Ｙａｎｇ，Ｘ．，ａｎｄ  Ｘｕ，Ｈ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４７２，６４３−６５０．）。
【実施例】
【０００７】
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これらに限定されるべきではない。
［実施例１］
遺伝子クローニング
本実施例において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法に従った。
Ｂｌａｓｔ解析による相同性検索によりシソ科コガネバナのグルクロン酸転移酵素ＳｂＵＢＧＡＴ（Ｎａｇａｓｈｉｍａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３，５３３−５３８，２０００）に対してアミノ酸配列レベルで５５％の配列同一性を示すゴマノハグサ科キンギョソウの配糖体化酵素遺伝子（ＡｍＵＧＴｃｇ１０、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ３６２９８８）を見出した（Ｏｎｏ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３，１１０７５−１１０８０，２００６）。
同じゴマノハグサ科であるオオイヌノフグリのフラボノイド７位グルクロン酸転移酵素ＶｐＦ７ＧＡＴをコードする遺伝子を単離するために、この同科キンギョソウの配列を基に以下に示す２種のプライマー（配列番号１および２）を設計した。
配列番号１
2010026666.tif 000002
配列番号２
2010026666.tif 000003
ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用して、オオイヌノフグリの花弁から総ＲＮＡを抽出した後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を製造業者が推奨する条件に従って使用して、総ＲＮＡ  １μｇからｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型にして、上記の配列番号１および２のプライマーを用いたＰＣＲにより、ＶｐＦ７ＧＡＴをコードする遺伝子の単離を試みた。
具体的にはＰＣＲ反応液（５０μｌ）は、オオイヌノフグリｃＤＮＡ  １μｌ、１×ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａＢｉｏ）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、プライマー（配列番号：１および２）各０．４ｐｍｏｌ／μｌ、ＥｘＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２．５Ｕからなるものとした。ＰＣＲ反応では、９４℃で３分間反応させた後、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で２分間の反応を３５サイクルの増幅を行った。
ＰＣＲ反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動により分離したところ、約１．０ｋｂのサイズに増幅断片を得た。この増幅した断片をｐＣＲ−ＴＯＰＯＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のマルチクローニングサイトに挿入し、挿入断片の塩基配列を、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して、合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるプライマーウォーキング法によって決定した。得られた塩基配列をＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラム（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ  ７．２．２ソフトウェア、Ａｃｃｅｒｌｙ社）で解析した結果、キンギョソウＡｍＵＧＴｃｇ１０およびコガネバナＳｂＵＢＧＡＴと高い配列同一性を示したことから、本ｃＤＮＡをＶｐＦ７ＧＡＴの候補遺伝子とした。
しかしながらＡｍＵＧＴｃｇ１０とアライメントした結果、得られたｃＤＮＡ増幅断片は５’および３’領域が欠損している不完全ＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）であった。そこで、Ｇｅｎｅ  Ｒａｃｅｒ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を製造業者の推奨する方法に従ってＲａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄ（以下、ＲＡＣＥ）を行い、ｃＤＮＡ断片の５’および３’領域を増幅した。ＲＡＣＥには以下の配列番号３〜６に示すＶｐＦ７ＧＡＴ遺伝子に特異的なプライマーセットを用いた。
配列番号３
2010026666.tif 000004
配列番号４
2010026666.tif 000005
配列番号５
2010026666.tif 000006
配列番号６
2010026666.tif 000007
ＲＡＣＥによって得られた増幅断片について合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたプライマーウォーキング法によって塩基配列を決定し、完全長ＯＲＦを含むＶｐＦ７ＧＡＴ候補遺伝子およびそのアミノ酸配列を得た（配列番号：７（ＶｐＦ７ＧＡＴのｃＤＮＡ配列）、配列番号：８（ＶｐＦ７ＧＡＴのアミノ酸配列））。
このＶｐＦ７ＧＡＴ候補遺伝子はアミノ酸配列レベルでキンギョソウＡｍＵＧＴｃｇ１０およびコガネバナＳｂＵＢＧＡＴとそれぞれ６１および５１％の配列同一性を示した。
［実施例２］
発現ベクター構築
実施例１で得られたＶｐＦ７ＧＡＴ候補タンパク質（以下、本酵素）の生化学的な機能を明らかにするために、本酵素ｃＤＮＡを発現する大腸菌発現ベクターを構築した。完全長ＯＲＦを含むｃＤＮＡを、配列番号９および１０で示されるＶｐＦ７ＧＡＴ候補遺伝子特異的なプライマーセットによってＰＣＲ法で増幅した。鋳型には上記のオオイヌノフグリ花弁から抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて合成したｃＤＮＡを用いた。
配列番号９
2010026666.tif 000008
配列番号１０
2010026666.tif 000009
ＰＣＲ反応（ＫＯＤ  Ｐｌｕｓポリメラーゼ，ＴＯＹＯＢＯ社）は、９４℃，２ｍｉｎで熱変性させた後、［９４℃，１５ｓｅｃ；５０℃，３０ｓｅｃ；６８℃，１．５ｍｉｎ］×３５ｃｙｃｌｅｓで行った。増幅されたＤＮＡ断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングし、ＡＢＩ３１００Ａｖａｎｔ  ジェネティックアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によって塩基配列の確認を行った。
得られたプラスミドはＮｄｅＩとＸｈｏＩの制限酵素で完全消化し、生じた完全長ＯＲＦを含む約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を大腸菌発現ベクターｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅＩとＸｈｏＩサイトに連結し、大腸菌発現ベクターを得た。
［実施例３］
大腸菌組換えタンパク質発現および精製
上記で得られたそれぞれのプラスミドを用い定法に従って大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１０ｇ／ｌ  ｔｙｐｔｏｎｅ  ｐｅｐｔｏｎ，５ｇ／ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，１ｇ／ｌ  ＮａＣｌ）４ｍｌにて、３７℃で一晩振盪培養した。静止期に達した培養液４ｍｌを同組成の培地８０ｍｌに接種し、３７℃で振盪培養した。菌体濁度（ＯＤ６００）がおよそ０．７に達した時点で終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加し、２２℃で２０ｈｒ振盪培養した。
以下のすべての操作は４℃で行った。培養した形質転換体を遠心分離（７，０００×ｇ，１５ｍｉｎ）にて集菌し，Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓ［２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４），２０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌ，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，１４ｍＭ  β−メルカプトエタノール］２ｍｌ／ｇ  ｃｅｌｌを添加し、懸濁した。続いて超音波破砕（１５ｓｅｃ×８回）を行い，遠心分離（１５，０００×ｇ，１０ｍｉｎ）した。得られた上清に終濃度０．１２％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミンを添加して懸濁し，３０ｍｉｎ静置した。遠心分離（１５，０００×ｇ，１０ｍｉｎ）を行い、上清を粗酵素液として回収した。粗酵素液をＢｕｆｆｅｒ  Ｓにて平衡化したＨｉｓ  ＳｐｉｎＴｒａｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、遠心（７０×ｇ，３０ｓｅｃ）した。Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓ６００μｌで洗浄後、１００，２００，５００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含むＢｕｆｆｅｒ  Ｓ各６００μｌにてカラムに結合したタンパク質を段階的に溶出した。各溶出画分をＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３０（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて２０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５），１４ｍＭ  β−メルカプトエタノールにバッファー置換した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果、２００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ溶出画分においてＶｐＦ７ＧＡＴのアミノ酸配列から推定される約５０ｋＤａ付近に精製された発現タンパク質を確認したので、この画分を酵素解析に用いた（図１、矢印：目的のタンパク質）。
［実施例４］
酵素反応および生成物分析
標準的な反応条件は以下の通りである。反応液（２ｍＭ  ＵＤＰ−グルクロン酸，１００μＭ  糖受容体基質，５０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５），酵素溶液）５０μｌを調製し、酵素溶液を添加することで反応を開始させ、３０℃、１分間反応させた。０．５％  ＴＦＡを含むＣＨ３ＣＮ５０μｌを添加することにより反応を停止させ，逆相ＨＰＬＣ（ＬＣ−２０１０システム、島津製作所）にて分析した。
ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。カラムはＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−５（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、野村化学）をカラムオーブン４０℃で用い、移動相Ａ（０．１％  ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ）と移動相Ｂ（０．１％  ＴＦＡ／９０％  ＣＨ３ＣＮ）を用いた。溶離条件は１５分間の直線濃度勾配（Ｂ２０％→Ｂ７０％）の後、さらに一分間Ｂ７０％で保持した。その後再びＢ２０％に戻し２０分間平衡化した。流速は１ｍｌ／ｍｉｎで行った。検出はＳＰＤ−Ｍ１０Ａ  Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ（（株）島津製作所）を用いて２８０および３６０ｎｍで行った。本条件で標準品のアピゲニン（フナコシ）、キンギョソウ花弁から精製したアピゲニン７位グルクロナイドおよびアピゲニン７位グルコシド（フナコシ）はそれぞれ保持時間約１１．７５分、８．３６分および８．２２分に溶出される（図２（Ａ）：アピゲニン、図２（Ｃ）：アピゲニン７位グルクロナイド）。
アピゲニンを糖受容体基質、ＵＤＰ−グルクロン酸を糖供与体とした酵素反応液のＨＰＬＣ分析の結果、標品のアピゲニン７位グルクロナイドと保持時間が一致する新たな生成物が確認された（図２（Ｂ））。
ＬＣ−ＭＳの条件は、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−３カラム（野村化学（株）、３．０ｍｍ×１５０ｍｍ）を用い、移動相は、Ａ液として０．１％蟻酸を含む水を、Ｂ液として０．１％蟻酸を含む１００％アセトニトリルを用いた。２０分間の直線濃度勾配（Ｂ液２０％→７０％）を用いて溶出し、その後、Ｂ液７０％で５分間のアイソクラティック溶出を行った。（流速：０．２ｍｌ／分、カラムオーブン：４０℃）。
検出はフォトダイオードアレイ検出器（ＳＰＤ−Ｍ１０Ａ、（株）島津製作所）で２３０−５００ｎｍのデータを収集し、Ａ３３７ｎｍのクロマトグラムを測定した。またＰＤＡ検出器の後にＴＯＦ−ＭＳ検出器（Ｑ−ＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ，Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，ＵＫ）を接続し、以下の条件で生成物の分子量の測定を行った。ＭＳの測定条件はネガティブモードで行った（イオン源：ＥＳＩ、Ｌｏｃｋ  ｓｐｒａｙ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ロイシンエンケファリン（ｍ／ｚ  ５５４．２６１５［Ｍ−Ｈ］−）、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ：２．７ｋＶ、Ｃｏｎｅ：３０Ｖ，ＭＳ／ＭＳ  ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ：２０ｅＶ）。
この条件下で、保持時間１７．５１分に溶出される基質であるアピゲニンはｍ／ｚ  ２６９．０４４１［Ｍ−Ｈ］−の分子イオンを与えた。一方、保持時間１１．７２分に溶出される生成物はｍ／ｚ  ４４５．０７５９［Ｍ−Ｈ］−の分子イオンを与え、アピゲニンにグルクロン酸が一個付加したものであると確認された（図２（Ｄ））。またＭＳ／ＭＳ分析によって、この生成物の分子イオンからアピゲニンと一致するｍ／ｚ  ２６９．０４５０［Ｍ−Ｈ］−のフラグメントイオンが検出された。
以上の結果から本酵素はオオイヌノフグリのＦ７ＧＡＴ活性を有するタンパク質であることが示された。
［実施例５］
ＶｐＦ７ＧＡＴの酵素機能解析
Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５４，４１５−４２７．２００８と同様の方法で本酵素のＵＤＰ糖供与体に対する選択性（糖受容体基質：アピゲニン）を測定したところ、ＵＤＰ−グルクロン酸を１００％とした相対活性はＵＤＰ−グルコースは５．８％、ＵＤＰ−ガラクトースは検出限界以下であり、本酵素のＵＤＰ−グルクロン酸に対する高い特異性が確認された。また本酵素のアピゲニンおよびＵＤＰ−グルクロン酸に対する基質特異性（Ｋｍ）はそれぞれ１０．７±１．７μＭおよび３６．６±８．７μＭであり、アピゲニンに対する触媒活性（ｋｃａｔ）は８．６４Ｓ−１であった。
本酵素の糖受容体基質の選択性（糖供与体：ＵＤＰグルクロン酸）について検討したところ、内在性の基質であるアピゲニンに対して最も高い活性を示した（図３）。このアピゲニンに対する活性を１００％とした相対活性はフラボンであるスクテラレイン、バイカレイン、ルテオリン、ジオスメチン、およびクリソエリオール；フラボノールであるケルセチン、およびケンフェロール；ならびにフラバノンであるナリンゲニンに対してそれぞれ８８．３％、１３．１％、１４．９％、１２．９％、３４．０％、１．０％、１３．３％、および１８．０％であった。
特にフラボノイドＢ環の４’位に水酸基のメチル化されたジオスメチンやＢ環に二個以上の水酸基を持つフラボノイドでは４‘位に単独の水酸基を持つものと比べ本酵素の活性が低かった。さらにＢ環に水酸基を持たないバイカレインに対する活性が低かったことから、フラボノイドＢ環の４’位の水酸基が本酵素の糖受容体基質の認識に極めて重要であることが分かった。
また本酵素反応条件においてはスチルベンであるレスベラトロール、クマリンであるエスクレチン、リグナンであるセサミノール、イソフラボンであるダイゼイン、ジェニステイン、およびフラボンＣグルコシドであるイソビテキシン、オリエンチンに対してはグルクロン酸転移活性が認められなかった。したがって本酵素はフラボノイドの中でも特にＢ環の４’位に水酸基を有するフラボンに対して強い活性を持つことが示された。
フラボン：アピゲニン、ルテオリン、ジオスメチン、クリソエリオール、バイカレイン、およびスクテラレイン
フラボンＣグルコシド：イソビテキシン、およびオリエンチン
尚、下記Ｇｌｃはグルコースを表す。
2010026666.tif 000010
フラボノール：ケルセチン、およびケンフェロール
2010026666.tif 000011
フラバノン：ナリゲニン
2010026666.tif 000012
［実施例６］
ＶｐＦ７ＧＡＴ遺伝子の発現解析
Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５４，４１５−４２７．２００８と同様の方法でＶｐＦ７ＧＡＴ遺伝子の器官別発現パターンを７５００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた定量ＲＴ−ＰＣＲによって解析を行った。オオイヌノフグリの各器官（葉、花、果実、茎、根）から実施例１と同様の方法でトータルＲＮＡを抽出し、そのうち１μｇを逆転写（ＲＴ）反応することによって各器官のｃＤＮＡを得、これをＰＣＲの鋳型とした。
定量ＰＣＲに用いる各遺伝子特異的プライマーはＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３．０プログラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて以下の４種をデザインした。ＶｐＦ７ＧＡＴ特異的プライマーとして配列番号１１および１２を用いた。内部標準遺伝子としてオオイヌノフグリのリボゾームＲＮＡ（ＡＦ５０９７８５）を採用し、以下の配列番号１３および１４の遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した。
配列番号１１
2010026666.tif 000013
配列番号１２
2010026666.tif 000014
配列番号１３
2010026666.tif 000015
配列番号１４
2010026666.tif 000016
ＶｐＦ７ＧＡＴの発現量を内部標準遺伝子の発現量で標準化し、ΔΔＣｔ法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって相対発現量を得た。その結果、ＶｐＦ７ＧＡＴ遺伝子は顕著に花弁で高発現していることが明らかとなった（図４）。本酵素が与えるフラボン７位グルクロン酸の蓄積部位と本酵素遺伝子発現領域が一致することから、本酵素がコピグメント生成を介してオオイヌノフグリの花色発現に関わっていることを強く支持した。また、葉においてもＶｐＦ７ＧＡＴの発現が認められたにも関わらず顕著な発色は認められないことは、主色素であるアントシアニンが花弁と比べ著しく少ないことに起因すると考えられた。
以上のように本発明によってオオイヌノフグリからフラボノイドの７位にグルクロン酸を転移する酵素（ＶｐＦ７ＧＡＴ）が単離できた。本酵素を利用することによって、花色が改変された植物体（例えば、青い花）の作出および機能性食品素材の開発などが可能になる。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明のＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素は、基質特性が広く、種々のグルクロン酸抱合体の製造に有用である。本発明のグルクロン酸転移酵素を利用することによって、例えば、花色が改変された植物体（例えば、青い花）、あるいは機能性食品素材の開発などが可能になる。
［配列表］
2010026666.tif 000017
2010026666.tif 000018
2010026666.tif 000019
2010026666.tif 000020
2010026666.tif 000021
2010026666.tif 000022
2010026666.tif 000023
2010026666.tif 000024
2010026666.tif 000025
2010026666.tif 000026
【図２】
2010026666.tif 000027
【図４】
2010026666.tif 000028
【図１】
2010026666.tif 000029
【図３】
2010026666.tif 000030
【国際調査報告】
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2010026666.tif 000032
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