(57)【要約】  本発明の乳酸菌により二本鎖ＲＮＡを生成するキットは、哺乳動物内で機能するプロモーターを含むベクターを備えている。これにより、人間や動物の腸内細胞内で、簡便に且つ安定してＲＮＡｉを起こす。
2010050109.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物内で機能するプロモーターを含むベクターを備えていることを特徴とする乳酸菌により二本鎖ＲＮＡを生成するキット。
【請求項２】
上記哺乳動物内で機能するプロモーターは、ＰｏｌＩＩＩによって転写されるプロモーターであることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項３】
上記ＰｏｌＩＩＩによって転写されるプロモーターが、Ｕ６プロモーターであることを特徴とする請求項２に記載のキット。
【請求項４】
哺乳動物内で機能するプロモーターに二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡが作動可能に連結されたベクターを、含有していることを特徴とする乳酸菌。
【請求項５】
上記哺乳動物内で機能するプロモーターは、ＰｏｌＩＩＩによって転写されるプロモーターであることを特徴とする請求項４に記載の乳酸菌。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の乳酸菌を含んでいることを特徴とする腸内疾患用治療組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌により二本鎖ＲＮＡを生成するキット及びその利用に関するものである。さらに詳しくは、二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡを発現可能とした乳酸菌によって二本鎖ＲＮＡを生成するための、乳酸菌により二本鎖ＲＮＡを生成するキット及びそれを利用した技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡｉとは、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡ干渉）によって特定の遺伝子の発現を抑制する技術である。例えば、二本鎖ＲＮＡを細胞、組織、器官、個体等に導入することによりＲＮＡｉを引き起こすことができる。標的遺伝子のｍＲＮＡに二本鎖ＲＮＡがハイブリダイズすると当該ｍＲＮＡの分解が促進される。これにより、標的遺伝子の発現が抑制されるのである。【０００３】
従来、遺伝子発現抑制法としては、アンチセンス法及びリボザイム法等が知られていたが、これらの方法と比べて、ＲＮＡｉは遺伝子発現を抑制する効果が長時間持続することが判明してきた。【０００４】
そのため、近年、ＲＮＡｉは分子生物学・細胞生物学研究において急速に広まりつつある。さらに、人間及び動物にも適用できることが明らかになったことから、分子生物学における哺乳動物研究の新手法として脚光を浴びており、医薬品及び食品への応用が期待されている。【０００５】
ＲＮＡｉの医薬品及び食品への応用として、（１）がん、高脂血症、糖尿病等の、特定の遺伝子の過剰な活性発現を原因とする疾患の治療に利用すること（例えば、特許文献１参照）、（２）人間及び動物の体内に寄生している線虫、回虫等の寄生虫を、その生存に必要な遺伝子の発現を抑制することにより駆除すること等が提案されている。例えば、ｄｓＲＮＡをコードする遺伝子の発現ベクターを導入した大腸菌を、土壌生息性の線虫であるＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓに食べさせて、当該線虫の有する特定遺伝子の発現を抑制する方法も提案されている（非特許文献１参照）。【０００６】
また、ＲＮＡｉを行なうための方法として、合成高分子又はウイルスを二本鎖ＲＮＡ発現ベクターのキャリアとして細胞等に導入する方法、動物の受精卵に二本鎖ＲＮＡ発現遺伝子を導入する方法等が報告されている。特許文献２には、キャリアとして細菌ミニ細胞を用いる方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開２００６−２４６７８７号公報（２００６年９月２１日公開）」
【特許文献２】日本国公開特許公報「特表２００５−５０５２９６号公報（２００５年２月２４日公表）」
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Lisa Timmons and Andrew Fire, Specific interference by ingested dsRNA, NATURE, 1998, vol. 395, 29 OCTOBER, p. 854
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、従来の方法では、人間及び動物の腸内で、簡便に且つ安定してＲＮＡｉを起こすことが困難であるという問題を生じる。【００１０】
例えば、非特許文献１に開示の、二本鎖ＲＮＡをコードする遺伝子を発現可能な大腸菌を用いる場合、人間及び動物の腸内でＲＮＡｉを起こさせるために当該大腸菌を経口投与すると、当該大腸菌は腸内に到達することなく胃酸等により死滅してしまう確率が高い。また、大腸菌を経口投与することは安全性の面でも問題があり、特に、大量投与は困難であるため、腸内で効率よくＲＮＡｉを起こすことが困難である。一方、経口投与以外の方法により腸内に当該大腸菌を導入することは簡便ではない。よって、腸内でＲＮＡｉの効果を簡便且つ安定に得ることはできない。【００１１】
また、特許文献１及び２に開示の、ウイルス、合成高分子又は細菌ミニ細胞をキャリアとする方法でも、胃酸等の影響により、当該キャリアを腸内に到達させることが困難であるため、腸内で安定してＲＮＡｉを起こすことはできない。【００１２】
なお、ウイルス又は合成高分子をキャリアとして用いる方法では、キャリア自体の安全性も問題となるため、そもそも人間及び動物に投与することは好ましくない。また、細菌ミニ細胞は細菌細胞から核を除去したものであり、細菌細胞とは全く異なる物質である。そのため、細菌ミニ細胞をキャリアとして用いる方法では、当該キャリア自体は増幅せず、ＲＮＡｉによる効果を長時間安定して得ることができない。【００１３】
そもそも、非特許文献１、特許文献１及び２のような従来のＲＮＡｉに関する報告からは、人間及び動物の腸内でＲＮＡｉを起こすという課題すら想到し得ない。例えば、非特許文献１で適用した線虫は土壌生息性であり、土壌は人間及び動物の腸内とは全く環境が異なる。そのため、非特許文献１から、腸内でＲＮＡｉを起こすという課題に想到することすら困難である。【００１４】
本発明は、上記の問題点に鑑みて、上述のように全く新たな課題を解決するためになされたものであり、その目的は、人間及び動物の腸内で簡便に且つ安定してＲＮＡｉを起こすために、人間及び動物の腸内の細胞内において二本鎖ＲＮＡ（特に、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡと呼ばれる、哺乳動物細胞に対してＲＮＡｉ効果を発揮する短い二本鎖ＲＮＡ）を生成させるキット及びこれらを利用した技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するために、本発明に係る乳酸菌により二本鎖ＲＮＡを生成するキットは、哺乳動物内で機能するプロモーターを含むベクターを備えていることを特徴としている。【００１６】
本発明に係るキットでは、上記哺乳動物内で機能するプロモーターは、ＰｏｌＩＩＩによって転写されるプロモーターであることがより好ましい。【００１７】
本発明に係るキットでは、上記ＰｏｌＩＩＩによって転写されるプロモーターが、Ｕ６プロモーターであることがより好ましい。【００１８】
また、本発明に係る乳酸菌は、哺乳動物内で機能するプロモーターに二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡが作動可能に連結されたベクターを、含有していることを特徴としている。【００１９】
本発明に係る乳酸菌では、上記哺乳動物内で機能するプロモーターは、ＰｏｌＩＩＩによって転写されるプロモーターであることがより好ましい。【００２０】
また、本発明に係る腸内疾患用治療組成物は、上記の本発明に係る乳酸菌を含んでいることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係る乳酸菌により二本鎖ＲＮＡを生成するキットは、ＰｏｌＩＩＩによって転写されるプロモーター等の哺乳動物内で機能するプロモーターを含むベクターを備えているので、人間及び動物の腸内における当該人間及び動物の細胞内において安定して且つ簡便にＲＮＡｉの効果を得ることができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃを導入して得たコロニーをコロニーＰＣＲに供した結果を示す図である。
【図２】リアルタイムＰＣＲ法により乳酸菌内のｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃを定量した結果を示す図である。
【図３】ＣＨＯ細胞内におけるｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃによるＲＮＡｉの効果を確認した結果を示す図である。
【図４】実施例４において、２１１Ｈ−Ｌｕｃをマウスに投与した様子を示す図である。
【図５】実施例４において、実施例１にて得た乳酸菌をマウスに局所注射する様子を示す図である。
【図６】実施例４において、サンプルの投与の前後におけるマウスの様子を、ＩＶＩＳ２００を用いて観察した結果を示す図である。
【図７】実施例４において、サンプルの投与の前後におけるＦＬｕｃ活性比を算出した結果を示す図である。
【図８】実施例５において胃ゾンテ法を用いて乳酸菌を経口投与している様子を示す図である。
【図９】実施例５において乳酸菌をマウスに経口投与してルシフェラーゼ活性を観察した結果を示す図であり、図９の（ａ）はｐＵＣＹＩＴ−Ｌｕｃ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉを投与した結果を示し、図９の（ｂ）は比較のために作製したｐＵＣＹＩＴ−Ｌｕｃベクター溶液を投与した結果を示し、図９の（ｃ）は参考として示すマウスの解剖図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
＜１．本発明に係る乳酸菌により二本鎖ＲＮＡを生成するキット＞
本発明に係る乳酸菌により二本鎖ＲＮＡを生成するキット（以下、単に「キット」と表記する）は、ＰｏｌＩＩＩによって転写されるプロモーター等の哺乳動物内で機能するプロモーターを含むベクターを備えていればよい。
【００２４】
本発明に係るキットを用いれば、二本鎖ＲＮＡ（以下、「ｄｓＲＮＡ」と表記する。）を、乳酸菌を利用して人及び動物の腸内の細胞内にて生成させることができる。換言すれば、本発明に係るキットを用いれば、人及び動物細胞内でｄｓＲＮＡを生成するための発現ベクターを乳酸菌に保持させて、人及び動物の腸内まで運搬することができる。
【００２５】
乳酸菌は、人間及び動物に経口投与しても、生きたまま腸内に辿り着くことができる。そして、当該人間及び動物の細胞内にてｄｓＲＮＡを発現してＲＮＡｉを起こすことができる。よって、本発明に係るキットを用いれば、ｄｓＲＮＡを生成することができる乳酸菌を作製して、これを経口投与するだけで、人間及び動物の腸内で安定してｄｓＲＮＡを生成することができる。これにより、例えば、ｄｓＲＮＡとして、腸内疾患の原因タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制するｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡと呼ばれる、哺乳動物細胞に対してＲＮＡｉ効果を発揮する短鎖ｄｓＲＮＡ）を用いれば腸内疾患の治療を行なうことも可能となる。
【００２６】
従来、ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを発現することが可能な乳酸菌に関する報告は無かった。これは、大腸菌等と比べ、乳酸菌を宿主細胞として用いた遺伝子操作および形質転換技術に関する知見が極めて少ないことが理由の一つとして挙げられる。
【００２７】
なお、本明細書において用語「ｄｓＲＮＡ」は、上述の通り二本鎖ＲＮＡを意図する。「ｄｓＲＮＡ」は、長鎖の２本鎖ＲＮＡを指して用いられる場合もあるが、本明細書ではｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ等の短鎖の２本鎖ＲＮＡをも含めて「ｄｓＲＮＡ」と表記する。また、本明細書において「乳酸菌により二本鎖ＲＮＡを生成する」とは、乳酸菌によってｄｓＲＮＡを生成することを意味し、具体的には、乳酸菌の細胞内のベクターが当該乳酸菌とは別の細胞に移って、当該別の細胞内において当該ベクターが発現してｄｓＲＮＡを生成する等の形態も包含される。
【００２８】
〔１−１．ベクターの構成〕
本発明に係るキットが備えるベクターは、哺乳動物内で機能するプロモーターを含むものであればよい。哺乳動物内で機能するプロモーターとしては、ＰｏｌＩＩＩによって転写されるプロモーター、ＳＶプロモーター等が挙げられるが、ＰｏｌＩＩＩによって転写されるプロモーターがより好ましい。以下、説明の簡単のため「ＰｏｌＩＩＩによって転写されるプロモーター」を「ＰｏｌＩＩＩ系プロモーター」という。当該ベクターに含まれるＰｏｌＩＩＩ系プロモーターとしては、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター等が挙げられる。中でもＵ６プロモーターが好ましい。Ｕ６プロモーターを用いれば、高い効率で、かつ人間及び動物の細胞内にて、ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを発現させることができ、さらに、Ｕ６プロモーターを用いれば、短鎖のｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを好適に発現させることができる。
【００２９】
なお、ＰｏｌＩＩＩ系プロモーター、ＳＶプロモーターは、哺乳動物内で働くプロモーターであり、且つ、乳酸菌内では働かないことが分かっているプロモーターである。しかし、本発明者らは鋭意検討した結果、このようなプロモーターを含むベクターを用いることにより、乳酸菌を用いて生体内でｄｓＲＮＡを好適に発現させることに想到したのである。つまり、このようなプロモーターを含むベクターを乳酸菌に導入して哺乳動物に投与すると、哺乳動物の体内で乳酸菌の細胞内から細胞外へベクターの放出が起こり、その後当該ベクター中のプロモーター等が機能してｄｓＲＮＡを好適に発現する。乳酸菌を用いるにもかかわらず、乳酸菌内では働かないプロモーターを用いるという発想は、当業者では容易に想到しないものであり、本発明者らは独自の着眼によって本発明に想到したのである。
【００３０】
本発明に係るキットが備えるベクターの種類は特に限定させるものではなく、当該ベクター中に導入されたＰｏｌＩＩＩ系プロモーター等の哺乳動物内で機能するプロモーターが作動可能であればよい。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００３１】
本発明に係るキットが備えるベクターは、ＰｏｌＩＩＩ系プロモーター等の哺乳動物内で機能するプロモーターの下流にｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを導入するための領域を設けていてもよく、キットの用途等に応じて予めｄｓＲＮＡを導入していてもよい。
【００３２】
ＰｏｌＩＩＩ系プロモーター等の哺乳動物内で機能するプロモーターの下流にｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを導入するための領域を設けておく場合、従来公知の制限酵素部位等を設けることにより、当該領域を形成すればよい。予めｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを導入しておく場合、当該ｄｓＲＮＡとしては、後述の、腸内の疾患の原因となるタンパク質をコードするＤＮＡの発現を阻害するｄｓＲＮＡ等を例示できるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
本発明に係るキットが備えるベクターは、ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡの下流、又は当該ＤＮＡを導入するための領域の下流にターミネーターを含んでもよい。ターミネーターとしては、特に限定されるものではなく、プロモーターの種類等に応じて適宜選択すればよい。例えばＰｏｌＩＩＩ系プロモーターとしてＵ６プロモーターを採用した場合、Ｕ６ターミネーターを採用することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３４】
本発明に係るキットに含まれる、ＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの形態は、特に限定されるものではなく、種々の形態で含むことができる。例えば、ＰｏｌＩＩＩ系プロモーターを含むベクターに、さらにＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡが導入されていてもよいし、ＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを含むベクターが別途備えられていてもよい。
【００３５】
このような本発明に係るキットが備えるベクターは、従来公知の制限酵素及び／又はリガーゼ等を用いる慣用的な手法によって作製することができる。
【００３６】
本発明に係るキットの構成は、哺乳動物内で機能するプロモーターを含むベクターを備える限り、特に限定されるものではなく、他の試薬及び器具を含んでもよい。例えば、ベクターを安定的に保持するための試薬、バッファー等を含んでもよいし、当該ベクターにｄｓＲＮＡを導入するための制限酵素、リガーゼ等の試薬を含んでもよい。また、当該ベクターの宿主細胞である乳酸菌を含んでもよいし、当該ベクターを乳酸菌に導入するためのリン酸カルシウム、リポソーム等の試薬を含んでもよい。また、本発明に係るキットは、複数の異なる試薬を、適切な容量及び／又は形態で混合していてもよいし、それぞれ別の容器により提供してもよい。
【００３７】
また、本発明に係るキットには、ベクターにｄｓＲＮＡを導入するための手順及び／又はｄｓＲＮＡを導入した後のベクターを乳酸菌に導入するための手順等を記載した指示書を含んでもよい。紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能なディスク又はＣＤ−ＲＯＭ等のような電子媒体に付されてもよい。
【００３８】
〔１−２．本発明に係るキットの使用方法〕
本発明に係るキットは、当該キットに備えられるベクターに、適宜選択したｄｓＲＮＡを導入して用いればよい。つまり、本発明に係るキットが備えるベクターには、使用者の目的に応じて様々なｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを挿入することができる。なお、予めベクターにｄｓＲＮＡが挿入されている場合は、そのまま乳酸菌に導入すればよい。
【００３９】
本発明に係るキットが備えるベクターにｄｓＲＮＡを挿入する場合、ｄｓＲＮＡの種類としては、特に限定されるものでない。
【００４０】
また、哺乳動物等の細胞におけるタンパク質遺伝子の発現を抑制するためには、当該タンパク質をコードするＤＮＡに由来するｍＲＮＡにハイブリダイズするように設計したｄｓＲＮＡを発現するようにすればよい。腸内疾患の原因タンパク質を標的として、当該原因タンパク質の遺伝子の発現を阻害することで、腸内疾患の治療が可能となる。
【００４１】
なお、哺乳動物等の細胞におけるタンパク質遺伝子の発現を抑制するためには、ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡの二本鎖領域の長さを２０〜３０ｂｐとした短鎖ｄｓＲＮＡが採用されることが多い。このようにｄｓＲＮＡにおける二本鎖領域のサイズは用途によって異なるが、本発明に係るキットによれば、上述のように、短鎖ｄｓＲＮＡを好適に、乳酸菌に生成させることができる。
【００４２】
本発明に係るキットが備えるベクターに、ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを挿入する方法は限定されるものではなく、従来公知の制限酵素及び／又はリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って方法により行なえばよい。
【００４３】
ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡが導入されたベクター（以下、「ｄｓＲＮＡ発現ベクター」と表記する。）は、乳酸菌内に導入すればよい。ｄｓＲＮＡ発現ベクターの宿主細胞として用いる乳酸菌の種類は特に限定されるものではなく、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌ．  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌ．  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ等の従来公知の乳酸菌を例示できる。中でも、Ｌ．  ｃａｓｅｉは、胃酸に対する抵抗力が強く、生きたまま腸内に届く確率が高いため、好ましい。
【００４４】
ｄｓＲＮＡ発現ベクターを、乳酸菌に導入する方法、即ち形質転換法は、特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００４５】
人間及び動物等の被験体の腸内細胞内において、本発明に係る乳酸菌にｄｓＲＮＡを生成させるためには、ｄｓＲＮＡ発現ベクターが導入された本発明に係る乳酸菌を、当該被験体に経口投与すればよい。乳酸菌は胃酸に対して強い抵抗性を有しているので、生きたまま腸内に到達する。腸内に到達した乳酸菌は、例えば、腸内で疾患を生じている細胞に取り込まれ、当該細胞内でＲＮＡｉを起こして、当該疾患の原因となるタンパク質遺伝子の発現を阻害することで腸内疾患を治療することができる。
【００４６】
なお、本発明に係るキットにより作製した乳酸菌の利用方法は、被験体への経口投与に限定されるものではない。また、乳酸菌は様々な生物に対して安全に腸内送達しうるので、様々な生物におけるＲＮＡｉの研究に用いることができる。
【００４７】
以上の説明にも示されているように、ＰｏｌＩＩＩによって転写されるプロモーターを含むベクターによって乳酸菌を形質転換し、人間及び／動物の腸内にてＲＮＡｉを起こす方法も本発明の範疇である。
【００４８】
＜２．本発明に係る乳酸菌＞
本発明に係る乳酸菌は、哺乳動物内で機能するプロモーターにｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡが作動可能に連結されたベクターを、含有していればよい。哺乳動物内で機能するプロモーターとしては、ＰｏｌＩＩＩ系プロモーター、ＳＶプロモーター等が挙げられるが、ＰｏｌＩＩＩ系プロモーターがより好ましい。換言すれば、本発明に係る乳酸菌は、ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡがＰｏｌＩＩＩ系プロモーター等の哺乳動物内で機能するプロモーターによって発現可能なように、当該ＤＮＡと当該プロモーターとが連結されたベクターを含有していればよい。
【００４９】
ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡがＰｏｌＩＩＩ系プロモーター等の哺乳動物内で機能するプロモーターに作動可能に連結されているので、本発明に係る乳酸菌は、ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを発現することができる。また、宿主細胞は乳酸菌であるので、胃酸に対して優れた耐性を有している。そのため、本発明に係る乳酸菌を人間及び動物に経口投与しても、胃を通過して、生きたまま腸内に到達する。そして、腸内細胞内においてｄｓＲＮＡを発現する。よって、本発明に係る乳酸菌によれば、人間及び動物の腸内に簡便に導入することが可能で、且つ腸内細胞内にて安定してＲＮＡｉ効果を得ることができる。
【００５０】
本発明に係る乳酸菌が備えるベクター及び宿主細胞としての乳酸菌に関する説明は、上述の本発明に係るキットの説明に準ずる。
【００５１】
本発明に係る乳酸菌は、従来公知の方法により作製することができる。例えば、まず、ＰｏｌＩＩＩ系プロモーター及びｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡを、当該ＤＮＡが当該プロモーターによって作動可能に連結されるように、制限酵素及び／又はリガーゼを用いてベクターに導入することでｄｓＲＮＡ発現ベクターを構築する。そして、当該ｄｓＲＮＡ発現ベクターを電気穿孔法等によって乳酸菌に導入しても、本発明に係る乳酸菌を作製できる。
【００５２】
＜３．本発明に係る乳酸菌の利用＞
本発明は、腸内における癌等の疾患を治療するための腸内疾患用治療組成物を提供する。
【００５３】
本発明に係る腸内疾患用治療組成物は、上記の本発明に係る乳酸菌を含んでいればよい。
【００５４】
本明細書において「腸内疾患用治療組成物」は、本発明に係る乳酸菌を含む治療組成物であって、人間及び動物の腸内疾患を治療の対象として用いる治療組成物を意図する。
【００５５】
本発明に係る腸内寄生虫駆除用組成物に含まれる乳酸菌としては、上述の本発明に係る乳酸菌であればよい。例えば、本発明に係る乳酸菌であって、腸内の疾患の原因となるタンパク質遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡを生成するように作製した乳酸菌を含めばよい。
【００５６】
腸内の疾患の原因となるタンパク質遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡとしては、対象の疾患に応じて適宜設定したものを用いればよい。例えば疾患として大腸癌を対象とする場合、Ｋ−Ｒａｓ変異体タンパク質のｍＲＮＡにハイブリダイズするように設計したものを用いればよい。Ｋ−Ｒａｓ変異体タンパク質は、例えば、ヒト大腸癌細胞ＳＷ４８０で高発現しているタンパク質であり、通常のヒト細胞が発現するＫ−Ｒａｓタンパク質の変異体である。具体的には、１２番目のコドンがＧＧＴ（グリシン）からＧＴＴ（バリン）に変異している。Ｋ−Ｒａｓ変異体ｍＲＮＡの配列は、当業者であれば容易に得ることができる。例えば、Ｋ−Ｒａｓ変異体ｍＲＮＡ配列の一例として、ＧｅｎＢａｎＫのａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ５４９６８が挙げられる。また、Matilde E. Lleonart, Santiago Ramon y Cajal, John D. Groopman and Marlin D. Friesen, Sensitive and specific detection of K-ras mutations in colon tumors by short oligonucleotide mass analysis, Nucleic Acids Research, 2004, vol.32, no.5 e53にもＫ−Ｒａｓ遺伝子の変異について開示されている。
【００５７】
また、本発明に係る治療用組成物が治療の対象とする腸内疾患はこれに限定されるものではなく、例えば、ウイルスの関与する腸内疾患が挙げられる。つまり、当該ウイルスの遺伝子発現を抑制することで、当該腸内疾患を治療することができる。ｄｓＲＮＡにおける二本鎖領域の長さは、当該ｄｓＲＮＡがＲＮＡｉを起こしうる限り限定されるものではないが、例えば、一般に哺乳動物細胞の中でＲＮＡｉを起こすために、２０〜３０ｂｐ程度の長さの短鎖ｄｓＲＮＡがよく用いられる。
【００５８】
また、本発明において、乳酸菌を生体内に導入することにより遺伝子の発現を調節することによって、哺乳動物において癌または細胞増殖障害を治療または予防することができる。治療または予防の対象となる増殖細胞は、例えば、上述のように大腸癌であってもよいし、結腸癌細胞または膵臓癌細胞であってもよい。大腸癌の場合、ＲＮＡｉの標的は変異Ｋ−Ｒａｓ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子及びβ−カテニン遺伝子等である。１つの態様において、該結腸癌細胞はＳＷ４８０細胞である。また、別の１つの態様において、該膵臓癌細胞はＣＡＰＡＮ−１細胞である。また、様々な炎症性腸疾患の治療及び予防も本発明によって可能である。この場合、ＲＮＡｉの標的は例えばＴＮＦ−α遺伝子である。
【００５９】
本発明に係る腸内疾患用治療組成物に含まれる乳酸菌の形態は、腸内でｄｓＲＮＡを生成可能である限り限定されるものではない。例えば、本発明に係る腸内疾患用治療組成物は、本発明に係る乳酸菌を含有する培養液、当該培養液から菌体を回収して粗精製物又は精製物を含んでもよく、本発明に係る乳酸菌を凍結乾燥等により休眠状態としたものを含んでいてもよい。
【００６０】
本発明に係る腸内疾患用治療組成物は、本発明に係る乳酸菌以外の組成を含んでもよい。本発明に係る乳酸菌以外の組成としては、人間、動物等の投与対象に対して害が少なく且つ当該乳酸菌の機能を損なわないものであれば限定されない。
【００６１】
例えば、本発明に係る腸内疾患用治療組成物は、水、生理食塩水、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝化物質、安定化剤、抗酸化剤等のような補助物質を含み得る。
【００６２】
また、本発明に係る乳酸菌を経口投与しても、腸内まで生きたまま到達して、腸内細胞内にてｄｓＲＮＡを発現し、病気となっている細胞を駆除できるので、本発明に係る腸内疾患用治療組成物は経口投与用に調製されることが好ましい。
【００６３】
そして、本発明に係る腸内疾患用治療組成物を、経口投与用に調製する場合、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチを含み得る。また、さらに結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合してもよい。
【００６４】
上述のように、本発明に係る腸内疾患用治療組成物は経口投与用に調製されることが好ましいので、その形態としては錠剤、カプセル等の形態が好ましいがこれに限定されるものではない。
【００６５】
本発明に係る腸内疾患用治療組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。また、本発明に係る腸内疾患用治療組成物はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【００６６】
以上の説明にも示されているように、本発明に係る乳酸菌を投与することにより腸内疾患を処置する方法も本発明の範疇である。
【００６７】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された特許文献及び非特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００６８】
＜実施例１：実験材料の調製＞
〔プラスミド〕
本実施例では、乳酸菌に導入するプラスミドとしてｐＵＣＹＩＴ-ｓｈＬｕｃを用いた。【００６９】
ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子及び乳酸菌内での複製に必要なｒｅｐＢ遺伝子が導入されたベクターｐＵＣＹＩＴ３５６Ｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.  ＡＢ１１９５２７）（ヤクルト株式会社中央研究所より供与された）（配列番号１に示す。なお、ＧｅｎＢａｎｋにＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．  ＡＢ１１９５２７として登録されている。）のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩサイトに、Ｕ６プロモーター、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを導入した。当該ｓｈＲＮＡは、ホタルルシフェラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ.  ＡＢＯ７６９０５．１）のｍＲＮＡを標的とし、ホタルルシフェラーゼコード領域の１１８８−１２０６位に相補的な配列を有するものである。【００７０】
作製したｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃの配列を配列番号２に示す。このベクターは乳酸菌の中で安定に保たれるが、その中ではｓｈＲＮＡ遺伝子の転写は起こらず、このベクターが哺乳動物細胞内に移ったときにＵ６プロモーターによってｓｈＲＮＡ遺伝子の転写が起こる。【００７１】
Ｕ６プロモーター、ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡの、それぞれの塩基配列は、配列番号２に示す塩基配列のうち、１３３９位〜１５９６位、１６０３位〜１６５４位である。なお、１３３３位〜１３３８位はＥｃｏＲＩサイトであり、１６５８位〜１６６３位はＳａｌＩサイトである。なお、ｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃの発現によって、得られるｓｈＲＮＡの塩基配列を配列番号３に示す。【００７２】
〔乳酸菌〕
乳酸菌として、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉを用いた（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入した（ＡＴＣＣ２７１３９））。【００７３】
〔エレクトロポレーションによるプラスミドの導入〕
本実施例では、Ｌ．  ｃａｓｅｉに対するベクターの導入を、エレクトロポレーション法により行なった。【００７４】
まず、ＭＲＳ液体培地２ｍｌに、Ｌ．  ｃａｓｅｉのグリセロールストック２０μｌを加えて、終夜３７℃で静置培養した。次に、ＭＲＳ液体培地から１００μｌ採取して、１０ｍｌの新鮮なＭＲＳ液体培地に添加して培養した。次に、Ｌ．  ｃａｓｅｉの対数増殖期に、ＭＲＳ液体培地から４ｍｌ採取して、２０００ｇ×５ｍｉｎで遠心して上清を取り除いた。得られた沈殿物に、１０％グリセロール溶液４０μｌを加えて懸濁させた。このグリセロール溶液に、導入するベクター（５００ｎｇ／μｌ）を１μｌ加えて、ピペッティングすることで攪拌した。【００７５】
次に、キュベット（ＢＩＯＲＡＤ社製 ０．２ｃｍ）に溶液を移し氷上で５分間静置した後、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、１．５ｋＶ、２００Ω、２５μＦでエレクトロポレーションした。その後、すぐに、０．９ｍｌのＭＲＳ培地（＋Ｅｍ ２０μｇ/ｍｌ）を加えて３７℃で２時間培養した。次に、培養後のＭＲＳ培地をＭＲＳプレート（＋Ｅｍ  ２０μｇ／ｍｌ）上に播いて、ＭＲＳプレートが乾かないようにタッパーの中に入れて３７℃静置培養した。２〜３日培養すると、コロニーが生えた。このようにして、ベクターの導入されたＬ．  ｃａｓｅｉを得た。【００７６】
なお、ベクターの導入の確認はコロニーＰＣＲにより行なった。まず、８連チューブに２×ＴＥＴ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を１０μｌ入れた後、爪楊枝を用いてコロニーを軽くつつくことで菌体を採取して、上記２×ＴＥＴに懸濁させた。次に、９５度で５分間インキュベートした後、卓上遠心機で５分間遠心して、上清１μｌを回収した。これをコロニーＰＣＲの鋳型として用いた。【００７７】
次に、当該上清１μｌ（鋳型）に、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．１μｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、１０×Ｖｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒ  １μｌ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに付属）、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  １μｌ、正鎖プライマー（ＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧ；配列番号４）  ０．２μｌ、逆鎖プライマー（ＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＴＡＧＴＣＧ；配列番号５）  ０．２μｌ、超純水６．５μｌを混合して、全量を１０μｌとした。また、上記超純水とは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（ミリポア社製）を用いて精製した超純水である。【００７８】
温度条件としては、９５℃で３分間インキュベートした後、９５℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３０サイクル行なった。コロニーＰＣＲを行なった後、反応後の溶液５μｌを３％アガロースゲルによる電気泳動に供して、エチジウムブロマイド染色を行なうことによって、コロニーＰＣＲの結果を確認した。【００７９】
コロニーＰＣＲの結果の例として、ｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃを導入した場合のコロニーＰＣＲの結果を図１に示す。図１はｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃを導入して得たコロニーをコロニーＰＣＲに供した結果を示す図であり、レーン１はベクターを導入したコロニーの結果を示す。また、レーン２は、２本鎖ＤＮＡのサイズマーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社  ２−Ｌｏｇ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ）を示す。レーン３は，ｐＵＣＹＩＴ３５６Ｎ を導入したＬ．  ｃａｓｅｉのコロニーＰＣＲ結果、レーン４は鋳型を用いずに同条件でＰＣＲした結果を示す。当該コロニーＰＣＲでは、４２０ｂｐのＰＣＲ断片が得られればプラスミドが導入されたコロニーであることを示す。図１に示すように、レーン１に供したコロニーから４２０ｂｐのＰＣＲ断片が確認できた（レーン３，４では確認できない）。よって、Ｌ．  ｃａｓｅｉにｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃが導入されたことが確認できた。【００８０】
＜実施例２：リアルタイムＰＣＲによる乳酸菌内のｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃの定量＞
本実施例では、実施例１で作製したｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃを用いて形質転換したＬ．  ｃａｓｅｉの中に存在するプラスミドの量を、リアルタイムＰＣＲ装置を用いて測定した。【００８１】
まず，ｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃを用いて形質転換したＬ．  ｃａｓｅｉをＭＲＳ培地（＋Ｅｍ ２０μｇ／ｍｌ）中で静置培養した。培養した細胞を計数して細胞数２×１０７ｃｅｌｌ／μＬの懸濁液を作り，これを１μＬ（すなわち２×１０７ｃｅｌｌ／μＬ）とって上記２×ＴＥＴを加え、全量を２０μＬにした。次に、９５度で５分間インキュベートした後、卓上遠心機で５分間遠心して、上清を回収した。これをＰＣＲの鋳型として用いた。【００８２】
次に、当該上清を１０倍希釈した溶液１μｌ（鋳型；１×１０５ｃｅｌｌ分に含まれるＤＮＡ）に、Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ  Ｍｉｘ  （２ｘ）  ５μｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、２μＭ  ５Ｕ６−２プライマー（ＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＴＣＧＧＧＣＡＧＧ；配列番号６）１μｌ、２μＭ  ３Ｕ６プライマー（ＧＧＴＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＣ；配列番号７）１μｌ、超純水２μｌを混合して、全量を１０μｌのＰＣＲ反応液とした。検量線用に、上記細胞抽出液１μｌの代わりに、３０ｐｇ、３００ｐｇ、３ｎｇ、３０ｎｇのｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃをそれぞれ含む１μｌ溶液を用いて、上記ＰＣＲ反応液と同様にＰＣＲ反応液を調製した。これらのＰＣＲ反応液に対して、リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＳｔｅｐＯｎｅ）を用いて目的プラスミドを定量した。ＰＣＲ条件は、９５℃を５秒間、次に（９５℃で１８秒間、６０℃で３０秒間）を４０サイクル、６０℃で１分間、９５℃１５秒間とした。なお、各測定点について３セットずつサンプルを用意して、測定した。このリアルタイムＰＣＲにより目的プラスミドが検出された場合、増幅されるＤＮＡの長さは２７８ｂｐとなる。結果を図２に示す。図２はリアルタイムＰＣＲ法により乳酸菌内のｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃを定量した結果を示す図であり、縦軸ＣＴ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）は、ＰＣＲ増幅曲線がｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｌｉｎｅ（指数関数的増幅期に設定した閾値）と交差したサイクル数を示し、横軸はリアルタイムＰＣＲに供したｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃの量を示す。【００８３】
図２に示されるように、リアルタイムＰＣＲによる計測によって、細胞１．０×１０５個中に１．２ｎｇのプラスミドが含まれていることが示された。【００８４】
＜実施例３：ｓｈＲＮＡ発現ベクターによるＲＮＡｉの確認＞
本実施例では、実施例１で構築したｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃによるＲＮＡｉを確認した。【００８５】
ｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃ  ７０ｎｇ、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ）７０ｎｇ及びウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製ｐＲＬ―ＳＶ４０）７０ｎｇを、ＣＨＯ細胞に導入した。ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ、及びそれにコードされているＦｌｕｃ配列をそれぞれ配列番号８及び９に示す。なお、配列番号８はＧｅｎＢａｎｋにＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．  Ｕ４７２９６として登録されている。配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号８に示すｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌの２８０〜１９３２位にコードされている。なお、配列番号９はＧｅｎＢａｎｋにＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．  ＡＡＡ８９０８４として登録されている。ｐＲＬ−ＳＶ４０、及びそれにコードされているＲＬｕｃ配列を配列番号１０及び１１に示す。なお、配列番号１０はＧｅｎＢａｎｋにＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．  ＡＦ０２５８４５として登録されている。配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号１０に示すｐＲＬ−ＳＶ４０の６９４〜１６２９位にコードされている。なお、配列番号１１はＧｅｎＢａｎｋにＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．  ＡＡＢ８２５７７として登録されている。また、当該ＣＨＯ細胞はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より得た（製品名：Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞）。また、ＲＮＡの細胞内導入については、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（登録商標）  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、これに添付の取扱説明書に従って行なった。【００８６】
プラスミドベクターを導入したＣＨＯ細胞を室温で２４時間、培養した後、翌日Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）によってルシフェラーゼ活性を測定した。ネガティブコントロールとして、（１）ＦＬｕｃ発現ベクター及びＲＬｕｃ発現ベクターのみを導入したＣＨＯ細胞、（２）ＦＬｕｃ発現ベクター及びＲＬｕｃ発現ベクターに加えｐＵＣＹＩＴ３５６Ｎを導入したＣＨＯ細胞を用いた。ネガティブコントロールでは、ｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃを用いなかった以外は本実施例に記載の方法と同じ方法を行なった。結果を図３に示す。図３はＣＨＯ細胞内におけるｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃによるＲＮＡｉの効果を確認した結果を示す図である。【００８７】
図３に示されるように、ネガティブコントロールと比べて、ｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃを導入したＣＨＯ細胞では、特異的にＦＬｕｃの発現抑制が起こっていることが確認された。すなわち、ｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃが哺乳動物細胞内でＲＮＡｉ効果を持つことが確認された。【００８８】
＜実施例４：ｓｈＲＮＡ発現ベクターを保持する乳酸菌による、マウス皮下の悪性腫瘍細胞におけるＲＮＡｉの確認＞
腸内におけるＲＮＡｉ効果を検証する指標として、ヒト腫瘍細胞に対してｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡｉ効果を確認することを目的として、次のモデル実験を行った。【００８９】
ヌードマウス（雄、６週齢）２０匹に対し、ヒト悪性中皮腫株化細胞ＦＬｕｃ発現株（２１１Ｈ−Ｌｕｃ）を１０７ｃｅｌｌｓずつ右側足根部皮下に投与した。その様子を図４に示す。図４は本実施例において、２１１Ｈ−Ｌｕｃをマウスに投与した様子を示す図である。なお、摂取させる際、２１１Ｈ−Ｌｕｃが生着しやすいように細胞はマトリゲル（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ）１００μＬに懸濁させて投与した。２１１Ｈ−Ｌｕｃ細胞の腫瘍が十分な大きさに成長するまで約３週間飼育した。その後、ＲＮＡｉ効果を送達するための乳酸菌（実施例１にて得た、ｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃにより形質転換されたもの）を腫瘍が生着した部位に局所注射した。その様子を図５に示す。図５は、実施例１にて得た乳酸菌をマウスに局所注射する様子を示す図である。局所注射の２日後にＦＬｕｃ活性を測定した。ＦＬｕｃ活性測定については、イソフルランを用いて麻酔をかけた後、マウスの腹腔にルシフェリン（３０ｍｇ／ｍｌ  ｉｎ  ＰＢＳバッファー）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｂｅｅｔｌｅ  Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）を５０μＬ投与し、５〜１０分後に、ＩＶＩＳ  ２００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ社）を用いて行なった（０．０２秒で計測）。ネガティブコントロール実験として、空ベクター（ｐＵＣＹＩＴ３５６Ｎ）で形質転換した乳酸菌の局所注射、及び、乳酸菌を投与せずに生理食塩水を局所注射した場合についてもＦＬｕｃ活性を測定した。なお、ｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃにより形質転換された乳酸菌、上記空ベクターにより形質転換された乳酸菌、共に、それぞれ２×１０８ｃｅｌｌｓ／２００μｌの濃度で生理食塩水に懸濁させたものを２００μｌ投与した。【００９０】
結果を図６及び７に示す。図６はサンプルの投与の前後におけるマウスの様子を、ＩＶＩＳ２００を用いて観察した結果を示す図であり、図７はサンプルの投与の前後におけるＦＬｕｃ活性比を算出した結果を示す図である。なお、図７の縦軸は、次のようにして算出した値である。即ち、マウスのＦＬｕｃイメージにおいて、腫瘍部位付近を円で囲み、その部分のＦＬｕｃ活性を計測する。次に、サンプル投与前後及びネガティブコントロール実験においても全て同様に同じサイズの円で囲んだ領域のＦＬｕｃ活性を計測する。そして、サンプル投与後のＦｌｕｃ活性をサンプル投与前のＦＬｕｃ活性で割ったものが当該縦軸の数値である。【００９１】
図６及び７に示すように、ネガティブコントロールと比べて、ｐＵＣＹＩＴ−ｓｈＬｕｃを保持する乳酸菌を投与したマウス群では、有意にＦＬｕｃ活性の低減が確認され、ＲＮＡｉ効果が確認された。この実験を繰り返し行なったところ再現性が確認された。また、図６で投与した乳酸菌（２×１０８ｃｅｌｌｓ）に含まれるプラスミド量（２．４μｇ）と等量のｐＵＣＹＩＴ―ｓｈＬｕｃを２００μｌの生理食塩水に溶かしてマウスに投与しても、全くＲＮＡｉ効果が見られなかった。これらの結果から、乳酸菌はｓｈＲＮＡ発現ベクターをヒト腫瘍細胞内に運び入れ、当該ｓｈＲＮＡによるＲＮＡｉ効果が当該ヒト腫瘍細胞内にて発揮されたことが確認された。【００９２】
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。【００９３】
＜実施例５：ルシフェラーゼの発現の確認＞
本実施例では、ＰｏｌＩＩＩによって転写されるプロモーターと同じく、哺乳動物内で機能するプロモーターであるＳＶプロモーターを備えた、ｐＵＣＹＩＴ３５６Ｎ由来のベクターを保持する乳酸菌をマウスに経口投与することで、そのベクターがマウス腸内細胞に伝わることを確認した。【００９４】
〔５−１：ルシフェラーゼ発現ベクターの作製〕
ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をＫｐｎＩ及びＳａｌＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により２４４０ｂｐの断片を精製した。この断片は哺乳動物細胞内で働くＳＶプロモーターの下流に、ホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ遺伝子が続く配列である。配列を配列番号１２に示す。配列番号１２において、１位〜６位がＫｐｎＩ配列であり、２４４８位〜２４５３位がＳａｌＩ配列であり、４８位〜２５０位がプロモーターであり、２８０位〜１９３２位がルシフェラーゼ遺伝子である。次に、この断片を、実施例１で用いたものと同じベクターであるｐＵＣＹＩＴ３５６Ｎ（配列番号１）のＫｐｎＩ−ＳａｌＩサイトに組み込んだ。これによって、哺乳動物細胞内に入るとルシフェラーゼ遺伝子を発現するベクター［ｐＵＣＹＩＴ−Ｌｕｃ］を作製した。ｐＵＣＹＩＴ−Ｌｕｃは乳酸菌内で安定に保持されるが、乳酸菌内ではルシフェラーゼ遺伝子の発現は起こらない。【００９５】
〔５−２：ルシフェラーゼを哺乳動物細胞内で発現する乳酸菌の作製〕
実施例１の〔エレクトロポレーションによるプラスミドの導入〕の項と同様にして、ｐＵＣＹＩＴ−ＬｕｃをＬ．  ｃａｓｅｉの細胞内に導入した。【００９６】
〔５−３強制給餌法によるマウスへの乳酸菌投与（１日３回投与×３日間）と観察〕
強制給餌法を用いてマウスへの乳酸菌投与を行なうことで、生体内でのｐＵＣＹＩＴ−Ｌｕｃベクターの移行を観察した。具体的には、Ｘｅｎｏｇｅｎ社製ＩＶＩＳ  ２００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてルシフェラーゼの発光を観察することで、マウスの腸内の細胞内にｐＵＣＹＩＴ−Ｌｕｃベクターが移行したか否かを調べた。【００９７】
（１）乳酸菌の集菌
２ｍＬ  ＭＲＳ培地（＋Ｅｍ  ２０μｇ／ｍＬ）中にｐＵＣＹＩＴ−Ｌｕｃを導入させた乳酸菌（ｐＵＣＹＩＴ−Ｌｕｃ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）を加え、プレ培養を行なった。翌日プレ培養した培養液２ｍＬを８００ｍＬ  ＭＲＳ培地（＋Ｅｍ  ２０μｇ／ｍＬ）に加えた。ＯＤ＝１．０（Ａ６００）になるまで３７℃で静置培養した。その後、全培養液を遠心した（２０００×Ｇ  ４℃  ４ｍｉｎ）。上清を除き、生理食塩水２００ｍＬで懸濁してから遠心した（２０００×Ｇ  ４℃  ４ｍｉｎ）。再び上清を除き生理食塩水を加え、遠心（２０００×Ｇ  ４℃  ４ｍｉｎ）した。上清を取り除いてから全量８ｍＬになるよう生理食塩水を加え、５ｍＬの乳酸菌溶液（２×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を得た。【００９８】
なお、比較のため、２×１０９ｃｅｌｌｓ／μＬの乳酸菌内に含まれる量と同じ量を含むｐＵＣＹＩＴ−Ｌｕｃベクター溶液も生理食塩水で調製した（２４μｇ／ｍＬ）。【００９９】
（２）乳酸菌の投与
乳酸菌は、胃ゾンテ法（シリンジに投与したい溶液を入れ、そのシリンジにつなげたチューブを胃まで届かせて注入する方法）を用いて強制給餌した。給餌している様子を図８に示す。図８は本実施例において胃ゾンテ法を用いて乳酸菌を経口投与している様子を示す図である。一回一匹当たり４００μＬ（８×１０８ｃｅｌｌ）ずつ投与した。１日３回（１０:００、１３:００、１６:００）を３日間続けて行なった（投与した乳酸菌は投与日前日に培養・集菌したものを用いた）。投与最終日の翌日、ＩＶＩＳ  ２００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、マウスのルシフェラーゼ発光を調べた。ルシフェリンは５０μＬ腹腔投与した。ルシフェリンは３０ｍｇ／ｍｌに希釈したものを用いた。【０１００】
（３）腸内の観察
まずマウスを頸椎脱臼させ安楽死させた。その後、マウス腹部を切断し十二指腸〜直腸までを摘出した。これをＰＢＳで洗浄し、新しいＰＢＳの入ったシャーレに移してからＩＶＩＳ  ２００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてルシフェラーゼ発光を調べた。シャーレ内にルシフェリンは５０μＬ添加した。ルシフェリンは３０ｍｇ／ｍｌに希釈したものを用いた。【０１０１】
（４）結果
結果を図９に示す。図９は本実施例において乳酸菌をマウスに経口投与してルシフェラーゼ活性を観察した結果を示す図であり、図９の（ａ）はｐＵＣＹＩＴ−Ｌｕｃ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉを投与した結果を示し、図９の（ｂ）は比較のために作製したｐＵＣＹＩＴ−Ｌｕｃベクター溶液を投与した結果を示し、図９の（ｃ）は参考として示すマウスの解剖図である。図９に示すように、ｐＵＣＹＩＴ−Ｌｕｃ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉを投与することで、腸の存在位置付近にルシフェラーゼ活性を確認できた。【０１０２】
以上のように、ｐＵＣＹＩＴ３５６Ｎ由来のルシフェラーゼ発現ベクターが伝わり、機能したことが、ルシフェラーゼの発光を確認することによって確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明に係るキットは、乳酸菌を用いて、人間及び動物の細胞内においてｄｓＲＮＡを生成させることができる。このため、人間及び動物の腸内で安定してＲＮＡｉを起こすことができる。よって、本発明は、製薬産業、食品産業及びその関連産業に利用可能である。
【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年1月4日(2010.1.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物内で機能するプロモーターを含むベクターを備えており、上記哺乳動物内で機能するプロモーターは、ＰｏｌＩＩＩによって転写されるプロモーターであることを特徴とする乳酸菌により二本鎖ＲＮＡを生成するキット。
【請求項２】
上記乳酸菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ又はＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓであることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項３】
上記ＰｏｌＩＩＩによって転写されるプロモーターが、Ｕ６プロモーターであることを特徴とする請求項１に記載のキット。
【請求項４】
哺乳動物内で機能するプロモーターに二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡが作動可能に連結されたベクターを、含有しており、上記哺乳動物内で機能するプロモーターは、ＰｏｌＩＩＩによって転写されるプロモーターであることを特徴とする乳酸菌。
【請求項５】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ又はＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓであることを特徴とする請求項４に記載の乳酸菌。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の乳酸菌を含んでいることを特徴とする腸内疾患用治療組成物。
【国際調査報告】
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