(57)【要約】本発明は、多能性幹細胞から神経堤細胞群を分化誘導する方法、及び前記方法によって分化誘導された神経堤細胞群の先天的な異常による神経堤症もしくは神経堤に由来する細胞の後天的な障害によって引き起こされた疾患への治療等への臨床応用に関する。さらに神経堤に由来する細胞を用いた創薬研究、及び神経堤細胞を用いた発生などの基礎研究にも関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を、無血清培地においてフィーダー細胞の非存在下で浮遊培養することにより、神経堤細胞群に分化誘導することを特徴とする、神経堤細胞群の分化誘導方法。
【請求項２】
神経堤細胞群が、ｐ７５陽性及びＳｏｘ１０陽性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多能性幹細胞を浮遊培養した後、接着培養することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
培地が、血清代替物、非必須アミノ酸、ピルビン酸、及び２−メルカプトエタノールから選ばれるいずれか１又は２以上を含有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
培地が、血清代替物を含有することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
培地が、さらにＷｎｔ、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、及びＢＭＰ４から選ばれる１又は２以上を含有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
培地が、ＢＭＰ４を含有することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
多能性幹細胞がＥＳ細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法で得られた神経堤細胞群を含む培養物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法で得られた神経堤細胞群を含む、神経堤に由来する細胞、組織の異常に起因する疾患を治療するための細胞製剤。
【請求項１２】
神経堤に由来する細胞、組織の異常に起因する疾患が、水疱性角膜症を含む角膜内皮機能不全、角膜ジストロフィー、発達緑内障、Ｒｉｅｇｅｒ奇形、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィー、輪部デルモイド、強膜化角膜、円錐角膜及びペルーシド角膜変性を含む角膜形状異常、角膜瘢痕、角膜浸潤、角膜沈着、角膜浮腫、角膜潰瘍、化学物質及び熱によるものを含む眼外傷、角膜炎、角膜変性、角膜感染症、Ｈｉｒｓｃｈｓｐｒｕｎｇ病、Ｗａａｄｅｎｂｕｒｇ症候群、ならびに限局性白皮症Ｒｅｃｋｌｉｎｇｈａｕｓｅｎ病からなる群より選ばれるいずれかの疾患をである、請求項１１に記載の細胞製剤。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法で得られた神経堤細胞群を、さらに末梢神経細胞、グリア細胞、色素細胞、角膜内皮細胞、角膜実質細胞、線維柱帯細胞、虹彩実質細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、内分泌細胞、及びクロム親和性細胞からなる群より選ばれるいずれかの細胞群に分化誘導させる方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法で分化誘導された細胞群を含む培養物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法で分化誘導された細胞群を含む細胞製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞から神経堤細胞群を分化誘導する方法、及び前記方法によって分化誘導された神経堤細胞群の先天的な異常による神経堤症もしくは神経堤に由来する細胞の後天的な障害によって引き起こされた疾患への治療等への臨床応用に関する。さらに神経堤に由来する細胞を用いた創薬研究、及び神経堤細胞用いた発生などの基礎研究にも関連する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの胚は、発生の段階で３つの胚葉、すなわち内胚葉、中胚葉、外胚葉を形成する。このうち内胚葉は、胃や小腸の粘膜上皮、肝臓、膵臓等になり、中胚葉は筋肉、骨、血管や血液、皮下組織、心臓、腎臓等になり、外胚葉は神経、目、表皮等を形成する。【０００３】
神経堤細胞は脊椎動物に特徴的な細胞群であり、発生初期において神経板から神経管が形成される際に神経外胚葉と表皮外胚葉の間から発生する。この細胞群はそのあと全身へ遊走を始め、色素細胞、末梢神経、内分泌細胞、頭部の結合組織などへ分化する。このような点から、神経堤細胞は外胚葉系の細胞に分類されるが、これとは別に、第４の胚葉と言われることもある。【０００４】
神経堤細胞は末梢神経細胞、グリア細胞、色素細胞、角膜内皮細胞や角膜実質細胞など多くの種類の細胞へと分化する細胞であり、その異常は神経芽細胞腫やＨｉｒｓｃｈｓｐｒｕｎｇ病、Ｗａａｄｅｎｂｕｒｇ症候群、Ｒｅｃｋｌｉｎｇｈａｕｓｅｎ病、Ｐｅｔｅｒｓ奇形、Ｒｅｇｅｒ奇形などに関与することが知られている。【０００５】
近年、未分化な細胞（幹細胞）を分化誘導することで、損傷した組織器官の補填を図る再生医療（細胞医療）の研究が進められている。特に胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、胎盤以外のすべての細胞に分化可能であるため、各細胞系譜への分化誘導やその分化決定因子の同定が注目されているが、樹立する際の受精卵の破壊という倫理的問題からその研究や利用には制約が多く、また移植を受ける患者由来のＥＳ細胞の樹立ができないため、拒絶反応の問題もあることから、未だ臨床応用には至っていない。【０００６】
これに対し、最近、体細胞や未分化な幹細胞に特定の因子を導入することでＥＳ細胞と同様の分化多能性を有する人工多能性幹細胞が樹立された。その代表的なものは、Ｙａｍａｎａｋａらによって樹立されたｉＰＳ細胞である（特許文献１、非特許文献１及び２）。人工多能性幹細胞を利用した再生医療は、受精卵を破壊しないため倫理的問題が少ないばかりか、患者由来の細胞から樹立することができることから、自家細胞をソースとすることで拒絶反応の問題も回避することができる。【０００７】
神経堤に由来する細胞、組織の異常に起因する疾患の治療にも、上記したＥＳ細胞や人工多能性幹細胞を利用した再生医療の応用が可能である。【０００８】
ＥＳ細胞から神経堤細胞を誘導する方法としては、ＳａｓａｉやＭｉｚｕｓｅｋｉらによって報告されたＳＤＩＡ（Ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）法が知られている。ＳＤＩＡ法はマウス由来の間質細胞（ＰＡ６細胞）をフィーダー細胞として利用することで、ＥＳ細胞から神経堤細胞を分化誘導する方法である（特許文献２及び３、非特許文献３〜５）。このほか、ＥＳ細胞から神経堤細胞を誘導する方法としては、ＳＴ２細胞を用いる方法（非特許文献６）や、ＭＳ−５細胞を用いる方法（非特許文献７）も知られている。しかしながら、上記の方法はいずれも異種由来のフィーダー細胞を用いるため、異種由来感染症の危険性や異種由来フィーダー細胞との共培養によってヒト細胞がヒトに抗原性を持つ蛋白を発現する危険性など（非特許文献８）、臨床応用にあたっては安全性の点で配慮すべき問題がある。【０００９】
一方、フィーダー細胞や血清を用いることなく、ＥＳ細胞から神経細胞を分化誘導する方法として、Ｗａｔａｎａｂｅらによって報告されたＳＦＥＢ（Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  Ｆｌｏａｔｉｎｇ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）法が知られている（特許文献４、非特許文献９）。Ｗａｔａｎａｂｅらは、フィーダー細胞の非存在下で、特別な無血清培養液と浮遊凝集塊培養を組み合わせることで、マウスＥＳ細胞から効率よく終脳（発生期の前脳の一部）の神経細胞を誘導できたことを報告している。ＳＦＥＢ法は、動物由来フィーダー細胞や動物由来血清を用いないことから、ＥＳ細胞や人工多能性幹細胞を利用した再生医療を実現するうえで有用な方法と考えられる。【００１０】
しかしながら、神経堤細胞については、ＥＳ細胞や人工多能性幹細胞から動物由来フィーダー細胞や動物血清を用いずに安全に分化誘導する臨床応用可能な方法は、現在のところ報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０６９６６６
【特許文献２】ＷＯ２００１／０８８１００
【特許文献３】ＷＯ２００３／０４２３８４
【特許文献４】ＷＯ２００５／１２３９０２
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３−６７６
【非特許文献２】Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１−８７２．
【非特許文献３】Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ｓａｓａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｅｕｒｏｎ  ２８，３１−４０．
【非特許文献４】Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．，Ｓａｓａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，１５８０−１５８５
【非特許文献５】Ｍｉｚｕｓｅｋｉ，Ｋ．，Ｓａｓａｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００，５８２８−５８３３
【非特許文献６】Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００７；２５：４０２−１０．
【非特許文献７】Ｌｅｅ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７；２５：１４６８−７５．
【非特許文献８】Ｍａｒｔｉｎ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１１：２２８−２３２
【非特許文献９】Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５；８：２８８−９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、ＥＳ細胞や人工多能性幹細胞を細胞源として、安全に神経堤細胞を分化誘導する方法を開発し、神経堤に由来する細胞の異常に起因する疾患等に対する再生医療の新たな手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明者らは、多能性幹細胞からフィーダー細胞や動物血清を用いることなく神経堤細胞を分化誘導する方法について鋭意検討し、特定の成分を含む無血清培地で浮遊培養を行うことにより、神経堤細胞マーカーであるｐ７５陽性、Ｓｏｘ−１０陽性の細胞群が得られることを見出した。【００１５】
この方法により、患者自身の細胞から作製した多能性幹細胞を用いて神経堤細胞を創出することができれば、拒絶反応や異種由来感染症の心配なく、神経堤の誘導、形成、遊走の欠陥に起因する各種疾患や神経堤に由来する細胞・組織の異常に起因する疾患の再生医療に利用することができる。すなわち得られた神経堤細胞群を、さらに神経細胞、グリア細胞、色素細胞、角膜内皮細胞や角膜実質細胞等に分化誘導することにより、さまざまな疾患の再生医療にも用いることができる。【００１６】
すなわち本発明は、多能性幹細胞を、無血清培地においてフィーダー細胞の非存在下で浮遊培養することにより、神経堤細胞群に分化誘導することを特徴とする、神経堤細胞群の分化誘導方法に関する。【００１７】
本発明の方法で分化誘導される神経堤細胞群は、神経堤細胞のマーカーの発現、すなわちｐ７５陽性及びＳｏｘ１０陽性によって特徴づけられる。なお、神経堤細胞群がｐ７５陽性及びＳｏｘ１０陽性とは、実質的に神経堤細胞群の多くの細胞において、これらのマーカーの発現が検出されるということを意味する。
本発明の方法は、上記のとおり多能性幹細胞を浮遊培養した後、さらに接着培養することが好ましい。【００１８】
本発明の方法で用いられる培地には、血清代替物、非必須アミノ酸、ピルビン酸、及び２−メルカプトエタノールから選ばれるいずれか１又は２以上が含まれる。特に、ＫＳＲ等の血清代替物の存在下で行われることが望ましい。【００１９】
本発明の方法で用いられる培地には、さらにＷｎｔ、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、及びＢＭＰ４等の増殖因子を含むことが好ましく、特にＢＭＰ４を含有することが好ましい。【００２０】
１つの実施形態において、多能性幹細胞はｉＰＳ細胞等の人工多能性幹細胞である。
別な実施形態において、多能性幹細胞はＥＳ細胞である。【００２１】
本発明は、本発明の方法で得られた神経堤細胞群を含む培養物も提供する。【００２２】
また本発明は、本発明の方法で得られた神経堤細胞群を含む、神経堤に由来する細胞、組織の異常に起因する疾患を治療するための細胞製剤も提供する。【００２３】
前記神経堤に由来する細胞、組織の異常に起因する疾患としては、水疱性角膜症を含む角膜内皮機能不全、角膜ジストロフィー、発達緑内障、Ｒｉｅｇｅｒ奇形、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィー、輪部デルモイド、強膜化角膜、円錐角膜やペルーシド角膜変性などの角膜形状異常、角膜瘢痕、角膜浸潤、角膜沈着、角膜浮腫、角膜潰瘍、化学物質や熱によるものを含む眼外傷、角膜炎、角膜変性、角膜感染症などの眼疾患やＨｉｒｓｃｈｓｐｒｕｎｇ病、Ｗａａｄｅｎｂｕｒｇ症候群、限局性白皮症、Ｒｅｃｋｌｉｎｇｈａｕｓｅｎ病を挙げることができる。【００２４】
本発明は、上記した方法で得られた神経堤細胞群を、さらに末梢神経細胞、グリア細胞、色素細胞、角膜内皮細胞、角膜実質細胞、線維柱帯細胞、虹彩実質細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、内分泌細胞、クロム親和性細胞からなる群より選ばれるいずれかの細胞群に分化誘導させる方法、及び前記方法で分化誘導された細胞群を含む培養物ならびに細胞製剤も提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、異種フィーダー細胞や血清を用いることなく、多能性幹細胞から神経堤細胞群を分化誘導することができる。そのため、誘導された神経堤細胞群は外来の未知の病原体によって汚染される可能性がなく、臨床応用に安全に利用しうる。【００２６】
本発明の方法で得られる神経堤細胞群は多分化能を有しており、神経堤由来のさまざまな細胞群にさらに分化誘導しうる。そのため、神経堤の誘導、形成、遊走の欠陥に起因する神経堤症等様々な疾患の再生医療に対する有用な細胞源となる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、分化誘導培養後の各時点における細胞を示す。（ａ）Ｄａｙ１、（ｂ）Ｄａｙ２、（ｃ）Ｄａｙ４、（ｄ）Ｄａｙ７、（ｅ）Ｄａｙ９
【図２】図２は、マウスｉＰＳ細胞からの分化誘導細胞の免疫染色によるｐ７５，Ｓｏｘ−１０，ＡＰ−２の発現をみた結果を示す。（ａ）ｐ７５、（ｂ）Ｓｏｘ１０、（ｃ）ＡＰ−２、（ｄ）（ｅ）青：Ｈｏｅｃｈｓｔ（核染色）緑：ｐ７５赤：Ｓｏｘ１０による多重染色。
【図３−１】図３は、マウスｉＰＳ細胞からの分化誘導細胞のフローサイトメトリーによるｐ７５陽性細胞率の解析結果を示す。Ａ：増殖因子を添加していない  Ｂ：ＢＭＰ４（０．５ｎＭ）をｄａｙ０−５で添加
【図３−２】図３は、マウスｉＰＳ細胞からの分化誘導細胞のフローサイトメトリーによるｐ７５陽性細胞率の解析結果を示す。Ｃ：ＢＭＰ４（５ｎＭ）をｄａｙ０−５で添加  Ｄ：ＢＭＰ４（５ｎＭ），Ｗｎｔ３ａ（５ｎｇ／ｍｌ）をｄａｙ０−５で添加  Ｅ：ＢＭＰ４（０．５ｎＭ），Ｗｎｔ３ａ（５ｎｇ／ｍｌ），ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）をｄａｙ０−５で添加
【図４】図４は、ヒトｉＰＳ細胞からの分化誘導細胞の免疫染色によるｐ７５，Ｓｏｘ−１０の発現をみた結果を示す。（ａ）青：Ｈｏｅｃｈｓｔ（核染色）緑：ｐ７５赤：Ｓｏｘ１０による多重染色
【図５】図５は、ヒトｉＰＳ細胞からの分化誘導細胞のフローサイトメトリーによるｐ７５陽性細胞率の解析結果を示す。
【図６】図６は、マウスｉＰＳ細胞からの分化誘導細胞のスフェア形成能と遊走能を示す。（ａ）マウスｉＰＳ分化誘導細胞のスフェア形成、（ｂ）（ｃ）ニワトリ胚移植後のマウスｉＰＳ分化誘導細胞、（ｄ）ＤｉＩ陽性細胞（移植した神経堤細胞）及びＨＮＫ−１染色によるｃｈｉｃｋの神経堤細胞の局在
【００２８】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００９−１３４１８２号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、多能性幹細胞を、無血清培地においてフィーダー細胞の非存在下で浮遊培養することにより、神経堤細胞に分化誘導することを特徴とする、神経堤細胞群の分化誘導方法、及び前記方法によって得られた神経堤細胞の神経堤症治療等への臨床応用に関する。
【００３０】
１．定義
以下、本発明にかかる用語のいくつかについて説明する。
（１）多能性幹細胞
本発明にかかる「多能性幹細胞」とは、胎盤以外のすべての細胞に分化可能な分化多能性を有する細胞すべてを含み、ＥＳ細胞やＥＳ細胞株のほか、ｉＰＳ細胞等の人工多能性幹細胞の両方を含む。
【００３１】
（２）人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞等）
本発明にかかる「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子を導入することにより、ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有するように再プログラミング（初期化）された細胞を言う。
【００３２】
「人工多能性幹細胞」は、Ｙａｍａｎａｋａらにより、マウス繊維芽細胞にＯｃｔ３／４・Ｓｏｘ２・Ｋｌｆ４・ｃ−Ｍｙｃの４因子を導入することにより、初めて樹立され「ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）」と命名された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３−６７６）。その後、同様の４因子をヒト繊維芽細胞に導入することにより、ヒトｉＰＳも樹立され（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１−８７２．）、さらにｃ−Ｍｙｃを含まない方法等（Ｎａｋａｇａｗａ  Ｍ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，１０１−１０６）、腫瘍形成誘導が低いより安全性の高いｉＰＳ細胞を樹立する方法の確立にも成功している。
【００３３】
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ大学のＴｈｏｍｓｏｎらは、ＯＣＴ３／４，ＳＯＸ２，ＮＡＮＯＧ，ＬＩＮ２８の４遺伝子をヒト繊維芽細胞に導入して作製した人工多能性幹細胞の樹立に成功している（Ｙｕ  Ｊ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１９１７−１９２０．）。また、Ｈａｒｖａｒｄ大学のＤａｌｅｙらは、皮膚細胞にＯＣＴ３／４，ＳＯＸ２，ＫＬＦ４，Ｃ−ＭＹＣ，ｈＴＥＲＴ，ＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔの６遺伝子を導入して作製した人工多能性幹細胞の樹立について報告している（Ｐａｒｋ  ＩＨ，Ｄａｌｅｙ  ＧＱ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５１：１４１−１４６）。
【００３４】
Ｓａｋｕｒａｄａらは、体細胞ではなく、出生後の組織に存在する未分化幹細胞を細胞源として、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ等を導入することで、より効率よく誘導される人工多能性幹細胞を報告している（特開２００８−３０７００７）。
【００３５】
このほか、ＯＣＴ３／４，ＫＬＦ４，低分子化合物をマウス神経前駆細胞等に導入して作製された人工多能性幹細胞（Ｓｈｉ  Ｙ．，Ｄｉｎｇ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，（２００８）Ｖｏｌ３，Ｉｓｓｕｅ  ５，５６８−５７４，）、ＳＯＸ２，Ｃ−ＭＹＣを内因性に発現しているマウス神経幹細胞にＯＣＴ３／４，ＫＬＦ４を導入して作製された人工多能性幹細胞（Ｋｉｍ  ＪＢ．，Ｓｃｈｏｌｅｒ  ＨＲ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００８）４５４，６４６−６５０）、Ｃ−ＭＹＣを用いることなく、Ｄｎｍｔ阻害剤やＨＤＡＣ阻害剤を利用して作製された人工多能性幹細胞（Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ．，Ｍｅｌｔｏｎ，ＤＡ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，Ｎｏ７，７９５−７９７）が報告されている。
【００３６】
上記を含めて、人工多能性幹細胞に関する公知の特許としては、特開２００８−３０７００７号、特開２００８−２８３９７２号、ＵＳ２００８−２３３６６１０、ＵＳ２００９−０４７２６３、ＷＯ２００７−０６９６６６、ＷＯ２００８−１１８２２０、ＷＯ２００８−１２４１３３、ＷＯ２００８−１５１０５８、２００９−００６９３０ＷＯ２００９−００６９９７、ＷＯ２００９−００７８５２等を挙げることができる。
【００３７】
本発明で用いられる「人工多能性幹細胞」は、冒頭に記載した定義を満たし、本発明の目的を損なわない限りにおいて、公知の人工多能性幹細胞及びこれと等価な人工多能性幹細胞細胞のすべてを含み、細胞源、導入因子、導入方法等は特に限定されない。
【００３８】
好ましくは、細胞源はヒト由来であり、より好ましくは、当該細胞から分化誘導された神経堤に由来する細胞を必要とする患者自身に由来する。
【００３９】
（３）神経堤細胞
本発明に係る「神経堤細胞」とは、脊椎動物に特徴的な細胞群であり、発生初期において神経板から神経管が形成される際に神経外胚葉と表皮外胚葉の間から発生する。神経堤細胞群は、色素細胞、末梢神経、内分泌細胞、頭部の結合組織など、さまざまな組織・器官へと分化する。神経堤細胞は外胚葉系の細胞に分類されるが、このように重要な役割を担うことから、これとは別に第４の胚葉と言われることもある。
【００４０】
神経堤細胞は末梢神経細胞、グリア細胞、色素細胞、角膜内皮細胞、角膜実質細胞、虹彩実質細胞、線維柱帯細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、内分泌細胞、クロム親和性細胞など多くの種類の細胞へと分化する。
【００４１】
本発明にかかる「神経堤細胞」は、その特異的マーカーであるｐ７５、Ｓｏｘ−１０の発現によって特徴づけられる。各マーカーの詳細については、後述する。
【００４２】
（４）フィーダー細胞
本発明の方法は「フィーダー細胞」を用いることなく多能性幹細胞を培養することを特徴とする。「フィーダー細胞（あるいは「フィーダー」と略記されることもある）」とは、目的とする細胞の培養条件を補助、調製するために用いられる、培養細胞とは異なる種類の細胞を意味する。フィーダー細胞は、実験の目的や細胞の種類によって異なるが、通常それ自体増殖することがないようＸ線照射やマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）等で前処理が施される。
【００４３】
本発明の分化誘導方法自体は「フィーダー細胞」を用いることはないが、細胞源となるＥＳ細胞（株）や人工多能性幹細胞の維持においては、「フィーダー細胞」を利用してもよい。例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を維持する場合は，ＭＥＦ（マウス胎児線維芽細胞）やＳＮＬやＳＮＬＰが用いられる。
【００４４】
（５）無血清培地
本発明で用いられる「無血清培地」とは、動物血清を含まない培地を言う。無血清培地は、動物血清に由来する病原体による感染の恐れがなく、得られた細胞や培養物は安全に、臨床応用に適用することができる。なお、「無血清培地」は、感染の恐れがない人工血清代替物を含んでいてもよい。そのような人工血清代替物としては、例えば、ＫＳＲ（ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ：ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（ＧＩＢＣＯ）製）、脂質リッチアルブミン等のアルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノールや３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物を挙げられる。
【００４５】
（６）神経堤細胞マーカー：ｐ７５、ＡＰ−２、Ｓｏｘ−１０
本発明では、分化誘導された細胞を同定するために、神経堤細胞に特異的なマーカーを利用する。具体的には、本発明にかかる神経堤細胞は、ｐ７５陽性やＳｏｘ−１０陽性によって特徴づけられる。さらに、ＡＰ−２陽性の細胞もみられた。
【００４６】
ｐ７５：
ｐ７５はＬｏｗ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｅｒとして知られており、遊走している神経堤細胞のマーカーである。また表面マーカーであることから、このマーカーを指標にして細胞を純化することができる。実際にラットの坐骨神経からｐ７５陽性細胞群をｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）によって純化し、その細胞が多分化能をもつことが証明されている（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｒｅｓｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  １９９９；９６：７３７−４９．）。
【００４７】
ＡＰ−２：
ＡＰ−２は転写因子であるが、そのなかでもＡＰ−２ａは、頭部神経堤のマーカーとして知られている。ノックアウトマウスの解析からも神経堤の形成に不可欠なものとして知られている。
【００４８】
Ｓｏｘ−１０：
Ｓｏｘ−１０はｓｏｘファミリー遺伝子のグループＥサブファミリーに属する転写因子として知られており、神経堤細胞のマーカーとして知られている。
【００４９】
２．分化誘導方法
本発明においては、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の人工多能性幹細胞を、フィーダー細胞を用いることなく無血清培地で浮遊培養することにより神経堤細胞群へと分化誘導する。
【００５０】
なお、分化誘導前において、ＥＳ細胞や人工多能性幹細胞を、ＭＥＦやＳＮＬ等のフィーダー細胞上で、適当な培地（市販のＥＳ細胞用培地や、ｉＰＳ細胞用培地等）を用いて維持しておいてもよい。
【００５１】
２．１  培地の調製
本発明の方法では、動物血清を含まない無血清培地を用いる。
基本培地としては、ＤＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、α  ＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ培地、ウイリアムスＥ培地、及びこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であればいずれも用いることができる。この基本培地に、細胞の維持増殖に必要な各種栄養源や分化誘導に必要な各成分を添加して作成される。
【００５２】
例えば、栄養源としては、グリセロール、グルコース、果糖、ショ糖、乳糖、ハチミツ、デンプン、デキストリン等の炭素源、また、脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール類等の炭化水素類、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム等の窒素源、食塩、カリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等の無機塩類、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム及び硫酸マンガン、各種ビタミン類、アミノ酸類等を含むことができる。
【００５３】
分化誘導に好適な成分としては、増殖因子等の各種サイトカイン、２−メルカプトエタノール、ＫＳＲ等の人工血清代替物、非必須アミノ酸、ピルビン酸等が挙げられる。２−メルカプトエタノールは、例えば約０．０．０５−１．０ｍＭ、好ましくは約０．１〜０．５ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭの終濃度で添加する。なお、非必須アミノ酸とは、必須アミノ酸（その動物の体内で合成できず、栄養分として摂取しなければならないアミノ酸）以外のアミノ酸を意味し、ヒトの場合、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、プロリン、オルニチン、チロシン、セリン、アラニンの１１種が非必須アミノ酸に該当する。本発明において、「非必須アミノ酸」は、上記１１種のすべてを含む必要はなく、これらの一部であってもよい。
【００５４】
これらの成分を配合して得られる培地のｐＨは６．０〜８．５、好ましくは６．４〜８．０、より好ましくは７．０〜７．４の範囲である。
【００５５】
なお、前述したとおり、無血清培地は、感染の恐れがない人工血清代替物を含んでいてもよい。そのような人工血清代替物としては、例えば、脂質リッチアルブミン等のアルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノールや３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物を挙げられる。例えば、市販品であれば、ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ）、Ｇｌｕｔｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）等が挙げられる。
【００５６】
培地には、ＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）を添加すると、より良好な神経堤細胞群への分化誘導が達成できる。ＢＭＰ４は骨形成因子の一つで、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属し、分化、増殖及び様々な細胞機能を調節することが知られているが、神経管の背側化を行うＫｅｙ  Ｆａｃｔｏｒであることが知られている。培地へのＢＭＰの添加量は特に制限されないが、０．００５ｎＭ〜５０ｎＭ、とくに０．１ｎＭ〜１０ｎＭ程度が好ましい。
【００５７】
培地には、さらに上記した以外の分化誘導物質を併用できる。そのような分化誘導物質としては、例えば、ＦＧＦ、Ｗｎｔ等を挙げることができる。Ｗｎｔは、０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ程度、好ましくは１−１０ｎｇ／ｍｌ程度添加することができる。ｂＦＧＦは、０．１〜５０ｎｇ／ｍｌ程度、好ましくは１〜２０ｎｇ／ｍｌ程度添加することができる。
【００５８】
２．２  培養方法
多能性幹細胞から神経堤細胞の分化誘導には、通常フィーダー細胞を用いるのが常法であるが、本発明においては、フィーダー細胞を用いることなく上記無血清培地で浮遊培養を行う。
【００５９】
浮遊培養は、約３６．０〜３８．０℃、好ましくは約３６．５℃〜３７．５℃で、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２といった通常の条件下で行われる。
【００６０】
浮遊培養で用いられる培養容器は、細胞非接着性であることが好ましい。よって、親水性ポリマーでコーティング処理がされたものが好ましい。
【００６１】
なお、培養開始後〜５日程度までは、浮遊状態で細胞を培養し、浮遊凝集体を形成させるが、その後、接着培養にて培養を行うことが好ましい。
【００６２】
例えば、浮遊培養においてはＧＭＥＭを基礎培地として使用し、非必須アミノ酸、ピルビン酸、２−メルカプトエタノール等を使用する。接着培養にはｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ、ラミニン、ファイブロネクチン等をコーティングしたディッシュを用い、培地は浮遊培養と同様のものを用いる。
【００６３】
条件にもよるが、通常接着培養に切り替えてから７日〜９日以降において、ｐ７５陽性、ＡＰ−２陽性、Ｓｏｘ１０陽性の神経堤細胞が出現してくる。
【００６４】
培養開始時の多能性幹細胞の濃度は特に限定されず、適宜設定できる。例えば、約１．０×１０３〜約１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、好ましくは約１．０×１０４〜約１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの開始濃度で播種する。
【００６５】
３．神経堤細胞群からの分化誘導
本発明の方法によって分化誘導された神経堤細胞群は、他のさまざまな神経堤由来の細胞群にさらに分化誘導することができる。
【００６６】
神経堤細胞群から分化誘導可能な細胞群としては、例えば、末梢神経細胞、グリア細胞、色素細胞、角膜内皮細胞、角膜実質細胞、虹彩実質細胞、線維柱帯細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、内分泌細胞、クロム親和性細胞、が挙げられる。
【００６７】
例えば、ＴＧＦ−ｂを添加することにより、選択的にｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌに分化誘導することができる。またｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，アスコルビン酸、血清などを含んだ培地（Ｌｏｎｚａ社のヒト間葉系幹細胞骨芽細胞分化培地キットなど）などを使用することにより選択的に骨芽細胞に分化誘導することができる。さらにＩＴＳ（ｉｎｓｕｌｉｎ，ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ，ｓｅｌｅｎｉｕｍ）、アスコルビン酸、デキサメサゾンなどを含む培地（Ｌｏｎｚａ社のヒト間葉系幹細胞軟骨細胞分化培地キットなど）などを使用することによって選択的に軟骨細胞へ分化誘導することができる。また、インスリン、ＩＢＭＸ、デキサメサゾン、血清などを含む培地（Ｌｏｎｚａ社のヒト間葉系幹細胞脂肪細胞分化培地キットなど）などを使用することで選択的に脂肪細胞へ分化誘導することができる。
【００６８】
４．細胞の単離（純化）
本発明の方法によって分化誘導された神経堤細胞群は、表面マーカーであるｐ７５を利用して、簡便に単離（純化）することができる。またＰＤＧＦＲａやＳｃａ−１といった表面マーカーを用いても単離することができる。
【００６９】
例えば、ｐ７５に特異的な抗体で標識された免疫磁気ビーズ、ｐ７５抗体を固相化したカラム、蛍光標識されたｐ７５抗体を用いたセルソーター（ＦＡＣＳ）による分離を用いて単離することができる。抗体は、市販のものを利用してもよいし、常法にしたがって作製してもよい。
【００７０】
５．再生医療への利用
５．１  培養物
本発明の方法によって得られた神経堤細胞群、及び／又は前記細胞群から分化誘導された細胞群を含む培養物は、それ自体、研究、再生医療あるいは後述する細胞製剤の原料として利用することができる。
【００７１】
５．２  細胞製剤
本発明の方法によって、分化誘導され、単離された神経堤細胞群、及び／又は前記細胞群から分化誘導された細胞群は、神経堤細胞に起因する疾患を治療するための細胞製剤として利用できる。
【００７２】
本発明の細胞製剤の投与方法は特に限定されず、適用部位に応じて、外科的手段による局所移植、静脈内投与、腰椎穿刺投与、局所注入投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、脳内投与、脳室内投与、眼への投与（静脈投与、角膜上投与、角膜内投与、前房内投与、硝子体内投与など）などが考えられる。
【００７３】
本発明の細胞製剤は、細胞の維持・増殖、患部への投与を補助する足場材料や成分、他の医薬的に許容しうる担体を含んでいてもよい。
【００７４】
細胞の維持・増殖に必要な成分としては、炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラル、塩類、各種サイトカイン等の培地成分、あるいはマトリゲルＴＭ等の細胞外マトリックス調製品、が挙げられる。
【００７５】
患部への投与を補助する足場材料や成分としては、生分解性ポリマー；例えば、コラーゲン、ポリ乳酸、ヒアルロン酸、セルロース、及びこれらの誘導体、ならびにその２種以上からなる複合体、注射用水溶液；例えば生理食塩水、培地、ＰＢＳなどの生理緩衝液、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液（例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム）等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０等と併用してもよいが挙げられる。
【００７６】
その他、必要に応じて、医薬的に許容される有機溶剤、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤等を含んでいてもよい。
【００７７】
実際の添加物は、本発明の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、これらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン等を加えたものを使用することができる。
【００７８】
５．３  細胞シート
細胞の投与方法として、これら以外に細胞シートとして投与する方があげられる。すなわち、発明の方法で得られた神経堤細胞群やこれから分化誘導された細胞群を単層であるいは重層化して細胞シートを作製することができる。
特に岡野らによって開発された温度応答性培養皿を用いれば、低温処理のみで細胞をシート状に回収することができる。この方法ではカドヘリンなどの細胞間接着蛋白やインテグリンなどの基底膜との接着蛋白を保存したまま細胞の回収が可能であり、酵素を用いた細胞回収法より優れている（Ｙａｍａｄａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９０；１１：５７１．Ｙａｍａｔｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  ２００１；７：４７３）。またこの方法を用いて角膜上皮や心筋の再生治療が既に臨床応用されている（Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００４；３５１：１１８７−９６．）。
【００７９】
これらの方法を用いた本発明の細胞製剤や細胞シート移植の対象となりうる疾患としては、水疱性角膜症を含む角膜内皮機能不全、角膜ジストロフィー、発達緑内障、Ｒｉｅｇｅｒ奇形、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィー、輪部デルモイド、強膜化角膜、円錐角膜やペルーシド角膜変性などの角膜形状異常、角膜瘢痕、角膜浸潤、角膜沈着、角膜浮腫、角膜潰瘍、化学物質や熱によるものを含む眼外傷、角膜炎、角膜変性、角膜感染症などの眼疾患や神経芽細胞腫、Ｈｉｒｓｃｈｓｐｒｕｎｇ病、Ｗａａｄｅｎｂｕｒｇ症候群、限局性白皮症Ｒｅｃｋｌｉｎｇｈａｕｓｅｎ病が挙げられる。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００８１】
実施例１：マウスｉＰＳ細胞からの神経堤細胞の分化誘導
１．マウスｉＰＳ細胞の培養：
マウスｉＰＳ細胞は、京都大学  山中伸弥教授より供与を受けた（Ｏｋｉｔａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｎａｔｕｒｅ，４４８：３１３−３１７）。同じく山中教授より供与を受けたＳＮＬＰ（ピューロマイシン耐性のＳＮＬ細胞）を常法に従って調製し、下記に示すＳＮＬＰフィーダー用培地を用いて維持した。【００８２】
ゲラチンコートした培養皿にマイトマイシン（ＭＭＣ）処理したＳＮＬＰ細胞を播種し、これをフィーダー細胞とした。この上にマウスｉＰＳ細胞を播種し、ｉＰＳ細胞培養用培地中３７℃５％ＣＯ２，２０％Ｏ２で維持した。【００８３】
ＳＮＬＰフィーダー培地                                                    
ＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）
７％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）
Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  【００８４】
ｉＰＳ細胞培養用培地                                                      
ＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）
１５％ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）
Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ）
ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）              【００８５】
２．分化誘導系の準備
（１）無血清培地の調製
Ｗａｔａｎａｂｅら（Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５；８：２８８−９６）の記載に従い、下記に示す無血清培地を調製した。【００８６】
培地組成                                                                      
ＧＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
５％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）                  【００８７】
（２）ｉＰＳ細胞の分化誘導培養
ＳＮＬＰフィーダー上のｉＰＳ細胞を０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ処理することにより、ｉＰＳ細胞を回収し、さらにピペッティングを行うことによりｉＰＳ細胞の細胞懸濁液（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を作製した。【００８８】
得られた細胞を無血清培地でｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎにしてゲラチンコートしたディッシュに１時間程度静置し、上清を回収することでフィーダー細胞を除去して、ｉＰＳ細胞を回収した。このｉＰＳ細胞を上述の無血清培地を用いて３７℃５％ＣＯ２で、５日間浮遊培養した。その後、同様の培地を用いて接着での培養を３７℃で、８日間行った。【００８９】
（３）ＢＭＰ４の影響
培地にＢＭＰ４  ０．５ｎＭから５ｎＭをｄａｙ０−５もしくはｄａｙ３−５の間添加する以外は、上記と同様にしてｉＰＳ細胞の分化誘導を行い、神経堤細胞誘導効率に対する影響を検討した。【００９０】
（４）ＦＧＦの影響
培地にｄａｙ０−５の間、ＢＭＰ４（０．５ｎＭ）及びＷｎｔ３ａ（５ｎｇ／ｍｌ）及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する以外は、上記と同様にｉＰＳ細胞の分化誘導を行い、神経堤細胞誘導効率に対する影響を検討した。【００９１】
（５）Ｗｎｔの影響
培地にｄａｙ０−５の間、ＢＭＰ４（０．５ｎＭ）及びＷｎｔ３ａ（５ｎｇ／ｍｌ）を添加して、上記と同様にｉＰＳ細胞の分化誘導を行い、神経堤細胞誘導効率に対する影響を検討した。【００９２】
３．分化誘導細胞の検証
分化誘導後の細胞について、免疫染色法により神経堤細胞マーカーであるｐ７５、ＡＰ−２、Ｓｏｘ−１０の発現をみた。また、フローサイトメトリーによりｐ７５陽性細胞率を解析した。免疫染色法及びフローサイトメトリー解析の詳細は下記に示す。【００９３】
＜免疫染色法＞
Ｌｏｗ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＮＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｐ７５）
ＰＦＡ（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で細胞を固定した後、５％ＮＳＴを入れ６０分室温に置きブロッキングした。その後、１次抗体（ｐ７５：Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で１晩反応（４℃）させた後、ＴＢＳで洗浄し、２次抗体に２時間反応（室温）させた。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。【００９４】
（ＡＰ−２）
ＰＦＡで細胞を固定した後、５％ＮＳＴでブロッキングをおこない（６０分）、一次抗体（ＡＰ−２（５Ｅ４）：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｂａｎｋ）で一晩反応（４℃）させた後、ＴＢＳで洗浄し、２次抗体に２時間反応させた。（室温）細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色を行った。【００９５】
（Ｓｏｘ１０）
ＰＦＡで細胞を固定した後、５％ＮＳＴでブロッキングをおこない（６０分）、一次抗体（Ｓｏｘ−１０：Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）で一晩反応（４℃）させた後、ＴＢＳで洗浄し、２次抗体に２時間反応させた。（室温）細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色を行った。【００９６】
＜フローサイトメトリー解析＞
細胞をコラゲナーゼ及びＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡで回収し、１次抗体（ｐ７５：Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１０００倍希釈で添加し、３０分４℃に静置した。遠心分離によりペレットを洗浄し、さらに２次抗体（ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ａｌｅｘａ６４７）を１００倍希釈で添加し、３０分４℃で静置した。遠心分離によりペレットを洗浄した後、ＰＢＳ１−２ｍｌに縣濁した。縣濁液をフローサイトメーターに供与し、ｐ７５陽性細胞率を調べた。【００９７】
４．結果
無血清培地での浮遊培養後Ｄａｙ１、Ｄａｙ２、Ｄａｙ４の細胞を図１（ａ）−（ｃ）に示す。細胞は浮遊細胞塊は徐々に大きくなっていった。（図１）。接着培養に切り替えてからの、Ｄａｙ７、Ｄａｙ９の細胞を図１（ｄ）（ｅ）に示す。浮遊培養した細胞塊から細胞が遊走しているのが確認された。
Ｄａｙ７以降において、神経堤細胞マーカーであるｐ７５、ＡＰ−２、Ｓｏｘ１０を発現する細胞が認められた（図２）。【００９８】
Ｐ７５陽性細胞のフローサイトメトリー解析の結果、分化誘導効率は、ＢＭＰ４，Ｗｎｔ３ａ，ｂＦＧＦといったファクターを添加しない場合は０．９％であるのに対してｄａｙ０−５の間、０．５ｎＭのＢＭＰ４を添加すると３．１％へ増加し、ｄａｙ０−５の間、５ｎＭのＢＭＰ４を添加すると４．０％へと増加した。さらにｄａｙ０−５の間、０．５ｎＭのＢＭＰ４及び５ｎｇ／ｍｌＷｎｔ３ａを添加すると２．０％、０．５ｎＭのＢＭＰ４及び５ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ及び１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加すると１．７％であった。（図３）。【００９９】
５．考察
以上の結果から、ＳＦＥＢ法を利用した無血清培地でのフィーダー細胞を使わない培養により、マウスｉＰＳ細胞から神経堤細胞を分化誘導できることが確認された。神経堤細胞への分化誘導効率は、ＢＭＰ４の添加により、有意に向上することが確認された。【０１００】
実施例２：ヒトｉＰＳ細胞からの神経堤細胞の分化誘導
１．ヒトｉＰＳ細胞の培養：
ヒトｉＰＳ細胞は、京都大学  山中伸弥教授より供与を受けた（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１−８７２）。ＭＥＦ細胞（ＫＢＬ９２８４６００北山ラベス）は、下記に示すＭＥＦフィーダー用培地を用いて維持した。【０１０１】
ゲラチンコートした培養皿にマイトマイシン（ＭＭＣ）処理したＭＥＦ細胞を播種し、これをフィーダー細胞とした。この上にヒトｉＰＳ細胞を播種し、ｉＰＳ細胞培養用培地中３７℃５％ＣＯ２，２０％Ｏ２で維持した。【０１０２】
ＭＥＦフィーダー培地                                        
ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）                                【０１０３】
ｉＰＳ細胞培養用培地                                        
霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル）
Ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ（Ｗａｋｏ）（４ｎｇ／ｍｌ）            【０１０４】
２．分化誘導系（ＳＦＥＢ法）の準備
マウスｉＰＳ細胞での誘導条件をもとに、ヒトｉＰＳ細胞からＳＦＥＢ法による神経堤細胞への分化誘導を行った。すなわち、０．２５％トリプシン、０．１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ、１ｍＭＣａＣｌ２、２０％ＫＳＲを含んだＰＢＳを用いてヒトｉＰＳ細胞のコロニーを回収し、ピペッティングによって５から１０個の細胞塊とした。ゲラチンコートディッシュを用いてフィーダー細胞を除去した。このようにして用意したヒトｉＰＳ細胞塊を非接着性の培養皿上で２１日間浮遊培養を行った後、４日間接着培養を行った。浮遊培養は、下記分化誘導培地（分化誘導培地１あるいは２のいずれか）にＢＭＰ４，Ｗｎｔ，ＦＧＦを加えて調製した培地を用いて行った。接着培養はｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ，ｌａｍｉｎｉｎ，ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎをコーティングした培養皿を用いて、浮遊培養と同様の培地を用いて行った。概要を下記に示す。
【化１】
2010140698.tif 000002
【０１０５】
分化用培地１                                                            
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）            【０１０６】
分化用培地２                                                              
ＧＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）              【０１０７】
３．分化誘導細胞の検証
分化誘導後の細胞について、実施例１と同様にして、免疫染色法により神経堤細胞マーカーであるｐ７５とＳｏｘ−１０の発現をみた。また、フローサイトメトリーによりｐ７５陽性細胞率を解析した。【０１０８】
４．結果
免疫染色の結果、ヒトｉＰＳ細胞からＳＦＥＢ法により誘導された細胞について、ｐ７５／ｓｏｘ１０陽性細胞はｄａｙ２５で約３０％認められ、ｄａｙ２５以降は、減少する傾向がみられた（図４）。
フローサイトメトリーの結果、ヒトｉＰＳ細胞からＳＦＥＢ法により誘導された細胞のうち３９．６％が神経堤細胞マーカーであるｐ７５陽性であることが確認された（図５）。【０１０９】
５．考察
以上の結果から、ＳＦＥＢ法を利用した無血清培地でのフィーダー細胞を使わない培養により、ヒトｉＰＳ細胞から神経堤細胞を分化誘導できることが確認された。【０１１０】
実施例３：マウスｉＰＳ誘導神経堤細胞の機能解析（ニワトリ胚への導入）
ＳＦＥＢ法による分化誘導後、ＦＣＡＳにより分離したｐ７５陽性誘導神経堤細胞はスフェア形成能を有していた（図６ａ）。この細胞の遊走能を確認するためニワトリ胚（ＨＨ１３）へ移植実験を行った。【０１１１】
ＦＡＣＳによってソーティングした細胞を非接着性培養皿で下記培地を用いて浮遊培養を行い、ｎｅｕｒａｌ  ｃｒｅｓｔ  ｓｐｈｅｒｅを作成した。作成したｓｐｈｅｒｅをｎｅｕｒａｌ  ｃｒｅｓｔのｍｅｄｉａｌもしくはｌａｔｅｒａｌ  ｐａｔｈｗａｙ（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎのステージ分類による９及び１２−１３）へ移植して細胞のｍｉｇｒａｔｉｏｎ及び分化能について検討した。【０１１２】
Ｎｅｕｒａｌ  ｃｒｅｓｔ  ｓｐｈｅｒｅ用培地                          
ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）
Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）                【０１１３】
背側移植２４時間後に組織を固定し、ＤｉＩ陽性細胞（移植した神経堤細胞）及びＨＮＫ−１染色によるニワトリ神経堤細胞の局在を確認した（図６ｄ）。その結果、移植したｉＰＳ由来神経堤細胞は、神経堤細胞に特徴的な遊走能を有していることが示唆された。【０１１４】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明の方法は、異種フィーダー細胞や血清を用いることなく、多能性幹細胞から神経堤細胞群を分化誘導することができる。そのため、誘導された神経堤細胞群が外来の未知の病原体によって汚染される可能性がなく、臨床応用実現化のために理想的な方法である。
本発明の方法で得られる神経堤細胞群は多分化能を有しており、神経堤由来のさまざまな細胞にさらに分化誘導しうる。そのため、神経堤の誘導、形成、遊走の欠陥に起因する神経堤症等様々な疾患の再生医療に利用しうる。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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