(57)【要約】  本発明はＤＮＡ配列特異的結合化合物による局所用眼科疾患治療薬に関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる局所用眼科疾患治療薬を提供する。  トランスフォーミング増殖因子β遺伝子及びマトリックスメタロプロテネース９遺伝子を阻害することができるピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる局所用眼科疾患治療薬である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトトランスフォーミング増殖因子β（以下ＴＧＦ−βとも言う）遺伝子プロモーターの塩基配列−５５５〜−５２８（配列番号２）、塩基配列−４２７〜−３９９（配列番号４）又は塩基配列−３８４〜−３５５（配列番号６）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる、局所用眼科疾患治療薬。
【請求項２】
更にβアラニン単位を含む請求項１に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項３】
更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む請求項１又は２に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項４】
眼科疾患がアルカリバーンによる外傷又は角膜手術後の外傷である請求項１〜３のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項５】
眼科疾患が眼科増殖性疾患又は炎症性疾患である請求項１〜３のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項６】
点眼剤の形態である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項７】
前記標的領域がトランスフォーミング増殖因子βプロモーターの塩基配列−５４４〜−５３８（配列番号３）、塩基配列−４１６〜−４１０（配列番号５）又は塩基配列−３７３〜−３６６（配列番号７）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１〜６のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項８】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１〜７のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【化１】
2010103683.tif 000029
【請求項９】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１〜７のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【化２】
2010103683.tif 000030
【請求項１０】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１〜７のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【化３】
2010103683.tif 000031
【請求項１１】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
【化４】
2010103683.tif 000032
【請求項１２】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
【化５】
2010103683.tif 000033
【請求項１３】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
【化６】
2010103683.tif 000034
【請求項１４】
Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ラットトランスフォーミング増殖因子β（以下ＴＧＦ−βとも言う）遺伝子プロモーターの塩基配列−２３１６〜−２２８７（配列番号２５）又は−２３２２〜−２２９３（配列番号８）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる、局所用眼科疾患治療薬。
【請求項１５】
更にβアラニン単位を含む請求項１４に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項１６】
更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む請求項１４又は１５に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項１７】
眼科疾患がアルカリバーンによる外傷又は角膜手術後の外傷である請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項１８】
眼科疾患が眼科増殖性疾患又は炎症性疾患である請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項１９】
点眼剤の形態である、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項２０】
前記標的領域がトランスフォーミング増殖因子βプロモーターの−２３０５〜−２２９８（配列番号２６）又は−２３１１〜−２３０４（配列番号９）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項２１】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【化７】
2010103683.tif 000035
【請求項２２】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【化８】
2010103683.tif 000036
【請求項２３】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
【化９】
2010103683.tif 000037
【請求項２４】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
【化１０】
2010103683.tif 000038
【請求項２５】
Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ９（以下ｈＭＭＰ−９とも言う）遺伝子プロモーターの塩基配列−８８〜−５９（配列番号１１）又は塩基配列−６１６〜−５８８（配列番号１３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる、局所用眼科疾患治療薬。
【請求項２６】
更にβアラニン単位を含む請求項２５に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項２７】
更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む請求項２５又は２６に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項２８】
眼科疾患がアルカリバーンによる外傷又は角膜手術後の外傷である請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項２９】
眼科疾患が眼科増殖性疾患又は炎症性疾患である請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項３０】
点眼剤の形態である、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項３１】
前記標的領域がトランスフォーミング増殖因子βプロモーターの塩基配列−７７〜−７０（配列番号１２）又は塩基配列−６０５〜−５９９（配列番号１４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項３２】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【化１１】
2010103683.tif 000039
【請求項３３】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【化１２】
2010103683.tif 000040
【請求項３４】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
【化１３】
2010103683.tif 000041
【請求項３５】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
【化１４】
2010103683.tif 000042
【請求項３６】
Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ラットマトリックスメタロプロテアーゼ９（以下ｒＭＭＰ−９とも言う）遺伝子プロモーターの塩基配列−１０５〜−７６（配列番号１５）又は塩基配列−６０２〜−５７５（配列番号１７）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる、局所用眼科疾患治療薬。
【請求項３７】
更にβアラニン単位を含む請求項３６に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項３８】
更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む請求項３６又は３７に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項３９】
眼科疾患がアルカリバーンによる外傷又は角膜手術後の外傷である請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項４０】
眼科疾患が眼科増殖性疾患又は炎症性疾患である請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項４１】
点眼剤の形態である、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項４２】
前記標的領域がマトリックスメタロプロテアーゼ９プロモーターの塩基配列−９４〜−８７（配列番号１６）又は塩基配列−５９１〜−５８６（配列番号１８）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【請求項４３】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【化１５】
2010103683.tif 000043
【請求項４４】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【化１６】
2010103683.tif 000044
【請求項４５】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
【化１７】
2010103683.tif 000045
【請求項４６】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
【化１８】
2010103683.tif 000046
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＤＮＡ配列特異的結合化合物を含む局所用眼科疾患治療薬に関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミド（以下ＰＩＰとも言う）を含んでなる局所用眼科疾患治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
角膜は、眼の前部に位置する高度に組織された血管の無い透明な組織である。角膜は光を適切に反射するために透明に保たれていなければならない。アルカリバーンによる眼の傷害は、熱傷や酸による外傷に比べ重篤な眼表面疾患であり、予後が非常に悪い。アルカリ物質は組織への深達性が強いため本来透明な角膜に白く濁りを生じるなど、角膜に深刻な臨床的問題を起こす。また、従来の治療により適切に治癒することはほとんど無いため、深刻で永続的な視覚機能障害の原因となりうる。アルカリバーンによる失明は後天的な原因による失明の主因の一つである。【０００３】
アルカリバーンにおける角膜実質細胞及び上皮細胞などの角膜細胞の活性化及び単核やマクロファージなどの炎症性細胞の流入はアルカリ組織ダメージ後の角膜傷害の病変形成に関与し、永続的な上皮の欠損につながり得るものである。【０００４】
治癒過程の促進及び瘢痕組織の予防は、角膜損傷後の二つの重要な臨床的考慮事項であるが、アルカリバーン後の角膜に生じる組織破壊や後期瘢痕に多くの成長因子やサイトカインが関与すると考えられている。【０００５】
また、視力矯正等のために行われる角膜手術（例えばレーシック等）後や感染症による炎症発生後においても、角膜が白濁するといった傷害が起こることがある。このような角膜手術後の外傷などの炎症の治癒過程も、アルカリバーンによる外傷と同様の成長因子やサイトカインが関与すると考えられている。【０００６】
アルカリバーン後に分泌されるトランスフォーミング増殖因子β（以下「ＴＧＦ−β」とも言う）により、創傷治癒過程が誘導され、ＴＧＦ−βの刺激により、マトリックスメタロプロテアーゼ（以下「ＭＭＰ」とも言う）が分泌され、基底膜の分解、さらに繊維芽細胞の誘導、血管の新生といった感染症や外部刺激への防御メカニズムを促す。角膜の基底膜の崩壊は角膜実質の潰瘍化又は穿孔の発症に貢献するとともに角膜上皮の再生を妨げると考えられる。角膜縁幹細胞の損失による不透明化を伴う角膜表面の結膜化と角膜実質の血管新生の全てが、後期治癒過程の患者の視野の機能障害を引き起こす（非特許文献１）。また近年の抗生物質等による感染がコントロールされる臨床現場を前提とすれば、基底膜が分解されないこと、細胞浸潤・血管新生が起こらないことのほうが創傷治癒において利点が多いと考えられる。
また、ＴＧＦ−βは、角膜上皮細胞及び角膜実質細胞の移動を促進するだけでなく、単核及びマクロファージの走化性を促進し、及び角膜実質細胞を筋繊維芽細胞への分化を誘導することが示されている。熱傷等の外部刺激や感染症により炎症反応を起こした角膜におけるＴＧＦ−βおよびその下流のＭＭＰ９の過剰発現は、ＴＧＦ−βが一部分において、局所的な血管新生及び炎症にそれぞれ関与すると考えられている、血管内皮成長因子（以下「ＶＥＧＦ」とも言う）及び単球マクロファージ走化性タンパク質―１（以下「ＭＣＰ−１」とも言う）等の他のサイトカイン類の発現を有することから、傷害組織のダメージを悪化させる。【０００７】
更に、アルカリバーンによる外傷のみならず、腫瘍、増殖糖尿病網膜症、翼状片、血管新生緑内障、加齢黄班変性症、角膜疾患に合併する角膜血管新生などの眼科増殖性疾患は、眼科領域の組織増殖性疾患として知られている。特に高齢化に伴い、異常血管新生や繊維化形成を伴う疾患は眼科領域で近年増加傾向にあり、視力低下や失明の危険性が高く、外科的手術を必要とし易再発性であるなど特に問題となっている症候群である。炎症性疾患においても同様の細胞浸潤、血管新生が見られることより、感染症、角膜炎、結膜炎、アレルギー性疾患、花粉症、に合併する角膜炎笑細胞浸潤などにおいても同様の発症機序が考えられる。このような症候群においても、アルカリバーンによる外傷の治癒過程と同様の成長因子やサイトカイン関与があると考えられている。【０００８】
視覚障害を起こすケースでは、多くの場合、角膜上皮幹細胞を含む角膜縁上皮の自家移植片又は同種移植片の外科的移植が行われる。このような移植は両目をアルカリによって傷害したケースなどの緊急性の高いケースにおいて有効に行われるが、長期にわたる薬剤による免疫抑制が必要であるため潜在的に感染のリスクが増加し、他の望ましくない副作用を生ずるとともに移植そのものも困難となる重篤な症例が特にアルカリ外傷で多い。さらに多くの角膜移植の適応がある待機視覚障害者が存在し、現実的には６ケ月以上待たないと角膜移植が受けられない患者が良好なアイバンクにおいても３分の１に達する、また全国のアイバンクの調査（平成１６年）では、３年以上移植を待たなければならないという結果が出ている現実もある。【０００９】
眼内疾患の薬物療法においては、医薬品の有効成分を眼内の標的組織へ効率よく送り込むドラッグデリバリーシステム（以下「ＤＤＳ」とも言う）が必要である。点眼で投与した薬剤はたいていの場合、角膜を通して十分には浸透しない。滴下した薬剤は涙液と一緒に流れてしまうか、結膜を通って体内に吸収されてしまう。点眼で投与された薬剤のうち角膜に浸透して眼組織に到達するのは、約５％のみに過ぎず、残りの９５％は涙の排出によって失われる。このため、通常の薬剤では頻回（数時間毎）の投与が必要になるが、睡眠中の点眼は現実的に不可能であり、持続時間の長い点眼剤の開発が必要である。【００１０】
加齢黄班変性症の治療方法としては既にＶＧＥＦ阻害剤によるアプタマー治療薬が存在する。しかしながら、上記ドラックデリバリーの問題から、このような薬剤は硝子体内投与により頻回に眼内に注射して投与することが必要であるため投与が容易でなく、頻繁に投与する必要があるほど眼内注射により感染症に罹患する危険も上昇するといった欠点を有する。静脈投与による場合は、全身投与となるため、眼内での薬剤濃度を保つために全身への影響も強くなり、副作用等が懸念される。従って、頻回に投与する必要がない局所用眼科疾患治療薬の開発も必要とされている。【００１１】
ピロールイミダゾールポリアミドは抗生物質であるｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ−Ａとｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ−ＡがＤＮＡを塩基特異的に認識することを基に、Ｄｅｒｖａｎらにより見出された化学合成物質である（特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。ＰＩポリアミドは二本鎖ＤＮＡを塩基配列特異的に認識し、ＤＮＡ二重螺旋構造のマイナーグルーブに結合することから、標的遺伝子の発現を特異的に制御する事が可能である（非特許文献３）。また、ＰＩポリアミドは、これまでの遺伝子発現制御薬であるアンチセンス・リボザイム・ｓｉＲＮＡ等と異なり、生体内において核酸分解酵素によって分解されず、核酸への結合能が高いことから、新規の分子標的治療薬として、抗癌剤等への臨床応用が期待されるところであるが、眼科疾患への適応、点眼、眼球内での薬剤としての動態に関しては検討されていない。【００１２】
逆遺伝学による遺伝子機能の不活性化の手法は、ある特定の遺伝子の機能を解析するために用いられるものであるが、一方でウイルス感染、癌、及び遺伝子の異常発現に基づくその他の疾病の治療にも大きな可能性を開いている。すなわち、遺伝子機能の不活性化を、相同的組換えによりＤＮＡレベルで、又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムによりＲＮＡレベルで実施することができることが知られている。しかし、相同組換えは組換え効率が一般に低く一部の細胞でしか効果がみられない、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。【００１３】
一方、アンチセンス試薬やリボザイムのような（デオキシ）リボヌクレオチド試薬とは異なり、ピロールイミダゾールポリアミド類が、ＤＮＡの塩基配列を特異的に認識し、特定遺伝子の発現を細胞外からコントロールすることができることが報告されている。【００１４】
ピロールイミダゾールポリアミド（以下Ｐｙ−Ｉｍポリアミドとも言う）は一群の合成小分子であり、芳香族環であるＮ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）及びＮ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）から構成されている（特許文献１、非特許文献１）。Ｐｙ及びＩｍは連続してカップリングし折りたたむことによりγ−アミノ酪酸の存在下でＵ字型のコンフォメーションを採ることができる。本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）、βアラニン(β)及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（特許文献２〜４）。【００１５】
このような合成ポリアミドは二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）中の特定の塩基対に高い親和性と特異性を以って結合することができる。塩基対の特異的認識はＰｙとＩｍとの１対１の対形成に依存している。即ち、ＤＮＡの副溝内でのＵ字型コンフォメーションにおいて、Ｐｙ／Ｉｍもしくはβ／Ｉｍ対はＣ−Ｇ塩基対を標的とし、Ｉｍ／ＰｙもしくはＩｍ／βはＧ−Ｃ塩基対を標的とし、そしてＰｙ／Ｐｙもしくはβ／β、Ｐｙ／β、β／ＰｙはＡ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対の両方を標的とする（非特許文献２，３，４，５）。最近の研究によれば、Ａ−Ｔ対及びＴ−Ａ対に対するＰｙ−Ｉｍポリアミド化合物の非選択性の問題は、Ｐｙ／Ｐｙ対の一つのピロール環を３−ヒドロキシピロール（Ｈｐ）で置換した結果として得られるＨｐ／Ｐｙ対が優先的にＴ／Ａ対に結合することによって克服することができることがわかっている。
また好ましくは、Ｃ−Ｇ塩基対の一部がβ／Ｉｍ対によって、Ｇ−Ｃ塩基対の一部がＩｍ／β対によって、そしてＡ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対の一部がβ／β対、Ｐｙ／β対又はβ／Ｐｙ対によって、それぞれ標的とされてもよい。【００１６】
一般的には転写の開始が遺伝子制御の重要なポイントであると考えられている。転写の開始には遺伝子プロモーター領域において特異的な認識配列に結合する転写因子が複合体を形成し、その複合体がＤＮＡ配列と結合するいくつかの過程を必要とする。副溝中のポリアミドは、もし転写因子もしくは、複合体の特定配列への結合が遺伝子発現において重要であれば、転写因子もしくはその複合体の結合を遮断して遺伝子の調節に干渉する可能性がある。この仮説はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで証明されている。ジンクフィンガーの認識部位（ＴＦＩＩＩＡの結合部位）の内部に結合した８員環Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは５ＳＲＮＡ遺伝子の転写を阻害した。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）プロモーター中の転写因子配列に隣接する塩基対に結合するポリアミド類は、ヒト細胞におけるＨＩＶ−１複製を阻害する。これらの配列にはＴＡＴＡボックス、リンパ系エンハンサー因子ＬＥＦ−１配列、及びＥＴＳ−１配列が包含される。これとは対照的に、ポリアミドはまた、リプレッサー因子を遮断することによって、又は生来の転写因子を置換することによって、遺伝子発現を活性化する。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＵＬ１２２仲介初期タンパク質２（ＩＥ８６）は、プロモーターにＲＮＡポリメラーゼＩＩを補充することを遮断し、その関連遺伝子の転写を抑制する。合成ポリアミドはＩＥ８６の抑制を遮断しその対応遺伝子の発現を開放することができる。Ｍａｐｐらにより設計されたポリアミドは人工転写因子として作用し、遺伝子転写反応を仲介する。さらに、この転写因子の結合阻害はＴＡＴＡボックスに対するＴＡＴＡ  ｂｏｘ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＢＰとも言う）の結合阻害実験において、結合配列より１０塩基はなれた部位に設計されたポリアミド化合物においても競争阻害が認められ、転写因子認識配列の周囲に設計したポリアミドでも転写阻害が認められることが報告されている（非特許文献６）。さらに本願で示すラットＭＭＰ９ＡＰ１ポリアミドはＡＰ１結合配列よりも４塩基転写開始点よりに離れて設計されているがＡＰ１に対する結合阻害が引き出されることが容易に想像できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】ＷＯ９８／４９１４２  Ａ１
【特許文献２】特許第３０４５７０６号
【特許文献３】特開２００１−１３６９７４
【特許文献４】ＷＯ０３／０００６８３  Ａ１
【特許文献５】ＷＯ／２００６／０１８９６７  Ａ１
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Saika S. et al. American Journal of Pathology 2005;166(5)1405-1418.
【非特許文献２】Sugiyama et al: Proc Natl Acad Sci U S A. 1996; 93: 14405-144410.
【非特許文献３】Dervan: Bioorg Med. Chem. 2001;9: 215-35.
【非特許文献４】Trauger J.W. et al: Nature 1996;382:559-561.
【非特許文献５】White S. et al: Chem Biol 1997;4:569-578.
【非特許文献６】Ehley J.A.et al. Mol Cell Biol 2002; 22(6) 1723-1733.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
これまで、アルカリバーンによる外傷及び角膜手術後の外傷を治療するための、眼内注射投与によらない点眼等の局所用眼科疾患治療薬は報告されていない。更に、頻回投与の必要がない眼科増殖性疾患を治療するための局所用眼科疾患治療薬は報告されていない。
従って、アルカリバーンによる外傷、角膜手術後の外傷及び眼科増殖性疾患を治療するための局所用眼科疾患治療薬が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）及びマトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ９）のプロモーターの特定の領域に特異的に結合することにより、トランスフォーミング増殖因子β及びマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子の発現を阻害することができるピロールイミダゾールポリアミドが局所用眼科疾患治療薬として有効に作用することを見出し、本発明をなすに至った。【００２１】
即ち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトトランスフォーミング増殖因子β（以下ＴＧＦ−βとも言う）遺伝子プロモーターの塩基配列−５５５〜−５２８（配列番号２）、塩基配列−４２７〜−３９９（配列番号４）又は塩基配列−３８４〜−３５５（配列番号６）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる、局所用眼科疾患治療薬。
（２）更にβアラニン単位を含む（１）に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（３）更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む（１）又は（２）に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（４）眼科疾患がアルカリバーンによる外傷又は角膜手術後の外傷である（１）〜（３）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（５）眼科疾患が眼科増殖性疾患又は炎症性疾患である（１）〜（３）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（６）点眼剤の形態である、（１）〜（５）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（７）前記標的領域がトランスフォーミング増殖因子βプロモーターの塩基配列−５４４〜−５３８（配列番号３）、塩基配列−４１６〜−４１０（配列番号５）又は塩基配列−３７３〜−３６６（配列番号７）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である（１）〜（６）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（８）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（１）〜（７）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【化１】
2010103683.tif 000002
（９）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（１）〜（７）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【化２】
2010103683.tif 000003
（１０）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（１）〜（７）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【化３】
2010103683.tif 000004
（１１）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
【化４】
2010103683.tif 000005
（１２）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
【化５】
2010103683.tif 000006
（１３）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
【化６】
2010103683.tif 000007
（１４）Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ラットトランスフォーミング増殖因子β（以下ＴＧＦ−βとも言う）遺伝子プロモーターの塩基配列−２３１６〜−２２８７（配列番号２５）又は−２３２２〜−２２９３（配列番号８）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる、局所用眼科疾患治療薬。
（１５）更にβアラニン単位を含む（１４）に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（１６）更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む（１４）又は（１５）に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（１７）眼科疾患がアルカリバーンによる外傷又は角膜手術後の外傷である（１４）〜（１６）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（１８）眼科疾患が眼科増殖性疾患又は炎症性疾患である（１４）〜（１６）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（１９）点眼剤の形態である、（１４）〜（１８）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（２０）前記標的領域がトランスフォーミング増殖因子βプロモーターの塩基配列−２３０５〜−２２９８（配列番号２６）又は−２３１１〜−２３０４（配列番号９）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である（１４）〜（１９）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（２１）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（１４）〜（２０）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【化７】
2010103683.tif 000008
（２２）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表わされる（１４）〜（２０）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【化８】
2010103683.tif 000009
（２３）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
【化９】
2010103683.tif 000010
（２４）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
【化１０】
2010103683.tif 000011
（２５）Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ９（以下ｈＭＭＰ−９とも言う）遺伝子プロモーターの塩基配列−８８〜−５９（配列番号１１）又は塩基配列−６１６〜−５８８（配列番号１３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる、局所用眼科疾患治療薬。
（２６）更にβアラニン単位を含む（２５）に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（２７）更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む（２５）又は（２６）に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（２８）眼科疾患がアルカリバーンによる外傷又は角膜手術後の外傷である（２５）〜（２７）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（２９）眼科疾患が眼科増殖性疾患又は炎症性疾患である（２５）〜（２７）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（３０）点眼剤の形態である、（２５）〜（２９）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（３１）前記標的領域がトランスフォーミング増殖因子βプロモーターの塩基配列−７７〜−７０（配列番号１２）又は塩基配列−６０５〜−５９９（配列番号１４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である（２５）〜（３０）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（３２）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（２５）〜（３１）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【化１１】
2010103683.tif 000012
（３３）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（２５）〜（３１）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【化１２】
2010103683.tif 000013
（３４）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
【化１３】
2010103683.tif 000014
（３５）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
【化１４】
2010103683.tif 000015
（３６）Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ラットマトリックスメタロプロテアーゼ９（以下ｒＭＭＰ−９とも言う）遺伝子プロモーターの塩基配列−１０５〜−７６（配列番号１５）又は塩基配列−６０２〜−５７５（配列番号１７）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる、局所用眼科疾患治療薬。
（３７）更にβアラニン単位を含む（３６）に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（３８）更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む（３６）又は（３７）に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（３９）眼科疾患がアルカリバーンによる外傷又は角膜手術後の外傷である（３６）〜（３８）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（４０）眼科疾患が眼科増殖性疾患又は炎症性疾患である（３６）〜（３８）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（４１）点眼剤の形態である、（３６）〜（４０）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（４２）前記標的領域がマトリックスメタロプロテアーゼ９プロモーターの塩基配列−９４〜−８７（配列番号１６）又は塩基配列−５９１〜−５８６（配列番号１８）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である（３６）〜（４１）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
（４３）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（３６）〜（４２）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【化１５】
2010103683.tif 000016
（４４）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（３６）〜（４２）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
【化１６】
2010103683.tif 000017
（４５）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
【化１７】
2010103683.tif 000018
（４６）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
【化１８】
2010103683.tif 000019
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、アルカリバーンによる外傷、角膜手術後の外傷及び眼科増殖性疾患又は炎症性疾患を治療するための局所性眼科疾患治療薬を得ることができる。また、本発明によれば、この遺伝子を用いた基礎実験の試薬を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ヒトＴＧＦ−βプロモーター領域の塩基配列を示す。
【図２】ラットＴＧＦ−βプロモーター領域におけるｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ化合物結合部位を示す。
【図３】ラットＴＧＦ−βプロモーター領域におけるｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０３）ＰＩＰ化合物結合部位を示す。
【図４】ラットＭＭＰ−９プロモーター領域におけるｒＭＭＰ９ＡＰ１ＰＩＰ化合物結合部位を示す。
【図５】ラットＭＭＰ−９プロモーター領域におけるｒＭＭＰ９ＮＦκＢＰＩＰ化合物結合部位を示す。
【図６】ヒトＭＭＰ−９プロモーター領域の塩基配列を示す。
【図７】ヒトＭＭＰ−９プロモーター領域におけるｈＭＭＰ９ＡＰ１ＰＩＰ化合物結合部位を示す。
【図８】ヒトＭＭＰ−９プロモーター領域におけるｈＭＭＰ９ＮＦκＢＰＩＰ化合物結合部位を示す。
【図９】ヒトＴＧＦ−βプロモーター塩基配列−５４４〜−５３８に結合するＰＩＰ化合物（ｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０１））を示す。
【図１０】ヒトＴＧＦ−βプロモーター塩基配列−４１６〜−４１０に結合するＰＩＰ化合物（ｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０５））を示す。
【図１１】ヒトＴＧＦ−βプロモーター塩基配列−３７３〜−３６６に結合するＰＩＰ化合物（ｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１1０６））を示す。
【図１２】ラットＴＧＦ−βプロモーター塩基配列−２３１１〜−２３０４に結合するＰＩＰ化合物（ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１））を示す。
【図１３】ラットＴＧＦ−βプロモーター塩基配列−２３０５〜−２２９８に結合するＰＩＰ化合物（ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０３））を示す。
【図１４】ヒトＭＭＰ−９（ＡＰ−１)プロモーター塩基配列−７７〜−７０に結合するＰＩＰ化合物（ｈＭＭＰ９ＡＰ１）を示す。
【図１５】ヒトＭＭＰ−９（ＮＦ−κＢ）プロモーター塩基配列−６０５〜−５９９に結合するＰＩＰ化合物（ｈＭＭＰ９ＮＦκＢ）を示す。
【図１６】ラットＭＭＰ−９（ＡＰ−１)プロモーター塩基配列−９４〜−８７に結合するＰＩＰ化合物（ｒＭＭＰ９ＡＰ１）を示す。
【図１７】ラットＭＭＰ−９（ＮＦ−κＢ）プロモーター塩基配列−５９１〜−５８６に結合するＰＩＰ化合物（ｒＭＭＰ９ＮＦκＢ）を示す。
【図１８】アルカリ外傷後におけるラットモデルによる本発明のＰＩＰ化合物の効果を示す。
【図１９】角膜の不透明度及び潰瘍化の評価の結果を示す。対照と比較してｒＴＧＦ−β１（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ及びＭＭＰ−９ＰＩＰは、有意に角膜の不透明度及び潰瘍化を治癒した。
【図２０】角膜の不透明度及び潰瘍化の評価の結果を示す。対照と比較してｒＴＧＦ−β１（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰは、有意に角膜の不透明度及び潰瘍化を治癒した。
【図２１】角膜欠損の程度の評価の結果を示す。対照と比較してＭＭＰ−９ＰＩＰ及びＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰは、有意に角膜欠損を早期（約２倍の速さ）に治癒した。
【図２２】角膜の不透明度及び潰瘍化の評価の結果を示す。対照と比較してｒＴＧＦ−β１（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰは、有意に角膜の不透明度及び潰瘍化を治癒した。
【図２３】ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）によるＴＧＦ−βｍＲＮＡの発現量を調べるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を示す。
【図２４】ｒＴＧＦ−β１（ＧＢＰ１２０１）によるＭＭＰ−９ｍＲＮＡの発現量を調べるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を示す。
【図２５】ｒＴＧＦ−β１（ＧＢＰ１２０１）によるＴＧＦ−βｍＲＮＡの発現量を調べるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を示す。
【図２６】ｒＭＭＰ９ＡＰ１によるＭＭＰ−９ｍＲＮＡの発現量を調べるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を示す。
【図２７】ＦＩＴＣ標識したラットＴＧＦ−βプロモーター塩基配列−２３１１〜−２３０４に結合するＰＩＰ化合物（以下、ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ＦＩＴＣとも言う）を示す。
【図２８】ラットＴＧＦ−βプロモーター塩基配列−２３１１〜−２３０４に対するミスマッチポリアミドを示す。
【図２９】ＦＩＴＣ標識したラットＭＭＰ−９（ＡＰ−１)プロモーター塩基配列−９４〜−８７に結合するＰＩＰ化合物（以下、ｒＭＭＰ９ＡＰ１ＦＩＴＣとも言う）を示す。
【図３０】アルカリ外傷後に投与したＦＩＴＣ標識ラットｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ化合物の一時間、１日、４日、及び７日目の角膜内分布を示す。
【図３１】アルカリ外傷後に投与したＦＩＴＣ標識ラットｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ化合物の一時間後の角膜内分布を示す。
【図３２】ｒＴＧＦ−β１（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰによるラット眼の免疫組織化学試験の結果を示す。
【図３３】本発明のＰＩＰ化合物ｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０５）及び（ＧＢ１１０６）のＴＩＣ（ｔｏｔａｌ  ｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｇｒａｍ）チャートとエレクトロスプレーイオン化質量分析スペクトルを示す。
【図３４】本発明のＰＩＰ化合物ｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０１）のＴＩＣ（ｔｏｔａｌ  ｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｇｒａｍ）チャートとエレクトロスプレーイオン化質量分析スペクトルを示す。
【図３５ａ】本発明のＰＩＰ化合物ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）及びｒＭＭＰ９ＡＰ１ＦＩＴＣのＲＰ−ＨＰＬＣチャートをそれぞれ（ａ）及び（ｂ）に示す。
【図３５ｂ】本発明のＰＩＰ化合物ｒＭＭＰ９ＡＰ１及びｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ＦＩＴＣのＲＰ−ＨＰＬＣチャートをそれぞれ（ａ）及び（ｂ）に示す。
【図３６】本発明のＰＩＰ化合物ｒＭＭＰＮＦκβのＲＰ−ＨＰＬＣチャートを示す。
【図３７】本発明のＰＩＰ化合物ｈＭＭＰ９ＡＰ１のＲＰ−ＨＰＬＣチャートを示す。
【図３８】本発明のＰＩＰ化合物ｈＭＭＰ９ＮＦκβのＲＰ−ＨＰＬＣチャートを示す。
【図３９】本発明のＰＩＰ化合物ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）のＲＰ−ＨＰＬＣチャートを示す。
【図４０】標的ＤＮＡに対する、ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰの結合特異性及び親和性を調べた結果を示す。（Ａ）はゲルシフトアッセイの結果を示す。レーン１は一本鎖ＤＮＡ、レーン２は二本鎖ＤＮＡ、レーン３はｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）と二本鎖ＤＮＡの結果を示す。（Ｂ）は、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイの結果を示す。グラフでは、下から、０ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、及び３００ｎＭの濃度のｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）の結果を示す。（Ｃ）は、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイの結果を示す。グラフでは、下から、０ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、及び３００ｎＭの濃度のミスマッチポリアミドの結果を示す。Ｄ）ｒＴＧＦ−β１のプロモータ領域をサブクローンしたルシフェレースリポータプラスミドを用いたプロモータにおけるｒＴＧＦ−β１プロモータ発現抑制アッセイの結果をを示す。ＰＭＡの添加により誘導されるリポータ遺伝子発現が、ＧＢＰ１２０１およびＧＢＰ１２０３の添加で抑制され、ミスマッチポリアミドでは抑制されなかった。
【図４１】本発明の図４０の実験に使用したＰＩＰ化合物ミスマッチポリアミドの構造式（ａ）とＲＰ−ＨＰＬＣチャート（ｂ）の結果を示す。
【図４２】本発明のＰＩＰ化合物ｒＴＧＦ−β１（ＧＢＰ１２０３）のＲＰ−ＨＰＬＣチャートを示す。
【図４３】本発明のＦＩＴＣ標識ヒトｈＴＧＦ−β１（ＧＢＰ１１０５）ＰＩＰ化合物のヒト網膜上皮細胞ＡＰＲＥ−１９における添加３０分、２時間、６時間後の細胞内分布(核内)局在を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位、Ｎ−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位（以下γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（例えば、特許文献１〜３参照）。
【００２５】
例えば、ピロールイミダゾールポリアミドはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）を用いた固相法（固相Ｆｍｏｃ法）による自動合成法によって製造することができる（特許文献３）。固相Ｆｍｏｃ法によれば、ピロールイミダゾールポリアミドの末端をカルボン酸残基として固体担体から切り出すことができるので、種々の官能基を分子末端に導入してピロールイミダゾールポリアミドの誘導体を作成することもできる。例えば、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ブレオマイシン、エンジイン化合物、ナイトロジェンマスタード、これらの誘導体等、ＤＮＡに対してアルキル化能を有する化合物を必要に応じて導入することもできる。固相Ｆｍｏｃ法は市販のタンパク（ペプチド）合成機を用いる自動合成法であるため、天然に存在するタンパク質や非天然タンパク質とピロールイミダゾールポリアミドとの共役体（コンジュゲート）を合成することもできる。また、Ｆｍｏｃ法はｔ−ＢＯＣ法に比べて反応条件が緩和であるため、タンパク質以外の有機化合物（酸性条件下で不安定な官能基を有する化合物をも含む）の導入も可能である。例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＤＮＡやＲＮＡ（又はそれらの誘導体）との共役体を自動的に合成することも可能である。
【００２６】
上記公知のＦｍｏｃ法等によれば、末端にカルボキシル基を有するピロールイミダゾールポリアミドを合成することができる。その具体例としては、例えば、末端にβ−アラニン残基（β−アミノプロピオン酸残基）やγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミド等が挙げられる。末端にβ−アラニン残基又はγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミドは、例えば、それぞれＦｍｏｃでアミノ基を保護した、アミノピロールカルボン酸、アミノイミダゾールカルボン酸、β−アラニン又はγ−アミノ酪酸を担持した固相担体を用い、ペプチド合成機を使用して固相Ｆｍｏｃ法により合成することができる。
【００２７】
アミノピロールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−ピロールカルボン酸等が挙げられる。アミノイミダゾールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−イミダゾールカルボン酸等が挙げられる。
【００２８】
固相Ｆｍｏｃ法によれば、例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）との共役体を合成することもできる。ＦＩＴＣは従来から抗体の蛍光標識試薬として知られているので、得られる共役体は、当該ピロールイミダゾールポリアミドが特定のＤＮＡ配列を認識することを証明するために用いることができる。
【００２９】
本発明のピロールイミダゾール化合物は、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトトランスフォーミング増殖因子βの塩基配列−５５５〜−５２８（配列番号２）、−４２７〜−３９９（配列番号４）の領域、−３８４〜−３５５（配列番号６）の領域、ラットトランスフォーミング増殖因子βの塩基配列−２３１６〜−２２８７（配列番号２５）の領域、−２３２２〜−２２９３（配列番号８）の領域、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ９の塩基配列−８８〜−５９（配列番号１１）の領域、−６１６〜−５８８（配列番号１３）の領域、ラットマトリックスメタロプロテアーゼ９の塩基配列−１０５〜−７６（配列番号１５）の領域、及び−６０２〜−５７５（配列番号１７）の領域の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含む。
【００３０】
通常ＤＮＡの螺旋の骨格は２種類の溝をつくり、広くて深い溝を主溝（メジャーグルーブ）、狭くて浅い溝を副溝（マイナーグルーブ）と呼んでいる。ここで上記ピロールイミダゾールポリアミドは、特定の塩基対がつくる副溝（マイナーグルーブ）に高い親和性と特異性を以って非共役結合的に結合することができる。この時の結合は、副溝のＣ−Ｇ塩基対に対してはピロールイミダゾールポリアミドのＰｙ／Ｉｍもしくはβ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／ＰｙもしくはＩｍ／β対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙもしくはβ／β、Ｐｙ／β、β／Ｐｙ対がそれぞれ対応している。そして、ピロールイミダゾールポリアミド分子中のγ−アミノ酪酸単位の部位で分子が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとる。
【００３１】
副溝の塩基対とピロールイミダゾールポリアミドのＰｙとＩｍの対が上述のように対応していないと、副溝とピロールイミダゾールポリアミドとの結合が不十分となる。このように、副溝の塩基対とＰｙ−Ｉｍ対が上述のように対応していないピロールイミダゾールポリアミドを本願ではミスマッチ又はミスマッチポリアミドと呼ぶ。
【００３２】
ヒトトランスフォーミング増殖因子β及びヒトマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子調節領域の塩基配列は図１（配列番号１）及び図６（配列番号１０）に示す通りである。
【００３３】
本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物のヒトトランスフォーミング増殖因子β（ＧＢＰ１１０１）（以下、ｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０１）とも言う）は分子式Ｃ８４Ｈ１０３Ｎ３０Ｏ１６、分子量１７８８．９１であり、特許文献５ＷＯ／２００６／０１８９６７におけるポリアミド化合物にＤｐを付加することで正電荷をくわえＤＮＡへの結合と水溶性を増す構造に改良したものでヒトトランスフォーミング増殖因子β（ＧＢＰ１１０５）（以下、ｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０５）とも言う）は、分子式Ｃ７６Ｈ９４Ｎ３０Ｏ１５、分子量１６６７．７５であり、ヒトトランスフォーミング増殖因子β（ＧＢＰ１１０６）（以下、ｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０６）とも言う）は分子式Ｃ８８Ｈ１０6Ｎ３４Ｏ１７、分子量１９１２．００である。そのｈＴＧＦ−β遺伝子調節領域（配列番号１）の標的配列はＧＢＰ１１０１が、塩基配列−５５５〜−５２８（配列番号２）の領域の脂肪特異性配列（ＦＳＥ２）結合領域、より具体的には−５４４〜−５３８（配列番号３）であり、ＧＢＰ１１０５がＡＰ１結合配列を含む塩基配列−４２７〜−３９９（配列番号４）の領域、より具体的には−４１６〜−４１０（配列番号５）であり、ＧＢＰ１１０６がＡＰ１結合配列を含む−３８４〜−３５５（配列番号６）の領域、より具体的には−３７３〜−３６６（配列番号７）であり、転写因子結合部位付近に結合することにより、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現を抑制する。
本発明のピロールイミダゾールポリアミドｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０１）、ｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０５）、ｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０６）は下記に示す通りである。
ｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０１）
【化１９】
2010103683.tif 000020
ｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０５）
【化２０】
2010103683.tif 000021
ｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０６）
【化２１】
2010103683.tif 000022
【００３４】
ラットトランスフォーミング増殖因子β遺伝子調節領域の塩基配列は図２及び図３に示す通りである。
本発明の（ピロールイミダゾールポリアミド化合物のラットトランスフォーミング増殖因子β（ＧＢＰ１２０１）及び（ＧＢＰ１２０３）（以下、ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）及びｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０３）とも言う）は、分子式Ｃ７６Ｈ９３Ｎ３０Ｏ１５、分子量１６６６．７及び分子式Ｃ７８Ｈ９７Ｎ２８Ｏ１５、分子量１６６５．８である。そのｒＴＧＦ−β遺伝子調節領域（図２及び図３）の標的配列はそれぞれ、ＡＰ１結合配列を含む塩基配列−２３２２〜−２２９３（配列番号８）の領域、より具体的には−２３１１〜−２３０４（配列番号９）であり、又は、−２３１６〜−２２８７（配列番号２５）の領域、より具体的には−２３０５〜−２２９８（配列番号２６）であり、転写因子結合部位付近に結合することにより、ｒＴＧＦ−β１遺伝子の発現を抑制する。
本発明のピロールイミダゾールポリアミドｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）は下記に示す通りである。
【００３５】
ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）
【化２２】
2010103683.tif 000023
ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０３）
【化２３】
2010103683.tif 000024
【００３６】
本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物のヒトマトリックスメタロプロテアーゼ９ＡＰ１（以下、ｈＭＭＰ９ＡＰ1とも言う）は、分子式Ｃ７５Ｈ９３Ｎ３１Ｏ１５、分子量１６６８．６を有し、その標的配列はヒトマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子調節領域（配列番号１０）の−６５３〜−２４の領域のうち、ＡＰ１結合領域およびＧＴ  ｂｏｘ  調節領域を含む−８８〜−５９（配列番号１１）の領域であり、より具体的には−７７〜−７０の領域のａｇｔｃａｇｃａ（配列番号１２）の８塩基に結合することにより、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子の発現を抑制する。
【００３７】
本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物のヒトマトリックスメタロプロテアーゼ９ＮＦκβ（以下、ｈＭＭＰ９ＮＦκβとも言う）は、分子式Ｃ６６Ｈ８４Ｎ２４Ｏ１３、分子量１４２１．３を有し、その標的配列はマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子調節領域（配列番号１０）の−６５３〜−２４の領域のうち、ＮＦκβ領域を含む−６１６〜−５８８（配列番号１３）の領域であり、より具体的には−６０５〜−５９９の領域のｔｇｇａａｔｔ（配列番号１４）の７塩基に結合することにより、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子の発現を抑制する。
本発明のピロールイミダゾールポリアミドｈＭＭＰ９ＡＰ１及びｈＭＭＰＮＦκβは下記に示す通りである。
【００３８】
ｈＭＭＰ９ＡＰ１
【化２４】
2010103683.tif 000025
【００３９】
ｈＭＭＰ９ＮＦκβ
【化２５】
2010103683.tif 000026
【００４０】
本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物のラットマトリックスメタロプロテアーゼ９ＡＰ１（以下、ｒＭＭＰ９ＡＰ1とも言う）は、分子式Ｃ７５Ｈ９３Ｎ３１Ｏ１５、分子量１６６８．７４を有し、その標的配列はラットマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子調節領域のうち、ＡＰ１結合領域及びＧＴ  ｂｏｘ調節領域を含む−１０５〜−７６（配列番号１５）の領域であり、より具体的には−９４〜−８７（配列番号１６）の８塩基に結合することにより、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子の発現を抑制する。
【００４１】
本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物のラットマトリックスメタロプロテアーゼ９ＮＦκβ（以下、ｒＭＭＰ９ＮＦκβとも言う）は、分子式Ｃ６６Ｈ８４Ｎ２４Ｏ１３、分子量１４２１．５を有し、その標的配列はラットマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子調節領域のうち、ＮＦκβ領域を含む−６０２〜−５７５（配列番号１７）の領域であり、より具体的には−５９１〜−５８６の領域の（配列番号１８）の６塩基に結合することにより、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子の発現を抑制する。
本発明のピロールイミダゾールポリアミドｒＭＭＰ９ＡＰ１及びｒＭＭＰＮＦκβは下記に示す通りである。
【００４２】
ｒＭＭＰ９ＡＰ1
【化２６】
2010103683.tif 000027
ｒＭＭＰ９ＮＦκβ
【化２７】
2010103683.tif 000028
なお、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子配列は哺乳類において高度に保存されているため、ｒＭＭＰ９ＡＰ１及びｒＭＭＰ９ＮＦκβＰＩＰ化合物はヒトに対しても使用することができる。
【００４３】
本発明において、眼科増殖性疾患とは、腫瘍、増殖糖尿病網膜症、翼状片、血管新生緑内障、加齢黄班変性症、角膜疾患に合併する角膜血管新生などを示すが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
本発明において、眼科炎症性疾患とは、感染症、角膜炎、結膜炎、アレルギー性疾患、花粉症、に合併する角膜炎笑細胞浸潤などを示すが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
本発明において、局所用眼科疾患治療薬は、特に限定しない限り、硝子体内投与薬、結膜下注射薬、点眼剤、軟膏剤等の眼科疾患治療薬のいかなる形態の剤形であってよい。
【００４６】
本発明において、局所用眼科疾患治療薬には、希釈剤、賦形剤等の一般的な薬学的に許容可能な添加成分を含んでもよい。
【００４７】
本発明者らは、トランスフォーミング増殖因子β及びマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子を選択的に抑制するピロールイミダゾールポリアミドを眼内注射によらないで眼に投与することにより、アルカリバーンによる外傷を治療できることを示した。
従来の眼内疾患の薬物療法においては、点眼で投与した薬剤が涙液により、洗い流され有効薬剤濃度を持続的に角膜で維持することは困難であるため、頻回の点眼投与が必要である。本発明者は、本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物が、点眼による投与により持続的に角膜細胞内に存在し、アルカリバーン後の眼中の濁りを治癒することを示した。
また、ＲＴ−ＰＣＲによる角膜におけるｍＲＮＡ量の測定においても、本発明のピロールイミダゾール化合物は角膜を通過して角膜中のＴＧＦ−β及びＭＭＰ−９遺伝子の発現を抑制したことが示された。
本願が示したラットモデルによるデータは、同じ哺乳類であるヒトの眼内における効果として、ヒトの眼内においても同様の効果を示すといえる。
従って、本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物を含む局所用眼科疾患治療薬は、頻回の点眼投与をすることなく治療が可能となり、薬効濃度の低下による、基底膜の消化、繊維芽細胞の浸潤、リスクを回避できる点で有利である。また、注射によらず容易に投与できることからも患者におけるＱＯＬが著しく向上する点においても有利である。
更に、本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物は核内にとどまることが分かっているため、通常の点眼薬のように一日に何度も投与する必要が無く、例えば一日一回の点眼投与で十分効果を発揮するため有利な効果を奏する。
従って、本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物は、眼科領域で標的遺伝子の阻害剤の欠点を補う新規化合物であり、眼球内及び周囲組織で遺伝子の抑制を選択的に行う効果が認められることより、従来の治療法で解決できなかった個々の疾患に対する治療を標的化合物のスクリーニングにより簡易的に発見できる。
【００４８】
また、硝子体投与薬や局所注射薬による投与による治療を必要とする眼科疾患治療薬としても、上記のように本発明のＰＩＰ化合物が細胞中の核内にとどまることから頻回の投与が必要ではなくなり、頻回の眼内投与により惹起される感染症への罹患の危険率も低下する。また、静脈投与の場合の全身への高い薬剤濃度を保つことによる副作用も防ぐことができる。従って、本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物は、硝子体投与や局所注射薬としても開発を容易にするものである。
更に、本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物は、その遺伝子選択的効果により、眼科領域における分子生物学的研究や薬剤開発研究に使用する機能検査試薬としても使用しうる。
【実施例】
【００４９】
１．プロモーターに対応するＰｙ−Ｉｍポリアミドの合成
（１）ヒト及びラットトランスフォーミング増殖因子β遺伝子、並びにヒト及びラットマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子の転写制御部位に対応するＰｙ−Ｉｍポリアミドの設計
Ｉ．材料及び方法
Ｐｙ−Ｉｍポリアミドとして、上記の本発明に係るＰＩＰ化合物を設計した。【００５０】
（２）Ｆｍｏｃ法を用いたＰｙ−Ｉｍポリアミドのマシンアシスト（機械補助）自動合成
ピロールイミダゾールポリアミドのマシンアシスト自動合成を、連続フローペプチド合成機Ｐｉｏｎｅｅｒ（商標）（アプライドバイオシステムズ）を用いて０．１ｍｍｏｌスケール（２００ｍｇのＦｍｏｃ−β−アラニン−ＣＬＥＡＲ酸レジン、０．５０ｍｅｑ／ｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃ．）で実施した。自動固相合成はＤＭＦ洗浄、Ｆｍｏｃ基の２０％ピペリジン／ＤＭＦによる除去、メタノール洗浄、ＨＡＴＵ及びＤＩＥＡ（それぞれ４当量）の存在下でのモノマーとの６０分間のカップリング、メタノール洗浄、必要に応じて無水酢酸／ピリジンによる保護、及び最終的なＤＭＦ洗浄からなっている。Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは一般に中程度の収率（１０−３０％）で得られた。【００５１】
ＦＩＴＣカップリング：４倍過剰のフルオレセイン（０．４０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（ＨＡＴＵなし）をＤＭＦに溶解したものをカラムを通して６０分間フラッシュした。
一般的手順：  Ｆｍｏｃ−β−アラニン−Ｗａｎｇ樹脂のＦｍｏｃ基を除去した後、樹脂をメタノールで連続的に洗浄した。カップリング工程をＦｍｏｃアミノ酸で実施し、次いでメタノールでの洗浄を行った。これらの工程を全配列が導入されるまで何度も繰返した。カップリング工程を終えた後、必要に応じてＮ末端アミノ基を保護するか又はＦＩＴＣでカップリングし、ＤＭＦで洗浄し、反応容器を取りはずした。【００５２】
カルボン酸としての分解：合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（９１％ＴＦＡ−３％／ＴＩＳ−３％ＤＭＳ−３％水の混合物５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ）の後に単離した。
アミンとしての分解：  合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン５ｍＬ／樹脂０．１ｍｍｏｌ、５０℃、一晩）の後に単離した。
精製：  最終精製は、１０ｍＬ／ｍｉｎの流速の分析用ＲＰ−ＨＰＬＣで、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水又は０．１％ＡｃＯＨ／水）中Ｂ（アセトニトリル）の直線勾配を用いて、３５０ｎｍのＵＶ検出、又は、１ｍＬ／ｍｉｎの流速の分析用ＲＰ−ＨＰＬＣで緩衝液Ａ（０．１％ＡｃＯＨ／水）中Ｂ（ＭｅＣＮ）の直線勾配を用いて、２５４ｎｍのＵＶ検出により行った。ｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０１）、ｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０５）、ｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０６）、ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）、ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０３）、ｈＭＭＰ９ＡＰ1、ｈＭＭＰ９ＮＦκβ、ｒＭＭＰ９ＡＰ1、ｒＭＭＰ９ＮＦκβ、ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）−ＦＩＴＣ、ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ミスマッチ、ｒＭＭＰ９ＡＰ1-ＦＩＴＣ、ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０３）ミスマッチをそれぞれ９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２７、２８及び２９、４１ａに示す。また、ｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０５）及びｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０６）のＲＰ−ＨＰＬＣチャートは図３３に、ｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０１）のＴＩＣ（ｔｏｔａｌ  ｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｇｒａｍ）チャートとエレクトロスプレーイオン化質量分析スペクトルを図３４に、ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）及びｒＭＭＰ９ＡＰ１ＦＩＴＣのＲＰ−ＨＰＬＣチャートを図３５ａに、ｒＭＭＰ９ＡＰ１及びｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ＦＩＴＣのＲＰ−ＨＰＬＣチャートを図３５ｂに、ｒＭＭＰＮＦκβのＲＰ−ＨＰＬＣチャートを図３６に、ｈＭＭＰ９ＡＰ１のＲＰ−ＨＰＬＣチャートを図３７に、ｈＭＭＰ９ＮＦκβのＲＰ−ＨＰＬＣチャートを図３８に、ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）のＲＴ−ＰＣＲのチャートを図３９に、ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０３）ミスマッチのＲＰ−ＨＰＬＣチャートを図４１（ｂ）に、ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０３）のＲＴ−ＰＣＲのチャートを図４２にそれぞれ示す。【００５３】
２．アルカリバーン動物モデルの作製
８週齢のオスWisterラットを、用意しジエチルエーテルにより麻酔後、Ｓａｉｋａら（Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏ．，２００５）に従って５μｌの０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を成体Wisterラットの両眼もしくは片眼の角膜中心部点眼する一般的方法で麻酔下に投与し、点眼１０秒後に１０ｍｌのリン酸緩衝液でアルカリ液を角膜表面から洗い流し、アルカリバーンラットモデルを作製した。【００５４】
３．標的ＤＮＡに対するｒＴＧＦ−β１（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰの結合特異性及び親和性
Ｉ．方法
ゲルシフトアッセイのためにＡＰ−１結合サイトを含む、ＴＧＦ−β１プロモーターに対応する蛍光標識マッチオリゴＤＮＡを合成した。試験に適切なセンス及びアンチセンスオリゴＤＮＡをアニールさせ、二重鎖オリゴＤＮＡを用意した。１μＭのＤＮＡを５０μＭのＰＩＰ化合物と１時間３７℃でインキュベートし、２０％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動にて分離し、蛍光イメージアナライザーＬＡＳ−３０００（フジフィルム、東京、日本）によって可視化した。
ビアコアアッセイは、ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰの標的ＤＮＡに対するリアルタイムの結合親和性を測定することができる。
ビオチン標識オリゴＤＮＡはアニールして二重鎖にし、ストレプトアビジンをあらかじめ固定したセンサーチップＳＡ（ビアコア社、ウプサラ、スウェーデン）に固定した。
ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ、ミスマッチ（図４１（ａ））、及びビオチン標識オリゴＤＮＡについて、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００システム（ビアコア社、ウプサラ、スウェーデン）を用いて相互作用の動力学を調べた。データ処理はＢｉａｃｏｒｅ２０００により推奨されたプロトコールに準じて実施した。【００５５】
ＩＩ．結果
ゲルシフトアッセイにより、本発明のｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰは、標的ＤＮＡに特異的に結合した（図４０）。一方、ミスマッチポリアミドには結合しなかった。
ビアコアアッセイによって、ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ及びミスマッチポリアミドに対する動力学的解析を行った。表面プラズモン共鳴センサーグラムから、ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰは、標的ＤＮＡに対する高い結合親和性を示し、ＫＤ＝５．１２±３．４３Ｅ−０９が算出され、ミスマッチポリアミドに比べ１４９倍の親和性を示した。【００５６】
４．本発明のピロールイミダゾールポリアミドのアルカリバーンラットにおける効果
Ｉ．方法
アルカリバーンによる外傷を惹起させてから１時間後（午前９時）、５μｌの０．１％酢酸水に溶解した１μＭｏｌ／LのｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ化合物及び１μＭｏｌ／L（ｒＭＭＰ９ＡＰ１およびｒＭＭＰ９ＮＦｋＢの１：１混合物（以下ｒＭＭＰ９ＰＩＰともいう）を、角膜中央部に滴下することによってラットの右眼に一日１回午前９時に、１週間にわたり連日投与した。コントロールとして０．１％酢酸水溶液を上記と同様に左眼に投与した。同様の実験を６匹のラットで行った。０．１％酢酸溶液を使用したのは、本発明のＰＩＰ化合物を当該水溶液に溶かして使用していた為である。また感染症の発生を防ぐため、抗生物質眼軟膏Tarivid ophthalmic ointment 0.3％（参天製薬）を毎日午後５時に投与した。さらに２匹のラットをアルカリバーン非誘導コントロールとして、薬剤投与を行った。ラットは毎日点眼時に及び眼軟膏塗布時に観察し、角膜所見を毎夕方観察撮影した。水溶性フルオレセインは、実質層が露出するような潰瘍や創傷部分のみを染色する性質があり、その性質を利用して角膜の状態を検査することができるフローレス試験紙（昭和薬品化工）を用いて角膜フルオレセイン検査に準じて角膜損傷部の判定を行った。
角膜の透明性は毎日顕微鏡で観察し、完全な再上皮化が観察されるまで観察を行った。角膜の蛍光染色が観察されなくなった時、完全な再上皮化がされたと定義した。【００５７】
角膜の不透明度及び潰瘍化の評価
角膜の透明度は以下の通り判断した。
グレード０：不透明度なし
グレード１：角膜表面の３分の１未満が曇っている
グレード２：角膜表面の３分の２未満が曇っている
グレード３：角膜表面の３分の２以上が曇っている
グレード４：ほとんど全ての表面が曇っており、瞳孔辺縁の視覚化を不透明性が妨げている状態【００５８】
角膜欠損の程度の評価
グレード０：欠損又は潰瘍化なし
グレード１：潰瘍化が角膜の前部３分の１に制限されている
グレード２：潰瘍化が角膜の中部３分の１まで拡張している
グレード３：潰瘍化が角膜の後部３分の１まで拡張している
グレード４：デスメ膜瘤の形成
グレード５：穿孔【００５９】
ＩＩ．結果
ラットにおけるアルカリ外傷後の角膜所見を図１８に示す。角膜の不透明度及び潰瘍化の評価の結果は図１９及び２１に、角膜欠損の程度の評価の結果は図２０及び２２に示す。対照と比較して  ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ化合物、及びｒＭＭＰ９ＰＩＰは、有意に角膜の不透明度及び潰瘍化、並びに角膜欠損を治癒した。【００６０】
５．リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ（ｍＲＮＡ発現の測定）
Ｉ．材料及び方法
４匹のラットをアルカリによって処理した後、ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ポリアミド、及びｒＭＭＰ９ＰＩＰをそれぞれ０．１％酢酸溶液に溶解し、１μＭｏｌ／Ｌの濃度に調整し、外傷誘発１時間後に５μｌを角膜中央部に滴下した。２４時間、５、１０及び３０日後に屠殺した。ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ化合物及びｒＭＭＰ９ＰＩＰ化合物で処理した群及び対照群について傷害を受けた角膜領域を切り取るために、３ｍｍのディスポーザル生検パンチを使用した。Ｓａｉｋａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏ，２００５及びＳａｉｋａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２００５に記載された方法に従い、総ＲＮＡを調製し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施してＴＧＦ−β１及びＭＭＰ−９ｍＲＮＡのレベルを評価した。
逆転写による相補的ＤＮＡ鎖はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄｋｉｔ（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．）によって合成された。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ＴＰ８００，Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．，Ｊａｐａｎ）は、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を使用した。ＴＧＦ−β１のためのプライマーは、（フォワード、５’−ＣＣＡ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＧＧ  ＡＡＴ  ＡＣＡ  ＧＧ−３’，配列番号１９；  リバース  ５’−ＡＧＣ  ＴＧＴ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  Ｃ−３’，配列番号２０；  １９４ｂｐのＰＣＲ産物）を使用した。ＭＭＰ−９のためのプライマーは、（フォワード、５’−ＴＴＣ  ＧＡＣ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＴＧ−３’，配列番号２１；  リバース  ５’−ＡＧＧ  ＧＧＡ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＧＴＧ  ＧＴＡ  ＧＴ−３’，配列番号２２；  １５６ｂｐのＰＣＲ産物）を使用した。ＧＡＰＤＨのためのプライマーは、（フォワード、５’−ＡＣＡ  ＴＣＡ  ＡＡＴ  ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＣＴ−３’，配列番号２３；  リバース  ５’−ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＣＡＣ  ＡＣＣ  ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＡＡ−３’，配列番号２４；  １６１ｂｐのＰＣＲ産物）を使用した。ツーステップＲＴ−ＰＣＲ混合物２５μｌは、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸＴａｑ１２．５μｌ、夫々のフォワード及びリバースプライマー０．５μｌ、ＲＮａｓｅフリー水１０．５μｌ、鋳型ｃＤＮＡ１μｌからなる。リアルタイムサイクル条件は、９５℃、１０秒、９５℃、５秒  ６０℃、３０秒の反応系によって行った。ＴＧＦ−β１およびＭＭＰ−９遺伝子の定量はＧＡＰＤＨ発現と比較することによって標準化した。【００６１】
ＩＩ．結果
本発明のポリアミドがラット角膜におけるＴＧＦ−β及びＭＭＰ−９ｍＲＮＡの発現の減少と相関しているかどうかを調べるために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、本発明のポリアミドで処理したラット角膜細胞と０．１％酢酸水溶液によるコントロールのＴＧＦ−β１及びＭＭＰ−９ｍＲＮＡ発現レベルを比較した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる分析は、ＴＧＦ−βＰＩＰ及びＭＭＰ９ＰＩＰ化合物の処理によってラット角膜におけるＴＧＦ−βｍＲＮＡ及びＭＭＰ９ｍＲＮＡが有意に減少したことが分かった（図２３〜２６）。【００６２】
６．本発明のピロールイミダゾールポリアミドのアルカリバーンラットにおける角膜内細胞の核内への迅速な送達効果
Ｉ．方法
ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ポリアミドとｒＭＭＰ−９ＮＦｋＢ、ｒＭＭＰ９ＡＰ１ポリアミドの角膜内細胞核内への移行を確認するため、各ポリアミドをＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒ−Ｉ（ＦＩＴＣ）でラベルしたＦＩＴＣポリアミドの合成を行った（図２７及び図２９）。合成したＦＩＴＣポリアミドを０．１％酢酸溶液に溶解し、１μＭｏｌ／Ｌの濃度に調整し、アルカリ外傷モデルラット８匹に、外傷誘発１時間後に５μｌを角膜中央部に滴下した。２匹ずつを、ＦＩＴＣポリアミド点眼後、１時間、１日目、４日目、７日目に安楽死させ、眼球を摘出、凍結切片標本用プラスチック容器にＯＣＴコンパウンド（Ｍｉｌｅｓ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ，ＵＳＡ）で抱埋し、液体窒素で凍結、−８０度の超低温冷蔵庫に保存した。凍結切片５μｍに薄切し、オリンパス蛍光顕微鏡で観察した。【００６３】
ＩＩ．結果
本発明ポリアミドは、角膜内に速やかに浸透し角膜のほぼ全ての細胞の核内に到達すると考えられた。また単回投与においても１週間後にも細胞核内の蛍光の観察が可能な細胞が存在した。図３０Ａ及び図３１にＦＩＴＣラベルしたｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ポリアミドを投与一時間後の蛍光観察において、角膜上皮、角膜内間質細胞の核が緑色のＦＩＴＣの蛍光を示している例を示す。図左白くぬけて見えるのが角膜の細胞の核であり、蛍光ＦＩＴＣにより白く見える。左が白色光による同一角膜検体。ＤＡＰＩ染色と同じ位置にＦＩＴＣによる強い蛍光が観察され、これは、すべての角膜組織、角膜上皮細胞、皮膜実質細胞及び上皮細胞において観察された。このことは、本発明用途においてポリアミド化合物が、投与回数を少なくしても涙液に流されること無く、持続的に薬効を示すであろうことを示唆している。実際このことはラットアルカリ外傷モデルにおいて１日一回の投与で十分に効果が得られていることからも実証された。この結果によりｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）は、傷害皮膜上皮層から、角膜間質層及び上皮層に浸透し、細胞全体の核に分布した。蛍光シグナルは前房においても検出された。また、２４時間後でも、核にとどまり、角膜細胞において検出可能なレベルであった（図３０Ｂ）。【００６４】
７．免疫組織化学試験
Ｉ．方法
ラットにおいて角膜外傷誘発後、１時間、１、４及び７日目に眼球を摘出し、ＯＣＴ化合物（マイルズ、エルクハート、インディアナ州、ＵＳＡ）に包埋した。凍結切片を、５μｍの厚さに切断し、組織学的及び免疫組織学的分析を行った。ウサギ−抗ヒトＴｇｆ−β１ポリクロナール抗体を（ヤナイヒラ株式会社、日本、カタログ番号Ｙ２４１）を第一抗体として１：１０００に希釈して使用した。４つの非外傷の角膜を正常対照として、ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ処理眼及びモック処理眼との比較に使用した。第一抗体の特異性を決定するために負の対照も含まれた。【００６５】
ＩＩ．結果
免疫組織化学的分析により、外傷を受けていない角膜においてもＴＧＦ−β１タンパク質がわずかながら発現していること、及び当該発現は上皮層にのみで検出された（図３２、正常）。アルカリ外傷の後、角膜上皮層は、破壊され完全に失われた。角膜実質細胞は、このような欠損を修復するために活性化され増殖した。１日目にはＴＧＦ−β１は、活性化された前方の角膜実質で強く発現した。ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ及び対照では、免疫組織学的差異は見られなかった（図３２Ａ及びＢ）。４日目には、角膜実質層の再生した上皮細胞及び増殖した角膜実質細胞の両方に強いＴＧＦ−β１免疫反応が検出された（図３２Ｃ）。ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）処理角膜（図３２Ｄ）では、角膜実質層の再生した上皮細胞においてＴＧＦ−β１免疫反応が弱く検出され、角膜実質においてより細胞性が少ない層状の上皮を示し、炎症細胞の浸潤が起きていないことと繊維細胞が局所で増えていないことがわかった。対照群では、角膜実質はより厚く膨張しておりより紡錘形のＴｇｆ−β１陽性角膜実質細胞を示し、浸潤炎症細胞は前方部分に集合しＴｇｆ−β１陽性をしめした（図３２Ｃ）。７日目には、ｒＴＧＦ−β（ＧＢＰ１２０１）処理角膜（図３２Ｆ）では、よく再生した上皮及び角膜実質を示し、ほぼ正常細胞と同様の角膜を示した。対照群（図３２Ｅ）では、顕著な細胞過形成（増殖した角膜実質細胞及びトランス分化した筋線維芽細胞であると推定される）及び角膜実質層でのＴＧＦ−β１に対する強い免疫応答を示した。【００６６】
８．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ網膜細胞における蛍光標識ヒトhＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０５）ＰＩＰの分布
Ｉ．材料及び方法
（Ａ）ＡＰＲＥ−１９細胞（ヒト網膜色素上皮由来細胞）は、６ウェルプレートの各ウェルに３Ｘ１０４個となるよう播種した。２ｍｌの１０％ＦＢＳ（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地にて３７℃、５％、ＣＯ２で培養した。培養２４時間後、ＡＰＲＥ−１９細胞に蛍光標識ＦＩＴＣ結合ヒトｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０５）を最終濃度５μＭで成長培地に添加し３０分、２時間、６時間培養した。細胞は洗浄しＦＢＳフリー培地を添加した。生存細胞を×２０の倍率で観察し４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。核はＨｏｅｃｈｓｔ３３４２（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって染色し、再度観察した。
ＩＩ．結果
ＦＩＴＣ結合ヒトｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０５）ＰＩＰは、ヒト網膜色素上皮細胞ＡＰＲＥ−１９細胞を培養している成長培地に添加された３０分後では、はっきりしないが、２時間ですべての細胞の核における局在が観察された。添加から６時間後であってもＦＩＴＣ結合ヒトｈＴＧＦ−β（ＧＢＰ１１０５）ＰＩＰは、ヒト網膜色素上皮細胞ＡＰＲＥ−１９細胞の核にとどまっていることが確認された（図４３）。このことは、既にヒトｈＴＧＦ−βの発現抑制作用が既知のＧＢＰ１１０５においてヒト眼組織（網膜色素上皮細胞）に対する取り込みが期待されることを示す。【００６７】
９．統計解析
結果は平均値±ＳＥで表現した。統計的有意性はスチューデントｔ−検定により評価した。０．０５未満のｐ値を有意であると判定した。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明はＤＮＡ配列特異的結合化合物を含む局所用眼科疾患治療薬に関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミド（以下ＰＩＰとも言う）を含んでなる局所用眼科疾患治療薬に関する。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
配列番号１９  フォワードプライマー
配列番号２０  リバースプライマー
配列番号２１  フォワードプライマー
配列番号２２  リバースプライマー
配列番号２３  フォワードプライマー
配列番号２４  リバースプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５ａ】
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【図３５ｂ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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