(57)【要約】安全性及び導入効率に優れた遺伝子導入剤、遺伝子導入用キット及び遺伝子導入方法を提供することを課題とする。下記式ＤＬ−Ｇ１〜ＤＬ−Ｇ４のいずれかで表される化合物を含む遺伝子導入剤組成物であってＤＬ−Ｇ１：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（ＸＨ２）２ＤＬ−Ｇ２：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（ＸＨ２）２）２ＤＬ−Ｇ３：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２ＤＬ−Ｇ４：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２）２（Ｘは、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ−を示す。）、上記式中Ｒ１が不飽和長鎖脂肪族基であり、かつＲ２が不飽和長鎖脂肪族基又は飽和長鎖脂肪族基であることを特徴とする遺伝子導入剤組成物を、その解決手段とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式ＤＬ−Ｇ１〜ＤＬ−Ｇ４のいずれかで表される化合物を含む遺伝子導入剤組成物であって
ＤＬ−Ｇ１：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（ＸＨ２）２
ＤＬ−Ｇ２：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（ＸＨ２）２）２
ＤＬ−Ｇ３：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２
ＤＬ−Ｇ４：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２）２
（Ｘは、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ−を示す。）、
上記式中Ｒ１が不飽和長鎖脂肪族基であり、かつＲ２が不飽和長鎖脂肪族基又は飽和長鎖脂肪族基であることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
【請求項２】
長鎖脂肪族基が炭素数１０〜２２の脂肪族基である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
さらにリン脂質を含む請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
リン脂質がＤＯＰＥである請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の組成物を遺伝子とともにイン・ビトロまたはイン・ビボ（ただし、ヒトを除く）で細胞に適用することを特徴とする遺伝子の細胞への導入方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物を含有する遺伝子導入用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤、遺伝子導入用キット及び遺伝子導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療等に用いられる効率の高い遺伝子導入剤としてウィルスベクターが知られているが、該ウィルスベクターは、臨床応用において死に至る重篤な副作用が報告されており、より安全な遺伝子導入剤が求められている。【０００３】
非ウィルスベクターは、ウィルスベクターと比較してより安全性が高いが、遺伝子の導入効率が低い欠点があった。【０００４】
このような問題点を解決しうる優れた遺伝子導入剤組成物として、本発明者はポリアミドアミンデンドロンを含む遺伝子導入剤組成物を既に開発している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2004-159504号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、安全性及び導入効率に優れた遺伝子導入剤、遺伝子導入用キット及び遺伝子導入方法を提供することを課題とする。特に、ポリアミドアミンデンドロンを含む改良された遺伝子導入剤組成物を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の遺伝子導入剤、遺伝子導入用キット及び遺伝子導入方法を提供するものである。
項１．下記式ＤＬ−Ｇ１〜ＤＬ−Ｇ４のいずれかで表される化合物を含む遺伝子導入剤組成物であって
ＤＬ−Ｇ１：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（ＸＨ２）２
ＤＬ−Ｇ２：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（ＸＨ２）２）２
ＤＬ−Ｇ３：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２
ＤＬ−Ｇ４：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２）２
（Ｘは、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ−を示す。）、
上記式中Ｒ１が不飽和長鎖脂肪族基であり、かつＲ２が不飽和長鎖脂肪族基又は飽和長鎖脂肪族基であることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
項２．長鎖脂肪族基が炭素数１０〜２２の脂肪族基である、項１に記載の組成物。
項３．不飽和長鎖脂肪族基がヘキサデセニル基、オクタデセニル基、オクタデカジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサペンタエニル基、又はドコサヘキサエニル基である、項１に記載の組成物。
項４．さらにリン脂質を含む項１〜３のいずれかに記載の組成物。
項５．リン脂質がＤＯＰＥである項４に記載の組成物。
項６．項１〜５のいずれかに記載の組成物を遺伝子とともにイン・ビトロまたはイン・ビボ（ただし、ヒトを除く）で細胞に適用することを特徴とする遺伝子の細胞への導入方法。
項７．項１〜５のいずれか１項に記載の組成物を含有する遺伝子導入用キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、従来の遺伝子導入剤と比較して、遺伝子導入効率が格段に向上しており、かつ、細胞毒性が格段に低減された遺伝子導入剤を提供できる。このため、導入効率及び安全性の両面に優れており、幅広く実用可能な遺伝子導入技術を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】オレイルオレオイルアミド（Oleyloleoylamide）が生成されていることを示す1H NMR spectrum (400MHz, CDCl3)である。
【図２】ジオレイルアミン（Dioleylamine）が生成されていることを示す1H NMR spectrum (400MHz, CDCl3)である。
【図３】ＤＬ−Ｇ−０．５−２Ｃ１８−Ｕ２が生成されていることを示す1H NMR spectrum (400MHz, CDCl3)である。
【図４】ＤＬ−Ｇ０−２Ｃ１８−Ｕ２が生成されていることを示す1H NMR spectrum (400MHz, CDCl3)である。
【図５】ＤＬ−Ｇ０．５−２Ｃ１８−Ｕ２が生成されていることを示す1H NMR spectrum (400MHz, CDCl3)である。
【図６】ＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８−Ｕ２が生成されていることを示す1H NMR spectrum (400MHz, CDCl3)である。
【図７】各種のＮ／Ｐ比を有するＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８、またはＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８−Ｕ２リポプレックスで処理したＣＶ１細胞のルシフェラーゼ活性（ｇルシフェラーゼ／ｍｇ蛋白質）を示す。細胞（５×１０４）は血清を含まない培地中１μｇのＤＮＡを含むリポプレックスで処理された。ＮおよびＰは、各々脂質の第一級アミノ基及びＤＮＡホスフェートの当量を示す。
【図８】各種のＮ／Ｐ比を有するＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８、またはＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８−Ｕ２リポプレックスで処理したＣＶ１細胞のルシフェラーゼ活性（ｇルシフェラーゼ／ウェル）を示す。細胞（５×１０４）は血清を含まない培地中１μｇのＤＮＡを含むリポプレックスで処理された。ＮおよびＰは、各々脂質の第一級アミノ基及びＤＮＡホスフェートの当量を示す。
【図９】Ｒ１及びＲ２のいずれもが不飽和アルキル基であるＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８−Ｕ２（ＤＬ−Ｕ２）と、Ｒ１及びＲ２のいずれもが飽和アルキル基であるＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８（ＤＬ−Ｇ１）をそれぞれ用いてＧＦＰ発現プラスミドをCOS7細胞にトランスフェクションした結果を示す１００倍の顕微鏡像である。
【図１０】ＤＬ−Ｕ２とＤＬ−Ｇ１をそれぞれ用いてＧＦＰ発現プラスミドをCOS7細胞にトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性を測定したグラフである。
【図１１】ＤＬ−Ｕ２とＤＬ−Ｇ１をそれぞれ用いてＧＦＰ発現プラスミドをNHDH-ad細胞にトランスフェクションした結果を示す１００倍の顕微鏡像である。
【図１２】ＤＬ−Ｕ２とＤＬ−Ｇ１をそれぞれ用いてＧＦＰ発現プラスミドをNHDH-ad細胞にトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性を測定したグラフである。
【図１３】ＤＬ−Ｕ２と他社製品（LF LTX及びFuGENE HD）をそれぞれ用いてＧＦＰ発現プラスミドを各種細胞にトランスフェクションした結果を示す顕微鏡像である。COS7細胞及びHela-S3細胞については１００倍、並びにK562細胞については２００倍の顕微鏡像を示している。
【図１４】ＤＬ−Ｕ２と他社製品（LF LTX及びFuGENE HD）をそれぞれ用いてＧＦＰ発現プラスミドを各種細胞にトランスフェクションした際における、LF LTXの値を１とするルシフェラーゼ活性値の相対値を示したグラフである。
【図１５】ＤＬ−Ｕ２と他社製品（LF LTX及びFuGENE HD）をそれぞれ用いてＧＦＰ発現プラスミドを各種細胞にトランスフェクションした際における、細胞毒性を評価した結果を示したグラフである。
【図１６】ＤＬ−Ｕ２と他社製品（FuGENE HD、FuGENE 6、及びLF LTX）をそれぞれ用いてＧＦＰ発現プラスミドをNHDH-ad細胞にトランスフェクションした結果を示す顕微鏡像である。COS7細胞及びHela-S3細胞については１００倍、並びにK562細胞については２００倍の顕微鏡像を示している。
【図１７】ＤＬ−Ｕ２と他社製品（FuGENE HD、FuGENE 6、及びLF LTX）をそれぞれ用いてＧＦＰ発現プラスミドをNHDH-ad細胞にトランスフェクションした際における、ルシフェラーゼ活性値を示したグラフである。
【図１８】ＤＬ−Ｕ２と他社製品（FuGENE HD、FuGENE 6、及びLF LTX）をそれぞれ用いてＧＦＰ発現プラスミドをNHDH-ad細胞にトランスフェクションした際における、細胞毒性を評価した結果を示したグラフである。
【図１９】ＤＬ−Ｕ２と他社製品（FuGENE HD、FuGENE 6、及びLF LTX）をそれぞれ用いてＧＦＰ発現プラスミドをNHDH-ad細胞に複数回トランスフェクションした結果を示す顕微鏡像である。全て４０倍の顕微鏡像を示している。
【図２０】ＤＬ−Ｕ２と他社製品（FuGENE HD、FuGENE 6、及びLF LTX）をそれぞれ用いてＧＦＰ発現プラスミドをNHDH-ad細胞に複数回トランスフェクションした際における、細胞毒性を評価した結果を示したグラフである。
【図２１】ＤＬ−Ｕ２を用いてＧＦＰ発現プラスミドを各種細胞にトランスフェクションした結果を示す顕微鏡像である。顕微鏡像の倍率は、A549細胞、COS7細胞、Jurkat細胞、及びBalb3T3細胞については１００倍、並びにその他の細胞については２００倍である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の遺伝子導入剤組成物は、下記式ＤＬ−Ｇ１〜ＤＬ−Ｇ４のいずれかで表される化合物を含む遺伝子導入剤組成物であって
ＤＬ−Ｇ１：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（ＸＨ２）２
ＤＬ−Ｇ２：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（ＸＨ２）２）２
ＤＬ−Ｇ３：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２
ＤＬ−Ｇ４：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２）２
（Ｘは、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ−を示す。）、
上記式中Ｒ１が不飽和長鎖脂肪族基であり、かつＲ２が不飽和長鎖脂肪族基又は飽和長鎖脂肪族基であることを特徴とする遺伝子導入剤組成物である。
【００１１】
１．Ｘについての説明
Ｘは、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ−を表し、その末端のＮは、通常２個の水素原子を有するが、１個の水素原子がロイシン、バリン、イソロイシン、ノルロイシン、フェニルアラニン、チロシンなどの疎水性アミノ酸で置換されていてもよい。
【００１２】
２．Ｒ１及びＲ２についての説明
Ｒ１は不飽和長鎖脂肪族基である。
【００１３】
Ｒ２は不飽和長鎖脂肪族基又は飽和長鎖脂肪族基である。
【００１４】
飽和長鎖脂肪族基、及び不飽和長鎖脂肪族基を総称して長鎖脂肪族基という。
【００１５】
長鎖脂肪族基は、天然由来であってもよく、天然由来のものを修飾したものでもよく、又は人工的に合成されたものであってもよい。
【００１６】
長鎖脂肪族基は、長鎖の鎖状脂肪族基であればよく限定されない。
【００１７】
長鎖脂肪族基の炭素数は、主鎖が長鎖であればよく限定されない。主鎖の炭素数は好ましくは８〜３０であり、より好ましくは１０〜２２であり、さらに好ましくは１２〜２０である。
【００１８】
長鎖脂肪族基は、分岐を有していてもよい。なお、主鎖についてはIUPAC命名法に基づいて、又はそれが困難若しくは不可能な場合はそれに準ずる方法に基づいて決定する。
【００１９】
長鎖脂肪族基は、炭化水素基において少なくとも1つ以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されているものであってもよい。ヘテロ原子とは、酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子からなる群より選択される少なくとも１種以上の原子をいう。長鎖脂肪族基の具体例としては、炭化水素基、酸素含有炭化水素基、窒素含有炭化水素基、及び硫黄含有炭化水素基等が挙げられる。
【００２０】
炭化水素基は、アルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基である。
【００２１】
酸素含有炭化水素基としては、例えば、エーテル結合及びカルボニル結合からなる群より選択される少なくとも１種の結合を有する酸素含有炭化水素基が挙げられる。カルボニル結合を有する酸素含有炭化水素基としては、例えば、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノン、酸塩化物、又は無水物等からなる群より選択される少なくとも１種の構造を有する基が挙げられる。
【００２２】
窒素含有炭化水素基としては、例えばニトリル、アミン、アミド、及びイミドからなる群より選択される少なくとも１種の構造を有する窒素含有炭化水素基が挙げられる。
【００２３】
硫黄含有炭化水素基としては、例えばチオール、チオエーテル、チオアセタール、スルフィド、ジスルフィド、ジチオカルボン酸、チオエステル、チオケトン、チオアルデヒド、チオカルバメート、チオウレタン、ホスフィンスルフィド、チオホスフェート、チオホスホネート、スルホネート、スルホン、及びスルホンアミドからなる群より選択される少なくとも１種の結合を有する硫黄含有炭化水素基が挙げられる。
【００２４】
長鎖脂肪族基は、上に例示したような構造の基においてさらに少なくとも１つ以上の置換基を有していてもよい。置換基としては、疎水性を示すものが好ましい。置換基としては、例えば、フェニル基、コレステリル基、及びピレニル基等が挙げられる。コレステリル基が好ましい。
【００２５】
不飽和長鎖脂肪族基は、不飽和結合を主鎖に有しており、かつ主鎖が鎖状構造を有する脂肪族基であれば好ましい。
【００２６】
不飽和結合の種類は、二重結合であってもよく、又は三重結合であってもよい。二重結合が好ましい。不飽和結合の数は、少なくとも１つ以上であればよく、限定されない。また、二重結合と三重結合の両方を有していてもよい。二重結合を１つ有していることが好ましい。
【００２７】
二重結合としては、シス型二重結合であってもよいし、トランス型二重結合であってもよい。シス型二重結合が好ましい。
【００２８】
不飽和長鎖脂肪族基としては、ヘキサデセニル基、オクタデセニル基、オクタデカジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサペンタエニル基、又はドコサヘキサエニル基が好ましい。
【００２９】
不飽和長鎖脂肪族基としては、9-ヘキサデセニル基、9-オクタデセニル基（オレイル基）、12-オクタデカジエニル基、6,9,12-オクタデカトリエニル基、8,11,14-イコサトリエニル基、5,8,11,14-イコサテトラエニル基、9，12，15−オクタデカトリエニル基、5，8，1１，14，17−イコサペンタエニル基、又は4，7，13，16，19−ドコサヘキサエニル基がより好ましい。
【００３０】
不飽和長鎖脂肪族基としては、9-オクタデセニル基（オレイル基）がさらに好ましい。例えば、Ｒ１が9-オクタデセニル基（オレイル基）であるとき、Ｒ２の例としてはオクタデシル基、又は9-オクタデセニル基（オレイル基）等が挙げられる。
【００３１】
不飽和長鎖脂肪族基の好適例としては、上に好適例として例示したような構造の基においてさらに少なくとも1つ以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されているものであってもよい。
【００３２】
不飽和長鎖脂肪族基の好適例としては、上に好適例として例示したような構造の基を基礎として、酸素含有炭化水素基、窒素含有炭化水素基、又は硫黄含有炭化水素基に特有な構造として上に例示したような構造をさらに有しているものであってもよい。
【００３３】
不飽和長鎖脂肪族基の好適例としては、上に好適例として例示したような構造の基においてさらに少なくとも１つ以上の置換基を有していてもよい。置換基としては、疎水性を示すものが好ましい。置換基としては、例えば、フェニル基、コレステリル基、及びピレニル基等が挙げられる。コレステリル基が好ましい。
【００３４】
３．製法についての説明
本発明のポリアミドアミンデンドロンは、例えば以下のようにして製造することができる。
【００３５】
【化１】
2010128669.tif 000002
【００３６】
４．好ましいポリアミドアミンデンドロンについての説明
本発明の好ましいポリアミドアミンデンドロンを以下に示す。
【００３７】
【化２】
2010128669.tif 000003
【００３８】
５．その他の説明
本発明の遺伝子導入剤組成物は、ポリアミドアミンデンドロンの他に、リン脂質を好適に含むことができる。このようなリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、プラスマロゲンおよびホスファチジン酸等を挙げることができ、これらは１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。このうち、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファリジルコリンをそれぞれ単独で、または組み合わせて用いるのが好ましい。これらのリン脂質の脂肪酸残基は、特に限定されるべきものではないが、炭素数１２から１８の飽和または不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、具体的には、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、オレオイル基、リノレイル基等を挙げることができ、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）が特に好ましい。
【００３９】
リン脂質の配合量は特に限定されないが、リン脂質とポリアミドアミンデンドロンの合計量を１００重量部とした場合にリン脂質３０〜９０重量部、ポリアミドアミンデンドロン７０〜１０重量部、好ましくはリン脂質５０〜８０重量部、ポリアミドアミンデンドロン５０〜２０重量部、より好ましくはリン脂質６０〜７０重量部、ポリアミドアミンデンドロン４０〜３０重量部である。
【００４０】
リン脂質の他に、遺伝子導入剤組成物に含有され得る添加剤としては、コレステロールなどが例示される。
【００４１】
ポリアミドアミンデンドロンを単独で用いる場合、遺伝子と遺伝子導入剤の配合割合は、遺伝子１重量部に対し、遺伝子導入剤を１〜２０重量部、好ましくは３〜１５重量部、より好ましくは５〜７重量部使用する。また、ポリアミドアミンデンドロンとリン脂質の混合物を用いる場合、遺伝子と遺伝子導入剤の配合割合は、遺伝子１重量部に対し、遺伝子導入剤を１〜５０重量部、好ましくは５〜３０重量部、より好ましくは１０〜１５重量部使用する。
【００４２】
遺伝子としては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれでもよく、特に形質転換等のイン・ビトロにおける導入用遺伝子や、イン・ビボで発現することにより作用する遺伝子、例えば、遺伝子治療用遺伝子、実験動物や家畜等の産業用動物の品種改良に用いられる遺伝子が好ましい。遺伝子治療用遺伝子としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、酵素、サイトカイン等の生理活性物質をコードする遺伝子等を挙げることができる。
【００４３】
遺伝子が導入される細胞としては、ヒトなどの動物細胞、植物細胞などの真核細胞、細菌などの原核細胞が例示できる。
【００４４】
本発明の組成物の形態としては、ポリアミドアミンデンドロン（ＤＬ−Ｇ１〜ＤＬ−Ｇ４）のみが存在していてもよく、ポリアミドアミンデンドロンとリン脂質が単に混合物として存在していてもよく、ポリアミドアミンデンドロンとリン脂質とが組み合わさって脂質膜構造体を形成していてもよい。該脂質膜構造体の存在形態およびその製造方法は特に限定されるべきものではないが、例えば、存在形態としては、乾燥した脂質混合物形態、水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態等を挙げることができる。
【００４５】
乾燥した脂質混合物は、例えば、使用する脂質成分をいったんクロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、次いでエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことで製造することができる。
【００４６】
脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態としては、一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定型の層状構造物などを挙げることができる。分散した状態の脂質膜構造体の大きさは、特に限定されるべきものではないが、例えば、リポソームやエマルションの場合には、粒子径が５０ｎｍから数μｍであり、球状ミセルの場合、粒子径が５ｎｍから５０ｎｍである。ひも状ミセルや不定型の層状構造物の場合は、その１層あたりの厚みが５ｎｍから１０ｎｍでこれらが層を形成していると考えればよい。
【００４７】
水系溶媒（分散媒）の組成も特に限定されるべきものではないが、水のほかに、グルコース、乳糖、ショ糖などの糖水溶液、グリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコール水溶液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。この水系溶媒に分散した脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、凝集などの物理的安定性の面から、水系溶媒中の電解質を極力なくすことが重要である。また、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３．０から８．０）に設定したり、窒素バブリングにより溶存酸素を除去することが重要である。さらに凍結乾燥保存や噴霧乾燥保存をする場合には、糖水溶液を、凍結保存する場合には、糖水溶液や多価アルコール水溶液をそれぞれ用いると効果的な保存が可能である。
【００４８】
これらの水系溶媒の添加物の濃度は特に限定されるべきものではないが、例えば、糖水溶液においては、２から２０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、５から１０％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。また、多価アルコール水溶液においては、１から５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、２から２．５％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。緩衝液においては、緩衝剤の濃度が５から５０ｍＭが好ましく、１０から２０ｍＭがさらに好ましい。
【００４９】
水系溶媒中の脂質膜構造体の濃度は、特に限定されるべきものではないが、本発明においては脂質膜構造体として用いるリン脂質の総量の濃度は、０．００１ｍＭから１００ｍＭが好ましく、０．０１ｍＭから２０ｍＭがさらに好ましい。
【００５０】
脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態は、上記の乾燥した脂質混合物を水系溶媒に添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することもでき、特に限定されるべきものではない。脂質膜構造体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルター等を用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。
【００５１】
また、上記の水系溶媒に分散した脂質膜構造体をさらに乾燥させる方法としては、通常の凍結乾燥や噴霧乾燥を挙げることができる。この時の水系溶媒としては、上記したように、糖水溶液、好ましくはショ糖水溶液、乳糖水溶液を用いるとよい。ここで、水系溶媒に分散した脂質膜構造体をいったん製造した上でさらに乾燥すると、脂質膜構造体の長期保存が可能となるほか、この乾燥した脂質膜構造体に遺伝子水溶液を添加すると、効率よく脂質混合物が水和されるために遺伝子自身も効率よく、脂質膜構造体に保持させることができるといったメリットがある。
【００５２】
本発明の遺伝子導入剤は、遺伝子だけでなく、親水性の大きい薬物、高分子量の生理活性ペプチド類、蛋白質などの細胞内に導入されにくい薬物などにも適用できる。本発明の組成物を用いれば、イン・ビトロ及びイン・ビボのいずれにおいても細胞内に遺伝子を効率良く導入することができる。
【００５３】
イン・ビトロでの遺伝子導入は、標的とする細胞を含む懸濁液に本発明の遺伝子含有導入剤組成物を添加したり、本発明の遺伝子含有組成物を含有する培地で標的とする細胞を培養する等の手段により、行うことができる。
【００５４】
イン・ビボでの遺伝子導入は、本発明の遺伝子含有組成物を宿主に投与すればよい。宿主への投与手段としては、経口投与でも、非経口投与でもよいが、非経口投与が好ましい。剤形としては、通常知られたものでよく、経口投与の剤形としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等を挙げることができる。また、非経口投与の剤形としては、例えば、注射剤、点眼剤、軟膏剤、坐剤等を挙げることができる。中でも、注射剤が好ましく、投与方法としては、静脈注射、標的とする細胞や臓器に対しての局所注射が好ましい。
【実施例】
【００５５】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の例にのみ限定されるものではない。【００５６】
なお、以下の実施例において、「リポプレックス」とは本発明のポリアミドアミンデンドロンとＤＮＡの複合体を意味する。【００５７】
実施例１．本発明の遺伝子導入剤組成物の合成
１．ポリアミドアミンデンドロンの合成
（１）オレイルオレオイルアミド（Oleyloleoylamide）の合成
Oleoylchloride 7.78ml(20.0×10-3mol)をジクロロメタン100mlに溶解して、十分にN2ガス置換した。反応容器を氷水浴で冷やし、撹拌しながら、これにジクロロメタン50ml にOleylamine 9.40ml(20.0×10-3mol)、トリエチルアミン3.3ml(0.024mol)を溶解したものを滴下ロートを用いてゆっくりと滴下した。その後、室温で70時間、N2ガス注入下で攪拌した。反応終了後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した。得られた粗生成物をオープンカラムクロマトグラフィーにより分離精製した（展開溶媒:クロロホルム/酢酸エチル＝2/1、充填材：シリカゲル）。得られた粗結晶を、エタノールを用いて-20℃で再結晶した。白色の固体として得られた生成物を、常温で減圧乾燥した。【００５８】
生成物の1H NMR spectrum (400MHz, CDCl3)を図１に示す。生成物の収量は7.53gであり、収率は70.7％であった。【００５９】
この生成物はオレイルオレオイルアミド（Oleyloleoylamide）（化３）であった。【００６０】
【化３】
2010128669.tif 000004
【００６１】
（２）ジオレイルアミン（Dioleylamine）の合成
Oleyloleoylamide（化４）2.84g(5.33×10-3mol)をテトラヒドロフラン(THF) 80mlに溶解した。これを、THF 80mlにリチウムアルミニウムヒドリド(LAH) 1.40g(37.0×10-3mol)を少しずつ加え作成した懸濁液に滴下ロートを用いてゆっくりと滴下した。その後、50℃で８日間攪拌した。反応終了後、吸引濾過して濾別したLAHを、THFで1回、クロロホルムで２回、エタノールで1回洗浄した。再びLAHを濾別し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した。その後、飽和食塩水で３回洗浄後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。得られた粗生成物をオープンカラムクロマトグラフィーにより分離精製した（展開溶媒：クロロホルム/酢酸エチル＝2/1→クロロホルム/メタノール＝9/1、充填材：シリカゲル）。黄色の油状物質として得られた生成物を、常温で減圧乾燥した。常温で減圧乾燥した。【００６２】
生成物の1H NMR spectrum (400MHz, CDCl3)を図２に示す。生成物の収量は1.59gであり、収率は58.2％であった。【００６３】
この生成物はジオレイルアミン（Dioleylamine）（化４）であった。【００６４】
【化４】
2010128669.tif 000005
【００６５】
（３）ＤＬ−Ｇ−０．５−２Ｃ１８−Ｕ２の追合成
Dioleylamine 1.59g(3.07×10-3mol)をアクリル酸メチル28ml(0.31mol)に溶解して、70℃で、N2ガス注入下で攪拌した。TLCより反応があまり進んでいないことを確認したため、反応開始後48時間、136時間でアクリル酸メチルを14mlずつ追加した（合計56ml）。反応終了後（168時間）、ロータリーエバポレーターを用いて未反応のアクリル酸メチルを留去し、得られた粗生成物をオープンカラムクロマトグラフィーにより分離精製した（展開溶媒：クロロホルム/酢酸エチル＝2/1、充填材：シリカゲル）。黄色の油状物質として得られた生成物を、常温で減圧乾燥した。【００６６】
生成物の1H NMR spectrum (400MHz, CDCl3)を図３に示す。生成物の収量は1.42gであり、収率は76.6％であった。【００６７】
この生成物（化５）をＤＬ−Ｇ−０．５−２Ｃ１８−Ｕ２と名付けた。【００６８】
【化５】
2010128669.tif 000006
【００６９】
（４）ＤＬ−Ｇ０−２Ｃ１８−Ｕ２の合成
ＤＬ−Ｇ−０．５−２Ｃ１８−Ｕ２1.42g(2.35×10-3mol)をメタノール100mlに加熱溶解した。これをシアン化ナトリウム 25.4mg(0.52×10-3mol)を含む、蒸留精製したエチレンジアミン70ml(1.05mol)にパスツールピペットを用いてゆっくりと滴下した。その後、70℃で７日間、N2ガス注入下で攪拌した。反応終了後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒、未反応のエチレンジアミンを留去し、得られた粗生成物をオープンカラムクロマトグラフィーにより分離精製した（展開溶媒：クロロホルム/メタノール/水＝60/35/5、充填材：シリカゲル）。黄色のペースト状物質として得られた生成物を、常温で減圧乾燥した。【００７０】
生成物の1H NMR spectrum (400MHz, CDCl3)を図４に示す。生成物の収量は0.45gであり、収率は30.3％であった。【００７１】
この生成物（化６）をＤＬ−Ｇ０−２Ｃ１８−Ｕ２と名付けた。【００７２】
【化６】
2010128669.tif 000007
【００７３】
（５）ＤＬ−Ｇ０．５−２Ｃ１８−Ｕ２の合成
DL-G0-2C18 0.45g(0.71×10-3mol)をメタノール45mlに加熱溶解した。これをアクリル酸メチル30ml(0.33mol)にパスツールピペットを用いてゆっくりと滴下した。その後、45℃で48時間、N2ガス注入下で還流した。反応終了後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒、未反応のアクリル酸メチルを留去し、得られた粗生成物をオープンカラムクロマトグラフィーにより分離精製した（展開溶媒：石油エーテル／酢酸エチル＝10/3→クロロホルム／メタノール＝4/1、充填材：シリカゲル）。黄色の油状物質として得られた生成物を、常温で減圧乾燥した。【００７４】
生成物の1H NMR spectrum (400MHz, CDCl3)を図５に示す。生成物の収量は0.45gであり、収率は78.8％であった。【００７５】
この生成物（化７）をＤＬ−Ｇ０．５−２Ｃ１８−Ｕ２と名付けた。【００７６】
【化７】
2010128669.tif 000008
【００７７】
（６）ＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８−Ｕ２の合成
DL-G0.5-2C18 0.45g(0.56×10-3mol)をメタノール13mlに加熱溶解した。これをシアン化ナトリウム 12.0mg(0.25×10-3mol)を含む、蒸留精製したエチレンジアミン24ml(0.36mol)にパスツールピペットを用いてゆっくりと滴下した。その後、50℃で45時間、N2ガス注入下で攪拌した。反応終了後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒、未反応のエチレンジアミンを留去した。黄色の固体として得られた生成物を常温で減圧乾燥した。塩酸によってプロトン化し、蒸留水に溶解させた後、3日間透析することで未反応のエチレンジアミン等を除去し、凍結乾燥して黄色の粉末状固体を得た。【００７８】
生成物の1H NMR spectrum (400MHz, CDCl3)を図６に示す。生成物の収量は0.29gであり、収率は60.2％であった。【００７９】
この生成物（化８）をＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８−Ｕ２と名付けた。【００８０】
【化８】
2010128669.tif 000009
【００８１】
２．リポプレックスの調製
（１）ポリアミドアミンデンドロンとプラスミドＤＮＡとのリポプレックスの調製
実施例１で得たＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８−Ｕ２のクロロホルム溶液からロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去して、脂質薄膜を形成させた。これにＰＢＳを加え、バス型超音波照射装置を用いて超音波を２分間照射し、脂質分散液を調製した。次に、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌのプラスミドＤＮＡ溶液（１μｇ／５０μｌ）と種々の濃度の脂質分散液（５０μｌ）を加えて混合し、室温で１０分間インキュベーションして、リポプレックスを得た。【００８２】
（２）ＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８−Ｕ２、ＤＯＰＥ、プラスミドからなるリポプレックスの調製
ＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８−Ｕ２と種々の量のＤＯＰＥからなる混合薄膜に、ＰＢＳ ０．５ｍｌを加え、バス型超音波照射装置を用いて超音波を２分間照射し、混合脂質分散液を調製した。２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌのプラスミドＤＮＡ溶液（１μｇ／５０μｌ）に混合脂質分散液を種々のＮ／Ｐ（ＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８−Ｕ２の１級アミノ基／ＤＮＡのリン酸エステル、モル／モル）比に混合し、室温で１０分インキュベーションしてリポプレックスを調製した。【００８３】
比較例１．ポリアミドアミンデンドロンのＲ１及びＲ２がいずれも飽和アルキル基である遺伝子導入剤の合成
次の通りＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８を合成した。【００８４】
（１）ＤＬ−Ｇ−０．５−２Ｃ１８の合成
Dioctadecylamine(2.0g、3.8 mmol)をアクリル酸メチル(35ml、0.39 mol)に溶解（60-70℃に加熱すると溶解）し、窒素雰囲気で還流(80℃)した。18時間後、エバポレーターで未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカ（展開溶媒：石油エーテル/ジエチルエーテル＝2/1）により精製した。生成物の収量は2.0gであり、収率は87.9%であった。【００８５】
（２）ＤＬ−Ｇ０−２Ｃ１８の合成
ＤＬ−Ｇ−０．５ (2.0g、3.4 mmol)をメタノール(40ml)に溶解した。(加熱によって溶ける）これをシアン化ナトリウム(33mg、0.67 mmol)を含む蒸留して精製したエチレンジアミン(70ml、1.05mol)に滴下して加え、窒素雰囲気下、50℃で7日間撹拌した。その後、シリカ（展開溶媒：クロロホルム/メタノール/水＝60/35/5）により精製した。生成物の収量は1.4gであり、収率は53.2%であった。【００８６】
（３）ＤＬ−Ｇ０．５−２Ｃ１８の合成
ＤＬ−Ｇ−０(1.2g、1.9 mmol)をメタノール(20ml)に溶解した。これをアクリル酸メチル(34ml、0.38 mol)に滴下して加え、窒素雰囲気下、35℃で50時間撹拌した。その後、シリカ（展開溶媒：石油エーテル/ジエチルエーテル＝2/1、のちクロロホルム/メタノール＝9/1）により精製した。生成物の収量は1.5gであり、収率は97.7%であった。【００８７】
（４）ＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８の合成
ＤＬ−Ｇ−０．５(1.5g、1.8 mmol)をメタノール(50ml)に溶解した。これをシアン化ナトリウム(18mg、0.37 mmol)を含む蒸留して精製したエチレンジアミン(65ml、0.92mol)に滴下して加え、窒素雰囲気下、45℃で60時間撹拌した。その後、LH-20（溶離液：クロロホルム）により精製した。生成物の収量は1.5gであり、収率は94.3%であった。【００８８】
実施例２．遺伝子導入（１）
１．方法
（１）遺伝子導入
ヒト子宮頸がん由来HeLa細胞を２４穴ディッシュ１穴当たり５．０×１０４個になるように撒き、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭメディウム０．５ｍｌ中、３７℃で一晩培養した。その後、０．３６ｍＭ ＣａＣｌ２と０．４２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＰＢＳ（ＰＢＳ（＋））で２回洗浄した後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭメディウム０．５ｍｌを加え、１穴当たり１マイクログラムのプラスミドＤＮＡを含むリポプレックス（100マイクロリットル）を細胞に加え、３７℃で４時間インキュベーションした。その後ＰＢＳ（＋）で３回洗浄して、細胞に取り込まれていないリポプレックスを除去し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭメディウム１ｍｌを加え３７℃で４０時間培養した。【００８９】
（２）ルシフェラーゼアッセイによる遺伝子導入の評価
リポプレックスと処理し、４０時間培養した後、ＰＢＳ（＋）で２回洗浄し、さらにＰＢＳ（−）で１回洗浄した後、１穴当たり５０μｌの細胞溶解剤を加えて細胞を溶かし、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、その上澄みを回収した。得られた細胞溶解液のルシフェラーゼ活性及びタンパク量を、シフェラーゼアッセイおよびCoomassie（Bradford）Protein Assay Kit（PIERCE） により行った。なお、ルシフェラーゼアッセイは、トリシン（358 mg）、および(MgCO3)4Mg(OH)2・5H2O（69.3 mg）を蒸留水に溶かし、さらにMgSO4（32.1 mg）、EDTA（3.7 mg）、DTT（513.6 mg）、CoA（20.7 mg）、ATP（29.2mg）、NaCl（800 mg）、KCl（20mg）、Na2HPO4（60 mg）、KH2PO4（19 mg）を加え溶解させた後、全量を99 mlにし、この溶液（9.9 ml）に、47 mM ルシフェリン（0.1 ml）を加えてたものを発光基質液として用い、この発光基質溶液（20 μl）を、ルシフェリン（13.5 μg）を含んだ発光基質液（95 μl）、及び5 mg / ml アルブミン溶液（5 ml）と混合し、ルミノメーターLumat LB9507（ベルトールドジャパン）を使って20秒間の発光量を測定することにより行った。【００９０】
２．結果
図７及び８に示されるように、本発明の遺伝子導入剤（Ｇ１−Ｕ２）は、ポリアミドアミンデンドロンのＲ１及びＲ２がいずれも飽和アルキル基である遺伝子導入剤（Ｇ１）に比べて２倍を上回る非常に高い遺伝子導入効率を発現することが明らかになった。これは予想を遙かに超える遺伝子導入効率であった。【００９１】
このような予想外に高い遺伝子導入効率がもたらされた原因について考察すると、その原因の一つとしては、飽和のアルキル鎖に比べて不飽和アルキル鎖は運動性が高いために、細胞膜に挿入されやすいことが挙げられる。しかしながら、この高い遺伝子導入効率は細胞膜への挿入という機構だけでとても説明のつくものではないと考えられる。驚くべきことに、さらに不飽和アルキル基の高い運動性は細胞膜を攪乱して膜融合を強く誘起し、エンドソーム膜との相互作用を増強することにつながっており、この機構によりさらに効果的に遺伝子がエンドソームからサイトゾルに移行されていることが予想される。【００９２】
これに加えて、高い運動性を有する不飽和アルキル基は飽和のアルキル鎖に比べて細胞膜の流動性を大きく損ねないことが期待されるため、これを用いた本発明の遺伝子導入剤は細胞毒性がより低減されているという予想外の効果をも有する。【００９３】
実施例３．遺伝子導入（２）
実施例１で得た、Ｒ１及びＲ２のいずれもが不飽和アルキル基であるＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８−Ｕ２（ＤＬ−Ｕ２）と、Ｒ１及びＲ２のいずれもが飽和アルキル基であるＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８（ＤＬ−Ｇ１）との比較を次の通り行った。【００９４】
遺伝子導入プラスミドとして、緑色蛍光タンパク質を発現するｐＥＧＦＰ−Ｃ１を用い、標的細胞としてはCOS-7を用いた。ＤＬ−Ｕ２又はＤＬ−Ｇ１を用いてリポプレックスをそれぞれ作成し、遺伝子導入を行った。【００９５】
具体的には次の通り行った。【００９６】
１．方法
（１）リポプレックスの調製
緑色蛍光タンパク質を発現するプラスミドDNAであるpEGFP-C1を用いて、以下の手順でリポプレックスを作製した。
ポリアミドアミンデンドロン（DL-G1、DL-G1-U2）のクロロホルム溶液（1mg/ml）からロータリーエバポレータを用いて溶媒を除去して脂質薄膜111.5μgを形成させた。この薄膜を2時間真空乾燥させた後、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）500μlを加えた。さらにバス型超音波照射装置を用いて超音波を2分間照射し、脂質分散液160μlを得た。それぞれの脂質分散液に、プラスミドDNAを20 mM Tris-HCl緩衝液に溶解させた溶液（20μg/ml、160μl）を様々なN/P比となるように加えて混合し、室温で30分インキュベートすることによりリポプレックスを得た。【００９７】
（２）GFPの発現
前日
COS7細胞を24ウェルプレートに播種した。
(COS7細胞：2.0×104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
当日
(i) 20mM Tris-HCl（pH7.4）バッファーに、2.0μg のプラスミドDNA(pCAG-GFP) を添加し、2.0μg/100μl となるように調製した。
(ii) (i)で調製した100μl のプラスミドDNA 溶液に、50μl のDL-G1, DL-U2リポソーム溶液（N/P比=4）を加え、ボルテックスでよく混合し、室温で30 分間インキュベートした。
(iii) さらに50μl のOpti-MEM（登録商標） I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(iv) 1 ウェルあたり20、50、又は100 μl のDL- プラスミドDNA 複合体溶液を加え、均一になるようプレートを揺らして混合した。
(v) 37℃、5%CO2 下、細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した。
(vi) 48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてＧＦＰ発現細胞を観察した（100倍観察）。【００９８】
（３）ルシフェラーゼ活性測定
前日
COS7細胞を24ウェルプレートに播種した。
(COS7細胞：2.0×104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
当日
(i) 20mM Tris-HCl（pH7.4）バッファーを、3本のチューブにそれぞれ363μl(NP比=2 用）、288μl(NP比=4 用)、又は138μl(NP比=8 用)分注した。
(ii) 6.0μg のプラスミドDNA(pEGFP-luc+) を(i)で用意した3本のチューブにそれぞれ12μl(6.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) DL-G1, DL-U2リポソーム溶液を(ii)で調整した3本のチューブにそれぞれ75μl(N/P比=2)、150μl(N/P比=4)、又は300μl(N/P比=8)添加した。
(iv) さらに150μl のOpti-MEM（登録商標） I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置。
(v) 1 ウェルあたり20, 50, 100 μl のDL- プラスミドDNA 複合体溶液を各々3ウェルに加え、混合した。
(vi) 37℃、5%CO2 下で細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した。
(vii) 24時間後、luciferase assay system(Promega, E1501 )のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した。【００９９】
２．結果
結果を図９（ＧＦＰ発現）及び１０（ルシフェラーゼ活性測定）に示す。【０１００】
実施例４．遺伝子導入（３）
実施例１で得た、ＤＬ−Ｕ２とＤＬ−Ｇ１との比較を次の通り行った。【０１０１】
遺伝子導入プラスミドとして、緑色蛍光タンパク質を発現するｐＥＧＦＰ−Ｃ１を用い、標的細胞としてはNHDH-adを用いた。ＤＬ−Ｕ２又はＤＬ−Ｇ１を用いてリポプレックスをそれぞれ作成し、遺伝子導入を行った。【０１０２】
具体的には次の通り行った。
リポプレックスの調製は実施例３と同様に行った。【０１０３】
１．方法
（１）GFPの発現
前日
NHDF-ad細胞を24ウェルプレートに播種した。
(NHDF-ad細胞：2.5×104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
当日
(i) 20mM Tris-HCl（pH7.4）バッファーを、2本のチューブにそれぞれ56.3μl(NP比=3 用）,37.5μl(NP比=6 用), 138μl(NP比=8 用) 分注した。
(ii) 1.0μg のプラスミドDNA(pCAG-GFP) を(i)で用意した2本のチューブにそれぞれ2μl(1.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) 調製したプラスミドDNA 溶液に、18.7μl のDL-G1(N/P比=3), 37.5μlのDL-U2リポソーム溶液（N/P比=6）をそれぞれ加え、ボルテックスでよく混合し、室温で30 分間インキュベートした。
(iv) さらに25μl のOpti-MEM（登録商標） I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(v) 1 ウェルあたり50μl のDL- プラスミドDNA 複合体溶液を加え、均一になるようプレートを揺らして混合した。
(vi) 37℃、5%CO2 下、細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した。
(vii) 48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてＧＦＰ発現細胞を観察した（100倍観察）。【０１０４】
（２）ルシフェラーゼ活性測定
前日
NHDF-ad細胞を24ウェルプレートに播種した。
(NHDF-ad細胞：2.5×104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
当日
(i) 20mM Tris-HCl（pH7.4）バッファーを、3本のチューブにそれぞれ363μl(NP比=2 用）,288μl(NP比=4 用), 138μl(NP比=8 用) 分注した。
(ii) 6.0μg のプラスミドDNA(pEGFP-luc+) を(i)で用意した3本のチューブにそれぞれ12μl(6.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) DL-G1, DL-U2リポソーム溶液を(ii)で調整した3本のチューブにそれぞれ75μl(N/P比=2), 150μl(N/P比=4), 300μl(N/P比=8)添加した。
(iv) さらに150μl のOpti-MEM（登録商標） I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(v) 1 ウェルあたり20, 50, 100 μl のDL- プラスミドDNA 複合体溶液を各々3ウェルに加え、混合した。
(vi) 37℃、5%CO2 下で細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した。
(vii) 48時間後、luciferase assay system(Promega, E1501 )のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した。【０１０５】
２．結果
結果を図１１（ＧＦＰ発現）及び１２（ルシフェラーゼ活性測定）に示す。【０１０６】
従来型の飽和アルキル基（2C18)を有するポリアミドアミンデンドロン（ＤＬ-Ｇ１)を用いた場合、１０〜２０％の細胞においてＧＦＰの発現が観察されたのに対して、本発明の不飽和型アルキル基（ジオレイル）を有するポリアミドアミンデンドロン（ＤＬ−Ｇ１-Ｕ２)を用いた場合、７０〜８０％の細胞でＧＦＰの発現が観察された。また、細胞が発現しているＧＦＰの蛍光強度は、ＤＬ−−Ｇ１-Ｕ２で処理した細胞におけるもののほうが従来型ＤＬ-Ｇ１におけるものよりも１０倍程度強いことがフローサイトメトリーの結果から分かった。これらの結果から、従来の飽和アルキル鎖型ポリアミドアミンデンドロンに比べて、本発明の不飽和型ポリアミドアミンデンドロンは格段に高い遺伝子導入活性を有することが分かった。【０１０７】
なお、成人ヒト由来正常上皮細胞であるNHDF-ad細胞は、iPS細胞を作製する際にも利用される。従来の飽和型ポリアミドアミンデンドロンを用いてもNHDF-ad細胞に対して遺伝子を導入することができなかったが、本発明の不飽和型ポリアミドアミンデンドロンを用いると遺伝子を導入することができた。【０１０８】
実施例５．遺伝子導入（４）
実施例１で得たＤＬ−Ｕ２と市販の遺伝子導入剤との比較を次の通り行った。【０１０９】
遺伝子導入プラスミドとして、緑色蛍光タンパク質を発現するｐＥＧＦＰ−Ｃ１を用い、標的細胞としては株化細胞として接着性細胞であるCOS-7、及びHela-S3、並びに浮遊性細胞であるK562を用いた。ＤＬ−Ｕ２を用いてリポプレックスをそれぞれ作成し、遺伝子導入を行った。【０１１０】
具体的には次の通り行った。
リポプレックスの調製は実施例３と同様に行った。【０１１１】
１．方法
（１）GFPの発現
前日
COS7細胞、HeLa-S3を24ウェルプレートに播種した。
(COS7細胞：2.0×104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
(HeLa-S3細胞：3× 10４ cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
当日
K562細胞を24ウェルプレートに播種した。
（1× 105 cell / ウェル・RPMI1640+10%FBS(Pe/St) 500μl）
(i) 20mM Tris-HCl（pH7.4）バッファーを、3本のチューブにそれぞれ35..5μl(NP比=6 用）×2本, 23μl(NP比=8 用) 分注した。
(ii) 1.0μg のプラスミドDNA(pCAG-GFP) を(i)で用意した3本のチューブにそれぞれ2μl(1.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) DL-U2リポソーム溶液を(ii)で調整した3本のチューブにそれぞれ37.5μl(N/P比=6)×2本, 50μl(N/P比=8)添加した。
(iv) さらに25μl のOpti-MEM（登録商標） I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(v) COS7細胞に、100μlのDL- プラスミドDNA 複合体溶液(N/P比=6)を加え、混合した。
HeL-S3細胞に、100μlのDL- プラスミドDNA 複合体溶液(N/P比=6)を加え、混合した。
K562細胞に、50μlのDL- プラスミドDNA 複合体溶液(N/P比=8)を加え、混合した。
(vi) 37℃、5%CO2 下で細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した (K562細胞は培地交換しなかった)。
(vii) 48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてＧＦＰ発現細胞を観察した。
・Lipofectamine LTX : プロトコールに従い遺伝子導入し、48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてＧＦＰ発現細胞を観察した。
DNA量  COS7 :1.0μg, HeLa-S3 :1.0μg, K562 :0.5μg 
・FuGENE HD : プロトコールに従い遺伝子導入し、48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてＧＦＰ発現細胞を観察した。
DNA量  COS7 :1.0μg, HeLa-S3 :1.0μg, K562 :0.5μg 【０１１２】
（２）ルシフェラーゼ活性測定
前日
COS7細胞、HeLa-S3を24ウェルプレートに播種した。
(COS7細胞：2.0×104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
(HeLa-S3細胞：3× 10４ cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
当日
K562細胞を24ウェルプレートに播種した。
（1× 105 cell / ウェル・RPMI1640+10%FBS(Pe/St) 500μl）
(i) 20mM Tris-HCl（pH7.4）バッファーを、3本のチューブにそれぞれ144μl(NP比=4 用） 分注した。
(ii) 3.0μg のプラスミドDNA(pEGFP-luc+) を(i)で用意した3本のチューブにそれぞれ6μl(3.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) DL-U2リポソーム溶液を(ii)で調整した3本のチューブにそれぞれ75μl(N/P比=4)×3本 添加した。
(iv) さらに75μl のOpti-MEM（登録商標） I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(v) COS7細胞に、50μlのDL- プラスミドDNA 複合体溶液を各々3ウェルに加え、混合した。
HeL-S3細胞に、50μlのDL- プラスミドDNA 複合体溶液を各々3ウェルに加え、混合した。
K562細胞に、100μlのDL- プラスミドDNA 複合体溶液を各々3ウェルに加え、混合した。
(vi) 37℃、5%CO2 下で細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した(K562細胞は培地交換しなかった)。
(vii) 48時間後、luciferase assay system(Promega, E1501 )のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した(LTXの活性を1とした相対値をグラフ化した)。
・Lipofectamine LTX : プロトコールに従い3ウェルに遺伝子導入し、48時間後、luciferase assay system(Promega, E1501 )のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
DNA量  COS7 :0.2μg, HeLa-S3 :0.2μg, K562 :1.0μg 
・FuGENE HD : プロトコールに従い3ウェルに遺伝子導入し、48時間後、luciferase assay system(Promega, E1501 )のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した。 
DNA量  COS7 :0.5μg, HeLa-S3 :0.5μg, K562 :1.0μg 【０１１３】
２．結果
結果を図１３（ＧＦＰ発現）、１４（ルシフェラーゼ活性測定）、及び１５（毒性評価）に示す。
現在よく使用されている市販の遺伝子導入剤であるリポフェクタミンＬＴＸ、及びFuGENE HDと本発明のポリアミドアミンデンドロンとの間で遺伝子導入活性の比較を行ったところ、接着性細胞（COS-7及びHeLa-S3)、並びに浮遊性細胞（K562)のいずれに対しても、本発明のポリアミドアミンデンドロンはより優れた遺伝子導入活性を示し、かつより細胞毒性が低かった。【０１１４】
実施例６．遺伝子導入（５）
実施例１で得たＤＬ−Ｕ２と市販の遺伝子導入剤との比較を次の通り行った。【０１１５】
遺伝子導入プラスミドとして、緑色蛍光タンパク質を発現するｐＥＧＦＰ−Ｃ１を用い、標的細胞としてはiPS細胞の作製にも利用されている成人ヒト由来正常上皮細胞NHDF-adを用いた。ＤＬ−Ｕ２を用いてリポプレックスをそれぞれ作成し、遺伝子導入を行った。【０１１６】
具体的には次の通り行った。
リポプレックスの調製は実施例３と同様に行った。【０１１７】
１．方法
（１）GFPの発現
前日
NHDF-ad細胞を24ウェルプレートに播種した。
(NHDF-ad細胞：2.5×104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
当日
(i) 20mM Tris-HCl（pH7.4）バッファーを、2本のチューブにそれぞれ56.3μl(NP比=3 用）,37.5μl(NP比=6 用), 138μl(NP比=8 用) 分注した。
(ii) 1.0μg のプラスミドDNA(pCAG-GFP) を(i)で用意した2本のチューブにそれぞれ2μl(1.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) 調製したプラスミドDNA 溶液に、18.7μl のDL-G1(N/P比=3), 37.5μlのDL-U2リポソーム溶液（N/P比=6）をそれぞれ加え、ボルテックスでよく混合し、室温で30 分間インキュベートした。
(iv) さらに25μl のOpti-MEM(R) I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(v) 1 ウェルあたり50μl のDL- プラスミドDNA 複合体溶液を加え、均一になるようプレートを揺らして混合した。
(vi) 37℃、5%CO2 下、細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した。
(vii) 48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてＧＦＰ発現細胞を観察した（100倍観察）。
・Lipofectamine LTX : プロトコールに従い遺伝子導入し、48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてＧＦＰ発現細胞を観察した。
（100倍観察）
DNA量  0.2μg  
・FuGENE HD : プロトコールに従い遺伝子導入し、48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてＧＦＰ発現細胞を観察した。
（100倍観察）
DNA量  0.2μg  
・FuGENE6 : プロトコールに従い遺伝子導入し、48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてＧＦＰ発現細胞を観察した。
（100倍観察）
DNA量  1.0μg【０１１８】
（２）ルシフェラーゼ活性測定
前日
NHDF-ad細胞を24ウェルプレートに播種した。
(NHDF-ad細胞：2.5×104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
当日
(i) 20mM Tris-HCl（pH7.4）バッファーを、2本のチューブにそれぞれ162.75μl(DL-G1用）,106.5μl(DL-U2用) 分注した。
(ii) 3.0μg のプラスミドDNA(pEGFP-luc+) を(i)で用意した3本のチューブにそれぞれ6μl(3.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) 調製したプラスミドDNA 溶液に112.5μlのDL-U2リポソーム溶液（N/P比=6）を加え、ボルテックスでよく混合し、室温で30 分間インキュベートした。
(iv) さらに75μl のOpti-MEM(R) I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(v) 1 ウェルあたり20, 50μl のDL- プラスミドDNA 複合体溶液を各々3ウェルに加え、混合した。
(vi) 37℃、5%CO2 下で細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した。
(vii) 48時間後、luciferase assay system(Promega, E1501 )のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
・Lipofectamine LTX : プロトコールに従い遺伝子導入し、luciferase assay system(Promega, E1501 )のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
DNA量  0.2μg, 0.5μg  
・FuGENE HD : プロトコールに従い遺伝子導入し、 luciferase assay system(Promega, E1501 )のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
DNA量  0.2μg, 0.5μg 
・FuGENE6 : プロトコールに従い遺伝子導入し、 luciferase assay system(Promega, E1501 )のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
DNA量  0.2μg, 0.5μg  【０１１９】
（３）毒性評価
前日
NHDF-ad細胞を96ウェルプレートに播種した。
(NHDF-ad細胞：3.5×103 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 70μl)
当日
(i) 20mM Tris-HCl（pH7.4）バッファーを、2本のチューブにそれぞれ54.25μl(DL-G1用）,35.5μl(DL-U2用) 分注した。
(ii) 1.0μg のプラスミドDNA(pEGFP-luc+) を(i)で用意した2本のチューブにそれぞれ2μl(1.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) 調製したプラスミドDNA 溶液に37.5μlのDL-U2リポソーム溶液（N/P比=6）を加え、ボルテックスでよく混合し、室温で30 分間インキュベートした。
(iv) さらに25μl のOpti-MEM(R) I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(v) 1 ウェルあたり2.8, 7.0μl のDL- プラスミドDNA 複合体溶液を各々3ウェルに加え、混合した（添加量は、ルシフェラーゼ活性測定の添加量のスケールの1/7）。
(vi) 37℃、5%CO2 下で細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した。
(vii) 48時間後、WST-8キット(キシダ化学）のプロトコールに従い、毒性評価を行った (未添加のウェルを100%とした) 。
・Lipofectamine LTX : プロトコールに従い遺伝子導入し、 WST-8キット(キシダ化学）のプロトコールに従い、毒性評価を行った (未添加のウェルを100%とした)。【０１２０】
添加量は、ルシフェラーゼ活性測定の添加量のスケールの1/7。
・FuGENE HD : プロトコールに従い遺伝子導入し、 WST-8キット(キシダ化学）のプロトコールに従い、毒性評価を行った (未添加のウェルを100%とした)。【０１２１】
添加量は、ルシフェラーゼ活性測定の添加量のスケールの1/7。
・FuGENE6 : プロトコールに従い遺伝子導入し、 WST-8キット(キシダ化学）のプロトコールに従い、毒性評価を行った (未添加のウェルを100%とした)。【０１２２】
添加量は、ルシフェラーゼ活性測定の添加量のスケールの1/7。【０１２３】
４．結果
結果を図１６（ＧＦＰ発現）、１７（ルシフェラーゼ活性測定）、及び１８（毒性評価）に示す。
成人ヒト由来正常上皮細胞に対しては、市販導入剤を用いてもＧＦＰ遺伝子をほとんど導入できなかったのに対して、本発明のポリアミドアミンデンドロンを用いると顕著に高い頻度で導入できることがわかった。【０１２４】
成人ヒト由来正常上皮細胞へＧＦＰ遺伝子導入を行った際の細胞毒性を、市販導入剤と比較したところ、本発明のポリアミドアミンデンドロンはほとんどのものより低毒性であった。市販導入剤のうちFuGENE6は比較的低毒性であったが、遺伝子導入活性はきわめて低いものであった。高い遺伝子導入効率と低い細胞毒性とを両立させることができるという点において、本発明のポリアミドアミンデンドロンが市販のものと比較しても特に優れていることが分かった。【０１２５】
実施例７．遺伝子導入（６）
実施例１で得た、ＤＬ−Ｕ２と市販の遺伝子導入剤との比較を次の通り行った。【０１２６】
遺伝子導入プラスミドとして、緑色蛍光タンパク質を発現するｐＥＧＦＰ−Ｃ１を用い、標的細胞としてはiPS細胞の作製にも利用されている成人ヒト由来正常上皮細胞NHDF-adを用いた。ＤＬ−Ｕ２を用いてリポプレックスをそれぞれ作成し、遺伝子導入を複数回行った。【０１２７】
具体的には次の通り行った。
リポプレックスの調製は実施例３と同様に行った。【０１２８】
１．方法
（１）GFPの発現
前日
NHDF-ad細胞を24ウェルプレートに播種した。
(NHDF-ad細胞：2×104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
一日目
(i) 20mM Tris-HCl（pH7.4）バッファーをチューブに71μl(NP比=6 用)分注した。
(ii) 2.0μg のプラスミドDNA(pCAG-GFP) を(i)で用意した2本のチューブにそれぞれ4μl(2.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) 調製したプラスミドDNA 溶液に、75μlのDL-U2リポソーム溶液（N/P比=6）を加え、ボルテックスでよく混合し、室温で30 分間インキュベートした。
(iv) さらに50μl のOpti-MEM(R) I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(v) 1 ウェルあたり100μlのDL- プラスミドDNA 複合体溶液を各々1ウェルに加え、均一になるようプレートを揺らして混合した。
(vi) 37℃、5%CO2 下、細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した。
1dayに遺伝子導入操作を行った細胞について、3day, ,5dayも同様の遺伝子導入を行った。
7day   蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてＧＦＰ発現細胞を観察した（40倍観察）。
・Lipofectamine LTX : 1day, 3day, 5dayに、同一細胞についてプロトコールに従い遺伝子導入し、7dayに蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてＧＦＰ発現細胞を観察した。
（100倍観察）
DNA量  1.0μg 
・FuGENE HD : 1day, 3day, 5dayに、同一細胞についてプロトコールに従い遺伝子導入し、7dayに蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてＧＦＰ発現細胞を観察した。
（100倍観察）
DNA量  1.0μg 
・FuGENE6 : 1day, 3day, 5dayに、同一細胞についてプロトコールに従い遺伝子導入し、7dayに蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてＧＦＰ発現細胞を観察した。
（100倍観察）
DNA量  1.0μg 【０１２９】
（２）毒性評価
前日
NHDF-ad細胞を96ウェルプレートに播種した。
(NHDF-ad細胞： 3.5×103  cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 70μl)
一日目
(i) 20mM Tris-HCl（pH7.4）バッファーをチューブに35.5μl(NP比=6 用)分注した。
(ii) 1.0μg のプラスミドDNA(pCAG-GFP) を(i)で用意した2本のチューブにそれぞれ2μl(1.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) 調製したプラスミドDNA 溶液に、37.5μlのDL-U2リポソーム溶液（N/P比=6）を加え、ボルテックスでよく混合し、室温で30 分間インキュベートした。
(iv) さらに25μl のOpti-MEM(R) I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(v) 添加量は、ルシフェラーゼ活性測定の添加量のスケールの1/7。
1 ウェルあたり7μl , 14μlのDL- プラスミドDNA 複合体溶液を各々3ウェルに加え、均一になるようプレートを揺らして混合した。
(vi) 37℃、5%CO2 下、細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した。
1dayに遺伝子導入操作を行った細胞について、3day、及び5dayも同様の遺伝子導入を行った。
7day   WST-8キット(キシダ化学）のプロトコールに従い、毒性評価を行った。
(未添加 のウェルを100%とした)
・Lipofectamine LTX : 1day, 3day, 5dayに、同一細胞についてプロトコールに従い遺伝子導入し、7dayにWST-8キット(キシダ化学）のプロトコールに従い、毒性評価を行った (未添加のウェルを100%とした) 。
添加量は、ルシフェラーゼ活性測定の添加量のスケールの1/7。 
・FuGENE HD : 1day, 3day, 5dayに、同一細胞についてプロトコールに従い遺伝子導入し、7dayにWST-8キット(キシダ化学）のプロトコールに従い、毒性評価を行った (未添加のウェルを100%とした) 。
添加量は、ルシフェラーゼ活性測定の添加量のスケールの1/7。 
・FuGENE6 : 1day, 3day, 5dayに、同一細胞についてプロトコールに従い遺伝子導入し、7dayにWST-8キット(キシダ化学）のプロトコールに従い、毒性評価を行った (未添加のウェルを100%とした) 。
添加量は、ルシフェラーゼ活性測定の添加量のスケールの1/7。【０１３０】
２．結果
結果を図１９（ＧＦＰ発現）、及び２０（毒性評価）に示す。それぞれ最初のトランスフェクションから７日経過時のデータを示している。
iPS細胞を作製するには、複数回遺伝子導入する必要がある。その状況を想定して、成人ヒト正常上皮細胞への遺伝子導入を複数回行った際における効果について、本発明のポリアミドアミンデンドロンと市販ベクターとの比較を行った。FuGENE 6は、遺伝子導入活性を示さなかった。本発明のポリアミドアミンデンドロンは最も高効率に遺伝子発現させることができるだけでなく、最も低毒性であった。したがって、iPS細胞の作製のために利用できる遺伝子導入剤という面においても、本発明のポリアミドアミンデンドロンは特に優れていることがわかった。【０１３１】
実施例８．遺伝子導入（７）
実施例１で得た、ＤＬ−Ｕ２を用いて、各種細胞株に対するトランスフェクションを次の通り行った。【０１３２】
１．方法
トランスフェクションの条件は表１に示す通りとした。添加4時間後、培地交換した（Jurkat,K562は培地交換していない）。48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてＧＦＰ発現細胞を観察した。なお、ここに記載されていない実験条件は、他の実施例におけるものに準じたものとした。【０１３３】
【表１】
2010128669.tif 000010
【０１３４】
２．結果
結果を図２１に示す。【０１３５】
多様な細胞に対して、本発明のポリアミドアミンデンドロンは効率よく遺伝子導入できることが示された。
【図１】
2010128669.tif 000011
【図２】
2010128669.tif 000012
【図３】
2010128669.tif 000013
【図４】
2010128669.tif 000014
【図５】
2010128669.tif 000015
【図６】
2010128669.tif 000016
【図７】
2010128669.tif 000017
【図８】
2010128669.tif 000018
【図９】
2010128669.tif 000019
【図１０】
2010128669.tif 000020
【図１１】
2010128669.tif 000021
【図１２】
2010128669.tif 000022
【図１３】
2010128669.tif 000023
【図１４】
2010128669.tif 000024
【図１５】
2010128669.tif 000025
【図１６】
2010128669.tif 000026
【図１７】
2010128669.tif 000027
【図１８】
2010128669.tif 000028
【図１９】
2010128669.tif 000029
【図２０】
2010128669.tif 000030
【図２１】
2010128669.tif 000031
【国際調査報告】
2010128669.tif 000032
2010128669.tif 000033
2010128669.tif 000034
2010128669.tif 000035
2010128669.tif 000036
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