(57)【要約】  本発明により、キク由来フラバノン３-水酸化酵素（F3H）遺伝子の転写調節領域を用いてデルフィニジンを花弁に含有するキク植物を生産する方法、及び該調節領域が導入された、キク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織、特に花弁、切り花が提供される。本発明は、キク由来フラバノン３-水酸化酵素（F3H）遺伝子の転写調節領域を転写調節領域として用いて、フラボノイド3',5'-水酸化酵素（F3'5'H）をキク植物において発現させて、その花弁にデルフィニジンを含むキク植物を生産する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
（１）配列番号３４又は配列番号８７に示す塩基配列を含む核酸、
（２）キク由来フラバノン３-水酸化酵素（F3H）遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号３４又は配列番号８７に示す塩基配列に対して１個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び／又は置換により修飾された塩基配列を含む核酸、
（３）キク由来フラバノン３-水酸化酵素（F3H）遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号３４又は配列番号８７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、及び
（４）キク由来フラバノン３-水酸化酵素（F3H）遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号３４又は配列番号８７に示す塩基配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸、
から成る群から選ばれる核酸を転写調節領域として用いて、フラボノイド3',5'-水酸化酵素（F3'5'H）をキク植物において発現させて、その花弁にデルフィニジンを含むキク植物を生産する方法。
【請求項２】
前記フラボノイド3',5'-水酸化酵素（F3'5'H）が、カンパニュラ、サイネリア（シネラリア）、バーベナ、及びパンジー#40由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記転写調節領域に加え、タバコのアルコールデヒドロゲナーゼ由来の翻訳エンハンサーをさらに用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記翻訳エンハンサーが前記Ｆ3'5'Ｈ遺伝子の開始コドンに直結されている発現ベクター又は発現カセットを用いる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記花弁中のデルフィニジンの含有率が、アントシアニジンの合計量の２５質量％以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１項に記載の核酸を含むか又は請求項１に記載の方法により生産された、キク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
【請求項７】
切り花である、請求項６に記載のキク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
【請求項８】
請求項７に記載の切り花を用いた切り花加工品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キク由来フラバノン３-水酸化酵素（F3H）遺伝子の転写調節領域を用いてデルフィニジンを花弁に含有するキク植物を生産する方法、該調節領域の核酸、該核酸を含む発現ベクター又は発現カセット、及び該調節領域が導入された、キク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織、特に花弁、切り花に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術を利用すると、有用な遺伝子を目的の植物で発現させることにより、その植物に新しい形質を植物に付与することができる。このようにして作製された遺伝子組換え植物はすでに広範囲で栽培されている。遺伝子の発現の調節は、主に転写の段階で制御されていて、転写調節は遺伝子の発現を調節する上で最も重要である。すなわち、適切な時期に、適切な組織で、適切な強さで転写をさせることが、産業上有用な遺伝子組換え植物を作製するために重要である。転写は多くの場合、翻訳領域の5'側にあるDNA配列により制御されている。遺伝子の転写の開始部位を決定し、その頻度を直接的に調節するDNA上の領域をプロモーターという。プロモーターは、開始コドンの5'側数十ｂｐに存在することがあり、ＴＡＴＡボックスなどの配列を含むことが多い。そのさらに5’側には様々な転写調節因子が結合するシスエレメントがあり、これらの存在は、転写の時期、転写が行われる組織、転写の強さを制御している。転写調節因子はアミノ酸配列により多くのファミリーに分類される。例えば、Ｍｙｂ型転写調節因子、ｂＨＬＨ（basic helix loop helix）型転写調節因子などは有名なファミリーである。実際には、転写制御領域とプロモーターは同じような意味で用いられることが多い。【０００３】
花の色の主成分であるアントシアニンは、フラボノイドと総称される二次代謝物の一員である。アントシアニンの色はその構造に依存する。すなわち、アントシアニンの発色団であるアントシアニジンのB環の水酸基の数が増加すると青くなる。また、アントシアニンを修飾する芳香族アシル基（クマロイル基、カフェオイル基など）の数が増加するとアントシアニンの色は青くなり（すなわち吸収極大値が長波長にシフトする）、アントシアニンの安定性が増すことが知られている（以下、非特許文献１参照）。
アントシアニンの生合成に関わる酵素や該酵素をコードする遺伝子はよく研究されている（同非特許文献１参照）。例えば、アントシアニンに芳香族アシル基を転移する反応を触媒する酵素遺伝子はリンドウ、ラベンダー、ペチュニアなどから得られている（以下、特許文献１、特許文献２参照）。赤ジソの葉に蓄積されるアントシアニン（マロニルシソニン、3-O-(6-O-(E)-p-coumaroyl-β-D-glucopyranosyl)-5-O-(6-O-malonyl-β-D-glucopyranosyl)-cyanidin）（以下、非特許文献２参照）の合成に関わる酵素遺伝子は、ヒドロキシシナモイルCoA:アントシアニン３グルコシド−芳香族アシル基転移酵素（３ＡＴ）の遺伝子｛以下、単に「シソアントシアニン３−アシル基転移酵素（３ＡＴ）遺伝子」ともいう。｝を始め既に報告されている（特許文献１参照）。さらにアントシアニンの生合成酵素の遺伝子の転写制御（調節）についても知見が得られている。これらの遺伝子の開始コドンの5'側に位置する転写調節領域の中には、Ｍｙｂ型転写調節因子、ｂＨＬＨ型転写調節因子が結合するシスエレメント配列がある。Ｍｙｂ型転写調節因子とｂＨＬＨ型転写調節因子がペチュニア、トウモロコシ、シソなどのアントシアニンの合成を制御していることも知られている（非特許文献１参照）。【０００４】
植物において遺伝子の転写を担っているプロモーター（以下、転写調節領域ともいう。）には、どの組織でも又は発育段階のどの時期にでも機能するいわゆる構成的プロモーターと、特定の器官・組織でのみ機能する器官・組織特異的プロモーターや、発育段階の特定時期にのみ発現する時期特異的プロモーターとがある。遺伝子組換植物で有用遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、構成的プロモーターがよく用いられる。代表的な構成的プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（以後、CaMV35Sプロモーターと表記することがある）やそれを元に構築されたプロモーター（以下、非特許文献３参照）、Mac1プロモーター（以下、非特許文献４参照）などがある。しかしながら、植物において、多くの遺伝子は、組織・器官特異的又は時期特異的に発現している。これは遺伝子を組織・器官特異的又は時期特異的に発現することが植物にとっては必要であることを示唆している。このような組織・器官特異的又は時期特異的な転写調節領域を利用して植物の遺伝子組換えを行った例がある。例えば、種子特異的な転写調節領域を用いて蛋白質を種子で蓄積させた例がある。【０００５】
ところで、植物は多様な色の花を咲かせるが、全ての色の花を咲かせることができる種は、その種がもつ遺伝的な制約から、少ない。例えば、バラ、カーネーションなどには青や紫色の花を咲かせる品種は自然には存在しない。なぜなら、バラやカーネーションは、多くの青や紫色の花を咲かせる種が合成するデルフィニジンというアントシアニジンを合成するために必要なフラボノイド3',5'-水酸化酵素遺伝子を持っていないからである。これらの種に、青や紫色の花を咲かせる種であるペチュニア、パンジーなどのフラボノイド3',5'-水酸化酵素遺伝子を導入することにより、これらの種で、花の色を青くすることができた。カーネーションの場合、異種由来のフラボノイド3',5'-水酸化酵素遺伝子を転写させるために、キンギョソウ又はペチュニア由来のカルコン合成酵素遺伝子の転写調節領域が用いられている。例えば、キンギョソウ又はペチュニア由来のカルコン合成酵素遺伝子の転写調節領域を含むプラスミドとして、以下の特許文献３に記載されたプラスミドpCGP485、pCGP653、構成的な転写調節領域を含むプラスミドとして、プラスミドpCGP628（Mac1プロモーターを含む）、以下の特許文献４に記載されたプラスミドpSPB130（El2エンハンサーが付加されたCaMV35Sプロモーターを含む）が挙げられる。【０００６】
しかしながら、このようなプロモーターが組換え植物において、どの程度強く機能して目的の表現型をもたらすことができるかどうかは、予測することは困難である。また、複数の外来遺伝子を発現させるために同じプロモーターを繰り返して使うことは遺伝子のサイレンシングを引き起こすことがあるので、避けるべきであると考えられている（以下、非特許文献５参照）。
したがって、いくつかのプロモーターが花の色を変えるために使われてきたが、さらに別の花の色を変えるために宿主植物と目的に応じた有用なプロモーターが求められている。【０００７】
特に、キク植物（単に、「キク」ともいう。）は、日本全国の卸売価格(農林水産統計平成19年花き卸売市場調査結果の概要)の内の約30％を占め、バラの約9％、カーネーションの約7％と比較しても重要な作目である。キクには、白・黄・橙・赤・桃・紫赤などの花色があるが、既存品種や近縁の野生種には、紫や青など青色系の花色がない。
したがって、青色系の育種は、新たな需要を喚起するための目標の一つとされている。キクの花色は、アントシアニンとカロテノイドの組み合わせにより発現している。アントシアニンは基本骨格であるアントシアニジンの構造の違いや、糖や有機酸による修飾の違いなどにより、多様な色を発現できる。しかし、キクの花色を担うアントシアニンは、シアニジンの3位がグルコースとマロン酸により修飾された二種類（cyanidin 3-O-(6"-O-monomalonyl-β-glucopyranosideとcyanidin 3-O-(3",6"-O-dimalonyl-β-glucopyranoside)であることが知られている（以下、非特許文献６参照）。また、それらの構造は比較的単純である（図１参照）。これにより、キクのアントシアニンによる発色の幅が極めて小さい要因になっている。ところで、青色系の発色は、主にアントシアニンによるものであるが、キクには、鍵となる酵素であるフラボノイド3',5'-水酸化酵素（Ｆ3'5'Ｈ）をコードする遺伝子が存在しないため、青を発色するデルフィニジン系アントシアニンが生合成されない（図１参照）。そこで、キクの花弁に蓄積するアントシアニン系色素を改変して、青色系の花色をもつキクの作出を可能にするために、遺伝子工学的手法を用いたキクのアントシアニンの発現制御技術の開発が望まれている。【０００８】
前記したように、キクは日本で最も重要な花きであるが、六倍体という高次倍数性を有し、かつゲノムサイズも大きいことから、形質転換効率が低いのに加えて、導入遺伝子のサイレンシング（不活化）が起こることもあり、安定に導入遺伝子を発現する遺伝子組換えキクを得ることは容易ではない。CaMV35Sプロモーターに連結したβ-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子を導入したキクでは、同じ遺伝子を導入したタバコに比べ、GUS遺伝子の活性は10分の１程度であり、かつ、その活性は形質転換後12ヶ月経過するとほとんどの個体で低下することが報告されている（以下、非特許文献７参照）。キクで外来遺伝子を安定に発現させるために、キクで良好に機能するクロロフィルa/b結合蛋白質のプロモーターを得た報告があるが、同プロモーターは、クロロフィルが余り存在しない花弁で遺伝子を発現させるためには適していない（以下、非特許文献８参照）。また、タバコのelongation factor 1（EF1α）プロモーターに連結したGUS遺伝子をキクに導入すると、20ヶ月以上経過しても葉や花弁でGUS遺伝子が発現したという報告がある（以下、非特許文献９参照）。さらに、変異型のエチレンレセプター遺伝子をキクで発現させ花の寿命を延長した例（以下、非特許文献１０参照）、キクのAGAMOUS遺伝子の発現を抑制して花の形を変化させた例（以下、非特許文献１１参照）、タバコのアルコールデヒドロゲナーゼの翻訳エンハンサー（特許文献７参照）を用いてキクにおける外来遺伝子の発現を上昇させた例（以下、非特許文献１２参照）がある。【０００９】
一方、遺伝子組換えによるキクの花色改変の成功例として、カルコン合成酵素（CHS）の遺伝子をコサプレッション法により抑制して、ピンク色を白色にした報告（以下、非特許文献１３参照）と、カロテノイド分解酵素（CCD4a）の遺伝子をRNAi法により抑制して、白色を黄色にした報告（以下、非特許文献１４参照）があるが、いずれも内在性の遺伝子の発現抑制による花色改変であり、外来遺伝子の過剰発現による花色改変の成功例はないし、アントシアニンの構造やそれに伴う花色の変化を実現した例もない。【００１０】
外来遺伝子の過剰発現による花色改変の試みは、デルフィニジンが合成されるために必要な酵素であるF3'5'Hをコードする遺伝子を導入した報告があるが（以下、特許文献５、非特許文献１５参照）、導入したF3'5'H遺伝子の働きにより生産されたデルフィニジンが舌状花弁に蓄積し、青色系のキクが作出されたという報告はない。キクでは、CaMV35SプロモーターでF3'5'Hを発現させても、デルフィニジンの生産は認められない（非特許文献１５参照）。また、CaMV35Sプロモーターで発現させた遺伝子の発現は、キク形質転換体の成長に伴って消失するなど、安定的な発現には不適切である（非特許文献７参照）。キクで外来遺伝子を舌状花弁で効率的かつ安定的に発現できるプロモーターとして、ポテトLhca3.St.1プロモーター（以下、非特許文献１６参照）、キクUEP1プロモーター（以下、非特許文献１７参照）や、タバコEF1αプロモーター（以下、特許文献６、非特許文献９参照）等が開発されている。しかし、これらのプロモーターを用いた外来遺伝子の過剰発現によるキクの花色改変は報告がない。以上のことから、花の色が変化したキクを遺伝子組換えにより作出するために、キクに適したプロモーターの開発を含むフラボノイド生合成系遺伝子の発現制御技術を確立する必要がある。【００１１】
遺伝子の発現は、主に転写調節領域により制御されているが、mRNAの翻訳を向上させる配列も知られている。たとえば、タバコモザイクウィルス由来のオメガ配列はオメガ配列に連結された異種の遺伝子の翻訳効率をin vitroでもin vivoでも上昇させることが知られている（以下、非特許文献１８参照）。また、タバコのアルコールデヒドロゲナーゼの5'-非翻訳領域（NtADH5'UTR）に存在する配列（ADH200）が、異種遺伝子の発現の安定性向上に寄与することが知られている（以下、特許文献７参照）。また、CaMV35Sプロモーターの3'側にこの配列の下流に存在する94bpの翻訳エンハンサー（ADHNF、特許文献８参照）を連結し、さらにGUS遺伝子を連結した発現カセットを導入した場合、キクにおいて、この配列は翻訳効率の上昇に寄与していることが報告されている（非特許文献１２参照）。しかしながら、この配列を用いてフラボノイドの構造や組成を変化させ、花の色を変化させるために用いられた例はない。花の色を変化させるためには、フラボノイドやアントシアニンが主に蓄積する上皮細胞で異種の遺伝子を発現させる必要があるため、従来の結果からは、NtADH5'UTR（ADH200や翻訳エンハンサーADHNF）が花色を変えるために有効であるかどうかは類推することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO 96/25500
【特許文献２】WO 01/72984
【特許文献３】WO 94/28140
【特許文献４】WO 05/17147
【特許文献５】米国特許第５９４８９５５号
【特許文献６】特開２００４−６５０９６号公報
【特許文献７】米国特許第6573429号公報
【特許文献８】特開２００３−７９３７２号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Plant J. 54, 737-749, 2008
【非特許文献２】Agricultural and Biological Chemistry, 53, 797-800, 1989
【非特許文献３】Plant Cell Physiology, 37, 49-59, 1996
【非特許文献４】Plant Molecular Biology, 15, 373-381, 1990
【非特許文献５】Annals of Botany, 79, 3-12, 1997
【非特許文献６】Journal of Horticultural Science & Biotechnology, 81, 728-734, 2006
【非特許文献７】Plant Biotechnology, 17, 241-245, 2000
【非特許文献８】Breeding Science, 54, 51-58, 2004
【非特許文献９】Japan Agricultural Research Quarterly, 39：269-274, 2005
【非特許文献１０】Postharvest Biology and Technology, 37, 101-110, 2005
【非特許文献１１】Plant Biotechnology, 25:55-59, 2008
【非特許文献１２】Plant Biotechnology, 25:69-75,2008
【非特許文献１３】Bio/Technology 12:268, 1994
【非特許文献１４】Plant Physiology 142:1193, 2006
【非特許文献１５】J. Plant Biol., 50:626, 2007
【非特許文献１６】Mol Breed 8: 335, 2001
【非特許文献１７】Transgenic Res 11: 437, 2002
【非特許文献１８】Nucleic Acids Research, 15, 3257-3273, 1987
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明が解決しようとする課題は、キク由来フラバノン３-水酸化酵素（F3H）遺伝子の転写調節領域を用いてデルフィニジンを花弁に含有するキク植物を生産する方法、及び該調節領域が導入された、キク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織、特に、花弁、切り花を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討し、実験を重ねた結果、キク由来フラバノン３-水酸化酵素(F3H)の転写調節領域を用いて、フラボノイド3',5'-水酸化酵素（F3'5'H）をキクにおいて発現させると、花弁にデルフィニジンが多く蓄積し、花の色が変化すること、さらにタバコのアルコールデヒドロゲナーゼ由来の翻訳エンハンサーを付加するとより多くのデルフィニジンが蓄積し、花の色がさらに変化することを発見し、その有用性を実験により確認して、本願発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。【００１６】
［１］以下の：
（１）配列番号３４又は配列番号８７に示す塩基配列を含む核酸、
（２）キク由来フラバノン３-水酸化酵素（F3H）遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号３４又は配列番号８７に示す塩基配列に対して１個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び／又は置換により修飾された塩基配列を含む核酸、
（３）キク由来フラバノン３-水酸化酵素（F3H）遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号３４又は配列番号８７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列から成る核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、及び
（４）キク由来フラバノン３-水酸化酵素（F3H）遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号３４又は配列番号８７に示す塩基配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸、
から成る群から選ばれる核酸を転写調節領域として用いて、フラボノイド3',5'-水酸化酵素（F3'5'H）をキク植物において発現させて、その花弁にデルフィニジンを含むキク植物を生産する方法。【００１７】
［２］前記フラボノイド3',5'-水酸化酵素（F3'5'H）が、カンパニュラ、サイネリア（シネラリア）、バーベナ、及びパンジー#40由来である、前記［１］に記載の方法。【００１８】
［３］前記転写調節領域に加え、タバコのアルコールデヒドロゲナーゼ由来の翻訳エンハンサーをさらに用いる、前記［１］又は［２］に記載の方法。【００１９】
［４］前記翻訳エンハンサーが前記F3'5'H遺伝子の開始コドンに直結されている発現ベクター又は発現カセットを用いる、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。【００２０】
［５］前記花弁中のデルフィニジンの含有率が、アントシアニジンの合計量の２５質量％以上である、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。【００２１】
［６］前記［１］に記載の核酸を含むか又は前記［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法により生産された、キク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。【００２２】
［７］切り花である、前記［６］に記載のキク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
［８］配列［７］に記載の切り花を用いた切り花加工品。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、キク由来フラバノン３-水酸化酵素(F3H)の転写調節領域を用いて、フラボノイド3',5'-水酸化酵素（F3'5'H）をキクにおいて発現させると、他のプロモーターを用いた場合に比較して、花弁にデルフィニジンがより多く蓄積し、花の色がより青色に向かって変化すること、さらにタバコのアルコールデヒドロゲナーゼ由来の翻訳エンハンサーを付加するとより多くのデルフィニジンが蓄積し、花の色がさらに青色に向かって変化することが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】F3'5'Hを導入した形質転換キクのフラボノイドの生合成経路の概略図
【図２】F3'5'H遺伝子導入用バイナリーベクターの概略図
【図３】キクF3Hpro::ADHNF-カンパニュラF3'5'H::NOSterを導入した形質転換個体における花色とデルフィニジンの含有割合
【図４】pBI121キクF3Hpro1k::ADHNF-カンパニュラF3'5'H::NOSterの構築過程
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、キク(chrysanthemum)のフラバノン３-水酸化酵素（F3H）をコードする遺伝子の5'領域（以下、「CmF3Hpro」、「chrysF3H 5'」ともいう。）により、フラボノイド3',5'-水酸化酵素（F3'5'H）を発現させる遺伝子カセットを含有するベクターでキクを形質転換することを含む、その花弁にデルフィニジンを含むキク植物を（作出）生産する方法に関する。前記遺伝子カセットには、好ましくは、タバコのアルコールデヒドロゲナーゼ由来の翻訳エンハンサーが含まれる（図２（最下）参照）。前記花弁中のデルフィニジンの含有率は、好ましくは、アントシアニジンの合計量の２５質量％以上であり、花弁の色は青色方向に改変されている。本発明は、該方法によって生産された、又はCmF3Hproを含む、キク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織にも関する。前記部分又は組織は、好ましくは、花弁、切り花である。
本明細書中、「発現カセット」とは、任意の核酸にプロモーターとターミネーターを連結したＤＮＡ断片をいう。
【００２６】
本発明によれば、F3'5'H遺伝子をキクの舌状花弁で発現させ、その酵素タンパク質が合成されて機能することで、デルフィニジン系アントシアニンを合成及び蓄積させることにより、青色系の花色のキクの作出が可能となる。F3'5'Hを発現させるために使用する遺伝子カセットに含まれるプロモーターとして、Rose CHSpro（バラのカルコン合成酵素(CHS)遺伝子プロモーター）、R. rugosa DFRpro（ハマナスのジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ(DFR)遺伝子プロモーター）、R. rugosa F3Hpro（ハマナスのフラバノン３-水酸化酵素（F3H）、Viola F3'5'H#40pro（パンジーのF3'5'H遺伝子のプロモーター）を用いた場合に、デルフィニジンの蓄積（最大5.4%）が確認されたものの（表１参照）、花色を青色系にするまでには至らなかった。そこで、キク花弁中のデルフィニジンの蓄積を高め、花色を青色系にするために有効なプロモーターを発見するために、各種プロモーターを用いてＦ3'5'Ｈの発現実験を繰り返した結果、CmF3Hproが有効なプロモーターであることが判明した。CmF3Hproを用いることで、他のプロモーターを使用した場合に比較してデルフィニジンの蓄積が向上し（表１参照、平均31.4%，最大80.5%）、さらに青色系の花色に至った（図３参照、RHSカラーチャート79A、77A、72A、72B）。また、CmF3Hproにより発現させるF3'5'H遺伝子の内、カンパニュラ（デルフィニジンの蓄積率：最高81%）、サイネリア（シネラリアともいう)（デルフィニジンの蓄積率：最高36%）、バーベナ及びパンジー（デルフィニジンの蓄積率：最高27-28%）由来のF3'5'Hが、キクの花色を紫色へと改変する能力のあることを見いだした。さらに、タバコADH翻訳エンハンサー（特許文献8参照）を直結した遺伝子カセットを導入することで、効率的にキクの舌状花にデルフィニジンを基本骨格とするアントシアニンを蓄積させて花色改変に成功した（表１、図３参照）。尚、直結とは、１のポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドの間に余分な核酸配列を含むことなく連結することをいう。
【００２７】
本発明に係る転写制御領域としては、例えば、配列番号３４又は配列番号８７に示す塩基配列から成る核酸が挙げられる。しかしながら、配列番号３４又は配列番号８７に示す塩基配列から成る核酸において数個（１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の塩基の付加、欠失及び／又は置換によって修飾された塩基配列から成るプロモーターも、元のプロモーターと同様の活性を維持していると考えられる。従って、本発明に係る転写調節領域は、キク由来フラバノン３-水酸化酵素（F3H）遺伝子の転写調節領域として機能する限り、配列番号３４又は配列番号８７に示す塩基配列に対して１個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び／又は置換により修飾された塩基配列から成る核酸であることもできる。
【００２８】
本発明に係る転写調節領域は、さらにキク由来フラバノン３-水酸化酵素（F3H）遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号３４又は配列番号８７に示す塩基配列に対して高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、又はキク由来フラバノン３-水酸化酵素（F3H）遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号３４又は配列番号８７に示す塩基配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸であることもできる。
【００２９】
これらの核酸として、配列番号３４又は配列番号８７に示す塩基配列を含有するポリヌクレオチドとストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる、配列番号３４に示す塩基配列と好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは約９９％の塩基配列同一性を有する塩基配列から成る核酸が挙げられる。
【００３０】
ここで、ストリンジェンシー条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーション条件のことで、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存して経験的に求められるものである。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性DNAの再アニールする能力に依存する。具体的には、例えば、低ストリンジェンシー条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、３７℃〜４２℃の温度条件下、５×SSC、０．１％SDS溶液中で洗浄することなどが挙げられる。また、高ストリンジェンシー条件としては、例えば、洗浄段階において、６５℃、０．１×SSC及び０．１％SDS中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェンシー条件をより高くすることにより、相同性又は同一性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。
【００３１】
本発明においては、前記フラボノイド3',5'-水酸化酵素（F3'5'H）は、好ましくは、カンパニュラ、サイネリア（シネラリア）、バーベナ、及びパンジー#40由来である。本発明においては、前記転写調節領域に加え、タバコのアルコールデヒドロゲナーゼ由来の翻訳エンハンサーをさらに用いることが好ましい。また、前記翻訳エンハンサーは、発現ベクターの遺伝子カセット内で、前記Ｆ3'5'Ｈ遺伝子の開始コドンに直結されていることが好ましい。
【００３２】
本発明の方法においては、前記花弁中のデルフィニジンの含有率は、好ましくは、アントシアニジンの合計量の２５質量％以上である。
【００３３】
本発明は、本発明の方法により生産（作出）されたか又は前記核酸が導入された、キク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織であり、好ましくは、花弁、切り花である。
本発明は、上記切り花を用いた加工品（切り花加工品）にも関する。ここで、切り花加工品としては、当該切り花を用いた押し花、プリザーブドフラワー、ドライフラワー、樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。
分子生物学的手法は特に断らない限り、Molecular Cloning（Sambrook and Russell, 2001）に依った。【００３５】
以下、参考例１〜９は、キク(chrysanthemum)のフラバノン３-水酸化酵素（F3H）をコードする遺伝子の5'領域（CmF3Hpro）以外のプロモーターを用いた例であり、一方、実施例１〜１０は、キク(chrysanthemum)のフラバノン３-水酸化酵素（F3H）をコードする遺伝子の5'領域（CmF3Hpro）に関する例である。【００３６】
参考例１：タバコEF1aプロモーターによるF3',5'H遺伝子の発現
特許文献６に記載されたpBIEF1αを、制限酵素HindIIIとBamHIで消化することにより、タバコEF1αのプロモーター配列を含む約1.2kbのDNA断片を得た。このDNA断片を、特許文献４に記載されたpSPB909のアイリスDFR cDNAの5'側に挿入することによりプラスミドpSFL339を得た。同様に、アイリスDFR cDNAの代わりにペチュニアDFR cDNA(国際公開公報WO 96/36716に記載)を挿入したプラスミドpSFL340も構築した。【００３７】
pSPB176（Plant Science 163, 253-263, 2002に記載）のBamHIとSalI部位に、特許文献４に記載されたpCGP1961からBamHIとXhoIの部分分解で切り出したパンジーF3'5'H 遺伝子BP40の断片を挿入したプラスミドをpSPB575とした。HindIIIとBamHIを用いて、このプラスミドのプロモーター部分を上述のタバコＥＦ１αのプロモーターに入れ替え、pSFL338とした。このAscI部位に、AscIで消化したpSFL339の内、アイリスDFRｃDNAを含む断片を挿入した。得られたプラスミドをpSFL346とした。このプラスミドpSFL346は、バンジーのF3'5'HとアイリスのDFR遺伝子をタバコEF1αのプロモーターの制御下で植物において発現させるようにデザインされている。【００３８】
ラベンダーのF3'5'HcDNAを含むプラスミドpLHF8は、国際公開公報WO 04/20637に記載されている。このプラスミドをBamHIとXhoIで消化して得られるDNA断片と、BamHIとSalIで消化して得られるpSPB176のDNA断片の内、分子量の大きなDNA断片とを連結することにより、プラスミドｐSPB2772を得た。このプラスミド上において、ラベンダー由来のF3'5'H cDNAはEl2エンハンサーの付加されたCaMV35Sプロモーターに連結されている。このプロモーター部分をHindIIIとBamHIを用いて、上述のタバコＥＦ１αのプロモーターに入れ替え、プラスミドpSPB2778を得た。このAscI部位に、AscIで消化したpSFL340のうちペチュニアDFRｃDNAを含む断片を挿入した。得られたプラスミドをpSPB2780とした。このプラスミドpSPB2780は、ラベンダーのF3'5'HとペチュニアのDFR遺伝子をタバコEF1αのプロモーターの制御下で植物において発現させるようにデザインされている。【００３９】
Plant Biotechnol 23, 5-11 (2006)に記載されたプラスミドpSPB748(チョウマメ由来のF3'5'HcDNAがEl2エンハンサーの付加されたCaMV35Sプロモーターに連結されている)のプロモーター部分をHindIIIとBamHIを用いて、上述のタバコEF1αのプロモーターに入れ替え、プラスミドpSPB2777を得た。このAscI部位に、AscIで消化したpSFL340のうちペチュニアDFR ｃDNAを含む断片を挿入した。得られたプラスミドをpSPB2779とした。このプラスミドpSPB2779は、チョウマメのF3'5'HとペチュニアのDFR遺伝子をタバコEF1αのプロモーターの制御下で植物において発現させるようにデザインされている。【００４０】
上記各プラスミドｐSFL346、pSPB2780、及びpSPB2779をアグロバクテリウムに導入し、この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765に導入した。形質転換キクの花弁のアントシアニジンを分析したがデルフィニジンは検出されなかった。【００４１】
参考例２：サイネリアF3',5'H遺伝子プロモーターを導入したキク
青いサイネリアセネッティー（サントリーフラワーズ社）の蕾の花弁から定法に基づいてRNAを抽出した。このRNAから調製したpoly-A + RNAを用いて、ZAP-cDNA（登録商標）Library Construction Kit（ストラタジーン社、製品番号200450)を用いて製造者の推奨する方法に従って、cDNAライブラリーを作製した。このcDNAライブラリーを、DIGシステム(Roche Applied Science社)で標識したチョウマメF3'5'H cDNA（Clitoria ternatea）(Plant Biotechnology 23, 5-11 (2006)参照)を用いて、同社が推奨する方法でスクリーニングを行った。得られた４８個のシグナルを示すファージを純化した。これらのファージから製造者（ストラタジーン社）の推奨する方法でin vivo excisionによりプラスミドを得た。【００４２】
これらのプラスミドに含まれるcDNA部分の塩基配列を決定し、DNAデータベースに対してBlast検索を行ったところ、多くのチトクロームP450に相同性を示す遺伝子を得ることができ、これらは８種類に分類することができた。それらの内CYP75Bに分類されると推定されたCi5a18の全塩基配列（配列番号７７参照）を決定した。この配列を含むpBluescriptSKII-のプラスミドをpSPB2774とした。【００４３】
同じサイネリアの葉から染色体DNAを抽出し、染色体ライブラリーをλBlueSTARTM Xho I Half-Site Arms Kit (Novagen, http://www.merckbiosciences.com/product/69242)を用いて作製した。得られた20万プラークを、DIGで標識したCi5a18 cDNA断片を用いてスクリーニングした。このcDNA断片は、プライマー（Ci5a18F1（配列番号８１）：5’-CATCTGTTTTCTGCCAAAGC-3’とCi5a18R1（配列番号８２）：5’-GGATTAGGAAACGACCAGG-3’）を用いてCi5a18を鋳型にして増幅した。得られた１７プラークから最終的に４つのプラークを得、これらをin vivo excisionによりプラスミドに変換した。これらのDNA塩基配列を決定したところ、これらは同じ配列を含んでいた。このうちgCi01-pBluestarとしたクローンを以後の実験に供した。gCi01-pBluestarクローン塩基配列を配列番号７９に示す。この配列は、サイネリアF3'5'Hのプロモーター活性を持つ配列を含む5'-非翻訳領域、翻訳領域、3'-非翻訳領域を含んでいることが期待された。【００４４】
gCi01-pBluestarからPvuIとEcoRVで切り出される約5.7ｋｂのDNA断片（配列番号８０）をDNA blunting kit (TAKARA)を用いて平滑末端化した。このDNA断片をpBinPLUSのSmaI部位にクローニングし、これをpSPB3130と命名した。このバイナリーベクターはT-DNA領域にカナマイシンによる選抜に使用できるnptII遺伝子を有していた。【００４５】
ｐSPB3130をアグロバクテリウム法によりキク品種94-765に導入した。形質転換キクの花弁のアントシアニジンを分析したが、デルフィニジンは検出されず、花の色も変化しなかった。【００４６】
参考例３：バラカルコン合成酵素遺伝子プロモーターを利用したデルフィニジンの生産
国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されているバラ由来のカルコン合成酵素プロモーターにパンジー由来のF3'5'HBP#18遺伝子を連結したバイナリーベクターを構築し、pBRBP18とした。参考例１及び２に記載したように、このバイナリーベクターが含む遺伝子をキク品種キク品種94-765に導入した。形質転換キクの花弁のアントシアニジンを分析したところ、全アントシアニジンに対し最高５．４％のデルフィニジンが検出されたが、花の色に変化は見られなかった。
また、バラカルコン合成酵素遺伝子プロモーターを用いたデルフィニジン生産の例として、表１中、上から９番目に記載するpSPB3325（バラCHSpro::パンジー#18+バラCHSp::キクF3'H IR）が挙げられ、この例では、デルフィニジン生産は最高3.6%であった。【００４７】
参考例４：パンジーF3'5'H遺伝子プロモーターを利用したデルフィニジンの生産
（１）シソアントシアニン3−アシル基転移酵素染色体遺伝子のクローニング
シソにはアントシアニンを葉に蓄積する赤い変種と蓄積しない緑色の変種が知られている。前者の葉から、その染色体DNAを、報告されている方法（Plant Mol Biol. December 1997; 35(6):915-27参照）で調製した。この染色体DNAをSau3AI（TOYOBO社製）で部分分解し、ショ糖密度勾配法により10〜15ｋｂのDNA断片を含む画分を回収した。この断片を、公知の方法を用いてラムダファージベクターの一種であるEMBL3（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＢａｍＨＩ部位に挿入することにより、染色体DNAライブラリーを作製した。得られたライブラリーをシソに由来するアントシアニン３−アシル基転移酵素のcDNAであるpSAT208（Plant Cell Physiol. April 2000; 41(4):495-502参照）をプローブとして用いてスクリーニングした。ライブラリーのスクリーニングは、既に報告されている方法（Plant Cell Physiol. July 1996; 37(5):711-6参照）に拠った。プローブとハイブリダイズしたプラークを純化後、培養し、得られたファージからDNAを調製した。【００４８】
（２）シソアントシアニン３−アシル基転移酵素染色体遺伝子の塩基配列決定
上記で得たDNA10μｇをXbaIで消化し、0.7%アガロースゲルで分離した後、ハイボンドN（アマシャム社製）にブロットした。この膜を上記と同じようにハイブリダイズしたところ、約６．８ｋｂのDNA断片がプローブとハイブリダイズすることがわかった。同じDNA20μｇをXbaIで消化し、0.7%アガロースゲルで分離した後、約６．８ｋｂのDNA断片を、ジーンクリーンを用いて精製し、XbaIで消化したpBluescriptSKII-と連結した。得られたプラスミドをpSPB513とした。このプラスミドに含まれるシソ由来のDNA配列をプライマーウォーキング法により決定した。その塩基配列を配列番号４に示す。この配列にはアントシアニン３−アシル基cDNAであるpSAT208と高い相同性を示す領域があり、この領域がコードする蛋白質のアミノ酸配列（配列番号６）はpSAT208のコードするアミノ酸配列と比べて１９個のアミノ酸残基の置換と２個のアミノ酸の欠失が見られ、イントロンは観察されなかった。また、上記pSAT208と高い相同性を示す領域の配列は、その開始コドンと考えられるATGの上流に３４３８ｂｐの配列と、その終止コドンと考えられるTAAの下流に２０５２ｂｐの配列を含んでいた。上記３４３８ｂｐの配列内には、アントシアニン３−アシル基転移酵素ではない別のオープンリーディングフレーム（ORF、配列番号５）が存在した。この部分を除く、シソアントシアニン３−アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域を増幅するために、以下の実験を行った。【００４９】
（３）シソアントシアニン３−アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域の増幅
1ngのpSPB513を鋳型として2種のプライマー（5’-AAGCTTAACTATTATGATCCCACAGAG-3’（配列番号７、下線部はHindIIIの認識配列）、5’-GGATCCGGCGGTGTTGAACGTAGC-3’（配列番号８、下線部はBamHIの認識配列）を用いて、PCR（95℃1分間保持後、52℃1分間、72℃2分間、95℃1分間からなる反応を25サイクル）を行なった。増幅された約1.1ｋｂのDNA断片をHindIIIとBamHIで消化した。【００５０】
特許文献４に記載されたプラスミドｐSPB567（El2エンハンサーが付加されたカリフラワーモザイク35Ｓプロモーターの3'側にパンジー由来のフラボノイド3',5'-水酸化酵素遺伝子が連結され、さらにその3'側にノパリンシンターゼのターミネーターが連結されている）をPacIで消化し、パンジー由来のフラボノイド3',5'-水酸化酵素遺伝子を含むDNA断片をｐBin＋のPacI部位にクローニングした。得られたプラスミドの内、El2エンハンサーが付加されたカリフラワーモザイク35ＳプロモーターがｐBin+のAscI部位近くに存在するところのプラスミドをpSPB575とした。このプラスミドをHindIIIとBamHIで消化し、これに、前記したシソアントシアニン３−アシル基転移酵素の転写調節領域を含む約1.1kbのDNA断片をHindIIIとBamHIで消化したDNA断片を、挿入した。得られたプラスミドをpSFL205とした。【００５１】
pSFL205をHindIIIとSacIで消化して、約100bpのDNA断片を回収した。このDNA断片と、pSPB513をSacIとXbaIで消化して得られる約4kbのDNA断片と、HindIIIとXbaIで消化したプラスミドpBin+(Transgenic Research 4, 288-290, 1995参照)とを連結して、プラスミドpSPB3311を得た。このプラスミドpSPB3311は、配列番号２に示す塩基配列を含むバイナリーベクターとなっていて、シソアントシアニン３−アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域と該遺伝子の翻訳領域とその3'側の非翻訳領域を含む。【００５２】
（４）pSPB3323の構築
パンジーのフラボノイド3',5'-水酸化酵素遺伝子BP#40（WO 04/020637参照）の転写調節領域をTaKaRa LA PCRTM in vitro Cloning Kitを用いて、以下のように増幅した。
パンジーの葉からDNA easy plant kit (QIAGEN社)を用いて染色体DNAを調製した。3μｇの染色体DNAを制限酵素HindIIIにより消化した。消化したDNAをHindIII末端DNA（TaKaRa LA PCRTM in vitro Cloning Kitに含まれる）と、Ligation High (TaKaRa)を用いて、16℃で40分間反応させ、連結した。反応液4μlを10μlの水で薄め、連結したDNAを94℃10分間の処理により変性させた後、氷中で冷却した。5pmolのプライマーC1 (5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA-3’、配列番号９、HindIIIカセット配列の一部の配列でKitに含まれる)と5pmolのプライマーBP40-i5 (5’-AGGTGCATGATCGGACCATACTTC-3’、配列番号１０、BP＃40の翻訳領域の相補鎖に相当する)を加え、キットのプロトコールに従い、25μlの反応液で、98℃20秒間、68℃で15分間の反応を30回繰り返した。反応液を水で10倍に希釈した。このうち、0.5μlを鋳型として、5pmolのプライマーC2（5’-CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’、配列番号１１、HindIIIカセット配列の一部の配列でKitに含まれる）と5pmolのプライマー BP40-i7 (5’-GACCATACTTCTTAGCGAGTTTGGC-3’、配列番号１２)を含む25μlの反応液で、98℃で5分間反応後、98℃で20秒間、68℃で15分間の反応を30回繰り返した。【００５３】
得られたDNA断片をプラスミドpCR2.1 （Invitrogen社）に導入した。挿入されたDNAの塩基配列を決定したところ、その配列はBP#40のcDNA塩基配列と一致しない箇所が見られた。これはPCRの際にエラーが起こったためと考えられる。エラーのない配列を増幅するために以下の操作を行なった。
約2kbのBP#40の5'-非翻訳領域と200bpの翻訳領域を増幅するために、200ngのパンジーの染色体DNAを鋳型として、50pmolのプライマー BP40-i7 (配列番号１２)と50pmolのプライマーBP40 pro-F (5’-ACTCAAACAAGCATCTCGCCATAGG-3’、配列番号１３、BP#40遺伝子の5'-非翻訳領域にある配列）を用いて25μlの反応液でPCRを行なった。98℃5分間処理した後、98℃20秒間と68℃15分間からなる反応を30回繰り返した。増幅されたDNA断片をpCR2.1に挿入した。このDNA断片には約2.1kbの5’-非翻訳領域と200bpの翻訳領域が含まれていた。このプラスミドをpSFL614とした。プラスミドpSFL614配列の塩基配列を配列番号１４に示す。【００５４】
ｐSFL614に含まれる約2.1kbの5'-非翻訳領域（BP40pro，配列番号１５）をBP#40遺伝子を転写させるために用いた。この際にBamHI部位をNheIに変更した。1ngのpSFL614プラスミドを鋳型とし、50pmolのプライマーBP40pro-HindIII-F (5’-AAG CTT GTG ATC GAC ATC TCT CTC C-3’、配列番号１６)と50pmolのプライマーBP40pro-NheI-R (5’-CGA GGC TAG CTA AAC ACT TAT-3’、配列番号１７)、Ex-TaqDNAポリメラーゼを加え、25μlの反応液で98℃5分間保持した後、98℃20秒間、68℃15分間の反応を25回繰り返した。増幅したDNA断片をpCR2.1にクローニングした。この配列にPCRによるエラーがないことを、塩基配列を確認することにより決定した。このプラスミドをHindIIIとNheIで消化し、470bpのDNA断片を得た。このDNA断片を断片Ａとした。【００５５】
1ngのpSFL614プラスミドを鋳型とし、50pmolのプライマーBP40pro-NheI-F (5’-TTT AGC TAG CCT CGA AGT TG-3’、配列番号１８)と50pmolのプライマーBP40pro-BamHI-R (5’-GGA TCC CTA TGT TGA GAA AAA GGG ACT-3’、配列番号１９)、Ex-TaqDNAポリメラーゼを加え、25μlの反応液で98℃5分間保持した後、98℃20秒間、68℃15分間の反応を25回繰り返した。増幅したDNA断片をpCR2.1にクローニングした。この配列にPCRによるエラーがないことを、塩基配列を確認することにより決定した。このプラスミドをHindIIIとNheIで消化し、630bpのDNA断片を得た。このDNA断片を断片Ｂとした。【００５６】
特許文献４に記載されたプラスミドpSPB567をBamHIとHindIIIで消化して生じるDNA断片のうち大きいほうの断片を回収し、上述の断片Ａと断片Ｂとを連結し、pSFL620とした。
ｐSFL620をPacIで消化後、約3.2kbのDNA断片を回収した。このDNA断片をpBin+のPacI部位に挿入した。得られたプラスミドをpSPB3317とした。上述のpSPB3311をAscIとXbaIで消化して得られる断片を、pSPB3317のAscIとXbaI部位に導入し、得られたプラスミドをpSPB3323とした。【００５７】
（５）シソアントシアニン３−アシル基転移酵素染色体遺伝子とパンジーF3'5'H遺伝子のキクでの発現
上記（４）で調製したpSPB3323をアグロバクテリウムに導入し、このアグロバクテリウムを用いてキク品種94-765（精興園、未発売）を公知の方法により形質転換した。６系統の形質転換系統を取得した。【００５８】
以下の方法で抽出したアントシアニジンの分析を行った。舌状花弁を凍結後に粉砕し、粉砕した花弁50〜100mgを500μLの１%塩酸メタノールで抽出し、この抽出液に500μLの4N塩酸（HCl）を加えて混合し、100℃で１時間、加水分解を行った。分解後の溶液を冷却後、1mlの0.05M トリフルオロ酢酸（TFA）を添加して混合した。次に、この溶液をSep-Pak C18（ミリポア）に添加して加水分解産物を吸着させた。Sep-Pak C18は予め80%アセトニトリル（MeCN）で洗浄後、0.05M TFAで平衡化した。Sep-Pak C18に吸着した加水分解産物を0.05M TFAで洗浄後、さらに20％MeCN, 0.05M TFAで洗浄した後に、80％MeCN, 0.05M TFAで加水分解産物を溶出し、分析サンプルとした。
分析サンプルは、高速液体クロマトグラフィーを用いて以下の条件で分析した。カラムはInertsil ODS-2（粒径5μm, 4.6×250mm, ジーエルサイエンス）を用い、流速0.8ml/minで、移動相は1.5%リン酸を含む、5%酢酸、6.25%アセトニトリルから20%酢酸、25%アセトニトリルの直線濃度勾配20分間の後、1.5%リン酸および20%酢酸を含む25%アセトニトリルで5分間のイソクラティック溶出を行った。検出はAgilent 1100 シリーズ ダイオードアレイ検出器（ジーエルサイエンス）を用い、250nmから600nmの波長領域を検出し、530nmの吸光度の面積により各アントシアニジンの存在比を求めた。
分析の結果、形質転換体である分析系統1300-3、1300-4、1300-5、及び1300-6において、それぞれ、デルフィニジンが全アントシアニジンの0.9%、0.8％、1.4%、及び0.6%検出された。これは、パンジーのBP＃４０転写調節領域がBP＃４０の転写を司ったことを示唆するが、花色の変化にはいたらなかった。【００５９】
参考例５：ハマナスDFRプロモーターを利用したキクにおけるデルフィニジンの生産
ハマナスの染色体DNAライブラリーを、λBlueSTARTM Xho I Half-Site Arms Kit (Novagen, http://www.merckbiosciences.com/product/69242)を用いて、以下のように作製した。ハマナスの若い葉から、Nucleon Phytopure [Registered] (TEPNEL Life Sciences)を用いて染色体DNAを調製した。約100μgの染色体DNAを制限酵素Sau3AIで部分消化した。
このDNA断片をdGTP とdATPの存在下においてDNA polymerase I Klenow fragment (TOYOBO)で部分的にフィルインをし、ショ糖密度勾配遠心により分画した。約13kbの大きさにDNAを回収し、エタノール沈殿により濃縮した。約180ngのDNAを1μL の λBlueSTARTM Xho I Half-Site Arms Kitと4℃で15時間連結した後、in vitro packaging反応を行ない、染色体ライブラリーを得た。【００６０】
このライブラリーを栽培バラのDFRｃDNA (Plant and Cell Physiology, 36, 1023-1031, 1995)を用いてスクリーニングし、シグナルを示すプラークを得た。このプラークから、製造者(Novagen)が推奨する方法を用いてin vivoの切り出しを行い、プラスミドpSFK710を得た。このプラスミドには前述の栽培バラのDFRｃDNAとよく一致するDNA配列が含まれていた。【００６１】
このプラスミドからDFR翻訳配列の5'-非翻訳領域を得、異種の遺伝子と連結が容易にできるように、PCRを行うことにより、１つのEcoRI認識配列をNheI認識配列に変異させ、HindIIIとBamHI認識配列を付加した。まず、pSFL710を鋳型に、各25pmolのプライマーDFRproHindIIIF (5’-TAATAAGCTTACAGTGTAATTATC-3’、配列番号２０)とDFRproNheIR (5’-TTATGCTAGCGTGTCAAGACCAC-3’、配列番号２１)と酵素ExTaq DNA Polymerase (TOYOBO) を用いて50μLの反応液でPCRを行なった。PCRの反応条件は、94℃5分反応後、94℃30秒間、50℃30秒間、72℃30秒間を１サイクルとする反応を30回繰り返し、さらに72℃で7分間保持した。これにより、約350bpのDNA断片Ａを得た。同様に、pSFL710を鋳型に、各25pmolのプライマーDFRproNheIF (5’-ACACGCTAGCATAAGTCTGTTG-3’、配列番号２２)とDFRproBamHI-R (5’-GCTTGGGGATCCATCTTAGG-3’、配列番号２３）、酵素ExTaq DNA Polymerase (TOYOBO) を用いて50μLの反応液でPCRを行なった。PCRの反応条件は、94℃5分間反応後、94℃30秒間、50℃30秒間、72℃30秒間を１サイクルとする反応を30回繰り返し、さらに72℃で7分間保持した。これにより600bpのDNA断片Ｂを得た。【００６２】
特許文献４に記載されたpSPB567（El2エンハンサーが付加されたCaMV35Sプロモーター、パンジーのF3'5'HBO#40、ノパリンシンターゼターミネーターを含むプラスミドpUC）をBamHIで消化し、HindIIIで部分消化することにより、El2エンハンサーが付加されたCaMV35Sプロモーターを除いた断片と、断片ＡをHindIIIとNheIで消化した断片と、断片ＢをNheIとBamHIで消化した断片とを連結し、プラスミドpSFL721 (R. rugosa DFR 5':BPF3'5'H#40: nos 3'の発現カセットを含む)を得た。このプラスミドをPacIで消化して得られる発現カセットを、pBinPLUSのPacI部位に導入することにより、pSFL724とした。このプラスミドをAgrobacterium tumefaciens EHA105株に導入した。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、品種94-765から組換えキクを得た。花弁でアントシアニジン全量のうち0.6%程度のデルフィジンを生産している系統があった。
また、ハマナスDFRプロモーターを用いた他の参考例は、表１中、上から２番目（pSPB3316（ハマナスDFRpro::パンジー#40+バラANSpro::トレニア5GT、デルフィニジン生産系統無し）と５番目（pSPB3325（ハマナスDFRpro::パンジー#40+リンドウ3'GTpro::トレニアMT、デルフィニジン最高0.9%）がある。いずれも花色の変化には至らなかった。【００６３】
参考例６：ハマナスF3Hプロモーターを利用したキクにおけるデルフィニジンの生産
参考例５で作製したハマナス染色体DNAライブラリーをトレニアのフラバノン3-水酸化酵素(F3H) cDNA (NCBI No. AB211958)によりスクリーニングし、シグナルを示すプラークを得た。そのうち1プラークについて参考例５と同様にプラスミドに変換した。これを制限酵素SpeIで消化し、2.6kbのDNA断片を回収し、pBluescript SKII- (STRATAGENE)のSpeI部位にサブクローングすることにより、プラスミドpSPB804を得た。このプラスミドはF3Hに相同性を示す塩基配列を有していた。【００６４】
F3Hの5'-非翻訳領域を増幅するために、1ngのpSPB804を鋳型に、プライマーRrF3H-F (5’-AAGCTTCTAGTTAGACAAAAAGCTA-3’、配列番号２４)、プライマーRrF3H (5’-GGATCCTCTCTTGATATTTCCGTTC-3’、配列番号２５)、及びEx-Taq DNA Polymerase (TOYOBA)を用いて50μLの反応液でPCRを行なった。PCRの反応条件は、94℃5分間反応後、94℃30秒間、50℃30秒間、72℃30秒間を１サイクルとする反応を30回繰り返し、さらに72℃で7分間保持した。得られたDNA断片をpCR-TOPO (INVITROGEN)に挿入し、プラスミドpSPB811を得た。このプラスミドからは、HindIIIとBamHIを用いて約1.2kbのF3Hの5'-非翻訳領域を回収できる。参考例５で述べたように、ｐSPB567のプロモーター部分をHindIIIとBamHIを用いて約1.2kbのF3Hの5'-非翻訳領域に置き換えて、プラスミドpSFL814 (R. rugosa F3H 5': BPF3'5'H#40: nos 3'を含む)を得た。このプラスミドをAgrobacterium tumefaciens EHA105株に導入した。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、品種94-765から組換えキクを３系統得たが、花弁でデルフィニジン生産が見られた系統はなかった（表１参照）。【００６５】
参考例７：pBINPLUS ハマナスF3Hpro::ADHNF-パンジーF3'5'H#40:: NOSterの作製
pSFL814（参考例６）を鋳型に、ADH-BP40-Fd（5'-CAAGAAAAATAAATGGCAATTCTAGTCACCGAC-3'、配列番号２６）とNcoI-BP40-Rv（5'-CTCGAGCGTACGTGAGCATC-3'、配列番号２７）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片、及びpBI221 ADH-221を鋳型にBamHI-ADH-Fd（5'-CGCGGATCCGTCTATTTAACTCAGTATTC-3'、配列番号２８）とBP40-ADH-Rv（5'-TAGAATTGCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3'、配列番号２９）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片を混合して鋳型に用い、BamHI-ADH-Fd（5'-CGCGGATCCGTCTATTTAACTCAGTATTC-3'、配列番号３０）とNcoI-BP40-Rv（5'-CTCGAGCGTACGTGAGCATC-3'、配列番号３１）をプライマーに用いて、PCRにより、タバコADH-5'UTR 94bpがパンジーF3'5'H#40の開始コドンに直結したDNA断片を得た。【００６６】
このDNA断片をpCR2.1にTAクローニングした後に、BamHI及びNcoIで消化して得られる約600bpのDNA断片と、pSFL814をBamHI及びNcoIで消化して得られるバイナリーベクター断片とを連結させることにより、pBinPLUS ハマナスF3Hpro::ADHNF-パンジーF3'5'H#40:: NOSterを得た。このプラスミドをAgrobacterium tumefaciens EHA105株に導入した。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の得られた形質転換体４系統のうちでデルフィニジンが検出された個体はなかった（表１参照）。【００６７】
参考例８：pBIN19バラCHSpro::ADH-パンジーF3'5'H#18::NOSterの作製
pBI221 ADH221を鋳型に、ADH KpnI Forward (5'-CGGTACCGTCTATTTAACTCAGTATTC-3'、配列番号３２)とGUS19R（5'-TTTCTACAGGACGTAACATAAGGGA-3'、配列番号３３）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片を、KpnIとSmaIで消化して約110bpのタバコADH-5'UTR DNA断片を得た。このDNA断片と、pBRBP18（pBIN19上にバラCHSpro::パンジーF3'5'H#18::NOSterの発現カセットを入れたもの）をKpnIとSmaIで消化して得られるバイナリーベクターのDNA断片を連結して、pBIN19バラCHSpro::ADH-パンジーF3',5'H#18::NOSterを得た。このプラスミドでは、タバコADH-5'UTRとパンジーF3'5'H#18の間に38bのスペーサーが存在する。このプラスミドをAgrobacterium tumefaciens EHA105株に導入した。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の組換えキク30系統を得た。このうち5系統の花弁でデルフィニジンが検出され、デルフィニジン含有率は1.9%に達した。しかし、花色の変化は見られなかった。【００６８】
参考例９：pBI121-バラCHSpro::ADHNF-パンジーF3'5'H#40::NOSterの作製
pBRBP18（参考例３）を鋳型に、HAPS-RhCHSpro3k-Fd（5'-CCAAGCTTGGCGCGCCTTAATTAAATTTAAATCAGCAAGAGTTGAAGAAATAG-3'、配列番号８５）とNS-RhCHSpro3k-Rv（5'-AAAGCTAGCACTAGTCATCTCGGAGAAGGGTCG-3'、配列番号８６）をプライマーとして用い、Pyrobest Polymerase（Takara）を用いたPCRにより得られたDNA断片を、HindIIIとNheIで消化し、pBI121 ADHNFをHindIIIとXbaIで消化して得られるバイナリーベクターの断片と連結することにより得られたバイナリーベクターをpBI121-RhCHSp-GUS-NOStとした。
pBI121-RhCHSp-GUS-NOStをSpeIおよびEcoICRIで消化して得られるバイナリーベクターの断片に、実施例１０で得られたpCR-ADHBP40-SpeSacをSpeI及びEcoICRIで消化して得られるADHNF-パンジーF3'5'H #40 DNA断片を、連結して、pBI121-バラCHSpro::ADHNF-パンジーF3'5'H#40::NOSterを得て、Agrobacterium tumefaciens EHA105株に形質転換した。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の組換えキク19系統を得たが、デルフィニジンが検出された個体はなかった。【００６９】
実施例１：キクのフラバノン3-水酸化酵素遺伝子のプロモーター領域のクローン化
キクのフラバノン３-水酸化酵素遺伝子（F3H）cDNA断片を用いたゲノミックライブラリのスクリーニングにより得られた、F3Hのプロモーター領域を含むDNA断片をサブクローニングして得られたpBluescript SK- gF3H9（菅野ら(2001)園学雑70（別2）193、配列番号３５）を鋳型に、HANS-F3Hpro1k-Fd （5'-CCAAGCTTGGCGCGCCGCGGCCGCATTTAAATTTACAAAACCATGTGCAAGAATG-3'、配列番号３６、下線部はF3Hのプロモーター領域を含むDNAとアニールする配列）と、SNM-F3Hpro-Rv（5'-ACTAGTGCTAGCACGCGTTTTTTATTTTTTCTTCACACACTTG-3'、配列番号３７、下線部はF3Hのプロモーター領域を含むDNAとアニールする配列）をプライマーに用いてPCRにより増幅したDNA断片をpCR2.1（Invitrogen）にクローニングして、pCR HANS-CmF3Hp1k-NSを得た。また、HANS-F3Hpro1k-Fdと、NSM-F3Hpro-Rv（5'-GCTAGCACTAGTACGCGTTTTTTATTTTTTCTTCACACACTTG-3'、配列番号３８、下線部はF3Hのプロモーター領域を含むDNAとアニールする配列）をプライマーに用いてPCRにより増幅したDNA断片をpCR2.1にクローニングして、pCR HANS-CmF3Hp1k-SNを得た。HANS-F3Hpro1k-FdとBclI-CmF3Hp-Rv（5'-TTTTGATCATTTTTTATTTTTTCTTCACACAGTG-3'、配列番号３９、下線部はF3Hのプロモーター領域を含むDNAとアニールする配列）をプライマーに用いてPCRにより増幅したDNA断片をpCR2.1にクローニングしてpCR HANS-CmF3Hp1k-BclIを得た。さらに、pBI121 ADHNF（Satoh J. et al., (2004) J Biosci Bioengineer）をHindIII及びXbaIで消化して得られるバイナリーベクター断片とpCR HANS-CmF3Hp1k-SNをHindIII及びNheIで消化して得られる約1.1kbのキクF3HプロモーターDNA断片を連結することにより、pBI121 HANS-CmF3Hp1k-Sを得た。【００７０】
別の長さのプロモーター領域を次のように増幅した。
pBluescript SK- gF3H9を鋳型に、HANS-F3Hpro500-Fd（5'-CCAAGCTTGGCGCGCCGCGGCCGCATTTAAATTACTGTTCGAACCTACAAAGG-3'、配列番号８３、下線部はF3Hのプロモーター領域を含むDNAとアニールする配列）と、MX-F3Hpro-Rv（5'-TTTCTAGAACGCGTTTTTTATTTTTTCTTCACACACTTG-3'、配列番号８４、下線部はF3Hのプロモーター領域を含むDNAとアニールする配列）をプライマーとして用いてPCRにより増幅したDNA断片をpCR2.1にクローニングして、pCR HANS-CmF3Hpro500-Xを得た。また、pBI121 ADHNFをHindIIIとXbaIで消化して得られるバイナリーベクターの断片と、pCR HANS-CmF3Hpro500-XをHindIII及びXbaIで消化して得られる約500bpのキクF3HプロモーターDNA断片を連結することにより、pBI121 HANS-CmF3Hp500-Xを得た。【００７１】
実施例２：pBI121 キクF3Hpro1k::ADHNF-カンパニュラF3'5'H::NOSterの作製
DNAデータベースGenBankに登録されているカンパニュラ（Campanula medium）のF3'5'HcDNA（アクセション番号D14590）の翻訳配列に基づいて2種のプライマーCamF1 (5’-GTGAAGCCACCATGTCTATAG-3’、配列番号４９)とCamR1 (5’-GCATTTGCCTAGACAGTGTAAG-3'、配列番号５０)を合成した。市販のカンパニュラの蕾の花弁からRNeasy Mini Plant Kit (QIAGEN社)を用いてRNAを抽出し、RT-PCRキットを用いて1st strand DNAを合成した。この1st strand DNAを鋳型に、プライマーを用いてPCRを実施した。得られたDNA断片をｐCR-TOPO IIにクローニングした。この内、クローン＃４（pSPB2561とした）の塩基配列を配列番号５１と決定した。【００７２】
以下の様にタバコADH-5'UTR 94bpとF3'5'H遺伝子を連結したベクターを構築した（図4）。なお、後述の実施例についても同様に行った。
pSPB2561を鋳型に、ADH-Campa-Fd（5'-CAAGAAAAATAAATGTCTATAGACATAACCATTC-3'、配列番号５３）とHpaI-Campa-Rv（5'-GTTAACATCTCTGGCACCACC-3'、配列番号５４）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片、並びにpBI221 ADH-221を鋳型に、XbaI-ADH-Fd（配列番号４２)とCampa-ADH-Rv（5'-GTCTATAGACATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3'、配列番号５５）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd（配列番号４２)とHpaI-Campa-Rv（5'-GTTAACATCTCTGGCACCACC-3'、配列番号５６）をプライマーに用いてPCRにより、タバコADH-5'UTR 94bpがカンパニュラF3'5'Hの開始コドンに直結したDNA断片を得た。このDNA断片をpCR2.1にTAクローニングした後にXbaIとHpaIで消化して得られる約650bの断片と、pSPB2561をXbaIとHpaIで消化して得られるベクター断片とを連結してpCR ADHNF-Campanula F3'5'Hを得た。【００７３】
次に、pCR ADHNF-Campanula F3'5'HをKpnIで消化した後に、Blunting High (TOYOBO)で平滑末端化し、さらに、XbaIで消化して得られた約1.7kbのDNA断片と、pBI121 HANS-CmF3Hp1k-SをSpeI及びEcoICRIで消化して得られるバイナリーベクター断片とを連結することにより、pBI121キクF3Hpro1k::ADHNF-カンパニュラF3'5'H::NOSterを得た。このプラスミドをAgrobacterium tumefaciens EHA105株に導入した。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の組換えキク48系統を得た。このうち30系統の花弁でデルフィニジンが検出され、デルフィニジン含有率は80.5％に達した。
pBI121キクF3Hpro1k::ADHNF-カンパニュラF3'5'H::NOSterからpＳＰＢ3738を構築した。このプラスミドをAgrobacterium tumefaciens AGL0株に導入し、これを用いてキク品種Sei Taitan（精興園）を形質転換した。得られた26系統の組換えキクのうち６系統で花色の変化が見られ、薄層クロマトグラフィーにより、デルフィニジンを検出できた。【００７４】
実施例３：pIG121-Hm-キクF3Hpro1k::ADHNF-トルコギキョウF3'5'H:: NOSterの作製
pBluescript SK-にクローニングしたトルコギキョウF3'5'H遺伝子（EgF3'5'H, GenBank AB078957）を、XhoIで消化した後に、Blunting High (TOYOBO)で平滑末端化し、さらに、XbaIで消化して得られた約1.9kbのEgF3'5'H DNA断片を、XbaI及びEcoICRIで消化して得られるpIG121-Hmバイナリーベクターの断片に連結することにより、pIG121-Hm 35S::EgF3'5'Hを得た。
次に、pBluescript SK- EgF3'5'Hを鋳型に、ADH-EgF3'5'H-Fd（5'-CAAGAAAAATAAATGGCTGTTGGAAATGGCGTT-3'、配列番号４０）とHpaI-EgF3'5'H-Rv（5'-GTTAACGCTGAGCCTAGTGCC-3'、配列番号４１）をプライマーに用いてPCRにより増幅したDNA断片、並びにpBI221 ADH-221（Satoh J. et al., (2004) J Biosci Bioengineer）を鋳型に、XbaI-ADH-Fd（5'-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3'、配列番号４２)及びEgF3'5'H-ADH-Rv（5'-TCCAACAGCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3'、配列番号４３）をプライマーに用いてPCRにより増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd（配列番号４２)及びHpaI-EgF3'5'H-Rv（5'-GTTAACGCTGAGCCTAGTGCC-3'、配列番号４４）をプライマーに用いてPCRにより、タバコADH-5'UTR 94bp（Satoh J. et al., (2004) J Biosci Bioengineer）がEgF3'5'Hの開始コドンに直結したDNA断片を得た。このDNA断片をpCR2.1にTAクローニングした後に、XbaI及びHpaIで消化して得られる約1.3kbのDNA断片と、pIG121-Hm 35S::EgF3'5'HをXbaI及びHpaIで消化して得られるバイナリーベクターの断片を連結することにより、pIG121-Hm 35S::ADHNF-EgF3'5'Hを得た。このpIG121-Hm 35S::ADHNF-EgF3'5'HをHindIII及びXbaIで消化して得られる約1.2kbのEgF3'5'HのDNA断片と約15kbのバイナリーベクターのDNA断片、さたにpCR HANS-CmF3Hp1k-MNSをHindIII及びSpeIで消化して得られるDNA断片を連結し、pIG121-Hm キクF3Hpro1k::ADHNF-トルコギキョウF3'5'H::NOSterを得た。このプラスミドをAgrobacterium tumefaciens EHA105株に導入した。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の組換えキク５系統を得た。このうち１系統の花弁でデルフィニジンが検出され、デルフィニジン含有率は4.4%であった。【００７５】
実施例4：pBI121 キクF3Hpro1k::ADHNF-ロベリアF3'5'H::NOSterの作製
pBluescript SK-にクローニングしたロベリアの花弁由来のF3'5'H遺伝子（LeF3'5'H1, GenBank AB221077及びLeF3'5'H4, GenBank AB221078）をKpnIで消化した後に、Blunting High (TOYOBO)で平滑末端化し、さらに、XbaIで消化して得られた約1.9kbのEgF3'5'H DNA断片を、XbaI及びEcoICRIで消化して得られるpIG121-Hmバイナリーベクターの断片に連結することにより、pIG121-Hm 35S::LeF3'5'H1及びpIG121-Hm 35S::LeF3'5'H4を得た。【００７６】
次に、pBluescript SK- LeF3'5'H1又はpBluescript SK- LeF3'5'H 4を鋳型に、ADH-LeF3'5'H-Fd（5'-CAAGAAAAATAAATGGACGCGACAWACATTGC-3'、配列番号４５）及びHpaI-LeF3'5'H-Rv（5'- GTTAACATCTCGGGCAGCACC-3'、配列番号４６）をプライマーに用いてPCRにより増幅したDNA断片、並びにpBI221 ADH-221を鋳型に、XbaI-ADH-Fd（配列番号４２)とLeF3'5'H-ADH-Rv（5'-TGTCGCGTCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3'、配列番号４７）をプライマーにより増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd（配列番号４２)及びHpaI-LeF3'5'H-Rv（5'-GTTAACATCTCGGGCAGCACC-3'、配列番号４８）をプライマーに用いてPCRにより、タバコADH-5'UTR 94bpがLeF3'5'H1又はLeF3'5'H4の開始コドンに直結したDNA断片をそれぞれ得た。【００７７】
これらのDNA断片をそれぞれpCR2.1にTAクローニングした後に、XbaI及びHpaIで消化して得られる約800bのDNA断片と、pIG121-Hm 35S::LeF3'5'H1又はpIG121-Hm 35S::LeF3'5'H4をXbaI及びHpaIで消化して得られるバイナリーベクターの断片とを、それぞれ連結することにより、pIG121-Hm 35S::ADHNF-LeF3'5'H1及びpIG121-Hm 35S::ADHNF-LeF3'5'H4を得た。これらのバイナリーベクターをXbaI及びEcoRVで消化して得られる約2.6kbのADHNF-LeF3'5'H1::NOSter DNA断片と、pBI121 HANS-CmF3Hp1k-SをSpeI及びEcoICRIで消化して得られるバイナリーベクター断片を連結することにより、pBI121キクF3Hpro1k pro::ADHNF-ロベリアF3'5'H1::NOSter及びpBI121キクF3Hpro1k pro::ADHNF-ロベリアF3'5'H4::NOSterを得た。
pBI121-キクF3Hpro1k::ADHNF-ロベリアF3'5'H1::NOSterを形質転換したアグロバクテリウムを用いて、キク品種'94-765'由来の組換えキク12系統を得たが、デルフィニジンを含有する個体は得られなかった。また、pBI121-キクF3Hpro1k::ADHNF-ロベリアF3'5'H４::NOSterを形質転換したアグロバクテリウムを用いて、キク品種'94-765'由来の組換えキク34系統を得たが、デルフィニジンを含有する個体は得られなかった。【００７８】
実施例５：pBINPLUSキクF3Hpro1k::ADHNF-パンジーF3'5'H#40::NOSterの作製
pCR HANS-CmF3Hp1k-BclIをAscI及びBclIで消化することにより得られる約1.1kbのキクF3HプロモーターDNA断片と、pBinPLUS ハマナスF3Hpro::ADHNF-パンジーF3'5'H#40::NOSTerをAscIとBamHIで消化することにより得られるバイナリーベクターの断片を連結することにより、pBinPLUSキクF3Hpro1k::ADHNF-パンジーF3'5'H#40::NOSterを得た。このプラスミドをAgrobacterium tumefaciens EHA105株に導入した。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の組換えキク６系統を得た。このうち４系統の花弁でデルフィニジンが検出され、デルフィニジン含有率は26.8%に達した。【００７９】
実施例６：pBI121 キクF3Hpro1k::ADHNF-シネラリアF3'5'H::NOSterの作製とキクへの導入
参考例２で得たシネラリアF3'5'H（pSPB2774）を鋳型に、ADH-ScF3'5'H-Fd（5'-CAAGAAAAATAAATGAGCATTCTAACCCTAATC-3'、配列番号５７）とNdeI-ScF3'5'H-Rv（5'-CATATGTTTAGCTCCAGAATTTGG-3'、配列番号５８）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片、並びにpBI221 ADH-221を鋳型にXbaI-ADH-Fd（配列番号４２)とScF3'5'H-ADH-Rv（5'-TAGAATGCTCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3'、配列番号５９）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd（配列番号４２)とNdeI-ScF3'5'H-Rv（5'-CATATGTTTAGCTCCAGAATTTGG-3'、配列番号６０）をプライマーに用いてPCRにより、タバコADH-5'UTR 94bpがシネラリアF3'5'Hの開始コドンに直結したDNA断片を得た。このDNA断片をpCR2.1にTAクローニングした後に、XbaIとNdeIで消化して得られたDNA断片と、pSPB2774をXbaIとNdeIで消化して得られたベクター断片とを連結してpBluescript Sk- ADHNF-シネラリアF3'5'Hを得た。【００８０】
次に、pBluescript Sk- ADHNF-シネラリアF3'5'HをXbaIとXhoIで消化して得られる約1.7kbのDNA断片とpCR2.1をXbaIとXhoIで消化して得られるベクター断片とを連結して、pCR2.1 ADHNF-シネラリアF3'5'Hを得た。このpCR2.1 ADHNF-シネラリアF3'5'HをXbaIとEcoRVで消化して得られるDNA断片と、pBI121 HANS-CmF3Hp1k-SをSpeI及びEcoICRIで消化して得られるバイナリーベクター断片とを連結することにより、pBI121キクF3Hpro1k::ADHNF-シネラリアF3'5'H::NOSterを得た。このプラスミドをAgrobacterium tumefaciens EHA105株に導入した。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の組換えキ50系統を得た。このうち37系統の花弁でデルフィニジンが検出され、デルフィニジン含有率は36.2%に達した。【００８１】
実施例７：pBI121 キクF3Hpro1k::ADHNF-リンドウF3'5'H::NOSterの作製
pBluescript SK-にクローニングされたリンドウF3'5'H（プラスミドpG48、WO2004/020637に記載）を鋳型にADH-Gentian-Fd（5'-CAAGAAAAATAAATGTCACCCATTTACACCACCC-3'、配列番号６１）とSalI-GentianF3'5'H-Rv（5'-GTCGACGCTATTGCTAAGCC-3'、配列番号６２）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片、並びにpBI221 ADH-221を鋳型にXbaI-ADH-Fd（配列番号４２)とGentian-ADH-Rv（5'-AATGGGTGACATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3'、配列番号６３)をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd（配列番号４２)とSalI-GentianF3'5'H-Rv（5'-GTCGACGCTATTGCTAAGCC-3'、配列番号６４）をプライマーに用いたPCRにより、タバコADH-5'UTR 94bpがリンドウF3'5'Hの開始コドンに直結したDNA断片を得た。このDNA断片をpCR2.1にTAクローニングした後に、XbaIとSalIで消化して得られる約400bのDNA断片と、pG48をXbaIとSalIで消化して得られるベクター断片とを連結してpBluescript SK- ADHNF-リンドウF3'5'Hを得た。【００８２】
次に、pBluescript SK- ADHNF-リンドウF3'5'HをXbaIとXhoIで消化して得られる1.8kbのDNA断片と、pCR2.1をXbaIとXhoIで消化して得られるベクター断片とを連結して、pCR2.1 ADHNF-リンドウF3'5'Hを得た。このpCR2.1 ADHNF-リンドウF3'5'HをXbaIとEcoRVで消化して得られるDNA断片と、pBI121 HANS-CmF3Hp1k-SをSpeIとEcoICRIで消化して得られるバイナリーベクター断片とを連結することにより、pBI121キクF3Hpro1k::ADHNF-リンドウF3'5'H::NOSterを得た。このプラスミドをAgrobacterium tumefaciens EHA105株に導入した。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の組換えキク21系統を得たが、デルフィニジンを含有する個体は得られなかった。【００８３】
実施例８：pBI121 キクF3Hpro1k::ADHNF-バーベナF3'5'H::NOSterの作製
pBluescript SK-にクローニングされたバーベナF3'5'H（pHVF7、Plant Biotechonology 23, 5-11, 2006, DNAデータベースアクセッション番号ABA234898）を鋳型に、ADH-Verbena-Fd（5'-CAAGAAAAATAAATGACGTTTTCAGAGCTTATAAAC-3'、配列番号６５）とNcoI-VerbenaF3'5'H-Rv（5'-CCATGGAGTAAATCAGCATCTC-3'、配列番号６６）をプライマーとして用いてPCRで増幅したDNA断片、並びにpBI221 ADH-221を鋳型にXbaI-ADH-Fd（配列番号４２)とVerbena-ADH-Rv（5'-TGAAAACGTCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3'、配列番号６７）をプライマーとして用いてPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd（配列番号４２)とNcoI-VerbenaF3'5'H-Rv（5'-CCATGGAGTAAATCAGCATCTC-3'、配列番号６８）をプライマーとして用いたPCRにより、タバコADH-5'UTR 94bpがバーベナF3'5'Hの開始コドンに直結したDNA断片を得た。このDNA断片をpCR2.1にTAクローニングした後に、XbaIとNcoIで消化して得られる約700bのDNA断片と、pHVF7をXbaIとNcoIで消化して得られるベクター断片を連結してpBluescript SK- ADHNF-バーベナF3'5'Hを得た。【００８４】
次に、pBluescript SK- ADHNF-バーベナF3'5'HをXbaIとXhoIで消化して得られる1.8kbのDNA断片と、pCR2.1をXbaIとXhoIで消化して得られるベクター断片を連結して、pCR2.1 ADHNF-バーベナF3'5'Hを得た。このpCR2.1 ADHNF-バーベナF3'5'HをXbaIとEcoRVで消化して得られるDNA断片と、pBI121 HANS-CmF3Hp1k-SをSpeIとEcoICRIで消化して得られるバイナリーベクター断片とを連結することにより、pBI121キクF3Hpro1k::ADHNF-バーベナF3'5'H::NOSterを得た。このプラスミドをAgrobacterium tumefaciens EHA105株に導入した。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の組換えキク17系統を得た。このうち11系統の花弁でデルフィニジンが検出され、デルフィニジン含有率は最高28.4%であった。【００８５】
実施例９：pBI121 キクF3Hpro1k::ADHNF-青キンギョソウF3'5'H::NOSterの作製
Uni-ZAP XR Vector kit (STRATAGENE社)を用いて製造者の推奨する方法により、キンギョソウの一種である（Antirrhinum kelloggii、青キンギョソウ）の蕾から得たmＲＮＡを用いて、cDNAライブラリーを作製した。このライブラリーを参考例２に記載した方法でスクリーニングし、2種類のF3'5'HcDNA＃１（配列番号６９）とF3'5'HcDNA＃１２（配列番号７１）をそれぞれ含むプラスミドpSPB3145とpSPB3146を得た。【００８６】
pSPB3145又はpSPB3146を鋳型に、ADH-AkF3'5'H-Fd（5'-CAAGAAAAATAAATGCAGATAATAATTCCGGTCC-3'、配列番号７３）とNsiI-AkF3'5'H-Rv（5'-ATGCATGTCCTCTAACATGTATC-3'、配列番号７４）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片、並びにpBI221 ADH-221を鋳型にXbaI-ADH-Fd（配列番号４２)とAkF3'5'H-ADH-Rv（5'-TATTATCTGCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3'、配列番号７５）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd（配列番号４２）とNsiI-AkF3'5'H-Rv（5'-ATGCATGTCCTCTAACATGTATC-3'、配列番号７６）をプライマーに用いたPCRにより、タバコADH-5'UTR 94bpが青キンギョソウ（Ak）F3'5'H#1又は#12の開始コドンに直結したDNA断片をそれぞれ得た。このDNA断片をpCR2.1にTAクローニングした後に、XbaIとNsiIで消化して得られる約700bのDNA断片と、pSPB3145（pBluescript SK- AkF3'5'H#1）とpSPB3146（pBluescript SK- AkF3'5'H#12）をXbaIとNsiIで消化して得られるベクター断片とをそれぞれ連結してpBluescript SK- ADHNF- AkF3'5'H#1及び#12を得た。【００８７】
次に、pBluescript SK- ADHNF-AkF3'5'H#1及び#12をXbaIとXhoIで消化して得られる約700bのDNA断片と、pCR2.1をXbaI及びXhoIで消化して得られるベクター断片とを連結してpCR2.1 ADHNF-AkF3'5'H#1及び#12を得た。このpCR2.1 ADHNF-Ak F3'5'H#1及び#12をXbaI及びEcoRVで消化して得られるDNA断片それぞれと、pBI121 HANS-CmF3Hp1k-SをSpeI及びEcoICRIで消化して得られるバイナリーベクター断片とを連結することにより、pBI121キクF3Hpro1k::ADHNF-AkF3'5'H#1::NOSter及びpBI121キクF3Hpro1k::ADHNF-AkF3'5'H#12::NOSterを得た。これらのプラスミドをAgrobacterium tumefaciens EHA105株に導入した。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の組換えキク1系統を得た。この系統の花弁でデルフィニジンが検出され、デルフィニジン含有率は2.9%に達した。【００８８】
実施例１０：pBI121-キクF3Hpro500::ADHNF-シネラリアF3'5'H::NOSterの作製
実施例１で得られたpBI121 HANS-CmF3Hp500-XをXbaIとEcoICRIで消化し得られるバイナリーベクターのDNA断片と、実施例６で得られたpCR2.1 ADHNF-シネラリアF3'5'HをXbaIとEcoRVで消化して得られる、ADHNF-シネラリアF3'5'HのDNA断とを連結してpBI121-キクF3Hpro500::ADHNF-シネラリアF3'5'H::NOSterを得て、Agrobacterium tumefaciens EHA105株に形質転換した。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種大平由来の組換えキク7系統を得た。このうち5系統でデルフィニジンが検出され、デルフィニジン含有率は25.5%に達した。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明に従って、キク由来フラバノン3-水酸化酵素(F3H)の転写調節領域を用いて、フラボノイド3',5'-水酸化酵素（Ｆ3'5'Ｈ）をキクにおいて発現させて、花弁にデルフィニジンを多く蓄積させ、キクの花の色を青色に向かって変化させることができる。キクには、白・黄・橙・赤・桃・紫赤といった花色が存在するが、既存品種や近縁の野生種には、紫や青といった青色系の花色がないので、本発明に係る方法により生産された青色系のキクは、新たな需要を喚起することにつながる。【００９０】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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