(57)【要約】  プロテインSの減少に伴う、炎症性疾患、血液凝固性疾患に対する治療薬が求められている。本発明によれば、N-グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えプロテインS分子からなる組成物であって、健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、糖化蛋白質受容体（RAGE; Receptor for advanced glycation endproducts）に対する結合活性が高く、かつ健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、プロテインSに結合しているN-グリコシド結合複合型糖鎖にフコースが結合していない糖鎖の割合が高いプロテインS組成物を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
N-グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えプロテインS分子からなる組成物であって、健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、糖化蛋白質受容体（RAGE; Receptor for advanced glycation endproducts、以下RAGEと記載する）に対する結合活性が高く、かつ健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、プロテインSに結合しているN-グリコシド結合複合型糖鎖にフコースが結合していない糖鎖の割合が高いプロテインS組成物。
【請求項２】
N-グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えプロテインS分子からなる組成物であって、N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である、請求項１に記載のプロテインS組成物。
【請求項３】
N-グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖非還元末端のガラクトースにシアル酸が結合した糖鎖である、請求項１または2に記載のプロテインS組成物。
【請求項４】
N-グリコシド結合複合型糖鎖が、プロテインSのN末端から458番目、468番目、489番目に位置するアスパラギン残基のうち少なくとも１箇所のアスパラギン残基に結合する糖鎖である、請求項1〜3のいずれか１項に記載のプロテインS組成物。
【請求項５】
プロテインSのN末端から1番目〜45番目のアミノ酸配列のうち、該アミノ酸配列に含まれる少なくとも１つのグルタミン酸残基の側鎖がγ-カルボキシル化を受けたアミノ酸配列である、請求項1〜4のいずれか１項に記載のプロテインS組成物。
【請求項６】
プロテインSが、以下の(a)、(b)および(c)からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項1〜5のいずれか１項に記載のプロテインS組成物。
(a)配列番号８（ヒト野生型プロテインS）で表されるアミノ配列からなる蛋白質；
(b)配列番号８で表されるアミノ酸配列において、1個以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつRAGEに対する結合活性を有する蛋白質；
(c)配列番号８で表されるアミノ酸配列と80％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつRAGEに対する結合活性を有する蛋白質。
【請求項７】
プロテインSが、以下の(a)または(b)から選ばれるDNAがコードする蛋白質である、請求項1〜6のいずれか１項に記載のプロテインS組成物。
(a)配列番号７（ヒト野生型プロテインS）で表される塩基配列からなるDNA；
(b)配列番号７で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつRAGEに対する結合活性を有する蛋白質をコードするDNA。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか1項に記載のプロテインSを生産する細胞。
【請求項９】
細胞が、細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素の活性が欠損するようにゲノムが改変された細胞である、請求項8に記載の細胞。
【請求項１０】
細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素が、GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ、及び、GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼからなる群から選ばれる酵素である、請求項9に記載の細胞。
【請求項１１】
細胞が、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースがα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が欠失するようにゲノムが改変された細胞である、請求項8に記載の細胞。
【請求項１２】
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースがα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α1,6-フコシルトランスフェラーゼである、請求項11に記載の細胞。
【請求項１３】
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースがα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α1,3-フコシルトランスフェラーゼである、請求項11に記載の細胞。
【請求項１４】
細胞が、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞である、請求項8に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項1〜7に記載のプロテインSを生産するトランスジェニック動物。
【請求項１６】
トランスジェニック動物が、細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素の活性が欠損するようにゲノムが改変された動物である、請求項15に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１７】
細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素が、GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ、及び、GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼからなる群から選ばれる酵素である、請求項15に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１８】
トランスジェニック動物が、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースがα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が欠失するようにゲノムが改変された動物である、請求項15に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１９】
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースがα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α1,6-フコシルトランスフェラーゼである、請求項15に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２０】
請求項8〜14に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に請求項1〜7のいずれか1項に記載のプロテインS組成物を生成蓄積させ、培養物から該プロテインS組成物を採取することを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載のプロテインS組成物を製造する方法。
【請求項２１】
請求項15〜19に記載のトランスジェニック動物を飼育し、該トランスジェニック動物の乳汁中に請求項1〜7のいずれか1項に記載のプロテインS組成物を生成蓄積させ、搾乳された乳汁から該プロテインS組成物を採取することを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載のプロテインS組成物を製造する方法。
【請求項２２】
請求項1〜7のいずれかに記載のプロテインS組成物を有効成分として含有する医薬。
【請求項２３】
請求項1〜7のいずれかに記載のプロテインS組成物を有効成分として含有する抗炎症剤。
【請求項２４】
請求項1〜7のいずれかに記載のプロテインS組成物を有効成分として含有する敗血症治療剤。
【請求項２５】
請求項1〜7のいずれかに記載のプロテインS組成物を有効成分として含有する血栓症の予防剤および治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、N-グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えプロテインS分子からなる組成物であって、健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、糖化蛋白質受容体（RAGE; Receptor for advanced glycation endproducts、以下RAGEと記載する）に対する結合活性が高く、かつ健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、プロテインSに結合しているN-グリコシド結合複合型糖鎖にフコースが結合していない糖鎖の割合が高いプロテインS組成物および該組成物を用いた治療用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインSは、ヒト血漿から単離された、血漿中の抗凝固活性を担う分子量約８万ダルトンの糖蛋白質である（非特許文献1、特許文献1）。プロテインSのmRNAは、肝臓、血管内皮、巨核細胞、精巣、および脳で発現が認められるが、蛋白質の主たる産生臓器は肝臓であることが知られている（非特許文献2）。
血漿中に分泌された成熟型プロテインSの蛋白質部分は635アミノ酸残基（）で構成され、分子内に17個のジスルフィド結合を含むマルチドメイン型一本鎖ポリペプチドである。プロテインSは、血液凝固第VII因子、第IX因子、プロトロンビン、プロテインCなどと同じく、ビタミンK依存性蛋白質ファミリーに分類される。天然型プロテインSはその分子内に４種類のドメイン構造を有しており、アミノ末端側から、γ-カルボキシルグルタミン酸（以下、Gla）ドメイン、トロンビン感受性領域、4つの連続した上皮細胞成長因子（EGF）様ドメインおよび性ホルモン結合グロブリン（SHBG）様ドメインが、存在することが知られている。【０００３】
天然型プロテインS分子が有するアスパラギン結合型糖鎖は、SHBG様ドメインのAsn458、Asn468およびAsn489の3つのアスパラギン残基に結合していることが知られている。なお、先天性プロテインS欠損症のひとつの型であるHeerlen変異では、Ser460がProに置換されているためにAsn458位に糖鎖が付加されなくなり、プロテインS蛋白質の血中半減期が短縮されていることが知られている（非特許文献3、4）。【０００４】
プロテインSの主たる生理作用は、ヒト血漿中に存在するセリンプロテアーゼの一種である活性化プロテインC（APC）に結合して、この酵素の活性を約20倍に増強する補因子として機能することにより、APCによる血液凝固因子の分解を促進して血液凝固を抑制する作用が知られている。プロテインSのこの活性は、APCコファクター活性と呼ばれている。
また、プロテインSは、リン脂質結合活性（非特許文献5）、プロトロンビナーゼ形成阻害活性（非特許文献6、7）、テンナーゼ形成阻害活性、補体C4BP結合活性（非特許文献8、9）、Tissue factor pathway inhibitor（TFPI）コファクター活性（非特許文献10）、マクロファージ表面受容体Axl/Mer/Tyro結合活性（非特許文献11）、などの多様な生物活性を有することが知られている。このうち、APCコファクター活性とリン脂質結合活性については、生体内でプロテインS分子に生じる翻訳後修飾のひとつであるグルタミン酸のγ-カルボキシル化（Gla化）の有無と、Glaドメインにカルシウムイオンが配位されることによるGlaドメイン立体構造の変化が、これらの活性に直接影響を与えることが知られている。しかし、プロテインSが有する糖鎖の構造と、プロテインSが関与する種々の生物反応との関連性は、上述のHeerlen変異体の例を除いては殆ど知られていない。【０００５】
近年、敗血症（Sepsis）や播種性血管内凝固症候群（Disseminated intravascular coagulation；DIC）といった、血液凝固と炎症の過剰亢進が多臓器不全を引き起こす種々のヒト疾患において、病態メカニズムの分子レベルでの解析が進んだ結果、患者体内で増加する炎症メディエーター分子の役割が明らかとなってきている。
糖化蛋白質受容体（Receptor for advanced glycation endproducts；以下RAGEと略記する）は、糖尿病患者の血中で増加する糖化蛋白質（AGEs）の受容体として古くから知られる膜局在型蛋白質であり、主に血管内皮表面上に発現していることが知られている。興味深いことに最近、敗血症患者やDIC患者の末梢血中において、RAGE蛋白質が可溶型蛋白質（以下、可溶型RAGEと記載する）として検出され、その血中濃度が予後の悪化に伴い上昇していることが明らかとなっている（非特許文献12）。この可溶型RAGEは、膜に発現しているRAGE（以下、膜型RAGEと記載する）の切断により生じるだけでなく、可溶型RAGEとしても細胞外に分泌されることが知られている（非特許文献13）。可溶型RAGEは、リンパ球表面上に発現しているある種のインテグリン分子（Mac-1）に特異的に結合した結果、リンパ球を活性化させ、腫瘍壊死因子α（TNFα）やインターロイキン6（IL-6）といった炎症性サイトカインの分泌を促進する活性を有することが、最近明らかにされた（非特許文献14）。更に、リポ多糖（LPS）投与マウス敗血症モデルにおいて、抗RAGE中和抗体を投与することによってマウスの生存率が有意に改善することが示されている（非特許文献15）。【０００６】
これらの知見から、可溶型RAGEは炎症のメディエーター分子として認識され、炎症性疾患治療法開発における標的分子のひとつと考えられている。一方の膜型RAGEは、糖化蛋白質（AGEs）の受容体として機能するだけでなく、High mobility group box chromosomal protein (HMGB）蛋白質ファミリーやS100（soluble in 100 % saturated ammonium sulfate）ペプチドファミリーなどの可溶性炎症メディエーター分子の受容体としての機能も有することが知られている（非特許文献16）。膜型RAGEを発現している細胞にHMGBやS100が結合することにより、細胞からの炎症性サイトカイン分泌促進、ICAMやVCAMなどの接着分子の発現上昇、細胞のケモタキシスといった炎症亢進に関与する種々のイベントが惹起されることが知られている（非特許文献17、18）。【０００７】
一方で、プロテインSによる抗炎症反応はこれまで知られておらず、更にプロテインSとRAGEの相互作用については、何ら知見が無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】日本特許2557385
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Biochemistry 16, 698 (1977)
【非特許文献２】血栓止血誌 12, 235 (2001)
【非特許文献３】Blood 76, 538 (1990)
【非特許文献４】Thromb Res 100, 81 (2000)
【非特許文献５】JBC 261, 5116 (1986)
【非特許文献６】JBC 268, 2872 (1993)
【非特許文献７】PNAS 91, 2728 (1994)
【非特許文献８】Blood 103, 1192 (2004)
【非特許文献９】J Immunol 169, 2580 (2002)
【非特許文献１０】PNAS 103, 3106 (2006)
【非特許文献１１】Biol Chem 381, 199 (2000)
【非特許文献１２】J Surgical Res 147, 79 (2008)
【非特許文献１３】Current Molecular Medicine 7, 777 (2007)
【非特許文献１４】Arthritis Rheumatism 54, 3898 (2006)
【非特許文献１５】Critical Care 11, R122 (2007)
【非特許文献１６】Current Molecular Medicine 7, 743 (2007)
【非特許文献１７】Cell 97, 889 (1999)
【非特許文献１８】J Immunol 170, 3233 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
生体内でのプロテインSの減少に伴う、過剰な炎症反応や血栓の形成が原因となって発症する各種ヒト疾患に対する効果の高い治療法開発の観点から、従来の既存のプロテインS製剤と比較して顕著に高い抗炎症作用を有するプロテインS製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下の（1）〜（25）に関する。
(1)N-グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えプロテインS分子からなる組成物であって、健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、糖化蛋白質受容体（RAGE; Receptor for advanced glycation endproducts、以下RAGEと記載する）に対する結合活性が高く、かつ健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、プロテインSに結合しているN-グリコシド結合複合型糖鎖にフコースが結合していない糖鎖の割合が高いプロテインS組成物。
(2)N-グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えプロテインS分子からなる組成物であって、N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である、(1)に記載のプロテインS組成物。
(3)N-グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖非還元末端のガラクトースにシアル酸が結合した糖鎖である、(1)または(2)に記載のプロテインS組成物。
(4)N-グリコシド結合複合型糖鎖が、プロテインSのN末端から458番目、468番目、489番目に位置するアスパラギン残基のうち少なくとも１箇所のアスパラギン残基に結合する糖鎖である、(1)〜(3)のいずれか１項に記載のプロテインS組成物。
(5)プロテインSのN末端から1番目〜45番目のアミノ酸配列のうち、該アミノ酸配列に含まれる少なくとも１つのグルタミン酸残基の側鎖がγ-カルボキシル化を受けたアミノ酸配列である、(1)〜(4)のいずれか１項に記載のプロテインS組成物。
(6)プロテインSが、以下の(a)、(b)および(c)からなる群から選ばれる蛋白質である、(1)〜(5)のいずれか１項に記載のプロテインS組成物。
(a)配列番号８（ヒト野生型プロテインS）で表されるアミノ配列からなる蛋白質；
(b)配列番号８で表されるアミノ酸配列において、1個以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつRAGEに対する結合活性を有する蛋白質；
(c)配列番号８で表されるアミノ酸配列と80％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつRAGEに対する結合活性を有する蛋白質。
(7)プロテインSが、以下の(a)または(b)から選ばれるDNAがコードする蛋白質である、(1)〜(6)のいずれか１項に記載のプロテインS組成物。
(a)配列番号７（ヒト野生型プロテインS）で表される塩基配列からなるDNA；
(b)配列番号７で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつRAGEに対する結合活性を有する蛋白質をコードするDNA。
(8)(1)〜(7)のいずれか1項に記載のプロテインSを生産する細胞。
(9)細胞が、細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素の活性が欠損するようにゲノムが改変された細胞である、(8)に記載の細胞。
(10)細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素が、GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ、及び、GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼからなる群から選ばれる酵素である、(9）に記載の細胞。
(11)細胞が、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースがα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が欠失するようにゲノムが改変された細胞である、(8)に記載の細胞。
(12)N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースがα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α1,6-フコシルトランスフェラーゼである、(11)に記載の細胞。
(13)N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースがα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α1,3-フコシルトランスフェラーゼである、(11)に記載の細胞。
(14)細胞が、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞である、(8)に記載の細胞。
(15)(1)〜(7)に記載のプロテインSを生産するトランスジェニック動物。
(16)トランスジェニック動物が、細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素の活性が欠損するようにゲノムが改変された動物である、(15)に記載のトランスジェニック動物。
(17)細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素が、GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ、及び、GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼからなる群から選ばれる酵素である、(15)に記載のトランスジェニック動物。
(18)トランスジェニック動物が、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースがα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が欠失するようにゲノムが改変された動物である、(15)に記載のトランスジェニック動物。
(19)N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースがα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α1,6-フコシルトランスフェラーゼである、(15)に記載のトランスジェニック動物。
(20)(8)〜(14)に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に(1）〜（7）のいずれか1項に記載のプロテインS組成物を生成蓄積させ、培養物から該プロテインS組成物を採取することを特徴とする(1)〜(7)のいずれか1項に記載のプロテインS組成物を製造する方法。
(21)(15)〜(19)に記載のトランスジェニック動物を飼育し、該トランスジェニック動物の乳汁中に(1)〜(7)のいずれか1項に記載のプロテインS組成物を生成蓄積させ、搾乳された乳汁から該プロテインS組成物を採取することを特徴とする(1)〜(7)のいずれか1項に記載のプロテインS組成物を製造する方法。
(22)(1)〜(7)のいずれかに記載のプロテインS組成物を有効成分として含有する医薬。
(23)(1)〜(7)のいずれかに記載のプロテインS組成物を有効成分として含有する抗炎症剤。
(24)(1)〜(7)のいずれかに記載のプロテインS組成物を有効成分として含有する敗血症治療剤。
(25)(1)〜(7)のいずれかに記載のプロテインS組成物を有効成分として含有する血栓症の予防剤および治療剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、N-グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えプロテインS分子からなる組成物であって、健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、プロテインSに結合しているN-グリコシド結合複合型糖鎖にフコースが結合していない糖鎖の割合が高く、かつ健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、糖化蛋白質受容体（RAGE; Receptor for advanced glycation endproducts、以下RAGEと記載する）に対する結合活性が高いことを特徴とするプロテインS組成物、及び該組成物を用いた治療用途が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】表面プラスモン共鳴法による、ヒト血漿由来プロテインSまたはヒト血漿アンチトロンビンIIIに対するレンズマメレクチン（LCA）結合活性の解析。横軸は時間（秒）、縦軸はBIAcore T100のセンサーチップ上での、糖蛋白質に対するLCAの結合活性を示す。各センサーグラムは上から順に、50000、25000、12500、6250、3125および0 ng/mL濃度のLCAを流した時の値を示す。上段がヒト血漿プロテインSとLCA、下段がヒト血漿アンチトロンビンIIIとLCAの結合を示す。
【図２】ヒトプロテインSの遺伝子を含むベクターpCR4-PSの構築フローを示す。
【図３】ヒトプロテインS発現ベクターpKAN-PSの構築フローを示す。
【図４】遺伝子組換えプロテインSの精製品分析結果を示す。精製で得られたMSPS、KCPSの各サンプルをSDS-ポリアクリルアミド電気泳動に供し、クマシーブリリアンドブルー（CBB）染色した図を左側に示す。また、ウエスタンブロッティングの結果を右側に示す。ポジティブコントロールとしてヒト血清由来プロテインSを用いた。
【図５】表面プラスモン共鳴法による、ヒト血漿由来プロテインSに対する糖化蛋白質受容体（RAGE）結合活性の解析。横軸は時間（秒）、縦軸はBIAcore T100のセンサーチップ上での、プロテインSに対するRAGEの結合活性を示す。各センサーグラムは上から順に、50000、25000、12500、6250、3125および0 ng/mLのRAGEを流した時の値を示す。
【図６】表面プラスモン共鳴法による、ヒト血漿由来性ホルモン結合グロブリン（SHBG）に対する糖化蛋白質受容体（RAGE）結合活性の解析。横軸は時間（秒）、縦軸はBIAcore T100のセンサーチップ上の、SHBGに対するRAGEの結合活性を示す。センサーグラムは上から順に、50000、25000、12500、6250、3125および0 ng/mLのRAGEを流した時の値を示す。
【図７】表面プラスモン共鳴法による、プロテインSに対する抗ヒトプロテインS抗体（C-17）結合活性の解析を示す。横軸は時間（秒）、縦軸はBIAcore T100のセンサーチップ上の各プロテインSに対するC-17抗体の結合活性を示す。各センサーグラムは上から順に、50000、25000、12500、6250、3125、1562、および0 ng/mLのC-17を流した時の値を示す。上段はヒト血漿プロテインS、中段はMSPS、下段はKCPSに対するC-17抗体の結合を示す。
【図８】表面プラスモン共鳴法による、プロテインSに対するRAGE結合性の解析。横軸は時間（秒）、縦軸はBIAcore T100のセンサーチップ上のRAGEと各プロテインSとの結合活性を示す。センサーグラムは上から、RAGE濃度50000、25000、12500、6250、3125、1562および0 ng/mLを示す。上段はヒト血漿プロテインS、中段はKCPS、下段はMSPSに対するRAGEの結合を示す。
【図９】表面プラスモン共鳴法を用いた、RAGE（5000 ng/mL）とHMGB-1またはMac-1結合反応における、遺伝子組換えプロテインS（MSPS、KCPS）の中和作用を示す。横軸はプロテインS濃度（μg/mL）を示す。縦軸は、プロテインSの非存在下でアナライト（RAGE）を注入した直後のレスポンス値を100％とした時の相対的なレスポンス値（％）を示す。上段はRAGE-HMGB-1結合、下段はRAGE-Mac-1結合反応における遺伝子組換えプロテインSの濃度依存的な中和作用を示す。
【図１０】遺伝子組換えプロテインSによる、活性化血管内皮からの炎症性サイトカイン産生の抑制効果を示す。白カラムはLPS誘導無し、黒カラムはLPS誘導有りを示す。縦軸は、インターロイキン-8産生量、横軸は添加したプロテインSを示す。
【図１１】ヒト血管内皮細胞株HUVECとヒト単球細胞株（U-937）の接着に対するプロテインSの阻害作用を示す。横軸はU-937細胞に添加したプロテインSの種類、縦軸はHUVECに接着したU-937細胞の数を示す。白カラムは、HUVECのTNFα刺激有り、黒カラムは、HUVECのTNFα刺激無しを示す。上段はTNFα刺激したU-937とHUVECとの接着に対するプロテインSの中和作用、下段はHMGB-1刺激したU-937とHUVECの接着に対するプロテインSの中和作用を示す。各データは、3ウェルの平均値および標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のN-グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えプロテインS分子からなる組成物であって、健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、糖化蛋白質受容体（RAGE; Receptor for advanced glycation endproducts、以下RAGEと記載する）に対する結合活性が高く、かつ健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、プロテインSに結合しているN-グリコシド結合複合型糖鎖にフコースが結合していない糖鎖の割合が高いプロテインS組成物（以下、「フコースの無いプロテインS組成物」と記載する場合もある。）とは、健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、RAGEなどのパターン認識型受容体ファミリー（pattern recognition receptor ; PRRファミリー）に対する結合活性が高く、かつ健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、プロテインSに結合しているN-グリコシド結合複合型糖鎖にフコースが結合していない糖鎖の割合が高いプロテインS組成物であればいかなる組成物も包含される。
【００１５】
本発明において、天然プロテインSとは、健常人ヒト血液中に存在して血中の活性化プロテインC（Activated Protein C：APC）コファクター活性を担い、ビタミンK依存性蛋白質ファミリーに属する１本鎖糖蛋白質であり、かつ本発明のプロテインS組成物と比べて、組成物に含まれるフコースが結合していない糖鎖の割合が低いプロテインSであればいかなるものも包含される。
【００１６】
本発明において、天然型プロテインSは、分泌シグナルペプチドが付加された前駆体プロテインSタンパク質（配列番号２）として細胞内で生成され、その後小胞体内で分泌シグナルペプチドが切断され、次にゴルジ体内で、前駆体プロテインSタンパク質（配列番号６）のN末端側に位置するプロペプチドが切断されることで、成熟型のプロテインS（配列番号８）として合成、分泌される。天然型プロテインSは、その分子内に４種類のドメイン構造を有し、N末端側から、γ-カルボキシルグルタミン酸（Gla）ドメイン、トロンビン感受性領域、４つの連続した上皮細胞成長因子（Epidermal growth factor：EGF）様ドメインおよび性ホルモン結合グロブリン（Sex hormone-binding globulin：SHBG）様ドメインが含まれる。プロテインSは、Glaドメインのグルタミン酸残基にはγ-カルボキシルグルタミン酸修飾、EGF様ドメインのアスパラギン残基やアスパラギン酸残基にはβ−ヒドロキシル化修飾、SHBG様ドメインにアスパラギン結合型複合型糖鎖の翻訳後修飾を受ける。
【００１７】
本発明のプロテインS組成物としては、N-グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えプロテインS分子からなる組成物であって、健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、プロテインSに結合しているN-グリコシド結合複合型糖鎖にフコースが結合していない糖鎖の割合が高いプロテインS組成物があげられる。
本発明において、プロテインSとは、天然プロテインSより高い糖化蛋白質受容体（RAGE）に対する結合活性を有し、かつγ-カルボキシルグルタミン酸修飾を受けたGlaドメインとN-グリコシド結合型複合型糖鎖が付加されたSHBG様ドメインを有し、該糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖蛋白質であればいかなるものも包含される。
【００１８】
γ-カルボキシルグルタミン酸修飾を受けたGlaドメインとは、プロテインSのアミノ酸配列のN末端から１番目〜４５番目のアミノ酸配列であって、当該アミノ酸配列中の少なくとも１つのグルタミン酸残基の側鎖が、γ-カルボキシル化修飾を受けているドメインをいう。
N-グリコシド結合複合型糖鎖が付加されたSHBG様ドメインとは、プロテインSのアミノ酸配列のN末端から458番目、468番目および489番目の少なくとも１つのアスパラギン残基の側鎖に、N−結合複合型糖鎖が付加されているドメインをいう。
【００１９】
具体的なプロテインSの例としては、下記(a)、(b)のDNAがコードする蛋白質、または下記(c)、(d)、(e)の蛋白質などがあげられる。
(a)配列番号７で表される塩基配列からなるDNA；
(b)配列番号７で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつRAGEに対する結合活性を有する蛋白質をコードするDNA；
(c)配列番号８で表されるアミノ配列からなる蛋白質；
(d)配列番号８で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつRAGEに対する結合活性を有する蛋白質；
(e)配列番号８で表されるアミノ酸配列と80％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつRAGEに対する結合活性を有する蛋白質； 
本発明において、プロテインS組成物とは、前段落に記載したいずれかのプロテインSを主成分として含有する糖蛋白質組成物であればいかなるものも包含される。
【００２０】
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとは、例えば配列番号７で表される塩基配列を有するDNAなどのDNAまたはその一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるDNAを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0Mの塩化ナトリウム存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるDNAをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なDNAとして具体的には、配列番号７で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するDNA、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するDNAをあげることができる。
【００２１】
本発明において、配列番号８で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつRAGEに対する結合活性を有する蛋白質とは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNAに部位特異的変異を導入することにより取得することができる蛋白質を意味する。欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００２２】
また、本発明において、配列番号８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつRAGEに対する結合活性を有する蛋白質とは、BLAST〔J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)〕やFASTA〔Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上である蛋白質であることをいう。
【００２３】
本発明のプロテインS組成物として好ましくは、N-グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えプロテインS分子からなる組成物であって、健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、RAGEに対する結合活性が高く、かつ健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、プロテインSに結合しているN-グリコシド結合複合型糖鎖にフコースが結合していない糖鎖の割合が高いプロテインS組成物があげられる。
【００２４】
また、本発明のプロテインS組成物としてより好ましくは、N-グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えプロテインS分子からなる組成物であって、N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である、プロテインS組成物があげられる。
本発明において、プロテインSに結合しているN-グリコシド結合糖鎖は、様々な構造を有しているが、いずれの場合にも以下の構造式（I）に示す共通のコア構造を有する。
構造式（I）
【００２５】
【化１】
2010018847.tif 000002
【００２６】
構造式（I）において、アスパラギンと結合する糖鎖の末端が還元末端、反対側が非還元末端と呼ばれている。N-グリコシド結合糖鎖はその構造上の特徴から以下に挙げる３タイプに分類される。コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型、コア構造の非還元末端側にガラクトース−N-アセチルグルコサミン（以下、Gal-GlcNAcと表記する）で形成されるラクトサミン構造を含む枝を並行して1以上、具体的には２ないし４本有し、更にGal-GlcNAcの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのN-アセチルグルコサミンなどの構造を有する複合型、コア構造の非還元末端側にハイマンノース型と複合型の両方の枝を持つハイブリッド型、の３タイプである。
【００２７】
本発明において、プロテインS組成物を構成するプロテインS分子には、少なくとも3カ所のN-グリコシド結合糖鎖の付加配列が存在し、少なくともこれらの１ヶ所はN-グリコシド結合糖鎖が結合する。N-グリコシド結合複合型糖鎖の結合部位としては、具体的には、プロテインSのアミノ酸配列のN末端から、458番目、468番目および489番目のアスパラギン残基があげられる。
【００２８】
本発明のプロテインS組成物に含まれるプロテインS分子に結合するN-グリコシド結合糖鎖としては、具体的には、上述のN-グリコシド結合複合型糖鎖、好ましくは該糖鎖非還元末端側のガラクトースにシアル酸が結合した複合型糖鎖をあげることができる。
糖鎖非還元末端側のガラクトースとシアル酸の結合としては、シアル酸の２位がガラクトースの６位にα結合している糖鎖、シアル酸の２位がガラクトースの３位にα結合している糖鎖等があげられる。
【００２９】
プロテインS分子に結合するN-グリコシド結合複合型糖鎖としては、前記構造式（I）で示されるコア構造を含むいかなる糖鎖も包含されるので、多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。
従って、本発明のプロテインS組成物は、天然プロテインSと比べて、RAGEに対する結合活性が高く、かつ健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、プロテインSに結合しているN-グリコシド結合複合型糖鎖にフコースが結合していない糖鎖の割合が高いプロテインS組成物であれば、該組成物に含まれるプロテインS分子が、単一の糖鎖構造を有するプロテインS分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有するプロテインS分子から構成されていてもよい。
【００３０】
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖とは、フコースがN-グリコシド結合複合型糖鎖のN-アセチルグルコサミンに結合していない糖鎖であれば、いかなるものも包含され、非還元末端の糖鎖の構造に多様性があってもよい。例えばフコースの１位がN-グリコシド結合複合型糖鎖のN-アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖や、フコースの１位がN-グリコシド結合複合型糖鎖のN-アセチルグルコサミンの３位にα結合していない糖鎖等があげられる。
【００３１】
本発明の、健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、プロテインSに結合しているN-グリコシド結合複合型糖鎖にフコースが結合していない糖鎖の割合が高いプロテインS組成物とは、健常人の血液中に存在するフコースが結合していないN-グリコシド結合複合型糖鎖を有する天然プロテインSの割合と比べて、組成物中に存在するフコースが結合していないN-グリコシド結合複合型糖鎖を有するプロテインSの割合が高いことをいう。
【００３２】
健常人の血液中に存在するフコースが結合していないプロテインSの割合は約70％未満であることから、本発明のプロテインS組成物中の、フコースのないプロテインSの割合は、70%以上、好ましくは、74%以上、75%以上、80%以上、85%以上、より好ましくは、90%以上、95%以上、96％以上、97%以上、98％以上、99％以上、最も好ましくは100％である。
N-グリコシド結合複合型糖鎖を有するプロテインS分子からなる組成物中の糖鎖構造の解析は、プロテインS分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法[生物化学実験法23―糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（1989）]を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識又は同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖をHPAED-PAD法[ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（J. Liq. Chromatogr.）, 6, 1577 (1983)]によって分析することで決定することもできる。
【００３３】
本発明において、糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖とは、糖鎖に、実質的にフコースが結合していないことをいい、好ましくはフコース含有率が０％であることをいう。実質的にフコースが結合していないとは、具体的には、後述の４に記載の糖鎖分析において、フコースが実質的に検出できない程度であることをいう。実質的に検出できないとは、測定の検出限界以下であることを意味する。
【００３４】
本発明のプロテインS組成物は、従来から知られているヒト血漿由来または遺伝子組換え体プロテインSなどのN-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合しているプロテインSに比べて、糖化蛋白質受容体（RAGE）などのパターン認識型受容体ファミリーに対する高い親和性を有し、かつリンパ球や血管内皮細胞からの炎症性サイトカイン分泌を抑制し、高い抗炎症作用を発揮することによる。
【００３５】
本発明において、糖化蛋白質受容体（Receptor for advanced glycation endproducts；RAGE）とは、1992年にSternらによって単離された別名AGER（Advanced glycosylation endproduct-specific receptor）とも呼ばれるイムノグロブリンスーパーファミリーに属する蛋白質であり（J Biol Chem 267, 14998 (1992)）、糖化蛋白質（Advanced glycation endproducts；AGEs）、High mobility group box chromosomal protein (HMGB）蛋白質、S100（soluble in 100% saturated ammonium sulfate）ペプチド（Calgranulin）ファミリー、アンフォテリン（Amphoterin）、βアミロイド、カルボキシメチルリジン修飾蛋白質、などに対する結合活性を有する蛋白質であればいかなるものも包含される。また、RAGEは、Toll-like receptorと同じくパターン認識型受容体ファミリー（pattern recognition receptor family；PRRファミリー）に属しており、単独もくしは他のPRRフェミリーと共同して自然免疫、獲得免疫に直接的および/または間接的に関与している。その具体的なRAGEの例としては、下記(a)、(b)、(c)、(d)の蛋白質などがあげられる。
(a)細胞外領域にイムノグロブリン様V型ドメインと２つのC型ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを有する完全長の膜型RAGE；
(b) 細胞外領域にイムノグロブリン様V型ドメインと２つのC型ドメイン、および膜貫通ドメインを有し、細胞内ドメインを欠くDominant negative RAGE（dnRAGE）；
(c) 細胞外領域にイムノグロブリン様V型ドメインと２つのC型ドメインを有し、膜貫通ドメインと細胞内ドメインを欠く分泌型（可溶型）RAGE（esRAGE）；
(d) 細胞外領域に２つのイムノグロブリン様C型ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを有し、細胞外のV型ドメインを欠くアミノ末端欠失型RAGE（ntRAGE）。
【００３６】
更に、本発明のフコースの無いプロテインS組成物は、健常人ヒト血液中に存在する天然プロテインSと比べて、CD14（Science 239, 497-500, 1988, NCBI reference sequence : NP_000582.1）への結合活性が高い。
本発明において、CD14（Lipopolysaccharide/LPS binding protein-receptor; LPS/LBP-R）とは、RAGEやToll-like receptorと同じくPRRファミリーに属し、356アミノ酸で構成される１回膜貫通型の糖蛋白質であり、炎症条件下で活性化した血管内皮、単球、好中球や樹状細胞の表面上に発現しており、単球分化抗原として知られている（NCBI reference sequence : NP_000582.1）。また、CD14は、ヒトにおいて炎症が過剰亢進し多臓器不全を生じた場合に、患者血漿中の可溶型CD14濃度が有意に上昇することも知られている。更に、CD14に、リガンドであるリポ多糖（Lipopolysaccharide; LPS）-LPS結合蛋白（LPS binding protein）複合体が結合すると、細胞内に炎症応答反応を引き起こすシグナルが伝達され、HMGB-1産生などが亢進することが知られている。これらのことから、CD14はRAGEと同様に、敗血症などの炎症性疾患における炎症メディエーターのひとつとして知られている。
【００３７】
本発明のプロテインS組成物を生産する細胞としては、本発明のプロテインS組成物を生産することができる細胞であれば、いかなる細胞も包含される。具体的には、プロテインS分子をコードするDNAを、以下の(a)〜（c)などの宿主細胞に導入して得られる細胞があげられる。
(a) 細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素の活性が欠失するようにゲノムが改変された細胞；
(b) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が欠失するようにゲノムが改変された細胞。
(c)  細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性が欠失するようにゲノムが改変された細胞。
【００３８】
細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素としては、GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ（GMD）、GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ（FX）などがあげられる。N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、α1,6-フコシルトランスフェラーゼなどがあげられる。細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質としては、GDP-フコーストランスポーターなどがあげられる。
【００３９】
上記宿主細胞としては、好ましくは宿主細胞内のα1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がノックアウトされた宿主細胞があげられる（WO02/31140、WO03/85107）。
また、上述の酵素活性が欠失した宿主細胞、すなわち細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素または細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性が欠失するようにゲノムが改変された宿主細胞に、プロテインS分子をコードするDNAを導入することによって、本発明のプロテインS組成物を生産する細胞を得ることができる。
【００４０】
ここで、細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素または細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性が欠失するようにゲノムが改変されたとは、該酵素の発現を消失させるように該遺伝子の発現調節領域に変異を導入したり、あるいは該酵素の機能を消失させるように該遺伝子のアミノ酸配列に変異を導入することを意味する。変異を導入するとは、ゲノム上の塩基配列に欠失、置換、挿入および／または付加といった塩基配列の改変を行うことを意味し、改変したゲノム遺伝子の発現または機能を完全に抑制することをノックアウトするという。ゲノム遺伝子をノックアウトする具体的な例としては、標的となる遺伝子のすべてまたは一部がゲノムから削除された例が挙げられる。標的となる遺伝子の開始コドンを含むエクソンのゲノム領域を染色体上から除くことでノックアウトすることができる。
【００４１】
このような細胞を取得する方法としては、目的とするゲノムの改変を行うことができれば、いずれの手法でも用いることができる。上述の酵素活性を欠失させる手法として、
（ａ）酵素の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法；
（ｂ）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
（ｃ）酵素についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法；
（ｅ）N-グリコシド結合糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法などがあげられる。
【００４２】
N-グリコシド結合糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、いずれのレクチンでも用いることができる。その具体的な例としては、レンズマメレクチンLCA（Lens Culinaris由来のLentil Agglutinin）、エンドウマメレクチンPSA（Pisum sativum由来のPea Lectin）、ソラマメレクチンVFA（Vicia faba由来のAgglutinin）、ヒイロチャワンタケレクチンAAL（Aleuria aurantia由来のLectin）、アスペルギルス・オリゼレクチンAOL（Aspergillus oryzae由来のLectin）等を挙げることができる。
【００４３】
レクチンに耐性な細胞とは、レクチンを有効濃度与えたときにも、生育が阻害されない細胞をいう。有効濃度とは、ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞（以下、「親株細胞」とも称す）が正常に生育できない濃度以上であり、好ましくは、ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞が生育できない濃度と同濃度、より好ましくは2〜5倍、さらに好ましくは10倍、最も好ましくは20倍以上である。
【００４４】
本発明において、生育が阻害されないレクチンの有効濃度は、細胞株に応じて適宜定めればよいが、通常10μg/mL〜10 mg/mL、好ましくは0.5 mg/mL〜2.0 mg/mLである。
本発明の形質転換体としては、本発明の組成物を発現できる細胞であればいかなる細胞でもよいが、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などがあげられ、これらの細胞の具体的な例としては、後述の２．に記載のものがあげられる。動物細胞の具体例としては、チャイニーズハムスター卵巣組織由来のCHO細胞、ラットミエローマ細胞株YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞、マウスミエローマ細胞株NS0細胞、マウスミエローマ細胞株SP2/0-Ag14細胞、シリアンハムスター腎臓組織由来BHK細胞、ヒトバーキットリンパ腫由来ナマルバ細胞、ヒト網膜芽腫由来PER.C6細胞、ヒト胚性腎臓組織由来HEK293細胞、ヒト骨髄性白血病由来NM-F9細胞、胚性幹細胞、および受精卵細胞などがあげられる。好ましくは、遺伝子組換え糖蛋白質医薬品を製造するための宿主細胞、遺伝子組換え糖蛋白質医薬品を生産するヒト以外のトランスジェニック動物を製造するために用いる胚性幹細胞または受精卵細胞、ならびに遺伝子組換え糖蛋白質医薬品を生産するトランスジェニック植物を製造するために用いる植物細胞などがあげられる。
【００４５】
親株細胞としては、細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素または細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質のゲノム遺伝子を改変させるための手法を施す前の細胞を包含する。例えば、以下の細胞が好適にあげられる。
【００４６】
NS0細胞の親株細胞としては、バイオ/テクノロジー(BIO/TECHNOLOGY), 10, 169 (1992)、バイオテクノロジー・バイオエンジニアリング(Biotechnol. Bioeng.), 73, 261, (2001)等の文献に記載されているNS0細胞があげられる。また、理化学研究所細胞開発銀行に登録されているNS0細胞株（RCB0213）、あるいはこれら株を様々な無血清培地に馴化させた亜株などもあげられる。
【００４７】
SP2/0-Ag14細胞の親株細胞としては、ジャーナル・オブ・イムノロジー(J. Immunol.), 126, 317, (1981)、ネイチャー(Nature), 276, 269, (1978) 、ヒューマン・アンチィボディズ・アンド・ハイブリドーマズ(Human Antibodies and Hybridomas), 3, 129, (1992) 等の文献に記載されているSP2/0-Ag14細胞があげられる。また、ATCCに登録されているSP2/0-Ag14細胞（ATCC CRL-1581）あるいはこれら株を様々な無血清培地に馴化させた亜株（ATCC CRL-1581.1）などもあげられる。
【００４８】
チャイニーズハムスター卵巣組織由来CHO細胞の親株細胞としては、Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968)、Genetics, 55, 513 (1968)、Chromosoma, 41, 129 (1973)、Methods in Cell Science, 18, 115 (1996)、Radiation Research, 148, 260 (1997)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)、Proc. Natl. Acad. Sci. 60, 1275 (1968)、Cell, 6, 121 (1975)、Molecular Cell Genetics, Appendix I,II (p883-900)等の文献に記載されているCHO細胞があげられる。また、ATCCに登録されているCHO-K1株（ATCC CCL-61）、DUXB11株（ATCC CRL-9096）、Pro-5株（ATCC CRL-1781）や、市販のCHO-S株（Lifetechnologies社製 Cat#11619）、あるいはこれら株を様々な無血清培地に馴化させた亜株などもあげられる。
【００４９】
ラットミエローマ細胞株YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞の親株細胞としては、Y3/Ag1.2.3細胞（ATCC CRL-1631）から樹立された株化細胞が包含される。その具体的な例としては、J. Cell. Biol., 93, 576 (1982)、Methods Enzymol. 73B, 1 (1981)等の文献に記載されているYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞があげられる。また、ATCCに登録されているYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞（ATCC CRL-1662）あるいはこれら株を様々な無血清培地に馴化させた亜株などもあげられる。
【００５０】
本発明のプロテインS組成物を生産する細胞としては、具体的には、α1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がノックアウトされたCHO細胞にプロテインSをコードする遺伝子を導入した形質転換株を無血清培地に馴化した株、GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼをコードする遺伝子がノックアウトされたCHO細胞にプロテインSをコードする遺伝子を導入した形質転換株を無血清培地に馴化した株、またはGDP-フコーストランスポーターをコードする遺伝子がノックアウトされたCHO細胞にプロテインSをコードする遺伝子を導入した形質転換株を無血清培地に馴化した株等があげられる。
【００５１】
本発明のトランスジェニック動物としては、細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素または細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性を欠失させるようにゲノム遺伝子を改変させたトランスジェニック動物などがあげられる。
【００５２】
具体的には、α1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がノックアウトされたトランスジェニック動物にプロテインSをコードする遺伝子を導入した動物、GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼをコードする遺伝子がノックアウトされたトランスジェニック動物にプロテインSをコードする遺伝子を導入した動物、またはGDP-フコーストランスポーターをコードする遺伝子がノックアウトされたトランスジェニック動物にプロテインSをコードする遺伝子を導入した動物などがあげられる。
【００５３】
本発明の形質転換体は、親株細胞から得られるプロテインS組成物に比べて、糖化蛋白質受容体（RAGE）への高い親和性を有しており、かつ高い抗炎症作用を発揮しうるプロテインS組成物を製造することができる。
プロテインS組成物の血液凝固阻害活性、血中半減期、RAGEに対する結合活性、抗炎症作用は、既に公知のin vitro試験あるいはマウスやラット、ウサギなどのモデル動物を用いたin vivo試験あるいはヒトを用いた臨床試験などを用いて測定することができる［JBC 256, 11128 (1981)、JBC 270, 27852 (1995)、JBC 272, 20678 (1997)、JBC 261, 12022 (1986)、Thromb Haemost 85, 761 (2001)、JBC 268, 2872 (1993)、PNAS 91, 2728 (1994)、Blood 86, 1062 (1995)、Thromb Haemost 80, 930 (1998)、Thromb Haemost 82, 80 (1999)、Arterioscler Thromb Vasc Biol 25, 2209 (2005)、Eur J Immunol 38, 809 (2008)、Arthritis Rheumatism 54、 3898 (2006)、Critical Care 11, R122 (2007)、Blood 86, 2642 (1995)、J Clin Invest 95, 1987 (1995)、Thromb Haemost 90, 227 (2003)］。
【００５４】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明のプロテインS組成物を生産するために用いる宿主細胞の作製
本発明のプロテインS組成物を生産するために用いる宿主細胞は、以下に述べる手法により作製することができる。
（１）酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
本発明のプロテインS組成物作製のために用いる宿主細胞は、細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素または細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質（以下、「フコース修飾に関連する酵素」と表記する）の遺伝子を標的とし、遺伝子破壊の方法を用いることにより作製することができる。細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、GDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ（以下、「GMD」と表記する）、GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ（以下、「Fx」と表記する）などがあげられる。N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α1,6-フコシルトランスフェラーゼ、α-L-フコシダーゼなどがあげられる。または細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質としては、GDP-フコーストランスポーターなどがあげられる。
【００５５】
ここでいう遺伝子とは、DNAまたはRNAを含む。
遺伝子破壊の方法としては、標的とする酵素の遺伝子を破壊することができる方法であればいかなる方法も包含される。その例としては、アンチセンス法、リボザイム法、相同組換え法、RNA-DNA オリゴヌクレオチド法（以下、「RDO法」と表記する）、RNAインターフェアレンス法（以下、「RNAi法」と表記する）、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法等があげられる。以下これらを具体的に説明する。
（ａ）アンチセンス法又はリボザイム法による本発明のプロテインS組成物を作製するための宿主細胞の作製
本発明のプロテインS組成物作製のために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する酵素遺伝子を標的とし、細胞工学, 12, 239 (1993)、バイオ／テクノロジー(BIO/TECHNOLOGY), 17, 1097 (1999)、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス(Hum. Mol. Genet.), 5, 1083 (1995)、細胞工学, 13, 255 (1994)、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 96, 1886 (1999)等に記載されたアンチセンス法またはリボザイム法を用いて、例えば、以下のように作製することができる。フコース修飾に関連する酵素をコードするcDNAあるいはゲノムDNAを調製する。調製したcDNAあるいはゲノムDNAの塩基配列を決定する。決定したDNAの配列に基づき、フコース修飾に関連する酵素をコードするDNA部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝子またはリボザイムのコンストラクトを設計する。該アンチセンス遺伝子、またはリボザイムを細胞内で発現させるために、調製したDNAの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
【００５６】
フコース修飾に関連する酵素の活性を指標として形質転換体を選択することにより、本発明のプロテインS組成物作製のために用いる宿主細胞を得ることができる。また、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造または産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択することにより、本発明のプロテインS組成物作製のために用いる宿主細胞を得ることもできる。
【００５７】
本発明のプロテインS組成物を作製するために用いられる宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、標的とするフコース修飾に関連する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能であるか、ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したアンチセンス遺伝子、またはリボザイムを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述３に記載の発現ベクターがあげられる。
【００５８】
各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
フコース修飾に関連する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、以下の方法があげられる。
形質転換体を選択する方法
フコース修飾に関連する酵素の活性が欠失した細胞を選択する方法としては、文献［新生化学実験講座３―糖質Ｉ,糖タンパク質(東京化学同人)日本生化学会編(1988)］、文献[細胞工学, 別冊, 実験プロトコールシリーズ,グライコバイオロジー実験プロトコール,糖タンパク質・糖脂質・プロテオグリカン(秀潤社製)谷口直之・鈴木明美・古川清・菅原一幸監修（1996）]、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などを用いて、フコース修飾に関連する酵素の活性を測定する方法があげられる。生化学的な方法としては、例えば、酵素特異的な基質を用いて酵素活性を評価する方法があげられる。遺伝子工学的な方法としては、例えば、酵素遺伝子のmRNA量を測定するノーザン解析やRT-PCR法等があげられる。
【００５９】
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述５に記載の方法があげられる。産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述５に記載の方法があげられる。
フコース修飾に関連する酵素をコードするcDNAを調製する方法としては、例えば、下記に記載の方法があげられる。
cDNAの調製方法
各種宿主細胞の組織又は細胞から全RNA又はmRNAを調製する。調製した全RNA又はmRNAからcDNAライブラリーを作製する。フコース修飾に関連する酵素のアミノ酸配列に基づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したcDNAライブラリーを鋳型としてPCR法でフコース修飾に関連する酵素をコードする遺伝子断片を取得する。取得した遺伝子断片をプローブとして用い、cDNAライブラリーをスクリーニングし、フコース修飾に関連する酵素をコードするDNAを取得することができる。ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞のmRNAは市販のもの(例えばClontech社)を用いてもよいし、以下のようにしてヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞から調製してもよい。
【００６０】
ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞から全RNAを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン-トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology), 154, 3 (1987)］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法［アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry), 162, 156 (1987); 実験医学、9, 1937 (1991)］などがあげられる。
【００６１】
また、全RNAからpoly(A)+ RNAとしてmRNAを調製する方法としては、オリゴ（dT）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。さらに、Fast Track mRNA Isolation Kit（Invitrogen社）、Quick Prep mRNA Purification Kit（Pharmacia社）などの市販のキットを用いることによりmRNAを調製することができる。
次に、調製したヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞mRNAからcDNAライブラリーを作製する。cDNAライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、A Laboratory Manual, 2 nd Ed.(1989)等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばSuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（Life Technologies社）、ZAP-cDNA Synthesis Kit（STRATAGENE社）を用いる方法などがあげられる。
【００６２】
cDNAライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌K12株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ZAP Express［STRATAGENE社、ストラテジーズ(Strategies), 5, 58 (1992)］、pBluescript II SK(+)［ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research), 17, 9494 (1989)］、λZAP II（STRATAGENE社）、λgt10、λgt11［ディーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプローチ(DNA cloning, A Practical Approach),1, 49 (1985)］、λTriplEx（Clontech社）、λExCell（Pharmacia社）、pT7T318U（Pharmacia社）、pcD2［モレキュラー・セルラー・バイオロジー(Mol. Cell. Biol.), 3, 280 (1983)］およびpUC18［ジーン(Gene), 33, 103 (1985)］等をあげることができる。
【００６３】
cDNAライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、Escherichiacoli XL1-Blue MRF'［STRATAGENE社、ストラテジーズ(Strategies), 5, 81 (1992)］、Escherichiacoli C600［ジェネティクス(Genetics), 39, 440 (1954)］、Escherichia coliY1088［サイエンス(Science), 222, 778 (1983)］、Escherichia coliY1090［サイエンス(Science), 222, 778 (1983)］、Escherichia coliNM522［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.), 166, 1 (1983)］、Escherichiacoli K802［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.), 16, 118 (1966)］およびEscherichiacoli JM105［ジーン(Gene), 38, 275 (1985)］等が用いられる。
【００６４】
このcDNAライブラリーは、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長cDNAの割合を下げ、なるべく完全長cDNAを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法［ジーン(Gene), 138, 171 (1994); ジーン(Gene), 200, 149 (1997); 蛋白質核酸酵素, 41, 603 (1996); 実験医学, 11, 2491 (1993); cDNAクローニング(羊土社)(1996); 遺伝子ライブラリーの作製法(羊土社) (1994)］を用いて調製して以下の解析に用いてもよい。
【００６５】
フコース修飾に関連する酵素のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の5'末端および3'末端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したcDNAライブラリーを鋳型としてPCR法［ピーシーアール・プロトコールズ(PCR Protocols), Academic Press (1990)］を用いてDNAの増幅を行うことにより、フコース修飾に関連する酵素をコードする遺伝子断片を取得することができる。
【００６６】
取得した遺伝子断片がフコース修飾に関連する酵素をコードするDNAであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Sanger）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)］あるいはABI PRISM377DNAシークエンサー（Applied Biosystems社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
【００６７】
該遺伝子断片をプローブとして、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれるmRNAから合成したcDNAあるいはcDNAライブラリーからコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）等を用いて、フコース修飾に関連する酵素のDNAを取得することができる。
また、フコース修飾に関連する酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを用い、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞に含まれるmRNAから合成したcDNAあるいはcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法を用いて増幅することにより、フコース修飾に関連する酵素のcDNAを取得することもできる。
【００６８】
取得したフコース修飾に関連する酵素をコードするDNAの塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Sanger）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)］あるいはABI PRISM377DNAシークエンサー（Applied Biosystems社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該DNAの塩基配列を決定することができる。
【００６９】
決定したcDNAの塩基配列をもとに、BLAST等の相同性検索プログラムを用いて、Genbank、EMBLおよびDDBJなどの塩基配列データベースを検索することにより、取得したDNAがデータベース中の遺伝子の中でフコース修飾に関連する酵素をコードしている遺伝子であることを確認することもできる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素をコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば、WO2005/035741に記載のGDP-マンノース 4,6-デヒドラターゼ、及び、GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼの塩基配列があげられる。
【００７０】
上記の方法で得られるN-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば、米国特許US7393683に記載のα1,6-フコシルトランスフェラーゼの塩基配列があげられる。
上記の方法で得られる細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質としては、例えば、US2004/0110282に記載のGDP-フコーストランスポーターの塩基配列があげられる。
【００７１】
決定されたDNAの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したDNA合成機model 392（Perkin Elmer社製）等のDNA合成機で化学合成することにより、フコース修飾に関連する酵素のcDNAを取得することもできる。
フコース修飾に関連する酵素のゲノムDNAを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。
ゲノムDNAの調製方法
ゲノムDNAを調製する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムDNAライブラリースクリーニングシステム（Genome Systems社）やUniversal GenomeWalkerTM Kits（CLONTECH社）などを用いることにより、フコース修飾に関連する酵素のゲノムDNAを取得することもできる。取得したフコース修飾に関連する酵素をコードするDNAの塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Sanger）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)］あるいはABI PRISM377DNAシークエンサー（Applied Biosystems社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該DNAの塩基配列を決定することができる。
【００７２】
決定したゲノムDNAの塩基配列をもとに、BLAST等の相同性検索プログラムを用いて、Genbank、EMBLおよびDDBJなどの塩基配列データベースを検索することにより、取得したDNAがデータベース中の遺伝子の中でフコース修飾に関連する酵素をコードしている遺伝子であることを確認することもできる。
決定されたDNAの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したDNA合成機model 392（Perkin Elmer社製）等のDNA合成機で化学合成することにより、フコース修飾に関連する酵素のゲノムDNAを取得することもできる。
【００７３】
また、発現ベクターを用いず、フコース修飾に関連する酵素の塩基配列に基づいて設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを、直接宿主細胞に導入することで、本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞を得ることもできる。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムは、常法またはDNA合成機により調製することができる。具体的には、フコース修飾に関連する酵素をコードするcDNAおよびゲノムDNAの塩基配列のうち、連続した5〜150塩基、好ましくは5〜60塩基、より好ましくは10〜40塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）または該オリゴヌクレオチドの配列を含むリボザイムを合成して調製することができる。
【００７４】
オリゴヌクレオチドとしては、オリゴRNAおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）等があげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３'-Ｐ５'ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ-５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ-５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ-５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified cytosine）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２'-O-プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２'-メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる［細胞工学, 16, 1463 (1997)］。
（ｂ）相同組換え法による本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する酵素の遺伝子を標的とし、染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を用いて改変することによって作製することができる。
【００７５】
染色体上の標的遺伝子の改変は、Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)（以下、「マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル」と略す）、Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング, ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製,羊土社 (1995)（以下、「ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」と略す）等に記載の方法を用い、例えば以下のように行うことができる。
【００７６】
フコース修飾に関連する酵素のゲノムDNAを調製する。
ゲノムDNAの塩基配列にも基づき、改変する標的遺伝子（例えば、フコース修飾に関連する酵素の構造遺伝子、あるいはプロモーター遺伝子）を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。
作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、染色体上の標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞を作製することができる。
【００７７】
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするフコース修飾に関連する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。
フコース修飾に関連する酵素のゲノムDNAを調製する方法としては、本項１（a）に記載のゲノムDNAの調製方法などがあげられる。
【００７８】
染色体上の標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング, ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製(羊土社)(1995)等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができる。
【００７９】
各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、後述の３に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング, ES細胞を用いた変異マウスの作製(羊土社)(1995)等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリA選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やPCR法［ピーシーアール・プロトコールズ(PCR Protocols), Academic Press (1990)］等があげられる。
(ｃ) RDO方法による本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する酵素の遺伝子を標的とし、RDO法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
【００８０】
フコース修飾に関連する酵素のcDNAあるいはゲノムDNAを本項１（a）に記載の方法を用い、調製する。調製したcDNAあるいはゲノムDNAの塩基配列を決定する。決定したDNAの配列に基づき、フコース修飾に関連する酵素をコードする部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのRDOのコンストラクトを設計し合成する。合成したRDOを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、すなわちフコース修飾に関連する酵素に変異が生じた形質転換体を選択することにより、本発明の組成物作製のための宿主細胞を作製することができる。
【００８１】
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするフコース修飾に関連する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述３に記載の宿主細胞があげられる。
各種宿主細胞へのRDOの導入には、後述３に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
【００８２】
フコース修飾に関連する酵素のcDNAを調製する方法としては、例えば、本項１（a）に記載のcDNAの調製方法などがあげられる。
フコース修飾に関連する酵素のゲノムDNAを調製する方法としては、例えば、本項１（a）に記載のゲノムDNAの調製方法などがあげられる。
DNAの塩基配列は、適当な制限酵素などで切断後、pBluescript SK(-)（Stratagene社製）等のプラスミドにサブクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Sanger）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.,U.S.A.), 74, 5463 (1977)］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、ABI PRISM377DNAシークエンサー（Applied Biosystems社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
【００８３】
RDOは、常法またはDNA合成機を用いることにより調製することができる。
RDOを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、フコース修飾に関連する酵素の遺伝子に変異が生じた細胞を選択する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法があげられる。
【００８４】
また、前記に記載の、導入したフコース修飾に関連する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法、後述の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法、あるいは、後述の産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法も用いることができる。
RDOのコンストラクトは、サイエンス(Science), 273, 1386 (1996); ネイチャー・メディシン(Nature Medicine), 4, 285 (1998); へパトロジー(Hepatology), 25, 1462 (1997); ジーン・セラピー(Gene Therapy), 5, 1960 (1999); ジーン・セラピー(Gene Therapy), 5, 1960 (1999); ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン(J. Mol. Med.), 75, 829 (1997); プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8774 (1999); プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8768 (1999); ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nuc. Acids. Res.), 27, 1323 (1999); インベスティゲーション・オブ・ダーマトロジー(Invest. Dematol.), 111, 1172 (1998); ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotech.), 16, 1343 (1998); ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotech.), 18, 43 (2000); ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotech.), 18, 555 (2000)等の記載に従って設計することができる。
（ｄ）RNAi法による本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する酵素の遺伝子を標的とし、RNAi法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
【００８５】
フコース修飾に関連する酵素の上記１に記載の方法を用い、cDNAを調製する。調製したcDNAの塩基配列を決定する。決定したcDNAの配列に基づき、フコース修飾に関連する酵素をコードする部分あるいは非翻訳領域の部分を含む適当な長さのRNAi遺伝子のコンストラクトを設計する。
該RNAi遺伝子を細胞内で発現させるために、調製したcDNAの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
【００８６】
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
導入したフコース修飾に関連する酵素の活性、あるいは産生糖蛋白質分子または細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞を得ることができる。
【００８７】
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするフコース修飾に関連する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述３に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体への組み込みが可能で、設計したRNAi遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述３に記載の発現ベクターがあげられる。
【００８８】
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述３に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
フコース修飾に関連する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、本項１に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、本項１（ａ）に記載の方法があげられる。産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述５の方法があげられる。
【００８９】
フコース修飾に関連する酵素のcDNAを調製する方法としては、例えば、本項１（ａ）に記載されたcDNAの調製方法などがあげられる。
また、発現ベクターを用いず、フコース修飾に関連する酵素の塩基配列に基づいて設計したRNAi遺伝子を、直接宿主細胞に導入することで、本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞を得ることもできる。
【００９０】
RNAi遺伝子は、常法またはDNA合成機を用いることにより調製することができる。RNAi遺伝子のコンストラクトは、[ネイチャー(Nature), 391, 806 (1998); プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 15502 (1998); ネイチャー(Nature), 395, 854 (1998); プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 5049 (1999); セル(Cell), 95, 1017 (1998); プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 1451 (1999); プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 13959 (1998); ネイチャー・セル・バイオロジー(Nature Cell Biol.), 2, 70 (2000)]等の記載に従って設計することができる。
（ｅ）トランスポゾンを用いた方法による、本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞の作製
本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞は、ネイチャー・ジェネティク(Nature Genetics，25, 35 (2000)等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、フコース修飾に関連する酵素の活性、あるいは産生糖蛋白質分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に突然変異体を選択することで、本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞を作製することができる。
【００９１】
トランスポゾンのシステムとは、外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させることで突然変異を誘発させるシステムであり、通常、トランスポゾンに挿まれた外来遺伝子に突然変異を誘発させるベクターとして用い、この遺伝子を染色体上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞の中に導入する。
トランスポゼースは、用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいかなるものも用いることができる。
【００９２】
外来遺伝子としては、宿主細胞のDNAに変異を誘起するものであればいかなる遺伝子も用いることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするフコース修飾に関連する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述２に記載の宿主細胞があげられる。各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述２に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
【００９３】
フコース修飾に関連する酵素の活性を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、本項１（ａ）に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、本項１（ａ）に記載の方法があげられる。産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、後述５に記載の方法があげられる。
（２）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法
本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する酵素の遺伝子を標的とし、該酵素のドミナントネガティブ体を導入する手法を用いることにより作製することができる。細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、GMD、Fxなどがあげられる。N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α1,6−フコシルトランスフェラーゼ、α-L-フコシダーゼなどがあげられる。GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質としては、具体的には、GDP-フコーストランスポーターなどがあげられる。
【００９４】
これらの酵素または蛋白質は、基質特異性を有したある特定の反応を触媒する酵素や蛋白質であり、このような基質特異性を有した触媒作用を有する酵素や蛋白質の活性中心を破壊することで、これらの酵素のドミナントネガティブ体を作製することができる。標的とする酵素のうち、GMDを例として、そのドミナントネガティブ体に作製について具体的に以下に述べる。
【００９５】
大腸菌由来のGMDの立体構造を解析した結果、４つのアミノ酸（133番目のトレオニン、135番目のグルタミン酸、157番目のチロシン、161番目のリジン）が酵素活性に重要な機能を担っていることが明らかにされている（Structure, 8, 2, 2000）。そこで、立体構造の情報にもとづきこれら４つのアミノ酸を異なる他のアミノ酸に置換した変異体を作製した結果、いずれの変異体においても有意に酵素活性が低下していたことが示されている。一方、GMDの補酵素NADPや基質であるGDP-マンノースとの結合能に関しては、いずれの変異体においてもほとんど変化が観察されていない。従って、GMDの酵素活性を担うこれら４つのアミノ酸を置換することによりドミナントネガティブ体を作製することができる。大腸菌由来のGMDのドミナントネガティブ体の作製の結果に基づき、アミノ酸配列情報をもとにした相同性比較や立体構造予測を行うことにより、例えば、CHO細胞由来のGMDでは、155番目のトレオニン、157番目のグルタミン酸、179番目のチロシン、183番目のリジンを他のアミノ酸に置換することによりドミナントネガティブ体を作製することができる。このようなアミノ酸置換を導入した遺伝子の作製は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。
【００９６】
本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞は、上述のように作製した標的酵素のドミナントネガティブ体をコードする遺伝子（以下、ドミナントネガティブ体遺伝子と略記する）を用い、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載された遺伝子導入の方法に従って、例えば、以下のように作製することができる。
【００９７】
フコース修飾に関連する酵素のドミナントネガティブ体遺伝子を調製する。
調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長DNAをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。
該DNA断片、または全長DNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
【００９８】
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得る。
フコース修飾に関連する酵素の活性、あるいは産生糖蛋白質分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞を作製することができる。
【００９９】
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするフコース修飾に関連する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述３に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、目的とするドミナントネガティブ体をコードするDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述２に記載の発現ベクターがあげられる。
【０１００】
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述３に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
フコース修飾に関連する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、前述の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述１の（５）に記載の方法があげられる。産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述４に記載の方法があげられる。
（３）酵素に突然変異を導入する手法
本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する酵素の遺伝子に突然変異を導入し、該酵素に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いることにより作製できる。
【０１０１】
細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、GMD、Fxなどがあげられる。N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α-L-フコシダーゼなどがあげられる。細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質としては、GDP-フコーストランスポーターなどがあげられる。
【０１０２】
フコース修飾に関連する酵素に突然変異を導入する方法としては、１）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、フコース修飾に関連する酵素の活性を指標として所望の細胞株を選択する方法、２）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、生産糖蛋白質分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、３）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、該細胞の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などがあげられる。
【０１０３】
突然変異誘発処理としては、親株の細胞のDNAに点突然変異、欠失あるいはフレームシフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができる。
具体的には、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン、アクリジン色素による処理、放射線の照射などがあげられる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。突然変異誘発物質を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術 第三版（朝倉書店）日本組織培養学会編(1996)、ネイチャー・ジェネティクス(Nature Genetics, 24, 314, (2000))等に記載の方法を挙げることができる。
【０１０４】
自然発生的に生じた突然変異体としては、特別な突然変異誘発処理を施さないで、通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる突然変異体を挙げることができる。
フコース修飾に関連する酵素の活性を測定する方法としては、例えば、本項１（ａ）に記載の方法があげられる。産生糖蛋白質分子の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、後述５に記載の方法があげられる。細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、本項の１の（５）に記載の方法があげられる。
（４）酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法
本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞は、フコース修飾に関連する酵素の遺伝子を標的とし、アンチセンスRNA／DNA技術［バイオサイエンスとインダストリー, 50, 322 (1992)、化学, 46, 681 (1991)、Biotechnology,9, 358 (1992)、Trends in Biotechnology,10, 87 (1992)、Trends in Biotechnology,10, 152 (1992)、細胞工学, 16, 1463 (1997)］、トリプル・ヘリックス技術［Trends in Biotechnology,10, 132 (1992)］等を用い、標的とする遺伝子の転写または翻訳を抑制することで作製することができる。
【０１０５】
細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素としては、具体的には、GMD、Fxなどがあげられる。N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α-L-フコシダーゼなどがあげられる。
（５）N-グリコシド結合糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法
本発明のプロテインS組成物を作製するために用いる宿主細胞は、N-グリコシド結合糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法を用いることにより作製することができる。
【０１０６】
N-グリコシド結合糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法としては、例えば、ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Somatic Cell Mol. Genet.）, 12, 51 (1986)等に記載のレクチンを用いた方法があげられる。
レクチンとしては、N-グリコシド結合糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いることができるが、その具体的な例としては、レンズマメレクチンLCA（LensCulinaris由来のLentil Agglutinin）エンドウマメレクチンPSA（Pisum sativum由来のPea Lectin）、ソラマメレクチンVFA（Vicia faba由来のAgglutinin）、ヒイロチャワンタケレクチンAAL（Aleuriaaurantia由来のLectin）等を挙げることができる。
【０１０７】
具体的には、１μg/mL〜１mg/mLの濃度の上述のレクチンを含む培地で１日〜２週間、好ましくは１日〜１週間培養し、生存している細胞を継代培養あるいはコロニーをピックアップし別の培養容器に移し、さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることによって、N-グリコシド結合糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択することができる。
２．本発明のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫の作製
本発明のプロテインS分子の糖鎖の修飾に係わる酵素の活性が制御されるようにゲノム遺伝子が改変されたトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫は、細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素またはN-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子または細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質を標的として、前記１を用いて作製した本発明の胚性幹細胞、受精卵細胞、植物カルス細胞より、例えば以下のように作製することができる。
【０１０８】
トランスジェニック非ヒト動物の場合、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の胚性幹細胞に、前記１．に記載の手法を用いることにより、細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素の活性、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素または細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性が制御された本発明の胚性幹細胞を作製することができる（Nature Biotechnology, vol.21, 157-162（2003）, Nature Biotechnology, vol. 174, 56-461（1999）, Glycobiology, vol.14, 51-64（2004））。
【０１０９】
具体的は、染色体上の細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素の活性、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素または細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質をコードする遺伝子を公知の相同組換えの手法［例えば、Nature, 326, 6110, 295 (1987)、Cell, 51, 3, 503 (1987)等］により不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作製する。作製した胚性幹細胞（例えば、該変異クローン）を用い、動物の受精卵の胚盤胞(blastcyst)への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により、胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を調製することができる。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞で細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素の活性、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素または細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白の活性が低下したトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。
【０１１０】
また、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の受精卵細胞に、前記１．に記載の手法と同様の手法を用いることにより、細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素の活性、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素または細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性が低下した本発明の受精卵細胞を作製することができる。
【０１１１】
作製した受精卵細胞を、マニピューレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載の胚移植の方法を用いて偽妊娠雌の卵管あるいは子宮に移植し出産させることで、細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素の活性、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素または細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性が低下したトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。
【０１１２】
トランスジェニック植物の場合、目的とする植物体カルスまたは細胞に、前記１．に記載の手法と同様の手法を用いることにより、細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素の活性、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素または細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性が低下した本発明のカルスを作製することができる。
【０１１３】
作製したカルスを、公知の方法[組織培養, 20(1994); 組織培養, 21 (1995);
トレンズ・イン・バイオテクノロジー(Trends in Biotechnology), 15, 45 (1997)]に準じてオーキシン及びサイトカイニンを含む培地で培養することで再分化させ、細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースの合成に関与する酵素の活性、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素または細胞内糖ヌクレオチドGDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性が低下したトランスジェニック植物を作製することができる。
３．本発明のプロテインS組成物の製造方法
本発明のプロテインS組成物は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988（以下、アンチボディズと略す）、Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993（以下、モノクローナルアンチボディズと略す）、Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996（以下、アンチボディエンジニアリングと略す）等に記載された方法を用い、例えば、以下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。
【０１１４】
プロテインS分子の全長cDNAを調製し、該プロテインS分子をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。
該DNA断片、または全長cDNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、プロテインS分子を生産する形質転換体を得ることができる。
【０１１５】
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
プロテインS分子に結合するN-グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素、すなわちフコース修飾に関連する酵素の活性が欠失した細胞を選択するか、または前述１に示された種々の人為的手法により得られた細胞を宿主細胞として用いることもできる。
【０１１６】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、目的とするプロテインS分子をコードするDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
cDNAは、前記１（ａ）に記載のcDNAの調製方法に従い、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞より、目的とするプロテインS分子に特異的なプローブやプライマー等を用いて調製することができる。
【０１１７】
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEP13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等をあげることができる。
【０１１８】
宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属、ピキア属等に属する微生物、例えば、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomycespombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomycesalluvius、Pichia pastoris等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods. Enzymol.),194, 182 (1990)］、スフェロプラスト法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 84, 1929 (1978)］、酢酸リチウム法［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J. Bacteriology),153, 163 (1983)］、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 75, 1929 (1978)］に記載の方法等をあげることができる。
【０１１９】
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8（フナコシ社より市販）、pAGE107［特開平3-22979；サイトテクノロジー(Cytotechnology), 3, 133, (1990)］、pAS3-3［特開平2-227075］、pCDM8［ネイチャー(Nature), 329, 840, (1987)］、pcDNAI/Amp（Invitrogen社）、pREP4（Invitrogen社）、pAGE103［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J. Biochemistry),101, 1307 (1987)］、pAGE210等をあげることができる。
【０１２０】
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【０１２１】
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞、サルの細胞であるCOS細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637（特開昭63-299）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー(Cytotechnology), 3, 133 (1990)］、リン酸カルシウム法［特開平2-227075］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413 (1987)］、インジェクション法[マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル]、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［特許第2606856、特許第2517813］、DEAE-デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４―遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編(1994)］、ウイルスベクター法[マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版]等をあげることができる。
【０１２２】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーBaculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、バイオ／テクノロジー(Bio/Technology), 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、本発明の組成物を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、本発明のプロテインS組成物を発現させることができる。
【０１２３】
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（ともにInvitorogen社）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
【０１２４】
昆虫細胞としては、Spodopterafrugiperdaの卵巣細胞であるSf9、Sf21［カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーBaculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)］、Trichoplusianiの卵巣細胞であるHigh 5（Invitrogen社）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413 (1987)］等をあげることができる。
【０１２５】
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Tiプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
【０１２６】
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）［特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/00977］、エレクトロポレーション法［特開昭60-251887］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本特許第2606856、日本特許第2517813］等をあげることができる。
【０１２７】
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産等を行うことができる。
糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した、酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が付加されたプロテインS分子を得ることができる。
【０１２８】
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のプロテインS組成物を生成蓄積させ、該培養物から該組成物を採取することにより、本発明のプロテインS組成物を製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。但し、組換え蛋白質の生産用宿主として一般的に使用される酵母は、プロテインS蛋白質のアミノ末端側に存在するグルタミン酸残基をγ-カルボキシル化する活性を完全に欠いていることが知られている。
【０１２９】
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
【０１３０】
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常16時間〜17日間である。培養中のpHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【０１３１】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【０１３２】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地［ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエイション(The Journal of the American Medical Association),199, 519 (1967)］、EagleのMEM培地［サイエンス(Science),122, 501 (1952)］、ダルベッコ改変MEM培地［ヴュウロロジー(Virology), 8, 396 (1959)］、199培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of the Society for the Biological Medicine), 73, 1 (1950)］、Whitten培地[発生工学実験マニュアル-トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（1987）]またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
【０１３３】
培養は、通常pH6〜8、30〜40℃、5％ CO2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地（Pharmingen社）、Sf-900 II SFM培地（Life Technologies社）、ExCell400、ExCell405（いずれもJRH Biosciences社）、Grace's Insect Medium［ネイチャー(Nature), 195, 788 (1962)］等を用いることができる。
【０１３４】
培養は、通常pH6〜7、25〜30℃等の条件下で、1〜5日間行う。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。但し、組換え蛋白質の生産用宿主として一般的に使用される植物は、プロテインS蛋白質のアミノ末端側に存在するグルタミン酸残基をγ-カルボキシル化する活性を完全に欠いていることが知られている。
【０１３５】
培養は、通常pH5〜9、20〜40℃の条件下で3〜60日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。上記のとおり、プロテインS分子をコードするDNAを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明のプロテインS組成物を生成蓄積させ、該培養物よりプロテインS組成物を採取することにより、本発明のプロテインS組成物を製造することができる。
【０１３６】
プロテインS組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるプロテインS分子の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
プロテインS組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)，264, 17619 (1989)］、ロウらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 86, 8227 (1989); ジーン・デベロップメント(Genes Develop.), 4, 1288（1990）］、または特開平05-336963、特開平06-823021等に記載の方法を準用することにより、該プロテインS組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【０１３７】
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、プロテインS分子をコードするDNA、およびプロテインS分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードするDNAを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入の後にプロテインS分子を発現させることにより、目的とするプロテインS分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
【０１３８】
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いてプロテインS組成物を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、プロテインS組成物を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該プロテインS組成物を採取することにより、該プロテインS組成物を製造することができる。
【０１３９】
動物個体を用いてプロテインS組成物を製造する方法としては、例えば公知の方法［アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション(American Journal of Clinical Nutrition), 63, 639S (1996); アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション(American Journal of Clinical Nutrition), 63, 627S (1996); バイオ／テクノロジー(Bio/Technology), 9, 830 (1991)］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とするプロテインS組成物を生産させる方法があげられる。
【０１４０】
動物個体の場合は、例えば、プロテインS分子をコードするDNAを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、プロテインS組成物を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中よりプロテインS組成物を採取することにより、プロテインS組成物を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭63-309192）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
【０１４１】
植物個体を用いてプロテインS組成物を製造する方法としては、例えばプロテインS分子をコードするDNAを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養, 20 (1994); 組織培養, 21 (1995); トレンド・イン・バイオテクノロジー(Trends in Biotechnology), 15, 45 (1997)］に準じて栽培し、プロテインS組成物を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該プロテインS組成物を採取することにより、プロテインS組成物を生産する方法があげられる。
【０１４２】
プロテインS分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造されたプロテインS組成物は、例えばプロテインS組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）-セファロース、DIAION HPA-75（三菱化学（株）製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（Pharmacia社）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、プロテインS組成物の精製標品を得ることができる。具体的には、1974年にMiller-Andersonらによって開発された固定化ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを用いた方法をあげることができる（Thromb. Res. 5, 439, 1974; 続生化学実験講座 8, 血液下巻（日本生化学会編）pp.569-574., 東京化学同人, 1985）。
【０１４３】
また、プロテインS組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてプロテインS組成物の不溶体を回収する。回収したプロテインS組成物の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該プロテインS組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該プロテインS組成物の精製標品を得ることができる。
【０１４４】
プロテインS組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該プロテインS組成物あるいはその誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、プロテインS組成物の精製標品を得ることができる。
すでに宿主細胞がプロテインS分子を発現する能力を有する場合には、上記１に記載した方法を用いてプロテインS分子を発現する能力を有する細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とするプロテインS組成物を精製することにより、本発明のプロテインS組成物を製造することができる。
４．プロテインS組成物の活性評価
精製されたプロテインS組成物のAPCコファクター活性やRAGEに対する結合活性をはじめとする生物活性は、既に公知の各種方法を用いて測定することができる。具体的には、プロテインSのAPCコファクター活性、プロトロンビナーゼ（テンナーゼ）阻害活性、RAGEに対する結合活性、サイトカイン抑制活性、敗血症、急性肺障害、不育症や血栓症の病態モデル動物を用いたin vivo試験は、文献［JBC 256, 11128 (1981)、JBC 270, 27852 (1995)、JBC 272, 20678 (1997)、JBC 261, 12022 (1986)、Thromb Haemost 85, 761 (2001)、JBC 268, 2872 (1993)、PNAS 91, 2728 (1994)、Blood 86, 1062 (1995)、Thromb Haemost 80, 930 (1998)、Thromb Haemost 82, 80 (1999)、Eur J Immunol 38, 809 (2008)、Arthritis Rheumatism 54、 3898 (2006)、Critical Care 11, R122 (2007)、Blood 86, 2642 (1995)、J Clin Invest 95, 1987 (1995)、J Immunol 165, 2950 (2000)、Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27, 99 (2001)、Thromb Haemost 90, 227 (2003)］等記載の公知の方法に従って行うことができる。また、既に公知の方法により精製プロテインS組成物を用いてin vivo試験を行うことで、プロテインS組成物の血中半減期を測定することができる（Arterioscler Thromb Vasc Biol 25, 2209 (2005)）。以下に、その具体的な例を示す。
（１）糖化蛋白質受容体（RAGE）結合活性測定法
被検物質として精製したプロテインS組成物を、標準品として濃度及び比活性既知の市販プロテインSを、体積比1％でウシ血清アルブミンを含有するダルベッコリン酸緩衝液pH7.0（Journal of Experimental Medicine 98, 167 (1954)、以下、PBSと称す）を用いてそれぞれ段階希釈する。また、市販の遺伝子組換え可溶型糖化蛋白質受容体（RAGE）-ヒトIgG1 Fcキメラ蛋白質（R&D systems社製）を濃度100 ng/mLでPBSに溶解後、96穴平底ELISA用プレートに100μL/ウェルで分注し４時間室温することにより、RAGEが固相化されたプレートを作製する。このプレートを体積比1％でウシ血清アルブミン（以下、BSAと記載することもある。）を含有するPBS（以下、1％BSA-PBSと記載する。）を用いてブロッキング後、上記段階希釈した被検物質及び標準品を100μL/ウェルで分注し、室温にて1時間インキュベートする。体積比0.01％でTween20を含有するPBS（以下、0.01％Tween-PBSと記載する。）で各ウェルを数回洗浄しプレートに結合しなかったRAGE−Fcを除去後、1％BSA-PBSに溶解したプロテインSを、100μL/ウェルで分注する。室温にて1時間インキュベート後、0.01％Tween-PBSで各ウェルを数回洗浄しプレートに結合しなかったプロテインSを除去し、1％BSA-PBSに溶解した市販HRP標識化抗プロテインS抗体（DAKO社製）を、100μL/ウェルで分注する。室温にて1時間インキュベート後、0.01％Tween-PBSで各ウェルを数回洗浄しプレートに結合しなかった抗プロテインS抗体を除去し、各ウェルに100μL/ウェルの3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate（Sigma社製）を添加し室温にて数分間発色させる。適当な発色が得られた時点で0.5規定の硫酸を加えて反応を停止させる。その後、反応液中の吸光度を波長450nmで測定し、被検物質であるプロテインSを加えていない対照反応溶液の吸光度から各希釈段階の被検物質あるいは標準品を加えた反応溶液の吸光度を差し引いた値を得る。この値をRAGEに結合したプロテインS量として縦軸に、被検物質あるいは標準品の希釈率を横軸にして片対数グラフにプロットする。プロットした測定値よりRAGEに結合したプロテインS量と希釈率の関係を直線近似し、被検物質と標準品の測定の結果得られた近似式を比較することで、被検物質の標準品に対する倍率を求めることができ、その力価を決定することができる。また、プロテインSとRAGEとの結合親和性を測定するための手段として、文献［Eur J Immunol 38, 809 (2008)］などに準じて、BIAcore T100（ビアコア社）等を用いた表面プラスモン共鳴法（以下、SPR法と略記する）も用いることができる。
（２）炎症性サイトカイン抑制活性測定法
精製したプロテインS組成物の炎症性サイトカイン抑制活性は、Pulleritsらの方法（Arthritis and Rheumatism. 54, 3898 (2006)）やTreutigerらの方法（J Internal Medicine 254, 375 (2003)）に順じ、プロテインSがリンパ球や血管内皮細胞からの炎症性サイトカイン分泌を抑制する活性を測定することで、求めることができる。具体的には、被検物質として精製したプロテインS組成物を、また、標準品として濃度既知のヒト血漿由来プロテインSを、1％BSA-PBS等を用いてそれぞれ段階希釈する。次に、組織培養用96穴プレートで培養しておいたヒト由来のリンパ球や血管内皮細胞に対して、上記のプロテインS段階希釈液を各ウエルに添加し、つづいて、炎症惹起物質、たとえば、リポ多糖（以下、LPSと略記する。）やHMGB-1蛋白質、S100ペプチドなどを添加する。一定時間培養した後に培養上清を採取し、培養上清に含まれる炎症性サイトカイン、たとえばインターロイキン6、インターロイキン8、腫瘍壊死因子α（TNFα）などの濃度を市販のELISAキット等を用いて測定することで、プロテインSの炎症性サイトカイン抑制活性を測定することができる。
（３）敗血症モデル動物を用いたin vivo試験
精製したプロテインS組成物の抗凝固作用および抗炎症作用は、凝固亢進モデル動物や敗血症モデル動物を用いたin vivo試験において、凝固系パラメーターの変動や血液凝固時間の延長、血中炎症性サイトカイン濃度等を調べることで解析できる。凝固亢進モデル動物としては、ウサギに組織トロンボプラスチン15 mg/kg を5 時間かけて静脈内持続投与することによって播種性血管内凝固症候群（DIC） を惹起するモデル等が挙げられる。この系において被験物質プロテインSは、たとえば、組織トロンボプラスチン投与15 分前から投与終了まで静脈内持続投与される。また、DIC惹起前および惹起後経時的に採血することにより、凝固系パラメーター（血小板数、フィブリノゲン量、APTT）と線溶系パラメーター（フィブリン分解産物（FDP）、PAI-1 活性）等を測定することができる。また組織トロンボプラスチン投与終了時に耳介静脈に刺針し、出血時間を測定すると共に、実験終了時に腎臓を摘出して糸球体へのフィブリン沈着を観察することができる。また、敗血症モデル動物としては、LPSなどのエンドトキシンを腹腔投与する腹膜炎モデルや盲腸穿孔によって腹膜炎を惹起させるモデルなどが挙げられる。この系において被験物質プロテインSは、たとえば、LPS投与60分前から投与60分後まで静脈内持続投与される。たとえばモデル動物にマウスを用いる場合には、プロテインS組成物の毎回の投与量は、たとえば1μg/１頭〜100μg/１頭の間で設定することができる。眼窩後方などから採血することによって毎週２回、各マウス末梢血中の炎症性サイトカイン濃度や各種炎症マーカーの濃度を測定することができる。また、試験終了後、マウス個体から肝臓や腎臓などの組織を採取し、被検物質の投与による炎症抑制や凝固抑制、臓器不全抑制の効果を解析することができる。
（４）モデル動物を用いたプロテインS血中半減期の測定
プロテインSは健常人の血漿中に25〜30μg/mL（モル濃度で300〜350 nM）というほぼ一定の濃度で存在していることが知られている。この血漿プロテインSはその存在形態により２つのタイプに分けられる。それは、C4BP結合型プロテインSとフリー体プロテインSである。C4BPとは、健常人の血漿中に約150 μg/mL（モル濃度で260 nM）の濃度で存在する補体抑制因子の一種で、プロテインSはこのC4BPのβ鎖に高いアフィニティー（KD値：0.1〜0.6 nM）で結合する。このことから、血漿C4BPは全てプロテインSに結合しているといわれている（Biochemistry 36, 3745 (1997)；Arch Pathol Lab Med 126, 1349 (2002)）。従って、フリー体プロテインSの血漿中濃度は、全プロテインS濃度とC4BP結合型の濃度の差に相当し、約10 μg/mL（モル濃度で130 nM）といわれている（PNAS 78, 2512 (1981)、Blood 79, 3203 (1992)）。
【０１４５】
精製した遺伝子組換えプロテインS組成物などを用いた血中半減期の測定は、ラットなどのモデル動物を用いて調べることができる。0.25％ラット血清アルブミン中で調製された被検物質または被検物質を含まないプラシーボ（0.25％ラット血清アルブミンを含むPBS）を、頚動脈カニューレなどを用いた静脈注射あるいは皮下注射により、ラットに単回投与する。その際のプロテインS組成物の毎回の投与量は、たとえば1μg/kg〜50mg/kgの間で設定することができる。投与後の任意の時点で300μLの血液を採取し、ヒトプロテインSを特異的に検出、定量できるELISA法によりラット血液中の被検物質濃度を測定する。得られたデータは、たとえばPCNONLIN非線形回帰分析（Statistical Consultants, 1992）を用いて各ラットの薬物動態パラメーターを測定する。なお、プロテインS組成物のクリアランス試験は、ラット以外のげっ歯類、たとえばマウスや、ラットよりヒトにより近縁の霊長類、たとえばカニクイザル等の動物種モデルを用いて評価することもできる。
５．プロテインS組成物の糖鎖の分析
各種細胞で発現させたプロテインS分子の糖鎖構造は、通常の糖タンパク質の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、プロテインS分子に結合している糖鎖はガラクトース、マンノースなどの中性糖、N-アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
プロテインS分子の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
【０１４６】
具体的な方法として、Dionex社製糖組成分析装置を用いる方法があげられる。BioLCはHPAEC-PAD（high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（J.Liq.Chromatogr.）, 6, 1577 (1983)］によって糖組成を分析する装置である。
また、2-アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agric.Biol.Chem.), 55(1), 283-284 (1991)］に従って酸加水分解した試料を2-アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、HPLC分析して組成比を算出することができる。
（２）糖鎖構造解析
プロテインS分子の糖鎖の構造解析は、2次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Anal. Biochem.）, 171, 73 (1988)、生物化学実験法23-糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（1989年）］により行うことができる。2次元糖鎖マップ法は、例えば、X軸には逆相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、Y軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
【０１４７】
具体的には、プロテインS組成物をヒドラジン分解して、プロテインS分子から糖鎖を遊離し、2-アミノピリジン（以下、「PA」と略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J. Biochem.）, 95, 197 (1984)］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のPA化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、2次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（TaKaRa社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Anal. Biochem.）, 171, 73 (1988)］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
【０１４８】
さらに各糖鎖のMALDI-TOF-MSなどの質量分析を行い、2次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
６．プロテインS分子の糖鎖構造を識別する免疫学的定量方法
本発明のプロテインS組成物は、糖鎖構造が異なったプロテインS分子から構成されている。本発明のプロテインS組成物は、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合しておらず、このようなプロテインS組成物は、上記５．に記載のプロテインS分子の糖鎖構造の分析法を用いることにより識別できる。また、レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いることによっても識別できる。
【０１４９】
レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いたプロテインS分子の糖鎖構造の識別は、文献［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ(Monoclonal Antibodies: Principles and Applications), Wiley-Liss, Inc., (1995); 酵素免疫測定法，第3版，医学書院（1987）; 改訂版，酵素抗体法，学際企画（1985）］等に記載のウエスタン染色、RIA（Radioimmunoassay）、VIA（Viroimmunoassay）、EIA（Enzymoimmunoassay）、FIA（Fluoroimmunoassay）、MIA（Metalloimmunoassay）などの免疫学的定量方法に準じて、例えば、以下のように行うことができる。
【０１５０】
プロテインS組成物を構成するプロテインS分子の糖鎖構造を認識するレクチンを標識し、標識したレクチンと試料であるプロテインS組成物を反応させる。次に、標識したレクチンとプロテインS分子の複合体の量を測定する。
プロテインS分子の糖鎖構造を識別に用いられるレクチンとしては、例えば、WGA (T. vulgaris由来のwheat-germ agglutinin)、ConA (C. ensiformis由来のconcanavalin A)、RIC (R. communis由来の毒素)、L-PHA (P.vulgaris由来のleukoagglutinin)、LCA (L. culinaris由来のlentil agglutinin)、PSA (P. sativum由来のPea lectin)、AAL (Aleuria aurantia Lectin)、ACL (Amaranthus caudatus Lectin)、BPL (Bauhinia purpurea Lectin)、DSL (Datura stramonium Lectin)、DBA (Dolichos biflorus Agglutinin)、EBL (Elderberry Balk Lectin)、ECL (Erythrina cristagalli Lectin)、EEL (Euonymus europaeus Lectin)、GNL (Galanthus nivalis Lectin)、GSL (Griffonia simplicifolia Lectin)、HPA (Helix pomatia Agglutinin)、HHL (Hippeastrum Hybrid Lectin)、Jacalin、LTL (Lotus tetragonolobus Lectin)、LEL (Lycopersicon esculentum Lectin)、MAL (Maackia amurensis Lectin)、MPL (Maclura pomifera Lectin)、NPL (Narcissus pseudonarcissus Lectin)、PNA (Peanut Agglutinin)、E-PHA (Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin)、PTL (Psophocarpus tetragonolobus Lectin)、RCA (Ricinus communis Agglutinin)、STL (Solanum tuberosum Lectin)、SJA (Sophora japonica Agglutinin)、SBA (Soybean Agglutinin)、UEA (Ulex europaeus Agglutinin)、VVL (Vicia villosa Lectin)、WFA (Wisteria floribunda Agglutinin)があげられる。
【０１５１】
本発明においては、上記レクチンのなかでもN-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合している糖鎖構造を特異的に認識するレクチンを用いることが好ましく、その具体的な例としては、レンズマメレクチンLCA（Lens Culinaris由来のLentil Agglutinin）エンドウマメレクチンPSA（Pisum sativum由来のPea Lectin）、ソラマメレクチンVFA（Vicia faba由来のAgglutinin）、ヒイロチャワンタケレクチンAAL（Aleuria aurantia由来のLectin）を挙げることができる。
７．本発明のプロテインS組成物の使用
本発明のプロテインS組成物は、従来から知られているヒト血漿由来または遺伝子組換え体プロテインSなどのN-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合しているプロテインSに比べて、糖化蛋白質受容体（RAGE）に対する高い親和性を有することから、プロテインS欠損または欠乏に伴う炎症性疾患、血栓症において、高い治療効果が期待される。また、投与量、投与回数を軽減できることから、患者や医療現場での身体的および経済的な負担を軽減するとともに、投与した患者の血圧上昇、抗プロテインS抗体の出現といった副作用も軽減することができる。
【０１５２】
プロテインS組成物を治療剤として用いる各種疾患としては、血中のプロテインS濃度の低下を呈する炎症性疾患および血液凝固亢進性疾患などをあげることができる。よって、血中のプロテインS濃度の低下に伴って引き起こされる、炎症性疾患および血液凝固亢進性疾患であれば、いずれの疾患に対しても本発明のプロテインS組成物は用いられる。
血中のプロテインS濃度の低下を呈する疾患としては、プロテインS欠損症があげられ、具体的には先天性プロテインS欠損症、後天性プロテインS欠損症などがあげられる。
【０１５３】
先天性プロテインS欠損症は先天性プロテインS欠乏症とも呼ばれ、ヒト遺伝性疾患の１つとして知られており、静脈血栓塞栓症（Venous thromboembolism；VTE）を呈する。VTEには２つの疾患、深部静脈血栓症（Deep vein thrombosis；DVT）と肺塞栓症（Pulmonary embolism；PE）が含まれる。
後天性プロテインS欠損症に伴って発症する疾患としては、習慣性流産（不育症）があげられる。更に、肝疾患、ネフローゼ症候群、HIV感染、播種性血管内凝固症候群（DIC）、敗血症、急性肺障害、関節リウマチなどの疾患、L-アスパラギナーゼ製剤、ワーファリン製剤、経口避妊薬などの投薬、および妊娠中期から後期にかけての血漿中プロテインSの低下などによっても、後天性プロテインS欠損症は発症することが知られており（Br J Ophthalmol 81, 810 (1997)、Thromb Haemost 93, 853 (2005)、血栓止血誌 12, 235 (2001)）、本発明のプロテインS組成物は、これらの後天性プロテインS欠損症に対して用いることができる。
【０１５４】
また、血中のプロテインSが関連する血液凝固亢進性疾患としては、全身性炎症反応症候群（systemic inflammatory response syndrome;SIRS）や、その他の病態により引き起こされる血栓症、上述のDVT、PEを含むVTEなどがあげられる。
本発明において、プロテインS組成物の使用方法としては、上述のようなプロテインSの欠損に伴う炎症性疾患および血液凝固性疾患があげられるが、プロテインS欠損症患者が、外科手術や妊娠出産などの最中あるいは直後の、急性的な血栓症に対して使用する場合や、術前にプロテインSを投与して血栓症の発生を抑える予防的使用もあげられる。
【０１５５】
また、本発明のプロテインS組成物を含有する医薬は、予防薬あるいは治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、プロテインS製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
【０１５６】
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
【０１５７】
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【０１５８】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、プロテインS組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
【０１５９】
また、噴霧剤はプロテインS組成物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつプロテインS組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。プロテインS組成物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０１６０】
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、有効成分の量として、通常成人１日当たり5μg/kg〜5mg/kgである。
また、プロテインS組成物の糖化蛋白質受容体（RAGE）結合活性をはじめとする生物活性を解析する方法は、APCコファクター活性、プロトロンビナーゼ（テンナーゼ）阻害活性、RAGEに対する結合活性、サイトカイン抑制活性などのインビトロ(in vitro)試験、あるいは、敗血症や血栓症の病態モデル動物を用いたインビボ（in vivo）試験等があげられる。
【０１６１】
プロテインSのAPCコファクター活性、プロトロンビナーゼ（テンナーゼ）阻害活性、RAGEに対する結合活性、サイトカイン抑制活性、敗血症や血栓症の病態モデル動物を用いたin vivo試験は、文献［JBC 256, 11128 (1981)、JBC 270, 27852 (1995)、JBC 272, 20678 (1997)、JBC 261, 12022 (1986)、Thromb Haemost 85, 761 (2001)、JBC 268, 2872 (1993)、PNAS 91, 2728 (1994)、Blood 86, 1062 (1995)、Thromb Haemost 80, 930 (1998)、Thromb Haemost 82, 80 (1999)、Eur J Immunol 38, 809 (2008)、Arthritis Rheumatism 54、 3898 (2006)、Critical Care 11, R122 (2007)、Blood 86, 2642 (1995)、J Clin Invest 95, 1987 (1995)、Thromb Haemost 90, 227 (2003)］等記載の公知の方法に従って行うことができる。
【０１６２】
以下の実施例により、本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１６３】
ヒト血漿由来プロテインS（天然プロテインS）の糖鎖構造解析
ヒト血漿より精製単離されたプロテインS蛋白質（CALBIOCHEM社製）を天然プロテインSとし、その中性糖・アミノ糖組成分析とシアル酸分析、およびN-グリコシド結合型糖鎖のプロファイリング解析を行った。中性糖・アミノ糖組成分析は、Shinkawaらの方法（Journal of Biological Chemistry 278, 3466 (2003)）に従って実施した。シアル酸分析は、シアル酸蛍光標識用試薬キット（タカラバイオ社製）を用いてシアル酸を1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene（DMB）で蛍光標識後に逆相カラム（PALPAK Type R；タカラバイオ社製）を用いてHPLC 分析することによって定量した。N-グリコシド結合型糖鎖のプロファイリング解析は、Kandaらの方法（Glycobiology 17, 104 (2007)）に従い、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（MALDI-TOF MS）を用いて実施した。【０１６４】
中性糖・アミノ糖組成分析とシアル酸分析の結果、マンノースの組成比を3.00として算出された各単糖の組成比は、フコースが0.26、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）が4.53、ガラクトースが2.80、シアル酸が2.11、であった。更に、N-グリコシド結合型糖鎖のプロファイリング解析の結果、検出された糖鎖は全て複合型糖鎖であり、主要な複合型糖鎖は非還元末端にシアル酸を有する２本アンテナ分岐型糖鎖（複合２本鎖型糖鎖；complex biantennary oligosaccharide）であること、また、糖鎖の還元末端に位置するGlcNAcにフコースが付加した複合型糖鎖が全複合型糖鎖中に約20％以上の割合で存在することが示された。更に、市販されている血清由来プロテインＳの各製造ロットの糖鎖分析を行ったところ、いずれのロットにおいてもフコースが２０％以上の割合で付加しているプロテインＳが確認され、一部のロットではフコースが更に高い割合で付加しているプロテインSが確認された。【０１６５】
次に、ヒト血漿由来プロテインSの糖鎖に付加したフコースの結合様式を解析する目的で、コアα1,6-フコース特異的レクチンであるレンズマメレクチン（LCA）とプロテインSとの結合性を、表面プラスモン共鳴法で解析した。アミンカップリングキット（ビアコア社製）を用いて、ヒト血漿由来プロテインS（CALBIOCHEM社製）とヒト血漿由来アンチトロンビンIII（CALBIOCHEM社製）をそれぞれ、CM5センサーチップ（ビアコア社製）の各フローセル上に固定化した。ヒト血漿由来アンチトロンビンIIIは４本のアスパラギン結合型糖鎖を有する糖蛋白質であるが、その糖鎖はコアα1,6-フコースを持たないことが知られている（WO2005/035563）。各フローセル上のリガンド蛋白質の固定化量は、2000〜3000 resonance unit（以下、RUと記載する。）の範囲になるようにした。次に、HBS-EP+バッファー（ビアコア社製）を用いて一定の濃度（50000、25000、12500、6250、3125、1562 ng/mL）に希釈したLCAレクチン（Vector Laboratories社製）をアナライトとし、温度25℃、流速5μL/分、結合時間140秒間、解離時間240秒間、の条件でリガンドが固定化されているフローセルに流して結合させた。チップの再生は、pH1.5のグリシン水溶液（ビアコア社製）を60秒間流すことで行った。【０１６６】
その結果、LCAレクチンは、ヒト血漿由来アンチトロンビンIIIに対しては結合性を示さなかったのに対して、ヒト血漿由来プロテインSに対しては結合することが示された（図１）。この結果から、ヒト血漿由来プロテインSは、そのアスパラギン結合型糖鎖の還元末端側に、コアα1,6-フコースを有することが示された。
【実施例２】
【０１６７】
α1,6-fucosyltransferase（FUT8）遺伝子ダブルノックアウト細胞による遺伝子組換えヒトプロテインSの発現
遺伝子組換えヒトプロテインSを生産するα1,6-fucosyltransferase（以下、FUT8と記す）遺伝子ダブルノックアウト細胞株を以下に示す方法で作製した。
1. ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
ヒトプロテインSの遺伝子配列（UniGene: Hs.64016  配列番号１）に対して、それぞれの5’末端に、2種の制限酵素BsiWIまたはBamHIの認識配列をぞれぞれ含む2種類のプライマー（配列番号3および配列番号4）を作製し、以下のPCRを行った。ヒト肝臓由来cDNA（インビトロジェン社製）をテンプレートとして含む20μLの反応液[KOD plus polymerase(東洋紡社製)、KOD plus buffer、0.2 mM dNTP mixture、2.5 mM MgSO4、0.5μMの2種類のプライマー（配列番号3および配列番号4）]を調製し、94℃で2分間の加熱の後、94℃で15秒間、64℃で30秒間、68℃で2分間からなる反応を1サイクルとして、35サイクルの条件でPCRを行った。PCR後、反応液を1.5％(w/v) アガロースゲル電気泳動に供し、2.1 kbpのヒトプロテインS遺伝子を含むDNA断片を確認し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて精製した。
2. プラスミドpCR4-PSの作製
前項で調製した精製ヒトプロテインS cDNA断片に対してZero Blunt TOPO(R) PCRクローニングキット(インビトロジェン社製) を用いたクローニングを行い、形質転換大腸菌を得た。形質転換株よりQIAprep(R)Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製)を用いてプラスミドDNAを調製し、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems社製)とDNAシーケンサABI PRISM 377(Applied Biosystems社製)を用いて塩基配列を解析した。ヒトプロテインS cDNA配列を含むプラスミドクローンをpCR4-PSと名付けた(図2)。
3. プラスミドpKAN-PSの作製
前項2で作製したpCR4-PS 3μgを17.5μLの水に溶解した。該液に10単位のBsiWI(New England Biolabs社製)、2μLのNEBuffer 3を加えて20μLの反応液を調製し、55℃で16時間消化反応を行った。さらに該液に10単位のBamHI(New England Biolabs社製)を加えて20μLの反応液を調製し、37℃で16時間消化反応を行った。次に、プラスミドpKANTEX93（WO1997/10354）3μgを17.5μLの水に溶解し、BsiWI(New England Biolabs社製)、2μLのNEBuffer 3を加えて20μLの反応液を調製し、55℃で16時間消化反応を行った。さらに該反応液に10単位のBamHI(New England Biolabs社製)を加えて20μLの反応液を調製し、37℃で16時間消化反応を行った。上記で得られたpCR4-PS断片(BsiWI-BamHI)およびpKANTEX93断片（BsiWI-BamHI）を1.5％(w/v)アガロースゲル電気泳動に供してそれぞれ約2.1 kbp、9.3 kbpのDNA断片を回収し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて精製した。次いで、精製pCR4-PS断片(BsiWI-BamHI)と精製pKANTEX93断片（BsiWI-BamHI）断片をLigation High (東洋紡社製) を用いて連結し、得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌DH5α株（東洋紡績社製）を形質転換した。各形質転換株よりプラスミドDNAを調製し、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Applied Biosystems社製)とDNAシーケンサABI PRISM 377(Applied Biosystems社製)を用いて塩基配列を解析した。この結果、ヒトプロテインS遺伝子配列（配列番号１）を含むプラスミドpKAN-PSを得た（図3）。
4. ゲノム上のFUT8遺伝子をダブルノックアウトしたCHO/DG44細胞株へのヒトプロテインS発現プラスミドの導入
α1,6-fucosyl transferase(FUT8)遺伝子をダブルノックアウトしたCHO/DG44細胞株（WO2002/31140）、およびCHO/DG44細胞株（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)）に対し、前項で作製したプラスミドpKAN-PSを遺伝子導入した。導入法は、文献[サイトテクノロジー (Cytotechnology), 3, 133 (1990)] に準じたエレクトロポレーション法で行った。プラスミドの線状化は、プラスミドpKAN-PS 100μg、NEBuffer 3 (New England Biolabs社製)60μL、120単位の制限酵素MluI(New England Biolabs社製) からなる600μLの反応液を調製し、37℃で5時間消化反応により行った。反応後、該反応液から、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿により、線状化したプラスミドの精製および回収を行った。次に、FUT8遺伝子ダブルノックアウトCHO/DG44細胞をK-PBS緩衝液(137 mM KCl、2.7 mM NaCl、8.1 mM Na2HPO4、1.5 mM KH2PO4、4.0 mM MgCl2)に懸濁して8×107細胞/mLとした。細胞懸濁液200μL (1.6×106細胞) と上記の線状化プラスミド9μg を混和した後、細胞-DNA混和液の全量をGene Pulser Cuvette (電極間距離2 mm) (BIO-RAD社製)へ移し、エレクトロポレーション装置Gene Pulser (BIO-RAD社製) を用いてパルス電圧350 V、電気容量250μFの条件で遺伝子導入を行った。細胞懸濁液を終濃度10％ ウシ胎児血清 (Life Technologies社製)および50μg/mL gentamicin（ナカライテスク社製）を添加したIMDM培地(Life Technologies社製)120 mLに懸濁し、接着細胞培養96 well plate(グライナー社製)3枚へ、100μL/ウェルで播種した。培養は5％CO2、37℃の条件下で行った。
5. 500 nM メトトレキセート（MTX）耐性株の取得
前項で得たpKAN-PS導入細胞を6日間培養した後、培養上清を除去し、終濃度10％透析ウシ胎児血清、50μg/mL gentamicinおよび50 nM メトトレキセート(シグマ社製、以下、MTXと記載する。)を添加したIMDM培地を100μL/ウェルずつ添加した。この培地交換作業を3〜4日毎に繰り返しながら9日間の培養を行った。次いで、終濃度10％透析ウシ胎児血清、50μg/mL gentamicin および200 nMのMTXを添加したIMDM培地を用いて、培地交換を同様に3〜4日毎に繰り返しながら18日間培養し、最終的に形成されたコロニーを24 well plate(シグマ社製)に拡大培養を行った。更に、終濃度10％透析ウシ胎児血清、50μg/mL gentamicinおよび500 nMのMTXを添加したIMDM培地を用いた培地交換を3〜4日毎に繰り返し、拡大しながら約3週間の培養を行い、500 nM MTX耐性プール株を取得した。
6. 培養上清中に分泌発現された遺伝子組換えヒトプロテインSの検出
前項で取得した複数の500 nM MTX耐性プール株より、各1.0×106細胞を5 mLの終濃度10％透析ウシ胎児血清、50μg/mL gentamicinおよび500 nMのMTXを添加したIMDM培地に懸濁し、T25フラスコへ播種して培養を行った。培養3日後に培養上清を回収し、上清中に含まれる遺伝子組換えヒトプロテインS量を、Mached- Pair Antibody Set for human Protein S antigen (Affinity Biological社製)を用いたELISAで測定した。洗浄用緩衝液に0.05％ Tween20を添加したPhosphate Buffered Saline(PBS)、サンプル希釈緩衝液に1％ウシ血清アルブミン、0.1％ Tween 20を添加した緩衝液、発色基質溶液に3,3’,5,5' -tetramethyl  benzidine (TMB : シグマ社製)、発色停止液に1 M H2SO4を使用した。標準品にはヒト血漿由来プロテインS(カルビオケム社製)を用いた。この解析によって、複数の500 nM MTX耐性プール株の培養上清中に、濃度１μg/mL以上の濃度で、遺伝子組換えヒトプロテインSが発現していることが確認された。
【実施例３】
【０１６８】
遺伝子組換えヒトプロテインS蛋白質の精製
1. 遺伝子組換えヒトプロテインS含有培養上清の取得
実施例2で得られた遺伝子組換えヒトプロテインS産生細胞株を10％透析ウシ胎児血清、50μg/mL gentamicinおよび500 nM MTXを添加したIMDM培地に懸濁し、組織培養用フラスコ(グライナー社製)に播種した。細胞は数日間培養を行い、コンフルエントまで増殖したことを確認し、各フラスコの上清を除去して細胞を10 mLのPBSで2回洗浄した。その後すぐに、細胞に、6 mM L-Glutamine、500 nM MTXを含むEX-CELL302培地（JRH社製）を30 mL加え、培養を行い、5日間の培養の後、培養上清を回収し、0.22μmボトルトップフィルター(IWAKI社製)でろ過した。その結果、遺伝子組換えヒトプロテインS含有培養上清を150 mL得た。
2. 遺伝子組換えプロテインSの精製
プロテインSの精製は、文献[Thromb Haemost.,91, 1105, 2004]および文献[Thromb Haemost.,77, 1156, 1997]に記載の方法を参考にして実施した。前項で得られた遺伝子組換えプロテインSを含有する培養上清を、限外ろ過膜(分画分子量10,000, ポリエーテルスルホン製：ミリポア社製)を用いたダイアフィルトレーション法により、緩衝液をPBSに置換した。得られたサンプル（約110 mL）に、終濃度が5 mMとなるようにEDTAを添加した。該サンプルに対して、カルシウム溶出陰イオン交換クロマトグラフィー精製を行った。精製用カラムには、Q sepharose FFカラム (1.0 mL、GEヘルスケア社製)を使用した。カラムの平衡化は、150 mM NaCl、5 mM EDTA、20 mM tris  (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) (pH7.4)からなる平衡化緩衝液で行った。Q sepharose FFカラムへのサンプルの吸着は、流速1.0 mL/分で20 mL送液することで行った。洗浄は、平衡化緩衝液15 カラム体積(CV)を送液し、さらに、150 mM NaCl、20 mM Tris (pH7.4)からなる緩衝液15 CVを送液することで行った。溶出は150 mM NaCl、20 mM CaCl2、20 mM Tris (pH7.4)からなる溶出緩衝液10 CVを送液することで行った。カラムの洗浄及び再生は、500 mM NaCl、20 mM Tris (pH7.4)からなる緩衝液5 CV、1 mM NaCl、20 mM Tris (pH7.4)からなる緩衝液で5 CVを送液することで行った。クロマト装置はAKTA purifierシステム(GEヘルスケア社製)を用い、サンプル吸着以外のポンプ流速は0.5 mL/分とし、溶出画分は250 μl毎に分画した。溶出物質の検出は280 nm、260 nm、320 nmの吸光度を測定することで行った。同様の操作を5回繰り返し、プロテインSの精製を行った。続いて溶出画分を混和し、限外ろ過膜(分画分子量10,000, ポリエーテルスルホン製：ミリポア社製)を用いたダイアフィルトレーション法による150 mM NaCl、20 mM Tris (pH7.4)へ緩衝液交換および1.8 mLへの濃縮を行った。更に、終濃度が25 mMとなるようにEDTAを添加した。【０１６９】
次に、該サンプルに対して塩濃度溶出陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。精製用カラムは、Q sepharose FFカラム (1.0 mL、GEヘルスケア社製)を使用した。カラムの平衡化は、150 mM NaCl、5 mM EDTA、20 mM Tris(pH7.4)からなる平衡化緩衝液で行った。Q sepharose FFカラムへのサンプルの吸着は、サンプルを800μL送液することで行った。洗浄は、平衡化緩衝液15 CVを送液し、さらに、150 mM NaCl、20 mM Tris (pH7.4)からなる緩衝液15 CVを送液することで行った。溶出は320 mM NaCl、20 mM Tris (pH7.4)からなる溶出緩衝液15 CV、400 mM NaCl、20 mM Tris (pH7.4)からなる溶出緩衝液15 CV、500 mM NaCl、20 mM Tris (pH7.4)からなる溶出緩衝液15 CVを送液することで行った。カラムの洗浄及び再生は、1 M NaCl、20 mM Tris (pH7.4)からなる緩衝液で5 CVを送液することで行った。クロマト装置はAKTA purifierシステム(GEヘルスケア社製)を用い、ポンプ流速は1.0 mL/分とし、溶出画分は15 mL毎に分画した。溶出物質の検出は280 nm、260 nm、320 nmの吸光度を測定することで行った。続いて溶出画分を混和し、限外ろ過膜(分画分子量10,000, ポリエーテルスルホン製：ミリポア社製)を用いたダイアフィルトレーション法による150 mM NaCl、20 mM Tris (pH7.4)へ緩衝液交換および1.0 mLへの濃縮を行った。【０１７０】
次に、該サンプルに対してゲルろ過クロマトグラフィーを行った。精製用カラムはSuperdex75 10/30カラム(GEヘルスケア社製)を使用した。通塔液は150 mM NaCl、20 mM Tris (pH7.4)とし、サンプルアプライ量は、200 μLとした。装置はAKTA purifierシステム(GEヘルスケア社製)を用い、ポンプ流速は0.5 mL/分で行い、溶出画分は15 mL毎に分画した。溶出物質の検出は280 nm、260 nm、320 nmの吸光度を測定することで行った。FUT8ノックアウトCHO/DG44細胞から得られた遺伝子組換えヒトプロテインSの精製品を、以下MSPSと略記し、CHO/DG44細胞から得られた遺伝子組換えヒトプロテインSの精製品を、以下KCPSと略記する。【０１７１】
取得したプロテインS組成物を、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動（PAGE）解析とウエスタン解析した結果、いずれのサンプルも95％以上の純度でプロテインS蛋白質が含まれていることが確認された(図4)。ウエスタンブロッティング解析の1次抗体は、ヤギ抗ヒトProtein S抗体（R&D systems社製）、2次抗体はHRP標識ロバ抗ヤギIgG抗体（Chemicon社製）を使用した。
【実施例４】
【０１７２】
遺伝子組換えプロテインSの糖鎖構造解析
実施例1に記載の方法に従って、中性糖・アミノ糖組成分析とシアル酸分析を実施した。実施例3で調製したMSPSにおける、マンノースの組成比を3.00として算出された各単糖の組成比は、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）が4.92、ガラクトースが3.51、シアル酸が2.13、であった。フコースは検出されなかった。また、実施例3で調製したKCPSにおける、マンノースの組成比を3.00として算出された各単糖の組成比は、フコースが0.69、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）が4.34、ガラクトースが3.06、シアル酸が2.03、であった。分析結果のまとめを表1に示す。【０１７３】
【表１】
2010018847.tif 000003
【０１７４】
*：マンノースを3とした時の中性糖・アミノ糖組成比
**:プロテインS  1分子あたりのシアル酸付加数
糖鎖は、Fuc:フコース、GlcNAc:N-アセチルグルコサミン、Gal：ガラクトース、Man：マンノースを、アミノ酸修飾は、Gla:γ-カルボキシル化グルタミン酸を示す。
また、N-グリコシド結合型糖鎖のプロファイリング解析の結果、MSPS、KCPSともに、検出された糖鎖は全て複合型糖鎖であり、主要な糖鎖は非還元末端にシアル酸を有する２本アンテナ分岐型糖鎖（複合２本鎖型糖鎖；complex biantennary oligosaccharide）であることが示された。MSPS由来の糖鎖には、還元末端に位置するGlcNAcにフコースが付加した複合型糖鎖は検出されなかった。【０１７５】
以上より、ヒト血漿由来プロテインS、MSPS、KCPSが有する主要なN-グリコシド結合複合型糖鎖はいずれも、非還元末端にシアル酸を有する複合２本鎖型糖鎖であることが分かった。また、糖鎖還元末端に位置するGlcNAcへのフコース付加率はKCPSが最も高く、次に高いのがヒト血漿由来プロテインSであり、MSPSのフコース付加率は0％であることが示された。【０１７６】
なお、エドマン分解法を用いたアミノ酸配列解析により、MSPSとKCPSは、ヒト血漿由来プロテインSと同様に、アミノ末端側のGlaドメイン内にγ-カルボキシル化されたグルタミン酸（Gla）を含むこと（表1）、アミノ末端のアミノ酸配列がヒト血漿由来プロテインSと同一であることが示された。
【実施例５】
【０１７７】
ヒト血漿由来プロテインSの糖化蛋白質受容体（RAGE）に対する結合性解析（表面プラスモン共鳴法）
アミンカップリングキット（ビアコア社製）を用いて、ヒト血漿由来プロテインS（CALBIOCHEM社製）、ヒト血漿由来補体C4結合蛋白質（C4BP；BioMed社製）、ヒト血漿由来補体C1インヒビター製剤ベリナートP（CSLベーリング社製）をCM5センサーチップ（ビアコア社製）の各フローセル上に固定化した。各フローセル上のリガンド蛋白質の固定化量は、2400〜3600 resonance unit（以下、RUと記す）の範囲になるようにした。補体C4結合蛋白質と補体C1インヒビターは、抗炎症作用を有する血漿糖蛋白質として知られている。次に、HBS-EP+バッファー（ビアコア社製）を用いて一定の濃度（50000、25000、12500、6250、3125、1562 ng/mL）に希釈した組換えヒトRAGE-Fc融合蛋白質（R&D systems社製）をアナライトとし、温度25℃、流速5 μL/分、結合時間140秒間、解離時間240秒間、の条件でリガンドが固定化されているフローセルに流して結合させた。チップの再生は、pH1.5のグリシン水溶液（ビアコア社製）を60秒間流すことで行った。【０１７８】
その結果、プロテインSとヒトRAGE-Fc融合蛋白質が結合することが示された（図5）。一方、補体C4結合蛋白質と補体C1インヒビターに対しては、ヒトRAGE-Fc融合蛋白質は全く結合性を示さなかった。なお、ヒトRAGE-Fc融合蛋白質が有するヒトIgG1のFcと同じく、Fcを有する蛋白質であるヒトE-セレクチン-Fc融合蛋白質（R&D systems社製）は、プロテインSに対して全く結合性を示さなかった。【０１７９】
次に、アミンカップリングキット（ビアコア社製）を用いて、ヒト血漿由来プロテインS（CALBIOCHEM社製）、遺伝子組換えヒト活性化プロテインC製剤Xigris（Eli Lilly社製）、ヒト血漿由来性ホルモン結合グロブリン（SHBG）（SCIPAC社製）をCM5センサーチップ（ビアコア社製）の各フローセル上に固定化した。各フローセル上のリガンド蛋白質の固定化量は、2000〜3000 RUの範囲になるようにした。活性化プロテインCと性ホルモン結合グロブリンは、ヒト蛋白質のなかではプロテインSに比較的相同性の高い血漿糖蛋白質として知られている。次に、HBS-EP+バッファー（ビアコア社製）を用いて一定の濃度（50000、25000、12500、6250、3125、1562 ng/mL）に希釈した組換えヒトRAGE-Fc融合蛋白質（R&D systems社製）をアナライトとし、温度25℃、流速5 μL/分、結合時間140秒間、解離時間240秒間、の条件でリガンドが固定化されているフローセルに流して結合させた。チップの再生は、pH1.5のグリシン水溶液（ビアコア社製）を60秒間流すことで行った。【０１８０】
その結果、プロテインSとヒトRAGE-Fc融合蛋白質が結合することが再度示された。一方、遺伝子組換えヒト活性化プロテインCとヒト性ホルモン結合グロブリンに対しては、ヒトRAGE-Fc融合蛋白質は結合性を示さなかった。RAGEと結合しなかった典型的なSHBGの反応を図6に示す。以上の結果より、RAGEに対する結合活性はプロテインSに固有の生物活性であることが明らかとなった。
【実施例６】
【０１８１】
遺伝子組換えプロテインSの糖化蛋白質受容体（RAGE）に対する結合性解析（表面プラスモン共鳴法）
アミンカップリングキット（ビアコア社製）を用いて、ヒト血漿由来プロテインS（CALBIOCHEM社製）、実施例４で調製した遺伝子組換えヒトプロテインS蛋白質であるMSPS、KCPSを、CM5センサーチップ（ビアコア社製）の各フローセル上に固定化した。各フローセル上のリガンド蛋白質の固定化量は、1500〜2000 RUの範囲になるようにした。次に、HBS-EP+バッファー（ビアコア社製）を用いて一定の濃度（50000、25000、12500、6250、3125、1562 ng/mL）に希釈した抗ヒトプロテインS抗体C-17（SantaCruz社製）（図7）、あるいは、ヒト血漿由来補体C4結合蛋白質（BioMed社製）をアナライトとし、温度25℃、流速5μL/分、結合時間140秒間、解離時間240秒間、の条件でリガンドが固定化されているフローセルに流して結合させた。抗ヒトプロテインS抗体C-17とヒト血漿由来補体C4結合蛋白質は、プロテインSのカルボキシル末端側に存在する性ホルモン結合グロブリン様ドメイン（SHBGドメイン）に結合することが知られている。チップの再生は、pH1.5のグリシン水溶液（ビアコア社製）を60秒間流すことで行った。取得したデータをBIAcore T100 evaluation software ver 1.1（ビアコア社製）を用いて解析し求めた解離定数を表2に示した。【０１８２】
【表２】
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【０１８３】
その結果、抗ヒトプロテインS抗体C-17（図7）とヒト血漿由来補体C4結合蛋白質はともに、チップ上に固相化された３種類のプロテインS蛋白質に対して同等の結合性を示すことが確認された。
次に、HBS-EP+バッファー（ビアコア社製）を用いて一定の濃度（50000、25000、12500、6250、3125、1562 ng/mL）に希釈した組換えヒトRAGE-Fc融合蛋白質（R&D systems社製）をアナライトとし、温度25℃、流速5 μL/分、結合時間140秒間、解離時間240秒間、の条件でリガンドが固定化されているフローセルに流して結合させた（図8）。チップの再生は、pH1.5のグリシン水溶液（ビアコア社製）を60秒間流すことで行った。【０１８４】
その結果、MSPSは、ヒト血漿由来プロテインSに比較して顕著に高いRAGEに対する結合性を示した。取得したデータをBIAcore T100 evaluation software ver 1.1（ビアコア社製）を用いてカイネティクス解析し求めた結合パラメーターを表3に示した。【０１８５】
【表３】
2010018847.tif 000005
【０１８６】
MSPSのRAGEに対するアフィニティーは、ヒト血漿プロテインSのRAGEに対するアフィニティーに比較して約７倍高いことが分かった。また、KCPSはヒトRAGE-Fc融合蛋白質に対してほとんど結合性を示さなかった（図8）。
以上の結果より、プロテインSが有するN−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端側のGlcNAcに結合したフコース残基は、プロテインSのRAGEに対する結合を顕著に阻害する因子であることが明らかとなった。
【実施例７】
【０１８７】
HMGB-1とRAGEの結合、Mac-1とRAGEの結合に対する、フコースの無い遺伝子組換えプロテインSの阻害活性解析（表面プラスモン共鳴法）
アミンカップリングキット（ビアコア社製）を用いて、組換えヒトHMGB-1（R&D systems社製）、組換えヒトMac-1へテロダイマー（αmβ2インテグリン、CD11b/CD18；R&D systems社製）、組換えヒトS100A8/A9（R&D systems社製）を、Series S C1センサーチップ（ビアコア社製）の各フローセル上に200RU、1200RU、400RUで固定化した。アナライトとして、50000、5000または500 ng/mLに希釈した組換えヒトRAGE-Fc融合蛋白質（R&D systems社製）を用いる以外は、実施例５と同様に測定を行った。その結果、HMGB-1、Mac-1およびS100A8/A9を固定化したフローセルのいずれも、RAGEの濃度依存的に有意な反応性の上昇が認められた。【０１８８】
次に、上記と同じセンサーチップを用いて、MSPS（終濃度50000、5000 μg/mL）を混合した組換えヒトRAGE-Fc融合蛋白質（5000 ng/mL）をアナライトとして、同様な結合実験を行った。
この解析の結果、HMGB-1、Mac-1およびS100A8/A9を固定化したフローセルのいずれも、MSPSの濃度依存的にRAGE-Fc融合蛋白質の反応性が有意に低下した。また、上記と同じセンサーチップを用いて、MSPS（終濃度50000 μg/mL）とHMGB-1、Mac-1およびS100A8/A9それぞれに対する結合活性を確認したが、有意な結合活性は認められなかった。【０１８９】
以上の結果より、MSPSは、RAGEに対して特異的に結合することによって、RAGEとHMGB-1、Mac-1またはS100A8/A9との結合をいずれも阻害する活性（RAGE中和活性）を有することが明らかとなった。
【実施例８】
【０１９０】
HMGB-1とRAGEの結合およびMac-1とRAGEの結合に対する、遺伝子組換えプロテインSの阻害活性解析（表面プラスモン共鳴法）
アミンカップリングキット（ビアコア社製）を用いて、HMGB-1（和光純薬社製）、および組換えヒトMac-1へテロダイマー（αmβ2インテグリン、CD11b/CD18；R&D systems社製）を、Series S C1センサーチップ（ビアコア社製）の各フローセル上に160RU、620RUでそれぞれ固定化した。次に、実施例3で調製したMSPSおよびKCPS（終濃度100、10、1 μg/mL）を混合した組換えヒトRAGE-Fc融合蛋白質（5000 ng/mL）をアナライトとし、後は実施例５と同様にして実験を行った。【０１９１】
この解析の結果、HMGB-1およびMac-1いずれのフローセルにおいても、組換えヒトRAGE-Fc融合蛋白質の結合は、MSPSおよびKCPSの濃度依存的に有意に低下した。プロテインS添加が無いときのビアコア反応性（RU; resonance  units）を100％としたときの相対反応性（％）とプロテインS濃度との関係を図9に示した。この結果より、MSPSのRAGE阻害活性は、KCPSのRAGE阻害活性より強いことが示された。
【実施例９】
【０１９２】
遺伝子組換えプロテインSのCD14に対する結合性解析（表面プラスモン共鳴法）
ヒトCD14は、RAGEと同じくパターン認識型受容体ファミリーに属する１回膜貫通型の糖蛋白質であり、リガンドであるリポ多糖（Lipopolysaccharide; LPS）-LPS結合蛋白（LPS binding protein; LBP）複合体が結合すると、細胞内に炎症応答反応を引き起こすシグナルが伝達され、HMGB-1産生などが亢進する。このことから、CD14はRAGEと同様に敗血症などにおける炎症メディエーターの1つとして知られている。このため、プロテインSとCD14の結合活性を確認するために、上述と同様ビアコアT100を用いて実験を行った。【０１９３】
アミンカップリングキットを用いて、ヒト血漿由来プロテインS、実施例3で調製した遺伝子組換えヒトプロテインS蛋白質であるMSPSを、Series S C1センサーチップ（ビアコア社製）の各フローセル上に700〜800RUで固定化した。次に、HBS-EP+バッファー（ビアコア社製）を用いて一定の濃度（25000、12500、6250、3125、1562 ng/mL）に希釈した組換えヒトCD14蛋白質（R&D systems社製）をアナライトとし、以下は実施例５と同様にして実験を行った。【０１９４】
その結果、MSPSは、KCPSおよびヒト血漿由来プロテインSに比較して、CD14に対する高い結合性を示すことが明らかとなった。
【実施例１０】
【０１９５】
活性化血管内皮からの炎症性サイトカイン産生の抑制効果
ヒトインターロイキン8（IL-8）は、敗血症、播種性血管内凝固症候群（DIC）、およびVTEなどの血栓症において主に活性化血管内皮などから産生され、病態進行に関与する炎症メディエーターのひとつとして知られている。そこで、遺伝子組換えプロテインSが血管内皮細胞からのIL-8産生を抑制する効果を有するか、解析を実施した。血管内皮細胞専用低血清培地（クラボウ社製）で培養した正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC ; Lonza社製）を8.3×104細胞/ウェルの密度で96穴細胞培養プレート(ベクトンデッキンソン社製)に播種した。48時間培養後、培地を血管内皮細胞専用無血清培地に交換し、終濃度20μg/mLのプロテインSを添加して、37℃、2時間培養した。次に、終濃度1μg/mLのサルモネラ由来リポ多糖（LPS；Sigma社製）を添加し、37℃にて20時間培養した。翌日、各ウエルの培養上清180μLを回収し、ヒトIL-8特異的ELISAキット（Rbender medsystems社製）を用いて、キット添付のマニュアルに従って培養上清中のIL-8濃度（単位：pg/mL）を測定した（図10）。【０１９６】
その結果、LPS非添加のバックグランド値は、プロテインS非添加ウエルで23.4 pg/mL、ヒト血漿由来プロテインS添加ウエルで18.9 pg/mL、MSPS添加ウエルで16.6 pg/mL、であった。一方、LPSを添加したウエルにおけるIL-8濃度は、プロテインS非添加ウエルで133.2 pg/mL、ヒト血漿由来プロテインS添加ウエルで123.2 pg/mL、であったのに対し、MSPS添加ウエルで68.7 pg/mLであった。この結果より、フコースの無い遺伝子組換えプロテインS組成物が、血管内皮細胞からのIL-8産生抑制活性を有し、抗炎症作用を有する可能性が示唆された。
【実施例１１】
【０１９７】
プロテインＳによるヒト単球の活性化血管内皮への接着抑制効果
ヒト敗血症や急性肺障害などで組織における炎症が亢進すると、末梢血中を循環していた単球をはじめとする各種白血球が血管内皮に結合、内皮表面上をローリングして接着し、最終的には組織内に浸潤して炎症を悪化させることが広く知られている。そこで、遺伝子組換えプロテインS組成物が、ヒト単球と活性化血管内皮との接着を抑制するかどうか検討した。【０１９８】
血管内皮細胞専用低血清培地（クラボウ社製）で培養した正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC ; Lonza社製）を2.0×104細胞/ウェルの密度で96穴細胞培養プレート(ベクトンデッキンソン社製)に播種した。48時間後、ウエル内のHUVECに終濃度5 ng/mLのヒトTNF-α(R&D systems 社製)を添加し、37℃で４時間培養した。これと並行して、体積比10％のウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地(インビトロジェン社製)で培養したヒト単球由来細胞株U-937細胞(ATCC CRL-1593)を、蛍光色素PKH67(シグマ社製)で標識した。蛍光標識したU-937細胞を、終濃度50μg/mLのプロテインSを添加したRPMI1640培地(インビトロジェン社製 ; 終濃度0.1％のウシ血清アルブミン含有)に懸濁し、37℃で１時間培養した。次に、U-937細胞を２群に分け、それぞれ、終濃度1μg/mLのHMGB(和光純薬製)、終濃度5ｎg/mLのヒトTNF-αを添加して、37℃で4時間培養した。次に、これらのU-937細胞を、上記のHUVECを培養しておいた培養プレートに2.0×104細胞/ウェルで添加し、37℃で1時間培養して接着させた。その後、各ウェルを培地で２回洗浄してHUVECに接着しなかったU-937細胞を除去した。HUVECに接着したU-937細胞の数は、蛍光プレートリーダーARVO(パーキンエルマー社製)でウェル内の蛍光強度（excitation:490 nm、emission；535 nm）を測定することにより定量した（図11）。【０１９９】
この解析の結果、プロテインSは、TNFαまたはHMGB-1依存的に活性化されたU-937細胞の活性化HUVECへの結合を抑制することが明らかとなった。また、その接着抑制効果は、ヒト血漿由来プロテインSと比べて、MSPSの方がより強力であった。この結果より、フコースの無い遺伝子組換えプロテインS組成物が強力な細胞接着抑制活性、すなわち高い抗炎症作用を有する可能性が示された。
【産業上の利用可能性】
【０２００】
本発明によれば、N-グリコシド結合複合型糖鎖を有する遺伝子組換えプロテインS分子からなる組成物であって、N-グリコシド結合複合型糖鎖にフコースが結合していない糖鎖の割合が高いプロテインS組成物を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０２０１】
配列番号3：ヒトプロテインS  5’-プライマー
配列番号4：ヒトプロテインS  3’-プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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