(57)【要約】  本発明の課題は、腎疾患の可能性のある被験者について、腎生検の必要性を判定するための検査方法を提供することである。かかる課題は、尿中のポドカリキシンと、１つ以上の他のマーカーとを組み合わせて使用することを特徴とする、腎疾患の検査方法ならびに、当該検査方法のための検査用試薬、および当該検査方法のための検査用試薬キットにより解決される。本発明により、従来の検査方法における予後不良不顕性症例についても予後不良群の鑑別が可能となり、腎疾患の判定、腎生検の要否の判定、予後予測等を正確に行うことが可能となる。
2010143422.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿中ポドカリキシンと、１つ以上の他のマーカーとを組み合わせて使用することを特徴とする、腎疾患の検査方法。
【請求項２】
他のマーカーが腎機能マーカーであることを特徴とする請求項１に記載の腎疾患の検査方法。
【請求項３】
腎機能マーカーが推算糸球体濾過量および／または尿蛋白である、請求項１または２に記載の腎疾患の検査方法。
【請求項４】
尿中ポドカリキシン値と他のマーカーの値とを用いてポドカリキシンインデックス値を算出し、ポドカリキシンインデックス値を指標として使用する、請求項１〜３のいずれか１に記載の腎疾患の検査方法。
【請求項５】
ポドカリキシンインデックス値が、尿中ポドカリキシン値を推算糸球体濾過量で除することにより得られる、請求項４に記載の腎疾患の検査方法。
【請求項６】
ポドカリキシンインデックス値が、尿中ポドカリキシン値に尿蛋白値を乗することにより得られる、請求項４に記載の腎疾患の検査方法。
【請求項７】
ポドカリキシンインデックス値が基準値より高い場合、腎生検が必要であると判定される、請求項４〜６のいずれか１に記載の腎疾患の検査方法。
【請求項８】
基準値が、ＩｇＡ腎症の予後良好群および予後比較的良好群からなる被験者群から得られた値である、請求項７に記載の腎疾患の検査方法。
【請求項９】
他のマーカーにより予後不良群に該当しないと予め判定された被験者を対象とする、請求項１〜８のいずれか１に記載の腎疾患の検査方法。
【請求項１０】
尿中ポドカリキシン値または１つ以上の他のマーカーの値の、いずれか１つ以上を尿中成分の値を用いて補正する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の腎疾患の検査方法。
【請求項１１】
尿中成分が、尿中クレアチニンである、請求項１０に記載の腎疾患の検査方法。
【請求項１２】
尿中ポドカリキシンの検出を免疫学的手法により行う、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の腎疾患の検査方法。
【請求項１３】
尿中ポドカリキシンを検出するための抗ポドカリキシン抗体を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の検査方法のための検査用試薬。
【請求項１４】
抗ポドカリキシン抗体を用いて尿中ポドカリキシンを検出する試薬を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の検査方法のための検査用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿中ポドカリキシンと、少なくとも１つ以上の他のマーカーとを組み合わせて使用することを特徴とする、腎疾患の検査方法、および抗ポドカリキシン抗体を含む当該検査方法に用いる検査用試薬および検査用試薬キットに関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2009-139187号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
近年、腎疾患をもつ患者数は年々増加している。腎疾患の原因や経歴は一様ではなく、糖尿病などの腎臓以外の病変により腎障害が発症し腎不全に至る場合や、ＩｇＡ腎症などの原発性糸球体腎炎などを原因とする場合がある。【０００４】
腎疾患を診断する手がかりとして、いわゆる検尿による尿蛋白や尿沈渣の検査が広く行われている。しかしながら尿蛋白は、健常人でも過激な運動、精神的ストレス、発熱、多量の肉食、月経前などで一過性に増加することがあり、また起立性蛋白尿など腎疾患に由来しない尿蛋白もある。尿沈渣は、尿を遠心分離し、その沈渣中の赤血球の増加を顕微鏡で観察することにより尿路出血を検査するものである。尿沈渣による検査は、健常人でも尿中には赤血球がみられることや、出血が腎障害以外の尿路系関連臓器に由来する場合があることから、必ずしも尿路出血を確実に判定できるものではない。さらに、尿成分の血中停滞を検査する目的で血清クレアチニン（ＳＣｒ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）の測定なども行われるが、これらの値は被験者の食事などの影響を受けやすい。【０００５】
従って、現在のところ、腎疾患の診断や重症度の最終的判定には、腎生検による組織学的診断が不可欠とされている。しかしながら、腎生検は腎臓の組織の一部を採取して顕微鏡で評価するものであり侵襲的検査であるため、出血、感染などの合併症の危険性が常に伴う。また腎生検を受けるためには、専門医と設備の整った施設に入院しなければならず、患者への肉体的・社会的負担は無視できない。【０００６】
腎生検は主として、１）１日１．０ｇ以上の尿蛋白がみられる場合、２）原因不明の腎障害があるが、画像検査で腎臓が萎縮していない場合、３）血尿が持続し進行する慢性腎炎が疑われる場合、４）急速に腎機能が低下している場合に適用される。一方、腎生検の禁忌の場合として、１）慢性的な腎機能障害のため画像検査ですでに腎臓が萎縮している場合、２）出血傾向やコントロール不全な高血圧のため止血困難な場合、３）多発性嚢胞腎の場合、４）腎生検の実施中および検査中および検査後の安静が守れない患者や指示に従えない場合などがある。かかる腎生検を行えない症例は、実際の臨床では非常に多く、問題となっている。【０００７】
腎疾患に関連して見られる物質として、尿中のポドカリキシンを測定することによる、簡便な腎障害の検査手段が開示されている（特許文献１）。ポドカリキシンは、腎糸球体を構成するタコ足細胞（ポドサイト）の表面に存在し、濾過機能を担っている糖蛋白質である。ポドサイトは、糸球体基底膜のボウマン腔側に位置し、糸球体濾過機構に重要な役割をもつため、ポドサイトの障害の程度を把握することは、腎疾患において極めて重要な意味をもつことが知られている（非特許文献１）。【０００８】
腎疾患のうち、ＩｇＡ腎症（ベルジェ病）は原発性慢性糸球体腎炎の一つであり、その約４０％以上を占める。ＩｇＡ腎症の患者の約３０％は投薬では症状が改善されず、末期腎不全透析療法に移行する予後不良の疾患であることが分かっている。現在のところ、尿検査および血液検査によりＩｇＡ腎症と疑われる所見が認められる場合に腎生険が実施され、その結果ＩｇＡ腎症の確定診断が行われ、予後分類が行われる。ＩｇＡ腎症は、予後良好群、予後比較的良好群、予後比較的不良群、予後不良群の４つに分けることができるが、分類は腎生検を用いた確定診断によるものである。４群について以下に説明する。【０００９】
１）予後良好群：透析療法に至る可能性がほとんど無いもの。糸球体所見として軽度のメサンギウム細胞増殖と基質増加のみで、糸球体硬化・半月体の形成・ボウマン嚢との癒着は認めないもの。尿細管・間質・血管所見として、尿細管・間質・血管著変を認めないもの。【００１０】
２）予後比較的良好群：透析療法に至る可能性が低いもの。糸球体所見として軽度のメサンギウム細胞増殖と基質増加を呈し、糸球体硬化・半月体の形成・ボウマン嚢との癒着を認める糸球体は全生検糸球体の１０％未満であるもの。尿細管・間質・血管所見として、尿細管・間質・血管著変を認めないもの。【００１１】
３）予後比較的不良群：５年以上・２０年以内に透析療法に移行する可能性があるもの。糸球体所見として中等度のメサンギウム細胞増殖と基質増加を呈し、糸球体硬化・半月体の形成・ボウマン嚢との癒着を認める糸球体は全生検糸球体の１０〜３０％であるもの。尿細管・間質・血管所見として、尿細管萎縮は軽度で、間質では一部の硬化糸球体周囲以外には細胞浸潤は軽度であり、血管には軽度の硬化性変化を認める程度のもの。【００１２】
４）予後不良群：５年以内に透析療法に移行する可能性があるもの。糸球体所見として高度のメサンギウム細胞増殖と基質増加を呈し、糸球体硬化・半月体の形成・ボウマン嚢との癒着を認める糸球体は全生検糸球体の３０％以上であるもの。更に硬化部位を加算し全節性硬化に換算するとその硬化率は全糸球体の５０％以上であるもの。また代償性肥大を示す糸球体を見ることがある。尿細管・間質・血管所見として、尿細管萎縮および間質細胞浸潤は高度であり、線維化も高度であるもの。一部の腎内小動脈壁に肥厚あるいは変性を認めることがある。【００１３】
ＩｇＡ腎症は慢性腎臓病（ＣＫＤ）の原疾患の比率が最も高く、その多くが学校検尿、職場検診などで無症候性血尿、蛋白尿として発見される。成人ではＩｇＡ腎症は慢性腎不全の主要原因である。ＩｇＡ腎症の診断に関し、被験者の血清についてＩｇＡ（免疫グロブリンＡ）を免疫学的に検出する方法などが提案されている（特許文献２および３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００２／０３７０９９号
【特許文献２】特許第２５９２１２１号公報
【特許文献３】特開２０００−２４１４３１号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Hara et al., Nephron 69: 397-403 (1995)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、腎疾患の可能性のある被験者について判定するための腎疾患の検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは上記課題を解決するために、腎疾患の判定における尿中ポドカリキシンの臨床的意義に着目し、尿中ポドカリキシンと少なくとも１つの他のマーカーを組み合わせることにより、腎疾患を有効に検査し得ることを見出し、本発明を完成させた。【００１８】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．尿中ポドカリキシンと、１つ以上の他のマーカーとを組み合わせて使用することを特徴とする、腎疾患の検査方法。
２．他のマーカーが腎機能マーカーであることを特徴とする前項１に記載の腎疾患の検査方法。
３．腎機能マーカーが推算糸球体濾過量および／または尿蛋白である、前項１または２に記載の腎疾患の検査方法。
４．尿中ポドカリキシン値と他のマーカーの値とを用いてポドカリキシンインデックス値を算出し、ポドカリキシンインデックス値を指標として使用する、前項１〜３のいずれか１に記載の腎疾患の検査方法。
５．ポドカリキシンインデックス値が、尿中ポドカリキシン値を推算糸球体濾過量で除することにより得られる、前項４に記載の腎疾患の検査方法。
６．ポドカリキシンインデックス値が、尿中ポドカリキシン値に尿蛋白値を乗することにより得られる、前項４に記載の腎疾患の検査方法。
７．ポドカリキシンインデックス値が基準値より高い場合、腎生検が必要であると判定される、前項４〜６のいずれか１に記載の腎疾患の検査方法。
８．基準値が、ＩｇＡ腎症の予後良好群および予後比較的良好群からなる被験者群から得られた値である、前項７に記載の腎疾患の検査方法。
９．他のマーカーにより予後不良群に該当しないと予め判定された被験者を対象とする、前項１〜８のいずれか１に記載の腎疾患の検査方法。
１０．尿中ポドカリキシン値または１つ以上の他のマーカーの値の、いずれか１つ以上を尿中成分の値を用いて補正する、前項１〜９のいずれか１項に記載の腎疾患の検査方法。
１１．尿中成分が、尿中クレアチニンである、前項１０に記載の腎疾患の検査方法。
１２．尿中ポドカリキシンの検出を免疫学的手法により行う、前項１〜１１のいずれか１項に記載の腎疾患の検査方法。
１３．尿中ポドカリキシンを検出するための抗ポドカリキシン抗体を含む、前項１〜１２のいずれか１項に記載の検査方法のための検査用試薬。
１４．抗ポドカリキシン抗体を用いて尿中ポドカリキシンを検出する試薬を含む、前項１〜１３のいずれか１項に記載の検査方法のための検査用試薬キット。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の検査方法により、従来の検査方法における予後不良の顕性症例のみならず、不顕性症例についても予後不良群の鑑別が可能となり、腎疾患の判定をより正確に行うことが可能となる。また本発明の検査方法では、顕性症例においても効果的に腎疾患の判定を行うことが可能である。例えば、本発明の検査方法により、ＩｇＡ腎症の予後比較的不良群または予後不良群と予測された被験者については、さらに腎生検を行い、確定診断を行うことができる。本発明の検査方法により、軽度の腎疾患の患者について腎生検の実施を避けることができ、被験者にとっては身体的・社会的負担を軽減することができるとともに、治療方針等の決定を速やかに行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】推算糸球体濾過量ｅＧＦＲ≧６０でありかつ尿蛋白排泄量「尿蛋白／Ｃｒｅ」が０．５ｇ／ｇクレアチニン未満のＩｇＡ腎症患者について、尿中ポドカリキシン排泄量「ＰＣＸ／Ｃｒｅ」を指標とした予後スクリーニング効果（ＲＯＣ曲線）を示す図である。（実施例２）
【図２】推算糸球体濾過量ｅＧＦＲ≧６０でありかつ尿蛋白排泄量「尿蛋白／Ｃｒｅ」が０．５ｇ／ｇクレアチニン未満のＩｇＡ腎症患者について、尿中ポドカリキシン排泄量「ＰＣＸ／Ｃｒｅ」をｅＧＦＲで除したインデックス値「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）／ｅＧＦＲ」を指標とした予後スクリーニング効果（ＲＯＣ曲線）を示す図である。（実施例２）
【図３】推算糸球体濾過量ｅＧＦＲ≧６０でありかつ尿蛋白排泄量「尿蛋白／Ｃｒｅ」が０．５ｇ／ｇクレアチニン未満のＩｇＡ腎症患者について、尿中ポドカリキシン排泄量「ＰＣＸ／Ｃｒｅ」を尿蛋白排泄量「尿蛋白／Ｃｒｅ」で乗したインデックス値「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）＊（尿蛋白／Ｃｒｅ）」を指標とした予後スクリーニング効果（ＲＯＣ曲線）を示す図である。（実施例２）
【図４】推算糸球体濾過量ｅＧＦＲ≧６０でありかつ尿蛋白排泄量「尿蛋白／Ｃｒｅ」が０．５ｇ／ｇクレアチニン未満のＩｇＡ腎症患者について、腎生検の組織学的所見に基づく予後分類での、尿中ポドカリキシン排泄量「ＰＣＸ／Ｃｒｅ」をｅＧＦＲで除したインデックス値「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）／ｅＧＦＲ」の比較を示す図である。（実施例２）
【図５】推算糸球体濾過量ｅＧＦＲ≧６０でありかつ尿蛋白排泄量「尿蛋白／Ｃｒｅ」が０．５ｇ／ｇクレアチニン未満のＩｇＡ腎症患者について、腎生検の組織学的所見に基づく予後分類での、尿中ポドカリキシン排泄量「ＰＣＸ／Ｃｒｅ」を尿蛋白排泄量で乗したインデックス値「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）＊（尿蛋白／Ｃｒｅ）」の比較を示す図である。（実施例２）
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は被験者の尿中のポドカリキシンを検出して、尿中ポドカリキシンを１つ以上の他のマーカーと組み合わせて使用することを特徴とする、腎疾患の検査方法である。本発明の検査方法は被験者についての腎疾患の判定を可能とし、腎疾患の判定には、腎生検の必要性の判定および／または予後予測などが含まれる。
【００２２】
本明細書において、検体である尿は、いかなる被験者から得られたものであってもよい。尿の採取方法は問わないが、早朝尿もしくは随時尿を用いることが好ましい。また、本発明の検査方法に必要な尿の量は１０〜２００μＬ程度である。本発明の検査方法は、従来の例えば健康診断等の一般的な尿検査と同時に行われてもよいし、腎生検以外の検査により腎疾患の疑いがあると判断された被験者について別途尿を採取して行われてもよい。
【００２３】
腎疾患には、慢性腎臓病（ＣＫＤ）、急性腎不全など様々な疾患があり、糖尿病性腎症、膜性腎症、巣状糸球体硬化症、膜性増殖性糸球体腎炎、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症などが含まれるが、好ましくはＩｇＡ腎症が挙げられる。ＩｇＡ腎症は慢性糸球体腎炎のうち、糸球体メサンギウム細胞の増殖・メサンギウム基質の拡大（増生）とメサンギウム領域へのＩｇＡを主体とする顆粒状沈着物を認めることを特徴とする疾患である。ＩｇＡ腎症は１９９５年に「厚生省特定疾患進行性腎臓障害調査研究班と日本腎臓学会の共同委員会」より提示されている尿検査および血液検査による診断基準により診断することができる。尿検査では持続的顕微鏡的血尿、間欠的または持続的蛋白尿があればＩｇＡ腎症の疑いがあり、血液検査では血清ＩｇＡ値が３１５ｍｇ／ｄＬ以上であればＩｇＡ腎症の疑いがあり、と判断される。
【００２４】
検体である尿の処理は、採取された尿に処理液を添加して混合することにより行うことができる。処理液は、尿のｐＨ調整、尿沈渣のマスキングおよび、ポドカリキシンの可溶化が可能なものであればいかなるものであってもよいが、好ましくは、緩衝液にキレート剤および界面活性剤などを添加した溶液が例示される。緩衝液、キレート剤は、公知のものであればいずれであってもよく、界面活性剤は、非イオン界面活性剤を用いることが好ましい。処理液としては、例えば２ＭＴＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）に、０．２Ｍ ＥＤＴＡと２％（Vol./Vol.）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む溶液が例示される。かかる処理液１０μＬを、尿検体９０μＬに添加して混合することにより、尿試料溶液を得ることが可能である。
【００２５】
尿試料溶液からポドカリキシンを検出する方法は様々な方法が考えられる。尿中ポドカリキシンの検出方法の一例として、免疫学的手法が挙げられる。免疫学的手法は、例えば、免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法を含む）、電気泳動法による分離と蛍光、酵素、放射性同位元素などによる検出方法との組み合わせ（ウェスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法を含む）、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ドット・ブロッティング法、ラテックス凝集法（ＬＡ：Latex Agglutination-Turbidimetric Immunoassay）、イムノクロマト法などにより行うことができるが、ＥＬＩＳＡ法もしくはＬＡ法を用いることが好ましい。定量性の観点からＥＬＩＳＡ法のうちサンドイッチ法を用いることが好ましい。サンドイッチ法では、抗ポドカリキシン抗体を固相化したマイクロタイタープレートに尿試料溶液を添加し、抗原・抗体反応をさせ、さらに酵素標識した抗ポドカリキシン抗体を添加し、抗原・抗体反応をさせ、洗浄後、酵素基質と反応・発色させ、吸光度を測定して尿中のポドカリキシンを検出すると共に、その測定値から尿中ポドカリキシン濃度を算出することができる。
【００２６】
免疫学的手法において用いられる抗ポドカリキシン抗体は、ポドカリキシンを検出しうる抗体であればよい。本発明において用いられる抗ポドカリキシン抗体は、公知のものであってもよく、また今後開発される抗体であってもよく、特に限定されないが、例えばモノクローナル・ポリクローナル抗体や標識化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびにこれらの結合活性断片などが挙げられる。
【００２７】
本発明において用いられる尿中ポドカリキシン値は、尿中ポドカリキシン濃度であってもよいが、尿中ポドカリキシン濃度を尿中に安定に排泄される尿中成分の値（尿中成分値）により補正したものであることが望ましい。尿中成分としては、特に尿中クレアチニンが好ましい。尿中クレアチニンはクレアチニンの産生が筋肉の量に依存することから、一個体において疾患にかかわらずほぼ一定であると考えられている。尿中排泄物質の検査においては、尿量誤差を回避するため、クレアチニン１ｇ当りの量により目的とする尿中排泄物質の量を補正する手法が一般的に用いられており、これによりクレアチニン単位グラム当たりの尿中排泄物質を比較することが可能になる。尿中ポドカリキシン濃度を、尿中クレアチニン濃度により補正して得られる補正値を、尿中ポドカリキシン排泄量（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）と称し、尿中ポドカリキシン排泄量は、以下の式により算出することができる。
＜式＞  ＰＣＸ／Ｃｒｅ：尿中ポドカリキシン排泄量（μｇ／ｇ）＝１００×尿中ポドカリキシン濃度（ｎｇ／ｍＬ）÷尿中クレアチニン濃度（ｍｇ／ｄＬ）
【００２８】
本発明において、尿中ポドカリキシンと組み合わせて用いられる、尿中ポドカリキシン以外の他のマーカーは種々のものを使用することができる。他のマーカーとは、生体の機能を表すマーカーであり、公知のマーカーとして既に臨床上使用されているものであっても、新規に見出されたものであってもよく、尿中ポドカリキシンと組み合わせることによって腎疾患を検査し得るものであれば、いかなるものであってもよい。また他のマーカーは、尿中に安定に排泄される尿中成分の値で補正したものであってもよい。他のマーカーとしては主に腎機能マーカーが挙げられる。他の腎機能マーカーとしては、推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ：estimatedglomerular filtration rate）や、尿蛋白が例示されるが、これらに限定されるものではない。本発明の検査方法において、尿中ポドカリキシンと尿中ポドカリキシン以外の他のマーカーとを組み合わせるとは、例えば、尿中ポドカリキシン値と他のマーカーの値とを用いて算出した新たなポドカリキシンインデックス値（以下単に「インデックス値」と称する）を得ること、および／または、他のマーカーによる腎疾患の判定を予め行い、その後尿中ポドカリキシンによる判定を行うことを意味する。
【００２９】
本発明においては、インデックス値を得、該インデックス値を指標とすることが好ましい。インデックス値は、例えば尿中ポドカリキシン排泄量に、他の腎機能マーカーの値を乗じたり、除したりすることによって得ることができる。かかるインデックス値は糸球体病変のアクティブな病的進展状況をリアルタイムで反映すると考えられる。
【００３０】
他の腎機能マーカーの１つである推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）は、腎臓が１分あたりに処理できる尿量である糸球体濾過量（ＧＦＲ）を、計算式を用いて算出したものである。推算糸球体濾過量は、例えば、年齢、性別、および血清クレアチニン濃度により算出することができる。推算糸球体濾過量を求める計算式は、公知の式もしくは今後開発される新たな式を用いることができるが、被験者の属性（例えば人種など）に応じて適当なものを選択して用いることが好ましい。例えば被験者が日本人の場合は以下の式により算出することができる。
ＧＦＲ（男）＝１９４×ＳＣｒｅ（血清クレアチニン）^−１．０９４×age（年齢）^−０．２８７
ＧＦＲ（女）＝ＧＲＦ（男）×０．７３９
本発明において、糸球体濾過量としては、推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）を用いることが好ましい。尿中ポドカリキシン排泄量をｅＧＦＲで割り、インデックス値「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）／ｅＧＦＲ」を算出する。インデックス値「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）／ｅＧＦＲ」の算出は、ソフトウェアを用いてコンピュータにより行ってもよい。インデックス値「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）／ｅＧＦＲ」を本発明の検査方法の指標として用いることができる。
【００３１】
他の腎機能マーカーのもう１つの例として、尿蛋白が挙げられるが、尿蛋白の値自体は公知の手法によって得ることができる。尿蛋白の値としては予め尿中クレアチニン濃度で補正した尿蛋白排泄量（尿蛋白／Ｃｒｅ）を用いることが好ましい。予め尿中クレアチニン濃度で補正した尿中ポドカリキシン排泄量（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）と、尿蛋白排泄量（尿蛋白／Ｃｒｅ）を乗し、インデックス値「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）＊（尿蛋白／Ｃｒｅ）」を算出する。インデックス値「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）＊（尿蛋白／Ｃｒｅ）」の算出は、ソフトウェアを用いてコンピュータにより行ってもよい。かかるインデックス値「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）＊（尿蛋白／Ｃｒｅ）」を本発明の検査方法における指標として用いることができる。
【００３２】
本発明では、尿中ポドカリキシン値、好ましくは上記のようにして得られたインデックス値を適宜定めた基準値と比較することにより、腎疾患の判定、例えば腎生検の要否の判定および／または予後予測をすることができる。基準値は適宜設定することができるが、健常者の尿中ポドカリキシン値、好ましくはインデックス値または、軽度の腎疾患である患者の尿中ポドカリキシン値、好ましくはインデックス値を用いることができる。例えば、ＩｇＡ腎症の疑いのある患者に関して、腎生検が必要か否かを本発明の検査方法にて検査する場合には、基準値としてＩｇＡ腎症の予後良好群および予後比較的良好群からなる被験者群から得られた尿中ポドカリキシン値、好ましくは「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）／ｅＧＦＲ」または、「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）＊（尿蛋白／Ｃｒｅ）」を用いればよい。かかる基準値を用いて、尿中ポドカリキシン値、好ましくはインデックス値が基準値より高い被験者は、予後比較的不良群または予後不良群に属する可能性が高いと判定することができ、予後予測が可能となる。同様に尿中ポドカリキシン値、好ましくはインデックス値が基準値より高い場合は、腎生検を行い、より精密に病態を確認する必要があると判定することができる。
【００３３】
また、他のマーカーによる腎疾患の判定を予め行い、その後尿中ポドカリキシンによる判定を行う方法として、他の腎機能マーカーにより予後不良群と判定された検体以外について、尿中ポドカリキシンを用いて検査を行う方法が例示される。他の腎機能マーカーにより予後不良群と判定された検体の被験者は、顕性の予後不良群に属する。尿中ポドカリキシンは、他の腎機能マーカーによる不顕性の予後不良群を、さらに検出することができるため、臨床的意義が大きい。顕性予後不良群の検出は、ｅＧＦＲおよび／または尿蛋白等のの腎機能マーカーを使用することが好ましい。例えば、ｅＧＦＲが６０未満、または尿蛋白排泄量「尿蛋白／Ｃｒｅ」が０．５ｇ／ｇクレアチニン以上のいずれか、あるいはその両方に該当する場合、予後不良群であると判定することができる。
【００３４】
本発明は、尿中ポドカリキシンを検出するための抗ポドカリキシン抗体を含む、腎疾患の検査を行うための腎疾患検査用試薬および腎疾患検査用試薬キットにも及ぶ。検査用試薬または検査用試薬キットに含まれる抗ポドカリキシン抗体は、例えば酵素などにより標識化されたものであってもよい。また、検査用試薬キットは２種類以上の抗ポドカリキシン抗体を含んでもよく、当該抗体は互いに異なるエピトープを認識する抗体であることが好ましい。さらに当該キットには、処理液、発色基質等の試薬および、試験に必要な器具等を含むことができる。
【実施例】
【００３５】
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。【００３６】
（実施例１）尿中ポドカリキシン濃度の測定
ポドカリキシン濃度の測定には、２種類の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を用いた。これらの２種類の抗体は、ヒトポドカリキシンの異なる２つのエピトープを各々認識し、それぞれ抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体ａ（以下単に「抗体ａ」と称する）と、抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体ｂ（以下単に「抗体ｂ」と称する）である。本実施例では、抗体ａ固相化マイクロタイタープレート（分割型マイクロプレートＧＦ８高：Ｎｕｎｃ社）と、西洋ワサビＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ（以下「ＨＲＰ」と略す）により標識化した抗体ｂを用いた。【００３７】
まず、被験者から得た原尿９０μＬと２Ｍ ＴＥＳ−ＮａＯＨ、０．２Ｍ ＥＤＴＡ、２％（Vol./Vol.）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ７．０の溶液１０μＬを混合した。混合して得られた尿試料溶液１００μＬを、抗体ａ固相化マイクロタイタープレートのウェルへ加えた。３７℃で１時間静置後、ウェルから尿試料溶液をデカンテーションにより除去した。３．６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１４５ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（Vol./Vol.）Ｔｗｅｅｎ２０（以下「ＰＢＳ−Ｔ」と略す）をマイクロタイタープレートのウェルに２００μＬ／ウェルで添加し、デカンテーションによりＰＢＳ−Ｔの除去を行い、洗浄を行った。この洗浄の工程を計３回行った。その後、ＨＲＰ標識化抗体ｂ溶液を、１００μＬ／ウェルで添加した。３７℃で１時間静置後、ＨＲＰ標識化抗体ｂ溶液をデカンテーションにより除去した。ＰＢＳ−Ｔを２００μＬ／ウェルで添加し、デカンテーションによりＰＢＳ−Ｔの除去を行い、洗浄を行った。この洗浄の工程を計３回行った。その後、TMB One-Step Substrate System（Ｄａｋｏ社）をＨＲＰ酵素反応の基質溶液として用いて、１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で３０分間、遮光で静置した。その後、３１３ｍＭ Ｈ２ＳＯ４溶液を反応停止溶液として１００μＬ／ウェルで添加し、マルチスキャンアセントとAscent Software for Multiskan（大日本製薬株式会社）を使用し、波長４５０ｎｍと６３０ｎｍで各ウェルの吸光度を測定した。そして、波長４５０ｎｍの吸光度から波長６３０ｎｍの吸光度を引いた値を測定値とした。検量線の標準品として腎臓から抽出したＮａｔｉｖｅなヒトポドカリキシンを使用し、検体中のポドカリキシン濃度を導き出した。次の式により、尿中ポドカリキシンのクレアチニン補正した濃度を以下の式から算出した。
＜式＞  尿中ポドカリキシン排泄量（μｇ／ｇ）＝１００×尿中ポドカリキシン濃度（ｎｇ／ｍＬ）÷尿中クレアチニン濃度（ｍｇ／ｄＬ）【００３８】
（実施例２）ＩｇＡ腎症予後スクリーニングとしての尿中ポドカリキシン排泄量の臨床的意義
実施例１の方法により、ＩｇＡ腎症患者２８症例から得た尿検体について、尿中ポドカリキシン排泄量（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）を算出した。また、同じ尿検体から推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ：estimated glomerular filtrationrate）及び尿蛋白排泄量（尿蛋白／Ｃｒｅ）を測定・算出し、尿中ポドカリキシン排泄量と組み合わせてインデックス値を得、インデックス値の予後スクリーニングマーカーとしての意義を検討した。【００３９】
ＩｇＡ腎症患者２８症例について、腎生検を行い、腎生検での組織学的所見に基づく予後分類により、予後良好群および予後比較的良好群からなる群（Ａ群）と、予後比較的不良群および予後不良群からなる群（Ｂ群）の２群に大別した。スクリーニング効果の指標としては、ＲＯＣ曲線の下面積を用いた。ＲＯＣ曲線（receiver operating characteristic curve（受信者動作特性曲線））は、スクリーニング検査等の精度の評価や異なる検査方法の比較に用いられ、どの範囲でカットオフポイント（cut-off point）を取るかを示すものである。カットオフポイントをどこに取るかで、ある状態にある者とない者を区別する検査の能力を視覚的に示すことが可能となる。ＲＯＣ曲線は、縦軸を真の陽性率、つまり敏感度 、横軸を偽陽性率、つまり（１−特異度）を尺度としてプロットされる。異なる検査の優劣を判定する場合は、この曲線がより左上方に位置するほど優れていると判断する。例えば、一方のＲＯＣ曲線に比べて他方の検査方法の曲線が左上方にあれば、他方の検査方法はより精度が高く優れていると判断され得る。スクリーニングにより完全に鑑別できる場合は、左上方の直角の角一点にプロットされ、ＲＯＣ曲線の下面積は1.0と評価される。本実施例では、予後分類のスクリーニングマーカーとしてを確認するため、Ａ群とＢ群をスクリーニングする場合の精度を評価した。【００４０】
先ず、ＩｇＡ腎症２８症例についてＲＯＣ曲線から求めたスクリーニング効果を表１に示す。
【表１】
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表１の結果からは「ＰＣＸ／Ｃｒｅ」のみでは、ＩｇＡ腎症の予後スクリーニング効果は発揮されていないことがわかる。一方「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）／ｅＧＦＲ」あるいは「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）＊（尿蛋白／Ｃｒｅ）」では予後スクリーニング効果が期待されることがわかる。しかし、これらインデックス値の予後スクリーニング効果は、ｅＧＦＲの逆数「１／ｅＧＦＲ」あるいは「尿蛋白／Ｃｒｅ」のみの効果とあまり変わらない。【００４１】
インデックス値の予後スクリーニング効果が抑えられている要因として、糸球体硬化が進んだ症例あるいは尿蛋白の過度な症例が２８症例中に含まれている点が考えられた。糸球体硬化が進んだ症例あるいは尿蛋白の過度な症例では、腎糸球体に発現するポドカリキシンの発現量の減少、ならびに尿排泄を許容し得るボウマン腔側の間隙スペースの減少に起因する尿中ポドカリキシンの排泄の消失が起こっていると考えられる。実際、この様な過度な症例（尿蛋白排泄量が０．５ｇ／ｇ尿クレアチニン以上および／またはｅＧＦＲが６０未満の症例）は、ｅＧＦＲが低下し、尿細管再吸収能の破綻を合併して尿蛋白の増加を来たすため、予後不良群に自ずと該当する（表２）。すなわち、尿蛋白排泄量０．５ｇ／ｇ尿クレアチニン以上か、ｅＧＦＲが６０未満かの少なくともいずれかに該当する予後不良群の７０％は、顕性の予後不良群である。
【表２】
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【００４２】
予後不良群のうち、残りの３０％の不顕性の予後不良群を如何に鑑別できるかが重要である。そこでｅＧＦＲが６０以上且つ尿蛋白排泄量が０．５ｇ／ｇクレアチニン未満に該当する計１４例（予後良好群および予後比較的良好群の８例と、予後比較的不良群および予後不良群の６例）についての予後スクリーニング効果についてサブ解析を行なった。【００４３】
結果を表３に示す。
【表３】
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表３の結果から、「ＰＣＸ／Ｃｒｅ」自体ならびに、「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）／ｅＧＦＲ」、ならびに「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）＊（尿蛋白／Ｃｒｅ）」において、高いＩｇＡ腎症の予後スクリーニング効果が見出された。特に「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）＊（尿蛋白／Ｃｒｅ）」においては、際立った予後スクリーニング効果が見出された（図１、２、３、４、５）。よって、ＩｇＡ腎症の予後スクリーニングならびにそれを指標とした腎生検の敢行を、「ＰＣＸ／Ｃｒｅ」を用いたインデックス値をもって効果的に実現可能となることがわかった。【００４４】
詳細には、顕性所見（ｅＧＦＲが６０未満もしくは尿蛋白排泄量が０．５ｇ／ｇクレアチニン以上）の症例では、「１／ｅＧＦＲ」もしくは「尿蛋白／Ｃｒｅ）自体で効果的なスクリーニングを可能とし（表１、表２）、不顕性症例では、「ＰＣＸ／Ｃｒｅ」自体ならびに、「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）／ｅＧＦＲ」、ならびに「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）＊（尿蛋白／Ｃｒｅ）」を以って予後不良群を鑑別可能とする（表３、図１、図２、図３、図４、図５）。また、表１に示した通り顕性症例においても「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）／ｅＧＦＲ」、ならびに「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）＊（尿蛋白／Ｃｒｅ）」を以って、スクリーニング効果が得られることから、ＩｇＡ腎症の予後スクリーニング全般に一貫して、「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）／ｅＧＦＲ」、ならびに「（ＰＣＸ／Ｃｒｅ）＊（尿蛋白／Ｃｒｅ）」を以って、効果的な予後不良群のスクリーニングが可能となる。【００４５】
本実施例において、顕性所見を呈した症例では、糸球体硬化ならびに尿細管障害の合併の為に必ずしも糸球体病変を「ＰＣＸ／Ｃｒｅ」のみでは反映しないが、「ｅＧＦＲ」あるいは「尿蛋白／Ｃｒｅ」を併用したインデックス値を用いることによって、糸球体病変のアクティブな病的進展の状況をリアルタイムに評価できた。これは、尿中ポドカリキシン排泄量の増多が、糸球体でのアクティブな病的進展を反映し、これに起因して顕在所見が現れるものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
上記説明したとおり、本発明の検査方法により腎疾患の病態を把握することができる。例えばＩｇＡ腎症の患者については、「ＰＣＸ／Ｃｒｅ」ならびにそれを用いたインデックス値を指標として予後比較的不良および予後不良と予測された場合に、さらに腎生検を行い、確定診断を行うことが可能である。またｅＧＦＲ≧６０でありかつ「尿蛋白／Ｃｒｅ」が０．５ｇ／ｇ クレアチニン未満の患者についてＩｇＡ腎症の予後予測を行うことができ、従来法より正確に予後予測が可能となる。よって軽度の腎疾患の患者について腎生検の実施を避けることができ、患者にとっては身体的負担を軽減することができ、医療費の費用軽減が可能となる。また、腎生検が必要であると判断された場合には、治療方針等の決定を速やかに行うことができ、有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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