(57)【要約】  ＩＦＣＣ準拠法と同様のＨｂＡ１ｃ含有率を測定できる汎用の手段を提供する。  Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有し、Ｎ末端バリンが修飾されていないペプチド又はタンパク質と反応し、当該ポリペプチド又はタンパク質のＮ末端バリンが修飾されたペプチド又はタンパク質と反応しない抗体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有し、Ｎ末端バリンが修飾されていないペプチド又はタンパク質と反応し、当該ペプチド又はタンパク質のＮ末端バリンが修飾されたペプチド又はタンパク質と反応しない抗体。
【請求項２】
Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有し、Ｎ末端バリンが修飾されていないヘモグロビンと反応し、当該ヘモグロビンのＮ末端バリンが修飾されたヘモグロビンと反応しないものである請求項１記載の抗体。
【請求項３】
ヘモグロビンＡ０と反応し、ヘモグロビンＡ１ｃと反応しないものである請求項１又は２記載の抗体。
【請求項４】
Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有さないヘモグロビンと反応しないものである請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体である請求項１〜４のいずれか１項記載の抗体。
【請求項６】
Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬ（配列番号２）を有し、Ｎ末端バリンが修飾されていないペプチド又はタンパク質を免疫原として用いる請求項１〜５のいずれか１項記載の抗体の製造法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項記載の抗体を用いて試料中のヘモグロビンＡ０量を測定し、抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体を用いて前記試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量を測定し、次式（１）
ヘモグロビンＡ１ｃ含有率（％）＝（ヘモグロビンＡ１ｃ量／（ヘモグロビンＡ１ｃ量＋ヘモグロビンＡ０量））×１００
から試料中のヘモグロビンＡ１ｃ含有率（％）を算出することを特徴とする試料中のヘモグロビンＡ１ｃ含有率の測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未修飾のヘモグロビンβ鎖のＮ末端領域を認識する抗体及び当該抗体を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中のヘモグロビン（以下、「Ｈｂ」という）に糖が結合した糖化ヘモグロビンのうち、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端バリン残基がグルコースで糖化されたヘモグロビンＡ１ｃ（以下、「ＨｂＡ１ｃ」という）は、臨床的に過去１〜２ヶ月の平均血糖値を反映することから、糖尿病の診断や糖尿病の経過観察に適した指標として広く使用されている。【０００３】
ＨｂＡ１ｃの測定法としては、ＨＰＬＣ法及び免疫学的測定法が用いられているが、ＨＰＬＣのカラムの種類や試薬メーカー間によって、測定対象が微妙に異なっており、測定の標準化が求められている。かかる観点から、ＩＦＣＣ（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine）のＨｂＡ１ｃ標準化のワーキンググループは、基準測定法（以下、「ＩＦＣＣ準拠法」という）を定めた（非特許文献１）。その方法は、赤血球溶血液をプロテアーゼで消化してヘモグロビンβ鎖のＮ末端ヘキサペプチド（ＶＨＬＴＰＥ）（配列番号１）を抽出し、その抽出物中のＨｂＡ１ｃのβ鎖Ｎ末端の糖化ヘキサペプチド（ｆ−ＶＨＬＴＰＥ）と、ヘモグロビンＡ０（以下、「ＨｂＡ０」という）のβ鎖Ｎ末端の修飾されていないヘキサペプチド（ＶＨＬＴＰＥ）（配列番号１）の量を求め、下記式によりＨｂＡ１ｃ含有率（％）を算出するというものである。【０００４】
ＨｂＡ１ｃ含有率（％）＝（ｆ−ＶＨＬＴＰＥ量／（ｆ−ＶＨＬＴＰＥ量＋ＶＨＬＴＰＥ量））×１００＝（ＨｂＡ１ｃ量／（ＨｂＡ１ｃ量＋ＨｂＡ０量））×１００【０００５】
しかしながら、この方法における糖化ヘキサペプチド含量の測定法は、ＨＰＬＣ−ＭＳ又はＨＰＬＣ−キャピラリー電気泳動を用いるものであることから、高価な装置を必要とし、特定の施設でしか測定することができない。また、この測定値は、従来法のＨｂＡ１ｃ値と大きく変わるという問題がある（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Clin. Chem. Lab. Med. 2002；40(1)：78-89
【非特許文献２】糖尿病４６巻９号(2003), 775〜778頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って本発明の課題は、ＩＦＣＣ準拠法と同様のＨｂＡ１ｃ含有率(％)を測定できる汎用の手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、ＨＰＬＣ−ＭＳやＨＰＬＣ−キャピラリー電気泳動法に代わるＩＦＣＣ準拠法を開発すべく検討した結果、Ｈｂβ鎖Ｎ末端のヘキサペプチドＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）に特異的に反応し、このヘキサペプチドが修飾されたペプチドには反応しない抗体の作製に初めて成功した。この抗体とＨｂＡ１ｃ抗体とを用いれば、ＨｂＡ１ｃとＨｂＡ０とが正確かつ簡便に定量でき、簡便な免疫学的手段でＩＦＣＣ準拠法によるＨｂＡ１ｃ含有率（％）が測定できることを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有するペプチド又はタンパク質と反応し、当該ペプチド又はタンパク質のＮ末端バリンが修飾されたペプチド又はタンパク質と反応しない抗体を提供するものである。
また、本発明は、上記抗体を用いて試料中のＨｂＡ０量を測定し、抗ＨｂＡ１ｃ抗体を用いて前記試料中のＨｂＡ１ｃ量を測定し、次式（１）
ＨｂＡ１ｃ含有率（％）＝（ＨｂＡ１ｃ量／（ＨｂＡ１ｃ量＋ＨｂＡ０量））×１００（１）
から試料中のＨｂＡ１ｃ含有率（％）を算出することを特徴とする試料中のＨｂＡ１ｃ含有率の測定法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の抗体を用いれば、試料中のＨｂＡ０量が正確かつ簡便に測定できることから、試料中のＨｂＡ０量とＨｂＡ１ｃ量とを基準とするＩＦＣＣ準拠法によるＨｂＡ１ｃ含有率（％）が簡便かつ正確に測定可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】イムノクロマト法によるＨｂＡ１ｃの測定法概略図を示す。
【図２】イムノクロマト法によるＨｂＡ１ｃの測定法概略図を示す。
【図３】抗原固相化ＥＬＩＳＡ法にてマウス抗血清中の抗体価を測定した結果を示す。
【図４】競合ＥＬＩＳＡ法にて本発明抗体のヘモグロビンβ鎖Ｎ末端ペプチド（ＶＨＬＴＰＥ）（配列番号１）及びその糖化ペプチド（ｆ−ＶＨＬＴＰＥ）に対する反応性を調べた結果を示す。
【図５】競合ＥＬＩＳＡ法にて本発明抗体のヘモグロビンβ鎖Ｎ末端ペプチド（ＶＨＬＴＰＥ）（配列番号１）及びα鎖Ｎ末端ペプチド（ＶＬＳＰＡＤ）（配列番号１０）に対する反応性を調べた結果を示す。
【図６】抗原固相化ＥＬＩＳＡ法にて本発明抗体及び抗ヘモグロビン抗体のＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０に対する反応性を調べた結果を示す。
【図７】抗原固相化ＥＬＩＳＡ法にて本発明抗体、抗ヘモグロビン抗体、及び抗ＨｂＡ１ｃ抗体のＨＰＬＣで分離したヘモグロビン亜分画に対する反応性を調べた結果を示す。
【図８】サンドイッチＥＬＩＳＡによるＨｂＡ１ｃ濃度測定系、及びＨｂＡ０濃度測定系における検量線を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の抗体は、Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有し、Ｎ末端バリンが修飾されていないペプチド又はタンパク質と反応し、当該ペプチド又はタンパク質のＮ末端バリンが修飾されたペプチド又はタンパク質と反応しない抗体である。
Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有し、Ｎ末端バリンが修飾されていないペプチドとしては、アミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）からなるオリゴペプチド、及びアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を含むポリペプチドが挙げられる。Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有し、Ｎ末端バリンが修飾されていないタンパクとしては、正常な成人の主要なＨｂであって、Ｈｂβ鎖を有するヘモグロビンＡ０、及びＨｂδ鎖を有するヘモグロビンＡ２（以下、「ＨｂＡ２」という）のうちδ鎖Ｎ末端が修飾されていないものが挙げられるが、ＨｂＡ２は、非常に微量な成分である。従って、本発明抗体と反応する主要なＨｂとしては、ＨｂＡ０が挙げられる。
一方、前記Ｎ末端バリンが修飾されたペプチド又はタンパク質としては、Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有し、そのＮ末端バリンが糖修飾されたペプチド又はＨｂが挙げられる。当該タンパク質としては、ＨｂＡ１ｃが挙げられる。
従って、本発明の抗体の好ましい形態としては、Ｎ末端にアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有し、Ｎ末端バリンが修飾されていないペプチド又はＨｂと反応し、当該ペプチド又はＨｂのＮ末端バリンが修飾されたペプチド又はＨｂと反応しない抗体が挙げられる。さらに好ましい形態としては、ＨｂＡ０と反応し、ＨｂＡ１ｃと反応しない抗体である。
さらに、本発明の抗体は、Ｈｂ以外のタンパク質とは反応せず、さらにアミノ酸配列ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有さないＨｂ、例えばＨｂＦとは反応しないものであるのが好ましい。【００１３】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であるのが特に好ましい。【００１４】
本発明の抗体は、ＨｂＡ０がβ鎖Ｎ末端にＶＨＬ（配列番号２）を有することから、アミノ酸配列ＶＨＬ（配列番号２）を有するペプチド又はタンパク質を免疫原として用い、常法により作製することができる。免疫原の例としては、ＶＨＬＣ（配列番号３）、ＶＨＬＴＣ（配列番号４）、ＶＨＬＴＰＣ（配列番号５）、ＶＨＬＴＰＥＣ（配列番号６）、ＶＨＬ（配列番号２）、ＶＨＬＴ（配列番号７）、ＶＨＬＴＰ（配列番号８）、ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）、及びこれらのペプチドとキャリアタンパクとが結合した抗原が挙げられる。キャリアタンパクとしてはオボアルブミン（以下、「ＯＶＡ」という）、ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」という）、陽イオン化ＢＳＡ（以下、「ｃＢＳＡ」という）、スカシ貝ヘモシアニン（以下、ＫＬＨという）等が挙げられる。ペプチドとキャリアタンパクとの結合方法は、ＭＢＳ法（ｍ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒを用いる方法）及びＥＤＣ法（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを用いる方法）等が挙げられる。【００１５】
本発明のモノクローナル抗体は、例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８８）に記載の方法に準じて作製することができる。【００１６】
免疫に用いる動物は特に限定されないが、例えばマウス、ラットなどが挙げられる。免疫方法は、一般的な手法に従って行うことができる。例えば、免疫原を通常の緩衝液や生理食塩水に懸濁させたもの、あるいは免疫原と完全フロイントアジュバンドなどの補液との混合物を、動物の皮下、皮内、腹腔などに投与して一時刺激後、必要に応じて同様の操作を繰り返し行う。抗原の投与量は投与経路、動物種に応じて適宣決定されるが、通常の投与量は１回当たり１０μｇ〜１ｍｇ程度が好ましい。【００１７】
細胞融合に用いる免疫細胞は、最終免疫の３〜４日後に摘出した脾臓細胞が好適である。また、前記免疫細胞と融合させる骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ細胞」という）としては、既に確立されている公知の各種細胞株が好ましく、例えばマウスにおけるＮＳ１（Ｐ３／ＮＳＩ／Ｉ−Ａｇ４−１）［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）］、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４［Ｎａｔｕｒｅ  ２７６：２６９（１９７８）］、Ｐ３-Ｘ６３−Ａｇ８．６５３［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：１５４８（１９７９）］、Ｐ３-Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ．１［Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：１（１９７８）］等や、ラットにおけるＹ３−Ａｇ１．２．３．［Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：１３１−１３３（１９７９）］、ＹＢ２／Ｏ（ＹＢ２／３ＨＬ／Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０）［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３Ｂ：１（１９８１）］等が挙げられる。【００１８】
細胞融合には、通常用いられるポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」という）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等を使用することができる。細胞融合の手法は通常の方法と同様であり、例えばミエローマ細胞とミエローマ細胞に対して約１〜１０倍の免疫細胞との混合ペレットに、平均分子量１０００〜６０００のＰＥＧを３０〜６０％の濃度で滴下し、混合する。ハイブリドーマの選択は、通常の選択培地、例えばヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（以下、「ＨＡＴ」という）を含む培地を使用する。ＨＡＴ培地で培養して得られたハイブリドーマを用いて、通常の限界希釈法により、目的とする抗体産生株の検索及び単一クローン化を行えばよい。【００１９】
目的とする抗体産生株は、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等により、ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）を有するペプチド又はタンパク質に反応し、当該ペプチド又はタンパク質のＮ末端バリンが修飾されたペプチド又はタンパク質と反応しない抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより得られる。
具体的には、まず培養上清中のモノクローナル抗体を、固相化した精製ＨｂＡ０抗原と反応させ、次いで標識抗ＩｇＧ抗体を反応させる。抗原固相化ＥＬＩＳＡ法により、ＨｂＡ０に対し高い反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。得られたハイブリドーマの培養上清について、さらに、精製ＨｂＡ０抗原を固相化したプレートを用い、ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）又は糖化ＶＨＬＴＰＥ（ｆ−ＶＨＬＴＰＥ）との間で競合ＥＬＩＳＡ法を行い、ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）に反応し、ｆ−ＶＨＬＴＰＥに反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。【００２０】
当該モノクローナル抗体は、常法に従いハイブリドーマを培養し、培養上清から分離する方法、前記ハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳類動物に投与し、腹水として回収する方法により製造できる。【００２１】
このようにして得られる本発明のモノクローナル抗体は、Ｈｂβ鎖Ｎ末端が修飾されていないペプチド又はタンパク質と反応し、かつＨｂβ鎖のＮ末端が修飾されたペプチド又はタンパク質とは反応しないことから、ＨｂＡ０と反応し、ＨｂＡ１ｃと反応しない抗体である。従って、ＨｂＡ０をＨｂＡ１ｃと区別して免疫測定するための抗体として有用である。【００２２】
本発明の抗体を用いれば、ＩＦＣＣ準拠法と同様のＨｂＡ１ｃ測定が可能になる。すなわち、本発明の抗体を用いて試料中のＨｂＡ０量を測定し、抗ＨｂＡ１ｃ抗体を用いて前記試料中のＨｂＡ１ｃ量を測定し、次式（１）
ＨｂＡ１ｃ含有率（％）＝（ＨｂＡ１ｃ量／（ＨｂＡ１ｃ量＋ＨｂＡ０量））×１００（１）
から試料中のＨｂＡ１ｃ含有率（％）を算出すれば、試料中のＨｂＡ１ｃ含有率が測定できる。【００２３】
また、前記式（１）は、本発明モノクローナル抗体の認識部位を考慮すれば、次式（２）で表わすこともできる。
ＨｂＡ１ｃ含有率（％）＝（ｆ−ＶＨＬＴＰＥ量／（ｆ−ＶＨＬＴＰＥ量＋ＶＨＬＴＰＥ量））×１００（２）【００２４】
本発明方法における、ＨｂＡ０の測定法及びＨｂＡ１ｃの測定法は、通常の免疫学的測定法であればいずれも採用できる。ここで免疫学的測定法としては、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法、ラテックス凝集法、競合ラテックス凝集法等が挙げられる。【００２５】
従来の任意の免疫学的測定法に本発明のモノクローナル抗体を適用することにより、ＨｂＡ０とＨｂＡ１ｃとをそれぞれ測定することができる。
例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定する場合には、精製したＨｂＡ０、又はＨｂＡ１ｃを標準品として次のような方法でＨｂＡ０又はＨｂＡ１ｃを定量できる。すなわち、本発明のモノクローナル抗体又は抗ＨｂＡ１ｃ抗体を固定化したＥＬＩＳＡプレートに、希釈した検体試料を添加し反応させた後、酵素標識した抗ヘモグロビン抗体（以下、「抗Ｈｂ抗体」という）を反応させ、発色後の吸光度の変化から試料中に存在するＨｂＡ０又はＨｂＡ１ｃを特異的に定量できる。
ラテックス凝集法で測定する場合には、精製したＨｂＡ０又はＨｂＡ１ｃを標準品として次のような方法で定量することができる。すなわち、本発明のモノクローナル抗体又は抗ＨｂＡ１ｃ抗体の少なくとも１種を不溶性担体であるラテックス粒子に感作し、検体試料及び抗Ｈｂモノクローナル抗体に接触させることにより、試料中のＨｂＡ０又はＨｂＡ１ｃを介して抗体感作ラテックス粒子同士が架橋し凝集を生じるため、この凝集度の変化から当該ＨｂＡ０又はＨｂＡ１ｃを特異的に定量できる。
あるいは競合ラテックス凝集法で測定する場合には、精製したＨｂＡ０又はＨｂＡ１ｃを標準品として次のような方法で定量することができる。すなわち、ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）又はｆ−ＶＨＬＴＰＥの少なくとも１種を不溶性担体であるラテックス粒子に感作し、検体試料、及び本発明のモノクローナル抗体又は抗ＨｂＡ１ｃ抗体の少なくとも１種を接触させることにより、ペプチド感作ラテックス粒子と抗体による凝集反応に対して検体試料中のＨｂＡ０又はＨｂＡ１ｃが競合阻害を示すため、この競合阻害の変化から当該ＨｂＡ０又はＨｂＡ１ｃを特異的に定量できる。
検体試料としては、ＨｂＡ０又はＨｂＡ１ｃを含有するヒト体液であれば特に制限されず、例えば血液、赤血球画分等が挙げられる。【００２６】
ラテックス凝集法等におけるラテックス粒子としては、ラテックス凝集反応を利用した免疫学的凝集反応及び凝集阻止反応において、一般的に用いられている微粒子の担体であれば特に制限されないが、工業的に大量生産することができる有機系微粒子が好ましい。このような有機系微粒子としては、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単独重合体又は共重合体；スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等が挙げられる。また、このような有機系微粒子に、カルボキシル基、第一級アミノ基、カルバモイル基、水酸基、アルデヒド基等の官能基が結合した反応性有機系微粒子も好ましく使用することができる。上記のラテックス粒子の中では、抗原又は抗体の吸着性に優れ、生物学的活性を長期間安定に保持できる点から、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体等のポリスチレン系ラテックス粒子が好ましい。【００２７】
ラテックス粒子の形状は特に制限されないが、その平均粒子径は、ラテックス粒子表面の蛋白質と測定対象物質との凝集反応の結果生じる凝集体が肉眼又は光学的に検出できるに充分な大きさが望ましい。好ましい平均粒子径としては０．０２〜１．６μｍであり、特に０．０３〜０．５μｍが好ましい。【００２８】
ラテックス粒子に本発明のモノクローナル抗体又は抗ＨｂＡ１ｃ抗体を感作する方法は、特に制限されず、公知の方法が使用できる。例えば、ラテックス粒子表面に物理的に吸着させる方法、官能基を有するラテックス粒子表面に共有結合させる方法、及び免疫学的結合によって感作する方法などが挙げられる。【００２９】
イムノクロマト法で測定する場合には、ＨｂＡ０とＨｂＡ１ｃとが同時に測定できるので特に好適である。例えば図１に示す如く、本発明モノクローナル抗体及び抗ＨｂＡ１ｃ抗体とをそれぞれ別の部位（Ａライン及びＢライン）に固定化したイムノクロマト支持体を用いる。図１中の露出化処理には、グアニジン又はその塩と非イオン性界面活性剤、グアニジン又はその塩と亜硝酸塩、グアニジン又はその塩と非イオン性界面活性剤と亜硝酸塩、もしくは従来公知のグアニジン、チオシアン酸、チオシアン酸リチウム、フェリシアニド、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等を用いることができる。エピトープが露出化されたＨｂＡ０及びＨｂＡ１ｃ含有試料をサンプルパットに滴下する。滴下された試料は、毛細管現象により展開され、Ａラインに到達すると試料中のＨｂＡ０のみが反応し、Ｂラインに到達すると試料中のＨｂＡ１ｃのみが反応する。その他のヘモグロビンは反応せずにエンドパッドまで移動する。Ａライン及びＢラインの色の濃さ、反射強度、又は吸光度等をイムノクロマトリーダーで測定すれば、試料中のＨｂＡ０及びＨｂＡ１ｃがそれぞれ定量できる。ここで、ＨｂＡ０の定量値をＡ、ＨｂＡ１ｃの定量値をＢとすると、ＨｂＡ１ｃ（％）＝（Ｂ／（Ａ＋Ｂ））×１００として、ＨｂＡ１ｃ（％）を求めることも出来る。【００３０】
また、上記イムノクロマト支持体において、予めサンプルパッド上にカラーラテックス結合抗Ｈｂ抗体を含浸させておく（図２）。図２中の露出化処理は、上記と同じものが用いられる。露出化処理されたＨｂＡ１ｃ含有試料をサンプルパットに滴下する。滴下された試料中のＨｂ（図２中だ円で示す）が抗Ｈｂ抗体と反応し、支持体上を移動する。Ａラインにおいては、抗Ｈｂ抗体−ＨｂＡ０−本発明抗体のサンドイッチ複合体が形成される。一方、Ｂラインにおいては、抗Ｈｂ抗体−ＨｂＡ１ｃ−抗ＨｂＡ１ｃ抗体のサンドイッチ複合体が形成される。その他のＨｂと抗Ｈｂ抗体との結合物はエンドパッドまで移動する。形成された前記のサンドイッチ複合体量を、Ａライン及びＢラインの色の濃さ、反射強度、又は吸光度等をイムノクロマトリーダーで測定すれば、試料中のＨｂＡ０及びＨｂＡ１ｃがそれぞれ定量できる。ここで、ＨｂＡ０の定量値をＡ、ＨｂＡ１ｃの定量値をＢとすると、ＨｂＡ１ｃ（％）＝（Ｂ／（Ａ＋Ｂ））×１００として、ＨｂＡ１ｃ（％）を求めることも出来る。
なお、カラーラテックスの代わりに金コロイド粒子等も使用可能である。【００３１】
ここで抗ＨｂＡ１ｃ抗体としては、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、例えば特許文献（特開昭６１−１７２０６４号公報、特開平６−６６７９６号公報）記載のもの等が使用可能である。【００３２】
なお、上記免疫学的測定法を実施するにあたって、本発明の抗体を使用して製造された当該抗体を含む免疫学的測定用キットを用いることができる。当該キットは、免疫学的測定法に用いる一般的な構成要素、例えば、標識物、担体、支持体、緩衝液、安定化剤、反応器等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００３３】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００３４】
実施例１（ハイブリドーマの作製と抗体の獲得）
（Ｉ）材料と方法
（１）精製ＨｂＡ０及び精製ＨｂＡ１ｃの調製
ヒト赤血球溶血液を非特許文献（Ｍｅｌｉｓｅｎｄａ  Ｊ．ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ、ＪＢＣ、２５３（７）、２３２７−２３３２、１９７８）記載のＢｉｏ−Ｒｅｘ７０（バイオラッド社）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、ＨｂＡ０及びＨｂＡ１ｃを精製し、以降の実験に用いた。【００３５】
（２）各種ペプチド及び糖化ペプチドの調製
各配列のペプチドは、ペプチド自動合成装置を用いＦｍｏｃ法により合成、及び精製した。各ペプチドの純度はＨＰＬＣで、９５％以上であることを確認した。また、分子量は、質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）にて理論値と同じであることを確認した。糖化ペプチドは、特許文献（特開昭６１−１７２０６４号公報）記載の方法にて合成及び精製した。すなわち、各配列のペプチドとグルコースを無水ピリジン中で反応させＨＰＬＣで精製した。各糖化ペプチドの分子量は、質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）で理論値、すなわち各ペプチドの分子量に１６２を加算した分子量と同じであることを確認した。【００３６】
（３）抗Ｈｂ抗体、及び抗ＨｂＡ１ｃ抗体の調製
抗Ｈｂ抗体は、上記（１）の精製ＨｂＡ０を免疫原として定法にて作製したマウスモノクローナル抗体を使用した。抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、特許文献（特開昭６１−１７２０６４号公報）記載の方法にて作製したマウスモノクローナル抗体を使用した。すなわち、上記（２）で合成した糖化ペプチド（ｆ−ＶＨＬＴＰＥＥＫＹＹＣ）（配列番号９）をＫＬＨに結合させ、これを免疫原とした。ハイブリドーマのスクリーニングでは、抗原固相化ＥＬＩＳＡで精製ＨｂＡ１ｃと反応し、且つ精製ＨｂＡ０と反応しない株を選択した。【００３７】
（４）免疫用抗原の調製
ａ．ヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端ペプチドのＣ末端側にシステインを結合させた各配列のペプチド（ＶＨＬＣ（配列番号３）、ＶＨＬＴＣ（配列番号４）、ＶＨＬＴＰＣ（配列番号５）、ＶＨＬＴＰＥＣ（配列番号６））を上記（２）のように調製した。これらを０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ含有２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液ｐＨ７．２（以下、「ＰＢＳ」という）に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。
ｂ．市販（ＰＩＥＲＣＥ社製）のマレイミド活性型の各キャリアタンパク（ＯＶＡ、ＢＳＡ、ｃＢＳＡ、ＫＬＨ）を精製水に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。
ｃ．上記ペプチド溶液とキャリアタンパク溶液を１対１で混和後、室温で緩やかに回転させながら２時間インキュベートした。
ｄ．その後、４℃で２日間、ＰＢＳ中にて透析を行った。
ｅ．透析後の液を回収し、各免疫用抗原として使用した。【００３８】
（５）免疫と試験採血
前記免疫用抗原をアジュバントと１：１で混合後、連結シリンジを用いてエマルジョンを作製した。これを雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの背部皮下に注入した（１匹当たり２０〜５０μｇ）。この操作（免疫）を２週間毎に５回繰り返した。免疫開始６週間後に各マウスの眼底からマウス抗血清を採取し、後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法にて該抗血清中の抗体価を確認した。なお、いずれのＥＬＩＳＡ法においても、免疫していないマウスの眼底から採取した血清をコントロールとして用いた。【００３９】
（６）細胞融合
前記試験採血にて高い抗体価が確認されたマウスから脾臓を摘出し、５０％−ＰＥＧ１４５０（シグマ社製）を用いた常法により細胞融合を行った。ミエローマ細胞はＳＰ２／Ｏを用いた。得られた融合細胞は、脾臓細胞として２．５×１０6／ｍＬになるようにＨＡＴ及び１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、９６穴培養プレートに０．２ｍＬずつ分注した。これを５％ＣＯ2インキュベーター中で３７℃にて培養した。【００４０】
（７）スクリーニング
細胞融合１０日後に１次スクリーニングとして、培養上清を用いて後記抗原固相化ＥＬＩＳＡ法を行い、精製ＨｂＡ０に対し高い反応性を示したｗｅｌｌを１次陽性ｗｅｌｌとして選別した。該１次陽性ｗｅｌｌ中の細胞は、２４穴プレートにおいて継代した。
継代２日後、２次スクリーニングとして、培養上清を用いて後記競合ＥＬＩＳＡ法を行い、ヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端ペプチド（ＶＨＬＴＰＥ）（配列番号１）に対し高い反応性を示し、且つ同じアミノ酸配列の糖化ペプチド（ｆ−ＶＨＬＴＰＥ）に反応を示さなかったｗｅｌｌを２次陽性ｗｅｌｌとして選択した。【００４１】
（８）クローニング及びイムノグロブリン（抗体）採取
２次スクリーニングで選別した５株のハイブリドーマを、限界希釈法にてクローニングした。次いで、各ハイブリドーマが産生するイムノグロブリン（抗体）を採取するため、２週間前にプリスタン０．５ｍＬを腹腔内に注射しておいた１２週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ハイブリドーマを細胞数０．５×１０6個の量で腹腔内に投与した。１４日後に腹水を採取し、遠心処理して上清を得た。上清を等量の吸着用緩衝液（３ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１．５ｍｏｌ／Ｌ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ８．５）と混和後、ろ過した。該ろ液を、吸着用緩衝液で平衡化したプロテインＡセファロースカラムに通し、ろ液中の抗体をカラムに吸着させた後、０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させた。該溶出液を、１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で中和後、ＰＢＳで透析を行い、抗体を採取した。【００４２】
（９）ＥＬＩＳＡ用プレートの作製
ＰＢＳに溶解して１μｇ／ｍＬの濃度に調製した精製ＨｂＡ０をスクリーニング用抗原として、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ９６穴プレートに固相化し、４℃で一晩静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下、「ＰＢＳＴ」という）４００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴ（以下、「１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴ」という）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置してブロッキングを行い、ＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。該ＥＬＩＳＡ用プレートは、ＰＢＳＴで３回洗浄後、各試薬を添加して実施例記載の各ＥＬＩＳＡ法試験に用いた。【００４３】
（１０）抗原固相化ＥＬＩＳＡ法
ａ．ＥＬＩＳＡ用プレートに、１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴにより段階希釈した各マウス抗血清、あるいは融合細胞の培養上清を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
ｂ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＨＲＰ−ＧｔＦ（ａｂ’）2−Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ’ｓ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製）を１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで５０００倍希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
ｃ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、オルトフェニレンジアミン塩酸塩を含む発色液（オルトフェニレンジアミン塩酸塩（東京化成社製）を２ｍｇ／ｍＬ、過酸化水素を０．０２％の濃度でｐＨ５．０のクエン酸緩衝液に溶解）(以下、「ＯＰＤ発色液」という)を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１０分間静置した。
ｄ．０．７５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注して反応を停止した後、プレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定した。【００４４】
（１１）競合ＥＬＩＳＡ法
ａ．ＥＬＩＳＡ用プレートにヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端ペプチド（ＶＨＬＴＰＥ）（配列番号１）、又は同じアミノ酸配列の糖化ペプチド（ｆ−ＶＨＬＴＰＥ）を１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで適当な濃度に希釈した溶液を２５μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。
ｂ．次いで、１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで適当な濃度に希釈した融合細胞の培養上清を２５μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
以降の操作は、前記（１０）抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の工程イ〜エと同様に行った。【００４５】
（ＩＩ）結果
（１）試験採血における抗原固相化ＥＬＩＳＡ法試験の結果
試験採血を行い、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法により各マウス抗血清中抗体の精製ＨｂＡ０に対する反応性を調べた結果、６種のマウス抗血清全てにおいてＨｂＡ０に対する反応性が確認された（図３）。本実施例で得られた各マウス抗血清は、免疫用抗原であるヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端ペプチドとキャリアタンパクの複合体、及びスクリーニング用抗原であるＨｂＡ０中の共通部分であるＨｂβ鎖のＮ末端配列を特異的に認識する抗体を含むと考えられた。【００４６】
（２）スクリーニング
１次スクリーニングで固相化された精製ＨｂＡ０に高い反応性を示した株を選択し、さらにその選択株について２次スクリーニングを実施した結果、５種の抗体（８５２０１、８５２０２、８５２０３、８５２０４、及び８５２０６）は、ヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端ペプチド（ＶＨＬＴＰＥ）（配列番号１）に対し高い反応性を示し、且つ同じアミノ酸配列の糖化ペプチド（ｆ−ＶＨＬＴＰＥ）に反応性を示さないことが判明した。【００４７】
（３）クローニング及びイムノグロブリン（抗体）採取
２次スクリーニングで選択された５種についてクローニングを実施し、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを独立行政法人産業技術総合研究所（２００８年１１月２８日付け、日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１中央第６）に寄託した。受託番号は以下のとおりである。【００４８】
抗体番号：受託番号
８５２０１：ＦＥＲＭ    ＢＰ−１１１８７
８５２０２：ＦＥＲＭ    ＢＰ−１１１８８
８５２０３：ＦＥＲＭ    ＢＰ−１１１８９
８５２０４：ＦＥＲＭ    ＢＰ−１１１９０
８５２０６：ＦＥＲＭ    ＢＰ−１１１９１【００４９】
実施例２（各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の特異性評価）
（Ｉ）材料と方法
（１）試薬の調製
評価に用いた各抗原及び各抗体は、実施例１の（１）から（４）と同様の操作で調製した。また、ＨＰＬＣフラクションは、ヒト赤血球溶血液を東ソー社製のＴＳＫ−ｇｅｌ  ＧｌｙｃｏＨＳｉカラムを用いたＫＯ５００法により分離し、フラクションコレクターを用い回収した各フラクションを用いた。抗原固相化ＥＬＩＳＡに添加するときは、各フラクションをＰＢＳで６倍希釈して使用した。【００５０】
（２）特異性の評価
実施例１の抗原固相化ＥＬＩＳＡ及び競合ＥＬＩＳＡ法と同様に行った。但し、用いた抗体は精製ＩｇＧ（モノクローナル抗体：０．２μｇ／ｍＬ）である。【００５１】
（ＩＩ）結果
（１）ペプチド及び糖化ペプチドに対する反応性
まず、図４に示すように、競合ＥＬＩＳＡにおいて試験に用いた特異抗体（８５２０１、８５２０２）はともにヒトヘモグロビンβ鎖Ｎ末端ペプチド（ＶＨＬＴＰＥ）（配列番号１）に対してのみに反応し、同じアミノ酸配列の糖化ペプチド（ｆ−ＶＨＬＴＰＥ）には反応しないことが確認された。また、図５に示すように、ヒトヘモグロビンα鎖Ｎ末端ペプチド（ＶＬＳＰＡＤ）には反応しないことが確認された。他の３種の特異抗体（８５２０３、８５２０４、８５２０６）についても同様に試験した結果、ＶＨＬＴＰＥ（配列番号１）に対してのみ反応し、且つｆ−ＶＨＬＴＰＥ及びＶＬＳＰＡＤ（配列番号１０）には反応しないことが確認された。
（２）精製ＨｂＡ０及び精製ＨｂＡ１ｃに対する反応性
図６に示すように、抗原固相化ＥＬＩＳＡにおいて、まず、対照として用いた抗Ｈｂ抗体は精製ＨｂＡ０及び精製ＨｂＡ１ｃに対し同等に反応した。これに対し、試験に用いた特異抗体（８５２０１）はＨｂＡ１ｃには反応せず、ＨｂＡ０に対してのみ反応した。他の４種の特異抗体（８５２０２、８５２０３、８５２０４、及び８５２０６）についても同様に試験した結果、精製ＨｂＡ０に対してのみ反応し、精製ＨｂＡ１ｃには反応しないことが確認された。
（３）ＨＰＬＣフラクションに対する反応性
図７に示すように、抗原固相化ＥＬＩＳＡにおいて、まず、対照として用いた抗Ｈｂ抗体は、ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡ０の両方に反応し、また、同じく対照として用いた抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、ＨｂＡ１ｃのピークのみに反応しＨｂＡ０のピークには反応しなかった。これに対し、試験に用いた３種の特異抗体（８５２０１、８５２０２、８５２０６）はＨｂＡ１ｃには反応せず、ＨｂＡ０に対してのみ反応した。他の２種の特異抗体（８５２０３、８５２０４）についても同様に試験した結果、ＨｂＡ０に対して反応し、ＨｂＡ１ｃには反応しないことが確認された。【００５２】
以上の結果から、試験に用いた５種の特異抗体はＨｂＡ１ｃには反応せず、ＨｂＡ０に対してのみ反応すること、また、これらの抗体は、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端ヘキサペプチド配列（ＶＨＬＴＰＥ）(配列番号１)を検出できることが確認された。【００５３】
実施例３（ＥＬＩＳＡによるＨｂＡ１ｃ値の測定）
（Ｉ）材料と方法
（１）抗ＨｂＡ１ｃ抗体、及び抗Ｈｂ抗体の調製
測定に用いた抗ＨｂＡ１ｃ抗体及び抗Ｈｂ抗体は、実施例１の（Ｉ）（３）と同様に調製した。【００５４】
（２）ビオチン標識抗Ｈｂ抗体の調製
上記（１）の抗Ｈｂ抗体を市販のビオチン標識試薬（ＰＩＥＲＣＥ社、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ）を用い、次のように標識した。１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解したビオチン標識試薬０．０５ｍＬを１ｍｇ／ｍＬの濃度の抗Ｈｂ抗体液１ｍＬに添加し、室温で２時間反応させた。反応後、ＰＢＳで透析し測定に使用した。【００５５】
（３）検体及び標準試料の調製
社内ボランティアよりＥＤＴＡ−２Ｎａ入りの真空採血管（積水メディカル社製）に採血し、遠心分離により赤血球を分離した。この赤血球４μＬと抗原処理液（１％Ｔｗｅｅｎ２０−１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＮＯ2−３ｍｏｌ／Ｌ  グアニジン塩酸塩−５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０）０．２ｍＬを混和した。２５℃で１０分間放置後、その混合液を３％スキムミルク−ＰＢＳＴで段階希釈し、下記サンドイッチＥＬＩＳＡの検体として使用した。尚、標準試料は、下記ＨＰＬＣ法により予めＨｂＡ１ｃ濃度及びＨｂＡ０濃度を求めておいた別人の検体を用いた。【００５６】
（４）サンドイッチＥＬＩＳＡによるＨｂＡ０量（濃度）の測定
ａ．実施例１で獲得した特異抗体（８５２０１）をＰＢＳで５μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。これをＥＬＩＳＡプレートに５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、４℃で１夜静置した。
ｂ．ＰＢＳＴ（３５０μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴを１００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
ｃ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、上記（３）で処理した標準試料又は検体を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
ｄ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１μｇ／ｍＬの濃度に希釈したビオチン標識抗Ｈｂ抗体を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
ｅ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１μｇ／ｍＬの濃度に希釈したＨＲＰ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で３０分間静置した。
ｆ．ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＯＰＤ発色液を分注し（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、室温で１０分間静置した。
ｇ．０．７５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注して反応を停止した後、プレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定した。
ｈ．各濃度の標準試料の吸光度をもとに検量線を作成し、それを用い検体の濃度を求めた。【００５７】
（５）サンドイッチＥＬＩＳＡによるＨｂＡ１ｃ量（濃度）の測定
上記（４）と同様の方法で、特異抗体（８５２０１）の代わりに抗ＨｂＡ１ｃ抗体を用いＨｂＡ１ｃ濃度を測定した。【００５８】
（６）ＨｂＡ１ｃ値の算出
上記（４）及び（５）で求めたＨｂＡ０濃度及びＨｂＡ１ｃ濃度をもとに下記式よりＨｂＡ１ｃ値（ＨｂＡ１ｃの含有率）を求めた。【００５９】
ＨｂＡ１ｃ含有率（％）＝（ＨｂＡ１ｃ量（濃度）／（ＨｂＡ１ｃ量（濃度）＋ＨｂＡ０量（濃度）））×１００【００６０】
（７）ＨＰＬＣ法によるＨｂＡ１ｃ値の測定
東ソー自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ−７２３Ｇ８を用い、全ヘモグロビン中のＨｂＡ１ｃの含有率を測定した。【００６１】
（ＩＩ）結果
（１）検量線
標準試料を用い、ＨｂＡ０濃度測定系、及びＨｂＡ１ｃ濃度測定系の検量線を作成した。図８に示すように、両測定系ともに各抗原濃度依存的に吸光度の上昇が確認された。
（２）ＨＰＬＣ法による測定値との比較
本発明抗体を用い上記サンドイッチＥＬＩＳＡで求めたＨｂＡ１ｃ値とＨＰＬＣ法で求めたＨｂＡ１ｃ値を比較した。健常者５名より採取した検体を用い両方法でそれぞれＨｂＡ１ｃ値を求めた。その結果、表１に示すように、両方法で求めたＨｂＡ１ｃ値は概ね同じような値を示した。【００６２】
【表１】
2010067611.tif 000002
【００６３】
以上の結果から、本発明の抗体がＨｂＡ０量（濃度）、ＨｂＡ１ｃ量（濃度）、及びＨｂＡ１ｃ値（ＨｂＡ１ｃの含有率）の定量測定に使用できることが確認された。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
2010067611.tif 000009
【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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