(57)【要約】アセスルファームK、スクラロース、サッカリンまたはグリチルリチンなどの甘味受容体アゴニストをインスリン分泌促進剤の有効成分として用いる。また、甘味受容体を発現する細胞に被検化合物を添加して甘味受容体シグナルを測定し、甘味受容体シグナルを増強する物質を選択することによりインスリン分泌促進剤候補物質をスクリーニングする。さらに、甘味受容体遺伝子を発現する細胞および甘味受容体遺伝子の発現が抑制された細胞において、被検化合物を添加してインスリン分泌量を測定し、化合物の甘味受容体を介したインスリン分泌促進効果を評価する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
甘味受容体アゴニストを有効成分とするインスリン分泌促進剤。
【請求項２】
甘味受容体アゴニストがアセスルファームK、スクラロース、サッカリンまたはグリチルリチンである、請求項１に記載のインスリン分泌促進剤。
【請求項３】
甘味受容体を発現する細胞に被検化合物を添加して甘味受容体シグナルを測定し、甘味受容体シグナルを増強する物質を選択する、インスリン分泌促進剤候補物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
甘味受容体遺伝子を発現する細胞および甘味受容体遺伝子の発現が抑制された細胞において、被検化合物を添加してインスリン分泌量を測定し、化合物の甘味受容体を介したインスリン分泌促進効果を評価する、化合物のインスリン分泌促進能の評価方法。
【請求項５】
甘味受容体アゴニストのインスリン分泌促進剤の製造における使用。
【請求項６】
甘味受容体アゴニストがアセスルファームK、スクラロース、サッカリンまたはグリチルリチンである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
甘味受容体アゴニストを投与する工程を含む、インスリン分泌促進方法。
【請求項８】
甘味受容体アゴニストがアセスルファームK、スクラロース、サッカリンまたはグリチルリチンである、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規メカニズムに基づくインスリン分泌促進剤、並びにインスリン分泌促進剤のスクリーニング方法及び評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリンは膵臓ランゲルハンス島β細胞（膵β細胞）から分泌されるホルモンで、その主な生理作用は血糖値を下げることにある。食事等により血糖値が上がると、インスリンが膵臓から分泌され、上記の作用により血糖値を正常に保つ。【０００３】
糖尿病は、インスリンの欠乏、または作用の不足によって、ブドウ糖の代謝に異常が起こり、慢性的に高血糖状態を呈する疾患である。そして、この高血糖状態により、神経障害、白内障、腎障害、網膜症、関節硬化症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性壊疽等の種々の合併症を発症することがある。糖尿病には、I型糖尿病(インスリン依存型)とII型糖尿病(インスリン非依存型)がある。I型糖尿病は、膵β細胞が、免疫障害等の原因でインスリンを分泌できなくなり、高血糖として発症するものである。一方、II型糖尿病は、インスリンの分泌量が低下するか（インスリン分泌不全）、インスリンの血糖を下げる作用が弱くなって（インスリン抵抗性）発症するもので、遺伝素因のほかに、エネルギーの過剰摂取や栄養の偏った食生活、運動不足、ストレスが大きく関わっており、日本人の糖尿病の90％を占めている。【０００４】
糖尿病の症状を改善するには、インスリンを直接注射する治療法のほかに、スルホニル尿素剤のように膵臓β細胞に直接働き、インスリンの分泌を促進する薬剤を服用する方法がある。
スルホニル尿素剤は、膵β細胞を刺激し、内因性インスリン分泌を促進するが、インスリン分泌のタイミング及び分泌量は、血糖値とは関係なく、薬物の投与タイミング及び投与量によって決まる。このため、副作用として薬剤の作用持続に起因する低血糖を呈する場合がある。また、食欲不振等の消化器症状が現れる。更に、重症ケトーシス又は肝若しくは腎機能障害のある患者には禁忌である。一方、インスリン製剤は、確実に血糖値を低下させるが、注射により投与しなければならない上に、低血糖になるおそれもある。そこで、より優れた血糖降下剤が切望されていた。【０００５】
甘味受容体はＴ１Ｒ２とＴ１Ｒ３という２種類のサブユニットからなるGタンパク共役受容体（GPCR）スーパーファミリーに属する受容体であり、甘味刺激を認識する受容体である（非特許文献１および２）。しかしながら、甘味受容体は主に舌上皮に存在する味細胞に発現しており、その他の組織での発現や役割は不明である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ，２００１．１０６（３）：ｐ．３８１−９０、
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２．９９（７）：ｐ．４６９２−６
【発明の概要】
【０００７】
本発明は新規標的に作用してインスリン分泌を促進する薬剤を提供することを課題とする。
【０００８】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、膵β細胞に甘味受容体が発現しており、甘味受容体のアゴニストにインスリン分泌促進作用があることを見出して本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）甘味受容体アゴニストを有効成分とするインスリン分泌促進剤。
（２）甘味受容体アゴニストがアセスルファームK、スクラロース、サッカリンまたはグリチルリチンである、（１）のインスリン分泌促進剤。
（３）甘味受容体を発現する細胞に被検化合物を添加して甘味受容体シグナルを測定し、甘味受容体シグナルを増強する物質を選択する、インスリン分泌促進剤候補物質のスクリーニング方法。
（４）甘味受容体遺伝子を発現する細胞および甘味受容体遺伝子の発現が抑制された細胞において、被検化合物を添加してインスリン分泌量を測定し、化合物の甘味受容体を介したインスリン分泌促進効果を評価する、化合物のインスリン分泌促進能の評価方法。
（５）甘味受容体アゴニストのインスリン分泌促進剤の製造における使用。
（６）甘味受容体アゴニストがアセスルファームK、スクラロース、サッカリンまたはグリチルリチンである、（５）に記載の使用。
（７）甘味受容体アゴニストを投与する工程を含む、インスリン分泌促進方法。
（８）甘味受容体アゴニストがアセスルファームK、スクラロース、サッカリンまたはグリチルリチンである、（７）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】マウス膵β細胞由来MIN6 細胞における甘味受容体遺伝子の発現（写真）。
【図２】マウス膵島における甘味受容体遺伝子の発現（写真）。
【図３】MIN6 細胞における人工甘味料AcesulfameKの作用（n=4、*: P<0.05）。
【図４】AcesulfameK による細胞内カルシウムと cAMP の増加。
【図５】MIN6 細胞における各種人工甘味料の作用（n=4、*: P<0.05）。
【図６】MIN6 細胞におけるＴ１Ｒ２ノックダウンの効果（n=4、*: P<0.05）。
【図７】in vivo における人工甘味料（Saccharin）の血糖降下作用（n=4、*: P<0.05）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のインスリン分泌促進剤は、甘味受容体アゴニストを有効成分とする。
ここで、甘味受容体とはＴ１Ｒ２とＴ１Ｒ３の２種類のサブユニットのヘテロダイマーからなるGタンパク質共役型受容体（GPCR）で、リガンドの刺激に対して細胞内にシグナル伝達を行う受容体を意味する。
甘味受容体としては、例えば、ヒトＴ１Ｒ２とＴ１Ｒ３からなる甘味受容体やマウスＴ１Ｒ２とＴ１Ｒ３からなる甘味受容体が例示される。
ヒトＴ１Ｒ２としては配列番号４のアミノ酸配列（GenBank Accession No: NM_152232）を有するタンパク質が挙げられ、ヒトＴ１Ｒ３としては配列番号８のアミノ酸配列（GenBank Accession No: NM_152228）を有するタンパク質が挙げられる。
また、マウスＴ１Ｒ２としては配列番号２のアミノ酸配列（GenBank Accession No: NM_031873）を有するタンパク質が挙げられ、マウスＴ１Ｒ３としては配列番号６のアミノ酸配列（GenBank Accession No: NM_031872）を有するタンパク質が挙げられる。
なお、これらのタンパク質のアミノ酸配列は種や個体の違いによってアミノ酸が１〜数個、置換、欠失、挿入等されることがあるので、そのようなアミノ酸配列であっても互いにヘテロダイマーを形成して甘味受容体としての機能を果たすことのできるものであれば、Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３として使用できる。なお、「１〜数個」とは好ましくは「１〜２０個」、より好ましくは「１〜１０個」を意味する。
【００１２】
甘味受容体アゴニストとは、甘味受容体に作用して甘味受容体のシグナルを増強させる物質をいう。甘味受容体のシグナルとしては、細胞内Ca2+濃度と細胞内サイクリックAMP（cAMP）濃度が挙げられる。
例えば、甘味受容体アゴニストとして、人工甘味料アセスルファームK（Acesulfame K ：アセスルファムカリウムとも呼ばれる）、 スクラロース（Sucralose：トリクロロガラクトスクロースとも呼ばれる）、サッカリン（Saccharin）、グリチルリチン (Glycyrrhizin)などが挙げられる。
また、ＷＯ２００５／０１５１５８に記載の化合物も甘味受容体アゴニストとして使用できる。
【００１３】
甘味受容体アゴニストは上記のものに限定されず、新たにスクリーニングを行うことによって得られる化合物であってもよい。化合物は合成化合物であってもよいし、天然物に含まれる化合物であってもよい。また、ペプチドであってもよい。スクリーニングには個々の被検化合物を用いてもよいが、これらの物質を含む化合物ライブラリーを用いてもよい。
甘味受容体アゴニストは、例えば、MIN6（マウスインスリノーマ細胞）などの膵β細胞由来細胞にＴ１Ｒ２遺伝子とＴ１Ｒ３遺伝子を発現させて、その細胞に被検化合物を添加し、細胞内のCa2+濃度とcAMP濃度を増加させる化合物を選択することによりスクリーニングすることができる。
ここで、Ｔ１Ｒ２遺伝子としては、配列番号１（マウス）または３（ヒト）の塩基配列を含むDNA、Ｔ１Ｒ３遺伝子としては、配列番号５（マウス）または７（ヒト）の塩基配列を含むDNAが挙げられる。また、これらの塩基配列とストリンジェントな条件（例えば、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）でハイブリダイズし、甘味受容体の機能的サブユニットをコードするDNAであってもよい。
化合物の選択の基準としては、例えば、上記のアセスルファームKをポジティブコントロールとし、それと同じかそれ以上の細胞内Ca2+濃度とcAMP濃度を増加させる能力を有する化合物を甘味受容体アゴニストとして選択することができる。
【００１４】
甘味受容体アゴニストは、膵β細胞に発現する甘味受容体に作用してインスリンの分泌を促進する。
したがって、インスリン分泌促進剤として使用することができる。インスリン分泌促進剤は、糖尿病、特に２型糖尿病治療薬の治療に使用することができるが、メタボリックシンドロームや肥満などの治療にも使用することができる。
【００１５】
本発明のインスリン分泌促進剤は、投与対象、投与ルート、対象疾患、体重、症状などによっても異なるが、例えば、成人のインスリン分泌促進剤が必要な糖尿病患者に経口投与する場合、有効成分である化合物を、通常1回量として約０．０１〜８００ｍｇ、好ましくは０．1〜５００ｍｇ、さらに好ましくは０．５〜３００ｍｇであり、この量を１日１〜３回投与するのが好ましい。
【００１６】
本発明のインスリン分泌促進剤は、経口、口腔内、吸入、経鼻、経粘膜、直腸および注射等の投与経路で投与されるが、有効成分である化合物に適当な製剤添加物を使用し製剤化することができる。当該製剤添加物としては、上記投与経路に適した剤型の医薬品を製造する上で通常使用される添加剤が挙げられ、例えば、第１４改正日本薬局方（以下、「局方」ともいう）および「医薬品添加物事典」（薬事日報社、1994年1月14日発行）に収載されている賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、湿潤剤、溶剤、基剤、懸濁化剤、乳化剤、溶解補助剤、保存剤、安定剤などから錠剤、顆粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、トローチ剤、ドライシロップ剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、注射剤、エアゾール剤および坐剤などに適したものが選択される。
【００１７】
当該製剤添加物の具体的な物質としては、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、ゼラチン、寒天、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、水素添加植物油、マクロゴール、グリセリン、注射用水、アルギン酸、ポリソルベート、レシチンなどが挙げられる。
本発明のインスリン分泌促進剤は、例えば、局方に記載の錠剤、顆粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、トローチ剤、ドライシロップ剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、注射剤、エアゾール剤および坐剤の製造法に従って製造することができる。
【００１８】
本発明はまた、甘味受容体遺伝子を発現する細胞および甘味受容体遺伝子の発現が抑制された細胞において、被検化合物を添加してインスリン分泌量を測定し、化合物の甘味受容体を介したインスリン分泌促進効果を評価する、化合物のインスリン分泌能の評価方法を提供する。用いる甘味受容体遺伝子を発現する細胞としては、ＭＩＮ６細胞などの膵β細胞が好ましい。そして、甘味受容体遺伝子の発現が抑制された細胞としては甘味受容体遺伝子を発現する細胞と同じ種類の細胞であって、siRNA（small interfering RNA）などを用いて甘味受容体遺伝子の発現を抑制した細胞が好ましく用いられる。
甘味受容体遺伝子が抑制された細胞ではインスリン分泌を促進せず、甘味受容体遺伝子を発現する細胞ではインスリン分泌を促進することが確認できれば、当該化合物は甘味受容体に作用してインスリン分泌を促進する化合物と判断することができる。
【実施例】
【００１９】
マウス膵β細胞由来MIN6 細胞における甘味受容体遺伝子の発現
MIN6 細胞よりトータルRNAを抽出し、甘味受容体（T1R2+T1R3）、ガストデューシンαサブユニット（Gαgust）遺伝子の発現をRT-PCRで検討した。プライマー配列は以下のとおり。
T1R2：配列番号９，１０
T1R3：配列番号１１，１２
Gαgust：配列番号１３，１４
結果を図１に示した。その結果、甘味受容体が膵β細胞において発現していることがわかった。なお、膵β細胞での発現が報告されているガストデューシンαサブユニットの発現も確認できた。【００２０】
マウス膵島における甘味受容体の発現
マウス（C57/B）から膵島を単離してmRNA を抽出し、T1R2、T1R3、ガストデューシンαサブユニット（Gαgust）についてmRNA 発現を RT-PCR法により測定した。用いたプライマーは上記と同じである。
結果を図２に示す。その結果、甘味受容体が膵島において発現していることがわかった。なお、ガストデューシンαサブユニットの発現も確認できた。【００２１】
MIN6 細胞における人工甘味料AcesulfameKの作用方法
MIN6 細胞を 3 x 105/well の密度で２４穴プレートに培養した。グルコースを含まないKrebs-Ringer bicarbonate buffer (KRB)に１時間プレインキュベーションした後、グルコースまたはAcesulfameKを加え、１時間インキュベーションを行った。この時、KRB のグルコース濃度は0、2.8 あるいは20 mM とした。【００２２】
結果を図３に示す。それによると、代表的なインスリン刺激物質である 20mM グルコースはインスリン分泌を基礎分泌(2.8mM グルコース) の約８倍に増加させたが、50mM AcesulfameK もほぼ同等の分泌刺激効果を示した。AcesulfameK の作用はグルコースの非存在下でも観察された。さらに、AcesulfameK の作用は 20mM グルコースと相加作用を示した。【００２３】
AcesulfameK による細胞内カルシウムと cAMP の増加
AcesulfameK をMIN6細胞に添加し、細胞内カルシウムと cAMPの濃度変化を調べた。
なお、細胞内サイクリックAMP(cAMP)濃度の変化は、EpacのcAMP結合ドメインを用いたFLET法（J.Biol.Chem. vol. 280:p31294-31302. 2005）によりモニターした。また細胞内カルシウム濃度は、カルシウム感受性蛍光色素 Fura2 を用いて cAMPと同時測定を行った。【００２４】
結果を図４に示す。それによると、AcesulfameK (50mM) を投与すると直ちに細胞内カルシウム濃度が増加した。わずかに遅れて細胞内 cAMP 濃度も増加し、ともにAcesulfameKが存在する間増加し続けた。以上の結果より、AcesulfameKのインスリン分泌促進効果は甘味受容体を介し正統的な細胞内メッセンジャー系を介して発現されることが考えられた。【００２５】
MIN6 細胞における人工甘味料の作用
その他の人工甘味料（Sucralose、Saccharinおよびグリチルリチン）についてもインスリン分泌促進効果を調べた。
MIN6 細胞を 3 x 105/well の密度で２４穴プレートに培養した。 2.8 mMグルコースを含むKrebs-Ringer bicarbonate buffer (KRB)に１時間プレインキュベーションした後、20 mMグルコース、50mM Acesulfame K (Ace-K)、50 mM Sucralose(Sucra)、50 mM Saccharin (Sacch)、または50 mMグリチルリチン (Gly)を加え、１時間インキュベーションを行いインスリンを測定した。この時、KRB のグルコース濃度2.8 mM とした。【００２６】
結果を図５に示す。それによると、Acesulfame K (Ace-K)、 Sucralose(Sucra)、Saccharin (Sacch)、グリチルリチン (Gly)など構造の異なる人工甘味料はグルコースにほぼ匹敵するインスリン分泌刺激能を示した。【００２７】
MIN6 細胞におけるsiRNA（small interfering RNA）を用いたＴ１Ｒ２ノックダウンの効果
MIN6 細胞にsiＴ１Ｒ２（配列番号１５）またはsiControl（配列番号１６）を導入し、甘味受容体をノックダウンした。その後、20 mM グルコースあるいは50 mM Sucralose(Sucra)を加え、１時間インキュベーションを行いインスリンを測定した。
結果を図６に示す。その結果、Sucraloseのインスリン分泌促進作用はＴ１Ｒ２のノックダウンにより抑制された。このことから、上記人工甘味料は甘味受容体を介した特異的作用によりインスリン分泌を促進していることが考えられた。【００２８】
in vivo における人工甘味料の血糖降下作用
ラット（ウィスター系雄ラット８週令）腹腔内に 1.25 mg/g 体重の Saccharin を投与し、その後の血糖値の変化を計時的に測定した。【００２９】
結果を図７に示す。それによると、Saccharin の腹腔内投与により血糖値は有意に低下し、その効果は少なくとも３０分以上持続した。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明のインスリン分泌促進剤は甘味受容体に作用してインスリンの分泌を促進するため、従来とは異なるメカニズムでインスリン分泌を促進することができる。本発明のインスリン分泌促進剤は高濃度グルコースに匹敵するインスリン分泌刺激能を持ち、さらに高濃度グルコースの作用と相加性を示すため、効率よくインスリン分泌を刺激することができる。
また、甘味受容体シグナルを増強する化合物をスクリーニングすることにより、新規なインスリン分泌促進剤を得ることもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年8月16日(2010.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
甘味受容体アゴニスト（グルコースとスクロースを除く）を有効成分とするインスリン分泌促進剤。
【請求項２】
甘味受容体アゴニストがアセスルファームＫ、スクラロース、サッカリンまたはグリチルリチンである、請求項１に記載のインスリン分泌促進剤。
【請求項３】
甘味受容体を発現する細胞に被検化合物を添加して甘味受容体シグナルを測定し、甘味受容体シグナルを増強する物質を選択する、インスリン分泌促進剤候補物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
甘味受容体遺伝子を発現する細胞および甘味受容体遺伝子の発現が抑制された細胞において、被検化合物を添加してインスリン分泌量を測定し、化合物の甘味受容体を介したインスリン分泌促進効果を評価する、化合物のインスリン分泌促進能の評価方法。
【請求項５】
甘味受容体アゴニスト（グルコースとスクロースを除く）のインスリン分泌促進剤の製造における使用。
【請求項６】
甘味受容体アゴニストがアセスルファームＫ、スクラロース、サッカリンまたはグリチルリチンである、請求項５に記載の使用。
【国際調査報告】
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