(57)【要約】  本発明によって提供される神経分化誘導剤は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）中のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列、または、該シグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の部分配列を含む人為的に合成されたペプチドを含む。
2010117079.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種の幹細胞を神経細胞に分化誘導し得る神経分化誘導剤であって、
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）中のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列、または、該シグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の一部分であって該配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて少なくとも６個の連続するアミノ酸残基から成るＮ末端側部分アミノ酸配列若しくは該シグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の一部分であって該配列のＣ末端アミノ酸残基から数えて少なくとも５個の連続するアミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列を、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列として含む人為的に合成されたペプチドと、
薬学上許容され得る少なくとも一種の担体と、
を含有する神経分化誘導剤。
【請求項２】
前記アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチドは、以下のアミノ酸配列：
ＭＬＰＧＬＡＬＬＬＬＡＡＷＴＡＲＡ（配列番号２）；または
ＭＬＰＳＬＡＬＬＬＬＡＡＷＴＶＲＡ（配列番号３）；
であり、
前記ＡＰＰシグナルペプチド関連配列は、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列であるか、或いは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列の一部分であって該配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて少なくとも６個の連続するアミノ酸残基から成るＮ末端側部分アミノ酸配列、若しくは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列の一部分であって該配列のＣ末端アミノ酸残基から数えて少なくとも５個の連続するアミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列である、請求項１に記載の神経分化誘導剤。
【請求項３】
前記ペプチドは、核小体局在シグナルを構成する以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）
をさらに含む人為的に合成されたペプチドである、請求項１または２に記載の神経分化誘導剤。
【請求項４】
前記ペプチドは、前記核小体局在シグナルを構成するアミノ酸配列のＮ末端側に前記ＡＰＰシグナルペプチド関連配列を含む、請求項３に記載の神経分化誘導剤。
【請求項５】
前記ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が５０以下である、請求項１〜４のいずれかに記載の神経分化誘導剤。
【請求項６】
前記ペプチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１のうちから選択されるいずれかの配列番号に示すアミノ酸配列から構成される合成ペプチドである、請求項５に記載の神経分化誘導剤。
【請求項７】
少なくとも一種の幹細胞を神経細胞に分化誘導し得る人為的に合成されたペプチドであって、
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）中のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列、または、該シグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の一部分であって該配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて少なくとも６個の連続するアミノ酸残基から成るＮ末端側部分アミノ酸配列若しくは該シグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の一部分であって該配列のＣ末端アミノ酸残基から数えて少なくとも５個の連続するアミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列をＡＰＰシグナルペプチド関連配列として含み、且つ、
核小体局在シグナルを構成する以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）
をさらに含む、ペプチド。
【請求項８】
前記アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチドは、以下のアミノ酸配列：
ＭＬＰＧＬＡＬＬＬＬＡＡＷＴＡＲＡ（配列番号２）；または
ＭＬＰＳＬＡＬＬＬＬＡＡＷＴＶＲＡ（配列番号３）；
であり、
前記ＡＰＰシグナルペプチド関連配列は、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列であるか、或いは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列の一部分であって該配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて少なくとも６個の連続するアミノ酸残基から成るＮ末端側部分アミノ酸配列、若しくは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列の一部分であって該配列のＣ末端アミノ酸残基から数えて少なくとも５個の連続するアミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列である、請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
前記核小体局在シグナルを構成するアミノ酸配列のＮ末端側に前記ＡＰＰシグナルペプチド関連配列を含む、請求項７または８に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が５０以下である、請求項７〜９のいずれかに記載のペプチド。
【請求項１１】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１のうちから選択されるいずれかの配列番号に示すアミノ酸配列から構成される、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
少なくとも一種の細胞材料から神経細胞を生産する方法であって、
請求項１〜６のいずれかに記載の神経分化誘導剤または請求項７〜１１のいずれかに記載のペプチドを前記細胞材料に供給することを特徴とする神経細胞の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経分化誘導性を有するペプチドとその利用に関する。特にそのペプチドを有効成分とする神経分化誘導剤に関する。
なお、本願は２００９年４月１０日に出願された日本国特許出願第２００９−０９５６４１号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
【背景技術】
【０００２】
再生医療分野における一つの課題として神経細胞の再生が挙げられる。例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病その他の中枢神経系疾患の治療として、神経幹細胞或いは胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を利用して神経細胞を再生することが期待されている（特許文献１）。しかし、胚性幹細胞等は入手（採取）が困難である。また、これら幹細胞は患部にそのまま移植されても神経細胞にほとんど分化せず生着も困難である。仮に生着した場合でもグリア細胞に分化してしまうものがほとんどである。
また、神経幹細胞、皮膚幹細胞、脂肪幹細胞等の体性（成体）幹細胞は、比較的入手が容易な幹細胞であり、これら幹細胞より神経細胞を分化することができれば医療産業上の利用価値は高い。しかし、従来、短時間に且つ高効率にこれら体性幹細胞から神経細胞を分化誘導する方法は未だ確立されておらず、かかる方法の確立、具体的には、そのような目的に適する神経分化誘導剤の開発が望まれている。例えば特許文献２には、ピロリドン誘導体を有効成分とする神経分化誘導剤が記載されているが、体性幹細胞から神経細胞を分化誘導する効果については記載がない。【０００３】
近年、幹細胞の神経細胞への分化を誘導する機能を有するペプチド（神経分化誘導ペプチド）の利用が注目されている。例えば、特許文献３には、神経幹細胞や皮膚幹細胞からの神経分化を誘導し得るペプチド（ＶＨＬペプチド）が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】日本国特許出願公開２００４−３５７５４３号公報
【特許文献２】日本国特許出願公開平９−３２３９２８号公報
【特許文献３】日本国特許出願公開２００５−３３０２０６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】トレンド・イン・セルバイオロジー(trends in CELLBIOLOGY)、８巻、１９９８年、ｐｐ．４１０−４１５
【非特許文献２】ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(THEJOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY)、２８１巻（３５号）、２００６年、ｐｐ．２５２２３−２５２３０
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、上記特許文献２に記載されるような従前の化学物質を成分とする神経分化誘導剤の開発アプローチとは異なるアプローチにより創出されたものであり、特許文献３に記載されるような既知の神経分化誘導ペプチドよりも高い神経分化誘導活性を有する人工ペプチドの提供を目的とする。また、そのようなペプチドを有効成分とする神経分化誘導剤（薬学的組成物）の提供を他の目的とする。また、そのようなペプチドを使用して神経細胞を生産する方法および神経細胞を発生させる方法を提供することを他の目的とする。
【０００７】
本発明によって提供される神経分化誘導ペプチドは、それ単独で自然界において神経分化誘導ペプチドとして存在するものではない人為的に設計された合成ペプチドである。
本発明者らは、脳の神経細胞中でアミロイド前駆体タンパク質（Amyloid
Precursor Protein：ＡＰＰ）がセクレターゼによって切断されて典型的には４０若しくは４２アミノ酸残基から成るアミロイドβタンパク質が産生し、該アミロイドβが脳内において凝集（蓄積）されることにより神経細胞が破壊され、その結果としてアルツハイマー病が発症するというアミロイド仮説において、いわばアルツハイマー病の出発物質ともいうべきアミロイド前駆体タンパク質の性状を詳細に検討し、該アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチドに着目した。
【０００８】
そして、アミロイド前駆体タンパク質中のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の全部または一部を含むようにして作製した合成ペプチドが、種々の幹細胞に対して高い神経分化誘導活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
さらに、本発明者は、核小体局在シグナル（ＮｏＬＳ：Nucleolar localization signal）として知られるアミノ酸配列（非特許文献２参照）が細胞外から核内（典型的には核小体）へのペプチド移行に関与するアミノ酸配列であることを見出し、該アミノ酸配列を含むように構成された合成ペプチドを使用することにより、幹細胞から神経細胞への分化効率を著しく高め得ることを見出した。
【０００９】
ここで開示される神経分化誘導ペプチドは、少なくとも一種の幹細胞を神経細胞に分化誘導し得るペプチド（以下「神経分化誘導ペプチド」ともいう。）である。
即ち、本発明によって提供される神経分化誘導ペプチドの一態様は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）中のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列を含む。
また、本発明によって提供される神経分化誘導ペプチドの他の一態様は、上記シグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の一部分であって該配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて少なくとも６個の連続するアミノ酸残基から成るＮ末端側部分アミノ酸配列を含む。
また、本発明によって提供される神経分化誘導ペプチドの他の一態様は、上記シグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の一部分であって該配列のＣ末端アミノ酸残基から数えて少なくとも５個の連続するアミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列を含む。
【００１０】
本明細書において、ここで開示される神経分化誘導ペプチドに含まれるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）中のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列または該シグナルペプチド配列中の部分アミノ酸配列（即ち上記のＮ末端側部分アミノ酸配列とＣ末端側部分アミノ酸配列）を総称して「ＡＰＰシグナルペプチド関連配列」という。
なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側である。
【００１１】
ここで開示される神経分化誘導ペプチドの好ましい一態様では、上記アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチドは、以下のアミノ酸配列：
ＭＬＰＧＬＡＬＬＬＬＡＡＷＴＡＲＡ（配列番号２）；または
ＭＬＰＳＬＡＬＬＬＬＡＡＷＴＶＲＡ（配列番号３）；
であり、
上記ＡＰＰシグナルペプチド関連配列は、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列それ自体であるか、或いは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列の一部分であって該配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて少なくとも６個の連続するアミノ酸残基から成るＮ末端側部分アミノ酸配列、若しくは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列の一部分であって該配列のＣ末端アミノ酸残基から数えて少なくとも５個の連続するアミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列である。なお、これらＡＰＰシグナルペプチド関連配列は、配列番号２及び配列番号３の各々に記載されたとおりのアミノ酸配列の他、これらアミノ酸配列に部分的な改変が施された改変アミノ酸配列を包含し得る。
【００１２】
また、ここで開示される神経分化誘導ペプチドの好ましい一態様は、核小体局在シグナルを構成する以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）
をさらに含む人為的に合成されたペプチドである。
【００１３】
また、ここで開示される神経分化誘導ペプチドの好ましい一態様は、上記核小体局在シグナルを構成するアミノ酸配列のＮ末端側にＡＰＰシグナルペプチド関連配列を含むように構成されている。
また、ここで開示される神経分化誘導ペプチドの特に好ましい一態様は、ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が５０以下である。
本発明によって提供される神経分化誘導ペプチドの好ましい具体例として、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１のうちから選択されるいずれかの配列番号に示すアミノ酸配列から構成される合成ペプチドが挙げられる。
【００１４】
また、本発明は、他の側面として、ここで開示されるいずれかの神経分化誘導ペプチドと、薬学上許容され得る少なくとも一種の担体とを含有する、少なくとも一種の幹細胞を神経細胞に分化誘導し得る神経分化誘導剤を提供する。
すなわち、ここで開示される神経分化誘導剤は、神経分化誘導ペプチドとして、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）中のシグナルペプチドを構成するアミノ酸配列、または、該シグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の一部分であって該配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて少なくとも６個の連続するアミノ酸残基から成るＮ末端側部分アミノ酸配列若しくは該シグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の一部分であって該配列のＣ末端アミノ酸残基から数えて少なくとも５個の連続するアミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列を、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列として含む人為的に合成されたペプチドを含有する。
好ましくは、上記アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチドは、以下のアミノ酸配列：
ＭＬＰＧＬＡＬＬＬＬＡＡＷＴＡＲＡ（配列番号２）；または
ＭＬＰＳＬＡＬＬＬＬＡＡＷＴＶＲＡ（配列番号３）；
であり、上記ＡＰＰシグナルペプチド関連配列は、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列であるか、或いは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列の一部分であって該配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて少なくとも６個の連続するアミノ酸残基から成るＮ末端側部分アミノ酸配列、若しくは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列の一部分であって該配列のＣ末端アミノ酸残基から数えて少なくとも５個の連続するアミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列である。
また好ましくは、神経分化誘導剤に含有される神経分化誘導ペプチドは、核小体局在シグナルを構成する以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）
をさらに含む人為的に合成されたペプチドである。
また好ましくは、神経分化誘導剤に含有される神経分化誘導ペプチドは、上記核小体局在シグナルを構成するアミノ酸配列のＮ末端側に上記ＡＰＰシグナルペプチド関連配列を含む。ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が５０以下であることが特に好ましい。
神経分化誘導剤に含有される神経分化誘導ペプチドの好適例として、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１のうちから選択されるいずれかの配列番号に示すアミノ酸配列から構成される合成ペプチドが挙げられる。
【００１５】
また、本発明は他の側面として、ここで開示される神経分化誘導剤若しくは神経分化誘導ペプチドを利用する種々の方法を提供する。
即ち、本発明は、少なくとも一種の細胞材料から神経細胞を生産する方法を提供する。この方法は、ここで開示されるいずれかの合成ペプチド若しくは該合成ペプチドを含む神経分化誘導剤（薬学的組成物）を用意し、該ペプチド若しくは該神経分化誘導剤を上記細胞材料に供給することを特徴とする。
また、本発明は、生体又は生組織中に神経細胞を発生させる方法を提供する。この方法は、ここで開示されるいずれかの合成ペプチド若しくは該合成ペプチドを含む神経分化誘導剤（薬学的組成物）を用意し、生体または生体外に一時的又は永久的に摘出された生組織に上記合成ペプチド若しくは該合成ペプチドを含む神経分化誘導剤（薬学的組成物）を付与することを特徴とする。
【００１６】
また、本発明は、ここで開示されるいずれかの合成ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、天然に存在しない人為的に設計されたポリヌクレオチド（例えばそれら配列により実質的に構成されるポリヌクレオチド）を提供する。
好ましいポリヌクレオチドとして、配列番号４〜３１のうちのいずれかに示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（例えばそれら配列により実質的に構成されるポリヌクレオチド）が挙げられる。
【００１７】
本発明の神経分化誘導ペプチドは、上述のとおり、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列（好ましくはＡＰＰシグナルペプチド関連配列に加えて核小体局在シグナル（ＮｏＬＳ）を構成するアミノ酸配列）を含む単純な構成の合成ペプチドであるため容易に製造することができる。このため、所望する量のペプチド（延いては神経分化誘導剤）を容易に調製することができる。
また、本発明によると、そのような神経分化誘導ペプチド（神経分化誘導剤）を利用することにより、従来は困難であった非神経細胞（典型的には神経幹細胞、脂肪幹細胞、皮膚幹細胞等の体性幹細胞、或いは胚性幹細胞）を神経細胞（ニューロン）に分化誘導することが容易に実現される。このため、比較的大量に調達し得る細胞材料（脂肪幹細胞等）を使用して、用途（例えば、神経の再生が要求されるような神経疾患の治療）に応じて所望される量の神経細胞を供給することができる。或いはまた、神経再生が必要な患部や体外に摘出した一時的又は永久的な生組織（細胞塊等の培養物を含む）に適当量を投与することにより、神経細胞の発生を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、マウス神経幹細胞の培養液にサンプルペプチド（サンプル１）を培養液中の濃度が０．５μＭとなるように添加して７日間培養した後、培養細胞の神経分化の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像と、ＤＡＰＩによる核染色画像と、蛍光色素標識抗チューブリン抗体を使用した免疫抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。
【図２】図２は、使用したペプチドがサンプル２であることを除いて図１の蛍光顕微鏡写真（画像）を撮影したときと同じ条件及び材料で培養した培養細胞の神経分化の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図３】図３は、使用したペプチドがサンプル３であることを除いて図１の蛍光顕微鏡写真（画像）を撮影したときと同じ条件及び材料で培養した培養細胞の神経分化の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図４】図４は、使用したペプチドがサンプル４であることを除いて図１の蛍光顕微鏡写真（画像）を撮影したときと同じ条件及び材料で培養した培養細胞の神経分化の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図５】図５は、使用したペプチドがサンプル５であることを除いて図１の蛍光顕微鏡写真（画像）を撮影したときと同じ条件及び材料で培養した培養細胞の神経分化の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図６】図６は、使用したペプチドがサンプル６であることを除いて図１の蛍光顕微鏡写真（画像）を撮影したときと同じ条件及び材料で培養した培養細胞の神経分化の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図７】図７は、使用したペプチドがサンプル７であることを除いて図１の蛍光顕微鏡写真（画像）を撮影したときと同じ条件及び材料で培養した培養細胞の神経分化の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図８】図８は、使用したペプチドがサンプル８であることを除いて図１の蛍光顕微鏡写真（画像）を撮影したときと同じ条件及び材料で培養した培養細胞の神経分化の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図９】図９は、使用したペプチドがサンプル９であることを除いて図１の蛍光顕微鏡写真（画像）を撮影したときと同じ条件及び材料で培養した培養細胞の神経分化の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図１０】図１０は、使用したペプチドがサンプル１０であることを除いて図１の蛍光顕微鏡写真（画像）を撮影したときと同じ条件及び材料で培養した培養細胞の神経分化の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図１１】図１１は、使用したペプチドがサンプル１１であることを除いて図１の蛍光顕微鏡写真（画像）を撮影したときと同じ条件及び材料で培養した培養細胞の神経分化の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図１２】図１２は、使用したペプチドがサンプル１２であることを除いて図１の蛍光顕微鏡写真（画像）を撮影したときと同じ条件及び材料で培養した培養細胞の神経分化の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図１３】図１３は、使用したペプチドがサンプル１３であることを除いて図１の蛍光顕微鏡写真（画像）を撮影したときと同じ条件及び材料で培養した培養細胞の神経分化の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図１４】図１４は、使用したペプチドがサンプル１４であることを除いて図１の蛍光顕微鏡写真（画像）を撮影したときと同じ条件及び材料で培養した培養細胞の神経分化の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図１５】図１５は、使用したペプチドがサンプル１５であることを除いて図１の蛍光顕微鏡写真（画像）を撮影したときと同じ条件及び材料で培養した培養細胞の神経分化の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）である。
【図１６】図１６は、マウス神経幹細胞を神経分化培地（神経分化誘導ペプチドは添加していない。）で７日間培養した後の培養細胞の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＩＣ画像と、ＤＡＰＩによる核染色画像と、蛍光色素標識抗チューブリン抗体を使用した免疫抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。
【図１７】図１７は、マウス神経幹細胞を一般の成長培地（神経分化誘導ペプチドは添加していない。）で７日間培養した後の培養細胞の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＩＣ画像と、ＤＡＰＩによる核染色画像と、蛍光色素標識抗チューブリン抗体を使用した免疫抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項（例えば神経分化誘導ペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチド合成、ポリヌクレオチド合成、ペプチドを成分とする神経分化誘導剤（薬剤組成物）の調製に関するような一般的事項）は、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、衛生学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。
また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
【００２０】
本明細書において「人為的に合成された神経分化誘導ペプチド」とは、そのペプチド鎖がそれのみで独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の系（例えば神経分化誘導剤を構成する組成物）の中で安定して存在し得るペプチド断片をいう。
本明細書において「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が１００以下、好ましくは５０以下である。
【００２１】
本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。また、本明細書において所定のアミノ酸配列に対して「部分的な改変が施されたアミノ酸配列（改変アミノ酸配列）」とは、当該所定のアミノ酸配列が有する神経分化誘導性を損なうことなく、１個または数個（例えば２，３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列をいう。例えば、１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列）、或いは、所定のアミノ酸配列について１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等は、本明細書でいう「部分的な改変が施された配列（改変アミノ酸配列）」に包含される典型例である。
また、本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、複数のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で結ばれたポリマー（核酸）を指す用語であり、ヌクレオチドの数によって限定されない。種々の長さのＤＮＡフラグメント及びＲＮＡフラグメントが本明細書におけるポリヌクレオチドに包含される。また、「人為的に設計されたポリヌクレオチド」とは、そのヌクレオチド鎖（全長）がそれ単独で自然界に存在するものではなく、化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって人為的に合成されたポリヌクレオチドをいう。
【００２２】
本発明者は、ヒト、チンパンジー、カニクイザル、マウス、ラット等の哺乳動物の脳の神経細胞中で産生されるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のシグナルペプチドに対応するアミノ酸配列を含むように合成した比較的短いペプチドが顕著な神経分化誘導活性を発揮し得ることを見出した。昨今、シグナルペプチドの機能に関する研究が進められている（例えば総説として上記非特許文献１が挙げられる。）が、当該ＡＰＰのシグナルペプチド配列の利用によって少なくとも一種の幹細胞（例えば種々の体性幹細胞や胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、等）の神経分化誘導が実現されることを示唆する文献はない。
【００２３】
本発明の実施にあたって好ましく利用されるアミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２及び配列番号３にそれぞれ示されている。
即ち、配列番号２として示す以下のアミノ酸配列：
ＭＬＰＧＬＡＬＬＬＬＡＡＷＴＡＲＡ（配列番号２）
は、ヒト、チンパンジーならびにカニクイザルの脳の神経細胞で産生されるアミロイド前駆体タンパク質の１７アミノ酸残基から構成されるシグナルペプチド配列である。
また、配列番号３として示す以下のアミノ酸配列：
ＭＬＰＳＬＡＬＬＬＬＡＡＷＴＶＲＡ（配列番号３）；
は、マウスならびにラットの脳の神経細胞で産生されるアミロイド前駆体タンパク質の１７アミノ酸残基から構成されるシグナルペプチド配列である。
而して本発明の神経分化誘導ペプチドを構築するにあたっては、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列として、上記配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列（１７アミノ酸残基から構成される）をそのまま適用することができる。
【００２４】
或いは、配列番号２または配列番号３のシグナルペプチド配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて少なくとも６個の連続するアミノ酸残基から成るＮ末端側部分アミノ酸配列、換言すればＮ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から６番目のアラニン残基迄を必須とし、それよりもＣ末端側のアミノ酸残基の使用は任意とするＮ末端側部分アミノ酸配列をＡＰＰシグナルペプチド関連配列として使用することができる。即ち、Ｎ末端側部分アミノ酸配列の具体例は次のとおりである。
＜１＞  配列番号２のシグナルペプチド配列由来のＮ末端側部分アミノ酸配列：
（１）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から６番目のアラニン残基迄の合計６アミノ酸残基から成る配列；
（２）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から７番目のロイシン残基迄の合計７アミノ酸残基から成る配列；
（３）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から８番目のロイシン残基迄の合計８アミノ酸残基から成る配列；
（４）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から９番目のロイシン残基迄の合計９アミノ酸残基から成る配列；
（５）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から１０番目のロイシン残基迄の合計１０アミノ酸残基から成る配列；
（６）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から１１番目のアラニン残基迄の合計１１アミノ酸残基から成る配列；
（７）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から１２番目のアラニン残基迄の合計１２アミノ酸残基から成る配列；
（８）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から１３番目のトリプトファン残基迄の合計１３アミノ酸残基から成る配列；
（９）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から１４番目のスレオニン残基迄の合計１４アミノ酸残基から成る配列；
（１０）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から１５番目のアラニン残基迄の合計１５アミノ酸残基から成る配列；
（１１）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から１６番目のアルギニン残基迄の合計１６アミノ酸残基から成る配列。
【００２５】
＜２＞  配列番号３のシグナルペプチド配列由来のＮ末端側部分アミノ酸配列：
（１）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から６番目のアラニン残基迄の合計６アミノ酸残基から成る配列；
（２）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から７番目のロイシン残基迄の合計７アミノ酸残基から成る配列；
（３）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から８番目のロイシン残基迄の合計８アミノ酸残基から成る配列；
（４）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から９番目のロイシン残基迄の合計９アミノ酸残基から成る配列；
（５）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から１０番目のロイシン残基迄の合計１０アミノ酸残基から成る配列；
（６）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から１１番目のアラニン残基迄の合計１１アミノ酸残基から成る配列；
（７）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から１２番目のアラニン残基迄の合計１２アミノ酸残基から成る配列；
（８）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から１３番目のトリプトファン残基迄の合計１３アミノ酸残基から成る配列；
（９）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から１４番目のスレオニン残基迄の合計１４アミノ酸残基から成る配列；
（１０）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から１５番目のバリン残基迄の合計１５アミノ酸残基から成る配列；
（１１）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１番目のメチオニン残基から１６番目のアルギニン残基迄の合計１６アミノ酸残基から成る配列。
【００２６】
或いはまた、配列番号２または配列番号３のシグナルペプチド配列のＣ末端アミノ酸残基から数えて少なくとも５個の連続するアミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列、換言すればＮ末端アミノ酸残基から数えて１３番目のトリプトファン残基から１７番目（即ちＣ末端）のアラニン残基迄を必須とし、それよりもＮ末端側のアミノ酸残基の使用は任意とするＣ末端側部分アミノ酸配列をＡＰＰシグナルペプチド関連配列として使用することができる。即ち、Ｃ末端側部分アミノ酸配列の具体例は次のとおりである。
＜３＞  配列番号２のシグナルペプチド配列由来のＣ末端側部分アミノ酸配列：
（１）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１３番目のトリプトファン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計５アミノ酸残基から成る配列；
（２）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１２番目のアラニン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計６アミノ酸残基から成る配列；
（３）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１１番目のアラニン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計７アミノ酸残基から成る配列；
（４）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１０番目のロイシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計８アミノ酸残基から成る配列；
（５）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて９番目のロイシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計９アミノ酸残基から成る配列；
（６）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて８番目のロイシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１０アミノ酸残基から成る配列；
（７）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて７番目のロイシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１１アミノ酸残基から成る配列；
（８）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて６番目のアラニン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１２アミノ酸残基から成る配列；
（９）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて５番目のロイシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１３アミノ酸残基から成る配列；
（１０）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて４番目のグリシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１４アミノ酸残基から成る配列；
（１１）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて３番目のプロリン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１５アミノ酸残基から成る配列；
（１２）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて２番目のロイシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１６アミノ酸残基から成る配列。
【００２７】
＜４＞  配列番号３のシグナルペプチド配列由来のＣ末端側部分アミノ酸配列：
（１）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１３番目のトリプトファン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計５アミノ酸残基から成る配列；
（２）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１２番目のアラニン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計６アミノ酸残基から成る配列；
（３）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１１番目のアラニン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計７アミノ酸残基から成る配列；
（４）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて１０番目のロイシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計８アミノ酸残基から成る配列；
（５）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて９番目のロイシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計９アミノ酸残基から成る配列；
（６）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて８番目のロイシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１０アミノ酸残基から成る配列；
（７）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて７番目のロイシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１１アミノ酸残基から成る配列；
（８）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて６番目のアラニン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１２アミノ酸残基から成る配列；
（９）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて５番目のロイシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１３アミノ酸残基から成る配列；
（１０）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて４番目のセリン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１４アミノ酸残基から成る配列；
（１１）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて３番目のプロリン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１５アミノ酸残基から成る配列；
（１２）．Ｎ末端アミノ酸残基から数えて２番目のロイシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１６アミノ酸残基から成る配列。
【００２８】
設計される神経分化誘導ペプチドは、前記ＡＰＰシグナルペプチド関連配列またはその改変アミノ酸配列のみから成るペプチドであってもよいが、神経分化誘導活性の向上の観点からは、いわゆる細胞膜通過ドメイン（タンパク質導入ドメイン：Protein Transduction Domain）を構成するアミノ酸配列の利用が好ましい。好適例を配列番号３３，３４及び３５に示す。配列番号３３は、ＨＩＶのＴＡＴに含まれるタンパク質導入ドメインのアミノ酸配列と該配列から成るペプチドを示している。配列番号３４は、前記ＴＡＴを改変したタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ４）のアミノ酸配列と該配列から成るペプチドを示している。配列番号３５は、ショウジョウバエ（Drosophila）の変異体AntennapediaのＡＮＴの関連アミノ酸配列と該配列から成るペプチドを示している。なお、配列表に示した上述の細胞膜通過ドメインはあくまでも例示であり、使用可能なドメインはこれらに限定されない。本発明の実施に使用可能な様々な細胞膜通過ドメインが本願出願当時に出版されている数々の文献に記載されている。それら細胞膜通過ドメインのアミノ酸配列は一般的な検索手段によって容易に知ることができる。
【００２９】
特に、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号１）
の利用が好ましい。
本発明者は、上記非特許文献２に記載されるように核小体局在シグナル（ＮｏＬＳ）として知られる上記配列番号１に示すアミノ酸配列と、目的とする他のアミノ酸配列（何らかの機能と関連付けられる比較的短い配列、即ちペプチドモチーフ）を構成するアミノ酸配列とを含むペプチドを合成し、培養中の真核細胞に添加したところ、当該ペプチドが高効率に対象細胞の細胞膜を通過し得ること、さらには高効率に核膜を通過し得ることを見出した。
即ち、本発明によると、目的とするＡＰＰシグナルペプチド関連配列（神経分化誘導に関連するペプチドモチーフ）を上記配列番号１に示すアミノ酸配列（以下「核小体局在シグナル関連配列」ともいう。）と組み合わせて得られた人工ペプチドを構築（合成) し、対象とする真核細胞に添加することによって、当該人工ペプチドを真核細胞の外部（細胞膜の外側）から核内（好ましくは核小体）に高効率に移送することができる。
【００３０】
本発明によって提供される神経分化誘導ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されているものが好ましい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基のアミド化により、神経分化誘導ペプチドの構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）を向上させ得る。
神経分化誘導ペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下が望ましく、５０以下が好ましい。このような鎖長の短いペプチドは、化学合成が容易であり、容易に神経分化誘導ペプチドを提供することができる。なお、ペプチドのコンホメーション（立体構造）については、使用する環境下で神経分化誘導性を発揮する限りにおいて、特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難いという観点から直鎖状又はへリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。かかる観点から、神経分化誘導剤に適用する神経分化誘導ペプチドとしては、直鎖状であり比較的低分子量（典型的には５０以下（特に４０以下）のアミノ酸残基数）のものが好適である。
【００３１】
全体のアミノ酸配列に対するＡＰＰシグナルペプチド関連配列の占める割合（即ちペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数に占めるＡＰＰシグナルペプチド関連配列部分を構成するアミノ酸残基数の個数％）は、神経分化誘導活性を失わない限り特に限定されないが、当該割合は２０％以上が望ましく、３０〜５０％が好ましい。なお、本発明の神経分化誘導ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、神経分化誘導活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
【００３２】
本発明の神経分化誘導ペプチドは、神経分化誘導性を失わない限りにおいて、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列ならびに核小体局在シグナル関連配列に含まれ得ない配列を部分的に含み得る。特に限定するものではないが、かかる部分配列としてはペプチド鎖におけるＡＰＰシグナルペプチド関連配列部分の３次元形状（典型的には直鎖形状）を維持し得る配列が好ましい。例えば、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列部分と核小体局在シグナル関連配列部分とを連結するリンカー配列（ヒンジ部）が挙げられる。かかるリンカー配列の典型例として、１〜９個程度（例えば１個、２個又は３個）のグリシン残基及び／又はセリン残基で構成されたリンカー配列が挙げられる（後述する実施例参照）。
【００３３】
ここで開示される神経分化誘導ペプチドのうちペプチド鎖の比較的短いものは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。
ここで開示されるアミノ酸残基数が１００以下（特に５０以下）の神経分化誘導ペプチドは、市販のペプチド合成機（例えば、Intavis AG社、Applied Biosystems社等から入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖として容易に合成することができる。
【００３４】
或いは、遺伝子工学的手法に基づいて神経分化誘導ペプチドを生合成してもよい。このアプローチは、ペプチド鎖の比較的長いポリペプチドを製造する場合に好適である。すなわち、所望する神経分化誘導ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のＤＮＡを合成する。そして、このＤＮＡと該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞、動物（哺乳類）細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からポリペプチドを単離し、精製することによって、目的の神経分化誘導ペプチドを得ることができる。一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からポリペプチドを単離し、精製することによって、目的の神経分化誘導ペプチドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
【００３５】
例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的の神経分化誘導ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズおよびアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出及び精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（設計した神経分化誘導ペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、本発明の神経分化誘導ペプチドを製造することができる。
或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち神経分化誘導ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の東洋紡績（株）から入手可能なPROTEIOS（商標）Wheat germ cell-free protein synthesis kit）が市販されている。
従って、上述のようにして、利用するアミノ酸配列（ＡＰＰシグナルペプチド関連配列）をひとたび決定し、ペプチド鎖を設計しさえすれば、そのアミノ酸配列に従って無細胞タンパク質合成システムによって目的の神経分化誘導ペプチドを容易に合成・生産することができる。例えば、日本の（株）ポストゲノム研究所のピュアシステム（登録商標）に基づいて本発明の神経分化誘導ペプチドを容易に生産することができる。
【００３６】
ここで開示される神経分化誘導ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。すなわち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、神経分化誘導ペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、神経分化誘導ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
本発明によると、新規なアミノ酸配列の神経分化誘導ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。例えば、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が５０以下（好ましくは４０以下）であって、配列番号１〜３５で示されるそれぞれのアミノ酸配列或いは該配列の改変配列を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む（又はそれら配列から実質的に構成された）人為的に設計されたポリヌクレオチドが提供される。
【００３７】
好適な本発明の神経分化誘導ペプチドは少なくとも一種の細胞に対して高い神経分化誘導活性を有する。このため、神経分化誘導剤の有効成分として好適に使用し得る。なお、神経分化誘導剤に含有される神経分化誘導ペプチドは、神経分化誘導活性を損なわない限りにおいて、塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。或いは、神経分化誘導活性を有する限り、他の塩（例えば金属塩）であってもよい。
【００３８】
神経分化誘導剤は、有効成分である神経分化誘導ペプチドの他、使用形態に応じて薬学（医薬）上許容され得る種々の担体を含み得る。希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。神経分化誘導剤の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、神経分化誘導剤に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
神経分化誘導剤の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、神経分化誘導ペプチド（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
【００３９】
本発明によって提供される神経分化誘導剤は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。
例えば、ここで開示されるＡＰＰシグナルペプチド関連配列を含む神経分化誘導ペプチド(即ち該ペプチドを含む神経分化誘導剤）は、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって患者(即ち生体)に所望する量だけ投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。これにより、生体内で、典型的には患部又はその周辺に存在する体性幹細胞から、神経細胞を発生(生産)させることができる。このため、神経再生が有力な治療法となる種々の神経疾患を効果的に治療することが可能となる。例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳梗塞、脊髄損傷による身体の麻痺、脳挫傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳腫瘍、網膜変性症等の神経疾患を再生医療的アプローチによって治療することが実現される。
【００４０】
或いはまた、生体から一時的に又は永久的に摘出した細胞材料、即ち生組織や細胞塊(例えば体性幹細胞の培養物)に、適当量の神経分化誘導剤（神経分化誘導ペプチド）を付与することによって、体外(インビトロ)で神経細胞を効率よく発生させることができる。このことは当該細胞材料中に所望する神経細胞を大量に生産し得ることを意味する。
而して、大量に生産された神経細胞、或いは該生産された神経細胞を含む細胞材料（生組織や細胞塊）を再び生体内(典型的には神経再生が要求されている患部）に戻すことによっても、生体に直接神経分化誘導剤（神経分化誘導ペプチド）を投与する場合と同様の治療効果が得られ得る。
以上の説明から明らかなように、本発明はまた、ここで開示される神経分化誘導ペプチドのいずれかを利用することによって、神経疾患治療に有用な、神経細胞に分化誘導された細胞、細胞塊又は生組織を提供することができる。
【００４１】
また、本発明の神経分化誘導ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、いわゆる遺伝子治療に使用する素材として用い得る。例えば、神経分化誘導ペプチドをコードする遺伝子（典型的にはＤＮＡセグメント、或いはＲＮＡセグメント）を適当なベクターに組み込み、目的とする部位に導入することにより、常時、生体（細胞）内で本発明に係る神経分化誘導ペプチドを発現させることが可能である。従って、本発明の神経分化誘導ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡセグメント、ＲＮＡセグメント等）は、上述した患者等に対し、神経疾患を治療し又は予防する薬剤として有用である。
【００４２】
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
【００４３】
＜実施例１：ペプチド合成＞
表１に示す計１５種類のペプチド（サンプル１〜１５）を後述するペプチド合成機を用いて製造した。なお、表１に各サンプルペプチドのアミノ酸配列と総アミノ酸残基数を記載している。
【００４４】
【表１】
2010117079.tif 000003
【００４５】
表１に示すように、各サンプルペプチドは、いずれもペプチド鎖のＣ末端側に配列番号１に示す核小体局在シグナル関連配列を含み、且つ、１個のグリシン残基から成るリンカーを挟んでそのＮ末端側に配列番号２又は配列番号３に示すＡＰＰシグナルペプチド由来のアミノ酸配列を含むように構成されており、全体が１９〜３１アミノ酸残基から成る直鎖状の化学合成ペプチドである。
サンプル１とサンプル２は、いずれもグリシンリンカーよりもＮ末端側に配列番号２に示すＡＰＰシグナルペプチド配列から選択された部分アミノ酸配列を有している。
即ち、サンプル１は、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列として、配列番号２のシグナルペプチド配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて１番目（Ｎ末端）のメチオニン残基から６番目のアラニン残基迄の合計６アミノ酸残基から成るＮ末端側部分アミノ酸配列を有する。
サンプル２は、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列として、配列番号２のシグナルペプチド配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて７番目のロイシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１１アミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列を有する。
【００４６】
また、サンプル３は、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列として、配列番号３のシグナルペプチド配列全体を有する。
サンプル４〜１５は、いずれもグリシンリンカーよりもＮ末端側に配列番号３に示すＡＰＰシグナルペプチド配列から選択された部分アミノ酸配列を有している。
即ち、サンプル４は、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列として、配列番号３のシグナルペプチド配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて３番目のプロリン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１５アミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列を有する。
サンプル５は、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列として、配列番号３のシグナルペプチド配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて４番目のセリン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１４アミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列を有する。
サンプル６は、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列として、配列番号３のシグナルペプチド配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて５番目のロイシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１３アミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列を有する。
サンプル７は、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列として、配列番号３のシグナルペプチド配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて６番目のアラニン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１２アミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列を有する。
サンプル８は、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列として、配列番号３のシグナルペプチド配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて７番目のロイシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１１アミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列を有する。
サンプル９は、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列として、配列番号３のシグナルペプチド配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて８番目のロイシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計１０アミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列を有する。
サンプル１０は、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列として、配列番号３のシグナルペプチド配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて９番目のロイシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計９アミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列を有する。
サンプル１１は、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列として、配列番号３のシグナルペプチド配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて１０番目のロイシン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計８アミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列を有する。
サンプル１２は、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列として、配列番号３のシグナルペプチド配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて１１番目のアラニン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計７アミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列を有する。
サンプル１３は、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列として、配列番号３のシグナルペプチド配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて１２番目のアラニン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計６アミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列を有する。
そして、サンプル１４は、ＡＰＰシグナルペプチド関連配列として、配列番号３のシグナルペプチド配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて１３番目のトリプトファン残基から１７番目（Ｃ末端）のアラニン残基迄の合計５アミノ酸残基から成るＣ末端側部分アミノ酸配列を有する。
【００４７】
一方、サンプル１５は、配列番号３のシグナルペプチド配列のＮ末端アミノ酸残基から数えて７番目のロイシン残基から１２番目のアラニン残基迄の合計６アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を有する。即ち、サンプル１５は、本明細書において規定される上記Ｎ末端側部分アミノ酸配列にもＣ末端側部分アミノ酸配列にも該当しない。即ち、サンプル１５は、本明細書において規定されるＡＰＰシグナルペプチド関連配列を有さないペプチドである。
【００４８】
上述した各ペプチドは、市販のペプチド合成機（Intavis AG社製品  Multi Pep RS）を用いて固相合成法（Ｆｍｏｃ法）により合成した。なお、縮合剤としてＨＡＴＵ（O-(7-azabenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluronium
hexafluoro-phosphate、渡辺化学工業（株）製品）およびＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン、和光純薬工業（株）製品）を使用し、固相合成法に用いた樹脂及びアミノ酸はNOVA biochem社から購入した。なお、アミノ酸配列のＣ末端をアミド化する場合には、固相担体として「Rink Amide resin (100〜200 mesh)」 を使用すればよいが、本実施例では使用していない。
而して、上記ペプチド合成機の合成プログラムに準じて脱保護基反応及び縮合反応を反復して樹脂に結合するFmoc−アミノ酸からペプチド鎖を伸長していき、目的の鎖長の合成ペプチドを得た。具体的には、２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミド(DMF)（ペプチド合成用グレード、和光純薬工業（株）製品）によって、アミノ酸のアミノ保護基であるFmocを切断除去し、ＤＭＦで洗浄し、Fmoc−アミノ酸(-OH)各４ｅｑを反応させ、ＤＭＦで洗浄する操作を反復した。そして、ペプチド鎖の伸長反応が全て終了した後、２０％ピペリジン／ＤＭＦによりFmoc基を切断し、ＤＭＦ、エタノールの順で上記反応物を洗浄した。
【００４９】
固相合成後、合成したペプチド鎖を樹脂と共に遠沈管に移し、エタンジオール１．８ｍＬ、m-クレゾール０．６ｍＬ、チオアニソール３．６ｍＬ及びトリフルオロ酢酸２４ｍＬを加え、室温で２時間撹拌した。その後、ペプチド鎖に結合していた樹脂を濾過して除去した。
次いで、濾液に冷ジエチルエーテルを加え、氷冷水で冷却してペプチド沈澱物を得た。その後、遠心分離（2500rpmで５分間）によって上澄みを廃棄した。沈殿物に冷ジエチルエーテルを新たに加えて十分に撹拌した後、上記と同じ条件で遠心分離を行った。この撹拌と遠心分離の処理を計３回反復して行った。
【００５０】
得られたペプチド沈殿物を真空乾燥し、高速液体クロマトグラフ（Waters 600：Waters社製品）を用いて精製を行った。
具体的には、プレカラム（日本ウォーターズ（株）製品、Guard-Pak
Delta-pak C18 A300）及びＣ１８逆相カラム（日本ウォーターズ（株）製品、XTerra（登録商標）カラム、MS C18、5μm、4.6×150mm）を使用し、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液との混合液を溶離液に用いた。即ち、溶離液に含まれる上記トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液の分量を経時的に増大させつつ（容積比で１０％から８０％への濃度勾配を設ける）、１．５ｍＬ／分の流速で上記カラムを用いて３０〜４０分間の分離精製を行った。なお、逆相カラムから溶離したペプチドは紫外線検出器（490E Detector：Waters社製品）を用いて波長：２２０ｎｍで検出され、記録チャート上にピークとして示される。
また、溶離した各ペプチドの分子量をPerSeptive Biosystems社製のVoyager DE RP（商標）を用いてMALDI-TOF/MS（Matrix-Assisted Laser Desorption Time of Flight Mass Spectrometry：マトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間型−質量分析)に基づいて決定した。その結果、目的のペプチドが合成・精製されていることが確認された。
【００５１】
＜実施例２：合成ペプチドの神経分化誘導活性評価＞
上記実施例１で得られた合成ペプチド（サンプル１〜１５）のそれぞれについて神経分化誘導活性を調べた。
即ち、サンプルペプチドを、マウスから採取した神経幹細胞の培養液（マウス神経幹細胞増殖培地：Cell Applications社製品）中に添加し、インキュベーションした。添加濃度は、何れのペプチドについても０．５μＭとした。
そして、ペプチドを添加して７日間経過後、各培養細胞について、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）による核染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。また、同じサンプルに対して神経分化誘導マーカーによる評価を行った。即ち、ニューロン（神経細胞）を識別するマーカーとしてチューブリン（具体的にはβ３−チューブリン）を採用し、当該チューブリンを識別する蛍光色素標識抗チューブリン抗体を用いた蛍光抗体法によって培養液中のチューブリンの存在（即ちニューロンの存在）の有無を確認した。結果を図１〜図１５に示す。図の番号と使用したサンプルペプチドの番号は対応している。
これら図面は、各サンプルペプチドを添加して７日間培養した後のマウス神経幹細胞の神経分化の状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＩＣ画像と、ＤＡＰＩによる核染色画像と、蛍光色素標識抗チューブリン抗体を使用した免疫抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。
なお、ポジティブコントロールとして、いずれのペプチドも添加することなく、マウス神経幹細胞をマウス神経幹細胞分化培地（Cell Applications社製品）で培養し、培養開始から７日間経過した後に上記と同様の処理及び蛍光顕微鏡観察を行った。結果を図１６に示す。
また、ネガティブコントロールとして、いずれのペプチドも添加することなく、マウス神経幹細胞をマウス神経幹細胞増殖培地（Cell Applications社製品）で培養し、培養開始から７日間経過した後に上記と同様の処理及び蛍光顕微鏡観察を行った。結果を図１７に示す。
【００５２】
上記評価試験の結果、サンプル１〜１４の人工ペプチド（神経分化誘導ペプチド）を添加した場合（図１〜１４参照）、ポジティブコントロール（図１６）以上の顕著な神経分化が認められた。即ち、サンプル１〜１４のいずれのペプチドを添加した場合でも、蛍光色素標識抗チューブリン抗体の存在による蛍光発色が良好に認められた。なかでもサンプル２，６，７，８のペプチドに特に高い神経分化誘導活性が認められた。一方、同じ増殖培地を使用したネガティブコントロールでは、このような蛍光発色（神経分化）は認められなかった（図１７）。
このことは、サンプルペプチドの添加によって、神経幹細胞がニューロンに分化したことを示しており、神経分化誘導に関連するペプチドモチーフとしてのＡＰＰシグナルペプチドの有用性を示すものである。
【００５３】
＜実施例３：顆粒剤の調製＞
サンプル１のペプチド５０ｍｇと結晶化セルロース５０ｍｇ及び乳糖４００ｍｇとを混合した後、エタノールと水の混合液１ｍＬを加え混練した。この混練物を常法に従って造粒し、神経分化誘導ペプチドを主成分とする顆粒剤（顆粒状神経分化誘導剤）を得た。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
上述のように本発明の神経分化誘導ペプチドは高い神経分化誘導活性を有しているため、医薬用のペプチド成分として利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号１〜配列番号３５  合成ペプチド
【図１】
2010117079.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2010117079.tif 000018
【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
2010117079000001.app
【国際調査報告】
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2010117079.tif 000023
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