(57)【要約】  本発明は、腫瘍等の疾患の診断マーカーなどとして利用される血中遊離核酸の血中レベルを測定するに際し、その疾患とは無関係の血中遊離核酸の影響を排除し、真に対象としたい血中遊離核酸の血中レベルのみを極力正確に測定することのできる分析方法を提供することを目的とする。本発明の血液由来試料に含まれる血中遊離核酸の分析方法は、血漿または血清試料（血液由来試料）中の血小板由来マイクロベシクルを除去する工程を含むことを特徴とする。前記血液由来試料中の血小板由来マイクロベシクルを、その表面に特異的に存在するエピトープと結合する抗体を用いることにより除去することが好適である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血漿または血清試料（以下「血液由来試料」という。）中の血小板由来マイクロベシクルを除去する工程を含むことを特徴とする、血液由来試料に含まれる血中遊離核酸の分析方法。
【請求項２】
前記血中遊離核酸が血液由来試料中の内在性マイクロベシクルに内包されるものである、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記血液由来試料中の血小板由来マイクロベシクルを、その表面に特異的に存在するエピトープと結合する抗体を用いることにより除去することを特徴とする、請求項１または２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記エピトープが糖タンパク質にあるものである、請求項３に記載の分析方法。
【請求項５】
前記糖タンパク質がGpIb，GpIX，GpIa，GpIIa，GpIIb，GpIIIaおよびGpIIIbからなる群より選ばれる少なくとも１種またはそれらの複合体である、請求項４に記載の分析方法。
【請求項６】
前記血液由来試料中の血小板由来マイクロベシクルを、担体上に固定化された前記抗体と接触させる方法、または血小板由来マイクロベシクルと前記抗体との複合体を形成させた後に、担体上に固定化された前記抗体に対する二次抗体と接触させる方法により除去する、請求項３〜５のいずれかに記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血中遊離核酸等を対象とする血液検査の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血液（血漿または血清試料）中に遊離している核酸を疾患の診断や治療のために利用する手法に関して、盛んに研究開発が進められている。
たとえば、しばしばがん細胞で調節不全に陥るｍｉＲＮＡは、がんの分類や診断のためのマーカーとして有望視されている。ｍｉＲＮＡは内在性のＲＮａｓｅに対して極めて安定的な形態で血漿中に存在し、たとえば前立腺がんで発現するｍｉＲ−１４１のヒト血清中のレベルを測定することにより、前立腺がん患者と正常人とを区別できることが示唆されている（非特許文献１）。【０００３】
また、グリオブラストーマ（神経膠芽細胞腫）の腫瘍細胞がｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび血管新生に関するタンパク質を内包するマイクロベシクルを放出し、脳微小血管の内皮細胞等がこれを受容しｍＲＮＡがその細胞内で翻訳されることや、グリオブラストーマ患者の血清中のマイクロベシクルにはグリオーマ（神経膠腫）にみられるｍＲＮＡ変異、ｍｉＲＮＡ特性が検出されることが報告され、したがってそのような腫瘍由来のマイクロベシクルががん患者に対する診断、治療のために有用であることが示唆されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Mitchell et al.  Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.  PNAS 105(30), pp10513-10518, 2008.
【非特許文献２】Skog et al.  Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.  nature cell biol., November 2008.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
腫瘍等の疾患の診断マーカーなどとして利用される血中遊離核酸の血中レベルを測定する際には、その疾患とは無関係の血中遊離核酸の影響を排除し、真に対象としたい血中遊離核酸の血中レベルのみを極力正確に測定する必要がある。本発明は、そのような観点から従来よりも優れた血液検査を可能とするための手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
血漿または血清試料中のマイクロベシクルは、一般的に超遠心などによるサイズ分離によって回収され、血中遊離核酸レベルの測定に供される。本発明者は、採血時または採血後に活性化した血小板から多量に血液中に放出され、それ以前の血液中にもいくらか存在することがある、血小板に由来するマイクロベシクルが血液由来試料に含まれていること、したがって従来の血中遊離核酸の分析においては、診断マーカーとなる核酸を内包する内在性マイクロベシクルのみならず、そのような血小板由来マイクロベシクルも回収してしまっているため、血中遊離核酸の測定値の信頼性に改善の余地があることに気付いた。そして、血液由来試料中の血小板由来マイクロベシクルを除去すれば、内在性マイクロベシクルの血中レベルをより正確に測定することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００７】
すなわち、本発明に係る血液由来試料に含まれる血中遊離核酸の分析方法は、血漿または血清試料（以下「血液由来試料」という。）中の血小板由来マイクロベシクルを除去する工程を含むことを特徴とする。【０００８】
前記血中遊離核酸は、より具体的には、血液由来試料中の内在性マイクロベシクルに内包されるものである。
前記血液由来試料中の血小板由来マイクロベシクルは、その表面に特異的に存在するエピトープと結合する抗体を用いることにより除去することが好適である。前記エピトープは、たとえば糖タンパク質にあるものであり、その糖タンパク質としては、GpIb，GpIX，GpIa，GpIIa，GpIIb，GpIIIaおよびGpIIIbからなる群より選ばれる少なくとも１種またはそれらの複合体が挙げられる。【０００９】
前記血液由来試料中の血小板由来マイクロベシクルは、担体上に固定化された前記抗体と接触させる方法、または血小板由来マイクロベシクルと前記抗体との複合体を形成させた後に、担体上に固定化された前記抗体に対する二次抗体と接触させる方法により除去することができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法を用いれば、試料中に混入した血小板由来マイクロベシクルの影響を最小限に抑制し、患者の臨床状態を反映した内在性マイクロベシクルに内包される核酸の血中レベルをより正確に測定できるようになる。このようにして得られた測定結果は、従来よりも的確に疾患の診断、予防、治療等を行うために有用な情報となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例２においてサンプル１（採血直後）、サンプル２（２４時間後）およびサンプル３（血小板由来マイクロベシクル除去後）それぞれについて測定した、細胞由来別マイクロベシクルの比率を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明に係る、血液由来試料に含まれる血中遊離核酸の分析方法は、血漿または血清試料（血液由来試料）中の血小板由来マイクロベシクルを除去する工程を含み、必要に応じて適宜その他の工程を組み合わせることができる。
【００１３】
血中遊離核酸の分析に供する血漿または血清試料は公知の従って調製すればよい。一般的には、抗凝固剤（ＥＤＴＡ等）が添加された血液を冷却遠心分離または膜濾過して血球成分を除去することにより血漿が得られ、また採取した血液を静置して沈殿物（血餅）を除去することにより血清が得られる。
【００１４】
本発明の分析方法が本来対象とする血中遊離核酸は通常、血液ないし上記のようにして調製した血漿または血清試料に含まれる「内在性マイクロベシクル」に、安定的な形態で内包されている。しかしながら、同種の血中遊離核酸は「血小板由来マイクロベシクル」に内包されている可能性もあるため、本発明を特徴付ける上記の工程が有用になる。
【００１５】
ここで、本発明においては、血漿または血清試料に含まれる、採血時または採血後に活性化した血小板から放出されたマイクロベシクルおよびそれ以前に血小板から放出されていたマイクロベシクルを「血小板由来マイクロベシクル」と総称する。換言すれば、血漿または血清試料に含まれるマイクロベシクルのうち、血小板由来マイクロベシクル以外のものはすべて「内在性マイクロベシクル」に該当する。具体的には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、単球などの血球由来マイクロベシクルや、上皮細胞由来等のマイクロベシクルが内在性マイクロベシクルに該当する。
【００１６】
また、血中遊離核酸とは、内在性マイクロベシクルに内包されたような形態で血中に遊離している（混入した血小板由来マイクロベシクルにも内包されている可能性のある）ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をいい、その種類は特に限定されるものではない。
【００１７】
血液由来試料中に含まれる内在性マイクロベシクルと血小板由来マイクロベシクルのうち後者のマイクロベシクルのみを除去するためには、血小板由来マイクロベシクルの表面に特異的に存在する（内在性マイクロベシクルの表面には存在しない）エピトープと結合する抗体（Ｘ）を用いる方法が好適である。抗体（Ｘ）は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体いずれであってもよいが、望ましくはモノクローナル抗体である。
【００１８】
上記のエピトープとしては、たとえば、GpIb，GpIX，GpIa，GpIIa，GpIIb，GpIIIa，GpIIIbなどの糖タンパク質あるいはこれらの複合体（例：GPIIb/IIIa複合体、GPIb/IX複合体）上に位置するものが挙げられる。
【００１９】
抗体（Ｘ）を用いて血小板由来マイクロベシクルを除去するためには、抗原抗体反応を利用した公知の各種の方法を適用することができ、抗体（Ｘ）の使用態様は特に限定されるものではない。
【００２０】
たとえば、アフィニティクロマトグラフィ用カラムなどの担体に抗体（Ｘ）を担持（固定化）し、この担体が充填されたカラムに血液由来試料を通過させることにより、血小板由来マイクロベシクルを除去することができる。
【００２１】
あるいは、抗体（Ｘ）に対する二次抗体（Ｙ）を別途用意し、血小板由来マイクロベシクルと抗体（Ｘ）との複合体を形成させた後に、二次抗体（Ｙ）が固定化された担体が充填されたカラムにその複合体を含む試料を通過させても、血小板由来マイクロベシクルを除去することができる。また、免疫凝集の原理を応用し、全血、血漿、または血清中に抗体（Ｘ）を添加することで血小板由来マイクロベシクル上の表面抗原と抗原抗体反応を形成し、更に二次抗体（Ｙ）が固定化されたラテックス粒子を添加することにより血小板由来マイクロベシクルとラテックス粒子の凝集体を形成した後、遠心分離などにより凝集体を沈殿させることで血小板由来マイクロベシクルを除去することができる。
【００２２】
以上のような本発明の方法により得られた試料からは、血小板由来マイクロベシクルが極力排除されており、内在性マイクロベシクルに内包されている核酸を分析するための試料として優れている。血中遊離核酸の分析に関するこれ以外の工程、すなわち内在性マイクロベシクルを回収する工程、回収された内在性マイクロベシクルに内包されている核酸を抽出する工程、その核酸を定量する工程などの態様は、従来と同様である。
【実施例】
【００２３】
実施例１
（サンプル１の調製）
末梢血試料を静脈よりＥＤＴＡ凝固防止剤含有試験管中に採取し、直ちに２０００Ｇ、１０分間の遠心分離にかけ、血漿を調製した。【００２４】
（サンプル２の調製）
末梢血試料を静脈よりＥＤＴＡ凝固防止剤含有試験管中に採取し、２４時間後に２０００Ｇ、１０分間の遠心分離にかけ、血漿を調製した。【００２５】
（サンプル３の調製）
末梢血試料を静脈よりＥＤＴＡ凝固防止剤含有試験管中に採取し、２４時間後に２０００Ｇ、１０分間の遠心分離にかけ、血漿を調製した。この血漿を生理食塩水で５倍希釈して調製した５０００マイクロリットルのサンプル中に、１０マイクログラム／ミリリッターに調製した抗ヒトＧｐＩｂ-マウスモノクローナル抗体（Exbio Praha a.s.社製）を１００分の１容量添加し、血小板由来マイクロベシクルとの抗原抗体反応物を形成させた。このサンプルをヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Acris Antibodies社製）が固定化されたアフィニティーカラム（SulfoLink Immobilization Kit, PIERCE社製、商品名）に通し、血小板由来マイクロベシクルを除去した。【００２６】
（マイクロベシクル由来microRNAの抽出、逆転写およびリアルタイムPCR）
上記サンプル１〜３それぞれについて、160,000×ｇ、４℃で一時間の超遠心分離を行い、上清を除去することにより、血漿サンプル中のマイクロベシクルを回収した。回収されたマイクロベシクルから、mirVana miRNA Isolation Kit （Ambion社製、商品名）を用いてマイクロベシクル由来の全microRNAを抽出した。抽出されたmicroRNAをMegaplex primer pools （アプライドバイオシステムス社）を用いて逆転写し、得られたcDNAをmicroRNA TaqMan (R) Array（アプライドバイオシステム社）にアプライし、リアルタイムＰＣＲによりＣｔ値を測定した。【００２７】
（結果および考察）
結果を下記表に示す。サンプル２（２４時間後）から検出されたmicroRNA（ここではＣｔ値が３５サイクル未満のものをいう。）の種類数は、サンプル１（採血直後）から検出されたmicroRNAの種類数とほとんど変わらないが、それらのmicroRNAの平均Ｃｔ値はサンプル２の方が小さい。これは、採血後に活性化した血小板から血小板由来マイクロベシクルが放出され、血漿中のmicroRNAの量（コピー数）が全体的に増加したことを示している。それに対し、サンプル３（血小板由来マイクロベシクル除去後）は、サンプル１および２のどちらと比較しても、検出されたmicroRNAの種類数は少なく、平均Ｃｔ値は大きい。これは、サンプル中から血小板由来マイクロベシクル由来のmicroRNAが除去され、内在性マイクロベシクル由来のmicroRNAが検出されていることを示している。【００２８】
【表１】
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【００２９】
実施例２
血小板由来マイクロベシクルが除去されたことを示すために、各サンプル中のマイクロベシクルを細胞特異的表面抗原に対する抗体で標識化し、フローサイトメトリー（BD Biosciences社製）で細胞由来別マイクロベシクルの比率を測定した。マイクロベシクルのうち、内在性マイクロベシクルには、好中球由来（CD66b-FITC, BD Biosciences社製）、上皮細胞由来（CD202b (Tie2)-PE, Ｒ＆Ｄシステムズ社製）、マクロファージ由来（CD206 PE-Cy5, BD Biosciences社製）、Ｂ細胞由来（CD79a-APC, BD Biosciences社製）、単球由来（CD14 Pe-Cy7, BD Biosciences社製）、Ｔ細胞由来（CD3-Alexa 610, BD Biosciences社製）のものが含まれ、それぞれ上記の各抗体で標識化し、一方血小板由来マイクロベシクルはCD41a-PE-Cy5（BD Biosciences社製）で標識化した。【００３０】
結果を図１に示す。サンプル２（２４時間後）の内在性マイクロベシクルの比率はサンプル１（採血直後）よりも減少しており、活性化した血小板から血小板由来マイクロベシクルが放出されていることを示している。一方、サンプル３（血小板由来マイクロベシクル除去後）では内在性マイクロベシクルの比率が大幅に増加することから、血漿サンプルに本発明の処理を施すことで、より正確に内在性マイクロベシクル由来のmicroRNAを測定できることを示している。
【図１】
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【国際調査報告】
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