【事件の表示】
　特許第２８８１４９９号「安定化抗体」の請求項１ないし１９に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２８８１４９９号の請求項１ないし１９に係る特許を維持する。
【理　由】
I．手続の経緯
　本件特許第２８８１４９９号の請求項１〜１９に係る発明についての出願は、平成４年１０月２７日（優先権主張　１９９１年１０月２８日　イギリス国）に特許出願され、平成１１年２月５日にその発明について特許権の設定登録がなされ、その後、特許異議の申立がなされ、取消の理由が通知され、その指定期間内である平成１２年１１月１０日付けで訂正請求（その後取り下げ）がなされ、再度取消の理由が通知され、その指定期間内である平成１３年１１月２１日付けで訂正請求がなされたものである。
II．訂正請求について
　１．訂正の内容
　訂正事項ａ：請求項１に記載の「安定化された免疫グロブリン医薬組成物」を
「安定化された免疫グロブリン医薬組成物」と訂正し、また、
「ＩｇＧ１免疫グロブリン」を
「ヒト定常ドメインを有するモノクローナルＩｇＧ１免疫グロブリン」と訂正する。
　訂正事項ｂ：請求項７に記載の「ＣＤ５、」および「ＣＤ１１ｂ」を削除する。
　訂正事項ｃ：請求項１０に記載の「０．ｌｍＭ〜３ｍＭである組成物。」を
「０．ｌｍＭ〜３ｍＭである組成物。」と訂正する。
　訂正事項ｄ：請求項１２に記載の「前記クエン酸イオンがクエン酸のアルカリ金属」を
「前記キレート化剤がクエン酸ナトリウム」と訂正する。
　訂正事項ｅ：請求項１６に記載の「免疫グロブリン」を
「ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナル免疫グロブリン」と訂正する。
　訂正事項ｆ：請求項１９に記載の「実質的に銅イオンを含まない精製された免疫グロブリン。」を
「精製されたヒト定常ドメイン部分を有するモノクロナールＩｇＧ１免疫グロブリンと、銅キレート化剤とを含有する組成物であって、銅キレート化剤の使用によって、銅イオンが実質的に含まれていないことを特徴とする、ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナルＩｇＧ１免疫グロブリン組成物。」と訂正する。
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無、及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否
　上記訂正事項ａは、請求項１における「免疫グロブリン組成物」を「免疫グロブリン医薬組成物」に訂正し、また「ＩｇＧ１免疫グロブリン」を「ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナルＩｇＧ１免疫グロブリン」と訂正するものであり、これらの訂正は、明細書第８頁第１６行〜第１０行に記載されており、より下位の概念に訂正するものであって、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当するものである。
　訂正事項ｂは、訂正前の請求項７におけるＣＤ５およびＣＤ１１ｂを削除するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当する。
　訂正事項ｃは、「０．０３ｍＭ〜５ｍＭ」を「０．１ｍＭ〜３ｍＭ」と訂正するものであり、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当し、明細書第８頁８行の記載に基づくものである。
　訂正事項ｄは、「前記クエン酸イオンがクエン酸のアルカリ金属塩である」を「前記キレート化剤がクエン酸ナトリウムである」と訂正するものであり、明細書第８頁１５行の記載に基づくもので、明りょうでない記載の釈明を目的とする訂正に該当する。
　訂正事項ｅは、免疫グロブリンについて、さらに下位の概念に限定するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当する。
　訂正事項ｆは、免疫グロブリンを、より下位の概念に訂正するとともに、実質的に銅イオンを含まない精製された免疫グロブリンとの記載をより明りょうにするための訂正であって、明細書５頁１９行〜６頁５行の記載に基づくもので、特許請求の範囲の減縮および明りょうでない記載の釈明を目的とする訂正に該当する。
　そしてこれらの訂正事項ａ〜ｆは、いずれも、明細書に記載した事項の範囲内の訂正であり、新規事項の追加に該当せず、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
３．独立の特許要件について
　後記IV．特許異議の申立について、の判断で示した理由により、請求項１〜１９に係る発明が、刊行物に記載された発明ではなく、また、刊行物に記載された発明から容易に発明をすることができたものでない以上、訂正後の請求項１〜１９に係る発明は、特許出願の際独立して特許を受けることができる。
４．むすび
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法等の一部を改正する法律（平成６年法律第１１６号）附則第６条第１項の規定によりなお従前の例によるとされる、特許法第１２０条の４第３項において準用する平成６年法律第１１６号による改正前の特許法第１２６条第１項ただし書き、第２項〜第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
III．本件発明
　訂正後の請求項１〜１９に係る発明は、訂正明細書の請求項１〜１９に記載された、次のとおりのものである。
「【請求項１】安定化された免疫グロブリン医薬組成物であって、溶液中に存在する銅イオンを結合して、免疫グロブリンを銅イオンによる分解から保護するのに十分な安定化量の銅イオンキレート化剤と共に、ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナルＩｇＧ１免疫グロブリンを含有する組成物。
【請求項２】請求項１に記載の組成物であって、前記免疫グロブリンが組み替え免疫グロブリンである組成物。
【請求項３】請求項２に記載の組成物であって、前記免疫グロブリンがキメラ免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリンである組成物。
【請求項４】請求項２または３に記載の組成物であって、前記免疫グロブリンがＣＨＯ細胞から産生される組成物。
【請求項５】請求項２または３に記載の組成物であって、前記免疫グロブリンがミエローマ細胞から産生される組成物。
【請求項６】請求項１〜５の何れか１項に記載の組成物であって、前記免疫グロブリンが腫蕩細胞マーカー抗原に対するものである組成物。
【請求項７】請求項２〜５の何れか１項に記載の組成物であって、前記免疫グロブリンがＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ５２、ＣＤ３３、またはＣＤ５４抗原に対するものである組成物。
【請求項８】請求項１〜７の何れか１項に記載の組成物であって、前記キレート化剤がエチレンジアミン四酢酸である組成物。
【請求項９】請求項８に記載の組成物であって、エチレンジアミン四酢酸の量が、０．０５ｍＭ〜５ｍＭである組成物。
【請求項１０】請求項９に記載の組成物であって、エチレンジアミン四酢酸の量が、０．１ｍＭ〜３ｍＭである組成物。
【請求項１１】請求項１〜７の何れか１項に記載の組成物であって、前記キレート化剤がクエン酸イオンである組成物。
【請求項１２】請求項１１に記載の組成物であって、前記キレート化剤がクエン酸ナトリウムである組成物。
【請求項１３】請求項１〜１２の何れか１項に記載の組成物であって、ＰＨが ６〜７．２である組成物。
【請求項１４】請求項１〜１３の何れか１項に記載の組成物であって、非経腸的投与に適した液剤の形態である組成物。
【請求項１５】請求項１〜１３の何れか１項に記載の組成物であって、非経腸的投与に適した液剤に再構成するのに適した凍結乾燥形態である組成物。
【請求項１６】銅イオンのキレート化剤を使用することにより、ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナル免疫グロブリンを、その保存中の分解に対して安定化する方法。
【請求項１７】請求項１６に記載の方法であって、前記キレート化剤がエチレンジアミン四酢酸である方法。
【請求項１８】請求項１６に記載の方法であって、前記キレート化剤がクエン酸イオン　である方法。
【請求項１９】精製されたヒト定常ドメイン部分を有するモノクロナールＩｇＧ１免疫グロブリンと、銅キレート化剤とを含有する組成物であって、銅キレート化剤の使用によって銅イオンが実質的に含まれていないことを特徴とする、ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナルＩｇＧ１免疫グロブリン組成物。」
IV．特許異議申立について
１．特許異議申立の概要
　特許異議申立人　水谷修子は、甲第１〜５号証を提出して、訂正前の請求項１〜７、１１、１２、１９に係る各発明は、前記甲第１号証に記載された発明であるか、または前記甲第１号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、訂正前の請求項１〜７、１１、１２、１９に係る各発明の特許は、特許法第２９条第１項の規定または同法第２９条第２項の規定に違反してされたものであり、取り消されるべき旨、また、訂正前の請求項８〜１０に係る各発明は、前記甲第１〜２号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、訂正前の請求項８〜１０に係る各発明の特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものであり、取り消されるべき旨、訂正前の請求項１３〜１５に係る各発明は、前記甲第１号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、訂正前の請求項１３〜１５に係る各発明の特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものであり、取り消されるべき旨、訂正前の請求項１６〜１７に係る各発明は、前記甲第１〜３号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、訂正前の請求項１６〜１７に係る各発明の特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものであり、取り消されるべき旨、訂正前の請求項１８に係る発明は、前記甲第１号証に記載された発明であるか、または前記甲第１〜３号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、訂正前の請求項１８に係る発明の特許は、特許法第２９条第１項の規定または同法第２９条第２項の規定に違反してされたものであり、取り消されるべき旨、さらに、訂正前の請求項１〜１９に係る発明の特許は、明細書の記載が特許法第３６条の規定を満たしていない特許出願に対してされたものであるから取り消されるべき旨、それぞれ主張している。
２．異議申立についての判断
（１）特許法第２９条第１項又は第２９条第２項違反について
（i）甲号証の記載事項
　甲第１号証（特開昭６０−１４６８３２号）には、以下の記載がされている。
「（１）ヒトＩｇＧの二量体および／または重合体を夾雑するヒトＩｇＧの０．２〜２０ｗ／ｖ％溶液をｐＨ３．７〜４．３で３０分〜２０時間処理してヒトＩｇＧ二量体および重合体を単量体へ解離させて得られた静脈投与可能なＩｇＧ。
（２）無機塩、糖類、蛋白質及び有機酸塩から選ばれる少なくとも一種の安定化剤０．５〜２０ｗ／ｖ％濃度の存在下に解離されたことを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の静脈投与可能なＩｇＧ。
（３）・・・有機酸塩がクエン酸塩であることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の方法。」（特許請求の範囲）
「ヒト由来ＩｇＧを、特定条件下で酸処理することによってＩｇＧの二量体および／または重合体（以下、これらをＩｇＧ凝集型と総称することもある）を除去して得られる静脈投与可能なＩｇＧに関する。」（１頁右下欄３行〜７行）
「ＩｇＧ凝集型を除去する方法として、酸処理法に関する先行技術としては以下のものがある。ミエローマＩｇＧの凝集型が、ｐＨ４処理で解離することは・・・観察されているが、ミエローマＩｇＧであるためか、又はｐＨ調整時の界面変性によるものか、中性に戻すと再重合することが報告されている。」（１頁右下欄１５行〜２頁左上欄１行）
「原料となるヒトＩｇＧは、ＩｇＧ凝集型を含むものが選ばれる。高度精製されたものであれば本発明処理後ただちに医薬品として調製できるし、・・・酸処理は原料をｐＨ３．７〜４．３に保ち行う。ここでｐＨ調製に用いられる酸としては、上記ｐＨに調整可能なもので、かつＩｇＧに悪影響を及ぼさないものであればよく、例えば塩酸などの無機酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸（注；昭和５９年３月８日付け補正書により、クエン酸およびシュウ酸が追加された。）などの有機酸があげられる。・・・この酸処理に際し、ＩｇＧの変性を防ぐためには無機塩、糖類、蛋白質および有機酸塩から選ばれる化合物の単独、又は複数を添加することが好ましい。無機塩としては・・・、糖類としては・・・、蛋白質としては・・・、有機酸塩としてはシュウ酸塩、クエン酸塩（特にこれら有機酸のナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩）等が好適に例示される。その添加量は総量として５〜２０ｗ／ｖ％である。当該安定剤は、本発明ＩｇＧ製造後もそのまま存在させておくことがＩｇＧの保存安定性の観点から、好ましい。」（２頁左下欄２行〜右下欄１６行）
　そして、甲第１号証に記載された実施例２において、ＩｇＧ凝集型を含む水溶液（７Ｓが３８％，二量体が６１％、重合体が１％）に各種安定剤を添加してＩｇＧの麻疹抗体価を測定し、安定剤の効果を見たことが示され、安定化剤としてクエン酸ナトリウム１５ｗ／ｖ％含むものについて麻疹抗体価が１０であることが示されている。
　甲第２号証（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．３（１９８９），ｐ．１１９−１２５）には、クエン酸塩及びエチレンジアミン四酢酸は代表的なキレート化剤であることが記載されている。
　甲第３号証（坂口武、上野景平著「金属キレート［III］」（昭和４２年）株式会社南江堂、（ｐ．１，８，９，１２〜１５，３６，３７，４４，４５，５６，５７，６０〜６３）には、クエン酸塩と銅イオンが結合して錯体を形成することが記載されている。更に、銅イオンは多くのキレート化剤と錯体を形成するものであることが記載されている。
　甲第４号証（特表平７−５０２４９７号）は、本件特許に係る出願の公表公報である。
　甲第５号証（ＴＨＥ ＬＡＮＣＥＴ，Ｖｏｌ．３４０（１９９２），ｐ．７４８‐７５２）には、ＣＡＭＰＡＴＨ １ＨはＩｇＧ１抗体であるであることが示されている。
（ii）判断
（ａ）訂正後の請求項１に係る発明（以下、本件発明という。）と甲第１〜５号証に記載の事項とを対比検討する。
　本件発明は、特に保存時および使用に先立つ処理の際の分解に対する免疫グロブリンの安定化を目的になされたもので、請求項１に記載された「安定化された免疫グロブリン医薬組成物であって、溶液中に存在する銅イオンを結合して、免疫グロブリンを銅イオンによる分解から保護するのに十分な安定化量の銅イオンキレート化剤と共に、ヒト定常ドメインを有するモノクローナルＩｇＧ１免疫グロブリンを含有する組成物」を構成とするものである。
　一方、甲第１号証に記載された発明は、ヒト由来ＩｇＧを、特定条件下で酸処理することによってＩｇＧの二量体および／または重合体を除去して得られる静脈投与可能なＩｇＧに関するものであるが、ヒト由来ＩｇＧに関しては、これが如何なるものであるのか何ら記載がない。
　また、甲第１号証には、先行技術として、ミエローマＩｇＧの凝集型が、ｐＨ４処理で解離することが観察されるが、これがミエローマＩｇＧであるためか、又はｐＨ調整時の界面変性によるものか、中性に戻すと再重合することが報告されている、と記載している。
　しかしながら、先行技術として示されているミエローマＩｇＧの凝集型が如何なるものであるかは、甲第１号証には何ら示されていない。
　そうすると、甲第１号証に記載のヒトＩｇＧが、本件発明の「ヒト定常ドメインを有するモノクローナルＩｇＧ１」であると言うことはできない。
　また、甲第１号証に記載された技術は、特定条件下で酸処理することによってＩｇＧの二量体および／または重合体を除去して得られる静脈投与可能なＩｇＧに関するものであるが、該酸処理に使用される酸としてクエン酸が示され、さらに、この酸処理に際しＩｇＧの変性を防ぐためにクエン酸ナトリウムが添加されることも記載されている。
　さらに、甲第１号証には、安定剤をＩｇＧ製造後もそのまま存在させておくことが保存安定性から好ましいことも記載され、実験例２において、ＩｇＧ型を含む水溶液に安定剤としてクエン酸Ｎａが添加されたものが例示されている。しかしながら、クエン酸塩の添加は、無機塩、糖類、蛋白質等と同等の作用効果を期待して、酸処理の際のＩｇＧの変性を防ぐために添加されるものである。
　してみると、甲第１号証に記載のヒト由来ＩｇＧは、本件発明の「ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナルＩｇＧ１」とは相違し、さらに、クエン酸塩の添加についても、甲第１号証に記載のものは、酸処理に際しＩｇＧの変性を防ぐために添加されるのに対し、本件発明の銅イオンキレート化剤は、銅イオンの作用の結果による分解に対する安定剤として添加されるものであるから、両者は、その目的が異なるものといえ、しかも、甲第１号証には、銅イオンを除去する必要性についても示されていないから、本件発明が甲第１号証に記載された発明であるとも、甲第１号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたとも言えない。
　甲第２号証には、クエン酸塩及びエチレンジアミン四酢酸は代表的なキレート化剤であることが示されているだけであり、免疫グロブリンの安定化については何ら示されていない。
　甲第３号証には、クエン酸塩と銅イオンが結合して錯体を形成することが記載され、銅イオンは多くのキレート化剤と錯体を形成するものであることが記載されているが、免疫グロブリンの保存時の安定化について、銅イオンのキレート化剤を使用できる記載又は示唆はされていない。
　甲第４号証は、本件特許に係る出願の公表公報であり、本件出願前に公知となった文献ではない。
　甲第５号証には、ＣＡＭＰＡＴＨ １ＨはＩｇＧ１抗体であるであることが示されているとしても、甲第１号証に示されたヒト由来ＩｇＧが、本件発明の「ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナルＩｇＧ１」と同一であることを示すものではないし、銅イオンを除去する必要性についても何ら記載がされていない。
　したがって、甲第１号証の技術に、甲第２〜３，５号証に記載の技術を適用しても、本件発明の構成が予測できるとは言えないから、本件発明は、前記甲第１〜３、５号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものではない。
（ｂ）訂正後の請求項２〜１５に係る発明について
　訂正後の請求項２〜１５に係る発明は、訂正後の請求項１を引用する発明であるか、又は訂正後の請求項１を引用する請求項をさらに引用する発明であるから、訂正後の請求項１に係る発明と同様の理由で、前記甲第１号証に記載された発明ということはできないし、前記甲第１〜５号証に記載された発明から容易に発明をすることができたとはいえない。
（ｃ）訂正後の請求項１６に係る発明について
　訂正後の請求項１６に係る発明は、銅イオンのキレート化剤を使用することにより、ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナル免疫グロブリンを、その保存中の分解に対して安定化する方法であるが、甲第１号証には、前記（ａ）で示したとおり、ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナル免疫グロブリンについては何ら記載がない。
　さらに、銅イオンのキレート化剤を使用することにより、ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナル免疫グロブリンを、その保存中の分解に対して安定化することについても記載がされていない。
　そして、甲第１号証に、「当該安定剤は、本発明ＩｇＧ製造後もそのまま存在させておくことがＩｇＧの保存安定性の観点から、好ましい。」と記載されているとしても、これは（ａ）で示したとおり、酸処理に際し、ＩｇＧの変性を防ぐために添加されるものであり、しかも、添加されるものが、無機塩、糖類、蛋白質および有機酸塩から選ばれる化合物の単独、又は複数とされており、これらが銅イオンのキレート化剤と捉えられるべきものではないから、クエン酸塩を添加することが示されているとしても、これがただちに銅イオンを除去する必要性を示しているとは言えない。
　また、甲第２〜３，５号証には、前記（ａ）で示したとおり、ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナル免疫グロブリンについては何ら記載がないし、銅イオンの除去が必要であることも示されていない。
　したがって、訂正後の請求項１６に係る発明は、甲第１号証に記載された発明ということはできないし、甲第１〜３、５号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
（ｃ）訂正後の請求項１７〜１８に係る発明について
　訂正後の請求項１７〜１８に係る発明は、請求項１６を引用するものであるから、請求項１６で示した理由と同様に、訂正後の請求項１７〜１８に係る発明は、甲第１号証に記載された発明ということはできないし、甲第１〜３、５号証に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
（ｄ）訂正後の請求項１９に係る発明について
　訂正後の請求項１９に係る発明は、精製されたヒト定常ドメイン部分を有するモノクロナールＩｇＧ１免疫グロブリンと、銅キレート化剤とを含有する組成物であって、銅キレート化剤の使用によって銅イオンが実質的に含まれていないことを特徴とする、ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナルＩｇＧ１免疫グロブリン組成物である。
　一方，甲第１号証には、前記（ａ）で示したとおり、ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナル免疫グロブリンについては何ら記載がない。さらに、甲第１号証に記載のクエン酸塩は、銅イオンキレート化剤として使用することの具体的記載についてはされていないのであり、銅イオンの除去についても記載がされていない。
　そうであれば、甲第１号証にクエン酸ナトリウムを含有するＩｇＧ組成物が記載されているとしても、甲第１号証のＩｇＧが、請求項１９に記載の「精製されたヒト定常ドメイン部分を有するモノクロナールＩｇＧ１免疫グロブリン」と言えるものでない以上、請求項１９に係る発明が、甲第１号証に記載された発明であると言うことはできない。
　また、甲第２〜３，５号証には、前記（ａ）で示したとおり、ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナル免疫グロブリンについては何ら記載がないし、銅イオンの除去が必要であることも示されていない。
　したがって、訂正後の請求項１９に係る発明は、甲第１号証に記載された発明ということはできないし、甲第１〜３、５号証に記載の発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
（２）特許法第３６条第４項違反について
　明細書の記載不備について、特許異議申立人の主張は、本件明細書の記載によって、キレート化剤があらゆる抗体に対する安定化作用を有することが支持されているとは到底いえず、あらゆるＩｇＧ１抗体を対象とする請求項１〜１９に記載の発明はいずれも当業者が明細書の記載に基づいて容易に実施しうるものではない、というものである。
　明細書（以下、特許公報に基づいて説明する）には、例１に、「組換え抗体の安定性に及ぼす種々の添加物の効果を３７℃で研究した。抗体は、ＣＤｗ５２抗原に対するヒト化抗体であるＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈ（・・・）であり、これは抗体分子の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡで形質転換された組換えＣＨＯ細胞系における発現により生産されたものである。・・・この期間の最後に試料をサイズ排除ＨＰＬＣで分析し、試料の安定性を、全溶出蛋白質に基づく「ピークＣ」（約５０Ｋの分子量を有する抗体の主要分解生成物によって形成されるピーク）の形成の程度により評価した。銅はＣｕＣｌ・２Ｈ２Ｏとして、１，１０−フェナントロリンは２％（ｖ／ｖ）エタノールを含有する水溶液として添加した。これらの結果は、銅が、対照と比較して、抗体の分解を増強することを示している。ＥＤＴＡの添加は、他の金属イオンキレート剤である１，１０−フェナントロリンが分解を相当程度減少させるのに対して、実質的に分解を排除する。」（８欄１９行〜９欄８行）と記載され、また例２が示され、それらの結果が表１および表２に示されている。そして、これらの表から見ると、ＣＤｗ５２抗原に対するヒト化抗体であるＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈについては、十分本件発明の効果が奏されていると言える。さらに、例７においては、「種々の抗体の分解に及ぼすＣｕ＋２およびＥＤＴＡの効果を下記表９に示す。」（１７欄〜１８欄）と記載されており、他の抗体についても本件発明の効果が奏されることが理解できる。
　そうすると、本件明細書には、本件発明について、当業者が容易に実施できる程度に、その目的、効果について記載されているものといえる。
　したがって、本件明細書の記載に、特許異議申立人が指摘する不備はない。
（３）特許法第３６条第５項違反について
　特許異議申立人の主張は、請求項１２について「クエン酸イオンがクエン酸のアルカリ金属塩である」という記載は技術的に誤っており意味が不明であるので、請求項１２は発明の構成に欠くことのできない事項が記載されていないので、請求項１２は特許法第３６条第５項の規定を満たしていない、というものであり、また、請求項１９について「実質的に銅イオンを含まない精製された免疫グロプリン」なる記載は公知の全ての精製された免疫グロプリンを文言上包含するものであり意味が不明であるので、請求項１９は発明の構成に欠くことのできない事項が記載されていないので、請求項１９は特許法第３６条第５項の規定を満たしていない、というものである。
　しかしながら、訂正後の請求項１２および訂正後の請求項１９は、前記訂正事項で示したとおり訂正された結果、前記各請求項には、発明の構成に欠くことのできない事項が記載されていないということはできない。
５．むすび
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件訂正後の請求項１〜１９に係る各発明についての特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件訂正後の請求項１〜１９に係る各発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年１２月１９日（２００１．１２．１９）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
　特許第２８８１４９９号の明細書の記載を、次のとおり訂正する。
　訂正事項ａ：請求項１を下記の通りに訂正する。
「１．安定化された免疫グロブリン医薬組成物であって、溶液中に存在する銅イオンを結合して、免疫グロブリンを銅イオンによる分解から保護するのに十分な安定化量の銅イオンキレート化剤と共に、ヒト定常ドメインを有するモノクローナルＩｇＧ１免疫グロブリンを含有する組成物。」
　訂正事項ｂ：請求項７を下記の通りに訂正する。
「７．請求項２〜５の何れか１項に記載の組成物であって、前記免疫グロブリンがＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ５２、ＣＤ３３、またはＣＤ５４抗原に対するものである組成物。」
　訂正事項ｃ：請求項１０を下記の通りに訂正する。
「１０．請求項９に記載の組成物であって、エチレンジアミン四酢酸の量が、０．１ｍＭ〜３ｍＭである組成物。」
　訂正事項ｄ：請求項１２を下記の通りに訂正する。
「１２．請求項１１に記載の組成物であって、前記キレート化剤がクエン酸ナトリウムである組成物。」
　訂正事項ｅ：請求項１６を下記の通りに訂正する。
　「１６．銅イオンのキレート化剤を使用することにより、ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナル免疫グロブリンを、その保存中の分解に対して安定化する方法。」
　訂正事項ｆ：請求項１９を下記の通りに訂正する。
　「１９．精製されたヒト定常ドメイン部分を有するモノクロナールＩｇＧ１免疫グロブリンと、銅キレート化剤とを含有する組成物であって、銅キレート化剤の使用によって、銅イオンが実質的に含まれていないことを特徴とする、ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナルＩｇＧ１免疫グロブリン組成物。」
（５４）【発明の名称】
安定化抗体
【発明の詳細な説明】
　この発明は、分解、特に保存時および使用に先立つ処理の際の分解に対する免疫グロブリンの安定化に関する。
　抗体もしくは免疫グロブリンは、二官能性タンパク分子である。異なる抗体の間で高度に変化し得る一方の部位は、第二の定常部位が細胞のＦＣ受容体への結合の要因であり、また補体を活性化するのに対し、抗原、例えば生体が遭遇し得る多くの異なる感染因子に結合する要因である。このように、抗体は、外来微生物およびウイルスの破壊における哺乳動物の免疫応答の生体成分を代表する。
　抗原を用いて動物を免疫することで、異なる特異性および親和性を有する異なる抗原の産生が生じる。したがって、免疫動物から得られる抗血清は異種抗血清であり、多くの異なるリンパ球クローンによって産生される抗体プールを含む。このようにして得られる抗体はポリクローナル抗体と呼ばれ、このポリクローナル性は、診断アッセイおよび治療用途での抗体の使用における主な欠点であった。
　１９７５年、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（
Ｎａｔｕｒｅ
２５６
　ハイブリドーマ科学の利点は深遠である。各脾臓から生起する多くの雑種を目的の抗原に対する抗体の産生能力についてスクリーニングし、わずか数種を選別するため、純粋ではない抗体を用いて免疫し、さらには特異抗体を得ることさえもが可能である。この細胞株の不死性は、よく特徴付けられた同種抗体を、特に病理学的疾患の診断および免疫療法を含む種々の用途に無限に供給して使用することを可能にする。不幸にして、臨床環境におけるそのような抗体の有用性は、ヒト抗マウス抗体の発現（抗グロブリン反応）によって極度の妨げられることがあり、これが治療を妨害したり、あるいはアレルギーや免疫複合体過敏症を引き起こしたりすることがある。
　抗体分子は、鎖間のジスルフィド結合によって互いに保持される２本の軽鎖と２本の重鎖とからなる。各々の軽鎖はジスルフィド結合によって重鎖に連結し、２本の重鎖はジスルフィド結合によって互いに連結している。各重鎖はその一端に可変ドメインとそれに続く幾つかの定常ドメインを有し、各軽鎖はその一端に可変ドメインを、他端に定常ドメインを有する。軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並列している。軽鎖定常ドメインは、重鎖の第１定常ドメインと並列している。重鎖の残りの定常ドメインは、互いに並列している。軽鎖および重鎖の定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合には直接関与しない。
　軽鎖および重鎖の対の各々の可変ドメインは、抗原結合部位を形成する。これらは、各ドメインがフレームワーク領域を含む同様の一般構造を有する。このフレームワーク領域は、その配列が比較的保全され、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結される４つの領域からなる。４つのフレームワーク領域はβ−シート・コンホメーションを大幅に取り入れ、ＣＤＲはβ−シート構造を結合し、時にはその一部を包含するループを形成する。ＣＤＲは、フレームワーク領域によって非常に接近した状態に保持され、他のドメインからのＣＤＲと共に抗原結合部位の形成に寄与する。
　ネズミモノクローナル抗体の使用において、ヒト抗マウス抗体反応の誘発は、ネズミ起源の定常ドメインおよび４つのフレームワーク領域によるものである。したがって、この問題は、２種類の基本型の変性抗体の開発によって処理されている。第１の型はキメラ抗体と呼ばれ、ネズミ定常ドメインのみがヒト起源の同等ドメインによって置換されたものである（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ
　ｅｔ　ａｌ
Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．
８１
　ｅｔ　ａｌ
Ｎａｔｕｒｅ
３１４
　ｅｔ　ａｌ
Ｎａｔｕｒｅ
３１４
ｅｔ　ａｌ
Ｎａｔｕｒｅ
３２１
　ｅｔ　ａｌ
Ｎａｔｕｒｅ
３２２
　完全な臨床研究に十分な量の抗体を産生させるためには、効率のよい組換え発現系を利用することが望ましい。ミエローマ細胞は、抗体産生および分泌に特殊化した天然ホストを代表するものであるので、これらから誘導された細胞系が組換え抗体の発現に用いられている。時には、免疫グロブリン調節要素周辺に基づく複合ベクターの設計が必要となり、大きく変化し得る最終発現レベルが報告されている（Ｗｉｎｔｅｒ
　ｅｔ　ａｌ
Ｎａｔｕｒｅ
３３２
ｅｔ　ａｌ
Ｇｅｎｅ
６０
ｅｔ　ａｌ
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
７
ｅｔ　ａｌ
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
７
　抗体について提案されている他の型の発現系には不死化ヒトＢ細胞が含まれる（Ｒｉｃｅ
　ｅｔ　ａｌ
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７９
Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０
　ｅｔ　ａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４２
　治療もしくは診断のいずれかの用途に用いられる精製抗体の産生においては、抗体が、保存時並びに抗体の安定に悪影響を及ぼし得る種々の化学物質に対して十分に安定であることが重要である。この発明は、痕跡量の銅（Ｃｕ＋＋）が保存時の免疫グロブリン分子に対する脱安定化作用を有し、この作用が免疫グロブリン分子を適切な銅イオンキレート剤と一緒に処方することにより除去し得るという驚くべき発見に基づいている。
　驚くべきことに、免疫グロブリンが原子吸光分光分析のような通常の技術で検出し得る量の銅を含有しない場合であっても、銅イオンキレート剤の存在が免疫グロブリン分子に対する安定化作用を示すことがあることも見出されている。特定の理論で区切りをつけることを望むものではないが、原子吸光分光分析のような技術の検出限界を下回る量の銅イオンの存在が、適切なキレート剤を添加することにより除去することができる免疫グロブリンに対する脱安定化作用を依然として有している可能性がある。
　この発明は、少なくとも１種の免疫グロブリンを、安定化量の銅イオンのキレート剤と一緒に含有する安定化免疫グロブリン組成物を提供する。
　この発明はまた、免疫グロブリンの保存時の分解、例えば銅イオンの作用の結果としての分解に対する安定化への銅イオンのキレート剤の使用を提供する。
　痕跡量の銅イオンが免疫グロブリンに対する脱安定化作用を有するという事実は、安定性の見地から、免疫グロブリンが最少可能量の銅イオンを含有することを確証するという利点があり得ることをも意味する。さらなる側面によると、この発明は、実質的に銅イオンを含有しない精製免疫グロブリンを提供する。特に、この発明は、原子吸光分光分析のような通常の技術を使用しても銅を検出することができない免疫グロブリンを提供する。
　この発明はまた、免疫グロブリンの安定性を増強する方法であって、免疫グロブリンに、それらから銅イオンを除去することが可能な精製手順を施すことを包含する方法を提供する。特に、この手順は、原子吸光分光分析のような通常の手続きの使用によっては免疫グロブリン中に銅を検出することができないようなものであるべきである。銅は、タンパク精製の分野において公知の通常の手順、例えば、シアン化カリウム含有リン酸緩衝液に対する透析とこれに続くゲル濾過で銅をシアン化銅として除去する手順（例えば、Ｂａｋｅｒ　ａｎｄ　Ｈｕｌｔｑｕｉｓｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２５３
　この発明は、全てのクラスの免疫グロブリン、すなわちＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＤの安定化に適用することが可能であり、Ｆａｂおよび二重特異性抗体の安定化に拡張することも可能である。この発明は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むクラスＩｇＧの免疫グロブリンの安定化に適用することが好ましい。この発明は、クラスＩｇＧ１の免疫グロブリンの安定化に適用することがより好ましい。
　この発明は、特には組換え抗体の安定化、最も詳しくはキメラ抗体もしくはヒト化（ＣＤＲ−グラフト化）抗体の安定化にその用途を見出す。これらの詳細な例には、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ５４に対するキメラもしくはヒト化抗体および、特に、ＣＤｗ５２抗原に対するヒト化抗体、例えばＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（ＣＡＭＰＡＴＨはウェルカム企業グループの商標）が含まれる。さらなる例には、種々の腫瘍細胞マーカー抗原に対するキメラもしくはヒト化抗体が含まれる。
　一般に、免疫グロブリンは、早期段階、例えば精製中もしくは精製直後に、金属イオンキレート剤と処方される。免疫グロブリンの産生手順は、一般に、クロマトグラフィおよび／またはゲル濾過カラムによる精製を包含する。キレート剤は、精製手順の都合のよい段階、例えば、精製手順の終了時に免疫グロブリン中にキレート剤が残留するように、最終カラムの段階で添加することができる。その代わりに、キレート剤は、精製に続く適切な段階で添加することができる。凍結乾燥免疫グロブリンの場合には、キレート剤は、一般に、凍結乾燥の前に添加する。
　免疫グロブリンに添加するキレート剤のレベルは、存在するいかなる銅もキレート剤に結合し、それにより免疫グロブリンの脱安定化においてそれらが無効になることを保証するようなものである。用いられるキレート剤は、目的とする免疫グロブリンの最終用途に対する悪影響を持たないように選択されるべきではあるものの、この発明は目的とする免疫グロブリンの最終用途に関係なく適用することができる。例えば、治療用途を目的とする抗体の場合には、キレート剤はそれが存在するであろうレベルで毒性作用を示すべきではない。
　特に好ましい金属イオンキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であり、これは、典型的には、０．０５ｍＭないし５ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭないし３ｍＭのレベルで免疫グロブリンに添加することができる。ヒトへ投与を目的とする免疫グロブリンの場合に、ＥＤＴＡ０．１ｍＭのレベルは、しばしば免疫グロブリンの安定化に十分なものであるが、２ｍＭまで、もしくはそれ以上のレベルは生理学的になんら問題を示さない。代わりの金属イオンキレート剤は、好ましくはアルカリ金属クエン酸塩の形で用いられるクエン酸イオン、例えばクエン酸ナトリウムである。
　治療用途を目的とする免疫グロブリンは、一般に、医薬製剤の形態で患者に投与される。そのような製剤には、免疫グロブリンに加えて、生理学的に許容し得る担体または希釈剤が、おそらくは１種以上の他の薬剤、例えば他の免疫グロブリンもしくは抗生物質のような薬剤と混合して、好ましく含まれる。適切な担体には、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコースおよび緩衝生理食塩水が含まれるが、これに限定されるものではない。これに代えて、免疫グロブリンを凍結乾燥し、必要に応じて使用するために上述の緩衝水溶液を添加することによりもどすこともできる。投与経路は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内注射もしくは送達を含む所定の非経口投与である。キレート剤は、保存および配布または最終用途のいずれかを目的とするいかなるタイプの免疫グロブリン製剤にも組み入れることができる。医薬製剤は一般に、凍結乾燥製品の場合にはもどされて、単位投与量当り有効治療投与量の免疫グロブリンを含有する。ヒト化抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈの場合には、液体製剤またはもどされた凍結乾燥製剤は、好ましくは抗体０．５ないし２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２ｍｇ／ｍｌもしくは１０ｍｇ／ｍｌを含有する。
　この発明を以下の例によって説明する。
例　１
　組換え抗体の安定性に及ぼす種々の添加物の効果を３７℃で研究した。抗体は、ＣＤｗ５２抗原に対するヒト化抗体であるＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ　
ｅｔ　ａｌ
Ｎａｔｕｒｅ
３２２
　上記ＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈの溶液０．５ｍｌを特定の添加物と共に収容するバイアルを、無菌条件下において、＋３７℃で４週間インキュベートした。この期間の最後に試料をサイズ排除ＨＰＬＣで分析し、試料の安定性を、全溶出タンパク質に基づく「ピークＣ」（約５０Ｋの分子量を有する抗体の主要分解生成物によって形成されるピーク）の形成の程度により評価した。
　銅はＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏとして、１，１０−フェナントロリンは２％（ｖ／ｖ）エタノールを含有する水溶液として添加した。
　これらの結果は、銅が、対照と比較して、抗体の分解の程度を増強することを示している。ＥＤＴＡの添加は、他の金属イオンキレート剤である１，１０−フェナントロリンが分解を相当程度減少させるのに対して、実質的に分解を排除する。
例　２
　この例もまた、例１において言及されるタイプのＣＨＯ細胞で産生されるＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈ（リン酸緩衝生理食塩水中１１．３ｍｇ／ｍｌ）を用い、このバッチは１ｍｌ当り０．０４μｇのＣｕ２＋を含有するものと測定された。この例並びに以下の例において、抗体試料の銅含量はフィリップスＰＵ９４００Ｘ原子吸光分光光度計を用いる原子吸光分光分析により測定した。この方法の検出限界は約０．０３μｇＣｕ／ｍｌなので、「検出可能な銅を含有しない」と称する試料は１ｍｌ当り０．０３μｇ未満のＣｕを含有する。このＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈの試料をリン酸緩衝生理食塩水中に１ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、ｐＨ６．０、ｐＨ６．４およびｐＨ６．８の０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液に対して徹底的に透析した。ＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈは、事前に、ｐＨ約６で熱による分解に対して最も安定であることが測定されていた。各ｐＨにおいて、試料３００μｌに以下の物質：
　（ｉ）水中１０ｍＭのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　３０μｌ；
　（ｉｉ）水中１０ｍＭのＥＤＴＡ　３０μｌ；
　（ｉｉｉ）緩衝液３０μｌ；
を添加し、試料を６２℃で２４時間インキュベートした。アリコート５０μｌを例１と同様に分析した。すなわち、分解をサイズ排除クロマトグラフィーにより評価し、全溶出タンパク質に基づく「ピークＣ」の形成の程度として測定した。
　％ピークＣの結果を下記表２に示す。
　この結果は、ｐＨの増加に従い、ＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈの分解に及ぼす銅の作用が高まることを示している。銅を添加しない場合においても、ｐＨの増加に従って％ピークＣの増加が見られる。ＥＤＴＡの存在下では、ＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈの分解は抑制される。
例　３
　この例は、例１において言及されるタイプのＣＨＯ細胞で産生されるＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈの２種類の異なるバッチ（リン酸緩衝生理食塩水中１０ｍｇ／ｍｌ）を用いた：バッチ１は原子吸光分光分析の測定による検出可能なＣｕ２＋を含有せず、バッチ２は１ｍｌ当り０．０４μｇのＣｕ２＋を含有する。両バッチの試料をリン酸緩衝生理食塩水中に１ｍｇ／ｍｌに希釈して、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムに対して４℃で２４時間徹底的に透析し、さらにバッチ２に１ｍＭ　ＥＤＴＡを添加して銅の作用を除去した。両バッチのアリコート２００μｌを４、１０、２０、３０、４０、５０および６２℃で２４時間インキュベートし、分解を例１に記載されるようにサイズ排除クロマトグラフィーにより評価し、全溶出タンパク質に基づく「ピークＣ」の形成の程度として測定した。
　％ピークＣの結果を下記表３に示す
　バッチ１においては検出可能なＣｕ２＋は見出されなかったが、３０および４０℃でのインキュベーションについては幾らかの分解が明らかであり、５０および６２℃では広範な分解があった。検出可能なＣｕ２＋を含有するバッチ２の場合には、ＥＤＴＡの存在下で、昇温時であっても最小限度の分解が見られた。これらの結果は、検出可能以下のレベル（ｓｕｂｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ　ｌｅｖｅｌｓ）のＣｕ２＋がＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈの分解を促進する可能性を示唆している。
例　４
　例１の結果を、ＣＨＯ細胞において産生された同じＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈ抗体を用いて、６２℃で２４時間にわたる計時インキュベーションにより確認した。用いたバッチは、原子吸光分光分析により１ｍｌ当り０．０３μｇのＣｕ２＋を含有することが測定された。リン酸緩衝生理食塩水中に３．７ｍｇ／ｍｌのＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈを含有するこのバッチを、３×２リットルの５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムに対して＋４℃で２４時間透析した。アリコート１００μｌを下記添加物と共に６２℃でインキュベートした：
　（ｉ）０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ５μｌ（水中）＋０．１Ｍ　ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　１０μｌ（水中）；
　（ｉｉ）０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ５μｌ（水中）；
　（ｉｉｉ）なし。
　添加するＥＤＴＡの量は、抗体中のいかなる残留遷移金属イオンをもキレートするに十分ではあるが、試料（ｉ）において添加される銅をキレートするには十分ではないものであるべきである。
　試料５０μｌを、分析のため、０、１、２、３、４、５および２４時間で抜き取った。これらの試料を、サイズ排除ＨＰＬＣにより、抗体が分解している程度の指標として得られるピークＣの形成の程度を用いて、例１と同様に分析した。その結果を下記表４に示す。
例　５
　この例もまた、例１において言及されるタイプのＣＨＯ細胞で産生されるＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈ（リン酸緩衝生理食塩水中１０．０ｍｇ／ｍｌ）および原子吸光分光分析による測定で検出可能な銅を含有しないバッチを用いた。このＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈの試料を５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムに対して＋４℃で透析し、アリコート１００μｌを増加する濃度のＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（水中）１０μｌと共に６２℃で２４時間インキュベートした。これらの試料を、サイズ排除ＨＰＬＣにより、抗体が分解している程度の指標として得られるピークＣの形成の程度を用いて、例１と同様に分析した。結果を下記表５に示す。
　分解の程度は、Ｃｕ２＋／ＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈのモル比の増加に伴って増加することが見出された。０．３を越える比率（データは示さず）では、全タンパク質の回収率をより低いものとする凝集が見られた。
例　６
　この例もまた、例１において言及されるタイプのＣＨＯ細胞で産生されるＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈ（リン酸緩衝生理食塩水中１．０ｍｇ／ｍｌ）を用い、バッチは原子吸光分光分析による測定で１ｍｌ当り０．１９μｇのＣｕ２＋を含有することが見出されていた。このため、この試料は高い銅含量を有し（銅／ＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈモル比４４９ｐモルＣｕ２＋／ｎモルＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈ）、早期の安定性研究はこのバッチが３７℃での保存時に実質的な分解を受けていることを示した。
　この試料の、２ｍＭ　ＥＤＴＡの存在および非存在下における、３７℃での４週間までのインキュベーションの効果を下記表６に示す。これらの試料を、サイズ排除ＨＰＬＣにより、抗体が分解している程度の指標として得られるピークＣの形成の程度を用いて、例１と同様に分析した。
　２ｍＭ　ＥＤＴＡはＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈの分解を実質的に減少させるが、それを完全に阻止することはない。
　同じＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈの試料を５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムに対して＋４℃で透析し、アリコート１００μｌを濃度を変化させたＥＤＴＡと共に６２℃で２４時間インキュベートした。これらの試料を、サイズ排除ＨＰＬＣにより、抗体が分解している程度の指標として得られる「ピークＣ」の形成の程度を用いて、例１と同様に再度分析した。２つの別々の実験の結果を下記表７および８に示す。
　これらの結果は、０．０１ｍＭ　ＥＤＴＡ程度の少量でＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈの分解を有効に阻害することを示す。
例　７
　種々の抗体の分解に及ぼすＣｕ２＋およびＥＤＴＡの効果を下記表９に示す。全ての試料は、あらゆる添加物の非存在下において４℃および６２℃で２４時間、並びにＣｕ２＋（１ｍＭ　ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ＋０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ）もしくはＥＤＴＡ（１ｍＭ　ＥＤＴＡ）のいずれかの存在下において６２℃で２４時間インキュベートした。
　ＩｇＧ１＝マウスモノクローナルＩｇＧ１抗体、リン酸緩衝
　　　　　　生理食塩水中１ｍｇ／ｍｌ；
　Ｃ１Ｈ　＝例１に記載されるタイプのＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈ、リン酸
　　　　　　緩衝生理食塩水中１ｍｇ／ｍｌ；
　ＣＤ４　＝ＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈと同じフレームワーク領域を有し、
　　　　　　ＣＨＯ細胞で産生されるヒト化抗ＣＤ４モノクロ
　　　　　　ーナル抗体、リン酸緩衝生理食塩水中
　　　　　　１ｍｇ／ｍｌ；
　ＩｇＧ２＝シグマ（Ｓｉｇｍａ）から市販されるマウスＩｇＧ２
　　　　　　モノクローナル抗体Ｉ−４１３９、リン酸緩衝液から
　　　　　　凍結乾燥されて供給され、水で１ｍｇ／ｍｌに再
　　　　　　溶解した。
　全ての試料は、４℃ではほとんどもしくは全く分解を示さない。これに対して、６２℃では幾らか分解し、これは銅の存在によって変動する度合いで増加する。６２℃での分解は、ＥＤＴＡによって抑制される。
例　８
　ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈの安定性に対するリン酸緩衝生理食塩水中の２ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）および５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６．０）の効果の間の比較を、種々のレベルの銅で行なった。例１において言及されるタイプのＣＨＯ細胞で産生されるＣＡＭＰＡＴＨ　１Ｈ（このバッチは原子吸光分光分析による測定で検出し得る銅を含有しない）を、リン酸緩衝生理食塩水で体積１０に対して１に希釈した。アリコート１ｍｌを下記緩衝液１リットルに対して透析した。
　（ｉ）リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２；
　（ｉｉ）リン酸緩衝生理食塩水中２ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２；
　（ｉｉｉ）５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０。
　透析は、４℃で、３回交換しながら１６時間にわたって行なった。次いで、緩衝液ブランクを用い、かつ吸光計数Ａ２８０（０．１％）を１．３２として３４０ないし２００ｎｍを走査することにより、３つの試料についてタンパク濃度を測定した。
　（ｉ）　　１．３２ｍｇ／ｍｌ
　（ｉｉ）　１．２０ｍｇ／ｍｌ
　（ｉｉｉ）１．２７ｍｇ／ｍｌ
のタンパク濃度が測定された。
　その後、上記緩衝液中の抗体のアリコート２００μｌを、増加する濃度のＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（２０ｍＭまで）と共に、６２℃で２４時間インキュベートした（６２℃はＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈの銅誘発開裂の最適温度である）。次いで、試料（アリコート５０μｌ）を例１に記載される方法でサイズ排除ＨＰＬＣによって分析し、カラムから溶出されるＡ２８０−吸光ピークのクロマトグラムを切断し、秤量することによって種々の画分を統合した。この場合、結果は％「ピークＢ」（全ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ）と記録した。
　結果を下記表１０に示す。
　ｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水単体におけるＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈの開裂は、たとえ銅を添加しなくとも、６２℃で２４時間のインキュベーションの際には比較的早い。リン酸緩衝生理食塩水プラス２ｍＭ　ＥＤＴＡにおいては、１ｍＭより多量の銅が添加された場合に開裂が誘発される。５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６．０においては、１０ｍＭを越える銅が添加された場合に開裂が起こる。
例　９
　例８と同様の実験でｐＨの変化の効果も調べた。リン酸緩衝生理食塩水中の、例１において言及されるタイプのＣＨＯ細胞において産生されるＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（このバッチは原子吸光分光分析による測定で検出し得る銅を含有していない）を、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２中に１：２０に希釈した。その後、例８に記載されるようにタンパク濃度を測定し、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２またはリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ６．０でタンパク濃度２ｍｇ／ｍｌに試料を希釈してｐＨをチェックした。ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ試料（ｐＨ７．２もしくはｐＨ６．０のいずれかのリン酸緩衝生理食塩水中２ｍｇ／ｍｌ）の各々のアリコート２００μｌに４μｌの０．１Ｍ−クエン酸三ナトリウム、ｐＨ７．０もしくは４μｌの０．１Ｍ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０のいずれかを添加し、クエン酸もしくはＥＤＴＡについて約２ｍＭの最終濃度を得た。
　ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（２ｍｇ／ｍｌ）試料２００μｌ当り３ｍＭまでの銅を、０．１Ｍ　ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏのアリコート０ないし６μｌとして添加した。水４μｌを銅を除いて試料に添加した。試料を６２℃で２４時間インキュベートし、遠心してあらゆる沈殿物質を除去して、アリコート５０μｌを例８に記載される方法でサイズ排除ＨＰＬＣにより分析した。％「ピークＢ」（全ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ）として記録される結果を下記表１１に示す。
　上記表は、２ｍＭ−ＥＤＴＡおよび２ｍＭ−クエン酸塩によるＣｕ２＋の結合のおおよその化学量論およびｐＨの寄与効果を示している。リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２中の２ｍＭ−ＥＤＴＡが、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈの銅誘発開裂の抑制に最も有効である。結合の約１：１の化学量論は、ｐＨ７．２で示される。２ｍＭを越える濃度の銅は、２ｍＭ　ＥＤＴＡにおいてもＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈの開裂を引き起こす。
（５７）【特許請求の範囲】
　１．安定化された免疫グロブリン
医薬
ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナル
　２．請求項１に記載の組成物であって、前記免疫グロブリンが組み替え免疫グロブリンである組成物。
　３．請求項２に記載の組成物であって、前記免疫グロブリンがキメラ免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリンである組成物。
　４．請求項２または３に記載の組成物であって、前記免疫グロブリンがＣＨＯ細胞から産生される組成物。
　５．請求項２または３に記載の組成物であって、前記免疫グロブリンがミエローマ細胞から産生される組成物。
　６．請求項１〜５の何れか１項に記載の組成物であって、前記免疫グロブリンが腫瘍細胞マーカー抗原に対するものである組成物。
　７．請求項２〜５の何れか１項に記載の組成物であって、前記免疫グロブリンがＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４
、
、
ＣＤ３３、
　８．請求項１〜７の何れか１項に記載の組成物であって、前記キレート化剤がエチレンジアミン四酢酸である組成物。
　９．請求項８に記載の組成物であって、エチレンジアミン四酢酸の量が、０．０５ｍＭ〜５ｍＭである組成物。
　１０．請求項９に記載の組成物であって、エチレンジアミン四酢酸の量が、
０．１
３
　１１．請求項１〜７の何れか１項に記載の組成物であって、前記キレート化剤がクエン酸イオンである組成物。
　１２．請求項１１に記載の組成物であって、前記キレート化剤が
クエン酸ナトリウム
　１３．請求項１〜１２の何れか１項に記載の組成物であって、ｐＨが６〜７．２である組成物。
　１４．請求項１〜１３の何れか１項に記載の組成物であって、非経腸的投与に適した液剤の形態である組成物。
　１５．請求項１〜１３の何れか１項に記載の組成物であって、非経腸的投与に適した液剤に再構成するのに適した凍結乾燥形態である組成物。
　１６．銅イオンのキレート化剤を使用することにより、
ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナル
　１７．請求項１６に記載の方法であって、前記キレート化剤がエチレンジアミン四酢酸である方法。
　１８．請求項１６に記載の方法であって、前記キレート化剤がクエン酸イオンである方法。
　１９．
精製されたヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナルＩｇＧ１免疫グロブリンと、銅キレート化剤とを含有する組成物であって、銅キレート化剤の使用によって、
ことを特徴とする、ヒト定常ドメイン部分を有するモノクローナルＩｇＧ１免疫グロブリン組成物。