【事件の表示】
　特許第３０８２２９１号「ジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞及びその製造方法」の請求項１ないし３に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３０８２２９１号の請求項１ないし２に係る特許を取り消す。
　同請求項３に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯　
　本件特許第３０８２２９１号の発明についての出願は、平成３年４月１８日に出願され、平成１２年６月３０日にその発明について特許権の設定登録がなされ、その後、土井清暢より全請求項に係る特許について特許異議の申立がなされ、平成１３年５月１６日付けで取消の理由の通知がなされ、その指定期間内である平成１３年７月３０日に訂正請求がなされ、これにつき平成１３年１１月１日付けで訂正拒絶の理由の通知および再度の取消の理由の通知がなされ、その指定期間内である平成１４年１月１５日に先の訂正請求に付き手続補正書が提出されたものである。　
２．訂正の適否　
（１）訂正請求の補正の適否　
　上記平成１４年１月１５日付けの手続補正前の訂正請求の趣旨は、特許明細書の特許請求の範囲の請求項１〜３をそれぞれ平成１３年７月３０日付けの訂正請求書に添付した訂正明細書のとおりに訂正するというものであったところ、上記補正は、上記訂正事項のうち請求項１に係るものを削除するものである。従って、当該補正は、上記訂正請求の一部を取り下げるものに相当し、訂正請求の要旨を変更するものには当たらないから、当該補正は特許法第１２０条の４第３項で準用する同法第１３１条第２項の規定を満たすものであり、適法なものである。　
（２）訂正の内容　
特許権者が求めている上記補正後の訂正の内容は、以下のとおりである。　
ア．特許請求の範囲の請求項２の「血清要求性のジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞を、基礎培地に加えてペプトンを含む無血清培地にて培養することを特徴とする、無血清培地で増殖継代可能なジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞の製造方法。」を、「血清要求性のジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞を、基礎培地に加えて少なくともインスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンを含む無血清培地にて約１ヶ月間培養することを特徴とする、請求項１記載の細胞の製造方法。」と訂正する。　
イ．特許請求の範囲の請求項３の「該無血清培地が基礎培地に加えて、インスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンを含むものである請求項２記載の方法。」を、「該無血清培地がさらに、ヒポキサンチン、チミジン、セレンおよびα−トコフェロールを含む、請求項２記載の方法。」と訂正する。　
（３）訂正の目的の適否、新規事項の有無、及び、特許請求の範囲の拡張・変更の存否　
　上記アの訂正事項に関連する記載として、願書に添付した明細書（以下、「特許明細書」という。）の発明の詳細な説明には、「無血清培地として特に好ましいものは、本発明者らが初めて提案する新規培地である。即ち、基礎培地にインスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンから選ばれる少なくとも１つを含有させた培地であり、その最も好ましいものは基礎培地にインスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンを全て添加した培地である。」（本件特許公報第２頁段落【００１３】参照）と記載され、また、その実施例には、「基礎培地としてＲＰＭＩ１６４０培地…を用い、添加物としてインスリン１ｍｇ、ＢＰ（牛肉由来ペプトン）５ｇ、トランスフェリン１０ｍｇ、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）１ｇ、ヒポキサンチン１３ｍｇ、チミジン４ｍｇ、α−トコフェロール０．１３ｍｇ及びセレン４μｇを用いて無血清培地（以下、「ＧＣＭ００１培地」という。）１リットルを作製した。」（本件特許公報第３頁段落【００２３】参照）、「血清含有培地で増殖させたCHO dhfr-細胞を…ＧＣＭ００１培地に懸濁し、対数増殖期の細胞を１００，１０，１細胞／ウエルの各濃度でそれぞれ４枚の９６ウエルプレートに植え込んだ。３日〜４日ごとに培地交換を行い、１ヶ月培養し、コロニー陽性ウエルを計測し、コロニー出現率（％）を…表１に表した。…このことから、約１００細胞に１細胞の割合でＧＣＭ００１培地中で増殖し得る細胞が取得できることが確認できた。」（本件特許公報第３頁段落【００２５】〜【００２７】参照）と記載されている。また、訂正後の請求項２が引用する請求項１には、「無血清培地で増殖継代可能なジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞において、該無血清培地が基礎培地に加えて、インスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンを含むものである細胞。」と記載されている。　
　そうすると、上記アの訂正は、特許明細書に記載された事項の範囲内において、訂正前の請求項２の特定要件である「基礎培地に加えてペプトンを含む無血清培地にて培養する」ことを「基礎培地に加えて少なくともインスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンを含む無血清培地にて約１ヶ月間培養する」に限定し、これにより得られる「無血清培地で増殖継代可能なジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞」を「無血清培地で増殖継代可能なジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞において、該無血清培地が基礎培地に加えて、インスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンを含むものである細胞」に限定したものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当するものであって、新規事項の追加に該当しない。　
　また、上記イの訂正事項に関連する記載として、特許明細書の発明の詳細な説明には「上記の新規無血清培地には、必要により、更にヒポキサンチン…、チミジン…、セレン…及びα−トコフェロール（ビタミンＥ）…を加えることができる。」（本件特許公報第２頁段落【００１７】参照）と記載され、また、上述のとおり、実際にこれらを含有するＧＣＭ００１培地を用いて培養を行うことが記載されている。そして、訂正前の請求項３は、その引用形式を「血清要求性のジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞を、基礎培地に加えて、インスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンを含む無血清培地にて培養することを特徴とする、無血清培地で増殖継代可能なジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞の製造方法。」と読み替えることができ、訂正後の請求項３は「血清要求性のジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞を、基礎培地に加えて少なくともインスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミン、ヒポキサンチン、チミジン、セレンおよびα−トコフェロールを含む無血清培地にて約１ヶ月間培養することを特徴とする、無血清培地で増殖継代可能なジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞において、該無血清培地が基礎培地に加えて、インスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンを含むものである細胞の製造方法。」と読み替えることができる。　
　そうすると、上記イの訂正は、特許明細書に記載された事項の範囲内において、訂正前の請求項３の特定要件である「基礎培地に加えて、インスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンを含む無血清培地にて培養する」ことを「基礎培地に加えて少なくともインスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミン、ヒポキサンチン、チミジン、セレンおよびα−トコフェロールを含む無血清培地にて約１ヶ月間培養する」に限定し、これにより得られる「無血清培地で増殖継代可能なジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞」を「無血清培地で増殖継代可能なジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞において、該無血清培地が基礎培地に加えて、インスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンを含むものである細胞」に限定したものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当するものであって、新規事項の追加に該当しない。　
　そして、上記いずれの訂正も実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。　
（４）むすび　
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項において準用する第１２６条第２、３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。　
３．特許異議申立についての判断　
（１）申立の理由の概要　
　申立人　土井清暢は、甲第１〜１２号証を提出し、訂正前の本件請求項１に係る特許発明は本件出願前に頒布された甲第１〜４号証刊行物に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号の規定に違反して特許されたものであり、また、本件出願前に出願された特願平２−５００７６号に係る特開平３−２５４６７９号公報（甲第５号証）に記載の発明と同一であるから、特許法第２９条の２の規定に違反して特許されたものであり、訂正前の本件請求項１〜３に係る特許発明は本件出願前に頒布された甲第１〜４号証刊行物及び甲第６〜１２号証刊行物に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであるため、請求項１〜３に係る発明の特許は同法第１１３条第２項の規定により取り消すべきものである旨主張し、更に、本件特許の明細書に記載不備があり、請求項１〜３に係る特許は特許法第３６条第４項又は第５項及び第６項に規定する要件を満たしていない特許出願に対しなされたものであるため、請求項１〜３に係る発明の特許は同法第１１３条第４項の規定により取り消すべきものである旨主張している。　
（２）本件発明　
　訂正後の本件請求項１〜３に係る発明（以下、本件発明１〜３という。）は、平成１３年７月３０日に提出され、平成１４年１月１５日付けで補正された訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１〜３に記載された事項により特定される、以下のとおりのものである。　
【請求項１】　無血清培地で増殖継代可能なジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞において、該無血清培地が基礎培地に加えて、インスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンを含むものである細胞。　
（【請求項２】、【請求項３】については、上記２．訂正の適否（２）項参照）　
（３）甲各号証に記載された発明　
甲第１号証：日本農芸化学会誌（１９９０），第６４巻，第３号，第３３７頁　
　「Ｍｕｒａｋａｍｉらの方法に準じ、無血清培地を開発した。…最終的に、基礎培地…にｉｎｓｕｌｉｎ、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、…を添加したＭ−Ｅ−ＲＤＦ−６Ｆを作製した。本培地中でＣＨＯ−ＤＵＫＸＢ１１細胞増殖能は１０％ＦＣＳ添加培地中でのそれとほぼ同程度であった。」（第３３７頁右上欄第１３−２１行）と記載されている。　
甲第２号証：特開平２−４６７号公報　
　「ＣＨＯ／ＤＨＦＲ−細胞をプレプロインシュリンベクターでトランスフェクトし、プロインシュリンをオートクリンの形で供給した。ＣＨＯ／ＤＨＦＲ−細胞をｐＳＶＥＮｅｏＢａｌ１６プラスミドにより…トランスフェクトし、血清不含（３５０ｍ　Ｏｓｍ）、インシュリン不含Ｆ−１２／ＤＭＥ（Ｇｉｂｃｏ）培地（ＳＦＩＦ）中、低密度で継代培養することによりインシュリン非依存性増殖に関して選択した。Ｆ−１２／ＤＭＥは、…１．０Ｍｇ／Ｌトランスフェリン…からなる。」（第１３頁右下欄第６−第１４頁左上欄８行）、「長期間に渡ってインシュリンの非存在下に生存し、増殖し得る２個のクローンを夫々ＤＰ７およびＤＰ１２と命名した。これらのインシュリン非依存性細胞を、さらに、ＳＦＩＦ中で…培養して選択した。…インシュリン非依存性に関する選択を２週間行った後…生存細胞を透析し、抽出した５％ＦＳＢにレスキューした。…約１ヶ月後、最初のクローニングから増殖し尽くした細胞を再度、１細胞／ウエルの割合で希釈した。次いで、生存し、増殖した細胞を１００ｍｍプレートに取った。これらの細胞をＳＦＩＦ＋５００ｎＭメトトレキセートに保持し、毎週継代培養した。」（第１４頁右上欄第１２行−左下欄第１４行）、「クローンＤＰ７およびＤＰ１２は、生存および増殖能力を有することが分かった。…本発明の細胞のインシュリン非依存性は、第６図に示されている。…インシュリン非依存性細胞系統の増殖は維持されていた。」（第１４頁左下欄第１５行−右下欄第５行）、「…第６ｂ図は血清不含条件下での様々なインシュリン濃度におけるクローン７および１２の一般的な増殖状態を示すグラフ…」（第２０頁左下欄第１７−１９行）と記載され、クローンＤＰ７及びＤＰ１２が、インシュリンを含まない血清不含培地、及び、インシュリンを含む血清不含培地のどちらにおいても、増殖を維持した旨、記載（Ｆｉｇ．６ｂ）されている。　
甲第３号証：Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．　（１９９０）　Ｖｏｌ．２６，ｐ．１１０１−１１０４　
　「ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞…を…１０μｇ／ｍｌインシュリン、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン…を添加した無血清Ｆ−１２培地で培養した。」（第１１０１頁ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ　ＡＮＤ　ＭＥＴＨＯＤＳ欄第２段落）と記載され、ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞が７２時間培養された旨、記載（Ｆｉｇ．１）されている。　
甲第４号証：特開平３−２２９７２号公報　
　「ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞を宿主とした遺伝子組換え細胞は、培地に牛胎児血清（以下ＦＣＳと略す）等の血清を１０％程度添加する必要があった。」（第２頁左上欄第１−３行）、「現在、血清の代替としてインシュリン、トランスフェリン等のホルモンや血清アルブミン等既知の物質を加えた無血清培地が開発され、市販の無血清培地も多く存在する。」（第２頁左上欄第８−１１行）、「本発明において実質的に血清を含まない培地とは、通常の…培地に、インシュリン、トランスフェリンや、アルブミン等の血清蛋白成分を含有せしめた培地である。」（第２頁右上欄第８−１５行）、「実施例１）表１の無血清培地（Ａ）を基礎培地としてＦＮ…を添加し、無血清培地（Ｂ）をつくり培養を実施した。細胞は、ＣＨＯｄｈｆｒ−を宿主とし…遺伝子を導入した遺伝子組換えＣＨＯ細胞…を使用した。」（第２頁右下欄第３−１３行）、無血清培地（Ａ）中に、ヒト・トランスフェリン及び結晶インシュリンが添加されている旨の記載（第３頁第１表）、「実施例２）…無血清培地（Ｂ）に、ＦＧＦ…を…添加し、実施例１）と同様の方法にて培養を実施した。」（第３頁左下欄下から第１０−５行）、「実施例３）無血清培地（Ｂ）に、ＤＸ…及び、Ｔ２　を…各々添加し実施例１）と同様の方法で培養を行った。」（第３頁右下欄第１−４行）、「実施例４）無血清培地（Ｂ）に、ＬＤＬ…添加し実施例１）と同様に培養な行い…」（第３頁左下欄第９−１２行）、及び、「実施例５）ＦＮ…、ＦＧＦ…、ＤＸ…、Ｔ２…、ＬＤＬ…の全てを同時に添加した無血清培地（Ｃ）をつくり、実施例１）と同様の方法にて４日間培養を行った。その結果、この培地において無添加地区（無血清培地（Ａ））の約５３％の細胞数の増加が認められその数は１０％ＦＣＳ添加培地に匹敵するものであった（第５図）。」（第３頁右下欄１３−第４頁左上欄第４行）と記載されている。　
甲第５号証：特願平２−５００７６号の出願当初の明細書及び図面　（参照公報：特開平３−２５４６７９号公報）　
　「ＣＨＯ細胞由来のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株ＣＨＯ細胞ｄ−ＤＸＢ１１株」（参照公報第３頁左上欄第９−１０行）、「ハムＦ１２を基礎培地として、トランスフェリン１０μｇ／ｍｌ、インスリン１０μｇ／ｍｌ、…を加えた無血清培地…を…培養フラスコに入れ、そこへＣＨＯ細胞ｄ−ＤＸＢ１１株（血清依存性）を…播種した。」（参照公報第４頁左下欄第１６−右下欄第５行）、「細胞は継代にするにしたがって生存が低下した。…そのまま継代培養を繰り返すことにより細胞の生存率が向上した。培養を開始してから２ヶ月後には生存率が８０％以上に回復し、細胞数も１×１０５個／ｍｌまで増殖可能となった。以後培養を開始してから１７ヶ月以上安定した増殖を示している。」（参照公報第４頁右下欄第１０行−１７行）、及び、「このようにして無血清培地馴化株であるＣＨＯ細胞ＫＪＭ−１株が得られた。」（参照公報第４頁右下欄第１９−２０行）と記載されている。　
甲第６号証：特開平２−５８５９号公報　
　「ＣＨＯ細胞…を血清不含懸濁培地で培養した。培地…はさらにトランスフェリン５ｍｇ／ｌ、インシュリン５ｍｇ／ｌ、…大豆産ペプトン２ｇ／ｌ、…を含有している。培地１ｍｌ当り１０５個の細胞を植え、…最大細胞密度（１２０時間後に１０６細胞）に達するまで培養する。」（第３頁左下欄第１８行−右下欄第９行）と記載されている。　
甲第７号証：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　（１９７６），Ｖｏｌ．１８，　ｐ．３６３−３８２　
　インシュリンが添加されている条件下では、血清代替物としてＭＥＭとともにバクトペプトンを静止懸濁培地に用いたとき、ＣＨＯ細胞が良く成長することを見出した。」（第３６８頁第５−７行）と記載されている。　
甲第８号証：国際公開第９０／０１３３３号パンフレット（１９９０）　
　「ベクター…を用いて形質転換したＣＨＯ細胞を、市販の適切な基礎培地、好ましくは血清を含まない基礎培地で培養する。該培地は…Ｈａｍ’ｓ　Ｆ−１２…等を含む。培地には、哺乳類の血清アルブミン好ましくはＨＳＡを約０．１％−０．２％の濃度となるよう添加し、さらに…インシュリン及びトランスフェリンを添加する。」（第１９頁第２０−２８行）と記載されている。　
甲第９号証：日本大学農獣医学部学術研究報告　第４２号　第２２頁（１９８５年）　
　バクトペプトンが動物細胞の培養に用いる無血清培地において血清の代替として広く用いられていることが記載されている。　
甲第１０号証：Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｃｙｃｌｉｃ　　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４，１６９（１９７８）　
　ＲＥＳＵＬＴＳ　　ＡＮＤ　　ＤＩＳＣＵＳＳＩＯＮの１〜１０行目に、「ＣＨＯ細胞を５％ウシ胎児血清含有培地から無血清培地に移すと、直ちに細胞の増殖・分裂が遅くなり、４８時間後まで抑制された（図１）。その後、細胞数は、検討期間の最終の１１日後まで一定である。…しかしながら、それまで４８時間細胞分裂が抑制されていた９６時間後に、細胞内ｃＡＭＰの持続的な増加が観察された（表１、７〜９行目）。」と記載されている。　
甲第１１号証：Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２１，５８８（１９８５）　
　５８９頁のＲＥＳＵＬＴＳの９〜１２行目には、「（トランスフェリン、インスリン等を添加した無血清培地における；第５８９頁左欄８〜１０行目）細胞増殖は、３６時間（４％血清含有標準培地では２４時間）の誘導期の後に始まり、２１±１．９時間（範囲：１８〜２４時間）の倍加時間（血清存在下では１５〜１６時間）で進行した。」と記載されている。　
甲第１２号証：特開平３−８７１７３号公報　
　ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞に、ｄｈｆｒ及びファクターＶＩＩＩＣの遺伝子を組み込んだ細胞を無血清培地中で培養するに際し、該培地にウシ血清アルブミンを添加することにより、ファクターＶＩＩＩＣの生産量が増加したことが記載されている（実施例−８及び第１１表）。　
甲第１３号証：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３６，１０９１（１９８７）　
　ＣＨＯ−ＤＵＫＸＢ１１細胞がＣＨＯｄｈｆｒ−細胞に相当することが記載されている（アブストラクト）。　
（４）対比・判断　
ア．本件発明１について　
　本件発明１の細胞は基礎培地に加えてインスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンを含む無血清培地で増殖継代可能なものである。そして、実際に本件特許明細書の実施例で用いられている無血清培地がこれに加えてヒポキサンチン、チミジン、セレンおよびα−トコフェロールを含むものであることからも明らかなように、本件発明１の無血清培地は基礎培地に加えてインスリン、ペプトン、トランスフェリン、アルブミン以外の成分を更に含むものをも包含するものである。　
　一方、異議申立人の引用する第三者の先願である特願平２−５００７６号の出願当初の明細書（甲第５号証）には、血清依存性のジヒドロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯ細胞株であるｄ−ＤＸＢ１１株を、ハムＦ１２を基礎培地とし、これにトランスフェリン、インスリン等を加えた無血清培地に播種し、継代培養を繰り返すことにより、培養を開始してから１７ヶ月以上安定した増殖を示す無血清培地馴化株であるＣＨＯ細胞ＫＪＭ−１株が得られたことが記載されている。
　そこで、本件発明１の細胞と上記先願の無血清培地馴化株を対比すると、先願の無血清培地馴化株はトランスフェリン、インスリン等を含む無血清培地で安定した増殖を示すものであるから、両者は、本件発明１の細胞が先願明細書の無血清培地にさらにペプトンとアルブミンを含む無血清培地で増殖継代可能なものである点で一応相違する。　
　しかしながら、甲第６号証、甲第７号証、甲第９号証にはＣＨＯ等の動物細胞を培養する無血清培地の成分としてペプトンを添加することが記載され、また、甲第４号証，甲第８号証には同じくアルブミンを添加することが記載されているように、ペプトンとアルブミンはそれぞれこのような培地に添加する成分として周知・慣用のものであるから、先願の無血清培地馴化株は先願の無血清培地に更にこれらの成分を加えた培地でも当然、安定した増殖を示すものと認められる。　
　してみると、先願の無血清培地馴化株は本件発明１に規定された要件をすべて満たすものであるから、本件発明１は、上記先願明細書に記載された発明と実質的に同一なものである。　
イ．本件発明２について　
　本件発明２は、血清要求性のＣＨＯ／ＤＨＦＲ−細胞を、基礎培地に加えて少なくともインスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンを含む無血清培地にて約１ヶ月間培養することにより、無血清培地で増殖継代可能なＣＨＯ／ＤＨＦＲ−細胞を得るものである。　
　これに対して、異議申立人の引用する甲第１号証及び甲第３号証には、ＣＨＯ／ＤＨＦＲ−細胞が基礎培地に加えてインスリン、トランスフェリン等を含む無血清培地において増殖したことが、また、甲第４号証には、インスリン、トランスフェリン、アルブミン等を含む無血清培地において増殖したことが、それぞれ記載されている。　
　本件発明２を上記甲各号証記載の発明と対比すると、本件発明２で用いる無血清培地が基礎培地に加えてインスリン、トランスフェリンを含むうえ、更に少なくともアルブミンとペプトンを含むのに対し、甲第１号証および甲第２号証のものはアルブミンおよびペプトンを含まず、甲第４号証のものはペプトンを含まない点、および、本件発明２が当該無血清培地にて約１ヶ月間培養し、無血清培地で増殖継代可能なＣＨＯ／ＤＨＦＲ−細胞を得るのに対し、上記甲各号証記載の発明ではＣＨＯ／ＤＨＦＲ−細胞が甲各号証記載の無血清培地で増殖したことが記載されているものの、増殖能を確認した期間については、甲第１号証には記載がなく、甲第３号証では３日間、甲第４号証では４日間程度だけであり、それ以上期間が経過した際の増殖能については記載されていない点で相違する。　
　しかしながら、上記「ア．本件発明１について」の項で述べたとおり、甲第６号証、甲第７号証、甲第９号証、甲第４号証、甲第８号証に記載されるように、ペプトンとアルブミンはそれぞれＣＨＯ等の動物細胞を培養する無血清培地に添加する成分として周知・慣用のものであるから、ＣＨＯ／ＤＨＦＲ−細胞は、甲第１号証、甲第３号証および甲第４号証の無血清培地に更にこれらの成分を加えた培地でも当然、増殖するものと認められる。そして、短期間しか確認されていないにしろ、上記甲第各号証において、ＣＨＯ／ＤＨＦＲ−細胞が基礎培地に加えてインスリン、トランスフェリン（甲第４号証においては更にアルブミン）を含む無血清培地で増殖することが示されている以上、当該増殖細胞には当該無血清培地に適合した細胞株が含まれていることが期待できるので、当該細胞から当該無血清培地に馴化する細胞株を選択して得ることを期待してこれを更に長期間培養してみること、および、無血清培地として上記甲各号証記載のものに更にペプトン又はペプトンとアルブミンを添加したものを用いてみることは、当業者が適宜に試みる範囲のことと認められる。そして、それによって得られる効果についても、本件特許明細書には、基礎培地に加えてインスリン、ペプトン、トランスフェリン、アルブミン、ヒポキサンチン、チミジン、セレンおよびα−トコフェロールを含む無血清培地を用いた場合には、１ヶ月の培養で良好な増殖性を示す細胞が得られたことが記載されている（【００２９】および図１）ものの、ヒポキサンチン、チミジン、セレンおよびα−トコフェロールを含まないものについては具体的に記載されていないので、基礎培地に加えて少なくともインスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンを含む無血清培地を用いることによりどの程度の効果が得られるのか不明であり、これにより格別の効果が得られたものと認めることもできない。　
　従って、本件発明２は、甲第１号証、甲第３号証、甲第４号証、および甲第６号証〜甲第９号証刊行物に記載された発明に基づいて、当業者が適宜になし得るものと認められる。　
ウ．本件発明３について　
　異議申立人の引用するいずれの甲号証にも、血清要求性のＣＨＯ／ＤＨＦＲ−細胞を、基礎培地に加えてインスリン、ペプトン、トランスフェリン、アルブミン、ヒポキサンチン、チミジン、セレンおよびα−トコフェロールを含む無血清培地にて約１ヶ月間培養して、無血清培地で増殖継代可能なＣＨＯ／ＤＨＦＲ−細胞を得ることは記載されていない。そして、本件特許明細書には、このようにすることによって無血清培地で増殖継代可能なＣＨＯ／ＤＨＦＲ−細胞が実際に得られたことが具体的に記載されている（実施例１）。　
　従って、本件発明３は、異議申立人の引用する甲第１号証〜甲第４号証及び甲第６号証〜甲第１２号証に記載された発明に基づいて容易になし得たものとは認められず、また、本件発明３について特許明細書の記載に不備な点も認められない。　
（５）むすび　
　以上のとおり、本件発明１は先願の出願当初明細書（甲第５号証）に記載された発明であるから、本件発明１についての特許は特許法第２９条の２の規定に違反してされたものであり、同法第１１３条第２項に該当し、取り消されるべきものである。　
　また、本件発明２は甲第１、３、４および６〜９号証刊行物に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、本件発明２についての特許は同法第２９条第２項の規定に違反してされたものであり、同法第１１３条第２項に該当し、取り消されるべきものである。　
　そして、本件発明３の特許は、特許異議申立ての理由及び証拠によっては取り消すことはできず、また、他に本件発明３の特許を取り消すべき理由を発見しない。　
　よって、結論のとおり決定する。　
【異議決定日】
平成１４年６月１８日（２００２．６．１８）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
１．特許請求の範囲の請求項２を、特許請求の範囲の減縮を目的として、「血清要求性のジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞を、基礎培地に加えて
少なくともインスリン、
、トランスフェリンおよびアルブミン
約１ヶ月間
請求項１記載の細胞
２．特許請求の範囲の請求項３を、特許請求の範囲の減縮を目的として、「該無血清培地が
さらに、ヒポキサンチン、チミジン、セレンおよびα−トコフェロール
（５４）【発明の名称】
ジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞及びその製造方法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　無血清培地で増殖継代可能なジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞において、該無血清培地が基礎培地に加えて、インスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンを含むものである細胞。
　【請求項２】　血清要求性のジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞を、基礎培地に加えて
少なくともインスリン、
、トランスフェリンおよびアルブミン
約１ヶ月間
請求項１記載の
　【請求項３】　該無血清培地が
さらに、ヒポキサンチン、チミジン、セレンおよびα−トコフェロールを含む、
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は、無血清培地で増殖継代可能なジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞（以下、「血清非要求性ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞」という。）及びその製造方法に関する。
　【０００２】
　【従来技術・発明が解決しようとする課題】
　従来、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞（以下、「ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞」という。）は、種々の遺伝子発現の宿主として汎用されている。この細胞株は、ｄｈｆｒ遺伝子とともに種々の遺伝子を形質導入した後、メソトレキセート（ＭＴＸ）を含む培地中で培養することにより導入した遺伝子を増幅させることが可能であり〔Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９，６０１（１９８２）〕、そのため目的の遺伝子産物の産生分泌量は数１０μｇ／ｍｌのオーダーに達する〔Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（７），１７５０（１９８５）、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（２１），９６２２（１９８６）〕。しかし、この細胞株は培養において血清依存性が高く、一般には、ウシ胎児、ウマまたはヒト等の血清を１〜１５％の濃度で使用しなければならなかった。
　【０００３】
　しかし、血清含有培地を使用する際には以下の様な問題があった。
▲１▼　血清自体が高価なためコスト高となる。
▲２▼　血清にはロット差があり、再現性のある培養には不利である。
▲３▼　産生物の培養上清からの精製が困難となる。
▲４▼　ウィルスやマイコプラズマの汚染源となる恐れがある。
　【０００４】
　このような現状に鑑みて、無血清培地で増殖継代可能なＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞の検索および無血清培地等の検討がなされているが（特開平２−９３８８号公報）、いずれも満足した結果は得られていない。
　【０００５】
　本発明の目的は、無血清培地において血清含有培地と同等の増殖性を示し、かつ長期継代培養が可能な血清非要求性ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を提供することである。
　【０００６】
　本発明のもう一つの目的は、効率的な上記血清非要求性ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞の製造方法を提供することである。
　【０００７】
　【課題を解決するための手段】
　本発明者らは上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、無血清培地において血清含有培地と同等の増殖性を示し、かつ長期継代培養が可能な血清非要求性ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を創製することに成功し、さらに研究を重ねて本発明を完成した。
　【０００８】
　即ち、本発明は、無血清培地において血清含有培地と同等の増殖性を示し、かつ長期継代培養が可能な血清非要求性ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞である。
　【０００９】
　もう一つの本発明は、ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を無血清培地にて培養することを特徴とする上記の本発明血清非要求性ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞の製造方法である。
　【００１０】
　本発明の血清非要求性ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞の細胞学的特性は次の通りである。
▲１▼　血清非要求性である。
▲２▼　ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞に固有の染色体数（２０または２１）を示す。
▲３▼　ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞に特有の核酸依存性を示す〔Ｇａｉｌ　Ｕｒｌａｕｂ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）．
７７
　【００１１】
　本発明の血清非要求性ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞は、ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を、無血清培地で培養することによって製造することができる。
　【００１２】
　ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞は、上記Ｇａｉｌ　Ｕｒｌａｕｂらの文献に記載の方法で調製され、増殖される。
　【００１３】
　無血清培地として特に好ましいものは、本発明者らが初めて提案する新規培地である。即ち、基礎培地にインスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンから選ばれる少なくとも１つを含有させた培地であり、その最も好ましいものは基礎培地にインスリン、ペプトン、トランスフェリンおよびアルブミンを全て添加した培地である。
　【００１４】
　基礎培地としては、細胞培養のためのすべての公知培地を使用することができ、例えばＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地及びＲＰＭＩ１６４０培地が例示され、就中ＲＰＭＩ１６４０培地が好適である。
　【００１５】
　上記新規無血清培地における各種添加物の量は、インスリン０．０１〜５０ｍｇ／ｌ、就中０．１〜２ｍｇ／ｌ、ペプトン０．１〜１００ｇ／ｌ、就中４〜６ｇ／ｌ、トランスフェリン０．１〜５０ｍｇ／ｌ、就中９〜１１ｍｇ／ｌ、アルブミン０．０１〜１０ｇ／ｌ、就中０．１〜２ｇ／ｌである。
　【００１６】
　本発明において使用されるインスリンは、その由来には特に制限はなく、好適にはウシ由来のものが使用される。本発明において使用されるペプトンは、その由来には特に制限はなく、好適には牛肉由来ペプトン（ＢＰ）が使用される。本発明において使用されるトランスフェリンは、その由来には特に制限はなく、好適にはヒト又はウシ由来のものが使用される。本発明において使用されるアルブミンは、その由来には特に制限はなく、好適にはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が使用される。
　【００１７】
　上記の新規無血清培地には、必要により、更にヒポキサンチン０．１〜１００ｍｇ／ｌ、就中１０〜１５ｍｇ／ｌ、チミジン０．０１〜１００ｍｇ／ｌ、就中２〜５ｍｇ／ｌ、セレン０．０１〜１００μｇ／ｌ、就中２〜５μｇ／ｌ及びα−トコフェロール（ビタミンＥ）０．００１〜１０ｍｇ／ｌ、就中０．１〜０．５ｍｇ／ｌを加えることができる。
　【００１８】
　本発明の血清非要求性ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞は、公知の無血清培地においても増殖継代可能であるが、特に、上記の新規無血清培地における増殖継代性にすぐれている。
　【００１９】
　本発明の血清非要求性ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞は、血清要求性ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を無血清培地で培養することによって、好ましくは当該細胞を低密度処理することによって製造することができる。具体的には、ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を無血清培地に懸濁し、対数増殖期の細胞を１０〜１０，０００細胞／ｍｌ程度、好ましくは１０〜１０００細胞／ｍｌ程度の濃度で適当な培養容器（例えば、ウェルプレート、ディッシュ等）に植え込み、１ヶ月程度培養する。この間、数日間隔、好ましくは３、４日ごとに培地交換を行うことにより、目的とする無血清培地で増殖継代可能な血清非要求性ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を製造することができる。上記低密度処理による取得法は単に例示にすぎず、この他血清非要求性を目的とした変異原処理や血清含有培地から無血清培地への徐々の適応によっても取得できる。
　【００２０】
　この処理により、主として培地中で浮遊し増殖するタイプの細胞、主として固相に付着・伸展して増殖するタイプの細胞の一方または両方が、単一または複数のクローンとして得られる。
　【００２１】
　元来、ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞は、血清を加えた培地中では付着・伸展性増殖をする細胞であるので、両タイプの細胞が得られることは多くの利点を有する。即ち、培養系によって細胞を選択することが可能となる。寒天やフィブリン等の培養支持体を用いたコロニー形成法や制限希釈培養法、担体を用いないスピンナー培養法、ホローファイバーなどの中空系を用いた培養法等の培養系を使用する際には、浮遊性増殖をする細胞を、一方、一般のコロニー形成培養法、担体を用いるスピンナー培養法、ホローファイバーなどの中空系を用いた培養法等の培養系を使用する際は、付着・伸展性増殖をする細胞を用いればよい。
　【００２２】
　こうして得られた細胞は遺伝子工学的手法による異種蛋白質（プロウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベータ、Ｂ型肝炎表面抗原、プレＳ−Ｂ型肝炎表面抗原、インターフェロン−γ、ＣＳＦ、アンチトロンビンＩＩＩ等）の製造における宿主細胞として利用できる。
　【００２３】
　【実施例】
　以下に、本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
実施例１
▲１▼　無血清培地（ＧＣＭ００１培地）の作製
　基礎培地としてＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ（１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ３９，２８５，ＪＡＭＡ１９９（１９５７）〕（日水製薬社製）１０．４ｇを用い、添加物としてインスリン１ｍｇ、ＢＰ（牛肉由来ペプトン）５ｇ、トランスフェリン１０ｍｇ、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）１ｇ、ヒポキサンチン１３ｍｇ、チミジン４ｍｇ、α−トコフェロール０．１３ｍｇ及びセレン４μｇを用いて無血清培地（以下、「ＧＣＭ００１培地」という。）１リットルを作製した。
　【００２４】
▲２▼　培養容器
　低密度処理には、９６ウェルプレート（ｃｏｓｔａｒＲ，Ｄａｔａ　Ｐａｃｋｉｎｇ　Ｃｏｒｐ）、その後のスケールアップには、４８ウェルプレート（同）、２４ウェルプレート（同）、６ウェルプレート（ＦａｌｃｏｎＲ，Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、６ｃｍディッシュ（同）、１０ｃｍディッシュ（同）を用いた。
　【００２５】
▲３▼　ＧＣＭ００１培地におけるＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞の低密度処理
　血清含有培地で増殖させたＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を上記▲１▼で作製したＧＣＭ００１培地に懸濁し、対数増殖期の細胞を１００、１０、１細胞／ウェルの各濃度でそれぞれ４枚の９６ウェルプレートに植え込んだ。３日〜４日ごとに培地交換を行い、１ヶ月培養し、コロニー陽性ウェルを計測し、コロニー出現率（％）を平均値±標準偏差で表１に表した。対照として０．１％非働化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈａｉｍ　Ｇｍｂｈ，Ｌｏｔ．６９８０７１　０２）を加えたＧＣＭ００１培地を用い、上記と同様の操作を行った。
　【００２６】
　【表１】
　【００２７】
　１００細胞／ウェルで植え込んだプレートにおいてはほとんど全ウェル（９０％）において、１０細胞／ウェルでは約１０％のウェルにおいて、１細胞／ウェルでは約１％のウェルにおいて細胞の増殖が観察された。このことから、約１００細胞に１細胞の割合でＧＣＭ００１培地中で増殖し得る細胞が取得できることが確認できた。
　【００２８】
▲４▼　血清非要求性ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞の増殖
　上記▲３▼の方法で取得した血清非要求性ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を１０ｃｍディッシュまでスケールアップし、初濃度２×１０５細胞／ｍｌ（２ｍｌ）で６ウェルプレートに植え込み、２、４、６日目の細胞数をマイクロセルカウンター（Ｓｙｓｍｅｘ　Ｆ３００，（株）日本医化器械製作所）で計測した。
　【００２９】
　その結果は、図１に示す通りである。細胞のクローンにより多少の差が認められたが、概ね倍加時間は１〜２日で、最も良好な増殖性を示した。クローンの培養開始後、２〜４日の間の平均倍加時間は１．１日となった。また、増殖飽和時間の細胞密度は２×１０６細胞／ｍｌ以上であった。
　【００３０】
　これら取得した血清非要求性ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞の増殖形態は主として培地中に浮遊して増殖するタイプと主としてプレートに付着・伸展して増殖するタイプの２種類の細胞が得られた。
　【００３１】
▲５▼　血清非要求性ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞の染色体数分析
　対数増殖期のＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞及び血清非要求性ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を０．２μｇ／ｍｌのコルセミドで４時間処理し、次に０．０７５Ｍ塩化カリウムで膨張させた。無水メタノール：氷酢酸（３：１）の固定液で固定した標本をギムザ染色し、各々５０標本について染色体数調べた。その結果を表２に示した。
　【００３２】
　【表２】
　【００３３】
▲６▼　血清非要求性ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞の核酸依存性
　細胞を１０％透析血清を含む２種類の培地（核酸前駆体を含む培地α−ＭＥＭ＋又は含まない培地α−ＭＥＭ−）に懸濁し、５０細胞／６ｃｍディッシュの割合でイノキュレートした。１０日後出現してきたコロニー数をカウントした。その結果を表３に示した。
　【００３４】
　【表３】
　【００３５】
　【発明の効果】
　本発明の細胞は、無血清培地で増殖可能である。従って、従来、血清含有培地でしか増殖することができなかったＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を、無血清培地においても血清含有培地と同等に増殖させることができ、かつ長期継代培養が可能であるので非常に経済的である。また、浮遊性増殖細胞、付着・伸展性増殖細胞両タイプ得られることは、培養系による細胞の選択を可能にならしめる。
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　ＧＣＭ００１培地における血清非要求性ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞の増殖曲線を示した図である。
　【図２】
　代表的な付着・伸展型細胞（３Ｃ２）（寄託番号ＩＦＯ　５０３２９、菌株名ＧＡＵ−３２）のＧＣＭ００１培地中での培養２日目の増殖形態を示した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。
　【図３】
　代表的な付着・伸展型細胞（３Ｃ２）（寄託番号ＩＦＯ　５０３２９、菌株名ＧＡＵ−３２）のＧＣＭ００１培地中での培養４日目の増殖形態を示した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。
　【図４】
　代表的な付着・伸展型細胞（３Ｃ２）（寄託番号ＩＦＯ　５０３２９、菌株名ＧＡＵ−３２）のＧＣＭ００１培地中での培養６日目の増殖形態を示した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。
　【図５】
　代表的な浮遊型細胞（４Ｇ３）（寄託番号ＩＦＯ　５０３２８、菌株名ＧＡＹ−４３）のＧＣＭ００１培地中での培養２日目の増殖形態を示した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。
　【図６】
　代表的な浮遊型細胞（４Ｇ３）（寄託番号ＩＦＯ　５０３２８、菌株名ＧＡＹ−４３）のＧＣＭ００１培地中での培養４日目の増殖形態を示した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。
　【図７】
　代表的な浮遊型細胞（４Ｇ３）（寄託番号ＩＦＯ　５０３２８、菌株名ＧＡＹ−４３）のＧＣＭ００１培地中での培養６日目の増殖形態を示した顕微鏡写真（倍率１００倍）である。