(57)【要約】  本発明は、新規なアミノ酸脱水素酵素、該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを導入された形質転換体に関する。また、本発明は、当該アミノ酸脱水素酵素もしくは当該酵素を生産しうる微生物又は形質転換体を基質化合物に作用させることを特徴とする、Ｌ−アミノ酸、２−オキソ酸、又はＤ−アミノ酸の製造方法にも関する。本発明のアミノ酸脱水素酵素は、従来既知のアミノ酸脱水素酵素では反応性が低かった、芳香環含有基等の嵩高い側鎖を有するアミノ酸又は２−オキソ酸に対しても良好な反応性を示し、有用な光学活性アミノ酸を安価に、効率よく提供することを可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(ａ)、(ｂ)、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡ：
(ａ)配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ；
(ｂ)配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
(ｃ)配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
(ｄ)配列表配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ;
(ｅ)配列表配列番号２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
(ｆ) 配列表配列番号２に示される塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
以下の(ｇ)、(ｈ)又は(ｉ)のポリペプチド:
(ｇ)配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(ｈ)配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド；
(ｉ)配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであって、
一般式（１）
【化１】
2010067578.tif 000013
（式中、Ｒ'は置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数４〜２０のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアラルキル基を示す。また、Ｘは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を示す。）で表される２−オキソ酸に対する活性を有し、かつナフチルピルビン酸に対する活性が、フェニルピルビン酸に対する活性の１／５０以上であるポリペプチド。
【請求項４】
上記一般式（１）において、Ｒ'がインドリルメチル基あるいはフェニルエチル基である請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
ロドコッカス（Rhodococcus）由来である請求項２から４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ロドコッカス  キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii）由来である請求項２から５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ロドコッカス  キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii）ＫＮＫ２１０８由来である請求項２から６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１記載のＤＮＡをベクターに挿入して得られる組換えプラスミド。
【請求項９】
請求項８記載の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１０】
請求項１記載のＤＮＡ、及びシャペロンをコードするＤＮＡで形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１１】
前記宿主微生物がエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）である請求項９又は１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項２から４のいずれか１項に記載のポリペプチドを生産する能力を有し、かつ、ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物。
【請求項１３】
ロドコッカス  キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii）である請求項１２記載の微生物。
【請求項１４】
ロドコッカス  キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii）ＫＮＫ２１０８である請求項１２記載の微生物。
【請求項１５】
請求項２から７のいずれか１項に記載のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取するアミノ酸脱水素酵素の製造方法。
【請求項１６】
前記微生物が、請求項９又は１０記載の形質転換体、又は、請求項１２記載の微生物である、請求項１５に記載のアミノ酸脱水素酵素の製造方法。
【請求項１７】
請求項２から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項９又は１０記載の形質転換体、または請求項１２の微生物を、
一般式（２）
【化２】
2010067578.tif 000014
（式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数２〜２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数２〜２０のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数４〜２０のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアラルキル基を示す。Ｘは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を示す。）で表される２−オキソ酸に作用させ、
一般式（３）
【化３】
2010067578.tif 000015
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＬ−アミノ酸を製造する方法。
【請求項１８】
還元型補酵素再生能を有する酵素の存在下にて行う、請求項１７記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１９】
請求項２から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項９又は１０記載の形質転換体、または請求項１２の微生物を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ存在下、
一般式（４）
【化４】
2010067578.tif 000016
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるラセミ体アミノ酸、又は
一般式（５）
【化５】
2010067578.tif 000017
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＤ−アミノ酸に作用させ、
一般式（３）
【化６】
2010067578.tif 000018
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＬ−アミノ酸を製造する方法。
【請求項２０】
還元型補酵素再生能を有する酵素の存在下にて行う、請求項１９記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２１】
カタラーゼ存在下にて行う、請求項１９又は２０記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２２】
請求項２から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項９又は１０記載の形質転換体、または請求項１２の微生物を、
一般式（３）
【化７】
2010067578.tif 000019
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＬ−アミノ酸、又は
一般式（４）
【化８】
2010067578.tif 000020
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるラセミ体アミノ酸に作用させ、
一般式（２）
【化９】
2010067578.tif 000021
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表される２−オキソ酸、又は
一般式（５）
【化１０】
2010067578.tif 000022
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＤ−アミノ酸を製造する方法。
【請求項２３】
酸化型補酵素再性能を有する酵素の存在下にて行う、請求項２２記載の２−オキソ酸、又はＤ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが請求項９又は１０に記載の形質転換体、又は請求項１２記載の微生物が生産するアミノ酸脱水素酵素である、請求項１７から２１のいずれか１項に記載のＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが請求項９又は１０に記載の形質転換体、又は請求項１２記載の微生物が生産するアミノ酸脱水素酵素である、請求項２２又は２３に記載の２−オキソ酸、又はＤ−アミノ酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の生産する新規なアミノ酸脱水素酵素、これをコードするＤＮＡ、及びアミノ酸脱水素酵素を生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体を用いたアミノ酸脱水素酵素の製造方法、また、アミノ酸脱水素酵素を用いた効率的なＬ−アミノ酸、２−オキソ酸、又はＤ−アミノ酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸脱水素酵素とは、補酵素依存的に２−オキソ酸を還元的にアミノ化する反応、およびその逆反応であるアミノ酸を酸化的に脱アミノ化する反応を触媒する酵素である。例えばアンモニアと補酵素の存在下、２−オキソ酸から高い立体選択性でＬ−アミノ酸を生成するなど、産業上有用な活性をもつことが知られている。Ｌ−アミノ酸は、食品や飼料、農薬、工業用薬品、化粧品や医薬品等の合成中間体として有用であり、また有機合成における光学分割剤やキラルビルディングブロック剤としても重要である。【０００３】
アミノ酸脱水素酵素として、例えばフェニルアラニン脱水素酵素（酵素番号［EC1.4.1.20］）やロイシン脱水素酵素（酵素番号［EC1.4.1.9］）等を挙げることができる。フェニルアラニン脱水素酵素を産生する微生物としては、例えばロドコッカス  エスピー（Rhodococcus sp.）（特許文献１）、ロドコッカス  マリス（Rhodococcus maris）(非特許文献１)、バチラス  バディウス（Bacillus badius）（特許文献２）、バチラス  スフェリカス（Bacillus sphaericus）（非特許文献２）、マイクロバクテリウム  エスピー（Microbacterium sp.）（非特許文献３）、サーモアクチノマイセス  インターメディウス（Thermoactinomyces intermedius）（特許文献３）、ブレビバクテリウム  エスピー（Brevibacterium sp.）（特許文献４）およびスポロサルシナ  ウレアエ（Sporosarcina ureae）（特許文献５、非特許文献４）等の微生物が知られている。【０００４】
アミノ酸脱水素酵素は、酵素が作用しやすい化合物種の違いに応じて分類されている。例えばロイシン脱水素酵素は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシンなどの分岐鎖アミノ酸やＬ−ノルバリンなどの短鎖の直鎖状アミノ酸、およびそれらに対応する２−オキソ酸にはよく作用するが、Ｌ−フェニルアラニンやＬ−チロシンなどの芳香族アミノ酸およびそれらに対応する２−オキソ酸にはほとんど作用しない。それに対して、フェニルアラニン脱水素酵素は前述の芳香族アミノ酸、およびそれらに対応する２−オキソ酸であるフェニルピルビン酸や４−ヒドロキシフェニルピルビン酸によく作用することが知られている。しかしながら、これまで知られているフェニルアラニン脱水素酵素は、ナフチルピルビン酸あるいはホモフェニルピルビン酸等のように、フェニルピルビン酸と比較して、側鎖が大きな構造である２−オキソ酸に対しては活性が弱い（非特許文献２、非特許文献３）。Ｌ−２−ナフチルアラニン、Ｌ−ホモフェニルアラニン等の非天然アミノ酸は、農薬、工業用薬品、化粧品や医薬品等の合成中間体として有用である。【０００５】
また、フェニルアラニン脱水素酵素遺伝子の形質転換体での発現に関しては、例えば、ロドコッカス  エスピー（Rhodococcus sp.）（非特許文献５）、バチラス  バディウス（Bacillus badius）（非特許文献６）、バチラス  スフェリカス（Bacillus sphaericus）（非特許文献７）、スポロサルシナ  ウレアエ（Sporosarcina ureae）（特許文献６）、サーモアクチノマイセス  インターメディウス（Thermoactinomyces intermedius）（非特許文献８）由来の遺伝子について知られている。【０００６】
また、ロドコッカス  エスピー（Rhodococcus sp.）由来、バチラス  スフェリカス（Bacillus sphaericus）由来、あるいはサーモアクチノマイセス  インターメディウス（Thermoactinomyces intermedius）由来のフェニルアラニン脱水素酵素と補酵素再性能を有する酵素を２−オキソ酸に作用させ、Ｌ−アミノ酸へと変換する反応はすでに知られている（特許文献１、非特許文献９、非特許文献１０）
また、牛肝臓由来のグルタミン酸脱水素酵素、あるいはクロストリジューム  サーモアセティカム（Clostridium thermoaceticum）由来のロイシン脱水素酵素とＤ−アミノ酸オキシダーゼおよび補酵素再生能を有する酵素をラセミ体アミノ酸に作用させ、Ｄ−アミノ酸を２−オキソ酸あるいはイミノ酸を経て、Ｌ−アミノ酸へと変換する反応はすでに知られている（非特許文献１０、非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭６１−１４６１８３号公報
【特許文献２】特開昭６３−３２４８２号公報
【特許文献３】特開昭６３−３０４９８０号公報
【特許文献４】特開昭５９−１９８９７２号公報
【特許文献５】特開昭６１−２３９８８７号公報
【特許文献６】特開昭６３−１５７９８６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Journal of Bacteriology, vol.171(1), p30 (1989)
【非特許文献２】有機合成化学、１９８９年、４７巻、８号、７４９頁
【非特許文献３】Arch. Microbiol., vol.169, p.220 (1998)
【非特許文献４】J. of Biological Chemistry, vol.262(21), p10346 (1987)
【非特許文献５】J. of Biological Chemistry, vol.269(23), p16203 (1994)
【非特許文献６】Eur. J. Biochem., vol.168, p153 (1987)
【非特許文献７】Agric. Biol. Chem., vol.51, p2621 (1987)
【非特許文献８】J. Biochem., vol.109(3), p371 (1991)
【非特許文献９】J. Org. Chem., vol.55, p5567 (1990)
【非特許文献１０】Biomolecular Engineering, vol.17, p167 (2001)
【非特許文献１１】J. Chem. Soc.: Chem. Commun., vol.13, p947 (1990)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、フェニルピルビン酸に加え、側鎖が大きいため、従来知られているアミノ酸脱水素酵素では反応性が低かったナフチルピルビン酸およびホモフェニルピルビン酸等の２−オキソ酸に対しても高い活性を有する新規なアミノ酸脱水素酵素を提供することにある。また、本発明の目的は、当該アミノ酸脱水素酵素のアミノ酸配列、その遺伝子のＤＮＡ配列を明らかにし、当該酵素を生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体、及びそれらを用いた当該アミノ酸脱水素酵素の製造方法を提供することにある。さらに本発明の目的は、当該アミノ酸脱水素酵素を利用した効率的なＬ−アミノ酸、２−オキソ酸、又はＤ−アミノ酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題に鑑み、広く土壌よりアミノ酸脱水素酵素活性を有する微生物を探索した結果、優れた新規な性質を有するアミノ酸脱水素酵素を高生産するロドコッカス（Rhodococcus）属細菌を新たに分離した。そして、当該微生物からアミノ酸脱水素酵素を単離、精製し、アミノ酸脱水素酵素遺伝子の単離、ならびに宿主微生物での発現を達成した。さらに、本発明で得たアミノ酸脱水素酵素を単独、あるいは補酵素再生能を有する酵素と組み合わせて２−オキソ酸、ラセミ体アミノ酸、又はＬ-アミノ酸に作用させることにより、Ｌ−アミノ酸、２−オキソ酸、又はＤ−アミノ酸を製造することが可能となり、本発明を完成するに至った。さらに、本発明で得たアミノ酸脱水素酵素をＤ−アミノ酸オキシダーゼおよび補酵素再性能を有する酵素と組み合わせて、ラセミ体アミノ酸、又はＤ−アミノ酸に作用させることにより、Ｌ−アミノ酸を製造することが可能となり、本発明を完成するに至った。【００１１】
本発明は、以下の１または複数の特徴を有する。
１）本発明は、以下の(ａ)、(ｂ)、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡである：
(ａ) 配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ
(ｂ) 配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(ｃ) 配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(ｄ) 配列表配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ
(ｅ) 配列表配列番号２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
(ｆ) 配列表配列番号２に示される塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。【００１２】
２）本発明は、以下の(ｇ)、(ｈ)又は(ｉ)のポリペプチドである:
(ｇ) 配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(ｈ) 配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド
(ｉ) 配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド。【００１３】
３）本発明は、アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであって、一般式（１）【００１４】
【化１】
2010067578.tif 000002
【００１５】
（式中、Ｒ'は置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数４〜２０のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアラルキル基を示す。また、Ｘは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を示す。）で表される２−オキソ酸に対する活性を有し、かつナフチルピルビン酸に対する活性が、フェニルピルビン酸に対する活性の１／５０以上であるポリペプチドである。
４）本発明は、上記一般式（１）において、Ｒ'がインドリルメチル基あるいはフェニルエチル基である前記ポリペプチドである。
５）本発明は、ロドコッカス（Rhodococcus）由来である前記ポリペプチドである。【００１６】
６）本発明は、前記ＤＮＡを含む組換えプラスミドである。【００１７】
７）本発明は、前記組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体である。
８）本発明は、前記ＤＮＡ、及びシャペロンをコードするＤＮＡで形質転換して得られる形質転換体である。【００１８】
９）本発明は、前記ポリペプチドを生産する能力を有し、かつ、ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物である。【００１９】
１０）本発明は、前記ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取するアミノ酸脱水素酵素の製造方法である。
１１）本発明は、前記ポリペプチド（アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド）、形質転換体、または微生物を、一般式（２）【００２０】
【化２】
2010067578.tif 000003
【００２１】
（式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数２〜２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数２〜２０のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数４〜２０のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアラルキル基を示す。また、Ｘは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を示す。）で表される２−オキソ酸に作用させ、
一般式（３）【００２２】
【化３】
2010067578.tif 000004
【００２３】
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＬ−アミノ酸を製造する方法である。【００２４】
１１）本発明は、前記ポリペプチド（アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド）、形質転換体、または微生物を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ存在下、
一般式（４）【００２５】
【化４】
2010067578.tif 000005
【００２６】
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるラセミ体アミノ酸、又は
一般式（５）【００２７】
【化５】
2010067578.tif 000006
【００２８】
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＤ−アミノ酸に作用させ、
一般式（３）【００２９】
【化６】
2010067578.tif 000007
【００３０】
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＬ−アミノ酸を製造する方法である。【００３１】
１２）本発明は、前記ポリペプチド（アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド）、形質転換体、または微生物を、
一般式（３）【００３２】
【化７】
2010067578.tif 000008
【００３３】
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＬ−アミノ酸、又は
一般式（４）【００３４】
【化８】
2010067578.tif 000009
【００３５】
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるラセミ体アミノ酸に作用させ、
一般式（２）【００３６】
【化９】
2010067578.tif 000010
【００３７】
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表される２−オキソ酸、又は
一般式（５）【００３８】
【化１０】
2010067578.tif 000011
【００３９】
（式中、ＲおよびＸは前記と同じ）で表されるＤ−アミノ酸を製造する方法である。
【発明の効果】
【００４０】
本発明は上述の構成からなり、従来から報告のあるアミノ酸脱水素酵素では反応性が低かった基質に対して高い反応性を示す新規なアミノ酸脱水素酵素を効率よく製造することができる。また、当該アミノ酸脱水素酵素、または、当該アミノ酸脱水素酵素を生産する形質転換体、または微生物を利用することで、効率良くＬ−アミノ酸、２−オキソ酸、又はＤ−アミノ酸を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、本発明の実施形態としてのアミノ酸脱水素酵素の作用温度と相対活性との関係（至適温度を含む）を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施形態としてのアミノ酸脱水素酵素の作用ｐＨと相対活性との関係（至適ｐＨを含む）を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施形態としてのアミノ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＲＰＤ００２の構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下、実施形態に基づいて本発明を詳細に説明する。本発明の範囲は、実施形態および実施例によって限定されるものではない。
【００４３】
１．ポリペプチド
まず、本発明の実施形態としてのポリペプチドについて説明する。実施形態としてのポリペプチドは、アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであって、以下のような理化学的性質を有することを特徴とする。
【００４４】
１）作用
アンモニアおよび補酵素の存在下、２−オキソ酸を還元的にアミノ化してＬ−アミノ酸を生成する。あるいは補酵素の存在下、Ｌ−アミノ酸を酸化的に脱アミノ化し、２−オキソ酸、アンモニアを生成する。
【００４５】
２）分子量
分子量約９４,０００
サブユニットの分子量約４６,０００。
【００４６】
３）作用温度の範囲
温度範囲：少なくとも約５℃〜約７０℃
至適温度：約４５℃〜約５０℃
温度範囲とは酵素が好適に作用する温度範囲であり、至適温度は酵素が最も好適に作用する温度である。本酵素は上記温度範囲以外の温度でも作用する。
【００４７】
４）作用ｐＨの範囲
ｐＨ範囲：少なくとも約７．１〜約１１．０
至適ｐＨ約８．８〜約１０．０；
ｐＨ範囲とは酵素が好適に作用するｐＨ範囲であり、至適ｐＨは酵素が最も好適に作用するｐＨである。本酵素は上記範囲以外のｐＨでも作用する。
５）比活性）
純粋酵素１ｍｇあたり    ２０４ｕｎｉｔ（３０℃）。
１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを消費する酵素量を１ｕｎｉｔと定義する。
【００４８】
６）基質特異性
フェニルピルビン酸と比較して、ナフチルピルビン酸、インドールピルビン酸、あるいはホモフェニルピルビン酸等の側鎖が大きな構造の２−オキソ酸に対しても高い活性を有する。ここでいう高い活性とは、フェニルピルビン酸に対する活性の１／５０以上、好ましくは１／２５以上、さらに好ましくは１／１０以上の活性を有することをいう。
【００４９】
また、側鎖が大きな構造の２−オキソ酸とは、前記一般式（１）おいて、Ｒ'が置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数４〜２０のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアラルキル基である２−オキソ酸を表す。
【００５０】
上記Ｒ'における置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアルキル基としては、特に限定されず、例えば、ペンタニル基、ヘキサニル基、ヘプタニル基、オクタニル基等が挙げられる。
【００５１】
置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアルケニル基としは、特に限定されず、例えば、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、又はオクテニル基等が挙げられる。
【００５２】
置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアルキニル基としては、特に限定されず、例えば、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、又はオクチニル基等が挙げられる。
【００５３】
置換基を有していてもよい炭素数４〜２０のアリール基としては、特に限定されず、例えば、フェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、アントラニル基、ピリジル基、ピリミジル基、インダニル基、インデニル基、又はナフチル基等が挙げられる。
【００５４】
置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアラルキル基とは、特に限定されず、例えば、インドリルメチル基、ナフチルメチル基、アントラニルメチル基、インダニルメチル基、インデニルメチル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、ジフェニルメチル基等が挙げられる。
【００５５】
置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、アルキル基、アラルキル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。
【００５６】
また、Ｘは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を表し、特に限定されないが、例えば、水素原子、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどが挙げられる。
【００５７】
実施形態のアミノ酸脱水素酵素は、その基質特異性からフェニルアラニン脱水素酵素（酵素番号［EC1.4.1.20］）に分類される。他のフェニルアラニン脱水素酵素と比べて、例えば以下のような異なる性質を有している。
【００５８】
（ａ）分子量３９，５００のサブユニットからなるホモ四量体構造であるロドコッカス  エスピー（Rhodococcus sp.）（特許文献１、非特許文献５）のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量および構造が大きく異なる。またアミノ酸配列でも大きく異なる（アミノ酸配列同一性６６．９％）。さらに、フェニルピルビン酸に対する酵素活性を１００とした場合、インドールピルビン酸および４−ヒドロキシピルビン酸に対する酵素活性がそれぞれ３および５であり、酵素活性の比率が大きく異なる。
【００５９】
（ｂ）分子量３６，０００のサブユニットからなるホモ二量体構造であるロドコッカス  マリス（Rhodococcus mariｓ） (非特許文献１)のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量が大きく異なる。また、フェニルピルビン酸に対する酵素活性を１００とした場合、インドールピルビン酸および２−オキソ−４−（メチルチオ）ブタン酸に対する酵素活性がそれぞれ５および９であり、酵素活性の比率が大きく異なる。
【００６０】
（ｃ）分子量４１，０００〜４２，０００のサブユニットからなるホモ八量体構造であるバチラス  バディウス（Bacillus badius）（非特許文献２、非特許文献６）のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量および構造が大きく異なる。またアミノ酸配列でも大きく異なる（アミノ酸配列同一性３６．１％）。
【００６１】
（ｄ）分子量３９，０００のサブユニットからなるホモ八量体構造であるバチラス  スフェリカス（Bacillus sphaericus）（非特許文献２、非特許文献７）のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量および構造が大きく異なる。またアミノ酸配列でも大きく異なる（アミノ酸配列同一性３６．６％）。さらに、フェニルピルビン酸に対する酵素活性を１００とした場合、ナフチルピルビン酸、ホモフェニルピルビン酸、およびインドールピルビン酸に対する酵素活性がそれぞれ、０．４６、３．４、および０．３９であり、酵素活性の比率が大きく異なる。
【００６２】
（ｅ）分子量４１，０００のサブユニットからなるホモ八量体構造であるマイクロバクテリウム  エスピー（Microbacterium sp.）（非特許文献３）のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量および構造が大きく異なる。また、フェニルピルビン酸に対する酵素活性を１００とした場合、ホモフェニルピルビン酸に対する酵素活性が０．１であり、酵素活性の比率が大きく異なる。
【００６３】
（ｆ）分子量４１，０００のサブユニットからなるホモ六量体構造であるサーモアクチノマイセス  インターメディウス（Thermoactinomyces intermedius）（特許文献３、非特許文献８）のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量および構造が大きく異なる。またアミノ酸配列でも大きく異なる（アミノ酸配列同一性３２．９％）。さらに、フェニルピルビン酸に対する酵素活性を１００とした場合、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸に対する酵素活性が０であり、酵素活性の比率が大きく異なる。
【００６４】
（ｇ）分子量６６，０００±５０００のサブユニットからなるホモ二量体構造であるブレビバクテリウム  エスピー（Brevibacterium sp.）（特許文献４）のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量が大きく異なる。また、純粋酵素の比活性も大きく異なる。
【００６５】
（ｈ）分子量３９，０００のサブユニットからなるホモ八量体構造であるスポロサルシナ  ウレアエ（Sporosarcina ureae）（特許文献５、非特許文献４）のフェニルアラニン脱水素酵素とは、酵素の分子量および構造が異なる。またアミノ酸配列でも大きく異なる（アミノ酸配列同一性３５．４％）。さらに、フェニルピルビン酸に対する酵素活性を１００とした場合、インドールピルビン酸に対する酵素活性が０．７３であり、酵素活性の比率が大きく異なる。
【００６６】
なお、実施形態における「配列同一性」は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。ここでは、例示としてＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７遺伝情報処理ソフトウェア／Ｗｉｎｄｏｗｓ版（ゼネティックス社製）のホモロジー検索を使用した。
【００６７】
２．アミノ酸脱水素酵素活性測定
実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸脱水素酵素活性測定は、例えば、１０ｍＭの基質フェニルピルビン酸を含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）１．５ｍｌに、０．５Ｍ  ＮＨ３／ＮＨ４Ｃｌ緩衝液（ｐＨ９．０）１．２ｍｌ、３ｍＭの補酵素ＮＡＤＨを含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）０．２ｍｌ、および適宜希釈した酵素溶液０．１ｍｌを添加し、３０℃で１分間反応させた際の、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出できる。実施形態では、特に明記しない場合を除き、本方法を用いてアミノ酸脱水素酵素活性を測定した。
【００６８】
３．微生物
実施形態のポリペプチドは、アミノ酸脱水素酵素活性を有する微生物から取得できる。同ポリペプチドを生産する微生物であれば特に限定されないが、例えばロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物が挙げられ、なかでもロドコッカス  キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii)が好ましく、より好ましくはロドコッカス  キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii)ＫＮＫ２１０８株である。
【００６９】
上記のロドコッカス  キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii)ＫＮＫ２１０８株は、本発明において発明者らが分離、取得した菌株であり、平成２０年１１月２６日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０６７として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番１号  つくばセンター中央第６）に寄託されている。
【００７０】
以下に、ロドコッカス  キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii)ＫＮＫ２１０８株の菌学的性質を示す。
【００７１】
１．形態
１）桿菌  ｒｏｄ−ｃｏｃｃｕｓ  ｃｙｃｌｅあり
２４時間：直径０．７−０．８μｍ×１．５−２．５μｍ程度
７２時間：直径０．６−０．７μｍ×１．０−１．２μｍ程度
２）グラム染色：陽性。
３）運動性：無し。
４）胞子の有無：無し。
５）寒天平板培地培養でのコロニー形態：円形、周縁全縁、半球状、表面の形状スムーズ、不透明、粘稠度バター様、淡いオレンジ色。
【００７２】
２．培養的性質
１）生育温度試験：３７℃（＋）、４５℃（−）。
【００７３】
３．生理学的性質
１）カタラーゼ反応：＋
２）オキシダーゼ反応：−
３）グルコースからの酸／ガス産生（酸産生／ガス産生）：−／−
４）Ｏ／Ｆテスト（酸化／発酵）：−／−
５）発酵性試験
グルコース：−
リボース：−
キシロース：−
マンニトール：−
マルトース：−
乳糖：−
白糖：−
グルコーゲン：−
６）生化学試験
硝酸塩還元：−
ピラジンアミダーゼ：−
ピロリドニルアリルアミダーゼ：−
アルカリフォスフォターゼ：＋
β−グルクロニダーゼ：−
β−ガラクトシダーゼ：−
α−グルコシダーゼ：＋
Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ：−
エスクリン（β−グルコシダーゼ）：−
ウレアーゼ：＋
ゼラチン加水分解：−
７）嫌気での生育：−
８）デンプンの加水分解：−
９）ＭＲ（メチルレッド試験）：−
１０）ＶＰ（アセトイン産生）：−。
【００７４】
上記の菌学的性質、及び、１６ＳｒＤＮＡ配列解析から、ＫＮＫ２１０８株はロドコッカス  キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii)と同定された。
【００７５】
なお、実施形態のポリペプチドを生産する微生物は、上述した微生物の野生株であっても良いし、変異改良された変異株であってもよい。変異株は、ＵＶ照射や、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の薬剤による処理といった当業者に周知の方法で取得することができる。
【００７６】
本発明のポリペプチドを生産する微生物を培養する培地としては、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類、窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキスなど、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウムなど、他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地が使用され得る。
【００７７】
更に、アミノ酸脱水素酵素の生産を増強させるような物質、例えば、アミノ酸又はアミノ酸誘導体を少量添加することもできる。これらアミノ酸脱水素酵素生産増強物質の培地中濃度は、０．００１重量％以上、１０重量％以下、好ましくは０．０１重量％以上、１重量％以下の範囲から選ばれる。
【００７８】
培養は通常好気的に行い、温度として１０℃以上、６０℃以下、好ましくは２０℃以上、５０℃以下の範囲、ｐＨとしては３以上、１１以下、好ましくはｐＨ５以上、９以下の範囲が用いられ、培養時間は１日以上、５日間以下程度で行い得る。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。
【００７９】
培養終了後に培養液から遠心分離などにより菌体を集め、超音波破砕などの手段により菌体を破砕して粗酵素液を得る。この粗酵素液を、塩析法、カラムクロマトグラフィー法などにより精製することで、本発明のポリペプチドを得ることができる。
【００８０】
４．アミノ酸配列
本発明のポリペプチドは、上記のように微生物から取得される天然酵素であってもよいし、遺伝子組換え技術を利用して生産される組換え酵素であってもよい。天然酵素としては、配列表の配列番号１に示されるポリペプチドをあげることができる。
【００８１】
また、本発明の実施形態としてのポリペプチドは、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであってもよいし、配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドであってもよい。「数個のアミノ酸」とは、アミノ酸脱水素酵素活性が失われない限り、その個数は制限されないが、例えば２５アミノ酸以下であり、好ましくは２０アミノ酸以下、より好ましくは１５アミノ酸以下、さらに好ましくは１０アミノ酸以下、最も好ましくは、５、４、３、または２個以下である。
【００８２】
また、「アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド」とは、上記の活性測定条件において、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上の活性を示すポリペプチドのことをいう。
【００８３】
５．ＤＮＡ
本発明の実施形態としての「ＤＮＡ」について説明する。本発明のＤＮＡは、上記のようなポリペプチドをコードするＤＮＡであればよい。配列表の配列番号２で示されるＤＮＡであってもよいし、配列表配列番号２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。「数個の塩基」とは、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドがアミノ酸脱水素酵素活性を失われない限り、その個数は制限されないが、好ましくは５０塩基以下であり、より好ましくは３０塩基以下、さらに好ましくは２０塩基以下、最も好ましくは、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個以下である。
【００８４】
また、配列番号２で示される塩基配列と７０％以上、好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつアミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。
【００８５】
また、本発明のＤＮＡとしては、配列表配列番号２で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、アミノ酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。
【００８６】
ここで「配列表配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を実施した際に、配列表配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、特異的にハイブリッドを形成し得るＤＮＡを言う。
【００８７】
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、および、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ  ４００（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）の組成からなる水溶液中、６５℃でハイブリダイズさせた後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６０℃で洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、上記条件でハイブリダイズさせた後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件であり、より好ましくは、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件である。
【００８８】
本発明のＤＮＡ（アミノ酸脱水素酵素遺伝子）は、前述したようなアミノ酸脱水素酵素活性を有する微生物から取得することができる。目的のＤＮＡを取得するには、例えば以下の方法によることができる。
【００８９】
まず、アミノ酸脱水素酵素活性を有する微生物より精製されたアミノ酸脱水素酵素のＮ末端のアミノ酸配列を、気相プロテイン・シークエンサーなどで決定する。また、精製されたアミノ酸脱水素酵素にＶ８プロテアーゼ等のプロテアーゼを作用させて適当な大きさのポリペプチドに消化した後、ＨＰＬＣ等を用いて得られたポリペプチドを精製し、上記と同様の方法に従って内部アミノ酸配列を決定する。このようにして得られたＮ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列にもとづいて設計したＤＮＡプライマーを合成する。
【００９０】
次に、アミノ酸脱水素酵素の起源となる微生物より、染色体ＤＮＡを単離する。染色体ＤＮＡは、培養された細胞から、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories, Inc.社製）等を用いて得られる。この染色体ＤＮＡを鋳型に、上記のＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、目的遺伝子の一部を取得できる。
【００９１】
次に、既に取得した部分遺伝子のさらにＮ末側とＣ末側をコードするＤＮＡ断片を、インバースＰＣＲ法により取得することができる（例えばNucleic Acids Res., vol.16, p8186 (1988)を参照）。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定後、酵素のＮ末端をコードするＤＮＡよりも上流、Ｃ末端をコードするＤＮＡより下流と推定されるＤＮＡの塩基配列にもとづきＤＮＡプライマーを作成して、この配列の間のＤＮＡを先に得た染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより増幅することで目的アミノ酸脱水素酵素遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得できる。
【００９２】
次いで、得られたアミノ酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片をベクターＤＮＡとＴ４  ＤＮＡリガーゼなどを用いて結合させることにより組換えプラスミドを得ることができる。このプラスミドを用いて、ベクターに挿入したアミノ酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片部分の塩基配列を解析、アミノ酸脱水素酵素のＮ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列をコードする塩基があることを確認し、また、これより翻訳開始部位と終止コドンを確認することでオープンリーディングフレームを決定する。
【００９３】
６．形質転換体・ベクター
上記方法によって取得したＤＮＡ、または該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換えプラスミドを用いることにより、宿主微生物を形質転換し形質転換体を得ることができる。
【００９４】
宿主、ベクターとしては、「組換えＤＮＡ実験指針」（科学技術庁研究開発局ライフサイエンス課編：平成８年３月２２日改定）に記載の宿主―ベクター系を用いることができる。
【００９５】
例えば、宿主としては、エシェリヒア（Escherichia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、バチルス（Bacillus）属、セラチア（Serratia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アセトバクター（Acetobacter）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、又はロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物を用いることができる。
【００９６】
ベクターは上記の宿主内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまたはその誘導体が使用できる。なかでも、宿主微生物としてエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、ベクターとして当該微生物中で自律複製できるベクターを用いるのが好ましい。このようなベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＳＣ１０１、ｐＴ７Ｂｌｕｅ、又はｐＵＣＮＴ、若しくはそれらの誘導体を挙げることができる。それらの誘導体とは、酵素の生産量上昇、プラスミド安定化を目的として、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ＳＤ配列、複製開始部位（ｏｒｉ）、その他の調節などに関わる遺伝子を改質したもの、また、薬剤耐性、クローニング部位の制限酵素サイトを改質したものなどを指す。
【００９７】
形質転換体によっては、生産された酵素が不溶化し、インクルージョンボディーを形成する場合がある。このような場合には、培養条件を変更する、宿主微生物を変更する、あるいは目的遺伝子とシャペロン遺伝子を宿主微生物内で同時発現させることで、酵素の不溶化を回避できる場合がある。シャペロンとは、生体内で、蛋白質の正常な立体構造への折りたたみを介助する役割を持つ蛋白質である（例えばAppl. Biochem. Biotech.,  vol.66, pp197-238 (1997)を参照）。
【００９８】
形質転換体の一例として、ロドコッカス  キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii)ＫＮＫ２１０８株から上記のようにして取得したＤＮＡをｐＵＣＴ（ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３参照）のＮｄｅＩサイトを破壊したプラスミドベクター）に組み込んだ組換えプラスミドｐＲＰＤ００２を用いて、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１を形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２）を得ることができる。
【００９９】
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１の菌学的性質は、「BIOCHEMICALS FOR LIFE SCIENCE」（東洋紡績株式会社、１９９３年、１１６−１１９頁）およびその他種々の公知文献に記載されており当業者に周知である。エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２）は、遺伝子組換えによって特定の酵素を産生し得る性質以外は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１と同様の菌学的性質を有する。
【０１００】
なお、本発明で用いた組換えＤＮＡ技術は当該分野において周知であり、例えば、Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、 (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)に記載されている。
【０１０１】
７．形質転換体等の培養
本発明のアミノ酸脱水素酵素を生産しうる上記形質転換体等を培養することにより当該酵素を大量に生産することができ、Ｌ−アミノ酸、２−オキソ酸、又はＤ−アミノ酸の製造に利用することができる。
【０１０２】
微生物の培養は、通常の培地を用いて行えば良い。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源および無機塩類などの栄養素を含む通常の培地で良い。これに、ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコースやシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜使用される。窒素源としては、アンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素などが用いられる。
【０１０３】
培養は温度範囲２５℃から４０℃で行えるが、２５℃から３７℃が特に好ましい。また、ｐＨは４から８で培養できるが５から７．５が好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。
【０１０４】
必要に応じてイソプロピル−１−チオ−β―Ｄ−ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）、ラクトース等の添加等の酵素誘導のための処理を行なうこともできる。
【０１０５】
８．Ｌ−アミノ酸等の製造方法
実施形態で得られるアミノ酸脱水素酵素を使用することによる、効率的なＬ−アミノ酸、２−オキソ酸、又はＤ−アミノ酸の製造方法について説明する。２−オキソ酸は、ラセミ体アミノ酸、又はＬ−アミノ酸にアミノ酸脱水素酵素を作用させ、Ｌ−アミノ酸を酸化することにより得ることができる（酸化的脱アミノ化反応）。Ｄ−アミノ酸は、前記酸化的脱アミノ化反応において、ラセミ体アミノ酸を基質とした時の残基質として得ることが可能である。Ｌ−アミノ酸は、２−オキソ酸にアミノ酸脱水素酵素を作用させ、２−オキソ酸を還元的にアミノ化することにより得ることができる（還元アミノ化反応）。またＬ−アミノ酸は、ラセミ体アミノ酸、又はＤ−アミノ酸にＤ−アミノ酸オキシダーゼを作用させ、Ｄ−アミノ酸を２−オキソ酸へと酸化し、さらにアミノ酸脱水素酵素を接触せしめ、反応させることにより、Ｌ−アミノ酸へと変換することもできる（立体反転反応）。
【０１０６】
９．Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
ここでＤ−アミノ酸オキシダーゼとは、酸素の存在下、Ｄ−アミノ酸を酸化し、２−オキソ酸、過酸化水素、及びアンモニアを生成する酵素である。本発明で用いるＤ−アミノ酸オキシダーゼとしては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの生産能力を有する微生物としては、例えば、以下の公知の当該酵素の生産能力を有する微生物である、アースロバクター（Arthrobacter）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、キャンディダ（Candida）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、クルブラリア（Curvularia）属、エクソフィアラ（Exophiala）属、フサリウム（Fusarium）属、ジベレラ（Gibberella）属、ハンセヌラ（Hansenula）属、クオエッケラ（Kloeckera）属、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属、ニューロスポラ（Neurospora）属、ピキア（Phichia）属、ロドスポリディウム（Rhodosporidium）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、トリゴノプシス（Trigonopsis）属、バーチシリウム（Verticillium）属、及びヤロヴィア（Yarrowia）属等が挙げられる。
【０１０７】
好ましくはキャンディダ（Candida）属に属する微生物由来の酵素が挙げられ、なかでもキャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）由来の酵素が好ましく、さらに好ましくは、キャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株由来の酵素が挙げられる。
【０１０８】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例えばＷＯ０７／０１５５１１記載のように、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を示す菌株からＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子をクローニングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換えＤＮＡ技術については当該分野において周知である。
【０１０９】
このようにして得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼを高生産する形質転換体としてはＷＯ０７／０１５５１１記載の、キャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含有するエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ-１０６３９）又はエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３８）を挙げることができる。
【０１１０】
これら形質転換体によるＤ−アミノ酸オキシダーゼ、あるいは前述のＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を示す菌株によるＤ−アミノ酸オキシダーゼの生産は、例えば、ＷＯ０７／０１５５１１記載の、通常の栄養培地を用いて培養を行なえば良く、必用に応じて、酵素誘導のための処理を行うこともできる。
【０１１１】
１０．補酵素再生系
アミノ酸脱水素酵素による還元アミノ化反応は、ＮＡＤＨのような還元型の補酵素を必要とし、当該反応の進行に伴い、補酵素ＮＡＤＨは酸化型に変換される。この酸化型の補酵素を還元型に変換する能力（以後、還元型補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素、および、当該酵素の基質となる化合物を、アミノ酸脱水素酵素と共存させて当該反応を行うことにより、補酵素の使用量を大幅に削減できる。
【０１１２】
還元型補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素などを使用できる。
【０１１３】
好適には、ギ酸脱水素酵素が使用される。ギ酸脱水素酵素としては、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できるが、例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物である、キャンディダ（Candida）属、クロイッケラ（Kloeckera）属、ピキア（Pichia）属、リポマイセス（Lipomyces）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、モラキセラ（Moraxella）属、ハイホマイクロビウム（Hyphomicrobium）属、パラコッカス（Paracoccus）属、チオバシラス（Thiobacillus）属、アンシロバクター（Ancylobacter）属がある。
【０１１４】
好ましくはチオバシラス（Thiobacillus）属、アンシロバクター（Ancylobacter）属に属する微生物由来の酵素が挙げられる。さらに好ましくはチオバシラス  エスピー（Thiobacillus sp．）ＫＮＫ６５ＭＡ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１）、アンシロバクター  アクアティカス（Ancylobacter aquaticus）ＫＮＫ６０７Ｍ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３３５）由来の酵素が挙げられる。
【０１１５】
ギ酸脱水素酵素を効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例えばＷＯ０３／０３１６２６記載のように、ギ酸脱水素酵素活性を示す菌株からギ酸脱水素酵素遺伝子をクローニングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換えＤＮＡ技術については当該分野において周知である。
【０１１６】
このようにして得られたギ酸脱水素酵素を高生産する形質転換体としてはＷＯ０３／０３１６２６記載の、チオバシラス  エスピー（Thiobacillus sp.）ＫＮＫ６５ＭＡ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１）由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含有するエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ-７６７２）又はエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７３）、又はＷＯ０２／４６４２７記載の、アンシロバクター  アクアティカス（Ancylobacter aquaticus）ＫＮＫ６０７Ｍ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３３５）由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含有するエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＡ００１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３３４）を挙げることができる。
【０１１７】
これら形質転換体によるギ酸脱水素酵素の生産、あるいは前述のギ酸脱水素酵素活性を示す菌株によるギ酸脱水素酵素の生産は、例えば、ＷＯ０３／０３１６２６記載の、通常の栄養培地を用いて培養を行なえば良く、必用に応じて、酵素誘導のための処理を行うこともできる。
【０１１８】
アミノ酸脱水素酵素による酸化的脱アミノ化反応は、ＮＡＤのような酸化型の補酵素を必要とし、当該反応の進行に伴い、補酵素ＮＡＤは還元型に変換される。この還元型の補酵素を酸化型に変換する能力（以後、酸化型補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素、および、当該酵素の基質となる化合物を、アミノ酸脱水素酵素と共存させて当該反応を行うことにより、補酵素の使用量を大幅に削減できる。
【０１１９】
酸化型補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えばＮＡＤＨオキシダーゼ等が挙げられる。ＮＡＤＨオキシダーゼは、補酵素再生反応のための基質として酸素が利用できること、その多くがＮＡＤＨに特異的であり、また触媒される反応が不可逆的である点などにおいて好ましい。なお、ＮＡＤＨオキシダーゼには水を生成するもの（水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ）と過酸化水素を生成するもの（過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼ）の２種が知られているが、過酸化水素は酵素などに悪影響を与えることが知られており、その点で、水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼがより好ましい。
【０１２０】
上記水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼの酵素源としては、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトバシルス（Lactobacillus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ロイコノストック（Leuconostock）属、エンテロコッカス（Entrococcus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、メタノコッカス（Methanococcus）属、セルプリナ（Serpulina）属、マイコプラズマ（Mycoplasma）属、ジアルディア（Giardia）属からなる群から選ばれた微生物由来の酵素群が挙げられ、好ましくはストレプトコッカス（Streptococcus）属微生物、さらに好ましくはストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、さらに好ましくはストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）ＮＣＩＭＢ１１７２３由来の酵素群が挙げられる。ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）ＮＣＩＭＢ１１７２３由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼは、そのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列はすでに報告されている(特開平８−１９６２８１)。
【０１２１】
１１．カタラーゼの添加
前記立体反転反応には、カタラーゼを添加してもよい。カタラーゼを添加しない場合にも反応は進行し、生成物を得ることができるが、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ反応で生成する過酸化水素により基質、反応中間体、あるいは生成物が分解され、収率が低下する可能性がある。カタラーゼを添加することで、そのような基質、反応中間体、あるいは生成物の分解を抑えることができ、収率の向上が期待できる。カタラーゼは過酸化水素を水と酸素に分解する反応を触媒する酵素である。
【０１２２】
カタラーゼとしては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できるが、例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物である、エシェリヒア（Escherichia）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、マイクロコッカス（Micrococcus）属、又はロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属等がある。
【０１２３】
また、市販の酵素も使用することもできる。市販酵素としては例えば、Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）、Ｔｅｒｍｉｎｏｘ  Ｕｌｔｒａ  ２００Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）、ＣＡＴＡＬＡＳＥ（Ｂｅｅｆ  Ｌｉｖｅｒ）（Ｐ−Ｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社製）がある。
【０１２４】
１２．形質転換体等
なお、本発明において使用するアミノ酸脱水素酵素、補酵素再生能を有する酵素、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、カタラーゼは、それぞれの酵素遺伝子を導入した形質転換体を育種し、培養して生産したものを使用してもよいし、複数の酵素遺伝子を導入した形質転換体を育種し、培養して生産したものを使用してもよい。
【０１２５】
本発明において、生産されたアミノ酸脱水素酵素、補酵素再生能を有する酵素、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、およびカタラーゼは、酵素自体として用いることができるほか、微生物もしくはその処理物としても用いることができる。ここで、微生物の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、またはそれらの菌体の破砕物を意味する。
【０１２６】
更にそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化して得た固定化酵素として用いられ得る。固定化は当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法などで行い得る。
【０１２７】
１３．Ｌ−アミノ酸等の生産
本発明の酸化的脱アミノ化反応による２−オキソ酸、又はＤ−アミノ酸の生産、還元アミノ化反応によるＬ−アミノ酸の生産、又は立体反転反応によるＬ−アミノ酸の生産は以下の方法で行なうことができる。
【０１２８】
酸化的脱アミノ化反応の基質としては、前記一般式（３）で表されるＬ−アミノ酸、又は前記一般式（４）で表されるラセミ体アミノ酸が挙げられる。還元アミノ化反応の基質としては、前記一般式（２）で表される２−オキソ酸が挙げられる。立体反転反応の基質としては、前記一般式（４）で表されるラセミ体アミノ酸、又は前記一般式（５）で表されるＤ−アミノ酸が挙げられる。
【０１２９】
これらの基質において、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数２〜２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数２〜２０のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数４〜２０のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアラルキル基を示す。
【０１３０】
上記Ｒにおける置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基としては、特に限定されず、例えば、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、１−メチルプロピル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、メルカプトメチル基、２−メチルチオエチル基、（１−メルカプト−１−メチル）エチル基、４−アミノブチル基、３−グアニジノプロピル基、４（５）−イミダゾールメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンタニル基、ヘキサニル基、ヘプタニル基、オクタニル基、２，２−ジメチルプロピル基、クロロメチル基、メトキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−アミノプロピル基、２−シアノエチル基、３−シアノプロピル基、４−（ベンゾイルアミノ）ブチル基、又は２−メトキシカルボニルエチル基等が挙げられる。
【０１３１】
置換基を有していてもよい前記炭素数２〜２０のアルケニル基としては、特に限定されず、例えば、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、又はオクテニル基等が挙げられる。
【０１３２】
置換基を有していてもよい前記炭素数２〜２０のアルキニル基としては、特に限定されず、例えば、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、又はオクチニル基等が挙げられる。
置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアラルキル基としては、特に限定されず、例えば、ベンジル基、インドリルメチル基、チアゾールメチル基、４−ヒドロキシベンジル基、ナフチルメチル基、アントラニルメチル基、ピリジルメチル基、ピリミジルメチル基、インダニルメチル基、インデニルメチル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、ジフェニルメチル基、２−フルオロベンジル基、３−フルオロベンジル基、４−フルオロベンジル基、又は３，４−メチレンジオキシベンジル基等が挙げられる。
【０１３３】
置換基を有していてもよい炭素数４〜２０のアリール基としては、フェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、アントラニル基、ピリジル基、ピリミジル基、インダニル基、インデニル基、又はナフチル基等が挙げられる。
【０１３４】
置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、アルキル基、アラルキル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。
【０１３５】
また、Ｘは水素原子、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を表し、特に限定されないが、例えば、水素原子、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどが挙げられる。  １４．酸化的脱アミノ化反応
酸化的脱アミノ化反応では、上記基質に前述のアミノ酸脱水素酵素、前述の補酵素再生能を有する酵素とその基質となる化合物を同時に存在させ、水性媒体中で反応を行なう。上記酸化的脱アミノ化反応には、ＮＡＤ等の補酵素を添加してもよい。ＮＡＤ等の補酵素を添加しない場合にも、微生物中に存在するＮＡＤ等の補酵素により反応が進行する場合もあるが、ＮＡＤ等の補酵素を添加することで、反応の効率が向上することが期待できる。ＮＡＤ等の補酵素の添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、２当量以下、より好ましくは０．００００１当量以上、０．１当量以下、さらに好ましくは０．０００１当量以上、０．０１当量以下である。
【０１３６】
１５．還元アミノ化反応
還元アミノ化反応では、上記基質に前述のアミノ酸脱水素酵素、アンモニア又はその塩、および前述の補酵素再生能を有する酵素とその基質となる化合物を同時に存在させ、水性媒体中で反応を行なう。上記還元アミノ化反応には、ＮＡＤ等の補酵素を添加してもよい。ＮＡＤ等の補酵素を添加しない場合にも、微生物中に存在するＮＡＤ等の補酵素により反応が進行する場合もあるが、ＮＡＤ等の補酵素を添加することで、反応の効率が向上することが期待できる。ＮＡＤ等の補酵素の添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、２当量以下、より好ましくは０．００００１当量以上、０．１当量以下、さらに好ましくは０．０００１当量以上、０．０１当量以下である。
【０１３７】
１６．立体反転反応
立体反転反応では、上記基質に前述のＤ−アミノ酸オキシダーゼ、前述のアミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素とその基質となる化合物を同時に存在させ、水性媒体中で反応を行なう。反応にはカタラーゼを添加してもよい。カタラーゼを添加することでＤ−アミノ酸オキシダーゼの反応で生成する過酸化水素を分解し、基質、反応中間体、あるいは生成物の分解を抑えることができる。
【０１３８】
また、上記反応にＦＡＤを添加してもよい。ＦＡＤはＤ−アミノ酸オキシダーゼの補酵素であり、添加することにより、反応の効率が向上することが期待できる。ＦＡＤの添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、１０当量以下、より好ましくは０当量以上、１当量以下、さらに好ましくは０当量以上、０．１当量以下である。
【０１３９】
また、上記立体反転反応にはＮＡＤ等の補酵素を添加してもよい。ＮＡＤ等の補酵素を添加しない場合にも、微生物中に存在するＮＡＤ等の補酵素により反応が進行する場合もあるが、ＮＡＤ等の補酵素を添加することで、反応の効率が向上することが期待できる。ＮＡＤ等の補酵素の添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、２当量以下、より好ましくは０．００００１当量以上、０．１当量以下、さらに好ましくは０．０００１当量以上、０．０１当量以下である。
【０１４０】
また、上記立体反転反応にアンモニア又はその塩を添加してもよい。アンモニアの添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、１０当量以下、より好ましくは０当量以上、２当量以下、さらに好ましくは０．１当量以上、１．５当量以下である。
【０１４１】
上記酸化的脱アミノ化反応、還元アミノ化反応、および立体反転反応の基質の仕込み濃度は０．１％（ｗ／ｖ）以上、９０％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上、６０％（ｗ／ｖ）以下で溶解または懸濁した状態で反応を行い、上記酸化的脱アミノ化反応、還元アミノ化反応、および立体反転反応における反応温度は１０℃以上、８０℃以下、好ましくは２０℃以上、６０℃以下の適当な温度で調節し、ｐＨ４以上、１２以下、好ましくはｐＨ６以上、１１以下に保ちつつ暫時静置または攪拌すればよい。また、基質は一括添加してもよいし、分割添加してもよいし、連続的に添加してもよい。上記酸化的脱アミノ化反応、還元アミノ化反応、および立体反転反応は、バッチ法または連続方式で行い得る。
【０１４２】
本発明の酸化的脱アミノ化反応、還元アミノ化反応、および立体反転反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。水性媒体としては、水、緩衝液、これらにエタノールのような水溶性有機溶媒を含む水性媒体、あるいは、水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒を含む水性媒体との２層系などの適当な溶媒を用いることができる。さらに必用に応じて、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、金属などを添加することもできる。
【０１４３】
１７．生成物の単離
生成したＬ−アミノ酸、２―オキソ酸、又はＤ−アミノ酸の単離は、常套分離方法、例えば、抽出、濃縮、晶析、またはカラムクロマトグラフィーなどの分離方法や、それらの組み合わせにより分離、精製することができる。
【実施例】
【０１４４】
以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【０１４５】
（実施例１）アミノ酸脱水素酵素の単離・精製
ロドコッカス  キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii)ＫＮＫ２１０８株を、５００ｍｌ坂口フラスコ内で滅菌した５０ｍｌの培地（肉エキス１．０％、ポリペプトン１．０％、イーストエキス０．５％、ＮａＣｌ０．３％、滅菌前ｐＨ７．０）に植菌して３０℃で２３時間、好気的に振とう培養した。この培養液３０ｍｌを５Ｌジャーファーメンター内で滅菌した３Ｌの培地Ａ（Ｌ−Ｐｈｅ１．０％、ポリペプトン０．１％、イーストエキス０．１％、肉エキス０．１％、ＫＨ２ＰＯ４０．４５％、Ｎａ２ＨＰＯ４０．６２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．０２％、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ０．０００２％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．００００４％、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ０．００００２％、アデカノールＬＧ１０９０．０１％、滅菌前ｐＨ７．０）に植菌して通気量０．３ｖｖｍ、攪拌４５０ｒｐｍ、３０℃で３１時間、好気的に培養した。【０１４６】
培養終了後、遠心分離で菌体を集菌して、１０％のグリセリンを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に菌体を懸濁後、超音波により菌体を破砕し、これを遠心分離した。上清に硫酸アンモニウムを５０％飽和で加えた時に塩析する沈殿を遠心分離で取得した。この画分を２０％のグリセリンを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解、同緩衝液で透析後、ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＬ（東ソー社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、同緩衝液で洗浄後、同緩衝液で０Ｍから０．４Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて溶出し、活性のあるフラクションを集めた。この活性画分を、Ｂｌｕｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、２０％のグリセリンを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で０Ｍから０．４Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて溶出した。得られた活性画分に、終濃度１Ｍとなるように硫酸アンモニウムを溶解した後、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＰＨＥ  ６ｍｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてカラムクロマトグラフィーを行ない、２０％のグリセリンを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で１Ｍから０Ｍの硫酸アンモニウムの濃度勾配をかけて溶出した。ここで得られた活性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって分析したところ、アミノ酸脱水素酵素は単一バンドとして検出され、精製酵素の純粋性が確認できた。【０１４７】
（実施例２）アミノ酸脱水素酵素の性質
実施例１で得られた精製アミノ酸脱水素酵素の性質を以下のように調べた。
[比活性]
アミノ酸脱水素酵素の活性測定は、１０ｍＭの基質フェニルピルビン酸を含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）１．５ｍｌに、０．５Ｍ  ＮＨ３／ＮＨ４Ｃｌ緩衝液（ｐＨ９．０）１．２ｍｌ、３ｍＭの補酵素ＮＡＤＨを含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）０．２ｍｌ、および適宜希釈した酵素溶液０．１ｍｌを添加し、３０℃で１分間反応させた際の、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出した。このとき１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを消費する酵素量を１ｕｎｉｔと定義した。また、タンパク質の定量は、ＢＳＡを標準タンパク質としてＢｒａｄｆｏｒｄ法で行った。精製したアミノ酸脱水素酵素の比活性は２０４ｕｎｉｔ／ｍｇタンパク質（３０℃）であった。【０１４８】
[作用温度の範囲・至適温度]
作用温度の範囲と至適温度を調べた。３０℃での活性を１００％とした場合の各温度での相対活性を図１に示した。本酵素は少なくとも検討した５〜７０℃の範囲でよく作用し、至適温度は４５℃〜５０℃であった。【０１４９】
[作用ｐＨの範囲・至適ｐＨ]
作用ｐＨの範囲と至適ｐＨを調べた。ｐＨ７．０から７．９の範囲では０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液を、ｐＨ７．９から８．８の範囲では０．１ＭのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を、ｐＨ８．８から１０．５までの範囲では０．１Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液を、ｐＨ１０．５から１１．０の範囲では０．１Ｍのグリシン／塩化ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝液を使用し、ｐＨ９．０での活性を１００％とした場合の各ｐＨでの相対活性を図２に示した。本酵素は少なくとも検討したｐＨ７．１〜１１．０の範囲で作用し、至適ｐＨは８．８〜１０．０であった。【０１５０】
[分子量の測定]
実施例１で得られた精製アミノ酸脱水素酵素を含む画分を、限外濾過膜(分画分子量１０，０００)を用いて濃縮した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライしてＦＰＬＣによるゲルろ過クロマトグラフィーを行い、０．１５Ｍの塩化ナトリウムと２０％のグリセリンを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。標準タンパク質の溶出時間と比較して分子量を測定したところ、約９４,０００（８６,０００以上、９８，０００以下）であった。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により標準タンパク質との移動度と比較してサブユニット分子量を測定したところ、約４６，０００（４３，０００以上、４９，０００以下）であり、本発明のアミノ酸脱水素酵素は同一のサブユニットからなる２量体構造であった。【０１５１】
[基質特異性]
精製アミノ酸脱水素酵素の基質特異性を調べた。前記酵素活性測定における基質フェニルピルビン酸をそれぞれの基質に変更し、酵素活性を測定した。ただし、ナフチルピルビン酸に対する酵素活性は、ナフチルピルビン酸１．０ｍｇ、硫酸アンモニウム１２．３ｍｇおよびＮＡＤＨ６．１ｍｇを含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌに、適宜希釈した酵素溶液１００μｌを添加し、３０℃で３０分間に生成する２−ナフチルアラニンの増加量をＨＰＬＣで定量することにより求めた。ＨＰＬＣ分析は、カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲII（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）、溶離液：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝５／１、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出：２１０ｎｍで行なった。このとき１分間に１μｍｏｌの２−ナフチルアラニンを生成する酵素量を１ｕｎｉｔと定義した。また、インドールピルビン酸に対する酵素活性は、インドールピルビン酸２．０ｍｇ、硫酸アンモニウム２６．０ｍｇおよびＮＡＤＨ７．６ｍｇを含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）１００μｌ、適宜希釈した酵素溶液１００μｌを添加し、３０℃で３０分間に生成するＬ−トリプトファンの増加量をＨＰＬＣで定量することにより求めた。ＨＰＬＣ分析は、カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＫ  ＣＲ−（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）、溶離液：ＨＣｌＯ４水溶液（ｐＨ２．０）、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：３０℃、検出：２１０ｎｍで行なった。このとき１分間に１μｍｏｌのＬ−トリプトファンを生成する酵素量を１ｕｎｉｔと定義した。表１は、フェニルピルビン酸に対する活性を１００％としたときの相対活性値を示す。【０１５２】
【表１】
2010067578.tif 000012
【０１５３】
（実施例３）アミノ酸脱水素酵素のＮ末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列決定
実施例１で得られた精製アミノ酸脱水素酵素を、逆相ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ（ＹＭＣ社製）、溶離液：２０％アセトニトリル水溶液〜８０％アセトニトリル水溶液のグラジエント、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：２５℃、検出：２３０ｎｍ）により分取精製した後、Ｎ末端のアミノ酸配列を気相プロテイン・シークエンサーＰＰＳＱ−３３Ａ（島津社製）を用いて決定した。さらに、実施例１で精製したアミノ酸脱水素酵素にＶ８プロテアーゼ（Ｗａｋｏ社製）を４Ｍの尿素の存在下作用させて生成したポリペプチド断片を上記と同様の逆相ＨＰＬＣを用いて精製した後、上記と同様の方法でアミノ酸脱水素酵素の内部アミノ酸配列を決定した。【０１５４】
（実施例４）アミノ酸脱水素酵素遺伝子の単離
ロドコッカス  キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii)ＫＮＫ２１０８株を、試験管内で滅菌した５ｍｌの培地（肉エキス１．０％、ポリペプトン１．０％、イーストエキス０．５％、ＮａＣｌ０．３％、滅菌前ｐＨ７．０）に植菌して３０℃で３８時間、好気的に振とう培養した。得られた菌体から、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories, Inc.社製）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。Ｎ末端アミノ酸配列にもとづいて設計したＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１：配列表の配列番号３）と、内部アミノ酸配列にもとづいて設計したＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−２：配列表の配列番号４）を用いて、先に得た染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ１００ｎｇにＥｘ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）０．２５μｌ、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）５μｌ、２．５ｍＭ各ｄＮＴＰ溶液４μｌ、２０μＭプライマー水溶液各２μｌを添加し、さらに滅菌水を加えて総量が５０μｌになるように調整した反応液を調製し、熱変性（９４℃、６０秒）、アニーリング（４８℃、６０秒）、伸長反応（７２℃、６０秒）を３０サイクル繰り返した後、４℃まで冷却することにより行なった。この結果、目的のアミノ酸脱水素酵素遺伝子の一部（部分遺伝子と称す）を取得した。この部分遺伝子の塩基配列をＤＮＡシーケンサー3130xl Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）を用いて決定した。【０１５５】
次に、目的遺伝子の全長を取得するために以下の操作を行った。上記部分遺伝子において、酵素のＮ末端側、Ｃ末端側それぞれの部分に相当する塩基配列にもとづき、部分遺伝子の外側方向へ向けたＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−３：配列表の配列番号５、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−４：配列表の配列番号６）を合成した。このプライマーを用い、先に得た染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ、あるいはＨｉｎｃIIで分解したものをＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて環化させて得たＤＮＡを鋳型に、インバースＰＣＲを行った。ＰＣＲは、基本的に上記と同様に行ったが、熱変性（９６℃、３０秒）、アニーリング（６０℃、６０秒）、伸長反応（７２℃、３００秒）とした。【０１５６】
これにより、既に取得した部分遺伝子のさらに外側の遺伝子部分を含むＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片の塩基配列を上記と同様の方法で決定後、先の部分遺伝子の塩基配列と合わせることで、配列表の配列番号７に示す開始コドンから終止コドンまでを含むアミノ酸脱水素酵素遺伝子の全塩基配列を決定した。決定した全塩基配列中に、実施例３で、精製したアミノ酸脱水素酵素を用いて決定したＮ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列をコードする塩基が含まれることを確認した。次にアミノ酸脱水素酵素遺伝子のＮ末端、Ｃ末端部分にそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩの切断部位を結合させた配列を持つプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−５：配列表の配列番号８、Ｐｒｉｍｅｒ−６：配列表の配列番号９）を用いて、この間のＤＮＡを先に得た染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲにより増幅することで、配列表配列番号２に示されるオープンリーディングフレームのＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ１００ｎｇにＰｒｉｍｅＳＴＡＲＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）０．５μｌ、５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）１０μｌ、２．５ｍＭ各ｄＮＴＰ溶液４μｌ、２０μＭプライマー水溶液各０．５μｌを添加し、さらに滅菌水を加えて総量が５０μｌになるように調整した反応液を調製し、熱変性（９８℃、１０秒）、アニーリング（５５℃、５秒）、伸長反応（７２℃、９０秒）を２５サイクル繰り返した後、４℃まで冷却することにより行なった。【０１５７】
（実施例５）アミノ酸脱水素酵素遺伝子を発現する組換えプラスミドの作成
実施例４で得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣＴ（ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３参照）のＮｄｅＩサイトを破壊したプラスミドベクター）とＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、図３の制限酵素地図で表され、アミノ酸脱水素酵素遺伝子を大量に発現できるように設計されたプラスミドｐＲＰＤ００２を取得した。【０１５８】
（実施例６）アミノ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを用いた形質転換体の作成
実施例５で得られたプラスミドｐＲＰＤ００２をエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合することで形質転換を行い、培地（トリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天１５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）にプレーティングして、アミノ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２）をコロニーとして取得した。【０１５９】
得られた形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌後、３７℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体のアミノ酸脱水素酵素液を取得した。得られた酵素液を用いて、実施例２に示す方法でアミノ酸脱水素酵素活性を測定したところ、アミノ酸脱水素酵素活性が確認された。【０１６０】
（実施例７）アミノ酸脱水素酵素活性菌を利用した還元アミノ化反応によるＬ−アミノ酸合成
ロドコッカス  キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii)ＫＮＫ２１０８株を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの実施例１記載の培地Ａに植菌して３０℃で４８時間、好気的に振とう培養した。得られた培養液５ｍｌ分の菌体を遠心分離により集菌し、１．０ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液１５０μｌ、ナフチルピルビン酸１．５ｍｇ、硫酸アンモニウム１．９ｍｇ、ＮＡＤＨ９．５ｍｇ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１５０μｌを混合して、３０℃で１６時間反応した後、反応液を水で５０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、Ｌ−ナフチルアラニンを定量した。【０１６１】
ＨＰＬＣ分析は次に示す条件で実施した。カラム：ＣＨＩＲＯＢＩＯＴＩＣ  Ｔ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ＡＳＴＥＣ社製）、溶離液：水／エタノール＝３／７、流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出：２１０ｎｍ。その結果、反応収率５４．６ｍｏｌ％でＬ−ナフチルアラニンが生成した。【０１６２】
（実施例８）形質転換体を利用したＬ−アミノ酸の合成
実施例６で得たアミノ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２）を培養液から遠心分離により集菌し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕し、菌体破砕液を調製した。また、後述する方法で得たギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体を培養液から遠心分離により集菌し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕し、菌体破砕液を調製した。また、後述する方法で得たＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体を培養液から遠心分離により集菌し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕し、菌体破砕液を調製した。それらの菌体破砕液を、ＤＬ−ナフチルアラニン、ＤＬ−ホモフェニルアラニン、又はＤＬ−トリプトファンのそれぞれに作用させて、立体反転反応により対応するＬ−アミノ酸を合成した。【０１６３】
ギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の培養液は次のようにして得た。チオバシラス  エスピー（Thiobacillus sp.）ＫＮＫ６５ＭＡ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１）由来のギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体であるエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７３）を、試験管内で滅菌した６ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、水１ｌ、滅菌前ｐＨ７）に接種して、３０℃で２４時間振とう培養した。また、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体の培養液は次のようにして得た。キャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体であるエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３９）を、試験管内で滅菌した６ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、水１ｌ、滅菌前ｐＨ７）に接種して、３７℃で２４時間振とう培養した。【０１６４】
（８−１）ＤＬ−ナフチルアラニンからＬ−ナフチルアラニンの合成
前記のアミノ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２）の培養液１０ｍｌ分、前記のＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体の培養液１０ｍｌ分、前記のギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体培養液１０ｍｌ分の各菌体を、遠心分離により集菌し、それぞれ１ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕し、菌体破砕液を調製した。得られた菌体破砕液と、ＤＬ−ナフチルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ＋０．３７ｍｇ、ギ酸アンモニウム２７ｍｇ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合して１．０ｍｌになるように反応液を調製し、３０℃で１９時間反応した。反応液を水で２０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は実施例７と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して９７．０ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−ナフチルアラニンが得られた。【０１６５】
（８−２）ＤＬ−ホモフェニルアラニンからＬ−ホモフェニルアラニンの合成
上記実施例（８−１）と同様に調製した菌体破砕液と、ＤＬ−ホモフェニルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ＋０．３７ｍｇ、ギ酸アンモニウム２７ｍｇ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合して１．０ｍｌになるように反応液を調製し、３０℃で１９時間反応した。反応液を水で２０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は実施例７と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して９８．６ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−ホモフェニルアラニンが得られた。【０１６６】
（８−３）ＤＬ−トリプトファンからＬ−トリプトファンの合成
上記実施例（８−１）と同様に調製した菌体破砕液と、ＤＬ−トリプトファン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ＋０．３７ｍｇ、ギ酸アンモニウム２７ｍｇ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合して１．０ｍｌになるように反応液を調製し、３０℃で１９時間反応した。反応液を水で２０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は実施例７と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して９４．５ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−トリプトファンが得られた。【０１６７】
（実施例９）アミノ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、及びシャペロン遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを用いた形質転換体の作製
実施例５で得られたプラスミドｐＲＰＤ００２、及び市販のシャペロンプラスミドｐＧｒｏ７（Ｔａｋａｒａ社製、シャペロンプラスミドセット）をエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合し形質転換を行うことで、アミノ酸脱水素酵素遺伝子、及びシャペロン遺伝子を発現できる形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２、ｐＧｒＯ７）を作製した。【０１６８】
（実施例１０）形質転換体を用いたアミノ酸脱水素酵素の生産
実施例９で得た形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２、ｐＧｒＯ７）を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、クロラムフェニコール１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリン、及びクロラムフェニコールは滅菌後に添加する）に接種して、３０℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液１ｍｌから遠心分離により菌体を集菌し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌに懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体の無細胞抽出液（可溶性画分）を取得した。菌体由来の不溶物は、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌで再懸濁し、これを不溶性画分溶液とした。また、実施例６で得た形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２）から上記と同様の方法（ただし、培地にはクロラムフェニコールを添加しない）で、形質転換体の無細胞抽出液（可溶性画分）と不溶性画分溶液を取得した。【０１６９】
それぞれの形質転換体から得た可溶性画分と不溶性画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって分析したところ、形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２）では、アミノ酸脱水素酵素の大部分が、不溶性画分に存在していたのに対し、形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２、ｐＧｒＯ７）では、アミノ酸脱水素酵素の大部分が、可溶性画分に存在することが確認された。【０１７０】
また、それぞれの形質転換体から得た無細胞抽出液を用いて、実施例２に示す方法でアミノ酸脱水素酵素活性を測定したところ、形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２、ｐＧｒＯ７）から得た無細胞抽出液は、形質転換体エシェリヒア  コリ（Eschesrichia coli）ＨＢ１０１（ｐＲＰＤ００２）から得た無細胞抽出液の約６１倍のアミノ酸脱水素酵素活性を示した。【０１７１】
（実施例１１）アミノ酸脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体の作製
ロドコッカス  キングシェンギ（Rhodococcus qingshengii）ＫＮＫ２１０８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０６７）由来のアミノ酸脱水素酵素遺伝子（配列番号２）の５’末端側にＮｄｅＩ認識部位を、３’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位を付加した遺伝子を、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲを行い取得した。上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、GenBank Accession No.L09136）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＲＨを構築した。構築した組換えベクターｐＮＲＨを用いて、エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＮＲＨ）を得た。得られた形質転換体を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に接種して、３０℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製）を用いてプラスミドｐＮＲＨを抽出した。【０１７２】
次に、チオバシラス  エスピー（Thiobacillus sp.）ＫＮＫ６５ＭＡ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１）由来のギ酸脱水素酵素遺伝子（ＷＯ０３／０３１６２６記載の配列表配列番号３参照）の５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位を、３’末端側にＫｐｎＩ認識部位を付加した遺伝子を、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲを行い取得した。得られたＤＮＡ断片を上記で構築したプラスミドｐＮＲＨのＥｃｏＲＩ認識部位とＫｐｎＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＲＨＳＦＤを構築した。組換えベクターｐＮＲＨＳＦＤを用いて、エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換することで、アミノ酸脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＮＲＨＳＦＤ）を作製した。【０１７３】
（実施例１２）アミノ酸脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体を用いたＬ−ナフチルアラニンの合成
実施例１１で得た形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＮＲＨＳＦＤ）を試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に接種して、３０℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕し、菌体破砕液を調製した。また、実施例８と同様の方法で、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体の菌体破砕液を調製した。調製したそれぞれの菌体破砕液と、ＤＬ−ナフチルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ＋０．３７ｍｇ、ギ酸アンモニウム２７ｍｇ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合して１．０ｍｌになるように反応液を調製し、３０℃で１９時間反応した。反応液を水で２０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は実施例７と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して９４．２ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−ナフチルアラニンが得られた。【０１７４】
（実施例１３）アミノ酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、及びＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体の作製
キャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子（ＷＯ０７／０１５５１１記載の配列表配列番号２参照）の５’末端側にＫｐｎＩ認識部位を、３’末端側にＢａｍＨＩ認識部位を付加した遺伝子を、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲを行い取得した。得られたＤＮＡ断片を実施例１１で構築したプラスミドｐＮＲＨＳＦＤのＫｐｎＩ認識部位とＢａｍＨＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＲＨＳＦＤＣＤＡを構築した。組換えベクターｐＮＲＨＳＦＤＣＤＡを用いて、エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換することで、アミノ酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、及びＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＮＲＨＳＦＤＣＤＡ）を作製した。【０１７５】
（実施例１４）アミノ酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、及びＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体を利用したＬ−アミノ酸の合成
（１４−１）ＤＬ−ナフチルアラニンからＬ−ナフチルアラニンの合成
実施例１３で作製したアミノ酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、及びＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＮＲＨＳＦＤＣＤＡ）を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に接種して、３０℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液１０ｍｌ分から遠心分離により菌体を集菌し、１ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁することで菌体濃縮液を調製した。得られた菌体濃縮液と、ＤＬ−ナフチルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ＋０．３７ｍｇ、ギ酸アンモニウム２７ｍｇ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合して１．０ｍｌになるように反応液を調製し、３０℃で２４時間反応した。反応液を水で２０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は実施例７と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して８９．６ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度９５．９％ｅｅのＬ−ナフチルアラニンが得られた。【０１７６】
（１４−２）ＤＬ−ホモフェニルアラニンからＬ−ホモフェニルアラニンの合成
上記実施例（１４−１）と同様に調製した菌体濃縮液と、ＤＬ−ホモフェニルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ＋０．３７ｍｇ、ギ酸アンモニウム２７ｍｇ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合して１．０ｍｌになるように反応液を調製し、３０℃で２４時間反応した。反応液を水で２０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は実施例７と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して１０２．７ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−ホモフェニルアラニンが得られた。【０１７７】
（１４−３）ＤＬ−トリプトファンからＬ−トリプトファンの合成
上記実施例（１４−１）と同様に調製した菌体濃縮液と、ＤＬ−トリプトファン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ＋０．３７ｍｇ、ギ酸アンモニウム２７ｍｇ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合して１．０ｍｌになるように反応液を調製し、３０℃で２４時間反応した。反応液を水で２０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は実施例７と同条件で実施した。その結果、ラセミ体アミノ酸に対して９７．３ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−トリプトファンが得られた。
【図１】
2010067578.tif 000023
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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