(57)【要約】  本発明は、ポリ乳酸を、糖を原料とした微生物発酵によって効率よく生産する方法を提供することを目的とする。  プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質、及び下記のａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質を有する組み換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する工程１）：  ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸の少なくとも１以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列  ｂ）ａ）に規定されるタンパク質において、さらに１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目以外の1若しくは数個のアミノ酸が欠失若しくは置換され、又は1以上のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列、及び、工程１）の培養物から前記ポリエステルを回収する工程２）を含む、ポリエステルの製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質、及び下記のａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質を有する組み換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する工程１）：
ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸の少なくとも１以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
ｂ）ａ）に規定されるタンパク質において、さらに１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失若しくは置換され、又は1若しくは数個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列、
及び、工程１）の培養物から前記ポリ乳酸を回収する工程２）
を含む、ポリ乳酸の製造方法。
【請求項２】
プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目及び４８１番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに、４８１番目のＧｌｎがＬｙｓにそれぞれ置換されたアミノ酸配列である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
前記タンパク質のいずれもが、微生物に導入された組み換え発現ベクターにコードされているタンパク質である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質、及び下記のａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質を有する組み換え微生物。
ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸の少なくとも１以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
ｂ）ａ）に規定されるタンパク質において、さらに１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目以外の1若しくは数個のアミノ酸が欠失若しくは置換され、又は1若しくは数個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列
【請求項８】
プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列である、請求項７に記載の組み換え微生物。
【請求項９】
プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列である、請求項７に記載の組み換え微生物。
【請求項１０】
ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目及び４８１番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列である、請求項７に記載の組み換え微生物。
【請求項１１】
ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに、４８１番目のＧｌｎがＬｙｓにそれぞれ置換されたアミノ酸配列である、請求項７に記載の組み換え微生物。
【請求項１２】
前記タンパク質をコードする遺伝子を有する組み換え発現ベクターが導入されていることを特徴とする請求項７に記載の組み換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換え微生物を用いたポリ乳酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球環境問題の観点から、自然界で容易に分解される生分解性プラスチックとして、また糖や植物油などの再生可能な炭素資源から合成することができる“グリーン”プラスチックとして生物由来のポリエステルが注目を浴びている。中でもポリ乳酸は、比較的コストが安く、融点も１７０℃以上と充分な耐熱性を有し、溶融成型可能なため、実用上優れた生分解性ポリマ−と期待されている。【０００３】
しかし従来は、特開2004-204464に示すように微生物で生産した乳酸を中和，精製工程を経て，二量体の環状化合物（ラクチド）にしてから重合することでポリ乳酸を生産していたことから，コストが高くなるという問題点があった。【０００４】
現在までに、糖を炭素源としてポリエステルを生産する能力を有する微生物が多数報告されている（非特許文献１）。微生物が生産する生分解性プラスチックの代表例は、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）をモノマーとするポリ−３−ヒドロキシ酪酸（ｐｏｌｙｈｙｄｏｒｏｘｙｂｕｔｙｌａｔｅ、ＰＨＢ）である。ＰＨＢは、１８０℃程度に融解温度をもつ熱可塑性高分子であり、生分解性に加えて溶融加工性に優れるという利点を有する。その一方、ＰＨＢは、結晶性が高いために、硬くて脆い、すなわち耐衝撃性に劣るという物性上の問題を抱えている。【０００５】
ＰＨＢの物性上の問題を解消する方法の一つとして、３ＨＢとその他のヒドロキシアルカン酸とからなる共重合ポリエステルを、微生物を用いて製造する方法が開発されている。【０００６】
例えば、特許文献１には３ＨＢと３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）とからなる共重合体の製造方法が開示されている。また特許文献２には、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）の微生物を、炭素数３から７の第一アルコールに接触させることにより、３ＨＢと３ＨＶとの共重合体を生産させる方法が開示されている。【０００７】
この３ＨＢと３ＨＶとの共重合体はＰＨＢに比べると柔軟性に富み、また共重合ポリエステル中の３ＨＶの含有率が増加すると柔軟性が高まることが確認されている。上記の微生物を用いた３ＨＢと３ＨＶとの共重合体の製造法では、例えば前記特許文献１ではプロピオン酸を、また特許文献３ではプロパン−１−オールをそれぞれ培地に添加することで、共重合ポリエステル中の３ＨＶの含有率を制御している。【０００８】
３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと略す）との２成分共重合ポリエステルであるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）およびその製造方法も、例えば、特許文献４及び特許文献５にそれぞれ記載されている。これらの公報のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）共重合体の製造方法は、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）を用い、オレイン酸等の脂肪酸やオリーブオイル等の油脂から発酵生産するものである。また、このＡ．ｃａｖｉａｅのＰＨＡシンターゼ遺伝子をクローニングし、この遺伝子をアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）に導入した組換え株を用いて、脂肪酸を炭素源としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する報告もなされている（特許文献６）。【０００９】
また、上記の共重合ポリエステルの微生物を用いた製造法では、何れの場合にも、直接ポリマーを合成する活性を有する酵素タンパク質であるポリヒドロキシアルカン酸合成酵素を使用することが必要であるが、この合成酵素を改変して、モノマー単位のモル分率を調節する試みも行われている。例えば特許文献７は、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６１−３として同定されている微生物のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素のアミノ酸配列を変換して、３ＨＢの含有率が高いＰＨＢを生産する変異酵素を開示している。【００１０】
一方、３−ヒドロキシアルカン酸以外の成分をモノマー単位とする共重合ポリエステルは、上記の共重合ポリエステルとは異なる物性を有することが期待される。特許文献８は、その様な３−ヒドロキシアルカン酸以外のモノマー単位を含む共重合ポリエステルの例として、クロストリジウム・プロピオニウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸を組み込んだラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、旧名アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ））を、培地に乳酸を添加しながら培養して、３ＨＢと乳酸（ＬＡ）とからなる共重合ポリエステルを製造する方法を開示している。また、同文献は、Ｃ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｕｍ由来のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸と、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６１−３由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする核酸とを組み込んだ大腸菌を、培地に乳酸とデセノイン酸を添加しながら培養して、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシデカノエート及び乳酸からなるコポリマーを製造する方法も開示している。【００１１】
以上は、３−ヒドロキシアルカン酸をモノマー単位とする共重合ポリエステルや３−ヒドロキシアルカン酸以外の成分をモノマー単位とする共重合ポリエステルと、微生物を用いたその製造法である。【００１２】
しかし、糖を原料として、微生物発酵によってポリ乳酸を効率的に生産する方法についての報告はない。
【非特許文献１】「生分解性プラスチックハンドブック」、生分解性プラスチック研究会編、１９９５年、第１７８−１９７頁、（株）エヌ・ティー・エス発行）
【特許文献１】特開昭５７−１５０３９３号公報
【特許文献２】特開平５−７４４９２号公報
【特許文献３】特公平７−７９７０５号公報
【特許文献４】特開平５−９３０４９号公報
【特許文献５】特開平７−２６５０６５号公報
【特許文献６】特開平１０−１０８６８２号公報
【特許文献７】国際公開公報ＷＯ２００３／１０００５５
【特許文献８】国際公開公報ＷＯ２００６／１２６７９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、ポリ乳酸を、糖を原料とした微生物発酵によって効率よく生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前記特許文献７に記載のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の変異体をコードする核酸を導入した組み換え微生物が、糖から直接的にポリ乳酸を効率的に製造することができることを見いだし、下記の各発明を完成した。【００１５】
（１）プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質、及び下記のａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質を有する組み換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する工程１）：
ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸の少なくとも１以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
ｂ）ａ）に規定されるタンパク質において、さらに１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目以外の1若しくは数個のアミノ酸が欠失若しくは置換され、又は1若しくは数個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列、
及び、工程１）の培養物から前記ポリ乳酸を回収する工程２）
を含む、ポリ乳酸の製造方法。【００１６】
（２）プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列である、（１）に記載の製造方法。【００１７】
（３）プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列である、（１）に記載の製造方法。【００１８】
（４）ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目及び４８１番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列である、（１）に記載の製造方法。【００１９】
（５）ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに、４８１番目のＧｌｎがＬｙｓにそれぞれ置換されたアミノ酸配列である、（１）に記載の製造方法。【００２０】
（６）前記タンパク質のいずれもが、微生物に導入された組み換え発現ベクターにコードされているタンパク質である、（１）に記載の製造方法。【００２１】
（７）プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質、及び下記のａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質を有する組み換え微生物。【００２２】
ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸の少なくとも１以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
ｂ）ａ）に規定されるタンパク質において、さらに１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目以外の1若しくは数個のアミノ酸が欠失若しくは置換され、又は1若しくは数個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列
（８）プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列である、（７）に記載の組み換え微生物。【００２３】
（９）プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列である、（７）に記載の組み換え微生物。【００２４】
（１０）ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目及び４８１番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列である、（７）に記載の組み換え微生物。【００２５】
（１１）ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに、４８１番目のＧｌｎがＬｙｓにそれぞれ置換されたアミノ酸配列である、（７）に記載の組み換え微生物。【００２６】
（１２）前記タンパク質をコードする遺伝子を有する組み換え発現ベクターが導入されていることを特徴とする、（７）に記載の組み換え微生物。【００２７】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008-276185号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の製造方法は、安価な炭素源を原料として、ポリ乳酸を効率的に製造することができ、生分解性プラスチックの製造コストを低くすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】組換えプラスミドｐＴＶ１１８ＮＰＣＴＣ１（ＳＴ／ＱＫ）の構成を示す概略図である。図中、ｐｈａＣ１（ＳＴ／ＱＫ）はＳＴＱＫ遺伝子を、ＰＣＴはＭ．エルスデニ（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ）由来のＰＣＴ遺伝子を、ＰＲｅはＲ．ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来プロモーターを、及びＰｌａｃは大腸菌ラクトースオペロンプロモーターを、それぞれ表す。
【図２】実施例で調製したポリマーの分子量分布曲線である。
【図３Ａ】Ｍ．エルスデニ由来のＰＣＴ遺伝子と、ｐｈａＣ１（ＳＴ／ＱＫ）遺伝子とを含む組換えプラスミドｐＴＶ１１８ＮＰＣＴＣ１（ＳＴ／ＱＫ）を用いて調製したポリマーのＧＣ／ＭＳ分析の結果を表わすチャートである。
【図３Ｂ】Ｍ．エルスデニ由来のＰＣＴ遺伝子と、ｐｈａＣ１（ＷＴ）遺伝子とを含む組み換えプラスミドｐＴＶ１１８ＮＰＣＴＣｌ（ＷＴ）を用いて調製したポリマーのＧＣ／ＭＳ分析の結果を表わすチャートである。
【図３Ｃ】ＰＬＡ標品（ＭＷ２０，０００）を用いて調製したポリマーのＧＣ／ＭＳ分析の結果を表わすチャートである。
【図３Ｄ】Ｍ．エルスデニ由来のＰＣＴ遺伝子又はＣ．プロピオニウム由来のＰＣＴ遺伝子と、ｐｈａＣ１（ＳＴ／ＱＫ）遺伝子とを含む組み換えプラスミドｐＴＶ１１８ＮＰＣＴＣ１（ＳＴ／ＱＫ）を用いて調製したポリマーのＧＣ／ＭＳ分析の結果を表すチャートである。
【図４】実施例で調製したポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析の結果を表わすチャートである。
【図５】組換えプラスミドｐＴＶ１１８ＮＰＣＴＣ１（ＷＴ）の構成を示す概略図である。図中、ｐｈａＣ１（ＷＴ）はシュードモナスｓｐ．６１−３由来ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子（野生型）を、ＰＣＴはＭ．エルスデニ由来ＰＣＴ遺伝子を、ＰＲｅはアルカリゲネス・ユウトロファス由来プロモーターを、及びＰｌａｃはラクトースオペロンプロモーターを、それぞれ示す。
【図６】ＰＣＴ遺伝子の違いによるラクトイルＣｏＡの生産量の違いを経時的に示すグラフである。
【図７】Ｍ．エルスデニ由来のＰＣＴ遺伝子とＣ．プロピオニウム由来のＰＣＴ遺伝子とのポリ乳酸生産性の比較を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質と、下記のａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質を有する組み換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する工程１）：
ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸の少なくとも１以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
ｂ）ａ）に規定されるタンパク質において、さらに１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目以外の1若しくは数個のアミノ酸が欠失若しくは置換され、又は1若しくは数個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列、
及び、工程１）の培養物から前記ポリ乳酸を回収する工程２）を含む、ポリ乳酸の製造方法である。以下、本発明で使用されるタンパク質、組み換え微生物、及び本発明の製造方法の諸条件について、説明する。【００３１】
１）プロピオン酸及び／又は乳酸（ＬＡ）にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質
本発明で使用される「プロピオン酸及び／又はＬＡにＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質」は、適当なＣｏＡ基質からプロピオン酸及び／又はＬＡにＣｏＡが転移される反応を触媒する活性を有するタンパク質である。かかる活性を有するタンパク質は、一般にプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＰｒｏｐｉｏｎｙｌＣｏＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＰＣＴ）と称されている。以下、本発明では、当該タンパク質をＰＣＴと表すこととする。【００３２】
表１に、これまでに報告されたＰＣＴの由来（微生物名）の代表例と、それをコードする塩基配列情報を開示した文献情報を示す。
【表１】
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【００３３】
本発明では、上記表１の他にも、これまでに報告されたＰＣＴのいずれも利用することができる。また、「プロピオン酸及び／又はＬＡにＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質」であるかぎり、既知のＰＣＴのアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても利用することができる。なお、ＰＣＴのアミノ酸配列の関連で使用する用語「数個」とは、１〜５０個、好ましくは１〜２５個、より好ましくは１０個以下をいう。【００３４】
プロピオン酸及び／又はＬＡにＣｏＡが転移される反応の触媒活性は、例えばＡ．Ｅ．Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒら（Ｅｕｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第２０６巻、第５４７−５５２頁）に記載された方法に従って測定することができる。【００３５】
本発明における好ましいＰＣＴは、メガスファエラ・エルスデニ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）由来のＰＣＴであり、そのアミノ酸配列を配列番号４に、当該アミノ酸配列をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列の例を配列番号３に示す。【００３６】
本発明における他の好ましいＰＣＴは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＰＣＴであり、そのアミノ酸配列を配列番号６に、当該アミノ酸配列をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列の例を配列番号５に示す。下記実施例に示すように、スタフィロコッカス・アウレウス由来のＰＣＴは、メガスファエラ・エルスデニ由来のＰＣＴに比較して、微生物培養の初期で高い乳酸ＣｏＡ生産性を示し、これはより迅速に乳酸ＣｏＡ及びポリ乳酸を生産できることを示唆している。したがって、スタフィロコッカス・アウレウス由来のＰＣＴの使用は、ポリ乳酸の生産に伴うコストを削減できるという利点を有する。【００３７】
本発明において、上記いずれか１種のＰＣＴを単独で用いてもよいし、複数種に由来するＰＣＴを組合せて用いてもよい。例えば、メガスファエラ・エルスデニ由来のＰＣＴは、スタフィロコッカス・アウレウス由来のＰＣＴに比較して、微生物培養の後期で高い乳酸ＣｏＡ生産性を示す。このようなメガスファエラ・エルスデニ由来のＰＣＴの特性と、上述したスタフィロコッカス・アウレウス由来のＰＣＴの特性に基づき、両者を併用することで、より長期間にわたって乳酸ＣｏＡ生産性を維持できると考えられる。【００３８】
２）ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質
本発明におけるポリヒドロキシアルカン酸の合成を触媒するタンパク質は、ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸の少なくとも１以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、又はｂ）ａ）に規定されるタンパク質において、さらに１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失若しくは置換され、又は1若しくは数個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。ａ）で規定するタンパク質は、前記特許文献７に記載されている、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６１−３由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素のアミノ酸配列の一部を変異させたタンパク質であり、ｂ）で規定するタンパク質は、ａ）で規定するタンパク質にその活性を失わない程度にさらに追加の変異が導入されたものである。なお、ｂ）に規定するタンパク質に関連して使用される用語「数個」とは、１〜５０個、好ましくは１〜２５個、より好ましくは１０個以下をいう。以下、本発明におけるポリヒドロキシアルカン酸の合成を触媒するタンパク質をＰｈａＣｍと表し、また特許文献７の記載を全て本明細書に取り込むこととする。【００３９】
ＰｈａＣｍの好適な具体例は、特許文献７の表６及び表７に記載されている、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸が、それぞれ単独で置換された単独変異、任意の２つのアミノ酸が置換された二重変異、任意の３つのアミノ酸が置換された三重変異、４つ全てのアミノ酸が置換された四重変異を挙げることができる。【００４０】
好ましいタンパク質は、任意の２つのアミノ酸が置換された二重変異であり、特に好ましくは３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに、及び４８１番目のＧｌｎがＬｙｓに置換された二重変異（以下、ＳＴＱＫと表す）である。【００４１】
ＰｈａＣｍをコードするＤＮＡは、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６１−３由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素のアミノ酸配列（配列番号２）及びそれをコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号１）を基に、当業者に知られた部位特異的変異導入法によって組み換え的に作製することができる。また、特許文献７に記載されている通り、ＰｈａＣｍのポリヒドロキシアルカン酸の合成を触媒する活性は、前記ＰｈａＣｍを発現可能な核酸で形質転換された宿主細胞を得、当該宿主細胞のポリヒドロキシアルカン酸の蓄積能によって確認することができる。【００４２】
３）タンパク質をコードする核酸
上記１）〜２）の各タンパク質は、それらをコードする核酸を微生物に導入して、当該微生物内でタンパク質に転写翻訳させて使用することが好ましい。微生物に導入される核酸は、ベクターに組み込まれた形態にあることが好ましい。【００４３】
前記の核酸を微生物に導入するためのベクターは、宿主中で自立複製可能なものであればよく、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡの形態にあることが好ましい。核酸を大腸菌に導入するためのベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢＬｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ等のプラスミドＤＮＡを、ＥＭＢＬ３、Ｍ１３、λｇｔＩＩ等のファージＤＮＡ等を、それぞれ挙げることができる。また酵母に導入するためのベクターの例としては、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等を挙げることができる。【００４４】
また、核酸をラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属細菌やシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌に導入するためのベクターの例としては、広範囲の宿主において複製・保持されるＲＫ２複製起点を有するｐＬＡ２９１７（ＡＴＣＣ３７３５５）やＲＳＦ１０１０複製起点を有するｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ ３７５３３）等を挙げることができる。【００４５】
上記１）〜２）の各タンパク質をコードする核酸、好ましくはＤＮＡのベクターへの挿入は、当業者に知られた遺伝子組み換え技術を用いて行うことができる。また組み換えに際して、ベクターに挿入されるＤＮＡからの各タンパク質の転写翻訳を調節することのできるプロモーターの下流に、前記ＤＮＡを連結することが好ましい。プロモーターとしては、宿主中で遺伝子の転写を調節できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーターなどを、酵母を宿主として用いる場合には、ｇａｌ1プロモーター、ｇａｌ１０プロモーターなどを用いることができる。また、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌を本発明の微生物として用いる場合には、プロモーターとして、ｐｈａＣ１Ｐｓ遺伝子上流やｐｈｂＣＲｅ上流のプロモーターを含むと考えられる領域などを用いることができる。【００４６】
また、本発明のベクターには、必要に応じて、核酸を導入しようとする微生物において利用可能なターミネーター配列、エンハンサー配列、スプライシングシグナル配列、ポリＡ付加シグナル配列、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）、選択マーカー遺伝子などを連結することができる。選択マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子の他、アミノ酸や核酸等の栄養素の細胞内生合成に関与する遺伝子、あるいはルシフェラーゼとうの蛍光タンパク質をコードする遺伝子などを挙げることができる。【００４７】
上記の核酸、好ましくはベクターの形態にある核酸は、当業者に知られた方法によって、微生物に導入される。微生物へのベクターの組み換え方法としては、例えばリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、接合伝達法、カルシウムイオンを用いる方法や等が挙げられる。【００４８】
４）微生物
本発明における組み換え微生物としては、上記１）〜２）のタンパク質を発現している微生物、好ましくは上記１）〜２）のタンパク質を機能的に発現し得る核酸の導入によって形質転換された微生物である。好適な微生物としては、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１−３株などのシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、Ｒ．ユートロファなどのラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属細菌、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などのエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、サッカロマイセス・セレビシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）などのカンジダ(Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母などを挙げることができる。中でも大腸菌、コリネバクテリウム属細菌、及びＲ．ユートロファが好ましく、特に好ましくは大腸菌、コリネバクテリウム属細菌である。【００４９】
Ｒ．ユートロファなどの、それ自体が固有のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素を持つ微生物の場合には、当該固有のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の発現能を失った微生物を使用することが好ましい。かかる発現能を失った微生物は、ニトロソグアニジンなどの化学変異源やＵＶ等の物理的変異源によって微生物を処理したり、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする核酸を改変して当該酵素の機能的な発現を不能とした変異核酸を微生物に導入し、「相同的組み換え」（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を行わせたりして、作製することができる。ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が破壊されていることの確認は、該遺伝子の一部をプローブとして用いるサザンハイブリダイゼーションによって、ハイブリダイズするバンドが、野性株由来のバンドに比べて予想される位置にシフトしていることを調べることによって行うことができる。【００５０】
５）ポリ乳酸の製造
ポリ乳酸の製造は、前記の核酸が導入された組み換え微生物を、炭素源を含む培地で培養し、培養菌体又は培養物中にポリ乳酸を生成蓄積させ、該培養菌体又は培養物からポリ乳酸を回収することにより行われる。【００５１】
本発明の組み換え微生物の培養は、培地組成を除き、組み換え微生物の種類に応じて、それぞれの微生物についての一般的な培養条件で行うことが好ましい。【００５２】
特殊な組成を有する培地は特に必要とされないが、炭素源以外の窒素源、無機塩類その他の有機栄養源のいずれかを制限した培地を利用することが好ましい。例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属細菌やシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌等に核酸を組み込んだ組み換え微生物を培養する培地としては、例えば窒素源を０．０１〜０．１％に制限した培地が挙げられる。【００５３】
炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、マルトース等の炭水化物が挙げられる。また、炭素数４以上の油脂関連物質を炭素源とすることもできる。炭素数４以上の油脂関連物質としては、コーン油、大豆油、サフラワー油、サンフラワー油、オリーブ油、ヤシ油、パーム油、ナタネ油、魚油、鯨油、豚油又は牛油などの天然油脂、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノレン酸、リノール酸若しくはミリスチン酸等の脂肪酸又はこれらの脂肪酸のエステル、オクタノール、ラウリルアルコール、オレイルアルコール若しくはパルミチルアルコール等又はこれらアルコールのエステル等が挙げられる。【００５４】
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。【００５５】
培養は、通常振盪培養などの好気的条件下、２５〜３７℃の範囲で、前記１）〜２）のタンパク質が転写発現されてから２４時間以上行うことが好ましい。培養中は、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。前記１）〜２）のタンパク質をコードするＤＮＡのいずれか或いは全てを誘導性プロモーターの制御下に連結した場合には、当該プロモーターの転写に誘導する因子を培地に添加すればよい。【００５６】
本発明の好ましい態様は、Ｍ．エルスデニ（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ）由来のＰＣＴをコードする核酸（配列番号３）又はＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＰＣＴをコードする核酸（配列番号５）、及びＳＴＱＫをコードする核酸を有する発現ベクターを導入した組み換え大腸菌を培養し、ポリ乳酸を製造する方法である。この方法は、培地にＬＡなどの、目的とするポリマーを構成するモノマー成分を培地に添加しなくても、安価な廃糖蜜から、ポリ乳酸を製造することができ、製造コストの点で有利である。【００５７】
本発明において、ポリ乳酸の回収は、微生物からポリ乳酸あるいはＰＨＡを回収するための、当業者に公知の方法によって行えばよい。例えば、培養液から遠心分離によって集菌、洗浄した後、乾燥させ、クロロホルムに乾燥菌体を懸濁し、加熱することによって、目的とするポリエステルをクロロホルム画分に抽出し、さらにこのクロロホルム溶液にメタノールを加えてポリ乳酸を沈殿させ、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去した後、乾燥することで、精製されたポリ乳酸を得ることができる。【００５８】
回収されたポリエステルがポリ乳酸であることの確認は、通常の方法、例えばガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行えばよい。【００５９】
以下、非限定的な実施例を示して本発明をさらに詳細に説明する。なお、実施例における各実験操作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ  ｅｄ．  １９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）を初めとする各種の実験操作を紹介したマニュアル、又は各種試薬及びキットに添付された指示書の各記載に従い、行った。
【実施例】
【００６０】
＜実施例１＞
１）組み換え微生物の作製
Ｍ．エルスデニ（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ、ＡＴＣＣ１７７５３）からＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出後、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ（アクセッションＮｏ．Ｊ０４９８７）をコードする核酸をＰＣＲで増幅するために、ＥｃｏＲＩ認識配列を含むフォワードプライマーと、ＰｓｔＩ認識配列を含むリバースプライマーのプライマーＤＮＡを合成した。【００６１】
前記ゲノムＤＮＡを鋳型として、ｉＣｙｃｌｅｒ(ＢｉｏＲａｄ)を用い、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ）、ＰＣＲバッファー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、各プライマー１５ｐｍｏｌ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（全て東洋紡株式会社製）を含む反応液中、９４℃２分を１サイクル、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとするＰＣＲ反応を３０サイクル行った後、約１，５００ｂｐの増幅断片を回収し、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化して、ＤＮＡフラグメントを得た。【００６２】
また、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、ＡＴＣＣ１０８３２）及びＣ．プロピオニウム（Ｃ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、ＡＴＣＣ２５５２２）からも同様に、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼをコードするＤＮＡフラグメントを取得した。使用したＰＣＲ増幅条件は次の通りである： ＰＣＲ反応（酵素ＫＯＤ‐ＰＬＵＳ）、９４℃ １分の１サイクル、９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、及び７２℃ ２分の３０サイクル、及び９４℃２分。【００６３】
各遺伝子の増幅に使用したプライマーセットの配列は次の通りである：
Ｍ．エルスデニＰＣＴ用：
MePCTN：5’-atgagaaaagtagaaatcattac-3’
MePCTC：5’-ttattttttcagtcccatgggaccgtcctg-3’
Ｃ．プロピオニウムＰＣＴ用：
CpPCTN：5’-gggggccatgggaaaggttcccattattaccgcagatgag -3’
CpPCTC：5’-ggggggctcgagtcaggacttcatttccttcagacccat-3’
Ｓ．アウレウスＰＣＴ用：
SpctN：5’-gtgccatggaacaaatcacatggcacgac-3’
SpctC：5’-cacgaattcatactttatgaattgattg-3’
プラスミドｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造）をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩを用いて消化し、アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化した後、Ｍ．エルスデニ由来の前記ＤＮＡフラグメントを加えてライゲーションし、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを含む、約４．７ｋｂｐの組み換えプラスミドＰＴＶ１１８Ｎ Ｍ．Ｅ．−ＰＣＴを調製した。【００６４】
同様に、Ｃ．プロピオニウム及びＳ．アウレウスの各ＰＣＴ遺伝子を、それぞれｐＴＶ１１８Ｎベクター(宝酒造)のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ、ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ間に挿入することで、発現プラスミドＰＴＶ１１８Ｎ Ｃ．Ｐ．−ＰＣＴ、ＰＴＶ１１８Ｎ Ｓ．Ａ．−ＰＣＴを作製した。【００６５】
Ｔａｋａｓｅら（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００３年、第１３３巻、第１３９−１４５頁）に記載されている方法に従い、ＳＴＱＫをコードするＤＮＡを全て含むプラスミドｐＧＥＭＣ１（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢを調製した。【００６６】
ｐＧＥＭＣ１（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢをＢａｍＨＩで消化して、約６ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収し、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ ＤＴＴ，０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰを含む３ｍＭ トリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．９）中、２００ユニットのＴ４ポリメラーゼを３７℃で５分間作用させて、ＳＴＱＫをコードするＤＮＡ断片を得た。【００６７】
ｐＴＶ１１８Ｎ Ｍ．Ｅ．−ＰＣＴをＰｓｔＩで消化し、上記と同条件でＴ４ポリメラーゼを作用させた後、アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化した後、前記ｐｈａＣｍをコードするＤＮＡ断片をライゲーションして、ｐＴＶ１１８Ｎ Ｍ．Ｅ．−ＰＣＴのＳａｌＩサイトにＳＴＱＫをコードするＤＮＡを導入した、約９．６ｋｂｐのプラスミドｐＴＶ１１８Ｎ‐ＰＣＴ‐Ｃ１（ＳＴ／ＱＫ）ＡＢを得た。ｐＴＶ１１８Ｎ‐ＰＣＴ−Ｃｌは、ｐＴＶ１１８Ｎ−ＰＣＴ−Ｃ１ＡＢのｐｈａＡ、ｐｈａＢ部分を除く領域をＰＣＲ法で増幅させ、その産物をセルフライゲーションして得た（図１）。大腸菌種Ｗ３１１０のコンピテントセルをｐＴＶ１１８Ｎ‐ＰＣＴ‐Ｃ１（ＳＴ／ＱＫ）を用いて形質転換した。【００６８】
また同様にして、発現プラスミドＰＴＶ１１８Ｎ  Ｃ．Ｐ．−ＰＣＴを用い、前記ｐｈａＣｍをコードするＤＮＡ断片を保持するｐＴＶ１１８Ｎ−Ｃ．Ｐ  ＰＣＴ−Ｃ１（ＳＴＱＫ）を取得し、大腸菌種Ｗ３１１０のコンピテントセルを形質転換した。【００６９】
２）ポリマーの生産
得られた形質転換体の培養は、ＬＢ寒天培地上で形成したアクティブコロニーを１００ｍｌ容三角フラスコに入った１０ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３０℃でＯＤ  ０．６〜１．０まで振盪培養（オリエンタル技研工業（株）製ＩＦＭ型，１３０ｒｐｍ）して生育した前培養菌液を、５００ｍｌ容三角フラスコに入った２００ｍｌの本培養用培地に１％容量接種し振盪培養を行った。【００７０】
前述した培養法により２００ｍｌ培養を行い、得られた培養液を５０ｍｌファルコンチューブで集菌（３０００×ｇ，５ｍｉｎ，ＲＴ）後、−８０℃で一晩凍結した。この凍結菌体を、凍結乾燥機（ＬＡＢＣＯＮＣＯ社製Ｍｏｄｅｌ  ７７４００型）にて２日間乾燥した。【００７１】
乾燥菌体を耐圧試験管へ移し、菌体100mg当たり1mlのクロロホルムを添加して、95℃のウォーターバス中で3時間リフラックスした。リフラックス後のサンプルを室温に戻し、0.22μm PTFEフィルターでシリコン製遠心管へろ過し、菌体を取り除いた。抽出されたサンプルは、クロロホルムが完全になくなるまで室温で乾燥させた。この乾燥後のペレットにヘキサン2mlを加え、約1分間ボルテックスし、その後遠心（6,000×g、15分、RT）して上清を取り除いた。このヘキサンによる洗浄は2回行った。ドライアップ後のサンプルを、2mlのクロロホルムに溶解し、ガラス製バイアルビンに移してドライアップし、これをポリマー分析用サンプルとした。【００７２】
３）ポリマーの分析
ｉ）ＧＰＣ
２）で回収されたポリマー約１ｍｇにクロロホルムを１ｍＬ加え、これを０．２μｍＰＴＦＥフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）で濾過した溶液をサンプルとして、下記の条件でＧＰＣ測定を行った。【００７３】
システム  ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＧＰＣ  ｓｙｓｔｅｍ
カラム    ：ＴＳＫｇｅｌ−Ｓｕｐｅｒ  ＴＨＺ−Ｍ（６．０ｍｍ×１５０ｍｍ）
溶離液    ：ＣＨＣｌ３ 
流量      ：０．８ｍＬ／分
温度      ：４０°
検出      ：１０Ａ  ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｄｅｔｅｃｔｏｒ
サンプル量：１０μＬ
測定された分子量分布曲線を図２に示す。分子量較正曲線は標準ポリスチレンを用いて作成し、標準ポリスチレン分子量の換算値で分子量を表した。その結果、ポリマーの分子量（Ｍｗ）は２２，０００であった。【００７４】
ｉｉ）ＧＣ／ＭＳ分析
前述した培養法により２００ｍｌ培養を行い、得られた培養液を５０ｍｌファルコンチューブで集菌（３０００×ｇ，５ｍｉｎ，ＲＴ）後、−８０℃で一晩凍結した。この凍結菌体を、凍結乾燥機（ＬＡＢＣＯＮＣＯ社製Ｍｏｄｅｌ  ７７４００型）にて２日間乾燥した。この乾燥菌体のうち１００ｍｇを耐圧試験管へ量り取り、クロロホルム１．６ｍｌを添加して一晩室温で静置した。この菌体／クロロホルム溶液に、メタノール硫酸（メタノール：硫酸＝17:3の混合液）１．６ｍｌ、内部標準１００μｌ（安息香酸１０ｍｇ／ＣＨＣｌ３１０ｍｌ）を添加し、９５℃のウォーターバス中で３時間リフラックスすることでメチル化を行った。メチル化終了後のサンプルは室温に戻し、Φ１８ｍｍのディスポ試験管に移した。ここに、ミリＱ水を８００μｌ加え、約３０秒撹拌した後、水層と溶媒層に分離するまで静置した。分離後、クロロホルム層をパスツールピペットで分取し、０．２２μｍ  ＰＴＦＥフィルターで２ｍｌ容バイアルビンへろ過し、分析に供した。【００７５】
ポリ乳酸の標品は、まず２０ｍｇのＰＬＡ−００２０（和光純薬工業（株）製、重量平均分子量２０，０００）を２０ｍｌ容バイアルビン中で１０ｍｌのクロロホルムに溶解し、このうち１ｍｌを耐圧試験管へ移し、クロロホルム０．６ｍｌ、メタノール硫酸１．６ｍｌ、内部標準１００μｌを添加し、９５℃のウォーターバス中で３時間リフラックスすることでメチル化を行った。メチル化終了後の標準サンプルは室温に戻し、Φ１８ｍｍのディスポ試験管に移した。ここに、ミリＱ水を８００μｌ加え、約３０秒間撹拌した後、水層と溶媒層に分離するまで静置した。分離後、パスツールピペットで２ｍｌ容バイアルビンへ移し、分析に用いた。【００７６】
ＧＣ／ＭＳ分析は下記の条件で行った。【００７７】
メチル化された生産物は、ＧＣ／ＭＳ（ＨＰ６８９０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＧＣ  ｓｙｓｔｅｍ／５９７３  Ｍａｓｓ  ＳｅｌｅｃｔｉｖｅＤｅｔｅｃｔｏｒ）にＡｇｉｌｅｎｔ製カラムのＤＢ−１（１２２−１０Ｇ３  ：１５０ｍｅｔｅｒｓ×０．２５ｍｍ×１ｍｍ）もしくはＤＢ−１（１２２−１０６３：  ６０ｍｅｔｅｒｓ×０．２５ｍｍ×１ｍｍ）を用いて分析を行った。各カラム使用時の分析メソッドを下記に記す。【００７８】
１２２−１０Ｇ３：  １５０℃で２分間ホールド、５℃／１分で昇温、３００℃で１０分ホールド
１２２−１０６３：  １２０℃で５分間ホールド、５℃／１分で昇温、３００℃で１０分ホールド
上記条件での分析結果及び乳酸メチルのＭＳスペクトルを図３Ａ〜Ｄに示す。なお、図３Ｄの結果のみ、クロロホルムを除去しないサンプルから取得されたものである。ＧＣ／ＭＳの結果より、２）で回収されたポリマーはＬＡをモノマー単位として含むことが確認された。【００７９】
ｉｉｉ）ＮＭＲ分析
２）で回収されたポリマーを重水素化クロロホルムに溶解してサンプルとし、３００ＭＨｚで１Ｈ−ＮＭＲ（図４）を測定した。その結果、２）で回収されたポリマーは乳酸をモノマー単位として含むことが判明した。【００８０】
４）微生物内でのＰＣＴ発現及びラクトイルＣｏＡ合成
１）で作成した組み換えプラスミドＰＴＶ１１８Ｎ Ｍ．Ｅ．−ＰＣＴ、ＰＴＶ１１８Ｎ Ｃ．Ｐ．−ＰＣＴ、及びＰＴＶ１１８Ｎ Ｓ．Ａ．−ＰＣＴを用いて、大腸菌種Ｗ３１１０のコンピテントセルを形質転換した。【００８１】
各菌株を前培養後、２００ｍｌ ＬＢ／２Ｌ ｆｌａｓｋに２％で植菌し、３７℃、１８０ｒｐｍで３時間培養した。ＯＤ６００＝０．５付近で１０ｍＭ ＩＰＴＧにより発現誘導し、３０℃、８０ｒｐｍで６時間培養した。次に遠心により菌体を回収し、Ｍ９（＋１．５％Ｇｌｕｃｏｓｅ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ パントテン酸Ｃａ）中３７℃で培養（ＯＤ＝２０，３ｍｌ）培養し、適宜サンプリングを行った。【００８２】
菌体を回収（１×１０５ｃｅｌｌに相当量）し、試料調製を行った（ｎ＝３）。サクションフィルターシステムにアプライし、ミリＱ水で２回洗浄した。ＭｅＯＨ溶液２ｍｌ入りのシャーレにフィルター（裏返）を入れ、室温で１０分間放置後、１．６ｍｌのＭｅＯＨ溶液を遠沈管に移送し、１．６ｍｌのクロロホルム及び６４０ｕｌのミリＱ水を混合し、懸濁した。４６００ｇ、４℃、５ｍｉｎ遠心後、水＋ＭｅＯＨ層１．５ｍｌを５ｋ限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ社製）にて約２時間遠心ろ過した。ろ液を回収し凍結乾燥した後、二次内部標準物質を含むミリＱ水により２００倍濃縮溶解しＣＥ−ＭＳ分析に供した。ＣＥ−ＭＳ分析条件はＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ  ２００２，７４，  ６２２４−６２２９「Ｐｒｅｓｓｕｒｅ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ａｎｉｏｎｓ」に準じた。その結果を図６に示す。【００８３】
図６から、Ｓ．アウレウス由来のＰＣＴ遺伝子は、Ｍ．エルスデニ由来のＰＣＴ遺伝子に比較して、培養初期に高い乳酸ＣｏＡ生産性を示すことが明らかになった。【００８４】
５）ポリ乳酸生産性に及ぼすＰＣＴ遺伝子の影響
図７は上記ｉｉ）ＧＣ／ＭＳ分析からの乳酸誘導体の定量結果を示している。【００８５】
図７の結果から、Ｍ．エルスデニ由来のＰＣＴは、Ｃ．プロピオニウム由来のＰＣＴに比較して、ポリ乳酸の生産性により良好に寄与することが明らかになった。【００８６】
＜比較例＞
実施例１で作製したプラスミドｐＴＶ１１８Ｎ‐ＰＣＴ‐Ｃ１（ＳＴ／ＱＫ）に含まれるＳＴＱＫをコードする塩基配列を、下記のタンパク質をコードする塩基配列に置き換えた発現ベクターを作製した。当該発現ベクターの構成を纏めて図５に示す。【００８７】
ｐＴＶ１１８Ｎ‐ＰＣＴ‐Ｃ１（ＷＴ）：シュードモナスｓｐ．６１−３のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素（野性型、配列番号１）
大腸菌Ｗ３１１０のコンピテントセルをｐＴＶ１１８Ｎ−ＰＣＴ−Ｃ１を用いて形質転換し、得られた形質転換体の培養は、ＬＢ寒天培地上で形成したアクティブコロニーを１００ｍｌ容三角フラスコに入った１０ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３０℃でＯＤ  ０．６〜１．０まで振盪培養（オリエンタル技研工業（株）製ＩＦＭ型，  １３０ｒｐｍ）して生育した前培養菌液を、５００ｍｌ容三角フラスコに入った２００ｍｌの本培養用培地に１％容量接種し振盪培養を行った。【００８８】
前述した培養法により２００ｍｌ培養を行い、得られた培養液を５０ｍｌファルコンチューブで集菌（３０００×ｇ，５ｍｉｎ，ＲＴ）後、−８０℃で一晩凍結した。この凍結菌体を、凍結乾燥機（ＬＡＢＣＯＮＣＯ社製Ｍｏｄｅｌ  ７７４００型）にて２日間乾燥した。この乾燥菌体のうち１００ｍｇを耐圧試験管へ量り取り、クロロホルム１．６ｍｌを添加して一晩室温で静置した。この菌体／クロロホルム溶液に、メタノール硫酸１．６ｍｌ、内部標準１００μｌ（安息香酸１０ｍｇ／ＣＨＣｌ３１０ｍｌ）を添加し、９５℃のウォーターバス中で３時間リフラックスすることでメチル化を行った。メチル化終了後のサンプルは室温に戻し、Φ１８ｍｍのディスポ試験管に移した。ここに、ミリＱ水を８００μｌ加え、約３０秒撹拌した後、水層と溶媒層に分離するまで静置した。分離後、クロロホルム層をパスツールピペットで分取し、０．２２μｍ  ＰＴＦＥフィルターで２ｍｌ容バイアルビンへろ過し、ＧＳ／ＭＳ分析に供した。【００８９】
ＧＳ／ＭＳ分析は、上記実施例１の記載と同様にして行った。図３Ｂに示す結果から、ｐＴＶ１１８ＮＰＣＴＣｌ（ＷＴ）を用いた場合、乳酸を含むポリマーはほとんど生産されないことが確認された。【００９０】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
2010050470.tif 000003
【図２】
2010050470.tif 000004
【図３Ａ】
2010050470.tif 000005
【図３Ｂ】
2010050470.tif 000006
【図３Ｃ】
2010050470.tif 000007
【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年8月27日(2010.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４又は６に示されるアミノ酸配列、若しくは配列番号４又は６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるプロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質、及び下記のａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質を有する組み換え微生物を、炭素源を含む培地で培養する工程１）：
ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸の少なくとも１以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
ｂ）ａ）に規定されるタンパク質において、さらに１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失若しくは置換され、又は１若しくは数個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列、
及び、工程１）の培養物から前記ポリ乳酸を回収する工程２）
を含む、ポリ乳酸の製造方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目及び４８１番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに、４８１番目のＧｌｎがＬｙｓにそれぞれ置換されたアミノ酸配列である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
前記タンパク質のいずれもが、微生物に導入された組み換え発現ベクターにコードされているタンパク質である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
配列番号４又は６に示されるアミノ酸配列、若しくは配列番号４又は６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるプロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒するタンパク質、及び下記のａ）又はｂ）のアミノ酸配列からなるポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質を有する組み換え微生物。
ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸の少なくとも１以上が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列
ｂ）ａ）に規定されるタンパク質において、さらに１３０番目、３２５番目、４７７番目及び４８１番目以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失若しくは置換され、又は１若しくは数個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目及び４８１番目のアミノ酸がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列である、請求項７に記載の組み換え微生物。
【請求項１１】
ポリヒドロキシアルカン酸の合成反応を触媒するタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに、４８１番目のＧｌｎがＬｙｓにそれぞれ置換されたアミノ酸配列である、請求項７に記載の組み換え微生物。
【請求項１２】
前記タンパク質をコードする遺伝子を有する組み換え発現ベクターが導入されていることを特徴とする請求項７に記載の組み換え微生物。
【国際調査報告】
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