(57)【要約】  本発明によって、アミノ酸が添加された培地を用いてカロテノイド産生細菌を培養し、得られる培養物からカロテノイドを採取することを含む、カロテノイドを製造する方法であって、前記アミノ酸が、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、アルギニン、チロシン、プロリン、フェニルアラニンおよびロイシン並びにこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１つである、前記方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸が添加された培地を用いてカロテノイド産生細菌を培養し、得られる培養物からカロテノイドを採取することを含む、カロテノイドを製造する方法であって、
前記アミノ酸が、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、アルギニン、チロシン、プロリン、フェニルアラニンおよびロイシン並びにこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１つである、前記方法。
【請求項２】
アミノ酸がグルタミン酸またはグルタミン酸塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アミノ酸の添加濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
カロテノイドがアスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、リコペン、β−カロテン、フェニコキサンチン、アドニキサンチン、エキネノン、アステロイデノンおよび３−ヒドロキシエキネノンからなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細菌がParacoccus属に属する細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の相同性を有する細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細菌が、Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）もしくはＡ−５８１−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６７１）またはそれらの変異株である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カロテノイドの微生物学的製造方法に関する。詳細には、本発明は、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、リコペン、β−カロテン、フェニコキサンチン、アドニキサンチン、エキネノン、アステロイデノンおよび３−ヒドロキシエキネノンなどのカロテノイドを、微生物発酵により製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カロテノイドは飼料添加物、食品添加物、医薬品等として有用な天然色素である。カロテノイドには、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、リコペン、β−カロテン、フェニコキサンチン、アドニキサンチン、エキネノン、アステロイデノンおよび３−ヒドロキシエキネノンなどが含まれる。中でも、アスタキサンチンは養殖魚であるサケ、マス、マダイ等の体色改善剤や、家禽類の卵黄色改善剤のような飼料添加物として有用である。また、アスタキサンチンは安全な天然の食品添加物や健康食品素材として産業上の価値が高い。アドニキサンチンおよびフェニコキサンチンは、工業的製造法が確立されることにより、アスタキサンチンと同様に飼料添加物、食品添加物、医薬品等としての用途が期待されている。さらに、β−カロテンは飼料添加物、食品添加物、医薬品等として使用され、カンタキサンチンは飼料添加物、食品添加物、化粧品等として使用され、ゼアキサンチンは食品添加物、飼料添加物等として使用されている。さらにリコペン、エキネノン、β−クリプトキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、アステロイデノン等も飼料添加物、食品素材等としての使用が期待される。これらカロテノイドの製造方法としては、化学合成法、天然物からの抽出法、微生物による産生方法などが知られている。【０００３】
アスタキサンチンの化学合成法としてはβ−カロテンの変換による方法（非特許文献１：Pure Appl. Chem., 57, 741, 1985）およびC15ホスホニウム塩から合成する方法（非特許文献２：Helv. Chim. Acta, 64, 2436, 1981）が知られている。これらの化学合成法で製造されたアスタキサンチンは、飼料添加物として販売されている。また、アスタキサンチンはマダイ、サケ等の魚類およびエビ、カニ、オキアミ等の甲殻類に存在するため、これらより抽出することも可能である。
微生物によるアスタキサンチンの生産方法としては、緑藻類Haematococcus pluvialisによる培養法（特許文献１：特開2007-97584）、赤色酵母Phaffia rhodozymaによる発酵法（特許文献２：特開平11-69969）、Paracoccus属に属する細菌（以下、「Paracoccus属細菌」ともいう）による発酵法が報告されている。アスタキサンチンを生産するParacoccus属に属する細菌の例としては、Ｅ−３９６株およびＡ−５８１−１株が挙げられる（特許文献３：特開平7-79796および非特許文献３：International Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49, 277-282）。他のアスタキサンチン生産性のParacoccus属に属する細菌としては、Paracoccus marcusii MH1株（特許文献４：特表2001-512030）、Paracoccus haeundaensis BC74171株（非特許文献４：International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2004), 54, 1699-1702）、Paracoccus属細菌N-81106株（特許文献５：特開2007-244205）、Paracoccus zeaxanthinifaciens（非特許文献５：International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2003), 53, 231-238）およびParacoccus sp. PC-1株（特許文献６：WO 2005/118812）などが挙げられる。【０００４】
しかしながら、前述のカロテノイドの製造方法はいくつかの問題点があった。例えば、化学合成法は安全性の観点から消費者に好ましくない印象を与えるものである。また、天然物からの抽出は製造コストが高い。さらに、緑藻類や酵母による産生では生産性が低いうえに強固な細胞壁を持つためにカロテノイドの抽出が困難である。【０００５】
一方、Paracoccus属に属する細菌は、増殖速度が速く、カロテノイドの生産性が高い、抽出が容易であるなどの利点を有し、いくつかの培養方法が報告されている。特開2007-143492（特許文献７）は培養途中に鉄塩を添加する方法を開示し、また、特開2008-167665（特許文献８）は炭素源濃度を制限する方法を開示するが，これらの方法は培地原料として高価な酵母エキスを多量に用いているため、商業的および工業的に実用的ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2007-97584号公報
【特許文献２】特開平11-69969号公報
【特許文献３】特開平7-79796号公報
【特許文献４】特表2001-512030号公報
【特許文献５】特開2007-244205号公報
【特許文献６】国際公開第2005/118812号パンフレット
【特許文献７】特開2007-143492号公報
【特許文献８】特開2008-167665号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Pure Appl. Chem., 57, 741, 1985
【非特許文献２】Helv. Chim. Acta, 64, 2436, 1981
【非特許文献３】International Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49, 277-282
【非特許文献４】International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2004), 54, 1699-1702
【非特許文献５】International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2003), 53, 231-238
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような実状に鑑みなされたものであり、その目的は高収量かつ安価にカロテノイドを微生物学的に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、カロテノイドを産生する細菌の培養において、細菌の培養に通常使用される培地にグルタミン酸ナトリウム等のアミノ酸又はその塩をさらに添加することにより、カロテノイドの生産性を向上させることが可能であることを見出し、本発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明は、
アミノ酸が添加された培地を用いてカロテノイド産生細菌を培養し、得られる培養物からカロテノイドを採取することを含む、カロテノイドを製造する方法であって、
前記アミノ酸が、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、アルギニン、チロシン、プロリン、フェニルアラニンおよびロイシン並びにこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１つである、前記方法に関する。
上記方法において、アミノ酸はグルタミン酸またはグルタミン酸塩が好ましい。
また、アミノ酸の添加濃度は、例えば、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌである。本明細書において、「アミノ酸の添加濃度」とは、当該アミノ酸が添加された培地において達成されるアミノ酸の濃度（すなわち、添加されるアミノ酸の培地中濃度）を意味する。
また、上記カロテノイドは、例えば、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、リコペン、β−カロテン、フェニコキサンチン、アドニキサンチン、エキネノン、アステロイデノンおよび３−ヒドロキシエキネノンからなる群から選ばれる少なくとも１つである。
上記方法において、細菌は、Paracoccus属に属する細菌が好ましく用いられる。また、上記細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の相同性を有する細菌でもよい。特に、上記細菌は、Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）もしくはＡ−５８１−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６７１）またはそれらの変異株が好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、高濃度のカロテノイドをより効率的に製造することが可能になった。また、本発明により、低コストにカロテノイドを微生物学的に製造することが可能になった。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に限定されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書において引用した全ての刊行物、例えば、先行技術文献、公開公報、特許公報およびその他の特許文献は、その全体が本明細書において参考として組み込まれる。本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願2008-268106号明細書の内容を包含する。
【００１３】
本発明は、カロテノイド産生細菌を培養し、カロテノイドを製造する方法に関するものであり、本方法は培地に所定のアミノ酸を添加することを特徴とする。本発明の方法により、高濃度のカロテノイドをより効率的かつ低コストに製造することが可能になる。
【００１４】
本発明に用いる細菌としては、カロテノイドを産生する細菌であれば何ら限定されないが、好ましくはParacoccus属に属する細菌が用いられる。Paracoccus属に属する細菌の中では、Paracoccus carotinifaciens、Paracoccus marcusii、Paracoccus haeundaensisおよびParacoccus zeaxanthinifaciensが好ましく用いられ、特にParacoccus carotinifaciensが好ましく用いられる。Paracoccus属に属する細菌の具体的な菌株の例として、Paracoccus carotinifaciens Ｅ−３９６株およびParacoccus属細菌Ａ−５８１−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６７１）が挙げられ、これらの菌株も本発明に好ましく用いられる。
【００１５】
また、カロテノイド産生細菌として、好ましくは１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号１に記載されるＥ−３９６株の塩基配列と高い相同性を有する細菌が用いられる。ここで言う「高い相同性を有する」とは、例えば、配列番号１に記載される塩基配列と比較される細菌の対応する塩基配列とが、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上相同であることを意味する。
１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列とは、１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列中のＵ（ウラシル）をＴ（チミン）に置き換えた塩基配列を意味する。
この１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列の相同性に基づいた微生物の分類法は、近年主流になっている。従来の微生物の分類法は、当該微生物の運動性、栄養要求性、糖の資化性など菌学的性質に基づいているため、自然突然変異による形質の変化等が生じた場合に、微生物を誤って分類する場合があった。これに対し、１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列は極めて遺伝的に安定であるので、その相同性に基づく分類法は従来の分類法に比べて分類の信頼度が格段に向上する。
【００１６】
Paracoccus carotinifaciens Ｅ−３９６株の１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列と、他のカロテノイド産生細菌Paracoccus marcusii DSM 11574株、Paracoccus属細菌N-81106株、Paracoccus haeundaensis BC 74171株、Paracoccus属細菌 A-581-1株、Paracoccus zeaxanthinifaciens ATCC 21588株、およびParacoccus sp. PC-1株の１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列との相同性は、それぞれ９９．７％、９９．７％、９９．６％、９９．４％、９５．７％、および９５．４％であり、これらは分類学上極めて近縁な菌株であることが分かる。よって、これらの菌株はカロテノイドを産生する細菌として一つのグループを形成しているといえる。このため、これらの菌株は本発明に好ましく用いられ、カロテノイドを効率的に産生することができる。
【００１７】
本発明において、カロテノイドの生産性が改良された変異株も用いることができる。改良された変異株の例としては、アスタキサンチン生産能の高い菌株（特開2001-95500）、カンタキサンチンを選択的に多く産生する菌株（特開2003-304875）、ゼアキサンチンとβ−クリプトキサンチンを選択的に多く産生する菌株（特開2005-87097）、リコペンを選択的に産生する菌株（特開2005-87100）を挙げることができる。
【００１８】
カロテノイドの生産性が改良された変異株は、変異処理とスクリーニングにより取得することができる。変異処理する方法は変異を誘発するものであれば特に限定されない。例えば、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）およびエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）などの変異剤による化学的方法、紫外線照射およびＸ線照射などの物理的方法、遺伝子組換えおよびトランスポゾンなどによる生物学的方法などを用いることができる。変異処理される細菌は特に限定されないが、カロテノイド産生細菌であることが好ましい。また、変異株は、自然に起こる突然変異により生じたものでもよい。
変異株のスクリーニング方法は特に限定されないが、例えば、寒天培地上のコロニーの色調で目的の変異株を選択する方法の他、試験管、フラスコ、発酵槽などで変異株を培養し、吸光度、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどを利用したカロテノイド色素分析により目的の変異株を選択する方法などが例示される。
変異およびスクリーニングの工程は１回でもよいし、また、例えば突然変異処理とスクリーニングにより変異株を得て、これをさらに変異処理とスクリーニングにより生産性の改良された変異株を取得するというように、変異およびスクリーニング工程を２回以上繰り返してもよい。
【００１９】
本発明に使用するカロテノイド産生細菌の例として挙げられるＥ−３９６株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに以下のとおり国際寄託されている。
国際寄託当局：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
（旧名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
〒305-8566
茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６
識別のための表示：Ｅ−３９６
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３
原寄託日：平成５年（1993年）４月２７日
【００２０】
また、本発明に使用するカロテノイド産生細菌の他の例として挙げられるＡ−５８１−１株は、上記機関に以下のとおり国際寄託されている。
識別のための表示：Ａ−５８１−１
受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６７１
原寄託日：平成６年（1994年）５月２０日
【００２１】
本発明において、上記のカロテノイド産生細菌を所定のアミノ酸添加培地で培養することにより、当該アミノ酸が添加されていない培地で培養する場合と比較して、より多くの量のカロテノイドを高濃度に生産させることができる。
本発明の方法によって産生されるカロテノイドは特に限定されないが、例えば、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、リコペン、β−カロテン、フェニコキサンチン、アドニキサンチン、エキネノン、アステロイデノンまたは３−ヒドロキシエキネノンであり、好ましくは、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチンまたはβ−クリプトキサンチンであり、より好ましくは、アスタキサンチン、ゼアキサンチンまたはβ−クリプトキサンチンである。本発明より製造されるカロテノイドは一種でもよいし、複数種が組み合わされていてもよい。
【００２２】
本発明において上記細菌を培養する方法を以下に説明する。
本発明の培養に用いるカロテノイド生産用培地は、所定のアミノ酸が添加されたアミノ酸添加培地であって、かつ、カロテノイド産生細菌が生育し、カロテノイドを生産するものであるならば特に限定されないが、炭素源、窒素源、無機塩類および必要に応じてビタミン類などを含有する培地が好ましく用いられる。すなわち、本発明において、アミノ酸は、カロテノイド産生細菌が生育し、カロテノイドを産生し得る培地（例えば、標準的なカロテノイド生産用培地）に添加される。
【００２３】
炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトールおよびマルトース等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸およびピルビン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノールおよびグリセノール等のアルコール類、大豆油、ヌカ油、オリーブ油、トウモロコシ油、ゴマ油およびアマニ油等の油脂類などが挙げられ、中でも好ましくはグルコースまたはシュークロースが用いられる。これらの炭素源の中、１種または２種以上を用いることができる。培養前の培地（始発培地）に添加する量は炭素源の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌ当たり１〜１００ｇ、好ましくは２〜５０ｇである。また、炭素源は始発培地に添加するだけでなく、培養途中に逐次的または連続的に追加供給することも好ましく行われる。
【００２４】
無機窒素源としては、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩類、硝酸カリウムなどの硝酸塩類、アンモニアおよび尿素等の中、１種または２種以上が用いられる。添加量は窒素源の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．１ｇ〜２０ｇ、好ましくは０．２〜１０ｇである。
有機窒素源としては、例えば、コーンスティープリカー（ろ過処理物を含む）、ファーマメディア、大豆粕、大豆粉、ピーナッツミール、ディスティラーズソルブルおよび乾燥酵母などの中、１種または２種以上が用いられる。添加濃度は窒素源の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、０〜８０ｇ／Ｌ、好ましくは０〜３０ｇ／Ｌである。
無機窒素源および有機窒素源は、通常始発培地に添加するが、逐次的または連続的に追加供給することも好ましく行われる。
【００２５】
無機塩類としては、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウムなどのリン酸塩類、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどのマグネシウム塩類、硫酸鉄、塩化鉄などの鉄塩類、塩化カルシウム、炭酸カルシウムなどのカルシウム塩類、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどのナトリウム塩類、硫酸マンガンなどのマンガン塩類、塩化コバルトなどのコバルト塩類、硫酸銅などの銅塩類、硫酸亜鉛などの亜鉛塩類、モリブデン酸ナトリウムなどのモリブデン塩類、硫酸ニッケルなどのニッケル塩類、セレン酸ナトリウムなどのセレン塩類、ホウ酸およびヨウ化カリウム等の中、１種または２種以上が用いられる。添加量は無機塩の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．０００１〜１５ｇである。リン酸塩類、マグネシウム塩類、カルシウム塩類、ナトリウム塩類および鉄塩類では、０．０２〜１５ｇ／Ｌが好ましく、マンガン塩類、コバルト塩類、銅塩類、亜鉛塩類、モリブデン塩類、ニッケル塩類、セレン塩類、ホウ酸、ヨウ化カリウムなどを加える場合には、０．１〜１５ｍｇ／Ｌが好ましい濃度である。無機塩類は通常始発培地に添加するが、逐次的または連続的に追加供給してもよい。
【００２６】
ビタミン類としては、例えば、シアノコバラミン、リボフラビン、パントテン酸、ピリドキシン、チアミン、アスコルビン酸、葉酸、ナイアシン、ｐ−アミノ安息香酸、ビオチン、イノシトール、コリンなどを用いることができる。添加割合はビタミン類の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．００１〜１０００ｍｇであり、好ましくは０．０１〜１００ｍｇである。ビタミン類は通常始発培地に添加するが、逐次的または連続的に追加供給してもよい。
【００２７】
本発明の特徴は、アミノ酸を添加したカロテノイド生産用アミノ酸添加培地中にカロテノイド産生細菌を培養することである。カロテノイド生産用アミノ酸添加培地でカロテノイド産生細菌を培養することにより、当該アミノ酸が添加されていない培地で培養する場合と比較して、より多くの量のカロテノイドを高濃度に製造することができる。
【００２８】
本発明で用いるアミノ酸は、カザミノ酸、酵母エキス、ペプトンなどの複雑な組成を有する天然混合物に含まれているアミノ酸ではなく、ある程度精製された純物（単品）、すなわち単離物である。天然混合物では有効なアミノ酸だけでなく、無用あるいは阻害的な成分を含む可能性があるうえに、ロットにより組成がばらつく恐れがある。さらにカザミノ酸、酵母エキス、ペプトンなどの天然混合物は高価であるので、工業的には利用価値が低い。
精製アミノ酸の純度は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
但し、本発明で用いるアミノ酸は、カロテノイド産生細菌の生育を阻害しない程度またはカロテノイド産生細菌のカロテノイドの産生を阻害しない程度に当該アミノ酸以外の成分を含んでいてもよい。この場合に使用されるアミノ酸は、例えば不純物などの他の成分を含まない純粋なアミノ酸であることが好ましいが、上記カロテノイドの産生を阻害しない限り未精製のもの（例えば、純度９０％未満のアミノ酸）であってもよい。
【００２９】
カロテノイド生産用培地に添加するアミノ酸としては、好ましくはグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、アルギニン、チロシン、プロリン、フェニルアラニンもしくはロイシン、またはこれらの塩が用いられる。これらのアミノ酸は、好ましくはL体であるが、Ｌ体とD体の混合物でもよい。より好ましくは、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミンもしくはアスパラギンまたはこれらの塩であり、さらに好ましくはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸またはこれらの塩である。中でも、グルタミン酸またはその塩が高いカロテノイド生産効果を有するので好ましい。Ｌ−グルタミン酸ナトリウムまたはその水和物は安価であるため、特に好ましく用いられる。
酸との塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩およびギ酸、酢酸、乳酸などの有機酸塩などを挙げることができる。また、塩基との塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジンなどの有機塩基塩、アンモニウム塩などを挙げることができる。
カロテノイド生産用培地に添加されるアミノ酸は、上記アミノ酸中少なくとも１種以上であり、１種でもよいが２種以上のアミノ酸を添加することも可能である。
必須アミノ酸の中でもシステイン、リジン、イソロイシンおよびメチオニンはカロテノイドの生産に対して阻害的に作用するので、本発明ではこれらを含有しないアミノ酸を培地に添加することが好ましい。
【００３０】
アミノ酸は通常始発培地に添加するが、培養途中に間欠的または連続的に添加してもよく、また、始発培地に添加した上でさらに培養途中に間欠的あるいは連続的に追加添加してもよい。
本発明の方法におけるアミノ酸添加濃度（すなわち、添加するアミノ酸の培地中濃度）に特に下限はないが、好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは３ｍｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、特に好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ、最も好ましくは１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上である。アミノ酸の添加濃度に上限はないが、好ましくは２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、さらにもっと好ましくは８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、特に好ましくは６０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、最も好ましくは５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。従って、本発明においては、アミノ酸添加濃度は例えば１ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００３１】
本発明において、培養液の発泡を抑えるために消泡剤が好ましく用いられる。消泡剤の種類は泡の発生を抑制しまたは発生した泡を消す作用があり、かつ生産菌に対する阻害作用の少ないものであれば、特に限定されるものではない。たとえば、アルコール系消泡剤、ポリエーテル系消泡剤、エステル系消泡剤、脂肪酸系消泡剤、シリコン系消泡剤、スルフォン酸系消泡剤などを例示することができる。添加量は消泡剤の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．０１ｇ〜１０ｇである。
消泡剤は通常殺菌前の始発培地に添加する。さらに、培養途中に連続的または間欠的に消泡剤を追加添加してもよい。培養途中に消泡剤を添加する方法としては、センサーで泡を感知して自動添加する方法、プログラムタイマーで一定時間ごとに添加する方法、生育速度に連動するようにフィード用炭素源、窒素源またはｐＨ調整剤などと混合して添加する方法などを例示できる。始発培地に添加する消泡剤と培養途中に培養液に添加する消泡剤とは同種でもよいが、作用に合わせて異なる種類を用いることもできる。
【００３２】
本発明において、アミノ酸を添加したアミノ酸添加培地の初期ｐＨは２〜１２、好ましくは６〜９、より好ましくは６．５〜８．０に調整する。培養中も上記範囲のｐＨを維持することが好ましい。ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、アンモニア水、アンモニアガス、硫酸水溶液またはこれらの混合物が例示される。
【００３３】
本発明において、アミノ酸添加培地は殺菌処理した後、細菌の培養に用いられる。殺菌処理は、当業者であれば、適宜行うことができる。例えば、適切な容器中の培地をオートクレーブで加熱滅菌すればよい。あるいは、滅菌フィルターによりろ過滅菌すればよい。
【００３４】
本発明において、カロテノイド生産細菌は、上記のように調製されたアミノ酸添加培地に植菌され、所定の条件で培養される。植菌は、試験管、フラスコあるいは発酵槽などを用いたシード培養により菌株を適宜増やし、得られた培養物をカロテノイド生産用アミノ酸添加培地に加えることで行う。シード培養に用いる培地は、所定のアミノ酸を添加した培地でも、アミノ酸を添加していない培地でも、カロテノイド生産菌が良好に増殖する培地であれば特に限定されない。
培養は、適切な培養容器において行われる。培養容器は培養容量により適宜選択することができ、例えば、試験管、フラスコ、発酵槽などをあげることができる。
培養温度は１５〜８０℃、好ましくは２０〜３５℃、より好ましくは２５℃〜３２℃であり、通常１日〜２０日間、好ましくは２〜１２日間、より好ましくは３〜９日間、好気条件で培養を行う。好気条件としては、例えば、振とう培養または通気撹拌培養等が挙げられ、溶存酸素濃度を一定の範囲に制御するのが好ましい。溶存酸素濃度の制御は、例えば、攪拌回転数、通気量、内圧などを変化させることにより行うことができる。溶存酸素濃度は好ましくは０．３〜１０ｐｐｍ、より好ましくは０．５〜７ｐｐｍ、さらに好ましくは１〜５ｐｐｍに制御する。
【００３５】
本発明において、カロテノイド産生細菌を培養して得られる培養物中のカロテノイド、または培養物から何らかの精製操作を経て採取されたカロテノイドの定量は、高速液体クロマトグラフィーにより行うことができる。
【００３６】
上記のようにカロテノイド産生細菌を培養し、得られる培養物からカロテノイド採取することができる。
培養物は、例えば、培養液、培養上清、菌体濃縮液、湿菌体、乾燥菌体、菌体溶解物などが挙げられる。培養上清は、培養液を遠心処理またはろ過処理することで、培養液から菌体を除いて調製すればよい。菌体濃縮液は、培養液を遠心分離または膜ろ過濃縮することにより得ることができる。湿菌体は、培養液を遠心またはろ過することにより得ることができる。乾燥菌体は、湿菌体または菌体濃縮液を一般的な乾燥方法によって乾燥させることにより得ることができる。このようにして得られたカロテノイド含有乾燥菌体をそのまま飼料添加物として用いることができる。
本発明においてカロテノイドを上記培養物から採取する方法は特に限定されず、カロテノイドが安定に効率よく回収されるいずれの方法でもよい。これらの方法は、当業者に公知の抽出技術および精製技術から適宜選択して行うことができる。
【００３７】
培養物からカロテノイドの抽出を行う前に、アルカリ試薬や界面活性剤などを用いた化学的処理、溶菌酵素、脂質分解酵素およびタンパク分解酵素などを用いた生化学処理、または超音波もしくは粉砕などの物理的処理の中、１つまたは２つ以上の処理を培養物に対して行ってもよい。
【００３８】
例えば、カロテノイドを培養物から抽出する場合、抽出および洗浄に用いる溶媒は特に限定されないが、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコール類、アセトン、テトラヒドロフラン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシドなどが挙げられる。
抽出操作中のカロテノイドの酸化を極力防止したい場合には、窒素ガスなどの不活性ガス雰囲気で処理すればよい。また、医薬品や食品で用いられている酸化防止剤を選択して抽出溶媒に加えてもよい。あるいは、これらの処理を組み合わせてもよい。
また、光によるカロテノイドの分解を極力防止するために、光を当てない条件下で行ってもよい。
【００３９】
このように得られた抽出物をカロテノイドとしてそのまま用いることが可能であり、さらに精製して使用することもできる。
【００４０】
抽出操作後の抽出物から細菌等を分離する方法は特に限定されないが、膜濾過、遠心分離、デカンテーションなどが用いられる。
【００４１】
抽出物からカロテノイド沈殿物を得る方法としては、一般的には加熱および／または減圧濃縮ならびに晶析が挙げられる。この他、低温におけるカロテノイド色素の析出、または酸・アルカリ薬剤もしくは各種塩類による析出によってカロテノイド色素を濃縮せずに分離してもよい。
工業的に用いる場合には、晶析することが望ましい。
【００４２】
得られたカロテノイド沈殿物は、洗浄のため必要に応じて少量の低級アルコール類などの溶媒を用いて懸濁攪拌させてもよい。
洗浄の手法は特に限定されないが、例えば、懸濁攪拌後に濾取する方法または沈殿物の上から通液する方法等が実用的に好ましい方法として挙げられる。
【００４３】
上記のように得られる培養物、抽出物または精製物は、カロテノイドとしてそれぞれ単独で用いることもできるし、これらを任意の割合で混合して用いることもできる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の例に限定されるものではない。
なお、実施例におけるカロテノイド類の定量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて以下のように行った。
カラムはＷａｋｏｓｉｌ−II  ５  ＳＩＬ−１００（φ４．６×２５０ｍｍ）（和光純薬製）を２本連結して使用した。溶出は、移動相であるｎ−ヘキサン−テトラヒドロフラン−メタノール混合液（４０：２０：１）を室温付近一定の温度にて毎分１．０ｍＬ流すことで行った。測定においては、サンプルをテトラヒドロフランで溶解したものを移動相にて１００倍希釈した液２０μＬを注入量とし、カラム溶離液の検出は波長４７０ｎｍで行った。また、定量のための標準品としては、シグマ社製アスタキサンチン（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ９３３５）を用いた。標準液のアスタキサンチン濃度の設定は、標準液の４７７ｎｍの吸光度（Ａ）及び上記条件でＨＰＬＣ分析を行ったときのアスタキサンチンピークの面積百分率％（Ｂ）を測定した後に、以下の式を用いて行った。
アスタキサンチンの濃度（ｍｇ／Ｌ）＝Ａ÷２１５０×Ｂ×１００【００４５】
〔実施例１〕
以下の組成の培地（シュークロース３０ｇ／Ｌ，コーンスティープリカー３０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ，リン酸水素二ナトリウム１２水和物３．８ｇ／Ｌ，塩化カルシウム２水和物５．０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物０．３ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）８ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れ１２１℃で１５分間オートクレーブ殺菌し、シード用試験管培地を調製した。
次に以下の組成の培地（グルコース３０ｇ／Ｌ，コーンスティープリカーろ過処理物５ｇ／Ｌ，硫酸アンモニウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ，リン酸水素二ナトリウム１２水和物３．８ｇ／Ｌ，塩化カルシウム２水和物５．０ｇ／Ｌ，硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ，硫酸鉄７水和物０．６ｇ／Ｌ、エステル系消泡剤０．２ｇ／Ｌ）８ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れたものを２１本準備した。
これにグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジンおよびプロリンの２０種類のアミノ酸をそれぞれ１．０ｇ／Ｌになるように添加した。１本は比較のためアミノ酸を何も添加しなかった。最後に水酸化ナトリウム水溶液または硫酸水溶液でｐＨ７．１に調整し、１２１℃で２０分間オートクレーブ殺菌した。【００４６】
Paracoccus carotinifaciens Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）をシード用試験管培地に植菌し、２８℃で２日間、３００ｓｐｍで振とう培養を行った後、その培養液を２１種類の試験管培地にそれぞれ０．１ｍｌずつ植菌し、２８℃で４日間、３００ｓｐｍで振とう培養を行った。【００４７】
培養液のカロテノイド濃度をＨＰＬＣにより測定し、また、菌体生育をＯＤ610（610nmの吸光度）により測定したところ、表１に示すとおり、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、アルギニン、チロシン、プロリン、フェニルアラニンおよびロイシンにカロテノイド色素の生産を促進する効果が見られた。一方、システイン、リジン、イソロイシンおよびメチオニンにはカロテノイドの生産に対する明らかな阻害作用があることが分かった。【００４８】
【表１】
2010044469.tif 000002
【００４９】
〔実施例２〕
以下の組成の培地（グルコース２０ｇ／Ｌ，コーンスティープリカーろ過処理物５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５４ｇ／Ｌ，リン酸水素二カリウム１２水和物２．７８ｇ／Ｌ，塩化カルシウム２水和物５．０ｇ／Ｌ，硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ，硫酸鉄７水和物３．０ｇ／Ｌ、アルコール系消泡剤０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．５）１００ｍｌを５００ｍＬ容量の綿栓付き三角フラスコに入れ、１２１℃で１５分間オートクレーブ殺菌し、シード用フラスコ培地を８本調製した。
次に以下の組成の培地（グルコース４０ｇ／Ｌ，コーンスティープリカー３０ｇ／Ｌ，硫酸アンモニウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２．２５ｇ／Ｌ，リン酸水素二ナトリウム１２水和物５．７ｇ／Ｌ，塩化カルシウム２水和物０．１ｇ／Ｌ，硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ／Ｌ，硫酸鉄７水和物５ｇ／Ｌ、アルコール系消泡剤０．５ｇ／Ｌ）２．０Ｌを５Ｌ容量の発酵槽に入れたものを８基準備した。これにＬ−グルタミン酸ナトリウム１水和物をそれぞれ０、１、５、１５、３０、５０、１００および２００ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、１２１℃で３０分間オートクレーブ殺菌した。【００５０】
Paracoccus carotinifaciens Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）をシード用フラスコ培地に一白金耳植菌し、２９℃で２日間、１００ｒｐｍで回転振とう培養を行った後、その培養液８０ｍＬを各発酵槽に植菌した。２９℃、通気量１ｖｖｍの好気培養を１００時間行った。培養中のｐＨが７．２を維持するように１５％アンモニア水で連続的にｐＨを制御した。グルコースは枯渇しないように培養１日目および２日目にそれぞれ３０ｇずつ添加した。また、最低攪拌回転数を２００ｒｐｍとして培養液中の溶存酸素濃度が２〜４ｐｐｍを維持するように攪拌回転数を変化させた。気泡センサーで発泡を感知することによりアルコール系消泡剤を自動添加して発泡を抑えた。【００５１】
培養終了時の培養液のカロテノイド濃度をＨＰＬＣにより測定したところ、結果は表２に示すとおりであった。グルタミン酸を添加した区は１〜２００ｍｍｏｌ／Ｌのいずれの濃度においても、添加しなかった区に比較して高いカロテノイド生産濃度を示した。【００５２】
【表２】
2010044469.tif 000003
【００５３】
〔実施例３〕
Paracoccus carotinifaciens Ｅ−３９６株をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで変異処理し、赤色の色調が濃いコロニーを選択し
た。選択された株の培養液中のカロテノイドを分析し、アスタキサンチン生産性の向上した変異株Ｙ−１０７１株を選択した。【００５４】
以下の組成の培地（シュークロース３０ｇ／Ｌ，ファーマメディア３０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．８ｇ／Ｌ，リン酸水素二カリウム４．２ｇ／Ｌ，塩化カルシウム２水和物１ｇ／Ｌ，硫酸マグネシウム７水和物１２ｇ／Ｌ，硫酸鉄７水和物１ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）８ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れ１２１℃で１５分間オートクレーブ殺菌し、シード用試験管培地を調製した。
次に以下の組成の培地（シュークロース３０ｇ／Ｌ，ファーマメディア２０ｇ／Ｌ，硫酸アンモニウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ，リン酸水素二ナトリウム１２水和物３．８ｇ／Ｌ，塩化カルシウム２水和物０．１ｇ／Ｌ，硫酸マグネシウム７水和物４．５ｇ／Ｌ，硫酸鉄７水和物５ｇ／Ｌ、ビオチン１ｍｇ／Ｌ、シリコン系消泡剤１ｇ／Ｌ）８ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れたものを２本準備した。１本にはＬ−グルタミン酸ソーダ１水和物を３０ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、他の１本には比較のため何も添加せず、最後に水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．１に調整し、１２１℃で２０分間オートクレーブ殺菌した。【００５５】
上記で選抜したParacoccus属細菌Ｙ−１０７１株をシード用試験管培地に植菌し、２８℃で２日間、３００ｓｐｍで振とう培養を行った後、その培養液を２種類の試験管培地にそれぞれ０．１ｍｌずつ植菌し、２８℃で４日間、３００ｓｐｍで振とう培養を行った。
培養液のカロテノイド濃度をＨＰＬＣにより測定したところ、結果は表３に示すとおりであった。
変異株であるParacoccus属細菌Ｙ−１０７１株においても、グルタミン酸を添加した区は、添加しなかった区に比較して高いカロテノイド生産濃度を示した。【００５６】
【表３】
2010044469.tif 000004
【００５７】
〔実施例４〕
以下の組成の培地（グルコース２０ｇ／Ｌ，乾燥酵母５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ，リン酸水素二ナトリウム１２水和物３．８ｇ／Ｌ，塩化カルシウム２水和物０．１ｇ／Ｌ，硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ，硫酸鉄７水和物３ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）８ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れ１２１℃で１５分間オートクレーブ殺菌し、シード用試験管培地を調製した。【００５８】
次に以下の組成の培地（グルコース４０ｇ／Ｌ，硫酸アンモニウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５４ｇ／Ｌ，リン酸水素二カリウム２．７８ｇ／Ｌ，塩化カルシウム２水和物１ｇ／Ｌ，塩化ナトリウム３ｇ／Ｌ，硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ，硫酸鉄７水和物５ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛７水和物２ｍｇ／Ｌ，塩化コバルト６水和物２ｍｇ／Ｌ，硫酸銅５水和物１ｍｇ／Ｌ，硫酸マンガン５水和物４ｍｇ／Ｌ，モリブデン酸ナトリウム２水和物２ｍｇ／Ｌ，硫酸ニッケル６水和物１ｍｇ／Ｌ，セレン酸ナトリウム０．５ｍｇ／Ｌ，ホウ酸５ｍｇ／Ｌ，ヨウ化カリウム１ｍｇ／Ｌ，シアノコバラミン１ｍｇ／Ｌ，リボフラビン１０ｍｇ／Ｌ，パントテン酸カルシウム１５ｍｇ／Ｌ，ピリドキシン塩酸塩２０ｍｇ／Ｌ，チアミン塩酸塩３０ｍｇ／Ｌ，アスコルビン酸３０ｍｇ／Ｌ，葉酸１ｍｇ／Ｌ，ナイアシン１５ｍｇ／Ｌ，ｐ−アミノ安息香酸１０ｍｇ／Ｌ，ビオチン０．１ｍｇ／Ｌ，ｍｙｏ−イノシトール５０ｍｇ／Ｌ，コリン１０ｍｇ／Ｌ，ポリエーテル系消泡剤０．２ｇ／Ｌ）８ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れたものを４本準備した。
ここで、グルコース、無機塩類、微量金属類およびビタミン類は別々に調製し、グルコース、無機塩類および微量金属類は１２１℃、１５分加熱殺菌し、ビタミン類はろ過滅菌し、あとで４種の溶液を混合した。
さらに、試験管の１本には加熱殺菌したＬ−グルタミン酸ソーダ１水和物水溶液を６ｇ／Ｌ（３２ｍｍｏｌ／Ｌ）になるように加え、１本には加熱殺菌した酵母エキス水溶液を６ｇ／Ｌになるように，１本には当該酵母エキスを１２ｇ／Ｌになるように加え，残りの１本には何も添加しなかった。最後にｐＨ７．２になるように無菌的に１２％アンモニア水を加えた。【００５９】
実施例３で選抜した変異株Paracoccus属細菌Ｙ−１０７１株をシード用試験管培地に植菌し、３０℃で２日間、３００ｓｐｍで振とう培養を行った後、その培養液を４種類の試験管培地にそれぞれ０．１ｍｌずつ植菌し、３０℃で３日間、３００ｓｐｍで振とう培養を行った。
培養液のカロテノイド濃度をＨＰＬＣにより測定したところ、表４に示すとおり、無添加区に比較してグルタミン酸添加区では高いカロテノイド生産濃度を示した。酵母エキス添加区ではグルタミン酸添加区ほどの顕著な生産向上効果は認められなかった。【００６０】
【表４】
2010044469.tif 000005
【００６１】
〔実施例５〕
以下の組成の培地（シュークロース２０ｇ／Ｌ，コーンスティープリカーろ過処理物５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５４ｇ／Ｌ，リン酸水素二カリウム１２水和物２．７８ｇ／Ｌ，塩化カルシウム２水和物５．０ｇ／Ｌ，硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ，硫酸鉄７水和物３．０ｇ／Ｌ、アルコール系消泡剤０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．５）１００ｍｌを５００ｍＬ容量の綿栓付き三角フラスコに入れ、１２１℃で１５分間オートクレーブ殺菌し、シード用フラスコ培地を２本調製した。
次に以下の組成の培地（グルコース４０ｇ／Ｌ，コーンスティープリカー３０ｇ／Ｌ，硫酸アンモニウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２．２５ｇ／Ｌ，リン酸水素二ナトリウム１２水和物５．７ｇ／Ｌ，塩化カルシウム２水和物０．１ｇ／Ｌ，硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ／Ｌ，硫酸鉄７水和物５ｇ／Ｌ、アルコール系消泡剤０．５ｇ／Ｌ）２．０Ｌを５Ｌ容量の発酵槽に入れたものを２基準備した。１基の発酵槽にはＬ−グルタミン酸ナトリウム１水和物を１５ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、１基には比較のために何も添加しなかった。これらの発酵槽を１２１℃で３０分間オートクレーブ殺菌した。【００６２】
Paracoccus属細菌 Ａ−５８１−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６７１）をシード用フラスコ培地に一白金耳植菌し、２７℃で２日間、１５０ｒｐｍで回転振とう培養を行った後、その培養液９０ｍＬを各発酵槽に植菌した。２７℃、通気量１ｖｖｍの好気培養を１００時間行った。培養中のｐＨが７．１を維持するように２０％水酸化ナトリウム水溶液で連続的にｐＨを制御した。グルコースは枯渇しないように培養１日目および２日目にそれぞれ３０ｇずつ添加した。培養２２ｈおよび２９ｈに、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム１水和物を始発培地１Ｌに対して５ｇ添加し、硫酸アンモニウムを３ｇ添加した。最低攪拌回転数を１００ｒｐｍとして培養液中の溶存酸素濃度が２〜４ｐｐｍを維持するように攪拌回転数を変化させた。アルコール系消泡剤を１時間に０．１ｇ添加することにより気泡の発生を抑えた。【００６３】
培養終了時の培養液のカロテノイド濃度をＨＰＬＣにより測定したところ、結果は表５に示すとおりであった。無添加区に比較してグルタミン酸添加区では高いカロテノイド生産濃度を示した。【００６４】
【表５】
2010044469.tif 000006
【００６５】
〔実施例６〕
Paracoccus属細菌Ａ−５８１−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６７１）を紫外線照射により変異処理し、赤色の色調が濃いコロニーを選択した。選択された株の培養液中のカロテノイドを分析し、アスタキサンチン生産性の向上した変異株Ｋ−１８５株を選択した。【００６６】
以下の組成の培地（シュークロース３０ｇ／Ｌ，コーンスティープリカー３０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ，リン酸水素二ナトリウム１２水和物３．８ｇ／Ｌ，塩化カルシウム２水和物５．０ｇ／Ｌ，硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ，硫酸鉄７水和物０．３ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）８ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れ１２１℃で１５分間オートクレーブ殺菌し、シード用試験管培地を調製した。
次に以下の組成の培地（グルコース３０ｇ／Ｌ，大豆粕２０ｇ／Ｌ，硫酸アンモニウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ，リン酸水素二ナトリウム１２水和物３．８ｇ／Ｌ，塩化カルシウム２水和物５．０ｇ／Ｌ，硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ，硫酸鉄７水和物０．６ｇ／Ｌ、エステル系消泡剤０．２ｇ／Ｌ）８ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れたものを２本準備した。１本の試験管にはＬ−グルタミン酸ソーダ１水和物を３０ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、他の１本には比較のため何も添加せず、最後にアンモニア水でｐＨ７．１に調整し、１２１℃で２０分間オートクレーブ殺菌した。【００６７】
Paracoccus属細菌Ｋ−１８５株をシード用試験管培地に植菌し、２８℃で２日間、３００ｓｐｍで振とう培養を行った後、その培養液を２種類の試験管培地にそれぞれ０．１ｍｌずつ植菌し、２８℃で３日間、３００ｓｐｍで振とう培養を行った。培養液のカロテノイド濃度をＨＰＬＣにより測定したところ、結果は表６に示すとおりであった。
変異株であるParacoccus属細菌Ｋ−１８５株においても、グルタミン酸を添加した区は、添加しなかった区に比較して高いカロテノイド生産濃度を示した。【００６８】
【表６】
2010044469.tif 000007
【００６９】
〔実施例７〕
Ｅ−３９６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２８３）をＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで変異処理し、赤紫色を呈する変異株コロニーを選択し、さらに、培養液中のカロテノイド化合物の分析を高速液体クロマトグラフィーにより行い、リコペンを特異的に生産する菌株Ｌ−２５株を選抜した。【００７０】
以下の組成の培地（シュークロース３０ｇ／Ｌ，コーンスティープリカー３０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ，リン酸水素二ナトリウム１２水和物３．８ｇ／Ｌ，塩化カルシウム２水和物５．０ｇ／Ｌ，硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ，硫酸鉄７水和物０．３ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２）８ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れ１２１℃で１５分間オートクレーブ殺菌し、シード用試験管培地を調製した。
次に以下の組成の培地（グルコース３０ｇ／Ｌ，コーンスティープリカーろ過処理物５ｇ／Ｌ，硫酸アンモニウム１．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１．５ｇ／Ｌ，リン酸水素二ナトリウム１２水和物３．８ｇ／Ｌ，塩化カルシウム２水和物５．０ｇ／Ｌ，硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ，硫酸鉄７水和物０．６ｇ／Ｌ、エステル系消泡剤０．２ｇ／Ｌ）８ｍｌを内径１８ｍｍの綿栓付き試験管に入れたものを２本準備した。１本の試験管にはＬ−グルタミン酸ソーダ１水和物を３０ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、他の１本には比較のため何も添加せず、最後にアンモニア水でｐＨ７．１に調整し、１２１℃で２０分間オートクレーブ殺菌した。【００７１】
上記で選抜したParacoccus属細菌Ｌ−２５株をシード用試験管培地に植菌し、２８℃で２日間、３００ｓｐｍで振とう培養を行った後、その培養液を２種類の試験管培地にそれぞれ０．１ｍｌずつ植菌し、２８℃で３日間、３００ｓｐｍで振とう培養を行った。培養液のカロテノイド濃度をＨＰＬＣにより測定したところ、結果は表７に示すとおりであった。
変異株であるParacoccus属細菌Ｌ−２５株においても、グルタミン酸を添加した区は、添加しなかった区に比較して高いカロテノイド生産濃度を示した。【００７２】
【表７】
2010044469.tif 000008
【００７３】
〔実施例８〕
以下の組成の培地（シュークロース２０ｇ／Ｌ，コーンスティープリカーろ過処理物５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．５４ｇ／Ｌ，リン酸水素二カリウム１２水和物２．７８ｇ／Ｌ，塩化カルシウム２水和物５．０ｇ／Ｌ，硫酸マグネシウム７水和物０．７ｇ／Ｌ，硫酸鉄７水和物３．０ｇ／Ｌ、脂肪酸系消泡剤０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．５）１００ｍｌを５００ｍＬ容量の綿栓付き三角フラスコに入れ、１２１℃で１５分間オートクレーブ殺菌し、シード用フラスコ培地を２本調製した。
次に以下の組成の培地（シュークロース４０ｇ／Ｌ，コーンスティープリカー３０ｇ／Ｌ，硫酸アンモニウム０．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム２．２５ｇ／Ｌ，リン酸水素二ナトリウム１２水和物５．７ｇ／Ｌ，塩化カルシウム２水和物０．１ｇ／Ｌ，硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ／Ｌ，硫酸鉄７水和物５ｇ／Ｌ、脂肪酸系消泡剤０．５ｇ／Ｌ）２．０Ｌを５Ｌ容量の発酵槽に入れたものを２基準備した。１基の発酵槽にはＬ−グルタミン酸ナトリウム１水和物を５０ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、１基には比較のために何も添加せず、１２１℃で３０分間オートクレーブ殺菌した。【００７４】
実施例３で選抜した変異株Paracoccus属細菌Ｙ−１０７１株をシード用フラスコ培地に一白金耳植菌し、２８℃で２日間、１５０ｒｐｍで回転振とう培養を行った後、その培養液８０ｍＬを各発酵槽に植菌した。２８℃、通気量１ｖｖｍの好気培養を１２０時間行った。培養中のｐＨが７．２を維持するように１５％アンモニア水で連続的にｐＨを制御した。グルコースは枯渇しないように培養１日目、２日目および３日目にそれぞれ３０ｇずつ添加した。最低攪拌回転数を１００ｒｐｍとして培養液中の溶存酸素濃度が２〜３ｐｐｍを維持するように攪拌回転数を変化させた。気泡センサーで発泡を感知することにより脂肪酸系消泡剤を自動添加して発泡を抑えた。
培養終了時の培養液のカロテノイド濃度をＨＰＬＣにより測定したところ、結果は表８に示すとおりであった。グルタミン酸添加区は、無添加区に比較して高いカロテノイド生産濃度を示した。【００７５】
【表８】
2010044469.tif 000009
【配列表フリーテキスト】
【００７６】
配列番号１：未知生物（E-396）の説明
ｎ=a,c,gまたはｔ（存在位置:1350）
【配列表】
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【国際調査報告】
2010044469.tif 000010
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