(57)【要約】  耐熱性及び酵素活性に優れたDFAIII合成酵素を提供する。  本発明は、イヌリンをDFAIIIに変換する活性を有し、80℃での残存活性が90%以上である、クルトバクテリウム属に属する微生物由来のDFAIII合成酵素に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌリンをDFAIIIに変換する活性を有し、80℃での残存活性が90%以上である、クルトバクテリウム属に属する微生物由来のDFAIII合成酵素。
【請求項２】
配列番号１のN末端アミノ酸配列を有する、請求項１に記載のDFAIII合成酵素。
【請求項３】
以下の理化学的性質を有する、請求項１又は２に記載のDFAIII合成酵素：
分子量：46,000〜48,000
至適温度：50〜60℃
熱安定性：80℃を超えると徐々に失活し始めるが、90℃で70%以上の残存活性を示す
至適pH：4〜6
pH安定性：pH3〜11で安定。
【請求項４】
イヌリンをDFAIIIに変換する活性を有する、クルトバクテリウム（Curtobacterium）sp.D436-1株（NITE BP-764）由来のDFAIII合成酵素。
【請求項５】
DFAIIIを製造する方法であって、請求項１〜４のいずれか１項に記載のDFAIII合成酵素をイヌリンに接触させることを含む、前記方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のDFAIII合成酵素を産生する微生物の培養液又は培養菌体もしくはその処理物をイヌリンに接触させることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
DFAIII合成酵素を産生する微生物が、クルトバクテリウム（Curtobacterium）sp.D436-1株（NITE BP-764）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
DFAIIIを製造する方法であって、スクロースに、スクロースをイヌリンに変換する酵素と、請求項１〜４のいずれか１項に記載のDFAIII合成酵素とを作用させることを含む、前記方法。
【請求項９】
スクロースをイヌリンに変換する酵素が、Bacillus (バチラス) sp.217C-11株 (FERM BP-7450)が産生するイヌリン合成酵素である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
クルトバクテリウム（Curtobacterium）sp.D436-1株（NITE BP-764）またはその変異株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はジフルクトース・ジアンヒドリドIII（α-D-フルクトフラノース-β-D-フルクトフラノース-1,2';2,3'-ジアンヒドリド、以下、DFAIIIと略記)合成酵素、該酵素を産生する微生物、ならびにDFAIIIの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
DFAIIIは、フラクトース2分子が1,2';2,3'で結合した難消化性の2糖類であり、低カロリー素材としてまた、ミネラル類の吸収を高める生理機能を有する食品として、あるいは高い水溶性や耐酸性、非褐変性といった優れた加工特性を有する食品素材として興味が持たれている。DFAIIIは、ジャクソンらによって単離・同定された物質であり(非特許文献１)、彼らはフラクトースを主構成糖とする多糖であるイヌリンを酸加水分解することにより得ているが、収率がわずか2%と低かった。その後、イヌリンを原料として微生物酵素を利用したDFAIIIの製造方法が報告された。特許文献１においては、アルスロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）由来の酵素を、特許文献２及び３においては、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）由来の酵素を、特許文献４においては、アルスロバクター・イリシス（Arthrobacter ilicis）由来の酵素を、非特許文献２においては、レイフソニア（Leifsonia）sp.T88-4を用いたDFAIIIの製造方法が報告されている。【０００３】
しかし、耐熱性及び酵素活性において満足できるDFAIII合成酵素については知られていない。また、クルトバクテリウム（Curtobacterium）属由来のDFAIII合成酵素についても知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特公平07-002116号公報
【特許文献２】特開昭63-219372号公報
【特許文献３】特開昭63-219389号公報
【特許文献４】特開平1-225492号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Bur.Stand.J.Res.,3(27),1929
【非特許文献２】Carbohydrate Polymers 66, p.75-80 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
DFAIIIの製造に用いられる原料のイヌリンは、水溶性に乏しく酵素反応に用いる場合は数パーセントという薄い濃度で用いざるを得ないものであり、反応効率が悪い上に微生物汚染のリスクが高いという問題があった。また、高濃度のイヌリンを原料として用いようとする場合には酵素反応の間にイヌリンが析出しないように反応温度を高くする必要があり、酵素に極度に高い耐熱性がなければ酵素が加熱変性してしまい反応が進まなくなる危険性があった。【０００７】
従って、本発明は、耐熱性及び酵素活性に優れたDFAIII合成酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、従来のDFAIII合成酵素に比べて酵素活性が高く耐熱性に優れたDFAIII合成酵素を、クルトバクテリウム属の微生物が産生することを見出した。本発明者らはまた、スクロース溶液にイヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素を加えて酵素反応を行うことにより、安価にDFAIII合成酵素を製造できることを見出した。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。【００１０】
（１）イヌリンをDFAIIIに変換する活性を有し、80℃での残存活性が90%以上である、クルトバクテリウム属に属する微生物由来のDFAIII合成酵素。【００１１】
（２）配列番号１のN末端アミノ酸配列を有する、（１）に記載のDFAIII合成酵素。【００１２】
（３）以下の理化学的性質を有する、（１）又は（２）に記載のDFAIII合成酵素：
分子量：46,000〜48,000
至適温度：50〜60℃
熱安定性：80℃を超えると徐々に失活し始めるが、90℃で70%以上の残存活性を示す
至適pH：4〜6
pH安定性：pH3〜11で安定。【００１３】
（４）イヌリンをDFAIIIに変換する活性を有する、クルトバクテリウム（Curtobacterium）sp.D436-1株（NITE BP-764）由来のDFAIII合成酵素。【００１４】
（５）DFAIIIを製造する方法であって、（１）〜（４）のいずれかに記載のDFAIII合成酵素をイヌリンに接触させることを含む、前記方法。【００１５】
（６）（１）〜（４）のいずれかに記載のDFAIII合成酵素を産生する微生物の培養液又は培養菌体もしくはその処理物をイヌリンに接触させることを含む、（５）に記載の方法。【００１６】
（７）DFAIII合成酵素を産生する微生物が、クルトバクテリウム（Curtobacterium）sp.D436-1株（NITE BP-764）である、（６）に記載の方法。【００１７】
（８）DFAIIIを製造する方法であって、スクロースに、スクロースをイヌリンに変換する酵素と、（１）〜（４）のいずれかに記載のDFAIII合成酵素とを作用させることを含む、前記方法。【００１８】
（９）スクロースをイヌリンに変換する酵素が、Bacillus (バチラス) sp.217C-11株 (FERM BP-7450)が産生するイヌリン合成酵素である、（８）に記載の方法。【００１９】
（１０）クルトバクテリウム（Curtobacterium）sp.D436-1株（NITE BP-764）またはその変異株。【００２０】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-142345号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明のDFAIII合成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図２】本発明のDFAIII合成酵素によるDFAIII生成の経時変化を示す図である。
【図３】本発明のDFAIII合成酵素による反応で得られる反応液の糖組成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
従来の微生物由来のDFAIII合成酵素は、酵素活性が低すぎたり、耐熱性が低く工業生産する上で連続的に使用するのには課題があると考えられたため、本発明者らはイヌリンをDFAIIIに変換する酵素を産生する微生物の検索を行った。鋭意検討した結果、クルトバクテリウム属の微生物が、酵素活性が高く耐熱性に優れたDFAIII合成酵素を産生することを見出した。当該酵素は、N末端のアミノ酸配列も新規なものであった。
【００２３】
本発明のDFAIII合成酵素は、イヌリンからDFAIIIを合成する活性を有し、酵素活性が高く耐熱性に優れる。本発明のDFAIII合成酵素は、以下の理化学的性質を有する。
【００２４】
分子量：46,000〜48,000、好ましくは47,000 (SDS-PAGE)
至適温度：50〜60℃、好ましくは55℃
熱安定性：80℃を超えると徐々に失活し始めるが、90℃で70%以上の残存活性を示す。
【００２５】
至適pH：4〜6、好ましくは5（37℃）
pH安定性：pH3〜11で安定。
【００２６】
本発明のDFAIII合成酵素は、従来のDFAIII合成酵素と比較した優れた酵素活性を有する。本発明のDFAIII合成酵素は、通常、95 u/ml以上、好ましくは100 u/ml以上、さらに110 u/ml以上の酵素活性を有する。ここで、酵素活性は、イヌリンから酵素反応によって生じるDFAIIIの生成量をHPLCで定量することで測定したものをさす。即ち、20%イヌリン、20mMリン酸緩衝液（pH6）0.50mlに酵素液0.5mlを加えて37℃条件下で60分間反応させ、5分間の煮沸によって反応停止後、生成したDFAIIIをHPLCにより測定する。ここで1単位（unit）の酵素活性は1分間に1μmole（マイクロモル）のDFAIIIを生成させる酵素量と定義する。また、残存活性とは、25℃での活性を100％として、これに対する残存活性を表す。
【００２７】
本発明のDFAIII合成酵素は、耐熱性において優れることから、高い反応温度で反応を実施でき、従って、水溶性に乏しい基質イヌリンを高濃度で存在させてもイヌリンが析出せず、効率的にDFAIIIを合成することができる。
【００２８】
さらに、本発明のDFAIII合成酵素は、そのN末端に部分アミノ酸配列：N末端アミノ酸配列：Pro-Ala-Asp-Lys-Lys-Lys-Pro-Val-Thr-Leu（配列番号１）を有する。
【００２９】
従って、本発明のDFAIII合成酵素は、例えば、前記部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を決定し、この塩基配列を元に適当なプライマーを設計・合成してPCRを行うことにより得ることができる。また、本発明のDFAIII合成酵素をコードする全塩基配列が決定された後は、例えばその全遺伝子配列をクローニングし、これを公知の遺伝子工学的手法を用いて発現させることにより本発明のDFAIII合成酵素を得ることができる。あるいは、該酵素を産生する微生物の培養液又は培養菌体もしくはその処理物から採取することもできる。
【００３０】
前記微生物は、本発明のDFAIII合成酵素を産生するクルトバクテリウム属に属する微生物であれば特に限定されるものではなく、公知の菌株、又は新たに土壌・海水等から分離した菌株であってもよい。あるいは、それらの菌株に変異処理（例えば、紫外線照射、ニトロソグアニジン（NTG）、エチルメタンスルホン酸（EMS））等を施すことによりその酵素のDFAIII生成能を向上させた変異株であってもよい。
【００３１】
具体的には、クルトバクテリウム（Curtobacterium）sp. D436-1株を挙げることができる。クルトバクテリウム（Curtobacterium）sp. D436-1株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号292-0818）に、平成21年（2009年）5月26日付け（原寄託日）に、受託番号NITE BP-764として寄託されている。
【００３２】
このクルトバクテリウムsp.D436-1株は、本発明者らにより新たに自然界より分離された菌株であり、以下のとおり、クルトバクテリウム属に属する菌株であると同定されたものである。
【００３３】
クルトバクテリウムsp.D436-1株の一般的性質は次のとおりであった。好気性：（＋）、グラム染色：陽性、形状：桿菌（0.6-0.7×1.0-1.2μm）、コロニー色調：黄色。
【００３４】
当該菌株（以下、D436-1株と称する）について、株式会社エヌシーアイエムビー・ジャパン(NCIMB Japan Co., LTD)に委託して、16S rDNA遺伝子の塩基配列（500 bp）を決定（MicroSeq 500 16S rDNA Bacterial Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA)を使用）し、さらに16S rDNA遺伝子の塩基配列に基づく分子系統樹を作製し、系統分析を行った。決定されたD436-1株の16S rDNA遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す。
【００３５】
得られた16S rDNAの塩基配列を用いて相同性検索を行い、相同率上位30株とD436-1株の16S rDNAを用いて近接結合法により分子系統樹を作製し、D436-1株の近縁種及び帰属分類の検討を行った。BLASTを用いた細菌基準株データベースに対する相同性検索の結果、D436-1株の16S rDNA部分塩基配列はクルトバクテリウム属由来の16S rDNAに対し最も高い相同性を示し、相同率99.6%でクルトバクテリウム・シトレウム（Curtobacterium citreum）の16S rDNAに対し最も高い相同性を示した。
【００３６】
GenBank(GenBank/EMBL/DDBJ 国際DNA配列データベース)に対する相同性検索も行った結果、D436-1株の16S rDNA部分塩基配列はクルトバクテリウム属由来の16S rDNAに対し最も高い相同性を示し、基準株ではD436-1株は、クルトバクテリウム・フルックムファシエンス（Curtobacterium flaccumfaciens）又はクルトバクテリウム・プシルム（Curtobacterium pusillum）、クルトバクテリウム・シトレウム（Curtobacterium citreum）、クルトバクテリウム・ルテウム（Curtobacterium luteum）の16S rDNAに対し、99%以上の高い相同性を示した。
【００３７】
なお、現在の細菌基準株データベースには、クルトバクテリウム・プシルム基準株由来の塩基配列の登録はないため、D436-1株の16S rDNAと細菌基準株データベースに対する相同性検索上位30株の16S rDNAにクルトバクテリウム・プシルム株の16S rDNAを加えて簡易分子系統樹解析を行った結果、D436-1株は、クルトバクテリウム属の16S rDNAが形成するクラスター内に含まれたが、単独で系統枝を形成した。
【００３８】
したがって、D436-1株はクルトバクテリウム属に属し、上記４種の何れかに帰属する可能性はあるものの、16S rDNAの塩基配列は完全には一致していないため、クルトバクテリウム・シトレウムに近縁であるが系統的に異なる菌株であると考え、クルトバクテリウム エスピー（Curtobacterium sp.）とした。以上のことから、D436-1株は、クルトバクテリウム属に属する新規な微生物であると判断した。
【００３９】
本発明のDFAIII合成酵素を微生物の培養液から採取する場合、例えば、次のようにして実施することができる；
まず、本発明のDFAIII合成酵素を産生するクルトバクテリウム属微生物、好ましくはクルトバクテリウムsp.D436-1株を適切な条件下で培養する。
【００４０】
培養に使用する培地は、天然培地又は合成培地のいずれでもよい。炭素源としては、例えば、グルコース、スクロース、マルトースやフルクトース等の糖類、酢酸、クエン酸やフマル酸等の有機酸又はその塩、あるいはエタノールやグリセロール等のアルコール類等を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキスやアミノ酸等の一般天然窒素源の他、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、硫酸、塩酸、燐酸やホウ酸等の無機酸又はその塩、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、カルシウム等を含む無機塩、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケル微量金属塩、微生物育成促進剤としてビタミンB1、B2、C、K等のビタミン等を必要に応じて適宜添加できる。さらに、誘導剤としてイヌリンを培地に添加することで、DFAIII合成酵素の生産量を高めることができる。具体的な培地としては、イヌリン1〜2%（w/v）、ペプトン1%、酵母エキス0.5%、リン酸1カリウム0.1%を含むpH7〜8の液体培地を用いることができる。
【００４１】
微生物の培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、30〜40℃、好ましくは25〜37℃で行う。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行い、好ましくはpH5〜9、特に好ましくはpH7〜8に設定する。培養時間は微生物が増殖し得る以上の時間であればよく、5〜96時間、好ましくは15〜24時間である。
【００４２】
本発明のDFAIII合成酵素の採取は、その酵素活性が主として上記微生物（培養菌体）の培養上清中に認められるため、例えば、その培養液を採取することにより実施することができる。
【００４３】
培養液の採取は、公知の固液分離法、例えば、培養液を遠心分離する方法、あるいは膜濾過により分離する方法などを用いて実施することができるが、これらに限定されない。上記の通りにして採取された本発明のDFAIII合成酵素は、培養液等の液状形態で粗酵素液としてそのまま後述の本発明のDFAIIIの製造方法に用いることも可能であるが、好ましくは濃縮して使用する。
【００４４】
濃縮方法としては、当業者に公知の手法、例えばアセトン、イソプロパノールによる溶媒沈殿法、硫安分画法、膜濃縮法などが用いられるが、これらに限定されない。
【００４５】
さらに、上記酵素液を公知の方法により固定化することもできる。固定化方法としては、例えばイオン交換体への結合法、樹脂や膜などとの共有結合・吸着法・高分子物質を用いた包括法などが用いられるがこれらに限定されない。
【００４６】
また、本発明のDFAIII合成酵素は、粗酵素（例えば、上記の粗酵素液）のまま使用することもできるが、当業者に公知の方法、例えば市販の樹脂を使用したイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等によってさらに精製することもできる。
【００４７】
例えば、微生物を培養後、遠心分離により除菌し、限外ろ過膜によって濃縮し、Phenyl-toyopearl 650M疎水クロマトグラフィー、DEAE-toyopearl 650M陰イオン交換カラムクロマトグラフィなどの各種精製工程を経てSDSゲル電気泳動的に均一に精製したものを酵素液として使用することができ、単に培養液を濃縮したものを用いてもよい。
【００４８】
本発明はまた、DFAIIIの製造方法に関する。本発明のDFAIIIの製造方法は、前記本発明のDFAIII合成酵素をイヌリンに接触させることを含む。DFAIII合成酵素を産生する微生物の培養液又は培養菌体もしくはその処理物をイヌリンに接触させることによって、DFAIII合成酵素をイヌリンに接触させることもできる。
【００４９】
すなわち、「イヌリンに接触させる」とは、具体的には、イヌリンを含有する反応液に本発明のDFAIII合成酵素、該酵素を産生する微生物の培養液又は培養菌体もしくはその処理物を添加し、これらが反応液中でイヌリンを基質としてDFAIIIを生成しうる条件下で反応させることを意味する。
【００５０】
「微生物の培養液」には、培養液そのもの（粗酵素液）、あるいはDFAIII合成酵素が濃縮、固定化、精製された形態のものが含まれる。
【００５１】
「培養菌体」には、生菌そのまま、凍結乾燥されたもの、さらにはアセトンパウダー等の形態のものが含まれる。
【００５２】
「培養菌体の処理物」には、例えば、上記培養菌体の破砕物、無細胞抽出物、固定化菌体、粗酵素、精製酵素、遺伝子組換え微生物等が含まれる。培養菌体の破砕物及び無細胞抽出物とは、該菌体を公知の破砕方法、例えば超音波破砕法、ダイノミル破砕法、フレンチプレス破砕法により破砕して得られる物質及び抽出物等を意味する。また、固定化菌体とは、公知の固定化法、例えば包括法、担体結合法で前記菌体を固定化し、必要に応じて架橋したものを意味する。包括法としては、例えば、カラギーナンやアルギン酸等の天然高分子を用いる方法が挙げられる。
【００５３】
前記反応液中の適切なイヌリンの濃度は、例えば、1〜35%(w/w)、好ましくは20〜30%(w/w)とする。
【００５４】
DFAIII合成酵素の使用量は特に制限されず、適宜決定される。通常原料とするイヌリン1モルに対してDFAIII合成酵素を0.1単位以上、好ましくは200単位以上とするのがよい。
【００５５】
酵素反応は通常、約20〜65℃、好ましくは45℃〜55℃の温度下で行われるのがよく、最適条件下においては約24時間前後で完了する。また、酵素反応系におけるpHは、酵素が失活しない範囲、通常好ましくは、約pH4〜8、より好ましくは約pH5〜7の範囲がよい。
【００５６】
本発明のDFAIII製造方法は、本発明のDFAIII合成酵素を公知の固定化手段、たとえばイオン結合法、物理的吸着法、ゲル包括法、マイクロカプセル法に従い固定化し、得られる固定化酵素を用いて連続的に実施することもできる。この固定化酵素を用いる連続的方法によれば、一定した純度のDFAIIIが容易に取得できる。上記固定化酵素を用いる方法は、通常、固定化酵素を適当なカラムに充填し、原料スクロース溶液を通過させることにより行われる。かくして安価に且つ大量にDFAIIIを取得できる。
【００５７】
反応液中に生成されたDFAIIIは、公知の方法に従い精製することができる。精製は、例えば、得られた反応液をイオン交換樹脂あるいは活性炭等で精製し、これを減圧濃縮あるいは逆浸透膜によって濃縮し、次いで冷却してDFAIIIの結晶を得ることにより実施することができる。あるいはまた、反応液にエタノールなどの有機溶媒を添加することにより、DFAIIIを沈殿させて回収することも可能であるが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明はまた、スクロースを原料として、本発明のDFAIII合成酵素をイヌリン合成酵素と組み合わせて用いることにより、DFAIIIを製造する方法にも関する。すなわち、該方法は、スクロースに、イヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素を作用させることを含む。スクロースにイヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素を作用させることには、スクロースに、イヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素を同時に接触させること、ならびにスクロースにイヌリン合成酵素を接触させた後、生成したイヌリンにDFAIII合成酵素を接触させることが包含される。本発明のDFAIII合成酵素については、既に記載したとおりである。イヌリン合成酵素は、スクロースをイヌリンに変換する活性を有する酵素であれば特に制限されず、既知のものでもよく、微生物を培養して得られるものでもよい。特にWO 02/00865に記載されているイヌリン合成酵素を用いることが望ましいが、植物体においてイヌリン合成に関与している1-SST(EC2.4.1.99)と1-FFT(EC 2.4.1.100)を用いてもよく、スクロースからβ-(2,1)フラクタンを生じせしめるものであれば特に限定されるものではない。
【００５９】
イヌリン合成酵素としては具体的にはWO 02/00865に記載されているBacillus (バチラス) sp.217C-11株 (FERM BP-7450)が産生する酵素が好ましい。バチラス sp.217C-11株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（旧名称：経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所）、日本国茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６（郵便番号305-8566）に、平成12年（2000年）6月14日付け（原寄託日）に、受託番号FERM BP-7450として寄託されている。当該菌株の培養方法及び酵素の調製方法については、WO 02/00865に記載されている。このBacillus sp.217C-11株由来のイヌリン合成酵素は、以下の理化学的性質を有する。
【００６０】
分子量： 45,000 〜 50,000
至適温度： 40〜50℃
熱安定性： 40℃を越えると徐々に失活し始め、50℃で70%、60℃で40%の残存活性を示す。
【００６１】
至適pH： 7〜8 (45℃)
pH安定性： pH6以上で安定。
【００６２】
当該イヌリン合成酵素は、Glu-Glu-Ile-Asn-Ser-Asp-Tyr-Thr-Ser-Ile-Trp-Ser-Arg-Gln-Gln-Ala-Glu-Lys-Val-Thr-Pro-Thr-Asp-Lys-Thr-Thr-Ala-Pro-Lys-Ile（配列番号３）
のN末端アミノ酸配列を有する。
【００６３】
各酵素を産生する微生物の培養液又は培養菌体もしくはその処理物をイヌリンに接触させることによって、各酵素をイヌリンを接触させることもできる。すなわち、スクロースに、イヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素を作用させてDFAIIIを製造する場合も、酵素の使用形態は特に制限されず、精製酵素、粗酵素、酵素を産生する微生物の培養液、又は培養菌体もしくはその処理物をスクロースに接触させてDFAIIIを生成することができる。「スクロースに接触させる」とは、具体的には、スクロースを含有する反応液にイヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素、各酵素を産生する微生物の培養液又は培養菌体もしくはその処理物を添加し、反応させることを意味する。微生物の培養液、培養菌体、及びその処理物については、既に記載したとおりである。微生物を利用する場合は、イヌリン合成酵素を産生する微生物とDFAIII合成酵素を産生する微生物の培養液又は培養菌体もしくはその処理物を添加してもよいし、イヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素の双方を産生する微生物の培養液又は培養菌体もしくはその処理物を添加してもよい。
【００６４】
イヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素の双方を産生する微生物としては、遺伝子組換え微生物を利用できる。遺伝子組換え微生物とは、酵素を発現し得るように宿主細胞中に該酵素をコードする遺伝子が組み込まれた微生物のことであり、イヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素の遺伝子を微生物に導入することによって、スクロースからDFAIIIを、イヌリンの蓄積を見ることなく生産するように改変したものである。
【００６５】
スクロースを原料とするDFAIII製造方法において、各々の酵素の使用量は特に制限されず、適宜決定される。通常原料とするスクロース1モルに対してイヌリン合成酵素は0.1単位以上、好ましくは200単位以上、またDFAIII合成酵素も0.1単位以上、好ましくは200単位以上とするのがよい。
【００６６】
酵素反応はイヌリンを基質とする場合と同様、通常、約20〜65℃、好ましくは45℃〜55℃の温度下で行われるのがよく、最適条件下においては約24時間前後で完了する。また、酵素反応系におけるpHは、用いる各酵素がいずれも失活しない範囲、通常好ましくは、約5〜8、より好ましくは約6〜7の範囲がよい。
【００６７】
上記2種の酵素を各々別個に又は予め上記適当割合となるように混合後、公知の固定化手段、たとえばイオン結合法、物理的吸着法、ゲル包括法、マイクロカプセル法に従い固定化し、得られる固定化酵素を用いて連続的に実施することもできる。この固定化酵素を用いる連続的方法によれば、一定した純度のDFAIIIが容易に取得できる。上記固定化酵素を用いる方法は、これを適当なカラムに充填し、原料スクロース溶液を通過させることにより行われる。かくして安価に且つ大量にDFAIIIを取得できる。
【００６８】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されない。
【実施例】
【００６９】
実施例１  DFAIII合成酵素の調製
クルトバクテリウムsp.D436-1株をイヌリン1〜2%（w/v）、ペプトン1%、酵母エキス0.5%、リン酸1カリウム0.1%を含むpH7〜8の液体培地で培養後、遠心分離により除菌し、限外ろ過膜によって濃縮し、Phenyl-toyopearl 650M疎水クロマトグラフィー、DEAE-toyopearl 650M陰イオン交換カラムクロマトグラフィなどの各種精製工程を経てSDSゲル電気泳動的に均一に精製した。【００７０】
得られたDFAIII合成酵素の酵素活性を、イヌリンを基質として酵素反応によって生じるDFAIIIの生成量をHPLCで定量することで測定した。即ち、20%イヌリン、20mMリン酸（クエン酸）緩衝液（pH5）0.5mlに酵素液0.5mlを加えて37℃で60分間（55℃で10分間）反応させ、5分間の煮沸によって反応停止後、生成したDFAIIIをHPLCにより測定した。ここで1単位（unit）の酵素活性は1分間に1μmole（マイクロモル）のDFAIIIを生成させる酵素量と定義した。定量HPLC条件は以下のとおりである。【００７１】
カラム：    ULTRON PS-80N(φ8×300mm)
溶離液：    蒸留水
流量：      0.5 ml/分
カラム温度： 50℃
検出器：    示差屈折計
注入量：    10μL
その結果、クルトバクテリウムsp.D436-1株が産生するDFAIII合成酵素の酵素活性は、117 u/mlであり、これまでに知られている同類の酵素と比べて非常に高いものであることがわかった。【００７２】
実施例２  DFAIII合成酵素の耐熱性の測定
クルトバクテリウムsp.D436-1株が産生するDFAIII合成酵素液1ｍLをエッペンドルフチューブに採り、37、40、50、60、70、80、90℃において30分処理した後、水冷して常温に戻した。熱処理した酵素液は以下に示す酵素活性測定法に従って残存酵素の活性を測定し、熱処理を行わなかったものに対する相対活性を求めた。結果を図１に示す。【００７３】
2010147085.tif 000002
クルトバクテリウムsp.D436-1株が産生するDFAIII合成酵素は、耐熱性が非常に高く、80℃までは活性の減少は認められず、90℃での酵素活性の残存率（残存活性）は80％であった。この耐熱性の高さはこれまでに知られている同類の酵素の中で最も高いものであった。【００７４】
実施例３  スクロースからのDFAIIIの製造
スクロースからイヌリンを合成するイヌリン合成酵素(WO 02/00865に記載されているBacillus (バチラス) sp.217C-11株 (FERM BP-7450)が産生するイヌリン合成酵素、以下「IPE」と略す)、クルトバクテリウムsp.D436-1株が産生するDFAIII合成酵素(以下「DPE」と略す)を組み合わせることにより、スクロースからDFAIIIを製造した。【００７５】
0.1Mクエン酸緩衝液(pH5.5)でpHを調整した50%のスクロース水溶液20gにIPE（250 u/ml）及びDPE (376 u/ml)を各0.3ml加えて55℃で酵素反応を行った。反応終了後、試料を脱塩した後、HPLCにより糖組成の分析を行った（カラム：MCI GEL(三菱化学)、溶離液：水、温度：75℃、流量：0.4mL/min、検出：示差屈折計）。結果を以下の表１に示す。
【表１】
2010147085.tif 000003
【００７６】
また、スクロース50％水溶液の比重1.2を参考に、標準液のピーク面積から各含有量(w/w%)を計算した結果を図２に示す。【００７７】
反応時間の経過に伴いスクロースが消費され、それに伴ってDFAIIIの生成が認められ、反応開始から16時間後、転換率38％で平衡に達した。グルコース生成量は徐々に増加したが、反応開始から6時間以降は約55％で平衡に達した。【００７８】
以上から、スクロースに、イヌリン合成酵素とDFAIII合成酵素を作用させることにより、DFAIIIを製造できることが示された。【００７９】
実施例４  固定化酵素を用いたスクロースからのDFAIIIの製造
スクロースからIPEを用いてイヌリンを調製した溶液を、固定化DPEで処理することによってDFAIIIを製造した。【００８０】
pH7.0に調整した46%スクロース溶液にIPE(250 u/ml)を固形スクロース分に対して1%添加し、55℃、48時間の酵素反応を行うことにより、イヌリン:44%、スクロース:9.5%、グルコース:43.7%、フラクトース:1.7%という組成の反応混合物(中間反応液)が得られた。【００８１】
この反応混合物をクエン酸緩衝液でpH5.0に調整し、Bx30に希釈したうえで、引き続きDPEを固定化した樹脂を充填したカラム(4ml)に、SV=6の流量で通液を行い、カラム容積の約40倍量の回収液を得た。得られた反応物(最終反応液)の組成は以下の通りであった。また、中間反応液と最終反応液の糖組成を図３に示す。
【表２】
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【００８２】
以上のように、IPEと固定化DPEを併用することによってスクロースを原料としたDFAIIIの酵素的生産が可能となった。初発原料として用いたスクロースからのDFAIII転換率は25%であった。DPEを固定化することによってDFAIIIの連続生産が可能となり使い捨ての生酵素反応に比べて繰り返し利用が効くため、生産コストを低減させることができる。【００８３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【受託番号】
【００８４】
NITE BP-764
FERM BP-7450
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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