(57)【要約】［課題］本発明は、ＳＰＦＳによる蛍光シグナルを向上させることができる高感度かつ高精度なプラズモン励起センサ、該センサを用いるアッセイ法、ＳＰＦＳ用分析装置および該アッセイ用キットを提供することを目的とする。［解決手段］透明平面基板と；該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と；該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に固定化された、金属コロイドを基点とする高分子からなる層と；該ポリマーに固定化されたリガンドとを含み、ＳＰＦＳ−ＬＰＦＳ系による新規測定方法に供することを特徴とするプラズモン励起センサ。
2010134592.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明平面基板と；
該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と；
該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された、金属コロイドを基点とする高分子からなる層と；
該高分子に固定化されたリガンドと
を含み、ＳＰＦＳ〔表面プラズモン励起増強蛍光分光法〕−ＬＰＦＳ〔局在表面プラズモン励起増強蛍光分光法〕系による測定方法に供することを特徴とするプラズモン励起センサ。
【請求項２】
上記金属薄膜と上記金属コロイドを基点とする高分子からなる層との間にＳＡＭ〔自己組織化単分子膜〕を有する請求項１に記載のプラズモン励起センサ。
【請求項３】
上記金属コロイドが、金，銀，白金およびそれらの合金からなる群から選択される少なくとも１種の金属からなるコロイドである請求項１または２に記載のプラズモン励起センサ。
【請求項４】
上記金属コロイドの粒径が、０．１ｎｍ〜１０μｍである請求項１〜３のいずれかに記載のプラズモン励起センサ。
【請求項５】
上記高分子が、タンパク質，核酸，多糖類，天然ゴム，合成樹脂，シリコン樹脂，合成繊維および合成ゴムからなる群から選択される少なくとも１種の高分子であり、かつ水に可溶性である請求項１〜４のいずれかに記載のプラズモン励起センサ。
【請求項６】
少なくとも下記工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とするアッセイ法；
工程（ａ）：請求項１〜５のいずれかに記載のプラズモン励起センサに検体を接触させる工程，
工程（ｂ）：上記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程，
工程（ｃ）：上記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサが有する透明平面基板の、上記金属薄膜が形成されている表面の反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された上記蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程，および
工程（ｄ）：上記工程（ｃ）で得られた測定結果から、上記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程。
【請求項７】
少なくとも、請求項１〜５のいずれかに記載のプラズモン励起センサを含み、請求項６に記載のアッセイ法に用いられることを特徴とするＳＰＦＳ用分析装置。
【請求項８】
透明平面基板と、該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と、該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された、金属コロイドを基点とする高分子からなる層とからなり、請求項１〜５のいずれかに記載のプラズモン励起センサに用いられるプラズモン励起センサ用基板を、少なくとも含むことを特徴とするアッセイ用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＰＦＳ−ＬＰＦＳ系による測定方法に供するプラズモン励起センサおよびアッセイ法に関する。より詳細には、本発明は、金属薄膜による電場増強効果に、さらに金属コロイドによる電場増強効果および電場増強エリア拡大効果を加えることにより超高感度化したプラズモン励起センサ、および該センサを用いるアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＰＲ〔表面プラズモン共鳴〕とは、照射したレーザ光が金薄膜表面で全反射減衰〔ＡＴＲ〕する条件において、誘電体に接触した金属薄膜表面に発生させた粗密波（表面プラズモン）と、誘電率（または屈折率）の差異による影響を受け易いエバネッセント波との波数が一致したとき両者が共鳴して反射光が減衰する現象であって、センサ表面においてリガンドとアナライトとが相互作用することによって誘電体の誘電率（または屈折率）に差異が生じ、その結果、表面プラズモン共鳴が変化することによって、リガンドとアナライトとの相互作用を定量することができる。【０００３】
このようなＳＰＲを利用したバイオセンサとして、例えば、特許文献１には、ＳＰＲ〔表面プラズモン共鳴〕分析に用いるセンサ・ユニットが開示されており、図２に示すように、該センサ・ユニットとは、ガラス，プラスチックその他の透明な材料で作った透明プレート１１と、このプレートの片面にスパッタリング等で形成した金属フィルム１２と、この金属フィルムに取り付けられた誘電体フィルムとを有する。この誘電体フィルムは、リガンドが結合したデキストラン層１４であって、該リガンドは、抗デキストランからなる１つの活性部分と検出しようとしている抗体に対する抗原からなる別の部分とを有する二官能価あるいは多官能価分子１５であってもよいことが記載されている。【０００４】
しかしながら、このようなセンサ・ユニットは、センサ表面の平均的な屈折率変化を基本とするため、低分子に対する応答が弱く、感度が低いことから改良の余地が認められる。【０００５】
また、非特許文献１には、ＳＰＲ分析に用いるＳＰＲセンサチップが開示されており、図３に示すように、該ＳＰＲセンサチップとは、カバーガラス６と、このカバーガラス６の片面にスパッタリングで形成した金フィルム７と、この金フィルム７の表面で重合して得られた分子インプリントポリマーからなるゲル８と、このゲル８中に埋め込まれた金ナノパーティクル１０とから構成されている。分子インプリントポリマーからなるゲル８は、低分子を認識する結合サイト９を有することが記載されおり、比較的低分子を対象にした測定においても、ＳＰＲ測定により検出が可能であることが記載されている。【０００６】
しかしながら、このようなセンサ・ユニットにおいても、センサ表面の平均的な屈折率変化を基本とするため、感度の点において改良の余地が認められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３２９４６０５号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Jun Matsui, Kensuke Akamatsu, Noriaki Hara, Daisuke Miyoshi, Hidemi Nawafune, Katsuyuki Tamaki, Naoki Sugimoto; SPR sensor chip for detection of small molecules using molecularly imprinted polymer with embedded gold nanoparticles, Anal. Chem., 2005年, 77巻, p.4282-4285
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＳＰＦＳによる蛍光シグナルを向上させることができる高感度かつ高精度なプラズモン励起センサ，該センサを用いるアッセイ法，ＳＰＦＳ用分析装置および該アッセイ用キットを提供することを目的とする。【００１０】
なお、ＳＰＦＳ〔表面プラズモン励起増強蛍光分光法〕とは、照射したレーザ光が金薄膜表面で全反射減衰〔ＡＴＲ〕する条件において、誘電体に接触した金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる蛍光測定法である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意研究した結果、ＳＰＦＳを用いたアッセイ系において、金属コロイドを分散浮遊状態に近い状態で金属基板上に固定化し蛍光測定を行うと、表面プラズモン励起による電場増強効果に加えて、金属コロイドによる局所電場増強効果も同時に得られることにより、蛍光色素が発する蛍光シグナルの強度が増大することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明のプラズモン励起センサは、透明平面基板と；該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と；該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された、金属コロイドを基点とする高分子からなる層と；該高分子に固定化されたリガンドとを含み、ＳＰＦＳ〔表面プラズモン励起増強蛍光分光法〕−ＬＰＦＳ〔局在表面プラズモン励起増強蛍光分光法〕系による新規測定方法に供することを特徴とする。【００１３】
本発明のプラズモン励起センサは、上記金属薄膜と上記金属コロイドを基点とする高分子層との間にＳＡＭ〔自己組織化単分子膜〕を有することが好ましい。【００１４】
上記金属コロイドは、金，銀，白金およびそれらの合金からなる群から選択される少なくとも１種の金属からなるコロイドであることが好ましく、特に金コロイドが好ましい。【００１５】
上記金属コロイドの粒径は、０．１ｎｍ〜１０μｍであることが好ましい。【００１６】
上記高分子は、タンパク質，核酸，多糖類，天然ゴム，合成樹脂，シリコン樹脂，合成繊維および合成ゴムからなる群から選択される少なくとも１種の高分子であり、かつ水に可溶性であることが好ましい。【００１７】
また、本発明のアッセイ法は、少なくとも下記工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とする。【００１８】
工程（ａ）：本発明のプラズモン励起センサに検体を接触させる工程，
工程（ｂ）：上記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程，
工程（ｃ）：上記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサが有する透明平面基板の、上記金属薄膜が形成されている表面の反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された上記蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程，および
工程（ｄ）：上記工程（ｃ）で得られた測定結果から、上記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程。【００１９】
本発明のＳＰＦＳ用分析装置は、少なくとも、本発明のプラズモン励起センサを含み、本発明のアッセイ法に用いられることを特徴とする。【００２０】
また、本発明のキットは、透明平面基板と；該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と；該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された、金属コロイドを基点とする高分子からなる層とからなり、本発明のプラズモン励起センサに用いられるプラズモン励起センサ用基板を、少なくとも含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、ＳＰＦＳ〔表面プラズモン励起増強蛍光分光法〕−ＬＰＦＳ〔局在表面プラズモン励起増強蛍光分光法〕系による電場増強効果および電場増強エリア拡大効果を有する、すなわち、表面プラズモン励起と局在プラズモン励起とによる電場増強を同時に誘起することによって、さらなる蛍光シグナルの増幅を図ることができる効果、およびＳＰＦＳ系およびＳＰＦＳ−ＬＰＦＳ系において、通常センサ極表面に限定されてしまう電場増強エリアを３次元的に拡大することができることから、蛍光シグナルの安定性を向上する効果を有する、極めて高感度かつ高精度のアッセイ法に用いるプラズモン励起センサを提供することができる。【００２２】
本発明において、蛍光シグナルが飛躍的に増幅する要因として、（ｉ）表面プラズモン光と局在表面プラズモン光との共鳴に伴う電場増強，（ｉｉ）得られた電場増強を効率的に蛍光シグナル増幅に繋げるための蛍光色素と金属コロイドとの近接，（ｉｉｉ）金属コロイド同士を適切な間隔に配置し、金属基板からの距離を調整することによる高さ方向へのアッセイエリア拡大，が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本発明のプラズモン励起センサの一態様を模式的に示した断面図である。
【図２】図２は、特許文献１に記載のセンサ・ユニットの一態様を模式的に示した断面図である。
【図３】図３は、非特許文献１に記載のＳＰＲセンサチップを模式的に示した断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明のプラズモン励起センサについて具体的に説明する。
【００２５】
＜プラズモン励起センサ＞
本発明のプラズモン励起センサは、透明平面基板と；該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と；該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された、金属コロイドを基点とする高分子からなる層と；該高分子に固定化されたリガンドとを含み、ＳＰＦＳ〔Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；表面プラズモン励起増強蛍光分光法〕−ＬＰＦＳ〔Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；局在表面プラズモン励起増強蛍光分光法〕系による測定方法に供することを特徴とするものである。
【００２６】
なお、本発明のプラズモン励起センサは、金属薄膜の、透明平面基板とは接していないもう一方の表面にＳＡＭ〔Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜〕を形成し、金属コロイドを基点とする高分子を該ＳＡＭに固定化することが好ましい。
【００２７】
また、金属薄膜による蛍光色素の金属消光を防止することを目的として、誘電体からなるスペーサ層を適宜形成してもよい。このスペーサ層は、金属薄膜の、透明平面基板と接していないもう一方の表面に形成されることが好ましい。
【００２８】
（透明平面基板）
本発明において、プラズモン励起センサの構造を支持する平面基板として透明平面基板が用いられる。本発明において、平面基板として透明平面基板を用いるのは、後述する金属薄膜への光照射をこの平面基板を通じて行うからである。
【００２９】
本発明で用いられる透明平面基板について、本発明の目的が達せられる限り、材質に特に制限はない。例えば、この透明平面基板が、ガラス製であってもよく、また、ポリカーボネート〔ＰＣ〕，シクロオレフィンポリマー〔ＣＯＰ〕などのプラスチック製であってもよい。
【００３０】
また、ｄ線（５８８ｎｍ）における屈折率〔ｎd〕が好ましくは１．４０〜２．２０であり、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【００３１】
なお、ガラス製の透明平面基板は、市販品として、ショット日本（株）製の「ＢＫ７」（屈折率〔ｎd〕１．５２）および「ＬａＳＦＮ９」（屈折率〔ｎd〕１．８５），（株）住田光学ガラス製の「Ｋ−ＰＳＦｎ３」（屈折率〔ｎd〕１．８４），「Ｋ−ＬａＳＦｎ１７」（屈折率〔ｎd〕１．８８）および「Ｋ−ＬａＳＦｎ２２」（屈折率〔ｎd〕１．９０），ならびに（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ１０」（屈折率〔ｎd〕１．７２）などが、光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。
【００３２】
透明平面基板は、その表面に金属薄膜を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。
【００３３】
酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。
【００３４】
プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製の「ＰＤＣ２００」）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。
【００３５】
（金属薄膜）
本発明に係るプラズモン励起センサでは、上記透明平面基板の一方の表面に金属薄膜を形成する。この金属薄膜は、光源からの照射光により表面プラズモン励起を生じ、電場を発生させ、蛍光色素の発光をもたらす役割を有する。また、この電場は、金属薄膜と金属コロイドとの間の局在電場を強化させる基となり、かつ金属コロイドと金属コロイドとの間の局在電場の基ともなり、増強電場内の蛍光色素からの発光をさらに増強させる。
【００３６】
上記透明平面基板の一方の表面に形成された金属薄膜としては、金，銀，アルミニウム，銅，および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。これらの金属は、その合金の形態であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。
【００３７】
なお、透明平面基板としてガラス製平面基板を用いる場合には、ガラスと上記金属薄膜とをより強固に接着するため、予めクロム，ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。
【００３８】
透明平面基板上に金属薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法，蒸着法（抵抗加熱蒸着法，電子線蒸着法等），電解メッキ，無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および／または金属薄膜を形成することが好ましい。
【００３９】
金属薄膜の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ，銀：５〜５００ｎｍ，アルミニウム：５〜５００ｎｍ，銅：５〜５００ｎｍ，白金：５〜５００ｎｍ，およびそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜２０ｎｍが好ましい。
【００４０】
電場増強効果の観点から、金：２０〜７０ｎｍ，銀：２０〜７０ｎｍ，アルミニウム：１０〜５０ｎｍ，銅：２０〜７０ｎｍ，白金：２０〜７０ｎｍ，およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜３ｎｍがより好ましい。
【００４１】
金属薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
【００４２】
（誘電体からなるスペーサ層）
誘電体からなるスペーサ層の形成に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物，天然または合成ポリマーを用いることもできる。その中で、化学的安定性，製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素〔ＳｉＯ2〕または二酸化チタン〔ＴｉＯ2〕を含むことが好ましい。
【００４３】
誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０〜２０ｎｍである。一方、電場増強の観点から、好ましくは２００ｎｍ〜１ｍｍであり、さらに電場増強の効果の安定性から、４００ｎｍ〜１，６００ｎｍがより好ましい。本発明のアッセイ法では、測定時にプラズモン励起センサと金属コロイドとの間に生じる電場をより効果的に増強させる目的から、スペーサ層の厚さが１０〜１００ｎｍであることが望ましい。
【００４４】
誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法，電子線蒸着法，熱蒸着法，ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。
【００４５】
（ＳＡＭ）
ＳＡＭ〔Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜〕は、金属薄膜の透明平面基板と接していない面に形成されることが好ましく、本発明のプラズモン励起センサでは、アナライトおよび蛍光色素を、リガンドを介して金属薄膜に捕捉した状態で蛍光を測定するが、このとき、金属コロイドを基点とする高分子を、ＳＡＭを介して金属薄膜に固定する。すなわち、ＳＡＭは、金属コロイドを基点とする高分子を金属薄膜に固定する際の土台としての役割を有する。
【００４６】
またＳＡＭは、金属薄膜の透明平面基板と接していない面に「誘電体からなるスペーサ層」が形成されている場合、該スペーサ層の金属薄膜と接していない面に形成されることが好ましい。
【００４７】
ＳＡＭを金属薄膜表面に直接形成する場合、ＳＡＭが含む単分子としては、通常、炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所，シグマ  アルドリッチ  ジャパン（株）などから入手可能），アミノアルカンチオール、特に好ましくは１０−カルボキシ−１−デカンチオール，１０−アミノ−１−デカンチオール（以下、単に「カルボキシデカンチオール」，「アミノデカンチオール」ともいう。）が用いられる。炭素原子数４〜２０のカルボキシアルカンチオール，アミノアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。
【００４８】
このようなＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。具体例として、金属薄膜がその表面に形成されたガラス製透明平面基板を、１０−カルボキシ−１−デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。このように、１０−カルボキシ−１−デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金薄膜の表面上で自己組織化し、ＳＡＭを形成する。
【００４９】
また、ＳＡＭを誘電体からなるスペーサ層表面に形成する場合、ＳＡＭが含む単分子としては、シランカップリング剤が用いられる。
【００５０】
シランカップリング剤は、反応性基を有するシランカップリング剤が好ましく、このようなシランカップリング剤としては、例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン，８−アミノ−オクチルトリエトキシシラン，６−アミノ−ヘキシルトリエトキシシラン，７−カルボキシ−ヘプチルトリエトキシシラン，５−カルボキシ−ペンチルトリエトキシシランなどが挙げられる。
【００５１】
このようなシランカップリグン剤は、例えば、金属コロイドと結合することができるカルボキシ基またはアミノ基を含有するアルカンチオール類とアミンカップリングにより結合することもできる。
【００５２】
シランカップリング剤からなるＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。
【００５３】
（金属コロイド）
本発明において、金属コロイドは、光源からの光照射によって表面プラズモン励起した金属薄膜からもたらされる電場を受け、この電場により表面プラズモン励起を生じるとともに、金属薄膜との間および金属コロイド間に強い局所電場を生じさせることにより、上記プラズモン励起センサに捕捉された蛍光色素の発光を増強する役割を果たす。このとき、表面プラズモンによる電場増強効果、ならびに金属コロイドと金属薄膜との間および金属コロイド同士間に生じる局在電場による電場増強効果は、金属コロイドが存在しない場合と比べてそれぞれ１５倍程度および７０倍程度に上る。また、原因は不明であるものの、金属コロイドが存在しない場合には、ＳＰＦＳによる蛍光測定の際の蛍光色素からの発光強度が経時的に消光する傾向にあるが、金属コロイドが存在する場合には、蛍光色素からの発光強度における経時的な消光の度合いが少なくなる効果が再現性よく現れる。
【００５４】
本発明で用いられる金属コロイドを構成する金属種には、特に制限はないものの、試料等に対する化学的安定性が高く、可視光によりプラズモン共鳴が効率的に発生することから、金，銀，白金等の貴金属およびこれらの合金からなる群から選択される少なくとも１種の金属が好ましく、その中で、金が特に好ましい。また、この金属コロイドを構成する金属は、金属薄膜を構成する金属と同じでもよく、あるいは異なっていてもよい。
【００５５】
金属コロイドの粒径については、コロイド溶液中でコロイドとして分散状態を維持でき、かつ本発明の作用・効果を発揮できる程度に局在表面プラズモン共鳴を充分に誘起することができる限り特に制限はない。しかし、一般的に、金属コロイドの最大吸光波長は、構成金属種により変わるほか、構成金属種が同じであっても、金属コロイドの粒径が大きくなるほど大きくなる傾向にある。そのため、金属コロイドの粒径は、蛍光色素の最大蛍光波長との関係で、蛍光色素からの蛍光が金属コロイドによる吸光により消光されないような粒径であることが望ましい。具体的には、電子顕微鏡を用いて粒径の平均値を測定した結果、その粒径が０．１ｎｍ〜１０μｍの範囲内にあることが好ましく、１ｎｍ〜１００ｎｍであるとより好ましい。
【００５６】
金属コロイドの形状については、任意の形状のものであってもよく、例えば、球状，楕円状，円柱状などの形状を有するものが挙げられる。
【００５７】
このような金属コロイドは、様々な粒径を有する金属コロイドのコロイド溶液の形態で市販品として入手可能である。あるいは、このような金属コロイドを、従来公知の方法、例えば、ＨＡｕＣｌ4，Ｈ2ＰｔＣｌ4，硝酸銀などの金属化合物の溶液を還元することによって得ることもできる。
【００５８】
また、コロイド溶液中での金属コロイドの分散性を向上させ、また、非特異吸着を防止するため、金属コロイドの表面にポリエチレングリコール〔ＰＥＧ〕修飾等の表面処理を施すことが望ましい。ＰＥＧ修飾金属コロイド粒子は、例えば、特開２００１−２０００５０号公報および特開２００５−３２８８０９号公報等に記載されているように、メルカプト基またはポリアミンを有するＰＥＧを金属微粒子と混合することによる調製することができる。あるいは、ＨＡｕＣｌ4，Ｈ2ＰｔＣｌ4，硝酸銀などの金属化合物の溶液を還元する際に、このような官能基を有するＰＥＧを共存させることにより調製してもよい。
【００５９】
本発明で用いる金属コロイドとして市販されているものも用いることができ、市販品として、例えば、田中貴金属工業（株）製，（株）ワインレッドケミカル製などが好適である。
【００６０】
（高分子）
本発明において、高分子は、金コロイドを分散浮遊状態に近い状態で捕捉し固定化するために用いるものであって、リガンドおよびアナライトに対して不活性であり、かつ水に可溶性である。
【００６１】
このような高分子として、上述した（ｉ）表面プラズモン光と局在表面プラズモン光との共鳴に伴う電場増強，（ｉｉ）得られた電場増強を効率的に蛍光シグナル増幅に繋げるための蛍光色素と金属コロイドとの近接，（ｉｉｉ）金属コロイド同士を適切な間隔に配置し、金属基板からの距離を調整することによる高さ方向へのアッセイエリア拡大の観点から、以下の条件（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を満たすものが好ましい。
【００６２】
条件（Ｉ）：繊維状に伸びる直線構造，球状構造体の連なった構造，ＸＹ平面（金属薄膜の表面を指す。なお、該表面に垂直な方向をＺ方向とする。）の広がりが限定された構造を形成するもの。
【００６３】
ただし、金属コロイドと金属基板との間に多く存在すると増強電場を遮蔽または減衰させることから、例えば、架橋により頑強な網目構造を形成するゲルや、高密度な成形品や塗膜などの層構造を形成する高分子を除く。
【００６４】
なお、ゲルや層構造を形成する高分子であっても、金属薄膜の表面へのパターニングによっては、用いることができるものもある。
【００６５】
条件（ＩＩ）：金属コロイドおよびリガンドを固定化するための反応点を多数有するもの。このような高分子は、リガンドを金属コロイドの近傍に配置することできるため好適である。
【００６６】
条件（ＩＩＩ）：ヒドロキシル基やカルボキシ基などの水和性の官能基を多数有するもの。本発明のプラズモン励起センサを用いるアッセイは水溶液中で実施されるため、疎水性の官能基を多数有する高分子を用いると該センサ表面に局在しやすく、また非特異吸着を起す場合がある。なお、疎水性の官能基を多数有する高分子であっても、親水性加工を施すことによって、本発明に係る高分子として用いることができるものもある。
【００６７】
このような高分子として、具体的には、タンパク質，核酸，多糖類，天然ゴム，合成樹脂，シリコン樹脂，合成繊維，合成ゴムなどが挙げられる。
【００６８】
これらのうち、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）；グルコース，グリコーゲン，デンプン，セルロース，デキストラン，デキストリン，グルカン，フルクトース等の多糖類；多糖類との重合体，ポリエチレンオキサイド構造含有物，アクリル酸誘導体，メタアクリル酸誘導体，ポリビニルアルコール，ポリエチレングリコール，ポリイミン等の線状またはポリマーブラシ状の構造を取り得る合成樹脂；水溶性シリコン樹脂；水溶性モノマーとして、アクリル酸，メタクリル酸，ヒドロキシエチルメタクリレート，アクリルアミド，メタクリルアミド，ジアセトンアクリルアミド，アクリレートまたはメタクリレート（エチレンオキサイド構造を含んでいてもよい。），マレイン酸，２−メチルプロパンスルホン酸等を用いてなるホモポリマーまたはコポリマーなどが好ましい。
【００６９】
特に、多糖類としてデキストランが、合成樹脂としてポリアクリル酸が好ましい。これらの高分子は、非特異吸着低減に対する効果が高い官能基として、水酸基〔−ＯＨ〕およびカルボキシル基〔−ＣＯＯＨ〕を有し、水素結合による水分子の内包により非特異タンパク質の吸着を防ぐことができるため好適である。
【００７０】
これら高分子は、１種単独でも２種以上併用してもよい。
【００７１】
（金属コロイドを基点とする高分子からなる層）
金属コロイドを基点とする高分子は、上記高分子１分子が有する２個の末端のうち、いずれか一方の末端は上記金属コロイドと結合しており、もう一方の末端は上記金属薄膜（好ましくは上記ＳＡＭ）または該金属コロイドと結合しているか、もしくは遊離している態様（このような態様は、その一方の末端が必ず金属コロイドと結合していることから、"金属コロイドを基点とする"を意味している。）であってもよく、または該高分子の側鎖に該金属コロイドを結合する態様であってもよい。
【００７２】
金属コロイドを基点とする高分子の作製方法として、例えば、上記高分子が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、アミノデカンチオールなどが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させた後に、上記金属コロイドを含むコロイド溶液と反応させることによって、アミノデカンチオールを介して金属コロイドをカルボキシメチルデキストランに固定化する方法などが挙げられる。
【００７３】
なお、該コロイド溶液に含まれる金属コロイドの濃度は、０．００００００１％〜０．１％が好ましく、０．００００００１％〜０．０１％がより好ましい。金属コロイドの濃度が上記範囲内であると、効果的に金属コロイドによる局所電場増強効果を得られるため好適である。また、このコロイド溶液として、市販されているコロイド溶液を用いる場合、このコロイド溶液中の金属コロイドの濃度は、製造会社によってそれぞれ異なり、通常０．０３％程度であるので、それ以上の濃度とすることは困難である。
【００７４】
上述の「金属コロイドを基点とする高分子の作製方法」として例示した方法のうち、アミノデカンチオールを介して金属コロイドをカルボキシメチルデキストランに固定化する工程について、より具体的に説明する。なお、本発明において、該工程は、下記工程（Ｉ）または（ＩＩ）を適宜選択することができる。
【００７５】
〔工程（Ｉ）〕
まず、透明平面基板と；該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と；該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面（縦：２ｍｍ，横：１４ｍｍ）に形成された、重量平均分子量が好ましくは１万〜１００万のカルボキシメチルデキストランとを含むプラズモン励起センサ用基板を流路（高さ０．５ｍｍ，容積１ｍＬ）に固定する。
【００７６】
次に、その流路に、アミノデカンチオールを好ましくは０．００１〜１００ｍＭの濃度に調製した溶液１０ｍＬを、好ましくは０．５〜２．０時間循環送液する。金属コロイドを好ましくは０．００００００１％〜０．１％の濃度で含むコロイド溶液１０ｍＬを、好ましくは１〜６０分間循環送液する（より好ましくは、該コロイド溶液を１〜６０分間循環送液後、１Ｍの濃度のアミノエタノールを含むリン酸緩衝溶液を３０〜６０分間循環送液する）ことによって、アミノデカンチオールを介して金属コロイドをカルボキシメチルデキストランに固定化することができる。
【００７７】
〔工程（ＩＩ）〕
予め、金属コロイドを好ましくは０．００００００１％〜０．１％の濃度で含むコロイド溶液に、その濃度が好ましくは０．００１〜１００ｍＭとなるようにアミノデカンチオールを混合し、室温の場合、好ましくは２４時間以上反応させることによって、金属コロイド表面にアミノデカンチオールを結合させる。
【００７８】
そして、上記工程（Ｉ）と同様にしてプラズモン励起センサ用基板を流路に固定する。
【００７９】
次に、その流路に、予め調製したその表面にアミノデカンチオールが結合した金属コロイド溶液（未反応の金属コロイドおよびアミノデカンチオールを除いた。）１０ｍＬを、好ましくは２４時間以上循環させる。このようにしても、アミノデカンチオールを介して金属コロイドをカルボキシメチルデキストランに固定化することができる。
【００８０】
このような作製方法によって得られた金属コロイドを基点とする高分子は、例えば、図１に示すように、金薄膜２に結合しており、金コロイド３を介してデキストラン４同士が直鎖状に連結する態様であってもよい。
【００８１】
このような金属コロイドを基点とする高分子は、金属薄膜（好ましくはＳＡＭ）に、好ましくは１０3〜１０15個／ｍｍ2という密度で、より好ましくは１０5〜１０9個／ｍｍ2という密度で結合する。金属コロイドを基点とする高分子の密度が上記範囲内であると、粗密のバランスが良好である、すなわち、流路中のアナライトと高分子に固定化されているリガンドとが充分に接触できるほど密であり、かつ流路中のアナライト以外の物質を滞留させないほど粗であることから好適である。
【００８２】
また、金属コロイドを基点とする高分子からなる層の厚さ（すなわち、金属コロイドを基点とする高分子の平均の長さ）は、１０〜１，０００ｎｍが好ましく、１０〜５００ｎｍがより好ましい。このような層の厚さが上記範囲内であると、効果的に金属コロイドによる局所電場増強効果および検出エリアの三次元的広がり効果を得られることから好適である。
【００８３】
（リガンド）
本発明では、上記高分子にリガンドを結合させる。このリガンドは、プラズモン励起センサに、検体中のアナライトを固定させる目的で用いられるものである。なお、本発明において、工程（ａ）で用いられるリガンドを「第１のリガンド」と称するのは、後述する工程（ｂ）で用いられるリガンド（「第２のリガンド」）と区別するためである。
【００８４】
本発明において、「リガンド」とは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し（または、認識され）結合し得る分子または分子断片をいう。このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド，オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子，複合体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８５】
「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能），抗ガン胎児性抗原〔ＣＥＡ〕モノクローナル抗体，抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体，抗ＰＳＡモノクローナル抗体などが挙げられる。
【００８６】
なお、本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体，遺伝子組換えにより得られる抗体，および抗体断片を包含する。
【００８７】
このリガンドの固定化方法としては、例えば、上記ＳＡＭを形成するシランカップリング剤などが有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、上記リガンドが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。
【００８８】
なお、後述する検体等がプラズモン励起センサに非特異的に吸着することを防止するため、上記リガンドを固定化させた後に、プラズモン励起センサの表面を牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕やアミノエタノール等のブロッキング剤により処理することが好ましい。
【００８９】
（ＳＰＦＳ−ＬＰＦＳ系による測定方法）
本発明において、金属コロイドを利用した「ＳＰＦＳ−ＬＰＦＳ系による測定方法」は、新規であり、表面プラズモン励起による金属薄膜の電場増強効果と、金属コロイドの局所電場増強効果とが同時に得られる。なお、本発明は、ＳＰＦＳ−ＬＰＦＳ系による測定方法のみならず、ＳＰＦＳ系による測定方法に供することも可能である。
【００９０】
「ＳＰＦＳ−ＬＰＦＳ系による測定方法」とは、プラズモン励起センサが有する上記透明平面基板の、上記金属薄膜が形成されている表面の反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射することによって、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する方法である。
【００９１】
＜アッセイ法＞
本発明のアッセイ法は、少なくとも下記工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とするものであり、適宜洗浄工程を含むことが好ましい。
【００９２】
工程（ａ）：本発明のプラズモン励起センサに検体を接触させる工程，
工程（ｂ）：上記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程，
工程（ｃ）：上記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサが有する透明平面基板の、上記金属薄膜が形成されている表面の反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された上記蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程，および
工程（ｄ）：上記工程（ｃ）で得られた測定結果から、上記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程。
【００９３】
洗浄工程：上記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面、および上記工程（ｂ）を経て得られるプラズモン励起センサの表面のうち少なくともいずれか一方を洗浄する工程。
【００９４】
〔工程（ａ）〕
工程（ａ）とは、本発明のプラズモン励起センサ、すなわち、「透明平面基板」と；該基板の一方の表面に形成された「金属薄膜」と；該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に固定化された「金属コロイドを基点とする高分子」と；該高分子に固定化された「第１のリガンド」とからなるプラズモン励起センサに検体を接触させる工程である。
【００９５】
なお、「透明平面基板」，「金属薄膜」および「金属コロイドを基点とする高分子」については、上述した通りである。
【００９６】
（第１のリガンド）
本発明において、工程（ａ）で用いられるリガンドを「第１のリガンド」と称するのは、下記工程（ｂ）で用いられるリガンド（「第２のリガンド」）と区別するためである。
【００９７】
第１のリガンドは、上述した「リガンド」と同様である。
【００９８】
（検体）
本発明において、「検体」とは、本発明のアッセイ法による測定対象となる種々の試料をいう。
【００９９】
「検体」としては、例えば、血液（血清・血漿），尿，鼻孔液，唾液，便，体腔液（髄液，腹水，胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒，緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液および唾液が好ましい。これらは１種単独で用いてもよく、また、２種以上を併用してもよい。
【０１００】
（接触）
本発明において、「接触」とは、プラズモン励起センサのリガンド等が固定化されている面が送液中に浸漬されている状態で、この送液中に含まれる対象物をこのプラズモン励起センサと接触させることをいう。工程（ａ）では、上記検体とプラズモン励起センサとの「接触」は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、プラズモン励起センサのリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、プラズモン励起センサと検体とを接触させる態様が好ましい。
【０１０１】
上記「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる直方体または管状のものである。また、この流路の形状として、プラズモン励起センサを設置する個所近傍は直方体構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は管状を有することが好ましい。
【０１０２】
その材料としては、プラズモン励起センサ部ではメチルメタクリレート，スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどの光透過性の材質からなり、薬液送達部ではシリコーンゴム，テフロン(登録商標)，ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いる。
【０１０３】
ただし、プラズモン励起センサ部については、蛍光測定時に流路が一定の形状に保たれ、かつプラズモン励起により発生した蛍光の検出が妨げられない限り、必ずしもその流路造のすべてを光透過性の材質のみから構成する必要はない。すなわち、プラズモン励起センサ部の流路のうち、プラズモン励起により発生した蛍光を透過させて検出部に導くために必要な部分、具体的には蛍光の集光に必要な透光窓を含む部分については、光透過性の材質で構成する必要があるが、その他の部分については、その一部または全部を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。プラズモン励起センサ部の流路が直方体構造を有する場合、金属薄膜（または、好ましくはＳＡＭ）が表面に存在するプラズモン励起センサの面を底面としたときに、例えば、この底面と対向する位置にある天井面を光透過性の材質で構成し、側面を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。
【０１０４】
ここで、上記その他の部分、例えば側面は、蛍光測定時に一定の形状が保たれる限り、必ずしも剛体である必要はなく、シール性を確保するために適度な弾性を有していてもよい。例えば、プラズモン励起センサ部の流路について、天井面をポリメチルメタクリレート〔ＰＭＭＡ〕で構成し、側面をシリコーンゴムで構成してもよい。
【０１０５】
プラズモン励起センサ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、プラズモン励起センサ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ〜１ｍｍ程度が好ましい。
【０１０６】
流路において、薬物送達部からプラズモン励起センサ部に送液を導入する送液導入口、およびその送液をプラズモン励起センサ部から排出する送液排出口の位置は、いずれも、蛍光測定の妨げとならない限り特に限定されない。例えば、プラズモン励起センサ部の流路が直方体構造を有する場合、前記送液導入口及び送液排出口とも天井面に設けるのが流路の作製上簡便であるが、この送液導入口と送液排出口とのうちいずれか一方、あるいはその両方を側面に設けてもよい。
【０１０７】
流路にプラズモン励起センサを固定する方法は、流路が一定の形状に保たれ、かつ蛍光測定が妨げられない限り特に限定されない。
【０１０８】
このような固定方法の例としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている表面上に、一定の厚さを有するシリコーンゴム製シートまたはＯリングを載せることによって流路の側面構造を形成し、次いで、その上に送液導入口及び送液排出口を設けてある光透過性の天板（例えば、ＰＭＭＡ基板）を配置することによって流路の天井面を形成し、その後、これらを圧着して適当な留め具により固定する方法などが挙げられる。このとき、側面構造を構成する材料として、その中央部に任意の形状および大きさを有する穴を開けてある、適当な厚さを有するシリコーンゴム製シートを用いると、この穴の内周がプラズモン励起センサ部の流路の側面構造となることから、所要の形状および大きさを有する流路を容易に形成することができるので好ましい。例えば、まず、該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有する穴あきポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを該プラズモン励起センサの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして配置し、次いで、このポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートの上に、予め送液導入口および送液排出口を設けてあるＰＭＭＡ基板を配置し、その後、該ＰＭＭＡ基板と該ポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートと該プラズモン励起センサとを圧着し、ビス等の留め具により固定する方法が好ましい。また、プラズモン励起センサに、シリコーンゴム製シートまたはＯリングと光透過性の天板とを圧着し、固定するにあたっては、必要に応じて、シリコーンゴムまたはステンレスなどの材質でできた適当なスペーサを併用してもよい。
【０１０９】
また、工業的に製造される大ロット（工場レベル）では、流路にプラズモン励起センサを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に直接金基板を形成するかあるいは別途作製した金基板を固定し、金表面に（好ましくはＳＡＭ）金コロイドを基点とする高分子からなる層の形成およびリガンドの固定化を行った後、流路の天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。
【０１１０】
このような「送液」としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕，トリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【０１１１】
送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃×１〜６０分間、好ましくは３７℃×５〜１５分間である。
【０１１２】
送液中の検体中に含有されるアナライトの初期濃度は、１００μｇ／ｍＬ〜０．０００１ｐｇ／ｍＬであってもよい。
【０１１３】
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．０００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．０１〜１ｍＬである。
【０１１４】
送液の流速は、通常１〜２,０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μＬ／ｍｉｎである。
【０１１５】
〔洗浄工程〕
洗浄工程とは、工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサの表面、および後述する工程（ｂ）を経て得られるプラズモン励起センサの表面のうち少なくともいずれか一方を洗浄する工程である。この洗浄工程は、工程（ｂ）の前後のうち少なくともいずれか一方に含まれることが好ましい。
【０１１６】
洗浄工程に使用される洗浄液としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０，ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を、工程（ａ）および（ｂ）の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に溶解させ、好ましくは０．００００１〜１重量％含有するものが望ましい。
【０１１７】
洗浄液を循環させる温度および流速は、上記工程（ａ）の「送液を循環させる温度および流速」と同じであることが好ましい。
【０１１８】
洗浄液を循環させる時間は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。
【０１１９】
〔工程（ｂ）〕
工程（ｂ）とは、上記工程（ａ）を経て得られたプラズモン励起センサに、第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程である。
【０１２０】
（蛍光色素）
「蛍光色素」とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
【０１２１】
本発明で用いられる蛍光色素は、後述する金属コロイドによる吸光に起因する消光を受けない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計〔ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ〕よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。
【０１２２】
このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製），ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製），ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製），クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製），ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス（株）製），シアニン・ファミリーの蛍光色素，インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素，オキサジン・ファミリーの蛍光色素，チアジン・ファミリーの蛍光色素，スクアライン・ファミリーの蛍光色素，キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製），ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素，ピレン・ファミリーの蛍光色素，トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。
【０１２３】
これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。
【０１２４】
【表１】
2010134592.tif 000003
【０１２５】
また、蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、Ｅｕ，Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も、本発明に用いられる蛍光色素となりうる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０〜３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ3+が挙げられる。さらに、青色蛍光タンパク質〔ＢＦＰ〕，シアン蛍光タンパク質〔ＣＦＰ〕，緑色蛍光タンパク質〔ＧＦＰ〕，黄色蛍光タンパク質〔ＹＦＰ〕，赤色蛍光タンパク質〔ＤｓＲｅｄ〕またはＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ〔ＡＰＣ〕（ＬｙｏＦｌｏｇｅｎ（登録商標））などに代表される蛍光タンパク質，ラテックスやシリカなどの蛍光微粒子なども、本発明に用いられる蛍光色素となりうる。
【０１２６】
本発明においては、後述する蛍光測定を行う際に、金属コロイドに含まれる金属による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属コロイドとして金を用いる場合には、金コロイドによる吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。したがって、この場合には、Ｃｙ５，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、金属コロイドとして銀を用いる場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。
【０１２７】
これら蛍光色素は１種単独でも、２種以上併用してもよい。
【０１２８】
（第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート）
「第２のリガンドと蛍光色素からなるコンジュゲート」は、リガンドとして２次抗体を用いる場合、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）を認識し結合し得る抗体であることが好ましい。
【０１２９】
本発明のアッセイ法において、第２のリガンドは、アナライトに蛍光色素による標識化を行う目的で用いられるリガンドであり、上記第１のリガンドと同じでもよいし、異なっていてもよい。ただし、第１のリガンドとして用いる１次抗体がポリクローナル抗体である場合、第２のリガンドとして用いる２次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該１次抗体がモノクローナル抗体である場合、２次抗体は、該１次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。
【０１３０】
さらに、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）と競合する第２のアナライト（競合抗原；ただし、標的抗原とは異なるものである。）と２次抗体とが予め結合した複合体を用いる態様も好ましい。このような態様は、蛍光信号（蛍光シグナル）量と標的抗原量とを比例させることができるため好適である。
【０１３１】
「第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート」の作製方法としては、第２のリガンドとして２次抗体を用いる場合、例えば、まず蛍光色素にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と２次抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ビオチン化された蛍光色素とストレプトアビジン化された２次抗体（あるいは、ストレプトアビジン化された蛍光色素とビオチン化された２次抗体）とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。
【０１３２】
このように作製された「第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート」の送液中の濃度は、０.００１〜１０,０００μｇ／ｍＬが好ましく、１〜１,０００μｇ／ｍＬがより好ましい。
【０１３３】
送液を循環させる温度、時間および流速は、それぞれ上記工程（ａ）の場合と同様である。
【０１３４】
〔工程（ｃ）〕
工程（ｃ）とは、上記工程（ｂ）を経て得られたプラズモン励起センサが有する透明平面基板の、上記金属薄膜が形成されている表面の反対側の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された上記蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。
【０１３５】
（光学系）
本発明のアッセイ法で用いる光源は、金属薄膜および金属コロイド粒子にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
【０１３６】
レーザ光の照射により、全反射減衰条件〔ＡＴＲ〕において、金属薄膜の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、透明平面基板の屈折率、金属薄膜の金属種および膜厚に依存するが、通常、金では約１０〜２０倍の増加量となる。本発明のアッセイ法では、金属薄膜における表面プラズモン発生に加えて、金属コロイドにおける表面プラズモン発生、および金属薄膜と金属コロイドとの間に生じる局在電場の増強も生じることから、さらに電場増強が誘起され、さらにフォトンが増加し、蛍光色素をさらに強く励起する。
【０１３７】
蛍光色素は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。
【０１３８】
「レーザ光」としては、例えば、波長２００〜９００ｎｍ、０.００１〜１,０００ｍＷのＬＤ，波長２３０〜８００ｎｍ（金属薄膜に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザなどが挙げられる。
【０１３９】
「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン励起センサに効率よく入射することを目的としており、屈折率が透明平面基板と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度，形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明平面基板」の市販品と同様のものが挙げられる。
【０１４０】
「光学フィルタ」としては、例えば、減光〔ＮＤ〕フィルタ，ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光〔ＮＤ〕フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
【０１４１】
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
【０１４２】
「カットフィルタ」は、外光（ＳＰＦＳ用分析装置外の照明光），励起光（励起光の透過成分），迷光（各所での励起光の散乱成分），プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光），酵素蛍光基質の自家蛍光などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ，色フィルタなどが挙げられる。
【０１４３】
「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【０１４４】
「ＳＰＦＳ検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。
【０１４５】
〔工程（ｄ）〕
工程（ｄ）とは、上記工程（ｃ）で得られた測定結果から、上記検体中に含まれるアナライトの量を算出する工程である。
【０１４６】
より具体的には、既知濃度の標的抗原もしくは標的抗体での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中の標的抗原量もしくは標的抗体量を測定シグナルから算出する工程である。
【０１４７】
（アナライト）
アナライトとしては、上記高分子に固定化された第１のリガンドを特異的に認識され（または、認識し）結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド，オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子，複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ〔αフェトプロテイン〕等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー，シグナル伝達物質，ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【０１４８】
（アッセイＳ／Ｎ比）
さらに、工程（ｄ）は、上記工程（ｃ）の前に測定した"ブランク蛍光シグナル"、上記工程（ｃ）で得られた"アッセイ蛍光シグナル"、および何も修飾していない金基板を流路に固定し、超純水を流しながらＳＰＦＳを測定して得られたシグナルを"初期ノイズ"としたとき、下記式（１ａ）で表されるアッセイＳ／Ｎ比を算出することができる：
アッセイＳ／Ｎ比＝｜Ｉａ／Ｉｏ｜／Ｉｎ  …（１ａ）
（上記式（１ａ）において、Ｉａはアッセイ蛍光シグナル、Ｉｏはブランク蛍光シグナル、Ｉｎは初期ノイズである）。
【０１４９】
ただし、アッセイＳ／Ｎ比を算出するにあたっては、実用上、上記式（１ａ）に代えて、検体中に含まれるアナライトの濃度が０の場合における"アッセイノイズシグナル"を基準として、下記式（１ｂ）にしたがって算出してもよい：
アッセイＳ／Ｎ比＝｜Ｉａ｜／｜Ｉａｎ｜  …（１ｂ）
（上記式（１ｂ）において、Ｉａｎはアッセイノイズシグナル、Ｉａは上記式（１ａ）の場合と同様にアッセイ蛍光シグナルである）。
【０１５０】
＜ＳＰＦＳ用分析装置＞
本発明のＳＰＦＳ用分析装置は、少なくとも、本発明のプラズモン励起センサを含み、本発明のアッセイ法に用いられることを特徴とするものであり、ＳＰＲ系による測定にも転用することができる。
【０１５１】
このような「ＳＰＦＳ用分析装置」としては、例えば、光源，各種光学フィルタ，プリズム，カットフィルタ，集光レンズ，表面プラズモン励起増強蛍光検出部なども含むことができる。なお、検体液，洗浄液，標識抗体液などを取り扱う際に、プラズモン励起センサと組み合った送液系を有することが好ましい。送液系としては、本発明の目的が達せられる限り、その種類を問わない。例えば、液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい。
【０１５２】
また、表面プラズモン共鳴〔ＳＰＲ〕検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサとしてのフォトダイオード、ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰〔ＡＴＲ〕条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、４５〜８５°の角度変更を可能とする。分解能は０．０１°以上が好ましい。）、表面プラズモン励起増強蛍光検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。
【０１５３】
「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ，送り精度が高く脈動が少なく好ましいが循環することができないシリンジポンプ，簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。
【０１５４】
＜アッセイ用キット＞
本発明のアッセイ用キットは、透明平面基板と；該基板の一方の表面に形成された金属薄膜と；該薄膜の、該基板とは接していないもう一方の表面に形成された、金属コロイドを基点とする高分子からなる層とからなり、本発明のプラズモン励起センサに用いられるプラズモン励起センサ用基板を、少なくとも含むことを特徴とするものである。
【０１５５】
このような「アッセイ用キット」は、本発明のアッセイ法を実施するにあたり、第１のリガンドと第２のリガンドと検体とを除き必要とされるすべてのもの、例えば、１次抗体、抗原などのリガンド（すなわち、検体中に含まれるアナライトは、抗原とは限らず、抗体であってもよい。）と検体と２次抗体とを除き必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。
【０１５６】
例えば、本発明のアッセイ用キットと、検体として血液または血清と、特定の腫瘍マーカーに対する抗体とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
【０１５７】
このような「アッセイ用キット」としては、具体的に、プラズモン励起センサ用基板；ＳＡＭを形成するための炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール；蛍光色素；検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液；プラズモン励起センサと検体とを反応させるための各種反応試薬および洗浄試薬が挙げられ、本発明のアッセイ法を実施するために必要とされる各種器材または資材や上記「ＳＰＦＳ用分析装置」を含めることもできる。
【０１５８】
さらに、キット要素として、検量線作成用の標準物質，説明書，多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。
【実施例】
【０１５９】
次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【０１６０】
［作製例１］（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識２次抗体の作製）
２次抗体として、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（１Ｄ５；２．５ｍｇ／ｍＬ，（株）日本医学臨床検査研究所製）を、市販のビオチン化キット（（株）同仁化学研究所製）を用いてビオチン化した。手順は、該キットに添付のプロトコールに従った。【０１６１】
次に、得られたビオチン化抗ＡＦＰモノクローナル抗体の溶液とストレプトアビジン標識Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）溶液とを混合し、４℃で６０分間、攪拌混合することで反応させた。【０１６２】
最後に、未反応抗体および未反応酵素を、分子量カットフィルタ（日本ミリポア（株）製）を用いて精製することで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。得られた抗体溶液はタンパク定量後、４℃で保存した。【０１６３】
［実施例１］(プラズモン励起センサの製造)
屈折率〔ｎd〕１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ  １０」）をプラズマ洗浄し、該基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。【０１６４】
このようにして得られた基板を、１ｍＭに調製した１０−アミノ−１−デカンチオールのエタノール溶液１０ｍＬに２４時間浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭを形成した。この基板を、該エタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールでそれぞれ洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。【０１６５】
続いて、分子量５０万のカルボキシメチルデキストランを２ｍｇ／ｍＬと、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を１００ｍＭとを含むリン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕にＳＡＭを形成した基板を１時間浸漬し、ＳＡＭにカルボキシメチルデキストランを固定化した。【０１６６】
次に、このように基板上に形成したＳＡＭの表面に、流路高さ０．５ｍｍを有し、かつ適当な形状および大きさを有する穴のあいたポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを設け、さらに、このＰＤＭＳ製シートの周囲にシリコーンゴム製スペーサを配置した（このシリコーンゴム製スペーサは送液に触れない状態にある。）。このＰＤＭＳ製シートおよび該シリコーンゴム製スペーサの上に、送液導入用の穴及び送液排出用の穴を予めそれぞれ形成してあるＰＭＭＡ基板を、ＰＤＭＳ製シートで囲まれた領域の内側にこれらの穴が位置するように配置した（このとき、ＳＡＭ表面が流路の内側となるように、ＰＭＭＡ基板が配置されている）。これらを流路の外側から圧着し、ビスでＰＭＭＡ基板と流路シート（すなわち、前記ＰＤＭＳ製シート）とプラズモン励起センサ（すなわち、ＳＡＭを形成した基板）とを固定した。【０１６７】
続いて、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を１００ｍＭとを含むリン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕を５ｍＬ送液し、２０分間循環送液させた後に、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（１Ｄ５；２．５ｍｇ／ｍＬ，（株）日本医学臨床検査研究所製）溶液２.５ｍＬを３０分間循環送液することで、カルボキシメチルデキストランに１次抗体を固相化した。【０１６８】
さらに、アミノデカンチオールを１ｍＭの濃度に調製した溶液１０ｍＬを１時間循環送液した。平均粒径２０ｎｍの金コロイドを０．０００７５％の濃度で含むコロイド溶液１０ｍＬを１０分循環送液後、１２時間放置することによって、アミノデカンチオールを介して金コロイドをカルボキシメチルデキストランに固定化した。【０１６９】
なお、１重量％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕および１Ｍのアミノエタノールを含むＰＢＳにて３０分間循環送液することで、非特異的吸着防止処理を行った。【０１７０】
［比較例１］（プラズモン励起センサの製造）
実施例１において、ＳＡＭを形成する際、１０−アミノ−１−デカンチオールの代わりに１０−カルボキシ−１−デカンチオールを用い、さらに金コロイドおよびデキストランを用いず、かつＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を１００ｍＭとを含むリン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕を５ｍＬ送液し、２０分間循環送液させた後に、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（１Ｄ５；２．５ｍｇ／ｍＬ，（株）日本医学臨床検査研究所製）溶液２.５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＳＡＭ上に１次抗体を固相化した以外は実施例１と同様にしてプラズモン励起センサを作製した。【０１７１】
［比較例２］（プラズモン励起センサの製造）
実施例１において、金コロイドを用いなかった以外は実施例１と同様にしてプラズモン励起センサを作製した。【０１７２】
実施例１および比較例１，２のそれぞれで製造したプラズモン励起センサの構成を下表にまとめる。【０１７３】
【表２】
2010134592.tif 000004
【０１７４】
［実施例２］（アッセイ法の実施）
工程（ａ）として、まず、実施例１で得られたプラズモン励起センサに標的抗原としてＡＦＰを１ｎｇ／ｍＬ含むＰＢＳ溶液を０．５ｍＬ添加し、２５分間循環させた。【０１７５】
工程（ｂ）として、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むトリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕を送液として１０分間循環させることによって洗浄した後、作製例２で得られたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識２次抗体（１,０００ｎｇ／ｍＬとなるように調製したＰＢＳ溶液）を２．５ｍＬ添加し、２０分間循環させた。【０１７６】
工程（ｃ）として、まず、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳを送液として１０分間循環させることによって洗浄した。プラズモン励起センサに、ガラス製の透明平面基板の、金薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズム（シグマ光機（株）製）を経由してレーザ光（６４０ｎｍ、４０μＷ）を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量をＣＣＤから観察したときのシグナル値を計測し「アッセイシグナル」とした。【０１７７】
なお、ＡＦＰが０ｎｇ／ｍＬの場合におけるＳＰＦＳシグナルを「アッセイノイズシグナル」とした。【０１７８】
工程（ｄ）として、上記工程（ｃ）で得られた測定結果から、アッセイＳ／Ｎ比を以下の式を用いて算出し、各条件での感度に関して、金コロイドを使用しない測定結果（比較例１）を基準とした規格値（ＬＰ増強率）により評価した。【０１７９】
アッセイＳ／Ｎ比＝｜（アッセイ蛍光シグナル）｜／｜（アッセイノイズシグナル）｜
すなわち、規格値（ＬＰ増強率）が大きければアッセイＳ／Ｎ比が向上していることを意味し、イムノアッセイ測定の信頼性が高いことがわかる。【０１８０】
得られた結果を表３に示す。【０１８１】
［実施例３］（アッセイ法の実施）
実施例２の工程（ｃ）において、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５重量％含むＴＢＳを送液として１０分間循環させることによって洗浄した後、０．５ｍＬ、０．０００７５％金コロイド溶液（金コロイド平均粒径２０ｎｍ）を０．５ｍＬ／ｍｉｎで送液することでプラズモン励起センサに金コロイドを接触させた以外は実施例２と同様にしてアッセイＳ／Ｎ比を算出した。【０１８２】
得られた結果を表３に示す。【０１８３】
［比較例３］（アッセイ法の実施）
実施例２において、実施例１で得られたプラズモン励起センサの代わりに比較例１で得られたプラズモン励起センサを用いた以外は実施例２と同様にしてアッセイＳ／Ｎ比を算出した。【０１８４】
得られた結果を表３に示す。【０１８５】
［比較例４］（アッセイ法の実施）
実施例２において、実施例１で得られたプラズモン励起センサの代わりに比較例２で得られたプラズモン励起センサを用いた以外は実施例２と同様にしてアッセイＳ／Ｎ比を算出した。【０１８６】
得られた結果を表３に示す。【０１８７】
【表３】
2010134592.tif 000005
【０１８８】
表３から、表面プラズモン増強蛍光を使用したとき（比較例２，３）に比べて、金属コロイドを分散状態で使用した系（実施例２，３）では有意に感度が向上していることが明らかである。【０１８９】
本発明では、金属コロイドが高分子からなる層中に分散に近い状態で固定化されているため、金属コロイド密度は極めて均質である。そのため、従来報告されているような局在プラズモンを利用した方法と比べて高い再現性が見込まれ、本発明が高感度かつ高精度な測定方法であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１９０】
本発明のプラズモン励起センサを用いたアッセイ法は、高感度かつ高精度に検出することができる方法であるから、例えば、血液中に含まれる極微量の腫瘍マーカーであっても検出することができ、この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。
【符号の説明】
【０１９１】
１・・・・・・透明平面基板
２・・・・・・金薄膜
３・・・・・・金コロイド
４・・・・・・デキストラン
５・・・・・・抗体
６・・・・・・カバーガラス
７・・・・・・金フィルム
８・・・・・・分子インプリントポリマーからなるゲル
９・・・・・・結合サイト
１０・・・・・・金ナノパーティクル
１１・・・・・・透明プレート
１２・・・・・・金属フィルム
１４・・・・・・デキストラン層
１５・・・・・・抗デキストランからなる１つの活性部分と検出しようとしている抗体に対する抗原からなる別の部分とを有する二官能価あるいは多官能価分子
【図１】
2010134592.tif 000006
【図２】
2010134592.tif 000007
【図３】
2010134592.tif 000008
【国際調査報告】
2010134592.tif 000009
2010134592.tif 000010
2010134592.tif 000011
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