【事件の表示】
　特許第３０２９１２５号「プロスタグランジンレセプターＩＰをコードするＤＮＡ」の請求項１ないし１９に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３０２９１２５号の請求項１ないし１９に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　特許第３０２９１２５号に係る発明についての出願は、平成６年１０月３日に特許出願され、平成１２年２月４日にその特許の設定登録がなされ、その後、五島香里より請求項１ないし１９の特許について特許異議の申立てがなされ、取消理由通知がなされ、訂正請求がなされたものである。
　
２．訂正の適否の判断
２−１　訂正の内容
　特許請求の範囲の請求項１９の「・・配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むヒトプロスタグランジンＩＰレセプター・・」を、「・・配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む組換えヒトプロスタグランジンＩＰレセプター・・」に訂正する。
２−２　訂正の目的の適否、新規事項の有無及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否
　上記訂正事項に関連する記載として、願書に最初に添附した明細書（以下、「特許明細書」という。）の発明の詳細な説明の実施例７には、「最近クローニングされたヒトプロスタグランジンＩ２（ＩＰ）レセプターをｐｃＤＮＡ１ａｍｐプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、ＤＥＡＥ−デキストラン法を用いてＣＯＳ−Ｍ６細胞にトランスフェクトした。・・・クローン化したヒトＩＰレセプターをＣＯＳ−Ｍ６細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞から調製した膜を用いて「３Ｈ」イロプロスト結合アッセイを実施した。・・・従って、ｈＩＰレセプターとのプロスタサイクリン及び関連合成類似体のアフィニティーの順位は、・・・であった。この力価の順位は従来の薬理研究からＩＰレセプターに予想された通りであった。」と記載されており、「組換えヒトプロスタグランジンＩＰレセプター」は特許明細書に記載されている。
　そうすると、上記訂正事項は、特許明細書に記載された範囲において、請求項１９を「・・配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む組換えヒトプロスタグランジンＩＰレセプター・・」に限定したものといえるから、特許請求の範囲の減縮に該当するものであって、新規事項の追加に該当せず、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。
　以上のとおりであるから、上記訂正請求は、特許法第１２０条の４第３項で準用する同法第１２６条第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議申立てについての判断
３−１　訂正明細書の請求項に係る発明
　訂正明細書の請求項１ないし１９に係る発明は、その特許請求の範囲の請求項１ないし１９に記載された次の事項により特定されるとおりのものである。
「１．配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子。
２．請求項１に記載のＤＮＡ分子を有する、組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現させるための発現ベクター。
３．請求項２に記載の発現べクターを有する、組換えヒトプロスタグランジンＩＰレセプターを発現する宿主細胞。
４．組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）請求項３に記載の発現べクターを適当な宿主細胞にトランスフェクションさせる段階と、
（ｂ）該発現べクターからヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現できるような条件下で該宿主細胞を培養する段階とを含む前記方法。
５．配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含む、ヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子。
６．請求項５に記載のＤＮＡ分子を有する、組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジン１Ｐレセプタータンパク質を発現させるための発現べクター。
７．請求項６に記載の発現べクターを有する、組換えヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現する宿主細胞。
８．組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジン１Ｐレセプタータンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）請求項６に記載の発現べクターを適当な宿主細胞にトランスフェクションさせる段階と、
（ｂ）該発現べクターからヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現できるような条件下で該宿主細胞を培養する段階とを含む前記方法。
９．配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなる、ヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子。
１０．請求項９に記載のＤＮＡ分子を有する、組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現させるための発現べクター。
１１．請求項１０に記載の発現ベクターを有する、組換えヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現する宿主細胞。
１２．組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジン１Ｐレセプタータンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）請求項１０に記載の発現べクターを適当な宿主細胞にトランスフェクシヨンさせる段階と、
（ｂ）該発現べクターからヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現できるような条件下で該宿主細胞を培養する段階とを含む前記方法。
１３．配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み、他のヒトタンパク質を含まないヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質。
１４．組換え宿主細胞より得られる請求項１３に記載のヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質。
１５．ヒトプロスタグランジンレセプターＩＰをコードするＤＮＡ分子でトランスフォーメーションされたかまたはトランスフェクションされた組換え宿主細胞から得られる、請求項１３に記載のヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を含む膜調製物。
１６．配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる、他のヒトタンパク質を含まないヒトプロスタグランジン１Ｐレセプタータンパク質。
１７．組換え宿主細胞より得られる請求項１６に記載のヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質。
１８．ヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質をコードする ＤＮＡ分子でトランスフォーメーションされたかまたはトランスフェクションされた組換え宿主細胞から得られる、請求項１６に記載のヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を含む膜調製物。
１９．ヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質活性を調節する化合物の選定方法であって、
（ａ）該化合物を配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む組換えヒトプロスタグランジンＩＰレセプターにさらす段階と、
（ｂ）該プロスタグランジンレセプターに及ぼす調節剤の作用を測定する段階とを含む前記方法。」
（以下、本件発明１ないし１９という。）
３−２　異議申立の理由の概要
　異議申立人　五島香里は、下記に示す甲第１号証〜甲第５号証を提出して、訂正前の本件請求項１９は甲第５号証に記載された発明と同一であるから、特許法第２９条第１項第３号の規定により、及び請求項１ないし１９に係る発明は、甲第１号証〜甲第４号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により、特許を受けることができないものである旨主張している。
　　　　　　　　　　　　　　　　　記
（１）甲第１号証：平田　雅一ら著、日本臨林、５１巻、６号、１９９３、１７８−１８２頁
（２）甲第２号証：The Journal of Biological Chemistry 、Vol ．264 、No．１、p．61−67．1989
（３）甲第３号証：村松　正実編、「実験医学」臨時増刊号 Ｖｏｌ．５、Ｎｏ．１１、１９８７、「バイオテクノロジー実験法シリーズ　遺伝子工学総集編」、２５−１４６頁、昭和６２年１１月１日、株式会社羊土社発行
（４）甲第４号証：特開平４−２１０５９５号公報
（５）甲第５号証：Br．J．Pharmacol．（1991）、102、p．251−259
３−３　各甲号証記載の発明
　上記甲第１号証には、「プロスタノイドは、アラキドン酸のシクロオキシゲナーゼ代謝産物の総称で、主なものに、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｅ２、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）、トロンボキサン（ＴＸ）Ａ２などがある。」（第１７８頁左欄本文第１〜４行）との記載、
「これまでにヒトとマウスのＴＸＡ２受容体と、マウスの２種類の ＰＧＥ２受容体のｃＤＮＡクローニングが報告されて、これらの受容体が、βアドレナリン受容体や、本特集の中でも紹介されている、エンドセリン、アンギオテンシンII受容体と同じく、Ｇタンパクに連関する７回膜貫通型の受容体であることが明らかになった。」（第１７８頁右欄第２〜９行）との記載、
「ＰＧＥ２受容体としては、これまでに、ＥＰ３、ＥＰ２受容体のｃＤＮＡがマウスからクローニングされている。マウスのＴＸＡ２、ＥＰ３、ＥＰ２の受容体について、アミノ酸配列を比較したのが図１である。Ｎ−グリコシル化部位の予想や疎水性のプロットから、いずれもＮ末が細胞外、Ｃ末が細胞質側にあり、７つの膜貫通領域を持っていると考えられている。」（第１８０頁左欄第５〜１２行）との記載
「その分子量については、可溶化された状態での推定がなされていたが、最近、ＰＧＩ２類縁体の非常に優れた光親和標識化合物が開発され、それを用いた解析では、マウスがん化肥満細胞では、分子量約４３ｋＤａ、ブタ血小板では約４５ｋＤａの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、比較的幅の広いバンドを示すタンパクがＰＧＩ２ 受容体分子として報告されている。タンパクのバンドの幅が広いのは、この受容体が糖鎖を持っていることを示唆していると考えられている。これらの細胞は、ＰＧＩ２受容体の薬理学的解析が詳しく行われてきた細胞であり、また、標識に使われているリガンドの親和性と特異性がかなり高いことから、信頼すべき結果であると考えられる。ＰＧＩ２受容体が、Ｇｓ に連関しており、糖蛋白で、４５ｋＤａ程度の分子量を示すことを考えると、この受容体も、ＴＸＡ２や、ＥＰ３、ＥＰ２に相同性のある分子であることは間違いのないことと思われる。」（第１８０頁右欄下から第２行〜第１８１頁左欄第７行）との記載、
及び「しかし、最近では、平滑筋の増殖調節や、免疫系の調節などにおけるプロスタノイドの働きにも理解が深まってきており、動脈硬化や臓器移植などにもプロスタノイド受容体作動薬が、将来有効な治療薬となりうると考えられ、実際に試みられつつある。現在臨床で用いられているプロスタノイド受容体作動薬は、特異性や、生体内での安定性などの点で、まだ発展途上だが、受容体分子の理解は、そのような問題点の克服の助けとなろう。また、ここに紹介したように、受容体分子がｃＤＮＡのレベルで明らかにされていくと、受容体の分布も明らかになり、例えば、ＥＰ２受容体が心臓のどの部位に存在しどのような働きを担っているのか、などが今後明らかになっていき、さらに新しい治療薬や治療法の開発につながることが期待される。」（第１８１頁左欄第２２〜３８行）との記載があり、さらに、ヒトＴＸＡ２受容体、マウスＴＸＡ２受容体、マウスＥＰ３受容体、マウスＥＰ２受容体の、クローニングされたｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列が、第１７９頁の図１に並べて示されており、その図１の脚注の第１行目には「ローマ数字は細胞膜貫通領域」と記載され、また、同脚注第１〜２行に「＊は４つの受容体間で保存されているアミノ酸。」と記載されている。
　上記甲第２号証には、「プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）レセプターが血小板及び他の組織上で同定されているが、活性のある可溶化レセプターを得ることが難しいためにそれらの理化学的性質はわかっていない。我々は、数種類の洗剤について、血小板膜調製物からレセプターを遊離する能力を調べた。・・我々は、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−クラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）（１０ ｍＭ）がＰＧＩ２レセブターの遊離に関して遥かに優れていることを見出した。・・［３Ｈ］イロプロストをリガンドとして用い、より高い捕捉効率を達成するためにポリエチレンイミンで前処理した選択性膜フィルター（ＡＰ−１５又はＧＦ／Ｂ）を用いることにより、我々は、可溶化されたレセプターが、ＫＤ１８．５ｎＭ、Βｍａｘ ０．５ ｐｍｏｌ／ｍｇの単一クラスの結合部位を示すことを平衡結合試験により示した。これらの値は、膜レセプターの値、すなわち、ＫＤ１６．６ｎＭ、Βｍａｘ １．０ｐｍｏｌ／ｍｇと同様であった。・・我々のデータは、血小板ＰＧＩ２レセプタ−の成功的な可溶化を初めて示すものである。可溶化されたレセプタ一は、ネイティブの膜レセプターとほとんど同じ結合特性を維持していた。」（第６１頁の要約欄）との記載がある。
　甲第３号証には、「ｉ）ｃＤＮＡの塩基配列を検出する方法・・（ａ）蛋白質の一次構造（アミノ酸配列）が部分的に知られている場合　これは、最近の蛋白質精製法の進歩、気相ペプチドシーケンサーによる微量蛋白質のアミノ酸配列決定法の進歩などにより、求める蛋白質の部分構造が知られやすくなったことによって急速に増加した。１５ヌクレオチド以上の相補鎖はかなり安定にハイブリダイズするので、５つ以上アミノ酸配列がわかると、１つのプローブを作ることができる。もっとも、遺伝暗号の縮退によって、アミノ酸配列いかんによっては非常に多数のプローブを同時に作って用いなければならない欠点があるが、最近のＤＮＡ合成機はこれらの混合物を簡単に作ってくれる。」（第２５頁左欄第２〜１８行）との記載、
「３） 合成オリゴヌクレオチドを用いたクローニング法
　蛋白質のアミノ酸配列より推定した塩基配列をもつオリゴヌクレオチドをプローブとして利用したクローニング法である。きわめて少量のぺプチドの精製法、アミノ酸配列の決定法の進歩により、本方法は広く使われている。また、構造を基本としているために確実にクローンを確定できる点もすぐれている。」（第４１頁左欄第５〜１１行）との記載、及び  
「Ｄｉｄｅｏｘｙシークエンスキツトが市販されて５年近くになる。その間、各社とも品質向上に努めた結果、シークエンス反応は指示通りに行えば必ず成功するようにまでなった。」（第６７頁右下欄下から第３行〜第６８頁左欄第１行）との記載があり、合成オリゴヌクレオチドのデザインや合成オリゴヌクレオチドをプローブとしてスクリーニングする方法が具体的に記載されるとともに、第６２頁〜第６８頁には、ＤＮＡシークエンス法が、さらに第１４２頁〜１４６頁には、哺乳動物細胞用発現べクタ−の作製が記載されている。
　上記甲第４号証には、「ＴＸＡ２受容体をコードする遺伝子。」（請求項１）との記載、及び「ＴＸＡ２受容体はＴＸＡ２アゴニストやアンタゴニストの探索に有用である。」（要約の【効果】の項の第２〜３行）との記載があり、同証の配列表の配列番号１には、ＴＸＡ２受容体をコードするｃＤＮＡの塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列が記載されており、また、実施例には、精製ＴＸＡ２レセプタ−の部分アミノ酸配列を決定し、それをコードする混合オリゴヌクレオチドプローブでｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、陽性クローンを選択してそのｃＤＮＡの塩基配列を決定し、さらに該ｃＤＮＡを発現べクターに組み込んで宿主細胞で発現させる方法が記載され、さらに段落番号【００２２】及び【００２３】には、ＴＸＡ２レセプターのｃＤＮＡの発現べクタ−を用いてＣＯＳ−７細胞を形質転換することにより、細胞膜上に該レセプターが発現した細胞が得られること、及びこの細胞から調製した膜調節物を用いて結合試験を行ったことが記載されている。
　上記甲第５号証には、「オクティミベートは、［３Ｈ］−イロプロスト（安定なＰＧＩ２の模倣物）の血小板膜への結合を明らかに完全に阻害する。見積もった Ｋｉは１５０ｎＭである。」（要約欄の第５頃）との記載、
「膜は上記のように調製し、［３Ｈ］−イロプロスト結合の阻害は、Ｈａｌｌ とＳｔｒａｎｇｅ（１９８４）によって記載されたように測定した。インキュベーション（総体積 ２７０μｌ）は、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ５０ ｍＭ（ｐＨ７．４、２０℃），ＭｇＣｌ２　４ｍＭ，ＥＤＴＡ ４０μＭ、［３Ｈ］−イロプロスト１０ｎＭ，膜タンパク質 ０．４−０．８ｍｇ，１．８５％ ＤＭＳ０，及び種々の濃度の非標識イロプロスト又はオクテイミべ−トを含んでいた。・・チューブ（各条件につき３本ずつ）を氷上にセットし、次いで３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベートは、Ｂｒａｎｄｅｌ ハーベスタ−を用いてＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ｂフィルター上で迅速にろ過することにより終結した。フィルターをＴｒｉｓ−Ｃｌ ５０ｍＭ，ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ、ｐＨ ７．４、２０℃で３回洗浄し、放射能を測定した。」（第２５３頁左欄下から８行〜右欄第６行）との記載、及び
「オクティミベートは、プロスタサイクリンレセプターにおける効力のあるアゴニスト（凝集）又は部分的なアゴニスト（アデニリルシクラーゼ）であると思われ、このタイプの同定された最初の非プロスタノイド剤である。」（第２５１頁の要約欄の第７項）との記載がある。
３−４　判断
（１）特許法第２９条第１項第３号について
　本件発明１９が甲第５号証に記載された発明と同一であるか否かについて検討すると、本件発明１９は、工程（ａ）において、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む「組換え」ヒトプロスタグランジンＩＰリセプターを用いる化合物の選定方法であるのに対して、甲第５号証に記載の発明は、天然に存在するヒトプロスタグランジンＩＰリセプターを用いる点で相違しており、両発明が同一であるとする異議申立人の主張は採用できない。
　なお、本件発明により組換え体が提供されることから、天然に存在するリセプター蛋白質を調製し、使用する際の種々の制約（少ない調製量、煩雑な操作、爽雑物質の影響など）が解決し得ることは明らかである。
（２）特許法第２９条第２項について
　本件発明１が甲第１号証〜甲第５号証に基づいて容易になし得たか否かについて検討する。
　本件発明１と甲第１号証に記載の発明を対比すると、甲第１号証には、ヒト及びマウスのトロンボキサンＡ２受容体（ＴＸＡ２受容体）、マウスのプロスタグランジンＥＰ２受容体（ＰＧＥＰ２受容体）及びプロスタグランジンＥＰ３受容体（ＰＧＥＰ３受容体）のアミノ酸配列が第７番目の膜貫通領域を含めて並べて記載されており、また、ＰＧＩ２受容体がＴＸＡ２やＥＰ３、ＥＰ２と相同性のあることは間違いのないことと思われるとも記載されているから、ＰＧＩ２受容体を含め、これらの受容体がプラスタノイドレセプターとして共通する部分を有するであろうことは推測し得るものと認められる。
　しかしながら、甲第１号証は、あくまで、ＰＧＩ２受容体のアミノ酸配列を推定しているだけであって、実際に受容体をコードする遺伝子を単離していない。即ち、甲第１号証における記載は、あくまで、ＰＧＩ２受容体がＴＸＡ２やＥＰ３、ＥＰ２の各受容体と相同性があると一般的に推定しているのであって、一部分でもアミノ酸配列を解明し、それに基づいて具体的な相同性を論じたものではない。そして、本件特許から明らかになったように、ＰＧＩ２受容体はＥＰ２　受容体とは２８％の相同性しかなく、その他のプロスタノイドファミリー間の相同性も２８％から４５％程度のものである。（J. Biol. Chem., 第２７０号（第１６巻）、１８９１０〜１８９１６頁）しかも、第７膜貫通領域のアミノ酸配列についても、ＰＧＥＰ２受容体の「ＮＰＩＬＤＰＷＩＹ」とＰＧＩ２受容体の「ＮＰＩＬＤＰＷＶＦ」とは異なっており、相同性があろうと推測される領域においてさえも、アミノ酸配列が相違している。
　このため、各受容体の相同性を単に推定しているだけであって、実際にＰＧＩ２受容体を単離していない甲第１号証の記載に基づいて、当業者が本件発明１を容易になし得たということはできない。
　次に、甲第２号証に記載の発明について検討すると、同甲号証には、ヒト血小板膜からＣＨＡＰＳという特定の界面活性剤を使用してＰＧＩ２受容体を可溶化し、そのリガンド結合を特性化したことが記載されているものの、同甲号証には同受容体を単離したとも、精製したとも記載されておらず、しかも、同受容体をコードする遺伝子のクローニング等については何も記載されていない。
　このため、甲第２号証の記載に基づいて、或いは、他の甲各号証と組み合わせたとしても、当業者が本件発明１を容易になし得たということはできない。
　甲第３号証は、部分アミノ酸配列が知られている場合の蛋白質のｃＤＮＡのクローニング方法、塩基配列の決定法、及び該ｃＤＮＡの哺乳動物細胞における発現方法を一般的に記載している。しかしながら、本件発明のＰＧＩ２受容体のアミノ酸配列は部分的にも決定されておらず、また、同受容体をコードする遺伝子等が実際に単離されていないことは上述のとおりであるから、甲第３号証の記載に基づいて、或いは、他の甲各号証と組み合わせたとしても、当業者が本件発明１を容易になし得たものとはいえない。
　更に、甲第４号証は、ＴＸＡ２受容体のｃＤＮＡのクローニング並びにその塩基配列及びその塩基配列がコードするアミノ酸配列を決定し、また、このｃＤＮＡを発現する宿主細胞の作成方法を記載しており、蛋白質の部分アミノ酸配列が知られている場合の上記ｃＤＮＡのクローニングや蛋白質の配列決定等について記載している。
　しかしながら、同甲号証にも、本件発明の受容体をコードする遺伝子、及びそれがコードするアミノ酸配列は何も記載されていない。しかも、同甲号証に記載された混合オリゴヌクレオチドプローブを用いるＴＸＡ２受容体遺伝子のクローニング法においては、このオリゴヌクレオチドプローブを用いて得たｃＤＮＡは５８６塩基対のＭＥＧと称される部分ＤＮＡであり、所望の全長ｃＤＮＡを単離するに当たっては、更に、このオリゴヌクレオチドとは到底言えないような大きさのＭＥＧを第２プローブとして使用しており、そのことによって初めて目的の全長ｃＤＮＡを単離し得たものであるから、同甲号証の記載に基づいて、当業者が本件発明１を容易になし得たものということもできない。
　甲第５号証については、本件発明の受容体を単離することについては何も記載していないから、当業者が単離ＤＮＡ分子に係る本件発明１を同甲号証の記載に基づいて容易になし得たものとは認められない。
　以上のとおりであるから、本件発明１が甲第１号証〜甲第５号証の記載に基づいて、当業者が容易になし得たものとすることはできない。
　また、本件発明２ないし１９は、本件発明１に係る発明の構成要件をすべて必須のものとする発明であるから、本件発明１と同様に甲第１号証〜甲第５号証に記載された各発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたということはできない。
４．むすび
　以上のとおりであるから、特許異議申立人の主張する理由及び提出した証拠方法によっては、本件発明１ないし１９に係る発明の特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件発明１ないし１９に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年８月２日（２００１．８．２）
【訂正の要旨】
　訂正の要旨
　特許請求の範囲に
「１．配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子。
２．請求項１に記載のＤＮＡ分子を有する、組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現させるための発現ベクター。
３．請求項２に記載の発現ベクターを有する、組換えヒトプロスタグランジンＩＰレセプターを発現する宿主細胞。
４，組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）請求項３に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクションさせる段階と、
（ｂ）該発現ベクターからヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現できるような条件下で該宿主細胞を培養する段階とを含む前記方法。
５．配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含む、ヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子。
６．請求項５に記載のＤＮＡ分子を有する、組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現させるための発現ベクター。
７．請求項６に記載の発現ベクターを有する、組換えヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現する宿主細胞。
８．組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジン１Ｐレセプタータンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）請求項６に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクションさせる段階と、
（ｂ）該発現ベクターからヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現できるような条件下で該宿主細胞を培養する段階とを含む前記方法。
９．配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなる、ヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子。
１０．請求項９に記載のＤＮＡ分子を有する、組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現させるための発現ベクター。
１１．請求項１０に記載の発現ベクターを有する、組換えヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現する宿主細胞。
１２．組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジン１Ｐレセプタータンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）請求項１０に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクシヨンさせる段階と、
（ｂ）該発現ベクターからヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現できるような条件下で該宿主細胞を培養する段階とを含む前記方法。
１３．配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み、他のヒトタンパク質を含まないヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンバク質。
１４．組換え宿主細胞より得られる請求項１３に記載のヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンバク質。
１５．ヒトプロスタグランジンレセプターＩＰをコードするＤＮＡ分子でトランスフォーメーションされたかまたはトランスフェクションされた組換え宿主細胞から得られる、請求項１３に記載のヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を含む膜調製物。
１６．配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる、他のヒトタンバク質を含まないヒトプロスタグランジン１Ｐレセプタータンパク質。
１７．組換え宿主細胞より得られる請求項１６に記載のヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質。
１８．ヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ分子でトランスフォーメーションされたかまたはトランスフェクションされた組換え宿主細胞から得られる、請求項１６に記載のヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を含む膜調製物。
１９．ヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンバク質活性を調節する化合物の選定方法であって、
（ａ）該化合物を配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むヒトプロスタグランジンＩＰレセプターにさらす段階と、
（ｂ）該プロスタグランジンレセプターに及ぼす調節剤の作用を測定する段階とを含む前記方法。」とあるを、特許請求の範囲の減縮を目的として、次のとおり、
「１．配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子。
２．請求項１に記載のＤＮＡ分子を有する、組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現させるための発現ベクター。
３．請求項２に記載の発現ベクターを有する、組換えヒトプロスタグランジンＩＰレセプターを発現する宿主細胞。
４，組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンバク質を発現させる方法であって、
（ａ）請求項３に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクションさせる段階と、
（ｂ）該発現ベクターからヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンバク質を発現できるような条件下で該宿主細胞を培養する段階とを含む前記方法。
５．配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含む、ヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子。
６．請求項５に記載のＤＮＡ分子を有する、組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジン１Ｐレセプタータンパク質を発現させるための発現ベクター。
７．請求項６に記載の発現ベクターを有する、組換えヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンバク質を発現する宿主細胞。
８．組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジン１Ｐレセプタータンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）請求項６に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクションさせる段階と、
（ｂ）該発現ベクターからヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現できるような条件下で該宿主細胞を培養する段階とを含む前記方法。
９．配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなる、ヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンバク質をコードする単離ＤＮＡ分子。
１０．請求項９に記載のＤＮＡ分子を有する、組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現させるための発現ベクター。
１１．請求項１０に記載の発現ベクターを有する、組換えヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンバク質を発現する宿主細胞。
１２．組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジン１Ｐレセプタータンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）請求項１０に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクシヨンさせる段階と、
（ｂ）該発現ベクターからヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンバク質を発現できるような条件下で該宿主細胞を培養する段階とを含む前記方法。
１３．配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み、他のヒトタンパク質を含まないヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンバク質。
１４．組換え宿主細胞より得られる請求項１３に記載のヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンバク質。
１５．ヒトプロスタグランジンレセプターＩＰをコードするＤＮＡ分子でトランスフォーメーションされたかまたはトランスフェクションされた組換え宿主細胞から得られる、請求項１３に記載のヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を含む膜調製物。
１６．配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる、他のヒトタンパク質を含まないヒトプロスタグランジン１Ｐレセプタータンパク質。
１７．組換え宿主細胞より得られる請求項１６に記載のヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質。
１８．ヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ分子でトランスフォーメーションされたかまたはトランスフェクションされた組換え宿主細胞から得られる、請求項１６に記載のヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を含む膜調製物。
１９．ヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンバク質活性を調節する化合物の選定方法であって、
（ａ）該化合物を配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む組換えヒトプロスタグランジンＩＰレセプターにさらす段階と、
（ｂ）該プロスタグランジンレセプターに及ぼす調節剤の作用を測定する段階とを含む前記方法。」と訂正する。
（注）訂正は、請求項１９においてのみなされている。
（５４）【発明の名称】
プロスタグランジンレセプターＩＰをコードするＤＮＡ
【発明の詳細な説明】
発明の背景
　ＰＧＩ２は動脈平滑筋を弛緩させ、血小板凝集、脱顆粒及び形状変化を阻止するので、血管恒常性の維持に重要であると考えられている。ＰＧＩ２の他の潜在的役割は確立されていないが、腎皮質における腎血流、レニン放出及び糸球体濾過速度の調節、心臓における神経伝達物質放出の調節、並びに胃及び大腸における分泌の刺激などである。他のプロスタグランジンと同様に、ＰＧＩ２は主に血管拡張薬としてのその役割によって充血、浮腫、過剰無痛覚症及び発熱を誘発する炎症性応答にも関与する。
　プロスタグランジン（ＰＧ）Ｉ２の生理的作用は、プロスタグランジンＩＰレセプターとの相互作用により媒介される。既知のＩＰレセプターの分布状況は、ＰＧＩ２の生理的作用を反映している。ＩＰレセプターはヒトを含む多数の種からの血小板で、放射性リガンド結合試験により広範に認められており、冠、肺、腎及び他の数種の動脈調製物並びに心臓中に存在することが薬理試験で確認されている。ＩＰレセプターは子宮筋層、陰茎勃起組織及び虹彩括約筋にも存在するらしく、ＮＣＢ−２０及びＮＧ１０８−１５ニューロンハイブリッド細胞系並びにマウス肥満細胞腫Ｐ−８１５細胞系に存在することが報告されている。
　ＩＰレセプターの機能活性は、動脈平滑筋などの組織調製物を用いたり、血小板を用いる細胞に基づくアッセイで試験されている。このようなＩＰレセプター活性の試験方法は、異なるリガンド結合特性をもつ数個の相互に関連し且つ異なるレセプター集団を含む調製物が必要であり、絶対力価と選択性の測定が非常に困難になるという点でいくつかの欠点がある。また、組織サンプルが必要であるが、組織のＩＰレセプター含有濃度は種々異なるため、化合物をヒトＩＰレセプターのエフェクターとして十分に試験することができない。
発明の要約
　ＩＰと呼ばれる新規プロスタグランジンレセプタータンパク質がヒト細胞から同定された。完全長ＩＰタンパク質をコードするＤＮＡ分子が単離及び精製され、そのヌクレオチド配列が決定された。ＩＰをコードするＤＮＡは発現ベクターにクローニングされ、これらの発現ベクターを組換え宿主細胞に導入すると、組換え宿主細胞は機能的ＩＰレセプタータンパク質を発現する。新規ＩＰタンパク質、ＩＰをコードするＤＮＡ、発現ベクター及び組換えＩＰを発現する組換え宿主細胞は、ＩＰレセプター活性調節剤の選定に有用である。
　組換えＩＰ発現宿主細胞を用いるＩＰレセプター調節剤選定法も開示する。ＩＰ活性調節剤はプロスタグランジン関連疾患の治療及びＩＰレセプターに及ぼすプロスタグランジンの作用の調節に有用である。
図面の簡単な説明
　図１はヒトＩＰ　ｃＤＮＡクローンｈＬＸＲ３−６のＤＮＡ配列を示す。
　図２はヒトＩＰ　ｃＤＮＡクローンｈＬＸＲ３−１１のＤＮＡ配列を示す。
　図３はＩＰレセプタータンパク質をコードするヒトＩＰ　ｃＤＮＡ構築物１１／６ｈＬＸＲ３のＤＮＡ配列を示す。　図４は１１／６ｈＬＸＲ３によりコードされるＩＰレセプタータンパク質の完全推定アミノ酸配列を示す。
　図５はＩＰ　ｃＤＮＡを注入したツメガエル卵母細胞におけるプロスタグランジン１２レセプターの発現を示す。図５Ａは、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ−ＣＦＴＲ２．６ｎｇとｐｃＤＮＡＩａｍｐ−１１／６ｈＬＸＲ３（ｈＩＰｃＤＮＡ）１ｎｇを同時注入した卵母細胞中においてイロプロストにより誘導され、ＣＦＴＲにより媒介されるＣｌ　電流を示し、電流は１〜１００ｎＭイロプロストの浴潅流により誘起されるが、ＰＧＥ２又はＰＧＤ２では誘起されない。図５Ｂは卵母細胞における内在性ＩＰレセプターの不在を示す。卵母細胞にＣＦＴＲ　ｃＤＮＡを注入し、１００ｎＭイロプロスト、ＰＧＥ２、ＰＧＤ２及び３ｍＭ　ＩＢＭＸで感作した。破線はゼロ電流レベルを示す。
　本図に示す電圧固定実験は核注入から４８時間後に実施し、３匹の異なるカエルからの卵母細胞を用いた６回の別々の実験の代表的なものである。
　図６はｐｃＤＮＡＩａｍｐ−ｈＩＰをトランスフェクトしたＣＯＳ−Ｍ６膜との［３Ｈ］イロプロスト特異結合に関する競合を示す。実施例７に記載するように［３Ｈ］イロプロスト結合アッセイを実施した。１００ｍＭまでの濃度範囲で各競合リガンド濃度におけるイロプロスト（■）、安定ＩＰレセプターアゴニストカルバサイクリン（□）、ＰＧＥ２（▲）、ＰＧＦ２α（●）、ＰＧＤ２（△）及びＴＰ−レセプターアゴニストＵ４６６１９（○）の最大［３Ｈ］イロプロスト特異結合百分率を測定した。
発明の詳細な説明
　本発明はＩＰと呼ばれる新規プロスタグランジンレセプターをコードするｃＤＮＡに関する。本発明は、組換え発現プラスミドに含まれるクローン化ＩＰコーディングＤＮＡを発現する組換え宿主細胞にも関する。本発明はＩＰレセプター活性を調節する物質のスクリーニング方法にも関する。本発明のＤＮＡはＩＰ産生細胞から単離される。本明細書中に使用するＩＰとは、プロスタグランジン分子と特異的に結合できるＧタンパク質結合レセプターを意味する。
　ＩＰを産生することができる哺乳動物細胞の非限定的な例としては、小腸、大腸、腎臓、胃、血管平滑筋、眼、胎盤、子宮、胸腺及び血小板から得られる細胞が挙げられる。ＩＰを産生する形質転換哺乳動物細胞系の非限定的な例としては肥満細胞腫Ｐ−８１５細胞が挙げられる。本発明に好適な細胞としては正常ヒト腎臓及び血小板が挙げられ、最適細胞はヒト肺細胞である。
　ＩＰ　ｃＤＮＡを単離するために使用するのに適した他の細胞及び細胞系もある。適切な細胞の選択は、細胞表面上のＩＰのスクリーニングにより実施することができる。ＩＰ活性の検出方法は当業者に周知であり、レセプターに特異的な放射性標識リガンドの結合を測定する。このアッセイでＩｐ活性をもつ細胞がＩＰ　ｃＤＮＡの単離に適切であり得る。
　種々の手順の任意のものを使用してＩＰ　ｃＤＮＡをクローニングすることができる。これらの方法の非限定的な例としては、適当な発現ベクター系でＩＰを含むｃＤＮＡライブラリーを構築後にＩＰ　ｃＤＮＡを直接機能的に発現させる方法がある。また、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクター中で構築したＩＰを含むｃＤＮＡライブラリーをＩＰタンパク質のアミノ酸配列から設計した標識オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングする方法もある。好適方法は、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクター中で構築したＩＰを含むｃＤＮＡライブラリーを、ＩＰタンパク質をコードする部分ｃＤＮＡでスクリーニングする方法である。この部分ｃＤＮＡは、プロスタグランジンＩＰレセプターに関連する他のＧタンパク質結合レセプターに公知のアミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計することにより、ＩＰ　ＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅により得られる。
　当業者に自明の通り、他の型のライブラリー及び他の細胞又は細胞種から構築したライブラリーもＩＰをコードするＤＮＡを単離するのに有用であり得る。他の型のライブラリーの非限定的な例としては、他の細胞又は細胞系から得られるｃＤＮＡライブラリー及びゲノムＤＮＡライブラリーが挙げられる。
　当業者に自明の通り、ＩＰ活性をもつ細胞又は細胞系から適切なｃＤＮＡライブラリーを構築することもできる。ＩＰ　ｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーの構築に有用な細胞又は細胞系の選択は、まず最初に本発明で使用する公知の上記標識リガンド結合アッセイを用いて細胞に関連するＩＰ活性を測定することにより実施することができる。
　ｃＤＮＡライブラリーの構築は、当業者に周知の標準方法により実施することができる。周知のｃＤＮＡライブラリー構築方法は例えばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９８２）に記載されている。
　同じく当業者に自明の通り、適切なゲノムＤＮＡライブラリーからＩＰをコードするＤＮＡを単離することもできる。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当業者に周知の標準方法により実施することができる。周知のゲノムＤＮＡライブラリー構築方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出に記載されている。
　好適方法の１つによりＩＰ遺伝子をクローニングするためには、ＩＰ又は同族タンパク質のアミノ酸配列又はＤＮＡ配列が必要である。このためには、ＩＰタンパク質又は同族タンパク質を精製し、自動配列分析装置により部分アミノ酸配列を決定することができる。完全アミノ酸配列を決定する必要はなく、６〜８アミノ酸の２つの領域の直線配列を決定し、部分ＩＰ　ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅すればよい。
　適切なアミノ酸配列が同定されたら、この配列をコードすることが可能なＤＮＡ配列を合成する。遺伝コードは縮重であるので、２個以上のコドンを使用して特定アミノ酸をコードすることができ、従って、類似ＤＮＡオリゴヌクレオチドの集合のうちの任意のものによってアミノ酸配列をコードすることができる。集合のうちの１個のみがＩＰ配列と同一であるが、その他のオリゴヌクレオチドは不適合をもつＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でもＩＰ　ＤＮＡとハイブリダイズすることができよう。不適合ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＩＰをコードするＤＮＡを同定及び単離できるように依然として十分にＩＰ　ＤＮＡとハイブリダイズすることができる。
　好適方法を使用し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法とｃＤＮＡライブラリースクリーニングを利用する２段階アプローチでＩＰをコードするｃＤＮＡクローンを単離する。第１段階では、精製ＩＰ又は同族タンパク質からのＮＨ２末端及び内部アミノ酸配列情報を用いてＩＰ特異的ＤＮＡフラグメントの増幅用縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。第２段階では、これらのフラグメントをクローニングし、ｃＤＮＡライブラリーから完全長ｃＤＮＡを単離するためのプライマーとして用いる。　ＩＰをコードするｃＤＮＡの配列を図３に示し、クローン１１／６ｈＬＸＲ３と命名した。クローン化ｃＤＮＡからのＩＰの推定アミノ酸配列を図４に示す。決定したｃＤＮＡ配列を調べると、３８６アミノ酸タンパク質をコードする単一の大きい開放読み枠の存在が明らかである。
　上記方法により得られたクローン化ＩＰ　ｃＤＮＡは、適切なプロモーターと他の適当な転写調節エレメントを含む発現ベクターへの分子クローニングにより組換えによって発現させることができ、原核又は真核宿主細胞にトランスフェクトし、組換えＩＰを製造することができる。この操作方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓらの上記文献に記載されており、当業者に周知である。
　発現ベクターは本明細書ではクローン化ＤＮＡの転写及び適当な宿主におけるそのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列として定義される。このようなベクターは細菌、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞などの種々の宿主で真核ＤＮＡを発現させるために使用することができる。
　特別に設計したベクターは、細菌−酵母又は細菌−動物細胞などの宿主間でＤＮＡのシャトリングが可能である。適切に構築した発現ベクターは、宿主細胞中の自律複製のための複製起点、選択可能なマーカー、制限された数の有用な制限酵素部位、高コピー数の可能性及び活性プロモーターを含むべきである。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡと結合させてＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列として定義される。強力なプロモーターはｍＲＮＡを高頻度で開始させるプロモーターである。発現ベクターの非限定的な例としては、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計したプラスミド又はウイルスが挙げられる。
　種々の哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞で組換えＩＰを発現させることができる。組換えＩＰ発現に適切であり得る市販の哺乳動物発現ベクターの非限定的な例としては、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）、１ＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）及びワクチニアウイルストランスファーベクターｐＴＭ１が挙げられる。
　ＩＰをコードするＤＮＡを発現ベクターにクローニングして宿主細胞で発現させることもできる。宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよく、非限定的な例を挙げると、細菌、酵母、哺乳動物細胞（非限定的な例としてヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類類動物に由来する細胞）、及び昆虫細胞（非限定的な例としてＳｆ９及びショウジョウバエに由来する細胞系）などである。哺乳動物種に由来する適切であり得る市販細胞系の非限定的な例は、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２）、Ｃ１２７１（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１７１）である。
　発現ベクターは、非限定的な例として形質転換、トランスフェクション、感染、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションなどの多数の方法のいずれかを用いて宿主細胞に導入することができる。発現ベクターを含む細胞を個々に分析し、ＩＰタンパク質を産生するか否かを判定する。ＩＰ発現細胞の同定は、非限定的な例として抗ＩＰ抗体との免疫反応性や、宿主細胞関連ＩＰ活性の存在など数種の手段により実施することができる。
　
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
　最適レベルのレセプター活性及び／又はＩＰタンパク質をもたらすＩＰ　ｃＤＮＡ配列を決定するためには、非限定的な例としてＩＰ　ｃＤＮＡの完全長開放読み枠や、レセプタータンパク質の特定ドメイン又はタンパク質の再配置ドメインのみをコードするｃＤＮＡの部分を含む種々の構築物などのＩＰ　ｃＤＮＡ分子を構築することができる。全構築物は、ＩＰ　ｃＤＮＡの５’及び／又は３’非翻訳領域を全く含まないように設計することもできるし、全部又は一部を含むように設計することもできる。これらの構築物を単独及び組み合わせて適当な宿主細胞に導入後にＩＰ活性及びタンパク質発現レベルを決定することができる。トランジェントアッセイで最適発現をもたらすＩＰ　ｃＤＮＡカセットを決定後、このＩＰ　ｃＤＮＡ構築物を非限定的な例として哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、大腸菌及び酵母細胞などの種々の発現ベクター（組換えウイルスを含む）に移す。
　以下の方法により哺乳動物細胞トランスフェクト細胞のＩＰレセプター活性レベルとＩＰタンパク質濃度をアッセイする。ＩＰレセプター活性を調べるには、標識リガンドを細胞に直接導入し、リガンドとＩＰ発現細胞との特異的結合量を測定する。レセプター活性の結合アッセイは当業者に公知である（Ｆｒｅｙら，１９９３，　Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　
２４４
２５０）。
　宿主細胞中のＩＰタンパク質の濃度は、非限定的な例としてイムノアフィニティー及び／又はリガンドアフィニティー法などの種々の方法により定量する。ＩＰ特異的アフィニティービーズ又はＩＰ特異抗体を用いて３５Ｓ−メチオニンで標識したＩＰタンパク質又は非標識ＩＰタンパク質を単離する。標識ＩＰタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。非標識ＩＰタンパク質はＩＰ特異抗体を用いるウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡアッセイにより検出する。
　宿主細胞でＩＰの発現後、ＩＰタンパク質を回収し、ＩＰ特異的リガンドと結合することが可能な活性形態のＩＰを提供する。数種のＩＰ精製法が使用可能であり、使用に適している。非限定的な例として洗剤可溶化、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水的相互作用クロマトグラフィーなどの標準分離法を種々に組み合わせるか又は個々に使用することにより細胞膜から組換えＩＰを精製することができる。
　更に、完全長新生短鎖ＩＰ又はＩＰのポリペプチドフラグメントに特異的なモノクローナル又はボリクローナル抗体から作成したイムノアフィニティーカラムを用いることにより他の細胞タンパク質から組換えＩＰを分離することもできる。
　ＩＰに対する単一特異抗体はＩＰに対して反応性の抗体を含む哺乳動物抗血清から精製するか、又はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｎａｔｕｒｅ　
２５６
　最初の免疫前に免疫前血清を採取する。許容可能な免疫アジュバントに組み合わせた約０．１μｇ〜約１０００μｇのＩＰ又はＩＰ関連ペプチドを各動物に投与する。このような許容可能なアジュバントの非限定的な例としてはフロイント完全、フロイント不完全、ミョウバン沈降物、
Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍ
　近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃをＩＰ又はＩＰ関連ペプチドで免疫することにより、ＩＰ又はＩＰタンパク質の配列から誘導されるペプチドに対して反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生させる。上述のように等量の許容可能なアジュバントに緩衝液又は塩類溶液約０．５ｍｌを加えた中にＩＰ又はＩＰ関連ペプチド約１μｇ〜約１００μｇ、好ましくは約１０μｇを加え、ＩＰ又はＳＣ経路でマウスを免疫する。フロイント完全アジュバントが好適である。マウスを０日目に初期免疫し、約３〜約３０週間安静にする。免疫したマウスをリン酸緩衝塩類溶液などの緩衝溶液中のＩＰ約１〜約１００μｇを静脈内（ＩＶ）経路で１回以上ブースター免疫する。当業者に公知の標準手順により免疫マウスから脾臓を取り出すことにより、抗体陽性マウスからのリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を得る。安定なハイブリドーマを形成できるような条件下で脾臓リンパ球を適当な融合パートナー、好ましくはミエローマ細胞と混合することにより、ハイブリドーマ細胞を調製する。融合パートナーの非限定的な例としてはマウスミエローマＰ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１、ＭＰＣ−１１、Ｓ−１９４及びＳｐ２／０が挙げられ、Ｓｐ２／０が好適である。抗体産生細胞とミエローマ細胞を濃度約３０％〜約５０％、分子量約１０００のポリエチレングリコール中で融合する。融合したハイブリドーマ細胞を当業者に公知の手順によりヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを補充したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で成長させることにより選択する。約１４、１８及び２１日目に成長陽性ウェルから上清液を集め、抗原としてＩＰ又はＩＰ関連ペプチドを用いる固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）などのイムノアッセイにより抗体産生に関してスクリーニングする。培養液を更にオクタロニー沈降アッセイで試験し、ｍＡｂのインタイプを決定する。Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ｋｒｕｓｅ　ａｎｄ　Ｐａｔｅｒｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９７３に所収のＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｓｏｆｔ　Ａｇａｒ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓの軟寒天法などの方法により抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞をクローニングする。　マウス１匹当たり約０．５ｍｌのプリスタインでプライミングしたＢａｌｂ／ｃマウスにプライミングから約４日後に約２×１０６〜約６×１０６個のハイブリドーマ細胞を注入することにより、モノクローナル抗体を
ｉｎ　ｖｉｖｏ
　約２％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中でハイブリドーマを成長させて抗ＩＰｍＡｂ
をｉｎ　ｖｉｔｒｏ
　非限定的な例として沈降、受動凝集、酵素によるイムノソルベント抗体（ＥＬＩＳＡ）法及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法などの種々の血清又は免疫アッセイにより腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価を測定する。同様のアッセイを用いて体液又は組織及び細胞抽出物中のＩＰの存在を検出する。
　当業者に自明の通り、単一特異抗体の上記製造方法を利用してＩＰポリペプチドフラグメント又は完全長ＩＰポリペプチドに特異的な抗体を製造することができる。
　抗体がアガロースゲルビーズ担体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドェステルで予備活性化したゲル担体であるＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に抗体を加えることによりＩＰ抗体アフィニティーカラムを作成する。次にスペーサーアームとのアミド結合を介して抗体をゲルと結合する。その後、残留する活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で失活させる。カラムを水、次いで０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄し、非結合抗体又は外来タンパク質を除去する。次にカラムをリン酸緩衝塩類溶液（ｐＨ７．３）と洗剤などの適当な膜可溶化剤で平衡化し、ＩＰ又はＩＰフラグメントを含む細胞培養上清又は細胞抽出物をカラムにゆっくりと通す。次に、光学密度（Ａ２８０）がバヅクグラウンドに低下するまでリン酸緩衝塩類溶液と洗剤などの適当な膜可溶化剤でカラムを洗浄した後、０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）と洗剤などの適当な膜可溶化剤でタンパク質を溶離する。次に、精製ＩＰタンパク質をリン酸緩衝塩類溶液と洗剤などの適当な膜可溶化剤で透析する。
　本発明のプロスタグランジンレセプターをコードするＤＮＡの単離に適した１方法では、他のＧタンパク質結合レセプターから得られるアミノ酸及び／又はＤＮＡ配列情報を使用する。他のプロスタグランジンレセプターでＧタンパク質に結合することが知られているものがあるので、トランスメンブラン及び／又は細胞質ドメインなどの所定の領域又はドメインは新規レセプターの単離用プローブを製造するために十分な程度の相同をもつと予想される。
　プロスタグランジンとロイコトリエンはＧタンパク質
結合レセプターを介してそのシグナルを変換することが知られている。種々の組織中に存在するＰＧＨ２／トロンボキサンＡ２、ＰＧＩ２、ＰＧＥ２、ＰＧＤ２、ＰＧＦ２α、ＬＴＢ４及びＬＴＤ４につき、別々のレセプターが報告されている。これらのレセプターには可溶化され、部分的に精製されているものもあり（Ｄｕｔｔａ−Ｒｏｙ，Ａ．Ｋ．ら，（１９８７）ＪＢＣ，
２６２
２６５
２６４
　これらのレセプターが一次構造に関係していると仮定して相同スクリーニングによる他のエイコサノイドレセプターの単離アプローチがとられた（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｙ．ら，（１９９２），ＪＢＣ，
２６７
　公表されているマウスＥＰ２レセプターアミノ酸配列のトランスメンブランドメインＶＩＩ中の９アミノ酸長に基づくアンチセンス１６倍縮重２６量体オリゴヌクレオチドを用いて、ヒト肺ライブラリーをスクリーニングし、ヒトＩＰｃＤＮＡクローンを単離した。このような２個のｃＤＮＡクローンから１個のクローンを構築した。この１．４１７ｋｂ　ｃＤＮＡクローンは３８６アミノ酸タンパク質をコードする。このタンパク質をＩＰレセプターと命名した。ＩＰレセプターは他の多くのＧタンパク質結合レセプターといくつかの共通な特徴をもつ。まず第１に、推定細胞外アミノ末端のＡｓｎ７に１個の潜在的Ｎ結合グリコシル化部位が存在する。第２に、細胞外ループ１及び２に保存システイン残基が存在する。Ｃ末端に潜在的タンパク質キナーゼリン酸化部位であるセリン残基が存在する。ＩＰレセプターはトランスメンブラン７の内側に公知の全エイコサノイドレセプターに存在する保存アルギニン（２７９位）をもつ。この領域はエイコサノイドレセプターのうちで最も高度に保存されている。
　本発明の新規プロスタグランジンレセブターは、レセプター活性を調節する化合物の選定用アッセイ手順で使用するのに適している。本明細書に記載する調節レセプター活性とは、レセプターの阻害又は活性化を含み、更にレセプター活性の正常調節を直接又は間接に操作することも含む。レセプター活性を調節する化合物は、アゴニスト、アンタゴニスト及びレセプター活性の調節を直接又は間接に操作する化合物を含む。
　本発明のプロスタグランジンレセプターは、レセプター調節剤を選定するアッセイ手順で使用するために天然又は組換え起源のどちらからも得られる。一般に、プロスタグランジンレセブター調節剤を選定するアッセイ手順は、本発明のプロスタグランジンレセプターと、プロスタグランジンレセブター調節活性を試験すべき化合物又はサンプルを含む。例えば天然又は組換えの如何に拘わらず精製レセプタータンパク質、天然又は組換えの如何に拘わらずレセプター産生細胞のサブ細胞フラクション及び／又は天然又は組換えの如何に拘わらずレセプターを発現する完全細胞で被験化合物又はサンプルを直接試験することができる。被験化合物又はサンプルは、公知標識又は非標識レセプターリガンドの存在下又は不在下でレセプターに加えることができる。被験化合物又はサンプルの調節活性は、例えば被験化合物又はサンプルがレセプターと結合する能力、レセプターを活性化させる能力、レセプター活性を阻害する能力、他の化合物とレセプターの結合を阻害又は強化する能力、レセプター調節を変更する能力、又は細胞内活性を調節する能力を分析することにより決定することができる。
　ＩＰレセプター活性調節剤の選定は、ＩＰレセプター活性に関連する疾患状態の治療に有用である。レセプターの活性を刺激又は阻害するには他の化合物も有用であり得る。非限定的な例として炎症、疼痛応答及び発熱を伴う浮腫などの疾患及び疾患状態の治療にはＩＰレセプターの選択的アゴニスト又はアンタゴニストも有用であり、これらの化合物は血小板凝集の阻止に有用であり、従って、血管疾患の治療や、外傷後の血液凝固、臓器移植やバイパス手術での拒否反応、充血性心不全、肺高血圧症、壊疽、レイノー病、骨吸収、ショック及び胃酸分泌の予防に有用であり得る。調節剤は細胞保護剤としても有用であり得る。ＩＰをコードするＤＮＡ分子の単離及び精製は、ＩＰレセプターの組織分布の確立、疾患状態におけるＩＰレセプター発現の変化の研究、ＩＰレセプター活性を調節する化合物の選定方法の確立にも有用であろう。
　以下の実施例は本発明を具体的に説明することを目的とし、本発明を限定するものではない。
　
実施例１
ＩＰ　ｃＤＮＡのクローニング
　マウスＥＰ２レセプターのトランスメンブランドメイン（ＴＭＤ）に存在し且つＴＰ、ＥＰ１、ＥＰ３及びＦＰレセプター内で高度に保存された９アミノ酸（ＮＰＩＬＤＰＷＩＹ）（配列番号２）に基づくアンチセンス１６倍縮重２６量体オリゴヌクレオチド（オリゴＥＰ２ｄ．ｏ．ＶＩＩ（−）と命名する）［５’−ＴＡ（Ａ，Ｇ）ＡＴＣＣＡＧＧＧ（Ａ，Ｇ）ＴＣ（Ｔ，Ｃ）ＡＧＧＡＴＧＧＧ（Ｇ，Ａ）ＴＴ−３’］（配列番号１）をＭｏｄｅｌ　３８０Ａ　ＤＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で合成した。３２Ｐで標識したオリゴＥＰ２ｄ．ｏ．ＶＩＩ（−）プローブを使用し、標準方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出）によりヒト肺、胸腺及び小腸λｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，　Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，　ＣＡ）をスクリーニングした。全３種のライブラリーからの陽性ファージクローンをプラーク精製し、プレート溶解物法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出）によりＤＮＡを調製した。ファージＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、得られたフラグメントをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターｐＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，　ＬａＪｏｌｌａ，　ＣＡ）にサブクローニングした。ＫＳ及びＳＫプライマー又は決定済みの配列から作成したプライマーと共にＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｂａｉｅｄ’Ｕｒｆｅ，　Ｃａｎａｄａ）製Ｔ７配列決定キットを使用した。特に肺ライブラリーからの２個のクローンλｈＬｃ．６及びλｈＬｃ．１１をＥｃｏＲＩで消化した処、それぞれサイズ１．３ｋｂ（ｈＬＸＲ３−６と命名、図１参照）及び１．５ｋｂ（ｈＬＸＲ３−１１と命名、図２参照）のインサートを含むことが判明した。フラグメントを両方の鎖で配列決定した処、ｃＤＮＡ　ｈＬＸＲ３−１１はｈＬＸＲ３−６よりも５’末端が７２ｂｐ、３’末端が５６ｂｐ長いことが判明した。ｈＬＸＲ３−１１はトランスメンブランドメイン（ＴＭＤ）ＶＩＩに２４ヌクレオチド反復を含み、８アミノ酸多いことも判明した。ｐＫＳ−ｈＬＸＲ３−１１をＳｍａＩ及びＮｃｏＩで消化し、０．４ｋｂフラグメントを精製した後、予めＥｃｏＲＶ及びＮｃｏＩで切断しておいたｐＫＳ−ｈＬＸＲ３−６に連結し、ｈＬＸＲ３−６の５’末端をｈＬＸＲ３−１１の５’末端に換え、ｐＫＳ−１１／６ｈＬＸＲ３とｈＩＰ　ｃＤＮＡ１１／６ｈＬＸＲ３（図３）を生成した。
　１１／６ｈＬＸＲ３（ｈＩＰ）のヌクレオチド配列を図３に示す。コード化タンパク質のアミノ酸配列を図４に示す。１．４１７ｋｂフラグメント（ＩＰ；図３）を配列決定した処、マウスＥＰ２、ヒトＥＰ１、ＥＰ３及びトロンボキサンレセプターｃＤＮＡとの配列相同を含むことが判明し、Ｇタンパク質結合レセプターに特徴的な推定７螺旋構造が明白であった。予想相対分子量４０，９６１をもつ３８６アミノ酸ポリペプチドをコードする長い開放読み枠（１１５８ｂｐ）が同定された。５’非翻訳配列の５６ｂｐと３’非翻訳配列の２０３ｂｐが存在する。
　
実施例２
ｐｃＤＮＡＩａｍ−１１／６ｈＬＸＲ３（ｈＩＰ）発現ベクターの構築
　１１／６ｈＬＸＲ３をｐｃＤＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　ＳａｎＤｉｅｇｏ，　ＣＡ）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。適正な方向であることをＳｐｈＩ消化により確認した。
　
実施例３
大腸菌発現ベクターへのＩＰ　ｃＤＮＡのクローニング
　非限定的な例としてｐＥＴ系（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの大腸菌発現ベクターにＩＰ発現カセットを移入して、大腸菌で組換えＩＰを製造した。このｐＥＴベクターは厳密に調節されたバクテリオファージＴ７プロモーターの制御下でＩＰを発現する。誘導ｌａｃプロモーターにより誘導されるＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含む大腸菌宿主にこの構築物を移入後、適当なｌａｃ基質（ＩＰＴＧ）を培養物に加えるとＩＰの発現が誘発される。ＩＰの発現レベルを上記アッセイにより測定する。
　ＩＰの完全開放読み枠をコードするｃＤＮＡをｐＥＴ１１ａのＮｄｅＩ部位に挿入する。正方向の構築物を配列分析により同定し、発現宿主株ＢＬ２１を形質転換するために用いる。次に形質転換細胞を使用して培養物に接種し、ＩＰタンパク質を製造する。当業者に公知の組成を有するＭ９又はＺＢ培地で培養物を増殖できる。約ＯＤ６００＝１．５まで増殖後、３７℃で３時間１ｍＭ　ＩＰＴＧでＩＰの発現を誘発する。これらの細胞からの膜フラクションにはＩＰレセプター結合活性が検出されよう。
　
実施例４
ツメガエル卵母細胞微量注入による合成ＩＰ　ｍＲＮＡのｉｎ　ｖｉｖｏ翻訳及び哺乳動物細胞における発現
　ＩＰ　ｃＤＮＡ構築物を
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
　バクテリオファージプロモーターを含むプラスミドベクターにＩＰ　ｍＲＮＡをコードする２本鎖ＤＮＡをクローニングし、ＩＰをコードするクローン化ＤＮＡを含むプラスミドベクターを直鎖化し、プラスミドベクター上のバクテリオファージプロモーターを特異的に認識するバクテリオファージからのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてクローン化ＤＮＡを
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
　バクテリオファージプロモーターを含むベクター上でＩＰ　ＤＮＡのクローニングに好都合且つ適切な使用可能な制限エンドヌクレアーゼクローニング部位の１個以上を用いて、ＩＰをコードする２本鎖ＤＮＡをこのベクターに適正な方向にクローニングする。ＩＰ　ＤＮＡを連結したベクターを使用して細菌を形質転換させ、適正な方向にＩＰ　ＤＮＡを含むベクターがクローン単離物に存在するか否かを分析する。
　ＩＰをコードするＤＮＡを適正な方向に含むベクターが同定及び単離されたら、ＩＰ転写単位を破壊することなくその下流の部位で制限エンドヌクレアーゼで切断して直鎖化する。直鎖化したプラスミドを単離及び精製し、ＩＰ　ｍＲＮＡの
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
　次に、ＩＰ　ｍＲＮＡを形成するＤＮＡ鋳型の転写を可能にする反応混合物中で鋳型ＤＮＡをバクテリオファージ特異的ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと混合する。数種のバクテリオファージ特異的ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが入手可能であり、非限定的な例としてはＴ３、Ｔ７及びＳＰ６　ＲＮＡポリメラーゼを挙げることができる。次に合成ＩＰ　ｍＲＮＡを単離及び精製する。
　ｍＲＮＡ安定性を改善するために５’末端キャップ構造と３’ポリＡテールを含むｍＲＮＡを合成すると有利であり得る。単に７−メチルグアノシンをＤＮＡ鋳型と共に反応混合物に加えるだけでｍＲＮＡの５’末端にキャップ構造即ち７−メチルグアノシンを加えることができる。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはｍＲＮＡを合成するにつれて５’末端にキャップ構造を形成する。ポリＡテールは多くのｃＤＮＡに天然に存在することが知られているが、単にポリＡテールをコードするＤＮＡ配列をＤＮＡ鋳型の３’末端に挿入するだけでｍＲＮＡの３’末端に加えることができる。
　単離及び精製したＩＰ　ｍＲＮＡを翻訳するには、非限定的な例としてウサギ網状赤血球溶解物及びコムギ麦芽エキス（いずれもＰｒｏｍｅｇａとＮｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒから市販されている）などの無細胞系や、非限定的な例としてツメガエル卵母細胞への微量注入などのような細胞に基づく系を利用し、ツメガエル卵母細胞への微量注入が好適である。
　ＩＰタンパク質を製造するために十分な量の合成ＩＰ　ｍＲＮＡをツメガエル卵母細胞に微量注入する。微量注入した卵母細胞をインキュベートしてＩＰ　ｍＲＮＡを翻訳し、ＩＰタンパク質を形成する。
　これらの合成ｍＲＮＡは標準手順［Ｇｕｒｄｏｎ，Ｊ．Ｂ．とＷｉｃｋｅｎｓ，Ｍ．Ｄ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．１０１：３７０−３８６，（１９８３）］によりツメガエル卵母細胞（５〜６期）に注入する。卵母細胞細胞を下記のように回収し、ＩＰ発現を分析する。
　
実施例５
ツメガエル卵母細胞におけるｐｃＤＮＡＩａｍｐ−ＩＰ発現
　標準外科手順（Ｃｏｌｍａｎ，Ａ．，　１９８４：　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　−　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）を使用して
Ｘｅｎｏｕｓ　ｌａｅｖｉｓ
　１〜１００ｎＭイロプロストアゴニストの潅流の結果、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ−ＩＰ＋ｐｃＤＮＡＩａｍｐ−ＣＦＴＲを注入した卵母細胞に顕著な電流応答が生じ、このクローンはｃＡＭＰシグナリング経路に関連する機能ＩＰレセプターをコードすることが確認された（図５Ａ）。ＩＰレセプターに予想されるような１００ｎＭ　ＰＧＤ２又はＰＧＥ２に対する応答は検出することができなかった。この力価の順位はＩＰレセプターについて報告されている順位に一致する［Ｃｏｌｅｍａｎら，１９９０．　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｈａｎｓｃｈ，Ｃ．，　Ｓａｍｍｅｓ，Ｐ．Ｇ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｂ．，及びＥｍｍｅｔｔ，Ｊ．Ｃ．編）Ｖｏｌ．３，ｐｐ．６４３−７１４，　Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｐｒｅｓｓ，　Ｏｘｆｏｒｄ］。対照（ＣＦＴＲ単独注入）卵母細胞では、ＩＢＭＸの効果により示されるような高いＣＦＴＲ発現レベル（図５Ｂ）にも拘わらず、イロプロスト、ＰＧＥ２及びＰＧＤ２に対する応答は観察されなかった。
　
実施例６
哺乳動物発現ベクターへのＩＰ　ｃＤＮＡのクローニング
　強力な汎用哺乳動物プロモーターを含むベクターであるｐＢＣ１２ＢＩ［Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．Ｒ．　Ｍｏｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１５２：６８４−７０４，１９８８］及びｐＥＥ１２（ＣｅｌｌＴｅｃｈ　ＥＰ　０３３８８４１）とその誘導体ｐＳＺ９０１６−１及びｐ９０１９の適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に、ＩＰ　ｃＤＮＡ発現カセットを連結する。ｐ９０１９は、ＳＶ４０初期プロモーターにより誘導されるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｍＤＨＦＲ）（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ，Ｃ．Ｃ．とＬｅｖｉｎｓｏｎ，Ａ．Ｄ．　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８０：２４９５−２４９９［１９８３］）の突然変異遺伝子から構成される選択可能なマーカー／増幅系を用いてｈＣＭＶＩＥプロモーター、ポリリンカー及びＳＶ４０ポリＡ部分を含む哺乳動物発現ベクターを構築したものである。ｐＤ５（ＢｅｒｋｅｒとＳｈａｒｐ，　Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．　１３：８４１−８５７［１９８５］）を鋳型として使用してプライマー１３９７８−１２０及び１３９７７８−１２１により定義されるＰＣＲ反応によりＳＶ４０ポリアデニル化配列を生成する。得られた０．２５Ｋｂ　ＰＣＲ産物をＣｌａＩ及びＳｐｅＩで消化し、同様に消化しておいたｐＥＥ１２の６．７Ｋｂフラグメントに連結する。得られたプラスミドをＢｇｌＩＩ及びＳｆｉＩで消化し、ＳＶ４０初期プロモーターの３’部分とＧＳｃＤＮＡをベクターから遊離させる。プラスミドｐＦＲ４００（Ｓｉｍｏｎｓｅｎら，前出）から単離した０．７３Ｋｂ　ＳｆｉＩ−ＸｈｏＩＩフラグメントを上記５．６Ｋｂベクターに連結し、ＳＶ４０初期プロモーターを再構成し、ｍＤＨＦＲ遺伝子を挿入する。このプラスミドをｐ９０１９と呼ぶ。ｐＳＺ９０１６−１はｈｕＣＭＶＩＥプロモーターをＨＩＶ　ＬＴＲに置換した以外はｐ９０１９と同一である。このベクターはｐ９０１９をＸｂａＩ及びＭｌｕＩで消化してｈｕＣＭＶＩＥプロモーターを除去することにより構築される。産物の末端の５’側にＭｌｕＩ及びＳｐｅＩ制限部位を加え、３’側にＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ部位を加えるオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、（ＨＩＶ−１　ＬＴＲ（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｃｅｌｌ　４６：９７３［１９８６］）の部分を含むベクターｐＣＤ２３に存在するような）残基−１１７〜＋８０からのＨＩＶ　ＬＴＲプロモーターをプラスミドｐＣＤ２３からＰＣＲ増幅する。得られた０．２ｋｂ　ＰＣＲ産物を酵素ＭｌｕＩ及びＸｂａＩで消化後、フラグメントをアガロースゲル精製し、４．３Ｋｂ無プロモーターＤＮＡフラグメントに連結すると、ベクターｐＳＺ９０１６−１が得られる。
　プロモーターに関して正方向にＩＰ　ｃＤＮＡを含むカセットをプロモーターの適当な制限部位３’に連結し、制限部位マッピング及び／又は配列決定により同定する。非限定的な例としてエレクトロボレーション又は化学的手順（カチオンリボソーム、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム）などの標準方法により、非限定的な例としてＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５１）、ＣＶ−１［Ｓａｃｋｅｖｉｔｚら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　
２３８
　哺乳動物トランジェント発現に用いる全ベクターは、ＩＰを発現する安定な細胞系を確立するために使用することができる。発現ベクターにクローニングした非改変ＩＰ　ｃＤＮＡ構築物は、細胞内ＩＰタンパク質を産生するように宿主細胞をプログラムすると予想されよう。トランスフェクション宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＶ−１［Ｓａｃｋｅｖｉｔｚら，前出］、ｔｋ−Ｌ［ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ　１１：２２３（１９７７）］、ＮＳ／０及びｄＨＦＲ−ＣＨＯ　［ＫａｕｆｍａｎとＳｈａｒｐ，　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
　１５９
　非限定的な例としてＧ４１８、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ｐＬＮＣＸ［Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．とＲｏｓｍａｎ　Ｇ．Ｊ．　ＢｉｏｔｅｃｈＮｅｗｓ　７：９８０−９９０（１９８９）］；ヒグロマイシン、ヒグロマイシンーＢホスホトランスフェラーゼ、ｐＬＧ９０［Ｇｒｉｔｚ，Ｌ．とＤａｖｉｅｓ，Ｊ．，　ＧＥＮＥ　２５：　１７９（１９８３）］；ＡＰＲＴ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ｐＭＡＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）［Ｍｕｒｒａｙら，　Ｇｅｎｅ　３１：２３３（１９８４）］などの薬剤選択プラスミドとＩＰ　ｃＤＮＡを含む任意のベクターの同時トランスフェクションにより、安定にトランスフェクトされるクローンを選択できよう。ＩＰのレベルは上記アッセイにより定量される。
　可能な限り最高レベルのＩＰを合成する哺乳動物細胞クローンを製造するために増幅可能な薬剤耐性マーカーを含むベクターにＩＰ　ｃＤＮＡ構築物を連結する。これらの構築物を細胞に導入後、プラスミドを含むクローンを適当な試薬で選択し、該物質の添加量を選択的に増加することによりプラスミドのコピー数の高い過剰発現クローンを単離することができる。利用する方法としては、突然変異ＤＨＦＲ遺伝子［Ｓｉｍｏｎｓｏｎら，前出］を含む９０１６又は９０１９プラスミドをＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、メトトレキセート中で選択する方法や、グルタミンシンチターゼを含むｐＥＥ１２プラスミドをＮＳ／Ｏ細胞にトランスフェクトし、メチオニンスルホキシイミン中で選択する方法（ＣｅｌｌＴｅｃｈ国際特許出願２０８９／１０４０４）や、チミジンキナーゼ遺伝子［ＣｏｌｂｅｒｅとＧａｒｏｐｉｎ，Ｆ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　７６：　３７５５（１９７９）］を含むｐＤＬＡＴ−３と９０１６又は他のＣＭＶプロモーターベクターをＡＰＲＴ及びＴＫ欠失Ｌ細胞に同時トランスフェクトし、ＡＰＲＴ（０．０５ｍＭアザセリン、０．１ｍＭアデニン、４μｇ／ｍｌアデノシン）中で選択し、ＨＡＴ（１００μＭヒボキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン）で増幅する方法などがある。
　
実施例７
ＣＯＳ−Ｍ６細胞におけるＩＰレセプターの発現及び
［３Ｈ］イロフロスト結合アッセイ
　最近クローニングされたヒトブロスタグランジンＩ２（ＩＰ）レセプターをｐｃＤＮＡｌａｍｐプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、ＤＥＡＥ−デキストラン法を用いてＣＯＳ−Ｍ６細胞にトランスフェクトした。細胞を７２時間培養保存した後、回収し、窒素キャビテーションによる細胞の溶解後に分画遠心（１０００×ｇで１０分間、次いで１００，０００×ｇで３０分間）により膜を調製した。１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、４　ｎＭ［３Ｈ］イロプロスト及び１００，０００×ｇ膜フラクションからのタンパク質６０μｇを含有する１０ｍＭ　ＭＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ６．０）中で［３Ｈ］イロプロスト結合アッセイを行った。３０℃で４５分間インキュベーション後、洗浄用緩衝液（０．０１％ウシ血清アルブミンを含有する１０μＭ　ＭＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ６．０））に４℃で予備浸漬したＷｈａｔｍａｎ　ＧＦ／Ｂフィルターで迅速濾過し、結合放射性リガンドと遊離放射性リガンドを分離した。フィルターを洗浄用緩衝液約１６ｍｌで洗浄し、フィルターに結合している残留［３Ｈ］イロプロストを液体シンチレーション計数により定量した。２μＭイロプロストの存在下で決定した結合合計と非特異結合の差として特異結合を定義した。
　クローン化したヒトＩＰレセプターをＣＯＳ−Ｍ６細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞から調製した膜を用いて［３Ｈ］イロプロスト結合アッセイを実施した。最も有効な競合リガンドは代謝的に安定なプロスタサイクリン模擬体であるイロプロストであり、４．０±０．１４ｎＭのＩＣ５０値を示した。関連プロスタサイクリン類似体であるカルバサイクリンの力価は１００分の１でＩＣ５０値は４３１±７１ｎＭであった。ＰＧＥ２とＰＧＦ２αは競合リガンドとしての効力が著しく低く、ＩＣ５０値は約１０μＭであり、ＰＧＤ２とトロンボキサン類似体Ｕ４６６１９はｈＩＰレセプターとの［３Ｈ］イロプロスト特異結合に関する競合において濃度３０μＭでほぼ不活性であった。従って、ｈＩＰレセプターとのプロスタサイクリン及び関連合成類似体のアフィニティーの順位は、イロプロスト≫カルバサイクリン≫ＰＧＥ２＞ＰＧＦ２α＝ＰＧＤ２＝Ｕ４６６１９であった。この力価の順位は従来の薬理研究からＩＰレセプターに予想された通りであった。
　
実施例８
昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス発現ベクターへのＩＰ　ｃＤＮＡのクローニング
　Ｓｆ９系昆虫細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ＃１７１１）で高レベルのｃＤＮＡの発現をもたらすように、ＡｃＮＰＶウイルスのゲノムに由来するバキュロウイルスベクターを設計する。ＩＰ　ｃＤＮＡを発現する組換えバキュロウイルスを以下の標準方法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｍａｘｂａｃ　Ｍａｎｕａｌ）により製造する。ｐＡＣ３６０及びｐＢｌｕｅＢａｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む種々のバキュロウイルストランスファーベクターでポリヘドリンプロモーターの下流にＩＰ　ｃＤＮＡ構築物を連結する。バキュロウイルストランスファーベクターと直鎖化ＡｃＮＰＶゲノムＤＮＡ［Ｋｉｔｔｓ，Ｐ．Ａ．，　Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８：５６６７（１９９０）］をＳｆ９細胞に同時トランスフェクション後に、同種組換えにより組換えバキュロウイルスを生成する。感染細胞中の封入体の不在により組換えｐＡＣ３６０ウイルスを同定し（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．とＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．，　Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｅｘｐ．Ｓｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ．１５５５）、β−ガラクトシダーゼ発現に基づいて組換えｐＢｌｕｅＢａｃウイルスを同定する（Ｖｉａｌａｒｄら，１９９０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，
６４
　ＩＰの完全開放読み枠をコードするｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃＩＩのＢａｍＨＩ部位に挿入する。ボリヘドリンプロモーターに関して正方向の構築物を配列分析により同定し、これを用いて、直鎖ＡｃＮＰＶ野生型ＤＮＡの存在下でＳｆ９細胞をトランスフェクトする。
　真正な活性ＩＰは感染細胞の膜に結合していることが知られている。標準手順により感染細胞から膜調製物を調製する。
　
実施例９
酵母発現ベクターへのＩＰ　ｃＤＮＡのクローニング
　異種タンパク質の細胞内発現を生じるように設計した発現ベクターに最適ＩＰｃＤＮＡ構築物を挿入後に、酵母
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
　
実施例１０
組換えＩＰの精製
　組換えにより製造したＩＰは抗体アフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
　抗体がアガロースゲルビーズ担体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで予備活性化したゲル担体であるＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に抗ＩＰ抗体を加えることにより、ＩＰ抗体アフィニティーカラムを作成する。次にスペーサーアームとのアミド結合により抗体をゲルと結合する。次に１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で残留活性化エステルを失活する。カラムを水、次いで０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄し、非結合抗体又は外来タンパク質を除去する。次にリン酸緩衝塩類溶液（ｐＨ７．３）と洗剤などの適当な膜可溶化剤中でカラムを平衡化し、可溶化ＩＰを含む細胞培養上清又は細胞抽出物をカラムにゆっくりと通す。次に、光学密度（Ａ２８０）がバックグラウンドに低下するまでリン酸緩衝塩類溶液と洗剤でカラムを洗浄した後、タンパク質を０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）と洗剤で溶離する。次に精製ＩＰをリン酸緩衝塩類溶液と洗剤に対して透析する。
（５７）【特許請求の範囲】
１．配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子。
２．請求項１に記載のＤＮＡ分子を有する、組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現させるための発現ベクター。
３．請求項２に記載の発現ベクターを有する、組換えヒトプロスタグランジンＩＰレセプターを発現する宿主細胞。
４．組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）請求項３に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクションさせる段階と、
（ｂ）該発現ベクターからヒトブロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現できるような条件下で該宿主細胞を培養する段階とを含む前記方法。
５．配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含む、ヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子。
６．請求項５に記載のＤＭ分子を有する、組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現させるための発現ベクター。
７．請求項６に記載の発現ベクターを有する、組換えヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現する宿主細胞。
８．組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）請求項６に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクションさせる段階と、
（ｂ）該発現ベクターからヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現できるような条件下で該宿主細胞を培養する段階とを含む前記方法。
９．配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなる、ヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子。
１０．請求項９に記載のＤＮＡ分子を有する、組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現させるための発現ベクター。
１１．請求項１０に記載の発現ベクターを有する、組換えヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現する宿主細胞。
１２．組換え宿主細胞中でヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現させる方法であって、
（ａ）請求項１０に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクションさせる段階と、
（ｂ）該発現ベクターからヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を発現できるような条件下で該宿主細胞を培養する段階とを含む前記方法。
１３．配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み、他のヒトタンパク質を含まないヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質。
１４．組換え宿主細胞より得られる請求項１３に記載のヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質。
１５．ヒトプロスタグランジンレセプターＩＰをコードするＤＮＡ分子でトランスフォーメーションされたかまたはトランスフェクションされた組換え宿主細胞から得られる、請求項１３に記載のヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を含む膜調製物。
１６．配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる、他のヒトタンパク質を含まないヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質。
１７．組換え宿主細胞より得られる請求項１６に記載のヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質。
１８．ヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質をコードするＤＮＡ分子でトランスフォーメーションされたかまたはトランスフェクションされた組換え宿主細胞から得られる、請求項１６に記載のヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質を含む膜調製物。
１９．ヒトプロスタグランジンＩＰレセプタータンパク質活性を調節する化合物の選定方法であって、
（ａ）該化合物を配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む
組換え
（ｂ）該プロスタグランジンレセブターに及ぼす調節剤の作用を測定する段階とを含む前記方法。