(57)【要約】  非投与部位での副作用のないボツリヌス毒素製剤を提供するために、投与部位以外の部位において軸索輸送に伴う副作用を示さないことを特徴とするＨＡ蛋白質非産生性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａの神経毒素を主成分として含有する医薬組成物を用いる。上記ボツリヌス神経毒素は、Ａ１型ボツリヌス菌由来神経毒素と比較して、神経軸索を介して非投与部位へ輸送されないため、体重１ｋｇあたり１５Ｕより多く２５Ｕ以下まで大量投与可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素を有効成分として含有し、
１回の投与で、投与対象の体重１ｋｇあたり上記ボツリヌス毒素が１５Ｕより多く２５Ｕ以下の量にて投与される医薬組成物。
【請求項２】
上記ボツリヌス毒素が１５Ｕより多く２０Ｕ以下の量にて投与される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
上記ＨＡ非生産性のボツリヌス菌は、Ａ２型ボツリヌス菌である請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
上記Ａ２型ボツリヌス菌は、Ｋｙｏｔｏ−Ｆ株、Ｃｈｉｂａ−Ｈ株、ＣＤＣ１４３６株、Ｍａｓｃａｒｐｏｎｅ株、ＺＫ３株、Ｙ−８０３６株、７Ｉ０３−Ｈ株、７Ｉ０５−Ｈ株、またはＫＺ１８２８株である請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の医薬組成物の、斜視、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、脳性麻痺、痙性発声障害、痙縮、片頭痛などの頭痛、慢性疼痛、腰痛、骨盤痛、ヘルペス後神経痛、神経障害性の痛み、肩こり、パーキンソン病や多発性硬化症などの発症時に起こる筋弛緩不全、筋膜痛症候群、咀嚼筋攣縮、慢性裂肛、排尿筋・括約筋協調不全、過活動膀胱、前立腺障害、多汗症、歯ぎしり、顔面ミオキミア、チック、固縮、拘縮、ジストニア、局所性ジストニア、霰粒腫、麦粒腫、手根管症候群、血液量増加性唇変形症、外反母趾、内反母趾、足親指異常症、硬着母趾、突発性内反足、ペプシン性潰瘍、胃食道逆流症、食道アカラシア、胃不全麻痺、膣痙、関節症、上顆炎、回旋筋キャップ症、筋膜症、テニス肘、胸郭出口症候群、にきび、神経伝達物質の過剰活動による統合失調症、アルツハイマー病、躁病、鬱病、心血管疾患、先端巨大症、巨人症、クッシング病、性機能亢進症、甲状腺機能亢進病、ゴナドトロピン関連疾患、排卵抑制、精子産生抑制、橋本病、甲状腺炎、甲状腺機能低下症や高カルシウム血症、低カルシウム血症、陰茎持続勃起症、粘液分泌過多、唾液分泌過多、骨腫瘍、糖尿病、膵臓障害、耳鳴、蝸牛神経異常、メニエル病、癌、育毛、円形脱毛症、自律神経障害、褥瘡、癲癇、減量、子宮障害、肛門挙筋症候群、糖尿病性神経障害、美容、または皺への使用。
【請求項６】
請求項１〜４の何れか１項に記載の医薬組成物を含有する、斜視、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、脳性麻痺、痙性発声障害、痙縮、片頭痛などの頭痛、慢性疼痛、腰痛、骨盤痛、ヘルペス後神経痛、神経障害性の痛み、肩こり、パーキンソン病や多発性硬化症などの発症時に起こる筋弛緩不全、筋膜痛症候群、咀嚼筋攣縮、慢性裂肛、排尿筋・括約筋協調不全、過活動膀胱、前立腺障害、多汗症、歯ぎしり、顔面ミオキミア、チック、固縮、拘縮、ジストニア、局所性ジストニア、霰粒腫、麦粒腫、手根管症候群、血液量増加性唇変形症、外反母趾、内反母趾、足親指異常症、硬着母趾、突発性内反足、ペプシン性潰瘍、胃食道逆流症、食道アカラシア、胃不全麻痺、膣痙、関節症、上顆炎、回旋筋キャップ症、筋膜症、テニス肘、胸郭出口症候群、にきび、神経伝達物質の過剰活動による統合失調症、アルツハイマー病、躁病、鬱病、心血管疾患、先端巨大症、巨人症、クッシング病、性機能亢進症、甲状腺機能亢進病、ゴナドトロピン関連疾患、排卵抑制、精子産生抑制、橋本病、甲状腺炎、甲状腺機能低下症や高カルシウム血症、低カルシウム血症、陰茎持続勃起症、粘液分泌過多、唾液分泌過多、骨腫瘍、糖尿病、膵臓障害、耳鳴、蝸牛神経異常、メニエル病、癌、育毛、円形脱毛症、自律神経障害、褥瘡、癲癇、減量、子宮障害、肛門挙筋症候群、または糖尿病性神経障害の治療剤。
【請求項７】
請求項１〜４の何れか１項に記載の医薬組成物を含有することを特徴とする、美容、皺の改善薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経軸索を介して投与部位以外の部位へ軸索輸送されることに伴う脱力等の副作用を示さないため高用量投与が可能であることを特徴とする、赤血球凝集素（ＨＡ蛋白質）非産生性のＡ２型ボツリヌス菌株より得られる１５０ｋＤａのＡ型神経毒素（Ａ２ＮＴＸ）を含有する医薬組成物およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
嫌気性のグラム陽性菌であるクロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）が産生するボツリヌス毒素は地球上で最も致死性の高い毒素であり、これまでに血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧの７種のボツリヌス菌由来の毒素とその特性が明らかにされている。これらは、それぞれ血清型に特異的な中和抗体で識別される。更に同じ血清型のボツリヌス毒素の中でも、毒素遺伝子の構造の違いによりいくつかの亜型に分類される。ボツリヌス毒素の活性中心蛋白質は、既知のボツリヌス毒素血清型の７種すべてにおいて、分子量約１５０ｋＤａの神経毒素（ＮＴＸ）である。【０００３】
すべてのボツリヌス毒素はボツリヌス菌から産生される場合、関係する無毒蛋白質と結合した複合体の分子形態をとる。Ａ型ボツリヌス毒素は、９００ｋＤａ（ＬＬ毒素）、５００ｋＤａ（Ｌ毒素）、または３００ｋＤａ（Ｍ毒素）の分子形態として、ボツリヌス菌から産生される。これら、ＬＬ毒素、Ｌ毒素、Ｍ毒素は、ボツリヌス毒素複合体、プロジェニター毒素などと呼ばれている。ボツリヌス毒素は、アルカリ条件下（ｐＨ７．２以上）で、神経毒素（Ｓ毒素とも呼ばれる。）とＮＴＮＨ（無毒非ＨＡ蛋白質である蛋白質）とが解離するため、この性質を利用することで、１５０ｋＤａのＮＴＸのみを単離することができる。【０００４】
ボツリヌス毒素は、小腸上部で吸収された場合（上皮輸送、粘膜輸送）には、リンパ管内で無毒蛋白質とＮＴＸとに解離する。解離したＮＴＸは、その重鎖Ｃ末端側で神経終末の受容体に結合し、受容体を介して神経細胞内に取り込まれる。その後、軽鎖のもつ亜鉛メタロエンドペプチダーゼ活性により神経シナプス前膜の蛋白質を特異的に切断し、カルシウム依存性の神経伝達物質の放出を阻害して、シナプスでの神経伝達を遮断する（非特許文献１）。神経終末の受容体については、近年Ｂ型ボツリヌス毒素で解明され、神経終末外表面にあるガングリオシドＧＴ１ｂと、アセチルコリンの放出が盛んでシナプス小胞の内面にあるsynaptotagminn IIとであることが判明している（非特許文献２）。【０００５】
また、Ａ１型ボツリヌス毒素の投与部位からの軸策輸送を介した拡散の機序については、Matteo Caleoらの報告がある。彼らはマウスとラットの視神経にＡ１型ボツリヌス毒素を投与し、切断されたＳＮＡＰ−２５を追跡することで、ボツリヌス毒素の拡散範囲を確認した。また、この系において、コルヒチンによる阻害実験を行ったところ、非投与部位における脱力が抑制されたことから、Ａ１型ボツリヌス毒素の神経における拡散は逆行性軸索輸送によるものであると考えられた（非特許文献３）。【０００６】
ボツリヌス毒素は、ボツリヌス中毒においては全身の神経伝達を遮断して人を死に至らしめる毒素ではあるが、逆にその活性を積極的に利用して、異常な筋緊張性亢進を来たす疾患、例えばジストニアの患者の筋肉内に直接投与することによって、局所の筋緊張を緩和する治療薬として用いられている（非特許文献４）。例えば、Ａ１型ボツリヌス毒素（ＢＯＴＯＸ（登録商標）：Ａｌｌｅｒｇａｎ  Ｉｎｃ．）は、眼瞼痙攣、斜視および片側顔面痙攣、頚部ジストニアの治療用、並びに眉間のしわの治療用としてアメリカ食品薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。また、Ｂ型ボツリヌス毒素（ＭＹＯＢＬＯＣ(登録商標)：Ｓｏｌｓｔｉｃｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ, Ｉｎｃ. ）も頚部ジストニア治療用としてＦＤＡによって承認されている。Ａ型ボツリヌス毒素１回の筋肉内注射から、症状の改善効果が現れ、そして消失するまでの典型的な期間は、平均して約３〜４ヶ月である。【０００７】
治療用ボツリヌス毒素製剤は、Ａｌｌｅｒｇａｎ  Ｉｎｃ．（米国）、Ｉｐｓｅｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（英国）、Ｓｏｌｓｔｉｃｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（米国）から入手可能である。これら市販されている治療用ボツリヌス製剤は、関係する無毒蛋白質と結合した分子形態をとったＡ１型ボツリヌス毒素を精製した製剤である。例えば、現在市販されているＡ１型ボツリヌス毒素製剤、すなわち、ＢＯＴＯＸ（登録商標）とＩｐｓｅｎ  ＬｉｍｉｔｅｄのＤｙｓｐｏｒｔ（登録商標）に含まれるボツリヌス毒素とは、その毒素複合体の成分として、ＨＡ１７、ＨＡ３４、およびＨＡ７０のＨＡ蛋白質蛋白を持つ。【０００８】
Ａ１型ボツリヌス毒素を繰り返し投与することにより、その有効性が減弱してくるという問題点が指摘されているが、この現象は毒素に対する抗体産生に依存していると考えられている。この原因の一つとしては、製剤中に含まれるＨＡ蛋白質に、抗体産生に関するアジュバント作用があることが指摘されており（非特許文献５）、このアジュバント作用により、ＮＴＸに対する中和抗体が生じやすくなっていると考えられる。【０００９】
２００５年に無毒蛋白を含まないＡ１型ＮＴＸ製剤（Ｘｅｏｍｉｎ（登録商標）：Ｍｅｒｚ  Ｐｈａｒｍａ：ドイツ）が発売され、また米国でも同様な別製剤の臨床試験も実施されており、次世代製剤の開発も積極的に行われている。【００１０】
一方、１９９０年に乳児ボツリヌス症の患者から単離されたＡ２型ボツリヌス毒素は、ＨＡ蛋白質を含まないＭ毒素のみを産生する。ＨＡ蛋白質を含まないボツリヌス毒素を産生するＡ２型ボツリヌス菌は、１９８６年に日本で最初に乳児ボツリヌス症に関する患者から同定されている（非特許文献６）。この臨床分離株は、Ｋｙｏｔｏ−Ｆ、Ｃｈｉｂａ−Ｈ、Ｙ−８０３６、７Ｉ０３−Ｈ、７Ｉ０５−ＨとＫＺ１８２８である。【００１１】
遺伝子学的見地から、Ａ２型ボツリヌス菌群の毒素遺伝子クラスターは、Ａ１型ボツリヌス毒素の遺伝子クラスターと構造が異なっている。Ａ１型ボツリヌス菌の毒素遺伝子クラスターは、毒素複合体の成分としてＨＡ蛋白質遺伝子群を持ち、ＨＡ１７、ＨＡ３４、およびＨＡ７０などのＨＡ蛋白質をコードする遺伝子を含んでいる。一方、Ａ２型ボツリヌス菌の毒素遺伝子クラスターでは、ＨＡ蛋白質をコードする遺伝子が完全に欠損している。【００１２】
また、ＮＴＸ分子自体については、従来のＡ１型ボツリヌス毒素の重鎖は９３ｋＤａであるが、Ａ２型ボツリヌス毒素では１０１ｋＤａであり、分子量が異なる。また、シナプトソームを使ったバインディング競合アッセイにおいて、Ａ１型ボツリヌス毒素とＡ２型ボツリヌス毒素とでは、レセプターに対する結合の親和性が異なることが明らかとなっている（非特許文献７）。これら２つのボツリヌス毒素アイソタイプのアミノ酸配列は、全体では１０．１％異なり、重鎖領域では１３％、軽鎖領域では４．９％が異なるにすぎない（非特許文献８）。【００１３】
市販のＡ１型ボツリヌス毒素製剤の製造に使用されている菌株については、ＢＯＴＯＸ（登録商標）及びＸｅｏｍｉｎ（登録商標）はＨＡＬＬ株であり（非特許文献９）、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）はＮＣＴＣ２９１６株であることが報告されている（非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Jankovic J., et al.,Curr. Opin. Neurol.,(7):358-366,1994
【非特許文献２】Kozaki S., et al.,Microb Pathog.,25(2): 91-99,1998
【非特許文献３】Matteo C., et al.,M The Journal of Neuroscience,28(14): 3689-96,2008
【非特許文献４】梶龍兒ら,「ジストニアとボツリヌス治療」, 診断と治療社, 2005年
【非特許文献５】Arimitsu H., et al.,Infect. Immun., 71(3):1599-1603,2003
【非特許文献６】Sakaguchi G., et al., Int. J. Food Microbiol.,11: 231-242,1990
【非特許文献７】Kozaki S., et al., Microbiol. Immunol. 39(10): 767-774, 1995
【非特許文献８】Cordoba J., et al., System. Appl. Microbiol. 18:13-22, 1995
【非特許文献９】梶龍兒ら,「ジストニアとボツリヌス治療」, 診断と治療社, :23，1996年
【非特許文献１０】Dressler D., et al., Disabil Rehabil.29(23):1761-1768, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ボツリヌス毒素の最も基本的な作用は神経筋接合部で神経終末に作用し、神経伝達物質の放出を抑制することである。ボツリヌス毒素は、この作用により患者に対して治療効果を発揮する薬剤として知られている。しかし、Ａ１型ボツリヌス毒素の投与により、投与筋以外の遠隔筋に対する影響と考えられる副作用が現れることがあり、嚥下障害、肺炎、重度の衰弱等に伴う死亡例も報告されている。これらの副作用報告から、既存のＡ１型ボツリヌス毒素製剤には投与上限が設けられており、その投与上限を超える高用量のボツリヌス毒素の投与が必要な症状、例えば四肢体幹の痙縮の治療には用いられないという問題がある。【００１６】
それゆえ、高用量の投与を行っても投与筋以外の遠隔筋に対する影響が少ないボツリヌス毒素製剤の開発が強く求められていた。【００１７】
本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、高用量の投与を行っても投与筋以外の遠隔筋に対する影響が少ないボツリヌス毒素製剤を含有する医薬組成物およびその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
現在市販されている治療用Ａ型ボツリヌス製剤は、関係する無毒蛋白質と結合した分子形態を取ったＬＬ毒素のみを精製した製剤である。市販のＡ型ボツリヌス毒素製剤の製造に使用されている菌株については、ＢＯＴＯＸ（登録商標）はＨＡＬＬ株であり、Ｄｙｓｐｏｒｔ（登録商標）はＮＣＴＣ２９１６株であることが知られており、これらはＨＡ蛋白質を含むＡ１型ボツリヌス毒素に分類される。【００１９】
今回の発明に先立ち、発明者は、ボツリヌス毒素の中でも最も致死活性が高いＡ型ボツリヌス毒素の中でも、Ａ１型ボツリヌス毒素とは異なる亜型のＡ２型ボツリヌス毒素に着目した。これは、１９９０年に乳児ボツリヌス症の患者から単離されたタイプのＡ型ボツリヌス毒素であり、ＨＡ蛋白質を含まないＭ毒素のみを産生するＡ２型ボツリヌス毒素に分類される。Ａ１型とＡ２型のボツリヌス毒素間のアミノ酸配列は、全体では１０．１％異なり、重鎖領域では１３％、軽鎖領域では４．９％が異なるにすぎない。このように、これら２つのボツリヌス毒素アイソタイプのアミノ酸配列は非常に類似しているため、これらの生物活性に違いがあるという発想は従来考えられていなかった。【００２０】
さらに、発明者は、Ａ２型ボツリヌス毒素を高度に精製することに成功した。これは、１９９０年に乳児ボツリヌス症の患者から単離されたタイプのＡ型ボツリヌス毒素であり、ＨＡ蛋白質を含まないＭ毒素から、ＮＴＸ部分を高度に精製したものである。【００２１】
加えて、本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、Ａ１型ボツリヌス毒素が非投与部位へ拡散するのは神経軸策を介する輸送のためであり、Ａ２型ボツリヌス毒素は神経軸策を介する輸送がなされないことを独自に見出した。この知見に基づき、高用量の投与を行っても投与筋以外の遠隔筋に対する影響が少ないという優れた効果を奏する本発明を完成させるに至った。【００２２】
すなわち、本発明は、下記（１）〜（７）の発明を含むものである。【００２３】
（１）ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素を有効成分として含有し、１回の投与で、投与対象の体重１ｋｇあたり上記ボツリヌス毒素が１５Ｕより多く２５Ｕ以下の量にて投与される医薬組成物。【００２４】
（２）上記ボツリヌス毒素が１５Ｕより多く２０Ｕ以下の量にて投与される（１）に記載の医薬組成物。【００２５】
（３）上記ＨＡ非生産性のボツリヌス菌は、Ａ２型ボツリヌス菌である上記（１）または（２）に記載の医薬組成物。【００２６】
（４）上記Ａ２型ボツリヌス菌は、Ｋｙｏｔｏ−Ｆ株、Ｃｈｉｂａ−Ｈ株、ＣＤＣ１４３６株、Ｍａｓｃａｒｐｏｎｅ株、ＺＫ３株、Ｙ−８０３６株、７Ｉ０３−Ｈ株、７Ｉ０５−Ｈ株、またはＫＺ１８２８株である上記（３）に記載の医薬組成物。【００２７】
（５）上記（１）〜（４）の何れかに記載の医薬組成物の、斜視、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、脳性麻痺、痙性発声障害、痙縮、片頭痛などの頭痛、慢性疼痛、腰痛、骨盤痛、ヘルペス後神経痛、神経障害性の痛み、肩こり、パーキンソン病や多発性硬化症などの発症時に起こる筋弛緩不全、筋膜痛症候群、咀嚼筋攣縮、慢性裂肛、排尿筋・括約筋協調不全、過活動膀胱、前立腺障害、多汗症、歯ぎしり、顔面ミオキミア、チック、固縮、拘縮、ジストニア、局所性ジストニア、霰粒腫、麦粒腫、手根管症候群、血液量増加性唇変形症、外反母趾、内反母趾、足親指異常症、硬着母趾、突発性内反足、ペプシン性潰瘍、胃食道逆流症、食道アカラシア、胃不全麻痺、膣痙、関節症、上顆炎、回旋筋キャップ症、筋膜症、テニス肘、胸郭出口症候群、にきび、神経伝達物質の過剰活動による統合失調症、アルツハイマー病、躁病、鬱病、心血管疾患、先端巨大症、巨人症、クッシング病、性機能亢進症、甲状腺機能亢進病、ゴナドトロピン関連疾患、排卵抑制、精子産生抑制、橋本病、甲状腺炎、甲状腺機能低下症や高カルシウム血症、低カルシウム血症、陰茎持続勃起症、粘液分泌過多、唾液分泌過多、骨腫瘍、糖尿病、膵臓障害、耳鳴、蝸牛神経異常、メニエル病、癌、育毛、円形脱毛症、自律神経障害、褥瘡、癲癇、減量、子宮障害、肛門挙筋症候群、糖尿病性神経障害、美容、または皺への使用。【００２８】
（６）上記（１）〜（４）の何れかに記載の医薬組成物を含有する、斜視、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、脳性麻痺、痙性発声障害、痙縮、片頭痛などの頭痛、慢性疼痛、腰痛、骨盤痛、ヘルペス後神経痛、神経障害性の痛み、肩こり、パーキンソン病や多発性硬化症などの発症時に起こる筋弛緩不全、筋膜痛症候群、咀嚼筋攣縮、慢性裂肛、排尿筋・括約筋協調不全、過活動膀胱、前立腺障害、多汗症、歯ぎしり、顔面ミオキミア、チック、固縮、拘縮、ジストニア、局所性ジストニア、霰粒腫、麦粒腫、手根管症候群、血液量増加性唇変形症、外反母趾、内反母趾、足親指異常症、硬着母趾、突発性内反足、ペプシン性潰瘍、胃食道逆流症、食道アカラシア、胃不全麻痺、膣痙、関節症、上顆炎、回旋筋キャップ症、筋膜症、テニス肘、胸郭出口症候群、にきび、神経伝達物質の過剰活動による統合失調症、アルツハイマー病、躁病、鬱病、心血管疾患、先端巨大症、巨人症、クッシング病、性機能亢進症、甲状腺機能亢進病、ゴナドトロピン関連疾患、排卵抑制、精子産生抑制、橋本病、甲状腺炎、甲状腺機能低下症や高カルシウム血症、低カルシウム血症、陰茎持続勃起症、粘液分泌過多、唾液分泌過多、骨腫瘍、糖尿病、膵臓障害、耳鳴、蝸牛神経異常、メニエル病、癌、育毛、円形脱毛症、自律神経障害、褥瘡、癲癇、減量、子宮障害、肛門挙筋症候群、または糖尿病性神経障害の治療剤。【００２９】
（７）上記（１）〜（４）の何れかに記載の医薬組成物を含有することを特徴とする、美容、皺の改善薬。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のＡ２型高度精製ボツリヌス毒素（Ａ２ＮＴＸ）は、Ａ１型ボツリヌス毒素を含有する医薬製剤と異なり、神経軸索を介して非投与部位へ軸索輸送されないため、患者の疾患部位付近の局所にとどまる毒素製剤である。そのため、既存のＡ１型ボツリヌス毒素製剤の投与上限を超える高用量のボツリヌス毒素の投与が必要とされる痙縮の治療剤として特に有用である。例えば、本発明のＡ２ＮＴＸは、ヒト患者に対し体重１ｋｇあたり１５Ｕより多く２５Ｕ以下まで投与しても非投与部位における脱力等の副作用を引き起こすことがないという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】横隔膜−横隔神経標本（ｐＨ７．４）におけるＡ２ＮＴＸ及びＡ１ＬＬの用量反応直線を示した図である（各点はｎ＝３〜５の平均値、エラーバーはＳＥＭを示す）。
【図２】横隔膜−横隔神経標本（ｐＨ６．８）におけるＡ２ＮＴＸ及びＡ１ＬＬの用量反応直線を示した図である（各点はｎ＝３〜５の平均値、エラーバーはＳＥＭを示す）。
【図３】Ａ２ＮＴＸ投与側の握力の推移を示した図である（各点はＮ＝５の平均値、エラーバーはＳＥＭを示す）。
【図４】Ａ１ＮＴＸ投与側の握力の推移を示した図である（各点はＮ＝５の平均値、エラーバーはＳＥＭを示す）。
【図５】Ａ１ＬＬ投与側の握力の推移を示した図である（各点はＮ＝５の平均値、エラーバーはＳＥＭを示す）。
【図６】各種毒素投与後１日の投与側握力の用量反応性を示した図である（各点はＮ＝５の平均値、エラーバーは９５％信頼区間を示す）。
【図７】Ａ２ＮＴＸ（１〜８Ｕ／ｈｅａｄ）の非投与側握力の推移を示した図である（各点はＮ＝５の平均値、エラーバーはＳＥＭを示す）。
【図８】Ａ１ＮＴＸ（１〜８Ｕ／ｈｅａｄ）の非投与側握力の推移を示した図である（各点はＮ＝５の平均値、エラーバーはＳＥＭを示す）。
【図９】Ａ１ＬＬ（１〜８Ｕ／ｈｅａｄ）の非投与側握力の推移を示した図である（各点はｎ＝５の平均値、エラーバーはＳＥＭを示す）。
【図１０】Ａ２ＮＴＸ（１〜５Ｕ／ｈｅａｄ）の非投与側握力の推移を示した図である（各点はｎ＝５の平均値、エラーバーはＳＥＭを示す）。
【図１１】Ａ１ＮＴＸ（１〜５U/head）の非投与側握力の推移を示した図である（各点はｎ＝５の平均値、エラーバーはＳＥＭを示す）。
【図１２】Ａ１ＬＬ（１〜５Ｕ／ｈｅａｄ）の非投与側握力の推移を示した図である（各点はｎ＝５の平均値、エラーバーはＳＥＭを示す）。
【図１３】Ａ２ＮＴＸ（１〜５Ｕ／ｈｅａｄ）投与後4日間における非投与側握力の変化量を示した図である（ｎ＝５）。
【図１４】Ａ１ＮＴＸ（１〜５Ｕ／ｈｅａｄ）投与後４日間における非投与側握力の変化量を示した図である（ｎ＝５）。
【図１５】Ａ１ＬＬ（１〜５Ｕ／ｈｅａｄ）投与後４日間における非投与側握力の変化量を示した図である（ｎ＝５）。
【図１６】コルヒチンモデルを用いたＡ２ＮＴＸの軸策輸送確認試験の結果を示した図である（各点はｎ＝５の平均値、エラーバーはＳＥＭを示す）。
【図１７】コルヒチンモデルを用いたＡ１ＮＴＸの軸策輸送確認試験の結果を示した図である（各点はｎ＝５の平均値、エラーバーはＳＥＭを示す）。
【図１８】コルヒチンモデルを用いたＡ１ＬＬの軸策輸送確認試験の結果を示した図である（各点はｎ＝５の平均値、エラーバーはＳＥＭを示す）。
【図１９】神経切断モデルを用いたＡ２ＮＴＸの軸策輸送確認試験の結果を示した図である（各点はｎ＝５の平均値、エラーバーはＳＥＭを示す）。
【図２０】神経切断モデルを用いたＡ１ＮＴＸの軸策輸送確認試験の結果を示した図である（各点はｎ＝５の平均値、エラーバーはＳＥＭを示す）。
【図２１】神経切断モデルを用いたＡ１ＬＬの軸策輸送確認試験の結果を示した図である（各点はｎ＝５の平均値、エラーバーはＳＥＭを示す）。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の種々の側面を以下詳細に説明する。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、Ａ２ＮＴＸを有効成分として含有しており、Ａ２ＮＴＸは、乳児ボツリヌス症の原因菌として分離されたＨＡ蛋白質非産生のＡ型ボツリヌス菌株より得られるＭ毒素のＮＴＮＨを除去して得られる高度精製Ａ型ボツリヌス毒素である。Ａ２ＮＴＸは、Ａ１型ボツリヌス菌由来の神経毒素と異なり、神経軸索を介して他の部位へ軸索輸送されず、非投与部位へ拡散されにくいため、既存のＡ１型ボツリヌス毒素製剤の投与上限を超える高用量のボツリヌス毒素の投与が必要とされる疾患の治療剤として有効であり、例えば、痙縮、固縮、拘縮及びジストニア等の治療剤として使用するのに最適である。
【００３４】
Ａ２型ボツリヌス菌は、Ａ１型ボツリヌス菌と同じＡ型に分類されるものの、ＨＡ蛋白質を含まないＭ毒素のみを産生する。ＨＡ蛋白質を含まないボツリヌス毒素を産生するＡ２型ボツリヌス菌の例として、Ｋｙｏｔｏ−Ｆ株、Ｃｈｉｂａ−Ｈ株、ＣＤＣ１４３６株、Ｍａｓｃａｒｐｏｎｅ株、ＺＫ３株、Ｙ−８０３６株、７Ｉ０３−Ｈ株、７Ｉ０５−Ｈ株、またはＫＺ１８２８株が挙げられる。
【００３５】
上述したようにＡ２型ボツリヌス菌に分類される菌株は複数種類存在するが、これらは同じ亜型に分類される菌株であるため、当然のことながら各菌株が生産するＡ２ＮＴＸは極めて類似している。例えば、Ｃｈｉｂａ−Ｈ株が生産するＡ２ＮＴＸのアミノ酸配列と比較した場合、Ｋｙｏｔｏ−Ｆ株が生産するＡ２ＮＴＸは１００％の相同性を示し、ＣＤＣ１４３６株が生産するＡ２ＮＴＸは９９％の相同性を示し、Ｍａｓｃａｒｐｏｎｅ株が生産するＡ２ＮＴＸは９９％の相同性を示し、７Ｉ０３−Ｈ株は１００％の相同性を示す。
【００３６】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、Ａ２型ボツリヌス毒素とボツリヌス毒素安定化物質とを含んでなる医薬組成物である。
【００３７】
ボツリヌス毒素安定化物質は、上記の組成物が保存される条件において、ボツリヌス神経毒素を安定化することができ、かつボツリヌス毒素の毒素活性を損なわないものであればよい。例えば、ボツリヌス毒素安定化物質の例としては、ヒト血清アルブミンが挙げられる。
【００３８】
本発明における好ましい医薬組成物は、Ａ２型ボツリヌス毒素をヒト血清アルブミンと混合する工程により製造することができる。
【００３９】
高度精製Ａ型ボツリヌス毒素は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて精製することができる。具体的にはボツリヌス菌の培養液についてろ過による除菌を行い、得られるＭ毒素をＵＦ膜等の方法により濃縮する。Ｍ毒素をｐＨ７．２以上の条件にすることで、神経毒素と無毒蛋白質とに分離させる。その後、例えば陽イオン交換クロマトグラフィーにより粗精製し、毒素活性のある分画を集めて、更にゲルろ過で精製するなどの方法があげられる。毒素活性は、例えばマウス腹腔内注射法（マウス腹腔内に投与してＬＤ50から毒素活性を求める方法）により測定し、マウスＬＤ50を１Ｕとする。
【００４０】
また、精製工程の後の製剤化工程では、例えばボツリヌス毒素とボツリヌス毒素安定化物質とを溶媒に溶解後、無菌ろ過し、アンプル、バイアル等に充填して本発明の医薬組成物を製造することができる。また、ボツリヌス毒素を予めボツリヌス毒素安定化物質を含む液に溶解後、無菌ろ過しアンプル等に充填することもできる。溶媒は、注射用蒸留水、生理食塩水、０．０１Ｍ〜０．１Ｍのリン酸緩衝液等を用いることができ、必要に応じて、エタノール、グリセリン等を混合することもできる。
【００４１】
更に、ボツリヌス毒素とボツリヌス毒素安定化物質とを溶媒に溶解後、無菌ろ過し、バイアル等に充填後、凍結乾燥して本発明の医薬組成物を製造することもでき、また、ボツリヌス毒素とボツリヌス毒素安定化物質とを混合後、バイアル等に無菌充填して本発明の医薬組成物を製造することもできる。
【００４２】
具体的には、精製したボツリヌス毒素に、ボツリヌス毒素安定化物質、好ましくはヒト血清アルブミン、更に好ましくはヒトでの安全性が確保された治療用ヒト血清アルブミンを、最終濃度が０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｍＬになるように加え、冷蔵保存、冷凍保存あるいは凍結乾燥することが挙げられる。
【００４３】
本発明の医薬組成物には、必要に応じさらに、マンニトール、グルコース、ショ糖、果糖、乳糖等の糖類等の添加剤を混合することができる。溶解状態での本発明にかかる医薬組成物のｐＨは、通常３〜８であり、好ましくは４〜７であり、より好ましくは５〜７である。
【００４４】
本発明の医薬組成物において、ボツリヌス毒素は、本発明の使用目的において有効な量が含まれていればよい。また、ボツリヌス毒素安定化物質が含まれる場合には、ボツリヌス毒素安定化物質は、ボツリヌス神経毒素を安定化するのに十分な量含まれていればよい。
【００４５】
本発明の医薬組成物は、Ａ１型ボツリヌス毒素製剤と比較して軸索輸送に起因する非投与部位への拡散性が低く、既存のＡ１型ボツリヌス毒素製剤の投与上限を超える高用量のボツリヌス毒素の投与が必要とされる痙縮の治療剤として使用するのに最適である。
【００４６】
例えば、実施例にも示すように、Ａ１型ボツリヌス菌由来の神経毒素（例えば、Ａ１ＮＴＸ、Ａ１ＬＬなど）は軸索輸送されて、投与部位からは離れた部位に対して副作用を生じる。具体的には、Ａ１型ボツリヌス菌由来の神経毒素を、投与対象の体重１ｋｇに対して１０Ｕ以上投与すれば副作用が現れ、１５Ｕ以上投与すれば当該副作用が顕著になって治療に用いることは困難となる（例えば、図１１および１２参照）。一方、本発明のＡ２ＮＴＸであれば、投与対象の体重１ｋｇに対して２５Ｕ投与しても副作用が現れることはない。つまり、Ａ２ＮＴＸであれば、従来では投与不可能であった量、具体的には、投与対象の体重１ｋｇに対して１５Ｕより多く２５Ｕ以下、より好ましくは１５Ｕより多く２０Ｕ以下の量を投与することが可能となる。しかも、図１〜図５にも示すように、Ａ２ＮＴＸは、投与部位における神経筋伝達抑制効果がＡ１型ボツリヌス菌由来の神経毒素よりも高いので、従来技術と比較して、極めて高い治療効果を得ることができる。
【００４７】
本発明の医薬組成物は、治療に有効な量投与される。ヒトに投与する場合、その投与形態は好ましくは局所的投与、更に好ましくは筋肉内注射である。また、それらの投与タイミングや投与量も、特に限定されず、症状の程度等により異なる。投与量は症状の程度、年齢、性別、体重、投与部位および形態等に応じて異なるが、例えば体重６０ｋｇの成人ならば０．０１〜１５００Ｕを、好ましくは５Ｕ以上１５００Ｕ以下を、更に好ましくは６００Ｕ以上１５００Ｕ以下を、更に好ましくは９００Ｕよりも多く１５００Ｕ以下を、更に好ましくは９００Ｕよりも多く１２００Ｕ以下を、１回筋肉内注射する。
【００４８】
ここで１Ｕとは、マウスに腹腔内投与した時に半数のマウスが死亡する毒素の量（１ＬＤ50）である。患者に対する総用量は、約０.０１〜１５００Ｕの範囲である。
【００４９】
つまり、本発明に係る医薬組成物は、ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素を有効成分として含有し、１回の投与で、投与対象の体重１ｋｇあたり上記ボツリヌス毒素が１５Ｕより多く２５Ｕ以下、より好ましくは１５Ｕより多く２０Ｕ以下の量にて投与される医薬組成物であればよい。
【００５０】
また、他の実施態様では、例えば、ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素を有効成分として含有し、１回の投与で、投与対象の体重１ｋｇあたり上記ボツリヌス毒素が１５Ｕより多く２５Ｕ以下、より好ましくは１５Ｕより多く２０Ｕ以下の量にて投与される分量を含有するように製剤化した医薬組成物またはキットであってもよい。特に注射による投与が好ましいため、上記の所定量がアンプル、バイアル、または注射器等によって製剤化されたもの、あるいはキット化されたものを例示することができる。
【００５１】
注射後、全身的または局所的副作用は無く、治療対象となる部位以外での大きな局所的緊張低下は見られないことと、治療対象筋肉の機能改善が見られることと、を筋電計などにより確認しながら治療を行う。
【００５２】
本発明は、高度精製Ａ２型ボツリヌス毒素を、既存のＡ１型ボツリヌス毒素製剤の投与上限を超える高用量のボツリヌス毒素の投与が必要とされる疾患への適用が好ましい。例えば、斜視、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、脳性麻痺、痙性発声障害、痙縮、片頭痛などの頭痛、慢性疼痛、腰痛、骨盤痛、ヘルペス後神経痛、神経障害性の痛み、肩こり、パーキンソン病や多発性硬化症などの発症時に起こる筋弛緩不全、筋膜痛症候群、咀嚼筋攣縮、慢性裂肛、排尿筋・括約筋協調不全、過活動膀胱、前立腺障害、多汗症、歯ぎしり、顔面ミオキミア、チック、局所性ジストニア、霰粒腫、麦粒腫、手根管症候群、血液量増加性唇変形症、外反母趾、内反母趾、足親指異常症、硬着母趾、突発性内反足、ペプシン性潰瘍、胃食道逆流症、食道アカラシア、胃不全麻痺、膣痙、関節症、上顆炎、回旋筋キャップ症、筋膜症、テニス肘、胸郭出口症候群、にきび、神経伝達物質の過剰活動による統合失調症、アルツハイマー病、躁病、鬱病、心血管疾患、先端巨大症、巨人症、クッシング病、性機能亢進症、甲状腺機能亢進病、ゴナドトロピン関連疾患、排卵抑制、精子産生抑制、橋本病、甲状腺炎、甲状腺機能低下症や高カルシウム血症、低カルシウム血症、陰茎持続勃起症、粘液分泌過多、唾液分泌過多、骨腫瘍、糖尿病、膵臓障害、耳鳴、蝸牛神経異常、メニエル病、癌、育毛、円形脱毛症、自律神経障害、褥瘡、癲癇、減量、子宮障害、肛門挙筋症候群、糖尿病性神経障害等の疾患のうち、高用量の投与量が必要となる疾患への適用が可能であり、特に、痙縮、固縮、拘縮及びジストニアの治療剤治療剤として使用することを特徴とする治療方法あるいは治療薬剤を提供する。高度精製ボツリヌス毒素、投与方法、製造方法等については上記に説明した通りである。
【００５３】
また、上記疾患以外にも美容、皺への適用のうち、高用量の投与量が必要となるものも本発明の範囲内に含まれる。
【００５４】
なお、本発明は、以下の（１）〜（６）のように構成することも可能である。
【００５５】
（１）：投与部位以外の部位において逆行性の軸索輸送に伴う副作用を示さないことを特徴とするＨＡ蛋白質非産生性のボツリヌス菌（例えば、Ａ２型ボツリヌス菌）に由来する分子量１５０ｋＤａの神経毒素を主成分として含有する医薬組成物。
【００５６】
（２）：Ａ１型ボツリヌス菌由来神経毒素（例えば、ボツリヌス毒素ＬＬ体、Ｌ体）と比較して、神経軸索を介して非投与部位へ輸送されないため、体重１ｋｇあたり５〜２０Ｕまで大量投与可能な上記（１）に記載の医薬組成物。
【００５７】
（３）：当該ＨＡ蛋白質非産生性のボツリヌス菌（例えば、Ａ２型ボツリヌス菌）に由来する分子量１５０ｋＤａの神経毒素が、乳児ボツリヌス症原因ボツリヌス菌に由来するＨＡ蛋白質非産生性のＫｙｏｔｏ−Ｆ株、Ｃｈｉｂａ−Ｈ株、ＣＤＣ１４３６株、Ｍａｓｃａｒｐｏｎｅ株、ＺＫ３株、Ｙ−８０３６株、７Ｉ０３−Ｈ株、７Ｉ０５−Ｈ株、またはＫＺ１８２８株の菌株のいずれかから精製されることを特徴とする上記（１）または（２）に記載の医薬組成物。
【００５８】
（４）：上記（１）から（３）のいずれかに記載の医薬組成物の、上記疾患または美容、皺への使用。
【００５９】
（５）：上記（１）から（３）のいずれかに記載の医薬組成物を含有することを特徴とする、上記疾患の治療剤。
【００６０】
（６）：上記（１）から（３）のいずれかに記載の医薬組成物を含有することを特徴とする、美容、皺の改善薬。
【実施例】
【００６１】
本発明を下記実施例により更に詳しく説明するが、本発明はこれに限られるものではない。なお、上述したように、Ａ２型ボツリヌス菌が生産するＡ２ＮＴＸは、極めて類似している。以下の実施例では、一例として、Ｃｈｉｂａ−Ｈ株から精製されるＡ２ＮＴＸを用いたが、本発明は、これに限定されない。【００６２】
〔実施例１．Ａ２ＮＴＸの精製〕
使用するボツリヌス菌としては、乳児ボツリヌス症の患者から分離されたタイプのＡ型ボツリヌス菌であるＣｈｉｂａ−Ｈ株を用い、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂｏｔｕｌｉｓｍ：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｔｏｘｉｎｓ．，２１−３４，Ｌｅｗｉｓ  ＧＥ．，１９８１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載された方法に従って、Ａ２型Ｍ毒素を精製した。【００６３】
得られたＡ２型Ｍ毒素を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファロースカラムに吸着させ、０〜０．３ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ濃度勾配を有する上記緩衝液にて溶出し、神経毒素と無毒蛋白質とに分離した。得られた高度精製ＮＴＸ（Ａ２ＮＴＸ）は、ＹＭ−１０メンブラン（ミリポア社製）で１ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した後、使用時まで−７０℃に保存した。これを、Ａ２ＮＴＸとした。【００６４】
〔実施例２．Ａ１ＮＴＸの精製〕
使用するボツリヌス菌としては、ＨＡ陽性のＡ１型ボツリヌス菌株である６２Ａ株を用い、実施例１と同様に、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂｏｔｕｌｉｓｍ：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｔｏｘｉｎｓ．，２１−３４，Ｌｅｗｉｓ  ＧＥ．，１９８１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載された方法に従って、Ａ１型Ｍ毒素を精製した。【００６５】
得られたＡ１型Ｍ毒素を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファロースカラムに吸着させ、０〜０．３ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ濃度勾配を有する上記緩衝液にて溶出し、神経毒素と無毒蛋白質とに分離した。得られた高度精製ＮＴＸ（Ａ１ＮＴＸ）は、ＹＭ−１０メンブラン（ミリポア社製）で１ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、当該濃縮物を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した後、使用時まで−７０℃に保存した。これをＡ１ＮＴＸとした。【００６６】
〔実施例３．横隔神経−横隔膜標本（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）試験による神経筋伝達抑制効果の比較〕
Ａ２ＮＴＸ及びＡ１型ＬＬ毒素であるＢＯＴＯＸ（登録商標：Ａｌｌｅｒｇａｎ Ｉｎｃ．、以下Ａ１ＬＬと呼ぶ）について神経筋伝達抑制効果を比較するため、マウス横隔神経−横隔膜標本試験を行った。方法は、既報（Sakaguchi G, Ohishi I, Kozaki S. Biomedical aspects of botulism: Purification and oral toxicities of Clostridium botulinum progenitor toxins, pp21-34, Lewis GE, Academic Press, New York, 1981.）に準じて実施した。【００６７】
マウスを安楽死させ、胸郭を開いて、左右の横隔神経を胸腺の高さで結紮した。左右の横隔神経を横隔膜に至るまで周囲の結合組織から剥離した後、腹腔側にも切開を加えて、横隔膜と第十二肋骨とを一体として横隔神経が付着したまま摘出した。摘出した横隔神経−横隔膜標本を３７．５℃に保温し、酸素（９５％  Ｏ２＋５％  ＣＯ２）を飽和しているＫｒｅｂｓ液（ｐＨ７．４）中で半切し、各々の横隔膜半片を、その第十二肋骨に通した絹糸を用いて組織支持装置に固定した。次いで、横隔神経を白金電極輪に通した後で、横隔膜標本を３７．５℃に保温した組織浴槽に移した。横隔膜中心腱に結紮した絹糸の一方の端を等尺張力トランスデューサーに接続して、横隔神経−横隔膜標本をＫｒｅｂｓ液中に懸垂した。白金電極輪から電圧１Ｖで持続時間１０ｍｓｅｃの矩形波を０．２５Ｈｚの頻度で横隔神経に加え、神経に対する電気刺激で誘発される横隔膜の収縮張力を張力アンプで増幅し、経時的にペンレコーダーに記録した。横隔神経−横隔膜標本に約２ｇの安静時負荷をかけ、１５〜２０分毎に組織浴槽中のＫｒｅｂｓ液を交換しながら誘発張力および基線が安定するまで１〜２時間無処理のまま観察した。誘発張力が２ｇ以下および不安定な標本については実験から除外した。また、痙縮患者の筋肉障害部位を想定して、筋肉内ｐＨ変動がもたらす各毒素による張力の変化を確認するため、乳酸を用いてｐＨ６．８のＫｒｅｂｓ液を作製し同様に試験した。【００６８】
基線および誘発張力が安定したことを確認した後、試験毒素を組織浴槽内のＫｒｅｂｓ液に添加して毒素による誘発張力の減衰の経時的変化を記録した。実験終了後に、各々の横隔神経−横隔膜標本についての記録テープを再生し、４秒間隔ごとの張力を求め、１分間ごとの平均張力を算出した。毒素作用による張力の減衰の指標として、毒素添加時から、誘発張力が毒素処理直前の誘発張力の１／ｅにまで減衰した時点までの時間を、張力減衰の時定数τとして用いた。【００６９】
Ａ１ＬＬ及びＡ２ＮＴＸの神経筋伝達抑制効果を横隔神経−横隔膜標本により測定した結果、いずれの毒素も、毒素の用量依存的に横隔膜の張力を減少させる時間が早くなった。毒素量を横軸、毒素処理直前の誘発張力の１／ｅにまで減衰した時点までの時間を縦軸とした場合に、分散が一様であることを確認した。各毒素の毒素用量が異なるため同一毒素用量での比較が出来なかったが、回帰直線の認められる範囲においてＡ１ＬＬ及びＡ２ＮＴＸを同一図上に描き比較した結果、Ａ２ＮＴＸは、Ａ１ＬＬよりも神経筋伝達抑制効果が１．９５倍高かった（図１）。また、乳酸添加によるｐＨ６．８の酸性条件下で同様に試験して比較した結果、Ａ２ＮＴＸは、Ａ１ＬＬよりも神経筋伝達抑制効果が３．７３倍高かった（図２）。【００７０】
〔実施例４．ラット握力試験による各毒素投与後の投与部位における筋弛緩作用の比較〕
Ａ２ＮＴＸ、Ａ１ＮＴＸ及びＡ１ＬＬを、０．５％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミンを含む生理食塩液（以下、Ｖｅｈｉｃｌｅと呼ぶ）を用いて、それぞれ０．０１５〜０．２４Ｕ／ｍＬとなるように調製した。各毒素水溶液及びＶｅｈｉｃｌｅを、ラット左前腕筋に０．１ｍＬずつ投与した（５匹／群）。【００７１】
ラットの左前肢（検体投与側）の握力は、握力測定装置（室町機械）を使用して測定した。ラットが握るバーはＴバーを使用し、ラットの尾の根の部分を持ち、神経毒素を投与した肢である左前肢にてＴバーを握った状態のラットを一定の速度で地面と平行に引っ張り、握力のピークを測定した。測定は５回行い、その平均値をデータとした。投与前（０日）と投与１、２、３、４、７及び１４日後に測定した。【００７２】
毒素投与後の左前肢（検体投与側）の握力の推移を図３〜５に示した。なお、図３〜５は、それぞれ、Ａ２ＮＴＸ、Ａ１ＮＴＸ、Ａ１ＬＬを投与した時の結果である。【００７３】
各毒素投与群ともに左前肢握力は、それぞれ用量依存的に低下した。Ａ１ＬＬならびにＡ１ＮＴＸ投与群は、いずれも投与してから３日後まで握力が低下し、Ａ２ＮＴＸ投与群は、投与してから２日後に握力低下がピークに達し、その後回復した（図３、４及び５）。【００７４】
速効性を比較するために、投与１日後の各毒素における前肢握力を縦軸に毒素投与量のＬｏｇ値を横軸にして回帰分析したところ、握力を低下させる効果は、Ａ２ＮＴＸが最も高いことが示された（図６）。さらに、毒素投与側前肢の握力低下のピーク時のデータから５０％有効量（ＥＤ５０）を算出した結果、ＥＤ５０は、Ａ２ＮＴＸ及びＡ１ＮＴＸの間でほぼ同じであったのに対し、Ａ２ＮＴＸ及びＡ１ＬＬの間では、２倍の差が認められた（表１）。【００７５】
〔実施例５．ラット握力試験による各毒素投与後の非投与部位における筋弛緩作用の比較〕
Ａ２ＮＴＸ、Ａ１ＮＴＸ及びＡ１ＬＬをＶｅｈｉｃｌｅで１０〜８０Ｕ/ｍＬに希釈調製し、各毒素水溶液及びＶｅｈｉｃｌｅをラット左前腕筋に０．１ｍＬずつ投与した(５匹／群)。【００７６】
握力は握力測定装置（室町機械）を使用して測定した。ラットが握るバーとしては、Ｔバーを使用し、ラットの尾の根の部分を持ち、神経毒素を投与した肢とは逆の右前肢にてＴバーを握った状態のラットを一定の速度で地面と平行に引っ張り、このときの握力のピークを測定した。測定は５回行い、その平均値をデータとした。投与前（０日）と投与１、２、３、４、７及び１４日後に測定した。【００７７】
毒素投与後の右前肢握力の推移を図７、８及び９に示した。なお、図７は、Ａ２ＮＴＸを投与した時の結果を示し、図８は、Ａ１ＮＴＸを投与した時の結果を示し、図９は、Ａ１ＬＬを投与した時の結果を示している。【００７８】
各毒素投与群ともに右前肢握力は、それぞれ用量依存的に低下した。握力低下のピークは投与３〜４日後に認められた。Ｖｅｈｉｃｌｅ群を対照にした群間比較をＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で行ったところ、投与４日及び７日後において、Ａ２ＮＴＸは８Ｕ／ｈｅａｄ以上で有意差が認められたのに対し、Ａ１ＮＴＸ及びＡ１型ＬＬ毒素は４Ｕ／ｈｅａｄ以上で有意差が認められた。以上のように、体重が約２００ｇのラットにＡ２ＮＴＸを４Ｕ投与しても非投与部位における脱力は認められなかったことから、体重１ｋｇあたり２０Ｕまで投与しても非投与部位の脱力はないことが示唆された（なお、実施例に用いられているラットの体重は、全ての実施例において約２００ｇである）。【００７９】
〔実施例６．ラット握力試験における各毒素投与後の非投与部位における筋弛緩作用の比較〕
Ａ２ＮＴＸ、Ａ１ＮＴＸ及びＡ１ＬＬをＶｅｈｉｃｌｅで１０〜５０Ｕ/ｍＬに希釈調製し、各毒素水溶液及びＶｅｈｉｃｌｅをラット左前腕筋に０．１ｍＬずつ投与した（５匹／群）。【００８０】
握力は、握力測定装置（室町機械）を使用して測定した。ラットが握るバーはＴバーを使用し、ラットの尾の根の部分を持ち、神経毒素を投与した肢とは逆の右前肢にてＴバーを握った状態のラットを一定の速度で地面と平行に引っ張り、握力のピークを測定した。測定は５回行い、その平均値をデータとした。投与前（０日）と投与１、２、３、４及び７日後に測定した。【００８１】
毒素投与後の右前肢握力の推移を図１０、１１及び１２に示した。なお、図１０は、Ａ２ＮＴＸを投与した時の結果を示し、図１１は、Ａ１ＮＴＸを投与した時の結果を示し、図１２は、Ａ１ＬＬを投与した時の結果を示している。【００８２】
Ａ１ＬＬ及びＡ１ＮＴＸ投与群は、用量依存的に握力の低下が認められた（図１１及び１２）。これらの毒素投与群において２Ｕ以上を投与した場合には、非投与側前肢握力は投与後４〜７日まで低下することが確認された。それに対し、Ａ２ＮＴＸ投与群の非投与側前肢握力は、ほとんど変化が認められなかった（図１０）。【００８３】
また、Ａ１ＬＬ及びＡ１ＮＴＸ投与群の非投与側前肢握力の低下が最小となるのは、投与後４日であったことから、投与後４日の握力から投与前の握力を差し引き、投与後４日間の握力の変化量を算出した。各種毒素投与群ならびにＶｅｈｉｃｌｅ群の変化量をＷｉｌｃｏｘｏｎ検定により群間比較した。その結果、Ａ１ＬＬ及びＡ１ＮＴＸは、それぞれ２Ｕ及び３Ｕ以上の投与群で、非投与側前肢握力が減少することが認められた（図１４及び１５）。それに対し、Ａ２ＮＴＸは５Ｕ投与しても非投与側前肢握力の減少は認められなかった（図１３）。これらの結果から、非投与側前肢握力を低下させない最大毒素量を安全量（ＳＤ）として算出した結果、Ａ２ＮＴＸ、Ａ１ＮＴＸならびにＡ１ＬＬの各ＳＤは、それぞれ５、２、１Ｕ／ｈｅａｄであった（表１）。以上のように、体重が約２００ｇのラットにＡ２ＮＴＸを５Ｕ投与しても非投与部位における脱力は認められなかったことから、体重１ｋｇあたり２５Ｕまで投与しても非投与部位の脱力はないことが示唆された。さらに、安全に使用できる毒素量の範囲を評価するために、ＳＤ／ＥＤ５０を治療域として定義して計算した結果、Ａ２ＮＴＸ、Ａ１ＮＴＸ及びＡ１ＬＬの治療域は、それぞれ１１９、３３、１１となり、Ａ２ＮＴＸは、Ａ１ＮＴＸの約３倍の広さの治療域を有し、Ａ１ＬＬの１０．８倍の広さの治療域を有していた（表１）。【００８４】
【表１】
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〔実施例７．軸索輸送確認試験（コルヒチンモデル）〕
Ａ２ＮＴＸ、Ａ１ＮＴＸ及びＡ１ＬＬをＶｅｈｉｃｌｅで希釈調製し、Ａ２ＮＴＸは６０Ｕ/ｍＬ、Ａ１ＮＴＸ及びＡ１ＬＬ（ＢＯＴＯＸ（登録商標））は４０Ｕ／ｍＬ溶液とした。【００８５】
ラットの左腕神経叢の一部をコルヒチン（１０μｇ）で浸した脱脂綿で包む処理を行った群（２群、以下コルヒチン処理群）と、無処置群（２群、以下Ｃｏｎｔｒｏｌ群）とに分け、コルヒチン処理群とＣｏｎｔｒｏｌ群とに、希釈調製した各毒素を左前肢筋に０．１ｍＬ投与した。各群は５匹ずつで実施した。【００８６】
握力は、握力測定装置（室町機械）を使用して測定した。ラットが握るバーとしては、Ｔバーを使用し、ラットの尾の根の部分を持ち、神経毒素を投与した肢とは逆の右前肢にてＴバーを握った状態のラットを一定の速度で地面と平行に引っ張り、握力のピークを測定した。測定は５回行いその平均値をデータとした。【００８７】
投与前（０日）と投与後２、３、及び４日に測定した。その結果を図１６、１７及び１８に示した。なお、図１６はＡ２ＮＴＸを投与した時の結果を示し、図１７はＡ１ＮＴＸを投与した時の結果を示し、図１８はＡ１ＬＬを投与した時の結果を示している。【００８８】
Ａ１ＮＴＸ及びＡ１ＬＬについてコルヒチン処理群とＣｏｎｔｒｏｌ群との握力の推移についてＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を行ったところ、１％以下の危険率で有意となった。またＡ２ＮＴＸについてはコルヒチン処理群とＣｏｎｔｒｏｌ群との間で差は認められなかった。なお、コルヒチンは軸索輸送を遮断する効果を有することが知られている。この実験において、Ａ１ＮＴＸ及びＡ１ＬＬは、コルヒチン処理により軸索輸送が遮断され、その結果、毒素が反対側へ流れないため反対側の握力に変化は認められないが、Ｃｏｎｔｒｏｌ群では軸索輸送を介して毒素が反対側へ流れ握力の低下が認められた。【００８９】
これに対してＡ２ＮＴＸは、コルヒチン処理の有無に関係なく毒素投与部位の反対側（毒素非投与側）での握力の変化は認められなかった。【００９０】
以上の結果から、Ａ１ＮＴＸ及びＡ１ＬＬは軸索輸送が認められる毒素であるが、Ａ２ＮＴＸは軸索輸送が認められない毒素であると考えられた。【００９１】
〔実施例８．軸索輸送確認試験（神経節断モデル）〕
Ａ２ＮＴＸ、Ａ１ＮＴＸ及びＡ１ＬＬをＶｅｈｉｃｌｅで希釈調製し、Ａ２ＮＴＸは６０Ｕ／ｍＬ、Ａ１ＮＴＸ及びＡ１ＬＬ（ＢＯＴＯＸ（登録商標））は４０Ｕ/ｍＬ溶液とした。【００９２】
ラットの左腕神経叢を外科的に切断した群（２群、以下神経切断群）と、無処置群（２群、以下Ｃｏｎｔｒｏｌ群）とに分け、神経切断群とＣｏｎｔｒｏｌ群とに、希釈調製した各毒素を左前肢筋に０．１ｍＬ投与した。各群は５匹ずつで実施した。【００９３】
握力は、握力測定装置（室町機械）を使用して測定した。ラットが握るバーはＴバーを使用し、ラットの尾の根の部分を持ち、神経毒素を投与した肢とは逆の右前肢にてＴバーを握った状態のラットを一定の速度で地面と平行に引っ張り、握力のピークを測定した。測定は５回行いその平均値をデータとした。【００９４】
投与前（０日）と投与後２、３、及び４日に測定した。その結果を図１９、２０及び２１に示した。なお、図１９はＡ２ＮＴＸを投与した時の結果を示し、図２０はＡ１ＮＴＸを投与した時の結果を示し、図２１はＡ１ＬＬを投与した時の結果を示している。【００９５】
Ａ１ＮＴＸ及びＡ１型ＬＬ毒素について神経切断群とＣｏｎｔｒｏｌ群との握力の推移についてＷｉｌｃｏｘｏｎ検定を行ったところ、１％以下の危険率で有意となった。またＡ２ＮＴＸについては神経切断群とＣｏｎｔｒｏｌ群との間で差は認められなかった。【００９６】
以上の結果から、Ａ１ＮＴＸ及びＡ１ＬＬは軸索輸送が認められる毒素であるが、Ａ２ＮＴＸは軸索輸送が認められない毒素であると考えられた。【００９７】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
各種疾患を治療するための治療剤、改善薬、治療方法として用いることが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年9月22日(2010.9.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
ＨＡ非生産性のボツリヌス菌に由来する分子量１５０ｋＤａのボツリヌス毒素を有効成分として含有し、
１回の投与で、投与対象の体重１ｋｇあたり上記ボツリヌス毒素が１５Ｕより多く２５Ｕ以下の量、かつ総投与量が０．０１〜１５００Ｕ（ただし、１回の投与量が０．０１〜９００Ｕの範囲を除く）にて投与される医薬組成物。
【国際調査報告】
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