【事件の表示】
　特許第２５４９２２５号「百日咳菌外膜蛋白質の精製方法」の請求項１〜２０に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２５４９２２５号の請求項１〜２０に係る特許を維持する。
【理　由】
Ａ．手続の経緯
　特許第２５４９２２５号の請求項１〜２０に係る発明は、平成３年４月３日を国際出願日として特許出願され（パリ条約に基づく優先権主張１９９０年４月４日、英国）、平成８年８月８日にその特許権の設定登録がされ、その後異議申立人スミスクライン　ビーチャム　バイオロジカルズ　ソシエテ　アノニムにより特許異議の申立てがなされ、取消しの理由が通知され、その指定期間内である平成１０年３月１９日に特許異議意見書が提出され、再度取消しの理由が通知され、その指定期間内である平成１１年７月１９日に訂正請求がされた後、再度取消しの理由が通知され、その指定期間内である平成１２年６月７日に特許異議意見書が提出され、その後特許異議申立人及び特許権者に対し審尋をし、その指定期間内に特許権者から回答書が提出されたが、特許異議申立人からは回答書は提出されていないものである。
　
Ｂ．訂正の内容
　本件訂正請求は、本件特許明細書を、訂正請求書のとおり、次の事項について訂正することを求めるものである。
１．訂正事項ａ
　請求項６の記載を「前記粗水溶液が、百日咳菌を培地中で培養し、得られた増殖菌体から尿素を含む抽出剤を用いてパータクチンを含む抽出物を調製し、該抽出物を限外濾過にかけて、該抽出物から高分子量蛋白質が除去された限外濾過液を供給し、該限外濾過液を更に限外濾過にかけて、該限外濾過液から低分子量蛋白質が除去された限外濾過保持液を供給し、該限外濾過保持液からパータクチンを含む沈殿物を形成させ、該沈殿物を溶解させることで前記粗水溶液を得ることにより形成される請求項１に記載の方法。
」と訂正する。
２．訂正事項ｂ
　請求項１５の記載を「前記粗水溶液の前記分離媒体との接触を通したパータクチンの精製が、該粗水溶液を、前記分離媒体としてのヒドロキシアパタイト及びイオン交換媒体マトリックスの少なくとも一方へのパータクチンの結合のための伝導度で、これら分離媒体への接触に通した後、これら分離媒体の少なくとも一方に結合したパータクチンをその溶出に必要な伝導度を有する緩衝液で選択的に溶出させることによって行われる請求項１〜13のいずれかに記載の方法。」と訂正する。
　
Ｃ．訂正の適否についての判断
１．訂正の目的の適否、新規事項の追加の有無及び拡張、変更の存否
　訂正事項ａは、訂正前のパータクチンを含む抽出物を得るための抽出剤を尿素を含む抽出剤に限定するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当し、抽出剤として尿素を含む溶液を用いることは特許明細書第５頁第７〜９行（特許公報第６欄第２３〜２５行）等の記載に基づくものであり、訂正事項ｂは、訂正前の請求項１５の記載の明らかな誤記の訂正であるから、訂正事項ａ及びｂは、いずれも明細書に記載した事項の範囲内のものであり、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものでもない。
　
２．独立特許要件について
　訂正明細書の請求項１〜２０に係る発明が、特許出願の際独立して特許を受けることができるものであるか否かについて以下に検討する。
（１）訂正明細書の請求項１〜２０に係る発明
　訂正明細書の請求項１〜２０に係る発明は下記のとおりのものである。
  「【請求項１】実質的に百日咳毒素（PT）および糸状血球凝集素（FHA）を含まない不純物含有のパータクチンの粗水溶液を供給し、該粗水溶液を分離媒体であるヒドロキシアパタイト及びイオン交換媒体マトリックスへの接触に通して、前記パータクチタンを水溶液中で精製し、得られた精製パータクチンの溶液を回収することを特徴とするパータクチンの製造方法。
【請求項２】前記粗水溶液が、百日咳菌を培地中で培養し、パータクチン、百日咳毒素（PT）、糸状血球凝集素（FHA）及び増殖菌体を含む培養物液を供給し、該培養物液から前記増殖菌体を分離し、該増殖菌体が分離された培養物液から、百日咳毒素（PT）、糸状血球凝集素（FHA）を選択的に除去してから、パータクチンを含む沈殿物を形成させ、得られた沈殿物を溶解させることで前記粗水溶液を得ることにより形成される請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記増殖菌体、百日咳毒素（PT）及び糸状血球凝集素（FHA）が除去された培養物液に、硫酸アンモニウムを添加することによって前記沈澱物を形成させる請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記粗水溶液が、百日咳菌を培地中で培養し、パータクチン、百日咳毒素（PT）および糸状血球凝集素（FHA）及び増殖菌体を含む培養物液を供給し、該培養物液から前記増殖菌体を分離し、該増殖菌体が分離された培養物液から、パータクチン、百日咳毒素（PT）及び糸状血球凝集素（FHA）を含む沈殿物を形成させ、得られた沈殿物の水溶液を形成し、該沈殿物の水溶液から百日咳毒素（PT）及び糸状血球凝集素（FHA）を選択的に除去して前記粗水溶液を得ることにより形成される請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記増殖菌体が除去された培養物液に、硫酸アンモニウムを添加することによって前記沈殿物を形成させる請求項４に記載の方法。
【請求項６】前記粗水溶液が、百日咳菌を培地中で培養し、得られた増殖菌体から尿素を含む抽出剤を用いてパータクチンを含む抽出物を調製し、該抽出物を限外濾過にかけて、該抽出物から高分子量蛋白質が除去された限外濾過液を供給し、該限外濾過液を更に限外濾過にかけて、該限外濾過液から低分子量蛋白質が除去された限外濾過保持液を供給し、該限外濾過保持液からパータクチンを含む沈殿物を形成させ、該沈殿物を溶解させることで前記粗水溶液を得ることにより形成される請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記抽出物の限外濾過が、分画分子量が約100kDa〜1000kDaの膜を用いて行われる請求項６に記載の方法。
【請求項８】パータクチンを含む沈殿物の形成に先だって前記限外濾過液に分画分子量が30kDa以下の膜でのダイアフィルトレーションを行う請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】前記限外濾過保持液に、硫酸アンモニウムを添加することにより前記パータクチンを含む沈殿物の形成を行う請求項６、７または８に記載の方法。
【請求項１０】前記パータクチンを含む沈殿物の形成を、pH約6.0〜約8.5の低イオン強度の緩衝液に溶解させることで行う請求項３または６に記載の方法。
【請求項１１】前記緩衝液が約4mS/cm以下のイオン強度を有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】前記精製パータクチンの水溶液を更に分子量限界が約100kDa〜300kDaの膜を用いた限外濾過にかける請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】前記精製パータクチン溶液の限外濾過処理液を、分画分子量が約30kDa以下の膜を用いて更に濃縮する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】前記粗水溶液の前記分離媒体との接触は、該分離媒体に結合せずに通過流分中に含まれるパータクチンと、該分離媒体に結合した不純物とを与え、これら分離媒体からの通過流分を集めて前記精製パータクチンの溶液を供給する請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】前記粗水溶液の前記分離媒体との接触を通したパータクチンの精製が、該粗水溶液を、前記分離媒体としてのヒドロキシアパタイト及びイオン交換媒体マトリックスの少なくとも一方へのパータクチンの結合のための伝導度で、これら分離媒体への接触に通した後、これら分離媒体の少なくとも一方に結合したパータクチンをその溶出に必要な伝導度を有する緩衝液で選択的に溶出させることによって行われる請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】限外濾過したパータクチンの溶液をイオン交換媒体マトリックスへの接触に通して該イオン交換媒体マトリックスにパータクチンを結合させ、該イオン交換媒体マトリックスから精製パータクチンを選択的に溶出させる請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】生物学的に純粋で、安定であり、アデニン酸シクラーゼ活性が検出されない精製パータクチン調製物。
【請求項１８】百日咳菌感染に対するワクチンであって、活性成分としての、生物学的に純粋で、安定であり、アデニン酸シクラーゼ活性が検出されない免疫防御性精製パータクチン調製物と、該活性成分のキャリアーとを含むことを特徴とするワクチン。
【請求項１９】他の免疫防御性百日咳菌抗原の少なくとも１種を更に含む請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２０】他の百日咳菌抗原が百日咳毒素（PT）、糸状血球凝集素（FHA）及び凝集原であり、これらの少なくとも１種が追加された請求項１９に記載のワクチン。」
　
（２）引用刊行物等に記載された発明
　当審の取消理由通知で引用した下記の刊行物等には、次の事項が記載されている。
　刊行物１：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５０ ｐ１９９‐２０６（１９８５）（甲第１号証）
  刊行物２：米国特許出願番号０７／３０８８６４明細書（ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｏｍｍｅｒｃｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＮＴＩＳ）１９８９年発行）（甲第４号証）
　刊行物３： ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６７ ｐ２８５‐２９０（１９９０，３月）（甲第６号証）
　刊行物４：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ 編（１９９０．４．２）（甲第１５号証）
　刊行物５：欧州特許公開第３３６７３６号明細書（１９８９公開）（甲第１４号証）
　刊行物６：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６４ ｐｌ９３０８‐１９３１２（１９８９）（甲第１９号証）
　刊行物７：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６４ ｐ１８１９５‐１８２０１（１９８９）（甲第２０号証）
　刊行物８：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６３ ｐ１４０６７‐１４０７３（１９８８）（甲第２１号証）
　刊行物９：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５１ ｐ５６９‐５７６（１９８８）（甲第２２号証）
　刊行物１０：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５６ ｐ３１８９‐３１９５（１９８８）（甲第２号証）
　刊行物１１：Ｔｈｅ Ｆｉｆｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ‐Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２２‐２３，１９８８ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ ｐ７６‐７７（甲第３号証）
　刊行物１２：Ｔｈｅ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ‐１９８９ ｐ５１ Ｂ‐１２６（甲第５号証）
　刊行物１３：Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ １１２，３９５，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．１０４８３８ ｂ（１９９０．３．１９）（甲第７号証）
　刊行物１６：Ｄｅｖｅｌｏｐ．ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ．６１ ｐ１１‐１９（１９８５）（甲第１０号証）
　刊行物１７：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４２ ｐ３３‐４１（１９８３）（甲第１１号証）
　刊行物１８：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６ ｐ３５５４‐３５５８（１９８９）（甲第１３号証）　
　刊行物１９：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７１ ｐ６３‐７３（１９９０，１月）（甲第１６号証）
　刊行物２０：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８　ｐ１３５１−１３６２（１９８８）（甲第１２号証）
　先願１：特願平３−５０６９６３号（特表平５−５０５７２５号公報）（優先日　１９９０年４月２日）（甲第８号証の１）
  先願２：特願平２−３２６０９６号（特開平３−１９１７８９号公報）（優先日　１９８９年１２月１１日）（甲第９号証の１）
　
　上記刊行物１には、「材料及び方法」の欄に株が三種（その一つとして百日咳菌ＣＮ２９９２）がある旨（１９９頁右欄９〜１５行）、「結果」の欄に６８‐ｋＤａタンパク質の精製として、B.Bronchisepticaのタンパクの ＤＥＡＥ‐トリスアクリルクロマトグラフィ、予備的等電点電気泳動、及び免疫親和性クロマトグラフィーからなる方法があり、ＤＥＡＥ‐トリスアクリルクロマトグラフィだけでは精製度は高くなく、同等の調製方法が、その属の三種類の細胞結合タンパク質の単離に使用しうる旨（２０５頁右欄最下行）、また、Ｐ６９抗原調製物は次のａ）〜ｄ）の方法で得る旨
ａ）熱処理により百日咳菌細胞からＰ６９を抽出して、「細胞表面抗原」（ＣＳＡ）を得るか、または酸−グリシン加水分解により酸−グリシン加水分解物（ＡＧＨ）を得る、
ｂ）ＣＳＡまたはＡＧＨのＤＥＡＥ−トリアクリルでのイオン交換クロマトグラフィー、
ｃ）予備的等電点電気泳動、及び
ｄ）免疫親和性クロマトグラフィー。
　さらに、主に百日咳菌のＰ６９抗原よりは気管支敗血症菌のＰ６９抗原に関するが、これらの抗原は非常に類似しており、同じ方法で製造できる旨（第２０５頁、第２欄、第５〜８行）、１００μｇという最高の負荷ですら、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ法によって不純物は検出されなかった」（甲第１号証第２０３頁図４（ａ））。分子量４０ｋＤａの不純物のバンドは、はるかに感度の高い免疫ブロットによってのみ通常検出された旨（第２０３頁図４（ｂ）及び第２０２頁第２欄の下から５行〜最下行）、処理を４℃で最小限の時間で実施すると、ｍｇ/分当り２００ｎモルまでのｃＡＭＰの試料は例外として、ｍｇ/分当り１０〜２５ｎモルのｃＡＭＰ活性を示した。精製された調製物の基礎的な活性はカルモジュリンの存在で常に増加した（２〜２０倍）結果として、カルモジュリンは反応混合物へ日常的に添加した。これまで分ったもっとも信頼できる酵素の不活性化を減少させる方法は最終生成物の１％（ｗｔ／ｖｏｌ）中での即時の凍結乾燥及びそれに−４０℃での貯蔵のようである。４℃の溶液に保つと、タンパク質（アデニル酸シクラーゼ）は２〜４日以内に不活性になった旨（第２０４頁第１欄第１〜２行）、酵素活性を有しない物質を室温または４℃で長期間貯蔵した旨（第２０５頁の第１欄の第２７〜２９行）、記載されている。
　上記刊行物２には、百日咳菌の６９０００Ｄａ外膜タンパク質の精製方法として、以下のＤＥＡＥ‐Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでのイオン交換クロマトグラフィー（１４頁図１）を含む（ア）〜（ウ）の工程からなる方法が記載されている。
（ア）６０℃で６０分間の百日咳菌からのＰ６９の透析熱抽出
（イ）ＤＥＡＥ‐Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでのイオン交換クロマトグラフィー
（ウ）Ａｆｆｉ−ゲルＢｌｕｅでのアフィニティクロマトグラフィー
　上記刊行物３には、百日咳菌からの６９０００Ｄａタンパク質の多段階による精製方法の一段階として、ＤＥＡＥ‐セファロースクロマトグラフィを行う旨（２８６頁左欄下から１９行〜右欄４行、及び図１）が記載されている。
　刊行物４には、タンパク質の精製にヒドロキシアパタイトへの吸着を用いる旨記載されている。
　刊行物５には、ヒドロキシアパタイトを百日咳菌の培養上清からのＰＴ及びＦＨＡの精製に用いる旨が記載されている（３３３〜３３８頁）。
  刊行物６〜９には、各種タンパク質の精製にヒドロキシアパタイト及びイオン交換媒体を組み合わせて用い、精製する目的物るをヒドロキシアパタイトへ吸着させる旨が記載されている。
  刊行物１０には、百日咳菌の６９−ｋＤａタンパク質はアデニル酸シクラーゼ活性を有する旨が記載されている（第３１９０頁第２欄第５〜１９行、第３１９４頁第２欄最後のパラグラフ）。
  刊行物１１には、アデニル酸シクラーゼ調整物中に６９−ｋＤａタンパク質が存在し、精製した６９−ｋＤａタンパク質調整物には酵素活性が認められない（第１頁第３パラグラフの第９〜１３行）。
  （特許権者が提出した資料１５は、要約である刊行物１１の本文であるが、該資料１５には６９−ｋＤａタンパク質がアデニル酸シクラーゼ活性を有する旨記載されている。）
　刊行物１２には、百日咳菌の６９−ｋＤａ外膜タンパク質の精製であって、上記刊行物２と同内容が記載されている。
　刊行物１３には、百日咳菌の６９−ｋＤａ外膜タンパク質の精製であって、上記刊行物３と同内容が記載されている。
　刊行物１６及び１７には、染色体へのＴｎ５挿入変異によるアデニル酸シクラーゼのない百日咳菌の変異体（ＢＰ３４８）が開示されている。
　刊行物１８には、Ｐ６９のためのクローニングと配列決定について記載され、また、Ｐ６９の精製の現在通用している方法はすべての微量のアデニル酸シクラーゼ不純物を取り除く旨（第３５５８頁第１欄第４２〜４４行）記載されている。
　刊行物１９には、６９−ｋＤ外膜タンパク質は最近クローン化され、配列決定され、抗原の大規模精製に適当な方法が開発された。したがって、精製された抗原を十分な量で入手できることは６９−ｋＤ外膜タンパク質のヒトにおける免疫防御を引き出すことにおける役割及びメカニズムを可能にする旨が記載されている。（第７１頁最後のパラグラフの第５〜１０行）
　刊行物２０には、アデニル酸シクラーゼのない百日咳菌の変異体（ＢＰ３４８）であって、該変異体はＴｎ５トランスポゾン変異体である旨が記載されている（第１３５３頁表１）。
　先願明細書１（甲第８号証の１）には、「・・・Ｐｉｃｈｉａ微生物で、パータクチン抗原をコードするＤＮＡを含む発現カセットでトランスフォームされたもの、またはそれからの抗原フラグメント。」（請求の範囲の請求項８）、「例６−Ｐ．６９の再生と精製　誘導ＳＬ４細胞を収獲、・・・パータクチンをさらに・・・精製した。全体としてのパータクチンの回収率は４０％であった。」（第７頁右上欄第２２行〜左下欄第１３行）が記載されている。
　先願明細書２（甲第９号証の１）には、「百日咳菌・・・細胞から６９，０００ダルトンの分子量を有する外膜タンパク質を抽出および精製する方法であって、百日咳菌・・・細胞を静菌剤と接触させて前記細胞を不活性化すること：複数の抽出工程、各抽出工程は水性媒質中に不活性化した細胞を懸濁し、前記細胞懸濁液をインキュベーションし、これにより前記細胞からタンパク質を解放し、そしてインキュベーション後細胞から解放されたタンパク質を分離し、これによりタンパク質抽出物を得ることからなる：・・・前記タンパク質抽出物から前記約６９、０００ダルトンの分子量を有する外膜タンパクを分離すること、：色素配位子の支持体へ結合したタンパク質を溶離し、・・・溶離液をクロマトフォーカシング支持体へ適用し、そして前記外膜タンパク質をそれから回収することからなる方法。」（特許請求の範囲の請求項４）、「本発明の方法により参生された純粋な６９Ｋ材料は、・・・汚染物質を含有せず、」（第１１頁左下欄第１４行〜右下欄第１行）、「８、前記色素配位子のクロマトグラフィー支持体はアフィーゲルブルー・・・からなる上記第７項記載の方法。」（第１６頁右下欄第１０〜１２行）が記載されている。
　
（３）特許異議申立人が提出した他の証拠及び参考資料
　甲第１７号証は、ノボトニイの欧州特許に対する異議申立てにおいて、特許権者が提出したクライン博士の宣誓供述書であって、実質的に英国特許出願第８４１２２０７号（優先権）の例５に記載されたようにして、百日咳菌による大脳内誘発マウスを防御する精製された６９ｋＤａタンパク質の能力を述べるために実験を実施した内容のものである。
　甲第１８号証の１〜２７は、百日咳菌の変異体（ＢＰ３４８）の提供を依頼するヴァイス博士宛の手紙とそれに対する返事である。
　
（４）訂正後の請求項１〜２０に係る発明についての対比・判断
　ア．特許法第２９条第１項第３号に関して
　ａ．請求項１７に係る発明について
　刊行物１には、Ｂ．bronchisepticaからの６８ｋＤａタンパク質の具体的精製方法に関する事項、及び該精製方法が百日咳菌にも応用できることが記載されているが、凍結乾燥や−４０℃での保温が、カルモジュリンの添加により確認したように、アデニン酸シクラーゼが保持できる条件である旨が記載されていることからみて、刊行物１に記載の発明は、精製物中にアデニン酸シクラーゼを保持しようとする発明である。
　刊行物２、３、１０、１２、１３に記載の発明は、いずれも百日咳菌のＰ６９タンパク質を精製し純粋なものを得ることに関するものであるが、純粋な精製物といってもアデニン酸シクラーゼ活性を有しないものであるのか否かが不明である。
　刊行物１１には、１９８８年に開催されたシンポジウムで使用された要約で、そこにはブレナン法による精製では酵素活性が失われている旨記載されているが、同年に発表された刊行物１１と同じ報告者による刊行物１１と同様の趣旨の論文（特許権者が平成１０年３月１９日付特許異議意見書と共に提出した参考資料１５参照）には、刊行物１１とは異なり、精製６９−ｋＤａタンパク質に結合したわずかな酵素活性がみられた旨記載されていることから、刊行物１１に記載のみでは、精製物は酵素活性を失っているか否かが確かではないものと解される。
　そうすると、刊行物１〜３、１０〜１３に記載の発明は、得られた精製タンパク質が、確かにアデニン酸シクラーゼ活性を有しないとするものではないので、結局請求項１７に係る発明の精製パータクチン調製物は、アデニン酸シクラーゼ活性が検出されない点で、そのようなことが不明な刊行物１〜３、１０〜１３に記載の発明と相違する。
　よって、請求項１７に係る発明が刊行物１〜３、１０〜１３に記載された発明であるとすることはできない。
　
　ｂ．請求項１８に係る発明について
　上記ａ．と同様の理由で、請求項１８に係る発明の精製パータクチン調製物は、アデニン酸シクラーゼ活性が検出されない点で、そのようなことが不明な刊行物１〜３、１０〜１３に記載の発明と相違する。
　よって、請求項１８に係る発明が刊行物１〜３、１０〜１３に記載された発明であるとすることはできない。
　
　イ．特許法第２９条の２違反に関して
　請求項１７に係る発明について
　先願明細書１の例６にはパータクチンを精製することが記載されているが、先願明細書１の優先権の主張の基礎となったイギリス出願の明細書（甲第８号証の２）には、該例６に相当する内容が記載されておらず、該例６の記載を基にして請求項１７に係る発明は先願明細書に記載の発明と同一であるとすることはできない。
　また、先願明細書２の記載について、精製手段として色素配位子のクロマトグラフィーとクロマトフォーカシングが記載されているが、該色素配位子のクロマトグラフィーは、権利者が平成１０年３月１９日付特許異議意見書と共に提出した参考資料１８（第５頁第３パラグラフ参照）によれば、アデニン酸シクラーゼとパータクチンを分離できず、さらに、クロマトフォーカシングは、同じく参考資料１（第６頁第１０〜１２行）によると、同様の原理に基づく等電位フォーカス法と同様にアデニン酸シクラーゼを除去できないと解される。そうすると、先願明細書２に記載の発明の精製タンパク質はアデニン酸シクラーゼを含有するものと認められる。
　したがって、請求項１７に係る発明は先願明細書１及び２に記載の発明と同一ではない。
　
　ウ．特許法第２９条第２項違反に関して
　ａ．請求項１〜１６に係る発明について
　上記（ａ）に記載したように、刊行物１には、精製方法の１つとしてＤＥＡＥ−トリアクリルクロマトグラフィーを採用し、カルモジュリンの添加により確認できるように、アデニン酸シクラーゼを保持した精製物を得ることが、刊行物２、３、１２、１３には、ＤＥＡＥ‐Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでのイオン交換クロマトグラフィーを１工程とする複数の工程からなる精製方法が、刊行物４には、タンパク質をヒドロキシアパタイトに吸着させることにより精製することが、刊行物５には、ヒドロキシアパタイトを百日咳菌の培養上澄からのＰＴ及びＦＨＡの精製に用いることが、刊行物６〜９には、各種タンパク質の精製にヒドロキシアパタイト及びイオン交換媒体を組み合わせて用い、精製する目的物をヒドロキシアパタイトに吸着させることが、刊行物１０には、百日咳菌の６９−ｋＤａタンパク質はアデニル酸シクラーゼ活性を有することが、刊行物１１には、アデニル酸シクラーゼ調整物中に６９−ｋＤａタンパク質が存在し、精製した６９−ｋＤａタンパク質調整物には酵素活性が認められないことが、刊行物１６には、アデニル酸シクラーゼのない百日咳菌の変異体（ＢＰ３４８）が、刊行物１７には、トランスポゾン変異によりアデニル酸シクラーゼのない変異体（ＢＰ３４８）を作ることができることが、刊行物１８には、Ｐ６９の現在通用している精製方法はすべての微量のアデニル酸シクラーゼ不純物を取り除くことが、刊行物１９には、６９−ｋＤ外膜タンパク質は最近クローン化され、配列決定され、抗原の大規模精製に適当な方法が開発された。したがって、精製された抗原を十分な量で入手できることは６９−ｋＤ外膜タンパク質のヒトにおける免疫防御を引き出すことが可能であることが記載されているが、請求項１〜１６における、百日咳毒素と糸状血球凝集素を含まない不純物含有のパータクチンを供給液とし、精製手段をヒドロキシアパタイト及びイオン交換マトリックスとする組合せの点については記載されておらず、また示唆もない。
　そして、請求項１〜１６に係る発明は、上記の組合せを採用することにより、検出可能な量のアデニル酸シクラーゼ活性を有しない、生物学的に純度が高くかつ安定なパータクチンを得るという顕著な効果を奏するものである。　
　したがって、請求項１〜１６に係る発明は刊行物１〜１３、１６〜１９に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるとすることはできない。
　ｂ．請求項１７に係る発明について
　上記ア．ａ．に記載のように、刊行物１〜３、１０〜１３にはアデニン酸シクラーゼ活性が検出されない精製パータクチン調製物が記載されておらず、また示唆もない。
　また上記ウ．ａ．に記載のように、刊行物４、５には、ヒドロキシアパタイトやヒドロキシアパタイトとイオン交換媒体を組み合わせて精製することが記載されており、刊行物１６，１７に記載の百日咳菌の変異体（ＢＰ３４８）は、染色体へのＴｎ５の挿入変異により得られるものであるが、そのような挿入変異体は不安定で更に変異し得るものであって、その結果、アデニン酸シクラーゼ活性が検出されない精製パータクチン調製物を得ることができるか否かについては明確でなく、刊行物２０に記載の菌体も刊行物４，５に記載の菌体と同様に染色体へのＴｎ５の挿入変異により得られるものであるから、不安定で更に変異し得るものであり、刊行物１８及び１９はＰ６９のためのクローニングと配列決定に関するものであることからすると、これらの刊行物には、アデニン酸シクラーゼ活性が検出されない精製パータクチン調製物が記載されているか、または示唆されているとみることはできない。
　そして、請求項１７に係る発明は、上記の組合せを採用することにより、検出可能な量のアデニル酸シクラーゼ活性を有しない、生物学的に純度が高くかつ安定なパータクチンを得るという顕著な効果を奏するものである。　
　したがって、請求項１７に係る発明は刊行物１〜１３、１６〜１９に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。
　
　ｃ．請求項１８〜２０に係る発明について
　請求項１８〜２０に係る発明は、請求項１７の精製パータクチン調製物を含むワクチンであるから、上記ウ．ｂ．に記載の理由と同じ理由で、刊行物１〜５、１０〜１３、１６〜２０には記載されておらず、また示唆もない。
　そして、請求項１８〜２０に係る発明は、上記の組合せを採用することにより、検出可能な量のアデニル酸シクラーゼ活性を有しない、生物学的に純度が高くかつ安定なパータクチンを得るという顕著な効果を奏するものである。　
　したがって、請求項１８〜２０に係る発明は刊行物１〜１３、１６〜２０に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。
　
　エ．特許法第３６条第５項第１号について
　平成１０年１２月１４日付け取消理由通知において、訂正前の請求項６、１５、１６に係る発明は発明の詳細な説明に記載したものではない旨指摘したところ、平成１１年７月１９日付け訂正請求書により特許明細書が訂正されたので、請求項６、１５、１６の記載は発明の詳細な説明に記載したものとなった。
　したがって、本件特許明細書の記載は特許法第３６条第５項第１号の規定を満足するものである。
　
　オ．特許法第３６条第５項第２号について
　平成１１年１１月１２日付け取消理由通知において、請求項１７及び１８に記載された「アデニン酸シクラーゼ活性が検出されない」がどの程度のものを意味するのかが不明である旨指摘したところ、平成１２年６月７日付け特許異議意見書及び平成１３年１月１５日付け回答書において釈明がなされ、その結果、明確となったと判断される。
　　したがって、本件特許明細書の記載は特許法第３６条第５項第２号の規定を満足するものである。
　
（５）異議申立人が提出した他の証拠との対比・判断
　請求項１７に係る発明について
　甲第１７号証によれば、得られたＰ６９は汚染されているとされるが、該Ｐ６９は請求項１７に係る発明の精製パータクチン調製物のように、生物学的に純粋でアデニル酸シクラーゼ活性が検出されないものであるのか否かが不明である。
　また、甲第１８号証の１〜１７により、百日咳菌の変異体（ＢＰ３４８）を広く提供していたとしても、上記ウ．ｂ．に記載したように、ＢＰ３４８によって、生物学的に純粋でアデニン酸シクラーゼ活性が検出されない精製パータクチン調製物を得ることができるか否かについては明確でない。
　そうすると、甲第１７、１８号証には、請求項１７に係る発明の生物学的に純粋でアデニン酸シクラーゼ活性が検出されない精製パータクチンについて、記載も示唆もない。
　そして、請求項１７に係る発明は、生物学的に純粋で、安定であり、アデニン酸シクラーゼ活性が検出されない精製パータクチンを得るという顕著な効果を奏するものと認められる。
　したがって、請求項１７に係る発明は、刊行物１〜１３、１６〜１９及び甲第１７、１８号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものとは認められない。
　
（６）独立特許要件についての結論
  訂正明細書の請求項１〜２０に記載された発明はいずれも特許出願の際独立して特許を受けることができるものである
　
３．訂正の適否についての結論
　以上のとおりであるから、上記訂正請求は、特許法第１２０条の４第３項において準用する平成６年法第１１６号による改正前の第１２６条第１項ただし書、第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
Ｄ．特許異議申立てについての判断
１．本件発明
　請求項１〜２０に係る発明（以下、「本件発明１〜２０」とする。）は、訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１〜２０に記載されたとおりのものである。
　
２．異議申立人の主張
　本件の特許異議申立てにおいて、申立人スミスクライン　ビーチャム　バイオロジカルズ　ソシエテ　アノニムは甲第１〜２２号証を提出して、以下の理由ａ〜ｇにより訂正前の請求項１〜２０に係る発明の特許は取り消されるべきものであると主張している。
　理由ａ：本件の訂正前の請求項１７に係る発明は、甲第１〜７号証に記載された発明であるから特許法第２９条第１項第３号に規定する発明に該当し、特許を受けることができない。
　理由ｂ：本件の訂正前の請求項１８に係る発明は、甲第１〜７号証に記載された発明であるから特許法第２９条第１項第３号に規定する発明に該当し、特許を受けることができない。
　理由ｃ：本件の訂正前の請求項１７に係る発明は、甲第８の１、９の１号証で示す出願の願書の最初に添付した明細書または図面（以下「先願明細書１及び２」という。）に記載された発明と同一であるから特許法第２９条の２号の規定によって特許を受けることができない。
　理由ｄ：本件の訂正前の請求項１〜１６に係る発明は、甲第１〜７，１０，１１，１３〜１６，１９〜２２号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、これらの発明は特許法第２９条第２項の規定によって特許を受けることができない。
　理由ｅ：本件の訂正前の請求項１７に係る発明は、甲第１〜７，１０，１１，１３〜１６号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、これらの発明は特許法第２９条第２項の規定によって特許を受けることができない。
　理由ｆ：本件の訂正前の請求項１８〜２０に係る発明は、甲第１〜７，１０，１１，１３〜１６号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、これらの発明は特許法第２９条第２項の規定によって特許を受けることができない。
　理由ｇ：本件明細書の記載には不備があるから、本件明細書は特許法第３６条第４項または５項の規定を満たしていない。
　
３．申立てについての判断
　本件発明１〜２０について、申立人が甲第１〜２２号証を提出し主張する上記理由ａ〜ｆは採用できないことは上記Ｃ．２．（４）、（５）において述べたとおりである。また、申立人が主張する上記理由ｇに関しても、上記Ｃ．２．（４）オ．において述べたとおり解消している。
　
４．むすび
　以上のとおりであるから、特許異議の申立ての理由及び証拠によっては、請求項１〜２０に係る発明の特許を取り消すことができない。
　また、他に請求項１〜２０に係る発明の特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年９月２１日（２００１．９．２１）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
１．訂正事項ａ
　特許請求の範囲を減縮する目的で、請求項６の記載を「前記粗水溶液が、百日咳菌を培地中で培養し、得られた増殖菌体から尿素を含む抽出剤を用いてパータクチンを含む抽出物を調製し、該抽出物を限外濾過にかけて、該抽出物から高分子量蛋白質が除去された限外濾過液を供給し、該限外濾過液を更に限外濾過にかけて、該限外濾過液から低分子量蛋白質が除去された限外濾過保持液を供給し、該限外濾過保持液からパータクチンを含む沈澱物を形成させ、該沈澱物を溶解させることで前記粗水溶液を得ることにより形成される請求項１に記載の方法。」と訂正した。
２．訂正事項ｂ
　訂正前の請求項１５の誤記を訂正する目的で、請求項１５の記載を「前記粗水溶液の前記分離媒体との接触を通したパータクチンの精製が、該粗水溶液を、前記分離媒体としてのヒドロキシアパタイト及びイオン交換媒体マトリックスの少なくとも一方へのパータクチンの結合のための伝導度で、これら分離媒体への接触に通した後、これら分離媒体の少なくとも一方に結合したパータクチンをその溶出に必要な伝導度を有する緩衝液で選択的に溶出させることによって行われる請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。」と訂正した。
（５４）【発明の名称】
百日咳菌外膜蛋白質の精製方法
【発明の詳細な説明】
　技術分野
　本発明は、分子量が約６９，０００ダルトンであり、以前には６９ｋＤａタンパク、また現在ではパータクチンと呼ばれる百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の培養ブロス及び細胞抽出液から得られる外膜蛋白質の新規な精製方法に関するものである。本方法により得られるタンパクは、百日咳疾患予防のための「コンポーネント」ワクチンに使用される。
　背景技術
　百日咳疾患は、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の感染によるもので、人間、特に幼児で重篤な衰弱性疾患である。過去５０年間に、本疾患は大規模な免疫プログラムにより予防されてきた。北米で現在認可されているワクチンは、「全細胞型」ワクチンで、細菌を発酵槽内で培養した後、得られた百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の細胞をホルムアルデヒドなどの化学薬品で処理して殺菌し、有毒なタンパクを不活化して調製する。この細胞を再度懸濁した後、直接もしくはその他の抗原と混合して使用する。このワクチンは効力が高いが、発熱、局所反応、号泣及び痙攣などの臨床症状を併発する。これらの症状とワクチンの関係は立証されていないにも関わらず、このワクチンに対する一般の許容は低下し、多数の国、例えば日本、スウェーデン、英国などでは予防接種率が減少し、百日咳疾患の大発生を招いている。さらに限定的なワクチンの必要性が認められており、きわめて精製度の高い少数のタンパクから成る有効な百日咳ワクチンの開発に向け、多くの製薬会社及び研究者が大いに努力してきた。このワクチンは、成分ワクチンと呼ばれている。
　この研究は、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の病原性機序に関する情報不足のため、あまり進歩していない。リンパ球増多症促進因子（ＬＰＦ）としても知られる百日咳毒素（ＰＴ）、糸状血球凝集素（ＦＨＡ）、アデニル酸シクラーゼ（アデニレートシクラーゼ：ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ）、リポ多糖体、凝集原及びその他の外膜タンパクなど毒性に関与する多数の因子は、コンポーネントワクチンと比較して限定性が低い「無細胞」ワクチンに含めるべきだとされている。最近の臨床試験の結果、ＰＴ−トキソイドのめから成るワクチンは、幼児の感染を部分的に予防するに過ぎないことが指摘されている。ＰＴ／ＦＨＡ混合ワクチンは、効果がやや高いが、全細胞ワクチンと比較すると、効果があることが知られている。
　可能性の高い予防活性抗原の１つに、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の全ての有毒菌株で認められる分子量が約６９，０００ダルトンの外膜タンパク（パータクチン）がある。このタンパクは、細菌培養中に比較的大量に産生し、発酵ブロスまたは細胞抽出液のいずれからも精製することができる。本発明は、この精製を行うための新規な方法を提供するものである。
　ヒト百日咳ワクチンとしての本外膜タンパクの重要性は、ブタの気管支敗血症菌（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）に対するを予防ワクチンの創製研究の結果から示唆された。すなわち、気管支敗血症菌（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）の細胞表面抽出液を用いて、雌ブタの免疫を試みたところ、分子量が６８，０００ダルトンの細胞表面抗原に対する抗体量と、ブタの新生仔の感染予防の間に相関が認められた。ほぼ同じ分子量を有する抗原が、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、約６９，０００ダルトン）及びパラ百日咳菌（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、約７０，０００ダルトン）で検出された。百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）から得られたタンパクで免疫を与えたマウスは、生存菌を大脳に接種しても発病せず、この試験で、タンパクに対する抗体が、マウスに受動的免疫を付与した。また、エーロゾル感染モデルにおいてもマウスの能動的及び受動的な防御作用が報告されている。
　発表されているパータクチンの精製手順では、精製度の高い非発熱原性の安定した抗原を大量に産生することが不可能である。すでに報告されている方法（カナダ特許第１，２５３，０７３号）は、細胞の酸グリシン抽出、陰イオン交換クロマトグラフィー及び分取型等電点電気泳動法に関するものである。しかし、この方法により得られるパータクチンは、さらに小さなフラグメントに分解し、ｐＨが低下すると分解し、またアデニル酸シクラーゼ活性を有することが報告されている。このため、この抽出方法はタンパクの大規模製造には望ましくないと思われる。また、等電点電気泳動法も、大量製造には不適当である。第２の手順は、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の非采状な菌株の細胞から外膜タンパクを抽出するものであった。このタンパクは、ＤＥＡＥ−セファロース及びアフイゲル−ブルーによるクロマトグラフィーを併用して精製した。青色染料が精製物中に浸出する可能性があるため、安全性に問題がある。ただし、いずれの場合にも、発酵ブロスから直接パーメクチンを精製する方法は述べられていない。
　発明の概略
　本発明を実施した場合、以下に記述する方法を用いて、パータクチンは、好ましい製造源である発酵ブロスから大量に、かつ精製された形で得ることができる。このタンパクは、幼児の百日咳ワクチンとして広く用いる製剤に封入することができる。
　発酵槽内で細菌を培養し、遠心分離および濾過におよって細胞を除去し、上清を濃縮滅菌する。このブロスを低イオン強度に希釈し、その他の抗原を除去した後、各種の担体を用いたクロマトグラフィーで分離し、さらには限外濾過により、パータクチンを精製する。
　また、本タンパクは、細胞から尿素で抽出し、遠心分離し、さらに前記の方法で処理可能な溶液を調製することもできる。
　ゆえに本発明は、１面では、パータクチン以外の百日咳菌抗原の含有量はかなり低いが、夾雑物を含むパータクチン水溶液を供給し、前記の水溶液を微粒子のイオン交換媒体及びゲル濾過媒体に順次通して接触させることにより、前記溶液中のパータクチンを精製し、得られた精製溶液を限界濾過することからなるパータクチンの精製方法を提供するものである。
　本法により精製した場合、得られた精製物はきわめて安定であり、アデニル酸シクラーゼ活性は検出されない。ゆえに、本発明の別の側面は、検出可能な量のアデニル酸シクラーゼ活性を有さず、生物学的に純度が高くかつ安定なパータクチンを提供するものである。
　発明についての記述
　本発明で記載する工程は、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のみを培養し、百日咳用コンポーネントワクチンとして用いることのできる数種のタンパク抗原の精製を可能にするものである。
　本発明では、調節条件下の発酵槽内で百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）を培養する。各抗原について、特異的な酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ）により測定した、百日咳菌タンパク（ＰＴ，ＦＨＡ及びパータクチン）が所定の濃度に達するまで、炭素源及び増殖因子を発酵期間中に所定の間隔で連続的、またはバッチに添加する。発酵槽内の培地を取り出し、遠心分離により大部分の細胞を除去し、望ましくは孔径約０．２μの既知のメンブランフィルターを用いて、マイクロフィルトレーションして殺菌する。限外濾過薄膜により、この培地を約１０倍に濃縮し、百日咳毒素及びＦＨＡの精製に用いる（ヨーロッパ特許出願公開第０，３３６，７３６号；米国特許第４，９９７，９１５号参照、これらの特許の開示内容をここに引用する）。取り出した細胞は、凝集素を精製するために使用する。パータクチンは培地または細胞のいずれからも精製することができる。タンパクの大部分は培地中に存在することから、望ましくは培地を用いる。
　パータクチン精製の第１段階として、培地を低イオン強度になるよう希釈し、ＰＴ及びＦＨＡ抗原を除去するため、パーライトまたはその他の適当な微粒子状の固体吸収剤を用いたクロマトグラフィーを行うことが必要である。これについては、前記のヨーロッパ特許出願公開第０，３３６，７３６号、米国特許第４，９９７，９１５号に詳述されている。このＰＴ及びＦＨＡ抗原は、高イオン強度の水溶液により吸収剤から溶出し、百日咳菌コンポーネントワクチンに使用することができる。
　ここで「低イオン強度」という用語は、電導度が約１１ｍＳ／ｃｍ以下、望ましくは４ｍＳ／ｃｍ以下の水溶液をさす。測定単位のｍＳ／ｃｍは、ミリジーメンス／センチメートルのことである。ジーメンス（Ｓ）とは、電導度の単位であり、抵抗（Ω）の逆数に相当し、ｍｈｏと表示されることもある。用いた「高イオン強度」は、電導度が約１１ｍＳ／ｃｍ以上、望ましくは少なくとも約５０ｍＳ／ｃｍの水溶液をさす。
　ついで、残った混合液は、メンブランフィルターで濾過して濃縮し、硫酸アンモニウムで析出し、生成したペレットをＴｒｉｓ−ＨＣｌなど低イオン強度の緩衝液ｐＨ６．０〜８．５に溶解し、溶液の最終電導度を一般には約４ｍＳ／ｃｍ以下、典型的には約３．４ｍＳ／ｃｍとする。この溶液は、水酸化燐灰石（ヒドロキシアパタイト）ならびにＱ−セファローズなどのイオン交換媒体を用いて連続的にクロマトグラフする。前記の緩衝液の電導度では、パータクチンは、両カラムとも吸着されず、流出画分中に溶出する。しかし水酸化燐灰石では電導度が１．５ｍＳ／ｃｍ以下、またＱ−セファローズでは２．８ｍＳ／ｃｍ以下の場合、パータクチンは両カラムとも吸着され、水酸化燐灰石カラムでは電導度が１．５ｍＳ／ｃｍ以上、またＱ−セファローズカラムでは２．８ｍＳ／ｃｍ以上の緩衝液を用いて溶出することができる。
　さらに、分画分子量（ｎｏｍｉｎａｌ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｌｉｍｉｔ：ＮＭＷＬ）が約１００〜３００ｋＤａの膜を用いた限外濾過法でパータクチンを精製する。この場合、パータクチンは濾液中に集まる。ＮＭＷＬ約３０ｋＤａまたはそれ以下の膜を用いて濃縮し、殺菌濾過して、その他の百日咳菌抗原と混合してワクチンに使用する。
　別の方法として、硫酸アンモニウムを添加することにより、パータクチンをＦＨＡ及びＰＴとともに培養培地から沈澱される。沈殿を培地から分離し、再溶解して適当な水溶液を調製し、前記の方法で処理してまずＰＴ及びＦＨＡを除去し、次にパータクチンを精製する。
　パータクチンは、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の細胞からも精製することが可能である。高濃度（例えば４Ｍ）の尿素を含む溶液を用い、室温で約１．５時間細胞を、抽出する。遠心分離により細胞の砕片を除去し、タンパクを含む上清をＮＭＷＬ１００〜１０００ｋＤａの膜を用いて濾過する。凝集素などの高分子タンパクは残るが、大部分のパータクチンは濾過される。濾液を濃縮し、ＮＭＷＬ３０ｋＤａまたはそれ以下の膜を用いてダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）した後、硫酸アンモニウムにより沈澱させ、遠心分離により、前記の処理に用いるペレットを得る。
　パータクチンは、蛋白解裂を受けやすいことが報告されているが、本発明による方法を用いて精製した場合にはきわめて安定である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したところ、精製パータクチンは均質で、分子量が３０〜４０ｋＤａの分解物が微量認められるだけで、基本的には分解は認められなかった。２〜８℃、あるいはさらに高温（２４℃、３７℃）で数か月保存した後も、分解または、免疫抗原性の変化は認められなかった。先願の特許（カナダ特許第１，２５３，０７３号）と比較して、本方法により調製されたパータクチンはアデニン酸シクラーゼ活性を含まず、安定性が増大することにより、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の予防に用いるコンポーネントワクチンとして理想的である。
　実施例
　本発明で使用したタンパク生化学的および免疫化学的方法は、本明細書ならびに本実施例で詳細には記載されていないが、関連する科学的文献には詳細に報告されており、当該技術分野の専門家には十分理解できるものである。
実施例　１
　本実施例では、培養槽中における百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の生育について説明する。
　百日咳菌（Ｂ．　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）は、２５０　Ｌのブロス（Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅの改良培地）を含む培養槽に接種した。培養期間中に、抗原の収量を増強するため、グルタミン酸一ナトリウム塩、ならびにグルタチオン、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、アスコルビン酸、ナイアシンおよびシステイン等の生育要素を培地に添加した。４８時間培養したのち、培地を遠心分離してほとんどの細胞を除去し、ＰＴ、　ＦＨＡおよび大部分のパータクチンを含む上清を、酢酸セルロース膜（孔径０．２２μｍ）を用いた限外濾過によってさらに精製した。殺菌した濾液をＮＭＷＬ２０　ｋＤａの膜で約倍に濃縮し、抗原特異性ＥＬＩＳＡｓによりタンパク濃度および抗原を検定した。
実施例　２
　本実施例では、パーライトカラムクロマトグラフィーによるＰＴおよびＦＨＡの大規模抽出について説明する。
　実施例１と同様に調製した培地濃縮液を水で希釈して、伝導度を４　ｍＳ／ｃｍまたはそれ以下とし、あらかじめ水で平衡化したパーライトカラム（高さ１２　ｃｍ　Ｘ　直径３７　ｃｍ）を用い、タンパク対パーライト比約３　ｍｇ／ｍｌ、約１００　ｃｍ／時間の直線流速でクロマトグラフィーを行った。パーライトに吸着されたタンパクのほとんどはＰＴおよびＦＨＡであり、パータクチンは流出液中に検出された。
実施例　３
　本実施例では、硫酸アンモニウム分画を用いたパータクチン沈澱の生成について説明する。
　実施例２から得られたカラム流出画分を、ＮＭＷＬ１０　ｋＤａの膜を用いた限外濾過により約１０　Ｌに濃縮した。これにより得られる溶液中のタンパク濃度は、通常１〜２ｍｇ／ｍｌであった。室温で攪拌しながら、硫酸アンモニウム（濃縮液１０　Ｌに対して３．５　Ｋｇまたは３５％　ｗ／ｖ）をゆっくりと添加し、混合液を放置して溶解させたのち、２〜８℃の冷蔵庫に置き、さらに２時間、望ましくは１夜攪拌した。遠心分離によって沈澱を集め、１０　ｍＭのトリス・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ　６．０〜８．５、２　Ｌに溶解した。この２　Ｌの溶液に硫酸アンモニウム（５００ｇ）をゆっくりと添加し、溶液を２〜８℃に冷却したのち、少なくとも２時間、通常は１夜攪拌して２回目の硫酸アンモニウム分画（２５％ｗ／ｖ）を行った。最後に、遠心分離によって沈澱を集め、２　Ｌのトリス・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ　７．５、に溶解し、硫酸アンモニウム（伝導度が３．４　ｍＳ／ｃｍ以下の場合）または１０　ｍＭのトリス・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ　７．５（伝導度が３．４　ｍＳ／ｃｍ以上の場合）のいずれかを添加して伝導度を約３．４　ｍＳ／ｃｍに調整した。
実施例　４
　本実施例では、百日咳菌培養培地の濃縮液からのパータクチンの沈澱化について説明する。
　培養培地の濃縮液に硫酸アンモニウム（２５０　ｇ／Ｌ）を添加し、混合液を２〜８℃に冷却したのち、２時間以上攪拌した。遠心分離により沈澱を集め、１０　ｍＭのトリス・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５に溶解し、伝導度が４．０　ｍＳ／ｃｍまたはそれ以下になるまで同一緩衝液を添加した。この溶液には、ＰＴ、ＦＨＡおよびパーテクチンが含まれていた。この溶液からＰＴおよびＦＨＡを除くため、パーライトクロマトグラフィーを行い（実施例２と同様）、カラム流出液について水酸化燐灰石およびＱ−セファローズクロマトグラフィー（実施例５参照）を行った。
実施例　５
　本実施例では、水酸化燐灰石およびＱ−セファローズによるパーテクチンのクロマトグラフィーについて説明する。
　水酸化燐灰石を適当な大きさ、望ましくは直径５　ｃｍ　Ｘ　高さ１０　ｃｍのカラムに充填し、１５　ｍＭの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ　７．５（伝導度約３．４　ｍＳ／ｃｍ）で平衡化した。Ｑ−セファローズも同じ大きさのカラムに充填し、同一の緩衝液で平衡化した。Ｑ−セファローズカラムの上に、水酸化燐灰石カラムを直列に接続した。再溶解したパータクチン（実施例３で得られたもの）は、直列に接続したカラムでクロマトグラフィーを行った場合、吸着剤に吸着されなかったので、流出画分を集めた。ＮＭＷＬ３００　ｋＤａの膜で濾過し、パーテクチンを含む濾液を濃縮し、ＮＭＷＬ３０　ｋＤａ以下の膜を用いてダイアフィルトレーションを行い、最後に０．２２μｍの膜を用いて殺菌濾過した。
実施例　６
　本実施例では、Ｑ−セファローズに対する吸着によるパータクチンの精製について説明する。
　実施例２で得られたパーライトカラム流出画分を約７　Ｌに濃縮した。この濃縮液中のタンパク濃度は、通常１．５〜３．０　ｍｇ／ｍｌの範囲内にあった。濃縮液に、硫酸アンモニウムの結晶を約３５％（ｗ／ｖ）の割合で添加した。これを２〜８℃で２時間以上攪拌した。集めた沈澱を、約５００　ｍｌの１０　ｍＭトリス・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ　８．０に溶解し、ついで硫酸アンモニウム（１００　ｇ／Ｌ）で沈澱させた。２〜８℃で少なくとも２時間攪拌したのち、遠心分離によって上清を分取した。さらに上清に硫酸アンモニウム（１００　ｇ／Ｌ）を添加し、パータクチンを沈澱させた。沈澱を１０　ｍＭのトリス・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ　８．０に溶解し、さらに伝導度を約３．４　ｍＳ／ｃｍに調整した。実施例と同様に、水酸化燐灰石およびＱ−セファローズカラム（それぞれ直径１１　ｃｍ　Ｘ　高さ８　ｃｍ）に通して精製し、３００　ｋＤａ膜で限外濾過し、１０〜３０　ｋＤａの膜で濃縮した。ついで、透析、ダイアフィルトレーションまたは溶媒交換カラムを用いて、パータクチンを１０　ｍＭのトリス・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ　８．０（伝導度約０．６　ｍＳ／ｃｍ）に転溶させたのち、１０　ｍＭのトリス・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ　８．０で平衡化したＱ−セファローズカラム（直径１１　ｃｍ　Ｘ　高さ８　ｃｍ）に吸着させた。５　ｍＭの硫酸アンモニウムを含む１０　ｍＭのトリス・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ　８．０（伝導度約１．７　ｍＳ／ｃｍ）でカラムを洗浄し、１０〜１００　ｍＭ（望ましくは５０　ｍＭ）の燐酸緩衝液、ｐＨ　８．０でパータクチンを溶出させた。精製したパータクチンをＰＢＳに転溶させ、殺菌濾過した。
　別の方法としては、硫酸アンモニウムによる沈澱化工程ののち、イオン強度を約３．４　ｍＳ／ｃｍに調整したパータクチン溶液を水酸化燐灰石カラムのみに通してもよい。カラム流出画分を濃縮し、１０　ｍＭのトリス・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ　８．０に転溶させ、直接Ｑ−セファローズカラムに吸着させる。５　ｍＭの硫酸アンモニウムを含む１０　ｍＭのトリス・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ　８．０でカラムを洗浄したのち、１０〜１００　ｍＭ（望ましくは５０　ｍＭ）の燐酸緩衝液、ｐＨ　８．０でＱ−セファローズカラムからパータクチンを溶出させる。精製したパータクチンを３００　ｋＤａ膜に通して限外濾過し、濃縮し、１０〜３０　ｋＤａの膜でダイアフィルトレーションし、殺菌濾過する。
実施例　７
　本実施例では、百日咳菌（Ｂ．　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の細胞からパータクチンを抽出する方法について説明する。
　百日咳菌（Ｂ．　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）細胞（５％　ｗ／ｖ）を４　Ｍの尿素を含む燐酸緩衝食塩水（１０　ｍＭの燐酸ナトリウム、ｐＨ７．５と０．１５　Ｍの塩化ナトリウム｛ＢＰＳ｝）に懸濁させ、１５秒〜６０分間分散させ、室温で１．５時間攪拌した。５〜６０００　ＸＧで遠心分離を行って細胞の破片を除去した。細胞抽出液を１００　ｋＤａまたは３００　ｋＤａ膜に通して、保持されたものを２〜３倍量のＢＰＳでダイアフィルトレーションした。膜を通った濾液とダイアフィルトレーションされた濾液を一緒にし、ＮＷＭＬ３０　ｋＤａ以下の膜を用いてもとの容積の１／５に濃縮し、さらに５倍量のＰＢＳを用いてダイアフィルトレーションした。
実施例　８
　本実施例では、百日咳菌（Ｂ．　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）細胞抽出物からのパータクチンの調製について説明する。
　実施例７で得られた膜保持物に、室温で硫酸アンモニウム（２５％ｗ／ｖ）をゆっくりと添加して沈澱させ、混合物を２〜８℃でさらに２時間、望ましくは１夜攪拌した。１５　ｍＭの硫酸アンモニウムを含む１０　ｍＭのトリス・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ　７．５と同じ伝導度（３．５　ｍＳ／ｃｍ）が得られるように飽和硫酸アンモニウムを添加した１０　ｍＭのトリス・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ　７．５に溶解した。ついで、実施例５と同様に、水酸化燐灰石／Ｑ−セファローズクロマトグラフィーによって純粋なパータクチンを得た。
実施例　９
　本実施例では、その他の抗原と組み合わせたパータクチンの免疫原性について説明する。　精製パータクチンの溶液を燐酸アルミニウム（３ｍｇ／ｍｌ）で希釈して調製した各種用量（１〜２０μｇ）のパータクチンに一定用量のＰＴトキソイド、ＦＨＡトキソイドおよび凝集原を添加した。試験０日目および２１日目にモルモット（１群１０匹、体重範囲４００〜４５０　ｇ）に注射し、試験２８日目に採血した。パータクチンは１μｇの低用量でも良好な抗体反応を示した。１〜１０μｇの用量では抗体反応に顕著な差は認められず、パータクチンのロット間でも変動は認められなかった（下表Ｉ参照）。
実施例　１０
　本実施例では、精製したパータクチンの安定性について説明する。
　パータクチンのみの場合、燐酸アルミニウムと混合した場合およびその他の百日咳抗原と混合してワクチン製剤にした場合についてパータクチン抗原の安定性を検査した。パータクチン（燐酸アルミニウムを添加しないもの）を−２０℃、２〜８℃、２４℃および３７℃で所定時間保存した。２ロットを用い、それぞれ保存剤（チメロサルおよびフェノキシエタノール）を添加して試験した。いずれの保存剤を添加した場合にも、少なくとも３カ月間、パータクチン特異性ＥＬＩＳＡ値の減少は認められなかった。保存剤としてフェノキシエタノールを使用した場合には、６および１２カ月時に特異性ＥＬＩＳＡ値の減少が認められた。結果は下表ＩＩに示す。
　燐酸アルミニウムを用いて調製したワクチン製剤は、２〜８℃、２４℃および３７℃で保存した。抗原の安定性は、外観、パータクチン特異性ＥＬＩＳＡ、タンパク濃度、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、単一特異性抗パータクチン血清を用いたウエスタン分析およびモルモットを用いた免疫原性試験で評価した。下表ＩＩＩに示したごとく、パータクチンは単独でも、いずれのアジュバントまたはその他の抗原と混合した場合にも、保存期間中に変化が認められなかった。実験に使用した材料は、パータクチンのみを燐酸アルミニウムアジュバントと混合したもの、および燐酸アルミニウムを用いてワクチンに製剤したものである。
　記述の要約
　上記の記述を要約すると、本発明はコンポーネントワクチンの成分として配合するのに適した形のパータクチンを、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ種の培養生産物からのカラムクロマトグラフィーと限外濾過を用て回収する新規な方法を提供する。本発明の範囲ないで種々の変法が可能である。
ａ）＝Ｌｏｇ２（反応力価／１００）：群当たり動物８匹
＊　＝これらの材料は、ワクチン製剤であった。
投与量：抗原は、１ｍＬに溶解し、動物当たり投与量は、試験０日目で０．５ｍＬ、試験２１日目で０．５ｍＬであった。試験２８日目に採血した。
Ｇ２３６１−ＴＨ＝防腐剤として０．０１％のチメロサールを含むパータクチン製剤
Ｇ２３６１−Ｐ　＝防腐剤として０．５％の２−フェノキシエタノールを含むパータクチン製剤
ａ）　＝試料中のタンパク濃度は、試料にＴＡＣを添加して沈澱させ、ＢＣＡ検定（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定した。
ｂ）　＝０時における試料中のタンパク濃度は、Ｋｊｅｌｄａｈｌによって測定した。
注：試料ｂ、ｃ及びｄは、注射直前に試料を希釈してパータクチンの濃度を６μｇ　／ｍＬとし、試験０日目には０．５ｍＬ、試験２８日目には０．５ｍＬを各動物に投与した。
注：試料ｅ及びｆについては、抗原を１ｍＬに溶解し、動物当たり投与量は、試験０日日で０．５ｍＬ、試験２８日目で０．５ｍＬであった。
ａ）＝Ｌｏｇ２（反応力価／１００）：群当たり動物８匹
ｂ）＝リン酸アルミニウムに吸着させたパータクチン溶液。５４μｇ／ｍＬのパータクチンを含む。
ｃ）＝リン酸アルミニウムに吸着させたパータクチン溶液。１３４μｇ／ｍＬのパータクチンを含む。
ｄ）＝リン酸アルミニウムに吸着させたパータクチン溶液。７７μｇ／ｍＬのパータクチンを含む。
ｅ）＝１０μｇ／ｍＬのパータクチンを含むワクチン製剤
ｆ）＝６μｇ／ｍＬのパータクチンを含むワクチン製剤
（５７）【特許請求の範囲】
１．実質的に百日咳毒素（ＰＴ）および糸状血球凝集素（ＦＨＡ）を含まない不純物含有のパータクチンの粗水溶液を供給し、
　該粗水溶液を分離媒体であるヒドロキシアパタイト及びイオン交換媒体マトリックスヘの接触に通して、前記パータクチンを水溶液中で精製し、
　得られた精製パータクチンの溶液を回収する
ことを特徴とするパータクチンの製造方法。
２．前記粗水溶液が、
　百日咳菌を培地中で培養し、パータクチン、百日咳毒素（ＰＴ）、糸状血球凝集素（ＦＨＡ）及び増殖菌体を含む培養物液を供給し、
　該培養物液から前記増殖菌体を分離し、
　該増殖菌体が分離された培養物液から、百日咳毒素（ＰＴ）、糸状血球凝集素（ＦＨＡ）を選択的に除去してから、パータクチンを含む沈殿物を形成させ、
　得られた沈殿物を溶解させることで前記粗水溶液を得る
ことにより形成される請求項１に記載の方法。
３．前記増殖菌体、百日咳毒素（ＰＴ）及び糸状血球凝集素（ＦＨＡ）が除去された培養物液に、硫酸アンモニウムを添加することによって前記沈殿物を形成させる請求項２に記載の方法。
４．前記粗水溶液が、
　百日咳菌を培地中で培養し、パータクチン、百日咳毒素（ＰＴ）および糸状血球凝集素（ＦＨＡ）及び増殖菌体を含む培養物液を供給し、
　該培養物液から前記増殖菌体を分離し、
　該増殖菌体が分離された培養物液から、パータクチン、百日咳毒素（ＰＴ）及び糸状血球凝集素（ＦＨＡ）を含む沈殿物を形成させ、
　得られた沈殿物の水溶液を形成し、
　該沈殿物の水溶液から百日咳毒素（ＰＴ）及び糸状血球凝集素（ＦＨＡ）を選択的に除去して前記粗水溶液を得る
ことにより形成される請求項１に記載の方法。
５．前記増殖菌体が除去された培養物液に、硫酸アンモニウムを添加することによって前記沈殿物を形成させる請求項４に記載の方法。
６．前記粗水溶液が、
　百日咳菌を培地中で培養し、
　得られた増殖菌体から
尿素を含む抽出剤を用いて
　該抽出物を限外濾過にかけて、該抽出物から高分子量蛋白質が除去された限外濾過液を供給し、
　該限外濾過液を更に限外濾過にかけて、該限外濾過液から低分子量蛋白質が除去された限外濾過保持液を供給し、
　該限外濾過保持液からパータクチンを含む沈殿物を形成させ、
　該沈殿物を溶解させることで前記粗水溶液を得る
ことにより形成される請求項１に記載の方法。
７．前記抽出物の限外濾過が、分画分子量が約１００ｋＤａ〜１０００ｋＤａの膜を用いて行われる請求項６に記載の方法。
８．パータクチンを含む沈殿物の形成に先だって前記限外濾過液に分画分子量が３０ｋＤａ以下の膜でのダイアフィルトレーションを行う請求項６または７に記載の方法。
９．前記限外濾過保持液に、硫酸アンモニウムを添加することにより前記パータクチンを含む沈殿物の形成を行う請求項６、７または８に記載の方法。
１０．前記パータクチンを含む沈殿物の形成を、ｐＨ約６．０〜約８．５の低イオン強度の緩衝液に溶解させることで行う請求項３または６に記載の方法。
１１．前記緩衝液が約４ｍＳ／ｃｍ以下のイオン強度を有する請求項１０に記載の方法。
１２．前記精製パータクチンの水溶液を更に分子量限界が約１００ｋＤａ〜３００ｋＤａの膜を用いた限外濾過にかける請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
１３．前記精製パータクチン溶液の限外濾過処理液を、分画分子量が約３０ｋＤａ以下の膜を用いて更に濃縮する請求項１２に記載の方法。
１４．前記粗水溶液の前記分離媒体との接触は、該分離媒体に結合せずに通過流分中に含まれるパータクチンと、該分離媒体に結合した不純物とを与え、これら分離媒体からの通過流分を集めて前記精製パータクチンの溶液を供給する請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
１５．前記粗水溶液の前記分離媒体との
接触を通した
　該粗水溶液を、前記分離媒体としてのヒドロキシアパタイト及びイオン交換媒体
マトリックス
　これら分離媒体の少なくとも一方に結合したパータクチンをその溶出に必要な伝導度を有する緩衝液で選択的に溶出させる
ことによって行われる請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
１６．限外濾過したパータクチンの溶液をイオン交換媒体マトリックスヘの接触に通して該イオン交換媒体マトリックスにパータクチンを結合させ、該イオン交換媒体マトリックスから精製パータクチンを選択的に溶出させる請求項１５に記載の方法。
１７．生物学的に純粋で、安定であり、アデニン酸シクラーゼ活性が検出されない精製パータクチン調製物。
１８．百日咳菌感染に対するワクチンであって、活性成分としての、生物学的に純粋で、安定であり、アデニン酸シクラーゼ活性が検出されない免疫防御性精製パータクチン調製物と、該活性成分のキャリアーとを含むことを特徴とするワクチン。
１９．他の免疫防御性百日咳菌抗原の少なくとも１種を更に含む請求項１８に記載のワクチン。
２０．他の百日咳菌抗原が百日咳毒素（ＰＴ）、糸状血球凝集素（ＦＨＡ）及び凝集原であり、これらの少なくとも１種が追加された請求項１９に記載のワクチン。