(57)【要約】  本発明は、酸化シリコン基板上のクロム、モリブデンまたはタングステン部分に、選択的にフェリチン及び無機粒子を配置することを目的とする。  本発明のフェリチン配置方法は、サブユニットＮ末端分に配列番号１に示すペプチドで修飾したフェリチンと、非イオン性界面活性剤を０．０１ｖ／ｖ％以上、１０ｖ／ｖ％以下含む、ｐＨ７．４以上８．２以下の溶液を調製する調製工程と、  表面の一部にクロム、モリブデンまたはタングステン部分が形成された酸化シリコン基板上に前記溶液を滴下し、ペプチド修飾フェリチンをクロム、モリブデンまたはタングステン部分に選択的に配置させる結合工程と、を含む。結合工程後に溶液を除去することにより、配列番号１に示すペプチドで修飾したフェリチン、および該フェリチンに内包させた無機粒子を、クロム、モリブデンまたはタングステン部分に選択的に配置することが可能である。
2010134140.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェリチンの配置方法であって、
前記配置方法は、
サブユニットＮ末端部に配列番号１に記載のペプチドを修飾したフェリチンと、０．０１ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下の非イオン界面活性剤とを含み、ｐＨが７．４以上８．２以下の範囲にある溶液を調製する調製工程と、
表面の一部にクロム、モリブデン、およびクロムから選択された１種の金属部分が形成された酸化シリコン基板上に前記溶液を滴下することによって、前記フェリチンを選択的に前記金属部分に結合させる結合工程と、
を包含する、配置方法。
【請求項２】
前記結合工程の後に、前記溶液を除去し、前記金属部分に選択的に結合した前記フェリチンを前記酸化シリコン基板上に残す除去工程をさらに包含する、請求項１に記載のフェリチンの配置方法。
【請求項３】
前記結合工程の後に、前記フェリチンを含まない溶液により前記酸化シリコン基板の表面を洗浄し、前記金属部分に選択的に結合した前記フェリチンを、前記酸化シリコン基板上の前記金属部分に残す洗浄工程をさらに包含する、請求項１に記載のフェリチンの配置方法。
【請求項４】
前記フェリチンが無機粒子を内包している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記結合工程の後に、前記酸化シリコン基板を加熱して前記フェリチンを分解し、前記フェリチンが内包していた無機粒子を、前記酸化シリコン基板上の前記金属部分に配置する分解工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフェリチンを酸化シリコン基板上に形成したクロム、モリブデンまたはタングステン部分に選択的に配置させる方法に関する。また、本発明はフェリチンに内包させた無機粒子を酸化シリコン基板上のクロム、モリブデンまたはタングステン部分に選択的に配置させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のフェリチンあるいはフェリチンに内包させた無機粒子を固体上に配置する方法としては、リソグラフィ法により作製した静電的に極性を反転したパターン上に静電相互作用を用いて配置する方法（例えば、非特許文献５参照）が知られている。【０００３】
非特許文献５では、酸化シリコン基板上にレジストを塗布し、電子ビームリソグラフィで露光した領域のレジストを現像することで除去し、酸化シリコン基板を露出させた領域を、アミノ基が末端に付いたシランカップリング剤、具体的にはアミノプロピルトリメトキシシランの蒸気に暴露することで、露出させた領域のみにアミノ末端シランカップリング剤を吸着させる。そして、レジストを溶剤で除去することで、酸化シリコン基板の一部にアミノ末端シランカップリングによりパターンを形成し、ｐＨとイオン強度の調整により静電相互作用を制御することで、フェリチンをアミノ末端シランカップリング修飾パターンのみに配置できることが開示されている。【０００４】
また、チタニウムに親和性を持つよう選ばれた６つのアミノ酸（アルギニン−リジン−ロイシン−プロリン−アスパラギン酸−アラニン：以下一文字表記でＲＫＬＰＤＡ）からなるペプチド（非特許文献１参照）をフェリチン表面に修飾することでフェリチンにチタニウムへの親和性を付与し、さらに、非イオン性界面活性剤を用いて固体表面との相互作用を弱めることにより、チタニウムパターン上に選択配置する方法（特許文献１、非特許文献３参照）も知られている。【０００５】
また、前記ペプチドＲＫＬＰＤＡによるチタニウム上への選択配置において、非イオン界面活性剤の吸着量の差が、選択比を増強していることが非特許文献４に開示されている。非特許文献４では疎水性基板及びシリコン基板上にはチタニウム基板上より多くの非イオン性界面活性剤が吸着することが示され、また、疎水性基板ならば多くの非イオン性界面活性剤が吸着するだろうことが示唆されているが、親水性基板であるチタニウムとシリコン上への吸着差の機構に関しては明らかにされていない。【０００６】
一方、非イオン性界面活性剤の吸着量差のみを利用することで白金または酸化シリコン上の、チタンまたは窒化シリコン上へ、フェリチンの選択配置を行う方法が特許文献２に開示されている。前記ペプチドＲＫＬＰＤＡが親和性を持つ材料に関しては、非特許文献２において開示されており、チタニウム、シリコン、銀に親和性を持つ一方、金、クロム、白金、錫、亜鉛、銅、鉄に対しては親和性を持たないことが示されている。【０００７】
すなわち、非イオン界面活性剤にはタンパク質と基板との相互作用を弱める効果があり、固体表面の吸着量差により、選択的に金や白金などの疎水性表面や酸化シリコン表面へのタンパク質の配置を抑制することができることや、ペプチドＲＫＬＰＤＡをタンパク質表面に修飾することにより、チタニウム、シリコン、銀に対する親和性を付与することができることがこれまでに知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００６／０６４６３９号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／０６４６４０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ken-Ichi Sano, Kiyotake Shiba, J.A.C.S., 125, 14234(2003)
【非特許文献２】Ken-Ichi Sano, Hiroyuki Sasaki, Kiyotake Shiba, Langmuir, 21, 3090(2005)
【非特許文献３】Ichiro Yamashita, Hiroya Kirimura, Mitsuhiro Okuda, Kazuaki Nishio, Ken-Ichi Sano, Kiyotake Shiba, Tomohiro Hayashi, Masahiko Hara, Yumiko Mishima, Small, 2, 1148(2006)
【非特許文献４】Tomohiro Hayashi, Ken-Ichi Sano, Kiyotake Shiba, Yoshikazu Kumashiro, Kenji Iwahori, Ichiro Yamashita, Masahiko Hara, Nano Letters, 6, 515(2006)
【非特許文献５】Shinya Kumagai, Shigeo Yoshii, Kiyohito Yamada, Nozomu Matsukawa, Isamu Fujiwara, Kenji Iwahori, Ichiro Yamashita, Applied Physics Letters, 88, 153103(2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
無機ナノ粒子を半導体デバイスや触媒として用いるためには、無機ナノ粒子を、シリコン基板上やシリカマトリックス中のクロム、モリブデンまたはタングステンといった金属元素部分に高密度に選択配置する必要がある。しかしながら、静電相互作用を用いた前記従来の方法では、リソグラフィによるパターンニングが必要、かつシリコン以外の表面に高密度に吸着できるカップリング剤が必要になる。【００１１】
ここで、ペプチドＲＫＬＰＤＡはチタニウム、シリコン、銀に対する親和性しか明らかでない一方、クロムに加え、金、白金、錫、亜鉛、銅、鉄といった多くの元素に対しては親和性を持たないことが知られている。さらに、ペプチドＲＫＬＰＤＡが親和性を有するシリコン上の所望の元素に選択配置させるためには、シリコン表面への親和性の抑制と、所望の元素への吸着を同時に実現する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述した従来の課題を解決するための本発明方法は、
フェリチンの配置方法であって、
前記配置方法は、
サブユニットＮ末端部に配列番号１に記載のペプチドを修飾したフェリチンと、０．０１ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下の非イオン界面活性剤とを含み、ｐＨが７．４以上８．２以下の範囲にある溶液を調製する調製工程と、
表面の一部にクロム、モリブデン、およびタングステンから選択された１種の金属部分が形成された酸化シリコン基板上に前記溶液を滴下することによって、前記フェリチンを選択的に前記金属部分に結合させる結合工程と、
を包含する、配置方法である。【００１３】
ここで、フェリチンのサブユニットＮ末端部をペプチドで修飾するとは、フェリチンＮ末端のアミノ酸残基（メチオニン残基）を配列番号１のペプチドで置換すること、フェリチンのＮ末端に配列番号１のペプチドを付加すること、及びフェリチンのＮ末端部のアミノ酸配列に配列番号１のペプチドを挿入することのいずれをも含む。【００１４】
前記結合工程の後に、前記溶液を除去し、前記金属部分に選択的に結合した前記フェリチンを前記酸化シリコン基板上に残す除去工程をさらに包含することが好ましい。【００１５】
前記結合工程の後に、前記フェリチンを含まない溶液により前記酸化シリコン基板の表面を洗浄し、前記金属部分に選択的に結合した前記フェリチンを、前記酸化シリコン基板上の前記金属部分に残す洗浄工程をさらに包含することも好ましい。【００１６】
本発明のフェリチン配置方法では、フェリチンが無機粒子を内包していてもよい。また、前記結合工程の後に、前記酸化シリコン基板を加熱して前記フェリチンを分解し、前記フェリチンが内包していた無機粒子を、前記酸化シリコン基板上の前記金属部分に配置する分解工程をさらに包含してもよい。【００１７】
フェリチンは窒素雰囲気中５００℃、酸素雰囲気中４００℃、オゾン雰囲気中１１０℃以上で熱処理することにより、酸化・分解するが、無機粒子は残る。このため、ペプチド修飾フェリチンに無機粒子を内包させれば、酸化シリコン上のクロム、モリブデンまたはタングステン部分に選択的にフェリチンを配置した後、熱処理によりフェリチンを分解除去することにより、無機粒子のみをクロム、モリブデンまたはタングステン部分に選択配置することが可能となる。【００１８】
なお、本発明のフェリチン配置方法においては、溶液中の吸着プロセスを用いているため、基板上に構造が形成されていても、溶液が接触できる領域においては平坦な基板と本質的に違いはない。【００１９】
本発明の上記目的、他の目的、特徴および利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のフェリチン配置方法によれば、酸化シリコン上の一部に形成されたクロム、モリブデンまたはタングステン部分に、フェリチンひいてはフェリチンに内包された無機粒子を選択的に配置することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、カゴ状フェリチンとサブユニット、並びにＮ末端の関係を説明する模式図である。
【図２】図２は、Ｌ型フェリチンサブユニットのプラスミドの主要構成と、大腸菌へのプラスミドの取り込みの模式図である。
【図３】図３は、酸化シリコン基板上のクロム部分に配置された鉄コア内包ｍｉｎＴ１−ＬＦのＳＥＭ画像の顕微鏡写真である。
【図４】図４は、酸化シリコン基板上のモリブデン部分に配置された鉄コア内包ｍｉｎＴ１−ＬＦのＳＥＭ画像の顕微鏡写真である。
【図５】図５は、酸化シリコン基板上のタングステン部分に配置された鉄コア内包ｍｉｎＴ１−ＬＦのＳＥＭ画像の顕微鏡写真である。
【図６】図６は、異なるｐＨで酸化シリコン基板上のタングステン部分に配置された鉄コア内包ｍｉｎＴ１−ＬＦのＳＥＭ画像の顕微鏡写真である。
【図７】図７は、ｍｉｎＴ１−ＬＦ吸着個数のｐＨ依存性を示すグラフである。
【図８】図８は、酸化シリコン基板へのｍｉｎＴ１−ＬＦ吸着個数のｐＨ依存性を示すグラフである。
【図９】図９は、ｍｉｎＴ１−ＬＦ吸着個数の非イオン性界面活性剤濃度依存性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００２３】
本発明で用いられるフェリチンは、サブユニットＮ末端に配列番号１で示されるアミノ酸配列を有している。一例として本発明において用いられるフェリチンは、配列番号３に示されるタンパク質のＮ末端の開始コドンに対応するメチオニンが配列番号１で示されるアミノ酸配列に置換されたフェリチンである。本実施の形態で用いた発現系では開始コドンに対応するメチオニンが欠失するため、このタンパク質は１８０残基を有し、配列番号３からメチオニンを除いた１７４残基のウマ由来フェリチンのアミノ酸配列のアミノ末端に配列番号１の６残基のアミノ酸配列が修飾されたものになった。
【００２４】
後述する実験例では、配列番号１が修飾されたフェリチンは「ｍｉｎＴ１−ＬＦ」と記述される。比較例で用いる一般のフェリチンとして、配列番号３からメチオニンが欠失した１７４残基からなるフェリチンを用い、これを「△１−ＬＦ」と記述する。
【００２５】
基板としては、熱酸化シリコン基板上に選択配置させたい金属元素のパターンが部分的に形成された基板を使用直前に洗浄して用いた。洗浄には水洗、有機溶剤洗浄、ＵＶオゾンによる処理を順次行った。
【００２６】
本発明のフェリチンの選択配置方法には大きく３つの工程、すなわち調製工程、結合工程と除去工程を有する。
【００２７】
（１）調製工程について
調製工程では、サブユニットＮ末端部に配列番号１に記載のペプチドを修飾したフェリチンと、０．０１ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下の非イオン界面活性剤とを含み、ｐＨが７．４以上８．２以下の範囲にある溶液を調製する。
【００２８】
（２）結合工程について
結合工程では、調製工程で調製した、フェリチンと非イオン界面活性剤を含む溶液を、酸化シリコン基板上に滴下する。
【００２９】
（３）除去工程について
除去工程では、酸化シリコン基板上に滴下した溶液中に残存しているフェリチンを除去することが目的となる。除去する方法としては、乾燥を抑制した状態で遠心により溶液を除去するか、フェリチンを含まない溶液で洗い流すことにより除去するという主に二つの方法がある。遠心による除去では、基板表面の凹凸により、除去しきれないフェリチンが残ることがあるため、フェリチンを含まない溶液で洗い流す方法が好ましい。
【００３０】
このようにして、フェリチンを基板上に配置することができる。なお、フェリチンとして、無機粒子を内包したフェリチンを用いれば、フェリチンを分解することによって無機粒子を基板上に配置することが可能となる。
【００３１】
以下、本発明の実施例をさらに詳細に説明する。
【００３２】
（実施例１）
まず、以下の実施例に用いたフェリチンの製造方法について説明する。本願の実施例では、配列番号１に示すポリペプチドでＮ末端部を修飾したリコンビナントフェリチン「ｍｉｎＴ１−ＬＦ」と配列番号１を有しないリコンビナントフェリチン「△１−ＬＦ」を使用した。
【００３３】
＜△１−ＬＦの製造方法＞
まず、△１−ＬＦの製造方法について説明する。天然のウマ脾臓由来フェリチンのサブユニットにはわずかに構造の異なるＬ型とＨ型があるため、天然フェリチンは、一定の構造を有さない。そこで、本願の実施例ではＬ型サブユニットのみから構成されるリコンビナントフェリチンを使用した。
【００３４】
はじめに、Ｌ型のフェリチンをコードするＤＮＡ（配列番号：2,528塩基対）を、ＰＣＲ法を用いて増幅し、多量のＬ型フェリチンＤＮＡを用意した。次に、このＬ型フェリチンＤＮＡを、制限酵素EcoRI及びHind IIIが特異的に切断する部位（制限酵素サイト）で切断した。この切断処理により、EcoRI及びHind IIIの制限酵素サイトを有するＬ型フェリチンＤＮＡ断片の溶液を調製した。この溶液にＤＮＡ電気泳動を行い、Ｌ型フェリチンをコードするＤＮＡ断片だけを回収、精製した。
【００３５】
その後、このＬ型フェリチン ＤＮＡ断片と、EcoRI - Hind IIIの制限酵素で処理したベクタープラスミド（pMK-2）とをインキュベートしてライゲーションを行った。これによりpMK-2プラスミドのマルチクローニングサイト（MSC）にＬ型フェリチンＤＮＡが入ったベクタープラスミド pMK-2-fer-0 を作製した。使用したベクタープラスミドのpMK-2は、プロモーターに Tac プロモーターを有し、多コピープラスミドとしてコピー数が多いという特徴を持ち、大量のフェリチンを得るのに有利であることから選択した。
【００３６】
作製したプラスミド (pMK-2-fer-0) を宿主（ホスト）である大腸菌株E. coli Nova Blue (Novagen ) に導入（形質転換）し、リコンビナントＬ型フェリチン株（△１−ＬＦ）を作製した。なお、Ｌ型フェリチンサブユニットのプラスミドの主要構成と、大腸菌へのプラスミドの取り込みを模式化した図を、図２に示した。
【００３７】
これらのリコンビナントフェリチンの内部に、後述する方法によって無機粒子を内包させた。
【００３８】
＜ｍｉｎＴ１−ＬＦの製造方法＞
次に、配列番号１でＮ末端部を修飾したフェリチン（ｍｉｎＴ１−ＬＦ）の製造方法について説明する。
【００３９】
フェリチンを構成するサブユニットのアミノ末端（Ｎ末端）をペプチドで修飾すると、図１に示したように、フェリチン粒子の外側に該ペプチドが突き出した構造となる。そのため、このＮ末端部分を任意のペプチドで修飾することにより、フェリチン粒子の表面を該ペプチドで修飾することが可能である。
【００４０】
ここで、ｍｉｎＴ１−ＬＦの具体的な製造方法を説明する。天然フェリチン（ウマ肝臓由来）のＬタイプのサブユニットの全長遺伝子を、配列番号２に示した。本実施例で用いた発現系では開始コドンに対応するメチオニンが欠失するため、配列番号２のＤＮＡからは、配列番号３に示すアミノ酸配列のフェリチンからメチオニンを除いた１７４残基のアミノ酸からなるフェリチンが合成される。
【００４１】
まず、配列番号１をコードするＤＮＡ（配列番号４（３０塩基対）及び配列番号５（２２塩基対））を、ＰＣＲ法を用いて増幅し、多量のＤＮＡを用意した。
【００４２】
次に、上記ＤＮＡと、制限酵素Bam I及びSac Iの制限酵素で処理した、リコンビナントＬ型フェリチンをコードするベクタープラスミド（pMK-2）をインキュベートしてライゲーションを行った。これによりpMK-2プラスミドのマルチクローニングサイト（MSC）に、上記塩基配列のＤＮＡ及びＬ型フェリチンＤＮＡが入ったベクタープラスミド(pKIS1) を作製した。pKIS1作製に使用したベクタープラスミドのpMK-2は、プロモーターに Tac プロモーターを有し、多コピープラスミドとしてコピー数が多いという特徴を持ち、大量のフェリチンを得るのに有利であることから選択した。
【００４３】
作製したプラスミドを宿主（ホスト）である大腸菌株 E. coli XLI Blue (Novagen) に導入（形質転換）し、配列番号１に示すポリペプチドでＮ末端が修飾されたＬ型フェリチン株（ｍｉｎＴ１−ＬＦ）を作製した。
【００４４】
＜ｍｉｎＴ１−ＬＦへの無機粒子の導入＞
本発明において、フェリチンに内包させる無機粒子の種類は、特に限定されるものではないが、実施例においては、無機粒子として酸化第二鉄（Ｆｅ２Ｏ３）を用いた。ｍｉｎＴ１−ＬＦへのＦｅ２Ｏ３コアの導入は、以下のようにして行った。
【００４５】
反応溶液として、０．５ｍｇ／ｍＬ  ｍｉｎＴ１−ＬＦ／１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）を調製し、ここに５ｍＭ酢酸アンモニウム鉄を添加した。２５℃で一晩反応させ、反応後の溶液からＦｅ２Ｏ３のコアが形成されたｍｉｎＴ１−ＬＦを、遠心分離とゲルろ過により分子精製して回収した。遠心分離は、１，６００Ｇ、１０分及び１０，０００Ｇ、３０分の条件で行って、段階的にｍｉｎＴ１−ＬＦ以外の不要部分を沈殿として除去し、最後に残った上清よりＦｅ２Ｏ３コアを形成したｍｉｎＴ１−ＬＦを、２３０，０００Ｇ、１時間の超遠心分離によってペレットとして回収した。
【００４６】
得られたｍｉｎＴ１−ＬＦを、ＨＰＬＣを用いたゲルろ過［カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ４０００ＷＸＬ  ＰＥＥＫ／流速：１ｍｌ／ｍｉｎ／バッファ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ］を行い、２４量体（約４８０ｋＤａ）のピークを分取した。分取したｍｉｎＴ１−ＬＦ溶液は、限外ろ過膜を用いて濃縮し、Ｆｅ２Ｏ３を内包したｍｉｎＴ１−ＬＦを得た。
【００４７】
なお、△１−ＬＦに上記と同様の操作を行うことにより、Ｆｅ２Ｏ３を内包した△１−ＬＦを得た。
【００４８】
＜基板作製方法＞
次に、本願の実施例に用いた基板の作製方法について説明する。
【００４９】
１０ｍｍ角の熱酸化シリコン基板の半分にレジスト（日本ゼオン：ＺＥＰ５２０）を塗布し、１４０℃３分間ベークした後に、金属元素をターゲットとしたＲＦマグネトロンスパッタにより金属薄膜を製膜した。ターゲットとしては純度９９．５％以上（高純度化学）のクロム、モリブデンまたはタングステンを用いた。段差による影響を排除するため、厚さは１ｎｍとした。
【００５０】
４０℃に加熱したリムーバー（日本ゼオン：ジメチルアセトアミド）中で超音波洗浄することにより、レジスト上の金属薄膜を除去し、半面が酸化シリコン基板、半面がクロム、モリブデンまたはタングステンである基板を作製した。
【００５１】
また、ナノサイズへの選択配置が可能なことを確認するために、電子ビームリソグラフィにより細線をパターニングした基板も作製した。１０ｍｍ角の熱酸化シリコン基板上に３００Åのレジスト（日本ゼオン：ＺＥＰ５２０）をスピンコート法により塗布した後、１４０℃３分間ベークした。電子ビームリソグラフィ（エリオニクス：ＥＬＳ−７５００）により細線を露光し、現像液（日本ゼオン：ｎ−アミルアセテート）で現像し、幅２０ｎｍ長さ２００ｎｍの細線領域の表面が露出した基板を作製した。以降は半面基板と同様の方法により、タングステンの細線を作製した。
【００５２】
作製した基板は使用する直前に(1) 超純水中、(2) 電子工業用グレードのエタノール中、(3) 電子工業用グレードのアセトン中、で順に超音波洗浄した後、１１０℃に加熱しながらＵＶオゾナイザーで表面をクリーニングして使用した。
【００５３】
また、上記洗浄後の基板を原子間力顕微鏡により表面計測し、基板上に作製されたクロム、モリブデンまたはタングステン部分が平坦な薄膜であること、及び薄膜の厚さが２ｎｍ以下であることを確認した。
【００５４】
＜溶液調製＞
次に、本願の実施例に用いた溶液の調製方法について説明する。
【００５５】
まず、緩衝液として超純水（Millipore）、ＭＥＳ（Sigma-Aldrich）、Ｔｒｉｓ（Sigma-Aldrich:Trizma base）を用い、５０ｍＭ、ｐＨ７．８の緩衝液を調製した。その後、フェリチンと非イオン界面活性剤とをそれぞれ０．５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｖ／ｖ％となるように加えた。非イオン界面活性剤としては化１で示すＴｗｅｅｎ２０（ICI）を用いた。
【００５６】
【化１】
2010134140.tif 000003
【００５７】
＜結合工程＞
上述した洗浄を行った基板を１インチウェハートレイ中に置き、調製した溶液１００μＬを滴下した後、乾燥を防ぐために蓋をし、１０分間静置した。その後、緩衝溶液のみを５００μＬ滴下し、希釈された溶液を５００μＬ吸引し除去するという工程を３回繰り返した後、同様に超純水のみを１ｍＬ滴下し、希釈された溶液を１ｍＬ吸引除去する工程を３回繰り返した後に、ビーカー中で超純水を流しながら５分間洗浄した。最後に、窒素ブローにより超純水を吹き飛ばし乾燥させた。
【００５８】
＜電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察＞
結合工程を行った基板に対し、高解像度電子顕微鏡（JEOL:JSM-7400F）を用いてフェリチンが内包する無機粒子コアを観察することにより、基板上のフェリチンの個数を計測した。ＳＥＭ画像から２００ｎｍ×２００ｎｍ角の領域を切り出し、個数をカウントした。個数が１００に満たない場合は３カ所の計測値を平均した。
【００５９】
酸化シリコン上のクロム部分に配置されたｍｉｎＴ１−ＬＦのＳＥＭ画像と、クロム部分の拡大図を、図３に示す。また、酸化シリコン上のモリブデン部分に配置されたｍｉｎＴ１−ＬＦのＳＥＭ画像と、モリブデン部分の拡大図を、図４に示す。また、酸化シリコン上のタングステンに配置されたｍｉｎＴ１−ＬＦのＳＥＭ画像と、酸化シリコン上のタングステン部分の拡大図を、図５に示す。ｍｉｎＴ１−ＬＦは、クロム、モリブデンまたはタングステン部分に選択的に配置されている。△１−ＬＦの場合、クロム、モリブデン、タングステン部分の配置個数は、ｍｉｎＴ１−ＬＦの４０％以下であった。
【００６０】
（実施例２）
緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ−Ｔｒｉｓを用い、ｐＨを６．７、７．４、７．８、８．０、８．２に調製した緩衝液を用い、フェリチン濃度２．０ｍｇ／ｍＬ、非イオン性界面活性剤濃度Ｔｗｅｅｎ２０  １ｖ／ｖ％とした溶液を調製した。
【００６１】
そして、この溶液を用いて実施例１と同様の結合工程を行った。結合工程後の基板表面のＳＥＭ画像を図６に、ｍｉｎＴ１−ＬＦの個数計測結果を図７に示す。ｐＨが７．４もしくは６．７の場合、ｍｉｎＴ１−ＬＦは溶液中で凝集する傾向にあり、ｐＨ６．７では混合してすぐに、ｐＨ７．４では数分後には溶液は混濁した。そのため、固体表面に配置されたｍｉｎＴ１−ＬＦにも凝集体が散見された。凝集体を避けて計測した結果を図７に示したが、７．４より低いｐＨでは安定した結果を得ることは困難だった。ｐＨ７．４においても、操作を短時間で終わらせる必要性があり、簡易に安定した結果を得るには７．４より高いｐＨが好ましい。
【００６２】
図７に見られるように、タングステン部分に配置されたｍｉｎＴ１−ＬＦの個数はｐＨ８．２〜７．８で特に多くなる結果が得られた。ｐＨ７．４を境界に個数は減少したが、上述した溶液中での凝集の影響と合わせて、ｐＨは７．４以上、好ましくは７．８以上で良い結果が得られている。
【００６３】
一方、酸化シリコン基板上のｍｉｎＴ１−ＬＦの配置個数の結果を、図８に示す。酸化シリコン上の個数は少ないため、酸化シリコン基板上に直接配置する実験をｐＨ８．４も含めて実施した。ｐＨ６．７〜８．２は半面がクロム、モリブデンまたはタングステンである基板の結果とほぼ重なる。そして、ｐＨ８．２を境界にアルカリ側で吸着個数が増加した。このことからｐＨは８．２以下、好ましくは８．０以下でフェリチンがクロム、モリブデンまたはタングステン部分に選択的に配置されるという結果が得られた。
【００６４】
なお、△１−ＬＦの配置個数結果は、ｐＨ６．７〜８．２の範囲内では、２００ｎｍ四方で１００を越えることは無かった。
【００６５】
また、実施例１の結果と合わせて、タンパク質濃度の影響を表１にまとめたが、タンパク質濃度の影響は見られなかった。
【００６６】
【表１】
2010134140.tif 000004
【００６７】
（実施例３）
緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、フェリチン濃度として０．５ｍｇ／ｍＬの溶液に、非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０の濃度を０．００５、０．０１、０．１、１、５、１０、１５、２０ｖ／ｖ％と変えた溶液を調製した。この溶液を酸化シリコン／タングステン基板上に滴下し、結合工程を行った。
【００６８】
非イオン性界面活性剤は粘度が高く、また、気泡ができやすいため、１５ｖ／ｖ％および２０ｖ／ｖ％では再現性のある結果が得られなかった。ｍｉｎＴ１−ＬＦの配置個数は、タングステン部分ではほぼ一定だった。酸化シリコン基板上では、０．０１ｖ／ｖ％を境界に、０．０１ｖ／ｖ％より低い濃度では配置個数は急激に増加し、０．００５ｖ／ｖ％ではタングステン上とほぼ同数だった。以上の結果から、非イオン性界面活性剤の濃度としては０．０１ｖ／ｖ％以上、好ましくは０．１ｖ／ｖ％以上で、ｍｉｎＴ１−ＬＦはタングステン部分への配置選択性が得られた。
【００６９】
なお、界面活性剤として、化２で示すＴｗｅｅｎ８０を用いても同様の結果が得られた。
【００７０】
【化２】
2010134140.tif 000005
【００７１】
（実施例４）
緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、フェリチン濃度として０．５ｍｇ／ｍＬ、非イオン性界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０  １ｖ／ｖ％の溶液を調製した。この溶液を、幅２０ｎｍ、長さ２００ｎｍのタングステン細線を形成した５ｍｍ×１０ｍｍの酸化シリコン基板上に滴下し、結合工程を行った。溶液の除去工程として、容量１．５ｍＬのエッペンドルフチューブの中に封入し、２，０００Ｇで遠心することで溶液を除去した。ｍｉｎＴ１−ＬＦは、細線上に幅２〜３個の列で配置された。また、酸化シリコン基板上には、基板端とシリコンかけらゴミ近傍以外にはｍｉｎＴ１−ＬＦは見られなかった。
【００７２】
溶液の洗浄工程として、緩衝液と純水により結合工程後の基板を順次洗浄し、基板表面を観察したところ、ｍｉｎＴ１−ＬＦは細線上に幅１個の列で配置された。また、酸化シリコン基板上にはｍｉｎＴ１−ＬＦは見られなかった。
【００７３】
以上のように、本発明によって、ｍｉｎＴ１−ＬＦはナノサイズのタングステン部分への選択的な配置が可能であった。
【００７４】
なお、フェリチン内に内包させる無機粒子として、酸化第二鉄に替えてコバルト酸化物を用いても、同様の結果が得られた。また、インジウム酸化物を内包したｍｉｎＴ１−ＬＦでは、インジウム酸化物粒子が、ＳＥＭの電子ビーム照射により二次電子輝度が失われる（おそらく蒸発したためと推察される）ために、正確な個数の比較は困難であったが、低倍率の簡易な個数計測で、ほぼ同様の結果が得られた。
【００７５】
上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施の形態が明らかである。したがって、上記説明は例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造および／または機能の詳細を実質的に変更できる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明にかかるフェリチンの配置方法は、酸化シリコン基板上のクロム、モリブデンまたはタングステン部分に、フェリチン及び無機粒子を選択配置することが可能である。【００７７】
タングステンは金属薄膜の下地層や、拡散防止層、あるいはシリコン半導体配線のプラグメタルとしてよく用いられることから、金属配線界面改善の為に微量の無機元素を界面に選択的に配置する用途に用いることに有用である。【００７８】
また、クロムやモリブデンは触媒としてよく用いられることから、酸化シリコンを基材とし、クロムやモリブデンやタングステンを分散した触媒において、助触媒として用いる無機粒子を内包したフェリチンを選択的に配置することにより、効率的に触媒−助触媒接合界面を酸化シリコン基材上に形成する用途にも応用できる。
【図７】
2010134140.tif 000006
【図８】
2010134140.tif 000007
【図９】
2010134140.tif 000008
【図１】
2010134140.tif 000009
【図２】
2010134140.tif 000010
【図３】
2010134140.tif 000011
【図４】
2010134140.tif 000012
【図５】
2010134140.tif 000013
【図６】
2010134140.tif 000014
【配列表】
2010134140000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年3月9日(2010.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェリチンの配置方法であって、
前記配置方法は、
サブユニットＮ末端部に配列番号１に記載のペプチドを修飾したフェリチンと、０．０１ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下の非イオン界面活性剤とを含み、ｐＨが７．４以上８．２以下の範囲にある溶液を調製する調製工程と、
表面の一部にクロム、モリブデン、およびタングステンから選択された１種の金属部分が形成された酸化シリコン基板上に前記溶液を滴下することによって、前記フェリチンを選択的に前記金属部分に結合させる結合工程と、
を包含する、配置方法。
【請求項２】
前記結合工程の後に、前記溶液を除去し、前記金属部分に選択的に結合した前記フェリチンを前記酸化シリコン基板上に残す除去工程をさらに包含する、請求項１に記載のフェリチンの配置方法。
【請求項３】
前記結合工程の後に、前記フェリチンを含まない溶液により前記酸化シリコン基板の表面を洗浄し、前記金属部分に選択的に結合した前記フェリチンを、前記酸化シリコン基板上の前記金属部分に残す洗浄工程をさらに包含する、請求項１に記載のフェリチンの配置方法。
【請求項４】
前記フェリチンが無機粒子を内包している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記結合工程の後に、前記酸化シリコン基板を加熱して前記フェリチンを分解し、前記フェリチンが内包していた無機粒子を、前記酸化シリコン基板上の前記金属部分に配置する分解工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成22年12月14日(2010.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフェリチンを酸化シリコン基板上に形成したクロム、モリブデンまたはタングステン部分に選択的に配置させる方法に関する。また、本発明はフェリチンに内包させた無機粒子を酸化シリコン基板上のクロム、モリブデンまたはタングステン部分に選択的に配置させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のフェリチンあるいはフェリチンに内包させた無機粒子を固体上に配置する方法としては、リソグラフィ法により作製した静電的に極性を反転したパターン上に静電相互作用を用いて配置する方法（例えば、非特許文献５参照）が知られている。
【０００３】
非特許文献５では、酸化シリコン基板上にレジストを塗布し、電子ビームリソグラフィで露光した領域のレジストを現像することで除去し、酸化シリコン基板を露出させた領域を、アミノ基が末端に付いたシランカップリング剤、具体的にはアミノプロピルトリメトキシシランの蒸気に暴露することで、露出させた領域のみにアミノ末端シランカップリング剤を吸着させる。そして、レジストを溶剤で除去することで、酸化シリコン基板の一部にアミノ末端シランカップリングによりパターンを形成し、ｐＨとイオン強度の調整により静電相互作用を制御することで、フェリチンをアミノ末端シランカップリング修飾パターンのみに配置できることが開示されている。
【０００４】
また、チタニウムに親和性を持つよう選ばれた６つのアミノ酸（アルギニン−リジン−ロイシン−プロリン−アスパラギン酸−アラニン：以下一文字表記でＲＫＬＰＤＡ）からなるペプチド（非特許文献１参照）をフェリチン表面に修飾することでフェリチンにチタニウムへの親和性を付与し、さらに、非イオン性界面活性剤を用いて固体表面との相互作用を弱めることにより、チタニウムパターン上に選択配置する方法（特許文献１、非特許文献３参照）も知られている。
【０００５】
また、前記ペプチドＲＫＬＰＤＡによるチタニウム上への選択配置において、非イオン界面活性剤の吸着量の差が、選択比を増強していることが非特許文献４に開示されている。非特許文献４では疎水性基板及びシリコン基板上にはチタニウム基板上より多くの非イオン性界面活性剤が吸着することが示され、また、疎水性基板ならば多くの非イオン性界面活性剤が吸着するだろうことが示唆されているが、親水性基板であるチタニウムとシリコン上への吸着差の機構に関しては明らかにされていない。
【０００６】
一方、非イオン性界面活性剤の吸着量差のみを利用することで白金または酸化シリコン上の、チタンまたは窒化シリコン上へ、フェリチンの選択配置を行う方法が特許文献２に開示されている。前記ペプチドＲＫＬＰＤＡが親和性を持つ材料に関しては、非特許文献２において開示されており、チタニウム、シリコン、銀に親和性を持つ一方、金、クロム、白金、錫、亜鉛、銅、鉄に対しては親和性を持たないことが示されている。
【０００７】
すなわち、非イオン界面活性剤にはタンパク質と基板との相互作用を弱める効果があり、固体表面の吸着量差により、選択的に金や白金などの疎水性表面や酸化シリコン表面へのタンパク質の配置を抑制することができることや、ペプチドＲＫＬＰＤＡをタンパク質表面に修飾することにより、チタニウム、シリコン、銀に対する親和性を付与することができることがこれまでに知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００６／０６４６３９号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／０６４６４０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ken-Ichi Sano, Kiyotake Shiba, J.A.C.S., 125, 14234(2003)
【非特許文献２】Ken-Ichi Sano, Hiroyuki Sasaki, Kiyotake Shiba, Langmuir, 21, 3090(2005)
【非特許文献３】Ichiro Yamashita, Hiroya Kirimura, Mitsuhiro Okuda, Kazuaki Nishio, Ken-Ichi Sano, Kiyotake Shiba, Tomohiro Hayashi, Masahiko Hara, Yumiko Mishima, Small, 2, 1148(2006)
【非特許文献４】Tomohiro Hayashi, Ken-Ichi Sano, Kiyotake Shiba, Yoshikazu Kumashiro, Kenji Iwahori, Ichiro Yamashita, Masahiko Hara, Nano Letters, 6, 515(2006)
【非特許文献５】Shinya Kumagai, Shigeo Yoshii, Kiyohito Yamada, Nozomu Matsukawa, Isamu Fujiwara, Kenji Iwahori, Ichiro Yamashita, Applied Physics Letters, 88, 153103(2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
無機ナノ粒子を半導体デバイスや触媒として用いるためには、無機ナノ粒子を、シリコン基板上やシリカマトリックス中のクロム、モリブデンまたはタングステンといった金属元素部分に高密度に選択配置する必要がある。しかしながら、静電相互作用を用いた前記従来の方法では、リソグラフィによるパターンニングが必要、かつシリコン以外の表面に高密度に吸着できるカップリング剤が必要になる。
【００１１】
ここで、ペプチドＲＫＬＰＤＡはチタニウム、シリコン、銀に対する親和性しか明らかでない一方、クロムに加え、金、白金、錫、亜鉛、銅、鉄といった多くの元素に対しては親和性を持たないことが知られている。さらに、ペプチドＲＫＬＰＤＡが親和性を有するシリコン上の所望の元素に選択配置させるためには、シリコン表面への親和性の抑制と、所望の元素への吸着を同時に実現する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述した従来の課題を解決するための本発明方法は、
フェリチンの配置方法であって、
前記配置方法は、
サブユニットＮ末端部に配列番号１に記載のペプチドを修飾したフェリチンと、０．０１ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下の非イオン界面活性剤とを含み、ｐＨが７．４以上８．２以下の範囲にある溶液を調製する調製工程と、
表面の一部にクロム、モリブデン、およびタングステンから選択された１種の金属部分が形成された酸化シリコン基板上に前記溶液を滴下することによって、前記フェリチンを選択的に前記金属部分に結合させる結合工程と、
を包含する、配置方法である。
【００１３】
ここで、フェリチンのサブユニットＮ末端部をペプチドで修飾するとは、フェリチンＮ末端のアミノ酸残基（メチオニン残基）を配列番号１のペプチドで置換すること、フェリチンのＮ末端に配列番号１のペプチドを付加すること、及びフェリチンのＮ末端部のアミノ酸配列に配列番号１のペプチドを挿入することのいずれをも含む。
【００１４】
前記結合工程の後に、前記溶液を除去し、前記金属部分に選択的に結合した前記フェリチンを前記酸化シリコン基板上に残す除去工程をさらに包含することが好ましい。
【００１５】
前記結合工程の後に、前記フェリチンを含まない溶液により前記酸化シリコン基板の表面を洗浄し、前記金属部分に選択的に結合した前記フェリチンを、前記酸化シリコン基板上の前記金属部分に残す洗浄工程をさらに包含することも好ましい。
【００１６】
本発明のフェリチン配置方法では、フェリチンが無機粒子を内包していてもよい。また、前記結合工程の後に、前記酸化シリコン基板を加熱して前記フェリチンを分解し、前記フェリチンが内包していた無機粒子を、前記酸化シリコン基板上の前記金属部分に配置する分解工程をさらに包含してもよい。
【００１７】
フェリチンは窒素雰囲気中５００℃、酸素雰囲気中４００℃、オゾン雰囲気中１１０℃以上で熱処理することにより、酸化・分解するが、無機粒子は残る。このため、ペプチド修飾フェリチンに無機粒子を内包させれば、酸化シリコン上のクロム、モリブデンまたはタングステン部分に選択的にフェリチンを配置した後、熱処理によりフェリチンを分解除去することにより、無機粒子のみをクロム、モリブデンまたはタングステン部分に選択配置することが可能となる。
【００１８】
なお、本発明のフェリチン配置方法においては、溶液中の吸着プロセスを用いているため、基板上に構造が形成されていても、溶液が接触できる領域においては平坦な基板と本質的に違いはない。
【００１９】
本発明の上記目的、他の目的、特徴および利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のフェリチン配置方法によれば、酸化シリコン上の一部に形成されたクロム、モリブデンまたはタングステン部分に、フェリチンひいてはフェリチンに内包された無機粒子を選択的に配置することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、カゴ状フェリチンとサブユニット、並びにＮ末端の関係を説明する模式図である。
【図２】図２は、Ｌ型フェリチンサブユニットのプラスミドの主要構成と、大腸菌へのプラスミドの取り込みの模式図である。
【図３】図３は、酸化シリコン基板上のクロム部分に配置された鉄コア内包ｍｉｎＴ１−ＬＦのＳＥＭ画像の顕微鏡写真である。
【図４】図４は、酸化シリコン基板上のモリブデン部分に配置された鉄コア内包ｍｉｎＴ１−ＬＦのＳＥＭ画像の顕微鏡写真である。
【図５】図５は、酸化シリコン基板上のタングステン部分に配置された鉄コア内包ｍｉｎＴ１−ＬＦのＳＥＭ画像の顕微鏡写真である。
【図６】図６は、異なるｐＨで酸化シリコン基板上のタングステン部分に配置された鉄コア内包ｍｉｎＴ１−ＬＦのＳＥＭ画像の顕微鏡写真である。
【図７】図７は、ｍｉｎＴ１−ＬＦ吸着個数のｐＨ依存性を示すグラフである。
【図８】図８は、酸化シリコン基板へのｍｉｎＴ１−ＬＦ吸着個数のｐＨ依存性を示すグラフである。
【図９】図９は、ｍｉｎＴ１−ＬＦ吸着個数の非イオン性界面活性剤濃度依存性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００２３】
本発明で用いられるフェリチンは、サブユニットＮ末端に配列番号１で示されるアミノ酸配列を有している。一例として本発明において用いられるフェリチンは、配列番号３に示されるタンパク質のＮ末端の開始コドンに対応するメチオニンが配列番号１で示されるアミノ酸配列に置換されたフェリチンである。本実施の形態で用いた発現系では開始コドンに対応するメチオニンが欠失するため、このタンパク質は１８０残基を有し、配列番号３からメチオニンを除いた１７４残基のウマ由来フェリチンのアミノ酸配列のアミノ末端に配列番号１の６残基のアミノ酸配列が修飾されたものになった。
【００２４】
後述する実験例では、配列番号１が修飾されたフェリチンは「ｍｉｎＴ１−ＬＦ」と記述される。比較例で用いる一般のフェリチンとして、配列番号３からメチオニンが欠失した１７４残基からなるフェリチンを用い、これを「△１−ＬＦ」と記述する。
【００２５】
基板としては、熱酸化シリコン基板上に選択配置させたい金属元素のパターンが部分的に形成された基板を使用直前に洗浄して用いた。洗浄には水洗、有機溶剤洗浄、ＵＶオゾンによる処理を順次行った。
【００２６】
本発明のフェリチンの選択配置方法には大きく３つの工程、すなわち調製工程、結合工程と除去工程を有する。
【００２７】
（１）調製工程について
調製工程では、サブユニットＮ末端部に配列番号１に記載のペプチドを修飾したフェリチンと、０．０１ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下の非イオン界面活性剤とを含み、ｐＨが７．４以上８．２以下の範囲にある溶液を調製する。
【００２８】
（２）結合工程について
結合工程では、調製工程で調製した、フェリチンと非イオン界面活性剤を含む溶液を、酸化シリコン基板上に滴下する。
【００２９】
（３）除去工程について
除去工程では、酸化シリコン基板上に滴下した溶液中に残存しているフェリチンを除去することが目的となる。除去する方法としては、乾燥を抑制した状態で遠心により溶液を除去するか、フェリチンを含まない溶液で洗い流すことにより除去するという主に二つの方法がある。遠心による除去では、基板表面の凹凸により、除去しきれないフェリチンが残ることがあるため、フェリチンを含まない溶液で洗い流す方法が好ましい。
【００３０】
このようにして、フェリチンを基板上に配置することができる。なお、フェリチンとして、無機粒子を内包したフェリチンを用いれば、フェリチンを分解することによって無機粒子を基板上に配置することが可能となる。
【００３１】
以下、本発明の実施例をさらに詳細に説明する。
【００３２】
（実施例１）
まず、以下の実施例に用いたフェリチンの製造方法について説明する。本願の実施例では、配列番号１に示すポリペプチドでＮ末端部を修飾したリコンビナントフェリチン「ｍｉｎＴ１−ＬＦ」と配列番号１を有しないリコンビナントフェリチン「△１−ＬＦ」を使用した。
【００３３】
＜△１−ＬＦの製造方法＞
まず、△１−ＬＦの製造方法について説明する。天然のウマ脾臓由来フェリチンのサブユニットにはわずかに構造の異なるＬ型とＨ型があるため、天然フェリチンは、一定の構造を有さない。そこで、本願の実施例ではＬ型サブユニットのみから構成されるリコンビナントフェリチンを使用した。
【００３４】
はじめに、Ｌ型のフェリチンをコードするＤＮＡ（配列番号：2,528塩基対）を、ＰＣＲ法を用いて増幅し、多量のＬ型フェリチンＤＮＡを用意した。次に、このＬ型フェリチンＤＮＡを、制限酵素EcoRI及びHind IIIが特異的に切断する部位（制限酵素サイト）で切断した。この切断処理により、EcoRI及びHind IIIの制限酵素サイトを有するＬ型フェリチンＤＮＡ断片の溶液を調製した。この溶液にＤＮＡ電気泳動を行い、Ｌ型フェリチンをコードするＤＮＡ断片だけを回収、精製した。
【００３５】
その後、このＬ型フェリチン ＤＮＡ断片と、EcoRI - Hind IIIの制限酵素で処理したベクタープラスミド（pMK-2）とをインキュベートしてライゲーションを行った。これによりpMK-2プラスミドのマルチクローニングサイト（MSC）にＬ型フェリチンＤＮＡが入ったベクタープラスミド pMK-2-fer-0 を作製した。使用したベクタープラスミドのpMK-2は、プロモーターに Tac プロモーターを有し、多コピープラスミドとしてコピー数が多いという特徴を持ち、大量のフェリチンを得るのに有利であることから選択した。
【００３６】
作製したプラスミド (pMK-2-fer-0) を宿主（ホスト）である大腸菌株E. coli Nova Blue (Novagen ) に導入（形質転換）し、リコンビナントＬ型フェリチン株（△１−ＬＦ）を作製した。なお、Ｌ型フェリチンサブユニットのプラスミドの主要構成と、大腸菌へのプラスミドの取り込みを模式化した図を、図２に示した。
【００３７】
これらのリコンビナントフェリチンの内部に、後述する方法によって無機粒子を内包させた。
【００３８】
＜ｍｉｎＴ１−ＬＦの製造方法＞
次に、配列番号１でＮ末端部を修飾したフェリチン（ｍｉｎＴ１−ＬＦ）の製造方法について説明する。
【００３９】
フェリチンを構成するサブユニットのアミノ末端（Ｎ末端）をペプチドで修飾すると、図１に示したように、フェリチン粒子の外側に該ペプチドが突き出した構造となる。そのため、このＮ末端部分を任意のペプチドで修飾することにより、フェリチン粒子の表面を該ペプチドで修飾することが可能である。
【００４０】
ここで、ｍｉｎＴ１−ＬＦの具体的な製造方法を説明する。天然フェリチン（ウマ肝臓由来）のＬタイプのサブユニットの全長遺伝子を、配列番号２に示した。本実施例で用いた発現系では開始コドンに対応するメチオニンが欠失するため、配列番号２のＤＮＡからは、配列番号３に示すアミノ酸配列のフェリチンからメチオニンを除いた１７４残基のアミノ酸からなるフェリチンが合成される。
【００４１】
まず、配列番号１をコードするＤＮＡ（配列番号４（３０塩基対）及び配列番号５（２２塩基対））を、ＰＣＲ法を用いて増幅し、多量のＤＮＡを用意した。
【００４２】
次に、上記ＤＮＡと、制限酵素Bam I及びSac Iの制限酵素で処理した、リコンビナントＬ型フェリチンをコードするベクタープラスミド（pMK-2）をインキュベートしてライゲーションを行った。これによりpMK-2プラスミドのマルチクローニングサイト（MSC）に、上記塩基配列のＤＮＡ及びＬ型フェリチンＤＮＡが入ったベクタープラスミド(pKIS1) を作製した。pKIS1作製に使用したベクタープラスミドのpMK-2は、プロモーターに Tac プロモーターを有し、多コピープラスミドとしてコピー数が多いという特徴を持ち、大量のフェリチンを得るのに有利であることから選択した。
【００４３】
作製したプラスミドを宿主（ホスト）である大腸菌株 E. coli XLI Blue (Novagen) に導入（形質転換）し、配列番号１に示すポリペプチドでＮ末端が修飾されたＬ型フェリチン株（ｍｉｎＴ１−ＬＦ）を作製した。
【００４４】
＜ｍｉｎＴ１−ＬＦへの無機粒子の導入＞
本発明において、フェリチンに内包させる無機粒子の種類は、特に限定されるものではないが、実施例においては、無機粒子として酸化第二鉄（Ｆｅ２Ｏ３）を用いた。ｍｉｎＴ１−ＬＦへのＦｅ２Ｏ３コアの導入は、以下のようにして行った。
【００４５】
反応溶液として、０．５ｍｇ／ｍＬ  ｍｉｎＴ１−ＬＦ／１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）を調製し、ここに５ｍＭ酢酸アンモニウム鉄を添加した。２５℃で一晩反応させ、反応後の溶液からＦｅ２Ｏ３のコアが形成されたｍｉｎＴ１−ＬＦを、遠心分離とゲルろ過により分子精製して回収した。遠心分離は、１，６００Ｇ、１０分及び１０，０００Ｇ、３０分の条件で行って、段階的にｍｉｎＴ１−ＬＦ以外の不要部分を沈殿として除去し、最後に残った上清よりＦｅ２Ｏ３コアを形成したｍｉｎＴ１−ＬＦを、２３０，０００Ｇ、１時間の超遠心分離によってペレットとして回収した。
【００４６】
得られたｍｉｎＴ１−ＬＦを、ＨＰＬＣを用いたゲルろ過［カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ４０００ＷＸＬ  ＰＥＥＫ／流速：１ｍｌ／ｍｉｎ／バッファ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ］を行い、２４量体（約４８０ｋＤａ）のピークを分取した。分取したｍｉｎＴ１−ＬＦ溶液は、限外ろ過膜を用いて濃縮し、Ｆｅ２Ｏ３を内包したｍｉｎＴ１−ＬＦを得た。
【００４７】
なお、△１−ＬＦに上記と同様の操作を行うことにより、Ｆｅ２Ｏ３を内包した△１−ＬＦを得た。
【００４８】
＜基板作製方法＞
次に、本願の実施例に用いた基板の作製方法について説明する。
【００４９】
１０ｍｍ角の熱酸化シリコン基板の半分にレジスト（日本ゼオン：ＺＥＰ５２０）を塗布し、１４０℃３分間ベークした後に、金属元素をターゲットとしたＲＦマグネトロンスパッタにより金属薄膜を製膜した。ターゲットとしては純度９９．５％以上（高純度化学）のクロム、モリブデンまたはタングステンを用いた。段差による影響を排除するため、厚さは１ｎｍとした。
【００５０】
４０℃に加熱したリムーバー（日本ゼオン：ジメチルアセトアミド）中で超音波洗浄することにより、レジスト上の金属薄膜を除去し、半面が酸化シリコン基板、半面がクロム、モリブデンまたはタングステンである基板を作製した。
【００５１】
また、ナノサイズへの選択配置が可能なことを確認するために、電子ビームリソグラフィにより細線をパターニングした基板も作製した。１０ｍｍ角の熱酸化シリコン基板上に３００Åのレジスト（日本ゼオン：ＺＥＰ５２０）をスピンコート法により塗布した後、１４０℃３分間ベークした。電子ビームリソグラフィ（エリオニクス：ＥＬＳ−７５００）により細線を露光し、現像液（日本ゼオン：ｎ−アミルアセテート）で現像し、幅２０ｎｍ長さ２００ｎｍの細線領域の表面が露出した基板を作製した。以降は半面基板と同様の方法により、タングステンの細線を作製した。
【００５２】
作製した基板は使用する直前に(1) 超純水中、(2) 電子工業用グレードのエタノール中、(3) 電子工業用グレードのアセトン中、で順に超音波洗浄した後、１１０℃に加熱しながらＵＶオゾナイザーで表面をクリーニングして使用した。
【００５３】
また、上記洗浄後の基板を原子間力顕微鏡により表面計測し、基板上に作製されたクロム、モリブデンまたはタングステン部分が平坦な薄膜であること、及び薄膜の厚さが２ｎｍ以下であることを確認した。
【００５４】
＜溶液調製＞
次に、本願の実施例に用いた溶液の調製方法について説明する。
【００５５】
まず、緩衝液として超純水（Millipore）、ＭＥＳ（Sigma-Aldrich）、Ｔｒｉｓ（Sigma-Aldrich:Trizma base）を用い、５０ｍＭ、ｐＨ７．８の緩衝液を調製した。その後、フェリチンと非イオン界面活性剤とをそれぞれ０．５ｍｇ／ｍＬ、１．０ｖ／ｖ％となるように加えた。非イオン界面活性剤としては化１で示すＴｗｅｅｎ２０（ICI）を用いた。
【００５６】
【化１】
2010134140.tif 000015
【００５７】
＜結合工程＞
上述した洗浄を行った基板を１インチウェハートレイ中に置き、調製した溶液１００μＬを滴下した後、乾燥を防ぐために蓋をし、１０分間静置した。その後、緩衝溶液のみを５００μＬ滴下し、希釈された溶液を５００μＬ吸引し除去するという工程を３回繰り返した後、同様に超純水のみを１ｍＬ滴下し、希釈された溶液を１ｍＬ吸引除去する工程を３回繰り返した後に、ビーカー中で超純水を流しながら５分間洗浄した。最後に、窒素ブローにより超純水を吹き飛ばし乾燥させた。
【００５８】
＜電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察＞
結合工程を行った基板に対し、高解像度電子顕微鏡（JEOL:JSM-7400F）を用いてフェリチンが内包する無機粒子コアを観察することにより、基板上のフェリチンの個数を計測した。ＳＥＭ画像から２００ｎｍ×２００ｎｍ角の領域を切り出し、個数をカウントした。個数が１００に満たない場合は３カ所の計測値を平均した。
【００５９】
酸化シリコン上のクロム部分に配置されたｍｉｎＴ１−ＬＦのＳＥＭ画像と、クロム部分の拡大図を、図３に示す。また、酸化シリコン上のモリブデン部分に配置されたｍｉｎＴ１−ＬＦのＳＥＭ画像と、モリブデン部分の拡大図を、図４に示す。また、酸化シリコン上のタングステンに配置されたｍｉｎＴ１−ＬＦのＳＥＭ画像と、酸化シリコン上のタングステン部分の拡大図を、図５に示す。ｍｉｎＴ１−ＬＦは、クロム、モリブデンまたはタングステン部分に選択的に配置されている。△１−ＬＦの場合、クロム、モリブデン、タングステン部分の配置個数は、ｍｉｎＴ１−ＬＦの４０％以下であった。
【００６０】
（実施例２）
緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ−Ｔｒｉｓを用い、ｐＨを６．７、７．４、７．８、８．０、８．２に調製した緩衝液を用い、フェリチン濃度２．０ｍｇ／ｍＬ、非イオン性界面活性剤濃度Ｔｗｅｅｎ２０  １ｖ／ｖ％とした溶液を調製した。
【００６１】
そして、この溶液を用いて実施例１と同様の結合工程を行った。結合工程後の基板表面のＳＥＭ画像を図６に、ｍｉｎＴ１−ＬＦの個数計測結果を図７に示す。ｐＨが７．４もしくは６．７の場合、ｍｉｎＴ１−ＬＦは溶液中で凝集する傾向にあり、ｐＨ６．７では混合してすぐに、ｐＨ７．４では数分後には溶液は混濁した。そのため、固体表面に配置されたｍｉｎＴ１−ＬＦにも凝集体が散見された。凝集体を避けて計測した結果を図７に示したが、７．４より低いｐＨでは安定した結果を得ることは困難だった。ｐＨ７．４においても、操作を短時間で終わらせる必要性があり、簡易に安定した結果を得るには７．４より高いｐＨが好ましい。
【００６２】
図７に見られるように、タングステン部分に配置されたｍｉｎＴ１−ＬＦの個数はｐＨ８．２〜７．８で特に多くなる結果が得られた。ｐＨ７．４を境界に個数は減少したが、上述した溶液中での凝集の影響と合わせて、ｐＨは７．４以上、好ましくは７．８以上で良い結果が得られている。
【００６３】
一方、酸化シリコン基板上のｍｉｎＴ１−ＬＦの配置個数の結果を、図８に示す。酸化シリコン上の個数は少ないため、酸化シリコン基板上に直接配置する実験をｐＨ８．４も含めて実施した。ｐＨ６．７〜８．２は半面がクロム、モリブデンまたはタングステンである基板の結果とほぼ重なる。そして、ｐＨ８．２を境界にアルカリ側で吸着個数が増加した。このことからｐＨは８．２以下、好ましくは８．０以下でフェリチンがクロム、モリブデンまたはタングステン部分に選択的に配置されるという結果が得られた。
【００６４】
なお、△１−ＬＦの配置個数結果は、ｐＨ６．７〜８．２の範囲内では、２００ｎｍ四方で１００を越えることは無かった。
【００６５】
また、実施例１の結果と合わせて、タンパク質濃度の影響を表１にまとめたが、タンパク質濃度の影響は見られなかった。
【００６６】
【表１】
2010134140.tif 000016
【００６７】
（実施例３）
緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、フェリチン濃度として０．５ｍｇ／ｍＬの溶液に、非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０の濃度を０．００５、０．０１、０．１、１、５、１０、１５、２０ｖ／ｖ％と変えた溶液を調製した。この溶液を酸化シリコン／タングステン基板上に滴下し、結合工程を行った。
【００６８】
非イオン性界面活性剤は粘度が高く、また、気泡ができやすいため、１５ｖ／ｖ％および２０ｖ／ｖ％では再現性のある結果が得られなかった。ｍｉｎＴ１−ＬＦの配置個数は、タングステン部分ではほぼ一定だった。酸化シリコン基板上では、０．０１ｖ／ｖ％を境界に、０．０１ｖ／ｖ％より低い濃度では配置個数は急激に増加し、０．００５ｖ／ｖ％ではタングステン上とほぼ同数だった。以上の結果から、非イオン性界面活性剤の濃度としては０．０１ｖ／ｖ％以上、好ましくは０．１ｖ／ｖ％以上で、ｍｉｎＴ１−ＬＦはタングステン部分への配置選択性が得られた。
【００６９】
なお、界面活性剤として、化２で示すＴｗｅｅｎ８０を用いても同様の結果が得られた。
【００７０】
【化２】
2010134140.tif 000017
【００７１】
（実施例４）
緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、フェリチン濃度として０．５ｍｇ／ｍＬ、非イオン性界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０  １ｖ／ｖ％の溶液を調製した。この溶液を、幅２０ｎｍ、長さ２００ｎｍのタングステン細線を形成した５ｍｍ×１０ｍｍの酸化シリコン基板上に滴下し、結合工程を行った。溶液の除去工程として、容量１．５ｍＬのエッペンドルフチューブの中に封入し、２，０００Ｇで遠心することで溶液を除去した。ｍｉｎＴ１−ＬＦは、細線上に幅２〜３個の列で配置された。また、酸化シリコン基板上には、基板端とシリコンかけらゴミ近傍以外にはｍｉｎＴ１−ＬＦは見られなかった。
【００７２】
溶液の洗浄工程として、緩衝液と純水により結合工程後の基板を順次洗浄し、基板表面を観察したところ、ｍｉｎＴ１−ＬＦは細線上に幅１個の列で配置された。また、酸化シリコン基板上にはｍｉｎＴ１−ＬＦは見られなかった。
【００７３】
以上のように、本発明によって、ｍｉｎＴ１−ＬＦはナノサイズのタングステン部分への選択的な配置が可能であった。
【００７４】
なお、フェリチン内に内包させる無機粒子として、酸化第二鉄に替えてコバルト酸化物を用いても、同様の結果が得られた。また、インジウム酸化物を内包したｍｉｎＴ１−ＬＦでは、インジウム酸化物粒子が、ＳＥＭの電子ビーム照射により二次電子輝度が失われる（おそらく蒸発したためと推察される）ために、正確な個数の比較は困難であったが、低倍率の簡易な個数計測で、ほぼ同様の結果が得られた。
【００７５】
上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施の形態が明らかである。したがって、上記説明は例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造および／または機能の詳細を実質的に変更できる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明にかかるフェリチンの配置方法は、酸化シリコン基板上のクロム、モリブデンまたはタングステン部分に、フェリチン及び無機粒子を選択配置することが可能である。
【００７７】
タングステンは金属薄膜の下地層や、拡散防止層、あるいはシリコン半導体配線のプラグメタルとしてよく用いられることから、金属配線界面改善の為に微量の無機元素を界面に選択的に配置する用途に用いることに有用である。
【００７８】
また、クロムやモリブデンは触媒としてよく用いられることから、酸化シリコンを基材とし、クロムやモリブデンやタングステンを分散した触媒において、助触媒として用いる無機粒子を内包したフェリチンを選択的に配置することにより、効率的に触媒−助触媒接合界面を酸化シリコン基材上に形成する用途にも応用できる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェリチンの配置方法であって、
前記配置方法は、
サブユニットＮ末端部に配列番号１に記載のペプチドを修飾したフェリチンと、０．０１ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下の非イオン界面活性剤とを含み、ｐＨが７．４以上８．２以下の範囲にある溶液を調製する調製工程と、
表面の一部にクロム、モリブデン、およびクロムから選択された１種の金属部分が形成された酸化シリコン基板上に前記溶液を滴下することによって、前記フェリチンを選択的に前記金属部分に結合させる結合工程と、
を包含する、配置方法。
【請求項２】
前記結合工程の後に、前記溶液を除去し、前記金属部分に選択的に結合した前記フェリチンを前記酸化シリコン基板上に残す除去工程をさらに包含する、請求項１に記載のフェリチンの配置方法。
【請求項３】
前記結合工程の後に、前記フェリチンを含まない溶液により前記酸化シリコン基板の表面を洗浄し、前記金属部分に選択的に結合した前記フェリチンを、前記酸化シリコン基板上の前記金属部分に残す洗浄工程をさらに包含する、請求項１に記載のフェリチンの配置方法。
【請求項４】
前記フェリチンが無機粒子を内包している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記結合工程の後に、前記酸化シリコン基板を加熱して前記フェリチンを分解し、前記フェリチンが内包していた無機粒子を、前記酸化シリコン基板上の前記金属部分に配置する分解工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2010134140.tif 000018
【図２】
2010134140.tif 000019
【図３】
2010134140.tif 000020
【図４】
2010134140.tif 000021
【図５】
2010134140.tif 000022
【図６】
2010134140.tif 000023
【図７】
2010134140.tif 000024
【図８】
2010134140.tif 000025
【図９】
2010134140.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成22年12月15日(2010.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェリチンの配置方法であって、
前記配置方法は、
サブユニットＮ末端部に配列番号１に記載のペプチドを修飾したフェリチンと、０．０１ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下の非イオン界面活性剤とを含み、ｐＨが７．４以上８．２以下の範囲にある溶液を調製する調製工程と、
表面の一部にクロム、モリブデン、およびタングステンから選択された１種の金属部分が形成された酸化シリコン基板上に前記溶液を滴下することによって、前記フェリチンを選択的に前記金属部分に結合させる結合工程と、
を包含する、配置方法。
【請求項２】
前記結合工程の後に、前記溶液を除去し、前記金属部分に選択的に結合した前記フェリチンを前記酸化シリコン基板上に残す除去工程をさらに包含する、請求項１に記載のフェリチンの配置方法。
【請求項３】
前記結合工程の後に、前記フェリチンを含まない溶液により前記酸化シリコン基板の表面を洗浄し、前記金属部分に選択的に結合した前記フェリチンを、前記酸化シリコン基板上の前記金属部分に残す洗浄工程をさらに包含する、請求項１に記載のフェリチンの配置方法。
【請求項４】
前記フェリチンが無機粒子を内包している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記結合工程の後に、前記酸化シリコン基板を加熱して前記フェリチンを分解し、前記フェリチンが内包していた無機粒子を、前記酸化シリコン基板上の前記金属部分に配置する分解工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成23年8月4日(2011.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェリチンの配置方法であって、
前記配置方法は、
サブユニットＮ末端部に配列番号１に記載のペプチドを修飾し、金属又は金属を含む化合物からなる無機粒子を内包したフェリチンと、０．０１ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下の非イオン界面活性剤とを含み、ｐＨが７．４以上８．２以下の範囲にある溶液を調製する調製工程と、
表面の一部にクロム、モリブデン、およびタングステンから選択された１種の金属部分が形成された酸化シリコン基板上に前記溶液を滴下することによって、前記フェリチンを選択的に前記金属部分に結合させる結合工程と、
を包含する、配置方法。
【請求項２】
前記結合工程の後に、前記溶液を除去し、前記金属部分に選択的に結合した前記フェリチンを前記酸化シリコン基板上に残す除去工程をさらに包含する、請求項１に記載のフェリチンの配置方法。
【請求項３】
前記結合工程の後に、前記フェリチンを含まない溶液により前記酸化シリコン基板の表面を洗浄し、前記金属部分に選択的に結合した前記フェリチンを、前記酸化シリコン基板上の前記金属部分に残す洗浄工程をさらに包含する、請求項１に記載のフェリチンの配置方法。
【請求項４】
前記結合工程の後に、前記酸化シリコン基板を加熱して前記フェリチンを分解し、前記フェリチンが内包していた無機粒子を、前記酸化シリコン基板上の前記金属部分に配置する分解工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
上述した従来の課題を解決するための本発明は、
フェリチンの配置方法であって、
前記配置方法は、
サブユニットＮ末端部に配列番号１に記載のペプチドを修飾し、金属又は金属を含む化合物からなる無機粒子を内包したフェリチンと、０．０１ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下の非イオン界面活性剤とを含み、ｐＨが７．４以上８．２以下の範囲にある溶液を調製する調製工程と、
表面の一部にクロム、モリブデン、およびタングステンから選択された１種の金属部分が形成された酸化シリコン基板上に前記溶液を滴下することによって、前記フェリチンを選択的に前記金属部分に結合させる結合工程と、
を包含する、配置方法である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明のフェリチン配置方法では、前記結合工程の後に、前記酸化シリコン基板を加熱して前記フェリチンを分解し、前記フェリチンが内包していた無機粒子を、前記酸化シリコン基板上の前記金属部分に配置する分解工程をさらに包含してもよい。
【国際調査報告】
2010134140.tif 000027
2010134140.tif 000028
2010134140.tif 000029
2010134140.tif 000030