(57)【要約】  低酸素環境を簡便かつ高感度に蛍光測定するための下記の式(I)で表される化合物〔R1は-CO-N(R11)-Y1-N(R12)-X1-(X2)m-p-C6H4-N=N-Ar-R13 [R11及びR12はH又はアルキル（互いに結合したアルキレンを含む）、Y1はアルキレン、X1は単結合、-CO-、又は-SO2-、X2は-O-Y2-N(R14)-（Y2はアルキレン、R14はH又はアルキル）、mは0又は1、p-C6H4-はp-フェニレン、Arはアリールジイル、R13はアルキルアミノ]を示し、R2はアルキル、アルコキシ、カルボキシ、スルホ、又はアルコキシカルボニル；R3〜R8はH又はハロゲン〕。2010026743.tif 000012
2010026743.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式(I)：
【化１】
2010026743.tif 000011
〔式中、R1は下記の一般式(A)：
-CO-N(R11)-Y1-N(R12)-X1-(X2)m-p-C6H4-N=N-Ar-R13
[式中、R11及びR12はそれぞれ独立に水素原子又は炭素数1ないし6個のアルキル基を示し、R11及びR12は互いに結合して炭素数2ないし6個のアルキレン基となってもよく、Y1は炭素数1ないし6個のアルキレン基を示し、X1は単結合、-CO-、又は-SO2-を示し、X2は-O-Y2-N(R14)-（式中、Y2は炭素数1ないし6個のアルキレン基を示し、R14は水素原子又は炭素数1ないし6個のアルキル基を示す）を示し、mは0又は1を示し、p-C6H4-はp-フェニレン基を示し、Arはアリールジイル基を示し、R13はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基を示す]で表される基を示し、R2は置換基を有していてもよいC1-12アルキル基、置換基を有していてもよいC1-12アルコキシ基、カルボキシ基、スルホ基、又は置換基を有していてもよいC1-12アルコキシカルボニル基を示し；R3、R4、R5、R6、R7、及びR8はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示す〕で表される化合物。
【請求項２】
R2がC1-12アルキル基又はカルボキシ基である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
R3、R4、R5、R6、R7、及びR8が水素原子である請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Ar-R13がp-ジメチルアミノフェニル基である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
mが0である請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
X1が-SO2-である請求項４又は５に記載の化合物。
【請求項７】
Y1が炭素数1ないし6個の直鎖アルキレン基である請求項４ないし６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
R11及びR12が互いに結合してエチレン基を形成する請求項４ないし７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
上記の一般式(I)で表される化合物を含む低酸素環境測定用試薬。
【請求項１０】
低酸素環境下でアゾ結合を還元的に開裂する能力を有する酵素の存在下において低酸素環境を測定するために用いる請求項１ないし８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
低酸素環境下でアゾ結合を還元的に開裂する能力を有する酵素がNADPH-チトクローム P450 レダクターゼである請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
低酸素環境の測定方法であって、下記の工程：
(A)上記一般式(I)で表される化合物を低酸素環境下でアゾ結合を還元的に開裂する能力を有する酵素の存在下において低酸素環境に導入する工程、及び
(B)上記工程(A)により生成した蛍光性化合物の蛍光を測定する工程
を含む方法。
【請求項１３】
低酸素環境下でアゾ結合を還元的に開裂する能力を有する酵素がNADPH-チトクローム P450 レダクターゼである請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低酸素環境測定試薬として有用な化合物又はその塩に関するものである。また、本発明は上記化合物又はその塩を含む低酸素環境測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内における低酸素微小環境は様々な疾患との関連が示唆されていることから、低酸素状態にある組織や細胞などを検出することは疾患の早期診断や治療方針の決定などに有用である。低酸素環境を測定可能な方法として現在までにいくつかの提案がなされている。例えば、PETトレーサーや免疫染色などが提案されているが、これらの方法は安全性や簡便性から問題を有している。【０００３】
一般に生体内微量成分や特定の環境を蛍光プローブを用いて測定する方法は簡便で高い安全性が期待できることから、蛍光プローブを用いて低酸素微小環境を測定する方法の開発が求められている。しかしながら、従来、低酸素微小環境を測定可能な蛍光プローブはほとんど提供されておらず、特に小分子を用いた蛍光プローブの提案はほとんどなされていない。報告されているいくつかの蛍光プローブも特異性や励起波長などの点で多くの問題を有している（例えば特開2007-77036号公報、ChemBioChem., 9, pp.426-432, 2008）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2007-77036号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ChemBioChem., 9, pp.426-432, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、低酸素環境の測定のために有用な化合物を提供することにある。より具体的には、安全かつ簡便に生体内組織や細胞の低酸素環境を蛍光によりイメージングできる化合物を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、下記の一般式(I)で表される実質的に非蛍光性の化合物が低酸素環境下において還元され、強い蛍光を発する化合物を与えること、及びこれらの化合物を用いることにより生体内の細胞や組織などにおける低酸素微小環境を効率的にイメージングできることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。【０００８】
すなわち本発明は、下記の式(I)：
【化１】
2010026743.tif 000003
〔式中、R1は下記の一般式(A)：
-CO-N(R11)-Y1-N(R12)-X1-(X2)m-p-C6H4-N=N-Ar-R13
[式中、R11及びR12はそれぞれ独立に水素原子又は炭素数1ないし6個のアルキル基を示し、R11及びR12は互いに結合して炭素数2ないし6個のアルキレン基となってもよく、Y1は炭素数1ないし6個のアルキレン基を示し、X1は単結合、-CO-、又は-SO2-を示し、X2は-O-Y2-N(R14)-（式中、Y2は炭素数1ないし6個のアルキレン基を示し、R14は水素原子又は炭素数1ないし6個のアルキル基を示す）を示し、mは0又は1を示し、p-C6H4-はp-フェニレン基を示し、Arはアリールジイル基を示し、R13はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基を示す]で表される基を示し、R2は置換基を有していてもよいC1-12アルキル基、置換基を有していてもよいC1-12アルコキシ基、カルボキシ基、スルホ基、又は置換基を有していてもよいC1-12アルコキシカルボニル基を示し；R3、R4、R5、R6、R7、及びR8はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示す〕で表される化合物が提供される。【０００９】
上記発明の好ましい態様によれば、R2がC1-12アルキル基又はカルボキシ基である上記の化合物；R2がメチル基又はカルボキシ基である上記の化合物；R3、R4、R5、R6、R7、及びR8が水素原子である上記の化合物；Ar-R13がp-ジメチルアミノフェニル基である上記の化合物；mが0である上記の化合物；X1が-SO2-である上記の化合物；Y1がエチレン基である上記の化合物；R11及びR12が互いに結合してエチレン基を形成する上記の化合物；及びY1がエチレン基であり、かつR11及びR12が互いに結合してエチレン基を形成する上記の化合物が提供される。【００１０】
別の観点からは、上記の一般式(I)で表される化合物を含む低酸素環境測定用試薬が本発明により提供され、好ましくはアゾ結合を還元的に開裂する能力を有する酵素の存在下において低酸素環境を測定するために用いる上記の一般式(I)で表される化合物、特に好ましくはNADPH-チトクローム P450 レダクターゼの存在下において低酸素環境を測定するために用いる上記の一般式(I)で表される化合物が提供される。また、一般式(I)で表される化合物からなるアゾ結合を還元的に開裂する能力を有する酵素基質、特にNADPH-チトクローム P450 レダクターゼ基質が本発明により提供される。【００１１】
さらに、本発明により、低酸素環境の測定方法であって、下記の工程：(A)上記一般式(I)で表される化合物を低酸素環境に導入する工程、及び(B)上記工程(A)により生成した蛍光性化合物（上記一般式(I)においてアゾ基が開裂してX1に結合する基又は-(X2)m-を介してX1に結合する基がp-アミノフェニル基となった化合物）の蛍光を測定する工程を含む方法が提供される。好ましくは、上記工程(A)は低酸素環境下でアゾ結合を還元的に開裂する能力を有する酵素、例えばNADPH-チトクローム P450 レダクターゼ、アゾレダクターゼ、DTジアホラーゼ等の存在下に行われる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の化合物は低酸素環境、特に低酸素微小環境の測定用試薬として有用であり、例えば、粘膜や皮膚あるいは臓器表面に生じた固形癌など低酸素環境にある組織や細胞を安全かつ簡便にイメージングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】NADPHまたはNADHの存在下で、通常酸素環境下又は低酸素環境下それぞれの条件下においてDBCF-PIP(3μM)とラット肝ミクロゾームとの反応を行った結果を示した図である。図中、■は低酸素環境下、●は通常酸素環境下の結果を示し、(A)は50μM NADPH、(B)は250μM NADHの結果を示す。
【図２】DBCF-PIPの吸収スペクトル(A)及びDBCF-PIP、低酸素環境・通常酸素環境それぞれの条件でラット肝ミクロゾームとDBCF-PIPを反応させた際の蛍光スペクトル(B)を示した図である。図(B)中、DBCF-PIPはDBCF-PIP の蛍光スペクトル、MS-aerobicは通常酸素環境でラット肝ミクロゾームとDBCF-PIPを反応させた際の蛍光スペクトル、MS-hypoxicは低酸素環境でラット肝ミクロゾームとDBCF-PIPを反応させた際の蛍光スペクトルを示す。
【図３】低酸素環境下においてNADPH-チトクローム P450 レダクターゼ阻害剤を加えてDBCF-PIPとラット肝ミクロゾームとの反応を行った結果を示した図である。図3(A)は経時変化の結果、図3(B)は1時間の反応後の測定結果を示す。
【図４】通常酸素環境下又は低酸素環境下それぞれの条件下において精製ヒトNADPH-チトクローム P450 レダクターゼとDBCF-PIPとの反応を行った結果を示した図である。
【図５】例1〜4で得た4種の化合物について低酸素環境下においてラット肝ミクロゾームとの反応を行った結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。
本明細書において、「アルキレン基」は直鎖状又は分枝鎖状のいずれであってもよく、環状構造を含むものであってもよい。例えば、エチレン基、プロピレン基などや、シクロペンタン-1,2-ジイル基、シクロヘキサン-1,2-ジイル基、シクロヘキサン-1,3-ジイル基、シクロヘキサン-1,4-ジイル基などであってもよい。
本明細書において、「ハロゲン原子」はフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子のいずれであってもよい。
【００１５】
R2が示すC1-12アルキル基、C1-12アルコキシ基、又はC1-12アルコキシカルボニル基が置換基を有する場合、置換基の種類、個数、及び置換位置は特に限定されないが、例えば、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、スルホ基、又はアルキルスルホネート基などを置換基として有していてもよい。
Arが示すアリールジイル基としては、例えば、フェニレン基、ナフタレンジイル基、アントラセンジイル基、フェナントレンジイル基などの芳香族炭化水素ジイル基のほか、ピリジンジイル基、キノリンジイル基、フランジイル基、チオフェンジイル基などのヘテロ芳香族ジイル基であってもよい。
【００１６】
R13がジアルキルアミノ基を示す場合、2個のアルキル基は同一でも異なっていてもよい。
R11及びR12としては水素原子、メチル基、又はエチル基が好ましく、共に水素原子であることがより好ましい。R11及びR12が結合してエチレン基となることも好ましい。
Y1としてはメチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンタメチレン基、又はヘキサメチレン基が好ましい。R11及びR12が結合してエチレン基となる場合にはY1がエチレン基であることが好ましい。
【００１７】
X1としては-CO-又は-SO2-が好ましく、-SO2-がより好ましい。
X2においてY2がメチレン基、エチレン基、又はプロピレン基であることが好ましく、R14が水素原子又はメチル基であることが好ましい。mは0又は1を示すが0であることが好ましく、この場合はX2が存在せずに単結合となることを意味する。
Arが示すアリールジイル基としてはフェニレン基が好ましく、o-フェニレン基又はp-フェニレン基がより好ましく、p-フェニレン基が特に好ましい。
【００１８】
R13としてはモノメチルアミノ基又はジメチルアミノ基が好ましく、ジメチルアミノ基がより好ましい。
R2としてはC1-12アルキル基又はカルボキシ基が好ましく、C1-6アルキル基又はカルボキシ基がより好ましく、メチル基又はカルボキシ基がさらに好ましい。また、本発明の化合物を細胞、生体組織又はイン・ビボで使用する場合には、上記一般式(I)のR2が示す置換基を有していてもよいC1-12アルキル基、置換基を有していてもよいC1-12アルコキシ基又は置換基を有していてもよいC1-12アルコキシカルボニル基の置換基を適宜選択して本発明の化合物の水溶性を調節し、細胞膜透過型及び非膜透過型のプローブとして使用することができる。
【００１９】
例えば、前記置換基としてスルホ基及びカルボキシ基を1つ又は2つ、好ましくは3つ以上有する本発明の化合物は、水溶性が非常に高く非膜透過性を示して細胞内に取り込まれないため、細胞外の低酸素環境の検出に好適に用いることができる。また、例えば、R2がアセトキシメトキシカルボニル基である本発明の化合物は、脂溶性が高まり細胞膜透過性を示して細胞内に取り込まれ（該アセトキシメトキシカルボニル基は細胞内に存在するエステラーゼにより加水分解されると、上記一般式(I)のR2がカルボキシ基で示される化合物に変換されて脂溶性が低下し、細胞内滞留性を示す場合がある）、細胞内の低酸素環境の検出に好適に用いることができる場合がある。
【００２０】
なお、上記一般式(I)のキサンテン環部位の6位の水酸基をアセチル化してアセトキシ基に変換して、本発明の化合物の脂溶性を高めて細胞膜透過性を付与することもできる（該アセトキシ基は細胞内に存在するエステラーゼにより加水分解されると、上記一般式(I)で示される化合物に変換される）。また、本発明の化合物が上記一般式(I)の R2がカルボキシ基であるフルオレセイン様化合物の場合には、該フルオレセイン様化合物がラクトンフォームをとってキサンテン環部位の3位のカルボニル基が水酸基となる互変異性体を形成するが、この場合にはキサンテン環部位の3位及び6位の水酸基の一方又は両方をアセチル化してアセトキシ基に変換して、本発明の化合物の脂溶性を高めて細胞膜透過性を付与することができる。
R3、R4、R5、R6、R7、及びR8は水素原子であることが好ましい。
【００２１】
一般式(I)で表される化合物として好ましい化合物は、
(a)Ar-R13がp-ジメチルアミノフェニル基であり；
(b)mが0であり；
(c)X1が-SO2-であり；
(d)Y1がエチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンタメチレン基、若しくはヘキサメチレン基であり；又は
(e)互いに結合したR11及びR12がエチレン基である
場合であり、さらに好ましくは上記(a)ないし(e)の2以上を含む場合であり、特に好ましくは上記(a)ないし(e)の全てを含む場合である。
【００２２】
一般式(I)で表される化合物は水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。また、上記一般式(I)で表される化合物は塩の形態で存在する場合もあり、本発明の範囲には塩の形態も包含される。塩としては酸付加塩又は塩基付加塩などを挙げることができ、例えば、塩酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、マレイン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩などの有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩などの有機アミン塩のほか、グリシン塩などのアミノ酸の塩であってもよい。
【００２３】
一般式(I)で表される化合物は、置換基の種類に応じて1個または2個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
【００２４】
一般式(I)で表される本発明の化合物は、一般的には、一般式(A)で表される基において末端のカルボニル基を水素原子で置き換えたアミン化合物を一般式(I)で表される化合物においてR1がカルボキシ基である化合物に対して反応させることにより容易に製造することができる。本発明の一般式(I)で表される化合物の代表的化合物の製造方法が本明細書の実施例に具体的に示されているので、当業者は実施例の具体的説明を基にして、出発原料及び反応試薬を適宜選択し、必要に応じて反応条件や工程を適宜変更ないし修飾することにより、本発明の化合物を容易に製造することが可能である。
【００２５】
なお、反応工程において特定の官能基を必要に応じて保護して反応を行うことにより、目的物を効率的に製造することができる場合があるが、保護基については、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス (Protective Groups in Organic Synthesis, T.W.Greene, John Wiley & Sons, Inc., 1981)などに詳しく説明されており、当業者は適宜の保護基を選択することが可能である。
【００２６】
また、上記製造法における生成物の単離、精製は通常の有機合成で用いられる方法、例えば濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、結晶化、各種クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ行うことができる。また、上記工程における製造中間体は、特に精製することなく次の反応に供することも可能である。本発明の化合物の塩を製造する場合には、上記製造法においてそれぞれの化合物の塩が得られる場合はそのまま精製すればよればよく、遊離形態の化合物が得られる場合には、遊離形態の化合物を適当な溶媒に溶解又は懸濁した後、酸あるいは塩基を加えて塩を形成させ、必要に応じて精製を行えばよい。
【００２７】
上記一般式(I)で表される本発明の化合物は、緩和な条件下、例えば生理的条件下において低酸素環境に置かれると一般式(A)におけるアゾ基が開裂し、上記一般式(I)においてX1に結合する基又は-(X2)m-を介してX1に結合する基がp-アミノフェニル基となった化合物を与える性質を有している。一般式(I)で表される化合物は実質的に非蛍光性であり、一方、アゾ基が開裂して生成する上記化合物は高強度の蛍光を発する性質を有している。従って、上記一般式(I)で表される化合物又はその塩を低酸素環境に導入し、アゾ基が開裂した化合物の蛍光を測定することによって、低酸素環境を高感度に測定することが可能である。
【００２８】
本発明の試薬により測定可能な低酸素環境としては、例えば、固形癌における0%〜5%（38mmHg）程度の低酸素環境などを挙げることができるが、本発明により測定可能な低酸素環境はこの状態に限定されることはない。低酸素環境としては、例えば、癌組織、癌細胞、又は虚血組織などを挙げることができ、癌組織としては、例えば、粘膜表面、皮膚、又は臓器表面などに生じた固形癌が好ましい測定対象である。例えば、内視鏡検査などの手段により本発明の試薬を用いて低酸素環境の組織を特定することができ、癌の存在を早期に発見することができる。また、腫瘍内酸素分圧pO2が10mmHgを下回ると放射線に対する抵抗が増大することが知られており、本発明の試薬は、このような放射線耐性を有する腫瘍の識別にも有用である。
【００２９】
本発明の化合物（試薬）を生物試料（組織や細胞）における低酸素環境に導入（適用）した場合、該組織や細胞中に存在する低酸素環境下でアゾ結合を還元的に開裂する能力を有する酵素によりアゾ基が開裂した化合物が生成され蛍光を生じる。このような低酸素環境下でアゾ結合を還元的に開裂する能力を有する酵素としては、NADPH-チトクローム P450 レダクターゼ（各種組織のミクロゾームに存在）、チトクローム-b5 レダクターゼ（各種組織のミクロゾームに存在）、DTジアホラーゼ（各種組織のサイトゾルに存在）、アゾレダクターゼ（微生物由来）等をあげることができる。これらのうち、NADPH-チトクローム P450 レダクターゼが広範な組織や細胞に存在するので好ましい。前記酵素は、低酸素環境を測定する試料や試験条件により、試料由来のものが使用されてもよいし、外部から加えてもよい。外部から加える場合には、遺伝子組み換え技術により得られたものであってもよい。
【００３０】
本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。本発明の低酸素環境の測定方法は、一般的には、(A)上記一般式(I)で表される化合物を低酸素環境に導入する工程、及び(B) 上記工程(A)で生成したアゾ基が開裂した化合物（上記一般式(I)においてX1に結合する基又は-(X2)m-を介してX1に結合する基がp-アミノフェニル基となった化合物）の蛍光を測定する工程を含んでいる。
【００３１】
アゾ基が開裂した化合物の蛍光の測定は通常の方法で行うことができ、インビトロで蛍光スペクトルを測定する方法や、バイオイメージングの手法を用いてインビボで蛍光スペクトルを測定する方法などを採用することができる。例えば、定量を行う場合には、常法に従って予め検量線を作成しておくことが望ましい。本発明の試薬の中でもDBTG-PIPは細胞内に取り込まれる性質を有しており、また他のプローブもキサンテン骨格の水酸基をアセチル基で保護する事により容易に細胞内に取り込まれる構造へと変換が可能である。そのため個々の細胞や組織内に局在する低酸素環境をバイオイメージング手法により高感度に測定できる。
【００３２】
本発明の低酸素環境測定用試薬としては、上記一般式(I)で表される化合物をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、pH調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。
【００３３】
上記の説明を基にすれば、必要に応じて薬物学的又は薬剤学的に許容される処方（製剤）形態として調製することにより、本発明の化合物が画像診断用組成物の主成分となりうること及び本発明の化合物を主成分とする画像診断用組成物が提供されることが当然に理解されよう。本発明の範囲には、上記した本発明の化合物のほか、上記試薬や上記組成物の画像診断への適用も包含される。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：DBCF-PIPの合成
(1)化合物1
【化２】
2010026743.tif 000004
【００３５】
N-Boc-ピペラジン(366 mg, 2 mmol)を20 mLの無水ジクロロメタンに溶解し、334μLのトリエチルアミン、塩化ダブシル（332 mg, 1 mmol）を加えアルゴン雰囲気下室温で5時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルで精製を行い、目的の化合物1を327 mg得た（収率69%、オレンジ色粉末）。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ:1.40 (s, 9H), 3.01 (t, 4H, J = 5.13 Hz), 3.13 (s, 6H), 3.51 (t, 4H, J = 5.13 Hz), 6.76 (d, 2H, J = 8.99 Hz), 7.82-7.95 (m, 6H)
LRMS (ESI+) 474 (M+H)+【００３６】
(2)DBCF-PIP
【化３】
2010026743.tif 000005
【００３７】
化合物1（47.4 mg, 0.1 mmol）を10 mLのジクロロメタンに溶解し、この溶液を氷冷下トリフルオロ酢酸20 mL中に滴下した。1時間後、トルエンを加えてトリフルオロ酢酸を減圧留去した。残渣を5 mLの脱水N,N-ジメチルホルムアミドに溶解し、HOBT・H2O（28.5 mg, 0.16 mmol）、HBTU（60.6 mg, 0.16 mmol）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（132 mL, 0.8 mmol）、5-カルボキシフルオレセイン（30 mg, 0.08 mmol）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で一晩攪拌する。溶媒を減圧留去後、セミ分取HPLCで精製を行い、目的物23 mgを得た（収率39%、暗赤色粉末）。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 2.39 (br, 8H), 3.16 (s, 6H), 6.37 (d, 2H, J = 2.20 Hz), 6.57 2.91-3.10 (m, 10H), 6.74 (d, 2H, J = 9.17 Hz), 6.79 (d, 2H, J = 9.17 Hz), 7.87-7.97 (m, 6H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ:9.8, 40.3, 46.7, 103.4, 111.1, 112.4, 113.5, 123.3, 124.2, 125.3, 126.4, 128.2, 129.8, 130.2, 132.7, 134.8, 136.4, 138.6, 144.2, 153.4, 154.4, 154.5, 156.6, 160.8, 168.9, 169.0
HRMS (ESI+) Calcd for [M+H]+, 732.2128, Found, 732.2122 (-0.54 mmu)【００３８】
例２：DBCF-Etの合成
(1)化合物2の合成
【化４】
2010026743.tif 000006
【００３９】
N-Boc-エチレンジアミン(345.8 mg, 2.16 mmol)を40 mLの無水ジクロロメタンに溶解し、334μLのトリエチルアミン、塩化ダブシル（330.4 mg, 1.02 mmol）を加えてアルゴン雰囲気下室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行い、目的の化合物2を392.5 mg得た（収率85.8%、暗赤色固体）。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ:1.43 (s, 9H), 3.07-3.13 (m, 8H), 3.21-3.27 (m, 2H), 6.75 (d, 2H, J = 9.35 Hz), 7.89-7.93 (m, 6H)
LRMS (ESI+) 470 (M+Na+)【００４０】
(2)DBCF-Et
【化５】
2010026743.tif 000007
【００４１】
化合物2（268.2 mg, 0.6 mmol）を20 mLのジクロロメタンに溶解し、この溶液を氷冷下トリフルオロ酢酸60 mL中に滴下した。1時間後、トルエンを加えトリフルオロ酢酸を減圧留去した。残渣を15 mLの脱水N,N-ジメチルホルムアミドに溶解させ、HOBT・H2O（149.8 mg, 0.84 mmol）、HBTU（320.3 mg, 0.84 mmol）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（612 μL, 4.0 mmol）、5-カルボキシフルオレセイン（153.8 mg, 0.41 mmol）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、セミ分取HPLCで精製を行い、目的物20.5 mgを得た（収率7.0%、暗赤色粉末）
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 3.01-3.40 (m, 8H), 3.41 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 6.48-6.70 (m, 8H), 7.15 (d, J = 7.8 Hz), 7.65-7.99 (m, 7H), 8.31 (s, 1H)
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 40.5, 41.2, 43.3, 103.5, 111.8, 113.0, 114.8, 122.9, 123.1, 125.8, 126.5, 127.2, 129.0, 129.1, 130.7, 130.9, 135.1, 137.6, 141.4, 144.4, 154.9, 155.1, 156.1, 163.0, 168.6, 170.0
HRMS (ESI+) Calcd for [M+H]+, 706.1971, Found, 706.1989 (+1.74 mmu )【００４２】
例３：DBCF-Hexの合成
(1)化合物3
【化６】
2010026743.tif 000008
【００４３】
N-Boc-ヘキサンジアミン(216 mg, 1 mmol)を20 mLの無水ジクロロメタンに溶解し、167μLのトリエチルアミン、塩化ダブシル（241 mg, 0.74 mmol）を加えアルゴン雰囲気下室温で5時間攪拌した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルで精製を行い、目的の化合物3を297 mg得た（収率79%、オレンジ色粉末）
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ:1.26-1.63 (m, 18H), 2.91-3.10 (m, 10H), 6.74 (d, 2H, J = 9.17 Hz), 7.87-7.97 (m, 6H)
LRMS (ESI+) 504 (M+H)+【００４４】
(2)DBCF-Hex
【化７】
2010026743.tif 000009
【００４５】
化合物3（85.6 mg, 0.17 mmol）を10 mLのジクロロメタンに溶解し、この溶液を氷冷下トリフルオロ酢酸20 mL中に滴下した。1時間後、トルエンを加えトリフルオロ酢酸を減圧留去した。残渣を5 mLの脱水N,N-ジメチルホルムアミドに溶解し、HOBT・H2O（72 mg, 0.40 mmol）、HBTU（152 mg, 0.40 mmol）、N,N-ジイソプロピルエチルアミ330μL、5-カルボキシフルオレセイン（75.2 mg, 0.20 mmol）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧留去後、セミ分取HPLCで精製を行い、目的物21.7 mgを得た（収率16.9%、暗赤色粉末）
1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 1.27-1.64 (m, 8H), 2.90 (t, 2H, J = 6.97 Hz), 3.16 (s, 6H), 3.38 (t, 2H, J = 9.97 Hz), 6.74 (m, 2H), 6.85-6.90 (m, 5H), 7.33 (d, J = 8.07 Hz), 7.79-7.90 (m, 6H), 8.17 (dd, 1H, J = 7.90, 1.56 Hz), 8.53 (s, 1H)
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ:27.0, 27.1, 30.2, 30.4, 41.0, 41.0, 43.9, 103.5, 113.3, 113.9, 116.3, 122.6, 127.1, 127.7, 128.1, 129.2, 129.9, 130.0, 131.5, 134.4, 138.1, 141.4, 141.5, 143.7, 154.5, 155.7, 156.4, 165.4, 168.1, 169.3
HRMS (ESI-) Calcd for [M-H]-, 760.2441, Found, 760.2480 (+3.89 mmu )【００４６】
例４：DBTG-PIPの合成
【化８】
2010026743.tif 000010
【００４７】
化合物1（94.6 mg, 0.2 mmol）を10 mLのジクロロメタンに溶解し、この溶液を氷冷下トリフルオロ酢酸30 mL中に滴下した。1時間後、トルエンを加えトリフルオロ酢酸を減圧留去した。残渣を7 mLの脱水N,N-ジメチルホルムアミドに溶解し、HOBT・H2O（72 mg, 0.40 mmol）、HBTU（152 mg, 0.40 mmol）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン330μL、2-Me-4-COOH TokyoGreen（9-[1-(4-カルボキシ-2-メチルフェニル)]-6-ヒドロキシ-3H-キサンテン-3-オン, 文献:Org. Lett., 8，pp.5963-5966, 2006; 62 mg, 0.20 mmol）（TokyoGreenは登録商標）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で一晩攪拌した。反応溶液に水を加え、ジクロロメタンで抽出を行い、有機層を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー、セミ分取HPLCにより精製し、目的物67.4 mgを得た。（収率48%、暗赤色粉末）
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 1.97 (s, 3H), 3.07 (br, 10H), 3.66 (br, 4H), 6.82-6.95 (m, 6H), 7.14 (d, 2H, J = 9.17 Hz), 7.30-7.41 (m, 2H), 7.47 (s, 1H), 7.80-7.96 (m, 6H)
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ:19.7, 40.5, 40.6, 42.8, 103.7, 113.0, 117.7, 121.9, 123.4, 125.9, 127.1, 127.3, 129.2, 129.9, 130.1, 130.5, 134.0, 136.4, 138.2, 138.7, 144.5, 155.2, 156.9, 161.0, 171.5, 173.7
HRMS (ESI-) Calcd for [M+Na]+, 724.2205, Found, 724.2202 (+0.29 mmu )【００４８】
例５：DBCF-PIPとラット肝ミクロゾームとの反応
NADPHまたはNADHの存在下で、通常酸素環境下又は低酸素環境下それぞれの条件下においてDBCF-PIP(3μM)とラット肝ミクロゾームとの反応を行った。励起波長490 nm、蛍光波長510 nmで測定を行い、試料は0.1% ジメチルスルホキシド(DMSO)を共溶媒として含むリン酸カリウム緩衝液(pH 7.4)で調製した。低酸素環境は100%アルゴンを30分間バブリングして作成した。結果を図1に示す。■は低酸素環境下、●は通常酸素環境下の結果を示し、(A)は50μM NADPH、(B)は250μM NADH存在下の結果を示す。何れの場合においても通常酸素環境下では殆ど蛍光強度の上昇が認められないのに対し、低酸素環境下では蛍光強度の大きな上昇が認められた。肝ミクロゾームは、チトクロムレダクターゼ類を含んでおり、NADPHを電子供与体とするものはNADPH-チトクローム P450 レダクターゼ、NADHを電子供与体とするものはチトクローム-b5 レダクターゼである。本発明の化合物は嫌気的（低酸素）条件下で肝ミクロゾーム中のチトクロムレダクターゼ類、特にNADPH-チトクローム P450 レダクターゼの基質として優れた性質を有することが示された。【００４９】
図2(A)にDBCF-PIPの吸収スペクトル(3μM)を示し、図2(B)にDBCF-PIP及び低酸素環境・通常酸素環境それぞれの条件でラット肝ミクロゾームと反応させた際の蛍光スペクトルを示す。試料は0.1% ジメチルスルホキシド(DMSO)を共溶媒として含むリン酸カリウム緩衝液(pH 7.4)で調製し、250μM NADHの存在下でラット肝ミクロゾームとの反応を3時間行い、励起波長490 nmで測定を行った。DBCF-PIPの吸収スペクトルはダブシルとフルオレセインを重ね合わせたスペクトル形状を示し、蛍光強度は非常に小さく抑えられていた（図2B、蛍光量子収率0.01）。通常酸素環境でも若干の蛍光上昇が認められたが、低酸素環境では通常酸素環境の10倍以上の非常に大きな蛍光上昇が認められた。【００５０】
低酸素環境下、NADPH-チトクローム P450 レダクターゼの阻害剤であるジフェニルヨードニウムクロリドを様々な濃度で加えた。試料は0.1% ジメチルスルホキシド(DMSO)を共溶媒として含むリン酸カリウム緩衝液(pH 7.4)で調製し、50μMのNADPHの存在下で測定を行った(励起波長490 nm)。図3(A)は経時変化の結果、図3(B)は1時間の反応後の測定結果を示す。低酸素環境において阻害剤の濃度依存的に蛍光の上昇が抑制された（図3(A)）。また、通常酸素環境での実質的な蛍光上昇はなかった（図3(B)）。以上の結果は、本発明の化合物DBCF-PIPは、通常酸素環境では分解されないが、低酸素環境においてはNADPH-チトクローム P450レダクターゼにより分解され、蛍光強度が上昇したことを示している。【００５１】
精製したヒトNADPH-チトクローム P450 レダクターゼ(5μg)を用いてDBCF-PIP(3μM)と反応させた結果を図4に示す。試料は0.1% ジメチルスルホキシド(DMSO)を共溶媒として含むリン酸カリウム緩衝液(pH 7.4)で調製し、50μMのNADPHの存在下で測定を行った(励起波長490 nm)。低酸素環境において大きな蛍光上昇が観測される一方、通常酸素環境では実質的な蛍光上昇は観察されなかった。【００５２】
例６
例1〜4で得た4種の化合物(3μM)について例５と同様に低酸素環境下においてラット肝ミクロゾーム(50μL、5倍希釈)との反応を行った。試料は0.1% ジメチルスルホキシド(DMSO)を共溶媒として含むリン酸カリウム緩衝液(pH 7.4)で調製し、50μMのNADPHの存在下で測定を行った(励起波長490 nm)。例1〜4で得た4種の本発明の化合物はいずれも低酸素環境下において蛍光を発することが確認された。
【図１】
2010026743.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2010026743.tif 000017
【国際調査報告】
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2010026743.tif 000019
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