(57)【要約】NR4A1、Arc及びNXF遺伝子のmRNAの発現量を定量することを含む、てんかんの治療薬または予防薬のスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）成長ホルモンをヒト以外の動物の脳内へ連続投与する工程、
（ii）被検化合物を、前記成長ホルモンを投与する、または投与した動物へ投与する工程、及び
（iii）成長ホルモン及び被検化合物を投与した動物の脳実質における、NR4A1、Arc及びNXFからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のmRNAの発現量を定量する工程を含む、てんかん治療薬または予防薬をスクリーニングする方法。
【請求項２】
さらに、（ａ）成長ホルモン及び被検化合物を投与した動物の脳実質における、Fos遺伝子のmRNAの発現量を定量する工程、及び（ｂ）Fos遺伝子のmRNAの発現量に影響を与えない化合物を選択する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）被検化合物をヒト以外の動物に投与する工程、及び
（ｉｉ）前記動物の脳実質における、成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc及びNXFからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のmRNAの発現量を定量する工程を含む、てんかんの治療薬または予防薬をスクリーニングする方法。
【請求項４】
さらに、（ａ）前記動物の脳実質における、Fos遺伝子のmRNAの発現量を定量する工程、及び（ｂ）Fos遺伝子のmRNAの発現量に影響を与えない化合物を選択する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
てんかんモデル動物を用いる、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
キンドリングマウスを用いる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
さらに正常非ヒト動物を用いる、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
動物が、マウスである請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
てんかんが難治てんかんまたは側頭葉てんかんである、請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
mRNAの発現量の定量を、定量的RT-PCRまたはDNAチップにより行う、請求項１−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
脳実質が、海馬及び側・後頭葉大脳皮質、前脳大脳皮質、並びに視床からなる群から、少なくとも１つ選択される部位の実質である、請求項１−１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
NR4A1、Arc及びNXF遺伝子のmRNAの発現量を同時に定量する工程を含む
、請求項１−１１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、てんかん、例えば、難治てんかんの治療薬または予防薬をスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、てんかんの診断用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
てんかんは日本において全人口の約1%の人に発症する慢性神経疾患であり発症年齢、発症原因、症状は様々である。原因別に分類すると、遺伝的素因が原因となり、薬物治療効果が期待できる特発性てんかんと、癌化・虚血・水頭症等の二次的素因が原因となる難治化率の高い症候性てんかんに分けられる。特発性てんかん及び症候性てんかんのどちらに関しても根本的な障害は、神経回路網の異常な同期性放電である。
特発性てんかんは主にイオンチャネルをコードしている領域を中心に原因遺伝子が同定されているので、別名「チャネル病」と呼ばれている。現在までに、特発性てんかんの原因遺伝子の解明は大きく進んでいる（非特許文献１）。一方、症候性てんかんはシナプス可塑性（非特許文献２）や神経回路形成などに関与する、いくつかの原因因子が候補として挙がっている。
てんかんの約２０〜３０％は既存の薬剤治療が有効でない。これらの既存の薬剤治療が有効でないてんかんは難治てんかんと呼ばれている。そして、難治てんかんの約５０％が側頭葉てんかんである。
難治てんかん、とりわけ、側頭葉てんかんの分子カスケードは未だ不明な点が数多く存在しており、そのカスケードの解明が必要とされている。【０００３】
現在、てんかんに関する研究では様々なてんかんモデル動物が用いられている。代表的てんかんモデル動物として、遺伝的にてんかん発作を起こしやすい状態にあるELマウス（非特許文献３）、神経毒であるカイニン酸を投与し、てんかん発作を引き起こすカイニン酸モデル（非特許文献４）、脳内に電極を挿入し毎日の電気刺激で、てんかん発作を引き起こすキンドリングモデル（非特許文献５）などが知られている。【０００４】
キンドリングモデルは、特定の脳内部位において、最初は痙攣を起こす閾値以下の電気刺激を繰り返し与えることで脳波上の発作（発作後放電）が生じ、次第に行動上での発作が見られるようになり、最終的に強直性間代性発作を誘発するモデルである。一度発作が引き起こされる状態にまで症状が進行すると、刺激を休止しても、再び刺激を与えれば容易に発作を誘発できる。キンドリングマウスでは、これまで形態学的に、海馬歯状回での樹状突起の径の肥大（非特許文献６）や顆粒細胞層の肥大（非特許文献７）、苔状繊維の萌芽（非特許文献８）などが観察されている。これらの構造学的な神経可塑性の変化は、難治てんかんである、側頭葉てんかん患者においてもみられる。【０００５】
また、扁桃体キンドリングマウスでは、刺激電極が扁桃体基底外側核に挿入されている。この神経核は海馬や内嗅領に軸索を伸ばしていることから、扁桃体から海馬へ刺激が伝わると、齧歯類ではそこから直接視床前核へ伝わり、大脳皮質帯状回に伝わる。一方、臨床の側頭葉てんかんの焦点になる頻度の高い神経領域として海馬や扁桃体が確認され、これらの神経核は辺縁系に含まれている。
よって、キンドリングマウスはヒト側頭葉てんかん患者でみられる神経の異常な可塑性を模倣していると考えられる。【０００６】
これまでに、てんかんモデル動物での遺伝子発現変動の解析はなされている（非特許文献９）ものの、臨床の難治てんかんに近いモデルであるキンドリングモデルを用いた難治てんかん発生に関連する脳内部位での遺伝子発現変動解析は、未だ十分に検討されていない。
【非特許文献１】Treiman L, Treiman D. Genetic aspects of epilepsy. In: Wyllie E, ed. The treatment of epilepsy: plinciples and practice. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2001
【非特許文献２】森本  清, 佐藤  圭子 : キンドリングモデルー神経可塑性研究への応用ー : 脳と精神の医学, 5巻増刊号, 17-26
【非特許文献３】Suzuki J. : Investigations of epilepsy with a mutant animal (EL mouse) model. :  Epilepsia. 2004;45 Suppl 8:2-5.
【非特許文献４】Tanaka T, Tanaka S, Fujita T, Takano K, Fukuda H, Sako K, Yonemasu Y. : Experimental complex partial seizures induced by a microinjection of kainic acid into limbic structures. :  Prog Neurobiol. 1992;38(3):317-34.
【非特許文献５】Goddard, G.V. : Development of epileptic seizures through brain stimulation at low intensity. : Nature. 1967; 214(92), 1020-1.
【非特許文献６】Kato K, Masa T, Tawara Y, Kobayashi K, Oka T, Okabe A, Shiosaka S. Kato K, Masa T, Tawara Y, Kobayashi K, Oka T, Okabe A, Shiosaka S.: Dendritic aberrations in the hippocampal granular layer and the amygdalohippocampal area following kindled-seizures. : Brain Res. 2001 May 18;901(1-2):281-95.
【非特許文献７】Suzuki F, Junier MP, Guilhem D, Sorensen JC, Onteniente B. : Morphogenetic effect of kainate on adult hippocampal neurons associated with a prolonged expression of brain-derived neurotrophic factor. :  Neuroscience. 1995 Feb;64(3):665-74.
【非特許文献８】Sutula T, He XX, Cavazos J, Scott G. : Synaptic reorganization in the hippocampus induced by abnormal functional activity. : Science. 1988 Mar 4;239(4844):1147-50.
【非特許文献９】Mathern GW, Pretorius JK, Leite JP, Kornblum HI, Mendoza D, Lozada A, Bertram EH 3rd. : Hippocampal AMPA and NMDA mRNA levels and subunit immunoreactivity in human temporal lobe epilepsy patients and a rodent model of chronic mesial limbic epilepsy. : Epilepsy Res. 1998 Sep;32(1-2):154-71.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規なてんかんの治療薬または予防薬のスクリーニング方法、新規なてんかん診断薬及び新規なてんかんの診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、キンドリングマウスがヒト側頭葉てんかんと同様な神経可塑性を生じていると考えたことから、キンドリングマウスを用い、てんかんの発症に関連する神経回路網を構成する脳部位について、てんかん形成過程で変動する遺伝子を検討した。その結果、成長ホルモン（以下、Ｇｈとも称す）の発現が、てんかん形成過程において、下垂体では変化しない一方、海馬及び大脳皮質等で増大することを見出した。そして、Ｇｈの継続的な脳内投与によりＧｈのシグナル伝達が亢進し、キンドリングマウスにおける可塑的変化と一致する可塑的変化を示すことを見出した。さらに、Ｇｈの分泌を抑制するソマトスタチンの誘導体であるオクトレオチドをマウスに投与するとてんかんの発生が抑制され、成長ホルモンを投与するとてんかんの発生が促進されることを見出した。
これらの新規な知見は、Ｇｈシグナル伝達系がヒト側頭葉てんかんの形成に重大な役割を果たすことを示すものである。そこで本発明者らはこのＧｈシグナル伝達系に着目し、成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc、NXF及びFos遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子のmRNA量を定量することを含むてんかん治療薬のスクリーニング方法に係る発明を完成させた。Ｇｈシグナル伝達系という既存の抗てんかん薬とは全く異なる作用機序を有するため、本発明のスクリーニング方法で見出された化合物は、難治てんかんの治療薬となり得る。
さらに、本発明者らは、成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc、NXF及びFos遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子のmRNA量を定量することを含むてんかんの診断方法に係る発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は、脳実質における、成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc、NXF及びFosからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のmRNAの発現量を定量する工程を含む、てんかんの治療薬または予防薬のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は例えば、脳実質における、NR4A1、Arc及びNXFからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のmRNAの発現量を定量する工程を含む、てんかんの治療薬または予防薬のスクリーニング方法である。
該てんかんは、例えば、難治てんかんであり、側頭葉てんかんであり、成長ホルモン依存性のてんかんであり得る。
また、本発明は、脳実質における、成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc、NXF及びFosからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のmRNAの発現量を定量するための試薬を含む、てんかんの診断用組成物を提供する。本発明のてんかんの診断用組成物は例えば、脳実質における、NR4A1、Arc及びNXFからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のmRNAの発現量を定量するための試薬を含む。該診断用組成物は、難治てんかんの確定診断用組成物、側頭葉てんかんの確定診断用組成物、成長ホルモン依存性てんかんの確定診断用組成物であり得る。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る、スクリーニング方法により、新規なてんかんの治療薬または予防薬が創出され得る。また、本発明に係る診断方法により、てんかんが診断され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実験スケジュールの模式図を示す。（Ａ）海馬内への薬液投与を伴ったキンドリングマウスの、発作獲得過程評価の試行スケジュールを示した。（Ｂ）てんかん刺激を伴わない薬液投与実験の試行スケジュールを示した。
【図２】てんかん発作獲得過程における成長ホルモンｍＲＮＡ発現の変動を示す。偽手術（Sham）→ステージ３（Stage3）→キンドリング（Kindling）とてんかん発作獲得が進むにつれ成長ホルモンmRNAの発現が増加した。（Kruskal-Wallis p*<0.05）
【図３】海馬への薬液投与を伴ったキンドリングマウスの発作獲得過程の観察を示す。（Ａ）Genotropin（登録商標）（遺伝子組換え天然型ヒト成長ホルモン製剤）投与群（○n=9）とGenotropin（登録商標）緩衝液投与群（●n=11）のてんかん発作獲得過程の棘波数を示した。Genotopin（登録商標）投与群は日数の経過に伴い有意に棘波数の増加が観察された（two-way fractorial ANOVA：F=21.855, p<0.0001）。また、各々の日で比較したところ１２、１３日目で有意にGenotropin（登録商標）投与群の棘波数が多かった（Mann-Whitney U-test *p<0.05, **p<0.01）。（Ｂ）Genotropin（登録商標）投与群と緩衝液投与群の棘波持続時間の推移を示した。Genotropin（登録商標）投与群は日数の経過に伴い棘波持続時間が有意に増加した（F=19.120,p<0.0001）。また各々の日で比較したところ４、１２日目で有意にGenotropin（登録商標）投与群の棘波持続時間が長かった。（Ｃ）Genotropin（登録商標）投与群と緩衝液投与群のフリーズ持続時間の推移を示した。Genotropin（登録商標）投与群は日数の経過に伴い有意にフリーズ時間の増加が観察された（F=20.742,p<0.0001）。また各々の日で比較したところ４、５、７、９、１１日目で有意にGenotropin（登録商標）投与群のフリーズ時間が長かった。（Ｄ）Genotropin（登録商標）投与群と緩衝液投与群のステージの推移を示した。Genotropin（登録商標）投与群は日数の経過に伴い有意にステージの進行が観察された（F=16.783, p<0.0001）。また各々の日で比較したところ、４、８日目で有意にGenotropin（登録商標）投与群のステージが進んでいた。（Ｅ）Sandostatin（登録商標）（成長ホルモン分泌抑制剤）投与群（○n=12）とSandostatin（登録商標）緩衝液投与群（●n=12）の棘波数の推移を示した。２群間に有意な差は見られなかった。（Ｆ）Sandostatin（登録商標）投与群と緩衝液投与群の棘波持続時間の推移を示した。２群間に有意な差は見られなかった。（Ｇ）Sandostatin（登録商標）投与群と緩衝液投与群のフリーズ時間の推移を示した。Sandostatin（登録商標）投与群は日数の経過に伴い、有意にフリーズ時間の減少が観察された（F=24.121,p<0.0001）。また、各々の日で比較したところ１、４、５、６、７、１０日目で有意にSandostatin（登録商標）投与群のフリーズの時間が短かった。（Ｈ）Sandostatin（登録商標）投与群と緩衝液投与群のステージの推移を示した。Sandostatin（登録商標）投与群は日数の経過に伴い、有意にステージ進行の抑制が観察された（F=21.551, p<0.0001）。また各々の日で比較したところ１、４、５、６、７、１０日目で有意にSandostatin（登録商標）投与群のステージ進行が抑制された。
【図４】NR4A1 mRNAの発現変動を示す。（Ａ）キンドリング（kindling）群、ステージ３（Stage3）群、偽手術（Sham）群でNR4A1 mRNA発現量の変動を測定した。ANOVA検定の結果、各群間に有意な差が存在した（F=5.339, p<0.05）。続いてPost-Hoc TestとしてFisher’s PLSDを用いた結果、Kindling群はSham群、Stage3群に比べて有意に発現量が増加していた（p*<0.05）。（Ｂ）ジェノトロピン（Genotropin（登録商標））６回投与、ソマベルト（Somavert（登録商標））６回投与、緩衝液（Buffer）６回投与による、NR4A1 mRNA発現量の変動を測定した。ANOVA検定の結果、各群間に有意な差が存在した（F=22.824, p<0.01）。続いてPost-Hoc TestとしてFisher’s PLSDを用いた結果、Genotropin（登録商標）投与群はSomavert（登録商標）投与群、Buffer投与群に比べて有意に発現量が多かった（p**<0.01）。（Ｃ）ジェノトロピン（Genotropin（登録商標））１回投与、緩衝液（Buffer）１回投与による、NR4A1 mRNA発現量の変動を測定した。各群間に有意な差は無かった。
【図５】Arc mRNAの発現変動を示す。（Ａ）キンドリング（kindling）群、ステージ３（Stage3）群、偽手術（Sham）群でArc mRNA発現量の変動を測定した。ANOVA検定の結果、各群間に有意な差が存在した（F=8.722, p<0.01）。続いてPost-Hoc TestとしてFisher’s PLSDを用いた結果、Kindling群はSham群、Stage3群に比べて有意に発現量が増加していた（p**<0.01）。（Ｂ）ジェノトロピン（Genotropin（登録商標））６回投与、ソマベルト（Somavert（登録商標））６回投与、Buffer６回投与による、Arc mRNA発現量の変動を測定した。ANOVA検定の結果、各群間に有意な差が存在した（F=13.141, p<0.01）。続いてPost-Hoc TestとしてFisher’s PLSDを用いた結果、Genotropin（登録商標）投与群はSomavert（登録商標）投与群、Buffer投与群に比べて有意に発現量が多かった（p*<0.05,p**<0.01）。（Ｃ）ジェノトロピン（Genotropin（登録商標））１回投与、緩衝液（Buffer）１回投与による、Arc mRNA発現量の変動を測定した。各群間に有意な差は無かった。
【図６】NXF mRNAの発現変動を示す。（Ａ）キンドリング（kindling）群、ステージ３（Stage3）群、偽手術（Sham）群でNXF mRNA発現量の変動を測定した。ANOVA検定の結果、各群間に有意な差が存在した（F=30.344, p<0.0001）。続いてPost-Hoc TestとしてFisher’s PLSDを用いた結果、Kindling群はSham群、Stage3群に比べて有意に発現量が増加していた（p**<0.01）。（Ｂ）ジェノトロピン（Genotropin（登録商標））６回投与、ソマベルト（Somavert（登録商標））６回投与、緩衝液（Buffer）６回投与による、NXF mRNA発現量の変動を測定した。ANOVA検定の結果、各群間に有意な差が存在した（F=4.284, p<0.05）。続いてPost-Hoc TestとしてFisher’s PLSDを用いた結果、Somavert（登録商標）投与群は、Buffer投与群に比べて有意に発現量が減少していた（p*<0.05）。（Ｃ）ジェノトロピン（Genotropin（登録商標））１回投与、緩衝液（Buffer）１回投与による、NXF mRNA発現量の変動を測定した。各群間に有意な差は無かった。
【図７】Fos mRNAの発現変動を示す。（Ａ）キンドリング（kindling）群、ステージ３（Stage3）群、偽手術（Sham）群でFos mRNA発現量の変動を測定した。ANOVA検定の結果、各群間に有意な差が存在した（F=12.808, p<0.01）。続いてPost-Hoc TestとしてFisher’s PLSDを用いた結果、Kindling群はSham群、Stage3群に比べて有意に発現量が増加していた（p**<0.01）。（Ｂ）ジェノトロピン（Genotropin（登録商標））６回投与、ソマベルト（Somavert（登録商標））６回投与、緩衝液（Buffer）６回投与による、Fos mRNA発現量の変動を測定した。各群間に有意な差は見られなかった。（Ｃ）ジェノトロピン（Genotropin（登録商標））１回投与、緩衝液（Buffer）１回投与による、Fos mRNA発現量の変動を測定した。Genotropin（登録商標）１回投与群は、Buffer１回投与群に比べて発現量が有意に減少していた（Mann-Whitney U-test, p*<0.05）。
【図８】cDNAからmRNAを合成したサンプル一覧を示す。○印のついているサンプルからcDNAを合成し、リアルタイムPCRに用いた。Kindlingはキンドリングマウスを、Stageはステージ３のマウスを、Shamは偽手術のマウスを、Genotropinはジェノトロピンを投与したマウスを、Bufferは緩衝液を投与したマウスを、Somavertはソマベルトを投与したマウスを示す。
【図９】各遺伝子において設計したプライマー、プローブの配列及びコード領域を示す。＃GeneBankのシークエンスをもとにした増幅領域を示す。＄フラグメントサイズを示す。％FはForward primer、Rはreverse primer、Pはprobeを示す。＠プローブをラベルしている蛍光色素名を示す。なお、プローブを記載している遺伝子はＴａｑＭａｎ（登録商標）法にて、その他の遺伝子はＣＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ（登録商標）法にて、Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。使用したプライマー、プローブは以下のとおりである：GhのmRNA発現量の定量に用いたプライマー及びプローブ（Forwardプライマー: 5'-GGCTGCTGACACCTACAAAGAGTT-3'（配列番号１）、Reverseプライマー: 5'-AGAAAGCAGCCTGGGCATT-3'（配列番号２）、プローブ：5'-FAM-CCCGAGGGACAGCG-3'（配列番号３））、GapdhのmRNA発現量の定量に用いたプライマー及びプローブ（Reverseプライマー: 5'-GGCGGAGATGATGACCCTTT-3'（配列番号４）、Forwardプライマー: 5'-GGAGCGAGACCCCACTAACA-3'（配列番号５）、プローブ：5'-VIC-CCACGACATACTCAGCAC-3'（配列番号６））、NR4A1のmRNA発現量の定量に用いたプライマー（Forwardプライマー:5'-CCCCGAGCCAGACTTATGAA-3'（配列番号７）、Reverseプライマー:5'-TGGGAGGACTGAAGGAGAAGAA-3'（配列番号８））、ArcのmRNA発現量の定量に用いたプライマー（Forwardプライマー:5'-GCCGCCAAACCCAATGT-3'（配列番号９）、Reverseプライマー:5'-GCTCTCGCTCCACCTGCTT-3'（配列番号１０））、NXFのmRNA発現量の定量に用いたプライマー（Forwardプライマー:5'-TCCATTTCAATCTGTATTCACTCGTA-3'（配列番号１１）、Reverseプライマー:5'-TTGGTGGGGGAAAGGCA-3'（配列番号１２））、FosのmRNA発現量の定量に用いたプライマー（Forwardプライマー: 5'-TTC CTA GTG ACA CCT GAG AGC TG-3'（配列番号１３）、Reverseプライマー: 5'-GAA CAT TGA CGC TGA AGG ACT AC-3'（配列番号１４）、GapdhのmRNA発現量の定量に用いたプライマー（Forwardプライマー：5'-GGA GCG AGA CCC CAC TAA CA-3'（配列番号１５）、Reverseプライマー：5'-GGC GGA GAT GAT GAC CCT TT-3'（配列番号１６）））。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の第一の実施態様では、脳実質における、成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc、NXF及びFosからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のmRNAの発現量を定量する工程を含む、てんかんの治療薬または予防薬に有用な化合物のスクリーニング方法を提供する。
例えば、本発明の第一の実施態様として提供されるてんかんの治療薬または予防薬に有用な化合物のスクリーニング方法は、
（ｉ）被検化合物を動物に投与する工程、及び
（ｉｉ）当該動物の脳実質における、成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc及びNXFからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のmRNAの発現量を定量する工程を含む。
てんかんの治療薬または予防薬はヒトのてんかんの治療薬または予防薬であり得る。
てんかんは、難治てんかんおよび／または側頭葉てんかんであり得る。さらに、てんかんは、成長ホルモン依存性のてんかんであり得る。
ここで、成長ホルモン依存性のてんかんとは、脳実質、例えば、海馬、側・後頭葉大脳皮質、前脳大脳皮質、及び視床からなる群から、少なくとも１つ選択される部位の実質で、成長ホルモンの発現が増大することにより、てんかんが発生し、または、てんかんの症状が悪化するてんかんである。【００１３】
本発明の第一の実施態様に使用する動物は、ヒト以外の動物であり、例えば、哺乳動物であり、マウス、ラット、ウサギ、イヌを含む。動物は正常動物であってもてんかんモデル動物であってもよい。
マウスは、限定はされないが、正常マウス、てんかんモデル動物、例えばキンドリングマウス、成長ホルモンを連続して脳内投与したマウス、トランスジェニックマウス及びノックアウトマウスを含む。
正常マウスは、特に限定されないが、実験動物用のマウスであり得、例えば、市販されているddYマウス、ICRマウス、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス等の近交系マウスを含む。
キンドリングマウスは、特定の脳内部位において、痙攣を起こす閾値以下の電気刺激を繰り返し与えることにより、最初は脳波上の発作（発作後放電）が生じ、次第に行動上での発作が見られるようになり、最終的に強直性間代性発作を誘発するてんかんモデルマウスである。キンドリングマウスは、当業者に周知の方法（Kato K, Masa T, Tawara Y, Kobayashi K, Oka T, Okabe A, Shiosaka S. Kato K, Masa T, Tawara Y, Kobayashi K, Oka T, Okabe A, Shiosaka S.: Dendritic aberrations in the hippocampal granular layer and the amygdalohippocampal area following kindled-seizures. : Brain Res. 2001 May 18;901(1-2):281-95.）（本文献は引用により本願の一部を構成する）で作成され得る。例えば、扁桃体基底外側核に設置した刺激電極により電気刺激を与えることによって作成され得る。
成長ホルモンを連続投与するマウスは、例えば、正常マウスまたはキンドリングマウスに、成長ホルモンを連続して脳内投与したマウスである。成長ホルモンの投与部位は、特に限定されないが、海馬、大脳皮質、脳室またはその組み合わせであり得る。
成長ホルモン（growth hormone）は、天然の成長ホルモンでも、遺伝子組換え技術により合成された天然の成長ホルモンと同じアミノ酸配列を持つポリペプチドでもよい。由来も限定されず、例えば、ヒト、マウス、ラット由来のものであり得る。例えば、成長ホルモンとして、遺伝子組換え技術により合成された天然のヒト成長ホルモンと同じアミノ酸配列を持つ成長ホルモン製剤であるジェノトロピン（Genotropin：登録商標）を用いてもよい。
成長ホルモンの連続投与のスケジュールは当業者が適宜設定することができる。例えば、連続投与の回数は２、３、４、５、６、７、８、９または１０回とすることができ、５回以上、６回以上または７回以上でもよい。投与頻度は毎日、隔日または1回以上/週の投与とすることができる。連続投与のスケジュールの例には、隔日で５回の投与、隔日で６回の投与、５回の連日投与及び６回の連日投与が含まれる。脳内投与は、当業者に周知の方法で、カニューレ等を使用して実施され得る。
成長ホルモンを連続投与するマウスがキンドリングマウスである場合、キンドリング刺激と成長ホルモンの投与のスケジュールは、当業者が適宜設定することができる。例えば、キンドリング刺激の前、後または前後に成長ホルモンを連続投与することができる。具体的には例えば、キンドリング刺激の５日前から隔日に５回投与し、キンドリング刺激の７及び９日後に各１回投与するスケジュールが考えられる。成長ホルモン投与と工程（ｉ）の被検化合物を投与するタイミングも当業者が適宜設定することができ、例えば、成長ホルモンの投与の前、後または前後に被検化合物を単回または連続投与できる。
トランスジェニックマウスは、特定の遺伝子が修飾されたマウスであり、特定の遺伝子を過剰発現したマウス、及び遺伝的に特定の遺伝子の生物活性を変化させたマウスを含む。
ノックアウトマウスは、限定はされないが、特定の遺伝子をターゲティングしたマウスを含む。【００１４】
動物としててんかんモデル動物を用いる場合には、本発明の第一の実施態様に係るスクリーニング方法は、工程（ｉｉ）に付け加えて、（ｉｉｉ）神経学的にてんかん発作獲得の程度を評価する工程を含んでもよい。てんかん発作獲得の程度は、ステージの進行、フリーズの持続時間、棘波数及びてんかん発作後発射の持続時間について測定し、その測定結果に基づき評価してもよい。ステージについては、例えば、以下のように決定することができる：ステージ1：フリーズする時間が5秒以下で、顔面の痙攣が観察される。ステージ2：フリーズが観察される時間が5秒以上15秒以下である。ステージ3：フリーズが観察される時間が15秒以上である。ステージ4：フリーズ後、全身の軽度痙攣及び尾の緊張による挙上が観察される。ステージ5：全身の痙攣、転倒及び泡ふきが観察される。フリーズとは動物の常動行動である探索行動の消失のことを指す。
上記本発明の第一の実施態様に係るスクリーニング方法では、コントロールとして工程（ｉ）において被検化合物の代わりに当該化合物の溶媒(vehicle)を投与した動物(以下、化合物vehicle群とも称す)を用意する。そして、被検化合物投与群と化合物vehicle群の脳実質における、成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc及びNXFからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のmRNAの発現量の定量を行う。化合物を投与した動物において、成長ホルモン遺伝子、NR4A1、ArcまたはNXF遺伝子の発現量が、化合物vehicle群の発現量に比較し抑制されていれば、当該化合物は、てんかん治療薬または予防薬のポテンシャルを有する化合物として評価され得る。
本発明の第一の実施態様に係るスクリーニング方法は、さらに（ｉｖ）当該動物の脳実質における、Fos遺伝子のmRNAの発現量を定量する工程を含んでもよい。Fos遺伝子は、immediate early gene (IEGs)としてあらゆる刺激に対して非特異的に発現が亢進する可能性があることから、Fos遺伝子の発現に影響を与えない被検化合物を、てんかん治療薬または予防薬の候補として選択してもよい。【００１５】
本発明者らは、成長ホルモンを連続して脳内投与することにより、てんかん発作獲得が促進され、成長ホルモンの分泌を抑制し、成長ホルモンの作用を抑制するソマトスタチンアナログを連続して脳内投与することにより、てんかん発作獲得が抑制されることを見出した。さらに、本発明者らは、成長ホルモンを連続して脳内投与することにより、NR4A1及びArc遺伝子のmRNAの発現が亢進し、NXF遺伝子及びFos遺伝子のmRNAの発現が変わらないこと、成長ホルモン受容体拮抗薬を連続して脳内投与すると、NXF遺伝子のmRNAの発現が低下し、NR4A1、Arc及びFos遺伝子の発現が変わらないことを見出した。
よって、成長ホルモンを連続脳内投与したマウスの脳実質において、NR4A1、Arc、NXF及び/またはFos遺伝子のmRNAの発現を測定することで、てんかん発作獲得が促進されるのか、抑制されるのかを検討することができる。
すなわち、成長ホルモン（Ｇｈ）を連続脳内投与したマウスに被検化合物を投与し、被検化合物投与により、脳実質において、次の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）：NXF遺伝子のmRNAの発現量が低下；
（ｂ）：ＧｈによるNR4A1遺伝子のmRNA発現量増加の抑制；及び
（ｃ）：ＧｈによるArc遺伝子のmRNA発現量増加の抑制； 
からなる群のうち少なくとも１つが見出されれば、当該被検化合物は、てんかん治療薬または予防薬としてのポテンシャルを有する化合物として選択され得る。
さらに、上記（ａ）〜（ｃ）からなる群から少なくとも１つを示した被検化合物について、Fos遺伝子のmRNAの発現量の化合物による影響を検討し、Fos遺伝子のmRNAの発現量に影響を与えない化合物を、てんかん治療薬または予防薬としてのポテンシャルを有する化合物として選択してもよい。
したがって、本発明の第一の実施態様の別の例としては、
（ｉ）成長ホルモンを動物脳内に連続投与する工程、
（ｉｉ）当該動物に被検化合物を投与する工程及び
（ｉｉｉ）当該動物の脳実質における、NR4A1、Arc及びNXFからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のmRNAの発現量を定量する工程を含む、てんかん治療薬または予防薬に有用な化合物をスクリーニングする方法、が挙げられる。
本態様はさらに、（ｉｖ）当該動物の脳実質における、Fos遺伝子のmRNAの発現量を定量する工程、を含んでもよい。また、本態様においては、工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の何れか一方もしくは両方に代えて、あるいは工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の両方に加えて（ｖ）神経学的にてんかん発作獲得の程度を評価する工程を含んでもよい。
ここで、動物は、ヒト以外の動物、例えば、哺乳動物であり、マウス、ラット、ウサギ、イヌを含む。マウスは、特に限定されないが、実験動物用のマウスであり得、例えば、トランスジェニックマウス、ノックアウトマウス、市販されているddYマウス、ICRマウス、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス等の近交系マウスを含む。本態様において、成長ホルモン連続投与と共にキンドリング刺激を与えてもよい。
成長ホルモン（growth hormone）は、天然の成長ホルモンでも、遺伝子組換え技術により合成された天然の成長ホルモンと同じアミノ酸配列を持つポリペプチドでもよい。由来も限定されず、例えば、ヒト、マウス、ラット由来のものであり得る。例えば、成長ホルモンとして、遺伝子組換え技術により合成された天然のヒト成長ホルモンと同じアミノ酸配列を持つ成長ホルモン製剤であるジェノトロピン（Genotropin：登録商標）を用いてもよい。
連続投与の回数は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回とすることができ、５回以上、６回以上または７回以上でもよく、投与頻度は毎日、隔日または１回以上/週の投与とすることができる。連続投与のスケジュールの例には、隔日で５回の投与、隔日で６回の投与、５回の連日投与及び６回の連日投与が含まれる。また、投与部位も、当業者が適宜選択でき、海馬、大脳皮質、脳室またはそれらの任意の組み合わせであり得る。脳内投与は、当業者に周知の方法で、カニューレ等を使用して実施され得る。
てんかんは、難治てんかん、側頭葉てんかん及び／または成長ホルモン依存性てんかんであり得る。
上記（ｉｖ）の工程の後において、例えば、NR4A1、Arc、NXFまたはそれらの任意の組み合わせと、FosのmRNAの発現量を定量し、ＧｈによるNR4A1及び／またはArcのmRNAの発現量増加が被検化合物により抑制され、及び／またはNXFのmRNAの発現量が被検化合物により低下し、且つFosのmRNAの発現量が被検化合物により変化しない場合は、当該被検化合物はてんかん治療薬または予防薬としてのポテンシャルを有する化合物として評価され得る。
NR4A1、Arc、NXF、Fos等のmRNAの発現量に対する化合物の効果を検討する際には、工程（ｉ）及び（ｉｉ）でＧｈ、被検化合物、及びそれらの代わりにその媒体(vehicle)を投与した動物、つまり、（ａ）Ｇｈ及び化合物の両方を投与した動物、（ｂ）Ｇｈと化合物の媒体（化合物vehicle）を投与した動物、（ｃ）Ｇｈの媒体（Ｇｈvehicleとも称す）及び化合物を投与した動物、（ｄ）Ｇｈvehicle及び化合物vehicleを投与した動物をそれぞれ作成してもよい。そして、これら（ａ）〜（ｄ）の動物のNR4A1、Arc、NXF、Fos等のmRNAの発現量を比較することにより化合物の効果を評価することができる。【００１６】
キンドリング動物（例えば、マウス）は作成に手間がかかることから、キンドリング刺激を与えずに成長ホルモンを脳内に連続投与した動物（例えば、マウス）を用いるスクリーニング方法は、キンドリング動物（例えば、マウス）を用いるスクリーニング方法より、簡便な方法である。【００１７】
本発明の実施態様において、動物（例えば、マウス）に、被検化合物を投与する方法は、特に限定されない。例えば、経口投与、混餌投与、皮下投与、腹腔内投与、または静脈内投与により、被検化合物を投与することができる。また、化合物の投与スケジュールも特に限定されず、当業者が適宜設定できる。例えば、被検化合物の投与は、１回でも、数回でもよい。キンドリング動物（例えば、マウス）においては、キンドリング刺激の前、後または前後に連日投与してもよく、成長ホルモンを連続して脳内投与した動物（例えば、マウス）においては、成長ホルモン投与の前、後または前後に投与してもよい。成長ホルモン投与前に被検化合物を投与する場合は、てんかん予防薬がスクリーニングされ得、成長ホルモン投与後に被検化合物を投与する場合は、てんかん治療薬がスクリーニングされ得る。
本発明の実施態様において、化合物、成長ホルモン等、動物に投与する薬剤は、当業者が適宜、適切な溶媒に溶かすことができる。【００１８】
mRNAの発現量は、種々の方法で定量することができる。例えば、脳実質のサンプルより、周知の方法を用いて全RNAを抽出し、定量的なRT-PCRを行うことにより実施できる。
定量的なRT-PCRは、当業者に周知の方法で行うことができる。例えば、全RNAを鋳型に逆転写酵素によりcDNAを合成し、そして、合成したcDNA、標的の遺伝子に特異的な一組のプライマー、TaqポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼ、さらに、発現量を定量するためのSYBR Green等のDNAインターカレーターとして機能できる色素またはTaqMan（登録商標）プローブの存在下でPCR反応を行うことにより実施できる。【００１９】
脳実質のサンプルは特に限定されるものではなく、海馬、側・後頭葉大脳皮質、前脳大脳皮質、及び視床からなる群から、少なくとも１つ選択される部位の実質であり得、例えば、海馬及び側・後頭葉大脳皮質である。また、脳実質のサンプルとして海馬及び／または大脳皮質を選択することもできる。
全RNAは、脳実質などのサンプルから、例えば、QIAGEN社より市販されているキット（RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Cat. No. 74804)）を用いて抽出することができる。
定量的なRT-PCRは、例えば、サーマルサイクラー等の装置を用いて、全RNAを鋳型に、逆転写酵素と、プライマー（増幅の対象とする遺伝子に特異的なプライマー、ランダムプライマーまたはオリゴｄTプライマー）によりcDNAを合成する段階、合成されたcDNAを鋳型に、定量的なPCRを行う段階を含んで実施される。
cDNAの合成は、当業者に周知の方法によりなされるが、例えば、リアルタイムRT-PCR用の逆転写反応キット（PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)、タカラバイオ）を用いてもよい。
定量的なPCRとしては、インターカレーター法、TaqMan（登録商標）プローブ法、サイクリングプローブ法を利用することができ、それぞれ、当業者に周知の方法によりなされる。ここで、TaqMan（登録商標）プローブとは、両末端に色素団(例えば、5’末端 = Reporter, 3’末端 = Quencher)を結合した20〜30 merの長さのオリゴヌクレオチドで、標的とするDNAに相補的な配列を特異的に認識するように設計することができる。TaqMan（登録商標）プローブ法については、例えば、市販のTaqMan（登録商標） Gene Expression Assays（Applied Biosystems Inc.）を利用し、TaqMan（登録商標）プローブ（プライマー及びPCR反応条件等も含む）を設計することができる。本発明に係るスクリーニング方法で使用できるTaqMan（登録商標）プローブには、例えば、マウスGhのmRNA発現量の定量に用いるTaqMan（登録商標）プローブとして、5'-FAM-CCCGAGGGACAGCG-3'（配列番号３）が、マウスのGapdhのmRNA発現量の定量に用いるTaqMan（登録商標）プローブとして、5'-VIC-CCACGACATACTCAGCAC-3'（配列番号６）が挙げられる。
インターカレーター法についても、例えば、Power SYBR（登録商標） Green PCR Master Mix（Applied Biosystems Inc.）、SYBR（登録商標） Green Realtime PCR Master Mix（東洋紡）等の市販のキットを用い、添付のプロトコールを参考にして、定量的PCRを実施することができる。
定量的なPCRに用いるプライマーは、合成したcDNA上に存在し、増幅の対象とする遺伝子に特異的な一組のプライマーとすることができる。PCRのプライマーは、増幅のサイズ（例えば、80〜150bpであり得る）、プライマーのサイズ（例えば、17〜25塩基とする）、GC含量（例えば、40〜60％とする）、３’末端の配列（例えば、３’末端の塩基をなるべくGまたはCとする、３’末端の近傍のGC含量が多すぎるプライマーは避ける）、配列の偏り（例えば、配列のリピートがないようにする）、配列の相補性（例えば、プライマー内部やプライマー間で３base以上相補しないようにする）、Tm値（例えば、上流プライマー、下流プライマーのTm値を揃える。なお、Tm値＝2(A+T)＋4(G+C)）、特異性（例えば、BLAST検索でプライマーの特異性を確認する）等を考慮して、設計でき、また、OLIGO Primer Analysis Software（タカラバイオ）、Primer3（フリーウェア）等の当業者に周知なプライマー設計ソフトウェアを使用して設計することができる。また、タカラバイオ、Applied Biosystems Inc.等にPCRプライマーの設計を依頼することもできる。
本発明に係るスクリーニング方法で使用できる、マウスのGh、Gapdh、NR4A1、Arc、NXF及びFos遺伝子の増幅に用いられるプライマーとしては、例えば、以下のプライマーを挙げることができる：GhのmRNA発現量の定量に用いられるプライマー（Forwardプライマー: 5'-GGCTGCTGACACCTACAAAGAGTT-3'（配列番号１）、Reverseプライマー: 5'-AGAAAGCAGCCTGGGCATT-3'（配列番号２））、GapdhのmRNA発現量の定量に用いられるプライマー（Reverseプライマー: 5'-GGCGGAGATGATGACCCTTT-3'（配列番号４）、Forwardプライマー: 5'-GGAGCGAGACCCCACTAACA-3'（配列番号５））、NR4A1のmRNA発現量の定量に用いられるプライマー（Forwardプライマー:5'-CCCCGAGCCAGACTTATGAA-3'（配列番号７）、Reverseプライマー:5'-TGGGAGGACTGAAGGAGAAGAA-3'（配列番号８））、ArcのmRNA発現量の定量に用いられるプライマー（Forwardプライマー:5'-GCCGCCAAACCCAATGT-3'（配列番号９）、Reverseプライマー:5'-GCTCTCGCTCCACCTGCTT-3'（配列番号１０））、NXFのmRNA発現量の定量に用いられるプライマー（Forwardプライマー:5'-TCCATTTCAATCTGTATTCACTCGTA-3'（配列番号１１）、Reverseプライマー:5'-TTGGTGGGGGAAAGGCA-3'（配列番号１２））、FosのmRNA発現量の定量に用いられるプライマー（Forwardプライマー: 5'-TTC CTA GTG ACA CCT GAG AGC TG-3'（配列番号１３）、Reverseプライマー: 5'-GAA CAT TGA CGC TGA AGG ACT AC-3'（配列番号１４））、GapdhのmRNA発現量の定量に用いたプライマー（Forwardプライマー：5'-GGA GCG AGA CCC CAC TAA CA-3'（配列番号１５）、Reverseプライマー：5'-GGC GGA GAT GAT GAC CCT TT-3'（配列番号１６））。
定量的なPCRの反応条件は、特に限定はされず、当業者が適宜設定できる。TaqMan（登録商標）法であれば、TaqMan（登録商標） Gene Expression Assays（Applied Biosystems Inc.）に添付されているプロトコールを参考にすることができる。また、インターカレーター法であれば、Power SYBR（登録商標） Green PCR Master Mix（Applied Biosystems Inc.）、SYBR（登録商標） Green Realtime PCR Master Mix（東洋紡）等のキットに添付のプロトコールを参考にすることができる。
定量的なPCRにより増幅されたDNAを定量する方法、装置は特に限定されず、当業者に周知の方法、装置が利用される。例えば、DNAの増幅と共に発生する蛍光を検出する装置を用いて、増幅されたDNAを定量することができる。定量的なPCRにより増幅されたDNAの定量に、例えば、Applied Biosystems 7300 リアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems Inc.）を使用することができる。
なお、内部標準として、ハウスキーピング遺伝子（例えば、GAPDH）について、定量の対象である標的遺伝子と同時に定量的なRT-PCRを行い、ハウスキーピング遺伝子（例えば、GAPDH）発現量に比較した標的遺伝子の発現量を評価することができる。これにより、サンプル量など実験操作に起因するバイアスがノーマライズ（正規化）され得る。【００２０】
また、mRNAの発現量はDNAチップアレイを用いて定量することができる。用いるDNAチップは、特に限定はされず、標的とする遺伝子（成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc、NXF、Fosを含む遺伝子）に特異的で且つ相補的なオリゴヌクレオチド（プローブ）が結合していればよく、タカラバイオ、Affymetrix社等から入手可能である。定量方法についても、特に限定はされず、当業者に周知の方法、例えば、タカラバイオ、Affymetrix社等から入手したDNAチップに添付された方法により定量とすることができる。【００２１】
本発明に係るスクリーニング方法は、脳実質における、成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc、NXF及びFosからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のmRNAの発現量を定量する工程を含むので、mRNAの発現量を定量する遺伝子は、成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc、NXF及びFosの５遺伝子の任意の組合せであり得る。つまり、本発明に係るスクリーニング方法は、脳実質における、当該５遺伝子の任意の１つ、任意の２つ、任意の３つ、任意の４つまたは５つのmRNAの発現量を定量する工程を含む。例えば、本発明に係るスクリーニング方法は、脳実質における、NR4A1、Arc及びNXFからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のmRNAの発現量を定量する工程、または、脳実質における、NR4A1、Arc、NXF及びFos遺伝子のmRNAを定量する工程を含む。【００２２】
本発明の第一の実施態様のmRNA発現量を定量する工程で、mRNA量を定量する遺伝子の数が多ければ多いほど、より特異的に、脳実質でのGhシグナル伝達系を標的としたてんかん治療薬または予防薬を選択することができる。例えば、脳実質におけるNR4A1、Arc及びNXF遺伝子の全てのmRNA発現量を抑制した化合物は、脳実質におけるNR4A1遺伝子のmRNA発現量のみを抑制した化合物に比較して、より特異的に脳実質でのGhの作用を阻害する化合物であり得、そして、より特異的な、Ghシグナル伝達系を標的とするてんかん治療または予防に有用な化合物であり得る。【００２３】
本発明の第一の実施態様では、てんかんモデル動物、例えばキンドリングマウスに被検化合物を投与したとき、脳実質における、NR4A1、Arc及びNXFからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のmRNAの発現量が、当該被検化合物により低下すれば、てんかんの治療薬または予防薬としてのポテンシャルを有する化合物と判断され得る。さらに、当該被検化合物をヒト以外の正常動物、例えば正常マウスに投与したときに、NR4A1、Arc及びNXFからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のmRNAの発現量が当該被検化合物により影響されない場合には、当該被検化合物は、てんかんの病態に特異的に作用を発揮する化合物として選択され得る。
また、別の例としては、成長ホルモンを脳内に連続投与した非ヒト動物を用いることができる。例えば、正常マウスに成長ホルモンを脳内に連続投与したマウスに被検化合物を投与したとき、当該被検化合物により、NXF遺伝子のmRNAの発現が低下するか、成長ホルモン投与により発現が亢進したNR4A1またはArcの発現が低下すれば、てんかんの治療薬または予防薬としてのポテンシャルを有する化合物と判断される（この例において、成長ホルモンと被検化合物の投与のタイミングは限定されない）。さらに、当該被検化合物をヒト以外の動物、例えば正常マウスに投与したときに、NR4A1、Arc及びNXFからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のmRNAの発現量が、当該被検化合物により影響されない場合には、てんかんの病態に特異的に作用する化合物として選択され得る。
なお、これらの例において、てんかんは、難治てんかん、側頭葉てんかん、及び／または成長ホルモン依存性てんかんであり得る。【００２４】
本発明の第一の実施態様に係るスクリーニング方法は、脳内でのＧｈの作用を阻害することによっててんかんを治療または予防する化合物を選択することができる。よって、本発明の第一の実施態様に係るスクリーニング方法は、脳内でのＧｈ作用阻害剤のスクリーニング方法でもあり得る。【００２５】
本発明の第二の実施態様では、脳実質における、成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc、NXF及びFosからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のmRNAの発現量を定量するための試薬を含む、てんかんの診断用組成物を提供する。本発明の第二の実施態様に係る診断用組成物は、脳実質における、成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc及びNXFからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のmRNAの発現量を定量するための試薬を含み得る。てんかんはヒトのてんかんであり得る。また、てんかん診断用組成物は、てんかんの確定診断用組成物、てんかんの前段階の診断用組成物、てんかん発症の危険性の判定用組成物であり得る。
てんかんの前段階とは、てんかん発作を発症する危険性の高い段階であり、例えば、Brain Res. 2001 May 18;901(1-2):281-95（引用によりその全内容が本出願に含まれる）に記載されているステージ３に相当する段階である。このようなてんかんの前段階を判定できるので、患者が、てんかん発作を発症する危険性があるか否かを評価できる。
脳実質とは、限定はされないが、海馬、側・後頭葉大脳皮質、前脳大脳皮質、及び視床からなる群から、少なくとも１つ選択される部位の実質であり得る。例えば、海馬及び側・後頭葉大脳皮質であり得る。また、脳実質として、海馬及び／または大脳皮質を選択することもできる。
本発明の第二の実施態様において、mRNAの発現量の定量は、本発明の第一の実施態様で説明した方法で定量できる。よって、mRNAの発現量を定量するための試薬は、mRNAの発現量を定量的RT-PCRで定量するための試薬を含むことができる。【００２６】
mRNAの発現量を定量的RT-PCRで定量するための試薬には、例えば、cDNAを合成するための逆転写酵素、当該合成したcDNAに結合し、標的遺伝子を特異的に増幅するための一組のプライマー、および、増幅された遺伝子の定量に用いるTaqMan（登録商標）プローブが含まれる。また、mRNAの発現量を定量的RT-PCRで定量するための試薬には、例えば、cDNAを合成するための逆転写酵素、当該合成したcDNAに結合し、標的遺伝子を特異的に増幅するための一組のプライマー、および、増幅された遺伝子の定量に用いるSYBR（登録商標） Green等の色素が含まれる。上記mRNAの発現量を定量的RT-PCRで定量するための試薬は、さらに、dNTP及びTaqポリメラーゼを含み得る。
上記「当該合成したcDNAに結合し、標的遺伝子を特異的に増幅するための一組のプライマー」には、標的遺伝子に特異的な一組のプライマーが含まれる。本実施態様において、標的遺伝子は、成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc、NXF及びFosからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子であり、上記５遺伝子のあらゆる組み合わせ（上記５遺伝子の任意の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの組み合わせ）を含む。
本実施態様において、マウスのGh、Gapdh、NR4A1、Arc、NXF及びFos遺伝子の増幅に用いられるプライマーとしては、例えば、以下のプライマーを挙げることができる：GhのmRNA発現量の定量に用いられるプライマー（Forwardプライマー: 5'-GGCTGCTGACACCTACAAAGAGTT-3'（配列番号１）、Reverseプライマー: 5'-AGAAAGCAGCCTGGGCATT-3'（配列番号２））、GapdhのmRNA発現量の定量に用いられるプライマー（Reverseプライマー: 5'-GGCGGAGATGATGACCCTTT-3'（配列番号４）、Forwardプライマー: 5'-GGAGCGAGACCCCACTAACA-3'（配列番号５））、NR4A1のmRNA発現量の定量に用いられるプライマー（Forwardプライマー:5'-CCCCGAGCCAGACTTATGAA-3'（配列番号７）、Revereseプライマー:5'-TGGGAGGACTGAAGGAGAAGAA-3'（配列番号８））、ArcのmRNA発現量の定量に用いられるプライマー（Forwardプライマー:5'-GCCGCCAAACCCAATGT-3'（配列番号９）、Revereseプライマー:5'-GCTCTCGCTCCACCTGCTT-3'（配列番号１０））、NXFのmRNA発現量の定量に用いられるプライマー（Forwardプライマー:5'-TCCATTTCAATCTGTATTCACTCGTA-3'（配列番号１１）、Revereseプライマー:5'-TTGGTGGGGGAAAGGCA-3'（配列番号１２））、FosのmRNA発現量の定量に用いられるプライマー（Forwardプライマー: 5'-TTC CTA GTG ACA CCT GAG AGC TG-3'（配列番号１３）、Revereseプライマー: 5'-GAA CAT TGA CGC TGA AGG ACT AC-3'（配列番号１４））、GapdhのmRNA発現量の定量に用いたプライマー（Forwardプライマー：5'-GGA GCG AGA CCC CAC TAA CA-3'（配列番号１５）、Reverseプライマー：5'-GGC GGA GAT GAT GAC CCT TT-3'（配列番号１６））。ヒトのGh、Gapdh、NR4A1、Arc、NXF及びFos遺伝子の増幅に用いられるプライマーとしては、例えば、上記マウスに対応するヒト配列が挙げられる。
また、上記「増幅された遺伝子の定量に用いるTaqMan（登録商標）プローブ」としては、例えば、マウスGhのmRNA発現量の定量に用いられるTaqMan（登録商標）プローブとして、5'-FAM-CCCGAGGGACAGCG-3'（配列番号３）が、マウスのGapdhのmRNA発現量の定量に用いられるTaqMan（登録商標）プローブとして、5'-VIC-CCACGACATACTCAGCAC-3'（配列番号６）が挙げられる。また、例えば、上記各プローブに対応するヒト配列を有するTaqMan（登録商標）プローブを、ヒトGhまたはヒトGapdhのmRNA発現量の定量に用いることもできる。【００２７】
また、mRNAの発現量はDNAチップアレイを用いて定量することができる。用いるDNAチップは、特に限定はされず、標的とする遺伝子（成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc、NXF、Fosからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子）に特異的で且つ相補的なオリゴヌクレオチド（プローブ）が結合していればよく、タカラバイオ、Affymetrix社等から入手可能である。定量方法についても、特に限定はされず、当業者に周知の方法、例えば、タカラバイオ、Affymetrix社等から入手したDNAチップに添付された方法により定量とすることができる。
この態様において、mRNAの発現量を定量するための試薬には、成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc、NXF及びFosからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子を検出するためのプローブを有するDNAチップが含まれる。よって、該DNAチップは、成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc、NXF及びFosからなる５遺伝子を特異的に検出するプローブのあらゆる組み合わせ（上記５遺伝子の任意の１つ、２つ、３つ、４つまたは５つに対応するプローブの組み合わせ）を有することができる。【００２８】
本発明の第二の実施態様において、てんかんは、難治てんかん、及び／または側頭葉てんかんであり得る。また、てんかんは、成長ホルモン依存性のてんかんであり得る。成長ホルモン依存性のてんかんとは、脳実質、例えば、海馬、側・後頭葉大脳皮質、前脳大脳皮質、及び視床からなる群から、少なくとも１つ選択される部位の実質で、成長ホルモンの発現が増大することにより、てんかんが発生し、または、てんかんの症状が悪化するてんかんである。
本発明の第二の実施態様に係る診断薬を用いて、例えば、脳実質として、海馬、側・後頭葉大脳皮質、前脳大脳皮質、及び視床からなる群から、少なくとも１つ選択される部位の実質で、成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc、NXF及びFosからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子の発現量が、健常動物に比較し有意に増大する結果を得た場合には、てんかんと診断され得、例えば上記遺伝子の２つ、３つ、４つ、または５つのmRNAの発現量が、健常動物に比較し有意に増大する結果を得た場合には、てんかんと診断され得る。
また、本発明の第二の実施態様に係るてんかんの診断用組成物は、てんかんの確定診断にも使用できる。てんかんの確定診断とは、臨床症状に基づくてんかんの診断を確認する目的で行われる診断である。例えば、臨床症状に基づき、てんかんと医師により診断された患者が手術を受け、脳のサンプルが摘出されれば、その脳サンプルにおいて、成長ホルモン遺伝子、NR4A1、Arc、NXF及びFosからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子の発現量を調べ、健常動物に比較し有意に増大する結果を得た場合には、てんかんであると確認できる。この態様においても、てんかんは、難治てんかん、または側頭葉てんかんであり得る。側頭葉てんかんを含む難治てんかんは、成長ホルモン依存性てんかんであり得る。【００２９】
本発明の第三の実施態様では、本発明の第二の実施態様で提供された組成物を使用した診断方法を提供する。
本発明の第四の実施態様では、成長ホルモンを脳内に連続投与して得られるてんかん研究用の動物、及び成長ホルモンを脳内に連続投与することを含むてんかん研究用の動物の作成方法を提供する。
動物は、ヒト以外の動物であり、例えば、哺乳動物であり、マウス、ラット、ウサギ、イヌを含む。動物は正常動物であってもてんかんモデル動物であってもよい。マウスは、限定はされないが、正常マウス（例えば、ddYマウス、ICRマウス、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス等の近交系マウス）、てんかんモデルマウス（例えば、キンドリングマウス）、トランスジェニックマウス及びノックアウトマウスを含む。
成長ホルモン（growth hormone）は、天然の成長ホルモンでも、遺伝子組換え技術により合成された天然の成長ホルモンと同じアミノ酸配列を持つポリペプチドでもよい。由来も限定されず、例えば、ヒト、マウス、ラット由来のものであり得る。例えば、成長ホルモンとして、遺伝子組換え技術により合成された天然のヒト成長ホルモンと同じアミノ酸配列を持つ成長ホルモン製剤であるジェノトロピン（Genotropin：登録商標）を用いてもよい。
連続投与の回数は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回とすることができ、５回以上、６回以上または７回以上でもよく、投与頻度は毎日、隔日または１回以上/週の投与とすることができる。連続投与のスケジュールの例には、隔日で５回の投与、隔日で６回の投与、５回の連日投与及び６回の連日投与が含まれる。また、投与部位も、当業者が適宜選択でき、海馬、大脳皮質、脳室またはその任意の組み合わせであり得る。脳内投与は、当業者に周知の方法で、カニューレ等を使用して実施され得る。
本発明の第五の実施態様では、本発明の第一の実施態様に係るスクリーニング方法で見出された化合物を含むてんかん治療用または予防用の医薬組成物を提供する。抗成長ホルモン抗体、成長ホルモン受容体拮抗薬、NR4A1、Arc及びNXFを含む成長ホルモンのシグナル伝達を阻害する薬剤及び成長ホルモンの分泌を阻害する薬剤は本発明の第一の実施態様に係るスクリーニング方法で見出されることができる。よって、抗成長ホルモン抗体、成長ホルモン受容体拮抗薬、または成長ホルモンの分泌を阻害する薬剤（例えば、ソマトスタチン、ソマトスタチン誘導体等）を含む組成物は、てんかん治療用または予防用の医薬組成物となり得る。成長ホルモン受容体拮抗薬には、ペグビソマント（Pegvisomant）が含まれる。ソマトスタチン誘導体とは、天然発生のテトラデカペプチドであるソマトスタチン由来の直鎖または環状のポリペプチドを意味し、天然のソマトスタチンが有する成長ホルモン分泌抑制作用を有するものである。例えば、天然ソマトスタチンより、１以上のアミノ酸単位が省略され、そして／または１以上の他のアミノ酸残基によって置換され、そして／または１以上の官能基が１以上の他の官能基によって置換され、そして／または１以上の官能基が１またはいくつかの他の同等の官能基によって置換されたものである。例えば、オクトレオチド、SOM-230、RC-160、BIM23014、RC-15、RC-76、RC-88、RC-101、RC-102、RC-113、RC-114、RC-115、RC-121、RC-138、RC-150、RC-157、RC-161、RC-164、およびこれらの水素付加体が挙げられる（R-Z. Cai, et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:1896-1900参照）。
本発明の医薬組成物は、適切な用量、適切な投与形態で投与されるように、当業者により適宜調製され得る。
【実施例１】
【００３０】
実験材料及び方法
1. 海馬内成長ホルモンまたは成長ホルモン分泌抑制剤の投与がキンドリングマウスに与える影響
1-1. 動物
動物は成熟マウス（Slc:ddY、雄、8週齢、日本SLC）を購入し、１週間の輸送ストレス除去期間を設け、9週齢で手術を行った。一連の動物実験は、大阪府立大学動物実験計画指針に準拠し実施した。一連のスケジュールを(図１-Ａ)に示した。【００３１】
1-2. 手術
マウスにイソフルラン（マイラン製薬株式会社）を用いて吸入麻酔を行った。麻酔の導入は4.0 ml/hr、維持麻酔は1.0 ml/hrで行った。十分に麻酔が効いていることを確認した後、頭部手術野を脱毛し、脳固定台(NARISHIGE)に固定した。術野をヒビテン（住友製薬株式会社）で消毒後、剃刀（FEATHER）で切皮し、右扁桃体基底外側核にステンレス線(COONER WIRE,Cat.NO.AC633)を１本つけたタングステン線電極（0.1Φ×200 mmコート付き、インターメディカル社）を、左側海馬に薬液投与用カニューレを、脳表にステンレス線をつけた小ネジ(Φ2 mm,深さ3mm ,Biotex Kyoto)を２本挿入した。タングステン線電極は挿入前に、先端から0.3 mmの部位までコーティングを取り除き、ブレグマから右方へ3 mm、尾方へ2 mmの部位に歯科用ドリル（Φ0.6 mm ,HYPER TECII,MORITA）で頭蓋骨に穴を開け、硬膜からまっすぐ腹側方向に4.5 mmまでゆっくりと挿入していき、周りをセメント（フジＩ, ジーシー社）で簡易に固定した。また、ステンレス線が２本ついた小ネジ（Φ1.0 mm）をブレグマから右側に1.5 mm、吻方に1.5 mmの部位に歯科用ドリル（Φ0.6 mm）で頭蓋骨に穴を開け、脳表に挿入しセメント（フジＩ, ジーシー社）で簡易に固定した。次に、ブレグマから左側に1.5 mm、吻方に1.5 mmの部位に歯科用ドリル（Φ0.6mm）で頭蓋骨に穴を開け、脳表にステンレス線を１本つけた小ネジ（Φ1.0 mm）を挿入した。次に、タングステン電極と右側に挿入した小ネジの両極につないだ銅線をハンダでキンドリング刺激用ソケットとつないだ。また、２つの小ネジの導線をハンダで脳波測定用ソケットとつないだ。そして、薬液投与用カニューレはブレグマから左方へ1.5 mm、尾方へ2 mmの部位に歯科用ドリル（Φ0.6 mm）で頭蓋骨に穴を開け、硬膜からまっすぐ腹側方向に2.5 mmまでゆっくりと挿入し、周りをセメント（フジＩ, ジーシー社）で簡易に固定した。最後に全体を歯科用セメント（ジーシーユニファストＩＩ, ジーシー社）で完全に固定した。手術中は25 mg/ml Kanamycin（ナカライ,Cat.NO.19860-44）,0.85% NaClで術野を拭き感染を防ぐよう心掛けた。【００３２】
1-3. 薬液投与
薬液投与は刺激開始の5日前から開始し、2日に1回１μl、0.5μl/minの速度で、薬液投与用カニューレを用いて、計7回投与した。薬物は遺伝子組換え天然型ヒト成長ホルモン製剤のGenotropin（登録商標）(ファイザー株式会社Cat.NO.872412)と持続性ソマトスタチンアナログ製剤のSandostatin(ノバルティスファーマ株式会社Cat.NO.872499)を使用し、薬液１μl中にGenotropin（登録商標）は542 pmol、Sandostatin（登録商標）は43 pmol含有するように調節した。コントロールとしてGenotropin（登録商標）の緩衝溶液(40 mg/ml D-mannitol,2 mg/ml glycine,0.02 mM phosphate buffer pH6.9)とSandostatin（登録商標）の緩衝溶液(45 mg/ml D-mannitol,3.4 mg/ml lactic acid-NaHCO3 pH4.5)を同条件で投与した。【００３３】
1-4. 刺激および脳波計測
刺激は電気刺激装置（SEN-3301, 日本光電）とアイソレーター（SS-202J, 日本光電）を用いて1日1回、次に示す条件でおこなった(周波数-60Hz、刺激強度-450μA、duration-200μsec、刺激時間-2sec)。ただし刺激強度はマウスの反応をみながら30μAずつ上げていった。
脳波計測は無麻酔下、有線の電極を介し計測した。脳波計測開始１分後にキンドリング刺激をおこない、その後５分間脳波の計測と行動を観察した。【００３４】
1-5. てんかん発作獲得過程の評価
てんかん発作獲得過程を評価するため、次の4つの指標(ステージ進行、フリーズ持続時間、棘波数、てんかん発作後発射の持続時間)について計測し、統計学的解析をおこなった(Excel,StatView-J 5.0)。(Ｉ)ステージとはRacineの評価法（Azcoitia,I., Perez-Martin, M., Salazar, V., Castillo, C., Ariznavarreta, C.,Garcia-Segura,L.M.,Tresguerres,J.A.F.:Growthhormoneprevents neuronal loss in the aged rat hippocampus  :Neurobiology of Aging 26 (5), pp. 697-703）の変法に準じ、てんかん発作獲得進行過程を5つのステージに分類したものである（Kato K, Masa T, Tawara Y, Kobayashi K, Oka T, Okabe A, Shiosaka S. Kato K, Masa T, Tawara Y, Kobayashi K, Oka T, Okabe A, Shiosaka S.: Dendritic aberrations in the hippocampal granular layer and the amygdalohippocampal area following kindled-seizures. : Brain Res. 2001 May 18;901(1-2):281-95.）。ステージ1：フリーズする時間が5秒以下で、顔面の痙攣が観察される。ステージ2：フリーズが観察される時間が5秒以上15秒以下である。ステージ3：フリーズが観察される時間が15秒以上である。ステージ4：フリーズ後、全身の軽度痙攣及び尾の緊張による挙上が観察される。ステージ5：全身の痙攣、転倒及び泡ふきが観察される。フリーズとはマウスの常動行動である探索行動の消失のことを指す。ステージ5の状態が3日間連続して見られたものをキンドリングマウスとした。(ＩＩ) フリーズ持続時間とは、計測時間内にマウスがフリーズした時間の長さである。(ＩＩＩ)てんかん特有の脳波パターンである棘波数を測定した。(ＩＶ)棘波の発生している時間を測定した。【００３５】
1-6. Total RNA抽出に用いる脳のサンプリング
刺激後、頸椎脱臼で安楽死させ断頭した後、脳を素早く摘出し、（１）前脳大脳皮質（bregma -0.9〜-5.2 mm）、（２）海馬及び側・後頭葉大脳皮質（bregma 4.0〜-0.9 mm）、（３）視床の3領域に分け液体窒素下にて凍結し、Total RNA抽出まで-80 ℃で保存した。【００３６】
2. ddYマウスの海馬内への薬液投与
2-1. 動物
動物は成熟マウス（Slc:ddY、雄、７週齢、日本SLC）を購入し、７日間の輸送ストレス除去期間を設けたあと手術を行い、７日間の手術ストレス除去期間を設けた後、実験を開始した。一連の動物実験は、大阪府立大学動物実験計画指針に準拠し実施した。一連のスケジュールを（図１-Ｂ）に示した。【００３７】
2-2. 手術
マウスにイソフルランを用いて吸入麻酔を行った。麻酔の導入は4.0 ml/hr、維持麻酔は1.0 ml/hrでおこなった。麻酔が十分に効いていることを確認した後、頭部手術野を脱毛し、脳固定台に固定した。術野をヒビテンで消毒後、剃刀で切皮し、薬液投与用カニューレをブレグマから左方へ1.5 mm、尾方へ2 mmの部分に歯科用ドリル（Φ0.6 mm）で頭蓋骨に穴を開け、硬膜からまっすぐ腹側方向に2.5 mmまでゆっくり挿入していき、周りをセメントで簡易に固定した。最後に歯科用セメントで完全に固定した。手術中は25 mg/ml Kanamycin, 0.85% NaClで術野を拭き感染を防ぐよう心掛けた。【００３８】
2-3. 薬液投与
薬液投与は、2日に1回1 μlを、0.5 μl/minの速度で、薬液投与用のカニューレを用いて計6回投与した。薬物はGenotropin（登録商標）と成長ホルモン受容体拮抗剤のSomavert（登録商標）(ファイザー株式会社)を使用した。薬液１μl中にGenotropin（登録商標）は542 pmol、Somavert（登録商標）は545 pmol含有するように調節した。また、コントロールとしてGenotropin（登録商標）, Somavert（登録商標）の緩衝液(40 mg/ml D-mannitol,2 mg/ml glycine,0.02 mM phosphate buffer pH7.1)を用いた。【００３９】
2-4.Total RNA抽出に用いる脳のサンプリング
刺激後、頸椎脱臼で安楽死させ断頭した後、脳を素早く摘出し（ｉ）前脳大脳皮質（bregma -0.9〜-5.2 mm）、（ｉｉ）海馬及び側・後頭葉大脳皮質（bregma 4.0〜-0.9 mm）、（ｉｉｉ）視床の3領域に分け、液体窒素下にて凍結し、Total RNA抽出まで-80 ℃にて保存した。【００４０】
3. 遺伝子発現量測定のためのReal time RT-PCR
3-1 Total RNAの抽出
Total RNAの抽出は、全工程をRNase freeの状況下でRNeasy Lipid Tissue Mini Kit（QIAGEN,Cat.No.74804）を用いておこなった。サンプリング後、凍結していた脳とQIAzol Lysis reagentを混ぜてホモジナイザー（DIAX 100, Heidolph）で攪拌した。次にchroloformを加えてよく混濁し、14,500 rpm, 4 ℃で15分間遠心した。遠心後3層に分離し、RNAが含まれている上層（透明層）をエッペンチューブに移し替え、そこに同量の70% ethanolを加え、よく混和した。RNeasy Mini Spin Columnに上記の溶液を移し11,000 rpm, 室温で15秒間遠心し、その後Buffer RW1, Buffer RPEでカラムを洗浄した。最後にRNase-free水でRNAを溶出した。【００４１】
3-2 cDNA合成
精製Total RNA 1 μgにMIX buffer（1x conc. Buffer [10 mM Tris-HCl, pH7.5, 20 mM NaCl, 20μM EDTA, 0.002% Nonidet P-40, 10% glycerol]（TOYOBO）, 40 mM dithiothreitol（ナカライテスク）, 0.5 mM dNTP（TOYOBO）, 8 unit RNase inhibitor（TOYOBO）, 200 ng random hexadeoxyribonucleotides primer（TAKARA））、及び50単位の逆転写酵素（ReverTraAce, TOYOBO）を加えた後、37℃で1時間反応させ、cDNAを合成した。その後95℃で3分間反応させ、酵素反応を止め、すぐに氷冷した。十分に冷えた事を確認した後、-80℃で保存した。本実験でReal time PCRの為にcDNAを合成したサンプル及び、脳部位は（図８）に示した。【００４２】
3-3 Real time PCR
3-3-1. TaqMan（登録商標）プローブを用いたReal time PCR
成長ホルモンをコードするmRNA配列を検索し、その配列を特異的にコードする約150bpの配列を決定した。そして、その両端を認識する約20塩基のforward / reverseプライマー及び、蛍光色素としてFAMあるいはVICをラベルしたProbe(Applied Biosystems)をプライマー作成ソフト(Primer Express 4.0, Applied Biosystems)用いて作成し使用した（図９）。合成cDNAにPremix Ex Taq(Takara)、800 nMのプライマー、200 nMのプローブ、ウェル間の蛍光シグナル補正を行うROX Reference Dye(Takara)を混合し、正確なデータを得る為、それぞれ3つずつ同じサンプルを調整し以下に示す条件でReal time RT-PCRを実施した(ABI7300; Applied Biosystems, 条件：95℃-10秒を1サイクル,95℃-5秒→60℃-31秒［この時カメラで蛍光強度を測定］を50サイクル)。解析には4段階に希釈した検量線用サンプルを用いて検量線を作成し、各サンプルのcDNA量を評価した。また、内在性コントロールとして各サンプル中のglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(以下Gapdh)のcDNA量を計測した。内在性コントロールは組織や細胞中に共通して一定量発現する遺伝子である。各ウェル内の標的遺伝子の発現量を、同じウェル内のGapdhの発現量で標準化する事でサンプル間の濃度差を補正する事が出来る。データの解析に7300 Syastem SDS Software (Applied Biosystems)を用いた。得られた結果から統計学的解析を行った（Excel,StatView-J5.0）。【００４３】
3-3-2. SYBR（登録商標） Greenを用いたReal time PCR
ジーンチップアレイ（Affymetrix,GeneChip（登録商標） Mouse Genome 430 2.0 Array）を用いて、てんかん発症後に発現上昇を示す遺伝子をスクリーニングした。その結果、成長ホルモンに加え、著しい発現上昇を示した4種の遺伝子(NR4A1,Arc（Activity-regulated cytoskeleton-associated gene）,NXF（Novel Basic Helix-Loop-Helix-PAS Factor）,Fos)について、遺伝子番号から目的の遺伝子の塩基配列を検索し、その配列を基に目的の遺伝子を特異的にコードする約150bpの配列を決定した。そして、その両端を認識する約20塩基のforward / reverseプライマー（Sigma Aldrich）をプライマー作成ソフトを用いて作成し使用した。合成cDNAにPower SYBR（登録商標） Green PCR Master Mix （Applied Biosystems）と1μMの設計したプライマー（図９）を混合し、正確なデータを得る為、それぞれ3つずつ同じサンプルを調整し以下に示す条件でReal time RT-PCRを実施した(ABI7300; Applied Biosystems, 条件：95℃-10分を1サイクル、95℃-15秒→60℃-1分［この時カメラで蛍光強度を測定］を50サイクル)。また、PCR反応後にmelt curveを以下の条件で作成し増幅産物の融解温度が1点に集中する事を確認した(60℃-1分を1サイクル、60℃-10秒を70サイクル, 0.5℃上昇/サイクル)。解析には4段階に希釈した検量線用サンプルを用いて検量線を作成し、各サンプルのcDNA量を計測した。また、各ウェルの濃度差を補正する為にGapdhの発現量も測定した。データの解析に7300 Syastem SDS Software (Applied Biosystems)を用いた。得られた結果から統計学的解析を行った（Excel,StatView-J5.0）。【００４４】
4. 結果
本研究では、成長ホルモンがてんかん発作獲得に連動する事を確認した後、海馬内への成長ホルモン投与の影響を２つの側面から解析した。
まず、成長ホルモンがてんかん発作獲得過程の、ステージ進行、フリーズ時間、棘波数、棘波持続時間に影響するか調べた。そして、成長ホルモンがてんかん発作獲得促進作用を持つ事を明らかにした。
続いて、海馬内成長ホルモンが脳内分子の発現変動に与える影響を解析し、いくつかのてんかん発症関連分子の発現が変動する事を明らかにした。以下に詳細を述べる。【００４５】
4-1.てんかん発作獲得に連動した成長ホルモンmRNAの発現変動（図２）
キンドリング群、stage3群、sham群間での成長ホルモンの発現変動をリアルタイムPCR法により計測した結果、sham群 に比べstage3群で19.0倍に、stage3群に比べキンドリング群で4.8倍、sham群に比べキンドリンング群で87.8倍もの発現上昇が確認された。これは、てんかん発作を獲得していく過程で徐々に脳内の成長ホルモンmRNA発現量が増加している事を示している。このような現象は、海馬及び側・後頭葉大脳皮質、前脳大脳皮質並びに視床のそれぞれについて認められた。【００４６】
4-2.てんかん発作獲得過程に対するGenotropin（登録商標）、Sandostatin（登録商標）投与の影響（図３）
まずGenotropin（登録商標）のてんかん発作獲得への影響を調べた。てんかん発作の指標である刺波の数と、その持続時間は刺激期間中の後半（11日以降）で特に増大した。（図３-Ａ,Ｂ）さらにフリーズ時間は刺激期間を通じて増加した（図３-Ｃ）。その結果、ステージの進行も亢進したと考えられる（図３-Ｄ）。一方、Sandostatin（登録商標）投与群の刺波の数、持続時間は変化しなかった（図３-Ｅ,Ｆ）。しかし、フリーズ時間は刺激期間を通じて減少した（図３-Ｇ）。その結果ステージの進行速度が低下したと考えることが出来る（図３-Ｈ）。以上の結果は、海馬内の成長ホルモンの増加が棘波数増加を伴うてんかん発作獲得促進を、減少が棘波数変化を伴わない発作獲得遅延を誘導する事を示している。【００４７】
4-3. Genotropin（登録商標）、Somavert（登録商標）投与によるてんかん発症関連分子の発現変動
4-3-1 NR4A1 mRNAの発現変動（図４）
キンドリング群,stage3群,sham群間での発現変動を解析した結果、キンドリング群はstage3群に比べて2.2倍、sham群に比べて2.1倍に発現が上昇した。この結果はNR4A1 mRNAの発現増加が、てんかん獲得過程ではなく獲得後に上昇する事を示している（図４-Ａ）。
次に、Genotropin（登録商標） 1回投与群, Buffer 1回投与群間での発現変動を計測した結果、各群の間に有意な差はなかった。最後に、Genotropin（登録商標） 6回投与群, Somavert（登録商標）6回投与群, Buffer6回投与群間で発現変動を計測した結果、Genotropin（登録商標） 6回投与群はSomavert（登録商標）6回投与群に比べて3.0倍、 Buffer 6回投与群に比べて2.6倍発現が増加した（図４-Ｂ,Ｃ）。この結果は、NR4A1 mRNAの発現が一過性の成長ホルモンによる誘導では亢進しないことを示している。【００４８】
4-3-2. Arc mRNAの発現変動（図５）
キンドリング群,stage3群,sham群間での発現変動を計測した結果、キドリング群はstage3群に比べて2.3倍、sham群に比べて2.4倍に発現が上昇した。この結果はArc mRNAの発現増加が、てんかん獲得過程ではなく獲得後に上昇することを示している（図５-Ａ）。
次に、Genotropin（登録商標） 1回投与群, Buffer 1回投与群間での発現変動を計測した結果、各群の間に有意な差はなかった。最後に、Genotropin（登録商標） 6回投与群, Somavert（登録商標） 6回投与群, Buffer 6回投与群間で発現変動を計測した結果、Genotropin（登録商標） 6回投与群はSomavert（登録商標） 6回投与群に比べ4.3倍, Buffer 6回投与群に比べ2.0倍に発現が増加した（図５-Ｂ,Ｃ）。以上の結果より、成長ホルモンによるArc mRNAの発現誘導パターンは、NR4A1と類似であることがわかった。【００４９】
4-3-3. NXFの発現変動（図６）
まずキンドリング群,stage3群,sham群間での発現変動を計測した結果、キンドリング群はstage3群に比べて17.3倍、sham群に比べて6.6倍に発現が上昇した。この結果はNXF mRNAの発現増加が、てんかん獲得後だけに上昇することを示している（図６-Ａ）。
次に、Genotropin（登録商標） 1回投与群, Buffer 1回投与群間での発現変動を計測した結果、各群の間に有意な差はなかった。最後に、Genotropin（登録商標） 6回投与群, Somavert（登録商標） 6回投与群, Buffer 6回投与群間で発現変動を計測した結果、Somavert（登録商標） 6回投与群はBuffer 6回投与群に比べて約1/5に発現が減少した（図６-Ｂ,Ｃ）。【００５０】
4-3-4. Fosの発現変動（図７）
まずキンドリング群,stage3群,sham群間での発現変動を計測した結果、キンドリング群はstage3群に比べて4.6倍、sham群に比べて4.3倍に発現が上昇した。この結果はFos mRNAの発現増加が、ステージ３より後に上昇することを示している（図７-Ａ）。このような現象は、海馬及び側・後頭葉大脳皮質、前脳大脳皮質並びに視床のそれぞれについて認められた。
次に、Genotropin（登録商標） 1回投与群、 Buffer 1回投与群間での発現変動を計測した結果、Genotropin（登録商標） 1回投与群は、Buffer 1回投与群に対して3/5に発現が減少した。最後に、Genotropin（登録商標） 6回投与群, Somavert（登録商標） 6回投与群, Buffer 6回投与群間で発現変動を計測した結果、各群の間に有意な差はなかった（図７-Ｂ,Ｃ）。【００５１】
考察
本研究では海馬内成長ホルモンの役割を解明する事を目的とした。まず、てんかん発作獲得により、脳内の成長ホルモンmRNAの発現が上昇する事を確認した。この発現上昇の結果から、てんかん発作に対する成長ホルモンの影響を解析する必要があると考え、海馬内への薬液投与を伴ったてんかん刺激を行った。その結果、Gh海馬内投与により、棘波数の少ない段階から、てんかん発症前症状が出現するようになり、ステージ進行が早まった。さらにはてんかん発症後の棘波数の増加を観察した。その一方で、Sandostatin（octreotide）の投与により、ステージの進行が抑制されたが、棘波数には影響を与えなかった。これらの結果から、Ghは、海馬において、てんかん特有の脳波の出現に影響するのではなく、てんかん発症の閾値を下げることで、てんかん発作を誘導するものと考えられた。  【００５２】
次に本研究では、てんかん発症を含む、成長ホルモンの脳生理学的作用がどのような分子メカニズムで生じるのかを調べるために、リアルタイムPCR法を用いた。まず、解析の標的としたNR4A1,Arc,NXF,Fosの4種の遺伝子のmRNAが、てんかん獲得過程で発現上昇を示すことを明らかにした。そこで、これら4種のmRNA発現が成長ホルモンのシグナル系の支配下にあるかどうかを調べた。本研究では、まずはてんかん誘導刺激を行わない薬剤投与（１回もしくは６回）がこれらの分子のmRNA発現を誘導するかどうかを検討することにした。具体的に、薬剤1回投与は海馬における成長ホルモンの一過性の発現上昇を模倣していると考えられる。また、薬剤6回投与は海馬における成長ホルモンあるいは成長ホルモン受容体拮抗薬の持続的な高い発現を模倣していると考えられる。 
結果として、成長ホルモンの持続的投与はNR4A1 mRNA及びArc mRNAの発現上昇を誘導した。てんかんモデル動物であるキンドリングマウスにおいて成長ホルモンが持続的に高発現していること、NR4A1 mRNA及びArc mRNAの発現が上昇していることを考慮すると、てんかんの病態において、成長ホルモンの下流でNR4A1 mRNA及びArc mRNAの発現が上昇すること、さらには、成長ホルモンを持続的投与したマウスが、てんかんの病態における、成長ホルモンシグナル伝達亢進の状態を反映することが示された。そして、成長ホルモンの持続的投与によるNR4A1及び/またはArcの発現上昇を抑制する薬剤がてんかん治療薬または予防薬となり得ることが示された。【００５３】
また、成長ホルモン受容体拮抗薬の持続的投与によりNXF mRNAの発現減少が誘導された。この結果から、NXFが成長ホルモン受容体を介するシグナル系に存在する事が示された。また、この結果から、正常状態においても、脳内でＧｈが分泌されること、そして、分泌されたＧｈにより、NFXを介するシグナルが伝達されることが示された。成長ホルモンの分泌を抑制するSandostatin（登録商標）の持続的投与によりキンドリングマウスにおいててんかん発症が抑制されることから、NXF mRNAの発現を低下させる薬剤がてんかん治療薬または予防薬となり得ることが示された。【００５４】
Fos mRNAの発現は成長ホルモンの６回投与により変化せず、成長ホルモンの持続的暴露によるFos遺伝子の発現の可塑的な変化は見られなかった。Fos遺伝子は、immediate early gene (IEGs)としてあらゆる刺激に対して非特異的に発現が亢進する傾向があることを考慮すると、キンドリングマウスで認められたFos遺伝子の発現増加も成長ホルモンの持続的な暴露による可塑的なものでなく、成長ホルモンに直接的に関係しないものと考えられた。よって、成長ホルモンシグナル系を標的とするてんかん治療薬または予防薬は、必ずしもFos遺伝子の発現に影響を与える必要がないこと、また、該治療薬または予防薬の候補として、Fos遺伝子の発現に影響を与えない薬剤を選択できることが明らかとなった。【００５５】
本出願の優先権主張の基礎となる出願は日本国特許出願第2009-026191であり、引用によりその全内容が本出願に含まれる。また、関連出願であるPCT/JP2009/050626についても、引用によりその全内容が本出願に含まれる。
【図１】
2010090285.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
2010090285000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月25日(2010.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）成長ホルモンをヒト以外の動物の脳内へ連続投与する工程、
（ｉｉ）被検化合物を、前記成長ホルモンを投与する、または投与した動物へ投与する工程、及び
（ｉｉｉ）成長ホルモン及び被検化合物を投与した動物の脳実質における、ＮＲ４Ａ１、Ａｒｃ及びＮＸＦからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のｍＲＮＡの発現量を定量する工程を含む、てんかん治療薬または予防薬をスクリーニングする方法。
【請求項２】
さらに、（ａ）成長ホルモン及び被検化合物を投与した動物の脳実質における、Ｆｏｓ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を定量する工程、及び（ｂ）Ｆｏｓ遺伝子のｍＲＮＡの発現量に影響を与えない化合物を選択する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）被検化合物をヒト以外の動物に投与する工程、
（ｉｉ）前記動物の脳実質における、成長ホルモン遺伝子、ＮＲ４Ａ１、Ａｒｃ及びＮＸＦからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のｍＲＮＡの発現量を定量する工程、
（ｉｉｉ）前記動物の脳実質における、Ｆｏｓ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を定量する工程、及び
（ｉｖ）Ｆｏｓ遺伝子のｍＲＮＡの発現量に影響を与えない化合物を選択する工程を含む、てんかんの治療薬または予防薬をスクリーニングする方法。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
てんかんモデル動物を用いる、請求項３または１３−１５のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
キンドリングマウスを用いる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
さらに正常非ヒト動物を用いる、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
動物が、マウスである請求項１−３、５−７および１２−１５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
てんかんが難治てんかんまたは側頭葉てんかんである、請求項１−３、５−８および１２−１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ｍＲＮＡの発現量の定量を、定量的ＲＴ−ＰＣＲまたはＤＮＡチップにより行う、請求項１−３、５−９および１２−１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
脳実質が、海馬及び側・後頭葉大脳皮質、前脳大脳皮質、並びに視床からなる群から、少なくとも１つ選択される部位の実質である、請求項１−３、５−１０および１２−１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ＮＲ４Ａ１、Ａｒｃ及びＮＸＦ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を同時に定量する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
ＮＲ４Ａ１、Ａｒｃ及びＮＸＦ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を同時に定量する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）被検化合物をヒト以外の動物に投与する工程、及び
（ｉｉ）前記動物の脳実質における、ＮＲ４Ａ１、Ａｒｃ及びＮＸＦ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を定量する工程、
を含む、てんかんの治療薬または予防薬をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
（ｉ）被検化合物をヒト以外の動物に投与する工程、及び
（ｉｉ）前記動物の脳実質における、成長ホルモン遺伝子及びＮＸＦからなる群から少なくとも１つ選択される遺伝子のｍＲＮＡの発現量を定量する工程を含む、てんかんの治療薬または予防薬をスクリーニングする方法。
【国際調査報告】
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2010090285.tif 000012
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