(57)【要約】  ホップ（Humulus）のプレニル化酵素のDNAの提供。  ホップのプレニル化酵素活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードする遺伝子を用いて新規の生物を作成・検定する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)または(b)のタンパク質：
(a) 配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；および
(b) 配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニル化酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の(c)〜(f)のいずれかのDNAからなる遺伝子：
(c) 配列番号３に示す塩基配列からなるDNA；
(d) 配列番号３に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プレニル化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；
(e) 配列番号３に示す塩基配列と80％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、プレニル化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；および
(f) 配列番号３に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA。
【請求項３】
以下の(g)又は(h)のタンパク質：
(g) 配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；および
(h) 配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニル化酵素活性を有するタンパク質。
【請求項４】
以下の(i)〜(l)のいずれかのDNAからなる遺伝子：
(i) 配列番号４に示す塩基配列からなるDNA；
(j) 配列番号４に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プレニル化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；
(k) 配列番号４に示す塩基配列と80％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、プレニル化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；および
(l) 配列番号４に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA。
【請求項５】
請求項２または４に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターを導入した形質転換体。
【請求項７】
植物体である請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
(i) ゲノムDNAまたはRNAである核酸を植物から単離する工程、
(ii) (i)の核酸がRNAである場合に逆転写しcDNAを合成する工程、
(iii) (i)または(ii)の工程で得られたDNAから配列番号３、配列番号４または配列番号１１に示す塩基配列を含有する遺伝子断片を増幅する工程、ならびに
(iv) DNA中に突然変異および／または多型の存在を決定する工程、
とを含む、植物におけるプレニル化酵素をコードする遺伝子の突然変異および／または多型の存在を検出する方法。
【請求項９】
植物がホップ属植物である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の方法によってプレニル化酵素をコードする遺伝子の突然変異および／または多型を検出し、突然変異および／または多型を有する植物体を選抜する方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法により選抜された、プレニル化酵素をコードする遺伝子に突然変異および／または多型を有する植物体。
【請求項１２】
ホップ属植物である請求項１１記載の植物体。
【請求項１３】
プレニル化酵素をコードする遺伝子の発現能またはコードするプレニル化酵素の活性が、既存品種に比較して改変されている植物を選抜する、請求項８または９に記載の植物体を選抜する方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法によって選抜された、プレニル化酵素をコードする遺伝子の発現能が既存品種に比較して改変されているか、またはプレニル化酵素の活性が既存品種に比較して改変されている植物体。
【請求項１５】
ホップ属植物である請求項１４記載の植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホップにおける特徴的なプレニル化化合物を生産する製造方法、プレニル化酵素、当該酵素をコードするDNA、および当該DNAを用いた新たなホップの育種、選抜方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プレニル化とは疎水性のプレニル基を化合物に付加する反応をいう。プレニル基は植物二次代謝産物の構造や生理活性の多様性に大きく貢献しており、プレニル化された芳香族化合物は天然有機化合物の大きなリソースとなっている。これらの化合物は、生合成的には複合経路と呼ばれる経路で生合成され、耐虫性や耐病性などにより植物の生命維持に多大な役割を果たしている。また、プレニル化芳香族化合物は、薬用植物において生理活性本体としてその薬理作用に寄与しているものもある（非特許文献１）。例えば、プレニルフラボノイドは、抗腫瘍活性や抗菌作用のような様々な生理活性をもつことが報告されており（非特許文献２）、医薬及び食品産業にとっても非常に重要な化合物群として認識されている。これらの化合物は、植物にとっては食害、感染防御において重要な役割を果たしている。【０００３】
プレニル基がプレニル化フラボノイドなどプレニル化芳香族化合物の生理活性にとって重要であることが報告されており、生理活性を有するプレニル化芳香族化合物に対して、プレニル基を持たない母核化合物が生理活性を有しない例も多数存在する。芳香族化合物のプレニル化を触媒する酵素は、芳香族化合物の生理活性を増強し得るという点で、産業的に非常に重要である。しかし、芳香族を基質とするプレニル化酵素の多くは膜結合性であり、解析が容易でなかった。特に、フラボノイドを基質とする植物プレニル化酵素においては、その遺伝子のクローニングは近年になり薬用植物クララから世界で始めて報告がされたに過ぎない（特許文献１）。【０００４】
ホップ（Humulus）においてプレニル化化合物は特に重要である。ビールの重要原料であるホップは、ビールにおいて苦味を与える。それらは様々な苦味酸の複合物からなり、そのさまざまな構成によってビールの香味をもたらすことが良く知られている（非特許文献３）。そのなかで代表的なホップの成分としてはα酸（フムロン）やβ酸（ルプロン）が上げられるが、これらは特殊なプレニル化化合物である。一方、プレニルフラボノイドは非常に興味深い生理活性作用を示すことが知られている（非特許文献４）。例えば、キサントフモールは、広範囲の抗癌作用を示す。８−プレニルナリンゲニンは最も強力な女性ホルモン作用を示す。これらの物質はホップの毬花のルプリン腺で生成されるが、そのプレニル化の酵素活性については苦味酸でのみ可溶性画分にあるとの報告があるのみで（非特許文献５）、プレニルフラボノイドについては全く無い。さらには遺伝子について言及されている研究も無い。【０００５】
近年、低分子プレニル合成酵素（ゲラニル（ゲラニル）二燐酸合成酵素）がホモダイマーの活性ではゲラニルゲラニル活性を示すが、ヘテロダイマーになるとゲラニル二燐酸合成酵素になることが示されている。ゲラニルゲラニル化とゲラニル化については様々な修飾因子の関与によって活性比率が変わることがわかる可能性が示されている。しかし、その活性の本質はプレニル合成酵素本体である（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2008-220304号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Mesia-Velaら、 Phytomedicine, 8 (2001), p.481-488
【非特許文献２】Sohnら、 Phytomedicine, 11 (2004), p.666-672
【非特許文献３】Pollock (編集) Brewing Science (Food Science & Technological Monograph) Academic Press (1979)
【非特許文献４】StevensとPage、 Phytochemistry.(2004) 65:1317-30.
【非特許文献５】Zuurbierら、 Phytochemistry.(1998) 49: 2315-2322.
【非特許文献６】Thollら、Plant Cell (2004) 16: 977-992
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ホップの新規プレニル化酵素活性を有するタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子の提供、ならびに該タンパク質をコードする遺伝子を用いて新規の生物を作成・検定する方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、それまで予想されていた可溶性画分にあるとされた苦味酸の酵素とは異なる、ホップで今だに明らかになっていないプレニル化酵素遺伝子を同定した。さらに本遺伝子を発現させることで新規のプレニル化化合物の生産が可能になり、同遺伝子のゲノム配列を各種のホップで比較することにより多型を解析することが可能となり新規に育種されたホップ植物を決定することが可能になることを示し、本発明を完成させるに至った。【００１０】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。【００１１】
[１]  以下の(a)または(b)のタンパク質：
(a) 配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；および
(b) 配列番号１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニル化酵素活性を有するタンパク質。【００１２】
[２]  以下の(c)〜(f)のいずれかのDNAからなる遺伝子：
(c) 配列番号３に示す塩基配列からなるDNA；
(d) 配列番号３に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プレニル化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；
(e) 配列番号３に示す塩基配列と80％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、プレニル化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；および
(f) 配列番号３に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA。【００１３】
[３]  以下の(g)又は(h)のタンパク質：
(g) 配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；および
(h) 配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プレニル化酵素活性を有するタンパク質。【００１４】
[４]  以下の(i)〜(l)のいずれかのDNAからなる遺伝子：
(i) 配列番号４に示す塩基配列からなるDNA；
(j) 配列番号４に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プレニル化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；
(k) 配列番号４に示す塩基配列と80％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつ、プレニル化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA；および
(l) 配列番号４に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNA。【００１５】
[５]  [２]または[４]の遺伝子を含有する組換えベクター。【００１６】
[６]  [５]の組換えベクターを導入した形質転換体。【００１７】
[７]  植物体である[６]の形質転換体。【００１８】
[８]  (i) ゲノムDNAまたはRNAである核酸を植物から単離する工程、
(ii) (i)の核酸がRNAである場合に逆転写しcDNAを合成する工程、
(iii) (i)または(ii)の工程で得られたDNAから配列番号３、配列番号４または配列番号１１に示す塩基配列を含有する遺伝子断片を増幅する工程、ならびに
(iv) DNA中に突然変異および／または多型の存在を決定する工程、
とを含む、植物におけるプレニル化酵素をコードする遺伝子の突然変異および／または多型の存在を検出する方法。【００１９】
[９]  植物がホップ属植物である[８]の方法。【００２０】
[１０]  [８]または[９]の方法によってプレニル化酵素をコードする遺伝子の突然変異および／または多型を検出し、突然変異および／または多型を有する植物体を選抜する方法。【００２１】
[１１]  [９]の方法により選抜された、プレニル化酵素をコードする遺伝子に突然変異および／または多型を有する植物体。【００２２】
[１２]  ホップ属植物である[１１]の植物体。【００２３】
[１３]  プレニル化酵素をコードする遺伝子の発現能またはコードするプレニル化酵素の活性が、既存品種に比較して改変されている植物を選抜する、[８]または[９]の植物体を選抜する方法。【００２４】
[１４]  [１３]の方法によって選抜された、プレニル化酵素をコードする遺伝子の発現能が既存品種に比較して改変されているか、またはプレニル化酵素の活性が既存品種に比較して改変されている植物体。【００２５】
[１５]  ホップ属植物である[１４]の植物体。【００２６】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-146765号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、ホップ由来の新規プレニル化酵素活性を有するタンパク質とそれをコードする遺伝子の活性発現の調整を行うことができ、即ち当該遺伝子の活性が調整された植物を作成する方法、が提供される。本発明によりプレニル化化合物の含有に特徴があるホップの育種が可能になる。本発明の酵素により、様々な有用な生理活性を示すプレニル芳香族化合物を大量かつ安価に生産できる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】Database: NCBI/blast/db/FASTA/2008_09_05_09_00_0/nr 6,937,173 sequences; 2,395,280,820 total lettersを用いたHlPT1の部分配列（1211塩基）とソラニシル二燐酸を基質とするプラストキノン合成酵素遺伝子の相同性についてBLASTXを用いて検索した結果（抜粋）を示す図である。下線で示す部分が相同性を示しているが、限定的かつ部分的な相同性であることがわかる。
【図１Ｂ】図１Ａの続きである。
【図２Ａ】Database: NCBI/blast/db/FASTA/2008_09_05_09_00_0/nr 6,937,173 sequences; 2,395,280,820 total lettersを用いたHlPT2の部分配列（693塩基）とソラニシル二燐酸を基質とするプラストキノン合成酵素遺伝子の相同性についてBLASTXを用いて検索した結果（抜粋）を示す図である。下線で示す部分が相同性を示しているが、限定的かつ部分的な相同性であることがわかる。
【図２Ｂ】図２Ａの続きである。
【図３】HlPT1とHlPT2の分子進化系統樹解析の結果を示す図である。
【図４】HlPT1とHlPT2の遺伝子発現によるゲラニルナリンゲニンの産生を示す図である。少なくともa, b, cの３つの生成物が得られていることがわかる。そのうちcは図５により６−ゲラニルナリンゲニンと同定された。
【図５】６−ゲラニルナリンゲニンの同定の結果を示す図である。
【図６】HlPT1の遺伝子発現によるゲラニルイソリキリチゲニンの産生を示す図である。
【図７】HlPT1の遺伝子発現によるゲラニルサクラネチン、ゲラニルタキシフォリン、ゲラニルゲニステインの産生を示す図である。
【図８】キサンタンゲノールの同定の結果を示す図である。
【図９】「キリン２号」と「とよみどり」の葉でのHlPT1とHlPT2の発現解析の結果を示す図である。いずれも「キリン２号」より「とよみどり」での発現が高いことがわかる。
【図１０Ａ】「キリン２号」のゲノム配列を示す図である。
【図１０Ｂ】「キリン２号」のゲノム配列を示す図である（図１０Aの続き）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３０】
１．新規のプレニル化酵素
本発明のタンパク質は、芳香族化合物とプレニル基を結合する活性を幅広く持つプレニル化酵素である。本発明の酵素は、ホップ(Humulus lupulus）等のホップ属（カラハナソウ属）植物由来のプレニル化酵素（プレニルトランスフェラーゼ）である。ホップ属植物には、ホップ（Humulus lupulus)、カラハナソウ（Humulus lupulus var. cordifolius)、カナムグラ(Humulus japonicus）等が含まれる。また、本発明の酵素は、膜結合型のプレニル化酵素である。
【００３１】
本発明のプレニル化酵素の基質となる好ましい芳香族化合物としては、フラボノイド、イソフラボノイド、クマリン、カルコン、フロログルシノール等が挙げられ、フラボノイドとして、ナリンゲニン、ヘスペレチン、ガランギン、クリシン、イソサクラネチン、イソリキリチゲニン、サクラネチン、タキシフォリン、ゲニステインまたは２’，４’，４−トリヒドロキシ−６’−メトキシカルコン、などが挙げられる。フロログルシノールとして、PIVP（phlorisovalerophenone）、PIBP（phlorisobutyrophenone）、PMBP（phlormethylbutanophenone）などが挙げられる。本発明のプレニル化酵素は炭素数５のイソプレン単位で構成されるプレニル基を芳香族化合物に結合する。プレニル基としては、ジメチルアリル基（炭素数５）、ゲラニル基（炭素数10）、ファルネシル基（炭素数15）、ゲラニルゲラニル基（炭素数20個）等が挙げられる。プレニル基を供与する基質であるプレニル基ドナーとしてジメチルアリルジホスフェート（DMAPP）、ゲラニル二燐酸（GPP）、ファルネシル二燐酸（FPP）、ゲラニルゲラニル二燐酸（GGPP）、フィチル二燐酸（PDP）などが挙げられる。これらのプレニル基ドナーからプレニル化酵素の触媒により上記芳香族化合物にプレニル基が転移される。
【００３２】
本発明の酵素の全長アミノ酸配列は、配列番号１または２に示される。さらに、本発明のタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列または配列番号２に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、プレニル化酵素活性を有するタンパク質を包含する。ここで、実質的に同一のアミノ酸配列としては、当該アミノ酸配列に対して１または複数もしくは数個(１〜10個、好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個もしくは２個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の配列同一性を有しているアミノ酸配列が挙げられる。
【００３３】
本発明のプレニル化酵素は、植物体から単離された天然のプレニル化酵素および遺伝子工学の手法により製造されたリコンビナントのプレニル化酵素を含む。
【００３４】
２．プレニル化酵素をコードする遺伝子
本発明の遺伝子は、芳香族化合物とプレニル基を結合する活性を持つプレニル化酵素をコードする遺伝子であり、上記のプレニル化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００３５】
本発明の遺伝子のDNAの塩基配列は、配列番号３または４に示される。さらに、配列番号３または４に示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、配列番号３または４に示される塩基配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の配列同一性を有しているDNA、または前記DNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１または複数もしくは数個(１〜10個、好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個もしくは２個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNAであって、プレニル化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを包含する。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１XSSC、0.1％ SDS、37℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0.5XSSC、0.1％ SDS、42℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0.2XSSC、0.1％ SDS、65℃」程度の条件である。さらに、本発明の遺伝子は、配列番号３または４に示す塩基配列の縮重異性体からなるDNAを包含する。
【００３６】
３.組換えベクター
本発明のベクターは、上記配列番号３または配列番号４のDNAが挿入された組換えベクターである。ベクターとしては公知の酵母用、植物細胞用、昆虫細胞用等のものを広く使用できる。公知の酵母用ベクターとしてはpDR196、pYES-DEST 52、Yip5、Yrp17、Yep24などが挙げられ、公知の植物細胞用ベクターとしては、pGWB vector、pBiEl2-GUS、pIG121-Hm、pBI121、pBiHyg-HSE、pB119、pBI101、pGV3850、pABH-Hm1などが挙げられ、公知の昆虫細胞用ベクターとしては、pBM030、pBM034、pBK283などが挙げられる。本発明において使用されるベクターには、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等の遺伝子の発現や抑制に関する構成要素が組込まれ、必要に応じて、選択マーカー（例えば、薬物耐性遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、レポーター遺伝子）を含有する。遺伝子の発現や抑制に関する構成要素は、その性質に応じて、それぞれが機能し得る形で組換えベクターに組み込まれることが好ましい。そのような操作は、当業者であれば適切に行うことができる。
【００３７】
４．形質転換体
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを保持する形質転換体である。形質転換体は、酵素をコードする遺伝子を挿入した組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。宿主は、ベクターに適したものを使用すればよい。例えば、酵母、植物細胞、昆虫細胞（Sf9など）、植物ウイルスなどが挙げられる。好ましくは、酵母、植物細胞または植物ウイルスなどが挙げられる。組換えベクターの導入方法は、微生物にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110(1972)]、エレクトロポレーション法、トリペアレンタルメイティング(tri-parental mating）法等が挙げられる。また、形質転換植物体を作製する方法として、ウイルス、アグロバクテリウムのＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド等をベクターとして用いる方法が挙げられる。宿主植物としては、イネ、ムギ、トウモロコシ等の単子葉植物、ダイズ、ナタネ、トマト、バレイショ等の双子葉植物が挙げられる。形質転換植物体は、本発明の遺伝子で形質転換した植物細胞を再生させることにより得ることができる。植物細胞からの植物体の再生は公知の方法により行うことができる。
【００３８】
５．プレニル化酵素の製造方法
本発明のプレニル化酵素は、通常の植物体から回収することができ、また、上記形質転換体から回収することができる。具体的には、例えば、Yazaki et al (JBC, 2002, 277, 6240-6246)に記載の方法を用いて行うことができる。
【００３９】
さらに、本発明のプレニル化酵素は、例えば、本発明の遺伝子で形質転換した酵母等の微生物発現系を用いた大量生産により製造することができ、また、上記の形質転換植物体中で本発明の遺伝子を発現させることにより得ることができる。
【００４０】
形質転換体の培養は公知の培地を用いて公知の方法で行えばよい。
【００４１】
６．形質転換体を用いたプレニル化芳香族化合物の生産
本発明の膜結合プレニル化酵素は、酵母等の微生物において高い活性を持ったタンパク質として発現できるため、形質転換酵母の培養液に前記プレニル化酵素の基質を添加することにより、プレニル化芳香族化合物を生産することができる。例えば、形質転換酵母の培養液にナリンゲニン等のフラボノイドを基質として投与することにより、プレニル化フラボノイドを効率的に大量に生産することが可能である。ナリンゲニンは適度な水溶性と疎水性を持つため、生体膜を通過し酵母細胞内に入り、酵母細胞内のプレニル化酵素と接触する。酵母はサイトゾルにDMAPPを生合成する経路（メバロン酸経路）を有しているため、プレニル基ドナーであるプレニル基質はインビボで供給される。生産されたプレニル化フラボノイドは、酵母培養物から得ることができる。ここで、酵母培養物とは、酵母細胞および培地を指す。
【００４２】
また、本発明の膜結合プレニル化酵素を本発明の遺伝子で形質転換した植物細胞や植物体で発現させることにより、プレニル化フラボノイド等のプレニル化芳香族化合物を植物で生産することができる。植物細胞の場合、DMAPPを生合成する経路は、サイトゾルのメバロン酸経路とプラスチド内に局在する非メバロン酸経路の２つある。前者の経路のDMAPPをプレニル基ドナーとして利用してプレニル化芳香族化合物を生産するためには、プラスチド局在化シグナルを除いた改変遺伝子を用いればよい。また、後者の経路のDMAPPをプレニル基ドナーとして利用してプレニル化芳香族化合物を生産するためには、内在性のプラスチド局在化シグナルを使うか、またはRuBisCo小サブユニットなどの他の遺伝子のプラスチド局在化シグナルを連結してプレニル化酵素をプラスチドに局在させればよい。フラボノイド基質等のフラボノイド芳香族化合物は、内在性の芳香族化合物がプレニル化されるため、植物を育成させて植物の組織からプレニル化芳香族化合物を回収することができる。または、ナリンゲニンのようなフラボノイドを植物に吸収させてプレニル化させ、プレニル化されたフラボノイドを植物組織から回収することもできる。この場合、植物の土壌等にフラボノイドを添加し、根から吸収させればよい。また、組織特異的なプロモータを利用することで、植物の任意の組織でプレニル化フラボノイドを生産することができる。
【００４３】
上記のように、本発明のプレニル化酵素およびプレニル化酵素をコードする遺伝子を用いてフラボノイド等の種々の芳香族化合物をプレニル化し、プレニル化フラボノイド等のプレニル化芳香族化合物を生産することができる。プレニル化フラボノイドは、抗腫瘍活性、抗菌活性、抗ウイルス活性、抗酸化活性、女性ホルモン様活性、免疫増強活性、抗炎症活性等の種々の活性を有しており、本発明のプレニル化酵素を利用して、これらの生理的活性が増強された化合物を製造することができる。また、本発明のホップ由来のプレニル化酵素はフムロンやルプロンの苦味酸の合成にも関与している。フムロンやルプロンはPIVP（phlorisovalerophenone）、PIBP（phlorisobutyrophenone）、PMBP（phlormethylbutanophenone）をプレニル化して得られる。本発明のプレニル化酵素は、単量体として用いてもよいし、二量体として用いてもよい。
【００４４】
７．本発明のプレニル化酵素の活性測定法および基質特異性の解析法
本発明のプレニル化酵素の活性測定は、例えば、以下の方法で行うことができる。
【００４５】
340μgから730μgの本発明の酵素、1 mMのフラボノイド等の基質芳香族化合物、1 mM プレニル基ドナー、20 mM MgCl2を100 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 7.5) 200μlになるように調製し、30℃で一晩反応させる。反応後、酢酸エチルで産生物を抽出し、乾固させMeOHで溶解する。これを質量分析計やクロマトグラフィーで分析すればよい。
【００４６】
また、この際種々の基質芳香族化合物を用いて、それぞれの芳香族化合物がプレニル化されたかどうかを調べることにより基質特異性を解析することができる。
【００４７】
８.遺伝子変異、多型個体、遺伝子発現変異の選抜
本発明は、植物におけるプレニル化酵素遺伝子突然変異、一塩基多型（SNP)等の多型、遺伝子発現変異の存在を検出するための方法を提供する。変異個体は放射線によるもの、化学処理によるもの、UV照射によるもの、自然突然変異によるものであっても構わない。
【００４８】
この方法には、ゲノムDNAやRNAを変異個体や様々な品種や育成個体の植物から単離し、後者は逆転写しcDNAを合成する工程と、DNA増幅技術の使用によりDNAからプレニル化酵素遺伝子を含有する遺伝子断片を増幅する工程と、このDNA中に突然変異の存在を決定する工程が含まれる。DNAやRNAを抽出する方法には市販のキット（例えばDNeasyやRNeasy(キアゲン社)など）が使用できる。cDNAを合成する方法も市販キット（例えばスーパースクリプト ファーストストランド システム（インビトロジェン社）など）を使うことができる。DNA増幅技術の使用により遺伝子断片を増幅する方法としては、いわゆるPCR法やLAMP法などの技術を用いることができる。これらは継続的なポリメラーゼ反応により特異的なDNA配列の増幅（つまり、コピー数を増やすこと）を達成するためにポリメラーゼを使用することを基にした、一群の技術を意味する。この反応は、クローニングの代わりに使用することができるが、必要であるのは、核酸配列に関する情報のみである。DNAの増幅を行うために、増幅しようとするDNAの配列に相補的なプライマーを設計する。次にそのプライマーを自動DNA合成により作成する。DNA増幅方法は、当技術分野で周知であり、本明細書中で与えられる教示及び指示に基づき、当業者であれば容易に行うことができる。いくつかのPCR法（ならびに関連技術）は、例えば、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、同第4,800,159号、同第4,965,188号、およびInnisら編、PCR Protocols:A guide to method and applicationsで述べられている。
【００４９】
DNA中に突然変異や多型の存在を決定する工程では塩基配列の決定（アプライドバイオシステムズ社ジェネティックアナライザ）やミスマッチペアの片側を切断する酵素を用いて突然変異体を検出するTILLING法（Till et al., 2003, Genome Res 13:524-530）など変異遺伝子と正常遺伝子の相同性を利用し検出する方法を用いればよい。これらは該技術から得られた配列データを遺伝子部分に関する配列番号３、配列番号４または配列番号１１で定義される塩基配列と比較することで行うことができる。
【００５０】
mRNA量の違いによる変異を決定する工程では上記cDNAに対し、配列番号３または配列番号４で定義される塩基配列に基づいて作製したプライマーを利用してリアルタイムPCR法（ロシュ・ダイアグノスティックス社ライトサイクラーなど）等の定量的PCRを採用すればよい。その後、例えば、品種「キリン２号」から得られたcDNAの量と比較することでmRNA量の違いによる変異を決定することができる。
【００５１】
特に好ましい実施形態において、上記で定義したプレニル化酵素遺伝子の変異の存在の決定方法を、ホップ（Humulus lupulus）等のホップ属（カラハナソウ属）植物から得られた材料に適用する。
【００５２】
上記の突然変異および／または多型を決定する方法により、プレニル化酵素をコードする遺伝子の突然変異や多型を塩基レベルで同定することができ、さらにプレニル化酵素をコードする遺伝子に突然変異を有する植物体を選抜し、得ることができる。本発明はこのようにして得られたプレニル化酵素をコードする遺伝子に突然変異や多型を有する植物体を包含する。
【００５３】
また、突然変異や多型の決定やmRNA量の違いの決定により、プレニル化酵素をコードする遺伝子の発現能またはプレニル化酵素の活性が改変された植物を選抜することが可能になる。ここで、ある植物の活性の改変は、その植物の種に含まれる既存品種に対する改変をいい、既存品種には野生型も含まれる。既存の品種は、プレニル化酵素をコードする遺伝子が改変された植物が得られたときに存在するすべての品種をいい、交配、遺伝子操作等の人為的操作により作出された品種、自然状態で出現した野生型とは酵素活性において区別できる個体群を含む。また、活性の改変において、すべての既存品種に対して、活性が変化している必要はなく、特定の既存品種に対して改変されていれば、「プレニル化酵素の活性が改変された植物」に含まれる。「プレニル化酵素の活性が改変された植物」は、人為的操作を受けず自然状態で突然変異により活性が改変された植物も含み、本発明の方法により、自然状態で活性が変化した植物を選抜することができ、新たな品種として確立することもできる。また、ある既存品種に変異誘発処理を行い、プレニル化酵素の活性が改変された植物を作出した場合、比較対象は変異誘発処理を行った既存品種でもよいし、それ以外の他の既存品種でもよい。例えば、植物がホップ（Humulus lupulus）の場合、既存品種として、「キリン２号」、「とよみどり」等がある。ここで、プレニル化酵素をコードする遺伝子の発現能またはプレニル化酵素の活性が既存品種に対して改変された植物とは、既存品種に対してプレニル化酵素をコードする遺伝子の発現能が増強した植物および低下した植物を含み、さらに、プレニル化酵素の活性が既存品種に対して上昇した植物および低下した植物を含む。本発明は、このようなプレニル化酵素をコードする遺伝子の発現能またはプレニル化酵素の活性が既存品種に対して改変された植物体も包含する。
【００５４】
これらの植物体は、例えば芳香族化合物をプレニル化する能力が増強されており、これらの植物や植物から得たプレニル化酵素を利用することにより、より効率的にプレニル化芳香族化合物を得ることができる。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を、実施例を示してより詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５６】
（実施例１）ホップの遺伝子発現ライブラリーの構築と塩基配列の決定
ホップ（Humulus lupulus）の品種「キリン２号」の毬花からルプリンを多く含む部分を切除し液体窒素を用いて破砕した。CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)法(Changら、1993. Plan Mol Biol Rep 11: 113-116)を用いて全RNAを抽出した。得られた全RNA 620μgをタカラバイオ株式会社に提供しcDNAライブラリーの作成、12,288のEST解析およびクラスタリング解析を委託し、Oligotex-dT Super mRNA Purification Kit(タカラバイオ)を使用してpoly(A)+RNAを単離し、逆転写酵素でcDNAを作成した。cDNAプラスミドライブラリーは酵母発現用ベクターpDR196を用いて構築した。cDNAの第１鎖を、XhoI制限部位を含むoligo(dT)18アンカープライマーを使用して合成した。cDNAの第２鎖を合成した後、EcoRI制限サイトを含む平滑末端アダプターを二本鎖DNAへ結合させ、次いで当該フラグメントを、構成的プロモータPMA1を有するプラスミド、pDR196中に組み込んだ。Escherichia coli DH10Bに構築したライブラリーについて、プラスミドを抽出し12,288の５’端の塩基配列を決定した。クラスタリング解析の結果、1597のクラスター遺伝子配列を含んでいることがわかった。【００５７】
（実施例２）候補cDNAクローンの抽出
上記クラスター遺伝子をアミノ酸配列データベース（Database: NCBI/blast/db/FASTA/2008_09_05_09_00_0/nr 6,937,173 sequences; 2,395,280,820 total letters）に対して塩基配列相同性検索BLASTX 2.2.10（Altschulら、Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))を用いて解析を行ったところ、プラストキノン合成酵素遺伝子（Genbank accretion ABB701280）に対し２つのクラスター遺伝子（HlPT1およびHlPT2）が相同性を示すことがわかった。HlPT1とプラストキノン合成酵素遺伝子の相同性についてのデータを図１Aおよび図１Bに、HlPT2とプラストキノン合成酵素遺伝子の相同性についてのデータを図２Aおよび図２Bに示す。図１Bは図１Aの続き、図２Bは図２Aの続きである。図１AおよびBならびに図２AおよびB中、下線で示す部分が相同性を示した部分である。相同性を有していたものの、相同性については部分的かつ限定的であり、活性を予測することはできなかった。驚くべきことに、以下の実施例で明らかなようにHlPT1とHlPT2はプラストキノン合成酵素遺伝子の活性とはかけ離れた活性を示すことが明らかになった。また以前取得されたホモゲンチジン酸プレニル基転移酵素遺伝子（トコトリエノールやトコフェロール）や薬用植物クララから世界で始めて報告がされた遺伝子（特開2008-220304号公報）を含むフラボノイドへのプレニル基転移酵素遺伝子とも分子進化系統樹（ClustalXプログラム： (http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/Top.html) (Human Genome Sequencing Center, Houston, TX)とTreeView (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.htmlを利用)を作成した。HlPT1とHlPT2はいずれもプラストキノン合成酵素遺伝子よりも類縁関係が遠いことがわかった（図３）。【００５８】
（実施例３）候補cDNAがコードする酵素の活性評価
２つのクラスター遺伝子（HlPT1とHlPT2）の全長を含むクローン（pDR196- HlPT1とpDR196- HlPT2）を、酢酸リチウム法を用いて酵母株W303-1A-Δcoq2に導入した。SD-Ura液体培地（180ml）中で対数増殖期に達するまで培養することによって、酵母形質転換体中で組換えタンパク質発現させ、そこからYazakiら（JBC, 2002, 277, 6240-6246）に記載の方法を用いてミクロソーム画分を調製した。全反応液を200μlにミクロソーム画分の340μgから730μgのタンパク質、1 mM flavonoid、1 mMプレニル基ドナー、20 mM MgCl2、100 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 7.5)になるように調製し、30℃で一晩反応した。反応後、酢酸エチルで抽出し、乾固させメタノール(MeOH)で溶解した。これをShimadzu LCMS-2010A及びLCMS-IT-TOF(島津製作所)、TSK-GEL ODS-80Ts 2.0 mm x 25 cm (TOSOH)、溶媒システム（0.3% 蟻酸：アセトニトリル＝３：７）、流速 0.2 ml min-1で解析を行った。基質としてナリンゲニン、プレニル基ドナーのゲラニル二燐酸を加えたところ、６位にプレニルが入ったものと８位や３‘位にプレニルが入ったと予想されるものが検出された（図４）。これらの化合物が植物由来の遺伝子を用いて異種発現系を使って作製されたことはいままでにない。６―ゲラニルナリンゲニン（図４のピークｃ、東京大学葛山智久准教授より供与）については標準品と比較し、同じ保持時間、同じフラグメントが確認できた（図５）。こうして、新規のプレニル化酵素であるcDNA(HlPT1全長1,224 bp, ORF 308 a.a.、HlPT2全長1,233 bp, ORF 411 a.a.)が得られた。HlPT1およびHlPT2のコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および２に示す。また、HlPT1およびHlPT2の塩基配列を、それぞれ配列番号３および４に示す。図３の結果から明らかのようにHlPT1とHlPT2の活性は同じように複数の産物を生成しており、かつHlPT1の活性が高かったことから以後の解析はHlPT1を主に解析を行ったが、同じように解析することは可能である。【００５９】
（実施例４）酵母発現系を用いた組換えHlPT1の基質特異性の解析
今まで知られているクララの遺伝子（特開2008-220304号公報）もダイズの遺伝子（明石ら、Plant Physiology 149:683-693 (2009)）も極めて基質が限られている特異性の高い酵素をコードすることがわかっている。組換えHlPT1の酵素化学的性質をLCMS-IT-TOFを用い解析を行った。プレニル基ドナーには同じゲラニル二燐酸を用い、様々なフラボノイド関連化合物（イソリキリチゲニン、サクラネチン、タキシフォリン、ゲニステイン）のプレニル化を行った。驚くべきことに、いずれの基質に対してもプレニル基を転移する活性が認められた（図６および７）。特にイソリキリチゲニンに転移してできるキサンタンゲノール（東京大学葛山智久准教授）については、標準品と比較したところ、同じ保持時間、および同じフラグメントを有することが確認できた（図８）。【００６０】
（実施例５）HlPT1とHlPT2のゲノム塩基配列と他品種との比較
ホップは体内のいたるところに樹脂性成分を含んでいる。この樹脂性成分はPCR等の分子生物学的な解析をする際に共雑物となり各種反応を阻害することがわかった。そのためDNAをNucleon PhytoPure法（GEヘルスケア バイオサイエンス）で「キリン２号」と「とよみどり」からそれぞれ抽出した。配列番号４の塩基配列に基づいて２種のプライマー(ATGGAGCTCTCTTCAGTTTCTAGC（配列番号５）:U866, TCCTTTTGCTGTGTATGGTCTT（配列番号６）:U855)を作製しPCR法を用いてホップ・ゲノム遺伝子断片約1.2kbを増幅した。増幅された断片について直接、塩基配列を決めることと、部分的に大腸菌にTOPOTA クローニングキット（インビトロジェン）でクローニングすることで部分のゲノム塩基配列を決定した。「キリン２号」のcDNAの282番目のGと283番目のGの間（「とよみどり」では276番目のGと277番目のGの間）にイントロンが存在することがわかった。さらに両品種でゲノム塩基配列を比較したところ、イントロンの16番目が「キリン２号」ではTであるのに対し「とよみどり」ではAであることが判明した。この一塩基多型を検出する方法を使うことで容易にホップの品種が識別できるほか、育種過程の追跡、プレニル化化合物と組成との相関を解析することで、品種評価、QTLなどの遺伝子解析が可能になり、遺伝子マーカーを作成することができる。【００６１】
このようにイントロンにはより多くの多型の存在が予想され、塩基配列の差異を検出しやすい部分であると考えられる。配列番号３に対応する「キリン２号」のゲノム配列を配列番号１１に示す。配列番号１１から「キリン２号」ではHlPT1は６つのイントロンを有することが明らかとなった。この塩基配列情報をもとに遺伝子の任意の場所にゲノムDNAを増幅するプライマーを設計することが可能である。【００６２】
（実施例６）ホップ品種および系統での遺伝子発現解析
ホップ品種「キリン２号」と「とよみどり」の葉からCTABを用いて全RNAを抽出した。cDNAはSuperScript IIIファーストストランド合成システム（インビトロジェン）で合成した。配列番号３および４の塩基配列に基づいてプライマー（HlPT1に対してはGCCCATTCCATTTGTAGCAG（配列番号７）:U862とGCCCCAATCACAAGATAACAA（配列番号８）:U849、HlPT2に対してはTGTATGTTGGGAGTATGTAAGACC（配列番号９）:U864とGCTGTAATGGGATTCTTCTTCC（配列番号１０）:U851)を作製しRT-PCRを行った。「キリン２号」より「とよみどり」はプレニル化化合物を多く含むことが知られている品種である（2001-2002年日本産のフムロン類の総量である平均α酸含量は「キリン２号」で5.9％に対し「とよみどり」で11.9％）。図９に示すように「とよみどり」では「キリン２号」よりHlPT1とHlPT2の両遺伝子の発現が高いことがわかった。このように毬花でなくとも葉でも検定が可能であり、プレニル化化合物と組成との相関を解析することで、品種評価、ＱＴＬなどの遺伝子解析が可能になり、遺伝子発現マーカーを作成することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の新規プレニル化酵素及びその遺伝子を用いる生物作成・検定方法は、植物等の生物を用いた、プレニル化化合物の生産の開発、ホップ品種の選抜に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列番号５〜１０  プライマー
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１Ａ】
2010147196.tif 000002
【図１Ｂ】
2010147196.tif 000003
【図２Ａ】
2010147196.tif 000004
【図２Ｂ】
2010147196.tif 000005
【図３】
2010147196.tif 000006
【図４】
2010147196.tif 000007
【図５】
2010147196.tif 000008
【図６】
2010147196.tif 000009
【図７】
2010147196.tif 000010
【図８】
2010147196.tif 000011
【図９】
2010147196.tif 000012
【図１０Ａ】
2010147196.tif 000013
【図１０Ｂ】
2010147196.tif 000014
【配列表】
2010147196000001.app
【国際調査報告】
2010147196.tif 000015
2010147196.tif 000016
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