(57)【要約】  効果が高く、副作用の心配がなく、摂取が容易であり、且つ価格的にも安全性の面からも長期間服用ができる抗炎症組成物を提供する。本発明は、ｐｙｒｏＧｌｕ−（Ｘ）ｎ−Ａ（Ｘは同一または異なって、Ｇｌｎ、ＡｓｎまたはＰｒｏであり、ＡはＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅであり、ｎは０〜２の整数である）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩、ならびにこれを含む抗炎症組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式：
ｐｙｒｏＧｌｕ−（Ｘ）ｎ−Ａ
（Ｘは同一または異なって、Ｇｌｎ、ＡｓｎまたはＰｒｏであり、ＡはＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅであり、ｎは０〜２の整数である）
で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩。
【請求項２】
ＸがＧｌｎまたはＰｒｏであり、ＡがＧｌｎ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅであり、ｎが０または１である、請求項１記載のペプチドまたはその塩。
【請求項３】
ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｌｅｕ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｖａｌ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｍｅｔ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｈｅ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ−ＧｌｎおよびｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎからなる群から選択される、請求項２記載のペプチドまたはその塩。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のペプチドまたはその塩の少なくとも１種を有効成分として含有する、抗炎症組成物。
【請求項５】
腫瘍壊死因子変換酵素および／またはカスパーゼ１を阻害することにより炎症を抑制するための、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
腫瘍壊死因子および／またはインターロイキンが関与する炎症性の疾患または状態を予防、改善または治療するための請求項４または５記載の組成物。
【請求項７】
食品の形態である請求項４〜６のいずれか１項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症活性を有するペプチド、ならびに該ペプチドを有効成分とする抗炎症組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、特にＴＮＦ−αは、炎症性細胞から放出され、多彩な細胞傷害反応、免疫反応および炎症反応を起こすことで知られている。ＴＮＦ−αは、多くの炎症疾患および自己免疫疾患の発症や遷延化に関与し、さらに血液中に放出されて全身に作用すると、重篤な敗血症および敗血症性ショックを起こすことが知られている。このようにＴＮＦ−αは生体の免疫系に広範に関連する因子であるため、ＴＮＦ−αを抑制する薬剤の開発が盛んに行われている。ＴＮＦ−αは不活性型で生合成され、プロテアーゼによって切断されて活性型となるが、この活性化に関与する酵素は腫瘍壊死因子変換酵素（ＴＡＣＥ）と呼ばれている。したがってこのＴＡＣＥを阻害する物質は、ＴＮＦ−αに起因する疾患、病態、異常な状態、不具合、不都合な自覚症状などを治療、改善、予防することができる。【０００３】
インターロイキン−１（ＩＬ−１）は、プロスタグランジン、コラゲナーゼおよびホスホリパーゼの産生、好塩基球および好酸球の脱顆粒ならびに好中球の活性化を刺激する主要な炎症性サイトカインである。ＩＬ−１の生理作用は極めて多岐に渡り、免疫細胞の活性化や分化・増殖促進を通じて、局所性または全身性に炎症反応を惹起し、発熱、急性期蛋白の誘導、破骨細胞の活性化等に関与する。このようにＩＬ−１は生体の免疫系に広範に関連する因子であるため、ＩＬ−１を抑制する薬剤の開発が盛んに行われている。ＩＬ−１は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βのサブタイプが存在するが、いずれも不活性型で生合成され、プロテアーゼによって切断されて活性型となる。ＩＬ−１βの活性化に関与する酵素はカスパーゼ１（別名、インターロイキン１β変換酵素（ＩＣＥ））と呼ばれている。したがってこのＩＣＥを阻害する物質は、ＩＬ−１に起因する疾患、病態、異常な状態、不具合、不都合な自覚症状などを治療、改善、予防することができる。【０００４】
従来からＴＡＣＥ阻害剤として、樹木であるモリンダ・シトリフォリアＬ由来の成分がある（特許文献１）。また、ＩＣＥ阻害剤として、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトンが知られている（特許文献２）。しかしながら、これらの成分は簡便に入手できるものではなく、入手できたとしても摂取のしやすさや安全性などに問題があった。
【特許文献１】特開２００７−０１６０１５号公報
【特許文献２】特開平１１−３０２１９２号公報
【発明の開示】
【０００５】
本発明の課題は、効果が高く、副作用の心配がなく、摂取が容易であり、且つ価格的にも安全性の面からも長期間服用ができる、抗炎症組成物を提供することである。
【０００６】
本発明者等は、腫瘍壊死因子変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害作用を有する物質およびカスパーゼ１（ＩＣＥ）阻害作用を有する物質の検索を鋭意行った結果、特定の配列を有するペプチドがＴＡＣＥ阻害活性およびＩＣＥ阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【０００８】
（１）次式：
ｐｙｒｏＧｌｕ−（Ｘ）ｎ−Ａ
（Ｘは同一または異なって、Ｇｌｎ、ＡｓｎまたはＰｒｏであり、ＡはＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅであり、ｎは０〜２の整数である）
で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩。
【０００９】
（２）ＸがＧｌｎまたはＰｒｏであり、ＡがＧｌｎ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅであり、ｎが０または１である、（１）記載のペプチドまたはその塩。
【００１０】
（３）ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｌｅｕ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｖａｌ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｍｅｔ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｈｅ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ−ＧｌｎおよびｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎからなる群から選択される、（２）記載のペプチドまたはその塩。
【００１１】
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチドまたはその塩の少なくとも１種を有効成分として含有する、抗炎症組成物。
【００１２】
（５）腫瘍壊死因子変換酵素および／またはカスパーゼ１を阻害することにより炎症を抑制するための、（４）記載の組成物。
【００１３】
（６）腫瘍壊死因子および／またはインターロイキンが関与する炎症性の疾患または状態を予防、改善または治療するための（４）または（５）記載の組成物。
【００１４】
（７）食品の形態である（４）〜（６）のいずれかに記載の組成物。
【００１５】
本発明により、従来の医薬品による治療よりも安全性が高く簡単な方法で摂取することが可能な、抗炎症組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の好適な実施形態について具体的に説明する。【００１７】
本発明者らは、ｐｙｒｏＧｌｕ−（Ｘ）ｎ−Ａで表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩（以下、該ペプチドを本発明のペプチドと呼称することがある）が、腫瘍壊死因子変換酵素および／またはカスパーゼ１を阻害する活性を有し、抗炎症作用を有することを見出した。ここでｐｙｒｏＧｌｕは、ピログルタミン酸を示し、Ｘは同一または異なって、Ｇｌｎ（グルタミン）、Ａｓｎ（アスパラギン）またはＰｒｏ（プロリン）、好ましくはＧｌｎまたはＰｒｏであり、ＡはＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ（ロイシン）、Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｍｅｔ（メチオニン）、Ｖａｌ（バリン）またはＰｈｅ（フェニルアラニン）、好ましくはＧｌｎ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅであり、ｎは０、１または２、好ましくは０または１である。この式で表されるペプチドとしては、例えば、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｌｅｕ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｖａｌ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｍｅｔ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｈｅ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ−ＧｌｎおよびｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎなどが挙げられる。【００１８】
ピログルタミン酸は、グルタミン酸のγ位のアミド基とα位のアミノ基が閉環したものである。本発明のペプチドは、天然もしくは組換え蛋白質の部分的加水分解物、化学合成法によりもしくは遺伝子工学的に作製したペプチド、またはこれらの組合せであってもよい。【００１９】
本発明のペプチドを構成するアミノ酸としては、Ｄ体、Ｌ体、ＤＬ体（ラセミ体）のいずれも用いることができるが、特にＬ体を用いるのが好ましい。本発明のペプチドを天然蛋白質の部分加水分解によって調製する場合、構成アミノ酸は全てＬ体になる。本発明のペプチドを化学合成法により調製する場合、構成アミノ酸の全部がＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸からなるペプチドでも、アミノ酸のうちいずれかがＬ−アミノ酸であって残りがＤ−アミノ酸であるペプチドでも調製することができ、いずれも本発明のペプチドに包含される。【００２０】
本発明のペプチドの組成は、アミノ酸分析法によって確認することができる。その際、一般的に行われている酸加水分解法では、ピログルタミン酸もグルタミンもグルタミン酸となってしまうため、グルタミンおよびピログルタミン酸はそれぞれに特異的な酵素を用いて分解後定量する方法が好ましく用いられる。また、ペプチドが合成物である場合、合成時における各アミノ酸の使用量や割合などから組成を求めることができる。【００２１】
本発明のペプチドの塩は、薬学的または食品として許容できる塩であれば特に制限されないが、たとえば、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硫酸、硝酸およびリン酸等の無機酸との塩、酢酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸およびクエン酸等の有機酸との塩が挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウムおよびカリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウムおよびマグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アンモニウムおよびトリエチルアミン等のアミン類との塩が挙げられる。【００２２】
本発明のペプチドを天然の蛋白質の部分加水分解によって調製する場合、蛋白質の加水分解方法としては、公知の方法を適宜採用できる。具体的には、酸を用いて加水分解する方法や、プロテアーゼを用いて加水分解する方法などが挙げられる。【００２３】
加水分解に用いる天然の蛋白質は、入手可能なものであればどのような蛋白質でもよいが、安全性が確認されている蛋白質を用いるのが好ましい。そのような蛋白質として、たとえば、動物の肉、皮、乳、血液などに由来する動物性蛋白質、ならびに米や小麦などの穀類、および柿や桃などの果実類などに由来する植物性蛋白質が挙げられる。これらの中でも、小麦の種子に含まれるグルテンなどの蛋白質は、グルタミンが豊富に含まれていることが知られており、本発明のペプチドを調製するための原料として好ましい。【００２４】
酸を用いて蛋白質を加水分解する方法としては、慣用の方法を採用できる。酸としては、鉱酸である硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、亜硫酸など、有機酸であるシュウ酸、クエン酸、酢酸、ギ酸などを使用できる。【００２５】
酸を用いて加水分解する場合、水性媒体中における蛋白質の濃度は、酸の種類や規定度により適宜調節する必要があるが、通常１.０〜８０質量％に調整して処理するのがよい。【００２６】
プロテアーゼを用いて蛋白質を加水分解する場合、水性媒体中、１種または複数種のプロテアーゼを作用させて加水分解物を生成させることができる。酸性プロテアーゼを単独で用いる方法、および酸性プロテアーゼと中性プロテアーゼもしくはアルカリ性プロテアーゼとを用いる方法が、効率よく加水分解することができる点で好ましい。また、蛋白質として植物性蛋白質を用いる場合、植物に含まれる澱粉や繊維質がプロテアーゼ作用や精製時の障害となる場合がある。そのような場合、前述のプロテアーゼを作用させる前後、あるいはプロテアーゼとともに、アミラーゼやセルラーゼなどの糖分解酵素を作用させるのが好ましい。【００２７】
このようにして得られた蛋白質加水分解物を精製する方法としては、不溶物を濾過する方法や、含水アルコール等により分画（抽出）する方法、ゲル濾過クロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やオートフォーカシングで精製する方法等が挙げられる。【００２８】
本発明のペプチドを化学合成法により調製する場合、液相合成法および固相合成法のいずれを使用してもよい。好ましくは、固相担体にアミノ酸またはペプチドのＣ末端を、リンカーを介して固定化し、順次Ｎ末端側へアミノ酸を伸張していく固相合成法が好ましい。固相合成法を採用する場合、ペプチド合成装置（たとえば、島津社製のＰＳＳＭ８、ＡＢＩ社製のＭｏｄｅｌ  ４３３Ａ等）を使用して合成することもできる。【００２９】
固相合成において用いられる固相担体は、本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸であるＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅのカルボキシル基との結合性を有するものであればいずれのものでも使用することができ、たとえば、ベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ樹脂）、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、アミノメチル樹脂、メチルベンズヒドリル樹脂（ＭＢＨＡ樹脂）、アセトアミドメチル樹脂（ＰＡＭ樹脂）、ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂（Ｗａｎｇ樹脂）、４−アミノメチルフェノキシメチル樹脂、４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂等が挙げられる。【００３０】
具体的な合成法の一例として、本発明のペプチドであるｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎを調製する場合の手順を以下に示す。【００３１】
Ｃ末端アミノ酸であるグルタミン（Ｇｌｎ）のカルボキシル基を保護したものを用意し、続いてアミノ基がＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）基またはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）基等の保護基によって保護され、カルボキシル基が活性化された２番目のアミノ酸であるグルタミン（Ｇｌｎ）を縮合させる。次いで、生成したＧｌｎ−ＧｌｎジペプチドのＮ末端側グルタミンのアミノ基の保護基を除去した後、アミノ基がＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）基またはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）基等の保護基によって保護され、カルボキシル基が活性化された３番目のアミノ酸であるグルタミン（Ｇｌｎ）を縮合させる。固相合成法を用いる場合は、Ｃ末端アミノ酸のグルタミンのカルボキシル基を保護する代わりに、固相担体に結合させればよい。【００３２】
カルボキシル基の活性化は、該カルボキシル基と種々の試薬とを反応させ、対応する酸クロライド、酸無水物もしくは混合酸無水物、アジド、または−ＯＮｐや−ＯＢｔなどの活性エステル等を形成させることにより行うことができる。また、上記ペプチド縮合反応は、縮合剤やラセミ化抑制剤、たとえば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤ）、カルボジイミダゾール等のカルボジイミド試薬、テトラエチルピロホスフェイト、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）等の存在下に行うこともできる。【００３３】
合成反応終了後、固相合成法の場合にはペプチドを固相担体から解離し、全ての保護基を除去した後、洗浄することにより、Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎトリペプチドを粗ペプチドの状態で得ることができる。次いで、Ｎ末端のグルタミンを環化してピログルタミン酸にすることで、本発明のペプチドが得られる。環化は、水溶液中でも徐々に進行するが、温度を上昇することで早めることができる。また、Ｎ末端アミノ酸としてピログルタミン酸を縮合反応に供して調製することもできる。【００３４】
液相合成法を用いる場合、Ｃ末端のアミノ酸が固相担体に結合していないだけで、固相合成法と同様の手段により合成することができる。このようにして得られた本発明のペプチドを含有する粗ペプチドは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの公知の方法によって適宜精製し、純度の高いペプチドとして得ることができる。【００３５】
上記のようにペプチド化学合成法においては、Ｃ末端側からＮ末端側へ順次アミノ酸を縮合-伸張させていくことにより、目的のアミノ酸配列を有する本発明のペプチドを合成することができる。この際、各アミノ酸のＬ体またはＤ体を用いることにより、いずれかのアミノ酸がＬ−アミノ酸であって残りがＤ−アミノ酸からなるペプチドを合成することもできる。【００３６】
このようにして得られた、本発明のペプチドは、腫瘍壊死因子変換酵素（ＴＡＣＥ）および／またはカスパーゼ１（ＩＣＥ）を阻害する活性を有する。【００３７】
ＴＡＣＥ阻害活性は、ＴＡＣＥと不活性型ＴＮＦ−αを反応させ、生成したＴＮＦ−αの生成量や活性を測定する方法、またはＴＡＣＥに特異的な基質と反応させた生成物量を測定する方法などにより測定することができる。また、市販の測定キット（Ｍｅｒｃｋ）を用いることもできる。【００３８】
ＩＣＥ阻害活性は、ＩＣＥと不活性型ＩＬ−１βを反応させ、生成したＩＬ−１βの生成量や活性を測定する方法、またはＩＣＥに特異的な基質と反応させた生成物量を測定する方法などにより測定することができる。また、市販の測定キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いることもできる。【００３９】
ＴＡＣＥは、炎症性細胞から放出され、多彩な細胞傷害反応、免疫反応および炎症反応を起こすことで知られている腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、特にＴＮＦ−αの活性化に関与することから、このＴＡＣＥを阻害する活性を有する本発明のペプチドは、炎症、特に腫瘍壊死因子（好ましくはＴＮＦ−α）に起因する炎症を抑制する活性を有する。ＩＣＥは、プロスタグランジン、コラゲナーゼおよびホスホリパーゼの産生、好塩基球および好酸球の脱顆粒ならびに好中球の活性化を刺激する主要な炎症性サイトカインであって局所性または全身性に炎症反応を惹起するインターロイキン、特にＩＬ−１βの活性化に関与することから、このＩＣＥを阻害する活性を有する本発明のペプチドは、炎症、特にインターロイキン（好ましくはＩＬ−１、さらに好ましくはＩＬ−１β）に起因する炎症を抑制する活性を有する。【００４０】
本発明において炎症とは、物理的、化学的、又は生物学的な要因による損傷や刺激に対する生体の免疫反応の結果生ずる現象であり、多くの場合、炎症組織における痛み、熱感、発赤、腫脹を引き起こし、さらに炎症組織の機能抑制又は機能喪失を生ずることもある。【００４１】
従って、本発明はまた、上記本発明のペプチドを有効成分として含む、抗炎症組成物、特に、ＴＡＣＥおよび／またはＩＣＥを阻害することにより炎症を抑制するための抗炎症組成物に関する（以下、本発明の組成物と呼称することがある）。本発明の組成物は、腫瘍壊死因子（特にＴＮＦ−α）および／またはインターロイキン（特にＩＬ−１β）が関与する炎症性の疾患または状態を予防、改善または治療するための組成物として使用することもできる。本発明の組成物は、本発明のペプチドを１種類のみ含んでいてもよいし、複数種含んでいてもよい。本発明はまた、本発明のペプチドまたは組成物を哺乳動物に投与することを含む、炎症を抑制する方法、特にＴＡＣＥおよび／またはＩＣＥを阻害することにより炎症を抑制する方法に関する。本発明はまた、本発明のペプチドまたは組成物を哺乳動物に投与することを含む、腫瘍壊死因子（特にＴＮＦ−α）および／またはインターロイキン（特にＩＬ−１β）が関与する炎症性の疾患または状態を予防、改善または治療する方法に関する。【００４２】
腫瘍壊死因子および／またはインターロイキンが関与する炎症性の疾患または状態としては、具体的には、関節炎、炎症、リウマチ、炎症性腸疾患、クローン病、逆流性食道炎、気腫、ぜん息、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、シェ−グレン症候群、悪液質、花粉症、アレルギー反応、食物アレルギー、アレルギー性接触過敏症、接触性皮膚炎、癌、組織潰瘍形成、再狭窄、歯周病、表皮水疱症、骨粗鬆症、移植拒絶反応、インプラントの痛み等不具合、人工関節の痛み等不具合、動脈硬化症、大動脈動脈瘤、うっ血性心不全、心筋梗塞、大脳虚血、虚血再環流症状、子宮内膜症、全身アレルギー、神経変性障害、自己免疫障害、ハンチントン病、パーキンソン病、片頭痛、うつ病、骨破壊性疾患、髄膜炎、神経障害性疼痛、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、強皮症、乾癬、眼新脈管形成、結膜障害、角膜障害、角膜瘢痕、強膜炎、黄斑変性、異常創傷癒合、熱傷、糖尿病、腫瘍浸潤、腫瘍増殖、腫瘍転移、ＡＩＤＳ、敗血症および敗血症性ショックが挙げられ、本発明の組成物は、特にリウマチの予防、改善または治療に特に有効である。【００４３】
その他、腫瘍壊死因子および／またはインターロイキンが関与する疾患や病態として、疲労、慢性疲労症候群、筋肉痛などが知られており、本発明はまた、これらに対しても特に有効である。【００４４】
本発明において疾患または状態の予防には、疾患または状態の発症を抑えることおよび遅延させることが含まれ、疾患または状態になる前の予防だけではなく、治療後の疾患または状態の再発に対する予防も含まれる。本発明において疾患または状態の治療には、疾患または状態を治癒すること、症状を改善することおよび症状の進行を抑えることが包含される。抗炎症活性とは炎症を抑制する活性をさし、炎症の抑制には、炎症の予防および治療が包含され、炎症を抑えること、炎症の進行を抑えること、炎症を治癒すること、および炎症を改善することが含まれる。【００４５】
本発明において哺乳動物は、温血脊椎動物をさし、たとえば、ヒトおよびサルなどの霊長類、マウス、ラットおよびウサギなどの齧歯類、イヌおよびネコなどの愛玩動物、ならびにウシ、ウマおよびブタなどの家畜が挙げられる。本発明の組成物は、霊長類、特にヒトへの投与に好適である。炎症を有するヒト、炎症を有すると診断されているヒト、炎症を発症する可能性があるヒト、炎症を予防する必要があるヒトに、本発明の組成物を投与することが特に好ましい。【００４６】
本発明の組成物は、通常の場合、ペプチドの質量として成人１日当たり０.０１〜２０ｇ、好ましくは０.１〜１０ｇの範囲で投与される。本発明で用いられるペプチドを天然の蛋白質を部分加水分解して調製する場合、天然物に由来する安全性の高いものであるので、その投与量をさらに増やすこともできる。投与量は効果などを見ながら適宜増減するのが望ましい。１日当たりの投与量を１回に投与または摂取することもできるが、数回に分けて投与するのが望ましい。【００４７】
本発明の抗炎症組成物の形態は特に制限されず、たとえば、医薬組成物および食品（飼料を含む）として調製することができる。【００４８】
本発明の組成物を医薬組成物として調製する場合は、通常、本発明のペプチドと薬学的に許容される担体とを含む製剤として調製する。薬学的に許容される担体とは、一般的に、有効成分である本発明のペプチドとは反応しない、不活性の、無毒の、固体または液体の、増量剤、希釈剤またはカプセル化材料等をいい、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物、植物性油などの溶媒または分散媒体などが挙げられる。【００４９】
医薬組成物の剤形は、特に制限されず、錠剤、丸剤、顆粒剤、粉剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、ドリンク剤、液剤、坐剤、流動食等の経口投与形態、舌下錠、点鼻スプレ─剤、注射剤等の非経口投与形態など任意の剤形とすることができる。【００５０】
本発明の医薬組成物の投与方法としては、経口投与の他、医薬の投与に一般に使用されている投与方法、たとえば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等が挙げられる。また、直腸、舌下、鼻内など消化管以外の粘膜から吸収せしめる投与方法を採用することも可能であり、この場合、たとえば、坐剤、舌下錠、点鼻スプレ─剤等の形で投与することができる。【００５１】
医薬組成物における本発明のペプチドの含有量は、その形態により異なるが、乾燥質量を基準として、通常０.００１〜９９質量％、好ましくは０.０１〜９０質量％、より好ましくは１〜８５質量％、さらに好ましくは５〜８０質量％の範囲であり、上述した成人１日当たりの摂取量を達成できるように、１日当たりの投与量が管理できる形にするのが望ましい。【００５２】
本発明の組成物を食品として調製する場合、その形態は特に制限されない。食品には飲料も包含され、健康食品および機能性食品も包含される。健康食品および機能性食品は、具体的には、錠剤、丸剤、顆粒剤、粉剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、ドリンク剤、液剤、流動食等の各種製剤形態とすることができる。製剤形態の食品は、上記医薬組成物と同様に製造することができ、たとえば、適当な賦形剤（たとえば、でん粉、加工でん粉、乳糖、ブドウ糖、水等）を加えた後、慣用の手段を用いて製造することができる。食品の具体例として、さらに、コーヒー飲料、茶飲料、果汁入り飲料、清涼飲料、乳飲料、バター、マヨネーズ、ショートニング、マーガリン、種々のサラダドレッシング、パン類、麺類、米飯類、パスタ、ソース類、菓子、クッキー類、チョコレート、キャンディ、チューインガム、各種調味料、各種ダイエット製品などが挙げられる。これらの食品に本発明のペプチドを配合することにより、本発明の食品形態の組成物を調製してもよい。【００５３】
本発明の食品において、本発明のペプチドの含有量は、食品の形態により異なるが、乾燥質量を基準として、通常０.０１〜８０質量％、好ましくは０.１〜７５質量％、より好ましくは１〜７０質量％、さらに好ましくは５〜７０質量％の範囲である。本発明のペプチドは安全性の高いものであるため、その含有量をさらに増やすこともできる。１日当たりの摂取量は、１回で摂取してもよいが、数回に分けて摂取してもよい。上述した、成人１日当たりの摂取量を達成できるよう、管理できる形にするのが好ましい。【００５４】
抗炎症作用を有する本発明のペプチドもしくはその塩、またはこれを含む本発明の組成物を摂取することにより、炎症を抑制し、特に腫瘍壊死因子および／またはインターロイキンが関与する炎症性の疾患または状態の予防、改善または治療の効果を期待することができる。【００５５】
本発明の組成物には、医薬、食品、飼料の製造に用いられる種々の添加剤を配合することができ、さらに種々の活性物質と共存させてもよい。このような添加剤および活性物質としては、各種油脂、生薬、アミノ酸、多価アルコール、天然高分子、ビタミン、ミネラル、食物繊維、界面活性剤、精製水、賦形剤、安定剤、ｐＨ調製剤、酸化防止剤、甘味料、呈味成分、酸味料、着色料および香料などが挙げられる。また、本発明のペプチドは、抗炎症活性を有するその他の有効成分の１種または複数種と混合または組み合わせて投与することができる。従って、本発明の抗炎症組成物は、本発明のペプチドに加えて、抗炎症活性を有するその他の有効成分を含んでいてもよい。【００５６】
前記各種油脂としては、たとえば、大豆油、サフラワー油、オリーブ油等の植物油脂、牛脂、イワシ油等の動物油脂が挙げられる。【００５７】
前記生薬としては、たとえば、牛黄、地黄、枸杞子、ロイヤルゼリー、人参、鹿茸等が挙げられる。【００５８】
前記アミノ酸としては、たとえば、システイン、ロイシン、アルギニン等が挙げられる。【００５９】
前記多価アルコールとしては、たとえば、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、糖アルコール等が挙げられる。糖アルコールとして、たとえば、ソルビトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、マンニトール等が挙げられる。【００６０】
前記天然高分子としては、たとえば、アラビアガム、寒天、水溶性コーンファイバー、ゼラチン、キサンタンガム、カゼイン、グルテンまたはグルテン加水分解物、レシチン、デキストリン等が挙げられる。【００６１】
前記各種ビタミンとしては、たとえば、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＢ群、ビタミンＥ（トコフェロール）の他に、ビタミンＡ、Ｄ、Ｋ、酪酸リボフラビンなどが含まれる。また、ビタミンＢ群には、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１誘導体、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、さらにビオチン、パントテン酸、ニコチン酸、葉酸などの各種ビタミンＢ複合体が包含される。ビタミンＢ１およびその誘導体には、チアミンまたはその塩、チアミンジスルフィド、フルスルチアミンまたはその塩、ジセチアミン、ビスブチチアミン、ビスベンチアミン、ベンフォチアミン、チアミンモノフォスフェートジスルフィド、シコチアミン、オクトチアミン、プロスルチアミンなどのビタミンＢ１の生理活性を有する全ての化合物が包含される。【００６２】
前記ミネラルとしては、たとえば、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄等が挙げられる。【００６３】
前記食物繊維としては、ガム類、マンナン、ペクチン、ヘミセルロース、リグニン、β−グルカン、キシラン、アラビノキシランなどが挙げられる。【００６４】
前記界面活性剤としては、たとえば、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。【００６５】
前記賦形剤としては、たとえば、白糖、ブドウ糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、乳糖、デキストリン、澱粉、結晶セルロース、サイクロデキストリン等が挙げられる。【００６６】
抗炎症活性を有するその他の有効成分としては、例えば、モリンダ・シトリフォリアＬ由来の成分、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ａｌａ−（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン、甘草（カンゾウ）、グリチルリチン酸、ベツリン、ウルソール酸、プロポリス、アロエ、アセロラ、ユーカリエキス、カミツレエキス、オウバク、カンフル、ベラドンナ、インドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフェナク、ケトプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカム等が挙げられる。【００６７】
上記以外に、たとえば、タウリン、グルタチオン、カルニチン、クレアチン、コエンザイムＱ、α-リポ酸、グルクロン酸、グルクロノラクトン、テアニン、γ−アミノ酪酸、カプサイシン、各種有機酸、フラボノイド類、ポリフェノール類、カテキン類、キサンチン誘導体、フラクトオリゴ糖などの難消化性オリゴ糖、ポリビニルピロリドン等を添加剤として配合してもよい。これら添加剤の配合量は、添加剤の種類と所望すべき摂取量に応じて適宜決められるが、一般的には０.０１〜３０質量％の範囲であり、好ましくは０.１〜１０質量％の範囲である。【００６８】
下記の実施例により本発明のペプチドおよび組成物の製造例および試験例を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されない。
【実施例】
【００６９】
（製造例１）ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎの合成
ＡＢＩ社製のＭｏｄｅｌ ４３３Ａペプチド合成装置を使用し、固相法で合成した。【００７０】
Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｐａｍ樹脂 ２ｇを出発原料とし、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）の各保護アミノ酸を使用し、以下の手順で自動合成を行った。【００７１】
（１）Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｐａｍ樹脂のＢｏｃ基の除去反応
（２）洗浄
（３）Ｂｏｃ−Ｇｌｎの活性化
（４）Ｇｌｎ−Ｐａｍ樹脂に活性化Ｂｏｃ−Ｇｌｎを加えて縮合反応
（５）洗浄
（６）未反応Ｎ端アミノ基のアセチル化反応
（７）洗浄
（８）Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐａｍ樹脂のＢｏｃ基の除去反応
（９）洗浄
（１０）Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）の活性化
（１１）Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐａｍ樹脂に活性化Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）を加えて縮合反応
（１２）洗浄
（１３）未反応Ｎ端アミノ基のアセチル化反応
（１４）洗浄
（１５）Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐａｍ樹脂。【００７２】
なお、Ｂｏｃ基の除去反応はトリフルオロ酢酸−ジクロロメタン（５０：５０）で２０分間処理することにより行った。洗浄工程は全てジクロロメタンを用い、３回行った。縮合反応は、Ｂｏｃ保護アミノ酸を、ＤＣＣ、ＨＯＢｔの存在下、樹脂結合アミノ基の５倍等量を加え、６０分間反応させることにより実施した。【００７３】
得られたＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐａｍ樹脂をペプチド合成装置より取り出して別容器に移し、樹脂１ｇ当たりチオアニソール１ｍＬ、エタンジチオール０.５ｍＬを加え室温で１０分間攪拌した。つぎに氷冷下で、フッ化水素１０ｍＬをゆっくり加え、３０分間攪拌した後、フッ化水素を減圧留去した。冷ジエチルエーテル１００ｍＬで容器を満たし、１分間攪拌してペプチドおよび樹脂を析出させた。これをポリフロンフィルターＰＦ０６０（アドバンテック製）で濾取し、冷ジエチルエーテル（−４０℃）で洗浄した。予め用意した冷ジエチルエーテル３００ｍＬにペプチドをトリフルオロ酢酸約３０ｍＬで溶解させて滴下し、再び析出させた。これを３μｍ孔ＰＴＦＥ膜（アドバンテック製）で濾取し冷ジエチルエーテル（−４０℃）で洗浄し、ペプチドを２規定酢酸に溶解後、凍結乾燥した。保護ペプチド−Ｐａｍ−樹脂２.３５ｇより粗ペプチド１.２１ｇを得た。粗ペプチドを水に溶解し、６０℃で６時間ピログルタミン酸への環化反応を行い、凍結乾燥した。【００７４】
得られた粗ペプチドを下記条件のＨＰＬＣで精製した。【００７５】
カラム： Inertsil ODS-3 φ20×250 mm（GL サイエンス製）
移動相：０.１％トリフルオロ酢酸→０.１％トリフルオロ酢酸中３５％アセトニトリルの濃度勾配
流速：  １０ｍＬ／分
検出器：紫外分光光度計  ２１０ｎｍ  
温度：  ４０℃
ＨＰＬＣクロマトグラムのメインピークを分取し、ペプチドシークエンサーを用いて分取物のアミノ酸配列を解析した。１ｇの粗ペプチドから０.８８ｇのｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ精製ペプチドを得た。【００７６】
（製造例２）ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｌｅｕの合成
Ｂｏｃメソッドを用いて液相法により合成した。【００７７】
（１）Ｂｏｃ−ｐｙｒｏＧｌｕとＨＣｌ  Ｌｅｕ−ＯｔＢｕとの縮合反応
ナス型フラスコにＨＣｌ  Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ（３９０ｍｇ）を入れＤＭＦ５ｍＬに溶解後、氷冷してトリエチルアミン０．１２４ｍＬを加えた。ついでＢｏｃ−ｐｙｒｏＧｌｕ−ＯＨ（４００ｍｇ）、ＨＯＢｔ(４７０ｍｇ)、ＷＳＣＤ  ＨＣｌ(３６７ｍｇ)を加えて、氷冷下１２時間撹拌して縮合反応させた。反応終了後、減圧してＤＭＦを留去し、残渣を酢酸エチルに溶解した後、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１０％クエン酸水溶液、水、飽和食塩水の順に酢酸エチルを洗浄後、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。硫酸ナトリウムをろ別して、ろ液を減圧濃縮して得られた残渣にエーテル−ヘキサンを加えてＢｏｃ−ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕを固化し、採取した。収量は６０９ｍｇ、収率８８％であった。【００７８】
（２）脱保護
上記で得られたＢｏｃ−ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ（６００ｍｇ）をナス型フラスコにとり、トリフルオロ酢酸５ｍＬを加えて溶解させ、１時間、氷冷下にて脱保護反応させた。トリフルオロ酢酸はＮ２ガスで除去し、脱保護ペプチドをエーテルを加えて固化させた後、ろ取した。得られた固体を４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサンに溶解し、エーテルを加えて再度固化させてろ取した。収量２２０ｍｇ、収率５３％であった。【００７９】
（製造例３）ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｖａｌの合成
製造例２と同様の方法でＨＣｌ  Ｈ−Ｖａｌ−ＯｔＢｕ ２０９．７ｍｇを出発原料として合成した。縮合反応の収量は３２６．６ｍｇ、収率８５％であり、脱保護ペプチドは収量２０５．０ｍｇ、収率９１％であった。【００８０】
（製造例４）ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｍｅｔの合成
製造例２と同様の方法でＨＣｌ  Ｈ−Ｍｅｔ−ＯｔＢｕ ２４１．８ｍｇを出発原料として合成した。縮合反応の収量は２０８．３ｍｇ、収率５０％であり、脱保護ペプチドは収量９０．３ｍｇ、収率６０％であった。【００８１】
（製造例５）ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｈｅの合成
製造例２と同様の方法でＨＣｌ  Ｈ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ ２５７．８ｍｇを出発原料として合成した。縮合反応の収量は２４２．９ｍｇ、収率５６％であり、脱保護ペプチドは収量１０３．１ｍｇ、収率５９％であった。【００８２】
（製造例６）ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎの合成
Ｆｍｏｃメソッドを用いて液相法により合成した。【００８３】
（１）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ−ＯｔＢｕの合成
ナス型フラスコにＨＣｌ  Ｈ−Ｇｌｎ−ＯｔＢｕ（１．１５ｇ）を入れＤＭＦ５ｍＬに溶解後、氷冷してトリエチルアミン０．７４ｍＬを加えた。ついでＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（２．９４ｇ）、ＨＯＢｔ (１．３ｇ)、ＷＳＣＤ  ＨＣｌ(１．０１ｇ)を加えて、氷冷下１２時間撹拌して縮合反応させた。反応終了後、減圧してＤＭＦを留去し、残渣を酢酸エチルに溶解した後、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１０％クエン酸水溶液、水、飽和食塩水の順に酢酸エチルを洗浄後、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。硫酸ナトリウムをろ別して、ろ液を減圧濃縮して得られた残渣に、エーテル−ヘキサンを加えてＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ−ＯｔＢｕ固化し、採取した。収量３．５１g、収率９２％であった。【００８４】
（２）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ−ＯｔＢｕの脱Ｆｍｏｃ基
ナス型フラスコにＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ−ＯｔＢｕ（１．１２ g）をとり、１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液の７ｍＬを氷冷下加えた。白濁が生じたのでメタノールを加えて溶解し、０℃で２時間反応させた。クエン酸を加えて中和後、減圧濃縮して得られた白色固体に水を加えて攪拌し、ガム状の固形物を得た。これを、クロロホルムを溶媒としてシリカゲルカラムにかけ、目的成分を分取して、エーテルで固化させた。収量は ５９０ｍｇ、収率 ７３％であった。【００８５】
（３）Ｂｏｃ−ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ−ＯｔＢｕの合成
ナス型フラスコにＨ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ−ＯｔＢｕ（５８０ｍｇ）を入れＤＭＦ５ｍＬに溶解後、氷冷してトリエチルアミン１５６μＬを加えた。ついでＢｏｃ−ｐｙｒｏＧｌｕ−ＯＨ（２３２ｍｇ）、ＨＯＢｔ(２７３ｍｇ)、ＷＳＣＤ  ＨＣｌ(２１３ｍｇ)を加えて、氷冷下１２時間撹拌して縮合反応させた。減圧してＤＭＦを留去し、残渣を酢酸エチルに溶解した後、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１０％クエン酸水溶液、水、飽和食塩水の順に酢酸エチルを洗浄後、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。硫酸ナトリウムをろ別して、ろ液を減圧濃縮して得られた残渣を、さらに真空ポンプで減圧して溶媒を除去した。収量５０９．３ｍｇ、収率６４％であった。【００８６】
（４）脱保護
Ｂｏｃ−ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ−ＯｔＢｕ（７６０ｍｇ）をナス型フラスコにとり、トリフルオロ酢酸１０ｍＬを加えて溶解させ、４時間、氷冷下にて反応させた。トリフルオロ酢酸はＮ２ガスで除去し、エーテルを加えて脱保護ペプチドを固化させた。遠心分離によって固体を採取し、再度エーテルを加えて懸濁させて遠心分離で固体を採取した。この操作を３回繰り返して粗ペプチドを得た。収量４４５ｍｇ、収率１００％であった。【００８７】
（５）ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎの精製
上記で得られた粗ペプチドには水に不溶性の不純物が含まれていたので、粗ペプチドを水に懸濁させ、フィルターを通してろ液を集めた。ろ液に１Ｍ塩酸２ｍＬを入れ、凍結乾燥した。凍結乾燥物にエーテルを加えて本発明のペプチドを固化し、固体を採取して乾燥させた。最終収量２５６ｍｇ、収率６３％であった。【００８８】
（製造例７）ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎの合成
製造例６と同様にＦｍｏｃメソッドを用いて液相法により合成した。最終収量１７４ｍｇ、収率４９％であった。【００８９】
（製造例８）天然蛋白質からのｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｌｅｕ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｉｌｅの抽出
（１）反応釜に、イオン交換水９,７００ｋｇ、無水クエン酸３８ｋｇおよび小麦グルテン(活性グルテン，Weston Foods Limited製)１,５００ｋｇを仕込み、４５℃に加温した後、プロテアーゼ（天野製薬株式会社製「プロテアーゼＭアマノ」）２.２ｋｇおよびアミラーゼ(阪急バイオインダストリー株式会社製「液化酵素Ｔ」)１.１ｋｇを加えて、４５℃で５時間加水分解反応を行い、次いで２５％水酸化ナトリウム水溶液を用いて液のｐＨを４.４〜４.５に調整して７時間保って酵素処理を行った。【００９０】
（２）次いで、液を８０℃に２０分間保ってプロテアーゼを失活させた後、６５℃に冷却し、そこにアミラーゼ(阪急バイオインダストリー株式会社製「液化酵素Ｔ」)０.５ｋｇを加えて小麦グルテン中に含まれていた澱粉質および繊維質を加水分解させた後、液を９０℃に２０分間保ってアミラーゼを失活させた。【００９１】
（３）次に、液を１０℃以下に冷却した後、再度５５℃に加熱し、そこに活性炭（武田薬品工業株式会社製「タケコール」）１００ｋｇを加えて５５℃で３０分間攪拌した。【００９２】
（４）液温を４５℃にし、濃過助剤（昭和化学工業株式会社製「ラヂオライト」）を加えて、加圧濾過装置を使用して濾過を行い、濾液７,０００リットル（７ｍ３）を回収した。【００９３】
（５）上記（４）で回収した濾液を減圧下で濃縮した後、プレートヒーターを使用して１１０℃で２０秒間加熱して殺菌し、次いで５５℃まで冷却した。【００９４】
（６）上記（５）で得られた液を、噴霧乾燥装置を使用して送風温度１６０℃、排風温度８０℃の条件下に噴霧乾燥して、小麦グルテンの加水分解物の粉末約１,０００ｋｇを得た。【００９５】
（７）上記（６）で得られた粉未からゲル濾過法を用いて分子量１０００以下の画分を分取し、さらにＨＰＬＣを用いて精製を行った。ＨＰＬＣでは製造例１と同様の方法で得られたｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｌｅｕ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｉｌｅ合成品を基準に、同じ条件で同じリテンションタイムの部分を採取した。その結果、８００ｋｇの小麦グルテンの加水分解物粉末から、それぞれ４．５ｋｇ、１．６ｋｇ、０．９ｋｇ、０．７ｋｇのペプチドが得られた。【００９６】
（８）ペプチドシークエンサーを用いて精製したペプチドのアミノ酸配列を解析したところ、それぞれｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｌｅｕ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｉｌｅの配列を有していた。【００９７】
（実施例１）錠剤の製造
製造例８で得られたｐｙｒｏＧｌｕ−Ｌｅｕペプチド８４ｇ、結晶セルロース（旭化成株式会社製）１０ｇおよびポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製）５ｇを混合し、これにエタノール３ｍｌを添加して、湿式法により常法に従って類粒を製造した。それにより得られた類粒を乾燥した後、ステアリン酸マグネシウム１.１ｇを加えて打錠用顆粒末とし、打錠機を用いて打錠し、１錠が１ｇの錠剤１００個を製造した（錠剤１錠当たりのｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ含有量０.８４ｇ）。【００９８】
（実施例２）シロップ剤の製造
精製水４００ｇを煮沸し、これに白糖７５０ｇおよび製造例８で得られたｐｙｒｏＧｌｕ−Ｌｅｕペプチド１００ｇをかき混ぜながら加えて溶解し、熱時に布ごしし、これに精製水を加えて全量を１０００ｍｌとしてシロップ剤を製造した（シロップ剤１００ｍｌ当たりのｐｙｒｏＧｌｕ−Ｌｅｕ含有量１０ｇ）。【００９９】
（実施例３）顆粒剤の製造
製造例８で得られたｐｙｒｏＧｌｕ−Ｌｅｕペプチド７６ｇ、乳糖（ＤＭＶ社製）１３.３ｇ、結晶セルロース（旭化成株式会社製）６.７ｇおよびポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製）４ｇを混合し、これにエタノール３０ｍｌを添加して、湿式法により常法に従って顆粒を製造し、乾燥後、整粒して顆粒剤を得た（顆粒剤１０ｇ当たりのｐｙｒｏＧｌｕ−Ｉｌｅ含有量７.６ｇ）。【０１００】
（実施例４）流動食の製造
約６５℃の純水７５０ｍｌにカゼインナトリウム（ＤＭＶ社製）４０ｇ、マルトデキストリン（三和デンプン社製）１６０ｇおよび製造例８で得られたｐｙｒｏＧｌｕ−Ｌｅｕペプチド２５ｇを添加して溶解させ、次いでビタミンミックス５ｇ、ならびにナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、塩素、鉄、リン、銅、亜鉛、マンガンおよびイオウのミネラル混合液５ｇを添加した。混合液をホモミキサー（特殊機化工業製）に投入し、約８０００ｒｐｍにて１５分間粗乳化した。得られた乳化液を約２０℃に冷却し、香料を添加後、１０００ｍＬに最終メスアップを行った。この液２３０ｇをパウチへ充填後、窒素置換を行いながらパウチを密封し、１２１℃で１５分間殺菌を行って濃厚流動食を得た（流動食２３０ｇ当たりのｐｙｒｏＧｌｕ−Ｉｌｅ含有量は約５．８ｇ）。【０１０１】
（実施例５）パンの製造
小麦粉（強力粉）１５０ｇとドライイースト２ｇを混ぜた。他に、製造例８で得られたｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎペプチド２０ｇ、砂糖２０ｇ、食塩３ｇ、脱脂粉乳６ｇを温湯７０ｇに溶かし、鶏卵１個を添加してよく混ぜた。これを小麦粉に加え、手でよくこねた後、バター約４０ｇを加えてさらにこね、２０個のロールパン生地を作った。次いで、発酵させた後、表面に溶き卵を塗り、オーブンにて１８０℃で約１５分焼き、ロールパンを製造した（このロールパンは、１個当たりｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎを約１ｇ含有していた）。【０１０２】
（実施例６）パスタ用ミートソースの製造
パスタ用のミートソース一人前（１５０ｇ）を鍋に入れ、同時に製造例８で得られたｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎペプチド５ｇを加えて加温し、パスタ用ミートソースを調製した。このソースをパウチへ充填した後、窒素置換を行いながらパウチを密封し、１２１℃で１５分間殺菌を行ってｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎペプチドを含有するパスタ用ミートソースを得た。【０１０３】
（実施例７）うどんの製造
小麦粉（中力粉）３００ｇに対して、水１５０ｇに製造例８で得られたｐｙｒｏＧｌｕ−Ｌｅｕペプチド１５ｇおよび食塩１５ｇを分散させたものを加え、よく混ぜこねて寝かす。この後、生地を延伸し、幅約５ｍｍで切断してうどんを製造した。これを沸騰したお湯で約１０分茹でたところ、外観、味、食感ともに良好であった。このうどんは、１食分当たりｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎペプチドを約５ｇ含有していた。【０１０４】
（試験例１）ＴＡＣＥ阻害活性の測定
上記製造例で合成したピログルタミルペプチド（ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｌｅｕ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｖａｌ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｍｅｔ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｈｅ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ）の各１ｍｇ／ｍＬサンプルを調製し、以下のとおりＴＡＣＥ阻害活性を評価した。【０１０５】
１μｍｏｌ／Ｌの反応基質（ＴＡＣＥ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍａｃ−ＰＬＡＱＡＶ−Ｄｐａ−ＲＳＳＳＲ−ＮＨ２）；Ｂｉｏｍｏｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＰ）１０μＬ、１０ｎｇ／１０μＬ酵素液（リコンビナントヒトＴＡＣＥ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）１０μＬ、緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０，５μＭ  ＺｎＣｌ２，０．０１％Ｂｒｉｊ３５）５０μＬ、蒸留水２０μＬにサンプル１０μＬを加えて、３７℃、２０分間反応させた。１０％トリフルオロ酢酸を終濃度１％になるよう加えて反応を停止し、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて、下記条件にて基質と生成物を分離した。基質および生成物は、励起波長３２０ｎｍ、測定波長４０５ｎｍで蛍光測定して定量した。【０１０６】
クロマトグラフィー条件：
Ａ液：１０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）／Ｂ液：８０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
グラジエント：Ｂ液５０％から１００％
カラム：５Ｃ１８  ＡＲ−ＩＩ；４．６φ×１５０
オーブン温度：３０℃
測定波長：２３０ｎｍ
結果は、生成物の蛍光強度の、生成物と基質の蛍光強度に対する比として以下の表１に示す。
【表１】
2010032322.tif 000002
【０１０７】
（試験例２）ＩＣＥ阻害活性の測定
上記製造例で合成したピログルタミルペプチド（ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｌｅｕ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｖａｌ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｍｅｔ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｈｅ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ、ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ）の各１ｍｇ／ｍＬサンプルを調製し、以下のとおりＩＣＥ阻害活性を評価した。【０１０８】
２０００μｍｏｌ／Ｌの反応基質（Ｃａｓｐａｓｅ−１  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ａｃ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＡＭＣ）；Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）１０μＬ、１０Ｕ／μＬ酵素液（Ｃａｓｐａｓｅ−１；Ｂｉｏｍｏｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＰ）５μＬ、緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％ＣＨＡＰＳ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０％グリセロール，１０ｍＭ  ＤＴＴ）６０μＬ、蒸留水２０μＬにサンプル５μＬを加えて、３７℃、２０分間反応させた。１０％トリフルオロ酢酸を終濃度１％になるよう加えて反応を停止し、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて、下記条件にて基質と生成物を分離した。基質および生成物は、励起波長３８０ｎｍ、測定波長４６０ｎｍで蛍光測定して定量した。【０１０９】
クロマトグラフィー条件
Ａ液：１０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）／Ｂ液：８０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
グラジエント：Ｂ液５０％から１００％
カラム：５Ｃ１８  ＡＲ−ＩＩ；４．６φ×１５０
オーブン温度：３０℃
測定波長：２３０ｎｍ
結果は、生成物の蛍光強度の、生成物と基質の蛍光強度に対する比として以下の表２に示す。
【表２】
2010032322.tif 000003
【０１１０】
本明細書で引用したすべての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中に取り入れるものとする。
【国際調査報告】
2010032322.tif 000004
2010032322.tif 000005
2010032322.tif 000006
2010032322.tif 000007