【事件の表示】
　特許第２７８３２９４号「増強された細胞増殖、培養寿命および生産物発現のための細胞培養培地」に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２７８３２９４号の請求項１〜３７に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続きの経緯
　本件特許2783294号は、特願平1-509895号（優先権主張1988年9月23日、ＵＳ）の特許出願に係るものであって、平成10年5月22日にその発明について特許権の設定登録がされ、その後ロンザ　アーゲーから特許異議の申立てがされたところ、当審において取消理由の通知がされ、その指定期間内に意見書が提出されると共に明細書の訂正請求がなされ、異議申立人に審尋し回答書を得た後訂正拒絶理由を通知し、意見書と共に手続補正書が提出された。次いで特許権者に対し審尋したところ回答書を得て再度手交による取消理由が通知され、新たな訂正請求がなされると共に先の訂正請求が取り下げられものである。
　
２．訂正の請求
　本件訂正の要旨は、特許請求の範囲の減縮ならびに明瞭でない記載の釈明を目的として請求項１〜３９のうち請求項２９及び３７を削除して、それに伴い以降の請求項を繰り上げ、新請求項２９（旧請求項３０）を請求項２４に従属させると共に各請求項の記載を訂正明細書に記載された請求項１〜３７の通りに訂正することを求めるものであり、当該訂正は、願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内において特許請求の範囲を減縮ならびに明瞭でない記載の釈明に相当するものであって、特許請求の範囲を拡張又は変更するものでもないと認められる。
　そして、後述する如く、訂正後の請求項１〜３７に記載される発明は刊行物１，２に記載された発明であるとも、刊行物１〜３に記載された発明から容易に想到できたものともいえない上に、他に特許を受けることができない理由を発見しないから、本件特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
  したがって、前記訂正は適法なものであると認められる。
　
  　　　　　　                 記
刊行物１：村上浩紀、日本農芸化学会誌第６巻第５８号第３５〜４３頁（甲第１号証）
刊行物２：Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1158-1162,1982（甲第２号証）
刊行物３：国際公開第87/00195号（WO87/00195)（甲第３号証）
　
３．特許異議申立について
（１）本件発明
　本件特許に係る発明は、前記特許明細書の訂正が認められることから、訂正明細書の請求項１〜３７に記載された事項により特定されたとおりのものである。（以下、下記請求項１に記載された発明を「本件発明」という。）
「【請求項１】
　培養寿命を増強する方法であって、培養中の動物細胞を主要補足物およびクラスＩ試薬に接触させる工程を包含し、該主要補足物がタンパク質を含まず、そして以下を含む、方法：
(a)グルタミンおよびグルタミン酸からなる群より選択される成分であって、少なくとも5mMの濃度で存在する、成分；
(b)少なくともコリンとエタノールアミンとを含む、リン脂質前駆体であって、ここで該コリンが該培養中で4mg/Lより高い濃度で存在し、そして該エタノールアミンが該培養中で少なくとも1mg/Lの濃度で存在する、リン脂質前駆体；および
(c)アミノ酸であって、ここで該アミノ酸が該培養中で20mg/Lより高い濃度で存在するトリプトファンを含む、アミノ酸；
ここで、該クラスＩ試薬が以下を含む：
(i)還元剤；
(ii)金属イオン；
(iii)金属キレート化剤；および
(iv)ビタミン；
ここで、該主要補足物およびクラスＩ試薬の成分が、少なくとも100時間、疑似定常期に維持するのに有効である濃度で存在し、
これにより、生産物発現の持続が最終生産物の増加を生じる、方法。」
　
（２）異議申立について：
（２−１）異議申立理由：
　異議申立人は、（イ）訂正前の請求項１〜３９に記載された発明は、甲第１〜３号証（刊行物１〜３に対応）に記載された発明であるか、これらの記載に基づいて当業者が容易に発明し得る程度のものであり、また（ロ）訂正前の本願明細書の記載は不備であって特許法第36条第5項に規定する要件を満たしていない旨主張している。
　
（２−２）主張（イ）について：
  異議申立人が提出した甲第１〜３号証にはハイブリドーマ等動物細胞を培養するための無血清培地について記載されており、甲第２号証の記載を勘案すると、甲第１号証のe-RDF-ITES培地および甲第３号証に記載の培地は、いずれも添加される培地成分の種類は一致しているものの、本件発明の必須の構成である、培地中のトリプトファンを20mg/Lより高い濃度で存在させると共にグルタミンおよびグルタミン酸からなる群より選択される成分が5mM以上、コリンが4mg/L以上、エタノールアミンが1mg/L以上の濃度であり、各配合成分が「少なくとも100時間、疑似定常期に維持するのに有効である濃度」で存在させることについては記載されていない。
　甲第１号証においても、細胞1個あたりのIgG生産量は変わらないことを観察し、培地中の細胞密度、生細胞をできるだけ増大しようとすることが記載され、甲第３号証においても細胞の生存性を延長させることで結果として産生物の収率を増大させることは記載されているが、いずれも特に擬似定常期に着目するものではなく、甲第１号証のFig.5等及び甲第３号証のFig.1等の実験結果を検討しても擬似定常期が100時間近くの長時間にわたり維持できたことを類推できる記載はない。
　そして、本件発明はそのことにより本件訂正明細書に記載される如く、長い培養寿命および高い培養産物量が達成できたものと認めることができる。
　そうであるから、本件発明は甲第１〜３号証に記載された発明であるとも、これらの記載に基づいて当業者が容易に発明できたものともいえない。
　同様に、訂正後の請求項２〜３７に記載された発明は、いずれも本件発明を直接もしくは間接的に引用しているか、もしくは本件発明と同様に培地中のトリプトファンを20mg/Lより高い濃度で存在させると共にグルタミンおよびグルタミン酸からなる群より選択される成分が5mM以上、コリンが4mg/L以上、エタノールアミンが1mg/L以上の濃度であり、各配合成分が「少なくとも100時間、疑似定常期に維持するのに有効である濃度」で存在させる点を必須の構成要件とするものであるから、甲第１〜３号証に記載された発明であるとも、これらの記載に基づいて当業者が容易に発明できたものともいえない。
　
（２−３）主張（ロ）について：
  異議申立人は、訂正前の本願明細書の記載に対して漠然と不備である旨主張するのみで、具体的に不備な点を指摘していないから、当該主張は採用できない。
　また、訂正後の明細書の記載を検討しても、格別の不備はない。
　
（２−４）まとめ：
　したがって、異議申立人の主張（イ）（ロ）はいずれも採用しない。
　
４．結語
　以上のとおりであるから、特許異議の申立て及び証拠によっては本件特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年８月２３日（２００１．８．２３）
【訂正の要旨】
　（３−１）特許請求の範囲の【請求項１】〜【請求項３９】を
「　【請求項１】　培養寿命を増強する方法であって、培養中の動物細胞を主要補足物およびクラスＩ試薬に接触させる工程を包含し、該主要補足物がタンパク質を含まず、そして以下を含む、方法：
（ａ）グルタミンおよびグルタミン酸からなる群より選択される成分であって、少なくとも５ｍＭの濃度で存在する、成分；
（ｂ）少なくともコリンとエタノールアミンとを含む、リン脂質前駆体
であって、ここで該コリンが該培養中で４ｍｇ／Ｌより高い濃度で存在し、そして該エタノールアミンが該培養中で少なくとも１ｍｇ／Ｌの濃度で存在する、リン脂質前駆体
（ｃ）アミノ酸
であって、ここで該アミノ酸が該培養中で２０ｍｇ／Ｌより高い濃度で存在するトリプトファンを含む、アミノ酸
ここで、該クラスＩ試薬が以下を含む：
（ｉ）還元剤；
（ｉｉ）金属イオン；
（ｉｉｉ）金属キレート化剤；および
（ｉｖ）ビタミン；
　ここで、該主要補足物およびクラスＩ試薬の成分が、培養寿命および生産物の発現を増強するのに有効な濃度であり、これらの増強は、グルタミン（またはグルタミン酸）単独、コリン単独、およびエタノールアミン単独の添加効果よりも長い時間、
少なくとも１００時間、
のに有効である濃度で存在する
　【請求項２】　前記細胞を成長ホルモンまたは成長因子と接触させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
　【請求項３】　前記細胞をＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオールと接触させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
　【請求項４】　前記細胞が抗体分泌細胞である、請求項１に記載の方法。
　【請求項５】　前記アミノ酸が約２０ｍｇ／Ｌと１００ｍｇ／Ｌとの間の濃度でトリプトファンを含む、請求項１に記載の方法。
　【請求項６】　前記アミノ酸がグルタミンおよびグルタミン酸からなる群より選択され、さらに、該アミノ酸が約５ｍＭと４０ｍＭとの間の濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
　【請求項７】　コリンが約４ｍｇ／Ｌと４０ｍｇ／Ｌとの間の濃度で存在する、請求項１または６に記載の方法。
　【請求項８】　エタノールアミンが約１ｍｇ／Ｌと１０ｍｇ／Ｌとの間の濃度で存在する、請求項１、６または７に記載の方法。
　【請求項９】　前記リン脂質前駆体が、セリン、イノシトール、グリセロール、ホスホエタノールアミン、ホスホコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルコリンからなる群より選択される組成物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
　【請求項１０】　前記組成物がセリン、イノシトール、およびグリセロールからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
　【請求項１１】　前記生産物の発現が１１６ｍｇ／Ｌより多いタンパク質である、請求項１に記載の方法。
　【請求項１２】　前記培養寿命の増強が１００時間を超える、請求項１に記載の方法。
　【請求項１３】　前記タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項１１に記載の方法。
　【請求項１４】　前記培養中の細胞が無血清培地中にある、請求項１に記載の方法。
　【請求項１５】　培養中の動物細胞の培養寿命およびタンパク質発現を増強する方法であって、該動物細胞を主要補足物、クラスＩ試薬、およびグルコースに接触させる工程を包含する、方法、ここで、該主要補足物が以下の成分を含む：
（ａ）グルタミンおよびグルタミン酸からなる群より選択される成分であって、少なくとも５ｍＭの濃度で存在する、成分；
（ｂ）コリンとエタノールアミンとを組み合わせて含む、リン脂質前駆体
であって、ここで該コリンが該培養中で４ｍｇ／Ｌより高い濃度で存在し、そして該エタノールアミンが該培養中で少なくとも１ｍｇ／Ｌの濃度で存在するリン酸前駆体
（ｃ）アミノ酸
であって、ここで該アミノ酸が該培養中で２０ｍｇ／Ｌより高い濃度で存在するトリプトファンを含む、アミノ酸
ここで、該クラスＩ試薬が以下を含む：
（ｉ）還元剤；
（ｉｉ）金属イオン；
（ｉｉｉ）金属キレート化剤；および
（ｉｖ）ビタミン；
　ここで、該主要補足物、該クラスＩ試薬、
および
培養寿命および生産物の発現を増強するのに有効な量で組み合わせて存在し、これらの増強は、該動物細胞を少なくとも１００時間、疑似定常期に維持することによってなされる
　【請求項１６】　前記金属イオンが、カルシウム、コバルト、銅、鉄、マグネシウム、マンガン、モリブデン、セレン、亜鉛、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
　【請求項１７】　少なくとも約１９４ｍｇ／Ｌのアルギニン、少なくとも約１５２．５ｍｇ／Ｌのアスパラギン酸、少なくとも約５４ｍｇ／Ｌのシスチン、少なくとも約３８ｍｇ／Ｌグリシン、少なくとも約１５９ｍｇ／Ｌのグルタミン酸、少なくとも約４５．２ｍｇ／Ｌのヒスチジン、少なくとも約１４５．２ｍｇ／Ｌのイソロイシン、少なくとも約９５．２ｍｇ／Ｌのロシイン、少なくとも約１５３．７ｍｇ／Ｌのリジン、少なくとも約１１９．８ｍｇ／Ｌのメチオニン、少なくとも約１３６ｍｇ／Ｌのフェニルアラニン、少なくとも約５９ｍｇ／Ｌのプロリン、少なくとも約５２．４ｍｇ／Ｌのセリン、少なくとも約７２．２ｍｇ／Ｌのスレオニン、少なくとも約１９ｍｇ／Ｌのトリプトファン、少なくとも約６６．４ｍｇ／Ｌのチロシン、および少なくとも約１０１．３ｍｇ／Ｌのバリンからなる群より選択されるアミノ酸をさらに含む、請求項１５または１６に記載の方法。
　【請求項１８】　前記還元剤がモノチオグリセロールである、請求項１５に記載の方法。
　【請求項１９】　前記還元剤が約０．１ｍｇ／Ｌと１０ｍｇ／Ｌとの間の濃度で含まれる、請求項１８に記載の方法。
　【請求項２０】　前記金属キレート化剤が、トランスフェリン、フェリチン、アルブミン、ピリドキシルイソニコチノイルヒドラゾン、クエン酸コリン、およびクエン酸塩からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
　【請求項２１】　前記金属キレート化剤がクエン酸塩である、請求項２０に記載の方法。
　【請求項２２】　前記ビタミンが、アスコルビン酸、ビオチン、フラビンアデニンジヌクレオチド、葉酸、フォリン酸、ニコチンアミド、ｐ−アミノ安息香酸、パントテン酸塩、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
　【請求項２３】　前記細胞がハイブリドーマである、請求項１５，１６，２０または２２に記載の方法。
　【請求項２４】　培養中の動物細胞の寿命を増強する方法であって、主要補足物およびクラスＩ試薬を有する培養培地中の該動物細胞を提供する工程を包含し、該主要補足物が以下を含む成分を有する、方法：
（ａ）グルタミンおよびグルタミン酸からなる群より選択される成分であって、少なくとも５ｍＭの濃度で存在する、成分；
（ｂ）少なくとも約４ｍｇ／Ｌのコリンおよび少なくとも約１ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含むリン脂質前駆体；および
（ｃ）アミノ酸
であって、ここで該アミノ酸が該培養中で２０ｍｇ／Ｌより高い濃度で存在するトリプトファンを含む、アミノ酸
ここで、該クラスＩ試薬が以下を含む：
（ｉ）還元剤；
（ｉｉ）金属イオン；
（ｉｉｉ）金属キレート化剤；および
（ｉｖ）ビタミン；
　ここで、該主要補足物およびクラスＩ試薬の成分が、培養寿命および生産物の発現を増加するのに有効な濃度であり、これらの増加は、前記成分（ａ）、コリン、およびエタノールアミンの添加効果により維持されるより長い時間、
少なくとも１００時間、
　【請求項２５】　グルタミンまたはグルタミン酸の濃度が８ｍＭと２０ｍＭとの間である、請求項２４に記載の方法。
　【請求項２６】　コリンの濃度が４ｍｇ／Ｌと４０ｍｇ／Ｌとの間である、請求項２４または２５に記載の方法。
　【請求項２７】　エタノールアミンの濃度が１ｍｇ／Ｌと１０ｍｇ／Ｌとの間である、請求項２４，２５または２６に記載の方法。
　【請求項２８】　グルタミンの濃度が８ｍＭと２０ｍＭとの間であり、コリンの濃度が４ｍｇ／Ｌと４０ｍｇ／Ｌとの間であり、そしてエタノールアミンの濃度が１ｍｇ／Ｌと１０ｍｇ／Ｌとの間である、請求項２４に記載の方法。
　
【請求項２９】
２４
　
【請求項３０】
　
【請求項３１】
であって
成分　　　　　　　　　　　　　　　　　濃度（ｍｇ／Ｌ）
Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ　　　　　　４０．００００−５０．００００
ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　４００−５６０
ＭｇＳＯ４　　　　　　　　　　　　　　７３．５−２４２．８
ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　５３００−６０００
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ　　　　　　　　６２５−７３２
Ｎａ２ＨＰＯ４　　　　　　　　　　　　３２０．４−４００．５
グルコース　　　　　　　　　　　　　　２７００−４８００
グルタチオン　　　　　　　　　　　　　０．４−０．５
ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　　　　　　２３８３．２−２９７９
ピルビン酸ナトリウム　　　　　　　　　４４−１１５５
ＮａＨＣＯ３　　　　　　　　　　　　　２３５０−２８５０
ｐ−アミノ安息香酸　　　　　　　　　　０．４６４−１．０
ビオチン　　　　　　　　　　　　　　　０．１−０．２
パントテン酸カルシウム　　　　　　　　１．７０１６−４．００００
葉酸　　　　　　　　　　　　　　　　　１．６０−４．０
ニコチンアミド　　　　　　　　　　　　２．０−５．０
ピリドキシン塩酸　　　　　　　　　　　０．４８−１．０
リボフラビン　　　　　　　　　　　　　０．２５６−０．６
チアミン塩酸　　　　　　　　　　　　　２．０−５．０
ビタミンＢ−１２　　　　　　　　　　　０．００２５−．２４
塩化コリン　　　　　　　　　　　　　　２２．８−２３．５
イノシトール　　　　　　　　　　　　　２４．８８００−４１．００００
エタノールアミン　　　　　　　　　　　
１
グリセロール　　　　　　　　　　　　　０−２００
グルタミン　　　　　　　　　　　　　　１１６０−１１８０
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオールＦ６８
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０００
トランスフェリン　　　　　　　　　　　４．０−５．０
Ｎａ２ＳｅＯ３　　　　　　　　　　　　．００４−．００５
ＦｅＣｌ３　　　　　　　　　　　　　　０．−１．６
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ　　０−０．１
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　．００５−０．１
ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　０−０．１
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　．００４−０．１
ＺｎＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　０−０．１
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　０−０．１１
モノチオグリセロール　　　　　　　　　０−１０
クエン酸塩　　　　　　　　　　　　　　０−２５８
アルギニン　　　　　　　　　　　　　　１９４．１−７９４
アスパラギン酸　　　　　　　　　　　　１２５−２８０
シスチン　　　　　　　　　　　　　　　４９−１９５
グルタミン酸　　　　　　　　　　　　　５０−３０８
グリシン　　　　　　　　　　　　　　　３８−５６
ヒスチジン　　　　　　　　　　　　　　４５．２−１２０
イソロイシン　　　　　　　　　　　　　１７８−２８２
ロイシン　　　　　　　　　　　　　　　９５．２−２８２
リジン塩酸　　　　　　　　　　　　　　１５３．７−３１７
メチオニン　　　　　　　　　　　　　　５２−２１７．６
フェニルアラニン　　　　　　　　　　　７０−２３２
プロリン　　　　　　　　　　　　　　　５０−１０８
セリン　　　　　　　　　　　　　　　　５２．４−１３６
スレオニン　　　　　　　　　　　　　　７２．２−１９４
トリプトファン　　　　　　　　　　　　
２０
チロシン　　　　　　　　　　　　　　　８６．８−１５８
バリン　　　　　　　　　　　　　　　　９７−１９１
、
ここで、該成分が、培養寿命および生産物の発現を増加するのに有効な濃度であり、これらの増加は、前記グルタミン（またはグルタミン酸）、コリン、およびエタノールアミンの添加効果により維持されるより長い時間、該細胞を少なくとも１００時間、疑似定常期に維持することによってなされる、方法。
　
【請求項３２】
（ａ）グルタミンおよびグルタミン酸からなる群より選択される成分であって、少なくとも５ｍＭの濃度で存在する、成分；
（ｂ）培養寿命を増強する量で、少なくともコリンとエタノールアミンとを組み合わせて含むリン脂質前駆体
であって、ここで該コリンが該培養中で４ｍｇ／Ｌより高い濃度で存在し、そして該エタノールアミンが該培養中で少なくとも１ｍｇ／Ｌの濃度で存在する、リン脂質前駆体
（ｃ）該動物細胞の増殖のための必須アミノ酸
であって、ここで該アミノ酸が該培養中で２０ｍｇ／Ｌより高い濃度で存在するトリプトファンを含む、アミノ酸
（ｄ）クラスＩ試薬；ここで、該クラスＩ試薬が以下を含む：
（ｉ）還元剤；
（ｉｉ）金属イオン；
（ｉｉｉ）金属キレート化剤；および
（ｉｖ）ビタミン
　ここで、該主要補足物の成分が、培養寿命および生産物の発現を増加するのに有効な濃度であり、これらの増加は、該細胞を少なくとも１００時間、疑似定常期に維持することによってなされる
　
【請求項３３】
３２
　
【請求項３４】
３２
３３
　
【請求項３５】
３２
３３
３４
　
【請求項３６】
３２
（ａ）還元剤；
（ｂ）金属イオン；
（ｃ）金属キレート化剤；および
（ｄ）ビタミン；さらに、該クラスＩ試薬は、前記成分（ａ）、コリン、エタノールアミンの添加効果により維持されるより長い時間、該細胞を疑似定常期に維持するのに有効な濃度である。
　
【請求項３７】
３６
　と訂正し、旧請求項２９および３７は削除します。
（５４）【発明の名称】
増強された細胞増殖、培養寿命および生産物発現のための細胞培養培地
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　培養寿命を増強する方法であって、培養中の動物細胞を主要補足物およびクラスＩ試薬に接触させる工程を包含し、該主要補足物がタンパク質を含まず、そして以下を含む、方法：
（ａ）グルタミンおよびグルタミン酸からなる群より選択される成分であって、少なくとも５ｍＭの濃度で存在する、成分；
（ｂ）少なくともコリンとエタノールアミンとを含む、リン脂質前駆体
であって、ここで該コリンが該培養中で４ｍｇ／Ｌより高い濃度で存在し、そして該エタノールアミンが該培養中で少なくとも１ｍｇ／Ｌの濃度で存在する、リン脂質前駆体
（ｃ）アミノ酸
であって、ここで該アミノ酸が該培養中で２０ｍｇ／Ｌより高い濃度で存在するトリプトファンを含む、アミノ酸
ここで、該クラスＩ試薬が以下を含む：
（ｉ）還元剤；
（ｉｉ）金属イオン；
（ｉｉｉ）金属キレート化剤；および
（ｉｖ）ビタミン；
　ここで、該主要補足物およびクラスＩ試薬の成分が、培養寿命および生産物の発現を増強するのに有効な濃度であり、これらの増強は、グルタミン（またはグルタミン酸）単独、コリン単独、およびエタノールアミン単独の添加効果よりも長い時間、
少なくとも１００時間、
のに有効である濃度で存在する
　【請求項２】　前記細胞を成長ホルモンまたは成長因子と接触させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
　【請求項３】　前記細胞をＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオールと接触させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
　【請求項４】　前記細胞が抗体分泌細胞である、請求項１に記載の方法。
　【請求項５】　前記アミノ酸が約２０ｍｇ／Ｌと１００ｍｇ／Ｌとの間の濃度でトリプトファンを含む、請求項１に記載の方法。
　【請求項６】　前記アミノ酸がグルタミンおよびグルタミン酸からなる群より選択され、さらに、該アミノ酸が約５ｍＭと４０ｍＭとの間の濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
　【請求項７】　コリンが約４ｍｇ／Ｌと４０ｍｇ／Ｌとの間の濃度で存在する、請求項１または６に記載の方法。
　【請求項８】　エタノールアミンが約１ｍｇ／Ｌと１０ｍｇ／Ｌとの間の濃度で存在する、請求項１、６または７に記載の方法。
　【請求項９】　前記リン脂質前駆体が、セリン、イノシトール、グリセロール、ホスホエタノールアミン、ホスホコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルコリンからなる群より選択される組成物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
　【請求項１０】　前記組成物がセリン、イノシトール、およびグリセロールからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
　【請求項１１】　前記生産物の発現が１１６ｍｇ／Ｌより多いタンパク質である、請求項１に記載の方法。
　【請求項１２】　前記培養寿命の増強が１００時間を超える、請求項１に記載の方法。
　【請求項１３】　前記タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項１１に記載の方法。
　【請求項１４】　前記培養中の細胞が無血清培地中にある、請求項１に記載の方法。
　【請求項１５】　培養中の動物細胞の培養寿命およびタンパク質発現を増強する方法であって、該動物細胞を主要補足物、クラスＩ試薬、およびグルコースに接触させる工程を包含する、方法、ここで、該主要補足物が以下の成分を含む：
（ａ）グルタミンおよびグルタミン酸からなる群より選択される成分であって、少なくとも５ｍＭの濃度で存在する、成分；
（ｂ）コリンとエタノールアミンとを組み合わせて含む、リン脂質前駆体
であって、ここで該コリンが該培養中で４ｍｇ／Ｌより高い濃度で存在し、そして該エタノールアミンが該培養中で少なくとも１ｍｇ／Ｌの濃度で存在するリン酸前駆体
（ｃ）アミノ酸
であって、ここで該アミノ酸が該培養中で２０ｍｇ／Ｌより高い濃度で存在するトリプトファンを含む、アミノ酸
ここで、該クラス　Ｉ試薬が以下を含む：
（ｉ）還元剤；
（ｉｉ）金属イオン；
（ｉｉｉ）金属キレート化剤；および
（ｉｖ）ビタミン；
　ここで、該主要補足物、該クラスＩ試薬、
および
培養寿命および生産物の発現を増強するのに有効な量で組み合わせて存在し、これらの増強は、該動物細胞を少なくとも１００時間、疑似定常期に維持することによってなされる
　【請求項１６】　前記金属イオンが、カルシウム、コバルト、銅、鉄、マグネシウム、マンガン、モリブデン、セレン、亜鉛、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
　【請求項１７】　少なくとも約１９４ｍｇ／Ｌのアルギニン、少なくとも約１５２．５ｍｇ／Ｌのアスパラギン酸、少なくとも約５４ｍｇ／Ｌのシスチン、少なくとも約３８ｍｇ／Ｌグリシン、少なくとも約１５９ｍｇ／Ｌのグルタミン酸、少なくとも約４５．２ｍｇ／Ｌのヒスチジン、少なくとも約１４５．２ｍｇ／Ｌのイソロイシン、少なくとも約９５．２ｍｇ／Ｌのロシイン、少なくとも約１５３．７ｍｇ／Ｌのリジン、少なくとも約１１９．８ｍｇ／Ｌのメチオニン、少なくとも約１３６ｍｇ／Ｌのフェニルアラニン、少なくとも約５９ｍｇ／Ｌのプロリン、少なくとも約５２．４ｍｇ／Ｌのセリン、少なくとも約７２．２ｍｇ／Ｌのスレオニン、少なくとも約１９ｍｇ／Ｌのトリプトファン、少なくとも約６６．４ｍｇ／Ｌのチロシン、および少なくとも約１０１．３ｍｇ／Ｌのバリンからなる群より選択されるアミノ酸をさらに含む、請求項１５または１６に記載の方法。
　【請求項１８】　前記還元剤がモノチオグリセロールである、請求項１５に記載の方法。
　【請求項１９】　前記還元剤が約０．１ｍｇ／Ｌと１０ｍｇ／Ｌとの間の濃度で含まれる、請求項１８に記載の方法。
　【請求項２０】　前記金属キレート化剤が、トランスフェリン、フェリチン、アルブミン、ピリドキシルイソニコチノイルヒドラゾン、クエン酸コリン、およびクエン酸塩からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
　【請求項２１】　前記金属キレート化剤がクエン酸塩である、請求項２０に記載の方法。
　【請求項２２】　前記ビタミンが、アスコルビン酸、ビオチン、フラビンアデニンジヌクレオチド、葉酸、フォリン酸、ニコチンアミド、ｐ−アミノ安息香酸、パントテン酸塩、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
　【請求項２３】　前記細胞がハイブリドーマである、請求項１５，１６，２０または２２に記載の方法。
　【請求項２４】　培養中の動物細胞の寿命を増強する方法であって、主要補足物およびクラスＩ試薬を有する培養培地中の該動物細胞を提供する工程を包含し、該主要補足物が以下を含む成分を有する、方法：
（ａ）グルタミンおよびグルタミン酸からなる群より選択される成分であって、少なくとも５ｍＭの濃度で存在する、成分；
（ｂ）少なくとも約４ｍｇ／Ｌのコリンおよび少なくとも約１ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含むリン脂質前駆体；および
（ｃ）アミノ酸
であって、ここで該アミノ酸が該培養中で２０ｍｇ／Ｌより高い濃度で存在するトリプトファンを含む、アミノ酸
ここで、該クラスＩ試薬が以下を含む：
（ｉ）還元剤；
（ｉｉ）金属イオン；
（ｉｉｉ）金属キレート化剤；および
（ｉｖ）ビタミン；
　ここで、該主要補足物およびクラスＩ試薬の成分が、培養寿命および生産物の発現を増加するのに有効な濃度であり、これらの増加は、前記成分（ａ）、コリン、およびエタノールアミンの添加効果により維持されるより長い時間、
少なくとも１００時間、
　【請求項２５】　グルタミンまたはグルタミン酸の濃度が８ｍＭと２０ｍＭとの間である、請求項２４に記載の方法。
　【請求項２６】　コリンの濃度が４ｍｇ／Ｌと４０ｍｇ／Ｌとの間である、請求項２４または２５に記載の方法。
　【請求項２７】　エタノールアミンの濃度が１ｍｇ／Ｌと１０ｍｇ／Ｌとの間である、請求項２４，２５または２６に記載の方法。
　【請求項２８】　グルタミンの濃度が８ｍＭと２０ｍＭとの間であり、コリンの濃度が４ｍｇ／Ｌと４０ｍｇ／Ｌとの間であり、そしてエタノールアミンの濃度が１ｍｇ／Ｌと１０ｍｇ／Ｌとの間である、請求項２４に記載の方法。
　
【請求項２９】
２４
　
【請求項３０】
　
【請求項３１】
であって
成分　　　　　　　　　　　　　　　　　濃度（ｍｇ／Ｌ）
Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ　　　　　　４０．００００−５０．００００
ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　４００−５６０
ＭｇＳＯ４　　　　　　　　　　　　　　７３．５−２４２．８
ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　５３００−６０００
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ　　　　　　　　６２５−７３２
Ｎａ２ＨＰＯ４　　　　　　　　　　　　３２０．４−４００．５
グルコース　　　　　　　　　　　　　　２７００−４８００
グルタチオン　　　　　　　　　　　　　０．４−０．５
ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　　　　　　２３８３．２−２９７９
ピルビン酸ナトリウム　　　　　　　　　４４−１１５５
ＮａＨＣＯ３　　　　　　　　　　　　　２３５０−２８５０
ｐ−アミノ安息香酸　　　　　　　　　　０．４６４−１．０
ビオチン　　　　　　　　　　　　　　　０．１−０．２
パントテン酸カルシウム　　　　　　　　１．７０１６−４．００００
葉酸　　　　　　　　　　　　　　　　　１．６０−４．０
ニコチンアミド　　　　　　　　　　　　２．０−５．０
ピリドキシン塩酸　　　　　　　　　　　０．４８−１．０
リボフラビン　　　　　　　　　　　　　０．２５６−０．６
チアミン塩酸　　　　　　　　　　　　　２．０−５．０
ビタミンＢ−１２　　　　　　　　　　　０．００２５−．２４
塩化コリン　　　　　　　　　　　　　　２２．８−２３．５
イノシトール　　　　　　　　　　　　　２４．８８００−４１．００００
エタノールアミン　　　　　　　　　　　
１
グリセロール　　　　　　　　　　　　　０−２００
グルタミン　　　　　　　　　　　　　　１１６０−１１８０
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオールＦ６８
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０００
トランスフェリン　　　　　　　　　　　４．０−５．０
Ｎａ２ＳｅＯ３　　　　　　　　　　　　．００４−．００５
ＦｅＣｌ３　　　　　　　　　　　　　　０．−１．６
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ　　０−０．１
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　．００５−０．１
ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　０−０．１
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　．００４−０．１
ＺｎＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　０−０．１
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　０−０．１１
モノチオグリセロール　　　　　　　　　０−１０
クエン酸塩　　　　　　　　　　　　　　０−２５８
アルギニン　　　　　　　　　　　　　　１９４．１−７９４
アスパラギン酸　　　　　　　　　　　　１２５−２８０
シスチン　　　　　　　　　　　　　　　４９−１９５
グルタミン酸　　　　　　　　　　　　　５０−３０８
グリシン　　　　　　　　　　　　　　　３８−５６
ヒスチジン　　　　　　　　　　　　　　４５．２−１２０
イソロイシン　　　　　　　　　　　　　１７８−２８２
ロイシン　　　　　　　　　　　　　　　９５．２−２８２
リジン塩酸　　　　　　　　　　　　　　１５３．７−３１７
メチオニン　　　　　　　　　　　　　　５２−２１７．６
フェニルアラニン　　　　　　　　　　　７０−２３２
プロリン　　　　　　　　　　　　　　　５０−１０８
セリン　　　　　　　　　　　　　　　　５２．４−１３６
スレオニン　　　　　　　　　　　　　　７２．２−１９４
トリプトファン　　　　　　　　　　　　
２０
チロシン　　　　　　　　　　　　　　　８６．８−１５８
バリン　　　　　　　　　　　　　　　　９７−１９１
、
ここで、該成分が、培養寿命および生産物の発現を増加するのに有効な濃度であり、これらの増加は、前記グルタミン（またはグルタミン酸）、コリン、およびエタノールアミンの添加効果により維持されるより長い時間、該細胞を少なくとも１００時間、疑似定常期に維持することによってなされる、方法。
　
【請求項３２】
（ａ）グルタミンおよびグルタミン酸からなる群より選択される成分であって、少なくとも５ｍＭの濃度で存在する、成分；
（ｂ）培養寿命を増強する量で、少なくともコリンとエタノールアミンとを組み合わせて含むリン脂質前駆体
であって、ここで該コリンが該培養中で４ｍｇ／Ｌより高い濃度で存在し、そして該エタノールアミンが該培養中で少なくとも１ｍｇ／Ｌの濃度で存在する、リン脂質前駆体
（ｃ）該動物細胞の増殖のための必須アミノ酸
であって、ここで該アミノ酸が該培養中で２０ｍｇ／Ｌより高い濃度で存在するトリプトファンを含む、アミノ酸
（ｄ）クラスＩ試薬；ここで、該クラスＩ試薬が以下を含む：
（ｉ）還元剤；
（ｉｉ）金属イオン；
（ｉｉｉ）金属キレート化剤；および
（ｉｖ）ビタミン
　ここで、該主要補足物の成分が、培養寿命および生産物の発現を増加するのに有効な濃度であり、これらの増加は、該細胞を少なくとも１００時間、疑似定常期に維持することによってなされる
　
【請求項３３】
３２
　
【請求項３４】
３２
３３
　
【請求項３５】
３２
３３
３４
　
【請求項３６】
３２
（ａ）還元剤；
（ｂ）金属イオン；
（ｃ）金属キレート化剤；および
（ｄ）ビタミン；さらに、該クラスＩ試薬は、前記成分（ａ）、コリン、エタノールアミンの添加効果により維持されるより長い時間、該細胞を疑似定常期に維持するのに有効な濃度である。
　
【請求項３７】
３６
【発明の詳細な説明】
　本発明は、動物細胞培養の一般的分野に属する。より詳しくは、本発明は、動物細胞の培養並びにそれから誘導される天然および組換え物質の生産のための改良培地に関する。
　現在まで、細胞培養増殖を最大にし、それによって得られる生成物の収量を増加させるような培養条件を開発するための努力がなされている。動物細胞の培地の開発における初期の研究は、迅速な細胞増殖を達成するような培地の調製に集中した（Ｗｈｉｔｅ，Ｐ．Ｒ．，１９４６，Ｇｒｏｗｔｈ，１０：２３１−２８９；およびＷａｙｍｏｕｔｈ，Ｃ．，１９７４，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．，５３：１４４３−１４４８）。そのような培地は、特定の栄養素、特に糖、アミノ酸、ビタミン、塩を含み、そして或る場合には微量金属イオン、プリンおよびピリミジンを含むことがある。それらの培地は、最も頻繁には動物血清が補足される。今日、哺乳動物細胞培養のために広く使われている幾つかの基礎培地としては、Ｈａｍｓ　Ｆ−１２，Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０およびＩｓｃｏｖｅ改良ＤＭＥが挙げられる。
　ハイブリドーマ細胞系を使ったヒトモノクローナル抗体の生産を、細胞培養における生産物発現の一例として本出願において用いることにする。
　モノクローナル抗体の生産のための低血清および無血清哺乳動物細胞培養用に特別に開発された培地が既に記載されている。そのような無血清培地の１つは、１９８３年４月１３日に発行されたヨーロッパ特許公告０７６，６４７号に開示されている。微量元素のような補足物およびビタミンのレベルを変更し、そして精製タンパク質ホルモン添加物を含めることにより、別の培地が開発されている。そのような培地に対する参考文献として、例えば、Ｂａｒｎｅｓ，Ｄ．，ら、１９８０，Ｃｅｌｌ，２２：６４９−６５５；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｗ．Ｌ．ら、１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，５６：２２１−２３４；Ｉｓｃｏｖｅ，Ｎ．ら、１９７８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４７：９２３−９３３；Ｋａｗａｍｏｔｏ，Ｔ．ら、１９８３，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３０：４４５−４５３；Ｋｏｖａｒ，Ｊ．ら、１９８４，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：３３９−３４５；Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｈ．ら、１９８３，Ａｒｇｉｃ　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４７（８）：１８３５−１８４０；Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｈ．ら、１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：１１５８−１１６２，Ｍｕｚｉｋ，Ｈ．ら、１９８２，Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ，１８：５１５−５２４；およびＷｏｌｐｅ，Ｓ．Ｄ．，“Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　ｉｎ　Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ”，Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ編、Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８４；Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｈ．ら、１９８５，Ｈ．Ｍｕｒａｋａｍｉら（編）Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９８５の第１１７−１２２頁；Ｔｈａｒａｋａｎ，Ｊ．Ｐ．ら、１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，９４：２２５−２３５；Ｃｏｌｅ，Ｓ．Ｐ．Ｃ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，９７：２９−３５；ＭｃＨｕｇｈ，Ｙ．Ｅ．，１９８３，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６月／７月号：７２−７７が挙げられる。それらの培地の全てでないにしろほとんどに共通している成分としては、４．５ｇ／Ｌまでの濃度のグルコース、２−４ｍＭの濃度のグルタミン、通常約１−４ｍｇ／Ｌのコリン、トリプトファンおよび他のアミノ酸が挙げられる。トリプトファンは通常２０ｍｇ／Ｌ未満の濃度で存在する。それらの培地の幾つかは、増殖因子インスリンおよびトランスフェリンも含有する。
　抗体の収量を増加させるための努力は、細胞増殖および細胞密度を最適化する方法に主に集中している。参考文献の一般的特徴として、マウスハイブリドーマ細胞系からの抗体価は細胞系によって非常に変動的であり、そして典型的には１０〜３５０ｍｇ／Ｌの範囲である（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｋ．Ｌ．ら、１９８７，Ｄｅｖ．Ｉｎｄｕｓｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２７：１０１−１０６）。ヒト／ヒトまたはヒト／マウス融合からのヒトモノクローナル抗体の発現は、細胞系によって非常に変動的であり、典型的には０．１〜２５ｍｇ／Ｌの範囲である（Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｒ．，Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｅ　ａｎｄ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第７章：１９６−２６３，Ｗｉｓｅｍａｎｄ，Ａ．編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８３）。それらの数値は、細胞増殖にとって最適である培養条件の指標である。
　生産物の生産を増加させる文献からの別のアプローチは、細胞再利用または封入方法により高い細胞密度を達成するものである。それらの方法の例としては、中空繊維型リアクター（Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ，Ｇ．Ｌ．ら、１９８６，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，ＸＸＶＩＩＩ：６４６−６５８；セラミックマトリックス型リアクター（Ｍａｒｃｉｐａｒ，Ａ．ら、１９８３，Ａｎｎａｌｓ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，４１３：４１６−４２０；Ｎａｔｕｒｅ，３０２：６２９−６３０）；潅流リアクター（Ｆｅｄｅｒ，Ｊ．ら、１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＩＩＩ：２４−３６）等が挙げられる。
　細胞培養物からの生産物の発現を増加させるための様々な方法が探索されているが、主な論点はまだ細胞増殖の最適化にある。典型的な培地においては、最大細胞密度に達した後は細胞が迅速に死滅する。
　文献からの別の例は、少なくとも幾つかの細胞系については、培養物が増殖を停止した後でも生産物（モノクローナル抗体）の生産が進行することを証明している（Ｖｅｌｅｚ，Ｄ．ら、１９８６，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，８６：４５−５２；Ｒｅｕｖｅｎｙ，Ｓ．ら、１９８６，同文献、５３−５９）。Ａｒａｔｈｏｏｎ，Ｗ．ら、１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：１３９０−１３９５は、１０００リットルのハイブリドーマ培養物が増殖期中に約８０ｇのモノクローナル抗体を生産し、そして延長した定常／減衰期中に更に１７０ｇの抗体を生産したことを報告している。Ｊ．Ｂｉｒｃｈら（ヨーロッパ特許出願第８７／００１９５号、１９８７）は、ある期間に渡り培養物に栄養素を添加しそして培養寿命を増加させる添加培養方法を記載している。こうして培養物からの最終抗体価が増加される。
　従って、動物細胞の増殖を維持し且つ抗体を含む生成物および天然または組換えタンパク質の生産を現在利用可能な培地を使って実現され得るよりも高いレベルに刺激するであろう培地への重大な要望がある。
　従って、ここに与えられる発明は、標準細胞培養培地に添加すると、細胞増殖、培養寿命および生産物発現を増強する無タンパク質補足物（「主要補足物」）を記載する。この補足物が無血清培地中でのハイブリドーマ細胞系を使った抗体の生産において特に効果的であることを示す実施例が与えられる。ある例では、抗体価が８０ｍｇ／Ｌから２５０ｍｇ／Ｌ以上に増加する。主要補足物とは、規定の組合せにおいて添加すると有利であり、そして１）グルタミン、２）最小限コリンとエタノールアミンの両方を含むリン脂質前駆体、３）トリプトファン、および４）特定の細胞系および生産しようとする生成物に必要とされる追加のアミノ酸、から成る標準培地成分の未知の相乗的組合せである。それらの成分を個々に標準培地に添加してもほとんど効果がないが、規定の組合せにおいて一緒に添加すると非常に効果的であり、そして規定の成分のいずれかの削除は所望の効果を減少させる。主要補足物中の幾つかの成分は、不要または禁止であると従来見なされていた濃度に添加される。規定の組合せにおいて一緒に添加すると、この補足物は生産物の発現が持続する擬似定常期に細胞を維持することにより培養寿命を増加させ、こうして最終生成物の力価の有意な増加をもたらす。
　本発明の第二の観点は、個々にまたは様々な組合せにおいて主要補足物に添加すると、細胞増殖および／または生産物発現の異なる改善をもたらす幾つかの追加の成分（「クラスＩ試薬」）の記載である。このクラスの追加の成分に含まれるのは、還元剤、微量金属イオンおよび／またはビタミンである。
　本発明の第三の観点は、前記補足物を含む無血清および血清補足培地、並びに脂質が補足されておりそして溶質ストレスを誘導する試薬の添加と共に使用することができる培地の調製である。
　本発明の更なる観点は、培養の開始時に培地中に含めることができるか、または流加もしくは連続方式で添加することができるような、上述の培地補足物を使った細胞の増殖方法である。得られた培地は、様々な培養方法、例えば限定的でなく、バッチ培養、流加培養、ヘモスタット培養および潅流培養において、そして様々な細胞培養設備、例えば限定的でなく、静置フラスコ、撹拌フラスコ、回転フラスコ、撹拌発酵槽、エアリフト発酵槽、メンブランリアクター（中空繊維、平板膜プレート、外部ループ潅流を含む）、固定された固体支持体上に維持された／微孔質ビーズ中に封入された細胞を有するリアクター、および所望の細胞系の増殖または維持に適当な任意の他の形状を用いて使うことができる。
　図１は、典型的な市販の培地Ｖｅｎｔｒｅｘ　ＨＬ−１中での増殖特性およびＤ２３４により生産される抗体のレベルを示す。
　図２は、細胞培養の文献中に記載の組成物を代表する標準無血清培地組成物中での増殖特性およびＤ２３４により生産される抗体のレベルを示す。
　図３は、主要補足物の試薬が補足された培地中での増殖特性およびＤ２３４により生産される抗体のレベルを示す。
　図４は、主要補足物の試薬とクラスＩ試薬が補足された培地中での増殖特性およびＤ２３４により生産される抗体のレベルを示す。
　図５は、主要補足物の試薬とクラスＩ試薬が補足されそして脂質の補足と組合せて使用される培地中での増殖特性およびＤ２３４により生産される抗体のレベルを示す。
　図６は、主要補足物とクラスＩ補足物の試薬並びに脂質が補足された培地を使った流加培養において増殖させたハイブリドーマＤ２３４を示す。
　本出願を通じて次の参照文献が引用され、そして読者の便宜上ここに与える。Ｉａｎ　Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌｓ−−Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，ＮＹ，１９８７）は、広範な動物細胞の培養およびそれからの生産物の生産のための文献中に記載の典型的な血清含有基礎培地の組成（表７．５：７４−７５）および典型的な無血清培地の組成（表７．６：７６−７８）を表にしている。それらの表は引用により本明細書中に組み込まれる。
　本発明は、第一に、細胞増殖、培養寿命および生産物発現を増強するための標準細胞培養培地と適合する無タンパク質補足物に関する。主要補足物が好ましく、そして少なくとも部分的には、使用する試薬の未知の相乗作用により生じる利点を有する。Ｉｓｃｏｖｅ（Ｎ．Ｎ．Ｉｓｃｏｖｅ，Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　ａｎｄ　Ｌｙｍｐｈｏｉｄ　Ｃｅｌｌｓ中の第１６９−１８５頁）は、「各成分の濃度を個々に２倍および４倍にすることの効果を調べた…」という箇所に、細胞培養培地を最適化する標準法を記載している。このアプローチは、細胞培養技術において広く使われているが、成分が相乗的に作用し得る可能性や、所望の効果を生ぜしめるのに幾つかの成分の補足物を組み合わせることが必要となり得る可能性を認識することはできない。
　第二グループの細胞培養試薬（クラスＩ試薬）から選択された成分は、主要補足物と組み合わせると相乗作用して高密度への細胞増殖において特に有利な効果を有する、より好ましい細胞培養補足物を生成することができる。
　試薬のクラスおよびそれから調製できる培地補足物の詳細な記載を与える前に、本明細書中で使用する幾つかの技術用語の簡単な定義が本発明の本質の理解を容易にするであろう。
定義
　「基礎培地」とは、本明細書では無機塩類、糖、アミノ酸、並びに所望により、ビタミン、有機酸および／または緩衝剤の栄養素混合物または他の公知の細胞培養栄養素を含むものと定義される。それらの試薬は、細胞増殖および再生産を維持するのに必要である。本発明の細胞増殖培地組成物の成分である好ましい基礎培地は、血清もタンパク質も含まない。種々様々な市販の基礎培地が当業者に公知であり、そのようなものとしてＤｕｌｂｅｃｃｏｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＲＰＭＩ）、Ｉｓｃｏｖｅ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ’ＭｅｄｉｕｍおよびＨａｍｓ培地が挙げられる。
　「ハイブリドーマ」なる用語は、免疫原の不死化細胞系と抗体産生細胞との融合により作製されたハイブリッド細胞系について言う。その用語は、ヒト細胞とマウスミエローマ細胞系との融合に次いで形質細胞との融合の結果得られ、当業界ではトリオーマ細胞系と呼称されるヘテロハイブリッドミエローマ融合体の子孫を含む意味である。従って、事実上この用語は、抗体を産生する任意の不死化ハイブリッド細胞系、例えばクアドローマを包含する意味である。Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．ら、１９８３，Ｎａｔｕｒｅ，５３７：３０５３。更に、ハイブリッド細胞系は、事実上ヒトおよびマウスを含む任意の種のものであることができる。
　「マイクロエマルション」なる用語は、事実上タンパク質様物質、例えば血清中に見つかるもの、特に血清アルブミンの助けをかりることなく乳化された脂質混合物について言及する。通常は、１９８９年１月９日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８９／０１０２７中に記載の乳化剤が、マイクロエマルションを形成せしめるために使用されるだろう。この特許出願は、そのまま引用することにより本明細書中に組み込まれる。
　本明細書で使用する「溶質ストレス」なる用語は、増殖阻害効果または最終細胞密度の減少、即ち最適増殖について測定されたものよりも小さい増殖速度または最大細胞密度、をもたらすような濃度における溶質の添加について言う。しかしながら、この減少した増殖レベルにおいて発現された生成物のレベルは、（細胞ごとの）特定の生産物の発現速度の増加または培養寿命の増加のため、最適増殖速度において達成される発現のレベルよりも比較的大きい。通常、１９８９年６月１日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８９／０４８６７に記載の溶質および方法が使用されるだろう。この出願は、そのまま引用することにより本明細書中に組み込まれる。
　「擬似定常期」とは、指数増殖期の後にくる培養物増殖期間を言い、そして時間と共に比較的遅く（指数増殖期または減衰期中と比較して）にのみ生存細胞濃度が変化するように、細胞の増殖速度と死滅速度が同じ位である期間のことを言う。
　「細胞成長ホルモン」または「増殖因子」とは、定義される培地中での細胞の増殖を刺激するかまたは細胞の存続を維持するような、天然に存在するかまたは遺伝子操作された多数の分子、断片、誘導体もしくは変形体を包含する意味である。前者の例としては、特に、トランスフェリンおよびインスリンが挙げられる。増殖因子の例としては、特に、神経増殖因子、表皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子および内皮細胞増殖因子が挙げられる。動物細胞系が異なると１または複数のそれらの分子に対する要求が異なること、および標準的な細胞培養技術を使って最適なホルモンもしくは増殖因子またはそれらの混合物が容易に決定されること、に注目することが重要である。
　本発明は、試験管内における動物細胞（特に哺乳動物細胞）の一般的増殖および維持の必要条件と両立でき、そして特に特定の細胞タイプに関係する分化した性質の発現（例えばハイブリドーマ細胞系による増大したモノクローナル抗体の産生）を増強するかまたは支持する。従って、本発明の補足物は、広範な用途を有すると思われ、日常的な細胞培養に通常有用であり、その上多量の天然または組換え細胞生産物が培養中の細胞により生産されることを所望する場合に使用されるであろう。
主要補足物
　本発明の主要補足物（Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）は、組合せにおいて１）グルタミン、２）好ましくはコリンとエタノールアミンを含むリン脂質前駆体、３）トリプトファン、および４）特定の細胞系に要求される追加のアミノ酸、を含む１クラスの試薬から成る。
ａ）グルタミン：
　主要補足物中には、グルタミンは５ｍＭより多く、好ましくは８−２０ｍＭにおいて含まれる。それらの濃度が細胞培養培地中に典型的に認められるものよりも有意に高いことに注目することが大切である。
　グルタミンは、タンパク質合成のためのアミノ酸成分としておよび細胞培養における一次エネルギー源として認識されている（Ｗ．Ｌ．ＭｃＫｅｅｈａｎ，“Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ，Ｇｌｕｔａｍｉｎｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ”，Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｉｎｔｒｏ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，１９８２，６（７）：６３５−６５０；Ｌ．Ｊ．Ｒｅｉｔｚｅｒら、“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｔｈａｔ　Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｎｏｔ　Ｓｕｇａｒ，Ｉｓ　ｔｈｅ　Ｍａｊｏｒ　Ｅｎｅｒｇｙ　Ｓｏｕｒｃｅ　ｆｏｒ　Ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ＨｅＬａ　Ｃｅｌｌｓ”，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７９，２５４（Ｂ）：２６６９−２６７６；Ｈ．Ｒ．Ｚｉｅｌｋｅら、“Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　ａｎｄ　Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｃｕｌｔｕｒｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｄｉｐｌｏｉｄ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ”，Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９７８，９５：４１−４８）。
　Ｆｒｅｓｈｎｅｙにより表にされた典型的培地組成の要約への参照は、標準血清補足培地および無血清培地中にグルタミンが典型的には２または４ｍＭにおいて含まれることを示す。対照的に、上述のように本発明の組成物は、５ｍＭより多い、好ましくは約８−２０ｍＭに高められた量のグルタミンを含有する。
　グルタミン代謝並びにグルタミンの自然分解（Ｇ．Ｌ．Ｔｒｉｓｃｈら、“Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉａ”，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９６２，２８：３６０−３６４）は共に、細胞増殖またはタンパク質生産に対して毒性であると文献中に広く記載されているアンモニウムイオンの放出をもたらし（Ｓ．Ｒｅｕｖｅｎｙら、“Ｆａｃｔｏｒｓ　Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｓｔｉｒｒｅｄ　Ｒｅａｃｔｏｒｓ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８６，８６：５３−５９）、そしてグルタミンを高濃度で添加すると毒性効果を有するであろう（間接的にはアンモニウムイオンの生成の増加により）ことを幾人かの研究者が論じている。幾人かの研究者は、グルタミンの欠損下で且つ代わりの基質としてグルタミン酸を用いて増殖するように培養物を改変せしめることにより（Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、“Ｔｈｅ　Ｕｐｔａｋｅ　ｏｆ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　ｂｙ　Ｍｏｕｓｅ　Ｃｅｌｌｓ（Ｓｔｒｎ　ＬＳ）Ｄｕｒｉｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　Ｂａｔｃｈ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｈｅｍｏｓｔａｔ　Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｔｈｅ　Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｒａｔｅ”，Ｐｒｏｃ．ＲｏｙＳｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，１９６７，１６８：４２１−４３８）、またはグルタミンの比較的一定低濃度を維持するための培養期間を通じてグルタミンをゆっくり添加することにより（Ｍ．Ｗ．Ｇｌａｃｋｅｎら、“Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗａｓｔｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ　ｖｉａ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｃｏｎｔｒｏｌ：Ｐｏｓｓｉｂｌｅ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｙｉｅｌｄｓ　ｏｎ　Ｓｅｒｕｍ　ｉｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９８６，２８：１３７６−１３８９）、培養物中のグルタミンの濃度を最小にすることが論じられている。
　上記の議論に基づいて、グルタミンの代わりにグルタミン酸または別の代替物を用いて増殖するように順応されている細胞系には、高レベルのグルタミン酸または他の代替物がグルタミンの代わりに補足物中に含まれるだろうことを除いて本発明の方法がまだ適用できることが理解されるだろう。培養中のグルタミン酸の添加によりグルタミンの低濃度が維持された状態で増殖するように順応されている細胞系には、培養期間に渡り増加量のグルタミンを徐々に添加することを除いて、本発明の方法を適用することができる。
　最近、幾人かの研究者は培養の後期における補足的グルタミンの添加が幾つかの細胞系の培養寿命を増加させ得ることを発見した（Ｓ．Ｒｅｕｖｅｎｙら、“Ｆａｃｔｏｒｓ　Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｓｔｉｒｒｅｄ　Ｒｅａｃｔｏｒｓ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８６，８６：５３−５９０）。
　本発明者らは、合計で１リットルあたり５−４０ミリモル、好ましくは約８−２０ミリモルの補足的グルタミンを、培養の開始時または培養期間中に添加できることを発見した。培養の後期、指数増殖期後の擬似定常期において、グルタミンが細胞にとっての主要なエネルギー源となり得る（即ち、グルコース消費が減衰し得るがグルタミン消費は持続する）と思われる。本発明者らは、グルタミンの補足は必要であるが、培養寿命の所望の増加を達成するには十分でないことを発見した。最適な性能を得るためには、グルタミンは一次補足物の他の試薬と組み合わせて添加しなければならない。
ｂ）リン脂質前駆体：
　主要補足物は、限定的ではないがセリン、イノシトール、コリン、エタノールアミンおよびグリセロールを含む群がら選択されたリン脂質前駆体も含有する。それらの成分は全てリン脂質前駆体である一方で別の生化学的役割も有するので、本発明は、提唱されるいずれかの作用機構の仮説により限定されると解釈してはならない。
　セリンは必須アミノ酸であり、そしてイノシトールは必須ビタミンであると考えられる。ほとんどの細胞培養培地は、リン脂質前駆体としての役割および他の生化学的役割に適したレベルにおいてセリンとイノシトールを含有する。
　コリンは、ほとんどの培地では１−４ｍｇ／Ｌにおいてビタミンとして含まれる。しかしながら、時折、コリンはより高濃度で使われている。例えば、非リンパ系起源の細胞を増殖させるためのＨａｍ培地（Ｒ．Ｇ．Ｈａｍ，“Ｃｌｏｎａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｓ　Ｍｅｄｉｕｍ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９６５，５３：２８８−２９３）は、チャイニーズハムスター卵巣細胞のクローン増殖のため、無血清培地中に１５ｍｇ／Ｌのコリンを含む。Ｂｉｒｃｈ培地（Ｊ．Ｂｉｒｃｈら、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．，１９６９，５：１３５−１４２）は、マウス繊維芽細胞の増殖のため血清培地中に２０ｍｇ／Ｌのコリンを含む。マウスＬ９２９繊維芽細胞結合組織細胞系の培養のためのＷａｙｍｏｕｔｈ（Ｃ．Ｗａｙｍｏｕｔｈ，“Ｒａｐｉｄ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｕｂｌｉｎｅｓ　ｏｆ　ＮＣＴＣ　Ｃｌｏｎｅ９２９　Ｍｏｕｓｅ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａ　Ｓｉｍｐｌｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｍｅｄｉｕｍ”，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．，１９５９，２２：１００３−１０１７）ＭＢ　７５２／１培地は、２５０ｍｇ／Ｌのコリンを含む点で例外である。Ｈａｍ，ＢｉｒｃｈおよびＷａｙｍｏｕｔｈは細胞増殖を支持する培地を開発したけれども、彼らは培地中での細胞増殖により生産される生物学的生産物の生産を研究しなかった。本発明者らは、細胞、好ましくは抗体産生細胞が、主要補足物の他の試薬との組合せにおいて約４ｍｇ／Ｌより高レベル、好ましくは約４−４０ｍｇ／Ｌのレベルに補足されたコリンを含有する培地中で増殖しそして最大量の抗体を分泌することを発見した。それらの濃度では、コリンは制限にならず、且つ顕著な毒性を持たない。
　エタノールアミンは、典型的には血清補足培地中に含まれない。Ｍｕｒａｋａｍｉ（Ｈ．Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８２，７９：１１５８−１１６２）は、２０μＭのエタノールアミンがマウスハイブリドーマ細胞系の増殖を刺激することを証明している。Ｔｈａｒａｋａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８６，９４：２２５−２３５；Ｃｏｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８７，９７：２９−３５；およびＫｏｖａｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８４，７：３３９−３４５もまた、幾つかのマウスハイブリドーマ細胞系の増殖に対して刺激性であることを見い出している。上記研究者のいずれも、本発明者らが最適な生産物発現に必要であることを発見したような、高レベルのグルタミン、コリン、トリプトファンおよび他のアミノ酸と高レベルのエタノールアミンとを組み合わせていない。幾つかの別の無血清培地はエタノールアミンを含有せず（Ｔ．Ｃｈａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８０，３９：３６９−３７５）、そしてＩｓｃｏｖｅによる概説（Ｎ．Ｎ．Ｉｓｃｏｖｅ，“Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　ａｎｄ　Ｌｙｍｐｈｏｉｄ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ　Ｉｎｃ．，ＮＹ　１９８４中の第１６９−１８４頁）は必須なものとしてコリンとイノシトールを挙げているが、エタノールアミンについては言及していない。本発明者らは、約１−１０ｍｇ／Ｌのレベルにおいてエタノールアミンを補足すると効果的であり、そして顕著な毒性を有することなく少なくとも１０ｍｇ／Ｌまでエタノールアミンを含めることができることを発見した。
　コリンとエタノールアミンは、ホスホコリンとホスホエタノールアミンまたはホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンを含む様々な形態で提供することができると理解すべきである。それらの様々な形態の相対的有効性は、そのような複合体形を取り込み（輸送し）そして代謝する特定の細胞系の能力に依存するだろう。
　リン脂質前駆体のみによる標準培地の補足は、培養寿命および生産物の生産の所望の最大拡大を達成するのに十分でない。むしろ、リン脂質前駆体は記載の他の成分と相乗作用する。
ｃ）トリプトファン：
　トリプトファンは必須アミノ酸と考えられ、そして典型的な血清補足培地および無血清培地中には２−２０ｍｇ／Ｌにおいて含まれる。ただし、Ｌ−９２９細胞用のＷａｙｍｏｕｔｈのＭＢ７５２／１培地中には４０ｍｇ／Ｌで存在する。幾人かの研究者は、別々に添加される増加したレベルの各アミノ酸による補足によって培地を最適化しようと試みている。それらの典型として、ＢａｒｎおよびＩｓｃｏｖｅ（Ｎ．Ｎ．Ｉｓｃｏｖｅ，“Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ”，Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　ａｎｄ　Ｌｙｍｐｈｏｉｄ　Ｃｅｌｌｓ中の第１６９−１８５頁）は、各々の標準アミノ酸による培地の補足をテストしたが、２人とも標準レベルより高いトリプトファンの添加が刺激性となることに気づかなかった。本発明者らは、培養寿命および生産物力価の所望の増加を達成するのにトリプトファンの補足が不可欠であることを発見した。最適効果のために、トリプトファンは、文献中に典型的に教示されているものよりも高いレベル、または２０ｍｇ／Ｌより高いレベルにおいて補足され、そして毒性効果を有することなく少なくとも１００ｍｇ／Ｌまで添加できる。
　トリプトファンのみによる標準培地の補足は、所望の効果を達成するのに十分でない。むしろ、高められた濃度のトリプトファンは主要補足物の他の成分と相乗作用して、細胞増殖、培養寿命および生産物生産の所望の最大拡大を達成する。
ｄ）他のアミノ酸：
　提案される主要補足物は、特定の細胞系からの生産物の発現にとって望ましいと決定されたアミノ酸の配合物も含有する。
　アミノ酸はタンパク質合成にとっての必須成分である。ほぼ特定された成分による培地の補足は、増加された培養寿命、および有意に増加された期間における生産物生産の基礎を提供する。最終生産物力価を最大にするために、それらのアミノ酸レベルは制限とならないように増加しなければならない。分析化学者に既知である技術を使った消耗培地のアミノ酸分析（Ｄ．Ｈ．Ｓｐｅｃｋｍａｎら、“Ａｕｔｏｍａｔｉｃ　Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ　ｆｏｒ　Ｕｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｏｆ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ”，ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９５８，３０：１１９０−１２０６）は、培養中に消耗されそして補足を必要とするアミノ酸を同定する手段として使用することができる。
　Ｉｓｃｏｖｅ（Ｎ．Ｎ．Ｉｓｃｏｖｅ，“Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　ａｎｄ　Ｌｙｍｐｈｏｉｄ　Ｃｅｌｌｓ中の第１６９−１８５頁）等は、各々の標準アミノ酸による培地の補足をテストしている。典型として、Ｉｓｃｏｖｅは、テストした全アミノ酸（シスチンを除く）の標準レベルより高レベルでの添加が刺激性でないことを認めている。
　Ｌｕａｎ（Ｙ．Ｔ．Ｌｕａｎら、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｔｏ　Ｅｘｔｅｎｄ　Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　ｉｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｐｒｏｍｏｔｅ　Ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”）は、グルタミン、必須アミノ酸（トリプトファンを含む）、ビタミン（コリンを含む）および血清を含有する補足物を、マウスハイブリドーマ細胞系の培養中の様々な時点において添加することから成るバッチ培養法を記載している。添加を行った培地は、ウシ胎児血清が補足されたＤＭＥＭから成った。この方法は、培養寿命の増加および最終抗体価の増加をもたらした。同様に、Ｂｉｒｃｈ（Ｊ．Ｒ．Ｂｉｒｃｈら、“Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ”，ＥＰＡ　ＰＣＴ／ＧＢ６／００３８３，１９８６）は、グルコース、グルタミン、必須および非必須アミノ酸（トリプトファンを含む）を含む補足物を別のマウスハイブリドーマ細胞系の培養中に添加する流加培養法を記載している。添加を行った培地は、同じくウシ胎児血清が補足されたＤＭＥＭであった。
　培地中にエタノールアミンを含まないＬｕａｎおよびＢｉｒｃｈに関して、本発明者らが最適細胞増殖および生産物生産効果にとってリン脂質前駆体が非常に好ましいと発見したことに注目することが重要である。更に、本発明者らは本発明の補足物を流加培養および連続培養において効果的に使用できることを発見し、本発明者らは（ＬｕａｎおよびＢｉｒｃｈと異なり）培養の開始時点における補足物の含有もまた効果的である（即ち、ＬｕａｎおよびＢｉｒｃｈと対照的に、培養中の栄養素の添加は本発明の補足物を用いる必要はない）ことを発見した。従って、本発明の補足物は無血清培地で有利に使用することができる。ＬｕａｎおよびＢｉｒｃｈのいずれとも異なる本研究は、限定された還元剤、例えば後述するように、細胞の生産物発現の更なる増加をもたらし得る好ましい態様として証明したＭＴＧを含んだ。
クラスＩ試薬
　主要補足物の試薬は、より好ましい細胞増殖および生産物発現特性を有する培地を作製するために追加の試薬と組み合わせることができる。それらのクラスＩ試薬としては、限定的でないが、還元剤、微量金属イオンおよび／またはビタミンが挙げられる。クラスＩ試薬の成分は、個々にまたは主要補足物の試薬の全セットと組み合わせて添加することができる。それらのクラスＩ試薬の使用法は、細胞系や基礎培地組成に依存して異なるであろう。
ａ）還元剤：
　グルタチオンおよび関連するスルフヒドリル種の代謝はＭｅｉｓｔｅｒにより概説されている（Ａ．Ｍｅｉｓｔｅｒ，“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８３，２２０：４７２−４７７）。Ｙａｍａｎｅ（Ｉ．Ｙａｍａｎｅら、“Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ　Ｇｒｏｕｐｓ　ａｎｄ　Ｏｘｙｇｅｎ　Ｔｅｎｓｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ　ｉｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ”，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，１９８２，７：１３３−１４３）は、還元剤の添加が高酸素張力に関係する損傷から培養物を保護することができることを示している。
　幾つかの血清補足培地（例えばＲＰＭＩ　１６４０）は、１−１５ｍｇ／Ｌに添加されたグルタチオン（ＧＨ）を含有する。他の還元剤は、血清補足培地に通常含まれない。例えば、β−メルカプトエタノール（Ｂ−ＭＥ）やモノチオグリセロール（ＭＴＧ）は典型的には細胞培養培地中に含まれず、そして上記のＦｒｅｓｈｅｙにより表にされた培地のいずれにも含まれていない。対照的に、ＭＣＤＢ　１１０無血清培地にはグルタチトンまたはジチオトレイトール（ＤＴＴ）が含まれるが、幾つかの他の無血清培地（ＣＤＢ　１７０，ＭＣＤＢ１５３，ＷＡＪＣ，ＨＩＴＥＳ等）では欠いている。Ｉｓｃｏｖｅの無血清培地はＧＨまたはＤＴＴを含有しない。
　還元剤を含有する培地の報告はあるけれども、どの培地も主要補足物の試薬の全部は含んでいないことに注目することが大切である。例えば、Ｉｓｃｏｖｅ（Ｎ．Ｎ．Ｉｓｃｏｖｅ，“Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　ａｎｄ　Ｌｙｍｐｈｏｉｄ　Ｃｅｌｌｓ中の第１６９−１８５頁）は、Ｂ−ＭＥ（５×１０−５Ｍ）またはＭＴＧ（７．５×１０−５Ｍ）のいずれかによるＩＭＤＭ培地の補足を勧めている。しかしながら、Ｉｓｃｏｖｅの培地は、主要補足物の試薬に起因する細胞増殖および生産物発現について観察される相乗効果に必要とされるエタノールアミンまたは高レベルのグルタミン、トリプトファンおよび他のアミノ酸を含有しない。更にＫａｗａｍｏｔｏ（Ｔ．Ｋａｗａｍｏｔｏ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８３，１３０：４４５−４５３）は、エタノールアミン（１０μＭ）およびＢ−ＭＥ（１０μＭ）を含む幾つかの成分により基礎培地を補足している。しかしながら、Ｋａｗａｍｏｔｏの培地は、相乗効果に必要とされる高レベルのグルタミン、トリプトファンおよび他のアミノ酸を含有しない。同様に、Ｋｏｖａｒ（Ｊ．Ｋｏｖａｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８４，７：３３９−３４５）は、エタノールアミン（２０μＭ）を含有する無血清培地を開発しているが、この培地もまた低レベルのグルタミン、トリプトファンおよび他のアミノ酸を含み、本発明者らが見い出した相乗効果を得ていない。Ｋｏｖａｒ（Ｊ．Ｋｏｖａｒら、“Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ａｎｄ　Ｐａｒｅｎｔａｌ　Ｍｙｅｌｏｍａ　Ｃｅｌｌｓ　Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ：Ａ　Ｎｏｖｅｌ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ　Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ”）は、エタノールアミンが補足されたＲＰＭＩ−１６４０ベースの無血清培地中の可能な成分としてβ−メルカプトエタノールをテストした。この培地は、本発明者らが最適な相乗効果に好ましいと発見した高レベルのグルタミン、トリプトファン、他のアミノ酸またはコリンを含有しなかった。ＫｏｖａｒおよびＦｒａｎｋはＢ−ＭＥが有用でないと判断し、それを最終組成物から削除した。
　本発明者らは、還元剤／スルフヒドリル化合物による培地の補足が培養寿命および生産物力価の増加をもたらすことができることを見い出した。しかしながら、そのような補足は、完全な主要補足物と組み合わせた時に最大に効果的である。使用される還元剤／スルフヒドリル化合物としては、β−メルカプトエタノール、モノチオグリセロール（ＭＴＧ）、ジチオトレイトール、グルタチオン、チオグリコレートおよびシスチンが挙げられる。より好ましいのは、ヒドロキシル基を有するチオール分子、例えばＢ−ＭＥ（β−メルカプトエタノール）、ＭＴＧ（モノチオグリセロール）およびＤＴＴ（ジチオトレイトール）である。最も好ましいのは、このクラスのモノチオール化合物、例えばＢ−ＭＥおよびＭＴＧである。それらは、０．１ｍｇ／Ｌより高い濃度において効果的であり、そして少なくとも１０ｍｇ／Ｌまでは毒性でない。好ましい濃度は０．５−５ｍｇ／Ｌである。
ｂ）金属イオン：
　金属イオンは動物細胞培養にとって必須であり、典型的な培地中には塩および微量元素混合物として、または血清のような不特定補足物の成分として含まれる（Ｋ．Ｈｉｇｕｃｈｉ，“Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｍｅｄｉａ−Ａ　Ｒｅｖｉｅｗ”，Ａｄｖａｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６：１１１−１３６）。主要補足物の試薬が補足された培地においては、低い細胞密度を維持するために考案された標準培地中に含まれているレベルにおいてのみ金属イオンを含む場合、或る種の金属イオンの利用可能性が制限になり得るような、高い細胞密度に達し得る。従って、本発明の好ましい態様では、特定の細胞系にとって必要であることが判明した補足物中に金属イオンも含まれる。要求され得る高濃度では、幾つかの金属イオンの溶解性限度が、有利な効果で添加できる最大濃度を制限することがある。従って、より好ましい態様は、適当なキレート化剤と一緒に金属イオンを供給することである。キレート化剤は、添加される濃度において毒性であってはならず、そしてそれらは十分な濃度で溶液中に保持されるが活性形において細胞に配送させるような可逆方式において、要求される金属イオンを結合しなければならない。
　分析化学者に周知である技術（“Ｆｌａｍｅ　Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ”、第１１章、Ｈ．Ｗｉｌｌａｒｄら、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｖａｎ　Ｎｏｓｔｒａｎｄ　Ｃｏ．，１９６５中）を使った消耗培地の分析は、使用され補足を必要とする金属イオンを同定するための手段として用いることができる。補足を必要とする幾つかの金属イオンとしては、限定的ではないが、カルシウム、マグネシウム、モリブデン、コバルト、銅マンガン、亜鉛、セレンおよび鉄が挙げられる。より広範なリストはＨａｍｉｌｔｏｎおよびＨａｍにより与えられている（Ｗ．Ｈａｍｉｌｔｏｎら、“Ｃｌｏｎａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉａ”，Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ，１９７７，１３（９）：５３７−５４７）。
　様々な金属キレート化剤が細胞培養において使われている。この機能を果たし得る天然タンパク質としては、特に鉄をキレート化するトランスフェリンおよびフェリチン、並びに様々な多価金属イオンをキレート化するアルブミンが挙げられる。特に鉄をキレート化するために使われるている別のキレート化剤としては、ピリドキシルイソニコチノイルヒドラゾン、クエン酸コリン、クエン酸塩（Ｃ．ＩＩＩ，Ｔ．Ｂｒｅｈｍら、“Ｓｐｅｃｉｅｓ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｉｒｏｎ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｉｎ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”，Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．，１９８８，２４（５）：４１３−４１９）およびアセチルアセトネート（Ｌ．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、“Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｒｏｎ　Ｃｏｍｐｌｅｘｅｘ　ｉｎ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ”，Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｈｉｓｉｏｌ．，１９８５，１２２：１５５−１５８）が挙げられる。本発明者らは、約１−１０ｍＭのクエン酸塩が幾つかの多価金属イオンを供給できる効果的なキレート化剤であることを見い出した。加えて、様々な有機酸、例えばリンゴ酸、コハク酸、フマル酸およびα−ケトグルタル酸が効果的なキレート化剤である。
ｃ）ビタミン：
　ビタミンは動物細胞培養にとって必須であり、通常細胞培養培地中に含まれている（Ｋ．Ｈｉｇｕｃｈｉ，“Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｍｅｄｉａ−Ａ　Ｒｅｖｉｅｗ”，Ａｄｖａｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９７７，１６：１１１−１３６）。主要補足物のみにより補足された培地においては、低い細胞密度を維持するために考案された標準培地中に組み込まれているレベルにおいてのみビタミンを含む場合、或る種のビタミンの利用可能性が限定となり得るような、高い細胞密度になり得る。限定となり得るビタミンとしては、限定的でないが、ｐ−アミノ安息香酸、ビオチン、葉酸、フォリン酸、ニコチンアミド、パントテン酸塩、ピリドキシン、リボフラビン、フラビンアデニンジヌクレオチド、アスコルビン酸、チアミンおよびビタミンＢ１２が挙げられる。
　本発明の培地補足物を一般的に記載してきたが、ここでそれらの使用法に関係する制限、並びに該制限を回避するための方法について議論する。
　第１に、細胞を再供給しなければならない培養期間中の後期ではなく細胞に供給される培地と容易に組み合わせることができる試薬のクラスを限定することが好都合であるけれども、補足物により提供されるレベルに試薬の濃度を維持するように培養期間中に培地に個々の試薬を添加することにより、同様な好ましい効果が得られることは当業者により認識されるだろう。このことはグルタミンに関して最も明白であり、グルタミンは主要補足物のその他の試薬と組み合わせて添加することができ、またはそれから削除して個別的に添加し、所望のレベルで維持することもできる。
　第二に、様々な補足物で使用される試薬の濃度は、言及される範囲を超えて異なることができ、そして補足物が添加される細胞培養培地並びに培養される特定の細胞タイプの両方の関数である。
　第三に、最大細胞培養効果のために補足物中に全部が存在しなければならない主要補足物の試薬を除いて、有利な結果のためにクラスＩ試薬のうちの１つのみが存在する必要がある。
　第四に、最適な結果のためには、補足物が添加される基礎培地が目的の細胞系に適当でなければならず、細胞増殖または生産物発現を増強するのに適切なレベルにおいて必須栄養素が利用可能でなければならないことは理解されよう。従って、例えば、基礎培地中のグルコース（または別のエネルギー源）のレベルを高めるか、または必須エネルギー源が消耗し、細胞増殖もしくは生産物発現を制限することが認められるならば、培養中にグルコース（または別のエネルギー源）を添加することが必要となり得る。
　次の実施例は本発明を説明するが、決して限定するものではない。例えば、ハイブリドーマと抗体は、本発明の組成物が補足された培地中で好結果に増殖できる細胞系と収得できる生産物のそれぞれ一例である。しかしながら、そのような培地は、ハイブリドーマの増殖または抗体の収得に限定されるのではなく、むしろ広範な生産物を生産する種々様々な細胞の増殖に利用することができる。
実施例１
代表的な市販の培地調製物
　Ｖｅｎｔｒｅｘ　ＨＬ−１は、細胞培養用の技術の現状の市販培地を代表する培地である。商品に関する文献は、この培地は「ハイブリドーマおよびリンパ系細胞の培養用に考案された」ことを指摘している。この培地は、多数の形質転換細胞系および樹立細胞系の増殖、特にマウスおよびヒトハイブリドーマからのモノクローナル抗体の生産に効果的であると主張されている。この培地中で好結果に増殖する５５種の細胞系のリストは、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，１（１）：５，Ｖｅｎｔｒｅｘ出版、２１７　Ｒｅａｄ　Ｓｔ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ中に与えられている。
　図１は、ＨＬ−１培地におけるヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系Ｄ−２３４の増殖および生産物発現を示す。１２０時間目に１．３×１０６細胞／ｍｌの最大生存細胞密度に達し、そしてその後培養物は迅速に死滅する。最大全細胞密度は２×１０６細胞／ｍｌである。最終抗体価は７０ｍｇ／Ｌである。
　ハイブリドーマＤ−２３４は、登録番号ＨＢ　８５９８のもとにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。
　このハイブリドーマはＩｇＭ抗体を生産し、標準的なＥＬＩＳＡ技術を使って該抗体をアッセイした。
実施例２
無血清培地配合物
　表Ｉの第１列は、典型的な無血清培地配合物を示す〔５０％ＲＰＭＩ，５０％ＤＭＥ、ウシインスリン（５ｍｇ／Ｌ）、ヒトトランスフェリン（５ｍｇ／Ｌ）、セレン（５μｇ／Ｌ）、０．１％プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール（Ｆ６８）〕。この培地は、文献中に報告された幾つかの組成物と類似している。
　図２は、表Ｉの第１列の培地中でのＤ２３４ハイブリドーマの増殖および生産物発現を示す。増殖および生産物発現は市販のＨＬ−１培地のものと同様である。最大生存細胞密度は１．３×１０６細胞／ｍｌである。最終抗体価は８０ｍｇ／Ｌである。
実施例３
主要補足物を含む培地
培養期間の前および最中でのグルタミンの添加
　表Ｉの第４列は、主要補足物の試薬（８ｍＭのグルタミン、１４０ｍｇ／Ｌのトリプトファン、２０ｍｇ／Ｌのコリン、１０ｍｇ／Ｌのエタノールアミンおよび典型的には基礎培地中の濃度のほぼ３倍に濃度が増加された他のアミノ酸）により標準培地を補足した組成物を示す。最初の研究において、基礎培地中のグルコースレベルが消耗され、培養物の増殖および寿命を制限し得ることが決定された。従って、基礎培地中に含めることに加えて、追加のグルコースを培養期間中に添加した。更に、グルタミンを、培養の開始時の培地への主要補足物中に含めることに加えて、供給される全グルタミンが培養物１リットルあたり２０ミリモルに等しくなるように４，８および１２日目に添加した。
　図３は、この補足培地中でのＤ２３４の増殖および生産物発現を示す。１２０時間目に１．２×１０６細胞／ｍｌの最大生存細胞密度に達し、その後培養物は、生存細胞密度が１００時間に渡りゆっくりとのみ減少するような細胞増殖と細胞死滅とがほぼ平衡となる疑似定常期に維持される。全細胞密度は２．５×１０６細胞／ｍｌまで上昇し続ける。細胞は疑似定常期に渡り生産物を発現し続け、そして１リットルあたり２９０ｍｇの最終ヒト抗体価に達する。
実施例４
主要補足物を含有する培地
培養期間の開始時のみにおけるグルタミンの添加
　グルタミンの濃度が培養開始時に２０ｍＭになるようにグルタミンを主要補足物中に含め、その後グルタミンを添加しないこと以外は、実施例３と同じ培地および条件においてＤ２３４を増殖させた。増殖および生産物発現は実施例３のものと同等であった。
実施例５
主要補足物とクラスＩ試薬を含有する培地
　表Ｉの第２列は、標準培地が主要補足物の試薬と１０ｍｇ／Ｌのチオグリセロール（クラスＩ試薬）とにより補足されている組成物を示す。グルコースとグルタミンは実施例３と同様にして供給した。
　図４は、この補足培地中でのＤ２３４の増殖および生産物発現を示す。１２０時間目に１．９×１０６細胞／ｍｌの最大生存細胞密度に達し、その後培養物は、生存細胞密度が１５０時間に渡りゆっくりとのみ減少するような細胞増殖と細胞死滅とがほぼ平衡となる疑似定常期に維持される。全細胞密度は３．８×１０６細胞／ｍｌまで上昇し続ける。細胞は疑似定常期に渡り生産物を発現し続け、そして１リッルあたり２３０ｍｇの最終ヒト抗体価に達する。
実施例６
脂質エマルションと組み合わせて使用される補足物
　表Ｉの第３列は、典型的な細胞培養培地が主要補足物の試薬（８ｍＭグルタミン、２８ｍｇ／Ｌのトリプトファン、２２．８ｍｇ／Ｌのコリン、０．８ｍｇ／Ｌのエタノールアミン、および典型的には基礎培地のほぼ３倍に補足される他のアミノ酸）およびクラスＩ試薬（１ｍｇ／Ｌのモノチオグルセロール、ビタミンＢ−１２、並びにモリブデン、コバルト、銅、亜鉛および鉄を含む微量元素）により補足されている組成物を示す。更に、この培地は脂質（リノレン酸、Ｔｗｅｅｎ　８０、レシチン、コレステロールおよびビタミンＥ）を含有する。更に、実施例３に記載のようにして、グルコースとグルタミンを培養期間中に添加した。
　図５は、この補足培地中でのＤ２３４の増殖および生産物発現を示す。８０時間目に１．７×１０６細胞／ｍｌの最大生存細胞密度に達する。その後、培養物は、その間の増殖が最大指数増殖期増殖の約５０％で持続し、更に１５０時間に渡りゆっくりのみ生存細胞密度が減少するような、増殖速度と死滅速度とがほぼ平衡になる疑似定常期に維持される。全細胞密度は３．５×１０６細胞／ｍｌまで上昇し続ける。細胞は疑似定常期に渡り生産物を発現し続け、そして１Ｌあたり２７５ｍｇの最終ヒト抗体価に達する。
　実施例７
流加培養における補足物の利用
　本発明の補足物は、流加培養および単純なバッチ培養において有利に利用することができる。表Ｉの第５列は、主要補足物の試薬およびクラスＩ試薬並びに脂質により補足された標準培地を示す。
　この培地は実施例６のもの（表Ｉの第３列）に類似している。この培地を流加培養法においてＤ２３４の増殖に使用した。１２０時間後、表ＩＩに示されるような追加の補足物を添加した。２２０時間後、更に５ミリモル／Ｌ培地のグルタミンを更に補足した。
　図６は、補足流加培養物におけるＤ２３４の増殖および生産物発現を示す。１３０時間目に１．８×１０６細胞／ｍｌの最大生存細胞密度に達する。その後、培養物は、その間の増殖が最大指数増殖期増殖の約２０％で持続し、更に１５０時間に渡りゆっくりのみ生存細胞密度が減少するような、増殖速度と死滅速度とがほぼ平衡になる疑似定常期に維持される。全細胞密度は３．７×１０６細胞／ｍｌまで上昇し続ける。細胞は疑似定常期に渡り生産物を発現し続け、そして１Ｌあたり４７０ｍｇの最終ヒト抗体価に達する。
　栄養素を上記試料と同じ全最終濃度に添加し、ただし異なるスケジュールで添加する別の供給方法もテストした。１９０時間後に始まるほとんど等しい毎日の添加に補足物添加を分割すると、上述したものと同様な結果を与える。ゆっくりした連続供給も同様な結果を与える。
　今まで本発明について記載してきたが、本発明が添付の請求の範囲による範囲による以外の何ものによっても限定されると解釈してはならないことが理解されるであろう。