(57)【要約】  フラボノイド、特にフラボノールの3位にグルクロン酸を転移し得る酵素（F3GAT）、当該酵素をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含有するベクター、及び当該ベクターを用いて得られる形質転換体等を提供する。本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号３で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号３で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列において１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列に対して、80％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号３で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；又は（ｆ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の（ｇ）〜（ｊ）のいずれかである請求項１に記載のポリヌクレオチド：
（ｇ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列において10個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列に対して、90％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；又は（ｊ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記（ｃ）〜（ｊ）に記載のポリヌクレオチドが、それぞれ、以下の（ｃ’）〜（ｊ’）に記載のポリヌクレオチドである、請求項１又は２記載のポリヌクレオチド：
（ｃ’）配列番号４で表わされるアミノ酸配列において第140番目のアミノ酸を除く１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ’）配列番号４で表わされるアミノ酸配列に対して、80％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって当該配列番号４で表わされるアミノ酸配列中の第140番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列を有し、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ’）配列番号３で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドあって当該配列番号３で表わされる塩基配列中の第418〜420番目の塩基に対応する塩基がアルギニンをコードする塩基であるポリヌクレオチドであり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；（ｆ’）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドあって当該配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列中の第418〜420番目の塩基に対応する塩基がアルギニンをコードする塩基であるポリヌクレオチドであり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｇ’）配列番号４で表わされるアミノ酸配列において第140番目のアミノ酸を除く10個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｈ’）配列番号４で表わされるアミノ酸配列に対して、90％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって当該配列番号４で表わされるアミノ酸配列中の第140番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列を有し、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｉ’）配列番号３で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドあって当該配列番号３で表わされる塩基配列中の第418〜420番目の塩基に対応する塩基がアルギニンをコードする塩基であるポリヌクレオチドであり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；又は（ｊ’）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドあって当該配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列中の第４１８〜420番目の塩基に対応する塩基がアルギニンをコードする塩基であるポリヌクレオチドであり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項４】
UDP-グルクロン酸転移酵素活性が、フラボノイド3位グルクロン酸転移酵素活性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号３で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
DNAである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
【請求項１１】
請求項９に記載のベクターが導入された形質転換体。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の形質転換体を用いる、請求項８に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１３】
請求項８に記載のタンパク質を触媒として、UDP-グルクロン酸と糖受容体基質からグルクロン酸抱合体を生成する、グルクロン酸抱合体の製造方法。
【請求項１４】
糖受容体基質がフラボノイドである、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラボノイド3位グルクロン酸転移酵素、当該酵素をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含有するベクター、及び当該ベクターを用いて得られる形質転換体等に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラボノイドやリグナンに代表される植物二次代謝産物は健康食品として利用されることが多いが、それらは体内においてUGTと呼ばれる糖転移酵素（配糖体化酵素）によってグルクロン酸抱合化される。一般にグルクロン酸抱合体は尿として排出されることからその機能性についてはこれまで研究の対象にされてこなかったが、近年になってモルヒネグルクロン酸抱合体やフラボノイドのグルクロン酸抱合体の生物活性が知られてきた（非特許文献１、２参照）。
ワイン原料であるブドウ科ブドウ（Vitis vinifera）は世界的に主要な農作物であり、赤ワインは心臓病リスクの軽減や抗肥満効果などの有用な機能性が知られているが、近年、抗肥満効果や延命効果の主要な機能性分としてスチルベンの一種であるレスベラトロールや、フレンチパラドクスの要因となる主要な成分としてプロシアニジンが同定されたことから機能性食品として注目されている（非特許文献３〜９参照）。【０００３】
ブドウ葉には、フラボノイドの一種であるフラボノール配糖体として、ケルセチン3位グルコース配糖体及びケルセチン3位グルクロン酸配糖体が蓄積していることが報告されている（非特許文献１０参照）。また近年、ブドウ果実およびワインにおいても各種フラボノール配糖体の蓄積が報告されている（非特許文献１１）。特にケルセチンの3位グルクロン酸配糖体はミケリアニンと呼ばれ、抗鬱剤として用いられているセントジョーンズワートの薬理種成分の一つとして知られており、経口投与によって腸管から吸収され中枢神経系へ達することが示されているが、ケルセチン3位ラムノース配糖体にはその活性がない（非特許文献１２参照）。さらに、ケルセチンの3位グルクロン酸配糖体は、LDL分解阻害効果（非特許文献１３、１４参照）や、H2O2による細胞内酸化ストレスの軽減効果（非特許文献１５参照）や、アンジオテンシンによる血管肥大の抑制効果（心臓病予防）（非特許文献１６参照）等が知られている。【０００４】
これらのことから、フラボノイド、特にフラボノールの3位にグルクロン酸を転移する酵素は、機能性フラボノイドの作出に有用と考えられるが、これまでフラボノイドの3位の配糖体化酵素としては、グルコース、ガラクトース、アラビノース及びラムノースを糖供与体として転移するもののみ知られており、グルクロン酸を糖供与体として転移する酵素及びそれをコードする遺伝子は知られていない（非特許文献１７〜２０参照）。
ところで、近年、イタリア及びフランスの合同コンソーシアムによって、ブドウ（ピノノワール（Pinot Noir）品種）のゲノム配列が解読され、240個もの配糖体化酵素（UGT）遺伝子が同定された（非特許文献２１、２２参照）。
しかしながら、遺伝子配列情報から糖転移酵素遺伝子であることが推定されても、そこから基質である糖の種類や受容体となる物質を類推することは容易ではなく、しかも、上述したように候補遺伝子の数も240個と非常に多いため、これらUGT遺伝子の中から、これまで他の生物においても報告のないフラボノイド3位グルクロン酸転移酵素（Flavonoid 3-O-glucuronic acid transferase; F3GAT）を同定することは極めて困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kroemer, H. K. and Klotz, U. Clin. Pharmacokinet., vol. 23, p. 292-310, 1992
【非特許文献２】Zhang, L. et al., Eur. J. Pharm. Sci., vol. 31, p. 221-231, 2007
【非特許文献３】Renaud, S. and De Lorgeril, M., Lancet, vol. 339, p. 1523-1526, 1992
【非特許文献４】Gehm, B. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, p. 14138-14143, 1997
【非特許文献５】Corder, R. et al., Nature, vol. 414, p. 863-864, 2001
【非特許文献６】Lamming, D. W. et al. Mol. Microbiol., vol. 53, p. 1003-1009, 2004
【非特許文献７】Corder, R. et al., Nature, vol. 444, p. 566, 2006
【非特許文献８】Baur, J. A. and Sinclair, D. A., Nature Rev. Drug Discovery, vol. 5, p. 493-506, 2006
【非特許文献９】Baur, J. A. et al., Nature, vol. 444, p. 337-342, 2006
【非特許文献１０】Hmamouchi, M. et al., Am. J. Enol. Vitic., vol. 47, p. 186-192, 1996
【０００６】
【非特許文献１１】Castillo-Munoz, N. et al., J. Agric. Food. Chem., vol. 55, p. 992-1002, 2007
【非特許文献１２】Juergenliemk, G. et al., Plant Med., vol. 69, p. 1013-1017, 2003
【非特許文献１３】Terao, J. et al, Free Radical Res., vol. 35, p. 925-931, 2001
【非特許文献１４】Shirai, M. et al., J. Agric. Food Chem., vol. 49, p. 5602-5608, 2001
【非特許文献１５】Shirai, M. et al., Biosci. Biotechnol. Biocham., vol. 66, p. 1015-1021, 2002
【非特許文献１６】Yoshimizu, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commu., vol. 293, p. 1458-1465, 2002
【非特許文献１７】Ford, C. M. et al., J. Biol. Chem., vol. 273, p. 9224-9233, 1998
【非特許文献１８】Miller, K. D. et al., J. Biol. Chem., vol. 274, p. 34011-34019, 1999
【非特許文献１９】Yonekura-Sakakibara, K. et al., J. Biol. Chem., vol. 282, p. 14932-14941, 2007
【非特許文献２０】Yonekura-Sakakibara, K. et al., Plant Cell, vol. 20, p. 2160-2176, 2008
【非特許文献２１】The French-Italian Public Consortium for Grapevine Genome Characterization, Nature, vol. 449, p. 463-468, 2007
【非特許文献２２】Velasco, T. et al., PLoS ONE, vol. 12, e1326, p. 1-18, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、フラボノイド、特にフラボノールの3位にグルクロン酸を転移し得る酵素、当該酵素をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含有するベクター、及び当該ベクターを用いて得られる形質転換体等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、本発明者は、フラボノイドUGTの遺伝子配列構造と糖受容体である基質に対する位置特異性との間に相関があることに着目し、フラボノイド3位に糖を転移する酵素遺伝子と相同性の高いブドウ由来UGT遺伝子をゲノム配列情報から抽出することにより、6種の候補ブドウ由来UGT遺伝子（Vitis vinifera UDP-sugar:glycosyltransferase; VvGT）を得た。その6種のVvGTのうちの1種（VvGT5）が、フラボノイドの3位にUDP-グルクロン酸依存的にグルクロン酸を転移する活性を有する酵素、すなわちフラボノイド3位グルクロン酸転移酵素（Flavonoid 3-O-glucuronic acid transferase; F3GAT）をコードする遺伝子であることを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）  以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号３で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列において１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列に対して、80％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号３で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；又は  （ｆ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。【００１０】
上記(1)のポリヌクレオチドは、例えば、以下の（ｇ）〜（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチドが挙げられる。
（ｇ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列において10個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列に対して、90％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；又は  （ｊ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。【００１１】
また、上記(1)のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｃ）〜（ｊ）に記載のポリヌクレオチドが、それぞれ、以下の（ｃ’）〜（ｊ’）に記載のポリヌクレオチドであるものが挙げられる。
（ｃ’）配列番号４で表わされるアミノ酸配列において第140番目のアミノ酸を除く１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｄ’）配列番号４で表わされるアミノ酸配列に対して、80％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって当該配列番号４で表わされるアミノ酸配列中の第140番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列を有し、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｅ’）配列番号３で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドあって当該配列番号３で表わされる塩基配列中の第418〜420番目の塩基に対応する塩基がアルギニンをコードする塩基であるポリヌクレオチドであり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；（ｆ’）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドあって当該配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列中の第418〜420番目の塩基に対応する塩基がアルギニンをコードする塩基であるポリヌクレオチドであり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｇ’）配列番号４で表わされるアミノ酸配列において第140番目のアミノ酸を除く10個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｈ’）配列番号４で表わされるアミノ酸配列に対して、90％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって当該配列番号４で表わされるアミノ酸配列中の第140番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列を有し、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
（ｉ’）配列番号３で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドあって当該配列番号３で表わされる塩基配列中の第418〜420番目の塩基に対応する塩基がアルギニンをコードする塩基であるポリヌクレオチドであり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；又は（ｊ’）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドあって当該配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列中の第４１８〜420番目の塩基に対応する塩基がアルギニンをコードする塩基であるポリヌクレオチドであり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。【００１２】
上記(1)のポリヌクレオチドは、例えば、上記UDP-グルクロン酸転移酵素活性が、フラボノイド3位グルクロン酸転移酵素活性であるものが挙げられる。
上記(1)のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号３で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は、配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するものが挙げられる。
上記(1)のポリヌクレオチドは、例えば、DNAであるものが挙げられる。【００１３】
（２）  上記(1)のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
（３）  上記(1)のポリヌクレオチドを含有するベクター。
（４）  上記(1)のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
（５）  上記(3)のベクターが導入された形質転換体。
（６）  上記(4)又は(5)の形質転換体を用いる上記(2)のタンパク質の製造方法。
（７）  上記(2)のタンパク質を触媒として、UDP-グルクロン酸と糖受容体基質からグルクロン酸抱合体を生成する、グルクロン酸抱合体の製造方法。
上記(7)の方法は、例えば、糖受容体基質がフラボノイドである方法が挙げられる。
【発明の効果】
【００１４】
一般に、フラボノイドは体内において、その多くが、3位又は7位がグルクロン酸抱合化されおり、その構造の違いから異なる機能性及び有用性が予測されている。しかしながら、ヒト又は動物からこれらのグルクロン酸抱合化された代謝物を分離及び精製して得ることは、経済性及び時間的コストが見合わないものであった。
本発明によれば、in vitroで、もしくは宿主細胞に本発明の遺伝子を導入することにより、フラボノイドの3位にグルクロン酸を転移することが可能となり、ミケリアニンをはじめとする有用フラボノイドグルクロナイドを上記のような天然資源に依存せずに容易に生産させ得る、糖転移酵素（配糖体化酵素）を提供することができる。また、本発明によれば、当該酵素をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含有するベクター、及び当該ベクターを用いて得られる形質転換体、並びに当該酵素を用いたグルクロン酸抱合体の製造方法等を提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ブドウ由来フラボノイド配糖体化酵素ホモログ遺伝子の系統解析の結果を示す図である。Neighbor-Joining（NJ）法による8種のブドウUGT (VvGT)を含むフラボノイドUGT遺伝子のクラスターＩの分子系統樹である。アウトグループ（Out group）は、アメリカブドウ Vitis labrusca（コンコード種）のレスベラトロールのグルコース転移酵素遺伝子(VlRSgt)である。
【図２】ブドウ由来配糖体化酵素ホモログ遺伝子の染色体マッピングの結果を示す図である。VvGT1ホモログ遺伝子は、LG11染色体とLG6染色体上にタンデム状に座位している。
【図３】大腸菌発現VvGT5タンパク質の精製（SDS-PAGE）の結果を示す図である。500mMイミダゾールによる溶出画分に認められるバンド（図中の矢印）は、Hisタグ融合VvGT5タンパク質である。なお、「M」は分子サイズマーカー、「粗」は粗酵素液、「素」は素通りの液、「洗」は洗浄後の液を示す。
【図４】VvGT5の酵素活性測定の結果を示す図である。具体的には、360nmでモニターしたHPLCチャートである。上段のチャートは、ケルセチンとVvGT5との反応液についてのもの、中段のチャートは、標品のケルセチン3-グルクロナイドについてのもの、下段のチャートは、標品のケルセチンについてのものである。上段のチャートに示した矢印は、反応生成物のピークを示す。
【図５】VvGT5の至適pHアッセイに用いたバッファー系を示す図表である。
【図６】VvGT5の反応pH依存性の結果を示す図である。縦軸は、最も活性が高いものを100％としたときの相対活性（％）を示す。
【図７】VvGT5の反応温度依存性の結果を示す図である。縦軸は、最も活性が高いものを100％としたときの相対活性（％）を示す。
【００１６】
【図８】VvGT5の糖受容体選択性の結果を示す図表である。「n. d.」は、検出限界以下を示す。
【図９】ケルセチン3-グルクロナイドのNMRの結果を示す図である。構造式の中央下部の太線で示した結合部分は、HMBC（Hetero-nuclear Multiple-Bond Connectivity）測定により結合が確認された部分である。
【図１０】定量RT-PCRによる器官別VvGT遺伝子発現解析の結果を示す図である。具体的には、ピノノアール品種（左）とカベルネソーヴィニョン品種（右）におけるVvGTの遺伝子発現解析を行った結果である。両品種とも、上段のグラフはVvGT1遺伝子について、中段のグラフはVvGT5遺伝子について、下段のグラフはVvGT6についての解析結果である。いずれのグラフも、内部標準遺伝子(VvUBQ)で標準化した相対発現量を示している。
【図１１】フラボノイドLC分析の結果を示す図である。「Q3GA」はケルセチン3-グルクロナイドを示し、「Q3Glc」はケルセチン3-グルコシドを示す。
【図１２】MS分析の結果を示す図である。「Q3GA」はケルセチン3-グルクロナイドを示し、「Q3Glc」はケルセチン3-グルコシドを示す。
【図１３】アミノ酸配列比較（Formatted Alignments）の結果を示す図である。VvGT5の140番目のアルギニン残基（R）の位置を太枠線で囲って示している。At3GlcT、Ph3GlcT及びVvGT1は、それぞれ順に、シロイヌナズナ、ペチュニア及びブドウのフラボノイド3位グルコース転移酵素を示す。
【図１４】VvGT5変異体（VvGT5 R140W）の糖供与体選択性の結果を示す図（下側のグラフ）である（酵素反応条件（上側の表））。グラフの縦軸は、野生型VvGT5（WT）及びその変異体（R140W）の各々について、最も活性が高かったUDP-グルクロン酸及びUDP-グルコースを100％としたときの相対活性（Relative activity (％)）である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願2009-011065号明細書（2009年1月21日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１８】
１．本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、（ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド（具体的には、DNA、以下、これらを単に「DNA」とも称する）；及び（ｂ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。本発明で対象とするDNAは、上記のグルクロン酸転移酵素をコードするDNAに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のDNAを含む。
【００１９】
機能的に同等なタンパク質としては、例えば、（ｃ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列において1〜15個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、配列番号４で表わされるアミノ酸配列において、例えば、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個、1〜8個、1〜7個、1〜6個（1〜数個）、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。なお、本発明においては、上記（ｃ）の機能的に同等なタンパク質は、配列番号４で表わされるアミノ酸配列中の第140番目のアミノ酸残基（アルギニン）に対応するアミノ酸残基が同様にアルギニンであるアミノ酸配列からなるものであることが好ましい。すなわち、上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加は、配列番号４で表わされるアミノ酸配列中の第140番目のアミノ酸以外のアミノ酸についてなされたものであることが好ましい。この好ましい態様は、前記（ｇ）のポリヌクレオチドにおいても同様である。
【００２０】
また、機能的に同等なタンパク質としては、例えば、（ｄ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列に対して、80％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質も挙げられる。このようなタンパク質としては、配列番号４で表わされるアミノ酸配列に対して、約80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。なお、本発明においては、上記（ｄ）の機能的に同等なタンパク質は、配列番号４で表わされるアミノ酸配列中の第140番目のアミノ酸残基（アルギニン）に対応するアミノ酸残基が同様にアルギニンであるアミノ酸配列からなるものであることが好ましい。この好ましい態様は、前記（ｈ）のポリヌクレオチドにおいても同様である。
【００２１】
ここで、本発明で言う「UDP-グルクロン酸転移酵素活性」とは、糖受容体基質となるフラボノイドの3位の水酸基に、糖供与体のUDP-グルクロン酸依存的にグルクロン酸を転移し、グルクロン酸抱合体を生じる反応を触媒する活性する活性を有する酵素、すなわちフラボノイド3位グルクロン酸転移酵素（Flavonoid 3-O-glucuronic acid transferase; F3GAT）活性を意味する。
UDP-グルクロン酸転移酵素活性は、例えば、UDP-グルクロン酸と糖受容体基質であるフラボノイド（例えば、フラボン、フラボノール等）とを評価対象となる酵素の存在下で反応させ、得られる反応物をHPLC等で分析することによって測定することができる（より具体的には、後述の実施例の記載を参照。）。
【００２２】
また、本発明は、（ｅ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。なお、本発明においては、上記（ｅ）のポリヌクレオチドは、配列番号３で表わされる塩基配列中の第418〜420番目の塩基（AGG）に対応する塩基が同一の「AGG」であるか又は同一の塩基でなくとも「CGU」、「CGC」、「CGA」、「CGG」及び「AGA」のいずれかであるポリヌクレオチドを含有するものであることが好ましい。ここで、上記第418〜420番目の塩基（AGG）とは、配列番号４で表わされるアミノ酸配列中の第140番目のアミノ酸残基（アルギニン）をコードする塩基（コドン）である。この好ましい態様は、前記（ｉ）のポリヌクレオチドにおいても同様である。
【００２３】
さらに、本発明は、（ｆ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。なお、本発明においては、上記（ｆ）のポリヌクレオチドは、配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列中の第418〜420番目の塩基に対応する塩基が同一の塩基であるか又は同一の塩基でなくとも「CGU」、「CGC」、「CGA」、「CGG」、「AGA」及び「AGG」のいずれかであるポリヌクレオチドを含有するものであることが好ましい。ここで、上記第418〜420番目の塩基とは、配列番号４で表わされるアミノ酸配列中の第140番目のアミノ酸残基（アルギニン）をコードする塩基（コドン）である。この好ましい態様は、前記（ｊ）のポリヌクレオチドにおいても同様である。
【００２４】
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、DNA又はRNAを意味する。好ましくは、DNAである。
本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号４で表わされるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの、全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、“Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001”、“Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997”などに記載されている方法を利用することができる。
【００２５】
本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1％ (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。
【００２６】
上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号３の塩基配列のDNA又は配列番号４で表わされるアミノ酸配列をコードするDNAと、約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上又は99.9％以上の相同性を有するDNAを挙げることができる。
【００２７】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 87, p. 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, p. 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al., J. Mol. Biol., vol. 215, p. 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore=100、word length=12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore=50、word length=3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能である。
【００２８】
２．本発明のタンパク質  本発明は、さらに別の実施形態において、上記本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質も提供する。本発明のある態様のタンパク質は、配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明の別の態様のタンパク質は、配列番号４で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００２９】
本発明のさらに別の態様のタンパク質は、配列番号４で表わされるアミノ酸配列において1〜15個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質である。このようなタンパク質としては、配列番号４で表わされるアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつUDP-グルクロン酸転移酵素活性を有するタンパク質が挙げられるこのようなタンパク質は、“Sambrook & Russell， Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol． 3， Cold Spring Harbor， Laboratory Press 2001”、“Ausubel， Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons 1987-1997”、“Nuc. Acids. Res., vol. 10, p. 6487, 1982”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 79, p. 6409, 1982”、“Gene, vol. 34, p. 315, 1985”、“Nuc. Acids. Res., vol. 13, p. 4431, 1985”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 82, p. 488, 1985”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。なお、上記の、さらに別の態様のタンパク質としては、配列番号４で表わされるアミノ酸配列中の第140番目のアミノ酸残基（アルギニン）に対応するアミノ酸残基が同様にアルギニンであるアミノ酸配列からなるものであることが好ましい。すなわち、上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加は、配列番号４で表わされるアミノ酸配列中の第140番目のアミノ酸以外のアミノ酸についてなされたものであることが好ましい。
【００３０】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上（例えば1〜15個、好ましくは10個以下）のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ1若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸；C群：アスパラギン、グルタミン；D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸；E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；G群：フェニルアラニン、チロシン。
【００３１】
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
ここで、本発明のタンパク質は、フラボノイド3位グルクロン酸転移酵素である。「グルクロン酸転移酵素」とは、糖供与体から糖受容体基質にグルクロン酸残基を転移し、グルクロン酸抱合体を生じる反応を触媒する。本発明において、糖受容体基質はフラボノイドであり、糖供与体は、UDP-グルクロン酸である。本発明のある態様のタンパク質は、UDP-グルクロン酸から、糖受容体基質であるフラボノイド（例えば、フラボノール、フラボン）の3位の水酸基にグルクロン酸残基を転移し、グルクロン酸抱合体とUDPとを生じる反応を触媒する。
【００３２】
糖受容体基質のフラボノイドには、フラボン、フラボノール、フラバノン、イソフラボン、フラボンC配糖体、オーロン及びカテキン等が好ましく挙げられる。このうち、フラボンとしては、例えば、バイカレイン、スクテラレイン、アピゲニン、ルテオリン、トリセチン、ジオスメチン及びクリソエリオールを挙げることができる。フラボノールとしては、例えば、ケルセチン、ミリセチン、ラリシトリン、イソラムネチン、シリンゲチン及びケンフェロールを挙げることができる。フラバノンとしては、例えば、ナリンゲニンを挙げることができる。イソフラボンとしては、例えば、ジェニステイン、ダイゼイン及びホルモノネチンを挙げることができる。フラボンC配糖体としては、例えば、ビテキシン、イソビテキシン及びオリエンチンを挙げることができる。オーロンとしては、例えば、オーレウシジンを挙げることができる。カテキンとしては、例えば、カテキン及びエピガロカテキンガレートを挙げることができる。本発明において、糖受容体基質のフラボノイドとしては、上述した中でも、フラボン及びフラボノールがより好ましく、さらに好ましくはフラボノールであり、特に好ましくはケルセチン、ケンフェロール及びミリセチンである。
【００３３】
３．ベクター及びこれを導入した形質転換体
本発明はまた、別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチド（例えば、前記（ａ）〜（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチド）を含有する。好ましくは、本発明の発現ベクターは、前記（ｇ）〜（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチドを含有する。さらに好ましくは、本発明の発現ベクターは、配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は、配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有する。
【００３４】
本発明のベクターは、通常、(i) 宿主細胞内で転写可能なプロモーター；(ii) 該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド（例えば、前記（ａ）〜（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチド）；及び (iii) RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。このように構築されるベクターは、宿主細胞に導入される。発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ又はコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００３５】
本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター及び／又は複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、trcプロモーター、tacプロモーター、lacプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、PH05プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、trpC等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター等）が挙げられる。
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ura5、niaD）、薬剤耐性マーカー（ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネチシン）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, p. 337, 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2miri, PDR4）（それぞれ、猪腰淳嗣ら, 生化学, vol. 64, p. 660, 1992；Hussain et al., Gene, vol. 101, p. 149, 1991）などが利用可能である。
【００３６】
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、前記（ａ）〜（ｊ）のいずれかのポリヌクレオチド）が導入された形質転換体を提供する。
形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。ここで用いられる宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、線虫（Caenorhabditis elegans）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞等を挙げることができる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地及び条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物又は動物が挙げられる。
宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法（Mackenxie D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, p. 4655-4661, 2000）、パーティクルデリバリー法（特開2005-287403「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 75, p. 1929, 1978）、酢酸リチウム法（J. Bacteriology, vol. 153, p. 163, 1983）、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法）で実施可能であるが、これらに限定されない。
【００３７】
本発明の別の態様において、形質転換体は、植物形質転換体であり得る。本実施形態に係る植物形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように植物中に導入することによって取得される。
組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明に係るポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター）を有するベクター又は外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）又は植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱又は双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。
【００３８】
植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、PEG法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知である。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（1990）27〜31頁、講談社サイエンティフィック、東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Nagelらの方法（Micribiol.Lett., 67, 325 (1990)）が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをPlantMolecular Biology Manual（S.B.Gelvinら、Academic Press Publishers）に記載の方法で植物細胞又は植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター（pBI121又はpPZP202など）を使用することができる。
【００３９】
また、遺伝子を直接植物細胞又は植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。遺伝子銃を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばPDS-1000（BIO-RAD社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料によって異なるが、通常は450〜2000psi程度の圧力、4〜12cm程度の距離で行う。
遺伝子が導入された細胞又は植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターを遺伝子銃、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
【００４０】
遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCRは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、SYBR Green液などによって染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
本発明に係るポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖又は無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体又はその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。従って、本発明には、本発明に係るポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、若しくは当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、又はこれら由来の組織も含まれる。
【００４１】
また、種々の植物に対する形質転換方法が既に報告されている。本発明に係る形質転換体植物としては、例えば、ブドウ、ゴマ、イネ、タバコ、オオムギ、コムギ、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシ、カリフラワー、バラ、キク、カーネーション、キンギョソウ、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、レンギョウ、シロイヌナズナ及びミヤコグサなどが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明のある態様によれば、形質転換植物体は機能性食品材料用植物体である。
【００４２】
４．本発明のタンパク質の製造方法
本発明はまた、別の実施形態において、上記の形質転換体を用いる本発明のタンパク質の製造方法を提供する。
具体的には、上記形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を分離・精製することによって、本発明のタンパク質を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体若しくは培養細胞、又は培養菌体若しくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明のタンパク質の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
【００４３】
具体的には、本発明のタンパク質が培養菌体内若しくは培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体若しくは細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により本発明のタンパク質の粗抽出液を得ることができる。本発明のタンパク質が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体若しくは細胞と培養上清とを分離することにより、本発明のタンパク質を含む培養上清を得ることができる。
このようにして得られた抽出液若しくは培養上清中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法及び限外ろ過法等を、単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。
【００４４】
５．グルクロン酸抱合体の製造方法
さらに、本発明は、本発明のタンパク質を用いてグルクロン酸抱合体を製造する方法を提供する。本発明のタンパク質は、糖受容体基質としてのフラボノイドに、糖供与体としてのUDP-グルクロン酸からグルクロン酸を転移する（詳しくは、フラボノイドの3位の水酸基に転移する）反応を触媒するので、本発明のタンパク質を用いることにより、糖受容体基質及び糖供与体を原料として、グルクロン酸抱合体を製造することができる。糖受容体基質としては、フラボノイドの中でも、フラボン及びフラボノールが好ましく、より好ましくはフラボノール、特に好ましくはケルセチン、ケンフェロール及びミリセチンである。
【００４５】
例えば、1mMの糖受容体基質、2mMの糖供与体、50mMのリン酸カルシウムバッファー（pH7.5）及び20μMの本発明のタンパク質を含む溶液を調製し、30℃で、30分間反応させることにより、グルクロン酸抱合体を製造することができる。この溶液から、グルクロン酸抱合体は、公知の方法により分離・精製することができる。具体的には、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法及び限外ろ過法などを、単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。
このようにして得られるグルクロン酸抱合体は、機能性食品の材料、その生体内での機能を調べるための試薬、又は抗酸化剤などとして有用である（Gao, Z., Huang, K., Yang, X., and Xu, H., Biochimica et Biophysica Acta, vol. 1472, p. 643-650, 1999）。
【００４６】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
遺伝子クローニング
本実施例において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、Molecular Cloning（Sambrookra,Cold Spring Harbour Laboratory Press,2001）に記載の方法に従った。
ブドウ由来フラボノイド3位グルコース転移酵素遺伝子であるVvGT1（Offen, W. et al., EMBO J., vol. 25, p. 1396-1405, 2006）の完全長配列を基に、Istituto Agrario San Michele all'Adige（IASMA）が提供するブドウゲノムデータベース（http://genomics.research.iasma.it/iasma/）に対してBlastホモロジー検索を行った。その結果、相同性の高い7種の候補UGT遺伝子を見出した（図１）。これらはMEGA4プログラム（Tamura, K. et al., Mol. Biol. Evol., vol. 24, p. 1596-1599, 2007）を利用したNJ系統樹解析によってフラボノイド3位UGTのクラスターであるCluster Iに属することを確認した（図１）。さらに、候補遺伝子配列を染色体物理地図と照らし合わせることで、染色体上のシンテニーを明らかにした（図２）。VvGT3、VvGT5及びVvGT6は、11番染色体上に同じ転写向きに座位しており、それらの間にはフラボノールスルフォトランスフェラーゼ様遺伝子が共通して見出された（Varin, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, p. 1286-1290, 1992）。VvGT5及びVvGT6は、特に相同性が高く、遺伝子重複によって生じたパラログであると考えられた。また、6番染色体には同じ転写向きに座位したVvGT2及びVvGT4が見出された。その下流に同じ転写向きにVvGT2及びVvGT4のセットのコピーが見出され、それぞれ順に、VvGT2-like及びVvGT4-likeと命名した。一方、既知のVvGT1は16番染色体に座位した。【００４８】
次に、これらのVvGT遺伝子をクローン化するためにブドウ葉由来cDNAを下記の方法で調製し、それを鋳型にPCRによる増幅を行った。ブドウ（Vitis vinifera，品種：Cabernet Sauvignon）の葉0.1gからFruitMate for RNA purification及びFast Pure RNA kit（TaKaRa Bio社）を用いて、製造業者の推奨する方法に従い総RNAを抽出し、SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Invitrogen社）を製造業者が推奨する条件に従って使用して、総RNA1μgからcDNAを合成した。
VvGT5遺伝子を例に、cDNAクローニング及び発現ベクター構築手順を下記に示す。逆転写によって得られたcDNAを鋳型に、ゲノム配列情報（GenBankアクセッション番号：CAN74919）を基にデザインした下記のVvGT5遺伝子特異的プライマー（配列番号１及び２）を用いて、PCRによるVvGT5の単離を試みた。
具体的には、PCR反応液（50μl）は、ブドウ葉由来cDNA 1μl、1×ExTaq buffer（TaKaRaBio）、0.2mM dNTPs、プライマー（配列番号１及び２）各0.4pmol/μl、ExTaq polymerase 2.5unitからなる。PCR反応は、94℃で3分間反応させた後、94℃で1分間、50℃で1分間、72℃で2分間の反応を1サイクルとして、計35サイクルの増幅反応を行った。【００４９】
CACC-NdeI-VvGT5-Fw：
5’- CAC CCA TAT GAC TAC CAC CGC CAG CTC CAT -3’（配列番号１）
BglII-VvGT5-RV：
5’- AGA TCT CTA CTT ATT GGT GTC CAA AGG TA -3’（配列番号２）【００５０】
PCR反応液を0.8%アガロースゲル電気泳動により分離したところ、約1.4kbのサイズの増幅断片を得た。この増幅断片をpENTR-Directional-TOPOベクター（Invitrogen社）にサブクローニングし、挿入断片の塩基配列を、DNA Sequencer model 3100（Applied Biosystems社）を使用して、合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるプライマーウォーキング法によって塩基配列を決定し、挿入されたcDNAがVvGT5であることを確認した（配列番号３及び４）。またこの配列は、データベースに登録されているピノノアール品種由来の配列（GenBankアクセッション番号：CAN74919）とアミノ酸配列レベルで99％の配列同一性を示した。この差はブドウ品種間での多型であると考えられた。【００５１】
VvGT5のcDNA配列：
ATGACTACCACCGCCAGCTCCATGGACAGGCATGTTGCAGTATTAGGGTTCCCCACCCATACAGCTACCCTCTTAAAACTCCTGCGCAGACTAGCATCTGCCGCACCCACCACCATCTTCTCCTTCTTCAACACTCCCAAGGCCAACAGCTCCATCTCCTCTGCTCAAAGTCCCCACGGTATTCACAATCTAAGAGTTTATGATGTAGCAGACGGCGTGCCAGAGGACCTTGTGCTTTCAGCAAACCCCCTGGCACGCATCGAGATGTTCTTGAAGGCGACGCCTGGGAACTTTCGTGATGCTTTGGAAGTGGCTGAGAAGGACATTGGAAGGAAGATAAGTTGCCTGGTGAGTGATGTCTTTTTGTGGTTCACTGCTGATATGGCTGAGGAAATGGGGGTTCCGTGGGTGGCAATTAGGACTGCTGCGCTTTACTCACTCTCCGTCCACATTTATACTGATGCTATCCGGGAAGCAGTGGGAGTTGCGGGGCAGGTGCAAGACCAAACCCTTGATTTCATCCCAGGATTCTCAGCAATAAAGGTTGAAGACCTACCTGAAGGAATGGTTTTCGGGGACACAGAATCTCCCTTCGCATGCATGTTGCATAAAATGGGGCTCATGCTGCCACGAGCAACCATTGTTGCCACAAATTCCTTTGAAGAACTAGAGCCGACCATTGTCACAAATGATCTCAAGTCCAAGCTCCAAAAAGTTCTTACTGTTGGTCCTTTTGACCTATCTTCACCACCACCGCTGATATTGGACGCCAGTGGCTGCCTGCCATGGTTGGACAATAAAAAAGAAGCGTCAGTGGCATATGTTAGTTTTGGAAGCATAGCAACACCACCACCCAACGAGATTGTAGCATTGGCAGAAGCCCTAGAAGCAACTGGGATACCGTTTCTTTGGTCTCTTAGGGAGCATGCAATGAACAATTTACCAAAAGGATTTCTAGAGAGGACGACCGCTCATGGAAAAGTAGTTTCGTGGGCACCCCAGCCTCAGGTCTTAGCACATGCCTCAGTTGCAGTGTTTATTACTCATAGCGGTTGGAACTCGGTGACTGAGAGTATAGTTGGTGGTGTGCCCATGATCTGCAGGCCATTCTTTGGAGATCAACGTCTTAACAGGCGGATGGTACAGGATGTATGGGGGATTGGTATAGGAGTTGAGGGAGGGATCCTCACAAAAAGGGGAGTAATGAGTGCTTTGGGACTAATTTTGTCCCATGAAGGGAAGAAAATGAGAGAGAAAATTGGGGTCCTAAAAGAGCTTGCTAGAAGGGCTGTTGAACCAAACGGGAGCTCAACTCAAAATTTAGGTCATTTGTTGGAGGTAATCACAACATCTAAGTTACCTTTGGACACCAATAAGTAG（配列番号３）【００５２】
VvGT5のアミノ酸配列：
MTTTASSMDRHVAVLGFPTHTATLLKLLRRLASAAPTTIFSFFNTPKANSSISSAQSPHGIHNLRVYDVADGVPEDLVLSANPLARIEMFLKATPGNFRDALEVAEKDIGRKISCLVSDVFLWFTADMAEEMGVPWVAIRTAALYSLSVHIYTDAIREAVGVAGQVQDQTLDFIPGFSAIKVEDLPEGMVFGDTESPFACMLHKMGLMLPRATIVATNSFEELEPTIVTNDLKSKLQKVLTVGPFDLSSPPPLILDASGCLPWLDNKKEASVAYVSFGSIATPPPNEIVALAEALEATGIPFLWSLREHAMNNLPKGFLERTTAHGKVVSWAPQPQVLAHASVAVFITHSGWNSVTESIVGGVPMICRPFFGDQRLNRRMVQDVWGIGIGVEGGILTKRGVMSALGLILSHEGKKMREKIGVLKELARRAVEPNGSSTQNLGHLLEVITTSKLPLDTNK（配列番号４）【００５３】
プライマーに内のNdeI及びBglIIの制限酵素部位を利用して約1.4kbのVvGT5断片を切り出し、大腸菌発現ベクターであるpET15bのNdeI及びBamHIサイトへ連結し、VvGT5の大腸菌発現ベクターを得た。なお、大腸菌ベクター構築の際には、本ベクターのNdeIサイト上流にあるHisタグとVvGT5のオープンリーディングフレームをあわせるようにし、Hisタグと融合したキメラVvGT5タンパク質が発現するよう設計した。
【実施例２】
【００５４】
酵素機能解析
本酵素の生化学的な機能を明らかにするために、本酵素を大腸菌において発現させた。
上記で得られたプラスミドを用い定法に従って大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。得られた形質転換体を、50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地（10 g/l typtone pepton，5 g/l yeast extract，1 g/l NaCl）4 mlに、て，37℃で一晩振盪培養した。静止期に達した培養液4 mlを同組成の培地80 mlに接種し、37℃で振盪培養した。菌体濁度（OD600）がおよそ0.5に達した時点で終濃度0.5 mMのIPTGを添加し、18℃で20時間振盪培養した。
以下のすべての操作は4℃で行った。培養した形質転換体を遠心分離（5,000×g，10分）にて集菌し、Buffer S［20 mM HEPESバッファー（pH 7.5），20 mM イミダゾール，14 mM β-メルカプトエタノール］1 ml/g cellを添加して、懸濁した。続いて、超音波破砕（15秒間×8回）を行い、遠心分離（15,000×g，15分間）した。得られた上清を粗酵素液として回収した。この中からHisタグを有するVvGT5発現タンパク質を精製するため、粗酵素液をBuffer Sにて平衡化したHis SpinTrap（GE Healthcare）に負荷し、遠心（70×g，30秒間）した。Bufferで洗浄後、100及び500 mM イミダゾールを含むBuffer S 各5ｍlにてカラムに結合したタンパク質を段階的に溶出した。各溶出画分をMicrocon YM-30（Amicon）を用いて、20 mM HEPESバッファー（pH 7.5）及び14 mM β-メルカプトエタノールにバッファー置換した（透析倍率1000倍）。【００５５】
SDS-PAGE解析の結果、500 mM イミダゾール溶出画分において、VvGT5の推定分子量49.68kDa付近にタンパク質を確認したので、この画分を酵素解析に用いた（図３）。
標準的な酵素反応条件は、以下の通りである。反応液（1 mM 糖供与体，200μM 糖受容体基質，20 mM HEPESバッファー（pH 7.5），精製酵素約2μg）50μlを調製し、酵素溶液を添加することで反応を開始させ、30℃で一晩反応させた。20％リン酸を 5μl添加することにより反応を停止させ、逆相HPLCで分析した。
逆相HPLCシステムは、以下の機器で構成される。Pump AとしてMODEL305（Gilson社）、Pump BとしてMODEL302（Gilson社）、Sample InjectorとしてMODEL231（Gilson社）、Dilutorとして401（Gilson社）、DYNAMIC MIXERとして811B（Gilson社）、Pressure Module（RAININ）、DEGASSERとしてDGU-12A（島津製作所）、検出器としてSPD-M20A DIODE ARRAY DETECTOR（島津製作所）を用いた。【００５６】
フラボノール類のHPLC条件は、以下の通りである。カラムは、J'sphere ODS-M80（4.6×150 mm、YMC）を室温で用い、移動相A（0.2％ ギ酸／10％CH3CN）と移動相B（0.2％ ギ酸／90％CH3CN）を用いた。溶離条件はB10％で3分間の平衡化をし、10分間の直線濃度勾配（B10％→B40％）、さらに10分間の直線濃度勾配（B40％→B90％）の後、1分間B90％で保持した。その後再びB10％に戻し、10分間平衡化した。流速は0.7 ml/分で行った。検出は、SPD-M20A DIODE ARRAY DETECTORを用いて360 nmで行った。本条件で標準品のケルセチン、ケルセチン3-グルクロナイド、ケンフェロール及びイソラムネチンは、それぞれ順に、保持時間約17.8分、11.8分、20.1分及び20.4分に溶出される。ケルセチン3-グルクロナイドは、ブドウ葉より、後述する参考例１に記載の方法で調製したものを使用した。
ケルセチンを糖受容体、UDP-グルクロン酸を糖供与体とした酵素反応液のHPLC分析の結果、ケルセチン3-グルクロナイドと保持時間が一致する保持時間約11.8分に新たな生成物が確認された（図４）。これによってVvGT5遺伝子がフラボノイドの3位にグルクロン酸を転移する活性を有するF3GATをコードすることが示された。【００５７】
次に、本酵素の至適pHを求めた。図５に示されるようにpH3からpH10.5までの各種バッファーを調製し、糖受容体として100μMケルセチン、糖供与体として1mM UDP-グルクロン酸、50mMバッファー、14mM 2-メルカプトエタノール及び上記精製VvGT5酵素 50ngを、30℃で5分間反応させた。ケルセチンを加えることで反応を開始し、等量の0.1% TFAを含む40％アセトニトリル溶液を加えることで反応を停止した。反応停止溶液を遠心分離（15000 rpm, 2分間, 4℃）することによって得られた上清100μlをHPLC分析に供し、各バッファー条件における生成物量を比較した。その結果、中性から塩基性領域で強い酵素活性が認められ、その最適pHは9.1であった（図６）。
次に、本酵素の至適温度を求めた。糖受容体として100μMケルセチン、糖供与体として1mM UDP-グルクロン酸、50mM Glycine-NaOH（pH9.5）バッファー、14mM 2-メルカプトエタノール及び上記精製VvGT5酵素50ngを、10、20、30、35、40、45、50及び60℃で、それぞれ15分間反応させた。ケルセチンを加えることで反応を開始し、等量の0.1%TFAを含む40％アセトニトリル溶液を加えることで反応を停止した。反応停止溶液を遠心分離（15000 rpm, 2分間, 4℃）することによって得られた上清100μlをHPLC分析に供し、各温度条件における生成物量を比較した。その結果、最適反応温度は45℃であった（図７）。【００５８】
次に、本酵素の糖受容体特異性について検討した。図８に示す各糖受容体100μM、糖供与体として1mM UDP-グルクロン酸、50mM Glycine-NaOH（pH9.5）バッファー、14mM 2-メルカプトエタノール及び上記精製VvGT5酵素 50ngを、30℃で15分間反応させた。糖受容体を加えることで反応を開始し、等量の0.1%TFAを含む40％アセトニトリル溶液を加えることで反応を停止した。反応停止溶液を遠心分離（15000 rpm, 2分, 4℃）することによって得られた上清100μlをHPLC分析に供し、各糖受容体における生成物量を比較した。
アントシアニン類については上記HPLCシステムを用い、下記の条件で分析を行った。また、アントシアン分析用HPLC条件は、以下の通りである。カラムはAsahipak ODP-50 4E(4.6×250 mm、昭和電工)を室温で用い、移動相A（0.5％ TFA／H2O）と移動相B（0.5％ TFA／50％ CH3CN）を用いた。溶離条件はB30％による3分間の平衡化の後、15分間の直線濃度勾配（B30％→B65％）、さらに1分間の直線濃度勾配（B65％→B100％）の後、さらに5分間B100％で保持した。その後再びB30%に戻し10分間平衡化した。流速は0.7 ml/分で行った。検出は、520 nmで行った。本条件で標準品のペラルゴニジン、シアニジン及びデルフィニジンは、それぞれ順に、保持時間約25.7分、23.9分及び20.8分に溶出される。【００５９】
分析の結果、VvGT5は、フラボノールに特異的であることが明らかとなった。中でもケルセチンに対して最も高い活性を有しており（図８）、これはブドウ葉に蓄積している主フラボノールグルクロナイドがケルセチン3-グルクロナイドであることと一致する。さらに常法に従って、本酵素の速度論解析を行ったところ、ケルセチン、ケンフェロール、及びイソラムネチンに対する基質特異性（Km）は、それぞれ順に、5.60±1.76μM、10.8±0.4μM及び7.92±0.32μMであり、触媒活性（kcat）は、それぞれ順に、7.16±0.37 s-1、6.05±0.05 s-1及び0.413±0.03 s-1であった。このように、速度論パラメーターからもVvGT5がケルセチンに対して最も高い活性を持っていることが確認された。
次に、本酵素の糖供与体特異性について検討した。各糖受容体として100μMケルセチン、1mM各糖供与体（UDP-グルクロン酸、UDP-グルコース又はUDP-ガラクトース；いずれもSIGMAより購入）、50mM Glycine-NaOH（pH9.5）バッファー、14mM 2-メルカプトエタノール及び上記精製VvGT5酵素 50ngを、30℃で15分間反応させた。糖受容体を加えることで反応を開始し、等量の0.1% TFAを含む40％アセトニトリル溶液を加えることで反応を停止した。反応停止溶液を遠心分離（15000 rpm, 2分, 4℃）することによって得られた上清100μlをHPLC分析に供し、各糖供与体における生成物量を比較した。その結果、UDP-グルクロン酸を基質にした場合にのみ生成物が得られ、UDP-グルクロン酸に対する基質特異性（Km）は17.7±2.9であった。このことからVvGT5はUDP-グルクロン酸に対して特異的であり、UDP-グルクロン酸依存的フラボノール3位グルクロン酸転移酵素（F3GAT）であることが明らかとなった。【００６０】
〔参考例１〕
＜ブドウからのフラボノイドの抽出と精製＞
ブドウ葉（カベルネソーヴィニョン品種）164gを液体窒素中で粉砕し、1.5Lの60% CH3CN及び0.05% HCOOHに一晩浸漬し、セライトろ過した。ろ液を体積が1／3程度になるまで減圧濃縮し、濃縮液を600mlのCHP-20Pに負荷し、600mlの水で洗浄後、20, 30, 40% CH3CN／H2O 各300ml x 2でステップワイズ溶出を行った。20%-2画分からポリフェノール類の溶出が認められた。20%-2から40%-1までの各画分について濃縮及び凍結乾燥を行い、HPLCで分析した。収量は20％-2（568.6mg）、30％-1（345.8mg）、30％-2（787.0mg）、40%-1（181.2mg）であった。
フラボノール配糖体が高純度で含まれていた30％-1画分及び30％-2画分を、下記の2段階の分取HPLC条件で精製した。
＜分取HPLC条件1＞
カラム：Develosil ODS-HG-15/30, φ50mm x 500mm
移動相：A-0.05%TFA, B-0.05% TFA／90% CH3CN
流速：32 ml／分
グラジエント：B10iso（15分間）, B15→B40%（100分間）,B40%iso（30分間）
検出：A350nm【００６１】
溶出時間103〜104分付近にフラボノール配糖体が確認され、この画分について濃縮及び凍結乾燥を行い、29.3mgを得た。
次に、この画分について下記の分取HPLC条件2で再分離を行った。
＜分取HPLC条件2＞
カラム：YMC-Pack Polymer C18, φ20mm x 300mm
移動相：A-0.05%TFA, B-0.05% TFA／90% CH3CN
流速：6 ml／分
グラジエント：B30iso（20分間）, B30→B50%（60分間）,B50%iso（10分間）
検出：A350nm【００６２】
本条件下において31.01分と34.03分に溶出されるフラボノール配糖体の吸収を持つピークAとピークBが認められ、それぞれピークの画分について濃縮及び凍結乾燥を行い、ピークAの画分から6.5mg、ピークBの画分から16.1mgを得た。ピークAは、標品のケルセチン3-グルコシドと保持時間が一致した。一方、ピークBについては、以下の通りNMRによる構造決定を行った。
＜質量分析（MS）及びNMRによる各ピークの確認等＞
MSは、Q-TOF Premier（Micromass社製、UK）でイオン源にZスプレーイオンソースをつけたESIを用い、ネガティブ、Vモードで測定した。Collision energy：45 eV、Ionspray voltage：3KV、ロックスプレーによる質量補正を行い、レファレンスにはロイシンエンケファリン（m/z 554.2777 [M-H]-）を用いた。その結果、ピークBは、m/z 477.0664 [M-H] -の分子イオンを与え、分子式C21H17O13（err.：-1.0 ppm）であった。また、同条件で測定したピークAは、m/z 463.0878 [M-H] -の分子イオンを与え、分子式C21H19O11（err.：0.2 ppm）であり、上述したように標品のケルセチン3-グルコシドと一致したことから、ケルセチン3-グルコシドと確認された。【００６３】
ピークBのNMRは、(CD3)2SO（DMSO-d6）に溶解し、DMSO-d6の1Hの2.50 ppmと13Cの残存ピークδ39.43を内部標準とした。測定項目は、1H NMR、13C NMR、1H｛13C｝-HSQC、1H｛13C｝-HMBC、TOCSY及びDQF-COSYをDMX-500 spectrometer （BRUKER BIOSPIN, Germany）で測定した。
上記MS及びNMRの結果、ピークBはケルセチンのグルクロナイドであり、1H｛13C｝-HMBCにおいてグルクロナイドの1位のプロトンからのケルセチンの3位（δ132.95）の炭素へのピークが認められたため、グルクロン酸は3位に結合していることが明らかになり、この化合物はケルセチン3-O-グルクロナイドであることが確認された（図９；図９中の太線はHMBCを示す。）。よって、この化合物をケルセチン3-O-グルクロナイドの標品として用いた。
【実施例３】
【００６４】
遺伝子発現解析
VvGT5の機能領域を同定するために、“Noguchi, A. et al., Plant J., vol. 54, p. 415-427, 2008”に記載の方法と同様の方法で、VvGT5遺伝子のブドウ器官別の遺伝子発現パターンを7500 Real Time PCR System（Applied Biosystems）を用いたSYBR-Green定量RT-PCRによって解析した。
ブドウは、ピノノアール品種及びカベルネソーヴィニョン品種の各器官（葉、葉柄、種子、果実、果皮）から、実施例１と同様の方法でトータルRNAを抽出し、そのうち0.5μgをRandom Hexamerプライマーで逆転写（RT）反応することによって各器官のcDNAを得、これをPCRの鋳型とした。【００６５】
定量PCRに用いる遺伝子特異的プライマーは、Primer Express 3.0プログラム（Applied Biosystems）を用いて以下の8種をデザインした。VvGT5特異的プライマーとして配列番号5及び6に示されるものを用いた。比較対照としての、アントシアニン3位グルコース転移酵素であるVvGT1、及びVvGT5ホモログであるVvGT6についても、それぞれ特異的プライマーを設計し解析に供した（VvGT1特異的プライマー：配列番号７及び８、VvGT6特異的プライマー：配列番号９及び１０）。内部標準遺伝子として、ブドウのユビキチン伸長酵素（GenBankアクセッション番号：CAO48597）を採用し、下記の遺伝子特異的プライマー（配列番号１１及び１２）を用いて増幅した。各VvGT遺伝子の発現量を内部標準遺伝子の発現量で標準化し、ΔΔCt法（Applied Biosystems）によって相対発現量を得た。【００６６】
qVvGT5-Fw1：
5’-GCT CCA TCT CCT CTG CTC AAA -3’（配列番号５）
qVvGT5-Rv2：
5’- GAA AGC ACA AGG TCC TCT -3’（配列番号６）
VvGT1-Fw：
5’- CCC ACC GCC GGT TAT ACC -3’（配列番号７）
VvGT1-Rv：
5’- CGA CCG AGG TGG GTT TTC T -3’（配列番号８）
VvGT6-Fw：
5’- GGT TCC CTG GTT GGC AAT TT -3’（配列番号９）
VvGT5-Rv：
5’- GCA CCC GCC CCA CAA CCT T -3’（配列番号１０）
VvUBQ2-Fw：
5’- TCC AGG ACA AGG AAG GGA TTC -3’（配列番号１１）
VvUBQ2-Rv：
5’- GCC ATC CTC AAG CTG CTT TC -3’（配列番号１２）【００６７】
その結果、VvGT5遺伝子は、その生成物が蓄積する葉において顕著に発現していることが確認された（図１０）。一方、VvGT1遺伝子については、果皮において特異的に発現しており、公知文献（Ford, C. M., et al., J. Biol. Chem., vol. 273, p. 9224-9233, 1998）に記載の結果と一致した。興味深いことに、VvGT5遺伝子は果皮においても強い発現が認められた。VvGT6遺伝子については、VvGT5遺伝子と類似した遺伝子発現パターンを示し、これらの遺伝子がゲノム上で近い位置に座位することが両遺伝子の協調的な遺伝子発現パターンに影響を与えていると推測された（図２）。
【実施例４】
【００６８】
ブドウ及びワインのフラボノイド分析
実施例３のVvGT5の遺伝子発現パターンから、果皮においてもフラボノール3−グルクロナイドが蓄積している可能性が示されたため、果皮フラボノイドの分析を行った。
ブドウ３品種（ピノノアール、カベルネソーヴィニョン及びシラー）の果皮と、比較対照としてピノノアール及びカベルネソーヴィニョンの葉を用い、各サンプルの生重量0.8gを凍結乾燥した。乾燥体をスパチュラで破砕し、8mlの0.1％蟻酸を含む50％アセトニトリル溶液を加え、室温で30分間超音波処理を行うことで、フラボノイド類を抽出した。超音波処理液を遠心分離（3000 rpm, 10分間, 4℃）して得られた上清をフィルター濾過（マイレクスLH、ポアサイズ0.45μm、ミリポア(株)製）し、HPLC分析に供した。【００６９】
HPLC分析条件は、カラムはYMC-PAK-Polymer C18 (4.6ｍｍ×250 mm、YMC)をカラムオーブン40℃で用い、移動相A（0.1％ TFA／H2O）と移動相B（0.1％ TFA／90％ CH3CN）を用いた。溶離条件は15分間の直線濃度勾配（B20％→B60％）の後、さらに10分間B60％で保持した。その後再び、B20%に戻し10分間平衡化した。流速は0.8 ml/分で行った。検出は、SPD-M10A Photodiode Array detector（島津製作所）を用いて350 nmで行った。本条件下で標準品のケルセチン3-グルクロナイド（Q3GA）及びケルセチン3-グルコシド（Q3Glc)は、それぞれ順に、保持時間約10.89分、11.21分に溶出される。LC分析の結果、各ブドウ品種の果皮においてQ3GAの蓄積が確認された（図１１）。サンプル間で含量に差が認められたが、これは果皮の成熟度合いの違いと品種間差を反映しているものだと考えられた。【００７０】
さらに、MS分析においてもブドウ果皮でQ3GAが確認された（図１２）。
LC-MS分析条件は、YMC-pak Polymer-C18（3.0mm×150mm、YMC）を用い、移動相は、A液として0.1％蟻酸を含む水を、B液として0.1％蟻酸を含む100％アセトニトリルを用いた。20分間の直線濃度勾配（B液10％→70％（15分間）を用いて溶出し、その後、B液70％で5分間のアイソクラティック溶出を行った。（流速：0.2ml／分、カラムオーブン：40℃）。
検出は、フォトダイオードアレイ検出器（SPD-M10A、島津製作所）で230〜500nmのデータを収集し、A350nmのクロマトグラムを測定した。また、PDA検出器の後にQ-TOF Premier（Micromass社製、UK）検出器を接続し、以下の条件で生成物の分子量の測定を行った。MSの測定条件は、ネガティブ、Vモードで行った（イオン化：ESI、Lock spray reference: ロイシンエンケファリン、Capillary: 2.6kV、Cone: 35V, collision energy: 5eV）。
この条件下で、Q3GlcはR.T.12.32分に溶出し、463.09[M-H]-の分子イオンを与え-3GlcAはR.T.12.41分に溶出し、477.07[M-H]-の分子イオンを与えた。マスクロマトグラムにより、葉及び果皮のQ3GAのピークを確認することができた。【００７１】
次に、ブドウを原材料とする食品中におけるQ3GAについて探索した。
赤ワイン（ボージョレ2007年、ガメイ品種）、赤ワイン（ブルゴーニュ2006年、ピノノアール品種）及びレーズン（干しブドウ、中国産白ブドウ）について検討した。
ワインについては、10mlに水を等量加えた溶液をSEP-PAK 1ccカートリッジ（Waters社）に吸着させ、10mlの水で洗浄後、1mlの90％アセトニトリルによって溶出し、10倍濃縮サンプルを得た。
レーズンについては、10gを液体窒素で凍結し乳鉢で粉砕し、20mlの50％アセトニトリルで抽出した。抽出液15mlに85mlの水を加え、SEP-PAK 20ccカートリッジ（Waters社）に吸着させ、100mlの水で洗浄後、2mlの90％アセトニトリルによって溶出しLC-MSサンプル液を得た。
LC-MSの条件は、YMC-Pack Polymer C18カラム（YMC、2.0mm×150mm、6μm）を用い、移動相は、A液として0.1％ギ酸を含む水を、B液として0.1％ギ酸を含む90％アセトニトリルを用いた。15分間の直線濃度勾配（A液80％：B液20％→A液40％：B液60％）を用いて溶出し、その後、A液40％：B液60で、5分間のアイソクラティック溶出を行った。（流速：0.2ml／分間）。【００７２】
検出は、フォトダイオードアレイ検出器（SPD-M10A、島津製作所）で230〜500nmのデータを収集した。また、PDA検出器の後にTOF-MS検出器（LCMS-IT-TOF、島津製作所）を接続し、分子量の測定を行った。MSの測定条件はネガティブ及びポジティブの両モードで、測定分子量範囲は100〜1000Da、インターフェンス電圧はそれぞれ4.5kV及び-3.5kVで行った。
この条件下で、標品であるQ3Glc及びQ3GAは8.5分付近に溶出された。上記3食品サンプルについて8.5分付近を探索したところ、いずれのサンプルにおいてもネガティブモードでQ3GAと一致するm/z 477.04 [M-H]-の分子イオンを検出した。また同時に、ネガティブモードでQ3Glcと一致するm/z 463.06 [M-H]-の分子イオンを検出した。
このようにVvGT5の遺伝子発現パターンから示されたように、ブドウ果皮及びそれが含まれる食品（ワイン及びレーズン）においてケルセチン3-グルクロナイドが存在することが確認された。従って、VvGT5は主にブドウの葉と果皮で発現し、フラボノールの3位をグルクロン酸化していることが示された。
【実施例５】
【００７３】
VvGT5の糖供与体選択性に関する点変異体解析
実施例２で示したように、VvGT5はUDP-グルクロン酸を特異的に利用することが明らかとなったが、この糖供与体選択性を決定するアミノ酸残基を明らかにするために、Clustal-Wによるアミノ酸配列のマルチプルアライメントを行った（図１３）。その結果、VvGT5と相同性が高いブドウのアントシアニン3位グルコース転移酵素であるVvGT1やシロイヌナズナ及びペチュニアのフラボノイド3位グルコース転移酵素であるAt3GlcT（UGT78D2; GenBankアクセッション番号：AAM91139）及びPh3GlcT（GenBankアクセッション番号：BAA89008）において高く保存されているN末端から140アミノ酸付近に存在するトリプトファン(W)が、VvGT5においてはアルギニン(R)に置換されていた。これらのアミノ酸残基のC末端側に隣接するスレオニン(T)は、VvGT1の結晶構造解析から糖供与体であるUDP-グルコースと相互作用することが知られているため（Offen, W. et al., EMBO J., vol. 25, p. 1396-1405, 2006）、VvGT5に特異的に見出されたアルギニン残基（配列番号４のアミノ酸配列の第140番目のアミノ酸残基）はその糖供与体であるUDP-グルクロン酸と何らかの相互作用をすることが示された。【００７４】
このユニークなアルギニン残基の糖供与体選択性における機能を明らかにするために、VvGT5の140番目のアルギニン残基をトリプトファン残基に置換したVvGT5-R140W変異体（「R140W」の表記は、第140番目のアルギニン(R)残基がトリプトファン(W)残基に置換された変異であることを示す。）を、Quick Change II Site-Directed Mutagenesis kit（Stratagene社）を用いて当該キットの推奨方法に従い、前述の野生型VvGT5が挿入されたpET15bベクターを鋳型とし、下記の合成オリゴプライマー（配列番号１３及び１４）を用いて作製した。
PCR条件は、96℃で30秒間の熱編成後、96℃で30秒間→ 58℃で1分間→ 68℃で7分間を1サイクルとする反応を、16サイクル行った。PCR溶液に制限酵素Dpn Iを添加し、37℃で1時間処理した後、反応液10μl分を大腸菌（Mach株）に形質転換した。得られたプラスミドを回収し、シークエンシングにより目的の変異導入を確認した。【００７５】
VvGT5 R140W Quik Fw:
5’- GGGTGGCAATTTGGACTGCTG -3’（配列番号１３）
VvGT5 R140W QuikRv:
5’-CAGCAGTCCAAATTGC ACCC -3’（配列番号１４）【００７６】
作製されたVvGT5-R140W変異体は、実施例２と同様の方法で大腸菌BL21株に形質転換し、1 mM IPTGを添加後、18℃で20時間培養し、Hisタグ融合VvGT5-R140Wタンパク質として調製した。実施例２と同様の方法によって、その糖供与体選択性について検討した。その結果、VvGT5-R140W変異体はUDP-グルクロン酸を基質とせず、代わってUDP-グルコースを主たる糖供与体とした（図１４）。
このことから、VvGT5の140番目のアルギニン残基は、UDP-グルクロン酸の認識に必須の役割を果たしていることが示された。このことから、アルギニン残基の特徴的な側鎖であるグアニジニウム基と、グルクロン酸の特徴的な官能基であるカルボン酸との電気的な相互作用がUDP-グルクロン酸を認識するために重要であることが推測され、おそらくUDP-グルクロン酸を特異的な糖供与体とするUGT酵素にはVvGT5のR140のようなアルギニン残基が備わっていると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
以上のように、ブドウからフラボノイドの3位にグルクロン酸を転移する新規な活性を有するUGT酵素（VvF3GAT）が単離できた。また、そのUDP-グルクロン酸に対する特異性を決定しているアミノ酸残基についても同定することができた。本発明を利用することにより、人為的にフラボノイドの3位をグルクロン酸化することが可能となるため、新しい機能性食品素材の開発や有用化合物を生産しうる植物の開発に貢献できる。従って、本発明は、農業、食品産業、医薬品産業及びこれらの関連産業にわたる広範な利用が可能である点で、極めて有用なものである。
【配列表フリーテキスト】
【００７８】
配列番号１：合成DNA
配列番号２：合成DNA
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成DNA
配列番号７：合成DNA
配列番号８：合成DNA
配列番号９：合成DNA
配列番号１０：合成DNA
配列番号１１：合成DNA
配列番号１２：合成DNA
配列番号１３：合成DNA
配列番号１４：合成DNA
【図１】
2010084879.tif 000002
【図２】
2010084879.tif 000003
【図３】
2010084879.tif 000004
【図４】
2010084879.tif 000005
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2010084879.tif 000014
【図１４】
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【配列表】
2010084879000001.app
【国際調査報告】
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2010084879.tif 000017
2010084879.tif 000018
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