(57)【要約】  本発明は、多種類の癌で発現しているタンパク質を用いて癌を検出する方法、ならびにそのタンパク質を標的とする癌を治療または予防するための医薬組成物を提供する。さらには、そのタンパク質に由来する癌抗原ペプチドを含む医薬組成物を提供する。詳細には、該方法は、対象から得られた試料においてｅＥＦ２ポリペプチドまたはｅＥＦ２抗体の存在または量を調べる工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の癌を検出する方法であって、該対象から得られた試料においてｅＥＦ２ポリペプチド、ｅＥＦ２抗体またはｅＥＦ２遺伝子の転写物の存在または量を調べる工程を含む方法。
【請求項２】
前記癌が、肺腺癌、非小細胞性肺癌、小細胞性肺癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大腸癌、膵管癌、神経膠芽腫、および悪性リンパ腫からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
癌細胞の増殖を阻害する二本鎖ｓｉＲＮＡであって、センス鎖が配列番号：２に示されるＲＮＡ配列からなり、アンチセンス鎖が配列番号：３に示されるＲＮＡ配列からなる、二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
前記癌細胞が、胃癌、肺癌、膵癌、神経膠芽腫および悪性リンパ腫からなる群から選択される癌に由来する、請求項３記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項５】
有効成分として請求項３または４記載の二本鎖ｓｉＲＮＡを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項６】
有効量の請求項５記載の医薬組成物を対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法。
【請求項７】
癌を治療または予防するための医薬の製造のための、請求項３または４記載の二本鎖ｓｉＲＮＡの使用。
【請求項８】
癌細胞の増殖を阻害するｓｈＲＮＡであって、配列番号：１８または１９に示すＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡを標的とする、ｓｈＲＮＡ。
【請求項９】
請求項８記載のｓｈＲＮＡが転写される核酸であって、配列番号：２０または２２に示すＤＮＡ配列を有する核酸。
【請求項１０】
請求項９記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項８記載のｓｈＲＮＡ、請求項９記載の核酸または請求項１０記載のベクターを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項１２】
有効量の請求項１１記載の医薬組成物を対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法。
【請求項１３】
癌を治療または予防するための医薬の製造のための、請求項８記載のｓｈＲＮＡ、請求項９記載の核酸または請求項１０記載のベクターの使用。
【請求項１４】
ｅＥＦ２タンパク質由来の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するｅＥＦ２ペプチドであって、前記アミノ酸配列が、
（ａ）Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ（配列番号：４）；
（ｂ）Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ（配列番号：５）；
（ｃ）Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ（配列番号：６）；
（ｄ）Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ（配列番号：７）；ならびに
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）に示すアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、または欠失もしくは付加されたアミノ酸配列
からなる群から選択されるものであるｅＥＦ２ペプチドを含む、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性対象の癌を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項１５】
アミノ酸配列が、Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ（配列番号：７）である、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１４記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、対象の癌を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項１７】
前記癌が、肺腺癌、小細胞性肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、膵管癌、悪性神経膠芽腫、悪性リンパ腫および頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択されるものである、請求項１４〜１６のうちのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１８】
有効量の請求項１４〜１７のいずれか１項記載の医薬組成物を、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法。
【請求項１９】
癌を治療または予防するための医薬を製造するための、請求項１４記載のペプチドの使用。
【請求項２０】
ｅＥＦ２タンパク質由来の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するｅＥＦ２ペプチドであって、前記アミノ酸配列が、
（ａ）Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ（配列番号：８）；
（ｂ）Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号：９）；
（ｃ）Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ（配列番号：１０）；
（ｄ）Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ（配列番号：１１）；
（ｅ）Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ（配列番号：１２）；
（ｆ）Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ（配列番号：１３）；
（ｇ）Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ（配列番号：１４）；ならびに
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）に示すアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、または欠失もしくは付加されたアミノ酸配列
からなる群から選択されるものであるｅＥＦ２ペプチドを含む、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性対象の癌を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項２１】
アミノ酸配列が、Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ（配列番号：８）またはＩｌｅ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ（配列番号：１１）である、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
アミノ酸配列が、Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ（配列番号：１４）において、第２位アミノ酸ＩｌｅをＬｅｕまたはＭｅｔに置換し、および／または第９位アミノ酸ＶａｌをＬｅｕに置換したものである、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２３】
請求項２０記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、対象の癌を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項２４】
前記癌が、肺腺癌、小細胞性肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、膵管癌、悪性神経膠芽腫、悪性リンパ腫および頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択されるものである、請求項２０〜２３のうちのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２５】
有効量の請求項２０〜２４のいずれか１項記載の医薬組成物を、対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法。
【請求項２６】
癌を治療または予防するための医薬を製造するための、請求項２０記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌を検出する方法および癌治療／予防用医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、ＨＬＡ分子との結合能を有するｅＥＦ２タンパク質由来の連続するアミノ酸を含むペプチド、これらのペプチドを含む癌治療／予防用医薬組成物、詳細には、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ｅＥＦ２ペプチド、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチド、もしくはＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性ｅＥＦ２ペプチド、およびそれらを含む癌治療／予防用医薬組成物などを提供する。なお、本願は、日本国特許出願第２００９−００２６０８号に対して優先権を主張するものであり、参照することによりその全内容を本願に取り込む。
【背景技術】
【０００２】
これまで様々な癌マーカーが知られているが、多種類の癌を１つのマーカーで診断できる癌マーカーはほとんどなく、かかる癌マーカーの探索が熱心に行われている。一方、今日、ＨＥＲ２を標的とするトラスツズマブ、チロシンキナーゼの１つを標的とするイマチニブ、ＥＧＦＲを標的とするゲフィチニブ、ＣＤ２０抗原を標的とするリツキシマブなどの癌の分子標的薬が次々と開発されているが、翻訳伸長因子として知られるｅＥＦ２（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２）を標的とした癌治療／予防用医薬組成物は、いまだ存在していない（非特許文献１）。また、種々の癌について抗原タンパク質の検索が行われているが、癌抗原として証明されているものは少ない。
【非特許文献１】Nygard O, Nilsson L. Kinetic determination of the effects of ADP-ribosylation on the interaction of eukaryotic elongation factor 2 with ribosomes. J Biol Chem. 1990; 265:6030-4
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明の解決課題は、多種類の癌で発現するタンパク質を指標として癌を検出する方法、ならびに該方法により検出された癌を治療または予防するための医薬組成物を提供することにある。さらには、このタンパク質に由来する癌抗原ペプチドを含む医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、多種類の癌組織で高発現する１つのマーカータンパク質ｅＥＦ２を見出し、このマーカータンパク質の発現およびこのマーカータンパク質に対して体内で産生される抗体を指標とする癌の検出方法およびｅＥＦ２タンパク質を標的とする癌の治療／予防用医薬組成物を完成させた。さらに、本発明者らは、ｅＥＦ２タンパク質をコードする連続するアミノ酸配列の一部が、癌抗原ペプチドとして機能することを知見し、これらを癌の治療／予防用医薬組成物として用いることが可能なことを示した。【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）対象の癌を検出する方法であって、該対象から得られた試料においてｅＥＦ２ポリペプチド、ｅＥＦ２抗体またはｅＥＦ２遺伝子の転写物の存在または量を調べる工程を含む方法、
（２）前記癌が、肺腺癌、非小細胞性肺癌、小細胞性肺癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大腸癌、膵管癌、神経膠芽腫、および悪性リンパ腫からなる群から選択される、（１）記載の方法、
（３）癌細胞の増殖を阻害する二本鎖ｓｉＲＮＡであって、センス鎖が配列番号：２に示されるＲＮＡ配列からなり、アンチセンス鎖が配列番号：３に示されるＲＮＡ配列からなる、二本鎖ｓｉＲＮＡ、
（４）前記癌細胞が、胃癌、肺癌、膵癌、神経膠芽腫および悪性リンパ腫からなる群から選択される癌に由来する、（３）記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ、
（５）有効成分として（３）または（４）記載の二本鎖ｓｉＲＮＡを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物、
（６）有効量の請求項５記載の医薬組成物を対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法、
（７）癌を治療または予防するための医薬の製造のための、（３）または（４）記載の二本鎖ｓｉＲＮＡの使用、
（８）癌細胞の増殖を阻害するｓｈＲＮＡであって、配列番号：１８または１９に示すＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡを標的とする、ｓｈＲＮＡ、
（９）（８）記載のｓｈＲＮＡが転写される核酸であって、配列番号：２０または２２に示すＤＮＡ配列を有する核酸、
（１０）（９）記載の核酸を含むベクター、
（１１）（８）記載のｓｈＲＮＡ、（９）記載の核酸または（１０）記載のベクターを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物、
（１２）有効量の（１１）記載の医薬組成物を対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法、
（１３）癌を治療または予防するための医薬の製造のための、（８）記載のｓｈＲＮＡ、（９）記載の核酸または（１０）記載のベクターの使用、
（１４）ｅＥＦ２タンパク質由来の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するｅＥＦ２ペプチドであって、前記アミノ酸配列が、
（ａ）Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ（配列番号：４）；
（ｂ）Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ（配列番号：５）；
（ｃ）Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ（配列番号：６）；
（ｄ）Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ（配列番号：７）；ならびに
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）に示すアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、または欠失もしくは付加されたアミノ酸配列
からなる群から選択されるものであるｅＥＦ２ペプチドを含む、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性対象の癌を治療または予防するための医薬組成物、
（１５）アミノ酸配列が、Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ（配列番号：７）である、（１４）記載の医薬組成物、
（１６）（１４）記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、対象の癌を治療または予防するための医薬組成物、
（１７）前記癌が、肺腺癌、小細胞性肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、膵管癌、悪性神経膠芽腫、悪性リンパ腫および頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択されるものである、（１４）〜（１６）のうちのいずれか１つ記載の医薬組成物、
（１８）有効量の（１４）〜（１７）のいずれか１つ記載の医薬組成物を、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法、
（１９）癌を治療または予防するための医薬を製造するための、（１４）記載のペプチドの使用、
（２０）ｅＥＦ２タンパク質由来の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するｅＥＦ２ペプチドであって、前記アミノ酸配列が、
（ａ）Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ（配列番号：８）；
（ｂ）Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号：９）；
（ｃ）Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ（配列番号：１０）；
（ｄ）Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ（配列番号：１１）；
（ｅ）Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ（配列番号：１２）；
（ｆ）Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ（配列番号：１３）；
（ｇ）Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ（配列番号：１４）；ならびに
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）に示すアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、または欠失もしくは付加されたアミノ酸配列
からなる群から選択されるものであるｅＥＦ２ペプチドを含む、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性対象の癌を治療または予防するための医薬組成物、
（２１）アミノ酸配列が、Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ（配列番号：８）またはＩｌｅ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ（配列番号：１１）である、（２０）記載の医薬組成物、
（２２）アミノ酸配列が、Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ（配列番号：１４）において、第２位アミノ酸ＩｌｅをＬｅｕまたはＭｅｔに置換し、および／または第９位アミノ酸ＶａｌをＬｅｕに置換したものである、（２０）記載の医薬組成物、
（２３）（２０）記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、対象の癌を治療または予防するための医薬組成物、
（２４）前記癌が、肺腺癌、小細胞性肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、膵管癌、悪性神経膠芽腫、悪性リンパ腫および頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択されるものである、（２０）〜（２３）のうちのいずれか１つ記載の医薬組成物、
（２５）有効量の（２０）〜（２４）のいずれか１つ記載の医薬組成物を、対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法、
（２６）癌を治療または予防するための医薬を製造するための、（２０）記載のペプチドの使用、
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、癌にかかっているか、そのおそれのある対象、または予後の対象において、多種類の癌、例えば、肺腺癌、非小細胞性肺癌、小細胞性肺癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大腸癌、膵管癌、神経膠芽腫、悪性リンパ腫などを高感度で検出することが可能となる。さらに、前記方法により検出された癌細胞の増殖を阻害することができる。また、本発明により、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ｅＥＦ２ペプチドもしくはＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチド、およびこれらを含む癌の治療／予防用医薬組成物などが得られるので、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１を有する対象におけるインビボおよびインビトロでのｅＥＦ２特異的ＣＴＬの誘導が可能となる。特に、日本人の約５５％が少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子を有し、約１９．９％が少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を有することから、非常に広範囲の対象においてｅＥＦ２特異的ＣＴＬを誘導することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、肺癌患者由来の血清中でｅＥＦ２ＩｇＧ抗体が検出されたことを示す。
【図２】図２は、非小細胞性肺癌（左図）および小細胞性肺癌（右図）にかかっている患者から得られた肺の組織切片における抗ｅＥＦ２抗体を用いた免疫染色の結果を示す。
【図３】図３は、頭頸部扁平上皮癌（左図）および食道扁平上皮癌（右図）にかかっている患者から得られた頭頸部扁平上皮および食道扁平上皮の組織切片における抗ｅＥＦ２抗体を用いた免疫染色の結果を示す。
【図４】図４は、胃癌（左図）および大腸癌（右図）にかかっている患者から得られた胃および大腸の組織切片における抗ｅＥＦ２抗体による免疫染色の結果を示す。
【図５】図５は、各種癌の患者および健常人から得られた血清におけるｅＥＦ２抗体の検出を示す。
【図６】図６は、非小細胞性肺癌患者において、血清中のｅＥＦ２抗体価の値が高い対象では予後が良好であることを示す。
【図７】図７は、ｅＥＦ２遺伝子のｍＲＮＡを標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡが胃癌細胞株の増殖を抑制することを示す。
【図８】図８は、ｅＥＦ２遺伝子のｍＲＮＡを標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡが各種癌細胞株の細胞増殖を抑制することを示す。
【図９】図９は、ｅＥＦ２７８６−７９４ペプチドを用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す。
【図１０】図１０は、ｅＥＦ２７８６−７９４ペプチドを用いて誘導されたＣＴＬの内因性ｅＥＦ２遺伝子発現細胞に対する細胞傷害活性を示す。
【図１１】図１１は、ｅＥＦ２７３９−７４７ペプチドを用いて誘導されたインターフェロンγをＦＡＣＳで解析した図を示す。
【図１２】図１２は、ｅＥＦ２６６１−６６９ペプチドを用いて誘導されたインターフェロンγをＦＡＣＳで解析した図を示す。
【図１３】図１３は、ｅＥＦ２タンパク質の強制発現が細胞周期Ｇ２／Ｍ期の進行を促進することを示す図である。
【図１４】図１４は、ｅＥＦ２タンパク質の強制発現がインビボにおける腫瘍形成を促進することを示す図である。
【図１５】図１５は、ｅＥＦ２タンパク質の強制発現がインビボにおける腫瘍形成を促進することを示す図である。
【図１６】図１６は、ｅＥＦ２７３９−７４７ペプチドを用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す図である。
【図１７】図１７は、ｅＥＦ２５１９−５２７ペプチドを用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す図である。
【図１８】図１８は、ｅＥＦ２６７１−６７９ペプチドを用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す図である。
【図１９】図１９は、ｅＥＦ２６６１−６６９ペプチドを用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す図である。
【図２０】図２０は、ｅＥＦ２３９４−４０２ペプチドを用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す図である。
【図２１】図２１は、ｅＥＦ２２８４−２９２ペプチドを用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す図である。
【図２２】図２２は、ｅＥＦ２２９２−３００ペプチドを用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す図である。
【図２３】図２３は、ｅＥＦ２２９２−３００２Ｌペプチドを用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す図である。
【図２４】図２４は、ｅＥＦ２２９２−３００２Ｍペプチドを用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す図である。
【図２５】図２５は、ｅＥＦ２２９２−３００２Ｌ９Ｌペプチドを用いて誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す図である。
【図２６】図２６は、ｅＥＦ２２９２−３００ペプチドまたは改変型ｅＥＦ２２９２−３００ペプチド（ｅＥＦ２２９２−３００２Ｌ、ｅＥＦ２２９２−３００２Ｍ、およびｅＥＦ２２９２−３００２Ｌ９Ｌペプチド）でパルスした場合のインターフェロン−γ活性測定の結果を示す図である。
【図２７】図２７は、ｅＥＦ２の新規なｓｈＲＮＡによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの癌細胞の増殖抑制を示す図である。細胞数はコントロールベクターであるｓｈＬｕｃが導入された細胞数に対するｅＥＦ２のｓｈＲＮＡを発現するベクターが導入された細胞数の割合（％）で示した。
【図２８】図２８は、改変型ｅＥＦ２２９２−３００ペプチド（ｅＥＦ２２９２−３００２Ｍ９Ｌペプチド）でパルスした場合のインターフェロン−γ活性測定の結果を示す図である。
【図２９】図２９は、７種類のｅＥＦ２ペプチド（ｅＥＦ２２９２−３００ペプチド、ｅＥＦ２７３９−７４７ペプチド、ｅＥＦ２５１９−５２７ペプチド、ｅＥＦ２６７１−６７９ペプチド、ｅＥＦ２６６１−６６９ペプチド、ｅＥＦ２３９４−４０２ペプチドおよびｅＥＦ２２８４−２９２ペプチド）がＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性ペプチドでもあることを示すインターフェロンγ活性測定の結果である。
【図３０】図３０は、３種類のｅＥＦ２ペプチド（ｅＥＦ２４０９−４１７ペプチド、ｅＥＦ２４１２−４２０ペプチド、およびｅＥＦ２７０１−７０９ペプチド）でパルスした場合のインターフェロン−γ活性測定の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、１の態様において、癌を検出する方法を提供する。本発明の方法を用いて癌を検出することができる対象は、いかなる動物であってもよく、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギなどが挙げられるが、最も好ましくはヒトである。本発明は、対象の動物が健常であっても用いることができ、好ましくは、癌にかかっているか、または癌にかかっているおそれがある状態である。また、対象が癌治療の予後であっても用いることができる。さらに、本発明の特徴は、従来の癌マーカーとして用いられるＣＥＡより早期に癌を検出することができる点である。例えば、本発明の方法は、非小細胞性肺癌を早期の段階、特にステージＩ期において高感度で検出することが可能である。ここで、ステージＩ期とは、悪性腫瘍の病期分類である国際対癌連合により定められたＴＮＭ分類において、Ｔ１またはＴ２、Ｎ０およびＭ０に分類される腫瘍の状態を表す時期をいう。【０００９】
本発明は、前記対象から得られた試料を用いて実施することができる。本発明で用いる試料は如何なる試料でもよく、例えば、細胞を含有する組織を用いることができる。本発明で用いる試料は、好ましくは、各種の組織切片または血清である。対象からの試料の取得は、当業者間で一般的な手法を用いて行うことができる。例えば、本発明に用いられる試料として組織切片を用いる場合、手術または生検により得られた組織を１０％ホルマリン中で一晩固定した後、パラフィン包埋して薄切切片を作成してもよい。また、本発明に用いられる試料として血清を用いる場合、対象の末梢血を分離剤入り試験管中で凝固させた後、遠心分離により取得されてもよい。【００１０】
本発明の方法で検出できる癌は、ｅＥＦ２タンパク質を発現するあらゆる癌を含み、好ましくは、肺腺癌、非小細胞性肺癌、小細胞性肺癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大腸癌、膵管癌、神経膠芽腫、および悪性リンパ腫である。特に好ましいのは、肺腺癌、小細胞性肺癌、胃癌、大腸癌、悪性リンパ腫である。本発明において検出される癌は如何なるステージにある癌でもよい。例えば、上述の国際対癌連合により定められたＴＮＭ分類のＩ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期の何れのステージの癌を検出してもよい。また、本発明の方法において、特に早期に検出可能であるのは非小細胞性肺癌である。【００１１】
対象において本発明の検出方法を実施する場合には、前記試料におけるｅＥＦ２ポリペプチドの存在または量を調べることができる。本発明におけるｅＥＦ２ポリペプチドは、ｅＥＦ２タンパク質のアミノ酸配列またはその部分配列を有するポリペプチドを意味し、以下の変異型を含むものとする。すなわち、本発明におけるｅＥＦ２ポリペプチドは、配列番号：１に示すヒトｅＥＦ２タンパク質のアミノ酸配列を有するものであってもよく、あるいは配列番号：１のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、または配列番号：１のアミノ酸において１または複数のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列、例えば、１〜９個、好ましくは、１〜５個、１〜４個、１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、または１〜９個、好ましくは、１〜５個、１〜４個、１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列；配列番号：１のアミノ酸配列と７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性、さらに好ましくは９３％、９５％、あるいは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列；ならびに上記のうちのいずれか１つのアミノ酸配列のフラグメントのアミノ酸配列を有するものであってもよい。アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの一般的な配列分析用ツールを用いて測定することができる。本発明におけるフラグメントとは、上記ｅＥＦ２ポリペプチドの一部分をいう。さらに、本発明において、ｅＥＦ２ポリペプチドは、ｅＥＦ２タンパク質と同等の性質を有しているものであって、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。本明細書における同等の性質とは、ｅＥＦ２タンパク質として同等の生物学的、化学的、および物理学的特性を有することをいう。また、本発明において、ｅＥＦ２タンパク質は、ヒト由来のものであるが、例えば、マウス、サル、ラット、ウシ、ネコなどの他の動物に由来するものであっても、これらの動物種におけるｅＥＦ２は、本明細書におけるｅＥＦ２タンパク質に包含されうる。【００１２】
本発明において、前記ハイブリダイズさせる条件は、J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressの記載に従って、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイズの条件は、低ストリンジェントな条件であってもよいが、好ましくは高ストリンジェントな条件である。低ストリンジェントな条件とは、上記文献に従ってハイブリダイズさせた後の洗浄において、例えば４２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの条件である。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、５×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳの条件などを含む。但し、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様の条件を実現することができる。【００１３】
本発明の検出方法は、如何なる方法により行われてもよい。例えば、本発明の検出方法は、上記ｅＥＦ２ポリペプチドに対する抗体を用いて行うことができる。本発明の検出方法において、上記ｅＥＦ２ポリペプチドのいかなる領域のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する抗体を用いてもよく、例えば、ヒトｅＥＦ２タンパク質のアミノ酸配列中の第１〜４１７位または第４１１〜８５８位の領域を有するポリペプチドに対する抗体であってもよい。本発明に用いられる抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥのうちのいずれのアイソタイプであってもよい。本発明で用いられる抗体はまた、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。本発明で用いられる抗体は、一般的な手法を用いて作成されてもよく、市販されているものであってもよい。【００１４】
本発明の検出方法はまた、ｅＥＦ２抗体に対する抗体を用いて行うことができる。本発明で検出できるｅＥＦ２抗体は、インビボ、すなわち対象の体内で作成されたものである。本発明の検出方法において、前記ｅＥＦ２抗体に対する抗体は、公知の手法により作成することができ、または市販されているものであってもよい。好ましくは、抗−ｅＥＦ２抗体（H-118, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）である。【００１５】
本発明では、試料におけるｅＥＦ２ポリペプチドまたはｅＥＦ２抗体の存在または量を調べるために、公知の手段・方法を用いることができる。ｅＥＦ２ポリペプチドまたはｅＥＦ２抗体を定性的・定量的に検出できる方法であればいかなる手段・方法であってもよく、例えば、免疫染色法、ドットブロット法、蛍光抗体法、補体結合反応、中和抗体測定法、免疫沈降法、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、ＥＬＩＳＡ法、ツーハイブリッドシステムなどの免疫学的なタンパク質の検出方法を含む。本発明において、好ましくは免疫染色法またはドットブロット法を用いることができる。【００１６】
本発明の検出方法において、対象から得られた試料におけるｅＥＦ２ポリペプチドまたはｅＥＦ２抗体の存在または量を、健常な対象または正常な時期の対象から得られた試料におけるｅＥＦ２ポリペプチドまたはｅＥＦ２抗体の存在または量と比較することにより、陽性であると決定することができる。本発明の検出方法において、試料として血清を用いる場合、血清中のｅＥＦ２抗体の抗体価（densitometric units）を指標としてもよい。この場合、対象の血清中におけるｅＥＦ２抗体の抗体価をドットブロット法により測定し、健常な対象由来の血清より高い数値、好ましくは１０００以上、より好ましくは２０００以上の抗体価（densitometric units）を陽性と決定してもよいが、この数値は癌の種類や組織などの様々な因子に依存して変動し得、当業者が適宜設定することができる。また、試料として組織切片を用いる場合、組織切片における免疫染色法による染色の程度を基準としてもよい。この場合、例えば、対応する正常細胞に比較して強い染色を示す癌細胞が、癌細胞全体の２５％以上である場合に陽性と判断してもよいが、当業者が適宜判断することができる。【００１７】
また、対象において本発明の検出方法を実施する場合には、試料におけるｅＥＦ２遺伝子の転写物の存在または量を調べることができる。本発明におけるｅＥＦ２遺伝子の転写物とは、上記ｅＥＦ２ポリペプチドまたはそのフラグメントのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から転写された産物を意味し、例えば、ｍＲＮＡまたはあらゆる他のタイプのＲＮＡ、ならびにこれらのフラグメントなどであってよい。また、本発明の検出方法では、ｅＥＦ２ポリペプチドまたはそのフラグメントのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ配列）を有するポリヌクレオチドの存在または量を調べることができる。【００１８】
本発明において、試料における上記転写物またはポリヌクレオチドの存在または量を調べるために、ポリヌクレオチドの検出方法として当業者間で一般的な手段・方法を用いてもよい。例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法、ノ−ザンブロット法、サザンブロット法、ドットブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲなどのポリヌクレオチドの検出法を含む。また、マイクロアレイ（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ、ｍｉｃｒｏＲＮＡマイクロアレイ、プロテインマイクロアレイなど）を用いた遺伝子解析方法を行ってもよいが、上記転写物またはポリヌクレオチドを定性的・定量的に検出できればこれら以外の方法であってもよい。【００１９】
さらに、本発明の方法は、癌を有する対象の予後の診断に用いることができる。本発明の方法を適用できる癌は、上記のごとくｅＥＦ２タンパク質を発現するいかなる癌であってもよいが、好ましくは肺腺癌、非小細胞性肺癌、小細胞性肺癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大腸癌、膵管癌、神経膠芽腫、悪性リンパ腫である。より好ましくは、非小細胞性癌である。本発明の予後の診断では、対象から得られた試料におけるｅＥＦ２抗体の抗体価が高い値であるほど、予後が良好と判断することができる。ｅＥＦ２抗体の抗体価（densitometric units）が、例えば、１０００以上であり、好ましくは、２０００以上、より好ましくは４０００以上の値であるが、当業者は様々な因子を考慮して適宜決定することができる。【００２０】
本発明は、別の態様において、上記ｅＥＦ２ポリペプチドもしくはｅＥＦ２抗体に対する抗体または上記ｅＥＦ２遺伝子の転写物もしくはその一部に相補的なポリヌクレオチドプローブを必須構成成分として含む、癌を検出するための診断キットに関するものである。本発明において、上記抗体またはプローブは、標識されていることが好ましい。前記標識は、一般的な方法により行うことができる。本発明のキットは、上記ｅＥＦポリペプチドもしくはｅＥＦ２抗体に対する抗体または上記ｅＥＦ２遺伝子の転写物もしくはその一部に相補的なポリヌクレオチドプローブのほかに、例えば、タンパク質またはポリヌクレオチドの検出方法に必須な試薬、試料の取得手段、反応容器などを含む。一般的に、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットを用いて、血清または組織においてｅＥＦ２タンパク質を発現する癌を効率よく検出することができる。【００２１】
本発明は、別の態様において、癌細胞の増殖を阻害する二本鎖ｓｉＲＮＡに関するものである。本発明で増殖を阻害できる癌細胞は、ｅＥＦ２タンパク質を発現するいずれの癌であってもよく、好ましくは、肺腺癌、非小細胞性肺癌、小細胞性肺癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大腸癌、膵管癌、神経膠芽腫、および悪性リンパ腫である。特に好ましいのは、肺腺癌、小細胞性肺癌、胃癌、大腸癌、悪性リンパ腫である。【００２２】
本発明のｓｉＲＮＡは、ヒトｅＥＦ２遺伝子から転写されたｍＲＮＡのヌクレオチド配列を標的とするセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ｓｉＲＮＡである。本発明のｓｉＲＮＡが標的とするヌクレオチド配列は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の部分配列であってもよい。本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、以下に示されるＲＮＡ配列を有するセンス鎖（配列番号：２）およびアンチセンス鎖（配列番号：３）からなる二本鎖ｓｉＲＮＡである。
本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖（配列番号：２）；
５’−ＣＡＵＧＧＧＣＡＡＣＡＵＣＡＵＧＡＵＣＧＡＵＣＣＵＧＵＣＣＵ−３’
本発明のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（配列番号：３）；
５’−ＡＧＧＡＣＡＧＧＡＵＣＧＡＵＣＡＵＧＡＵＧＵＵＧＣＣＣＡＵＧ−３’【００２３】
本発明のｓｉＲＮＡの好ましいＲＮＡ配列は、上記配列番号：２および３に示される配列であるが、これらの配列において、１個、２個、または３個の塩基が付加、欠失、置換されていてもよい。またはこれらの配列において１〜３個、好ましくは１もしくは２個、より好ましくは１個の塩基が置換、欠失、付加および／または挿入されていてもよい。この場合のハイブリダイズ条件は、本発明のｓｉＲＮＡを生体内に投与して用いる場合は、生体内の条件であり、本発明のｓｉＲＮＡを試薬としてインビトロで用いる場合は、中度のストリンジェントな条件または高度のストリンジェントな条件であり、このような条件として、例えば、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃〜７０℃で１２〜１６時間でのハイブリダイゼーション条件が挙げられる。また、本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖配列と標的配列は、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９５、９６、９７、９８または９９％以上の配列相同性を有する。【００２４】
さらに、本発明のｓｉＲＮＡは、５’末端または３’末端にオーバーハング配列が付加されてもよい。ここで、オーバーハング配列とは、二本鎖ｓｉＲＮＡの安定性を高めるために、センス鎖およびアンチセンス鎖が対合した二本鎖配列の５’末端もしくは３’末端のどちらかに付加された突出する配列をいい、例えば、５’側からＡＧ、ＵＡ、ＡＵＧ、ＵＵＧおよびＡＡＧＣＵＵなどの配列であるが、いかなる配列であってもよい。本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、好ましくは、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端にＵＵが付加されていることである。また、上述の本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、ループ配列により二本のｓｉＲＮＡを連結して、ｓｈＲＮＡとしてもよい。【００２５】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、当業者間において一般的な方法により調製することができる。例えば、インビトロで化学的または酵素的に合成されてもよく、あるいはインビボで合成されてもよく、これらに限定されない。好ましくは、化学的な合成法である。これらの合成法により、各々の鎖を合成した後、一般的な対合の条件下で対合させることができる。使用の際には、必要に応じて適宜精製してもよい。また、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、上記ｓｉＲＮＡのＲＮＡ配列（配列番号：２および配列番号：３）を発現するｓｉＲＮＡ発現ベクターとして調製されてもよい。この場合、例えば、ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ発現ベクター、ｐｉＧＥＮＥ  ｔＲＮＡ  Ｐｕｒ（Clontech, Palo Alto, CA）を用いて作成されてもよい。また、本発明で使用されるｓｉＲＮＡの長さは特に限定されないが、本発明の好ましいｓｉＲＮＡの例として、１５〜５０ｍｅｒのｓｉＲＮＡ、さらに好ましい例として、２０〜４０ｍｅｒのｓｉＲＮＡ、より好ましい例として、２５〜３５ｍｅｒ（例えば、３０ｍｅｒ）のｓｉＲＮＡを挙げることができる。従って、本発明の好ましいｓｉＲＮＡの例として、ｅＥＦ２  ｍＲＮＡの５’−ＣＡＵＧＧＧＣＡＡＣＡＵＣＡＵＧＡＵＣＧＡＵＣＣＵＧＵＣＣＵ−３’配列にハイブリダイズ可能な二本鎖ｓｉＲＮＡであって、それぞれのｓｉＲＮＡの長さが１５〜５０ｍｅｒ、好ましくは２０〜４０ｍｅｒ、さらに好ましくは２５〜３５ｍｅｒ（例えば、３０ｍｅｒ）の二本鎖ｓｉＲＮＡを挙げることができる。【００２６】
一般に、ｓｉＲＮＡは、導入された細胞内において、標的遺伝子のｍＲＮＡへの結合によりその発現を抑制することが知られている。したがって、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、ｅＥＦ２遺伝子の発現を抑制する機能を有し、それにより導入された対象における細胞の増殖を阻害することができる。本発明におけるｓｉＲＮＡの導入または投与方法は、トランスフェクション試薬を用いたリン酸カルシウム法、リポソーム法、ノンリポソーム法、エレクトロポレーション、磁気粒子などの当業者間で公知な方法、または一般的なｓｉＲＮＡ発現ベクターに組み込まれて前記のような公知の方法により導入される方法であってもよい。好ましくは、上記ｓｉＲＮＡのＲＮＡ配列（配列番号：２および配列番号：３）を発現するｓｉＲＮＡ発現ベクターが公知の方法により導入されることである。また、本発明のｓｉＲＮＡは、以下に記載するように医薬組成物として投与されてもよい。【００２７】
本発明において、上記二本鎖ｓｉＲＮＡを有効成分とする癌の治療または予防のための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物には、有効成分として、上記二本鎖ｓｉＲＮＡのほかに公知の抗がん剤が含有されていてもよい。【００２８】
本発明の医薬組成物では、有効成分としてのｓｉＲＮＡがベクターに組み込まれて含まれていてもよい。例えば、製造業者から市販されているｓｉＲＮＡ発現ベクターなどの公知のｓｉＲＮＡ発現ベクターまたは使用の態様に合わせて適宜組み換えた公知のｓｉＲＮＡ発現ベクターにクローン化された形態で包含されていてもよい。従って、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡをコードする核酸、および該核酸を含むベクターを提供する。【００２９】
本発明の医薬組成物は、医薬上許容されるキャリアを含んでもよい。本発明で用いることができる医薬上許容されるキャリアは、生理食塩水、蒸留水、リンゲル液、緩衝生理食塩水、ブドウ糖溶液、マルトブドウ糖溶液、グリセロール、エタノールおよびリポソームからなる群から選択される１種またはそれ以上の成分であってよいが、これらだけに限らない。さらに本発明の医薬組成物に抗酸化剤、緩衝水溶液、静菌剤のごとき他の一般的な添加物を添加してもよい。また、注射用溶液、ピル、カプセル、顆粒もしくはタブレット錠剤を製造するために、希釈剤、噴霧剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤をさらに添加してもよい。【００３０】
本発明の医薬組成物を投与する形態は、経口投与または非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与または経口投与）であってもよく、患部またはその近傍に効率的に有効成分を送達できればそれら以外の投与形態であってもよい。また、本発明の医薬組成物として投与される本発明のｓｉＲＮＡの有効な量を、対象の状態、例えば対象の重量、年齢、性別、および健康状態など、ならびに食事量、投与の頻度、投与の方法、排泄量および病気の重症度などによって決定することができる。本発明の医薬組成物として投与される本発明のｓｉＲＮＡの有効な量は、通常、１日あたり０．０１−１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは１日あたり０．１−１０ｍｇ／ｋｇである。【００３１】
本発明は、別の態様において、有効量の上記医薬組成物を対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するものである。治療または予防される癌は、ｅＥＦ２タンパク質を発現するものであればいずれのものであってもよく、例えば、肺腺癌、非小細胞性肺癌、小細胞性肺癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大腸癌、膵管癌、神経膠芽腫、および悪性リンパ腫を含む。また、本発明は、好ましくは、上記癌の検出方法により陽性と決定された対象に投与されてもよい。【００３２】
本発明は、さらに別の態様において、癌を治療または予防するための医薬の製造のための、上記二本鎖ｓｉＲＮＡの使用に関する。【００３３】
本発明は、なお別の態様において、癌細胞の増殖を阻害するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡに関するものである。ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡまたはｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）は通常、センス鎖とアンチセンス鎖がループ配列により連結されたＲＮＡであり、細胞内でループ構造が切断されて二本鎖のｓｉＲＮＡとなることもある。本発明のｓｉＲＮＡは二本鎖ｓｉＲＮＡであることが好ましい。本発明のｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡが標的とするｅＥＦ２の領域は特に限定されないが、好ましい例として、以下のＤＮＡ配列：
５’−gcc tggccgagga catcgataaa ggcgagg−３’（配列番号：１８）：あるいは
５’−actcaac cataacactt gatgccgttt ctt−３’（配列番号：１９）
から転写されたｍＲＮＡを標的とするｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを挙げることができる。本発明のｓｈＲＮＡは、上記ＤＮＡ配列のセンス配列−ループ配列−アンチセンス配列からなるＤＮＡ配列を含むベクターから転写されるものであってもよい。かかるＤＮＡ配列を含むベクターからＲＮＡに転写されると、センス配列およびアンチセンス配列に由来するＲＮＡが結合して短いヘアピン（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ）ＲＮＡを形成し、安定化する。なお、本発明で使用されるループ配列は如何なる配列でもよく、当業者が適宜選択することが可能である。本発明の好ましいｓｉＲＮＡの例として、５’−gcc tggccgagga catcgataaa ggcgagg−３’（配列番号：１８）：あるいは５’−actcaac cataacactt gatgccgttt ctt−３’（配列番号：１９）から転写されたｍＲＮＡとハイブリダイズ可能なｓｉＲＮＡを挙げることができる。本発明のより具体的なｓｉＲＮＡの例として、５’−gcc tggccgagga catcgataaa ggcgagg−３’（配列番号：１８）：あるいは５’−actcaac cataacactt gatgccgttt ctt−３’（配列番号：１９）から転写されたｍＲＮＡと相補的な配列を有するｓｉＲＮＡを挙げることができる。あるいは、本発明のｓｉＲＮＡは、配列番号：１８または１９に示すＤＮＡ配列に対応するＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる二本鎖ｓｉＲＮＡであってもよい。また、本発明の好ましいｓｈＲＮＡの例として、５’−gcc tggccgagga catcgataaa ggcgagg−３’（配列番号：１８）から転写されたｍＲＮＡにハイブリダイズ可能なＲＮＡおよび当該ＲＮＡにハイブリダイズ可能なＲＮＡを含むｓｈＲＮＡを挙げることができる。さらに、本発明の好ましいｓｈＲＮＡの例として、５’−actcaac cataacactt gatgccgttt ctt−３’（配列番号：１９）から転写されたｍＲＮＡにハイブリダイズ可能なＲＮＡおよび当該ＲＮＡにハイブリダイズ可能なＲＮＡを含むｓｈＲＮＡを挙げることができる。本発明のｓｈＲＮＡのより具体的な例として、以下のＤＮＡ配列：
５’−gcc tggccgagga catcgatgaa agcgtgg cttcctgtca cctcgcc tttatcgatg tcctcggcca ggc−３’（配列番号：２０）；
５’−actcaac cataacactt gataccattt gtt cttcctgtca aag aaacggcatc aagtgttatg gttgagt−３’（配列番号：２２）；
３’−cgg accggctcct gtagctactt tcgcacc gaaggacagt ggagcgg aaatagctac aggagccggt ccg−５’（配列番号：２１）；あるいは
３’−tgagttg gtattgtgaa ctatggtaaa caa gaaggacagt ttc tttgccgtag ttcacaatac caactca−５’（配列番号：２３）
を有する核酸から転写されたものである。本発明は、上記ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列において、１個、２個、または３個の塩基が付加、欠失、置換されていてもよく、あるいは、上記ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列に対して、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９５、９６、９７、９８または９９％以上の配列相同性を有するものであってもよい。なお、相同性、ハイブリダイズの条件、ｓｉＲＮＡの長さについては上述の通りである。また、本発明は、上記ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列において、１個、２個、または３個の塩基が付加、欠失、置換および／または挿入されていてもよい。【００３４】
本発明のｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、当業者間において一般的な方法により調製することができる。例えば、インビトロで化学的または酵素的に合成されてもよく、あるいはインビボで合成されてもよく、これらに限定されない。また、本発明のｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、上記配列番号：２０または２２に示すＤＮＡ配列を含むｓｈＲＮＡ発現ベクターまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターとして調製されてもよい。この場合、例えば、ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ発現ベクター、ｐｉＧＥＮＥ  ｔＲＮＡ  Ｐｕｒ（Clontech, Palo Alto, CA）を用いて作成されてもよい。【００３５】
本発明のｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの導入または投与方法は、トランスフェクション試薬を用いたリン酸カルシウム法、リポソーム法、ノンリポソーム法、エレクトロポレーション、磁気粒子などの当業者間で公知な方法、または一般的なｓｉＲＮＡ発現ベクターに組み込まれて前記のような公知の方法により導入される方法であってもよい。本発明のｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、以下に記載するように医薬組成物として投与されてもよい。【００３６】
本発明において、上記ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを有効成分とする癌の治療または予防のための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、公知の抗がん剤が一緒に含有されていてもよい。【００３７】
本発明の医薬組成物は、有効成分として、本発明のｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードする核酸（例えば、配列番号：２０または２２に示すＤＮＡ配列を含む核酸）が含まれていてもよい。例えば、かかるＤＮＡ配列を含む核酸が市販のｓｈＲＮＡ発現ベクターまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターに組み込まれた核酸であってもよい。従って、本発明は、本発明のｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードする核酸、および該核酸を含むベクターを提供する。【００３８】
本発明の医薬組成物は、医薬上許容される一般的なキャリアおよび添加剤を含んでもよい。本発明の医薬組成物を投与する形態は、経口投与または非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与または経口投与）であってもよい。また、本発明の医薬組成物として投与される本発明のｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの有効な量は、対象の状態、例えば対象の重量、年齢、性別、および健康状態など、ならびに食事量、投与の頻度、投与の方法、排泄量および病気の重症度などによって決定することができる。【００３９】
本発明は、別の態様において、有効量の上記医薬組成物を対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するものである。治療または予防される癌は、ｅＥＦ２タンパク質を発現するものであればいずれのものであってもよく、例えば、肺腺癌、非小細胞性肺癌、小細胞性肺癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大腸癌、膵管癌、神経膠芽腫、および悪性リンパ腫を含む。【００４０】
本発明は、さらに別の態様において、癌を治療または予防するための医薬の製造のための、上記ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの使用に関する。【００４１】
さらなる態様において、本発明は、ｅＥＦ２タンパク質由来の連続するアミノ酸を含むペプチドに関する。本発明のペプチドの例としては後述するアミノ酸配列を含むペプチドまたは後述するアミノ酸配列からなるペプチドを挙げることができる。好ましくは、これらのペプチドは、ＨＬＡ分子との結合能を有するものである。また好ましくは、これらのペプチドは細胞傷害活性を誘導するものである。また好ましくは、これらのペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ｅＥＦ２ペプチド、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチド、もしくはＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性ｅＥＦ２ペプチドである。また好ましくは、これらのペプチドは、９〜３０個のアミノ酸の長さである。さらに本発明は、これらのペプチドを含む癌の治療または予防のための医薬組成物、癌の治療または予防のための医薬の製造のためのこれらのペプチドの使用、ならびにこれらのペプチドを対象に投与することを特徴とする癌の治療または予防方法等も提供する。【００４２】
したがって、本発明は、１の態様において、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ｅＥＦ２ペプチドを提供する。また本発明は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性対象の癌を治療または予防するためのＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ｅＥＦ２ペプチド、ならびにそれらを含む医薬組成物を提供する。本発明で用いられるＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ｅＥＦ２ペプチドとしては、ｅＥＦ２タンパク質由来の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドまたはｅＥＦ２タンパク質由来の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記アミノ酸配列が、Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ（配列番号：４）；Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ（配列番号：５）；Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ（配列番号：６）；Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ（配列番号：７）；ならびに上記のうちの１つのアミノ酸配列において、数個、例えば、１〜９個まで、好ましくは、１〜５個、１〜４個、１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が、置換、または欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドが例示されるが、これらのペプチドに限定されない。また、上記のうちの１つのアミノ酸配列において、数個、例えば、１〜９個まで、好ましくは、１〜５個、１〜４個、１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が、置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドを含んでもよい。上述のペプチドのアミノ酸を置換する場合、好ましい置換部位としては２位および／または９位のアミノ酸を挙げることができる。上述のペプチドの２位のアミノ酸の好ましい例としては、ＰｈｅまたはＴｙｒを挙げることができる。また、上述のペプチドの９位のアミノ酸の好ましい例としては、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＰｈｅを挙げることができる。このような改変型ペプチドの具体例としては、表１２または表１３に記載されたペプチドを挙げることができる。本発明において好ましいｅＥＦ２ペプチドは、Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ（配列番号：７）である。但し、上記のいずれのペプチドであっても、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子との結合能を保持していることが条件となる。本明細書では、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２との結合能を保持しているペプチドをＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ｅＥＦ２ペプチドという。なお、本発明の上述のペプチドはＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性対象以外の対象に用いられてもよい。従って、本発明は上述のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、及び該ペプチドを含む医薬組成物を提供する。【００４３】
もう１つの態様において本発明は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドを提供する。また本発明は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性対象の癌を治療または予防するためのＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドを含む医薬組成物を提供する。本発明で用いられるＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドは、ｅＥＦ２タンパク質由来の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドまたはｅＥＦ２タンパク質由来の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むペプチドである。本発明に用いられるＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドの候補を下記の表１〜７に例示する。これらのうち、本発明において好ましいものとしては、前記アミノ酸配列が、Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ（配列番号：８）；Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号：９）；Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ（配列番号：１０）；Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ（配列番号：１１）；Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ（配列番号：１２）；Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ（配列番号：１３）；Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ（配列番号：１４）；ならびに上記のうちの１つのアミノ酸配列において、数個、例えば、１〜９個まで、好ましくは、１〜５個、１〜４個、１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が、置換、または欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドが例示されるが、これらのペプチドに限定されない。また、上記のうちの１つのアミノ酸配列において、数個、例えば、１〜９個まで、好ましくは、１〜５個、１〜４個、１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が、置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドを含んでもよい。これらのうち特に好ましいＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドは、Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ（配列番号：８）またはＩｌｅ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ（配列番号：１１）である。また、本発明のＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドは、特に、第２位のアミノ酸および／または第９位のアミノ酸を、別のアミノ酸に置換したものであってもよい。上述のペプチドの２位のアミノ酸の好ましい例としては、ＬｅｕまたはＭｅｔを挙げることができる。また、上述のペプチドの９位のアミノ酸の好ましい例としては、ＬｅｕまたはＶａｌを挙げることができる。このような改変型ペプチドの例としては、表１５〜２１に記載されるペプチドを挙げることができ、好ましくは、Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ（配列番号：１４）において、第２位のアミノ酸ＩｌｅをＬｅｕまたはＭｅｔに置換し、および／または第９位アミノ酸ＶａｌをＬｅｕに置換したペプチドを挙げることができる。特に好ましい例として��、Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ（配列番号：１５）、Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ（配列番号：１６）またはＬｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ（配列番号：１７）、Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ（配列番号：２４）を挙げることができる。但し、上記のいずれのペプチドであっても、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子との結合能を保持していることが条件となる。本明細書では、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１との結合能を保持しているペプチドをＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドという。また、本発明のＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドは、インターフェロンγ活性を上昇させる作用を有していてもよい。なお、本発明の上述のペプチドはＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性対象以外の対象に用いられてもよい。従って、本発明は上述のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、及び該ペプチドを含む医薬組成物を提供する。【００４４】
さらにもう１つの態様において本発明は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性ｅＥＦ２ペプチドを提供する。また本発明は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性対象の癌を治療または予防するためのＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性ｅＥＦ２ペプチドを含む医薬組成物を提供する。本発明で用いられるＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性ｅＥＦ２ペプチドは、ｅＥＦ２タンパク質由来の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するペプチドまたはｅＥＦ２タンパク質由来の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むペプチドである。本発明に用いられるＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性ｅＥＦ２ペプチドのうち、好ましいものとしては、前記アミノ酸配列が、Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ（配列番号：８）；Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ（配列番号：９）；Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ（配列番号：１０）；Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ（配列番号：１１）；Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ（配列番号：１２）；Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ（配列番号：１３）；Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ（配列番号：１４）であるペプチド；ならびに上記のうちの１つのアミノ酸配列において、数個、例えば、１〜９個まで、好ましくは、１〜５個、１〜４個、１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドが例示されるが、これらのペプチドに限定されない。また、上記のうちの１つのアミノ酸配列において、数個、例えば、１〜９個まで、好ましくは、１〜５個、１〜４個、１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が、置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドを含んでもよい。但し、上記のいずれのペプチドであっても、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子との結合能を保持していることが条件となる。本明細書では、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６との結合能を保持しているペプチドをＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性ｅＥＦ２ペプチドという。また、本発明のＨＬＡ−Ａ＊０２０６拘束性ｅＥＦ２ペプチドは、インターフェロンγ活性を上昇させる作用を有していてもよい。なお、本発明の上述のペプチドはＨＬＡ−Ａ＊０２０６陽性対象以外の対象に用いられてもよい。従って、本発明は上述のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、及び該ペプチドを含む医薬組成物を提供する。【００４５】
【表１】
2010079833.tif 000002
【００４６】
【表２】
2010079833.tif 000003
【００４７】
【表３】
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【００４８】
【表４】
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【００４９】
【表５】
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【００５０】
【表６】
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【００５１】
【表７】
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【００５２】
本発明で用いられるペプチドは、ｅＥＦ２タンパク質由来であって、上記の連続するアミノ酸配列またはその改変配列からなっていてもよく、これを含むものであってもよい。上記アミノ酸配列を含むペプチドの場合、そのペプチドの長さは特に限定されず如何なる長さのペプチドでもよい。上記の連続するアミノ酸配列を含むペプチドの好ましい例として、９〜３０アミノ酸のペプチド、より好ましい例として、９〜１５アミノ酸のペプチド、さらに好ましい例として、９〜１２アミノ酸のペプチドを挙げることができる。従って、本発明で用いられるペプチドは、例えば、上記アミノ酸配列からなるペプチドそのものであってもよく、あるいは上記アミノ酸配列を含むｅＥＦ２タンパク質またはその一部であってもよい。本発明で用いられるペプチドはまた、上記アミノ酸配列を含むペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、種々の物質を結合させることができる。例えば、アミノ酸、ペプチド、それらのアナログ等を結合させてもよい。本発明で用いられるペプチドにこれらの物質が結合している場合、これらの物質が例えば、生体内酵素などにより、あるいは細胞内プロセッシングなどの過程により処理され、最終的に上記アミノ酸配列からなるペプチドを生じ、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子との複合体として細胞表面に提示されることにより、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導効果を得ることができる。これらの物質は、本発明で用いられるペプチドの溶解性を調節するものであってもよく、耐プロテアーゼ作用等その安定性を向上させるものであってもよく、また例えば、所定の組織・器官に特異的に本発明で用いられるペプチドをデリバリーするようなものであってもよく、あるいはまた抗原提示細胞の取込み効率を増強させる作用などを有するものであってもよい。これらの物質はまた、ＣＴＬ誘導能を増大させるもの、例えば、ヘルパーペプチドなどであってもよい。【００５３】
本発明で用いられるペプチドは、当該技術分野において通常用いられる方法またはそれらの変法を用いて合成することができる。かかる合成方法は、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976；ペプチド合成、丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成、広川書店，1991などに記載されている。【００５４】
本発明で用いられるペプチドはまた、本発明で用いられるペプチドをコードするヌクレオチド配列情報に基づき、遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。かかる遺伝子工学的手法は、当業者に周知のものである。【００５５】
本発明は、上記ｅＥＦ２ペプチドを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物に関するものである。ｅＥＦ２遺伝子は、例えば、肺腺癌、小細胞肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、膵管癌、悪性神経膠芽腫、悪性リンパ腫、頭頸部扁平上皮癌などにおいて高発現しているため、本発明の医薬組成物を、ｅＥＦ２遺伝子を発現している癌の治療または予防のために用いることができる。本発明の医薬組成物がＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性対象に投与されると、該医薬組成物に含まれるＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ｅＥＦ２ペプチドまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドにより、ｅＥＦ２特異的ＣＴＬが誘導され、かかるＣＴＬにより対象中の癌細胞が傷害される。【００５６】
本発明の医薬組成物は、有効成分としての上記ｅＥＦ２ペプチド以外に、例えば、担体、賦形剤などを含んでいてもよい。本発明の医薬組成物に含まれるＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ｅＥＦ２ペプチドまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドは、ｅＥＦ２特異的ＣＴＬを誘導することから、その誘導効率を増強させるために、本発明の医薬組成物は適当なアジュバントを含むか、あるいは適当なアジュバントと共に投与されてもよい。好ましいアジュバントとしては、例えば、完全または不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどが挙げられるがこれらに限定されない。また、本発明の医薬組成物は、有効成分として上記ｅＥＦ２ペプチド以外の公知なペプチド、例えば、ＷＴ１ペプチドなどを一緒に含んでもよい。【００５７】
本発明の医薬組成物の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該方法は、例えば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限らない。さらに、前記方法は、リンパ球療法またはＤＣ（樹状細胞）療法であってもよい。本発明の医薬組成物に含まれるペプチドの量、医薬組成物の剤形、投与回数などは、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択できるが、１回あたりのペプチド投与量は、通常、０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１ｍｇ〜１００００ｍｇである。【００５８】
本発明は、別の態様において、有効量の上記医薬組成物をＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性対象もしくはＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するものである。治療または予防される癌は、いずれのものであってもよく、例えば、肺腺癌、非小細胞性肺癌、小細胞性肺癌、頭頸部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大腸癌、膵管癌、神経膠芽腫および悪性リンパ腫を含む。【００５９】
本発明は、なお別の態様において、上記医薬組成物を製造するためのｅＥＦ２ペプチドの使用に関する。【００６０】
本発明は、さらにもう１つの態様において上記ｅＥＦ２ペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、ｅＥＦ２ポリヌクレオチドともいう）に関するものである。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。本発明のポリヌクレオチドの塩基配列は、上記ｅＥＦ２ペプチドのアミノ酸配列に基づき決定できる。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成方法、ＰＣＲ法などにより製造することができる。【００６１】
本発明は、別の態様において、上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター（以下、ｅＥＦ２発現ベクターともいう）に関するものである。発現ベクターの種類、上記ポリヌクレオチド配列以外に含まれる配列等は、当該発現ベクターを導入する宿主の種類、目的等に応じて適宜選択できる。本発明の発現ベクターを対象に投与し、生体内においてｅＥＦ２ペプチドを産生させ、ｅＥＦ２特異的ＣＴＬを誘導し、これにより対象中の造血器腫瘍細胞、固形癌細胞などを傷害することで、該造血器腫瘍、固形癌の治療または予防を行うことができる。【００６２】
本発明は、さらに別の態様において上記ｅＥＦ２ポリヌクレオチドまたは上記ｅＥＦ２発現ベクターを含む、癌を治療または予防するための医薬組成物に関するものである。本発明のこの態様の医薬組成物の組成、投与方法等は、上述の通りである。【００６３】
本発明は、別の態様において、有効量の上記ｅＥＦ２ポリヌクレオチドまたはｅＥＦ２発現ベクターを含む医薬組成物を対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するものである。治療または予防される癌は、例えば、肺腺癌、非小細胞性肺癌、小細胞性肺癌、頭頸部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、胃癌、大腸癌、膵管癌、神経膠芽腫、悪性リンパ腫などの癌を含む。【００６４】
本発明は、なお別の態様において、上記ｅＥＦ２ポリヌクレオチドまたはｅＥＦ２発現ベクターを含む医薬組成物を製造するためのｅＥＦ２ポリヌクレオチドまたはｅＥＦ２発現ベクターの使用に関するものである。【００６５】
本発明は、別の態様において、上記ｅＥＦ２発現ベクターを含有する細胞に関するものである。本発明の細胞は、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などの宿主細胞を上記発現ベクターを用いて形質転換させることにより製造することができる。宿主細胞への発現ベクターの導入方法は、種々の方法を適宜選択して用いることができる。形質転換した細胞を培養し、産生されたｅＥＦ２ペプチドを回収・精製することにより、本発明のペプチドを製造することもできる。【００６６】
本発明は、さらなる態様において、上記ｅＥＦ２ペプチドにより誘導される、ｅＥＦ２特異的ＣＴＬに関するものである。本発明のＣＴＬは、ｅＥＦ２ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子との複合体を認識する。従って、本発明のＣＴＬを用いて、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性、かつｅＥＦ２高発現腫瘍細胞を特異的に傷害することができる。【００６７】
本発明は、別の態様において、ｅＥＦ２特異的ＣＴＬをＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するものである。ｅＥＦ２特異的ＣＴＬの投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該方法は、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限らない。【００６８】
本発明は、別の態様において、末梢血単核球を上記ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ｅＥＦ２ペプチドまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドの存在下で培養し、該末梢血単核球からｅＥＦ２特異的ＣＴＬを誘導することを特徴とする、ｅＥＦ２特異的ＣＴＬの誘導方法に関するものである。末梢血単核球が由来する対象は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を有していればいずれであってもよい。末梢血単核球をＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ｅＥＦ２ペプチドまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドの存在下で培養することで、末梢血単核球中のＣＴＬ前駆細胞からｅＥＦ２特異的ＣＴＬが誘導される。本発明により得られたｅＥＦ２特異的ＣＴＬをＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性対象またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性対象に投与することで、対象の造血器腫瘍、固形癌を治療または予防することができる。ここで、本明細書における末梢血単核球には、抗原提示細胞の前駆体である未熟抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、Ｂ−リンパ球、マクロファージなどの前駆体）が含まれるものとし、未熟抗原提示細胞は、例えば、末梢血単核球などに含まれているため、かかる細胞を上記ｅＥＦ２ペプチドの存在下で培養してもよい。【００６９】
本発明は、さらに別の態様において、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ｅＥＦ２ペプチドまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドを必須構成成分として含む、ｅＥＦ２特異的ＣＴＬを誘導するためのキットに関するものである。好ましくは、該キットは上記ｅＥＦ２特異的ＣＴＬの誘導方法に用いられる。本発明のキットは、上記ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ｅＥＦ２ペプチドまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドのほかに、例えば、末梢血単核球の取得手段、アジュバント、反応容器等を含んでいてもよい。一般的には、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットを用いて、ｅＥＦ２特異的ＣＴＬを効率よく誘導できる。【００７０】
本発明は、さらなる態様において、上記ｅＥＦ２ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を介して提示する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、Ｂ−リンパ球、マクロファージなど）に関するものである。本発明の抗原提示細胞は、上記ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ｅＥＦ２ペプチドまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドにより誘導される。本発明の抗原提示細胞を用いることで、上記ｅＥＦ２特異的ＣＴＬが効率よく誘導される。【００７１】
本発明は、別の態様において、上記ｅＥＦ２ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を介して提示する抗原提示細胞をＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性対象またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性対象に投与することを特徴とする、癌を治療または予防するための方法に関するものである。抗原提示細胞の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該方法は、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限らない。【００７２】
本発明は、さらなる態様において、ｅＥＦ２ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を介して提示する抗原提示細胞を誘導することを特徴とする、癌を予防または治療するための方法であって、
（ａ）試料とｅＥＦ２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１）をコードするヌクレオチド配列もしくはその部分配列を有する核酸または上記ｅＥＦ２ペプチドを反応させ、
（ｂ）該試料中に含まれるｅＥＦ２ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を介して提示する抗原提示細胞を得、
（ｃ）前記抗原提示細胞をＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性対象またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性対象に投与する
工程を含む方法に関するものである。上記方法における試料は、リンパ球または樹状細胞が含まれている可能性があればいずれのものであってもよく、例えば、血液などの対象由来試料、細胞培養液などが挙げられる。上記方法における反応は、一般的な手法を用いて行われてよく、好ましくは、エレクトロポレーションを用いて行われる。抗原提示細胞の取得は、当業者に既知の方法を用いて行うことができる。各工程における試料中の細胞の培養条件は、当業者が適宜決定することができる。抗原提示細胞の投与方法は、上述の如くであってもよい。【００７３】
さらに、本発明は、ｅＥＦ２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１）をコードするヌクレオチド配列もしくはその部分配列を有する核酸、またはｅＥＦ２ペプチドを必須構成成分として含む、癌を予防または治療するためのキットに関するものである。該キットは、上記のｅＥＦ２ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を介して提示する抗原提示細胞を誘導することを特徴とするキットである。また、本発明のキットは、上記必須構成成分のほかに、例えば、試料の取得手段、反応容器等を含んでいてもよい。一般的には、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットを用いて、ｅＥＦ２ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を介して提示する抗原提示細胞を効率よく得ることができ、この抗原提示細胞を投与することにより癌の治療または予防に用いることができる。【００７４】
本発明は、別の態様において、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ｅＥＦ２ペプチドまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドに対する抗体または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する抗体に関するものである。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。【００７５】
本発明は、さらなる態様において、上記ｅＥＦ２特異的ＣＴＬ、上記ｅＥＦ２ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子もしくはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を介して提示する抗原提示細胞、またはＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ｅＥＦ２ペプチドもしくはＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドに対する抗体または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する抗体を用いることを特徴とする、癌の診断方法に関するものである。好ましくは、ｅＥＦ２特異的ＣＴＬが本発明の診断方法に用いられる。例えば、上記ＣＴＬ、抗原提示細胞または抗体をＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性対象またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性対象由来の試料とインキュベーションする、あるいはＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性対象またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性対象に投与し、次に該ＣＴＬ、抗原提示細胞または抗体の例えば、位置、部位、量等を決定することで、癌の診断が可能となる。上記ＣＴＬ、抗原提示細胞または抗体は、標識されたものであってもよい。かかる標識を付すことで、本発明の診断方法を効率よく実施することができる。【００７６】
本発明は、別の態様において、上記ｅＥＦ２特異的ＣＴＬ、ｅＥＦ２ペプチドをＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を介して提示する抗原提示細胞、あるいはＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ｅＥＦ２ペプチドまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドに対する抗体または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対する抗体を必須構成成分として含む、癌の診断用キットに関するものである。【００７７】
本発明は、さらなる態様において、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性対象またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性対象におけるｅＥＦ２特異的ＣＴＬの存在または量を決定する方法であって、
（ａ）ｅＥＦ２ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子との複合体を該対象由来試料と反応させ；次に、
（ｂ）該試料に含まれる該複合体を認識するＣＴＬの存在または量を調べる、
工程を含む方法に関するものである。対象由来試料は、リンパ球が含まれている可能性があればいずれのものであってもよく、例えば、血液、リンパ液などの体液、組織などが挙げられる。ｅＥＦ２ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子との複合体は、例えば、ビオチンストレプトアビジン法などの当業者に既知の方法を用いて、例えば、テトラマー、ペンタマーなどの形態にされていてもよい。かかる複合体を認識するＣＴＬの存在または量は、当業者に既知の方法により測定することができる。本発明のこの態様において、上記複合体は標識されたものであってもよい。標識としては、蛍光標識、放射性標識などの公知のものを使用することができる。標識することで、ＣＴＬの存在または量の決定が容易かつ迅速になる。本発明のこの態様の方法を用いて、癌の診断、予後診断などが可能になる。【００７８】
従って、本発明はまた、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性対象またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性対象におけるｅＥＦ２特異的ＣＴＬの存在または量を決定するための、ｅＥＦ２ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子との複合体を含む組成物を提供する。【００７９】
さらに、本発明は、ｅＥＦ２ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子との複合体を含む、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性対象またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性対象におけるｅＥＦ２特異的ＣＴＬの存在または量を決定するためのキットを提供する。【００８０】
本発明は、さらなる態様において、ｅＥＦ２ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子との複合体を用いて、ｅＥＦ２特異的ＣＴＬを得る方法であって、
（ａ）試料と複合体を反応させ、
（ｂ）該試料中に含まれる該複合体を認識するＣＴＬを得る、
工程を含む方法に関するものである。ｅＥＦ２ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子との複合体については上述の通りである。試料は、リンパ球が含まれている可能性があればいずれのものであってもよく、例えば、血液などの対象由来試料、細胞培養液などが挙げられる。複合体を認識するＣＴＬの取得は、例えば、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳなど当業者に既知の方法を用いて行うことができる。得られたｅＥＦ２特異的ＣＴＬを培養し、種々の癌の治療または予防に用いることも可能になる。【００８１】
従って、本発明はまた、ｅＥＦ２ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子との複合体を用いて、ｅＥＦ２特異的ＣＴＬを得る方法により得ることのできる、ｅＥＦ２特異的ＣＴＬに関するものである。【００８２】
さらに、本発明は、ｅＥＦ２ペプチドとＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子との複合体を含む、ｅＥＦ２特異的ＣＴＬを得るためのキットに関するものである。【００８３】
本発明は、１の態様において、ｅＥＦ２ポリペプチドを発現させることを特徴とする、腫瘍形成のためのキットを提供する。すなわち、本発明のキットは、細胞または非ヒト動物において、ｅＥＦ２ポリペプチドを発現させることを必須構成要件とする。このため、該ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはこれを組み込んだベクターが必須構成成分である。ここで、本明細書における非ヒト動物は、ヒト以外の動物を示す。本発明のキットは、ｅＥＦ２タンパク質の強制発現が、細胞周期におけるＧ２／Ｍ期を促進させるという知見に基づく。また、本発明のキットは、上記ポリヌクレオチドまたはベクターのほかに、例えば、上記ポリヌクレオチドまたはベクターを細胞または非ヒト動物組織へ導入する手段、導入用試薬、反応容器等を含んでいてもよい。一般的には、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットを用いることにより、インビボまたはインビトロにおいて腫瘍を形成させ、次いで、例えば、候補分子の腫瘍形成や細胞増殖に対する効果を試験することを目的とすることができる。【００８４】
なお、本発明の方法は、インビボにおいて行われてもよいし、インビトロにおいて行われてもよい。【００８５】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００８６】
癌患者血清中のｅＥＦ２ＩｇＧ抗体の検出
肺癌細胞株ＰＣ１４およびＬＵ−９９Ｂ、白血病細胞株Ｋ５６２細胞をＳＤＳ−ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒに溶解した。これらに含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、肺癌患者１０名および健常者１０名より得られた血清を１５００：１に希釈したものを一次抗体として使用し、メンブレンに結合したＩｇＧ抗体を抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて可視化した。その結果、肺癌患者血清より特異的に認識される約１００ｋＤａのタンパク質を見出した（図１）。図１はウェスタンブロットの代表例である。その後、このタンパク質を分離後、質量分析の手法によりｅＥＦ２であると同定した。【００８７】
様々な癌におけるｅＥＦ２の過剰発現
パラフィン包埋ブロックより薄切切片を準備した。脱パラフィン処理後、クエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中で抗原賦活処理を行い、抗−ｅＥＦ２抗体（H-118, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA、１：１００希釈）と４℃で一晩反応後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ｋｉｔ／ＨＲＰ（Dako Cytomation）と室温で３０分間反応させた。０．７％  Ｈ２Ｏ２溶液と反応させた後、ＤＡＢを基質として発色させ、その後ヘマトキシリンにより核染色を行った。その結果、肺腺癌、小細胞性肺癌、頭頚部扁平上皮癌、食道癌、胃癌および結腸癌患者のそれぞれの患部組織において、抗体陽性細胞が観察された（図２〜４）。【００８８】
各種の癌でのｅＥＦ２抗体の検出
非小細胞肺癌の患者７２名、大腸癌の患者４２名、頭頚部扁平上皮癌の患者２０名、神経膠芽腫の患者１８名、および健常者１７名より同意のもと末梢血を得た。これを凝固させた後、遠心分離により血清を得た。ｅＥＦ２の第４１１−８５８位のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を挿入した組み換えタンパク質発現用のベクターｐＧＥＸ−５Ｘ−３（ＧＥ）を作成した。精製した組み換えＧＳＴ−ｅＥＦ２４１１−８５８タンパク質を１５０ｎｇ／レーンとなるよう調整し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。これをＰＶＤＦメンブレンに電気転写を行った。これと１５００：１に希釈した血清を室温で一晩反応させ、メンブレンに結合したＩｇＧ抗体を抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて可視化した。このバンドの密度を測定し、抗ｅＥＦ２抗体価とした。健常者１７名の抗体価の中央値は５００densitometric unitsで標準偏差は５００であったので、カットオフレベルをｍｅｄｉａｎ＋３ＳＤである２０００densitometric unitsとした。その結果、特異度９４．７％でｅＥＦ２  ＩｇＧ抗体は非小細胞肺癌では６６．７％、大腸癌では７１．８％、頭頚部扁平上皮癌では６０．０％、神経膠芽腫では８８．９％で陽性であった（図５）。各種癌におけるｅＥＦ２タンパク質の発現を免疫染色法により解析した。対応する正常細胞に比較して強い染色を示す癌細胞が、癌細胞全体の２５％以上である場合に陽性と判定した（表８）。【００８９】
【表８】
2010079833.tif 000009
【００９０】
ｅＥＦ２抗体による癌の早期検出
血清ＣＥＡ値の明らかである非小細胞肺癌の患者７０名（Ｉ期４４名、ＩＩ期１３名、ＩＩＩ期１３名）においてｅＥＦ２抗体価の陽性率とＣＥＡの陽性率を比較した。ここで、Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期の分類は、国際対癌連合により定められたＴＮＭ分類に従って行った。ｅＥＦ２抗体価はドットブロット法により決定した。その結果、非小細胞肺癌の各病期におけるｅＥＦ２ＩｇＧ抗体の陽性率は、ステージＩ期から高い値であることがわかった（表９）。【００９１】
【表９】
2010079833.tif 000010
【００９２】
ｅＥＦ２抗体価と無病生存率の関連
非小細胞肺癌におけるｅＥＦ２抗体価と無病生存率の関連について解析した。４４名の患者のうちｅＥＦ２抗体価が４０００densitometric units以上であった群（１１名）では、ｅＥＦ２抗体価が２０００ないし４０００densitometric unitsであった群（２６名）や２０００densitometric units未満であった群（７名）と比較して、有意に無病生存率が高かった（ｌｏｇ  ｒａｎｋ検定、図６）。
【実施例２】
【００９３】
各種細胞株における細胞増殖の抑制
ｅＥＦ２ｍＲＮＡの５’−caugggcaacaucaugaucgauccuguccu−３’配列を標的とするｓｉＲＮＡを発現するベクター（以下、ｓｈＥＦ２という）を、ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ発現ベクター、ｐｉＧＥＮＥ  ｔＲＮＡ  Ｐｕｒ（Clontech , Palo Alto, CA）を用いて作成した。次に、ｓｈＥＦ２または空のｓｈＲＮＡベクター（ｓｈＭｏｃｋ）１０μｇを、ｅＥＦ２を発現する胃癌細胞株ＡＺ−５２１およびＭＫＮ２８、大腸癌細胞株ＳＷ６２０、肺癌細胞株ＬＵ９９ＢおよびＰＣ−１４、膵癌細胞株ＭｉａＰａＣａ２およびＰＣＩ６、神経膠芽腫細胞株Ａ１７２およびＵ８７ＭＧ、ならびに悪性リンパ腫細胞株ＩＢ４およびＹＴ（各５ｘ１０５個）にＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍ（Bio Rad, Hercules, CA）を用いて、１６５Ｖ、１０００μＦの条件でエレクトロポレーションにより導入した。導入後２４、４８、７２および９６時間後、細胞をトリプシン処理し、生存細胞数を算定した。実験はｄｕｐｌｉｃａｔｅで３回独立に行った。いずれにおいてもｓｈＥＦ２は有意に細胞増殖を抑制した（図７および図８）。
【実施例３】
【００９４】
ｅＥＦ２ペプチドの選択
まず、４種のペプチドの選択は、ｅＥＦ２タンパク質のアミノ酸配列中のＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子に結合しうる配列をＰｒｏＰｒｅｄ−Ｉウェブサイト（http://www.imtech.res.in/raghava/propred1/）を用いて予測した。その結果を以下の表１０に示す。
（表１０．各種プログラム（ＮｅｔＭＨＣ３．０、ＲａｎｋｐｅｐおよびＳＹＦＰＥＩＴＨＩ）を用いて選択した、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子への高い結合親和性を有する候補ｅＥＦ２ペプチド）
【表１０】
2010079833.tif 000011
開始残基番号は、配列番号：１に示す番号である。全ての候補ｅＥＦ２ペプチドは９残基のアミノ酸からなる。例えば、開始残基番号７８６のペプチドは、配列番号：１の７８６番目の残基Ａから７９４番目の残基Ｆまでの９アミノ酸残基からなるペプチドである。【００９５】
次に、実際に、ＨＬＡ−Ａ２４０２分子への結合能をＭＨＣ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙにより解析した。簡単に説明すると、ＨＬＡ分子への抗原提示能を持たない、ヒトＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子を強制発現させたＴ２−２４０２細胞（１×１０６個）を、１０μＭの合成ペプチドを含み、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地において２７℃で１６時間インキュベートした後、３７℃で３時間放置した。ＨＬＡ−Ａ２４分子の細胞表面での発現はペプチドの結合により安定化されるので、それぞれのペプチドにより処理後、細胞表面のＨＬＡ−Ａ２４分子の発現をフローサイトメトリーで解析し、それぞれのペプチドのＨＬＡ−Ａ２４０２分子への結合能を評価した。その結果、ｅＥＦ２４０９−４１７（配列番号：４）、ｅＥＦ２４１２−４２０（配列番号：５）、ｅＥＦ２７０１−７０９（配列番号：６）およびｅＥＦ２７８６−７９４（配列番号：７）の各々のペプチドがＨＬＡ−Ａ２４０２分子に対して結合能を示した（表１１）。【００９６】
【表１１】
2010079833.tif 000012
【００９７】
インターフェロン活性の測定
Ｔ細胞をｅＥＦ２ペプチド（ｅＥＦ２４０９−４１７、ｅＥＦ２４１２−４２０およびｅＥＦ２７０１−７０９ペプチド）でパルスしたＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子発現Ｔ２細胞とｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（Ｓｉｇｍａ）存在下にて３７℃で５時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、ＰｅｒＣＰ抱合抗ＣＤ３（BD Biosciences）およびＰＥ抱合抗ＣＤ８（Caltag, Burlingame, CA）抗体により細胞表面抗原であるＣＤ３およびＣＤ８分子を氷上で１５分間染色した。次にＣｙｔｏｆｉｘ（BD Biosciences）を用いて細胞を氷上で２０分間固定し、細胞内のＩＦＮ−γをＦＩＴＣ抱合抗ＩＦＮ−γ抗体（BD Biosciences）により氷上で３０分間反応させた。フローサイトメーターを用いて解析し、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の中に占めるＩＦＮ−γ陽性細胞の頻度を解析した。この結果、ｅＥＦ２４０９−４１７、ｅＥＦ２４１２−４２０およびｅＥＦ２７０１−７０９ペプチドはインターフェロンγ活性を上昇させ、よってＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性ペプチドであることがわかった（図３０）。【００９８】
改変型ｅＥＦ２ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子への結合親和性
さらに、上記ペプチドのうち、ｅＥＦ２７８６−７９４（配列番号：７）およびｅＥＦ２４０９−４１７（配列番号：４）のペプチドにおいて、アミノ酸配列の第２位（以下、Ｐ２ともいう）および／または第９位（以下、Ｐ９ともいう）を別のアミノ酸に改変した改変型ｅＥＦ２ペプチドについても、上述のごとく結合親和性を予測した。
（表１２．ｅＥＦ２７８６−７９４ペプチドの改変型（配列番号：２５および２６）に関するＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子への結合親和性の予測）
【表１２】
2010079833.tif 000013
（表１３．改変型ｅＥＦ２４０９−４１７ペプチド（配列番号：２７〜３１）に関するＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子への結合親和性の予測）
【表１３】
2010079833.tif 000014
ｅＥＦ２７８６−７９４（配列番号：７）ペプチドは、Ｐ２がＹであり、Ｐ９がＦであり、ＹとＦはアンカー残基であるため、他の残基に改変しても、結合親和性の向上は認められなかった（表１２）。一方、ｅＥＦ２４０９−４１７（配列番号：４）ペプチドは、Ｐ２をアンカー残基Ｙに改変すると、著しい結合親和性の向上が認められた（表１３）。【００９９】
ｅＥＦ２特異的キラーＴ細胞の誘導
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子を持つドナーから得られた末梢血単核球からＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇ細胞をＣＤ２５  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Miltenyi Biotech, Auburn, CA）を用いて除去した。次にドナーの単球をＢＤ  ＩＭａｇ  ＣＤ１４  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（BD Bioscience）を用いて単離し、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを含み、１％ヒトＡＢ血清が補充されたＸ−ＶＩＶＯ１５（Bio Whittaker, Walkersville, MD）中で培養し、翌日、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＰＧＥ−２を樹状細胞の成熟のために添加し、さらに３日間培養した。樹状細胞に放射線（３０Ｇ）照射した後、ペプチドを１０μｇ／ｍＬ含有培地中で２時間培養し、樹状細胞をペプチドでパルスした後、Ｔｒｅｇ細胞を除去した単核球（２ｘ１０６細胞）をペプチドパルスした樹状細胞と１０：１の比で共培養し、ペプチドによる刺激を行い、翌日、ＩＬ−２を培地に添加した。その後、１０日毎にペプチドパルスした放射線照射ドナー単核球により再刺激を行い、数回刺激を行った後、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を含む培地で培養し、Ｔ細胞クローンを樹立した。【０１００】
細胞傷害活性の測定
上述のごとく樹立したＴ細胞クローンからＣＤ８陽性Ｔ細胞をＣＤ８  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを用いて精製し、エフェクター細胞を調製した。次に、標的細胞を５１Ｃｒ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｒｏｍａｔｅ（Amersham Biosciences Corp., NJ）で１時間インキュベートしてラベルした後、これらをエフェクター細胞と細胞数の比が１：１、３：１および９：１のＣＴＬ／標的細胞（Ｅ／Ｔ）の比で混ぜ、４時間放置した。溶解した細胞の割合は、式：
％特異的溶解＝［（cpm experimental release−cpm spontaneous release）／（cpm maximal release−cpm spontaneous release）］ｘ１００
で求めた。標的細胞としてｅＥＦ２７８６−７９４ペプチドをパルスされたＴ２−２４０２細胞および陰性コントロールとしてｅＥＦ２７８６−７９４ペプチド（配列番号：７）でパルスしていないＴ２−２４０２細胞を用いた。これにより、ｅＥＦ２７８６−７９４ペプチドでパルスされたＴ２−２４０２細胞の％特異的溶解が、Ｅ／Ｔ比とともに著しく上昇することが示された（図９）。また、標的細胞として、内在性のｅＥＦ２発現があり、細胞表面でのＨＬＡ−Ａ＊２４０２発現がある大腸癌ＳＷ４８０細胞、ならびに陰性コントロールとして、内在性のｅＥＦ２発現があるが、細胞表面でのＨＬＡ−Ａ＊２４０２発現がない胃癌ＡＺ−５２１細胞および膵癌ＭｉａＰａＣａ２細胞を用いた。この結果、ｅＥＦ２７８６−７９４ペプチドで活性化された細胞傷害性Ｔ細胞が、ｅＥＦ２を発現し、かつＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子を有する細胞を特異的に傷害することが示された（図１０）。
【実施例４】
【０１０１】
ｅＥＦ２ペプチドの選択
ペプチドの選択は、ｅＥＦ２タンパク質のアミノ酸配列中のＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に結合しうる配列をＰｒｏＰｒｅｄ−Ｉウェブサイト（http://www.imtech.res.in/raghava/propred1/）を用いて予測した（表１〜７）。次に、実際に、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子への結合能をＭＨＣ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙにより解析した。簡単に説明すると、ＨＬＡ分子への抗原提示能を持たない、ヒトＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を強制発現させたＴ２−０２０１細胞（１×１０６個）を、１０μＭの合成ペプチドを含み、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地において２７℃で１６時間インキュベートした後、３７℃で３時間放置した。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子の細胞表面での発現はペプチドの結合により安定化されるので、それぞれのペプチドにより処理後、細胞表面のＨＬＡ−Ａ０２０１分子の発現をフローサイトメトリーで解析し、それぞれのペプチドのＨＬＡ−Ａ０２０１分子への結合能を評価した。その結果、ｅＥＦ２２８４−２９２（配列番号：１３）、ｅＥＦ２３９４−４０２（配列番号：１２）、ｅＥＦ２５１９−５２７（配列番号：９）、ｅＥＦ２６６１−６６９（配列番号：１１）、ｅＥＦ２６７１−６７９（配列番号：１０）およびｅＥＦ２７３９−７４７（配列番号：８）の各々のペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に対して結合能を示した（表１４）。【０１０２】
【表１４】
2010079833.tif 000015
【０１０３】
インターフェロン活性の測定
Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ｅＥＦ２ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子発現Ｔ２細胞とｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（Ｓｉｇｍａ）存在下にて３７℃で５時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、ＰｅｒＣＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ３（BD Biosciences）およびＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ８（Caltag, Burlingame, CA）抗体により細胞表面抗原であるＣＤ３およびＣＤ８分子を１５分間氷上で染色した。次にＣｙｔｏｆｉｘ（BD Biosciences）を用いて氷上で２０分間細胞を固定し、細胞内のＩＦＮ−γをＦＩＴＣ−抱合抗−ＩＦＮ−γ抗体（BD Biosciences）により氷上で３０分間反応させた。フローサイトメーターを用いて解析し、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の中に占めるＩＦＮ−γ陽性細胞の頻度を解析した。図１１ではｅＥＦ２７３９−７４７ペプチド、図１２ではｅＥＦ２６６１−６６９ペプチドを用いた。この結果、ｅＥＦ２６６１−６６９（配列番号：１１）およびｅＥＦ２７３９−７４７（配列番号：８）のペプチドがインターフェロンγ活性を上昇させることがわかった（図１１および１２）。【０１０４】
細胞傷害活性の測定
次いで、上述のごとく選択した６種類の候補ペプチド（ｅＥＦ２７３９−７４７（配列番号：８）、ｅＥＦ２５１９−５２７（配列番号：９）、ｅＥＦ２６７１−６７９（配列番号：１０）、ｅＥＦ２６６１−６６９（配列番号：１１）、ｅＥＦ２３９４−４０２（配列番号：１２）およびｅＥＦ２２８４−２９２（配列番号：１３）であって、ｅＥＦ２２９２−３００（配列番号：１４）は除いた）が実際に細胞傷害活性を有するかどうかを調べた。上記の実施例３とほぼ同様に実験を行った。すなわち、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を保有する健全なドナーから採血し、末梢血単核球を分離し、６種類の候補ペプチドで１回目の刺激を行った（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ：自己ＰＢＭＣ）。その後、２日目以降のペプチド刺激を８〜１３日間隔で行った（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ：ａｌｌｏ  Ｂ−ＬＣＬ  ３ｍｇ／ｍｌ）。さらに、２回目以降２日ごとに最終濃度２０ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２を添加した。最終ペプチド刺激から６日後に細胞傷害性の測定を行った。その結果、上記６種類のペプチドで細胞傷害活性の上昇が見られた（図１６〜２１）。以上より、上記６種類のペプチド（ｅＥＦ２７３９−７４７（配列番号：８）、ｅＥＦ２５１９−５２７（配列番号：９）、ｅＥＦ２６７１−６７９（配列番号：１０）、ｅＥＦ２６６１−６６９（配列番号：１１）、ｅＥＦ２３９４−４０２（配列番号：１２）およびｅＥＦ２２８４−２９２（配列番号：１３）が、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に結合し、かつ細胞傷害性活性を有することがわかった。【０１０５】
次に、上記６種類のペプチドおよびｅＥＦ２２９２−３００ペプチド（配列番号：１４）がＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子に結合して、インターフェロン−γを産生させることができるかどうかを調べた。ＨＬＡ−Ａ＊０２０６分子を保有するドナーを用いることを除いて、上記方法と同じ手法を用いて実験を行った。その結果、試験した全てのペプチドが、インターフェロン−γの産生を上昇させることがわかった（図２９）。【０１０６】
改変型ｅＥＦ２ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子への結合親和性
次いで、上記６種類のペプチド（ｅＥＦ２７３９−７４７、ｅＥＦ２５１９−５２７、ｅＥＦ２６７１−６７９、ｅＥＦ２６６１−６６９、ｅＥＦ２３９４−４０２およびｅＥＦ２２８４−２９２）、ならびにｅＥＦ２２９２−３００ペプチド（配列番号：１４）において、第２位アミノ酸および／または第９位アミノ酸を別のアミノ酸に改変した改変型ｅＥＦ２ペプチドについても、上述のごとくプログラムを用いて結合親和性を予測した（表１５〜２１）。
【表１５】
2010079833.tif 000016
【表１６】
2010079833.tif 000017
【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
2010079833.tif 000021
【表２１】
2010079833.tif 000022
【０１０７】
さらに、上記ペプチドのうち、ｅＥＦ２２９２−３００（配列番号：１４）の改変型ペプチド（配列番号：１５〜１７および２４）について、上述のごとき手法を用いて、実際のＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子への結合親和性（表２２）、細胞傷害性（図２２〜２５）およびインターフェロンγ活性（図２６）を調べた。
【表２２】
2010079833.tif 000023
この結果、ｅＥＦ２２９２−３００ペプチドの改変型のうち、ｅＥＦ２２９２−３００２Ｌ（ｅＥＦ２２９２−３００ペプチド中、第２位のアミノ酸がＩからＬに改変されたペプチド、配列番号：１５）、ｅＥＦ２２９２−３００２Ｍ（ｅＥＦ２２９２−３００ペプチド中、第２位のアミノ酸がＩからＬに改変されたペプチド、配列番号：１６）、ｅＥＦ２２９２−３００２Ｌ９Ｌ（ｅＥＦ２２９２−３００ペプチド中、第２位のアミノ酸がＩからＬに、および第９位のアミノ酸がＶからＬに改変されたペプチド、配列番号：１７）およびｅＥＦ２２９２−３００２Ｍ９Ｌ（ｅＥＦ２２９２−３００ペプチド中、第２位のアミノ酸がＩからＭに、および第９位のアミノ酸がＶからＬに改変されたペプチド、配列番号：２４）は、元のｅＥＦ２２９２−３００ペプチドよりＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に対する結合が高く（表２２）、ヒトにおける細胞傷害性およびインターフェロンγ活性を上昇させることがわかった（図２２〜２６、２８）。
【実施例５】
【０１０８】
癌細胞株におけるｅＥＦ２強制発現
胃癌細胞株ＡＺ−５２１にｅＥＦ２発現ベクターまたは空の発現ベクターを発現させた細胞クローンを樹立した。ｅＥＦ２発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Invitrogen）の制限酵素切断部位ＥｃｏＲＩにｅＥＦ２遺伝子のヌクレオチド配列を挿入したものである。これらの細胞を同調させずに培養し、培養開始後４８時間および７２時間後の細胞数から細胞の倍加時間を計算した。さらに１ｘ１０５個の細胞を８０％エタノールで固定後、細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ、５μｇ／ｍｌ）およびＲＮａｓｅＡ（２００μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ中で３０分間放置し、フローサイトメトリーにより細胞周期のｐｈａｓｅごとの分布を解析した（図１３、左上のグラフ）。次に、細胞の倍加時間は細胞周期の長さに相当するので、これと各細胞周期のｐｈａｓｅの分布の割合をかけることにより、各ｐｈａｓｅの進行時間を計算した（図１３、右上のグラフおよび下の表）。その結果、ｅＥＦ２を発現させた細胞では、Ｇ２／Ｍ期の細胞数が減少し、進行時間が短くなることが観察された（図１３）。このことは、ｅＥＦ２がＧ２／Ｍ期の進行を促進することを示唆する。【０１０９】
上述のごとく樹立させた、ｅＥＦ２を強制発現した胃癌細胞株ＡＺ−５２１（２クローン）とコントロールの空ベクターを発現させたＡＺ−５２１（２クローン）のそれぞれ５ｘ１０６個を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Becton Dickinson）と混和し、ヌードマウスの左右の腹部に皮下注射し、腫瘍を形成させ、そのサイズを週に２回計測し、３４日間観察した。腫瘍体積（ｍｍ３）は、（短径）２ｘ（長径）２／２で計算した。各クローンについて独立して３回実験した結果を示す（図１４）。この結果から、ｅＥＦ２を強制発現させた細胞を注射したマウスでは、コントロールと比べて、腫瘍の体積が著しく肥大化することが示された。図１５は代表例を示す。左側の腫瘍が空ベクターを発現したＡＺ−５２１細胞、右側の腫瘍がｅＥＦ２を強制発現したＡＺ−５２１細胞である。
【実施例６】
【０１１０】
ｅＥＦ２を標的とするｓｈＲＮＡの新たな標的配列の同定
ｅＥＦ２を標的として効率的にｅＥＦ２の発現を抑制し、癌の増殖を抑制しうるｓｈＲＮＡ（以下、ｓｈＥＦ２という）を開発するために、新たにｅＥＦ２の配列中で標的となりうる２つの配列（以下、ｓｈＥＦ−１９１８およびｓｈＥＦ−２８０４という）を選択した。
ｅＥＦ２遺伝子の第１９１８〜１９４７位（ｅＥＦ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列の５’末端から第１９１８〜１９４７位）の標的配列：
５’−gcc tggccgagga catcgataaa ggcgagg−３’（配列番号：１８）
ｅＥＦ２遺伝子の第２８０４〜２８３３位の（ｅＥＦ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列の５’末端から第２８０４〜２８３３位）の標的配列：
５’−actcaac cataacactt gatgccgttt ctt−３’（配列番号：１９）【０１１１】
ｓｈＲＮＡの構築
上記配列（配列番号：１８および１９）に対するｓｈＲＮＡを構築するために、ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ発現ベクター、ｐｉＧＥＮＥ  ｔＲＮＡ  Ｐｕｒ（Clontech , Palo Alto, CA）のＳａｃＩとＫｐｎＩの認識部位に標的配列のセンス配列（３０塩基）−ループ配列（１０塩基）−アンチセンス配列（３０塩基）からなるＤＮＡ配列（ｓｈＥＦ−１９１８またはｓｈＥＦ−２８０４（センス鎖））、およびその相補ＤＮＡ配列（ｓｈＥＦ−１９１８またはｓｈＥＦ−２８０４（アンチセンス鎖））を化学合成後、アニールさせ、挿入した。かかる挿入したＤＮＡ配列を以下に示す。ここで、配列が転写されたＲＮＡが切断された際にアンチセンス鎖が効率よくＲＩＳＣに取り込まれるように、標的配列のセンス配列の一部に変異を加えた（以下の配列中、下線で示す）。
・ｓｈＥＦ−１９１８（センス鎖）：
５’−(gcc tggccgagga catcgatgaa agcgtgg) cttcctgtca (cctcgcc tttatcgatg tcctcggcca ggc)−３’（配列番号：２０）
・ｓｈＥＦ−１９１８（アンチセンス鎖）：
３’−（cgg accggctcct gtagctactt tcgcacc) gaaggacagt (ggagcgg aaatagctac aggagccggt ccg)−５’（配列番号：２１）
・ｓｈＥＦ−２８０４（センス鎖）：
５’−(actcaac cataacactt gataccattt gtt) cttcctgtca (aag aaacggcatc aagtgttatg gttgagt)−３’（配列番号：２２）
・ｓｈＥＦ−２８０４（アンチセンス鎖）：
３’−(tgagttg gtattgtgaa ctatggtaaa caa) gaaggacagt (ttc tttgccgtag ttcacaatac caactca)−５’（配列番号：２３）【０１１２】
細胞培養およびｓｈＲＮＡの導入
肺癌細胞ＰＣ−１４、膵癌細胞ＰＣＩ６、線維肉腫細胞ＨＴ−１０８０および悪性神経膠腫細胞Ａ１７２をＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ中で培養した。ＳｈＲＮＡを導入するために、細胞（１ｘ１０５個）をＰＢＳで２回洗浄した後、２５０μＬのＦＢＳ不含ＲＰＭＩ１６４０培地中で懸濁し、これに５０ｕＬのＦＢＳ不含ＲＰＭＩ１６４０培地で溶解した１０ｕｇのｓｈＥＦ−１９１８、ｓｈＥＦ−２８０４、またはＬｕｃｉｆｅｒａｓｅに対するｓｈＲＮＡベクター、ｓｈＬｕｃをそれぞれ加え、９５０μＦＤ、１７５Ｖの条件下でＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｏｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、エレクトロポレーションを行った。この条件における細胞の生存率は約９０％である。ｓｈＲＮＡを導入した後、生細胞数を算定し、１ｘ１０５細胞／ｍＬの密度で細胞を播き、７２時間後にトリプシン処理し、細胞数を算定した。その結果、ｓｈＥＦ−１９１８およびｓｈＥＦ−２８０４は、解析した４つのすべての細胞においてｓｈＬｕｃに比較して、有意にその増殖を抑制した（図２７）。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明により、ｅＥＦ２をマーカーとして用いた癌の検出方法、ｅＥＦ２を標的とした治療または予防のための医薬組成物、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性もしくはＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のｅＥＦ２ペプチド、およびそれらを含む医薬組成物等が提供されるので、医薬品等の分野、例えば、ｅＥＦ２遺伝子を高発現している種々の造血器腫瘍、固形癌の予防薬、または治療薬の開発、製造分野において利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１４】
SEQ ID NO:2: eEF2 siRNA
SEQ ID NO:3: eEF2 siRNA
SEQ ID NO:18: eEF2 1918-1947
SEQ ID NO:19: eEF2 2804-2833
SEQ ID NO:20: shEF-1918 sense
SEQ ID NO:21: shEF-1918 antisense
SEQ ID NO:22: shEF-2804 sense
SEQ ID NO:23: shEF-2804 antisense
【図１】
2010079833.tif 000024
【図２】
2010079833.tif 000025
【図３】
2010079833.tif 000026
【図４】
2010079833.tif 000027
【図５】
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【図６】
2010079833.tif 000029
【図７】
2010079833.tif 000030
【図８】
2010079833.tif 000031
【図９】
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【図１０】
2010079833.tif 000033
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2010079833.tif 000039
【図１７】
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【図１８】
2010079833.tif 000041
【図１９】
2010079833.tif 000042
【図２０】
2010079833.tif 000043
【図２１】
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【図２２】
2010079833.tif 000045
【図２３】
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【図２４】
2010079833.tif 000047
【図２５】
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【図２６】
2010079833.tif 000049
【図２７】
2010079833.tif 000050
【図２８】
2010079833.tif 000051
【図２９】
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【図３０】
2010079833.tif 000053
【配列表】
2010079833000001.app
【国際調査報告】
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