(57)【要約】本発明により、鉄イオンに対して選択的にキレート可能な鉄キレート剤が提供される。本発明の鉄キレート剤は、下記式（１）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする。（式（１）中、環Ｚは、芳香族炭化水素環又は芳香族複素環を表す。Ｒ１は、アルキレン基を表す。Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して水素原子、炭化水素基又はキレート能を有する基を表し、Ｒ２及びＲ３で表される基の配位数の合計は１又は２である。）   ［化１］2010032489.tif 000021
2010032489.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄イオンに対してキレート能を有する鉄キレート剤であって、下記式（１）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする鉄キレート剤。
［化１］
2010032489.tif 000020
（式（１）中、環Ｚは、芳香族炭化水素環又は芳香族複素環を表す。Ｒ１は、アルキレン基を表す。Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して水素原子、炭化水素基又はキレート能を有する基を表し、Ｒ２及びＲ３で表される基の配位数の合計は１又は２である。）
【請求項２】
式（１）における環Ｚが、６員環の芳香族炭化水素環又は芳香族複素環であることを特徴とする請求項１記載の鉄キレート剤。
【請求項３】
式（１）における環Ｚが、ベンゼン環であることを特徴とする請求項２記載の鉄キレート剤。
【請求項４】
式（１）におけるＲ１が、メチレン基であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか1項に記載の鉄キレート剤。
【請求項５】
式（１）におけるＲ２のキレート能を有する基が、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カルバモイル基、アミノ基、グアニジノ基、アミジノ基、及び窒素原子含有複素環基から選ばれる１又は２の官能基を有する基であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか1項に記載の鉄キレート剤。
【請求項６】
式（１）におけるＲ２のキレート能を有する基が、カルボキシアルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルバモイルアルキル基、ピリジルアルキル基、ピラジニルアルキル基、ピリミジニルアルキル基、ピロリルアルキル基、イミダゾリルアルキル基、ベンゾイミダゾリルアルキル基、又はピラゾリルアルキル基であることを特徴とする請求項５記載の鉄キレート剤。
【請求項７】
式（１）におけるＲ３のキレート能を有する基が、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、（ｐ−ヒドロキシフェニル）メチル基、インドリルメチル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、カルボキシメチル基、２−カルボキシエチル基、４−アミノブチル基、（１Ｈ−イミダゾ−４−イル）メチル基、３−グアニジノプロピル基、メルカプトメチル基又は２−メチルチオエチル基であり、Ｒ３の炭化水素基が、メチル基、１−メチルエチル基、２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基又はフェニルメチル基であることを特徴とする請求項１〜６記載の鉄キレート剤。
【請求項８】
式（１）におけるＲ３が、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、（ｐ−ヒドロキシフェニル）メチル基、インドリルメチル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、カルボキシメチル基、２−カルボキシエチル基、４−アミノブチル基、（１Ｈ−イミダゾ−４−イル）メチル基、又は３−グアニジノプロピル基であり、かつ式（１）におけるＲ２が水素原子であることを特徴とする請求項７記載の鉄キレート剤。
【請求項９】
式（１）におけるＲ３が、メチル基、１−メチルエチル基、２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基又はフェニルメチル基であり、かつ式（１）におけるＲ２がキレート能を有する基であることを特徴とする請求項７記載の鉄キレート剤。
【請求項１０】
式（１）における環Ｚ及びＲ１〜Ｒ３が硫黄原子を含まないことを特徴とする請求項１〜９のいずれか1項に記載の鉄キレート剤。
【請求項１１】
４座又は５座配位子であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか1項に記載の鉄キレート剤。
【請求項１２】
生体不安定鉄に対するキレート能を有することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか1項に記載の鉄キレート剤。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか1項に記載の鉄キレート剤の製造方法であって、
ヒドロキシル基とホルミル基又はホルミルアルキル基とが隣接した炭素原子に結合した構造の芳香族化合物又は複素環化合物と、式（１）におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸又はその塩とを反応させる工程を具備することを特徴とする鉄キレート剤の製造方法。
【請求項１４】
式（１）におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸が、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グルタミン、アルパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン又はアルギニンであることを特徴とする請求項１３記載の鉄キレート剤の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の鉄キレート剤を用いて鉄イオンを定量することを特徴とする鉄イオンの定量方法。
【請求項１６】
吸光分析法により定量することを特徴とする請求項１５記載の鉄イオンの定量方法。
【請求項１７】
鉄イオンが生体不安定鉄である請求項１５又は１６記載の鉄イオンの定量方法。
【請求項１８】
定量に使用される試薬、器具及び／または溶媒の除鉄を行う過程を更に含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の鉄イオンの定量方法。
【請求項１９】
除鉄がキレート剤により行われることを特徴とする、請求項１８記載の鉄イオンの定量方法。
【請求項２０】
定量の対象となる試料から２つの部分を分取し、一方を全鉄濃度測定用試料とし、他方を定量の対象となる試料以外の鉄濃度の測定用試料としてそれぞれ鉄濃度を求め、全鉄濃度より定量の対象となる試料以外の鉄濃度を差し引くことで真の鉄濃度を求めることを特徴とする、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の鉄イオンの定量方法。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の鉄キレート剤を用いて鉄イオンを捕捉することを特徴とする鉄イオンの捕捉方法。
【請求項２２】
鉄イオンが生体不安定鉄である請求項２１記載の鉄イオンの捕捉方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鉄キレート剤、例えば、生体不安定鉄に対してキレート可能な鉄キレート剤、並びに鉄イオンの定量方法、鉄イオンの捕捉方法に関する。
本願は、２００８年９月２２日に、日本に出願された特願２００８−２４３０９５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
近年、慢性腎臓病（Chronic Kidney Disease:ＣＫＤ）という新しい病気の概念が指摘され、世界中で注目されている。この慢性腎臓病の治療は、アンジオテンシンＩＩ抑制剤の使用、低蛋白質米による食事管理、各種危険因子の管理などで行われるが、年間４万人にも及ぶ透析導入、心血管障害合併による死亡につながり、新しい治療法が求められている。慢性腎臓病の治療法として、慢性腎臓病の原因の最上流にある生体不安定鉄（ＮＴＢＩ；non-transferrin-bound iron）、カルボニル化合物を除去する治療法が有効である。【０００３】
生体内の鉄（特に、生体不安定鉄（ＮＴＢＩ））を体外に除去する治療法として、（１）瀉血療法、（２）鉄制限食法、（３）鉄キレート剤による薬物療法、（４）体外血液循環浄化療法などがある。瀉血療法は、患者のＱＯＬ（生活の質；Quality of Life）がよいが、貧血や低たんぱく血症などの副作用があり、貧血の無い患者に対してのみ適応可能である。鉄制限食法は、栄養のアンバランスなどの副作用があり、一部の肝疾患のみ適応可能である。鉄キレート剤による薬物療法は、鉄キレート剤の効果は顕著であり、輸血後鉄過剰症の患者に対して主に利用されているが、軽度の鉄過剰または鉄代謝異常による一部臓器での鉄関連障害では、オーバーキレートによる副作用の頻度が高いと言われている。また、体外血液循環浄化療法は、血液の体外循環により鉄（鉄イオンなど）を除去する方法であり、生体に毒性のある不安定鉄を、オーバーキレートによる臓器毒性を生じることなく施行可能であるという特性を有している。【０００４】
そのため、体外血液循環浄化療法により、生体不安定鉄を除去する方法が検討されており、生体不安定鉄を特異的に且つ有効に吸着するリガンド（鉄キレート剤）の開発が求められている。特に、生体に有用なトランスフェリン結合型鉄に対してキレート能を有しておらず（すなわち、トランスフェリン結合型鉄は捕捉せず）、生体不安定鉄のみを捕捉できる鉄キレート剤の開発が求められている。【０００５】
なお、慢性腎臓病では、ステージ４の段階にはいると荒廃したネフロンの増加により、残存ネフロンに負荷がかかり更に荒廃し、悪循環に陥り、透析導入が確実となる。一方、ステージ３の段階では、心血管系病変のリスクが飛躍的に増加する。透析治療は、週３回必要であり、しかも透析に要する時間は４時間にもなり、患者のＱＯＬを損なうとともに、労働の機会を損失させている。そのため、ステージ３の段階で治療を行い、透析導入、心血管疾患合併を防ぐことができれば、多大な医療費（日本の透析医療費は１．２兆円超と言われている。）の削減にもつながる。
他方、鉄イオンをキレート可能な鉄キレート剤が種々提案されている（例えば、特許文献１〜８参照）。【０００６】
また、生体不安定鉄、特に非トランスフェリン結合鉄の高速液体クロマトグラフィ（Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｌｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いた定量方法において、健常人血中のＮＴＢＩ値がマイナス表記されることが多く、信頼性に欠けるという問題があった。そこで、このＨＰＬＣを用いたＮＴＢＩ測定システムの問題点を明らかにし改善することで、安定かつ高感度なＮＴＢＩ測定系を構築することが可能であり、その結果、健常人血中ＮＴＢＩ値を正確に求めることができるものと考えられた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００７−５３２５０９号公報
【特許文献２】特表２００６−５０４７４８号公報
【特許文献３】特表２００５−５０９６４９号公報
【特許文献４】特表２０００−５０７６０１号公報
【特許文献５】特表２００８−５２０６６９号公報
【特許文献６】特表２００２−５０２８１６号公報
【特許文献７】特表２０００−５０６５４６号公報
【特許文献８】特開２００４−２０３８２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、鉄イオン、特に生体不安定鉄に対して選択的にキレート可能な鉄キレート剤、及びその製造方法を提供することにある。また、本発明の他の目的は、本発明の鉄キレート剤を用いた鉄イオンの定量方法、及び本発明の鉄キレート剤を用いた鉄イオンの捕捉方法を提供することにある。更に、本発明の目的は、安定かつ高感度なＮＴＢＩ測定系を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意検討した結果、特定のアミノ酸が導入された構造のフェノール系キレート剤は、鉄イオンに対して選択的にキレート可能であることを見い出すと共に、生体不安定鉄などの鉄イオンを有効に定量・捕捉することができること、及びキレート剤やイオン交換樹脂などを用いて試料の前処理などに使用される試薬や溶媒の除鉄を行うか、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄを除くＳｕｂｓｔｒａｃｔｉｏｎ法を採用することで、安定かつ高感度ＮＴＢＩ測定系を提供することができることを見い出し、本発明を完成させるに至った。【００１０】
すなわち、本発明は、
［１］  鉄イオンに対してキレート能を有する鉄キレート剤であって、下記式（１）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする鉄キレート剤【００１１】
【化１】
2010032489.tif 000003
【００１２】
（式（１）中、環Ｚは、芳香族炭化水素環又は芳香族複素環を表す。Ｒ１は、アルキレン基を表す。Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して水素原子、炭化水素基又はキレート能を有する基を表し、Ｒ２及びＲ３で表される基の配位数の合計は１又は２である。）や、
［２］式（１）における環Ｚが、６員環の芳香族炭化水素環又は芳香族複素環であることを特徴とする上記［１］記載の鉄キレート剤や、
［３］式（１）における環Ｚが、ベンゼン環であることを特徴とする上記［２］記載の鉄キレート剤や、
［４］式（１）におけるＲ１が、メチレン基であることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれかに記載の鉄キレート剤や、
［５］式（１）におけるＲ２のキレート能を有する基が、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カルバモイル基、アミノ基、グアニジノ基、アミジノ基、及び窒素原子含有複素環基から選ばれる１又は２の官能基を有する基であることを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれかに記載の鉄キレート剤や、
［６］式（１）におけるＲ２のキレート能を有する基が、カルボキシアルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルバモイルアルキル基、ピリジルアルキル基、ピラジニルアルキル基、ピリミジニルアルキル基、ピロリルアルキル基、イミダゾリルアルキル基、ベンゾイミダゾリルアルキル基、又はピラゾリルアルキル基であることを特徴とする上記［５］記載の鉄キレート剤や、
［７］式（１）におけるＲ３のキレート能を有する基が、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、（ｐ−ヒドロキシフェニル）メチル基、インドリルメチル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、カルボキシメチル基、２−カルボキシエチル基、４−アミノブチル基、（１Ｈ−イミダゾ−４−イル）メチル基、３−グアニジノプロピル基、メルカプトメチル基又は２−メチルチオエチル基であり、Ｒ３の炭化水素基が、メチル基、１−メチルエチル基、２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基又はフェニルメチル基であることを特徴とする上記［１］〜［６］記載の鉄キレート剤や、
［８］式（１）におけるＲ３が、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、（ｐ−ヒドロキシフェニル）メチル基、インドリルメチル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、カルボキシメチル基、２−カルボキシエチル基、４−アミノブチル基、（１Ｈ−イミダゾ−４−イル）メチル基、又は３−グアニジノプロピル基であり、かつ式（１）におけるＲ２が水素原子であることを特徴とする上記［７］記載の鉄キレート剤や、
［９］式（１）におけるＲ３が、メチル基、１−メチルエチル基、２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基又はフェニルメチル基であり、かつ式（１）におけるＲ２がキレート能を有する基であることを特徴とする上記［７］記載の鉄キレート剤や、
［１０］式（１）における環Ｚ及びＲ１〜Ｒ３が硫黄原子を含まないことを特徴とする上記［１］〜［９］のいずれかに記載の鉄キレート剤や、
［１１］４座又は５座配位子であることを特徴とする上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の鉄キレート剤や、
［１２］生体不安定鉄に対するキレート能を有することを特徴とする上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の鉄キレート剤や、
［１３］上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の鉄キレート剤の製造方法であって、ヒドロキシル基とホルミル基又はホルミルアルキル基とが隣接した炭素原子に結合した構造の芳香族化合物又は複素環化合物と、式（１）におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸又はその塩とを反応させる工程を具備することを特徴とする鉄キレート剤の製造方法や、
［１４］式（１）におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸が、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グルタミン、アルパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン又はアルギニンであることを特徴とする上記［１３］記載の鉄キレート剤の製造方法や、
［１５］上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の鉄キレート剤を用いて鉄イオンを定量することを特徴とする鉄イオンの定量方法や、
［１６］吸光分析法により定量することを特徴とする上記［１５］記載の鉄イオンの定量方法や、
［１７］鉄イオンが生体不安定鉄である上記［１５］又は［１６］記載の鉄イオンの定量方法や、
［１８］定量に使用される試薬、器具及び／または溶媒の除鉄を行う過程を更に含む、［１５］〜［１７］のいずれか１項に記載の鉄イオンの定量方法や、
［１９］除鉄がキレート剤により行われることを特徴とする、［１８］記載の鉄イオンの定量方法や、
［２０］定量の対象となる試料から２つの部分を分取し、一方を全鉄濃度測定用試料とし、他方を定量の対象となる試料以外の鉄濃度の測定用試料としてそれぞれ鉄濃度を求め、全鉄濃度より定量の対象となる試料以外の鉄濃度を差し引くことで真の鉄濃度を求めることを特徴とする、［１５］〜［１９］のいずれかに記載の鉄イオンの定量方法や、
［２１］上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の鉄キレート剤を用いて鉄イオンを捕捉することを特徴とする鉄イオンの捕捉方法や、
［２２］鉄イオンが生体不安定鉄である上記［２１］記載の鉄イオンの捕捉方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の鉄キレート剤は、鉄イオンに対して選択的にキレートが可能であり、特に生体不安定鉄に対して有効に作用する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の鉄濃度測定用試料の前処置方法を示した説明図である。
【図２】従来の鉄濃度の測定方法を示した説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［鉄キレート剤］
本発明の鉄キレート剤は、前記式（１）で表される化合物である。前記式（１）で表される化合物は、環Ｚの隣接する炭素原子に、ヒドロキシル基（−ＯＨ基）と、アミノ酸残基−アルキレン基（−Ｒ１−ＮＲ２−ＣＨＲ３−ＣＯＯＨ基）が結合している。すなわち、本発明の鉄キレート剤は、ヒドロキシル基と、アミノ酸残基−アルキレン基とがオルト位の位置関係で環Ｚの炭素原子に結合した構造（三脚型）を有している。
例えば特許文献１等にも記載されるキレート剤においても、フェノールのヒドロキシル基とオルトの位置に所定の構造を有している点で三脚型構造をとっているのに対し、本願発明者が種々検討した結果、本願発明に係るキレート剤においては、当該ヒドロキシル基とオルトの位置に上記所定のアミノ酸残基−アルキレン基を含む置換基を結合させたことにより、トランスフェリン結合型鉄を捕捉せず、生体不安定鉄のみを選択的に捕捉できるキレート剤とできることを見出したものである。
本願発明に係るキレート剤においては、フェノール系キレート剤のヒドロキシル基とオルトの位置に設けられる置換基が、（−Ｒ１−ＮＲ２−ＣＨＲ３−ＣＯＯＨ）の構造を有すると共に、当該置換基内に鉄イオンと配位可能な配位原子の数が３〜４であることが特徴である。これは、本願発明者がフェノール系キレート剤において、生体不安定鉄を選択的に捕捉可能であるものを探索した結果として見出したものであって、ヒドロキシル基とオルトの位置に設けられる置換基内の配位数を３〜４とすることで、同様に鉄イオンが配位可能なヒドロキシル基と相まって、生体不安定鉄を捕捉する際の選択性を高めることが可能である。つまり、本発明の鉄キレート剤は、合計の配位数が４である４座配位子、又は配位数が５である５座配位子である。
上記置換基においては、アミノ酸残基のＮと、カルボキシル基中のＯが鉄イオンの配位原子となり、その他の１〜２箇所の配位原子を上記置換基内のＲ２とＲ３で示される基の中に適宜設けることで、生体不安定鉄を選択的に捕捉するキレート剤とすることができる。
Ｒ２とＲ３で示される基は、上記のとおり、合計の配位数が１〜２となる組み合わせであれば、適宜、水素原子、炭化水素、キレート能を有する基の中から選択して用いることができる。
上記Ｒ２を含む基としてＮを含むアミノ酸残基を用いることで、当該Ｎが鉄イオンに対して好適な配位原子となる点で好ましい。また、当該アミノ酸残基として、生体のタンパク質を構成するアミノ酸に対応するものを選択することで、人体に適用された場合に示す毒性を非常に低く抑えることが可能となり、人体に対する安全性が極めて高いキレート剤とすることができる。
また、Ｒ１で示される基は、鉄イオンに関する配位原子を有さないアルキレン基が好ましく用いられる。このとき、アルキレン基としては炭素数が１〜１０程度のものであれば、生体不安定鉄を選択的にキレートすることが可能である。Ｒ１で示されるアルキレン基の大きさは、特にＲ１に連なるアミノ酸残基の窒素が鉄イオンに対して示す配位力の強弱に影響することが本発明者の検討により明らかになっており、特に生体不安定鉄の選択性を向上させるためには炭素数が１〜４程度が好ましく、特にメチレン基を用いることで、生体不安定鉄の選択性を向上することができる。
以上のように構成される本発明のキレート剤によれば、生体不安定鉄の捕捉のために適切な数の配位原子がキレート剤中の適切な位置に配置されることで、生体不安定鉄を選択的に捕捉可能であると共に、当該キレート剤が鉄イオンを包み込むように配位するために、安定した錯体を形成して鉄イオンが再び解離されることを防止することができる。
上記置換基が結合するフェノール系キレート剤においては、置換基とヒドロキシル基を適切な位置に保持可能なものであれば、前記式（１）においてフェノール部を成す環Ｚは芳香族炭化水素環又は芳香族複素環のいずれでもよいが、芳香族炭化水素環がより好適である。
【００１６】
環Ｚは、５員以上の環であることが好ましく、５〜８員環であることがより好ましく、６員環が特に好ましい。すなわち、環Ｚとしては、６員環の芳香族炭化水素環（ベンゼン環）が最適である。また、環Ｚの芳香族複素環としては、環を構成する原子（環構成原子）として、炭素原子、窒素原子、酸素原子から選択された少なくとも２種の原子を含むものが好ましく、炭素原子及び窒素原子のみを含むものが特に好ましい。環構成原子として炭素原子及び窒素原子のみを含む芳香族複素環としては、例えば、ピリジン環、ピリダジン環、ピリミジン環、ピラジン環等の６員環の芳香族複素環などを例示することができる。
【００１７】
環Ｚの芳香族炭化水素環及び芳香族複素環は置換基を有していてもよい。すなわち、ヒドロキシル基やアミノ酸残基−アルキレン基が結合している炭素原子以外の環構成原子に、置換基が結合していてもよい。置換基としては、置換基同士が互いに結合して環［芳香族環（芳香族炭化水素環や芳香族複素環など）、非芳香族性環（非芳香族炭化水素環や非芳香族複素環など）など］を形成していてもよい。このような置換基としては、ヒドロキシル基やアミノ酸残基−アルキレン基によるキレート能を阻害しない基であれば特に制限されるものではなく、例えば、環Ｚがベンゼン環の場合、５−Ｃｌ，３−ＯＨなどの置換基を好適に例示することができる。また、置換基は、キレート能を有していない基が好適であり、具体的にアルキル基等の炭化水素基を例示することができる。
【００１８】
Ｒ１のアルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、プロピレン基、テトラメチレン基などの炭素数１〜１０のアルキレン基を例示することができ、炭素数１〜４のアルキレン基が好適である。具体的には、メチレン基又はエチレン基が好ましく、メチレン基が特に好ましい。
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して水素原子、炭化水素基又はキレート能を有する基を表す。
【００１９】
Ｒ２及びＲ３の炭化水素基は、キレート能を有しない基であり、例えば、アルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基を例示することができる。アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基などの直鎖状・分岐鎖状のアルキル基を例示することができる。アリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基を例示することができる。アラルキル基としては、例えば、フェニルメチル基を例示することができる。シクロアルキル基としては、例えば、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基を例示することができる。
【００２０】
Ｒ３の炭化水素基としては、生体のタンパク質を構成するアミノ酸に対応する、メチル基（「−ＣＨ３」）、１−メチルエチル基（「−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３」）、２−メチルプロピル基（「−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３」）、１−メチルプロピル基（「−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３」）又はフェニルメチル基（「下記式（２ａ）で表される基」）であることが好適である。
【００２１】
Ｒ２のキレート能を有する基としては、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、アミノ基、グアニジノ基、アミジノ基、窒素原子含有複素環基等の官能基を有する基を例示することができ、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、及び窒素原子含有複素環基から選ばれる１又は２の官能基を有する基であることが好ましく、ヒドロキシ基、カルボキシ基、カルバモイル基、及び窒素原子含有複素環基から選ばれる１又は２の官能基を有するアルキル基であることがより好ましい。アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基などの直鎖状・分岐鎖状のアルキル基を例示することができる。具体的には、例えば、カルボキシアルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルバモイルアルキル基、ピリジルアルキル基、ピラジニルアルキル基、ピリミジニルアルキル基、ピロリルアルキル基、イミダゾリルアルキル基、ベンゾイミダゾリルアルキル基、ピラゾリルアルキル基を例示することができる。窒素原子含有複素環としては、例えば、ピリジン環、ピリダジン環、ピリミジン環、ピラジン環、ピロール環、イミダゾール環、ベンゾイミダゾール環、ピラゾール環、フラン環、オキサゾール環、イソオキサゾール環等の芳香族複素環などを例示することができる。
【００２２】
Ｒ３のキレート能を有する基としては、上記Ｒ２のキレート能を有する基と同様の基であってもよいが、生体のタンパク質を構成するアミノ酸に対応する、ヒドロキシメチル基（「−ＣＨ２ＯＨ）」）、１−ヒドロキシエチル基（「−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３）」）、（ｐ−ヒドロキシフェニル）メチル基（「下記式（２ｂ）で表される基」）、インドリルメチル基（「下記式（２ｃ）で表される基」）、カルバモイルメチル基（「−ＣＨ２ＣＯＮＨ２」）、２−カルバモイルエチル基（「−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２」）、カルボキシメチル基（「−ＣＨ２ＣＯＯＨ」）、２−カルボキシエチル基（「−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ」）、４−アミノブチル基（「−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２」）、（１Ｈ−イミダゾ−４−イル）メチル基（「下記式（２ｄ）で表される基」）、又は３−グアニジノプロピル基（「−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２」）、メルカプトメチル基（「−ＣＨ２ＳＨ」）又は２−メチルチオエチル基（「−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３」）であることが好適である。これにより、本発明の鉄キレート剤は、人体に対して無害なアミノ酸が導入された構造となり、人体に対する安全性が極めて高い。
【００２３】
【化２】
2010032489.tif 000004
【００２４】
本発明においては、Ｒ２及びＲ３で表される基の配位数（実際に鉄イオンに配位する配位数）の合計が１又は２であることが重要である。すなわち、Ｒ３を基準として説明すると、Ｒ３がキレート能を有しない基（水素原子又は炭化水素基）であるときには、Ｒ２は配位数が１又は２のキレート能を有する基である。Ｒ３が配位数が１のキレート能を有する基であるときには、Ｒ２はキレート能を有しない基であるか配位数が１のキレート能を有する基である。Ｒ３が配位数が２のキレート能を有する基であるときには、Ｒ２はキレート能を有しない基である。例えば、生体のタンパク質を構成するアミノ酸を原料として用いる場合、Ｒ３に相当する基がキレート能を有しているときには、Ｒ２は水素原子のまま他の基を導入する必要はなく、Ｒ３がキレート能を有しない基であるときには、Ｒ２としてキレート能を有する基を導入することが必要となる。
【００２５】
具体的には、Ｒ３が、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、（ｐ−ヒドロキシフェニル）メチル基、インドリルメチル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、カルボキシメチル基、２−カルボキシエチル基、４−アミノブチル基、（１Ｈ−イミダゾ−４−イル）メチル基、３−グアニジノプロピル基等のキレート能を有している基である場合、Ｒ２はキレート能を有しない水素原子又は炭化水素基であり、水素原子であることが好適である。
【００２６】
また、Ｒ３が、水素原子、メチル基、１−メチルエチル基、２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基、フェニルメチル基等のキレート能を有しない基である場合、Ｒ２はキレート能を有する基であり、具体的には、カルボキシアルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルバモイルアルキル基、ピリジルアルキル基、ピラジニルアルキル基、ピリミジニルアルキル基、ピロリルアルキル基、イミダゾリルアルキル基、ベンゾイミダゾリルアルキル基、ピラゾリルアルキル基などの配位数（実際に配位する配位数）が１のキレート基であることが好適である。
【００２７】
本発明の鉄キレート剤においては、環Ｚ及びＲ１〜Ｒ３が硫黄原子を含まないことが好ましい。キレート剤に含まれる硫黄原子は、鉄イオン以外にも金属イオンに対する親和性が高いため、硫黄原子がキレート剤の一部に含まれることで、特に生体不安定鉄に対する選択性が低下するおそれを生じるためである。
【００２８】
本発明の鉄キレート剤は、式（１）で表される化合物又はその塩であり、塩の形態としては、例えば、前記式（１）で表される化合物のナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩や、アンモニウム塩などである。また、本発明の鉄キレート剤が塩の形態を有している場合、通常、フェノール性ヒドロキシル基が塩の形態になっているが、他の部位が塩の形態になっていてもよい。
【００２９】
また、本発明の鉄キレート剤は、水和物や溶媒和物の形態であってもよい。さらに、本発明の鉄キレート剤は、光学異性体などの立体異性体が存在する場合がある。鉄キレート剤に立体異性体が存在する場合、鉄キレート剤としては、いずれの立体異性体であってもよく、任意の立体異性体の混合物やラセミ体であってもよい。
【００３０】
本発明の鉄キレート剤は、使用までの間、ヒドロキシル基やカルボキシル基等の各種官能基が、保護基により保護されていてもよい。しかし、このような保護基は、鉄キレート剤を使用する際には、取り除き、遊離のヒドロキシル基やカルボキシル基等の各種官能基に戻すことが重要である。
【００３１】
本発明の鉄キレート剤は、配位数が４である４座配位子又は配位数が５である５座配位子である。また、本発明の鉄キレート剤は、環Ｚにおいて、隣接する炭素原子に、それぞれ、ヒドロキシル基と、アミノ酸残基−アルキレン基とが結合した構造である。すなわち、環Ｚの炭素原子に結合しているヒドロキシル基に対してオルト位に、アミノ酸残基−アルキレン基が結合した構造（「三脚型」）を有している。
【００３２】
本発明の鉄キレート剤は、鉄キレート剤が４座又は５座配位子であり且つ三脚型であるため、１つの鉄イオンに対して、１つの鉄キレート剤が配位することができる。すなわち、本発明の鉄キレート剤は、鉄イオン１つに鉄キレート剤が１つ配位した形態の単核配位（錯体）の形態で、鉄イオンに対して配位することができる。このため、本発明の鉄キレート剤が鉄イオンに配位した錯体は、鉄イオンが内部に取り込まれ、容易に解離されない（移動できない）。したがって、人体に適用する場合、人体（特に腎臓）に対する毒性は非常に低く、人体に対する安全性が極めて高い。また、本発明の鉄キレート剤は、セリン、ヒスチジン、グルタミンなどの生体のタンパク質を構成するアミノ酸の残基によりその一部を構成することができ、人体に対する毒性が非常に低く、人体に対する安全性が極めて高い。
【００３３】
なお、本発明の鉄キレートによりキレート可能な鉄イオンとしては、どのような鉄イオンであってもよく、また、鉄イオンの価数としては、２価、３価のいずれであってもよいが、好ましくは３価である。さらに、鉄イオンは、生体不安定鉄であってもよく、該生体不安定鉄は３価の鉄イオンである。
【００３４】
本発明において、生体不安定鉄とは、トランスフェリンと結合しておらず、かつ人体にとって有害な作用を及ぼす可能性のある鉄イオンのことを意味する。したがって、生体不安定鉄には、例えば、トランスフェリンと結合している鉄（トランスフェリン鉄錯体中の鉄イオン；トランスフェリン結合型鉄）、フェリチンとして肝臓・脾臓・骨髄に存在する貯蔵鉄、赤血球に含まれるヘム（鉄を持つポルフィリン錯化合物）４分子とグロビン（４本のポリペプチド鎖）１分子からなるヘモグロビン、筋肉中にあって酸素分子を代謝に必要な時まで貯蔵する色素タンパク質で１個のヘムを含むミオグロビンなどは含まれない。このような生体不安定鉄である鉄イオンは、通常、生体中では、完全な遊離の状態ではなく、陰イオンと対になった形態を有していると思われる。このような陰イオンとしては、例えば、ヒドロキシイオン（ＯＨ−）などを例示することができる。すなわち、生体不安定鉄は、例えば、Ｆｅ３＋・３（ＯＨ−）、a hydroxy-citrate- (Ｃｉｔ)complex（ＦｅＣｉｔＯＨ−）、などの形態で生体中に存在していると考えられる。
【００３５】
本発明の鉄キレート剤は、上記のように医療用途として使用することができる。例えば、人体に投与する場合、経口的又は非経口的に投与することができる。非経口投与としては、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下に注射投与することを例示することができる。また、医療用途の他、工業用途として使用することも可能である。
【００３６】
［鉄キレート剤の製造方法］
本発明の鉄キレート剤の製造方法としては、上記式（１）で表される本発明の鉄キレート剤を製造することが可能な方法であればいずれの製造方法でも採用することができる。例えば、ヒドロキシル基とホルミル基又はホルミルアルキル基とが隣接した炭素原子に結合した構成を有している芳香族炭化水素環化合物又は芳香族複素環化合物と、式（１）におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸又はその塩とを反応させる工程を具備する製造方法が好適である。このような製造方法によれば、効率よく、温和な条件下で、かつ低コストで本発明の鉄キレート剤を製造することができる。
【００３７】
式（１）において、環Ｚがベンゼン環であり、Ｒ１がメチレン基である鉄キレート剤を製造する場合、基質（ヒドロキシル基とホルミル基又はホルミルアルキル基とが隣接した炭素原子に結合した構造の芳香族炭化水素環化合物又は芳香族複素環化合物）としては、サリチルアルデヒドを用いることができる。
【００３８】
また、式（１）におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸としては、例えば、生体のタンパク質を構成するアミノ酸である、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、アラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）、バリン（Ｖａｌｉｎｅ）、ロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、セリン（Ｓｅｒｉｎｅ）、スレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、チロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、トリプトファン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、アスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、リジン（Ｌｙｓｉｎｅ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、システイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）などを用いることができ、これらの中でも、Ｒ３に相当する位置にキレート能を有する基を備えている、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グルタミン、アルパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、アルギニン、システイン、メチオニンを好適に用いることができ、特に、硫黄原子を含まない、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グルタミン、アルパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、アルギニンを好適に用いることができる。すなわち、キレート能を有する基を備えているこれらのアミノ酸を用いることにより、別途キレート能を有する基を導入する必要がなく、極めて簡便に本発明の鉄キレート剤を製造することができる。また、このような生体のタンパク質を構成するアミノ酸を用いて製造した鉄キレート剤は人体に対する安全性が極めて高い。なお、これらのアミノ酸のＲ３に相当する基の官能基を追加・削除する等適宜置換して用いてもよい。
【００３９】
具体的には、例えば、前記式（１）において、環Ｚがベンゼン環であり、Ｒ１がメチレン基であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３がヒドロキシメチル基（アミノ酸残基がセリンの残基となる）を製造する場合、サリチルアルデヒドと、セリン又はその塩とを反応させる工程を具備する製造方法により、鉄キレート剤を製造することができる。
【００４０】
より具体的には、例えば、ビーカーに水酸化ナトリウム水溶液（２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液）を入れ、その中に、Ｄ，Ｌ−セリン（粉末状）を、攪拌下、室温（１０〜３０℃程度）で、少しずつ粉末状態のまま入れて約３０分間攪拌することにより、セリンを水酸化ナトリウム水溶液に溶解させた後、エバポレータを用いて、４０〜５０℃の温度で、水を除去させる。その後、白く残った残渣を、ビーカーを用いて、攪拌下、室温（１０〜３０℃程度）で、メタノール中に入れて、３０分間攪拌することにより、溶解させ、この溶液に、攪拌下、室温（１０〜３０℃程度）で、Ｄ，Ｌ−セリンと同モル数のサリチルアルデヒドを直接加える。この際、溶液は直ちに黄色になる。その後、一度メタノールを、エバポレータを用いて、３０〜４０℃の温度で完全に除去させ、残った黄色の固体を、ビーカーを用いて、攪拌下、室温（１０〜３０℃程度）で、メタノールに溶解させる。このメタノール溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を固体のまま、攪拌下、室温（１０〜３０℃程度）で、少しずつ、加える。この際、溶液が白くなってくる。黄色の成分が全部消えた時点で（約６０分）、水素化ホウ素ナトリウムの添加を止め、室温（１０〜３０℃程度）で攪拌を１時間行った後、室温（１０〜３０℃程度）で、少量の水を加え、その後、不溶のものを自然濾過により濾過して除去する。その後、濾液から溶媒を、エバポレータを用いて、４０〜５０℃の温度で、除去し、残った白い残渣を、ビーカーを用いて、攪拌下、室温（１０〜３０℃程度）で、少しずつ水に添加して、水に溶解させた後、この水溶液に、塩酸水溶液（２Ｎの塩酸水溶液）を攪拌下、室温（１０〜３０℃程度）で徐々に添加する。この際、溶液のｐＨが低くなるにつれ、白い結晶が析出する（なお、この際、ｐＨは１以下には下げないようにする）。その後、室温（１０〜３０℃程度）で、１日放置（静置）させた後、結晶を吸引濾過し、メタノールで洗浄させた後、デシケータを利用して、２４時間かけて乾燥させることにより、前記式（１）において、環Ｚがベンゼン環であり、Ｒ１がメチレン基であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３がヒドロキシメチル基である本発明の鉄キレート剤を得ることができる。他の鉄キレート剤に関しては、この具体的な製造方法に準じて製造することができる。
【００４１】
このように、ヒドロキシル基とホルミル基又はホルミルアルキル基とが隣接した炭素原子に結合した構造の芳香族炭化水素環化合物又は芳香族複素環化合物と、式（１）におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸又はその塩との反応は、室温（１０〜３０℃程度）で行うことができ、非常に温和な条件下で反応を行うことができる。また、各ステップでの反応時間も、通常、１時間以内であり、迅速に反応を行うことができる。さらに、空気環境下で反応を進行させることができ、不活性ガス（窒素ガスなど）による置換等は必要でない。さらにまた、溶媒も、水系溶媒や親水性有機溶媒などを用いることができ、しかも、親水性有機溶媒として用いられるメタノール等は回収により再利用することができ、環境の面でも良好であると言える。さらに、原材料などは、比較的安価なものを用いることができ、コスト面からも有利であると言える。また、このような製造方法によれば、鉄キレート剤は、収率５０％以上で得ることができ、純度もほぼ１００％の鉄キレート剤を得ることができる。
【００４２】
なお、Ｒ２への所望の基の導入は、環Ｚ側の基質と反応させる前又は後に行うことができ、合成上、環Ｚ側の基質と反応させた後に行うことが好ましい。すなわち、下記の工程Ａ及び工程Ｂを具備する製造方法を採用することができる。
【００４３】
工程Ａ：ヒドロキシル基とホルミル基又はホルミルアルキル基とが隣接した炭素原子に結合した構造の芳香族炭化水素環化合物又は芳香族複素環化合物と、式（１）におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸又はその塩とを反応させる工程
工程Ｂ：工程Ａにより得られたキレート剤に、Ｒ２に対応する化合物を反応させる工程
【００４４】
［鉄イオンの定量方法］
本発明の鉄イオンの定量方法は、上記本発明の鉄キレート剤を用いて鉄イオンを定量することを特徴とする。本発明の定量方法は、鉄イオンとしての生体不安定鉄であっても、有効に定量することができる。したがって、例えば、生体から採取した血液の生体不安定鉄を定量し、生体の鉄過剰状態などを評価することができる。
【００４５】
本発明の鉄キレート剤が鉄イオンに配位した錯体（鉄錯体又は鉄キレート体）は、鉄イオンや鉄キレート剤の吸光波長とは異なる特徴的な吸収波長（吸光波長）を有している。したがって、鉄錯体の光の吸収波長に応じた所望の波長の光（例えば、波長４６６ｎｍの光（紫外線））を利用して吸光分析を行うことができる。しかも、鉄錯体の吸光度は、鉄錯体の濃度に依存し、鉄錯体の濃度増加に比例して強度が増加するので、鉄イオンの定量を吸光分析法（吸光光度分析法）を利用して行うことができる。
【００４６】
具体的には、本発明の鉄イオンの定量方法は、例えば、鉄イオンを含む溶液に、本発明の鉄キレート剤の溶液を添加し、反応（キレート化反応）終了後、分光光度計を用いて、特定の波長の光（例えば、波長４６６ｎｍの光）を照射し、照射した光が試料（すなわち、鉄錯体を含む溶液）を通過した際に吸光される量を測定することにより、鉄錯体の量（すなわち、鉄イオンの量）を定量することができる。なお、鉄イオンの定量に際しては、予め、鉄錯体の吸光度と鉄錯体の濃度との関係を把握し、検量線データなどを得ておく。
【００４７】
鉄イオンの定量に際して用いられる鉄イオンを含む溶液や鉄キレート剤の溶液の溶媒としては、ダルベッコ−リン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）、純水（例えば、ミリポア（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）社製の超純水製造装置「ミリＱ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）」により作製された純水など；いわゆる「ミリＱ水」）などを用いることができる。溶媒は１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４８】
なお、鉄イオンの定量に際しては、鉄キレート剤を鉄イオンのモル数よりも過剰に添加して、すべての鉄イオンを確実にキレート化させることが鉄イオンを正確に定量する上で重要である。
【００４９】
なお、本発明の鉄イオンの定量方法は、医療用途、工業用途として使用することができる。
【００５０】
［鉄イオンの捕捉方法］
本発明の鉄イオンの捕捉方法としては、上記本発明の鉄キレート剤を用いて鉄イオンを捕捉することを特徴とする。本発明の鉄キレート剤は、鉄イオン（特に３価の鉄イオン）に対するキレート能が非常に高く、鉄イオンを選択的に捕捉し、系内の鉄イオンの量を効果的に低減させることができる。また、鉄イオンとしての生体不安定鉄も有効に捕捉することができるため、生体内の過剰鉄である生体不安定鉄を有効に捕捉し、過剰鉄による生体への悪影響を低減させることができる。なお、生体内の過剰鉄を捕捉させた後、生体外に除去させることも可能である。
【００５１】
具体的に鉄イオンを捕捉する方法は、例えば、鉄イオン含有物に、本発明の鉄キレート剤（又は含有物）を導入する方法、本発明の鉄キレート剤（又は含有物）に、鉄イオン含有物を導入する方法のいずれであってもよい。なお、鉄イオン含有物としては、例えば、鉄イオンを含む液状物を挙げることができ、水性液状物が好適である。また、鉄キレート剤含有物としては、特に制限されず、使用する形態に応じて適宜設定することができ、例えば、鉄キレート剤が溶解又は分散した液状物、鉄キレート剤が混合された水溶性又は水分解性の固状物、鉄キレート剤を内部に含む水溶性又は水分解性のカプセル状物、鉄キレート剤が固定された固状物（フィルター等）などを例示することができる。
【００５２】
本発明の鉄イオンの捕捉方法では、鉄イオンを本発明の鉄キレート剤で直接に捕捉させることが最適であるが、鉄イオンを、一旦、ニトリロトリ酢酸（ニトリロ三酢酸；ＮＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−トリ酢酸（ＨＥＤＴＡ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などの他のキレート剤により錯体化（キレート化）させた後、該錯体中（キレート体中）の鉄イオンを本発明の鉄キレート剤により奪取させることにより、鉄イオンを捕捉することも可能である。
【００５３】
なお、本発明の鉄キレート剤は、トランスフェリンに結合している鉄（トランスフェリン結合型鉄）に対してキレート能が低く、トランスフェリン結合型鉄から殆ど又は全く鉄イオンを奪取（置換）しない。このため、本発明では、生体中の過剰鉄を捕捉させる場合、生体にとって必要なトランスフェリン結合型鉄から鉄イオンを殆ど又は全く奪取させずに、生体にとって不必要な生体不安定鉄のみを有効に捕捉させることができ、生体中の過剰鉄の低減を有効に図ることができる。
【００５４】
なお、本発明の鉄イオンの捕捉方法は、医療用途、工業用途として使用することができる。
以下に実施例を示し、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はかかる実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００５５】
ビーカーに、２Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を入れ、その中に、Ｄ，Ｌ−セリン（東京化成工業株式会社製；粉末状）を、攪拌下、室温（２５℃程度）で、少しずつ粉末状態のまま入れて約３０分間攪拌することにより、セリンを水酸化ナトリウム水溶液に溶解させた。その後、エバポレータを用いて、４０〜５０℃の温度で、水を除去させた。さらにその後、白く残った残渣を、ビーカー用いて、攪拌下、室温（２５℃程度）で、メタノール中に入れて、３０分間攪拌することにより、溶解させ、この溶液に、攪拌下、室温（２５℃程度）で、Ｄ，Ｌ−セリンと同モル数のサリチルアルデヒドを直接加えたところ、溶液が直ちに黄色になった。
その後、一度メタノールを、エバポレータを用いて、３０〜４０℃の温度で完全に除去させ、残った黄色の固体を、ビーカーを用いて、攪拌下、室温（２５℃程度）で、メタノールに溶解させた。このメタノール溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を固体のまま、攪拌下、室温（２５℃程度）で、少しずつ、加えた。この際、溶液の色が白くなっていき、黄色の成分が全部消えた時点で（約６０分）、水素化ホウ素ナトリウムの添加を止め、室温（２５℃程度）で攪拌を１時間行った後、室温（２５℃程度）で、少量の水を加え、その後、不溶のものを自然濾過により濾過して除去させた。
その後、濾液から溶媒を、エバポレータを用いて、４０〜５０℃の温度で、除去し、残った白い残渣を、ビーカーを用いて、攪拌下、室温（２５℃程度）で、少しずつ水に添加して、水に溶解させた後、この水溶液に、２Ｎの塩酸水溶液を攪拌下、室温（２５℃程度）で徐々に添加させた。この際、溶液のｐＨが低くなるにつれ、白い結晶が析出した。この際のｐＨは１以上であった。
その後、室温（２５℃程度）で、１日放置（静置）させた後、結晶を吸引濾過し、さらに、メタノールで洗浄させた後、デシケータを利用して、２４時間かけて乾燥させることにより、下記式（３ａ）で表される鉄キレート剤（セリンが用いられた鉄キレート剤；ｏ−［（１−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル）−アミノ−メチル］−フェノール）を得た。【００５６】
【化３】
2010032489.tif 000005
【実施例２】
【００５７】
実施例１と同様にして、下記式（３ｂ）で表される鉄キレート剤（ヒスチジンが用いられた鉄キレート剤；ｏ−［（１−カルボキシ−２−（１Ｈ−イミダゾ−４−イル）エチル）−アミノ−メチル］−フェノール）を得た。【００５８】
【化４】
2010032489.tif 000006
【実施例３】
【００５９】
実施例１と同様にして、下記式（３ｃ）で表される鉄キレート剤（グルタミンが用いられた鉄キレート剤；ｏ−［（１−カルボキシ−２−カルバモイルメチルエチル）−アミノ−メチル］−フェノール）を得た。【００６０】
【化５】
2010032489.tif 000007
【００６１】
［比較例１］
鉄キレート剤として、ニトリロ三酢酸（nitrilotriacetic acid ；ＮＴＡ）のフリー塩（商品名「２４５０１−４２」（ＮＴＡ））およびナトリウム塩（商品名「２４５−０２」（NTA Disodium Salt：ＮＴＡ２Ｎａ）および「２４５０３−２２」（NTA Trisodium Salt：ＮＴＡ３Ｎａ）nacalai tesque社製）を用いた。【００６２】
［比較例２］
鉄キレート剤として、クエン酸（citrate）を用いた。なお、鉄キレート剤の評価では、クエン酸が鉄にキレートしたクエン酸鉄錯体のアンモニウム塩が市販されており、その市販品として、商品名「Ｆ５８７９−１００Ｇ」（Sigma社製；Ammnonium iron(III) citrate)を用いた。【００６３】
［比較例３］
鉄キレート剤として、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−エチレンジアミン三酢酸［N-(2-hydroxyethyl)-ethylenediaminetriacetic acid；ＨＥＤＴＡ］のナトリウム塩（商品名「Ｈ２３７８−１００Ｇ」Sigma社製；HEDTA trisodium salt hydrate）を用いた。【００６４】
［鉄キレート剤の評価Ａ］
実施例１に係る鉄キレート剤に関して、鉄に対するキレート能の有無について、下記の評価方法Ａにより評価を行った。【００６５】
（鉄キレート剤溶液の調製方法）
実施例１に係る鉄キレート剤（ＭＷ：２０９．２）：３３５ｍｇを、５０ｍｌのコニカルチューブに計り取った後、ダルベッコ−リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２；１×Ｄ−ＰＢＳ）を１５ｍｌ添加し、さらに、水酸化ナトリウム（ＭＷ：４０．０）の結晶を７０ｍｇ添加し、１０分間、激しく攪拌（シェイク）させ、蓋を開ける前に、かるく遠心分離させた（１０００ｒｐｍ、ｆｌａｓｈｉｎｇ）。その後、１×Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を１６．７５ｍｌ添加して、全量を３１．７５ｍｌとし、鉄キレート剤溶液を調製した。この鉄キレート剤溶液（「Ｆｅ−Ｓｅｒ・Ｎａ（５０ｍＭ）」）は、鉄キレート剤の濃度が５０ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）であり、ｐＨは９．２７であった。【００６６】
（クエン酸鉄錯体アンモニウム塩溶液の調製方法）
クエン酸鉄錯体アンモニウム塩（商品名「Ｆ５８７９−１００Ｇ」Sigma社製;Ammnonium iron(III) citrate）を２２０ｍｇ分取し、１×Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を４１．５ｍｌ添加して溶解させて、クエン酸鉄錯体アンモニウム塩溶液（茶褐色）を調製した。このクエン酸鉄錯体アンモニウム塩溶液（「ＦＡＣ溶液（２０ｍＭ）」）は、鉄イオンの濃度が２０ｍＭである。
さらに、ＦＡＣ溶液（２０ｍＭ）に、１×Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を添加して、鉄イオンの濃度が２ｍＭのクエン酸鉄錯体アンモニウム塩溶液（「ＦＡＣ溶液（２ｍＭ）」）を調製した。【００６７】
（評価方法Ａ）
クエン酸鉄錯体アンモニウム塩溶液［ＦＡＣ溶液（２０ｍＭ）、ＦＡＣ溶液（２ｍＭ）］と、１×Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）とを表１〜２で示される割合で混合して、分光光度計（商品名「NanoDrop ND-1000 Full-spectrum UV/Vis Spectrophotometer」SCRUM社製）を用いて、吸光度（波長４７０ｎｍ）を測定し（「UV-Vis Module、Measure」）、ブランクでの吸光度（表１〜２中の［Ａ］）を求めた。その後、前記の混合液に、Ｆｅ−Ｓｅｒ・Ｎａ（５０ｍＭ）を、１５８μｌ添加して、前記と同様にして、吸光度（波長４７０ｎｍ）を測定し、実施例に係る鉄キレート剤添加後の吸光度（表１〜２中の［Ｂ］）を求めた。測定結果を表１〜２に示す。【００６８】
表１〜２より、実施例１に係る鉄キレート剤は、鉄に対してキレート能を有していることが確認された。特に、クエン酸鉄錯体より鉄イオンを奪取することが可能であることが確認された。【００６９】
【表１】
2010032489.tif 000008
【００７０】
【表２】
2010032489.tif 000009
【００７１】
［鉄キレート剤の評価Ｂ］
実施例１に係る鉄キレート剤に関して、鉄に対するキレート能の有無について、下記の評価方法Ｂにより評価を行った。
（鉄キレート剤溶液の調製方法）
前記鉄キレート剤の評価Ａにおける鉄キレート剤溶液の調製方法と同様にして、鉄キレート剤の濃度が５０ｍＭの鉄キレート剤溶液（Ｆｅ−Ｓｅｒ・Ｎａ（５０ｍＭ））を調製した。【００７２】
（ニトリロ三酢酸鉄錯体溶液の調製方法）
塩化第二鉄六水和物ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（ＭＷ２７０．３０）の結晶をミリＱ水に溶解し８０ｍＭ溶液を調製した（Ａ液）。一方、ニトリロ三酢酸はフリー塩のＮＴＡ（１９１．１４）結晶を６Ｎ塩酸に溶解して１６０ｍＭ溶液を調製した（Ｂ液）。Ａ液１０ｍｌとＢ液１０ｍｌとをビーカーに分取し、ゆっくり攪拌しながら次に炭酸水素ナトリウムＮａＨＣＯ３の結晶を少量ずつ添加していった。ガスの発生がおさまり、溶液が暗緑色に変化した時点でＮａＨＣＯ３の添加を終了した。最後に４０ｍｌにメス・アップして鉄イオンの濃度が２０ｍＭのニトリロ三酢酸鉄錯体溶液（「Ｆｅ−ＮＴＡ溶液（２０ｍＭ）」）を調製した。
さらに、Ｆｅ−ＮＴＡ溶液（２０ｍＭ）に、１×Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を添加して、鉄イオンの濃度が２ｍＭのニトリロ三酢酸鉄錯体溶液（「Ｆｅ−ＮＴＡ溶液（２ｍＭ）」）を調製した。【００７３】
（評価方法Ｂ）
ニトリロ三酢酸鉄錯体溶液［Ｆｅ−ＮＴＡ溶液（２０ｍＭ）、Ｆｅ−ＮＴＡ溶液（２ｍＭ）］と、１×Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）とを表３〜４で示される割合で混合して、分光光度計（商品名「NanoDrop ND-1000 Full-spectrum UV/Vis Spectrophotometer」SCRUM社製）を用いて、吸光度（波長４７０ｎｍ）を測定し（「UV-Vis Module、Measure」）、ブランクでの吸光度（表３〜４中の［Ａ］）を求めた。その後、前記の混合液に、Ｆｅ−Ｓｅｒ・Ｎａ（５０ｍＭ）を、１５８μｌ添加して、前記と同様にして、吸光度（波長４７０ｎｍ）を測定し、実施例に係る鉄キレート剤添加後の吸光度（表３〜４中の［Ｂ］）を求めた。測定結果を表３〜４に示す。【００７４】
【表３】
2010032489.tif 000010
【００７５】
【表４】
2010032489.tif 000011
【００７６】
表３〜４より、実施例１に係る鉄キレート剤は、鉄に対してキレート能を有していることが確認された。特に、ニトリロ三酢酸鉄錯体より鉄イオンを奪取することが可能であることが確認された。【００７７】
［鉄キレート剤の評価Ｃ］
実施例１〜３に係る鉄キレート剤に関して、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography；ＨＰＬＣ）で用いられる溶媒としてのモルフォリンプロパンスルホン酸（3-Morpholinopropanesulfonic acid、Ｃ７Ｈ１５ＮＯ４Ｓ；ＭＯＰＳ）及びアセトニトリル溶液中における鉄に対するキレート能の有無について、下記の評価方法Ｃにより評価を行った。
（ＭＯＰＳ溶液の調製方法）
１００ｍｌの三角フラスコに、モルフォリンプロパンスルホン酸（Ｃ７Ｈ１５ＮＯ４Ｓ、FW=209.26、Code 341-01801、Lot PX013、Dojindo／Wako社製）を２．０９ｇ量り取り、超純水（ミリポア社製の超純水製造装置（ミリＱ）により作られた純水；「ミリＱ水」）：８０ｍｌを添加し、溶解させた［ｐＨ４．１５（２４．４℃）］。この溶液に、１Ｎの水酸化ナトリウム溶液（１ｍｏｌ／ｌ  Sodium Hydroxide Solution、Code 192-02175、Lot SEP7274、Wako社製）を１００μｌづつ加えていき、ｐＨを７．０に調整し、さらに、メスシリンダーを用いて、ミリＱ水で１００ｍｌにアジャストし、１００ｍＭのＭＯＰＳ溶液（ｐＨ６．９９）を調製した。【００７８】
（鉄キレート剤溶液の調製方法）
前記鉄キレート剤の評価Ａにおける鉄キレート剤溶液の調製方法と同様にして、実施例１〜３に係る各鉄キレート剤に関して、鉄キレート剤の濃度が５０ｍＭの鉄キレート剤溶液を調製した。
また、前記ＭＯＰＳ溶液の調製方法により調製した１００ｍＭのＭＯＰＳ溶液（ｐＨ６．９９）を使用した。
さらに、アセトニトリル（Ｃ２Ｈ３Ｎ、FW=41.05、Code 347-06641、Lot WPI96、Dojindo/Wako社製）は原液を使用した。
ミリＱ水：１３．８ｍｌを、５０ｍｌのコニカルチューブに分取した後、実施例１〜３に係る各鉄キレート剤による鉄キレート剤溶液（Ｆｅ−Ｓｅｒ・Ｎａ（５０ｍＭ）、Ｆｅ−Ｈｉｓ・Ｎａ（５０ｍＭ）、Ｆｅ−Ｇｌｕ・Ｎａ（５０ｍＭ））をそれぞれ１．２ｍｌ添加した後、１００ｍＭのＭＯＰＳ溶液を１．０ｍｌ添加し、さらに、アセトニトリル溶液を４．０ｍｌ添加して、ＭＯＰＳが用いられた鉄キレート剤溶液をそれぞれ調製した。なお、実施例１〜３に係る各鉄キレート剤によるＭＯＰＳが用いられた鉄キレート剤溶液を、それぞれ、「Ｆｅ−Ｓｅｒ・Ｎａ（ＭＯＰＳ溶液）」（実施例１に係る鉄キレート剤）、「Ｆｅ−Ｈｉｓ・Ｎａ（ＭＯＰＳ溶液）」（実施例２に係る鉄キレート剤）、「Ｆｅ−Ｇｌｕ・Ｎａ（ＭＯＰＳ溶液）」（実施例３に係る鉄キレート剤）という。【００７９】
（鉄錯体溶液の調製方法）
前記鉄キレート剤の評価Ａにおけるクエン酸鉄錯体アンモニウム塩溶液の調製方法と同様にして、鉄イオンの濃度が２０ｍＭのクエン酸鉄錯体アンモニウム塩溶液（ＦＡＣ溶液（２０ｍＭ））と、鉄イオンの濃度が２ｍＭのクエン酸鉄錯体アンモニウム塩溶液（ＦＡＣ溶液（２ｍＭ））とを調製した。
また、前記鉄キレート剤の評価Ｂにおけるニトリロ三酢酸鉄錯体溶液の調製方法と同様にして、鉄イオンの濃度が２０ｍＭのニトリロ三酢酸鉄錯体溶液（Ｆｅ−ＮＴＡ溶液（２０ｍＭ））と、鉄イオンの濃度が２ｍＭのニトリロ三酢酸鉄錯体溶液（Ｆｅ−ＮＴＡ溶液（２ｍＭ））とを調製した。【００８０】
（評価方法Ｃ）
ＭＯＰＳが用いられた鉄キレート剤溶液［Ｆｅ−Ｓｅｒ・Ｎａ（ＭＯＰＳ溶液）、Ｆｅ−Ｈｉｓ・Ｎａ（ＭＯＰＳ溶液）、Ｆｅ−Ｇｌｕ・Ｎａ（ＭＯＰＳ溶液）］に、それぞれ、ＦＡＣ溶液（２０ｍＭ）を添加し混合させたところ、茶褐色に発色した。また、同様にして、ＦＡＣ溶液（２ｍＭ）を添加し混合させたところ、茶褐色に発色した。
また、ＭＯＰＳが用いられた鉄キレート剤溶液［Ｆｅ−Ｓｅｒ・Ｎａ（ＭＯＰＳ溶液）、Ｆｅ−Ｈｉｓ・Ｎａ（ＭＯＰＳ溶液）、Ｆｅ−Ｇｌｕ・Ｎａ（ＭＯＰＳ溶液）］に、それぞれ、Ｆｅ−ＮＴＡ溶液（２０ｍＭ）を添加し混合させたところ、茶褐色に発色した。
また、同様にして、Ｆｅ−ＮＴＡ溶液（２ｍＭ）を添加し混合させたところ、茶褐色に発色した。
従って、この溶媒系でも、実施例１〜３に係る鉄キレート剤が、鉄キレート能を有しており、クエン酸鉄錯体アンモニウム塩（ＦＡＣ）や、ニトリロ三酢酸鉄錯体（Ｆｅ−ＮＴＡ）から、鉄イオンを奪取することが可能であることが確認された。【００８１】
（鉄キレート剤の評価Ｄ）
実施例１〜２に係る鉄キレート剤に関して、トランスフェリン鉄錯体（トランスフェリンが鉄イオンにキレートしたトランスフェリン鉄錯体）から鉄イオンを奪取する特性について、下記の評価方法Ｄにより評価を行った。【００８２】
（鉄キレート剤溶液の調製方法）
実施例１に係る鉄キレート剤を、前記鉄キレート剤の評価Ａにおける鉄キレート剤溶液の調製方法と同様にして、１×Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解させて、鉄キレート剤の濃度が５ｍＭの鉄キレート剤溶液（「Ｆｅ−Ｓｅｒ・Ｎａ（５ｍＭ）」）を調製した。
また、前記と同様にして、実施例２に係る鉄キレート剤を、１×Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解させて、鉄キレート剤の濃度が５ｍＭの鉄キレート剤溶液（「Ｆｅ−Ｈｉｓ・Ｎａ（５ｍＭ）」）を調製した。
さらに、前記と同様にして、比較例３に係る鉄キレート剤であるＨＥＤＴＡの８００ｍＭ溶液を調製した。結晶１３．７６ｇを５０ｍｌのコニカルチューブに分取し、ミリＱ水２５ｍｌを加え溶解した後、濃塩酸（３５〜３７％）を用いてｐＨ７．０に調整し、ミリＱ水で全量を５０ｍｌとした（「ＨＥＤＴＡ溶液（８００ｍＭ）」）。１×Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いて、ＨＥＤＴＡの濃度が５ｍＭのＨＥＤＴＡ溶液（「ＨＥＤＴＡ溶液（５ｍＭ）」）を調製した。【００８３】
（ニトリロ三酢酸溶液の調製方法）  
さらに、前記と同様にして、比較例１に係る鉄キレート剤であるＮＴＡ２ＮａおよびＮＴＡ３Ｎａを用いて８００ｍＭ溶液（ｐＨ７．０）を調製した。ＮＴＡ２Ｎａ９.４g をミリＱ水に溶解し全量を５０ｍｌとした（「ＮＴＡ２Ｎａ溶液（８００ｍＭ）」と称する場合がある）。一方、ＮＴＡ３Ｎａ１１．０ｇ をミリＱ水に溶解し全量を５０ｍｌとした（「ＮＴＡ３Ｎａ溶液（８００ｍＭ）」）。ＮＴＡ２Ｎａ溶液（８００ｍＭ）（ｐＨ６．３）とＮＴＡ３Ｎａ溶液（８００ｍＭ）（ｐＨ１１．３）とを混合しｐＨ７．０の８００ｍＭＮＴＡ溶液を調製した。１×Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いて、ＮＴＡの濃度が５ｍＭのＮＴＡ溶液（「ＮＴＡ溶液（５ｍＭ）」）を調製した。【００８４】
（トランスフェリン鉄錯体の調製方法）
市販されているトランスフェリン鉄錯体（holo-Transferrin（ｈＴｆ）、human、Code T0665-50MG、Lot 095K1633、Sigma社製）を、１×Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解させて、鉄イオン（トランスフェリン結合型鉄である鉄イオン）の濃度が５０μＭのトランスフェリン鉄錯体溶液を調製した。【００８５】
（評価方法Ｄ）
５０μＭのトランスフェリン鉄錯体溶液を１．５ｍｌのサンプル・チューブに５０μｌ分取し、これに、各鉄キレート剤溶液（Ｆｅ−Ｓｅｒ・Ｎａ（５ｍＭ）、Ｆｅ−Ｈｉｓ・Ｎａ（５ｍＭ）、ＮＴＡ溶液（５ｍＭ）、ＨＥＤＴＡ溶液（５ｍＭ））を、それぞれ、５０μｌ添加し、室温、遮光下で２４時間静置した。各種反応液５０μｌを遠心式の限外ろ過ユニット（商品名「Amicon Ultra-4 Ultracel-30k」 UFC8030 Millipore社製）に分取し、そこに１×Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）４５０μｌを添加し、３，５００ｒｐｍ、３０分間、２０℃で遠心を行い、トランスフェリンと低分子の各鉄キレート剤とを分離した（１回目）。遠心後、ろ過液は廃棄した。ユニットに濃縮されたトランスフェリンを含む溶液（約５０μｌ残る）に再度１×Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）４５０μｌを添加し同一条件で遠心分離を行った（２回目）。２回目の遠心処理後にユニット内に濃縮されたトランスフェリンを含む溶液を回収し、分光光度計（商品名「Spectrophotometer DU 640」Beckman Coulter社製）を用いて、波長４６６ｎｍの吸光度を測定した。評価結果を表５に示す。【００８６】
【表５】
2010032489.tif 000012
【００８７】
表５より、実施例に係る鉄キレート剤は、トランスフェリン鉄錯体溶液に添加しても、吸光度（波長４６６ｎｍ）の変化が少なく、トランスフェリン鉄錯体より鉄イオンをほとんど又は全く奪取しないことが確認された。なお、実施例１に係る鉄キレート剤の場合、トランスフェリン鉄錯体溶液に添加後の吸光度（波長４６６ｎｍ）が上昇している。これは、実施例１に係る鉄キレート剤が、トランスフェリン鉄錯体の鉄イオンではなく、系中に存在するバックグランドの鉄イオンを取り去ることによるものと思われる。
【実施例４】
【００８８】
キレート剤ならびにイオン交換樹脂を用いて試料（血清）の前処理に使用される試薬ならびに溶媒の除鉄を試みた。一方、限外ろ過ユニットは除鉄済蒸留水を用いて洗浄した。【００８９】
蒸留水、ＰＢＳ：
蒸留水（和光純薬）ならびにＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）は、各溶液３ｌｉｔｅｒに対してＣｈｅｌｅｘ（登録商標）１００ Ｒｅｓｉｎ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｇｒａｄｅ、１００−２００Ｍｅｓｈ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏ．）（以下。Ｃｈｅｌｅｘ１００と略す）１００ｇを直接試薬瓶に添加し、全体を攪拌した後、静置しその上清を用いた（バッチ法）。  【００９０】
ＮＴＡ溶液：
各種ロットのＮＴＡ試薬を用意し、あらかじめ鉄の混在を比較検討した。その上で、鉄の混在が最も少ないロットを選択した。本来、ＮＴＡ溶液の調製方法は、ＮＴＡ・２Ｎａ溶液（ｐＨ６．３０）とＮＴＡ・３Ｎａ溶液（ｐＨ１１．３０）とを混合し、目的のｐＨになるようその混合比を調製した。例えば、ＮＴＡ・２Ｎａ溶液５．０ｍｌにＮＴＡ・３Ｎａ溶液０．１ｍｌを添加した場合、そのＮＴＡ溶液のｐＨは７．２１を示した。しかし、強酸性陽イオン交換樹脂を用いると、溶液のｐＨを調整することは難しい。そこで、ＮＴＡ・３Ｎａ単独でＮＴＡ溶液を調製し、除鉄処理後、ＭＯＰＳ  Ｂｕｆｆｅｒで希釈することでＮＴＡ溶液のｐＨを中性域に調整することが可能となった。そこで、ＮＴＡ・３Ｎａ結晶（和光純薬）をＣｈｅｌｅｘ１００ 処理済み蒸留水で溶解し８００ｍＭ溶液を調製した（ｐＨ１１．４２）。この８００ｍＭ  ＮＴＡ・３Ｎａ溶液１ｍｌに対して強酸性陽イオン交換樹脂（ＳＫ１ＢＨ、三菱化学）１ｇを添加し、１時間攪拌した後、上清を回収した。次にＣｈｅｌｅｘ１００樹脂処理済１００ｍＭ  ＭＯＰＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（同仁化学）で１０倍希釈し、８０ｍＭ  ＮＴＡ・３Ｎａ溶液（ｐＨ７．０８）とした。【００９１】
［Ｎａ３（Ｃｏ（ＣＯ３）３］・３Ｈ２Ｏ：
この溶液はコバルト・イオンを中心とする錯体試薬であり、この溶液中に混在する鉄イオンのみを取り除くことは出来ない。そこで、この溶液を調製する際に、鉄イオンの混入を最小限に抑えるため、試薬瓶、ピペットはすべてプラスチック製使い捨て器具を用いた。試薬溶解のための蒸留水はあらかじめＣｈｅｌｅｘ１００処理を施した。【００９２】
精密ろ過ユニット：
［Ｎａ３（Ｃｏ（ＣＯ３）３］・３Ｈ２Ｏ溶液調製ならびにＨＰＬＣ移動相溶液調製時に使用する吸引式フィルターユニット：ステリカップ−ＨＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は、使用直前にＣｈｅｌｅｘ１００処理済み蒸留水５０ｍｌで２回洗浄し、メンブレンに混入する鉄を洗浄除去処理した。【００９３】
限外ろ過フィルター・ユニット：
Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）  Ｕｌｔｒａ−４／Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３０ＫおよびＡｍｉｃｏｎ（登録商標）  Ｕｌｔｒａ−０．５／Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は使用直前にＣｈｅｌｅｘ１００処理済み蒸留水０．５〜１．０ｍｌで２回洗浄し、メンブレンに混入する鉄を洗浄除去処理した。【００９４】
評価方法：
測定装置：Ｎｏｎｍｅｔａｌｌｉｃ  ＰＥＥＫ（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ−ｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ） チューブを用いた２７９６ＢｉｏＳｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ、２９９８Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ検出器（Ｗａｔｅｒｓ）に、ＯｍｎｉＳｐｈｅｒ５Ｃ１８ガラス・カラム（Ｇ１００ ´ ３  Ｒｅｐｌ）、ＣｈｒｏｍＳｅｐガード・カラム（Ｖａｒｉａｎ）を装着した Ｎｏｎ−ｍｅｔａｌ  ＨＰＬＣシステム、あるいは原子吸光法にて鉄イオンの混在を評価した。【００９５】
蒸留水：
Ｎｏｎ−ｍｅｔａｌ  ＨＰＬＣを用い、Ｃｈｅｌｅｘ１００による除鉄効果を評価した。その結果、Ｃｈｅｌｅｘ１００処理後の蒸留水中の鉄イオン濃度は検出限界以下にまで抑えることができた。【００９６】
【表６】
2010032489.tif 000013
【００９７】
ＰＢＳ：
Ｎｏｎ−ｍｅｔａｌ  ＨＰＬＣを用い、Ｃｈｅｌｅｘ１００による除鉄効果を評価した。その結果、Ｃｈｅｌｅｘ１００処理後のＰＢＳ中の鉄イオン濃度は検出限界以下にまで抑えることができた。【００９８】
【表７】
2010032489.tif 000014
【００９９】
ＮＴＡ：
Ｎｏｎ−ｍｅｔａｌ  ＨＰＬＣを用い、各種ロット間による鉄の混在量を比較検討した。【０１００】
【表８】
2010032489.tif 000015
その結果、試薬の製造元によりその品質に差があることが判明した。
次に、各種キレート剤ないしはイオン交換樹脂を用いて除鉄効果を比較検討した。【０１０１】
【表９】
2010032489.tif 000016
４種類の樹脂のうち、ＳＫ１ＢＨ樹脂が有効であることが明らかとなった。ただし、樹脂処理後のＮＴＡ溶液のｐＨを考慮し、上記のＮＴＡ溶液調製方法を採用した。【０１０２】
［Ｎａ３（Ｃｏ（ＣＯ３）３］・３Ｈ２Ｏ：
コバルト濃度はＩＣＰ質量分析法、および鉄濃度は電気加熱原子吸光法にてそれぞれ測定した。１回目の調製はガラス製試薬瓶や定性用濾紙を用いて調製した［Ｎａ３（Ｃｏ（ＣＯ３）３］・３Ｈ２Ｏ溶液のコバルト濃度および鉄濃度である。１ｍＭコバルト濃度に対して０．８２０μＭ  鉄が混在していた。一方、２回目の調製ではプラスチック製使い捨て器具である試薬瓶、ピペットを用い、濾紙の代わりにＣｈｅｌｅｘ  １００  処理済み蒸留水であらかじめ洗浄した吸引式ろ過フィルターを用いて調製した［Ｎａ３（Ｃｏ（ＣＯ３）３］・３Ｈ２Ｏ溶液は１ｍＭコバルト濃度に対して鉄濃度０．０１４μＭまで抑制することができた。１回目の調製と２回目の調製との間では、混入する鉄の量を５８．５倍軽減することができた。【０１０３】
【表１０】
2010032489.tif 000017
【実施例５】
【０１０４】
除鉄処理した試薬、溶液を用いて健常人血中ＮＴＢＩを測定した。測定方法は従来の方法を改良し「Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ法」を考案した。血清中の生体不安定鉄をスカベンジ（キレート）するＮＴＡ試薬中に混入する鉄を除去することが可能となったことで、［Ｎａ３（Ｃｏ（ＣＯ３）３］・３Ｈ２Ｏ溶液中に混在する鉄を完全に除去することなく、試料を２つに分けることで、一方をＢａｃｋｇｒｏｕｎｄを含んだ全鉄濃度測定用試料とし、もう片方をＢａｃｋｇｒｏｕｎｄの鉄濃度測定用試料としてそれぞれ鉄濃度を求め、全鉄濃度よりＢａｃｋｇｒｏｕｎｄの鉄濃度を差し引くことで真の鉄濃度（ＮＴＢＩ）を求めることができる。以下に従来の測定方法を示す。【０１０５】
試料の前処置：
試料の前処置方法を図１に示した。凍結保存の試料（血清）を速やかに解凍し、使用時まで氷中で冷蔵保存した。解凍した試料より４５０μｌを１．５−ｍＬサンプル・チューブに分取し、そこに５ｍＭ［Ｎａ３（Ｃｏ（ＣＯ３）３］・３Ｈ２Ｏを５０μｌ添加した。３７℃の恒温槽にて静置し、ａｐｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎの鉄結合サイトにコバルト・イオンを導入した。１時間後、試料を３７℃の恒温槽より取り出し、新たに用意した１．５−ｍＬサンプル・チューブ２本にコバルト・イオン処理した試料をそれぞれ２２５μｌずつ分注した。一本のサンプル・チューブに８０ｍＭ  ＮＴＡ・３Ｎａ溶液２５μｌを添加し（試料Ａ）、もう一本のサンプル・チューブには８０ｍＭ  ＮＴＡ・３Ｎａ溶液を調製した際の溶媒を２５μｌ添加した（試料Ｂ）。室温下で３０分間静置し、非トランスフェリン結合鉄（Ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−ｂｏｕｎｄ  ｉｒｏｎ：ＮＴＢＩ）をＦｅ−ＮＴＡ錯体としてスカベンジした。次に試料中の鉄結合蛋白質であるｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、ｆｅｒｒｉｔｉｎや発色蛋白質のｂｉｌｌｉｒｕｂｉｎからＦｅ−ＮＴＡを分離する目的で分画分子量１０，０００の限外ろ過ユニットに試料を添加し、１４，０００ｘｇ、１時間、２０℃で遠心分離し、限外ろ過液を回収した。試料Ａおよび試料Ｂのそれぞれの限外ろ過液２０μｌをｎｏｎ−ｍｅｔａｌ  ＨＰＬＣにインジェクトした。【０１０６】
ＨＰＬＣによるＮＴＢＩの定量：
装置：Ｎｏｎｍｅｔａｌｌｉｃ  ＰＥＥＫ（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ−ｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ） チューブを用いた２７９６ＢｉｏＳｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ、２９９８Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ検出器（Ｗａｔｅｒｓ）に、ＯｍｎｉＳｐｈｅｒ５Ｃ１８ガラス・カラム（Ｇ１００ ´ ３  Ｒｅｐｌ）、ＣｈｒｏｍＳｅｐガード・カラム（Ｖａｒｉａｎ）を装着した Ｎｏｎ−ｍｅｔａｌ  ＨＰＬＣを構築した。
移動相：５ｍＭ  ＭＯＰＳ（同仁化学）、３ｍＭ  ＣＰ−２２（Biochemical Pharmacology 57:1305-1310, 1999に掲載されている発色性キレート剤、依頼合成）、２０％  ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（和光純薬）溶液を調製し、濾過フィルター・ユニットにてろ過と脱気処理を行った。
定量：鉄濃度を算出するための標準曲線には電気加熱原子吸光法にて鉄濃度を決定したＦｅ−ＮＴＡ溶液を用い、鉄濃度で０−１０μＭの範囲の標準曲線を得た。試料Ａおよび試料Ｂの各限外ろ過液２０μｌをインジェクトし、標準曲線を求める際に用いたＦｅ−ＮＴＡがＦｅ−ＣＰ２２として検出される位置（検出器の波長を４５０ｎｍとする）に相当するピークより鉄濃度を求め、試料Ａの鉄濃度（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄを含んだ全鉄濃度）より試料Ｂの鉄濃度（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄとしての鉄濃度）を差し引いた値を試料中のＮＴＢＩとして算出した。【０１０７】
結果：
対象として、採血時点で特に治療を必要とする疾患を抱えていない健常人を選んだ。内訳は男性２０名（平均年齢３３．４歳、平均Ｈｂ値１５．６ｇ／ｄｌ）、女性１６名（平均年齢３３．８歳、平均Ｈｂ値１３．２ｇ／ｄｌ）であった。それぞれのＮＴＢＩの平均値は、男性で０．２０６±０．０９１μＭ、女性で０．２１２±０．０９５μＭであった。【０１０８】
【表１１】
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【０１０９】
従来報告されていたＨＰＬＣを用いた測定系に対し、各段階で混入する鉄のＣｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎを様々なキレート剤などを使用して低減させ、かつ、検体を測定過程で２つにわけてＢａｃｋｇｒｏｕｎｄを最終的にＳｕｂｔｒａｃｔｉｏｎすることで、非常に低濃度のＮＴＢＩ測定まで可能となった。今回確立した方法によって、健常人における血清ＮＴＢＩの存在も確認でき、さらに測定値も安定して得られるようなった。
［比較例４］【０１１０】
従来のＨＰＬＣ測定方法における問題点は、以下に示す試料（血清）の前処置に使用されてきた試薬ならびに溶液中に混在する鉄イオンによるものと考えられる。試薬を溶解するための溶媒として用いる蒸留水、試料の希釈に用いるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＮＴＢＩを捕捉するためのニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ａｐｏｔｒａｎsｆｅｒｒｉｎの鉄結合サイトをブロックするトリス炭酸コバルト溶液（［Ｎａ３（Ｃｏ（ＣＯ３）３］・３Ｈ２Ｏ）に鉄イオンが混入している。図２に従来の測定方法を示す。【０１１１】
図２の方法により測定した血中ＮＴＢＩ値の結果を示す。【０１１２】
【表１２】
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検体２ならびに検体３ではＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ値を差し引くとマイナス表示になってしまった。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明の鉄キレート剤は、鉄イオンに対して選択的にキレートが可能であり、特に生体不安定鉄に対して有効に作用するため、産業上極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年7月9日(2010.7.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄イオンに対してキレート能を有する鉄キレート剤であって、下記式（１）で表される化合物又はその塩からなり、生体中に存在する生体不安定鉄をキレートし、オーバーキレートによる副作用を生じないことを特徴とする鉄キレート剤。
【化１】
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（式（１）中、環Ｚは、芳香族炭化水素環又は芳香族複素環を表す。Ｒ１は、アルキレン基を表す。Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して水素原子、炭化水素基又はキレート能を有する基を表し、Ｒ２及びＲ３で表される基の配位数の合計は１又は２である。）
【請求項２】
式（１）における環Ｚが、６員環の芳香族炭化水素環又は芳香族複素環であることを特徴とする請求項１記載の鉄キレート剤。
【請求項３】
式（１）における環Ｚが、ベンゼン環であることを特徴とする請求項２記載の鉄キレート剤。
【請求項４】
式（１）におけるＲ１が、メチレン基であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の鉄キレート剤。
【請求項５】
式（１）におけるＲ２のキレート能を有する基が、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カルバモイル基、アミノ基、グアニジノ基、アミジノ基、及び窒素原子含有複素環基から選ばれる１又は２の官能基を有する基であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の鉄キレート剤。
【請求項６】
式（１）におけるＲ２のキレート能を有する基が、カルボキシアルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルバモイルアルキル基、ピリジルアルキル基、ピラジニルアルキル基、ピリミジニルアルキル基、ピロリルアルキル基、イミダゾリルアルキル基、ベンゾイミダゾリルアルキル基、又はピラゾリルアルキル基であることを特徴とする請求項５記載の鉄キレート剤。
【請求項７】
式（１）におけるＲ３のキレート能を有する基が、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、（ｐ−ヒドロキシフェニル）メチル基、インドリルメチル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、カルボキシメチル基、２−カルボキシエチル基、４−アミノブチル基、（１Ｈ−イミダゾ−４−イル）メチル基、３−グアニジノプロピル基、メルカプトメチル基又は２−メチルチオエチル基であり、Ｒ３の炭化水素基が、メチル基、１−メチルエチル基、２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基又はフェニルメチル基であることを特徴とする請求項１〜６記載の鉄キレート剤。
【請求項８】
式（１）におけるＲ３が、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、（ｐ−ヒドロキシフェニル）メチル基、インドリルメチル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、カルボキシメチル基、２−カルボキシエチル基、４−アミノブチル基、（１Ｈ−イミダゾ−４−イル）メチル基、又は３−グアニジノプロピル基であり、かつ式（１）におけるＲ２が水素原子であることを特徴とする請求項７記載の鉄キレート剤。
【請求項９】
式（１）におけるＲ３が、メチル基、１−メチルエチル基、２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基又はフェニルメチル基であり、かつ式（１）におけるＲ２がキレート能を有する基であることを特徴とする請求項７記載の鉄キレート剤。
【請求項１０】
式（１）における環Ｚ及びＲ１〜Ｒ３が硫黄原子を含まないことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の鉄キレート剤。
【請求項１１】
４座又は５座配位子であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の鉄キレート剤。
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の鉄キレート剤の製造方法であって、
ヒドロキシル基とホルミル基又はホルミルアルキル基とが隣接した炭素原子に結合した構造の芳香族化合物又は複素環化合物と、式（１）におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸又はその塩とを反応させる工程を具備することを特徴とする鉄キレート剤の製造方法。
【請求項１４】
式（１）におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸が、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グルタミン、アルパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン又はアルギニンであることを特徴とする請求項１３記載の鉄キレート剤の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の鉄キレート剤を用いて鉄イオンを定量することを特徴とする鉄イオンの定量方法。
【請求項１６】
吸光分析法により定量することを特徴とする請求項１５記載の鉄イオンの定量方法。
【請求項１７】
鉄イオンが生体不安定鉄である請求項１５又は１６記載の鉄イオンの定量方法。
【請求項１８】
定量に使用される試薬、器具及び／または溶媒の除鉄を行う過程を更に含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の鉄イオンの定量方法。
【請求項１９】
除鉄がキレート剤により行われることを特徴とする、請求項１８記載の鉄イオンの定量方法。
【請求項２０】
定量の対象となる試料から２つの部分を分取し、一方を全鉄濃度測定用試料とし、他方を定量の対象となる試料以外の鉄濃度の測定用試料としてそれぞれ鉄濃度を求め、全鉄濃度より定量の対象となる試料以外の鉄濃度を差し引くことで真の鉄濃度を求めることを特徴とする、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の鉄イオンの定量方法。
【国際調査報告】
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