(57)【要約】  癌の外科的な治療において、癌転移部位を術前または術中に検出し、癌の転移範囲をあらかじめ特定しつつ外科手術を行うこと。  癌の外科的治療に際し、患者の癌転移部位を検出する方法を提供する。すなわち、外科手術に先立って前記患者から癌組織の生検試料を採取するステップと、採取した試料を、前記癌において特異的に発現するタンパク質に対する１種または２種以上の抗体を用いてインビトロにて免疫染色するステップと、前記生検試料の癌細胞を染色しうる少なくとも１種の抗体を選択するステップと、前記選択された抗体を用いて前記患者を画像処理（イメージング）するステップと、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の外科的治療に際し、患者の癌転移部位を検出する方法であって、
外科手術に先立って前記患者から癌組織の生検試料を採取するステップと、
採取した試料を、前記癌において特異的に発現するタンパク質に対する１種または２種以上の抗体を用いてインビトロにて免疫染色するステップと、
前記生検試料の癌細胞を染色しうる少なくとも１種の抗体を選択するステップと、
前記選択された抗体を用いて前記患者を画像処理（イメージング）するステップと、
を含む癌転移部位の検出方法。
【請求項２】
前記抗体が、前記癌の原発腫瘍において発現し、かつ当該癌の転移可能な正常周辺組織細胞においては発現しないタンパク質に結合する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌が肝癌、胃癌、膵癌、食道癌、肺癌、腎癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌または大腸癌である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記インビトロにて免疫染色するステップにおいて、
ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ＹＨ−２０６、カドヘリンスーパーファミリー、ＣＡ１２５、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、シアリルＴｎ抗原、ＣＥＡ、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、Ｓｐａｎ−Ｉ、ＤＵＰＡＮ−２、ＳＬＸ、ＳＣＣ、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＡ１５−３、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＢＲＣＡ１、ＳＴＮ、ＧＡＴ、ＰＳＡ、γ−セミノプロテイン、ＭＵＣ１７、ＴＭ４ＳＦ２０、ＥＲＥＧ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＮＭＵＲ２、ＳＬＣ２８Ａ２、及びＰＴＰＲＲから選択される少なくとも１つのタンパク質に対する抗体を用いる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記癌が胃癌であり、前記インビトロにて免疫染色するステップにおいて、
カドヘリンスーパーファミリー、ＣＡ１２５、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、シアリルＴｎ抗原、ＣＥＡ、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９−９、ＭＵＣ１７、ＴＭ４ＳＦ２０、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＲＥＧ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＮＭＵＲ２、ＳＬＣ２８Ａ２、及びＰＴＰＲＲから選択される少なくとも１つのタンパク質に対する抗体を用いる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記癌が胃癌であり、前記インビトロにて免疫染色するステップにおいて、
ＣＤＨ１７、ＭＵＣ１７、ＴＭ４ＳＦ２０、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、及びＥＲＥＧに対する抗体を用いる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法により癌転移部位を検出すること、及び、外科手術により患者の原発腫瘍および前記抗体によって造影された周辺組織を切除することを含む癌の治療方法。
【請求項８】
特定の癌において特異的に発現する１または複数のタンパク質に対する抗体を含み、患者の生検試料における癌細胞をインビトロにて免疫染色するための免疫染色試薬と、
前記各抗体を含み、患者における癌細胞をインビボイメージングで検出するための造影試薬と、
を含む、術前または術中診断において癌転移部位を検出するためのキット。
【請求項９】
前記タンパク質が、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ＹＨ−２０６、カドヘリンスーパーファミリー、ＣＡ１２５、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、シアリルＴｎ抗原、ＣＥＡ、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、Ｓｐａｎ−Ｉ、ＤＵＰＡＮ−２、ＳＬＸ、ＳＣＣ、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＡ１５−３、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＢＲＣＡ１、ＳＴＮ、ＧＡＴ、ＰＳＡ、γ−セミノプロテイン、ＭＵＣ１７、ＴＭ４ＳＦ２０、ＥＲＥＧ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＮＭＵＲ２、ＳＬＣ２８Ａ２、及びＰＴＰＲＲからなる群より選択される請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
カドヘリンスーパーファミリー、ＣＡ１２５、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、シアリルＴｎ抗原、ＣＥＡ、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９−９、ＭＵＣ１７、ＴＭ４ＳＦ２０、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＲＥＧ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＮＭＵＲ２、ＳＬＣ２８Ａ２、及びＰＴＰＲＲから選択される少なくとも１つのタンパク質に対する抗体を含み、患者の生検試料における癌細胞をインビトロにて免疫染色するための免疫染色試薬と、
前記抗体を含み、患者における癌細胞をインビボイメージングで検出するための造影試薬と、
を含む、術前または術中診断において胃癌の転移部位を検出するためのキット。
【請求項１１】
ＣＤＨ１７、ＭＵＣ１７、ＴＭ４ＳＦ２０、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、及びＥＲＥＧに対する抗体を含み、患者の生検試料における癌細胞をインビトロにて免疫染色するための免疫染色試薬と、
前記抗体を含み、患者における癌細胞をインビボイメージングで検出するための造影試薬と、
を含む、術前または術中診断において胃癌の転移部位を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の転移部位を検出する方法、および当該方法との組み合わせによる癌の外科的治療方法に関する。より詳細には、患者の癌に対する１種または２種以上の抗体を用意し、これを用いてあらかじめ患者の癌抗原を特定し、外科手術を行う際に当該患者の癌抗原特異的な抗体によるイメージング（画像処理）を行いながら癌の転移範囲を特定しつつ外科手術を行う方法、並びに癌転移部位を検出するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌は、我が国で最も多い癌であり、その死亡率も肺癌に次いで２番目に高い悪性疾患である。胃癌の外科的手術では、内視鏡での早期癌の切除や、腹腔鏡での手術など侵襲の少ない治療方法が開発途上にはあるものの、現在も基本的に広範な切除が行われており、患者の苦労は大きい。現在の胃癌や食道癌の外科手術は長時間を要する場合もあるが、そのほとんどの時間は転移の可能性のあるリンパ節を除去するために費やされている。治療的切除をめざす場合にリンパ節転移の可能性があれば、広範な郭清は必須と考えられてきた。例えば、早期胃癌においては、リンパ節への転移比率は２０％程度であり、実際は転移していない８０％の患者にとっては、無用なリンパ節切除が行われていたことになる。また、広範な切除はリンパ節だけではない。粘膜内にとどまる胃癌はリンパ節転移がないと想定されるがゆえに、内視鏡的に胃癌を含む粘膜層のみ切除すれば根治が見込まれている。それと同様に、もしリンパ節郭清が必要でなければ、胃癌手術は原発腫瘍部分を除去できるような胃部分切除を行えば、広範な胃切除は必要ではない。しかし、リンパ節郭清を行うがゆえに、そのリンパ節が所属する血管やその血流支配を受ける領域まで手術的に処理する必要が生じ、胃亜全摘・胃全摘などの広範な胃切除が行われている。そしてこうして努力してリンパ節を郭清しても、ステージ２および３の胃癌手術症例の３０〜４０％には様々な形で再発が起こってしまう。【０００３】
乳癌においても、かつては乳房を全部取ってしまう単純切除術や、大胸筋まで切除するハルステッド手術がかなり行われてきた。しかし、ＱＯＬのあまりの低下と、こうして大きく切除しても転移がなくならない例も多いことから、近年ではリンパ節転移の正確な評価をめざすセンチネルリンパ節（病変部から最初にがん細胞が到達するリンパ節、センチネルとは見張り番という意味）生検などが日常的に行われ、正確なリンパ節転移の有無が評価されるようになってきた。【０００４】
癌がリンパ節に転移する場合は、ランダムに転移が生じることは無く、一定のパターンに従って、病変部からリンパ管を経て、リンパ節に転移する。癌の原発巣からリンパ管に入った癌細胞が最初に到達するリンパ節をセンチネルリンパ節（Sentinel Lymph Node）という。癌がリンパ節に転移している場合には、必ずセンチネルリンパ節に転移があると考えられる。
そのため、早期癌における癌切除手術中に、センチネルリンパ節を見つけ、生検し、迅速病理検査を行うことにより、リンパ節への転移の有無を見つけることができる。センチネルリンパ節に癌が転移していない場合には、残りのリンパ節の切除は不要となる。センチネルリンパ節に転移があると、転移状況に応じて、病変部周囲のリンパ節を郭清する。【０００５】
従来のセンチネルリンパ節の検出方法の一つとしては、青色蛍光色素インドシアニングリーンを用いた色素法が知られている。癌切除手術直前に青色蛍光色素を癌周囲に経皮的に、あるいは漿膜下層か内視鏡を用いて粘膜下層に局注する。注入された色素は、５分から１５分後には、センチネルリンパ節に達する。観察者は青色に染まったセンチネルリンパ節を目視により検出する。
しかしリンパ節は脂肪などの生体組織に覆われていることが多く、生体組織の剥離を行いながらセンチネルリンパ節を探す必要があり、検出に時間がかかる。また、その間に色素がセンチネルリンパ節の下流のリンパ節まで達してもしまうことがあり、その場合にはセンチネルリンパ節の検出が困難になるという問題があった。【０００６】
またラジオアイソトープをトレーサーとして使用したＲＩ法が開発され、実用化されつつある。ＲＩ法では手術前日にラジオアイソトープを癌の周囲に経皮的または内視鏡により局注する。注入されたラジオアイソトープは注入部位よりリンパ管に移行し、一定時間センチネルリンパ管に留まる。ラジオアイソトープ注入の数時間後に、リンファシンチグラフィーを行い、大まかな位置をマーキングし、癌の切除部手術の際に、その位置を切開し、ガンマプローブを用いて切開位置周辺のリンパ節から放射されるガンマ線量検出し、センチネルリンパ節として検出する。【０００７】
一方、近年、蛍光色素を用いた病変組織を検出する蛍光色素法が提案されている。例えば特許文献１にはシアニン系色素を生体に投与し、励起光を照射することにより病変部を検出する方法が開示されている。上記特許文献１に開示された蛍光色素法では、腫瘍親和性を示し、光により励起された時に蛍光を発する光感受性物質を蛍光診断薬としてあらかじめ生体に投与し、光感受性物質の励起波長帯域にある励起光を照射して病変部に集積した蛍光診断薬から蛍光を生じせしめ、この蛍光を受光することにより病変部の局在、浸潤範囲を検出している。またセンチネルリンパ節にも上記蛍光色素は蓄積され、検出可能であると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開ＷＯ９８／４８８４５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記の手法は、あくまでリンパ節転移がおこるとしたら最初に転移する可能性の高いリンパ節を描出しているに過ぎない。上述したように、最近ようやく術中に病変部に蛍光色素やＲＩを注入して、センチネルリンパ節がどこになるかの臨床研究が行われているが、この方法ではリンパ節をとった後で迅速に病理検査（術中迅速という。）を行って転移の有無を調べなくてはならない。すなわち、この方法では（１）脂肪に覆われたリンパ節を探して切除するのに時間を要する、（２）転移の有無の判定にはリンパ節の迅速病理検査（術中迅速）を要する、（３）センチネルリンパ節より遠隔のリンパ節について情報が得られない、（４）広範なリンパ節郭清を行うか行わないかの二者択一しか判定できない、などの欠点がある。
また、胃癌のようにリンパ流が複雑な臓器の癌においては、センチネルリンパ節を発見するのはさらに困難である。触診によって３ミリ程度の大きさの腫瘍は認識可能であるが、１ミリ程度のリンパ節転移を検出する技術が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、予め患者の癌組織の生検を行い、当該癌において特異的に発現するタンパク質に対する抗体を用いて生検試料の免疫染色を行えば、その患者の癌細胞を染色し得る抗体を特定することを通じて、その患者の癌細胞で特異的に発現しているタンパク質を特定できることを見出した。さらにその患者の癌細胞を染色し得る抗体を検出可能に標識して患者に投与することによって、転移部位を含めて癌細胞をイメージングできることを見出した。
また、特定の癌において特異的に発現するタンパク質（いわゆる腫瘍マーカー）は、患者によって発現の有無にばらつきがあることが知られるが、例えば胃癌においては、腫瘍マーカーを１０種類程度特定しておけば、そのうちのいずれかに対する抗体で、ほとんどの患者の癌細胞を検出できることを見出した。従って、当該１０種類程度の腫瘍マーカーに対する抗体を用意しておけば、術前又は術中にその患者において発現している腫瘍マーカーを免疫染色により迅速に特定し、当該腫瘍マーカーに対する抗体を利用して転移部位を含めた癌細胞をイメージングできる。
すなわち、本発明は、
〔１〕癌の外科的治療に際し、患者の癌転移部位を検出する方法であって、外科手術に先立って前記患者から癌組織の生検試料を採取するステップと、採取した試料を、前記癌において特異的に発現するタンパク質に対する１種または２種以上の抗体を用いてインビトロにて免疫染色するステップと、前記生検試料の癌細胞を染色しうる少なくとも１種の抗体を選択するステップと、前記選択された抗体を用いて前記患者を画像処理（イメージング）するステップと、を含む癌転移部位の検出方法；
〔２〕前記抗体が、前記癌の原発腫瘍において発現し、かつ当該癌の転移可能な正常周辺組織細胞においては発現しないタンパク質に結合する上記〔１〕に記載の方法；
〔３〕前記癌が肝癌、胃癌、膵癌、食道癌、肺癌、腎癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌または大腸癌である上記〔１〕または〔２〕に記載の方法；
〔４〕前記インビトロにて免疫染色するステップにおいて、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ＹＨ−２０６、カドヘリンスーパーファミリー、ＣＡ１２５、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、シアリルＴｎ抗原、ＣＥＡ、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、Ｓｐａｎ−Ｉ、ＤＵＰＡＮ−２、ＳＬＸ、ＳＣＣ、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＡ１５−３、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＢＲＣＡ１、ＳＴＮ、ＧＡＴ、ＰＳＡ、γ−セミノプロテイン、ＭＵＣ１７、ＴＭ４ＳＦ２０、ＥＲＥＧ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＮＭＵＲ２、ＳＬＣ２８Ａ２、及びＰＴＰＲＲから選択される少なくとも１つのタンパク質に対する抗体を用いる上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法；
〔５〕前記癌が胃癌であり、前記インビトロにて免疫染色するステップにおいて、カドヘリンスーパーファミリー、ＣＡ１２５、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、シアリルＴｎ抗原、ＣＥＡ、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９−９、ＭＵＣ１７、ＴＭ４ＳＦ２０、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＲＥＧ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＮＭＵＲ２、ＳＬＣ２８Ａ２、及びＰＴＰＲＲから選択される少なくとも１つのタンパク質に対する抗体を用いる上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法；
〔６〕前記癌が胃癌であり、前記インビトロにて免疫染色するステップにおいて、ＣＤＨ１７、ＭＵＣ１７、ＴＭ４ＳＦ２０、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、及びＥＲＥＧに対する抗体を用いる、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法；
〔７〕上記〔１〕〜〔６〕のいずれか記載の方法により癌転移部位を検出すること、及び、外科手術により患者の原発腫瘍および前記抗体によって造影された周辺組織を切除することを含む癌の治療方法；
〔８〕特定の癌において特異的に発現する１または複数のタンパク質に対する抗体を含み、患者の生検試料における癌細胞をインビトロにて免疫染色するための免疫染色試薬と、前記各抗体を含み、患者における癌細胞をインビボイメージングで検出するための造影試薬と、を含む、術前または術中診断において癌転移部位を検出するためのキット；
〔９〕前記タンパク質が、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ＹＨ−２０６、カドヘリンスーパーファミリー、ＣＡ１２５、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、シアリルＴｎ抗原、ＣＥＡ、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、Ｓｐａｎ−Ｉ、ＤＵＰＡＮ−２、ＳＬＸ、ＳＣＣ、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＡ１５−３、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＢＲＣＡ１、ＳＴＮ、ＧＡＴ、ＰＳＡ、γ−セミノプロテイン、ＭＵＣ１７、ＴＭ４ＳＦ２０、ＥＲＥＧ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＮＭＵＲ２、ＳＬＣ２８Ａ２、及びＰＴＰＲＲからなる群より選択される上記〔８〕に記載のキット；
〔１０〕カドヘリンスーパーファミリー、ＣＡ１２５、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、シアリルＴｎ抗原、ＣＥＡ、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９−９、ＭＵＣ１７、ＴＭ４ＳＦ２０、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＲＥＧ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＮＭＵＲ２、ＳＬＣ２８Ａ２、及びＰＴＰＲＲから選択される少なくとも１つのタンパク質に対する抗体を含み、患者の生検試料における癌細胞をインビトロにて免疫染色するための免疫染色試薬と、前記抗体を含み、患者における癌細胞をインビボイメージングで検出するための造影試薬と、を含む、術前または術中診断において胃癌の転移部位を検出するためのキット；及び
〔１１〕ＣＤＨ１７、ＭＵＣ１７、ＴＭ４ＳＦ２０、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、及びＥＲＥＧに対する抗体を含み、患者の生検試料における癌細胞をインビトロにて免疫染色するための免疫染色試薬と、前記抗体を含み、患者における癌細胞をインビボイメージングで検出するための造影試薬と、を含む、術前または術中診断において胃癌の転移部位を検出するためのキット、に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、リンパ流を利用せずに、癌細胞自体を特異的に検出することができるので、転移範囲を正確に知ることができ、無用なリンパ節の切除等を防いで患者の負担を軽減することができる。また、手術範囲が限定されるので、腹腔鏡などで手術を行うこともでき、患者に対する侵襲をさらに大幅に減らすことができる。手術の時間や費用を減少させることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、正常組織標本及び癌組織標本におけるＣＤＨ１７のＲＮＡ発現をマイクロアレイで解析した結果である。
【図２】図２は、正常組織標本及び癌組織標本におけるＧＵＣＹ２ＣのＲＮＡ発現をマイクロアレイで解析した結果である。
【図３】図３は、正常組織標本及び癌組織標本におけるＮＭＵＲ２のＲＮＡ発現をマイクロアレイで解析した結果である。
【図４】図４は、正常組織標本及び癌組織標本におけるＳＬＣ２８Ａ２のＲＮＡ発現をマイクロアレイで解析した結果である。
【図５】図５は、正常組織標本及び癌組織標本におけるＰＴＰＲＲのＲＮＡ発現をマイクロアレイで解析した結果である。
【図６】図６は、正常組織標本及び癌組織標本におけるＭＵＣ１７のＲＮＡ発現をマイクロアレイで解析した結果である。
【図７】図７は、正常組織標本及び癌組織標本におけるＴＭ４ＳＦ２０のＲＮＡ発現をマイクロアレイで解析した結果である。
【図８】図８は、正常組織標本及び癌組織標本におけるＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）のＲＮＡ発現をマイクロアレイで解析した結果である。
【図９】図９は、正常組織標本及び癌組織標本におけるＥＲＥＧのＲＮＡ発現をマイクロアレイで解析した結果である。
【図１０】図１０は、胃癌の原発腫瘍組織におけるＣＤＨ１７タンパク質発現を免疫染色で検出した結果である。
【図１１】図１１は、胃癌の原発腫瘍組織におけるＮＭＵＲ２タンパク質発現を免疫染色で検出した結果である。
【図１２】図１２は、胃癌の原発腫瘍組織におけるＳＬＣ２８Ａ２タンパク質発現を免疫染色で検出した結果である。
【図１３】図１３は、胃癌のリンパ節転移組織におけるＣＤＨ１７タンパク質発現を免疫染色で検出した結果である。
【図１４】図１４は、分化型胃癌の原発腫瘍及びリンパ節転移組織におけるＣＤＨ１７タンパク質の発現を、組織アレイを用いた免疫染色で検出した結果である。
【図１５】図１５は、胃癌の原発腫瘍及びリンパ節転移組織におけるＭＵＣ１７タンパク質及びＣＤＨ１７タンパク質の発現を、組織アレイを用いた免疫染色で検出した結果である。
【図１６】図１６は、胃癌の原発腫瘍及びリンパ節転移組織におけるＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）タンパク質の発現を、組織アレイを用いた免疫染色で検出した結果である。
【図１７】図１７は、胃癌の原発腫瘍組織におけるＴＭ４ＳＦ２０タンパク質の陽性例を、組織アレイを用いた免疫染色で検出した結果である。
【図１８】図１８は、胃癌の原発腫瘍組織におけるＴＭ４ＳＦ２０タンパク質の陰性例を、組織アレイを用いた免疫染色で検出した結果である。
【図１９】図１９は、胃癌のリンパ節転移組織におけるＴＭ４ＳＦ２０タンパク質の陽性例を、組織アレイを用いた免疫染色で検出した結果である。
【図２０】図２０は、胃癌におけるＥＲＥＧタンパク質の陽性例を、組織アレイを用いた免疫染色で検出した結果である。
【図２１】図２１は、胃癌におけるＥＲＥＧタンパク質の陽性例を、組織アレイを用いた免疫染色で検出した結果である。
【図２２】胃癌の生検サンプルにおけるＣＤＨ１７タンパク質の発現を、免疫染色によって検出した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［患者の癌転移部位の検出方法］
本明細書において引用されるすべての特許および参考文献は、本明細書においてその全体が参考として援用される。本発明は、癌の外科的治療に際し、患者の癌転移部位を検出する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、外科手術に先立って患者から癌組織の生検試料を採取するステップと、採取した試料を、前記癌において特異的に発現するタンパク質に対する１種または２種以上の抗体を用いてインビトロにて免疫染色するステップと、前記生検試料の癌細胞を染色しうる少なくとも１種の抗体を選択するステップと、前記選択された抗体を用いて前記患者を画像処理（イメージング）するステップと、を含む。
【００１４】
「患者」とは、動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトをいう。「患者」には成人および小児、並びに男性および女性を含む。
【００１５】
本発明の対象となる「癌」は、肝癌、胃癌、膵癌、食道癌、肺癌、腎癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌および大腸癌等を含むがこれらに限定されない。「転移」とは、癌細胞が原発病変とは違う場所に到達し、そこで再び増殖し、同一種類の癌を二次的に生じることをいう。癌が転移して新しい腫瘍が形成されると、それは二次癌あるいは転移癌と呼ばれ、転移した細胞は原発病変のものと同一種となる。これは、例えば乳癌が肺に転移した場合、二次癌は悪性の肺細胞ではなく、悪性の乳腺細胞によって形成されることを意味する。この肺の疾患は、肺癌ではなく転移性乳癌になる。
【００１６】
特定のがんは特定の臓器に転移するといった傾向もある。例えば、前立腺癌は通常骨に転移する。同様に、大腸癌は肝臓に転移する傾向がある。また女性の場合、胃癌はしばしば卵巣に転移する（Kruckenberg播種）。
【００１７】
「生検(biopsy)」とは、生きた患者の癌であることが疑わしい部分から組織を採ることをいい、メスや特殊な探索針等を用いて行われる。
【００１８】
本明細書において「抗体」とは、天然に存在するか、または正常免疫グロブリン遺伝子の組換えＤＮＡ技術によって産生される、全長の免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または抗体フラグメントのような免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分をいう。抗体という用語は、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全なヒト抗体を包含する。さらに、いずれのタイプ、クラス、サブクラスも含み、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２などが含まれる。これらの抗体は、慣用技術を用いて作製することができ、鳥類や哺乳動物に免疫して得られるポリクローなる抗体であっても、あるいはハイブリドーマ細胞株を用いて産生されるモノクローナル抗体のいずれであってもよい。抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体の一部分である。その構造にかかわらず、抗体フラグメントは無傷の抗体によって認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗ＣＥＡモノクローナル抗体フラグメントはＣＥＡのエピトープと結合する。
【００１９】
「抗体フラグメント」という用語は、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のようにふるまう合成または遺伝子組み換えタンパク質も含む。例えば、抗体フラグメントには、Ｌ鎖可変領域からなる単離フラグメント、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、並びに超可変領域に類似したアミノ酸残基からなる最小認識ユニットが含まれる。
【００２０】
キメラ抗体は、マウス抗体などの第１の種由来の可変ドメインおよび相補性決定領域を含む組換えタンパク質であり、抗体分子のＨ鎖およびＬ鎖定常領域はヒト抗体などの第２の種に由来する。
【００２１】
ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の相補性決定領域が、マウス免疫グロブリンなどの第１の種の免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖可変領域からヒトＨ鎖およびＬ鎖可変ドメイン中に移されている組換えタンパク質であり、抗体分子のＨ鎖およびＬ鎖定常領域はヒト抗体に由来する。ヒト化抗体はまたＣＤＲグラフト化抗体と呼ばれる。
【００２２】
好ましい実施形態において、本発明の方法に用いる抗体は、前記癌において特異的に発現するタンパク質に対する抗体である。
本明細書において、「癌において特異的に発現するタンパク質（以下、「マーカータンパク質」という場合もある。）」は、特定の癌においてのみ発現するか、あるいは発生の初期段階においてのみ発現するいわゆる癌抗原を含む。一方で、マーカータンパク質は、全身において癌の原発組織にしか発現しないタンパク質である必要はなく、当該癌の原発組織で発現し、且つ当該癌の転移可能な正常周辺組織細胞においては発現しないタンパク質であってもよい。すなわち、標的とする癌細胞の他に複数の正常臓器において発現するタンパク質であっても、当該癌細胞が転移しやすい周辺正常組織において発現していなければよい。本発明の方法は、外科手術の際に癌組織と周辺の正常組織を識別できれば十分であり、切除する組織から離間した臓器や組織で当該タンパク質が発現していても差支えないからである。
マーカータンパク質としては、例えば、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ＹＨ−２０６、カドヘリンスーパーファミリー、ＣＡ１２５、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、シアリルＴｎ抗原、ＣＥＡ、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、Ｓｐａｎ−Ｉ、ＤＵＰＡＮ−２、ＳＬＸ、ＳＣＣ、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＡ１５−３、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＢＲＣＡ１、ＳＴＮ、ＧＡＴ、ＰＳＡ、γ−セミノプロテイン、ＭＵＣ１７、ＴＭ４ＳＦ２０、ＥＲＥＧ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＮＭＵＲ２、ＳＬＣ２８Ａ２、及びＰＴＰＲＲが挙げられる。
【００２３】
上記マーカータンパク質のうちカドヘリン (Cadherin) は細胞表面に存在する糖タンパク質の一群で、細胞接着をつかさどり、動物の胚発生に重要な役割を果たす。典型的なカドヘリン（Ｅカドヘリン、Ｎカドヘリン、Ｐカドヘリンなど）は、接着結合の構築を通じて、細胞と細胞の接着の形成と維持に関わる。これらのカドヘリンは、その細胞外に５つのドメイン構造（ＥＣドメイン）を繰り返し、１つの膜貫通セグメントと細胞内ドメインを有する。ＥＣドメインをもつ分子は脊椎動物ゲノム中に１２０個ほど見いだされ、カドヘリンスーパーファミリーと呼ばれている。カドヘリンスーパーファミリーの中で、例えば、カドヘリン１(Cadherin1:CDH1)およびカドヘリン１７(Cadherin17:CDH17)は、大腸癌由来の癌細胞のリンパ節転移を検出するためのマーカーとなりうることが報告されている（特開２００７−１７５０２１号公報）。
【００２４】
また、胃癌の場合、マーカータンパク質としては、胃癌細胞において発現し、且つ正常なリンパ節で発現していないタンパク質が好ましく、小腸や大腸など胃から離間した臓器で発現しているタンパク質であってもよい。かかるタンパク質として、例えば、ＣＤＨ１７、ＭＵＣ１７、ＴＭ４ＳＦ２０、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＲＥＧ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＮＭＵＲ２、ＳＬＣ２８Ａ２、及びＰＴＰＲＲが挙げられる。
ＭＵＣ１７は、ムチンファミリーに属する４５２ｋＤａの巨大なタンパクである。Ｓｅｒ、Ｔｈｒに富む５９merからなるコンセンサス配列を６１回繰り返す構造を持ち、Ｏ型糖鎖による修飾を高度に受け生体防御に関わる。
ＴＭ４ＳＦ２０（transmembrane 4 L six family member 20）は、染色体2q36.3に遺伝子がコードされる、４回膜貫通型の膜タンパクである。その機能は不明である。
ＥＲＢＢ２は、ＨＥＲ２とも呼ばれ、細胞表面に発現する約１８５ｋＤａの糖タンパク質である。多くの種類の癌で遺伝子増幅が見られ、抗体医薬トラスツズマブの標的としても知られている。
ＥＲＥＧ（epiregulin）は上皮細胞成長因子であり、ＨｅＬａ細胞の形態変化を誘導する癌増殖阻害因子として機能することが知られている（例えば、J. Biol. Chem. 270:7495-7500, 1995）。
ＧＵＣＹ２Ｃは、グアニル酸シクラーゼ２Ｃであり、リンパ節におけるＧＵＣＹ２Ｃの発現量を測定することによって、大腸癌の再発リスクを評価できる可能性について報告されている（Waldman, S.A, et al., JAMA. 301(7):745-752, 2009）。
ＮＭＵＲ２は、ニューロメディンＵ受容体２である。ニューロメディンＵは、平滑筋の収縮活性を指標としてブタ脊髄から単離された神経ペプチドであり（Minamino N., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 130:1078-1085, 1985）、ＮＭＵＲ２については、膵臓癌などの癌細胞で高発現していること、また、ＮＭＵＲ２に対するリガンドが癌細胞増殖抑制効果を示すことが報告されている（国際公開第2008/029601号パンフレット）。
ＳＬＣ２８Ａ２は、ヌクレオシドトランスポーターＳＬＣ２８のメンバー２であり、細胞外アデノシン濃度を調節することにより、アデノシンが調節する代謝標的を調節する。
ＰＴＰＲＲは、受容体型チロシンホスファターゼであり、チロシンキナーゼによってリン酸化されたタンパク質のチロシンを脱リン酸する酵素である。受容体型チロシンホスファターゼは、酵素活性を有する細胞内領域と、膜貫通ドメインと、細胞外領域とからなり、細胞外領域にリガンドが結合することにより酵素活性が制御される。
本発明者らは、後述する実施例に示すとおり、以上のタンパク質がいずれも胃癌において発現し、且つ胃癌が転移する可能性のある周辺組織の正常細胞で発現しておらず、マーカータンパク質として好適であることを確認した。
【００２５】
また、これらのマーカータンパク質は、胃癌の患者により、発現している場合と発現していない場合があるところ、ＣＤＨ１７、ＭＵＣ１７、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＴＭ４ＳＦ２０、及びＥＲＥＧの５種類のマーカータンパク質に対する抗体を使えば、未分化型（diffuse type）の胃癌で６０％以上、分化型（intestinal type）で８０％以上の患者の癌を検出できることを確認した。
【００２６】
また、胃癌のマーカータンパク質としては、カドヘリンスーパーファミリー、ＣＡ１２５、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、シアリルＴｎ抗原、ＣＥＡ、ＣＡ７２−４、およびＣＡ１９−９等も好ましい。
【００２７】
従って、マーカータンパク質に対する抗体は、好ましくは５種類以上、より好ましくは８種類以上、さらに好ましくは１０種類程度のセットを用意する。抗体のセットを用いて生検試料に対する免疫染色を行えば、高い確率でその患者の癌のマーカータンパク質を決定することができる。
【００２８】
本発明に係る検出方法では、次に、上述の方法で癌種に応じてあらかじめ用意されたマーカータンパク質に対する１種又は２種以上の抗体を用いて、患者の癌組織から採取した生検試料をインビトロにて免疫染色する。
インビトロでの免疫染色は、公知の方法に従って行うことができ、上述したマーカータンパク質に対する抗体（一次抗体）を予め検出可能な物質で標識し、標的マーカータンパク質に結合させる直接法、又は、一次抗体を抗原として認識する抗体（二次抗体）を予め検出可能な物質で標識しておき、標的マーカータンパク質に結合した一次抗体に結合させる間接法によって、標的マーカータンパク質を可視化することができる。
検出可能な物質としては、たとえば、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等）、補欠分子族（ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン等）、蛍光物質（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等）、発光物質（ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン）、放射性物質（１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ）、ナノ粒子（金コロイド、量子ドット）等が挙げられる。
インビトロにおける免疫染色により患者の癌組織を染色し得る抗体を選択し、当該抗体を用いて次の画像処理工程を行う。
【００２９】
本発明の画像処理工程は、インビトロの免疫染色によって選択された抗体を用いて、患者を画像処理（イメージング）するステップであり、公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。
例えば、抗体を画像処理で検出可能な物質で標識し、転移し得る領域に注射投与する。抗体は、癌細胞で発現しているマーカータンパク質に結合するので、これを標識物質に適した検出装置で検出することにより、転移範囲を描出することができる。
例えば、ＰＥＴ（Positron Emission Tomography）又はＳＰＥＣＴ(Single Photon Emission Computed Tomography）で検出する場合、放射性同位元素で抗体を標識する。ＰＥＴ用造影剤として好ましい放射性同位元素は、６４Ｃｕ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆなどのベータ線核種、ＳＰＥＣＴ用核種として好ましい放射性同位元素は、９９ｍＴＣ、２０１ＴＩ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３０Ｘｅなどのガンマ線核種である。
光イメージング法で検出する場合は、インドシアニングリーン、メチレンブルー、ＦＩＴＣ、ローダミン、トルイジンブルー、アミノレブリン酸、クロリン化合物、フタロシアニン、ポルフィリン、プルプリン、テキサフィリンの蛍光色素、西洋わさびフォスファターゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素と基質からなる化学発光剤で抗体を標識することが好ましい。
検出装置としては、ＰＥＴやＳＰＥＣＴといった体外イメージング装置のほか、術中には腹腔鏡下プローブや内視鏡も用いられる。腹腔鏡下プローブや内視鏡によれば、癌の転移が疑われる領域を走査（スキャン）し、より迅速かつ正確に患者の癌転移部位を検出することができる。
【００３０】
［癌の治療方法］
本発明の１つの実施形態において、上記本発明の方法により癌転移部位の検出を行うと共に、外科手術により患者の癌原発組織、および上記抗体によって造影された周辺組織を切除する。通常の外科的手術のほかに、レーザービームによる外科手術法やブランキセラピー（密封小線源治療）、光動力学療法などを行ってもよい。
【００３１】
［癌転移部位を検出するためのキット］
本発明に係る癌転移部位を検出するためのキットは、術前または術中診断において癌転移部位を検出するために用いられるものであり、特定の癌において特異的に発現する１または複数のタンパク質に対する抗体を含み、患者の生検試料における癌細胞をインビトロにて免疫染色するための免疫染色試薬と、前記各抗体を含み、患者における癌細胞をインビボイメージングで検出するための造影試薬と、を含む。
免疫染色試薬は、例えば、検出可能な物質で標識したマーカータンパク質を認識する抗体（一次抗体）を含む。また、標識されていない一次抗体と、検出可能な物質で標識した一次抗体を抗原として認識する抗体（二次抗体）とを含んでいてもよい。検出可能な物質は、上記免疫染色工程で述べたので、ここでは説明を省略する。
免疫染色試薬としては、マーカータンパク質を認識する一次抗体と、検出可能な物質としてビオチンを結合させた二次抗体と、ビオチンを検出するためのアビジン又はストレプトアビジンとペルオキシダーゼの複合体と、を含むものが好ましい。
【００３２】
造影試薬は、用いられるイメージング方法によって適宜選択され、上述のとおり、ＰＥＴやＳＰＥＣＴ法を用いる場合、それぞれに適した放射性同位元素で標識した抗体とすることができ、光イメージング法を用いる場合、蛍光色素や化学発光剤で標識した抗体とすることができる。
造影試薬は、以下の２種類の態様があり得る。
第一の態様は、マーカータンパク質に対する抗体を放射性同位元素、蛍光色素、化学発光剤などで直接標識したものであり、その標識方法は既存の公知の方法を使用することができる。
たとえば、造影試薬として放射性同位元素を用いる場合は、放射性同位元素と結合しうるキレート化剤であるＤＯＴＡ（1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N’’、N’’’-tetraacetic  acid）、ＴＥＴＡ（（1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-N,N',N’’、N’’’-tetraacetic  acid），Ｎ２Ｓ２、ＭＡＧ３、あるいはＣＨＸ−Ａ−ＤＴＰＡなどを反応性の高いイソシアネート基を介して抗体へ導入し、次いでキレート化抗体を放射性同位元素で標識する。また蛍光色素あるいは化学発光剤と抗体との結合にはグルタルアルデヒド法、マレイミド法、などの公知の方法を使用することができる。
第二の態様は、いわゆるプレターゲッティング法と呼ばれる技術に基づく要素Ａと要素Ｂの２つから構成されるものである。
要素Ａは、マーカータンパク質に対する抗体を、一対の親和性物質、例えば（ａ）アビジン、ストレプトアビジン、又はその誘導体と、（ｂ）ビオチンまたはその誘導体のいずれか一方と結合させたものであり、要素Ｂは（ａ）（ｂ）の他方と放射性同位元素、蛍光色素、化学発光剤などの標識を結合させたものである。
抗体と親和性物質（ａ）又は（ｂ）との結合は、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、などの公知の方法を使用することができる。
アビジン、あるいはビオチンと放射性同位元素の結合方法は、第一の態様と同様のキレート化剤を用いる方法が使用可能である。
プレターゲッティング法においては、最初に要素Ａを投与し、癌転移部位への要素Ａの集積後、要素Ｂを投与し、要素Ａに要素Ｂを結合させる。
【００３３】
本発明のキットは、インビボあるいはインビトロのいずれのイメージングにも使用可能であるが、検出感度を向上させるためにはインビボが好ましく、内視鏡に前記イメージング検出機を組み込んだイメージング機器が適用可能である。かかるイメージング機器を用いる場合も、本発明に係る造影試薬を用いることができる。
【００３４】
上記免疫染色試薬およびインビボイメージングに用いるための造影試薬に用いる抗体は、特定の癌において発現する１または複数のタンパク質または癌抗原に対する抗体を含む。例えば、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ＹＨ−２０６、カドヘリンスーパーファミリー、ＣＡ１２５、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、シアリルＴｎ抗原、ＣＥＡ、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、Ｓｐａｎ−Ｉ、ＤＵＰＡＮ−２、ＳＬＸ、ＳＣＣ、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＡ１５−３、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＢＲＣＡ１、ＳＴＮ、ＧＡＴ、ＰＳＡおよびγ−セミノプロテインなどを挙げることができるがこれらに限定されない。これらの癌抗原の中から特定の癌について発現している可能性の高い１種または複数種類の組み合わせを選択することが好ましい。特に好ましくは、患者の人種、居住地域、生活環境などに合わせて最適な１または複数種類の癌抗原に対する抗体を選択することができる。
【００３５】
胃癌の転移部位を検出するためのキットとしては、カドヘリンスーパーファミリー、ＣＡ１２５、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、シアリルＴｎ抗原、ＣＥＡ、ＣＡ７２−４、およびＣＡ１９−９からなる群より選択される少なくとも１つに対する抗体を含むことが好ましい。
また、胃癌の転移部位を検出するためのキットとしては、ＣＤＨ１７、ＭＵＣ１７、ＴＭ４ＳＦ２０、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＲＥＧ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＮＭＵＲ２、ＳＬＣ２８Ａ２、及びＰＴＰＲＲからなる群より選択される少なくとも１つに対する抗体を含むことも好ましい。
胃癌の転移部位を検出するためのキットとして、ＣＤＨ１７、ＭＵＣ１７、ＴＭ４ＳＦ２０、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、及びＥＲＥＧの５種類のマーカータンパク質に対する抗体を含むものも好ましい。これらの５種類の抗体を使えば、胃癌患者において特異的に発現しているマーカータンパク質を高い確率で決定することができる。
【００３６】
これらの造影試薬標識された抗体は、薬学的に許容しうる溶媒、結合剤、安定化剤、分散剤などと共に注射用溶液、懸濁液、乳剤などの財形に製剤化できる。注射用の溶液としては、水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩緩衝液などのむ生理学的に適合性のある緩衝液中に溶解することが出来る。さらに組成物は、油性または水性のビヒクル中で、懸濁液、溶液、または乳濁液などの形状をとることが出来る。
【００３７】
前記造影試薬の投与経路は特に限定されないが、通常は非経口投与であり、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、粘液膜などで投与することが出来る。
【００３８】
本発明の方法に従って、非経口的に投与される代表的な製剤は、通常約０．０１から２０ｍｇ、好ましくは約０．０５から５ｍｇの標識された抗体またはそのフラグメントを滅菌された溶液中に含む。
【００３９】
上記免疫染色およびインビボイメージング用の造影試薬は、それぞれの目的に合わせて構成成分ごとに別々に、若しくはあらかじめ混合した状態で、使用しやすいように一定量ごと分注して製品として配送することができる。これらの製品は凍結又は乾燥状態で保存することができ、保存及び輸送に適した容器に収容してキットとして販売される。キットには取扱説明書を添付することができる。
【実施例】
【００４０】
以下に示す実施例は、単なる例示であって、上述する好適な態様と共に本発明を詳細に説明することのみを意図しており、本発明を限定するものではない。また、当業者であれば本発明の意義から逸脱することなく本発明を改変することが可能であり、そのような改変は本発明の範囲に含まれるものである。【００４１】
［実施例１］イメージングに応用可能な癌特異的抗原の同定
正常組織標本および癌組織標本からＲＮＡを抽出し、マイクロアレイを用いて遺伝子発現をゲノム網羅的に抽出した。約２５，０００種類のヒト遺伝子の中から、細胞表面に存在する蛋白をコードする遺伝子で、癌で特異的に高発現し、リンパ節を含む正常組織では発現が全くない、あるいはほとんどないものを抽出した。図１〜８に、リンパ節標本２個を含む正常６６組織、胃癌細胞株１１個、胃癌手術標本１３例から採取したＲＮＡを用いてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙを用いて解析した遺伝子発現結果の例を示す。
ＣＤＨ１７遺伝子（図１）、ＧＵＣＹ２Ｃ遺伝子（図２）、ＮＭＵＲ２遺伝子（図３）、ＳＬＣ２８Ａ２遺伝子（図４）、ＰＴＰＲＲ遺伝子（図５）、ＭＵＣ１７遺伝子（図６）、ＴＭ４ＳＦ２０遺伝子（図７）、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子（図８）、ＥＲＥＧ遺伝子（図９）は、正常小腸、正常大腸、及び胎児大腸、胎児胃等で発現が認められるが、正常リンパ節、及び膵臓など胃癌の転移リンパ節検出の妨げになるような部位に存在する臓器には遺伝子発現を認めなかった。
また、ＣＤＨ１７遺伝子は胃癌症例１３例中８例（６２％）で高発現し、ＧＵＣＹ２Ｃ遺伝子は１３例中５例（３８％）、ＮＭＵＲ２遺伝子は１３例中３例（２３％）、ＳＬＣ２８Ａ２遺伝子は１３例中３例（２３％）、ＰＴＰＲＲ遺伝子は１３例中３例（２３％）、ＭＵＣ１７遺伝子は１３例中５例（３８％）、ＴＭ４ＳＦ２０遺伝子は１３例中５例（３８％）、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子は１３例中２例（１５％）、ＥＲＥＧ遺伝子は１３例中２例（１５％）で高発現していた。
胃癌細胞株でも高発現が認められることは、胃癌組織中で高発現しているのは胃癌細胞であることを示唆している。
以上より、ＣＤＨ１７遺伝子、ＧＵＣＹ２Ｃ遺伝子、ＮＭＵＲ２遺伝子、ＳＬＣ２８Ａ２遺伝子、ＰＴＰＲＲ遺伝子、ＭＵＣ１７遺伝子、ＴＭ４ＳＦ２０遺伝子、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）遺伝子、ＥＲＥＧ遺伝子の各遺伝子産物であるタンパク質は、本発明に係る検出方法等におけるマーカータンパク質として有用であることが示唆された。【００４２】
［実施例２］抗体による原発腫瘍組織及びリンパ節転移巣組織での発現検出
上記マーカータンパク質のうち、まずＣＤＨ１７について、胃癌での発現を、免疫染色法を用いて次のように検出した。
１．胃癌手術検体切除後、２０％中性緩衝ホルマリン中で約１２時間、組織を固定した。
２．２時間水洗後、標本の切り出しを行った。検索の必要な箇所を２−３ｃｍ大、４−５ｍｍ厚の大きさの切片に切り分けた。
３．サクラ精機のＥＴＰ自動パラフィン浸透装置を用いて、組織切片をアルコールで脱水、クロロホルムで置換し、１〜２日パラフィン浸透させた。  
４．完成したパラフィンブロックをミクロトームにて３μｍで薄切し、スライドガラスに乗せ、乾燥させた。これを、ベンタナ社のベンチマーク自動免疫染色装置を用いて５−１１のごとく免疫染色した。
５．キシレン→アルコール→水洗の順にスライドガラス標本の脱パラフィンを行った。
６．９５度、６０分間、Ｔｒｉｓ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）で前処置をした。
７．１次抗体をａｐｐｌｙする。ＣＤＨ１７の場合、１次抗体としてＲ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のマウス抗ヒトＣＤＨ１７  モノクローナル抗体ＭＡＢ１０３２を１０μｇ／ｍＬの濃度で３２分間反応させた。
８．２次抗体をａｐｐｌｙする。ＣＤＨ１７の場合、ベンタナ社の抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。
９．ストレプトアビジン−ＨＲＰを反応させた。
１０．ＤＡＢ発色を行った。  
１１．対比染色としてヘマトキシリンで細胞核の染色を行った。
１２．アルコールで脱水し、キシレンを用いて透徹する。封入剤を付けてカバーガラスを被せる封入を行った。
その結果、図１０に示す如く、胃癌細胞表面でのＣＤＨ１７発現を認めた。間質など周辺の正常細胞では発現を認めない。
同様に、抗ＮＭＵＲ２抗体（ab50928）、及び抗ＳＬＣ２８Ａ２抗体（Abgent社、AP7738b及びＡＰ7738c）を用いて、癌の原発腫瘍組織サンプルを染色した結果を図１１及び１２に示す。図１１及び１２に示されるように、ＮＭＵＲ２タンパク質及びＳＬＣ２８Ａ２タンパク質も、腫瘍組織で発現していれば免疫染色によって検出することが確認でき、本発明で用いられるマーカータンパク質として好適であることが確認された。【００４３】
癌の原発組織でこの抗原が発現しているだけでなく、リンパ節に転移した癌細胞においても発現していないと、抗体を用いて転移リンパ節をイメージングすることはできない。胃癌手術で摘出された転移リンパ節を、原発組織と同じ手法で免疫染色した。図１３ａに示すごとく、転移リンパ節においてもＣＤＨ１７は高発現しており、同じ抗体により検出・同定可能であった。図１３ｂは転移のないリンパ節であり、免疫染色陰性であった。【００４４】
また、免疫染色をハイスループットに行う組織アレイ（マクロアレイ）を用いて、さらにマーカータンパク質の発現を分析した。組織アレイは、病理組織標本から２ｍｍ以下の細い円筒状に組織を打ち抜き、多数の組織を整列させ、一つのブロックに包埋するものである。免疫染色は上述の方法と同様に行った。
分化型胃癌２４例、未分化型胃癌２０例の原発腫瘍及びリンパ節転移組織から組織アレイを作製し、ＣＤＨ１７、ＭＵＣ１７、ＴＭ４ＳＦ２０、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）及びＥＲＥＧタンパク質の発現を検討した。
結果を図１４〜２１に示す。
図１４に示すとおり、原発腫瘍（ｐｒｉｍａｒｙ）及びリンパ節転移巣組織（ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）において、ＣＤＨ１７の発現をハイスループットに確認することができた。同じ分化型胃癌・未分化型胃癌であっても、抗ＣＤＨ１７抗体によって染色される例とされない例が存在する。
図１５に示すとおり、抗ＭＵＣ１７抗体及び抗ＣＤＨ１７抗体を用いると、原発腫瘍及びリンパ節転移巣組織は濃く染色され、ＭＵＣ１７及びＣＤＨ１７が本発明のマーカータンパク質として好適であることが示された。
図１６〜図２１に示すとおり、濃淡はあるものの、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＴＭ４ＳＦ２０及びＥＲＥＧも、サンプルによっては原発腫瘍及びリンパ節転移で染色され、サンプルによっては染色されなかった。【００４５】
次に、上記分化型胃癌２４例についての組織アレイを用いた免疫染色の結果に基づき、患者を分類した。結果を表１に示す。癌細胞の５０％以上で染色（＋）の症例を強陽性（濃灰色）、１０％以上５０％未満の症例を弱陽性（灰色）、１０％未満の症例を陰性（白）、判定不能例を黒色とした。表中、primaryは原発腫瘍組織、ＬＮはリンパ節転移組織を示す。
【表１】
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【００４６】
同様に、未分化型胃癌２０例についての組織アレイを用いた免疫染色の結果に基づき、患者を分類した。結果を表２に示す。癌細胞の５０％以上で染色（＋）の症例を強陽性（濃灰色）、１０％以上５０％未満の症例を弱陽性（灰色）、１０％未満の症例を陰性（白）、判定不能例を黒色とした。
【表２】
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【００４７】
また、癌細胞の５０％以上で染色（＋）である強陽性症例の割合を表３及び表４にまとめた。
表３に示すとおり、５種類の抗体を使用することにより、分化型では、２４人中２０人（８３％）の患者において少なくとも１種類以上の有効なマーカータンパク質を特定することができた。また、表４に示すとおり、未分化型では、２０人中１３人（６５％）の患者において少なくとも１種類以上の有効なマーカータンパク質を特定することができた。
【表３】
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【表４】
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一般に、分化型は未分化型に比較して予後が良好であり、広範な切除を行う必要がない場合も多い。従って、本発明の方法によってある患者の胃癌で発現しているマーカータンパク質を選択し、当該マーカータンパク質によるインビボイメージングによって転移範囲を検出し、限定的に手術を行うことができれば、患者の負担を軽減し、且つ十分な治療を行うことができる。【００４８】
［実施例３］術前におけるマーカータンパク質の同定
手術時に、マーカータンパク質に対する抗体を用いて癌のイメージングを行うには、あらかじめ術前に、この胃癌で特異的に発現している抗原を同定し、造影試薬標識した抗体を準備しておく必要がある。術前の胃内視鏡検査において、術前病理診断のために胃癌組織の生検を行うが、この生検標本を上記実施例２と同じ手法で免疫染色した。図２２に示すごとく、生検標本を用いて、術前にＣＤＨ１７発現の同定が可能であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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