(57)【要約】  乳癌の摘出手術を行った患者より取得された血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドにおけるメチル化を検出し、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂからなる群より選ばれた少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにメチル化が検出された場合に、乳癌が転移していると判定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌の摘出手術を行った患者の血清を取得する工程と、
取得工程で得られた血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドにおけるメチル化を検出する工程と、
検出工程において、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂからなる群より選ばれた少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにメチル化が検出された場合に、乳癌が転移していると判定する工程と
を含む、乳癌の転移の判定方法。
【請求項２】
転移が、遠隔転移である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出工程において、メチル化特異的ＰＣＲ法を用いて、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドにおけるメチル化を検出する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
メチル化特異的ＰＣＲ法が、配列番号：１及び配列番号：２で示されるプライマーを含む第１プライマーセットと、
配列番号：３及び配列番号：４で示されるプライマーを含む第２プライマーセットと、
配列番号：５及び配列番号：６で示されるプライマーを含む第３プライマーセットと
を用いて行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
乳癌の摘出手術を行った患者の血清を取得する工程と、
取得工程で得られた血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドにおけるメチル化を検出する工程と、
取得工程で得られた血清に含まれる乳癌の腫瘍マーカーの量を測定する工程と、
検出工程において、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂからなる群より選ばれた少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにメチル化が検出され、かつ測定工程で得られた腫瘍マーカーの量が異常量である場合、乳癌が転移していると判定する工程と
を含む、乳癌の転移の判定方法。
【請求項６】
乳癌の腫瘍マーカーが、ＣＥＡ及び／又はＣＡ１５−３である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（Ａ）  乳癌の摘出手術を行った患者から採取された血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドにおけるメチル化の有無を測定する工程、及び
（Ｂ）  前記工程（Ａ）において、血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂからなる群より選ばれた少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにメチル化が検出された場合に、当該血清が、乳癌が転移した患者から採取された血清であると評価する工程
を含む、血清の評価方法。
【請求項８】
（ａ）  乳癌の摘出手術を行った患者から採取された血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドにおけるメチル化の有無を測定する工程、
（ｂ）  前記血清に含まれる乳癌の腫瘍マーカーの量を測定する工程、及び
（ｃ）  前記工程（ａ）において、血清におけるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂからなる群より選ばれた少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにおいてメチル化が検出され、かつ工程（ｂ）において、血清における腫瘍マーカーの量が異常量である場合に、当該血清が、乳癌が転移した患者から採取された血清であると評価する工程
を含む、血清の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌の摘出手術を行った患者における乳癌の転移の有無を判定する乳癌の転移の判定方法及び乳癌の転移の判定のための指標を得るのに有用な血清の評価方法に関する。
なお、本出願は、２００８年９月１９日出願の日本国特許出願第２００８−２４１３０２号の優先権を主張し、それらの全内容は、ここに援用される。
【背景技術】
【０００２】
乳癌の摘出手術を行った患者において、乳癌の転移の有無を確認することは、術後の治療方針を決定する上で、重要である。特に、原発巣から遠く離れた臓器やリンパ節に癌が転移した、遠隔転移が発見された場合、患者に適切な治療を行ううえで、乳癌の転移の有無の確認は、極めて重要である。【０００３】
術後における、乳癌の転移による癌の再発診断のための手法としては、エコー、ＭＲＩ、マンモグラフィーなどの画像検査が知られている。しかし、これらの画像検査には、熟練した技術が必要であること、画像検査に際して用いられる装置が患者に不快感を与える場合があり、かつコストが高いことなどの欠点があった。【０００４】
ヒトなどの高等真核生物の染色体ＤＮＡにおいて、ＣＧジヌクレオチド配列からなるＣｐＧ部位のシトシンは、メチル化されていることがある。このＣｐＧ部位のシトシンのメチル化は、遺伝子の発現制御機構として機能している。例えば、遺伝子のプロモーター領域には、ＣｐＧ部位を多く含む領域が存在しており、この遺伝子のプロモーター領域におけるシトシンのメチル化の有無により、当該遺伝子のＤＮＡからの転写のオン・オフが制御されている。【０００５】
ＤＮＡのメチル化による遺伝子発現の制御は、初期胚発生、組織特異的な遺伝子の発現、遺伝子刷り込み、Ｘ染色体の不活性化、染色体の安定化、ＤＮＡ複製のタイピングなどの事象において、重要な役割を果たしている。また、ＤＮＡのメチル化は、がんなどの疾患に大きく関与している可能性が報告されている。【０００６】
上記のＤＮＡのメチル化を解析する方法として、メチル化特異的ＰＣＲ法が知られている。この方法では、解析対象のＤＮＡのメチル化されていないシトシン（非メチル化シトシン）を、非メチル化シトシンを別の塩基に変換する試薬（非メチル化シトシン変換剤）である亜硫酸水素塩を用いて、別の塩基に変換する処理（非メチル化シトシン変換処理）を行なう。そして、シトシンが別の塩基に変換されなかった場合の配列を増幅するためのプライマーセットを用いて、ＰＣＲ反応を行ない、その増幅産物の有無を調べることにより、ＤＮＡのメチル化の有無を検出することができる。【０００７】
ここで、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂは、そのＣｐＧアイランドが乳癌の原発巣において高度にメチル化されていることが知られている遺伝子である。また、非特許文献１には、患者から採取した血清に含まれる、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂのＣｐＧアイランドにおけるメチル化の有無を調べることで、乳癌のスクリーニングを行う方法が記載されている。しかし、非特許文献１には、術後の患者における乳癌の転移の有無を判定することについては全く記載されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】モハムド（Mohammad O. Hoque）ら，「乳癌の検出のための血漿ＤＮＡ中の４遺伝子における異常メチル化の検出(Detection of Aberrant Methylation of Four Genes in Plasma DNA for the Detection of Breast Cancer)」，ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー(Journal of Clinical Oncology)，第２４巻，第２６号，２００６年９月１０日，ｐ．４２６２−４２６９
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、乳癌の摘出手術を行った患者における乳癌の転移の有無を、患者に不快感を与えることなく、低コストで、かつ簡便に判定することができる乳癌の転移の判定方法を提供することを目的とする。また、本発明は、乳癌の摘出手術を行った患者における乳癌の転移の有無の判定のための指標を、患者に不快感を与えることなく、低コストで、かつ簡便に得ることができる乳癌の転移の判定のための有用な指標を得ることができる血清の評価方法を提供することを目的とする。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）  乳癌の摘出手術を行った患者の血清を取得する工程と、
取得工程で得られた血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドにおけるメチル化を検出する工程と、
検出工程において、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂからなる群より選ばれた少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにメチル化が検出された場合に、乳癌が転移していると判定する工程と、
を含む、乳癌の転移の判定方法、
（２）  転移が、遠隔転移である、前記（１）に記載の方法、
（３）  検出工程において、メチル化特異的ＰＣＲ法を用いて、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドにおけるメチル化を検出する、前記（１）に記載の方法、
（４）  メチル化特異的ＰＣＲ法が、配列番号：１及び配列番号：２で示されるプライマーを含む第１プライマーセットと、
配列番号：３及び配列番号：４で示されるプライマーを含む第２プライマーセットと、
配列番号：５及び配列番号：６で示されるプライマーを含む第３プライマーセットと、
を用いて行われる、前記（１）に記載の方法、
（５）  乳癌の摘出手術を行った患者の血清を取得する工程と、
取得工程で得られた血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドにおけるメチル化を検出する工程と、
取得工程で得られた血清に含まれる乳癌の腫瘍マーカーの量を測定する工程と、
検出工程において、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂからなる群より選ばれた少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにメチル化が検出され、かつ測定工程で得られた腫瘍マーカーの量が異常量である場合、乳癌が転移していると判定する工程と、
を含む、乳癌の転移の判定方法、
（６）  乳癌の腫瘍マーカーが、ＣＥＡ及び／又はＣＡ１５−３である、前記（５）に記載の方法、
（７）  （Ａ）  乳癌の摘出手術を行った患者から採取された血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドにおけるメチル化の有無を測定する工程、及び
（Ｂ）  前記工程（Ａ）において、血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂからなる群より選ばれた少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにメチル化が検出された場合に、当該血清が、乳癌が転移した患者から採取された血清であると評価する工程、
を含む、血清の評価方法、並びに
（８）  （ａ）  乳癌の摘出手術を行った患者から採取された血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドにおけるメチル化の有無を測定する工程、
（ｂ）  前記血清に含まれる乳癌の腫瘍マーカーの量を測定する工程、及び
（ｃ）  前記工程（ａ）において、血清におけるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂからなる群より選ばれた少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにおいてメチル化が検出され、かつ工程（ｂ）において、血清における腫瘍マーカーの量が異常量である場合、当該血清が、乳癌が転移した患者から採取された血清であるか否かを評価する工程、
を含む、血清の評価方法、
に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１におけるＰＩＴＰＮＭ１プライマーセットによるリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示すグラフである。
【図２】実施例１におけるＧＳＴＰ１プライマーセットによるリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示すグラフである。
【図３】実施例１におけるＲＡＳＳＦ１ＡプライマーセットによるリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示すグラフである。
【図４】実施例１におけるＲＡＲｂプライマーセットによるリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示すグラフである。
【図５】実施例１におけるリアルタイムＰＣＲによる増幅産物のアガロースゲル電気泳動による確認の結果を示す図面代用写真である。
【図６】実施例２において、ＣＡ１５−３及びＣＥＡの量並びにＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂのＣｐＧアイランドにおけるメチル化の有無に基づいて乳癌の転移を判定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（乳癌の転移の判定方法）
本発明の第１の実施形態に係る乳癌の転移の判定方法は、乳癌の摘出手術を行った患者の血清を取得する工程と、取得工程で得られた血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドにおけるメチル化を検出する工程と、検出工程において、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂからなる群より選ばれた少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにメチル化が検出された場合に、乳癌が転移していると判定する工程とを含む（「判定方法１」ともいう）。かかる判定方法１によれば、乳癌の摘出手術を行った患者における乳癌の転移の有無を判定することができる。
【００１３】
本判定方法１において、乳癌の摘出手術を行った患者は、特に限定されないが、乳癌の摘出手術後、３日以上経過した患者が好ましい。これは、手術後、３日以上経過することで、手術前に存在した血液中のＤＮＡが分解されるため、摘出された乳癌からのＤＮＡが与える判定結果への影響を抑制することができるからである。
【００１４】
本判定方法１において、患者の血清を取得する方法としては、公知の方法を用いればよく、特に限定されない。例えば、患者から採取した血液を試験管に入れ、しばらく放置することで血清と血餅とに分離させる。この血清と血餅とに分離した試料を、さらに遠心分離することで、完全に血清と血餅とに分離する。これにより、遠心分離後の上澄みを血清として取得することができる。
【００１５】
前記ＧＳＴＰ１は、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼｐｉ  １遺伝子である。ＧＳＴＰ１の塩基配列は、ジーンバンクアクセッション番号：ＮＣ＿００００１１に示されている。
【００１６】
また、前記ＲＡＳＳＦ１Ａは、Ｒａｓ会合ドメインファミリー１Ａ遺伝子である。ＲＡＳＳＦ１Ａの塩基配列は、ジーンバンクアクセッション番号：ＸＭ＿０１１７８０に示されている。
【００１７】
さらに、前記ＲＡＲｂは、２−レチノイン酸レセプターβ遺伝子である。ＲＡＲｂの塩基配列は、ジーンバンクアクセッション番号：Ｓ８２３６２に示されている。
【００１８】
本実施形態において、血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドにおけるメチル化は、公知の方法を用いて検出することができる。公知の方法としては、メチル化特異的ＰＣＲ法やバイサルファイトシークエンシング法などが挙げられる。これらの方法では、解析対象のＤＮＡの非メチル化シトシンを、非メチル化シトシン変換剤を用いて、非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する処理（非メチル化シトシン変換処理）を行なう。
【００１９】
メチル化特異的ＰＣＲ法では、解析対象のＤＮＡのシトシンがウラシルに変換しなかった場合にＰＣＲ法による核酸増幅が可能となるプライマーセットを用いる。このプライマーセットによるＰＣＲにおいて、核酸増幅産物が検出された場合、解析対象のＤＮＡのシトシンがメチル化シトシンであることがわかる。前記プライマーセットとしては、例えば、前記ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれについて、ＣｐＧアイランドを含む塩基配列におけるＣｐＧ部位以外のシトシンが他の塩基（ウラシル、チミンなど）に変換された塩基配列からなる変換核酸にアニーリングする第１プライマーと、前記変換核酸の相補鎖にアニーリングする第２プライマーとからなるプライマーセットなどが挙げられる。なお、本明細書において、「（変換核酸または相補鎖に）アニーリングする」とは、メチル化特異的ＰＣＲにおけるアニーリング工程で採用される反応温度下に、変換核酸または相補鎖に水素結合を介して結合することをいう。また、本明細書においては、後述の「ハイブリダイズ」という用語も同義である。
【００２０】
また、バイサルファイトシークエンシング法では、非メチル化シトシン変換処理後の解析対象のＤＮＡの塩基配列を決定することにより、解析対象のＤＮＡのメチル化を解析することができる。
【００２１】
非メチル化シトシン変換処理は、例えば、公知の方法により行うことができる。かかる方法は、特に制限されない。非メチル化シトシン変換処理を行う方法としては、例えば、非メチル化シトシン変換剤を用いる方法などが挙げられる。この非メチル化シトシン変換剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウムなどの亜硫酸水素塩などが挙げられる。非メチル化シトシン変換処理において、例えば、非メチル化シトシン変換剤として、亜硫酸水素塩を用いた場合、非メチル化シトシンはウラシルに変換される。亜硫酸水素塩を用いた非メチル化シトシン変換処理における、亜硫酸水素塩の濃度は、血清に含まれるＤＮＡの非メチル化シトシンを充分に変換できる程度であれば、特に限定されない。より具体的な亜硫酸水素塩の濃度としては、血清に含まれるＤＮＡの非メチル化シトシンを充分に変換させる観点から、１Ｍ以上、好ましくは１〜１５Ｍ、より好ましくは３〜１０Ｍである。例えば、血清に最終濃度が４Ｍとなるように亜硫酸水素ナトリウムを添加する場合、１０〜９０分間、５０〜８０℃でインキュベートすることにより非メチル化シトシンのウラシルへの変換を行うことができる。また、亜硫酸水素塩を低濃度で用いる場合は、非メチル化シトシンを充分に変換できる程度の時間及び温度に適宜変更すればよい。
【００２２】
メチル化特異的ＰＣＲ法を用いて、ＧＳＴＰ１のＣｐＧアイランドのメチル化を検出するための具体的なプライマーセットとしては、以下の配列番号：１及び配列番号：２で示される各プライマーを含むものが挙げられる。なお、配列番号：１で示されるプライマーは、センスプライマー（ＧＳＴＰ１センスプライマー）である。配列番号：２で示されるプライマーはアンチセンスプライマー（ＧＳＴＰ１アンチセンスプライマー）である。
5'-TTCGCGGGATTTTTTAGAAGAGC-3'（配列番号：１）
5'-CACTAATAACGAAAACTACGACGACG-3'（配列番号：２）
【００２３】
配列番号：１及び配列番号：２で示される各プライマーによる核酸増幅の対象となる、ＧＳＴＰ１のプロモーター領域を含むＤＮＡの塩基配列を、配列番号：１３に示す。
5'-TCCGCGGGACCCTCCAGAAGAGCGGCCGGCGCCGTGACTCAGCACTGGGGCGGAGCGGGGCGGGACCACCCTTATAAGGCTCGGAGGCCGCGAGGCCTTCGCTGGAGTTTCGCCGCCGCAGTCTTCGCCACCAGTG-3'  （配列番号：１３）
【００２４】
配列番号：１で示されるプライマーは、配列番号：１３の１〜２３番目の範囲の塩基配列において、ＣｐＧ部位以外のシトシンがウラシル又はチミンに変換された塩基配列に相補的な塩基配列の核酸にハイブリダイズする。配列番号：２で示されるプライマーは、配列番号：１３の１１１〜１３６番目の範囲の塩基配列において、ＣｐＧ部位以外のシトシンがウラシル又はチミンに変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする。
【００２５】
ＲＡＳＳＦ１ＡのＣｐＧアイランドのメチル化を検出するための具体的なプライマーセットとしては、以下の配列番号：３及び配列番号：４で示される各プライマーを含むものが挙げられる。なお、配列番号：３で示されるプライマーは、センスプライマー（ＲＡＳＳＦ１Ａセンスプライマー）である。配列番号：４で示されるプライマーは、アンチセンスプライマー（ＲＡＳＳＦ１Ａアンチセンスプライマー）である。
5'-ATAGTTTTTGTATTTAGGTTTTTATTGCGC-3'  （配列番号：３）
5'-ACCCGTACTTCGCTAACTTTAAACG-3'  （配列番号：４）
【００２６】
配列番号：３及び配列番号：４で示される各プライマーによる核酸増幅の対象となる、ＲＡＳＳＦ１Ａのプロモーター領域を含むＤＮＡの塩基配列を、配列番号：１４に示す。
5'-ACAGTCCCTGCACCCAGGTTTCCATTGCGCGGCTCTCCTCAGCTCCTTCCCGCCGCCCAGTCTGGATCCTGGGGGAGGCGCTGAAGTCGGGGCCCGCCCTGTGGCCCCGCCCGGCCCGCGCTTGCTAGCGCCCAAAGCCAGCGAAGCACGGGC-3'  （配列番号：１４）
【００２７】
配列番号：３で示されるプライマーは、配列番号：１４の１〜３０番目の範囲の塩基配列において、ＣｐＧ部位以外のシトシンがウラシル又はチミンに変換された塩基配列に相補的な塩基配列の核酸にハイブリダイズする。配列番号：４で示されるプライマーは、配列番号：１４の１２９〜１５３番目の範囲の塩基配列において、ＣｐＧ部位以外のシトシンがウラシル又はチミンに変換した塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする。
【００２８】
ＲＡＲｂのＣｐＧアイランドのメチル化を検出するための具体的なプライマーセットとしては、以下の配列番号：５及び配列番号：６で示される各プライマーを含むものが挙げられる。なお、配列番号：５で示されるプライマーは、センスプライマー（ＲＡＲｂセンスプライマー）である。配列番号：６で示されるプライマーは、アンチセンスプライマー（ＲＡＲｂアンチセンスプライマー）である。
5'-GAATATCGTTTTTTAAGTTAAGTCGTC-3'  （配列番号：５）
5'-GAAACGCTACTCCTAACTCACG-3'  （配列番号：６）
【００２９】
配列番号：５及び配列番号：６で示される各プライマーによる核酸増幅の対象となる、ＲＡＲｂのプロモーター領域を含むＤＮＡの塩基配列を、配列番号：１５に示す。
5'-GAACACCGTTTTCCAAGCTAAGCCGCCGCAAATAAAAAGGCGTAAAGGGAGAGAAGTTGGTGCTCAACGTGAGCCAGGAGCAGCGTCCC-3'  （配列番号：１５）
【００３０】
配列番号：５で示されるプライマーは、配列番号：１５の１〜２７番目の範囲の塩基配列において、ＣｐＧ部位以外のシトシンがウラシル又はチミンに変換された塩基配列に相補的な塩基配列の核酸にハイブリダイズする。配列番号：６で示されるプライマーは、配列番号：１５の６８〜８９番目の範囲の塩基配列において、ＣｐＧ部位以外のシトシンがウラシル又はチミンに変換した塩基配列の核酸にハイブリダイズする。
【００３１】
なお、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドのメチル化を検出するためのプライマーセットは、適宜設計が可能であり、上述のプライマーセットに限定されるものではない。
【００３２】
また、本判定方法１において、上述の非メチル化シトシン変換処理が適正に行われたか否かを確認することが好ましい。この確認は、公知の方法を用いればよく特に制限されない。例えば、
（１）非メチル化シトシン変換処理が適正に行われたか否かを確認する解析対象となるＤＮＡにおいて、非メチル化シトシンを含む領域の所定の塩基配列を認定しておき；
（２）非メチル化シトシン変換処理後の所定の塩基配列の核酸にハイブリダイズ可能なプライマー、すなわち、ＰＣＲにおけるアニーリング工程において、前記ＤＮＡにおける非メチル化シトシンの全てが他の塩基に変換された変換核酸またはその相補鎖にアニーリングするプライマーを有するコントロールプライマーセットを用いて、ＰＣＲを行い；
（３）ＰＣＲによる増幅産物を検出する；
ことにより、非メチル化シトシン変換処理が適正に行われたか否かを確認することができる。ここで、前記（３）において増幅産物が検出された場合は、非メチル化シトシン変換処理が適正に行われたことの指標になる。逆に、前記（３）において増幅産物が検出されない場合は、非メチル化シトシン変換処理が適正に行われていないことの指標になる。すなわち、非メチル化シトシン変換処理により、所定の塩基配列の非メチル化シトシンが変換された場合に、コントロールプライマーセットによるＰＣＲの核酸増幅が可能となり、増幅産物が検出される。逆に、特定された塩基配列の非メチル化シトシンが変換されていない場合は、コントロールプライマーセットによるＰＣＲの核酸増幅が不能となり、増幅産物が検出されない。
したがって、前記コントロールプライマーセットを用いたＰＣＲによる増幅産物の検出結果に基づいて、非メチル化シトシン変換処理が適正に行われたか否かを確認することができる。
【００３３】
具体的なコントロールプライマーセットとしては、以下の配列番号：７及び配列番号：８で示される各プライマーを含むものが挙げられる。なお、配列番号：７で示されるプライマーは、センスプライマーである。配列番号：８で示されるプライマーはアンチセンスプライマーである。
5'-GGGATATTAAGTGGAGTTATTTTGGTTTTAGTT-3'  （配列番号：７）
5'-CCCTCCCAACATCCTTCCTAA-3'  （配列番号：８）
【００３４】
配列番号：７及び配列番号：８で示される各プライマーによる核酸増幅の対象となる塩基配列は、フォスファチジルイノシトール転移タンパク質（ＰＩＴＰＮＭ１）のプロモーター領域を含むＤＮＡの塩基配列である。核酸増幅の対象となる、ＰＩＴＰＮＭ１のプロモーター領域を含むＤＮＡの塩基配列を、配列番号：１６に示す。
5'-GGGATACCAAGTGGAGCCACTCTGGCCTCAGCCTGAGGAGGGCTCACCCCCTGGGAAGAGGACGGAGTGGCTGCCTAGGCGCGTGGAGAGCCGGCGAGGGCCAGGGGTCCAGGAAGGATGCTGGGAGGG-3'  （配列番号：１６）
【００３５】
配列番号：７で示されるプライマーは、配列番号：１６の１〜３３番目の範囲の塩基配列において、シトシンがウラシル又はチミンに変換した塩基配列に相補的な塩基配列の核酸にハイブリダイズする。配列番号：８で示されるプライマーは、配列番号：１６の１０９〜１２９番目の範囲の塩基配列において、シトシンがウラシル又はチミンに変換した塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする。ここで、配列番号：１６に示されるＰＩＴＰＮＭ１のシトシンは、乳癌組織及び正常乳腺から抽出したＤＮＡのバイサルファイトシークエンスで、いずれも非メチル化シトシンであることが、予め確認されたものである。
【００３６】
なお、コントロールプライマーセットは、適宜設計が可能であり、上述のプライマーセットに限定されるものではない。
【００３７】
本判定方法１の判定工程では、検出工程においてＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂからなる群より選ばれた少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにおいてメチル化が検出された場合に、乳癌が転移していると判定する。これは、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂの全てのＣｐＧアイランドがメチル化されていない場合、乳癌が転移していないと判定することと同意義である。この判定により、高感度で、簡便に、乳癌が転移した患者をスクリーニングすることができる。
【００３８】
なお、本判定方法１において、上述の非メチル化シトシン変換処理が適正に行われたか否かの確認が行われた場合、判定工程において、判定結果の信頼性も併せて判定することができる。すなわち、非メチル化シトシン変換処理が適正に行われていた場合は、判定結果の信頼性が高いと判定できる。逆に、非メチル化シトシン変換処理が適正に行われていない場合は、判定結果の信頼性が低いと判定できる。このように、判定結果の信頼性も併せて判定することで、より正確に、乳癌が転移した患者をスクリーニングすることができる。
【００３９】
本明細書において、「乳癌の転移」とは、乳癌細胞が原発巣とは違う場所に到達し、そこで再び増殖し、同一種類の腫瘍を二次的に生じることを示す。また、「遠隔転移」とは、原発巣から遠く離れた臓器やリンパ節に癌が転移したものを示す。なお、乳癌は、鎖骨上リンパ節、肺、骨、肝臓、脳などに遠隔転移しやすいことが知られている。
【００４０】
本発明の他の実施形態に係る乳癌の転移の判定方法は、乳癌の摘出手術を行った患者の血清を取得する工程と、取得工程で得られた血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドにおけるメチル化を検出する工程と、取得工程で得られた血清に含まれる乳癌の腫瘍マーカーの量を測定する工程と、検出工程において、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂの少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにおいてメチル化が検出され、かつ測定工程で得られた腫瘍マーカーの量が異常量の場合、乳癌が転移していると判定する工程と、を含む（「判定方法２」ともいう）。
【００４１】
本判定方法２における取得工程及び検出工程は、それぞれ、上述の判定方法１における取得工程及び検出工程と同様である。また、本判定方法２の説明に用いられている用語のうち、前記判定方法１の説明に用いられている用語と共通している用語は、前記判定方法１の説明に用いられている用語と同様の意味を示すものである。
【００４２】
ここで、乳癌の腫瘍マーカーとしては、例えば、ＣＡ１５−３（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  １５−３、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ、ＢＣＡ２２５（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−２２５、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９（ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｎｔｅｒ−ＳＴ４３９及びＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）などが挙げられる。特に、ＣＡ１５−３及びＣＥＡが好ましい。
【００４３】
乳癌の腫瘍マーカーの量を測定する方法は、乳癌の腫瘍マーカーに対する抗体を用いて、タンパク質レベルで乳癌の腫瘍マーカーの量を測定する方法、乳癌の腫瘍マーカーをコードする核酸又はその相補鎖に基づくプライマーセット、プローブ、ポリヌクレオチドなどを用いて、核酸レベルで乳癌の腫瘍マーカーの量を測定する方法などの公知の測定方法を用いればよく、特に制限されない。また、乳癌の腫瘍マーカーの量を測定するための装置及び試薬は、一般に市販されている。例えば、ＣＡ１５−３の量の測定は、富士レビオ株式会社製の全自動化学発光酵素免疫測定装置であるルミパルス（登録商標）ｆ及びＣＡ１５−３測定試薬であるルミパルス（登録商標）ＣＡ１５−３を用いて行うことができる。また、ＣＥＡの量の測定は、ベックマン・コールター社製の全自動化学発光酵素免疫測定装置であるＵｎｉＣｅｌ  ＤｘＩ  ８００  Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）及びＣＥＡ測定試薬であるＡｃｃｅｓｓ（登録商標）ＣＥＡを用いて行うことができる。
【００４４】
本判定方法２の判定工程において、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂからなる群より選ばれた少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにメチル化が検出された場合に、乳癌が転移していると判定することは、上述の判定方法２の場合と同様である。
【００４５】
ここで、本判定方法２の判定工程では、測定工程で得られた腫瘍マーカーの量が異常量である場合も、乳癌が転移していると判定する。これは、腫瘍マーカーの量が正常量である場合、乳癌が転移していないと判定することと同意義である。この判定により、より正確に、乳癌が転移した患者をスクリーニングすることができる。
【００４６】
ここで、「異常量」とは、取得工程で得られた血清に含まれる乳癌の腫瘍マーカーの量が、健常人の血清に含まれる通常の乳癌の腫瘍マーカーの量の範囲外の量であることを示す。一方、正常量とは、取得工程で得られた血清に含まれる乳癌の腫瘍マーカーの量が、健常人の血清に含まれる通常の乳癌の腫瘍マーカーの量の範囲内の量であることを示す。異常量か正常量かの判定は、例えば、測定工程で得られた腫瘍マーカーの量を、所定の閾値と比較し、その比較結果に基づいて行うことができる。より具体的には、測定工程で得られた腫瘍マーカーの量が、所定の閾値を超えている場合を異常量と判定し、所定の閾値以下の場合を正常量と判定することができる。所定の閾値は、複数の健常人及び複数の乳癌が転移した患者の血清中の乳癌の腫瘍マーカーの量の測定結果に基づいて、設定することができる。また、上述の市販されている乳癌の腫瘍マーカーの量を測定するための装置及び試薬を用いる場合、その取扱説明書に記載されている閾値を用いることもできる。
【００４７】
以上、説明したように、本発明の乳癌の転移の判定方法によれば、判定に際して、従来の画像検査に用いられる装置を用いないため、患者に不快感を与えることなく、低コストで、かつ簡便に、乳癌の摘出手術を行った患者における乳癌の転移の有無を判定することができる。この乳癌の転移の判定方法によれば、乳癌の摘出手術後、定期的に当該判定方法により乳癌の転移、特に乳癌の遠隔転移の有無を判定することで、早期に乳癌の転移による再発を検出することもできる。
【００４８】
（その他の応用例）
前述した乳癌の判定方法を応用することにより、血清が、乳癌が転移した患者から採取された血清であるか否かを評価する血清の評価、すなわち、乳癌の転移の可能性の指標の提供、乳癌の転移の見極めのための検査などを行うことが可能になる。これらは、医師による診断のために、検査機関などが乳癌の転移の判断に有用な情報を提供するものである。
【００４９】
本発明の血清の評価方法は、１つの側面では、（Ａ）  乳癌の摘出手術を行った患者から採取された血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドにおけるメチル化の有無を測定する工程、及び
（Ｂ）  前記工程（Ａ）において、血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂからなる群より選ばれた少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにメチル化が検出された場合に、当該血清が、乳癌が転移した患者から採取された血清であると評価する工程
を含む方法（評価方法１）である。また、本発明の血清の評価方法は、他の側面では、（ａ）  乳癌の摘出手術を行った患者から採取された血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドにおけるメチル化の有無を測定する工程、
（ｂ）  前記血清に含まれる乳癌の腫瘍マーカーの量を測定する工程、及び
（ｃ）  前記工程（ａ）において、血清におけるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂからなる群より選ばれた少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにおいてメチル化が検出され、かつ工程（ｂ）において、血清における腫瘍マーカーの量が異常量である場合に、当該血清が、乳癌が転移した患者から採取された血清であると評価する工程
を含む方法である。
【００５０】
評価方法１および評価方法２の説明に用いられている用語のうち、前述した判定方法１の説明に用いられている用語と共通している用語は、かかる判定方法１の説明に用いられている用語と同様の意味を示すものである。
【００５１】
評価方法１の工程（Ａ）および評価方法２の工程（ａ）は、判定方法１における検出工程と同様に操作して行なうことができる。
【００５２】
評価方法１の工程（Ｂ）は、検査機関などで行なうことができる工程である。この工程（Ｂ）では、前記工程（Ａ）において、血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂからなる群より選ばれた少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにメチル化が検出された場合に、当該血清は、乳癌が転移した患者から採取された血清であると評価される。
【００５３】
評価方法１の工程（Ｂ）では、例えば、評価方法１の工程（Ａ）で得られた結果と、血清が、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂからなる群より選ばれた少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにメチル化が存在するＤＮＡを含むとき、当該血清が、乳癌が転移した患者の血清であるという基準とを比較することにより、前記血清が、乳癌が転移した患者から採取された血清であるか否かを評価することができる。なお、得られた比較結果は、乳癌の転移の可能性の指標として乳癌の転移の判定者に提供することもできる。
また、かかる比較結果により、患者に乳癌の転移があるか否かの乳癌の転移の見極めのためのデータを得ることができる。
【００５４】
一方、評価方法２の工程（ｂ）は、判定方法１における測定工程と同様に操作して行なうことができる。評価方法２の工程（ｃ）は、検査機関などで行なうことができる工程である。この工程（ｃ）では、前記工程（ａ）において、血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂからなる群より選ばれた少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにメチル化が検出され、前記工程（ｂ）において、血清における腫瘍マーカーの量が異常量である場合に、当該血清は、乳癌が転移した患者から採取された血清であると評価される。
【００５５】
前記評価方法２の工程（ｃ）では、血清が、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂからなる群より選ばれた少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにメチル化が存在するＤＮＡを含み、腫瘍マーカーの量が異常量であるとき、当該血清は、乳癌が転移した患者の血清であるという基準と、前記工程（ａ）及び（ｂ）で得られた結果とを比較することにより、前記血清が、乳癌が転移した患者から採取された血清であるか否かを評価することができる。なお、得られた比較結果は、乳癌の転移の可能性の指標として乳癌の転移の判定者に提供することもできる。
また、かかる比較結果により、患者に乳癌の転移があるか否かの乳癌の転移の見極めのためのデータを得ることができる。
【００５６】
本発明の血清の評価方法によれば、前述した乳癌の転移の判定方法と同様に、従来の画像検査に用いられる装置を用いないため、評価に際して、患者に不快感を与えることがなく、低コストで、かつ簡便に乳癌の摘出手術を行った患者における乳癌の転移の有無の判定のための指標を得ることができる
【００５７】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
（実施例１）
(1)血清の取得
乳癌の遠隔転移による再発が診断された６人の患者それぞれから、血清分離剤入採血管（テルモ（株）製、商品名：ベノジェクトII真空採血管）を用いて約６ｍｌの採血を行った。採血してから３０分経過後、採血管を１２００Ｇで１０分間の遠心分離に供した。遠心分離後、上澄みを血清として取得した。【００５９】
(2)血清に含まれるＤＮＡの非メチル化シトシン変換処理
血清３００μｌに、８Ｍのグアニジン塩酸塩水溶液３００μｌと２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ(シグマアルドリッチ製)水溶液２０μｌとを添加して混合し、得られた混合物を５０℃で１時間保温した。次に、保温後の混合物に、１０Ｍの水酸化ナトリウム水溶液２０μｌを添加して混合し、得られた混合物を室温で１０分間保温した。その後、保温後の混合物に、１０Ｍの亜硫酸水素ナトリウム水溶液６００μｌを添加して混合し、得られた混合物を８０℃で４０分間保温することにより、亜硫酸水素ナトリウム処理を行った。亜硫酸水素ナトリウム処理された試料に含まれるＤＮＡを精製キット（キアゲン製、商品名：QIAquick PCR Purification Kit）により精製し、精製物を蒸留水５０μｌにて溶出することで回収した。回収したＤＮＡ溶液５０μｌに、３Ｍの水酸化ナトリウム溶液５．５μｌを添加して混合し、室温にて保温した。５分間経過後すぐに、水酸化ナトリウムを除去するために、得られた混合物をゲル濾過担体（GEヘルスケア製、商品名：sephacryl S-300）により精製した。回収されたＤＮＡ溶液を、メチル化検出用溶液とした。【００６０】
(2)メチル化特異的ＰＣＲ法によるメチル化シトシンの検出
前記メチル化検出用溶液を用い、リアルタイムＰＣＲを以下の条件で行った。【００６１】
（2-1）ＰＩＴＰＮＭ１プライマーセットによるリアルタイムＰＣＲ
非メチル化シトシン変換処理が十分に行われたかを確認するためのコントロールプライマーセットとして、ＰＩＴＰＮＭ１プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＩＴＰＮＭ１プライマーセットは、上述の配列番号：７で示されるプライマーと、配列番号：８で示されるプライマーと、以下の配列番号：９で示される蛍光標識プローブとを含む。なお、蛍光標識プローブは、リアルタイムＰＣＲを用いた蛍光検出法による増幅産物の検出に用いた。【００６２】
FAM-ATTTTTTGGGAAGAGGATGGAGTGGTTGTTTAGG-DarkQuencher  (配列番号：９)
なお、ＦＡＭ（５−カルボキシ−フルオレセイン）は蛍光色素であり、ＤａｒｋＱｕｅｎｃｈｅｒ（Dark Quencher（エポックバイオサイエンシーズ（Epoch Biosciences））社の登録商標））はクエンチャー(励起エネルギー吸収剤)を示す。また、配列番号：９で示される蛍光プローブは、配列番号：１６の４６〜８０番目までの範囲の塩基配列において、シトシンがウラシル又はチミンに変換した塩基配列からなる部分にハイブリダイズする。【００６３】
ＰＩＴＰＮＭ１プライマーセットによるリアルタイムＰＣＲの反応液の組成を以下に示す。【００６４】
【表１】
2010032797.tif 000002
【００６５】
ＰＩＴＰＮＭ１プライマーセットによるリアルタイムＰＣＲの反応条件は、以下の通りである。【００６６】
【表２】
2010032797.tif 000003
【００６７】
(2-2)ＧＳＴＰ１プライマーセットによるリアルタイムＰＣＲ
ＧＳＴＰ１のＣｐＧアイランドのメチル化を検出するためのＧＳＴＰ１プライマーセットは、配列番号：１で示されるプライマーと、配列番号：２で示されるプライマーと、以下の配列番号：１０で示される蛍光標識プローブとを含む。【００６８】
FAM-ATAAGGTTCGGAGGTCGCGAGGTTTTCGT-DarkQuencher  （配列番号：１０）
なお、配列番号：１０で示される蛍光標識プローブは、配列番号：１３の７４〜１０３番目までの範囲の塩基配列において、ＣｐＧ部位以外のシトシンがウラシル又はチミンに変換した塩基配列からなる部分にハイブリダイズする。【００６９】
ＧＳＴＰ１プライマーセットによるリアルタイムＰＣＲの反応液の組成を以下に示す。【００７０】
【表３】
2010032797.tif 000004
【００７１】
ＧＳＴＰ１プライマーセットによるリアルタイムＰＣＲの反応条件は、ＰＩＴＰＮＭ１プライマーセットと同様である。【００７２】
(2-3)ＲＡＳＳＦ１ＡプライマーセットによるリアルタイムＰＣＲ
ＲＡＳＳＦ１ＡのＣｐＧアイランドのメチル化を検出するためのＲＡＳＳＦ１Ａプライマーセットは、配列番号：３で示されるプライマーと、配列番号：４で示されるプライマーと、以下の配列番号：１１で示される蛍光標識プローブとを含む。【００７３】
FAM-TTGAAGTCGGGGTTCGTTTTGTGGTTTCGT-DarkQuencher  （配列番号：１１）
なお、配列番号：１１で示されるプローブは、配列番号：１４の８１〜１１１番目までの範囲の塩基配列において、ＣｐＧ部位以外のシトシンがウラシル又はチミンに変換した塩基配列からなる部分にハイブリダイズする。【００７４】
ＲＡＳＳＦ１ＡプライマーセットによるリアルタイムＰＣＲの反応液の組成を以下に示す。【００７５】
【表４】
2010032797.tif 000005
【００７６】
ＲＡＳＳＦ１ＡプライマーセットによるリアルタイムＰＣＲの反応条件は、PITPNM1プライマーセットと同様である。【００７７】
（2-4）ＲＡＲｂプライマーセットによるリアルタイムＰＣＲ
ＲＡＲｂのＣｐＧアイランドのメチル化を検出するためのＲＡＲｂプライマーセットは、配列番号：５で示されるプライマーと、配列番号：６で示されるプライマーと、以下の配列番号：１２で示される蛍光標識プローブとを含む。【００７８】
FAM-AGGCGTAAAGGGAGAGAAGTTGGTGTTTA-DarkQuencher  （配列番号：１２）
なお、配列番号：１２で示されるプローブは、配列番号：１５の３８〜６７番目の範囲の塩基配列において、ＣｐＧ部位以外のシトシンがウラシル又はチミンに変換した塩基配列からなる部分にハイブリダイズする。【００７９】
ＲＡＲｂプライマーセットによるリアルタイムＰＣＲの反応液の組成を以下に示す。【００８０】
【表５】
2010032797.tif 000006
【００８１】
ＲＡＲｂプライマーセットによるリアルタイムＰＣＲの反応条件は、ＰＩＴＰＮＭ１プライマーセットと同様である。【００８２】
(3)乳癌の転移の判定および血清の評価
図１〜４に、上述のリアルタイムＰＣＲによる増幅曲線の結果を示す。ここで、図１は、実施例１におけるＰＩＴＰＮＭ１プライマーセットによるリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示すグラフである。図２は、実施例１におけるＧＳＴＰ１プライマーセットによるリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示すグラフである。図３は、実施例１におけるＲＡＳＳＦ１ＡプライマーセットによるリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示すグラフである。図４は、実施例１におけるＲＡＲｂプライマーセットによるリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示すグラフである。また、図５に、実施例１におけるリアルタイムＰＣＲによる増幅産物のアガロースゲル電気泳動による確認の結果を示す図面代用写真である。なお、図１〜５における「蒸留水」は、メチル化検出用溶液の代わりに蒸留水を用いてリアルタイムＰＣＲをおこなった結果である。【００８３】
図１及び図５に示された結果から、ＰＩＴＰＮＭ１プライマーセットによるリアルタイムＰＣＲにより、蒸留水を除く、６検体の全てにおいて増幅産物が確認されることがわかる。このことから、６検体の全ての非メチル化シトシン変換処理は適正に行われたことがわる。【００８４】
また、図２及び図５に示された結果から、検体１及び検体４において、ＧＳＴＰ１プライマーセットによるリアルタイムＰＣＲで増幅産物が確認されることがわかる。このことから、検体１及び検体４のＧＳＴＰ１のＣｐＧアイランドがメチル化されていることがわかる。【００８５】
また、図３及び図５に示された結果から、検体４において、ＲＡＳＳＦ１ＡプライマーセットによるリアルタイムＰＣＲで増幅産物が確認されることがわかる。このことから、検体４のＲＡＳＳＦ１ＡのＣｐＧアイランドがメチル化されていることがわかる。【００８６】
また、図４及び図５に示された結果から、検体１、検体２、検体３、及び検体６において、ＲＡＲｂプライマーセットによるリアルタイムＰＣＲで増幅産物が確認されることがわかる。このことから、検体１、検体２、検体３、及び検体６のＲＡＲｂのＣｐＧアイランドがメチル化されていることがわかる。【００８７】
以上の結果から、乳癌の遠隔転移による再発が診断された６人の患者から得られた６検体の血清のうち、５検体において、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂの少なくとも１つのＣｐＧアイランドにおいてメチル化が検出されることがわかる。このことから、本実施例において、乳癌の遠隔転移による再発が診断された６検体のうち、５検体を乳癌の転移があると判定することができることがわかる。【００８８】
これらの結果から、血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂの少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランド内でのメチル化の存在に基づいて、乳癌の遠隔転移が判定できることがわかる。【００８９】
また、血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂの少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランド内でのメチル化を検出することにより、血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂの少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにメチル化が検出された場合に、当該血清が、乳癌が転移した患者の血清であるという基準に基づいて、前記血清が、乳癌が転移した患者から採取された血清であるか否かを評価することができることがわかる。【００９０】
（実施例２）
(1)血清の取得
乳癌の遠隔転移による再発が診断された３４人の患者から、実施例１と同様の方法で、血清を取得した。【００９１】
(2)ＣＡ１５−３及びＣＥＡの測定
取得した血清それぞれについて、腫瘍マーカーであるＣＡ１５−３及びＣＥＡの量を測定した。ＣＡ１５−３の量は、富士レビオ株式会社製のルミパルス（登録商標）ｆ及びルミパルス（登録商標）ＣＡ１５−３を用いて測定した。また、ＣＥＡの量は、ベックマン・コールター社製のＵｎｉＣｅｌ  ＤｘＩ  ８００  Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）及びＡｃｃｅｓｓ（登録商標）ＣＥＡを用いて測定した。ここで、ＣＡ１５−３の血清中の濃度が、３０Ｕ／ｍｌを超える検体を、乳癌の転移が陽性である検体であると判定した。また、ＣＥＡの血清中の濃度が、５ｎｇ／ｍｌを超える検体を、乳癌の転移が陽性であると判定した。【００９２】
(3)ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドにおけるメチル化の検出
取得した血清それぞれについて、上述の実施例１と同様の方法により、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂそれぞれのＣｐＧアイランドにおけるメチル化の有無を調べた。ここで、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂの少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにメチル化が検出された検体を、乳癌の転移が陽性である検体であると判定した。【００９３】
(4)乳癌の転移の判定および血清の評価
実施例２において、ＣＡ１５−３及びＣＥＡの量並びにＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂのＣｐＧアイランドにおけるメチル化の有無に基づいて乳癌の転移を判定した結果を示す図を図６に示す。なお、図中、枠により囲まれた各数字は、ＣＥＡの量を指標として乳癌の転移が陽性である判定された検体の数、ＣＡ１５−３の量を指標として乳癌の転移が陽性である判定された検体の数又はＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂの少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドのメチル化を指標として乳癌の転移が陽性である判定された検体の数を示している。また、図中、２つ以上の枠が重なっている部分の各数字は、対応する２つ以上の指標により共通して乳癌の転移が陽性である判定された検体の数を示している。【００９４】
図６に示された結果から、従来のＣＡ１５−３の量及びＣＥＡの量の両方を指標とした乳癌の転移の判定では、３４検体中１１検体について、乳癌の転移が陰性であると判定された。また、前記判定の感度を、陽性判定の検体数／全検体数により算出したところ、ＣＡ１５−３の量及びＣＥＡの量の両方を指標とした乳癌の転移の判定は、６８％（陽性判定の２３検体／全３４検体）の感度しかないことがわかる。【００９５】
しかし、ＣＡ１５−３の量及びＣＥＡの量の両方を指標とした乳癌の転移の判定に加えて、メチル化の存在を指標とした判定をさらに加えた場合、ＣＡ１５−３及びＣＥＡそれぞれの量を指標とした乳癌の転移の判定によって乳癌の転移が陰性であると判定された１１検体のうち６検体が、乳癌の転移が陽性であると判定され、感度が、８５％（陽性判定の２９検体／全３４検体）に向上することがわかる。【００９６】
また、ＣＡ１５−３の量又はＣＥＡの量を指標とした乳癌の転移の判定と、メチル化の検出による乳癌の転移の判定との組み合わせでも、約８５％（それぞれ、陽性判定の２９検体／全３４検体）の感度を有することがわかる。【００９７】
以上の結果から、従来の乳癌の腫瘍マーカーによる乳癌の転移の判定に加え、ＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂの少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランド内でのメチル化の存在に基づいて、乳癌の転移の判定を行うことで、より高感度で、乳癌の転移を判定できることがわかる。【００９８】
また、血清に含まれる乳癌の腫瘍マーカーの量を測定し、かつこの血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂの少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランド内でのメチル化を検出することにより、血清に含まれるＧＳＴＰ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ及びＲＡＲｂの少なくとも１つにおけるＣｐＧアイランドにメチル化が検出され、かつ血清における腫瘍マーカーの量が異常量の場合に、当該血清が、乳癌が転移した患者の血清であるという基準に基づいて、前記血清が、乳癌が転移した患者から採取された血清であるか否かを評価することができることがわかる。
【配列表フリーテキスト】
【００９９】
配列番号：１は、ＧＳＴＰ１センスプライマーの配列である。
配列番号：２は、ＧＳＴＰ１アンチセンスプライマーの配列である。
配列番号：３は、ＲＡＳＳＦ１Ａセンスプライマーの配列である。
配列番号：４は、ＲＡＳＳＦ１Ａアンチセンスプライマーの配列である。
配列番号：５は、ＲＡＲｂセンスプライマーの配列である。
配列番号：６は、ＲＡＲｂアンチセンスプライマーの配列である。
配列番号：７は、ＰＩＴＰＮＭ１センスプライマーの配列である。
配列番号：８は、ＰＩＴＰＮＭ１アンチセンスプライマーの配列である。
配列番号：９は、プローブの配列である。
配列番号：１０は、プローブの配列である。
配列番号：１１は、プローブの配列である。
配列番号：１２は、プローブの配列である。
【図６】
2010032797.tif 000007
【図１】
2010032797.tif 000008
【図２】
2010032797.tif 000009
【図３】
2010032797.tif 000010
【図４】
2010032797.tif 000011
【図５】
2010032797.tif 000012
【配列表】
2010032797000001.app
【国際調査報告】
2010032797.tif 000013
2010032797.tif 000014
2010032797.tif 000015