(57)【要約】  本発明は、多種類の細胞を同一層内で培養を可能にし、かつ細胞を破壊することなく、基材から細胞のみを均等に剥離することにある。本発明の細胞培養支持体また細胞培養方法は、基材上に２種類以上の温度応答性高分子により異なる領域に表面被覆を行った細胞培養支持体であって、該温度応答性高分子の少なくとも一つがアクリル系樹脂を含有することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材上に２種類以上の温度応答性高分子により異なる領域に表面被覆を行った細胞培養支持体であって、該温度応答性高分子の少なくとも一つがアクリル系樹脂を含有することを特徴とする細胞培養支持体。
【請求項２】
前記アクリル系樹脂を含有する温度応答性高分子の少なくとも一つが下記一般式（１）で表されることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養支持体。
【化１】
2010010837.tif 000007
（一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２は水素原子、炭素原子数１〜８のアルキル基、アリール基を表す。Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ３は水素原子、炭素原子数１〜３０のアルキル基、シクロアルキル基、または、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｍ−Ｒ０で表されるポリオキシアルキレン基を表す。ここにおいてｎは１〜３００、ｍは０〜６０の整数を表す。また、Ｒ０は、水素原子、炭素原子数１〜３０のアルキル基を表す。Ｒ４は炭素原子数３以上２２以下のアルキル基を表す。また、ｘ、ｙ、ｚは各成分の質量％を表し、０≦ｘ≦８０、０≦ｙ≦８０、０≦ｚ≦４０、ここでｘ＋ｙ＋ｚ＝１００である。）
【請求項３】
前記温度応答性高分子の少なくとも一つがＮ−イソプロピルアクリルアミドのホモポリマーもしくは他のモノマー成分との共重合ポリマーであることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞培養支持体。
【請求項４】
前記温度応答性高分子がインクジェット法によって基材上にパターニングされていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養支持体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞培養支持体上で２種類以上の異なる細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項６】
請求項５に記載の細胞培養方法であって、２種類以上の異なる細胞を温度応答性高分子の臨界温度以下にして剥離することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞培養方法で培養した細胞を重ね合わせることを特徴とする細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人や細胞培養、組織培養等の分野において利用される細胞の培養を生体外で行うための細胞培養支持体、この細胞培養支持体を用いた細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、動物細胞の一般的な培養法として広く用いられる単層細胞培養法は、生体内で有していた複雑系の細胞本来の培養環境下におかれないため、生存を継続する分化機能を維持することが困難であり、細胞は生存または増殖するものの、生体の複雑系を精密に再現していないため、分化機能の停止や制御困難を招くことがよく知られている。【０００３】
例えば、初代培養細胞の中でも高度に生体の代謝機能が分化した初代肝細胞では、単層培養期間内にその機能が消失してしまい易い。例えば、マウス初代培養肝細胞は、シャーレ内で単層培養を行っても、肝細胞の重要な機能の一つであるアンモニア代謝能が、通常、培養開始から１０代程度で失われてしまうことが知られている。【０００４】
肝細胞の長期培養化には、（生体の肝臓の構造を考えて）血管由来の細胞との共培養が有効であると考えられているが、通常の培養皿を用いる方法で、ただ単に肝細胞と線維芽細胞あるいは肝細胞と内皮細胞との混合等では安定に共培養することはできない。【０００５】
肝実質細胞とラット血管内皮細胞との共培養の例が知られているが（例えば、特許文献１）、基材にパターニングされている温度応答性高分子が、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミドモノマー重合体とＮ−イソプロピルアクリルアミドモノマー重合体とそれぞれの単独ポリマーで構成されている。２つの単独ポリマーは、温度応答性の性能に差があるため、細胞培養後の、低温にして剥離する際に均等に剥がれず、一部細胞が破損する。【０００６】
また細胞培養基材への細胞接着層のパターニングには、例えば、特許文献２のようにインクジェット法により細胞接着材料で細胞接着層を基材にパターニングする方法があるが、１つのポリマーで基材に塗布し、一定の線幅を描いているだけであり、複数のポリマーを塗り分ける技術については言及されていない。【０００７】
また、細胞接着材料としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いているため、細胞の剥離ができない。また、基材へＰＥＧを固定する手段として超臨界二酸化炭素を使っており、プロセスが複雑な上に、装置が大型化してしまう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第０１／０６８７９９号パンフレット
【特許文献２】特開２００６−３２５７９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
多種類の細胞を同一層内で培養を可能にし、かつ細胞を破壊することなく、基材から細胞のみを均等に剥離することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の上記目的は、以下の構成により達成することができる。【００１１】
１．基材上に２種類以上の温度応答性高分子により異なる領域に表面被覆を行った細胞培養支持体であって、該温度応答性高分子の少なくとも一つがアクリル系樹脂を含有することを特徴とする細胞培養支持体。【００１２】
２．前記アクリル系樹脂を含有する温度応答性高分子の少なくとも一つが下記一般式（１）で表されることを特徴とする前記１に記載の細胞培養支持体。【００１３】
【化１】
2010010837.tif 000002
【００１４】
（一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２は水素原子、炭素原子数１〜８のアルキル基、アリール基を表す。Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ３は水素原子、炭素原子数１〜３０のアルキル基、シクロアルキル基、または、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｍ−Ｒ０で表されるポリオキシアルキレン基を表す。ここにおいてｎは１〜３００、ｍは０〜６０の整数を表す。また、Ｒ０は、水素原子、炭素原子数１〜３０のアルキル基を表す。Ｒ４は炭素原子数３以上２２以下のアルキル基を表す。また、ｘ、ｙ、ｚは各成分の質量％を表し、０≦ｘ≦８０、０≦ｙ≦８０、０≦ｘ≦４０、ここでｘ＋ｙ＋ｚ＝１００である。）
３．前記温度応答性高分子の少なくとも一つがＮ−イソプロピルアクリルアミドのホモポリマーもしくは他のモノマー成分との共重合ポリマーであることを特徴とする前記１または２に記載の細胞培養支持体。【００１５】
４．前記温度応答性高分子がインクジェット法によって基材上にパターニングされていることを特徴とする前記１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養支持体。【００１６】
５．前記１〜４のいずれか１項に記載の細胞培養支持体上で２種類以上の異なる細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法。【００１７】
６．前記５に記載の細胞培養方法であって、２種類以上の異なる細胞を温度応答性高分子の応答温度以下にして剥離することを特徴とする細胞培養方法。【００１８】
７．前記６に記載の細胞培養方法で培養した細胞を重ね合わせることを特徴とする細胞培養方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の細胞培養支持体により、多種類の細胞を同一層内で培養を可能にし、かつ細胞を破壊することなく、基材から細胞のみを剥離する技術が達成できた。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下本発明を実施するための最良の形態について詳しく説明する。
【００２１】
（温度応答性高分子）
本発明においては、温度応答性高分子を一般的な細胞培養基材の上に塗布することが好ましい。温度応答性高分子とは、親水性と疎水性とが温度変化により可逆的に変化する高分子材料のことである。また、好ましい温度応答性高分子として、アクリル系樹脂のモノマー及びアクリルアミドモノマーが共重合したポリマーがあげられる。更に好ましい温度応答性高分子としては前記一般式（１）で表される高分子があげられる。温度応答性高分子を表面に備えた細胞培養基材は、疎水性条件下では細胞と優れた接着性を示すため、細胞を好適に培養、増殖させることができ、また親水性条件下では、細胞との接着性を低下させることができるため、タンパク質加水分解酵素や化学薬品を使用せずに細胞を剥離できるため、細胞の破損や、基材の剥離混入を生じることなく、容易に細胞の回収が可能である。
【００２２】
さらに、疎水性から親水性あるいは親水性から疎水性への変化が迅速であるため、温度をはじめとする外部環境を変化させる際に細胞に与える影響が少ないので好ましい。温度応答性高分子の親水性と疎水性とが変化する温度を臨界温度といい、特に高温で疎水性、低温で親水性になる時の温度を下限臨界温度という。細胞培養に使用される細胞は、多くは恒温動物由来であるため、人間の体温付近の３７度近辺で培養されることが多く、該温度で細胞が細胞培養支持体に接着しやすい方が良く、つまり、３７度近辺で細胞培養支持体表面は疎水性の性質であることが好ましい、細胞の剥離時には、熱によるたんぱく質の変性を起こさないために低温で細胞培養支持体から剥離した方が好ましいい。つまり低温で細胞培養支持体表面は親水性の性質であることが好ましい。
【００２３】
さらには、細胞を好適に培養・剥離できることから、該下限臨界温度が２０℃以上４０℃以下程度の温度範囲にあることが好ましい。
【００２４】
本発明においては、温度応答性高分子の少なくとも一つがアクリル系樹脂を含有することを特徴とする。
【００２５】
本発明におけるアクリル系樹脂としては、アクリル酸、メタクリル酸、メチルアクリレート、メチルメタクリレート等の一般的なアクリル樹脂でもよく、その誘導体でかまわない。また脂環式炭化水素骨格からなる多環式炭化水素系化合物であるアクリル樹脂でもよく、多環式炭化水素系化合物としては、脂肪族の多環構造を有し、３次元的な架橋構造を含むものでもよい、例えば、トリシクロデカンジメタノールジメタクリレート、トリシクロデカンジメタノールジアクリレートや、アダマンチルメタクリレート、アダマンチルアクリレート等や、イソボルニルメタクリレート、イソボルニルアクリレート、ビニルノルボルネン等が挙げられる。
【００２６】
アクリル系樹脂モノマーおよびアクリルアミドモノマーが共重合したポリマーを用いると細胞の剥離性がよくなる。その理由として、アミドは生体内たんぱく質のペプチド結合と化学的に同じ構造であるため、細胞とポリマーの親和性が強くなり、これが剥離時の細胞破損の原因になっていると考えられる。アクリルアミドモノマーとアクリル系樹脂モノマーを共重合したポリマーを細胞培養の支持体とすることで細胞剥離性と温度応答性の両方が満足できる素材が得られた。
【００２７】
温度応答性高分子としては、アクリルアミドポリマーがよく知られており、これはアクリルアミドモノマーを重合することにより得られる。
【００２８】
このような重合体を与えるアクリルアミドモノマーの例としては、Ｎ−置換アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換アクリルアミド誘導体、Ｎ−置換メタクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換メタクリルアミド誘導体などを好ましく使用することができ、具体的にはＮ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピペリディン、Ｎ−アクリロイルピロリジンが挙げられる。
【００２９】
かかるアクリルアミドポリマーとしては、例えば、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−テトラフルフリルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−エチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−アクリロイルピペリディン）、ポリ（Ｎ−アクリロイルピロリディン）が挙げられる。
【００３０】
また水溶性アクリルアミドモノマーの重合体としては、以上のような単一水溶性アクリルアミドモノマーからの重合体の他、これらから選ばれる複数の異なる水溶性アクリルアミドモノマーを重合して得られる共重合体を用いることも有効である。
【００３１】
また上記水溶性アクリルアミドモノマーからなる重合体が好ましいが、上記水溶性アクリルアミドモノマーとそれ以外の水溶性アクリルアミドモノマーまたは有機溶媒可溶性アクリルアミドモノマーとの共重合体も、得られた重合体が親水性および疎水性の両方を示すものであれば使用することができる。共重合に用いられるアクリルアミドモノマーとしては、具体的にはＮ−アルキルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、アクリルアミド等のアクリルアミド類、または、Ｎ−アルキルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルメタクリルアミド、メタクリルアミド等のメタクリルアミド類が挙げられる。なお、より好ましくは、Ｎ−アルキルアクリルアミドまたはＮ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミドが用いられる。アルキル基としては、炭素数が１〜４のものが好ましく選択される。その他には、アクリロイルモルフォリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルメチルホモピペラディン、Ｎ−アクリロイルメチルピペラディン等も用いることができる。
【００３２】
またアクリル系樹脂としては、アクリル樹脂モノマーを基本として他のモノマーと共重合してよく、本発明において、温度応答性高分子としては、好ましくは、下記一般式（１）で表される化合物である。
【００３３】
【化２】
2010010837.tif 000003
【００３４】
ここにおいてＲ１、Ｒ２は水素原子、炭素原子数１〜８のアルキル基、アリール基を表す。Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ３は水素原子、炭素原子数１〜３０のアルキル基、シクロアルキル基、または、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｍ−Ｒ０で表されるポリオキシアルキレン基を表す。ここにおいてｎは１〜３００、ｍは０〜６０の整数を表す。また、Ｒ０は、水素原子、炭素原子数１〜３０のアルキル基を表す。Ｒ４は炭素原子数３以上２２以下のアルキル基を表す。また、ｘ、ｙ、ｚは各成分の質量％を表し、０≦ｘ≦８０、０≦ｙ≦８０、０≦ｘ≦４０、ここでｘ＋ｙ＋ｚ＝１００である。
【００３５】
Ｒ１、Ｒ２で表される炭素原子数１〜８のアルキル基としては直鎖でもよく分岐してもよい。例えば、メチル基、エチル基、イソプロピル基、イソブチル基、ドデシル基等の基を表し、また、置換されていてもよい。置換基としては、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、カルボキシ基、また、アシル基等の基を含み、例えば、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基等が挙げられる。シクロアルキル基としてはシクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
【００３６】
Ｒ１、Ｒ２で表されるアリール基としてはフェニル基、またトリル基等の置換フェニル基が挙げられる。また、Ｒ１、Ｒ２の少なくとも一つは水素原子であることが好ましい。
【００３７】
Ｒ３で表される炭素原子数１〜３０のアルキル基は、直鎖でもよく分岐してもよい、分岐してもよいアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、イソプロピル基、イソブチル基、ドデシル基等の基を表す。無置換のアルキル基、置換アルキル基を含み、無置換のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ドデシル基等の基を表す。また、置換アルキル基における置換基としてはハロゲン原子、ヒドロキシ基、カルボキシ基等の基を含み、例えば、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基等が挙げられる。シクロアルキル基としてはシクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられるが、置換シクロアルキル基でもよい、また、シクロアルキル基の骨格炭素がヘテロ原子で置換された例えばオキソラニル基、オキサニル基、ピラジニル基等のヘテロ原子を含む飽和炭化水素基でもよい。
【００３８】
Ｒ３に含まれてもよい−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｍ−Ｒ０で表されるポリオキシアルキレン基としては、オキシエチレン基の繰り返し単位（ｎ）としては１〜３００が好ましく、より好ましいのは６〜１００の範囲が好ましく、さらに好ましいのは８〜５０の範囲である。また、またＲ３に含まれてもよいオキシプロピレン基の繰り返し単位（ｍ）としては０〜６０が好ましく、より好ましいのは０〜３０の範囲が好ましく、さらに好ましいのは０〜１５の範囲である。これらオキシエチレン基とオキシプロピレン基は混在してもよい。Ｒ０で表される炭素原子数１〜３０のアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、オクチル、デシル、ドデシル、ステアリル等の基が挙げられる。
【００３９】
Ｒ４で表される炭素原子数３以上２２以下のアルキル基としては、直鎖あるいは分岐アルキル基でもよく、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、ヘキシル基、ドデシル基、ステアリル基等を表す。
【００４０】
一般式（１）の共重合体の製造は、各成分モノマーの共重合により得ることができる。
【００４１】
下記に各成分モノマーの例を挙げるが、一般式（１）の条件を満たしていれば、これに限定されることはない。
【００４２】
一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５で表される基を含むモノマーとしては、代表的にはダイアセトンアクリルアミド、アクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ピロリジニルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−メチル、Ｎ−イソロプロピルアクリルアミド、Ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−メチル、Ｎ−イソロプロピルアクリルアミド、Ｎ−ピペリジニルアクリルアミド、Ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド等のモノマーが挙げられる。
【００４３】
一般式（１）において、Ｒ３、Ｒ６を含むモノマー、また、Ｒ４、Ｒ７で表される基を含むモノマーとしては、下記の中から選択して用いることができる。
【００４４】
例えば、アクリル酸、メタクリル酸、メチルメタクリレート、ブチルメタクリレート等が挙げられる。
【００４５】
また、例えば（ポリオキシアルキレン）アクリレートおよびメタクリレートは、市販のヒドロキシポリ（オキシアルキレン）材料、例えば商品名“プルロニック”［Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（旭電化工業（株）製）］、アデカポリエーテル（旭電化工業（株）製）、カルボワックス［Ｃａｒｂｏｗａｘ（グリコ・プロダクス）］、トリトン［Ｔｏｒｉｔｏｎ（ローム・アンド・ハース（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ製））］およびＰ．Ｅ．Ｇ（第一工業製薬（株）製）として販売されているものを公知の方法でアクリル酸、メタクリル酸、アクリルクロリド、メタクリルクロリドまたは無水アクリル酸等と反応させることによって製造できる。
【００４６】
また、上市されているものとして、日本油脂株式会社製のポリアルキレングリコールモノ（メタ）アクリレートとしてブレンマーＰＥ−９０、ブレンマーＰＥ−２００、ブレンマーＰＥ−３５０、ブレンマーＡＥ−９０、ブレンマーＡＥ−２００、ブレンマーＡＥ−４００、ブレンマーＰＰ−１０００、ブレンマーＰＰ−５００、ブレンマーＰＰ−８００、ブレンマーＡＰ−１５０、ブレンマーＡＰ−４００、ブレンマーＡＰ−５５０、ブレンマーＡＰ−８００、ブレンマー５０ＰＥＰ−３００、ブレンマー７０ＰＥＰ−３５０Ｂ、ブレンマーＡＥＰシリーズ、ブレンマー５５ＰＥＴ−４００、ブレンマー３０ＰＥＴ−８００、ブレンマー５５ＰＥＴ−８００、ブレンマーＡＥＴシリーズ、ブレンマー３０ＰＰＴ−８００、ブレンマー５０ＰＰＴ−８００、ブレンマー７０ＰＰＴ−８００、ブレンマーＡＰＴシリーズ、ブレンマー１０ＰＰＢ−５００Ｂ、ブレンマー１０ＡＰＢ−５００Ｂなどがあげられる。同様に日本油脂株式会社製のアルキル末端ポリアルキレングリコールモノ（メタ）アクリレートとしてブレンマーＰＭＥ−１００、ブレンマーＰＭＥ−２００、ブレンマーＰＭＥ−４００、ブレンマーＰＭＥ−１０００、ブレンマーＰＭＥ−４０００、ブレンマーＡＭＥ−４００、ブレンマー５０ＰＯＥＰ−８００Ｂ、ブレンマー５０ＡＯＥＰ−８００Ｂ、ブレンマーＰＬＥ−２００、ブレンマーＡＬＥ−２００、ブレンマーＡＬＥ−８００、ブレンマーＰＳＥ−４００、ブレンマーＰＳＥ−１３００、ブレンマーＡＳＥＰシリーズ、ブレンマーＰＫＥＰシリーズ、ブレンマーＡＫＥＰシリーズ、ブレンマーＡＮＥ−３００、ブレンマーＡＮＥ−１３００、ブレンマーＰＮＥＰシリーズ、ブレンマーＰＮＰＥシリーズ、ブレンマー４３ＡＮＥＰ−５００、ブレンマー７０ＡＮＥＰ−５５０など、また共栄社化学株式会社製ライトエステルＭＣ、ライトエステル１３０ＭＡ、ライトエステル０４１ＭＡ、ライトアクリレートＢＯ−Ａ、ライトアクリレートＥＣ−Ａ、ライトアクリレートＭＴＧ−Ａ、ライトアクリレート１３０Ａ、ライトアクリレートＤＰＭ−Ａ、ライトアクリレートＰ−２００Ａ、ライトアクリレートＮＰ−４ＥＡ、ライトアクリレートＮＰ−８ＥＡなどが挙げられ、これらの中から選択し用いることができる。
【００４７】
これらの共重合体からなるポリマーは親水性と親油性を併せもち下限臨界温度によりその性質が可逆的に変化する。下限臨界温度を変化させるには、一般式（１）のｘ、ｙ、ｚの共重合比を変えることで任意に決めることができる。
【００４８】
例えば、オキシエチレン基の繰り返し単位を多くすることで下限臨界温度をあげることができる。またＲ４、Ｒ７の置換基を疎水的にすることで下限臨界温度を下げることができる。
【００４９】
目的の下限臨界温度に応じた混合比率で、モノマーを混合し、例えば溶媒として各モノマー、また共重合体に対し溶解性のよい溶媒、例えばメチルエチルケトン等に溶解し、重合開始剤を加えて、室温あるいは加温、またはＵＶ光で溶液重合させればよい。
【００５０】
共重合の形態としては、ランダム共重合でもよく、ブロック共重合でもよい。下限臨界温度の親水、疎水変化をシャープにするためには、ランダム共重合が好ましい。
【００５１】
これらの、また本発明に係るアクリル系樹脂を含有する温度応答性高分子においては、重合開始剤としては、アクリル系樹脂モノマーとアクリルアミドモノマーの重合であるため、ラジカルを発生する開始剤であることが好ましく、アゾ系開始剤、過酸化物系開始剤を用いることができる。
【００５２】
油溶性の過酸化物系あるいはアゾ系開始剤が好ましく、一例を挙げると、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、過酸化オクタノイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、メチルエチルケトンパーオキサイド、ジイソプロピルパーオキシジカーボネート、キュメンハイドロパーオキサイド、シクロヘキサノンパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ジイソプロピルベンゼンハイドロパーオキサイド等の過酸化物系開始剤、２，２′−アゾビスイソブチロニトリル、２，２′−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、２，２′−アゾビス（２，３−ジメチルブチロニトリル）、２，２′−アゾビス（２−メメチルブチロニトリル）、２，２′−アゾビス（２，３，３−トリメチルブチロニトリル）、２，２′−アゾビス（２−イソプロピルブチロニトリル）、１，１′−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）、２，２′−アゾビス（４−メチキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）、２−（カルバモイルアゾ）イソブチロニトリル、４，４′−アゾビス（４−シアノバレリン酸）、ジメチル−２，２′−アゾビスイソブチレート等がある。
【００５３】
特に、ターシャリイソブチルハイドロパーオキサイド、クメンハイドロパーオキサイド、パラメンタンハイドロパーオキサイドなどの有機過酸化物類、過酸化水素等が好ましい。
【００５４】
またＵＶ硬化性開始剤も同様に重合開始剤として好ましく、例えば、アセトフェノン、アセトフェノンベンジルケタール、１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン、キサントン、フルオレノン、ベンズアルデヒド、フルオレン、アントラキノン、トリフェニルアミン、カルバゾール、３−メチルアセトフェノン、４−クロロベンゾフェノン、４，４′−ジメトキシベンゾフェノン、４，４′−ジアミノベンゾフェノン、ミヒラーケトン、ベンゾインプロピルエーテル、ベンゾインエチルエーテル、ベンジルジメチルケタール、１−（４−イソプロピルフェニル）−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−１−オン、２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニルプロパン−１−オン等の光ラジカル開始剤等が挙げられる。
【００５５】
これら重合開始剤は、モノマーに対して、０．０１〜２０質量％、特に、０．１〜１０質量％使用されるのが好ましい。
【００５６】
本発明に係る共重合体の製造において反応の場としては、有機溶媒または水を使ってもよく、または使わなくてもよい。後工程で溶媒を除く必要があるため、好ましくは、溶媒を使用しない方がよい。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、酢酸エチル、酢酸メチル等のエステル類、メチルエチルケトン、アセトン等のケトン類、エーテル、イソプロピルエーテル等エーテル類、またテトラヒドロフラン、ジオキサン等の環状エーテル類、あるいは芳香族炭化水素であるトルエン等特に制限はないが、原料となるモノマーに対しまた生成する共重合体に対し、溶解性の高い溶媒を選択して用いることが好ましい。
【００５７】
重合温度が余り低くならない様に、溶媒の沸点としては５０℃以上が好ましく、７０℃以上がさらに好ましい。しかしながら、１５０℃以上と高くなると、その後の取り扱いに工数を要するので、１５０℃以下であることが好ましい。
【００５８】
前記共重合反応において、重合後、最終的には、固形分濃度が１０質量％以上４０質量％以下であることが好ましく、また、最終的な共重合体を含む溶液の粘度が固形分３０質量％換算で１０ｍＰａ・ｓ以上５００ｍＰａ・ｓ以下となる重合度であることが好ましい。
【００５９】
本発明に係る共重合反応においては、残モノマー量を１質量％以下とし、反応を終了させる。この測定は、ガスクロマトグラフにて行う。
【００６０】
共重合ポリマーを含有する反応液は、貧溶媒と混合し、析出させ、さらに、溶解、析出を繰り返し、固形分として、単離することができる。
【００６１】
本発明に用いられる温度応答性高分子の具体例としては実施例中、Ｎｏ．Ｅ〜Ｌ等で表されるポリマーが挙げられる。
【００６２】
本発明の細胞培養基材に上記温度応答性高分子を塗布する際には、その特性を改良する目的で、重合時に公知慣用の有機架橋剤を使用してもよい。使用する有機架橋剤濃度は特に限定されず、目的に応じて選択できる。使用できる有機架橋剤としては、従来から公知のＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ′−プロピレンビスアクリルアミド、ジ（アクリルアミドメチル）エーテル、１，２−ジアクリルアミドエチレングリコール、１，３−ジアクリロイルエチレンウレア、エチレンジアクリレート、Ｎ，Ｎ′−ジアリルタータルジアミド、Ｎ，Ｎ′−ビスアクリリルシスタミンなどの二官能性化合物や、トリアリルシアヌレート、トリアリルイソシアヌレートなどの三官能性化合物が例示できる。
【００６３】
（細胞培養支持体について）
本発明にかかわる細胞培養支持体の基材としては各種高分子材料、ガラス、改質ガラス、ウール布、コットン布、紙、金属（例えばアルミニウム）等が挙げられる。取り扱い上の観点より本発明の細胞培養支持体における基材としては、プラスチック材料（例えば、セルロースアセテート、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリアミド、ポリイミド、セルローストリアセテートまたはポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等）が好ましく、本発明においてはポリスチレンが特に好ましい。支持体の厚みとしては５０〜３０００μｍ程度、好ましくは７０〜１８００μｍである。
【００６４】
細胞培養用の基材は、温度応答性高分子を付着し易くさせるため基材表面にグロー放電、コロナ放電、真空プラズマ処理、大気圧プラズマ処理またはシランカップリング処理などで表面処理を施されていてもよい。
【００６５】
（温度応答性高分子の被覆方法）
本発明の温度応答性高分子を基材の表面に被覆する方法としては、基材にモノマーで塗布して、重合する方法と、あらかじめモノマーを重合して温度応答性高分子にしてから塗布する方法がある。どちらの方法でもよいが、パターニングの観点からモノマーで基材へ塗布後、重合する方が好ましい。
【００６６】
基材上に温度応答性高分子、またはそのモノマーを塗布する方法には特に制限はなく、例えばバーコーター法、カーテンコート法、浸漬法、エアーナイフ法、ホッパー塗布法、リバースロール塗布法、グラビア塗布法、エクストリュージョン塗布法、真空蒸着法（スパッタリング法）等の公知の方法を用いることができる。また２種類の温度応答性高分子を細胞培養基材の支持体上にパターニングする際には、リソグラフィー法、インクジェット方法、スーパーインクジェット方法で塗布することが好ましい。
【００６７】
温度応答性高分子を基材上へ固定化する技術としては、熱による硬化、またはＵＶ照射による硬化のどちらを採用してもよい。
【００６８】
反応が早いという観点でＵＶ照射による硬化が好ましく、ＵＶ光を用いる場合は、光源として、例えば、０．１ｋＰａ〜１ＭＰａまでの動作圧力を有する低圧、中圧、高圧水銀ランプ、メタルハライドランプや紫外域の発光波長を持つキセノンランプ、冷陰極管、熱陰極管、ＬＥＤ等従来公知のものが用いられる。
【００６９】
なお、本発明において、温度応答性高分子の塗布量は、細胞培養の目的に応じた適量を選ぶことが好ましいが、細胞を培養し、その後、細胞を基材から剥離するという目的の場合には、０．１μｇ／ｃｍ２以上、５．０μｇ／ｃｍ２以下が好ましく、０．５μｇ／ｃｍ２以上、３．０μｇ／ｃｍ２以下がより好ましい。
【００７０】
（温度応答性高分子の細胞培養基材へのパターニングについて）
本発明は、同一層内に異なる領域を被覆した２種類以上の温度応答性高分子上で２種類以上の細胞を異なる領域で培養できればよいが、細胞を積層する際には、各層間の細胞パターンが同じであった方が組織的な機能発現という点で好ましい。そのためには、温度応答性高分子が基材へパターニングされた細胞培養支持体の方が好ましい。
【００７１】
本発明に係る温度応答性高分子を基材の表面に所定パターンで付加する際には、温度応答性高分子を構成する材料を液状化して付加することが好ましい。液状化した温度応答性高分子を構成する材料を所定のパターンで付加する方法としては、スクリーン印刷法やインクジェット法などの印刷方法を用いることが好ましい。このような印刷方法を用いると、より簡単に温度応答性高分子を構成する材料を細胞培養する基材の表面に任意のパターンで付加することができる。また、所定のパターンに穿孔したマスクを作製し、これを基材表面上に設置した後、温度応答性高分子を構成する材料を含有した溶液をスプレー塗布する方法を採用することもできる。
【００７２】
なお、本発明の細胞培養支持体を用いて血管や神経系などの複雑で個体差のあるパターンを形成する場合、特に、個別対応性の高いインクジェット法が好ましい。それ以外の方法としては、スクリーン印刷方法、スプレー塗布方法でも可能であるが、複雑なパターンを形成しようとした場合、隣接する異種の温度応答性高分子間でにじみによる混合、重なり合い、境界線ですきまが開いてしまうなどの問題を起こしやすい。この観点からも解像度の高いインクジェット方法がより好ましい。
【００７３】
また、温度応答性高分子を構成する材料を液状にする方法としては、温度応答性高分子を構成する材料を加熱して軟化させる方法や、温度応答性高分子を構成する材料を所定の溶媒に溶解する方法などが挙げられるが、温度調整を行う必要のない点から溶媒に溶解する方法が好適である。
【００７４】
またパターニングできる線幅としては、１μｍ以上１０００μｍ以下が好ましく、さらに好ましくは、３μｍ以上１００μｍ以下が好ましい。
【００７５】
（細胞培養支持体上で培養される細胞とその積層化について）
本発明の細胞培養支持体上で培養される細胞は温度応答性高分子の下限臨界温度以下にし、支持体表面を親水化することで培養された細胞を剥離する。この剥離された細胞を重ね合わせるにあたり、細胞が概ね２〜２００層程度、特に５〜１００層程度重なり合った積層体が得られるように、細胞数を調整することが望ましい。積層体において細胞が多数重なりすぎている場合には積層体の中央層部の細胞が栄養不足、ガス交換不足になり、細胞の重なりが少なすぎる場合は細胞数が少なく十分な機能を発揮する積層体が形成され難い。上記範囲であればこのような問題は生じない。
【００７６】
本発明の細胞培養支持体は、２種類以上の下限臨界温度をもった温度応答性高分子で表面を加工しているため、それに合わせる形で２種類以上の異なった細胞を同一層内に共培養できる。この細胞のうち少なくとも１つを血管内皮細胞等の血管再生能力を秘めた細胞にすることで、積層数を増やしても細胞が栄養不足、ガス交換不足になりにくく、本発明の目的である多種類の細胞の分化機能を精密且つ厳密に発現、さらに組織としての機能を維持するこのできる細胞の培養方法が確立できることとなった。
【００７７】
積層体の細胞数は、例えば積層体の載った透過性膜を切り出し、これをホルマリン固定後、パラフィン包埋切片を作製して顕微鏡観察することにより確認することができる。
【００７８】
本発明方法の対象となる細胞としては、特に限定されるものではないが、接着性の動物細胞が好適である。細胞の由来も特に限定されず、ヒト、マウス、ラット等のいずれの動物由来のものも使用できる。また、接着性の動物細胞は、初代培養細胞および株化細胞の双方を対象とすることができる。
【００７９】
本発明方法は、特に、細胞の機能維持が困難な初代培養細胞の培養に適する。初代培養細胞は、軟骨、骨、皮膚、神経、口腔、消化管、肝臓、膵臓、腎臓、腺組織、副腎、心臓、筋肉、腱、脂肪組織、結合組織、生殖器、眼球、血管、骨髄または血液のいずれの組織に由来するものであってもよい。細胞培養支持体表面の温度応答性高分子の種類１つに対して１つの細胞を藩種することが適しており、細胞は、単一組織に由来する単一種類の細胞を用いることもできる。複数の温度応答性高分子が表面に存在している場合は、その数だけ異なる複数種の細胞を用いることもできる。
【００８０】
具体的には、例えば、軟骨細胞、骨芽細胞、表皮角化細胞、メラニン細胞、神経細胞、神経幹細胞、グリア細胞、肝細胞、腸上皮細胞、膵β細胞、膵外分泌細胞、腎糸球体内皮細胞、尿細管上皮細胞、乳腺細胞、甲状腺細胞、唾液腺細胞、副腎皮質細胞、副腎髄質細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、脂肪前駆細胞、水晶体細胞、角膜細胞、血管内皮細胞、骨髄間質細胞またはリンパ球などを使用できる。細胞は、一種を単独でまたは二種以上を組み合わせて用いることができる。
【００８１】
このようにして得られた細胞培養物は、例えば医用生体材料用の細胞として使用できる。本発明において、再生医用生体材料とは、ヒト等の動物の組織の代替物として使用される材料をいう。再生医用生体材料としては、培養された細胞の種類に応じて、人工膵臓、人工脾臓、人工腎臓、人工心臓のような人工臓器、人工消化管、人工血管、人工皮膚、人工神経、人工骨、人工軟骨、人工内耳、人工水晶体、人工角膜など、またはこれらの一部分が挙げられる。
【００８２】
またヒト等の動物の組織の代替物として、実験用動物代替細胞、抗癌剤感受性試験、創薬支援等に使用される場合も再生医用生体材料に含まれる。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。なお、特に断りない限り、実施例中の「％」は「質量％」を示す。【００８４】
（１）試料の作製
（１．１）温度応答性高分子Ａ〜Ｌの合成（比較例、本発明）
０．５リットルの四つ口セパラブルフラスコに滴下装置、温度計、窒素ガス導入管、攪拌装置および還流冷却管を付し、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）５０ｇ、および表１に記載の組成割合でＮＩＰＡＭ以外のモノマー（単位ｇ）、を仕込み、８０℃に加熱した。さらに表１に記載のＮＩＰＡＭモノマー（単位ｇ）をメチルエチルケトン４３ｇに溶解しさらにラウリルパーオキサイド０．１２ｇを溶解した液を、フラスコ中に２時間かけて滴下した。その後１時間かけて昇温し還流状態になった時点で、ラウリルパーオキサイド０．１７ｇをメチルエチルケトン３３ｇに溶解した液をフラスコ中に２時間かけて滴下し、同温度にてさらに３時間反応させた。その後メチルハイドロキノン０．３３ｇをメチルエチルケトン１０７ｇに溶解した液を添加し冷却後、ポリマー含有量として３０質量％のポリマー溶液Ａ〜Ｌをそれぞれ得た。分子量は、ＧＰＣでポリスチレン換算の重量平均分子量として求めた。【００８５】
以下において、
ブレンマーＰＭＥ−４００：−（ＥＯ）ｍ−ＣＨ３（ｍ≒９）を有するメタアクリレートブレンマーＰＳＥ−４００：−（ＥＯ）ｍ−Ｃ１８Ｈ３７（ｍ≒９）を有するメタアクリレート
（ＥＯ；エチレンオキシ基）
上記はすべて日本油脂製。
ＮＩＰＡＭ：Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（興人製）
ＤＥＡＡ：Ｎ−ジエチルアクリルアミド（興人製）
ＤＡＡＭ：ダイアセトンアクリルアミド（協和発酵製）
ＢＭＡ：ブチルメタクリレート（東京化成品）
（１．２）温度応答性高分子Ａ〜Ｌの下限臨界温度評価
上記（１．１）で作製されたポリマー／ＭＥＫ溶液の３００ｇを室温で蒸留水１０００ｇに徐々に添加したのち（ポリマー溶液Ｃ及びＤ以外は均一溶液を構成している）、温度を４５℃にあげると、析出するので、これを分離し、４０℃の温水で充分に洗浄し、残モノマーを除いた。その後、単離したポリマーを２５℃の純水に溶解させ１０質量％濃度のポリマー溶液を作製した。その後溶液の温度を上げてゆき、ポリマーが析出した温度を下限臨界温度とした。結果を表１に記載した。ただし、ポリマー溶液Ｃ及びＤは２５℃の純水に溶解せず、既にポリマーが析出しているため、下限臨界温度はなしとした。【００８６】
【表１】
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【００８７】
表１より、アクリル樹脂の共重合組成比を変化させることで、細胞が培養しやすい体温付近で下限臨界温度を生じるポリマーの下限臨界温度を変化させることが達成できた。【００８８】
（１．３）モノマーのインクジェット塗布と重合方法
上記（１．１）で作製したポリマー／ＭＥＫ（３０質量％溶液）と同じ組成になるように、各モノマーを以下表２記載の組成比にして同じく固形分３０質量％になるようにＭＥＫ溶液に溶解させた。また、（１．１）記載のラウリルパーオキサイドの代わりにＵＶ重合開始剤としてＩＲＧＡＣＵＲＥ１８４（チバ・ジャパン製）をモノマーに対して１質量％含有させた。【００８９】
【表２】
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【００９０】
さらに表３記載の種類のモノマー／ＭＥＫ溶液（表２記載のＭ〜Ｘ）をインクの代わりに表３記載のインクタンク−１、インクタンク−２に充填し、ノズル口径２５μｍ、駆動周波数１２ｋＨｚ、ノズル数１２８、ノズル密度１８０ｄｐｉ（本発明でいうｄｐｉとは、２．５４ｃｍ当たりのドット数を表す）であるピエゾ型記録ヘッドを用い、最大記録密度７２０×７２０ｄｐｉのオンデマンド型のインクジェットプリンタを使用し、市販のポリスチレン製細胞培養皿（ベクトン・ディッキンソン・ラブウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）社製  ファルコン（ＦＡＬＣＯＮ）３００１ペトリディッシュ（直径３．５ｃｍ））上に、表３記載のＭ〜Ｘ溶液のうち片方が幅１００μｍの細線になるようそれぞれプリントした。【００９１】
各インクを連続吐出し、着弾した後０．１秒後に、１２０Ｗ／ｃｍメタルハライドランプ（日本電池社製  ＭＡＬ  ４００ＮＬ、電源電力３ｋＷ・ｈｒ）を照射し、モノマーを重合させた。【００９２】
これにより温度応答性高分子をポリスチレン製細胞培養皿表面に吸着させた。【００９３】
その後、残モノマーと溶媒であるＭＥＫを取り除くために、大量の水で洗浄し、細胞培養支持体とした。【００９４】
（１．４）コントロールの重合
表３記載のＮｏ．１８は、コントロールとして、インクジェット塗布の代わりに、表２記載Ｍ溶液を０．１ｍｌディッシュに滴下し、塗布液が水平になるのをまって（１．３）同様の方法で重合させた。【００９５】
（１．５）重合済みポリマーをインクジェットで塗布
表３記載のＮｏ．１９〜２５には、表１記載のポリマー／ＭＥＫ溶液（表３記載の種類）を用いて、（１．３）のモノマー／ＭＥＫ溶液に置き換えて用いた以外は同様の方法で吸着させた。【００９６】
（１．６）スクリーン印刷方法による塗布、重合
表３記載のＮｏ．２６〜３１には、（１．３）記載のインクジェット塗布と同様のパターンになるように幅１００μｍの細線のマスクを用いて、表３記載の種類のモノマー／ＭＥＫ溶液（表２記載のＭ〜Ｘで作成）を塗りわけ、（１．３）記載のインクジェット塗布と同様のパターンニングを行った。その後０．１秒後に、１２０Ｗ／ｃｍメタルハライドランプ（日本電池社製  ＭＡＬ  ４００ＮＬ、電源電力３ｋＷ・ｈｒ）を照射し、モノマーを重合させた。【００９７】
これにより温度応答性高分子をポリスチレン製細胞培養皿表面に吸着させた。【００９８】
その後、残モノマーと溶媒であるＭＥＫを取り除くために、大量の水で洗浄し、細胞培養支持体とした。【００９９】
（１．７）細胞の培養
上記作製した細胞培養支持体に培養細胞を播種して細胞の培養を行った。培養する細胞は、パターニングされた温度応答性高分子表面の下限臨界温度違いを利用して、表３記載の細胞をパターニングさせた。培養は、ウシ胎児血清（ＩＣＮ製）を１０％含有するミニマム・エッセンシャル・イーグル培地（ＳＩＧＭＡ製）（ピルビン酸（ＩＣＮ製）および非必須アミノ酸（ＩＣＮ製）を添加剤として含有）使用し、５％炭酸ガス充填３７℃恒温器内で行った。【０１００】
播種してから１週間後、この細胞培養アレイを、２０℃恒温槽内に５分間静置してから、表面を光学顕微鏡にて観察したところ、細胞が細胞培養アレイ上にパターニングされて接着して、また十分に増殖していたことが確認された。この取り出した細胞についてトリプシン−ＥＤＴＡ処理を行い、各細胞を個々の状態に分離した後、トリパンブルー染色を行うことによって、生細胞数を計測したところ、表３記載Ｎｏ．１８の培養開始時には８．２×１０２個であった細胞数が、培養後は５．３×１０３個に増加したことが確認された。この細胞培養後の値を１００％として、以下の結果を表３に記載した。本発明は、比較に対して培養効率がよいことが確認できた。【０１０１】
（１．８）ブリード耐性
上記細胞を目視観察し、下記の基準に従って細胞のブリード耐性の評価を行った。
◎：細線とベタの境界線がはっきりしている
○：わずかに境界がにじんでいる箇所があるが、実用上問題のない品質である
△：境界部ににじみが認められるが、実用上許容限界内の品質である
×：境界部で明らかなにじみの発生が認められ、線幅が１．５倍ほどとなり、実用上問題となる品質である
××：細線とベタ部の境界が不明瞭な品質であり、ブリード耐性が極めて乏しい
（１．９）細胞の積層
上記（１．７）で作成した細胞で培養１４日後、培養した細胞の上に直径３．５ｃｍのポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜をかぶせ、培地を静かに吸引し、細胞培養支持体材料ごと２０℃で３０分インキュベートし冷却することで、いずれの細胞培養支持体材料上の細胞もそのかぶせた膜と共に剥離させられた。かぶせた膜と細胞を同様に作製した細胞培養支持体材料上で正常に増殖した同一の培養細胞の上にかぶせて、５％炭酸ガス充填３７℃恒温器内で２枚を接着させた。２枚の細胞シートが接着した後、ＰＶＤＦ膜を剥離した。同様の操作を繰り返すことで２０層の細胞シートを作成した。【０１０２】
かぶせた膜はいずれの細胞シートからも容易に剥がすことができた。２０枚の積層された細胞シートは、細胞、細胞間のデスモソーム構造、および細胞、基材間の基底膜様蛋白質が保持されていた。【０１０３】
（１．１０）細胞の剥離性の評価
上記（１．９）で細胞培養支持体上から細胞剥離した際の細胞の状態を目視で観察し、下記の基準に従って、評価を行った。表３記載の結果は、１枚目から２０層目重ね合わせるまでの平均をとった。
◎：問題なく完全に剥離できた
○：わずかに細胞が支持体に残るが、問題ないレベル
△：一部の細胞が支持体に残り、シートに穴が確認されるレベル
×：支持体から剥がれるが、シートがぼろぼろになる
××：支持体から細胞が剥がれない
（１．１１）積層された機能性の評価
肝臓細胞で重要な機能はアンモニア代謝である。よってアンモニア代謝速度の評価を行った。ブタ生体内より採取した細胞を１００％として比率で計算し表３に結果を記載した。本発明の方法は、比較例に対して、生体から直接採取したものと同等かそれ以上であった。【０１０４】
【表３】
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【０１０５】
本発明の細胞培養支持体を用いることによりブリード耐性が良好であり、細胞の支持体からの剥離が格段に向上し、かつ積層された細胞の組織機能化が発現できた。今後の複雑な組織の細胞培養方法の進展に大きく貢献できる技術であることがわかった。
【国際調査報告】
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