【事件の表示】
　特許第２７６６９８４号「組み換え家禽痘疹ウイルス」の請求項１、３ないし１１、１５ないし２３に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２７６６９８４号の請求項２ないし１０、１４ないし２２に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯　
　本件特許第２７６６９８４号の発明についての出願は、昭和６３年１０月２７日に出願（パリ条約による優先権主張　１９８７年１０月２９日及び１９８８年６月２０日、フランス）され、平成１０年４月１０日にその発明について特許権の設定登録がなされ、その後、日本ゼオン株式会社より特許異議の申立がなされ、平成１１年２月２２日付けで取消の理由の通知がなされ、その指定期間内である平成１１年９月２０日に訂正請求がなされ、平成１３年３月２７日付けで訂正拒絶理由の通知及び再度の取消の理由の通知がなされ、その指定期間内である平成１３年７月６日に新たな訂正請求がなされるとともに、先の訂正請求が取り下げられたものである。　
２．訂正の適否　
（１）訂正の内容　
特許権者が求めている訂正の内容は、以下のとおりである。　
ア．特許請求の範囲の請求項１を削除し、請求項２に限定する。請求項２の記載を以下のとおり訂正するとともに、請求項の番号を繰り上げる。　
「請求項２．　非コード遺伝子間領域が、ウイルスＤＮＡの１．３キロ塩基対Ｈｉｎｄ　III断片のＯＲＦ７とＯＲＦ９との間に位置する領域である請求項１に記載の家禽痘疹ウイルス。」を、「請求項１．　家禽痘疹ウイルスの弱毒株由来の組み換え家禽痘疹ウイルスであって、家禽痘疹ウイルスゲノムの１．３キロ塩基対Ｈｉｎｄ　III断片のＯＲＦ７とＯＲＦ９との間に位置する非コード遺伝子間領域に、家禽痘疹ウイルスにとって異種である蛋白質の全部又は一部をコードするＤＮＡ配列及び上述組み換えウイルスで感染された細胞でのこの蛋白質の発現を可能とする要素を含む組み換え家禽痘疹ウイルス。」と訂正する。　
イ．これに伴い、各請求項の番号を１つ繰り上げるとともに、引用請求項の番号を同様に訂正する。　
（２）訂正の目的の適否、新規事項の有無、特許請求の範囲の拡張・変更の存否、及び独立特許要件　
　上記アの訂正は、請求項１を削除するものであり、また、訂正前の請求項１に記載される「非コード遺伝子間領域」を、その下位概念であって訂正前の請求項２に記載された「家禽痘疹ウイルスゲノムの１．３キロ塩基対Ｈｉｎｄ　III断片のＯＲＦ７とＯＲＦ９との間に位置する非コード遺伝子間領域」に限定しようとするものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当するものであって、新規事項の追加に該当せず、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。　
　上記イの訂正は、アの請求項１の削除に伴い、請求項２以降の請求項の番号を繰り上げるとともに、各請求項において引用していた請求項の番号を訂正しようとするものであるから、明瞭でない記載の釈明を目的とするものであって、新規事項の追加に該当せず、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。　
　そして、上記訂正後の各請求項に係る発明は、下記の「３．異議申立についての判断」の項で詳述するとおり、その構成及び効果が当業者がその発明を容易に実施することができる程度に発明の詳細な説明に記載されている。また、平成１３年３月２７日付けの取消理由通知で引用した刊行物１（特表昭６０?５００５１８号公報）には、ワクシニアウイルスのごときポックスウイルスのＤＮＡの非必須領域に抗原をコードする外来ＤＮＡを挿入した組み換えウイルスワクチンが記載され、刊行物２（特表昭６１?５０２５８６号公報）及び３（AVIAN　DISEASES 　Vol.３０，No.１，ｐ.２４〜２７）には、組み換えウイルスワクチンの作製にあたって、ワクシニアウイルスに代えて家禽痘疹ウイルス（フォウルポックスウイルス）が使用できることが記載又は示唆され、刊行物５（ＷＯ８６／０５８０６）には、外来ＤＮＡとこれにリンクするウイルスプロモーターとを家禽痘疹ウイルスに挿入してウイスルベクターを作製することが記載され、更に刊行物４（VIROLOGY　Vol.１６０，No.１，ｐ.２０３〜２０９（１９８７年９月））には、家禽痘疹ウイルスゲノムの１．３キロ塩基対Ｈｉｎｄ　III断片のＯＲＦ７とＯＲＦ９との間に位置する領域が非コード遺伝子間領域であることが記載されているが、同刊行物４には、当該領域が遺伝子の制御領域を含む可能性が示唆されており（２０８頁左欄）、当該非コード遺伝子間領域が直ちに家禽痘疹ウイルスにとって非必須領域であるとはいえないので、刊行物４の記載に基づいて、「家禽痘疹ウイルスにとって異種である蛋白質の全部又は一部をコードするＤＮＡ配列及び組み換えウイルスで感染された細胞でのこの蛋白質の発現を可能とする要素」を挿入する部位として、当該ＯＲＦ７とＯＲＦ９との間に位置する領域を選択することは、当業者が容易に想到し得たこととは認められない。　
　よって、訂正後の各請求項に係る発明は、訂正前の請求項１，３〜１１，１５〜２３について通知した特許取消の理由を勘案しても、特許出願の際、独立して特許を受けることができるものである。　
（３）むすび　
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項において準用する第１２６条第２〜４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。　
３．異議申立についての判断　
（１）異議申立の概要　
　異議申立人　日本ゼオン株式会社は、本件明細書には、訂正前の本件請求項１，３〜１１，１５〜２３に係る各発明を当業者が容易に実施することができる程度にその発明の構成及び効果が記載されていないから、その特許は、特許法第３６条第３項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものであり、取り消されるべきものであると主張している。　
（２）本件発明　
　訂正後の本件請求項１〜２２に係る発明（以下、本件発明１〜２２という。）は、平成１３年７月６日付けの訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１〜２２に記載された事項により特定されるとおりのものである。　
　本件発明１及び１１，１２，１３は、それぞれ、訂正前の請求項２及び１２，１３，１４に相当するものであるから、これらの発明の特許は本件異議申立の対象ではない。従って、これらの発明を除き、本件発明２〜１０、及び１４〜２２の特許について、以下に検討する。　
（３）判断　
　異議申立理由は、本件明細書には、家禽痘疹ウイルスゲノム中の非コード遺伝子間領域として、１．３キロ塩基対Ｈｉｎｄ　III断片のＯＲＦ７とＯＲＦ９との間の領域が記載されているだけであり、それ以外の非コード遺伝子間領域については記載されておらず、また、当該ＯＲＦ７とＯＲＦ９との間の領域以外の領域を同定することは本件明細書の記載及び本件出願日前の公知技術を勘案しても極めて困難であったから、該非コード遺伝子間領域又はさらにその近傍の塩基配列を決定することも極めて困難であり、従ってさらに、挿入すべき異種（外来）コード配列ＤＮＡの両端に付加すべき相同組み換えのためのＤＮＡ断片を設計することも極めて困難であったため、非コード遺伝子間領域をＯＲＦ７とＯＲＦ９との間に位置する領域に特定した訂正前の請求項２、並びに挿入すべき異種ＤＮＡの両端に付加すべきＤＮＡ断片をＯＲＦ７の３’末端とＯＲＦ９の５’末端に特定した訂正前の請求項１２，１３，１４以外の請求項の発明については、その構成及び効果が当業者がその発明を容易に実施することができる程度には記載されていないというものである。　
　この点については、非コード遺伝子間領域をＯＲＦ７とＯＲＦ９との間に位置する領域に特定していない訂正前の請求項１が訂正により削除された結果、訂正前の請求項１を直接又は間接的に引用していた訂正前の請求項３〜１１，１５〜２３に対応する本件発明２〜１０，１４〜２２は、訂正前の請求項１に関する部分が削除され、すべて、非コード遺伝子間領域をＯＲＦ７とＯＲＦ９との間に位置する領域に特定した本件発明１（訂正前の請求項２）の家禽痘疹ウイルスに関するものに限定されたため、上記理由は解消した。　
（４）むすび　
　以上のとおりであるから、本件発明２〜１０、及び１４〜２２の特許は、特許異議申立ての理由及び証拠によっては取り消すことはできない。　
　また、他に本件発明２〜１０、及び１４〜２２の特許を取り消すべき理由を発見しない。　
　よって、結論のとおり決定する。　
【異議決定日】
平成１３年１１月１６日（２００１．１１．１６）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
１．特許請求の範囲の減縮を目的として、特許請求の範囲の請求項１を削除し、請求項２の記載を以下のとおり訂正するとともに、請求項の番号を繰り上げる。
「請求項２．　非コード遺伝子間領域が、ウイルスＤＮＡの１．３キロ塩基対Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片のＯＲＦ７とＯＲＦ９との間に位置する領域である請求項１に記載の家禽痘疹ウイルス。」を、「請求項１．　家禽痘疹ウイルスの弱毒株由来の組み換え家禽痘疹ウイルスであって、家禽痘疹ウイルスゲノムの１．３キロ塩基対Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片のＯＲＦ７とＯＲＦ９との間に位置する非コード遺伝子間領域に、家禽痘疹ウイルスにとって異種である蛋白質の全部又は一部をコードするＤＮＡ配列及び上述組み換えウイルスで感染された細胞でのこの蛋白質の発現を可能とする要素を含む組み換え家禽痘疹ウイルス。」と訂正。
２．これに伴い、明瞭でない記載の釈明を目的として、各請求項の番号を１つ繰り上げるとともに、引用請求項の番号を同様に訂正する。
（５４）【発明の名称】
家禽痘疹ウイルス
（５７）【特許請求の範囲】
　
【請求項１】家禽痘疹ウイルスの弱毒株由来の組み換え家禽痘疹ウイルスであって、家禽痘疹ウイルスのゲノムの１．３キロ塩基対Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片のＯＲＦ７とＯＲＦ９との間に位置する非コード遺伝子間領域に、家禽痘疹ウイルスにとって異種である蛋白質の全部又は一部をコードするＤＮＡ配列及び上述組み換えウイルスで感染された細胞でのこの蛋白質の発現を可能とする要素を含む組み換え家禽痘疹ウイルス。
　
【請求項２】
１
　
【請求項３】
２
　
【請求項４】
１〜３
　
【請求項５】
１〜４
　
【請求項６】
５
　
【請求項７】
１〜５
　
【請求項８】
７
　
【請求項９】
８
　
【請求項１０】
１〜５
　
【請求項１１】
　
【請求項１２】
１１
　
【請求項１３】
１１
１２
　
【請求項１４】
１〜１０
１３
　
【請求項１５】
１〜１０
　
【請求項１６】
１５
　
【請求項１７】
１〜１０
　
【請求項１８】
１５
１６
　
【請求項１９】
１７
１８
　
【請求項２０】
１７
１８
　
【請求項２１】
１０
　
【請求項２２】
１５
１６
【発明の詳細な説明】
　本発明は、伝染性上腫症（鳥禽ポックス）として一般に知られている家禽痘疹の組換えウイルス及びワクチン又は家禽代謝に有用な蛋白質の生産への応用に関するものである。
　家禽ポックスウイルスが属するｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ族のウイルスは、細胞の細胞質内で増殖し、複写に必要な酵素的機構の大部分をコードする二本鎖のＤＮＡウイルスである。
　精製されたウイルス性ＤＮＡは、感染性はない。なぜなら、ウイルス粒子に関連した酵素が、ＤＮＡの発現及び複製を開始するのに必要であるためである。しかしながら、ウイルス性ＤＮＡは、同じ細胞内に取り込まれた感染性ウイルスのＤＮＡと共に組換えに関与し得る。この発見（サム及びダンベル、１９８１）は、ワクシニアウイルス由来の外来遺伝子のクローニング及び発現のためのベクターの開発の基礎になるものである（マケットら、１９８２；パニカリ及びパオレッテイ，１９８２）。生きた組み換えワクシニアウイルスは、外来抗原を発現することを可能にしており、それ故、種々のウイルス性又は寄生虫性疾患に対する免疫法が得られる（スミスら、１９８３；パニカリら、１９８３；キーニーら、１９８４；チャクラバーティら、１９８６；フーら、１９８６；キーニーら、１９８６）。
　最近の論文にベクターとして家禽ポックスの使用が報告さているが、（ブラウン，１９８５；テイラーら、１９８７）、実験結果については、今のところ報告されておらず、家禽ポックスウイルスの分子生物学に関する詳細な研究は、未だ行なわれていない。対照的に、種痘ウイルスの生態学は、十分に研究されている（モスの総説を参照、１９８５）。
　本発明は、異種蛋白質の発現のために、ベクターとして家禽痘疹ウイルスを使用することに関する。
　更に詳細には、本発明の目的は、弱毒化つまり人工的に非病原性とした株由来で、そのゲノムの必須でない部分、すなわち非コード遺伝子間領域に異種蛋白質の全部又は一部をコードするＤＮＡ配列及び適当な細胞内での家禽痘疹ウイルスによる発現を可能とする要素を含む組み換え家禽ポックスウイルスに関する。
　このような見地の１つとして、本発明は、ワクチンの生産、特に家禽を冒す疾病の少くとも１つに対して保護作用を示すワクチンの生産に関連する。この場合、異種蛋白質とは、異種ウイルスに対する免疫反応を誘発する蛋白質をいう。興味ある異種ウイルスの中には、ニューカッスル病ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、マレック病ウイルスが挙げられる。
　本発明は、特に麻疹ウイルスに対するワクチンの生産のための家禽痘疹ウイルスの使用に関するものである。それ故、本発明の対象は、麻疹ウイルスに対して免疫反応を誘発する蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む家禽痘疹ウイルスである。
　麻疹ウイルス族に属するウイルスとして、麻疹ウイルス、カレ病ウイルス、牛疫ウイルス及び小反芻動物ペスト（ｐｅｓｔｅ　ｄｅ　ｐｅｔｉｅｓ　ｒｕｍｉｎａｎｔｓ）が挙げられる。
　種々の麻疹ウイルスの研究により、麻疹ウイルスの表面蛋白質のいくつかをコードするＤＮＡ間の配列相同性と同様に、麻疹ウイルスの表面蛋白質とその他の麻疹ウイルスの表面蛋白質間の免疫学的相関性を証明できた。このような類似性は、カレ病、牛疫及び小反芻動物ペスト（ｐｅｓｔｅ　ｄｅ　ｐｅｔｉｅｓ　ｒｕｍｉｎａｎｔｓ）に対するワクチン接種のための麻疹ウイルス抗原の使用を予想することを可能にする。また、同種又は異種のワクチン接種系における麻疹ウイルスの各々から由来する表面抗原の使用を予見することも可能である。
　血球凝集蛋白質（ＨＡ）及び融合蛋白質（Ｆ）のような表面蛋白質は特により有用である。しかしながら、核蛋白質（ＮＰ）のような他の構造蛋白質も使用可能である。対応するＤＮＡ配列が、麻疹ウイルスを中和する抗体のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの合成を誘発するのに十分なフラグメント（断片）又は全長蛋白質をコードすることができる。
　また、数種類の蛋白質又はその断片をコードするＤＮＡ配列の使用を予見することも可能である。
　また、本発明は、例えば成長ホルモン又はＧＲＦの如き成長ホルモン誘発因子のような物質の代謝に関与する因子のｉｎ　ｖｉｖｏ、家禽での生産に関る。この場合、異種蛋白質は、上述の因子であり、家禽痘疹ウイルスは、ｉｎ　ｖｉｖｏでのその発現に必要な要素を含んでいる。この生産のために、この因子をコードする遺伝子を含む本発明の家禽痘疹ウイルスを生きたまま動物に投与する。
　最後に、本発明は、工業的又は治療上に重要な蛋白質を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞培養液中、特に鳥類細胞培養液中で、及びｉｎ　ｖｉｖｏでは動物体内で生産することを可能とする。
　痘疹ウイルスにより、特に家禽痘疹ウイルスにより外来蛋白質をコードする配列の発現には、次の３段階が必要である。
１）コードする配列は、痘疹ウイルスのプロモーターと一直線をなし、適当な細菌プラスミドにクローン化された家禽ウイルスのＤＮＡの必須でない断片に挿入されなければならない。
２）コード配列の各側面に位置する家禽痘疹ウイルスのＤＮＡ配列は、受容細胞のウイルスゲノムとプラスミドの間で同種組み換えが起こるようにさせなければならない。二重組み換えは、プラスミドから、増殖及び発現のためのウイルスゲノムへのＤＮＡインサートの移転をもたらす。
３）組み換え家禽痘疹ゲノムに合体されたＤＮＡ配列は、ウイルスの増殖に耐える適当な細胞で発現されなければならない。
　上述したように、外来ＤＮＡの挿入は、家禽痘疹ウイルスゲノムの必須でない部分、つまり、その複製を妨げない部分で行わなければならない。組み換えワクシニアウイルスにおけるように、ＴＫ遺伝子への外来遺伝子の導入が予想されていたかもしれない。しかしながら、出発株は弱毒化株であるため、複製に有用な機能の減損が非常に大きな不利益となり、免疫原力が減少し、そのため組み換えウイルスによって発現される外来抗原の効力を低下させる虞れがある。このため、本発明では、外来ＤＮＡ配列は、家禽痘疹ウイルスの非コード遺伝子間領域に導入される。この遺伝子間領域は、ドリリエンら（１９８７）によると、ゲノムの１．３Ｋｂｐ（キロ塩基対）Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片のＯＲＦ７及び９の間の間に好ましく位置している。本発明においてＯＲＦ７とは、種痘ウイルスのＨｉｎｄ　ＩＩＩ　ｊ断片と実質的に相同性を有する家禽痘疹ウイルスのＤＮＡ断片に含まれるＯＲＦ（読み枠：Ｏｐｅｎ　Ｒｅａｄｉｎｇ　Ｆｒａｍｅ）の一つであって、種痘ウイルスのＯＲＦのＦ７と相同性を有するＤＮＡ断片を意味し、またＯＲＦ９とは、同種に種痘ウイルスのＨｉｎｄ　ＩＩＩ　ｊ断片と実質的に相同性を有する家禽痘疹ウイルスのＤＮＡ断片に含まれるＯＲＦの一つであって、種痘ウイルスのＯＲＦのＦ９と相同性を有するＤＮＡ断片を意味する。尚、各ＯＲＦの位置関係並びに種痘ウイルスのＨｉｎｄ　ＩＩＩ断片との関係については、後述の実施例３並びにドリリエンら（１９８７）に記載されている。
　また、本発明は、本発明の組み換えウイルスにより感染され、その複製を可能にする真核細胞培養物にも関する。予想され得る細胞のうちでも、鳥類細胞が特に挙げられる。
　また、本発明は、生きているウイルスか又は不活性化ウイルスの型で、これ等の組み換えウイルスから得られるワクチンに係る。この様なワクチン類の生産方法は、技術的に詳細に知られているので、ここでは述べない。
　また、本発明は、その投与によって、ウイルスの増殖の間に家禽の代謝に有用な因子をｉｎ　ｖｉｖｏで産生させる生きた組み換えウイルスに関する。
　最後に、本発明は、各側面にＯＲＦ７の３′末端及びＯＲＦ９の５′末端が付加し、痘疹ウイルスプロモーターの制御の下にあり、家禽痘疹ウイルスに異種である少くとも１つの遺伝子を含むＤＮＡ配列及びこれ等のＤＮＡ配列を運搬するプラスミドにも関する。
　このようなプラスミドは、特に、本発明により組み換えウイルスを得る過程で有用である。この場合、コンピテントな細胞の培養液は、発明によるプラスミドのＤＮＡを用いてトランスフェクション（形質転換）され、上述の培養液は、必要ならば選択要素を含む家禽痘疹ウイルスで予め感染させられている。
　本発明の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかとなろう。
実施例１　家禽痘疹ウイルスの温度感受性（ｔｓ）変異株の選択及び特徴付け
　家禽天然痘又は家禽痘疹のウイルスのワクチン用株として、例えばソールズベリー研究所で生産されたワクチン（商標“Ｐｏｘｉｎｅ”ソールズベリー研究所、フランス）が用いられた。
　ウイルスの増殖は、３つの温度で測定された。
　　　　　６日後の力価
　　　３３℃　　４．１×１０５ｐｆｕ／ｍｌ
　　　３７℃　　４．１×１０５ｐｆｕ／ｍｌ
　３９．５℃　　４．２×１０５ｐｆｕ／ｍｌ
　非変異ウイルスは、３つの温度での全ての場合に効率的に増殖した。
　クローンされ、３９．５℃で増殖させたウイルスの１ストックを１０又は２０μｇ／ｍｌのニトロソグアニジンで処理する。この変異処理後、ウイルスを、ひよこ胚線維芽細胞培養液に、プラークが十分に分離できるような濃度に希釈して接種した。培養液は、３３℃（許容温度）で６〜７日間インキュベートされ、中性赤で染色し、ウイルスのプラークを見えるようにした。
　次いで、培養液を３９．５℃（制限温度）で２日間インキュベートした。大きさが変らないプラークを、温度感受性であるとみなす。数個のプラークのウイルスを移植し、３３℃で増殖させ、ｔｓ性（温度感受性）を確認するために、３３℃と３９．５℃で再び力価測定した。次の表に、２つの温度で得られた力価を示す。
実施例２　温度感受性ウイルスと非変異ウイルスの精製ＤＮＡとの間の組み換えの条件の改善
　制限条件下では、ｔｓ変異株（温度感受性株）は、もはや増殖しない。
　痘疹ウイルス族のウイルスの精製ＤＮＡは、感染性ではない。
　もし、ｔｓウイルスと精製ＤＮＡとを同一細胞に導入することにより、ウイルスの増殖が活発になるならば、それは、２個のゲノム間の相補性又はｉｎ　ｖｉｖｏ組み換えに起因する。
　ひよこ胚線維芽細胞の培養芝を、温度感受性ウイルスで感染させる（４×１０４ｐｆｕ／１０６細胞）。１時間吸着させた後、培養液に新鮮培地を補充し、許容温度（３３−３７℃）で２時間インキュベートした。
　次いで、培地を除き、非変異ウイルスの精製ＤＮＡは、リン酸カルシウム沈殿物として吸着されている（４個の培養皿に対し、５μｌの緩衝液中にＤＮＡ１μｇ）。
　１時間の吸着後、培養液に新鮮培地を補充後、非許容温度（３９．５℃）で２時間インキュベートした。その後、グリセロール（１０％）ショックを与えた。
　各培養液を再び３９．５℃で５日間インキュベートした。
　ウイルスのプラークを、培養皿の半分については、操作を行なったものを直接計数し、残りの半分は増幅後（つまり、一回目の培養皿を冷凍後、２回目の増殖を行なった後）計数した。
　実験は、家禽痘疹ウイルス野生株の精製ＤＮＡは、ｔｓ変異株（温度感受性株）によって再活性化され、感染性子孫を生じさせることを示している。
　ｔｓ１変異株は、次の実験に用いられた。
実施例３　非相同ＤＮＡを家禽ポックスウイルスに転移するためのベクターの構築
　外来ＤＮＡ配列をウイルスのゲノムに転移させるために、この配列をウイルスの正常配列の真中に合体させ、二重相同組み換えを起こさせなければならない。外来ＤＮＡは、ウイルスの増殖を妨げないように、ウイルスの非必須領域に挿入されなければならない。
　家禽痘疹ウイルスの非コード遺伝子間領域に、外来ＤＮＡを挿入するのを促進するために、ベクターを組み立てた。
ａ）家禽痘疹のＤＮＡ断片の細菌プラスミドへの挿入：ｐＴＧ１１７０の構築。
　種痘ウイルスのＤＮＡと実質的相同性を有している家禽痘疹のＤＮＡ断片は、ドリリエンら（１９８７）により述べられている。
　この断片（種痘ウイルスのＨｉｎｄ　ＩＩＩｊ断片と相同性あり）は、５個の開かれた読みわく（ＯＲＦ）配列を有しており、Ｆ８遺伝子がなく、これが３２塩基対の遺伝子間の非コード領域により入れ替えられているという点で、種痘ウイルスと異なる。
　この遺伝子間領域は、外来ＤＮＡの挿入部位として選ばれた。
　この領域を取り巻く大きなＤＮＡ断片は、組み換えと合体が家禽痘疹ウイルスゲノム中で行なわれることを可能とする相同配列として使用するために回収された。この断片は、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化した後に得られた。ＥｃｏＲＩ部位は、ＯＲＦ６の上流に位置しており、ＰｓｔＩは、ＯＲＦ９に位置している（上図参照）。ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片は、Ｍ１３ＴＧ１３１ベクター（キーニーら、１９８３）中に合体され、Ｍ１３ＴＧ１８８を得る。
　外来ＤＮＡの挿入を可能にする制限酵素を認識する部位を導入するために、Ｍ１３への導入は、局在変異誘発を行なわせる。
　次のような合成オリゴヌクレオチドを用いて、３２塩基対の遺伝子間領域に、Ｘｈｏ　Ｉ、ＢａｍＨ　Ｉ及びＥｏｃ　Ｉの３つの部位が作られた。
　合成挿入物を運ぶ構造体をＭ１３ＴＧ１９５と命名する。制限部位の存在は、対応する酵素で確かめられた。
　変異家禽痘疹ＤＮＡ配列は、Ｂｇｌ　ＩＩ−Ｐｓｔ　Ｉ断片の形態で（Ｂｇｌ　ＩＩ部位は、ＯＲＦ６の始めにある。ドリリエンら（１９８７）でＭ１３ＴＧ１９５から回収され、いくつかの制限部位を含む合成アダプターを含むｐＭＬ２由来クローニングベクター、即ちポリＩＩ（ＰＯＬＹ　ＩＩ）とラテら（１９８７）によって述べられたベクターに導入される。
　家禽痘疹のＢｇｌ　ＩＩ−ＰｓｔＩを、ＢａｍＨ　Ｉ−ＰｓｔＩで開いたポリＩＩベクターに挿入するとｐＴＧ１１７０プラスミドが得られる。このプラスミドを図１に示した。
ｂ）ｐＴＧ１１７０ベクターへの痘疹ウイルスプロモーターの挿入。
　痘疹ウイルスによる外来遺伝子の発現を得るには、この遺伝子を痘疹ウイルスプロモーターの制御下におく必要がある。
　まず、ワクシニアウイルスの十分に性質が明かとなったプロモーター、７．５Ｋ蛋白質遺伝子のプロモーターで、短く『７．５ｋプロモーター』と命名されているものを用いた。種痘ウイルスの７．５ｋプロモーターは、キーニーら（１９８４）が報告したＭ１３ＴＧ７．５ｋベクターから、ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片の形態で回収され、ｐＴＧ１１７０ベクターに導入された。
　このプロモーター配列は、ｐＴＧ１１７０の合成アダプターのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位間に導入された（図１参照）。
　その結果得られた構造体ｐＴＧ１１７１は、家禽痘疹のＯＲＦ６−７とＯＲＦ９の間に挿入された７．５ｋプロモーターを有し、そのすぐ下流にはＢａｍＨＩ部位（ｐ７．５ｋ配列により供給される）とＥｃｏＲＩ部位とがある。
実施例４　ｐＴＧ１１７１ベクターへの外来遺伝子の挿入
　ベクター及び家禽痘疹ウイルス組み換え体の選択系の有用性を実証するために、モデル遺伝子として大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を用いた。この遺伝子が選ばれたのは、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を加えると、β−ガラクトシダーゼの作用下で青色に着色することによって容易に検出される発現型を有するからである。
　大腸菌のβ−カラクシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子は、例えばｐＣＨ１１０プラスミド（ホールら、１９８３）から回収される。ｌａｃＺ遺伝子は、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄ　ＩＩＩにより切り取られ、ポリＩＩクローニングベクターに挿入され（上述）、Ｂｇｌ　ＩＩ−ＢａｍＨＩ断片の形で取り上げられ、ＢａｍＨＩで開裂され、フォスファクターゼで処理されたｐＴＧ１１７１に挿入される。
　７．５ｋプロモーターの下流にｌａｃＺ遺伝子を保持する構造体をｐＴＧＨ７７と命名する。
実施例５　組み換え家禽痘疹ウイルスによる外来遺伝子の発現
　ｐＴＧＨ７７プラスミドのＤＮＡ（１００ｎｇ／１０６細胞）を、実施例２に述べた手順に従って、家禽痘疹ウイルスｔｓ１（温度感受性株）で予め感染させたひよこ胚芽細胞にトランスフェクトさせた。
　３９．５℃で５日間インキュベートした後、組み換えウイルスを、細胞の冷凍溶解後集めた。
　ウイルスは、寒天培地で、ひよこ胚線維芽細胞で力価測定した。５日後、ウイルスプラークは、Ｘ−Ｇａｌ（３０ｍｇ／ｍｌを含有し、ＰＢＳ培地中で１００倍希釈された溶液＋１％アガロース）で肉眼観測された。
　ウイルスプラークは、青色に染まり、機能を有するβ−ガラクトシダーゼの存在を示した。
実施例６　非相同のＤＮＡを家禽痘疹ウイルスに転移させるためのもう１つのベクターの構築
ａ）家禽痘疹ウイルスに異種ＤＮＡを転移させることができる別のベクターは、ＯＲＦのＦ７とＦ９の間により大きな遺伝子間領域を保持しておくことにより構築される。この目的を達成するために、次のような合成オリゴヌクレオチドを用いてＭ１３ＴＧ１８８ファージ（実施例３で述べた）で最初の局在化変異が行なわれた。
　これにより、Ｍ１３ＴＧ２１２３ファージが得られ、ＯＲＦ　Ｆ７部分の３′−コード部分にＢａｍＨＩ部位を導入したことになる。２回目の変異は、次のオリゴヌクレオチドを用いＭ１３ＴＧ２１２３ファージで行なわれた。
　その結果得られたＭ１３ＴＧ２１２５ファージでは、ＯＲＦ　Ｆ７とＯＲＦ　Ｆ９の間の遺伝子間距離が約１５個のヌクレオチド分だけが広がり、ＯＲＦ　Ｆ７の３′側にあるコドンは、同じアミノ酸をコードする等価のコドンに置き代る。
　変異した家禽痘疹ＤＮＡ配列は、Ｂａｌ　ＩＩ−ＰｓｔＩ断片の形でＭ１３ＴＧ２１２５から回収され、実施例３と同様に、ポリＩＩベクターに導入され、ｐＴＧ２１３４プラスミドを形成する。
ｂ）ｐＴＧ２１３４ベクターへの痘疹ウイルスプロモーターの挿入。
　Ｍ１３ＴＧ２１１９（実施例３でのべたＭ１３ＴＧ７．５ｋから誘導された）ベクターのＢａｌ　ＩＩ−ＢａｍＨＩ断片の形で回収された種痘ウイルスの７．５ｋ蛋白質遺伝子のプロモーターを、ＰＴＧ２１３４プラスミドのＢａｍＨＩ部位に挿入した。これにより２個のベクター、ｐＴＧ２１３５とｐＴＧ２１３６が生じ、これらは、プロモーターの方向性がお互いに異っていた。ｐＴＧ２１３５プラスミドでは、プロモーターは、ＯＥＦ　Ｆ７とＦ９と同方向性を有しているが、ｐＴＧ２１３６プラスミドは、逆方向である。
実施例７　ベクターｐＴＧ２１３５及びｐＴＧ２１３６への外来遺伝子の挿入
　実施例４と同様、Ｂａｌ　ＩＩ−ＢａｍＨＩ断片の形でβ−ガラクタシダーゼ遺伝子を、予めＢａｍＨＩで開裂し、フォスファクターゼで処理したベクターｐＴＧ２１３５とｐＴＧ２１３６に挿入した。このような操作により、ｐＴＧ２１３７ベクター（この中でβ−ガラクトシダーゼ遺伝子はＯＲＦのＦ７とＦ９の遺伝子と同方向を向いている）及びｐＴＧ２１３８ベクター（この中ではβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の方向は、上記とは逆である）を得た。
　ｐＴＧ２１３７のＤＮＡを実施例５と同様に、家禽痘疹ウイルスｔｓｌで感染させたひよこ胚芽細胞にトランスフェクトした。
　組み換えウイルスのプラークが、５日後に観察され、Ｘ−Ｇａｌ添加で青色に染った。
実施例８　β−ガラクトシダーゼ遺伝子とは異なる外来遺伝子の家禽痘疹ゲノムへの挿入及び組み換え家禽痘疹ウイルスで感染させた細胞での発現
Ａ　組み換えウイルスの構築
　β−ガラクトシダーゼ遺伝子を家禽痘疹ゲノム内に転移させ、染色物質（Ｘ−Ｇａｌ）の存在下に家禽痘疹プラークの青色により組み換えウイルスを認識させるベクター（ｐＴＧ２１３７）の構築は、主特許の中で述べられている。更に、家禽痘疹ゲノムが、新しい容易に検出できる表現型をウイルスに転移することなしに、このゲノムに第２の遺伝子を合体させるために選択することができる。このことは、麻疹ウイルスのＦ蛋白質をコードする遺伝子の場合について説明される。
　各段階は次のようである。
　まず、β−ガラクトシダーゼとは無関係に第２の遺伝子の転写を準備するために、２つめのｐ７．５プロモーターをｐＴＧ２１３７に添えた。ｐ７．５プロモーターは、前述したようにＭ１３ＴＧ２１１９ファージから切り取られたＢｇｌ　ＩＩ−ＢａｍＨＩ断片の形で得られる。ｐ７．５プロモーターは、ｐＴＧ２１３７ベクターのＢａｍＨＩ部位のＢ−ｇａｌ遺伝子から下流に結合した。この場合、最初のｐ７．５プロモーターと同方向に結合するとｐＴＧ２１４９プラスミドが得られ、逆方向だとｐＴＧ２１５０プラスミドが得られる。
　麻疹ウイルスのＦ遺伝子をコードするｃＤＮＡを、２つのベクターｐＴＧ２１４９とｐＴＧ２１５０に、新しいｐ７．５プロモーターから下流側に挿入した。まず、Ｆ蛋白質のＮ−末端部分をコードするｃＤＮＡは、酵素Ｂｇｌ　ＩＩとＢａｍＨＩを用いてｐＴＧ１１７２を切断して切り取られ、得られた断片は、ｐＴＧ２１４９又はｐＴＧ２１５０のＢａｍＨＩ部位に挿入された。ｐ７．５プロモーターに対しＦ遺伝子の転写の正方向に挿入し、各々ＰＴＧ２１９２とｐＴＧ２１９３プラスミドを得た。
　Ｆ遺伝子のＣ−末端部分をコードするｃＤＮＡを、ＢａｍＨＩ酵素で切断して、ｐＴＧ１１７３から分離し、断片は、正常無傷Ｆ遺伝子を再形成するために、同じ酵素で予め切ったｐＴＧ２１９２に加えられた。ｐＴＧ１１７３プラスミドのＦ遺伝子のＣ−末端部分は、Ｍ１３ＴＧ２１４３ファージの中で削られていたｐｏｌｙ（Ａ）領域を含んでいる。Ｍ１３ＴＧ２１４３は、ＢａｍＨＩで切られたｐＴＧ２１９３プラスミドに添加されたＢｇｌ　ＩＩ−ＢａｍＨＩ断片の形で、Ｆ遺伝子のＣ−末端部分を供給した。上述のライゲーション中に形成されたプラスミドは、ｐＴＧ３１１３と命名された。従って、ｐＴＧ２１９５とｐＴＧ３１１３プラスミドは、各々ｐ７．５プロモーターの制御下に麻疹ウイルスの完全Ｆ遺伝子を含む。Ｆ遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｐＴＧ２１９５）の発現を支配する最初のｐ７．５プロモーターと同方向又は逆方向に向いている。組み換えプラスミドを生成するために行なわれたクローニングの組み合わせば、図３にまとめた。
　組み換えプラスミドｐＴＧ２１９５とｐＴＧ３１１３は、実施例２と５で述べた技術に従って、家禽痘疹ウイルスゲノムにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子及びＦ蛋白質遺伝子を転移するために用いられた。
　ＦＰＶ２１９５及びＦＰＶ３１１３と命名された組み換え家禽痘疹ウイルスのプラークは、Ｘ−ｇａｌの存在下、青色となって同定される。プラーク中に存在するウイルスを取り上げ、ひよこ胚芽細胞への感染により増殖させ、再び培養皿に接種した。青色プラークが同定され、上述の操作を繰り返した。
　このような連続的クローニング技術により、最初は混り合っていた非組み換えウイルスから解放されたＦＰＶ３１１３ウイルスが、安定したβ−ガラクトシダーゼ表現型を有することが示された。
　これと対照的に、ＦＰＶ２１９５ウイルスは、同じ連続クローニング操作を繰り返し行っても、不安定であった。即ち、分離された青色プラークは、β−ガラクトシダーゼをコードできない無色プラークを約２％与えた。それ故、初期に分離されたＦＰＶ２１９５ウイルスは、Ｆ蛋白質をコードする遺伝子を保有しているのに、β−ｇａｌ遺伝子を分離する傾向がある。その結果、得られたウイルスは、ＦＰＶ２１９５β−ｇａｌ−と命名された。β−ｇａｌ遺伝子の喪失は、恐らく、β−ｇａｌ遺伝子に関し、直接的繰り返しで配列された２個のｐ７．５プロモーターの間での分子間又は分子内組み換え現象に伴って起こるのであろう。この方法は、まず物理的にその遺伝子と結合するβ−ｇａｌマーカーによって選ばれた遺伝子（この場合、Ｆ遺伝子）の合体のための一次的選択、次いでウイルスの自然の組み換え機構によるマーカーの除去、及び最後に別の遺伝子の挿入又は、ゲノムの別の領域に同じ遺伝子の挿入のためにマーカーの再利用を可能にする利点を有する。
Ｂ　ＦＰＶ２１９５β−ｇａｌ−及びＦＰＶ３１１３で感染させた細胞でのＦ蛋白質の発現
　ひよこ胚芽細胞をＦＰＶ３１１３、ＦＰＶ２１９５β−ｇａｌ−又は野生型ＦＰＶにより約１ｐｆｕ／細胞で感染させた。４０時間の感染後、細胞を［３５Ｓ］メチオニンで４時間ラベルし、免疫沈降緩衝液を用いて溶菌した。組み換え体で感染させた細胞の溶解産物中に存在するＦ蛋白質は、セファロースに結合したスタフィロコッカス、アウレウス蛋白質Ａの存在下に、麻疹ウイルスの全ての蛋白質に対するモルモットポリクローナル血清で免疫沈降させた。免疫沈降させた蛋白質は、ＳＤＳ存在下にポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。乾燥させたゲルは、オートラジオグラフィーにかけた。組み換えＦＰＶ３１１３に対して示された結果（図４）は、分解産物Ｆ１及びＦ２ばかりでなく、Ｆ遺伝子（Ｆ°）に対応するｍＲＮＡの一次翻訳産物の存在を示している。
参考資料
　ブラウン（Ｂｒｏｗｎ），Ｔ．Ｄ．Ｋ．Ｓｐａｎ，２８，６８−７０（１９８５）
　チャクラバーティ，エス．（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ．），ロバート−グロフ，エム（Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ，Ｍ．），ウオン−スタール，エフ．（Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ，Ｆ），ギャロ，アール．シー．（Ｇａｌｌｏ，Ｒ．Ｃ．）及びモス，ビー．（Ｍｏｓｓ，Ｂ．），ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２０，５３５−５４０（１９８６）
　ドリリアン，ア−ル．（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ，Ｒ．），スペ−ナ−，デイ−．（Ｓｐｅｈｎｅｒ，Ｄ．），ヴィレヴァル，ディ−．（Ｖｉｌｌｅｖａｌ，Ｄ．），及びルコック，ジェイ．ピ−．（Ｌｅｃｏｃｑ，Ｊ．Ｐ．），ヴィロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），１６０，印刷中（１９８７）
　ホール，シ−．ヴイ．（Ｈａｌｌ，Ｃ．Ｖ．），ジェイコブ，ピー．イー．（Ｊａｃｏｂ，Ｐ．Ｅ．），リンゴールド，ジー．エム．（Ｒｉｎｇｏｌｄ，Ｇ．Ｍ．）及びリー．エフ．（Ｌｅｅ．Ｆ．），Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．，２，１０１−１０９（１９８３）
　フー，エス．エル．（Ｈｕ，Ｓ．Ｌ．），コゾウスキイ，エス．ジー．（Ｋｏｓｏｗｓｋｉ，Ｓ．Ｇ．）及びダブリンプル，ジェイ．エム．（Ｄａｂｒｙｍｐｌｅ，Ｊ．Ｍ．），ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　３２０，５３７−５４０（１９８６）
　キーニー，エム．ピー．（Ｋｉｅｎｙ，Ｍ．Ｐ．），ラテ，アール．（Ｌａｔｈｅ，Ｒ．）及びルコック，ジェイ．ピー．（Ｌｅｃｏｃｑ，Ｊ．Ｐ．）ジーン（Ｇｅｎｅ），２６，９１−９９（１９８３）
　キーミー，エム．ピー．（Ｋｉｅｎｙ，Ｍ．Ｐ．），ラテ，アール．（Ｌａｔｈｅ，Ｒ．），ドリリアン，アール．（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ，Ｒ．），スペーナー，デイー．（Ｓｐｅｈｎｅｒ，Ｄ．），スコリー，エス．（Ｓｋｏｒｙ，Ｓ），シュミット，デイ（Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｄ．），ヴィクター，テイ（Ｗｉｋｔｏｒ，Ｔ．），コプロウスキ，エイチ．（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｈ）及びルコック，ジェイ．ピー．（Ｌｅｃｏｃｑ，Ｊ．Ｐ．），ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　３１２，１６３−１６６（１９８４）
　キーニー，エム．ピー．（Ｋｉｅｎｙ，Ｍ．Ｐ．），ラウトマン，ジー．（Ｒａｕｔｍａｎｎ，Ｇ．），シュミット，デイ（Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｄ．），ドット，ケイ（Ｄｏｔｔ，Ｋ．），ウェインーホブソン，エス．（Ｗｅｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ，Ｓ．），アリゾン，エム．（Ａｌｉｚｏｎ，Ｍ．），ジラール，エム．（Ｇｉｒａｒｄ，Ｍ．），シャマレ，エス（Ｃｈａｍａｒｅｔ，Ｓ．），ローレン，エ―．（Ｌａｕｒｅｎｔ，Ａ．），モンタニエ，エル．（Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ，Ｌ．）及びルコック，ジェイ．ピー．（Ｌｅｃｏｃｑ，Ｊ．Ｐ．），バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）４，７９０−７９５（１９８６）
　ラテ，アール．（Ｌａｔｈｅ，Ｒ．），ヴィロッテ，ジェイ．エル．（Ｖｉｌｌｏｔｔｅ，Ｊ．Ｌ．）及びクラーク，エイ．ジェイ．（Ｃｌａｒｋ，Ａ．Ｊ．），ジーン（Ｇｅｎｅ），印刷中（１９８７）
　マケット，エム．（Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．），スミス，ジー．エル．（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｌ．）及びモス，ビー．（Ｍｏｓｓ．Ｂ．），プロシーデイングス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミー　オブ　サイエンス　オブ　ザ　ユナイテッド　ステイツ　オブ　アメリカ　（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ），７９，７４１５−７４１９（１９８２）
　モス，ビー．（Ｍｏｓｓ，Ｂ．）「ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」（編集ビー．エヌ．フィールズ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ））レイヴェン　プレス、ニューヨーク（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）（１９８５）
　パニカリ，デイ．（Ｐａｎｉｃａｌｉ，Ｄ．），デイヴィス，エス．ダブリュ．（Ｄａｖｉｓ．Ｓ．Ｗ．），ワインバーグ，アール．エル．（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｌ．），パオレッテイ，イー．（Ｐａｏｌｅｔｔｉ，Ｅ．），プロシーデイングス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミー　オブ　サイエンス　オブ　ザ　ユナイテッド　ステイツ　オブ　アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８０，５３６４−５３６８（１９８３）
　サム，シー．ケイ．（ｓａｍ，Ｃ．Ｋ．）及びダンベル，ケイ．アール．（Ｄｕｍｂｅｌｌ，Ｋ．Ｒ．），アナル　ドゥー　ヴィロロジイ（Ａｎｎ．Ｖｉｒｏｌ．）（アンスティトゥー　パストゥール（Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ））１３２，１３５−１５０（１９８１）
　スミス，ジー．エル．（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｌ．），マケット，エム．（Ｍａｋｅｔｔ，Ｍ．），モス，ヴィ．（Ｍｏｓｓ，Ｖ．），ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３０２，４９０−４９５（１９８３）
　テイラー，ジェイ．（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．），ワインバーグ，アール．（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．），デスメトル，ピー．（Ｄｅｓｍｅｔｔｒｅ，Ｐ．），パオレティ，イー．（Ｐａｏｌｅｔｔｉ，Ｅ．）「モダーン　アプローチイズ　トゥ　ニュー　ヴァクシンズ　インクリューディング　プリヴェンション　オブ　エイズ（Ｍｏｄｅｒｎ　ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　ｎｅｗ　ｖａｃｃｉｎｅｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡＩＤＳ）」コールド　スプリング　ハーバー、ニューヨーク（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）学会抄録　１２０頁（９月９日−１３日，１９８７）
【図面の簡単な説明】
　図面は、本発明実施例で得られた結果を示すものである。
図１：ｐＴＧ１１７１を得るために、ポリリンカーに導入された７．５ｋｄプロモーターを有するインサート及びプラスミドｐｔｇ１１７０を図示する。
図２：β−ガラクトシダーゼを発現する組み換え家禽痘疹ウイルスのプラークを示すひよこフィ　ブロブラスト（線維芽細胞）の培養皿の写真である。Ｘ−Ｇａｌの存在下、青色に見えるのが当プラークである。
図３：麻疹ウイルスのＦ蛋白質をコードする遺伝子を家禽痘疹ウイルスのゲノムに移転させる２個のベクターの構築。
　家禽痘疹ウイルスのゲノムのＤＮＡ配列は、Ｆ６−Ｆ７又はＦ９を含む読みわくに従って表示された円の二重線の弧で示される。円の一本線の弧は、細菌ベクターｐポリＩＩを示す。ｐ７．５プロモーターは、転写の方向を示す太い矢印で図式的に示されている。大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ及び麻疹ウイルスの蛋白質をコードする遺伝子は、夫々ｌａｃＺ及びＦ麻疹と名付けられ、正常な読み方向は、各遺伝子の下流に位置するｐ７．５プロモーターと同じである。Ｂ０と命名された部位は、Ｂｇｌ　ＩＩ部位と　ＢａｍＨＩ部位の間の結紮点に相当する。
図４：ＦＰＶ３１１３ウイルスで感染させた細胞での麻疹ウイルスのＦ蛋白質の合成を証明するオートラジオグラフィーの写真である。
　家禽痘疹の野生株（Ｔと記号化された列）又はＦＰＶ３１１３の組み換え株のうちの３個の単離株（１，２，３と記した列）で感染させたひよこ細胞の蛋白質を、モルモット抗麻疹血清で免疫沈降させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。乾燥ゲルの放射能写真（オートラジオグラフィー）を示した。Ｆ蛋白質（Ｆ０，Ｆ１、Ｆ２）の異なった型を矢印で示した。