(57)【要約】  次の方法により、大量の胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞を簡便に分化誘導することができる。細胞付着性領域の周囲に細胞非付着性領域を有する基材表面を利用し、（１）当該細胞を分化誘導化培地下で基材表面の細胞付着性領域に付着させ、（２）その後、当該細胞を細胞付着性表面上でコンフルエントになるまで増殖させ、（３）培養をさらに継続し、当該細胞を細胞付着性領域周囲の細胞非付着性領域との境界部から3次元に重層化させ、及び、（４）最終的にその細胞付着性領域内に形成された複数の重層化部分を結合させ、細胞付着性領域全体を厚みのある細胞集合体を作製する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞付着性領域の周囲に細胞非付着性領域を有する基材表面を利用した胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞の分化誘導方法であり、その方法が、
（１）当該細胞を分化誘導化培地下で基材表面の細胞付着性領域に付着させ、
（２）その後、当該細胞を細胞付着性表面上でコンフルエントになるまで増殖させ、
（３）培養をさらに継続し、当該細胞を細胞付着性領域周囲の細胞非付着性領域との境界部から3次元に重層化させ、及び、
（４）最終的にその細胞付着性領域内に形成された複数の重層化部分を結合させ、細胞付着性領域全体を厚みのある細胞集合体を作製することを含む、胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞の分化誘導方法。
【請求項２】
重層化が、細胞付着性領域内で増殖した細胞が細胞非付着性領域上へ侵入した後もそのまま増殖を続け、最終的に細胞非付着性領域上の細胞が膜状で細胞付着性領域内の細胞の上へ反り返えることによるものである、請求項１記載の胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞の分化誘導方法。
【請求項３】
細胞付着性領域において、周囲の細胞非付着性領域との境界部から形成した少なくとも２つの重層化部分が結合するまでの距離が３００μｍ以下である、請求項１、２のいずれか１項記載の胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞の分化誘導方法。
【請求項４】
細胞付着性領域の基材表面に、接着性蛋白質及び／又は温度応答性ポリマーが被覆されている、請求項１〜３のいずれか１項記載の胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞の分化誘導方法。
【請求項５】
温度応答性ポリマーが、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）である、請求項４記載の胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞の分化誘導方法。
【請求項６】
温度応答性ポリマーを含むものが被覆された細胞付着性領域の基材表面上で得られた細胞集合体を酵素処理を行わず、基材表面の温度を変えることだけで剥がすことを特徴とする請求項４、５のいずれか１項記載の胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞の分化誘導方法。
【請求項７】
細胞付着性領域へ細胞を播種後、細胞がコンフルエントになるまでの時間が８日以内である、請求項１〜６のいずれか１項記載の胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞の分化誘導方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかの方法で得られる、分化誘導幹細胞。
【請求項９】
分化誘導が心筋細胞への分化誘導である、請求項８記載の分化誘導幹細胞。
【請求項１０】
分化誘導幹細胞を含む細胞集合体が、細胞密度の高い最外層部分と細胞密度の低い内部からなるものである、請求項８、９のいずれか１項記載の分化誘導幹細胞。
【請求項１１】
細胞の由来がヒト、イヌ、ブタ、ウサギ、マウス、及びラットのいずれかである、請求項８〜１０のいずれか１項記載の分化誘導幹細胞。
【請求項１２】
得られた分化誘導幹細胞を移植治療に利用する、請求項８〜１１のいずれか１項記載の分化誘導幹細胞。
【請求項１３】
得られた分化誘導幹細胞を細胞評価に利用する、請求項８〜１１のいずれか１項記載の分化誘導幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創薬、薬学、医学、生物学等の分野において有用な胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞の分化誘導方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞移植に基づく再生医療が臓器移植に代替する治療法として注目を集めつつある。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は多能性、及び無限増殖性を有しているため、再生医療に必要とされる細胞を調製するための細胞ソースとして期待されている。また近年ＥＳ細胞に相応する性質を備えた人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が成人の体細胞から調製可能であることが示され、これらの細胞の臨床応用への期待はますます高まってきている。【０００３】
ＥＳ細胞の臨床応用を実現するためには、ＥＳ細胞の分化を再現性良く制御することが不可欠である。ＥＳ細胞の凝集体を形成させると、凝集体中において多細胞間相互作用が生じることにより、心筋細胞、肝細胞、神経細胞などの三胚葉由来の様々な細胞への分化が促進されることが明らかとなっている。ＥＳ細胞凝集体は一般的に胚様体と呼ばれる浮遊状態で球形の凝集体として調製される。ＥＳ細胞の分化は胚様体の大きさに依存するため、特定の細胞へ効率良く分化を誘導するためには、胚様体の大きさを制御する必要性がある。【０００４】
そのような中、非特許文献１には胚様体の大きさを制御する既存の方法としてハンギングドロップ法が示されている。具体的には、培地中に数百〜数千個のＥＳ細胞を含む液滴を細胞培養皿の蓋からぶら下げて2日間培養し、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ；  ＥＢ)と呼ばれる細胞塊を形成させるものである。これを細胞非接着性培養皿で数日間浮遊培養した後、細胞接着性培養皿に播種してさらに数日間培養する. 培養皿に接着したＥＢの展開細胞群をＥＢ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈと呼ぶ。マウスＥＳ細胞をハンギングドロップ法により分化誘導培養することにより、５〜５０％のＥＢ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ中に、拍動する心筋細胞が観察されるようになる（非特許文献２、４、５）。またこのとき、全ての細胞数に対する分化した心筋細胞数の割合は、一般的に1〜３％である（非特許文献６）。しかしながらハンギングドロップ法は煩雑な作業を要するため、胚様体の大量調製が困難であるという欠点を有している。また多くの場合、胚様体中におけるＥＳ細胞のさらなる分化を促進するためには、浮遊状態にある胚様体を培養基材上に接着させて引き続き培養する必要がある。【０００５】
また、心筋細胞への分化誘導を促進する化学物質の探求が精力的に行われている。現在明らかにされている代表的な分化誘導物質として、非特許文献２ではレチノイン酸が例示され、特許文献１及び非特許文献３ではアスコルビン酸、非特許文献４では一酸化窒素、非特許文献５ではｎｏｇｉｎ等が挙げられ、これらの物質を適正な濃度とタイミングで培地に加えることにより、心筋細胞への分化誘導率を高めることが可能である。さらに、特許文献２では無血清培地下で培養する方法、並びに特許文献３では心筋細胞分化誘導因子を排出する細胞との共培養する方法等が挙げられ、心筋細胞への分化誘導率を高める方法が種々検討されている。しかしながら、目的の細胞に分化誘導されなかった細胞が移植後に問題を引き起こす危険性は依然として残されており、さらには、移植に必要なだけの十分な細胞数を簡便に大量調製するための培養技術が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００８−５２３８２３号公報
【特許文献２】特表２００８−５００８２１号公報
【特許文献３】特表２００６−５２３０９１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Circ Res.2002;91(3):189-201
【非特許文献２】J Mol Cell Cardiol.1997;29(6):1525-39
【非特許文献３】Circulation2003;107(14):1912-6
【非特許文献４】Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(33):12277-81
【非特許文献５】Nat Biotechnol.2005;23(5):607-11
【非特許文献６】Cell.2008;132(4):661-80
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述したような胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞の分化誘導方法に関する問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、従来技術と全く異なった発想からの新規な胚性幹細胞等の分化誘導方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、当該細胞を培養基材に付着させ、三次元の特定の構造をとらせることで胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞を分化誘導することができることを見出した。さらにその分化誘導により心筋細胞が得られることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。【００１０】
すなわち、本発明は、胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞を培養基材に付着させ、三次元の特定の構造をとらせることで胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞を分化誘導させる方法を提供する。また、本発明は胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞を心筋細胞へ分化誘導する方法を提供する。加えて、本発明は、かかる分化誘導方法によって得られる分化誘導幹細胞を提供する。さらに、本発明ではそれらを利用した移植治療方法についても提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明による分化誘導方法であれば、胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞を簡便な手法で目的の細胞へ誘導することができるようになる。従来、こうした作業には手間と作業者の技術を必要としていたが、本発明であればその必要がなくなり、細胞の大量処理ができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１の細胞パターン化培養基材上におけるＥＳ細胞凝集体の形成と心筋細胞分化誘導の結果を示す図である。直径２００μｍの円形細胞付着性領域を有する基材上にて分化誘導培養されたＥＳ細胞の、播種３時間後（ａ）、培養３日目（ｂ，ｅ）、培養６日目（ｃ）、及び培養９日目（ｄ）における顕微鏡画像。白くサチュレーションしている部分がＥＧＦＰの蛍光を示す。スケールバーは２００μｍを示す。
【図２】実施例１の細胞パターン化培養基材上におけるＥＳ細胞凝集体の形成と心筋細胞分化誘導の結果を示す図である。直径１００μｍ（ａ）、２００μｍ（ｂ）、３００μｍ（ｃ）、及び４００μｍ（ｄ）の円形細胞付着性領域を有する基材上、及びポリアクリルアミドの固定されていないシラン化カバーガラス表面上（ｅ）にて分化誘導培養されたＥＳ細胞の培養１０日目における顕微鏡画像。白くサチュレーションしている部分がＥＧＦＰの蛍光を示す。スケールバーは５００μｍを示す。
【図３】実施例１の細胞パターン化培養基材上におけるＥＳ細胞凝集体の形成と心筋細胞分化誘導の結果を示す図である。分化誘導培養１０日目において、ＥＧＦＰ蛍光を呈する細胞凝集体の割合（丸プロット）、及び拍動を呈する細胞凝集体（三角形プロット）の割合と、円形細胞付着性領域の直径との関係。一回の実験につき１００個の細胞凝集体を解析した。エラーバーは５回の独立な実験における標準偏差を示す。
【図４】実施例１の心筋細胞への分化誘導効率の結果を示す図である。ポリアクリルアミドの固定されていないシラン化カバーガラス表面上（ａ）、及び直径１００μｍ（ｂ）、２００μｍ（ｃ）、３００μｍ（ｄ）、４００μｍ（ｅ）の円形細胞付着性領域を有する基材上にて１０日間分化誘導培養されたＥＳ細胞の、フローサイトメトリーにおける代表的な細胞分布図。一回の実験につき５００００個の細胞を解析した。
【図５】実施例１の心筋細胞への分化誘導効率の結果を示す図である。フローサイトメトリーにより解析された、直径１００μｍ（丸プロット）、２００μｍ（三角形プロット）、３００μｍ（正方形プロット）、及び４００μｍ（ひし形プロット）の円形細胞付着性領域を有する基材上にて分化誘導培養されたＥＳ細胞中におけるＥＧＦＰ陽性細胞率の時系列。一回の実験につき５００００個の細胞を解析した。エラーバーは５回の独立な実験における標準偏差を示す。
【図６】実施例１の分化したＥＳ細胞凝集体の形態解析を行った結果を示す図である。直径２００μｍの円形細胞付着性領域上にて分化誘導培養され形成された、培養７日目（ａ）及び培養１０日目（ｂ）におけるＥＳ細胞凝集体、直径４００μｍの円形細胞付着性領域上にて分化誘導培養され形成された、培養７日目（ｃ）及び培養１０日目（ｄ）におけるＥＳ細胞凝集体、及びポリアクリルアミドの固定されていないシラン化カバーガラス表面上にて分化誘導培養された、培養７日目（ｅ）及び培養１０日目（ｆ）におけるＥＳ細胞の、コンフォーカル顕微鏡画像。上方の画像は培養基材と並行な面における断層像を示し、下方の画像は培養基材と垂直な面における断層像を示す。培養基材と垂直な面における断層像において、細胞集合体の輪郭を点線で示している。白くサチュレーションしている部分がＥＧＦＰの蛍光を示す。スケールバーは１００μｍを示す。
【図７】実施例２の心筋細胞への分化誘導効率の結果を示す図である。フローサイトメトリーにおける、１２日間分化誘導培養したマウスＥＳ細胞株ＥＭＧ７の心筋細胞への分化誘導効率を示す代表的な細胞分布図。同様の条件で分化誘導培養したマウスＥＳ細胞株ＥＢ５をＥＧＦＰ陰性対照として用いた。
【図８】実施例３の細胞パターン化培養基材上におけるＥＳ細胞凝集体の形成と心筋細胞分化誘導の結果を示す図である。直径２００μｍの円形細胞付着性領域を有する基材上にて分化誘導培養されたＥＳ細胞の培養１２日目における顕微鏡画像。白くサチュレーションしている部分がＥＧＦＰの蛍光を示す。スケールバーは１ｍｍを示す。
【図９】実施例４の細胞パターン化培養基材上におけるＥＳ細胞凝集体の形成と心筋細胞分化誘導の結果を示す図である。幅１００μｍのライン状細胞付着性領域を有する基材上にて分化誘導培養されたＥＳ細胞の培養１０日目における顕微鏡画像。白くサチュレーションしている部分がＥＧＦＰの蛍光を示す。スケールバーは５００μｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、細胞付着性領域の周囲に細胞非付着性領域を有する基材表面を利用した胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞の分化誘導方法に関するものである。その際、被覆を施される細胞培養基材の材質は、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の物質のみならず、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス、金属類など全て用いることができる。その形状は、ペトリ皿等の細胞培養皿に限定されることはなく、プレート、ファイバー、（多孔質）粒子であってもよい。また、一般に細胞培養等に用いられる容器の形状（フラスコ等）を有したものであっても差し支えない。
【００１４】
本発明で示すところの細胞付着性領域、並びに細胞非付着性領域とはこの細胞培養基材表面に形成されたものである。その際、細胞付着性領域とは、細胞が付着する基材表面であれば特に限定されるものでなく、上述したような一般的な培養基材に使われるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の物質のみならず、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス、金属類でも良く、それらにグロー放電、コロナ放電などで表面処理を施したものでも良く、さらにこれらの表面へフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン等の細胞接着性蛋白質の１種、あるいはこれらの２種以上の混合物を被覆したものでも良い。一方、本発明に使用される細胞非付着性領域とは細胞を付着させない領域であり、上記培養基材上に細胞の付着を妨げる物質を被覆することによって得られる。この目的を達成するために好適な物質としてポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、澱粉のいずれか１種、もしくは２種以上が混合されたものが挙げられるが、その種類は、何ら制約されるものではない。
【００１５】
細胞付着性領域、並びにその周囲の細胞非付着性領域の形態は、上部から観察して、例えば、（１）ラインとスペースからなるパターン、（２）水玉模様のパターン、（３）格子状のパターン、その他特殊な形のパターン、或いはこれらが混ざっている状態のパターンが挙げられるが、何ら限定されるものではない。また、被覆領域の大きさについても何ら限定されるものではないが、本発明では後述するように基材に付着し増殖した胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞が細胞付着性領域内でコンフルエントとなり、そのまま培養を継続することでオーバーコンフルエントの状態となり、細胞付着性領域と細胞非付着性領域の境界部付近から細胞が重層化し始めるものである。そのメカニズムは、細胞付着性領域内で細胞がコンフルエントになった後も、細胞付着性領域と細胞非付着性領域の境界部における細胞においてはコンタクトインヒビションがかからず、細胞増殖が抑制されないことに帰する。本発明では、目的とする細胞への高い分化効率を得るために、細胞付着性領域内で形成された複数の重層化した部分が速やかに結合することが必須である。従って細胞付着性領域、並びにその周囲の細胞非付着性領域の形態は、細胞付着性領域内の少なくとも一部でその結合が実現されることが必須であり、従って、細胞付着性領域において、周囲の細胞非付着性領域との境界部から形成した少なくとも２つの重層化部分が結合するまでの距離が３００μｍ以下であることが好ましく、さらに好ましくは２５０μｍであり、もっとも好ましくは２００μｍ以下である。ここで２つの重層化部分が結合するまでの距離が３００μｍより長いと所定の培養時間内に重層化部分の結合が起こらず好ましくない。その際、重層化部分の重なりとは特に限定されないが、細胞付着性領域内で隣接して形成された重層化部分が重なったものでも良く、或いは細胞付着性領域の形態が円形の場合直径方向の両端に形成された重層化部分が重なったもの、さらには細胞付着性領域の形態がライン状の場合、ラインの幅方向の両端に形成された重層化部分が重なったものでも良い。
【００１６】
本発明の細胞付着性領域、並びにその周囲の細胞非付着性領域の製造法としては、最終的に上記の構造を有するものであれば何ら制約されるものではないが、例えば、（１）細胞付着性基材表面上に細胞付着性領域をマスクして細胞非付着性領域になる部分だけに上述したポリマーを被覆する方法、（２）細胞付着性基材表面上に細胞非付着性ポリマーをオフセット印刷する方法、（３）あらかじめ細胞付着性ポリマー、並びに細胞非付着性ポリマーの２層を被覆しておき、超音波或いは走査型機器によりどちらかの層を削り取る方法（この場合、培養基材上に細胞付着性ポリマー及び細胞非付着性ポリマーの順に被覆しても、培養基材上に細胞非付着性ポリマー及び細胞付着性ポリマーの順に被覆してもよい）、（４）基材表面上全体にまず細胞非付着性領域を作製し、その後、最終的に細胞付着性領域を構成するものを噴霧して上乗せする方法、或いはそれを逆にした方法、等を単独または併用する方法が挙げられる。
【００１７】
細胞培養基材への各種ポリマーの被覆方法は、基材と被覆物質を、（１）化学的な反応によって結合させる方法、（２）物理的な相互作用を利用する方法、を単独でまたは併用して行うことができる。すなわち、（１）化学的な反応によって結合させる場合は、電子線照射（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｂｅａｍ；ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理等を用いることができる。さらに、支持体と被覆材料が適当な反応性官能基を有する場合は、ラジカル反応、アニオン反応、カチオン反応等の一般に用いられる有機反応を利用することができる。（２）物理的な相互作用による方法としては、被覆材料単独または支持体との相溶性のよいマトリックスを媒体とし（例えば、支持体を形成するモノマーまたは支持体と相溶性のよいモノマーと被覆材料とのグラフトポリマー、ブロックポリマー等）、塗布、混練等の物理的吸着を用いる方法等がある。
【００１８】
本発明では細胞培養基材の細胞付着性領域に温度応答性ポリマーを被覆しても良い。その際、温度応答性ポリマーは、水溶液中で０℃〜８０℃、より好ましくは２０℃〜５０℃の上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度を有する。上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が８０℃を越えると細胞が死滅する可能性があるので好ましくない。また、上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が０℃より低いと一般に細胞増殖速度が極度に低下するか、または細胞が死滅してしまうため、やはり好ましくない。本発明に用いる温度応答性ポリマーはホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このようなポリマーとしては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。その際、培養、剥離されるものが細胞であることから、分離が５℃〜５０℃の範囲で行われるため、温度応答性ポリマーとしては、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）などが挙げられる。本発明に用いられる共重合のためのモノマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリアクリル酸及びその塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの含水ポリマーなどが挙げられるが、特に制約されるものではない。
【００１９】
細胞付着性領域への温度応答性ポリマーの被覆量は、１．１〜２．３μｇ／ｃｍ２の範囲が良く、好ましくは１．４〜１．９μｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは１．５〜１．８μｇ／ｃｍ２である。１．１μｇ／ｃｍ２より少ない被覆量のとき、刺激を与えても当該ポリマー上の細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に２．３μｇ／ｃｍ２以上であると、その領域に細胞が付着し難く、細胞を十分に付着させることが困難となる。
【００２０】
本発明は、上述のような基材表面へ胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞を付着させることで分化誘導する方法である。その際、使用される細胞は胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞であれば良く、その入手先、作製方法は特に限定されるものではない。本発明の細胞は、例えば、動物、昆虫、植物等の細胞、細菌類が挙げられる。特に、動物細胞の由来として、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、ヌードマウス、マウス、モルモット、ブタ、ヒツジ、チャイニーズハムスター、ウシ、マーモセット、アフリカミドリザル等が挙げられるが特に限定されるものではない。
【００２１】
本発明における胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞の分化誘導方法とは以下の通りである。まず、播種前の胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞は非分化誘導化培地を用いて未分化性を維持したものとする。上述の基材表面へ播種する前後において分化誘導化培地に切り換え、本発明の基材表面へ播種させ、そのまま細胞を細胞付着性領域内でコンフルエントになるまで増殖させる。コンフルエントになった後も分化誘導化培地の状態で培養を継続し、細胞を細胞付着性領域周囲の細胞非付着性領域との境界部から3次元に重層化させる。そして、最終的にその細胞付着性領域内に形成された複数の重層化部分が結合し、細胞付着性領域全体を厚みのある細胞集合体となるまで培養を行うものである。得られた細胞集合体に対し酵素処理を行うことで目的とする分化誘導細胞を得ることができる。
【００２２】
本発明で用いる非分化誘導化培地は、胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞を分化誘導させない培地であれば特に限定されないが、例えば、マウス胚性幹細胞、及びマウス人工多能性幹細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られているｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒを含む培地や、ヒト胚性幹細胞、及びヒト人工多能性幹細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られているｂａｓｉｃ  ＦＧＦを含む培地等が挙げられる。逆に、分化誘導化培地は、胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞を分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、例えば、血清含有培地や、血清に代替する性質を有する既知成分を含有した無血清培地等が挙げられる。分化誘導培地には、さらに上述したようなレチノイン酸、アスコルビン酸等の分化誘導物質を添加しても良い。基材表面への播種密度は常法に従えば良く特に限定されるものではない。しかしながら、本発明では播種された細胞が細胞付着性領域内をコンフルエントになるまでの日数は、８日以内が良く、好ましくは７日以内、もっとも好ましくは６日以内が良い。コンフルエントになるまでの日数が９日以上となるとその後の重層化が十分に行えず、本発明に示される技術として好ましくないものとなる。従って、本発明においては、細胞を播種する細胞付着性領域の面積、並びに細胞播種量を調整してコンフルエントになるまでの日数を８日以内とすれば良いこととなる。
【００２３】
本発明は、胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞が細胞付着性領域においてコンフルエントになった後も培養を継続するところに特徴がある。すなわち、細胞付着性領域内で細胞がコンフルエントになった後も、細胞付着性領域と細胞非付着性領域の境界部における細胞においてはコンタクトインヒビションがかからず、細胞増殖が抑制されないため、細胞付着性領域周囲の細胞非付着性領域まで増殖しようとするが、細胞非付着性領域に細胞が十分に付着できず、従って細胞付着性領域上の細胞とは結合するものの基材表面との接着が十分でなく中途半端な状態で細胞が増殖し培養面積を広げていくこととなる。そして最終的には、その基材表面と不安定な接着をしている培養細胞が細胞付着性領域と細胞非付着性領域との境界部付近から細胞付着性領域側に折れ畳んできたり、シート状になって細胞付着性領域と細胞非付着性領域との境界部付近から細胞付着性領域側に折れ畳んできたり、さらには細胞付着性領域と細胞非付着性領域との境界部付近から細胞付着性領域側へ盛り上がってくることとなる。同時にその境界部付近には行き場を失った細胞が重なり合う状態にもなっている。本発明ではこうした細胞が連なったものが折れ畳んでくることにより胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞が特定の環境に置かれることとなり、その結果、これらの幹細胞が分化誘導化するものと考えられる。その際、細胞の折れ畳まれ方は特に限定されるものでないが、シート状になった細胞が折れ畳まれるとその部分に空間ができその後の分化誘導化を効率良く進められ好都合である。そして、本発明ではその折れ畳まれた部分が心筋細胞に分化していることが判明した。また得られた細胞集合体の断面を見ると最外層に細胞が密度高く存在し、集合体の内部の細胞の密度は低いことも分かった。本発明の心筋細胞は内部に多く存在していた。集合体の外層と内部とでは細胞の分化の方向が違うことも示唆された。
【００２４】
また、本発明の細胞付着性領域に温度応答性ポリマーが被覆されていれば、培養基材の温度を培養基材上の被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって分化させた細胞を酵素処理なく剥離させることができる。その際、培養液中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。細胞をより早く、より高効率に剥離、回収する目的で、基材を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、更にはピペットを用いて培地を撹拌する方法等を単独で、あるいは併用して用いても良い。
【００２５】
本発明に記載される分化誘導方法であれば、胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞を簡便な手法で目的の細胞へ誘導することができるようになる。従来、こうした作業には手間と作業者の技術を必要としていたが、本発明であればその必要がなくなり、細胞の大量処理ができるようになる。さらに本発明では、培養基材表面上における細胞接着性領域と細胞非接着性領域のパターンを設計することにより、胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞の特定の細胞への高い分化誘導効率を実現しつつ、簡便に大量の胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞を分化誘導できるようになる。
【実施例】
【００２６】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００２７】
（試薬）
実施例１に使用した試薬を以下に列記する。３−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（ＭＰＴＭＳ）は信越化学工業株式会社より購入した。ｇ線ポジ型フォトレジスト（ＯＦＰＲ−８００ＬＢ、３４ｃＰ）、現像液（ＮＭＤ−３）は東京応化工業株式会社より購入した。アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、過硫酸アンモニウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、ピルビン酸ナトリウム、タウリン、水酸化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸水素二カリウム、クレアチン、水酸化カリウム、パラホルムアルデヒドは和光純薬工業株式会社より購入した。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＴＥＭＥＤ）、グルコースは関東化学株式会社より購入した。Ｄ−ＰＢＳ、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ  Ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（α−ＭＥＭ、製品番号Ｍ０６４４）、ＨＥＰＥＳ、Ｎａ２ＡＴＰはシグマアルドリッチジャパン株式会社より購入した。フィブロネクチンはＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．より購入した。ウシ胎児血清は株式会社ニチレイサイエンスより購入した。２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン、ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｏｒａｎｇｅ  ＣＭＴＭＲ、ＳｌｏｗＦａｄｅ  Ｇｏｌｄ  ａｎｔｉｆａｄｅ  ｒｅａｇｅｎｔはインビトロジェン株式会社より購入した。ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡは同仁化学研究所より購入した。コラゲナーゼ／ディスパーゼはロシュ・ダイアグノスティックス株式会社より購入した。【００２８】
（細胞パターン化培養基材の作製）
文献（Ｉｔｏｇａ  Ｋ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｊ，Ｙａｍａｔｏ  Ｍ，Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ａ，Ｏｋａｎｏ  Ｔ．Ｍａｓｋｌｅｓｓ  ｌｉｑｕｉｄ−ｃｒｙｓｔａｌ−ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７（１５）：３００５−９）に基づき、細胞培養面に細胞付着性領域と細胞非付着性領域のパターンを有する培養基材の作製をおこなった。カバーガラス（２４ｍｍ×５０ｍｍ、厚さ０．１２〜０．１７ｍｍ、松浪硝子工業株式会社）にＭＰＴＭＳを用いて蒸発法によりシラン処理を施した。シラン処理カバーガラス上にｇ線ポジ型フォトレジストをスピンコート（５０００ｒｐｍ、３０秒）し、８０℃で１時間プレベイクした。マスクレス露光装置を用いたフォトリソグラフィーにより、直径が１００、２００、３００、または４００μｍの円形フォトレジストパターンが表面に３００μｍの間隔で正方配列した基材を作製した。これを８０℃で１時間ポストベイクした。０．７ｍＭのアクリルアミド、６５μＭのＮ，Ｎ‘−メチレンビスアクリルアミドにより構成される水溶液に窒素ガスを室温にて２０分間バブリングして溶存酸素を取り除き、これを４℃に冷却し、過硫酸アンモニウムとＴＥＭＥＤをそれぞれ２．２ｍＭ、１１ｍＭとなるように加え、その後すぐさまフォトレジストパターン基材をこの水溶液中に浸した。水溶液を静かに攪拌しつつ４℃で３時間静置し、基材上にてフォトレジストにコートされていないシラン化ガラス表面上にポリアクリルアミドを固定した。基材を約４０℃の温水を用いて十分に洗浄してシラン化ガラス表面上に固定されていないポリアクリルアミドを除去し、引き続きアセトンで洗浄して基材表面の円形フォトレジストパターンを除去した。このようにして作製された基材表面は、シラン化ガラス表面からなる細胞付着性の円形領域と、ポリアクリルアミド表面からなる細胞非付着性領域により構成される。基材を脱イオン水で十分に洗浄して乾燥させ、２４ｍｍ×２０ｍｍの大きさに切断し、これを直径３５ｍｍのペトリディッシュに入れ、エチレンオキサイドガスにより滅菌した。円形領域への細胞付着性を向上させるため、細胞を播種する前に３０μｇ／ｍＬのフィブロネクチンを含む２ｍＬのＤ−ＰＢＳ中に３７℃で一晩基材を浸し、基材表面にフィブロネクチンをコートした。【００２９】
（細胞培養）
実験には心筋型α―ミオシン重鎖プロモーター制御下にＥＧＦＰが発現するように遺伝子導入されたマウスＥＳ細胞株ＥＭＧ７（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ＪＫ，Ｔａｋａｎｏ  Ｍ，Ｈｉｒａｏｋａ−Ｋａｎｉｅ  Ｍ，Ｓｈｉｍａｚｕ  Ｃ，Ｐｅｉｓｈｉ  Ｙ，Ｙａｎａｇｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆｃａｒｄｉａｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２００５；１９（１１）：１５３４−６）を用いた。未分化状態のＥＳ細胞をゼラチンコートされた培養皿上にて文献に記載された培養法に従い継代培養した。分化を誘導する際には、α―ＭＥＭに５％のウシ胎児血清、５０μＭの２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、５ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリン、５μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが加えられた分化誘導培地を用いた。ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓ処理（３７℃、５分）により回収され分化誘導培地に懸濁された未分化ＥＳ細胞を、上記の方法により作製された培養基材上に２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、３７℃、５％の二酸化炭素、飽和水蒸気圧下において培養した。細胞を播種してから３時間後に１度培地交換をおこない、細胞非付着性領域に落ちているＥＳ細胞を取り除いた。その後は１日に１回培地交換をおこなった。対照実験として、ポリアクリルアミドの固定されていないシラン化カバーガラス表面上にて、同様の条件でＥＳ細胞の分化誘導培養をおこなった。培養された細胞は、ＨｉＳＣＡ  ＣＣＤカメラ（モデルＣ６７９０、浜松ホトニクス株式会社）が装備された倒立顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｕ、株式会社ニコン）により観察し、顕微鏡画像は画像解析ソフトウェアＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳ（浜松ホトニクス株式会社）により取得した。ＥＧＦＰ蛍光を観察する際には専用の光学フィルター（ＸＦ１１６−２、Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ）を用いた。【００３０】
（細胞パターン化培養基材上におけるＥＳ細胞凝集体の形成と心筋細胞分化誘導）
直径２００μｍの細胞付着性領域を有する基材上にて分化誘導培養したＥＳ細胞の時系列顕微鏡観察を行った。図１にその顕微鏡画像を示す。基材上に播種されたＥＳ細胞は円形の細胞付着性領域中にて増殖し、培養３日目にはコンフルエントに達して円形の細胞コロニーを形成した（図１ｂ、ｅ）。拡大された顕微鏡画像（図１ｅ）に示されるように、円形の細胞コロニーの縁は非常にくっきりとしており、細胞のパターニングが精細に実現されていることが確認された。コンフルエントに達した後も細胞付着性領域と細胞非付着性領域の境界におけるＥＳ細胞はさらに増殖し続け、これらの増殖細胞が細胞付着性領域上に重層化することにより次第に立体的なＥＳ細胞凝集体が形成された（図１ｃ、ｄ）。また最終的に形成されたＥＳ細胞凝集体の多くは細胞密度の高い最外層部分と細胞密度の低い内部からなる立体構造を有するものであった。培養７日目前後において心筋細胞への分化を示す明確なＥＧＦＰ蛍光が観察され始め、ＥＧＦＰ蛍光を呈する細胞凝集体の内のいくつかは拍動を呈し始めた。図２に直径１００、２００、３００、または４００μｍの細胞付着性領域を有する基材上にて分化誘導培養したＥＳ細胞の培養１０日目における顕微鏡画像を示す。すべての基材において円形の細胞付着性領域上にてＥＳ細胞凝集体が形成され、心筋細胞への分化を示すＥＧＦＰ蛍光と拍動が確認された。しかしながら細胞付着性領域の直径が１００μｍの場合においては、形成された細胞凝集体の半数以上は培地交換の際に基材上から解離して失われてしまった（図２ａ）。また対照実験としてポリアクリルアミドの固定されていないシラン化カバーガラス表面上にて同様の条件で分化誘導培養したＥＳ細胞は、基材上にて立体的な凝集体を形成せず（図２ｅ）、ＥＧＦＰ蛍光と拍動はほとんど観察されなかった。顕微鏡観察により、分化誘導培養１０日目において基材上にて形成されたすべての細胞凝集体のうち、ＥＧＦＰ蛍光を呈する細胞凝集体の割合、及び拍動を呈する細胞凝集体の割合を解析した（図３）。いずれの割合も細胞付着性領域の直径が大きくなるにつれて高くなり、直径３００μｍと直径４００μｍで最大に達した。ＥＧＦＰ蛍光を呈する細胞凝集体の割合は最大約７０％に達し、拍動を呈する細胞凝集体の割合は最大約４５％に達した。【００３１】
（フローサイトメトリー）
分化したＥＳ細胞のフローサイトメトリーをおこなうため、文献（Ｗｏｂｕｓ  ＡＭ，Ｇｕａｎ  Ｋ，Ｙａｎｇ  ＨＴ，Ｂｏｈｅｌｅｒ  ＫＲ．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｃａｒｄｉａｃ,  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ，ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００２；１８５：１２７−５６）に記載された方法にいくらかの改変を加えた方法により、分化したＥＳ細胞凝集体からの単一細胞懸濁液の調製をおこなった。基材上にて分化誘導培養されたＥＳ細胞を低カルシウムイオン培地（１２０ｍＭの塩化ナトリウム、５．４ｍＭの塩化カリウム、５ｍＭの硫酸マグネシウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２０ｍＭのグルコース、２０ｍＭのタウリンにより構成され、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６．９に調整された溶液）で洗い、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ／ディスパーゼと３０μＭの塩化カルシウムを加えた低カルシウムイオン培地に３７℃で４０分浸した。細胞を遠沈管に回収して遠心操作（１００×ｇ、５分）により細胞を沈殿させ上澄み液を取り除いた。引き続き、１０％のＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのタウリンを加えたＤ−ＰＢＳ中に細胞を懸濁し、３７℃で３０分静置した。遠心操作（３００×ｇ、５分）により細胞を沈殿させ、上澄み液を注意深く取り除いた。続いて細胞をＫＢ培地（８５ｍＭの塩化カリウム、３０ｍＭのリン酸水素二カリウム、５ｍＭの硫酸マグネシウム、１ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのＮａ２ＡＴＰ、５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのクレアチン、２０ｍＭのグルコース、２０ｍＭのタウリンにより構成され、水酸化カリウムを用いてｐＨ７．２に調整された溶液）中に懸濁し、ピペットによる細胞懸濁液の吸引拍出を繰り返すことにより細胞塊にせん断応力を加えて単一細胞に分離した。さらにこの細胞懸濁液を３５μｍのナイロンメッシュに通して残存する細胞塊を取り除き、フローサイトメーターＥＰＩＣＳ  ＸＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を用いてフローサイトメトリーを行った。【００３２】
（心筋細胞への分化誘導効率）
分化誘導培養したＥＳ細胞凝集体から単一細胞懸濁液を調製し、フローサイトメトリーにより全細胞中におけるＥＧＦＰ陽性細胞の割合を解析した（図４）。対照実験においてポリアクリルアミドの固定されていないシラン化カバーガラス表面上にて分化誘導培養されたＥＳ細胞においてはＥＧＦＰ蛍光がほとんど観察されなかったため、これをＥＧＦＰ陰性対照として用いた（図４ａ）。ＥＧＦＰ陽性細胞、すなわちＥＳ細胞から分化した心筋細胞の割合は、分化誘導培養１０日目において細胞付着性領域の直径が１００μｍ、及び２００μｍのときに最大となり、その値は１．５±０．５％（平均±標準偏差、サンプル数５）であった（図５）。ＥＧＦＰ陽性細胞の割合は分化誘導培養１０日目から１２日目にかけてはむしろ減少したが、これは心筋細胞以外の細胞が増殖したことによるものと推測される。【００３３】
（コンフォーカル顕微鏡観察）
基材上にて分化誘導培養されたＥＳ細胞の細胞質を蛍光染色するため、３７℃、５％の二酸化炭素、飽和水蒸気圧下において、１０μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｏｒａｎｇｅ  ＣＭＴＭＲを加えたα−ＭＥＭ中で１時間培養し、引き続き分化誘導培地中で１時間培養した。この細胞を２％のホルマリンを含むＤ−ＰＢＳを用いて固定し（室温、１５分）、Ｄ−ＰＢＳを用いて穏やかに洗った。封入剤（ＳｌｏｗＦａｄｅ  Ｇｏｌｄ  ａｎｔｉｆａｄｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）で細胞をコートし、基材の縁に沿って厚み１．５ｍｍのシリコンスペーサーを挟んでスライドガラス（７６×２６ｍｍ、松浪硝子工業株式会社）を被せて封入し、コンフォーカル顕微鏡ＬＳＭ５１０（カールツァイス株式会社）を用いて観察をおこなった。【００３４】
（分化したＥＳ細胞凝集体の形態解析）
コンフォーカル顕微鏡観察により、直径２００μｍ、及び４００μｍの細胞付着性領域上にて分化誘導培養され形成されたＥＳ細胞凝集体、及び対照実験においてポリアクリルアミドの固定されていないシラン化カバーガラス表面上にて分化誘導培養されたＥＳ細胞の形態解析をおこなった（図６）。直径２００μｍの細胞付着性領域上にて分化誘導培養されたＥＳ細胞は、培養７日目においてすでに立体的な凝集体を形成し、ＥＧＦＰ蛍光が現れ始めていた（図６ａ）。また培養１０日目において細胞凝集体は細胞密度の高い最外層部分と細胞密度の低い内部からなる立体構造を形成しており、細胞密度の低い内部においてＥＧＦＰ発現領域が拡大していた（図６ｂ）。一方、直径４００μｍの細胞付着性領域上にて分化誘導培養されたＥＳ細胞は、培養７日目において細胞付着性領域と細胞非付着性領域の境界付近のみにおいて細胞凝集体が形成され始めており（細胞付着性領域の縁から内側に向って約１５０μｍまでの領域上）、形成された凝集体の内部においてＥＧＦＰ蛍光が現れ始めていた（図６ｃ）。培養１０日目においては直径４００μｍの細胞付着性領域上全体において立体的な細胞凝集体が形成されていたが、ＥＧＦＰ発現領域は細胞付着性領域の縁から内側に向って約１２０μｍまでの領域上に限られていた（図６ｄ）。また一方、対照実験において分化誘導培養されたＥＳ細胞は、培養７日目において基材上にて立体的な凝集体は形成せずに単層構造を呈し（図６ｅ）、培養１０日目において若干の厚み（約２０μｍ）を有した層構造を呈したが（図６ｆ）、いずれの場合においてもＥＧＦＰ蛍光は観察されなかった。
【実施例２】
【００３５】
（試薬）
実施例２に使用した試薬を以下に列記する。３−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（ＭＰＴＭＳ）は信越化学工業株式会社より購入した。ｇ線ポジ型フォトレジスト（ＯＦＰＲ−８００ＬＢ、３４ｃＰ）、現像液（ＮＭＤ−３）は東京応化工業株式会社より購入した。アクリルアミド、Ｎ，Ｎ‘−メチレンビスアクリルアミド、過硫酸アンモニウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、ピルビン酸ナトリウム、タウリン、水酸化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸水素二カリウム、クレアチン、水酸化カリウム、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸エステル三ナトリウムは和光純薬工業株式会社より購入した。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＴＥＭＥＤ）、グルコースは関東化学株式会社より購入した。Ｄ−ＰＢＳ、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ  Ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（α−ＭＥＭ、製品番号Ｍ０６４４）、ＨＥＰＥＳ、Ｎａ２ＡＴＰはシグマアルドリッチジャパン株式会社より購入した。フィブロネクチンはＢＤより購入した。ウシ胎児血清は株式会社ニチレイサイエンスより購入した。２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン、ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡはインビトロジェン株式会社より購入した。ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡは同仁化学研究所より購入した。コラゲナーゼ／ディスパーゼはロシュ・ダイアグノスティックス株式会社より購入した。ＤＮａｓｅはＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより購入した。【００３６】
（細胞パターン化培養基材の作製）
文献（Ｉｔｏｇａ  Ｋ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｊ，Ｙａｍａｔｏ  Ｍ，Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ａ，Ｏｋａｎｏ  Ｔ．Ｍａｓｋｌｅｓｓ  ｌｉｑｕｉｄ−ｃｒｙｓｔａｌ−ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７（１５）：３００５−９）に基づき、細胞培養面に細胞付着性領域と細胞非付着性領域のパターンを有する培養基材の作製をおこなった。カバーガラス（２４ｍｍ×５０ｍｍ、厚さ０．１２〜０．１７ｍｍ、松浪硝子工業株式会社）にＭＰＴＭＳを用いて蒸発法によりシラン処理を施した。シラン処理カバーガラス上にｇ線ポジ型フォトレジストをスピンコート（３０００ｒｐｍ、３０秒）し、８０℃で１時間プレベイクした。フォトリソグラフィーにより、直径が２００μｍの円形フォトレジストパターンが表面に５０μｍの間隔で正三角形配列した基材を作製した。これを８０℃で１時間ポストベイクした。０．７ｍＭのアクリルアミド、６５μＭのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドにより構成される水溶液に窒素ガスを室温にて２０分間バブリングして溶存酸素を取り除き、これを４℃に冷却し、過硫酸アンモニウムとＴＥＭＥＤをそれぞれ２．２ｍＭ、１１ｍＭとなるように加え、その後すぐさまフォトレジストパターン基材をこの水溶液中に浸した。水溶液を静かに攪拌しつつ４℃で３時間静置し、基材上にてフォトレジストにコートされていないシラン化ガラス表面上にポリアクリルアミドを固定した。基材を約４０℃の温水を用いて十分に洗浄してシラン化ガラス表面上に固定されていないポリアクリルアミドを除去し、引き続きアセトンで洗浄して基材表面の円形フォトレジストパターンを除去した。このようにして作製された基材表面は、シラン化ガラス表面からなる細胞付着性の円形領域と、ポリアクリルアミド表面からなる細胞非付着性領域により構成される。基材を脱イオン水で十分に洗浄して乾燥させ、２４ｍｍ×２０ｍｍの大きさに切断し、これを直径３５ｍｍのペトリディッシュに入れ、エチレンオキサイドガスにより滅菌した。円形領域への細胞付着性を向上させるため、細胞を播種する前に１μｇ／ｍＬのフィブロネクチンを含む２ｍＬのＤ−ＰＢＳ中に室温で２時間以上基材を浸し、基材表面にフィブロネクチンをコートした。【００３７】
（細胞培養）
実験には、マウスＥＳ細胞株ＥＢ５（Ｈｉｒａｉ  Ｈ，Ｏｇａｗａ  Ｍ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｎ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｍ，Ｂｒｅｉｅｒ  Ｇ，Ｍａｚｄａ  Ｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｍｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎｈｅｍｏｇｅｎｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｃａｎ  ｂｅ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｋｉｎａｓｅ  （Ｆｌｋ）−１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ  ２００３；１０１（３）：８８６−９３）、および心筋型α―ミオシン重鎖プロモーター制御下にＥＧＦＰが発現するようにＥＢ５に遺伝子導入されたマウスＥＳ細胞株ＥＭＧ７（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ＪＫ，Ｔａｋａｎｏ  Ｍ，Ｈｉｒａｏｋａ−Ｋａｎｉｅ  Ｍ，Ｓｈｉｍａｚｕ  Ｃ，Ｐｅｉｓｈｉ  Ｙ，Ｙａｎａｇｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆｃａｒｄｉａｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２００５；１９（１１）：１５３４−６）を用いた。未分化状態のＥＳ細胞をゼラチンコートされた培養皿上にて文献に記載された培養法に従い継代培養した。分化を誘導する際には、α―ＭＥＭに２０％のウシ胎児血清、０．５ｍＭのＬ−アスコルビン酸２−リン酸エステル三ナトリウム、５０μＭの２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、５ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリン、５μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが加えられた分化誘導培地を用いた。Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ処理（０．５％、３７℃、５分）により回収され分化誘導培地に懸濁された未分化ＥＳ細胞を、上記の方法により作製された培養基材上に３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、３７℃、５％の二酸化炭素、飽和水蒸気圧下において培養した。細胞を播種してから３時間後に１度培地交換をおこない、細胞非付着性領域に落ちているＥＳ細胞を取り除いた。その後４日目までは１日に１回培地交換をおこない、４日目以降は２日に１回培地交換をおこなった。【００３８】
（細胞パターン化培養基材上におけるＥＳ細胞凝集体の形成と心筋細胞分化誘導）
基材上に播種されたＥＳ細胞は円形の細胞付着性領域中にて増殖し、培養３日目にはコンフルエントに達して円形の細胞コロニーを形成した。コンフルエントに達した後も細胞付着性領域と細胞非付着性領域の境界におけるＥＳ細胞はさらに増殖し続け、これらの増殖細胞が細胞付着性領域上に重層化することにより次第に立体的なＥＳ細胞凝集体が形成された。培養１０日目前後において心筋細胞への分化を示す明確なＥＧＦＰ蛍光が観察され始め、ＥＧＦＰ蛍光を呈する細胞凝集体の内のいくつかは拍動を呈し始めた。【００３９】
（フローサイトメトリー）
分化したＥＳ細胞のフローサイトメトリーをおこなうため、文献（Ｗｏｂｕｓ  ＡＭ，Ｇｕａｎ  Ｋ，Ｙａｎｇ  ＨＴ，Ｂｏｈｅｌｅｒ  ＫＲ．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｃａｒｄｉａｃ,  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ，ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００２；１８５：１２７−５６）に記載された方法にいくらかの改変を加えた方法により、分化したＥＳ細胞凝集体からの単一細胞懸濁液の調製をおこなった。基材上にて分化誘導培養されたＥＳ細胞を低カルシウムイオン培地（１２０ｍＭの塩化ナトリウム、５．４ｍＭの塩化カリウム、５ｍＭの硫酸マグネシウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２０ｍＭのグルコース、２０ｍＭのタウリンにより構成され、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６．９に調整された溶液）で洗い、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ／ディスパーゼと３０μＭの塩化カルシウムを加えた低カルシウムイオン培地に３７℃で４０分浸した。細胞を遠沈管に回収して遠心操作（２００×ｇ、３分）により細胞を沈殿させ上澄み液を取り除いた。引き続き、ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓ中に細胞を懸濁し、３７℃で２０分静置した。遠心操作（２００×ｇ、５分）により細胞を沈殿させ、上澄み液を注意深く取り除いた。続いて細胞を、６００Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅが加えられたＫＢ培地（８５ｍＭの塩化カリウム、３０ｍＭのリン酸水素二カリウム、５ｍＭの硫酸マグネシウム、１ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのＮａ２ＡＴＰ、５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのクレアチン、２０ｍＭのグルコース、２０ｍＭのタウリンにより構成され、水酸化カリウムを用いてｐＨ７．２に調整された溶液）中に懸濁し、ピペットによる細胞懸濁液の吸引拍出を繰り返すことにより細胞塊にせん断応力を加えて単一細胞に分離した。さらにこの細胞懸濁液を３５μｍのナイロンメッシュに通して残存する細胞塊を取り除き、フローサイトメーターＥＰＩＣＳ  ＸＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を用いてフローサイトメトリーを行った。【００４０】
（心筋細胞への分化誘導効率）
１２日間分化誘導培養したマウスＥＳ細胞株ＥＭＧ７の凝集体から単一細胞懸濁液を調製し、フローサイトメトリーにより全細胞中におけるＥＧＦＰ陽性細胞の割合を解析した（図７）。同様の条件で分化誘導培養したマウスＥＳ細胞株ＥＢ５をＥＧＦＰ陰性対照として用いた。ＥＧＦＰ陽性細胞、すなわちＥＳ細胞から分化した心筋細胞の割合は８．９±１．５％（平均±標準偏差、サンプル数３）であった。
【実施例３】
【００４１】
（試薬）
実施例３に使用した試薬を以下に列記する。３−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（ＭＰＴＭＳ）は信越化学工業株式会社より購入した。ｇ線ポジ型フォトレジスト（ＯＦＰＲ−８００ＬＢ、３４ｃＰ）、現像液（ＮＭＤ−３）は東京応化工業株式会社より購入した。アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、過硫酸アンモニウム、炭酸水素ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸エステル三ナトリウムは和光純薬工業株式会社より購入した。Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ‘−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＴＥＭＥＤ）、グルコースは関東化学株式会社より購入した。Ｄ−ＰＢＳ、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ  Ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（α−ＭＥＭ、製品番号Ｍ０６４４）はシグマアルドリッチジャパン株式会社より購入した。フィブロネクチンはＢＤより購入した。ウシ胎児血清は株式会社ニチレイサイエンスより購入した。２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン、ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓはインビトロジェン株式会社より購入した。【００４２】
（細胞パターン化培養基材の作製）
文献（Ｉｔｏｇａ  Ｋ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｊ，Ｙａｍａｔｏ  Ｍ，Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ａ，Ｏｋａｎｏ  Ｔ．Ｍａｓｋｌｅｓｓ  ｌｉｑｕｉｄ−ｃｒｙｓｔａｌ−ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７（１５）：３００５−３００９）に基づき、細胞培養面に細胞付着性領域と細胞非付着性領域のパターンを有する培養基材の作製をおこなった。カバーガラス（２４ｍｍ×５０ｍｍ、厚さ０．１２〜０．１７ｍｍ、松浪硝子工業株式会社）にＭＰＴＭＳを用いて蒸発法によりシラン処理を施した。シラン処理カバーガラス上にｇ線ポジ型フォトレジストをスピンコート（３０００ｒｐｍ、３０秒）し、８０℃で１時間プレベイクした。フォトリソグラフィーにより、直径が２００μｍの円形フォトレジストパターンが表面に１００μｍの間隔で正三角形配列した基材を作製した。これを８０℃で１時間ポストベイクした。０．７ｍＭのアクリルアミド、６５μＭのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドにより構成される水溶液に窒素ガスを室温にて２０分間バブリングして溶存酸素を取り除き、これを４℃に冷却し、過硫酸アンモニウムとＴＥＭＥＤをそれぞれ２．２ｍＭ、１１ｍＭとなるように加え、その後すぐさまフォトレジストパターン基材をこの水溶液中に浸した。水溶液を静かに攪拌しつつ４℃で３時間静置し、基材上にてフォトレジストにコートされていないシラン化ガラス表面上にポリアクリルアミドを固定した。基材を約４０℃の温水を用いて十分に洗浄してシラン化ガラス表面上に固定されていないポリアクリルアミドを除去し、引き続きアセトンで洗浄して基材表面の円形フォトレジストパターンを除去した。このようにして作製された基材表面は、シラン化ガラス表面からなる細胞付着性の円形領域と、ポリアクリルアミド表面からなる細胞非付着性領域により構成される。基材を脱イオン水で十分に洗浄して乾燥させ、２４ｍｍ×２４ｍｍの大きさに切断し、これを直径３５ｍｍのペトリディッシュに入れ、エチレンオキサイドガスにより滅菌した。円形領域への細胞付着性を向上させるため、細胞を播種する前に５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンを含む２ｍＬのＤ−ＰＢＳ中に室温で１時間以上基材を浸し、基材表面にフィブロネクチンをコートした。【００４３】
（細胞培養）
実験には心筋型α―ミオシン重鎖プロモーター制御下にＥＧＦＰが発現するように遺伝子導入されたマウスＥＳ細胞株ＥＭＧ7（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ＪＫ，Ｔａｋａｎｏ  Ｍ，Ｈｉｒａｏｋａ−Ｋａｎｉｅ  Ｍ，Ｓｈｉｍａｚｕ  Ｃ，Ｐｅｉｓｈｉ  Ｙ，Ｙａｎａｇｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆｃａｒｄｉａｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２００５；１９（１１）：１５３４−６）を用いた。未分化状態のＥＳ細胞をゼラチンコートされた培養皿上にて文献（Ｈｉｒａｉ  Ｈ，Ｏｇａｗａ  Ｍ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｎ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｍ，Ｂｒｅｉｅｒ  Ｇ，Ｍａｚｄａ  Ｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｍｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎｈｅｍｏｇｅｎｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｃａｎ  ｂｅ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｋｉｎａｓｅ  （Ｆｌｋ）−１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ  ２００３；１０１（３）：８８６−９３）に記載された培養法に従い継代培養した。分化を誘導する際には、α―ＭＥＭに２０％、または１０％のウシ胎児血清、０．５ｍＭのＬ−アスコルビン酸２−リン酸エステル三ナトリウム、５０μＭの２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、５ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリン、５μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが加えられた分化誘導培地を用いた。ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓ処理（３７℃、７分）により回収され分化誘導培地に懸濁された未分化ＥＳ細胞を、上記の方法により作製された培養基材上の細胞付着性領域に対して３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように播種し、３７℃、５％の二酸化炭素、飽和水蒸気圧下において培養した。培養４日目までは１日に１回培地交換をおこない、４日目以降は２日に１回培地交換をおこなった。また、培養６日目までは２０％のウシ胎児血清を含む分化誘導培地を用い、６日目以降は１０％のウシ胎児血清を含む分化誘導培地を用いた。培養された細胞は、ＨｉＳＣＡ  ＣＣＤカメラ（モデルＣ６７９０、浜松ホトニクス株式会社）が装備された倒立顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｕ、株式会社ニコン）により観察し、顕微鏡画像は画像解析ソフトウェアＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳ（浜松ホトニクス株式会社）により取得した。ＥＧＦＰ蛍光を観察する際には専用の光学フィルター（ＸＦ１１６−２、Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ）を用いた。【００４４】
（細胞パターン化培養基材上におけるＥＳ細胞凝集体の形成と心筋細胞分化誘導）
基材上に播種されたＥＳ細胞は円形の細胞付着性領域中にて増殖し、培養３日目にはコンフルエントに達して円形の細胞コロニーを形成した。コンフルエントに達した後も細胞付着性領域と細胞非付着性領域の境界におけるＥＳ細胞はさらに増殖し続け、これらの増殖細胞が細胞付着性領域上に重層化することにより次第に立体的なＥＳ細胞凝集体が形成された。培養１０日目前後において心筋細胞への分化を示す明確なＥＧＦＰ蛍光が観察され始め、ＥＧＦＰ蛍光を呈する細胞凝集体の内のいくつかは拍動を呈し始めた。図８に、分化誘導培養１２日目において基材上に形成された細胞凝集体の顕微鏡像を示す。ＥＧＦＰ蛍光を呈する細胞凝集体の割合は約６０％であった。
【実施例４】
【００４５】
（試薬）
実施例４に使用した試薬を以下に列記する。３−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ（ＭＰＴＭＳ）は信越化学工業株式会社より購入した。ｇ線ポジ型フォトレジスト（ＯＦＰＲ−８００ＬＢ、３４ｃＰ）、現像液（ＮＭＤ−３）は東京応化工業株式会社より購入した。アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、過硫酸アンモニウム、炭酸水素ナトリウムは和光純薬工業株式会社より購入した。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＴＥＭＥＤ）、グルコースは関東化学株式会社より購入した。Ｄ−ＰＢＳ、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ  Ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（α−ＭＥＭ、製品番号Ｍ０６４４）はシグマアルドリッチジャパン株式会社より購入した。フィブロネクチンはＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．より購入した。ウシ胎児血清は株式会社ニチレイサイエンスより購入した。２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、ペニシリン−ストレプトマイシン、ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓはインビトロジェン株式会社より購入した。【００４６】
（細胞パターン化培養基材の作製）
文献（Ｉｔｏｇａ  Ｋ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｊ，Ｙａｍａｔｏ  Ｍ，Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ａ，Ｏｋａｎｏ  Ｔ．Ｍａｓｋｌｅｓｓ  ｌｉｑｕｉｄ−ｃｒｙｓｔａｌ−ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００６；２７（１５）：３００５−９）に基づき、細胞培養面に細胞付着性領域と細胞非付着性領域のパターンを有する培養基材の作製をおこなった。カバーガラス（２４ｍｍ×５０ｍｍ、厚さ０．１２〜０．１７ｍｍ、松浪硝子工業株式会社）にＭＰＴＭＳを用いて蒸発法によりシラン処理を施した。シラン処理カバーガラス上にｇ線ポジ型フォトレジストをスピンコート（５０００ｒｐｍ、３０秒）し、８０℃で１時間プレベイクした。マスクレス露光装置を用いたフォトリソグラフィーにより、幅が１００μｍのライン状フォトレジストパターンが表面に３００μｍの間隔で配列した基材を作製した。これを８０℃で１時間ポストベイクした。０．７ｍＭのアクリルアミド、６５μＭのＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドにより構成される水溶液に窒素ガスを室温にて２０分間バブリングして溶存酸素を取り除き、これを４℃に冷却し、過硫酸アンモニウムとＴＥＭＥＤをそれぞれ２．２ｍＭ、１１ｍＭとなるように加え、その後すぐさまフォトレジストパターン基材をこの水溶液中に浸した。水溶液を静かに攪拌しつつ４℃で３時間静置し、基材上にてフォトレジストにコートされていないシラン化ガラス表面上にポリアクリルアミドを固定した。基材を約４０℃の温水を用いて十分に洗浄してシラン化ガラス表面上に固定されていないポリアクリルアミドを除去し、引き続きアセトンで洗浄して基材表面の円形フォトレジストパターンを除去した。このようにして作製された基材表面は、シラン化ガラス表面からなる細胞付着性の円形領域と、ポリアクリルアミド表面からなる細胞非付着性領域により構成される。基材を脱イオン水で十分に洗浄して乾燥させ、２４ｍｍ×２０ｍｍの大きさに切断し、これを直径３５ｍｍのペトリディッシュに入れ、エチレンオキサイドガスにより滅菌した。細胞付着性を向上させるため、細胞を播種する前に３０μｇ／ｍＬのフィブロネクチンを含む２ｍＬのＤ−ＰＢＳ中に３７℃で一晩基材を浸し、基材表面にフィブロネクチンをコートした。【００４７】
（細胞培養）
実験には心筋型α―ミオシン重鎖プロモーター制御下にＥＧＦＰが発現するように遺伝子導入されたマウスＥＳ細胞株ＥＭＧ７（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ＪＫ，Ｔａｋａｎｏ  Ｍ，Ｈｉｒａｏｋａ−Ｋａｎｉｅ  Ｍ，Ｓｈｉｍａｚｕ  Ｃ，Ｐｅｉｓｈｉ  Ｙ，Ｙａｎａｇｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆｃａｒｄｉａｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２００５；１９（１１）：１５３４−６）を用いた。未分化状態のＥＳ細胞をゼラチンコートされた培養皿上にて文献に記載された培養法に従い継代培養した。分化を誘導する際には、α―ＭＥＭに５％のウシ胎児血清、５０μＭの２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、５ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリン、５μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが加えられた分化誘導培地を用いた。ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓ処理（３７℃、５分）により回収され分化誘導培地に懸濁された未分化ＥＳ細胞を、上記の方法により作製された培養基材上に２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、３７℃、５％の二酸化炭素、飽和水蒸気圧下において培養した。細胞を播種してから３時間後に１度培地交換をおこない、細胞非付着性領域に落ちているＥＳ細胞を取り除いた。その後は１日に１回培地交換をおこなった。培養された細胞は、ＨｉＳＣＡ  ＣＣＤカメラ（モデルＣ６７９０、浜松ホトニクス株式会社）が装備された倒立顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｕ、株式会社ニコン）により観察し、顕微鏡画像は画像解析ソフトウェアＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳ（浜松ホトニクス株式会社）により取得した。ＥＧＦＰ蛍光を観察する際には専用の光学フィルター（ＸＦ１１６−２、Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ）を用いた。【００４８】
（細胞パターン化培養基材上におけるＥＳ細胞凝集体の形成と心筋細胞分化誘導）
基材上に播種されたＥＳ細胞はライン状の細胞付着性領域中にて増殖し、培養３日目にはコンフルエントに達した。コンフルエントに達した後も細胞付着性領域と細胞非付着性領域の境界におけるＥＳ細胞はさらに増殖し続け、これらの増殖細胞が細胞付着性領域上に反り返ってくることにより次第に立体的なＥＳ細胞凝集体が形成された。培養７日目前後において心筋細胞への分化を示す明確なＥＧＦＰ蛍光が観察され始め、ＥＧＦＰ蛍光を呈する細胞凝集体の内のいくつかは拍動を呈し始めた。図９に、分化誘導培養１０日目において基材上に形成された細胞凝集体の顕微鏡像を示す。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明に記載される分化誘導方法であれば、胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞を基材表面に付着させ特定の条件下で当該細胞を増殖させることで目的の細胞へ誘導することができるようになる。従来のような煩雑な操作を必要とせず、胚性幹細胞或いは人工多能性幹細胞の簡便な大量処理ができるようになる。したがって、本発明は創薬、薬学、医学、生物学等の分野における極めて有用な発明である。
【図３】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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