(57)【要約】  ＣａＳＲアゴニスト活性を有する多くのバリエーション化合物を探索してより優れたコク味付与作用、特に先味型のコク味付与作用を有し、かつ安定性に優れ簡便かつ低コストで生産することが可能なコク味を付与するこのできる物質を見出し、該物質からなるコク味付与剤、及び該物質と他のＣａＳＲアゴニスト活性を有する物質からなる複合コク味付与剤を提供する。γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ（Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−２−アミノ酪酸）からなるコク味付与剤、及び該物質に他のＣａＳＲアゴニスト活性を有する物質を併用してなる複合コク味付与剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕからなるコク味付与剤。
【請求項２】
（ａ）γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕに、
（ｂ）γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｙ（Ｙはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｏｒｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｙ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、Ｃｙｓ−Ｍｅｔ、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ2、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ｏｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔａｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ、γ−Ｇｌｕ−ｔ−Ｌｅｕおよびγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）からなる群より選択される１種又は２種以上のアミノ酸又はペプチド、を併用してなる複合コク味付与剤。
【請求項３】
γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを１０００重量ｐｐｍ以上含有する調味料。
【請求項４】
γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを２５００重量ｐｐｍ以上含有する請求項３記載の調味料。
【請求項５】
１０００重量ｐｐｍ以上のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを含有する飲食品原料を別の飲食品原料に添加する工程、及び、必要に応じて、得られる飲食品原料混合物をさらに調理する工程を含む、飲食品又は飲食品の製造中間品の製造方法。
【請求項６】
γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを含有する飲食品原料を別の飲食品原料に添加する工程が、飲食品の製造中間品のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ濃度を４００〜５０００００重量ｐｐｍとする工程を含む、請求項５記載の飲食品又は飲食品の製造中間品の製造方法。
【請求項７】
飲食品の製造中間品を別の飲食品原料に添加して、飲食品のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ濃度を２０〜２００重量ｐｐｍとする工程をさらに含む、請求項６記載の飲食品の製造方法。
【請求項８】
γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを含有する飲食品原料を別の飲食品原料に添加する工程が、飲食品のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ濃度を２０〜２００重量ｐｐｍとする工程を含む、請求項５記載の飲食品の製造方法。
【請求項９】
飲食品が低塩食品である、請求項５〜８いずれか１項に記載の飲食品の製造方法。
【請求項１０】
更に、乳酸、クエン酸、リンゴ酸およびコハク酸から選択される少なくとも１の有機酸もしくはその塩を、飲食品中の濃度が０．００５〜０．１重量％となるように飲食品原料に添加する工程を含む、請求項９の製造方法。
【請求項１１】
請求項５〜１０のいずれかに記載の方法により得られる飲食品又は飲食品の製造中間品。
【請求項１２】
飲食品又は飲食品の製造中間品であって、該飲食品又は飲食品の製造中間品基準で、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ：２０〜２００重量ｐｐｍ、乳酸、クエン酸、リンゴ酸およびコハク酸から選択される少なくとも１の有機酸もしくはその塩０．００５〜０．１重量％、および、食塩０．０１〜０．５重量％、ならびに、飲食品的に許容しうる担体、及び／又は、１もしくは２以上の調味原料を含有する、前記飲食品又は飲食品の製造中間品。
【請求項１３】
４００重量ｐｐｍ以上のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを含有する組成物を飲食品に添加する工程を有する、飲食品の呈味増強方法。
【請求項１４】
呈味増強が、コク味付与である、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣａＳＲアゴニスト活性を示すペプチドからなるコク味付与剤及び複合コク味付与剤に関する。又、本発明はＣａＳＲアゴニスト活性を示すペプチドを一定濃度以上含有する調味料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の多様化等により味覚に対する消費者の要求が高まってきており、これに伴い、甘味、塩味、酸味、苦味、うま味で表される５基本味だけでは表すことのできない、厚み・ひろがり・持続性・まとまりなど上記基本味の周辺の味をも増強した味覚である「コク味」を付与することのできる優れたコク味付与剤へのニーズが高まっている。
一方、カルシウムセンシング受容体（Calcium Sensing Receptor：ＣａＳＲ）は、カルシウム受容体とも呼ばれるが、当該受容体シグナルは種々の生体内機能を調節し、ＣａＳＲアゴニスト活性を有する物質はコク味付与剤として用いることができる（特許文献１、３、非特許文献４）。【０００３】
上記の「コク味」には種々の呈味パターンが存在するが、特に呈味パターンが先味型であるコク味を付与することのできるコク味付与剤へのニーズは高い。またコク味を付与する物質は通常、食品等に用いられるため、安定性に優れることが求められる。さらに、コク味を付与する物質は、より簡便かつ低コストで生産することができることが産業上望まれる。【０００４】
従って、ＣａＳＲアゴニスト活性を有する多くのバリエーション化合物を探索し、より優れたコク味付与作用、特に先味型のコク味付与作用を有し、かつ安定性に優れ簡便かつ低コストで生産することが可能なコク味を付与するこのできる物質を見出し、該物質からなるコク味付与剤、及び該物質を他のＣａＳＲアゴニスト活性を有する物質と併用してなる複合コク味付与剤を提供することが求められている。
一方、γ−グルタミンをＮ末端に有するいくつかのγ−グルタミルペプチドについては、酵素活性の研究等において基質として合成された例は知られているが（特許文献２、非特許文献１〜３）、γ-Ｇｌｕ−Ａｂｕがコク味付与剤や調味料として用いられたり食品用途に用いられた例は知られていない。尚、特許文献１及び３の内容は、本明細書の記載に含まれるものとする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００７／０５５３９３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００７／０６６４３０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００８／１３９９４５号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Molecular Pharmacology (1982), 21(3), 629-36
【非特許文献２】Agricultural and Biological Chemistry (1981), 45(12), 2839-45
【非特許文献３】Journal of Biological Chemistry (1979), 254(12), 5184-90
【非特許文献４】Journal of Biological Chemistry, (2010), 285 (2), 1016-22
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＣａＳＲアゴニスト活性を有する多くのバリエーション化合物を探索してより優れたコク味付与作用、特に先味型のコク味付与作用を有し、かつ安定性に優れ簡便かつ低コストで生産することが可能なコク味を付与するこのできる物質を見出し、該物質からなるコク味付与剤、及び該物質を他のＣａＳＲアゴニスト活性を有する物質と併用してなる複合コク味付与剤を提供することを課題とする。更に、一定濃度以上の該物質を含有する調味料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、種々の化合物を探索した結果、驚くべきことに、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ（Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−２−アミノ酪酸）が高いＣａＳＲアゴニスト活性と極めて優れたコク味付与効果を有し、特にその呈味パターンが先味型であるコク味を付与することができることを見出した。さらに、見出されたγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕが、同様のジペプチドであるγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓと比較して安定性に優れ、かつより先味が強いという好ましい呈味パターンを示すことを見出した。さらに、見出されたγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕが、単独で有用なコク味付与剤となりえ、また該物質を他のＣａＳＲアゴニスト活性を有する物質と併用してなる複合コク味付与剤となりうることを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕからなるコク味付与剤を提供する。また、本発明は、（ａ）γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕに、（ｂ）γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｙ（Ｙはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｏｒｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｙ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、Ｃｙｓ−Ｍｅｔ、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ2、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ｏｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔａｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ、γ−Ｇｌｕ−ｔ−Ｌｅｕおよびγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）からなる群より選択される１種又は２種以上のアミノ酸又はペプチド、を併用してなる複合コク味付与剤を提供する。
また、本発明は、（ａ）γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕに、（ｂ）γ−Ｇｌｕ−Ｘ−ＯＣＨ（Ｚ）ＣＯ2Ｈ（Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表し、ＺはＨ（水素原子）又はＣＨ3（メチル基）を表す）、または、前記式γ-Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｙ（ＹはＧｌｙＡまたはＬａｃＡ）から選択される１種又は２種以上のペプチドを併用してなる複合コク味付与剤を提供する。
更に本発明は、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを１０００重量ｐｐｍ以上、好ましくは２０００重量ｐｐｍ以上、より好ましくは２５００重量ｐｐｍ以上含有する調味料（以下、「本発明の調味料」ともいう。）を提供する。
また、本発明は、１０００重量ｐｐｍ以上、好ましくは２０００重量ｐｐｍ以上、より好ましくは２５００重量ｐｐｍ以上のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを含有する飲食品原料を別の飲食品原料に添加する工程、及び、必要に応じて、得られる飲食品原料混合物をさらに調理する工程を含む、飲食品又は飲食品の製造中間品の製造方法及び該製造方法により得られる飲食品又は飲食品の製造中間品を提供する。
また、本発明は、飲食品又は飲食品の製造中間品であって、該飲食品又は飲食品の製造中間品基準で、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ：２０〜２００重量ｐｐｍ、乳酸、クエン酸、リンゴ酸およびコハク酸から選択される少なくとも１の有機酸もしくはその塩０．００５〜０．１重量％、および、食塩０．０１〜０．５重量％、ならびに、飲食品的に許容しうる担体、及び／又は、１もしくは２以上の調味原料を含有する、飲食品又は飲食品の製造中間品を提供する。
また、本発明は、４００重量ｐｐｍ以上好ましくは１０００重量ｐｐｍ以上、より好ましくは２０００重量ｐｐｍ以上、更に好ましくは２５００重量ｐｐｍ以上のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを含有する組成物を飲食品に添加する工程を有する、飲食品の呈味増強方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、極めて優れたコク味付与作用、特に呈味パターンが、図１に示されるようなプロフィールを有するユニークな先味型の優れたコク味付与作用を有し、かつ安定性に優れ簡便かつ低コストで生産することが可能なコク味付与剤、及び複合コク味付与剤を提供することができる。又、本発明によれば、優れたコク味付与作用を有する物質を一定濃度以上含有する、優れた調味料を提供することができる。
本発明のコク味付与剤を用いると、その呈味パターンが食塩の呈味パターンに類するため、減塩食品の呈味に塩味様濃厚感及び先味・パンチを付与できるので、食品中の食塩の含有量を低下させても、元の食品と同様の塩味感を保持でき、健康志向の高い食品にすることができる。このような食品としては、各種スープや各種ソースなどがあげられる。特に、本発明のコク味付与剤を含有する食品を喫食すると、食べたとたんに、塩味様濃厚感及び先味・パンチを感じることができるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、先味型のコク味付与剤の味覚プロフィール（呈味パターン）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のコク味付与剤はγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕからなるが、味の観点から本質的にγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕからなれば良く、味に関して実質的に影響を与えない程度の他成分の含有は許容される。
本発明のコク味付与剤、すなわち、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕは、グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）などのアミノ酸類、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）などの核酸類、塩化ナトリウムなどの無機塩類、クエン酸などの有機酸類、種々の酵母エキスなどから選択される少なくとも１種の他の調味原料と組み合わせて用いることにより、他の調味原料を単独で用いる場合に比べて、よりコク味の増した、好ましい調味料を提供することができる。γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを上記の他の調味原料と組み合わせて用いる場合の濃度は、当業者であれば官能評価等の検討を経て適宜設定することができる。
本発明の調味料、すなわちγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを１０００重量ｐｐｍ以上含有する調味料も同様に、他の調味原料と組み合わせて用いることにより、より好ましい別の調味料を提供することができる
【００１３】
本発明において「コク味」とは、甘味（sweet taste）、塩味（salty taste）、酸味（sour taste）、苦味（bitter taste）、うま味（umami）で表される５基本味（five basic tastes）では表すことのできない味を意味し、基本味だけでなく、厚み（thickness）・ひろがり（growth（mounthfulness））・持続性（continuity）・まとまり（harmony）など基本味の周辺の味（marginal tastes）をも増強した味をいう。また、「コク味付与」とは、甘味、塩味、酸味、苦味、うま味で表される５基本味の増強と、それに伴う厚み・ひろがり・持続性・まとまりなど基本味の周辺の味を付与することをいう。また、これを呈味増強作用と表現することもできる。したがって、本発明のコク味付与剤であるγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕは、呈味増強剤（Flavor Enhancer）と表現することもできる。本発明のコク味付与剤であるγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕは、甘味増強剤、塩味増強剤、酸味増強剤、苦味増強剤またはうま味増強剤としても使用することができる。また、味覚は喫食後の時間経過とともに変化するが、喫食直後から順に、先味（initial taste）、中味（middle taste）及び後味（after taste）と呼ぶ。これらは相対的な概念であるが、概して、先味、中味及び後味は、それぞれ喫食後０から２秒まで、２秒から５秒まで、及び５秒以降に感じる呈味である。また、０から５秒までを「先中味」といい、２秒以降約３０秒前後までを「中後味」とする（図１参照）。３区分に分けた評価について、喫食者の評価への集中が困難なため、ふつう２区分に分けた評価を常用する。
コク味及び呈味パターンに対するＣａＳＲ活性を有する物質の効果は、ヒトによる味覚試験などの方法によって確認することができる。このようなヒトによる味覚官能試験としては例えば本願明細書の実施例で示される試験が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
本明細書において、「ＣａＳＲ」とは、カルシウムセンシング受容体（Calcium Sensing Receptor）を意味し、７回膜貫通型受容体のクラスＣに属するものであり、カルシウム受容体とも呼ばれる。本明細書において「ＣａＳＲアゴニスト」とは、上記ＣａＳＲに結合し、ＣａＳＲを活性化する物質を意味する。また、本明細書において、「ＣａＳＲを活性化する」とは、ＣａＳＲにリガンドが結合し、グアニンヌクレオチド結合タンパク質を活性化して、シグナルを伝達することを意味する。また、ＣａＳＲに結合し、ＣａＳＲを活性化する性質を「ＣａＳＲアゴニスト活性」という。
【００１５】
ＣａＳＲアゴニスト活性を有する化合物をスクリーニングする方法を具体的に示すが、これらのステップに限定されるものではない。
１）ＣａＳＲ活性を測定するためのＣａＳＲ活性測定系に被検物質を添加して、ＣａＳＲ活性を測定する。
２）被検物質を添加したときのＣａＳＲ活性と、被検物質を添加しなかったときのＣａＳＲ活性を比較する。
３）被検物質を添加したときにＣａＳＲアゴニスト活性を示す被検物質を選択する。
【００１６】
ＣａＳＲ活性の測定は、例えば、ＣａＳＲを発現する細胞を用いた測定系を用いて行うことができる。上記細胞は、ＣａＳＲを内在的に発現する細胞であっても、外来的にＣａＳＲ遺伝子を導入した組み換え細胞であってもよい。上記ＣａＳＲ活性測定系は、上記ＣａＳＲを発現する細胞に、ＣａＳＲに特異的な細胞外リガンド（活性化物質）を加えたときに、活性化物質とＣａＳＲとの結合（反応）を検出することができるか、又は、活性化物質とＣａＳＲとの結合（反応）に応答して細胞内に検出可能なシグナルを伝達するものであれば、特に制限なく用いることができる。被検物質との反応によりＣａＳＲ活性が検出された場合、当該被検物質はＣａＳＲ刺激活性を有すると判定される。
【００１７】
上記ＣａＳＲとしては、GenBank Accession No. NM_000388で登録されているヒトＣａＳＲ遺伝子によってコードされるヒトＣａＳＲが好ましく例示できる。尚、ＣａＳＲは、上記配列の遺伝子によってコードされるタンパク質に制限されず、ＣａＳＲ機能を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有する遺伝子によってコードされるタンパク質であってもよい。なお、ＣａＳＲ機能はこれらの遺伝子を細胞に発現させ、カルシウム添加時の電流の変化や細胞内カルシウムイオン濃度の変化を測定することによって調べることができる。
上記ＣａＳＲは、その由来は特に制限されず、上記ヒトのＣａＳＲのみならず、マウス、ラット、イヌなどを含むあらゆる動物由来のＣａＳＲが挙げられる。
【００１８】
上述の如く、ＣａＳＲ活性は、ＣａＳＲ又はその断片を発現した生きた細胞、ＣａＳＲ又はその断片を発現した細胞膜、ＣａＳＲ又はその断片のタンパク質を含むインビトロの系などを利用して確認することができる。
以下に生きた細胞を用いた一例を示すが、これに限定されるものではない。
ＣａＳＲは、アフリカツメガエル卵母細胞やハムスター卵巣細胞やヒト胎児腎臓細胞等の培養細胞に発現させる。これは外来遺伝子を保持するプラスミドにＣａＳＲ遺伝子をクリーニングしたものを、プラスミドの状態もしくはそれを鋳型にしたｃＲＮＡを導入することで可能となる。反応の検出には電気生理学的手法や細胞内カルシウム上昇の蛍光指示試薬を用いることができる。
ＣａＳＲの発現は、初めにカルシウムもしくは特異的活性化剤による応答で確認する。５ｍＭ程度の濃度のカルシウムに対して、細胞内電流が観察された卵母細胞もしくは蛍光指示試薬の蛍光が観察された培養細胞を使用する。カルシウムの濃度を変えて濃度依存性を測定する。次に、被検物質を１μＭ〜１ｍＭ程度に調製し、卵母細胞もしくは培養細胞に添加し、上記被検物質存在下でのＣａＳＲ活性を測定することで、上記被検物質のＣａＳＲアゴニスト活性を測定する。
又、より具体的には、ＣａＳＲアゴニスト活性試験としては例えば本願明細書の試験例で示される試験が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明の複合コク味付与剤においてγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕと併用されるアミノ酸又はペプチドは、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕと、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｙ（Ｙはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｏｒｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｙ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、Ｃｙｓ−Ｍｅｔ、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ2、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ｏｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔａｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ、γ−Ｇｌｕ−ｔ−Ｌｅｕおよびγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）からなる群より選択される１種又は２種以上のアミノ酸又はペプチドであるが、ここで、アミノ酸とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、ｔ−Ｌｅｕ等の中性アミノ酸、Ａｓｐ、Ｇｌｕ等の酸性アミノ酸、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ等の塩基性アミノ酸、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ等の芳香族アミノ酸や、ホモセリン、シトルリン、オルニチン、α−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、タウリン等も含まれる。また、ｔｅｒｔ−ロイシン、シクロロインシン、α−アミノイソブチル酸、Ｌ−ペニシラミン、アロスレオニン、アロイソロイシン等の非天然（非タンパク質構成）アミノ酸であってもよい。尚、ペプチドγ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙにおいては、Ｘは上記のようなアミノ酸又はその誘導体のいずれでもよいが、Ｃｙｓ以外のアミノ酸又はその誘導体が好ましい。
また本発明の複合コク味付与剤においてγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕと併用されるアミノ酸又はペプチドは、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−ＯＣＨ（Ｚ）ＣＯ2Ｈの構造を有するペプチド誘導体であってもよい。ここに、式中Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表し、ＺはＨ（水素原子）又はＣＨ3（メチル基）を表す。また、前記式γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｙにおいて、ＹがＧｌｙＡまたはＬａｃＡである化合物であってもよい。具体例としては、γ-Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＧｌｙＡ、γ-Ｇｌｕ−ｔＬｅｕ−ＧｌｙＡ、γ-Ｇｌｕ−Ａｂｕ−ＧｌｙＡ、γ-Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＬａｃＡ、γ-Ｇｌｕ−ｔＬｅｕ−ＬａｃＡ、及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−ＬａｃＡ等が好適に挙げられる。なお、ＧｌｙＡとは、グリコール酸を表し、ＬａｃＡとは、酪酸を表す。酪酸はＳ体とＲ体のいずれでも良いが、好ましくはＳ体である。これらの化合物の構造式を以下に記す。
【化１】
2010114022.tif 000002
【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【００２０】
特に、本発明のコク味付与剤はγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕからなり、図１に示されるようなプロフィールを有するユニークな先味型の優れたコク味付与作用を有するので、このようなプロフィールとは異なるプロフィールを有するペプチト、例えば、γ―Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙと組み合わせて用いるのが好ましい。
【００２１】
本明細書において、アミノ酸残基の略号は以下のアミノ酸を意味する。
（１）Ｇｌｙ：グリシン
（２）Ａｌａ：アラニン
（３）Ｖａｌ：バリン
（４）Ｌｅｕ：ロイシン
（５）Ｉｌｅ：イソロイシン
（６）Ｍｅｔ：メチオニン
（７）Ｐｈｅ：フェニルアラニン
（８）Ｔｙｒ：チロシン
（９）Ｔｒｐ：トリプトファン
（10）Ｈｉｓ：ヒスチジン
（11）Ｌｙｓ：リジン
（12）Ａｒｇ：アルギニン
（13）Ｓｅｒ：セリン
（14）Ｔｈｒ：トレオニン
（15）Ａｓｐ：アスパラギン酸
（16）Ｇｌｕ：グルタミン酸
（17）Ａｓｎ：アルパラギン
（18）Ｇｌｎ：グルタミン
（19）Ｃｙｓ：システイン
（20）Ｐｒｏ：プロリン
（21）Ｏｒｎ：オルニチン
（22）Ｓａｒ：サルコシン
（23）Ｃｉｔ：シトルリン
（24）Ｎ−Ｖａｌ（又は、Ｎｖａ）：ノルバリン  （２−アミノ吉草酸）
（25）Ｎ−Ｌｅｕ（又は、Ｎｌｅ）：ノルロイシン
（26）Ａｂｕ：α−アミノ酪酸
（27）Ｔａｕ：タウリン
（28）Ｈｙｐ：ヒドロキシプロリン
（29）ｔ−Ｌｅｕ：ｔｅｒｔ−ロイシン
（30）Ｃｌｅ：シクロロイシン
（31）Ａｉｂ：α−アミノイソブチル酸（α−aminoisobutyric acid、２−メチルアラニン）
（32）Ｐｅｎ：Ｌ−ペニシラミン（penicillamine）
（33）ａｌｌｏ−Ｔｈｒ：アロスレオニン
（34）ａｌｌｏ−Ｉｌｅ：アロイソロイシン
【００２２】
また、アミノ酸誘導体とは、上記アミノ酸の各種誘導体であって、例えば、特殊アミノ酸や非天然アミノ酸、アミノアルコール、或いは末端カルボニル基やアミノ基、システインのチオール基等のアミノ酸側鎖が各種置換基により置換したものが挙げられる。置換基としては、アルキル基、アシル基、水酸基、アミノ基、アルキルアミノ基、ニトロ基、スルホニル基や各種保護基等が挙げられ、例えば、Ａｒｇ（ＮＯ2）：Ｎ−γ−ニトロアルギニン、Ｃｙｓ（ＳＮＯ）：Ｓ−ニトロシステイン、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）：Ｓ−メチルシステイン、Ｃｙｓ（Ｓ−allyl）：Ｓ−アリルシステイン、Ｖａｌ−ＮＨ2：バリンアミド、Ｖａｌ−ｏｌ：バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）等が含まれる。尚、本明細書において、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（ＳＮＯ）−Ｇｌｙは下記の構造式を有するものであり、上記γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｏ）およびγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ）式中の（Ｏ）はスルホキシド構造であることを意味する。γ−Ｇｌｕの（γ）とは、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基を介して他のアミノ酸が結合していることを意味する。
【化７】
2010114022.tif 000008
【００２３】
本発明で用いられるγ−Ｇｌｕ−ＡｂｕはＬ−γ−グルタミル−Ｌ−２−アミノ酪酸のことである。本発明のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びこれと併用されるアミノ酸又はペプチドは、市販されている場合には市販品を用いることもでき、その他、（１）化学的に合成する方法、又は（２）酵素的な反応により合成する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得することができるが、化学的な合成がより簡便である。本発明において用いられるγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕは含まれるアミノ酸の残基数が２残基と短いので、化学的に合成する方法が簡便であり、含まれるアミノ酸の残基数が３残基であるトリペプチドと比較してより簡便かつ低コストで生産することが可能であり、産業上非常に有利である。また、本発明のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びこれと併用されるアミノ酸又はペプチドを化学的に合成する場合には、該オリゴペプチドをペプチド合成機を用いて合成あるいは半合成することにより行うことができる。化学的に合成する方法としては、例えばペプチド固相合成法等が挙げられる。そのようにして合成したペプチドは通常の手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等によって精製することができる。このようなペプチド固相合成法、およびそれに続きペプチド精製はこの技術分野においてよく知られたものである。
【００２４】
また、本発明において用いられるγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及びこれと併用されるアミノ酸又はペプチドを酵素的な反応により生産する場合には、例えば、国際公開パンフレットＷＯ２００４／０１１６５３号に記載の方法を用いてもよい。すなわち、一方のアミノ酸又はジペプチドのカルボキシル末端をエステル化又はアミド化したアミノ酸又はジペプチドと、アミノ酸がフリーの状態であるアミノ酸（例えば、カルボキシル基が保護されたアミノ酸）とを、ペプチド生成酵素の存在下において反応させ、生成したジペプチド又はトリペプチドを生成することによっても生産することが可能である。ペプチド生成酵素としては、ペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、又は該微生物の菌体処理物、又は該微生物に由来するペプチド生成酵素が挙げられる。尚、ＷＯ２００４／０１１６５３号に記載されている事項は、本明細書の記載に含まれるものとする。
さらに、上述したような酵素的な方法や化学的合成方法以外にも本発明において用いられるペプチドが、野菜や果物等の植物、酵母等の微生物、その他の天然物中に存在する場合がある。天然に存在する場合には、これらから抽出して用いることも可能である。
本発明のコク味付与剤あるいは複合コク味付与剤は、そのままで、又は飲食品的に許容しうる担体や他の調味原料と混合して、調味料とすることができる。他の調味原料としては、例えば、香料、糖類、甘味料、食物繊維類、ビタミン類、グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）などのアミノ酸類、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）などの核酸類、塩化ナトリウムなどの無機塩類、クエン酸などの有機酸やその塩類が挙げられ、更には種々の酵母エキスも挙げられる。
尚、本発明のコク味付与剤あるいは複合コク味付与剤を含有する食品組成物として好ましい低塩食品は、元来食塩を含む食品であり、特に、その食塩含量が低減された食品である。低塩食品としては、固形の食品のみならず飲料をも含み、低塩飲食品と同義である。
このような低塩食品としては、バター、チーズ等の乳製品、マーガリン、 ソース、ルーなどの動物油脂及び/又は植物油脂含有食品、ドレッシング、マヨネーズなどの乳化食品等、各種カレーやシチュー、各種スナック、肉エキス・クリームを含む各種スープなどがあげられる。又、味噌、醤油など醸造食品や醸造食品を用いたつゆ・たれ類、漬物、ピクルスなど野菜加工食品、ハム・ソーセージなど畜肉加工食品、蒲鉾、干物、佃煮など水産加工食品、調理済みのミートボール、ハンバーグ、揚げもの、焼き鳥どもあげられる。これらのうち、低塩食品としては、喫食時の食塩含有量が０．０１〜０．５質量％であるものが好ましい。さらに、乳酸、クエン酸、リンゴ酸およびコハク酸から選択される少なくとも１の有機酸もしくはその塩を０．００５〜０．１重量％で併用することがより好ましく、併用により、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕの塩味増強効果がさらに向上する。
本発明は、又、２０〜２００重量ｐｐｍのγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕと０．０１〜０．５重量％の食塩とを含有する飲食品を提供する。ここで該飲食品は更に、乳酸、クエン酸、リンゴ酸およびコハク酸から選択される少なくとも１の有機酸もしくはその塩を０．００５〜０．１重量％含有するのが好ましい。
本発明のコク味付与剤を上記低塩食品に含有させることにより、これらの食品を喫食した時、最初に、塩味様濃厚感及び先味・パンチを感じることができる。
【００２５】
本発明において用いられるγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及び併用されるアミノ酸又はペプチドは塩の形態をも包含する。本発明のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ及び併用されるアミノ酸又はペプチドが塩の形態を形成し得る場合、その塩は薬理学的に許容されるものであればよく、例えば、カルボキシル基等の酸性基に対しては、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロヘキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミン酸との塩を挙げることができる。また、塩基性基に対しては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩を挙げることができる。
【００２６】
本発明のコク味付与剤、あるいは複合コク味付与剤は、乾燥粉末、ペースト、溶液などの物性に制限なしにあらゆる形態で用いることができる。
本発明のコク味付与剤あるいは複合コク味付与剤は、食品、飲料、調味料等に配合して用いることができる。
本発明のコク味付与剤、あるいは複合コク味付与剤を食品、飲料、調味料等に配合して用いる場合の最終的なγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕの量及び併用されるアミノ酸又はペプチドの量は所望の効果が得られる量であれば特に制限されないが、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕの量及び／又はアミノ酸若しくはペプチドの量として、食品、飲料あるいは調味料等の全質量を基準として、それぞれについて１質量ｐｐｂ〜９９．９質量％、好ましくは１０質量ｐｐｂ〜１０質量％、より好ましくは１質量ｐｐｍ〜１質量％程度である。
本発明は、本発明のコク味付与剤を他の調味原料又は飲食品的に許容しうる担体と混合する工程を含む、調味料の製造方法を提供する。ここで製造される調味料のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ濃度は４００から５０００００重量ｐｐｍが特に好ましい。特に、本発明のコク味付与剤を他の調味原料と混合する工程、及び、製造される調味料のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ濃度を４００から５０００００重量ｐｐｍとする工程を含む、調味料の製造方法が好ましい。
本発明は、又、本発明のコク味付与剤を別の飲食品原料に添加する工程を含む、飲食品の製造方法を提供する。ここで製造される飲食品のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ濃度は２０〜２００重量ｐｐｍが特に好ましい。よって、本発明のコク味付与剤を別の飲食品原料に添加する工程が、製造される飲食品のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ濃度を２０〜２００重量ｐｐｍとする工程を含む、飲食品の製造方法が好ましい。
【００２７】
本発明のコク味付与剤、あるいは複合コク味付与剤が配合された食品、飲料、調味料等には、飲食品的に許容しうるあらゆる固体又は液体の担体、適当な調味原料等をさらに配合させてもよい。
上記担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ゼラチン、アルブミン、アミノ酸、水、生理食塩水等が挙げられる。
上記の調味原料は、当業界で用いられるいずれの調味原料であってもよく特に制限されないが、より具体的には既に上述のものが挙げられる。
上記の担体、他の調味原料等はいずれもその含有量は特に制限されない。
本発明の調味料は、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを１０００重量ｐｐｍ以上、好ましくは２０００重量ｐｐｍ以上、より好ましくは２５００重量ｐｐｍ以上含有し、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕの有する呈味効果が特に好適に発揮される。本発明の調味料においてγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕの占める割合は、好ましくは３０００重量ｐｐｍ以上、更に好ましくは５０００重量ｐｐｍ以上、更に好ましくは１重量％以上、特に好ましくは３重量％以上であり、又、９９．９重量％以下であるのも好ましい。本発明の調味料のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ以外の成分としては、特に限定されないが、例えば上述した、飲食品的に許容しうる担体や調味原料が挙げられる。
より具体的な本発明の調味料としては、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを２５００重量ｐｐｍ以上含有する酵母エキスが挙げられる。酵母エキスは、由来となる菌体・その培養条件・抽出処理方法のいずれも特に限定されず任意の酵母エキスを用いることができ、更に加熱処理、酵素処理、濃縮、粉末化処理等が施されたものでも良い。γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを２５００重量ｐｐｍ以上含有する酵母エキスの製法は特に限定されないが、例えば、酵母エキスにγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを上記の濃度になるように添加して得ることができる。
本発明の調味料は、乾燥粉末、ペースト、溶液などの物性に制限なしにあらゆる形態で用いることができる。
本発明の調味料は、食品、飲料等に配合して用いることができる。
本発明は、本発明の調味料を他の調味原料又は飲食品的に許容しうる担体に添加する工程を含む、別の調味料の製造方法を提供する。ここで製造される調味料のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ濃度は４００から５０００００重量ｐｐｍが特に好ましい。特に、本発明の調味料を他の調味原料に添加する工程、及び、製造される別の調味料のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ濃度を４００から５０００００重量ｐｐｍとする工程を含む、調味料の製造方法が好ましい。
本発明は、本発明の調味料を別の飲食品原料に添加する工程を含む、飲食品の製造方法を提供する。ここで製造される飲食品のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ濃度は２０〜２００重量ｐｐｍが特に好ましい。特に、本発明の調味料を別の飲食品原料に添加する工程が、製造される飲食品のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ濃度を２０〜２００重量ｐｐｍとする工程を含む、飲食品の製造方法が好ましい。
【００２８】
本発明は又、食品、飲料あるいは調味料等の製造中間品に、１質量ｐｐｂ〜９９．９質量％含有させるようにγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを添加することを特徴とする、食品、飲料、調味料等の製造方法を提供する。ここで食品、飲料、調味料等としては、低塩食品が好ましい。
本発明は又、食品あるいは飲料の製造中間品に、本発明の調味料を添加することを特徴とする、食品あるいは飲料の製造方法を提供する。ここで食品あるいは飲料としては、低塩食品が好ましい。
本発明の飲食品又は飲食品の製造中間品の製造方法において、別の飲食品原料に添加される、１０００重量ｐｐｍ以上のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを含有する飲食品原料には、例えば、高濃度のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを含有する前述した酵母エキスを用いてもよく、また、化学的若しくは酵素的合成方法によって得られる単離されたγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ、または単離されたγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕの希釈倍散品を用いても良い。γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕの希釈倍散品としては、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕの原末を、上述の飲食品的に許容しうるあらゆる固体又は液体の担体により、希釈したものが挙げられる。
本発明において、「別の飲食品原料」とは、「１０００重量ｐｐｍ以上のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを含有する飲食品原料」以外の飲食品の原料として通常用いられるいかなる飲食品原料であってもよく、例えば、前述した飲食品的に許容しうる担体や他の調味原料等に加え、以下に飲食品又は飲食品の製造中間品として列挙されるものであってもよい。
本発明の飲食品又は飲食品の製造中間品の製造方法は、１０００重量ｐｐｍ以上のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを含有する飲食品原料を別の飲食品原料に添加する工程により得られる飲食品原料混合物を、さらに調理する工程を有していてもよいが、本発明において、「調理する」とは、当業界で通常用いられるいずれの調理工程をも包含する。調理工程の例としては、焼く、煮る、揚げる、蒸す、切る、砕く、擦る、すりおろす、潰す、すり潰す、挽く、混ぜる、ふるう及び叩く等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明の方法によって製造される飲食品又は飲食品の製造中間品としては、前述のバター、チーズ等の乳製品、マーガリン、 ソース、ルーなどの動物油脂及び/又は植物油脂含有食品、ドレッシング、マヨネーズなどの乳化食品等、各種カレーやシチュー、各種スナック、肉エキス・クリームを含む各種スープなど、又、味噌、醤油など醸造食品その関連のつゆ、たれ類、漬物、ピクルスなど野菜加工食品、ハム・ソーセージなど畜肉加工食品、蒲鉾、干物、佃煮など水産加工食品、調理済みのミートボール、ハンバーグ、揚げもの、焼き鳥等が挙げられる。
本発明における飲食品は、一般に流通し、喫食される形態である最終製品としての食品あるいは飲料等を含み、また、飲食品の製造中間品は、最終製品となる前のいかなる形態の製造中間品をも含む意味において用いられる。食品あるいは飲料の製造中間品が、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを含有する調味原料として用られる場合は、該製造中間品は、４００〜５０００００重量ｐｐｍ、好ましくは４０００〜４００００重量ｐｐｍ程度のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを含有するのが好ましく、そのような製造中間品は、例えば１０００重量ｐｐｍ以上のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを含有する飲食品原料をそのような濃度となるように添加することによって製造することができる。また、最終製品は、喫食時、すなわち最終製品としての飲食品中の濃度として、２０〜２００重量ｐｐｍ程度のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを含有するを含有するのが好ましく、そのような最終品は、例えば１０００重量ｐｐｍ以上のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを含有する飲食品原料をそのような濃度となるように添加することによって製造することができる。
本発明の飲食品又は飲食品の製造中間品の製造方法において、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを含有する飲食品原料を別の飲食品原料に添加する工程は、好ましくは、飲食品の製造中間品のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ濃度を４００〜５０００００重量ｐｐｍとする工程を含み、より好ましくは、本発明の飲食品の製造方法は、飲食品の製造中間品を別の飲食品原料に添加して、飲食品のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ濃度を２０〜２００重量ｐｐｍとする工程をさらに含む。
本発明の飲食品の製造方法において、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕを含有する飲食品原料を別の飲食品原料に添加する工程は、好ましくは、飲食品のγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ濃度を２０〜２００重量ｐｐｍとする工程を含む。
【００３０】
本発明の飲食品の製造方法は、例えば、飲食品が低塩食品である場合に好適である。この場合、乳酸、クエン酸、リンゴ酸およびコハク酸、好ましくは乳酸およびリンゴ酸から選択される少なくとも１の有機酸もしくはその塩を、飲食品中の濃度が０．００５〜０．１重量％となるように飲食品原料に添加する工程を含むことが好ましく、又、対応する既存の飲食品を製造する場合よりも、少ない量の食塩を飲食品原料に添加する工程を含むことが好ましい。ここで少ない量の食塩としては例えば、該既存飲食品中の食塩濃度に対して低塩食品中の食塩が、少なくとも５％減、好ましくは１０％減となるような量が挙げられる。
本発明の飲食品は、飲食品業界で通常用いられるいかなる形態で提供されてもよく、例えば、レトルト容器、缶詰、瓶詰め等、あるいは乾燥品等として提供されてもよい。
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３１】
各種試料の調製
γ-Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｂｕ(Ａｂｕ：α-アミノ酪酸、Ｂａｃｈｅｍ  Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ  ＡＧ)、γ-Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ(Ｂａｃｈｅｍ  Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ  ＡＧ)、γ-Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｃｙｓ（シグマアルドリッチジャパン株式会社）、γ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｔｈｒ（国産化学株式会社）の４種類は購入品を用いた。【００３２】
γ−Ｌ-Ｇｌｕ−Ｌ-Ｖａｌの合成
（工程１）Ｚ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＯＢｚｌ（Ｎ−α−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミン酸α−ベンジルエステル，７．６１９ｇ，  ２０．５１ｍｍｏｌ）とＶａｌ−ＯＢｚｌ・ＨＣｌ（Ｌ−バリンベンジルエステルヒドロクロリド，５ｇ，２０．５１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１００ｍｌ）に溶解し、溶液を０℃に保った。トリエチルアミン（３．２ｍｌ，２２．５７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール，３．０５３ｇ，２２．５７ｍｍｏｌ）及びＷＳＣ・ＨＣｌ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド，４．３２６ｇ，２２．５７ｍｍｏｌ）を溶液に加え、室温で一夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチル（２２０ｍｌ）に溶解した。溶液を５％クエン酸水溶液（１００ｍｌ）で分液し、水層を更に酢酸エチル（６０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水（８０ｍｌ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（８０ｍｌ）、飽和食塩水（８０ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル−ｎ−ヘキサン（１：１）でスラリー洗浄し、濾過することによりＺ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＢｚｌ（１０．０２７３ｇ）を得た。また、酢酸エチル−ｎ−ヘキサン画分にｎ−ヘキサンを加えることにより析出した結晶を、酢酸エチル−ｎ−ヘキサンから再結晶し、Ｚ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＢｚｌ（１．０３９９ｇ）を得た。
収率９４．２５％【００３３】
（工程２）Ｚ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＢｚｌ（１１．７１ｇ，  ２０．８６ｍｍｏｌ）にエタノール（１６０ｍｌ）を加えた後、１０％パラジウム炭素（２．３ｇ）、次いで水（１０ｍｌ）を加え、水素雰囲気下室温で一晩撹拌した。反応中、水（１００ ml）を少しずつ加えた。パラジウム炭素を濾過して除き、濾液を減圧濃縮し、残渣を少量の水とエタノールから再結晶し、γ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｖａｌ（５．０ｇ）を得た。
収率：９７．２３％
その特性値を次に示す。
ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）+＝２４７．２
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ（ｐｐｍ）：０．８６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８  Ｈｚ），０．８８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８  Ｈｚ），２．０４−２．１３（３Ｈ，ｍ），２．４２−２．４６（２Ｈ，ｍ），３．７４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３  Ｈｚ），４．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ）．【００３４】
γ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｓｅｒの合成
γ−Ｌ-Ｇｌｕ−Ｌ-Ｖａｌの合成方法に従い、Ｚ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＯＢｚｌとＬ−Ｓｅｒ−ＯＢｚｌを原料に使用して、γ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｓｅｒを合成した。その特性値を次に示す。
ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）+＝２３５．１
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ（ｐｐｍ）：１．９８−２．０９（２Ｈ，ｍ），２．４０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．７１−３．８１（３Ｈ，ｍ），４．３３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）．【００３５】
γ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−ｔ−Ｌｅｕの合成
γ−Ｌ-Ｇｌｕ−Ｌ-Ｖａｌの合成方法に従い、Ｚ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＯＢｚｌとＬ−ｔ−Ｌｅｕ−ＯＢｚｌを原料に使用して、γ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ａｉｂを合成した。その特性値を次に示す。
ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）+＝２６１．３【００３６】
γ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ａｉｂの合成
γ−Ｌ-Ｇｌｕ−Ｌ-Ｖａｌの合成と類似の方法に従い、Ｚ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＯＢｚｌとＡｉｂ−Ｏｔ−Ｂｕを原料に使用して、γ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ａｉｂを合成した。その特性値を次に示す。
ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）+＝２３３．３
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ（ｐｐｍ）：１．３６（６Ｈ，ｓ），２．００−２．０６（２Ｈ，ｍ），２．３０−２．３４（２Ｈ，ｍ），３．６９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）．【００３７】
（試験例１）ＣａＳＲ発現プラスミドの調製
ＣａＳＲ発現プラスミドの調製を以下のように行った。
ＮＣＢＩに登録されたＤＮＡ配列（ＣａＳＲ（カルシウム受容体）：NM_000388、配列番号１、２）を元に、ＰＣＲに使う合成オリゴＤＮＡ（フォワードプライマー（配列番号３：ACTAATACGACTCACTATAGGGACCATGGCATTTTATAGCTGCTGCTGG）、及びリバースプライマー（配列番号４:TTATGAATTCACTACGTTTTCTGTAACAG）を合成した。
ヒト腎臓由来のｃＤＮＡ（Clontech社製）を材料として、前記プライマー、及びPfu Ultra DNA Polymerase（Stratagene社製）を用い、以下の条件でＰＣＲを実施した。９４℃で３分の後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分を３５回繰り返した後、７２℃で７分反応させた。アガロース電気泳動を行い、ＤＮＡ染色試薬で染色した後、紫外線照射によってＰＣＲによって増幅がなされたか否かを検出した。又、同時に電気泳動したサイズ既知のＤＮＡマーカーと比較することで、ＰＣＲ産物の鎖長を確認した。
プラスミドベクターｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲＶ（Takara社製）によって切断し、その切断部位にＰＣＲによって増幅された遺伝子断片をLigation kit（Promega社製）を用いて連結した。この反応溶液でエシェリヒア・コリＤＨ５α株を形質転換し、ＰＣＲ増幅産物がクローニングされたプラスミドを保持する形質転換体を選抜し、更にＰＣＲ増幅産物をＤＮＡ塩基配列解析によって確認した。
この組換えプラスミドを用いてヒトＣａＳＲ発現プラスミドhCaSR/pcDNA3.1を作製した。【００３８】
（試験例２）CaSRアゴニスト活性の評価
293E細胞（EBNA1発現HEK293細胞、ATCC No.CRL-10852）を、200μg/mlのG418（ジェネティシン）存在下、10%のウシ胎児血清を含むDMEM/Ham's-F12（3.15/ml Glucose含有Dulbecco's modified Eagle medium、ナカライテスク）にて培養した。3×106ceells/10mlでF25フラスコに撒き、CO2インキュベータ（5%CO2、37℃）に24時間静置した後、トランスフェクション試薬Fugene6（Roche）にてヒトCaSR発現プラスミドhCaSR/pcDNA3.1をトランスフェクションした。CO2インキュベータに6〜7時間置いた後、細胞を10%ウシ胎児血清含有DMEM/Ham's-F12にて回収し、70,000cells/wellでpoly-D-lysine coat 96well plate（BD-Biocoat）に播種した。
CO2インキュベータにて24時間静置した後、この細胞を播種した96 well plateから培地を除去し、Assay Buffer (146mM NaCl、5mM KCl、1mM MgSO4、1mg/ml Glucose、20mM HEPES(pH 7.2)、0.75〜1.25 mM CaCl2)に溶解したCa2+蛍光指示薬Calcium 4 Assay Kit（Molecular Devices）を200μl/well添加し、37℃で1時間、次いで室温で10分静置し指示薬を取り込ませた。
この96well plateに、0.1%BSA含有Assay Bufferに溶解した被験化合物を50μl/well添加し、FLEX Station（Molecular Devices）で3分間蛍光強度変化を測定した。【００３９】
（EC50算出法）
化合物添加前後の蛍光強度の最大値と最小値の差(RFU(Max-Min)）をFLEX Stationの自動計算にて求めた。化合物最大濃度添加時のRFU(Max-Min)を100%、被験化合物を含まない0.1%BSA含有Assay Bufferを使用時のRFU(Max-Min)を0%と定義した活性率を計算し、表計算ソフトXfitもしくはグラフパッドプリズムにてカーブフィッティングし、活性率50%時の化合物濃度であるEC50値を求めた。結果を表１に示した。
【表１】
2010114022.tif 000009
【００４０】
他のジペプチドと比較してγ−Glu−Abuはγ−Glu−Cys並みの強いCaSR作用活性を示した。CaSR作用活性を有する低分子ペプチドがコク味付与剤として有用であることが知られており（特許文献１）、γ−Glu−Abuは特に優れたコク味付与剤であることが示唆された。【００４１】
実施例１  コク味付与活性の評価
γ−Glu−Abuについて、定量的な官能評価試験によりコク味付与活性の強度を調べた。
定量的官能評価試験は以下のように実施した。グルタミン酸ナトリウム（０．０５ｇ／ｄｌ）、イノシン酸一リン酸（０．０５ｇ／ｄｌ）、塩化ナトリウム（０．５ｇ／ｄｌ）を含有する蒸留水に、被験化合物を０．００１〜０．５ｇ／ｄｌにて混合した場合の、コク味付与活性の強度を測定した。試料溶解後に無添加コントロールに対し酸性を呈したサンプルについては、ＮａＯＨで無添加コントロールに対しｐＨ±０．２の幅に合わせて使用した。官能評点について、コントロール：０点、強い：３点、非常に強い：５点として、ｎ＝４で実施した。また、尺度をより明確にするため、０．００１ｇ／ｄｌのγ-Glu-Val-Glyの先味、中後味を各々3.0点とした。尚、「中後味」とは、中味から後味を合わせた時間で感じる呈味である。採点ついては、直線尺度法を用い、−５〜０〜５点の位置を示した直線に対し、該当する採点を位置として記入する方法を用いた。また、食品の調味開発を累積で１年以上経験し、うま味塩味溶液に添加したγ-Glu-Cys-Glyとγ-Glu-Val-Glyの力価の差が１０倍前後と判定できる者（定期的に確認）をパネラーとした。上記添加濃度で幅広くコク味付与活性を示したが、代表的な濃度の結果を表２に示した。
又、γ−Glu−Alaについて同様に評価した結果も表２に示した。両者は先味の評点が高い先味タイプだが、γ-Glu-Abuは極めて力価が強いジペプチドであることが分かった。
【表２】
2010114022.tif 000010
【００４２】
さらにγ−Glu−Cysやその他ジペプチドについても、上記と同一の定量的な官能評価試験によりコク味付与活性の強度を調べた。その結果を表３に示した。
【表３】
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【００４３】
γ−Glu−Abuが優れたコク味付与活性を有し、更にその呈味パターンについて先味の立ち上がりが優れていることが分かった。この先味の立ち上がりはγ−Ｇｌｕ−Ｃysに比べて極めて優位な点の一つである。また、γ−Glu−Abuは安定性に優れており、この点もγ−Ｇｌｕ−Ｃysに比べて優位な点である。また、γ−Glu−Abuは含まれるアミノ酸の残基数が２残基と短いので、含まれるアミノ酸の残基数が３残基であるトリペプチドと比較してより簡便かつ低コストで生産することが可能であり、産業上も非常に有利である。【００４４】
実施例２  コク味付与活性の強度測定
γ−Glu−Abuについて、主観的等価値（ＰＳＥ；Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｓｕｂｊｅｃｔｉｖｅ  Ｅｑｕａｌｉｔｙ）を極限法より求める試験法（「統計的官能検査法」佐藤信(筆）、日本科学技術連盟）を用いて、コク味付与活性の強度を調べた。
官能評価は以下のように実施した。官能評価用の溶液として、グルタミン酸ナトリウム（０．０５ｇ／ｄｌ）、イノシン酸一リン酸（０．０５ｇ／ｄｌ）、塩化ナトリウム（０．５ｇ／ｄｌ）を含有する蒸留水を用いた。比較する既存のコク味付与効果を有するジペプチドとしてγ−Glu−Valを用いた。γ−Glu−Cysもγ−Glu−Valと同程度の強い効果を有するが、先味が特別強いわけでなく、味質が異なる。γ−Glu−Alaは、γ−Glu−Valより強度が弱いとともに酸味が強く、ｐH調整が必要で扱い難い。γ−Glu−Serも、γ−Glu−Valよりも強度が弱く、また異風味を発生するため扱い難い。
官能評価用の溶液に０．００５ｇ／ｄｌγ-Glu-Abuを含有させた溶液に対し、同等の強度の呈味を示すγ−Glu−Valの濃度を求めるため、官能評価用の溶液に０．０１ｇ／ｄｌγ−Glu−Valを含有させた溶液を基準に、５０％の対数尺度にて濃度を変化させたγ−Glu−Val溶液を調製した。γ−Glu−Valの濃度は０．００３０〜０．０３３７ｇ／ｄｌで７段階であった。試料溶解後に無添加コントロールに対し酸性を呈したサンプルについては、ＮａＯＨで無添加コントロールに対しｐＨ±０．２の幅に合わせて使用した。１８名のパネラーに、γ−Glu−Val濃度が低い溶液から順に提示し、γ-Glu-Abuの０．００５ｇ／ｄｌ溶液と比較し強度が強いと感じられるまで評価を実施した。時間を空け、次に、１８名のパネラーに、γ−Glu−Val濃度の高い溶液から順に提示し、γ-Glu-Abuの０．００５ｇ／ｄｌ溶液と比較し強度が弱いと感じられるまで評価を実施した。
本官能評価について、食品開発の経験者をパネラーとした。評価結果を表４に示した。
【表４】
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【表５】
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１）下閾、上閾が同値の場合は、弱い、強いとの判断の間に差が不確定と判断したγ−Glu−Valの濃度がない場合である。たとえば、パネルNo１は、γ−Glu−Valが44ppm（０．００４４ｇ／ｄｌ）では、弱い、67ppm（０．００６７ｇ／ｄｌ）では、強いと評価しているので、下閾55.5ppm、上閾55.5ppmと同値となる。
２）信頼閾（平均）は下閾および上閾の平均である。
50ppm（０．００５０ｇ／ｄｌ）γ−Glu−Abuに対するγ−Glu−Valの
PSE（主観的等価値）は、下閾の信頼閾と上閾の信頼閾の和÷２となる
。【００４５】
０．００５０ｇ／ｄｌのγ-Glu-Abuと同等の強度となるγ−Glu−Valの濃度（PSE）は、表４の評価者人数から０．０１００ｇ／ｄｌ前後と推定される。各個人が同等と評価するγ−Glu−Valの上閾、下閾濃度から、PSEを算出すると０．０１２２ｇ／ｄｌである。γ-Glu-Abuの強度は、γ−Glu−Valの約２．４倍で、極めて強度が高いジペプチドであった。γ-Glu-Abuは、今まで以上に安価で、広い範囲の食品に先味からコク味を発揮できる貴重なジペプチドと言える。【００４６】
実施例３  塩味増強の評価
γ−Glu−Abuについて、定量的な官能評価試験により塩味増強を調べた。
官能評価試験は以下のように実施した。塩化ナトリウム（０．５ｇ／ｄｌ）を含有する蒸留水に、被験化合物を最適と考えられる量を添加し、塩味強度を測定した。試料溶解後に無添加コントロールに対し酸性を呈したサンプルについては、ＮａＯＨで無添加コントロールに対しｐＨ±０．２の幅に合わせて使用した。
官能評点について、０点を無添加コントロール、すなわち０．５ｇ／ｄｌ塩化ナトリウム溶液、５点を０．７５ｇ／ｄｌ塩化ナトリウム溶液とする、−５点〜０点〜５点の尺度にて、ｎ＝５で実施した。「先味」とは喫食開始から２秒後まで、「中後味」とは、２秒後以降すなわち中味から後味を合わせた時間で感じる呈味である。採点ついては、直線尺度法を用い、−５〜０〜５点の位置を示した直線に対し、該当する採点を位置として記入する方法を用いた。また、食品の調味開発を累積で１年以上経験し、うま味塩味溶液に添加したγ-Glu-Cys-Glyとγ-Glu-Val-Glyの力価の差が１０倍前後と判定できる者（定期的に確認）をパネラーとした。評価の結果を表６に示した。
【表６】
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【００４７】
コク味付与力が高力価のトリペプチドであるγ−Glu-Val-Glyと、ジペプチドである本発明のγ−Glu-Abuとを、塩味増強力について比較した。評価濃度と評点から、γ-Glu-Val-Glyは、γ-Glu-Abuより呈味付与の強度が高い。しかし、官能評価プロファイルにも記載されるように、γ−Glu-Val-Glyは、塩味のバランスが著しく低下する。一方、γ-Glu-Abuは極めてバランスの良い塩味の増強を示し、塩味増強用のペプチドとして、特に適している。【００４８】
実施例４  有機酸との併用効果の評価
定量的な官能評価試験により、γ−Glu−Abuの塩味増強効果の有機酸の併用による向上について検討した。
官能評価試験は以下のように実施した。市販の味の素株式会社製、塩分控えめ「丸鶏がらスープ」を食塩濃度が０．４８ｇ／ｄｌになるよう熱湯に溶解し、被験化合物を適正量溶解し、塩味強度を測定した。試料溶解後と無添加コントロールとはｐＨに関し、低下など差が無く、ｐＨ調整を実施しなかった。官能評価でも酸味などによる影響を認めなかった。官能評点について、尺度を明確にするため、コントロールの塩味：３点、コントロールを１．２５倍に増塩したスープの塩味：４点、コントロールを１．５倍に増塩したスープの塩味：５点として、ｎ＝６で実施した。採点ついては、直線尺度法を用い、１〜３〜５点の位置を示した直線に対し、該当する採点を位置として記入する方法を用いた。また、食品の調味開発を累積で１年以上経験し、うま味塩味溶液に添加したγ-Glu-Cys-Glyとγ-Glu-Val-Glyの力価の差が１０倍前後と判定できる者（定期的に確認）をパネラーとした。評価結果を表７に示した。
【表７】
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【００４９】
有機酸である乳酸やリンゴ酸はγ−Glu-Abuとの相性が極めて良く、有機酸である乳酸やリンゴ酸を併用することにより、γ−Glu-Abuによる塩味増強効果がさらに向上されることが分かった。
すなわち、バランス良く塩味を増強するγ-Glu-Abuの効果に関して、有機酸の併用によりさらなる向上が可能である。従って、γ-Glu-Abuは、安価通常良く用いる素材により、その効果をさらに強化することのできる極めて有用な化合物である。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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