(57)【要約】  糖脂質型バイオサーファクタント、特にラクトン型ソホロースリピドの安価で効率的な製造方法に関し、該バイオサーファクタント生産微生物を酸素供給量を制限して培養することを特徴とする。本発明によれば、ラクトン型のソホロースリピドを優先的に生産させることができ、また、該ラクトン型を固体状で容易に回収することができる。更には、こうして得られる高純度のラクトン型ソホロースリピドを加水分解することにより、高純度のアシッド型ソホロースリピドを製造することができる。また本発明は、強力な抗菌／防カビ活性を有するラクトン型ソホロースリピド、及び該ソホロースリピドを含有する抗菌剤及び／又は防カビ剤にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸素供給量を制限して微生物を培養する糖脂質型バイオサーファクタントの製造方法。
【請求項２】
培養初期を除き、溶存酸素飽和度が２０％以下になるように酸素供給量を制限する請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
糖脂質型バイオサーファクタントがソホロースリピドである請求項１または２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項４】
ソホロースリピド中のラクトン型ソホロースリピドに占めるジアセチルラクトン型ソホロースリピドのモル比率が８０％以上である請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
糖脂質型バイオサーファクタント中の脂肪酸側鎖を構成する脂肪酸残基に占める飽和型脂肪酸残基のモル比率が４０％以上である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
ソホロースリピド中の脂肪酸側鎖を構成する脂肪酸残基に占める飽和型脂肪酸残基のモル比率が４０％以上である請求項４に記載の製造方法。
【請求項７】
油脂を原料とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
油脂が、植物油脂、もしくは、植物油脂を加工して得られる脂肪酸またはその誘導体、である請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
植物油脂を加工して得られる脂肪酸またはその誘導体が飽和脂肪酸エステルである請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
飽和脂肪酸エステルを構成するアシル基の炭素数が１６〜１８である請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
油脂がパーム油である請求項７に記載の製造方法。
【請求項１２】
微生物がキャンディダ・ボンビコラ（Candida bombicola）である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
さらに、糖脂質型バイオサーファクタントを晶析させる工程を含む請求項１〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
さらに、糖脂質型バイオサーファクタントを有機溶媒により洗浄及び／又は抽出する工程を含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１５】
糖脂質型バイオサーファクタントを固体状で得る請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１６】
さらに、糖脂質型バイオサーファクタント中のラクトン型糖脂質型バイオサーファクタントを加水分解してアシッド型糖脂質型バイオサーファクタントにする工程を含む請求項１〜１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
請求項６に記載の製造方法により製造される、ソホロースリピド中の脂肪酸側鎖を構成する脂肪酸残基に占める飽和型脂肪酸残基のモル比率が４０％以上であるソホロースリピド。
【請求項１８】
ソホロースリピド中のラクトン型ソホロースリピドに占めるジアセチルラクトン型ソホロースリピドのモル比率が８０％以上である請求項１７に記載のソホロースリピド。
【請求項１９】
ソホロースリピド中の脂肪酸側鎖を構成する脂肪酸残基に占める飽和型脂肪酸残基のモル比率が４０％以上であるソホロースリピド。
【請求項２０】
ソホロースリピド中の脂肪酸側鎖を構成する脂肪酸残基に占める飽和型脂肪酸残基のモル比率が６０％以上である請求項１９に記載のソホロースリピド。
【請求項２１】
ソホロースリピド中の脂肪酸側鎖を構成する脂肪酸残基に占める飽和型脂肪酸残基のモル比率が８０％以上である請求項２０に記載のソホロースリピド。
【請求項２２】
ソホロースリピド中の脂肪酸側鎖を構成する脂肪酸残基に占める飽和型脂肪酸残基のモル比率が９０％以上である請求項２１に記載のソホロースリピド。
【請求項２３】
ソホロースリピド中のラクトン型ソホロースリピドに占めるジアセチルラクトン型ソホロースリピドのモル比率が８０％以上である請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のソホロースリピド。
【請求項２４】
ソホロースリピド中のラクトン型ソホロースリピドに占めるジアセチルラクトン型ソホロースリピドのモル比率が８５％以上である請求項２３に記載のソホロースリピド。
【請求項２５】
ソホロースリピド中のラクトン型ソホロースリピドに占めるジアセチルラクトン型ソホロースリピドのモル比率が９０％以上である請求項２４に記載のソホロースリピド。
【請求項２６】
ソホロースリピド中のラクトン型ソホロースリピドに占めるジアセチルラクトン型ソホロースリピドのモル比率が９５％以上である請求項２５に記載のソホロースリピド。
【請求項２７】
固体状である請求項１７〜２６のいずれか一項に記載のソホロースリピド。
【請求項２８】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の製造方法により得られる糖脂質型バイオサーファクタント、及び／又は、請求項１７〜２７のいずれか一項に記載のソホロースリピド、を含む組成物。
【請求項２９】
請求項２８に記載の組成物を含む界面活性剤。
【請求項３０】
請求項２９に記載の界面活性剤の、食品用途、家庭用品用途、生活資材用途、土木・建築材料用途、塗料・インク用途、ゴム・プラスチック用途、機械・器具用途、医療・化粧料用途、畜産・漁業用途、農業用途、又は、製品製造時での利用用途における使用。
【請求項３１】
請求項２８に記載の組成物を含む抗菌剤及び／又は防カビ剤。
【請求項３２】
対象とする微生物がグラム陽性細菌、酵母、カビである、請求項３１に記載の抗菌剤及び／又は防カビ剤。
【請求項３３】
対象とする微生物が、ミクロコッカス（Micrococcus）属、ストマトコッカス（Stomatococcus）属、プラノコッカス（Planococcus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、デイノコッカス（Deinococcus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ルーコノストク（Leuconostoc）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、アエロコッカス（Aerococcus）属、ゲメラ（Gemella）属、ペプトコッカス（Peptococcus）属、ペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus）属、ルミノコッカス（Ruminococcus）属、コプロコッカス（Coprococcus）属、サルシナ（Sarcina）属、バチラス（Bacillus）属、スポロラクトバチラス（Sporolactobacillus）属、クロストリジウム（Clostridium）属、デサルフォトマキュラム（Desulfotomaculum）属、スポロサルシナ（Sporosarcina）属、オスシロスピラ（Oscillospira）属、ラクトバチラス（Lactobacillus）属、リステリア（Listeria）属、エリシペロテリックス（Erysipelothrix）属、ブロコテリックス（Brochothrix）属、レニバクテリウム（Renibacterium）属、クルチア（Kurthia）属、カリオファノン（Caryophanon）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ガルデネレラ（Gardenerella）属、アルカノバクテリウム（Arcanobacterium）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、クロトバクテリウム（Curtobacterium）属、カセオバクター（Caseobacter）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、アウレオバクテリウム（Aureobacterium）属、セルロモナス（Cellulomonas）属、アグロマイセス（Agromyces）属、アラクニア（Arachnia）属、ロチア（Rothia）属、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属、エウバクテリウム（Eubacterium）属、アセトバクテリウム（Acetobacterium）属、ラクノスピラ（Lachnospira）属、ブチリビブリオ（Butyrivibrio）属、サーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）属、アクチノマイセス（Actinomyces）属、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、ノカルディア（Nocardia）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、ノカルディオイデス（Nocardioides）属、シュードノカルディア（Pseudonocardia）属、オエルスコビア（Oerskovia）属、サッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）属、ミクロポリスポラ（Micropolyspora）属、プロミクロモノスポラ（Promicromonospora）属、イントラスポランギウム（Intrasporangium）属、クラドスポリウム（Cladosporium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、フザリウム（Fusarium）属、ペニシリウム（Penicillium）属、グロエオフィラム（Gloeophyllum）属、シゾフィラム（Schizophyllum）属、キャンディダ（Candida）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ピキア（Pichia）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する微生物から選ばれる１以上の微生物である請求項３２に記載の抗菌剤及び／又は防カビ剤。
【請求項３４】
対象とする微生物が、バチラス（Bacillus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、クラドスポリウム（Cladosporium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、フザリウム（Fusarium）属、ペニシリウム（Penicillium）属、グロエオフィラム（Gloeophyllum）属、シゾフィラム（Schizophyllum）属に属する微生物から選ばれる１以上の微生物である、請求項３３に記載の抗菌剤及び／又は防カビ剤。
【請求項３５】
請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の抗菌剤及び／又は防カビ剤の、食品用途、家庭用品用途、生活資材用途、土建・塗料用途、機械・器具用途、水処理用途、分離用途、医療・化粧料用途、畜産・漁業用途、又は、農業用途における使用。
【請求項３６】
請求項２８に記載の組成物を含む医薬品。
【請求項３７】
請求項１７〜２７のいずれか１項に記載のソホロースリピドを加水分解することを特徴とする、アシッド型ソホロースリピドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ソホロースリピドとその製造方法及びこれを有効成分とした抗菌剤及び／又は防カビ剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオサーファクタントは、微生物により生産される界面活性剤であり、界面活性作用のみならず様々な生理活性を示すことが知られている。また、生分解性に優れ、かつ動植物に対して低毒、低刺激性であることから、人や環境に優しい化合物として様々な分野での応用が期待されている。バイオサーファクタントとして、これまでに糖脂質型バイオサーファクタントのほか、ペプチド型バイオサーファクタントや脂肪酸型バイオサーファクタント等が知られている。【０００３】
ソホロースリピドは糖脂質型バイオサーファクタントの一種であり、二分子のグルコースから成るソホロースに脂肪酸がグリコシルエーテル結合により結合した構造を有する。ソホロースリピドには、脂肪酸側鎖のカルボキシル基がソホロースと環状エステル結合を形成したラクトン型と、加水分解されたアシッド型が存在し、更に、脂肪酸側鎖における二重結合の有無、炭素鎖長の違い、グリコシルエーテル結合の位置の違い、糖の水酸基のアセチル基導入の有無、などにより複数の誘導体が存在する（非特許文献１）。糖や油脂などを培養基質として酵母を培養することによりソホロースリピドはこれらの混合物として生産され、その組成は培養に用いる培養基質により異なる（非特許文献２）。また、ソホロースリピドの脂肪酸側鎖の組成も用いる培養基質の種類により異なる（非特許文献２）。【０００４】
ソホロースリピドは通常、取り扱い難い高粘性の油状物として得られることが知られている（非特許文献３）。例えば、培養液から沈降傾斜により得られるソホロースリピド油状物は４０〜５０％の水分を含有する油状物であり、これから有機溶媒でソホロースリピドを抽出して純度を向上させると、極めて高粘性の物質として得られる（特許文献１）。【０００５】
ヘキサデカン等のアルカンを培養基質として用いた場合には、ラクトン型ソホロースリピドの中でも、特にジアセチルラクトン型が主成分のソホロースリピドが生産され、これは疎水性が比較的高いため、培養液中に結晶として析出することが知られている（非特許文献４）。これは、ソホロースリピドを取り扱い容易な固体状として得られる点で有用である。しかし、高価なアルカンを原料とするために、工業的な実施は非現実的である。【０００６】
一方、安価な植物油脂や植物油脂由来の脂肪酸などを原料としたソホロースリピドの生産研究は数多く報告されているが、得られるソホロースリピドはいずれも油状であり、固体状で取得した例はほとんど無い。唯一、ターキッシュコーンオイルを培養基質とした培養液から固体状ソホロースリピドを得た例がある（非特許文献５）。しかし、培養方法によっては粘性のある蜂蜜状のソホロースリピドが得られており、固体状ソホロースリピドを取得するための培養条件に関する知見が十分に記載されているわけではない。また、得られた固体状ソホロースリピドの組成比率、例えば、ラクトン型とアシッド型の比率、ジアセチルラクトン型とモノアセチルラクトン型とジオールラクトン型の比率、脂肪酸側鎖における飽和型側鎖と不飽和型側鎖の比率、などに関する記載も無い（非特許文献５）。【０００７】
ソホロースリピドの生産性向上を目的とした報告は多い。ソホロースリピドを高生産させるためには、好気的な通気条件で微生物を培養することが重要であることは知られており（非特許文献６）、微生物の増殖に伴って溶存酸素飽和度が低下した場合は攪拌数を上げて溶存酸素飽和度を高く保つなどの工夫がなされている（非特許文献５）。これらの報告においても、通気条件などの培養条件と生産されるソホロースリピドの組成比率、例えば、ラクトン型とアシッド型の比率、ジアセチルラクトン型とモノアセチルラクトン型とジオールラクトン型の比率、脂肪酸側鎖における飽和型側鎖と不飽和型側鎖の比率、などとの関係に関する記述は無い。【０００８】
更に、ラクトン型ソホロースリピドはアシッド型ソホロースリピドに比べて強い抗菌活性を有し、中でもジアセチル体及びモノアセチル体が強い活性を示すことは知られている（非特許文献７）。他にも、例えば、オレイン酸を含む培地から得た培養液由来のラクトン型ソホロースリピドが抗菌、防カビ活性を有することが報告されている（特許文献２、特許文献３、非特許文献７）。これらの報告において、ソホロースリピドの脂肪酸側鎖の構造と抗菌活性との関係に関する記述は無い。【０００９】
アシッド型ソホロースリピドは水溶性が高く、培養液中に生成しても培養液から単離するのは困難であり、工業的実施が事実上不可能なクロマトグラフィーによる精製法しか知られていない（非特許文献１）。また、ラクトン型ソホロースリピドを加水分解してアシッド型を得る方法があるが（特許文献１）、そもそも安価で高純度のラクトン型ソホロースリピドを取得する方法が知られていないため、安価で高純度のアシッド型ソホロースリピドを得るのは現状では非常に困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開昭54-28895号公報
【特許文献２】国際公開第WO2004/044216号公報
【特許文献３】国際公開第WO2006/069175号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Journal of the American Oil Chemists’ Society, vol.65, no.9, 1460(1988)
【非特許文献２】Journal of Industrial Microbiology, vol.13, 249 (1994)
【非特許文献３】Canadian Journal of Chemistry, vol.39, 846(1961)
【非特許文献４】Journal of the American Oil Chemists’ Society, vol.83, no.2, 137(2006)
【非特許文献５】Engineering in Life Sciences, vol.5, no.4, 357 (2005)
【非特許文献６】Applied Microbiology and Biotechnology, vol.76, 23(2007)
【非特許文献７】Fett Wissenschaft Technologie, vol.91, 363(1989)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、特定の構造を有する糖脂質型バイオサーファクタント、特にジアセチルラクトン型のモル比率が高いソホロースリピド、を安価な油脂から製造する方法を提供することを課題とする。また、ジアセチルラクトン型のモル比率が高いソホロースリピドを提供すること、特にジアセチルラクトン型のモル比率が高いソホロースリピドを取り扱いが容易な固体として提供すること、を課題とする。また、ジアセチルラクトン型のモル比率が高いソホロースリピド、特に脂肪酸側鎖の飽和度が高いジアセチルラクトン型のモル比率が高いソホロースリピド、を有効成分とした抗菌剤及び／又は防カビ剤を提供することを課題とする。更に、高純度なアシッド型ソホロースリピド、及びその安価な製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題に鑑み、安価油脂を用いて強い抗菌、防カビ活性を有するラクトン型ソホロースリピドを高生産できる条件について検討した結果、培養液への酸素の供給量を制限してバイオサーファクタント産生菌を培養することにより、ジアセチルラクトン型のモル比率が向上することを見出した。また、ジアセチルラクトン型のモル比率が８０％以上であれば、ソホロースリピドを取り扱い容易な固体として簡便に得られ、更に、得られた高純度のラクトン型を原料にすることにより、高純度のアシッド型ソホロースリピドが容易に得られることを見出した。また、ラクトン型ソホロースリピドを多く含むこれらのソホロースリピドの中でも、脂肪酸側鎖が飽和のラクトン型ソホロースリピドが非常に強力な抗菌・防カビ活性を有しすることを見出した。これら知見に基づき、本発明を完成するに至った。【００１４】
即ち、本発明の一つの特徴は、酸素供給量を制限して微生物を培養する糖脂質型バイオサーファクタントの製造方法である。【００１５】
また、本発明の別の特徴は、培養初期を除き、溶存酸素飽和度が２０％以下になるように酸素供給量を制限する、上記の製造方法である。【００１６】
また、本発明の別の特徴は、糖脂質型バイオサーファクタントがソホロースリピドである、上記の製造方法である。【００１７】
また、本発明の別の特徴は、ソホロースリピド中のラクトン型ソホロースリピドに占めるジアセチルラクトン型ソホロースリピドのモル比率が８０％以上である、上記の製造方法である。【００１８】
また、本発明の別の特徴は、糖脂質型バイオサーファクタント中の脂肪酸側鎖を構成する脂肪酸残基に占める飽和型脂肪酸残基のモル比率が４０％以上である、上記の製造方法である。【００１９】
また、本発明の別の特徴は、ソホロースリピド中の脂肪酸側鎖を構成する脂肪酸残基に占める飽和型脂肪酸残基のモル比率が４０％以上である、上記の製造方法である。【００２０】
また、本発明の別の特徴は、油脂を原料とする、上記の製造方法である。【００２１】
本発明の別の特徴は、微生物がキャンディダ・ボンビコラ（Candida bombicola）である、上記の製造方法である。【００２２】
本発明の別の特徴は、さらに、糖脂質型バイオサーファクタントを晶析させる工程を含む、上記の製造方法である。【００２３】
本発明の別の特徴は、糖脂質型バイオサーファクタントを固体状で得る、上記の製造方法である。【００２４】
本発明の別の特徴は、さらに、糖脂質型バイオサーファクタント中のラクトン型糖脂質型バイオサーファクタントを加水分解してアシッド型糖脂質型バイオサーファクタントにする工程を含む、上記の製造方法である。【００２５】
本発明の別の特徴は、ソホロースリピド中の脂肪酸側鎖を構成する脂肪酸残基に占める飽和型脂肪酸残基のモル比率が４０％以上であるソホロースリピドである。【００２６】
本発明の別の特徴は、ソホロースリピド中のラクトン型ソホロースリピドに占めるジアセチルラクトン型ソホロースリピドのモル比率が８０％以上である、ソホロースリピドである。【００２７】
本発明の別の特徴は、ソホロースリピド中の脂肪酸側鎖を構成する脂肪酸残基に占める飽和型脂肪酸残基のモル比率が４０％以上であるソホロースリピドである。【００２８】
本発明の別の特徴は、ソホロースリピド中のラクトン型ソホロースリピドに占めるジアセチルラクトン型ソホロースリピドのモル比率が８０％以上であるソホロースリピドである。【００２９】
本発明の別の特徴は、固体状であるソホロースリピドである。【００３０】
本発明の別の特徴は、上記の製造方法により得られる糖脂質型バイオサーファクタント、及び／又は、上記ソホロースリピドを含む組成物である。【００３１】
本発明の別の特徴は、上記の組成物を含む、界面活性剤である。【００３２】
本発明の別の特徴は、上記の界面活性剤の、食品用途、家庭用品用途、生活資材用途、土木・建築材料用途、塗料・インク用途、ゴム・プラスチック用途、機械・器具用途、医療・化粧料用途、畜産・漁業用途、農業用途、又は、製品製造時での利用用途における使用である。【００３３】
本発明の別の特徴は、上記の組成物を含む、抗菌剤及び／又は防カビ剤である。【００３４】
本発明の別の特徴は、上記の抗菌剤及び／又は防カビ剤の、食品用途、家庭用品用途、生活資材用途、土建・塗料用途、機械・器具用途、水処理用途、分離用途、医療・化粧料用途、畜産・漁業用途、又は、農業用途における使用である。【００３５】
本発明の別の特徴は、上記の組成物を含む医薬品である。【００３６】
本発明の別の特徴は、上記のソホロースリピドを加水分解することを特徴とする、アシッド型ソホロースリピドの製造方法である。
【発明の効果】
【００３７】
本発明によれば、特定の構造を有する糖脂質型バイオサーファクタント、特にジアセチルラクトン型のモル比率が高いソホロースリピド、を安価な油脂から製造することが可能となる。また、ジアセチルラクトン型のモル比率が高いソホロースリピド、特に固体状のジアセチルラクトン型のモル比率が高いソホロースリピドを取得できる。更に、ジアセチルラクトン型のモル比率が高いソホロースリピドであって、特にその脂肪酸側鎖の飽和度が高いソホロースリピドを提供できる。当該ソホロースリピドは非常に高い抗菌、防カビ活性を有し、抗菌剤及び／又は防カビ剤として有用である。更に、高純度なラクトン型ソホロースリピドを酸、アルカリで加水分解することで、高純度なアシッド型ソホロースリピド、及びその安価な製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の実施例３に係る、通気条件０．２ｖｖｍの溶存酸素飽和度の経時変化、を示した図である。
【図２】本発明の参考例１に係る、通気条件０．５ｖｖｍの溶存酸素飽和度の経時変化、を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、本発明を実施形態に基づいて詳細に説明する。
【００４０】
１．糖脂質型バイオサーファクタント
糖脂質型バイオサーファクタントは、親水基として糖を、疎水基として炭化水素鎖を有する、微生物により生産される界面活性剤である。例えば、ソホロースリピド、マンノシルエリスリトールリピド、ラムノースリピド、トレハロースリピド、などが挙げられる。
【００４１】
２．ソホロースリピド
ソホロースリピドは糖脂質型バイオサーファクタントの一種であり、一般に下記一般式（１）：
【００４２】
【化１】
2010050413.tif 000002
【００４３】
（式中、Ｒ1及びＲ2は、Ｈ又はＣＯＣＨ3を表す。Ｒ3はＨ又はＣＨ3を表し、Ｒ3＝Ｈのとき、Ｒ4は炭素数１２〜１６の飽和又は不飽和炭化水素基を、Ｒ3＝ＣＨ3のとき、Ｒ4は炭素数１１〜１５の飽和又は不飽和炭化水素基を表す。）で表されるラクトン型、及び、下記一般式（２）：
【００４４】
【化２】
2010050413.tif 000003
【００４５】
（式中、Ｒ1〜Ｒ4は前記に同じ。）で表されるアシッド型がある。このようにソホロースリピドは、アセチル基の位置及びその数、脂肪酸側鎖の二重結合の有無、脂肪酸側鎖の炭素鎖長、脂肪酸側鎖上におけるグリコシルエーテル結合の位置、ラクトン環を形成するソホロース上のヒドロキシル基の位置、などの違いにより複数の誘導体が存在し、通常、これらの化合物の混合物である。ソホロースリピドは通常、取り扱い難い高粘性の油状物として得られる。比較的疎水性の高いジアセチルラクトン型ソホロースリピドについては、固体としても取得し得る。
【００４６】
３．微生物
本発明における糖脂質型バイオサーファクタントは、糖脂質型バイオサーファクタントの生産能を有する微生物を培養することで得られる。糖脂質型バイオサーファクタントの生産能を有する微生物であればいずれでも用いることができるが、例えば、ソホロースリピドの場合は、キャンディダ（Candida）属、トルロプシス（Torulopsis）属、ウィッカハミエラ（Wickerhamiella）属、スターメレラ（Starmerella）属に属する酵母を用いることが好ましい。特にキャンディダ（Candida）属に属する酵母が好ましく、キャンディダ・ボンビコラ（Candida bombicola）、トルロプシス・アピコラ（Torulopsis apicola）などがより好ましい。最も好ましくはキャンディダ・ボンビコラ（Candida bombicola）ATCC22214である。
【００４７】
４．培地
糖脂質型バイオサーファクタント、例えば、ソホロースリピドは、以下の培地で前記の微生物を培養することにより得られる。
【００４８】
本発明の培養は、通常、酵母が資化できる栄養源を含む培地であれば何でも使用できる。例えば、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、エタノール、グリセリン等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等の炭素源；硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源；更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源；を適宜混合・配合した通常の培地を用いることができる。
【００４９】
糖及び／又は油脂を主原料にしてもよい。主原料の糖としてはグルコースが好ましい。主原料の油脂としては、動植物油脂が使用できる。植物油脂としては、例えば、ナタネ油、大豆油、ひまわり油、ココナッツ油、綿実油、コーン油、パーム油、パーム核油、アマニ油、ひまし油、などが挙げられる。これらの植物油脂を加工して得られる不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸エステル、飽和脂肪酸エステル、等を用いても良いが、これらの中でも好ましくは飽和脂肪酸エステルである。飽和脂肪酸エステルを構成するアシル基の炭素数は１６〜１８のものを好適に利用できる。脂肪酸エステルのエステル種は特に限定されず、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、等のエステルが挙げられる。好ましくはメチルエステル又はエチルエステルであり、更に好ましくはメチルエステルである。油脂として最も好ましくは、パーム油、パルミチン酸メチル、ステアリン酸メチル、又はこれらの混合物である。
【００５０】
５．培養条件
本発明の培養ｐＨ、培養温度、培養時間は通常一般の条件により実施でき、例えば、ｐＨ２．５〜９．５、温度範囲２０〜４５℃の範囲で、４〜１４日間培養するのが好ましい。
【００５１】
培養液への酸素供給量を通常一般の好気的培養条件よりも制限することで、ソホロースリピドにおけるジアセチルラクトン型のモル比率は向上する。ジアセチルラクトン型のモル比率については後述する。酸素供給量は、通気量及び／又は攪拌条件により制限できる。一般に、通気量の低減、攪拌数の低減、培養装置の変更等により、酸素供給量は制限できる。これは、培養の進行に伴い蓄積されるバイオサーファクタントによる培養液の発泡の抑制にもつながる。
【００５２】
例えば一般に、培養開始直後に１００％であった溶存酸素飽和度は、菌体の増殖に伴う培養液中の酸素消費により著しく低下するため、通常の好気的培養では溶存酸素飽和度を高く保つべく、高通気、高攪拌等の工夫がなされる。しかし、本発明の培養では、溶存酸素飽和度を低く保つように、酸素供給量を制限して培養する。例えば、菌体が増殖する培養開始直後の培養初期の期間を除き、溶存酸素飽和度を２０％以下に、好ましくは１５％以下に、より好ましくは１０％以下に、さらに好ましくは５％以下に、最も好ましくは０％に保つように酸素供給量を調節して培養する。通気条件の変更による数時間〜半日程度の一時的な溶存酸素飽和度の増加は、後述のジアセチルラクトン型のモル比率に大きな影響を与えないため問題とならない。菌体が増殖する培養開始直後の培養初期の期間とは、培養開始からの０〜３日間であり、好ましくは０〜２日間、最も好ましくは０〜１日間である。培養開始直後の培養初期の期間も、菌体の増殖に必要な酸素を供給すればよく、また溶存酸素飽和度は１００％から開始する必要も無い。例えば一般的な５Ｌミニジャーファーメンターを４５０ｒｐｍの条件で攪拌した場合の通気条件として、好ましくは０．４ｖｖｍ以下、更に好ましくは０．２ｖｖｍ以下、最も好ましくは０．１ｖｖｍ以下である。例えば５００ｍｌ容坂口フラスコで振とう培養を行う場合、１００ｍｌ以上の培地量とするのが好ましい。また、培養途中に通気量を上げるとソホロースリピド蓄積速度が向上するため、上記範囲の中で酸素供給量を上げても良い。
【００５３】
６．ソホロースリピドの組成
発酵生産されたソホロースリピドの組成は、J. Chromatogr., vol.648, 139 (1993)に記載のＨＰＬＣ条件、もしくはこれと同等の分析条件、で分析することにより解析できる。構造が異なる各種ソホロースリピドの本分析条件における溶出パターンは上記文献に記載されており、これと実際の分析結果の溶出パターンとを比較すれば、各溶出ピークの化合物を同定することができる。
【００５４】
本発明の培養で得られるソホロースリピドは、ラクトン型ソホロースリピドが主成分であり、アシッド型ソホロースリピドのモル比率は低い。
【００５５】
ラクトン型ソホロースリピドは、ジアセチルラクトン型（前記一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２が共にＣＯＣＨ３であるもの）、モノアセチルラクトン型（前記一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２のいずれかがＣＯＣＨ３であり、もう一方がＨであるもの）、ジオールラクトン型（前記一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２が共にＨであるもの）から構成されるが、これらの存在モル比率は前述の培養条件における酸素供給量により変化する。後述の固体状ソホロースリピドの取得方法で得られる固体状ソホロースリピドの主成分はジアセチルラクトン型である。ジアセチルラクトン型のモル比率が８０％より低い場合は、固体として析出し難いため、ジアセチルラクトン型のモル比率は高い方が好ましい。なお、「ジアセチルラクトン型のモル比率」とは、ジアセチルラクトン型、モノアセチルラクトン型、ジオールラクトン型から構成されるラクトン型ソホロースリピドに占めるジアセチルラクトン型の割合を示す。また後述のように、ジアセチルラクトン型は強い抗菌活性を示すため、取得したソホロースリピドを抗菌剤及び／又は防カビ剤として用いる場合には、ジアセチルラクトン型のモル比率は高い方が好ましい。従って、発酵生産されたソホロースリピドのうち、ジアセチルラクトン型のモル比率は、好ましくは８０％以上、更に好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
【００５６】
また、ソホロースリピドの脂肪酸側鎖部分は、飽和型でも不飽和型でも良く、これらが混ざっていてもよい。飽和型と不飽和型の組成モル比率は、培養時に用いる油脂により制御できる。飽和型の脂肪酸側鎖を多く有するソホロースリピドを取得したい場合は、飽和型脂肪酸を多く含有する油脂を用いればよく、不飽和型の脂肪酸側鎖を多く有するソホロースリピドを取得したい場合は、不飽和型脂肪酸を多く含有する油脂を用いればよい。また後述のように、ジアセチルラクトン型ソホロースリピドのうち、特に飽和型の脂肪酸側鎖を有するジアセチルラクトン型ソホロースリピドが強い抗菌、防カビ活性を有する。そのため、ソホロースリピドを抗菌剤及び／又は防カビ剤として用いる場合には、脂肪酸側鎖の飽和型のモル比率が高い方が好ましい。具体的には脂肪酸側鎖の飽和型のモル比率は４０％以上が好ましく、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上である。
【００５７】
７．ソホロースリピドの取得
本発明のソホロースリピドは、以下の方法で得られる。
【００５８】
培養液を静置することにより、生産されたソホロースリピドのほぼ全量が培養液の下部へ速やかに沈降するため、これを回収すればソホロースリピドが高収率で得られる。この時、培養液を８０℃程度に加熱すれば、ソホロースリピドの流動性が向上して分液性が良くなるため、収率が向上する。取得したソホロースリピドは、不純物を除去する目的で、水や水系緩衝液、ヘキサン等の有機溶媒などで洗浄しても良い。
【００５９】
上記のソホロースリピドから、ジアセチルラクトン型ソホロースリピドの純度が向上するように精製すれば、固体状ソホロースリピドが得られる。例えば以下のような方法が挙げられる。上記方法で得られたソホロースリピドを、ヘキサンなどの有機溶媒で洗浄すれば、未資化油脂などの脂溶性の不純物が除去できる。また、ソホロースリピドを酢酸エチルやトルエンなどの有機溶媒で抽出すれば、水や水溶性の不純物を除去できる。これら不純物の除去操作は、実施してもしなくても良い。抽出に用いた有機溶媒は、減圧濃縮により簡単に留去することができる。こうして得られたソホロースリピドから、ソホロースリピドを固体として単離するには、水や水系緩衝液など、ソホロースリピドが結晶化する溶媒から晶析すればよい。水や水系緩衝液などからの晶析時のｐＨは、中性から酸性が好適であり、特に中性付近が好ましい。具体的なｐＨ値としてはｐＨ１〜８、好ましくはｐＨ２〜７．５、より好ましくはｐＨ３〜７、もっとも好ましくはｐＨ６〜７である。ｐＨを調整後に攪拌すればソホロースリピドの結晶が析出する。低温で晶析を実施すれば、収率が向上するので好ましい。晶析の液が凍らない温度、例えば４℃程度、まで冷却攪拌して晶析するのが好ましい。この晶析液からの固体状ソホロースリピドの単離は、一般的な方法、例えば、遠心分離や濾過により実施できる。本願発明で得られるソホロースリピド、特にジアセチルラクトン型のモル比率が高いソホロースリピド、さらには脂肪酸側鎖の飽和型のモル比率が高いソホロースリピドは、晶析による精製を好適に用いることができる。ソホロースリピド以外のバイオサーファクタントであっても、本願発明により得られる糖脂質型バイオサーファクタントであれば、同様に晶析による精製を好適に用いることができる。
【００６０】
８．抗菌、防カビ活性と脂肪酸側鎖の組成
本発明において「抗菌、防カビ活性」とは、細菌及び酵母、カビ等の微生物の増殖を抑制する効果を言う。これらの生菌数を減少、または殺滅させる効果を指す。
【００６１】
抗菌、防カビ活性を有することが知られるラクトン型ソホロースリピドのうち、脂肪酸側鎖の飽和型のモル比率が４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上であるものが強い抗菌、防カビ活性を有しており、これらを抗菌剤及び／又は防カビ剤として用いるのが好ましい。これらを抗菌剤及び／又は防カビ剤として用いれば、従来の抗菌剤及び／又は防カビ剤よりも低濃度で効果を発揮するため、使用量の低減につながる。
【００６２】
本発明の抗菌剤及び／又は防カビ剤の対象とする微生物は、特に限定されない。例えば、グラム陽性細菌に効果的である。グラム陽性細菌としては、例えば、ミクロコッカス（Micrococcus）属、ストマトコッカス（Stomatococcus）属、プラノコッカス（Planococcus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、デイノコッカス（Deinococcus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ルーコノストク（Leuconostoc）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、アエロコッカス（Aerococcus）属、ゲメラ（Gemella）属、ペプトコッカス（Peptococcus）属、ペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus）属、ルミノコッカス（Ruminococcus）属、コプロコッカス（Coprococcus）属、サルシナ（Sarcina）属、バチラス（Bacillus）属、スポロラクトバチラス（Sporolactobacillus）属、クロストリジウム（Clostridium）属、デサルフォトマキュラム（Desulfotomaculum）属、スポロサルシナ（Sporosarcina）属、オスシロスピラ（Oscillospira）属、ラクトバチラス（Lactobacillus）属、リステリア（Listeria）属、エリシペロテリックス（Erysipelothrix）属、ブロコテリックス（Brochothrix）属、レニバクテリウム（Renibacterium）属、クルチア（Kurthia）属、カリオファノン（Caryophanon）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ガルデネレラ（Gardenerella）属、アルカノバクテリウム（Arcanobacterium）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、クロトバクテリウム（Curtobacterium）属、カセオバクター（Caseobacter）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、アウレオバクテリウム（Aureobacterium）属、セルロモナス（Cellulomonas）属、アグロマイセス（Agromyces）属、アラクニア（Arachnia）属、ロチア（Rothia）属、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属、エウバクテリウム（Eubacterium）属、アセトバクテリウム（Acetobacterium）属、ラクノスピラ（Lachnospira）属、ブチリビブリオ（Butyrivibrio）属、サーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）属、アクチノマイセス（Actinomyces）属、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、ノカルディア（Nocardia）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、ノカルディオイデス（Nocardioides）属、シュードノカルディア（Pseudonocardia）属、オエルスコビア（Oerskovia）属、サッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）属、ミクロポリスポラ（Micropolyspora）属、プロミクロモノスポラ（Promicromonospora）属、イントラスポランギウム（Intrasporangium）属、等が挙げられる。
【００６３】
中でも、バチラス（Bacillus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する細菌に好適に用いることができる。
【００６４】
特に、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属に属する細菌、具体的にはスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミジス（Staphylococcus epidermidis）や、コリネバクテリウム属に属する細菌、具体的にはコリネバクテリウム・キセロシス（Corynebacterium xerosis）や、ストレプトコッカス（Streptococcus）属に属する細菌、具体的にはストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）や、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属に属する細菌、具体的にはプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）等に好適に用いることができる。
【００６５】
酵母やカビとしては、例えば、クラドスポリウム（Cladosporium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、フザリウム（Fusarium）属、ペニシリウム（Penicillium）属、グロエオフィラム（Gloeophyllum）属、シゾフィラム（Schizophyllum）属、キャンディダ（Candida）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ピキア（Pichia）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、等が挙げられる。
【００６６】
特に、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、クラドスポリウム（Cladosporium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、フザリウム（Fusarium）属、ペニシリウム（Penicillium）属、グロエオフィラム（Gloeophyllum）属、シゾフィラム（Schizophyllum）属、等に好適に用いることができる。
【００６７】
９．使用用途
本発明で得られる糖脂質型バイオサーファクタントは、界面活性剤としての性質や抗菌・防カビ活性を有するため、これら特性が求められる分野で利用できる。また、新たな性質や機能を見出した場合は、その特性が求められる分野で利用することができる。
【００６８】
本発明で得られる糖脂質型バイオサーファクタントの界面活性剤としての使用用途としては、例えば、食品用途（乳化剤、防カビ剤など）、家庭用品用途（トイレ・風呂・キッチンなどで用いる洗剤、洗濯用洗剤（柔軟剤、帯電防止剤）、など）、生活資材用途（防錆剤、殺菌剤、など）、土木・建築材料用途（コンクリート用混和剤、減水剤、など）、塗料・インク用途（水性インク用、消泡剤、分散剤、など）、ゴム・プラスチック用途（帯電防止剤、防曇剤、分散剤、など）、機械・器具用途（殺菌剤、洗浄剤、防錆剤、など）、医療・化粧料用途（医薬品、化粧品、香料、殺菌剤、など）、畜産・漁業用途（飼料添加物、抗菌剤、など）、農業用途（農薬、土壌改質剤、殺菌剤、など）、製品製造時での利用用途（紙・パルプ、ゴム・プラスチック、繊維、などの分野）、等が挙げられる。
【００６９】
本発明で得られる糖脂質型バイオサーファクタントの抗菌剤及び／又は防カビ剤としての使用用途としては、例えば、食品用途（保存料、日持ち向上剤、鮮度保持剤など）、家庭用品用途（ブラシ製品、文房具、靴中敷などの雑貨品、家具等のインテリア、壁・床・天井などの被覆材料、トイレ・風呂・キッチンなどの水まわり設備や用品、など）、生活資材用途（繊維製品、皮革製品、紙製品、ゴム製品、衣類、包装材料、包装容器、など）、土建・塗料用途（固定構造物、建築物の内外装材料、木材、金属、コンクリート、プラスチック、など）、機械・器具用途（電気・家電製品、機械、乗り物、光学器械、医療・福祉・衛生用器具、など）、水処理用途（用水処理、廃水処理、汚泥処理、など）、分離用途（濾過装置、濾過材、濾過機材、など）、医療・化粧料用途（医薬品、化粧品、香料、など）、畜産・漁業用途（飼料添加物など）、農業用途（農薬など）、等が挙げられる。
【００７０】
本発明で得られる糖脂質型バイオサーファクタントの使用形態に特に制限は無く、用途に応じて適宜他の成分と併用あるいは混在した状態でも使用できる。例えば、ニート（液体又は固体状態）の状態で使用してもよく、各種の溶媒に溶解させた液体状態で用いても良い。また、水又は有機溶媒の存在下で乳化した状態で用いても良いし、固体成分と混合して用いても良い。
【００７１】
本発明で得られる糖脂質型バイオサーファクタントの使用量は、使用用途などに合わせて設定すればよい。例えば、抗菌剤及び／又は防カビ剤として使用する場合、有効成分であるソホロースリピドの含有量は特に限定されるものではなく、通常、０．００１重量％以上、より好ましくは０．０１重量％以上、更に好ましくは０．１重量％以上である。
【００７２】
１０．アシッド型ソホロースリピドの調製
上記の方法で得られる高純度の固体状ソホロースリピドを原料として、酸やアルカリなどで加水分解することにより、高純度のアシッド型ソホロースリピドが容易に得られる。例えば、３モル当量の水酸化ナトリウムを室温で作用させれば、ジアセチルラクトン型のソホロースリピドは速やかに加水分解され、無色透明の純度が高いアシッド型ソホロースリピド水溶液が得られる。この水溶液から水を留去すれば更に高純度化が図れる。
【実施例】
【００７３】
以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００７４】
実施例で用いる微生物はいずれも、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（NBRC）（〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）、又は米国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection, ATCC）から、なんら制限なく入手することができる。【００７５】
（実施例１）
種母培地として、リン酸二水素カリウム０．１％、硫酸マンガン七水和物０．５％、塩化第二鉄０．０１％、塩化ナトリウム０．０１％、酵母エキス０．４％、グルコース１０％、ナタネ油１０％からなる液体培地（ｐＨ４．５）５０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに、また、本培養培地として、リン酸二水素カリウム０．１％、硫酸マンガン七水和物０．５％、塩化第二鉄０．０１％、塩化ナトリウム０．０１％、酵母エキス０．４％、グルコース１０％、パーム油より製造されたエステルパル−Ｍ（ミヨシ油脂社製、パルミチン酸メチルとステアリン酸メチルのモル比率が７：３の油脂）、からなる液体培地（ｐＨ４．５）３Ｌを５Ｌ容ミニジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に注入し、１２１℃で２０分間蒸気滅菌した。種母培地に、キャンディダ・ボンビコラ（Candida bombicola）ATCC22214株を１白金耳植菌し、３０℃で１日間振盪培養した。種母培養液の全量を本培養培地に植菌し、３０℃、４５０ｒｐｍ、０．３ｖｖｍの条件で７日間培養した。溶存酸素飽和度は、培養開始後１日で０％となり、以降０％を維持した。【００７６】
培養液中のソホロースリピドの組成は、下記ＨＰＬＣ条件で分析して決定した。【００７７】
（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：YMC-Pack Pro C18 RS(150X4.6mm, 3um, 株式会社ワイエムシィ製)
溶離液：２％アセトニトリル水溶液→７０％アセトニトリル水溶液のリニアグラジエント（０→４８分）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
カラム温度：３０℃
検出：コロナ荷電化粒子検出器（ＥＳＡ社製）。【００７８】
各種ソホロースリピドの構造は、文献値（J. Chromatogr., 648, 139 (1993)）に記載の溶出時間との比較により同定した。上記ＨＰＬＣ分析条件においては、アシッド型ソホロースリピドは２８〜３４分、モノアセチルラクトン型およびジオールラクトン型は３４〜４５分、ジアセチルラクトン型は４５分〜５５分に溶出した。これらのピーク面積をそれぞれの溶出時間の範囲で積算して比較し、ピーク面積のモル比率をソホロースリピドの組成のモル比率とした。その結果、培養終了時の培養液中にはアシッド型ソホロースリピドは検出されず、ラクトン型が１００％であった。また、ラクトン型ソホロースリピドのうちジアセチルラクトン型のモル比率は８１％であった。また、脂肪酸側鎖の飽和型のモル比率は７５％であった。【００７９】
（実施例２）
実施例１で得た本培養液の全量を８０℃に加熱し、沈降した約３００ｇの油状物を得た。等容量のヘキサンで洗浄して未資化油脂を除去した後、等容量の酢酸エチルで抽出し、ソホロースリピドの酢酸エチル溶液を得た。減圧濃縮により酢酸エチルを留去後、１．５Ｌの水を添加し、そのｐＨを６．５に調整した後に室温から４℃まで冷却晶析を行った。析出した結晶を濾過により取得後、乾燥すると１８ｇの固体状ソホロースリピドが得られた。実施例１に記載のＨＰＬＣ条件で分析した。その結果、ラクトン型ソホロースリピドのモル比率は１００％であった。ラクトン型ソホロースリピドのうちジアセチルラクトン型のモル比率は９６％であった。また、脂肪酸側鎖の飽和型のモル比率は９２％であった。【００８０】
（実施例３）
本培養時の通気条件を０．２ｖｖｍに変更した以外は、実施例１に記載と同様に培養した。培養終了時の培養液を実施例１に記載のＨＰＬＣ条件で分析した。その結果、アシッド型ソホロースリピドは検出されず、ラクトン型ソホロースリピドのモル比率は１００％であった。ラクトン型ソホロースリピドのうちジアセチルラクトン型の
モル比率は８９％であった。また、脂肪酸側鎖の飽和型のモル比率は８６％であった。【００８１】
培養時の、溶存酸素飽和度の経時変化を図１に示した。培養１日で溶存酸素飽和度は０％となり、以降溶存酸素飽和度は上昇しなかった。【００８２】
（実施例４）
実施例３で得た培養液に対して、実施例２と同様の操作を行い、約３００ｇの油状物を得た後に結晶を取得した。その結果、３９ｇの固体状ソホロースリピドが得られた。実施例１に記載のＨＰＬＣ条件で分析した結果、ラクトン型ソホロースリピドのモル比率は１００％であった。ラクトン型ソホロースリピドのうちジアセチルラクトン型のモル比率は１００％であった。また、脂肪酸側鎖の飽和型のモル比率は９８％であった。【００８３】
（参考例１）
本培養時の通気条件を０．５ｖｖｍに変更した以外は、実施例１に記載と同様に培養した。実施例１に記載のＨＰＬＣ条件で分析したところ、培養終了時の培養液中のラクトン型ソホロースリピドのモル比率は９９％であった。ラクトン型ソホロースリピドのうちジアセチルラクトン体のモル比率は７１％であった。また、脂肪酸側鎖の飽和型のモル比率は６２％であった。【００８４】
培養時の、溶存酸素飽和度の経時変化を図２に示した。溶存酸素飽和度は、培養１日で２％まで低下し、培養２日目まで維持した。培養２日目以降は上昇し、培養を終了した４日目まで１５％以上を維持した。【００８５】
（比較例１）
参考例１で得た培養液に対して、実施例２と同様の操作を行い、約３００ｇの油状物を得た後に結晶の取得を試みた。その結果、結晶の析出は全く認められず、ソホロースリピドを固体として得られなかった。【００８６】
（実施例５）
本培養時に用いる油脂（エステルパル−Ｍ）をパーム油とした以外は、実施例１と同様に培養した。得られた培養液を８０℃に加熱し、沈降した油状物をパーム油由来のソホロースリピドとして約３００ｇ取得した。実施例１に記載のＨＰＬＣ条件で分析した結果、ラクトン型ソホロースリピドのモル比率は９７％であった。ラクトン型ソホロースリピドのうちジアセチルラクトン型のモル比率は８３％であった。また、脂肪酸側鎖の飽和型のモル比率は４３％であった。【００８７】
（実施例６）
実施例５で得たソホロースリピドの油状物に対して、実施例２と同様の操作を行い、結晶を取得した。その結果、２０ｇの固体状ソホロースリピドが得られた。実施例１に記載のＨＰＬＣ条件で分析した結果、ラクトン型ソホロースリピドのモル比率は１００％であった。ラクトン型ソホロースリピドのうちジアセチルラクトン型のモル比率は９５％であった。また、脂肪酸側鎖の飽和型のモル比率は８０％であった。【００８８】
（実施例７）
実施例１、２、５で得られた各種ソホロースリピドの抗菌、防カビ活性を調べた。肉エキス１％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．３％からなる液体培地（ｐＨ７．０）５ｍｌをφ２４ｍｍ試験管に分注し、１２１℃で２０分間蒸気滅菌した。この液体培地に表１に示した細菌及び酵母を１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振盪培養し、これを種母培養液とした。同じ培地に０．００１〜０．１％になるように各種ソホロースリピドを加え、種母培養液を５０μｌ植菌し、３０℃で１５時間振盪培養した。得られた培養液を水で４１倍希釈して５５０ｎｍの吸光度を測定し、ソホロースリピド非添加区の吸光度を１００％とした時の相対値を生育度として算出した。結果を表１に示した。試験した各種ソホロースリピドのうち、飽和脂肪酸モル比率が高いもののほうが、より低濃度でグラム陽性細菌や酵母の生育を強く阻害した。【００８９】
【表１】
2010050413.tif 000004
【００９０】
（実施例８）
実施例１、２、５で得られた各種ソホロースリピドの防カビ活性を調べた。硝酸ナトリウム０．２％、リン酸水素二カリウム０．１％、塩化カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％、硫酸鉄七水和物０．００１％、ショ糖３％、寒天１．５％からなる寒天培地８ｍｌをφ１８ｍｍ試験管に調製し、１２１℃で２０分間蒸気滅菌した。この寒天培地に下表のカビを１白金耳植菌して３０℃で２週間培養し、胞子形成スラントを得た。これに５ｍｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液を入れて懸濁後、ガーゼで濾過し、胞子懸濁液を得た。グルコース２％、酵母エキス１％を含む培地をφ２４ｍｍ試験管に分注し、１２１℃で２０分間蒸気滅菌した。この液体培地に０．１％になるように各種ソホロースリピドを加え、胞子懸濁液を５０μｌ植菌し、３０℃で１週間振盪培養した。カビの生育の有無を目視で判定した。生育の認められた試験区を＋、生育が認められなかった試験区を−として、結果を表２に示した。試験した各種ソホロースリピドのうち、脂肪酸側鎖部分の飽和型のモル比率が高いものの方が、より強力にカビの生育を阻害した。【００９１】
【表２】
2010050413.tif 000005
【００９２】
（実施例９）
実施例１、２、５で得られた各種のソホロースリピドの防カビ活性を調べた。各種ソホロースリピドを０．１％加えて作製したポテトデキストロース寒天培地（日水製薬株式会社製）プレートにφ８ｍｍの濾紙を設置した。この濾紙上に、実施例８と同様にして下表のカビについて調製した胞子懸濁液５μｌを植菌し、３０℃で３日間培養した。カビの生育の有無を目視で判定すると共に、生育したカビの直径を測定した。生育度は以下の式により算出した。【００９３】
生育度（％）＝（ソホロースリピド添加区の生育範囲直径）／（ソホロースリピド非添加区の生育範囲直径）×１００（％）
結果を表３にまとめた。試験した各種ソホロースリピドのうち、脂肪酸側鎖部分の飽和型のモル比率が高いものほど、より強力にカビの生育を阻害した。【００９４】
【表３】
2010050413.tif 000006
【００９５】
（実施例１０）
実施例２で得た固体状ソホロースリピド５ｇに、２．５ｇの４０％水酸化ナトリウム水溶液を添加して、室温で１時間攪拌した。その後、濃塩酸でｐＨを７に調整した。これを実施例１に記載のＨＰＬＣ条件で分析した。その結果、ラクトン型ソホロースリピドは検出されず、全てアシッド型に変換されていた。この方法により、無色透明で高純度・高含量のアシッド型ソホロースリピドの水溶液が得られた。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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