(57)【要約】【課題】本発明は、抗Aβ抗体の効率的な誘導ならびにアルツハイマー病の予防および治療のための方法を提供する。【解決手段】AB5トキシンBサブユニットとAβ抗原ペプチドとの融合蛋白質を発現するRNAウイルスベクターを投与することにより、非常に高い効率で抗Aβ抗体を誘導することに成功した。当該ベクターの投与により、血漿中の抗Aβ抗体は有意に上昇し、脳組織中のAβ量および抗Aβ抗体陽性の占有面積は低下した。本発明により、アルツハイマー病の予防および治療を目的としたより効率的な遺伝子ワクチン療法が可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
AB5トキシンBサブユニットとアミロイドβ抗原ペプチドとの融合蛋白質をコードするRNAウイルスベクター。
【請求項２】
AB5トキシンBサブユニットがコレラトキシンB（CTB）である、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
アミロイドβ抗原ペプチドが、Aβ1-15またはその断片を１または複数コピー含む、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
アミロイドβ抗原ペプチドが、Aβ1-15またはその断片を１から８個繋げた構造からなる、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
アミロイドβ抗原ペプチドが、４から８個のAβ1-15を繋げた構造からなる、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、請求項１から５のいずれかに記載のベクター。
【請求項７】
マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載のベクターおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１０】
抗Aβ抗体の誘導に用いるための、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
アルツハイマー病の予防または治療に用いるための、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１から８のいずれかに記載のベクターからなるアルツハイマー病の予防または治療用の医薬。
【請求項１３】
請求項１から８のいずれかに記載のベクターの、抗Aβ抗体誘導用組成物の製造のための使用。
【請求項１４】
請求項１から８のいずれかに記載のベクターの、アルツハイマー病の予防または治療用組成物の製造のための使用。
【請求項１５】
アミロイドβ抗原を含む蛋白質または該蛋白質をコードするベクターによりブーストが行われる、請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項１６】
アミロイドβ抗原を含む蛋白質が、AB5トキシンBサブユニットとアミロイドβ抗原ペプチドとの融合蛋白質である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
請求項１から８のいずれかに記載のベクターまたは該ベクターおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を投与する工程を含む、抗Aβ抗体を誘導する方法。
【請求項１８】
請求項１から８のいずれかに記載のベクターまたは該ベクターおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を投与する工程を含む、アルツハイマー病を予防または治療する方法。
【請求項１９】
アミロイドβ抗原を含む蛋白質または該蛋白質をコードするベクターによりブーストする工程をさらに含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
アミロイドβ抗原を含む蛋白質が、AB5トキシンBサブユニットとアミロイドβ抗原ペプチドとの融合蛋白質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗原蛋白質をコードするRNAウイルスベクターを２回以上投与する工程を含む、該抗原に対する抗体価を上昇させる方法。
【請求項２２】
抗原蛋白質をコードするRNAウイルスベクターおよび薬学的に許容される担体を含む、該ベクターを２回以上投与する工程を含む方法により該抗原に対する抗体価を上昇させることに用いるための組成物。
【請求項２３】
抗原蛋白質をコードするRNAウイルスベクターの、該ベクターを２回以上投与する工程を含む方法により該抗原に対する抗体価を上昇させるための薬剤の製造における使用。
【請求項２４】
請求項１から８のいずれかに記載のベクターからなるウイルス様粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗Aβ抗体の効率的な誘導ならびにアルツハイマー病の予防および治療を目的とした、新規の遺伝子導入ベクターおよび該ベクターを含む能動免疫用ワクチン等に関する。
【背景技術】
【０００２】
いわゆる高齢化社会への変遷に伴い、神経変性疾患の患者数は増加の一途を辿っており、例えばアルツハイマー病患者数は日本で100万人、米国では450万人、世界的には1500万人以上いるとされ、今後20年間で２倍以上の患者数に達すると予想されている。幾つかの治療薬は存在しているものの、病状が進行した段階の治療法、あるいは早期であっても進行抑制効果の高い治療法、さらには発症そのものを予防する方法などの開発が望まれており、新規の治療法に対する社会的ニーズは極めて高い。【０００３】
アルツハイマー病の病態仮説として、アミロイドβ（Aβ）の凝集および沈着による老人斑の形成が原因であるとする「アミロイドカスケード仮説」が有力である。この仮説をもとに、アルツハイマー病に対する新規治療法として、Aβを標的とするワクチン療法が注目されており、この有効性のためには液性免疫（抗Aβ抗体）の誘導が重要であると考えられている。実際に、凝集Aβペプチドをアジュバントとともに投与することで、モデルマウスにおける脳のアミロイド沈着が減少したことが報告された（Schenk D, et al., Nature 400:173-177,1999）。【０００４】
これらの結果をもとに、Elan社およびWyeth社によって、合成Aβペプチド（AN-1792：Aβ42）をアジュバント（QS21）とともに投与する臨床試験が行なわれ、被験者の約20%で、血清中の抗Aβ抗体の上昇が確認され（Hock C, et al., Nat. Med. 8:1270-1275, 2002）、高次脳機能の改善も報告され（Hock C, et al., Neuron 38:547-554, 2003）、さらに長期的観察によっても有効性が確認されたことが報告されている（Gilman S. et al., Neurology 64, 1553-1562, 2005）。しかし合成Aβペプチドとアジュバントとを組み合わせたワクチン療法においては、髄膜脳炎が発生する場合があることが報告されており（Orgogozo JM, et al., Neurology 61:46-54, 2003）、髄膜脳炎を起こした脳組織の病理学的解析によると、新皮質での老人斑の消失に伴い、アストロサイトの増殖や変性軸索の消失が観察される例が見られた。髄膜脳炎を発症した原因については、アジュバントを必要とするワクチン療法であったため、一部の患者においてアジュバント誘導性の細胞性免疫により、AβまたはAPPに反応するTh1タイプのCD4陽性T細胞が脳内に浸潤することで、アレルギー性実験的脳脊髄炎様の髄膜脳炎を引き起こしたのではないかと推察されている。ワクチン療法そのものは有効であると認識されており、髄膜脳炎のないより安全なワクチン技術の開発が望まれている。【０００５】
髄膜脳炎（副作用）を抑制する一つの方法として、T細胞エピトープを含まないと考えられているAβペプチドのN末端部分のみを利用する方法が考案され、評価されている。既に、Aβ1-7ペプチドをTh2タイプのアジュバント（CRM197：non-toxic diphtheria toxin mutant）とともに使用する免疫法が開発され、その有効性が検証されている（Vaccine ACC-001, Wyeth社）またAβ1-15ペプチドの評価も報告されており、Aβ1-15ペプチドでは免疫原としてはAβ42よりも弱いこと（Leverone JF et al., Vaccine. 21, 2197-206, 2003）、Aβ1-15をデンドリマーとすることで抗Aβ抗体価の上昇が可能になることが示されている（Seabrook TJ et al., J Neuroinflammation. 3, 14, 2006、Seabrook TJ et al., Neurobiol Aging. 28, 813-23, 2007）。また、Aβ1-15の2-tandemタイプにおいても、抗Aβ抗体価の上昇は少ないながらも確認され、モデルマウスでの有効性も示されている（Maier M et al., J Neurosci. 26, 4717-4728, 2006）。【０００６】
このように、安全性を高めるための一つの方法として、AβペプチドのN末端部分のみを利用することは有効であると考えられるが、免疫原としての機能は弱く、構造的工夫や、アジュバントの工夫、投与法の工夫などの組合せが必要である。【０００７】
Aβに対する抗体を直接投与する受動免疫法（Bard F, Cannon C, Barbour R et al., Nat. Med. 6:916-919,2000）による臨床試験（bapineuzumab = AAB-001, Elan および Wyeth社; RN-1219, Rinat/Pfizer社; LY-2062430, Eli Lilly社）も実施されている。この方法では理論的にT細胞の反応を生じることはなく、AN1792で見られたような髄膜脳炎は発生しないことが期待される。但し、受動免疫においては、大量の抗体を長期間に渡って投与することによる抗イディオタイプ抗体の出現、および血管へのアミロイド沈着により出血傾向に陥ることが懸念されている。【０００８】
一方で、遺伝子ワクチンの検討も行われている。プラスミド（Qu B, Boyer PJ, Johnston SA et al., J Neurol Sci. 244:151-158,2006、Okura Y, Miyakoshi A, Kohyama K et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9619-9624,2006）、アデノウイルスベクター（Kim HD, Cao Y, Kong FK et al., Vaccine 23:2977-2986,2005、Kim HD, Tahara K, Maxwell JA et al., J Gene Med. 9:88-98,2007）、アデノ随伴ウイルスベクター（Zhang J, Wu X, Qin C et al., Neurobiol Dis. 14:365-379,2003、Hara H, Monsonego A, Yuasa K et al., J Alzheimers Dis. 6:483-488,2004）などを利用した例が報告されている。しかしながら、効果の面では未だ十分とは言えない。
以上のように、ワクチン療法そのものは有効であると認識されているものの、より安全で効果的なワクチン技術を提供できた例はなく、その開発が未だに強く望まれている状況である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Schenk D. et al., Nature 400:173-177,1999
【非特許文献２】Hock C. et al., Nat. Med. 8:1270-1275, 2002
【非特許文献３】Hock C. et al., Neuron 38:547-554, 2003
【非特許文献４】Gilman S. et al., Neurology 64, 1553-1562, 2005
【非特許文献５】Orgogozo JM. et al., Neurology 61:46-54, 2003
【非特許文献６】Leverone JF. et al., Vaccine. 21, 2197-206, 2003
【非特許文献７】Seabrook TJ. et al., J Neuroinflammation. 3, 14, 2006
【非特許文献８】Seabrook TJ. et al., Neurobiol Aging. 28, 813-23, 2007
【非特許文献９】Maier M. et al., J Neurosci. 26, 4717-4728, 2006
【非特許文献１０】Bard F. et al., Nat. Med. 6:916-919, 2000
【非特許文献１１】Qu B. et al., J Neurol Sci. 244:151-158, 2006
【非特許文献１２】Okura Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9619-9624, 2006
【非特許文献１３】Kim HD. et al., Vaccine 23:2977-2986, 2005
【非特許文献１４】Kim HD. et al., J Gene Med. 9:88-98, 2007
【非特許文献１５】Zhang J. et al., Neurobiol Dis. 14:365-379, 2003
【非特許文献１６】Hara H. et al., J Alzheimers Dis. 6:483-488, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記状況に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、抗Aβ抗体の効率的な誘導方法、ならびにアルツハイマー病の治療あるいは予防を目的としたより安全で効果的な免疫療法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意努力を重ね、Aβを発現するRNAウイルスベクターを用いたワクチン療法の開発を推進した。その過程で本発明者らは、AB5トキシンBサブユニットとアミロイドβペプチドとの融合蛋白質を発現する核酸と、RNAウイルスベクターとを組み合わせて用いたワクチン療法により、Aβに対する有意に高い抗体価が誘導されることを見出した。特にアミロイドβペプチドとしてAβ1-15を含む融合蛋白質を発現するRNAウイルスベクターは、従来の治療法に比べて著しく有効性の高い治療効果を示し、本発明らが先に報告していたアミロイドβ発現ベクターに比較して（WO2006/112553）、Aβ発現量そのものの顕著な亢進と、有効性の一つの指標である抗Aβ抗体の確実な発現を可能にした。また、開発した治療法では、従来のAβペプチドとアジュバントの併用法で免疫した場合に問題になっていた髄膜脳炎が観察されず、安全面を担保できる可能性が高いことが示唆された。【００１２】
すなわち本発明は、AB5トキシンBサブユニットとアミロイドβ抗原ペプチドとの融合蛋白質をコードするRNAウイルスベクター、該ベクターによる抗Aβ抗体（液性免疫）の誘導、および該ベクターを用いたアルツハイマー病の予防および治療等に関し、より具体的には、
〔１〕AB5トキシンBサブユニットとアミロイドβ抗原ペプチドとの融合蛋白質をコードするRNAウイルスベクター、
〔２〕AB5トキシンBサブユニットがコレラトキシンB（CTB）である、〔１〕に記載のベクター、
〔３〕アミロイドβ抗原ペプチドが、Aβ1-15またはその断片を１または複数コピー含む、〔１〕または〔２〕に記載のベクター、
〔４〕アミロイドβ抗原ペプチドが、Aβ1-15またはその断片を１から８個繋げた構造からなる、〔３〕に記載のベクター、
〔５〕アミロイドβ抗原ペプチドが、４から８個のAβ1-15を繋げた構造からなる、〔４〕に記載のベクター、
〔６〕RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のベクター、
〔７〕マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、〔６〕に記載のベクター、
〔８〕パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、〔７〕に記載のベクター、
〔９〕〔１〕から〔８〕のいずれかに記載のベクターおよび薬学的に許容される担体を含む組成物、
〔１０〕抗Aβ抗体の誘導に用いるための、〔９〕に記載の組成物、
〔１１〕アルツハイマー病の予防または治療に用いるための、〔９〕または〔１０〕に記載の組成物、
〔１２〕〔１〕から〔８〕のいずれかに記載のベクターからなるアルツハイマー病の予防または治療用の医薬、
〔１３〕〔１〕から〔８〕のいずれかに記載のベクターの、抗Aβ抗体誘導用組成物の製造のための使用、
〔１４〕〔１〕から〔８〕のいずれかに記載のベクターの、アルツハイマー病の予防または治療用組成物の製造のための使用、
〔１５〕アミロイドβ抗原を含む蛋白質または該蛋白質をコードするベクターによりブーストが行われる、〔１３〕または〔１４〕に記載の使用、
〔１６〕アミロイドβ抗原を含む蛋白質が、AB5トキシンBサブユニットとアミロイドβ抗原ペプチドとの融合蛋白質である、〔１５〕に記載の使用、
〔１７〕〔１〕から〔８〕のいずれかに記載のベクターまたは該ベクターおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を投与する工程を含む、抗Aβ抗体を誘導する方法、
〔１８〕〔１〕から〔８〕のいずれかに記載のベクターまたは該ベクターおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を投与する工程を含む、アルツハイマー病を予防または治療する方法、
〔１９〕アミロイドβ抗原を含む蛋白質または該蛋白質をコードするベクターによりブーストする工程をさらに含む、〔１７〕または〔１８〕に記載の方法、
〔２０〕アミロイドβ抗原を含む蛋白質が、AB5トキシンBサブユニットとアミロイドβ抗原ペプチドとの融合蛋白質である、〔１９〕に記載の方法、
〔２１〕抗原蛋白質をコードするRNAウイルスベクターを２回以上投与する工程を含む、該抗原に対する抗体価を上昇させる方法、
〔２２〕抗原蛋白質をコードするRNAウイルスベクターおよび薬学的に許容される担体を含む、該ベクターを２回以上投与する工程を含む方法により該抗原に対する抗体価を上昇させることに用いるための組成物、
〔２３〕抗原蛋白質をコードするRNAウイルスベクターの、該ベクターを２回以上投与する工程を含む方法により該抗原に対する抗体価を上昇させるための薬剤の製造における使用、
〔２４〕〔１〕から〔８〕のいずれかに記載のベクターからなるウイルス様粒子、に関する。
なお上記の各項において、同一の項を引用する各項に記載の発明の２つまたはそれ以上を任意に組み合わせた発明は、それらに引用される上位の項に記載の発明において、既に意図されている。また、本明細書に記載した任意の発明要素、技術的要素、およびそれらの任意の組み合わせは、本明細書において意図されている。また、それらの発明において、本明細書に記載の任意の要素またはその任意の組み合わせを除外した発明も、本明細書に意図されている。また本明細書は、明細書中に例えば好ましいとしてある特定の態様を記載した場合、それを開示するのみならず、その態様を含むより上位の本明細書に開示された発明から、その態様を除外した発明も開示するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のベクターを用いたアルツハイマー病のワクチン療法を実施すれば、有効な治療法のなかったアルツハイマー病型痴呆患者を救済するだけでなく、高齢者の生活向上や介護問題の大きな改善、医療費の削減など多くの社会的貢献が期待される。さらに、最近PET（ポジトロンCT）あるいはMRI（磁気共鳴画像装置）を利用したアルツハイマー病の早期診断技術開発が盛んに行われており、すでに臨床研究段階にあるものもある。この早期診断と効果の高い本発明のワクチン療法を組み合わせて、発症初期に根治的治療を提供することにより、本人、家族ならびに社会的負担を大きく軽減できることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Aβ42 NotIフラグメント構造図。
【図２】Aβ42 NotIフラグメント構築図。
【図３】CTB-Aβ42 NotIフラグメント構造図。
【図４】Aβ42、IL-4-Aβ42、PEDI-Aβ42、CTB-Aβ42のBHK21細胞における細胞破砕液と培養上清中の発現量を示す図である。
【図５】CTB-Aβ15 NotIフラグメント構築図。
【図６】CTB-Aβ15x2,CTB-Aβ15x4,CTB-Aβ15x8  NotIフラグメント構築図。
【図７】CTB-Aβ42、CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、CTB-Aβ15x8遺伝子を搭載したSeVベクターを感染させたBHK細胞の細胞破砕液および培養上清中のWestern blotによるAβ抗原量を示す図である。
【図８】CTB-Aβ42、CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、CTB-Aβ15x8遺伝子を搭載したSeVベクターを感染させたBHK細胞の細胞破砕液および培養上清中のGM1に対する結合活性を示す図である。
【図９】CTB-Aβ42、CTB-Aβ15x8、GFP遺伝子を搭載したSeVベクターを筋肉内投与したC57BL/6NマウスのAβ抗体価を示す図である。
【図１０】CTB-Aβ15x8遺伝子を搭載したSeVベクターを筋肉内、皮内、鼻腔内投与したC57BL/6NマウスのAβ抗体価を示す図である。
【図１１】CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、CTB-Aβ15x8遺伝子を搭載したSeVベクターを鼻腔内投与したC57BL/6NマウスのAβ抗体価を示す図である。
【図１２】CTB-Aβ42遺伝子を搭載したSeVベクターを筋肉内投与し、大腸菌より精製したCTB-Aβ42タンパクでブーストを行ったC57BL/6NマウスのAβ抗体価を示す図である。
【図１３】CTB-Aβ15x8遺伝子を搭載したSeVベクターを筋肉内投与し、同SeVベクターでブーストを行ったC57BL/6NマウスのAβ抗体価を示す図である。
【図１４】CTB-Aβ42もしくはCTB-Aβ15x8遺伝子を搭載したSeVベクターを筋肉内投与し、同SeVベクターでブーストを行ったC57BL/6NマウスのAβ抗体価を示す図である。パネルBではパネルAのCTB-Aβ42遺伝子搭載SeVベクターの結果のみが示されている。
【図１５】CTB-Aβ15x8遺伝子を搭載したSeVベクターを鼻腔内投与し、同SeVベクターでブーストを行ったC57BL/6NマウスのAβ抗体価を示す図である。
【図１６】CTB-Aβ15x8、CTB-Aβ42、GFP遺伝子を搭載したSeVベクターを筋肉内投与し、CTB-Aβ42タンパクでブーストを行ったTg2576マウスのAβ抗体価を示す図である。
【図１７】CTB-Aβ15x8、CTB-Aβ42、GFP遺伝子を搭載したSeVベクターを筋肉内投与し、CTB-Aβ42タンパクでブーストを行ったTg2576マウスの脳内Aβ量を示す図である。
【図１８】脳病理組織標本上の6E10免疫染色陽性部位の分布を示す例。対照のSeV18+GFP/ΔF群（A）では嗅球、海馬、大脳新皮質に6E10染色陽性のAβ沈着（茶色）が散在性に数多く認められるのに対し、SeV18+CTB-Aβ15x8/ΔF投与群の例（B）では明らかにAβ沈着が少ないことがわかる。
【図１９】6E10免疫染色標本の画像解析グラフ。対照のSeV18+GFP/ΔF群（左欄）に比べてSeV18+CTB-Aβ15x8/ΔF投与群（右欄）では脳の各部位において明らかに面積率の減少傾向が認められ、とくに海馬においてその差が大きいことがわかる。
【図２０】蛋白使用によるノーマルマウスでの抗Aβ抗体価の誘導。Group A (6匹)は、SeV18+GFP/ΔFを5x107 CIU/200μl/headで筋注投与してから、8週目に同ベクター同様に投与した群。Group B(6匹)は、SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔFを5x107 CIU/200μl/headで筋注投与してから、8週目に同ベクター同様に投与した群。Group C(6匹)は、SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔFを5x107 CIU/200μl/headで筋注投与してから、2週目一回計5回CTB-Aβ15x4KK蛋白を100μg/100μl/headで皮下投与した群。Group D(6匹)は、CTB-Aβ15x4KK蛋白を100μg/100μl/headで皮下投与してから、2週目一回計5回CTB-Aβ15x4KK蛋白を100μg/100μl/headで皮下投与した群。
【図２１】蛋白使用によるPDGF-hAPPV717Iマウスでの抗Aβ抗体価の誘導。Group A は、未処置とした群。Group Bは、SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔFを5x107 CIU/10μl/headで点鼻投与してから、8週目に同ベクター同様に投与した群。Group Cは、SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔFを5x107 CIU/10μl/headで点鼻投与してから、2週目一回計7回CTB-Aβ15x4KK蛋白(大腸菌から生産したモノ)を100μg/15x2μl/headで点鼻投与した群。Group Dは、CTB-Aβ15x4KK蛋白を100μg/15x2μl/headで点鼻投与してから、2週目一回計7回CTB-Aβ15x4KK蛋白を100μg/15x2μl/headで点鼻投与した群。
【図２２】SeVと蛋白併用によるTg2576マウスでの抗Aβ抗体価の誘導。Group A は、未処置とした群。Group Bは、SeV18+GFP/ΔFを5x107 CIU/200μl/headで点鼻投与してから、12週目に同ベクター同様に投与した群。Group Cは、SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔFを5x107 CIU/10μl/headで点鼻投与してから、1週目一回計4回、その後2週目一回計５回、CTB-Aβ15x4KK蛋白を100μg/100μl/headで皮下投与した群。
【図２３】SeVと蛋白併用によるTg2576マウスでの脳内老人斑の減少。Group A は、未処置とした群。Group Bは、SeV18+GFP/ΔFを5x107 CIU/200μl/headで点鼻投与してから、12週目に同ベクター同様に投与した群。Group Cは、SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔFを5x107 CIU/10μl/headで点鼻投与してから、1週目一回計4回、その後2週目一回計５回、CTB-Aβ15x4KK蛋白を100μg/100μl/headで皮下投与した群。
【図２４】SeVと蛋白併用によるTg2576マウスでの脳内Aβ量の減少（不溶性Aβ42）。Group A は、未処置とした群。Group Bは、SeV18+GFP/ΔFを5x107 CIU/200μl/headで点鼻投与してから、12週目に同ベクター同様に投与した群。Group Cは、SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔFを5x107 CIU/10μl/headで点鼻投与してから、1週目一回計4回、その後2週目一回計５回、CTB-Aβ15x4KK蛋白を100μg/100μl/headで皮下投与した群。
【図２５】各種ベクターによるPDGF-hAPPV717Iマウスでの抗Aβ抗体価の誘導。Group A は、AAV-GFPを5x1010 particles/200μl/headで筋注投与してから、8週目に同ベクター同様に投与した群。Group B は、AAV-CTBAβ42を5x1010 particles/200μl/headで筋注投与してから、8週目に同ベクター同様に投与した群。Group Cは、SeV18+GFP/ΔFを5x107 CIU/200μl/headで筋注投与してから、8週目に同ベクター同様に投与した群。Group Dは、SeV18+(CTB-Aβ42)/ΔFを5x107 CIU/200μl/headで筋注投与してから、8週目に同ベクター同様に投与した群。Group Eは、SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔFを5x107 CIU/200μl/headで筋注投与してから、8週目に同ベクター同様に投与した群。Group Fは、SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔFを5x107 CIU/10μl/headで点鼻投与してから、8週目に同ベクター同様に投与した群。
【図２６】非感染性粒子(VLP)によるノーマルマウスでの抗Aβ抗体価の誘導。Group A (6匹)は、SeV18+GFP/ΔFを5x107 CIU/200μl/headで筋注投与してから、1週目に一回計４回、その後２週目に一回、同ベクター同様に投与した群。Group B(6匹)は、非感染性粒子であるSeV18+(NP-Aβ15x8)/ΔF-VLPを150μg/200μl/headで筋注投与してから、1週目に一回計４回、その後２週目に一回、同ベクター同様に投与した群。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、AB5トキシンBサブユニット（AB5B）とアミロイドβ（Aβ）由来の抗原ペプチドとの融合蛋白質をコードするRNAウイルスベクター、該ベクターを含む抗Aβ抗体誘導剤、アルツハイマー病の予防または治療用組成物、該ベクターを用いて抗Aβ抗体を誘導する方法およびアルツハイマー病を予防または治療する方法等に関する。本発明者らは、AB5BとAβの融合蛋白質をコードする核酸を、RNAウイルスベクターと組み合わせて用いることにより、アルツハイマー病に対するワクチン効果を顕著に高めることが可能であることを見出した。すなわちAB5BとAβペプチドの融合蛋白質をコードするRNAウイルスベクターを用いることにより、Aβに対する抗体の産生を劇的に高めることができ、アルツハイマー病に対するこれまでにない有効な予防および/または治療が可能となる。
【００１６】
本発明においてウイルスベクターとは、当該ウイルスに由来するゲノム核酸を有し、該核酸に導入遺伝子を組み込むことにより、該ゲノム核酸から該遺伝子を発現させるためのベクター（運び屋）である。また本発明においてウイルスベクターには、感染ウイルス粒子の他、ウイルスコア、ウイルスゲノムとウイルス蛋白質との複合体、非感染性粒子（非感染性ウイルス様粒子または非感染性ウイルス粒子）などからなる複合体であって、細胞に導入することにより搭載する遺伝子を発現する能力を持つ複合体が含まれる。例えばRNAウイルスにおいて、ウイルスゲノムとそれに結合するウイルス蛋白質からなるリボヌクレオ蛋白質（ウイルスのコア部分）は、細胞に導入することにより細胞内で導入遺伝子を発現することができる（WO00/70055）。このようなリボヌクレオ蛋白質（RNP）も本発明においてウイルスベクターに含まれる。細胞への導入は、適宜トランスフェクション試薬等を用いて行うことができる。導入されたRNPは、本来のウイルスと同様の機構により、ゲノムRNAに搭載された遺伝子を発現する。
【００１７】
本発明においてRNAウイルスとは、RNAゲノムを有するウイルスであって、ライフサイクルにおいてDNAのフェーズを持たないウイルスを言う。本発明においてRNAウイルスは、逆転写酵素を持たない（すなわちレトロウイルスは含まれない）。すなわちウイルス増殖において、ウイルスゲノムはDNAを介さずに、RNA依存性RNAポリメラーゼにより複製される。RNAウイルスには、一本鎖RNAウイルス（プラス鎖RNAウイルスおよびマイナス鎖RNAウイルスを含む）、および二本鎖RNAウイルスが含まれる。またエンベロープを有するウイルス（エンベロープウイルス；enveloped viruses）およびエンベロープを有さないウイルス（非エンベロープウイルス；non-enveloped viruses）を含むが、好ましくはエンベロープウイルスに由来するベクターが用いられる。本発明においてRNAウイルスには、具体的には以下の科に属するウイルスが含まれる。
ラッサウイルスなどのアレナウイルス科（Arenaviridae）
インフルエンザウイルスなどのオルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae；Infuluenza virus A, B, C, および Thogoto-like viruses 等を含む）
SARSウイルスなどのコロナウイルス科（Coronaviridae）
風疹ウイルスなどのトガウイルス科（Togaviridae）
ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、センダイウイルス、RSウイルスなどのパラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）
ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルスなどのピコルナウイルス科（Picornaviridae）
マールブルグウイルス、エボラウイルスなどのフィロウイルス科（Filoviridae）
黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、C型肝炎ウイルス、G型肝炎ウイルスなどのフラビウイルス科（Flaviviridae）
ブンヤウイルス科（Bunyaviridae；Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, および Phlebovirus属等を含む）
狂犬病ウイルスなどのラブドウイルス科（Rhabdoviridae）
レオウイルス科（Reoviridae）
【００１８】
本発明において好適なRNAウイルスベクターの１つとしては、例えばマイナス鎖RNAウイルスベクターが挙げられる。マイナス鎖RNAウイルスベクターとは、マイナス鎖（ウイルス蛋白質をアンチセンスにコードしている鎖）のRNAをゲノムとして含むウイルスに由来するウイルスベクターである。マイナス鎖RNAはネガティブ鎖RNAとも呼ばれる。本発明においては、特に一本鎖マイナス鎖RNAウイルス（非分節型（non-segmented）マイナス鎖RNAウイルスとも言う）が例示できる。「一本鎖ネガティブ鎖RNAウイルス」とは、一本鎖ネガティブ鎖［すなわちマイナス鎖］RNAをゲノムに有するウイルスを言う。このようなウイルスとしては、パラミクソウイルス（Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, および Pneumovirus属等を含む）、ラブドウイルス（Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus, および Ephemerovirus属等を含む）、フィロウイルス（Filoviridae）などの科に属するウイルスが含まれ、分類学上モノネガウイルス目(Mononegavirales)に属している。（ウイルス 第57巻 第１号、pp29-36、2007; Annu. Rev. Genet. 32, 123-162, 1998; Fields virology fourth edition, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1305-1340,2001; Microbiol. Immunol. 43, 613-624, 1999; Field Virology, Third edition pp. 1205-1241, 1996）。
【００１９】
本発明においてマイナス鎖RNAウイルスベクターとしては、特にパラミクソウイルスベクターが挙げられる。パラミクソウイルスベクターは、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ウイルスに由来するウイルスベクターである。例えばパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ウイルスのセンダイウイルス(Sendai virus)を挙げることができる。他の例としては、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)、おたふくかぜウイルス(Mumps virus)、麻疹ウイルス(Measles virus)、RSウイルス(Respiratory syncytial virus)、牛疫ウイルス(rinderpest virus)、ジステンパーウイルス(distemper virus)、サルパラインフルエンザウイルス（SV5）、ヒトパラインフルエンザウイルス1,2,3型、オルトミクソウイルス科 (Orthomyxoviridae)のインフルエンザウイルス(Influenza virus)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)の水疱性口内炎ウイルス(Vesicular stomatitis virus)、狂犬病ウイルス(Rabies virus)等が挙げられる。
【００２０】
本発明において用い得るウイルスをさらに例示すれば、例えば Sendai virus (SeV)、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)、phocine distemper virus (PDV)、canine distemper virus (CDV)、dolphin molbillivirus (DMV)、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)、rinderpest virus (RPV)、Hendra virus (Hendra)、Nipah virus (Nipah)、human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)、simian parainfluenza virus 5 (SV5)、human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)、human parainfluenza virus-4b (HPIV-4b)、mumps virus (Mumps)、およびNewcastle disease virus (NDV) などが含まれる。より好ましくは、Sendai virus (SeV)、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)、phocine distemper virus (PDV)、canine distemper virus (CDV)、dolphin molbillivirus (DMV)、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)、rinderpest virus (RPV)、Hendra virus (Hendra)、および Nipah virus (Nipah) からなる群より選択されるウイルスが挙げられる。
【００２１】
本発明において用いられるベクターは、例えば、パラミクソウイルス亜科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモルビリウイルス属を含む）に属するウイルスまたはその誘導体であり、例えばレスピロウイルス属（genus Respirovirus）（パラミクソウイルス属（Paramyxovirus）とも言う）に属するウイルスまたはその誘導体である。誘導体には、ウイルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウイルス遺伝子が改変されたウイルス、および化学修飾されたウイルス等が含まれる。本発明を適用可能なレスピロウイルス属ウイルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１型（HPIV-1）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（HPIV-3）、ウシパラインフルエンザウイルス3型（BPIV-3）、センダイウイルス(Sendai virus; マウスパラインフルエンザウイルス１型とも呼ばれる)、およびサルパラインフルエンザウイルス10型（SPIV-10）などが含まれる。
【００２２】
本発明のウイルスベクターは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。また伝播能を有していても、いなくてもよい。ここで伝播能とは、ウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子を産生する能力を言う。ウイルスベクターは、天然から単離されたウイルスと同様の構造を持つウイルスベクターであっても、遺伝子組み換えにより人為的に改変したウイルスベクターであってもよい。例えば、野生型ウイルスが持ついずれかの遺伝子に変異や欠損があるものであってよい。また、DI粒子（J.Virol. 68: 8413-8417, 1994）などの不完全ウイルスを用いることも可能である。例えば、ウイルスのエンベロープ蛋白質または外殻蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子に変異または欠損を有するウイルスを好適に用いることができる。このようなウイルスベクターは、例えば感染細胞においてはゲノムを複製することはできるが、感染性ウイルス粒子を形成できない。このような複製能欠損型のウイルスベクターは、周囲に感染を拡大する懸念がないので安全性が高い。例えば、F、H、HN、G、M、または M1などのエンベロープ蛋白質またはスパイク蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子、2つ以上、3つ以上、あるいは4つ以上の任意の組み合わせを欠失するマイナス鎖RNAウイルスベクターを用いることができる （WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。ゲノム複製に必要な蛋白質（例えば N、P、およびL蛋白質）をゲノムRNAにコードしていれば、感染細胞においてゲノムを増幅することができる。欠損型ウイルスを製造するには、例えばウイルスゲノムから遺伝子を欠損させ、欠損させた遺伝子産物またはそれを相補できる蛋白質をウイルス産生細胞において外来的に供給する（WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。また、欠損するウイルス蛋白質を完全に相補することなく、非感染性のウイルス粒子（VLP）としてウイルスベクターを回収する方法も知られている（WO00/70070）。また、ウイルスベクターをRNP（例えば N、L、P蛋白質、およびゲノムRNAからなるRNP）として回収する場合は、エンベロープ蛋白質を相補することなくベクターを製造することができる。
【００２３】
またエンベロープウイルスに由来するウイルスベクターを作製する場合は、当該ウイルスが本来持つエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むウイルスベクターを作製することができる。例えば、ウイルス製造の際に、所望の外来性エンベロープ蛋白質をウイルス産生細胞で発現させることにより、これを含むウイルスを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はなく、哺乳動物細胞への感染能を付与する所望の接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質が用いられる。具体的には、例えば水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus; VSV）のG蛋白質（VSV-G）を挙げることができる。VSV-G蛋白質は、任意のVSV株に由来するものであってよく、例えば Indiana血清型株（J. Virology 39: 519-528 (1981)）由来のVSV-G蛋白を用いることができるが、これに限定されない。
【００２４】
本発明のウイルスベクターは、Aβ抗原ペプチドを、AB5トキシンBサブユニットとの融合蛋白質としてコードしている。ここでAβ抗原ペプチドとは、Aβに由来する抗原ペプチドを言い、Aβまたは抗原性を有するその断片を含むペプチドである。本発明においてAβ抗原ペプチドとしては、天然のAβ、その抗原性断片（6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15アミノ酸以上の断片）、それらに他のアミノ酸配列を付加したり、それらを任意につなぎ合わせた合成ペプチド等が挙げられるが、それらに限定されない（Harlow, Antibodies：A laboratory Manual, 1998；Chapter 5 page 76）。Aβ抗原ペプチドは、好ましくはAβのB細胞エピトープを１つ以上有するペプチドである。Aβの由来は特に制限はないが、好ましくはヒトAβ（Aβ40、Aβ42、Aβ43等）に由来するAβペプチドを使用する（Aβ43の配列を配列番号69に例示）。より具体的には、Aβ1-39、Aβ1-40、Aβ1-41、Aβ1-42、Aβ1-43、Aβ17-40、Aβ17-42、Aβ1-5、Aβ1-6、Aβ1-7、Aβ1-8、Aβ1-9、Aβ1-10、Aβ1-11、Aβ1-12、Aβ1-13、Aβ1-14、Aβ1-15、Aβ1-16、Aβ1-17、Aβ1-18、Aβ1-19、Aβ1-20、Aβ1-21、Aβ1-33、Aβ3-7、Aβ4-10、およびそれらの同一または任意の組み合わせを、１または複数個、例えばタンデムつなぎ合わせたものが挙げられる（各番号はAβのN末端からの位置を表す）（特開2005-21149）。また、アミロイド繊維形成を阻害し神経を保護する能力について公知の抗Aβモノクローナル抗体10D5および6C6は、Aβ42の3番目〜6番目のアミノ酸に相当する4アミノ酸エピトープ(EFRH)を認識することが報告されている(Frenkel, D. et al., J. Neuroimmunol. 88：85-90, 1998；Frenkel, D. et al., J. Neuroimmunol. 95：136-142, 1999)。同じエピトープを認識するモノクローナル抗体508Fも、Aβによる神経毒性を抑制する(Frenkel, D. et al., J. Neuroimmunol. 106：23-31, 2000)。従って、この配列（EFRH）を含むAβ配列における6〜8アミノ酸以上のポリペプチドを好適に用いることができる。細胞性免疫のエピトープはAβのC末端領域に集中する。従ってAβ1-21などのN末端断片を含み、Aβ22-43等のAβのC末端付近の配列を含まない断片を発現させることで、相対的に細胞性免疫よりも液性免疫を優位にすることができる。
【００２５】
特に好ましいAβペプチドは、天然のAβのN末端の1〜3番目から10〜20番目までの断片（Aβ1-10〜Aβ1-20、Aβ2-10〜Aβ2-20、または Aβ3-10〜Aβ3-20、）を、１個または複数コピー含むペプチドが挙げられる。具体的には、Aβ1-10、Aβ1-11、Aβ1-12、Aβ1-13、Aβ1-14、Aβ1-15、Aβ1-16、Aβ1-17、Aβ1-18、Aβ1-19、Aβ1-20、Aβ2-10、Aβ2-11、Aβ2-12、Aβ2-13、Aβ2-14、Aβ2-15、Aβ2-16、Aβ2-17、Aβ2-18、Aβ2-19、Aβ2-20、Aβ3-10、Aβ3-11、Aβ3-12、Aβ3-13、Aβ3-14、Aβ3-15、Aβ3-16、Aβ3-17、Aβ3-18、Aβ3-19、または Aβ3-20 の配列を１個または複数コピー含むペプチドを挙げることができる。例えばAβ42に対するB細胞のエピトープの大半は、N末端の1〜15番目のアミノ酸の領域に集中している(Cribbs, D.H. et al., Int. Immunol. 15(4)：505-14, 2003)ので、Aβペプチドとして、Aβ1-15（配列番号：1の1〜15）またはその断片を含むポリペプチドを好適に用いることができる。断片の長さは、エピトープを含む限り制限はないが、例えば6、7、8、9、10またはそれらのいずれか以上である。例えば、Aβ3-6（EFRH）を含む断片が好適である。より好ましくは、Aβ1-15またはその断片を１個または複数個含むペプチドが用いられ、例えば1〜12個、好ましくは2〜10個、より好ましくは2〜8個、3〜8個、4〜8個含むペプチドが用いられる。複数のAβ1-15またはその断片は、好ましくはリンカーを介してタンデムに連結される。リンカーの配列に特に制限はないが、例えば1〜15アミノ酸、好ましくは1〜8アミノ酸、例えば1〜6アミノ酸の配列であってよく、具体的には例えばK（リジン）、KK、またはKKK、GP（グリシンープロリン）、GPGP、GGS（グリシン−グリシン−セリン）、GGGS、GGGGS、これらの繰り返し、あるいはこれらの任意の組み合わせ等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２６】
本発明においてAB5トキシンとは、多くの病原性バクテリアにおいて共通しているトキシンであって、１つのAサブユニットと５つのBサブユニットからなるトキシンである（Merritt E, and Hol W (1995) "AB5 toxins", Curr Opin Struct Biol 5 (2): 165-71; Lencer W, and Saslowsky D (2005) "Raft trafficking of AB5 subunit bacterial toxins", Biochim Biophys Acta 1746 (3): 314-21）。AB5トキシンを例示すれば、例えば Campylobacter jejuni のエンテロトキシン (enterotoxin)、コレラトキシン (Vibrio cholerae)、易熱性エンテロトキシン (heat-labile enterotoxins) (例えば LT および LT-II) (Escherichia coli)、百日咳毒素 (pertussis toxin) (Bordetella pertussis)、志賀毒素 (shiga toxin) (Shigella dysenteriae)、およびその他の腸管出血性細菌が生産する志賀様毒素またはベロ毒素 (shiga-like toxin または verotoxin) が例示できる。一般にこれらのトキシンの毒性はAサブユニットが担っており、Bサブユニットはペンタマーを形成し、細胞への接着に関与していると考えられている。
【００２７】
本発明において特に好ましいAB5トキシンとしてはコレラトキシンおよび大腸菌易熱性エンテロトキシンが挙げられ、両者は構造的にも機能的にも類似している（Hovey BT et al., J Mol Biol., 1999, 285(3):1169-78; Ricci S. et al., Infect Immun. 2000, 68(2): 760-766; Tinker J.K. et al., Infect Immun. 2005, 73(6): 3627-3635）。コレラトキシンおよび大腸菌易熱性エンテロトキシンの具体的なBサブユニットとしては、accession number ZP_01954889.1, ZP_01976878.1, NP_231099.1, P13811.1, ABV01319.1, P32890、並びに配列番号：14、あるいはそれらの成熟型蛋白質（N末の21アミノ酸を除いたもの；例えば22〜124アミノ酸）を含む蛋白質などが挙げられる。これらをコードする塩基配列としては、NZ_AAWE01000267.1、NC_002505.1、M17874.1、EU113246.1、および M17873.1、あるいはそれらの成熟型蛋白質をコードする配列（例えば 5' の63塩基を除いたもの）を含む配列などが挙げられる。本発明において好適なAB5トキシンBサブユニットとしては、これらのアミノ酸配列または塩基配列がコードするアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらのアミノ酸配列に対して高い類似性を有するものが挙げられる。
【００２８】
なお、AB5トキシンBサブユニットは、天然の配列だけでなく変異を有していてもよい。天然型のBサブユニットを用いた場合と比較して、融合蛋白質の発現量、抗Aβ抗体の誘導能および/またはアルツハイマー病の少なくとも１つ症状の緩和効果を有意に低下させない限り、例えば1または少数（例えば数個、3個以内、5個以内、10個以内、15個以内、20個以内）のアミノ酸が付加、欠失、置換、および/または挿入されたアミノ酸配列を有するBサブユニットを使用することができる。またN末端および/またはC末端の1〜数残基（例えば2、3、4、5、6、10、15または20残基）のアミノ酸が欠失または付加されたポリペプチド、及び1〜数残基（例えば2、3、4、5、6、10、15または20残基）のアミノ酸が置換されたポリペプチドなども使用できる。使用し得るバリアントとしては、例えば天然の蛋白質の断片、アナログ、派生体、及び他のポリペプチドとの融合蛋白質（例えば異種シグナルペプチドまたは抗体断片を付加したもの等）が含まれる。具体的には、野生型のアミノ酸配列の１または複数のアミノ酸を置換、欠失、及び/または付加した配列を含み、Aβ抗原ペプチド単体で発現させる場合に比べ、Aβ抗原ペプチドとの融合蛋白質の発現量、抗Aβ抗体の誘導および/またはアルツハイマー病の少なくとも１つ症状の緩和について、野生型Bサブユニットと同等またはそれ以上にその効果を上昇させる活性を有するポリペプチドは、本発明においてAB5トキシンBサブユニットとして用いることができる。AB5トキシンBサブユニットの改変体は、好ましくはペンタマーを形成する活性を保持する。野生型蛋白質の断片を用いる場合は、通常、野生型ポリペプチド（分泌蛋白質の場合は成熟型の形態）の70％以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90％以上（または95％以上）の連続領域を含む。
【００２９】
アミノ酸配列のバリアントは、例えば天然のポリペプチドをコードするDNAに変異を導入することにより調製することができる（Walker and Gaastra, eds. Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York, 1983); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492, 1985 ; Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382, 1987; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.), 1989; U.S. Pat. No. 4,873,192）。生物学的活性に影響を与えないようにアミノ酸を置換するためのガイダンスとしては、例えばDayhoffら（Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), 1978）が挙げられる。AB5Bとしては、例えば、大腸菌エンテロトキシンLTのR192G変異体（Lemere et al., Neurobiol. Aging 2002, 23: 991-1000; Seabrook et al., Neurobiol. Aging, 2004, 25: 1141-1151; Seabrook et al., Vaccine, 2004, 22: 4075-7083）が含まれる。
【００３０】
改変されるアミノ酸数に特に制限はないが、例えば天然の成熟型ポリペプチドの全アミノ酸の30％以内、好ましくは25％以内、より好ましくは20％以内、より好ましくは15％以内、より好ましくは10％以内、5％以内、3％以内または1％以内であり、例えば15アミノ酸以内、好ましくは10アミノ酸以内、より好ましくは8アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、より好ましくは3アミノ酸以内である。アミノ酸を置換する場合は、側鎖の性質が似たアミノ酸に置換することにより蛋白質の活性を維持することが期待できる。このような置換は、本発明において保存的置換という。保存的置換は、例えば塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸 (例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸 (例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸 (例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸 (例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族アミノ酸 (例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などの各グループ内のアミノ酸間の置換などが挙げられる。また、例えば、BLOSUM62置換マトリックス（S. Henikoff and J.G. Henikoff, Proc. Acad. Natl. Sci. USA 89: 10915-10919, 1992）において、正の値の関係（例えば+1以上、+2以上、+3以上または+4以上）にあるアミノ酸間の置換が挙げられる。
【００３１】
改変された蛋白質は、野生型蛋白質のアミノ酸配列と高いホモロジーを示す。高いホモロジーとは、例えば70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、93%以上、95%以上、または96%以上の同一性を有するアミノ酸配列である。アミノ酸配列の同一性は、例えばBLASTPプログラム（Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990）を用いて決定することができる。例えばNCBI（National Center for Biothchnology Information）のBLASTのウェブページにおいて、デフォルトのパラメータを用いて検索を行うことができる（Altschul S.F. et al., Nature Genet. 3:266-272, 1993; Madden, T.L. et al., Meth. Enzymol. 266:131-141, 1996; Altschul S.F. et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Zhang J. & Madden T.L., Genome Res. 7:649-656, 1997）。例えば２つの配列の比較を行うblast2sequencesプログラム（Tatiana A et al., FEMS Microbiol Lett. 174:247-250, 1999）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、例えば天然型蛋白質（分泌後の成熟型の形態）のアライメントの範囲内のアミノ酸配列全体に対する同一性の値を計算する。具体的には、野生型蛋白質 (分泌蛋白質の場合は成熟型) の全アミノ酸数における一致するアミノ酸数の割合を計算する。
【００３２】
またAB5トキシンBサブユニットは、野生型蛋白質をコードする遺伝子のコード領域の一部または全部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸がコードする蛋白質であって、野生型蛋白質と同等の活性（Aβ抗原ペプチドとの融合蛋白質の発現量、抗Aβ抗体の誘導および/またはアルツハイマー病の少なくとも１つ症状の緩和）を有する蛋白質が挙げられる。該蛋白質は、好ましくはペンタマーを形成する。ハイブリダイゼーションにおいては、例えば野生型蛋白質遺伝子のコード領域の配列またはその相補配列を含む核酸、またはハイブリダイズの対象とする核酸のどちらかからプローブを調製し、それが他方の核酸にハイブリダイズするかを検出することにより同定することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、例えば 5xSSC、7%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5xデンハルト液（１xデンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、及び0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、50℃、好ましくは60℃、より好ましくは65℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度で2xSSC中、好ましくは1xSSC中、より好ましくは0.5xSSC中、より好ましくは0.1xSSC中で、振蘯しながら2時間洗浄する条件である。
【００３３】
AB5トキシンBサブユニットがもともと有しているシグナルペプチド（典型的には最初の21アミノ酸）は、そのままにして組み換え蛋白質と融合させてもよく、あるいは除去するか、例えば真核細胞由来の蛋白質のシグナルペプチドをN末端に付加したり、またはもともとあるシグナルペプチドから置き換えてもよい（実施例参照）。具体的にはimmunoglobulin kappa light chain、interleukin (IL)-2、tissue plasminogen activator (tPA)、アミロイド前駆体タンパク質(APP) などの所望の分泌蛋白質のシグナル配列を用いることができるが、これらに限定されない（accession NP_958817；NM_201414のシグナル配列を参照）。
【００３４】
また融合蛋白質は、タグやリンカー、スペーサーをさらに含むことができる。例えばAβ抗原ペプチドとAB5トキシンBサブユニットは、直接結合していてもよく、リンカー（またはスペーサー）を介して結合していてもよい。リンカー・スペーサーの配列は特に限定はないが、例えば1〜15アミノ酸、好ましくは1〜8アミノ酸、例えば2〜6アミノ酸、例えば約4アミノ酸の配列であってよく、具体的には、KK（リジンーリジン）、GP（グリシンープロリン）、GPGP（グリシン−プロリン−グリシン−プロリン）、GGS（グリシン−グリシン−セリン）、GGGS、GGGGS、これらの繰り返し、あるいはこれらの任意の組み合わせ等が挙げられるが、それらに限定されない。AβペプチドとAB5Bは、通常はAB5BがAβ抗原ペプチドのN末端側、すなわちAβ抗原ペプチドがAB5BのC末端側に位置するように融合される。
【００３５】
例えばマイナス鎖RNAウイルスベクターから融合蛋白質の遺伝子を発現させる場合、遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上流(マイナス鎖の3'側)に付加する転写開始配列の種類により調節することができる(WO 01/18223)。発現レベルは、ゲノム内の外来遺伝子の挿入位置によって制御することができ；マイナス鎖の3'末端の近くに挿入するほど発現レベルが高く；5'末端の近くに挿入するほど発現レベルが低くなる。このように、融合蛋白質をコードする遺伝子の挿入位置は、融合蛋白質の所望の発現量を得るために、または挿入する遺伝子の近傍のウイルスタンパク質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となるように適切に調節することができる。一般に、AB5B-Aβ抗原ペプチド融合蛋白質の高い発現レベルを得ることが有利であると考えられるため、融合蛋白質をコードする核酸を、効率の高い転写開始配列に連結し、それをマイナス鎖ゲノムの3'末端近くに挿入することが好ましい。具体的には、融合蛋白質をコードする遺伝子は、3'リーダー領域と3'末端に最も近いウイルスタンパク質ORFとの間に挿入される。または、該遺伝子は、3'末端に一番近いウイルス遺伝子と2番目の遺伝子のORFの間に挿入してもよい。野生型パラミクソウイルスにおいて、ゲノムの3'末端に最も近いウイルスタンパク質遺伝子はN遺伝子であり、2番目に近い遺伝子はP遺伝子である。または、導入遺伝子の高発現レベルが望ましくない場合、適切な効果が得るために、例えばベクターにおいてマイナス鎖ゲノムのなるべく5'側の位置で外来遺伝子を挿入することによって、または効率の低い転写開始配列を選択することによって、ウイルスベクターからの遺伝子発現レベルを低く抑えることができる。
【００３６】
また本発明のベクターは、AB5B-Aβ抗原ペプチド融合蛋白質をコードする遺伝子を挿入した以外の位置に他の外来遺伝子を保持していてもよい。このような外来遺伝子としては制限はない。例えばベクターの感染をモニターするためのマーカー遺伝子であってもよく、あるいは免疫系を調節するサイトカイン、ホルモン、受容体、抗体、それらの断片、またはその他の遺伝子であってもよい。本発明のベクターは、生体の標的部位への直接(インビボ)投与、または患者由来細胞もしくはそれ以外の細胞にベクターを感染させ、その細胞を標的部位へ注入する間接(エクスビボ)投与のいずれかにより、遺伝子を導入することができる。本発明のベクターは、抗Aβ抗体の効率的な誘導や、アルツハイマー病の治療、進行の防止または抑制のための極めて優れた手段として用いることができる。
【００３７】
組み換えRNAウイルスベクターの再構成は公知の方法を利用して行えばよい。具体的には、（ａ）ウイルスゲノムRNAを含むRNPを構成するウイルス蛋白質の存在下、AB5トキシンBサブユニットとAβ抗原ペプチドとの融合蛋白質をコードするRNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖をコードするRNAを細胞に導入するか、あるいは細胞において転写させる工程、（ｂ）生成したウイルスまたは該ゲノムRNAを含むRNPを回収する工程、により製造することができる。上記のRNPを構成するウイルス蛋白質(viral proteins)とは、典型的には、ウイルスゲノムRNAと共にRNPを形成し、ヌクレオカプシドを構成する蛋白質を言う。これらはゲノムの複製および遺伝子発現に必要な蛋白質群であり、マイナス鎖RNAウイルスにおいては、典型的には、N（ヌクレオキャプシド (またはヌクレオプロテイン (NP) とも言う)）、P（ホスホ）、およびL（ラージ）蛋白質である。ウイルス種によっては、表記は異なることもあるが、対応する蛋白質群は当業者には知られている (Anjeanette Robert et al., Virology 247:1-6 (1998))。
【００３８】
ウイルスベクターの産生には所望の哺乳動物細胞および鳥類細胞などを用いることができるが、具体的には、例えば、サル腎由来のLLC-MK2細胞（ATCC CCL-7）、CV-1細胞 (例えばATCC CCL-70)、ハムスター腎由来のBHK細胞 (例えばATCC CCL-10) などの培養細胞、ヒト由来細胞等が挙げられる。また、鶏卵でウイルスを増幅できる場合には、上記の宿主から得られたウイルスベクターを発育鶏卵に感染させ、大量にウイルスベクターを調製することも考えられる。鶏卵を使ったウイルスベクターの製造方法は既に開発されている（中西ら編,(1993),「神経科学研究の先端技術プロトコールIII, 分子神経細胞生理学」, 厚生社, 大阪, pp.153-172）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ9〜12日間 37〜38℃で培養し、胚を成長させる。ウイルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間（例えば３日間）卵を培養してウイルスベクターを増殖させ、ウイルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのウイルスベクターの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人,「ウイルス実験プロトコール」, 永井、石浜監修, メジカルビュー社, pp.68-73,(1995)）。
【００３９】
粒子形成に必要なウイルス蛋白質は、転写させたウイルスゲノムRNAから発現されてもよいし、ゲノムRNA以外からトランスに供給されてもよい。例えばマイナス鎖RNAウイルスベクターの再構成においては、N、P、およびL蛋白質を、それらを発現する発現プラスミド等を細胞に導入するなどして供給することができる。転写されたゲノムRNAは、これらのウイルス蛋白質の存在下で複製され、機能的RNPまたはビリオンが形成される。ウイルス蛋白質やRNAゲノムを細胞内で発現させるためには、適当なプロモーターの下流に該蛋白質またはゲノムをコードするDNAが連結されたベクターを、宿主細胞に導入する。プロモーターとしては、例えばCMVプロモーター（Foecking, M.K, and Hofstetter H. Gene 1986; 45: 101-105）、レトロウイルスLTR（Shinnik, T. M., Lerner, R. A. & Sutcliffe (1981) Nature, 293, 543-548）、EF1-αプロモーター、CAGプロモーター (Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108: 193-199、特開平3-168087) などが用いられる。
【００４０】
エンベロープ蛋白質などの遺伝子を欠損する欠損型ウイルスを製造する場合は、欠損する蛋白質および/またはその機能を相補できる他のウイルス蛋白質などをウイルス産生細胞において発現させ、産生されるウイルスの感染性を相補することができる。（WO00/70055、WO00/70070、および WO03/025570; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。例えば、ウイルスベクターのゲノムとは由来が異なるウイルスのエンベロープ蛋白質でシュードタイプ化することもできる。このようなエンベロープ蛋白質としては、例えば水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus; VSV）のG蛋白質（VSV-G）（J. Virology 39: 519-528 (1981)）を用いることができる（Hirata, T. et al., 2002, J. Virol. Methods, 104:125-133; Inoue, M. et al., 2003, J. Virol. 77:6419-6429; Inoue M. et al., J Gene Med. 2004;6:1069-1081）。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、マイナス鎖RNAウイルスベクターであれば、例えばF、HN、H、Gなどのスパイク蛋白質遺伝子、Mなどのエンベロープ裏打ち蛋白質遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。スパイク蛋白質遺伝子の欠失は、例えばマイナス鎖RNAウイルスベクターを非伝播性にするために有効であり、また、M蛋白質などのエンベロープの裏打ち蛋白質遺伝子の欠失は、感染細胞からの粒子形成を不能にするために有効である。例えば、F遺伝子欠失型マイナス鎖RNAウイルスベクター（Li, H.-O. et al., J.Virol. 74, 6564-6569 (2000)）、M遺伝子欠失型マイナス鎖RNAウイルスベクター（Inoue, M. et al., J.Virol. 77, 6419-6429 (2003)）などは好適に用いられる。また、F、HN (またはH)、およびMの少なくとも２つの遺伝子の任意の組み合わせを欠損するベクターは、より安全性が保障される。例えば、MおよびF遺伝子両欠失型ベクターは、高レベルの感染性および遺伝子発現能を保ったまま、非伝播性でかつ粒子形成を欠くベクターとなる。
【００４１】
例えばF遺伝子欠失型の組み換えウイルスの製造を具体的に例示すれば、F遺伝子が欠損したマイナス鎖RNAウイルスゲノムまたはその相補鎖を発現するプラスミドを、F蛋白質を発現する発現ベクター、ならびにN、P、およびL蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションする。または、F遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いれば、より効率的にウイルスを製造することができる（WO00/70070）。この場合は、F遺伝子を誘導発現できるように、Cre/loxPやFLP/FRTなどの配列特異的組み換え酵素とその標的配列を用いて、発現を誘導できるようにしておくことが好ましい（WO00/70055 および WO00/70070；Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820参照）。具体的には、例えばCre/loxP誘導型発現プラスミドpCALNdlw（Arai, T. et al., J. Virology 72, 1998, p1115-1121）等の組み換え酵素標的配列を持つベクターにエンベロープ蛋白質遺伝子を組み込む。発現の誘導は、例えばアデノウイルスAxCANCreをMOI 3〜5 で感染させて行う（Saito et al., Nucl. Acids Res. 23: 3816-3821 (1995); Arai, T.et al., J. Virol 72,1115-1121 (1998)）。
【００４２】
また本発明のベクターは、例えばウイルス蛋白質による免疫原性を低下させるために、またはRNAの転写効率または複製効率を高めるために、ベクターに含まれる任意のウイルス遺伝子が野生型遺伝子から改変されていてよい。具体的には、例えばマイナス鎖RNAウイルスベクターにおいては、複製因子であるN、P、およびL遺伝子の中の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、エンベロープ蛋白質の１つであるHN蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン（hemagglutinin）活性とノイラミニダーゼ（neuraminidase）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウイルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、F蛋白質を改変することにより膜融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるF蛋白質またはHN蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用してこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めたウイルスベクターを作製することもできる。さらに、二次放出粒子（またはVLP:virus like particle）放出抑制を目的として、ウイルス遺伝子に温度感受性変異を導入することができる（WO2003/025570）。
【００４３】
ウイルス蛋白質の変異としては、具体的には、SeV P蛋白質の86番目のGlu（E86）の変異、SeV P蛋白質の511番目のLeu（L511）の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖RNAウイルスP蛋白質の相同部位の置換が挙げられる。具体的には、86番目のアミノ酸のLysへの置換、511番目のアミノ酸のPheへの置換などが例示できる。またL蛋白質においては、SeV L蛋白質の1197番目のAsn（N1197）および/または1795番目のLys（K1795）の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖RNAウイルスL蛋白質の相同部位の置換が挙げられ、具体的には、1197番目のアミノ酸のSerへの置換、1795番目のアミノ酸のGluへの置換などが例示できる。P遺伝子およびL遺伝子の変異は、持続感染性、2次粒子放出の抑制、または細胞傷害性の抑制の効果を顕著に高めることができる。また、例えば、M遺伝子については、G69E，T116A，A183Sを、HN遺伝子については、A262T，G264，K461Gの変異導入を行うことができるが、導入可能な変異はこれらに限定されない（詳細はWO2003/025570を参照のこと）。
【００４４】
例えばマイナス鎖RNAウイルスの製造であれば、以下の公知の方法を利用して実施することができる（WO97/16539; WO97/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO01/18223; WO03/025570； WO2005/071092; WO2006/137517; WO2007/083644; WO2008/007581; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997、Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 及び Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404; Tokusumi, T. et al. Virus Res. 2002: 86; 33-38、Li, H.-O. et al., J. Virol. 2000: 74; 6564-6569）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含むマイナス鎖RNAウイルスをDNAから再構成させることができる。
【００４５】
プラス (+) 鎖RNAウイルスの製造方法としては、以下の例が挙げられる。
１）コロナウイルス
Enjuanes L, Sola I, Alonso S, Escors D, Zuniga S.
Coronavirus reverse genetics and development of vectors for gene expression.
Curr Top Microbiol Immunol. 2005;287:161-97. Review.
２）トガウイルス
Yamanaka R, Zullo SA, Ramsey J, Onodera M, Tanaka R, Blaese M, Xanthopoulos KG.
Induction of therapeutic antitumor antiangiogenesis by intratumoral injection of genetically engineered endostatin-producing Semliki Forest virus.
Cancer Gene Ther. 2001 Oct;8(10):796-802.
Datwyler DA, Eppenberger HM, Koller D, Bailey JE, Magyar JP.
Efficient gene delivery into adult cardiomyocytes by recombinant Sindbis virus.
J Mol Med. 1999 Dec;77(12):859-64.
３）ピコルナウイルス
Lee SG, Kim DY, Hyun BH, Bae YS.
Novel design architecture for genetic stability of recombinant poliovirus: the manipulation of G/C contents and their distribution patterns increases the genetic stability of inserts in a poliovirus-based RPS-Vax vector system.
J Virol. 2002 Feb;76(4):1649-62.
Mueller S, Wimmer E.
Expression of foreign proteins by poliovirus polyprotein fusion: analysis of genetic stability reveals rapid deletions and formation of cardioviruslike open reading frames.
J Virol. 1998 Jan;72(1):20-31.
４）フラビウイルス
Yun SI, Kim SY, Rice CM, Lee YM.
Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus.
J Virol. 2003 Jun;77(11):6450-65.
Arroyo J, Guirakhoo F, Fenner S, Zhang ZX, Monath TP, Chambers TJ.
Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever Virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE).
J Virol. 2001 Jan;75(2):934-42.
５）レオウイルス
Roner MR, Joklik WK.
Reovirus reverse genetics: Incorporation of the CAT gene into the reovirus genome.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 3;98(14):8036-41. Epub 2001 Jun 26.
その他のRNAウイルスの増殖方法および組み換えウイルスの製造方法については、ウイルス学実験学 各論、改訂二版（国立予防衛生研究所学友会編、丸善、1982）を参照のこと。
【００４６】
また本発明は、本発明のベクターを含む組成物に関する。本発明の組成物は、医薬（医薬組成物）および試薬が含まれる。該組成物は、本発明のベクターが導入された細胞を含む組成物であってもよい。本発明の組成物の製造においては、ベクターまたは細胞は、必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。薬学的に許容される担体または媒体とは、ベクターまたは細胞を懸濁できる所望の溶液が挙げられ、例えばリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液、培養液等が例示できる。ベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んでよい。また本発明の組成物は、脱イオン水、5%デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤またはその他の添加剤を添加することができる。
【００４７】
また本発明の組成物は、バイオポリマーなどの有機物、ハイドロキシアパタイトなどの無機物、具体的にはコラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコールポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体などを担体として組み合わせることもできる。
【００４８】
本発明のベクター、該ベクターが導入された細胞、およびそれらのいずれかを含む組成物は、Aβ抗原ペプチドの効率的な発現および抗Aβ抗体（Aβに対する液性免疫）の誘導のために用いることができ、また、アルツハイマー病の予防および/または治療のために有用である。本発明のベクターまたは本発明の組成物を直接または間接に（例えば細胞を介して）個体に投与することにより、抗Aβ抗体（Aβに対する液性免疫）の誘導、アルツハイマー病の治療および/または予防を実施することができる。本発明は、本発明のベクターまたは本発明の組成物を直接または間接に投与する工程を含む、抗Aβ抗体（Aβに対する液性免疫）を誘導する方法に関する。また本発明は、本発明のベクターまたは本発明の組成物を直接または間接に投与する工程を含む、アルツハイマー病を治療および/または予防する方法を提供する。また本発明は、本発明のベクター、該ベクターが導入された細胞、または本発明の組成物からなる抗Aβ抗体誘導剤、および、本発明のベクター、該ベクターが導入された細胞、または本発明の組成物からなるAβに対する液性免疫誘導剤に関する。また本発明は、該ベクター、該細胞、および該組成物の、抗Aβ抗体の誘導に用いるための使用、およびAβに対する液性免疫の誘導に用いるための使用を提供する。また本発明は、本発明のベクター、該ベクターが導入された細胞、および本発明の組成物の、アルツハイマー病の予防および/または治療に用いるための使用を提供する。また本発明は、本発明のベクター、該ベクターが導入された細胞、および本発明の組成物の、抗Aβ抗体（Aβに対する液性免疫）を誘導するための薬剤の製造における使用を提供する。また本発明は、本発明のベクター、該ベクターが導入された細胞、および本発明の組成物の、アルツハイマー病の予防および/または治療に用いるための医薬の製造における使用を提供する。また本発明は、本発明のベクターまたは該ベクターが導入された細胞と、薬学的に許容される担体または媒体とを含む組成物を製造する工程を含む、抗Aβ抗体（Aβに対する液性免疫）を誘導するための薬剤の製造方法に関する。また本発明は、本発明のベクターまたは該ベクターが導入された細胞と、薬学的に許容される担体または媒体とを含む組成物を製造する工程を含む、アルツハイマー病の治療薬および/または予防薬の製造方法に関する。また本発明は、本発明のベクター、または該ベクターが導入された細胞を含む、アルツハイマー病の予防および/または治療のための医薬に関する。また本発明は、本発明の組成物からなる、アルツハイマー病の予防および/または治療のための医薬組成物に関する。また本発明は、抗Aβ抗体（Aβに対する液性免疫）の誘導に用いるための薬剤の製造における、AB5トキシンBサブユニットとAβペプチドの融合蛋白質をコードするRNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖（アンチゲノムRNA）、あるいはそれらの少なくともいずれかをコードするDNAの使用に関する。また本発明は、アルツハイマー病の予防および/または治療に用いるための医薬の製造における、AB5トキシンBサブユニットとAβペプチドの融合蛋白質をコードするRNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖（アンチゲノムRNA）、あるいはそれらの少なくともいずれかをコード���るDNAの使用に関する。
【００４９】
ここでアルツハイマー病の治療とは、アルツハイマー病の少なくとも１つの症状を改善することであり、アルツハイマー病の予防とは、アルツハイマー病の少なくとも１つの症状の発症率を低下、および/または発症した場合の症状の程度を低下させることである。これらは個々の個体に必ず効果を発揮するものでなくても、統計学的に有意なものであってよい。例えば血中のAβ量、脳組織等におけるAβの蓄積、あるいは老人斑の数または脳組織内のその面積の割合などを減少させることが挙げられる。本発明のベクターおよび組成物は、Aβの蓄積抑制剤、特に脳組織または血中等におけるAβの蓄積を、本発明の組成物を投与しない場合に比べ抑制する薬剤として有用である。また本発明のベクターおよび組成物は老人斑抑制剤、特に老人斑の数および/または面積の合計を、本発明の組成物を投与しない場合に比べ減少させるための薬剤として有用である。
【００５０】
本発明のベクターは、上述の通り in vivo投与、および細胞を介したex vivo投与において使用することができる。細胞を介してベクターを投与する場合は、適当な培養細胞または接種対象動物から採取した細胞などにベクターを導入する。ベクターを体外（例えば試験管またはシャーレ内）で細胞に導入する場合は、例えば培養液、生理食塩水、血液、血漿、血清、体液など所望の生理的水溶液中でin vitro（またはex vivo）で行う。この時、MOI（多重感染度; 細胞1つあたりの感染ウイルス数）は1〜1000の間にすることが好ましく、より好ましくは2〜500、さらに好ましくは3〜300、さらに好ましくは5〜100である。得られた細胞は、直接、または細胞破砕物（ライセート）として接種することができるが、好ましくは本発明のベクターからAB5B-Aβ抗原ペプチド融合蛋白質を発現する細胞が接種に用いられる。シグナルペプチドを有する融合蛋白質をベクターから発現させ、細胞外に分泌させてもよい。また細胞は、放射線照射、紫外線照射または薬剤処理等により増殖能をなくしてもよい。ベクター導入細胞のライセートを得る場合は、界面活性剤で細胞膜を溶解する方法、凍結・融解をくり返す方法などで作製することができる。界面活性剤としては非イオン性のTriton X-100、Nonidet P-40などが用いられる。より具体的には、ベクターを導入した細胞のライセートは、界面活性剤で細胞膜を溶解する手順または、凍結-融解サイクルの繰り返しを含む手順によって調製することができる。Triton X-100およびNonidet P-40などの非イオン性界面活性剤が、0.1〜1％の濃度範囲で適用され得る。例えばPBSで洗浄した後、遠心によって細胞塊を回収し、TNE緩衝液[25mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、1％ Nonidet P-40]に再懸濁し、氷上で10〜30分間、懸濁液をインキュベートすることで得られる。抗原として使用するタンパク質が細胞質に可溶性である場合、調製したライセートを遠心(10,000×g、10分)し、不要な不溶性画分を沈殿として除去し、得られた上清を免疫に用いることができる。界面活性剤が望ましくない部位に、ライセートを投与する場合、洗浄後、細胞をPBSに再懸濁し、5〜6回の凍結-融解サイクルを繰り返して細胞を破壊することによって、ライセートを調製してもよい。また、界面活性剤をはじめから使用せずに、sonicationにより調製してもよい。ライセートには、本発明のRNAウイルスベクターおよび/またはそのゲノムおよびウイルス蛋白質からなるRNPが含まれていてもよい。
【００５１】
細胞溶解物、ウイルスゲノムRNAを含むRNP、または非感染性ウイルス粒子（ウイルス様粒子 (VLP)）等をトランスフェクションにより細胞や個体に導入する方法を具体的に挙げれば、リン酸カルシウム (Chen, C. & Okayama, H. (1988) BioTechniques 6:632-638; Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745)、DEAE-デキストラン (Rosenthal, N. (1987) Methods Enzymol. 152:704-709)、リポソームやその他の種々のトランスフェクション試薬 (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY))、エレクトロポレーション (Ausubel, F. et al. (1994) In Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, NY), Vol. 1, Ch. 5 および 9) など、当業者に知られる様々な方法が例示できる。エンドソームでの分解を抑制するため、トランスフェクションにおいてクロロキンを加えることもできる（Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015）。トランスフェクション試薬を幾つか例示すれば、DOTMA（Roche）、Superfect Transfection Ragent（QIAGEN, Cat No. 301305）、DOTAP、DOPE、DOSPER（Roche #1811169）、TransIT-LT1 (Mirus, Product No. MIR 2300)、CalPhosTM Mammalian Transfection Kit (Clontech #K2051-1)、CLONfectinTM (Clontech #8020-1) などが挙げられる。エンベロープウイルスはウイルス粒子形成の際に宿主細胞由来の蛋白質を取り込むことが知られており、このような蛋白質は、細胞に導入した際に抗原性や細胞傷害性の原因となることが考えられる（J. Biol. Chem. (1997) 272, 16578-16584）。従って、エンベロープが除去されたRNPを用いることには利点がある（WO00/70055）。
【００５２】
また、AB5B-Aβ抗原ペプチド融合蛋白質をコードするウイルスゲノムRNAを転写する発現ベクター、および該ゲノムRNAの複製に必要なウイルス蛋白質（N、PおよびL蛋白質）をコードする発現ベクターを細胞に導入して、細胞内でウイルスRNPを直接形成させることもできる。ウイルスベクターが導入された細胞をこのようにして作製してもよい。
【００５３】
本発明のベクターの投与量は、疾患の種類、患者の体重、年齢、性別、および症状、投与目的、導入する組成物の投与形態、投与方法、導入する遺伝子などにより異なるが、当業者は適切な投与量を決定すればよい。投与経路は適切に選択することができ、例えば経皮、鼻腔内、経気管支、筋内、腹腔内、および皮下の経路を含むがそれらに限定されない。特に筋肉内投与、皮下投与、経鼻投与（点鼻、スプレー、カテーテルによる投与等を含む）、手掌または足蹠皮内投与、脾臓直接投与、腹腔内投与などが好ましい。接種部位は、一ヵ所または複数ヵ所、例えば2〜15ヶ所であってよい。接種量は、対象動物、接種部位、および接種回数などに応じて適切に調整してよい。ベクターは、約105〜約1011 CIU/ml、より好ましくは約107〜約109 CIU/ml、最も好ましくは約1×108〜約5×108 CIU/mlの範囲内の量で、薬学上許容される担体と組み合わせて投与することが好ましい。ヒト対する1回あたりの投与量は、ウイルス力価に換算して、1×104 CIU〜5×1011 CIU(細胞感染単位)、および好ましくは2×105 CIU〜2×1010 CIUである。細胞を介して接種(エクスビボ投与)する場合、例えばヒト細胞、好ましくは自己の細胞にベクターを導入し、104〜109細胞、および好ましくは105〜108細胞、またはそのライセートを用いることができる。非ヒト動物に接種する場合は、投与量は、例えば目的の動物とヒトとの体重または投与標的部位の容積比(例えば平均値)に基づき、上記の投与量を換算することができる。
【００５４】
投与回数は、1回、または副作用が臨床上許容される範囲内である限り複数回可能である。1日の投与回数についても同様に決定してもよい。単回投与だけでも有意な効果を発揮できるが、ベクターを2回以上導入することにより、より強い効果が得られる。また、他のAβ抗原またはそれを発現するベクターを投与してもよい。
【００５５】
複数回投与する場合、投与の間隔は適宜調整してよい。例えば１週間から数十ヶ月の間隔で接種することができる。より具体的には、1〜60週、2〜60週、3〜30週、4〜20週、5〜10週の間隔で接種してよい。また、複数回接種においては、例えば、本発明のベクター、所望のAβ抗原ぺプチドまたはそれを発現するベクター等を任意に組み合わせることができ、筋注、点鼻、皮内、皮下投与などの所望の接種経路によりブーストを行うことができる。複数回接種する場合、本発明のベクターは、そのいずれかの投与において少なくとも１回投与される。好ましくは、初回免疫または２回目の免疫において、本発明のベクターが投与されるが、それ以外の投与においても、本発明のベクターを投与してよい。また、本発明のベクターの投与は、例えば精製または粗生成Aβペプチド、AB5B-Aβ抗原ペプチド融合蛋白質、それらをコードする所望のベクター、または該ベクターが導入された細胞やその破砕物などの投与と任意に組み合わせてよい。特に、本発明のベクターの複数回投与、あるいは本発明のベクターの投与とAB5B-Aβ抗原ペプチド融合蛋白質の投与との組み合わせが好ましい。融合蛋白質としては、例えば本発明のベクターが導入された細胞のライセートであってもよい。
【００５６】
例えば、初回免疫に本発明のベクターを接種し、２回目の免疫に本発明のベクターまたはAβ抗原ペプチド（Aβまたはその断片、またはそれを含む融合蛋白質など）を接種することは好適である。また、初回免疫にAβ抗原ペプチド（Aβまたはその断片、またはそれを含む融合蛋白質など）を接種し、２回目の免疫に本発明のベクターを接種してもよい。ブーストに用いるAβ抗原ペプチドとしては、例えば本発明のベクターで産生したもの、大腸菌等のバクテリアを用いて産生したもの、動物細胞を用いて産生したものあるいは合成ペプチド等を用いることができる（実施例参照）。
【００５７】
投与対象は、免疫系を有する所望の脊椎動物(ヒトおよび非ヒト脊椎動物)が含まれ、好ましくは鳥類および哺乳動物であり、より好ましくは哺乳動物(ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む)である。具体的には、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類、マウスおよびラットなどのげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、およびイヌなどその他の全ての哺乳動物が含まれる。これらの動物は、例えば効率的な抗Aβ抗体の製造に有用である他、アルツハイマー病モデル動物を使えば、本発明のベクターの治療効果を評価するためにも有用である。アルツハイマー病の治療および/または予防を目的とする場合は、投与対象となる対象は、例えばアルツハイマー病の少なくとも１つの因子を有するか、またはアルツハイマー病の少なくとも１つの症状を呈するまたはその恐れが健常個体よりも高い動物・患者またはそれらに由来する組織や細胞が挙げられ、例えばアルツハイマー病に罹患した個体、Aβレベルが亢進している個体、Aβ沈着が亢進している個体、アルツハイマー病型変異遺伝子を持つ個体、アルツハイマー病モデル動物、あるいはそれらに由来する組織や細胞などである。例えば、APP、PS-1および/またはPS-2等のアルツハイマー病型変異体を発現する動物を好適に使用することができる。具体的には、ロンドン型変異（V717I等）、スウェーデン型変異（K670N, M671L）などのFAD変異を有するAPPを発現するトランスジェニック動物等を用いることができる（Hsiao K et al., Science. 1996;274:99-102; Irizarry M et al., J Neuropath Exper Neurol. 1997;56:965-973; Sturchler-Pierrat C et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94(24):13287-13292; Proc Natl Acad Sci USA 92: 2041-2045, 1995）。
【００５８】
本発明のベクターを投与することにより、Aβ抗原ペプチドを含む融合蛋白質が高発現し、Aβに対する液性免疫（抗Aβ抗体）が誘導される。それにより、アルツハイマー病の少なくとも１つの症状が改善することが期待される。アルツハイマー病の症状としては、例えば脳組織内または血中のAβ蓄積および/または沈着、老人斑の数または脳内の占有面積の割合の増加、ミクログリア活性の亢進、脳、特に老人斑へのミクログリアの浸潤および/または集積、炎症時に活性化される物質、例えば補体の脳内の蓄積、学習および/または記憶力の低下などが挙げられる。特に本発明のベクターの投与により、血中抗Aβ抗体レベルの上昇、および/または脳組織中のAβの減少が期待される。抗Aβ抗体はそれ自体がアルツハイマー病に対して治療効果を有することが知られているので、血中の抗Aβ抗体の上昇は治療効果の指標となる。
【００５９】
Aβに対する液性免疫の誘導は、例えば血漿中の抗Aβ抗体の測定により確認することができる。抗体レベルは、ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)およびオークタロニー法により測定することができる。ELISA法は、例えばマイクロプレートに抗原を吸着させ、抗血清を調製し、調製した抗血清を2倍段階希釈(開始溶液1:1000)し、希釈した抗血清プレートに加え抗原抗体反応を行わせることによって実施すればよい。次いで発色のために、免疫動物の抗体をペルオキシダーゼ酵素標識した異種抗体と反応させ、二次抗体とする。吸光度が最大発色吸光度の1/2である場合、抗体の希釈倍率に基づいて、抗体価を算出することができる。または、オークタロニー法において、寒天ゲル内に抗原および抗体が拡散し、免疫沈降反応の結果として白い沈降線が形成される。沈降線は、免疫沈降反応が生じた場合の抗血清の希釈倍率である抗体価を測定するのに用いることができる。脳組織におけるAβレベルは、例えば脳組織の抽出物を用いて、Biosource ELISA kitあるいはWako ELISA Kitなどを用いて測定することができる。
【００６０】
また本発明は、本発明のベクター、あるいは本発明のベクターまたは該ベクターが導入された細胞を含む組成物を個体に投与する工程、および該個体におけるアルツハイマー病の少なくとも1つの症状を検出する工程を含む、アルツハイマー病に対する予防または治療効果を測定する方法に関する。投与対象としては、アルツハイマー病の少なくとも１つの因子を有するか、またはアルツハイマー病の少なくとも１つの症状を呈するまたはその恐れが健常個体よりも高い個体が挙げられ、例えばアルツハイマー病に罹患した個体、アルツハイマー病モデル動物、Aβレベルが亢進している個体、Aβ沈着が亢進している個体、アルツハイマー型変異遺伝子を持つ個体、その他、アルツハイマー病の少なくとも１つの症状が発症または発症していなくても、発症率が正常個体よりも高い個体が挙げられる。比較対象として、本発明のベクターまたは組成物を投与しない場合と比較してもよい。アルツハイマー病発症前の個体に投与した場合は、投与しない対照個体がアルツハイマー病の少なくとも１つの症状を呈するまで待ち、投与の有無による効果を比較することができる。
アルツハイマー病の症状としては、脳内のAβ量の亢進、Aβ蓄積または沈着、老人斑の出現、老人斑の数、脳組織内の占有率、学習および/または記憶力等を測定することができる。これらの方法により、アルツハイマー病の治療および予防効果のモニタリングが可能である。
【００６１】
Aβ沈着(老人斑)の減少効果は、例えば以下の手順によって測定することができる：脳組織切片を70％ギ酸で処理し、5％H2O2で内因性のペルオキシダーゼを失活させた後、抗Aβ抗体（例えば6E10 (Kim KS, et al. Neurosci. Res. Comm. 7:113, 1988)）と切片を反応させ、ペルオキシダーゼ標識二次抗体を用いてDAB発色を行う。染色後、顕微鏡での観察によりAβ蓄積部分の面積を測定することができる。本発明のベクターを投与しない場合に比べ、蓄積部分の面積の割合が減少すれば、Aβ沈着レベルが減少したと判断できる。または、1-フルオロ-2,5-ビス-(3-ヒドロキシカルボニル-4-ヒドロキシ)スチリルベンゼン(FSB)などのアミロイドに親和性の化合物を静注投与した後、MRIを用いて、生きた対象において老人斑を観察することができる(Higuchi M et al., Nat. Neurosci. 8(4):527-33, 2005; Sato, K. et al., Eur. J. Med. Chem. 39: 573, 2004; Klunk, W. E. et al., Ann. Neurol. 55(3):306-19, 2004)。このような非侵襲的なアミロイドイメージング技術により、本発明のベクターの効果を確認することができる。
【００６２】
本発明はまた、以下の工程を含む、Aβに対する免疫反応を測定する方法に関する：本発明のベクター、該ベクターが導入された細胞、またはそれらのいずれかを含む組成物を、Aβの蓄積および/または沈着を有するまたは起こし得る素因を有する対象に導入する工程、および対象における抗Aβ抗体を検出する工程。Aβの蓄積および/または沈着を起こし得る素因を有する対象とは、正常型の個体に比べ、有意にAβの蓄積および/または沈着の発症率が統計的に高い個体といい、例えばアルツハイマー病モデル動物、アルツハイマー型変異遺伝子を持つ個体などが挙げられる。本発明はまた、以下の工程を含む、Aβの蓄積および/または沈着を測定する方法に関する：本発明のベクター、該ベクターが導入された細胞、またはそれらのいずれかを含む組成物を、Aβ蓄積および/または沈着を有するまたは起こし得る素因を有する対象に投与する工程、および対象におけるAβ蓄積および/または沈着のレベルを検出する工程。必要に応じて、非投与個体と比較し、ベクター投与の効果を決定する。これらの方法により、Aβに対する免疫反応および/またはAβ蓄積・沈着の減少効果のモニタリングが可能である。
【００６３】
また本発明は、本発明のベクター、該ベクターが導入された細胞、またはそれらのいずれかを含む組成物を個体に投与する工程を含む、抗Aβ抗体の誘導、検出、または製造方法に関する。抗Aβ抗体の検出に際しては、該動物が産生する抗Aβ抗体を検出する工程をさらに含む。また抗Aβ抗体の製造方法に関しては、該動物が産生する抗Aβ抗体を回収する工程をさらに含む。投与個体は、免疫系を有する所望の動物が挙げられ、アルツハイマー病を発症した動物や、発症率が上昇した動物に限定されない。例えばヒト化抗体を産生するよう改変された動物（マウス）等に本発明のベクターを投与して、Aβに対するヒト抗体を製造することもできる。本発明のベクターは抗Aβ抗体を強力に誘導できるので、効率的に抗Aβ抗体を生産させることが可能である。得られた抗体は、Aβの検出、単離、精製、およびAβの蓄積を抑制するための治療薬（受動免疫薬）として有用である。
【００６４】
また本発明において、RNAウイルスベクターによるブーストは、抗体価を有意に上昇させることが明らかとなった（実施例11）。これまでRNAウイルスベクターの複数回投与は、宿主の免疫反応の惹起きにより、導入遺伝子の高い発現は得にくいと予想されてきた。しかしながら本発明者らが抗原蛋白質を発現するRNAウイルスベクターによる初回免疫後に再度、抗原蛋白質を発現するRNAウイルスベクターを接種したところ、抗体価は著しく上昇することが判明した。このことは、抗原蛋白質をコードするRNAウイルスベクターの複数回（２回以上）の投与は、導入遺伝子の発現効率から予想されることに反して、抗原に対する抗体価の上昇には極めて有用であることを示している。すなわち本発明は、以下の発明にも関する。
【００６５】
（１）抗原蛋白質をコードするRNAウイルスベクターを２回以上投与する工程を含む、該抗原に対する抗体価を上昇させる方法。
（２）抗原がAB5トキシンBサブユニットとの融合蛋白質である、（１）に記載の方法。
（３）AB5トキシンBサブユニットがコレラトキシンB（CTB）である、（２）に記載の方法。
（４）抗原が、感染症を引き起こす微生物またはウイルス、癌、またはアルツハイマー病の関連抗原である、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（５）抗原がアミロイドβ抗原ペプチドを含む、（４）に記載の方法。
（６）アミロイドβ抗原ペプチドが、Aβ1-15またはその断片を１または複数コピー含む、（５）に記載の方法。
（７）アミロイドβ抗原ペプチドが、Aβ1-15またはその断片を１から８個繋げた構造からなる、（５）に記載の方法。
（８）アミロイドβ抗原ペプチドが、４から８個のAβ1-15を繋げた構造からなる、（５）に記載の方法。
（９）RNAウイルスベクターがマイナス鎖RNAウイルスベクターである、（１）から（７）のいずれかに記載の方法。
（１０）マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、（９）に記載の方法。
（１１）マイナス鎖RNAウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、（９）に記載の方法。
（１２）投与の少なくとも１回が筋肉内投与である、（１）から（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）投与の少なくとも１回が鼻腔内投与である、（１）から（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）疾患の治療に用いられる、（１）から（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）疾患が感染症、癌、またはアルツハイマー病である、（１４）に記載の方法。
（１６）抗原蛋白質をコードするRNAウイルスベクターおよび薬学的に許容される担体を含む、該ベクターを２回以上投与する工程を含む方法により該抗原に対する抗体価を上昇させることに用いるための組成物。
（１７）上記（１）から（１５）のいずれかに記載の方法において用いるための、（１６）に記載の組成物。
（１８）感染症、癌、またはアルツハイマー病の治療のための、（１６）または（１７）に記載の組成物。
（１９）抗原蛋白質をコードするRNAウイルスベクターの、該ベクターを２回以上投与する工程を含む方法により該抗原に対する抗体価を上昇させるための薬剤の製造における使用。
（２０）上記（１）から（１５）のいずれかに記載の方法において使用する薬剤の製造における使用である、（１９）に記載の使用。
（２１）感染症、癌、またはアルツハイマー病の治療において使用する薬剤の製造における使用である、（１９）または（２０）に記載の使用。
【００６６】
ベクターの投与経路、投与量、投与間隔等は適宜選択してよく、例えば本明細書中に具体的に記載した通りである。抗原としては特に限定されず、感染症原因微生物またはウイルス等に由来する抗原、癌抗原、アルツハイマー病抗原（Aβやその断片）などが挙げられる。複数回投与は、２回、３回、４回またはそれ以上であってよい。また、少なくとも一部の抗原が共通する限り、複数回投与において全く同一ではない抗原をコードするベクターを投与してよい。例えば初回免疫にAB5トキシンBサブユニットと融合させた抗原蛋白質をコードするベクターを投与し、ブースト時にAB5トキシンBサブユニットと融合させていない抗原蛋白質をコードするベクターを投与したり、あるいはその逆でもよい。またRNAウイルスベクターである限り、各回の投与において用いるベクターの種類を変えてもよい。好ましくはパラミクソウイルスベクター、より好ましくはセンダイウイルスベクターが用いられる。投与間隔は、特に限定されないが、例えば１週間〜6箇月、2週間〜4箇月、あるいは3週間〜3箇月の間で適宜調整してよい。複数回投与により、抗体価は例えば1.2倍以上、1.3倍以上、1.4倍以上、1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上、または2倍以上に上昇してよい。抗体価は、ELISA等の公知の方法により測定することができる。このようにして、本発明のベクターは、アルツハイマー病の予防または治療用の医薬として用いることができる。
また、本発明のベクターはウイルス様粒子（ＶＬＰ）としても好ましく用いられ、通常知られるウイルス粒子のように用いることもできる。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。【００６８】
[実施例１]  Aβ42遺伝子を搭載したSeVベクターの構築
(1) Aβ42遺伝子のNot Iフラグメントの構築
Aβ42遺伝子はヒトアミロイドβペプチド配列(1-42)(配列番号1)を元に、全長を複数のプライマーでカバーしてPCRで結合した。Aβ42の塩基配列はヒトcodon usageを考慮して最適化し、N端側にはIgκの分泌シグナルを結合させ、C端側にはセンダイウイルスの転写シグナルを付加した構造をしている。（図1, 配列番号2）
構築方法は図2に示した。まずIgκシグナルとAβ42領域の全長をカバーする6種類の長いプライマーF1 (配列番号4), F2 (配列番号5), R1 (配列番号6), R2 (配列番号7), R3 (配列番号8), R4 (配列番号9) を同時に混ぜて、テンプレート入れずにPCRを行い、次にそのPCR産物をテンプレートとして制限酵素EcoRIの認識配列を導入した２つのプライマーF1-1 (配列番号10) とR4-1 (配列番号11) で更にPCRを行った。そして得られたPCR産物を制限酵素EcoRIで切断し、pCI発現プラスミド（Promega社）のEcoRIサイトへサブクローニングし、塩基配列の確認を行い正しい配列のクローンを選択した。
選択したプラスミドをテンプレートにし、NotI認識配列を付加したプライマーNotI-Aβ-F（配列番号12）とセンダイウイルス転写シグナルとNotI認識配列を付加したプライマーNotI-polyA-R（配列番号13）とでPCRを行ない、得られたPCR産物を制限酵素NotIで消化し、目的のAβ42 NotIフラグメント（図1, 配列番号2）を構築した。【００６９】
（2）Aβ42遺伝子搭載センダイウイルスcDNAの構築
F遺伝子欠失型SeVベクター（WO00/70070）のcDNA（pSeV18+NotI/ΔF）をNotIで消化し、そのNotI部位にAβ42 NotIフラグメントを挿入し、Aβ42遺伝子搭載F遺伝子欠失型SeV cDNA（pSeV18+Aβ42/ΔF）を構築した。【００７０】
[実施例２]  Aβ42とCTBの融合遺伝子（CTB-Aβ42）を搭載したSeVベクターの構築
（1）CTB-Aβ42遺伝子のNotIフラグメントの構築
CTB-Aβ42のNotIフラグメントは、ヒトアミロイドβ配列（1-42）の配列のＮ末端側に分泌シグナルを含むコレラトキシンＢサブユニット配列（配列番号14）をGPGPアミノ酸リンカーでつなぎ、Ｃ末端側にセンダイウイルスの転写シグナルを付加した構造をしている(図3, 配列番号15)。更に発現効率を増すためにCTBとAβの塩基配列はヒトのcodon usageに従ってアミノ酸配列を変えずに塩基配列を変更した。
この遺伝子の構築には、全長をカバーする長い複数のプライマーを用いてPCRにより全長を合成した。具体的には、CTB-Aβ領域の全長をカバーする長いプライマーを８種類 [CTB-AβF-1 (配列番号17), F-2 (配列番号18), F-3 (配列番号19), F-4 (配列番号20), R-1 (配列番号21), R-2 (配列番号22), R-3 (配列番号23), R-4 (配列番号24)] 合成し、それら８種類を混ぜてPCRを行うことによりN端からAβ42までに対応するフラグメントを得た。センダイウイルス転写シグナルを含むC端側のフラグメントは、pCIプラスミド (Promega社) をテンプレートにして２種のプライマー CTB-Aβ F1-2 (配列番号25) CTB-Aβ R5-2 (配列番号26) でPCRを行いCTB-Aβ全長のPCRフラグメントを得た。そのPCRフラグメントはTAクローニングによりpGEM-T Easyプラスミド (Promega社) にサブクローニングして、塩基配列を確認し、プラスミドを増幅した。そのプラスミドを制限酵素NotIで消化することにより、目的のCTB-Aβ42 NotIフラグメント (配列番号15) を構築した。【００７１】
（2）CTB-Aβ42遺伝子搭載センダイウイルスcDNAの構築
F遺伝子欠失型SeVベクター（WO00/70070）のcDNA（pSeV18+NotI/ΔF）をNotIで消化し、そのNotI部位にCTB-Aβ42 NotIフラグメントを挿入し、CTB-Aβ42遺伝子搭載F遺伝子欠失型SeV cDNA（pSeV18+CTB-Aβ42/ΔF）を構築した。【００７２】
[実施例３]  Aβ42とIL-4の融合遺伝子を搭載したSeVベクターの構築
（１）Aβ42とIL-4の融合遺伝子のNotIフラグメントの構築
Aβ42遺伝子とマウスIL-4の融合は一部をオーバーラップさせてPCRで結合させる方法で行った。
Aβ42遺伝子はAβ42 EcoRIフラグメント（実施例１：図2）が入ったプラスミドを利用し、マウスIL-4遺伝子（配列番号27）は、マウス(BALB/cA)の脾臓からmRNAを抽出し、IL-4特異的プライマーを用いて逆転写し、PCRで増幅し、クローニングプラスミドにサブクローニングすることによりcDNAの形で取得した。このマウスIL-4 cDNAが組み込まれたプラスミドを構築に用いた。
具体的には、マウスIL-4プラスミドをテンプレートして、2つのプライマー NotI-IL4-F（配列番号29）とプライマー IL4-R（配列番号30）でPCRを行い、一方でAβ42プラスミドをテンプレートとし、プライマーAβ42-F（配列番号31）とプライマー NotI-Aβ42-R（配列番号32）でPCRを行い、IL-4とAβ42のPCRフラグメントを得た。プライマーIL4-RとAβ42-Fは一部がオーバーラップするようデザインされているため、IL-4とAβ42のPCRフラグメントを混ぜてテンプレートとし、プライマー NotI-IL4-Fとプライマー NotI-Aβ42-RでPCRすることで、2つの遺伝子を一つの融合遺伝子として結合させた。このPCRフラグメントをクローニングプラスミドにサブクローニングし、塩基配列を確認後、制限酵素NotIで切断することにより、目的のAβ42とIL-4の融合遺伝子NotIフラグメント（配列番号33）を構築した。【００７３】
（２）Aβ42遺伝子搭載センダイウイルスcDNAの構築
F遺伝子欠失型SeVベクター（WO00/70070）のcDNA（pSeV18+NotI/ΔF）をNotIで消化し、そのNotI部位に上記で作製したmIL4-Aβ42 NotIフラグメントを挿入し、Aβ42遺伝子搭載F遺伝子欠失型SeV cDNA（pSeV18+mIL4-Aβ42/ΔF）を構築した。【００７４】
[実施例４]  センダイウィルスベクターの再構成と増幅
ウィルスの再構成および増幅はLiらの報告（Li, H.-O. et al., J. Virology 74. 6564-6569 (2000), WO00/70070）およびその改良法（WO2005/071092）に従って行った。使用したベクターはF遺伝子欠失型であるので、Cre/loxP発現誘導システムによりF蛋白質を発現するF蛋白のヘルパー細胞を利用した。当該システムはCre DNA リコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現するように設計されたプラスミドpCALNdLw（Arai, T. et al., J. Virol. 72: 1115-1121 (1988)）を利用したものであり、同プラスミドのトランスフォーマントにCre DNAリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウィルス（AxCANCre）をSaitoらの方法（Saito, I. et al., Nucl. Acid. Res. 23, 3816-3821 (1995), Arai, T. et al., J. Virol. 72, 1115-1121 (1998)）で感染させて挿入遺伝子を発現させる。
これらの方法によって、CTB-mCRF, CTB-mET1, CTB-mPYY, CTB-mGLP2, mCRF, mET1, mPYY, mGLP2, Aβ42, CTB-Aβ42, mIL4-Aβ42の各遺伝子を搭載したF遺伝子欠失型SeVベクター（それぞれSeV18+CTB-mCRF/ΔF, SeV18+CTB-mET1/ΔF, SeV18+CTB-mPYY/ΔF, SeV18+CTB-mGLP2/ΔF, SeV18+mCRF/ΔF, SeV18+mET1/ΔF, SeV18+mPYY/ΔF, SeV18+mGLP2/ΔF, SeV18+Aβ42/ΔF, SeV18+CTB-Aβ42/ΔF, SeV18+mIL4-Aβ42/ΔF）を調製した。【００７５】
[実施例５]  Aβ42とPEDIの融合遺伝子を搭載したSeVベクターの構築
（1）Aβ42-PEDI融合遺伝子搭載SeVベクターcDNAの構築
プライマー PEDI-1F (配列番号35)、PEDI-2R (配列番号36)、PEDI-3F (配列番号37)、PEDI-4R (配列番号38)、PEDI-5F (配列番号39)、PEDI-6R (配列番号40)、PEDI-7F (配列番号41)、PEDI-8R (配列番号42)、PEDI-9F (配列番号43)とPEDI-10R (配列番号44) 計10種を用いたPCRでPEDI遺伝子を増幅した。PEDI遺伝子とAβ42を融合してSeVベクターへ搭載するため、Aβ42搭載SeVベクターをTemplateとして、プライマー SeVF6 (配列番号45)とS-PEDI-C (配列番号46)を用いたPCRで得られたFragment 1、同Templateでプライマー PEDI-Ab-N (配列番号47)と SEVR280 (配列番号48)を用いたPCRで得られたFragment 3、PEDI遺伝子をTemplateとして、プライマー PEDI-N (配列番号49)と PEDI-C (配列番号50)を用いたPCRで得られたFragment 2をTemplateとして、オーバーラップPCRでPEDI-Aβ42 NotIフラグメント（配列番号51）が得られ、pSeV18+/ΔFのNotIサイトへ挿入し、PEDI-Aβ42融合遺伝子搭載F欠失型SeVベクターのcDNAが得られた。【００７６】
(2) PEDI-Aβ42搭載F欠失型SeVベクターの再構築
PEDI-Aβ42遺伝子を搭載するSeVベクター（SeV18+PEDI-Aβ42/ΔF）の再構成は、実施例４と同様に、Liらの方法（Li, H.-O. et al., J. Virology 74. 6564-6569 (2000), WO00/70070）およびその改良法（WO2005/071092）に従って行った。【００７７】
[実施例６]   Aβ42発現におけるCTB融合, PEDI融合, IL-4融合の効果の比較： CTB-Aβ42融合蛋白発現SeVベクター、PEDI-Aβ42融合蛋白発現SeVベクターおよびIL-4-Aβ42融合蛋白発現SeVベクターによる発現能比較
（１）  BHK21細胞にSeV18+Aβ42/ΔF、SeV18+IL-4-Aβ42/ΔF、SeV18+PEDI-Aβ42/ΔF、SeV18+CTB-Aβ42/ΔFを感染させ、Aβ42抗原量の評価を行った。BHK21細胞をコラーゲンコートされた6穴プレートに1x106個／wellになるよう播き、MOI 10 になるように無血清培地（VPSFM）で希釈された各SeVベクターを感染させた。1時間後に10% FBS含有GMEMを加え、24時間後に無血清培地（VPSFM）に置換し、48時間後に培養上清と細胞を回収し、細胞破砕液を調製した。【００７８】
（２）ELISAによる測定
Aβ42の測定は和光純薬工業のヒトAβ42 ELISAキット用いた。発現量の評価は、プレートリーダーでの吸光度測定(O.D.450)により行った。
結果を図4に示す。Aβ42はほとんど発現していないのに対し、IL-4-Aβ42、PEDI-Aβ42、CTB-Aβ42は発現が増大している。細胞内における発現量はそれぞれkkAβ42の1395倍、171.5倍、12608倍であった。【００７９】
[実施例７]  Aβ42発現におけるCTB融合の効果：Aβ42単独発現SeVベクターとCTB-Aβ42融合蛋白発現SeVベクターによる発現能比較
コンフルエントになった前日播種したBHK-21細胞（3x105 cells/well播種, 12-well plate）へAβ42単独搭載SeVベクターとCTB-Aβ42搭載SeVベクターをMOI 10で感染させ、1 ml/well VP-SFM培地で37℃, 5% CO2培養し、４日目の培養上清と細胞lysateを回収した。培養上清アセトン沈殿で10倍濃縮し、1x SDS Loading Bufferでサンプルを調製した。細胞Lysateは150μl/wellの1x SDS Loading Bufferを用いて調製した。調製した培養上清と細胞Lysateを98℃, 10min処理した後、Aβ42ペプチドを1-0.5-0.25-0.125ng/laneでコントールとしてSDS-PAGE（15% Wakoゲル使用）/Western blotting（6E10抗体使用）を行い、蛋白定量をした。Aβ42単独搭載SeVベクターによるAβの発現量は、細胞Lysateでは4.4ng/well、上清では7.2x10-3 ng/wellしかなかった。一方、Aβ42-CTB融合遺伝子搭載SeVベクターによるAβ発現量は、細胞Lysateでは2500ng/well、上清では200ng/wellであり、Lysateでは568倍、上清では27778倍と大幅改善されたことがわかった。【００８０】
[実施例８]  Aβ15とCTBの融合遺伝子（CTB-Aβ15）、およびAβ15のタンデムタイプとCTBの融合遺伝子（CTB-Aβ15x2, CTB-Aβ15x4, あるいはCTB-Aβ15x8）を搭載したSeVベクターの構築
（１）CTB-Aβ15遺伝子のNot1フラグメントの構築
CTB-Aβ15遺伝子のNotIフラグメントは、CTB-Aβ42遺伝子をもとに構築した(図5)。
CTB-Aβ42遺伝子NotIフラグメントが入ったプラスミドをテンプレートとし、EcoRV制限酵素サイトを付加した２種類のプライマーAβ15-EcoR-R (配列番号53) およびAβ15-EcoR-F (配列番号54) でinverse PCRを行い、得られたPCR産物を制限酵素EcoRVで切断した。そしてセルフライゲーションすることにより、CTB-Aβ15フラグメントが入ったプラスミドを得た。そのプラスミドを制限酵素NotIで切断することにより、目的のCTB-Aβ15遺伝子のNotIフラグメント (配列番号55) を得た。【００８１】
（２）CTB-Aβ15タンデムタイプ（CTB-Aβ15x2, CTB-Aβ15x4, あるいはCTB-Aβ15x8）遺伝子のNotIフラグメントの構築
CTB-Aβ15タンデム遺伝子のNotIフラグメントは、2つの遺伝子を利用して構築した（図6）。
方法はCTB-Aβ42の入ったプラスミドのAβ42部分を除いて制限酵素サイトを導入し、
その部分にPCRで制限酵素サイトを付加したAβ15タンデムのフラグメントを組み込んだ。
具体的にはCTB-Aβ42のNotIフラグメント（実施例２：配列番号15）が入ったプラスミドをテンプレートとし、制限酵素SmaIサイトを付加した2種のプライマーCTB-SmaI-R(配列番号57)およびCTB-SmaI-F(配列番号58)でinverse PCRを行い、得られたPCR産物をSmaIで切断し、セルフライゲーションすることにより、Aβ42を除去したプラスミドを得た。そしてそのプラスミドのSmaIサイトにAβ15タンデムフラグメントを組み込んだ。
Aβ15タンデムフラグメントの作成方法は、Aβ15の8タンデムNotIフラグメント（配列番号59）が入ったプラスミドを基に作成した。そのプラスミドをテンプレートとし、制限酵素サイトを付加した2種のプライマーAβ15-SmaI-F(配列番号61)およびAβ15-EcoRV-R (配列番号62) でPCRを行うと、Aβ15のリピート数が異なるPCR産物が得られる。それらをTAクローニングして塩基配列確認後に、2種の制限酵素SmaI, EcoRIで切り出すと平滑末端のAβ15タンデムフラグメントが得られる。そのフラグメントをAβ42を除去したプラスミドのSmaIサイトへ組み込んでプラスミドを増幅し、制限酵素NotIで切り出すことにより、目的のCTB-Aβ15x2 NotIフラグメント（配列番号63）, CTB-Aβ15x4 NotIフラグメント（配列番号65）およびCTB-Aβ15x8 NotIフラグメント（配列番号67）を得た。【００８２】
（３）CTB-Aβ15, CTB-Aβ15x2, CTB-Aβ15x4,CTB-Aβ15x8遺伝子搭載センダイウイルスcDNAの構築
F遺伝子欠失型SeVベクター（WO00/70070）のcDNA（pSeV18+NotI/ΔF）をNotIで消化し、そのNotI部位にCTB-Aβ15, CTB-Aβ15x2, CTB-Aβ15x4, CTB-Aβ15x8フラグメントを挿入し、CTB-Aβ15, CTB-Aβ15x2, CTB-Aβ15x4, CTB-Aβ15x8遺伝子搭載F遺伝子欠失型SeV cDNA（pSeV18+CTB-Aβ15/ΔF, pSeV18+CTB-Aβ15x2/ΔF, pSeV18+CTB-Aβ15x4/ΔF, pSeV18+CTB-Aβ15x8/ΔF）を構築した。【００８３】
[実施例９]  Aβペプチド発現能の比較
（1）Western blotting
構築したベクターの感染と発現をウエスタンブロット法により評価した。
SeVベクターを感染させた細胞の破砕液および培養上清は等量のSDS-PAGE用サンプルbufferと混和し、98℃で5分間熱変成した。15%のアクリルアミドゲルでSDS-PAGEを行い、セミドライブロッティング法によりPVDF膜へ転写を行った。5%ミルク/TBS-Tでブロッキングを行い、抗Aβ抗体（6E10）と反応させた後、2次抗体としてHRP標識された抗マウスIgGと反応させ、化学発光基質SuperSignal West Femtoを用いてCCDカメラにより検出を行った。
その結果、CTB-Aβ42、CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、CTB-Aβ15x8のBHK細胞内における発現と培地中への分泌が確認された。CTB-Aβ15x8の発現量はCTB-Aβ42の発現量より多く、CTB-Aβ15x8の培地中へ分泌も、CTB-Aβ42の培地中へ分泌に対して非常に多いことが示された（図7）。【００８４】
（2）GM1-ELISA
ガングリオシドGM1を固相化したプレートを用いてCTBのGM1に対する結合を評価した。
ガングリオシドGM1 (5μg/mL)を96ウェルプレート (Nunc，MaxiSorp plate)の各ウェルに固相化させ、20％ BlockingOne（ナカライテスク）でブロッキングした後、SeVベクターを感染させた細胞の培養上清（20倍〜2百万倍希釈）を加え、HRP標識された6E10抗体と反応させ、TMB発色基質を用いて検出した。結合量の評価はプレートリーダーでの吸光度測定(O.D.450)により行った。
その結果、培地中に分泌されたCTB-Aβ42、CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、CTB-Aβ15x8はGM1に結合し、CTB-Aβ15x8はCTB-Aβ42の10倍、CTB-Aβ15はCTB-Aβ15x8の100倍結合しており、Aβ15の繰り返しが増えるほどGM1に対する結合能が低下していることが示された（図8）。【００８５】
[実施例１０]  構築した各種SeVベクターによる、正常マウスでの抗Aβ抗体惹起能の評価
（1）正常マウス（筋肉内投与CTB-Aβ42とCTB-Aβ15x8の比較）
C57BL/6Nマウス にCTB-Aβ42遺伝子、CTB-Aβ15x8遺伝子、GFP遺伝子を搭載したSeVベクターを各5x107 CIU/headのタイターで筋肉内投与（右後肢）し、抗体価の評価を行った。上記処置14日後、マウスから血液を採取し、血漿中の抗Aβ抗体量を測定した。Aβ1-42ペプチド(5μg/mL)を96ウェルプレート (Nunc，MaxiSorp plate)の各ウェルに固相化させ、20％ BlockingOne（ナカライテスク）でブロッキングした後、マウス血漿を加え（300〜30万倍希釈）、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体を反応させ、TMB発色基質を用いて検出した。Aβ抗体価の評価は、プレートリーダーでの吸光度測定(O.D.450)により行った。標準抗体として抗Aβ抗体（6E10）を用いた。
その結果、CTB-Aβ42遺伝子投与群（n=6）およびCTB-Aβ15x8遺伝子投与群（n=6）においてAβ抗体価が上昇し、ControlであるGFP遺伝子投与群（n=6）ではAβ抗体価の上昇が見られなかった（図9）。CTB-Aβ15x8遺伝子投与群の抗体価はCTB-Aβ42遺伝子投与群の12.23倍であった。【００８６】
（2）正常マウス（筋肉内、皮内、点鼻投与）
C57BL/6Nマウス にCTB-Aβ15x8遺伝子を搭載したSeVベクターを5x106 CIU/headと5x107 CIU/headのタイターで鼻腔内、皮内、筋肉内（右後肢）に投与し、Control群としてGFP遺伝子を搭載したSeVベクターを5x107 CIU/headのタイターで筋肉内投与（右後肢）し、抗体価の評価を行った。上記処置14日後、マウスから血液を採取し、血漿中の抗Aβ抗体量を測定した。
その結果、Control群を除く全ての投与群においてAβ抗体価が上昇した。皮内投与群では他の投与群に比べて抗体価が低く、鼻腔内投与群では同タイターの筋肉内投与群に比べ高い抗体価が得られた（図10）。【００８７】
（3）正常マウス（点鼻投与）
C57BL/6Nマウス にCTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、CTB-Aβ15x8、Control群としてGFP遺伝子を搭載したSeVベクターを5x107 CIU/headのタイターで鼻腔内に投与し、抗体価の評価を行った。
その結果、いずれも投与群においても、Control群に比べて有意に抗体価が上昇した。CTB-Aβ15x8投与群に比べ、CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x4投与群において特に高いAβ抗体価が得られた（図11）。【００８８】
[実施例１１]   構築した各種SeVベクターによる、正常マウスでの抗Aβ抗体惹起におけるブースト効果の評価
（1） 正常マウス（筋注）：精製CTB-Aβ42蛋白によるブースト
C57BL/6Nマウス にCTB-Aβ42遺伝子を搭載したSeVベクターを各5x107 CIU/headのタイターで筋肉内投与（右後肢）し、14、28日後に大腸菌で生産したCTB-Aβ42タンパクをそれぞれ20μg/PBS/head、100μg/PBS/head、100μg/IFA（不完全フロイントアジュバント）/headで筋肉内投与（右後肢）し、抗体価の評価を行った。上記処置14日ごとに、マウスから血液を採取し、血漿中の抗Aβ抗体量を測定した。
その結果、CTB-Aβ42遺伝子で免役し、CTB-Aβ42タンパクを追加免役した群では顕著な抗Aβ抗体上昇が得られた（図12）。2回ブースト後のAβ抗体価は20μgブースト群で32μg/ml、100μgブースト群で107μg/ml、100μg+IFAブースト群で25.9μg/mlであった。【００８９】
（2） 正常マウス（筋注）：SeVベクターによるブースト−１
C57BL/6Nマウス にCTB-Aβ42遺伝子およびCTB-Aβ15x8遺伝子を搭載したSeVベクターを5x107 CIU/headのタイターで筋肉内投与（右後肢）し、56日後に同SeVベクターを同タイターで筋肉内投与（右後肢）し、抗体価の評価を行った。
上記処置14、28日後、マウスから血液を採取し、血漿中の抗Aβ抗体量を測定した。
その結果、CTB-Aβ15x8遺伝子ブースト群において顕著なAβ抗体価の上昇が得られた（図13）。一方、CTB-Aβ42遺伝子ブースト群では、上記のCTB-Aβ15x8遺伝子ブースト群と比べると、Aβ抗体価の上昇は弱かった。【００９０】
（3）正常マウス（筋注）：SeVベクターによるブースト−２
C57BL/6Nマウス にCTB-Aβ15x8遺伝子またはCTB-Aβ42遺伝子を搭載したSeVベクターを5x106 CIU/head および5x107 CIU/headのタイターで筋肉内投与（右後肢）し、56日後に同SeVベクターを同タイターで筋肉内投与（右後肢）し、抗体価の評価を行った。
上記処置14、28日後、マウスから血液を採取し、血漿中の抗Aβ抗体量を測定した。
その結果、両ベクターともブーストの明確な効果が得られたが、CTB-Aβ15x8遺伝子ブースト群において得に顕著なAβ抗体価の上昇が得られた（図14）。【００９１】
（4） 正常マウス（点鼻投与）：SeVベクターによるブースト
C57BL/6Nマウス にCTB-Aβ15x8遺伝子を搭載したSeVベクターを5x106 CIU/head および 5x107 CIU/headのタイターで鼻腔内投与し、56日後に同SeVベクターを同タイターで鼻腔内投与し、抗体価の評価を行った。
上記処置14、28日後、マウスから血液を採取し、血漿中の抗Aβ抗体量を測定した。
その結果、CTB-Aβ15x8遺伝子ブースト群において3/3の割合で顕著なAβ抗体価の上昇が得られた（図15A）。【００９２】
（5）正常マウス（点鼻投与）：SeVベクターによる複数回ブーストおよび抗体価の長期観察（１年間）
C57BL/6Nマウス にCTB-Aβ15x8遺伝子を搭載したSeVベクターを5x106 CIU/head および 5x107 CIU/headのタイターで鼻腔内投与し、84日後、168日後、371日後に同SeVベクターを同タイターで鼻腔内投与し、抗体価の評価を行った。
上記処置14, 28日後、マウスから血液を採取し、血漿中の抗Aβ抗体量を測定した。
その結果、CTB-Aβ15x8遺伝子ブースト群において3/3の割合で顕著なAβ抗体価の上昇が得られ、試験開始後1年後においても20μg/mL以上の抗体価を維持し、１年後のブーストにおいても顕著なAβ抗体価の上昇が得られた（図15B）。【００９３】
[実施例１２]  構築した各種SeVベクターによる、APPモデルマウスでの有効性評価：筋注
（1） 抗Aβ抗体価
アルツハイマー病のモデルマウスであるAPPトランスジェニックマウス（Tg2576）（13ヶ月齢）にSeV18+CTB-Aβ18x5/ΔF（CTB-Aβ15x8とも記す）、又はSeV18+CTB-Aβ42/ΔF（CTB-Aβ42とも記す）、対照群としてGFP遺伝子を搭載したSeVベクター（SeV18+GFP/ΔF；以下、「GFP」とも記す）を5x107 CIU/headで筋肉内投与（右後肢）した。14、28日後、CTB-Aβ42遺伝子投与群の半分に大腸菌で生産したCTB-Aβ42タンパクを筋肉内投与（右後肢）した。SeVベクター投与から14、28、42、56日後に血漿中のAβ抗体価を測定した。
その結果、CTB-Aβ15x8遺伝子投与群において顕著なAβ抗体価の上昇が観察された。CTB-Aβ42遺伝子投与群においてはAβ抗体価がほとんど上昇しない個体が半分存在し、Aβ抗体価の上昇もCTB-Aβ15x8遺伝子投与群に対して低かった。CTB-Aβ42タンパクブースト群においてはブーストによるAβ抗体価の上昇は見られなかった（図16）。【００９４】
（2） 脳内Aβ量：ELISA
上記APPマウスより、SeVベクター投与開始56日後に脳組織を採材し、脳組織左半球中のAβ量をELISAにより測定した。脳組織をTBS中で超音波ホモジナイズし、35,000gで1時間遠心後、上清をAβ可溶性画分として採取、沈殿を10%ギ酸中で超音波ホモジナイズし、1M Trisを用いて中和、Aβ不溶性画分として採取した。和光純薬工業のAβ42 ELISAキットおよびAβ40 ELISAキットを用いて脳内Aβの量を測定した。その結果、不溶性画分中のAβ量はCTB-Aβ15x8遺伝子投与群においてGFP遺伝子投与群に比べ80%程度に低下していた。CTB-Aβ42遺伝子投与群ではAβ量の低下は見られなかった。CTB-Aβ42タンパクブースト群においては若干のAβ量低下が見られた。可溶性画分中のAβ量はCTB-Aβ15x8遺伝子投与群においてGFP遺伝子投与群に比べ50%程度に低下していた。CTB-Aβ42遺伝子投与群ではAβ量の低下は見られなかった。CTB-Aβ42タンパクブースト群におけるAβ量は60〜70%に低下していた（図17）。【００９５】
（３）SeV18+CTB-Aβ15x8/ΔFによる老人斑消失効果
センダイウイルスベクターを筋注投与したマウスから、投与後8週間（15ヶ月齢）の時点で各群を解剖し、右脳半球を病理組織検査用に10%中性緩衝ホルマリン液に浸漬固定し、パラフィン包埋後、脳正中裂より約2mmの部位の脳組織縦断切片を得た。上記切片組織中のAβ蛋白や老人斑を検出するために、70％ギ酸で処理し、5％ H2O2で内因性ペルオキシダーゼ活性を失活させた。抗Aβ抗体(6E10抗体、1000倍希釈)と反応させた後、ペルオキシダーゼ標識二次抗体を加え、DAB発色を行った。また、顕微鏡に連結させた3CCDカメラ用いて撮影し、各例20-30枚の画像ファイルを合成し（図18）、嗅球、大脳新皮質および海馬の各領域におけるAβ蓄積部分の占める面積を画像解析ソフトNIH imageを用いて全例同一条件にて測定した。そして、各測定部位に占めるAβ蓄積部分の面積率を計算した。また、そのときの計測に使用された老人斑の個数も比較した。その結果、図19に示すように、とくに海馬における老人斑面積率が減少傾向を示した。【００９６】
（４）SeV18+CTB-Aβ15x8/ΔF投与の安全性の検討
治療群およびコントロール群から、上記（３）と同様にして投与後8週間経過時（15ヶ月齢）のパラフィン切片のHE染色標本および抗Iba-1抗体（ミクログリア）染色標本を用いて中枢神経系における炎症性細胞浸潤およびミクログリア活性化の有無を確認した。その結果、コントロール群、治療群ともに、脳のいずれの部位においても、炎症細胞浸潤は全く観察されず、本発明のベクターが中枢神経系の炎症を起こさないことが実証された。
また、ミクログリアの活性化は両群の動物の老人斑周囲に観察されたが、ベクター投与群の動物では老人斑が減少する傾向にあったことと平行して、ミクログリアの占める面積率も減少する傾向にあった。【００９７】
[実施例１３]  NP-Aβ融合蛋白搭載SeVベクターのcDNA構築
センダイウイルスのNP蛋白質をN末端側に、Aβペプチド（Aβ15を8つタンデムに連結したもの (Aβ15x8)）をC末端側に持つ融合蛋白質をコードするセンダイウイルスベクターを次のようにして作製した。pSeV18+CTB-Aβ15x8/ΔFをテンプレートとして、プライマー SeVF6（配列番号45）とプライマー NP/Aβ15-R（配列番号72）でPCRを行い、NPフラグメントが得られ、プライマーNP/Aβ15-F（配列番号71）とプライマー NotI-EIS-R（配列番号70）でPCRを行い、Aβ15x8フラグメントが得られた。プライマーNP/Aβ15-FとNP/Aβ15-Rは一部がオーバーラップするようデザインされているため、NPフラグメントとAβ15x8のPCRフラグメントを混ぜてテンプレートとし、プライマー SeVF6とプライマー NotI-EIS-RでPCRすることで、2つの遺伝子を一つの融合遺伝子として結合させた。このPCRフラグメントをクローニングプラスミドにサブクローニングし、塩基配列を確認後、制限酵素NotIで切断することによって得られたNP-Aβ15x8の融合遺伝子NotIフラグメントをpSeV18+/ΔFのNotIサイトへ組み込み、目的のNP-Aβ融合蛋白搭載SeVベクターのcDNA (pSeV18+(NP-Aβ15x8)/ΔF)を得た。
NotI-EIS-R: 5’- ACCTGCGGCCGCGAACTTTCACCCTAAGTTTTTC (34mer)（配列番号70）
NP/Aβ15-F: 5’- GAATCGGCCCCGGCCCCGACGCCGAGTTCAGACAC (35mer)（配列番号71）
NP/Aβ15-R: 5’- GCGTCGGGGCCGGGGCCGATTCCTCCTATCCCAGC (35mer)（配列番号72）【００９８】
[実施例１４]  CTB-Aβ蛋白の使用効果(単独使用或はSeVベクターとの併用)
（1）正常マウスでの抗Aβ抗体価の誘導
C57BL/6Nマウス（8w、メス）を用いてCTB-Aβ蛋白による抗Aβ抗体価の誘導に関して検討を行った。CTBをN末端側に、Aβ15を4つタンデムにKKリンカー（リジン-リジン）でつないだペプチドをC末端側に持つ融合蛋白質（CTB-Aβ15x4KK）をコードする遺伝子断片をpSeV18+/ΔFのNotIサイトへ組み込み、SeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔFを作製した。また大腸菌を用いてCTB-Aβ15x4KKを合成した。これらのベクターおよび融合蛋白質を用いて実験を行った。Group A (6匹)がSeV18+GFP/ΔFを5x107 CIU/200μl/headで筋注投与してから、8週目に同ベクター同様に投与した。Group B(6匹)がSeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔFを5x107 CIU/200μl/headで筋注投与してから、8週目に同ベクター同様に投与した。Group C(6匹)がSeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔFを5x107 CIU/200μl/headで筋注投与してから、2週目一回計5回CTB-Aβ15x4KK蛋白を100μg/100μl/headで皮下投与した。Group D(6匹)がCTB-Aβ15x4KK蛋白を100μg/100μl/headで皮下投与してから、2週目一回計5回CTB-Aβ15x4KK蛋白を100μg/100μl/headで皮下投与した。最初投与前（0W）と投与後２週ごと（2W-4W-6W-8W-10W-12W）マウスから採血し、採血した血清を用いて抗Aβ抗体価を測定した。
その結果、図20に示したように、CTB-Aβ15x4kk蛋白をSeVと併用（Group C）した場合、SeVのみ（Group B）と比べて非常に高い抗Aβ抗体価を誘導した。また、蛋白単独使用（Group D）でも高い抗Aβ抗体価の誘導ができた。【００９９】
（２）PDGF-APPV717Iモデルマウスでの抗Aβ抗体価の誘導
アルツハイマー病モデルマウスPDGF-hAPPV717I（中国医科学院実験動物研究所提供、メス、12ヶ月齢、7〜9匹/Group）を用いて、Group A が未処置として、Group BがSeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔFを5x107 CIU/10μl/headで点鼻投与してから、8週目に同ベクターを同様に投与した。Group CがSeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔFを5x107 CIU/10μl/headで点鼻投与してから、2週目一回計7回CTB-Aβ15x4KK蛋白(大腸菌から生産)を100μg/15x2μl/headで点鼻投与した。Group DがCTB-Aβ15x4KK蛋白を100μg/15x2μl/headで点鼻投与してから、2週目一回計7回CTB-Aβ15x4KK蛋白を100μg/15x2μl/headで点鼻投与した。最初投与前（0W）と投与後（2W-8W-12W-16W）マウスから採血し、採血した血清を用いて抗Aβ抗体価を測定した。
その結果、図21に示したように、CTB-Aβ15x4KK蛋白Boost（Group C）による抗Aβ抗体の誘導が見られた。また、蛋白単独使用（Group D）でも抗Aβ抗体価の誘導もできた。【０１００】
（３）Tg2576マウスを用いた評価
アルツハイマー病モデルマウスTg2576（TACONIC社提供、メス、12か月齢、14〜16匹/Group）を用いて、Group A が未処置として、Group BがSeV18+GFP/ΔFを5x107 CIU/200μl/headで点鼻投与してから、12週目に同ベクター同様に投与した。Group CがSeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔFを5x107 CIU/10μl/headで点鼻投与してから、1週目一回計4回、その後2週目一回計５回、CTB-Aβ15x4KK蛋白を100μg/100μl/headで皮下投与した。最初投与前（0W）と投与後（4W-8W-12W-16W）マウスから採血し、採血した血清を用いて抗Aβ抗体価を測定した。最後、マウスを解剖し、左脳を10%ホルマリン固定液で固定し、脳切片を免疫染色(FSB染色と6E10染色)を行った。また、右脳を凍結保存し、後ほど脳内Aβを抽出し、ELISAで脳内Aβを定量した。
その結果、図22に示したように、未処置Group Aとコントロールベクター投与Group Bと比べてワクチン（SeV + 蛋白）投与したGroup Cが高い抗Aβ抗体価を誘導した。また、図23に示した免疫染色結果のように、未処置（Group A）或はコントロールベクター投与（Group B）と比べて、ワクチン投与したGroup Cにおいて有意的な老人斑面積の減少が認められた。最後、図24に示した脳内Aβ定量ELISA結果のように、未処置と比べて、ワクチン投与したGroup Cにおいて不溶性Aβ42画分が有意的な減少が認められた。【０１０１】
[実施例１５]  各種ベクターによる抗Aβ抗体の誘導
PDGF-hAPPV717Iモデルマウス（中国医科学院実験動物研究所提供、オス、12ヶ月齢、8〜9匹/Group）を用いて、Group A では、GFPを発現するアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター AAV-GFPを5x1010 particles/200μl/headで筋注投与してから、8週目に同ベクター同様に投与した。Group B では、CTB-Aβ融合蛋白質を発現するAAVベクター AAV-CTBAβ42を5x1010 particles/200μl/headで筋注投与してから、8週目に同ベクター同様に投与した。Group CがSeV18+GFP/ΔFを5x107 CIU/200μl/headで筋注投与してから、8週目に同ベクター同様に投与した。Group DがSeV18+(CTB-Aβ42)/ΔFを5x107 CIU/200μl/headで筋注投与してから、8週目に同ベクター同様に投与した。Group EがSeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔFを5x107 CIU/200μl/headで筋注投与してから、8週目に同ベクター同様に投与した。Group FがSeV18+CTB-Aβ15x4KK/ΔFを5x107 CIU/10μl/headで点鼻投与してから、8週目に同ベクター同様に投与した。最初投与前（0W）と投与後（2W-8W-12W-16W）マウスから採血し、採血した血清を用いて抗Aβ抗体価を測定した。
その結果、図25に示したように、CTB-Aβ42搭載のSeVベクターが同CTB-Aβ42を搭載したAAVベクターと比べて僅かながら高い抗Aβ抗体価を誘導したが、CTB-Aβ15x4KK搭載SeVベクター（Group E,F）になると、前の２者（Group B,D）より驚くほど高い抗Aβ抗体価の誘導ができた。【０１０２】
[実施例１６]  非感染性ウイルスベクター(VLP)による抗Aβ抗体の誘導
C57BL/6Nマウス（8w、メス）を用いて非感染性ウイルスベクター(VLP)による抗Aβ抗体の誘導に関して検討を行った。Group A (6匹)がSeV18+GFP/ΔFを5x107 CIU/200μl/headで筋注投与してから、1週目に一回計４回、その後２週目に一回、同ベクター同様に投与した。Group B(6匹)が非感染性粒子であるSeV18+(NP-Aβ15x8)/ΔF-VLPを150μg/200μl/headで筋注投与してから、1週目に一回計４回、その後２週目に一回、同ベクター同様に投与した。最初投与前（0W）と投与後（2W-4W-6W-8W）マウスから採血し、採血した血清を用いて抗Aβ抗体価を測定した。
その結果、図26に示したように、VLPの投与（Group B）によって抗Aβ抗体価の誘導ができた。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明により効果的に抗Aβ抗体を誘導することが可能となる。本発明を用いてアルツハイマー病のワクチン療法を実施すれば、有効な治療法のなかったアルツハイマー病型痴呆患者を救済するだけでなく、高齢者の生活向上や介護問題の大きな改善、医療費の削減など多くの社会的貢献が期待される。早期診断と効果の高い本発明のワクチン療法を組み合わせて、発症初期に根治的治療を提供することにより、本人、家族ならびに社会的負担を大きく軽減できることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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