(57)【要約】  膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と、担体とを必須としてなる複合体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と、担体とを必須としてなることを特徴とする複合体。
【請求項２】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質が、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体又はそのフラグメントである請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質が、ジフテリア毒素変異体ＣＲＭ１９７又はそのフラグメントである請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
さらに、細胞に導入する目的物質が担体に封入されている、又は該目的物質と担体とが複合体を形成している請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
目的物質が、抗癌剤、心不全治療剤、神経疾患治療剤若しくは肺疾患治療剤、又は核酸である請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と担体とを必須としてなる複合体を含有することを特徴とするＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌、心不全、神経細胞疾患又は肺疾患の治療又は予防剤。
【請求項７】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と担体とを必須としてなる複合体を含有することを特徴とするＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌、心不全、神経細胞疾患又は肺疾患の診断薬。
【請求項８】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と担体とを必須としてなる複合体を含有することを特徴とする目的物質の細胞内への導入促進剤。
【請求項９】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と担体とを必須としてなる複合体、及び細胞に導入する目的物質をＨＢ−ＥＧＦを発現する細胞に添加する、又はヒトを除く動物に投与する工程を含むことを特徴とする目的物質の細胞内への導入促進方法。
【請求項１０】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と担体とを必須としてなる複合体を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤、遺伝子等の目的物質を細胞に効率よく導入することができるＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体、該複合体を含有する医薬、目的物質の細胞内への導入促進剤及び目的物質の細胞内への導入促進方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学の分野において、患部又は標的部位に直接作用し、高い効果を示す副作用の少ない医薬の開発が盛んに行われている。特に、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）と呼ばれる方法は、標的細胞及び標的組織に対して特異的に薬剤等の有効成分を運搬し、目的箇所で有効成分を作用させることのできる方法として注目されている。また、最近の分子細胞生物学の分野においても、標的細胞への遺伝子導入は、遺伝子の構造、機能又は制御機構を解析する際に不可欠となっている。さらに、このような細胞への目的物質導入技術は、医療分野で重要となるタンパク質の生産、遺伝子治療、ＤＮＡワクチン等においても極めて重要である。【０００３】
細胞に薬剤、生理活性物質、ＤＮＡ等の物質を導入する方法は種々知られている。例えば、哺乳動物の遺伝子実験系において、細胞内に遺伝子等を導入する方法として、ウイルスベクターを用いる方法（ウイルスベクター法）、リポソームを用いるリポフェクションによる方法（リポソーム法）、超音波法、エレクトロポレーション法等が行われている。【０００４】
ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターが知られており、アデノウイルスベクターにｓｈＲＮＡをデザインしたベクターを用いる一過性遺伝子発現抑制、レンチウイルスベルターにｓｈＲＮＡをデザインしたベクターを用いる恒常性遺伝子発現抑制等が行われている。しかしながら、ウイルスベクター法は、ウイルスベクターに誘導される免疫反応の問題、ウイルスベクターにより細胞の遺伝子が改変される危険性等がある。治療等に用いる場合には倫理上の問題もある。【０００５】
リポソーム法は、ウイルスベクターを用いる方法のように免疫反応等の危険性がないため安全性が高く、さらに超音波法やエレクトロポレーション法のように細胞に障害を与えることがなく、特殊な装置も必要ないため広く実施されている。しかしながら、リポソーム法では、細胞への物質導入効率が低いという問題がある。このため、疾患の治療又は実験系において、標的細胞に十分に目的物質を導入することができなかった。中でも特に、心筋細胞、神経細胞、癌細胞等の細胞に、遺伝子、薬剤等の目的物質を十分量導入することは困難であった。【０００６】
特許文献１には、細胞を、特定のアミノ酸配列を有するペプチドおよび目的物質を含む組成物と接触させる、目的物質を細胞に導入する方法が開示されている。特許文献２には、特定のアミノ酸配列を有するペプチドを用いた目的物質の細胞内導入方法が開示されている。しかしながらこれらの方法においては、心筋細胞等に特異的にかつ効率よく目的物質を導入できるようにするには、改善の余地があった。
したがって、安全性が高く、かつ心筋細胞、神経細胞等の細胞にも特異的に目的物質を効率よく導入することができる技術の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００４−５３４００４号公報
【特許文献２】特許第３７４８５６１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、薬剤、遺伝子等の目的物質を効率よく標的細胞内に導入することができるＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体、該複合体を含むキット、及び癌、心不全、神経疾患又は肺疾患の治療又は予防剤、診断薬、並びに目的物質の細胞内への導入促進剤及び導入促進方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
へパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）の膜結合型は、ジフテリア毒素の受容体であり、当該毒素が該ＨＢ−ＥＧＦに結合すると、毒素とＨＢ−ＥＧＦとの複合体はエンドサイト−シスによって細胞内へ取り込まれることが知られている（例えば、Cell, 1992, 69, p.1051-1061等）。本発明者らは、標的細胞に目的物質を効率よく導入する技術について鋭意研究した結果、ＰＥＧ−リポソームを抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体で修飾することによって作製した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体修飾リポソーム（抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム）が、膜結合型ＨＢ−ＥＧＦを介して細胞内へ効率よく導入される（取り込まれる）ことを見出した。膜結合型ＨＢ−ＥＧＦを介する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体修飾リポソームの細胞内への導入効率は、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体で修飾していないＰＥＧ−リポソームの細胞内への導入効率と比べて約６０倍以上高かった。また、ＨＢ−ＥＧＦを発現しない細胞においては、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体修飾リポソームの取り込みはほとんど起こらないことを見出し、該抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体修飾リポソームを用いると、ＨＢ−ＥＧＦを発現する細胞に特異的に、効率よく目的物質を導入することができることを見出した。さらに、従来は心筋細胞、神経細胞等への物質の導入が困難であったが、不全心筋細胞、神経細胞、肺細胞等の細胞ではＨＢ−ＥＧＦが高発現しているため（ＨＢ−ＥＧＦの不全心筋細胞での発現については、Hypertens Res. 2008 Feb;31(2):335-44.等に、心臓、肺、脳等での発現についてはBiochem Biophys Res Commun. 1993 Jan 15;190(1):125-33.等にそれぞれ記載されている）、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体修飾リポソームを用いると、これらの細胞に特異的に、しかも効率的に薬剤、遺伝子等を導入できることに想到した。また、卵巣癌、子宮癌、乳癌等の癌細胞でもＨＢ−ＥＧＦが高発現しているため（ＨＢ−ＥＧＦの卵巣癌での発現についてはCancer Sci. 2006 May;97(5):341-7.等に、子宮癌での発現については、Gynecol Oncol. 2007 Jan;104(1):158-67.等に、乳癌での発現についてはInt J Surg Pathol. 2002 Apr;10(2):91-9.等に、それぞれ記載されている）、これらの癌細胞内に、より効率よく薬剤等を導入できることも見出した。
本発明者らは、上記知見に基づきさらに研究を重ね、本発明を完成させるに至った。【００１０】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１０）に関する。
（１）膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と、担体とを必須としてなることを特徴とする複合体。
（２）膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質が、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体又はそのフラグメントである上記（１）に記載の複合体。
（３）膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質が、ジフテリア毒素変異体ＣＲＭ１９７又はそのフラグメントである上記（１）に記載の複合体。
（４）さらに、細胞に導入する目的物質が担体に封入されている、又は該目的物質と担体とが複合体を形成している上記（１）〜（３）のいずれか一項に記載の複合体。
（５）目的物質が、抗癌剤、心不全治療剤、神経疾患治療剤若しくは肺疾患治療剤、又は核酸である上記（４）に記載の複合体。【００１１】
（６）膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と担体とを必須としてなる複合体を含有することを特徴とするＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌、心不全、神経細胞疾患又は肺疾患の治療又は予防剤。
（７）膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と担体とを必須としてなる複合体を含有することを特徴とするＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌、心不全、神経細胞疾患又は肺疾患の診断薬。
（８）膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と担体とを必須としてなる複合体を含有することを特徴とする目的物質の細胞内への導入促進剤。
（９）膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と担体とを必須としてなる複合体、及び細胞に導入する目的物質をＨＢ−ＥＧＦを発現する細胞に添加する、又はヒトを除く動物に投与する工程を含むことを特徴とする目的物質の細胞内への導入促進方法。
（１０）膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と担体とを必須としてなる複合体を含むキット。【００１２】
本発明はまた、（Ａ）膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と、担体とを必須としてなる複合体、及び（Ｂ）抗癌剤、心不全治療剤、神経疾患治療剤又は肺疾患治療剤を、癌患者、心不全患者、神経疾患患者又は肺疾患患者に投与する工程を含む、癌、心不全、神経疾患又は肺疾患の治療又は予防方法；（Ａ）膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と、担体とを必須としてなる複合体、及び（Ｃ）診断試薬を、ヒトを含む哺乳動物に投与する工程を含む、癌、心不全、神経疾患又は肺疾患の診断方法；癌、心不全、神経疾患又は肺疾患の治療、予防又は診断のための、膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と、担体とを必須としてなる複合体、に関する。本発明はさらに、膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と担体とを必須としてなる複合体、及び細胞に導入する目的物質をヒトを含む動物に投与する工程を含む目的物質の細胞内への導入促進方法も包含する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、従来細胞への導入が困難であった薬剤、遺伝子等の物質を、心筋細胞、癌細胞等の標的細胞に特異的にかつ効率的に導入することができる。このため、新しい治療薬、診断薬等の開発、及び遺伝子の構造、機能等の解析等が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１（ａ）は、Ｖｅｒｏ細胞及びＶｅｒｏ−Ｈ細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現をウェスタンブロッティングにより調べた結果を示す図であり、図１（ｂ）は、コントロールであるβ−アクチンの発現をウェスタンブロッティングにより調べた結果を示す図である。
【図２】ペプシンで消化した抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体（ＩｇＧ）の還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図３】４℃における、Ｖｅｒｏ細胞（ａ）及びＶｅｒｏ−Ｈ細胞（ｂ）それぞれへの抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームの結合（接着）を示す図である。
【図４】３７℃における、Ｖｅｒｏ細胞（ａ）及びＶｅｒｏ−Ｈ細胞（ｂ）それぞれによる抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームの取り込みを示す図である。
【図５】ラット培養心筋細胞におけるヒトＨＢ−ＥＧＦのｍＲＮＡの発現（ａ）及びマウスＨＢ−ＥＧＦのｍＲＮＡの発現（ｂ）を調べた結果を示す図である。
【図６】ラット培養心筋細胞における内在性遺伝子の発現を調べた結果を示す図である。
【図７】ラット培養心筋細胞におけるヒトＨＢ−ＥＧＦ蛋白の発現（ａ）及びマウスＨＢ−ＥＧＦ蛋白の発現（ｂ）をウェスタンブロッティングにより調べた結果を示す図である。
【図８】ラット培養心筋細胞におけるヒトＨＢ−ＥＧＦ蛋白の発現局在を、抗ヒトＨＢ−ＥＧＦ抗体を用いる免疫染色により調べた結果を示す図である。
【図９】ラット培養心筋繊維芽細胞におけるヒトＨＢ−ＥＧＦ蛋白（（ａ）及び（ｃ））及びマウスＨＢ−ＥＧＦ蛋白の発現局在（（ｂ）及び（ｄ））を、抗ヒトＨＢ−ＥＧＦ抗体を用いる免疫染色により調べた結果を示す図である。
【図１０】ラット培養心筋細胞又はヒトＨＢ−ＥＧＦを強制発現させたラット培養心筋細胞へのリポソームの結合（接着）及び導入を調べた結果を示す図である。
【図１１】ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）による抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム及び対照リポソームの取り込みを調べた結果を示す図である。
【図１２】ｓｉＲＮＡ（５ｐｍｏｌ（ａ）又は５０ｐｍｏｌ（ｂ））を封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム及び対照リポソームによるＶｅｒｏ−Ｈ細胞中のルシフェラーゼ遺伝子のノックダウン実験の結果を示す図である。
【図１３】ｓｉＲＮＡを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム及び対照リポソームによるＶｅｒｏ−Ｈ細胞中のラミン遺伝子のノックダウン実験の結果を示す図である。
【図１４】ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）を移植したマウスにおけるドキソルビシン封入抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームの腫瘍増殖抑制効果を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書中、「本願発明の複合体又は促進剤が、目的物質の細胞内への導入（取り込み）を促進する」とは、本願発明の複合体又は促進剤の不在下で行われた目的物質の細胞内への導入（目的物質の細胞内への取り込み）に対して、本願発明の複合体又は促進剤が存在する場合の細胞内への目的物質の導入（目的物質の細胞内への取り込み）が、より効率よく行われることを意味する。
【００１６】
なお、本明細書中、「治療」とは、病態を完全に治癒させることの他、完全に治癒しなくても症状の進展及び／又は悪化を抑制し、病態の進行をとどめること、又は病態の一部若しくは全部を改善して治癒の方向へ導くことを、「予防」とは病態の発症を防ぐこと、抑制すること又は遅延させることを、それぞれ意味するものとする。
【００１７】
本発明の複合体は、膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質（以下、「ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質」ともいう）と、担体とを必須としてなる複合体である。このような本発明の複合体を、以下、単に「ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体」ともいう。
本発明のＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体は、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質により細胞膜上の膜結合型ＨＢ−ＥＧＦ（ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦ）と結合するものである。この結合によってシグナル伝達に変化が生じてエンドサイトシスが起こり、本発明の複合体と膜結合型ＨＢ−ＥＧＦとが結合した複合体が細胞内に取り込まれる。このような作用を利用して、細胞に導入する目的物質を細胞内へ効率よく導入することができることになる。細胞内に導入された核酸、薬剤等の目的物質は、細胞内のタンパク質等に作用したり、又は他の遺伝子の発現を制御したりして作用を発揮することになる。
【００１８】
本発明の複合体は、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質と、担体とを必須として形成される複合体であればよく、例えば、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質と、担体とが結合、接着又は吸着してなる複合体等が挙げられる。好ましくは、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質と、担体とが結合してなる複合体である。また、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質は、膜結合型ＨＢ−ＥＧＦとの結合部位以外の部位において、担体と結合、接着又は吸着していることが好ましい。このような複合体において、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質と担体とは直接結合、接着又は吸着していてもよく、スペーサー等を介して結合等していてもよい。
【００１９】
本発明におけるＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質は、膜結合型ＨＢ−ＥＧＦを認識して結合し、これにより上述したエンドサイトシスを引き起こす作用を有するものであれば特に限定されないが、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体又はそのフラグメントが好ましい。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに対する特異性が高い点から、モノクローナル抗体が好ましい。
【００２０】
抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体又はそのフラグメントは、目的物質を導入する細胞に発現している膜結合型ＨＢ−ＥＧＦが由来する動物と同種動物由来の抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体又はそのフラグメントが好ましく、例えば、ヒトＨＢ−ＥＧＦを細胞膜上に発現する細胞に目的物質を導入する場合には、抗ヒトＨＢ−ＥＧＦ抗体又はそのフラグメントが好ましい。抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体としては、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット、ヒト等の哺乳動物の細胞膜上に存在する膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに対する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体が好ましく、中でも、抗ヒトＨＢ−ＥＧＦ抗体がより好ましい。
【００２１】
本発明における抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体のフラグメントとしては、例えば、上述した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体のＦｃ部分を削除したＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ部分の可変部のみを結合させたｓｃＦｖ抗体等が好ましい。中でも、Ｆａｂ’フラグメントが好ましい。
【００２２】
本発明におけるＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質としては、ジフテリア毒素変異体ＣＲＭ１９７、そのフラグメント等も好ましい。ＣＲＭ１９７は、ジフテリア毒素のフラグメントＡ部分に変異がある無毒な変異体であり、膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合する活性は野生型毒素と同じものである。ＣＲＭ１９７は、特にヒト及びサルを含み、マウス、ラットを除く哺乳動物の膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに対して高い親和性を有することが知られているため、ＣＲＭ１９７と担体とを必須としてなる複合体を用いると、マウス、ラットを除く哺乳動物のＨＢ−ＥＧＦを発現する細胞、中でも特にヒト又はサルのＨＢ−ＥＧＦを発現する細胞に目的物質を非常に効率よく導入することができる。ＣＲＭ１９７については、J Biol Chem. 1985 Oct 5;260(22):12148-53.等に記載されている。また、特許第４２０３７４２号にはＣＲＭ１９７のアミノ酸配列等が記載されている。ＣＲＭ１９７のアミノ酸配列を配列番号１に示す。配列番号１のアミノ酸配列において、最初の２５個のアミノ酸配列がシグナル配列である。ＣＲＭ１９７のシグナル配列を除いたアミノ酸番号で３７８〜５３５番目のアミノ酸により構成されるドメインが、膜結合型ＨＢ−ＥＧＦとの結合に重要なドメインである。ＣＲＭ１９７のフラグメントとしては、ＣＲＭ１９７のシグナル配列を除いたアミノ酸番号で３７８〜５３５番目のアミノ酸配列を含むフラグメントが好ましい。
【００２３】
さらに、本発明におけるＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質には、本発明の効果を奏する限り、放射性標識、蛍光標識、色素標識等がされていてもよい。
【００２４】
本発明における「担体」とは、後述する核酸、薬剤等の細胞に導入する目的物質を、標的細胞又は標的部位まで運搬することができる素材を意味する。
本発明における担体は、巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソーム及びエマルジョンからなる群より選択される少なくとも一つから構成されることが好ましい。中でも、リポソームが好ましい。リポソームは、脂質二重層構造を有する閉鎖小胞である限り、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）であってもよいし、ＳＵＶ（small unilamellar vesicle）、ＬＵＶ（large unilamellar vesicle）、ＧＵＶ（giant unilamellar vesicle）等の一枚膜リポソームであってもよい。リポソームのサイズは特に限定されるものではないが、通常は直径約５０〜３０００ｎｍ、好ましくは直径約５０〜４００ｎｍ、さらに好ましくは直径約８０〜２００ｎｍである。リポソームを構成する脂質は特に限定されず、通常使用されるものを使用することができる。また、リポソームはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等で修飾されていてもよい。
【００２５】
本発明の複合体は、さらに、細胞に導入する目的物質（以下、単に目的物質ともいう）を含んでいてもよい。本発明の複合体が目的物質を含む場合には、例えば、細胞に導入する目的物質が担体に封入されている、又は該目的物質と担体とが複合体を形成していることが好ましい。
【００２６】
細胞に導入する目的物質は、診断、治療、研究等の目的に応じて適宜選択することができ、例えば、核酸、薬剤、ペプチド、タンパク質、糖又はこれらの複合体、試薬、治験薬等が挙げられる。
核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線状又は環状のいずれであってもよい。核酸としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等が挙げられる。核酸には、ＤＮＡ又はＲＮＡに加え、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。
【００２７】
薬剤としては、抗癌剤、心不全治療剤、神経疾患治療剤又は肺疾患治療剤が好ましい。
抗癌剤としては、ＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌の治療又は予防剤が好ましい。ＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌としては、子宮癌、卵巣癌、乳癌等が挙げられる。子宮癌の治療剤としては、例えば、シスプラチン、ドキソルビシン等が挙げられ、卵巣癌の治療剤としては、例えば、パクリタキセル、ドキシル等が挙げられる。心不全治療剤としては、キサンチン誘導体などの非選択的ＰＤＥ阻害剤；アムリノン、ミルリノン、オルプリノン、ピモベンダン、ベスナリノンなどのＰＤＥＩＩＩ阻害剤；ジギタリス製剤；その他ＡＣＥ阻害剤、ＡＴＰ製剤、硝酸薬、ジピリダモール、ニコランジル、クラスＩＩＩ群抗不整脈薬、ベプリジル（ベプリコール）等が挙げられる。また、これらの薬剤には、核酸も含まれる。例えば、心不全治療剤として、不全心筋細胞に特異的に発現する遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の核酸を含む剤を用いることができる。
【００２８】
試薬としては、蛍光試薬、色素、診断試薬等が挙げられる。
【００２９】
本発明のＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体は、ＨＢ−ＥＧＦを高発現する細胞、例えば、子宮癌、卵巣癌、乳癌等のＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌細胞、不全心筋細胞、神経細胞及び肺細胞等に効率よく目的物質を導入することができるものであることから、目的物質としては、抗癌剤、心不全治療剤、神経疾患治療剤若しくは肺疾患治療剤、又は核酸が好ましく、抗癌剤若しくは心不全治療剤、又は核酸がより好ましい。また、癌、心不全、神経疾患、肺疾患等の疾患の診断試薬も好ましい。
【００３０】
本発明の複合体の製造方法は特に限定されず、例えば、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質と担体とを、公知の方法により結合、接着又は吸着させて複合体を形成させる方法が挙げられる。例えば、担体がリポソームである場合には、マレイミド基を介してリポソームとＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質とを結合させる方法等を採用することができる。担体には、所望によりあらかじめ細胞に導入する目的物質を封入又は結合させておいてもよい。また、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質と、担体とを公知の方法により結合、接着又は吸着させて複合体を形成させた後、所望に応じて、担体に目的物質を封入又は結合させてもよい。このような担体とタンパク質とを結合等させる方法、担体に目的物質を封入等する方法は公知であり、例えば、「リポソーム応用の新展開  〜人工細胞の開発に向けて〜」（監修  秋吉  一成／辻井  薫、株式会社エヌ・ティー・エス、２００５年６月１日発刊）等に記載の方法によって行うことができる。
【００３１】
本発明のＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体の製造に用いるＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質としては、上述したように抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体若しくはそのフラグメント、又はジフテリア毒素変異体ＣＲＭ１９７若しくはそのフラグメントが好ましい。
抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに対する特異性が高い点から、モノクローナル抗体が好ましい。
【００３２】
抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体は、市販されており、本発明においては、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体として、抗体の市販品を用いることができる。抗ヒトＨＢ−ＥＧＦ抗体の市販品としては、以下のモノクローナル抗体等が挙げられ、これらの抗体はいずれもコスモ・バイオ社から販売されている。
ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＩＮＣ．製のＡｎｔｉ  ＨＢ−ＥＧＦ（Ｈ−８８）（カタログ品番：ＳＣ２８９０８）、Ａｎｔｉ  ＨＢ−ＥＧＦ（Ｃ−１８）（カタログ品番：ＳＣ１４１３）、Ａｎｔｉ  ＨＢ−ＥＧＦ（Ｅ−１０）（カタログ品番：ＳＣ７４５２６）、Ａｎｔｉ  ＨＢ−ＥＧＦ（Ｇ−１１）（カタログ品番：ＳＣ７４４４１）、Ａｎｔｉ  ＨＢ−ＥＧＦ（Ｚ１４）（カタログ品番：ＳＣ７４０７７Ｌ、ＳＣ７４０７７）、Ａｎｔｉ  ＨＢ−ＥＧＦ（Ｃ−１４）（カタログ品番：ＳＣ２１５９３）、Ａｎｔｉ  ＨＢ−ＥＧＦ（Ｎ−１７）（カタログ品番：ＳＣ２１５９１）；Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＩＮＣ．製のＡｎｔｉ  ＨＢ−ＥＧＦ（カタログ品番：ＭＡＢ２５９、ＡＦ２５９ＮＡ、ＭＡＢ２５９１）、Ａｎｔｉ  ＨＢ−ＥＧＦ，Ｈｕｍａｎ，（Ｐｏｌｙ）（商標名）（カタログ品番：ＢＡＦ２５９）；ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ−ＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ  ＩＮＴＥＲＮ’Ｌ製のＡｎｔｉ  ＨＢ−ＥＧＦ（カタログ品番：ＰＣ３１９Ｌ）；コスモ・バイオ社製のＡｎｔｉ  ＨＢ−ＥＧＦ（カタログ品番：７１５０３、７１５０１）；ＬＩＦＥＳＰＡＮ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ  ＩＮＣ製のＡｎｔｉ  Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｅｇｆ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（カタログ品番：ＬＳＣ３６６４６５００）。
抗マウスＨＢ−ＥＧＦ抗体の市販品としては、ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＩＮＣ．製のＡｎｔｉ  ＨＢ−ＥＧＦ（Ｍ−１８）（カタログ品番：ＳＣ１４１４）が挙げられる。
【００３３】
抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体は、公知の方法、例えば、Mine N, Iwamoto R, Mekada E. HB-EGF promotes epithelial cell migration in eyelid development. Development. 2005 Oct;132(19):4317-26に記載されている方法（４３１８頁、ＨＢｄｅｌ／ｄｅｌマウスを用いる作製方法）に準じて作製することもできる。例えば、抗ヒトＨＢ−ＥＧＦ抗体のモノクローナル抗体は、上記Mineらの文献において、抗原としてヒト抗原を用いて製造することができる。本発明における好ましい抗ヒトＨＢ−ＥＧＦ抗体として、大阪大学（日本国大阪府吹田市山田丘３‐１（〒565-0871）大阪大学微生物病研究所、細胞機能分野、目加田研究室）保有のハイブリドーマにより作製されるモノクローナル抗体ＨＢ−ＥＧＦ  ｍａｂ  クローン：＃３Ｅ９、＃３Ｈ４、及び＃４Ｇ１０等も使用できる。例えば、ＨＢ−ＥＧＦ  ｍａｂ  クローン：＃３Ｅ９の作製は、抗原としてヒト抗原を用いて、上記Mineらの文献に記載されているクローン４Ｄ９の作製方法に準じて行うことができる。
【００３４】
抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体のフラグメントは、公知の方法、例えば、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体を化学的又は酵素的に切断する方法、該抗体の結合部位を遺伝子工学的に調製する方法等により得ることができる。抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体のフラグメントとして、上述したＨＢ−ＥＧＦ抗体のＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ抗体等を好適に使用できる。
【００３５】
本発明のＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体の製造に用いるジフテリア毒素変異体ＣＲＭ１９７は、例えば、Uchida T. et al., Diphtheria toxin and related proteins. I. Isolation and properties of mutant proteins serologically related to diphtheria toxin. J Biol Chem 1973;248:3838‐44.に記載の方法で得ることができる。又は、特許第４２０３７４２号に記載の方法に従って、Ｃ７（β１９７）の溶原菌のストック（Ｃ７（β１９７）ファージを溶原化したジフテリア菌Ｃ７（ｂｅｔａ１９７）Ｍ１としてＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)Bacteria collection(No.39255)から入手可能）を培養し、該培養液からＣＲＭ１９７を精製する方法によっても得ることができる。また、特許第４２０３７４２号に記載のＣＲＭ１９７のアミノ酸配列（配列番号１）に基づき、Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976;  ペプチド合成、丸善（株）、１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）１９８５；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成、広川書店、１９９１などに記載されているペプチド合成方法によって合成することもできる。さらに、ＣＲＭ１９７をコードするＤＮＡ配列（配列番号２）を適当な発現ベクターに組み込み、該ベクターを大腸菌等に挿入して大腸菌等にＣＲＭ１９７を合成させることでも作製できる。
【００３６】
ＣＲＭ１９７のフラグメントは、ＣＭＲ１９７を化学的又は酵素的に切断する方法、ＣＲＭ１９７の結合部位を含むペプチドを遺伝子工学的に調製する方法等により得ることができる。また、特許第４２０３７４２号に記載のＣＲＭ１９７のアミノ酸配列（配列番号１）に基づきペプチド合成方法によって合成することができる。
【００３７】
担体の製造方法としては、公知の方法を採用することができる。例えば、リポソームの製造方法は、「リポソーム応用の新展開  〜人工細胞の開発に向けて〜」（監修  秋吉  一成／辻井  薫、株式会社エヌ・ティー・エス、２００５年６月１日発刊）等に記載されており、バンガム（単純水和）法、逆相蒸発法、超臨界二酸化炭素法等によって脂質を水和し、リポソーム溶液を得ることができる。
【００３８】
細胞に導入する目的物質を担体に封入する、又は該目的物質と担体との複合体を形成する方法としては特に限定されず、公知の方法により行うことができる。例えば、担体にリポソームを使用する場合、目的物質が水溶性である場合には、リポソームの製造にあたり脂質膜を水和する際に使用される水性溶媒に目的物質を添加することにより、リポソーム内部の水相に目的物質を封入することができる。また、目的物質が脂溶性である場合には、リポソームの製造にあたり使用される有機溶剤に目的物質を添加することにより、リポソームの脂質二重層に目的物質を封入することができる。
【００３９】
本発明のＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体は、膜結合型ＨＢ−ＥＧＦを介して細胞内に効率よく取り込まれるため、ＨＢ−ＥＧＦを高発現している細胞に後述する目的物質を効率よく導入するために使用することができるものである。例えば、子宮癌、卵巣癌、乳癌等の癌細胞、不全心筋細胞、神経細胞及び肺細胞等はＨＢ−ＥＧＦを高発現しているため、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体によりこのような細胞内に効率よく目的物質を導入することができる。
【００４０】
例えば、子宮癌、卵巣癌、乳癌等のＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌；心不全；神経疾患又は肺細疾患を発症している動物に、本発明のＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体と共に、薬剤（抗癌剤、心不全治療剤、神経疾患治療剤又は肺疾患治療剤等）を投与すると、癌細胞、不全心筋細胞、神経細胞又は肺細胞に薬剤を特異的かつ効率的に導入することができるため、これらの疾患の治療又は予防に有効である。この場合、薬剤は、本発明の複合体の投与と同時に、又は投与前若しくは投与後に、投与することができる。つまり、（１）本発明の複合体及び薬剤を含む組成物を調製して該複合体及び薬剤を同時に投与してもよく、（２）本発明の複合体を動物に投与して癌細胞、不全心筋細胞等の細胞内への取り込みを促進させた後、薬剤を添加して細胞内にとりこませてもよい。また、あらかじめ動物に薬剤を投与しておき、次いで本発明の複合体を投与してもよい。また、上記（１）の場合、薬剤（抗癌剤、心不全治療剤、神経疾患治療剤又は肺疾患治療剤等）は、本発明の複合体に含まれていてもよい。このような、目的物質として抗癌剤、心不全治療剤、神経疾患治療剤又は肺疾患治療剤等の薬剤を含む上記複合体は、本発明の好ましい実施態様の１つである。中でも、抗癌剤又は心不全治療剤を含むことが好ましい。
【００４１】
ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質と、担体とを必須としてなる複合体（ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体）を含有するＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌、心不全、神経細胞疾患又は肺疾患の治療又は予防剤も、本発明の１つである。好ましい態様としては、ＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌又は心不全の、治療又は予防剤である。本発明の治療又は予防剤は、さらに、抗癌剤、心不全治療剤、神経疾患治療剤及び肺疾患治療剤からなる群より選択される１種以上の薬剤を含んでいてもよく、剤型に応じて医薬上許容される成分を含んでいてもよい。また、本発明においては、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体が上述した抗癌剤、心不全治療剤、神経疾患治療剤又は肺疾患治療剤を含んでいてもよい。本発明の治療又は予防剤の剤型としては、非経口投与のための剤型が好ましく、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、貼付剤、噴霧剤、スプレー剤等が挙げられるが、注射剤が好ましい。
【００４２】
非経口投与のための注射剤としては、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒（注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤を適宜添加した溶液に、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体（及び所望により薬剤）を混合した後、フィルター等で濾過等して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。医薬上許容される添加剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等の等張化剤；リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等の緩衝剤；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等の保存剤；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等の増粘剤；亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等の安定化剤；塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等のｐＨ調整剤等が挙げられる。また注射剤には、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、リソレシチン、プルロニックポリオール等の非イオン界面活性剤等をさらに配合してもよい。また、例えば、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等のタンパク質；アミノデキストラン等のポリサッカリド等を含有してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアル等に充填される。注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存することもできる。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
【００４３】
本発明の治療又は予防剤に含まれるＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体の量は、治療又は予防剤の製剤形態又は投与経路によって異なるが、通常、最終製剤中に約０．０００１〜１００％の範囲から適宜選択して決定することができる。
【００４４】
本発明の治療又は予防剤をヒトを含む哺乳動物に投与する方法としては、例えば、静脈、腹腔内、皮下、経鼻等の非経口投与が挙げられる。また、細胞又は部位によっては、局所的に直接投与することもできる。例えば、心筋細胞に薬剤等を導入する場合には、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体を含む治療又は予防剤を、ＣＡＲＴＯ（登録商標）システム（ジョンソン・エンド・ジョンソン社、メディカル  カンパニー）、心筋組織内注射等によって心筋細胞に直接投与することができる。また、血管透過性亢進処置後、冠血脈内投与することも可能である。
【００４５】
本発明の治療又は予防剤を投与する際には、該治療又は予防剤の投与と同時又は投与前若しくは投与後に、対象疾患に応じて、上述した抗癌剤、心不全治療剤、神経疾患治療剤又は肺疾患治療剤等の薬剤を別途投与することもできる。例えば、（１）ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質及び薬剤（抗癌剤、心不全治療剤、神経疾患治療剤又は肺疾患治療剤等）を含む治療又は予防剤を調製して投与してもよく、（２）本発明の治療又は予防剤を動物に投与して癌細胞、不全心筋細胞等の細胞内への取り込みを促進させた後、薬剤を添加して細胞内にとりこませてもよい。また、あらかじめ動物に薬剤を投与しておき、次いで治療又は予防剤を投与してもよい。上記（１）の場合、薬剤（抗癌剤、心不全治療剤、神経疾患治療剤又は肺疾患治療剤等）は、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体に含まれていてもよい。本発明の治療又は予防剤が薬剤を含む場合、その含有量は、投与される薬剤の種類等に応じて適宜調節することができる。本発明の治療又は予防剤とは別に薬剤を投与する場合、その投与量も、投与される薬剤の種類等に応じて適宜調節することができる。
【００４６】
本発明の治療又は予防剤の投与量及び投与回数は、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク複合体と共に投与される薬剤（抗癌剤、心不全治療剤、神経疾患治療剤又は肺疾患治療剤等）の種類、量、患者の体重及び疾患等に応じて、適宜調節することができ、該薬剤が患部又は標的細胞に効率よく取り込まれるように、投与量等を調節することが好ましい。
【００４７】
本発明の治療又は予防剤の投与対象としては、子宮癌、卵巣癌、乳癌等のＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌；心不全；神経疾患及び肺細疾患からなる群より選択される１種以上の疾患を発症している哺乳動物が好適であり、治療に用いる場合には、ＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌又は心不全を発症している哺乳動物がより好ましい。予防に用いる場合には、ＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌；心不全；神経疾患及び肺細疾患からなる群より選択される１種以上の疾患を発症する可能性がある哺乳動物が好ましい。哺乳動物としては、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられ、特に該疾患を発症している又は発症する可能性があるヒトが好ましい。
【００４８】
さらに、上記ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体を、ＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌、心不全等の診断又は検出に使用することもできる。ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体を含有するＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌、心不全、神経細胞疾患又は肺疾患の診断薬も、本発明の１つである。例えば、子宮癌、卵巣癌、乳癌等のＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌、心不全、神経細胞疾患又は肺疾患等を発症した可能性がある動物に、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体を投与し、該複合体の投与と同時に、又は投与前若しくは投与後に蛍光試薬、診断試薬等を投与すると、癌細胞、不全心筋細胞、神経細胞又は肺細胞に該試薬が効率よく導入される。次いで、該試薬を公知の方法で検出等することにより、患部の検出、疾患の診断等が可能となる。なお診断試薬等は、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体に含まれていてもよい。本発明の診断薬の剤型及び投与方法は、上述した治療又は予防剤の剤型及び投与方法と同じであり、適宜選択することができる。ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体と共に用いる診断試薬の種類、投与方法、投与量等は、疾患の種類等に応じて適宜選択することができる。
【００４９】
上記ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいては細胞（標的細胞）に添加することにより、又はｉｎ  ｖｉｖｏでは動物に投与することにより、目的物質の細胞内への導入を促進することができる。ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体及び細胞に導入する目的物質をＨＢ−ＥＧＦを発現する細胞に添加する、又は動物に投与する工程を含む目的物質の細胞内への導入促進方法も、本発明の１つである。
【００５０】
本発明の細胞内への導入促進方法（以下、本発明の促進方法という）における標的細胞は、ＨＢ−ＥＧＦを高発現する細胞が好ましく、細胞膜上にＨＢ−ＥＧＦを高発現する細胞が特に好ましい。ＨＢ−ＥＧＦを発現しない又は低発現する細胞である場合には、該細胞にＨＢ−ＥＧＦを発現する遺伝子を公知の手法、例えば、実施例に記載のアデノウイルスベクターを用いる方法、又は適当なプラスミドベクターにＨＢ−ＥＧＦを発現する遺伝子を組み込んだベクターをリポフェクション、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション等の手法により細胞内に導入する方法等を用いて細胞に導入することによりＨＢ−ＥＧＦを高発現させることが可能である。標的細胞としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等の哺乳動物由来の細胞が挙げられる。哺乳動物の心筋細胞、神経細胞等の非分裂細胞も好ましい。
【００５１】
本発明の促進方法において、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体を投与する動物としては、上述した哺乳動物が挙げられる。本発明の促進方法を用いると、例えば、卵巣癌、子宮癌、乳癌等のＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌；心不全；神経疾患又は肺細疾患を発症している動物において、患部である癌細胞、不全心筋細胞、神経細胞又は肺細胞に、治験薬、薬剤、試薬、遺伝子等の目的物質を効率よく導入することができる。
【００５２】
本発明の方法においては、目的物質、及びＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体を含む組成物を調製して標的細胞に添加又は動物に投与してもよく、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体を標的細胞に添加又は動物に投与して細胞内への取り込みを促進させた後、目的物質を添加して細胞内に取り込ませてもよい。また、あらかじめ標的細胞に目的物質を添加又は動物に目的物質を投与しておき、次いでＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体を添加又は該動物に投与してもよい。目的物質は、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体に含まれていてもよく、この場合には、目的物質が担体に封入されている、又は該目的物質と担体とが複合体を形成していることが好ましい。ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体及び目的物質の添加量又は投与量は、細胞又は動物の種類、目的物質等に応じて適宜選択すればよい。
【００５３】
本発明の促進方法においては、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体を含有する組成物を細胞に添加又は動物に投与することが好ましい。このようなＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体を含有する組成物は、目的物質への細胞内導入促進剤として有用なものである。このような、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体を含有する細胞内導入促進剤も、本発明の１つである。本発明の細胞内導入促進剤は、さらに目的物質を含有してもよく、該目的物質は、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体に含まれていてもよい。
【００５４】
本発明の促進剤の剤形は特に限定されず、例えば、動物に投与する場合には、上述した治療又は予防剤と同様の剤形が挙げられ、注射剤又は点滴剤が好ましい。さらに、剤型に応じて医薬上許容される成分を含んでいてもよい。また、本発明の促進剤の動物への投与方法、投与量等も、上述した治療又は予防剤と同じである。
【００５５】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞に添加する場合の剤型としては、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体の分散液が挙げられる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液、クエン緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加して使用してもよい。
【００５６】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞に添加する場合の別の剤形としては、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体の分散液の乾燥物（例えば、凍結乾燥物、噴霧乾燥物等）が挙げられる。乾燥物は、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液を加え、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体の分散液として使用することができる。
【００５７】
本発明の促進剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて細胞に添加する場合には、例えば、好適な培地で培養した細胞に、本発明の促進剤を添加又は接触等させればよい。次いで、細胞と促進剤とをインキュベーションする工程、細胞を洗浄する工程、細胞を回収する工程等を行なってもよい。細胞内への目的物質の導入は、例えば、細胞溶解後、公知の方法により確認することができる。
【００５８】
ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質と担体とを必須としてなる複合体を含むキットも、本発明の１つである。
本発明のキットは、目的物質、目的物質を導入する細胞、緩衝液、培地等を適宜含んでもよい。ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体の好ましい態様は、上述した通りであり、ＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体が目的物質を含んでいてもよい。目的物質としては、治験薬、核酸又は薬剤が好ましい。目的物質を導入する細胞は特に限定されず、例えば、心筋細胞、神経細胞等の非分裂細胞が好ましい。目的物質を導入する細胞がＨＢ−ＥＧＦを発現しない又は低発現する細胞である場合には、該細胞にＨＢ−ＥＧＦを発現する遺伝子を公知の手法、例えば、実施例に記載したアデノウイルス等のウイルスベクターを利用する方法、又は適当なプラスミドベクターにＨＢ−ＥＧＦを発現する遺伝子を組み込んだベクターをリポフェクション、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション等により細胞内に導入する方法等によって導入することにより、ＨＢ−ＥＧＦを高発現する細胞とすることができる。
【００５９】
本発明のキットは、これまで技術的に困難であった培養心筋細胞、培養神経細胞への核酸、治験薬等の導入等に好適に用いることができるものである。
【実施例】
【００６０】
次に本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００６１】
試験例１
（Ｉ）Ｖｅｒｏ−Ｈ細胞の調製
Ｖｅｒｏ（ＨＢ−ＥＧＦ低発現）細胞は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から入手可能である。Ｖｅｒｏ−Ｈ（ＨＢ−ＥＧＦ高発現）細胞は、ヒトＨＢ−ＥＧＦを高発現する細胞であり、Goishi K., et al Phorbol ester induces the rapid processing of cell surface heparin-binding EGF-like growth factor: conversion from juxtacrine to paracrine growth factor activity. Mol Biol Cell 1995;6:967‐980.に記載されている方法に従って作製した。【００６２】
Ｖｅｒｏ（ＨＢ−ＥＧＦ低発現）細胞を、非必須アミノ酸含有ＭＥＭ培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを含有する溶液）中にて３７℃で５％二酸化炭素存在下に保存した。Ｖｅｒｏ−Ｈ（ＨＢ−ＥＧＦ高発現）細胞を、非必須アミノ酸含有ＭＥＭ培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ、及びジネティシン１μｇ／ｍＬを含有する溶液）中にて３７℃で５％二酸化炭素存在下に保存した。コンフルエント時には、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）溶液で細胞をはがした。
Ｖｅｒｏ−Ｈ細胞がＨＢ−ＥＧＦを高発現することの確認は、ウェスタンブロッティングにより行った。【００６３】
（ＩＩ）ウェスタンブロッティング
（１）細胞播種
２４個のくぼみ（ウェル）を持つプレート中に上記のＶｅｒｏ細胞又はＶｅｒｏ−Ｈ細胞を１ウェルあたり３．０×１０４個入れ、３７℃で４８時間インキュベートした。
（２）サンプル調製
（１）で培養した細胞を、氷冷したＰＢＳ（−）で、３回洗浄した。次に、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １％、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（タンパク質阻害剤を含む）で細胞を溶解させた（４℃、１時間）。細胞溶解液を遠心分離（２０，０００、１０分、４℃）し、上澄みをサンプルとして用いた。サンプルは、２８０ｎｍの吸光度によりタンパク質量を測定した後、ウェスタンブロッティングに用いた。【００６４】
（３）ウェスタンブロッティング
サンプル７．０４μＬを、４×Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＭＥ（＋）  ２．３５μＬで希釈し、次いでこの希釈液を９５℃で５分間ボイルした。サンプル（２０μｇ）と、マーカーとを、ウェスタンブロッティング用のゲルにアプライした。マーカーとして、Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ  ｍａｒｋｅｒ（５μＬ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）及びＭａｇｉｃ  ｍａｒｋ（５μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用した。濃縮ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｇｅｌ）では５ｍＡ、ランニングゲル（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｇｅｌ）では１０ｍＡで泳動を行なった。濃縮ゲルをランニングゲルから切り離し、タンパク質をニトロセルロースフィルターに４０Ｖ、９０分かけて転写した（ブロッティング）。次いで、室温で１時間、ブロッキング溶液（５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＴＴＢＳ）中で振とうしてブロッキングした。ＴＴＢＳは、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）である。【００６５】
ブロッキングしたニトロセルロースフィルターを、一次抗体を含むＴＴＢＳ（５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む）に浸して振とうしながら、４℃で一晩インキュベートした後、ＴＴＢＳで洗浄（５分×３）した。ＨＢ−ＥＧＦに対する一次抗体としては、０．１μｇ／ｍＬの抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｅｍｓ，Ｉｎｃ．製、５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＴＴＢＳで２５００倍希釈したもの）を用いた。次いで、二次抗体を含むＴＴＢＳ（５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む）に浸し、室温で１時間振とうした後、ＴＴＢＳで洗浄した（５分×３）。二次抗体には、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体  抗ヤギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ社製、５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＴＴＢＳで４０００倍希釈したもの）を用いた。ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を利用して、目的抗原の存在位置を検出した。
コントロールとして、β−アクチンを選択した。β−アクチンに対する一次抗体として、抗アクチンＩｇＧウサギ（５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＴＴＢＳで４０００倍希釈したもの）を用いた。二次抗体には、ＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製、５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＴＴＢＳで５０００倍希釈したもの）を使用した。【００６６】
（４）結果
図１（ａ）は、Ｖｅｒｏ細胞及びＶｅｒｏ−Ｈ細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現をウェスタンブロッティングにより調べた結果を示す図である。図１（ａ）及び（ｂ）において、左のレーンはマーカー、中央のレーンはＶｅｒｏ−Ｈ細胞、右のレーンはＶｅｒｏ細胞である。図１（ａ）に示すように、Ｖｅｒｏ−Ｈ細胞（中央のレーン）においては、約２０−３０ｋＤａにバンドを認め、ＨＢ−ＥＧＦを高発現していることが確認された。
図１（ｂ）は、Ｖｅｒｏ細胞及びＶｅｒｏ−Ｈ細胞におけるβ−アクチン（コントロール）の発現をウェスタンブロッティングにより調べた結果を示す図である。図１（ｂ）より、Ｖｅｒｏ細胞及びＶｅｒｏ−Ｈ細胞のいずれにおいても、β−アクチンは同程度に発現していることが分かる。【００６７】
実施例１
（Ｉ）抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合ＰＥＧリポソームの調製
（１）Ｆ（ａｂ’）２化抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の調製
Ｆ（ａｂ’）２化抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の調製は、常法に従って行った。
ヒトＩｇＧ（大阪大学微生物病研究所、細胞機能分野、目加田研究室（日本国大阪府吹田市山田丘３‐１（〒565-0871））保有のハイブリドーマより作製したモノクローナル抗体（ＨＢ−ＥＧＦ  ｍａｂ  クローン：＃３Ｅ９））を、ペプシンで消化した（３７℃、１０時間）。なお、ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体ＨＢ−ＥＧＦ  ｍａｂ  クローン：＃３Ｅ９は、例えば、抗原としてヒト抗原を用いて、Mine N, Iwamoto R, Mekada E. HB-EGF promotes epithelial cell migration in eyelid development. Development. 2005 Oct;132(19):4317-26の４３１８頁、ＨＢｄｅｌ／ｄｅｌマウスを用いる作製方法に準じて作製できる（ＨＢ−ＥＧＦ  ｍａｂ  クローン：＃３Ｅ９の作製は、該文献に記載されているクローン４Ｄ９の作製方法に準じて行うことができる）。Ｕｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ５４（ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたゲル濾過により、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを精製した。２８０ｎｍの吸光度を指標として、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを含む溶出画分を集めた。切断とＦ（ａｂ’）２フラグメントの精製とをモニタするためにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ約３０ｋＤａにバンドを認め、Ｆ（ａｂ’）２化されていることが確認できた（図２）。図２に示すＳＤＳゲル電気泳動は還元条件で実施しているため、Ｆ（ａｂ’）２化フラグメントのバンドは１１０ｋＤａには観察されないが、ＩｇＧのレーン（中央）でみられる約５０ｋＤａのバンドが消失しており、これにより完全にＦ（ａｂ’）２化されていることがわかる。このＦ（ａｂ’）２フラグメントを、Ｆ（ａｂ’）２化抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体として用いた。【００６８】
（２）蛍光標識リポソームの調製
薄膜法（Ｔｈｉｎ  ｆｉｌｍ  ｍｅｔｈｏｄ）により、水素添加大豆ホスファチジルコリン／コレステロール／ポリエチレングリコール結合水素添加大豆ホスファチジルコリン／マレイミド化ポリエチレングリコール結合水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｍａｌ）リポソームを調製した。
マイクロシリンジで脂質溶液（水素添加大豆ホスファチジルコリン／コレステロール／ポリエチレングリコール結合水素添加大豆ホスファチジルコリン／マレイミド化ポリエチレングリコール結合水素添加大豆ホスファチジルコリン／オクタデシルインドカルボシアニン（蛍光物質）＝１／０．６７／０．０３／０．００３（対照リポソームの場合は０）／０．０５（モル比））をナス型フラスコに分取した。溶媒を完全に留去し、６０℃に温めた生理食塩水を加え、ボルテックスミキサーを用いながら完全に復水した。エクストルーダーにセットした孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜フィルターを１０回通過させ、リポソームの粒子径を調整した。【００６９】
（３）蛍光標識抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームの調製
上記で調製したＦ（ａｂ’）２化抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体を、システアミン塩酸塩（ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ−ＨＣｌ）と混合し、３７℃で１．５時間インキュベートして反応させ、Ｆ（ａｂ’）２化抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体を還元した。次に、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏ．製）を用いたゲル濾過により、還元したＦａｂ’化抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体を分離した。このＦａｂ’化抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体をマレイミド化ポリエチレングリコール結合水素添加大豆ホスファチジルコリンと等モルとなるように、（２）で調製したリポソーム溶液に添加し、４℃で２０時間反応させた。反応後、Ｆａｂ’化抗ＨＢ−ＥＧＦの１０倍モル量の０．１Ｍ  Ｎ−エチルマレイミドを添加し、未反応のスルフヒドリル基を阻害した。セファロース担体を用いたゲル濾過により、蛍光標識された、Ｆａｂ’化抗ＨＢ−ＥＧＦが結合したリポソーム（蛍光標識抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム）を精製した。蛍光標識抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームの検出は、２８０ｎｍ及び６１０ｎｍの吸光度の測定により行った。【００７０】
（ＩＩ）細胞培養
Ｖｅｒｏ（ＨＢ−ＥＧＦ低発現）細胞を、非必須アミノ酸含有ＭＥＭ培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを含有する溶液）中にて３７℃で５％二酸化炭素存在下に保存した。Ｖｅｒｏ−Ｈ（ＨＢ−ＥＧＦ高発現）細胞を、非必須アミノ酸含有ＭＥＭ培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ、及びジネティシン１μｇ／ｍＬを含有する溶液）中にて３７℃で５％二酸化炭素存在下に保存した。コンフルエント時には、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）溶液で細胞をはがした。
得られた細胞を、取り込み試験に用いた。【００７１】
（ＩＩＩ）取り込み試験
２４個のくぼみを持つプレート中に前記で培養したＶｅｒｏ細胞又はＶｅｒｏ−Ｈ細胞を１ウェルあたり３．０×１０４個入れ、３７℃で４８時間細胞をインキュベートした。次いで、プレートのそれぞれくぼみから培養液を取り除き、上記（Ｉ）の（２）及び（３）で調製した蛍光標識抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム（ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｍａｌ／ＤｉＩ）又は対照の蛍光標識リポソーム（ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ／ＤｉＩ）を含む非必須アミノ酸含有ＭＥＭ培地を、表１に示す量添加した。表１に、調製したサンプルのリポソーム濃度を示した。【００７２】
【表１】
2010090222.tif 000002
【００７３】
４℃又は３７℃にてリポソーム及び細胞を含む培地を４時間インキュベートした後、リン酸緩衝生理食塩水を用いて３回細胞を洗浄した。洗浄した細胞に、細胞溶解用緩衝溶液（０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むトリス−塩酸緩衝溶液）を加えることにより、細胞を溶解させた。細胞溶解液を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに回収して、次いで１，０００ｇで１０分間遠心し、その上清を回収した。そのサンプルの蛍光強度を蛍光光度計で測定した（Ｅｘ：５４９ｎｍ、Ｅｍ：５９２ｎｍ）。各サンプルの蛍光強度は、タンパク質量で補正した。【００７４】
また、Ｖｅｒｏ細胞又はＶｅｒｏ−Ｈ細胞それぞれに上記の蛍光標識した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合ＰＥＧリポソームを添加後、細胞内における該リポソームの局在を、共焦点レーザー顕微鏡観察によって調べた。【００７５】
（ＩＶ）結果
結果を図３及び図４に示した。グラフの縦軸は蛍光強度（Ｅｘ：５４９ｎｍ、Ｅｍ：５９２ｎｍ）を示し、縦軸の値が大きいほど、細胞へのリポソームの結合（接着）及び細胞によるリポソームの取り込み量が多いことを意味する。図中、四角（◆）は、対照のリポソームを、三角（▲）は、Ｆａｂ’化抗ＨＢ−ＥＧＦが結合したリポソーム（抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム）を、それぞれ表わす。
図３は、４℃における細胞内へのリポソームの結合（接着）を調べた結果であり、図４は、３７℃における細胞内へのリポソームの取り込みを調べた結果である。４℃では、細胞内へのリポソームの取り込みはほとんど起こらなかった。図３及び図４において、いずれも左図（図３（ａ）及び図４（ａ））のＶｅｒｏ細胞（ＨＢ−ＥＧＦ低発現）では、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームの細胞内への結合（接着）又は取り込みは、対照のリポソームの取り込みをわずかに上回るのみであった。一方、右図（図３（ｂ）及び図４（ｂ））のＶｅｒｏ−Ｈ細胞（ＨＢ−ＥＧＦ高発現）では、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームの細胞内への結合（接着）又は取り込みは、対照のリポソームの取り込みを大きく上回った。
以上の結果より、ＨＢ−ＥＧＦ高発現が認められる不全心筋、卵巣癌、子宮癌、乳癌細胞等の細胞では、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム（抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体修飾リポソーム）の細胞内への取り込みの増強が期待できると考えられた。【００７６】
さらに、共焦点レーザー顕微鏡観察での分析の結果、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいては、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合ＰＥＧリポソームは、Ｖｅｒｏ−Ｈ細胞（ＨＢ−ＥＧＦ高発現細胞株）に積極的に取り込まれ、細胞内に内在化されることが明らかとなった。【００７７】
なお、実施例１で製造した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームにおいて、上記で使用した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の代わりに、他の抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体（例えば、市販されている抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体）、ＣＲＭ１９７等を使用しても、実施例１と同様の結果が得られる。以降の実施例についても、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームにおいて、上記で使用した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体以外の抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体（例えば、市販されている抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体）、ＣＲＭ１９７等を使用しても、同様の結果が得られる。【００７８】
実施例２
実施例１のＶｅｒｏ細胞及びＶｅｒｏ−Ｈ細胞において確認された実験結果を踏まえて、ヒトＨＢ−ＥＧＦを特異的に認識する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームが実際に心筋細胞に取り込まれることを確認することを目的として、以下の実験を行なった。
具体的には、新生仔ラット培養心筋細胞にヒトＨＢ−ＥＧＦを発現させ、該ヒトＨＢ−ＥＧＦ発現系における抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームの取り込みを調べた。【００７９】
（Ｉ）アデノウイルスコンストラクト作製
ヒトＨＢ−ＥＧＦを発現するアデノウイルスコンストラクト（Ａｄ−ＨｓＨＢＥＧＦ）、及びマウスＨＢ−ＥＧＦを発現するアデノウイルスコンストラクト（Ａｄ−ＭｍＨＢＥＧＦ）を、それぞれ作製した。また、アデノウイルスコントロールとして、ＬａｃＺを発現するアデノウイルスコンストラクトを作製した（Ａｄ−ＬａｃＺ）。【００８０】
アデノウイルスコンストラクト（アデノウイルスベクター）の作製には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＧａｔｅｗａｙシステムを用いた。エントリーベクター（ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ）にヒトＨＢ−ＥＧＦ遺伝子（ＮＭ＿００１９４５．１）又はマウスＨＢ−ＥＧＦ遺伝子（ＮＭ＿０１０４１５．１）を導入したのち、アデノウイルス発現ベクター（ｐＡＤ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴ）に、コンバージョンさせることにより各コンストラクト（ベクター）を作製した。このようなベクターの作製は、例えば、Hartley JL, Temple GF, Brasch MA. (2000) DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res, Vol. 10 (11): 1788-95.に記載の方法に準じて行うことができる。【００８１】
（ＩＩ）新生仔ラット培養心筋細胞における発現検討
ラット培養心筋細胞Ｗｉｓｔａｒ  ｒａｔ（紀和実験動物研究所社製）を６ウェルのプレートに、１ウェルあたり１．５×１０６細胞で播種した。これに、上記で作製したＡｄ−ＨｓＨＢＥＧＦ、Ａｄ−ＭｍＨＢＥＧＦ又はＡｄ−ＬａｃＺのいずれかを混合して、ラット培養心筋細胞に感染させた。Ａｄ−ＨｓＨＢＥＧＦ、Ａｄ−ＭｍＨＢＥＧＦ又はＡｄ−ＬａｃＺは、ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）０−２０でラット培養心筋細胞に感染させた。なお、細胞数が１．５×１０６個の場合、ＭＯＩ  １０は＝１．５×１０−１０ＰＦＵに相当すると計算され、ＭＯＩ  １０の場合は、１．０×１０−１０ＰＦＵ／μＬの溶液を１ウェルあたり１．５μＬずつ加えた。感染後、リアルタイムＰＣＲにより、ラット培養心筋細胞におけるヒトＨＢ−ＥＧＦ又はマウスＨＢ−ＥＧＦのｍＲＮＡ発現量を調べたところ、ラット培養心筋細胞において、ヒトＨＢ−ＥＧＦ及びマウスＨＢ−ＥＧＦ遺伝子が感染用量依存的にｍＲＮＡレベルで発現していることが分かった（図５（ａ）及び（ｂ））。さらに、Ａｄ−ＨｓＨＢＥＧＦ又はＡｄ−ＭｍＨＢＥＧＦを導入したことにより、内在性遺伝子（ＡＮＰ、ＢＮＰ及びラットＨＢ−ＥＧＦのｍＲＮＡ）の発現が変化するかどうかを調べたところ、Ａｄ−ＨｓＨＢＥＧＦ又はＡｄ−ＭｍＨＢＥＧＦ導入して強制発現させたＨＢ−ＥＧＦによって、内在性ＨＢ−ＥＧＦ（ラットＨＢ−ＥＧＦ）を含む内在性遺伝子の発現は、影響を受けないことが分かった（図６）。図６（ａ）は、アデノウイルスコンストラクト導入後の利尿ペプチド（ＡＮＰ）のｍＲＮＡ、（ｂ）は利尿ペプチド（ＢＮＰ）のｍＲＮＡ、（ｃ）は内在性ＨＢ−ＥＧＦ（ラットＨＢ−ＥＧＦ）のｍＲＮＡの発現量をそれぞれ示す。なお図６（ａ）〜（ｃ）において、横軸は、コンストラクト導入後の時間を示す。【００８２】
さらに、感染後３６時間後に、Ａｄ−ＨｓＨＢＥＧＦ又はＡｄ−ＭｍＨＢＥＧＦを導入したラット培養心筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦ蛋白の発現についてウェスタンブロットにより調べた結果、ヒト又はマウスＨＢ−ＥＧＦ遺伝子が感染用量依存的に蛋白レベルで発現していることが確認できた（図７）。
図７（ａ）は、感染後３６時間後のラット培養心筋細胞におけるヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質の発現を、抗ヒトＨＢ−ＥＧＦ抗体（大阪大学微生物病研究所、細胞機能分野、目加田研究室（日本国大阪府吹田市山田丘３‐１（〒565-0871））保有のハイブリドーマより作製したモノクローナル抗体（ＨＢ−ＥＧＦ  ｍａｂ  クローン：＃３Ｈ４））を使用してウェスタンブロットにより検出した結果である（非還元条件）。この抗ヒトＨＢ−ＥＧＦ抗体（ＨＢ−ＥＧＦ  ｍａｂ  クローン：＃３Ｈ４）の作製は、抗原としてヒト抗原を用いて、Mine N, Iwamoto R, Mekada E. HB-EGF promotes epithelial cell migration in eyelid development. Development. 2005 Oct;132(19):4317-26に記載されている、ＨＢｄｅｌ／ｄｅｌマウスを用いる作製方法（４３１８頁）に準じて行うことができる。図７（ｂ）は、ラット培養心筋細胞におけるマウスＨＢ−ＥＧＦタンパク質の発現を、抗マウスＨＢ−ＥＧＦ抗体（Ｍ−１８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製、ＳＣ１４１４）を使用してウェスタンブロットにより検出した結果である（非還元条件）。【００８３】
培養心筋細胞でのヒトＨＢ−ＥＧＦ発現の用量依存性変化及び細胞内における局在を検討した（図８）。図８（ａ）〜（ｄ）は、それぞれＡｄ−ＨｓＨＢＥＧＦを（ａ）：ＭＯＩ＝０、（ｂ）：ＭＯＩ＝２、（ｃ）：ＭＯＩ＝５、（ｄ）：ＭＯＩ＝１０導入した培養心筋細胞上に存在する膜結合型ＨＢ−ＥＧＦを、抗ヒトＨＢ−ＥＧＦ抗体（ＨＢ−ＥＧＦ  ｍａｂ  クローン：＃３Ｈ４）を使用して免疫染色により染色した結果である。図において、白い部分が染色された膜結合型ヒトＨＢ−ＥＧＦである。図８（ａ）〜（ｄ）より、ラット培養心筋細胞においては、ヒトＨＢ−ＥＧＦタンパク質が、感染用量依存的に細胞膜に発現することが分かった。【００８４】
（ＩＩＩ）新生仔ラット培養心筋線維芽細胞における発現解析検討
（ＩＩ）のラット培養心筋細胞の代わりに新生仔ラット培養心筋繊維芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ  ｒａｔ、紀和実験動物研究所社製）を使用して、上記で作製したアデノウイルスコンストラクト（Ａｄ−ＨｓＨＢＥＧＦ又はＡｄ−ＭｍＨＢＥＧＦ）をＭＯＩ＝１０で細胞に感染させた。上記（ＩＩ）と同様にして、培養心筋線維芽細胞におけるＨＢ−ＥＧＦ発現の局在性を調べた。【００８５】
培養心筋線維芽細胞におけるＨＢ−ＥＧＦ発現の局在性を検討したところ、ヒトＨＢ−ＥＧＦ及びマウスＨＢ−ＥＧＦは強制発現させた新生仔ラット培養心筋繊維芽細胞においても細胞膜に局在していることが分かった（図９、スケールバー：１００μｍ）。図９（ａ）及び（ｃ）は、Ａｄ−ＨｓＨＢＥＧＦを感染させてヒトＨＢ−ＥＧＦを発現させた培養心筋線維芽細胞を、抗ヒトＨＢ−ＥＧＦ抗体（ＨＢ−ＥＧＦ  ｍａｂ  クローン：＃３Ｈ４）を用いて免疫染色した結果である。図９（ｂ）及び（ｄ）は、Ａｄ−ＭｍＨＢＥＧＦを感染させてマウスＨＢ−ＥＧＦを発現させた培養心筋線維芽細胞を、抗ヒトＨＢ−ＥＧＦ抗体（ＨＢ−ＥＧＦ  ｍａｂ  クローン：＃３Ｈ４）を用いて免疫染色した結果である。図において、白い部分が染色された膜結合型ＨＢ−ＥＧＦである。ＨＢ−ＥＧＦ  ｍａｂ  クローン：＃３Ｈ４はマウスＨＢ−ＥＧＦを検知しない（マウスＨＢ−ＥＧＦに結合しない）ため、マウスＨＢ−ＥＧＦは染色されない。培養心筋線維芽細胞においても、導入したアデノウイルスベクターにより発現したヒトＨＢ−ＥＧＦは細胞膜上に局在することが確認された。【００８６】
以下の免疫リポソームの細胞取り込み及び接着実験においては、上記のヒトＨＢ−ＥＧＦを発現させたラット培養心筋細胞を用いた。コントロールとして、Ａｄ−ＬａｃＺを導入したラット培養心筋細胞を用いた。【００８７】
（ＩＶ）リポソームの細胞への取り込み及び接着実験
実施例１と同様の方法で、３７℃又は４℃にて、Ｆａｂ’化抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームが細胞に接着するか、及び細胞に取り込まれるかを調べた。使用したＦａｂ’化抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームは、実施例１で作製した蛍光標識抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームである。
結果を、図１０（ａ）〜（ｄ）に示す。グラフの縦軸は、蛋白質量で補正した蛍光強度（Ｅｘ：５４９ｎｍ、Ｅｍ：５９２ｎｍ）を示す。図１０（ａ）〜（ｄ）において、波線は、Ｆａｂ’化抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体で修飾したＰＥＧリポソームを使用した場合であり、実線は、Ｆａｂ’化抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体で修飾していないＰＥＧリポソームを使用した場合である。図１０（ａ）は、Ａｄ−ＬａｃＺを導入したラット培養心筋細胞の、３７℃におけるリポソームの接着及び取り込みを、（ｂ）は、Ａｄ−ＨｓＨＢＥＧＦを導入したラット培養心筋細胞の、３７℃におけるリポソームの接着及び取り込みを、それぞれ示している。図１０（ｃ）は、Ａｄ−ＬａｃＺを導入したラット培養心筋細胞の、４℃におけるリポソームの接着及び取り込みを、（ｄ）は、Ａｄ−ＨｓＨＢＥＧＦを導入したラット培養心筋細胞の、４℃におけるリポソームの接着及び取り込みを、それぞれ示している。【００８８】
Ａｄ−ＬａｃＺを導入したラット培養心筋細胞においては、Ｆａｂ’化抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合ＰＥＧリポソーム及びＦａｂ’化抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体で修飾していないＰＥＧリポソームのいずれについても、該細胞への接着及び取り込みがほとんど起こらなかった（図１０（ａ）及び（ｃ））。Ａｄ−ＨｓＨＢＥＧＦの導入によりヒトＨＢ−ＥＧＦを発現させたラット培養心筋細胞では、４℃及び３７℃において、Ｆａｂ’化抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームの接着及び取り込みが観察された。また、４℃に比べて３７℃での測定値が高く、細胞への取り込みが示唆された（図１０（ｂ）及び（ｄ））。さらに、Ｆａｂ’化抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体で修飾していないＰＥＧリポソームについては、細胞への接着及び取り込みが温度に関わらず観察されなかったことから、ＨＢ−ＥＧＦに対する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の特異性が示唆された。【００８９】
実施例３
Ｆａｂ’化抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合ＰＥＧリポソームが、乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）に取り込まれるかを調べた。使用した蛍光標識抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームは、実施例１で作製したものである。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＡＴＣＣ社製）を、２４個のくぼみを持つプレート中に１ウェルあたり３×１０４個入れ、次いでＬｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ−１５（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを含む））培地（ＧＩＢＣＯより購入）を１ウェル当たり５００μＬ添加した。３７℃で４時間細胞をインキュベートした。次いで、プレートのそれぞれくぼみから培養液を取り除き、実施例１で作製した蛍光標識抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム（ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｍａｌ／ＤｉＩ）又は対照の蛍光標識リポソーム（ＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ／ＤｉＩ）を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ−１５培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを含む）（リポソーム濃度１ｍＭ）を、１ウェルあたりそれぞれ２５、５０、１００μＬ添加して、サンプル中のリポソーム濃度がそれぞれ０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、及び０．１５ｍＭとなるようにした。調製したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＡＴＣＣ社製）及び蛍光標識抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム（又は対照のリポソーム）を含むサンプルを、３７℃で４時間インキュベートした。【００９０】
細胞を洗浄後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に取り込まれたリポソームを、実施例１と同様に蛍光分析によって決定した。図１１に、結果を示す。縦軸は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に取り込まれたリポソームの量を、細胞蛋白質１ｍｇあたりの蛍光色素（オクタデシルインドカルボシアニン（Ｄｉｌ１８））の量（μｇ／ｍｇ）で表わしている。横軸は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に添加したリポソーム濃度（ｍＭ）である。図１１中、四角（◆）は、対照のリポソームを表し、三角（▲）は、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームを表す。図１１は、数値データ（測定値）と標準偏差を示している。有意差は、アスタリスク（＊）で示されている（＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．０１）。有意差検定は、Ｔ検定により行った。【００９１】
図１１から明らかなように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞による抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームの取り込みは、対照のリポソームの取り込みを大きく上回った。【００９２】
実施例４
ｓｉＲＮＡを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームを用いて、細胞内の標的遺伝子のノックダウン実験を行なった。
（Ｉ）ルシフェラーゼ強制発現細胞の作製
試験例１で調製したＶｅｒｏ−Ｈ細胞に、ルシフェラーゼ遺伝子を導入して強制発現させた。具体的には、Ｖｅｒｏ−Ｈ細胞を９６個のくぼみを持つプレート（ＮＵＮＣ）中に１ウェルあたり５．０×１０３  個／０．２ｍＬ藩種し、５％ＣＯ２、３７℃にて２４時間インキュベートした。その後、ルシフェラーゼを発現するプラスミドＤＮＡ  pCAG-luc3（ニッポンジーン社から購入）（１ウェル当たり２μｇ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．）を用いて細胞に導入し、５％ＣＯ２、３７℃にて２４時間インキュベートしてルシフェラーゼを発現させた。【００９３】
（ＩＩ）ｓｉＲＮＡを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム及び対照リポソームの調製
ルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（センス鎖：ＣＵＵ ＡＣＧ ＣＵＧ ＡＧＵ ＡＣＵ ＵＣＧ ＡＴＴ（配列番号３）、アンチセンス鎖：ＵＣＧ ＡＡＧ ＵＡＣ ＵＣＡ ＧＣＧ ＵＡＡ ＧＴＴ（配列番号４）（いずれも北海道システム・サイエンス社））を封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームを調製した。具体的には、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）／ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）／コレステロール＝９／２／２（モル比）となる比率の脂質薄膜を作製した。一方でｓｉＲＮＡとプロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ）との複合体溶液を作製しておき、その複合体溶液で脂質薄膜を水和した。その後、３７℃で１０分間超音波処理をし、ｓｉＲＮＡ内封リポソームを作製した（１０μｍｏｌの総脂質に対して、ｓｉＲＮＡ ２ｎｍｏｌ、ｐｒｏｔａｍｉｎｅ ８０μｇ）。その後、リポソーム総脂質に対して９％のＰＥＧ２０００と１．５％のＰＥＧマレイミド２０００でｓｉＲＮＡ内封リポソームを修飾し、該修飾リポソームと、マレイミドと同量のＦａｂ’化抗ＨＢ−ＥＧＦ（実施例１で調製したものと同じもの）とを２０時間インキュベートし反応させた。反応後、ゲルろ過を行い精製されたリポソーム画分を得た。【００９４】
対照として、上記ｓｉＲＮＡを封入したＰＥＧ−リポソームを調製した。具体的には、上記の操作からＰＥＧマレイミド２０００及びＦａｂ’化抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体の修飾工程を除いた方法で作製した。
抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム及び対照リポソームへのｓｉＲＮＡの封入量は、各リポソームあたり５ｐｍｏｌ又は５０ｐｍｏｌとした。【００９５】
（ＩＩＩ）ｓｉＲＮＡを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム及び対照リポソームによるルシフェラーゼ遺伝子のノックダウン
上記で作製したルシフェラーゼ遺伝子を強制発現させたＶｅｒｏ−Ｈ細胞に、（ＩＩ）で作製したｓｉＲＮＡを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム及び対照リポソームをそれぞれ添加した。
細胞の培地を、血清を含まない非必須アミノ酸含有ＭＥＭ培地  １５０μＬ／ｗｅｌｌに交換し、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合ｓｉＲＮＡ内封リポソームをＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ 水で希釈した溶液（リポソーム濃度（総脂質濃度）：ｓｉＲＮＡ５ｐｍｏｌのものは１ｍＭ、ｓｉＲＮＡ５０ｐｍｏｌのものは１０ｍＭ））を１ウェルあたり５０μＬずつ添加した。添加後、５％ ＣＯ２下、３７℃で２４時間細胞を培養した。
ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、ルシフェラーゼ活性を測定することにより調べた。まずＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して生細胞数を算出した。具体的にはＫｉｔに付属する緩衝液１ｍＬに付属の基質５μＬを加え、ボルテックスにより混和しＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ試薬を得た。血清を含まない非必須アミノ酸含有ＭＥＭ培地８０μＬに培地交換し、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ試薬を２０μＬ加え、３０秒間混和後、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、蛍光光度計を用いて蛍光強度を測定し（Ｅｘ：４００ｎｍ、Ｅｍ：５０５ｎｍ）、生細胞数を算出した。続いてＯｎｅ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用してルシフェラーゼ活性を求めた。ルシフェリン基質試薬を１ウェルあたり１００μＬずつ添加し、３分後に発光強度を測定した。ルシフェラーゼ活性は生細胞数で補正した。
ルシフェラーゼ遺伝子を強制発現させたＶｅｒｏ−Ｈ細胞にリポソームを添加しなかった場合のルシフェラーゼ活性を１００％として、ルシフェラーゼ遺伝子のノックダウン（遺伝子発現抑制）を評価した。ルシフェラーゼ活性の低下は、ルシフェラーゼ遺伝子の発現が抑制されたことを表す。【００９６】
結果を図１２（ａ）及び（ｂ）に示す。図１２（ａ）は、各リポソームあたり５ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム及び対照リポソームそれぞれを用いてルシフェラーゼ遺伝子のノックダウンを調べた結果である。図１２（ｂ）は、各リポソームあたり５０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム及び対照リポソームをそれぞれ用いてシフェラーゼ遺伝子のノックダウンを調べた結果である。
図１２（ａ）及び（ｂ）において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は、ルシフェラーゼ遺伝子を強制発現させたＶｅｒｏ−Ｈ細胞（リポソームを添加しなかったもの）である。「Ｌｉｐｏ」は、該Ｖｅｒｏ−Ｈ細胞に、ｓｉＲＮＡを封入した対照リポソームを添加したものである。「ＨＢ−ＥＧＦ  Ｌｉｐｏ」は、該Ｖｅｒｏ−Ｈ細胞に、ｓｉＲＮＡを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームを添加したものである。図１２（ａ）及び（ｂ）の縦軸は、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」におけるルシフェラーゼ活性を１００％としたときの、ルシフェラーゼ活性（％）を表す。【００９７】
図１２から明らかなように、ｓｉＲＮＡを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームにより、高発現外来遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子）がノックダウンされた。ｓｉＲＮＡを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームは、ｓｉＲＮＡを封入した対照のリポソームよりもルシフェラーゼの発現を強く抑制した。さらに、ｓｉＲＮＡを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームを用いると、封入したｓｉＲＮＡの用量依存的にルシフェラーゼの発現が抑制された。従って、ＨＢ−ＥＧＦを発現している細胞では、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームにより標的遺伝子が効率よくノックダウンされた。【００９８】
実施例５
実施例４の（ＩＩ）の操作のうち、内封するｓｉＲＮＡをラミンＡ／Ｃを標的とするｓｉＲＮＡ(ターゲット配列５’-ＣＴＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡ-３’（配列番号５）、Ｂ-Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ)に変更し、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体修飾リポソームを作製した。内因性遺伝子であるラミンＡ／ＣのノックダウンをそのｍＲＮＡ量の測定によって判定した。
まず、６０ｍｍ ｄｉｓｈ に３．０×１０５ ｃｅｌｌｓ個のＶｅｒｏ−Ｈ細胞を播種し、全量５ｍＬの非必須アミノ酸含有ＭＥＭ培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ、及びジネティシン１μｇ／ｍＬを含有する溶液）で２４時間プレインキュベートした。細胞を血清を含まない非必須アミノ酸含有ＭＥＭ培地 ４．５ｍＬに交換し、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合ｓｉＲＮＡ内封リポソームをＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ 水で希釈した溶液を５００μＬ（ｓｉＲＮＡ量としては７５０ｐｍｏｌ）ずつ添加し、５％ＣＯ２、３７℃にて２０時間インキュベートしてｓｉＲＮＡを細胞内に導入した。続いてＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、全ＲＮＡを抽出し、各サンプルの全ＲＮＡ量を一致させて、Ｔ−Ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてｃＤＮＡを精製した。ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによってラミンＡ／Ｃ及びβ-アクチンのｍＲＮＡ量を定量し、ラミンＡ／ＣのｍＲＮＡ量をβ-アクチンのｍＲＮＡ量で補正し、ラミンＡ／Ｃのノックダウン効率を判定した。【００９９】
結果を図１３に示す。図１３中、「Ｃｏｎｔ．」は、リポソームを添加しなかったＶｅｒｏ−Ｈ細胞である。「Ｐｅｇ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ」は、該Ｖｅｒｏ−Ｈ細胞に、ｓｉＲＮＡを封入した対照リポソームを添加したものである。「ＨＢ−ＥＧＦ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ」は、該Ｖｅｒｏ−Ｈ細胞に、ｓｉＲＮＡを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームを添加したものである。図１３の縦軸は、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」におけるラミンＡ／ＣのｍＲＮＡ量を１００（％）としたときの、ラミンＡ／ＣのｍＲＮＡの相対的な量（％）を表す。【０１００】
図１３から明らかなように、ｓｉＲＮＡを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームにより、内因性遺伝子であるラミンＡ／Ｃが効率よくノックダウンされた。ｓｉＲＮＡを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームは、ｓｉＲＮＡを封入した対照のリポソームよりもラミンＡ／Ｃの発現を強く抑制した。従って、ＨＢ−ＥＧＦを発現している細胞では、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームにより標的遺伝子が効率よくノックダウンされた。【０１０１】
実施例６
ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）移植マウスを用いて、ドキソルビシンを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームによる腫瘍増殖抑制効果を調べた。
（Ｉ）ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）移植マウスの作製
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＡＴＣＣから購入した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ−１５培地中で、３７℃で培養した。８週齢のＢａｌｂ/ｃ（ｎｕ/ｎｕ)マウス（日本ＳＬＣ社から購入）の腹側部に、培養したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を１．０×１０７個皮下移植した。移植後、１２日間、均一な温湿度（２２℃、湿度５５％）の条件で飼育して以下の実験に使用した。【０１０２】
（ＩＩ）ドキソルビシンを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム及び対照リポソームの調製
実施例４において、ｓｉＲＮＡの代わりにドキソルビシン（一般名）（協和発酵社製）を使用した以外は同様の方法で、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームのリポソーム部分にドキソルビシンを封入した。ドキソルビシンは、ＨＳＰＣ  １ｍｏｌあたりドキソルビシン０．２６ｍｏｌとなるようにリポソームに封入した。
比較のため、ドキソルビシンを封入しなかった以外は上記と同様にして、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームを調製した（ドキソルビシンを封入していない抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム）。【０１０３】
対照として、ｓｉＲＮＡの代わりにドキソルビシンを使用した以外は実施例４と同様の方法で、ドキソルビシンをＰＥＧ−リポソームのリポソーム部分に封入した。ドキソルビシンは、ＨＳＰＣ１ｍｏｌあたりドキソルビシン０．２６ｍｏｌとなるように、リポソームに封入した。【０１０４】
（ＩＩＩ）ドキソルビシンを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム及び対照リポソームによる腫瘍増殖抑制効果
（Ｉ）で作製したヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）移植マウスに、（ＩＩ）で調製したドキソルビシンを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームを、ドキソルビシンの投与量が１回あたり体重あたり１０ｍｇ／ｋｇとなるように尾静脈内投与した（ｎ＝５）。比較として、ドキソルビシンを封入していない抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム及び対照リポソームを、それぞれ同様に投与した（それぞれｎ＝５）。なお、リポソームの投与は、各リポソームを生理食塩水に懸濁したリポソーム溶液を用いて行った。投薬開始時（治療前）及び投薬から４８時間後に、腫瘍体積を測定した。投薬開始時の腫瘍体積を１００％とした場合の、投薬から４８時間後の腫瘍の相対的な体積により、腫瘍増殖抑制効果を評価した。腫瘍の体積は、ノギスを用いて腫瘍の短径と長径を測定し、次の式によって算出した。
腫瘍の体積（Tumor volume）＝０．４×ａ×ｂ２ （ａ；腫瘍の長径、ｂ；腫瘍の短径）【０１０５】
投薬から４８時間後の腫瘍の増殖抑制効果を、図１４に示す。図１４の縦軸は、投薬開始時（治療前）の腫瘍の体積を１００％とした場合の、投薬から４８時間後の相対的な体積（腫瘍増殖割合（％））である。図１４中、（１）は、ドキソルビシン及びリポソームを投与しなかったヒト乳癌細胞移植マウス（コントロール）である。（２）は、ドキソルビシンを封入していない抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームを投与したヒト乳癌細胞移植マウスである。（３）は、ドキソルビシンを封入した対照リポソームを投与したヒト乳癌細胞移植マウスである。（４）は、ドキソルビシンを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームを投与したヒト乳癌細胞移植マウスである。【０１０６】
図１４から明らかなように、ドキソルビシンを封入した対照リポソーム（３）と比較して、ドキソルビシン封入抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム（４）は、顕著に腫瘍増殖を抑制した。ドキソルビシンを封入したＰＥＧ−リポソーム（図１４の対照リポソーム（３））を動物モデルに使用すると、ドキソルビシンをそのまま投与するよりも腫瘍抑制効果が高いことが報告されている（ＳＫ Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ., Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ５２ （１９９２）, ｐｐ. ６７７４-６７８１）。このため、ドキソルビシンを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームは、ドキソルビシンを直接投与するよりも顕著に高い腫瘍抑制効果を奏することが分かった。なお、ドキソルビシンを封入していない抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームを投与したヒト乳癌細胞移植マウス（２）では、コントロールと同程度に腫瘍が増殖した。【０１０７】
実施例７
実施例２の（ＩＩ）で行ったラット培養心筋細胞を用いた実験と同様にして心筋細胞を準備する。この心筋細胞に、ｓｉＲＮＡを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームを添加して、遺伝子発現抑制効果を検討することができる。【０１０８】
実施例５において、内封するｓｉＲＮＡをラミンＡ／Ｃを標的とするｓｉＲＮＡ(ターゲット配列５’-ＧＧＴＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＴＧＧＧＣＴ-３’（配列番号６）、Ｂ-Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ)に変更した以外は同様の方法により、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体修飾リポソームを作製する。内因性遺伝子であるラミンＡ／Ｃのノックダウンを、そのラミンＡ／ＣのｍＲＮＡ量の測定によって確認することができる。【０１０９】
新生仔ラット培養心筋細胞（Ｗｉｓｔａｒ  ｒａｔ、紀和実験動物研究所社製）を６ウェルのプレートに、１ウェルあたり１．５×１０６細胞で播種した。これに、実施例２の（Ｉ）で作製したＡｄ−ＨｓＨＢＥＧＦ又はＡｄ−ＬａｃＺのいずれかを混合して、実施例（ＩＩ）の方法に従ってラット培養心筋細胞に感染させた。感染後、３６時間後にラミンＡ／Ｃに対するｓｉＲＮＡを内封した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体修飾リポソームをラット培養心筋細胞に導入する。リポソーム導入後２４時間後にリアルタイムＰＣＲを行ない、ラット培養心筋細胞におけるラミンＡ／ＣのｍＲＮＡ発現量を調べることにより、該遺伝子のノックアウトを調べることができる。リポソーム導入後４８時間後には、ラミンＡ／Ｃ蛋白の発現抑制についてもウェスタンブロット法により確認することができる。ｓｉＲＮＡを封入した抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームにより、Ａｄ−ＬａｃＺを導入したラット培養心筋細胞よりも、Ａｄ−ＨｓＨＢＥＧＦを感染させたラット培養心筋細胞において、ラミンＡ／Ｃが効率よくノックダウンされる。【０１１０】
上記実施例の結果より、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム等のＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体により、ＨＢ−ＥＧＦの発現増加が認められる不全心（圧負荷心臓、梗塞後心臓等）、癌細胞等に薬剤、ｓｉＲＮＡ等を特異的に送達できることが分かった。従って、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームは、不全心、動脈硬化部位等の循環器疾患、婦人科系癌疾患等を標的とした新規治療システムとして有用であることが分かった。特に、心不全を対象としたドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）は現在報告がなく、非常に画期的である。心不全におけるＨＢ−ＥＧＦ高発現を呈するとともに、血管内皮が障害を受けやすい炎症が併発する心筋炎（自己免疫性又は感染性など）、心筋梗塞、虚血再灌流の病態は心不全において抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソームを用いることができる典型的なモデルであると考えられる。さらに、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体結合リポソーム等のＨＢ−ＥＧＦ結合性タンパク質複合体は、ＨＢ−ＥＧＦを発現する標的細胞に選択的に運搬されることに加え、標的細胞に結合するとＨＢ−ＥＧＦ自体の細胞内取込みを促進するため、増殖因子であるＨＢ−ＥＧＦの細胞内取り込みによる増殖抑制も生じることが予想される。このため、癌細胞、動脈硬化部位では他のＤＤＳ技術では認められない腫瘍増殖抑制効果も期待できる。さらに、癌の組織内では、癌細胞のみならず新生血管の内皮細胞においてもＨＢ−ＥＧＦの発現上昇が認められることが知られている。従って、ＨＢ−ＥＧＦを標的としたＤＤＳは、癌、動脈硬化部位内等の新生血管を標的としたＤＤＳとしても有効に機能する。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明によれば、目的物質を心筋細胞、癌細胞等の標的細胞内に特異的に、かつ効率よく導入することが可能となる。このため、本発明は、医療及び研究分野においてに有用なものである。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年7月26日(2010.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と、担体とを必須としてなることを特徴とする複合体。
【請求項２】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質が、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体又はそのフラグメントである請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質が、ジフテリア毒素変異体ＣＲＭ１９７又はそのフラグメントである請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
さらに、細胞に導入する目的物質が担体に封入されている、又は該目的物質と担体とが複合体を形成している請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
目的物質が、抗癌剤、心不全治療剤、神経疾患治療剤若しくは肺疾患治療剤、又は核酸である請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と担体とを必須としてなる複合体を含有することを特徴とするＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌、心不全、神経細胞疾患又は肺疾患の治療又は予防剤。
【請求項７】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と担体とを必須としてなる複合体を含有することを特徴とするＨＢ−ＥＧＦを高発現する癌、心不全、神経細胞疾患又は肺疾患の診断薬。
【請求項８】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と担体とを必須としてなる複合体を含有することを特徴とする目的物質の細胞内への導入促進剤。
【請求項９】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と担体とを必須としてなる複合体、及び細胞に導入する目的物質をＨＢ−ＥＧＦを発現する細胞に添加する、又はヒトを除く動物に投与する工程を含むことを特徴とする目的物質の細胞内への導入促進方法。
【請求項１０】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有するタンパク質と担体とを必須としてなる複合体を含むキット。
【請求項１１】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体又はそのフラグメントと、リポソームとを必須としてなる複合体を含有し、該リポソームに抗癌剤が封入されていることを特徴とする乳癌の治療又は予防剤。
【請求項１２】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体又はそのフラグメントと、担体とを必須としてなる複合体を含有し、該担体に心不全治療剤が封入されていることを特徴とする心不全の治療又は予防剤。
【請求項１３】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体又はそのフラグメントと、担体とを必須としてなる複合体を含有することを特徴とする不全心筋細胞への心不全治療剤導入促進剤。
【請求項１４】
膜結合型ＨＢ−ＥＧＦに結合し、これにより該膜結合型ＨＢ−ＥＧＦの細胞内への取り込みを促進する作用を有する抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体又はそのフラグメントと、担体とを必須としてなる複合体を含有し、該担体にｓｉＲＮＡが封入されていることを特徴とする不全心筋細胞への核酸導入促進剤。
【国際調査報告】
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