【事件の表示】
　特許第２９８０８８８号「肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子」の請求項１ないし４に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２９８０８８８号の請求項１ないし２に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　特許第２９８０８８８号の請求項１及び２に係る発明は、平成１年８月１１日に出願した特願平１−２０９４４９号の一部を新たな特許出願とした特願平８−７１９１１号の一部をさらに新たな特許出願として出願され、平成１１年９月１７日にその特許権の設定登録がなされ、その後、武山真理により特許異議の申立てがなされ、取消理由の通知がされ、その指定期間内である平成１３年３月１３日に訂正請求がなされたものである。
　
２．訂正の適否についての判断
（１）訂正の内容
ａ．請求項１を削除し、「【請求項２】請求項１記載のアミノ酸配列で表されるシグナル配列を含む肝実質細胞増殖因子において、３２番目のグルタミンから７２８番目のセリンまでの配列で表されることを特徴とするシグナル配列を含まない肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子。」とあるのを、
「【請求項１】下記のアミノ酸配列：（アミノ酸配列は略）で表されるシグナル配列を含む肝実質細胞増殖因子において、３２番目のグルタミンから７２８番目のセリンまでの配列で表されることを特徴とするシグナル配列を含まない肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子。」に訂正する。
ｂ．請求項３を削除し、「【請求項４】請求項３に記載の塩基配列のうち９４番目のシトシンから２１８７番目のグアニンまでの配列で表される請求項１に記載の遺伝子。」とあるのを、
「【請求項２】下記の塩基配列（塩基配列は略）のうち９４番目のシトシンから２１８７番目のグアニンまでの配列で表される請求項１に記載の遺伝子。」に訂正する。
（２）訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正事項ａは、請求項１を削除し、それに伴い請求項１を引用していた記載に代えて、具体的なアミノ酸配列を記載したものであって、特許請求の範囲の減縮を目的とした明細書の訂正に該当する。また、上記訂正事項ｂは、請求項３を削除し、それに伴い請求項３を引用していた記載に代えて、具体的な塩基配列を記載したものであって、特許請求の範囲の減縮を目的とした明細書の訂正に該当する。
　そして、訂正後の請求項１は訂正前の請求項２と同一の内容であり、訂正後の請求項２は訂正前の請求項４と同一の内容であり、また、上記訂正事項ａ及びｂについては、願書に添付した明細書の段落【０００７】に「・・細胞から分泌される場合にはシグナル配列が切断され、３０番目のグルタミン酸残基（Ｇｌｕ）または３２番目のグルタミン残基（Ｇｌｎ）以後のアミノ酸配列を有するｈＨＧＦが産生される。」と記載されているから、この訂正は願書に最初に添付した明細書に記載された事項の範囲内においてなされたものであり、また、実質的に特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。
（３）むすび
　したがって、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項で準用する特許法第１２６条第第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議申立てについて
（１）本件発明
　上記２．で示したように上記訂正が認められるから、本件の請求項１及び２に係る発明（以下、それぞれ「本件発明１」及び「本件発明２」という。）は、上記訂正請求に係る訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１及び２に記載されたとおりの次のものである。
「【請求項１】下記のアミノ酸配列：（アミノ酸配列は略）で表されるシグナル配列を含む肝実質細胞増殖因子において、３２番目のグルタミンから７２８番目のセリンまでの配列で表されることを特徴とするシグナル配列を含まない肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子。
【請求項２】下記の塩基配列（塩基配列は略）のうち９４番目のシトシンから２１８７番目のグアニンまでの配列で表される請求項１に記載の遺伝子。」
（２）異議申立ての理由の概要
　異議申立人　武山真理は、ａ．本件特許の明細書及び特許請求の範囲の記載には不備があり、特許法第３６条第３項及び第４項に規定される要件を満たしておらず、また、ｂ．請求項２及び４に係る発明は、甲１号証に記載された発明であるので特許法第２９条第１項第３号に規定される発明に該当するから、本件特許は取り消されるべきものであると、主張している。
（３）刊行物（甲第１号証）記載の発明
　当審で通知した取消理由で引用した刊行物１（甲第１号証）の第１図には、ヒト肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子の１〜２１８７の塩基配列が、第２図にはヒト肝実質細胞増殖因子の１〜７２８のアミノ酸配列が記載されており、「配列中、第１番目〜第３１番目（−）はシグナルペプチドを表わし、Ｚは修飾される前がＧ１ｎを表わし、修飾された後はピログルタミン酸を表わす。」（第１０頁右上欄１８行〜左下欄１行）との記載がある。
（４）判断
（ａ）異議申立人の上記３．（２）ａ．の主張について
　特許異議申立人は、特許法第３６条第３項及び第４項に規定する要件を満たさない理由として、（ア）「シグナル配列を含まないＨＧＦ」のＮ末端が、本件発明１に記載された１〜７２８のアミノ酸配列の３２番目であるといえる根拠は明細書中に何ら記載されていないこと（特許異議申立書第９頁２２〜２５行）、（イ）本願明細書には有用性についての記載が見あたらないこと（同申立書第１１頁５〜６行）、即ち「成熟ｈＨＧＦの活性発現のために必要なアミノ酸配列を供給する」という有用性については、本願明細書には何ら記載がないこと（同申立書第１１頁２７〜２９行）、及び（ウ）訂正前の請求項１記載の発明と請求項２記載の発明ではシグナル配列が異なることになり、矛盾しているため、用語の統一性に欠けること（同申立書第１２頁１３〜１９行）を、主張している。
　そこで、上記主張について検討するに、本件発明は、そもそも、ヒト肝細胞増殖因子（以下、ｈＨＧＦとも称する）を組換えＤＮＡ技術により大量に取得する手段を提供することを目的とするものであり、この目的に有用なｈＨＧＦをコードする遺伝子を初めてクローニングすることに成功したことにより（段落【０００５】）、本件発明１に記載のとおり、ｈＨＧＦの１〜７２８番目までのアミノ酸配列を同定することができ、またその構造の解析が可能となったものであることは、本件明細書の段落【０００６】〜【０００８】等の記載から明らかである。
　先ず、上記（ア）の点について検討すると、本件明細書中には、シグナル配列を有するヒト肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子の全長アミノ酸配列、即ち遺伝子の全体構造が開示され、また、劇症肝炎患者血漿より精製され、このためシグナルペプチドを有しないｈＨＧＦを還元条件下で処理するとジスルフィド結合が切断され２本のポリペプチドに分かれること（段落【０００８】）が記載されており、具体的には、実施例１において、（１）プラークハイブリダイゼーション及び（２）ｃＤＮＡ断片のサブクローニング及び塩基配列決定の実施により、ｈＨＧＦをコードする遺伝子を含むｃＤＮＡの全塩基配列を決定したことが記載されている。さらに、本件明細書の段落【０００７】には、「この時、ｈＨＧＦをコードするｍＲＮＡから翻訳される蛋白はシグナル配列を含んでいるが、細胞から分泌される場合にはシグナル配列が切断され、３０番目のグルタミン酸残基（Ｇｌｕ）または３２番目のグルタミン残基（Ｇｌｎ）以後のアミノ酸配列を有するｈＨＧＦが産生される。また、宿主細胞内にシグナル配列のない成熟ｈＨＧＦを発現させる場合は、ｈＨＧＦをコードする遺伝子として図３ないし５に示す塩基配列のうち８８番目のＧまたは９４番目のＣから以後の塩基配列を有する遺伝子を、ベクターのＡＴＧコドンにつなげて使用すればよい。」と記載されている。
　このような、ｈＨＧＦの精製・取得及びその構造決定の技術的過程について配慮しつつ、本件特許出願時のシグナルペプチドの解明に係る技術的手段及び技術常識を考慮すると、本願明細書中に記載された３２番目のグルタミン残基（Ｇｌｎ）以後のアミノ酸配列がシグナル配列を有しないＨＧＦであることは、当業者が確認可能で蓋然性の高い知見であるといえる。
　したがって、Ｎ−末端であることに関する根拠についての異議申立人の主張は全く理解し得ないことであるとはいえないものの、異議申立人の主張するように、本件発明１について明細書の記載が不備であるとまではいうことができない。
　同様に、本件発明２についても明細書の記載が不備であるとすることはできない。
　次に、上記（イ）の点について検討すると、本件発明１及び２は、特定部位のアミノ酸配列あるいは塩基配列で表される「遺伝子」に係る発明であり、かかる遺伝子に関する事項として、本件明細書の段落【０００７】には、「以下に本発明を説明するに、本発明のｈＨＧＦをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）は例えば図３ないし５に示すような塩基配列を有する。なお、塩基配列は他の相補的な塩基配列を省略し１本鎖のみを記載した。この遺伝子より組換えＤＮＡ技術により例えば図１及び２に示すアミノ酸配列を有するｈＨＧＦを発現させることができる。」との記載があり、この記載に引き続いて、上記（ア）で摘記した段落【０００７】の記載がある。
　さらに、明細書の段落【００１３】には、「しかしながら、天然のｈＨＧＦは糖蛋白であることを考慮すると、宿主としては動物細胞が望ましい。また、動物細胞を宿主とする場合はシグナル配列に相当する部分を含むｈＨＧＦ遺伝子を導入することにより、シグナル配列が除かれたｈＨＧＦが分泌生産されるという利点が期待される。シグナル配列としてはｈＨＧＦの本来のシグナル配列以外にもヒト血清アルブミン、インターフェロン、ヒト・アミラーゼ等のシグナル配列を利用してもよく、その場合は本来のシグナル配列をコードするＤＮＡ断片にかえて、それらのシグナル配列に相当する塩基配列の ＤＮＡ断片を５’側に置換すればよい。」と記載されており、ｈＨＧＦのシグナル配列以外の他のタンパク質のシグナル配列を利用し得ることも記載されている。
　このように、本件発明の「シグナル配列を含まないｈＨＧＦをコードする遺伝子」は、ｈＨＧＦのシグナル配列以外の他の蛋白質のシグナル配列と結合させて用いることが可能であり、また、宿主細胞内にシグナル配列のない成熟ｈＨＧＦを発現させる場合には９４番目以降の塩基配列をベクターのＡＴＧコドンにつなげて使用され得るから、本件発明の「遺伝子」が有用であることも明らかである。
　したがって、本件発明の遺伝子について有用性の記載がないということはできない。
　最後に、上記（ウ）の点について検討すると、Ｎ末端を３０番目であるとする訂正前の請求項１及び３は削除されたから、記載が矛盾するという点は解消された。
　以上のとおりであるから、本件発明１および２に係る特許が、特許法第３６条第３項及び第４項に規定する要件を満たさない特許出願に対してされたものであるとすることはできない。
（ｂ）異議申立人の上記３．（２）ｂ．の主張について
　異議申立人は、本件発明は、平成１１年７月１２日付け手続補正書により補正されているところ、右補正は本願明細書の要旨を変更するものであるから、本件出願は上記の日に出願されたとみなされるべきであり、又、本件発明は実質的に甲第１号証に記載された発明であると主張している。
　しかしながら、上記（ア）の点において述べたとおり、シグナル配列の全長を含まないＨＧＦの開始アミノ酸は３２番目からであるということは明細書に開示されているといえるから、上記補正が明細書の要旨を変更するものであるということはできない。
　このため、本件出願の出願日は原出願の出願日である平成１年８月１１日まで遡るから、甲第１号証は本件出願前に頒布された刊行物には該当しない。
　したがって、本件発明１及び２が刊行物１に記載された発明であるか否かを判断するまでもなく、同発明が特許法第２９条第１項第３号に規定する発明であるということはできない。
　
４．むすび
　以上のとおりであるから、特許異議申立ての理由及び提出した証拠によっては、本件請求項１及び２に係る特許を取り消すことができない。
　また、他に本件請求項１及び２に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年１２月１８日（２００１．１２．１８）
【訂正の要旨】
　訂正の要旨
ａ．特許請求の範囲の減縮を目的として、請求項１を削除し、「【請求項２】請求項１記載のアミノ酸配列で表されるシグナル配列を含む肝実質細胞増殖因子において、３２番目のグルタミンから７２８番目のセリンまでの配列で表されることを特徴とするシグナル配列を含まない肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子。」とあるのを、
「【請求項１】下記のアミノ酸配列：（アミノ酸配列は略）で表されるシグナル配列を含む肝実質細胞増殖因子において、３２番目のグルタミンから７２８番目のセリンまでの配列で表されることを特徴とするシグナル配列を含まない肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子。」に訂正する。
ｂ．特許請求の範囲の減縮を目的として、請求項３を削除し、「【請求項４】請求項３に記載の塩基配列のうち９４番目のシトシンから２１８７番目のグアニンまでの配列で表される請求項１に記載の遺伝子。」とあるのを、
「【請求項２】下記の塩基配列（塩基配列は略）のうち９４番目のシトシンから２１８７番目のグアニンまでの配列で表される請求項２に記載の遺伝子。」に訂正する。
（５４）【発明の名称】
肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　下記のアミノ酸配列：
で表されるシグナル配列を含む肝実質細胞増殖因子において、３２番目のグルタミンから７２８番目のセリンまでの配列で表されることを特徴とするシグナル配列を含まない肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子。
　【請求項２】　下記の塩基配列
のうち９４番目のシトシンから２１８７番目のグアニンまでの配列で表される請求項１に記載の遺伝子。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【発明の属する技術分野】
　本発明は、肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子に関する。
　【０００２】
　【従来の技術】
　肝臓は、生体中で最も高度に分化の進んだ最大の器官である。これは主に各種栄養素（糖質、タンパク質、脂質、ビタミン、ホルモン等）の処理（代謝）、貯蔵、解毒、分解、排せつ等の重要な多種の機能を兼ね備えており、なかでも生体内中間代謝の中心的な役割を果たすことが知られている。これらの機能を担っている肝実質細胞は生体内において各種のホルモンによる制御下に置かれ、ある場合にはきわめて旺盛な増殖を示す。例えば、ラットの肝臓のほぼ２／３を切除しても、約１０日後には元の大きさに戻ることが知られており、ヒトでも肝癌患者等において、部分肝切除とその後の再生による治療法が行われている。肝実質細胞の増殖による肝再生の機構については従来より数多くの研究が行われ、肝実質細胞増殖因子の存在が報告されてきた。とりわけ、本発明者らの一部は、ヒト劇症肝炎患者血漿中には、肝実質細胞増殖活性が極めて高いことを見いだし（Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．，６，２３１（１９８５）及びＥｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１６６，１３９（１９８６））、その活性を有する因子を世界で初めて単一のタンパク質として精製することに成功した（特開昭６３−２２５２６号公報及びＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１，４１４（１９８８））。
　【０００３】
　このヒト肝細胞増殖因子（以下「ｈＨＧＦ」と略す）は非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量が約７６０００−９２０００であり、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは分子量５６０００−６５０００及び３２０００−３５０００の２つのバンドに分かれた。中村らは、ラット血小板由来の同様な活性を有する因子を報告しており（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１２２，１４５０（１９８４））、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、その推定分子量は約２７０００であるとしていたが（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，６４８９（１９８６））、その後、単一のタンパク質として精製し、分子量６９０００と３４０００との２つのポリペプチドからなる分子量８２０００のタンパク質であると報告された（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２４，３１１（１９８７））。これらｈＨＧＦ及びラットＨＧＦ以外には単一のタンパク質として精製された肝細胞増殖因子は今までに報告されていないし、ｈＨＧＦ及びラットＨＧＦに関しても、その一次構造及び該当するｃＤＮＡの塩基配列については、なんの報告もなされていない。
　【０００４】
　【発明の解決すべき課題】
　ｈＨＧＦの生体における詳細な機能あるいは肝障害時における肝再生に対する効果等を生体外で調べるには、多量のｈＨＧＦを必要とするが、劇症肝炎患者血漿から多量のｈＨＧＦを精製することは人的、時間的、経費的に必ずしも容易ではなく、また感染源の存在する血漿中からｈＨＧＦのみを安定に取り出すことは困難を極める。かかる理由からｈＨＧＦの劇症肝炎患者血漿からの安定かつ大量の精製は行われていなかった。
　【０００５】
　【課題を解決するための手段】
　そこで、本発明者らは、ｈＨＧＦを組換えＤＮＡ技術により大量に取得するべく種々検討した結果、かかる目的に有用なｈＨＧＦをコードする遺伝子を初めてクローニングすることに成功し、本発明を完成するに至った。
　【０００６】
　すなわち、本発明の要旨は、図１及び２に示すアミノ酸配列で表される、シグナル配列を含むｈＨＧＦ、図１及び２に示すアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列のうち３０番目のグルタミン酸残基（Ｇｌｕ）から最後のセリン残基（Ｓｅｒ）までの配列で表されるｈＨＧＦ、図１及び２に示すアミノ酸配列のうち３２番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から最後のセリン残基（Ｓｅｒ）までの配列で表されるｈＨＧＦ、及びこれらをコードする遺伝子に存する。
　【０００７】
　【発明の実施の形態】
　以下に本発明を説明するに、本発明のｈＨＧＦをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）は例えば図３ないし５に示すような塩基配列を有する。なお、塩基配列は他の相補的な塩基配列を省略し１本鎖のみを記載した。この遺伝子より組換えＤＮＡ技術により例えば図１及び２に示すアミノ酸配列を有するｈＨＧＦを発現させることができる。この時、ｈＨＧＦをコードするｍＲＮＡから翻訳される蛋白はシグナル配列を含んでいるが、細胞から分泌される場合にはシグナル配列が切断され、３０番目のグルタミン酸残基（Ｇｌｕ）または３２番目のグルタミン残基（Ｇｌｎ）以後のアミノ酸配列を有するｈＨＧＦが産生される。シグナル配列として、他の蛋白のシグナル配列を利用する事もできる。また、宿主細胞内にシグナル配列のない成熟ｈＨＧＦを発現させる場合は、ｈＨＧＦをコードする遺伝子として図３ないし５に示す塩基配列のうち８８番目のＧまたは９４番目のＣから以後の塩基配列を有する遺伝子を、ベクターのＡＴＧコドンにつなげて使用すればよい。さらに、本発明においては、肝実質細胞増殖促進活性を損なわない範囲内で、一部のアミノ酸または核酸を除去、変更あるいは追加する等の改変を行ったものも本発明に含まれる。
　【０００８】
　本発明のｈＨＧＦをコードする遺伝子のＤＮＡ断片は例えば次の様な方法によって得られる。劇症肝炎患者血漿より、例えばＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，８１，４１４（１９８８）に記載された方法によって精製されたｈＨＧＦは、還元条件下では、ジスルフィド結合が切断されて２本のポリペプチドに分かれる。分子量５６０００−６５０００ポリペプチドをＨ鎖、分子量３２０００−３５０００のポリペプチドをＬ鎖とする。ｈＨＧＦを還元処理し生成したシステイン残基のチオール基をカルボキシメチル化したのち、逆相高速液体クロマトグラフィーでＨ鎖とＬ鎖を分離するか、あるいはｈＨＧＦを還元条件下で電気泳動し、そのゲルからＨ鎖、Ｌ鎖のそれぞれを抽出したのち、例えばアプライド・バイオシステムズ社製気相プロテインシーケンサーで分析することにより、両鎖のアミノ末端アミノ酸配列を調べることができる。さらに、ｈＨＧＦ自体を、またはＨ鎖、Ｌ鎖分離後に、適切な蛋白分解酵素例えばアクロモバクタープロテアーゼＩ（リジルエンドペプチダーゼ）で分解し、生成するペプチド断片を例えば逆相高速液体クロマトグラフィーで分離したのち、各ペプチドを上記と同様にしてアミノ酸配列分析すればポリペプチド内部のアミノ酸配列を知ることができる。これらのアミノ酸配列からＤＮＡ塩基配列を推定しオリゴヌクレオチドを作成しやすい配列を選定して、そのオリゴヌクレオチド、例えば、後述の実施例に示すようなオリゴヌクレオチドを合成してプローブとして使用する。
　【０００９】
　ｈＨＧＦをコードする遺伝子をスクリーニングするｃＤＮＡライブラリーとしては、人由来の肝臓ｃＤＮＡライブラリー、脾臓ｃＤＮＡライブラリー、胎盤ｃＤＮＡライブラリー、等が利用できる。これらのライブラリーはクローンテック社より販売されている。特に胎盤ｃＤＮＡライブラリーが望ましい。その他ｈＨＧＦを発現している細胞株、及び組織材料から常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを作成してもよい。このようなｃＤＮＡが組み込まれたλファージをＭａｎｉａｔｉｓらの方法（「モレキュラークローニング」、コールドスプリングハーバーラボラトリー、５６頁−７３頁（１９８２））により大腸菌に感染させ培養する。形成されたプラークをｈＨＧＦの一部のアミノ酸配列から推定される塩基配列から作成したオリゴヌクレオチドをプローブとしてプラークハイブリダイゼーション法（「モレキュラークローニング」、コールドスプリングハーバーラボラトリー、３２０頁−３２８頁（１９８２））に従って選択することにより、容易に目的とするｈＨＧＦのアミノ酸配列の一部と同じアミノ酸配列を有しなおかつｈＨＧＦのアミノ酸配列のプローブ以外の領域に相当する塩基配列をも有する、異なるλファージクローンをいくつか得ることができる。
　【００１０】
　さらに上記スクリーニング陽性のプラークからＭａｎｉａｔｉｓらの方法（「モレキュラークローニング」、コールドスプリングハーバーラボラトリー、７６頁−７９頁（１９８２））によりファージを増殖させ、そのものからグリセロールグラヂエント法にしたがってＤＮＡを精製し適切な制限酵素例えばＥｃｏＲＩ等で切断後、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ　１９等のプラスミドベクターあるいはＭ　１３　ｍｐ　１８、Ｍ　１３　ｍｐ　１９などの一本鎖ファージベクターにｃＤＮＡをサブクローニングし、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ法（プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）
７４
　【００１１】
　かくして得られるｃＤＮＡの発現は、例えば、該ＤＮＡ群をその塩基配列の順番がｈＨＧＦのアミノ酸配列に従う形でつないでそれらｈＨＧＦの全領域を含むＤＮＡ断片としこれをｐＣＤＬ−ＳＲα２９６等のプラスミドのプロモーターの下流に翻訳開始コドンＡＴＧとフェーズを合わせて接続して蛋白質発現用プラスミドを形成し、該プラスミドで形質転換された動物細胞の宿主内等で行うことができる。次いで、常法に従い発現された蛋白質を回収することにより本発明のＨＧＦを得ることができる。
　【００１２】
　上記発現用プラスミドとしては、工業的生産のためには、安定した宿主−ベクター系を構築することが望ましい。例えば、特願平１−１１５８３１号に記載されているようなものが挙げられる。具体的には、大腸菌、枯草菌等の微生物を宿主とするときは、プロモーター、リボゾーム結合配列、ｈＨＧＦ遺伝子、転写終結因子、及びプロモーターを制御する遺伝子より成ることが好ましい。プロモーターとしては、例えばトリプトファン合成酵素オペロン（ｔｒｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、リポプロテインのプロモーター（ｌｐｐ）等が挙げられ、また、ｔａｃ（ｔｒｐ：ｌａｃ）、ｔｒｃ（ｔｒｐ：ｌａｃ）、ｐａｃ（ファージ：大腸菌）等のハイブリッドプロモーターでもよい。ｈＨＧＦ遺伝子としてはシグナル配列に相当する部分を除去したものが好ましいが、シグナル配列に相当する部分を含むものでも産生されるプレ体からシグナル配列を除くことによってｈＨＧＦを得ることが出来る。使用するプラスミドとしては、大腸菌や枯草菌で多コピー数になるプラスミド、例えばｐＢＲ３２２系プラスミド、ｐＵＢ　１１０系プラスミド等が望ましい。通常の方法により形質転換された大腸菌、枯草菌などは、通常の培地を用いて１５−４２℃で培養すればよい。酵母を宿主とする場合は、酵母由来のプロモーター、例えばピルビン酸キナーゼ（ｐＹＫ）、ホスホグリセロキナーゼ（ｐＧＫ）等の配列の支配下にｈＨＧＦ遺伝子を接続し、酵母内に導入して３０℃前後で培養すればよい。
　【００１３】
　しかしながら、天然のｈＨＧＦは糖蛋白であることを考慮すると、宿主としては動物細胞が望ましい。また、動物細胞を宿主とする場合はシグナル配列に相当する部分を含むｈＨＧＦ遺伝子を導入することにより、シグナル配列が除かれたｈＨＧＦが分泌生産されるという利点が期待される。シグナル配列としてはｈＨＧＦの本来のシグナル配列以外にもヒト血清アルブミン、インターフェロン、ヒト・アミラーゼ等のシグナル配列を利用してもよく、その場合は本来のシグナル配列をコードするＤＮＡ断片にかえて、それらのシグナル配列に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を５’側に置換すればよい。動物細胞を宿主とする場合、プロモーターとしては、ＳＶ４０後期プロモーター、アポリポプロテインＥ遺伝子のプロモーター、アポリポプロテインＡ１遺伝子のプロモーター、熱ショック蛋白遺伝子のプロモーター、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター、ＨＳＶＴＫプロモーター、アデノウイルスのプロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ等が挙げられるが、ＳＶ４０プロモーター及びメタロチオネイン遺伝子のプロモーターが好ましい。発現ベクターには、ｈＨＧＦ遺伝子の下流にポリアデニル化部位が含まれる。ポリアデニル化部位の具体例としては、ＳＶ４０　ＤＮＡ、β−グロビン遺伝子またはメタロチオネイン遺伝子に由来するものが挙げられる。
　【００１４】
　また、β−グロビン遺伝子のポリアデニル化部位及びＳＶ４０　ＤＮＡのポリアデニル化部位が連結したものであってもよい。発現ベクターは、形質転換体の選択マーカーを有していてもよい。発現ベクター中に選択マーカーがなくても、二重形質転換により、形質転換された動物細胞を選択できる。このような選択マーカーとしては、メトトレキセート耐性を与えるＤＨＦＲ遺伝子、ＨＡＴ培地中での形質転換ｔｋ株の選択を可能とするヘルペス・シンプレックスウイルス（ＨＳＶ）のｔｋ−遺伝子、３’−デオキシストレプタミン抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する大腸菌のトランスポゾンＴｎ　５からのアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、重層増殖によるウシパピローマウイルス遺伝子、ａｐｒｔ遺伝子等が挙げられる。また、二重形質転換法により、発現ベクターで形質転換した動物細胞を選択するには、上記した選択マーカーとなる遺伝子を含有するプラスミドその他のＤＮＡを発現ベクターと一緒に形質転換し、選択マーカーの発現による上記した表現形質により、形質転換細胞を選択出来る。
　【００１５】
　発現ベクターは、大腸菌等の細菌由来の複製開始点を有するプラスミド断片を有すると、細菌中でのクローニングも可能となり有利である。このようなプラスミド断片としてはｐＢＲ　３２２、ｐＢＲ　３２７、ＰＭＬ等のプラスミド断片が挙げられる。発現ベクターに使用されるプラスミドベクターの具体例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、ウサギのβ−グロビン遺伝子に由来するスプライス配列ＤＮＡ、ウサギのβ−グロビン遺伝子からのポリアデニル化部位、ＳＶ４０初期領域からのポリアデニル化部位並びにｐＢＲ　３２２からの複製開始点及びアンピシリン耐性遺伝子を含有するｐＫＣＲ、ｐＫＣＲのｐＢＲ　３２２部分をｐＢＲ　３２７で置換し、ウサギβ−グロビン遺伝子のエクソン３中に存在するＥｃｏ　Ｒ１部位をＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位に変えたｐＫＣＲ　Ｈ２、ＢＰＶ遺伝子及びメタロチオネイン遺伝子を含有するｐＢＰＶ　ＭＴ１等が挙げられる。
　【００１６】
　発現ベクターで形質転換される動物細胞としては、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、マウスＦＭ３Ａ細胞等が挙げられる。発現ベクターの動物細胞への移入はトランスフェクション法、マイクロインジェクション法等により行われるが、その中では、リン酸カルシウム法が最も一般的である。移入により形質転換された動物細胞の培養は、常法により浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地としては、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ　１６４０などが一般的である。
　【００１７】
　産生されたｈＨＧＦの分離精製は、劇症肝炎患者血漿からの精製と同様に、ヘパリン・セファローズやハイドロキシアパタイト等を用いたカラムクロマトグラフィーにより行うことが出来る。
　【００１８】
　【発明の効果】
　本発明に係わるｈＨＧＦをコードする遺伝子は常法により発現ベクターに導入することによって、これを鋳型とする発現によりｈＨＧＦまたはｈＨＧＦ様物質あるいはこれを含む融合蛋白を得ることができる。得られる組換えｈＨＧＦ，ｈＨＧＦ様物質あるいはｈＨＧＦを含む融合蛋白は肝再生促進剤、肝機能改善剤、肝炎治療剤あるいは肝硬変抑制剤等肝疾患の治療薬となる可能性がある。
　【００１９】
　【実施例】
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、その要旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
［１］ｈＨＧＦの部分アミノ酸配列決定及びプローブの作製
　劇症肝炎患者血漿より、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１，４１４（１９８８）に記載された方法に従ってｈＨＧＦを精製した。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけたところ、非還元条件下では、分子量７６０００−９２０００の位置にややブロードな単一バンドが現れ、還元条件下では、分子量５６０００−６５０００のややブロードなバンドと分子量３２０００−３５０００のバンドの２つのバンドが現れた。この精製ｈＨＧＦ５０μｇを５モル濃度の尿素を含有するｐＨ　９の５０ミリモル濃度のトリス塩酸緩衝液１００μｌに溶解し、これに、ｈＨＧＦに対しモル比で１／２００に相当するアクロモバクタープロテアーゼＩを加えて３７℃で６時間反応させた。生成したペプチド混合物は常法により還元カルボキシメチル化したのち、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社製Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ　ＷＰ　Ｏｃｔｙｌ　Ｃｏｌｕｍｎを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離して、各ペプチドを分取した。
　【００２０】
　６つのペプチドについて気相プロテインシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社Ｍｏｄｅｌ　４７０Ａ）を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、表１に示すような配列が見いだされた。
　【表１】
　【００２１】
［２］ｈＨＧＦの一部をコードするｃＤＮＡのスクリーニング
（１）プラークハイブリダイゼーション
　スクリーニングを行うλファージｃＤＮＡライブラリーとして３４週齢のヒト胎盤由来のｃＤＮＡ（クローンテック社）のスクリーニングを説明書に従って行った。１００万クローンのファージを大腸菌Ｙ−１０９０株に感染させ２４．５ｃｍ×２４．５ｃｍのシャーレ中のＮＺＹ軟寒天培地［ＮＺＹ培地；１％　ＮＺ−アミン、０．５％イーストイクストラクト、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．５に調整し０．２５％塩化マグネシウムを加えたもの、ＮＺＹ軟寒天培地；ＮＺＹ培地に０．７％になるように寒天沫を加えオートクレイブしたもの］中で１枚あたり２０万クローンの割合で５枚分を４２℃で一晩培養した。
　【００２２】
　次に培地中のλファージクローンを市販のナイロン膜であるジーンスクリーニングプラス（デュポン社）上に移し取り、以下に説明するプラークハイブリダイゼーションを行った。即ち、１枚のシャーレあたりナイロン膜２枚の割合でファージ粒子を移し取り、その様にしてできたナイロン膜を０．１Ｍ水酸化ナトリウム−１．５Ｍ塩化ナトリウムが染み込んだろ紙上に２分間静置し別に用意した乾いたろ紙上で水分を除いた後、次に、同様に２×ＳＳＣＰ（２倍の濃度のＳＳＣＰ溶液のこと、以下同様の表記方法をとる。１０×ＳＳＣＰ；１．２Ｍ塩化ナトリウム、１５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１３０ｍＭ燐酸二水素カリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ　７．２）−０．２Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．４）を染み込ませたろ紙上でこのナイロン膜を静置し乾いたろ紙上で風乾した後、同じ操作を再び繰り返した。こうして処理したナイロン膜は、３×ＳＳＣ（２０倍の濃度のＳＳＣ溶液；３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）−０．１％ＳＤＳで６０℃１５分間２回洗浄し、次にナイロン膜１枚当り５ｍｌのプレハイブリダイゼーション液［３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ（５０倍の濃度のＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液；１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）１％ポリビニルピロリドン、及び１％フィコール４００）、２０μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ］に６５℃３時間浸した。
　【００２３】
　次に、表１のペプチド４、すなわちＡｓｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−ＬｙｓのうちのＡｓｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−ＨｉｓおよびＨｉｓ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏを基に合成オリゴヌクレオチドを作成した。即ち、前述のアミノ酸配列の順に１７塩基６４種類のＴＨ　２３（５’−Ｔ−Ｇ−Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ−Ａ−Ａ／Ｇ−Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ／Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｔ−３’）、１７塩基２４種類のＴＨ　２４（５’−Ｇ−Ｇ−Ｔ／Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ａ／Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ／Ｇ／Ｔ−Ａ−Ｔ−Ａ／Ｇ−Ｔ−Ｇ−３’）を作成した。これらを常法に従いポリヌクレオチドキナーゼによりその５’末端を反応液［５０　ｍＭ　トリス−塩酸　ｐＨ７．６、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭメルカプトエタノール、１００μＭ（γ３２Ｐ）ＡＴＰ、基質ＤＮＡ］中で３２Ｐ標識した後、常法に従いＤＥＡＥセルロースカラムをかけて余分なモノヌクレオチドを除いた。こうしてできあがった３２Ｐ標識合成オリゴヌクレオチドプローブを含むハイブリダイゼーション液［３×ＳＳＣ、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、５０μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ、１Ｍ塩化ナトリウム、１％　ＳＤＳ、２５０μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ、合成プローブ１種類当り１０万ｃ．ｐ．ｍ．／ｍｌ３２Ｐ標識プローブＤＮＡ］中で前述のフィルターをプローブに応じＡまたはＴを２℃に、ＧまたはＣを４℃に置き換えて全ての塩基を合計した温度、実際はプローブにより４２℃（ＴＨ２３）４６℃（ＴＨ２４）で３６時間保温した。その後、ナイロン膜を取り出し、４×ＳＳＣ溶液中で室温で３０分間２回洗い、４×ＳＳＣ溶液でハイブリダイゼーションの時と同じ温度で３０分間２回洗った後２×ＳＳＣ溶液で室温で１５分間２回洗い、オートラジオグラフィーをとった。
　【００２４】
　２枚１組のナイロン膜のオートラジオグラフィー上のシグナルが一致したものは６個あった。得られたシグナルに相当するクローンを単離するために、これらシグナルと一致する軟寒天培地上のプラークをガラス管で打ち抜き５０μｌのクロロフォルム存在下１ｍｌのＴＭＧ緩衝液［５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム及び０．０１％　ゼラチン］中でファージ粒子を一晩抽出し再び大腸菌Ｙ−１０９０株に感染させ９ｃｍシャーレ中で適当量培養し前述の方法でプラークハイブリダイゼーションを行った。この一連の操作を繰り返すことによりシグナルに相当するクローンを各々単離することができた。その結果独立した６個のクローンを得た。そのうち２個のクローン、すなわちλ　ｈＨＧＦ　２１とλ　ｈＨＧＦ　５０２について、含まれるｃＤＮＡの塩基配列を解析した。
　【００２５】
（２）ｃＤＮＡ断片のサブクローニング及び塩基配列の決定
　これらのλファージクローンから以下のようにＤＮＡを抽出しプラスミドベクターｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９及び一本鎖ファージベクターＭ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９にサブクローニングをおこなった。即ち、５００ｍｌ三角フラスコ中の２００ｍｌのＮＺＹ培地中において、２００μｌのＴＭＧ溶液に懸濁してあるλファージクローン２×１０７ｐ．ｆ．ｕ．（ｐ．ｆ．ｕ．；プラーク形成単位）と４０μｌの大腸菌Ｙ−１０９０株２×１０８を３７℃１５分置くことにより感染させた。１５分後さらに１ｍｌの１Ｍ塩化カルシウムを加え一晩、概ね１４時間ほど培養した。次に、２ｍｌのクロロフォルムを加え１０分ほど置き、１５．８ｇの塩化ナトリウムを加え溶かし、それらを４℃において日立冷却遠心機ＳＣＲ２０ＢＢで、ローターＲＰＲ　９−２を用いて６０００回転２０分間遠心した上清に２０ｇのポリエチレングリコール６０００を加えて十分に溶解した後に氷中で１時間静置した。
　【００２６】
　これを日立冷却遠心機ＳＣＲ　２０ＢＢで、ローターＲＰＲ　９−２において６０００回転２０分間遠心し沈澱を６ｍｌのＡ緩衝液［０．５％　ＮＰ　４０、３６ｍＭ塩化カルシウム、３０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５　５０ｍＭ塩化マグネシウム、１２５ｍＭ塩化カリウム、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２５％デオキシコール酸、０．６ｍＭメルカプトエタノール］に懸濁しここに１００μｌの１０ｍｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼＩと１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡを加え３０℃で３０分間保温することにより大腸菌由来の核酸を分解した。その後上記反応液に等量のクロロフォルムを加え良く攪はんしたのちにトミー遠心機ＬＣ−０６、ローターＴＳ−７で３０００回転１０分間遠心し上清を得た。一方予め日立超遠心機ローターＲＰＳ　４０Ｔ用遠心管に４０％グリセロール溶液［０．５％　ＮＰ　４０、３０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５、１２５ｍＭ塩化カリウム、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．６ｍＭ　メルカプトエタノール、１０％グリセロール］を１ｍｌ入れておきその上に３ｍｌの１０％グリセロール溶液［０．５％　ＮＰ　４０、３０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５、１２５ｍＭ塩化カリウム、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．６ｍＭ　メルカプトエタノール、４０％グリセロール］を重層して準備しておいた上に先ほどのヌクレアーゼ処理をしたファージ懸濁液を重層し、日立超遠心機７０　Ｐ　７２、ローターＲＰＳ　４０Ｔで３５０００回転１時間遠心した。
　【００２７】
　遠心後沈澱として落ちてきたファージ粒子を０．４ｍｌの４０ｍＭトリス−塩酸　ｐＨ７．５、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、２％　ＳＤＳに懸濁し４μＬの１０ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼＫを加えて５５℃１時間保温を行った。その後溶液をエッペンドルフチューブに移し等量のフェノール／クロロフォルムにてファージＤＮＡを抽出しエタノール沈澱を行うことにより目的とするファージＤＮＡを２００μｇ得ることが出来た。このファージＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで常法に従い切断しアガロース電気泳動法にて解析した。その結果クローンλ　ｈＨＧＦ　２１から０．２ｋｂと０．８５ｋｂと０．７２ｋｂの３本のＥｃｏＲＩ断片を得た。一方アガロースゲルから該インサートｃＤＮＡ断片を常法に従い回収することにより目的とするｃＤＮＡ断片を得ることが出来た。これらｃＤＮＡ断片１００ｎｇを予め常法に従い制限酵素ＥｃｏＲＩによって切断しておいたプラスミドベクターｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９及び一本鎖ファージベクター　Ｍ３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９　２００ｎｇと１０μｌの反応液［６６ｍＭ　トリス−塩酸　ｐＨ７．６、６．６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール、６６μＭ　ＡＴＰ、基質ＤＮＡ］中でユニットのＴ４　ＤＮＡリガーゼにより結合しそれぞれのベクターに見合った宿主の大腸菌を常法に従い形質転換することによりＥｃｏＲＩ挿入部位にＨＧＦ蛋白質の部分配列を持つサブクローンを得た。
　【００２８】
　得られたｃＤＮＡサブクローンの塩基配列の決定は、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ法によって行った。プライマーは市販のＭ１３ファージベクターに対応するものを使用した。その結果、最も長いｃＤＮＡを持つクローンλ　ｈＨＧＦ　２１の塩基配列をアミノ酸に翻訳すると図１及び２に示すようにすでに明らかにされているアミノ酸配列のうちプローブの設計に使用したアミノ酸配列とは異なる領域のアミノ酸配列のうちのいくつかを含んでいることが判明し、このクローンがｈＨＧＦの少なくとも一部分の領域を含むｃＤＮＡであることが判明した。また、λ　ｈＨＧＦ　２１にはないｃＤＮＡ断片を含むクローンλ　ｈＨＧＦ　５０２のｃＤＮＡの塩基配列をＳａｎｇｅｒ法に従い解析した結果、クローンλ　ｈＨＧＦ　５０２はクローンλ　ｈＨＧＦ　２１と同じ塩基配列を図３ないし５で示す制限酵素切断部位ＮｃｏＩの近傍から５’上流から数えて三番目のＥｃｏＲＩ切断部位の近傍までの０．８ｋｂの長さで共有し３’側にλ　ｈＨＧＦ　２１にはない０．７ｋｂの塩基配列をもつことがわかった。λ　ｈＨＧＦ　５０２の塩基配列のうちλ　ｈＨＧＦ２１の有しない塩基配列のなかには既に解析されているアミノ酸配列に相当する塩基配列があることが判明した。これら２つのクローンの塩基配列を一部が重複する形でつなぎあわせるとｈＨＧＦのアミノ酸配列の全てをカバーすることが判明した。
【図面の簡単な説明】
　【図１】　本発明のｈＨＧＦの全アミノ酸配列のうち第１番目のアミノ酸（Ｍｅｔ）から第３６０番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）までの配列を表す図である。図中下線はすでに明らかにされていたアミノ酸配列を示す。
　【図２】　本発明のｈＨＧＦの全アミノ酸配列のうち第３６１番目のアミノ酸（Ｇｌｕ）から第７２８番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）までの配列を表す図である。図中の下線は図１と同じである。
　【図３】　実施例１で得られた本発明のｈＨＧＦをコードする遺伝子を含むｃＤＮＡの全塩基配列のうち、第１番目の塩基から第７８０番目の塩基までの配列を示す図である。図中に主な制限酵素の認識部位を併記した。また下線はすでに明かにされていたアミノ酸配列に対応する部分を示す。
　【図４】　実施例１で得られた本発明のｈＨＧＦをコードする遺伝子を含むｃＤＮＡの全塩基配列のうち、第７８１番目の塩基から第１６２０番目の塩基までの配列を示す図である。図中に主な制限酵素の認識部位を併記した。図中の下線は図３と同じであり、二重下線は最初のクローンを得る際に使用したプローブに対応する塩基配列を表す。
　【図５】　実施例１で得られた本発明のｈＨＧＦをコードする遺伝子を含むｃＤＮＡの全塩基配列のうち、第１６２１番目の塩基から第２１８７番目の塩基までの配列を示す図である。図中に主な制限酵素の認識部位を併記した。また下線は図３と同じである。