(57)【要約】  ５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果を顕著に増強させることができる新規なＲＮＡｉ分子の提供。  配列番号２に示される塩基配列を有するＲＮＡｉ分子。当該ＲＮＡｉ分子と５−ＦＵ系抗腫瘍剤からなる抗腫瘍剤。
2010113844.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡｉ作用によりチミジル酸合成酵素の発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子であって、配列番号１、３または５で表される塩基配列からなるセンス鎖と該センス鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンス鎖がハイブリダイズしてなる二本鎖ＲＮＡ部分を含む、上記ＲＮＡｉ分子。
【請求項２】
以下のセンス鎖およびアンチセンス鎖の組み合わせからなる、請求項１記載のＲＮＡｉ分子：
配列番号１で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖；
配列番号３で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号４で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖；または
配列番号５で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号６で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖。
【請求項３】
センス鎖とアンチセンス鎖がリンカー部分を介して連結されている、請求項１または２記載のＲＮＡｉ分子。
【請求項４】
配列番号８で表される塩基配列からなる、請求項３記載のＲＮＡｉ分子。
【請求項５】
請求項３または４記載のＲＮＡｉ分子の鋳型ＤＮＡを含み該ＲＮＡｉ分子を発現するベクター。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載のＲＮＡｉ分子および／または請求項５記載のベクターを含む抗腫瘍剤。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載のＲＮＡｉ分子および／または請求項５記載のベクターと、５−ＦＵ系抗腫瘍剤とを組み合わせてなる、癌を治療および／または予防するための医薬組成物。
【請求項８】
５−ＦＵ系抗腫瘍剤が、テガフール含有配合剤である、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
５−ＦＵ系抗腫瘍剤が、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤である、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウムを１：０．４：１のモル比で含有する、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項記載のＲＮＡｉ分子および／または請求項５記載のベクターと、５−ＦＵ系抗腫瘍剤がそれぞれ単剤である、請求項７〜１０のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜４いずれか１項記載のＲＮＡｉ分子および／または請求項５記載のベクターと、５−ＦＵ系抗腫瘍剤がキット製剤である、請求項７〜１０のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１項記載のＲＮＡｉ分子および／または請求項５記載のベクターを含有する、５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項１４】
５−ＦＵ系抗腫瘍剤が、テガフール含有配合剤である、請求項１３記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項１５】
５−ＦＵ系抗腫瘍剤が、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤である、請求項１４記載の抗腫瘍効果増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チミジル酸合成酵素に対するＲＮＡｉ分子、当該ＲＮＡｉ分子を含有する抗腫瘍剤、当該ＲＮＡｉ分子を含有する５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果増強剤、ならびに当該ＲＮＡｉ分子および５−ＦＵ系抗腫瘍剤（特にテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤）を含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
５−フルオロウラシル（以下、５−ＦＵ）、テガフール・ウラシル配合剤、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウムをモル比１：０．４：１で配合した製剤。以下、Ｓ−１）などの５−ＦＵ系抗腫瘍剤は、消化器癌や非小細胞肺癌などの幅広い癌種の治療において、標準的に用いられている。５−ＦＵの標的分子としては、ＤＮＡ合成に関与しているチミジル酸合成酵素（以下、ＴＳ）が知られている。今日までに多くの臨床試験から、ＴＳの発現量と５−ＦＵ系抗腫瘍剤の感受性の関係が報告されており、すなわち、癌患者の中でもＴＳの発現が比較的低い癌患者は、５−ＦＵ系抗腫瘍剤が顕著に奏効する一方、癌患者の中でもＴＳの発現が比較的亢進している癌患者の多くは、５−ＦＵ系抗腫瘍剤に対して耐性を有する（非特許文献１、２）。したがって、ＴＳの発現が高く、５−ＦＵ系抗腫瘍剤に対して耐性を有する癌患者のために、５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果を増強させる新しい癌治療法が求められている。【０００３】
また、特定の遺伝子の発現を抑制するツールとして開発されたＲＮＡ干渉（以下、ＲＮＡｉ）を用いて、ＴＳの発現を抑制できることが報告された（特許文献１）。そこで、ＲＮＡｉによりＴＳの発現を抑制させ、５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果を増強する試みが行われているが、その増強効果はいまだに満足できるものではない（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２５３３４２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｇ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９５；５５：１４０７−１２．
【非特許文献２】Ｋｕｎ−Ｈｕｅｉ  Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  １９９８；８２：１６２６−３１．
【非特許文献３】門田ら、第６７回日本癌学会（２００８）；２３５頁、Ｐ−４２７４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果を顕著に増強させることができる新規なＲＮＡｉ分子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らはこのような現状に鑑み、５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果を顕著に増強させる新規なＲＮＡｉ分子に関して研究を重ねた結果、ＴＳの発現を特に顕著に抑制することが可能な新規なＲＮＡｉ分子を見出した。また、本発明者らは、当該ＲＮＡｉ分子がＴＳの発現を顕著に抑制することにより、抗腫瘍効果を有すること、また５−ＦＵ系抗腫瘍剤（特にテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤）の抗腫瘍効果を増強することを確認し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち本発明は、以下のとおりである。【０００９】
[１]  ＲＮＡｉ作用によりチミジル酸合成酵素の発現を抑制することができるＲＮＡｉ分子であって、配列番号１、３または５で表される塩基配列からなるセンス鎖と該センス鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンス鎖がハイブリダイズしてなる二本鎖ＲＮＡ部分を含む、上記ＲＮＡｉ分子。【００１０】
[２]  以下のセンス鎖およびアンチセンス鎖の組み合わせからなる、[１]のＲＮＡｉ分子：
配列番号１で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖；
配列番号３で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号４で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖；または
配列番号５で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号６で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖。【００１１】
[３]  センス鎖とアンチセンス鎖がリンカー部分を介して連結されている、[１]または[２]のＲＮＡｉ分子。【００１２】
[４]  配列番号８で表される塩基配列からなる、[３]のＲＮＡｉ分子。【００１３】
[５]  [３]または[４]のＲＮＡｉ分子の鋳型ＤＮＡを含み該ＲＮＡｉ分子を発現するベクター。【００１４】
[６]  [１]〜[４]のいずれかのＲＮＡｉ分子および／または[５]のベクターを含む抗腫瘍剤。【００１５】
[７]  [１]〜[４]のいずれかのＲＮＡｉ分子および／または[５]のベクターと、５−ＦＵ系抗腫瘍剤とを組み合わせてなる、癌を治療および／または予防するための医薬組成物。【００１６】
[８]  ５−ＦＵ系抗腫瘍剤が、テガフール含有配合剤である、[７]の医薬組成物。【００１７】
[９]  ５−ＦＵ系抗腫瘍剤が、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤である、[８]の医薬組成物。【００１８】
[１０]  テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウムを１：０．４：１のモル比で含有する、[９]の医薬組成物。【００１９】
[１１]  [１]〜[４]のいずれかのＲＮＡｉ分子および／または[５]のベクターと、５−ＦＵ系抗腫瘍剤がそれぞれ単剤である、[７]〜[１０]のいずれかの医薬組成物。【００２０】
[１２]  [１]〜[４]のいずれかのＲＮＡｉ分子および／または[５]のベクターと、５−ＦＵ系抗腫瘍剤がキット製剤である、[７]〜[１０]のいずれかの医薬組成物。【００２１】
[１３]  [１]〜[４]のいずれかのＲＮＡｉ分子および／または[５]のベクターを含有する、５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果増強剤。【００２２】
[１４]  ５−ＦＵ系抗腫瘍剤が、テガフール含有配合剤である、[１３]の抗腫瘍効果増強剤。【００２３】
[１５]  ５−ＦＵ系抗腫瘍剤が、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤である、[１４]の抗腫瘍効果増強剤。【００２４】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-086463号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係るＲＮＡｉ分子は、ＴＳの発現を特に顕著に抑制することが可能であり、ＴＳを発現する腫瘍の増殖を抑制することが可能である。さらに、本発明に係るＲＮＡｉ分子により、５−ＦＵ系抗腫瘍剤（特にテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤）の抗腫瘍効果を顕著に増強することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、ヒト結腸直腸癌株ＤＬＤ−１／５ＦＵにおける、ＴＳを標的としたｓｉＲＮＡのＴＳ発現抑制効果を示す特性図である。
【図２】図２は、ヒト結腸直腸癌株ＤＬＤ−１／５ＦＵ担癌マウスにおける、ＴＳを標的としたｓｈＲＮＡおよび／またはＳ−１の抗腫瘍効果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明のＲＮＡｉ分子は、配列番号１、配列番号３または配列番号５で表される塩基配列からなるセンス鎖と、当該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖とがハイブリダイズしてなる二本鎖ＲＮＡ部分を含む。本発明のＲＮＡｉ分子は、当該センス鎖と同じ塩基配列を有するＴＳのｍＲＮＡ部分（以下、標的ｍＲＮＡ部分）を標的とすることにより、ＴＳ特異的にＲＮＡｉ作用を奏し、ＴＳの発現を顕著に抑制することができる。
【００２８】
ここで本発明のＲＮＡｉ分子が、標的ｍＲＮＡ部分を「標的」とするとは、本発明のＲＮＡｉ分子の二本鎖ＲＮＡ部分のアンチセンス鎖が、標的ｍＲＮＡ部分とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできることをいう。
【００２９】
ストリンジェントな条件下とは、常法に従ってハイブリッドを形成する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて求めることができる。例えば、ハイブリダイズ状態を維持できる洗浄条件として通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件、より厳格には「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度の条件、さらに厳格には「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件が挙げられる。
【００３０】
本発明のＲＮＡｉ分子の二本鎖ＲＮＡ部分のアンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡ部分と完全に相補的な塩基配列からなるＲＮＡであることが望ましいが、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる限り、１〜３の塩基、好ましくは１〜２塩基、より好ましくは１塩基の欠失、置換、付加を含むミスマッチを有するものであってもよい。
【００３１】
好ましくは、本発明のＲＮＡｉ分子は、以下のセンス鎖およびアンチセンス鎖とがハイブリダイズしてなる二本鎖ＲＮＡ部分を含む：
配列番号１で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖；
配列番号３で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号４で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖；または
配列番号５で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号６で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖。
【００３２】
特に好ましくは、本発明のＲＮＡｉ分子は、配列番号１で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とがハイブリダイズしてなる二本鎖ＲＮＡ部分を含む。
【００３３】
本発明のＲＮＡｉ分子を構成するセンス鎖またはアンチセンス鎖は必要に応じて、3’末端にオーバーハングを有していても良い。当該オーバーハングの塩基の種類、数は限定されず、例えば、１〜５、好ましくは１〜３、さらに好ましくは１もしくは２塩基からなる配列が挙げられ、例えば、ＴＴＴ、ＵＵやＴＴが挙げられる。本発明において、オーバーハングとは、ＲＮＡｉ分子の一方の鎖の末端に付加された塩基であって、もう一方の鎖の対応する位置に相補的に結合し得る塩基が存在しない塩基をいう。オーバーハングはＤＮＡを構成する塩基であってもよい。さらに、ＲＮＡｉ分子を構成するセンス鎖またはアンチセンス鎖は、遺伝子の配列決定など種々の実験操作を円滑に行うために、ＲＮＡｉ活性に対して影響を与えない範囲で必要に応じて１〜３塩基、さらに好ましくは１もしくは２塩基の置換、付加、欠失をさらに含んでも良い。
【００３４】
また、センス鎖またはアンチセンス鎖は必要に応じて、5’末端がリン酸化されていてもよく、5’末端に三リン酸（ppp）が結合していても良い。
【００３５】
本発明のＲＮＡｉ分子には、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）分子、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）分子等の二本鎖ＲＮＡ分子が含まれるが、好ましくはｓｉＲＮＡ分子およびｓｈＲＮＡ分子である。
【００３６】
本発明におけるｓｉＲＮＡ分子とは、上記センス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズし、二本鎖部分を形成した二本鎖ＲＮＡ分子である。
【００３７】
ｓｉＲＮＡ分子を構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖は、公知の方法に基づいて、化学合成や、プロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼを用いた転写系によってin vitroで合成することができる。また、適当な発現ベクターに当該アンチセンス鎖およびセンス鎖の鋳型ＤＮＡを導入し、当該ベクターを適当な宿主細胞内に投与することによってin vivoで合成することも可能である。合成されたセンス鎖およびアンチセンス鎖のアニーリングは、当業者に公知である一般的な方法によって行うことができる。合成したセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ二本鎖ＲＮＡ用アニーリングバッファーに溶解し、等量（等モル数）を混合し、二本鎖が解離するまで温度を加熱し、その後徐々に冷却してインキュベートすることによって行うことができる。アニーリング条件は、例えば、９０℃にて１分間、続いて37℃にて１時間静置することによって行うことができる。その後、フェノール／クロロホルム抽出・エタノール沈殿を行うことによって、二本鎖ＲＮＡ分子であるｓｉＲＮＡ分子を得ることができる。
【００３８】
本発明における、ｓｈＲＮＡ分子とは、上記センス鎖とアンチセンス鎖とが、リンカー部分を介して連結された４０〜６０塩基からなる一本鎖ＲＮＡであり、当該リンカー部分がループを形成することにより折りたたまれ、当該アンチセンス鎖と当該センス鎖がハイブリダイズして、二本鎖部分を形成する。
【００３９】
ｓｈＲＮＡ分子に含まれるリンカー部分は、センス鎖とアンチセンス鎖を連結しステムループ構造を形成し得る限り、ポリヌクレオチドリンカーであっても、非ポリヌクレオチドリンカーであってもよく、特に限定しないが、当業者に公知である２〜２２塩基のポリヌクレオチドリンカーが好ましい。具体的には、ＵＡＧＵＧＣＵＣＣＵＧＧＵＵＧ（配列番号７）、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＣＣＡＣＣ、ＣＵＣＧＡＧ、ＣＣＡＣＡＣＣ、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＡＵＧ、ＣＣＣおよびＵＵＣＧが例示でき、ＵＡＧＵＧＣＵＣＣＵＧＧＵＵＧ（配列番号７）が好ましい。
【００４０】
好ましいｓｈＲＮＡ分子としては、配列番号８で表される塩基配列からなる一本鎖ＲＮＡである。
【００４１】
ｓｈＲＮＡ分子も、上記したように公知の方法に基づいて、in vitroまたはin vivoにて合成することが可能である。合成に際しては、センス鎖とアンチセンス鎖を逆方向配列として含む1本のＲＮＡ鎖を合成し、その後この1本のＲＮＡ鎖を自己相補的結合によって二本鎖構造を形成させｓｈＲＮＡ分子を得ることができる。
【００４２】
ｓｈＲＮＡ分子はまた、当該ｓｈＲＮＡ分子をコードする鋳型ＤＮＡを含む発現ベクターを使用して得ることもできる。
【００４３】
本発明に用いることができるベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター、非ウイルスベクターなどを用いることができる。プラスミドベクターとしては、pBAsiベクター、pSUPERベクター、pBAsi-hU6等を用いることができる。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター（pAxcwitなど）、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等を用いることができる。非ウイルスベクターとしては、リポソームベクター等を用いることができる。
【００４４】
ベクターには、プロモーターおよび／またはその他の制御配列をｓｈＲＮＡ分子の鋳型ＤＮＡに機能し得るかたちで連結して挿入する。「機能し得るかたちで連結して挿入する」とは、当該ベクターが導入された細胞において、プロモーターおよび／またはその他の制御配列の制御の下、上記ｓｈＲＮＡ分子が発現され標的となるＴＳのｍＲＮＡが分解されるように、プロモーターおよび／またはその他の制御配列を連結してベクターに組み込むことを意味する。ベクターに組み込むことができるプロモーターおよび／またはその他の制御配列は特に限定されないが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、時期特異的プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーター、ポリメラーゼＩＩ系プロモーター、ＣＭＶプロモーターなど、その他の調節エレメントなど（例えば、チミジン残基が少なくとも４つ以上連続する配列からなるターミネーター配列）、当該分野で公知のプロモーターおよび／またはその他の制御配列を適宜選択することが可能である。
【００４５】
このように作製された上記ｓｈＲＮＡ分子を発現するベクターは、導入された細胞内でｓｈＲＮＡ分子を発現し、ＴＳのｍＲＮＡを特異的に分解することができる。
【００４６】
本発明のＲＮＡｉ分子の投与方法は、腫瘍内で効果を奏する限り特に制限はなく、ＲＮＡｉ分子は、腫瘍内や血中に投与することが可能である。本発明のＲＮＡｉ分子が血中に投与される場合、ＲＮＡｉ分子の分解を防ぐため、公知の核酸修飾法により修飾してもよい。また、腫瘍に到達しやすいように、リポソームや高分子ミセル等の公知のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）技術を用いてもよい。
【００４７】
また、本発明のｓｈＲＮＡ分子発現ベクターを細胞に導入する方法としては、脂質を媒介とする担体輸送法（例えば、リポフェクトアミン法）、化学物質（リン酸カルシウムなど）を媒介とする輸送、マイクロインジェクション、遺伝子銃による打ち込み法、電気穿孔法等が挙げられる。
【００４８】
本発明のＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターの効果は、当該分子またはベクターを導入された細胞や組織、および個体におけるＴＳのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量が、当該分子またはベクターを導入していない（または導入前の）細胞や組織、および個体におけるＴＳのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量と比較して低下していることを指標にして評価することが可能である。測定対象がｍＲＮＡである場合には、ノザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、in situ hybridizationなどによって測定することができる。また、測定対象がタンパク質である場合には、ウエスタンブロッティング、ELISA、抗体を結合させたプロテインチップを用いた測定、タンパク質の活性測定などによって測定することができる。
【００４９】
本発明のＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターは、導入された細胞や組織、および個体におけるＴＳのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量を、対照と比較して５割以上、６割以上、７割以上、好ましくは８割以上またはさらに好ましくは９割以上、低下させることが可能である。
【００５０】
本発明のＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターの効果は、ＴＳのｍＲＮＡを標的とする当業者に公知であるＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターと比べて、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、またはそれ以上のＴＳの発現抑制効果を有し得る。
【００５１】
なお、ＲＮＡｉ分子の設計において、標的ｍＲＮＡ部分の塩基配列を選択する方法として種々の方法が知られており、例えば、ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ株式会社）などを用いることが可能である。しかし、当該手法により選択された塩基配列を有するＲＮＡｉ分子の全てがＲＮＡｉ作用を有するわけではない。したがって、当該手法により選択された塩基配列を有する候補ＲＮＡｉ分子の中から、所望するＴＳの発現を顕著に抑制する作用を有するＲＮＡｉ分子を選択することは多大な困難性を有するものである。
【００５２】
上述したＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターは、（ａ）抗腫瘍剤、（ｂ）５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果増強剤、および（ｃ）癌を治療および／または予防するための医薬組成物の有効成分として使用できる。
【００５３】
（ａ）抗腫瘍剤
下記実施例にて詳述されるように、本発明のＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターは腫瘍細胞の増殖を抑制することが可能であることから、本発明のＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターは、癌を治療および／または予防するための抗腫瘍剤として使用できる。
【００５４】
本発明の抗腫瘍剤を用いて治療できる癌としては、ＴＳを高発現している癌が挙げられ、特に制限されるものではないが、例えば、結腸・直腸癌、肝臓癌、腎臓癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、胆道癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮体癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍、骨・軟部肉腫、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、皮膚癌、脳腫瘍等が挙げられる。好ましくは結腸・直腸癌、胃癌、頭頸部癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、胆道癌、肝臓癌であり、特に好ましくは結腸・直腸癌である。
【００５５】
本発明の抗腫瘍剤は、上記本発明のＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターを１種または複数種を組み合わせて含んでも良い。また、本発明の抗腫瘍剤の有効成分としては、ｓｈＲＮＡ分子発現ベクターを使用することが好ましい。当該ベクターは、ＲＮＡｉ分子を合成するより安価であり、かつ、細胞内に導入後増幅されてｓｈＲＮＡ分子を安定して大量に生成し得る点でＲＮＡｉ分子を導入するのに比べて量的な効率も良いためである。当該ｓｈＲＮＡ発現ベクターは配列番号８で表されるｓｈＲＮＡ分子を発現するものが好ましい。
【００５６】
本発明の抗腫瘍剤はまた、本発明のＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターと共に、通常用いられている適当なキャリア、希釈剤、エマルジョン、賦形剤、増量剤、結合剤、浸潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、着色料、香味剤、および安定化剤などを含んでも良い。
【００５７】
本発明の抗腫瘍剤は、注射によって直接癌に対して投与することが可能であり、また、経口投与または非経口投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、注射による局所投与、腹腔または胸腔への投与、皮下投与、筋肉内投与、舌下投与、経皮吸収または直腸内投与など）によっても、投与することができる。
【００５８】
また、本発明の抗腫瘍剤は、投与経路に応じて適当な剤形とすることができる。具体的には注射剤、懸濁剤、乳化剤、軟膏剤、クリーム剤錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ錠、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤等の各種製剤形態に調製することができる。
【００５９】
本発明の抗腫瘍剤に含まれる本発明のＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターは、患者の年齢、体重、疾患の重篤度などの要因によって変化し得るが、1回につき体重1ｋｇあたり0.0001ｍｇ〜100ｍｇの範囲から適宜選択される量を含めることができる。
【００６０】
また、本発明の抗腫瘍剤中に含有されるＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターの目的の組織または細胞への遺伝子送達は、遺伝子治療の分野で通常用いられている種々の投与方法を利用することが可能であり、例えば、上記したようにリポソームや高分子ミセル等の公知のＤＤＳ技術、脂質を媒介とする担体輸送法（例えば、リポフェクトアミン法）、化学物質（リン酸カルシウムなど）を媒介とする輸送、マイクロインジェクション、遺伝子銃による打ち込み法、電気穿孔法等を利用することが可能である。
【００６１】
本発明の抗腫瘍剤の効果は、上記癌に由来する細胞や組織、および上記癌に罹患する個体に当該抗腫瘍剤を投与し、腫瘍の大きさが当該抗腫瘍剤を投与していない（または投与前の）細胞や組織、および個体における腫瘍の大きさと比較して、腫瘍が縮小または消滅していることを指標にして評価することが可能である。本発明の抗腫瘍剤の効果を評価するのに利用できる癌細胞として、ＴＳが発現していれば癌種等は特に制限されず、例えば、ヒト結腸直腸癌細胞株ＤＬＤ−１／５ＦＵ、ＫＭ１２Ｃ／５ＦＵ、ＨＴ２９／５ＦＵ、ヒト胃癌細胞株ＮＵＧＣ−３／５ＦＵ等が挙げられる。
【００６２】
本発明の抗腫瘍剤の効果は、ＴＳのｍＲＮＡを標的とする当業者に公知のＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターを有効成分とする抗腫瘍剤と比べて、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、またはそれ以上の抗腫瘍効果を有し得る。
【００６３】
（ｂ）５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果増強剤
当該分野において周知であるように、ＴＳの発現が高い腫瘍は、５−ＦＵ系抗腫瘍剤に対して耐性を有し得る（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  Ｐ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９５；５５：１４０７−１２．；Ｙｅｈ  Ｋ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  １９９８；８２：１６２６−３１．）。下記実施例にて詳述されるように、本願発明の５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果増強剤は、当該腫瘍においてＴＳの発現を抑制し、投与された５−ＦＵ系抗腫瘍剤の効果を高めることができる。
【００６４】
本発明において、５−ＦＵ系抗腫瘍剤として、５−ＦＵおよび活性代謝物質が５−ＦＵである５−ＦＵ誘導体が挙げられる。５−ＦＵ誘導体としては例えば、テガフールを含有するものを挙げることができる。５−ＦＵ誘導体としては好ましくは、テガフール含有配合剤であり、具体的には、テガフール・ウラシル配合剤、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、ドキシフルリジン、カペシタビン、カルモフールなどが例示できる。この中でも、下記に詳述されるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、例えばティーエスワン（登録商標）(大鵬薬品工業株式会社)が特に好ましい。
【００６５】
本発明の５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果増強剤は、上記本発明のＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターを１種または複数種を組み合わせて含んでも良い。好ましくはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターを含有する。好ましくは当該ｓｈＲＮＡ発現ベクターは配列番号８で表されるｓｈＲＮＡ分子を発現する。
【００６６】
本発明の５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果増強剤に含まれる本発明のＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターは、患者の年齢、体重、疾患の重篤度などの要因によって変化し得るが、1回につき体重1ｋｇあたり0.0001ｍｇ〜100ｍｇの範囲から適宜選択される量を含めることができる。
【００６７】
本発明の５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果増強剤は、上記抗腫瘍剤と同様に、投与経路、投与対象などの要因に応じて、公知の手法に基づいて適宜調製することが可能であり、含有されるＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターは、目的の組織または細胞へ遺伝子治療の分野で通常用いられている種々の投与方法を利用して送達することが可能である。
【００６８】
本発明の５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果増強剤の効果は、上記癌に由来する細胞や組織、および上記癌に罹患する個体に、５−ＦＵ系抗腫瘍剤と本発明の５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果増強剤を共投与し、腫瘍の大きさが５−ＦＵ系抗腫瘍剤を単独で投与した細胞や組織、および個体における腫瘍の大きさと比較して、腫瘍が縮小または消滅していることを指標にして評価することが可能である。本発明の５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果増強剤の効果を評価するのに利用できる癌細胞として、ＴＳが発現していれば癌種等は特に制限されず、例えば、ヒト結腸直腸癌細胞株ＤＬＤ−１／５ＦＵ、ＫＭ１２Ｃ／５ＦＵ、ＨＴ２９／５ＦＵ、ヒト胃癌細胞株ＮＵＧＣ−３／５ＦＵ等が挙げられる。５−ＦＵ系抗腫瘍剤と本発明の５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果増強剤とは、同時に或いは間隔を空けて投与してもよい。
【００６９】
本発明の５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果増強剤は、５−ＦＵ系抗腫瘍剤と共に用いることによって５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果を2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍またはそれ以上に高めることが可能である。
【００７０】
本発明の５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果増強剤は、５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果を増強することが可能であるために、上記癌に罹患する患者を治療するのに必要とされる５−ＦＵ系抗腫瘍剤の投与量を低減することができる。これによって、５−ＦＵ系抗腫瘍剤の投与により引き起こされ得る副作用（例えば、骨髄抑制、溶血性貧血、播種性血管内凝固症候群、劇症肝炎、脱水症状、腸炎、間質性肺炎、口内炎、消化管潰瘍、消化管出血、消化管穿孔、急性腎不全、皮膚粘膜眼症候群、中毒性表皮壊死症、精神神経障害、急性膵炎、横紋筋融解症、嗅覚脱失など、これらに限定されない）の発症を抑制または遅延することができる。
【００７１】
（ｃ）癌を治療および／または予防するための医薬組成物
本発明の癌を治療および／または予防するための医薬組成物は、上記本発明のＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターと５−ＦＵ系抗腫瘍剤とを有効成分として含有する。本発明の医薬組成物は、ＴＳを高発現しており、５−ＦＵ系抗腫瘍剤に対し耐性を示す癌を治療および／または予防するのに使用できる。
【００７２】
本発明の医薬組成物によって治療できる癌としては、ＴＳを高発現している癌が挙げられ、特に制限されるものではないが、例えば、結腸・直腸癌、肝臓癌、腎臓癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、胆道癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮体癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍、骨・軟部肉腫、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、皮膚癌、脳腫瘍等が挙げられる。好ましくは結腸・直腸癌、胃癌、頭頸部癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、胆道癌、肝臓癌であり、特に好ましくは結腸・直腸癌である。
【００７３】
本発明の医薬組成物において、５−ＦＵ系抗腫瘍剤とは、５−ＦＵだけではなく、活性代謝物質が５−ＦＵである５−ＦＵ誘導体を含むものであり、例えば、テガフールを含有するものであり得る。好ましくは、テガフール含有配合剤であり、具体的には、テガフール・ウラシル配合剤、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、ドキシフルリジン、カペシタビン、カルモフールなどが例示できる。これらのうち、好ましくはテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤である。
【００７４】
テガフールとは、５−フルオロ−１−（２−テトラヒドロフリル）−２，４−（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオンで表される公知の化合物であり、生体内で活性化を受けて抗腫瘍活性の本体である５−ＦＵを放出する薬剤である。テガフールは、公知の方法、例えば特公昭４９−１０５１０号公報に記載されている方法に従って製造することができる。
【００７５】
ギメラシルとは、２，４−ジヒドロキシ−５−クロロピリジンで表される公知の化合物であり、それ自身全く抗腫瘍活性を有さないものであるが、５−ＦＵが生体内において代謝されて不活性化されることを抑制するものであり、抗腫瘍効果を増強させることができる。
【００７６】
オテラシルカリウムとは、モノポタシウム  １，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−１，３，５−トリアジン−６−カルボキシレートで表される公知の化合物であり、それ自身は抗腫瘍活性を有さないが、主に消化管に分布してその部位での５−ＦＵの活性化を抑制することにより消化管障害を抑制するものである。
【００７７】
好ましいテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤において、テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウムの配合割合は、それぞれの配合目的を奏する範囲であれば特に制限されず、例えば、特許第２６１４１６４号公報に記載されている公知の配合剤と同様の範囲で良く、1日量としてテガフール１モルに対して、ギメラシルを０．１〜５モル程度、好ましくは０．２〜１．５モル程度とすればよく、オテラシルカリウムを０．１〜５モル程度、好ましくは０．２〜２モル程度とすればよい。特に好ましくは、各有効成分の配合割合は、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム（モル比）＝１：０．４：１である。なお、テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウムを１：０．４：１のモル比で配合したテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を、本明細書中にてＳ−１と称する場合がある。
【００７８】
本発明の医薬組成物は、上記本発明のＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターを１種または複数種を組み合わせて含んでも良い。好ましくはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターを含有する。さらに好ましくは当該ｓｈＲＮＡ発現ベクターは配列番号８で表されるｓｈＲＮＡ分子を発現する。
【００７９】
本発明の医薬組成物は、ＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクター、ならびにテガフール、ギメラシルおよびオテラシルカリウムを適当な配合比において配合剤（複数の有効成分を含有する製剤）として一の剤型に製剤化したもの（１剤型形態）でも、同時にまたは間隔を空けて別々に使用できるように、上記有効成分を単剤（単一の有効成分を含有する製剤）または配合剤として複数の剤型に製剤化したもの（多剤型形態）であってもよい。このうちテガフール、ギメラシルおよびオテラシルカリウムは、配合剤として一の剤型に製剤化することが好ましく、ＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターは、単剤として製剤化することが好ましい。
【００８０】
上記各製剤の投与形態としては特に制限は無く、治療目的に応じて適宜選択でき、具体的には経口剤（錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤など）、注射剤、坐剤、貼付剤、軟膏剤等が例示できる。本発明の医薬組成物を複数の剤型に製剤化する場合は、上記各製剤はそれぞれ異なる投与形態であっても同一の投与形態であってよい。例えば、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤は経口剤、ＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターを含有する製剤は注射剤とすることが好ましい。
【００８１】
本発明の医薬組成物は、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、およびＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターが併用投与される限り、上記各製剤ごとにそれぞれ個別に製造・包装・流通されるものでもよく、また上記各製剤のすべてまたは一部を併用投与に適した単一のパッケージ（キット製剤）として製造・包装・流通されるものでもよい。
【００８２】
本発明の医薬組成物における各有効成分を含有する製剤は、薬理学的に許容される担体を用いて、通常公知の方法により調製することができる。斯かる担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を例示できる。
【００８３】
賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、イノシトール、デキストラン、ソルビトール、アルブミン、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴムおよびこれらの混合物等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物等が挙げられる。結合剤としては、例えば、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウムおよびこれらの混合物等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖およびこれらの混合物等が挙げられる。希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類およびこれらの混合物等が挙げられる。安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸およびこれらの混合物等が挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ホウ酸、ブドウ糖、グリセリンおよびこれらの混合物等が挙げられる。ｐＨ調整剤および緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびこれらの混合物等が挙げられる。無痛化剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインおよびこれらの混合物等が挙げられる。
【００８４】
本発明の医薬組成物における各有効成分の投与量は、それぞれの配合目的を奏する量であれば特に制限されず、患者の年齢、癌種、病期、転移の有無、治療暦、他の抗腫瘍剤の有無などにより適宜設定されるが、テガフールは０．２〜４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙが、ギメラシルは０．０５〜１２ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、好ましくは０．１〜６ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙが、オテラシルカリウムは０．２〜４０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙが、ＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターは、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙが例示できる。
【００８５】
本発明の医薬組成物における各有効成分の投与順序や投与間隔は、各有効成分による相乗効果が得られる範囲であれば特に制限されない。また、本発明の医薬組成物をキットとする場合は、それぞれ単独の製剤を、同時に或いは間隔を空けて投与してもよい。
【００８６】
本発明の医薬組成物の効果は、上記癌に由来する細胞や組織、および上記癌に罹患する個体に当該医薬組成物を投与し、腫瘍の大きさが当該医薬組成物を投与していない（または投与前の）細胞や組織、および個体における腫瘍の大きさと比較して、腫瘍が縮小または消滅していることを指標にして評価することが可能である。本発明の医薬組成物の効果を評価するのに利用できる癌細胞として、ＴＳが発現していれば癌種等は特に制限されず、例えば、ヒト結腸直腸癌細胞株ＤＬＤ−１／５ＦＵ、ＫＭ１２Ｃ／５ＦＵ、ＨＴ２９／５ＦＵ、ヒト胃癌細胞株ＮＵＧＣ−３／５ＦＵ等が挙げられる。
【００８７】
本発明の医薬組成物が有する抗腫瘍効果は、各有効成分がそれぞれに有する抗腫瘍効果による相加効果ではなく、ＲＮＡｉ分子またはｓｈＲＮＡ分子発現ベクターによってもたらされる５−ＦＵ系抗腫瘍剤の活性増強効果による、相乗的な効果であり得る。「相加効果」とは、各有効成分によってもたらされる抗腫瘍効果の総和であり、下記実施例にて詳述されるように各有効成分によってもたらされる腫瘍増殖阻害率を掛け合わせた値として示すことができる。一方、「相乗的な効果」とは、各有効成分によってもたらされる抗腫瘍効果の相加効果よりも統計学的に有意に高い抗腫瘍効果を意味し、下記実施例にて詳述されるように各有効成分によってもたらされる相加効果による腫瘍増殖阻害率よりも統計学的に有意に低い腫瘍増殖阻害率を示す。
【００８８】
本発明はまた、上記本発明の抗腫瘍剤、５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果増強剤、および／または医薬組成物を用いた癌の治療方法に関する。当該方法により治療し得る癌としては、上に定義したような癌が含まれる。
【実施例】
【００８９】
以下に実施例を示し、本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。【００９０】
（実施例１）
ＴＳに対するｓｉＲＮＡ分子の同定
５−ＦＵに耐性を示すことが報告されているヒト結腸直腸癌細胞株ＤＬＤ−１／５ＦＵ（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２０００；１７：２７７−８３．）を５０〜６０％コンフルエントになるまで２４時間、６ｃｍカルチャーディッシュ上で培養した。【００９１】
次いで、以下のｓｉＲＮＡ分子：ＴＳ−ｓｉＲＮＡ１（センス鎖：配列番号１、アンチセンス鎖：配列番号２）；ＴＳ−ｓｉＲＮＡ２（センス鎖：配列番号３、アンチセンス鎖：配列番号４）；ＴＳ−ｓｉＲＮＡ３（センス鎖：配列番号５、アンチセンス鎖：配列番号６）を化学合成し、各ｓｉＲＮＡ分子（最終濃度２５ｎＭ）とＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ社）２５μｌを含む２．５ｍｌの溶液を用いて常法にしたがい上記細胞にトランスフェクトした。なお、ネガティブコントロールとしてＳｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｉＲＮＡ（ＴＳ−Ｓｃｒａ１）を用いた。【００９２】
トランスフェクトから７２時間後、各ｓｉＲＮＡ分子におけるＴＳ発現抑制効果を、ＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲ法（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社））にて確認した。なお、ＴＳのプライマーおよびプローブは、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ  Ｄｅｍａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘ（ａｓｓａｙ  ＩＤ  Ｈｓ００４２６５９１＿ｍ１，ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓｉｚｅ  ８７  ｂｐ；  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。また、内部標準としてはＧＡＰＤＨを用いた（Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，ａｓｓａｙ  ＩＤ  Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１，ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓｉｚｅ  １２２  ｂｐ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）。【００９３】
結果を図１に示す。ＴＳ−ｓｉＲＮＡ１〜３のすべてでＴＳの発現抑制効果が確認されたが、そのうち、ＴＳ−ｓｉＲＮＡ１は、ＴＳ−ｓｉＲＮＡ２、３と比較してＴＳの発現を強く抑制した（８３．５±１．３％）。【００９４】
（実施例２）
ＴＳに対するｓｈＲＮＡ分子を発現するアデノウイルスベクターの構築
ＴＳ−ｓｉＲＮＡ１を基にＴＳに対するｓｈＲＮＡ分子の鋳型となるＤＮＡ（ＴＳ−ｓｉＲＮＡ１のセンス鎖（ＧＴＡＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡＴＣＡＴＧＡ、配列番号９）＋リンカー部分（ＴＡＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＴＧ、配列番号１０）＋ＴＳ−ｓｉＲＮＡ１のアンチセンス鎖（ＴＣＡＴＧＡＴＣＧＡＴＧＧＴＧＴＴＡＣ、配列番号１１）＋ポリメラーゼＩＩＩターミネーター（ＴＴＴＴＴＴ））を合成した。ＴＳに対するｓｈＲＮＡ分子を発現するプラスミドベクターを作製するため、当該鋳型を、ヒトＵ６プロモーターを有するｐＢＡｓｉ−ｈＵ６プラスミドベクター (タカラバイオ株式会社)に挿入した。【００９５】
次いで、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｋｉｔ(タカラバイオ株式会社)を用いて、ＥｃｏＲＶにて上記プラスミドベクターから切り出したヒトＵ６プロモーターと当該鋳型を、ｐＡｘｃｗｉｔコスミドベクターに挿入した。ＣＯＳ−ＴＰＣ法（Ｊｐｎ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｂｉｏｌ  １９９４；４７：１５７−６６．）を用いて、ＴＳを標的としたｓｈＲＮＡ分子を発現するＥ１領域欠損型アデノウイルスベクター（以下、Ａｄ−ｓｈＴＳ）を構築した。なお、コントロールとして、バクテリアのＬａｃＺ遺伝子を含むアデノウイルスベクター（以下、Ａｄ−ＬａｃＺ）を用いた（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００４；２３：７４７５−８３．）。【００９６】
（実施例３）
ＴＳに対するｓｈＲＮＡ分子のＴＳ−１の抗腫瘍効果増強作用
皮下継代したヒト結腸直腸癌細胞株ＤＬＤ−１／５ＦＵの約８ｍｍ３のフラグメントを６週齢の雄ヌードマウスの背中に移植し、その腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達した時、６匹ずつに群分けを行った。Ａｄ−ｓｈＴＳを投与した群（以下、Ａｄ−ｓｈＴＳ群）およびＡｄ−ｓｈＴＳとＳ−１を投与した群（以下、Ａｄ−ｓｈＴＳ＋Ｓ−１群）においては、Ａｄ−ｓｈＴＳを、１６日間４日毎、２×１０９ｐｆｕを腫瘍内に注射した。Ａｄ−ｓｈＴＳ＋Ｓ−１群およびＳ−１を投与した群（以下、Ｓ−１群）においては、Ｓ−１（大鵬薬品工業株式会社）を、１日１回１４日間連続、１０ｍｇ／ｋｇを経口投与した。Ａｄ−ｓｈＴＳの最初の投与は、Ｓ−１投与開始の２日前に行った。なお、コントロール群においては、ＰＢＳを１６日間４日毎、腫瘍内に注射した。【００９７】
その後３０日間３日毎に腫瘍の大きさを測定することにより、各マウスにおける腫瘍増殖を検討した。なお、腫瘍体積および腫瘍増殖率は、以下の式により求めた。【００９８】
腫瘍体積（ｍｍ３）  ＝  （腫瘍の長辺）×（腫瘍の短辺）２×０．５
腫瘍増殖率  ＝  （測定日での腫瘍体積）／（投与開始時の腫瘍体積）
結果を図２に示す。３０日目でのコントロール群の腫瘍増殖率は、４４．５±１８．０であるのに対し、Ａｄ−ｓｈＴＳ群では２２．３±８．２、Ｓ−１群では１７．４±１１．５、Ａｄ−ｓｈＴＳ＋Ｓ−１群では４．７±０．９であった。よって、Ａｄ−ｓｈＴＳ＋Ｓ−１群の抗腫瘍効果は、コントロール群、Ａｄ−ｓｈＴＳ群およびＳ−１群と比べて統計上有意に高いことが確認された。【００９９】
また、コントロール群に対する腫瘍増殖阻害率（％）（＝３０日目での各薬剤投与群の腫瘍増殖率／３０日目でのコントロール群の腫瘍増殖率×１００）は、Ａｄ−ｓｈＴＳ群で５０％、Ｓ−１群で３９％であった。ここでＡｄ−ｓｈＴＳとＳ−１の併用による抗腫瘍効果の増強作用が相加効果である場合、Ａｄ−ｓｈＴＳ＋Ｓ−１群のコントロール群に対する腫瘍増殖阻害率は両者を掛け合わせた５０％×３９％＝２０％であると考えられる。しかし、実際には１１％であったことから、Ａｄ−ｓｈＴＳとＳ−１の併用による抗腫瘍効果の増強作用は相乗効果であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明のＴＳ ｍＲＮＡを標的とするＲＮＡｉ分子は、腫瘍細胞におけるＴＳの発現量を抑制することが可能であり、また腫瘍細胞の増殖を抑制することが可能である。また、本発明のＲＮＡｉ分子を用いてＴＳの発現量を抑制することにより、５−ＦＵ系抗腫瘍剤の抗腫瘍効果を増強することが可能であり、効率的に癌を治療および／または予防することを可能とする。【０１０１】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
2010113844.tif 000003
【図２】
2010113844.tif 000004
【配列表】
2010113844000001.app
【国際調査報告】
2010113844.tif 000005
2010113844.tif 000006
2010113844.tif 000007
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