(57)【要約】  反応層の所望位置に捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を、確実に励起させて高感度に蛍光検出を行うことができ、さらに複数のアナライト検出を低コストでしかも短時間で行うことのできる表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサを提供することを目的とする。  プラズモン励起センサは、第１誘電体部材と、前記第１誘電体部材の上面に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜の上面に形成された第２誘電体部材と、前記第２誘電体部材の上面に形成された反応層と、から少なくとも構成され、前記第２誘電体部材は、その膜厚の一部が他の部分とは異なる異膜厚部を有する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属薄膜の一方側に励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させることにより、前記金属薄膜の他方側に形成された反応層の蛍光物質を励起させ、これにより増強された蛍光を光検出手段にて検出するようにした表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサであって、
前記プラズモン励起センサは、
第１誘電体部材と、
前記第１誘電体部材の上面に形成された金属薄膜と、
前記金属薄膜の上面に形成された第２誘電体部材と、
前記第２誘電体部材の上面に形成された反応層と、
から少なくとも構成され、
前記第２誘電体部材は、
その膜厚の一部が他の部分とは異なる異膜厚部を有することを特徴とするプラズモン励起センサ。
【請求項２】
前記異膜厚部が、
前記第２誘電体部材に複数箇所設けられていることを特徴とする請求項１に記載のプラズモン励起センサ。
【請求項３】
複数の前記異膜厚部は、前記異膜厚部のそれぞれの厚みが一定となるように構成されていることを特徴とする請求項２に記載のプラズモン励起センサ。
【請求項４】
複数の前記異膜厚部は、複数の異なる厚みの前記異膜厚部から構成されていることを特徴とする請求項２に記載のプラズモン励起センサ。
【請求項５】
複数の前記異膜厚部は、前記異膜厚部のそれぞれの厚みが一定である部分と、前記一定である部分とは異なる厚みを有する部分と、を有することを特徴とする請求項２に記載のプラズモン励起センサ。
【請求項６】
複数の前記異膜厚部は、前記異膜厚部の上面視形状が同一形状であることを特徴とする請求項２から５のいずれかに記載のプラズモン励起センサ。
【請求項７】
複数の前記異膜厚部は、複数種類の異なる上面視形状から構成されていることを特徴とする請求項２から５のいずれかに記載のプラズモン励起センサ。
【請求項８】
複数の前記異膜厚部は、前記異膜厚部のそれぞれの上面視形状が、同一形状である部分と、前記同一形状とは異なる異形状である部分と、を有することを特徴とする請求項２から５のいずれかに記載のプラズモン励起センサ。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載のプラズモン励起センサを配設してなることを特徴とする表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づいた表面プラズモン増強蛍光測定装置およびこの表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づき、例えば生体内の極微少なアナライトの検出が行われている。【０００３】
表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）は、光源より照射したレーザ光（励起光）が金属薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ；attenuated total reflectance）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、光源より照射したレーザ光（励起光）が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金属薄膜近傍の蛍光物質を効率良く励起させ、この励起された蛍光を検出することで極微量および／または極低濃度のアナライトを検出するようにしたものである。【０００４】
近年、このような表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づいた表面プラズモン増強蛍光測定装置の開発が進められており、例えば特許文献１や特許文献２などにその技術開示がなされている。【０００５】
このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１００は、図１０に示したように基本的な構造において、まず金属薄膜１０２と、金属薄膜１０２の一方側面に形成された反応層１０４と、この金属薄膜１０２の他方側面に形成された誘電体部材１０６と、を有するプラズモン励起センサ１０８を備えている。【０００６】
そして、プラズモン励起センサ１０８の誘電体部材１０６側には、誘電体部材１０６内に入射され、金属薄膜１０２に向かって励起光１１０を照射する光源１１２を備え、さらに光源１１２から照射され金属薄膜１０２で反射した金属薄膜反射光１１４を受光する受光手段１１６が備えられている。【０００７】
一方、プラズモン励起センサ１０８の反応層１０４側には、反応層１０４で捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光１１８を受光する光検出手段１２０が設けられている。【０００８】
なお、反応層１０４と光検出手段１２０との間には、蛍光１１８を効率よく集光するための集光部材１２２と、蛍光１１８以外に含まれる光を除去し、必要な蛍光のみを選択する波長選択機能部材１２４が設けられている。【０００９】
そして、表面プラズモン増強蛍光測定装置１００の使用においては、金属薄膜１０２上に、あらかじめ蛍光物質で標識されたアナライトが捕捉された反応層１０４を形成しておき、この状態で光源１１２より誘電体部材１０６内に励起光１１０を照射し、この励起光１１０が特定の角度（共鳴角）１２６で金属薄膜１０２に入射することで、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）を生ずることとなる。【００１０】
なお、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光１１０と金属薄膜１０２中の電子振動とがカップリングし、金属薄膜反射光１１４の光量減少という現象が生ずる。【００１１】
このため、受光手段１１６で受光される金属薄膜反射光１１４のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ、粗密波（表面プラズモン）が生ずる共鳴角１２６を得ることができる。【００１２】
そして、この粗密波（表面プラズモン）を生ずる現象により、金属薄膜１０２上の反応層１０４の蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光１１８の光量が増大することとなる。【００１３】
この増大した蛍光１１８を、集光部材１２２および波長選択機能部材１２４を介して光検出手段１２０で受光することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができるようになっている。【００１４】
なお、上記した表面プラズモン増強蛍光測定装置１００のように、金属薄膜１０２上に直に蛍光分子が載せられていると、クエンチングにより蛍光１１８が生じ難くなるという現象が生ずる場合がある。【００１５】
このため図１１に示したように、金属薄膜１０２と反応層１０４との間に、さらに別の誘電体部材１２８を設けることでクエンチングを防止するといった工夫が既に本発明者らによってなされている。また、このような誘電体部材１２８の追加は、電場増強をさらに高める効果を有しており、超高精度な蛍光検出を行うのに重要な役割をなしている。【００１６】
このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１００は、特に生体分子間などの微細な分子活動を観察するのに好適である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特許第３２９４６０５号公報
【特許文献２】特開２００６−２０８０６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従来の表面プラズモン増強蛍光測定装置１００では、反応層１０４において１種類のアナライトが捕捉されている場合、検出対象となるアナライトが替わる度にプラズモン励起センサ１０８を用意する必要があり、複数のアナライト検出を行うのに、コストや時間がかかっているのが現状である。【００１９】
本発明はこのような現状に鑑みなされたものであって、反応層の所望位置に捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を、確実に励起させて高感度に蛍光検出を行うことのできる表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサを提供することを目的とする。【００２０】
さらに本発明は、複数のアナライト検出を低コストでしかも短時間に行うことのできる表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、前述したような従来技術における問題点を解決するために発明されたものであって、
本発明のプラズモン励起センサは、
金属薄膜の一方側に励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させることにより、前記金属薄膜の他方側に形成された反応層の蛍光物質を励起させ、これにより増強された蛍光を光検出手段にて検出するようにした表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサであって、
前記プラズモン励起センサは、
第１誘電体部材と、
前記第１誘電体部材の上面に形成された金属薄膜と、
前記金属薄膜の上面に形成された第２誘電体部材と、
前記第２誘電体部材の上面に形成された反応層と、
から少なくとも構成され、
前記第２誘電体部材は、
その膜厚の一部が他の部分とは異なる異膜厚部を有することを特徴とする。【００２２】
このように、金属薄膜と反応層との間に第２誘電体部材を設けているのでクエンチングにより蛍光が生じ難くなるという現象を防ぐことが可能となる。また第２誘電体部材が異膜厚部を有していれば、膜厚によって異なる電場増強特性を利用して、電場増強させたいエリアと、そうでないエリアとに確実に区分けすることができる。【００２３】
このため、例えば異膜厚部の膜厚の際に最適な電場増強が生ずるよう励起光の共鳴角を設定しておけば、異膜厚部でのみ電場増強がなされるため、蛍光検出エリアを電場増強エリアに絞ることができ、Ｓ／Ｎ比を向上させて高感度に蛍光検出を行うことができる。【００２４】
また、第２誘電体部材の膜厚の違いにより粗密波（表面プラズモン）が生ずる共鳴角がそれぞれ異なることが確認されているため、プラズモン励起センサの反応層に複数種類のアナライトを捕捉していても、第２誘電体部材の「異膜厚部の箇所」と「主となる膜厚を有する箇所」のそれぞれの位置に合わせて反応層のアナライトを位置決めして捕捉しておけば、共鳴角の角度を変えることによりそれぞれの箇所で異なるアナライトの検出を行うことができ、アナライト検出におけるコストを抑えるとともに、検出時間を短縮させることができる。【００２５】
また、本発明のプラズモン励起センサは、
前記異膜厚部が、
前記第２誘電体部材に複数箇所設けられていることを特徴とする。【００２６】
このように異膜厚部が複数箇所設けられていれば、少なくとも電場増強させたいエリアと、そうでないエリアとに確実に区分けすることができる。さらに、２種類以上のアナライト検出を同一のプラズモン励起センサ上で行うことができるようになる。【００２７】
また、本発明のプラズモン励起センサは、
複数の前記異膜厚部は、前記異膜厚部のそれぞれの厚みが一定となるように構成されていることを特徴とする。【００２８】
このように、異膜厚部のそれぞれの厚みが一定であれば、電場増強エリアを１つのプラズモン励起センサに複数箇所設けることができるため、確実に所望のアナライト検出が行え、検出精度を高めることができる。【００２９】
また、本発明のプラズモン励起センサは、
複数の前記異膜厚部は、複数の異なる厚みの前記異膜厚部から構成されていることを特徴とする。【００３０】
第２誘電体部材の膜厚の違いにより粗密波（表面プラズモン）が生ずる共鳴角がそれぞれ異なることが確認されているため、このように、複数の異なる厚みの異膜厚部から構成されていれば、共鳴角を変更することにより厚みの種類の数と同じ種類のアナライト検出を同一のプラズモン励起センサ上で行うことができる。【００３１】
また、本発明のプラズモン励起センサは、
複数の前記異膜厚部は、前記異膜厚部のそれぞれの厚みが一定である部分と、前記一定である部分とは異なる厚みを有する部分と、を有することを特徴とする。【００３２】
このように、複数の異膜厚部のうちでそれぞれの厚みが一定である部分と、この一定である部分とは異なる厚みを有する部分とを有していれば、電場増強エリアを１つのプラズモン励起センサに複数箇所設けることができ、確実に所望のアナライト検出が行えるとともに、厚みの違う箇所の数と同じ種類のアナライト検出を同一のプラズモン励起センサ上で行うことができる。【００３３】
また、本発明のプラズモン励起センサは、
複数の前記異膜厚部は、前記異膜厚部の上面視形状が同一形状であることを特徴とする。【００３４】
このように、複数の異膜厚部のそれぞれの上面視形状が同一形状であれば、形状ごとに電場増強効果が同様となる傾向にあるためアナライト検出精度も略一定とすることができる。【００３５】
また、本発明のプラズモン励起センサは、
複数の前記異膜厚部は、複数種類の異なる上面視形状から構成されていることを特徴とする。【００３６】
このように、複数の異膜厚部が複数種類の異なる上面視形状で構成されていれば、形状の違いや共鳴角により電場増強効果が異なることが確認されているため、共鳴角に合わせ電場増強に適した形状を調べることができ、より高精度なアナライト検出を行うことができる。【００３７】
また、本発明のプラズモン励起センサは、
複数の前記異膜厚部は、前記異膜厚部のそれぞれの上面視形状が、同一形状である部分と、前記同一形状とは異なる異形状である部分と、を有することを特徴とする。【００３８】
このように、複数の異膜厚部のうちでそれぞれの上面視形状が同一形状である部分と、この同一形状とは異なる異形状である部分とを有していれば、形状ごとのアナライト検出精度を略一定とすることができるとともに、共鳴角に合わせ電場増強に適した形状を調べることができる。【００３９】
また、本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置は、
上記いずれかに記載のプラズモン励起センサを配設してなることを特徴とする。【００４０】
このように第２誘電体部材が異膜厚部を有したプラズモン励起センサを配設した表面プラズモン増強蛍光測定装置であれば、部分的に電場増強エリアを作ることができるのでアナライト検出を精度良く行うことができる。【００４１】
また、異膜厚部の位置に合わせて複数種類のアナライトを反応層に捕捉しておけば、同一センサ上で、複数のアナライト検出を高精度に行うことができる。
【発明の効果】
【００４２】
本発明によれば、第２誘電体部材に異膜厚部を設けることで、反応層の所望位置に捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を、確実に励起させて高感度に蛍光検出を行うことのできる表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサを提供することができる。【００４３】
また、第２誘電体部材の異膜厚部を複数箇所に設け、それぞれ膜厚を変えておけば、複数種類のアナライト検出を同一センサ上で行うことのできる表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。
【図２】図２は、本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサの第１の実施例を説明するための概略図である。
【図３】図３は、本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサの第１の実施例を説明するためのものであって、反応層の大きさを検出エリアの大きさに合わせた場合を説明する概略図である。
【図４】図４は、本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサの第２の実施例を説明するための概略図である。
【図５】図５は、本発明のプラズモン励起センサにおける第２誘電体層の上面図である。
【図６】図６は、本発明のプラズモン励起センサにおける他の第２誘電体層の上面図である。
【図７】図７は、本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサの第３の実施例を説明するための概略図である。
【図８】図８は、本発明のプラズモン励起センサの第１誘電体部材の他の形態を説明するための概略図である。
【図９】図９は、第２誘電体部材の膜厚と電場増強度との関係をしめすグラフである。
【図１０】図１０は、従来の表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。
【図１１】図１１は、従来の表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
以下、本発明の実施の形態について、図面に基づいてより詳細に説明する。
【００４６】
図１は、本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図、図２は、本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサの第１の実施例を説明するための概略図、図３は、反応層の大きさを検出エリアの大きさに合わせた場合を説明する概略図である。
【００４７】
本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置および表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサは、反応層の所望位置に捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を、確実に励起させて高感度に蛍光検出を行うことができ、また複数のアナライト検出を低コストでしかも短時間で行うことができるものである。
【００４８】
また、本明細書中でいう「表面プラズモン」とは、広義の意味で用いられるものであって、「局在プラズモン」についても含まれるものである。さらに、本明細書中で「異膜厚部」とは、第２誘電体部材の膜厚が、主となる膜厚を有する箇所とは異なる膜厚を有する箇所を指すものである。ここで主な膜厚を有する箇所と、これとは膜厚が異なる箇所（異膜厚部）とは、どこを「主な膜厚を有する箇所」とするかで、その都度変わるものである。
【００４９】
例えば、第２誘電体部材の形状が図２に示したように凸字形状である場合、略中央部を「異膜厚部」とすると、略中央部から一段下がった部分が「主となる膜厚を有する部分」となる。
【００５０】
反対に、略中央部を「主となる膜厚を有する部分」とすると、略中央部から一段下がった部分が「異膜厚部」となる。また、図７に示したように複数の段を有する（異なる膜厚部分を複数有する）第２誘電体部材の場合には、いずれの段についても「主な膜厚を有する箇所」と、「主な膜厚を有する箇所とは膜厚が異なる箇所（異膜厚部）」となり得るものであるが、説明の便宜上、いずれの段も異膜厚部として説明する。
【００５１】
＜表面プラズモン増強蛍光測定装置１０＞
本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、図１に示したように、まず第１誘電体部材１６と、第１誘電体部材１６の上面に形成された金属薄膜１２と、金属薄膜１２の上面に形成された第２誘電体部材３８と、第２誘電体部材３８の上面に形成された反応層１４と、を有するプラズモン励起センサ１８を備えている。
【００５２】
そして、プラズモン励起センサ１８の第１誘電体部材１６側には、第１誘電体部材１６内に入射され、金属薄膜１２に向かって励起光２０を照射する光源２２を備え、さらに光源２２から照射され金属薄膜１２に反射した金属薄膜反射光２４を受光する受光手段２６が備えられている。
【００５３】
光源２２から照射される励起光２０としてはレーザ光が好ましく、波長２００〜９００ｎｍ、０．００１〜１，０００ｍＷのＬＤレーザ、または波長２３０〜８００ｎｍ、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザが好適である。
【００５４】
一方、プラズモン励起センサ１８の反応層１４側には、反応層１４で生じた蛍光２８を受光する光検出手段３０が設けられている。光検出手段３０としては、超高感度の光電子増倍管、または多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサを用いることが好ましい。
【００５５】
なお、プラズモン励起センサ１８の反応層１４と光検出手段３０との間には、光を効率よく集光するための集光部材３２と、光の内で蛍光２８のみを選択するように形成された波長選択機能部材３４が設けられている。
【００５６】
集光部材３２としては、光検出手段３０に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであれば、任意の集光系で良い。簡易な集光系としては、顕微鏡などで使用されている市販の対物レンズを転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【００５７】
一方、波長選択機能部材３４としては、光学フィルタ，カットフィルタなどを用いることができる。光学フィルタとしては、減光（ＮＤ）フィルタ，ダイアフラムレンズなどが挙げられる。
【００５８】
さらにカットフィルタとしては、外光（装置外の照明光），励起光（励起光の透過成分），迷光（各所での励起光の散乱成分），プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光），酵素蛍光基質の自家蛍光などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば干渉フィルタ，色フィルタなどが挙げられる。
【００５９】
そして、このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１０の使用においては、金属薄膜１２上に、例えばあらかじめ蛍光物質で標識されたアナライトが捕捉された反応層１４を設け、この状態で、光源２２より第１誘電体部材１６内に励起光２０を照射し、この励起光２０が特定の角度（共鳴角（電場増強時に励起光２０と金属薄膜１２の垂線とから成る角度）符号３６）で金属薄膜１２に入射することで、金属薄膜１２上に粗密波（表面プラズモン）を生ずるようになる。
【００６０】
なお、金属薄膜１２上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光２０と金属薄膜１２中の電子振動とがカップリングし、金属薄膜反射光２４のシグナルが変化（光量が減少）することとなるため、受光手段２６で受光される金属薄膜反射光２４のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ良い。
【００６１】
そして、この粗密波（表面プラズモン）により、金属薄膜１２上の反応層１４で生じた蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光２８の光量が増大し、この蛍光２８を集光部材３２および波長選択機能部材３４を介して光検出手段３０で受光することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる。
【００６２】
なお、プラズモン励起センサ１８の金属薄膜１２の材質としては、好ましくは金，銀，アルミニウム，銅，および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなり、さらにこれら金属の合金から成ることである。
【００６３】
このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ粗密波（表面プラズモン）による電場増強が大きくなることから金属薄膜１２に好適である。
【００６４】
また、金属薄膜１２の形成方法としては、例えばスパッタリング法，蒸着法（抵抗加熱蒸着法，電子線蒸着法など），電解メッキ，無電解メッキ法などが挙げられる。中でもスパッタリング法，蒸着法は、薄膜形成条件の調整が容易であるため好ましい。
【００６５】
さらに金属薄膜１２の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【００６６】
電場増強効果の観点からは、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍの範囲内であることがより好ましい。
【００６７】
金属薄膜１２の厚さが上記範囲内であれば、粗密波（表面プラズモン）が発生し易く好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１２であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されないものである。
【００６８】
さらに、アナライト検出時に用いられる検体としては、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液，唾液，便，体腔液（髄液，腹水，胸水等）などが挙げられる。また、検体中に含有されるアナライトは、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子，複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー，シグナル伝達物質，ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【００６９】
さらに蛍光物質としては、所定の励起光２０を照射するか、または電界効果を利用することで励起し、蛍光２８を発する物質であれば特に限定されないものである。なお本明細書でいう蛍光２８とは、燐光など各種の発光も含まれるものである。
【００７０】
また、第１誘電体部材１６としては、光学的に透明な各種の無機物，天然ポリマー，合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性，製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）または二酸化チタン（ＴｉＯ２）を含むことが好ましい。
【００７１】
さらに、このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、光源２２から金属薄膜１２に照射される励起光２０による表面プラズモン共鳴の最適角（共鳴角３６）を調整するため、角度可変部（図示せず）や、光検出手段３０に入力された情報を処理するためのコンピュータ（図示せず）などを有しても良いものである。
【００７２】
ここで、角度可変部（図示せず）は、サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるために受光手段２６と光源２２とを同期し、４５〜８５°の角度変更を可能とし、分解能が０．０１°以上であることが好ましい。
【００７３】
上記した構成を有する本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、特にプラズモン励起センサ１８の第２誘電体部材３８において特徴的な構造を有している。
【００７４】
このような第２誘電体部材３８には、その膜厚の一部が他の部分とは異なる異膜厚部４０を有する構造となっている。以下、このような構造の第２誘電体部材３８を有するプラズモン励起センサ１８の実施例について説明する。
【００７５】
＜第２誘電体部材３８＞
本発明のプラズモン励起センサ１８に用いられる第２誘電体部材３８は、図２に示したように、その膜厚の一部（本図では略中央部分）が他の部分とは異なる異膜厚部４０を有している。
【００７６】
このような第２誘電体部材３８は、その膜厚の違いによって電場増強効果が異なり、また第２誘電体部材３８の膜厚の違いにより、プラズモン共鳴を生ずる共鳴角３６も異なることが本発明者らによって確認された。
【００７７】
つまり、図２に示したプラズモン励起センサ１８のように、第２誘電体部材３８の一部に異膜厚部４０が設けられていると、膜厚の違いによる電場増強の違いにより、電場増強エリアとそうでないエリアとに区分けが可能となる。
【００７８】
例えば、図２において、第２誘電体部材３８の略中央部の異膜厚部４０の膜厚Ｔ１の際に電場増強効果が高まるよう、予め共鳴角３６を設定した場合には、この第２誘電体部材３８の異膜厚部４０に対応する略中央部のエリアのみで電場増強がなされるため、このエリアの直上に位置する反応層１４のアナライトだけが検出対象となる。
【００７９】
逆に第２誘電体部材３８の略中央部以外の箇所を異膜厚部４０とし、この膜厚Ｔ２の際に電場増強効果が高まるよう予め共鳴角３６を設定した場合には、この第２誘電体部材３８の略中央部以外のエリアでのみ、電場増強がなされるため、このエリアの直上に位置する反応層１４のアナライトだけが検出対象となる。
【００８０】
このため、反応層１４が第２誘電体部材３８の面方向外形寸法と略同サイズであっても、電場増強エリアは略中央部分（略中央部分以外）に限定できるため、反応層１４の略中央部（略中央部以外）でのみ蛍光励起がなされ、この部分だけを光検出手段３０で検出するようにすれば、検出範囲が狭まるためＳ／Ｎ比が向上し、超高精度にアナライトの検出を行うことができる。
【００８１】
このような第２誘電体部材３８は、第１誘電体部材１６と基本的に同様の材質からなり、光学的に透明な各種の無機物，天然ポリマー，合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性，製造安定性および光学的透明性の観点からは、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）または二酸化チタン（ＴｉＯ２）を含むことが好ましい。
【００８２】
また、第２誘電体部材３８の異膜厚部４０は、第２誘電体部材３８上にマスキングを行い、エッチング処理することで所望の位置に異膜厚部４０を形成することができる。さらに同一膜厚の誘電体部材上に部分的に他の誘電体部材を積層することにより異膜厚部４０を形成しても良い。
【００８３】
第２誘電体部材３８の膜厚Ｔの下限値としては５０ｎｍである。下限値以上であればクエンチングの影響を少なくすることができ、且つ誘電体未使用時（膜厚Ｔがゼロ）よりも有利な電場増強を得ることが可能となる。第２誘電体部材３８の適正な範囲としては５０ｎｍ〜１０００ｎｍおよび１００００ｎｍ以上である。電場増強度はＴｉＯ２膜厚条件で不規則に変動し、上記条件範囲内にいくつかのピークを持つ（後述の図９参照）。従ってこの範囲で膜厚Ｔの条件を設定することで、電場増強度としても高値に設定することができるため、測定上高感度な検出が可能となるだけでなく、異膜厚の設定条件によっては電場増強度のコントラストを大きく設定することが可能となるためである。
【００８４】
また第２誘電体部材の異なる複数種類の膜厚の組み合わせとして、一の膜厚Ｔａの領域での電場増強が最適となる共鳴角３６で励起光２０を照射したときに他の膜厚Ｔｂの領域では膜厚Ｔａの電場増強の強度よりも弱い電場増強となるように設定するものがある。これは反応層の蛍光物質（及びアナライト）の捕捉数が想定した量よりも多く、膜厚Ｔａの領域では電場増強により蛍光物質から発せられる蛍光２８の光量が光検出手段の検出感度を超えてオーバーレンジしていたような場合に有効である。これよりも電場増強の強度が弱い膜厚Ｔｂの領域を検出対象とすればオーバーレンジを防ぐことができる。
【００８５】
また第２誘電体部材の膜厚Ｔを異ならせることにより、この上面にある反応層１４の高さが異なることになる。蛍光２８は、反応層１４に捕捉されている蛍光物質から発生するので、反応層１４の高さが異なれば、蛍光が発生する箇所の高さが異なることになる。このような構成を利用するために、光検出手段３０に共焦点光学系を用いて、光検出手段３０を上下に僅かに移動させながら焦点位置を、異なる高さの反応層１４のそれぞれの領域に順に合わせてゆくことにより、各領域の検出を順次行うことが可能となる。
【００８６】
また、図３に示したように、予め第２誘電体部材３８の略中央部を異膜厚部４０として電場増強エリアにした場合、反応層１４の異膜厚部４０の直上に位置するエリアのみを検出エリア４２とし、この検出エリア４２にのみアナライトを捕捉するようにしても良い。
【００８７】
このように、本実施例におけるプラズモン励起センサ１８は、第２誘電体部材３８の一部に異膜厚部４０が設けられているため、電場増強エリアを絞ることができ、これにより反応層１４の所望位置に捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を確実に励起させて高感度に蛍光検出を行うことができる。
【００８８】
次に、図４に示したプラズモン励起センサ１８は、本発明の第２の実施例における概略図である。
【００８９】
図４に示したプラズモン励起センサ１８は、図２または図３に示した第１の実施例のプラズモン励起センサ１８と基本的には同じ構成であるので、同じ構成部材には同じ参照番号を付してその詳細な説明を省略する。
【００９０】
図４に示したプラズモン励起センサ１８は、第２誘電体部材３８の異膜厚部４０が複数箇所設けられている点で、実施例１と異なっている。
【００９１】
このような第２誘電体部材３８は、第２誘電体部材３８の膜厚が、異膜厚部４０の膜厚Ｔ３の部分と、そうでない膜厚Ｔ４の部分とが交互となるように設定されており、例えば図５に示したように四角形状を交互に並べたタイプや図６に示したように三角形状を並べたタイプなどとすることができる。
【００９２】
この場合、共鳴角３６の設定により異膜厚部４０の膜厚Ｔ３のエリアを電場増強エリアに設定しておけば、電場増強エリアをセンサ上に複数得ることができる。また電場増強エリアは、形状の頂点部分にでき易いことが本発明者らによって確認されている。このため複数の異膜厚部４０を設ければ、当然頂点部分が複数形成されるため、さらに電場増強効果を高めることができる。
【００９３】
したがって、例えば図５および図６に示したように複数の異膜厚部４０を形成すれば、電場増強エリアを複数個所に設けることができ、しかも電場増強効果も高められるため、超高精度にアナライトの検出を行うことができる。
【００９４】
次に、図７に示したプラズモン励起センサ１８は、本発明の第３の実施例における概略図である。図７に示したプラズモン励起センサ１８は、図２または図３に示した第１の実施例のプラズモン励起センサ１８と基本的には同じ構成であるので、同じ構成部材には同じ参照番号を付してその詳細な説明を省略する。
【００９５】
図７に示したプラズモン励起センサ１８は、第２誘電体部材３８の異膜厚部４０が複数箇所設けられており、複数の異なる厚みの異膜厚部４０から構成されている点で実施例１と異なっている。
【００９６】
このような第２誘電体部材３８は、それぞれの異膜厚部４０の直上の反応層１４に、それぞれの異膜厚部４０と対応する箇所に、それぞれ異なるアナライトを捕捉するようにした検出エリア４２ａ，４２ｂ，４２ｃが形成されている。このため、検出エリア４２ａ，４２ｂ，４２ｃ毎に励起光２０の共鳴角３６を変えるだけで、複数種類のアナライトを同一センサ１８上で検出することができる。
【００９７】
このため、複数のアナライト検出を低コストでしかも短時間で行うことができる。以上、本発明における表面プラズモン増強蛍光測定装置１０およびこれに用いられるプラズモン励起センサ１８の好ましい形態について説明したが、本発明は上記の形態に限定されるものではないものである。
【００９８】
例えばプラズモン励起センサ１８の第１誘電体部材１６は一つの部材からなっていても、図８に示したように断面略三角状の誘電体部材１６ａの上に板状の誘電体部材１６ｂを重ねた積層体であっても良く、特に限定されないものである。なお、複数の部材から誘電体部材１６が構成されている場合には、それぞれの部材の材質を同様にすれば良い。
【００９９】
また、第２誘電体部材３８の異膜厚部４０の形状は図５や図６に示したように全て同一であっても異なっていても良く、またこれらの形状以外の円形状、星形状など如何なる形状であっても良く、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能なものである。
【０１００】
次に、第２誘電体部材３８の膜厚Ｔと電場増強度との関係について説明する。実施例として、第１誘電体部材１６をガラスＢＫ７（ｎ＝１．５２）、金属薄膜１２を膜厚５０ｎｍのＡｕ、第２誘電体部材３８をＴｉＯ２で膜厚Ｔ、その上の反応層１４には水（Ｈ２０）を配置させた。この条件で、第２誘電体部材３８の膜厚Ｔを変更した際の電場増強度（電場増強最大値ともいう）との関係を計算した。その結果を図９に示す。
【０１０１】
図９は第２誘電体部材３８の膜厚Ｔと電場増強度との関係を示したグラフである。横軸は、膜厚Ｔ（ｎｍ）であり縦軸は電場増強度である。同図からわかるように１０ｎｍ≦膜厚Ｔ≦５０ｎｍの範囲では電場増強度は１倍以下であり、クエンチングの影響を受けている。１００ｎｍ≦膜厚Ｔ≦１０００ｎｍの範囲においては、４００ｎｍ、１０００ｎｍの膜厚において電場増強度が２５〜３０倍のピークを持つ。１００００ｎｍ≦膜厚Ｔの範囲においては電場増強度が２０倍以上となっている。
【０１０２】
異膜厚部４０の膜厚Ｔをこのようなピークとなるように設定することにより電場増強度として高く設定することができるので高感度の検出が可能となる。また複数の異なる厚みの異膜厚部の組み合わせる際に一方をピークとなる膜厚に設定し、他方をピークとなる膜厚からずらした設定とすることにより両者のコントラストを大きくすることが可能となる。
【符号の説明】
【０１０３】
１０  表面プラズモン増強蛍光測定装置
１２  金属薄膜
１４  反応層
１６  誘電体部材
１６ａ  誘電体部材
１６ｂ  誘電体部材
１８  プラズモン励起センサ
２０  励起光
２２  光源
２４  金属薄膜反射光
２６  受光手段
２８  蛍光
３０  光検出手段
３２  集光部材
３４  波長選択機能部材
３６  共鳴角
３８  誘電体部材
４０  異膜厚部
４２  検出エリア
４２ａ  検出エリア
４２ｂ  検出エリア
４２ｃ  検出エリア
Ｔ１  膜厚
Ｔ２  膜厚
Ｔ３  膜厚
Ｔ４  膜厚
１００  表面プラズモン増強蛍光測定装置
１０２  金属薄膜
１０４  反応層
１０６  誘電体部材
１０８  プラズモン励起センサ
１１０  励起光
１１２  光源
１１４  金属薄膜反射光
１１６  受光手段
１１８  蛍光
１２０  光検出手段
１２２  集光部材
１２４  波長選択機能部材
１２６  共鳴角
１２８  誘電体部材
【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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