(57)【要約】  本発明は、安価で且つ簡便に特定のRNAから対応する二本鎖DNAを合成する方法及び該二本鎖DNAを増幅する方法の提供を課題とし、既知配列のDNA断片を5’末端に付加したオリゴ(dT)プライマーを用いて、polyAを有する鋳型RNAの逆転写反応を行い、一本鎖DNAを取得する工程１、及び、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないポリメラーゼの存在下、既知配列のDNA断片を5’末端に付加したランダムプライマーを用いて、工程１で得られた一本鎖DNAの二本鎖化反応を行い、二本鎖DNAを取得する工程２を含むことを特徴とする、polyAを有する鋳型RNAに対応する塩基配列を有する二本鎖DNAの合成方法、並びに、得られた二本鎖DNAを用いて、更にPCR反応を行う工程３を含むことを特徴とする、polyAを有する鋳型RNAに対応する塩基配列を有する二本鎖DNAの増幅方法に関する。
2010131645.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1) 既知配列のDNA断片を5’末端に付加したオリゴ(dT)プライマーを用いて、polyAを有する鋳型RNAの逆転写反応を行い、一本鎖DNAを取得する工程１、
及び
2) 3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないポリメラーゼの存在下、既知配列のDNA断片を5’末端に付加したランダムプライマーを用いて、工程１で得られた一本鎖DNAの二本鎖化反応を行い、二本鎖DNAを取得する工程２、
を含むことを特徴とする、polyAを有する鋳型RNAに対応する塩基配列を有する二本鎖DNAの合成方法。
【請求項２】
工程１の後、得られた一本鎖DNAを精製する工程を更に含む、請求項１記載の合成方法。
【請求項３】
polyAを有するRNAの鎖長が30〜1500baseである、請求項１記載の合成方法。
【請求項４】
ランダムプライマーの鎖長が5〜15merである、請求項１記載の合成方法。
【請求項５】
工程２の二本鎖化反応を、90〜98℃で1〜15分、20〜40℃で10秒〜5分、65〜75℃で10秒〜10分順に反応させることにより行う、請求項１記載の合成方法。
【請求項６】
1) 既知配列のDNA断片（アダプター１）を5’末端に付加したオリゴ(dT)プライマーを用いて、polyAを有する鋳型RNAの逆転写反応を行い、一本鎖DNAを取得する工程１、
2) 3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないポリメラーゼの存在下、既知配列のDNA断片（アダプター２）を5’末端に付加したランダムプライマーを用いて、工程１で得られた一本鎖DNAの二本鎖化反応を行い、二本鎖DNAを取得する工程２、
及び
3)アダプター１の塩基配列を3’末端に有するプライマー１とアダプター２の塩基配列を3’末端に有するプライマー２を用いて、工程２で得られた二本鎖DNAを鋳型としてPCR反応を行う工程３
を含むことを特徴とする、polyAを有する鋳型RNAに対応する塩基配列を有する二本鎖DNAの増幅方法。
【請求項７】
工程１の後、得られた一本鎖DNAを精製する工程を更に含む、請求項６記載の増幅方法。
【請求項８】
polyAを有するRNAの鎖長が30〜1500baseである、請求項６記載の増幅方法。
【請求項９】
ランダムプライマーの鎖長が5〜15merである、請求項６記載の増幅方法。
【請求項１０】
工程２の二本鎖化反応を、90〜98℃で1〜15分、20〜40℃で10秒〜5分、65〜75℃で10秒〜10分順に反応させることにより行う、請求項６記載の増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のRNAからの対応する二本鎖DNAの合成方法並びに該二本鎖DNAの増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、RNAの遺伝子解析においては、完全長cDNAの取得を目的として、SMART法、Oligo-Capping法、Cap Trapper法等種々の研究がなされてきた。しかし、何れの方法もpolyA及びCap構造を有するRNAでなければ、完全長cDNAを取得することはできず、Cap構造が欠けたRNA断片は解析できない等の問題を有していた。一方、RNA断片も解析できる方法として、マイクロアレイ法が知られているが、該方法は高価な機器を必要とするため、実験レベルで容易に用いられる方法ではなかった。【０００３】
そのため、Cap構造が欠けたようなRNA断片であっても遺伝子解析が可能で、容易に且つ安価に遺伝子解析を可能とする新たな方法の開発が望まれていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、安価で且つ簡便に特定のRNAから対応する二本鎖DNAを合成する方法及び該二本鎖DNAを増幅する方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記状況に鑑み、現在多くのcDNAがデータベース化され、完全長cDNAでなくとも一部の断片が解析できれば、データベースからcDNAの特定ができることに注目し、RNAのcDNA断片を取得する方法及びそのcDNA断片を用いたRNAの遺伝子解析について鋭意研究してきた。その結果、mRNAやmRNA由来の断片等のpolyAを有するRNAから、既知配列のDNA断片を5’末端に付加したオリゴ(dT)プライマーを用いて第１鎖を合成した後、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないポリメラーゼの存在下、アダプターを付加したランダムプライマーを用いて第１鎖から第２鎖を合成することにより、polyAを有するRNAに対応するcDNA断片を安価で且つ容易に得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、
「既知配列のDNA断片を5’末端に付加したオリゴ(dT)プライマーを用いて、polyAを有する鋳型RNAの逆転写反応を行い、一本鎖DNAを取得する工程１、及び、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないポリメラーゼの存在下、既知配列のDNA断片を5’末端に付加したランダムプライマーを用いて、工程１で得られた一本鎖DNAの二本鎖化反応を行い、二本鎖DNAを取得する工程２を含むことを特徴とする、polyAを有する鋳型RNAに対応する塩基配列を有する二本鎖DNAの合成方法」及び「既知配列のDNA断片（アダプター１）を5’末端に付加したオリゴ(dT)プライマーを用いて、polyAを有する鋳型RNAの逆転写反応を行い、一本鎖DNAを取得する工程１、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないポリメラーゼの存在下、既知配列のDNA断片（アダプター２）を5’末端に付加したランダムプライマーを用いて、工程１で得られた一本鎖DNAの二本鎖化反応を行い、二本鎖DNAを取得する工程２、及び、アダプター１の塩基配列を3’末端に有するプライマー１とアダプター２の塩基配列を3’末端に有するプライマー２を用いて、工程２で得られた二本鎖DNAを鋳型としてPCR反応を行う工程３を含むことを特徴とする、polyAを有する鋳型RNAに対応する塩基配列を有する二本鎖DNAの増幅方法」に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の方法によれば、polyAを有する鋳型RNAが配列未知のものであっても、対応する（相補の）塩基配列を有する二本鎖DNAを取得することができる。即ち、従来の方法では難しかった、Cap構造を有さないRNA断片に対応する二本鎖DNAの取得が可能となる。また、マイクロアレイ法のような高価な機器を必要とせずにpolyAを有するRNAに対応する二本鎖DNA取得も可能となる。よって、本発明の方法によれば、容易且つ安価にRNAの遺伝子解析が可能となる。具体的には、本発明の方法により得た二本鎖DNAの配列を解析し、公知の遺伝子データベースと比較することにより、容易且つ安価に鋳型RNAの同定が可能となる。
更に、本発明の増幅方法によれば、polyAを有するRNAが微量であっても、クローニング可能な量のDNAの取得が可能となる。また、得られる二本鎖DNAの鎖長はpolyAを有するRNAの鎖長に依存しないため、試料中のtotal RNAに対するpolyAを有するRNAの存在比率を維持したまま増幅が可能となり、RNAの定量的解析への応用も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、本発明の二本鎖DNAの増幅方法の一例を示した模式図を表す。
【図２】図２は、実施例１の６.のコロニーPCRで得た、同一クローン3種のコロニーの挿入断片を電気泳動した後のゲルの影像を表す。
【図３】図３は、実施例４において、マウス精巣を試料としてマウス抗PIWIL1抗体固定化担体を用いて免疫沈降法によりRNAを得て、該RNAを鋳型として本発明の方法により合成したDNAを、Agilent 2100 Bioanalyzerを用いてキャピラリー電気泳動した結果である。
【図４】図４は、実施例４において、マウス精巣を試料としてマウス抗IgG抗体固定化担体を用いて免疫沈降法により得たRNAを得て、該RNAを鋳型として本発明の方法により合成したDNAを、Agilent 2100 Bioanalyzerを用いてキャピラリー電気泳動した結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明に係るpolyAを有する鋳型RNA（以下、本発明に係る鋳型RNAと略記する場合がある）としては、polyAを有するRNAであれば特に限定されず、具体的には、例えばメッセンジャーRNA(mRNA)、ノン・コーディングRNA(non-coding RNA)、Alu RNA等が挙げられる。また、本発明に係る鋳型RNAは、これらRNAの断片であってもよく、例えばCap構造が欠けたものであってもよい。なお、このようなCap構造が欠けたRNAに対応する塩基配列を有する二本鎖DNAの合成は、マイクロアレイ以外の従来の方法では難しかったが、本発明の方法によればそのようなRNAであっても対応する二本鎖DNAを容易に合成することが可能となる。また、本発明に係る鋳型RNAは、既知配列であっても未知配列であってもよいが、未知配列であっても対応する二本鎖DNAを合成又は増幅することができるのが、本発明の効果の１つでもある。本発明に係る鋳型RNAの鎖長は、通常30 base以上〜1500base、好ましくは通常30〜1000base、より好ましくは30〜100base、更に好ましくは30〜50baseである。
【０００９】
本発明の二本鎖DNAの合成方法において得られる二本鎖DNAは、本発明に係る鋳型RNAに対応する塩基配列の一部を含む一本鎖DNA及びその一本鎖DNAに対応する一本鎖DNAとからなるものを表す。
【００１０】
polyAを有するRNAに対応する塩基配列を有する二本鎖DNAの合成方法
polyAを有するRNAに対応する塩基配列を有する二本鎖DNAの合成方法（以下、本発明の二本鎖DNAの合成方法と略記する場合がある）は、以下の工程によりなされることを特徴とする。
1) 既知配列のDNA断片（以下、アダプター１と略記する場合がある）を5’末端に付加したオリゴ(dT)プライマーを用いて、本発明に係る鋳型RNAの逆転写反応を行い、一本鎖DNAを取得する工程１、
2) 3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないポリメラーゼの存在下、既知配列のDNA断片を5’末端に付加したランダムプライマーを用いて、工程１で得られた一本鎖DNAの二本鎖化反応を行い、二本鎖DNAを取得する工程２。
【００１１】
上記工程１は、通常この分野で用いられている公知の方法に従って、本発明に係るpolyAを有する鋳型RNAに、アダプター１を付加したオリゴ(dT)プライマーを用いて逆転写反応を行うことによりなされ、これにより本発明に係る鋳型RNAと相補の塩基配列を含む一本鎖DNAが得られる。市販のキットを用いて行うこともできるが、例えばNucleic Acids Research, 1988, Vol. 16, No. 5 1999-2014、Nucleic Acids Research, 1988, Vol. 16, No. 1 265-277に記載の方法に準じて行えばよく、具体的には例えば、鋳型RNAに、アダプター１を付加したオリゴ(dT)プライマー、逆転写酵素、４種類の混合デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTPs)を添加し、トリス緩衝液(pH8.3)等の緩衝液中で通常35〜50℃、好ましくは40〜50℃で通常5〜40分間、好ましくは5〜20分間反応させ、その後、加熱処理又は反応停止液を加えて反応を停止することによりなされる。これにより、本発明に係る鋳型RNAに対して相補的な一本鎖DNAを得ることができる。
【００１２】
この際に用いられる本発明に係る鋳型RNAの量としては、用いられる試料により変動するので特に限定されないが、本発明に係る鋳型RNAの核酸量として通常1ng〜１μgである。例えば、total RNAを用いる場合には、その試料量は、通常100ng〜50μg、好ましくは1〜20μgである。尚、これらRNAは通常上記核酸量を溶液中に含有させて上記工程に付され、その溶液の量としては、通常1〜30μL、好ましくは1〜20μLである。このようなRNAを含む試料溶液の溶媒としては通常滅菌された蒸留水が用いられる。
【００１３】
上記オリゴ(dT)プライマーは、polyAと結合するものであれば特に限定されず、通常この分野で用いられるもの全てを用いることができる。具体的には、通常10〜100merであり、10〜50merが好ましく、15〜30merがより好ましい。また、オリゴ(dT)プライマーに付加される既知配列のDNA断片としては、アダプターとして用いることができるものであればよく、通常10〜50merであり、12〜40merが好ましく、15〜30merがより好ましい。アダプター１を付加したオリゴ(dT)プライマーの使用量は、鋳型RNAの核酸量1μgに対して通常1〜250pmol、好ましくは、10〜50pmolである。
【００１４】
上記逆転写反応時の逆転写酵素としては、通常この分野で用いられているものであれば特に限定されないが、例えばMoloney Murine Leukemia Virus(M-MLV) 逆転写酵素、Avian myeloblastosis virus(AMV)逆転写酵素、M-MLV逆転写酵素(RNaseHマイナス)等が挙げられ、中でもM-MLV逆転写酵素(RNaseHマイナス)が好ましい。また、その使用量は用いられる酵素の種類により異なるが、鋳型RNAの核酸量1μgに対して通常1〜400units、好ましくは、10〜200unitsである。
【００１５】
上記dNTPsは、通常この分野で用いられる、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸の混合物であり、その使用量は、鋳型RNAの核酸量1μgに対して通常0.1〜20nmol、好ましくは、1〜10nmolである。上記反応停止液としては、例えばEGTA、EDTA等のキレート剤を含むものが挙げられ、その使用量は、キレート剤の種類により異なるが、最終濃度として通常10〜100mmol/L、好ましくは40〜60mmol/Lとなるように添加される。また、反応を停止させるための加熱処理は、通常65〜100℃、好ましくは65〜70℃で、通常15〜60分、好ましくは15〜30分行われる。上記逆転写反応においては、通常このような逆転写反応時に用いられている、DTT(ジチオスレイトール)等の還元剤、塩化カリウム、塩化マグネシウム、リボヌクレアーゼ阻害剤等の試薬を添加してもよく、これら試薬の濃度及び使用量は通常この分野で用いられている範囲から適宜選択される。
【００１６】
上記工程１においては、その工程後、本発明に係る鋳型RNAを除去し、得られた一本鎖DNAを精製するのが好ましい。具体的には、例えば工程１の逆転写反応後の溶液をアルカリ処理に付したり、或いはRNaseH処理をすることによりなされる。該アルカリ処理としては、例えばアルカリ又はその水溶液を逆転写反応後の溶液に添加して反応溶液をアルカリ性にすることによりなされる。該アルカリとしては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、水酸化バリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属水酸化物、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属の炭酸塩、アンモニア、アミン類が挙げられるが、中でも水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物が好ましく、これらの中でも水酸化ナトリウムが特に好ましい。該アルカリ処理は、具体的には当該溶液のpHを10〜14、好ましくは12〜14とし、通常20〜120分間、好ましくは20〜60分間、通常50〜80℃、好ましくは60〜70℃で加温することによりなされる。上記RNaseH処理としては、逆転写反応後の溶液にRNaseHを添加して本発明に係る鋳型RNAと逆転写された対応のDNAを分離させ、その後通常この分野でなされるカラム精製することでなされる。ここで用いられるRNaseHは、通常この分野で用いられるものであれば何れでもよく、公知の方法により調製されたものであっても、市販品であってもよい。また、用いられるRNaseHの量も通常この分野で用いられる範囲であれば特に限定はされない。
【００１７】
工程２は、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないポリメラーゼの存在下、工程１で得られた一本鎖DNAに、既知配列のDNA断片（以下、アダプター２と略記する場合がある）をその5’末端に付加したランダムプライマーを用いて二本鎖化反応を行うことによりなされ、これにより、本発明に係る鋳型RNAに対応する塩基配列を有する二本鎖DNAを得ることができる。該工程２は具体的には例えば、工程１で得られた一本鎖DNAを含む溶液に、既知配列のDNA断片（アダプター２）を5’末端に付加したランダムプライマー、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないポリメラーゼ、４種類の混合デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTPs)を添加し、通常90〜98℃で1〜15分、20〜40℃で10秒〜5分、65〜75℃で10秒〜10分反応させることによりなされる。
【００１８】
工程２で用いられるランダムプライマーの鎖長は、通常5〜15merであるが、6mer以下ではPCRに付す場合PCRプライマーともアニーリングする可能性があり、13mer以上ではランダムプライマー同士のアニーリングの可能性が高くなるため7〜12merが好ましく、9〜12merがより好ましい。具体的には、C（シトシン）,G（グアニン）又はT（チミン）をBで表し、A（アデニン）,C（シトシン）,G（グアニン）又はT（チミン）をNで表した場合、例えば、12N、11N、10N、9N、8N、7N、14N1B、13N1B、11N1B、10N1B、9N1B、8N1B等が挙げられ、12N、11N、10N、9N、11N1B、10N1B、9N1B、8N1B等が好ましく、中でも11N1B、10N1B、9N1B、12N、11Nが特に好ましい。ランダムプライマーに付加される既知配列のDNA断片（アダプター２）としては、アダプターとして用いることができるものであればよく、その鎖長は、通常10〜50merであり、12〜40merが好ましく、15〜30merがより好ましい。アダプター２を付加したランダムプライマーの使用量は、鋳型RNAの核酸量1μgに対して通常1〜250pmol、好ましくは、10〜50pmolである。
【００１９】
工程２で用いられる3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないポリメラーゼとしては、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性両方の活性を有さないものであればよく、具体的には例えばTaqDNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ等が挙げられ、中でもTaqDNAポリメラーゼが好ましい。工程２において、ポリメラーゼとして3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有し且つ鎖置換活性を有するポリメラーゼを用いると、その鎖置換活性のため、ランダムプライマーがDNAにアニーリングして伸長したヌクレオチド鎖が遊離してしまう。その結果、遊離したヌクレオチド鎖にランダムプライマーがアニーリングするため、種々のDNAが合成されてしまう。しかし、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないポリメラーゼを用いると、DNAにアニーリングし伸長したランダムプライマーは遊離することがないため、効率よく本発明に係る二本鎖DNAを合成することが可能となる。3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないポリメラーゼの使用量は用いられる酵素の種類により異なるが、本発明に係る鋳型DNAの核酸量100pg〜100ngに対して通常1〜10units、好ましくは、1〜5unitsである。
【００２０】
工程２で用いられる４種類の混合デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTPs)は、上記工程１で用いられるものと同様、通常この分野で用いられるものであればよく、その使用量は、鋳型DNAの核酸量100pg〜100ngに対して通常0.1〜20nmol、好ましくは、1〜10nmolである。
【００２１】
工程２の二本鎖化反応は、通常、順に90〜98℃で1〜15分、20〜40℃で10秒〜5分、65〜75℃で10秒〜10分、好ましくは、94〜96℃で1〜10分、25〜35℃で1〜3分、68〜72℃で30秒〜2分反応させることによりなされるが、上記条件が含まれていれば段階的に温度を変化させても構わない。即ち、順に、90〜98℃で1〜15分、25〜35℃で10秒〜5分、35〜45℃で10秒〜5分、45〜55℃で10秒〜5分、55〜65℃で10秒〜5分、65〜75℃で10秒〜10分反応させることにより行ってもよい。
【００２２】
上記本発明の二本鎖DNAの合成方法の好ましい例を以下で説明する。
【００２３】
即ち、先ずpolyAを有する鋳型RNAを核酸量として1〜20ng含有する溶液例えば10μLに、既知配列を5’末端に付加したオリゴ(dT)プライマーを10〜50μmol/L含む溶液1〜5μL及び10〜200units／μLの逆転写酵素を含む溶液1〜5μLを加え、40〜50℃で10〜60分間反応させることにより、鋳型RNAに対して相補的な一本鎖DNAが得られる。更に、鋳型RNAに対して相補的な一本鎖DNAを含む溶液に、例えば水酸化ナトリウム等のアルカリ金属の水酸化物を反応溶液がpH12〜14となるように添加し、60〜70℃で30〜60分間反応させることにより、残存するRNAを分解させる。次いで、例えばカラム分画による抽出等の方法を用いる精製方法等により、得られた一本鎖DNAを精製することで、本発明に係る、鋳型RNAに相補的な塩基配列を含む一本鎖DNAを得ることができる。
【００２４】
更に、得られた本発明に係る一本鎖DNAを含む溶液例えば10μLに、5〜20μmol/Lの既知配列のDNA断片を5’末端に付加したランダムプライマー  1〜5μL、並びに各濃度が1〜5mmol/Lの４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）の混合溶液1〜5μL、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないポリメラーゼ1〜5unitを添加して、例えば(1)93〜98℃、1〜10分→(2)25〜35℃、30秒〜５分、(3)68〜72℃、1〜5分間で反応を行うことにより、本発明に係る二本鎖DNAを得ることができる。その後得られた本発明に係る二本鎖DNAを、例えばカラム分画により抽出し精製してもよい。
【００２５】
polyAを有するRNAに対応する塩基配列を有する二本鎖DNAの増幅方法
本発明に係る、polyAを有するRNAに対応する塩基配列を有する二本鎖DNAの増幅方法（以下、本発明の二本鎖DNAの増幅方法と略記する場合がある）は、以下の工程によりなされることを特徴とする。
1) 既知配列のDNA断片（アダプター１）を5’末端に付加したオリゴ(dT)プライマーを用いて、polyAを有する鋳型RNAの逆転写反応を行い、一本鎖DNAを取得する工程１、
2) 3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないポリメラーゼの存在下、既知配列のDNA断片（アダプター２）を5’末端に付加したランダムプライマーを用いて、工程１で得られた一本鎖DNAの二本鎖化反応を行い、二本鎖DNAを取得する工程２、
及び
3)アダプター１の3’末端に塩基配列を有するプライマー１とアダプター２の塩基配列を3’末端に有するプライマー２を用いて、工程２で得られた二本鎖DNAを鋳型としてPCR反応を行う工程３。
【００２６】
上記工程１及び２は、上記本発明の二本鎖DNAの合成方法の項の工程１及び２と同じ工程であり、その好ましい操作法も同じである。即ち、上記工程１及び２の工程を経て得られた本発明に係る二本鎖DNAを工程３に付すことにより、本発明に係る鋳型RNAに対応する塩基配列を含む二本鎖DNAを増幅することができる。
【００２７】
上記工程３は、例えば以下の如くなされる。
【００２８】
即ち、まずアダプター１（本発明に係るオリゴ(dT)プライマーに付加する既知配列のDNA断片）を3’末端に含むように設計されたプライマー１及びアダプター２（本発明に係るランダムプライマーに付加する既知配列のDNA断片）を3’末端に含むように設計されたプライマー２を作製し、これらプライマー１及び２並びに3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないポリメラーゼを用いて、工程２で得られた二本鎖DNAをPCR反応に付すことによりなされる。
【００２９】
上記プライマー１としては、アダプター１の配列の全部又は一部を含むものであり、その鎖長は通常12〜30merであり、15〜25merが好ましく、18〜22merがより好ましい。上記プライマー２としては、アダプター２の配列の全部又は一部を含むものであり、その鎖長は通常12〜30merであり、15〜25merが好ましく、18〜22merがより好ましい。これらプライマー１及び２の使用量は、工程２で得られた二本鎖DNA 10pg〜100ngに対して通常1〜250pmol、好ましくは、10〜50pmolである。
【００３０】
工程３で用いられる3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないポリメラーゼは、工程２で用いられるものと同じものが挙げられ、その好ましい用量も同じである。なお、本発明の増幅方法においては、工程２及び工程３で3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないポリメラーゼを用いることにより、鎖長の異なる二本鎖DNAが合成されにくくなり、本発明に係る鋳型RNAのtotal RNA中の存在比率を維持したまま、二本鎖DNAを増幅することが可能となる。
【００３１】
上記PCR反応は、自体公知の方法例えばNucleic Acids Research,1991,Vol.19,3749、BioTechniques, 1994, Vol.16, 1134-1137に記載の方法に準じて行えばよいが、具体的には以下のようになされる。即ち、例えば、鋳型RNA1ng〜100ngを用いて工程１及び２を経て得られた本発明に係る二本鎖DNA含有水溶液20〜40μLに対して、上記プライマー１が通常0.1〜100pmol、好ましくは0.1〜50pmol、上記プライマー２が通常0.1〜100pmol、好ましくは0.1〜50pmol、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）がそれぞれ通常0.01〜50nmol、好ましくは、0.1〜20nmol、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性及び鎖置換活性を有さないポリメラーゼが1〜5unitとなるように添加し、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液中で、例えば(1)93〜98℃、1〜10分→(2)93〜98℃、10〜30秒→50〜60℃、10〜30秒→68〜72℃、10〜30分（10〜30サイクル）、(3)68〜72℃、1〜5分間のサイクルで反応を行うことにより、本発明に係る二本鎖DNAを増幅することができる。上記PCR反応においては、反応後、通常この分野で用いられている精製方法、例えばフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶液による抽出、アルコール沈殿、カラム精製、フィルターろ過等の方法により精製するのが好ましい。
【００３２】
なお、下記図１に、本発明の二本鎖DNAの増幅方法の一例を示した模式図を示す。
【００３３】
上述の如く、本発明の二本鎖DNAの合成方法及び増幅方法により得られた、本発明に係る二本鎖DNAは、Proceedings of the National Academy of Sciences,1995, Vol 92, 4347-4351等に記載の通常この分野で用いられる方法により塩基配列解析をすることができる。具体的には例えば、クローニング用キットを用いて得られた二本鎖DNAをコンピテントセル等に形質転換した後培養し、コロニーPCRにより増幅させる。その後、プラスミド抽出を行い、得られたプラスミドを鋳型としてキット等により塩基配列の解読を行うことによりなされる。解読された塩基配列を用いて相同性検索を行うことによりRNAの同定を行うことができる。
【００３４】
以下に実施例、参考例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等により何等限定されるものではない。
【実施例】
【００３５】
実施例１  mRNA３種（Human Albumin、Beta actin、GAPDH）のクローニング
1.逆転写反応
Human Albumin(2122 bases)、Beta actin(1874 bases)及びGAPDH(1380 bases)のmRNA（(株)ニッポンジーン製）をそれぞれ1×109 copies含有する水溶液11μLを鋳型RNA水溶液とした。該水溶液に、20μmol/L逆転写用プライマー溶液(5'-GACCATATGACGAGATCCGAGCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')1μLを添加した。次いで、70℃で3分間加熱して熱変性させた後、氷上で2分間静置した。その後、逆転写反応用の緩衝液（750mmol/L塩化カリウム、30mmol/L塩化マグネシウム、50mmol/L ジチオスレイトールを含有する500mmol/L トリス塩酸緩衝液（pH8.3））2μL、dNTPs(各2.5mmol/LのdATP、dGTP、dCTP、dTTP溶液の混合液、(株)ニッポンジーン製) 4μL、リボヌクレアーゼ阻害剤（20units/μL、和光純薬工業(株)製Ribonuclease Inhibitor (Super)）溶液 1μL、逆転写酵素(200units/μL、和光純薬工業(株)製ReverScript IV)溶液 1μLを加え、氷冷状態で緩やかに混合した。42℃で10分間反応させた後、0.5mol/L EDTA 2μLを加えてよく混合し、反応を停止した。【００３６】
2.アルカリ処理
反応停止後の溶液に、0.2mol/L NaOH 8μLを加えて混合し、65℃で30分間加熱した後、氷上で2分間静置した。更に、1mol/L Tris-HCl(pH 7.5)を20μL加えて混合した後、Invisorb Spin PCRapid Kit(Invitek社製)を用いて未反応の逆転写反応プライマーを除去した。次いで、エタ沈メイト（(株)ニッポンジーン製）を1μL、10mol/L 酢酸アンモニウムを12μL、エタノール125μLをそれぞれ加えて混合した。更に、10分間遠心分離し（18,800×g）、75%エタノールで2回洗浄し、沈殿、乾燥後、35.5μLの滅菌水に溶解した。【００３７】
３.第２鎖合成反応
逆転写反応産物を含む水溶液35.5μLに、HotGoldstar DNA polymerase用10×Reaction Buffer（EUROGENTEC社製） 5μL 、各2.5mmol/LのdNTP Mixture（(株)ニッポンジーン製）4μL、20μmol/L 第2鎖合成用ランダムプライマー溶液(5’-CATGGTATCGACGAGACTGAGGCTGNNNNNNNNNB-3’, Bは、C,G又はTを、Nは、A,C,G又はTを表す)1μL、25 mmol/L MgCl2 4μL、HotGoldstar DNA polymerase(5U/μL,EUROGENTEC社製)0.5μLをそれぞれ加え、氷上で緩やかに混合し、以下の条件で第２鎖合成反応を行った。
95℃ 10分→30℃ 1分→40℃ 30秒→50℃ 30秒→60℃ 30秒→72℃ 2分→95℃ 1分→氷上 2分
次いで、Invisorb Spin PCRapid Kit(Invitek社製)を用いて、得られた溶液から未反応の第2鎖合成用プライマーを除去した。その後、エタ沈メイト（(株)ニッポンジーン製）1μL、10mol/L 酢酸アンモニウム 12μL、エタノール125μLをそれぞれ加えて混合した。更に、10分間遠心分離し（18,800×g）、75%エタノールで2回洗浄し、沈殿物を乾燥後、34.5μLの滅菌水に溶解した。【００３８】
4.PCR
3.で得られた水溶液34.5μLにHotGoldstar DNA polymerase用10×Reaction Buffer（EUROGENTEC社製） 5μL 、2.5mmol/L dNTP Mixture（(株)ニッポンジーン製）4μL、PCR プライマー溶液(20μmol/L、5'-CATGGTATCGACGAGACTGAG-3'又は5'-GACCATATGACGAGATCCGAG-3'を含有)それぞれ1μL、25 mmol/L MgCl2 4μL、HotGoldstar DNA polymerase(5U/μL,EUROGENTEC社製)0.5μLをそれぞれ加え、氷上で緩やかに混合し、以下の条件でPCR反応を行った。
95℃ 10分 → 95℃ 20秒・60℃ 10秒・72℃ 30秒（24サイクル）→ 72℃ 2分
次いで、Invisorb Spin PCRapid Kit(Invitek社製)を用いて、得られた溶液から未反応の逆転写反応プライマーを除去した。その後、エタ沈メイト（(株)ニッポンジーン製）1μL、10mol/L 酢酸アンモニウム 12μL、エタノール125μLをそれぞれ加えて混合した。更に、10分間遠心分離し（18,800×g）、75%エタノールで2回洗浄し、沈殿物を乾燥後、4μLの滅菌水に溶解した。【００３９】
5.形質転換
4.で得られたクローニング用cDNA含有溶液  2μLに20ng/μLのpGEM Teasy Vector (Promega社製) 1μLとDNA Ligation Kit Mighty Mix（タカラバイオ(株)製）溶液 3μLを添加して16℃で30分間反応させ、クローニング用cDNAをベクターに挿入した。その後、ECOSTM Competent E.coli DH5α（(株)ニッポンジーン製）を用いて全量を42℃、45秒のヒート・ショック法によりコンピテントセルに形質転換した。次いで、100μg/mLのアンピシリンナトリウムを含むLuria-Bertani's broth(LB)寒天培地で37℃、16時間培養した。【００４０】
6.コロニーPCR
培地上の単一の48コロニーそれぞれの一部を、Alubmin cDNA増幅用の反応溶液［全量10μL：10×Universal Buffer（(株)ニッポンジーン製）1μL、2.5mM dNTPs（各2.5mmol/LのdATP、dGTP、dCTP、dTTP溶液の混合液、(株)ニッポンジーン製）1μL、5μmol/Lのプライマー溶液2種（5'-GTATCGACGAGACTGAGGCTG-3'、5'-GAAGCACAGAGAAAAGAGGCAAAATG-3'）それぞれ1μL、滅菌水5.9μL、Gene Taq NT（5units/μL、(株)ニッポンジーン製）0.1μL］に加え、氷冷状態で緩やかに混合し、以下の条件でPCR反応を行った。
95℃ 2分間 → 95℃ 20秒間・58℃ 10秒間・72℃ 20秒間 （30サイクル） → 72℃ 1分間
また、同48コロニーについて同様にして、Beta actin及びGAPDHについてもPCR反応を行った。但し、Beta actinの反応溶液（全量10μL）は、プライマーとしてBeta actin増幅用プライマー（5'-GTATCGACGAGACTGAGGCTG-3'、5'-GTGTGCACTTTTATTCAACTGGTC-3'）を用いた以外はAlubminの場合と同様であり、また、GAPDHの反応溶液（全量10μL）は、プライマーとしてGAPDH増幅用プライマー（5'-GTATCGACGAGACTGAGGCTG-3'、5'- GAGCACAGGGTACTTTATTGATGG-3'）を用いた以外はAlubminの場合と同様である。
その後、得られた各PCR反応液に6×Loading Buffer Triple Dye（(株)ニッポンジーン製） 2μLを加え、混合した。【００４１】
7.電気泳動
6.で得られた溶液5μLを1.5%アガロースゲルにて電気泳動し、0.5μg/mL エチジウムブロマイド染色液に10分 浸した後、FAS-III（紫外線照射機：東洋紡績）を使用して各コロニーの挿入断片の種類を確認した。3種類のクローンPCR増幅産物を1〜3段目に電気泳動した結果を図２に示す。その結果、コロニー1はGAPDH由来の挿入断片、コロニー2はBeta actin由来の挿入断片、コロニー3はAlbumin由来の挿入断片と判定された。
また、48コロニーについて、3種のmRNAの何れに該当するかを調べた判定結果を表１に示す。【００４２】
【表１】
2010131645.tif 000003
【００４３】
その結果、Beta actin : Albumin : GAPDH = 19 : 15: 14であった。よって、３種のmRNAの比が、概ね1 : 1 : 1 の比となり、mRNAの存在比率を反映して増幅しているとが判った。即ち、本発明の方法により得られた二本鎖DNAは、その存在比率を維持したまま増幅し得ることが示された。【００４４】
なお、実施例１で使用したmRNAの塩基配列を以下に示す。【００４５】
Albumin mRNA, Human（(株)ニッポンジーン製）
GGGUUUAGCUUUUCUCUUCUGUCAACCCCACACGCCUUUGGCACAAUGAAGUGGGUAACCUUUAUUUCCCUUCUUUUUCUCUUUAGCUCGGCUUAUUCCAGGGGUGUGUUUCGUCGAGAUGCACACAAGAGUGAGGUUGCUCAUCGGUUUAAAGAUUUGGGAGAAGAAAAUUUCAAAGCCUUGGUGUUGAUUGCCUUUGCUCAGUAUCUUCAGCAGUGUCCAUUUGAAGGUCAUGUAAAAUUAGUGAAUGAAGUAACUGAAUUUGCAAAAACAUGUGUUGCUGAUGAGUCAGCUGAAAAUUGUGACAAAUCACUUCAUACCCUUUUUGGAGACAAAUUAUGCACAGUUGCAACUCUUCGUGAAACCUAUGGUGAAAUGGCUGACUGCUGUGCAAAACAAGAACCUGAGAGAAAUGAAUGCUUCUUGCAACACAAAGAUGACAACCCAAACCUCCCCCGAUUGGUGAGACCAGAGGUUGAUGUGAUGUGCACUGCUUUUCAUGACAAUGAAGAGACAUUUUUGAAAAAAUACUUAUAUGAAAUUGCCAGAAGACAUCCUUACUUUUAUGCCCCGGAACUCCUUUUCUUUGCUAAAAGGUAUAAAGCUGCUUUUACAGAAUGUUGCCAAGCUGCUGAUAAAGCUGCCUGCCUGUUGCCAAAGCUCGAUGAACUUCGGGAUGAAGGGAAGGCUUCGUCUGCCAAACAGAGACUCAAGUGUGCCAGUCUCCAAAAAUUUGGAGAAAGAGCUUUCAAAGCAUGGGCAGUAGCUCGCCUGAGCCAGAGAUUUCCCAAAGCUGAGUUUGCAGAAGUUUCCAAGUUAGUGACAGAUCUUACCAAAGUCCACACGGAAUGCUGCCAUGGAGAUCUGCUUGAAUGUGCUGAUGACAGGGCGGACCUUGCCAAGUAUAUCUGUGAAAAUCAAGAUUCGAUCUCCAGUAAACUGAAGGAAUGCUGUGAAAAACCUCUGUUGGAAAAAUCCCACUGCAUUGCCGAAGUGGAAAAUGAUGAGAUGCCUGCUGACUUGCCUUCAUUAGCUGCUGAUUUUGUUGAAAGUAAGGAUGUUUGCAAAAACUAUGCUGAGGCAAAGGAUGUCUUCCUGGGCAUGUUUUUGUAUGAAUAUGCAAGAAGGCAUCCUGAUUACUCUGUCGUGCUGCUGCUGAGACUUGCCAAGACAUAUGAAACCACUCUAGAGAAGUGCUGUGCCGCUGCAGAUCCUCAUGAAUGCUAUGCCAAAGUGUUCGAUGAAUUUAAACCUCUUGUGGAAGAGCCUCAGAAUUUAAUCAAACAAAAUUGUGAGCUUUUUGAGCAGCUUGGAGAGUACAAAUUCCAGAAUGCGCUAUUAGUUCGUUACACCAAGAAAGUACCCCAAGUGUCAACUCCAACUCUUGUAGAGGUCUCAAGAAACCUAGGAAAAGUGGGCAGCAAAUGUUGUAAACAUCCUGAAGCAAAAAGAAUGCCCUGUGCAGAAGACUAUCUAUCCGUGGUCCUGAACCAGUUAUGUGUGUUGCAUGAGAAAACGCCAGUAAGUGACAGAGUCACCAAAUGCUGCACAGAAUCCUUGGUGAACGGGCGACCAUGCUUUUCAGCUCUGGAAGUCGAUGAAACAUACGUUCCCAAAGAGUUUAAUGCUGAAACAUUCACCUUCCAUGCAGAUAUAUGCACACUUUCUGAGAAGGAGAGACAAAUCAAGAAACAAACUGCACUUGUUGAGCUUGUGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACUGAAAGCUGUUAUGGAUGAUUUCGCAGCUUUUGUAGAGAAGUGCUGCAAGGCUGACGAUAAGGAGACCUGCUUUGCCGAGGAGGGUAAAAAACUUGUUGCUGCAAGUCAAGCUGCCUUAGGCUUAUAACAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAAGAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAAAGCUUAUUCAUCUGUUUUUCUUUUUCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUUCUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCUGUGCUUCAAUUAAUAAAAAAUGGAAAGAAUCUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUAACCCCUUGG【００４６】
Beta actin mRNA, Human（(株)ニッポンジーン製）
GGGUUUACCGCCGAGACCGCGUCCGCCCCGCGAGCACAGAGCCUCGCCUUUGCCGAUCCGCCGCCCGUCCACACCCGCCGCCAGCUCACCAUGGAUGAUGAUAUCGCCGCGCUCGUCGUCGACAACGGCUCCGGCAUGUGCAAGGCCGGCUUCGCGGGCGACGAUGCCCCCCGGGCCGUCUUCCCCUCCAUCGUGGGGCGCCCCAGGCACCAGGGCGUGAUGGUGGGCAUGGGUCAGAAGGAUUCCUAUGUGGGCGACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGGCAUCCUCACCCUGAAGUACCCCAUCGAGCACGGCAUCGUCACCAACUGGGACGACAUGGAGAAAAUCUGGCACCACACCUUCUACAAUGAGCUGCGUGUGGCUCCCGAGGAGCACCCCGUGCUGCUGACCGAGGCCCCCCUGAACCCCAAGGCCAACCGCGAGAAGAUGACCCAGAUCAUGUUUGAGACCUUCAACACCCCAGCCAUGUACGUUGCUAUCCAGGCUGUGCUAUCCCUGUACGCCUCUGGCCGUACCACUGGCAUCGUGAUGGACUCCGGUGACGGGGUCACCCACACUGUGCCCAUCUACGAGGGGUAUGCCCUCCCCCAUGCCAUCCUGCGUCUGGACCUGGCUGGCCGGGACCUGACUGACUACCUCAUGAAGAUCCUCACCGAGCGCGGCUACAGCUUCACCACCACGGCCGAGCGGGAAAUCGUGCGUGACAUUAAGGAGAAGCUGUGCUACGUCGCCCUGGACUUCGAGCAAGAGAUGGCCACGGCUGCUUCCAGCUCCUCCCUGGAGAAGAGCUACGAGCUGCCUGACGGCCAGGUCAUCACCAUUGGCAAUGAGCGGUUCCGCUGCCCUGAGGCACUCUUCCAGCCUUCCUUCCUGGGCAUGGAGUCCUGUGGCAUCCACGAAACUACCUUCAACUCCAUCAUGAAGUGUGACGUGGACAUCCGCAAAGACCUGUACGCCAACACAGUGCUGUCUGGCGGCACCACCAUGUACCCUGGCAUUGCCGACAGGAUGCAGAAGGAGAUCACUGCCCUGGCACCCAGCACAAUGAAGAUCAAGAUCAUUGCUCCUCCUGAGCGCAAGUACUCCGUGUGGAUCGGCGGCUCCAUCCUGGCCUCGCUGUCCACCUUCCAGCAGAUGUGGAUCAGCAAGCAGGAGUAUGACGAGUCCGGCCCCUCCAUCGUCCACCGCAAAUGCUUCUAGGCGGACUAUGACUUAGUUGCGUUACACCCUUUCUUGACAAAACCUAACUUGCGCAGAAAACAAGAUGAGAUUGGCAUGGCUUUAUUUGUUUUUUUUGUUUUGUUUUGGUUUUUUUUUUUUUUUUGGCUUGACUCAGGAUUUAAAAACUGGAACGGUGAAGGUGACAGCAGUCGGUUGGAGCGAGCAUCCCCCAAAGUUCACAAUGUGGCCGAGGACUUUGAUUGCACAUUGUUGUUUUUUUAAUAGUCAUUCCAAAUAUGAGAUGCGUUGUUACAGGAAGUCCCUUGCCAUCCUAAAAGCCACCCCACUUCUCUCUAAGGAGAAUGGCCCAGUCCUCUCCCAAGUCCACACAGGGGAGGUGAUAGCAUUGCUUUCGUGUAAAUUAUGUAAUGCAAAAUUUUUUUAAUCUUCGCCUUAAUACUUUUUUAUUUUGUUUUAUUUUGAAUGAUGAGCCUUCGUGCCCCCCCUUCCCCCUUUUUUGUCCCCCAACUUGAGAUGUAUGAAGGCUUUUGGUCUCCCUGGGAGUGGGUGGAGGCAGCCAGGGCUUACCUGUACACUGACUUGAGACCAGUUGAAUAAAAGUGCACACCUUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUAACCCCUUGGGGC【００４７】
GAPDH mRNA, Human（(株)ニッポンジーン製）
GGGUUUAAAUUGAGCCCGCAGCCUCCCGCUUCGCUCUCUGCUCCUCCUGUUCGACAGUCAGCCGCAUCUUCUUUUGCGUCGCCAGCCGAGCCACAUCGCUCAGACACCAUGGGGAAGGUGAAGGUCGGAGUCAACGGAUUUGGUCGUAUUGGGCGCCUGGUCACCAGGGCUGCUUUUAACUCUGGUAAAGUGGAUAUUGUUGCCAUCAAUGACCCCUUCAUUGACCUCAACUACAUGGUUUACAUGUUCCAAUAUGAUUCCACCCAUGGCAAAUUCCAUGGCACCGUCAAGGCUGAGAACGGGAAGCUUGUCAUCAAUGGAAAUCCCAUCACCAUCUUCCAGGAGCGAGAUCCCUCCAAAAUCAAGUGGGGCGAUGCUGGCGCUGAGUACGUCGUGGAGUCCACUGGCGUCUUCACCACCAUGGAGAAGGCUGGGGCUCAUUUGCAGGGGGGAGCCAAAAGGGUCAUCAUCUCUGCCCCCUCUGCUGAUGCCCCCAUGUUCGUCAUGGGUGUGAACCAUGAGAAGUAUGACAACAGCCUCAAGAUCAUCAGCAAUGCCUCCUGCACCACCAACUGCUUAGCACCCCUGGCCAAGGUCAUCCAUGACAACUUUGGUAUCGUGGAAGGACUCAUGACCACAGUCCAUGCCAUCACUGCCACCCAGAAGACUGUGGAUGGCCCCUCCGGGAAACUGUGGCGUGAUGGCCGCGGGGCUCUCCAGAACAUCAUCCCUGCCUCUACUGGCGCUGCCAAGGCUGUGGGCAAGGUCAUCCCUGAGCUGAACGGGAAGCUCACUGGCAUGGCCUUCCGUGUCCCCACUGCCAACGUGUCAGUGGUGGACCUGACCUGCCGUCUAGAAAAACCUGCCAAAUAUGAUGACAUCAAGAAGGUGGUGAAGCAGGCGUCGGAGGGCCCCCUCAAGGGCAUCCUGGGCUACACUGAGCACCAGGUGGUCUCCUCUGACUUCAACAGCGACACCCACUCCUCCACCUUUGACGCUGGGGCUGGCAUUGCCCUCAACGACCACUUUGUCAAGCUCAUUUCCUGGUAUGACAACGAAUUUGGCUACAGCAACAGGGUGGUGGACCUCAUGGCCCACAUGGCCUCCAAGGAGUAAGACCCCUGGACCACCAGCCCCAGCAAGAGCACAAGAGGAAGAGAGAGACCCUCACUGCUGGGGAGUCCCUGCCACACUCAGUCCCCCACCACACUGAAUCUCCCCUCCUCACAGUUGCCAUGUAGACCCCUUGAAGAGGGGAGGGGCCUAGGGAGCCGCACCUUGUCAUGUACCAUCAAUAAAGUACCCUGUGCUCAACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUAACCCCUUGGGGC【００４８】
実施例２  第２鎖合成時の反応温度の違いによる増幅効果の違い
1．HeLa細胞由来のAgo2結合RNAの取得
(1)抗ヒトAgo2抗体固定化担体の作製
磁性担体Dynabeads ProteinG（インビトロジェン社製）20μLにPBS（pH7.4）1mLを添加混合後、マグネティックスタンドを用いて担体を取り出した。その後、1mg/mL抗ヒトAgo2抗体（和光純薬工業(株)製）5μLとリン酸緩衝生理食塩液（PBS、pH7.4）95μLの混合液を担体に添加し、室温で1時間転倒混和した。次いで、マグネティックスタンドを用いて担体を取り出し、PBS（pH7.4）1mLで3回洗浄し、最終的にPBS（pH7.4）1mLで懸濁し、その溶液を抗ヒトAgo2抗体固定化担体溶液とした。
(2)HeLa細胞抽出液の作製
HeLa細胞1×107細胞に細胞溶解液（20mM トリス塩酸、200mM塩化ナトリウム、2.5mM塩化マグネシウムを含む0.05w/v% NP-40（和光純薬工業（株）製）） 1mLを添加し、ピペッティングにより細胞を懸濁した。懸濁液を氷上で10分間静置し、遠心分離（20000×g、20分間、4℃）後に上清を分取し、HeLa細胞抽出液とした。
(3)HeLa細胞由来RNAの精製
抗ヒトAgo2抗体固定化担体溶液からマグネティックスタンドを用いて担体を取り出した後、HeLa細胞抽出液1mLを添加し、冷蔵で3時間転倒混和した。マグネティックスタンドを用いて再度担体を取り出した後、細胞溶解液1mLで3回洗浄した。その後担体に0.5w/v % ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液50μLを添加し、担体に結合したタンパク質を溶出した。溶出液に滅菌水350μL、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）400μLを添加し、ボルテックスミキサーで混合後、遠心分離（20000×g、10分間）した。次いで、上層を分取し、クロロホルム400μLを添加し、ボルテックスミキサーで混合後、遠心分離（20000×g、10分間）した。更に、上層を分取し、エタ沈メイト（ニッポンジーン(株)製） 3μL、3M酢酸ナトリウム 40μL、エタノール 1mLを加え、ボルテックスミキサーで懸濁後、遠心分離（20000×g、15分間）した。得られた沈殿物を70 v/v ％エタノール1mLで洗浄後、室温で20分間風乾し、滅菌水11μLに溶解して精製RNA溶液を得た。【００４９】
2.逆転写反応
上記抗ヒトAgo2抗体固定化担体により得たRNA溶液11μLと20μMオリゴｄ（T）プライマー溶液（5'-GACCATATGACGAGATCCGAGCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'）1μLを添加混合した。混合液を 70℃で3分間インキュベーションした後、氷冷し、そこに、2.5mMｄNTP混合液（ニッポンジーン(株)製）4μL、20U/μL RNase阻害剤スーパー（和光純薬工業(株)製）1μL、リバースクリプトIV用10×反応緩衝液（和光純薬工業(株)製）2μL、200U/μLリバースクリプトIV（逆転写酵素、和光純薬工業(株)製）1μLを添加混合し総量20μLの反応液を、42℃で10 分間反応させた。その後、0.5mol/L EDTA 2μLを加え、よく混合し、反応を停止した。【００５０】
3.アルカリ処理
反応停止後、0.2mol/L NaOH 8μLを加えて混合し、65℃で30分間加熱した後、氷上で2分間静置した。更に、1mol/L Tris-HCl(pH 7.5)を20μL加えて混合した後、Invisorb Spin PCRapid Kit(Invitek社製)を用いて未反応の逆転写反応プライマーを除去した。次いで、エタ沈メイト（(株)ニッポンジーン製）を1μL、10mol/L 酢酸アンモニウムを12μL、エタノール125μLをそれぞれ加えて混合した。更に、10分間遠心分離し（18,800×g）、75%エタノールで2回洗浄し、沈殿、乾燥後、35.5μLの滅菌水に溶解した。【００５１】
4.第２鎖合成反応
上記3．で得た逆転写反応産物を含む水溶液35.5μLに、HotGoldstar DNA polymerase用10×Reaction Buffer（EUROGENTEC社製） 5μL 、各2.5mmol/LのdNTP Mixture（(株)ニッポンジーン製）4μL、20μmol/L 第2鎖合成用ランダムプライマー溶液(5’-CATGGTATCGACGAGACTGAGGCTGNNNNNNNNNB-3’, Bは、C,G又はTを、Nは、A,C,G又はTを表す)1μL、25 mmol/L MgCl2 4μL、HotGoldstar DNA polymerase(5U/μL,EUROGENTEC社製)0.5μLをそれぞれ加え、氷上で緩やかに混合し、以下の条件で第２鎖合成反応を行った。
95℃ 10分→30℃ 1分→40℃ 30秒→50℃ 30秒→60℃ 30秒→72℃ 2分→95℃ 1分→氷上 2分
また、上記1.〜3.の反応を同様に行って得た逆転写反応産物を含む水溶液35.5μLを用い、以下の反応温度で行った以外は上記反応と同様に第２鎖合成反応を行った。
95℃ 10分→30℃ 1分→72℃ 2分→95℃ 1分→氷上 2分
次いで、Invisorb Spin PCRapid Kit(Invitek社製)を用いて、得られた溶液それぞれから未反応の第2鎖合成用プライマーを除去した。その後、エタ沈メイト（(株)ニッポンジーン製）1μL、10mol/L 酢酸アンモニウム 12μL、エタノール125μLをそれぞれ加えて混合した。更に、それぞれ10分間遠心分離し（18,800×g）、75%エタノールで2回洗浄し、沈殿物を乾燥させ、34.5μLの滅菌水に溶解した。【００５２】
5.PCR
4.で得られた２種の水溶液34.5μLそれぞれに、HotGoldstar DNA polymerase用10×Reaction Buffer（EUROGENTEC社製） 5μL 、2.5mmol/L dNTP Mixture（(株)ニッポンジーン製）4μL、PCR プライマー溶液(20μmol/L 、5'-CATGGTATCGACGAGACTGAG-3'及び5'- GACCATATGACGAGATCCGAG-3')それぞれ1μL、25 mmol/L MgCl2 4μL、HotGoldstar DNA polymerase(5U/μL,EUROGENTEC社製)0.5μLをそれぞれ加え、氷上で緩やかに混合し、以下の条件でPCR反応を行った。
95℃ 10分 → 95℃ 20秒・60℃ 10秒・72℃ 30秒（24サイクル）→ 72℃ 2分
次いで、Invisorb Spin PCRapid Kit(Invitek社製)を用いて、得られた溶液それぞれから未反応の逆転写反応プライマーを除去した。その後、エタ沈メイト（(株)ニッポンジーン製）1μL、10mol/L 酢酸アンモニウム 12μL、エタノール125μLをそれぞれ加えて混合した。更に、10分間遠心分離し（18,800×g）、75%エタノールで2回洗浄し、沈殿物を乾燥後、5μLの滅菌水に溶解した。
得られた溶液のうち１μLずつについて、Agilent 2100 Bioanalyzerを用いて鎖長解析を行った。その結果を下記表２に示す。【００５３】
【表２】
2010131645.tif 000004
【００５４】
目的とするRNAの合成量を比較すると、アニーリング温度（30℃→72℃）の場合は、12.74ng（6.91ng+5.83ng）で、アニーリング温度（30℃→40℃→50℃→60℃→72℃）の場合は、23.92ng（9.12ng+14.8ng）であり、30℃→40℃→50℃→60℃→72℃と段階的に温度を上昇させた時の方がDNAの合成量が高まることが判った。しかし、30℃→72℃の２段階で温度を上昇させた場合でもDNA解析が十分できる程度にDNAが合成、増幅されることも判った。【００５５】
実施例３  Cap構造を有さないRNA（HeLa細胞由来のAlu RNA）に対応するDNAの合成
１．形質転換
実施例２の５．で得られたPCR反応溶液  2μLに20ng/μLのpGEM Teasy Vector (Promega社製) 1μLとDNA Ligation Kit Mighty Mix（タカラバイオ(株)製）溶液 3μLを添加して16℃で30分間反応させ、クローニング用cDNAをベクターに挿入した。その後、ECOSTM Competent E.coli DH5α（(株)ニッポンジーン製）を用いて全量を42℃、45秒のヒート・ショック法によりコンピテントセルに形質転換した。次いで、100μg/mLのアンピシリンナトリウムを含むLuria-Bertani's broth(LB)寒天培地で37℃、16時間培養した。【００５６】
２.コロニーPCR
培地上の単一の96コロニーそれぞれの一部を、反応溶液［全量10μL：10×Universal Buffer（(株)ニッポンジーン製）1μL、2.5mM dNTPs（各2.5mmol/LのdATP、dGTP、dCTP、dTTP溶液の混合液、(株)ニッポンジーン製）1μL、5μmol/Lのプライマー2種（5'-GTATCGACGAGACTGAGGCTG-3'、5'-GAAGCACAGAGAAAAGAGGCAAAATG-3'）それぞれ1μL、滅菌水5.9μL、Gene Taq NT（5units/μL、(株)ニッポンジーン製）0.1μL］を加え、氷冷状態で緩やかに混合し、以下の条件でPCR反応を行った。
95℃ 2分間 → 95℃ 20秒間・58℃ 10秒間・72℃ 20秒間 （30サイクル） → 72℃ 1分間
その後、得られた各PCR反応液に6×Loading Buffer Triple Dye（(株)ニッポンジーン製） 2μLを加え、混合した。電気泳動によりポジティブクローンを選択し、プラスミド抽出を行った。【００５７】
３．塩基配列解析
上記プラスミドの塩基配列の解析をBaseStation（バイオラッドラボラトリーズ(株)製）にて行い、NCBIに登録されているデータベースを比較した。
その結果、Alu RNAと80%以上の相同性を有するcDNAが４種あることが判った。Alu RNAは、レトロトランスポゾンとして働くと言われているものであり、Ago２に結合すると推測されていたものである。そして、Alu RNAは、Cap構造を有さないRNAである。即ち、この実験により、Ago２中にAlu RNAが存在することが判明し、また、本発明の方法によれば、Cap構造を有さないAlu RNAに対応するDNAをも取得（増幅）し得ることが示された。尚、得られた４種のAlu RNAの解析結果を以下に示す。【００５８】
free Alu RNA 1（Human primary Alu transcript (GeneBank accession No. U67811)との相同性：86％）
TTCAAGGGGTTTGGCTTTGTTCGTTTTACGGAATATGAAACACAAGTGAAAGTAATGTCACAGCGACATATGATAGATGGACGATGGTGTGACTGCAAACTTCCTAATTCTAAGCAAAGCCAAGATAAGCCTTTGAGAAGCAGAAAAGTGTTTGTGGGGCGCTGTACAGAGGACATGACTGAGGATGAGCTGCGGGAGTTCTTCTCTCAGTACGGGGATGTGATGGATGTCTTCATCCCCAAGCCATTCAGGGCCTTTGCCTTTGTTACATTTGCAGATGATCAGGTATTTTTCTCCTTAACGATATGTCCCGGCCGGGCGTGGTGGCTCATGCTTACAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGTGGATCACGAGGTCAGGAGATCGGGACCATCCTGGCCAGCATGGTGAAACCCCGTCTCTATT【００５９】
free Alu RNA 2（Human primary Alu transcript (GeneBank accession No. U67812)との相同性：83％）
GAAAATGAGGTCAGGAGTTTGGGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAACCTCTGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCAAGTGTGGTGGTGCGTGCCTGTAATCCCAGCCTCTCGGGAGACTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCCAGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGGTCGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAATAGGGCAAGACTCTGTCTC【００６０】
free Alu RNA 3（Human primary Alu transcript (GeneBank accession No. U67813)との相同性：84％）
GGGTAGTGCTTGAGCCTAGAAGTTGCAGTGAGCTATGATCATGCCACACTGTACTCCAGCCTGGATGACAGAGTGAAACCCTGCCTCTAAATAAAAGAAAATAGAGGCAGACTGTGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGTAGGCCAAGGCGGGTGGATCACCTGCAGTCAGGAGTTCACAACCAGCCTGACCAACATGGTGAAACCCTGTCTATACTAAAAATACAAAACATTAGCCACGTGTGGTGGTACACGCCTGTAATCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGTCAGGAGAATCACTTGAACCTGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATTGTACCACTGCACTCCAGCCTGGGTGACAGAGCAAAACCCTATCTC【００６１】
free Alu RNA 4（Human primary Alu transcript (GeneBank accession No. U67812)との相同性：86％）
AACATCGCTTGAACCTGGGAGGTGGAGGTTGCAGTGAGCAGAGATCGCGCCATTGCACTCCAGCCTGGGCAATAGAGTGAGACCCTGTCTCAAAAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAGAAAGGGACTGCAAACTCTAACAACCTTCAATATGTCCTTGCTCAGATCCATTTTAAAAATTATATTCATGTGTTTTGTAAACATATCATTTCTGGG【００６２】
実施例４  PIWI結合mRNAのcDNA合成
1．マウス精巣由来のPIWIL1結合RNAの取得
(1)抗マウスPIWIL1抗体およびマウスIgG固定化担体の作製
磁性担体Dynabeads Protein G（インビトロジェン社製）20μLにPBS（pH7.4）1mLを添加混合し、マグネティックスタンドを用いて担体を取り出した。その後、0.5mg/mL抗マウスPIWIL1抗体（和光純薬工業(株)製）10μLとPBS（pH7.4）90μLの混合液を担体に添加し、室温で1時間転倒混和した。次いで、マグネティックスタンドを用いて担体を取り出した後、PBS（pH7.4）1mLで3回洗浄し、抗マウスPIWIL1抗体固定化担体を得た。
また、0.5mg/mL抗マウスPIWIL1抗体（和光純薬工業(株)製）10μLとPBS（pH7.4）90μLの混合液の代わりに、1mg/mLマウスIgG（和光純薬工業(株)製）5μLとPBS（pH7.4）95μLの混合液を用いた以外は同様の方法により、抗マウスIgG抗体固定化担体を得た。
(2)マウス精巣抽出液の作製
Balb/cマウス（アダルト、オス）から摘出した精巣25mgに細胞溶解液（20mM トリス塩酸、200mM塩化ナトリウム、2.5mM塩化マグネシウムを含む0.05w/v% NP-40（和光純薬工業（株）製）） 1mLを添加し、テフロン（登録商標）ホモジナイザーにより細胞を懸濁した。懸濁液を氷上で10分間静置し、遠心分離（20000×g、20分間、4℃）後に上清を分取し、0.45μmフィルターでろ過したろ液をマウス精巣抽出液とした。
(3)免疫沈降法によるマウス精巣由来PIWIL1結合RNAの精製
抗マウスPIWIL1抗体に、マウス精巣抽出液1mLを添加し、冷蔵で3時間転倒混和した。マグネティックスタンドを用いて担体を取り出した後、細胞溶解液1mLで3回洗浄した。その後担体に0.5w/v % SDS溶液50μLを添加し、担体に結合したタンパク質を溶出した。溶出液に滅菌水350μL、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）400μLを添加し、ボルテックスミキサーで混合後、遠心分離（20000×g、10分間）した。次いで、上層を分取し、クロロホルム400μLを添加し、ボルテックスミキサーで混合後、遠心分離（20000×g、10分間）した。更に、上層を分取し、エタ沈メイト（ニッポンジーン(株)製） 3μL、3M酢酸ナトリウム 40μL、エタノール 1mLを加え、ボルテックスミキサーで懸濁後、遠心分離（20000×g、15分間）した。得られた沈殿物を70 v/v ％エタノール1mLで洗浄後、室温で20分間風乾し、滅菌水11μLに溶解して精製RNA溶液を得た。
また、マウスIgG固定化担体を用いて、抗マウスPIWIL1抗体を用いた場合と同様に、マウス精巣抽出液を添加混和し、SDS溶液を用いて担体からタンパク質を溶出させ、溶出液を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）、エタ沈メイトを用いて精製し、ブランクとしての精製RNA溶液を得た。【００６３】
2.逆転写反応
上記抗マウスPIWIL1抗体により得た精製RNA溶液及びマウスIgG固定化担体により得た精製RNA溶液各11μLに、20μM オリゴｄ（T）プライマー溶液（5'-GACCATATGACGAGATCCGAGCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'）1μLをそれぞれ添加し混合した。各混合液を 70℃で3分間インキュベーションした後、氷冷し、そこに、2.5mMｄNTP混合液（ニッポンジーン(株)製）4μL、20U/μL RNase阻害剤スーパー（和光純薬工業(株)製）1μL、リバースクリプトIV用10×反応緩衝液（和光純薬工業(株)製）2μL、200U/μLリバースクリプトIV（逆転写酵素、和光純薬工業(株)製）1μLをそれぞれ添加混合した後、総量20μLの反応液２種を42℃で10 分間反応させた。その後、それぞれに0.5mol/L EDTA 2μLを加え、よく混合し、反応を停止した。【００６４】
3.アルカリ処理
反応停止後、0.2mol/L NaOH 8μLをそれぞれに添加混合し、65℃で30分間加熱した後、氷上で2分間静置した。更に、1mol/L Tris-HCl(pH 7.5)20μLをそれぞれに加えて混合した後、Invisorb Spin PCRapid Kit(Invitek社製)を用いて未反応の逆転写反応プライマーを除去した。次いで、エタ沈メイト（(株)ニッポンジーン製）を1μL、10mol/L 酢酸アンモニウムを12μL、エタノール125μLをそれぞれ加えて混合した。更に、それぞれを、10分間遠心分離し（18,800×g）、75%エタノールで2回洗浄し、沈殿、乾燥後、35.5μLの滅菌水に溶解した。【００６５】
4.第２鎖合成反応
逆転写反応産物を含む２種の水溶液35.5μLに、HotGoldstar DNA polymerase用10×Reaction Buffer（EUROGENTEC社製） 5μL 、各2.5mmol/LのdNTP Mixture（(株)ニッポンジーン製）4μL、20μmol/L 第2鎖合成用ランダムプライマー溶液(5’-CATGGTATCGACGAGACTGAGGCTGNNNNNNNNNB-3’, Bは、C,G又はTを、Nは、A,C,G又はTを表す)1μL、25 mmol/L MgCl2 4μL、HotGoldstar DNA polymerase(5U/μL,EUROGENTEC社製)0.5μLをそれぞれ加え、氷上で緩やかに混合し、以下の条件で第２鎖合成反応を行った。
95℃ 10分→30℃ 1分→40℃ 30秒→50℃ 30秒→60℃ 30秒→72℃ 2分→95℃ 1分→氷上 2分
次いで、Invisorb Spin PCRapid Kit(Invitek社製)を用いて、得られた溶液それぞれから未反応の第2鎖合成用プライマーを除去した。その後、エタ沈メイト（(株)ニッポンジーン製）1μL、10mol/L 酢酸アンモニウム 12μL、エタノール125μLをそれぞれ加えて混合した。更に、それぞれ10分間遠心分離し（18,800×g）、75%エタノールで2回洗浄し、沈殿物を乾燥させ、34.5μLの滅菌水に溶解した。【００６６】
5.PCR
4.で得られた水溶液34.5μLそれぞれに、HotGoldstar DNA polymerase用10×Reaction Buffer（EUROGENTEC社製） 5μL 、2.5mmol/L dNTP Mixture（(株)ニッポンジーン製）4μL、PCR プライマー溶液(20μmol/L 、5'-CATGGTATCGACGAGACTGAG-3'及び5'- GACCATATGACGAGATCCGAG-3')それぞれ1μL、25 mmol/L MgCl2 4μL、HotGoldstar DNA polymerase(5U/μL,EUROGENTEC社製)0.5μLをそれぞれ加え、氷上で緩やかに混合し、以下の条件でPCR反応を行った。
95℃ 10分 → 95℃ 20秒・60℃ 10秒・72℃ 30秒（24サイクル）→ 72℃ 2分
次いで、Invisorb Spin PCRapid Kit(Invitek社製)を用いて、得られた溶液それぞれから未反応の逆転写反応プライマーを除去した。その後、エタ沈メイト（(株)ニッポンジーン製）1μL、10mol/L 酢酸アンモニウム 12μL、エタノール125μLをそれぞれ加えて混合した。更に、10分間遠心分離し（18,800×g）、75%エタノールで2回洗浄し、沈殿物を乾燥後、5μLの滅菌水に溶解した。
抗PIWIL1抗体固定化担体を用いて得られた溶液１μLについて、Agilent 2100 Bioanalyzerを用いてキャピラリー電気泳動を行った。その結果を図３に示す。また、抗IgG抗体固定化担体を用いて得られた溶液１μLをブランクとして、Agilent 2100 Bioanalyzerでキャピラリー電気泳動した結果を図４に示す。
図３及び図４の結果より、抗PIWIL1抗体固定化担体を用いることにより、100〜1500bpの範囲のcDNAが増幅していることが判る。即ち、本発明の方法によれば、PIWIL1に結合した微量のmRNAに由来するcDNAを増幅し得ることが示された。【００６７】
実施例５
実施例１と同様に実験を行い、以下のmRNAについても本発明の方法により同定できることを確認した。
mRNA (GeneBank accession No.)：ALPI (J03930)、ANKHD1 (BC009909)、ATAD3A (BC063607)、BASP1 (BC000518)、BHLHB2 (EF015895)、BLVRB (BC109371)、C12orf10 (BC051871)、COP1 (AY885669)、CPNE1 (BC001142)、CTNNBIP1 (BC014300)、DC36 (AF265442)、DKFZp451P176 (AL832365)、DKFZp667O1817 (AL832271)、DKFZp686E13246 (CR627112)、DKFZp686H2396 (BX648036)、DKFZp686M18208 (BX648809)、DNAJC11 (BC008772)、FLJ12498 (AK022560)、FLJ26394 (AK129904)、FLJ30115 (AK054677)、FLJ33729 (AK091048)、FLJ33826 (AK091145)、FLJ34030 (AK091349)、FLJ36398 (AK093717)、FLJ37703 (AK095022)、FLJ41250 (AK123244)、FTH1 (M11146)、H19 (BC110657)、HET (U72355)、HMGN2 (BC081567)、HSBP1 (AF068754)、hypothetical protein (AJ011916)、IMAGE:40148924 (BC142726)、JDP2 (BC051303)、KIAA0184 (D80006)、LOC128977 (BC030758)、MRPS24 (BC012167)、NACAP1 (BC069411)、NAT11 (BC052298)、NDUFB2 (BC063026)、NOLA2 (BC000009)、PFN1 (BC057828)、PNKD (BC021118)、PNPLA7 (BC025663)、POLD3 (BC020587)、PRDX6 (BC053550)、PTPMT1 (BC014048)、RNASEH2A (BC011748)、RPL8 (BC093064)、RPL22 (BC058887)、RPL30 、BC095426)、RPLP1 (BC007590)、RPS10 (BC073799)、RPS20 (BC087850)、RPS21 (L04483)、RPS28 (BC070218)、RPS29 (BC035313)、S100A6 (BC009017)、S100A11 (BC014354)、SFRS7 (BC017369)、SOCS3 (BC060858)、TMSB10 (BC016731)、TUBG2 (BC108739)、ZNF205 (BC002810)
【図１】
2010131645.tif 000005
【図２】
2010131645.tif 000006
【図３】
2010131645.tif 000007
【図４】
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【配列表】
2010131645000001.app
【国際調査報告】
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