【事件の表示】
　特許第２５９４５３３号「変異サブチリシンを製造する方法」の請求項１、４、５に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２５９４５３３号の請求項１に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯　
　本件特許第２５９４５３３号の発明についての出願は、昭和５９年６月２２日（パリ条約による優先権主張１９８３年６月２４日、１９８４年５月２９日、１９８４年５月２９日、１９８４年５月２９日、１９８４年５月２９日、１９８４年５月２９日、それぞれ米国）に出願され、平成８年１２月１９日にその発明について特許権の設定登録がなされ、その後、ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブより、特許異議の申立がなされ、平成９年１２月４日付けで取消の理由の通知がなされ、平成９年１２月１８日に異議申立人より上申書が提出され、取消理由通知の延長された指定期間内である平成１０年７月２１日に特許権者より意見書が提出され、平成１０年８月２８日に特許権者より上申書が提出され、平成１１年４月６日付けで異議申立人に対し審尋がなされ、平成１１年７月２７日に異議申立人より回答書が提出され、平成１３年３月１５日付で再度の取消理由通知がなされ、その延長された指定期間内である平成１３年１０月１日に訂正請求がなされ、平成１４年２月２１日付けで再々度の取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１４年３月４日に訂正請求がなされ、先の訂正請求が取り下げられたものである。　
　
２．訂正の適否　
（１）訂正の内容　
特許権者が求めている訂正の内容は、以下のとおりである。　
ア．特許請求の範囲の請求項１の「変化した活性を有する変異サブチリシンを製造する方法であって、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）サブチリシンまたはそのプレ酵素あるいはプレプロ酵素のＡｓｎ＋１５５、Ｔｙｒ＋１０４、Ｍｅｔ＋２２２、Ｇｌｙ＋１６６、Ｇｌｙ＋１６９、Ｇｌｕ＋１５６、Ｓｅｒ＋３３、Ｐｈｅ＋１８９、Ｔｙｒ＋２１７およびＡｌａ＋１５２に相当する、サブチリシン酵素、そのプレ酵素またはプレプロ酵素の１またはそれ以上の位置に突然変異をもたらし、その突然変異によって生じる酵素の望ましい活性の変化を調べることからなる方法。」を、「変化した活性を有する変異サブチリシンを製造する方法であって、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）サブチリシンまたはそのプレ酵素あるいはプレプロ酵素のＭｅｔ＋２２２、Ｇｌｙ＋１６６、またはＧｌｙ＋１６９に相当する、サブチリシン酵素、そのプレ酵素またはプレプロ酵素の位置に突然変異をもたらし、その突然変異によって生じる酵素の望ましい活性の変化を調べることにより、それぞれＳｅｒ＋２２２もしくはＡｌａ＋２２２に変異させて酸化安定性の増強した変異サブチリシンを製造するか、またはＣｙｓ＋２２２に変異させて至適ｐＨの変化した変異サブチリシンを製造するか、あるいはＡｌａ＋１６６もしくはＬｙｓ＋１６６に変異させて触媒効率が変化した変異サブチリシンを製造するか、またはＡｓｐ＋１６６、Ｇｌｕ＋１６６もしくはＡｓｎ＋１６６に変異させて基質特異性が変化した変異サブチリシンを製造するか、あるいはＡｌａ＋１６９もしくはＳｅｒ＋１６９に変異させて触媒効率が変化した変異サブチリシンを製造する方法。」と訂正する。　
イ．特許請求の範囲の請求項２〜５を削除する。　
（２）訂正の目的の適否、新規事項の有無、特許請求の範囲の拡張・変更の存否、及び独立特許要件　
　上記アの訂正事項に関連する記載として、願書に添付した明細書（以下、「特許明細書」という。）の発明の詳細な説明には、Ｍｅｔ＋２２２に相当する位置をＳｅｒ＋２２２またはＡｌａ＋２２２に変異させると酸化安定性の増強した変異サブチリシンが得られること（特許掲載公報３５欄（１８頁）４１行〜３６欄（１８頁）１５行、実施例１７）、Ｍｅｔ＋２２２に相当する位置をＣｙｓ＋２２２に変異させると至適ｐＨの変化した変異サブチリシンが得られること（特許掲載公報３７欄（１９頁）２３〜３５行、実施例１９）、Ｇｌｙ＋１６６に相当する位置をＡｌａまたはＬｙｓ＋１６６に変異させると、触媒効率の向上した変異サブチリシンが得られること（特許掲載公報３６欄（１８頁）及び３７欄（１９頁）、実施例１８、表Ｄ）、Ｇｌｙ＋１６６に相当する位置をＡｓｐ、ＧｌｕまたはＡｓｎ＋１６６に変異させると、基質特異性の変化した変異サブチリシンが得られること（特許掲載公報３６欄（１８頁）及び３７欄（１９頁）、実施例１８、表Ｄ）、Ｇｌｙ＋１６９に相当する位置をＡｌａ＋１６９またはＳｅｒ＋１６９に変異させると、触媒効率が向上した変異サブチリシンが得られること（特許掲載公報３７欄〜３８欄（１９頁）、実施例２０、表Ｅ）が、それぞれ記載されている。そして、訂正前の請求項１は「変化した活性を有する変異サブチリシンを製造する方法」に係るものであり、訂正前の請求項１の末尾は「突然変異によって生じる酵素の望ましい活性の変化を調べることにより、変化した活性を有する変異サブチリシンを製造する方法。」と読み替えることができるから、上記アの訂正は、変化した活性を有する変異サブチリシンを製造するために突然変異をもたらすべき位置を、訂正前の「Ａｓｎ＋１５５、Ｔｙｒ＋１０４、Ｍｅｔ＋２２２、Ｇｌｙ＋１６６、Ｇｌｙ＋１６９、Ｇｌｕ＋１５６、Ｓｅｒ＋３３、Ｐｈｅ＋１８９、Ｔｙｒ＋２１７およびＡｌａ＋１５２に相当する、サブチリシン酵素、そのプレ酵素またはプレプロ酵素の１またはそれ以上の位置」から訂正後の「Ｍｅｔ＋２２２、Ｇｌｙ＋１６６、またはＧｌｙ＋１６９に相当する、サブチリシン酵素、そのプレ酵素またはプレプロ酵素の位置」に限定し、また、変化した活性を有する変異サブチリシンを「Ｓｅｒ＋２２２もしくはＡｌａ＋２２２に変異させて酸化安定性の増強した変異サブチリシン」、「Ｃｙｓ＋２２２に変異させて至適ｐＨの変化した変異サブチリシン」、「Ａｌａ＋１６６もしくはＬｙｓ＋１６６に変異させて触媒効率が変化した変異サブチリシン」、「Ａｓｐ＋１６６、Ｇｌｕ＋１６６もしくはＡｓｎ＋１６６に変異させて基質特異性が変化した変異サブチリシン」および「Ａｌａ＋１６９もしくはＳｅｒ＋１６９に変異させて触媒効率が変化した変異サブチリシン」に特定するものである。従って、上記アの訂正は、特許明細書に記載された事項の範囲内において、特許請求の範囲第１項の「突然変異をもたらす」位置を限定し、「変化した活性を有する変異サブチリシン」を特定したものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当するものであって、新規事項の追加に該当しない。　
　上記イの訂正は、特許請求の範囲の請求項を削除するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当するものであり、新規事項の追加に該当しない。　
　そして、上記いずれの訂正も実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。　
　また、下記「３．異議申立についての判断」の項において詳述するように、訂正後の請求項１に係る発明は、特許出願の際独立して特許を受けられるものである。　
（３）むすび　
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項において準用する第１２６条第２〜４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。　
３．特許異議申立についての判断　
（１）申立の理由の概要　
ア．申立人　ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブは、下記の甲第１〜１１号証を提出し、訂正前の請求項１に係る発明は、甲２〜７号証に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号の規定に違反して特許されたものであり、甲２〜７号証に記載された発明、甲１号証及び甲２〜７号証に記載された発明、あるいは甲１１号証及び甲１号証及び甲２〜７号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであり、また、発明の詳細な説明が請求項１、４及び５に係る発明を当業者が容易に実施し得る程度に記載されておらず、請求項１、４及び５の記載が不明瞭であるから、特許法第３６条の規定に違反して特許されたものであるため、請求項１、４及び５に係る発明の特許は取り消すべきものである旨主張している。　
甲第１号証：Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　，ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄ．（１９８０）　
甲第２号証：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．２３（１９７２）ｐ．４２９３?４３０３　
甲第３号証：Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．３６（１９７１）ｐ．１１７?１２３　
甲第４号証：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１３（１９７２）ｐ．２４３９?２４４９　
甲第５号証：Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２５０，Ｎｏ．１８（１９７５）ｐ．７１２０?７１２６　
甲第６号証：Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２５１，Ｎｏ．４（１９７５）ｐ．１０９７?１１０３　
甲第７号証：Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｖｏｌ．４１　Ｎｏ．５（１９７６）ｐ．２３９?２９１　
甲第８号証：Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２１９（１９８３），ｐ．６６６?６７１　
甲第９号証：Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｏ．２９９，Ｎｏ．２１（１９８２）ｐ．７５６?７５８　
甲第１０号証：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７９（１９８２）ｐ．６４０９?６４１３　                                      .
甲第１１号証：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２），ｐ．２２６?２２７，３１２?３２９　
　また、異議申立人は、審理の過程で以下の甲第１２〜１４号証を追加、提出し、当審は、取消理由通知に際し、文献１を追加、引用している。　
甲第１２号証：Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．３　ｐ．８０?８４（１９８３年８月）　
甲第１３号証：Ｎａｔｕｒｅ　Ｖｏｌ．３０７，１２，ｐ．１８７?１８８（１９８４年１月）　
甲第１４号証：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１０，ｐ．３１１３?３１２１（１９８３年１０月）　
文献１：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．２２，ｐ．７９１１?７９２５　
（２）本件発明　
　訂正後の本件請求項１に係る発明（以下、本件発明という。）の要旨は、平成１４年３月４日付けの訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１に記載されたとおりのものと認める。　
（３）明細書の記載不備について　
　異議申立人は、訂正前の請求項１には、変異の部位は記載されているものの、いかなる変異を意図するか、アミノ酸の置換であるとすれば、各置換部位をいかなるアミノ酸により置換するかが記載されておらず、且つ望ましい活性の変化がいかなるものであるかについても記載されていないので、請求項１の記載が不明瞭であると主張し、訂正前の請求項４及び５は、記載事項の技術的意味が不明瞭である等の不備を有する旨を主張している。　
　これらについては、特許明細書が上述のとおり訂正され、請求項１に、各置換部位を置換するアミノ酸、及び、それにより生じる活性の変化が明記されるとともに、請求項４，５は削除されたので、明細書の記載不備は解消した。　
（５）甲各号証及び引用文献１に記載された発明との対比・判断　
　異議申立人の提出した甲第１号証〜甲第１４号証及び当審が引用した文献１のいずれにも、バチルス・アミロリクエファシエンス  サブチリシンまたはそのプレ酵素あるいはプレプロ酵素において、Ｍｅｔ＋２２２に相当する位置、Ｇｌｙ＋１６６に相当する位置、あるいはＧｌｙ＋１６６に相当する位置を、本件発明に規定された特定のアミノ酸に変異させた、変異サブチリチンについては記載されていない。そして、本件発明は、上記位置を上記特定のアミノ酸により置換することによって、それぞれ、サブチリチンの酸化安定性が増強され、あるいは至適ｐＨが変化し、あるいは基質特異性が変化し、あるいは触媒効率が向上するという、甲各号証及び文献１の記載から予期しがたい効果を奏するものである。　
　従って、本件発明は、上記甲第１号証〜甲第１４号証、または文献１に記載された発明とは認められず、また、上記甲各号証および文献１に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとも認められない。　
（６）むすび　
　以上のとおりであるから、特許異議の申立の理由及び証拠によっては、本件発明を取り消すことはできない。　
　また、他に本件発明を取り消すべき理由を発見しない。　
　よって、結論のとおり決定する。　
【異議決定日】
平成１４年３月７日（２００２．３．７）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
１．特許請求の範囲の請求項１を、特許請求の範囲の減縮を目的として、「変化した活性を有する変異サブチリシンを製造する方法であって、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）サブチリシンまたはそのプレ酵素あるいはプレプロ酵素
のＭｅｔ
または
の位置
により、それぞれＳｅｒ＋２２２もしくはＡｌａ＋２２２に変異させて酸化安定性の増強した変異サブチリシンを製造するか、またはＣｙｓ＋２２２に変異させて至適ｐＨの変化した変異サブチリシンを製造するか、あるいはＡｌａ＋１６６もしくはＬｙｓ＋１６６に変異させて触媒効率が変化した変異サブチリシンを製造するか、またはＡｓｐ＋１６６、Ｇｌｕ＋１６６もしくはＡｓｎ＋１６６に変異させて基質特異性が変化した変異サブチリシンを製造するか、あるいはＡｌａ＋１６９もしくはＳｅｒ＋１６９に変異させて触媒効率が変化した変異サブチリシンを製造する方法。」
２．特許請求の範囲の請求項２〜５を、特許請求の範囲の減縮を目的として、削除する。
（５４）【発明の名称】
変異サブチリシンを製造する方法
（５７）【特許請求の範囲】
　１．変化した活性を有する変異サブチリシンを製造する方法であって、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）サブチリシンまたはそのプレ酵素あるいはプレプロ酵素
のＭ
または
９に
の位
により、それぞれ
　Ｓｅｒ＋２２２もしくはＡｌａ＋２２２に変異させて酸化安定性の増強した変異サブチリシンを製造するか、またはＣｙｓ＋２２２に変異させて至適ｐＨの変化した変異サブチリシンを製造するか、あるいは
　Ａｌａ＋１６６もしくはＬｙｓ＋１６６に変異させて触媒効率が変化した変異サブチリシンを製造するか、またはＡｓｐ＋１６６、Ｇｌｕ＋１６６もしくはＡｓｎ＋１６６に変異させて基質特異性が変化した変異サブチリシンを製造するか、あるいは
　Ａｌａ＋１６９もしくはＳｅｒ＋１６９に変異させて触媒効率が変化した変異サブチリシンを製造する方法
【発明の詳細な説明】
　本発明は、適当な宿主中での組換え技術を用いた蛋白質の生産およびその処置に関するものである。さらに詳しくは、本発明はサブチリシンおよび中性プロテアーゼのような原核生物の（原核性）プロテアーゼを組換え微生物宿主を用いて生産する方法、微生物宿主により外来性蛋白質を合成させる方法、および酵素類の特性を改良するための、該酵素の方向づけられた変異誘発法に関するものである。
　
本発明の背景
　多くの細菌類は、そのライフサイクルのある時期においてプロテアーゼを分泌することは知られている。桿菌類（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は２つの主要な細胞外プロテアーゼ、中性プロテアーゼ（ＥＤＴＡにより阻止されるメタロ（金属）プロテアーゼ）およびアルカリ性プロテアーゼ（即ちサブチリシン、セリン・エンドプロテアーゼ）を生産する。この両者は、その培養物が指数増殖期を過ぎ、定常期に入って胞子形成を開始すると、最も多量に生産される。これらの２つのプロテアーゼの生理学的役割は明らかでない。それらは、胞子形成において役割を果たしている（Ｊ．Ｈｏｃｈ，１９７６，“Ａｄｖ．Ｇｅｎｅｔ．”
１８
４０
４１
１４１
　サブチリシンは工業および商業的な応用範囲が非常に広い（米国特許第３６２３９５７およびＪ．Ｍｉｌｌｅｔ，１９７０，“Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔ．”
３３
　
先行技術
　照射および化学物質などの試剤および手段によって細菌を変異誘発させる典型的な方法により、プロテアーゼの分泌が起こる増殖期、そのタイミングおよび分泌されたプロテアーゼの活性レベルについて異なった性質を示す多血症のミュータント株が生産される。しかし、その変異誘発過程が基本的に不規則であり、所望の性質に近づいた微生物を同定するのに必要な選択およびスクリーニング法が冗長であるため、これらの株はその究極的な潜在能力に近づいていない。さらにこれらのミュータントはその親株、即ち野生型株に復帰することができる。このような場合には所望の性質は失われてしまう。不規則な変異誘発によって処理した場合、ミューテーションのタイプや部位は解からないか、あるいはほとんど特性化できないので、復帰の可能性も解からない。このことは酵素合成細菌に基づく工業的生産に著しい不安定を付与することになる。最後に、古典的な変異誘発法は、過度の未熟溶菌のような望ましくない性質を、例えばプロテアーゼレベルの低下のような望ましい表現形質と共に表すことが多い。
　桿菌類によって分泌されるプロテアーゼに関しては特別の問題が存在している。その１つは、そのようなプロテアーゼは少なくとも２種存在しているので一方のみの欠落をスクリーニングすることが難しいことである。さらに、胞子形成およびプロテアーゼ生産の両者に影響を与える多数の多形質発現ミューテーションは、真のプロテアーゼミューテーションの分離を困難にする。
　中性プロテアーゼ遺伝子の温度感受性ミュータントが通常の変異誘発技術により得られており、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓのクロモゾーム（染色体）中の調節および構造遺伝子の位置を決めるのに使用されている（Ｈ．Ｕｅｈａｒａら１９７９，“Ｊ．Ｂａｃｔ．”
１３９
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　不活性なセリンプロテアーゼまたは非常に減少した濃度のセリンプロテアーゼを生産する桿菌の温度感受性ミュータントが単離されている。しかしこれらのミュータントは無胞子性であり、約１０−７〜１０−８の野生型への復帰頻度を示す（Ｆ．Ｐｒｉｅｓｔ同上７１９頁）。これらのミュータントは外来性蛋白質の組換体による生産には不適当である。と言うのは、無胞子性ミュータントは胞子形成ミュータントより最少培地中でのその増殖サイクルの初期の段階において溶菌する傾向があり、そのため細胞内容物（細胞内プロテアーゼを含む）が培養上清中に未成熟で放出されるからである。野生型復帰体は培養上清を、それが分泌したプロテアーゼで汚染するので、復帰の可能性を有することも望ましくない。
　桿菌類（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）は外来性蛋白質の発現用として提案されたが、分泌されたプロテアーゼが存在し、所望の生産物がそれによって強力に加水分解されるため、外来性蛋白質発現のための宿主として桿菌類を商業的に受け入れることが遅れてきた。胞子形成をすることができ、増殖期に胞子形成に関連してプロテアーゼを発現しないＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍミュータントが報告されている。しかし採用された分析法は他のプロテアーゼ類の存在を除外しなかったし、問題のプロテアーゼは胞子形成期には発現される（Ｃ．Ｌｏｓｈｏｎら１９８２，“Ｊ．Ｂａｃｔ．”
１５０
　
本発明の目的
　本発明の目的は、増殖サイクルのあらゆる時点において細胞外中性およびアルカリ性プロテアーゼを実質的に含んでおらず、実質的に正常な胞子形成特性を示す桿菌株を組立てることである。外来性（ヘテロローガス）または内性（ホモローガス）の蛋白質を発現するためのコピー数の高いプラスミドで形質転換し得る復帰不能の微生物、さもなくば正常なプロテアーゼを含んでいない微生物が要求されている。
　入手し得るストックのものとは異なる性質を持った酵素類が要求されている。特に、強力な酸化安定性を有する酵素類は、洗濯物に使用されるプロテアーゼの漂白適合性および貯蔵寿命を延ばすのに有用であろう。同様に、酸化安定性の低いものは、酵素活性の迅速なかつ効率的な消滅を必要とする工業的生産において有用であろう。
　酵素のｐＨ活性プロフィルを改良することは、その酵素を各種のプロセスにおいてより有効にするのに役立つであろう。例えばプロテアーゼのｐＨ活性プロフィルを拡げれば、アルカリ性および中性の洗濯物の両者に適した酵素が得られるであろう。このプロフィルを狭くすると、特に修正した基質特異性と一緒にすると、酵素は混合物中でより適合性のあるものとなるであろう（後述）。
　原核生物のカルボニル水解酵素（原核性カルボニル水解酵素）（基本的にはプロテアーゼであるがリパーゼも含む）を突然変異させると、多種多様の水解酵素、特にＫｍ、Ｋｃａｔ、Ｋｍ／Ｋｃａｔ比および基質特異性において改良された特性を持ったものが得られる。これらの酵素は、例えばペプチド製造あるいは洗濯に使用するなどの加水分解工程において存在すると予測される特定の基質用に修正することができる。
　酵素の科学的な改変は知られている。例えばＩ．Ｓｃｉｎｄｓｅｎ，１９７６，“Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．”
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　ｃｙｓ残基をセリンに変換することからなる、ｔＲＮＡ合成酵素の予定された、部位指定性の変異誘発法が報告されている（Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒら１９８２，“Ｎａｔｕｒｅ”）
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本発明の要約
　本明細書には、組換え宿主細胞中でサブチリシンおよび中性プロテアーゼのような原核生物のカルボニル水解酵素（カルボニルヒドロラーゼ）を生産する方法が記載されており、この方法はプロ、プレ、またはプレプロ型のこれらの酵素を含む所望のサブチリシンまたは中性プロテアーゼを暗号化している配列を含んだ発現ベクターを使って宿主を形質転換し、その宿主を培養し、所望の酵素を回収するものである。この暗号配列は後に詳述するように、天然のものと正確に対応している場合もあり、生産される蛋白質に望ましい性質を付与する改良部分を含んでいる場合もある。
　次いでこの新規な株をこのような操作をしなければその宿主株中で発現されないポリペプチドを暗号化している少なくとも１つのＤＮＡ部分で形質転換し、その形質転換された株を培養し、ポリペプチドをその培養物から回収する。このＤＮＡ部分は、真核生物（酵母または哺乳動物）の蛋白質を暗号化しているＤＮＡであってもよいが、通常は宿主桿菌遺伝子の方向づけられたミュータントである。この新規な株はまた、その宿主ゲノム以外の起源由来の細菌性遺伝子から発現される蛋白質、あるいはこれらの外来性遺伝子またはその宿主ゲノムからのホモローガス遺伝子を発現するベクターのための宿主としても役立つ。後者の場合、中性プロテアーゼまたはサブチリシンを含んでいないアミラーゼのような酵素が得られる。さらに、酵素的に活性なサブチリシンを含んでいない中性プロテアーゼを培養で得ることができ、またその逆も可能である。
　原核生物のカルボニル水解酵素のためのクローンした遺伝子をコピー数の高いプラスミドに結合させ、親細胞に比べてはるかに高い収率でこの酵素を合成することができる。本明細書においてはまた、水解酵素の改変型を開示しており、これにはプロおよびプレプロチモーゲン型の酵素、そのプレ型、および方向づけられたそのミューテーションが含まれている。
　蛋白質の暗号領域内のあらゆる部位において多数のミューテーションを迅速かつ効率的に生成させ得る飽和変異誘発のための好適な方法は以下の工程からなる：
　（ａ）前駆体（プレカーサー）蛋白質の少なくとも一部を暗号化しているＤＮＡ部分を得、
　（ｂ）その部分内の領域を同定し、
　（ｃ）その領域内にすでに存在しているヌクレオチドをヌクレオチドで置き換えてその部分に特殊な少なくとも１種の制限酵素部位を作り、これにより、発現されたときにその領域によって暗号化されているアミノ酸を変えることなく、その同定された領域に対する特殊な制限部位を５’および３’に利用できるようにし、
　（ｄ）５’および３’末端に工程（ｃ）で導入された制限酵素部位とアニーリングすることができる配列を含んでおり、該ＤＮＡ部分に結合させた場合、該前駆体蛋白質が、その内部における少なくとも１個のアミノ酸が置換、欠落（切除）および／または挿入された形で発現されるような複数のオリゴヌクレオチドを合成し、
　（ｅ）その特異な部位を開裂し得る制限酵素で工程（ｃ）のＤＮＡ部分を消化し、そして、
　（ｆ）工程（ｄ）のオリゴヌクレオチドのそれぞれを工程（ｅ）の消化した部分に結合させ、複数のミュータントＤＮＡ部分を得る。
　上記の方法またはその他の既知の方法により、原核生物のカルボニル水解酵素を暗号化している分離したＤＮＡにミューテーションを導入すると、そのＤＮＡを発現した場合、水解酵素の予定された部位に少なくとも１個のアミノ酸の置換、欠落（切除）または挿入が起こる。この方法は野生型蛋白質のミュータントを作成するのに（この場合、「前駆体」蛋白質は野生型である）またはミュータントを野生型に返すのに（この場合「前駆体」はミュータントである）有用である。
　前駆体酵素と異なる酸化安定性および／またはｐＨ活性プロフィルを示すミュータント酵素を回収する。このようにして種々のＫｍ、Ｋｃａｔ、Ｋｃａｔ／Ｋｍ比を持ち、基質特異性を有する原核生物カルボニル水解酵素が得られる。
　本発明方法によって得られるミュータント酵素を、常法により界面活性剤や洗浄剤と混合し、洗剤工業あるいはその他の洗浄技術分野において有用な新規な組成物を得ることができる。
　
図面の説明
　第１は機能的Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　サブチリシン遺伝子の配列を示す模式図である。
　第１図のＡにおいてはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　ゲノムの１．５ｋｂフラグメント上に、プロモーターおよびリボソーム結合部位を含んだＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのための全機能配列が存在している。
　第１図のＢはその暗号鎖のヌクレオチド配列を、蛋白質のアミノ酸配列と関連させて示している。そのＤＮＡ配列のプロモーター（ｐ）、リボソーム結合部位（ｒｂｓ）および終止（ｔｅｒｍ）領域も示されている。
　第２図はプール１（パネルＡ）およびプール２（パネルＢ）でそれぞれプローブした純化陽性クローンのレプリカ・ニトロセルロース・フィルターの結果を示すグラフである。
　第３図はサブチリシン発現プラスミド（ｐＳ４）の制限分析を示している。ｐＢＳ４２ベクター配列（４．５ｋｂ）は実線で、挿入配列（４．４ｋｂ）は点線で示してある。
　第４図はｐＢＳ４２およびｐＳ４で形質転換した培養物からの上清について行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示すグラフである。
　第５図はシャトルベクターｐＢＳ４２の構成を示している。
　第６図はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓサブチリシン遺伝子を含む配列の制限地図を示す模式図である。
　第７図は機能的なＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓサブチリシン遺伝子の配列を示す模式図である。
　第８図はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓサブチリシン遺伝子の欠失ミュータントを得るための組立法を示す模式図である。
　第９図はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ遺伝子の制限地図を示す模式図である。
　第１０図はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を示す模式図である。
　第１１図はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ遺伝子を含んでいるベクターの組立を示す模式図である。
　第１２、１３および１６図は本発明方法による変異誘発技術の具体例を示す模式図である。第１２図中、１は野生型のＤＮＡ配列、２はΔｐ２２２ＤＮＡ配列、３はＫｐｎＩおよびＰｓｔＩで切断されたΔｐ２２２、４はオリゴヌクレオチドプールと結合した切断Δｐ２２２を示す。第１３図中、１は野生型ＤＮＡ配列、２はΔｐ１６６、３はＳａｃＩおよびＸｍａＩＩＩで切断したΔｐ１６６、４はオリゴヌクレオチドプールに結合させた切断Δｐ１６６を示す。第１６図はＧ−１６９飽和変異誘発を示しており、１は野生型ＤＮＡ配列、２はΔｐ１６９ＤＮＡ配列、３はＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＶで切断したΔｐ１６９、４はオリゴヌクレオチドプールに結合させた切断Δｐ１６９を示す。
　第１４図はサブチリシンミュータントの強化された酸化安定性を示すグラフである。図中、ＡはＡｌａ−２２２ミュータント、ＣはＣｙｓ−２２２ミュータント、●はＭｅｔ−２２２（ＷＴ）を示す。
　第１５図は野生型酵素と比較した場合のサブチリシンミュータントのｐＨ活性プロフィルの変化を示すグラフである。○はＣ−２２２、●はＷＴである。
　
詳細な説明
　原核生物のカルボニル水解酵素は、Ｏ＝Ｃ−Ｘ結合（Ｘは酵素または窒素）を含んでいる化合物を加水分解する酵素である。これらには、基本的に加水分解酵素、例えばリパーゼ、およびペプチド加水分解酵素、例えばサブチリシンまたはメタロプロテアーゼなどが含まれる。ペプチド加水分解酵素には、α−アミノアシルペプチドヒドロラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノヒドロラーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、チオールプロテイナーゼ、カルボキシルプロテイナーゼおよびメタロプロテイナーゼなどが含まれる。セリン、メタロ、チオールおよび酸プロテアーゼも、エンドおよびエキソプロテアーゼと同様に含まれる。
　サブチリシンは通常、蛋白質またはペプチドの内部ペプチド結合を開裂させるセリンプロテイナーゼである。メタロプロテアーゼは活性を現わすのに金属イオンのコファクター（副因子）が必要なエキソまたはエンドプロテアーゼである。
　サブチリシンや中性プロテアーゼには多数の天然のミュータントが存在しており、これらは全て出発遺伝子材料のソースとして同等の効果で使用することができる。
　これらの酵素およびその遺伝子は多くの原核生物から入手できる。好適な例はグラム陰性の微生物、例えばＥ．ｃｏｌｉまたはシュードモナスおよびグラム陽性菌、例えばマイクロコッカスまたは桿菌（バチルス）である。
　カルボニル水解酵素を暗号化している遺伝子は本明細書の一般的な方法に従って得ることができる。実施例から明らかなように、この方法は、問題の水解酵素領域を暗号化している推定配列を持った標識したプローブを合成し、この水解酵素を発現する微生物からゲノムライブラリーを調製し、そしてプローブに対するハイブリダイゼーションにより、問題の遺伝子についてこのライブラリーをスクリーニングすることからなる。次いで陽性のハイブリダイズしたクローンを位置づけ、配列を決定する。クローンした遺伝子を、宿主中での複製に必要な領域を持った発現ベクター（これもクローニングベクターであってよい）に結合させ、そのプラスミドを宿主にトランスフェクトして酵素を合成させ、その組換え宿主細胞を酵素合成に有利な条件下で、通常抗生物質の存在により与えられる選択圧の下で（これに対する耐性はベクターにより暗号化されている）で培養する。このような条件下で培養すると、形質転換されるのが親の微生物であっても、その野生型の親の微生物の酵素合成よりもはるかに高い効率で酵素が生産される。
　「発現ベクター」とは、適当な宿主中でＤＮＡを発現させ得る適当なコントロール（調節）配列に機能的に結合している（ｏｐｅｒａｂｌｙ　ｌｉｎｋｅｄ）ＤＮＡ配列を含有しているＤＮＡ構成物を意味する。このようなコントロール配列には転写を司るプロモータ、このような転写を調節する、場合により存在するオペレータ配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合サイトを暗号化している配列および転写および翻訳の終了を支配する配列などが含まれる。ベクターはプラスミド、ファージ粒子または単に潜在的なゲノム挿入物であってよい。ベクターを適当な宿主に導入すると、このベクターは複製することができ、宿主ゲノムとは独立に機能し、またある場合にはそのゲノム自体に組み込まれることもある。本明細書において「プラスミド」と「ベクター」とは交換可能に使用することがある。それはプラスミドは現在において最も普通に使用されるベクターの形態であるからである。しかし、本発明は同等の機能を営む現在知られている、あるいは将来知られるであろう発現ベクターのあらゆる形をも包含するものである。
　「組換え宿主細胞」とは、組換えＤＮＡ技術を使って組立てられたベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を意味する。本発明においては、組換え宿主細胞は、原核生物のカルボニル水解酵素を暗号化している発現ベクターによって形質転換されたものであるので、その水解酵素を種々の形で生産するものを意味する。この組換え宿主細胞は形質転換前に１つの形のカルボニル水解酵素を生産したものであってもよく、また、生産しなかったものであってもよい。
　「機能的に結合」という用語を２つのＤＮＡ領域の関係について用いる場合、それらが互いに機能的に関連し合っていることを意味する。例えば１つのプレ配列を、もしそれが信号配列として機能するならば、ペプチドと機能的に結合させると、これは蛋白質の成熟型の分泌に関与しほとんどの場合、信号配列の開裂に関係する。プロモーターを暗号配列に機能的に結合させると、それはその暗号配列の転写を支配する。リボソーム結合サイトは、それを翻訳可能なように位置づけると、それは暗号配列と機能的に結合されたことになる。
　「プロヒドロラーゼ」とは、酵素を不活性化する追加のＮ末端アミノ酸残基を含んでいる水解酵素であって、その残基が除去されたとき酵素となる水解酵素を意味する。多くの蛋白質分解酵素は変換性プロ酵素産物として天然に存在し、ポスト−翻訳産物が存在しないとこの形で発現される。
　「プレ配列」とは、水解酵素の分泌に関与する、水解酵素のＮ末端部分に結合したアミノ酸の信号配列を意味する。プレ配列も、本明細書に記載した同じ方法で改変してもよく、これには予定したミューテーションを導入することが含まれる。水解酵素と結合すると、目的とする蛋白質は「プレヒドロラーゼ」になる。従って、本発明の目的に叶うプレヒドロラーゼはプレサブチリシンおよびプレプロサブチリシンである。プレヒドロラーゼは、プレプロ暗号領域から、「プロ」配列（あるいは酵素を不活性な状態に維持する、そのプロ配列の少なくともその部分）を削除し、次いでそのプレヒドロラーゼを発現させることにより生産される。このようにすると生物はプロ酵素ではなく活性酵素を分泌する。
　このクローンしたカルボニルヒドロラーゼを使って、その水解酵素を発現させるために宿主細胞を形質転換する。既述したように、洗濯物におけるサブチリシンのように、水解酵素がその改変されない形で工業的に使用し得る場合には、このことは興味ある事実である。好ましい実施態様では、ヒドロラーゼ遺伝子はコピー数の高いプラスミドに結合させる。このプラスミドは宿主中で、それが以下に述べるようなプラスミドの複製に必要なよく知られた要素を含んでいるという意味において複製される：問題の遺伝子に機能的に結合したプロモーター（これは、もしそれが認識されるならば、すなわち宿主細胞によって転写されるならば、その遺伝子自身のホモローガスプロモーターとして供給されてもよい）、転写終了およびポリアデニル化領域（宿主細胞によって転写されたｍＲＮＡの、そのヒドロラーゼ遺伝子に対する安定性のために必要である）（これは外来性であるかまたはそのヒドロラーゼ遺伝子の内性終止領域によって供給される）および望ましくは抗生物質含有培地中で、プラスミドで感染された宿主細胞の増殖を連続的に維持し得る抗生物質耐性遺伝子のような選択遺伝子。コピー数の多いプラスミドは、また宿主のための複製起源を含んでおり、これにより染色体の制限を受けることなく細胞質内で多数のプラスミドが生成する。しかし、ヒドロラーゼ遺伝子の複数のコピーを宿主ゲノムに組込むことも本発明の範囲に含まれる。これはホモローガスな組換えに特に感受性のある細菌株によって促進される。得られた宿主細胞は組換え宿主細胞と呼ばれる。
　カルボニルヒドロラーゼ遺伝子をクローンしたら、その遺伝子の用途を野生型または前駆体酵素の合成を凌駕して強化するために種々の改変を行う。前駆体酵素は、本明細書に記載した方法で改変する前の酵素である。通常この前駆体は、この方法に従って改変されたＤＮＡを付与した微生物によって発現される酵素である。本発明でいう「前駆体」とは、前駆体酵素それ自体を操作することにより生成酵素を作る時の前駆体を意味するものではないと解すべきである。
　この改変の最初のステップとして、ホモローガス遺伝子を含んでいる組換え陽性（ｒｅｃ＋）微生物からその遺伝子を削除してもよい。これはクローンした遺伝子のインビトロ欠失ミューテーションを微生物のゲノムと組換えることにより達成することができる。Ｅ．ｃｏｌｉや桿菌のように多くの微生物株が組換え可能であることが知られている。必要なのは、候補宿主のホモローガス領域と組換えられる欠失ミュータントからの残りのＤＮＡの領域である。この欠失は暗号領域内であってもよく（酵素的に不活性なポリペプチドを残す）あるいはまたホモローガスな境界領域（例えばプロモーターまたは終止領域）が宿主に存在する限りは全暗号領域を含んでいてもよい。宿主が欠失ミュータントとの組換えを受け入れたかどうかは、形質転換された表現形質の欠失についてスクリーニングすることにより決定される。これは、カルボニルヒドロラーゼの場合には、本来水解酵素によって加水分解される染色体性の基質を開裂する能力を失っているかどうかを宿主培養物について分析することにより容易に達成することができる。
　プロテアーゼ欠失ミュータントを含んだ形質転換宿主は、蛋白質分解酵素と適合しない生産物を合成するのに有用である。このような宿主は、ここに記載した欠失プロテアーゼを分泌することはできないが、事実上正常に胞子形成を行う。さらに、この形質転換体のその他の増殖特性は親の微生物と実質的に同じである。このような微生物は、その親細胞よりも外来性蛋白質の不活性化において活性が低く、そしてこれらの宿主は、既知のプロテアーゼ欠失微生物よりも優れた増殖特性をも持っているという点で有用である。しかし、本発明方法に従って中性プロテアーゼおよびサブチリシンを欠失させるということは、桿菌のすべての蛋白質分解活性を除去するということではない。通常細胞外には分泌されない細胞内プロテアーゼは培養の後期には「漏れ」たりまたはその細胞から拡散すると考えられている。これらの分子内プロテアーゼは、それらの酵素がここで定義されているように、サブチリシンまたは中性プロテアーゼであってもよく、そうでないかもしれない。従って本発明の新規な桿菌株は、通常その親株において細胞外に分泌されるサブチリシンおよび／または中性プロテアーゼ酵素を分泌することができない。「できない」とは野生型に復帰しないことを意味する。復帰は従来知られているプロテアーゼを欠落した天然株に関して存在している有限の可能性である。というのは、このような株の表現形質は容易に復帰し得るミューテーション、例えば点変異の関数ではないという保証はないからである。これを本発明で提供する極めて大きな欠失と比較すべきである。
　本発明に係る欠失ミュータント−形質転換宿主細胞は、第１図，第７図または第１０図に示した遺伝子と実質的に相同であると定義される遺伝子であって、酵素的に活性な中性プロテアーゼまたはサブチリシンを暗号化している遺伝子を含んでいない。「相同」な遺伝子は、第１，７または１０図に示した遺伝子と、極めて厳密な条件下でハイブリダイズし得る暗号領域を含んでいる。
　カルボニルヒドロラーゼ欠失ミュータントを含んでいる微生物株は２つの基本的なプロセスにおいて有用である。１つの態様では、通常宿主によって発現される、その欠失遺伝子によって暗号化された蛋白質で汚染されていないことが望ましい生産物を発酵生産するのに好都合である。１つの例はアミラーゼの発酵合成であり、この場合不純物としてのプロテアーゼがアミラーゼの工業的使用において各種の妨害をする。本発明に係る新規な株は、このような生産物から夾雑カルボニルヒドロラーゼを除去するという負担を軽減させるものである。
　２番目の重要な実施態様では、サブチリシンおよび中性プロテアーゼ欠失−ミュータント株は、本来その株によって暗号化されていない蛋白質を合成するのに有用である。これらの蛋白質は２つのクラスの何れかである。最初のクラスは宿主のそれと実質的な形質転換前の相同性を示さない遺伝子によって暗号化されている蛋白質からなる。これらはその他の原核生物からの蛋白質であってもよいが、しかし通常は、酵母または高等な真核生物、特に哺乳類からの真核性蛋白質である。発現されたホモローガスでない蛋白質を原核生物が分解する可能性が減少するので、本発明に係る新規な株は、そのような蛋白質を暗号化している遺伝子を含有している発現可能なベクターのための有用な宿主として役立つのである。
　第２のグループは、宿主のそれと実質的に形質転換前相同性を示すミュータント宿主遺伝子からなる。これには微生物のもの（レンニン、例えばムコール属からのレンニン）と同様、サブチリシンおよび中性プロテアーゼのような原核生物のカルボニルヒドロラーゼのミューテーションが含まれる。これらのミュータントは、工業的に使用するための前駆体酵素の性質を改善するために選択される。
　本発明方法はこのようなミュータントの組立ておよび同定を行う新規な方法を提供するものである。まず、ヒドロラーゼを暗号化している遺伝子を得、その全部あるいは一部の配列決定を行う。次いでその配列を精査して、発現される酵素の１もしくはそれ以上のアミノ酸のミューテーション（削除、挿入または置換）を作成するのに望ましい場所を決定する。この点に接している配列に、発現されたときに各種のミュータントをコードすることになるオリゴヌクレオチドプールでその遺伝子の短いセグメント（断片）を置換するための制限サイトが存在しているかどうかを評価する。選択された点から好適な距離（１０〜１５ヌクレオチド）内の場所に特異な制限部位は通常存在しないので、その遺伝子のヌクレオチドを、最終的な組立て物において解読枠も暗号化されているアミノ酸も変化しないように、置換することによってそのような部位を生成させる。好適な隣接領域の位置づけ、および必要な変化を評価して２つの特異な制限部位配列に到達するための仕事は、遺伝暗号の重剰性、その遺伝子の制限酵素地図および多数の異なった制限酵素によって常法通り行う。もし、偶然に１つの隣接する特異な制限部位が利用できるような場合には、上の方法はその部位を含有してない隣接領域に関してのみ使用する。
　その配列を変化させ所望の配列にするための遺伝子のミューテーションは、常套の方法に従ってＭ１３プライマーエクステンション（延長）によって行う。この遺伝子をクローンしたら、それを特異な制限酵素で消化し、多数の最終的な末端相補性オリゴヌクレオチドカセットをその特異な部位に結合させる。オリゴヌクレオチドは全て同じ制限部位を持つように合成することができ、かつ、制限部位を作成するのに合成リンカーが必要でないので、この方法によって変異誘発が極めて単純化される。
　問題の遺伝子中に存在していない部位を持った市販の制限酵素の数は非常に多い。適当なＤＮＡ配列コンピューターサーチ・プログラムを使用すれば潜在的な５’および３’特異隣接部位を見出すのが簡単になる。基本的な制約は、制限部位の作成で導入されるミューテーションは全て最終的に組立てられたアミノ酸暗号配列に対してサイレントでなければならないということである。標的コドンに対して５’の候補制限部位については、配列は、その候補酵素の切断に対して５’の認識配列中に少なくとも、１つを除く全てのヌクレオチドを含んでいる遺伝子内に存在していなければならない。例えば、もし近くの５’配列がＮＣＣ、ＣＮＣまたはＣＣＮを含んでいるならば、平滑切断酵素ＳｍａＩ（ＣＣＣ／ＧＧＧ）が５’候補となるだろう。さらに、もしＮをＣに変えなければならない場合、この変換はアミノ酸暗号配列を無傷にしておかなければならない。制限部位を導入するのに永久的なサイレントミューテーションが必要な場合、滅多に使用しないコドンの導入を避けたいと考えるであろう。ＳｍａＩについての同様の状況が、配列ＮＧＧ、ＧＮＧ、またはＧＧＮが存在しなければならないことを除いて３’隣接部位に適用される。候補酵素を位置づけるためのこの制限は、平滑切断酵素については最も緩和であり、４塩基突き出し酵素については最も厳格である。一般に多くの候補部位を利用することができる。ここに述べたコドン−２２２標的については、ＫｐｎＩ部位から１塩基対５’にＢａｌＩ部位（ＴＧＧ／ＣＣＡ）を手術することができた。３’ＥｃｏＲＶ部位（ＧＡＴ／ＡＴＣ）はＰｓｔＩ部位に向かって１１塩基対５’を使用することができた。平滑末端から４塩基突き出しに渡る末端を持ったカセットは容易に機能するであろう。回顧すると、この仮定のＥｃｏＲＶ部位は使用したオリゴヌクレオチドカセットを極めて短くし（９および１３塩基対）、かくして純度を上げプールバイアスの問題を低くしたことであろう。オリゴヌクレオチドカセットの結合が一方向に保証され得るように隣接部位はそれ自体が結合できないものを選択すべきである。
　ミューテーション自体は予め決定する必要はない。例えばオリゴヌクレオチドカセットまたはフラグメントはニトロソグアニジンあるいはその他の突然変異誘発物質で無秩序に変異誘発させ、それを予め決められた場所でヒドロラーゼ遺伝子に結合させる。
　適当な宿主に形質転換することによって発現されたミュータントカルボニルヒドロラーゼは、所望の特性、例えば基質特異性、酸化安定性、ｐＨ活性プロフィルなどを示す酵素についてスクリーニング（選択）する。
　基質特異性の変化は、前駆体酵素のＫｃａｔ／Ｋｍ比とそのミュータントのそれとの違いによって決められる。Ｋｃａｔ／Ｋｍ比は触媒効率の大きさを現している。Ｋｃａｔ／Ｋｍ比が増加または減少した真核生物のカルボニルヒドロラーゼについては実施例に記載してある。一般に目的とするところは、与えられた基質に対して大きなＫｃａｔ／Ｋｍ比（数字で言えば大きな比）を持ったミュータントを確保することであり、これによって標的基質に対して酵素をより効率よく使用することができるのである。ある基質に対してＫｃａｔ／Ｋｍ比が増加すると別の基質に対するＫｃａｔ／Ｋｍ比が減少するということがある。これは基質特異性のシフトであり、このようなシフトを示すミュータントは、前駆体が望ましくない場合に利用価値があり、例えば基質混合物中の特定の基質の望ましくない加水分解を防止することができる。
　ＫｃａｔおよびＫｍは既知の方法あるいは実施例１８に記載の方法に従って測定する。
　酸化安定性は、実施例に記載したミュータントによって達成されるもう１つの目標である。この安定性は各種の使用目的に応じて強化したり減少したりすることができる。安定性は１もしくはそれ以上のメチオニン、トリプトファン、システインまたはリジン残基を削除し、場合によりメチオニン、トリプトファン、システインまたはリジンの１つではない他のアミノ酸残基で置換えることにより強化される。その反対の置換を行うと酸化安定性が減少する。置換された残基は好ましくはアラニルであるが中性残基も好適である。
　改変されたｐＨ活性プロフィルを示すミュータントも得られる。ｐＨ活性プロフィルは酵素活性に対するｐＨのプロットであり、実施例１９に例示したように、あるいは既知の方法で作成することができる。より広いプロフィルを持ったミュータント、すなわちあるｐＨにおいてその前駆体よりも強い活性を有するが、如何なるｐＨにおいても顕著に強い活性を示さないミュータントあるいはより鋭いプロフィルを持ったミュータント、すなわちある一定のｐＨではその前駆体と比べて強い活性を有するがその他のｐＨではより低い活性を持ったミュータントを得るのが好ましい。
　上記のミュータントは好ましくはその酵素の活性部位内で調製する。と言うのはこれらのミューテーションは活性に最も影響を与えそうであるからである。しかし酵素の安定性または形態にとって重要なその他の部位でのミュータントも有用である。桿菌のサブチリシンまたはそのプレ、プレプロおよびプロ型の場合、チロシン−１、アスパルテート＋３２、アスパラギン＋１５５、チロシン＋１０４、メチオニン＋２２２、グリシン＋１６６、ヒスチジン＋６４、グリシン＋１６９、フェニルアラニン＋１８９、セリン＋３３、セリン＋２２１、チロシン＋２１７、クルタメート＋１５６および／またはアラニン＋１５２におけるミューテーションによって上記の特性またはその酵素のプロセシングにおいて変化したミュータントが得られる。これらのアミノ酸の位置番号は第７図から明らかなように、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのサブチリシンに対して決められたものである。削除または挿入を行うと与えられた位置からＮ末端方向において対応するアミノ酸の位置がシフトし、残部はその元の位置すなわち野生型の位置番号を取らなくなることは理解されるであろう。また、対立遺伝子の違いおよび各種の原核生物種の中での変動によって位置のシフトが起こり、従ってそのようなサブチリシンの位置１６９はグリシンでは占められなくなるであろう。このような場合グリシンの新しい位置は、グリシン＋１６９という定義で表わされ、その範囲に包含される。グリシン＋１６９に対する新しい位置は第７図のグリシン＋１６９に相同な領域について問題のサブチリシンを精査することにより容易に同定される。
　１もしくはそれ以上のアミノ酸残基、通常約１０個までのアミノ酸残基を変異させ得る。しかし商業的な実際性を除けばミューテーションの数に制限はない。
　本発明の酵素は塩の形で得ることもできる。蛋白質のイオン化状態は、もしそれが溶液中にある場合は、その周囲の媒質のｐＨに依存し、もしそれが固状の形である場合はそれが調製された溶液のｐＨに依存することは明らかである。酸性の蛋白質は通常、例えばアンモニウム塩、ナトリウム塩またはカリウム塩として調製され、塩基性蛋白質は塩酸塩、硫酸塩または燐酸塩として調製される。従って、本発明はカルボニルヒドロラーゼの電気的に中性のもの、および塩の形のものの両者を含み、カルボニルヒドロラーゼという用語はイオン化状態に関係なく有機化学の基本的な構造をさすものとする。
　本発明のミュータントは特に食品加工および洗浄技術において有用である。ミュータントを包含するこのカルボニルヒドロラーゼは本明細書に記載した発酵法により製造され適当な記述で回収される（例えば、Ｋ．Ａｎｓｔｒｕｐ，１９７４，Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｅｄ．Ｂ．Ｓｐｅｎｃｅｒ　２３−４６頁参照）。これらは自体既知の方法で洗剤または他の界面活性剤と共に製剤化され、工業的過程、特に洗剤技術において使用される。後者の場合、この酵素は蛋白質分解酵素の分野でよく知られているように洗剤、ビルダー、漂白剤および／または蛍光漂白剤と混合する。好適な洗剤には直鎖状アルキルベンゼンスルホネート、アルキルエトキシ化サルフェート、硫酸化直鎖状アルコールまたはエトキシ化直鎖状アルコールなどが含まれる。この組成物は粒状または液状に製剤化することができる（例えば米国特許３６２３９５７号、４４０４１２８号、４３８１２４７号、４４０４１１５号、４３１８８１８号、４２６１８６８号、４２４２２１９号、４１４２９９９号、４１１１８５５号、４０１１１６９号、４０９０９７３号、３９８５６８６号、３７９０４８２号、３７４９６７１号、３５６０３９２号、３５５８４９８号および３５５７００２号参照）。
　以下に本発明の実施態様を記載するが本発明はこれによって限定されるものと解釈してはならない。
　
実験操作における用語の解説
　実施例を簡単にするために、度々使用する方法は簡単な用語によって表わす。
　プラスミドは大文字および／または数値を前および／または後に付けた小文字のｐで表わす。本発明で使用する出発プラスミドは市販されているか、無制限に利用可能であるか、あるいはそのような入手可能なプラスミドから既知の方法に従って組立てることができる。
　「Ｋｌｅｎｏｗ　処置」とは、２本鎖ＤＮＡの凹んだ３’末端を、ヌクレオチドに相補的なデオキシリボヌクレオチドで満たして、そのＤＮＡ鎖の突出した５’末端を作成する過程を言う。この方法は通常ＤＮＡの制限酵素開裂によって生成した凹んだ末端を満たすのに使われる。これによってその後の結合に必要な平滑末端が作られる。Ｋｌｅｎｏｗ　処置は、触媒的に活性な量の（通常１０単位）Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（「Ｋｌｅｎｏｗ」）の存在下、満たすべきＤＮＡと適当な相補的デオキシリボヌクレオチドと反応させることにより（通常１５℃で１５分間）達成される。Ｋｌｅｎｏｗおよびその他の必要な試薬は市販されている。この方法については多数の報告がある（例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら１９８２　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１０７−１０８頁参照）。
　ＤＮＡの「消化」とは、そのＤＮＡのある部位だけに作用する酵素によってそのＤＮＡを触媒的に開裂することをいう。このような酵素は制限酵素と呼ばれ、それぞれの酵素に特異な部位を制限部位と呼ぶ。「部分的」消化とは制限酵素による不完全な消化を意味し、ＤＮＡ基質中の、与えられた制限エンドヌクレアーゼの開裂部位の幾つかが開裂されるが、全てが開裂されないような条件を選んで行われる。本発明で使用した各種の制限酵素は市販されており、その反応条件、コファクターおよびその他の必要な事項は、その酵素の供給者によって確立されたものを使用した。制限酵素は通常、大文字およびそれに続くその他の文字および通常その制限酵素が初めて得られた微生物を表わす番号で構成される略号によって表わされる。通常、約１μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、約２０μｌの緩衝液中約１単位の酵素と共に使用される。個々の制限酵素に対する適当な緩衝液および基質の量は製造業者によって指示されている。通常インキュベーション時間は３７℃で約１時間であるが、製造業者の指示に従いそれを変えることもできる。インキュベーションの後、蛋白質をフェノールおよびクロロホルムによる抽出で除き、消化した核酸をエタノールを用いた沈殿によって水性フラクションから回収する。制限酵素で消化した場合ＤＮＡフラグメントの２つの制限開裂末端が「環化」、すなわち閉じた環を形成するのを防ぐために、細菌性アルカリホスファターゼで末端の５’燐酸を加水分解する操作を行う。環化が起こるとその制限部位に別のＤＮＡフラグメントが挿入するのが妨げられる。特に指摘しない限り、プラスミドの消化は５’末端の脱燐酸化を伴っていないと解釈すべきである。脱燐酸化の方法および試薬は通常のものである（Ｔ．Ｍｎｉａｔｉｓら前記１３３−１３４頁参照）。
　制限消化物から、ＤＮＡのある特定のフラグメントを「回収」または「分離」するとは、消化物を６％のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、分子量によって所望のフラグメントを同定し（マーカーとして分子量の解かっているＤＮＡフラグメントを使用する）、所望のフラグメントを含んでいるゲル断片を切り取り、ＤＮＡからゲルを分離することを言う。この方法は一般に知られている（例えば、Ｒ．Ｌａｗｎ　ら１９８１，“Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．”９：６１０３−６１１４およびＤ．Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）“Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．”８：４０５７参照）。
　「サザーン分析」とは、消化物またはＤＮＡ含有組成物中のＤＮＡ配列の存在を、既知の標識化（ラベル）したオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントとハイブリダイズさせることにより確認する方法を言う。本発明においてはサザーン分析とはＧ．Ｗａｈｌら１９７９，“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．”７６：３６８３−３６８７に記載された方法により１％アガロース上で消化物を分離して脱プリン化（ｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎ）し、Ｅ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５，“Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．”９８：５０３−５１７の方法でニトロセルロースに転移させ、そしてＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ　ら１９７８，“Ｃｅｌｌ”１５：６８７−７０１に記載の方法でハイブリダイゼーションを行うことを意味する。
　「形質転換」とは、ＤＮＡが染色体外要素または染色体組込体として複製可能なように、ＤＮＡを生物に導入することを意味する。特に指摘しない限り、本発明で使用した方法は、Ｅ．ｃｏｌｉ　の形質転換についてはＭａｎｄｅｌ　ら１９７０，“Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．”５３：１５４のＣａＣｌ２法であり、桿菌については、Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｌｏｕｓ　ら１９６１，“Ｊ．Ｂａｃｔ．”８１：７９１−７４６の方法による。
　「結合（ライゲーション）」とは、２本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成させることを言う（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ　ら前記１４６頁）。特に指摘しない限り、結合は既知の緩衝液および条件を使って、ほぼ当モル量の結合すべきＤＮＡフラグメント０．５μｇ当たり１０単位のＴ４ＤＮＡリカーゼ（「リカーゼ」）を用いて行う。形質転換体からプラスミドを調製し、制限地図を作成して分析し、そして／またはＭｅｓｓｉｎｇ　ら１９８１，“Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．”，９：３０９の方法により配列決定する。
　形質転換体からのＤＮＡの「調製」とは、微生物培養液からプラスミドＤＮＡを分離することを言う。特に指摘しない限りＭａｎｉａｔｉｓ　ら（前記、９０頁）のアルカリ／ＳＤＳ法を使用した。
　「オリゴヌクレオチド」とは、Ｃｒｅａ　らの方法（１９８０，“Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．”
８
　全ての文献を参考として明細書に記載した。
　
実施例１
　細胞外Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ　の既知のアミノ酸配列により適当なブローブ混合物の組立てが可能である。成熟サブチリシンの配列が第１図に記載されており、これには本発明者らにより見出されたその他の情報も含まれている。１１７位から１２１位までのアミノ酸の配列に対する全てのコドンの多義性は以下の配列の８つのオリゴヌクレオチドのプールでカバーされる：
　Ｊ．Ｍａｒｍｕｒ，“Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．”
３
５３
　形質転換混合物からの細胞を、ＬＢ培地＋１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するプレート１５０ｍｍ当たり１〜５×１０３形質転換体の密度になるように置き、肉眼で観察できるコロニーが現れるまで３７℃で一夜増殖させた。次いでこのプレートを、ＬＢ／クロラムフェニコールプレート上に積層したＢＡ８５ニトロセルロースフィルター平板反復法でプリントした。この平板反復プレートを３７℃で１０〜１２時間増殖させ、フィルターをＬＢおよび１５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有している新しいプレートに移し、プラスミドプールを増幅させた。
　３７℃で一夜インキュベートした後、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　およびＨｏｇｎｅｓｓ　の方法（１９７５，“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）”
７２
の何れかを用いて上記した方法でプローブした。
　第２図に示したように、プール１はプール２よりもはるかに高い割合で全ての陽性クローンとハイブリダイズし、特異なハイブリダイゼイションを暗示した。
　陽性クローンからのミニプラスミド標品（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ら、前記）５個の内４個は、Ｓａｕ　３ＡまたはＨｉｎｃＩＩで消化すると同一の制限消化物パターンを示した。Ｍａｎｉａｔｉｓ　ら（前記）の方法により、これらの４つの同一のコロニーの１つから分離したプラスミドは全て正しい遺伝子配列を持っており、これをｐＳ４と命名した。制限分析により決定したこのプラスミドの特徴を第３図に示す。
　
実施例２
　サブチリシン遺伝子の発現
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　Ｉ−１６８（カタログＮｏ．１−Ａ１，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）をｐＳ４で形質転換し、１個のクロラムフェニコール耐性形質転換体を最少培地で増殖させた。２４時間後、培養物を遠沈し、上清（１０〜２００μｌ）およびペレットを、０．１Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ８．０）中２５℃で染色体基質サクシニル−Ｌ−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（０．２μＭ）１ｍｌを使って４１２ｎｍにおける１分当たりの吸収の変化を測定することにより、蛋白質分解活性を分析した。対照（コントロール）として使用したｐＢＳ４２で形質転換したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　Ｉ−１６８培養物は、ｐＳ４で形質転換した培養物の活性の１／２００以下の活性を示した。ｐＳ４培養物のプロテアーゼ活性の９５％以上が上清に存在しており、これはフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）で処理すると完全に阻害されたがＥＤＴＡでは阻害を受けなかった。
　上清の一部をＰＭＳＦおよびＥＤＴＡで処理し、全てのプロテアーゼ活性を阻害し、Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，１９７０“Ｎａｔｕｒｅ”，２２７：６８０の方法に従って、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。この上清を調製するために、１６μｌの上清を１ｍＭ　ＰＭＳＦ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡで１０分間処理し、４μｌの５×濃ＳＤＳ試料緩衝液マイナスβ−メルカプトエタノールと共に煮沸した。
　ｐＳ４、ｐＢＳ４２で形質転換した細胞および形質転換しなかったＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　の上清を使った泳動上のＣｏｏｍａｓｓｉｅ　染色の結果を第４図に示す。レーン３はＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　からの標準品としてのサブチリシンを示している。ｐＢＳ４２で形質転換したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　からの上清である２レーンには、ｐＳ４形質転換宿主からのレーン１によって示されるサブチリシンに伴っている３１，０００ＭＷ（分子量）帯（バンド）がなかった。サブチリシンについての約３１，０００ＭＷのバンドは、一般に既知の分子量２７，５００のサブチリシン標準品によって示される遅い移動率の特徴である。
　
実施例３
　ｐＳ４のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（ここでＥｃｏＲＩ部位はＨｉｎｃＩＩ部位の変換により組立てられた）の全配列を、Ｆ．Ｓａｎｇｅｒの方法（１９７７，“Ｐｒｏｃ．Ｂａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）”，
７４
　この配列を調べることにより、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓによって分泌されたものに相当する成熟サブチリシンのためのコドンが存在することが確認された。
　この配列のすぐ上流に−１０７位のＧＴＧ開始コドンから始まる一連の１０７個のコドンが存在する。−１０７のコドンから約−７５のコドンまでが既知の信号配列のそれに相当する特徴を持ったアミノ酸配列を暗号化している（大部分のこのような信号配列は長さ１８〜３０のアミノ酸であり、疎水性中心部を持っており、僅かな疎水性アミノ酸で終っている）。従って配列決定のデータの結果は−１０７から約−７５のコドンが信号配列を暗号化しており、−７５から−１までの残りの介在コドンはたぶんプロ配列を暗号化していると思われる。
　
実施例４
　ｐＢＳ４２は、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４およびｐＢＲ３２２から導かれたフラグメントの三方向ライゲーションにより調製する（第５図）。ｐＵＢ１１０からのフラグメントは、１９００位のＨｐａＩＩ部位と４５００位のＢａｍＨＩ部位との間の約２６００塩基対フラグメントであり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（桿菌）中で機能する複製起源を含んでいる（Ｔ．Ｇｒｙｃｚｔａｎら１９７８“Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．”，
１３４
１４
７４
１５０
　このようにｐＢＳ４２はＥ．ｃｏｌｉおよび桿菌の両者で機能する複製起源およびクロラムフェニコール耐性のための発現し得る遺伝子を含んでいる。
　
実施例５
　Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　Ｉ１６８染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、そのフラグメントをゲル電気泳動にかけた。１個の６ｋｂフラグメントが「α−３２ｐ」ＣＴＰニック・トランスレーション−上記のｐＳ４のサブチリシン構造遺伝子のＣ末端から得られた標識フラグメント−にハイブリダイズした。この６ｋｂフラグメントを電気溶出し、ＥｃｏＲＩで消化し細菌性アルカリホスファターゼで処理したｐＢＳ４２に結合させた。この結合混合物でＥ．ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ　３１４４６を形質転換し、形質転換体を、１２．５μｇのクロラムフェニコール／ｍｌを含有しているＬＢ寒天上で増殖させて選択した。５０００個の形質転換コロニーのプールした懸濁液からプラスミドＤＮＡを調製した。このＤＮＡを、プロテアーゼ欠落株であるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＢＧ８４（この調製法は実施例８に記載してある）に導入した。プロテアーゼを生産するコロニーを、ＬＢ寒天プラス１．５％（ｗ／ｗ）カーネーション粉末脱脂スキムミルクおよび５μｇクロラムフェニコール／ｍｌ（以降スキムミルク選択プレートと言う）上に置き、蛋白分解活性を示す澄明な部分を観察することによりスクリーニングした。
　プラスミドＤＮＡをプロテアーゼ生産コロニーから調製し、ＥｃｏＲＩで消化し、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓからのサブチリシン構造遺伝子の３２ｐ−標識Ｃ末端フラグメントにハイブリダイズさせることにより、サザーン分析によって６ｋｂＥｃｏＲＩ挿入体の存在についてしらべた。陽性クローンを同定し、このプラスミドをｐＳ１６８．１と命名した。ｐＳ１６８．１で形質転換したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＢＧ８４は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　Ｉ１６８によって生産されるものよりも５倍の濃度でセリンプロテアーゼを分泌した。ＥＤＴＡを上清に加えても分析の結果は変らなかったがＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）を上清に加えると、ＢＧ８４株について実施例８で述べた分析において検出できない濃度まで、プロテアーゼ活性が減少した。
　６．５ｋｂ　ＥｃｏＲＩ挿入体の制限地図を第６図に示した。種々の制限酵素消化物をサブクローンし、そしてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＢＧ８４中でサブチリシンの発現を試験することにより、サブチリシン遺伝子を２．５ｋｂ　ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントの内部に位置せしめた。Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓサブチリシン遺伝子のＣ末端からの標識フラグメントをプローブとして用いたサザーン分析により、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子のＣ末端をこのサブクローンの中央の６３１ｂｐ　ＨｉｎｃＩＩフラグメントＢの内部またはその一部に位置づけた。縦列のＨｉｎｃＩＩフラグメントＢ、Ｃ、およびＤ並びにＨｉｎｃＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントＥ（第６図）をＭ１３ベクター−ｍｐ８またはｍｐ９に結合させ、ジデオキシ読み終り法（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒら１９７７，“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．”
７４
１９
　
実施例６
　桿菌の染色体に組込まれる欠落遺伝子を持ったプラスミドを組立てるには、二段階の結合が必要であった（第８図参照）。最初の工程で、実施例５で述べたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムライブラリーから回収した６．５ｋｂ挿入体を含んでいるｐＳ１６８．１をＥｃｏＲＩで消化し、この反応生成物をＫｌｅｎｏｗで処理し、そのＤＮＡをＨｉｎｃＩＩで消化し、その一部にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓサプチリシン遺伝子の５’末端を含んでいる８００ｂｐＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｃＩＩフラグメントＥ（第６図参照）を回収した。このフラグメントを、ＨｉｎｃＩＩで消化し細菌性アルカリホスファターゼで処理したｐＪＨ１０１に結合させた（ｐＪＨ１０１はＪ．Ｈｏｃｈ（Ｓｃｒｉｐｐｓ）から入手でき、Ｆ．Ａ．Ｆｅｒｒａｒｉら１９８３，“Ｊ．Ｂａｃｔ．”１３４：３１８−３２９に記載されている）。得られたプラスミド、ｐＩＤＶ１は、第８図に示した方向にフラグメントＥを含有していた。第２の工程ではｐＳ１６８．１をＨｉｎｃＩＩで消化し、サブチリシン遺伝子の３’末端を含んでいる７００ｂｐ　ＨｉｎｃＩＩフラグメントＢを回収した。ｐＩＤＶ１をその特異なＨｉｎｃＩＩ部位で消化し、フラグメントＢをこの線状化したプラスミドに結合させ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ　３１４４６に形質転換し、そして１２．５μｇのクロラムフェニコール／ｍｌまたは２０μｇのアンピシリン／ｍｌを含有しているＬＢプレート上で選択した。ｐＩＤＶ１．４と命名された１つの得られたプラスミドはフラグメントＥに関して正しい方向にフラグメントＢを含有していた。第８図に示したこのプラスミドｐＩＤＶ１．４は、５’および３’隣接配列の部分をも含んでいるサブチリシン遺伝子の欠失誘導体である。
　後記実施例８で調製した部分的プロテアーゼ欠落（欠失）ミュータント（Ｐｒｔ＋／−）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＢＧ７７をｐＩＤＶ１．４で形質転換した。２つのクラスのクロラムフェニコール耐性（Ｃｍｒ）形質転換体が得られた。ＬＢ寒天プラススキムミルクを含有しているプレート上の相当する位置の澄明さを観察することにより、７５％がＢＧ７７（Ｐｒｔ＋／−）と同じレベルのプロテアーゼ活性を示したが２５％はほとんど完全にプロテアーゼを欠失していた（Ｐｒｔ−）。ＣｍｒＰｒｔ−形質転換体は、そのプラスミドのフラグメントＥまたはＢのための相同領域における１回の交叉組込みによるものとは考えられない。というのは、このような場合その遺伝子は中断されずそして発現形質はＰｒｔ＋／−となるであろうから。事実、フラグメントＥまたはＢのいずれかを独立してｐＪＨ１０１に結合させ、次いでＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＢＧ７７に導入するとプロテアーゼ欠落表現形質は、観察されなかった。ＣｍｒＰｒｔ−　ｐＩＤＶ１．４形質転換体のＣｍｒの表現形質は、ＣｍｓＰｒｔ−誘導体がＣｍｒＰｒｔ−培養物から、抗生物質選択の非存在下に最少培地で１０世代増殖させた後、約０．１％の頻度でＣｍｒＰｒｔ−培養物から分離することができたという点で不安定であった。このような誘導体の１つを、ＢＧ２０１８と命名した。この欠失を、ＰＢＳ１形質導入によりＩＡ８４（サブチリシン遺伝子に隣接する（両端に位置する）２個の栄養要求ミューテーションを持ったＢＧＳＣ株）に導入した。この誘導体微生物をＢＧ２０１９と命名した。
　
実施例７
　Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの中性プロテアーゼの部分的なアミノ酸配列はＰ．Ｌｅｖｙら１９７５，“Ｐｒｏｃ，Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ”
７２
　それぞれ６通りの組み合せを含む４つのプールを実施例１に記載したようにして調製した。このプールを「γ−３２ｐ」ＡＴＰを用いて燐酸化により標識した。
　Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（１Ａ７２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｉｎｅｔｉｃ　Ｓｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）ＤＮＡを各種の制限酵素で消化し、消化物を電気泳動ゲルで分離し、その４つのプローブプールのそれぞれを、ブロットした消化物のそれぞれに、条件を徐々に厳格にしながら１個のバンドがハイブリダイズするのが確認されるまで、ハイブリダイゼイションを行なうことによりＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノム中の特異な配列に最も合致する配列を含んだ標識プールを選択した。徐々に条件を厳格にするということは、ハイブリダイゼーションを起しにくい条件にすることを言い、例えばホルムアミド濃度を増大させること、塩濃度を減少させることおよび温度を上げることである。５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、５×ＳＳＣ、５０ｍＭＮａＰＯ４（ｐＨ６．８）および２０％ホルムアミドの溶液中、３７℃でプール４だけがプロットした消化物とハイブリダイズした。これらを中性プロテアーゼ遺伝子のために使用する適当なハイブリダイゼーション条件として選択し、プール４をプローブとして使用した。
　桿菌のゲノムＤＮＡをＳａｕ３Ａで部分消化し、その部分消化物を電気泳動ゲル上で分子量により分離し、１５〜２０ｋｂフラグメントを溶出し（Ｒ．Ｌａｗｎら１９８１，“Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．”
９
　チャロンラムダーファージのための全ての既知の宿主を使用することができるが、このファージライブラリーの宿主としてはＥ．ｃｏｌｉ　ＤＰ５０ｓｕｐＦを使用した。このＥ．ｃｏｌｉ宿主をライブラリーファージとともにプレートして培養し、その後プラークを、ニトロセルロースに転移させ、プローブプール４でスクリーニングする（ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ１９７７，“Ｓｃｉｅｎｃｅ”
１９６
　この２４００ｂｐλＮＰＲＧ１フラグメントをｐＪＨ１０１のＨｉｎｄＩＩＩ部位に、以下の方法でサブクローンした。λＮＰＲＧ１をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物を電気泳動により分画し、そして２４００ｂｐフラグメントをゲルから回収した。このフラグメントをアルカリホスファターゼで処理したＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＪＨ１０１に結合させ、この結合混合物を使い、Ｖ．Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄら１９７４，“Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）”
７９
　形質転換コロニーから数個のプラスミドを得た。各プラスミド中の２４００ｂｐフラグメントの方向性は通常の制限分析により決定した（方向性とは、結合させた発現ベクターの読み取り方向に関して遺伝子フラグメントの読み取り方向または転写方向を意味する）。向い合った２つのプラスミドが得られ、これらをｐＮＰＲｓｕｂＨ６およびｐＮＰＲｓｕｂＨ１と命名した。
　λＮＰＲＧ２をＥｃｏＲＩで消化することおよびプラスミドがアルカリホスファターゼで処理したＥｃｏＲＩ消化ｐＢＲ３２５であることを除いて、２４００ｂｐフラグメントについて上記した方法と同様にしてλＮＰＲＧ２の４３００ｂｐＥｃｏＲＩフラグメントをｐＢＲ３２５にサブクローンした。ｐＢＲ３２５はＦ．Ｂｏｌｉｖａｒ．１９７８，“Ｇｅｎｅ”
４
　
実施例８
　ｐＮＰＲｓｕｂＨ１挿入体を種々の制限エンドヌクレアーゼで順次消化し、標識化したプール４とプロットハイブリダイズさせ、その挿入体の制限地図を作成した（一般的な制限地図の作成法についてはＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓら前記３７７頁参照）。プローブプール４とハイブリタイズした最も小さなフラグメントは４３０ｂｐ　ＲｓａＩフラグメントであった。このＲｓａＩフラグメントをＭ１３ｍｐ８（Ｍ．Ｍｅｓｓｉｎｇら１９８２，“Ｇｅｎｅ”
１９
１０１
７４
７６
　この中性プロテアーゼ遺伝子のために決定された、推定上の分泌リーダーおよびプレプロ配列を含む全ヌクレオチド配列を第１０図に示す。列の上の数値はアミノ酸番号を示している。第１０図において下線を引いたヌクレオチドはリボソーム結合部位（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）を構成していると考えられ、一方上に線を引いたヌクレオチドはターミネーターであると推定される潜在的なヘアピン構造を構成している。最初の２７〜２８の推定アミノ酸は中性プロテアーゼのための信号であると考えられ、開裂点はａｌａ−２７またはａｌａ−２８にある。プロ酵素構造の「プロ」配列は成熟、活性酵素のアミノ末端アミノ酸（ａｌａ−２２２）に至っている。
　１９００ｂｐを含んでいるｐＮＰＲｓｕｂＲ１のＢｇｌＩＩフラグメント（第９図）を１４００ｂｐを含んでいるｐＮＰＲｓｕｂＨ１のＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと結合させることにより、全ての中性プロテアーゼ遺伝子を持ったコピー数の高いプラスミドを組立てた（第１１図）。実施例４からのｐＢＳ４２をＢａｍＨＩで消化し、細菌性アルカリホスファターゼで処理してプラスミドの再環化を防止した。ｐＮＰＲｓｕｂＲ１をＢｇｌＩＩで消化し、１９００ｂｐフラグメントをゲル電気泳動法で分離し、ｐＢＳ４２の開いたＢａｍＨＩ部位に結合させた。この結合させたプラスミドを使ってＥ．ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ　３１４４６を、塩化カルシウムショック法（Ｖ．Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄら前記）により形質転換し、形質転換された細胞を、１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地を含んだプレート上で増殖させることにより選択した。第１１図に示した方向にＢｇｌＩＩフラグメントを持ったプラスミドを形質転換体から分離し、ｐＮＰＲｓｕｂＢ１と命名した。ｐＮＰＲｓｕｂＢ１をＥｃｏＲＩで消化（線状化）し、Ｋｌｅｎｏｗ処理により修復して平滑末端とし、次いでＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ＨｉｎｄＩＩＩ消化により得られる大きい方のフラグメント（アミノ末端および上流領域を暗号化している配列を含んでいる）を回収した。
　この遺伝子のカルボキシ末端領域は、ｐＮＰＲｓｕｂＨ１をＰｖｕＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し１４００ｂｐフラグメントを回収することによって得たｐＮＰＲｓｕｂＨ１からのフラグメントで供給した。この１４００ｂｐフラグメントの平滑末端ＰｖｕＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位をそれぞれ、ｐＮＰＲｓｕｂＢ１の平滑なＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位と結合させた（第１１図参照）。この組立物を、後記の分析法で、本来蛋白分解活性物を分泌しないＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＢＧ８４に導入した。この形質転換体を、ＬＢ培地プラス１．５％カーネーション粉末脱脂ミルクおよび５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有しているプレート上で選択した。大きなかさ（ｈａｌｏ）を清澄にしたコロニーからのプラスミドを分析した。構造遺伝子および中性プロテアーゼ遺伝子の隣接領域を挿入しているプラスミド−ｐＮＰＲ１０を制限分析によって知らべたところ第１１図に示す構造を持っていた。
　Ａｄｅｌｂｅｒｇらの一般的な方法（１９６５，“Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．”１８：７８８−７９５）に従い、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　Ｉ１６８のＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）による変異誘発によってＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＢＧ８４を作った。変異誘発させた株Ｉ１６８をスキムミルクプレート（抗生物質を含まず）においた。小さいかさを形成するコロニーを拾い上げさらに分析した。各コロニーにつきスキムミルクプレート上でプロテアーゼ生産を、デンプンプレート上でアミラー生産を調べた。部分的にプロテアーゼ欠失であり、アミラーゼ陽性であり、そして胞子形成し得る１つの単離物をＢＧ７７と命名した。プロテアーゼ欠失ミューテーションはｐｒｔ−７７と命名した。このｐｒｔ−７７対立遺伝子を下に述べる会合によってｓｐｏＯＡバックグラウンドに移動させて、胞子形成欠落株であるＢＧ８４株を作った。
　ＢＧ８４はスキムミルクプレート上でプロテアーゼ活性を完全に失っており、０．１Ｍの燐酸ナトリウム（ｐＨ８）中、２５℃で０．２μｇ／ｍｌのサクシニル（−Ｌ−ａｌａ−Ｌ−ａｌａ−Ｌ−ｐｒｏ−Ｌ−ｐｈｅ）Ｐ−ニトロアニリド（Ｖｅｇａ）とインキュベーションし、１分当りの４１２ｍｎにおける吸収の変化を測定して分析した結果、検出可能な濃度のサブチリシンも中性プロテアーゼも生産しなかった。ＢＧ８４は１９８３年７月２１日にＡＴＣＣに寄託された（寄託番号３９３８２）。サブチリシン分析のための試料は、改良Ｓｃｈａｅｆｆｅｒの培地（Ｔ．Ｌｅｉｇｈｔｏｎら１９７１，“Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．”２４６：３１８９−３１９５）で増殖させた培養の後期対数増殖期の上清から採取した。
　
実施例９
　ｐＮＰＲ１０で形質転換したＢＧ８４を、０．１％のカゼイン加水分解物および１０μｇのクロラムフェニコールを添加した最少培地に接種し、１６時間培養した。培養上清０．１ｍｌを採取し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ６．８）中に１．４ｍｇ／ｍｌのＡｚｏｃｏｌｌ蛋白分解基質（Ｓｉｇｍａ）を入れた懸濁液に加え、攪拌下にインキュベートした。消化されなかった基質を遠心分離により除き、５０５ｎｍにおける光学密度を測定した。Ａｚｏｃｏｌｌ基質懸濁液のバックグラウンド値を減じた。標準的なプロテアーゼ発現株であるＢＧ１６によって分泌されるプロテアーゼの量を任意に１００と定めた。ＢＧ１６、および対照並びに中性プロテアーゼ遺伝子含有プラスミドで形質転換したＢＧ８４についての結果を後記実施例１２の表Ｂに示す。分泌されるプロテアーゼ−欠落Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＢＧ８４を形質転換したものは、野生株であるＢＧ１６よりも遥かに高い濃度でプロテアーゼ活性体を分泌することが解る。
　
実施例１０
　ｐＮＰＲｓｕｂＨ１の２４００ｂｐ挿入体の２つのＲｓａＩに囲まれた領域、全５２７ｂｐ、を削除し、不完全な構造遺伝子を作ることができる。この遺伝子の翻訳産物は酵素的に不活性である。この欠失のあるプラスミドを以下の如くして組立てた。ｐＪＨ１０１をＨｉｎｄＩＩＩで消化して開裂させ、細菌性アルカリホスファターゼで処理した。線状化したｐＪＨ１０１に挿入すべき中性プロテアーゼ遺伝子のフラグメントは、ｐＮＰＲｓｕｂＨ１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＲｓａＩで消化しゲル電気泳動によって１２００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＲｓａＩおよび６８０ｂｐのＲｓａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを回収することにより得た。これらのフラグメントを線状化したｐＪＨ１０１に結合させ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ３１４４６の形質転換に使用した。形質転換体をＬＢ培地および２０μｇのアンピシリン／ｍｌ含有プレート上で選択した。この形質転換体からプラスミドを回収し、制限酵素分析によって分析し、ｐＮＰＲｓｕｂＨ１出発プラスミドと同じ方向性に２つのフラグメントを持ったプラスミドを同定した。内部のＲｓａＩフラグメントを失ったこのプラスミドをｐＮＰＲｓｕｂＨ１Δと命名した。
　
実施例１１
　プラスミドｐＮＰＲｓｕｂＨ１ΔをＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＢＧ２０１９（実施例６のサブチリシン欠除ミュータント）に導入し、染色体組込み体をスキムミルクプレート上で選択した。コロニーの周囲に親株と同レベルの蛋白分解を示すものと、蛋白分解ゾーンのほとんどないものとの２つのタイプのＣｍｒ形質転換体が観察された。蛋白分解ゾーンのないものを選択し、再画線して個々のコロニーを純化し、それらのプロテアーゼ欠失特性をスキムミルクプレート上で確認した。Ｃｍｒである蛋白分解欠失コロニーの１つを選んでこれをさらに研究した（このコロニーをＢＧ２０３４と命名した）。ＢＧ２０３４の偶発Ｃｍｓ復帰突然変異体を、Ｃｍ含有ＬＢ培地で一夜増殖させて分離し、個々のコロニーをプレートし、Ｃｍを含んだ、および含まない培地上に反復プレートした。３個のＣｍｓ復帰突然変異体を分離したところ、その内の２つはプロテアーゼ能があり、残りの１はプロテアーゼ能がなかった（これをＢＧ２０３６と命名した）。ＢＧ２０３６のハイブリダイゼーション分析の結果、このプラスミドは、たぶん組換えによって、この株から欠落し、サブチリシンおよび中性プロテアーゼの欠失フラグメントだけが残ったことを確認した。
　
実施例１２
　中性またはアルカリ性のプロテアーゼあるいはその両者の機能的遺伝子を欠く株についてその増殖、胞子形成およびプロテアーゼの発現について試験した。プロテアーゼの発現はスキムミルクプレート上のコロニーの周りの澄明化バンドおよび液体培養上清中のプロテアーゼ濃度の測定によって調べた（表Ｂ）。サブチリシン遺伝子欠失株（ＢＧ２０３５）はプロテアーゼ活性の３０％の減少およびミルクプレート上の正常なかさ（ｈａｌｏ）を示した。削除された中性プロテアーゼ遺伝子および活性サブチリシン遺伝子を持ち、ＢＧ２０３６（実施例１１）のＤＮＡでＢＧ１６（実施例８）を形質転換することにより組立てられたＢＧ２０４３株は、プロテアーゼ活性の８０％の減少およびミルクプレート上の小さいかさを示した。上記の両遺伝子における削除を有する点でＢＧ２０３６（実施例１１）と等価であると考えられるＢＧ２０５４株は、検出可能なプロテアーゼ活性を示さず、ミルクプレート上の検出し得るかさも示さなかった。
　プロテアーゼ遺伝子群の片方または両方を削除しても増殖または胞子形成に明らかな影響を与えなかった。これらの削除（欠失）を有する株は最少グルコース培地およびＬＢ培地の両者において正常な増殖速度を示した。これらの株は親株ＢＧ１６に匹敵する頻度の胞子形成を示した。これらの株を形態学的に調べたところ欠失を含まない株と明らかな違いを示さなかった。
１プロテアーゼ表現形質に関連する座だけを示した。
２プロテアーゼ活性はＢＧ１６を１００とする任意の単位で表してある。ＮＤはプロテアーゼ活性が検出されなかったことを示す。
　
実施例１３
　Ｗｅｌｌらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９８３，１１：７９１１−７９２４）に従って調製したｐＳ４の誘導体であるｐＳ４−５をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、１．５ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを回収した。このフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した複製型のＭ−１３ｍｐ９に結合させた（Ｓａｎｇｅｒら，１９８０“Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．”１４３，１６１−１７８；Ｍｅｓｓｉｎｇら，１９８１，“Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ”９，３０４−３２１；Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．およびＶｉｅｉｒａ，Ｊ．（１９８２）Ｇｅｎｅ　１９，２６９−２７６）。Ｍ−１３ｍｐ９ＳＵＢＴと命名したこのＭ−１３ｍｐ９ファージ結合体をつかってＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０１を形質転換し、２ｍｌの終夜培養物から１本鎖ファージＤＮＡを調製した。以下の配列を持ったオリゴヌクレオチドプライマーを合成した：
　５’−ＧＴＡＣＡＡＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＣ−ＧＣＡＣＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＣ−３’
このプライマーは２２２−２２５位のアミノ酸に対する１０ｂｐのコドンが削除されており、ｍｅｔ−２２２コドンにＫｐｎＩ部位（５’）を、ｍｅｔ＋２２２コドンにＰｓｔＩ部位（３’）を導入するためにアミノ酸２２０、２２７および２２８に対するコドンが変異されていることを除けば、アミノ酸２１６−２３２を暗号化しているサブチリス遺伝子フラグメントの配列に符合している（第１２図参照）。置換したヌクレオチドは星印で示してあり、ライン２の下線を引いたコドンは新しい制限部位を示しており、ライン４の線を引いた部分は挿入されたオリゴヌクレオチドを表わしている。このプライマー（約１５μＭ）を以下の如くして「３２ｐ」でラベルした：「ｒ３２ｐ」−ＡＴＰ（２０μｌの反応液中１０μｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，１０２１８）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０単位）、次いで非放射性ＡＴＰ（１００μＭ）とともにインキュベートしこの変異誘発プライマーを完全に燐酸化した。この燐酸化混合物を６８℃で１５分間加熱してキナーゼを不活性化した。
　Ｎｏｒｒｉｓらの改良法（１９８３，“Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．”１１，５１０３−５１１２）に従い、５μｌのラベルした変異誘発プライマー（〜３μＭ）、約１μｇＭ−１３ｍｐ９ＳＵＢＴ鋳型、１μｌの１μＭ　Ｍ−１３塩基配列プライマー（１７−ｍｅｒ）および２．５μｌの緩衝液（０．３Ｍトリス（ｐＨ８）、４０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１２ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭ　ＤＴＴ，０．５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）を混合することにより、このプライマーをＭ−１３ｍｐ９ＳＵＢＴにハイブリダイズした。この混合物を６８℃で１０分間加熱し、室温で１０分間冷却した。このアニリング混合物に３．６μｌの０．２５ｍＭ　ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰ、１．２５μｌの１０ｍＭ　ＡＴＰ、１μｌのリガーゼ（４単位）および１μｌのＫｌｅｎｏｗ（５単位）を添加した。このプライマーの延長およびライゲーション反応（全量２５μｌ）は１４℃で２時間行なった。６８℃で２０分間加熱してＫｌｅｎｏｗおよびリガーゼを不活性化した。この加熱した反応混合物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、その消化物の一部を６％ポリアクリルアミドゲルに適用し、放射活性フラグメントをオートラジオグラフィーにより検出した。その結果「３２ｐ」変異誘発プライマーが、今や変異したサブチリシン遺伝子を含んでいるＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに挿入されたことが解った。
　消化した反応混合物の残りを、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭトリス（ｐＨ８）で２００μｌに希釈し、フェノール／クロロホルム混合物（１：１（ｖ：ｖ））で１回、次いでクロロホルムで１回抽出し、水相を回収した。５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ８）１５μｌを２倍容量のエタノールとともに加え、水相からＤＮＡを沈澱させた。マイクロフュージ中、５分間遠心分離してＤＮＡをペレット化し、上清を捨てた。７０％エタノール３００μｌを加えてＤＮＡペレットを洗浄し、洗液を捨てペレットを凍結乾燥した。
　実施例４のｐＢＳ４２をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、アクリルアミドゲル上で精製してベクターを回収した。この消化したベクター０．５μｇ、５０μＭ　ＡＴＰおよび６単位のリガーゼをライゲーション緩衝液２０μｌに溶解した。ライゲーション（結合）を１４℃で終夜行なった。このＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ２９４　ｒｅｃ＋に導入し、形質転換体を１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール含有ＬＢ培地４ｍｌ中で増殖させた。この培養物からプラスミドＤＮＡを調製し、ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した。この制限フラグメントを分析した結果、分子の３０〜５０％が変異誘発プライマーによってプログラムされた所望のＫｐｎＩ部位を含んでいることが解った。ＫｐｎＩ部位を含んでいないプラスミドは、変異誘発部位の細菌による修復前にＭ−１３複製により生成したと思われ、このようにして、ある形質転換体において、ＫｐｎＩ＋およびＫｐｎＩ−プラスミドのヘテロジーナス体が生成したと考えられる。ＫｐｎＩ＋プラスミドの純粋な培養を得るために、このＤＮＡをもう１度Ｅ．ｃｏｌｉに導入し、新しいＫｐｎＩ部位を含有するプラスミドをクローンした。このような形質転換体１６個からＤＮＡを調製し、その内６個が予想したＫｐｎＩ部位を含んでいることが解った。
　これらの６個の形質転換体の内の１つ（ｐΔ２２２と命名）からプレパラティブな量のＤＮＡを作り、制限分析により予想されたＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ部位が存在すること、およびその位置を確認した。４０μｇのｐΔ２２２を３００μｌのＫｐｎＩ緩衝液プラス３０μｌのＫｐｎＩ（３００単位）中３７℃で１．５時間消化した。ＤＮＡをエタノール沈澱させ、７０％エタノールで洗浄し凍結乾燥した。ＤＮＡペレットを２００μｌのＨｉｎｄＩＩＩ緩衝液にとり、２０μｌ（５００単位）のＰｓｔＩで３７℃で１．５時間消化した。水相をフェノール／ＣＨＣｌ３で抽出し、ＤＮＡをエタノール沈澱させた。このＤＮＡを水に溶解し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により精製した。ベクターバンド（帯）を電気溶出（１２０ｖ、２時間、０℃、０．１倍のＴＢＥ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前記）中）した後、ＤＮＡをフェノール／ＣＨＣｌ３抽出により精製し、エタノール沈澱し、エタノールで洗浄した。
　ＰΔ２２２はＫｎｐＩまたはＰｓｔＩによりそれぞれ別々に完全に消化することができたが（＞９８％）、徹底的な二重消化は不完全であった（＜＜５０％）。これらの部位が非常に近くにあるため（１０ｂｐ）、ＫｎｐＩによる消化によってそのＰｓｔＩ部位の近くのＤＮＡが「ブリージング」、すなわち鎖の分離、すなわちほつれを起したために、このような結果になったものと考えられる。ＰｓｔＩは２本鎖ＤＮＡだけを開裂させるので鎖の分離によってその後のＰｓｔＩの消化が阻害されるのであろう。
　
実施例１４
　５’が燐酸化されていない４つの相補性オリゴヌクレオチドプール（Ａ−Ｄ、表１参照）１０μＭを、２０μｌのリガーゼ緩衝液中で５分間６８℃で加熱し、次いで室温で１５分間冷却することによりアニーリングした。各アニーリングしたオリゴヌクレオチドプール１μＭ、〜０．２μｇのＫｐｎＩおよびＰｓｔＩで消化した実施例１３で得たｐΔ２２２、０．５ｍＭ　ＡＴＰ、リガーゼ緩衝液および６単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ、の全量２０μｌを１４℃で終夜反応させ、プールしたカセットをベクターに結合させた。大過剰のカセット（ｐΔ２２２末端を越えること〜３００×）をこの結合に使用して分子内ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩ結合を防止した。１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有している１０ｍＭトリス（ｐＨ８）２５μｌを加えて反応物を希釈した。この混合物を６８℃で５分間加熱し、室温で１５分間冷却することにより再びアニーリングしてカセットのコンカテマー（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ）形成を防止した。各プールからのこの結合混合物を別々にＥ．ｃｏｌｉ２９４ｒｅｃ＋細胞に形質転換した。各形質転換混合物の一部をプレートし、それぞれの形質転換体の数を測定した。多数の形質転換体が多変異誘発性の高い可能性を示した。形質転換体の残り（〜２００−４００形質転換体）をＬＢ培地プラス１２．５μｇのクロラムフェニコール／ｍｌの４ｍｌ中で培養した。各形質転換プール（Ａ−Ｄ）からＤＮＡを分離した。このＤＮＡをＫｐｎＩで消化し、その〜０．１μｇを使って再びＥ．ｃｏｌｉ　ｒｅｃ＋を形質転換し、その混合物をプレートして各プールから個々のコロニーを分離した。遺伝子へのカセットの結合および形質転換時の細菌性修復によりＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ部位が破壊された。このようにして形質転換体ＤＮＡをＫｐｎＩで消化したときｐΔ２２２だけが切断された。この切断プラスミドはＥ．ｃｏｌｉを形質転換しないであろう。個々の形質転換体を培養して増殖させ、直接的なプラスミドの塩基配列決定のためにプール当り２４〜２６の形質転換体からＤＮＡを調製した。５’−ＧＡＧＣＴＴＧＡＴＧＴＣＡＴＧＧＣ−３’の配列を持った合成オリゴヌクレオチドプライマーを使ってジデオキシ配列決定反応をプライムした。得られたミュータントを以下の表Ｃに示す。
　記載したスクリーニングの後２個のコドン＋２２２ミュータント（すなわちｇｌｎおよびｉｌｅ）は見出されなかった。これらを得る目的で、第１２図の上のオリゴヌクレオチド鎖に相当する各ミュータントのための１本鎖２５ｍｅｒ（２５量体）オリゴヌクレオチドを構成した。それぞれを燐酸化し、そのそれぞれの非燐酸化オリゴヌクレオチドプール（すなわちｇｌｎに対してはプールＡ、ｉｌｅに対してはプールＤ）の下の鎖にアニーリングした。これをＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ消化ｐΔ２２２に結合させ、もとのオリゴヌクレオチドプールについて記載したようにプロセッシングした。このようにして得られたシングルミュータントの出現率はｇｌｎに対して２／８、ｉｌｅに対しては０／７であった。この明らかなかたよりを避けるため、上の鎖を燐酸化し、その非燐酸化相補性プールにアニーリングした。ヘテロ燐酸化カセットを切断ｐΔ２２２に結合させ、前と同様にしてプロセシングした。ｇｌｎおよびｉｌｅミュータントの出現率はそれぞれ７／７および７／７となった。
　表Ｃのデータはこのプールから得られたミュータントの出現におけるかたよりを表わしている。これは、プールにおいてオリゴヌクレオチドを等価に表わしていないことから起ったものと考えられる。これは特定のポリマーがプールの変異誘発コドンを越えて非等価にカップリングすることにより惹起されたものかもしれない。このようなかたよりの問題は、合成中にトリマーレベルの適当な調節により（同じ反応を行なう）なおすことができた。いずれの場合も、第１次スクリーニングで単離されなかったミュータントは所望のミューテーションを表わしている１本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、両末端を燐酸化し、非燐酸化相補鎖のプールにアニーリングし、カセット部位に結合させることにより得ることができた。完全に非燐酸化したカセットについて観察されたかたよったヘテロデュプレックス修復は、２２２位は下の鎖の５’末端よりも上の鎖５’末端により近いという事実から起ったものと思われる（第１２図参照）。非燐酸化５’末端にはギャップが存在し、２本鎖ＤＮＡにはミスマッチバブル（ｂｕｂｂｌｅ）が２２２位にあるので、上の鎖のギャップの切除修復はより容易に複製可能な環状にハイブリダイズしたデュプレックスを維持することになる。上の鎖は選択的５’燐酸化により完全に保持し得るという事実はこの仮説に合致している。この場合、下の鎖だけが切除修復を促進し得る５’ギャップを含んでいる。この方法は、変異誘発オリゴヌクレオチドカセットを使った場合、合成オリゴヌクレオチド鎖のかたよった挿入を方向づけるのに有用である。
　
実施例１５
　変異誘発プライマーが異なっていること（第１３図の３７ｍｅｒを使用した）、２つの制限酵素がＰｓｔＩおよびＫｐｎＩではなくてＳａｃＩおよびＸｍａＩＩＩであること、および得られた組立て物が異なっていることを除けば実施例１３〜１４に示した操作を忠実に繰返した（第１３図参照）。
　１６６位のミュータントサブチリシンを分泌する桿菌株を後記実施例１６に記載した方法で得た。野生型残基のａｌａ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ｐｈｅ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｓｎ、ａｒｇおよびｖａｌが置換されているミュータントサブチリシンを回収した。
　
実施例１６
　実施例１１の方法で得たＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＢＧ２０３６を実施例１４，１５または２０のプラスミドおよび対照としてｐＳ４−５により形質転換した。形質転換体をプレートまたは振盪フラスコ中１６〜４８時間３７℃でＬＢ培地プラス１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール中で培養した。酵素的に活性なミュータントサブチリシンを、細胞ブロスをｐＨ６．２の０．０１Ｍ燐酸ナトリウムに対して透析することにより回収した。透析したブロスを１Ｎ　ＨＣｌでｐＨ６．２に調節し、ＣＭセルロース（ＣＭ−５２ワットマン）の２．５×２ｃｍのカラムに充填した。０．０１Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ６．２）で洗浄した後、サブチリシン（＋２２２におけるミュータントを除く）をＮａＣｌについて０．０８Ｎとして同じ緩衝液で溶出した。＋２２２のミュータントサブチリシンは０．１Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で溶出した。この精製したミュータントおよび野性型酵素を使って酸化安定性、Ｋｍ、Ｋｃａｔ、Ｋｃａｔ／Ｋｍ比、至適ｐＨおよび基質特異性における変化を調べた。
　１コドンは、クローンしたサブチリシン塩基配列の多使用性に基づいて選んだ（Ｗｅｌｌｓら１９８３、前記）
　２頻度は、直接プラスミド塩基配列決定によりシングルトラック分析から決定した。
　３予想外ミュータントは、一般に２２２の隣のコドンまたは結合点、において変化しているダブルミュータントからなっていた。これらは、オリゴヌクレオチドプールにおける不純物／またはギャップ末端の誤った修復の結果得られたものと考えられる。
　
実施例１７
　野生型のメチオニンの代りに、２２２において置換したシステインおよびアラニンを有するサブチリシン（実施例１６）を各種の濃度の次亜鉛素酸ナトリウム（Ｃｌｏｒｏｘ　Ｂｌｅａｃｈ）とともにインキュベートすることにより酸化に対する抵抗性を分析した。
　全量４００μｌの０．１Ｍ　ＮａＰＯ４緩衝液（ｐＨ７、第１４図に示した濃度の上記の漂白剤含有）４００μｌに、終濃度が０．０１６ｍｇ／ｍｌ（酵素）となるように充分な酵素を加えた。この溶液を２５℃で１０分間インキュベートし、以下の如くし酵素活性を分析した：１２０μｌのａｌａ＋２２２または野生型、あるいは１００μｌのｃｙｓ＋２２２インキュベーション混合物を８９０μｌの０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．６）および１０μｌのｓＡＡＰＦ　ｐＮ（実施例１８）基質溶液（２０ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ中）と混合した。ｐ−ニトロアニリンの遊離に基づく４１０ｎｍにおける吸光度の増加率をモニターした（Ｄｅｌ　Ｍａｒ，Ｅ．Ｇ．ら１９７９“Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．”９９，３１６−３２０）。この結果を第１４図に示す。メチオニンの代りに不安定なシステイン残基が置換したミュータントあるいは野生型酵素の何れと比較しても、より安定な酵素をアラニン置換体が生産した。驚くべきことに、このアラニン置換は、アッセイ基質に対する酵素活性を実質的に阻害することなく、かつ、この酵素にかなりの酸化安定性を付与した。セリン＋２２２ミュータントも改良された酸化安定性を示した。
　
実施例１８
　グリシン＋１６６の各種のミュータントを、改良されたＫｃａｔ、ＫｍおよびＫｃａｔ／Ｋｍ比についてスクリーニングした。速度的パラメータは反応の進行カーブを分析することにより得た。反応速度は基質濃度の関数として計算した。データはＭａｒｑｕａｒｄｔの非線形回帰アルゴリズム（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ，Ｄ．Ｗ．１９６３“Ｊ．Ｓｏｃ．Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｓ．”１１，４３１−４１）を使って、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎの方程式に合わせて分析した。すべての反応は、初期濃度０．００２５Ｍ〜０．０００２６Ｍ（問題の酵素のＫｍ比に依存する。濃度は各測定毎にＫｍ比を越えるように調節した。）のべンゾイル−Ｌ−バリル（Ｖａｌｙｌ）−グリシル（Ｇｌｙｃｙｌ）−Ｌ−アルギニル（Ａｒｇｉｎｙｌ）−ｐ−ニトロアニリド（ＢＶＧＲ　ｐＮ；Ｖｅｇａ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含有しているか、または初期濃度０．００１０Ｍ〜０．０００２８Ｍ（ＢＶＧＲ　ｐＮについての場合と同様に変化する）のサクシニル−Ｌ−アラニル（Ａｌａｎｙｌ）−Ｌ−アラニル（Ａｌａｎｙｌ）−Ｌ−プロリル（Ｐｒｏｌｙｌ）−Ｌ−フェニルアラニル（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ）−ｐ−ニトロアニリド（ｓＡＡＰＦ　ｐＮ；Ｖｅｇａ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含有させ０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．６）中、２５℃で行なった。
　これらの実験の結果を以下に示す。
　各ミュータントのＫｃａｔ／Ｋｍ比は野生型酵素のものと異なっていた。触媒効率の測定の結果、これらの比率は、本発明方法に従って、与えられた基質に対して遥かに高い活性を有する酵素を容易に設計することができ、かつスクリーニングによって選択することができるということを示している。例えばＡ１６６は、ｓＡＡＰＦ　ｐＮにおける野生型の活性の２倍以上の活性を示す。
　このデータはまた、野生型酵素のミューテーションによる基質特異性の変化をも示している。例えばＤ１６６およびＥ１６６ミュータントのｋｃａｔ／Ｋｍ比は、ＢＶＧ　ｐＮ基質に対しては野生型より高いが、ｓＡＡＰＦ　ｐＮについては質的に逆の結果が得られている。従ってＤ１６６およびＥ１６６ミュータントは、ｓＡＡＰＦ　ｐＮよりもＢＶＧＲ　ｐＮに対してより特異性がある。
　
実施例１９
　実施例１６で得られたＣｙｓ＋２２２ミュータントのｐＨプロフィルを野生型酵素のそれと比較した。ＤＭＳＯ中の１０μｌの６０ｍｇ／ｍｌ　ｓＡＡＰＦ　ｐＮ、１０μｌのＣｙｓ＋２２２（０．１８ｍｇ／ｍｌ）か野生型（０．５ｍｇ／ｍｌ）および９８０μｌの緩衝液（ｐＨ６．６、７．０および７．６の場合の測定については０．１Ｍ　ＮａＰＯ４緩衝液；ｐＨ８．２、８．６および９．２の場合は０．１Ｍトリス緩衝液；およびｐＨ９．６および１０．０の場合は０．１Ｍグリシン緩衝液）を混合した後、１分当りの４１０ｎｍにおける吸光度の初期変化率を各ｐＨについて測定し、そのデータを第１５図に示した。Ｃｙｓ＋２２２ミュータントは野生型酵素よりも狭い至適ｐＨを示した。
　
実施例２０
　変異誘発プライマーが異なっていること（第１６図に示したプライマーを使用）、２つの制限酵素がＰｓｔＩおよびＫｐｎＩの代りにＫｐｎＩとＥｃｏＲＶであること、および得られた組立物が異なっていること（第１６図に示した）を除けば実施例１３〜１４と同じ操作を行なった。
　１６９位におけるミュータントサブチリシンを分泌する桿菌株は実施例１６に記載したようにして得た。野生型の残基の代りにａｌａおよびｓｅｒの置換を示すミュータントサブチリシンを回収し、速度諭的特徴の変化を調べるために分析した。この分析にはｐＨ８．６でＳＡＡＰＦ　ｐＮを実施例１８に示したものと同様にして使用した。結果を以下に示す。
　
実施例２１
　実施例１５および１６で得た１６６位のミュータントを、天然の蛋白質基質に対する特異活性の変化について分析した。これらのミュータントプロテアーゼは、変化した比活性とともに変化した特異性をも示すことがあるので、１つのタイプの特異性を持ったプロテアーゼの方向に分析がかたよらないために、基質は十分な量の種々の開裂部位、すなわち酸性、塩基性、中性および疎水性の部位を含んでいなければならない。基質はある配列部位をマスキングすることになるデリビタイズド残基を含んでいてはならない。ヘモグロビン、アゾコローゲン（ａｚｏｃｏｌｌｏｇｅｎ）、アゾカゼイン、ジメチルカゼインなどの広く用いられている基質は、この理由で使用できない。牛カゼイン、αおよびα２カゼインが好適な基質として選ばれた。
　１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ中で１％カゼイン溶液（ｗ／ｖ）を調製した。分析のプロトコールは次の通りである：
　７９０μｌの５０ｍＭトリス（ｐＨ８．２）
　１００μｌの１％カゼイン（Ｓｉｇｍａ）溶液
　１０μｌの試験酵素（１０−２００μｇ）。
　このアッセイ混合物を混合し、室温で２０分間インキュベートした。１００μｌの１００％トリクロロ酢酸を添加し、次いで室温で１５分間インキュベートすることにより反応を終結させた。沈澱した蛋白質を遠心分離によりペレット化し、上清の２８０ｎｍにおける光学密度を分光光度計を用いて測定した。光学密度は、反応混合物中の沈澱しなかった、すなわち加水分解されたカゼインの量を表わしている。それぞれのミュータントプロテアーゼによって加水分解されたカゼインの量を、種々の量の野生型プロテアーゼを含んでいる一連の標準物と比較し、その活性を野生型の活性に対するパーセンテージで表わした。酵素活性を、分析に使用した酵素溶液の２８０ｎｍにおける吸光度でカゼイン加水分解活性を割ることにより比活性に変換した。
　Ａｓｎ＋１６６を除き、分析した全てのミュータントは野生型のものよりカゼインに対する比活性が低かった。Ａｓｎ＋１６６は野生型よりカゼインに対する活性が２６％高かった。最も低い比活性を示したミュータントはｉｌｅ＋１６６であり、野生型の活性の０．１８４であった。
【図面の簡単な説明】
　第１図Ａは機能的Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓサブチリシン遺伝子の配列を示す模式図、第１図Ｂはその暗号鎖のヌクレオチド配列を、蛋白質のアミノ酸配列と関連させて示している模式図、第２図はプール１（パネルＡ）およびプール２（パネルＢ）でそれぞれプローブした純化陽性クローンのレプリカ・ニトロセルロース・フィルターの結果を示すグラフ、第３図はサブチリシン発現プラスミド（ｐＳ４）の制限分析を示す模式図、第４図はｐＢＳ４２およびｐＳ４で形質転換した培養物からの上清について行なったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示すグラフ、第５図はシャトルベクターｐＢＳ４２の構成を示す模式図、第６図はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓサブチリシン遺伝子を含む配列の制限地図を示す模式図、第７図は機能的なＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓサブチリシン遺伝子の配列を示す模式図、第８図はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓサブチリシン遺伝子の欠失ミュータントを得るための組立法を示す模式図、第９図はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ遺伝子の制限地図を示す模式図、第１０図はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を示す模式図、第１１図はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ遺伝子を含んでいるベクターの組立を示す模式図、第１２，１３および１６図は本発明方法による変異誘発技術の具体例を示す模式図、第１４図はサブチリシンミュータントの強化された酸化安定性を示すグラフ、第１５図は野生型酵素と比較した場合のサブチリシンミュータントのｐＨ活性プロフィルの変化を示すグラフである。