(57)【要約】  変性剤により溶解させた不溶性蛋白質及び／又はペプチドの溶液から変性剤を除去する際に、ヌクレオチドを添加する事によって不溶性蛋白質及び／又はペプチドを効率的に可溶化する。本発明の可溶化方法により、がんや感染症などの疾病抗原蛋白質を可溶化し、抗原提示細胞に導入した場合には疾病抗原特異的ＣＴＬを誘導することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法であって、
不溶性蛋白質及び／又はペプチドと変性剤とを同一の溶液中で混合し、不溶性蛋白質及び／又はペプチドを溶解させ、不溶性蛋白質及び又はペプチドの溶液を作製する工程、
該溶液にヌクレオチドを添加する工程、および
該溶液から変性剤を除去する工程
を含む、不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法。
【請求項２】
前記ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドである請求項１に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法。
【請求項３】
前記ヌクレオチドを構成する塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルのいずれかであり、前記ヌクレオチドの１種又は２種以上を組み合わせて添加する請求項１又は２に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法。
【請求項４】
前記ヌクレオチドを構成するリン酸基の数が、１〜３である請求項１乃至３のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法。
【請求項５】
前記ヌクレオチドが、不溶性蛋白質及び／又はペプチドと変性剤とを混合した後又は同時に添加される請求項１乃至４のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法。
【請求項６】
前記溶液から変性剤を除去する工程において、該溶液を生理的溶媒に置換しながら変性剤を除去し、好ましくは該生理的溶媒がヌクレオチドを含む請求項１乃至５のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法。
【請求項７】
前記不溶性蛋白質及び／又はペプチドが、天然由来の蛋白質及び／又はペプチド、遺伝子組み換え技術によって作製される蛋白質及び／又はペプチド、又は化学合成した蛋白質及び／又はペプチドである請求項１乃至６のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法。
【請求項８】
前記不溶性蛋白質及び／又はペプチドが、抗原蛋白質である請求項１乃至７のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法。
【請求項９】
前記変性剤が、尿素及び／又はグアニジン塩酸である請求項１乃至８のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法。
【請求項１０】
前記不溶性蛋白質及び／又はペプチドと変性剤とを同一の溶液中で混合する工程において、さらに還元剤を添加する請求項１乃至９のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法。
【請求項１１】
前記還元剤が、ジチオレイストールまたは２−メルカプトエタノールである請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法。
【請求項１２】
不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞内への導入方法であって、
不溶性蛋白質及び／又はペプチドと変性剤とを同一溶液中で混合し、不溶性蛋白質及び／又はペプチドを溶解し、不溶性蛋白質及び／又はペプチドの溶液を作製する工程、
該溶液にヌクレオチドを添加する工程、
該溶液を、生理的溶媒に置換しながら変性剤を除去し、該不溶性蛋白質及び／又はペプチドの生理的溶液を作製する工程、および
該生理的溶液を所望の細胞の細胞質及び/又は細胞内へ導入する工程、
を含む、不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法。
【請求項１３】
ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドである請求項１２に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法。
【請求項１４】
前記ヌクレオチドを構成する塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルのいずれかであり、前記ヌクレオチドの１種又は２種以上を組み合わせて添加する請求項１２又は１３に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法。
【請求項１５】
前記ヌクレオチドを構成するリン酸基の数が、１〜３である請求項１２乃至１４のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法。
【請求項１６】
前記ヌクレオチドが、不溶性蛋白質及び／又はペプチドと変性剤とを混合した後又は同時に添加される請求項１２乃至１５のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法。
【請求項１７】
蛋白質及び／又はペプチドの溶液の置換に用いる前記生理的溶媒が、ヌクレオチドを含む請求項１２乃至１６のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法。
【請求項１８】
前記細胞が、抗原提示機能を有する細胞である請求項１２乃至１７のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法。
【請求項１９】
前記抗原提示機能を有する細胞が、樹状細胞である請求項１２乃至１８のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法。
【請求項２０】
前記不溶性蛋白質及び／又はペプチドが、天然由来蛋白質及び／又はペプチド、遺伝子組み換え技術によって作製される蛋白質及び／又はペプチド、又は化学合成した蛋白質及び／又はペプチドである請求項１２乃至１９のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法。
【請求項２１】
前記不溶性蛋白質及び／又はペプチドが、抗原蛋白質及び／又はペプチドである請求項１２乃至２０のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法。
【請求項２２】
前記変性剤が、尿素及び／又はグアニジン塩酸である請求項１２乃至２１のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法。
【請求項２３】
前記不溶性蛋白質及び／又はペプチドと変性剤とを同一の溶液中で混合する工程において、さらに還元剤を添加する請求項１２乃至２２のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法。
【請求項２４】
前記還元剤が、ジチオレイストール又は２−メルカプトエタノールである請求項１２乃至２３のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法。
【請求項２５】
前記可溶化した不溶性蛋白質及び／又はペプチドが、エレクトロポレーション法により細胞質及び/又は細胞内へ導入される請求項１２乃至２４のいずれか一項に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法。
【請求項２６】
不溶性抗原を提示する抗原提示細胞を作製する方法であって、
不溶性抗原と変性剤とを同一溶液内で混合し、不溶性抗原を溶解し、不溶性抗原を含む溶液を作製する工程、
該溶液にヌクレオチドを添加する工程、
該溶液を、生理的溶媒に置換しながら変性剤を除去し、不溶性抗原を含む生理的溶液を作製する工程、および
該不溶性抗原を含む生理的溶液を抗原提示細胞質及び/又は細胞内に導入する工程、
を含む抗原提示細胞の作製方法。
【請求項２７】
前記ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドである請求項２６に記載の抗原提示細胞の作製方法。
【請求項２８】
前記ヌクレオチドを構成する塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルのいずれかであり、前記ヌクレオチドの１種又は２種以上を組み合わせて添加する請求項２６又は２７に記載の抗原提示細胞の作製方法。
【請求項２９】
前記ヌクレオチドを構成するリン酸基の数が１〜３である請求項２６乃至２８のいずれか一項に記載の抗原提示細胞の作製方法。
【請求項３０】
抗原の溶液の置換に用いる前記生理的溶媒が、ヌクレオチドを含む請求項２６乃至２９のいずれか一項に記載の抗原提示細胞の作製方法。
【請求項３１】
前記抗原が腫瘍細胞、腫瘍組織、感染症細胞または病原性細胞の破砕物から得られる不溶性画分である請求項２６乃至３０のいずれか一項に記載の抗原提示細胞の作製方法。
【請求項３２】
前記抗原が、蛋白質又はペプチドである請求項２６乃至３１のいずれか一項に記載の抗原提示細胞の作製方法。
【請求項３３】
前記抗原が、天然由来蛋白質及び／又はペプチド、遺伝子組み換え技術によって作製される蛋白質及び／又はペプチド、又は化学合成した蛋白質及び／又はペプチドである請求項２６乃至３２のいずれか一項に記載の抗原提示細胞の作製方法。
【請求項３４】
前記抗原提示細胞が、樹状細胞である請求項２６乃至３３のいずれか一項に記載の抗原提示細胞の作製方法。
【請求項３５】
前記変性剤が、尿素及び／又はグアニジン塩酸である請求項２６乃至３４のいずれか一項に記載の抗原提示細胞の作製方法。
【請求項３６】
前記不溶性蛋白質及び／又はペプチドと変性剤とを同一の溶液中で混合する工程において、さらに還元剤を添加する請求項２６乃至３５のいずれか一項に記載の抗原提示細胞の作製方法。
【請求項３７】
前記還元剤が、ジチオレイストールまたは２−メルカプトエタノールである請求項２６乃至３６のいずれか一項に記載の抗原提示細胞の作製方法。
【請求項３８】
請求項２６乃至３７のいずれか一項に記載の作製方法により作製された抗原提示細胞。
【請求項３９】
請求項２６乃至３７のいずれか一項に記載の作製方法により作製された抗原提示細胞をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、細胞性傷害性Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項４０】
請求項２６乃至３７のいずれか一項に記載の作製方法により作製された抗原提示細胞をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、がん及び／又は感染症の治療もしくは予防方法。
【請求項４１】
請求項２６乃至３７のいずれか一項に記載の作製方法により作製された抗原提示細胞を有効成分とする、細胞性傷害性Ｔ細胞誘導用組成物。
【請求項４２】
請求項２６乃至３７のいずれか一項に記載の作製方法により作製された抗原提示細胞を有効成分とする、がん及び／又は感染症の治療もしくは予防用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法に関する。また、不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞内への導入方法に関する。更には、不溶性抗原を提示する抗原提示細胞の作製方法、該作製方法により作製された抗原提示細胞、該抗原提示細胞を用いた細胞傷害性Ｔ細胞誘導方法および細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤、並びに該抗原提示細胞を用いたがん及び/又は感染症予防もしくは治療方法及び予防もしくは治療剤に関する。 
【背景技術】
【０００２】
がんをはじめとする難治性疾患の新たな治療法として、近年免疫細胞療法が注目されている。免疫細胞療法とは、患者本人の免疫細胞、特に白血球を取り出して活性化し、再度患者本人に戻し、人工的に免疫力を強化するという治療方法である。患者本人の細胞を用いるため、従来の抗癌剤治療などと比べて格段に副作用が少ないという利点がある。【０００３】
免疫細胞療法として、現在、体外でリンパ球をリンフォカインにより抗原非特異的に活性化し、体内に戻す活性化自己リンパ球療法が普及しつつあるが、さらに強力な細胞傷害活性を持ち、病変を特異的に認識・傷害する細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、以下ＣＴＬとも記す）を利用した治療法の普及が望まれている。【０００４】
現在試みられているＣＴＬ誘導を目的とした治療法としては、がん抗原ペプチド等を直接患者に投与する方法がとられているが、この場合、組織中のペプチダーゼによる分解や患者の免疫能の低下といった問題点があり、ＣＴＬ誘導能はあまり期待できない。そこで、抗原提示細胞、例えば樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ、以下ＤＣとも記す）等を患者由来の細胞から体外で誘導し、抗原と接触させて強力に抗原提示させ、そのＤＣを患者体内へ戻すことでＣＴＬを誘導する樹状細胞ワクチン療法等がある（例えば、非特許文献１）。【０００５】
具体的にこの樹状細胞ワクチン療法とは、ＤＣが疾病抗原蛋白質等（例えばがん抗原蛋白質、又は感染症関連の抗原蛋白質）を取り込んで、細胞内でプロセシングした後、その一部を主要組織適合遺伝子複合体抗原（主要組織適合抗原、組織適合抗原、Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ａｎｔｉｇｅｎ：ＭＨＣ抗原、ヒトの場合にはヒト白血球抗原、Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ：ＨＬＡ）に提示し、そのＤＣをワクチンとして投与し、体内で疾病抗原を発現した異常細胞を選択的に攻撃する疾病抗原特異的ＣＴＬを誘導し、治療を行う療法である（例えば、非特許文献１）。このように、ＤＣワクチンは、疾病特異的なＣＴＬを誘導できることから、免疫細胞療法の中でも最も治療効果が有望視されている方法のひとつである。【０００６】
ＭＨＣ抗原にはＭＨＣクラスＩとクラスＩＩが存在し、クラスＩは抗原特異的ＣＴＬを誘導し、クラスＩＩはヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞を誘導する。また、ヒトの場合はクラスＩにさらにＨＬＡ−Ａ０２やＨＬＡ−Ａ２４等のサブタイプが存在し、同じ抗原蛋白質であっても、それぞれ提示するペプチドが異なっている。【０００７】
このＤＣワクチン療法において重要なのは、その抗原等をＤＣに提示させることであるが、その方法としては現在二つの方法が用いられている。一つ目に抗原蛋白質に由来する抗原ペプチドをＤＣ表面のＭＨＣ抗原（ＨＬＡ）に直接結合させる方法、二つ目に蛋白質をエンドサイトーシス等によってＤＣ内に取り込ませる方法である。【０００８】
上記のうち、抗原蛋白質に由来するＭＨＣクラスＩ拘束性の抗原ペプチドを抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ抗原に直接結合させる方法を利用する場合には、抗原提示細胞を培養によって十分成熟させた後、生理的な溶媒に溶解させたペプチドを培養液中で１μｇ／ｍＬ程度になるように添加し、２時間から２４時間程度静置することで、ＭＨＣクラスＩ分子に結合させる。【０００９】
しかし、抗原蛋白質に由来する抗原ペプチドを抗原提示細胞のＭＨＣ抗原に直接結合させる方法では、クラスＩの抗原提示によってＣＴＬを誘導することはできるが、例としてヒトの場合では特定のＨＬＡ、例えばコアクラスＩのＡ０２やＡ２４等に結合する抗原ペプチドの同定はすすんでいるが、他のＨＬＡの型ではほとんど同定されていない。すなわち、ペプチドは特定のＨＬＡ拘束性となるため、特定のＨＬＡ適合患者にしか用いることができないという問題がある。また、この場合にはクラスＩＩも利用できないため、ＣＤ４陽性（ヘルパー）Ｔ細胞機能が利用できていないという問題もある。【００１０】
一方、エンドサイトーシスによる抗原蛋白質の取り込みとしてこれまで行われてきた方法は、腫瘍組織をリン酸緩衝食塩水（以下、ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）等の生理的な緩衝液中でホモジネート（粉砕処理）し、そのライゼート（上清）中のタンパク質やペプチドを単にＤＣの培養液に添加するものである。この場合、取り込まれた蛋白質はライソゾーム内で処理され、主としてクラスＩＩ組織適合抗原（クラスＩＩ）によって提示される経路にのり、主としてＣＤ４陽性（ヘルパー）Ｔ細胞を刺激し、その活性化を誘導する。また、細胞外物質を取り込む系として老廃物処理のための受容体に結合した物質を取り込む機構も存在し、例えばマンノース受容体は結合した糖蛋白質等を細胞内へ取り込むことが知られているが、これもライソゾームを介してクラスＩＩによる提示の経路に進む。これに対して、細胞質内の蛋白質はプロテアソームで処理され、主としてクラスＩ組織適合抗原（クラスＩ）によって提示される経路にのり、主としてＣＤ８陽性（キラー）Ｔ細胞（ＣＴＬ）を刺激してその活性化を誘導することとなる。【００１１】
がん組織を生理的な緩衝液中でホモジネートした場合には、可溶性画分は上清としてＤＣに添加されるが、不溶性画分は沈殿物として除去されてしまう。そのため、その不溶性画分に含まれる抗原蛋白質は利用できていない。その蛋白質を組換え蛋白質として作製しても不溶性画分に回収されてしまうため、ＤＣに抗原提示させることができないという問題点があった。【００１２】
また、エンドサイトーシスによって樹状細胞に抗原を取込ませた場合には、本質的にはクラスＩＩへの抗原提示経路に輸送され、クラスＩからのＣＤ８陽性（キラー）Ｔ細胞、ＣＴＬへの十分な抗原提示ができないという問題がある。その問題を解決するため、近年細胞内に蛋白質を導入する方法としてエレクトロポレーション法等の応用が可能となっているが、不溶性蛋白質を導入するためには生理的な溶媒中で可溶化しておく必要がある。【００１３】
不溶性の蛋白質を可溶化するには、一般的に尿素やグアニジン塩酸といった変性作用のある溶媒に一度溶解させ、溶解しにくい場合にはジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤を加える等の手法がとられていた。【００１４】
その後ランダムな分子間ジスルフィド結合を抑制させる目的でグルタチオンを加え、場合によっては分子間の凝集を抑制する目的でアルギニンも加えてから、酸化還元反応（グルタチオン化）をさせ、酸化還元反応後はＰＢＳ等（場合によっては１０％程度のグリセロールを加えたもの）の緩衝液で透析等を行い、生理的な溶媒に置換することで可溶化及び精製を行っていた（非特許文献２）。しかし、これらの方法では可溶化できない蛋白質も多くあり、また可溶化できる蛋白質であっても、生理的溶媒で透析を行った際にほとんどの蛋白質が沈殿してしまう等、十分な効果が得られないことが多かった。【００１５】
上記説明のように、十分な抗腫瘍効果を与えるには標的となる抗原蛋白質を可溶化した状態で樹状細胞に取り込ませ、ＭＨＣクラスＩに抗原提示させるため、不溶性蛋白質を生理的溶媒に溶解するための技術は必須であると考えられた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｍ．Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，ＶＯＬ．２８：５４２−５５０（２００５）．
【非特許文献２】Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９９９；３０９，２１７−２３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、従来の方法では十分に可溶化できなかった不溶性蛋白質及び／又はペプチド（以下、不溶性蛋白質とも記す）を生理的溶媒に溶解する方法を提供するものである。また、不溶性蛋白質を効率的に細胞内へ導入する方法を提供するものである。更には、不溶性抗原を提示する抗原提示細胞の作製方法、該作製方法により作製された抗原提示細胞、該抗原提示細胞を用いた細胞傷害性Ｔ細胞誘導方法および細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤、並びに該抗原提示細胞を用いたがん及び/又は感染症予防もしくは治療方法及び予防もしくは治療剤を提供するものである。 
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、これらの課題を解決するため、様々な研究を行い、変性剤により溶解した蛋白質溶液を生理的溶媒に置換する際に、ヌクレオチドを添加する事によって効率的に可溶化する事を見出した。また、本発明の可溶化方法によって可溶化された蛋白質は、エレクトロポレーション法により細胞内へ導入できることが確認された。そのため、がんや感染症などの疾病抗原蛋白質を可溶化し、抗原提示細胞に導入した場合には疾病抗原特異的ＣＴＬを誘導できる事を見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の（１）から（４２）の通りである。【００１９】
（１）不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法であって、
不溶性蛋白質及び／又はペプチドと変性剤とを同一の溶液中で混合し、不溶性蛋白質及び／又はペプチドを溶解させ、不溶性蛋白質及び又はペプチドの溶液を作製する工程、
該溶液にヌクレオチドを添加する工程、および
該溶液から変性剤を除去する工程
を含む、不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法；
（２）前記ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドである（１）に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法；  
（３）前記ヌクレオチドを構成する塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルのいずれかであり、前記ヌクレオチドの１種又は２種以上を組み合わせて添加する（１）又は（２）に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法；
（４）前記ヌクレオチドを構成するリン酸基の数が、１〜３である（１）乃至（３）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法；
（５）前記ヌクレオチドが、不溶性蛋白質及び／又はペプチドと変性剤とを混合した後又は同時に添加される（１）乃至（４）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法；
（６）前記溶液から変性剤を除去する工程において、該溶液を生理的溶媒に置換しながら変性剤を除去し、好ましくは該生理的溶媒がヌクレオチドを含む（１）乃至（５）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法； 
（７）前記不溶性蛋白質及び／又はペプチドが、天然由来の蛋白質及び／又はペプチド、遺伝子組み換え技術によって作製される蛋白質及び／又はペプチド、又は化学合成した蛋白質及び／又はペプチドである（１）乃至（６）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法；
（８）前記不溶性蛋白質及び／又はペプチドが、抗原蛋白質である（１）乃至（７）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法；
（９）前記変性剤が、尿素及び／又はグアニジン塩酸である（１）乃至（８）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法；
（１０）前記不溶性蛋白質及び／又はペプチドと変性剤とを同一の溶液中で混合する工程において、さらに還元剤を添加する（１）乃至（９）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法；
（１１）前記還元剤が、ジチオレイストールまたは２−メルカプトエタノールである（１）乃至（１０）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法；【００２０】
（１２）不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞内への導入方法であって、
不溶性蛋白質及び／又はペプチドと変性剤とを同一溶液中で混合し、不溶性蛋白質及び／又はペプチドを溶解し、不溶性蛋白質及び／又はペプチドの溶液を作製する工程、
該溶液にヌクレオチドを添加する工程、
該溶液を、生理的溶媒に置換しながら変性剤を除去し、該不溶性蛋白質及び／又はペプチドの生理的溶液を作製する工程、および
該生理的溶液を所望の細胞の細胞質及び/又は細胞内へ導入する工程、
を含む、不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法；
（１３）ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドである（１２）に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法；
（１４）前記ヌクレオチドを構成する塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルのいずれかであり、前記ヌクレオチドの１種又は２種以上を組み合わせて添加する（１２）又は（１３）に記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法；
（１５）前記ヌクレオチドを構成するリン酸基の数が、１〜３である（１２）乃至（１４）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法；
（１６）前記ヌクレオチドが、不溶性蛋白質及び／又はペプチドと変性剤とを混合した後又は同時に添加される（１２）乃至（１５）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法；
（１７）蛋白質及び／又はペプチドの溶液の置換に用いる前記生理的溶媒が、ヌクレオチドを含む（１２）乃至（１６）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法；
（１８）前記細胞が、抗原提示機能を有する細胞である（１２）乃至（１７）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法；
（１９）前記抗原提示機能を有する細胞が、樹状細胞である（１２）乃至（１８）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法；
（２０）前記不溶性蛋白質及び／又はペプチドが、天然由来蛋白質及び／又はペプチド、遺伝子組み換え技術によって作製される蛋白質及び／又はペプチド、又は化学合成した蛋白質及び／又はペプチドである（１２）乃至（１９）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法；
（２１）前記不溶性蛋白質及び／又はペプチドが、抗原蛋白質及び／又はペプチドである（１２）乃至（２０）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法；
（２２）前記変性剤が、尿素及び／又はグアニジン塩酸である（１２）乃至（２１）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法；
（２３）前記不溶性蛋白質及び／又はペプチドと変性剤とを同一の溶液中で混合する工程において、さらに還元剤を添加する（１２）乃至（２２）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法；
（２４）前記還元剤が、ジチオレイストール又は２−メルカプトエタノールである（１２）乃至（２３）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法；
（２５）前記可溶化した不溶性蛋白質及び／又はペプチドが、エレクトロポレーション法により細胞質及び/又は細胞内へ導入される（１２）乃至（２４）のいずれか１つに記載の不溶性蛋白質及び／又はペプチドの細胞への導入方法；【００２１】
（２６）不溶性抗原を提示する抗原提示細胞を作製する方法であって、
不溶性抗原と変性剤とを同一溶液内で混合し、不溶性抗原を溶解し、不溶性抗原を含む溶液を作製する工程、
該溶液にヌクレオチドを添加する工程、
該溶液を、生理的溶媒に置換しながら変性剤を除去し、不溶性抗原を含む生理的溶液を作製する工程、および
該不溶性抗原を含む生理的溶液を抗原提示細胞質及び/又は細胞内に導入する工程、
を含む抗原提示細胞の作製方法；
（２７）前記ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドである（２６）に記載の抗原提示細胞の作製方法；
（２８）前記ヌクレオチドを構成する塩基が、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルのいずれかであり、前記ヌクレオチドの１種又は２種以上を組み合わせて添加する（２６）又は（２７）に記載の抗原提示細胞の作製方法；
（２９）前記ヌクレオチドを構成するリン酸基の数が１〜３である（２６）乃至（２８）のいずれか１つに記載の抗原提示細胞の作製方法；
（３０）抗原の溶液の置換に用いる前記生理的溶媒が、ヌクレオチドを含む（２６）乃至（２９）のいずれか１つに記載の抗原提示細胞の作製方法；
（３１）前記抗原が腫瘍細胞、腫瘍組織、感染症細胞または病原性細胞の破砕物から得られる不溶性画分である（２６）乃至（３０）のいずれか１つに記載の抗原提示細胞の作製方法；
（３２）前記抗原が、蛋白質又はペプチドである（２６）乃至（３１）のいずれか１つに記載の抗原提示細胞の作製方法；
（３３）前記抗原が、天然由来蛋白質及び／又はペプチド、遺伝子組み換え技術によって作製される蛋白質及び／又はペプチド、又は化学合成した蛋白質及び／又はペプチドである（２６）乃至（３２）のいずれか１つに記載の抗原提示細胞の作製方法；
（３４）前記抗原提示細胞が、樹状細胞である（２６）乃至（３３）のいずれか１つに記載の抗原提示細胞の作製方法；
（３５）前記変性剤が、尿素及び／又はグアニジン塩酸である（２６）乃至（３４）のいずれか１つに記載の抗原提示細胞の作製方法；
（３６）前記不溶性蛋白質及び／又はペプチドと変性剤とを同一の溶液中で混合する工程において、さらに還元剤を添加する（２６）乃至（３５）のいずれか１つに記載の抗原提示細胞の作製方法；
（３７）前記還元剤が、ジチオレイストールまたは２−メルカプトエタノールである（２６）乃至（３６）のいずれか１つに記載の抗原提示細胞の作製方法；
（３８）（２６）乃至（３７）のいずれか１つに記載の作製方法により作製された抗原提示細胞；
（３９）（２６）乃至（３７）のいずれか１つに記載の作製方法により作製された抗原提示細胞をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法； 
（４０）（２６）乃至（３７）のいずれか１つに記載の作製方法により作製された抗原提示細胞をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、がん及び／又は感染症の治療もしくは予防方法；
（４１）（２６）乃至（３７）のいずれか１つに記載の作製方法により作製された抗原提示細胞を有効成分とする、細胞傷害性Ｔ細胞誘導用組成物；および
（４２）（２６）乃至（３７）のいずれか１つに記載の作製方法により作製された抗原提示細胞を有効成分とする、がん及び／又は感染症の治療もしくは予防用組成物。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の可溶化方法により、天然の蛋白質や組み換え蛋白質等の不溶性蛋白質を可溶化することができる。また、可溶化した蛋白質を用いることでエレクトロポレーション法により細胞質内へ直接導入することができる。本発明の具体的な利用方法としては、不溶性抗原を提示する抗原提示細胞の作製方法、免疫反応医薬品の作製及び試薬の調製等への応用や可溶化したタンパク質抗原を含む蛋白質ワクチン、ペプチドワクチン又は、樹状細胞ワクチン等の医薬を提供することが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、アルギニン、ヌクレオチド、その両方を添加してＴＲＰ−２融合蛋白質の可溶化を行い、上清及び沈殿に含まれるＴＲＰ−２融合蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した結果を示す図である。
【図２】図２は、４種のヌクレオチドをそれぞれ、又は組み合わせて添加してＴＲＰ−２の可溶化を行い、上清及び沈殿に含まれるＴＲＰ−２をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した結果を示す図である。
【図３】図３は、リボヌクレオチド（ＧＴＰ）又はデオキシリボヌクレオチド（ｄＧＴＰ）を添加してＴＲＰ−２の可溶化を行い、上清及び沈殿に含まれるＴＲＰ−２をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した結果を示す図である。
【図４】図４は、ＧＭＰ又はＧＴＰを添加してＴＲＰ−２の可溶化を行い、上清及び沈殿に含まれるＴＲＰ２をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した結果を示す図である。
【図５】図５は、ＵＭＰ又はＵＴＰを添加してＴＲＰ−２の可溶化を行い、上清及び沈殿に含まれるＴＲＰ２をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した結果を示す図である。
【図６】図６は、ＵＭＰを添加してＴＲＰ−２を可溶化し、ｐＨの異なる溶液を用いて透析を行い、上清及び沈殿に含まれるＴＲＰ−２をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した結果を示す図である。
【図７】図７ａは、ヒトメラノーマ細胞株ホモジネートの可溶性画分（Ｓ）と不溶性画分（Ｐ）をウエスタンブロッティングで解析した際に転写されずにゲルに残っている蛋白質をＣＢＢ染色した結果を示す図である。図７ｂは、抗ＭＡＲＴ−１抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【図８】Ｍｅｗｏ不溶性画分を本発明の可溶化方法により可溶化し、抗ＭＡＲＴ−１抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【図９】図９は、ＵＭＰを用いてマウスメラノーマ（Ｂ１６）のホモジネート沈殿画分を可溶化し、上清又は沈殿に含まれる蛋白質の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した結果を示す図である。
【図１０】図１０は、ＵＭＰを用いてヒト乳がん（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）のホモジネート沈殿画分を可溶化し、上清又は沈殿に含まれる蛋白質の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した結果を示す図である。
【図１１】図１１は、ＵＭＰを用いてヒト前立腺がん（ＤＵ１４５）のホモジネート沈殿画分を可溶化し、上清又は沈殿に含まれる蛋白質の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した結果を示す図である。
【図１２】図１２は、樹状細胞誘導後の表現型をＣＤ１１ｂ／ＣＤ１１ｃ及びＣＤ８０／ＣＤ８６抗体にて解析した図である。
【図１３】図１３は、テトラマー解析によるＴＲＰ−２に特異的なＣＴＬ誘導効果の確認を行った図である。
【図１４】図１４ａは、Ｂ１６のＨ−２Ｋｂ及びＨ−２Ｄｂの発現を確認した図である。図１４ｂは、Ｂ１６のライゼート（可溶性画分：ｓｕｐ）または可溶化不溶性画分（ｐｐｔ）をエレクトロポレーションでＤＣに導入し、そのＤＣで免疫されたマウス体内でＢ１６のがん抗原を特異的に認識するＣＴＬが誘導されたかを、Ｔｅｒａｓｃａｎ  ＶＰシステムを用いた細胞傷害活性の測定により確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を実施する為の形態を説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、様々なる態様で実施しうるものである。
【００２５】
不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法
まず、本発明に係る不溶性蛋白質及び／又はペプチドの可溶化方法（以下「本発明の可溶化方法」とも言う）について説明する。
本明細書において「不溶性」とは、蛋白質の特性を説明するためのものであり、室温において、液体に溶解して均一な混合液を形成せず、特に水または生理的溶媒に溶解できないもしくは溶解しにくいという特性を指す。本明細書に説明する種類の不溶性の天然型蛋白質は、その蛋白質が水、水および塩、水およびその蛋白質を変性しない生理的溶媒中にある際、１５，１００×ｇで一時間遠心（遠心）した後に、その蛋白質が上清に実質的に存在しない場合に、あるいはその蛋白質の少なくとも５０％、望ましくは７５％以上、より望ましくは１００％が上清に存在しない場合に、不溶性と呼ぶ。
【００２６】
ここでいう「蛋白質」とは、ペプチド、ポリペプチド等を含み、自然界に存在する天然由来の蛋白質に限定されず、遺伝子導入等により形質転換した細胞由来の組み換え蛋白質、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで無細胞蛋白発現系を用いて発現させた蛋白質、また、有機合成化学的に作製する合成蛋白質も含まれる。また、蛋白質を構成するアミノ酸の一部又は全部がアセチル化、リン酸化、メチル化等の官能基が付加されたもの、糖鎖、蛋白質、脂質等で修飾されたものであっても構わない。なお、本明細書、請求の範囲及び要約書においては、不溶性ペプチドも本発明の対象であることをより明確にするために、「不溶性蛋白質及び／又はペプチド」と、蛋白質とペプチドを併記することもある。
【００２７】
ここでいう「不溶性蛋白質」とは、室温において、水や生理的溶媒中に攪拌しても溶解せずもしくは溶解しにくく、例えば変性剤を用いることで溶解しても、生理的溶媒に置換すると沈殿を生ずる蛋白質を指す。また、元来天然型が可溶性の蛋白質であっても、組み換え蛋白質として異種生物を用いて発現させた場合（例えば、遺伝子組み換え技術を用いて大腸菌での発現系を構築した場合等）、目的蛋白質はインクルージョンボディ（封入体）として回収される場合、その目的蛋白質も不溶性蛋白質と言う。
【００２８】
例えば、腫瘍組織又は腫瘍細胞の破砕物に含まれる不溶性蛋白質として、膜貫通構造を有する膜蛋白質があげられる。膜蛋白質は親水性部分と疎水性部分を有するため、不溶性画分に回収されることが一般に知られている。膜蛋白質にはがん抗原として知られている分子があり、これら蛋白質を可溶化し、免疫細胞療法に用いることは極めて重要である。例えば、腫瘍組織や腫瘍細胞の破砕物に含まれる不溶性蛋白質としてはＭＡＲＴ−１、ＰＳＭＡ、ＴＲＰ−２等が挙げられる。また、本来可溶性であった抗原蛋白質が変異することで、アミノ酸の組成が変化し、正常な構造をとれなくなり、不溶性となってしまうことも考えられる。前述のような現象は、プリオン（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００７；３２：９０−９６．）、スーパーオキサイドジスムターゼ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８；２８３：８６６−８７４．）、アルファＡ−クリスタリン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００８；４７：９６９７−９７０６．）等のタンパク質で確認されている。
【００２９】
本明細書において「可溶化」とは、不溶性蛋白質を、アミノ酸配列を維持したまま生理的溶媒中に溶解させることをいい、変性剤によって溶解した不溶性蛋白質を含む溶液を生理的溶媒に置換し、遠心した際に、該不溶性蛋白質が遠心後に上清に回収される量を増加させることをいう。
【００３０】
本発明の可溶化方法に用いられるヌクレオチドとは、塩基、糖、リン酸が結合した化合物である。糖の部分がＤ−２−デオキシリボースであるものをデオキシリボヌクレオチドといい、ＤＮＡを構成する成分である。また、糖の部分がリボースのものをリボヌクレオチドといい、ＲＮＡを構成する成分である。リン酸の部分には１つから３つのリン酸が結合している。塩基の部分はアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルが結合する。
【００３１】
本発明の可溶化方法では、デオキシリボヌクレオチドでもリボヌクレオチドでも用いることができる。また、ヌクレオチドに結合しているリン酸の数も１つから３つのいずれであっても構わない。ヌクレオチドを構成する塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルのいずれの塩基が結合したヌクレオチドでも使用することができるが、構成する塩基、可溶化する蛋白質によって可溶化の効率が異なるため、いずれか１種又は２種以上を組み合わせて添加することが望ましい。例えば、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ；ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの混合物）等が挙げられる。
【００３２】
本発明の可溶化方法に用いられる変性剤は、一般的に尿素、グアニジン塩酸、界面活性剤等で、不溶性の立体構造を形成しているイオン結合、水素結合、疎水性相互作用等を切断する性質を持つものを指す。それら変性剤は、水溶液に溶解した状態で用いられ、例えば、ｐＨ調整が可能なリン酸ナトリウム水溶液等の緩衝液が好ましい。
【００３３】
本発明の可溶化方法に用いられる還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）等で、不溶性の立体構造を形成しているジスルフィド結合を切断する性質のものを指す。これら還元剤は予め変性剤と混合して用いても、異なる溶媒に溶解して用いても構わない。
【００３４】
本発明の可溶化方法において、変性剤を含む蛋白質の溶液から変性剤を除去する方法としては、透析やゲルろ過により溶媒を置換する方法等があげられる。特に、操作の簡便さから透析を行うことが好ましい。置換するために用いる溶媒は変性剤を含まない溶媒であればよく、例えば、水や生理的溶媒等を用いることができる。特に、蛋白質の溶液を細胞の培養液に添加する場合や、生体に投与する場合には、生理的溶媒で置換することが好ましく、例えば、生理的溶媒としてはＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）や生理食塩水等が好ましい。また、生理的溶媒にヌクレオチドを添加しておくとさらに効率よく不溶性蛋白質を可溶化することができる。生理的溶媒に添加するヌクレオチドの濃度は１０μＭ程度であることが好ましい。
【００３５】
本発明の可溶化方法は対象とする蛋白質の由来によって実施形態が異なる。
例えば、ａ）天然由来の蛋白質として、腫瘍組織及び細胞から得られた蛋白質を可溶化する場合、
ａ−１）組織を細分化し、凍結融解を繰り返す事により細胞を破壊する、または超音波等で粉砕し、遠心により上清（可溶性画分）と沈殿（不溶性画分）に分画する。
ａ−２）回収した沈殿を変性剤、例えば４Ｍ〜８Ｍの尿素等により溶解する。溶解しにくい場合には還元剤、例えばＤＴＴまたは２ＭＥ等を添加してもよい。
ａ−３）還元剤を添加した場合には、酸化型グルタチオン等を加えるのが好ましい。
ａ−４）変性剤により不溶性蛋白質を可溶化させた状態でヌクレオチドを添加する。ヌクレオチドの量は終濃度が０．５ｍＭ〜１０ｍＭとなるように添加することが好ましい。
ａ−５）１０μＭ程度のヌクレオチドを含む生理的溶媒で透析し、変性剤等を除去する。
【００３６】
例えば、ｂ）真核細胞や菌体等を利用して発現させた不溶性の組み換え蛋白質等を可溶化する場合、
ｂ−１）超音波等により細胞または菌を破砕し遠心することにより不溶性画分を分取し、不溶性蛋白質を回収する。
ｂ−２）回収した不溶性蛋白質を変性剤、例えば４Ｍ〜８Ｍの尿素等により溶解する。溶解しにくい場合には還元剤、例えばＤＴＴ又は２ＭＥ等を添加する。
ｂ−３）クロマトグラフィーシステムにて目的蛋白質の精製を行う。溶媒に影響されること無く、目的とする蛋白質を抽出できるものであれば何であってもよく、例えば、蛋白質特異的な抗体によるアフィニティークロマトグラフィー、若しくは蛋白質にヒスチジンタグ等が付加されている場合にはニッケルアフィニティークロマトグラフィー等が好ましい。
ｂ−４）さらに精製を行う場合、例えば分子排斥クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等（これらに高速液体クロマトグラフィーを組み合わせてもよい）、目的とする蛋白質の性質及び溶媒に合わせた精製方法を用い、蛋白質の精製を行う。
ｂ−５）精製前、精製中、または精製された蛋白質溶液に還元剤を添加する。精製後に添加する場合には、添加後１時間程度室温で静置して還元反応を行う。還元剤としては、ＤＴＴ等が好ましい。
ｂ−６）還元剤を含まない変性剤溶液で透析して、余分な還元剤を除く。
ｂ−７）酸化型グルタチオン（必要に応じて還元型グルタチオン）等を加えるのが好ましい。
ｂ−８）ヌクレオチドを添加し、室温で一時間静置する。ヌクレオチドの量は終濃度が０．５ｍＭ〜１０ｍＭとなるように添加することが好ましい。
ｂ−９）１０μＭ程度のヌクレオチドを含む生理的溶媒で透析し、変性剤等を除去する。
【００３７】
例えば、ｃ）不溶性の合成蛋白質を可溶化する場合、
ｃ−１）アミノ酸及びランダムに結合したペプチド断片を含む合成蛋白質溶液から、高速液体クロマトグラフィー等で目的の不溶性蛋白質を回収する。
ｃ−２）回収された不溶性蛋白質を変性剤、例えば４Ｍ〜８Ｍの尿素等により溶解する。溶解しにくい場合には還元剤、例えばＤＴＴ又は２ＭＥ等を添加する。
ｃ−３）還元剤を添加した場合には、酸化型グルタチオン等を加えるのが好ましい。
ｃ−４）変性剤により不溶性蛋白質を可溶化させた状態でヌクレオチドを添加する。ヌクレオチドの量は終濃度が０．５ｍＭ〜１０ｍＭとなるように添加することが好ましい。
ｃ−５）１０μＭ程度のヌクレオチドを含む生理的溶媒で透析し、変性剤等を除去する。
【００３８】
このようにして生理的溶媒に溶解された蛋白質及び／又はペプチドは不溶性の状態と異なり、フィルターを用いたろ過による滅菌が行えるため、場合によってはワクチンとして患者に投与することが可能となる。
【００３９】
不溶性蛋白質の細胞への導入方法について
次いで、本発明の不溶性蛋白質の細胞への導入方法について説明する。上記した本発明の可溶化方法によって可溶化した不溶性蛋白質をエレクトロポレーション法等により細胞質内及び／又は細胞内へ導入し、抗原提示細胞を作製することが可能となる。
【００４０】
上記した本発明の可溶化方法により、不溶性蛋白質を生理的溶媒に溶解する。生理的溶媒に溶解することにより、蛋白質導入時または導入後に、溶媒の毒性で細胞が死滅する、活性が低下するといった不具合が生じにくくなる。
本発明の細胞への導入方法において、生理的溶媒に溶解した不溶性蛋白質を導入する方法としては一般に利用される様々な技術が利用できるが、例えばエレクトロポレーション法が挙げられる。
【００４１】
本発明の導入方法において、可溶化した不溶性蛋白質をエレクトロポレーション法によって抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）に導入した場合、導入された蛋白質及び／又はペプチドはＭＨＣクラスＩに提示され、ＣＴＬを誘導することができる。また、ペプチドの一部はクロスプレゼンテーションによりＭＨＣクラスＩＩにも提示され、Ｔｈ細胞を活性化する。ＭＨＣクラスＩＩに提示された抗原で活性化されたＴｈ１細胞は細胞性免疫に必要なサイトカインを産生し、ＣＴＬの誘導を促す。
【００４２】
エレクトロポレーション法とは、細胞に対して電気パルスを与えると一過的に原核・真核細胞の膜が破断する物理的原理を応用した導入法である。例えば、細胞培養液中に抗原蛋白質等を添加した状態で、電気パルスを与えることにより、拡張した細胞膜の穴から細胞質内へ直接、可溶化蛋白質を導入することができる。
【００４３】
培養しておいた細胞の培養液を、血清を含まない培地やＰＢＳ等に置換し、１ｘ１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度に調製する。細胞懸濁液に蛋白質の溶液を添加し、この細胞懸濁液をキュベットに入れ、エレクトロポレーション機本体に接続されている電極にセットする。速やかに通電し、５倍容以上の培養用培地等の中に回収する。その後最低一時間の培養を行い、目的の用途にする。
【００４４】
可溶化した蛋白質及び／又はペプチドを導入した樹状細胞を医学的に許容される溶媒（例えば、生理食塩水）に懸濁すれば、樹状細胞ワクチンとして患者に投与することが可能である。
【００４５】
次いで、本発明の抗原提示細胞の作製方法について説明する。
【００４６】
本発明の抗原提示細胞の作製方法において、使用する生理的溶媒に不溶性の抗原は、例えば、腫瘍組織又は腫瘍細胞の破砕物から取得した不溶性画分、ウイルスに感染した感染症細胞の破砕物から取得した不溶性画分、病原性細菌の破砕物から取得した不溶性画分、人工的に合成した不溶性蛋白質又はペプチド等が挙げられる。特に腫瘍組織又は腫瘍細胞の破砕物から取得した不溶性画分ウイルスに感染した感染症細胞の破砕物から取得した不溶性画分、病原性細菌の破砕物から取得した不溶性画分には腫瘍組織又は腫瘍細胞、感染症細胞、病原性細菌に特異的に発現する不溶性蛋白質抗原が含まれている。それらを可溶化して抗原提示させることで従来のように上清のみでＣＴＬを誘導していた場合に比べ、高い抗腫瘍活性、抗（ウイルス）感染症活性、抗病原性細菌活性の誘導が期待される。
【００４７】
不溶性抗原と変性剤（例えば、４Ｍ〜８Ｍの尿素等）を同一溶液内で混合し、不溶性抗原を含む溶液を作製する。必要に応じて、還元剤としてＤＴＴや２ＭＥを添加する。次いで、不溶性抗原を含む溶液にヌクレオチドを添加する。
【００４８】
不溶性抗原を含む溶液を、生理的溶媒に置換し、変性剤を除去する。これにより不溶性抗原を含む生理的溶液が得られる。
【００４９】
不溶性抗原を含む生理的溶液を抗原提示細胞内（例えば、樹状細胞内）に導入する。導入する方法としては直接細胞質内に導入する方法が好ましく、例えばエレクトロポレーション法などがあげられる。
【００５０】
このようにして作製された抗原提示細胞は、導入された抗原を細胞内で分解し、ＭＨＣクラスＩに提示するため、その抗原に対する特異的なＣＴＬを誘導することができる。特に蛋白質を導入した場合には配列中に含まれる複数のエピトープが提示されるため、その抗原に対する複数のタイプのＣＴＬを活性化することができる。また、ＭＨＣクラスＩＩのエピトープも提示されるため、Ｔｈ１細胞が活性化され、さらにＣＴＬの活性化を促進することができる。
従って、このように作製された抗原提示細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞誘導方法、細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤、がん及び/又は感染症予防もしくは治療方法、がん及び/又は感染症予防もしくは治療剤に用いることができる。より具体的には、例えば、がん患者から採取した腫瘍組織または腫瘍細胞の破砕物から不溶性画分を取得し、あるいは、ウイルス感染症患者と同じウイルスの破砕物から不溶性画分を取得し、または病原性細菌感染症患者と同じ病原性細菌の破砕物から不溶性画分を取得し、それらの不溶性画分を、本発明の可溶化方法に付して、可溶化させ、可溶化させたものを、同じ患者から採取したリンパ球や樹状細胞などの抗原提示細胞に添加して培養して抗原提示細胞を誘導し、誘導した抗原提示細胞を同じ患者に投与することによって、腫瘍細胞、ウイルスまたは病原性細菌に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するこができ、それによって、がんやウイルス感染症などの疾患の予防もしくは治療を行うことができる。また、組換え蛋白質や合成蛋白質などを、本発明の可溶化方法に付して、可溶化させ、可溶化させたものを、患者から採取したリンパ球や樹状細胞などの抗原提示細胞に添加して培養して抗原提示細胞を誘導し、誘導した抗原提示細胞を、同じ患者に投与することもできる。誘導された抗原提示細胞は、通常の方法によって患者に投与すればよく、例えば、そのまま患者に投与してもよく、通常の注射剤などの製剤の形態にして投与してもよく、また、通常のワクチン製剤として投与してもよい。また、抗原提示細胞の投与量は、患者の症状や疾患の種類などにより、予防のためには、予防しようとする疾患、対象者などに応じて任意に決めることができる。また、作製した抗原提示細胞を利用して、患者から採取したリンパ球と抗原提示細胞を混合培養し、体外でＣＴＬを誘導することもできる。
【実施例１】
【００５１】
＜ヌクレオチドの有効性の検討＞
不溶性蛋白質として組換え型マウスＴｙｒｏｓｉｎａｓｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２（以下、ＴＲＰ−２ともいう）を用いて、ヌクレオチドによる可溶化方法の検討を行った。
まず、Ｎ末端にヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）が付加された、ユビキチン断片（以下、Ｕｂｉともいう）とＴＲＰ−２からなる組換え型融合蛋白質（以下、ＵＴともいう）を作製した。Ｕｂｉは配列番号１のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを単離、ＴＲＰ−２はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースのＡＣ  Ｎｏ．Ｐ２９８１２に記載のアミノ酸配列に基づき、Ｎ末端から５６残基目のグルタミン酸（Ｅ）から４７２残基目のセリン（Ｓ）までをコードするｃＤＮＡを単離し、ｐＥＴ１９ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入して発現プラスミドとした（ｐＥＴ１９ｂ／ＵＴ）。ｐＥＴ１９ｂ／ＵＴで大腸菌（Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ：Ｎｏｖａｇｅｎ社、＃７１３５２−３）を形質転換し、組換え蛋白質を発現させた場合、ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｕｂｉ−ＴＲＰ−２−ＣＯ２Ｈという配列（配列番号２）の融合蛋白質（ＵＴ蛋白質）が産生されるが、インクルージョンボディ（封入体）を形成し不溶性であった。【００５２】
ＵＴ蛋白質を発現させた大腸菌を、プロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、Ｒｏｃｈｅ社、＃０４  ６９３  １３２  ００１）を添加したＰＢＳに懸濁させ、超音波装置で破壊した後、Ｍ−Ｘ１００遠心機、ＴＭＰ−１１ローター（ＴＯＭＹ）で１５，１００×ｇ、４℃、１時間の遠心分離を行った。【００５３】
遠心分離後の不溶性画分（沈殿）を４Ｍ尿素／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁させ、１時間室温で撹拌し、１５，１００×ｇ、４℃、１時間の遠心分離を行った。
この遠心分離後の不溶性画分（沈殿）を
１）８Ｍ尿素／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ＤＴＴ／２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）に溶解し、
２）ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  液体クロマトグラフィーシステム（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｓｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、ニッケルアフィニィティー（Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  ＨＰカラム、ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｓｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ、＃１７−５２４７−０１）と、
３）６Ｍ尿素／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  ＤＴＴ／２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）を使用して、ゲルろ過クロマトマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２  ＨＲカラム、ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｓｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ、＃１７−０５３８−０１）で組換え蛋白質の部分精製を行った。【００５４】
ゲルろ過精製後のサンプルに、５ｍＭになるようにＤＴＴを添加して１時間反応後、６Ｍ尿素／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）で透析を行い、未反応のＤＴＴを除いた。【００５５】
以上の行程によって蛋白質サンプルを得た。しかし、上記行程で得られた蛋白質サンプルは変性剤を含んだ状態であり、このままでは細胞に導入する等の目的では使用できないため、生理的な溶媒に交換する必要があった。そこで、４〜１０の工程により、蛋白質を生理的溶媒中に溶解することを試みた（以下、生理的な溶媒中に蛋白質を溶解させることを可溶化という）。アルギニンを添加する方法は公知の技術であり、コントロールとして行った。【００５６】
４）３）で得られた蛋白質サンプルに、グルタチオン（ＧＳＳＧ）を添加し、酸化還元反応を行った。
５）添加剤（アルギニン又はｄＮＴＰ）を添加し、室温で１時間反応。
６）グリセロール添加（１０％）。
７）生理的な溶媒で透析（ＰＢＳ等）。
８）サンプル回収、１５，１００×ｇ、４℃で１時間遠心。
９）上清（可溶性画分）、沈殿（不溶性画分）を分離し回収。
１０）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で可溶化効率を解析。【００５７】
４〜１０の工程を具体的に説明する。６Ｍ尿素／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）に溶解しているＵＴサンプルに２ｍＭ  ＤＴＴを加え、室温で一時間静置した後、余分なＤＴＴを除くため、６Ｍ尿素／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）で透析した。このサンプルを３本のサンプルチューブ（１）、（２）、（３）に分注し、すべてのチューブに、２．５ｍＭ酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を加えた（各濃度は終濃度である）。さらに（３）のチューブにのみアルギニン（Ｌ（＋）Ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ｗａｋｏ、＃０１５−０４６１７）を終濃度１２５ｍＭとなるように加え、すべてのチューブを１時間静置した。その後、アルギニンを加えた（３）のチューブと、（２）のチューブに１０％グリセロール（終濃度）を加えた。これら３種の反応液を別々に、１０％グリセロール／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（ｐＨ８．４）で透析を行い、溶媒を置換した。この透析操作によって不溶性の蛋白質が生じることから、１５，１００×ｇ、１０℃、１時間の遠心を行い、上清と沈殿に分画した（可溶化できていない蛋白質は沈殿に回収され、可溶化できた蛋白質は上清に回収される）。【００５８】
上清には２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（トリスＳＤＳ−２ＭＥサンプル処理液：第一化学薬品、＃４２３４３７）を加え、沈殿画分は上清と同量の１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に溶解させ、等量ずつＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後にクーマシーブリリアントブルーＧ２５０染色液で染色して上清と沈殿に回収されている蛋白質の量を見積もった。図１及び表１中（１）、（２）、（３）に示してあるように、いずれも可溶性画分には蛋白質が回収されていなかった。表１に示す可溶化の割合は、クーマシーブリリアントブルーで染色したゲルをＧｅｌ  Ｄｏｃ  ２０００（ＢＩＯ  ＲＡＤ社）のＣＣＤカメラで画像として取り込み、ａ、ｂの各バンドの面積と濃度を乗じて数値化（ｖ）し、下記の計算により可溶化の割合を求めた。ｂのバンドはａの分解産物である。
可溶化の割合（％）＝Ｓ（ｖ）×１００／Ｓ（ｖ）＋Ｐ（ｖ）
Ｓ（ｖ）：上清のバンドａの面積×濃度＋上清のバンドｂの面積×濃度
Ｐ（ｖ）：沈殿のバンドａの面積×濃度＋沈殿のバンドｂの面積×濃度【００５９】
６Ｍ尿素／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）に溶解している同一の蛋白質を用いて、アルギニンの替わりにｄＮＴＰ（ｉｌｌｕｓｔｒａ  ｄＮＴＰ  Ｓｅｔ、１００ｍＭ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２７−２０３５−０１）を終濃度１２．５ｍＭとなるように添加した場合と、１２．５ｍＭ  ｄＮＴＰと１２５ｍＭアルギニンを添加した場合の可溶化について検討を行った。他の操作は（１）−（３）と同様に行った。夫々の結果を図１及び表１中（４）と（５）に示した。ｄＮＴＰを加えた場合には上清に明らかなバンドが観察され、その割合は５０．８％であった。またｄＮＴＰとアルギニン（Ａｒｇ）を添加した場合も上清に明らかなバンドが観察されるが、その割合は２０．７％であった。【００６０】
【表１】
2010126081.tif 000002
【００６１】
以上の結果から、従来の方法では可溶化不可能な蛋白質がｄＮＴＰ添加によって可溶化できることが見出された。また、ｄＮＴＰを添加すればアルギニンの添加は不要と考えられた。
【実施例２】
【００６２】
＜ヌクレオチドの種類（塩基）の検討＞
不溶性蛋白質のモデルとして、組換え型マウスＴＲＰ−２（ｒＴＲＰ−２；配列番号３）を使用した。ｒＴＲＰ−２はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースのＡＣ  Ｎｏ．Ｐ２９８１２に記載のアミノ酸配列に基づき、Ｎ末端から５６残基目のグルタミン酸（Ｅ）から４７２残基目のセリン（Ｓ）までをコードするｃＤＮＡを単離し、ｐＥＴ１９ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入し発現プラスミドとした（ｐＥＴ１９ｂ／ｍｄＴ）。ｐＥＴ１９ｂ／ｍｄＴで大腸菌（Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ：Ｎｏｖａｇｅｎ社、＃７１３５２−３）を形質転換し、発現させるとＮ末端にヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を有する組換え蛋白質が得られる。この組換え蛋白質はインクルージョンボディを形成し、不溶性であった。この不溶性画分を８Ｍ尿素／ＰＢＳ／５ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨ８．５）または、８Ｍ尿素／ＰＢＳ／１０ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨ８．０）に溶解させ、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  液体クロマトグラフィーシステム（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｓｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、ニッケルアフィニィティー（Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  ＨＰカラム，ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｓｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ、＃１７−５２４７−０１）とゲルろ過クロマトマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ  ２６／６０Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００  ＨＲカラム、ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｓｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ、＃１７−１１９６−０１）で部分精製を行った。精製したサンプルの溶媒を生理的な緩衝液に置換する為、ＰＢＳで透析したが、ほぼ全量が沈殿した。【００６３】
６Ｍ尿素／ＰＢＳ／５ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨ８．５）に溶解しているｒＴＲＰ−２を５本のサンプルチューブに用意し、すべてのチューブに、２．５ｍＭ  還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と２．５ｍＭ  ＧＳＳＧを加えた。夫々のチューブには終濃度１０ｍＭでｄＡＴＰ（ｄＡ、Ｓｉｇｍａ、＃Ｄ６５００）、ｄＴＴＰ（ｄＴ、Ｓｉｇｍａ、＃Ｄ５２８８）、ｄＣＴＰ（ｄＣ、Ｓｉｇｍａ、＃Ｄ４６３５）、ｄＧＴＰ（ｄＧ、Ｓｉｇｍａ、＃Ｄ４０１０）若しくはｄＮＴＰを加え、すべてのチューブを１時間静置した。その後、夫々のチューブに１０％グリセロールを加え、別々に１０％グリセロール／ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で透析を行い、溶媒を置換した。その後１５，１００×ｇ、１０℃、１時間の遠心を行い、上清と沈殿に分画し、沈殿画分は８Ｍ尿素／ＰＢＳ（ｐＨ８．０）に溶解させた。以下、実施例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析を行った。【００６４】
図２に示したように、いずれの塩基を用いた場合でもｒＴＲＰ−２は可溶性画分に回収されていることが確認でき、なかでもｄＴとｄＧを添加した場合には蛋白質のほぼ全量が可溶化できたことが確認された。
【実施例３】
【００６５】
＜ヌクレオチドの種類（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド）の検討＞
６Ｍ尿素／ＰＢＳ／５ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨ８．５）に溶解しているｒＴＲＰ−２を６本のサンプルチューブに用意し、すべてのチューブに、２．５ｍＭ  ＧＳＨと２．５ｍＭ  ＧＳＳＧを加えた。夫々のチューブにＧＴＰ（Ｓｉｇｍａ，＃Ｇ８８７７）またはｄＧＴＰを２ｍＭ、１０ｍＭまたは５０ｍＭとなるように添加し、すべてのチューブを１時間静置した。その後、夫々のチューブに１０％グリセロールを加えた。１０％グリセロール／ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で透析を行い、溶媒を置換した。その後１５，１００×ｇ、１０℃、１時間の遠心を行い、上清と沈殿に分画し、実施例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析を行った。【００６６】
図３に示したように、２〜１０ｍＭのＧＴＰ及び２〜１０ｍＭのｄＧＴＰは約５０％が上清中に可溶化されて回収された。ところが、ＧＴＰとｄＧＴＰの濃度を５０ｍＭにするとほぼ全量が不溶性であり、沈殿画分に回収されてきた。以上から、添加するヌクレオチドは１０ｍＭ以下が適切と考えられ、リボ核酸を構成するヌクレオチドとデオキシリボ核酸を構成するヌクレオチドは同等の効果があることが明らかとなった。
【実施例４】
【００６７】
＜ヌクレオチドの種類（一リン酸、三リン酸）の検討（グアニンの例）＞
６Ｍ尿素／ＰＢＳ／５ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨ８．５）に溶解させたｒＴＲＰ−２（実施例３と同一）を６本のサンプルチューブに用意し、すべてのチューブに、２．５ｍＭ  ＧＳＨと２．５ｍＭ  ＧＳＳＧを加えた。夫々のチューブには１０ｍＭ  ＧＭＰ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｇ８３７７）、２ｍＭ  ＧＭＰ、０．５ｍＭ  ＧＭＰ、１０ｍＭ  ＧＴＰ、２ｍＭ  ＧＴＰ又は０．５ｍＭ  ＧＴＰを加え、すべてのチューブを１時間静置した。その後、夫々のチューブに１０％グリセロールを加えた。１０％グリセロール／ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で透析を行い、溶媒を置換した。その後１５，１００×ｇ、１０℃、１時間の遠心を行い、上清と沈殿に分画し、実施例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析を行った。【００６８】
図４に示したように、０．５〜１０ｍＭのＧＭＰ及び０．５〜２ｍＭのＧＴＰを添加した場合、ＴＲＰ−２のほぼ全量が上清中に可溶化されて回収された。１０ｍＭ  ＧＴＰでは一部が不溶性のまま回収されているが５０％以上が可溶性で回収されていた。以上から、ＧＭＰとＧＴＰでは適切な添加濃度域が異なるものの、いずれも同等の効果があることが明らかとなった。
【実施例５】
【００６９】
＜ヌクレオチドの種類（一リン酸、三リン酸）の検討（ウラシルの例）＞
本実施例は実施例２で可溶化の効率が高かったｄＴＴＰに対応したリボ核酸構成塩基ウラシルの効果の検討でもある。グアニンの例と同様に、ＧＭＰに替わりＵＭＰ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｕ６３７５）を、ＧＴＰに替わりＵＴＰ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｕ６６２５）を用いて実施例４と同様に検討を行った。【００７０】
図５に示したように、０．５〜１０ｍＭのＵＭＰ及び０．５〜２ｍＭのＵＴＰはほぼ全量のｒＴＲＰ−２が可溶化されて上清中に回収された。１０ｍＭ  ＵＴＰではｒＴＲＰ−２の一部が不溶性のまま回収されているが５０％以上が可溶性で回収されていた。以上から、ＵＭＰとＵＴＰでは適切な添加濃度域が異なるものの、いずれも同等の可溶化の効果があることが明らかとなった。実施例２と本検討により、ヌクレオチドはリン酸の数の異なるもの、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドのいずれも使用可能であることが明らかとなった。
【実施例６】
【００７１】
＜ｐＨの検討＞
６Ｍ尿素／ＰＢＳ／５ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨ８．５）に溶解させたｒＴＲＰ−２に、実施例５と同様に１０ｍＭ  ＵＭＰを添加したもの、及び添加していないものを用意して１時間反応させた後、ＵＭＰを添加したものは２等分して１０μＭ  ＵＭＰ／１０％グリセロール／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）若しくは（ｐＨ８．０）で、ＵＭＰを添加していないものは１０％グリセロール／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析した。回収したサンプルを１５，１００×ｇ、１０℃で１時間の遠心後、上清と沈殿に分け、沈殿画分は８Ｍ尿素−ＰＢＳに溶解させた。以下、実施例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析を行った。【００７２】
その結果、図６に示したようにｐＨ７．４で透析した場合、ＵＭＰ無添加では可溶性画分の蛋白質は検出されず、ほとんどが不溶性となって沈殿しているにもかかわらず、ＵＭＰを添加した場合には可溶性画分にも回収できることが明らかとなった。また、ｐＨを８．０にすると可溶化の効率が上昇することが判った。
【実施例７】
【００７３】
＜細胞由来天然不溶性蛋白質の定量＞
ヒトメラノーマ細胞株であるＭａｌｍｅ−３Ｍ、Ｍｅｗｏ及びＧ−３６１を夫々７５ｃｍ２培養フラスコで培養を行った。細胞が底面にいっぱいになった時点で、ＰＢＳで三回洗浄した。洗浄後スクレーパーで細胞を剥がし、１，０００×ｇ、５分間、４℃の遠心により沈殿として回収して、その湿重量を測定した。【００７４】
各湿重量から細胞が４００μＬ／１００ｍｇとなるように、再びＰＢＳの懸濁液とした。その後６回の凍結（−８０℃）融解（３０℃）を行い、１５，１００×ｇ、１時間、４℃で遠心（この遠心操作を以下、単に遠心と記す）し、上清（可溶性画分：Ｓ）と沈殿（不溶性画分：Ｐ）に分画した。上清はＢＣＡ法で、沈殿は上清と等容積の８Ｍ尿素−ＰＢＳに溶解させた後Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で蛋白定量を行なった。【００７５】
その結果を表２に示す。Ｍａｌｍｅ−３ＭとＧ−３６１では５０％以上の蛋白質が沈殿に回収されており、Ｍｅｗｏでは４７％の蛋白質が沈殿で回収された。従って、従来の樹状細胞（ＤＣ）の加工方法であるライゼートパルスＤＣを調製する際に使用されていた可溶性蛋白質は、細胞に含まれる総蛋白質量の５０％程度であることが確認された。【００７６】
【表２】
2010126081.tif 000003
【実施例８】
【００７７】
＜細胞由来天然不溶性蛋白質中のがん抗原の検出＞
これらの沈殿（不溶性）画分にどの程度のがん抗原が含まれているかを見積もる為、メラノーマのがん抗原として知られているＭＡＲＴ−１蛋白質を特異的に認識する抗体を用いたウエスタンブロッティングを行なった。先に得た各メラノーマ細胞株由来の上清と沈殿を等容積ずつＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離した。Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ  ＰＶＤＦ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社、＃１６２−０１７６）に転写後、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｉｎ  ＴＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、＃３７５３５）でブロッキングを行なった。その後、抗ヒトＭＡＲＴ−１単クローン抗体（ＭＡＲＴ−１  Ｍｏｕｓｅ  Ｍａｂ：ＳＰＲＩＮＧ社、＃Ｅ６７０４）、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ（Ｗｈｏｌｅ  Ａｂ：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、＃ＲＰＮ１００１−２ＭＬ）及びＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅコンジュゲート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、＃ＲＰＮ１２３４）を反応させ、基質であるＢＣＩＰ／ＮＢＴ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｗａｋｏ、＃５４７−０１９４１）により発色させた。各反応の前には０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳでＰＶＤＦ膜を洗浄した。【００７８】
その結果、ＭＡＲＴ−１のバンドはＭａｌｍｅ−３Ｍの上清には検出されず、Ｍｅｗｏ及びＧ−３６１の上清では微かに検出できる程度であった。また各細胞由来の沈殿には明瞭なＭＡＲＴ−１のバンドが確認された（図７）。以上の結果から、がん細胞の不溶性画分には相当量のがん抗原蛋白質が含まれていることが想定された。【００７９】
その不溶性画分に含まれる蛋白質を生理的な溶媒中で可溶化させることができれば、従来法で使用されていたライゼート中の蛋白質のみを使用する場合と比較して、より多量（かつ異質）のがん抗原蛋白質を樹状細胞にパルスできるようになると考えた。【００８０】
そこで、本発明の可溶化方法により、不溶性画分に含まれる蛋白質をどの程度可溶化できるか、以下に確認の実験を行なった。
【実施例９】
【００８１】
＜不溶性組換え蛋白質の可溶化＞
実施例４及び５より、ヌクレオチドの中でも特にＧＭＰとＵＭＰの可溶化効果は強く安定的であったことから、以下の実験で添加するヌクレオチドはこれら２種類に限定して行なった。【００８２】
８Ｍ尿素−ＰＢＳに溶解させたｒＴＲＰ−２を３本の試験管に等容積ずつ（１本の試験管には０．３６７ｍｇずつを含む）分けた。これらの試験管に終濃度２．５ｍＭのＧＳＳＧを加え、さらに１本の試験管には終濃度１０ｍＭのＧＭＰを、別の一本には終濃度１０ｍＭのＵＭＰを、もう１本の試験管には６Ｍ尿素−ＰＢＳを等容積加え、室温で一時間の反応を行なった。その後、反応液に５０％グリセロール、６Ｍ尿素−ＰＢＳを１／１０容積加えて、１０μＭの対応するヌクレオチド（ＧＭＰ、ＵＭＰまたはｎｏｎｅ）を含んだ１０％グリセロール−ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で透析した。回収したサンプルは遠心により上清と沈殿に分け、上清中に溶解している蛋白質（可溶化された蛋白質）量をＢＣＡ法で定量した。【００８３】
その結果を表３に示す。ヌクレオチドを添加しない場合では可溶性で回収されたｒＴＲＰ−２は８２．８％であるのに対し、ＧＭＰ添加では９７．２％、ＵＭＰ添加では１００％となっており、本発明の可溶化方法の有効性が確認された。【００８４】
【表３】
2010126081.tif 000004
【実施例１０】
【００８５】
＜細胞由来天然不溶性蛋白質の可溶化＞
実施例７と同様にＭｅｗｏ細胞の不溶性画分を得た。これを８Ｍ尿素−ＰＢＳに溶解させ、３本の試験管に等容積ずつ分けた（夫々の試験管中には１８２μｇの不溶性蛋白質が含まれることになる）。これらの試験管に終濃度１０ｍＭのＧＳＳＧを加え、さらに１本の試験管には終濃度１０ｍＭのＧＭＰを、別の一本には終濃度１０ｍＭのＵＭＰを、もう１本の試験管には６Ｍ尿素−ＰＢＳを等容積で加え、室温にて一時間の反応を行なった。その後、反応液に５０％グリセロール、６Ｍ尿素−ＰＢＳを１／１０容積加えて、１０μＭの対応するヌクレオチド（ＧＭＰ、ＵＭＰまたはｎｏｎｅ）を含んだ１０％グリセロール−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析した。回収したサンプルは遠心により上清と沈殿に分け、上清中に溶解している蛋白質量をＢＣＡ法で定量した。【００８６】
その結果を表４に示した。ヌクレオチドを添加しない場合では可溶性化されて上清に回収された蛋白質は３５．９％であるのに対し、ＧＭＰ添加では４５．８％（添加なしと比較した場合、Ｐ＜０．０２）、ＵＭＰ添加では５９．９％（添加なしと比較した場合、Ｐ＜０．０２）となっており、本発明の可溶化方法により可溶化効率が有意に上昇することが確認された。【００８７】
【表４】
2010126081.tif 000005
【００８８】
さらに、ここで得られた可溶化蛋白質の中にＭＡＲＴ−１が含まれているか、実施例８と同様にウエスタンブロッティングで見積もった。可溶化処理後の上清（Ｓ）と、上清と等容積の２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル処理液で溶解させた沈殿（Ｐ）を等容積ずつＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。以下、実施例８と同様の操作で、ＭＡＲＴ−１を検出した（図８）。またこの画像をＧｅｌ  Ｄｏｃ  ２０００（ＢＩＯ  ＲＡＤ社）で取込み、得られたバンドの濃度と面積の積により可溶化された割合を求めた。その結果、ＧＭＰ添加により可溶化を行なった場合には４６．６％が、ＵＭＰ添加により可溶化を行なった場合には４７．３％が上清（可溶性画分）に回収されていることが確認された。
【実施例１１】
【００８９】
組換え蛋白質での検討により、添加するヌクレオチドは一リン酸でも三リン酸でも同等の効果が確認されたが、天然の蛋白質での再現性を確認することとした。また実施例７ではヒト細胞由来の蛋白質で検討したため、今回はマウス細胞由来の不溶性蛋白質に一リン酸の一例としてＵＭＰを添加した実験系で検証を行った。【００９０】
Ｂ１６メラノーマをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養しておき、付着している細胞をＰＢＳ中でスクレーパーを利用し、剥がして回収した。７００×ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を棄て、細胞の沈殿を−８０℃で凍結した。その後、再度ＰＢＳを加え、凍結融解（６回）と超音波で破砕した。以下、実施例７と同様に操作し、Ｂ１６メラノーマの不溶性画分を変性剤によって溶解した溶液を作製し、ヌクレオチドとして１０ｍＭ  ＵＭＰを加えた。一時間後、１０μＭ  ＵＭＰ／１０％グリセロール／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析を行い、遠心後に上清と沈殿を回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び蛋白定量で解析し、その結果を図９及び表５に示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、透析後のヌクレオチドを添加していないもの（ＰＢＳ添加：図表中−）も、ＵＭＰを添加したもの（図表中＋）でも上清に蛋白質が観察されるが、蛋白定量でのｓｕｐ回収率では、（−）２７．６％に対して（＋）では４１．２％となっており、ＵＭＰ添加によって可溶化効率が上昇していると判断された。即ち、一リン酸のヌクレオチドも三リン酸のヌクレオチドと同様に、天然の不溶性蛋白質の可溶化に有効であることが確認された。【００９１】
【表５】
2010126081.tif 000006
【実施例１２】
【００９２】
更にＵＭＰを用いて、ヒト細胞由来の不溶性蛋白質の可溶化でも検証を行った。乳がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）と前立腺がん細胞株（ＤＵ１４５）を利用し、実施例７と同様に実験を行い、その結果を図１０、図１１及び表６に示した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１では、Ｓｕｐ回収率がＵＭＰ添加なしでは４０．０％であったが、ＵＭＰ添加では４５．０に、ＤＵ１４５では、Ｓｕｐ回収率がＵＭＰ添加なしでは１８．５％であったが、ＵＭＰ添加では２２．６％という結果になっており、いずれもＵＭＰ添加で可溶化の効率が上昇していた。
以上の結果から、不溶性蛋白質の可溶化にヌクレオチド添加が有効であることが確認された。【００９３】
【表６】
2010126081.tif 000007
【実施例１３】
【００９４】
＜マウスＤＣの誘導＞
本発明の方法によって可溶化させた蛋白質が、研究や医薬品開発に有用であることを確認する為、マウス樹状細胞を用いた抗原提示法への応用を試みた。非特許文献１（Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｍ．Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，ＶＯＬ．２８：５４２−５５０（２００５）．）では、生理的な溶媒に溶解しているがん細胞由来の可溶性蛋白質をエレクトロポレーション法で樹状細胞の細胞質内へ導入すると、導入された蛋白質が細胞内で断片化された後、ＭＨＣクラスＩに抗原ペプチドとして提示され、そのＤＣを投与された個体に免疫反応を誘導できることを示している。【００９５】
実施例２で作製した不溶性ｒＴＲＰ−２を利用し、可溶化した後、エレクトロポレーションでＤＣに導入することで実際に抗原提示されるかについて検証を行った。
８週齢で購入したＣ５７ＢＬ／６の雄をＳＰＦ環境で飼育しておき、９週目以降に骨髄細胞を採取した。採取した骨髄細胞をＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、０８７−０１１２ＤＫ）培地で培養用フラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で４−６時間静置後、浮遊細胞を除去した。付着細胞は１０ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、＃２１４−１４）と２０ｎｇ／ｍｌマウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、＃３１５−０３）を添加したＡＩＭ−Ｖで一日培養し、翌日、新鮮な同培地に交換した。さらに一日おきに培地交換を行い、付着細胞の培養を開始してから７日目までに自然に浮遊した細胞を成熟ＤＣとして使用した。【００９６】
成熟ＤＣの細胞表面抗原を確認した例を図１２に示した。ＣＤ１１ｃの解析は、ＰＥ  ａｎｔｉ−ＣＤ１１ｃ，Ｃｌｏｎｅ  Ｎ４１８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃１１７３０７）、及びＰＥ  Ａｒｍｅｎｉａｎ  Ｈａｍｓｔｅｒ  ＩｇＧ  Ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｃｌｏｎｅ  ＨＴＫ８８８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００９０７）で、ＣＤ１１ｂの解析はＦＩＴＣ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＣＤ１１ｂ，Ｃｌｏｎｅ  Ｍ１／７０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃１０１２０５）、及びＦＩＴＣ  Ｒａｔ  ＩｇＧ２ｂ，Ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｃｌｏｎｅ  ＲＴＫ４５３０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００６０５）で、ＣＤ８０の解析はＦＩＴＣ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＣＤ８０，Ｃｌｏｎｅ  １６−１０Ａ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃１０４７０５）、及びＦＩＴＣ  Ａｒｍｅｎｉａｎ  Ｈａｍｓｔｅｒ  ＩｇＧ  Ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｃｌｏｎｅ  ＨＴＫ８８８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００９０５）で標識し、ＣＤ８６の解析はＢｉｏｔｉｎ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＣＤ８６，Ｃｌｏｎｅ  ＧＬ−１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃１０５００３）、及びＢｉｏｔｉｎ  Ｒａｔ  ＩｇＧ２ａ，Ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｃｌｏｎｅ  ＲＴＫ２７５８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００５０３）で標識した後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＰＥ／Ｃｙ５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４０５２０５）で標識して、フローサイトメーター（ＣＹＴＯＭＩＣＳ  ＦＣ  ５００、ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）による解析を行った。【００９７】
図１２ａ）はＣＤ１１ｃとＣＤ１１ｂで展開したものであり、８２．３％がＣＤ１１ｃ陽性であることが判る。また、図１２ｂ）はＣＤ８０とＣＤ８６で展開したものであり、８１．６％がＣＤ８０陽性又はＣＤ８６陽性の細胞であることを確認した。以上のことから、使用した細胞が成熟ＤＣであることを確認した。【００９８】
＜エレクトロポレーション＞
培養７日目に回収したＤＣの培地をＸ−ＶＩＶＯ  ２０（タカラバイオ、＃０４−４４８Ｑ）に交換し、細胞数を数えた。生細胞数２×１０５ｃｅｌｌｓに対して、ＵＭＰまたはＧＭＰ添加で可溶化したｒＴＲＰ−２を１５０ｐｍｏｌｅになるように加え、全容を０．４ｍＬ、総細胞数が約１×１０６ｃｅｌｌｓになるように緩衝液で調製した。この際、培地の割合は最低でも７５％にした。この細胞懸濁液をＮＥＰＡキュベット電極２ｍｍ  ｇａｐ（ネッパジーン、＃ＥＣ−００２Ｓ）へ入れ、Ｅｌｅｃｔｒｏ  ｓｑｕａｒｅ  Ｐｏｒａｔｏｒ（ＢＴＸ，ＥＣＭ８３０）を用いて、５００ｖ、５００μｓｅｃ．でパルスした。パルス後、直ぐに５倍溶のＸ−ＶＩＶＯ  ２０で細胞を回収し、３７℃、５％ＣＯ２下、１時間静置した。静置後の生細胞率は概ね２０％であった。この手法でＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎ（Ｓｉｇｍａ、＃ＦＤ  ５００Ｓ）をパルスした場合には、ほぼ全細胞にＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａｎが導入されていることを予備検討で確認している。１時間の静置後、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４、２０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦと１０ｎｇ／ｍｌマウスＩＦＮ−γ（Ｐｅｐｒａｔｅｃｈ、＃３１５−０５）を加え、約１５時間培養した。培養後に細胞を回収して、培地を０．５％の正常Ｃ５７ＢＬ／６血清を含むＰＢＳに交換して生細胞数で約２×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌに調製した。【００９９】
＜免疫＞
エレクトロポレーションに用いたＤＣの一部をそのまま培養しておき、免疫当日にＴＲＰ−２  ペプチド（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ：配列番号４）を１μｇ／ｍｌで添加し、６時間培養後に回収して同様に生細胞数で約２×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌに調製した（ペプチドパルスＤＣ）。ペプチドパルスＤＣを陽性対照（ペプチド）として、ＵＭＰ添加により可溶化させたｒＴＲＰ−２をエレクトロポレーションで導入したＤＣ（Ｔ（Ｕ））またはＧＭＰ添加により可溶化させたｒＴＲＰ−２をエレクトロポレーションで導入したＤＣ（Ｔ（Ｇ））を生細胞数で約２×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｍｏｕｓｅでＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔に投与することで免疫した。免疫は１週間おきに３回行い、最後の免疫から１週間後に脾細胞を回収した。【０１００】
＜ＣＴＬ誘導の確認＞
回収した脾細胞を、Ｈ−２Ｋｂ  ＴＲＰ−２テトラマー  −ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号４）−（ＭＢＬ，＃ＴＳ−５００４−１）若しくは陰性対照であるＨ−２Ｋｂ  ＯＶＡテトラマー  −ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号５）−（ＢＣＩ，＃ＴＳ−５００１−１）で標識し、同時に抗ＣＤ８ａ抗体−ＦＩＴＣ，Ｃｌｏｎｅ  ５３−６．７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃５５３０３０）若しくはＲａｔ  ＩｇＧ２ａ，ｋ  ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｃｌｏｎｅ  Ｒ３５−９５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃５５３９２９）を用いてＭＢＬ社の提示している手法に従い、フローサイトメーターでＴＲＰ−２特異的ＣＴＬの解析を行った。【０１０１】
その結果を図１３に示した。いずれのマウス由来脾細胞でも、ＣＤ８陽性かつＯＶＡテトラマー陽性（ＣＤ８＋ＯＶＡ＋）細胞は検出されなかった。陰性対照群と標記した無処理マウス由来脾細胞では、ＣＤ８陽性かつＴＲＰ−２テトラマー陽性（ＣＤ８＋ＴＲＰ２＋）細胞は０．０％であり、ペプチドと標記したペプチドパルスＤＣで免疫したマウス由来脾細胞ではＣＤ８＋ＴＲＰ２＋細胞が２．４％となっていた。このとき、Ｔ（Ｕ）で免疫したマウス由来脾細胞では２．３％、Ｔ（Ｇ）で免疫したマウス由来脾細胞では１．５％のＣＤ８＋ＴＲＰ２＋細胞が誘導されていた。以上の結果から、可溶化させたｒＴＲＰ−２をＤＣに導入し、免疫することで、ＴＲＰ−２特異的ＣＴＬが誘導できることが確認された。【０１０２】
単一のエピトープ（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ：配列番号４）に対するＣＴＬの誘導効率の比較検討を行った結果では、本発明の不溶性タンパク質及び／又はペプチドの細胞内への導入方法はペプチドをパルスした場合とほぼ同等のＣＴＬ誘導効果を示した。ペプチドをパルスした場合にはパルスしたペプチドに特異的なＣＴＬしか誘導できないが、本発明の導入方法により可溶化した蛋白質をＤＣへ導入した場合には、タンパク質に含まれる複数のエピトープがクラスＩだけでなくクラスＩＩを含めた様々なタイプのＭＨＣで提示されうることから、ペプチドパルスＤＣワクチンに比べて、効果が増強されると推察された。
【実施例１４】
【０１０３】
＜がん細胞ホモジネート不溶性画分を利用したＣＴＬの誘導＞
実施例１３で示した通り、不溶性組換え蛋白質（ｒＴＲＰ−２）を可溶化することで、エレクトロポレーションによりＤＣに取込ませることが可能となった。蛋白質を取り込ませたＤＣをマウスに投与することで、マウス体内にＣＴＬが誘導できることをテトラマーアッセイによって明らかにした。今回はさらに、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞ホモジネートの不溶性画分を本発明の方法により可溶化したものを利用してＤＣを調製し、マウス体内での抗腫瘍免疫への影響を検討した。【０１０４】
＜Ｂ１６ライゼートと可溶化不溶性画分の調製＞
Ｂ１６を７５ｃｍ２培養フラスコで培養を行なった。細胞が底面にいっぱいになった時点で、ＰＢＳで三回洗浄した。洗浄後スクレーパーで細胞を剥がし、１０００×ｇ、５分間、４℃の遠心により沈殿として回収して、その湿重量を測定した。【０１０５】
各湿重量から４００μＬ／１００ｍｇとなるように、再びＰＢＳの懸濁液とした。その後６回の凍結（−８０℃）融解（３０℃）を行い、遠心し、上清と沈殿に分画した。この上清（ライゼート：ｓｕｐ）はＢＣＡ法で蛋白定量を行なった。また沈殿は８Ｍ尿素−ＰＢＳに溶解させ、終濃度１０ｍＭのＧＳＳＧと終濃度１０ｍＭのＵＭＰを加え、室温で一時間の反応を行なった。その後、反応液に５０％グリセロール、６Ｍ尿素−ＰＢＳを１／５容加えて、１０μＭのＵＭＰを含んだ１０％グリセロール−ＰＢＳで透析した。回収したサンプルを遠心し、上清（可溶化不溶性画分：ｐｐｔ）中に溶解している蛋白質量をＢＣＡ法で定量した。【０１０６】
＜ＤＣの調製と免疫＞
実施例１０と同様にＣ５７ＢＬ／６マウスの骨髄細胞から、成熟ＤＣを誘導した。成熟ＤＣをＸ−ＶＩＶＯ２０培地に懸濁させ１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、０．２ｍＬずつ分注した。ここに、１０μＭのＵＭＰを含んだ１０％グリセロール−ＰＢＳを０．２ｍＬ、先に調製しておいたＢ１６ライゼート０．２ｍＬ（終濃度２ｍｇ／ｍＬ）またはＢ１６可溶化不溶性画分０．２ｍＬ（終濃度２ｍｇ／ｍＬ）を添加し、エレクトロポレーションを行なった。通電後、直ちに細胞を回収し、５倍容積の０．２％正常Ｃ５７ＢＬ／６マウス血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１時間静置した。その後、終濃度２０ｎｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−４及び１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮ−γを加えて一晩同様に静置した後、夫々のＤＣを回収して洗浄した。このＤＣを０．２％正常Ｃ５７ＢＬ／６マウス血清を含むＰＢＳに懸濁させ、５×１０５ｃｅｌｌｓ／マウスでＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔へ投与した。陰性対照として、エレクトロポレーションを行なわず、ライゼート又は可溶化不溶性画分と共培養したＤＣも同様に投与した。この免疫を一週間後に再び行い、その一週間後に各マウスから脾細胞を採取した。【０１０７】
＜細胞傷害性試験＞
脾細胞から、ＣＤ８ａ＋ＴＣｅｌｌアイソレーションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０−０９０−８５９）で、ＣＤ８ａ＋細胞を単離分取した後、１０％ＦＢＳ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１５６３０−０８０）、５×１０−５Ｍ  ２−ＭＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃２１９８５−０２３）、２ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃２５０３０−０８１）、１×１０−５Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１１３６０−０７０）、１％  ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１１１４０−０５０）、１００μｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ、１００ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１５０７０−０６３）を含んだＲＰＭＩ１６４０（コンプリート）培地に１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう懸濁し、１０Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２（Ｃｈａｉｒｏｎ）を加えて３日間培養を行い、エフェクター細胞とした。【０１０８】
ターゲット細胞には継代培養をしているＢ１６細胞に、終濃度１ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮ−γを加えて２４時間培養したものを使用した。ＩＦＮ−γ処理後のＭＨＣクラスＩ分子の発現を抗Ｈ−２Ｋｂ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＰＥ、＃５５３５７０）と抗Ｈ−２Ｄｂ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＦＩＴＣ、＃５５３５７３）を用いて、フローサイトメーターで解析した。図１４ａに示したように、陽性細胞率は３７．４％であった。このことは、抗原特異的認識による最大の細胞傷害性は３７．４％になることを意味する。ＩＦＮ−γ処理Ｂ１６細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、終濃度２μｇ／ｍＬになるようにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁化学研究所、＃３４９−０７２０１）を加えて攪拌し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１０分ごとに撹拌を行ないながら、３０分間静置した。この操作によりＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭで標識されたＢ１６細胞を、５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、ターゲット細胞とした。エフェクター細胞数（Ｅ）とターゲット細胞数（Ｔ）の割合（Ｅ／Ｔ比）を５、１０及び２０で混和させ、３７℃５％ＣＯ２存在下で２時間静置させることにより、細胞傷害性試験を行なった。細胞傷害性の測定は、Ｔｅｒａｓｃａｎ  ＶＰ（ＭＩＮＥＲＶＡ  ＴＥＣＨ）システムによって測定した。【０１０９】
その結果を図１４ｂに示した。縦軸は、一群２匹ずつから由来したエフェクター細胞による傷害性の平均値を示しており、エラーバーはそのＳＤを意味する。ライゼートと共培養したＤＣ（Ｃｏ  ｓｕｐ）と、可溶化不溶性画分と共培養したＤＣ（Ｃｏ  ｐｐｔ）で免疫したマウス由来エフェクター細胞は、抗原なしでエレクトロポレーション処理したＤＣ（Ｅｐ（−））を投与したマウス由来エフェクター細胞と同程度の傷害性であり、非特異的な傷害性しか認められなかった。また、ＴＲＰ−２ペプチドをパルスしたＤＣ（Ｐｅｐ）で免疫したマウス由来エフェクター細胞でも特異的な傷害性を認めるに至らなかった。一方、ライゼートをエレクトロポレーションで取り込ませたＤＣ（Ｅｐ  ｓｕｐ）で免疫したマウス由来エフェクター細胞では、Ｅ／Ｔ＝２０で特異的な傷害性が認められた。さらに、可溶化不溶性画分をエレクトロポレーションで取り込ませたＤＣ（Ｅｐ  ｐｐｔ）で免疫したマウス由来エフェクター細胞は、Ｅ／Ｔ＝１０及び２０でさらに強い抗原特異的な細胞傷害性を示した。【０１１０】
以上の結果から、本明細書で示した可溶化方法によって可溶化させた蛋白質を抗原として利用することで、従来の方法よりも効果の高いＣＴＬを誘導することが可能となり、単一のエピトープペプチドよりも強力な抗腫瘍免疫を誘導可能であることが示唆された。また、従来では廃棄処分されていた腫瘍組織ホモジネートの不溶性画分が、本可溶化方法で利用可能になることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
以上説明したように、本発明の方法を用いることにより、不溶性蛋白質を効率的に可溶化することが可能となる。また、本発明の方法によって可溶化された蛋白質は、細胞内へ導入され易い。そのため、抗原提示細胞によるＣＴＬの誘導に効果的である。本発明の技術を用いることで、例えば、不溶性の癌及び感染症の抗原蛋白質を可溶化し、樹状細胞等へ導入した後、誘導される抗原提示細胞を、当該抗原蛋白質に対して特異的なＣＴＬ誘導剤として、また、当該抗原蛋白質をもつ癌及び感染症患者への治療等に利用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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