(57)【要約】  本発明の目的は、安全性の高い、ＴＴＲタンパク質のアミロイド線維形成を抑制し得る物質を有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤を提供することにある。上記目的は、デンドリマー又はその塩を有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤により解決される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンドリマー又はその塩を有効成分として含む、アミロイド線維形成抑制剤。
【請求項２】
デンドリマーが、アルキレンジアミンをコアとするポリ（アミドアミン）デンドリマーである、請求項１に記載のアミロイド線維形成抑制剤。
【請求項３】
デンドリマーが、アルキレンジアミンをコアとする第２〜第１０世代のポリ（アミドアミン）デンドリマーである、請求項１に記載のアミロイド線維形成抑制剤。
【請求項４】
デンドリマーが、アルキレンジアミンをコアとする第２〜第６世代のポリ（アミドアミン）デンドリマーである、請求項１に記載のアミロイド線維形成抑制剤。
【請求項５】
アルキレンジアミンが、炭素数１〜６のアルキレンジアミンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアミロイド線維形成抑制剤。
【請求項６】
デンドリマーにおける少なくとも１個のアミンが、ポリエチレングリコール又はラクトースで修飾されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアミロイド線維形成抑制剤。
【請求項７】
デンドリマーが、下記式（１）
【化１】
2011002026.tif 000018
で示されるデンドリマー；下記式（２）
【化２】
2011002026.tif 000019
で示されるデンドリマー；下記式（３）
【化３】
2011002026.tif 000020
で示されるデンドリマー；下記式（４）
【化４】
2011002026.tif 000021
で示されるデンドリマー；及び下記式（５）
【化５】
2011002026.tif 000022
で示されるデンドリマーからなる群から選ばれる少なくとも１種のデンドリマーである、請求項１に記載のアミロイド線維形成抑制剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のアミロイド線維形成抑制剤を含む、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬。
【請求項９】
アミロイドーシスが、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）である、請求項８に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デンドリマー又はその塩を有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤、並びに該アミロイド線維形成抑制剤を有効成分として含むアミロイドーシスを予防及び／又は治療するための医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロイドーシスとは、β−シート構造を有するタンパク質が重合して不溶性のアミロイド（ａｍｙｌｏｉｄ）又はアミロイド線維と呼ばれる細線維を形成し、生体内に沈着して組織傷害をもたらす疾患群のことを指す。ドイツの病理学者であるＶｉｒｃｈｏｗは、アミロイドーシスの組織標本がヨードで紫色に染まることを発見した。この結果から、Ｖｉｒｃｈｏｗは組織に沈着した物質は多糖体であると考え、これを「デンプン様物質」すなわち「アミロイド」と命名し、アミロイドの沈着により惹起される病態をアミロイドーシスと呼ぶことを提唱した。その後の研究により、アミロイドの主成分はナイロン様に重合して線維を形成するタンパク質であり、アミロイドには血清アミロイドＰ成分やグリコサミノグリカンなどが含まれていることが分かっている。現在では、アミロイドは「コンゴレッド染色で橙赤色に染まり、偏光顕微鏡下で観察すると緑色に強く輝く複屈折を起こす幅８−１５ｎｍの枝分かれのない細線維の集積からなる」と定義されている。【０００３】
アミロイドーシスには、家族性アミロイドポリニューロパチー（familial amyloid polyneuropathy；ＦＡＰ）、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（狂牛病）、ハンチントン病その他遺伝性の疾患など様々な疾患が含まれる。その中でもＦＡＰは、末梢神経、自律神経、腎、皮膚などの全身諸臓器にアミロイド沈着をきたし、常染色体優性遺伝形式で遺伝浸透する全身性アミロイドーシスであり、我が国、特に九州地方及び中部地方で多くの症例が確認されている。１９５２年にポルトガル人のＦＡＰ症例が初めて報告されて以来、世界各国から同様の症例報告がなされている。ＦＡＰの原因となるアミロイド線維は、主として、血清タンパク質であるトランスサイレチン（ＴＴＲ）が変異したもので構成されている。【０００４】
正常ＴＴＲは、β−シート構造を多く含む立体構造をしており、肝臓、脳脈絡叢、網膜、膵α細胞などで産生されるが、特にその９０％以上が肝臓で産生されるといわれている。正常ＴＴＲは、四量体を形成してサイロキシン（Ｔ４）やレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）などを介したビタミンＡの輸送体としての役割を担っている。正常ＴＴＲの変異体は、これまでに１００種以上が報告されており、構造安定性が低く、四量体から単量体への構造変化を起こしやすいことが明らかになっている。【０００５】
わが国で多いＦＡＰは、Ｖａｌ３０Ｍｅｔ型の変異ＴＴＲを原因タンパク質とするＦＡＰである。ＦＡＰの主要性状は、左右対称性に下肢末端から上行する知覚障害を伴う多発性神経炎と自律神経障害（交代性の下痢と便秘、起立性低血圧、排尿障害等）であり、これらはいずれもアミロイドによる神経障害が原因である。その後、心臓、腎臓、消化管へのアミロイド沈着が著しくなり、これらの臓器の機能不全を引き起こす。一般的には、２０代後半から３０代で発症し１０年で歩行不能となり、１０数年の経過で心不全、腎不全などで死亡する予後不良の疾患であり、厚生省特定疾患にも指定されている難病の一つである。【０００６】
ＦＡＰをもたらし得る変異ＴＴＲタンパク質は、正常ＴＴＲタンパク質に比べ構造安定性が低く、分子中のβ−シート構造が互いに会合し不溶性のアミロイド線維を形成して組織に沈着するといわれている。ＦＡＰの治療としては、変異ＴＴＲの約９０％以上が肝臓で産生されることから肝移植治療が行われている。一方で、アミロイド線維形成メカニズムに基づいたＦＡＰの治療方法として、四量体ＴＴＲ分子の乖離（解離）の阻害などが試みられている（非特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yukio Ando, (2005), Med Mol Morphol, 38: pp. 142-154
【非特許文献２】Yoshiki Sekijima et.al., "Long-term effects of diflunisal on familial amyloid polyneuropathy," 2008, VIIth International symposium on Familial Amyloid Polyneuropathy
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＦＡＰの治療方法として、肝移植治療法は、病状が進行した患者には無効で、ドナーも不足しているなど多くの問題がある。一方で、アミロイド線維形成メカニズムに基づいたＦＡＰの治療方法は、変異ＴＴＲタンパク質によるアミロイド線維形成を抑制することにより、ＦＡＰを予防又は治療、或いはその両方をすることができると考えられている。この治療方法は、肝移植をしないことから、肝移植に関連する上記問題を回避することが期待できる。しかし、このような方法において、臨床的な治療効果が認められているＦＡＰの治療方法はない。また、アミロイドーシスの予防及び／又は治療に応用できる、安全性の高い、アミロイド線維形成を抑制する物質についてもこれまでに知られていない。【０００９】
したがって、本発明の目的は、安全性の高い、ＴＴＲタンパク質のアミロイド線維形成を抑制し得る物質を有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤を提供することにある。さらに、本発明の目的は、該抑制剤を含む、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬、特に家族性アミロイドーシスポリニューロパチー（ＦＡＰ）の予防及び／又は治療のための医薬を提供することにあり、さらにはアミロイドーシスに起因する知覚障害と自律神経障害の発症を予防するための医薬、及び上記知覚障害と自律神経障害の進行防止などを可能にする治療のための医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討したところ、デンドリマーがアミロイド線維形成を抑制し得ることを見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明によれば、デンドリマー又はその塩を有効成分として含むアミロイド線維形成抑制剤が提供される。【００１１】
好ましくは、デンドリマーが、アルキレンジアミンをコアとするポリ（アミドアミン）デンドリマーである。【００１２】
好ましくは、デンドリマーが、アルキレンジアミンをコアとする第２〜第１０世代のポリ（アミドアミン）デンドリマーである。【００１３】
好ましくは、デンドリマーが、アルキレンジアミンをコアとする第２〜第６世代のポリ（アミドアミン）デンドリマーである。【００１４】
好ましくは、アルキレンジアミンが、炭素数１〜６のアルキレンジアミンである。【００１５】
好ましくは、デンドリマーにおける少なくとも１個のアミンが、ポリエチレングリコール又はラクトースで修飾されている。【００１６】
好ましくは、デンドリマーが、下記式（１）
【化１】
2011002026.tif 000002
で示されるデンドリマー；下記式（２）
【化２】
2011002026.tif 000003
で示されるデンドリマー；下記式（３）
【化３】
2011002026.tif 000004
で示されるデンドリマー；下記式（４）
【化４】
2011002026.tif 000005
で示されるデンドリマー；及び下記式（５）
【化５】
2011002026.tif 000006
で示されるデンドリマーからなる群から選ばれる少なくとも１種のデンドリマーである。【００１７】
本発明の別の側面によれば、本発明のアミロイド線維形成抑制剤を含む、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬が提供される。【００１８】
好ましくは、アミロイドーシスが、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）である。【００１９】
本発明の別の側面によれば、本発明のアミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬を製造するための、本発明のアミロイド線維形成抑制剤の使用が提供される。【００２０】
本発明の別の側面によれば、本発明のアミロイド線維形成抑制剤を哺乳動物に投与することを含む、アミロイドーシスの予防及び／又は治療する方法が提供される。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤は、アミロイド線維形成を有意に抑制することができる。したがって、本発明のアミロイド線維形成抑制剤を含む医薬は、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬として有用であり、特に対症療法や肝臓移植しか治療方法のない家族性アミロイドーシスポリニューロパチー（ＦＡＰ）に対して有効性の高い医薬として用いることができる。さらに、本発明の医薬は、薬物のプロドラッグ化の観点から、薬物吸収性の改善、特定部位への標的化（副作用の軽減）、作用の持続化などを意図して医薬品製剤や遺伝子デリバリー素材などとして汎用されている安全性の高いデンドリマーを有効成分として含有することから、人体に対して安全性の高い医薬である。したがって、本発明の医薬は、その有効性及び安全性から、アミロイドーシスの予防及び／又は治療に際して早期の実用化が見込める医薬である。特に、本発明の医薬は、特に対症療法や肝臓移植しか治療方法のない家族性アミロイドーシスポリニューロパチー（ＦＡＰ）に対する医薬として期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、デンドリマーの合成経路の概略図である。
【図２】図２は、デンドリマーによるアミロイド線維形成の抑制効果を、各濃度について調べた結果を示した図である。
【図３】図３は、デンドリマーによるアミロイド線維の溶解効果を、各濃度について調べた結果を示した図である。
【図４】図４は、デンドリマーによるFAP患者の組織沈着TTRアミロイド線維の減少を示した図である。
【図５】図５は、デンドリマーの態様を、分子量、分子サイズ及びアミノ基とともに示した図である。
【図６】図６は、デンドリマーによるアミロイド線維形成の抑制効果を、デンドリマーの修飾態様別に調べた結果を示した図である。
【図７】図７は、デンドリマーによるアミロイド線維形成の抑制効果を、デンドリマーの世代別に調べた結果を示した図である。
【図８】図８は、ATTR V30Mラットにおける血中TTRの安定性を調べた結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明について以下に詳細に説明する。
本発明のアミロイド線維形成抑制剤は、デンドリマー又はその塩を有効成分として含む。
【００２４】
［１］デンドリマー
デンドリマーは、中心部であるコア (core)と樹状側鎖部であるデンドロン (dendron)とから構成される樹状高分子化合物である。また、デンドロンの分岐回数は、世代 (generation) と呼ばれている。
【００２５】
デンドリマーは、球状の形態や分子表面に多数の官能基を導入できることから、医薬分野や化学分野などをはじめとした様々な分野において新しい高機能材料として利用されている。デンドリマーは、一般の高分子と比べて構造制御が容易であり、官能基を導入するなどの修飾が可能である。そこで、デンドリマーの溶解性や機能性を改善した様々なデンドリマー誘導体が開発されている。このようなデンドリマー誘導体を用いることにより、アミロイド線維の抑制効果と共に、様々な臨床症状に対する治療効果が期待できる。
【００２６】
デンドリマーの具体例として、アルキレンジアミンをコアとするポリ（アミドアミン）デンドリマーを挙げることができる。
【００２７】
コアのアルキレンジアミンは、炭素数１〜６のアルキレンジアミンであることが好ましく、例えば、メチレンジアミン、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、ブチレンジアミン、ペンチレンジアミン及びn-ヘキシレンジアミンを挙げることができるが、より好ましくはメチレンジアミン、エチレンジアミン、プロピレンジアミン又はブチレンジアミンであり、より好ましくはエチレンジアミンである。
【００２８】
デンドロンは、窒素原子が３級アミンとして連なることで、樹状構造をとる。デンドロンの末端部は１個の窒素原子に２個のアミノ基が結合している。
【００２９】
図１に、エチレンジアミンをコアとするポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーの合成経路を示す。図１が示す通り、コアのアミン１個あたり２個のアミドアミンが結合したものが第１世代（図１のGeneration 1）のデンドリマーであり、さらにその下にアミドアミンが結合したものが第２世代のデンドリマー（図１のGeneration 2）である。以下、世代数が大きくなるにつれて、デンドリマーの樹状構造は複雑になり、分子量及び分子径が大きくなる。
【００３０】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤に含まれるデンドリマーとしては、後述する実施例２に示す通り、世代数が大きいデンドリマーほどアミロイド線維形成の抑制効果が大きくなることから、第２〜第１０世代のデンドリマーが好ましく、第２〜第８世代のデンドリマーがより好ましく、第２〜第６世代のデンドリマーがさらに好ましく、第２〜第４世代のデンドリマーがなおさらに好ましい。
【００３１】
エチレンジアミンをコアとする第２世代のポリ（アミドアミン）デンドリマーの製造方法については、Roseita Esfandらの文献（Roseita Esfand and Donald A. Tomalia, (2001), DDT, Vol.6, No.8, pp427-436）に詳細が記載されている。本記載を参照すれば、当業者は、世代数がさらに大きいデンドリマーやエチレンジアミン以外のアルキレンジアミンをコアとするデンドリマーを合成することができる。または、世代数が１０までのエチレンジアミンをコアとするポリ（アミドアミン）デンドリマーは、Ｓｉｇｍａ社から販売されており入手可能である。
【００３２】
デンドリマーにおける少なくとも１個、例えば、２個、3個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個以上のアミンが、種々の官能基で修飾されていてもよい。例えば、修飾基としてラクトースやポリエチレングリコールで修飾されたデンドリマーは、分子周辺の水和構造やタンパク質との相互作用様式が変化するために、アミロイドの線維形成の抑制効果を向上させることが期待できる。
【００３３】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤に含まれるデンドリマーの好ましい態様は、下記式（１）
【化６】
2011002026.tif 000007
で示されるデンドリマー；下記式（２）
【化７】
2011002026.tif 000008
で示されるデンドリマー；下記式（３）
【化８】
2011002026.tif 000009
で示されるデンドリマー；下記式（４）
【化９】
2011002026.tif 000010
で示されるデンドリマー；及び下記式（５）
【化１０】
2011002026.tif 000011
で示されるデンドリマーからなる群から選ばれる１種又は2種以上のデンドリマーである。
【００３４】
上記式（１）〜（３）のデンドリマーの分子量、サイズ及びアミノ基数を図５に示す。上記式（１）〜（３）のデンドリマーは、多機能なコアの周囲に高度に分岐したデンドロンを配置した３次元のマクロ分子である。これらのデンドリマーは、分子量が大きくなるほど、細胞毒性が上昇する傾向にある。したがって、本発明のアミロイド線維形成抑制剤の有効成分として含まれるデンドリマーとしては、アミロイド線維形成の抑制効果が大きく、かつ分子量が比較的小さい、上記式（２）で示されるデンドリマーがより好ましい。
【００３５】
上記式（４）や（５）で示されるラクトースやポリエチレングリコールで修飾されたポリ（アミドアミン）デンドリマーは、これまでに知られている方法によってポリ（アミドアミン）デンドリマー、及びラクトースまたはポリエチレングリコールを用いて製造することができるが、例えば、ラクトースで修飾されたポリ（アミドアミン）デンドリマーは、デンドリマー、ラクトース一水和物、及びシアノトリヒドロホウ酸ナトリウムなどのシアノトリヒドロホウ酸塩を０．２Ｍ  ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ  ７．５）に溶解した後、１５℃〜４０℃程度で数時間〜数十時間攪拌することによって得られる。一方、ポリエチレングリコールで修飾されたポリ（アミドアミン）デンドリマーは、例えば、ｍＰＥＧ−ｓｕｃｃｉｎｙｌ−ＮＨＳなどのポリエチレングリコール修飾物をＤＭＳＯなどの溶媒に溶解させた溶液にデンドリマーを加えて１５℃〜４０℃程度で数時間〜数十時間攪拌し、次いで水を加えて反応を停止した後、透析および凍結乾燥することによって得られる。これらの方法により得られたラクトースやポリエチレングリコールで修飾されたポリ（アミドアミン）デンドリマーは、ゲルろ過などの通常知られる方法により精製することが好ましい。ポリエチレングリコールとしては、分子量が１０００〜２００００程度のものを使用することが好ましい。
【００３６】
上記式（５）におけるｎの数は、２５〜５００の範囲内であれば特に制限されないが、分子周辺の水和構造やタンパク質との相互作用様式を考慮すれば、好ましくは２２〜４５０である。
【００３７】
［２］アミロイド線維形成抑制剤
本発明のアミロイド線維形成抑制剤は、デンドリマー又はその塩を有効成分として含むことにより、変異ＴＴＲからのアミロイド線維の生成反応を抑制することができる。
【００３８】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤は、デンドリマー又はその塩を含む限り、これらをどのような形態で含んでもよい。本発明のアミロイド線維形成抑制剤に含まれる有効成分の割合（有効成分の質量／アミロイド線維形成抑制剤の質量）は、変異ＴＴＲのアミロイド線維形成を抑制できる量であれば特に制限されないが、例えば、８０％〜１００％が好ましい。
【００３９】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤は、デンドリマー又はその塩の有効量を含めば、固体又は液体のいずれの形態でも利用することができるが、これに薬学上許容される担体または添加剤を配合して、固体又は液体状の医薬組成物として調製することもできる。
【００４０】
本発明のアミロイド線維形成抑制剤によるアミロイド線維形成抑制効果は、β−シートに選択的に結合する蛍光プローブであるチオフラビンＴを用いて、ＴＴＲがアミロイド線維化したことにより生じるβ−シートをを蛍光強度として検出することにより確認することができる。このとき、本発明のアミロイド線維形成抑制剤を用いない場合に比べて、本発明のアミロイド線維形成抑制剤を用いた場合の蛍光強度が小さいとき、本発明のアミロイド線維形成抑制剤はアミロイド線維形成を抑制したと判断できる。
【００４１】
［３］アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬
本発明には、本発明のアミロイド線維形成抑制剤を有効成分として含む、アミロイドーシスの予防及び／又は治療のための医薬が包含される。
【００４２】
本発明の医薬は、家族性アミロイドーシスポリニューロパチー（ＦＡＰ）や老人性アミロイドーシスなどをはじめとするアミロイドーシスやアミロイドーシスに関連する疾患に対して、広い範囲で適用可能である。図４に示す通り、すでにアミロイドーシスに罹患した患者であっても、本発明の医薬を適用すれば、障害が見られる組織を改善することが期待できる。したがって、本発明の医薬によれば、アミロイドーシスやアミロイドーシスに関連する疾患の予防およびこれらの疾患による病状の進行や悪化の抑制だけでなく、病状の改善、すなわちこれらの疾患に対する治療効果が期待できる。本発明の医薬が対象とする具体的な疾患としては、家族性アミロイドーシスポリニューロパチー（ＦＡＰ）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００４３】
例えば、ＦＡＰを発病した患者のうち症状が軽度な患者は本発明の医薬を投与することにより症状の進行や悪化を防ぐことが可能であり、症状が重篤な患者に対しても治療効果を期待できる場合がある。また、変異トランスサイレチンを有する個体は加齢とともにＦＡＰを発症する可能性の高い潜在患者であるが、本発明の医薬を投与することによりＦＡＰの発症を予防することができる。
【００４４】
本発明の医薬としては、本発明のアミロイド線維形成抑制剤をそのまま用いてもよいが、通常は有効成分である本発明のアミロイド線維形成抑制剤と１又は２種以上の製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態を調製して用いることが望ましい。
【００４５】
ＦＡＰの予防及び治療の際には、本発明の医薬だけでなく、トランスサイレチン四量体を安定化する非ステロイド性抗炎症薬、例えば、ジフルニサールなどと併用することも望ましい。
【００４６】
本発明の医薬は、非経口剤であることが好ましく、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、吸入剤等を挙げることができる。上記の医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物としては、例えば、乳糖やオリゴ糖などの賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、抗酸化剤、矯味剤、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、保存剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、等張化剤、噴射剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、キャリア、薬学的アジュバント及び粘着剤等を挙げることができるが、これらは医薬組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することができ、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４７】
本発明の医薬のより好ましい形態として、注射剤を挙げることができる。注射剤としては、通常、非水溶媒（または水溶性有機溶媒）を実質的に含まず、媒体が実質的に水である溶媒で溶解または希釈可能である。注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、注射剤は、生理食塩水、ＰＢＳなどの緩衝液、滅菌水等の溶剤に溶解した後、フィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプル等）に充填することにより調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。また、非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法を用いてもよい。本発明で用いることができるキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、又は血清アルブミンを含む生理食塩水等が挙げられる。
【００４８】
さらに、本発明の医薬の好ましい形態として、凍結乾燥製剤（凍結乾燥した注射剤）もまた挙げることができる。このような凍結乾燥製剤であっても、注射用水（注射用蒸留水）、電解質液（生理食塩水など）などを含む輸液、栄養輸液などから選択された少なくとも１つの液体または溶媒により溶解可能であり容易に注射液を調製でき、その容器もガラス容器およびプラスチック容器が使用できる。注射剤内容物の１００重量部に対して本発明の医薬を０．０１重量部以上、好ましくは０．１〜１０重量部含有することができる。
【００４９】
本発明の医薬の投与量及び投与回数などは特に限定されず、患者の年齢、体重、及び性別などの条件、並びに疾患の種類や重篤度、予防又は治療の目的などに応じて適宜選択可能である。通常は、非経口投与による場合には有効成分量として成人一日あたり０．１μｇ〜１０ｇが好ましく、１０μｇ〜１０００ｍｇがより好ましく、１００μｇ〜５００ｍｇがより好ましいが、このような投与量を一日数回に分けて投与してもよい。本発明の医薬の投与頻度は、例えば、一日一回〜数ヶ月に１回であればよく、特に制限されない。
【００５０】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
実施例１
１．実験材料
本実験で用いたトランスサイレチン（TTR）は、健常者ボランティアより精製した。純度の検定は非加熱（非還元）SDS-PAGE を用いて行った。また、本研究で使用したデンドリマー(Dendrimer)は、シグマ社から購入した。【００５２】
２．チオフラビンＴを用いたアミロイド線維の定量
ヒト血清由来の野生型TTR を100 mM塩化ナトリウムを含む20 mM酢酸バッファー（pH 3.0-6.5）で0.2 mg/mL の濃度になるように調製し、遮光して37℃でインキュベーションしアミロイド線維を形成させた。作成したアミロイド線維は、重合したβ−シートに選択的に結合する蛍光プローブであるチオフラビンT を用いて検出した。50 mM グリシン溶液（pH 9.5）に溶解した10 mM チオフラビンT 溶液1 mL に、インキュベーションしたサンプル10μL を添加後混合し、測定用試料とした。日立蛍光分光光度計 F-4500 を用い、25℃で442 nm の励起光で励起される489 nm の蛍光強度を測定した。なお、励起側、蛍光側ともにスリット幅は5 nm で測定した。【００５３】
３．デンドリマー共存下でのアミロイド線維形成抑制（１）
上記２のアミロイド線維形成時に、下記式（１）
【化１１】
2011002026.tif 000012
のデンドリマーを各種濃度で加えて、デンドリマー非共存下と比較することにより、アミロイド線維形成におけるデンドリマーの影響を評価した。【００５４】
上記の通りに、ヒト血清由来の野生型TTR（WT-TTR）を、0μＭ、5μＭ、50μＭ又は500μＭのデンドリマーとの共存下でアミロイド化させ、アミロイド化により重合したβシートと選択的に結合するチオフラビンＴを用いて、TTR のアミロイド線維形成の定量解析を行った（図２を参照）。その結果、チオフラビンTを用いたアミロイド線維の定量解析の結果、デンドリマー共存下で、TTR のアミロイド線維形成能は用量依存的に低下した。【００５５】
４．デンドリマー共存下でのアミロイド線維形成抑制（２）
デンドリマーのアミロイド線維溶解作用を検討するために、上記と同様の方法（37℃で14日インキュベーション）で一度TTRをアミロイド線維化させた後、0μＭ、5μＭ、50μＭ又は500μＭのデンドリマーを添加しさらに37℃で7日インキュベーションし、チオフラビンＴによりTTR のアミロイド線維の定量解析を行った（図３を参照）。その結果、デンドリマーは、一度形成したTTRアミロイド線維に対してアミロイド線維溶解効果を示した。【００５６】
５．組織沈着アミロイドの検出
FAP患者由来の組織を10%ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋後、３μm厚で薄切し、MASコートスライドグラス（Matsunami Glass Ind.Ltf., Osaka, Japan）上で伸展させた切片で、以下に示すコンゴレッド染色を行いアミロイド沈着の同定を行った。【００５７】
Congo red原末（MERCK, Darmstadt, Germany）1 gを蒸留水100 ml に溶解し、攪拌しながら45 gのNaClを加えて、さらに十分攪拌し、100 mlのエタノールを加えて10℃で冷却後ろ過する。このCongo red 原液100 ml に対して、5 gのフェノールと1 mlの酢酸を加えたコンゴレッド染色液で1時間染色し、水洗後にヘマトキシリン液で核染色した。アミロイドの検出は本法を用い、偏光顕微鏡でアップルグリーンを呈することにより同定した。【００５８】
上記の方法を用い、FAP患者由来の組織切片を、デンドリマーとの共存又は非共存下で37℃で21日間インキュベーションし、組織沈着TTRアミロイド線維の解析を行った。【００５９】
FAP 患者由来の組織切片を0μＭ又は1000μＭのデンドリマーと共存させ、組織沈着アミロイドの変化をCongo red染色した後に偏光顕微鏡により解析した結果を図４に示す。図４に示す通り、Congo red染色、偏光顕微鏡によるアミロイド線維解析の結果、デンドリマーを共存させると、FAP患者の組織沈着TTRアミロイド線維の減少が確認された。【００６０】
実施例２
１．実験材料
本実験で用いたトランスサイレチン（TTR）は、健常者ボランティアより精製した。純度の検定は非加熱（非還元）SDS-PAGE を用いて行った。デンドリマー及びデンドリマー誘導体は、以下の式（１）〜（５）の化合物を用いた。デンドリマーは、シグマ社から購入した。【００６１】
式（４）のラクトース修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーの合成法は以下の通りである。デンドリマー（シグマ社；94.2μL）、ラクトース一水和物（9mg）、及びシアノトリヒドロホウ酸ナトリウム（15.7mg）を０．２Ｍ  ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ  ７．５）に溶解した後、室温で３時間攪拌した。反応により得られたラクトース修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーはゲルろ過（TOSOH TOYOPEARL HW-40F (5.3cm2 x 70cm); 溶出液：0.1M ammonium hydroxycarbonate）により精製した。【００６２】
式（５）ポリエチレングリコール修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーの合成法は以下の通りである。デンドリマー（178.5μL）にDMSO（500μL）に溶解したポリエチレングリコール（50mg）を加え、一晩攪拌する。水を加えて反応を停止した後、透析し、凍結乾燥した。なお、ポリエチレングリコールは、日本油脂製 (SUNBRIGHT ME-020CS；分子量２０００)を用いた。【００６３】
【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【００６４】
２．チオフラビンT を用いたアミロイド線維の定量
TTR を100 mM塩化ナトリウムを含む20 mM酢酸バッファー（pH 3.0-6.5）で0.2 mg/mL の濃度になるように調製し、遮光して37℃でインキュベーションしアミロイド線維を形成させた。作成したアミロイド線維は、重合したβ−シートに選択的に結合する蛍光プローブであるチオフラビンT を用いて検出した。50 mM グリシン溶液（pH 9.5）に溶解した10 mM チオフラビンT 溶液1 mL に、インキュベーションしたサンプル10 μL を添加後混合し、測定用試料とした。日立蛍光分光光度計 F-4500 を用い、25℃で442 nm の励起光で励起される489 nm の蛍光強度を測定した。なお、励起側、蛍光側ともにスリット幅は5 nm で測定した。【００６５】
上記の方法を用い、ヒト血清由来の野生型TTRを、各種デンドリマーとの共存、非共存下でアミロイド化させ、TTR のアミロイド線維形成の定量解析を行った結果を図６及び７に示す。図６が示す通り、デンドリマー誘導体（各10μM）のTTRアミロイド線維に対する抑制効果は、各種デンドリマー間の置換基の差異により大きく変化した。また、図７が示す通り、デンドリマー誘導体（各10μM）のTTRアミロイド線維に対する抑制効果は、デンドリマーの世代数により変化し、世代数の上昇とともに増強された。【００６６】
実施例３
生理的条件下（in vivo）における、各種Dendrimerの血中TTR の安定性に対する影響を検討するため、異型TTR（ATTR V30M）を発現するFAPの疾患モデルのトランスジェニック（Tg）ラット（ATTR V30M）に各種デンドリマーを投与し、非投与群との血中TTR の安定性の比較検討を行った（Ueda et al. Biochem. Biophys. Res. Commun 352 (2007) 299-304）。【００６７】
Ｄｅｎ：上記［化１４］の式（１）の化合物。中心から規則的に分岐した構造を持つ樹状高分子で、アルキレンジアミンのコアと三級アミンの分岐構造からなり、末端に 1 級アミノ基を有する。
ＰＥＧ−Ｄｅｎ：上記［化１３］の式（５）の化合物。デンドリマーにおける少なくとも１個のアミンが、ポリエチレングリコールで修飾されている。【００６８】
ATTR V30Mラットに各種Dendrimerを投与し、約8時間後に血清を回収しTTR抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、各種デンドリマーとの共存、非共存下における血中TTR の安定性の比較検討を行った。結果を図８に示す。各種Dendrimer投与群では、血中の可溶性TTRの減少はみられず、血中TTRの安定性が向上していた。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
アミロイド線維の沈着によって臓器障害が引き起こされる疾患には、ＦＡＰをはじめ、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（狂牛病）、ハンチントン病、及びその他の遺伝性の疾患が含まれる。例えば、アルツハイマー病は、６５歳以上の高齢者の約１０％を占め、今後高齢化がさらに進む日本において社会的な問題となっている。アミロイド線維の沈着はタンパク質の不溶性の繊維状凝集体の形成に起因することから、デンドリマーはこれらの多様なアミロイドーシス疾患への治療にも応用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年4月14日(2011.4.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンドリマー又はその塩を有効成分として含む、アミロイド線維形成抑制剤であって、
デンドリマーが、アルキレンジアミンをコアとするポリ（アミドアミン）デンドリマーである、
トランスサイレチン（ＴＴＲ）タンパク質のアミロイド繊維形成の抑制に用いるための上記アミロイド線維形成抑制剤。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
デンドリマーが、アルキレンジアミンをコアとする第２〜第１０世代のポリ（アミドアミン）デンドリマーである、請求項１に記載のアミロイド線維形成抑制剤。
【請求項４】
デンドリマーが、アルキレンジアミンをコアとする第２〜第６世代のポリ（アミドアミン）デンドリマーである、請求項１に記載のアミロイド線維形成抑制剤。
【請求項５】
アルキレンジアミンが、炭素数１〜６のアルキレンジアミンである、請求項１、３及び４のいずれか１項に記載のアミロイド線維形成抑制剤。
【請求項６】
デンドリマーにおける少なくとも１個のアミンが、ポリエチレングリコール又はラクトースで修飾されている、請求項１及び３〜５のいずれか１項に記載のアミロイド線維形成抑制剤。
【請求項７】
デンドリマーが、下記式（１）
【化１】
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で示されるデンドリマー；下記式（２）
【化２】
2011002026.tif 000032
で示されるデンドリマー；下記式（３）
【化３】
2011002026.tif 000033
で示されるデンドリマー；下記式（４）
【化４】
2011002026.tif 000034
で示されるデンドリマー；及び下記式（５）
【化５】
2011002026.tif 000035
で示されるデンドリマーからなる群から選ばれる少なくとも１種のデンドリマーである、請求項１に記載のアミロイド線維形成抑制剤。
【請求項８】
請求項１及び３〜７のいずれか１項に記載のアミロイド線維形成抑制剤を含む、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）の予防及び／又は治療のための医薬。
【国際調査報告】
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2011002026.tif 000037
2011002026.tif 000038
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