(57)【要約】  疎水性多孔質基材と、多孔質基材の細孔表面に固定された、多孔質基材と異なる材質の親水性を有する分子鎖と、炭素原子数が２又は３のアルキル基が１乃至３個結合している窒素原子を含む分子鎖の側鎖と、備える多孔膜を用いて、２量体以上の抗体凝集体を含む抗体溶液を多孔膜に透過させ、抗体凝集体を多孔膜に吸着させる事により、透過液中に精製された抗体モノマーを回収する、抗体モノマーの精製方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性多孔質基材と、前記多孔質基材の細孔表面に固定された、前記多孔質基材と異なる材質の親水性を有する分子鎖と、炭素原子数が２又は３のアルキル基が１乃至３個結合している窒素原子を含む前記分子鎖の側鎖と、備える多孔膜を用いて、２量体以上の抗体凝集体を含む抗体溶液を前記多孔膜に透過させ、前記抗体凝集体を前記多孔膜に吸着させる事により、透過液中に精製された抗体モノマーを回収する、抗体モノマーの精製方法。
【請求項２】
前記抗体溶液が、宿主細胞由来タンパク質、デオキシリボ核酸、エンドトキシン、プロテアーゼ、及びウィルスより選択される少なくとも１種類の夾雑物をさらに含む、請求項１に記載の抗体モノマーの精製方法。
【請求項３】
前記抗体溶液の塩濃度が０．３ｍｏｌ／Ｌ以下であり、
前記側鎖が、水酸基及びカルボニル基をさらに含む、
請求項１又は２に記載の抗体モノマー溶液の精製方法。
【請求項４】
前記側鎖が、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、トリエチルアミノ基、及びトリプロピルアミノ基より選択される、少なくとも１種類のアミノ基を含み、
前記抗体溶液が、不純物タンパク質、宿主細胞由来タンパク質、デオキシリボ核酸、エンドトキシン、プロテアーゼ、及びウィルスより選択される少なくとも１種類の不純物をさらに含み、
前記抗体モノマーの回収率が８０％以上であり、
さらに、前記抗体溶液を前記多孔膜に透過させた後、４０ｍＳ／ｃｍ以上の溶液を前記多孔膜に通液して前記多孔膜に吸着した不純物を溶出し、前記多孔膜を再利用可能にする、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の抗体モノマーの精製方法。
【請求項５】
前記多孔質基材が、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、及びポリフッ化ビニリデンより選択される少なくとも一種からなる、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の抗体モノマーの精製方法。
【請求項６】
前記分子鎖の骨格が、グリシジルメタクリレート、グリシジルアクリレート、グリシジルソルベート、グリシジルイタコレート、及びグリシジルマレエートから選択される少なくとも１種類の単量体よりなる重合体である、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の抗体モノマーの精製方法。
【請求項７】
前記分子鎖の有する全側鎖の６０％以上９７％以下に、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、トリエチルアミノ基、及びトリプロピルアミノ基より選択される窒素原子を含む官能基が１個結合している、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の、抗体モノマーの精製方法。
【請求項８】
疎水性多孔質基材と、
前記多孔質基材の細孔表面に固定された、前記多孔質基材と異なる材質の親水性を有する分子鎖と、
を備える多孔膜であって、
前記分子鎖の有する全側鎖の６０％以上９７％以下に、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、トリエチルアミノ基、及びトリプロピルアミノ基より選択される官能基が１個結合し、
前記分子鎖の有する全側鎖の３％以上４０％以下の側鎖はジオール基を有する、
多孔膜。
【請求項９】
静電相互作用、疎水性相互作用、及び水素結合相互作用より選ばれる少なくとも一つの相互作用により、タンパク質を含む有機高分子を吸着する吸着体を用いた、抗体モノマーの精製方法であって、
前記吸着体の表面又は該吸着体の有する細孔の表面に、溶液中で負電荷を有する官能基が結合されており、
前記タンパク質を含む溶液を、前記吸着体に透過させることにより、前記タンパク質の凝集体を含む不純物を除去することを含み、
前記吸着体の透過液中の前記タンパク質の濃度は、透過前の前記タンパク質の濃度の１／２以上であり、前記透過液に含まれる前記タンパク質の回収率は７０％以上である、タンパク質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質基材に固定されたグラフト鎖に結合しているアミノ基及びアルキル基を有する多孔膜、及び該多孔膜を用いたタンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品及び医療分野において、有用なタンパク質を効率的に精製する方法が強く求められている。また近年、バイオテクノロジー産業においては、タンパク質の大量精製が重要な課題となっている。特に医薬の分野において、抗体医薬の需要が急速に拡大しており、効率的に大量のタンパク質を産生及び精製可能な技術の確立が強く望まれている。【０００３】
一般的に、タンパク質は、動物由来の細胞株を用いる細胞培養によって産生される。細胞培養液からタンパク質を精製する通常の操作においては、最初に、細胞培養液を遠心分離し、濁質成分を沈降除去する。次いで、遠心分離で除去しきれない約１μｍ以下の細胞デブリを、精密ろ過膜を用いるサイズろ過により除去する。さらに無菌化するために、最大細孔径が０．２２μｍ以下のろ過膜を用いて無菌化ろ過を施し、目的タンパク質を含む無菌溶液を得る（ハーベスト工程）。続いて、代表的にはプロテインＡを用いるアフィニティクロマトグラフィーを初めとする、複数のクロマトグラフィー技術の組み合わせによる精製プロセスを用いて、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ：Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、目的タンパク質の凝集体、エンドトキシン、ウィルス、カラムから脱離したプロテインＡ、並びにプロテインＡ及び抗体の凝集体等の夾雑物を、この無菌溶液から除去し、目的タンパク質を分離・精製する（ダウンストリーム工程）。【０００４】
以上説明した従来のタンパク質の精製方法の対象となる細胞培養液中の目的タンパク質の濃度は、現状では通常１ｇ／Ｌ程度である。また、夾雑物の濃度も、目的タンパク質の濃度とほぼ同程度又はそれ以下であると考えられる。かかる濃度においては、上記のハーベスト工程及びダウンストリーム工程を含む従来のタンパク質の精製方法でも有効でありうる。【０００５】
しかしながら、抗体医薬の需要が急速に拡大し、抗体医薬に用いられるタンパク質の大量生産が指向されたため、近年では細胞培養液中のタンパク質濃度を高める細胞培養技術が急速に発達している。そのため、細胞培養液中の目的タンパク質の濃度が１０ｇ／Ｌ又はそれ以上に達することもある。同時に、細胞培養液中の夾雑物の濃度も同様に増加し、従来のタンパク質の精製方法では、目的タンパク質の精製が困難になりつつある。【０００６】
特に、細胞培養液中の目的とする抗体タンパク質の濃度の増大に伴い、そのモノマーの凝集体、例えば２量体、３量体などの多量体の濃度も顕著に増加する傾向にある。凝集体は、生体内への投与時に、補体の活性又はアナフィラキシーをもたらしうる。そのため、凝集体が抗体医薬の安全性に有害な影響を及ぼしうるとの指摘がされており、その有効な除去方法が近年希求されている。これに対し、凝集体を含む各種の夾雑物を有効に除去し、抗体医薬品として使われる抗体タンパク質、すなわちモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体及び免疫グロブリンなどを精製することを目的としたクロマトグラフィー工程が多数報告されている。【０００７】
イオン交換クロマトグラフィーは、抗体と、夾雑物と、の等電点の相違を利用して、これらを分離する方法である。特にアニオン交換クロマトグラフィーは、一般に等電点の値が抗体タンパク質より小さいＨＣＰ、ＤＮＡ、及びウィルスなどの夾雑物の除去に多用されている。また、等電点がモノマーとほぼ等しい凝集体を除去して抗体モノマーを精製する方法も提案されている。【０００８】
ＨＣＰなどの一般的な夾雑物を除去する方法として近年では、多孔質膜にイオン交換基を導入して、タンパク質吸着能力を付与したタンパク質吸着膜が開発されている（例えば、特許文献１及び２参照）。また、タンパク質吸着膜の使用例として、特許文献３には、アニオン交換基を導入したセルロース多孔膜と、カチオン交換基を導入したセルロース多孔膜と、の２種類のタンパク質吸着膜を用いて、リンパ液からアルブミンを分離する方法が開示されている。さらに、特許文献４には、アニオン交換基を導入したセルロース多孔膜を用いて、核酸と、エンドトキシンと、を分離する方法が開示されている。またさらに、特許文献５及び６には、カチオン交換基及びアニオン交換基をポリエーテルスルホン多孔膜に導入したタンパク質吸着膜が開示されている。【０００９】
加えて、細胞培養液やカチオン交換クロマトグラフィー工程の溶出液のような、比較的塩濃度が高い、即ち、電気伝導度の高い状態の溶液から不純物を除去し、抗体モノマーを精製することに適した多孔膜として、特許文献７には１級アミンをアニオン交換基として固定した膨潤ゲル層を有する多孔膜が開示されている。【００１０】
また、抗体の凝集体を除去する方法として例えば、特許文献８には、抗体モノマーと、凝集体と、の混合液を抗体の等電点の近傍のｐＨに調整し、アニオン交換クロマトグラフィーカラムに通液して透過液を回収し、さらに同じｐＨの緩衝液を通液して洗浄液を回収し、これらの回収液を抗体モノマーの精製液とする抗体モノマーの精製方法が開示されている。凝集体はモノマーに比べて多くの電荷点を有するため、僅かではあるがアニオン交換基により固定されやすいという原理にこの精製方法は基づいている。また、特許文献９には、抗体モノマーと、凝集体と、をともにアニオン交換クロマトグラフィーカラムに吸着させた後、溶出液の塩濃度を徐々に上昇させるグラジエント溶出により、先に溶出される抗体モノマーの溶出ピークを回収する、抗体モノマーの精製方法が開示されている。【００１１】
また、近年、効率的に抗体を夾雑物から分離精製するために、複数のリガンドを有する混合モードの樹脂を充填したクロマトグラフィーカラムを用いることが、広く検討されている。このようなクロマトグラフィーカラムには、ミックスモードリガンド又はマルチモーダルリガンドと呼ばれるリガンドが用いられている。このようなリガンドを用いるクロマトグラフィーにおいては、電荷による相互作用の差と、疎水性による相互作用の差という、複数の相互作用の差を利用するため、より高精度な分離が可能になるばかりでなく、複数の夾雑物を同時かつ有効に除去可能になることが期待される。【００１２】
例えば、特許文献１０には、アニオン交換基及び疎水性基からなるマルチモーダルリガンドのクロマトグラフィーを用いたフロースルーモードにより、夾雑物を吸着して抗体モノマーを回収する方法、特に遊離したプロテインＡリガンド及び抗体モノマーからなる凝集体を吸着除去する方法が記載されている。また、特許文献１１には、四級アンモニウム基、水素結合基及び疎水性基を有するマルチモーダルのクロマトグラフィーを用いて、ＤＮＡ、ウィルス、エンドトキシン、凝集体、及びＨＣＰなどの殆どの夾雑物を吸着し、抗体モノマーをフロースルーにより回収する方法が記載されており、特にＨＣＰはほぼ完全に除去されることが記載されている。さらに、特許文献１２には、メルカプト基及び芳香族ピリジン環を有するミックスモードのクロマトグラフィーを用いて、抗体モノマーのみを吸着し、凝集体を非吸着画分として除去することにより、結合モードで抗体モノマーを精製する方法が記載されている。【００１３】
凝集体を選択的にカラムに吸着させ、より有効に凝集体を除去することを目的としたフロースルーモードで抗体モノマーを精製回収する方法として、特許文献１３には、ヒドロキシアパタイトのクロマトグラフィーを適用した例が記載されている。また、グラフト鎖を介して基材表面にアミノ基によるアニオン交換基を固定した多孔膜については、特許文献７に記載されており、気相反応による限定されたアミノ基の固定方法が開示されている。さらに、特許文献８には、グラフト鎖を介してジエチルアミノ基及び２−ヒドロキシエチルアミノ基を固定した多孔膜を用いて、卵白タンパク質を分離する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５，５４７，５７５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７３９，３１６号明細書
【特許文献３】米国特許第６，００１，９７４号明細書
【特許文献４】米国特許第６，２３５，８９２号明細書
【特許文献５】米国特許第６，７８３，９３７号明細書
【特許文献６】米国特許第６，７８０，３２７号明細書
【特許文献７】特開２００９−５３１９１号公報
【特許文献８】米国特許第６，１７７，５４８号明細書
【特許文献９】特表２００２−５１７４０６号公報
【特許文献１０】特表２００８−５０５８５１号公報
【特許文献１１】特表２００８−５１７９０６号公報
【特許文献１２】特表２００８−５００９７２号公報
【特許文献１３】特表２００７−５３２４７７号公報
【特許文献１４】特許第２７９６９９５号公報
【特許文献１５】特開平１１−１２３００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述のとおり、細胞培養液中の多種多様な夾雑物から抗体を高精度で分離する方法が数多く提案され、報告されている。しかしながら、全ての夾雑物を有効かつ迅速に除去して抗体を精製することは、現状でも困難であり、特にアフィニティクロマトグラフィー後の塩濃度の高い中間精製溶液において、微量に残存するＨＣＰ及び凝集体などを医薬品として要求されるレベルにまで除去し、高精度な抗体モノマーを回収することは、細胞培養液中の目的タンパク質濃度が大幅に向上しつつある状況下、さらに困難になることが懸念される。また、抗体モノマーの精製、特に凝集体の除去を目的とした精製を有効に実施する事は極めて困難である。【００１６】
特許文献１乃至６に開示されたタンパク質吸着膜は、細孔径が１μｍ以上であるため、濁質不純物である細胞デブリを除去する能力が乏しい。また溶存タンパク質の吸着容量が小さいため、大量のタンパク質を吸着できない。さらに細胞培養液には、通常、塩が含まれているが、細胞培養液に０．１ｍｏｌ／Ｌ以上の塩が含まれていると、特許文献１乃至６に開示されたタンパク質吸着膜のタンパク質の吸着量は著しく少なくなる。したがって、特許文献１乃至６に開示されたタンパク質吸着膜を用いて、電気伝導度の高い細胞培養液あるいはカチオン交換クロマトグラフィー工程の溶出液から、不純物タンパク質を除去することは、実用的ではない。【００１７】
特許文献７に開示された多孔膜は、塩を含む高電気伝導度の高い溶液に対して顕著なタンパク質吸着性を示す。しかし、吸着性能が高すぎるために不純物タンパク質のみを選択的に吸着除去することが難しく、目的タンパク質をも吸着しやすい。そのため、目的タンパク質の回収率が低下するという課題が生じる。また、吸着した不純物を十分に洗浄溶出することが出来ないため、繰返し使用することが出来ないという実用上の課題も生じる。【００１８】
特許文献８及び９に開示された、アニオン交換クロマトグラフィーカラムを用いた方法では、凝集体の除去のために極僅かな電荷相互作用の相違のみを用いるため、非常に精密な条件の制御と、分解能と、が要求される。そのため、高流速で通液することが困難であり、迅速な処理に適していない。【００１９】
特許文献１０及び１１に開示されたマルチモーダルのリガンドについても、同様にクロマトグラフィーカラムに用いるビーズのみをリガンドの固定対象としており、高流速で通液することが困難である。また、特許文献１２及び１３に開示されたミックスドモードのリガンドについても、クロマトグラフィーカラムに用いるビーズのみをリガンドの固定対象としており、高流速で通液することが困難である。これは、クロマトグラフィーに用いるビーズが多孔体粒子であり、本質的に溶液が拡散により多孔体の細孔内に侵入することによってのみ、タンパク質と、リガンドと、の接触が行われるためである。そのため、通常ビーズによるカラムクロマトグラフィーの場合、有効に吸着がなされるための通液流速は１００Ｖ／ｈ（１時間あたりカラム体積の１００倍の溶液を通液）程度である。【００２０】
グラフト鎖を介して基材表面にアミノ基によるアニオン交換基を固定した多孔膜については、特許文献１４に記載されているが、得られた多孔膜を用いたタンパク質の精製方法に関しての記載はない。また、特許文献１５には、グラフト鎖を介してジエチルアミノ基と、２−ヒドロキシエチルアミノ基と、を固定した多孔膜を用いて、卵白タンパク質を分離する方法が記載されているが、タンパク質は卵白タンパク質に限定されており、抗体モノマーの精製方法に関する記載はない。【００２１】
全ての夾雑物を有効かつ迅速に除去して抗体を精製することの困難さは、フロースルーモード及び結合モードの両方において、有効に抗体を分離精製するための有効なｐＨ、塩濃度、及び溶液組成などの条件、すなわち従来の精製技術のプロセスウィンドウが狭く、安定で汎用的な精製条件を決定することが容易ではないことにも起因する。この状況は、より効率的に夾雑物を除去することを目的とした混合モードリガンドのクロマトグラフィーにおいても同様である。【００２２】
加えて、中間精製において夾雑物を除去する工程は、高精度が要求されるために、分解能が高いクロマトグラフィーカラムによるプロセスが指向される。特に、アフィニティグロマトグラフィーにより低濃度にまで除去された状態から、さらに除去することが必要とされるＨＣＰのような夾雑物の除去においては、なおさらプロセスウィンドウが狭いために条件の設定がより困難となる。さらに凝集体は、抗体モノマーに近似した相互作用の性質を有するために、特に条件の設定が困難であり、これまで吸着膜などを用いて迅速に除去することは不可能であった。このため、これまでに多孔質膜を用いて抗体モノマーから夾雑物を除去する方法については報告されていない。【００２３】
かかる状況に鑑み、本発明の解決しようとする課題の一つは、高い濃度で抗体モノマー等のタンパク質及び夾雑物を含む、電気伝導度の高い溶液から、簡便、高速、かつ広いプロセスウィンドウで、ＨＣＰ、ＤＮＡ、エンドトキシン、脂質、ウィルス及び目的タンパク質を含むタンパク質の凝集体等の夾雑物を、有効かつ迅速に除去可能な、多孔膜を用いたタンパク質の精製方法を提供することである。本発明の解決しようとするさらなる課題の一つは、夾雑物を捕捉後、適切な洗浄により吸着した不純物を洗浄することにより再利用可能な多孔膜を用いた、タンパク質の精製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、多孔質基材と、多孔質基材表面に固定されたグラフト鎖の側鎖に結合しているアミノ基及び該アミノ基に結合しているアルキル基と、を有する多孔膜を用いることが、２量体を含む凝集体をはじめとするこれまで除去することが困難であった夾雑物の除去に有効であることを見出し、本発明を完成した。【００２５】
すなわち、本発明の態様は、疎水性の多孔質基材と、多孔質基材の細孔表面に固定された、多孔質基材と異なる材質の親水性を有する分子鎖と、炭素原子数が２又は３のアルキル基が１乃至３個結合した窒素原子を含む分子鎖の側鎖と、を備える多孔膜を用いて、２量体以上の抗体凝集体を含む抗体溶液を多孔膜に透過させ、抗体凝集体を多孔膜に吸着させる事により、透過液中に精製された抗体モノマーを回収する、抗体モノマーの精製方法であることを要旨とする。【００２６】
また、本発明の他の様態は、塩濃度が０．３ｍｏｌ／Ｌ以下の抗体モノマー溶液の精製方法であって、前記抗体モノマー溶液を多孔膜で濾過することで、少なくとも抗体モノマー溶液に含まれる不純物を多孔膜に吸着し、濾過された抗体モノマー溶液を回収する工程を有し、前記多孔膜は、疎水性の多孔質基材と、多孔質基材の細孔を含む表面に固定された、多孔質基材と異なる材質の親水性を有する分子鎖と、アルキル基が１乃至３個結合した窒素原子、水酸基及びカルボニル基を含む側鎖と、を備える、抗体モノマー溶液の精製方法であることを要旨とする。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の、多孔膜を用いたタンパク質の精製方法によれば、抗体等のタンパク質及び夾雑物を含む比較的塩濃度の高い溶液から、ＨＣＰ、ＤＮＡ、エンドトキシン、ウィルス及びタンパク質凝集体などの夾雑物を簡便かつ高速に除去可能であり、抗体等のタンパク質モノマーの精製を有効かつ迅速に実施することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００２９】
本実施の形態に係る多孔膜は、疎水性の多孔質基材と、多孔質基材の細孔を含む表面に固定された、多孔質基材と異なる材質の親水性を有する分子鎖と、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、トリエチルアミノ基、及びトリプロピルアミノ基より選択される、少なくとも１種類のアミノ基を含む分子鎖の側鎖と、を備える。また、本実施の形態に係る抗体モノマーの製造方法は、本実施の形態に係る多孔膜を用意することと、不純物を含む抗体モノマー溶液を多孔膜に透過させ、不純物を多孔膜に吸着させることと、８０％以上の回収率で、透過液中に精製された抗体モノマーを回収することと、を含む。
【００３０】
本実施の形態における「抗体」とは、生体内に侵入した抗原と抗原抗体反応を起こし、抗原に対する免疫性を生体に与えるタンパク質の総称であり、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体及び免疫グロブリンなどを指す。特に本実施の形態における精製方法は、抗体医薬の製造工程で用い得るという観点から、上記の抗体のうち、抗体医薬となり得る抗体が、本実施の形態に係る精製方法の精製対象として好適である場合もある。本実施の形態における「抗体モノマー」とは、上記の抗体のうち、単量体で存在するものを指す。
【００３１】
本実施の形態における「夾雑物」とは、抗体モノマーを精製しようとする対象溶液（混合液）中に含まれる、抗体モノマー以外の不純物を指す。例えば、抗体を細胞培養により産生させる際に培養槽内で産生される、目的抗体モノマー以外の不純物が、「夾雑物」として挙げられる。より具体的には、抗体モノマーの凝集体、誤って折りたたまれた抗体タンパクの種、ＨＣＰ、エンドトキシン、ＤＮＡ、プロテアーゼ、遊離プロテインＡ、ウィルス及びバクテリアなどが、「夾雑物」として挙げられる。
【００３２】
本実施の形態における「凝集体」（「抗体モノマーの凝集体」ということもある）とは、１種若しくは複数種の抗体モノマー同士の複合体、又は抗体モノマーと他のタンパク質等の化合物との複合体を指し、例えば、抗体モノマーの２量体又は３量体などの多量体、並びに遊離したプロテインＡ及び抗体の複合体などを含む。
【００３３】
本実施の形態における「抗体モノマー及び夾雑物を含む混合液」は、上記の抗体モノマー及び夾雑物を含有する溶液（又は含有する可能性のある溶液）であれば特に制限されず、本実施の形態に係る抗体モノマーの精製方法により、そこから抗体モノマーを精製しようとする対象溶液である。例えば、抗体の産生において用いられる細胞培養液又はその除濁液、あるいはそれらのダウンストリーム工程でのクロマトグラフィー工程中又は工程後の部分精製液等が挙げられる。
【００３４】
これらの中でも、ダウンストリーム工程における、代表的にはプロテインＡを用いるアフィニティクロマトグラフィー工程前の除濁液、又はアフィニティクロマトグラフィー工程後の部分的に精製された溶液が、溶液が澄明であること、また夾雑物が部分的に除去されていることで後段の精製工程における負荷がより低減されることから、本実施の形態に係る精製方法の精製対象として好適である。混合液中の抗体モノマー及び夾雑物の濃度は、特に限定されない。しかし、本実施の形態における抗体モノマーの精製方法が、特に高濃度で抗体モノマー及び夾雑物を含有する混合液に対しても効率よく実施することができるという観点から、例えば、混合液は、抗体モノマー及び夾雑物を合わせて２ｇ／Ｌ以上含んでいてもよい。さらには、混合液は、抗体モノマーを５ｇ／Ｌ以上含んでいてもよいし、夾雑物を１ｇ／Ｌ以上含んでいてもよい。
【００３５】
本実施の形態において用いられる「多孔膜」は、疎水性の多孔質基材と、多孔質基材の細孔を含む表面に固定された、多孔質基材と異なる材質の親水性を有する分子鎖と、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、トリエチルアミノ基、及びトリプロピルアミノ基より選択される、少なくとも１種類のアミノ基を含む分子鎖の側鎖と、を有する。なお、以下において、多孔質基材に固定された親水性を有する分子鎖を「グラフト鎖」という。また、多孔質基材の内部の細孔の側壁を含む多孔質基材の総ての表面を単に「表面」といい、多孔質基材の内部の細孔の側壁を含まない表面を「主表面」という。
【００３６】
本実施の形態において用いられる多孔膜は、アミノ基と、アルキル基と、の組み合わせにより、タンパク質によって吸着性能及び精製条件に相違が生じることを利用する。そのため、目的に応じてアミノ基と、アルキル基と、の組み合わせを選択することにより、プロセスウィンドウの広い、タンパク質精製のための多孔膜を得ることが可能となる。特に抗体タンパク質の精製を目的とする場合は、２級アミノ基としては、プロピルアミノ基（−Ｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、及びイソプロピルアミノ基（−Ｎ−ＣＨ（ＣＨ３）２）が好適である。３級アミノ基としては、ジエチルアミノ基（−Ｎ−（ＣＨ２ＣＨ３）２）、及びジイソプロピルアミノ基（−Ｎ−（ＣＨ（ＣＨ３）２）２）が好適である。４級アミノ基としては、トリエチルアミノ基（−Ｎ＋−（ＣＨ２ＣＨ３）３）、トリプロピルルアミノ基（−Ｎ＋−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）３）、及びトリジプロピルルアミノ基（−Ｎ＋−（ＣＨ（ＣＨ３）２）３）が好適である。なお、２級アミノ基、３級アミノ基、及び４級アミノ基は、それぞれ、モノアルキル置換アミノ基、ジアルキル置換アミノ基、及びトリアルキル置換アミノ基ともいう。
【００３７】
一般に、アミンの級数が多く、疎水性が高いほど、高塩濃度でのタンパク質の吸着性は高いと予想される。これはアミン級数が多いほど、タンパク質の有するカルボン酸と、アミンと、の静電的な相互作用が強く、また疎水性が高いほど、疎水性相互作用による吸着が起こりやすいためである。しかし、アミン級数が多いほど、塩濃度が高くなった場合に、静電相互作用の減衰が大きくなる傾向にある。また、塩濃度が高いほど、疎水性相互作用が強くなる傾向にある。そのため、アミンの級数及びアルキル基の種類のみから、高塩濃度においても吸着性を有する官能基を理論的に予想することは困難である。本実施の形態では、実験評価により得られた結果から、有効な静電相互作用と、疎水相互作用と、の組み合わせを決定した。
【００３８】
その結果、上記したアミノ基と、アルキル基と、の組み合わせの中でも、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ジエチルアミノ基、トリエチルアミノ基、及びトリプロピルアミノ基が、高塩濃度での吸着を実現するために、より好ましいことを見出した。
また、側鎖に水酸基及びカルボニル基が含まれることにより、アミノ基によるアニオン交換性、アルキル基による疎水性に加えて、親水性、水素結合性、及び適度なカチオン交換性が相乗し、よりプロセスウィンドウの広いタンパク質精製が可能となることから好適である。
【００３９】
多孔質基材の材料は、特に限定はされないが、疎水性であれば、タンパク質と、多孔質基材と、の間に付加的な疎水性相互作用が生じ得るという観点、並びに機械的性質を保持するという観点から、ポリオレフィン系重合体から構成されていることが好ましい。ポリオレフィン系重合体の例としては、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレン及びフッ化ビニリデンなどのオレフィンの単独重合体、前記オレフィンの２種以上の共重合体、又は１種若しくは２種以上の前記オレフィンとパーハロゲン化オレフィンとの共重合体などが挙げられる。また、これらの重合体の２種以上の混合物であってもよい。パーハロゲン化オレフィンの例としては、テトラフルオロエチレン及びクロロトリフルオロエチレンなどが挙げられる。
【００４０】
これらの中でも、疎水性と、機械的強度と、に特に優れ、かつ高い吸着容量が得られる素材であるという観点から、多孔質基材の材料として、ポリエチレン又はポリフッ化ビニリデンが好ましく、ポリエチレンがより好ましい。
【００４１】
アルキル化されたアミノ基の多孔質基材への固定の方法は、特に制限されないが、一般に、エポキシのような反応性の高い官能基を多孔質基材の表面に導入し、その後、該官能基に有機アミン化合物を結合させる方法によって行うことができる。本実施の形態においては、エポキシ基を有するグラフト鎖を予め多孔質基材の表面に固定しておき、所望のアミノ基と、アルキル基と、の組み合わせからなる有機アミン化合物をエポキシ基に反応させることにより、多孔質基材の主表面及び多孔質基材に設けられた細孔の側壁に有機アミン化合物を固定する。
【００４２】
本実施の形態において、「グラフト鎖」は、多孔質基材の主表面と、多孔質基材に設けられた細孔の側壁と、に結合した、多孔質基材の材料と異なる材料からなる分子鎖であり、基材を形成する基材骨格内部及び多孔質部分を形成する細孔内部の両方に存在しうる。グラフト鎖としては、例えば、グリシジルメタクリレート、グリシジルアクリレート、グリシジルソルベート、グリシジルイタコレート、グリシジルマレエート、酢酸ビニル、ヒドロキシプロピルアセテート又はこれらのいずれか２種以上の重合体を含む分子鎖が挙げられる。これらの中でも、エポキシ基の開環によりアミノ基を導入しやすく、水酸基及びカルボニル基を側鎖に容易に導入できることから、グリシジルメタクリレートの重合体が好ましい。多孔質基材に対するグラフト鎖の結合率（グラフト率）は、例えば後述の実施例等に記載の手法を用いて測定可能であり、より高い吸着容量及び力学的に安定な強度をともに確保するという観点から、好ましくは１０％〜２００％、より好ましくは２０％〜１５０％、更に好ましくは３０％〜１００％である。
【００４３】
アミノ基は、グラフト鎖の全側鎖の６０％以上９７％以下、より好ましくは７０％以上９６％以下に導入されていることが好ましい。アミノ基が導入されなかったエポキシ基は、タンパク質との化学結合を抑制するためにアルカリ溶液処理などによって開環し、ジオール化することが好ましい。側鎖がジオール基を有する事により、グラフト鎖の親水性が増し、溶液が充填された細孔内にグラフト鎖が有効に広がり得る。ジオール基を有するグラフト鎖の側鎖は、全側鎖の３％以上４０％以下が好ましく、より好ましくは４％以上３０％以下である。ジオール基の比率が４０％より高くなると、アミノ基によるアニオン交換相互作用の効果が低下する傾向にある。
【００４４】
多孔質基材の表面及び細孔の側壁にグラフト鎖を導入し、さらにアルキル化されたアミノ基をグラフト鎖に固定する方法としては、限定されるものではないが、例えば特開平２−１３２１３２号公報に開示される方法が挙げられる。この方法では、気相反応に従うために、アミン化合物は、反応環境下において気相として存在し、エポキシ基と反応しうるものに限定される。液相反応によってアミン化合物をグラフト鎖に固定されたエポキシ基と反応させ固定する方法としては、例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，  ６８９（１９９５）  ２１１−２１８に記載された方法がある。ただし、当該文献には、ジエチルアミンを反応させる方法のみが開示されている。任意のアミン化合物をエポキシ基と反応させて固定する方法は、使用するアミン化合物によって適切に選択される必要があり、例えば後述の実施例等に記載の方法を用いて行う。
【００４５】
本実施の形態に用いられる多孔膜は、多孔質基材と、多孔質基材の主表面及び多孔質基材に設けられた細孔の側壁に固定されたグラフト鎖と、グラフト鎖が有する側鎖に結合しているアミノ基及びアルキル基と、を備える。このような多孔膜は、多孔質基材に固定された各グラフト鎖が１以上の側鎖を有し、その側鎖にアミノ基及びアルキル基がそれぞれ１以上固定された構造を有する。そのため、アミノ基及びアルキル基が、細孔空間内に立体的に分布する。よって、電荷点を有するタンパク質などに対してアミノ基の吸着点の数が多く、吸着量が増加するとともに、相互作用の小さなタンパク質などの吸着性も高くなる。さらに、アニオン交換による電荷相互作用以外に、アルキル基、水酸基、及びカルボニル基が存在することによって、より高度に選択的なタンパク質の吸着が実現される効果がある。特に抗体などの、電荷相互作用のみでは精製が困難なタンパク質を、有効に夾雑物から分離し、精製することが可能である。また、抗体モノマーと、夾雑物と、を含む溶液を通液することにより、夾雑物のみを選択的に吸着し、抗体を非吸着で透過させることにより、迅速かつ効率的に抗体精製を実施する目的に特に適している。
【００４６】
多孔膜の最大細孔径は、溶液中の抗体モノマー及び／又は夾雑物を有効に吸着し、かつ高い透過流速を得るという観点から、上記のアニオン交換基の固定及びグラフト鎖の導入前の状態で、好ましくは０．０１μｍ〜５．０μｍであり、より好ましくは０．１μｍ〜３．０μｍであり、さらに好ましくは０．１μｍ〜１．０μｍである。
【００４７】
多孔膜の全体積に占める細孔の体積の割合である空孔率は、多孔膜の形状を保持しかつ通液時の圧損が実用上問題のない程度であれば、特に限定されないが、好ましくは５％〜９９％であり、より好ましくは１０％〜９５％であり、さらに好ましくは３０％〜９０％である。
【００４８】
上記細孔径及び空孔率の測定は、Ｍａｒｃｅｌ  Ｍｕｌｄｅｒ著「膜技術」（株式会社アイピーシー）などに記載されているような、当業者にとって公知の方法により行うことができる。例えば、電子顕微鏡による観察、バブルポイント法、水銀圧入法、及び透過率法などの測定方法が挙げられる。例えば最大細孔径の測定は、後述の実施例等に記載のバブルポイント法を適切に用いることができる。
【００４９】
多孔質基材の形態は、溶液を通液することが可能な形態であれば特に限定されず、例えば、平膜、不織布、中空糸膜、モノリス、又はキャピラリーなどが挙げられる。これらの形態の中でも、製造のし易さ、スケールアップ性、及びモジュール成型した際の膜のパッキング性などの観点から、中空糸膜が好ましい。また、多孔質基材の形状は、例えば円板又は円筒状であってもよいが、これに限定されない。
【００５０】
本実施の形態において、中空糸多孔膜とは、中空部分を有する円筒状又は繊維状の多孔膜であり、中空糸の内層と、外層と、が貫通孔である細孔によって連通しており、その細孔によって内層から外層、あるいは外層から内層に、液体又は気体が透過する性質を有する多孔体を意味する。中空糸の外径及び内径は、物理的に多孔膜が形状を保持することができ、かつモジュール成型可能であれば、特に限定されない。
【００５１】
上述した本実施の形態に係る多孔膜に、抗体モノマー及び夾雑物を含む混合液を通液し、夾雑物及び／又は抗体モノマーを多孔膜に吸着させる工程を、以下に説明する。
本実施の形態による典型的な抗体モノマーの精製方法の例としては、特に限定するものではないが、抗体モノマーと、夾雑物と、を含む混合液を本実施の形態に係る多孔膜に通液し、混合液中の夾雑物を多孔膜に吸着させることより夾雑物を混合液から除去し、透過液を抗体モノマーの精製液として回収する方法が、最も簡便であり速やかに精製を実施することができることから好ましい。
【００５２】
抗体モノマーの等電点（ｐＩ）は通常、６．５〜８．５の範囲である。一方、ＨＣＰ、ＤＮＡ、及びウィルスなどの夾雑物の多くのｐＩは６以下にある。そのため、上記の多孔膜に通液する溶液のｐＨ範囲及び塩濃度（電気伝導度）を好適に制御することによって、夾雑物の多くを多孔膜の正に帯電したアミノ基に吸着させ、透過液を抗体モノマーの精製液として回収することが可能となる。夾雑物のうち、凝集体のｐＩは、抗体モノマーに近いか、ほぼ等しい。しかし、抗体モノマーと、凝集体と、の相違点は、凝集体は抗体モノマーの複合体であるため、ｐＩが抗体モノマーと同程度であっても、凝集体の方が一つの分子が有する電荷点の数が多い点である。このため、凝集体は、正に帯電したアミノ基を有する多孔膜に、抗体モノマーよりも僅かながら吸着しやすい性質を有する。そのため、溶液のｐＨ及び塩濃度を適切に調整することにより、凝集体を多孔膜のアミノ基に吸着させ、透過液を抗体モノマーの精製液として回収することが可能となる。
【００５３】
特に、多孔質基材にグラフト鎖を介してアミノ基が固定された多孔膜（好ましくは各グラフト鎖が１以上の側鎖を有し、各側鎖がアミノ基を有する多孔膜）を用いる場合、多孔膜においてアミノ基が立体的に固定されていることになる。その結果、凝集体などのタンパク質は、電荷点において複数のアミノ基によって立体的に固定される。そのため、凝集体は抗体モノマーよりも、より強固に多孔膜に吸着される傾向にあり、抗体モノマーの精製を容易に行うことができる。
【００５４】
また、タンパク質、ＤＮＡ、及びウィルスなどは、本質的に疎水性相互作用などアニオン交換相互作用以外の性質も有する。そのため、疎水性、水素結合性、及びカチオン交換性が適切に制御された性質を有する多孔膜を用いることにより、抗体の精製をより容易に行うことができうる。したがって、グラフト鎖が適切なアルキル基、水酸基、及びカルボニル基を有することにより、より選択的に夾雑物を吸着除去することが可能になる。特に抗体モノマーの凝集体は、抗体モノマーとは疎水性の性質が異なる。したがって、グラフト鎖がアルキル基を有することにより、より選択的に凝集体を吸着除去することが可能になる。
【００５５】
混合液中の夾雑物を多孔膜に吸着させ、吸着により夾雑物を混合液から除去し、透過液を抗体モノマーの精製液として回収する場合、夾雑物（特に凝集体）の多孔膜への吸着性が抗体モノマーよりも顕著になる条件に混合液のｐＨ及び塩濃度を調整する。具体的には、ｐＨ６〜９及び塩濃度が０ｍｏｌ／Ｌ以上０．３ｍｏｌ／Ｌ以下の範囲に混合液を調整することが好ましい。
【００５６】
塩濃度の調整に用いる塩としては、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及び硫酸アンモニウムなどの他、クエン酸、リン酸又はグリシンの金属塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、ｐＨの調整は通常、簡便には塩酸又は水酸化ナトリウムの添加によって行うことができるが、これに限定されず、当業者に公知のｐＨ調整方法を適宜用いることができる。溶液のｐＨ及び塩濃度の測定は、例えば市販の測定機器を用いて、当業者に公知の手法を用いて行うことができる。
【００５７】
上記のｐＨ及び塩濃度の混合液を、本実施の形態における多孔膜に通液することにより、凝集体、ＨＣＰ、ＤＮＡ、エンドトキシン、及びウィルスなどのｐＩが６以下の夾雑物が多孔膜に吸着される。混合液のｐＨ及び塩濃度を、精製対象とする抗体モノマーのｐＩに応じて調整することにより、夾雑物（特に凝集体）がより選択的に多孔膜に吸着され、抗体モノマーの精製をより有効に行うことができる。一般的な抗体モノマーのｐＩは８近辺にあるという観点から、混合液の酸性度は、好ましくはｐＨ６〜９、より好ましくはｐＨ７〜８．５、さらに好ましくはｐＨ７．５〜８．５である。また、混合液の塩濃度は、０ｍｏｌ／Ｌ以上が好ましく、０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上がより好ましく、０．０２ｍｏｌ／Ｌ以上がさらに好ましい。また、０．３ｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、０．２ｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以下がさらに好ましく、０．０５ｍｏｌ／Ｌ以下が特に好ましい。
【００５８】
具体的には、精製対象とする抗体モノマーによって異なるが、抗体モノマーの等電点が７．５以上、例えば７．５〜８．５の範囲にある場合、混合液のｐＨ及び塩濃度を上記の範囲とすれば、抗体モノマーの精製を有効に行い得る。なお、上記の混合液と同じｐＨ及び塩濃度を有する洗浄液で、混合液通液後の多孔膜を洗浄することで、抗体モノマーをより高収率で精製することが可能となる。
【００５９】
このように、抗体モノマー及び夾雑物を含む混合液のｐＨ及び塩濃度を調整し、本実施の形態に係る多孔膜に通液することによって、凝集体を含む夾雑物を容易に除去し、抗体モノマーの精製を簡便に行うことが可能となる。この際、通液する溶液と、多孔膜に固定されたアミノ基及びアルキル基と、の接触は、強制対流によってなされるため、カラムクロマトグラフィーの場合と比べて極めて早い通液流速、例えば、１０００Ｖ／ｈ又はそれ以上の流速でも抗体モノマーの精製を行うことができる。  
【００６０】
本実施の形態に係る方法及び多孔膜を用い、本明細書の記載を参照することにより、高濃度の抗体と、高濃度の夾雑物と、を含み、さらに塩を含む溶液から、夾雑物を、簡便、高速、かつ広いプロセスウィンドウで除去することが可能となる。そのため、有効かつ迅速に、溶液から抗体を精製することが可能となる。したがって、精製された抗体を工業的に効率的に得ることが可能となる。
【００６１】
以下、実施例及び比較例（本明細書中において、単に「実施例等」ともいう。）に基づいて本実施の形態をさらに具体的に説明するが、本実施の形態の範囲は以下の実施例のみに限定されない。
【００６２】
［製造例１］  アニオン交換基が表面に固定された多孔膜モジュールの作製
（ｉ）中空糸状の多孔質基材へのグラフト鎖の導入
外径３．１ｍｍ、内径２．１ｍｍ、長さ１００ｍｍ、空孔率７０％、重量０．１３５ｇ、後述するバブルポイント法で測定した最大細孔径が０．３μｍのポリエチレン製で中空糸状の多孔質基材（旭化成ケミカルズ製、ポリエチレンＢ膜）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン製で中空糸状の多孔基材をガラス反応管に入れて、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。ここに４０℃に調整したグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）２．５体積部、及びメタノール９７．５体積部からなる反応液を、中空糸状の多孔質基材の２０質量部に注入した後、１２時間密閉状態で静置してグラフト重合反応を施し、グラフト鎖が導入された中空糸多孔膜を得た。なお、ＧＭＡ及びメタノールからなる反応液は予め窒素でバブリングして、反応液内の酸素を窒素置換した。
【００６３】
グラフト重合反応後、反応管内の反応液を捨てた。次いで、反応管内にジメチルスルホキシドを入れて中空糸多孔膜を洗浄することにより、残存したグリシジルメタクリレート、そのオリゴマー及び中空糸多孔膜に固定されなかったグラフト鎖を除去した。洗浄液を捨てた後、さらにジメチルスルホキシドを入れて２回洗浄を行った。次いでメタノールを用いて洗浄を同様に３回行った。洗浄後の中空糸多孔膜を乾燥し、重量を測定したところ、中空糸多孔膜の重量はグラフト鎖導入前の１５５％の０．２０９ｇであった。グラフト鎖導入前の多孔膜基材の重量に対するグラフト鎖の重量の比として定義されるグラフト率は、５５％であった。また反応後の中空糸は外径３．３５ｍｍ、内径２．１５ｍｍ、長さ１０８ｍｍであった。
【００６４】
（ｉｉ）グラフト鎖へのアミノ基及びアルキル基の固定
グラフト鎖を導入した後乾燥させた中空糸多孔膜をメタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。次に、アミノ基と、アルキル基と、を有するアミン化合物として、イソプロピルアミン、ノルマルプロピルアミン、ブチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、及びトリプロピルアミンを用意した。さらに、後述する実施例及び比較例に記載する、それぞれのアミン化合物に適した反応条件により、グラフト鎖が有するエポキシ基を開環反応によりアミン化合物に置換し、アミノ基と、アルキル基と、をグラフト鎖に固定した。置換率Ｔは、エポキシ基のモル数Ｎ０のうち、アミン化合物に置換されたモル数をＮ１として下記式（１）により表される。
Ｔ＝Ｎ１／Ｎ０・・・（１）
Ｎ１＝Ｎ０の場合はＴ＝１となり、エポキシ基の１００％がアミン化合物に置換された状態を示す。Ｔ＝１の場合は、グラフト鎖にジオール基は存在しない。
【００６５】
アミン化合物が置換されなかったエポキシ基は強アルカリ性の反応条件において、水と反応する事によりジオール基となる。そのため、Ｔは、下記式（２）の一次方程式を解くことにより、解析的に得られる。
１＝｛（Ｗ２−Ｗ１）／（Ｍ１Ｔ＋Ｍ０（１−Ｔ）｝／｛Ｗ１（ｄｇ／（ｄｇ＋１００））／Ｍ２｝・・・（２）
式（２）中、Ｍ１はアミン化合物の分子量、Ｍ０は水の分子量で１８、Ｗ１はグラフト重合反応後の中空糸多孔膜の重量、Ｗ２はアミノ基置換反応後の中空糸多孔膜の重量、ｄｇはグラフト率、Ｍ２はＧＭＡの分子量で１４２である。
【００６６】
（ｉｉｉ）アミノ基と、アルキル基と、が固定された中空糸多孔膜モジュールの作製
（ｉｉ）で得られた、アミノ基と、アルキル基と、がグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜１本の長手方向の両末端を、中空糸多孔膜の中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で、内径０．５ｃｍ、有効長９．２ｃｍのポリスルホン酸製モジュールケースに固定して、中空糸多孔膜モジュールを作製した。これを、以下の実施例等において、評価モジュールとして用いた。
【００６７】
［評価方法例１］バブルポイント法
中空糸多孔膜の最大細孔径は、バブルポイント法を用いて測定した。長さ８ｃｍの中空糸多孔膜の一方の末端を閉塞し、他方の末端に圧力計を介して窒素ガス供給ラインを接続した。この状態で窒素ガスを供給してライン内部を窒素に置換した後、中空糸多孔膜をエタノールに浸漬した。この時、エタノールがライン内に逆流しないように極僅かに窒素で圧力をかけた状態で、中空糸多孔膜をエタノールに浸漬した。中空糸多孔膜を浸漬した状態で、窒素ガスの圧力をゆっくりと増加させ、中空糸多孔膜から窒素ガスの泡が安定して出始めた圧力Ｐを記録した。これより、最大細孔径をｄ、表面張力をγとして、下記式（３）に従って、中空糸多孔膜の最大細孔径を算出した。
ｄ＝Ｃ１γ／Ｐ・・・（３）
式（３）中、Ｃ１は定数である。エタノールを浸漬液としたときのＣ１γ＝０．６３２（ｋｇ／ｃｍ）であり、上式にＰ（ｋｇ／ｃｍ２）を代入することにより、最大細孔径ｄ（μｍ）を求めた。
【００６８】
［評価方法例２］中空糸多孔膜のタンパク質動的吸着容量の測定
０ｍｏｌ／Ｌ又は０．１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む、２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に１ｇ／Ｌの濃度でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を溶解したＢＳＡ溶液を用い、破過が開始するまで（ｉｉｉ）で作成した中空糸多孔膜モジュールにＢＳＡ溶液を透過させた。なお、ＢＳＡ溶液を通液する前に、あらかじめ２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液を２０ｍＬ通液し、多孔膜を平衡化した。ここで、０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含むＢＳＡ溶液の電気伝導度は１．３ｍＳ／ｃｍであった。また、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含むＢＳＡ溶液の電気伝導度は１０．２ｍＳ／ｃｍであった。溶液は評価モジュール内の中空糸多孔膜の内側から外側に向かって、流速３ｍＬ／ｍｉｎにて通液した。評価はＧＥヘルスケアバイオサイエンス製ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００を用いて実施した。具体的には、同装置において得られる、透過液の２８０ｎｍのＵＶ吸光度が、供給液の２８０ｎｍのＵＶ吸光度（１５０ｍＡＵ）の１／１０（１５ｍＡＵ）となった時点を破過点とし、その時点までに供給したＢＳＡ溶液の体積から、動的吸着容量を算出した。ここで、ＢＳＡ溶液の濃度Ｑ、評価モジュールが破過した時までに透過させたＢＳＡ溶液の体積ＶＢ、及び評価モジュール内の実施例に係る中空糸多孔膜の体積ＶＭから、下記式（４）に基づいて動的吸着容量Ａは算出可能である。
Ａ＝Ｑ×ＶＢ／ＶＭ  ・・・（４）
中空糸多孔膜の体積とは、中空部分を除いた体積である。また破過とは、透過液中のＢＳＡ濃度が、供給されたＢＳＡ溶液の濃度の１０％である０．１ｇ／Ｌを超えた時点のことをいう。
【００６９】
［評価方法例３］抗体凝集体選択除去評価
（ｉ）凝集体を含む抗体たんぱく溶液の調整
０ｍｏｌ／Ｌ又は０．１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む、２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に、抗体タンパク質（株式会社ベネシス製、献血ヴェノグロブリン−ＩＨ）を添加し、抗体タンパク質１ｍｇ／ｍＬが溶解した溶液を作成した。こうして得られた溶液を供給液とし、製造例の方法にて作成した各種リガンドを有する中空糸多孔膜モジュールに、中空糸多孔膜モジュールに含まれる膜体積に対して１００体積に相当する供給液を通液し、透過後の抗体タンパク質の回収率と、抗体凝集体である２量体と、の比率を測定した。
【００７０】
（ｉｉ）抗体回収率の評価
中空糸多孔膜モジュール透過液中の抗体タンパク質の回収率は、アフィニティクロマトグラフィーによって評価した。島津製作所株式会社製高速液体クロマトグラフＬＣ−２０ＡシステムにアフィニティカラムとしてＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製ＰＯＲＯＳ  Ｇ（ＰｒｏｔｅｉｎＧカラム）を取り付け、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸に０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含むバッファー（ｐＨ７．０）を用い、室温において流速２ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液し、ここにサンプルを１００μＬ添加した。また、溶出には１２ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸に０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含むバッファーを用いた。（ｉ）にて調整した濃度が１ｍｇ／ｍＬの抗体タンパク質溶液をサンプルとして添加し、プロテインＧカラムに吸着させ、さらにプロテインＧカラムから溶出させた場合のピーク面積を、１ｍｇ／ｍＬの抗体タンパク質濃度に対応させた。さらに、中空糸多孔膜モジュールの透過液も同様にして、カラムに通液して溶出ピーク面積を求め、１ｍｇ／ｍＬの抗体タンパク質溶液より得られた溶出ピーク面積との比率から、中空糸多孔膜モジュールの透過液中の抗体タンパク質濃度を算出し、回収率を得た。
【００７１】
（ｉｉｉ）抗体モノマーと、抗体凝集体と、の比率の測定
抗体タンパク質に含まれる、抗体モノマーと、凝集体と、の比率は、ゲルろ過クロマトグラフィーによって評価した。島津製作所株式会社製クロマトグラフＬＣ−２０Ａシステムにゲルろ過カラムとして東ソー株式会社製ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬを取り付け、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸及び０．２ｍｏｌ／Ｌのアルギニン（ｐＨ６．８）を含むバッファーを用いて、２５℃において流速０．８ｍｌ／ｍｉｎでカラムに通液し、ここに評価サンプルを２０μＬ添加した。カラム透過後に抗体モノマーと、凝集体と、はそれぞれ分離した溶出ピークを示し、得られた抗体モノマーと、凝集体と、のピーク面積比から、溶液中でのそれぞれの存在比率を算出した。評価に用いた混合前の抗体タンパク質、及び（ｉ）にて調整した溶液中の抗体タンパク質に含まれる２量体比率は、ともに４．０６％であった。
【００７２】
［評価方法例４］不純物除去性並びに抗体の回収率
（ｉ）不純物を含む溶液の調整
インビトロジェン社製、ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ（登録商標）無血清培地を用いて得られた細胞培養液を、最大孔径０．４５μｍの精密ろ過膜（旭化成メディカル社製、ＭＦ−ＳＬ）によりろ過、除濁し、細胞培養液の清澄液を得た。得られた清澄液をＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、ＡＫＴＡｃｌｏｓｓｆｌｏｗを用いて、脱塩濃縮することにより、ＨＣＰを主成分とする細胞培養液の不純物濃縮溶液を得た。得られた不純物溶液のタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質としたＢｒａｄｆｏｒｄ法（ｎｏｖｅｘｉｎ社製、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ＵＬＴＲＡ  ｋｉｔ）により測定したところ、３ｍｇ／ｍＬであった。
【００７３】
次に、抗体タンパク質（株式会社ベネシス製、献血ヴェノグロブリン−ＩＨ）を用意した。さらに、０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液に、不純物０．１ｍｇ／ｍＬと、用意した抗体タンパク質１０ｍｇ／ｍＬと、を溶解し、溶液を作成した。こうして得られた溶液を供給液とし、製造例の方法にて作成した各種リガンドを有する中空糸多孔膜モジュールに通液し、抗体タンパク質の回収率と、透過後の不純物濃度と、を測定した。
【００７４】
（ｉｉ）抗体回収率及び不純物除去性の評価
中空糸多孔膜モジュール透過液中の抗体タンパク質の回収率と、ＨＣＰを主成分とする不純物タンパク質の濃度と、は、アフィニティクロマトグラフィーによって評価した。島津製作所株式会社製高速液体クロマトグラフＬＣ−２０ＡシステムにアフィニティカラムとしてＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製ＰＯＲＯＳ  Ｇ（ＰｒｏｔｅｉｎＧカラム）を取り付け、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸に０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含むバッファー（ｐＨ７．０）を用い、室温において流速２ｍＬ／ｍｉｎでカラムに通液し、ここにサンプルを１００μＬ添加した。また溶出には１２ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸に０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含むバッファーを用いた。その後、システムに、プロテインＧカラムに吸着・溶出した抗体タンパク質の溶出ピークと、カラム吸着せず流出した不純物の溶出ピークと、を表示させた。さらに、抗体タンパク質の溶出ピーク面積と、不純物の溶出ピーク面積と、から、溶液中の抗体回収率と、不純物濃度と、を算出した。
【００７５】
また、透過液中のＨＣＰ濃度は、ＣＹＧＮＵＳ社製、ＣＨＯ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、３ｒｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎを用いたＥＬＩＳＡ法により定量した。微量に含まれるＤＮＡは、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ｄｓＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  Ｑｕｂｉｔ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔを用いた、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒにより定量した。ＥＬＩＳＡ法により求めた供給液中のＨＣＰ濃度は８７μｇ／ｍＬ、Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ法で求めたこの溶液中のＤＮＡ濃度は１．７μｇ／ｍＬであった。
【００７６】
（ｉｉｉ）中空糸多孔膜モジュール透過液中の抗体モノマーと、凝集体と、の比率の測定
中空糸多孔膜モジュール透過液として得られる抗体タンパク質溶液は、不純物を含むため、抗体タンパク質のみをアフィニティカラムクロマトグラフィーにて単離した後、評価方法例３（ｉｉ）に記載した方法により、抗体モノマーと、凝集体と、の比率を求めた。アフィニティカラムはＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ  １ｍｌをＧＥヘルスケアバイオサイエンス製ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００に取り付け、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸バッファー（ｐＨ７．０）にて平衡化した後、カラムに中空糸多孔膜モジュール透過液２ｍｌを通液して、抗体タンパク質のみをカラムに吸着させた。続いて、カラムを平衡化バッファー１０ｍｌで洗浄した後、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  クエン酸バッファー（ｐＨ３．３）を用いて、吸着した抗体タンパク質を溶出して、３ｍｌの単離された抗体たんぱく溶液を回収し、ここに直ちに５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）バッファー溶液１７ｍｌを加えて中和した。得られた抗体たんぱく単離液を評価方法例３（ｉｉ）の方法により評価し、抗体モノマーと、凝集体と、の比率を求めた。
【００７７】
［実施例１］
グラフト鎖へのイソプロピルアミノ基（２級アミノ基とイソプロピル基）の固定：
製造例１（ｉ）によって得られた、グラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を、メタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。また、精製水２０ｍＬにイソプロピルアミンを全体積が４０ｍＬとなるまで攪拌しながら添加し、反応液を作製した。次に、上記（ｉ）で得られたグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜の乾燥重量に対して２５質量部の反応液をガラス反応管に入れ、４０℃に調整した。その後、反応液に、純水浸漬後のグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、４８時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をイソプロピルアミノ基に置換し、２級アミノ基と、イソプロピル基と、がグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径３．４３ｍｍ、内径２．１０ｍｍであり、式（２）より、グラフト鎖が有する全エポキシ基の７２％がイソプロピルアミノ基によって置換されていた。
【００７８】
次に、イソプロピルアミノ基を有する中空糸多孔膜を用いて、製造例１（ｉｉｉ）に従って、中空糸多孔膜モジュールを作製した。中空糸多孔膜モジュール内に占める中空糸多孔膜の中空部分を除いた多孔膜のみの体積は０．５３ｍＬであった。中空糸多孔膜の内表面積は６．１ｃｍ２であった。得られた中空糸多孔膜モジュールを用いて、評価方法例２に従いＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、６３ｍｇ／ｍＬであり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、３３ｍｇ／ｍＬであった。
【００７９】
さらに、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合のＢＳＡの動的吸着容量を評価した後の中空糸多孔膜モジュールに、電気伝導度が４０ｍＳ／ｃｍ以上である、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液（電気伝導度８４ｍＳ／ｃｍ）２０ｍＬを通液して、吸着したＢＳＡを溶出した。その後、評価方法例２に従い、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合の中空糸多孔膜モジュールのＢＳＡの動的吸着容量を再度求めたところ、６３ｍｇ／ｍＬと同じ値が得られた。即ち、実施例１に係る中空糸多孔膜モジュールは、高濃度の塩を含む溶液により適切に洗浄され、再生することができた。
【００８０】
また、評価方法例２に従い、抗体タンパク質溶液透過後の回収率と、２量体比率と、を評価した。抗体回収率は、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、８９％であり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、９５％であった。また、２量体比率は、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、１．０３％であり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、１．２１％であった。これらの結果を表１に示す。
【表１】
2011001963.tif 000002
【００８１】
［比較例１］
グラフト鎖へのブチルアミノ基（２級アミノ基とブチル基）の固定：
製造例１（ｉ）によって得られた、グラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を、メタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。また、精製水９２．７重量部にノルマルブチルアミン７．３重量部を添加し、攪拌溶解する事により、反応液を作製した。次に、上記（ｉ）で得られたグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜の乾燥重量に対して２５質量部の反応液をガラス反応管に入れ、４０℃に調整した。その後、反応液に、純水浸漬後のグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、２０時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をブチルアミノ基に置換し、２級アミノ基と、ブチル基と、がグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径３．４９ｍｍ、内径２．１６ｍｍであり、式（２）より、グラフト鎖が有する全エポキシ基の７９％がブチルアミノ基によって置換されていた。
【００８２】
次に、ブチルアミノ基を有する中空糸多孔膜を用いて、製造例１（ｉｉｉ）に従って、中空糸多孔膜モジュールを作製した。中空糸多孔膜モジュール内に占める中空糸多孔膜の中空部分を除いた多孔膜のみの体積は０．５３ｍＬであった。中空糸多孔膜の内表面積は６．２ｃｍ２であった。得られた中空糸多孔膜モジュールを用いて、評価方法例２に従いＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、１５ｍｇ／ｍＬであり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、６ｍｇ／ｍＬであって、吸着容量は少なかった。
【００８３】
さらに、０ｍｏｌ／ＬでのＢＳＡ吸着評価後の中空糸多孔膜モジュールに、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液２０ｍＬを通液して、吸着したＢＳＡを溶出した。その後、評価方法例２に従い、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合の中空糸多孔膜モジュールのＢＳＡの動的吸着容量を再度求めたところ、９ｍｇ／ｍＬと１回目より少ない値が得られた。即ち、比較例１に係る中空糸多孔膜モジュールは、高濃度の塩を含む溶液により適切に洗浄、再生することができなかった。
【００８４】
また、評価方法例２に従い、抗体タンパク質溶液透過後の回収率と、２量体比率と、を評価した。抗体回収率は、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、９２％であり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、９７％であった。また、２量体比率は、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、３．０２％であり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、３．３２％であり、実施例１と比較して劣っていた。これらの結果を表１に示す。
【００８５】
［実施例２］
グラフト鎖へのプロピルアミノ基（２級アミノ基とプロピル基）の固定：
製造例１（ｉ）によって得られた、グラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を、メタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。また、精製水２０ｍＬにノルマルプロピルアミンを全体積が４０ｍＬとなるまで攪拌しながら添加し、反応液を作製した。次に、上記（ｉ）で得られたグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜の乾燥重量に対して２５質量部の反応液をガラス反応管に入れ、４０℃に調整した。その後、反応液に、純水浸漬後のグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、２４時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をプロピルアミノ基に置換し、２級アミノ基と、プロピル基と、がグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径３．４４ｍｍ、内径２．１０ｍｍであり、式（２）より、グラフト鎖が有する全エポキシ基の７８％がプロピルアミノ基によって置換されていた。
【００８６】
次に、プロピルアミノ基を有する中空糸多孔膜を用いて、製造例１（ｉｉｉ）に従って、中空糸多孔膜モジュールを作製した。中空糸多孔膜モジュール内に占める中空糸多孔膜の中空部分を除いた多孔膜のみの体積は０．５４ｍＬであった。中空糸多孔膜の内表面積は６．１ｃｍ２であった。得られた中空糸多孔膜モジュールを用いて、評価方法例２に従いＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、塩化ナトリウム濃度が、０ｍｏｌ／Ｌ及び０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、それぞれ４９ｍｇ／ｍＬ及び２１ｍｇ／ｍＬであった。
【００８７】
さらに、０ｍｏｌ／ＬでのＢＳＡ吸着評価後の中空糸多孔膜モジュールに、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液２０ｍＬを通液して、吸着したＢＳＡを溶出した。その後、評価方法例２に従い、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合の中空糸多孔膜モジュールのＢＳＡの動的吸着容量を再度求めたところ、４７ｍｇ／ｍＬとほぼ同じ値が得られた。即ち、本中空糸多孔膜モジュールは高濃度の塩を含む溶液により適切に洗浄され、再生することができた。
【００８８】
また、評価方法例２に従い、抗体タンパク質溶液透過後の回収率と２量体比率を評価した。抗体回収率は、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、９０％であり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、９５％であった。また、２量体比率は、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、１．０８％であり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、１．２４％であった。これらの結果を表１に示す。
【００８９】
［実施例３］
グラフト鎖へのジエチルアミノ基（３級アミノ基とジエチルアミノ基）の固定：
製造例１（ｉ）によって得られた、グラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を、メタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。また、精製水２０ｍＬにジエチルアミンを全体積が４０ｍＬとなるまで攪拌しながら添加し、反応液を作製した。次に、上記（ｉ）で得られたグラフト鎖導入後の中空糸多孔膜の乾燥重量に対して２５質量部の反応液をガラス反応管に入れ、３０℃に調整した。その後、反応液に、純水浸漬後のグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、２４時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をジエチルアミノ基に置換し、３級アミノ基と、エチル基と、がグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径３．５４ｍｍ、内径２．１７ｍｍであり、式（２）より、グラフト鎖が有する全エポキシ基の８９％がジエチルアミノ基によって置換されていた。
【００９０】
次に、ジエチルアミノ基を有する中空糸多孔膜を用いて、製造例１（ｉｉｉ）に従って、中空糸多孔膜モジュールを作製した。中空糸多孔膜モジュール内に占める中空糸多孔膜の中空部分を除いた多孔膜のみの体積は０．５６ｍＬであった。中空糸多孔膜の内表面積は６．３ｃｍ２であった。得られた中空糸多孔膜モジュールを用いて、評価方法例２に従いＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌ及び０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、それぞれ５９ｍｇ／ｍＬ及び２４ｍｇ／ｍＬであった。
【００９１】
さらに、０ｍｏｌ／ＬでのＢＳＡ吸着評価後の中空糸多孔膜モジュールに、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液２０ｍＬを通液して、吸着したＢＳＡを溶出した。その後、評価方法例２に従い、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合の中空糸多孔膜モジュールのＢＳＡの動的吸着容量を再度求めたところ、５８ｍｇ／ｍＬとほぼ同じ値が得られた。即ち、本中空糸多孔膜モジュールは、高濃度の塩を含む溶液により適切に洗浄され、再生することができた。
【００９２】
また、評価方法例２に従い、抗体タンパク質溶液透過後の回収率と、２量体比率と、を評価した。抗体回収率は、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、９１％であり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、９６％であった。２量体比率は、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、０．８３％であり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、０．９１％であった。これらの結果を表１に示す。
【００９３】
［比較例２］
グラフト鎖へのジメチルアミノ基（３級アミノ基とメチル基）の固定：
製造例１（ｉ）によって得られた、グラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を、メタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。また、精製水２５ｍＬにジメチルアミンを全体積が４０ｍＬとなるまで攪拌しながら添加し、反応液を作製した。反応液を作製した。次に、上記（ｉ）で得られたグラフト鎖導入後の中空糸多孔膜の乾燥重量に対して２５質量部の反応液をガラス反応管に入れ、３０℃に調整した。その後、反応液に、純水浸漬後のグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、４８時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をジメチルアミノ基に置換し、３級アミノ基と、メチル基と、がグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径３．４０ｍｍ、内径２．０７ｍｍであり、式（２）より、グラフト鎖が有する全エポキシ基の６９％がジメチルアミノ基によって置換されていた。
【００９４】
次に、ジメチルアミノ基を有する中空糸多孔膜を用いて、製造例１（ｉｉｉ）に従って、中空糸多孔膜モジュールを作製した。中空糸多孔膜モジュール内に占める中空糸多孔膜の中空部分を除いた多孔膜のみの体積は０．５３ｍＬであった。中空糸多孔膜の内表面積は６．０ｃｍ２であった。得られた中空糸多孔膜モジュールを用いて、評価方法例２に従いＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、塩化ナトリウム濃度が、０ｍｏｌ／Ｌ及び０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、それぞれ２２ｍｇ／ｍＬ及び１１ｍｇ／ｍＬであり、吸着容量は少なかった。
【００９５】
さらに、０ｍｏｌ／ＬでのＢＳＡ吸着評価後の中空糸多孔膜モジュールに、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液２０ｍＬを通液して、吸着したＢＳＡを溶出した。その後、評価方法例２に従い、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合の中空糸多孔膜モジュールのＢＳＡの動的吸着容量を再度求めたところ、２１ｍｇ／ｍＬとほぼ同じ値が得られた。したがって、比較例２に係る中空糸多孔膜モジュールは、高濃度の塩を含む溶液により適切に洗浄、再生することができたものの、ＢＳＡの動的吸着容量が少なかった。
【００９６】
また、評価方法例２に従い、抗体タンパク質溶液透過後の回収率と、２量体比率と、を評価した。抗体回収率は、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、９３％であり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、９７％であった。また、２量体比率は、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、３．１３％であり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、３．６５％であった。これらの結果を表１に示す。
【００９７】
［比較例３］
グラフト鎖へのジプロピルアミノ基（３級アミノ基とプロピル基）の固定：
製造例１（ｉ）によって得られた、グラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を、メタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。また、精製水５ｍＬと、イソプロピルアルコール２０ｍＬと、を混合攪拌した後、ジプロピルアミンを全体積が４０ｍＬとなるまで攪拌しながら添加し、反応液を作製した。次に、上記（ｉ）で得られたグラフト鎖導入後の中空糸多孔膜の乾燥重量に対して２５質量部の反応液をガラス反応管に入れ、３０℃に調整した。その後、反応液に、純水浸漬後のグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、４８時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をジプロピルアミノ基に置換し、３級アミノ基と、プロピル基と、がグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径３．４６ｍｍ、内径２．１１ｍｍであり、式（２）より、グラフト鎖が有する全エポキシ基の６８％がジプロピルアミノ基によって置換されていた。
【００９８】
次に、ジプロピルアミノ基を有する中空糸多孔膜を用いて、製造例１（ｉｉｉ）に従って、中空糸多孔膜モジュールを作製した。中空糸多孔膜モジュール内に占める中空糸多孔膜の中空部分を除いた多孔膜のみの体積は０．５４ｍＬであった。中空糸多孔膜の内表面積は６．１ｃｍ２であった。得られた中空糸多孔膜モジュールを用いて、評価方法例２に従いＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌ及び０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、それぞれ１６ｍｇ／ｍＬ及び７ｍｇ／ｍＬであり、吸着容量は少なかった。
【００９９】
さらに、０ｍｏｌ／ＬでのＢＳＡ吸着評価後の中空糸多孔膜モジュールに、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液２０ｍＬを通液して、吸着したＢＳＡを溶出した。その後、評価方法例２に従い、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合の中空糸多孔膜モジュールのＢＳＡの動的吸着容量を再度求めたところ、１０ｍｇ／ｍＬと１回目より低い値が得られた。よって、比較例３に係る中空糸多孔膜モジュールは、高濃度の塩を含む溶液により適切に洗浄、再生することができなかった。
【０１００】
また、評価方法例２に従い、抗体タンパク質溶液透過後の回収率と、２量体比率と、を評価した。抗体回収率は、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、９４％であり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、９８％であった。また、２量体比率は、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、３．２１％であり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、３．５４％であった。これらの結果を表１に示す。
【０１０１】
［実施例４］  
グラフト鎖へのトリエチルアミノ基（４級アミノ基とエチル基）の固定：
製造例１（ｉ）によって得られた、グラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を、メタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。また、１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ水溶液１７ｍＬと、メタノール１７ｍＬと、を混合攪拌し、ここにトリエチルアミン塩酸塩４．８１ｇを攪拌しながら添加し、反応液を作製した。次に、上記（ｉ）で得られたグラフト鎖導入後の中空糸多孔膜の乾燥重量に対して２５質量部の反応液をガラス反応管に入れ、４０℃に調整した。その後、調整した反応液に、純水浸漬後のグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、３６時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をトリエチルアミノ基に置換し、４級アミノ基と、エチル基と、がグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径３．５１ｍｍ、内径２．１３ｍｍであり、式（２）より、グラフト鎖が有する全エポキシ基の６９％がトリエチルアミノ基によって置換されていた。
【０１０２】
次に、トリエチルアミノ基を有する中空糸多孔膜を用いて、製造例１（ｉｉｉ）に従って、中空糸多孔膜モジュールを作製した。中空糸多孔膜モジュール内に占める中空糸多孔膜の中空部分を除いた多孔膜のみの体積は０．５６ｍＬであった。中空糸多孔膜の内表面積は６．２ｃｍ２であった。得られた中空糸多孔膜モジュールを用いて、評価方法例２に従いＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌ及び０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、それぞれ６７ｍｇ／ｍＬ及び３１ｍｇ／ｍＬであった。
【０１０３】
さらに、０ｍｏｌ／ＬでのＢＳＡ吸着評価後の中空糸多孔膜モジュールに、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液２０ｍＬを通液して、吸着したＢＳＡを溶出した。その後、評価方法例２に従い、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合の中空糸多孔膜モジュールのＢＳＡの動的吸着容量を再度求めたところ、６５ｍｇ／ｍＬとほぼ同じ値が得られた。即ち、実施例４に係る中空糸多孔膜モジュールは、塩を含む溶液により適切に洗浄され、再生することができた。
【０１０４】
また、評価方法例２に従い、抗体タンパク質溶液透過後の回収率と、２量体比率と、を評価した。抗体回収率は、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、９２％であり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、９７％であった。また、２量体比率は、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、０．７１％であり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、０．７８％であった。これらの結果を表１に示す。
【０１０５】
［実施例５］  
グラフト鎖へのトリプロピルアミノ基（４級アミノ基とプロピル基）の固定：
製造例１（ｉ）によって得られた、グラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を、メタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。また、メタノール１７ｍＬ、精製水７．５ｍＬ、及び水酸化ナトリウム０．８４ｇを混合攪拌し、ここにトリプロピルアミン塩酸塩４．７１ｇを攪拌しながら添加し、反応液を作製した。次に、上記（ｉ）で得られたグラフト鎖導入後の中空糸多孔膜の乾燥重量に対して２５質量部の反応液をガラス反応管に入れ、４０℃に調整した。その後、調整した反応液に、純水浸漬後のグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、４６時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をトリプロピルアミノ基に置換し、４級アミノ基と、プロピル基と、がグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径３．４３ｍｍ、内径２．０９ｍｍであり、式（２）より、グラフト鎖が有する全エポキシ基の６３％がトリプロピルアミノ基によって置換されていた。
【０１０６】
次に、トリプロピルアミノ基を有する中空糸多孔膜を用いて、製造例１（ｉｉｉ）に従って、中空糸多孔膜モジュールを作製した。中空糸多孔膜モジュール内に占める中空糸多孔膜の中空部分を除いた多孔膜のみの体積は０．５３ｍＬであった。中空糸多孔膜の内表面積は６．０ｃｍ２であった。得られた中空糸多孔膜モジュールを用いて、評価方法例２に従いＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌ及び０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、それぞれ５３ｍｇ／ｍＬ及び２７ｍｇ／ｍＬであった。
【０１０７】
さらに、０ｍｏｌ／ＬでのＢＳＡ吸着評価後の中空糸多孔膜モジュールに、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液２０ｍＬを通液して、吸着したＢＳＡを溶出した。その後、評価方法例２に従い、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合の中空糸多孔膜モジュールのＢＳＡの動的吸着容量を再度求めたところ、５０ｍｇ／ｍＬとほぼ同じ値が得られた。即ち、実施例５に係る中空糸多孔膜モジュールは、塩を含む溶液により適切に洗浄され、再生することができた。
【０１０８】
また、評価方法例２に従い、抗体タンパク質溶液透過後の回収率と、２量体比率と、を評価した。抗体回収率は、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、８９％であり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、９６％であった。２量体比率は、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、１．０５％であり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、１．２３％であった。これらの結果を表１に示す。
【０１０９】
［比較例４］  
グラフト鎖へのトリメチルアミノ基（４級アミノ基とメチル基）の固定：
製造例１（ｉ）によって得られた、グラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を、メタノールに１０分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。また、精製水１２．５ｍＬと、１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ水溶液１２．５ｍＬと、を混合攪拌し、ここに１．１９ｇのトリメチルアミン塩酸塩を加えて、反応液を作製した。次に、上記（ｉ）で得られたグラフト鎖導入後の中空糸多孔膜の乾燥重量に対して２５質量部の反応液をガラス反応管に入れ、４０℃に調整した。その後、調整した反応液に純水浸漬後のグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、６時間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をトリメチルアミノ基に置換し、４級アミノ基と、メチル基と、がグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径３．５３ｍｍ、内径２．１５ｍｍであり、式（２）より、グラフト鎖が有する全エポキシ基の９０％がトリメチルアミノ基によって置換されていた。
【０１１０】
トリメチルアミノ基を有する中空糸多孔膜を用いて、製造例１（ｉｉｉ）に従って、中空糸多孔膜モジュールを作製した。中空糸多孔膜モジュール内に占める中空糸多孔膜の中空部分を除いた多孔膜のみの体積は０．５６ｍＬであった。中空糸多孔膜の内表面積は６．２ｃｍ２であった。得られた中空糸多孔膜モジュールを用いて、評価方法例２に従いＢＳＡの動的吸着容量を求めたところ、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、６０ｍｇ／ｍＬであったが、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、６ｍｇ／ｍＬと低かった。
【０１１１】
さらに、０ｍｏｌ／ＬでのＢＳＡ吸着評価後の中空糸多孔膜モジュールに、１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液２０ｍＬを通液して、吸着したＢＳＡを溶出した。さらに、評価方法例２に従い、０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムでの中空糸多孔膜モジュールのＢＳＡの動的吸着容量を再度求めたところ、５８ｍｇ／ｍＬとほぼ同じ値が得られた。即ち、比較例４に係る中空糸多孔膜モジュールは、塩を含む溶液により適切に洗浄、再生することができたが、塩濃度の高い溶液でのタンパク質吸着性に劣ることが判明した。
【０１１２】
また、評価方法例２に従い、抗体タンパク質溶液透過後の回収率と、２量体比率と、を評価した。抗体回収率は、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、８８％であり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、９８％であった。２量体比率は、塩化ナトリウム濃度が０ｍｏｌ／Ｌの場合、３．２６％であり、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌの場合、３．４５％であった。これらの結果を表１に示す。
【０１１３】
［実施例７］イソプロピルアミノ基を有する多孔膜による抗体溶液の精製
評価方法例３にて作成したＨＣＰを主成分とする不純物と、抗体タンパク質と、からなる供給液を、実施例１にて作成した中空糸多孔膜モジュールに通液した。さらに、中空糸多孔膜モジュールに含まれる膜体積に対して２０体積に相当する透過液を、フラクションとして連続的に採取した。また、透過液量に対する抗体タンパク質の回収率、及び各透過フラクション中の不純物濃度を測定した。結果を表２に示す。表２に示すように、中空糸多孔膜モジュールの透過液中の不純物は、供給液に比べ大幅に減少した。また、透過液の体積が膜体積の４０倍を超えると、抗体タンパク質の回収率は９０％以上となった。さらに、各透過フラクションに含まれる抗体タンパク質のモノマーと、凝集体と、の比率を評価方法例３に記載する方法により評価し、抗体タンパク質中の２量体比率を求めた。この結果も表２に示す。表２に示すように、中空糸多孔膜モジュール透過液中の抗体タンパク質の２量体は、供給液に比べ有意に減少していた。
【表２】
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【０１１４】
［実施例８］プロピルアミノ基を有する多孔膜による抗体溶液の精製
評価方法例３にて作成したＨＣＰを主成分とする不純物と、抗体タンパク質と、からなる供給液を、実施例２にて作成した中空糸多孔膜モジュールに通液した。さらに、中空糸多孔膜モジュールに含まれる膜体積に対して２０体積に相当する透過液を、フラクションとして連続的に採取した。また、透過液量に対する抗体タンパク質の回収率、及び各透過フラクション中の不純物濃度を測定した。結果を表２に示す。表２に示すように、中空糸多孔膜モジュールの透過液中の不純物は、供給液に比べ大幅に減少していた。また、透過液の体積が膜体積の４０倍を超えると、抗体タンパク質の回収率は９０％以上となった。さらに、各透過フラクションに含まれる抗体タンパク質のモノマーと、凝集体と、の比率を評価方法例３に記載する方法により評価し、抗体タンパク質中の２量体比率を求めた。この結果も表２に示す。表２に示すように、中空糸多孔膜モジュール透過液中の抗体タンパク質の２量体は、供給液に比べ有意に減少していた。
【０１１５】
［実施例９］ジエチルアミノ基を有する多孔膜による抗体溶液の精製
評価方法例３にて作成したＨＣＰを主成分とする不純物と、抗体タンパク質と、からなる供給液を、実施例３にて作成した中空糸多孔膜モジュールに通液した。さらに、中空糸多孔膜モジュールに含まれる膜体積に対して２０体積に相当する透過液を、フラクションとして連続的に採取した。また、透過液量に対する抗体タンパク質の回収率、及び各透過フラクション中の不純物濃度を測定した。結果を表２に示す。表２に示すように、中空糸多孔膜モジュールの透過液中の不純物は、供給液に比べ大幅に減少していた。また、透過液の体積が膜体積の４０倍を超えると、抗体タンパク質の回収率は９０％以上となった。さらに、各透過フラクションに含まれる抗体タンパク質のモノマーと、凝集体と、の比率を評価方法例３に記載する方法により評価し、抗体タンパク質中の２量体比率を求めた。この結果も表２に示す。表２に示すように、中空糸多孔膜モジュール透過液中の抗体タンパク質の２量体は、供給液に比べ有意に減少していた。
【０１１６】
［実施例１０］トリエチルアミノ基を有する多孔膜による抗体溶液の精製
評価方法例３にて作成したＨＣＰを主成分とする不純物と、抗体タンパク質と、からなる供給液を、実施例４にて作成した中空糸多孔膜モジュールに通液した。さらに、中空糸多孔膜モジュールに含まれる膜体積に対して２０体積に相当する透過液を、フラクションとして連続的に採取した。また、透過液量に対する抗体タンパク質の回収率、及び各透過フラクション中の不純物濃度を測定した。結果を表２に示す。表２に示すように、中空糸多孔膜モジュールの透過液中の不純物は、供給液に比べ大幅に減少していた。また、透過液の体積が膜体積の４０倍を超えると、抗体タンパク質の回収率は９０％以上となった。さらに、各透過フラクションに含まれる抗体タンパク質のモノマーと、凝集体と、の比率を評価方法例３に記載する方法により評価し、抗体タンパク質中の２量体比率を求めた。この結果も表２に示す。表２に示すように、中空糸多孔膜モジュール透過液中の抗体タンパク質の２量体は、供給液に比べ大幅に減少していた。
【０１１７】
［比較例５］トリメチルアミノ基を有する多孔膜による抗体溶液の精製
評価方法例３にて作成したＨＣＰを主成分とする不純物と、抗体タンパク質と、からなる供給液を、比較例４にて作成した中空糸多孔膜モジュールに通液した。さらに、中空糸多孔膜モジュールに含まれる膜体積に対して２０体積に相当する透過液を、フラクションとして連続的に採取した。また、透過液量に対する抗体タンパク質の回収率、及び各透過フラクション中の不純物濃度を測定した。結果を表２に示す。表２に示すように、透過液の体積が膜体積の４０倍を超えると、抗体タンパク質の回収率は９０％以上となるものの、比較例に係る中空糸多孔膜モジュールの透過液中の不純物は、供給液に比べ半分程度にしか減少していないことが示された。また、各透過フラクションに含まれる抗体タンパク質のモノマーと、凝集体と、の比率を評価方法例３に記載する方法により評価し、抗体タンパク質中の２量体比率を求めた。この結果も表２に示す。表２に示すように、比較例に係る中空糸多孔膜モジュールの透過液中の抗体タンパク質の２量体の減少程度は、少ないことが示された。
【０１１８】
以上により、疎水性の多孔質基材と、多孔質基材の細孔を含む表面に固定された、多孔質基材と異なる材質の親水性を有する分子鎖と、炭素原子数２又は３のアルキル基が１乃至３個結合している窒素原子、水酸基、及びカルボニル基を含む側鎖と、を備える多孔膜と、その製造方法とが示され、さらにその多孔膜を用いることにより、実用的な塩濃度において、抗体溶液から不純物を吸着除去し、抗体を精製することが、高速でかつ簡便になされることが示された。
【０１１９】
本出願は、２００９年７月３日に日本国特許庁に出願された日本特許出願（特願２００９−１５８４２１）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本実施の形態に係る方法は、従来のカラムクロマトグラフィーを用いる方法に比べて、より高速かつ高効率な処理が可能であり、スケールアップも容易である。このことから、工業レベルで医薬品を製造する際の抗体の精製に適するという、産業上の利用可能性を有する。
【国際調査報告】
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