【事件の表示】
　特許第３１２９６６２号「皮膚刺激判定法」の請求項１、２に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３１２９６６２号の請求項１ないし２に係る特許を維持する。
【理　由】
　
【１】手続の経緯
　
　本件特許第３１２９６６２号発明は、平成８年７月１６日に特許出願され、平成１２年１１月１７日にその特許権の設定登録がされ、その後、特許異議申立人長田ちえによって特許異議の申立てがされ、当審より取消理由の通知がされ、その指定期間内である平成１４年１月３１日に訂正の請求がされたものである。
　
　
【２】訂正の適否についての判断
　
［１］訂正の内容
　
・訂正事項ａ
　特許明細書の特許請求の範囲の請求項１に
「　［請求項１］　皮膚モデルを被検物質で処理した後、かかる被検物質を除去し、更に該皮膚モデルを大量の培養液中で培養することを特徴とする皮膚刺激判定法。　」
とあるのを
「　［請求項１］　皮膚モデルを被検物質で処理した後、かかる被検物質を除去し、更に該皮膚モデルを大量の培養液中で培養することよりなる皮膚刺激判定法であって、前記処理は、気液界面上において行うものであり、前記培養は、培養液中に皮膚モデルを沈めて行うものであることを特徴とする皮膚刺激判定法。　」
と訂正する。
　
・訂正事項ｂ
　特許明細書【０００５】（特許第３１２９６６２号公報（以下特許公報という）第２頁第３欄第８〜１２行）中に
「　即ち、本発明は、皮膚モデルを被検物質で処理した後、かかる被検物質を除去し、更に該皮膚モデルを大量の培養液中で培養することに特徴を有する。更に、皮膚モデルが、皮膚細胞を含む表皮・真皮の二層構造よりなることに特徴を有する。　」
とあるのを
「　即ち、本発明は、皮膚モデルを被検物質で処理した後、かかる被検物質を除去し、更に該皮膚モデルを大量の培養液中で培養することよりなる皮膚刺激判定法であって、前記処理は、気液界面上において行うものであり、前記培養は、培養液中に皮膚モデルを沈めて行うものであることを特徴とする皮膚刺激判定法である。更に、皮膚モデルが、皮膚細胞を含む表皮・真皮の二層構造よりなることに特徴を有する。　」
と訂正する。
　
［２］訂正の目的の適否、拡張・変更の存否、及び新規事項の追加の有無
　
　訂正事項ａは、処理、培養の各々の工程における皮膚モデルの環境について限定するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。そして、処理工程を気液界面上において行うことについては、特許明細書【００１６】（特許公報第３頁第５欄第２８行〜同頁第６欄第２７行）中に、皮膚モデルを「表皮層２を気液界面上に、かつ真皮層１をＤＭＥ＋５％血清培地３中にあるようにした。」（特許公報第３頁第６欄第６〜８行）と記載され、「（２）被検物質処理　　表皮層にのみ作用するように、表皮層上に被検物質１００μｌを滴下し、一定時間作用させた。」（特許公報第３頁第６欄第９〜１１行）と記載されていることから、特許明細書に記載された範囲内の事項であるし、培養工程を培養液中に皮膚モデルを沈めて行うことについては、同じく特許明細書【００１６】（特許公報第３頁第５欄第２８行〜同頁第６欄第２７行）中に、（２）被検物質処理及び（３）洗浄の後「（４）インキュベーション　　２４ウェルプレートにＤＭＥ＋５％血清培地１．５ｍｌを分注し、この中に皮膚モデル（培養皮膚）を沈め、一晩培養した。」と記載されていることから、これまた特許明細書に記載された範囲内の事項である。
　そして、これらの訂正のいずれも、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。
　
［３］むすび
　
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び第３項で準用する同法第１２６条第２〜４項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
　
【３】当審の判断
　
［１］本件発明
　
　本件特許の請求項１，２に係る発明は、訂正後の特許請求の範囲に記載されたとおりの、以下のものである（以下、各々順に第１発明、第２発明ということがある）。
　
「　［請求項１］　皮膚モデルを被検物質で処理した後、かかる被検物質を除去し、更に該皮膚モデルを大量の培養液中で培養することよりなる皮膚刺激判定法であって、前記処理は、気液界面上において行うものであり、前記培養は、培養液中に皮膚モデルを沈めて行うものであることを特徴とする皮膚刺激判定法。
　［請求項２］　前記皮膚モデルが、皮膚細胞を含む表皮・真皮の二層構造よりなることに特徴とする請求項１に記載の皮膚刺激判定法。　」
　
　
［２］申立ての概要
　
　特許異議申立人長田ちえは、甲第１号証（ Photodermatol.Photoimmunol.Photomed., (1994)20 p.111-117 ）を提出し、本件の請求項１及び２に係る発明は甲第１号証に記載されたものであるから特許法第２９条第１項第３号に該当し、また両発明は甲第１号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから特許法第２９条第２項の規定に違反しており、いずれも特許法第１１３条第２号の規定により取り消されるべきものである旨を主張する。
　
　
［３］対比・判断
　
(A)　刊行物１（甲第１号証：Photodermatol.Photoimmunol.Photomed., (1994)20 p.111-117　と同一。以下刊行物１という）の記載
　
　(i)　刊行物１には、ヒトの皮膚モデル（Ｓｋｉｎ２ＴＭＺＫ１３５１）を用いて光に曝したときの毒性をインビトロで定量的に判定する方法に関する内容が記載されている。
　具体的には、上記皮膚モデルＳｋｉｎ２ＴＭＺＫ１３５１が、ヒトの生きた細胞を組み込んだ３次元モデルであって、新生児の陰茎包皮より得られた繊維芽細胞がナイロンメッシュに播種され、それらはそこに付着すると同時にマトリックスタンパク質を分泌しながら成長し真皮層を形成すること、ついで、ケラチノサイトがこの真皮上に播種され、よく発達した角質層とともに多層の真皮とは区別された表皮を形成することが記載されている（p.112右欄第２〜１０行）。
　(ii)　また、光に曝したときの毒性判定を、第１段階としてまず紫外線（ＵＶ）に曝すことなく種々の化学物質の毒性を測定し、ついで第２段階として、化学物質の濃度を毒性のない最も高い濃度にしたときのＵＶ暴露の影響を試験したことが記載されている（p.113左欄第１３〜２０行）。
　(iii)　p.113左欄第２１行〜右欄第１８行には、第１段階の化学物質毒性測定に係るプロトコールが開示されている。具体的には、組織基質（皮膚モデル）が表皮面を上にして、１ウェルに１ｍｌの試験用培地を含み予め３７℃に温められた６ウェルの「MILLICELLＲ」（登録商標）プレートに移され、その後２０μｌの希釈液又は被検化学物質が９×９ｍｍのアプリケーターパッド上にのせられてから（皮膚モデルの）角質組織層の上に移され、３７℃：５％ＣＯ２、湿度９０％以上のインキュベーターの中に置かれたこと、１時間後にアプリケーターパッドが取り除かれたこと、組織（皮膚モデル）はＵＶ照射時間に対応させるために追加時間の間再インキュベートされたこと、その後組織はＰＢＳで洗浄されそして上述のように調製された新しい「MILLICELLＲ」プレート上に移されたこと、それからプレートはインキュベーターに戻され１６〜２４時間の回復期間置かれ、その後組織（皮膚モデル）はＭＴＴ還元アッセイに供されたこと、が記載されている。
　(iv)　p.113右欄第１９〜５２行には、第２段階であるＵＶ曝露後の毒性測定に係るプロトコールが開示されており、具体的には、化学物質の濃度を毒性のない最高の濃度としてＵＶ曝露の効果を試験したこと、組織への処理工程はアプリケーターパッドへの被検物質２０μｌによりなされたこと、非照射区（対照）を設けたこと、プレートは１時間インキュベートされたこと、３０分のＵＶ照射が行われたこと、ＵＶ曝露終了後の皮膚モデルを３０分インキュベーターに置いたこと、ＵＶ照射区・非照射区共に緩衝液（ＰＢＳ）でリンスして、新鮮で血清を含まないアッセイ培地を含む新たなプレート（ MILLICELLＲ ）に移し、さらに３７℃、５％ＣＯ２、湿度９０％以上で１６〜２４時間インキュベートしてからＭＴＴ還元アッセイを行ったこと、光毒性の疑いがある被検試薬において陰性の結果が得られた場合は被検物質の浸透に完全を期するためインキュベート時間を２４時間に延長したこと、等が記載されている。
　
(B)　
　(i)　ここで、本件第１発明と刊行物１記載の発明とを対比する。
　本件特許明細書の【０００８】欄に記載されているとおり、「皮膚刺激」とは「細胞毒性」であるから、刊行物１の細胞毒性アッセイ法は本件第１発明の「皮膚刺激判定法」に相当するものである。
　また、本件第１発明に規定される特許明細書記載の皮膚モデルと刊行物１記載の皮膚モデルであるＳｋｉｎ２ＺＫ１３５１とは「皮膚細胞を含む表皮・真皮の二層構造よりなる」ものである点で共通しているし、刊行物１においてＵＶ曝露の影響について測定される物質が本件第１発明における被検物質に相当することは明らかである。
　そして、アプリケーターパッドを皮膚モデルの角質組織層に載置することは本件第１発明にいう「被検物質で処理」することに相当し、パッドを除いて後ＰＢＳで洗浄することは本件第１発明にいう「被検物質を除去」することに相当する。
　さらに、上記(A)(iii)、(A)(iv)において、１６〜２４時間インキュベートすることは、本件第１発明における「培養」に相当する。
（ここで、(A)(iv)で摘示した、被検物質除去（rinse）後の１６〜２４時間培養工程において用いられている培地は血清入りのものではないアッセイ用のものであるが、刊行物１においては被検物質処理後の皮膚モデルを前記培地に移して「インキュベーション」すると表記されており（p.111 abstract 欄の第２０〜２１行に「Following this incubation,・・・」、p.113右欄第３７〜３８行に「The tissue substrates were incubated・・・」、と記載されている。そして、「incubation」が「培養」と訳される場合が多いことは周知である）、また当該培地を用いた１６〜２４時間の「インキュベーション」は被検物質処理後の皮膚モデルの生細胞数アッセイに先立って皮膚モデルを回復させるための処理工程であると認められる（p.111 abstract欄の第１９〜２０行「the substrates were・・・allowed to recover for 24h.」と記載されている）から、前記培地による処理もまた、被検物質処理後の生細胞を維持するための一種の「培養」に相当するものである）。
　
　してみると、両者は
「　皮膚モデルを被検物質で処理した後、かかる被検物質を除去し、更に該皮膚モデルを大量の培養液中で培養することを特徴とする皮膚刺激判定法　」
である点において共通している。
　
　(ii)　しかしながら、刊行物１には、第１段階のアッセイにおいて、被検物質処理（アプリケーターパッド載置）時の培養液と、当該処理後洗浄され、ＭＴＴアッセイに供される前の１６〜２４時間の培養時に採用されている培養液とは、同様に調製された旨記載されていることから（上記(A)(iii)）、被検物質による処理工程時とその後の培養工程時との間で、添加する培養液の絶対量もしくは皮膚モデルに対する培養液の相対量に差異が存在しているとは推認できない。第２段階のアッセイについても、１６〜２４時間の培養時に採用されている培養液については、血清入りでないことを除けば、その組成や添加量について、第１段階のアッセイにおいて被検物質処理時及びその後の培養時で採用されている培養液との間に特段の差異がある旨の記載を認めることはできない。
　即ち、少なくとも、被検物質処理工程時において当該被検物質適用箇所を気液界面上に置き、かつ、その後の培養処理工程において処理工程時より培養液の量を大量として培養液中に皮膚モデルを沈めしめること、については、刊行物１中に記載されているとは認められない。
　
　そうすると、本件第１発明においては
　「　前記処理を気液界面上において行うものであり、前記培養を培養液中に皮膚モデルを沈めて行うものである」　
　（以下、かかる特定事項を、処理・培養に係る発明特定事項ということがある）
のに対し、刊行物１においてはそのような事項については記載されていないという点で相違している。
　
(C)　したがって、本件発明１は、刊行物１に記載された発明であるとはいえない。
　
(D)　また、上述の(B)(i)のとおり、皮膚モデルを被検物質で一定時間処理し、その後余剰の被検物質を除去して培養すること自体は刊行物１にも記載されているものの、本件第１発明においては、当該除去によって必要以上の処理を防ぎかつ処理工程により細胞に傷害を与えてからそれが細胞死（或いはそれに準ずる反応）として現れるまでのタイムラグを原因とする偽陰性が生じることを防ぐのみならず、当該処理後に皮膚モデルを培養液中に沈めしめる程度のより大量の培養液が加えられた環境下に置いて培養工程に供することで、培養工程下において当該より大量の培養液により拡散希釈効果を生ぜしめ、元来拡散希釈効果の低い皮膚モデルにおける処理工程後に被検物質による作用の蓄積が進んで偽陽性が生じることを防ぐことができる、という顕著な効果が奏されるものである。
　してみると、刊行物１の記載に基づき、処理工程を気液界面上において行いかつその後の培養工程をより大量の培養液下で培養液中に皮膚モデルを沈めて行うことを想起することは、当業者にとり容易になし得たことであるとはいえず、したがって本件第１発明は、刊行物１に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。
　
(E)　本件の第２発明は請求項１を引用して記載された発明であるから、上で述べたと同様の理由により、刊行物１に記載された発明であるともいえないし、刊行物１に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるともいえない。
　
　
［４］　
　
　なお、当審において、上記［２］の申立ての内容を踏まえた取消理由とは別に、以下の（＊）を概要とする取消理由を通知した。
　
　　したがって、本件の各請求項１，２に係る特許はいずれも、特許法第１１３条第２号に該当し、取り消されるべきものである。　　
　
　しかしながら、以下(A)〜(E)に述べるとおり、上の理由及び証拠方法によっても、本件の請求項１，２に係る発明を取り消すことはできない。
　
　
　(i)　刊行物２には、皮膚細胞を含む表皮・真皮の二層構造よりなる皮膚モデルを用いた各種被検物の毒性をＮＲ法で判定する方法が記載されており（summary他文献全体）、被検物として界面活性剤、香水、シャンプー、コンディショナー、モイスチャライザー等も記載されている（summary他文献全体）。
　(ii)　p.239右欄第１０行〜p.241左欄第１３行の Materials and Methods の項には、上記判定のための具体的な手法が開示されており、特に、ナイロンメッシュ上でヒト繊維芽細胞を増殖させてなるシートを１４ｍｍ径のディスク状に裁断し、このディスク上にヒトケラチノサイトを播種して培養することにより、表皮・真皮の二層構造よりなる皮膚モデルを調製することが記載されており（p.239右欄最下行〜p.240右欄第８行）、この１４ｍｍ径のディスク状皮膚モデルを２４ウェルプレートのウェルに入れ２ｍｌの被検物質溶液で３７℃、５％ＣＯ２下インキュベーター内で一晩処理したことや、その後培地を吸引し１ｍｌの５０μｇ／ｍｌＮＲ含有ＤＭＥＭ培地で置き換え、３７℃、５％ＣＯ２下で３時間インキュベートしたことも記載されており（p.240右欄第９〜２６行）、その後余剰のＮＲが吸引され、ＰＢＳで洗浄され、ホルムアルデヒド処理、１％酢酸−５０％エタノールによるＮＲ抽出を経てＮＲ量アッセイに供されたことが記載されている（p.240右欄第２６行〜p.241左欄第１３行）。
　
(B)　
　(i)　ここで、本件第１発明と刊行物２記載の発明とを対比する。
　本件第１発明に規定される特許明細書記載の皮膚モデルと刊行物２記載のそれとは「皮膚細胞を含む表皮・真皮の二層構造よりなる」ものである点で共通していること、界面活性剤やシャンプー等の被検物質の例も両者間で共通していること、及び刊行物２記載のＮＲ法が生細胞を測定するアッセイ法であるという点で本件明細書記載のＭＴＴ法等と共通していること、からみて、刊行物２記載の毒性判定法は本件第１発明にいう「皮膚刺激判定法」に相当するものである。
　そして、刊行物２の上記 assay procedure の項における上記「培地を吸引して１ｍｌのＮＲ含有（５０μｇ／ｍｌ）ＤＭＥＭ培地下で３時間培地下で３時間インキュベートすること」は、本件第１発明に規定される「被検物質を除去し、更に該皮膚モデルを大量の培養液中で培養する」工程に相当するものである（上記ＤＭＥＭ培地はＮＲを含有しているからアッセイ用の培養液であるとも認められるが、かかる培養液を採用しつつ実際のアッセイ用処理前に３時間「インキュベート」する工程は、被検物質処理後の皮膚モデルを回復・維持せしめるための「培養」工程に相当するものであるといえる）。
　
　してみると、両者は
「　皮膚モデルを被検物質で処理した後、かかる被検物質を除去し、更に該皮膚モデルを大量の培養液中で培養することを特徴とする皮膚刺激判定法　」
である点において共通している。
　
　(ii)　しかしながら、刊行物２においては、被検物質の処理工程時の培養液量を２ｍｌとし、被検物質吸引後の３時間培養時の培養液量を１ｍｌとすることが記載されている（上記(A)(ii)参照）のであるから、被検物質による処理工程時とその後の３時間の培養工程時との間の培養液の量を比較すれば、培養工程時における培養液の量の方が少ないことは明らかである。
　そうすると、少なくとも、被検物質処理工程時において当該被検物質適用箇所を気液界面上に置き、その後の培養処理工程において処理工程時より培養液の量を大量として培養液中に皮膚モデルを沈めしめること、については、刊行物２中に記載されているとは認められない。
　
　そうすると、本件第１発明においては
　「　前記処理を気液界面上において行うものであり、前記培養を培養液中に皮膚モデルを沈めて行うものである」　
のに対し、刊行物２においてはそのような事項については記載されていないという点で相違している。
　
(C)　したがって、本件発明１は、刊行物２に記載された発明であるとはいえない。
　
(D)　また、上述の(B)(i)のとおり、皮膚モデルを被検物質で一定時間処理し、その後余剰の被検物質を除去してから培養すること自体は刊行物２にも記載されているものの、本件第１発明においては、当該除去によって必要以上の処理を防ぎかつ処理工程により細胞に傷害を与えてからそれが細胞死（或いはそれに準ずる反応）として現れるまでのタイムラグを原因とする偽陰性が生じることを防ぐのみならず、当該処理後に皮膚モデルを培養液中に沈めしめる程度のより大量の培養液が加えられた環境下に置いて培養工程に供することで、培養工程下において当該より大量の培養液により拡散希釈効果を生ぜしめ、元来拡散希釈効果の低い皮膚モデルにおける処理工程後に被検物質による作用の蓄積が進んで偽陽性が生じることを防ぐことができる、という顕著な効果が奏されるものである。
　してみると、刊行物２の記載に基づき、処理工程を気液界面上において行いかつその後の培養工程をより大量の培養液下で培養液中に皮膚モデルを沈めて行うことを想起することは、当業者にとり容易になし得たことであるとはいえず、したがって本件第１発明は、刊行物２に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。　
　
(E)　本件の第２発明は請求項１を引用して記載された発明であるから、上で述べたと同様の理由により、刊行物２に記載された発明であるともいえないし、刊行物２に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるともいえない。
　
　
［５］むすび
　
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠方法によっては、本件の請求項１，２の発明に係る特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件請求項１，２の発明に係る特許を取り消す理由を発見しない。
  よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１４年３月１日（２００２．３．１）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
（１）訂正事項ａ
　特許第３１２９６６２号明細書（以下特許明細書という）の特許請求の範囲の請求項１に
「　［請求項１］　皮膚モデルを被検物質で処理した後、かかる被検物質を除去し、更に該皮膚モデルを大量の培養液中で培養することを特徴とする皮膚刺激判定法。　」
とあるのを
「　［請求項１］　皮膚モデルを被検物質で処理した後、かかる被検物質を除去し、更に該皮膚モデルを大量の培養液中で培養することよりなる皮膚刺激判定法であって、前記処理は、気液界面上において行うものであり、前記培養は、培養液中に皮膚モデルを沈めて行うものであることを特徴とする皮膚刺激判定法。　」
と訂正する。
（２）訂正事項ｂ
　特許第３１２９６６２号明細書【０００５】（特許第３１２９６６２号公報第２頁第３欄第８〜１２行）中に
「　即ち、本発明は、皮膚モデルを被検物質で処理した後、かかる被検物質を除去し、更に該皮膚モデルを大量の培養液中で培養することに特徴を有する。更に、皮膚モデルが、皮膚細胞を含む表皮・真皮の二層構造よりなることに特徴を有する。　」
とあるのを
「　即ち、本発明は、皮膚モデルを被検物質で処理した後、かかる被検物質を除去し、更に該皮膚モデルを大量の培養液中で培養することよりなる皮膚刺激判定法であって、前記処理は、気液界面上において行うものであり、前記培養は、培養液中に皮膚モデルを沈めて行うものであることを特徴とする皮膚刺激判定法である。更に、皮膚モデルが、皮膚細胞を含む表皮・真皮の二層構造よりなることに特徴を有する。　」
と訂正する。
（５４）【発明の名称】
皮膚刺激判定法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　皮膚モデルを被検物質で処理した後、かかる被検物質を除去し、更に該皮膚モデルを大量の培養液中で培養する
ことよりなる皮膚刺激判定法であって、
前記処理は　気液界面上において行うものであり、
前記培養は、培養液中に皮膚モデルを沈めて行うものである
ことを特徴とする皮膚刺激判定法。
　【請求項２】　前記皮膚モデルが、皮膚細胞を含む表皮・真皮の二層構造よりなることを特徴とする請求項１に記載の皮膚刺激判定法。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【発明の属する技術分野】
本発明は、皮膚モデルを用いた毒性試験に好適な皮膚刺激判定法に関する。
　【０００２】
　【従来の技術】
近年、動物愛護運動の高まりの中で、特に化粧品等の開発における動物実験の是非が問われており、化粧品開発における動物実験を全廃しようとする動きがある。このような状況の中、動物を用いた皮膚刺激性試験を代替する方法の一つとして、細胞を組み込んだ皮膚モデルを用いた皮膚刺激性試験が提案されている。即ち、化粧品や皮膚適用製剤等の皮膚刺激性試験を、皮膚モデルを用いて行う際、通常それらの成分の中で最もヒト皮膚に刺激を与えるのは界面活性剤であり、かかる界面活性剤の皮膚刺激性をいかに予測し得るかということは重要なことであった。
　【０００３】
しかしながら、これまでに報告されてきた方法では、皮膚モデルを用いた皮膚刺激性試験のデータと、動物実験のデータとが合致しない点がいくつかあった。例えば、強い皮膚刺激性のカチオン性界面活性剤が偽陰性を示す場合があったり、また逆にほとんど皮膚刺激性のないノニオン性界面活性剤が偽陽性を示す場合があった。
　【０００４】
　【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述のような実状に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、動物を用いた皮膚刺激性試験を代替し、かつ動物実験のデータと非常によく合致する、皮膚モデルを用いた皮膚刺激判定法を提供する点にある。
　【０００５】
　【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、皮膚モデルを被検物質で処理した後、かかる被検物質を除去し、更に該皮膚モデルを大量の培養液中で培養する
ことよりなる皮膚刺激判定法であって、前記処理は　気液界面上において行うものであり、前記培養は　培養液中に皮膚モデルを沈めて行うものである皮膚刺激判定法である。
　【０００６】
前記構成とすることにより、動物実験のデータと非常によく合致する、皮膚モデルを用いた皮膚刺激判定法が得られた。従来の方法がなぜ動物実験のデータと合致しなかったのか、その詳細な理由は分からないが、おそらく次のようなことに起因しているものと思われる。
　【０００７】
即ち、皮膚モデルを用いた毒性試験ではほとんどの場合、「細胞死」を指標としており、ある種のカチオン性界面活性剤（例えばＣｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＣＰＣ）の場合、細胞に傷害を与えてからそれが細胞死（あるいはそれに準ずる反応）として現れるまでにタイムラグがあり、それがしばしば偽陰性を示す主原因であったと思われる。
　【０００８】
一方、ある種のノニオン性界面活性剤（例えばＰｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｒ：ＴＸ１００）の場合、細胞毒性は強いものの角質層透過性が低く、更には拡散希釈効果によって動物実験での皮膚刺激性は低いが、皮膚モデルでは拡散希釈効果が低いため、長時間作用させるうちに蓄積が進み毒性を示すようになり、これがしばしば偽陽性を示す主原因であったと思われる。
　【０００９】
従って、従来の方法では、ＣＰＣのようなカチオン性界面活性剤に合わせて条件を設定すると、ＴＸ１００のようなノニオン性界面活性剤が偽陽性を、逆にＴＸ１００のようなノニオン性界面活性剤に合わせて条件を設定すると、ＣＰＣのようなカチオン性界面活性剤が偽陰性を示すことになり、常にいずれか一方がｉｎｖｉｖｏ　データと合致しなかったのである。
　【００１０】
本発明の、皮膚モデルを用いた皮膚刺激判定法は、この二律背反する両者を同時に改善したものであり、皮膚モデルを被検物質で一定時間処理した後、かかる被検物質を除去することにより、必要以上の処理を防ぎ、ある種のノニオン性界面活性剤（例えばＰｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｒ：ＴＸ１００）のような物質が偽陽性を示すのを防ぐことができる。また、皮膚モデルを大量の培養液中で一定時間培養することにより、ある種のカチオン性界面活性剤（例えばＣｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＣＰＣ）のような物質による傷害が細胞死として現れてくるので、偽陰性を示すのを防ぐことができる。更に、大量の培養液中で培養するので、ある程度の希釈拡散効果を持たせることができる。
　【００１１】
前記構成において、本発明に適用できる皮膚モデルとは、皮膚細胞を含む表皮・真皮の二層構造よりなるものであればよく、例えば本出願人が既に開示している特開平８−８９２３９号（特願平６−２６３０４７号）に記載されている培養皮膚が好適に用いられる。また、被検物質としては、界面活性剤の他に、化粧品、洗浄剤、あるいは皮膚適用製剤等が挙げられ、更に界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤（Ｂｅｎｚｅｔｈｏｎｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＢＴＣ、Ｃｅｔｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＣＰＣ、Ｓｔｅａｒｙｌ　Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ　Ａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＳＴＡＣ等）、アニオン性界面活性剤（Ｓｏｄｉｕｍ　Ｌａｕｒｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ：ＳＬＳ、Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｌａｕｒａｔｅ：ＰＬ等）、あるいはノニオン性界面活性剤（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　２３　Ｌａｕｒｙｌ　Ｅｔｈｅｒ：Ｂ３５、Ｓｕｃｒｏｓｅ　Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｅｓｔｅｒ：ＳＦＡＥ、ｔ−Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ：ＴＸ１００、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｓｏｒｂｉｔａｎ　ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ：ＴＷ２０、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｓｏｒｂｉｔａｎ　ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ：ＴＷ８０等）が挙げられる。
　【００１２】
皮膚モデルを被検物質で処理する時間は、長すぎても短すぎても好ましくなく、該処理時間は被検物質の種類により異なるが、例えば被検物質が界面活性剤の場合、好ましくは１分間〜１時間処理するのが好ましい。被検物質で処理された皮膚モデルは、被検物質を除去後、大量の培養液中で一定時間培養されるが、かかる培養液としては、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ等、一般的な培養液に、１〜１０％程度のウシ胎児血清を添加したものが好ましい。また、培養時間は培養液の種類により異なるが、好ましくは３〜２４時間培養するのが好ましい。
　【００１３】
　【発明の実施の形態】
　【実施例】
（実施例１）
１．皮膚モデル（培養皮膚）の作製
（１）高架橋スポンジの作製３ｍｇ／ｍｌに希釈したＴｙｐｅＩコラーゲン溶液５０ｇにクロロホルム０．５ｇを添加し、ホモジナイザーを用いて６０００ｒｐｍで１分間ホモジナイズしたものをステンレス製枠に流し込み、−４０℃で凍結し、これを真空減圧下（０．０１ｍｍＨｇ）、３０℃で２４時間凍結乾燥した。更に、真空減圧下（０．０１ｍｍＨｇ）、１０５℃で２４時間熱脱水架橋を加えた後、０．２％グルタルアルデヒド溶液に２４時間浸漬することにより化学架橋を導入した。これを再び凍結乾燥して孔径９０μｍ、厚さ３ｍｍの高架橋コラーゲンスポンジを得た。
　【００１４】
（２）低架橋スポンジの作製０．３％水溶液（ｐＨ３）のＴｙｐｅＩコラーゲンをエタノールで希釈し、０．２８５％コラーゲン、１０％エタノール水溶液とした。更に、この溶液を直径９ｃｍのシャーレに１０ｇ流し込み、−１３５℃で凍結し、真空度：０．１、乾燥温度：４０℃、乾燥時間：２４時間の条件で凍結乾燥を行い、更に真空減圧下（０．０１ｍｍＨｇ）、１０５℃で２４時間熱脱水架橋して、孔径３０μｍ、厚さ１ｍｍの低架橋コラーゲンスポンジを得た。
　【００１５】
（３）細胞の播種及び培養２４ウェル培養プレートの底面に、（１）で作製した高架橋コラーゲンスポンジを敷き詰め、クラボウ（株）から購入したヒト繊維芽細胞をＭＥＭ＋１０％血清培地に懸濁し、このスポンジ上に５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度で播種し、細胞が完全に接着するまで３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。次に、このスポンジ上に（２）で作製した低架橋コラーゲンスポンジを重ね、クラボウ（株）から購入したヒト角化細胞をＫＧＭ培地に懸濁し、この低架橋コラーゲンスポンジ上に５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度で播種し、細胞が完全に接着するまで３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。次に、かかる培養基材を２４ウェル培養プレートから取り出し、６ウェル培養プレートに移した後、培地をＤＭＥ＋５％血清培地に変更した。ヒト角化細胞が空気中に出るように培養液の量を調整しながら５日間培養を続けた後、所望の皮膚モデル（培養皮膚）を得た。なお、上記した高架橋コラーゲンスポンジ、低架橋コラーゲンスポンジとは、それぞれ高度に架橋したコラーゲンスポンジ、低度に架橋したコラーゲンスポンジのことであり、表皮層には低架橋コラーゲンスポンジを用い、真皮層には高架橋コラーゲンスポンジを用いた。
　【００１６】
２．皮膚刺激判定
上記１によって作製された直径８ｍｍの円形で筒状の皮膚モデルを以下の判定法に用いた。
（１）準備段階
図１及び図２は、それぞれ培地の入った培養プレートに皮膚モデルを置いた時の状態を示した断面図及びその平面図であり、本発明の判定法の準備として、２４ウェルプレート４に、ＤＭＥ＋５％血清培地３を２５０μｌ分注し、この中に皮膚モデルを置いた。この際、表皮層２を気液界面上に、かつ真皮層１をＤＭＥ＋５％血清培地３中にあるようにした。
（２）被検物質処理
表皮層にのみ作用するように、表皮層上に被検物質１００μｌを滴下し、一定時間作用させた。
（３）洗浄
表皮層に残った被検物質を、ＰＢＳバッファーで洗い落とした。
（４）インキュベーション
２４ウェルプレートにＤＭＥ＋５％血清培地１．５ｍｌを分注し、この中に皮膚モデル（培養皮膚）を沈め、一晩培養した。
（５）ＭＴＴ法により生細胞数を測定した。
（６）上記の方法で被検物質作用時間を１０分間に設定し、被検物質として１０種類の界面活性剤１０％溶液（溶媒：ＰＢＳ）についてそれぞれ試験を行った。その結果を表１に示す。
なお、試験結果はＭＴＴ発色後５７０ｎｍの吸光度を測定し、ＰＢＳのみを作用させた場合の吸光度を１００％として次式より比を求め、それを細胞生存率（％）とした。
　【００１７】
　【数１】
　【００１８】
一方ｉｎ　ｖｉｖｏ　動物実験としては、日本白色種ウサギの健常皮膚を用い、１０％濃度に調整した各被検物質を４時間閉塞貼付し、除去後１時間、２４時間および４８時間後にドレイズ基準により判定した。得られたｉｎ　ｖｉｖｏ　動物実験データを表１及び表２に示す。また、本発明の判定法により得られたデータと、ｉｎ　ｖｉｖｏ　動物実験データとの比較図を図３に示す。図３から明らかなように、両者は非常によい相関を示していることが判る。
　【００１９】
（比較例１）
実施例１の１で作製した皮膚モデル（培養皮膚）を用い、被検物質として実施例１で用いたものと同じ１０種類の界面活性剤について従来法で試験を行った。方法としては、被検物質を１時間および２４時間作用後インキュベーションを行わずそのままＭＴＴ法で生細胞数を測定した。得られたデータを、実施例１と同様ｉｎ　ｖｉｖｏ　動物実験データと比較した。その結果を表２に示す。また、従来法により得られたデータと、ｉｎ　ｖｉｖｏ　動物実験データとの比較図を図４の（ａ）、（ｂ）に示す。これらの図より、１時間処理ではカチオン系のＣＰＣおよびＳＴＡＣが偽陰性を、２４時間処理ではノニオン系のＢ３５およびＴＸ１００が偽陽性を示すことが判る。
　【００２０】
（実施例２）
被検物質が、化粧品（シャンプー、ウォッシング）であるという以外は、実施例１と同様の条件で行った。ｉｎ　ｖｉｖｏ　動物実験のデータと比較した結果を表３に示す。また、本発明の判定法により得られたデータと、ｉｎ　ｖｉｖｏ　動物実験データとの比較図を図５に示す。図５から明らかなように、両者は非常によい相関を示していることが判る。
　【００２１】
（比較例２）
被検物質が、化粧品（シャンプー、ウォッシング）であるという以外は、比較例１と同様の条件で行った。ｉｎ　ｖｉｖｏ　動物実験のデータと比較した結果を表３に示す。また、従来法により得られたデータと、ｉｎ　ｖｉｖｏ　動物実験データとの比較図を図６の（ａ）、（ｂ）に示す。これらの図から明らかなように、両者は１時間処理及び２４時間処理ともほとんど合致していないことが判る。
　【００２２】
　【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、動物を用いた皮膚刺激性試験を代替し、かつ動物実験のデータと非常によく合致する皮膚刺激判定法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
　【図１】
培地の入った培養プレートに皮膚モデルを置いた時の状態を示した断面図である。
　【図２】
図１の平面図である。
　【図３】
実施例１における相関関係を示した図である。
　【図４】
（ａ）比較例１の１時間処理における図である。
（ｂ）比較例１の２４時間処理における図である。
　【図５】
実施例２における相関関係を示した図である。
　【図６】
（ａ）比較例２の１時間処理における図である。
（ｂ）比較例２の２４時間処理における図である。
　【符号の説明】
１．真皮層
２．表皮層
３．ＤＭＥ＋５％血清培地
４．２４ウェルプレート
　【表１】
　【表２】
　【表３】