【事件の表示】
　特許第２５７６２００号「生理活性タンパク質の製造法」の請求項１ないし５に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２５７６２００号の請求項１ないし５に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯　
　本件特許第２５７６２００号の発明についての出願は、昭和６３年７月８日に出願（国内優先権主張　昭和６３年３月９日）され、平成８年１１月７日にその発明について特許権の設定登録がなされ、その後、土井清暢、市原敏夫、松山美奈子、水谷修子、上坂陽子、および雪印乳業株式会社よりそれぞれ特許異議の申立がなされ、平成９年１２月２日付けで取消の理由の通知がなされ、その指定期間内である平成１０年３月３１日に訂正請求がなされ、これにつき各異議申立人に審尋を行い、異議申立人　土井清暢、松山美奈子、水谷修子、および雪印乳業株式会社より回答書が提出され、平成１３年６月８日付けで訂正拒絶理由の通知がなされ、その指定期間内である平成１３年８月２１日に特許権者より意見書が提出され、平成１４年６月５日付けで再度の取消の理由の通知がなされ、平成１４年６月１７日に新たな訂正請求がなされたものである。　
　
２．訂正の適否　
（１）訂正の内容　
特許権者が求めている訂正の内容は、以下のとおりである。　
ア．特許請求の範囲の請求項１の「生理活性タンパク質をコードする遺伝子及びジヒドロ葉酸還元酵素（以下ｄｈｆｒとする。）遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドをチャイニーズ・ハムスターオバリージヒドロ葉酸還元酵素欠損株（ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−）細胞に形質転換して得られた浮遊攪拌培養に適した細胞を浮遊攪拌培養し、培養液中に目的生理活性タンパク質を生産させ、そして目的生理活性タンパク質を取得することを特徴とする生理活性タンパク質の製造法。」を、「生理活性タンパク質をコードする遺伝子及びジヒドロ葉酸還元酵素（以下ｄｈｆｒとする。）遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドを
元来付着性である
予め
形質転換細胞を培地中に懸濁させ、浮遊攪拌培養を継代して行うことにより
形質転換細胞を樹立し、当該浮遊攪拌培養に適した形質転換
イ．明細書第４頁第１１行〜第１７行（特許掲載公報第２頁左欄３３〜３９行）の、　
「即ち、本発明は生理活性タンパク質をコードする遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドをＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞に形質転換して得られた浮遊攪拌培養に適した細胞を浮遊攪拌培養し、培養液中に目的生理活性タンパク質を生産させ、そして、目的生理活性タンパク質を取得することを特徴とする生理活性タンパク質の製造法である。」を、「即ち、本発明は生理活性タンパク質をコードする遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドを
元来付着性である
予め
形質転換細胞を培地中に懸濁させ、浮遊攪拌培養を継代して行うことにより
形質転換細胞を樹立し、当該浮遊攪拌培養に適した形質転換
（２）訂正の目的の適否、新規事項の有無、特許請求の範囲の拡張・変更の存否、及び独立特許要件　
　上記アの訂正事項に関連する記載として、願書に添付した明細書（以下、「特許明細書」という。）の発明の詳細な説明には、「従来、ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞は、タンパク質の生産宿主として広く用いられているが、本細胞がその生育（増殖）に支持体を必要とする付着細胞であるため本細胞を大量に培養し、生理活性タンパク質を多量に取得することは困難であった。」と記載され（特許掲載公報２頁３欄８〜１２行）、実施例１に、「付着状態で生育する形質転換細胞（４μＭメソトレキセート耐性…）より浮遊化に適した細胞（ＣＨＯ−ＳＵＳＰ）を以下の様にして分離した。４μＭメソトレキセート耐性細胞を…培養した。完全に生育した後細胞を集め、全容４００ｍｌスピンナーフラスコに１０％血清を含む１００ｍｌ培地を張った。次に４×１０４個／ｍｌになるように本細胞を培地に懸濁した後、攪拌培養を行い３７℃で培養した。８日間培養した後に、最大細胞密度８．８×１０４個／ｍｌ、世代時間１９２時間以上を示した。そして更に８日間の培養を繰り返し行うことで４週間後には、最大細胞密度２．６×１０５個／ｍｌ、世代時間８７ｈｒｓの細胞が得られた。そして次に細胞初期密度１×１０５個／ｍｌで培養をくり返すことで、（１０週間後には）世代時間４８ｈｒｓ、最大細胞密度７．８×１０５個／ｍｌと良好に生育する株、すなわちＣＨＯ−ＳＵＳＰが得られた。このようにして得られたＣＨＯ−ＳＵＳＰ株は、安定にＢＵＦ−３を培地中に８０００Ｕ／ｍｌ蓄積していた。そしてＣＨＯ−ＳＵＳＰ株は、同様の培養を２０サイクルくり返し行ったが、世代時間、最大細胞密度ＢＵＦ−３蓄積量には変化はなく、安定な生育、ＢＵＦ−３生産量を示した。」ことが、また、実施例２及び実施例３についても同様なことが記載されている（同公報４頁８欄８〜４０行、５頁１０欄４３行〜６頁１１欄９行、６頁１２欄２５〜４０行）。　
　そうすると、上記アの訂正は、特許明細書に記載された事項の範囲内において、形質転換される「ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞」が元来付着性であることを明らかとし、「浮遊攪拌培養に適した細胞」が、予め形質転換して得られた形質転換細胞を培地中に懸濁させ、浮遊攪拌培養を継代して行うことにより樹立された、浮遊攪拌培養に適した形質転換細胞である旨限定したものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当するものであって、新規事項の追加に該当しない。　
　また、上記イの訂正は、上記アの訂正による特許請求の範囲の減縮に合わせて、該減縮訂正前の内容に対応する内容を記載している発明の詳細な説明における記載を訂正するものであるから、明瞭でない記載の釈明に該当するものであり、新規事項の追加に該当しない。　
　更に、上記いずれの訂正も実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。　
　そして、下記の「３．特許異議申立についての判断」の項で詳述するとおり、訂正後の特許請求の範囲に記載されている事項により構成される発明は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。　
（３）むすび　
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項において準用する平成６年法律第１１６号による改正前の特許法第１２６条第１項ただし書、第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。　
　
３．特許異議申立についての判断　
（１）申立の理由の概要　
ア．異議申立人　土井清暢は、甲第１〜１５号証を提出し、訂正前の本件請求項１及び２に係る発明は甲第１号証刊行物に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号の規定に違反して特許されたものであり、また、訂正前の本件請求項１〜５に係る発明は甲第１号証又は甲第１号証〜甲第１３号証刊行物に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであるため、請求項１〜５に係る発明の特許は取り消すべきものである旨主張している。　
甲第１号証；ＦＥＢＳ．ＬＥＴＴＥＲＳ，２２６（１），４７−５２（１９８７）　
甲第２号証；「新基礎生化学実験法７　遺伝子工学」（丸善（株）発行、昭和６３年１月３０日）第２１９頁−第２２４頁　
甲第３号証；特開昭５９−４２３２１号公報　
甲第４号証；「生化学辞典」（株）東京化学同人発行、１９８４年、２３１頁「回転振とう培養」、２４７頁「かくはん培養」、７０９頁「旋回培養」、１０７８頁「浮遊培養」の各項　
甲第５号証；Ｊ．ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬ．，８７，７５５−７６３（１９８０）　
甲第６号証；ＥＸＰ．ＣＥＬＬ  ＲＥＳ．，１０４，１１９−１２５（１９７７）　
甲第７号証；ＭＯＬ．ＣＥＬ．ＢＩＯＬ．，５，１７５０−１７５９（１９８５）　
甲第８号証；特開昭６３−３２４８４号公報　
甲第９号証；特開昭６２−２８９６００号公報　
甲第１０号証；ＭＵＴＡＴＩＯＮ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ，６７，６５−８０（１９７９）　
甲第１１号証；ＥＸＰ．ＣＥＬＬ  ＲＥＳ．，１３０，４３７−４４２（１９８０）　
甲第１２号証；ＭＵＴＡＴＩＯＮ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ，１８２，９９−１１１（１９８７）　
甲第１３号証；ＩＮ  ＶＩＴＲＯ，１９（９），６９９−７０６（１９８３）　
甲第１４号証；ＥＰＯ　９３６１９号公報　
甲第１５号証；「生化学辞典（第２版）」（株）東京化学同人発行、１９９０年、１１３６頁「浮遊（細胞）培養」の項　
　また、同人は、特許権者の最初の訂正請求後の当審からの審尋への回答に際し、以下の文献を引用している。　
文献１：ＥＸＰ．ＣＥＬＬ  ＲＥＳ．，４４，１１９−１２８（１９６６）　
文献２：ＰＲＯＣ．ＲＯＹ．ＳＯＣ．ＭＥＤ．，５６，１０６２（１９６３）　
文献３：ＮＡＴＵＲＥ（ＬＯＮＤ），１９５，１１６３（１９６２）　
文献４：「バイオテクノロジー事典」（株）シーエムシー、１９８６年、９３７頁「浮遊培養細胞」の項　
文献５：ＡＴＣＣ　ＣＡＴＡＬＯＧＵＥ  ＯＦ  ＳＴＲＡＩＮＳ  ＩＩ  ４ＴＨ  ＥＤＩＴＩＯＮ  １９８３，４９−５０　
文献６：Ｊ．ＢＩＯＣＨＥＭ．，１０２，１２３−１３１（１９８７）　
文献７：ＭＵＴＡＴＩＯＮ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ，７４，２１−３６（１９８０）　
イ．異議申立人　市原敏夫は、甲第１、２号証を提出し、訂正前の本件請求項１、２、５に係る発明は甲第１号証刊行物に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号の規定に違反して特許されたものであり、訂正前の本件請求項１〜５に係る発明は甲第１号証刊行物に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであり、また、訂正前の本件請求項１、２に係る発明は本件出願の優先日前に出願されその出願後公開された特願昭６２−２９１２１号の出願時の明細書（甲第２号証）に記載された発明と同一であり、発明者も出願人も異なるから、特許法第２９条の２の規定に違反して特許されたものであるため、請求項１〜５に係る発明の特許は取り消すべきものである旨主張している。　
甲第１号証；ＦＥＢＳ．ＬＥＴＴＥＲＳ，２２６（１），４７−５２（１９８７）（土井清暢の引用する甲第１号証）　
甲第２号証；特開昭６３−１９６２６８号公報　
ウ．異議申立人　松山美奈子は、甲第１〜７号証を提出し、訂正前の本件請求項１に係る発明は甲第１号証〜甲第３号証刊行物に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであり、訂正前の本件請求項２に係る発明は甲第１号証〜甲第６号証刊行物に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであり、また、本件明細書の記載には不備があるから、請求項１、２に係る特許は特許法第３６条第４項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してなされたものであるため、請求項１、２に係る発明の特許は取り消すべきものである旨主張している。　
甲第１号証；特開昭５９−１７３０９６号公報　
甲第２号証；「生化学辞典」（株）東京化学同人発行、第１版、第４刷、ｐ．１０７８の「浮遊培養」の項、１９８５年（土井清暢の引用する甲第４号証と同内容）　
甲第３号証；ＭＵＴＡＴＩＯＮ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ，１８２，９９−１１１（１９８７）（土井清暢の引用する甲第１２号証）　
甲第４号証；特開昭６２−２３４０９７号公報　
甲第５号証；特開昭５９−１４０８８２号公報　
甲第６号証；特開昭６３−４２６８８号公報　
甲第７号証；ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．４２１６−４２２０（１９８０）　
　また、同人は、特許権者の最初の訂正請求後の当審からの審尋への回答に際し、以下の文献を引用している。　
文献１：「組織培養」朝倉書店発行、６８−７９頁（１９８４年）（雪印の引用する甲第２号証）　
文献２：「バイオテクノロジー事典」（株）シーエムシー、１９８６年、９３７頁「浮遊培養細胞」の項（土井の回答書文献４）　
文献３：「バイオテクノロジー事典」（株）シーエムシー、１９８６年、４６７−４６８頁「細胞周期」の項　
文献４：「バイオテクノロジー事典」（株）シーエムシー、１９８６年、８４４−８４５頁「培養細胞株」の項　
エ．異議申立人　水谷修子は、甲第１〜５号証を提出し、訂正前の本件請求項１、２、５に係る発明は甲第１号証刊行物に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号の規定に違反して特許されたものであるか、または甲第１号証〜甲第３号証刊行物に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであり、また、訂正前の本件請求項３に係る発明は甲第１号証及び甲第４号証刊行物に記載された発明に基づいて、訂正前の本件請求項４に係る発明は甲第１号証及び甲第５号証刊行物に記載された発明に基づいて、それぞれ当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであるため、請求項１〜５に係る発明の特許は取り消すべきものである旨主張している。　
甲第１号証；ＦＥＢＳ．ＬＥＴＴＥＲＳ，２２６（１），４７−５２（１９８７）（土井清暢の引用する甲第１号証）　
甲第２号証；ＩＮ  ＶＩＴＲＯ，２３（１），３　ｐｔ２，３７Ａ（１９８７）　
甲第３号証；Ａｂｓｔｒ．Ｐａｐ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．；（１９８７）１９４　Ｍｅｅｔ．，ＭＢＤＴ１６９　
甲第４号証；特開昭６２−２３４０９７号公報（松山美奈子の引用する甲第４号証）　
甲第５号証；特開昭６３−４２６８８号公報（松山美奈子の引用する甲第６号証）　
　また、同人は、特許権者の最初の訂正請求後の当審からの審尋への回答に際し、以下の文献を引用している。　
文献１：ＮＡＴＵＲＥ，２２，１１６３−１１６４（１９６２）　
文献２：ＥＸＰ．ＣＥＬＬ  ＲＥＳ．，４４，１１９−１２８（１９６６）（土井清暢の回答書文献１）　
文献３：ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  １１：６８７−７０６（１９８３）　
文献４：米国特許公報第３８５０７４８号（１９７４）　
文献５：ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＰＨＹＳＩＯＬＯＧＹ  １５３：５７５−５８２（１９９２）　
文献６：蛋白質核酸酵素　３３：２８７−２８８（１９８８）　
文献７：ＩＮ  ＶＩＴＲＯ，２３（１），３　ｐｔ２，３７Ａ（１９８７）（同人の引用する甲第２号証）　
文献８：Ａｂｓｔｒ．Ｐａｐ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．；（１９８７）１９４　Ｍｅｅｔ．，ＭＢＤＴ１６９（同人の引用する甲第３号証）　
オ．異議申立人　上坂陽子は、甲第１〜５号証を提出し、訂正前の本件請求項１、２に係る発明は甲第１号証刊行物に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号の規定に違反して特許されたものであり、また、甲第２号証刊行物に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであり、訂正前の本件請求項３〜５に係る発明は甲第１号証及び甲第２号証刊行物に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであるため、請求項１〜５に係る発明の特許は取り消すべきものである旨主張している。　
甲第１号証；ＦＥＢＳ．ＬＥＴＴＥＲＳ，２２６（１），４７−５２（１９８７）（土井清暢の引用する甲第１号証）　
甲第２号証；特開昭６３−３２４８４号公報（土井清暢の引用する甲第８号証）　
甲第３号証；ＥＰＯ　９３６１９号公報（土井清暢の引用する甲第１４号証）　
甲第４号証；「生化学辞典」（株）東京化学同人発行、第１版、第３刷、１９８５年、１０７８頁「浮遊培養」の項（土井清暢の引用する甲第４号証と同内容）　
甲第５号証；特開昭５９−４２３２１号公報（土井清暢の引用する甲第３号証）　
カ．異議申立人　雪印乳業株式会社は、甲第１、２号証を提出し、訂正前の本件請求項１〜５に係る発明は甲第１号証及び甲第２号証刊行物に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであるため、請求項１〜５に係る発明の特許は取り消すべきものである旨主張している。　
甲第１号証；ＦＥＢＳ．ＬＥＴＴＥＲＳ，２２６（１），４７−５２（１９８７）（土井清暢の引用する甲第１号証）　
甲第２号証；「組織培養」朝倉書店発行、６８−７９頁（１９８４年）　
　また、同人は、特許権者の最初の訂正請求後の当審からの審尋への回答に際し、以下の文献を引用している。　
文献１：「生化学辞典」（株）東京化学同人発行、１９８４年、６９５頁「世代時間」、７２３頁「増殖能」の各項　　
文献２：「バイオテクノロジーシリーズ　細胞培養技術」講談社、１９８５年、ｐ．１６〜１７，８６〜８９，１１０〜１１１　　
文献３：ＡＴＣＣ　ＣＡＴＡＬＯＧＵＥ  ＯＦ  ＳＴＲＡＩＮＳ  ＩＩ  ４ＴＨ  ＥＤＩＴＩＯＮ  １９８３，４９−５０（土井の回答書文献５）　
文献４：ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．４２１６−４２２０（１９８０）（松山の引用する甲第７号証）　
（２）本件発明　
　訂正後の本件請求項１〜５に係る発明（以下、本件発明１〜５という。）は、平成１４年６月１７日付けの訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１〜５に記載された、以下のとおりのものである。　
【請求項１】生理活性タンパク質をコードする遺伝子及びジヒドロ葉酸還元酵素（以下ｄｈｆｒとする。）遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドを元来付着性であるチャイニーズ・ハムスターオバリージヒドロ葉酸還元酵素欠損株（ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−）細胞に予め形質転換して得られた形質転換細胞を培地中に懸濁させ、浮遊攪拌培養を継代して行うことにより浮遊攪拌培養に適した形質転換細胞を樹立し、当該浮遊攪拌培養に適した形質転換細胞を浮遊攪拌培養し、培養液中に目的生理活性タンパク質を生産させ、そして目的生理活性タンパク質を取得することを特徴とする生理活性タンパク質の製造法。　
【請求項２】生理活性タンパク質がヒト分化誘導因子ＢＵＦ−３（以下ＢＵＦ−３とする）、ヒトインターロイキン２（以下ＩＬ−２とする）、及びヒトＢ細胞分化因子（以下ＢＳＦ−２とする）のいずれかである請求項（１）記載の製造法。　
【請求項３】プラスミドがｐＳＤ（ｘ）／ＢＵＦ−３△ＳＶ４０初期プロモーター−ＢＵＦ−３をコードする遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナル−ＳＶ４０初期プロモーター−ジヒドロ葉酸還元酵素（以下ｄｈｆｒとする）遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナルである請求項（１）記載の製造法。　
【請求項４】プラスミドがｐＳＤ（ｘ）／ＢＳＦ−２△ＳＶ４０初期プロモーター−ｄｈｆｒ遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナル−ＳＶ４０初期プロモーター−ＢＳＦ−２をコードする遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナルである請求項（１）記載の製造法。　
【請求項５】プラスミドがｐＳＤ（ｘ）／ＩＬ−２△ＳＶ４０初期プロモーター−ｄｈｆｒ遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナル−ＳＶ４０初期プロモーター−ＩＬ−２をコードする遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナルである請求項（１）記載の製造法。　
（３）甲各号証に記載された発明　
　異議申立人がそれぞれ提出した甲号証、審尋に対する回答書で引用した文献、及びその記載内容を整理すると、以下のとおりである。　
刊行物１：ＦＥＢＳ．ＬＥＴＴＥＲＳ，２２６（１），４７−５２（１９８７）（土井、市原、水谷、上坂、雪印の甲第１号証）　
　ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を、ヒトインターロイキン２遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドで形質転換し、浮遊培養してヒトインターロイキン２を生産することが記載されている（４７頁の要約部分及び４８頁のマテリアルズ　アンド　メソッズの項）。　
刊行物２：「新基礎生化学実験法７　遺伝子工学」（丸善（株）発行、昭和６３年１月３０日）第２１９頁−第２２４頁（土井の甲第２号証）　
　ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞に目的タンパク質の遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子を含むベクターをトランスフェクトしてタンパク質を生産する方法が一般的な方法であることが示されている（２１９〜２２４頁）。　
刊行物３：特開昭５９−４２３２１号公報（土井の甲第３号証、上坂の甲第５号証）　
　発現ベクターｐＥＴＰＦＲでＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞をトランスフェクトしてヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）を生産することが記載されている（３０頁左下欄〜３２頁左上欄）。　
刊行物４：「生化学辞典」（株）東京化学同人発行、１９８４年、２３１頁「回転振とう培養」、２４７頁「かくはん培養」、７０９頁「旋回培養」、１０７８頁「浮遊培養」の各項（土井の甲第４号証、松山の甲第２号証、上坂の甲第４号証）　
　浮遊培養についての説明があり、２種類の浮遊培養系の一つとして、ＣＨＯ細胞等の元来単層培養している細胞集団の中から浮遊上で増殖しやすいクローンを選択して、これを浮遊培養に移す方法が挙げられており、また、浮遊培養法として、攪拌培養、回転振とう培養、旋回培養等があること、及び一般に浮遊培養法は細胞の大量培養や培養液中の代謝産物の抽出に利用されることも記載されている（１０７８頁左欄）。　
刊行物５：Ｊ．ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬ．，８７，７５５−７６３（１９８０）（土井の甲第５号証）　
　ＣＨＯ細胞をエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）で処理後、浮遊培養し浮遊細胞を集めることを繰り返すことにより接着性の低いＣＨＯ細胞を得る方法が記載されている（７５６頁左欄下２８〜１３行目）。　
刊行物６：ＥＸＰ．ＣＥＬＬ  ＲＥＳ．，１０４，１１９−１２５（１９７７）（土井の甲第６号証）　
　ＣＨＯ細胞をコラーゲン処理したプレートで培養し、浮遊細胞を集めることを繰り返すことによりコラーゲンに接着性の低いＣＨＯ細胞を得る方法が記載されている（１２１頁左欄）。　
刊行物７：ＭＯＬ．ＣＥＬ．ＢＩＯＬ．，５，１７５０−１７５９（１９８５）（土井の甲第７号証）　
　ＣＨＯ細胞におけるヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）配列及びマウスジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）配列の同時増幅及び同時発現に関する論文であり、ｔ−ＰＡｃＤＮＡ遺伝子及びＤＨＦＲｃＤＮＡ遺伝子を同時にトランスフェクションしたＣＨＯ　ＤＨＦＲ欠損細胞が、メトトレキセート（ＭＴＸ）濃度の増加により、細胞形態学的に明らかに変化し、接着性が低くなることが記載されている（１７５０頁の要約部分及び１７５６頁左欄１４〜１８行目）。　
刊行物８：特開昭６３−３２４８４号公報（土井の甲第８号証、上坂の甲第２号証）　
　発現ベクターｐＥＴＰＦＲをトランスフェクションしたＣＨＯ細胞を懸濁培養してヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）を生産することが記載されている（７頁左下欄及び右下欄）。　
刊行物９：特開昭６２−２８９６００号公報（土井の甲第９号証）　
　ヒトインターフェロン−γ遺伝子の上流にＳＶ４０初期プロモーターを連結し、マーカー遺伝子としてＥｃｏｇｐｔを有する発現ベクターｐＳＶｅＳｍａｌγでＣＨＯ・Ｋ１細胞をトランスフェクトして得られるＣＨＯ−２０株を浮遊攪拌培養してヒトインターフェロン−γを生産することが記載されている（３頁実施例１及び２）。　
刊行物１０：ＭＵＴＡＴＩＯＮ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ，６７，６５−８０（１９７９）（土井の甲第１０号証）　
　ＣＨＯ−Ｓ細胞を浮遊培養することが記載されている（６８頁４〜１８行目）。　
刊行物１１：ＥＸＰ．ＣＥＬＬ  ＲＥＳ．，１３０，４３７−４４２（１９８０）（土井の甲第１１号証）　
　浮遊培養ＣＨＯ細胞とマイクロキャリアー上培養ＣＨＯ細胞を比較した論文であり、ここで用いたＣＨＯ細胞は単層培養と浮遊培養のいずれにおいても生育することが記載されている（４３８頁）。　
刊行物１２：ＭＵＴＡＴＩＯＮ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ，１８２，９９−１１１（１９８７）（土井の甲第１２号証、松山の甲第３号証）　
　トリプシン処理したＣＨＯ細胞を旋回インキュベーター内で浮遊培養することが記載されている（１００頁右欄１５〜４０行目）。　
刊行物１３：ＩＮ  ＶＩＴＲＯ，１９（９），６９９−７０６（１９８３）（土井の甲第１３号証）　
　ＣＨＯ細胞を浮遊培養することが記載されている（７００頁左欄下１５〜３行目）。　
刊行物１４：ＥＰＯ　９３６１９号公報（土井の甲第１４号証、上坂の甲第３号証）　
　発現ベクターｐＥＴＰＦＲが野生型ＤＨＦＲ遺伝子及びｔ−ＰＡ遺伝子を有することが示されている（４７頁３０〜３２行及びＦＩｇ．１１）。　
刊行物１５：「生化学辞典（第２版）」（株）東京化学同人発行、１９９０年、１１３６頁「浮遊（細胞）培養」の項（土井の甲第１５号証）　
　浮遊培養と懸濁培養が同義語であることが示されている。　
刊行物１６：特開昭５９−１７３０９６号公報（松山の甲第１号証）　
　ｄｈｆｒ遺伝子及びＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）遺伝子を有する発現ベクターが記載され（実施例３及び第３図）、宿主としてＤＨＦＲ活性を欠損しているＣＨＯ細胞を使用することが記載され（実施例４）、形質転換された細胞を増殖させ、所望のタンパク質を取得することが記載されている（実施例５〜７）。　
刊行物１７：特開昭６２−２３４０９７号公報（松山の甲第４号証、水谷の甲第４号証）　
　ヒト分化誘導因子ＢＵＦ−３がそのアミノ酸配列とともに記載されている。　
刊行物１８：特開昭５９−１４０８８２号公報（松山の甲第５号証）　
　ヒトインターロイキン２活性を持つポリペプチドをコードする遺伝子ならびに該遺伝子を用いて組み換え法によってヒトインターロイキン２を製造する方法が記載されている。
刊行物１９：特開昭６３−４２６８８号公報（松山の甲第６号証、水谷の甲第５号証）　
　ヒトＢ細胞分化因子活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ならびに該遺伝子を用いて組み換え法によってヒトＢ細胞分化因子を製造する方法が記載されている。　
刊行物２０：甲第７号証；ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．４２１６−４２２０（１９８０）（松山の甲第７号証、雪印の回答書文献４）　
　ジヒドロ葉酸還元酵素活性を欠損したＣＨＯ細胞が記載されており、当該細胞の生育のために培地中に血清を添加することが記載されている（４２１６頁右カラム１０〜１６行）。　
刊行物２１：ＩＮ  ＶＩＴＲＯ，２３（１），３　ｐｔ２，３７Ａ（１９８７）（水谷の甲第２号証、回答書の文献７）　
　ＣＨＯのジヒドロ葉酸還元酵素欠損株を浮遊攪拌培養したことが記載されている。　
刊行物２２：Ａｂｓｔｒ．Ｐａｐ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．；（１９８７）１９４　Ｍｅｅｔ．，ＭＢＤＴ１６９（水谷の甲第３号証、回答書の文献８）　
　ｔ−ＰＡ発現をＣＨＯ細胞の浮遊攪拌培養で行っていることが記載されている。　
刊行物２３：「組織培養」朝倉書店発行、６８−７９頁（１９８４年）（雪印の甲第２号証、松山の回答書文献１）　
　細胞を浮遊培養する方法が記載され、ＣＨＯ細胞などの諸細胞を浮遊培養する方法や、同法によりそれらの細胞が単層培養と同様の増殖能を示すことが実証済みであることが記載され（６９頁下１３〜７行目）、細胞を培養液に浮遊させた状態で増殖できれば、限られた容量の培養液を用いて、より多数の細胞を培養増殖できること、浮遊培養法の実施は、特別な撹拌装置や培養液を必要とするが、それほど困難なものではなく手法も煩雑ではないこと、多くの動物細胞において、浮遊培養が実施され、従来より多大の効果が上げられていること等が記載され（６８頁下８行目〜６９頁下７行目）、細胞が浮遊細胞に適していないものである場合には、当該細胞の中から浮遊培養に適した細胞のみを選択し、浮遊培養を繰り返せば、最終的に浮遊培養に適応した細胞だけが残り、その目的を達成することができることが記載され（６９頁下６行目〜７０頁１４行目）、浮遊培養法として、浮遊攪拌培養法の説明が記載されている（７３頁下５行目〜７５頁１０行目）。　
刊行物２４：ＥＸＰ．ＣＥＬＬ  ＲＥＳ．，４４，１１９−１２８（１９６６）（土井の回答書文献１、水谷の回答書文献２）　
　シリアン（ゴールデン）ハムスター腎臓由来の繊維芽細胞株であるＢＨＫ２１クローン１３細胞の浮遊培養について記載され、ハムスター腎臓細胞を浮遊性に適応させ、該細胞を継代培養した際の、細胞増殖速度の増加現象を詳細に解析した結果から、浮遊性に適合した細胞を７回程度継代培養することにより、５９時間だった世代時間が３３時間まで減少することが示され、細胞の増殖が活発になる一因は細胞を浮遊性に適応させ継代培養したことによる細胞の世代時間の短縮によるものであることが示されている（１２２頁の表Ｉ）。このことから、一般的にクローニング（株を構築）後の細胞はダメージがあり、世代時間は細胞本来のものよりも長くなること、その際、継代培養を繰り返し細胞を環境に馴染ませる（馴化する）こと、すなわち世代時間を細胞本来のものに戻す（世代時間を短くする）ことが示唆される。また、１２６頁下５行〜１２８頁１８行に、浮遊培養適応の過程で細胞には機能及び形態、特に染色体数に大きな変化が起こることが示されている。　
刊行物２５：ＰＲＯＣ．ＲＯＹ．ＳＯＣ．ＭＥＤ．，５６，１０６２（１９６３）（土井の回答書文献２）　
　ハムスター腎臓細胞を浮遊性に適応させ、該細胞を継代培養させることについて記載されている。　
刊行物２６：ＮＡＴＵＲＥ（ＬＯＮＤ），１９５，１１６３（１９６２）（土井の回答書文献３）　　
　ハムスター腎臓細胞を浮遊性に適応させ、該細胞を継代培養させることについて記載されている。　
刊行物２７：「バイオテクノロジー事典」（株）シーエムシー、１９８６年、９３７頁「浮遊細胞培養」の項（土井の回答書文献４、松山の回答書文献２）　
　ＢＨＫ細胞がＣＨＯ細胞と同様に浮遊培養が可能であることが記載されている。また、浮遊培養によって大量生産が可能であり、実際に大容量のタンクでＣＨＯ細胞を浮遊培養してインターフェロン、プラスミノーゲンアクチベーターなどの生理活性物質を生産していることが記載されている。　
刊行物２８：ＡＴＣＣ　ＣＡＴＡＬＯＧＵＥ  ＯＦ  ＳＴＲＡＩＮＳ  ＩＩ  ４ＴＨ  ＥＤＩＴＩＯＮ  １９８３，４９−５０（土井の回答書文献５、雪印の回答書文献３）　
　ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−株のもととなり、それを用いて形質転換を行いｄｈｆｒ遺伝子欠損株が構築されるところのＣＨＯ−Ｋ１株について、３７℃の条件下で７日間で１５〜２０倍の増殖を示すことが記載されている。　
刊行物２９：Ｊ．ＢＩＯＣＨＥＭ．，１０２，１２３−１３１（１９８７）（土井の回答書文献６）　
　ＣＨＯ細胞に遺伝子を導入した、ＩＬ−２産生細胞がほぼ４８時間以内の世代時間を維持していることが示されている（１２７頁のＦｉｇ．２）。　
刊行物３０：ＭＵＴＡＴＩＯＮ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ，７４，２１−３６（１９８０）（土井の回答書文献７）　
　ＣＨＯ細胞を浮遊化したＳＣ１細胞のクローン細胞が、α−ＭＥＭの基礎培地に１０％のＦＣＳ等を添加した培地において、世代時間１２時間を達成したことが記載されている。　
刊行物３１：「バイオテクノロジー事典」（株）シーエムシー、１９８６年、４６７−４６８頁「細胞周期」の項（松山の回答書文献３）　
　細胞の倍加時間が世代時間と同義語であることが記載されている。　
刊行物３２：「バイオテクノロジー事典」（株）シーエムシー、１９８６年、８４４−８４５頁「培養細胞株」の項（松山の回答書文献４）　
　培養細胞株の対数増殖期での倍加時間が通常１５−３０時間であることが記載され、またよく用いられる培養細胞株としてＣＨＯ細胞が挙げられている。　
刊行物３３：ＮＡＴＵＲＥ，２２，１１６３−１１６４（１９６２）（水谷の回答書文献１）　
　ハムスター腎臓細胞を浮遊性に適応させ、該細胞を継代培養した細胞を用いることにより、ワクチン生産に関連した病原ウイルス抗原の大量生産が可能となったこと、具体的には、浮遊性に適応させ継代培養することによって、初代培養時には３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった細胞が継代後には１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌまで増えるようになったことが記載されている。また、１１６４頁左欄５行〜右欄４行には、浮遊適応細胞はウイルス感染性が変化したことが記載されている。　
刊行物３４：ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  １１：６８７−７０６（１９８３）（水谷の回答書文献３）　
　ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞をインターフェロン遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子を含むプラスミドで形質転換し、単層培養または浮遊培養してインターフェロンを生産させたことが記載されており、ディスカッションの項に、当該形質転換細胞が浮遊状態で成長することができ、遺伝子組み換えによる生産物を繰り返し回収することができるであろうことが示されている（７０２頁２３〜２６行）。　
刊行物３５：米国特許公報第３８５０７４８号（１９７４）（水谷の回答書文献４）　
　世代時間の短くなった細胞の有用性（例えば、ウイルスワクチンの大量生産のための宿主細胞として使用）が記載され（第２カラム５６−５９行）、更に浮遊細胞の培養プロセスの重要性についても指摘されている（第２カラム、５９−６１行）。　
刊行物３６：ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＰＨＹＳＩＯＬＯＧＹ  １５３：５７５−５８２（１９９２）（水谷の回答書文献５）　
　形質転換ＣＨＯ細胞（接着性）の世代時間が２６時間であることが記載されている（５７９頁右カラム５−８行）。　
刊行物３７：蛋白質核酸酵素　３３：２８７−２８８（１９８８）（水谷の回答書文献６）　
　形質転換されていないＣＨＯ細胞（接着性）の世代時間が１２時間であることが記載されている（２８７頁左列１７行）。　
刊行物３８：「生化学辞典」（株）東京化学同人発行、１９８４年、６９５頁「世代時間」、７２３頁「増殖能」の各項（雪印の回答書文献１）　　
　「世代時間」という用語は平均世代時間のことであり、１個の細胞が２個になるまでの時間であること、及び「増殖能」とは細胞が細胞分裂を伴って細胞数の増加を行える能力のことであることが記載されている。　
刊行物３９：「バイオテクノロジーシリーズ　細胞培養技術」講談社、１９８５年、ｐ．１６〜１７，８６〜８９，１１０〜１１１（雪印の回答書文献２）　　
　「がん由来細胞や動物株化細胞のような増殖能旺盛な細胞では、ＦＢＳ含有培地であればいずれの培地でも増殖可能であるが、長期継代培養中に細胞が培養液に馴化するか、その培地に適した細胞の比率が増大し、元の細胞株と性質の異なる細胞集団となることも知られているので、意図的に用いる以外は、なるべく原著に従った培養液を用いるのが望ましい。」と記載され（８７頁下２行〜８８頁３行）、「株化された細胞を目的に応じて改良していくことは、株化と同様重要な育種上の課題である。改良の内容はたとえば、目的物質を高濃度に産生させたり、無血清培地で培養可能な細胞に改変したり、あるいは高濃度増殖が容易になるように改変することも重要であろうし、その他にも種々の改変が考えられる。改変の方法としては、自然に段階的に馴化させる方法と、…」と記載されている（１７頁１３〜２０行）。　
先願の出願当初明細書：特開昭６３−１９６２６８号公報（市原の甲第２号証）　
　特許請求の範囲第９項に「有用蛋白質をコードする遺伝子が導入された継代増殖可能な形質転換細胞を無血清培地で培養し有用蛋白質を生産する方法」が記載され、「本発明により得られた無血清培養可能な有用蛋白質生産細胞は、実施例に示すごとく大量培養も可能であり、またＣＨＯ細胞等のように通常血清培地では付着して生育する細胞が、白血球由来細胞と同様に浮遊状態で生育するため、大量培養では浮遊培養可能な細胞が得られることが判明した。また、本発明により、無血清培養可能な有用蛋白質生産細胞が確実に取得でき、実施例に示すごとく、培養上清中の有用蛋白質は高純度で得られ、産業上、コスト、精製面でより有利な方法を提供するものである。」と記載され（４頁右上欄５〜１５行）、有用蛋白質の例として４頁左下欄２〜７行に、インターフェロン−γ等が記載され、形質転換細胞の具体例として、４頁右上欄７行にＣＨＯ細胞が記載され、更に具体的には、無血清培地に馴養したＣＨＯ−Ｋ１細胞にＥｃｏｇｐｔ遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子、インターフェロン−γ遺伝子をもつベクタープラスミドをトランスフェクションし、無血清培養可能なインターフェロン１５００ｕ／ｍｌ産生する形質転換体を取得したこと（４頁左下欄９行〜右下欄１１行（実施例１））、当該形質転換体をメソトレキセートを含む無血清培地で継代培養して、無血清培養可能なインターフェロン３０万ｕ／ｍｌ以上の生産株ＣＨＯ−５９０株を得たこと（４頁右下欄１９行〜５頁左上欄１３行（実施例２））が記載され、当該ＣＨＯ−５９０株について、「ＣＨＯ−５９０株は浮遊培養可能であり、温度３７℃、ｐＨ７．０で培地灌流培養を行った。培地灌流速度は細胞密度向上に伴い増加させた」と記載されている（５頁右上欄９〜２０行（実施例４））。　
（４）明細書の記載不備について　
　異議申立人　松山美奈子は、目的の生理活性タンパク質を大量に産生することを目的とした本件発明に係る細胞の培養においては、その培地中に血清が添加されていなくてはならず、もし添加されていない場合には、本件発明に係る培養を行っても細胞は生育（増殖）しないところ、本件発明において、培地中に血清を含むことは必須要件とされておらず、本件発明の製法において目的タンパク質を大量に得ることはできないから、本件発明１、２に係る特許は特許法第３６条第４項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してなされたものであると主張している。　
　しかしながら、異議申立人の指摘するとおり、本件出願時にはＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞の培養は血清が添加された培地で行うのが通常であったものと認められ、また、本件発明１、２は、元来付着性であるＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を培地中に懸濁させ、浮遊攪拌培養を継代して行うことにより浮遊攪拌培養に適した細胞を樹立した点に特徴があり、その際に用いる培地が無血清培地などのように本件出願時にＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞の培養に通常用いるものではない特殊な培地であるのであればともかく、上記ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞の培養に通常用いる培地である血清培地を用いることで本件発明の目的を達成することができるのであるから、培地として血清培地を用いることを請求項１、２にあえて記載しなかったことをもって、本件発明１、２の構成が明瞭でないということはできない。　
　従って、本件発明１、２に係る特許は特許法第３６条第４項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してなされたとの異議申立人の主張は採用できない。　
（５）甲号証との対比・判断　
ア．新規性、進歩性について　
　本件発明１は、生理活性タンパク質をコードする遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドを元来付着性であるＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞に予め形質転換して得られた形質転換細胞を培地中に懸濁させ、攪拌培養を継代して行うことにより、浮遊攪拌培養に適した形質転換細胞を樹立し、当該浮遊攪拌培養に適した形質転換細胞を浮遊攪拌培養し、培養液中に目的生理活性タンパク質を生産させ、当該タンパク質を収得するものである。　
　これに対して、異議申立人が引用する刊行物１には、ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を、ヒトインターロイキン２遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドで形質転換し、浮遊培養してヒトインターロイキン２を生産することが記載されているものの、当該形質転換細胞を浮遊培養に馴化させ、浮遊培養に適した形質転換細胞を樹立したことは記載されていない。　
　また、異議申立人が当審からの審尋に対する回答に際し提出した刊行物３４にも、ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を、目的タンパク質遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子を含むプラスミドで形質転換し、浮遊培養して目的タンパク質を生産させたことが記載されているが、当該刊行物にも、当該形質転換細胞を浮遊培養に馴化させ、浮遊培養に適した形質転換細胞を樹立したことは記載されていない。　
　更に、各異議申立人の引用する、本件優先日前に頒布されたその他のいずれの甲号証刊行物にも、元来付着性の細胞を予め形質転換し、これを浮遊攪拌培養に馴化させる工程を経たのち、得られた馴化細胞を浮遊攪拌培養して組み換え産物を産生させることは記載されていない。すなわち、刊行物２、３、１６には、ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を目的タンパク質遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子を含むプラスミドで形質転換し、目的タンパク質を生産することが記載されているものの、当該形質転換細胞を浮遊培養することは記載されていない。また、刊行物８、９、２２、２７には、ＣＨＯ細胞を目的タンパク質遺伝子を含むプラスミドで形質転換し、浮遊培養して目的タンパク質を生産することが記載されているものの、ＣＨＯ細胞を形質転換したのち、浮遊培養に馴化させる工程を経て樹立した細胞を用いることまでは記載されていない。更に、刊行物５、６には、ＣＨＯ細胞を処理して浮遊細胞を集めることを繰り返すことにより、接着性の低いＣＨＯ細胞を得ることが、また、刊行物４、１０〜１３、２１、３０、３２には、ＣＨＯ細胞を浮遊培養することが記載され、刊行物７には、目的タンパク質遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子を含むプラスミドで形質転換したＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞をメトトリキセートで処理して、目的タンパク質遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子の同時増幅を行う際に、メトトリキセートの濃度増加により、細胞の接着性が低くなることが記載されているが、形質転換したＣＨＯ細胞ないしＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞から浮遊培養に適した形質転換細胞を樹立することについては記載するところがない。その他の刊行物には、ＣＨＯ細胞ないしＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞と浮遊培養とに関連する記載はない。　
　そして、上述のとおり、刊行物１〜３、１６及び３４等により、ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を生理活性タンパク質をコードする遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドで形質転換し、当該細胞に生理活性タンパク質を産生させることが本件出願の優先日前に知られ、また、刊行物２３等により、付着性の細胞を浮遊攪拌培養に馴化する一般的な手法は知られてはいたが、刊行物２４及び３３に記載されているように、付着性の細胞を浮遊培養に馴化させると、細胞の特性が変化することがあることも知られており、このことからすれば、予め形質転換したＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を浮遊培養に馴化させた際に、形質転換により導入された生理活性タンパク質遺伝子の発現が安定に維持された浮遊性の細胞が得られるか否かは当業者といえども予測しがたいことであったものと認められ、また、特許権者が平成１３年８月２１日付意見書に添付して提出した、本件出願の優先日前の１９８７年に頒布された刊行物である、月刊「組織培養」、ニューサイエンス社、Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．４，１９（１３１）〜２４（１３６）頁に掲載された「遺伝子導入を利用した物質生産」と題する論文には、「…動物細胞での効率のよい発現ベクターもいくつか開発され、すでに、ＴＰＡ…などの、組み換え動物細胞を用いた生産が、報告されている。現在、高い生産性を持つ安定した系として良く利用されているものに、Ｃ１２７細胞／ＢＰＶベクター系とｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞／ｄｈｆｒベクター系の２つがある。」と記載され（１９頁左欄２８行〜右欄８行）、更に、「組み換えＣ１２７細胞およびＣＨＯ細胞は、いずれも接着依存性の細胞で浮遊化はできない。」と記載されており、当該文脈で「ＣＨＯ細胞」とは「ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞」を指すものと認められるから、本件出願の優先日には形質転換ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞は浮遊化はできないと考えられていたと認められるところ、本件発明１は、形質転換細胞を、１０週間の長期にわたって（実施例１）、あるいは１４、１５もの多数のサイクルで（実施例２、３）、継代して浮遊攪拌培養することにより、初めて、浮遊攪拌培養により安定して生育、増殖でき、かつ、生理活性タンパク質を安定して産生することができる「浮遊培養に適した形質転換細胞」を樹立し得た（例えば第３図参照）ものであり、このことは当業者が容易に想到できたものとはいえないと認められる。　
　よって、本件発明１は刊行物１に記載された発明とは認められず、刊行物１〜２３、及び当審からの審尋に対して異議申立人から提出された刊行物２４〜３９に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとも認められない。　
　また、本件発明２〜５は、本件発明１の「生理活性タンパク質の製造法」において、製造される生理活性タンパク質を特定し、用いられるプラスミドを特定するものであるから、本件発明１について上述したのと同じ理由により、本件発明２、５は刊行物１に記載された発明とは認められず、また、本件発明２〜５は刊行物１〜２３及び刊行物２４〜３９に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとは認められない。　
　従って、本件発明１、２、５は特許法第２９条第１項第３号の規定に違反して特許されたものであり、あるいは、本件発明１〜５は特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであるとの異議申立人の主張は採用できない。　
イ．先願発明との同一性について　
　異議申立人　市原敏夫の引用する先願の出願当初明細書には、「本発明により得られた無血清培養可能な有用蛋白質生産細胞は、実施例に示すごとく大量培養も可能であり、またＣＨＯ細胞等のように通常血清培地では付着して生育する細胞が、白血球由来細胞と同様に浮遊状態で生育するため、大量培養では浮遊培養可能な細胞が得られることが判明した。」と記載され、具体的には、無血清培地に馴養したＣＨＯ−Ｋ１細胞にＥｃｏｇｐｔ遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子、インターフェロン−γ遺伝子をもつベクタープラスミドをトランスフェクションし、得られた形質転換体をメソトレキセートを含む無血清培地で継代培養して、無血清培養可能なインターフェロン３０万ｕ／ｍｌ以上の生産株ＣＨＯ−５９０株を得たこと、及び、当該ＣＨＯ−５９０株は浮遊培養可能であり、培地灌流培養を行うことができることが記載されているが、当該ＣＨＯ−５９０株のもととなったＣＨＯ−Ｋ１細胞はジヒドロ葉酸還元酵素欠損株ではないから、当該明細書には、形質転換したＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞から浮遊攪拌培養に適した形質転換細胞を得ることは記載されているとはいえず、また、形質転換細胞を培地中に懸濁させ、攪拌培養を継代して行うことにより、浮遊攪拌培養に適した形質転換細胞を樹立することについては何ら記載されていない。　
　よって、本件発明１、２は第３者の先願である特願昭６２−２９１２１号の出願当初の明細書に記載された発明と同一なものとは認められないから、本件発明１、２は特許法第２９条の２の規定に違反して特許されたものであるとの異議申立人の主張は採用できない。　
（６）むすび　
　以上のとおりであるから、本件発明１〜５の特許は、特許異議申立ての理由及び証拠によっては取り消すことはできない。　
　また、他に本件発明１〜５の特許を取り消すべき理由を発見しない。　
　よって、結論のとおり決定する。　
【異議決定日】
平成１４年６月１８日（２００２．６．１８）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
１．特許請求の範囲の請求項１を、特許請求の範囲の減縮を目的として、「生理活性タンパク質をコードする遺伝子及びジヒドロ葉酸還元酵素（以下ｄｈｆｒとする。）遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドを
元来付着性である
予め
形質転換細胞を培地中に懸濁させ、攪拌培養を継代して行うことにより、
形質転換細胞を樹立し、当該浮遊攪拌培養に適した形質転換
２．明細書第４頁第１１行〜第１７行（特許掲載公報第２頁左欄３３〜３９行）の、
「即ち、本発明は生理活性タンパク質をコードする遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドをＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞に形質転換して得られた浮遊攪拌培養に適した細胞を浮遊攪拌培養し、培養液中に目的生理活性タンパク質を生産させ、そして、目的生理活性タンパク質を取得することを特徴とする生理活性タンパク質の製造法である。」を、明瞭でない記載の釈明を目的として、「即ち、本発明は生理活性タンパク質をコードする遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドを
元来付着性である
予め
形質転換細胞を培地中に懸濁させ、攪拌培養を継代して行うことにより、
形質転換細胞を樹立し、当該浮遊攪拌培養に適した形質転換
（５４）【発明の名称】
生理活性タンパク質の製造法
（５７）【特許請求の範囲】
　（１）生理活性タンパク質をコードする遺伝子及びジヒドロ葉酸還元酵素（以下ｄｈｆｒとする。）遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドを
元来付着性である
予め
形質転換細胞を培地中に懸濁させ、浮遊攪拌培養を継代して行うことにより
形質転換細胞を樹立し、当該浮遊攪拌培養に適した形質転換
　（２）生理活性タンパク質がヒト分化誘導因子ＢＵＦ−３（以下ＢＵＦ−３とする）、ヒトインターロイキン２（以下ＩＬ−２とする）、及びヒトＢ細胞分化因子（以下ＢＳＦ−２とする）のいずれかである請求項（１）記載の製造法。
　（３）プラスミドがｐＳＤ（ｘ）／ＢＵＦ−３△ＳＶ４０初期プロモーター−ＢＵＦ−３をコードする遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナル−ＳＶ４０初期プロモーター−ジヒドロ葉酸還元酵素（以下ｄｈｆｒとする）遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナルである請求項（１）記載の製造法。
　（４）プラスミドがｐＳＤ（ｘ）／ＢＳＦ−２△ＳＶ４０初期プロモーター−ｄｈｆｒ遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナル−ＳＶ４０初期プロモーター−ＢＳＦ−２をコードする遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナルである請求項（１）記載の製造法。
　（５）プラスミドがｐＳＤ（Ｉ）／ＩＬ−２△ＳＶ４０初期プロモーター−ｄｈｆｒ遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナル−ＳＶ４０初期プロモーター−ＩＬ−２をコードする遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナルである請求項（１）記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
　本発明は、チャイニーズ・ハムスターオバリージヒドロ葉酸還元酵素欠損株（以下ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−と略する）細胞を生産宿主として用い、これを浮遊攪拌培養することによる生理活性タンパク質を効率よく大量に生産させる方法に関する。
従来技術
　従来、ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞は、タンパク質の生産宿主として広く用いられているが、本細胞がその生育（増殖）に支持体を必要とする付着細胞であるため本細胞を大量に培養し、生理活性タンパク質を多量に取得することは困難であった。マイクロビーズの上に細胞を生育させ浮遊攪拌系で物質を生産させる方法が開発されたが、マイクロビーズ上に均一に細胞が生育しない等の問題点があり実用化は行われなかった。また、ファイバー状の支持体に細胞を生育させる高密度培養装置が開発されたが、その培養液量の制限より物質の大量生産には応用されていない。
本発明が解決しようとする課題
　目的遺伝子を有するプラスミド（ＤＨＦＲ遺伝子を含む）で形質転換したＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を大量培養し、生理活性タンパク質を大量に生産させる場合に一番問題となっているのは生育（増殖）に増殖支持体を必要とする点である。従って本発明の課題は増殖支持体を用いずに形質転換した細胞を浮遊攪拌系で大量培養して目的とする生理活性物質を大量に生産する方法の提供である。
課題を解決する為の手段
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、生育（増殖）に支持体を必要とするＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞及び目的遺伝子を有するプラスミドで形質転換したＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞が浮遊攪拌培養下で生育できることを見い出し本発明を完成した。
　即ち、本発明は生理活性タンパク質をコードする遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドを
元来付着性である
予め
形質転換細胞を培地中に懸濁させ、浮遊攪拌培養を継代して行うことにより
形質転換細胞を樹立し、当該浮遊攪拌培養に適した形質転換細胞を
　本発明を更に詳細に説明する。
　まず、浮遊攪拌培養可能なＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞（この場合既に、生理活性タンパク質をコードする遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドで本細胞を形質転換した細胞並びに、生理活性タンパク質をコードする遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子を発現可能な状態で有するプラスミドにより、まだ形質転換されていない細胞のどちらを用いてもよい。）の取得方法としては、以下のように行えばよい。
　支持体表面で細胞を生育させた後、核酸を含むα−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社、カタログＮｏ．４１０−１９００）（１０％牛血清を含む）に出来るだけ低密度（１−４×１０４個／ｍｌ）になるように細胞を懸濁し、浮遊攪拌培養を行う。
　尚、浮遊攪拌培養を行う時の条件は特にこだわらないが、初期細胞濃度は４×１０４／ｍｌを出来るだけ越えない方が望ましい。
　また、この時、培養液のｐＨを正確にコントロールすることが望ましいが、完全な密閉状態が維持できてさえいれば、培養初期にｐＨを７．０に正確に合わせておけば問題はない。
　この操作を繰り返すことで浮遊攪拌培養に適した細胞が得られる。また、培地は、上述のα−ＭＥＭ培地と同程度、もしくはそれ以上の濃度の核酸を含む培地ならいづれでもよい。しかし、本細胞がブロリン要求性であるためブロリンを含む培地でなくてはいけない。
　当初、細胞の生育は悪く、また最大細胞密度も低いが繰り返し培養を行い生育（増殖）の良好な最大細胞密度の高い細胞がえられる。
　この様にして得られた細胞は、従来から知られている浮遊培養株、例えば、ヒト急性単球白血病細胞（ＴＨＰ−１，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　２６：１７１−１７６（１９８０））、ヒト急性前骨髄性白血病細胞のＨＬ−６０（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２４０）、ヒト急性単球性白血病細胞のＵ−９３７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１５９３）、ヒト慢性骨髄性白血病細胞のＫ−５６２（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２４３）、ヒト急性骨髄性白血病細胞のＫＧ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２４６）、ヒト単球性白血病細胞のＪ−１１１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２４）と同様に扱うことができる。
　得られた浮遊攪拌培養に適したＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞の培養は、好ましくは、攪拌基の付いたスピンナーフラスコで行なうことが望ましい。
　やむをえない場合は、微生物用のフラスコディッシュ（組織細胞用ディッシュフラスコではなく、細胞が付着しやすいようにコーティングしていないものなら良い）で培養することも可能である。また前記以外の方法を用いてもかまわない。このように浮遊攪拌培養に適したＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を樹立しても、目的とする生理活性タンパク質をコードする遺伝子、ｄｈｆｒ遺伝子を有するプラスミドを含有していない場合には以下に示すような操作を行なうことにより目的とする生理活性タンパク質を生産し得る。
　つまり、予め、ｄｈｆｒ遺伝子及び目的生理活性タンパク質をコードする遺伝子を有するプラスミドを導入する細胞、即ち、ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を浮遊攪拌培養に適した細胞として分離した後に、ｄｈｆｒ遺伝子及び目的生理活性物質をコードする遺伝子を有するプラスミドで形質転換し、次に、目的生理活性蛋白質を産生している形質転換株を分離する。
　このようにして得られた形質転換株をメソトレキセート（以下ＭＴＸと略す。）を含む培地で生育させ、耐性形質転換細胞を分離する。この様な細胞は、ＭＴＸ耐性になったことでｄｈｆｒ遺伝子が増幅されている。従ってこの時に目的生理活性蛋白質をコードする遺伝子も一緒に増幅されているため、目的生理活性蛋白質を大量に生産している。
　この目的生理活性蛋白質を大量に生産している細胞を以後用いれはよい。
　くり返し述べるが、もちろんｄｈｆｒ遺伝子と目的生理活性蛋白質をコードする遺伝子を有するプラスミドをまずＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞に形質転換した後に浮遊攪拌培養に適した細胞を樹立してもよい。即ち、形質転換した後に、浮遊攪拌培養に適した細胞を樹立してもよいし、また、浮遊攪拌に適した細胞を樹立してから形質転換しても良いのである。
　本発明で用いるプラスミドは原則的にｄｈｆｒ遺伝子及び生理活性蛋白質をコードする遺伝子を有していなけれはいけないが、好ましくは真核生物細胞内で転写可能なプロモーター及びＳＶ４０スプライシングシグナル（尚、本発明においてはＳＶ４０スプライシングシグナルとはＳＶ４０スプライシングシグナル及びポリＡ付加シグナルの両方からなるシグナルのことを言うものとする。）を有している方が好ましい。
　プロモーターとしては普通ＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶ４０　ｅａｒｌｙ）、ウシパピロ−マウイルス（ＢＰＶと略する）などが用いられ、このプロモーターとスプライシングシグナルの間に目的とする生理活性蛋白質をコードする遺伝子を挿入するわけである。
　プラスミドとしては同一プラスミド内にて目的生理活性蛋白質をコードする遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子を有する方が好ましい。
　しかし、プラスミド内にｄｈｆｒ遺伝子を有していなくても別のプラスミド上にｄｈｆｒ遺伝子を有している場合でもよい。
　この時は、両者を一緒にして形質転換を行なわせる。また、プロモーター中に転写活性を上昇させるようなエンサンサー配列（例えばＳＶ４０　７０ｂｐくり返し、レトロウイルスロングターミナルリピート（ＬＴＲ）中に存在するエンハンサー配列）を有していることも好ましい。
　さて、このようなプラスミドの転写単位（プロモーター）の下流に目的生理活性蛋白質をコードする遺伝子を導入する。
　上述のことを考え合すと、好ましいプラスミドの形としてはＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶ４０　ｅａｒｌｙ）、目的生理活性蛋白質をコードする遺伝子、ＳＶ４０スプライシングシグナル（ＳＶ４０　ｓｐｌｉｃｉｎｇ　＆　ｐｏｌｙＡ）、ｄｈｆｒ等の遺伝子を含有するプラスミドがよい。尚、ＳＶ４０スプライシングシグナルはＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＰ．Ｂｅｒｇにより報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ　７８，２０７２−７０７６（１９８１）に記載されていて、しかも入手可能である。
　さて、好ましいプラスミドの例を具体的に示すと、プラスミド△ＳＶ４０初期プロモーター−目的生理活性蛋白質をコードする遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナル−ＳＶ４０初期プロモーター−ｄｈｆｒ遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナル又はプラスミド△ＳＶ４０初期プロモーター−ｄｈｆｒ遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナル−ＳＶ４０初期プロモーター−目的生理活性蛋白質をコードする遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナルである。
　さて、本発明で言う、目的生理活性蛋白質とはヒト及びマウスインターロイキン１、ヒト及びマウスインターロイキン２、ヒト及びマウスインターロイキン３、ヒト及びマウスα−インターフェロン、ヒト及びマウスβ−インターフェロン、ヒト及びマウスγ−インターフェロン、エリスロポエチン、ヒト分化誘導因子ＢＵＦ−３ヒトＢ細胞分化因子ＢＳＦ−２等、何を用いてもよい。
　これらの生理活性蛋白質の中でもヒト分化誘導因子ＢＵＦ−３（ＢＵＦ−３）、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）、及びヒトＢ細胞分化因子（ＢＳＦ−２）が特に好ましい。尚、以後、ＩＬ−２、ＢＵＦ−３、ＢＳＦ−２と記すと特にことわりがない限り、ヒトＩＬ−２、ヒトＢＵＦ−３、ヒトＢＳＦ−２を表示するものとする。また、ＢＳＦ−２はＢＣＤＦとも、ＩＬ−６とも呼はれているが、本発明においては最近、最っともよく用いられているＢＳＦ−２という名称を用いる。
　本発明でいう形質転換法としてはＤＮＡをカルシウムリン酸と共澱させるカルシウムリン酸法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ．Ａ．Ｊ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．５２，４５６（１９７３））、あるいはＤＥＡＥ−テキストラン法（Ｓｔｏｗ，Ｎ．Ｄ．　ｅｔ　ａｌ：Ｊ．Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏ１　３３．４４７（１９７６）、ミクロマニピュレーターを用いて核内に遺伝子を導入する微注入法（Ｇｒａｅｓａｍａｈｎ，Ａ．，ｅｔ　ａｌ　Ｈｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ，６５，８１６（１９８０））、リン脂質を懸濁して得られるリポソーム中に遺伝子を入れ標的細胞と融合させるリポソーム融合法（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ　２８３，８１４（１９８０））、目的遺伝子を有する原核細胞生物をプロトプラスト化もしくは、スフエロブラスト化にし標的細胞とＰＥＧ存在下で融合させるプロトプラスト法（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　Ｕ．Ｓ．Ａ　７７，２１６３（１９８０））などがある．
　尚、培養液中に生産された目的生理活性タンパク質を精製する方法は従来より用いられている一般的な方法を用いればよい。
　以下、本発明を実施例に基づいて説明する。
実施例１
　ヒト分化誘導因子ＢＵＦ−３について
　ＢＵＦ−３は、ヒト急性単球性白血病細胞ＴＨＰ−１細胞が産生する蛋白性分化誘導因子である。
　ＢＵＦ−３は、マウス・フレンド白血病細胞に作用し、この細胞を正常赤芽球細胞へ分化誘導する分化誘導活性を有する蛋白質である。
　ＢＵＦ−３遺伝子は既にクローニングされていて、その塩基配列及びアミノ酸配列も決定されている（第１図参照）。ＢＵＦ−３に関しては特開昭６２−２３４０９７号公報にくわしく記載されている。
　さて、このＢＵＦ−３をコードする遺伝子を含有する動物細胞発現ベクターｐＳＤ（ｘ）／ＢＵＦ−３を第２図に示すように構築した。プラスミドベクターＰＳＶ２ｄｈｆｒとｐＢＲ３２２よりメソトレキセート耐性遺伝子（ｄｈｆｒ遺伝子）をＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶ４０　ｅａｒｌｙ）及びＳＶ４０スプライシングシグナル（ＳＶ４０　ｓｐｌｉｃｉｎｇ　＆　ｐｏｌｙＡ）の間に順方向に導入したプラスミドｐＢＲ３２２−ｄｈｆｒを得た。
　また、第２図のように、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒを制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ／Ｂｇｌ　ＩＩで切断後、本断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、平滑末端にした後、アガロースゲル電気泳動により、ＳＶ４０初期プロモーター及びＳＶ４０スプライシングシグナルを含むラージフラグメントを分離した後、これにＸｈｏＩリンカーを付加した。
　このフラグナントを再び制限酵素ＸｈｏＩで処理した後にＴ４ＤＮＡリガーゼで処理し、閉環した。これをプラスミドｐＳＶ（ｘ）と命名した。
　次に前述のプラスミドｐＢＲ３２２−ｄｈｆｒを制限酵素ＢａｍＨＩで処理後アガロースゲル電気泳動を行うことより、ＳＶ４０プロモーター−ｄｈｆｒ遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナルのフラグナントを単離した（第２図）。
　このＳＶ４０初期プロモーター−ｄｈｆｒ遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナルを含むＢａｍＨＩ断片をプラスミドｐＳＶ（ｘ）のＢａｍＨＩ部位に導入し、プラスミドｐＳＤ（ｘ）を構築した（第２図）。
　次にクローニングしたＢＵＦ−３のＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理した後、ＸｈｏＩリンカーを結合させ、そして、ＸｈｏＩ処理して得た断片をプラスミドｐＳＤ（ｘ）のＸｈｏＩ部位に導入した（第２図）。
　このようにしてＢＵＦ−３遺伝子を有するプラスミドｐＳＤ（ｘ）／ＢＵＦ−３を構築した。
　即ち、発現ベクターｐＳＤ（ｘ）／ＢＵＦ−３は、ＳＶ４０初期プロモーター−ＢＵＦ−３をコードする遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナル−ＳＶ４０初期プロモーター−ｄｈｆｒ遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナルを有する。
　尚、この実施例１では、ｐＳＤ（ｘ）／ＢＵＦ−３プラスミドを予め、チャイニーズ・ハムスター・オバリージヒドロ葉酸還元酵素欠損株に形質転換し、ＢＵＦ−３を産生する形質転換株を分離した後に浮遊攪拌培養に適した株を分離する方法について述べる。
　プラスミドｐＳＤ（ｘ）／ＢＵＦ−３　１０μｇをカルシウムリン酸法でマウスＣＨＯ細胞にトランスフェクションした。導入後は１０％仔牛血清を含む所定の選択培地（ＧＩＢＣＯ社製α−ＭＥＭ培地ＣＡＴ４１０−２０００，核酸類を含まない）５％ＣＯ２存在下、３７℃で選択を行ない、３日毎に培地換えを行った。約２週間後に生育してくる細胞集団が得られた（ＩＦＯ　５０１２５）。次に導入されたプラスミドのコピー数を増加させてやるためにｄｈｆｒの拮抗剤であるメソトレキセート（０．１μＭ）含む選択培地で培養し耐性細胞を得た。そして順次メソトレキセート濃度を０．２μＭ，０，４μＭ，１μＭ，２μＭ，４μＭで上昇させ種々の段階での耐性コロニーを得た。そして各メソトレキセート濃度で耐性を示す形質転換細胞が産生するＢＵＦ−３蛋白量をフレンド細胞を用いたヘモグロビン合成量で測定したところ、メソトレキセート４μＭ濃度に耐性であった形質転換細胞では、２０００Ｕ／ｍｌの濃度のＢＵＦ−３を３日間で蓄積していた、これは、蛋白量換算にすると１μｇ／ｍｌの濃度に相当するＢＵＦ−３を生産していた。
　次に、付着状態で生育する形質転換細胞（４μＭメソトレキセート耐性２０００Ｕ／ｍｌ／３ｄａｙｓ）より浮遊化に適した細胞（ＣＨＯ−ＳＵＳＰ）（ＩＦＯ　５０１４６）を以下の様にして分離した。４μＭメントレキセート耐性細胞を細胞培養用プラスチックフラスコＦ−７５（Ｎｕｎｃ社製Ｎｏ．１５６５０２）に３０ｍｌの１０％仔牛血清を含む選択培地（４μＭメソトレキセートを含む）を入れ、１×１０６個の細胞を添加し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。完全に生育した後細胞を集め、全容４００ｍｌスピンナーフラスコに１０％血清を含む１００ｍｌ培地（ＧＩＢＣＯ社製α−ＭＥＭ培地ＣＡＴ４１０−１９００、上記選択培地に核酸添加したもの。）を張った。次に４×１０４個／ｍｌになるように本細胞を培地に懸濁した後、攪拌培養を行ない３７℃で培養した。８日間培養した後に、最大細胞密度８．８×１０４個／ｍｌ、世代時間１９２時間以上を示した（表−１参）。そして更に８日間の培養を繰り返し行なうことで４週間後には、最大細胞密度２．６×１０５個／ｍｌ、世代時間８７ｈｒｓの細胞が得られた（表−１参）。そして次に細胞初期密度１×１０５個／ｍｌで培養を繰り返すことで、世代時間４８ｈｒｓ、最大細胞密度７．８×１０５個／ｍｌと良好に生育する株、即ちＣＨＯ−ＳＵＳＰ（ＩＦＯ−５０１４６）が得られた（表−１参）。
　このようにして得られたＣＨＯ−ＳＵＳＰ株（ＩＦＯ５０１４６）は、安定にＢＵＦ−３を培地中に８０００Ｕ／ｍｌ蓄積していた。そしてＣＨＯ−ＳＵＳＰ株は、同様の培養を２０サイクル繰り返し行ったが、世代時間、最大細胞密度ＢＵＦ−３蓄積量には変化はなく、安定な生育、ＢＵＦ−３生産量を示した（第３図）。
　更にこのＣＨＯ−ＳＵＳＰ株（ＩＦＯ　５０１４６）は、ｐＨを７．０、溶存酸素を０．０５，０．０１５ａｔｍに正確にコントロールされた培養系では世代時間は、２４ｈｒｓとなり、最大細胞密度は１．０×１０６個／ｍｌにまで達した。
　このようにして得られた浮遊攪拌培養に適した細胞を分離することでＢＵＦ−３の大量生産が容易となった。
　尚、ＢＵＦ−３の単離精製は特開昭６２−２３０４９７号公報に従って行った。即ち、ＢＵＦ−３を含む培養液１００ｍｌを、６５％飽和の硫安で５℃，１２時間塩析した。遠心分離により得られた塩析沈殿物を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）２．５ｍｌに溶解し、透析チューブ（スペクトロボア社製，ＣＭＷ６，０００−８，０００）を用い、５℃で充分透析した。
　次に、この透析内液にアセトニトリルを７１％、かつｐＨが２になるようにトリフルオロ酢酸（以下ＴＦＡと略す。）を添加し、２３℃で３０分間、攪拌させた。次に、この懸濁液を遠心分離し、その遠心上清液を室温２３℃から−５℃に冷却した状態で３時間以上静置させた。これにより、本液は二相分離をおこした。その際、ＢＵＦ−３は、選択的に下層画分（アセトニトリル約４５％）に濃縮・精製された。これを０．１％ＴＦＡで２倍希釈し、逆相高速液体クロマトグラフィーで精製した。逆相カラムは、ハイボアＲＰ−３０４（バイオラッド社製，Ｃ４，３００Å，５μｍ）を用いた。溶媒は、０．１％ＴＦＡ及び、８０％アセトニトリル−０．１％ＴＦＡの２液を用い、リニアグラジエントプログラムで溶出させた。
　次に、この溶出されたＢＵＦ−３画分を、再度、逆相高速液体クロマトグラフィーを行った。カラムは、ハイボアＲＰ−３０４（バイオラッド社製，Ｃ４，３００Å，５μｍ）を用いた。
　溶媒は、０．１３％ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）及び８０％アセトニトリル−０．１３％ヘプタフルオロ酪酸の２液を用い、リニアグラジエントプログラムで溶出させた。
　次に、このようにして得られたＢＵＦ−３精製品のうち１μｇを用いＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１５％）を行った。その結果、メルカプトエタノール非存在下では２５ｋｄに、メルカプトエタノール存在下では１６ｋｄに単一なバンド（銀染色法）が認められ、他に蛋白のバンドは検出されなかった。このようにして精製されたサンプルの比活性は約２×１０６Ｕ／ｍｇ蛋白であった。
　更に、この精製品を逆相高速液体クロマトグラフィーに供した。この時、用いたカラムはＹＭＣ　ＡＰ−８０３（山村化学研究所（株）製）、溶出液は０．１％ＴＦＡ及び８０％アセトニトリル−０．１％ＴＦＡを用いリニアグラジェント（アセトニトリル１％分）により溶出した。
　これにより完全に単一なピークが得られることにより完全にＢＵＦ−３は単離精製し得た。
　尚、念の為に得られたＢＵＦ−３精製サンプルをアミノ酸分析に供したところ、第１図と同じアミノ酸配列を有していることを確認した。
実施例２
　ヒト・インターロイキン−２について
　ヒト・インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、Ｔ細胞の増殖を促進させる蛋白性因子である。
　ＩＬ−２遺伝子は、谷口ら（Ｎａｔｕｒｅ，３０２．３０５（１９８３））によって既にクローニングされている。また第４図に示すようにその塩基配列も既に決定されている（特開昭５９−１４０８８２）。このＩＬ−２　ｃＤＮＡは、ｐＣＥＩＬ−２に含まれている（第５図）。以下第５図に示すような操作を行なった。このＩＬ−２　ｃＤＮＡは両端に数十塩基の長さに及ぶＧＣテイルを有している。このＧあるいはＣという同一の塩基が並んだ場合、ｃＤＮＡの発現の邪魔になると考えられた。したがってｐＣＥＩＬ−２より制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造）処理によりＩＬ−２　ｃＤＮＡフラグメントを分離し、それにエクソヌクレアーゼであるＢａｌ　３１（ＮＥＢ）処理を行ない、ＧＣテイルの除去を行なった。そして、Ｔ４　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）で両末端を平滑末端にした後、ｐＣＥＩＬ−２よりＰｓｔＩ処理をしてＩＬ−２　ｃＤＮＡを除いたフラグメントも同様にＴ４　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで平滑末端にし、両者をＴ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ（宝酒造）で結合した。そして、作製されたプラスミドを大腸菌ＨＢ１０１株に導入した後、得られた形質転換株より、プラスミドを調製した。得られたプラスミドの中で、ＧＣテイルが除かれ発現効率の高まったものを選択し、このプラスミドをｐＣＥＩＬ−２（Ｂａｌ　７）と名づけた。
　ｐＣＥＩＬ−２（Ｂａｌ　７）からは制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造）処理によりＩＬ−２　ｃＤＮＡフラグメントを分離し、Ｔ４　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによって平滑末端にし、さらにＢａｍＨＩ，Ｈｉｎｄ　ＩＩＩの各リンカー（宝酒造）と共にＴ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ処理を行ない、その後、ＢａｍＨＩ，Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ（宝酒造）処理を行なった。このようにして得られたフラグメントを次に、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，ｅｔ　ａｌ．：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１，８５４（１９８１））のＨｉｎｄ　ＩＩＩ，Ｂｇｌ　ＩＩ処理して得られる大きい方の断片と結合し、大腸菌ＤＨ１株に形質転換し、その中から、第５図のｐＳＶ２−ＩＬ２を有するものを得る。すなわち、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ由来のＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶ４０　ｅａｒｌｙ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）とＳＶ４０スプライシングシグナル（ＳＶ４０ｓｐｌｉｃｉｎｇ　＆　ＰｏｌｙＡ）との間にＩＬ−２　ｃＤＮＡが挿入されたものを得る。次にこのｐＳＶ２−ＩＬ−２プラスミドをＰｖｕＩＩ，ＢａｍＨＩ処理して得られるＩＬ−２　ｃＤＮＡを含んだフラグメントにＢａｍＨＩリンカーをつけ、ＢａｍＨＩ処理した後に、ｐＳＶ２　ｄｈｆｒのＢａｍＨＩ切断部位に挿入し、プラスミドｐＳＤ（Ｉ）／ＩＬ−２△ＳＶ４０初期プロモーター−ｄｈｆｒ遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナル−ＳＶ４０初期プロモーター−１Ｌ−２をコードする遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナルを得た。このプラスミドｐＳＤ（Ｉ）／ＩＬ−２はＩＬ−２　ｃＤＮＡの上流にｐＳＶ２−ｄｈｆｒ由来のマウスｄｈｆｒ　ｃＤＮＡを有している。
　プラスミドｐＳＤＩ／ＩＬ−２をＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞にカルシウム・リン酸法でトランスフェクションし、ｐＳＤＩ／ＩＬ−２プラスミドが導入された形質転換細胞を分離した。導入直後では、２２．９Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２を生産していた。次に本細胞をＭＴＸ　１μＭを含む培地で生育させＭＴＸ耐性細胞を分離した。
　１μＭ　ＭＴＸ耐性形質転換細胞は、５１２Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２を生産していた。次に本細胞より浮遊攪拌培養に適した細胞の分離を行った。１μＭ　ＭＴＸ耐性形質転換細胞を支持体の上で生育させた後、細胞初期密度４×１０４個／ｍｌになる様に攪拌基の付いたスピンナーフラスコ全容４００ｍｌの１００ｍｌ培地（実施例１で示した核酸を有する培地）に懸濁した。そして、３７℃で攪拌培養し、細胞密度が最大に達するまで培養をつづけ、この攪拌培養を８サイクル繰り返すことで最大細胞密度２．９×１０５個／ｍｌ、世代時間８０時間となり、そして更に６サイクル繰り返すことで最大細胞密度６．８×１０５個／ｍｌ、世代時間３０時間を有する浮遊攪拌に適した細胞が分離された。そして、このようにして得られた浮遊攪拌に適した細胞は、安定にヒトＩＬ−２生産能力を有していた。また、実施例１で示したように、得られた浮遊攪拌に適した細胞を以後、繰り返し継代をつづけても、世代時間、最大細胞密度、ヒトＩＬ−２生産能力を安定に保持していた。
実施例３
　（１）ＢＳＦ−２は、ヒトの成熟Ｂ細胞を抗体産生細胞へ分化される因子で、第６図に示すようにそのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列も既に決定されている（特開昭６３−４２６８８、特開昭６３−５６２９１）。
　またＢＳＦ−２は感染症及び癌の治療に有用であることも本発明者らは見い出している（特願昭６２−２８９００７）。
　さて、このような有用なＢＳＦ−２をコードする遺伝子をハムスターＣＨＯ細胞において発現させる為に、以下のようにプラスミドｐＳＤ（ｘ）／ＢＳＦ−２を構築した。
　ｉ）　まずｐＣＤαを制限酵素ＨｐａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により大きなＤＮＡ断片を回収した（第７図）。
　ｉｉ）　ＢＳＦ−２　ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＢＳＦ２−３８（Ｔ．Ｈｉｒａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　３２４，７３（１９８６））を制限酵素ＢａｍＨＩとＢａｎＩＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼ処理した後、アガロースゲル電気泳動によりＢＳＦ−２　ｃＤＮＡを含む断片を回収した（第７図）。
　ｉｉｉ）　ｉ）とｉｉ）で得られた２種類のＤＮＡ断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた（第７図）。
　得られた組み換えＤＮＡを大腸菌ＨＢ１０１株へ導入しアンピシリン抵抗性を有する株を選択した。得られた株からプラスミドＤＮＡを得て制限酵素による切断試験を行なうことによりｐＣＤ　ＢＳＦ−２と保持する菌を選定した。
　ｉｖ）　ファージＤＮＡ　λ　ＢＳＦ２．５（Ｔ．Ｈｉｒａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　３２４，７３，（１９８６））をＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＢＳＦ−２　ｃＤＮＡを含む最も小さな断片を回収した（第７図）。
　ｖ）　プラスミドｐＳＰ６５（アマシャム社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、これをｉｖ）で精製したＤＮＡ断片とＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた（第７図）。得られた組換えＤＮＡを大腸菌ＨＢ１０１株へ導入しアンピシリン抵抗性を有する株を選択した。得られた株からプラスミドＤＮＡを得て制限酵素による切断試験を行なうことによりｐＢＳＦ２−１０Ｓ６を保持する菌を選定した．
　ｖｉ）　上述の　ｉｉｉ）で得たプラスミドｐＣＤ　ＢＳＦ−２を制限酵素Ｘｈｏ　ＩとＸｂａ　Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動により小さな断片を回収した（第８図）。
　ｖｉｉ）　上述の　ｖ）で得たプラスミドｐＢＳＦ２−１０Ｓ６を制限酵素ＳｍａＩで切断した後、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いてＸｈｏ　Ｉリンカーを結合し、さらに制限酵素Ｘｈｏ　ＩとＸｂａ　Ｉを切断してアガロースゲル電気泳動によりＢＳＦ−２　ｃＤＮＡの後半部分を含む断片を回収した（第８図）。
　ｖｉｉｉ）　プラスミドｐＳＤ（ｘ）を制限酵素Ｘｈｏ　Ｉで切断した後、この断片とｖｉ）で得た断片及びｖｉｉ）で得た断片の３者をＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた（第８図）。即ち、プラスミドｐＳＤ（ｘ）／ＢＳＦ−２△ＳＶ４０初期プロモーター−ｄｈｆｒ遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナル−ＳＶ４０初期プロモーター−ＢＳＦ−２をコードする遺伝子−ＳＶ４０スプライシングシグナルを構築した。この構築したプラスミドを大腸菌ＨＢ１０１株へ導入し、アンピシリン抵抗性を有する株を選択した。得られた株からプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素による切断試験を行ったことによりプラスミドｐＳＤ（ｘ）／ＢＳＦ−２を保持する株を選定した。
　（２）プラスミドｐＳＤ（ｘ）／ＢＳＦ−２をカルシウムリン酸法により、実施例１に従ってハムスターＣＨＯ細胞に導入し、核酸非要求株を選択した。その培養上清をＥＬＩＳＡ法により測定したところ、１００Ｕ／ｍｌのＢＳＦ−２活性を示した。
　（３）（２）で得られたＣＨＯ細胞株を１×１０−８Ｍメソトレキセート（ＭＴＸ）を含む培地で培養したところ、培養上清中のＢＳＦ−２活性は２００Ｕ／ｍｌに上昇した。また、さらに１×１０−７ＭＭＴＸを含む培地で培養したところ、ＢＳＦ−２活性は８００Ｕ／ｍｌに上昇した。
　８００Ｕ／ｍｌのＢＳＦ−２活性を有する細胞が得られましたが、本細胞が付着細胞であるため浮遊かくはん培養に適した細胞の分離を行った。
　ＢＳＦ−２活性８００Ｕ／ｍｌの細胞を初期細胞密度４×１０４／ｍｌで５００ｍｌ容量のスピンナーフラスコで培養温度は３７℃、回転速度１００ｒｐｍの８日間の培養を行った。この培養を９サイクル行ったところ、培養初期では最大細胞密度が７×１０４／ｍｌであったものが３×１０５／ｍｌと上昇し、世代時間も初期では１３０時間以上であったが５６時間と上昇した。
　更に、初期細胞密度を１×１０５／ｍｌとし、４日間の培養を６サイクル繰り返した。この結果、最終的に世代時間３０時間、最大細胞密度６×１０５／ｍｌと生育の良い細胞ＣＨＯ−ＢＳＦ２（ＦＥＲＭ　Ｐ−９９７０）を得た。この様に浮遊かくはん培養に適した細胞（ＦＥＲＭ　Ｐ−９９７０）が得られたがＢＳＦ−２生産能は安定に保持されていた。
　ＢＳＦ−２ユニットは、１×１０４／ｍｌのＳＫＷ−ｃ１４細胞においてＩｇＭ産生を最大の５０％だけ誘導する活性を１Ｕと定義する。
効果
　従来ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞はＢＵＦ−３、ＩＬ−２、ＢＳＦ−２等の各種生理活性タンパク質の生産には適しているが、浮遊攪拌培養ができない為に目的とする生理活性タンパク質を大量に生産することはできなかった。しかし、本発明の方法を用いるとＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞での浮遊攪拌培養が可能となり、それ故、目的とする生理活性タンパク質を極めて大量に生産し得ることかできる。
【図面の簡単な説明】
　第１図はヒト分化誘導因子ＢＵＦ−３のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を示す。
　第２図はプラスミドｐＳＤ（ｘ）／ＢＵＦ−３の構築図である。
　第３図は得られたＣＨＯ−ＳＵＳＰ株のＥＤＦ生産能及び生育の安定性を示した図である。
　第４図はヒトインターロイキン２のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を示す。
　第５図はプラスミドＬＰＳＤＩ／ＩＬ−２の構築図である。
　第６図はヒトＢ細胞分化因子のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を示す。
　第７図はプラスミドｐＣＤ　ＢＳＦ−２及びプラスミドｐＢＳＦ２−１０Ｓ６の構築図を示す。
　第８図はプラスミドｐＳＤ（ｘ）／ＢＳＦ−２の構築図を示す。