(57)【要約】要約  既存の抗酸化ペプチドよりも高い抗酸化能を発揮できる抗酸化剤が開示されている。本発明の抗酸化剤は、ミモシン又はミモシン含有ペプチドを含有する。ミモシン含有ペプチドとは、そのアミノ酸配列中に少なくとも１個のミモシン残基を含むペプチドである。ミモシンは単独でも公知の抗酸化トリペプチドより強い抗酸化力を有し、抗酸化剤として有用である。また、ペプチドに導入することによってペプチドの抗酸化作用が高まり、もとのペプチドよりも抗酸化力の高いペプチドを得ることができる。
2010104147.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミモシン又はミモシン含有ペプチドを含む抗酸化剤。
【請求項２】
前記ミモシン含有ペプチドは、アミノ酸配列中に少なくとも１個のミモシン残基を含む請求項１記載の抗酸化剤。
【請求項３】
前記ミモシン含有ペプチドのアミノ酸残基数が２〜２０である請求項１又は２記載の抗酸化剤。
【請求項４】
前記ミモシン含有ペプチドのアミノ酸残基数が３又は４である請求項３記載の抗酸化剤。
【請求項５】
前記ミモシン含有ペプチドは、抗酸化作用を有するペプチドにおいて少なくとも１個のアミノ酸がミモシンで置換又は該ペプチドに少なくとも１個のミモシンが付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなる請求項１ないし４のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
【請求項６】
前記抗酸化作用を有するペプチドが以下のいずれかである請求項５記載の抗酸化剤。
Pro-His-His
Tyr-Arg-Tyr
Xaa1-His-Tyr (Xaa1 = Pro, Arg, Tyr)
Tyr-Lys-Tyr
Xaa2-His-Trp (Xaa2 = Leu, Arg)
Xaa3-Trp-Trp (Xaa3 = Leu, Pro, Arg)
【請求項７】
前記ミモシン含有ペプチドが以下のいずれかの構造を有する請求項６記載の抗酸化剤。
Mim-Pro-His-His
Mim-Arg-Tyr
Mim-His-Tyr
Mim-Lys-Tyr
Mim-His-Trp
Mim-Trp-Trp
Pro-Mim-His
Pro-His-Mim
Leu-Trp-Mim
Leu-His-Mim
（Mimはミモシン残基を示す）
【請求項８】
抗酸化作用を有するペプチド中の少なくとも１個のアミノ酸をミモシンで置換又は該ペプチドに少なくとも１個のミモシンを付加若しくは挿入することを含む、ペプチドの抗酸化作用の向上方法。
【請求項９】
ミモシン含有ペプチドを含むチロシナーゼ阻害剤。
【請求項１０】
前記ミモシン含有ペプチドが以下のいずれかの構造を有する請求項９記載のチロシナーゼ阻害剤。
Mim-Pro-His-His
Mim-His-Tyr
Mim-His-Trp
Mim-Trp-Trp
（Mimはミモシン残基を示す）
【請求項１１】
請求項９又は１０記載のチロシナーゼ阻害剤を有効成分として含有する美白用組成物。
【請求項１２】
酸化抑制用であるミモシン又はミモシン含有ペプチド。
【請求項１３】
チロシナーゼ阻害用であるミモシン含有ペプチド。
【請求項１４】
美白用である請求項１３記載のミモシン含有ペプチド。
【請求項１５】
酸化の抑制が望まれる製品にミモシン又はミモシン含有ペプチドを含有させることを含む製品の酸化抑制方法。
【請求項１６】
生体にミモシン又はミモシン含有ペプチドを投与することを含む生体内の活性酸素の除去方法。
【請求項１７】
生体にミモシン含有ペプチドを投与することを含む生体内のチロシナーゼの阻害方法。
【請求項１８】
美白方法である請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミモシン又はミモシン含有ペプチドを含む抗酸化剤、及びミモシン含有ペプチドを含むチロシナーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトは体内に常時酸素を取り入れる事によって生命の維持を保っている。しかし、体内に取り入れた酸素のうち、全体の約2〜3％が活性酸素になる。生成した過剰な活性酸素は生体を構成する脂質、糖質、タンパク質、核酸を攻撃して酸化させ、それが組織や細胞の傷害となり、癌、脳卒中、老化、各種の生活習慣病、皮膚の老化(シワ)、色素沈着(シミ)などの発症につながるとされている。従って、生体においては抗酸化物によって、活性酸素を除去することは健康を維持する上で重要であり、また成人病の予防の鍵となるとされている。このため、近年、抗酸化能を有する機能性分子が注目を浴びている（非特許文献１）。【０００３】
一方、１０年以上前に抗酸化作用を有する天然アミノ酸からなるペプチドが発見され構造解析された。この構造に基づき各種の合成ペプチドを用いた研究でトリペプチドが活性の中心であることが示された（非特許文献２）。【０００４】
ミモシンを多く含むギンネム（英名：Leucaena、学名：Leucaena leucocephala de Wit）は、世界中の熱帯・亜熱帯地域に繁茂しているマメ科の植物であり、異常アミノ酸ミモシンを含む。この亜熱帯性植物ギンネムは、自生する地域に他植物が生育することを妨げるアレロパシー作用を有することで知られており、その原因物質としてギンネム内で生成される成分ミモシンが知られている（非特許文献３)。軒原らは、既にミモシンの単離精製法、および品質管理法、誘導体化法を確立し、特許出願している（特願2008-210592）。ミモシンは多くの生物作用を有するため、薬剤、農薬、機能性化粧品開発等の分野への応用が期待されている（特許文献１、非特許文献４)。【０００５】
ミモシンそのものは既知化合物であるが、ミモシンを単体で用いるよりも、ペプチドに導入して細胞透過性や分子認識能など多様な機能を付与することにより、付加価値の高い化合物が創製できると考えられる。例えば化粧品にあるペプチドを添加することで機能・効果を付与することが知られているが、そのときのペプチド添加物の濃度は数〜10 ppmで十分であることが知られている。【０００６】
本発明者らはこれまでに、大豆タンパク質の部分加水分解物から単離されたペプチドに基づいて高い抗酸化力を有するペプチド(Pro-His-His)を発明し、さらに類似ペプチド群においてHisやTrp、Tyrなどのアミノ酸を有する短いペプチドが抗酸化活性において重要な役割を果たすことに着目し、ペプチドのデザインを行い、合成品を用いて抗酸化作用を解明してきた(非特許文献５〜１２)。しかしながら、ミモシン単体及びミモシン導入ペプチドの抗酸化作用についてはこれまでに報告がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭63-295502号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】成人病予防食品の開発（二木鋭雄、吉川敏一、大澤俊彦編)、シーエムシー出版社、東京, 1998
【非特許文献２】Chen, H-M., Muramoto, K., Yamauchi, F., and Nokihara, K., J. Agric. Food Chem., 44, 2619-2623, 1996. Antioxidant Activity of Designed Peptides Based on the Antioxidative Peptide Isolated from Digests of a Soybean Protein
【非特許文献３】Tawata S. Pesticide and Alternatives, Elservier Science Publishers, Amsterdam, pp. 541-544.
【非特許文献４】W.D. DeWys and T.C.Hall, europ. J. Cencer Vol.9, pp. 218-283. 1973.
【非特許文献５】Saito, K., Jin, D-H., Ogawa, T., Muramoto, K., Hatakeyama, E., Yasuhara, T. and Nokihara, K., J. Agric. Food Chemistry, 51, 3668-3674, 2003. Antioxidative Properties of Tripeptide Libraries Prepared by the Combinatorial Chemistry
【非特許文献６】安原義、軒原清史、古庄律、片岡榮子、東農大農学集報, 43, 260-267, 1999.  合成トリペプチドライブラリーの構築と抗酸化活性ペプチドの高効率スクリーニング
【非特許文献７】Chen, H-M., Muramoto, K., Yamauchi, F., Fujimoto, K., and Nokihara, K., J. Agric. Food Chem., 46, 49-53, 1998.  Antioxidative Properties of Histidine-Containing Peptides Designed from Peptide Fragments Found in the Digests of a Soybean Protein
【非特許文献８】Chen, H M., Muramoto, K., Yamauchi, F., and Nokihara, K., J. Agric. Food Chem., 44, 2619-2623, 1996.  Antioxidant Activity of Designed Peptides Based on the Antioxidative Peptide Isolated from Digests of a Soybean Protein
【非特許文献９】Yasuhara, T., and Nokihara, K., Peptide 1997, ed. Shimonishi, Y., Kluwer Academic  Publishers, The Netherlands, 134-135, 1999.  Manual Construction of Combinatorial Resin Bound Tripeptide Library (One Peptide on One Bead) and Screening to Find Antioxidative Peptides
【非特許文献１０】Nokihara, K., Yasuhara, T., Muramoto, K., Ando, E., and Wray, V., Peptide Chemistry 1996, ed. Kitada, C., Protein Research Foundation, Osaka, 245-248, 1997.  Studies on Peptides Exhibiting Antioxidative Activity: Construction of a Peptide Library and Screening
【非特許文献１１】村本光二、軒原清史、成人病予防食品の開発（二木鋭雄、吉川敏一、大澤俊彦編)、シーエムシー出版社、東京、p.159-166, 1998.
【非特許文献１２】H-M. Chen et al., J. Agric. Food Chem (1995) 43, p.574-578
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、抗酸化剤として有用な、既存の抗酸化ペプチドよりも高い抗酸化能を発揮できるペプチド誘導体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らはこれまでの数多くの機能性ペプチドの研究を行ない、少数のアミノ酸からなる抗酸化ペプチドを発見している。これらの知見に基づいた鋭意研究の結果、既知の抗酸化ペプチドにミモシン残基を導入することで、より強力な抗酸化力をもつペプチドを得ることができることを見出し、さらに、ミモシンが単体でも抗酸化力を有することを見出した。また、ミモシンが単体でチロシナーゼ活性を有することは公知であるが（特許文献１、非特許文献４）、ミモシンを導入したペプチドではミモシン単体よりもチロシナーゼ阻害活性が高く、公知の強力なチロシナーゼ阻害剤であるコウジ酸にも匹敵するほど高いチロシナーゼ阻害活性を発揮し得ること、従ってミモシン導入ペプチドは美白成分として有用であることを見出し、本願発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は、ミモシン又はミモシン含有ペプチドを含む抗酸化剤を提供する。また、本発明は、抗酸化作用を有するペプチド中の少なくとも１個のアミノ酸をミモシンで置換又は該ペプチドに少なくとも１個のミモシンを付加若しくは挿入することを含む、ペプチドの抗酸化作用の向上方法を提供する。さらに、本発明は、ミモシン含有ペプチドを含むチロシナーゼ阻害剤を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のチロシナーゼ阻害剤を有効成分として含有する美白用組成物を提供する。さらに、本発明は、酸化抑制用であるミモシン又はミモシン含有ペプチドを提供する。さらに、本発明は、チロシナーゼ阻害用であるミモシン含有ペプチドを提供する。さらに、本発明は、酸化の抑制が望まれる製品にミモシン又はミモシン含有ペプチドを含有させることを含む製品の酸化抑制方法を提供する。さらに、本発明は、生体にミモシン又はミモシン含有ペプチドを投与することを含む生体内の活性酸素の除去方法を提供する。さらに、本発明は、生体にミモシン含有ペプチドを投与することを含む生体内のチロシナーゼの阻害方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、既知の抗酸化ペプチドよりも高い抗酸化能を示す抗酸化剤が提供された。ミモシンは世界中の熱帯・亜熱帯地域に繁茂しているギンネム植物体から抽出して得ることができる。ミモシンは単体でも抗酸化剤として有用である。また、ペプチドに導入することによってペプチドの抗酸化作用が高まり、公知の抗酸化ペプチドよりも抗酸化力の高いペプチドを得ることができる。ミモシン含有ペプチドは３〜４残基程度の短いペプチドとして調製することができるので、低コストで容易に合成することができる。ペプチド性抗酸化剤は相乗効果を有し、ペプチド性抗酸化剤を既存のブチルハイドロキシトルエン（BHT）等の非ペプチド性抗酸化剤と組み合わせて用いることで、非ペプチド性の合成抗酸化剤の使用量を大きく減らすことができることが知られている（非特許文献２）。本発明により、新規なペプチド性抗酸化剤が提供されたので、合成抗酸化剤の使用量低減にも貢献できる。本発明が提供するペプチド性抗酸化剤は、高いチロシナーゼ阻害活性も有しており、ミモシン含有ペプチドではミモシン単体よりもチロシナーゼ活性が高まり、美白化粧品の有効成分として公知のコウジ酸と同等ないしはそれ以上の高いチロシナーゼ阻害活性を発揮することができる。従って、本発明の抗酸化剤は美白化粧品の有効成分としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＤＰＰＨ法により本発明のペプチドの抗酸化能を調べた結果を示す。
【図２】βカロテン法により本発明のペプチドの抗酸化能を調べた結果を示す。
【図３】各種阻害剤の濃度とチロシナーゼ活性との関係を示す図である。
【図４】抗酸化ペプチドHPOA05（Mim-His-Trp-OH）及びコウジ酸による吸光度の経時的変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ミモシン（以下、「Mim」と略記することがある）は下記構造を有する化合物であり、アミノ酸の１種に分類される。ミモシンは、下記実施例のＰＤＤＨラジカル消去能に基づく抗酸化能評価において、公知の抗酸化トリペプチドPro-His-Hisよりも高い抗酸化能を有することが確認された。従って、ミモシンは単体でも抗酸化剤として有用である。
【００１５】
【化１】
2010104147.tif 000003
【００１６】
ミモシンは、天然には、熱帯・亜熱帯地域に繁茂しているマメ科の植物ギンネム（学名：Leucaena leucocephala de Wit）中に存在する。ミモシンは市販品も存在するが、ギンネムから抽出して得ることもできる。例えば、次のような抽出方法により得ることができる。ギンネムの茎葉部を沸騰水中で５分間〜２０分間程度抽出後（茎葉部１ｋｇに対して水は３〜７Ｌ程度使用する）、抽出液を適宜濾過して不溶物を除去し、強酸性陽イオン交換樹脂（抽出液１０Ｌに対し８００ｇ〜１５００ｇ程度）と接触させてミモシンを樹脂に吸着させる。次いで、樹脂を８０％程度のエタノールや水に浸漬して洗浄後、樹脂１ｋｇ当たり３〜７Ｌ程度の塩基性溶媒（１〜４Ｎのアンモニア水等）中に樹脂を５〜７時間程度浸漬してミモシンを溶出させる。溶出液は、適宜活性炭で処理後、濃縮し、塩酸等を添加してpH４．５〜５．０に調整し、０℃〜１０℃の低温下で７〜２４時間程度維持して溶出液中のミモシンを粗結晶として析出させる。次いで、粗結晶を水酸化ナトリウム等の強塩基水溶液で溶解し、酸でpHを４．５〜５．０に調整した後、０℃〜１０℃の低温下で７〜２４時間放置することで、純度の高いミモシンを結晶として析出させることができる。
【００１７】
ミモシン含有ペプチドとは、アミノ酸配列中に少なくとも１つのミモシン残基を含むペプチドである。ミモシン含有ペプチドのアミノ酸残基数（ミモシン残基も含む）は、特に限定されないが、合成のコスト及び簡便さの観点からはサイズの小さいペプチドが好ましい。従って、ミモシン含有ペプチドのアミノ酸残基数は、好ましくは２〜２０程度であり、より好ましくは２〜１０であり、さらに好ましくは３〜４程度である。
【００１８】
ミモシン含有ペプチドとしては、そのアミノ酸配列中に１つ以上のミモシン残基を含んでいればよく、ミモシン残基以外のアミノ酸残基の配列は特に限定されない。ミモシンは単体でも抗酸化作用を有するため、いかなるペプチドにミモシンを導入しても抗酸化作用を発揮すると考えられる。しかしながら、より高い抗酸化作用を有するミモシン含有ペプチドを得る観点からは、抗酸化作用を既に有するペプチドにミモシン残基を導入することが好ましい。すなわち、ミモシン含有ペプチドとしては、抗酸化作用を有するペプチドにおいて少なくとも１個のアミノ酸がミモシンで置換又は該ペプチドに少なくとも１個のミモシンが付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。ミモシン残基を導入することにより、ペプチドがもともと有する抗酸化作用をさらに高めることができる。
【００１９】
抗酸化ペプチドは種々のものが公知であり、非特許文献５〜１２にも２０残基程度以下の短いペプチドで抗酸化作用を有するものが各種開示されている。このような公知の抗酸化ペプチドのいずれを用いてもよい。公知の抗酸化ペプチドの一例を下記表１に示す。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
公知の抗酸化ペプチドの中でも、アミノ酸数が３であるトリペプチドにミモシンを導入することが好ましい。特に好ましい抗酸化トリペプチドの一例を以下に示す。
Pro-His-His
Tyr-Arg-Tyr
Xaa1-His-Tyr (Xaa1 = Pro, Arg, Tyr)
Tyr-Lys-Tyr
Xaa2-His-Trp (Xaa2 = Leu, Arg)
Xaa3-Trp-Trp (Xaa3 = Leu, Pro, Arg)
【００２２】
ミモシンの導入部位は特に限定されず、ペプチドのＮ末端でもＣ末端でもよいし、またペプチド内部に導入してもよい。ただし、後述するように、合成の収率等の観点からは、Ｃ末端に導入するよりもＮ末端に導入する方が好ましい。特に好ましいミモシン含有ペプチドの一例を以下に示す。
Mim-Pro-His-His
Mim-Arg-Tyr
Mim-His-Tyr
Mim-Lys-Tyr
Mim-His-Trp
Mim-Trp-Trp
Pro-Mim-His
Pro-His-Mim
Leu-Trp-Mim
Leu-His-Mim
【００２３】
また、ミモシン含有ペプチドは高いチロシナーゼ阻害活性を有する。ミモシン単体にチロシナーゼ阻害活性があることは公知であるが（特許文献１、非特許文献４）、下記実施例に示される通り、チロシナーゼ及びその基質であるL-DOPAを用いて公知の方法によりチロシナーゼ阻害活性を調べたところ、ミモシン含有ペプチドではミモシン単体よりも高いチロシナーゼ阻害活性が確認された。従って、ミモシン含有ペプチドはチロシナーゼ阻害剤としても有用である。チロシナーゼはチロシンを酸化してメラニンを生ずる酵素であり、肌のシミ形成に深く関わる酵素である。従来より、コウジ酸等の多くのチロシナーゼ阻害剤が美白成分として活用されている。従って、ミモシン含有ペプチドは美白化粧品等の成分としても有用である。
【００２４】
なお、ペプチドの抗酸化作用は、DPPH法やβカロテン脱色法等の公知の手法により調べることができる（Chen, H M., Muramoto, K., Yamauchi, F., and Nokihara, K., J. Agric. Food Chem., 44, 2619-2623, 1996.  Antioxidant Activity of Designed Peptides Based on the Antioxidative Peptide Isolated from Digests of a Soybean Protein等参照）。DPPH法とは、1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル(DPPH)を利用した、ラジカル消去能を測定する方法である。ペプチドが抗酸化作用を有する場合には、517nmに吸収極大をもつDPPHが還元されて、517nmにおける吸光度が減少する。すなわち、該吸光度が減少した場合にはペプチドが抗酸化作用を有すると判断できる。さらに、吸光度の減少度合いによって抗酸化作用の強さを評価することができる。また、βカロテン脱色法とは、βカロテンとリノール酸および被検体の混合液を自動酸化させ、βカロテン酸化の抑制を測定することにより被検体の抗酸化能を算出する方法である。ペプチドが抗酸化作用を有さない場合には、自動酸化が進みβカロテンが脱色されるので、492 nmにおける吸光度が減少する。すなわち、該吸光度が減少しない場合にはペプチドが抗酸化作用を有すると判断できる。さらに、吸光度の減少度合いによって抗酸化作用の強さを評価することができる。こうした公知の評価方法は、生体内で並行して働く複数の抗酸化機構の一部を反映するものであり、いずれかの評価方法において抗酸化作用があると評価できれば、抗酸化剤として有用であると考えることができる。
【００２５】
また、ペプチドのチロシナーゼ阻害活性は、例えば、チロシナーゼ及びその基質であるL-ジヒドロキシフェニルアラニン（L-DOPA）やL-チロシン等の基質物質を用いた公知の測定方法により評価することができる。その具体例は下記実施例に記載される通りであり、例えば、チロシナーゼ阻害活性を測定すべきペプチドと、チロシナーゼと、基質物質とをリン酸緩衝液にそれぞれ溶解させ（ペプチドとチロシナーゼは同一溶液中でもよい）、３者を混合後、直ちに分光光度計により波長475 nmにおける吸光度変化を測定する。メラニンは475 nmに吸収極大をもつため、チロシナーゼによりL-DOPAからメラニンが合成されると475 nmの吸光度が増大する。ペプチドによりチロシナーゼ活性が阻害されれば、475 nmにおける吸光度の増大が減少する。従って、この吸光度変化を指標としてペプチドのチロシナーゼ阻害活性を評価することができる。
【００２６】
ミモシン含有ペプチドの合成は、通常の固相法ペプチド合成技術を用いて容易に行なうことができる。固相法において使用されるC末端アミノ酸としては、目的ペプチドのC末端アミノ酸がすでに固相レジンに結合したものが市販されており、そのような市販品を好ましく用いることができる。例えば、レジンとしては、ポリスチレンにWangの開発したリンカー(トリフルオロ酢酸(TFA)によって切断可能である)を有するもの、弱い酸でもペプチド鎖とレジンとの間での切断が可能なクロルトリチルレジンを好ましく用いることができる。また同様に、ペプチド合成で通常用いられている手法でMimをペプチド鎖のC末端に配置することもできる。この場合は、通常のペプチド固相合成に用いられる条件で切断可能なリンカーを配した担体（レジン）に常法によりMimを導入する。Mimレジンに順次アミノ酸を結合することによって得られた保護ペプチドレジンをクリーベイジすればよい。しかしながら、収率などから鑑みて、MimはN末端に導入する方が価格的に有利であり精製も容易である。
【００２７】
Nαアミノ基の保護には、フルオレニルメトキシカルボニル基(Fmoc基)を用い、除去には通常のFmoc法で用いられるピペリジン溶液を用いることができる。ミモシンのアミノ基保護も同様にFmoc法で行なうことができ、例えば、ミモシンに対し２〜５当量の塩基と１〜３当量の保護化試薬（Fmoc-OSu等）とを用い、水：ジオキサン＝１：１の混合溶媒等の水系溶媒中で好ましくFmoc化反応を行なうことができる。反応系内に添加するミモシンの量は、通常、１５〜６０ｇ／Ｌ程度である。
【００２８】
アミノ酸の側鎖保護には通常のFmoc-tBuタイプの保護基群、即ち、アミノ基(Lys, Trp)にはtert-ブトキシカルボニル基(Boc基)を、Hisのイミダゾール基にはトリフェニルメチル基(Trt基)を、Argのグアニジノ基には2,2,4,6,7−ペンタメトキシルジヒドロベンゾフラン-5-スルフォニル基(Pbf基)をそれぞれ用いることができる。これらはクリーベイジの際、TFAによって容易に除去できるため好ましい。なお、アミノ酸の側鎖の官能基を保護する方法自体は周知である（例えば、軒原清史、有機合成化学協会誌、52, 347-358, 1994、「高効率ペプチド合成：多種品目同時自動合成とペプチドライブラリー」；軒原清史、横溝義男、島津評論、52、1-8、1995、「Fmoc-tBuストラテジーによる合成ペプチドの切り出し法」；軒原清史、島津評論、 50, 13-24, 1993, 「高効率ペプチド固相法合成のための試薬」；軒原清史、島津評論、 50, 3-12, 1993, 「ペプチド化学合成の基礎」； K. Nokihara, R. Yamamoto, M. Hazama, O. Wakizawa, S. Nakamura, and M. Yamaguchi, Peptide Chemistry 1991, ed., A. Suzuki, Protein Research Foundation, Osaka, 203-208, 1992, "Development and Applications of a Novel and Practical Simultaneous Multiple Solid Phase Peptide Synthesizer"；Chan, W. C.; White, P. D. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach; Oxford University Press: New York, 2000; pp 41- 76.等）。
【００２９】
各保護アミノ酸及び保護ミモシン(アシル成分)の導入は、塩基存在下、アシル成分のカルボキシル基をベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロフォスフェート(PyBOP)、1-ヒドロキシルベンゾトリアゾール(HOBt)により活性化してアミノ成分と反応させることによって行なうことができる。
【００３０】
目的のアミノ酸を全て導入したのち得られる保護ペプチド-レジンのNαFmocを常法通り除去し、DMF、メタノール、t-ブチルメチルエーテルにより洗浄し、十分乾燥させ、そののち、TFAによりクリーベイジを行なうことで、所望の位置にミモシンを導入したミモシン含有ペプチドを得ることができる。このプロセスでは、実際に副生するカチオンを捕捉するためのスカベンジャー試薬が混在したTFAが好んで用いられる。これをこの分野ではクリーベイジカクテルと称することがあり、このカクテルの使用によって副反応生成物を大きく減らしうることが知られている。所望により、クリーベイジ後のペプチドをTFA/ジエチルエーテルによって沈殿させ、逆相HPLCで精製し、逆相HPLCで単一成分であることを確認した上、ESI-Ion-trap-MS(エレクトロスプレーイオン化質量分析)により分子量等を確認してもよい。
【００３１】
本発明の抗酸化剤は、ミモシン又は上記したミモシン含有ペプチドを含むものであるが、ミモシンとミモシン含有ペプチドの両者を含むものであってもよいし、また、ミモシン含有ペプチドを２種類以上含んでいてもよい。ミモシン又はミモシン含有ペプチドのみからなるものであってもよいし、これらの有効成分の安定化等に有用な他の成分を含んでいてもよい。また、他の公知の抗酸化ペプチド又は非ペプチド性の抗酸化剤（ブチルハイドロキシトルエン（ＢＨＴ）、α−トコフェロール等）をさらに含んでいてもよい。ペプチド性抗酸化剤を組み合わせて用いることで既存の非ペプチド性抗酸化剤の使用量を大きく減らすことが可能であることも知られている（非特許文献２）。
【００３２】
また、ミモシン含有ペプチドはミモシン単体よりも高いチロシナーゼ阻害活性を有している。そのため、ミモシン含有ペプチドはチロシナーゼ阻害剤としても有用である。チロシナーゼはチロシンを酸化してメラニンを生ずる酵素であり、肌のシミ形成に深く関わる酵素である。従って、ミモシン含有ペプチドは美白用組成物の有効成分としても有用である。美白用組成物は、洗顔料、化粧水、乳液、美容液等の基礎化粧品や、ファンデーション等の化粧品の材料として使用することができる。なお、化粧品にペプチドを添加することで機能・効果を付与することが公知であり、そのときのペプチド添加物の濃度は数〜10 ppmで十分であることが知られている。ミモシン含有ペプチドを化粧品に添加する場合は数〜10 ppm程度でもよいが、濃度はこれに限定されず、適宜決定することができる。
【００３３】
本発明の抗酸化剤を食品、化粧品、医薬品等の製品中に含有させれば、製品中の成分の酸化を抑制し、製品の保存性を高めることができる。また、近年、活性酸素と癌、脳卒中、老化、各種生活習慣病等との関連が報告され、抗酸化能を有する機能性分子が注目を浴びている。本発明の抗酸化剤は、生体に投与することで、生体内の活性酸素を除去することができるので、癌、脳卒中、老化、各種生活習慣病の予防等に有用である。また、シワやシミの防止等の美容にも有用である。投与はいかなる経路であってもよく、非経口でも経口でもよいし、全身投与でも局所投与でもよい。食品中に含有させて抗酸化のための機能性食品として提供することもできる。
【００３４】
本発明によれば、既存の抗酸化ペプチドにミモシン残基を導入することにより、該ペプチドがもともと有する抗酸化作用を向上させることができる。従って、本発明は、ペプチドの抗酸化作用の向上方法をも提供する。該方法は、抗酸化作用を有するペプチド中の少なくとも１個のアミノ酸をミモシンで置換又は該ペプチドに少なくとも１個のミモシンを付加若しくは挿入することを含む。なお、ミモシンで置換又はミモシンを付加若しくは挿入することを含むとは、そのようにミモシンで置換等された配列からなるペプチドを合成することも包含する。抗酸化作用を有するペプチドは上記した通り公知であり、好ましい抗酸化ペプチドの条件は上記と同様である。
【００３５】
上記方法に従いミモシンが導入されたペプチドは、導入前のペプチドよりも抗酸化作用が増大する。ペプチドの抗酸化作用が向上したか否かは、上記したDPPH法やβカロテン脱色法等の公知の手法により評価することができる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００３７】
１．精製ミモシンの入手
ミモシンは、以下の方法によりギンネムの茎葉部から抽出したものである。新鮮なギンネムの葉25 Kgを沸騰水100 Ｌで10分間煮沸抽出した。抽出液約100 Ｌを室温まで冷却してろ過により不溶物を除去した後、強陽イオン交換樹脂（AMBERLITE(商標) IR120 H（Plus）, GFS Chemicals Inc., 米国オハイオ州）を10 Kg加えて一晩吸着させた。イオン交換樹脂を80%エタノール25Ｌ中に12時間浸漬して洗浄を行い、続けて25 Ｌの蒸留水中に2時間浸漬して洗浄した。イオン交換樹脂を2Nアンモニア水 40 Ｌ中に6時間浸漬してミモシンをイオン交換樹脂から溶出させた。溶出液はまず活性炭処理をした。活性炭の量は当該スケールでは5 gを用い室温で10分間攪拌した後活性炭を濾過によって除去した。得られた濾液を減圧濃縮し、濃縮液を6N HClでpH 4.5〜5.0に調整し、4℃で一晩置くことで粗ミモシン塩酸塩を析出させ、ミモシン粗結晶を得た（融点175℃分解）。濾取により得られた粗結晶を6N NaOH水溶液1.8 Lに溶解させ、6N HClで中和後4℃で一晩置くことで再結晶させ、ミモシン塩酸塩の結晶100 gを得た。【００３８】
２．ミモシン導入ペプチドの合成
(1)  Ｃ末端以外にMimを導入した合成ペプチド
合成ペプチドは全てHiPep研究所の小型多種品目合成機PetiSyzer（商標）を用い、通常の固相法ペプチド合成技術を用いて合成した。具体的には下記の通りである。C末端アミノ酸としては目的ペプチドのC末端アミノ酸がすでに固相レジンに結合したもの(市販品)を用いた。レジンとしては、ポリスチレンにWangの開発したリンカーを結合させたもの(トリフルオロ酢酸(TFA)によって切断される)または弱い酸でもペプチド鎖とレジンとの間での切断が可能なクロルトリチルレジンを用いた。アミノ酸及びミモシンのNαアミノ基保護にはフルオレニルメトキシカルボニル基(Fmoc基)を用い、この除去には通常のFmoc法で用いられる2%ピペリジン、2% 1,8-ジアザビシクロ-[5,4,0]-7-ウンデセン(DBU)のDMF溶液を用いた。側鎖保護には通常のFmoc-tBuタイプの保護に用いられるもの、即ち、アミノ基(Lys, Trp)にはt-ブトキシカルボニル基(Boc基)を、Hisのイミダゾール基にはトリフェニルメチル基(Trt基)を、Argのグアニジノ基には2,2,4,6,7−ペンタメトキシルジヒドロベンゾフラン-5-スルフォニル基(Pbf基)をそれぞれ用いた。これらはクリーベイジの際、TFAによって容易に除去できた。保護された各アミノ酸及びミモシン(アシル成分)のカップリングは、カルボキシル基を塩基存在下ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロフォスフェート(PyBOP)と1-ヒドロキシルベンゾトリアゾール(HOBt)により活性化して、アミノ成分のアミノ基に結合させることにより行なった。目的のアミノ酸を全て導入した後、得られた保護ペプチド-レジンのNαFmocを常法通り塩基で除去し、DMF、メタノール、t-ブチルメチルエーテルにより洗浄し、十分乾燥し、さらにTFAによるクリーベイジでレジンからペプチドを遊離させた。クリーベイジ溶液としてはカクテルTFA/TIS（トリイソプロピルシラン）/水=90/5/5 を使用し、Trp残基を含むペプチドには2メチルインドールを添加したクリーベイジカクテルを使用した。【００３９】
合成したペプチドはすべて、クリーベイジ後のペプチドをTFA/ジエチルエーテルによって沈殿させ、0.1% TFAあるいは10mM塩酸30%アセトニトリルに溶かし凍結乾燥した。そして、逆相HPLCカラムを用いるLCMS（エレクトロスプレーイオン化質量分析［ESI-Ion-trap-MS］）により単一成分であることを確認し、抗酸化アッセイに供した。【００４０】
逆相HPLCは、HiPep研究所のHiPep-CadenzaC18-3015S (3.0×150mm)を使用した。流速は0.5ml/分、検出はUV法(210 nm)で行った。溶出条件は、A液を0.1% TFA、B液を0.1%TFA−90%アセトニトリルとし、A/Bを99/01から69/31まで(溶出時間Rt＝(a))、A/Bを85/15から55/45まで(溶出時間Rt＝(b))、A/Bを85/15から55/45まで（溶出時間Rt＝(c)）又はA/Bを80/20から50/50まで（溶出時間Rt＝(d)）のいずれかにより直線濃度勾配で30分間溶出した。ESIMSはブルカーダルトニクス社製質量分析装置を用いて測定した。【００４１】
(2)  Ｃ末端にミモシンを配置するためのレジンの合成：Mim-2-Cl-Trt-Resin合成法
低水分ジクロロメタン（DCM）とジイソプロピルエチルアミン（DIEA）をモレキュラーシーブスで一晩乾燥させた。Cl-(2-Cl-Trt)-resin (0.98 mmol/g)（NovaBioChem, P/N:01-64-0114） 20gを三角フラスコに、Fmoc-Mim-OH（株式会社ハイペップ研究所製） 8.4 gをナスフラスコに量りとり、五酸化ニリンを入れたデシケーター中で一晩真空乾燥させた。Fmoc-Mim-OHが入ったナスフラスコへDCM（100 mL）とDIEA（13.7 mL, 80 mmol）を加え溶解させた。窒素ガス雰囲気下で、氷冷したFmoc-Mim-OH溶液を、レジンの入った三角フラスコに滴下した。発熱と発煙に気をつけながら、攪拌、氷冷を繰り返し、反応溶液を全て加えた。溶液の添加後は室温に戻し、5-10分間隔でマニュアル攪拌を行い、60分間反応を行った。反応終了後、レジンをグラスフィルターに濾取しレジンの洗浄を行なった。洗浄はDCM:メタノール（MeOH）:DIEA=17:2:1溶液で3回、DCMで3回、ジメチルホルムアミド（DMF）で3回、各100 mLずつで行なった。置換率算出のため、10 mg程度のレジンをDMF wet状態で量り取り、メタノールで3回、t-ブチルメチルエーテル（tBME）で3回洗浄し、1時間程度真空乾燥させた。精確なレジン重量を計測してから、ピペリジン（PIP）:DCM=1:1溶液を0.5 mL加えた。10分間脱Fmoc反応後、反応溶液を50 mLサイズのメスフラスコへろ過して入れた。レジンをDCMで洗浄し（1 mL x 3）、洗浄溶液もメスフラスコへ加えた。50 mLまでDCMでメスアップし、よく攪拌してからUVを測定した（301 nm, 290 nm, 267 nm）。以下の計算式から置換率を算出し、中間値を採用した。
301 nm: 置換率={(A/1.56/resin mg}x10
290 nm: 置換率={(A/1.16/resin mg}x10
267 nm: 置換率={(A/3.5/resin mg}x10          
Mim-2-Cl-Trt-Resinの置換率: 0.45 mmol/g【００４２】
置換率確認後、PIP:DBU:DMF=2:2:96でレジンの脱Fmocを行った。脱Fmoc後はDCMで3回、MeOHで3回、tBMEで3回、各100 mLで洗浄した。洗浄後はグラスフィルターにレジンを入れた状態で2-3日間デシケーター中にて減圧乾燥し、重量を計測した（Mim-2-Cl-Trt-Resinの収量: 26.8 g）。なお、特に明記したものを除き、試薬は全てナカライテスク株式会社製を使用した。【００４３】
上記の通りに調製したMim-2-Cl-Trt-Resinを用いた他は上記(1)と同様にして固相合成を行ない、Ｃ末端にミモシンが配置されたミモシン導入ペプチドを合成した。【００４４】
【表２】
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【００４５】
３．ミモシン及びミモシン導入ペプチドの急性皮膚毒性試験：ミモシンクリームの作製
植物性乳化ワックス（エマルシファイイングワックス  オレンジフラワー社、成分: ステアリルアルコール、ポリソルベート60）とオイル（食用オリーブオイル  味の素社）とを湯煎（50℃）にかけ完全に溶かし、温水（超純水）を加えて混合した。ここにミモシン、あるいはミモシン導入ペプチドの水溶液を加え完全混合、動物実験まで4℃で保存した。【００４６】
ddYマウス（9週齢、雄、各群６匹）をエーテル麻酔下でバリカンで左右の胴部の毛を除去した。左右にミモシンあるいはミモシン導入ペプチドを混入させて作製したクリームを塗布し観察した。塗布は１日に２回、３日間繰り返し、途中も含めて皮膚の状況を観察した。特段の変化は認められなかった。５日目解剖し皮膚を精査したがコントロール（ミモシンあるいはミモシン導入ペプチドの入ってないクリームを使用）の個体とで差違は認められなかった。ミモシン及びミモシン導入ペプチドに急性皮膚毒性は認められなかった。したがって、ミモシンあるいはミモシン導入ペプチドは化粧品分野に利用できると考えられる。【００４７】
４．抗酸化活性の測定
(1)  DPPHラジカル消去能
上記で合成したミモシン導入ペプチドをエタノールを使用して濃度1 mM、各1 mL調整した。また、抗酸化ペプチド(Pro-His-His)をはじめとするすでに抗酸化作用が知られているMimの無いペプチドおよびポジティブコントロールとしてBHTも同様に濃度1 mM、1 mLずつ調整し、測定対象の原液とした。次に、DPPHをエタノールに溶解し、0.1 mM DPPH-エタノール溶液を10 mL調整した。DPPH-エタノール溶液を0.15 mLと先の原液0.15 mLとを混合攪拌し（サンプル濃度500μM）、50分間室温で反応させ、波長517 nmの吸光度を紫外可視分光光度計(日本分光V-570型)で測定した。ブランクは同様の反応条件で、DPPHの代わりに同量のエタノールを加えて吸光度を測定した。コントロールは同様の反応条件で、試料液の代わりにエタノールを加えて吸光度を測定した。【００４８】
そして、以下の式によってDPPHラジカル消去能を算出した。
ラジカル消去能 AntOx (%) = ( Acon - Asam ) / Acon × 100
Acon＝50分静置後のコントロール吸光値
Asam＝50分静置後時のサンプル吸光値【００４９】
さらに、以下の式によってBHT相対抗酸化能を算出した。
BHT相対抗酸化能 (%) = [AntOx(%)] / [500μM BHT(%)]×100【００５０】
得られた結果を表３及び図１に示す。ポジティブコントロールとして測定した抗酸化ペプチドのBHT相対ラジカル消去能(抗酸化力)は23.01%であったが、ミモシンを導入すると抗酸化能は111.67%と、約５倍に上昇した。本発明ペプチドはいずれも既知の抗酸化ペプチドPro-His-Hisよりもはるかに高いラジカル消去能を示した。特にサンプル1、5および6は、抗酸化剤として一般的に使用されているBHTと同等、またはそれ以上のラジカル消去能を示した。【００５１】
【表３】
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【００５２】
(2)  βカロテンブリーチング能測定
βカロテンをクロロホルムで1 mg/mLに調整した。リノール酸をクロロホルムで0.1 g/mLに調整した。ツイーン40をクロロホルムで0.2 g/mLに調整した。100 mLナスフラスコに、βカロテンクロロホルム溶液を0.15 mL、リノール酸クロロホルム溶液を0.1 mL、ツイーン40クロロホルム溶液を0.3 mL分取し、エバポレーターでクロロホルム臭が完全になくなるまで乾固した。乾固した混合液に30 mLの純水を添加して溶解し、さらに0.2 Mリン酸緩衝液(pH 6.8) 2.7 mLを添加し、静かに攪拌しカロテン・リノール酸溶液を調整した。次に、実施例1で得られたペプチドをエタノールを使用して濃度0.05 mM、1 mLずつ調整した。また、抗酸化ペプチド(Pro-His-His)をはじめとするすでに抗酸化作用が知られているMimの無いペプチドおよびポジティブコントロールとしてBHTも同様に濃度0.05 mM、各1 mL調整し、測定対象の原液とした。【００５３】
カロテン・リノール酸溶液0.45 mLと試料原液0.05 mLとを混合攪拌し（サンプル濃度5μM）、50分間50℃で反応させ、5分後と50分後のOD 492 nmにおける吸光度を、紫外可視分光光度計で測定した。ブランクは同様の反応条件で、カロテン・リノール酸溶液の代わりに同量の蒸留水を加えて吸光度を測定した。コントロールは同様の反応条件で、試料液の代わりにエタノールを加えて吸光度を測定した。【００５４】
そして、以下の式によって抗酸化能を算出した。
抗酸化能 (%) = [ 1 - ( A5S - A50S ) / ( A5C - A50C ) ] ×100
A5C＝反応5分間後のコントロール吸光値
A5S＝反応5分後のサンプル吸光値
A50C＝反応50分後のコントロール吸光値
A50S＝反応50分後のサンプル吸光値【００５５】
さらに、以下の式によってBHT相対抗酸化能を算出した。
BHT相対抗酸化能 (%) = [AntOx(%)] / [5μM BHT(%)]×100【００５６】
得られた結果を表４及び図２に示す。ポジティブコントロールとして測定した抗酸化ペプチドの抗酸化力は63.00%であり、これにミモシンを導入すると抗酸化力は93.86%と約1.5倍に上昇した。本発明ペプチドはいずれも既知の抗酸化ペプチドPro-His-Hisよりも高い抗酸化能を示した。サンプル1、3および5は、抗酸化剤として一般的に使用されているBHTと同等の抗酸化能を持つことが示された。βカロテン法による評価ではミモシン単独の抗酸化力は15.41%にとどまり、ミモシン単独よりもペプチドに導入した方が93.86%と約６倍も効果的であった。【００５７】
【表４】
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【００５８】
５．チロシナーゼ阻害活性の測定
(1)  材料
マッシュルームチロシナーゼ（SIGMA-Aldrich, Missouri, USA）
L-DOPA（SIGMA-Aldrich, Missouri, USA）
50 mM リン酸ナトリウムバッファー(pH 6.8)
ミモシン（Lot. 20070929)
コウジ酸（Wako, Japan）
抗酸化ペプチド（ハイペップ研究所合成品HPOA01, 03, 05, 06。配列は表５に示す）【００５９】
(2)  方法
(i)  チロシナーゼ活性の測定
50 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.8）を用いて、5 mM L-DOPA溶液、マッシュルームチロシナーゼ溶液（2 units/μL）、及び1 mM阻害剤ストック溶液 (x10) を調整した。さらに1mMストック溶液から0.5、0.1、0.05、0.01 mM、及び0.005 mM (HPOA05及びコウジ酸のみ)の各ストック溶液を希釈調整した。【００６０】
2本のエッペンチューブにそれぞれ反応溶液A (5 mM DOPA溶液 25μL、50 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.8）75μL)、及び反応溶液B (阻害剤ストック溶液25μL、チロシナーゼ溶液12.5μL、50 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.8）112.5μL) を調整した。測定直前に反応溶液A、Bを混和し、分光光度計（V-570, Jasco, Tokyo, Japan）を用いて波長475 nmの吸光度を測定した。その際、室温で60秒間測定し、1秒ごとの吸光度を記録した。この操作を各サンプル濃度につき3回実施した。【００６１】
(ii)  IC50の算出
各阻害剤濃度あたりのチロシナーゼ活性率を、コントロール（チロシナーゼのみ）の値を基に算出し、Ngraphを用いて各サンプルのチロシナーゼ阻害におけるIC50を計算した。その際、下記のフィッテング式を用いた。
y=a-(a-b)/(1+(x/c)^d    (a=yの最小値、b=yの最大値、c=阻害剤濃度、d=変数)【００６２】
(3)  結果
今回の実験条件において、コントロールとして測定したミモシン及びコウジ酸のIC50はそれぞれ38.3及び6.49μMであった。それに対してHPOA01, 03, 05, 06のIC50はそれぞれ16.4、8.84、3.02、28.2μMであった（表５、図３）。すべての抗酸化ペプチドにおいてミモシン以上のチロシナーゼ阻害活性を示したが、アミノ酸配列によって阻害活性が異なっている。特にHPOA05（Mim-His-Trp-OH、Mwt：598.50）がコウジ酸以上のチロシナーゼ阻害活性を示した。以上の結果から、抗酸化ペプチド（特にHPOA05）はL-DOPAのチロシナーゼ触媒酸化反応に対する高い阻害物質として作用していると考えられる。【００６３】
その阻害機構は不明であるが、抗酸化ペプチドにおいては高濃度での反応速度 (吸光度変化) が時間経過と共に徐々に低下していくのに対して、コウジ酸では低濃度での反応速度が時間経過と共に僅かに上昇した（図４）。これはそれぞれの阻害剤において作用機構が異なる可能性（コウジ酸はチロシナーゼにより直接的に作用し、抗酸化ペプチドは間接的（L-DOPA等）に作用している等）を示唆していると考えられる。【００６４】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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