【事件の表示】
　特許第３０７９１８３号「褐藻分解物の製造法」の請求項１、２に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３０７９１８３号の請求項１ないし２に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第３０７９１８３号の請求項１乃至２に係る発明についての出願は、平成３年８月３日に特願平３−１９４５８０号として出願され、平成１２年６月２３日にその特許の設定登録がなされ、その後、石原庸男より特許異議申立がなされ、２回取消理由通知がなされ、平成１３年１２月２６日に訂正請求がなされたものである。
　
II．訂正請求
１．訂正の内容
(1)特許請求の範囲の請求項１に係る記載「アルテロモナス属に属する微生物によって生産される褐藻類分解酵素を用いて褐藻類を分解することを特徴とする褐藻分解物の製造法。」を、「アルテロモナス属に属する微生物によって生産される褐藻類分解酵素を用いて、褐藻類からアルギン酸を抽出することなく、褐藻類を直接分解し、アルギン酸オリゴ糖及び糖以外の低分子化合物を含有する可溶化物を得ることを特徴とする褐藻分解物の製造法。」と訂正する。
(2)明細書段落【0006】の「本発明は、・・・提供するものである。」を、「本発明は、上記知見に基づいてなされたもので、アルテロモナス属に属する微生物によって生産される褐藻分解酵素を用いて、褐藻類からアルギン酸を抽出することなく、褐藻類を直接分解し、アルギン酸オリゴ糖及び糖以外の低分子化合物を含有する可溶化物を得ることを特徴とする褐藻分解物の製造法を提供するものである。」と訂正する。  
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正事項(1)は、訂正前の請求項１に「褐藻類からアルギン酸を抽出することなく、」、「直接」及び「アルギン酸オリゴ糖及び糖以外の低分子化合物を含有する可溶化物を得る」という事項を直列的に付加するものであるから特許請求の範囲の減縮に該当し、同(2)は、同(1)の訂正に伴うものであり、また、これらの訂正は新規事項に該当せず、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
３．むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法１２０条の４,２項及び同条３項で準用する１２６条２項及び３項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
　
III．特許異議申立
１．特許異議申立書の理由の概要
　特許異議申立人は、甲第１号証乃至甲第３号証を提出し、訂正前の本件請求項１に係る発明は、甲第１号証に記載された発明である、或いは、甲第１号証及び甲第３号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものである、並びに、同請求項２に係る発明は、甲第１号証乃至甲第２号証に記載された発明である、或いは、甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条１項３号或いは同条２項の規定により特許を受けることができないと主張している。
　　　　　　　　　記
甲第１号証：特開昭６３−２１４１９２号公報
甲第２号証：特公平５−２８５９７号公報
甲第３号証：丸尾文治ら監修「酵素ハンドブック」（1982年12月1日朝倉書店発行）706〜707頁
２．甲各号証の記載内容
　甲第１号証は、「アルギン酸オリゴ糖の製造法」に関するもので、
(a)「(1)アルギン酸もしくはその塩を含む物質にアルギン酸リアーゼを作用させてアルギン酸オリゴ糖を製造するにあたり、反応液の２３０nmの吸光度（・・・）が３０〜６０となったとき反応を停止することを特徴とするアルギン酸オリゴ糖の製造法。
(2)アルギン酸リアーゼがアルテロモナス属に属する微生物に由来する酵素である特許請求の範囲第１項記載の方法。
(3)アルテロモナス属に属する微生物がアルテロモナス・エスピーＬＢ102株（FERMP-9218）である特許請求の範囲第２項記載の方法。」（特許請求の範囲の項）、
(b)「本菌を用いてアルギン酸リアーゼを生産するには、たとえばアルギン酸ソーダ０．５％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．２５％、MgSO4・７Ｈ2Ｏ０．６４％、NaCl０．９６％、海水２０％を含有する培地で本菌を２５℃、２５０rpmの条件で２４時間培養すればよく、その培養濾液をそのまま酵素液として使用できる。」（３頁左上欄6〜12行）、
(c)「上記アルギン酸リアーゼを用いてアルギン酸もしくはその塩からアルギン酸オリゴ糖を製造する方法について、原料としてアルギン酸ソーダを用いる場合を例にして述べると、アルギン酸ソーダ１〜５部に水を１００部加えてアルギン酸を溶解後、酵素の至適pHにpHを調整し、アルギン酸リアーゼをアルギン酸ソーダ１ｇ当たり１００〜４０００単位添加して酵素の作用至適温度で２４〜４８時間反応させることによって目的とするアルギン酸オリゴ糖を調整することができる。」（３頁右上欄6〜15行）、
(d)「さらに、アルギン酸を含有する海藻類に直接アルテロモナス属に属し、アルギン酸リアーゼ産生能を有する微生物を作用させることによってもアルギン酸オリゴ糖を製造することができる。例えば昆布２４部に１％Na2CO3を含む海水４００部を添加し、９０〜１００℃に１時間保持した後、これを磨砕し、２％HCl溶液２００部を添加して中和し、次いでアルテロモナス・エスピーＬＢ102株を接種し、２５℃で８〜２４時間培養したのち、温度を４０℃に上昇させ、さらに２４〜４８時間反応させると、反応液の２３０nmにおけるＥ1%1cm値が３０〜６０に達し、目的とするアルギン酸オリゴ糖が得られる。」（３頁右下欄7〜19行）が記載されている。
　甲第２号証は、甲第１号証に係る発明に対応する公告公報に係り、アルギン酸リアーゼの生産菌であるアルテロモナス属に属する微生物の詳細な菌学的性質が記載されている。
　甲第３号証には、「4.2.2.3 Alginate lyase」の項に、アルギン酸リアーゼに係る系統名、反応、測定、所在及び性質についての記載がある。
３．判断
（本件発明１について）
　訂正された請求項１に係る発明（以下、「本件発明１」という。）は、「アルテロモナス属に属する微生物によって生産される褐藻類分解酵素を用いて、褐藻類を分解することによる褐藻分解物の製造法」において、「褐藻類からアルギン酸を抽出することなく、褐藻類を直接分解し、アルギン酸オリゴ糖及び糖以外の低分子化合物を含有する可溶化物を得ること」を特徴とするものである。
　しかるに、甲第１号証の摘示事項(a)、(b)によると、甲第１号証には、アルテロモナス属に属する微生物によって生産される培養濾液からなる酵素液を用いて褐藻類を分解することにより褐藻分解物を製造することについての記載はある。
　しかし、摘示事項(d)の記載によると、甲第１号証においては、酵素処理に先立ち、「昆布２４部に１％Na2CO3を含む海水４００部を添加し、９０〜１００℃に１時間保持した後、これを磨砕し、２％HCl溶液２００部を添加して中和」する工程を有するところ、「昆布に１％Na2CO3を含む海水を添加」することは、「褐藻類からアルギン酸を抽出すること」に他ならないから、この点で「褐藻類からアルギン酸を抽出することなく、褐藻類を直接分解」する本件発明１と明らかに相違する。
　そして、甲第１号証には、「褐藻類からアルギン酸を抽出することなく、褐藻類を直接分解」し得ることについて教示するところはなく、また、甲第３号証には、同じく「褐藻類からアルギン酸を抽出することなく、褐藻類を直接分解」し得ることについての記載及び示唆すらないのであるから、甲第１号証及び甲第３号証に記載の事項に基づいて、本件発明１のような構成を採用することは、当業者にとって容易なことであるとはいえない。
　したがって、本件発明１は、甲第１号証に記載された発明ではなく、また、甲第１号証及び甲第３号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものではないので、特許法２９条１項３号、或いは同条２項の規定に違反するものではない。
（本件発明２について）
　訂正された請求項２に係る発明（以下、「本件発明２」という。）は、「アルテロモナス属に属する微生物が、アルテロモナス・エスピー（Alteromonas sp.）No.4778である請求項１記載の褐藻分解物の製造法。」であるところ、「アルテロモナス・エスピー（Alteromonas sp.）No.4778」は、甲第１号証及び甲第２号証に具体的に開示されている「アルテロモナス・エスピーＬＢ102株」と比較して、菌学的性質、すなわち、「カタラーゼテスト」並びに「キシロース」及び「マンノース」における酸生成能について相違しており、しかも、本件発明２に係る「アルテロモナス・エスピー（Alteromonas sp.）No.4778」は、「褐藻類からアルギン酸を抽出することなく、褐藻類を直接分解」するという格別の効果を奏するものであるから、本件発明２は、甲第１号証乃至甲第２号証に記載に記載された発明であるとはいえず、また甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
　したがって、本件発明２は、甲第１号証乃至甲第２号証に記載された発明ではなくまた、甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものではないので、特許法２９条１項３号、或いは同条２項の規定に違反するものではない。
４．まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明１乃至２についての特許を取り消すことはできない。
　また他に本件発明１乃至２についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１４年１月１１日（２００２．１．１１）
【訂正の要旨】
（訂正の要旨）
（１）特許請求の範囲の請求項１に係る記載「アルテロモナス属に属する微生物によって生産される褐藻類分解酵素を用いて褐藻類を分解することを特徴とする褐藻分解物の製造法。」を特許請求の範囲の減縮を目的として、「アルテロモナス属に属する微生物によって生産される褐藻類分解酵素を用いて、褐藻類からアルギン酸を抽出することなく、褐藻類を直接分解し、アルギン酸オリゴ糖及び糖以外の低分子化合物を含有する可溶化物を得ることを特徴とする褐藻分解物の製造法。」と訂正する。
（２）明細書段落【０００６】の「本発明は、・・・提供するものである。」を明りょうでない記載の釈明を目的として、「本発明は、上記知見に基づいてなされたもので、アルテロモナス属に属する微生物によって生産される褐藻分解酵素を用いて、褐藻類からアルギン酸を抽出することなく、褐藻類を直接分解し、アルギン酸オリゴ糖及び糖以外の低分子化合物を含有する可溶化物を得ることを特徴とする褐藻分解物の製造法を提供するものである。」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
褐藻分解物の製造法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　アルテロモナス属に属する微生物によって生産される褐藻分解酵素を用いて
、褐藻類からアルギン酸を抽出することなく、
直接
し、アルギン酸オリゴ糖及び糖以外の低分子化合物を含有する可溶化物を得る
　【請求項２】　アルテロモナス属に属する微生物が、アルテロモナス・エスピー（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）Ｎｏ．４７７８である請求項１記載の褐藻分解物の製造法。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は、褐藻分解物の製造法、詳しくは、微生物の生産する酵素を用いて褐藻類（褐藻類由来の多糖類等）を分解させる方法に関するものである。
　【０００２】
　【従来の技術】
　褐藻類の主要構成成分の一つに多糖類であるアルギン酸がある。このアルギン酸は、褐藻類から水、アルカリなどを用いた抽出法により得られている。上記アルギン酸は、その主構成分子としてＤ−マンヌロン酸及びＬ−グルロン酸を含むもので、このアルギン酸を低分子化すれば、オリゴ糖を得ることができると考えられる。上記オリゴ糖の製造法としては、前記のアルギン酸を酸または酵素で分解することにより得る方法が開発されている。
　【０００３】
　【発明が解決しようとする課題】
　しかしながら、上記のように褐藻類から一旦アルギン酸を抽出し、そのアルギン酸からオリゴ糖を得る工業的方法は、確立されておらず、褐藻類由来のオリゴ糖は、市販されるに至っていない。
　また、褐藻類には、糖以外の有効成分（生理活性物質）が含まれているが、現在、一般に用いられている酸、アルカリ、有機溶媒を用いた抽出法では、それらの有効成分のすべてを、その有効性を低下させずに抽出することは不可能であるという問題もあった。
　【０００４】
　従って、本発明の目的は、褐藻類に属する海藻であるミツイシコンブ、ワカメ、ヒジキなどから直接、褐藻分解物を製造する方法を提供することにある。
　【０００５】
　【課題を解決するための手段】
　本発明者等は、種々の検討を行った結果、海藻を常食にしている魚介類の腸管及び海藻に付着している細菌から、コンブを唯一の炭素源としてスクリーニングを実施した結果、三陸大谷海岸で採取した砂泥より分離した微生物（本菌株）の生産する酵素である褐藻分解酵素を用いることにより、上記目的を達成し得ることを知見した。
　【０００６】
　本発明は、上記知見に基づいてなされたもので、アルテロモナス属に属する微生物によって生産される褐藻分解酵素を用いて
、褐藻類からアルギン酸を抽出することなく、
直接
し、アルギン酸オリゴ糖及び糖以外の低分子化合物を含有する可溶化物を得る
　以下、本発明の褐藻分解物の製造法について詳述する。
　先ず、本発明の褐藻分解物の製造法で用いる褐藻分解酵素を生産する微生物（本菌株）について説明する。
　【０００７】
　上記微生物の形態学的性質及び生理学的性質は、下記の表１に示す通りである。
　上記表１に示す菌株の性質に基づいて、清水らの方法〔海洋微生物研究法、学会出版センター、２２８〜２３９（１９８５）〕に従って同定を行った結果、上記記微生物（本菌株）は、アルテロモナス属に属するものであることが判明した。本菌株は、微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第１２３４６号（ＦＥＲＭＰ−１２３４６）として寄託されている。さらに、本菌株の各種炭素源に対する利用（資化性）を下記表２に示した。
　而して、本発明で用いられる褐藻分解酵素は、上記表１に示す性質を有する菌株を、実施例として示す後記の培養法等により培養して得られるもので、褐藻類を直接可溶化することができ、その最適酵素反応条件は次の通りである。
　【０００８】
　従って、本発明の製造法は、下記の酵素反応条件下に実施するのが好ましい。
　（１）至適ｐＨ：本発明で用いる褐藻分解酵素の各ｐＨにおける相対活性量を示す図１のグラフから明らかなように、ｐＨ６．５〜８．０の範囲で相対活性量が高く、相対活性量が最大になるｐＨ７．５が至適ｐＨである。
　（２）至適温度：褐藻分解酵素の各温度における相対活性量を示す図２のグラフから明らかなように、３０℃〜４０℃の範囲で相対活性が高く、相対活性量が最大となる３５℃が至適温度である。
　【０００９】
　尚、本発明においては、上記本菌株を通常の変異手段を適用して得られる変異株であって、褐藻分解酵素産生能を有する菌株を培養して得られる、褐藻分解酵素も使用することができる。
　【００１０】
　【実施例】
　以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　なお、実施例１は本発明で用いる褐藻分解酵素を得るための前記微生物（本菌株）の培養法を示し、実施例２は本発明の褐藻分解物の製造法の実施例を示す。
　【００１１】
　実施例１
　〔培地組成〕
・ミツイシコンブ・・・・・２０ｇ
・ＮａＣｌ・・・・・・・・２０ｇ
・脱塩水・・・・・・・１０００ｍｌ
　上記組成の培地に、凍結乾燥保存菌体アルテロモナス・エスピーＮｏ．４７７８株を接種し、２５℃の温度で２４時間振とう培養した。
　【００１２】
　〔酵素液の調製〕
　上述のようにして得られた培養液を、４℃の温度で１００００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して、その上澄液を酵素液とした。
　〔褐藻分解反応試験〕
　上記酵素液１００μｌを基質であるミツイシコンブ５ｍｇ及び０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５００μｌと共にエッペンドルフチュウブに入れ、３０℃で３０分間反応させた後、沸騰水浴中で１０分間加熱して酵素反応を停止させ、次いで、急冷後反応液を遠心分離した。この、遠心分離した反応液の上澄液中の遊離全糖量をフェノール硫酸法で比色定量したところ、酵素活性を示した。その結果、培養液１ｍｌあたり１．２単位の褐藻分解酵素が生産されていることがわかった。なお、酵素活性は３０℃、１分間に１００μｇの糖をコンブから溶出する酵素量を１単位と定義している。なお、フェノール硫酸法の検量線は、アルギン酸ナトリウムで作成した。
　【００１３】
　反応液の組成
　・コンブ粉末０．５％を含む０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）；０．５ｍｌ
　・酵素液；０．１ｍｌ
　実施例２
　ミツイシコンブ８００ｇに、上記実施例１で得られた褐藻分解酵素溶液１２リットル（１１５２０単位）を加え、３５℃で２４時間攪拌しながら反応させた。その結果、ミツイシコンブオリゴ糖が３１８ｇ得られた。
　【００１４】
　その一部を脱塩水に溶解させ、ＨＰＬＣに供した。この際の溶出条件は、以下のとうりであった。
　蒸留水と２Ｍ塩化ナトリウム水溶液を用いて、塩化ナトリウム濃度を４０分間で０〜０．２５Ｍまで直線的に上昇させた後、直ちに塩化ナトリウム濃度を２Ｍに上げ５分間その濃度に保ち、その後蒸留水を１５分間流して溶出した。
　【００１５】
　図３に、上記ＨＰＬＣによる生成物の溶出結果を示した。
　【００１６】
　【発明の効果】
　１）本発明の褐藻分解物の製造法によれば、褐藻類から多糖類（アルギン酸）を抽出することなく、褐藻類由来のオリゴ糖を直接得ることができる。
　２）また、褐藻類を分解することにより、糖以外の低分子化合物（有効成分）を、穏和な条件で可溶化物として得ることができる。
　【００１７】
　３）アルテロモナス属に属する上記本菌株を用いることにより、コンブを、２％ＮａＣｌ溶液に２％懸濁させた、簡単な培地で褐藻分解酵素を容易に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　図１は、本発明で用いる褐藻分解酵素の各ｐＨにおける相対活性量を示すグラフである。
　【図２】
　図２は、褐藻分解酵素の各温度における相対活性量を示すグラフである。
　【図３】
　図３は、分取用ＤＥＡＥ　ＧＬＡＳＳでのミツイシコンブオリゴ糖の溶出結果を示すグラフである。