(57)【要約】  本発明は、イネ等の植物由来の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡが導入された、種子が大型化された形質転換植物およびその作出方法に関する。
2010044450.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡが発現可能に導入された、形質転換植物。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡが発現可能に導入された、形質転換植物。
（ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｅ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
以下の（ｈ）〜（ｊ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡが発現可能に導入された、形質転換植物。
（ｈ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｉ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
（ｊ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
【請求項４】
種子を大型化させる活性が、種子の表面積、体積または重量を増加させる活性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【請求項５】
植物体、植物体の一部、植物培養細胞または種子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の形質転換植物。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクター。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
【請求項７】
以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡを含む組換えベクター。
（ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｅ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項８】
以下の（ｈ）〜（ｊ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクター。
（ｈ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｉ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
（ｊ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡを植物細胞に導入し、植物を育成することを特徴とする、形質転換植物の作出方法。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
【請求項１０】
以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡを植物細胞に導入し、植物を育成することを特徴とする、形質転換植物の作出方法。
（ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｅ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項１１】
以下の（ｈ）〜（ｊ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡを植物細胞に導入し、植物を育成することを特徴とする、形質転換植物の作出方法。
（ｈ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｉ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
（ｊ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
【請求項１２】
請求項６〜８のいずれかに記載の組換えベクターを用いてＤＮＡが導入される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種子が大型化された形質転換植物およびその作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、植物の種子を大型化するため、交雑による育種や遺伝子のランダムな突然変異の導入などが行われてきた。しかしながら、植物では、目的遺伝子への変異導入法は十分に確立されていないため、人為的な改変が困難であった。また、種子の大きさに関与する遺伝子が単離されても、そのほとんどが、該遺伝子を破壊した場合に種子が大型化もしくは小型化することから、種子サイズを制御する遺伝子として同定されていた。【０００３】
種子を大型化する遺伝子を導入した形質転換植物の例として、イネ由来のPLASTOCHRON1遺伝子（National Center for Biotechnology Information（NCBI）のアクセッションナンバーAB096259）を、バイナリーベクターとエレクトロポレーション法を用いてイネに導入することにより、種子重量を増加させた形質転換植物が挙げられる（特許文献１）。該形質転換植物は、イネ由来の遺伝子がイネ植物に導入されたものである。しかし、該遺伝子がイネ以外の植物に導入された場合、種子を大型化できるかどうかについては不明である。
【特許文献１】特開２００５−２０４６２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、種子の大型化に関与するＤＮＡを明らかにし、該ＤＮＡを植物に導入することにより、種子が大型化された形質転換植物およびその作出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、Fox hunting systemを用いて種子の大型化に関与する遺伝子を明らかにし、該遺伝子を植物に導入して過剰発現させることにより、本発明を完成した。【０００６】
本発明は、要約すると以下の通りである。【０００７】
〔１〕  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡが発現可能に導入された、形質転換植物。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質【０００８】
〔２〕  以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡが発現可能に導入された、形質転換植物。
（ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｅ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ【０００９】
〔３〕  以下の（ｈ）〜（ｊ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡが発現可能に導入された、形質転換植物。
（ｈ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｉ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
（ｊ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質【００１０】
〔４〕  種子を大型化させる活性が、種子の表面積、体積または重量を増加させる活性である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の形質転換植物。【００１１】
〔５〕  植物体、植物体の一部、植物培養細胞または種子である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の形質転換植物。【００１２】
〔６〕  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクター。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質【００１３】
〔７〕  以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡを含む組換えベクター。
（ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｅ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ【００１４】
〔８〕  以下の（ｈ）〜（ｊ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクター。
（ｈ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｉ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
（ｊ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質【００１５】
〔９〕  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡを植物細胞に導入し、植物を育成することを特徴とする、形質転換植物の作出方法。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質【００１６】
〔１０〕  以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡを植物細胞に導入し、植物を育成することを特徴とする、形質転換植物の作出方法。
（ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｅ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ【００１７】
〔１１〕  以下の（ｈ）〜（ｊ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡを植物細胞に導入し、植物を育成することを特徴とする、形質転換植物の作出方法。
（ｈ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｉ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
（ｊ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質【００１８】
〔１２〕  〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の組換えベクターを用いてＤＮＡが導入される、〔９〕〜〔１１〕のいずれかに記載の方法。【００１９】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008-267877号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に用いられるＤＮＡは、種子の大型化に関与するＤＮＡであり、該ＤＮＡを植物に導入し、過剰発現させることにより、種子が大型化された植物を作出することができる。形質転換技術が確立されている植物であれば、該ＤＮＡを高発現させることが可能となり、扱う植物を選ばずに本発明を適用できる。本発明に用いられるＤＮＡは、科の異なる植物に導入しても種子を大型化することができる。また、本発明の形質転換植物により、種子の収穫量が多い作物を生産することができる。種子の大型化により植物の商品価値を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例のスキームを示す。
【図２】野生型の種子とK06835、K15507のＴ２種子を示す。
【図３】野生型の種子とK32722のＴ２種子を示す。
【図４】野生型の種子とK42340のＴ２種子を示す。
【図５】野生型の種子とK32722、K42340のＴ２世代の種子における面積を示す。
【図６】野生型の種子とK32722のＴ２世代の種子における面積のヒストグラムを示す。
【図７】野生型の種子とK42340のＴ２世代の種子における面積のヒストグラムを示す。
【図８】野生型の種子とK32722のＴ２世代の種子における体積を示す。
【図９】K32722に導入されたＤＮＡ(AK073303)によりコードされるアミノ酸配列と同一性の高いタンパク質(相同性タンパク質)のアミノ酸配列（トウモロコシ、シロイヌナズナ、アルファルファ）の比較を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（１）種子の大型化に関与するＤＮＡ
本発明に用いる種子の大型化に関与するＤＮＡは、以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質、または
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡである。【００２３】
または、本発明に用いる種子の大型化に関与するＤＮＡは、以下の（ｄ）〜（ｇ）：
（ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｅ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
である。【００２４】
あるいは、本発明に用いる種子の大型化に関与するＤＮＡは、以下の（ｈ）〜（ｊ）：
（ｈ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｉ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
（ｊ）配列番号９、配列番号１０または配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡである。【００２５】
本明細書において「種子を大型化させる活性を有するタンパク質（またはＤＮＡ）」とは、直接的または間接的を問わず、種子の大型化に関与するタンパク質（またはＤＮＡ）をいう。【００２６】
本明細書において使用される「ＤＮＡ」は、ゲノムＤＮＡ、遺伝子およびｃＤＮＡなどを含む。【００２７】
本明細書において「種子を大型化させる活性」は、野生型に比べて種子の大きさを大きくする活性であれば特に限定されず、例えば、種子の表面積、体積、または重量を増加させる活性が挙げられる。種子の大きさは、野生型と比べて統計学的に有意に大きければ限定されないが、例えば５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上大きいことが好ましい。【００２８】
本明細書において「アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、特定のアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、特定のアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよく、あるいは特定のアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよいことを意味する。【００２９】
本明細書において「アミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」の「同一性」は、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。【００３０】
本明細書で使用される「同一性」とは、２つのアミノ酸配列（または塩基配列）のアラインメントにおいて、同一のアミノ酸残基数（または塩基数）が最大となるように該２つの配列を整列させたときの配列間の一致度を意味し、具体的には総アミノ酸残基数（または総塩基数）に対する同一アミノ酸残基数（または同一塩基数）のパーセンテージ（％）で表される。％同一性は、公知のＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムを用いて決定することができる。ＦＡＳＴＡのようにギャップを導入する場合、ギャップの数も総アミノ酸残基数（または総塩基数）に加算する。【００３１】
本明細書において「塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列」とは、例えば、特定の塩基配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が欠失してもよく、特定の塩基配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が他の塩基に置換してもよく、あるいは特定の塩基配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が付加してもよいことを意味する。【００３２】
本明細書において「塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列」の「同一性」は、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。【００３３】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが実質的に形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い核酸、すなわち特定の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより同一性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。【００３４】
または、ストリンジェントな条件は、２〜６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ、１×ＳＳＣは１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０である。）、室温〜４０℃でハイブリダイゼーションを行い、０．１〜１×ＳＳＣ（好ましくは０．１〜０．２×ＳＳＣ）、０．１％ＳＤＳ、５０〜６８℃にて１回または複数回の洗浄を行う条件でもよい。【００３５】
本発明に用いるＤＮＡは、配列番号２、４、６、８、９、１０もしくは１１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、または配列番号１、３、５もしくは７に示されるＤＮＡ配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリー等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、該ＤＮＡは、上記ライブラリー等由来の核酸を鋳型とし、該ＤＮＡの一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいは該ＤＮＡは、化学合成法等の当該技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。【００３６】
上記ＤＮＡまたはアミノ酸の欠失、置換および付加は、上記タンパク質をコードするＤＮＡを、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。ＤＮＡに変異を導入するには、例えばKunkel法またはGapped duplex法等により行うことができ、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（Mutan-K（タカラバイオ株式会社）、LA PCR in vitro mutagenesis kit（タカラバイオ株式会社））等を用いて変異を導入できる(Sambrookら（1989）, Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubelら(1995) , Short Protocols In Molecular Biology, third edition, John Wiley ( Sons, Inc.)。【００３７】
本発明に用いられるＤＮＡは、Fox hunting systemによる形質転換体のラインから得られた種子の大きさを測定し、野生型と比べて有意に大きい種子を生産するラインに導入されたｃＤＮＡを特定することにより、種子を大型化させる活性を有することが初めて明らかにされた。【００３８】
Fox hunting system（Full-length cDNA Over-expressor Gene Hunting System）は、完全長ｃＤＮＡを植物に導入して高発現させることによりもたらされる形質の変化から遺伝子の機能を明らかにする方法である（再公表２００３／０１８８０８号公報参照）。本発明では、植物に導入する完全長ｃＤＮＡとして、イネ完全長ｃＤＮＡを用い、完全長ｃＤＮＡを導入する植物として、例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を用いることができるが、これらに限定されない。【００３９】
Fox hunting systemを利用した本発明に用いるＤＮＡの同定は、具体的には以下のようにして行うことができる。【００４０】
独立したイネの完全長ｃＤＮＡ約１３，０００種類をｃＤＮＡの等量比のプールとして調製し（標準化という）、このｃＤＮＡを、プロモーター、エンハンサー（転写エンハンサーＥ２１、オメガ配列等）、ターミネーター等の制御領域、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカー等を持ったＴ−ＤＮＡベクターに組み込む。該Ｔ−ＤＮＡベクターをアグロバクテリウムに導入してイネ完全長ｃＤＮＡ発現ライブラリー（イネＦＯＸライブラリーという）を作製し、全体のｃＤＮＡの分布が該ライブラリーに反映されているかを確認後、前記アグロバクテリウムを用いてフローラルディッピング法によりシロイヌナズナの形質転換を行い、シロイヌナズナの形質転換ライン（イネＦＯＸライン）を作製する。Fox hunting systemでは、植物を何億クローンものライブラリーに感染させても、１植物に１〜２クローンしか導入されないので、植物に別々のクローンが導入された形質転換ラインを作製することができる。【００４１】
このようにして得られた約２０，０００のイネＦＯＸラインの組換え当代（Ｔ０）のシロイヌナズナから種子（Ｔ１種子）を回収し、抗生物質を含んだ培地にＴ１種子を播種し、選抜し、Ｔ１世代の形質転換体を得る。該形質転換体が自殖して得られた種子をＴ２種子とする。Ｔ２種子を、１ラインに付き例えば５０粒ずつ、目視観察すると同時に、コンピュータに種子の画像をデータとして取り込んで、種子形状測定プログラムであるWINSEEDLE（Regent Instruments 社）を用いて分析する。WINSEEDLEは、種子の画像から、種子形状、大きさ、色を測定するプログラムである。該プログラムにより、コンピュータに取り込まれた種子の縦、横が測定され、面積が計算される。野生型シロイヌナズナの種子をコントロールとし、コントロールと比較して有意に大きい種子が優性に出現しているラインを選抜する。選抜されたラインの種子を播種し、育成し、種子の大型化という表現型が再現するかを確認する。表現型が再現した種子からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法を用いて、導入されているイネ完全長ｃＤＮＡを単離する。該ｃＤＮＡを種子の大型化の原因ＤＮＡ候補とする。該候補ＤＮＡを再びシロイヌナズナに導入し、過剰発現させ、種子が大型化するかどうかを確認し、確認できたイネ完全長ｃＤＮＡを、種子を大型化させる活性を有するＤＮＡ（種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ）と決定する。【００４２】
このような方法で同定されたＤＮＡは、それぞれNCBIに以下のアクセッションナンバーで登録されている。【００４３】
AK100982（ＤＮＡ配列：配列番号１、アミノ酸配列：配列番号２）
AK099678（ＤＮＡ配列：配列番号３、アミノ酸配列：配列番号４）
AK073303（ＤＮＡ配列：配列番号５、アミノ酸配列：配列番号６）
AK071204（ＤＮＡ配列：配列番号７、アミノ酸配列：配列番号８）
上記イネ由来のアミノ酸配列と、他の植物由来のアミノ酸配列を比較し、同一性の高いアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、かつ種子を大型化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを、本発明に用いるＤＮＡとすることもできる。同一性は、例えばNCBI、EMBL(The European Molecular Biology Laboratory)などの配列データベースにアクセスし、例えばBLAST、FASTAなどの配列相同性検索プログラムを利用して調べることができる（Alteschul, S. F.ら（1990）J. Mol. Biol. 15:403-410; Karlin, S.とAltschul S. F. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268など）。【００４４】
AK073303のアミノ酸配列と同一性の高い、他の植物のアミノ酸配列として、例えば、トウモロコシ由来のアミノ酸配列（配列番号９、NCBIアクセッションナンバー：ACF86069（アミノ酸配列）、BT041064（ＤＮＡ配列））、シロイヌナズナ由来のアミノ酸配列（配列番号１０、NCBIアクセッションナンバー：NP#567660（アミノ酸配列）、NM#118359（ＤＮＡ配列））、アルファルファ（タルウマゴヤシ）由来のアミノ酸配列（配列番号１１、NCBIアクセッションナンバー：ABD28483（アミノ酸配列）、AC148915.2（ＤＮＡ配列））が挙げられる。【００４５】
（２）組換えベクター
植物の形質転換に用いる本発明の組換えベクターは、上記（ａ）〜（ｃ）、（ｈ）〜（ｊ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡ、または上記（ｄ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡを適当なベクターに導入することにより構築することができる。ベクターとして、アグロバクテリウムを介して植物に目的ＤＮＡを導入することができるｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系のベクター等が好適に用いられる。特にｐＢＩ系のバイナリーベクターまたは中間ベクター系が好適に用いられ、例えばｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩＧ２１１３等が挙げられる。バイナリーベクターとは、大腸菌（Escherichia coli）およびアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリウムを植物に感染させると、ベクター上にあるＬＢ配列とＲＢ配列よりなるボーダー配列で囲まれた部分のＤＮＡを植物核ＤＮＡに組み込むことができる。また、その他のベクターとして、植物にＤＮＡを直接導入することができるｐＵＣ系のベクター、例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等が挙げられる。さらに、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等の植物ウイルスベクターが挙げられる。【００４６】
バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記バイナリーベクターの境界配列（ＬＢ、ＲＢ間）に、目的ＤＮＡを挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増殖する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５あるいはアグロバクテリウム・リゾゲネスＬＢＡ１３３４等に、エレクトロポレーション法等により導入し、該アグロバクテリウムを用いて植物への目的ＤＮＡの導入を行う。【００４７】
ベクターに目的ＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。【００４８】
また、目的ＤＮＡは、そのＤＮＡの機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには目的ＤＮＡの上流、内部あるいは下流に、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、バイナリーベクター系を使用するための複製開始点（ＴｉまたはＲｉプラスミド由来の複製開始点等）、選択マーカー遺伝子等を連結することができる。【００４９】
プロモーターとしては、植物細胞において機能し、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡであれば、植物由来のものでなくてもよい。具体的には、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来アクチンプロモーター、タバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター等が挙げられる。【００５０】
エンハンサーとしては、例えば、目的ＤＮＡの発現効率を高めるために用いられ、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域、転写エンハンサーＥ１２、オメガ配列等が挙げられる。【００５１】
ターミネーターとしては、プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、例えばノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ ３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。【００５２】
選択マーカー遺伝子としては、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等が挙げられる。【００５３】
（３）形質転換植物およびその作出方法
本発明の形質転換植物は、上記（ａ）〜（ｃ）、（ｈ）〜（ｊ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡまたは上記（ｄ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡ、あるいは上記組換えベクターを対象植物に導入することによって作出することができる。本発明において「ＤＮＡの導入」とは、例えば公知の遺伝子工学的方法により、目的ＤＮＡを上記宿主植物の細胞内に発現可能に導入することを意味する。ここで導入されたＤＮＡは、宿主植物のゲノムＤＮＡに組み込まれてもよいし、外来ベクターに含有されたままで存在していてもよい。【００５４】
「発現可能に」とは、プロモーター、エンハンサーなどの調節配列の存在下で構成的にまたは誘導的にＤＮＡが発現可能な状態にあることをいう。【００５５】
ＤＮＡまたは組換えベクターの導入は、公知の方法、例えばアグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。アグロバクテリウム法では、プロトプラストを用いる場合、組織片を用いる場合、および植物体そのものを用いる場合（in planta法）がある。プロトプラストを用いる場合は、ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドをもつアグロバクテリウム（それぞれAgrobacterium tumefaciensまたはAgrobacterium rhizogenes）と共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）に感染させる方法やカルス（未分化培養細胞）に感染させる等により行うことができる。また、種子あるいは植物体を用いるin planta法を適用する場合、吸水種子、幼植物（幼苗）、鉢植え植物等へのアグロバクテリウムの直接処理等にて実施可能である。これらの植物形質転換法は、「新版 モデル植物の実験プロトコール 遺伝学的手法からゲノム解析まで（監修 島本功 岡田清孝、秀潤社、2001年）」等の記載に従って行うことができる。【００５６】
ＤＮＡが植物体に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、目的ＤＮＡに特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲを行った後は、増幅産物についてアガロース電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらにマイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。【００５７】
あるいは、種々のレポーター遺伝子、例えばベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、Green fluorescent protein（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）等の遺伝子を目的ＤＮＡの下流域に連結したベクターを作製し、該ベクターを導入したアグロバクテリウムを用いて上記と同様にして植物を形質転換させ、該レポーター遺伝子の発現を測定することによっても確認できる。【００５８】
本発明において形質転換に用いられる植物としては、単子葉植物または双子葉植物のいずれでもよく、例えばアブラナ科（シロイヌナズナ、キャベツ、ナタネ等）、マメ科（エンドウ、ダイズ、アルファルファ、アズキ、ソラマメ、ササゲ等）、イネ科（イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ等）、キク科（ベニバナ、ヒマワリ等）、ゴマ科（ゴマ等）、トウダイグサ科（ナンヨウアブラギリ（ヤトロファ）、トウゴマ等）に属する植物が挙げられるが、これらの植物に限定されない。とりわけ、種子植物、例えば、食用、採油用種子植物が好ましい。【００５９】
本発明において、形質転換の対象とする植物材料としては、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の植物器官・植物組織、これらの切片、未分化のカルス、これを酵素処理して細胞壁を除いたプロトプラスト等の植物培養細胞のいずれであってもよい。また、in planta法の場合、吸水種子や植物体全体を利用できる。【００６０】
植物培養細胞を形質転換の対象とする場合において、得られた形質転換細胞から形質転換体を再生させるためには、既知の組織培養法により器官または個体を再生させればよい。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば以下のように行うことができる。【００６１】
まず、形質転換の対象とする植物材料として植物組織またはプロトプラストを用いた場合、これらを無機要素、ビタミン、炭素源、エネルギー源としての糖類、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノステロイド等の植物ホルモン）等を加えて滅菌したカルス形成用培地中で培養し、不定形に増殖する脱分化したカルスを形成させる（以下「カルス誘導」という）。このように形成されたカルスをオーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移しかえて更に増殖（継代培養）させる。【００６２】
カルス誘導は寒天等の固形培地で行い、継代培養は例えば液体培養で行うと、それぞれの培養を効率よくかつ大量に行うことができる。次に継代培養により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより器官の再分化を誘導し（以下、「再分化誘導」という）、最終的に完全な植物体を再生させる。再分化誘導は、培地におけるオーキシン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。かかる再分化誘導により、不定胚、不定根、不定芽、不定茎葉等が形成され、さらに完全な植物体へと育成させる。あるいは、完全な植物体になる前の状態（たとえばカプセル化された人工種子、乾燥胚、凍結乾燥細胞および組織等）で貯蔵等を行うこともできる。【００６３】
本発明の形質転換植物は、上記（ａ）〜（ｃ）、（ｈ）〜（ｊ）のいずれかのタンパク質をコードするＤＮＡまたは上記（ｄ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡを導入した植物体全体、植物体の一部（例えば葉、花弁、茎、根、花粉等）、植物培養細胞（例えばカルス、プロトプラスト等）、種子のいずれをも包含するものである。また、該植物体の有性生殖または無性生殖により得られる子孫の植物体、およびその子孫植物体の一部、培養細胞、種子も包含するものとする。本発明の形質転換植物は、形質転換植物から種子、プロトプラスト等の繁殖材料を取得し、それを栽培または培養することによって量産することができる。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されない。【００６５】
（１）Fox hunting systemによるイネＦＯＸラインの作製
本実施例では、ベクターとして、恒常発現型ベクターｐＢＩＧ２１１３Ｎ（Taji,T.らPlant J.,2002.24(4):p.p.417-426及びBecker,D.らNucleic Acid Res.,1990.18(1):p.203）にＳｆｉＩクローニングサイトを導入したｐＢＩＧ２１１３ＳＦを以下に用いた。【００６６】
(i)標準化イネ完全長ｃＤＮＡミックスの作製
イネから完全長ｃＤＮＡをＣＡＰｔｒａｐｐｅｒ法によって作製した。このｃＤＮＡをＬａｍｂｄａ ＺＡＰ、あるいはＬａｍｂｄａ ｐＬＣ−１−ＢのＳｆｉＩ制限酵素部位によって挟まれる部位にクローニングした（参考文献：Seki M. et al. Plant J., 15, 707-720 (1998)）。ベクター配列を用いてｃＤＮＡの５'末端と３'末端の配列を読み、ｃＤＮＡのグルーピングを行い、独立の２０，０００種クローンを同定した（参考文献：Seki M. et al. Plant Physiol. Biochem. 39, 211-220 (2001））。次に、５０ｎｇ／μｌに調製した各クローンから０．５μｌを分取して１本のチューブに混ぜた。この混合液１μｌ分取し、２０μｌのElectric competent cell DH10B（Gibco BRL社、米国）に形質転換した。Ａｍｐが含まれた寒天培地上で生育した独立のコロニーを約２００，０００個混合し、そこからプラスミドを回収した。これを標準化イネ完全長ｃＤＮＡミックスとした。【００６７】
(ii)イネＦＯＸライブラリーの作製
２μｇの標準化イネ完全長ｃＤＮＡミックスと、７００μｇのｐＢＩＧ２１１３ＳＦを混ぜてから同時にＳｆｉＩで完全に切断した。切断後、イソプロパノール沈殿により濃縮し、８μｌの水に溶かし１μｌの１０×バッファーと１μｌのＴ４リガーゼを混ぜ、１６℃で１昼夜反応させた。２μｌの反応液を４０μｌのElectric competent cell DH10Bに混ぜて形質転換した。【００６８】
カナマイシン（Ｋｍ）が含まれた寒天培地上で生育した独立のコロニーを約１５０，０００個混合し、そこからプラスミドを回収した。回収した２μｌのプラスミド液を、４０μｌのElectric competent Agrobacterium cell GV3101に混ぜて形質転換した。Ｋｍが含まれる寒天培地上で生育した独立のコロニーを約１５０，０００個ＬＢ液体培地に懸濁し、１５％になるようグリセロールを加え、−８０℃にて保存した。このグリセロール溶液をイネＦＯＸライブラリーとした。【００６９】
(iii)イネＦＯＸラインの作製
上記イネＦＯＸライブラリーを約２００，０００コロニー生育させ、ディッピング溶液に懸濁させた後、野生型シロイヌナズナ（コロンビア（Ｃｏｌ−０））のフローラルディッピングを行った。種（Ｔ１種子）を収穫し、ハイグロマイシンを含む貧栄養培地ＢＡＭ上で発芽させ、ハイグロマイシン耐性を示す約２０，０００ラインの植物のみを土に移植した。これらの植物を自殖させ、得られた種子をＴ２種子とし、種子の大きさの観察に用いた。【００７０】
（２）Ｔ２種子の観察によるイネＦＯＸラインの選抜、原因ＤＮＡの塩基配列の同定、およびシロイヌナズナへのＤＮＡの再導入
Ｔ２種子を１ラインにつき約５０粒ずつ、プラスチックプレートの穴に入れた（図１(1)）。目視による種子の観察を行うと同時に、コンピュータに種子の画像をデータとして取り込んだ（図１(2)）。このときに、野生型の種子より有意に大きい種子が優性に出現しているラインを選抜した。コンピュータに取り込んだ画像は、WINSEEDLEプログラムにより種子の画像の縦、横を測定し、面積を計算した（図１(3)）。選抜したラインの種子を播種し、生育させ、次世代でも種子が大型化する表現型が再現するかを確認した。表現型が再現された種子から、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法を用いて、導入されたイネ完全長ｃＤＮＡを単離し、塩基配列を同定した。【００７１】
ＰＣＲ法では、ＰＣＲ反応液は以下の表１に示す組成のものを用い、９４℃で０．５分、５５℃で０．５分及び７２℃で４分を１サイクルとして４０サイクルの条件で反応させた。
【表１】
2010044450.tif 000003
【００７２】
ＰＣＲのためのプライマーは以下の通りである。【００７３】
ＧＴＡＣＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣ（配列番号１２）
ＧＧＡＴＴＣＡＡＴＣＴＴＡＡＧＡＡＡＣＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＡ（配列番号１３）
ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で回収した後に、ｐＢＩＧ２１１３ＳＦと混ぜ、ＳｆｉＩによって完全切断した後にイソプロパノールを用いて沈殿させ、Ｔ４リガーゼで処理した後、大腸菌に形質転換した。ＰＣＲ断片が挿入されたプラスミドを選抜して、上記プライマーを用いて挿入されている原因ＤＮＡ候補のｃＤＮＡ断片の塩基配列を同定した（図１(4)）。【００７４】
候補の原因ＤＮＡを、FOX hunting systemで用いる方法と同様の方法を用いて、再びシロイヌナズナで過剰発現させ（図１(5)）、種子が大型化するかを確認した。確認できたイネ完全長ｃＤＮＡを、種子を大型化させるＤＮＡと決定した。【００７５】
（３）種子を大型化させるＤＮＡ
上記（２）で種子を大型化させるＤＮＡとされたのは、以下の番号で示される４つのイネＦＯＸラインに導入されたＤＮＡであった。括弧内は該イネＦＯＸラインに導入されたＤＮＡのNCBIアクセッションナンバーと本明細書における塩基配列の配列番号を示す。【００７６】
K06835 (AK100982、配列番号１)
K15507 (AK099678、配列番号３)
K32722 (AK073303、配列番号５)
K42340 (AK071204、配列番号７)
図２に野生型の種子、K06835、K15507のＴ２種子を示す。図３に野生型の種子、K32722のＴ２種子を示す。図４に、野生型の種子、K42340のＴ２種子を示す。野生型の種子よりも、イネＦＯＸラインの種子が大きいことがわかる。【００７７】
野生型の種子の面積、K32722、K42340に導入されたＤＮＡをシロイヌナズナに再導入して過剰発現させて得られた種子（Ｔ２世代）の面積を比較した（図５）。野生型に比べて、K32722、K42340は、面積で約４０％の大型化が認められた。【００７８】
図６に、野生型の種子とK32722のＴ２世代の種子における面積のヒストグラム(すなわち、K32722過剰発現ラインにおける種子の面積の分布)を示す。縦軸は種子の数、横軸は面積（ピクセル数）である。野生型の種子ではピクセル数1600に一つの大きなピークを示し、このピークは左右対称の正規分布様の形になった。これに対し、K32722の種子では大小それぞれ一つずつのピークを有していた。小さなピーク（灰色）は、野生型と同じ位置（ピクセル数1600）に現れ、大きなピーク（黒）は、これよりより大きな面積を示す位置（ピクセル数2200）に現れた。分離世代において、形質転換体の表現型は優性に現れるので、大きなピークが形質転換体を示していると考えられた。また、小さなピークを構成する種子の面積の平均（ピクセル数1586）は、野生型の種子の平均（ピクセル数1591）とほぼ一致し、大きなピークを構成する種子の平均（ピクセル数2429）は、野生型の平均より約50％大きいものであった。【００７９】
図７に、野生型の種子とK42340のＴ２世代の種子における面積のヒストグラム(すなわち、K42340過剰発現ラインにおける種子の面積の分布)を示す。縦軸は種子の数、横軸は面積（ピクセル数）である。K42340ではいびつなピークを示した。K42340のピークは野生型のピークと比べて右側にずれており、この集団において野生型より大きな種子が優占していることがわかる。【００８０】
図８に、K32722を例に、Ｔ２世代の種子の形状を楕円の回転体として、当該種子の体積を計算した結果(すなわち、K32722過剰発現ラインにおける種子の体積)を示す。野生型の種子に比べてK32722の種子では、約50％体積が増加した。【００８１】
図９に、K32722に導入されたＤＮＡ(AK073303)のアミノ酸配列（配列番号６)と、トウモロコシ（イネ科トウモロコシ属）のアミノ酸配列（配列番号９）、シロイヌナズナ（アブラナ科シロイヌナズナ属）のアミノ酸配列（配列番号１０）、アルファルファ（マメ科ウマゴヤシ属）のアミノ酸配列（配列番号１１）を比較した。科の異なる植物でもAK073303のＤＮＡは非常に強く保存されていることがわかる。配列番号９、配列番号１０および配列番号１１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを植物に導入すれば、種子を大型化できると考えられる。【００８２】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
2010044450.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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