(57)【要約】  同一の電子線照射において０〜８０℃の範囲で水に対する相互作用が変化する温度応答性ポリマーのグラフト効率が異なる２種類以上の材質による表面がパターン状に現れている器材に、それぞれの表面に対し同時に電子線を照射し温度応答性ポリマーをグラフト化して温度応答性細胞培養器材を得る。この方法によれば、簡便な方法で（１）細胞培養時に細胞が付着、増殖し、培養温度を変えることでその付着、増殖した細胞を剥離させられる表面、と（２）細胞を全く付着させない表面を有する温度応答性細胞培養器材を得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
同一の電子線照射において０〜８０℃の範囲で水に対する相互作用が変化する温度応答性ポリマーのグラフト効率が異なる２種類以上の材質がパターン状に現れている器材表面に温度応答性ポリマーがグラフト化されたものであり、その温度応答性ポリマーがグラフト化された当該材質の表面に、少なくとも
（１）細胞培養時に細胞が付着、増殖し、培養温度を変えることでその付着、増殖した細胞を剥離させられる表面、および
（２）細胞を全く付着させない表面
を含む、温度応答性細胞培養器材。
【請求項２】
請求項１の（２）の表面が、1つの（１）の表面の周囲にある、請求項１記載の温度応答性細胞培養器材。
【請求項３】
請求項２の（１）の表面が四角状である、請求項２記載の温度応答性細胞培養器材。
【請求項４】
細胞培養時に細胞が付着、増殖し、培養温度を変えることでその付着、増殖した細胞を剥離させられる表面の材質が、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレートのいずれか、またはそれらの２種以上の組み合わせであるとき、細胞を全く付着させない表面の材質が、ポリメチルペンテン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ＡＢＳ樹脂のいずれか、またはそれらの２種以上の組み合わせである、請求項１〜３のいずれか１項記載の温度応答性細胞培養器材。
【請求項５】
温度応答性ポリマーが、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドである、請求項１〜４のいずれか１項記載の温度応答性細胞培養器材。
【請求項６】
請求項５の温度応答性ポリマーにイオン性モノマー成分が共重合している、請求項５記載の温度応答性細胞培養器材。
【請求項７】
細胞培養時に細胞が付着、増殖し、培養温度を変えることでその付着、増殖した細胞を剥離させられる表面にグラフトしている温度応答性ポリマー量が、０．７〜２．５μｇ／ｃｍ２である、請求項１〜６のいずれか１項記載の温度応答性細胞培養器材。
【請求項８】
細胞を全く付着させない表面にグラフトしている温度応答性ポリマー量が、２．７μｇ／ｃｍ２以上である、請求項１〜７のいずれか１項記載の温度応答性細胞培養器材。
【請求項９】
同一の電子線照射において０〜８０℃の範囲で水に対する相互作用が変化する温度応答性ポリマーのグラフト効率が異なる２種類以上の材質による表面がパターン状に現れている器材の成型方法が、二色成型、インサート成型のいずれかの方法である、請求項１〜８のいずれか１項記載の温度応答性細胞培養器材。
【請求項１０】
同一の電子線照射において０〜８０℃の範囲で水に対する相互作用が変化する温度応答性ポリマーのグラフト効率が異なる２種類以上の材質による表面がパターン状に現れている器材表面全体に、当該温度応答性ポリマーが形成されるモノマー溶液、或いはポリマー溶液のいずれか、若しくはそれらの混合物を塗布し、その後、当該器材表面全体に同一の電子線を照射し、当該器材表面に、
（１）細胞培養時に細胞が付着、増殖し、培養温度を変えることでその付着、増殖した細胞を剥離させられる表面、および
（２）細胞を全く付着させない表面
を形成させる、温度応答性細胞培養器材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学、医学等の分野において有用な細胞培養器材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
今日、動物細胞培養技術が著しく進歩し、動物細胞を対象とした研究開発もさまざまな分野に広がって実施されるようになってきた。対象となる動物細胞の使われ方も、開発当初の細胞そのものを製品化したり、その産生物を製品化するだけでなく、今や細胞やその表層蛋白質を分析することで有用な医薬品を設計したり、患者本人の細胞を生体外で増殖させたり、或いはその細胞の機能を高めて生体内へ戻し治療することも実施されつつある。現在、動物細胞を培養する技術は、多くの研究者が注目している一分野である。【０００３】
ところで、ヒト細胞を含め動物細胞の多くは付着依存性のものである。すなわち、動物細胞を生体外で培養しようとするときは、それらを一度、どこかに付着させる必要性がある。そのような背景のもと、以前より多くの研究者らによって細胞にとってより好ましい器材表面の設計、考案がなされてきたが、これらの技術は何れも細胞培養時に関係するものばかりであった。付着依存性の培養細胞は何かに付着する際、自ら接着性蛋白質を産生する。従ってその細胞を剥離させるときには、従来技術ではその接着性蛋白質を破壊しなければならず、通常酵素処理が行われる。その際、細胞が培養中に産生した各種細胞固有の細胞表層蛋白も同時に破壊されてしまうという重大な課題であったにもかかわらず、現実には解決する手段が全くなく、特に検討されていなかった。この細胞回収時の課題の解決こそが、今後動物細胞を対象とした研究開発を飛躍的に発展させる上で強く求められるものと考えられる。【０００４】
このような背景のもと、特開平２−２１１８６５号公報には、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が０〜８０℃である高分子で器材表面を被覆した細胞培養支持体上にて、細胞を上限臨界溶解温度未満または下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度未満にすることにより酵素処理なくして培養細胞を剥離させる新規な細胞培養法が記載されている。また、特開平０５−１９２１３８号公報には、この温度応答性細胞培養器材を利用して皮膚細胞を上限臨界溶解温度未満或いは下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上或いは下限臨界溶解温度未満にすることにより培養皮膚細胞を低損傷で剥離させることが記載されている。さらに、特願２００７−１０５３１１号公報には、この温度応答性細胞培養器材を用いて培養細胞の表層蛋白質の修復方法が記載されている。温度応答性細胞培養器材を利用することにより、従来の培養技術を更に発展させることが可能になった。【０００５】
温度応答性細胞培養器材を利用することにより、従来の培養技術に対しさまざまな新規な展開をはかれるようになった。しかしながら、ここでの技術は、細胞培養器材表面全体に一様に温度応答性ポリマーが被覆されたものであり、得られる細胞シートの大きさは常に培養器材の大きさに左右されていた。また、その形状も既存の培養容器の培養表面の形状が通常、円状であることから、得られる細胞シートも円状となり、例えばそれを患部に移植する際、細胞シートを効率良く患部に並べられない問題があった。このため、この培養器材表面の温度応答性部分をより精密に設計することが望まれていた。【０００６】
この温度応答性ポリマーの被覆状態に注目すると、特許３４４１５３０号公報では、特異的親和性を有する領域と刺激応答性ポリマー領域が培養面に局所的、或いはパターン状に存在する表面が開示されている。しかしながら、ここでの方法は同一器材表面に少なくとも２段階以上の工程でそれぞれの領域を作製する必要があり器材表面の製造方法は必ずしも効率良く簡便なものではなかった。同様に、特許３６４１３０１号公報にも特異的親和性を有する領域と刺激応答性ポリマー領域が培養面に局所的、或いはパターン状に存在する表面が開示されているが、これらの技術においても上述の理由から器材表面の製造方法は必ずしも簡便なものではなく、その開発が求められていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上述したような温度応答性細胞培養器材に関する問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、従来技術と全く異なった発想からの新規な温度応答性細胞培養器材を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、器材表面に電子線を利用して温度応答性ポリマーをグラフト化する際、同一の電子線照射条件においても器材の材質によって温度応答性ポリマーのグラフト量が異なることが分かった。本発明はこの知見を基になされたものであり、本発明とは、あらかじめ、少なくとも電子線による温度応答性ポリマーのグラフト効率の異なる２種類以上の材質の表面が同一表面上に露出するように細胞培養器材を成型加工しておけば、その後の電子線照射による温度応答性ポリマーのグラフト化では、従来のように何段階にも分けてポリマーを固定化する必要がなく、一度の電子線照射によって温度応答性ポリマーのグラフト量の異なる領域を同時に作製できることが判明した。細胞は所定量の温度応答性ポリマーが被覆された表面では付着し、増殖し、さらに温度を変えるだけで剥離する。しかしながら、細胞は温度応答性ポリマーがその所定量を超えてしまう付着しないことが分かっている。すなわち器材表面の特定の場所にだけ温度応答性ポリマーを所定量グラフト化させたいとき、それ以外の場所では温度応答性ポリマーが大量にグラフト化するようになれば、細胞は前者の表面だけに付着し、増殖し、しかも温度を変えるだけで剥離するようになる。そしてその表面を特定の形状にしておけば、希望する形、或いは希望する大きさの細胞シートを得られるようになる。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。【０００９】
すなわち、本発明は、同一の電子線照射において０〜８０℃の範囲で水に対する相互作用が変化する温度応答性ポリマーのグラフト効率が異なる２種類以上の材質がパターン状に現れている器材表面に温度応答性ポリマーがグラフト化されたものであり、その温度応答性ポリマーがグラフト化された当該材質の表面に、少なくとも
（１）細胞培養時に細胞が付着、増殖し、培養温度を変えることでその付着、増殖した細胞を剥離させられる表面、および
（２）細胞を全く付着させない表面
を含む、温度応答性細胞培養器材を提供する。【００１０】
また、本発明は、同一の電子線照射において０〜８０℃の範囲で水に対する相互作用が変化する温度応答性ポリマーのグラフト効率が異なる２種類以上の材質による表面がパターン状に現れている器材表面全体に、当該温度応答性ポリマーが形成されるモノマー溶液、或いはポリマー溶液のいずれか、若しくはそれらの混合物を塗布し、その後、当該器材表面全体に同一の電子線を照射し、当該器材表面に、
（１）細胞培養時に細胞が付着、増殖し、培養温度を変えることでその付着、増殖した細胞を剥離させられる表面、および
（２）細胞を全く付着させない表面
を形成させる、温度応答性細胞培養器材の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に記載される器材であれば、器材表面に細胞が付着する領域だけに細胞が付着し、温度を変えるだけで剥離できるようになる。従って、細胞シートの形状は所定のものとすることができるようになる。また、本発明の方法によれば、１回の電子線照射で温度応答性ポリマーのグラフト量が異なる領域を同時に作製することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例１のポリスチレン部の形状を示す図である。
【図２】図２は、実施例１の温度応答性細胞培養器材の基板の全体を示す図である。
【図３】図３は、実施例１で得られた温度応答性細胞培養器材の基板の全体を示す図である。
【図４】図４は、実施例１でヒト骨格筋筋芽細胞を培養した結果を示す図である。培養細胞を分かり易くするために染色を行った。
【図５】図５は、実施例１で冷却後の培養細胞を示す図である。
【図６】図６は、実施例２の温度応答性細胞培養器材の基板の全体を示す図である。
【図７】図７は、実施例３の温度応答性細胞培養器材の基板の全体を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本願において、「グラフト化」とは、０〜８０℃の範囲で水に対する相互作用が変化する温度応答性ポリマーを培養器材の表面に固定化（結合）させることを意味する。また、本願において、「固定化」は「グラフト化」と同じ意味を有する。以下に示すように、本願においては、それらの量を単位面積当たりの量「μｇ／ｃｍ２」として用いているが、これに限定されない。
【００１４】
本願において、「グラフト効率」とは、器材表面への０〜８０℃の範囲で水に対する相互作用が変化する温度応答性ポリマーの「固定化」もしくは「グラフト化」される程度を意味する。すなわち、複数の材質の器材表面があって同一条件で０〜８０℃の範囲で水に対する相互作用が変化する温度応答性ポリマーが特定の器材表面に多く固定化されれば、その特定の器材表面はグラフト効率が良い材質となる。
【００１５】
本発明は、新規な温度応答性細胞培養器材を提供するものである。この器材とは、特定の表面を持った細胞培養器材に温度応答性ポリマーをグラフト化させたものである。その特定の表面を持った細胞培養器材とは、同一の電子線照射条件において０〜８０℃の範囲で水に対する相互作用が変化する温度応答性ポリマーのグラフト効率が異なる２種類以上の材質が表面に露出したものである。すなわち、本発明の温度応答性細胞培養器材を得るためには少なくとも温度応答性ポリマーがグラフト化した際、（１）細胞培養時に細胞が付着、増殖し、培養温度を変えることでその付着、増殖した細胞を剥離させられる表面（以下、「（１）細胞付着表面」と称する。）、（２）細胞を全く付着させない表面を持った表面（以下、「（２）細胞非付着表面」と称する。）が必要となる。その際、グラフト効率の異なる材質とは、特に限定されるものではないが、前者の（１）細胞付着表面としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレートのいずれか、若しくはこれらの２以上を組み合わせたものである。この中で特にポリスチレンは細胞培養用器材で通常使われており好適である。
【００１６】
本発明では、上述した（１）細胞付着表面へ実施される条件と同じ条件の電子線が照射されたとき（２）細胞非付着表面となる表面が必要である。このような材質としては、（１）細胞付着表面としてポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレートのいずれか、若しくはこれらの２以上を組み合わせたものを選んだとき、（１）細胞付着材質へ実施される電子線照射条件と同条件の電子線が照射されたとき細胞を全く付着しない量まで温度応答性ポリマーをグラフト化させられれば特に限定されるものではないが、例えばポリメチルペンテン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ＡＢＳ樹脂、ポリオキシメチレン、ナイロン、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。この中で、ポリメチルペンテンは上述の（１）細胞付着材質であるポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレートのいずれか、若しくはこれらの２以上を組み合わせたものとの成型時の相性が良く好適である。
【００１７】
上述のように、本発明は、電子線照射による温度応答性ポリマーのグラフト効率の異なる材質が同一表面に露出した器材を利用するものである。そして、これまでに（１）細胞付着表面の材質の具体例を挙げ、（１）細胞付着表面得るための電子線照射条件と同じ条件の電子線が照射されたとき、細胞を全く付着させない量まで温度応答性ポリマーがグラフト化される（２）細胞非付着表面の材質の具体例を挙げてきた。しかしながら、（２）細胞非付着表面の材質であるポリメチルペンテン、ポリエチレンテレフタレート等の材質の表面においても電子線の条件を変え、最適化すれば、温度応答性ポリマーをグラフト化させても、細胞培養時に細胞が付着、増殖し、培養温度を変えることでその付着、増殖した細胞を剥離させられる表面となる。従って、本発明とは、（１）細胞付着表面の材質を決めれば、（２）細胞非付着表面の材質が決まることを示すものであり、例えば、（１）細胞付着表面の材質をポリメチルペンテン、ポリエチレンテレフタレート等とすると（２）細胞非付着表面の材質は例えばポリテトラフルオロエチレン等となる。本発明とは、あくまでも複数の素材から構成される1つの細胞培養表面に対し、一度の電子線処理を施し、それぞれの材質の領域によって異なる量の温度応答性ポリマーを同時にグラフト化しようとするものである。その電子線の照射に関する照射量、照射強さ、照射時間、加速電圧等の条件に関しては特に限定されるものではなく通常の照射方法で良い。また、グラフト化される温度応答性ポリマーの原料としては、それらのモノマーであっても良く、ポリマーそのものであっても良く、さらにそれらの混合物でも良い。さらにその原料が基材表面に塗布されるときも溶液状態、固体状態、或いはそれらが混合した状態であっても良く、本発明においては何ら限定されるものではない。
【００１８】
本発明において、例えば、上述の（１）細胞付着表面と（２）細胞非付着表面の割合は特に限定されるものではなく、１箇所の（１）細胞付着表面の周囲に（２）細胞非付着表面があるような培養器材表面でも良く、或いはそれらの（１）細胞付着表面と（２）細胞非付着表面の位置関係が逆になっていたり、さらには（１）細胞付着材質と（２）細胞非付着材質の表面のいずれか、若しくは両方が複数箇所あったりしても良い。また、それぞれの材質の表面の形状も特に限定されるものではないが、（１）細胞付着表面から得られる細胞シート移植する際、細胞シートが多角状であると複数の場所に細胞シートを移植する際、細胞シート同志が重なることがないため好都合であり、具体的には三角状、四角状、五角状、六角状等が挙げられ、その中で四角状は細胞シートを扱いやすく好適である。また、それぞれの形状の輪郭部分は温度応答性ポリマーのグラフト量が異なる領域の境界部であり、その境界部を境に一方では細胞が増殖しシート状になって器材表面に付着しているのに対し、一方では細胞が全く付着しておらず、そのような境界部は培養した細胞をシート状に容易に剥離させるためのきっかけになり有効であることも本発明で見出している。
【００１９】
本発明は、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化する温度応答性ポリマーを利用する。本発明において、対象となる温度応答性細胞培養器材とは、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆されたものである。本発明に用いる温度応答性高分子はホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このようなポリマーとしては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているものが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類、細胞の付着性や増殖性を向上するためのイオン性モノマーとの共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。
【００２０】
本発明で上述した（１）細胞付着表面における温度応答性ポリマーの固定化量は、細胞を培養させられ、かつ温度処理することだけで器材表面から剥離できるに十分な量が固定化されていれば良く特に限定されるものではないが、０．７〜２．５μｇ／ｃｍ２、好ましくは１．３〜２．３μｇ／ｃｍ２、さらに好ましくは１．５〜２．１μｇ／ｃｍ２が良く、最も好ましくは１．８〜２．０μｇ／ｃｍ２が良い。ポリマー量が２．５μｇ／ｃｍ２より多いと細胞の付着性が悪くなり、逆に０．７μｇ／ｃｍ２より少ないと温度を変えても剥離せず、（２）細胞非付着材質の表面の差が顕著でなくなり本発明の技術を十分に達成できず好ましくない。ポリマーの固定化量の測定は常法に従えば良く、例えばＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲを用いて直接測る方法、あらかじめラベル化したポリマーを同様な方法で固定化しラベル化ポリマー量より推測する方法などが挙げられるがいずれの方法を用いても良い。
【００２１】
本発明で上述した（２）細胞非付着表面における温度応答性ポリマーの固定化量は、細胞付着しないだけの十分な量であれば良く特に限定されるものではないが、２．７μｇ／ｃｍ２以上、好ましくは３．０μｇ／ｃｍ２以上、さらに好ましくは３．５μｇ／ｃｍ２以上が良く、最も好ましくは４．０μｇ／ｃｍ２以上が良い。ポリマー量が２．７μｇ／ｃｍ２より少ないと上述の（１）細胞付着表面と（２）細胞非付着表面との差が顕著でなくなり本発明の技術を十分に達成できず好ましくない。
【００２２】
本発明における培養器材の形状は特に制約されるものではないが、例えばディッシュ、マルチプレート、フラスコ、セルインサートのような形態のものなどが挙げられる。
【００２３】
本発明の細胞培養支持体において、器材に被覆されている温度応答性ポリマーは温度を変えることで水和、脱水和を起こすものであり、その温度域は０℃〜８０℃、好ましくは１０℃〜５０℃、さらに好ましくは２０℃〜４５℃であることが判明した。８０℃を越えると細胞が死滅する可能性があるので好ましくない。また、０℃より低いと一般に細胞増殖速度が極度に低下するか、または細胞が死滅してしまうため、やはり好ましくない。
【００２４】
本発明は、電子線照射による温度応答性ポリマーのグラフト効率の異なる材質が同一表面に露出した器材を利用するものである。そのような器材を得るための器材成型方法は特に限定されるものではないが、例えばインサート成型、二色成型等が挙げられ、成型したい形状、大きさ、或いは使用する材料によって適宜使い分ければ良い。
【００２５】
本発明では、上述した電子線照射による温度応答性ポリマーのグラフト効率の異なる材質が同一表面に露出した器材表面に、電子線を利用して温度応答性ポリマーをグラフト化するものである。本発明の目的の一つは電子線照射操作を簡便にすることであるため、電子線照射回数は少ない方が良い。その方法としては特に限定されるものではないが、例えば、上述した０〜８０℃の範囲で水に対する相互作用が変化する温度応答性ポリマーのグラフト効率が異なる２種類以上の材質による表面がパターン状に現れている器材表面全体に、当該温度応答性ポリマーが形成されるモノマー溶液、或いはポリマー溶液のいずれか、若しくは混合物を塗布し、その後、当該器材表面全体に１回電子線を照射する方法が好ましい。
【００２６】
本発明の温度応答性細胞培養器材は幅広い細胞に使われ、例えば、動物、昆虫、植物等の細胞、細菌類が挙げられるが特に限定されるものではない。この中で、動物細胞は市販されているものが多く好都合である。動物細胞の由来として、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、ヌードマウス、マウス、モルモット、ブタ、ヒツジ、チャイニーズハムスター、ウシ、マーモセット、アフリカミドリザル等が挙げられるが特に限定されるものではない。また、特にその動物細胞の株化細胞であればそのもの自身の培養が安定に行え、本発明に使用する細胞として好ましい。このような細胞株としては、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（マウス胎仔線維芽細胞）、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  ａｌｂｉｎｏ細胞株（マウス胎仔線維芽細胞）、Ａ５４９細胞株（ヒト肺腺がん細胞）、ＨｅＬａ細胞株（ヒト子宮頸部類上皮腫細胞）、Ｖｅｒｏ細胞株（アフリカミドリザル正常腎細胞）、２９３（ヒト胎児腎細胞）、３Ｔ３−Ｌ１（マウス繊維芽細胞）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝臓ガン由来細胞）、ＭＣＦ−７（ヒト乳癌由来細胞）、Ｖ７９（チャイニーズハムスター由来線維芽細胞）、ＣＯＳ−７（アフリカミドリザル腎臓由来細胞）、ＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣由来細胞）、ＷＩ−３８（ヒト肺線維芽細胞）、ＭＤＣＫ（イヌ腎由来細胞）、ＭＲＣ−５（正常肺線維芽細胞）等が挙げられるが特に限定されるものではない。また、これらの細胞を培養するための細胞播取量、培養時間、培地などは特に限定されるものではなく、通常行われる条件に従えば良い。
【００２７】
以上のことを温度応答性ポリマーとしてポリ（N−イソプロピルアクリルアミド）を例にとり説明する。本発明の温度応答性細胞培養器材には（１）細胞培養時に細胞が付着、増殖し、培養温度を変えることでその付着、増殖した細胞を剥離させられる表面、（２）細胞を全く付着させない表面を持った表面がある。そのいずれにもポリ（N−イソプロピルアクリルアミド）がグラフト化されている。そのポリ（N−イソプロピルアクリルアミド）は３１℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で３１℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集し、白濁する。逆に３１℃未満の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本発明で対象となる器材は、このポリマーがシャーレなどの器材表面に固定されたものである。上述の（１）細胞培養時に細胞が付着、増殖し、培養温度を変えることでその付着、増殖した細胞を剥離させられる表面の場合、３１℃以上の温度であれば、器材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が器材表面に被覆、固定されているため、器材表面が疎水性を示すようになる。逆に、３１℃未満の温度では、器材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が器材表面に被覆、固定されているため、器材表面が親水性を示すようになる。このときの疎水的な表面は細胞が付着、増殖できる適度な表面であり、また、親水的な表面は細胞が付着できないほどの表面となり、培養中の細胞も冷却するだけで剥離させられることになる。一方の（２）細胞を全く付着させない表面を持った表面では、ポリ（N−イソプロピルアクリルアミド）のグラフト量が多すぎて細胞は全く付着しない。すなわち、細胞は所定の領域のみで付着、増殖し、培養温度を変えることで剥離することとなる。
【００２８】
本発明により温度応答性細胞培養器材の所定の表面だけで細胞を付着、増殖させ、培養温度を変えることで剥離させられるようになる。本発明の方法であれば、そのような器材を簡便に作製することができるようになり、温度応答性細胞培養器材を利用した細胞培養技術を広げられる。
【実施例】
【００２９】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００３０】
温度応答性ポリマーとしてポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを選び、それがグラフト化されることで細胞培養時に細胞が付着、増殖し、培養温度を変えることでその付着、増殖した細胞を剥離させられる表面となる材質としてポリスチレン樹脂を選択した。まず、このポリスチレン表面の成型加工を行った。成型加工品の設計図を図１に示す。その際の射出成型条件は、シリンダー温度：２００℃、射出圧力：４００ｋｇ/ｃｍ２、射出速度：１０／１００ｍｍ／ｓｅｃ、冷却時間：２０秒、金型温度：５０℃とした。射出成型機として名機製作所製Ｍ−１００を使用した。次に、このポリスチレンからなる平板を名機製作所製Ｍ−１００に組み込み、ポリメチルペンテンに射出成型することで、四角状のポリスチレン表面を有するポリメチルペンテン製ディッシュを成型した。その成型加工品の設計図を図２に示す。図２中の黒色に着色した四角状部分がポリスチレン表面に相当する。その際の射出成型条件は、シリンダー温度：３００℃、射出圧力：４７０ｋｇ/ｃｍ２、射出速度：１０／１００ｍｍ／ｓｅｃ、冷却時間：２３秒、金型温度：５５℃とした。得られた成型品を図３に示す。図３の右図は得られた成型品の中心部を通る直線で切断したときの断面図の模式図である。ポリスチレン部とポリメチルペンテン部の組み方が分かる。ポリスチレンとポリメチルペンテンを用いて、本発明である温度応答性細胞培養器材の基板を作製できた。【００３１】
次に、この基板に対し、電子線を使用して温度応答性ポリマーをグラフト化した。基板上に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドモノマーを５２％になるようにイソプロピルアルコールに溶解させたものを０．０７ｍｌ塗布した。０．２５ＭＧｙの強度の電子線を基板表面全体に照射し、基板表面にポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）を固定化した。照射後、イオン交換水により基板表面を洗浄し、残存モノマーおよび基板に結合していないＰＩＰＡＡｍを取り除き、クリーンベンチ内で乾燥し、エチレンオキサイドガスで滅菌することで温度応答性細胞培養器材を得た。基材表面にグラフト化した温度応答性ポリマーを測定したところ、ポリスチレン表面上では１．９μｇ／ｃｍ２被覆され、ポリメチルペンテン表面上では３．０μｇ／ｃｍ２被覆されていることが分かった。以上より、本発明である温度応答性細胞培養器材を作製できた。【００３２】
この基材表面に、３７℃に保温した細胞培養液（ＳｋＢＭ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍに、ウシ胎児血清１０％、ＥＧＦ、リン酸デキサメタゾンナトリウム、硫酸ゲンタマイシン、アンフォテリシンＢを常法通りに含んだ培地）を８ｍｌ入れ、３７℃の炭酸ガス培養装置内で１５分間以上静置した。その後、ヒト骨格筋筋芽細胞を別の基材表面に１×１０５個／ｃｍ２の細胞同士が接触しない範囲の細胞密度で播種し、３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下で４日間炭酸ガス培養装置内で培養した。培養後のようすを図４に示す。図４では培養した細胞が分かり易いように染色した結果を示している。培養したヒト骨格筋筋芽細胞がコンフルエントとなりシート状になっていることが分かる。得られたシート状ヒト骨格筋筋芽細胞は、温度応答性細胞培養器材を炭酸ガス培養装置から取り出し、２０℃で、１５分静置することで器材表面から剥離させられた。得られた結果を図５に示す。以上より、本発明である温度応答性細胞培養器材が得られ、このものを利用して細胞を培養することで希望の形状、大きさの培養細胞シートが得られることが分かった。
【比較例１】
【００３３】
実施例１で得られた温度応答性細胞培養器材の基板を用い、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドモノマーを３５％になるようにイソプロピルアルコールに溶解させたものを０．０７ｍｌ塗布した。０．２５ＭＧｙの強度の電子線を基板表面全体に照射し、基板表面にポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）を固定化した。照射後、イオン交換水により基板表面を洗浄し、残存モノマーおよび基板に結合していないＰＩＰＡＡｍを取り除き、クリーンベンチ内で乾燥し、エチレンオキサイドガスで滅菌することで温度応答性細胞培養器材を得た。基材表面にグラフト化した温度応答性ポリマーを測定したところ、ポリスチレン表面上では１．３μｇ／ｃｍ２被覆され、ポリメチルペンテン表面上では２．４μｇ／ｃｍ２被覆されていることが分かった。このものへ実施例１と同様な方法でヒト骨格筋筋芽細胞を播種し培養した。その結果、温度応答性細胞培養器材表面のポリスチレン部の細胞はコンフルエントな状態まで増殖し、その周囲のポリメチルペンテン部のところにも細胞が増殖していた。実施例1と同様に温度応答性細胞培養器材を冷却したところ、温度応答性細胞培養器材表面全体の細胞が剥離し、四角状の細胞シートは得られなかった。
【実施例２】
【００３４】
実施例１と同様に、温度応答性ポリマーとしてポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを選び、それがグラフト化されることで細胞培養時に細胞が付着、増殖し、培養温度を変えることでその付着、増殖した細胞を剥離させられる表面となる材質としてポリスチレン樹脂を選択した。ポリスチレン表面の成型加工は図６に示される形態のものとした。まず、実施例１と同様に、シリンダー温度：２００℃、射出圧力：４００ｋｇ/ｃｍ２、射出速度：１０／１００ｍｍ／ｓｅｃ、冷却時間：２０秒、金型温度：５０℃の射出条件で四角状ポリスチレン板を作製した（図６中央に１個ある黒色着色部分）。射出成型機は実施例１と同様に名機製作所製Ｍ−１００を使用した。次に、このポリスチレンからなる平板を名機製作所製Ｍ−１００に組み込み、ポリメチルペンテンに射出成型することで、四角状のポリスチレン表面を有するポリメチルペンテン製ディッシュを成型した。その際、上述したポリスチレン板の一部だけが露出するように（図６中の４個の四角の部分）、その他の部分にポリメチルペンテンが覆うように成型した。図６中の４個の四角状部分がポリスチレン表面に相当する。その際の射出成型条件は、シリンダー温度：３００℃、射出圧力：４７０ｋｇ/ｃｍ２、射出速度：１０／１００ｍｍ／ｓｅｃ、冷却時間：２３秒、金型温度：５５℃とした。ポリスチレンとポリメチルペンテンを用いて、本発明である温度応答性細胞培養器材の基板を作製できた。次に、この基板に対し、電子線を使用して温度応答性ポリマーをグラフト化した。基板上に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドモノマーを５４％になるようにイソプロピルアルコールに溶解させたものを０．０７ｍｌ塗布した。０．２５ＭＧｙの強度の電子線を基板表面全体に照射し、基板表面にポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）を固定化した。照射後、イオン交換水により基板表面を洗浄し、残存モノマーおよび基板に結合していないＰＩＰＡＡｍを取り除き、クリーンベンチ内で乾燥し、エチレンオキサイドガスで滅菌することで温度応答性細胞培養器材を得た。基材表面にグラフト化した温度応答性ポリマーを測定したところ、ポリスチレン表面上では２．０μｇ／ｃｍ２被覆され、ポリメチルペンテン表面上では３．１μｇ／ｃｍ２被覆されていることが分かった。以上より、本発明である温度応答性細胞培養器材を作製できた。実施例１と同様な手法に従ってヒト骨格筋筋芽細胞を４日間し、実施例１と同様に冷却したところ、図６中の４個の四角の部分から細胞シートが剥離した。以上より、本発明である温度応答性細胞培養器材が得られ、このものを利用して細胞を培養することで希望の形状、大きさの培養細胞シートが得られることが分かった。
【実施例３】
【００３５】
ポリスチレン表面の露出部分を図７中央にある４個の円形状部分とすること以外は実施例２とすべて同様に検討を行った。実施例１と同様な手法に従ってヒト骨格筋筋芽細胞を４日間し、実施例１と同様に冷却したところ、図７中の４個の円形状部分から細胞シートが剥離した。以上より、本発明である温度応答性細胞培養器材が得られ、このものを利用して細胞を培養することで希望の形状、大きさの培養細胞シートが得られることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明に記載される器材を利用すれば、器材表面に細胞が付着する領域だけに細胞が付着、増殖し、温度を変えるだけで剥離させられ、特定の形状、大きさの細胞シートを得ることができるようになる。この方法で得られる培養細胞シートは、たとえば角膜移植、皮膚移植、角膜疾患治療、虚血性心疾患治療等の臨床応用が強く期待される。本発明は、このような器材を１回の電子線照射で作製することができる。したがって、本発明は細胞工学、医用工学、などの医学、生物学等の分野における極めて有用な発明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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