(57)【要約】  本発明は、アミノ酸のＮ−サクシニル体のエナンチオマー混合物に、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼの共存下に、Ｌ−サクシニラーゼを作用させてＬ体を特異的に加水分解することにより、Ｌ−アミノ酸を製造する方法に関する。特には、特に溶解濃度の低いアミノ酸のＮ−サクシニル体を原料として、生成したＬ−アミノ酸を反応系外に析出させつつ反応させることにより、高収率でＬ−アミノ酸を製造する方法に関する。本発明によれば、光学純度の高いＬ−アミノ酸、特に医薬品、農薬等の原料として有用な、Ｌ−アミノ酸を効率的に製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−サクシニルアミノ酸のエナンチオマー混合物にＬ−サクシニラーゼを作用させて、Ｌ−アミノ酸を製造する方法であって、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼの共存下に、生成させたＬ−アミノ酸を析出させつつ反応を行うことを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２】
上記Ｌ−アミノ酸の溶解濃度が１重量％以下である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
上記Ｎ−サクシニルアミノ酸が一般式（I）；
【化１】
2010050516.tif 000007
（式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数２〜２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数２〜２０のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数４〜２０のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアラルキル基を示す。）で表され、上記Ｌ−アミノ酸が一般式（II）；
【化２】
2010050516.tif 000008
（式中、Ｒは前記と同じ置換基を表す。）で表される請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
上記式（I）及び（II）においてＲが４−ブロモベンジル基、３−フルオロベンジル基、ナフチルメチル基、インダニル基、または６−ヘプテニル基である請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼがゲオバチルス（Geobacillus）属或いはサーマス（Thermus）属、Ｌ−サクシニラーゼがゲオバチルス（Geobacillus）属に属する微生物由来である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼがゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、Ｌ−サクシニラーゼがゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）由来である請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼがゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）ＮＢＲＣ１０２４４５、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）ＨＢ８、Ｌ−サクシニラーゼがゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）ＮＢＲＣ１０２４４５由来である請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼとＬ−サクシニラーゼが、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼとＬ−サクシニラーゼをコードするＤＮＡを含むベクターで形質転換された形質転換体である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
一般式（III）；
【化３】
2010050516.tif 000009
（式中、Ｒ１は置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数２〜２０のアルキニル基、置換基を有していてもよいインダニル基、置換基を有していてもよいナフチルメチル基、またはフルオロベンジル基、クロロベンジル基またはブロモベンジル基を示す。）で表されるＮ−サクシニルアミノ酸またはその塩。
【請求項１０】
上記式（III）においてＲが４−ブロモベンジル基、３−フルオロベンジル基、２−ナフチルメチル基、２−インダニル基、または６−ヘプテニル基である請求項９記載のＮ−サクシニルアミノ酸またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１）Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニルアミノ酸をラセミ化する反応、及び２）Ｌ−サクシニラーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を特異的に加水分解する反応を組み合わせることにより、Ｎ−サクシニルアミノ酸のエナンチオマー混合物からＬ−アミノ酸を効率的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性アミノ酸、特に光学活性非天然アミノ酸は、農薬、医薬品等の合成原料及び中間体として有用な化合物である。光学活性なアミノ酸、特に非天然アミノ酸をいかにして効率的に製造するかは、産業上重要な課題となっている。【０００３】
この課題を解決する方法の１つとして、ラセミ体Ｎ−アセチルアミノ酸を原料として、Ｄ−アミノアシラーゼ或いはＬ−アミノアシラーゼを用いることによりＤ体或いはＬ体に光学分割し、光学純度が高いアミノ酸を取得する方法がある（特許文献１）。この方法では光学活性アミノ酸の取得収率が最高で５０％であり、ラセミ体の半分が無駄になる。そこで、残存するＮ−アセチルアミノ酸をラセミ化するＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼとアミノアシラーゼを組み合わせて、収率を向上させる試みがなされてきた。ところが、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼとアミノアシラーゼを組み合わせた分割は反応性が低く、アミノ酸の収率が７０から７５％に留まっており、更にはＮ−アシル体基質が残存し、その分離工程が必要となることから実用化への障害となっていた（特許文献２、３、４、５）。【０００４】
また、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼのＮ−アシルアミノ酸に対する反応性が低いことが明らかであったが(非特許文献１、２、特許文献６）、近年、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼがＮ−アセチルアミノ酸よりもＮ−サクシニルアミノ酸に対する反応性のほうが高いことが報告されている(非特許文献１、２、特許文献６）。更には、天然Ｌ−アミノ酸のＮ−サクシニル体に対してＬ−サクシニラーゼが作用することも報告されている(非特許文献１、２、特許文献６）。しかしながら、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼとＬ−サクシニラーゼを組み合わせて、Ｎ−サクシニル−アミノ酸のエナンチオマー混合物からＬ−アミノ酸を効率的に製造する方法については知られていない。【０００５】
また、本製造法において使用可能な原料である一般式（III）；【０００６】
【化１】
2010050516.tif 000002
【０００７】
（式中、Ｒ１は置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数２〜２０のアルキニル基、置換基を有していてもよいインダニル基、置換基を有していてもよいナフチルメチル基、またはフルオロベンジル基、クロロベンジル基またはブロモベンジル基を示す。）で表されるＮ−サクシニルアミノ酸またはその塩についてはこれまでに知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−２５４７８９号公報
【特許文献２】特開２００１−４６０８８号公報
【特許文献３】特開２００１−３１４１９１号公報
【特許文献４】特開２００２−２３８５８１号公報
【特許文献５】特開２００７−８２５３４号公報
【特許文献６】特開２００８−６１６４２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４年、４３巻、２２４頁
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年、４５巻、４４５５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、従来法よりも効率的なＬ−アミノ酸の製造法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニルアミノ酸をラセミ化する反応と、Ｌ−サクシニラーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸を特異的に加水分解する反応を組み合わせた反応時に、生成するアミノ酸を反応系外に析出させることによって反応性を高められることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
即ち本発明は、Ｎ−サクシニルアミノ酸のエナンチオマー混合物にＬ−サクシニラーゼを作用させて、Ｌ−アミノ酸を製造する方法であって、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼの共存下に、生成させたＬ−アミノ酸を析出させつつ反応を行うことを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法、である。【００１３】
本発明の製造方法において、好ましくは、上記Ｌ−アミノ酸の溶解濃度は１重量％以下である。【００１４】
また、本発明の製造方法において、好ましくは、基質であるＮ−サクシニルアミノ酸が一般式（I）；【００１５】
【化２】
2010050516.tif 000003
【００１６】
（式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数２〜２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数２〜２０のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数４〜２０のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアラルキル基を示す。）で表されるＮ−サクシニルアミノ酸であり、製造されるＬ−アミノ酸が一般式 （II）；【００１７】
【化３】
2010050516.tif 000004
【００１８】
（式中、Ｒは前記と同じ置換基を表す）で表されるＬ−アミノ酸である。【００１９】
本発明のより好ましい実施態様において、上記式（I）及び（II）におけるＲが４−ブロモベンジル基、３−フルオロベンジル基、ナフチルメチル基、インダニル基、または６−ヘプテニル基である。【００２０】
また本発明の好ましい実施態様においては、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ及びＬ−サクシニラーゼとして、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡとＬ−サクシニラーゼをコードするＤＮＡを含むベクターで形質転換された形質転換体を使用する。【００２１】
また本発明は、一般式（III）；【００２２】
【化４】
2010050516.tif 000005
【００２３】
（式中、Ｒ１は置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数２〜２０のアルキニル基、置換基を有していてもよいインダニル基、置換基を有していてもよいナフチルメチル基、またはフルオロベンジル基、クロロベンジル基またはブロモベンジル基を示す。）で表されるＮ−サクシニルアミノ酸またはその塩でもある。【００２４】
本発明の好ましい態様においては、上記式（III）におけるＲが４−ブロモベンジル基、３−フルオロベンジル基、２−ナフチルメチル基、２−インダニル基、または６−ヘプテニル基である
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、溶解濃度が低いアミノ酸のＮ-サクシニル体を原料として反応を行うことで生成するアミノ酸を反応系外に析出させることを可能とし、反応阻害を回避し、効率的にＬ-アミノ酸を製造できることが明らかになった。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明を、実施形態を用いて詳細に説明する。本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００２７】
本発明の「エナンチオマー混合物」とはＤ体を０％超〜１００％未満の範囲で含むＬ体及びＤ体の混合物である。本発明の原料であるＮ−サクシニルアミノ酸は一般式（I）；
【００２８】
【化５】
2010050516.tif 000006
【００２９】
で表され、種々の公知方法で合成することができる。例えば、
１）アミノ酸及びアミノ酸と当量以上の無水コハク酸を酢酸中で反応後、溶媒留去を行い、酢酸エチル・メタノール中で再結晶させる方法
２）アミノ酸及びアミノ酸と当量以上の無水コハク酸を水中でｐＨをアルカリ側に保ちながら反応後、ｐＨを酸性にして結晶として析出させる方法、
等によって取得できる。
【００３０】
前記式（I）において、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数２〜２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数４〜２０のアリール基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数５〜２０のアラルキル基を示す。
【００３１】
前記炭素数１〜２０のアルキル基としては、直鎖状であっても分岐鎖状であっても良く、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンタニル基、ヘキサニル基、ヘプタニル基、オクタニル基等が挙げられる。前記炭素数２〜２０のアルケニル基としては、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、オクテニル基等が挙げられる。
【００３２】
前記炭素数２〜２０のアルキニル基としては、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、オクチニル基等が挙げられる。
【００３３】
前記炭素数４〜２０のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、アントラニル基、ピリジル基、ピリミジル基、インダニル基、インデニル基等が挙げられる。
【００３４】
前記炭素数５〜２０のアラルキル基としては、ベンジル基、ナフチルメチル基、アントラニルメチル基、ピリジルメチル基、ピリミジルメチル基、インダニルメチル基、インデニルメチル基等が挙げられる。
【００３５】
上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基及びアラルキル基は置換基を有していても良く、置換基としては、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基等が挙げられる。
【００３６】
前記式（I）で表されるＮ−サクシニルアミノ酸として、具体的には、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−４−ブロモフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−３−フルオロフェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−２−ナフチルアラニン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−２−インダニルグリシン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−６−ヘプテニルグリシン等が挙げられる。
【００３７】
本発明で用いるＬ−サクシニラーゼとは、一般式（I）で表されるＮ−サクシニルアミノ酸のサクシニル基をＬ体選択的に加水分解（脱サクシニル化）する酵素であり、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼとは、一般式（I）で表されるＮ−サクシニルアミノ酸のエナンチオマーをラセミ化する酵素である。
【００３８】
本発明の反応においては、Ｎ−サクシニルアミノ酸のエナンチオマー混合物のうちＬ体のみがＬ−サクシニラーゼによって特異的に加水分解（脱サクシニル化）され、目的のＬ−アミノ酸が生成する。この際、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸が過剰となるので、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼによってＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸からＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸へのラセミ化反応が進行する。Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼにより生成したＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−サクシニラーゼによって目的のＬ−アミノ酸へと変換される。
【００３９】
以上のＬ体特異的加水分解反応とラセミ化反応の組み合わせにより、Ｎ−サクシニルアミノ酸のエナンチオマー混合物を実質的に単一のエナンチオマーからなるＬ−アミノ酸に変換することができる。更に本発明の好ましい実施態様では、上記反応過程或いは反応終了後のＬ−アミノ酸の蓄積濃度がその溶解濃度以上となるとＬ−アミノ酸が反応系外に析出し、反応は効率的に進行する。
【００４０】
なお、高活性のＤ−サクシニラーゼ（Ｄ体選択的に脱サクシニル化）を用いれば、本発明の上記原理を適用して、Ｎ−サクシニルアミノ酸のエナンチオマー混合物を、実質的に単一のエナンチオマーからなるＤ−アミノ酸へ効率的に変換することができる。ただし、Ｎ−サクシニルアミノ酸をＤ体選択的に加水分解する酵素としてＤ−アミノアシラーゼが知られている（特開2008-61642）が、実用的な活性が得られたことは示されていない。
【００４１】
ここで、溶解濃度とは、反応終了後の反応液中に溶解可能なアミノ酸の重量％であり、以下に述べる方法で測定できる。反応終了後の反応液に溶けなくなるまでＬ−アミノ酸を添加した後に遠心処理しその上清をフィルターろ過した溶液中の生成アミノ酸を高速液体クロマトグラフィーにて定量分析測定を行い、算出する。
【００４２】
また、反応終了後の反応液中の生成アミノ酸（析出した生成アミノ酸と溶解している生成アミノ酸を含む）の重量％は以下に述べる方法で測定できる。反応終了後の反応液を析出した生成アミノ酸を含めて均一にサンプリングし、析出した生成アミノ酸を適当な溶媒を用いて可溶化しその溶液中のアミノ酸を高速液体クロマトグラフィーにて定量分析測定を行い、算出する。
【００４３】
上記溶解濃度は、好ましくは３重量％以下、より好ましくは１重量％以下である。上記溶解濃度を超えてＬ−アミノ酸が生成するとＬ−アミノ酸が析出し、その際、反応終了後の反応液中の生成アミノ酸の重量％は高いほうが好適であり、好ましくは溶解濃度の２倍以上、より好ましくは５倍以上である。
【００４４】
本発明のＬ−アミノ酸の製造方法は、適当な溶媒中に、基質となるＮ−サクシニルアミノ酸のエナンチオマー混合物と、Ｌ−サクシニラーゼ及びＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼとを共存させることにより実施できる。
【００４５】
反応には水系溶媒を用いてもよいし、水系の溶媒と有機系の溶媒とを混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ヘキサン、イソプロパノール、ジイソプロピルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。反応は例えば１０℃〜７０℃、好ましくは３０℃〜５５℃の温度で行われる。反応液のｐＨは例えば４〜１０、好ましくは６〜９に維持する。
【００４６】
反応は、バッチ方式あるいは連続方式で実施できる。バッチ方式の場合、反応基質は例えば０．１％から７０％（ｗ／ｖ）、好ましくは３％から５０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加される。
【００４７】
反応で生じたＬ−アミノ酸は、常法により、それぞれを単離、精製できる。反応で生じたＬ−アミノ酸を含む反応液を、クロマトグラフィー等の処理を行うことにより、単離、精製できる。或いは、反応液から微生物菌体を除去したろ液を塩酸等を用いて中和晶析し、析出した目的物をろ別することによっても単離、精製できる。また、反応液から微生物菌体を除去したろ液をそのまま次工程の反応に使用することもできる。
【００４８】
本発明に使用するＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼは、前記式（I）に示されるＮ−サクシニルアミノ酸をラセミ化する能力を有する。そのような酵素としては、特に制限はないが、具体的には、ゲオバチルス（Geobacillus）属及びサーマス（Thermus）属などに属する微生物由来の酵素が挙げられ、好ましくは、ゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）等の微生物に由来する酵素である。より好ましくはゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacilluskaustophilus）ＮＢＲＣ１０２４４５、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）ＨＢ８に由来する酵素である。ゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）ＮＢＲＣ１０２４４５に由来するＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子は配列番号２で示される。
【００４９】
本発明に使用するＬ−サクシニラーゼは、前記式（I）に示されるＮ−サクシニルアミノ酸のＬ体を加水分解する能力を有する。そのような酵素としては、特に制限はないが、代表的なものとして、ゲオバチルス（Geobacillus）属等に属する微生物由来の酵素が挙げられ、好ましくはゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）等の微生物に由来する酵素である。より好ましくはゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）ＮＢＲＣ１０２４４５に由来する酵素であり、そのアミノ酸配列をコードする遺伝子は配列番号１で示される。
【００５０】
これらの微生物は、さまざまな寄託機関より当業者が入手可能である。寄託機関としては、各微生物を特定する受託番号に対応する機関が挙げられる。具体的には、ＮＢＲＣ番号で特定される微生物は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８にある独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門より入手可能である。また、自然界から分離することもできる。なお、これらの微生物に変異を生じさせてより本反応に有利な性質を有する株を得ることもできる。また、これらの微生物から単離した酵素遺伝子を通常の方法で各種宿主ベクター系に導入した形質転換体の利用も可能である。
【００５１】
本発明においては、酵素として、上記微生物または形質転換体を適当な培地中で培養して得られる微生物培養液を使用できるほか、培養物の処理物を使用することもできる。該処理物としては、微生物培養液から遠心分離などの集菌操作によって得られる培養上清、微生物菌体、微生物菌体の破砕物、該破砕物より得られる無細胞抽出物、固定化菌体、精製された精製酵素、固定化酵素等が挙げられる。
【００５２】
本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）等の成書に記載されている方法により実施できる。
【００５３】
本明細書内に記載される「宿主」としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。ＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販のEscherichia coli HB101コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主に導入できる。
【００５４】
本明細書内に記載される「ベクター」は、適当な宿主内でＤＮＡがコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
【００５５】
このようなベクターは、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、ＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮ１８が好適に使用できる。プラスミドｐＵＣＮ１８は、ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、GenBank Accession No. L09136）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミドである。
【００５６】
前記制御因子は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。上記の「作動可能に連結」という用語は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００５７】
本明細書において記述されている「形質転換体」は、ポリペプチドをコードするＤＮＡを、ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる。なお、本明細書において記述されている「形質転換体」は、培養菌体は言うまでもなく、その処理物も含まれる。ここで言う処理物とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれらを固定化したものを意味する。本明細書において記述されている形質転換体の培養は、それが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。
【００５８】
本発明の製造方法を実施するに際しては、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡ及びＬ−サクシニラーゼをコードするＤＮＡの両者を導入され、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ及びＬ−サクシニラーゼの両方の活性を有する形質転換体を用いることもできる。このような形質転換体を用いれば、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼとＬ−サクシニラーゼをそれぞれ別個に調製する必要がなく、本発明の製造方法をより簡便に実施することができる。
【００５９】
本発明のＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡ及びＬ−サクシニラーゼをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡ及びＬ−サクシニラーゼをコードするＤＮＡの両者を同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することによって得られるほか、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。本発明のＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡ及びＬ−サクシニラーゼをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体の例としては、後述するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＩＧＨＫ）が挙げられる。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。【００６１】
（参考例１）Ｌ−サクシニラーゼの調製
ゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）ＮＢＲＣ１０２４４５株由来のＬ−サクシニラーゼ遺伝子（配列番号１）にＥｃｏＲＩ認識部位とＢａｍＨＩ認識部位を付加した遺伝子を、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲを行い取得した。上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、GenBank Accession No. L09136）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＥｃｏＲＩ認識部位とＢａｍＨＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＨＫを構築した。組換えベクターｐＮＨＫを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＨＫ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のサクシニラーゼ活性を測定し、サクシニラーゼ活性５Ｕの発現が認められた。【００６２】
（参考例２）Ｌ−サクシニラーゼの活性測定
Ｌ−サクシニラーゼのサクシニラーゼ活性は以下に述べる方法で測定した。基質となるＮ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン溶液２５０μｌ（終濃度５０ｍＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（０．５Ｍ／ｐＨ７．５）２３０μｌを混和し、この反応液に酵素液２０μｌを加えて３０℃で反応を行い、適当な時間で１Ｎ  ＨＣｌ添加により反応停止させた。生成したＬ−フェニルアラニンを高速液体クロマトグラフィーにより定量し、酵素活性を算出した。酵素活性はＮ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニンからＬ−フェニルアラニンが１分間に１μｍｏｌｅ生成された場合を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義した。【００６３】
（参考例３）Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼの調製
ゲオバチルス・カウストフィラスＮＢＲＣ１０２４４５株由来のＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子（配列番号２）にＥｃｏＲＩ認識部位とＳａｃＩ認識部位を付加した遺伝子を、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲを行い取得した。上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣＮ１８のｌａｃプロモーターの下流のＥｃｏＲＩ認識部位とＳａｃＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＩＧを構築した。組換えベクターｐＮＩＧを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＩＧ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を測定し、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性２Ｕの発現が認められた。  サーマス・サーモフィラスＨＢ８株由来のＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子（配列番号３）にＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位を付加した遺伝子を、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲを行い取得した。上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣＮ１８のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＩＴを構築した。組換えベクターｐＮＩＴを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＩＴ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を測定し、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性１Ｕの発現が認められた。【００６４】
（参考例４）Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼの活性測定
Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼのラセマーゼ活性は以下に述べる方法で測定した。基質となるＮ−アセチル−Ｄ−メチオニン溶液を１００μｌ（終濃度２０ｍＭ）、塩化コバルト水溶液を５μｌ（終濃度１ｍＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（０．５Ｍ／ｐＨ７．５）を５０μｌ（終濃度５０ｍＭ）、滅菌蒸留水を２４５μｌを混和し、この反応液にＬ−アミノアシラーゼ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ、ラセマーゼによって生成するＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンを脱アシル化しＬ−メチオニンを生成する）５０μｌ、及び酵素液５０μｌを加えて３０℃で反応を行い、適当な時間で１Ｎ  ＨＣｌ添加により反応停止させた。生成したＬ−メチオニンを高速液体クロマトグラフィーにより定量し、酵素活性を算出する。酵素活性はＮ−アセチル−Ｄ−メチオニンからＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンが１分間に１μｍｏｌｅ生成された場合を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義した。【００６５】
（実施例１）Ｌ−４−ブロモフェニルアラニンの製造
ＤＬ−４−ブロモフェニルアラニン２．２ｇと無水コハク酸０．９９ｇ及び酢酸２０ｍｌを混合し、５５℃で４ｈ反応させ、濃縮後酢酸エチルでの晶析を行い、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−４−ブロモフェニルアラニン２．１ｇを取得した。Ｎ−サクシニル−ＤＬ−４−ブロモフェニルアラニンの基質溶液（ｐＨ８）を調製し、塩化コバルト水溶液を終濃度１ｍＭとなるように添加後、参考例１及び参考例３と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＨＫ）及びＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＩＧ）の培養液を混合し（基質の終濃度は８重量％）、４５℃にて反応を行ったところ、反応液中に４−ブロモフェニルアラニンが析出した。１８時間攪拌後、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率（ｍｏｌ％）及び光学純度（％ｅ．ｅ．）を求めた結果、変換率は９８．０ｍｏｌ％、Ｌ−４−ブロモフェニルアラニンの光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。変換率より算出されるＬ−４−ブロモフェニルアラニンの蓄積濃度は５．５重量％であった。また、Ｌ−４−ブロモフェニルアラニンの溶解濃度を高速液体クロマトグラフィーにて定量分析測定したところ、０．５重量％以下であった。【００６６】
変換率（ｍｏｌ％）＝生成物量／（残存基質量＋生成物量）×１００
光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００（Ａは対象とする鏡像異性体量でＢは対応する鏡像異性体量）
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
［変換率の分析］
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ
（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ナカライ社製）
溶離液：２０ｍＭ  リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝８／２
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＣ  ＣＲ（+）（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）
溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）／メタノール＝８５／１５
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２１０ｎｍ。【００６７】
Ｎ−サクシニル−ＤＬ−４−ブロモフェニルアラニン１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：２．４４−２．５６（４Ｈ，ｍ），２．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），３．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），４．６２−４．６６（１Ｈ，ｍ），７．１４−７．１９（２Ｈ，ｍ），７．３９−７．４３（２Ｈ，ｍ）。【００６８】
（実施例２）Ｌ−３−フルオロフェニルアラニンの製造
ＤＬ−３−フルオロフェニルアラニン２．０ｇと無水コハク酸０．９９ｇ及び酢酸２０ｍｌを混合し、５５℃で４ｈ反応させ、濃縮後酢酸エチルでの晶析を行い、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−３−フルオロフェニルアラニン１．９ｇを取得した。Ｎ−サクシニル−ＤＬ−３−フルオロフェニルアラニンの基質溶液（ｐＨ８）を調製し、塩化コバルト水溶液を終濃度１ｍＭとなるように添加後、参考例１及び参考例３と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＨＫ）及びＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＩＧ）の培養液を混合し（基質の終濃度は８重量％）、４５℃にて反応を行ったところ、反応液中に３−フルオロフェニルアラニンが析出した。２０時間攪拌後、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率（ｍｏｌ％）及び光学純度（％ｅ．ｅ．）を求めた結果、変換率は９７．５ｍｏｌ％、Ｌ−３−フルオロフェニルアラニンの光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。変換率より算出されるＬ−３−フルオロフェニルアラニンの蓄積濃度は５．１重量％であった。また、Ｌ−３−フルオロフェニルアラニンの溶解濃度を高速液体クロマトグラフィーにて定量分析測定したところ、０．５重量％以下であった。【００６９】
変換率（ｍｏｌ％）＝生成物量／（残存基質量＋生成物量）×１００
光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００（Ａは対象とする鏡像異性体量でＢは対応する鏡像異性体量）
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
［変換率の分析］
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ
（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ナカライ社製）
溶離液：２０ｍＭ  リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝８／２
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＣ  ＣＲ（+）（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）
溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）／メタノール＝８５／１５
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２１０ｎｍ。【００７０】
（実施例３）Ｌ−２−ナフチルアラニンの製造
ＤＬ−２−ナフチルアラニン２．０ｇと無水コハク酸１．０２ｇ及び酢酸２５ｍｌを混合し、５５℃で４ｈ反応させ、濃縮後酢酸エチルでの晶析を行い、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−２−ナフチルアラニン２．３ｇを取得した。Ｎ−サクシニル−ＤＬ−２−ナフチルアラニンの基質溶液（ｐＨ８）を調製し、塩化コバルト水溶液を終濃度１ｍＭとなるように添加後、参考例１及び参考例３と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＨＫ）及びＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＩＧ）の培養液を混合し（基質の終濃度は９重量％）、４５℃にて反応を行ったところ、反応液中に２−ナフチルアラニンが析出した。２０時間攪拌後、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率（ｍｏｌ％）及び光学純度（％ｅ．ｅ．）を求めた結果、変換率は９９．８ｍｏｌ％、Ｌ−２−ナフチルアラニンの光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。変換率より算出されるＬ−２−ナフチルアラニンの蓄積濃度は６．２重量％であった。また、Ｌ−２−ナフチルアラニンの溶解濃度を高速液体クロマトグラフィーにて定量分析測定したところ、０．２重量％以下であった。【００７１】
変換率（％）＝生成物量／（残存基質量＋生成物量）×１００
光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００（Ａは対象とする鏡像異性体量でＢは対応する鏡像異性体量）
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
［変換率の分析］
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ
（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ナカライ社製）
溶離液：２０ｍＭ  リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝８／２
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＣＨＩＲＯＢＩＯＴＩＣ  Ｔ（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、Ａｓｔｅｃ社製）
溶離液：水／エタノール＝３／７
流速：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
測定波長：２１０ｎｍ。【００７２】
Ｎ−サクシニル−ＤＬ−２−ナフチルアラニン１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：２．３８−２．５０（４Ｈ，ｍ），３．１４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），４．７４−４．８７（１Ｈ，ｍ），７．３６−７．４５（３Ｈ，ｍ），７．０５−７．１５（４Ｈ，ｍ）。【００７３】
（実施例４）Ｌ−２−インダニルグリシンの製造
ＤＬ−２−インダニルグリシン２．５ｇと無水コハク酸１．４４ｇ及び酢酸３０ｍｌを混合し、５５℃で４ｈ反応させ、濃縮後酢酸エチルでの晶析を行い、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−２−インダニルグリシン３．２ｇを取得した。Ｎ−サクシニル−ＤＬ−２−インダニルグリシンの基質溶液（ｐＨ８）を調製し、塩化コバルト水溶液を終濃度１ｍＭとなるように添加後、参考例１１及び参考例３と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＨＫ）及びＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＩＧ）の培養液を混合し（基質の終濃度は８重量％）、４５℃にて反応を行ったところ、反応液中に２−インダニルグリシンが析出した。２０時間攪拌後、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率（ｍｏｌ％）及び光学純度（％ｅ．ｅ．）を求めた結果、変換率は１００ｍｏｌ％、Ｌ−２−インダニルグリシンの光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。変換率より算出されるＬ−２−インダニルグリシンの蓄積濃度は５．３重量％であった。また、Ｌ−２−インダニルグリシンの溶解濃度を高速液体クロマトグラフィーにて定量分析測定したところ、０．５重量％以下であった。【００７４】
変換率（％）＝生成物量／（残存基質量＋生成物量）×１００
光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００（Ａは対象とする鏡像異性体量でＢは対応する鏡像異性体量）
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
［変換率の分析］
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ
（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ナカライ社製）
溶離液：２０ｍＭ  リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝８／２
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＣ  ＣＲ（+）（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）
溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）／メタノール＝８５／１５
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３５℃
測定波長：２１０ｎｍ。【００７５】
Ｎ−サクシニル−ＤＬ−２−インダニルグリシン１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：２．４７−２．６１（４Ｈ，ｍ），２．７９−３．３１（５Ｈ，ｍ），４．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．０５−７．１５（４Ｈ，ｍ）。【００７６】
（実施例５）Ｌ−６−ヘプテニルグリシンの製造
ＤＬ−６−ヘプテニルグリシン２．０ｇと無水コハク酸１．２９ｇ及び酢酸２０ｍｌを混合し、５５℃で４ｈ反応させ、濃縮後酢酸エチルでの晶析を行い、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−６−ヘプテニルグリシン１．４ｇを取得した。Ｎ−サクシニル−ＤＬ−６−ヘプテニルグリシンの基質溶液（ｐＨ８）を調製し、塩化コバルト水溶液を終濃度１ｍＭとなるように添加後、参考例１及び参考例３と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＨＫ）及びＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＩＧ）の培養液を混合し（基質の終濃度は９重量％）、４５℃にて反応を行ったところ、反応液中に６−ヘプテニルグリシンが析出した。２４時間攪拌後、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率（ｍｏｌ％）を求めた結果、変換率は９９．６ｍｏｌ％であった。更に生成物を二炭酸ジｔｅｒｔ−ブチルでＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル６−ヘプテニルグリシンへと誘導化し高速液体クロマトグラフィーにて光学純度（％ｅ．ｅ．）分析を行ったところ、１００％ｅ．ｅ．であった。変換率より算出されるＬ−６−ヘプテニルグリシンの蓄積濃度は５．７重量％であった。また、Ｌ−６−ヘプテニルグリシンの溶解濃度を高速液体クロマトグラフィーにて定量分析測定したところ、０．５重量％以下であった。
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
［変換率の分析］
カラム：ＹＭＣ−Ａ３０３（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）
溶離液：２０ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝１／１
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３５℃
測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ−ＲＨ（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）
溶離液：０．０２％  リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝６５／３５
流速：０．７ｍｌ／分
カラム温度：３５℃
測定波長：２０５ｎｍ。【００７７】
Ｎ−サクシニル−ＤＬ−６−ヘプテニルグリシン１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．２５−１．３８（６Ｈ，ｍ），１．５１−１．６９（２Ｈ，ｍ），２．０１（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），２．３２−２．４４（４Ｈ，ｍ）,４．１６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ），４．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．１Ｈｚ），５．７９（１Ｈ，ｍ），８．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）。【００７８】
（比較例）Ｌ−フェニルアラニンの製造
ＤＬ−フェニルアラニン５．０ｇと無水コハク酸３．０ｇ及び酢酸３０ｍｌを混合し、５５℃で４ｈ反応させ、濃縮後酢酸エチルでの晶析を行い、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン４．５ｇを取得した。Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニンの基質溶液（ｐＨ８）を調製し、塩化コバルト水溶液を終濃度１ｍＭとなるように添加後、参考例１及び参考例３と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＨＫ）及びＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＩＧ）の培養液を混合し（基質の終濃度は６重量％）、４５℃にて反応を行った。２１時間攪拌後、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率（ｍｏｌ％）及び光学純度（％ｅ．ｅ．）を求めた結果、変換率は８６．０ｍｏｌ％、Ｌ−フェニルアラニンの光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。変換率より算出されるＬ−フェニルアラニンの蓄積濃度は３．２重量％であった。また、Ｌ−フェニルアラニンの溶解濃度を高速液体クロマトグラフィーにて定量分析測定したところ、４重量％であった。【００７９】
変換率（ｍｏｌ％）＝生成物量／（残存基質量＋生成物量）×１００
光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００（Ａは対象とする鏡像異性体量でＢは対応する鏡像異性体量）
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
［変換率の分析］
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ
（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ナカライ社製）
溶離液：２０ｍＭ  リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝８／２
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＣ  ＣＲ（-）（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）
溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ２．５）
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３５℃
測定波長：２５４ｎｍ。【００８０】
（実施例６）Ｌ−サクシニラーゼとＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体の作製
ゲオバチルス・カウストフィラスＮＢＲＣ１０２４４５株由来のＬ−サクシニラーゼ遺伝子（配列番号１）の６１５番目のＣをＧに改変した遺伝子にＳａｃＩ認識部位とＢａｍＨＩ認識部位を付加した遺伝子を、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲを行い取得した。上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を参考例３で作製したプラスミドｐＮＩＧのＳａｃＩ認識部位とＢａｍＨＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＩＧＨＫを構築した。組換えベクターｐＮＩＧＨＫを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＩＧＨＫ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のサクシニラーゼ活性及びＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性測定し、サクシニラーゼ活性４Ｕ及びＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性１Ｕの発現が認められた。【００８１】
（実施例７）Ｌ−サクシニラーゼとＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体を用いたＬ−６−ヘプテニルグリシンの製造
実施例５と同様にしてＮ−サクシニル−ＤＬ−６−ヘプテニルグリシンの基質溶液（ｐＨ８）を調製し、塩化コバルト水溶液を終濃度１ｍＭとなるように添加後、実施例６と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＩＧＨＫ）の培養液を混合し（基質の終濃度は９重量％）、４５℃にて反応を行ったところ、反応液中に６−ヘプテニルグリシンが析出した。２４時間攪拌後、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率（ｍｏｌ％）を求めた結果、変換率は９９．６ｍｏｌ％であった。更に生成物を二炭酸ジｔｅｒｔ−ブチルでＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル６−ヘプテニルグリシンへと誘導化し高速液体クロマトグラフィーにて光学純度（％ｅ．ｅ．）分析を行ったところ、１００％ｅ．ｅ．であった。変換率より算出されるＬ−６−ヘプテニルグリシンの蓄積濃度は５．７重量％であった。また、Ｌ−６−ヘプテニルグリシンの溶解濃度を高速液体クロマトグラフィーにて定量分析測定したところ、０．５重量％以下であった。【００８２】
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
［変換率の分析］
カラム：ＹＭＣ−Ａ３０３（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）
溶離液：２０ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝１／１
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３５℃
測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ−ＲＨ（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）
溶離液：０．０２％  リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝６５／３５
流速：０．７ｍｌ／分
カラム温度：３５℃
【配列表】
2010050516000001.app
【国際調査報告】
2010050516.tif 000010
2010050516.tif 000011
2010050516.tif 000012