(57)【要約】遺伝子組換え技術を用いずに、現在までに開発された高オレイン酸ダイズを上回る量のオレイン酸を含有するダイズを提供すること。  本発明は、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異遺伝子及びＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異遺伝子を含むダイズ種を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ω−６脂肪酸不飽和化酵素をコードするＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子及びＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子に機能欠失型変異が導入された、非遺伝子組換え型オレイン酸高含有ダイズ。
【請求項２】
オレイン酸含有量が、ダイズの総脂肪酸量の７５％以上である、請求項１に記載のダイズ。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つの特徴を有する、請求項１に記載のダイズ。
（ａ）  種子の表皮の皺が野生型と比較して増加しない
（ｂ）  実質的に問題となる量のリノール酸を生成しない
（ｃ）  総貯蔵タンパク質中のβ−コングリシニン含有量が野生型と比較して実質的に低下しない
（ｄ）  総貯蔵タンパク質量が野生型と比較して実質的に低下しない
（ｅ）  稔性が野生型と比較して低下しない
【請求項４】
前記機能欠失型変異が、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異及びヌル変異からなる群から選択されるいずれかの変異である、請求項１に記載のダイズ。
【請求項５】
前記ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異は、ω−６脂肪酸不飽和化酵素のアミノ酸配列のうち、以下の（１）〜（８）からなる群から選択される領域に含まれるアミノ酸残基をコードするコドンに生じた変異である、請求項１に記載のダイズ。
（１）  第５８番目〜第７９番目のアミノ酸残基からなる領域
（２）  第８８番目〜第１０８番目のアミノ酸残基からなる領域
（３）  第１８０番目〜第１９４番目のアミノ酸残基からなる領域
（４）  第２２９番目〜第２５１番目のアミノ酸残基からなる領域
（５）  第２５４番目〜第２７７番目のアミノ酸残基からなる領域
（６）  第１０９番目〜第１１４番目のアミノ酸残基からなる領域
（７）  第１４１番目〜第１４９番目のアミノ酸残基からなる領域
（８）  第３１９番目〜第３２６番目のアミノ酸残基からなる領域
【請求項６】
前記アミノ酸残基が、第１０３番目及び／又は第１８９番目のアミノ酸残基である、請求項５に記載のダイズ。
【請求項７】
前記変異が、第１０３番目及び／又は第１８９番目のアミノ酸残基をコードするコドンのミスセンス変異である、請求項５に記載のダイズ。
【請求項８】
前記第１０３番目のアミノ酸残基をコードするコドンのミスセンス変異が、グリシンのコドンからバリンのコドンへの置換によるものである、請求項７に記載のダイズ。
【請求項９】
前記第１８９番目のアミノ酸残基をコードするコドンのミスセンス変異が、スレオニンのコドンからプロリンのコドンへの置換によるものである、請求項７に記載のダイズ。
【請求項１０】
配列番号３又は５で示される塩基配列からなる遺伝子を有する、請求項５に記載のダイズ。
【請求項１１】
ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異が、Ｍ２３ダイズ又はＫＫ２１ダイズのＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の変異と同一のものであるである、請求項２に記載のダイズ。
【請求項１２】
受領番号がＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１２４９であるＫＫ２１ダイズと受領番号がＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１２４８であるＢ１２ダイズとを交雑させて得られる、非遺伝子組換え型オレイン酸高含有ダイズ。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のダイズ又はその処理物を含む医薬品組成物、食品又は飼料。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のダイズ又はその処理物から抽出されたダイズ油。
【請求項１５】
請求項１４に記載のダイズ油を含む、医薬組成物用、食品用又は飼料用の材料。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のダイズ又はその処理物から生成される燃料。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のダイズ同士、又は当該ダイズと他のダイズ種とを交雑させることを特徴とする、非遺伝子組換え型オレイン酸高含有ダイズの製造方法。
【請求項１８】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群から選ばれるいずれかの工程を含む、非遺伝子組換え型オレイン酸高含有ダイズの製造方法。
（ｉ）  ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の変異を有するダイズ種と、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の変異を有するダイズ種とを交雑させる工程
（ｉｉ）  ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異を有するダイズ種に、変異誘発剤又はＸ線処理を施してＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異を誘発する工程
（ｉｉｉ）  ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異を有するダイズ種に、変異誘発剤又はＸ線処理を施してＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異を誘発する工程
（ｉｖ）  野生型ダイズ種に、変異誘発剤又はＸ線処理を施してＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子及びＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異を誘発する工程
【請求項１９】
非遺伝子組換え型オレイン酸高含有ダイズのスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載のダイズが有するＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子若しくはＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の変異部位の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ、及び／又は前記遺伝子の塩基配列及びその相補配列の少なくとも一方を増幅したときの増幅断片中に前記変異部位が含まれるように作製されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて被検ダイズのＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子について増幅処理及び／又はハイブリダイゼーション処理を行う工程、並びに
（ｂ）前記遺伝子の変異部位を検出する工程
を含む、前記方法。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のダイズが有するＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の変異部位の塩基配列を含むように作製されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドの５’末端若しくは３’末端又は中央の塩基が、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の変異部位となるように作製されたものである、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
１０〜２００塩基の長さを有する、請求項２０又は２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドが支持体に固定されたマイクロアレイ。
【請求項２４】
請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド及び／又は請求項２３に記載のマイクロアレイを含む、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダイズのＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子に機能欠失型変異を導入したダイズ種及び当該変異が導入された遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ダイズは、世界で最も大量に生産される植物油脂供給源である。植物油脂に含まれる脂肪酸の組成は、油脂の品質に直接的な影響を与えるため、ダイズにおいても脂肪酸組成の改変が品種改良の主要な課題となっている。一般的に、脂肪酸組成において、飽和脂肪酸含有量が高いと油脂の品質は安定するが、この様な油脂を摂取すると低密度リポタンパク質コレステロールの血中レベルが上昇するため、栄養学的に好ましくない。また、リノール酸などの多価不飽和脂肪酸は、酸化されやすく不安定であり、バイオ燃料として用いた場合にスラッジが生じやすいという問題がある。
従来より、多価不飽和脂肪酸の不安定性を補う手段として水素付加が行われているが、コストがかかるために経済的ではなく、また、副生成物として冠動脈系疾患のリスクファクターと考えられるトランス脂肪酸が生じてしまうために好ましくない。対照的に、オレイン酸などの一価不飽和脂肪酸は、比較的酸化に対して安定であり、血中コレステロールレベルを低下させることから、オレイン酸を多く含むダイズは、燃料源としても、栄養源としても好ましい。
一般的に流通しているダイズの種子から得られる油脂の組成は、オレイン酸量が２０〜２５％程度であり、リノール酸量が５０〜５７％であるため、オレイン酸含有量の増加を図るべく多くの品種改良がなされてきた。しかしながら、現在までに開発された品種は、実用的に十分なオレイン酸含量を有するには至っていない。
これまでの研究により、植物油脂中のオレイン酸含量を増加させるためには、オレイン酸を不飽和化しリノール酸を生産する過程を触媒する小胞体型オメガ−６脂肪酸不飽和化酵素（ＦＡＤ２）の活性を低下させることが重要であることが明らかになっており（非特許文献１）、この酵素をコードしているＦＡＤ２遺伝子が品種改良の際の標的となっている。遺伝子組換え技術を利用したＦＡＤ２遺伝子改変ダイズとして、コサプレッション法を用いて、ＦＡＤ２遺伝子の発現を阻害した超高オレイン酸ダイズ（系統名：２６０−０５）が開発されており、オレイン酸含量が約８０％以上にまで増加したことが報告されている（特許文献１及び非特許文献２）。また、遺伝子組換えにより、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の比率調節に関与するパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、オレイン酸含有量を増加させた例も報告されている（特許文献２）。しかしながら、これらの高オレイン酸ダイズは遺伝子組換え体であったことから、最終的に消費者に受け入れられず、現時点では食用としての生産はされていない。
従って、高オレイン酸含有の食用ダイズ又はダイズ油の提供を目的とした場合、遺伝子組換え技術を用いずに高オレイン酸ダイズを提供することが望まれる。以前、本発明者は突然変異の誘発によりＦＡＤ２遺伝子の一つであるＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能を完全に破壊した２種類の突然変異系統（Ｍ２３及びＫＫ２１）を作製し、ダイズのオレイン酸含有量を約２５％から５０％以上にまで倍増させることに成功したが（特許文献３及び非特許文献１）、遺伝子組換え技術を用いずにオレイン酸含有量を更に増加させることは困難であった。
【特許文献１】特表平１１−５０８９６１号公報
【特許文献２】特開２００５−５３０５０６号公報
【特許文献３】特開２００４−３号公報
【非特許文献１】Ａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５８：４４７−４５２（２００８）
【非特許文献２】Ｋｉｎｎｅｙ  ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｔｏｎ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｂｌａｃｋｉｅ，Ｌｏｎｄｏｎ．１９３−２１３．ｐｐ．（１９９８）
【発明の開示】
【０００３】
本発明の課題は、現在までに開発された高オレイン酸含有ダイズを上回る量のオレイン酸を含有する非遺伝子組換え型ダイズを提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、野生型ダイズの、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子とは別のＦＡＤ２遺伝子であるＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子に機能欠失型の変異を導入することに成功した。そして、この突然変異を有するダイズは、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異を併せ持つ場合、オレイン酸がリノール酸に変換されず、非常に高いオレイン酸含有率を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］  ω−６脂肪酸不飽和化酵素をコードするＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子及びＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子に機能欠失型変異が導入された、非遺伝子組換え型オレイン酸高含有ダイズ。
［２］  オレイン酸含有量が、ダイズの総脂肪酸量の７５％以上である、前記［１］に記載のダイズ。
［３］  以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つの特徴を有する、前記［１］に記載のダイズ。
（ａ）  種子の表皮の皺が野生型と比較して増加しない
（ｂ）  実質的に問題となる量のリノール酸を生成しない
（ｃ）  総貯蔵タンパク質中のβ−コングリシニン含有量が野生型と比較して実質的に低下しない
（ｄ）  総貯蔵タンパク質量が野生型と比較して実質的に低下しない
（ｅ）  稔性が野生型と比較して低下しない
［４］  前記機能欠失型変異が、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異及びヌル変異からなる群から選択されるいずれかの変異である、前記［１］に記載のダイズ。
［５］  前記ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異は、ω−６脂肪酸不飽和化酵素のアミノ酸配列のうち、以下の（１）〜（８）からなる群から選択される領域に含まれるアミノ酸残基をコードするコドンに生じた変異である、前記［１］に記載のダイズ。
（１）  第５８番目〜第７９番目のアミノ酸残基からなる領域
（２）  第８８番目〜第１０８番目のアミノ酸残基からなる領域
（３）  第１８０番目〜第１９４番目のアミノ酸残基からなる領域
（４）  第２２９番目〜第２５１番目のアミノ酸残基からなる領域
（５）  第２５４番目〜第２７７番目のアミノ酸残基からなる領域
（６）  第１０９番目〜第１１４番目のアミノ酸残基からなる領域
（７）  第１４１番目〜第１４９番目のアミノ酸残基からなる領域
（８）  第３１９番目〜第３２６番目のアミノ酸残基からなる領域
［６］  前記アミノ酸残基が、第１０３番目及び／又は第１８９番目のアミノ酸残基である、前記［５］に記載のダイズ。
［７］  前記変異が、第１０３番目及び／又は第１８９番目のアミノ酸残基をコードするコドンのミスセンス変異である、前記［５］に記載のダイズ。
［８］  前記第１０３番目のアミノ酸残基をコードするコドンのミスセンス変異が、グリシンのコドンからバリンのコドンへの置換によるものである、前記［７］に記載のダイズ。
［９］  前記第１８９番目のアミノ酸残基をコードするコドンのミスセンス変異が、スレオニンのコドンからプロリンのコドンへの置換によるものである、前記［７］に記載のダイズ。
［１０］  配列番号３又は５で示される塩基配列からなる遺伝子を有する、前記［５］に記載のダイズ。
［１１］  ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異が、Ｍ２３ダイズ又はＫＫ２１ダイズのＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の変異と同一のものであるである、前記［２］に記載のダイズ。
［１２］  受領番号がＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１２４９であるＫＫ２１ダイズと受領番号がＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１２４８であるＢ１２ダイズとを交雑させて得られる、非遺伝子組換え型オレイン酸高含有ダイズ。
［１３］  前記［１］〜［１２］のいずれか１つに記載のダイズ又はその処理物を含む医薬品組成物、食品又は飼料。
［１４］  前記［１］〜［１２］のいずれか１つに記載のダイズ又はその処理物から抽出されたダイズ油。
［１５］  前記［１４］に記載のダイズ油を含む、医薬組成物用、食品用又は飼料用の材料。
［１６］  前記［１］〜［１２］のいずれか１つに記載のダイズ又はその処理物から生成される燃料。
［１７］  前記［１］〜［１２］のいずれか１つに記載のダイズ同士、又は当該ダイズと他のダイズ種とを交雑させることを特徴とする、非遺伝子組換え型オレイン酸高含有ダイズの製造方法。
［１８］  以下の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群から選ばれるいずれかの工程を含む、非遺伝子組換え型オレイン酸高含有ダイズの製造方法。
（ｉ）  ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の変異を有するダイズ種と、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の変異を有するダイズ種とを交雑させる工程
（ｉｉ）  ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異を有するダイズ種に、変異誘発剤又はＸ線処理を施してＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異を誘発する工程
（ｉｉｉ）  ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異を有するダイズ種に、変異誘発剤又はＸ線処理を施してＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異を誘発する工程
（ｉｖ）  野生型ダイズ種に、変異誘発剤又はＸ線処理を施してＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子及びＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異を誘発する工程
［１９］  非遺伝子組換え型オレイン酸高含有ダイズのスクリーニング方法であって、
（ａ）前記［１］〜［１２］のいずれか１つに記載のダイズが有するＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子若しくはＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の変異部位の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ、及び／又は前記遺伝子の塩基配列及びその相補配列の少なくとも一方を増幅したときの増幅断片中に前記変異部位が含まれるように作製されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて被検ダイズのＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子について増幅処理及び／又はハイブリダイゼーション処理を行う工程、並びに
（ｂ）前記遺伝子の変異部位を検出する工程
を含む、前記方法。
［２０］  前記［１］〜［１２］のいずれか１つに記載のダイズが有するＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の変異部位の塩基配列を含むように作製されたオリゴヌクレオチド。
［２１］  オリゴヌクレオチドの５’末端若しくは３’末端又は中央の塩基が、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の変異部位となるように作製されたものである、前記［２０］に記載のオリゴヌクレオチド。
［２２］  １０〜２００塩基の長さを有する、前記［２０］又は［２１］に記載のオリゴヌクレオチド。
［２３］  前記［２０］〜［２２］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドが支持体に固定されたマイクロアレイ。
［２４］  前記［２０］〜［２２］のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド及び／又は前記［２３］に記載のマイクロアレイを含む、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異検出用キット。
本発明の突然変異遺伝子を有するダイズは、オレイン酸を高含量で含有し、特に、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子及びＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異を併せ持つ場合、約８０％という極めて高いオレイン酸含量を示す。このオレイン酸値は、オレイン酸含量の希望基準値を完全に満たすものであると考えられる。さらに、本発明の超高オレイン酸含有ダイズは、遺伝子組換え技術を用いずに入手可能な非遺伝子組換えダイズであるため、消費者の受け入れにも全く支障はなく、食品、飼料及び薬品の素材として幅広い用途と有用性を有するものと考えられる。
また、本発明の遺伝子の変異は、オリゴヌクレオチドで作製したプローブやプライマーなどを用いて容易に検出することが可能である。したがって、本発明のダイズを別のダイズ品種と交雑させ、その子孫ダイズのゲノムＤＮＡについて、これらのプローブ又はプライマーを用いて本発明の突然変異遺伝子を含むダイズ系統を選抜することにより、新たな特性を有する高オレイン酸ダイズ品種を作製することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＧｍＦＡＤ２−１ａ及びＧｍＦＡＤ２−１ｂに機能欠失型変異を有するＦＨ００ＥＳ０４Ｅ１１系統の種子の脂肪酸組成を示すガスクロマトグラフである。ピーク１〜５は、それぞれパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸及びα−リノレン酸に対応する。
図２は、ＧｍＦＡＤ２−１ａのみに機能欠失型変異を有するＢＣ３Ｆ４系統の種子の脂肪酸組成を示すガスクロマトグラフである。ピーク１〜５の対応は、図１と同様である。
図３は、ＧｍＦＡＤ２−１ａ及びＧｍＦＡＤ２−１ｂのいずれにも機能欠失型変異を有しないフクユタカの種子の脂肪酸組成を示すガスクロマトグラフである。ピーク１〜５の対応は、図１及び図２と同様である。
図４は、ＣＥＬＩヌクレアーゼ処理による切断パターンを解析した結果を示す図である。
図５は、制限酵素による切断パターンを解析した結果を示す図である。
図６は、各ダイズに含まれるタンパク質の組成をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示す図である。
図７は、各ダイズに含まれる脂肪酸の組成をガスクロマトグラフィーで分析した結果を示す図である。
図８は、本発明のダイズを製造する方法の模式図である。
図９は、本発明のダイズを製造する方法を示す模式図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２００９年６月２２日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２００９−１４７７０６号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
本発明者らは、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子に機能欠失変異を有するダイズに、さらに変異処理を施すことにより、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子に機能欠失型の変異を導入することに成功し、その結果、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子及びＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の両方に機能欠失変異を有する非遺伝子組換えダイズを作製した。この非遺伝子組換えダイズはオレイン酸を高含量で含有していた。また、本発明により得られた非遺伝子組換え型ダイズを詳細に観察した結果、以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つの特徴（表現型）を有することが分かった。
（ａ）  種子の表皮の皺が野生型と比較して増加しない
（ｂ）  実質的に問題となる量のリノール酸を生成しない
（ｃ）  総貯蔵タンパク質中のβ−コングリシニン含有量が野生型と比較して実質的に低下しない
（ｄ）  総貯蔵タンパク質量が野生型と比較して実質的に低下しない
（ｅ）  稔性が野生型と比較して低下しない
従って、本発明は、上記変異を有するダイズ、好ましくは、さらに上記（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つの特徴を有する非遺伝子組換えダイズ（以下、「本発明のダイズ」と呼ぶ）を提供する。
本発明において、「ダイズ」とは、ダイズの植物個体の全体又は一部を意味し、植物個体のほか、該植物個体の器官（種子等）、該植物個体由来の細胞又は細胞小器官などの部分構造体を意味する場合もある。
本発明において、「非遺伝子組換えダイズ」又は「非遺伝子組換え型ダイズ」とは、遺伝子組換え技術による遺伝的性質の改変を経ていないダイズ育種、すなわち、ダイズ原種、及び原種に非遺伝子組換え技術による遺伝子変異を導入して品種改良を行うことにより得られたダイズ品種を意味する。
本発明において、「野生型」又は「野生型ダイズ」とは、既存の非遺伝子組換えダイズであって、かつ正常な生物学的機能を有することによりω−６脂肪酸不飽和化酵素を生成するダイズ種を意味する。野生型ダイズの例としては、「Ｂａｙ」、「むらゆたか」及び「フクユタカ」が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
上記表現形質において、特徴（ａ）は、ダイズ１個体から収穫されるダイズ種子の総粒数に占める「表皮に皺を有しない種子」の割合が、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上又は８０％以上であり、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上又は９５％以上であることを意味する。この特徴は、ダイズ種子を肉眼で観察することにより確認することができる。
上記特徴（ｂ）について、「実質的に問題となる量のリノール酸を生成しない」とは、油脂の酸化を早め、安定性を低下させるレベルまでリノール酸を生成しないことを意味する。
具体的には、上記特徴（ｂ）は、総脂肪酸量に対するリノール酸の比率（すなわち、リノール酸含有率）が、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下又は４％以下であることを意味する。
リノール酸含有率は、ダイズから抽出される油脂について通常の油脂分析を行うことにより測定することが可能であり、例えば、公知文献（Ａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５８：４４７−４５２（２００８））に記載される条件下でのガスクロマトグラフィー分析などにより測定することができる。但し、測定法はこれに限定されるものではない。このようにして本発明のダイズの種子のリノール酸含有量を測定することにより、上記特徴（ｂ）を確認することができる。
上記特徴（ｃ）は、本発明のダイズの総貯蔵タンパク質中のβ−コングリシニン含有量が、野生型ダイズの総貯蔵タンパク質中のβ−コングリシニン含有量と比べて、実質的に同程度以上であることを意味し、例えば、本発明のダイズの総貯蔵タンパク質中のβ−コングリシニン含有量は、野生型ダイズの総貯蔵タンパク質中のβ−コングリシニン含有量の７０％以上であり、好ましくは、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上である。
総貯蔵タンパク質中のβ−コングリシニン含有量は、ダイズ、好ましくはダイズ種子に含まれるタンパク質について通常のタンパク質分析を行うことにより測定することができる。例えば、ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）、各種クロマトグラフィー分析などにより測定することできる。このようにして測定された本発明のダイズ及び野生型ダイズのβ−コングリシニン含有量を比較することにより、上記特徴（ｃ）を確認することができる。
上記特徴（ｄ）は、本発明のダイズに含有されるタンパク質量が、野生型ダイズに含有されるタンパク質量と比べて、実質的に同程度以上であることを意味し、例えば、本発明のダイズに含有されるタンパク質量が、野生型ダイズに含有されるタンパク質量の７０％以上であり、好ましくは、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上である。ダイズ、好ましくはダイズ種子に含有されるタンパク質量は、上記特徴（ｃ）の記載において述べた測定方法等により測定することできる。このようにして測定された本発明のダイズ及び野生型ダイズに含有されるタンパク質量を比較することにより、上記特徴（ｄ）を確認することができる。
上記特徴（ｅ）は、本発明のダイズ同士を交雑させた場合、受粉による受精率が、野生型ダイズと比べて、実質的に同程度以上であることを意味する。ここで、「実質的に同程度以上である」とは、本発明のダイズの受粉による受精率が、野生型ダイズの受粉による受精率と比べて、７０％以上であること、好ましくは、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の範囲にあることを意味する。受粉による受精率は、ダイズの雄しべと雌しべとを接触させて人工受粉させ、受粉した花の個数に対する形成されたダイズの房の数の比率として求めることができる。このようにして求めた本発明のダイズ及び野生型ダイズの受精率を比較することにより、上記特徴（ｅ）を確認することができる。
また、本発明のダイズは、オレイン酸含有量が高いことを特徴としており、本発明のダイズのオレイン酸含有量は、ダイズに含まれる総脂肪酸量の３０％以上を占め、好ましくは、５０％以上、より好ましくは、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上又は８１％以上であり、さらに好ましくは８１．５％以上であり、さらにより好ましくは、８１．６％以上である。オレイン酸含有量は、ダイズから抽出される脂肪酸について通常の油脂分析を行うことにより容易に測定することができる。例えば、公知文献（Ａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５８：４４７−４５２（２００８））に記載されるような条件下でのガスクロマトグラフィー分析などにより測定できる。但し、測定法はこれに限定されるものではない。
１．変異遺伝子
本発明のダイズは、好ましくは、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子及び／又はＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子に機能欠失型変異を含む。本発明において、「変異遺伝子を含む」とは、ダイズ細胞内に変異遺伝子を保持することを意味し、このようなダイズは、好ましくは、該変異遺伝子を該ダイズのゲノム中に保持し、さらに好ましくは、遺伝子組換え操作によらずに、例えば、突然変異又は他品種との交雑の結果として変異遺伝子をゲノム中に保持する、非遺伝子組換え型のダイズである。
ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異を保持するダイズは、種子内の総ＦＡＤ２活性が著しく低下しており、特に、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異及びＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異の両方を保持するダイズは、種子内でのＦＡＤ２の機能がほぼ完全に失われており、そのためオレイン酸がリノール酸に変換されない。
本発明において、「ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子」及び「ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子」は、ともにダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．）のミクロソームω−６脂肪酸不飽和化酵素（ω−６  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ：ＦＡＤ２）をコードする遺伝子である。また、「ω−６脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子」とは、ω−６脂肪酸不飽和化酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる遺伝子領域を意味し、いわゆるオープンリーディングフレーム領域を意味する。「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」とは、タンパク質に翻訳されるＤＮＡあるいはＲＮＡの領域であり、遺伝子において、ＯＲＦは開始コドンと終了コドンの間に位置する配列を意味する。
ω−６脂肪酸不飽和化酵素は、ダイズ内でオレイン酸をリノール酸に変換する反応を触媒する酵素であり、この酵素をコードする遺伝子としては、ＧｍＦＡＤ２−１ａ、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ、ＧｍＦＡＤ２−２ａ、ＧｍＦＡＤ２−２ｂ及びＧｍＦＡＤ２−２ｃが確認されているが、このうち、ＧｍＦＡＤ２−１ａ及びＧｍＦＡＤ２−１ｂのみが、発生段階の種子において特異的に発現することが知られている（Ａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５８：４４７−４５２（２００８））。ＧｍＦＡＤ２−１ａとＧｍＦＡＤ２−１ｂとは、それぞれ、連鎖群ＬＧＯおよびＬＧＩに座乗している遺伝子であり、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ１８８２５０．１とＡＢ１８８２５１．１として登録されている塩基配列を持つ。これらは、ＯＲＦの塩基配列で９４％の相同性を示し、５残基の異なるアミノ酸を含む。
フクユタカ由来の野生型ω−６脂肪酸不飽和化酵素をコードするＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号１に、また該酵素のアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、フクユタカ由来の野生型ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号１４に、野生型ＧｍＦＡＤ２−１ａ酵素のアミノ酸配列を配列番号１５に示す。
本発明において、「機能欠失型変異（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）」とは、その遺伝子にコードされるタンパク質等が、その生物学的機能を失うような変異を意味しており、完全に機能を失ったアモルフ（ａｍｏｒｐｈ）型と、部分的に機能を失ったハイポモルフ（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈ）型のいずれであってもよいが、ＦＡＤ２機能を完全に欠損したアモルフ型が好ましい。また、接合型は、ホモ型及びヘテロ型のどちらでもよいが、ホモ接合型であることが好ましい。この場合、完全に機能を失うとは、実質的にＦＡＤ２の機能が認められなくなることを意味し、例えば、野生型の機能活性を１００％と定めた場合に、変異体が、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは３％以下、さらにより好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下の機能活性しか示さないことを意味する。また、部分的に機能を失うとは、変異体が、野生型と比較して、９０％以下、好ましくは、７０％以下、より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは５０％以下、さらにより好ましくは４０％以下、最も好ましくは３０％以下の機能活性しか示さないことを意味する。
ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子及びＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異遺伝子は、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子及びＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子によりコードされるＦＡＤ２が、そのＦＡＤ２活性を喪失するものであれば特に限定されないが、好ましくは、ＦＡＤ２をコードするＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子及びＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子中のミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異及びヌル変異からなる群から選択されるいずれかの変異が導入された、機能欠失型変異遺伝子である。
ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異は、ＦＡＤ２のアミノ酸配列のうち、以下の（１）〜（８）からなる群から選択される領域に含まれるアミノ酸残基をコードするコドンに生じていることが好ましい。
（１）  第５８番目〜第７９番目のアミノ酸残基からなる領域
（２）  第８８番目〜第１０８番目のアミノ酸残基からなる領域
（３）  第１８０番目〜第１９４番目のアミノ酸残基からなる領域
（４）  第２２９番目〜第２５１番目のアミノ酸残基からなる領域
（５）  第２５４番目〜第２７７番目のアミノ酸残基からなる領域
（６）  第１０９番目〜第１１４番目のアミノ酸残基からなる領域
（７）  第１４１番目〜第１４９番目のアミノ酸残基からなる領域
（８）  第３１９番目〜第３２６番目のアミノ酸残基からなる領域
前記ＦＡＤ２のアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号２に示すアミノ酸配列であり、配列番号２のアミノ酸配列において、（１）〜（８）の領域のアミノ酸配列は、以下の通りである。
（１）第５８番目〜第７９番目のアミノ酸：Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｈｉｓ（配列番号１６）
（２）第８８番目〜第１０８番目のアミノ酸：Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ａｌａ（配列番号１７）
（３）第１８０番目〜第１９４番目のアミノ酸：Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ（配列番号１８）
（４）第２２９番目〜第２５１番目のアミノ酸：Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ（配列番号１９）
（５）第２５４番目〜第２７７番目のアミノ酸：Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ（配列番号２０）
（６）第１０９番目〜第１１４番目のアミノ酸：Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ（配列番号２１）
（７）第１４１番目〜第１４９番目のアミノ酸：Ｔｒｐ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ（配列番号２２）
（８）第３１９番目〜第３２６番目のアミノ酸：Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ（配列番号２３）
上記（１）〜（８）のうち、（１）〜（５）に示される領域は、ＦＡＤ２の膜貫通ドメインに含まれる領域であり、（６）〜（８）に示される領域は、該ＦＡＤ２のヒスチジンボックスに含まれる領域である。膜貫通ドメインは、ＦＡＤ２の構造安定化に重要な部位であり、一方、ヒスチジンボックスは、金属イオンとの結合部位であり、ＦＡＤ２酵素の活性化に重要な部位である。従って、これらの領域に変異が生じた場合、ＦＡＤ２酵素はその活性が失うものと考えられる。前記変異は、上記（１）〜（８）のアミノ酸領域うち、（１）〜（３）の領域に生じていることが好ましい。
本発明のダイズに生じている機能欠失型変異は、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異、ヌル変異又はこれらの組み合わせであるが、前記（１）〜（８）からなる群から選択される領域に含まれるアミノ酸残基をコードするコドンに生じる変異は、ミスセンス変異であることが好ましい。ミスセンス変異により生じるアミノ酸置換としては、例えば、親水性アミノ酸から疎水性アミノ酸への置換、あるいは疎水性アミノ酸から親水性アミノ酸への置換が挙げられる。親水性のアミノ酸の例としては、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ及びＡｓｎが挙げられる。一方、疎水性のアミノ酸残基の例としては、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔ及びＩｌｅが挙げられる。
更に好ましくは、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子中の変異は、ＦＡＤ２酵素のアミノ酸配列のうち第１０３番目及び／又は第１８９番目のアミノ酸残基をコードするコドンのミスセンス変異である。例えば、前記第１０３番目のミスセンス変異は、グリシンのコドンからグリシン以外の１９種類のアミノ酸（Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ）のコドンへの置換によるものであり、さらに好ましくは、グリシンのコドン（ＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、ＧＧＧ）からバリンのコドン（ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ、ＧＴＧ）への置換によるものであり、前記第１８９番目のミスセンス変異は、スレオニンのコドンからスレオニン以外の１９種類のアミノ酸（Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ）のコドンへの置換によるものであり、さらに好ましくは、スレオニンのコドン（ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧ）からプロリンのコドン（ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＧ）への置換によるものであり、あるいは、前記第１０３番目の変異と前記１８９番目の変異の組合せも含まれる。
最も好ましくは、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異遺伝子は配列番号３又は５で示される塩基配列を有する。配列番号３は、野生型のＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の塩基配列（配列番号１）の第３０８番目の塩基が、グアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）に置換された、機能欠失変異型ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の塩基配列であり、この置換によって、配列番号３の塩基配列にコードされるＦＡＤタンパク質は、野生型のＦＡＤのアミノ酸配列（配列番号２）の第１０３番目のアミノ酸残基が、グリシンからバリンに置換されたアミノ酸配列（配列番号４）を有することになる。配列番号５は、野生型のＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の塩基配列（配列番号１）の第５６５番目の塩基が、アデニン（Ａ）からシトシン（Ｃ）に置換された、機能欠失変異型ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の塩基配列であり、この置換によって、配列番号５の塩基配列にコードされるＦＡＤタンパク質は、野生型のＦＡＤのアミノ酸配列（配列番号２）の第１８９番目のアミノ酸残基が、スレオニンからプロリンに置換されたアミノ酸配列（配列番号６）を有することになる。
ここで、「ＦＡＤ２活性」とは、ダイズ細胞、好ましくは、ダイズ種子細胞内で、オレイン酸をリノール酸に変換する反応を触媒する活性を意味する。
ω−６脂肪酸不飽和化酵素のアミノ酸配列のうち第１０３番目及び第１８９番目のアミノ酸残基は、それぞれ、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の開始コドンがコードするメチオニンを第１番目のアミノ酸残基と定め、順にカルボキシル末端側にアミノ酸残基を数えた場合の第１０３番目及び第１８９番目のアミノ酸残基である。したがって、ω−６脂肪酸不飽和化酵素のアミノ酸配列のうち第１０３番目及び第１８９番目のアミノ酸残基をコードするコドンは、それぞれ、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子のオープンリーディングフレームの５’末端に位置するヌクレオチドを１番目のヌクレオチドと定めたときの３０７〜３０９番目のヌクレオチド及び５６５〜５６７番目のヌクレオチドの塩基配列からなるコドンを意味する。
本発明において、「ミスセンス変異」とは、核酸配列のコドン内の塩基の変化又は置換により、そのコドンにコードされるアミノ酸の種類が変化する変異を意味する。
本発明において、「ナンセンス変異」とは、核酸配列のコドン内の変化又は置換により、そのコドンが終止コドンに変化し、そのコドンよりも３’側のＯＲＦ領域が翻訳されなくなる変異を意味するものである。ナンセンス変異は、終止変異とも呼ばれる。
本発明において、「フレームシフト変異」とは、塩基の挿入又は欠失により、その挿入又は欠失部位よりも３’側の領域でコドンの読み枠がずれる変異を意味する。
本発明において、「ヌル変異」とは、そのタンパク質をコードするヌクレオチド配列が完全に欠失しているか、又はヌクレオチド配列が存在していても機能性タンパク質を発現できない変異を意味する。
野生型ＦＡＤ２のアミノ酸配列（配列番号２）では、第１０３番目のアミノ酸残基はグリシンである。これに対し、本発明のある態様では、ＦＡＤ２は、ＦＡＤ２のアミノ酸配列の第１０３番目のアミノ酸残基にミスセンス変異を含むことにより、ＦＡＤ２活性を喪失し、特に、当該ミスセンス変異によって、ＦＡＤ２のアミノ酸配列の第１０３番目のアミノ酸残基（グリシン）が、グリシン以外の１９種類のアミノ酸、例えば、バリンに置換された場合（配列番号４）、さらに具体的には、ＦＡＤ２をコードする塩基配列において、第１０３番目のアミノ酸に対応するコドンの塩基配列が「ＧＴＣ」である場合（配列番号３）、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子は機能性ＦＡＤ２を生成できなくなる。
また、野生型ＦＡＤ２のアミノ酸配列（配列番号２）では、第１８９番目のアミノ酸残基はスレオニンである。本発明のある態様では、ＦＡＤ２は、ＦＡＤ２のアミノ酸配列の第１８９番目のアミノ酸残基にミスセンス変異を含むことにより、ＦＡＤ２活性を喪失し、特に、該ミスセンス変異によって、ＦＡＤ２のアミノ酸配列の第１８９番目のアミノ酸残基（スレオニン）が、スレオニン以外の１９種類のアミノ酸、例えば、プロリンに置換された場合（配列番号６）、さらに具体的には、ＦＡＤ２をコードする塩基配列において、第１８９番目のアミノ酸に対応するコドンの塩基配列が「ＣＣＡ」である場合（配列番号５）、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子は機能性ＦＡＤ２を生成できなくなる。
すなわち、配列番号１に示される野生型ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の第３０８番目のヌクレオチド残基がグアニンからチミンに置換された一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）を有する場合（配列番号３）又は第５６５番目のアデニンがシトシンに置換されたＳＮＰを有する場合（配列番号５）は、ＦＡＤ２の第１０３番目のアミノ酸残基がグリシンからバリンに置換され、又は第１８９番目のアミノ酸がスレオニンからプロリンに置換されるため、このような配列からなるＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子は機能欠失型変異遺伝子であるといえる。本発明において、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子は、コードするＦＡＤ２が機能欠失している限り、ヌクレオチド配列の第３０８番目又は第５６５番目以外のヌクレオチドが、欠失、挿入又は置換などによって変異していてもよい。すなわち、配列番号３又は５に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＡＤ２活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の機能欠失型変異遺伝子であってもよい。好ましくは、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３又は５に示す配列と８５％以上の相同性を有し、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、更により好ましくは９８％以上、最も好ましくは、９９％以上の相同性を有する。このような変異を有する遺伝子も本発明に含まれる。
配列番号３で示される塩基配列は、ＦＨ００ＥＳ０４Ｅ１１系統由来変異型ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子のヌクレオチド配列であり、配列番号１に示される野生型ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の第３０８番目のヌクレオチドがグアニンからチミンに置換された変異を有する。一方、配列番号５で示される塩基配列は、Ｅ０１５Ｂ１２系統由来変異型ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子のヌクレオチド配列であり、配列番号１に示される野生型ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の第５６５番目のヌクレオチドがアデニンからシトシンに置換された変異を有する。
「ストリンジェントな条件」とは、例えば、塩（ナトリウムなど）濃度が１５０〜９００ｍＭであり、かつ温度が５５〜７５℃の条件であり、好ましくは、塩（ナトリウムなど）濃度が２５０〜４５０ｍＭであり、かつ温度が６２〜７０℃の条件である。
ここで、「ＦＡＤ２活性を有するタンパク質」又は「機能性ＦＡＤ２」とは、ダイズ細胞、好ましくは、ダイズ種子細胞内で、オレイン酸をリノール酸に変換する反応を触媒する小胞体型オメガ−６脂肪酸不飽和化酵素（ＦＡＤ２）と同一の活性を有するタンパク質を意味する。したがって、「ＦＡＤ２活性を有するタンパク質を発現しない」とは、結果としてＦＡＤ２活性を有するタンパク質が生成されないことを意味し、例えば、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列が存在しないこと、該タンパク質の上記触媒機能を有するドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドが存在しないこと、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列は存在するが、そのヌクレオチド配列が転写されないこと、又は前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写産物であるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が翻訳されないこと等、種々の要因によって、ＦＡＤ２活性を有するタンパク質を発現しないことを意味する。
ＦＡＤ２の活性は、例えば、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いて測定できる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、リノール酸などの多価不飽和脂肪酸の合成能を持たないため、その細胞内で、対象のＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子を組換え発現させることにより得られるリノール酸量を、そのＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子にコードされるＦＡＤ２の活性量として測定できる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いた測定の詳細は、Ａｎａｉ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０６，１６１５−１６２３（２００５））に記載されており、本発明に適用することができる。
２種類以上のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の相同性は、相同性を測定する対象配列のうち、基準となる配列（例えば、配列番号３又は５に示す配列）を定め、この基準配列に対して、他の配列をアライメントすることにより、測定することができる。このようなアライメントは、多重整列アルゴリズムの使用によって可能であり、このようなアルゴリズムを用いたコンピューターソフトウェアとしては、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ）から入手可能なＣｌｕｓｔａｌＷなどが挙げられる。
ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異は、Ｂａｙ、オレリッチ５０又はフクユタカなどのダイズ品種に、常法に従い、Ｘ線照射やメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）などの変異誘発剤処理を施すことにより得ることができる。例えば、Ｘ線照射により変異を導入する場合、乾燥種子に対して１００Ｇｙ〜３００Ｇｙの照射量を、１回以上照射することにより、変異を導入することができる。また、ＥＭＳ処理を行う場合、０．１重量％〜０．５重量％の濃度のＥＭＳを用いた３０分〜２４時間のＥＭＳ曝露を１回以上行うことにより、変異を導入することができる。ＥＭＳ処理を行なう場合、上記濃度で処理すると、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の近傍の他の遺伝子に与える影響を最小限にして、主体的に目的の領域に変異を導入することができる。
本発明のダイズは、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異に加えて、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異を有していることが好ましい。種子内で発現するＦＡＤ２をコードする遺伝子としては、ＧｍＦＡＤ２−１ａ及びＧｍＦＡＤ２−１ｂのみが同定されており、これらの遺伝子の両方が機能を喪失した場合、ダイズ種子において、オレイン酸のリノール酸への変換が著しく低下し、オレイン酸含有量が非常に高くなるからである。
本発明において、「ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異遺伝子」とは、ＧｍＦＡＤ２−１ａにコードされるＦＡＤ２が機能を喪失するものであれば特に限定されないが、好ましくは、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子中に、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異及びヌル変異からなる群から選択されるいずれかの変異が導入された機能欠失型変異遺伝子であり、更に好ましくは、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異は、Ｍ２３ダイズ又はＫＫ２１ダイズのＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の変異と同一のものであり、最も好ましくは、Ｍ２３ダイズのＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の変異と同一のものである。
「ミスセンス変異」、「ナンセンス変異」、「フレームシフト変異」、「ヌル変異」については、上記で説明したとおりである。
本発明において、「Ｍ２３ダイズのＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の変異」としては、例えばＡｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５８：４４７−４５２（２００８）に記載されるＭ２３ダイズのＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の変異が挙げられる。具体的には、Ｍ２３の親品種であるＢａｙのＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子のＯＲＦ領域を含む核酸配列を増幅するように設計された以下のプライマー：
2010150901.tif 000002
を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、そのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した際に、親品種のゲノムＤＮＡを鋳型鎖として用いた場合に検出される約１．３Ｋｂｐのバンドが、Ｍ２３のゲノムＤＮＡを鋳型鎖として用いた場合には検出されなくなるような変異であり、野生型ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子のＯＲＦ全体のヌクレオチドが欠失した変異である。（特開２００４−３号公報及びＡｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５８：４４７−４５２（２００８）を参照）。ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動については、以下を参照することができる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ。
本発明において、「ＫＫ２１ダイズのＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の変異」としては、例えば、Ａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５８：４４７−４５２（２００８）に記載されるＫＫ２１ダイズのＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子のフレームシフト変異が挙げられる。ＫＫ２１の変異は、Ｍ２３の突然変異と同等の効果を示すことが報告されている（Ａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５８：４４７−４５２（２００８））。具体的には、野生型ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子のＯＲＦ（配列番号１４）の２３２番目のチミン塩基が欠失して、この欠失部位から３’側の領域でフレームシフトが生じる変異を意味する。この変異の存在は、例えば、以下のプライマーセット：
2010150901.tif 000003
を用いてＰＣＲ反応を行い、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の塩基配列の一部を増幅したのち、精製したＤＮＡ断片を鋳型として、例えば、以下のプライマー：
2010150901.tif 000004
を用いてシークエンスを行い、ＯＲＦの２３２番目のチミン塩基の欠失を確認することで検出できる。シークエンス法については、以下を参照することができる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ。
ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子のコードするＦＡＤ２の活性も、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子にコードされるＦＡＤ２の活性と同様に、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いて測定できる。Ａｎａｉ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０６，１６１５−１６２３（２００５））。
ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異も、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異と同様に、Ｂａｙ、オレリッチ５０又はフクユタカなどのダイズ品種に、Ｘ線照射、あるいはＥＭＳなどの変異誘発剤処理を施すことにより、導入することができる。
２．本発明のダイズの作製方法
本発明のダイズは、以下（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの工程によって作製することができる。
（ｉ）  ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の変異を有するダイズ種と、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の変異を有するダイズ種とを交雑させる工程
（ｉｉ）  ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異を有するダイズ種に、変異誘発剤又はＸ線処理を施してＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異を誘発する工程
（ｉｉｉ）  ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異を有するダイズ種に、変異誘発剤又はＸ線処理を施してＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異を誘発する工程
（ｉｖ）  野生型ダイズ種に、変異誘発剤又はＸ線処理を施してＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子及びＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異を誘発する工程
上記工程（ｉ）の具体例を図８に示す。図８では、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子変異ダイズ種であるＫＫ２１とＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子変異ダイズ種であるＢ１２とを交雑させることにより、超高オレイン酸ダイズを製造する。但し、工程（ｉ）において使用されるダイズ種は、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子変異ダイズ種及びＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子変異ダイズ種に限定されるものではない。
上記工程（ｉｉ）の具体例を図９に示す。図９は、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子変異ダイズ種であるＢＣ３Ｆ４にＥＭＳ処理を施すことにより、超高オレイン酸ダイズを製造する工程を示すものである。但し、工程（ｉｉ）において、使用されるダイズ種は、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子変異ダイズ種に限定されるものではない。
上記工程（ｉｉｉ）の具体例は、図９に示すＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子変異ダイズ種を、Ｂ１２又はＥ１１等のＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子変異ダイズ種に置き換えた方法が挙げられる。但し、使用するダイズ種は、工程（ｉｉｉ）において使用するＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子変異ダイズ種に限定されるものではない。
上記工程（ｉｖ）は、野生型ダイズ（例えばフクユタカ）にＥＭＳ処理を施すことにより、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ及びＧｍＦＡＤ２−１ａの両遺伝子に機能欠失型変異を誘発し、超高オレイン酸ダイズを製造する工程を示すものである。但し、工程（ｉｖ）において、野生型ダイズは、フクユタカに限定されるものではない。
ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子変異ダイズ種の例としては、オレリッチ５０、Ｍ２３及びＫＫ２１が挙げられ、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子変異ダイズ種の例としては、Ｅ０１５Ｂ１２又はＦＨ００ＥＳ０４Ｅ１１系統（以下、それぞれ「Ｂ１２」又は「Ｅ１１」と呼ぶ）が挙げられる。これらのダイズ種のうち、ＫＫ２１及びＢ１２は、２０１０年４月２２日で、それぞれ受領番号「ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１２４９」及び「ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１２４８」として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託されている。
上記Ｍ２３、ＫＫ２１、Ｂ１２、Ｋ２１  ｘ  Ｂ１２及びＥ１１の各系統の種子は、佐賀大学農学部（〒８４０−８５０２  佐賀市本庄町１番地）にも保存されている。
３．用途
本発明において、「医薬品」とは、人や動物などの対象に投与することにより、対象の疾病の診断、治療又は予防を行うための物を意味し、このような効能が得られる限りにおいて医薬部外品を含み得る。ダイズに含まれるイソフラボンは、エストロゲン受容体に対してアゴニスト作用を示すことが知られており、骨粗鬆症の治療薬としても用いられている。また、本発明のダイズは、オレイン酸を多く含むことから、本発明のダイズ又はその処理物を含む医薬品としては、従来のダイズの効能に加えて、オレイン酸による血中コレステロールレベルの低下を目的とした医薬品が考えられる。このような医薬品の対象疾患としては、高脂血症、動脈硬化症、糖尿病などが挙げられる。
「ダイズの処理物」とは、ダイズに、例えば酵素処理、粉末化、乾燥、加熱、凍結、精製などの処理を施して得られるものを意味する。
本発明において、「食品」とは、栄養素の摂取や嗜好を目的として飲食される物を意味する。ダイズは、古くから食品として摂取されている。本発明のダイズは、枝豆のように生鮮食品として食べてもよく、納豆のように発酵食品として食べてもよく、乾燥豆、味噌、醤油、豆腐、ゆば、豆乳、きな粉のように加工食品として飲食してもよい。本発明のダイズは、非遺伝子組換えダイズとして入手可能であるため、飲食への利用に消費者の抵抗が少ないと期待される。また、本発明のダイズは、オレイン酸を多く含むことから、食品として摂取した場合に血中コレステロールレベルが低下することが期待され、生活習慣病の予防に効果的であると考えられる。又は、このような効果を得るための、サプリメント、健康機能食品、特定保健用食品に本発明のダイズを使用することもできる。
本発明において、「飼料」とは、飼育動物に餌として与えられる物を意味し、「飼育動物」には、家畜、家禽、養魚、ペットなどが含まれる。ダイズは、ウシ、ブタ、ニワトリなどの家畜、家禽用の飼料やペットフードに広く用いられている。本発明のダイズを飼料として摂取させた場合、その高オレイン酸含有量のために血中コレステロールレベルが低下することが期待され、飼育動物の健康維持及び健康増進に貢献すると考えられる。これに加えて、食肉や鶏卵中のオレイン酸含量の増加が期待され、これらを食用とした場合の効果も期待できる。
本発明において、「ダイズ油」とは、ダイズ又はその処理物から採取される油脂を意味する。ダイズ油は、フライ用油やサラダ油に用いられるほかに、マーガリンやマヨネーズの原料として広く用いられている。また、食用以外にも、その透明性の高さを理由に、ダイズインキとしても利用されている。本発明のダイズから抽出されるダイズ油は、その高オレイン酸含有量のために、摂取者の健康増進に寄与するだけでなく、高温で使用した場合にも酸化に対して非常に安定であるという優位的効果を奏する。
また、本発明のダイズから抽出されるダイズ油は、オレイン酸含有率が高いため、血中コレステロールレベルの低下を目的として、医薬品用、食品用又は飼料用の材料として使用することもできる。
本発明において、「燃料」とは、化学反応を起こすことによってエネルギーを発生させるものを意味する。本発明における燃料は、ダイズを原料として生産され得る燃料であれば、特に限定されないが、好ましい例としては、バイオディーゼルが挙げられる。バイオディーゼルとは、生物由来油から作られるディーゼルエンジン用燃料を意味する。従来のダイズのようにリノール酸などの多価不飽和脂肪酸を多く含む原料からバイオディーゼルを調製した場合、加熱によりスラッジが生じやすいという問題がある。しかしながら、本発明のダイズからバイオディーゼルを調製した場合には、一価不飽和脂肪酸のオレイン酸の含有率が高いため、スラッジは生じにくく、酸化に対して安定で高品質なバイオディーゼルが提供されるものと期待される。バイオディーゼル燃料の製造方法及び利用方法については、「バイオディーゼル燃料の製造・利用に係るガイドライン」（全国バイオディーゼル燃料利用推進協議会、２００８年５月３０日発行）に記載される方法を利用できる。
４．品種交雑
本発明のダイズの特徴を有する新種の非遺伝子組換えダイズは、本発明のダイズ種同士、あるいは本発明のダイズ種と他の非遺伝子組換えダイズ種と交雑させることにより作製することができる。このようにして得られたダイズも、オレイン酸を高含量で含有し、また、以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つの特徴を有する。
（ａ）  種子の表皮の皺が野生型と比較して増加しない
（ｂ）  実質的に問題となる量のリノール酸を生成しない
（ｃ）  総貯蔵タンパク質中のβ−コングリシニン含有量が野生型と比較して実質的に低下しない
（ｄ）  総貯蔵タンパク質量が野生型と比較して実質的に低下しない
（ｅ）  稔性が野生型と比較して低下しない
好ましくは、本発明のダイズ種を他の非遺伝子組換えダイズ種と交雑させることにより、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異（及びＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異）を有する新種の非遺伝子組換えダイズを作製することができる。例えば、本発明のダイズ種を、特定の害虫及び／又は栽培条件に耐性を有する他の非遺伝子組換えダイズ種と交雑させることにより、オレイン酸含有量が高く、かつ特定の害虫及び／又は栽培条件に耐性を有する新種の非遺伝子組換えダイズを作製することができる。
本発明において、「交雑」とは、遺伝的組成の異なる２個体間の交雑であって、その結果として雑種が形成されるものを意味する。交雑方法としては、戻し交雑が好ましい。交雑によって得られる新種ダイズにおいて高オレイン酸含有量を実現するためには、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子（及びＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子）がコードするＦＡＤ２の活性をほぼ完全に喪失させる必要があるため、該新種ダイズを本発明のダイズ種と戻し交雑することにより、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子変異（及びＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子変異）のホモ接合体を得る必要がある。「戻し交雑」とは、変異をもった親Ａと持たない親Ｂ（Ｂａｙ及びフクユタカなどの既存のダイズ品種）との間に生まれた子を親Ｂ（Ｂａｙ及びフクユタカなどの既存のダイズ種）と交雑させて、変異型遺伝子を保持し、かつ親Ｂの特性を有する子孫を得る方法である。
５．スクリーニング方法
本発明のダイズは、好ましくは、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子及びＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子に機能欠失型変異を有するので、これらのいずれかの遺伝子（又は両方の遺伝子）の変異を検出することにより、上記オレイン酸高含有ダイズ、あるいは上記（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つの特徴を有するダイズをスクリーニングすることができる。
ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異遺伝子の検出方法としては、
（ａ）  本発明のダイズが有するＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子若しくはＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の変異部位の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ、及び／又は前記遺伝子の塩基配列及びその相補配列の少なくとも一方を増幅したときの増幅断片中に前記変異部位が含まれるように作製されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて被検ダイズのＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子について増幅処理及び／又はハイブリダイゼーション処理を行う工程、及び、
（ｂ）  前記処理物を分析することにより変異部位を検出する工程
を含む、方法が挙げられる。
このような検出方法の具体例としては、ＰＣＲ法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、シーケンス法、マイクロアレイ法などの公知の方法が挙げられ、特に、機能欠失型変異がＳＮＰである場合には、インベーダー法やＴＩＬＬＩＮＧ法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ＰＣＲ法の場合、３’末端部分が変異部位の塩基配列に相補的な配列を有するようなプライマーを作製することが好ましい。このように設計されたプライマーを用いると、鋳型となるサンプルが変異を有する場合には、プライマーが完全に鋳型にハイブリダイズするため、ポリメラーゼ伸長反応が進むが、鋳型が変異を有しない場合には、プライマーの３’末端のヌクレオチドが鋳型とミスマッチを生じるので、伸長反応は起こらない。したがって、このようなプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動などによって分析し、所定のサイズの増幅産物が確認できれば、サンプルである鋳型が変異を有していることになり、増幅産物が存在しない場合には、鋳型が変異を有していないものと判断できる。ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動については、以下を参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ。
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法とは、蛍光標識したアレル特異的オリゴとＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ反応とを利用した方法である（Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１４，１４３（１９９９）；Ｍｏｒｒｉｓ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４，２９３３（１９９６））。
シークエンス法とは、変異を含む領域をＰＣＲにて増幅させ、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒなどを用いてＤＮＡ配列をシークエンスすることで、変異の有無を解析する方法である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
ＤＮＡマイクロアレイは、ヌクレオチドプローブの一端が支持体上にアレイ状に固定されたものであり、ＤＮＡチップ、Ｇｅｎｅチップ、マイクロチップ、ビーズアレイ等を含むものである。ＤＮＡチップなどのＤＮＡマイクロアレイアッセイとしてはＧｅｎｅＣｈｉｐアッセイが挙げられる（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社；米国特許第６，０４５，９９６号、同第５，９２５，５２５号、及び同第５，８５８，６５９号参照）。ＧｅｎｅＣｈｉｐ技術は、チップに貼り付けたオリゴヌクレオチドプローブの小型化高密度マイクロアレイを利用するものである。
インベーダー法とは、ＳＮＰ等の遺伝子多型のそれぞれのアレルに特異的な２種類のレポータープローブ及び１種類のインベーダープローブの鋳型ＤＮＡへのハイブリダイゼーションと、ＤＮＡの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有するＣｌｅａｖａｓｅ酵素によるＤＮＡの切断を組み合わせた方法である（Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１４，１４３−１４９（１９９９）；Ｍｏｒｒｉｓ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４，２９３３（１９９６）；Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，７７８−７８３（１９９３）等）。
ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）法とは、変異導入した突然変異体集団のゲノム中の変異ミスマッチをＰＣＲ増幅とＣＥＬ  Ｉヌクレアーゼ処理によってスクリーニングする方法である。ＴＩＬＬＩＮＧ法によれば、例えば以下のプライマーセットを用いて、サンプル中のＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子のＯＲＦを含む領域のＰＣＲ増幅を行い、そのＰＣＲ産物をＣＥＬ  Ｉヌクレアーゼ処理に付することにより変異の有無を確認できる。
ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の場合：
2010150901.tif 000005
ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の場合：
2010150901.tif 000006
ＣＥＬ  Ｉヌクレアーゼとは、二本鎖ＤＮＡのミスマッチ部分を特異的に切断するエンドヌクレアーゼである。サンプルが、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子に変異を含む場合、上記ＰＣＲ産物にはミスマッチ部分が生じるが、変異を含まない場合には、ミスマッチは生じない。したがって、変異が存在する場合には、ＰＣＲ産物のミスマッチペア部位が切断されることになり、変異が存在しない場合には、ＰＣＲ産物は切断されない。従って、ＣＥＬ  Ｉヌクレアーゼ処理したＰＣＲ産物をアガロース電気泳動などで分析し、核酸配列の長さを比較することにより、変異の有無を容易に確認することができる。ＣＥＬ  Ｉヌクレアーゼの詳細については、以下の文献を参照できる：Ｏｌｅｙｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．２０，４５９７−４６０２（１９９８）。
上記に例示される変異検出方法においては、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異部位を含むように作製されたオリゴヌクレオチドが、プローブ又はプライマーとして使用される。したがって、本発明は、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異部位を含むように作製されたオリゴヌクレオチドも提供する。
インベーダー法によってＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異を検出する場合、用いるプライマー若しくはプローブは、ＳＮＰ部位が当該プライマー若しくはプローブの塩基配列の３’若しくは５’端に存在するように設計し、又は相補配列の３’若しくは５’端に存在するように設計し、又は前２者（プライマー若しくはプローブ、又は相補配列）の３’若しくは５’端から４塩基内、好ましくは２塩基内に存在するように設計する。あるいは、オリゴヌクレオチドの塩基配列全長の中央にＳＮＰが存在するように設計する。「中央」とは、ＳＮＰの塩基よりも５’端に向かう塩基の数と、３’端に向かう塩基の数とがほぼ同数となる中心部の領域をいい、オリゴヌクレオチドの塩基数が奇数の場合は、「中央」は、中心部の５塩基が好ましく、より好ましくは中心部の３塩基、さらに好ましくは最も中心部の１塩基である。また、オリゴヌクレオチドの塩基数が偶数の場合は、「中央」は、中心部の４塩基が好ましく、より好ましくは中心部の２塩基である。
また、本発明のオリゴヌクレオチドをインベーダー法にアレルプローブとして使用する場合、該オリゴヌクレオチドは、前記機能欠失型変異部位を含むＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子配列若しくはＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子、又はその相補配列とハイブリダイズする断片と、ハイブリダイズしない断片（フラップ部分）とが前記機能欠失型変異部位の遺伝子配列又はその相補配列を介して結合したものであることが好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドをサンプル中の核酸分子にハイブリダイズさせる場合、そのハイブリダイゼーション反応は、ストリンジェントな条件下で行われる。
本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは、少なくとも１０塩基となるように設計することが好ましく、より好ましくは１０〜２００塩基、さらに好ましくは１５〜１５０塩基、最も好ましくは１８〜８０塩基である。
このオリゴヌクレオチド配列は、被検遺伝子を検出するためのプローブとして使用することができ、また、フォワード（センス）プライマー及びリバース（アンチセンス）プライマーのどちらに使用してもよい。
以上のように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー又はオリゴヌクレオチドプローブは、公知の手段・方法により化学合成することができるが、一般には、市販の化学合成装置を使用して合成される。
なお、プローブには、予め蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＶＩＣ、Ｒｅｄｍｏｎｄ  Ｄｙｅ等）及び蛍光標識に対するクエンチャーを付加して作業の自動化を図ることも可能である。
６．マイクロアレイ
また、本発明のオリゴヌクレオチドの一端をガラス、シリコン、ゲルなどの支持体に固定することでマイクロアレイを作製することができる。オリゴヌクレオチドのアレイは、例えば固相化学合成法と半導体産業において用いられているフォトリソグラフィー製造技術とを組み合わせた光照射化学合成法（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）により製造される。チップの化学反応部位の境界を明確するためにフォトリソグラフィーマスクを利用し、特定の化学合成工程を行うことによって、アレイの所定の位置にオリゴヌクレオチドプローブが貼り付けられた高密度アレイを構築することができる。
７．キット
また、本発明の別の態様では、本発明のオリゴヌクレオチド及び／又は該オリゴヌクレオチドを用いて作製したマイクロアレイを含む、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異検出用キットが提供される。このようなキットには、本発明のオリゴヌクレオチド又は該オリゴヌクレオチドを用いて作製したマイクロアレイ以外にも、検出反応用の溶液、コントロール用のオリゴヌクレオチド、検出反応に利用する容器、使用説明書などが含まれていてもよい。
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は、本発明の例示を目的とするものであり、本発明を限定するものではない。以下の実施例及び比較例に於ける％表示は質量％である。
【実施例】
【０００６】
［実施例１］
１．植物材料：
材料として使用したダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．）品種は以下の通りである。
（ｉ）「Ｂａｙ」；
（ｉｉ）「オレリッチ５０」；
（ｉｉｉ）「ＢＣ３Ｆ４系統」（「フクユタカ」に「Ｍ２３系統」を戻し交雑することでＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の欠失変異を導入した品種）。
（ｉ）〜（ｉｉｉ）のダイズ品種の種子を０．３％のＥＭＳ水溶液中に１晩浸漬した後、流水中で８時間すすぐことにより得られたダイズＭ１種子を圃場に播種し、常法に従ってＭ１個体を栽培した。稔性を保持していた植物体については個体当たり１粒ずつのＭ２種子を回収し保存した。翌年、保存しておいたＭ２種子を、再度圃場に播種しＭ２個体を栽培した。この際、栽培しているＭ２個体を個体別に系統番号を付け、緑葉からＤＮＡの抽出を行うとともに十分に成熟・乾燥したＭ３種子を個体別に回収し、あわせて−２０℃の冷凍庫中に保存した。
２．ＤＮＡの抽出：
ＤＮＡの抽出は、ＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４３２１−４３２５）を一部改変した方法を用いて行った。具体的には、約１００ｍｇの緑葉を液体窒素中で粉砕し、これに３００μｌの２％ＣＴＡＢ溶液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），１．４Ｍ  ＮａＣｌ，２％ＣＴＡＢ）を加え、６５℃で３０分間保温した後、遠心分離によって植物残渣を沈殿させて上精を回収した。この上精をクロロホルム抽出によって除タンパクし、この抽出物に１ｍｌの１％ＣＴＡＢ溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），１％ＣＴＡＢ）を加え、遠心分離によりＤＮＡ−ＣＴＡＢ複合体を沈殿させた。得られた沈殿を終濃度５μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを含む２００μｌの１Ｍ  ＮａＣｌに溶解した後、３００μｌの２−プロパノールを加え、遠心分離によりＤＮＡを沈殿させた。得られた沈殿を１００μｌの珪藻土懸濁液（５０ｇ／ｌ  珪藻土、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），７ＭグアニジンＨＣｌ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、ＤＮＡを珪藻土に結合させた。珪藻土を７０％エタノール水溶液で２回洗浄した後、１／１０濃度のＴＥバッファー〔１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）〕を用いてＤＮＡを溶出した。
３．突然変異体のスクリーニング：
８個体分を混合したプールＤＮＡを鋳型として、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子に特異的な以下のプライマーセット及びＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応液を調製した。
2010150901.tif 000007
標的遺伝子領域の増幅は、９５℃：３０秒、６５℃：１分、７２℃：２分のサイクルを４０回繰り返すことにより行った。
得られたＰＣＲ産物は９５℃で５分間熱変成した後、２℃／秒の速度で８５℃まで冷却し１分間保温した。その後、０．１℃／秒の速度で２５℃まで冷却し１分間保温し、更に最高速で４℃まで冷却して保温した。
続いて反応バッファー（５ｘ：１  Ｍ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００〕及びＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：３５３３−３５４１（２０００））に従って調製したＣＥＬ  Ｉヌクレアーゼを加え、３７℃で１０分間保温することでミスマッチを持つＤＮＡ断片を切断した。その後、終濃度０．５％のＳＤＳと１ｘ  ＧｅｌＲｅｄ溶液を含む電気泳動用サンプルバッファーを加えて反応を停止させ、１．５％アガロース電気泳動により標的配列に変異が生じた突然変異体を選抜した。
４．突然変異部位の同定：
スクリーニングによって得られた突然変異体のＤＮＡを鋳型とし、スクリーニングに使用した特異的なプライマーセット（配列番号１２及び１３）を用いて、再度ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子のＰＣＲ増幅を行った。
2010150901.tif 000008
ＰＣＲ増幅により得られたＤＮＡ断片の塩基配列をダイレクトシークエンス法によって同定した。
５．同定結果：
ＥＭＳ処理したＢａｙ由来の３６２６系統、オレリッチ５０由来の３３６０系統、フクユタカ×Ｍ２３であるＢＣ３Ｆ４系統に由来する１７８２系統、計８７６８系統のＭ２個体から、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子上に塩基置換を生じた４系統の突然変異体が得られた。このうち２系統ではアミノ酸の変化を伴わないサイレント変異が生じており、残り２系統については塩基置換に伴いアミノ酸の置換が生じていることが明らかになった。このうちＢａｙ由来の突然変異系統「Ｅ０１５Ｂ１２系統」ではＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の塩基配列の第５６５番目の塩基がＡからＣに置換されており、その結果、ＦＡＤ２のアミノ酸配列の第１８９番目のアミノ酸残基が、スレオニンからプロリンへと変化していることが明らかとなった。また、ＢＣ３Ｆ４系統由来の突然変異系統「ＦＨ００ＥＳ０４Ｅ１１系統」ではＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の塩基配列の第３０８番目の塩基がＧからＴに置換されており、その結果、ＦＡＤ２のアミノ酸配列の第１０３番目のアミノ酸残基が、グリシンからバリンへと変化していることが明らかとなった。
６．突然変異遺伝子の評価：
ＦＡＤ２のアミノ酸配列に変化が認められた「Ｅ０１５Ｂ１２系統」及び「ＦＨ００ＥＳ０４Ｅ１１系統」の変異遺伝子については、酵母発現ベクターｐＹＥＳ２／ＣＴにクローニングした。その後、それぞれ野生型ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子（フクユタカ由来）、変異型のＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子（ＢＣ３Ｆ４系統由来）、変異型のＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子（Ｅ０１５Ｂ１２系統及びＦＨ００ＥＳ０４Ｅ１１系統由来）を含む酵母発現ベクターをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＩＮＶＳｃ１株）に導入した株を作製し、２％ガラクトースを含み、かつウラシルを含まないＳＣ培地中にて２０℃で７２時間培養することにより導入遺伝子の発現を誘導した。その後、集菌した組換え酵母細胞並びに突然変異体種子の粉末から、硫酸−メタノール法により脂肪酸メチルエステルを調製し、非特許文献１の記載に従いガスクロマトグラフィーを用いて脂肪酸組成の分析を行った。分析結果を図１〜３に示す。
また、ガスクロマトグラフィーの結果を元に、野生型ＧｍＦＡＤ２−１ｂを含むダイズ、ＧｍＦＡＤ２−１ａ変異型遺伝子を含むダイズ、ＧｍＦＡＤ２−１ｂとＧｍＦＡＤ２−１ａの両変異型遺伝子とを含むダイズについて脂肪酸組成の比較を行った。比較結果を表１に示す。
【表１】
2010150901.tif 000009
脂肪酸組成分析の結果、Ｅ０１５Ｂ１２及びＦＨ００ＥＳ０４Ｅ１１突然変異系統で見出されたアミノ酸置換変異は、著しくＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子産物の酵素活性を低下させることが明らかになった。特に、ＦＨ００ＥＳ０４Ｅ１１系統から単離された変異型ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の産物については、リノール酸を全く合成することが出来ない程度まで酵素活性が低下していることが明らかになった（図１及び表１参照）。
更にＦＨ００ＥＳ０４Ｅ１１系統では、オレイン酸含量が７９．６％にまで増加していることが明らかとなった。この結果は、基準品種のフクユタカ（オレイン酸含有量：２０．３％）にＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の欠失変異を導入したダイズ（ＢＣ３Ｆ４系統（オレイン酸含量：３３．３％））においてオレイン酸含有量が約１３％程度増加した効果と比較した場合、ＢＣ３Ｆ４系統とＦＨ００ＥＳ０４Ｅ１１系統の間には約４６．３％ものオレイン酸含量の増加が認められることから、極めて高い効果が得られたことを示している。
［実施例２］
１．ＧｍＦＡＤ２−１ｂ変異体ダイズ及びＧｍＦＡＤ２−１ａ変異体ダイズの交雑：
実施例１で作製したＥ０１５Ｂ１２系統とＫＫ２１系統とを交雑させることにより、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子及びＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子に機能欠損型変異を有するダイズ「ＫＫ２１  ｘ  Ｂ１２」系統を作製した。具体的には、以下の手順で交雑を行った。
交雑前日の午後に、翌日開花予定のＫＫ２１系統の蕾を開いて、雌しべに傷を付けないように注意しながら全ての雄しべを取り除き、乾燥や外部からの花粉の混入を防ぐために袋がけを行った。交雑当日の午前９時から１１時までにＢ１２系統の開花を確認し、当日開花した直後の花から花粉を取り出し、前日雄しべを除去しておいたＫＫ２１の花の雌しべの先端に花粉を着けた。交雑作業が終了した花については、乾燥と目的外の花粉の混入を防ぐため速やかに袋がけを行い、２日後に袋を除去した。
２．二重変異系統の選抜：
上記交雑によって得られた「ＫＫ２１  ｘ  Ｂ１２」系統のＦ１種子を播種し、発芽した植物体の緑葉から抽出されたＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーを用いて、ＧｍＦＡＤ２−１ａ変異遺伝子及びＧｍＦＡＤ２−１ｂ変異遺伝子のＰＣＲ検出を行った。
ＧｍＦＡＤ２−１ａ変異遺伝子増幅用
2010150901.tif 000010
ＧｍＦＡＤ２−１ｂ変異遺伝子増幅用
2010150901.tif 000011
ＰＣＲ反応の条件は、実施例１の「突然変異体のスクリーニング」と同様である。前述の突然変異体のスクリーニングの手順に従って変異遺伝子の検出を行い、ＫＫ２１およびＢ１２由来の遺伝子をともにヘテロで持つことを確認した。このＦ１個体から得られたＦ２種子についても同様に播種し、発芽した植物体の緑葉から個体別にＤＮＡを抽出して、変異遺伝子の確認を行った。その結果、図４（上段のパネルがＫＫ２１由来の変異型ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子、下段のパネルがＢ１２由来の変異型ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子についての分析結果であり、両方のパネルで分析した試料の順序は対応している）に示す二重変異系統を得た。
３．変異体ダイズの制限酵素切断パターンの確認：
二重突然変異系統の選抜は上記の方法以外にも、ＫＫ２１系統由来のＧｍＦＡＤ２−１ａ及びＢ１２系統又はＥ１１系統由来のＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子を前述の二重変異系統の選抜に使用したプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって増幅した後に、変異配列に特異的な制限酵素切断パターンの変化によって検出することも可能である。具体的には、以下の処理によりそれぞれの系統由来の突然変異遺伝子の検出を行った。
図５において、パネル（Ａ）は、ＫＫ２１由来のＧｍＦＡＤ２−１ａ変異遺伝子をＢｓａＸＩで処理した切断パターンを示しており、野生型の遺伝子は切断されず約１．３ｋｂｐであるのに対し、変異遺伝子は一カ所で切断され約１．０ｋｂｐと０．３ｋｂｐの２本の断片を生じる。パネル（Ｂ）は、Ｅ１１由来のＧｍＦＡＤ２−１ｂ変異遺伝子をＢｓｒ  Ｉで処理した切断パターンを示しており、野生型の遺伝子は切断され約１．０ｋｂｐと０．４ｋｂｐの２本の断片を生じるのに対し、変異遺伝子はこの処理によって切断されず約１．４ｋｂｐである。またパネル（Ｃ）は、Ｂ１２由来のＧｍＦＡＤ２−１ｂ変異遺伝子をＦｏｋＩで処理した切断パターンであり、野生型の遺伝子は切断されず約１．４ｋｂｐであるのに対し、変異遺伝子は約０．７ｋｂｐのバンドを生じることが確認された。
４．変異体ダイズのタンパク質組成分析：
野生型ダイズである「Ｂａｙ」及び「むらゆたか」、並びに変異体ダイズである「ＫＫ２１」、「Ｂ１２」、ＫＫ２１とＢ１２との交雑世代（ＫＫ２１  ｘ  Ｂ１２（２系統））及びＥ１１に含まれるタンパク質の組成をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。具体的には、以下の処理を行った。
電動ミルを用いて粉砕したダイズ種子粉末１０ｍｇに対して、５００ｕｌのサンプルバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），２％  ＳＤＳ，１０％  グリセリン，５％  ２−メルカプトエタノール，０．１％  ブロムフェノールブルー）を加え、１００℃で１０分間加熱した。その後、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上精を常法に従い１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、クマジーブリリアントブルー染色によりポリペプチドのバンドを可視化し、品種間の比較を行った。
図６に示すように、ＫＫ２１、Ｂ１２、ＫＫ２１  ｘ  Ｂ１２及びＥ１１のいずれの変異体系統も、タンパク質の組成において野生型系統（Ｂａｙ及びむらゆたか）と著しい差異は認められなかった。また、ダイズの主要タンパク質であるβ−コングリシニン及びグリシニンの含有量は、変異体系統及び野生型系統において差異が認められなかった（図６）。
５．変異体ダイズの脂肪酸組成分析：
野生型ダイズである「Ｂａｙ」及び「フクユタカ」、並びに変異体ダイズであるＫＫ２１、Ｂ１２、ＫＫ２１  ｘ  Ｂ１２（２系統）及びＥ１１に含まれる脂肪酸の組成をガスクロマトグラフィーで分析した。具体的には、各系統のダイズ種子の粉末から、硫酸−メタノール法により脂肪酸メチルエステルを調製し、非特許文献１の記載に従ってガスクロマトグラフィー分析を行った。分析結果を表２及び図７に示す。
【表２】
2010150901.tif 000012
2010150901.tif 000013
表２に示されるようにＧｍＦＡＤ２−１ｂ及びＧｍＦＡＤ２−１ａの両遺伝子に機能喪失を有するダイズ系統（ＫＫ２１  ｘ  Ｂ１２及びＥ１１）では、オレイン酸含有量が８０％を超えていた。ＫＫ２１  ｘ  Ｂ１２及びＥ１１は、それぞれ異なる作製工程により得られた系統である。従って、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ及びＧｍＦＡＤ２−１ａの両遺伝子が機能喪失している限り、その系統に関係なく、高オレイン酸含有ダイズが得られることが証明された。
また、図７に示すように、変異体及び野生型のダイズにおいて、異なる種類の脂肪酸のピークは検出されなかった。従って、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子若しくはＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子、又はこれら両方の遺伝子の機能を喪失させた場合でも、野生型ダイズと異なる種類の脂肪酸が生成されることはないことが確認された。
６．変異体ダイズの形態観察：
野生型ダイズであるＢａｙ、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子に変異を有するＭ２３、ＫＫ２１及びＢＣ３Ｆ４、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子に変異を有するＢ１２、並びにＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子及びＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の両遺伝子に変異を有するＥ１１について、肉眼にてダイズ種子の形態観察を行った。
ダイズ種子の形態観察の結果、Ｍ２３及びＭ２３由来のＧｍＦＡＤ２−１ａ変異遺伝子を有する系統（ＢＣ３Ｆ４及びＥ１１）では、１個体当たりから収穫されるダイズ種子の総数に対し、皺を有するダイズ種子の比率が高いことが判明した（表３参照）。一方、変異ダイズ系統であっても、Ｍ２３由来のＧｍＦＡＤ２−１ａ変異遺伝子を有しないＫＫ２１及びＢ１２は、皺を有するダイズ種子の比率は、野生種であるＢａｙと同程度であった（表３参照）。
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明のＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異遺伝子をマーカーとして用いることで、高オレイン酸含有ダイズをスクリーニングできる。また、本発明のダイズを用いることにより、オレイン酸含量の高いダイズ油を容易に入手でき、本発明のダイズを他の品種のダイズと交雑させることにより、種子中のオレイン酸含量の高く、さらに別の特性を併せ持つダイズ品種を作製することができる。
受託番号
＜寄託の表示＞
ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１２４８：２０１０年４月２２日で、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託した。
識別の表示：Ｂ１２
ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１２４９：２０１０年４月２２日で、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託した。
識別の表示：ＫＫ２１
【配列表フリーテキスト】
【０００８】
配列番号１：野生型ＧｍＦＡＤ２−１ｂ
配列番号３：変異型ＧｍＦＡＤ２−１ｂ
配列番号５：変異型ＧｍＦＡＤ２−１ｂ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：野生型ＧｍＦＡＤ２−１ａ
配列番号２４：合成ＤＮＡ
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010150901.tif 000049
【図４】
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【図８】
2010150901.tif 000051
【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年4月7日(2011.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ω−６脂肪酸不飽和化酵素をコードするＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子及びＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子に機能欠失型変異が導入された、非遺伝子組換え型オレイン酸高含有ダイズ。
【請求項２】
オレイン酸含有量が、ダイズの総脂肪酸量の７５％以上である、請求項１に記載のダイズ。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つの特徴を有する、請求項１に記載のダイズ。
（ａ）  種子の表皮の皺が野生型と比較して増加しない
（ｂ）  実質的に問題となる量のリノール酸を生成しない
（ｃ）  総貯蔵タンパク質中のβ−コングリシニン含有量が野生型と比較して実質的に低下しない
（ｄ）  総貯蔵タンパク質量が野生型と比較して実質的に低下しない
（ｅ）  稔性が野生型と比較して低下しない
【請求項４】
前記機能欠失型変異が、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異及びヌル変異からなる群から選択されるいずれかの変異である、請求項１に記載のダイズ。
【請求項５】
前記ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異は、ω−６脂肪酸不飽和化酵素のアミノ酸配列のうち、以下の（１）〜（８）からなる群から選択される領域に含まれるアミノ酸残基をコードするコドンに生じた変異である、請求項１に記載のダイズ。
（１）  第５８番目〜第７９番目のアミノ酸残基からなる領域
（２）  第８８番目〜第１０８番目のアミノ酸残基からなる領域
（３）  第１８０番目〜第１９４番目のアミノ酸残基からなる領域
（４）  第２２９番目〜第２５１番目のアミノ酸残基からなる領域
（５）  第２５４番目〜第２７７番目のアミノ酸残基からなる領域
（６）  第１０９番目〜第１１４番目のアミノ酸残基からなる領域
（７）  第１４１番目〜第１４９番目のアミノ酸残基からなる領域
（８）  第３１９番目〜第３２６番目のアミノ酸残基からなる領域
【請求項６】
前記アミノ酸残基が、第１０３番目及び／又は第１８９番目のアミノ酸残基である、請求項５に記載のダイズ。
【請求項７】
前記変異が、第１０３番目及び／又は第１８９番目のアミノ酸残基をコードするコドンのミスセンス変異である、請求項５に記載のダイズ。
【請求項８】
前記第１０３番目のアミノ酸残基をコードするコドンのミスセンス変異が、グリシンのコドンからバリンのコドンへの置換によるものである、請求項７に記載のダイズ。
【請求項９】
前記第１８９番目のアミノ酸残基をコードするコドンのミスセンス変異が、スレオニンのコドンからプロリンのコドンへの置換によるものである、請求項７に記載のダイズ。
【請求項１０】
配列番号３又は５で示される塩基配列からなる遺伝子を有する、請求項５に記載のダイズ。
【請求項１１】
ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異が、Ｍ２３ダイズ又はＫＫ２１ダイズのＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の変異と同一のものであるである、請求項２に記載のダイズ。
【請求項１２】
受領番号がＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１２４９であるＫＫ２１ダイズと受領番号がＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１２４８であるＢ１２ダイズとを交雑させて得られる、非遺伝子組換え型オレイン酸高含有ダイズ。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のダイズ又はその処理物を含む医薬品組成物、食品又は飼料。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のダイズ又はその処理物から抽出されたダイズ油。
【請求項１５】
請求項１４に記載のダイズ油を含む、医薬組成物用、食品用又は飼料用の材料。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のダイズ又はその処理物から生成される燃料。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のダイズ同士、又は当該ダイズと他のダイズ種とを交雑させることを特徴とする、非遺伝子組換え型オレイン酸高含有ダイズの製造方法。
【請求項１８】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群から選ばれるいずれかの工程を含む、非遺伝子組換え型オレイン酸高含有ダイズの製造方法。
（ｉ）  ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の変異を有するダイズ種と、ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の変異を有するダイズ種とを交雑させる工程
（ｉｉ）  ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異を有するダイズ種に、変異誘発剤又はＸ線処理を施してＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異を誘発する工程
（ｉｉｉ）  ＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異を有するダイズ種に、変異誘発剤又はＸ腺処理を施してＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異を誘発する工程
（ｉｖ）  野生型ダイズ種に、変異誘発剤又はＸ線処理を施してＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子及びＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異を誘発する工程
【請求項１９】
非遺伝子組換え型オレイン酸高含有ダイズのスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載のダイズが有するＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子若しくはＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の変異部位の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ、及び／又は前記遺伝子の塩基配列及びその相補配列の少なくとも一方を増幅したときの増幅断片中に前記変異部位が含まれるように作製されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて被検ダイズのＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子について増幅処理及び／又はハイブリダイゼーション処理を行う工程、並びに
（ｂ）前記遺伝子の変異部位を検出する工程
を含む、前記方法。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のダイズが有するＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の変異部位の塩基配列を含むように作製されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドの５’末端若しくは３’末端又は中央の塩基が、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の変異部位となるように作製されたものである、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
１０〜２００塩基の長さを有する、請求項２０又は２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドが支持体に固定されたマイクロアレイ。
【請求項２４】
請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド及び／又は請求項２３に記載のマイクロアレイを含む、ＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子又はＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異検出用キット。
【請求項２５】
ＦＨ００ＥＳ０４Ｅ１１系統と同一のＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異及びＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異を有する、非遺伝子組換え型オレイン酸高含有ダイズ。
【請求項２６】
ＫＫ２１ダイズと同一のＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子の機能欠失型変異及びＢ１２ダイズと同一のＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子の機能欠失型変異を有する、非遺伝子組換え型オレイン酸高含有ダイズ。
【請求項２７】
ω−６脂肪酸不飽和化酵素をコードするＧｍＦＡＤ２−１ｂ遺伝子及びＧｍＦＡＤ２−１ａ遺伝子に機能欠失型変異が導入された、非遺伝子組換え型オレイン酸高含有ダイズ又はその処理物からダイズ油を抽出する工程を含む、ダイズ油の製造方法。
【国際調査報告】
2010150901.tif 000053
2010150901.tif 000054
2010150901.tif 000055
2010150901.tif 000056
2010150901.tif 000057
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