(57)【要約】  本発明は、高感度かつ高い特異性を有するＤＮＡメチル化を指標とした大腸腫瘍、具体的には大腸癌又は大腸線種の有無の判定方法及びこれを実施するためのキットを提供することを目的とする。本発明は、被検細胞のゲノム配列上におけるＴＷＩＳＴ１遺伝子（Homo sapiens twist homolog 1；Drosophila）遺伝子の−４７７〜−７４７領域内の１又は２以上のＣｐＧ配列、より好適には−６８８〜−６９１のＣＧＣＧ配列のメチル化の程度を測定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検細胞中のゲノム配列上におけるＴＷＩＳＴ１遺伝子の−４７７〜−７４７領域内の１又は２以上のＣｐＧ配列のメチル化の程度を測定することを特徴とする大腸腫瘍の有無の判定方法。
【請求項２】
大腸腫瘍が有ると判定された場合に、さらに大腸腫瘍が大腸癌又は大腸腺腫であることを判定することを特徴とする請求項１記載の判定方法。
【請求項３】
ＴＷＩＳＴ１遺伝子の−４７７〜−７４７領域内の１又は２以上のＣｐＧ配列が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の５７番目から６０番目に位置するＣＧＣＧ配列であることを特徴とする請求項１又は２記載の判定方法。
【請求項４】
メチル化の程度を測定する方法が、ＣＯＢＲＡ（Combined Bisulfite Restriction Analysis）法であり、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の５７番目から６０番目に位置するＣＧＣＧ配列を増幅する工程において用いられるプライマーセットが、５’−ＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＴＴＧＴＴＧＴＴＡＴＴ−３’（配列番号４）、５’−ＣＲＡＡＡＡＡＡＡＣＴＡＴＣＣＴＡＡＣ−３’（配列番号５）の組み合わせであることを特徴とする請求項３記載の判定方法。
【請求項５】
被検細胞が、大腸癌や前癌病変が疑われる組織に由来する細胞、大便中に含まれる細胞、大腸洗浄液に含まれる細胞、血液中に含まれる細胞、又は血清に含まれる細胞であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の判定方法。
【請求項６】
被検細胞中のゲノム配列上におけるＴＷＩＳＴ１遺伝子の−４７７〜−７４７領域内の１又は２以上のＣｐＧ配列のメチル化の程度を測定するキットであって、ゲノムＤＮＡを抽出するための試薬、非メチル化シトシンをウラシルに変換するための試薬、前記ゲノムＤＮＡ中のＴＷＩＳＴ１遺伝子の−４７７〜−７４７領域内の１又は２以上のＣｐＧ配列を増幅するためのプライマーセット、及びメチル化パターンを分析するための試薬を備えることを特徴とする大腸腫瘍判定用キット。
【請求項７】
プライマーセットが、配列番号４及び配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対であることを特徴とする請求項６記載の大腸腫瘍判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸腫瘍の有無の判定方法に関し、より詳しくは被検細胞中のゲノム配列上におけるHomo sapiens twist homolog 1（Drosophila）遺伝子（以下、ＴＷＩＳＴ１と記載）遺伝子の−４７７〜−７４７におけるＣｐＧ配列のメチル化の程度を測定することを特徴とする、大腸癌又は大腸腺腫の判定方法や、大腸腫瘍判定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
盲腸、結腸、直腸に発生する大腸腫瘍は、良性腫瘍である大腸腺腫や、悪性度が高く転移性を有する場合もある大腸癌を含む概念であり、なかでも大腸癌は、我が国において現状２番目に罹患者数の多い癌疾患であって、多くは消化管内面の粘膜上皮細胞の突然変異によって生じることが知られている。粘膜上皮細胞の癌化の主因は細胞増殖を制御するゲノムＤＮＡ上の変異であると考えられており、その他環境因子（リスク因子）、遺伝、ウィルス感染などが癌化に影響する因子として知られている。【０００３】
多くの癌と同様、大腸癌も早期の発見がその治療にとっては何より重要であり、これまでに多くの検査手法が開発されてきた。主な検査手法としては便潜血検査、血液検査、直腸指診、大腸内視鏡を用いた診断などがあるが、便潜血検査は早期の癌の検出感度に問題があり、血液検査（血中に含まれる腫瘍マーカー検査）も進行癌でしか陽性にならないという問題があり、直腸指診は指の届く範囲内しか診断できないという問題、大腸内視鏡による診断も視認しにくい早期の癌では検出感度が落ちるという問題、等々、それぞれの検査手法には特に早期の癌における感度において課題があった。【０００４】
癌の初期段階においては、将来癌化する細胞のゲノムＤＮＡに変異が生じるという点に着目して、ＤＮＡや発現産物であるＲＮＡの変異、この中でもＤＮＡのメチル化を癌化の指標にするという癌の検出方法が開発されてきた。特許文献１においては癌化と関係のあるヒトＤＮＡ配列が開示されており、またビメンチン遺伝子の配列上のメチル化を指標とする大腸癌の検出方法（特許文献２）、ＳＰＡＲＣ遺伝子のメチル化を指標とする癌の検出方法（特許文献３）、セラミド水酸化酵素のｍＲＮＡ発現情報による癌の検出方法（特許文献４）、ＡＰＣ、Ｋ−ｒａｓ及びｐ５３遺伝子の変異を指標とする大腸癌の検出方法（特許文献５）、ＡＰＣ及び／またはＤＣＣ遺伝子のメチル化を指標とする消化器癌の検出方法（特許文献６）などが開示されているが、いずれの手法においても検出感度や特異性、コストの面などで問題があり、臨床的には実用化に至っていないのが現状であった。【０００５】
これらの現状をふまえ、少ない遺伝子の情報、より具体的には１遺伝子の配列上におけるメチル化を指標とすることで、消化器腫瘍、特に大腸腫瘍、具体的には大腸癌又は大腺腺腫を早期に感度良く、進行度に応じて、かつ高い特異性で検出する方法の開発が望まれていた。【０００６】
一方、ＴＷＩＳＴ１遺伝子はショウジョウバエDrosophila melanogasterの形態形成に関与する転写調節因子ＴＷＩＳＴのヒトホモログとして単離された遺伝子であり、Ｈ−ＴＷＩＳＴやTWIST homolog of Drosophilaの名でも呼ばれる遺伝子である。その実体はBasic helix-loop-helix（ｂＨＬＨ）タイプの転写調節因子であり、一般に発生時における細胞の系譜や分化に関与すると考えられている。ＴＷＩＳＴ１遺伝子そのもの（コード領域）に生じる変異がSeathre-Chotzen syndromeの原因になることが知られ、近年では上咽頭癌細胞のタキソール耐性獲得に関与していることが示唆されている。しかしながら、ＴＷＩＳＴ１遺伝子のメチル化、特に調節領域やその近傍配列に存在するメチル化が大腸細胞の癌化と強い関連を持つという事実は以前には知られていなかった。【０００７】
他方、乳癌患者における研究において、患者の内視鏡で視覚化されたがんを含む乳管由来の液から検出されるＣｙｃｌｉｎＤ２、ＲＡＲ−β及びＴｗｉｓｔのメチル化アレルをメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）により検討したこと（非特許文献１）や、癌関連遺伝子として知られるＲＡＳＳＦ１Ａ、ＨＩＮ−１、ＲＡＲ−、ＣｙｃｌｉｎＤ２及びＴｗｉｓｔが上皮内小葉癌（ＩＬＣ）と湿潤性小葉癌（ＩＬＣ）において検討され、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）法により、１００％のＩＬＣと６９％のＬＣＩＳが一以上の高メチル化遺伝子を有していることが確認されている（非特許文献２）。がん患者ではＱ−ＰＣＲ法により、Ｓｌｕｇ、Ｔｗｉｓｔの発現を増加し、Ｓｎａｉｌの発現が減少したこと及びＴｗｉｓｔプロモーターにおいてメチル化が示されたこと（非特許文献３）や、ヒトの乳癌においてｔｗｉｓｔ、ｃｙｃｌｉｎＤ２、レチノイン酸、ＲＡＲβ、ＨＩＮ−１のいずれか一以上において異常な高メチル化を示したこと（非特許文献４）が報告されている。また、ＤＮＡメチル化阻害剤、脱メチル化剤、およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性のアンタゴニストから選ばれるメチル化調節剤を、定型または悪性細胞を含む異常な乳管上皮細胞を有する患者の乳管に投与する方法が報告されている（特許文献７）。しかし、例えば少なくとも一つのＣＧジヌクレオチドを含むプライマーが使用され、そのうちの一つが３’末端に位置するプライマーが必要とされるメチル化感受性ＰＣＲ（ＭＳＰ）法では、メチル化された配列を検出することには優れるが、定量的な検出には向かなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００４−５２７２４５号公報
【特許文献２】特表２００７−５０２１２１号公報
【特許文献３】特表２００７−５２４３９３号公報
【特許文献４】特開２００７−２５２２７２号公報
【特許文献５】特開２００７−２７４９２６号公報
【特許文献６】特開２００６−１６６７３２号公報
【特許文献７】特開２００９−９６８０８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Evron E.et al.2001.Detection of breast cancer cells in ductal lavage fluid by methylation-specific PCR.The Lancet 357:1335-1336.
【非特許文献２】Fackler M.J.et al.2003.DNA methylation of RASSF1A,HIN-1,RAR-b,CYCLIN D2 and TWIST in in situ and invasive lobular breast carcinoma.Int.J.Cancer 107:970-975.
【非特許文献３】Tracey A.et al.2005.Expression of the transcription factors snail,slug,and twist and their clinical significance in human breast cancer.
【非特許文献４】Bae Y.K.et al.2005.Gene promoter hypermethylation in tumors and plasma of breast cancer patients.Cancer Res Treat.37(4):233-240.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の現状に鑑み、本発明の課題は、高感度かつ高い特異性を有する、大腸腫瘍の検出方法及びこれを実施するためのキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、乳癌細胞において、種々の遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化が乳癌との関連性を有しているとの知見を基に、大腸腫瘍を特異的に検出可能な各種遺伝子のメチル化領域を探索したところ、大腸腫瘍細胞においても多数の遺伝子において高度にメチル化されている部位があることを見いだしたが、例えば、ＳＦＲＰ遺伝子では、大腸癌におけるメチル化頻度が高いが、正常大腸粘膜におけるメチル化頻度も６８．０％と極めて高いことが確認され、同様に複数の他の遺伝子についても大腸癌細胞においてメチル化頻度が高いものは、正常大腸粘膜におけるメチル化頻度も高いという傾向があり、検出の特異性という点で問題があることを確認した。また、他の臓器における癌と各種遺伝子のメチル化領域についても検討したが、例えば、ＴＷＩＳＴ１のＣｐＧにおけるメチル化と胃癌とでは関連性がみいだせないことを確認した。しかし、さらに詳細に検討を続け、肝臓癌細胞におけるヒトＴＷＩＳＴ１の５’上流側調節領域の高度にメチル化されている部位に着目して正常大腸粘膜、大腸癌及び大腸腺腫の臨床検体を用い、正常者と大腸腫瘍患者・大腸がん患者とのメチル化の割合を検討したところ、驚くべきことに、ヒトＴＷＩＳＴ１プロモーター領域の−６８８〜−６９１のＣＧＣＧ部位のメチル化が、大腸腫瘍の有無、及び腫瘍の進行度と強い相関関係があることを見いだし、かかる知見をもとにさらに検討したところ、ヒトＴＷＩＳＴ１プロモーター領域の−４７７〜−７４７の領域中のＣｐＧ部位を大腸腫瘍の検出、判別のためのマーカーとして用いることができることを見いだし、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は、（１）被検細胞中のゲノム配列上におけるＴＷＩＳＴ１遺伝子の−４７７〜−７４７領域内の１又は２以上のＣｐＧ配列のメチル化の程度を測定することを特徴とする大腸腫瘍の有無の判定方法や、（２）大腸腫瘍が有ると判定された場合に、さらに大腸腫瘍が癌又は腺腫であることを判定することを特徴とする上記（１）記載の判定方法や、（３）ＴＷＩＳＴ１遺伝子の−４７７〜−７４７領域内の１又は２以上のＣｐＧ配列が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の５７番目から６０番目に位置するＣＧＣＧ配列であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の判定方法や、（４）メチル化の程度を測定する方法が、ＣＯＢＲＡ（Combined Bisulfite Restriction Analysis）法であり、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の５７番目から６０番目に位置するＣＧＣＧ配列を増幅する工程において用いられるプライマーセットが、５’−ＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＴＴＧＴＴＧＴＴＡＴＴ−３’（配列番号４）、５’−ＣＲＡＡＡＡＡＡＡＣＴＡＴＣＣＴＡＡＣ−３’（配列番号５）の組み合わせであることを特徴とする上記（３）記載の判定方法や、（５）被検細胞が、大便中に含まれる細胞、大腸洗浄液に含まれる細胞、血液中に含まれる細胞、又は血清に含まれる細胞であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の判定方法に関する。【００１３】
また本発明は、（６）被検細胞中のゲノム配列上におけるＴＷＩＳＴ１遺伝子の−４７７〜−７４７領域内の１又は２以上のＣｐＧ配列のメチル化の程度を測定するキットであって、ゲノムＤＮＡを抽出するための試薬、非メチル化シトシンをウラシルに変換するための試薬、前記ゲノムＤＮＡ中のＴＷＩＳＴ１遺伝子の−４７７〜−７４７領域内の１又は２以上のＣｐＧ配列を増幅するためのプライマーセット、及びメチル化パターンを分析するための試薬を備えることを特徴とする大腸腫瘍判定用キットや、（７）プライマーセットが、配列番号４及び配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー対であることを特徴とする上記（６）記載の大腸腫瘍判定用キットに関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の大腸腫瘍の検出方法を利用することにより、高感度かつ高い特異性で大腸癌等の腫瘍と非腫瘍組織を判別することが可能となり、また腫瘍の進行に応じメチル化のレベルが上昇することから、腫瘍の進行度の判別にも利用可能となる。更に、この方法を実施するためのキットなどを用いることにより、簡便に大腸腫瘍を検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明のＣＯＢＲＡアッセイの結果を示す。（Ａ）正常大腸粘膜由来の泳動像、（Ｂ）大腸癌細胞由来の泳動像をそれぞれ示す。
【図２】臨床検体（大腸癌）の各試料におけるメチル化定量値を示す。
【図３】臨床検体（正常大腸粘膜）の各試料におけるメチル化定量値を示す。
【図４】大腸癌細胞と正常大腸粘膜細胞におけるＴＷＩＳＴ１遺伝子のメチル化レベルを比較して示す。
【図５】図２と図３の結果から導かれるＲＯＣ曲線およびカットオフ値を示す。
【図６】カットオフ値０．４５−２１．２０％における大腸癌と正常大腸粘膜の間のＲＯＣ解析の結果を示す。
【図７】カットオフ値２１．９５−４０．７０％における大腸癌と正常大腸粘膜の間のＲＯＣ解析の結果を示す。
【図８】カットオフ値４１．０５−５８．５５％における大腸癌と正常大腸粘膜の間のＲＯＣ解析の結果を示す。
【図９】カットオフ値５８．７０−８３．６０％における大腸癌と正常大腸粘膜の間のＲＯＣ解析の結果を示す。
【図１０】カットオフ値８３．８５−９９．６０％における大腸癌と正常大腸粘膜の間のＲＯＣ解析の結果を示す。
【図１１】ＲＯＣ解析から導かれたカットオフ値を図４のグラフに適用して示す。
【図１２】大腸癌におけるＴＷＩＳＴ１のメチル化頻度を従来報告のある他の遺伝子と比較して示す。
【図１３】大腸正常粘膜、大腸癌、大腸腺腫由来のＤＮＡを鋳型にしたＣＯＢＲＡアッセイの結果を示す。
【図１４】大腸腺種検体の各試料におけるメチル化定量値を示す。
【図１５】大腸腺腫におけるＴＷＩＳＴ１遺伝子のメチル化レベルを正常大腸粘膜及び大腸癌と比較して示す。
【図１６】大腸腺腫と正常大腸粘膜におけるＴＷＩＳＴ１遺伝子のメチル化のＲＯＣ曲線およびカットオフ値を示す。
【図１７】カットオフ値０．０５−８．６５０における大腸腺腫と正常組織との間のＲＯＣ解析の結果を示す。
【図１８】カットオフ値８．７５０−３７．４０における大腸腺腫と正常組織との間のＲＯＣ解析の結果を示す。
【図１９】カットオフ値３８．３０−９９．０５における大腸腺腫と正常組織との間のＲＯＣ解析の結果を示す。
【図２０】ＲＯＣ解析から導かれたカットオフ値を図１５の大腸正常粘膜と大腸腺腫とのグラフに適用して示す。
【図２１】カットオフ値０．８００−１４．９５における大腸癌と大腸腺腫との間のＲＯＣ解析の結果を示す。
【図２２】カットオフ値１５．２５−２９．８５における大腸癌と大腸腺腫との間のＲＯＣ解析の結果を示す。
【図２３】カットオフ値３０．０５−４５．９５における大腸癌と大腸腺腫との間のＲＯＣ解析の結果を示す。
【図２４】大腸癌細胞株ＤＬＤ‐１，ＨＴ‐２９，ＨＣＴ‐１１６，ＲＫＯ及びメチル化陰性コントロール（ＮＬ末梢血リンパ球由来）、メチル化陽性コントロール（ＩＶＤ、メチル化転移酵素処理を行ったＤＮＡ）における、ＴＷＩＳＴ１遺伝子−４７７〜−７４７におけるＣｐＧメチル化の分布の分析結果を示す。
【図２５】胃癌細胞と正常胃粘膜におけるＴＷＩＳＴ１遺伝子のメチル化レベルを比較して示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の大腸腫瘍の有無の判定方法としては、被検細胞中のゲノム配列上におけるＴＷＩＳＴ１遺伝子の−４７７〜−７４７領域内の１又は２以上のＣｐＧ配列のメチル化の程度（頻度、割合等）を測定する方法であれば特に制限されず、大腸腫瘍は、組織の正常細胞の形質転換により生じる大腸癌又は大腸腺腫を含む概念であり、ここで、大腸腺腫は、前癌状態の形成異常大腸細胞や、転移性のない良性腫瘍を意味し、大腸癌は、転移性を有する悪性腫瘍を意味し、大腸腫瘍の進行は、大腸正常組織に大腸腺腫が増殖することや、前癌状態にある大腸腺腫が新たに癌化することや、癌部より転移した癌細胞が非癌部大腸組織中で増殖して新たに大腸癌組織が形成されることを意味する。
【００１７】
また、ＣｐＧ配列のメチル化の程度（頻度、割合等）を測定するとは、具体的にはＴＷＩＳＴ１プロモーター領域の−４７７〜−７４７内にＣｐＧ配列として存在するシトシンのメチル化、特に好ましくは−６８８〜−６９１（配列番号１に記載の塩基配列中の５７番目から６０番目）のＣＧＣＧ配列に存在するシトシンのメチル化の有無、頻度、割合等を測定することをいい、メチル化の程度の測定を測定する方法としては、ＣＯＢＲＡ（Combined Bisulfite Restriction Analysis）法、メチルライト（MethylLight）法、パイロシークエンシング（Pyrosequencing）法、バイサルファイトシーケンシング(Bisulfite sequencing)法、マスアレイ法、ｑＡＭＰ（Restriction and real-time PCR）法、ＲＴ‐ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法を挙げることができるが、なかでもＣＯＢＲＡ（Combined Bisulfite Restriction Analysis）法を好適に挙げることができる。
【００１８】
また本発明の大腸腫瘍の有無の判定方法は、１）被検細胞からゲノムＤＮＡを抽出する工程ａ、２）工程ａで得られたＤＮＡ中のＣｐＧ配列における非メチル化シトシンを異なる塩基（好ましくはウラシル）に変換する工程ｂ、３）工程ｂで変換されたＴＷＩＳＴ１遺伝子の−４７７〜−７４７領域又は該領域に含まれるＣｐＧ部位を、１組のプライマーでＰＣＲ法を用いて増幅する工程ｃ、４）工程ｃで得られた増幅産物におけるメチル化の程度を測定（メチル化パターンを分析）する工程ｄの各工程を含む方法であり、工程ｄにおいては、メチル化の割合を計算し、所定のカットオフ値を適用して、メチル化の割合が高いときは大腸癌と判定し、メチル化の割合が少し低いときは大腸腺腫と判定することができる。なお工程ｄを、メチル化パターンを分析するためのデータを収集する工程とすることができる。更に適切には、工程ｄにおける分析の工程がターゲット配列のメチル化／非メチル化を区別可能な制限酵素（メチル化特異的制限酵素）処理を含む方法である。
上記工程ｃにおける１組のプライマーは、ＴＷＩＳＴ１の配列情報に基づいて適宜設計し、適当なオリゴヌクレオチド合成装置を用いて適宜作製することができ、ＴＷＩＳＴ１プロモーター領域の−４７７〜−７４７の領域に存在する１又は２以上のいずれかのＣｐＧ配列を増幅できるように設計されていれば、その位置、長さ等に特に制限されず、例えば配列番号１の５７番目から６０番目に存在するＣＧＣＧを増幅する場合、実施例に示すとおり、配列番号２及び配列番号３で示すプライマーの組み合わせや、配列番号４及び配列番号５で示すプライマーの組み合わせを具体的に例示することができ、配列番号４及び配列番号５で示すプライマーの組み合わせを特に好適に示すことができる。また上記工程におけるメチル化特異的制限酵素とは、好適にはＣＧＣＧを認識するＢｓｔＵＩ、ＡｃｃII、Ｂｓｈ１２３６Ｉ、ＢｓｔＦＮＩ、ＦｎｕＤII、ＭｖｎＩ、及びＴｈａＩより選択される制限酵素を挙げることができる。
【００１９】
本発明が大腸腫瘍の検出のために用いられる方法に関することから、本発明における被検細胞は、大腸腫瘍が疑われる細胞であって、その存在部位や由来については特段の限定は無いが、例えば検出の感度を重要視する場合には内視鏡検査等で大腸癌や前癌病変が疑われる組織に由来する細胞などが良く、また検出の簡便性を重要視する場合には大便中に含まれる細胞や大腸洗浄液に含まれる細胞、血液中に含まれる細胞が適している。あるいは血清、尿、喀痰、膵液、胆汁、精液、唾液、脳脊髄液等に含まれる細胞も適している。
【００２０】
また、本発明が検出対象とする大腸腫瘍としては、大腸またはその直近の消化管に生じる癌腫や腺腫を挙げることができ、例えば盲腸癌、結腸癌、直腸癌、盲腸腺腫、結腸腺腫、直腸腺腫が適した例であり、肛門癌、肛門腺腫も含まれるものである。
【００２１】
本発明の大腸腫瘍判定用キットとしては、被検細胞中のゲノム配列上におけるＴＷＩＳＴ１遺伝子の−４７７〜−７４７におけるＣｐＧ配列のメチル化の程度を測定するためのキットであって、ゲノムＤＮＡを抽出するための試薬、非メチル化シトシンをウラシルに変換するための試薬、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の５７番目から６０番目に位置するＣＧＣＧ配列を含む、前記ゲノムＤＮＡ中のＴＷＩＳＴ１遺伝子のプロモーター領域又はその一部の遺伝子断片を増幅するためのプライマーセット、及びメチル化パターンを分析するための試薬を備えるものであれば特に制限されず、具体的なキットの構成としては、例えば（１）ＤＮＡの抽出工程に係る試薬や備品であって、細胞から直接ＤＮＡを抽出するものやパラフィン標本等からＤＮＡを抽出するための脱パラフィン用試薬や備品、糞便からのＤＮＡを抽出するための試薬や備品等、（２）メチル化ＤＮＡの判別工程に係る試薬や備品であって、非メチル化シトシンをウラシルに変換するための試薬や備品、適切には重亜硫酸塩（Sodium Bisulfite）、より適切には亜硫酸水素ナトリウムとその反応に用いるための緩衝液等、（３）メチル化特異的ＰＣＲを行う工程のための試薬や備品、すなわちターゲットとするメチル化ＣＧＣＧ領域を増幅可能なプライマーセットと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、ポリメラーゼ用の緩衝液等、（４）メチル化特異的制限酵素とその反応のための緩衝液等、を含むキットを挙げることができる。それぞれの工程に必要な試薬類等については、常法として論文等で開示されている手法の他、市販のキット、例えばAll Prep DNA/RNA Mini Kit（Qiagen, Hilden, GERM）、パラフィン標本等からＤＮＡ抽出はQIAamp DNA Micro Kit（Qiagen社製）、糞便からのＤＮＡ抽出にはQIAamp Stool DNA Isolation Kit（Qiagen社製)を用いてＤＮＡの抽出を行ってもよいし、メチル化ＰＣＲに関しては、例えばAmpliTaq Gold（Applied Biosystems社製）を使用可能である。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
（外科的切除凍結標本からのＤＮＡ抽出）
正常大腸粘膜の検体２５２検体、大腸癌検体３２０検体よりAll Prep DNA/RNA Mini Kit（Qiagen,Hilden,GERM）を用いて外科的切除凍結標本からのＤＮＡの抽出を行った。２ｍｌチューブへ製品付属のＲＬＴ  ｐｌｕｓバッファーを６００μｌ添加し、βメルカプトエタノールを６μｌ添加後、外科的切除凍結標本を加え、Stainless Steel Beads 5mm（Qiagen社製）を１個加え、Qiagen Mixer Mill MM300（Qiagen社製）を用いて３０Ｈｚ、１０分間、標本の超音波破砕を行った。ホモジナイズしたライセートをAll Prep DNAスピンカラム（Qiagen社製）に入れ、１００００ｒｐｍ、３０秒間遠心した。室温または４℃において、新しいAll Prep DNAスピンカラムを２ｍｌのコレクションチューブにセットしてインキュベートした。
インキュベートしたＤＮＡスピンカラムに５００μｌのＡＷ１バッファー（製品付属）を添加し、１００００ｒｐｍ、３０秒間遠心し廃液のみを捨てた後にカラムを２ｍｌのコレクションチューブにセットした。次いで５００μｌのＡＷ２バッファー（製品付属）を添加し、１５３００ｒｐｍ、２分間遠心を行った。カラムを新しい１．５ｍｌチューブに移し、１００μｌのＥＢバッファー（製品付属）を直接カラムのメンブレンに添加し、室温で１分間インキュベートした後、１００００ｒｐｍ、１分間遠心してＤＮＡを溶出した。【００２３】
（コントロール試料の作製）
メチル化アレルのポジティブコントロールとして、ＳｓｓＩメチル化転移酵素（New England Biolabs,Beverly,MA）にて処理した胎盤由来ＤＮＡ（Sigma,St.Louis,MO）を用いた。胎盤由来ＤＮＡを１０μｇ含む溶液に対し、製品付属の１×ＮＥＢバッファー２、１６０μＭのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、０．２Ｕ（unit）のＳｓｓＩを加え、滅菌水にて２００μｌにした。３７℃にて２時間インキュベート後、３２ｍＭのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを３μｌ、ＳｓｓＩを３μｌ添加して３７℃にて１時間インキュベートした。その後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１，ＰＣＩ，ＰＨ８．０，Sigma社製）を等量添加し、３０秒間懸濁して５分間静置した。室温で１４０００ｒｐｍ、５分間遠心後、上清のみを回収して新しいチューブに移し、ＰＣＩを加えて上記の操作をもう一度行った。ＰＣＩ処理後の試料に１μｌの２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン（Roche社製）、２０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、５００μｌの１００％エタノールを添加し、−８０℃で２時間エタノール沈澱を行った。インキュベート後、４℃、１４０００ｒｐｍで２０分間遠心を行い、上清を除去して７０％エタノールでリンスした。真空乾燥でペレットを乾燥させ、１００μｌの蒸留水にてＤＮＡを溶解させ、メチル化アレルのポジティブコントロールとした。【００２４】
一方、非メチル化アレルのポジティブコントロールとして、末梢血リンパ球より抽出したＤＮＡを用いた。抗凝固剤ＥＤＴＡ−２Ｎａの入った採血管を用い、採取した末梢血に０．２％ＮａＣｌを加えて転倒混和後、２５００ｒｐｍ、５分間遠心した。管底に沈澱させた白血球を吸わないようアスピレーターで上清を除去し、この操作をペレット（白血球）が白くなるまでくり返した。白くなったペレットを１．５ｍｌチューブに移し、核酸抽出剤ＳｅｐａＧｅｎｅ（三光純薬）を用いた核酸抽出を行った。抽出法は用法に従った。抽出により得られた核酸のペレットを風乾させ、蒸留水を１００μｌ加えて溶解したものを、非メチル化アレルのポジティブコントロールとした。【００２５】
（ＤＮＡの亜硫酸水素ナトリウム処理）
メチル化ＤＮＡを修飾し、重亜硫酸塩ＰＣＲ法での解析に供するため、亜硫酸水素ナトリウム処理を行った。上記で精製したＤＮＡ２μｇに蒸留水を加えて全量を５０μｌとし、５．５μｌの２Ｍ  ＮａＯＨを加えて後、３７℃で１０分間インキュベートした。３０μｌの１０ｍＭヒドロキノン（Sigma）と５２０μｌの３Ｍ  亜硫酸水素ナトリウム（ｐＨ５．０，Fisher Scientific）を加え、遮光下で５０℃、１６時間インキュベートした。亜硫酸水素ナトリウム処理したＤＮＡ試料を、DNA Cleanup Kit（Promega）を用いて精製した。精製方法は用法に従った。精製したＤＮＡに３Ｍ  ＮａＯＨを５．５μｌ添加後、５分間インキュベートし、２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲンを１μｌ、１０Ｍ  酢酸アンモニウムを３３μｌ、１００％エタノールを２６０μｌ添加してエタノール沈澱を行い、エタノール沈澱後に真空乾燥でＤＮＡをペレットにし、これに１００μｌの蒸留水を加え、３０分間ボルテックスを行い溶解させた後、４℃にて一晩おき溶解させて、重亜硫酸塩処理ＤＮＡ試料とした。非メチル化ＣｐＧは亜硫酸水素ナトリウム処理によりシトシンからウラシルへと変換されるが、メチル化されたシトシンではこの変換が起こらない。このため、後段で述べる制限酵素処理によって、メチル化ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ産物は切断されるが、非メチル化ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ産物は切断されないという差を検出可能である。【００２６】
（メチル化定量解析）
メチル化の定量解析を行うために、ＣＯＢＲＡ（Combined Bisulfite Restriction Analysis）アッセイを行った。ポリメラーゼはAmpliTaq Gold DNA Polymerase（Applied Biosystems）を用い、２μｌのＧｅｎｅＡｍｐ  １０×バッファーII（製品付属）、２ｍＭ  塩化マグネシウム、８００ｎＭ  ｄＮＴＰｓ、５００ｎＭ  プライマー（表１記載、配列番号２，３）、２μｌ  重亜硫酸塩処理ＤＮＡ、０．５Ｕのポリメラーゼを含む２０μｌの反応溶液を調整した。プライマーの詳細は下記表１及び配列番号２，３に示す。またＰＣＲの温度条件を下記表２に示した。ＰＣＲ産物は３％アガロースゲル電気泳動で確認した。【００２７】
【表１】
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【００２８】
【表２】
2010113529.tif 000003
【００２９】
目的のＰＣＲ産物が確認できた試料について、８μｌを新しいチューブに分注し、１０Ｕの制限酵素ＢｓｔＵＩ（New England Biolabs）、製品付属の１０×ＮＥＢバッファー４を１μｌ添加して全量１０μｌの反応溶液を調整し、６０℃で２時間インキュベートした。ＢｓｔＵＩは塩基配列５’−ｎｎｎＣＧ↓ＣＧｎｎｎ−３’を認識して切断する制限酵素であり、重亜硫酸塩処理後のＤＮＡは、ＣＧＣＧにおけるすべてのシトシンにメチル化があれば、重亜硫酸塩処理を受けてもＣＧＣＧのままであり、この配列を持ったＰＣＲ産物は制限酵素ＢｓｔＵＩにて切断される。一方で、ＣＧＣＧにおけるいずれか或いは全てのシトシンにメチル化がない場合、重亜硫酸塩処理によりＴＧＴＧ、ＣＧＴＧ、ＴＧＣＧのいずれかとなり、この配列を持ったＰＣＲ産物はＢｓｔＵＩで切断されない。この様な性質を利用して、メチル化ＤＮＡの有無とその割合がバンドの有無とその濃さで視覚化可能である。制限酵素処理後のＤＮＡ試料を、エチジウムブロマイドを含有する４％アガロースゲルにて電気泳動し、ゲルの写真をFujifilm Multi Gauge V3.0ソフトウェア（富士フイルム社製）を用いて解析し、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡの定量を行った。【００３０】
（結果）
図１に、ＣＯＢＲＡアッセイの結果を示す。図中上段は正常大腸粘膜細胞由来の重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物のＢｓｔＵＩ分解断片を電気泳動したもの、下段は大腸癌細胞由来の重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物のＢｓｔＵＩ分解断片を電気泳動したものをそれぞれ示す。本実施例で用いたプライマーはＴＷＩＳＴ１遺伝子の調節領域及び調節領域近傍−４７７〜−７４７を含み、配列中に存在する−６８８〜−６９１のＣＧＣＧのメチル化を検出の標的にしている。非メチル化ＤＮＡはＢｓｔＵＩにより切断されず高分子側（図中「非メチル化ＤＮＡ」で示される）に、メチル化ＤＮＡは低分子側（図中「メチル化ＤＮＡ」で示される）にそれぞれバンドが観察され、またこのバンドの濃さ（蛍光強度）がゲノム中における標的のメチル化／非メチル化比を反映している。各レーン下の数字はＴＷＩＳＴ１ＣｐＧのメチル化レベルを全体に対する％で示した数字であり、理論的に全てがメチル化されていれば１００、全てが非メチル化であれば０の値をとる。レーン上の数字は試料の番号である。また、試料レーンの右にあるＩＶＤはメチル化のポジティブコントロールで、ＮＬは非メチル化のポジティブコントロールである。【００３１】
図１Ａの正常大腸粘膜では、代表的な写真の一部を示しているが、非メチル化ＤＮＡがほとんどであり、メチル化レベルの中央値は０．０％であった。一方、図１Ｂの大腸癌では、メチル化ＤＮＡの比が増大し、メチル化レベルの中央値は４０．１％と高い値を示した。また、図１Ａ，Ｂの試料レーンの右にあるＩＶＤはメチル化のポジティブコントロールで、ＮＬは非メチル化のポジティブコントロールである。
また、正常大腸粘膜と大腸癌のすべて検体のメチル化データを図２（大腸癌）及び図３（正常大腸粘膜）に示す。図中Ｎｏ．は検体番号を、メチル化（％で表す）はバンドの蛍光強度から算出したメチル化の割合を、ＵｏｒＭは後述のカットオフ値を適用したときのメチル化の判定（Ｕ＝メチル化せず、Ｍ＝メチル化）をそれぞれ表している。【００３２】
正常大腸粘膜の組織２５２検体、大腸癌組織３２０検体より抽出したゲノムＤＮＡを用い、上記と同様のメチル化レベル解析を行った。図４に、正常大腸粘膜と大腸癌それぞれのメチル化レベルを示す。グラフ縦軸はＴＷＩＳＴ１ＣｐＧのメチル化レベルを％で表しており、各々の点（○）が１検体を表す。グラフより、正常大腸粘膜由来のゲノムＤＮＡではそのほとんどでメチル化レベルが５．０％以下なのに対し、大腸癌由来のゲノムＤＮＡではメチル化レベルが際だって上昇していた。正常大腸粘膜における中央値は０．０％であったのに対し、大腸癌における中央値は４０．１％であった（Ｐ＜０．０００１）。この結果から、ＴＷＩＳＴ１遺伝子のメチル化レベルにより大腸癌を鑑別できる可能性が強く示唆されたので、上記の正常大腸粘膜の検体２５２検体、大腸癌検体３２０検体を用いたＲＯＣ曲線（Receiver operating characteristic curve）を作成した。図５に、作成したＲＯＣ曲線を示す。グラフ縦軸は検出感度を、横軸は１００．０％−特異度を示している。またＲＯＣ解析に用いたデータを図６から図１０に示す。図中Ｃｕｔｏｆｆはカットオフ値を、Sensitivityは検出感度（％）を、９５％ＣＩは９５％の信頼区間を、Specificityは特異度（％）をそれぞれ表し、Likelihood ratioは尤度比を示している。図６−１０はカットオフ値に関して０．４５から９９．８０までのデータを分割したものであり、Ｃｕｔｏｆｆ＝５０．４５以降の尤度比は求めていない。グラフおよび図６−１０より、感度と特異度が最適値（図６中太字と下線で示す）であるメチル化レベル＝３．７％をカットオフ値に決定した。このカットオフ値を、図４のグラフに適用したのが図１１である。グラフ上に点線で示したのがカットオフ値（３．７％）であり、グラフ右の上段のボックスにカットオフ値を適用した場合のメチル化／非メチル化ＤＮＡの割合を示している。カットオフ値３．７％を適用した場合、大腸癌におけるメチル化ＤＮＡの割合は９０．０％（２８８／３２０）であり、一方正常大腸粘膜では６．３％（１６／２５２）と極めて低い値を示した。この値から導かれる感度と特異度は、９０．０％と９３．７％であった。また、陽性的中率は９４．７％（２８８／３０４）であり、陰性的中率は８８．１％（２３６／２６８）あった。【００３３】
本発明の実施例における大腸癌と正常大腸粘膜でのＴＷＩＳＴ１遺伝子のメチル化頻度を、これまでに大腸癌で報告のある他の遺伝子での結果と比較して図１２に示す。図中遺伝子名は報告された遺伝子の略称を、大腸癌は大腸癌細胞におけるそれぞれの遺伝子のメチル化頻度（例数及び割合）を、正常大腸粘膜は正常大腸粘膜におけるそれぞれの遺伝子のメチル化頻度（例数及び割合）を示している。遺伝子の並びは大腸癌におけるメチル化頻度の高い（％）順であり、表右側にそれを示している。またＴＷＩＳＴ１は太字及び下線で示している。
図１２で示された様に、ＳＦＲＰ遺伝子（９１．７％）はＴＷＩＳＴ１遺伝子（９０．０％）よりも大腸癌におけるメチル化頻度が高いが、正常大腸粘膜におけるメチル化頻度も６８．０％と高く、この点においてＴＷＩＳＴ１遺伝子の正常大腸粘膜におけるメチル化頻度が６．３％ときわめて低い値である事と対照的である。これまでに報告のある他の遺伝子を見ても、大腸癌におけるメチル化頻度が高いものは正常大腸粘膜におけるメチル化頻度も高いという傾向があり、検出の特異性という点で問題があったことを表している。本発明の提供するＴＷＩＳＴ１遺伝子は、大腸癌で高度に特異的にメチル化されるという、マーカーとして求められる性質を有しており、従来のマーカーに対する優位性は明らかである。
【実施例２】
【００３４】
（ＴＷＩＳＴ１遺伝子のメチル化を指標とした大腸腺腫の検出）
実施例１と同様のプロトコルを用い、大腸に生じる良性腫瘍である大腸腺腫に対してＴＷＩＳＴ１遺伝子のメチル化がマーカーになりうるかどうか検証した。
ホルマリン固定された大腸腺腫のパラフィン包埋標本１８９検体について、腫瘍部のみをマイクロダイゼクションにて回収し、Qiagen DNA FFPE Tissue kit（Qiagen社製）を用いてＤＮＡ抽出を行った。抽出法は製品付属のプロトコルに従った。【００３５】
（試料の作製）
コントロール試料の作製は実施例１に準じ、ＳｓｓＩメチル化転移酵素（New England Biolabs）にて処理した胎盤由来ＤＮＡ（Sigma）よりメチル化アレルのポジティブコントロールを、末梢血リンパ球より抽出したＤＮＡより非メチル化アレルのポジティブコントロールを、それぞれ作製した。【００３６】
（ＤＮＡの亜硫酸水素ナトリウム処理、メチル化定量解析）
メチル化ＤＮＡを修飾し、重亜硫酸塩ＰＣＲ法での解析に供するためのＤＮＡの亜硫酸ナトリウム処理については、実施例１に準じた。またメチル化定量解析のためのＣＯＢＲＡアッセイについても実施例１の方法に準じた。ただしプライマーは下記表３のプライマーを新たに設計して用い（配列番号４，５参照）、メチル化定量解析のＰＣＲは下記表４のプログラムで行った。改良の目的は、定量ＰＣＲアッセイによるメチル化検出も可能とするためであり、定量ＰＣＲでメチル化評価が可能となればハイスループット解析が可能となるからである。【００３７】
【表３】
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【００３８】
【表４】
2010113529.tif 000005
【００３９】
（結果）
図１３に、ＣＯＢＲＡアッセイの結果を示す。図中上段（Ａ）は正常大腸粘膜由来の重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物のＢｓｔＵＩ分解断片を電気泳動したもの、中段（Ｂ）は大腸腺腫由来の重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物のＢｓｔＵＩ分解断片を電気泳動したもの、下段（Ｃ）は大腸癌細胞由来の重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物のＢｓｔＵＩ分解断片を電気泳動したものそれぞれ示す。本実施例で用いたプライマーはＴＷＩＳＴ１遺伝子の調節領域及び調節領域近傍−４７７〜−７４７を含み、配列中に存在する−６８８〜−６９１のＣＧＣＧのメチル化を検出の標的にしている。また図中右側レーンのＩＶＤはメチル化のポジティブコントロール、ＮＬは非メチル化のポジティブコントロールである。その他の各レーンには代表的なサンプルを９サンプルずつ示している。
図１３Ａの正常大腸粘膜では、非メチル化ＤＮＡがほとんどであり、メチル化レベルの中央値は０．０％であった。一方、図１３Ｂの大腸腺腫では、メチル化レベルの中央値は２５．６％と高い値を示し、大腸癌でのメチル化レベルの中央値５５．７％の約半分の値であった。この結果は、本発明の提供する大腸腫瘍の検出方法により大腸癌だけではなく良性腫瘍である大腸腺腫も検出可能であること、そしてメチル化の度合いにより腫瘍の進行度も検出・推定が可能であることを示している。
本実施例における大腸腺腫の全１８９検体のメチル化データを図１４に示す。図中Ｎｏ．は検体番号を、メチル化（％で表す）はバンドの蛍光強度比から算出したメチル化の割合を、Ｕ  ｏｒ  Ｍは後述のカットオフ値を適用したときのメチル化の判定（Ｕ＝非メチル化、Ｍ＝メチル化）をそれぞれ表している。【００４０】
図１５に、大腸腺腫検体のメチル化レベルを正常大腸粘膜組織（２５１検体、１検体は実験上の都合で削除）、大腸癌組織（１８９検体）と比較して示す。グラフは実施例１の図４に準じて作成し、正常大腸粘膜、大腸癌のデータは図４と共通である。縦軸はＴＷＩＳＴ１ＣｐＧのメチル化レベル（％）を示し、各々の点（○）が１検体を表す。グラフより、正常大腸粘膜由来のゲノムＤＮＡではそのほとんどでメチル化レベルが５．８％以下であるのに対し、大腸腺腫及び大腸癌では高値を示した。メチル化レベルの中央値はそれぞれ、正常大腸粘膜で０．０％、大腸腺腫で２５．６％、大腸癌で５５．７％であった（Ｐ＜０．０００１）。【００４１】
図１６に、正常大腸粘膜のデータと大腸腺腫のデータを用いて作成したＲＯＣ曲線を示す。グラフ縦軸は検出感度を、横軸は１００．０％−特異度を示している。またＲＯＣ解析に用いたデータを図１７から１９に示す。図中Cutoffはカットオフ値を、Sensitivityは検出感度（％）を、９５％ＣＩは９５％の信頼区間を、Specificityは特異度をそれぞれ表し、Likelihood ratioは尤度比を示している。図１７−１９はカットオフ値に関して０．０５から９９．０５までのデータを分割したものであり、Cutoff＝５７．２０以降の尤度比は求めていない。図１６グラフ及び図１７−１９より、感度と特異度が最適値（図中太字と下線で示す）であるメチル化レベル＝４．５５％をカットオフ値に決定した。
このカットオフ値を正常大腸粘膜と大腸腺腫のメチル化頻度のグラフに適用したのが図２０である。グラフ上に点線で示したのがカットオフ値（４．５５％）であり、グラフ右の上段のボックスにカットオフ値を適用した場合における正常大腸粘膜と大腸腺腫でのメチル化／非メチル化ＤＮＡの割合を表している。カットオフ値４．５５％を適用した場合、大腸腺腫におけるメチル化ＤＮＡの割合は８４．１％（１５９／１８９）であり、一方正常大腸粘膜では１５．５％（３９／２５１）と極めて低い値を示した。この値から導かれる感度と特異度はそれぞれ８４．１％と８４．５％であった。また陽性的中率は８０．３％（１５９／１９８）であり、陰性的中率は８７．６％（２１２／２４２）であった。【００４２】
上記実施例１，２で得られたデータを用い、メチル化頻度に基づく大腸腺腫と大腸癌との判別を試みた。図１５で用いたデータを基に、大腸腺腫（メチル化頻度が相対的に低い）と大腸癌（メチル化頻度が相対的に高い）との間での最適なカットオフ値をＲＯＣ解析により検討した。
図２１から図２３に、同検討の結果を示す。表中Ｃｕｔｏｆｆはカットオフ値を、Sensitivityは検出感度（％）を、９５％ＣＩは９５％の信頼区間を、Specificityは特異度（％）をそれぞれ表し、Likelihood ratioは尤度比を示している。図２１−２３はカットオフ値に関して０．８０００から４５．９５までのデータを分割したものである。図２１−２３より、感度と特異度が最適値（図中太字と下線で示す）であるメチル化レベルは２６．０％と求められた。カットオフ値２６．０％を適用したとき、検出感度７２．４％、特異度５０．８％、陽性的中率７１．３％、陰性的中率５２．２％の確率で、大腸癌と大腸腺腫とを区別することが可能であった。これにより、本発明の提供するマーカーが腫瘍の有無だけでなく、その進行度（良性／悪性度）をも検出可能なマーカーとして利用可能であることが示された。
【実施例３】
【００４３】
（大腸癌細胞株の使用）
大腸癌細胞株を用いて、ＴＷＩＳＴ１遺伝子の−４７７〜−７４７領域内のＣｐＧ配列、具体的には、配列番号１に示される塩基配列中の５７番目から６０番目のＣＧＣＧ及びそれ以外の箇所のＣｐＧのメチル化について検討した。大腸癌細胞株として、ＤＬＤ−１，ＨＴ−２９，ＨＣＴ−１１６，ＲＫＯを用い、メチル化陰性コントロールとして末梢血リンパ球由来細胞であるＮＬ、メチル化陽性コントロールとしてメチル化転移酵素処理を行ったＤＮＡであるＩＶＤを用いた。大腸癌細胞株(ＤＬＤ−１，ＨＴ−２９，ＨＣＴ−１１６，ＲＫＯ)についてはそれぞれ１０クローンのメチル化パターン（１０個の細胞における個々の細胞のメチル化パターン）、メチル化陽性(ＩＶＤ)及び陰性コントロール(ＮＬ)についてはそれぞれ５クローンのメチル化パターンを検討した。図２４は、ＴＷＩＳＴ１遺伝子−４７７〜−７４７におけるＣｐＧメチル化の分布を表した図である。黒丸がＣｐＧメチル化あり、白丸がＣｐＧメチル化なしである。メチル化パターンは、ＢｓｔＵＩを用いたＣＯＢＲＡ法又はバイサルファイトシーケンシング法により分析した。【００４４】
（結果）
塩基配列中の５７番目から６０番目のＣＧＣＧ（−６９１〜−６８８領域）におけるメチル化パターンと−４７７〜−７４７領域におけるＣｐＧメチル化パターンは良く相関することが確認された。すなわち、５７番目から６０番目のＣＧＣＧにメチル化があれば、他の部位でもメチル化が認められることがわかった。【００４５】
［比較例３］
胃癌細胞と正常胃粘膜を用いて、実施例1と同様に、ＴＷＩＳＴ１についてＣｐＧメチル化レベル（％）について比較検討したところ、何ら優位性は認められなった。結果を図２５に示す。
【実施例４】
【００４６】
（臨床検体からの細胞の検出）
被検者から採取された便をメッシュで濾した後、上皮細胞の基底側面部表面に広く発現することが知られているＥＰ−ＣＡＭを発現する細胞を選択するために、抗ＥＰ−ＣＡＭ抗体を添加し、攪拌後に鉄ビーズ抗体を用いて二次抗体反応をすすめ、再び攪拌した後、磁石により標的細胞をカラムに吸着させ細胞の回収を行った。QIAamp Stool DNA Isolation Kit（Qiagen社製)を用いて回収された細胞からのＤＮＡの抽出を行った他は、実施例１の方法に準じて、ＴＷＩＳＴ１遺伝子のメチル化パターンの分析を行った。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の大腸腫瘍の有無の判定方法を利用することにより、大腸癌や大腸腺腫をはじめとする大腸腫瘍を感度よくかつ高い特異性で検出するキット等を開発することが可能となる。これは早期発見が最重要である腫瘍、特に癌の検出において、きわめて有用なツールを提供するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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