(57)【要約】  本発明の目的は、腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片と放射性同位元素とを組み合わせて含む腫瘍の診断剤又は治療剤キットを提供するである。本発明によれば、（ａ）腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片と、一対の親和性物質のうちの一方とを連結した第一の標的化分子、及び（ｂ）放射性同位元素と、前記一対の親和性物質のうちの他方とを連結した第二の標的化分子を含む、腫瘍の診断剤又は治療剤キットであって、前記第一の標的化分子の投与後、所定の時間が経過した後に、前記第二の標的化分子を前記患者に投与することを特徴とする、上記の腫瘍の診断剤又は治療剤キットが提供される。
2010131590.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片と、一対の親和性物質のうちの一方とを連結した第一の標的化分子、及び（ｂ）放射性同位元素と、前記一対の親和性物質のうちの他方とを連結した第二の標的化分子を含む、腫瘍の診断剤又は治療剤キットであって、腫瘍の診断又は治療を必要とする患者に、前記第一の標的化分子を投与し、前記第一の標的化分子が腫瘍部位に特異的に結合し、かつ当該腫瘍部位に安定して存在する間であって、前記患者の非腫瘍部位に非特異的に吸着された前記第一の標的化分子が患者の血中から実質的に排出されるのに十分な時間が経過した後に、前記第二の標的化分子を前記患者に投与し、前記放射性同位元素を前記腫瘍部位に局在化させることを特徴とする、上記の腫瘍の診断剤又は治療剤キット。
【請求項２】
一対の親和性物質のうちの一方が、ビオチン結合性タンパク質であり、一対の親和性物質のうちの他方がビオチン又はその誘導体である、請求項１に記載の腫瘍の診断剤又は治療剤キット。
【請求項３】
ビオチン結合性タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジン、タマビジン、又はそれらの誘導体である、請求項２に記載の腫瘍の診断剤又は治療剤キット。
【請求項４】
第二の標的化分子において、放射性同位元素と結合しうるキレート剤を用いて、放射性同位元素と前記一対の親和性物質のうちの他方とが連結している、請求項１から３の何れかに記載の腫瘍の診断剤又は治療剤キット。
【請求項５】
腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片が、抗Ｒｏｂｏ１抗体である、請求項１から４の何れかに記載の腫瘍の診断剤又は治療剤キット。
【請求項６】
第一の標的化分子が、腫瘍細胞に特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ストレプトアビジとを連結してなる４量体又は２量体の分子である、請求項１から５の何れかに記載の腫瘍の診断剤又は治療剤キット。
【請求項７】
腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片が、重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、Ｒｏｂｏ１に特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１から６の何れかに記載の腫瘍の診断剤又は治療剤キット。
【請求項８】
前記患者の非腫瘍部位に非特異的に吸着された前記第一の標的化分子が患者の血中から実質的に排出されるのに十分な時間が、前記第一の標的化分子の投与後６時間から１４４時間である、請求項１から７の何れかに記載の腫瘍の診断剤又は治療剤キット。
【請求項９】
前記放射性同位元素が、64Ｃｕ、124Ｉ、76Ｂｒ、68Ｇａ、111Ｉｎ、99mＴｃ、67Ｇａ、123Ｉ、131Ｉ、または90Ｙである、請求項１から８の何れかに記載の腫瘍の診断剤又は治療剤キット。
【請求項１０】
重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、Ｒｏｂｏ１に特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）。
【請求項１１】
一対の親和性物質のうちの一方が連結されている、請求項１０に記載の一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする核酸。
【請求項１３】
腫瘍の診断又は治療を必要とする患者に、腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片と、一対の親和性物質のうちの一方とを連結した第一の標的化分子を投与し、前記第一の標的化分子が腫瘍部位に特異的に結合し、かつ当該腫瘍部位に安定して存在する間であって、前記患者の非腫瘍部位に非特異的に吸着された前記第一の標的化分子が患者の血中から実質的に排出されるのに十分な時間が経過した後に、放射性同位元素と、前記一対の親和性物質のうちの他方とを連結した第二の標的化分子を前記患者に投与し、前記放射性同位元素を前記腫瘍部位に局在化させることを含む、腫瘍の診断又は治療のための方法。
【請求項１４】
一対の親和性物質のうちの一方が、ビオチン結合性タンパク質であり、一対の親和性物質のうちの他方がビオチン又はその誘導体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ビオチン結合性タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジン、タマビジン、又はそれらの誘導体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第二の標的化分子において、放射性同位元素と結合しうるキレート剤を用いて、放射性同位元素と前記一対の親和性物質のうちの他方とが連結している、請求項１３から１５の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片が、抗Ｒｏｂｏ１抗体である、請求項１３から１６の何れかに記載の方法。
【請求項１８】
第一の標的化分子が、腫瘍細胞に特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ストレプトアビジとを連結してなる４量体又は２量体の分子である、請求項１３から１７の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片が、重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、Ｒｏｂｏ１に特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１３から１８の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
前記患者の非腫瘍部位に非特異的に吸着された前記第一の標的化分子が患者の血中から実質的に排出されるのに十分な時間が、前記第一の標的化分子の投与後６時間から１４４時間である、請求項１３から１９の何れかに記載の方法。
【請求項２１】
前記放射性同位元素が、64Ｃｕ、124Ｉ、76Ｂｒ、68Ｇａ、111Ｉｎ、99mＴｃ、67Ｇａ、123Ｉ、131Ｉ、または90Ｙである、請求項１３から２０の何れかに記載の方法。
【請求項２２】
腫瘍の診断剤又は治療剤キットの製造のための、（ａ）腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片と、一対の親和性物質のうちの一方とを連結した第一の標的化分子、及び（ｂ）放射性同位元素と、前記一対の親和性物質のうちの他方とを連結した第二の標的化分子の使用であって、腫瘍の診断又は治療を必要とする患者に、前記第一の標的化分子を投与し、前記第一の標的化分子が腫瘍部位に特異的に結合し、かつ当該腫瘍部位に安定して存在する間であって、前記患者の非腫瘍部位に非特異的に吸着された前記第一の標的化分子が患者の血中から実質的に排出されるのに十分な時間が経過した後に、前記第二の標的化分子を前記患者に投与し、前記放射性同位元素を前記腫瘍部位に局在化させることを特徴とする、上記の使用。
【請求項２３】
一対の親和性物質のうちの一方が、ビオチン結合性タンパク質であり、一対の親和性物質のうちの他方がビオチン又はその誘導体である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
ビオチン結合性タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジン、タマビジン、又はそれらの誘導体である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
第二の標的化分子において、放射性同位元素と結合しうるキレート剤を用いて、放射性同位元素と前記一対の親和性物質のうちの他方とが連結している、請求項２２から２４の何れかに記載の使用。
【請求項２６】
腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片が、抗Ｒｏｂｏ１抗体である、請求項２２から２５の何れかに記載の使用。
【請求項２７】
第一の標的化分子が、腫瘍細胞に特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ストレプトアビジとを連結してなる４量体又は２量体の分子である、請求項２２から２６の何れかに記載の使用。
【請求項２８】
腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片が、重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、Ｒｏｂｏ１に特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項２２から２７の何れかに記載の使用。
【請求項２９】
前記患者の非腫瘍部位に非特異的に吸着された前記第一の標的化分子が患者の血中から実質的に排出されるのに十分な時間が、前記第一の標的化分子の投与後６時間から１４４時間である、請求項２２から２８の何れかに記載の使用。
【請求項３０】
前記放射性同位元素が、64Ｃｕ、124Ｉ、76Ｂｒ、68Ｇａ、111Ｉｎ、99mＴｃ、67Ｇａ、123Ｉ、131Ｉ、または90Ｙである、請求項２２から２９の何れかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片と放射性同位元素とを組み合わせて含む、腫瘍の診断剤又は治療剤キットに関する。より詳細には、本発明は、腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片と放射性同位元素との投与時期を規定することを特徴とする、腫瘍の診断剤又は治療剤キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Robo1(roundabout, axon guidance receptor, homolog 1)は肝細胞癌の細胞膜表面において特異的に発現が亢進しており、新しい抗体治療薬開発のための標的分子として有望視されている(非特許文献１)。本発明者らは、Robo1を高発現しているHepG2細胞のnude mouse xenograftのマイクロPET イメージングのために、anti-Robo1 IgGの改変を進め、抗原を認識するために必要な最小単位であるVHおよびVLから構成される可変領域(Fv)をフレキシブルなペプチドリンカーで結合した単鎖可変領域フラグメント(single chain Fv)を作成した。さらにscFvをストレプトアビジン(SA)化、64Cu-DOTAをビオチン化することによって、ストレプトアビジン-ビオチン結合を利用したプレターゲッティング法の導入を試みてきた。しかし，抗体の腫瘍へのターゲティングの後に投与する低分子核種が，循環血中に残存する余剰抗体により吸収され，目的の腫瘍への集積度が低下するという問題点を残していた。固形腫瘍の64Cuによるイメージングでは プレターゲッティング法を実施するために、改変抗体、除去剤（clearing agent）、および核種を順次投与することが必須であるとされている(非特許文献２)。しかし、実際には各々の投与量や投与間隔といったプレターゲッティング法の実施手順には無数とも言える組み合わせが可能である。例えば、仮に生体に順次投与する3つの物質の血液中動態が既知であったとしても、生体内の各臓器および腫瘍内で起こる複雑なinteractionや経時的変化のため、正常組織集積に比して腫瘍集積を最大とするようなプレターゲッティング法の実施手順を個々の物質に関する単独データのみから推定することは困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ito H, Funahashi S, Yamauchi N, Shibahara J, Midorikawa Y, Kawai S, Kinoshita Y, Watanabe A, Hippo Y, Ohtomo T, Iwanari H, Nakajima A, Makuuchi M, Fukayama M, Hirata Y, Hamakubo T, Kodama T, Tsuchiya M, Aburatani H. Identification of ROBO1 as a novel hepatocellular carcinoma antigen and a potential therapeutic and diagnostic target. Clin Cancer Res. 2006 Jun 1;12(11 Pt 1):3257-64
【非特許文献２】Goldenberg DM, Sharkey RM, Paganelli G, Barbet J, Chatal JF. Antibody pretargeting advances cancer radioimmunodetection and radioimmunotherapy. J Clin Oncol. 2006 Feb 10;24(5):823-34
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明においては、64Cuを用いたプレターゲッティング マイクロPET によって、biodistributionの最適化のために、scFv-SA及び64Cu-DOTA-Biotinの組み合わせ投与方法を検討し、腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片と放射性同位元素とを組み合わせて含む腫瘍の診断剤又は治療剤キットを提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、除去剤（clearing agent）を使用することなく、腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片と放射性同位元素とを投与して腫瘍を診断又は治療することができる、腫瘍の診断剤又は治療剤キットを提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討し、（ａ）腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片と、一対の親和性物質のうちの一方とを連結した第一の標的化分子、及び（ｂ）放射性同位元素と、前記一対の親和性物質のうちの他方とを連結した第二の標的化分子を含む、腫瘍の診断剤又は治療剤キットを用いて、腫瘍の診断又は治療を必要とする患者に、前記第一の標的化分子を投与し、前記第一の標的化分子が腫瘍部位に特異的に結合し、かつ当該腫瘍部位に安定して存在する間であって、前記患者の非腫瘍部位に非特異的に吸着された前記第一の標的化分子が患者の血中から実質的に排出されるのに十分な時間が経過した後に、前記第二の標的化分子を前記患者に投与し、前記放射性同位元素を前記腫瘍部位に局在化させることによって、腫瘍を診断及び治療できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  （ａ）腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片と、一対の親和性物質のうちの一方とを連結した第一の標的化分子、及び（ｂ）放射性同位元素と、前記一対の親和性物質のうちの他方とを連結した第二の標的化分子を含む、腫瘍の診断剤又は治療剤キットであって、腫瘍の診断又は治療を必要とする患者に、前記第一の標的化分子を投与し、前記第一の標的化分子が腫瘍部位に特異的に結合し、かつ当該腫瘍部位に安定して存在する間であって、前記患者の非腫瘍部位に非特異的に吸着された前記第一の標的化分子が患者の血中から実質的に排出されるのに十分な時間が経過した後に、前記第二の標的化分子を前記患者に投与し、前記放射性同位元素を前記腫瘍部位に局在化させることを特徴とする、上記の腫瘍の診断剤又は治療剤キット。
（２）  一対の親和性物質のうちの一方が、ビオチン結合性タンパク質であり、一対の親和性物質のうちの他方がビオチン又はその誘導体である、（１）に記載の腫瘍の診断剤又は治療剤キット。
（３）  ビオチン結合性タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジン、タマビジン、又はそれらの誘導体である、（２）に記載の腫瘍の診断剤又は治療剤キット。【０００７】
（４）  第二の標的化分子において、放射性同位元素と結合しうるキレート剤を用いて、放射性同位元素と前記一対の親和性物質のうちの他方とが連結している、（１）から（３）の何れかに記載の腫瘍の診断剤又は治療剤キット。
（５）  腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片が、抗Ｒｏｂｏ１抗体である、（１）から（４）の何れかに記載の腫瘍の診断剤又は治療剤キット。【０００８】
（６）  第一の標的化分子が、腫瘍細胞に特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ストレプトアビジとを連結してなる４量体又は２量体の分子である、（１）から（５）の何れかに記載の腫瘍の診断剤又は治療剤キット。
（７）  腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片が、重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、Ｒｏｂｏ１に特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である、（１）から（６）の何れかに記載の腫瘍の診断剤又は治療剤キット。【０００９】
（８）  前記患者の非腫瘍部位に非特異的に吸着された前記第一の標的化分子が患者の血中から実質的に排出されるのに十分な時間が、前記第一の標的化分子の投与後６時間から１４４時間である、（１）から（７）の何れかに記載の腫瘍の診断剤又は治療剤キット。
（９）  前記放射性同位元素が、64Ｃｕ、124Ｉ、76Ｂｒ、68Ｇａ、111Ｉｎ、99mＴｃ、67Ｇａ、123Ｉ、131Ｉ、または90Ｙである、（１）から（８）の何れかに記載の腫瘍の診断剤又は治療剤キット。【００１０】
（１０）  重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、Ｒｏｂｏ１に特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）。
（１１）  一対の親和性物質のうちの一方が連結されている、（１０）に記載の一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）。
（１２）  （１０）又は（１１）に記載の一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする核酸。【００１１】
（１３）  腫瘍の診断又は治療を必要とする患者に、腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片と、一対の親和性物質のうちの一方とを連結した第一の標的化分子を投与し、前記第一の標的化分子が腫瘍部位に特異的に結合し、かつ当該腫瘍部位に安定して存在する間であって、前記患者の非腫瘍部位に非特異的に吸着された前記第一の標的化分子が患者の血中から実質的に排出されるのに十分な時間が経過した後に、放射性同位元素と、前記一対の親和性物質のうちの他方とを連結した第二の標的化分子を前記患者に投与し、前記放射性同位元素を前記腫瘍部位に局在化させることを含む、腫瘍の診断又は治療のための方法。
（１４）  一対の親和性物質のうちの一方が、ビオチン結合性タンパク質であり、一対の親和性物質のうちの他方がビオチン又はその誘導体である、（１３）に記載の方法。
（１５）  ビオチン結合性タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジン、タマビジン、又はそれらの誘導体である、（１４）に記載の方法。【００１２】
（１６）  第二の標的化分子において、放射性同位元素と結合しうるキレート剤を用いて、放射性同位元素と前記一対の親和性物質のうちの他方とが連結している、（１３）から（１５）の何れかに記載の方法。
（１７）  腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片が、抗Ｒｏｂｏ１抗体である、（１３）から（１６）の何れかに記載の方法。【００１３】
（１８）  第一の標的化分子が、腫瘍細胞に特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ストレプトアビジとを連結してなる４量体又は２量体の分子である、（１３）から（１７）の何れかに記載の方法。
（１９）  腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片が、重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、Ｒｏｂｏ１に特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である、（１３）から（１８）の何れかに記載の方法。【００１４】
（２０）  前記患者の非腫瘍部位に非特異的に吸着された前記第一の標的化分子が患者の血中から実質的に排出されるのに十分な時間が、前記第一の標的化分子の投与後６時間から１４４時間である、（１３）から（１９）の何れかに記載の方法。
（２１）  前記放射性同位元素が、64Ｃｕ、124Ｉ、76Ｂｒ、68Ｇａ、111Ｉｎ、99mＴｃ、67Ｇａ、123Ｉ、131Ｉ、または90Ｙである、（１３）から（２０）の何れかに記載の方法。【００１５】
（２２）  腫瘍の診断剤又は治療剤キットの製造のための、（ａ）腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片と、一対の親和性物質のうちの一方とを連結した第一の標的化分子、及び（ｂ）放射性同位元素と、前記一対の親和性物質のうちの他方とを連結した第二の標的化分子の使用であって、腫瘍の診断又は治療を必要とする患者に、前記第一の標的化分子を投与し、前記第一の標的化分子が腫瘍部位に特異的に結合し、かつ当該腫瘍部位に安定して存在する間であって、前記患者の非腫瘍部位に非特異的に吸着された前記第一の標的化分子が患者の血中から実質的に排出されるのに十分な時間が経過した後に、前記第二の標的化分子を前記患者に投与し、前記放射性同位元素を前記腫瘍部位に局在化させることを特徴とする、上記の使用。
（２３）  一対の親和性物質のうちの一方が、ビオチン結合性タンパク質であり、一対の親和性物質のうちの他方がビオチン又はその誘導体である、（２２）に記載の使用。
（２４）  ビオチン結合性タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジン、タマビジン、又はそれらの誘導体である、（２３）に記載の使用。【００１６】
（２５）  第二の標的化分子において、放射性同位元素と結合しうるキレート剤を用いて、放射性同位元素と前記一対の親和性物質のうちの他方とが連結している、（２２）から（２４）の何れかに記載の使用。
（２６）  腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片が、抗Ｒｏｂｏ１抗体である、（２２）から（２５）の何れかに記載の使用。【００１７】
（２７）  第一の標的化分子が、腫瘍細胞に特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ストレプトアビジとを連結してなる４量体又は２量体の分子である、（２２）から（２６）の何れかに記載の使用。
（２８）  腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片が、重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、Ｒｏｂｏ１に特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である、（２２）から（２７）の何れかに記載の使用。【００１８】
（２９）  前記患者の非腫瘍部位に非特異的に吸着された前記第一の標的化分子が患者の血中から実質的に排出されるのに十分な時間が、前記第一の標的化分子の投与後６時間から１４４時間である、（２２）から（２８）の何れかに記載の使用。
（３０）  前記放射性同位元素が、64Ｃｕ、124Ｉ、76Ｂｒ、68Ｇａ、111Ｉｎ、99mＴｃ、67Ｇａ、123Ｉ、131Ｉ、または90Ｙである、（２２）から（２９）の何れかに記載の使用。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片と放射性同位元素とを組み合わせて用いることによって、除去剤（clearing agent）を使用することなく腫瘍を診断又は治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、B5209B mouse-scFv- Streptavidin（SA）の発現ベクターの構造を示す。
【図２】図２は、サイズ排除クロマトグラフィーによりB5209B scFv-Streptavidinを最終精製した結果を示す。
【図３】図３は、B5209B scFv-StreptavidinとROBO1の等温滴定型熱量測定(ITC)の結果を示す。
【図４】図４は、B5209B scFv-StreptavidinとBiotinの等温滴定型熱量測定(ITC)の結果を示す。
【図５】図５は、 B5209B scFv-Streptavidinの示差走査型熱量測定(DSC)の結果を示す。
【図６】図６は、実施例におけるマイクロPETイメージングで使用した遺伝子組み換え抗ROBO1モノクローナル抗体の構造を示す。抗Robo1 whole IgG B5209 mAb (150kDa)をもとに、改変モノクローナル抗体としてscFv-StreptAvdin (scFv-SA, SA四量体を含め170kDa)を作成した。なお、IgGのFc部分には、複数のDOTAが導入される余地があるのに対し、scFv-SAでは四量体を形成するSAのそれぞれのsubunitに対して、一つの64Cu-DOTA-Biotinしか結合しない。
【図７】図７は、64Cu-DOTA-BiotinとscFv-SAを混和して投与した場合の結果を示す（左上A: 2時間後、右上B: 1日後、左下C: 2日後、右下D: 3日後)。64Cu-DOTA-Biotin-SA-scFv複合体の血中滞留性は高い(A)。ほとんどが肝臓経由で排泄され、大分子のため腫瘍への移行性は低いと推察される(B, C)。腫瘍への移行は量的には少ないが、正常軟部組織と比べた場合には腫瘍への特異的結合を確認することができる(D)。
【図８】図８は、64Cu-DOTA-Biotinのみを投与した場合（改変抗体は投与していない）の結果を示す（左A: 30分後、中央B: 2時間後、右C: 1日後）。投与後30分では膀胱へすでに排泄されたRI、腎盂に貯留しているRI（両側腎臓中央部）、腎実質に集積しているRI、および肝実質に集積していると考えられるRIが描出されている(A)。2時間後では腎尿路系から64Cu-DOTA-Biotinはほとんど排泄されているにもかかわらず、肝臓への集積が持続している(B)。一日後では、胆道系を介して腸管へ排泄されたと考えられるRI像に加えて、新たに腫瘍への集積が同定できる。肝臓への集積は依然として最も高い(C)。
【図９】図９は、プレターゲッティング実験において、ビオチン化アシアロシンチをclearing agent(CA)として用いた場合の一例(64Cuから一日後の画像)を示す。64Cu-DOTA-Biotinの投与36時間前にscFv-SAを400μg投与し、12時間前にclearing agentを1000μg投与した。腫瘍へのRIの集積度は低く、CAはこの例では集積度を下げており、CA使用の有用性は認められない。
【図１０】図１０は、プレターゲッティング実験において、clearing agent(CA)を使用しなかった場合（左A: 1日後、中央B: 2日後、右C: 3日後）の結果を示す。
【図１１】図１１は、scFv-SA投与から64Cu-DOTA-Biotin投与までの間隔を変化させて、腫瘍集積への影響を評価した結果を示す。
【図１２】図１２は、HepG2担癌マウスに、scFv-SA400μgを尾静脈より投与し、その４日後に90Yを標識したDOTA-Biotin  1.5mCiを投与した後30日間の腫瘍増殖曲線を示す。
【図１３】図１３は、ELISAによるscFv-Streptavidin血中濃度の測定の結果を示す。
【図１４】図１４は、scFv-Streptavidin血中濃度の測定結果の対数近似曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
（１）腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片
本発明では、腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片と、一対の親和性物質のうちの一方とを連結した第一の標的化分子を用いる。
【００２２】
腫瘍細胞に特異的に結合する抗体としては、Ｒｏｂｏ１(roundabout, axon guidance receptor, homolog 1)に対する抗体のほか、例えば、以下の腫瘍抗原に対する抗体を使用することもできる。
【００２３】
【表１】
2010131590.tif 000003
【００２４】
抗体断片としては、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を用いることが好ましいが、それ以外の抗体断片（例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなど）を用いることができる。
第一の標的化分子は好ましくは、腫瘍細胞に特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ストレプトアビジンとを連結してなる４量体又は２量体の分子である。
【００２５】
既知の抗原に対する抗体の作成は、当業者に公知の方法により行うことができる。腫瘍細胞に特異的に結合する抗体を作成するためには、まず、腫瘍抗原またはそのフラグメントを免疫原として用いて、抗体 を生成することが知られている任意の動物（マウス、ウサギ等）に皮下または腹膜内注射することにより免疫することができる。免疫に際してアジュバントを用いてもよく、そのようなアジュバントは当業者に公知である。モノクローナル抗体 は、免疫した動物から脾臓細胞を切除し、ミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体 を産生するハイブリドーマ細胞を作製することにより得ることができる。ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、細胞表面上に腫瘍抗原を発現している細胞を用いたＦＡＣＳ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、当該腫瘍抗原を認識する抗体 を産生するハイブリドーマ細胞を選択することができる。所望の抗体 を分泌するハイブリドーマをクローニングし、適切な条件下で培養し、分泌された抗体を回収し、当該技術分野においてよく知られる方法、例えばイオン交換カラム、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて精製することができる。
【００２６】
モノクローナル抗体 をコードするDNAは、慣用な方法(例えば、モノクローナル抗体 の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)により容易に単離、配列決定できる。ハイブリドーマ細胞はこのようなDNAの好ましい出発材料である。一度単離したDNA（例えば、モノクローナル抗体の重鎖をコードする遺伝子、およびモノクローナル抗体の軽鎖をコードする遺伝子）を発現ベクターに挿入し、E.coli細胞、COS細胞、CHO細胞または形質転換されなければ免疫グロブリンを産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞へ組換え、組換え宿主細胞からモノクローナル抗体を産生させることができる。
【００２７】
本発明で用いることができる抗Ｒｏｂｏ１抗体の具体例としては、重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、Ｒｏｂｏ１に特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を挙げることができる。
【００２８】
（２）放射性同位元素
本発明では、放射性同位元素と、一対の親和性物質のうちの他方とを連結した第二の標的化分子を用いる。本発明で用いることができる放射性同位元素の具体例を以下に挙げる。、治療用の放射性同位元素としては、ベータ線核種（32P、67Cu、89Sr、90Y、114mIn、117mSn、131I、153Sm、166Ho、177Lu、186Re 、188Re など）、アルファ線核種（211At、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra及び225Acなど）、オージェ電子核種（125I、及び165Erなど）を用いることができる。また、イメージング用の放射性同位元素としては、ガンマ線核種（67Ga、99mTc、111In、及び123Iなど）、ポジトロン放出核種（18F、62Cu、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、86Y、89Zr、94Tc、及び124Iなど）を用いることができる。上記の中でも、好ましくは、64Ｃｕ、124Ｉ、76Ｂｒ、68Ｇａ、111Ｉｎ、99mＴｃ、123Ｉ、131Ｉ、または90Ｙを用いることができる。
【００２９】
（３）キレート剤
本発明における第二の標的化分子においては、放射性同位元素と結合しうるキレート剤を用いて、放射性同位元素を、前記一対の親和性物質のうちの他方とを連結することができる。本発明で用いることができるキレート剤としては、ＤＯＴＡ（1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid）、ＴＥＴＡ（1,4,8,11-tetraazaryclotetradecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid）、Ｎ２Ｓ２、ＭＡＧ３、ＣＨＸ−Ａ−ＤＴＰＡなどを挙げることができる。
【００３０】
（４）一対の親和性物質
一対の親和性物質としては、（ａ）アビジン、ストレプトアビジン、タマビジン、又はそれらの誘導体等のビオチン結合性タンパク質と、（ｂ）ビオチン又はその誘導体の組み合わせを挙げることができる。アビジン、ストレプトアビジン又はタマビジンと、ビオチンとは、互いに親和性を有する限りは、それぞれの誘導体を使用することもできる。なお、タマビジンの配列は、特許第4257119号、特開2008-200038、ＷＯ２００９／０２８６２５に記載されている。
【００３１】
（５）投与方法及び製剤形態など
本発明においては、腫瘍の診断又は治療を必要とする患者に、前記第一の標的化分子を投与し、前記第一の標的化分子が腫瘍部位に特異的に結合し、かつ当該腫瘍部位に安定して存在する間であって、前記患者の非腫瘍部位に非特異的に吸着された前記第一の標的化分子が患者の血中から実質的に排出されるのに十分な時間が経過した後に、前記第二の標的化分子を前記患者に投与し、前記放射性同位元素を前記腫瘍部位に局在化させる。
【００３２】
患者の非腫瘍部位に非特異的に吸着された前記第一の標的化分子が患者の血中から実質的に排出されるのに十分な時間は特に限定されないが、一般的には、前記第一の標的化分子の投与後６時間以上３０日以内であり、好ましくは６時間から２０日以内であり、より好ましくは６時間以上１６日以内であり、例えば、６時間から１４４時間、１２時間から９６時間、又は２４時間から９６時間である。また、前記第一の標的化分子の投与回数は特に限定されず、１回だけ投与してもよいし、２回以上の任意の回数（例えば、２〜１０回など）で投与してもよい。十分な量の第一の標的化分子を腫瘍に集積させるためには、第一の標的化分子は２回以上の複数回投与することが好ましい。
【００３３】
本発明で用いる、腫瘍細胞に特異的に結合する抗体断片と、一対の親和性物質のうちの一方とを連結した第一の標的化分子、及び放射性同位元素と、前記一対の親和性物質のうちの他方とを連結した第二の標的化分子は、それぞれ薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、乳化などすることによって、腫瘍の診断剤又は治療剤として用いてもよい。例えば、上記の第一の標的化分子及び第二の標的化分子は、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、第一の標的化分子及び第二の標的化分子は、水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、組成物は、油性または水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、または乳濁液等の形状をとることができる。
【００３４】
第一の標的化分子及び第二の標的化分子の投与経路は特に限定されないが、通常は非経口投与であり、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜などで投与することができる。
【００３５】
投与量および投与回数は、患者の年齢、体重、診断の目的などによって異なる。一般には、第一の標的化分子及び第二の標的化分子の投与量としては、有効成分の投与量として１回あたり体重１ｋｇあたり、約０．１ｍｇから１０００ｍｇの範囲、好ましくは約０．１ｍｇから１００ｍｇの範囲となるように投与することができる。
【００３６】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１：改変モノクローナル抗体の作成
（１）ハイブリドーマ細胞よりのtotal RNAの調製]
モノクローナル抗体B5209B (IgG2b)産生ハイブリドーマ細胞として、特開２００８−２９０９９６号公報に記載れているモノクローナル抗体Ｂ５２０９Ｂを産生するハイブリドーマを用いた。このモノクローナル抗体Ｂ５２０９Ｂを産生するハイブリドーマは、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２３８として、２００７年（平成１９年）３月２日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託されており、さらに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２１として、２００７年（平成１９年）１０月１６日付けで国際寄託に移管された。【００３８】
上記のモノクローナル抗体B5209B (IgG2b)産生ハイブリドーマ細胞1 x 107個をphosphate -buffered saline (PBS)で一回洗浄後、細胞沈殿にTrizol液（Invitrogen社製）1 mlを加えて可溶化した。抽出液を20 G注射針を２回通してDNAをせん断した後、Trizol液付属の説明書に従ってクロロホルム抽出、イソプロパノール沈澱、80%エタノール洗浄によりtotal RNAを精製し、ジエチルピロカーボネート含有滅菌蒸留水に溶解した。得られたtotal RNAは、アガロースゲル電気泳動により、分解していないことを確認した。【００３９】
（２）IgG heavy chain V region (VH) cDNAの合成とクローニング
B5209B total RNA 5μgを鋳型として、3'-primerとしてマウスIgG2b heavy chain C領域5'端のcDNA配列に基づくprimer (5'-ccaagcttaggggccagtggatagactg-3')(配列番号５)を用い、SuperScript cDNA合成キット（Invitrogen社製）を使用してキットの説明に従い、1st strand cDNAを合成した。得られた1st strand cDNAにNovagen社Mouse Ig-Primer SetのMuIgVH5'-A primerを加えて、Expand High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics社製)を用いて２本鎖cDNAを増幅した。得られた２本鎖cDNAをTAクローニング法によりpGEM-T vector (Promega社製)にサブクローニングし、大腸菌DH5αに導入してプラスミド含有クローンを得た。6クローンに関してプラスミドDNAをQiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen社製)で精製し、常法に従って、DNA塩基配列を決定した。抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちの１番目から１２２番目までのアミノ酸配列（配列番号３のアミノ酸配列）であることが判明した。【００４０】
（３）抗ROBO1モノクローナル抗体B5209BのIgG light chainN末端アミノ酸配列の決定
モノクローナル抗体B5209B (IgG2b)を含むハイブリドーマ無血清培養上清からProtein Gカラム（GE 社製）を用いて、付属の説明書に従い抗体の精製を行った。
精製したモノクローナル抗体B5209BをSDS-PAGEを用いて電気泳動を行った。電気泳動ゲルはPVDF膜に転写した後、クマシー染色を行った。染色されたIgG Light chainのバンドを切り出し、エドマン分解法によりN末端アミノ酸配列（DIQMT）を決定した。【００４１】
（４）B5209B mouse-scFv-SA の発現ベクターの構築（図１）
図１に記載の構造を有するB5209B mouse-scFv-SA の発現ベクターを構築した。当該発現ベクター中のB5209B mouse-scFv-SA の塩基配列を配列番号１に記載し、アミノ酸配列を配列番号２に記載する。抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちの１番目から１２２番目までのアミノ酸配列（配列番号３のアミノ酸配列）に対応し、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちの１４２番目から２４８番目までのアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸配列）に対応する。【００４２】
（５）B5209B scFv-Streptavidin  培養法
大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、アンピシリン50μg/mL含有LBプレート培地にて28℃条件下で20時間程度培養した。プレートから単一コロニーを釣菌し、アンピシリン50 μg/mL含有LB試験管培地(3 mL)に植菌後、28℃にて18時間程度振とう培養(140 rpm程度)を行った。続いて、アンピシリン50μg/mL含有2×YT培地 (1L)に前培養液の全量を植え継ぎ、28℃にて振とう培養(125 rpm)した。OD600 = 0.8の時点で終濃度 0.5 mMのIPTGを添加することで発現誘導を行い、引き続き一晩培養した。【００４３】
（６）B5209B scFv-Streptavidin  調製法
菌体内可溶性画分から目的蛋白質を回収し、Ni2+アフィニティーカラムHisTrap HP (GE healthcare)によって粗製性を行った。このとき、50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 8.0 緩衝液を移動相に用い、50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 500 mM イミダゾール, pH 8.0緩衝液を用いて段階的に溶出させた。目的蛋白質溶出画分を回収し、50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 8.0 緩衝液にて透析後、サイズ排除クロマトグラフィーにより最終精製を行った。使用したカラムはHiLoad TM 26/60 Superdex 200 (GE healthcare)、移動相には50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 8.0 緩衝液を用いた。最終精製物について、SDS-PAGEにより確認した。サイズ排除クロマトグラフィーによる最終精製とSDS-PAGEの結果を図２に示す。【００４４】
実施例２：B5209B scFv-Streptavidin  活性評価
（１）ROBO1との結合活性
等温滴定型熱量測定(ITC)により、B5209B scFv-StreptavidinとROBO1との相互作用に関する熱力学的解析を行った。図３には、溶媒にPBSを用い、25℃条件下にてB5209B scFv-Streptavidin (3.7μM)に対し、ROBO1(34.7μM)を一定量ずつ滴下した時の測定結果を示す。ここから算出された解離定数は5.6×10-8 (1/M)、エンタルピー変化量(ΔH)は-41.4 kJ/mol、またエントロピー変化量(ΔS)は0.52 J/mol・Kであった。scFvと比較すると、ΔHは顕著な変化は認められなかった。一方、ΔSは1/40程度低下しており、親和性ではおよそ一桁程度の低下が認められた。さらに、結合比では、B5209B scFv-Streptavidin 4量体に対しROBO1が2分子結合することが示唆され、4量体のうち隣接した2つの抗原結合部位は立体障害のため片方しかROBO1を認識できない可能性があると考えられる。【００４５】
（２）Biotinとの結合活性
等温滴定型熱量測定(ITC)により、B5209B scFv-StreptavidinのBiotinに対する結合活性評価を行った。図４には、溶媒にPBSを用い、25℃条件下にてB5209B scFv-Streptavidin (9μM)に対し、Biotin (90μM)を一定量ずつ滴下した時の測定結果を示す。
ここから算出された結合定数は6.94×10-9 (1/M)、エンタルピー変化量(ΔH)は-122.2 kJ/mol、また、エントロピー変化量(ΔS)は0.25 kJ/mol・Kであった。【００４６】
（３）B5209B scFv-Streptavidin  熱安定性評価
示差走査型熱量測定(DSC)により、B5209B scFv-Streptavidinの熱安定性を評価した。そのときの測定結果を図５に示す。溶媒には、PBSを用いた。B5209B scFvの熱安定性は50℃付近であることから、B5209B scFv-StreptavidinのscFvドメインの変性温度はTm 51.4℃、Streptavidinドメイン4量体解離温度はTm 66.5℃、1分子の完全変性温度はTm 108℃であると推察される。【００４７】
実施例３：scFv-Streptavidinの血中濃度の測定
（１）マウス血清サンプルの調製
HepG2細胞を移植した担癌ヌードマウスにscFv-Streptavidinを400μg投与した。15、30分後、1、2、4、8、24時間後に尾部から10μL採血を行い、3.2% クエン酸ナトリウム(wako)、1.6%ブロックエース(雪印乳業)をPBSに溶解したサンプルバッファーと混和して、血清サンプルとした。【００４８】
（２）ELISAによるscFv-Streptavidin血中濃度の測定
scFv-Streptavidin血中濃度の測定はReacti-Bind TM Biotin Coated PolystyreneStrip Plates (pierce)を用いて行った。以下にプロトコルを示す。Reacti-Bind TM Biotin Coated
Polystyrene Strip Platesへ、1.6%ブロックエースをPBSに溶解したブロッキングバッファーを添加し、室温で１時間静置してブロッキングを行った。0.05% Tween20をPBSに溶解した洗浄バッファーで洗浄後、ブロッキングバッファーで希釈した血清サンプルを添加し、室温で１時間静置してscFv-Streptavidinをプレートへ吸着させた。洗浄バッファーで洗浄後、ブロッキングバッファーで希釈したHRP標識抗ストレプトアビジン抗体(abcam)を添加し、室温で１時間静置して抗体反応を行った。洗浄バッファーで洗浄後、TMB発色試薬(scytek)を添加し、室温で30分間反応させた。反応後、TMB発色停止液を添加し、450nm吸光度を測定した。血清サンプル中のscFv-Streptavidin濃度は、精製Streptavidin (pierce)の希釈系列より検量線を作製し、算出した。結果を図１３に示す。横軸はscFvSAを投与してからの時間、縦軸は投与してから15分後のscFvSA濃度を100％としたときそれぞれの時間における濃度を%で表す。【００４９】
また、scFv-Streptavidin血中濃度の測定結果の対数近似曲線を図１４に示す。
Y = -18.24ln(x) + 75.107
R2 = 0.9832
図１４に示す近似曲線より48, 72, 168時間後の血中濃度を推定すると
2 days (48 h): Y = -18.24ln(48) + 75.107 = 4.50 (%)
3 days (72 h): Y = -18.24ln(48) + 75.107 = -2.90 (%)
7 days (168 h): Y = -18.24ln(48) + 75.107 = -18.35 (%)
となる。【００５０】
実施例４：マイクロPET
（１）材料と方法
改変モノクローナル抗体：
実施例１で作製した抗Robo1 IgG B5209 mAb (150kDa)からscFv-StreptAvdin (scFv-SA, SA四量体を含めて170kDa)を使用した(図６)。なお、scFvは28kDaである。なお、いずれのモノクローナル抗体（mAb）についても、抗体結合活性が低下していないことを事前に確認し、マイクロPET実験の際には、マウス一匹あたり400〜1000μgを使用した。【００５１】
使用動物と前処置：
HepG2細胞107個を6週齢のBALB/cAjcl-nu/nu雄マウスに移植し、マイクロPET実験時に12週齢、体重約25ｇとなるようにxenograft nude mouse modelを作成した。腫瘤部のサイズは8〜10mmである。すべてのマウスをポジトロン核種投与前の6時間は絶食とし、飲水のみとした。なお、プレターゲッティング実験の場合には、内因性Biotinの低減を目的として、マイクロPET実験の約一週間前から低ビオチン食を給餌した。【００５２】
放射性医薬品の合成：
ポジトロン核種64Cu(半減期12.7時間)を、サイクロトロンにて64Ni(p,n) 64Cu核反応を生じさせる方法により製造した。次に、製造した比放射能の高い64Cuを、双機能性キレート剤1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid(DOTA)を介して、事前に作成したプレターゲッティング用cold DOTA-Biotinの標識に使用した。【００５３】
使用機器およびデータ収集：
positron emissionデータ収集には、Siemens社製小動物用スキャナーマイクロPET Focus 120を用いた。ヌードマウス尾静脈に留置したラインから64Cu標識放射性医薬品（プレターゲッティングの場合、64Cu-DOTA-Biotin）を投与し、Emissionデータを収集した。【００５４】
Study 1: 64Cu-DOTA-Biotin-SA-scFv複合体マイクロPET Biodistribution試験（参考例）
scFv-SAの腫瘍細胞表面抗原への結合性を確認するために、scFv-SAの直接標識放射性医薬品を64Cu-DOTA-Biotin溶液と生体外で直接混和することによって作成し、xenograft nude mouseに投与した。64Cu-DOTA-Biotin-SA-scFv（複合体）の投与開始から最大で約4日後まで、マイクロPETを用いて64Cu標識複合体のヌードマウス全身への分布画像を作成した。【００５５】
Study 2: 64Cu-DOTA-Biotin マイクロPET Biodistribution試験（参考例）
プレターゲッティングに用いられるBiotin-Avdinの特異的結合は極めて強固であるが、DOTA-BiotinがscFv-SAとの結合に寄与しない場合も一定の割合で想定される。64Cu-DOTA-Biotin単独のbiodistributionを知るため、scFv-SAを投与せず64Cu-DOTA-BiotinのみHepG2腫瘍マウスモデルに投与し、マイクロPET イメージング を実施した。【００５６】
Study 3: 64Cu-DOTA-Biotin & scFv-SA プレターゲッティング 試験（clearing agentを使用）（参考例）
clearing agentはプレターゲッティング実験において癌特異的抗原と結合していない血中の余剰抗体を除去する目的に用いられる。血液中からのクリアリングは肝細胞に潤沢なアシアロ糖蛋白レセプターを介する。余剰のscFv-SAとの結合はclearing agentにも付加されたbiotinによる。つまり、Biotin-SA結合は、余剰抗体のclearing にも、pretargetされた癌細胞表面抗原の二次的な標識（腫瘍のイメージング）にも用いられていることになる。64Cu投与予定時刻の約一日前にscFvを、引き続いて64Cu投与の一定時間前には余剰の血中scFvを除去する目的で、Clearing Agentを投与した。具体的には、約3分前から12時間前までの複数の投与パターンを検討している。Clearing Agentとして99mTc標識前のアシアロシンチ原末（日本メジフィジックス社製ガラクトシル人血清アルブミン）を入手し、Biotin化した上でマウス一匹につき約100-1000μgを使用した。【００５７】
Study 4: 64Cu-DOTA-Biotin & scFv-SA プレターゲッティング 試験（clearing agentを使用しない）（本発明）
生体に投与されたclearing agnetが仮に分解され、遊離のBiotinを生じたと仮定すると癌細胞表面にpretargetされた改変抗体のSA結合部位を占拠してしまう。これは腫瘍イメージングには有害な作用である。よって、Clearing agent(CA)を使用せずにプレターゲッティングによるマイクロPET イメージングを行った。別途、実験にてscFv-SAの血液中半減期が約8時間であることが判明しており、これに基づけばCAを使用せずにscFv-SAの十分な血中クリアランスを得るためには最低2日の投与間隔が必要となる。よって、64Cu-DOTA-Biotin投与の約3日前にscFv-SAのみを約1000μg投与し、マイクロPET イメージング を実施した。なお、この例では、腎集積を減らすための利尿負荷をかけることはしていない。【００５８】
画像再構成と画像データ解析（概略）：
収集したPETデータは、上記のStudy1、Study2、Study3、およびStudy4以降ともに一連の処理後、最終段階でFiltered Back Projection法によって、3Dもしくは4D画像(dynamicデータ収集の場合)へと再構成した。画像表示、臓器や腫瘍の関心領域（ROI）設定は、マイクロPET用ソフトウェアであるAsiProなどを用いて行った。【００５９】
（２）結果
Study 1: 64Cu-DOTA-Biotin-SA-scFv複合体マイクロPET Biodistribution試験（参考例）
図７Ａでは、64Cu-DOTA-Biotin-SA-scFv complex投与後2時間にても64Cu-DOTA-Biotin-SA-scFv複合体の血中滞留性は高い。ほとんどが肝臓経由で排泄され、分子サイズの大きさのため腫瘍への移行性は低いと推察される(図７Ｂ、Ｃ)。複合体分子の腫瘍への移行は量的には少ないが、3日後まで緩徐に腫瘍部の集積は上昇し、正常軟部組織と比べた場合には腫瘍への特異的結合を確認することができた(図７Ｄ)。【００６０】
Study 2: 64Cu-DOTA-Biotin マイクロPET Biodistribution試験（参考例）
64Cu-DOTA-Biotinの単独投与後30分では膀胱へすでに排泄されたRI、腎盂に貯留しているRI（両側腎臓中央部）、腎実質に集積しているRI、および肝実質に集積していると考えられるRIが描出されている(図８Ａ)。2時間後では腎尿路系から64Cu-DOTA-Biotinはほとんど排泄されているにもかかわらず、肝臓への集積が持続している(図８Ｂ)。一日後では、胆道系を介して腸管へ排泄されたと考えられるRI像に加えて、新たに腫瘍への集積が同定できる。肝臓への集積は依然として最も高い(図８Ｃ)。なお、肝への集積度は10〜15%ID/gと算出される。【００６１】
Study 3: 64Cu-DOTA-Biotin & scFv-SA プレターゲッティング試験（clearing agentsを使用）（参考例）
図９は64Cu-DOTA-Biotinの投与36時間前にscFv-SAを400μg投与し、12時間前にclearing agentを1000μg投与したヌードマウスの例である。腫瘍へのRIの集積度は低く、むしろCAはこの例では集積度を下げており、CA使用の有用性は認められない。Clearing agentの投与方法については、64Cu-DOTA-Biotin投与までの間隔が一時間以内の場合から、12時間まで、さらにCAの投与量も増減させて複数の場合を検討したが、腫瘍部への集積が他の正常臓器と比較して良好となる結果を得ることはできなかった。【００６２】
Study 4: 64Cu-DOTA-Biotin & scFv-SA プレターゲッティング 試験（clearing agentを使用しない）（本発明）
64Cu-DOTA-Biotin投与から一日後の画像では、概ね腫瘍、肝臓、腎臓の集積が同程度どなっているが、腎集積がやや優位である。時間の経過とともに腫瘍への集積は増強し、一方で肝臓、腎臓からの排泄が進む結果、腫瘍への集積が最終的には優位となっている(図１０)。結局、CAを用いるStudy3のすべての実験と比較しても、腫瘍への集積度に関してCAを使用しないStudy 4の結果を上回る例は確認できなかった。【００６３】
scFv-SA投与から64Cu-DOTA-Biotin投与までの間隔を変化させて、腫瘍集積への影響を評価した(図１１)。その結果、投与間隔4日間、10日間、１６日間いずれも腫瘍への集積性は保たれており、比較的長期間にわたってscFv-SAが細胞表面から外れない・除去されない(あるいはinternalizationされない)ということが示され、scFv-SAと64Cu-DOTA-Biotinの投与間隔と投与方法を工夫することで、血中の余剰抗体の低減化とscFv-SAの腫瘍への高集積化を同時に達成できる可能性が示唆された。【００６４】
Study 5: 90Y-DOTA-Biotin ＆  scFv-SAプレターゲッテイング試験( clearing agentを使用しない)(本発明)
HepG2担癌マウスに、プレターゲットのため、scFv-SA400μgを尾静脈より投与し、その４日後に90Yを標識したDOTA-Biotin  1.5mCiを投与し、腫瘍増殖抑制効果の有無を評価した。図１２に90Y-DOTA-Biotin投与後、30日間の腫瘍増殖曲線を示す。Ｙ軸は、投与日の腫瘍体積を１としたときの腫瘍体積比、X軸は投与後の時間（日）を示す。概ね、投与したマウスの腫瘍増殖曲線は、コントロールマウスの近似増殖曲線（太線で表示：scFv-SA 400μgのみ投与し、90Y-DOTA-Biotinを投与していない群）を下回り、腫瘍増殖がコントロール群に比し抑えられた。また、30日の時点で、投与マウスの健康状態は、比較的良好であった。このことから、クリアリングエージェントを用いないプレターゲット法で、重篤な副作用を出さずに、腫瘍増殖をある程度抑制出来ることが示唆された。【００６５】
（３）考察
固形腫瘍のイメージングあるいは治療を目的とする分子プローブとして、モノクローナル抗体(mAb)を用いる場合には、IgGの長い血中滞留性は正常組織への高い分布による腫瘍イメージングの際のコントラスト低下のみならず、RITに応用した場合には最も放射線感受性の高い造血器の被ばく障害という致命的な問題を生じる。したがって、改変mAbの導入は固形腫瘍を対象とするイメージングおよび治療用の分子プローブを開発する上で必須である。改変mAbの生体内分布など薬物としての基本的な動態は、正常臓器への悪影響を最小限に抑制し、かつ腫瘍部へのイメージング/治療の効果が最大限に発揮されるように最適化されていなくてはならない。本実施例では、肝細胞癌に高発現しているRobo1を標的とするmAb分子B5209 IgGを元に抗体の改変を進め、機能的最小fragmentであるscFvを得た。さらに、64Cuの比放射能が低かった問題を克服した上で、HepG2腫瘍ヌードマウスを対象にしてプレターゲッティング法の導入を行った。Goldenbergらの総説によれば、Biotin-SA系を用いたプレターゲッティング法の場合には、癌細胞表面抗原との結合していない血中の余剰抗体を低減するためにclearing agentの使用が標準となっている。しかしながら、本発明によれば、biotinをcomponentとして含むclearing agentの使用が、必ずしも64Cu-DOTA-Biotinを用いたマイクロPETイメージングに有益であるとは限らないことが示された。腫瘍細胞上のscFv-SAにあるビオチン結合部位をclearing agent に由来するビオチンが少量であれ占拠している可能性がある。【００６６】
clearing agent を使用せずにプレターゲッティング法を実施する場合には、scFv-SAが自然にクリアランスされて十分に血中濃度が低下するまで、64Cu-DOTA-Biotinの投与を待たなくてはならないが、その一方で投与物質の数（すなわち投与回数）が減ることによるメリットがある。特に生体内でscFv-SAと64Cu-DOTA-Biotinの間にどのようなinteractionが生じているのか考えやすい。今後さらに抗体の改変を進めたり、プレターゲッティング systemの改善を図る上で、これは大きな利点となりうる。具体的にscFv-SAと64Cu-DOTA-Biotinの投与によって血中に生じるものは、少量の複合体と、極少量のフリーの64Cu-DOTA-Biotinであると思われるが、これらも図７及び図８で示されているように緩徐に腫瘍への集積するため、腫瘍イメージングの大きな妨げにはならなかったと思われる。【００６７】
64Cuを用いたマイクロPET イメージングから90Yが100%放射するベータ線を活用してRITを目指した場合、最も重要なことは、放射線感受性の低い正常臓器（特に造血器）への集積を抑制して、すべての正常臓器を被ばく許容閾値以下に保つ一方、腫瘍部への集積を最大限にすることである。腫瘍への集積は特異的な抗原抗体結合のみに依存する必要はなく、RIT目的では64Cu-DOTA-Biotin単独で示した腫瘍集積のように何からのpassiveなメカニズムによる集積であってもよい。上記Study4のbiodistributionからは、whole IgGよりも造血器の被ばくが著しく低下したことが明らかである。さらFab抗体の直接標識では高いFabの腎集積が明らかであったが、プレターゲッティング法によって64Cu-DOTA-Biotinを使用する場合には利尿負荷によって腎集積をさらに減少させることが可能である。以上により、正常組織の被ばくを抑えながら、一定の腫瘍への内照射治療効果を期待することができる。【００６８】
実際のＲＩＴにおいては、正常臓器への被曝を最小限に抑制し、腫瘍増殖抑制・縮小効果を得ることが重要である。本ＲＩＴ実施例においては、抗ROBO1改変抗体による、クリアリングエージェントを用いないプレターゲット法によるRITを施行し、重篤な副作用を出さずに、腫瘍増殖をある程度抑制出来ることが示唆された。プレターゲットによるRITにおいて高い抗腫瘍効果の達成には、当然ながら腫瘍への核種の高集積化が必要である。その方法の一つとして、核種投与量の増量が挙げられるが、主として全身への放射線障害の観点から90Y-DOTA-Biotinの投与量の上限が決定されることとなる。核種の高集積化を達成する別の方法としては、生体への影響を与えない程度量の改変抗体を間隔をおいて数回投与して腫瘍への高集積化を達成させるブースト法が考えられる。このブースト法の必要条件として、改変抗体がある程度長い期間、腫瘍表面に集積し続ける必要がある。本実施例では投与間隔4日間、10日間、１６日間いずれも腫瘍への集積性は保たれており、比較的長期間にわたってscFv-SAが細胞表面から外れない・除去されないことが示され、このことからブースト投与によるscFv-SAの高集積化が達成される可能性があるということが示された。このブースト投与法とＲＩＴを組み合わせることで、さらに高い抗腫瘍効果が得られることが期待される。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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