(57)【要約】  最初に、プロテアーゼ、酵母エキスなどが添加されたホエイ分解培地を調製する。さらに、ホエイ分解培地には、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、またはモノオレイン酸プロピレングリコールが添加される。ホエイ分解培地にバクテリオシンを生産する乳酸菌を接種し、ホエイ分解培地のｐＨを４〜５に維持しながら乳酸菌を培養する。培養後のホエイ分解培地（培養液）を遠心分離して、乳酸菌が濃縮された濃縮菌液を分離する。濃縮菌液は、非常に低い抗菌活性（数１０ＡＵ以下）を示す。上記の濃縮菌液をヨーグルトミックスに添加して発酵させることにより、バクテリオシンを生産する乳酸菌を含むヨーグルトを、発酵遅延を発生させることなく製造することができる。
2010113816.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌の培養法であって、
タンパク質分解酵素により分解された乳清を含む培養液を調製する培養液調製工程と、
バクテリオシンを生産する乳酸菌を前記培養液に接種し、前記乳酸菌が接種された培養液のｐＨを４以上５未満に維持しながら前記乳酸菌を培養する培養工程と、
を備える。
【請求項２】
請求項１に記載の乳酸菌の培養法において、さらに、
前記乳酸菌が培養された培養液から前記乳酸菌が濃縮された濃縮菌液を分離する分離工程と、
を備える。
【請求項３】
請求項１に記載の乳酸菌の培養法において、
前記培養工程は、前記乳酸菌が接種された培養液のｐＨを４．７以上５未満に維持する。
【請求項４】
請求項１に記載の乳酸菌の培養法において、
前記培養液調製工程は、
前記培養液に乳化剤を添加する乳化剤添加工程、
を含む。
【請求項５】
請求項４に記載の乳酸菌の培養法において、
前記乳化剤は、モノオレイン酸プロピレングリコールおよびモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンのいずれかを含む。
【請求項６】
請求項１に記載の乳酸菌の培養法において、
前記培養工程は、前記乳酸菌が接種された培養液にアルカリ溶液を加えることにより、前記乳酸菌が接種された培養液のｐＨを調節する。
【請求項７】
発酵乳の製造法であって、
ヨーグルトミックスを生成する原料乳生成工程と、
バクテリオシンを生産する乳酸菌であるバクテリオシン生産菌を培養し、前記バクテリオシン生産菌の培養物を生成する培養物生成工程と、
前記培養物を前記ヨーグルトミックスに添加する添加工程と、
前記培養物が添加されたヨーグルトミックスを発酵させる発酵工程と、
を備え、
前記培養物生成工程は、
タンパク質分解酵素により分解された乳清を含む培養液を調製する培養液調製工程と、
前記バクテリオシン生産菌を前記培養液に接種し、前記バクテリオシン生産菌が接種された培養液のｐＨを４以上５未満に維持しながら、前記バクテリオシン生産菌を培養することにより、前記培養物を生成する培養工程と、
を含む。
【請求項８】
請求項７に記載の発酵乳の製造法において、
前記培養物生成工程は、
前記バクテリオシン生産菌が培養された培養液から前記バクテリオシン生産菌が濃縮された濃縮菌液を分離する分離工程、
を含み、
前記添加工程は、前記培養物として前記濃縮菌液を前記ヨーグルトミックスに添加する。
【請求項９】
請求項７に記載の発酵乳の製造法において、
前記培養工程は、前記バクテリオシン生産菌が接種された培養液のｐＨを、４．７以上５未満に維持する。
【請求項１０】
請求項７に記載の発酵乳の製造法において、
前記培養液調製工程は、
前記培養液に乳化剤を添加する乳化剤添加工程、
を含む。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発酵乳の製造法において、
前記乳化剤は、モノオレイン酸プロピレングリコールおよびモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンのいずれかを含む。
【請求項１２】
請求項７に記載の発酵乳の製造法において、
前記培養工程は、前記バクテリオシン生産菌が接種された培養液にアルカリ溶液を加えることにより、前記バクテリオシン生産菌が接種された培養液のｐＨを調節する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バクテリオシンを生産する乳酸菌の培養法、およびバクテリオシンを生産する乳酸菌を含む発酵乳の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヨーグルトなどの発酵乳は、生乳、脱脂粉乳、ホエイ（乳清）タンパク質などが混合された原料乳（ヨーグルトミックス）にスターターを添加し、ヨーグルトミックスを発酵させることにより製造される。スターターには、ブルガリア菌およびサーモフィラス菌などの乳酸菌が用いられる。【０００３】
一部の乳酸菌が、バクテリオシンと呼ばれる抗菌性のタンパク質またはペプチドを生産することが知られている。下記特許文献１、２に示すように、バクテリオシンを生産する乳酸菌を利用して、食品の保存性を向上させたり、食品に旨味を付与したりすることができる。【０００４】
特許文献１に係る発明では、乳および乳成分を主成分とする液体培地を用いてビフィズス菌とラクティス菌とを共生培養している。ラクティス菌は、バクテリオシンを生産する乳酸菌である。共生培養後の培養液を食品の保存剤として、食品（食パン、うどんなど）に添加することにより、食品の保存性を向上させるとともに、食品に良好な風味を付与することができる。【０００５】
特許文献２には、酵母エキスなどが添加されたホエイ培地を用いて、ラクティス菌を培養し、培養後のホエイ培地からラクティス菌を除去した風味改良剤が記載されている。この風味改良剤を用いることにより、魚介類の生臭さを消したり、食品に旨味などを付与したりすることができる。【０００６】
また、体内に摂取することで、人体に有益な作用をもたらすプロバイオティクスの機能を有する乳酸菌が存在しており、これらの乳酸菌を利用したヨーグルトなどが実用化されている。【０００７】
【特許文献１】特開平８−１８７０７１号公報
【特許文献２】特開２００４−２８３１０９号公報
【０００８】
プロバイオティクスの機能を有する乳酸菌の中には、バクテリオシンを生産するものがある。このため、プロバイオティクスとしての利用を目的として、バクテリオシンを生産する乳酸菌を含むヨーグルトを製造するときに、ヨーグルトミックスの発酵において遅延の現象が発生することがある。【０００９】
バクテリオシンを生産する乳酸菌を含むヨーグルトを製造する場合、乳酸菌の培養物をヨーグルトミックスに接種する。培養物には乳酸菌が生産したバクテリオシンが含まれるため、ヨーグルトの製造時には、プロバイオティクスとしての利用に必要な乳酸菌だけでなく、バクテリオシンがヨーグルトミックスに添加されることになる。【００１０】
ヨーグルトミックスに添加されたバクテリオシンによりスターターの活動が阻害され、カードの形成が遅れるなどして発酵遅延が生じる。したがって、プロバイオティクスとしての利用を目的として、バクテリオシンを生産する乳酸菌の培養物をヨーグルトミックスに添加する際には、培養物の抗菌活性を可能な限り低くすることが望ましい。
【発明の開示】
【００１１】
本発明の乳酸菌の培養法は、タンパク質分解酵素により分解された乳清を含む培養液を調製する培養液調製工程と、バクテリオシンを生産する乳酸菌を前記培養液に接種し、前記乳酸菌が接種された培養液のｐＨを４以上５未満に維持しながら前記乳酸菌を培養する培養工程と、を備える。
【００１２】
本発明に係る乳酸菌の培養法は、バクテリオシンを生産する乳酸菌の培養物の抗菌活性を、非常に低くすることができる。
【００１３】
本発明の発酵乳の製造法は、ヨーグルトミックスを生成する原料乳生成工程と、バクテリオシンを生産する乳酸菌であるバクテリオシン生産菌を培養し、前記バクテリオシン生産菌の培養物を生成する培養物生成工程と、前記培養物を前記ヨーグルトミックスに添加する添加工程と、前記培養物が添加されたヨーグルトミックスを発酵させる発酵工程と、を備え、前記培養物生成工程は、タンパク質分解酵素により分解された乳清を含む培養液を調製する培養液調製工程と、前記バクテリオシン生産菌を前記培養液に接種し、前記バクテリオシン生産菌が接種された培養液のｐＨを４以上５未満に維持しながら、前記バクテリオシン生産菌を培養することにより、前記培養物を生成する培養工程と、を含む。
【００１４】
本発明に係る発酵乳の製造法は、ヨーグルトミックス中のスターターの活動がバクテリオシンにより阻害されることを防止することができる。したがって、バクテリオシン生産菌を含む発酵乳を効率よく製造することができる。
【００１５】
それゆえに、この発明の目的は、抗菌活性の低い培養物を得ることができる乳酸菌の培養法と、発酵遅延を防ぐことができる発酵乳の製造法とを提供することである。
【００１６】
この発明の目的、特徴、局面、および利点は、以下の詳細な説明と添付図面によって、明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１で使用するホエイ分解培地の組成を示す図である。
【図２】実施例１におけるガセリ菌の培養結果を示す図である。
【図３】実施例２で使用するホエイ分解培地の組成を示す図である。
【図４】実施例２におけるガセリ菌の培養結果を示す図である。
【図５】実施例３で使用するヨーグルトミックスの組成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について説明する。本実施の形態に係る乳酸菌の培養法は、培地のｐＨが一定の範囲（ｐＨが４以上５未満）内となるように、アルカリ溶液を培地に加えながら乳酸菌を培養する。これにより、生菌数あたりの抗菌活性が非常に低い乳酸菌の培養物を得ることができる。
【００１９】
本実施の形態に係る乳酸菌の培養法において、培養の対象となる乳酸菌は、バクテリオシンを生産することができる乳酸菌（以下、「バクテリオシン生産菌」と呼ぶ）である。ガセリ菌などのラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌、ラクティス菌などのラクトコッカス（Lactococcus）属に属する乳酸菌などを、本実施の形態に係る乳酸菌の培養法を用いて培養することができる。具体的には、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９（Lactobacillus  gasseri  OLL2959，NITE BP-224，特許微生物寄託センター）、ラクティス菌ＯＬＳ３３１１（Lactococcus lactis subsp. lactis OLS3311，FERM
BP-10966，特許生物寄託センター）、クレモリス菌ＯＬＳ３３１２（Lactococcus lactis
subsp. cremoris OLS3312，FERM BP-10967，特許生物寄託センター）などを例示できる。
【００２０】
本実施の形態に係る乳酸菌の培養法について具体的に説明する。まず、ホエイ（乳清）を含むホエイ水溶液に、プロテアーゼなどのタンパク質分解酵素を添加して、ホエイ水溶液中のホエイタンパク質を分解させる。タンパク質分解酵素の添加前に、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）などのホエイタンパク質をホエイ水溶液に添加してもよい。
【００２１】
次に、ビール酵母エキスなどの酵母エキスをホエイ水溶液に添加して、バクテリオシン生産菌の培養に用いるホエイ分解培地を調製する。ホエイ分解培地に、窒素源として、ホエイタンパク質の他に、肉エキス、魚肉エキスなどを添加してもよい。また、ホエイ分解培地に、アスコルビン酸ナトリウムなどのビタミンと、硫酸鉄および硫酸マグネシウムなどの無機栄養物とを添加してもよい。
【００２２】
そして、好ましくは、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノオレイン酸プロピレングリコールなどの乳化剤をホエイ分解培地に添加する。これにより、バクテリオシン生産菌の培養物の抗菌活性を確実に抑制することができる。
【００２３】
ホエイ分解培地にバクテリオシン生産菌を接種し、バクテリオシン生産菌を培養する。好ましくは、ホエイ分解培地のｐＨが５未満になるまでバクテリオシン生産菌を培養させた後に、バクテリオシン生産菌を培養中のホエイ分解培地のｐＨを４以上５未満の範囲に調整しながら、バクテリオシン生産菌を培養する。ｐＨの調整は、ホエイ分解培地にアルカリ溶液を添加することにより行うことができる。アルカリ溶液として、炭酸カリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液などを用いることができる。より好ましくは、ホエイ分解培地のｐＨを４．７以上５未満の範囲に調整しながら、バクテリオシン生産菌を培養する。ホエイ分解培地の培養中のｐＨを４．７以上５未満とした場合、ホエイ分解培地の培養中のｐＨを４．７未満とした場合と比べ、バクテリオシン生産菌の増殖を促進して効率よく培養することができる。
【００２４】
バクテリオシン生産菌の培養後に、バクテリオシン生産菌を培養したホエイ分解培地（培養液）からバクテリオシン生産菌が濃縮された濃縮菌液を分離する。濃縮菌液の分離には、遠心分離または膜分離を用いることができる。
【００２５】
このようにして得られたバクテリオシン生産菌の濃縮菌液は、培養中にホエイ分解培地のｐＨが５以上に維持されながら調製された濃縮菌液と比べて、非常に低い抗菌活性を示す。すなわち、ホエイ分解培地のｐＨを４〜５に維持しながら、バクテリオシン生産菌を培養することにより、バクテリオシン生産菌の培養物の抗菌活性を低い状態に制御することができる。
【００２６】
次に、本実施の形態に係る発酵乳（ヨーグルト）の製造法について具体的に説明する。まず、原料乳であるヨーグルトミックスを調製する。ヨーグルトミックスは、生乳に脱脂粉乳、ホエイタンパク質、および水などを混合することにより調製される。なお、ヨーグルトミックスに砂糖、果肉、果汁などを添加してもよい。
【００２７】
ヨーグルトミックスを従来と同様に均質化および殺菌した後で、ヨーグルトミックスに、スターターと、上記乳酸菌の培養法で得たバクテリオシン生産菌やその濃縮菌液とを接種する。バクテリオシン生産菌やその濃縮菌液の接種量は、特に限定されない。
【００２８】
なお、スターターとして用いられる乳酸菌は、バクテリオシン生産菌と同一の乳酸菌であってもよいし、異なる乳酸菌であってもよい。
【００２９】
バクテリオシン生産菌やその濃縮菌液が接種されたヨーグルトミックスを発酵させることにより、ヨーグルトが製造される。上記発酵乳の製造法により調製された濃縮菌液などの抗菌活性は非常に低いため、ヨーグルトミックスの発酵中にスターター（乳酸菌）の活動が阻害されることがない。したがって、バクテリオシン生産菌を含むヨーグルトを従来と同程度の発酵時間で効率的に製造することができる。
【実施例】
【００３０】
以下、図面を参照しつつ、本発明に係る乳酸菌の培養法の実施例について説明する。【００３１】
｛実施例１｝
図１は、実施例１で使用するホエイ分解培地の組成を示す図である。まず、配合Ａ、Ｂのホエイ分解培地の調製について説明する。具体的には、配合Ａ、Ｂのホエイ分解培地の総重量を基準として、８．７０重量％のホエイパウダー（明治乳業社製）と、１．５０重量％のホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ８０、ＮＺＭＰ社製）と、８８．８０重量％の水とを混合して、ホエイ水溶液を調製する。０．１０重量％のタンパク質分解酵素（プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ、天野エンザイム社製）をホエイ水溶液に添加して、ホエイ水溶液中のホエイタンパク質を分解させた。【００３２】
ホエイタンパク質が分解されたホエイ水溶液に、０．２０重量％のビール酵母エキス（アサヒビール社製）と、０．５０重量％の魚肉エキス（マルハニチロ食品社製）と、０．１０重量％のアスコルビン酸ナトリウムと、０．０５重量％の硫酸鉄（ＦｅＳＯ４）とを添加した。【００３３】
さらに、乳化剤として０．０５重量％のポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、日油社製）をホエイ水溶液に添加することにより、配合Ａのホエイ分解培地を調製した。同様に、乳化剤として０．０５重量％のサンソフト８１Ｓ（モノオレイン酸ソルビタン、太陽化学社製）をホエイ水溶液に添加することにより、配合Ｂのホエイ分解培地を調製した。【００３４】
次に、生菌数が２〜４×１０７ｃｆｕ／ｍｌとなるように、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９（Lactobacillus  gasseri  OLL2959，NITE  BP-224，特許微生物寄託センター）を配合Ａ、Ｂのホエイ分解培地にそれぞれ接種した。ガセリ菌ＯＬＬ２９５９は、体内に摂取することで、血中尿酸値を低減させる作用を有しており、プロバイオティクスに利用することができるバクテリオシン生産菌である。【００３５】
ホエイ分解培地のｐＨが４．７になるまでガセリ菌ＯＬＬ２９５９を培養させた後で、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９を中和培養した。具体的には、配合Ａのホエイ分解培地のｐＨが常に４．７〜５となるように、炭酸カリウム水溶液（４０重量％）を配合Ａのホエイ分解培地に添加し、攪拌しながら、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９を３５℃、２１時間の条件で培養した（中和培養）。同様に、配合Ｂのホエイ分解培地のｐＨが常に５．５以上となるように、炭酸カリウム水溶液を配合Ｂのホエイ分解培地に添加し、攪拌しながら、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９を中和培養した。なお、中和培養は、炭酸ガスを吹き込んだ嫌気条件の下で行われている。【００３６】
中和培養の後に、配合Ａ、Ｂのホエイ分解培地（培養液）中のガセリ菌ＯＬＬ２９５９の生菌数を、ＢＣＰ培地を用いた混釈培養法により測定した。図２に、実施例１におけるガセリ菌ＯＬＬ２９５９の培養結果を示す。配合Ａのホエイ分解培地（培養液）中の生菌数は、１．１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌであり、配合Ｂのホエイ分解培地（培養液）中の生菌数は、１．６×１０１０ｃｆｕ／ｍｌであった。配合Ａ、Ｂのホエイ分解培地（培養液）中のガセリ菌ＯＬＬ２９５９の生菌数は、中和培養の後でも大きな差異は認められなかった。【００３７】
配合Ａ、Ｂのホエイ分解培地（培養液）をそれぞれ遠心分離（重力加速度：６０００Ｇ）することにより、濃縮菌液を得た。配合Ａのホエイ分解培地（培養液）から得られた濃縮菌液（以下、「濃縮菌液Ａ」という）の抗菌活性と、配合Ｂのホエイ分解培地（培養液）から得られた濃縮菌液（以下、「濃縮菌液Ｂ」という）の抗菌活性とを、後述する方法を用いて測定した。【００３８】
図２に示すように、濃縮菌液Ａの１ｍｌあたりの抗菌活性は、２００ＡＵ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｕｎｉｔ）未満であった。濃縮菌液Ａの１×１０９ｃｆｕあたりの抗菌活性は、約２０ＡＵ未満であった。一方、濃縮菌液Ｂの１ｍｌあたりの抗菌活性は、１８０００ＡＵであった。濃縮菌液Ｂの１×１０９ｃｆｕあたりの抗菌活性は、約１１００ＡＵであった。つまり、ｐＨが４．７〜５の条件で得られた濃縮菌液Ａの生菌数あたりの抗菌活性は、ｐＨが５．５以上の条件で得られた濃縮菌液Ｂの生菌数あたりの抗菌活性の６０分の１程度となった。【００３９】
また、配合Ａのホエイ分解培地を用いてｐＨが５以上となるように調整しながら、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９を中和培養した。この結果、ｐＨ５以上の条件で中和培養したときの生菌数はｐＨが４．７〜５の条件で中和培養したときの生菌数と同程度であった。ｐＨ５以上の条件で中和培養したときの１ｍｌあたりの抗菌活性は、濃縮菌液Ａの１ｍｌあたりの抗菌活性より一桁以上で大きくなった。さらに、乳化剤が添加されていないホエイ分解培地を用いて、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９を培養した。この結果、ｐＨが４．７〜５の条件でガセリ菌ＯＬＬ２９５９を中和培養したときの１ｍｌあたりの抗菌活性が、ｐＨが５以上の条件で中和培養したときの１ｍｌあたりの抗菌活性より一桁以上で低くなった。【００４０】
これらのことから、ホエイ分解培地のｐＨを４．７〜５に調整して、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９を中和培養することにより、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９を効率よく培養でき、培養物の抗菌活性を非常に低い状態に制御することができた。【００４１】
また、配合Ａのホエイ分解培地を用いてｐＨが４〜４．７の条件でガセリ菌ＯＬＬ２９５９を中和培養することにより、濃縮菌液を得た。ｐＨが４〜４．７の条件で中和培養したときの生菌数は、ｐＨが４．７〜５の条件で中和培養したときの生菌数よりやや低くなった。ｐＨが４〜４．７の条件で中和培養することにより得られた濃縮菌液の抗菌活性は、濃縮菌液Ａの抗菌活性と同程度であった。このように、ｐＨが４〜４．７の条件で中和培養しても、抗菌活性の非常に低いガセリ菌ＯＬＬ２９５９の濃縮菌液を得ることができた。【００４２】
｛実施例２｝
図３は、実施例２で使用する配合Ｃ、Ｄのホエイ分解培地の組成を示す図である。まず、配合Ｃ、Ｄのホエイ分解培地の調製について説明する。実施例１と同様の手順で、ホエイタンパク質が分解されたホエイ水溶液を調製した。そして、図３に示す配合比で、ホエイ水溶液に、ビール酵母エキス、魚肉エキス、アスコルビン酸ナトリウム、および硫酸鉄を添加した。【００４３】
ビール酵母エキスなどが添加されたホエイ水溶液に、乳化剤として０．０２５重量％のポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、日油社製）と、０．０２５重量％のサンソフト８１Ｓ（モノオレイン酸ソルビタン、太陽化学社製）とを添加して、配合Ｃのホエイ分解培地を調製した。また、ビール酵母エキスなどが添加されたホエイ水溶液に、乳化剤として０．０５重量％のサンソフトＮｏ．２５（モノオレイン酸ポリプロピレングリコール、太陽化学社製）を添加して、配合Ｄのホエイ分解培地を調製した。【００４４】
次に、生菌数が２〜４×１０７ｃｆｕ／ｍｌとなるように、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９を配合Ｃ、Ｄのホエイ分解培地にそれぞれ接種した。実施例１と同様に、ホエイ分解培地のｐＨが４．７になるまでガセリ菌ＯＬＬ２９５９を培養させた後で、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９を中和培養した。具体的には、配合Ｃ、Ｄのホエイ分解培地のｐＨがそれぞれ４．７〜５となるように、炭酸カリウム水溶液（４０重量％）を配合Ｃ、Ｄのホエイ分解培地に添加し、攪拌しながら、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９を３５℃、２１時間の条件で中和培養した。なお、中和培養は、炭酸ガスを吹き込んだ嫌気条件の下で行われている。【００４５】
中和培養の後に、配合Ｃ、Ｄのホエイ分解培地（培養液）中のガセリ菌ＯＬＬ２９５９の生菌数を、実施例１と同じ方法を用いて測定した。図４に、実施例２におけるガセリ菌ＯＬＬ２９５９の培養結果を示す。配合Ｃのホエイ分解培地（培養液）中のガセリ菌ＯＬＬ２９５９の生菌数は、１．６×１０１０ｃｆｕ／ｍｌであった。配合Ｄのホエイ分解培地（培養液）中のガセリ菌ＯＬＬ２９５９の生菌数は、１．７×１０１０ｃｆｕ／ｍｌであった。ホエイ分解培地（培養液）に使用する乳化剤によって、ガセリ菌ＯＬＬ２９５９の生菌数に差異は生じなかった。【００４６】
遠心分離により、配合Ｃ、Ｄのホエイ分解培地（培養液）から濃縮菌液をそれぞれ分離した。配合Ｃのホエイ分解培地（培養液）から得られた濃縮菌液（以下、「濃縮菌液Ｃ」という）の抗菌活性と、配合Ｄのホエイ分解培地（培養液）から得られた濃縮菌液（以下、「濃縮菌液Ｄ」という）の抗菌活性とを、実施例１と同一の方法を用いて測定した。この結果、濃縮菌液Ｃおよび濃縮菌液Ｄの１ｍｌあたりの抗菌活性は、ともに２００ＡＵ未満であった。濃縮菌液Ｃおよび濃縮菌液Ｄの１×１０９ｃｆｕあたりの抗菌活性は、ともに約１５ＡＵ未満であった。【００４７】
配合Ｃ、Ｄのホエイ分解培地（培養液）をｐＨが４〜４．７の範囲で中和培養して得られた濃縮菌液の抗菌活性は、濃縮菌液Ｃ、Ｄの抗菌活性と同程度であった。配合Ｃ、Ｄのホエイ分解培地（培養液）をｐＨが４〜４．７の範囲で中和培養したときの生菌数は、ｐＨが４．７〜５の条件で中和培養したときの生菌数より、やや低くなった。【００４８】
また、乳化剤としてサンソフトＮｏ．２５とサンソフト８１Ｓとを０．０２５重量％ずつ添加したホエイ分解培地を用いて中和培養した結果、配合Ｃと同様の結果が得られた。【００４９】
実施例１および実施例２における試験結果から、ポリソルベート８０、サンソフトＮｏ．２５を乳化剤として使用することで、抗菌活性の非常に低い濃縮菌液を得ることができた。また、乳化剤としてポリソルベート８０およびサンソフトＮｏ．２５を使用する場合、これらの乳化剤と他の乳化剤とを併用しても、抗菌活性の非常に低い濃縮菌液を得ることができた。【００５０】
｛抗菌活性の測定方法｝
次に、濃縮菌液の抗菌活性の測定方法について、濃縮菌液Ａを例にして説明する。なお、濃縮菌液Ｂ、Ｃ、Ｄの抗菌活性も、同じ方法により測定している。【００５１】
市販のＭＲＳ培地（ベクトン・ディッキンソン社製）に、ＭＲＳ培地を基準として０．１％（ｖ／ｖ）の指標菌を添加することにより、試験培地を調製した。指標菌には、ブルガリア菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）ＡＴＣＣ１１８４２（基準株）を用いた。【００５２】
凍結保存された濃縮菌液Ａを熱水浴中に５分間保持した上で、濃縮菌液Ａの１％（ｖ／ｖ）水溶液を調製した。濃縮菌液Ａの水溶液を２倍ずつ段階的に希釈して、希釈率の段数の異なる複数の希釈液を得た。希釈率の段数は、８〜１２段である。これにより、濃縮菌液Ａの水溶液を２８〜２１２倍に希釈された希釈液を調製した。各段数の希釈液を試験培地にそれぞれ添加し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）を用いて、各段数の希釈液が添加された試験培地を３７℃、２４時間の条件で嫌気培養した。【００５３】
嫌気培養の後に、指標菌が生育しない希釈率の最高段数（ｎ）を確認した。そして、希釈率の最高段数（ｎ）と濃縮菌液の水溶液の濃度（０．０１：１％）とに基づいて、濃縮菌液Ａの抗菌活性（ＡＵ）を求めた。抗菌活性は、以下の式に基づいて求めることができる。
抗菌活性（ＡＵ）＝希釈率の最高段数（ｎ）／濃縮菌液の水溶液の濃度（０．０１）【００５４】
以下、本発明に係る発酵乳の製造法の実施例として、濃縮菌液Ａ〜Ｃをそれぞれ添加したヨーグルトの製造について説明する。【００５５】
｛実施例３｝
図５は、実施例３で使用した４種類のヨーグルトミックスの組成を示す図である。まず、配合Ｅ〜Ｈのヨーグルトミックスの調製について説明する。ヨーグルトミックスの総重量を基準として、１４．１０重量％の脱脂粉乳および０．９３重量％の無塩バター（ともに明治乳業社製）と、水とを混合して、配合Ｅ〜Ｈのヨーグルトミックスを調製した。水の配合比は、配合Ｅで８２．９７重量％、配合Ｆ〜Ｈで８２．８７重量％である。【００５６】
配合Ｅ〜Ｈのヨーグルトミックスの均質化および殺菌を従来と同様に行い、配合Ｅ〜Ｈのヨーグルトミックスを約４０℃に冷却した。冷却後、２．００重量％の乳酸菌スターターを配合Ｅ〜Ｈのヨーグルトミックスに接種した。乳酸菌スターターには、明治ブルガリアヨーグルト（明治乳業社製）から分離した乳酸菌を用いた。【００５７】
配合Ｆのヨーグルトミックスに、０．１０重量％の濃縮菌液Ａを接種した。配合Ｇのヨーグルトミックスに、０．１０重量％の濃縮菌液Ｂを接種した。配合Ｈのヨーグルトミックスに、０．１０重量％の濃縮菌液Ｃを接種した。配合Ｅのヨーグルトミックスには、濃縮菌液を接種しなかった。そして、それぞれのヨーグルトミックスを４０℃の条件で乳酸濃度が１．２０％になるまで発酵させることにより、ヨーグルトを製造した。このとき、ヨーグルトミックスの乳酸濃度が１．２０％になるまでの時間（発酵時間）を測定した。【００５８】
濃縮菌液が接種されていない配合Ｅのヨーグルトミックスと、濃縮菌液Ａ、Ｃが接種された配合Ｆ、Ｈのヨーグルトミックスとは、発酵時間が約５時間であった。このことから、抗菌活性の低い濃縮菌液Ａ、Ｃが接種されたヨーグルトミックス（配合Ｆ、Ｈ）では、発酵遅延が生じなかった。【００５９】
一方、抗菌活性の高い濃縮菌液Ｂが接種されたヨーグルトミックス（配合Ｇ）の発酵時間は７時間であった。つまり、配合Ｇのヨーグルトミックスで発酵遅延が発生した。抗菌活性の高い濃縮菌液Ｂをヨーグルトミックスに添加することにより、配合Ｇのヨーグルトミックス中の乳酸菌スターターの活動が、濃縮菌液Ｂに含まれるバクテリオシンにより阻害されたと推測される。【００６０】
このように、ホエイ分解培地のｐＨを４．７以上５未満に維持しながら中和培養して得た培養物（濃縮菌液Ａ、Ｃ）をヨーグルトミックスに添加することで、バクテリオシン生産菌が添加されたヨーグルトを、従来のヨーグルトと同程度の発酵時間で効率よく製造することができた。したがって、バクテリオシン生産菌をプロバイオティクスの用途で使用する場合においても、通常のヨーグルトの製造工程をそのまま使用することができる。【００６１】
この発明を添付図面に示す実施態様について説明したが、この発明は、その詳細な説明の記載をもって制約しようとするものではなく、特許請求の範囲に記載する範囲において広く構成される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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