(57)【要約】  グラム陰性菌の外膜におけるＹａｅＴ複合体の形成を阻害することにより、菌の生存に必要な外膜タンパク質（ＯＭＰ）の生合成を遮断する方法及びそのための薬剤を提供し、以てグラム陰性菌の多剤耐性化の問題を根本的に解決することを目的とする。本発明は、ＹａｅＴ複合体の形成を阻害することによりグラム陰性菌に対する殺菌作用、増殖阻害作用、及び／又は薬剤排出阻害作用を発揮することを特徴とする抗グラム陰性菌剤を提供する。当該薬剤は、少なくともＬＴＬＲからなるアミノ酸配列を含むペプチド分子又は少なくともＦＩＲＬからなるアミノ酸配列を含むペプチド分子であるのが好ましい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＹａｅＴ複合体の形成を阻害することによりグラム陰性菌に対する殺菌作用、増殖阻害作用、及び／又は薬剤排出阻害作用を発揮することを特徴とする抗グラム陰性菌剤。
【請求項２】
ＹａｅＴとＴｆｇＬとの結合を阻害することを特徴とする、請求項１に記載の抗グラム陰性菌剤。
【請求項３】
少なくともＬＴＬＲからなるアミノ酸配列を含むペプチド分子である、請求項２に記載の抗グラム陰性菌剤。
【請求項４】
ＹａｅＴとＹｆｉＯとの結合を阻害することを特徴とする、請求項１に記載の抗グラム陰性菌剤。
【請求項５】
少なくともＦＩＲＬ又はＩＲＬＨからなるアミノ酸配列を含むペプチド分子である、請求項４に記載の抗グラム陰性菌剤。
【請求項６】
少なくともＦＩＲＬＨＰからなるアミノ酸配列を含むペプチド分子である、請求項５に記載の抗グラム陰性菌剤。
【請求項７】
前記ペプチド分子のＣ末端がアミド化されていることを特徴とする、請求項３、５又は６に記載の抗グラム陰性菌剤。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の項グラム陰性菌剤と、抗生剤を含有することを特徴とする、グラム陰性菌感染症の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陰性菌感染症の予防／治療に有効な薬剤に関する。より詳細には、グラム陰性菌の外膜に存在するＹａｅＴ複合体の形成を阻害することにより、グラム陰性菌に対する殺菌作用、増殖阻害作用、及び／又は薬剤排出阻害作用を発揮することのできる薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
多剤耐性の緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）やアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）等のグラム陰性菌は院内感染症の主要起因菌であり、免疫力が低下した患者を重篤な病態に至らしめる場合がある。これらの菌は多剤耐性を示すために感染症の治療が難しく大きな問題となっている。グラム陰性菌は内膜と外膜という二つの膜を備えており、抗生物質が有効に作用するためには、抗生物質はグラム陰性菌の複雑な膜構造を通過して細胞内部に到達する必要がある。ところが、薬剤修飾酵素、外膜の透過性の低下、標的の変化、薬剤排出ポンプによる薬剤の排出などによって抗生物質の効果が低下し、多剤耐性を獲得するものと考えられている。【０００３】
緑膿菌の多剤耐性獲得に大きく貢献しているのが多剤排出ポンプである。このポンプは、菌内部に入った薬剤をエネルギーを使って積極的に細胞外に輸送、排出する。多剤排出ポンプは幾つかのファミリーに分類され、それらの中で、様々な抗生剤を排出することが知られているＲＮＤ（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ）ファミリーのポンプは３種類のサブユニットから構成されている。緑膿菌には複数のＲＮＤ型ポンプが存在するが、そのうちで主要なポンプはＭｅｘＡＢ−ＯｐｒＭポンプである。【０００４】
本発明者等は、緑膿菌のＭｅｘＡＢ−ＯｐｒＭポンプに着目し、当該多剤排出ポンプを構成するサブユニットであるＯｐｒＭのアミノ酸配列を改変することにより、緑膿菌の薬剤排出ポンプ機能を阻害し、抗生剤の薬効を増強する方法を開発し、当該効果を奏する薬剤並びに当該薬剤をスクリーニングする方法を提案した（特許文献１）。しかしながら、標的配列において変異が生ずると、当該方法の効果が失われる可能性があった。【０００５】
一方、緑膿菌や大腸菌などを含むグラム陰性菌の研究が進んでおり、β−バレルプロテイン（外膜の孔を形成するタンパク質）生合成にＹａｅＴ複合体が必須であることが知られるに至り（非特許文献１）、当該ＹａｅＴ複合体の立体構造も解明されてきている（非特許文献２）。ＹａｅＴは、ＹｆｇＬ、ＹｆｉＯ、ＮｌｐＢ及びＳｍｐＡなる４つのリポタンパク質と複合体を形成することにより、外膜タンパク質（ＯＭＰ）の生合成を司っている。言い換えれば、ＹａｅＴの複合体形成を阻害すれば薬剤排出ポンプを含むＯＭＰの外膜への輸送を阻止することができると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００７／０９１３９５号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｅｏｋｈｅｅ  Ｋｉｍ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．  ３１７，  ｐｐ．９６１−９６４  （２００７）
【非特許文献２】Ｒａｊｅｅｖ  Ｍｉｓｒａ，  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ２，  ｐｐ．６４９−６５１  （２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、グラム陰性菌の外膜におけるＹａｅＴ複合体の形成を阻害することにより、菌の生存に必要な外膜タンパク質（ＯＭＰ）の輸送を遮断する方法及びそのための薬剤を提供し、以てグラム陰性菌の多剤耐性化の問題を根本的に解決することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
よって本発明は、ＹａｅＴ複合体の形成を阻害することによりグラム陰性菌に対する殺菌作用、増殖阻害作用、及び／又は薬剤排出阻害作用を発揮することを特徴とする抗グラム陰性菌剤を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来の抗生物質の存在下及び／又は非存在下で、グラム陰性菌のＹａｅＴ複合体形成を阻害し、それによりグラム陰性菌に対する殺菌作用、増殖阻害作用、及び／又は薬剤排出阻害作用が発揮されるため、外膜タンパク質の変異による多剤耐性化の問題が根本的に解決される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】グラム陰性菌の外膜及び内膜並びにＹａｅＴ複合体と外膜タンパク質との関係を説明する模式図である（非特許文献１から引用）。
【図２】種々のグラム陰性菌のＹｆｇＬの、ＹａｅＴとの結合部位のアミノ酸配列を比較する図である。
【図３】種々のグラム陰性菌のＹｆｉＯの保存領域のアミノ酸配列を比較する図である。
【図４】ＬＴＬＲおよびＬＴＬＲ−ＮＨ２のＰＡＯ１株に対する殺菌作用の濃度依存性を示したグラフである。
【図５】ＬＴＬＲ−ＮＨ２  （５  ｍＭ）  の存在および非存在下でのｎａｌＢ株のＯＦＬＸに対する感受性の変化のグラフである。
【図６】ＬＴＬＲ−ＮＨ２  （５  ｍＭ）  の存在および非存在下でのｎａｌＢ株のＡＺＴに対する感受性の変化のグラフである。
【図７】ＦＩＲＬ−ＮＨ２  （１．５  ｍＭ）  の存在および非存在下でのｎａｌＢ株のＯＦＬＸに対する感受性の変化のグラフである。
【図８】角膜潰瘍モデル（実施例７）における細菌数変化を示すグラフである。
【図９】角膜潰瘍モデル（実施例７）における１２時間後の角膜の外観を示す写真である。
【図１０】角膜潰瘍モデル（実施例７）における２４時間後の角膜の外観を示す写真である。
【図１１】角膜潰瘍モデル（実施例７）における臨床スコア変化を示すグラフである。
【図１２】肺炎モデル（実施例８）における細菌数変化を示すグラフである。
【図１３】肺炎モデル（実施例８）における細菌数変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
上記したように、本発明の抗グラム陰性菌剤は、ＹａｅＴ複合体の形成を阻害することにより、グラム陰性菌に対する殺菌作用、増殖阻害作用、及び／又は薬剤排出阻害作用を発揮することを特徴とする。
【００１３】
本発明における「グラム陰性菌」なる用語は、一般に用いられている意味で使用される。即ち、グラム染色においてクリスタルバイオレットによる染色が脱色される細菌の総称である。代表的なグラム陰性菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ菌、シュードモナス、ヘリコバクター等のプロテオバクテリア及びシアノバクテリアが含まれる。医学に関連して分類すると、桿菌としては、呼吸器系の傷害を惹起する緑膿菌、インフルエンザ菌など、泌尿器系の障害を惹起する大腸菌、ミラビリス変形菌など、消化器系の障害を惹起するヘリコバクター・ピロリ、ゲルトネル菌などが挙げられ、球菌としては、髄膜炎菌、カタラリス菌、淋菌が挙げられる。
【００１４】
グラム陰性菌におけるＹａｅＴ複合体は、膜タンパク質であるＹａｅＴに、ＹｆｇＬ、ＹｆｉＯ、ＮｌｐＢ及びＳｍｐＡなる４つのリポタンパク質が集合して構成されている。中でも、ＹａｅＴ複合体がＯＭＰの生合成を行うためには、ＹｆｇＬ及びＹｆｉＯが結合することが必須とされており、これらのＹａｅＴへの結合を阻害することによりＯＭＰは生合成されないことになる。
【００１５】
よって、本発明の第一の態様は、ＹａｅＴとＹｆｇＬとの結合を阻害することを特徴とする抗グラム陰性菌剤である。
この態様の薬剤を探索するに当たり、本発明者等は、各種グラム陰性菌のＹｆｇＬのＹａｅＴへの結合部位のアミノ酸配列を比較し（図２参照）、高度に保存されている領域を検討した。図２において、四角で囲んだ領域が高度に保存されたアミノ酸残基を示しているが、これらの中で「Ａ」で示した領域のアミノ酸配列を基にして様々なペプチド分子を合成し、その作用を確認した。
【００１６】
その結果、アミノ酸配列「ＬＴＬＲ」を含むペプチド分子を用いた場合、ＹａｅＴとＹｆｇＬとの結合と競合し、それらの結合を有効に阻害できることを見出した。従って、本発明の抗グラム陰性菌剤は、少なくともＬＴＬＲからなるアミノ酸配列を含むペプチドであるのが好ましい。
【００１７】
次に、本発明の第二の態様として、ＹａｅＴとＹｆｉＯとの結合を阻害することに着目した。各種グラム陰性菌のＹｆｉＯのアミノ酸配列を比較したのが図３である。高度に保存された領域の中で、アミノ酸配列「ＦＩＲＬＨＰ」を有するペプチド分子が、ＹａｅＴとＹｆｉＯとの結合と競合し、それらの結合を有効に阻害できることを見出した。当該ペプチド分子は、アミノ酸配列「ＦＩＲＬＨＰ」全てを含まなくても、その一部のアミノ酸配列「ＦＩＲＬ」又は「ＩＲＬＨ」を含んでいれば有効であることも確認された。従って、本発明の抗グラム陰性菌剤は、少なくともＦＩＲＬ又はＩＲＬＨからなるアミノ酸配列を含むペプチドが好ましく、特に、少なくともＦＩＲＬＨＰからなるアミノ酸配列を含むペプチドであるのが好ましい。
【００１８】
また、上記のペプチド分子は、化学修飾されていてもよい。例えば、ペプチド分子のＣ末端をアミド化したものは、未修飾のペプチド分子に比較して殺菌作用が格段に向上する。本発明者等は、Ｃ末端の負電荷がアミド基によって打ち消されるために膜透過性が向上した結果ではないかと考えている。
【００１９】
しかしながら、逆に上記ペプチド分子のＮ末端をアセチル化したものは、その殺菌作用が低下した。
従って、本発明の抗グラム陰性菌剤は、前記のペプチド分子のＣ末端をアミド化したものであるのが好ましい。
【００２０】
本発明において標的としているＹａｅＴとＹｆｇＬ及びＹｆｉＯとの相互作用部位は菌の外膜と内膜の間にあるペリプラズムに存在する（図１参照）。従って、本発明の薬剤（ペプチド分子）が外部から作用部位に到達するためには、外膜を通過する必要がある。
特に未修飾の場合、実用的な濃度で有効性を発揮させるためには、外膜の透過性を向上させる薬剤と同時投与するのが好ましい。
【００２１】
外膜の透過性を向上させる作用を有する薬剤としては、特に限定されるものではないが、細胞膜変質作用を有する抗生剤が挙げられる。具体的には、ポリミキシンＢ、コリスチン等である。
【００２２】
一方、Ｃ末端をアミド化したペプチド分子の場合、上記したようにＣ末端の負電荷が消失しているので、それ自身で外膜を通過できると考えられる。実際に、ポリミキシンＢではなく、膜変質作用を持たない抗生剤であるアズトレオナム（βラクタム剤）を同時投与した場合にも菌の生存率の低下が確認された。
【００２３】
即ち、本発明のアミド化ペプチド分子を用いる場合、膜変質作用を有する抗生剤を同時投与しなくても、当該ペプチド分子が外膜を通過してＹａｅＴ複合体形成部位に到達し、外膜タンパク質の生合成を阻害すると思われる。従って、例えば、膜変質作用を持たない抗生剤を同時投与した場合には、本発明のアミド化ペプチド分子の作用によって膜が脆弱化し、その結果抗生剤に対しより感受性となり、殺菌効果を奏すると考えられる。
【００２４】
よって、本発明の第三の態様は、本発明の抗グラム陰性菌剤（修飾／未修飾）と、抗生剤（膜変質作用の有無によらない）とを含有することを特徴とする、グラム陰性菌感染症の治療薬である。
【００２５】
膜変質作用を持たない抗生剤としては、特に限定されず、従来から一般に使用されているものが使用できる。例えば、セファロスポリン系抗生剤であるセファレキシン、セフォタキシム等、フルオロキノロン系抗生剤であるオフロキサシン、シプロフロキサシン等、アミノグリコシド系抗生剤であるアミカミン等、カルバペネム系抗生剤であるメロペネム等が挙げられる。
【実施例】
【００２６】
以下に具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下に示す実施例等において、グラム陰性菌（緑膿菌又は大腸菌）の生菌数の測定方法は次の通りである。
３７℃で一晩培養した菌の一部をフレッシュなＭＨ培地に添加して、同じ温度で培養を続ける。菌の濁度（６００ｎｍでの吸光度）が０．７?０．８に達したとき、その菌液をＭＨ培地に加えて１００?２００倍希釈した菌液を調製し、実験に供する。
菌液６０?８０μＬとペプチド等の溶液を加えて最終的に１００μＬにした溶液を３７℃で攪拌しながら一定時間（３時間）培養する。培養後、菌液をＰＢＳ溶液で希釈し、その希釈液をＭＨ寒天プレートに播き、３７℃で一晩培養する。翌日プレートに生えたコロニーの数をカウントすることで生菌数を求める。【００２７】
（実施例１）
上記の実験系で、ポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  Ｂ）（最終濃度は０．４μｇ／ｍＬ）（この濃度では緑膿菌の生存に影響がない）を添加して、緑膿菌（ＰＡＯ１株）を培養した。この時、さらにペプチドＬＴＬＲ（ロイシンースレオニンーロイシンーアルギニンの配列をもつ４アミノ酸残基からなるペプチド）を種々の濃度で加えた条件で培養した。それぞれの条件下で、緑膿菌の生菌数を測定し、ペプチドを添加しないときの生菌数に比べて、ペプチド添加によって生菌数がどのように変化するかを測定した。結果を図４（Ａ）のグラフに示した。【００２８】
０．４μｇ／ｍＬのポリミキシンＢ存在下で、緑膿菌の生存率は、ペプチドＬＴＬＲの濃度依存的に減少し、２．５ｍＭのＬＴＬＲを加えて培養した場合には、緑膿菌の生存率はほぼ０％になった。【００２９】
（比較例１）
実施例１において、ペプチドＬＴＬＲの４番目のアミノ酸（Ｒ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換したペプチドＬＴＬＥを合成し、実施例１と同条件で、２．５ｍＭのＬＴＬＥを加えて生菌数の変化を測定した。その結果、緑膿菌の生存率の減少は観察されなかった。従って、実施例１で観察された抗菌作用はアミノ酸配列（ＬＴＬＲ）に特異的であることが示唆された。
（比較例２）
実施例１において、ペプチドＬＴＬＲのアミノ酸配列をランダム化したペプチドＬＲＴＬを合成し、実施例１と同条件で、２．５ｍＭ  のＬＲＴＬを加えて生菌数の変化を測定した。その結果、緑膿菌の生存率の減少は観察されなかった。従って、実施例１で観察された抗菌作用はアミノ酸配列（ＬＴＬＲ）に特異的であることが示唆された。【００３０】
（実施例２）
実施例１で使用したＰＡ０１株（標準株）の緑膿菌に代えて、臨床分離株（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ２４，４２，８３，８８および９２）、ｎａｌＢ  株（薬剤排出ポンプであるＭｅｘＡＢ−ＯｐｒＭを高発現し、高度多剤耐性となった株）、及びｎｆｘＣ株（薬剤排出ポンプであるＭｅｘＥＦ−ＯｐｒＮを高発現し、高度多剤耐性となった株）を用い、それらに対するＬＴＬＲの作用を測定した。この実験ではｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  Ｂの最終濃度を０．２μｇ／ｍＬし、３ｍＭのＬＴＬＲを添加して生存率の変化を調べた。その結果を下記の表１に示す。【００３１】
【表１】
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【００３２】
生存率が最も高かった臨床分離株（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ４２株）であっても、その生存率は半数以下であり、いわゆる高度剤耐性株であるｎａｌＢ株やｎｆｘＣ株においても菌の生存率はほぼゼロであり、本発明のペプチドが多剤耐性菌に対しても有効であることが確認された。【００３３】
（実施例３）
緑膿菌のかわりに大腸菌（ＡＴＣＣ２５９２２）を用い、実施例２と同様の測定を行った。その結果、大腸菌の生存率は約１％という結果が得られた。これによりＬＴＬＲは、緑膿菌のみならず大腸菌を含むグラム陰性菌全般にも作用することが示唆された。【００３４】
（比較例２）
アミノ末端をアセチル化したＬＴＬＲを合成し、その作用を調べた。実施例１と同じ条件下で、ＬＴＬＲをアセチル化ＬＴＬＲに変えて緑膿菌の生存率を調べた。その結果、生存率の減少は観察されず、アセチル化することで抗グラム陰性菌活性が著しく低下したことが示された。【００３５】
（実施例４）
カルボキシ末端をアミド化したＬＴＬＲを合成し、その作用を調べた。実施例１と同じ条件下で、種々濃度のアミド化ＬＴＬＲを加えて、緑膿菌の生存率の変化を検討した。その結果を図４（Ｂ）に示す。アミド化によってＬＴＬＲの活性が増加した事を示しており、カルボキシ末端のアミド化はペプチドの保護作用とともにその活性の増大にも関与することが明らかとなった。
同様の実験結果は大腸菌に対しても得られた。【００３６】
（比較例３）
ＬＴＬＲの長さを変えたときに活性にどのように影響するかを調べるために、カルボキシ末端をアミド化したＴＬＲおよびＬＲをそれぞれ合成し、その活性を測定した。実施例４と同様の条件下で、アミド化したＴＬＲあるいはＬＲを１０ｍＭの濃度加えて、緑膿菌に対する作用を調べた。その結果、菌の生存率の減少は見られなかった。【００３７】
（実施例５）
抗生剤として、膜変質作用を有するポリミキシンＢに代えて、オフロキサシン（ＯＦＬＸ）又はアズトレオナム（ＡＺＴ）を使用した系で、実施例４と同様の実験を行った。結果を図５及び図６に示す。ＯＦＬＸ又はＡＺＴのいずれを用いた系でも、アミド化ペプチド分子（ＬＴＬＲ）を添加した場合、同じ抗生剤濃度における多剤耐性株（ＮａｌＢ）の緑膿菌の生存率は添加しない場合に比較して格段に低下した。即ち、本発明のアミド化ペプチド分子は、外膜を通過して標的部位に到達し、菌を脆弱化したことが示唆された。従って、本発明のアミド化ペプチド分子は、アズトレオナム等の抗生剤の効果を向上させる作用を有することが確認された。【００３８】
（実施例６）
ペプチド分子として、ＹｅａＴとＹｆｉＯとの結合を阻害するＦＩＲＬ（Ｙｆ２Ｂ１）を用い、緑膿菌（ｎａｌＢ）で実施例１と同様の実験を行った。結果を図７に示す。
ＹｅａＴとＹｆｉＯとの結合を阻害するペプチド分子は更に優れた抗グラム陰性菌作用を示すことが確認された。【００３９】
本発明の抗グラム陰性菌剤の一例であるペプチドＦＩＲＬ及びそのアミド化物を用いて以下の動物実験を実施した。【００４０】
（実施例７）
緑膿菌感染によるウサギ角膜潰瘍モデルを用いた実験
日本白色家ウサギ（２ｋｇ、雄）の角膜中央部に傷をつけて多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）を接種することにより潰瘍を形成させた。ウサギを以下の３群（５匹ずつ）に分け、接種の６時間後から各群に次の薬剤の点眼を開始した。点眼はＭＤＲＰ接種後６時間、１２時間、１８時間の３回行った。
第１群：生理食塩水（コントロール）
第２群：オフロキサチン(OFLX)点眼薬（タリビット点眼液０．３％、参天製薬）
第３群：OFLX点眼薬と５０ｍMのＦＩＲＬ／生理食塩水の混合液【００４１】
潰瘍形成１２時間後（点眼開始６時間後）及び潰瘍形成２４時間後（点眼開始１８時間後）に、各群について菌数を測定した。測定方法は次の通りである。
眼脂と角膜を回収し、５ｍＬの生理食塩水を加えてすり鉢で乳化し、ＮＡＣ寒天培地に播種し、２４時間後に菌数をカウントした。結果を図８のグラフに示す。【００４２】
潰瘍形成１２時間後（点眼開始６時間後）、潰瘍形成１８時間後（点眼開始１２時間後）及び潰瘍形成２４時間後（点眼開始１８時間後）に、各群の角膜実質の混濁を観察し、次の方法で臨床スコアを決定した。
角膜潰瘍部を軸に観察領域を１２象限に分割し、各象限における混濁の有無を、混濁有り：１、混濁無し：０により数値化し、各検体に関する臨床スコア（１２象限の合計値）を算出する。
潰瘍形成１２時間後及び２４時間後の各群の検体における角膜の外観を図９及び図１０に示し、潰瘍形成後１２時間から２４時間の臨床スコアの変化を図１１に示す。【００４３】
図８〜１１に示した結果から明らかなように、従来の抗菌剤であるＯＦＬＸを投与した第２群では、潰瘍形成後１２時間の時点ではコントロール群（第１群）より菌数が増加しているのに対し、本発明のグラム陰性菌剤（ＦＩＲＬ）を同時投与した第３群では１２時間後には菌数が格段に減少しており、本発明の抗グラム陰性菌は即効性に優れている。また、臨床スコアにおいても、本発明のグラム陰性菌剤を動じ投与した第３群では、ＯＦＬＸのみを投与した第２群に比較して混濁の解消が早く、その効果も大きいことがわかる。【００４４】
(実施例８)
緑膿菌感染によるマウス肺炎モデルを用いた実験
Ｂａｌｂ／Ｃマウス（７−８週齢、雌）の気管に、１０７ＣＦＵ／マウスの緑膿菌（ＰＡＯ１株）を作用させて肺炎モデルマウスとした。マウスを以下の４群（５匹ずつ）に分け、各群に次の薬剤、各３０μＬを緑膿菌感染と同時に経気管投与した。
第１群：生理食塩水（コントロール）
第２群：アミド化ＦＩＲＬ（２．５ｍＭ）
第３群：硫酸コリスチン（４．７ｍｇ／ｋｇ）
第４群：アミド化ＦＩＲＬ（２．５ｍＭ）と硫酸コリスチン（４．７ｍｇ／ｋｇ）の混合液
６時間後にマウスを屠殺し、細菌数（ＣＦＵ）を測定した。結果を図１２に示す。【００４５】
次に、アミド化ＦＩＲＬの濃度を５．０ｍＭとし、硫酸コリスチン（４．７ｍｇ／ｋｇ）をレボフロキサシン（ＬＶＦＸ）（５．０ｍｇ／ｋｇ）に置換した以外は前記と同様にして第１群から第４群までの細菌数（ＣＦＵ）を測定した。その結果を図１３に示す。【００４６】
図１２及び図１３に示した結果から、アミド化ＦＩＲＬ単独では肺炎モデルに対して即効性は見られなかったが（第２群）、他の抗菌薬と同時投与することにより相乗効果が得られ、他の抗菌薬のみを投与した第３群）に比較して細菌数が１／１０程度に減少したことがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2010147145.tif 000018
2010147145.tif 000019
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