(57)【要約】黴や黄色ブドウ球菌等の増殖を効果的に抑制し、安全かつ食品の風味への影響が少ない、新規菌株を提供することを課題とする。ラクトバチルス・サンフランシスエンシスＷＢ１００６（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＷＢ１００６）（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１２４６）である菌株に関する。また、該菌株を使用した食品に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１２４６菌株。
【請求項２】
以下の（１）から（９）の菌学的性質を有する菌株：
（１）グラム陽性
（２）桿菌
（３）運動性なし
（４）無胞子
（５）通性嫌気性
（６）カタラーゼ陰性
（７）生育温度  １０〜２８℃
（８）生育ｐＨ  ５．５〜９．０
（９）マルトースを資化してＤ（＋）−乳酸、Ｌ（＋）−乳酸、エタノール及び炭酸ガスを生成。
【請求項３】
請求項１または２に記載の菌株の培養物、その含有物またはその凍結乾燥菌末。
【請求項４】
菌株が生菌であることを特徴とする請求項３に記載の培養物、その含有物またはその凍結乾燥菌末。
【請求項５】
請求項１または２に記載の菌株を培地に接種して培養することを特徴とする菌株の培養方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の菌株、培養物、含有物、または凍結乾燥菌末を有効成分として含む、
黴及び黄色ブドウ球菌の増殖を抑制する食品添加物。
【請求項７】
加熱処理を経た後にも黴及び黄色ブドウ球菌の増殖を抑制する、請求項６に記載の食品添加物。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の食品添加物を含む食品。
【請求項９】
菌株により食品材料を発酵させた請求項８に記載の食品。
【請求項１０】
黴及び黄色ブドウ球菌の増殖抑制効果を得るために、
乳酸菌、小麦粉、及び水を含む混合物を発酵させることによる元種の製造方法であって、
前記乳酸菌がグルコース以外の１種類の糖を主に資化し、別の糖を微弱に資化する乳酸菌である製造方法。
【請求項１１】
前記混合物が、さらにイーストを含むものである、請求項１０に記載の元種の製造方法。
【請求項１２】
前記乳酸菌が、１０〜１５℃で生育可能な乳酸菌であることを特徴とする、請求項１１に記載の元種の製造方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法で製造した元種を使用して中種を製造し、次いで最終生地を製造する工程からなる、食品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）菌株、その培養物若しくはその含有物または凍結乾燥菌末、さらには該菌株を使用して得られたパンなどの食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
パンは黴が発生することにより品質が低下し商品価値を失う。一般的に、パンは清潔な環境下で製造されるが、常温下で配送・販売されるため、一部のパンでは防黴剤を添加することも行われている。防黴剤としては、主に酢酸やクエン酸等の酸味料、その他に酢酸ナトリウム等のｐＨ調整剤やプロピオン酸、エタノール等の静菌剤を含有するものが用いられている。これらの添加物により、パン本来の風味とは別に、酸味や酸臭、アルコール臭などが加わってしまうという問題がある。この様な背景と近年の自然派志向の高まりにより、これらの化学防黴剤を避ける傾向があり、長年の使用経験から、微生物のなかでも安全性が高いと考えられる乳酸菌を用い、防黴効果を特徴としたパンの製造がなされている（特許文献１）。【０００３】
この乳酸菌と酵母の発酵による酸味のあるパン生地種をサワー種と言い、これらを利用して作られる有名なものには、アメリカ西海岸のサンフランシスコサワーブレッドやイタリアのパネトーネがあり、これらのサワー種から分離された乳酸菌として、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）等が一般的である（非特許文献１）。さらに新菌種としてラクトバチルス・コモエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｍｏｅｎｓｉｓ）（特許文献２）、ラクトバチルス・アシディファリナリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｆａｒｉｎａｒｉｕｓ）（特許文献３）の報告がある。【０００４】
サワー種の分類に属するパネトーネ種は、イタリアの一部地方でしか培養できないといわれる極めて特殊なパン種である。例えば、ラクトバチルス・コモエンシスは、他の乳酸菌や酵母と共存したパネトーネ種として、現在もイタリア北部の伝承的な技法による種継を毎日行うことで維持されている（特許文献４）。【０００５】
パネトーネ種を用いたパンは、保存料を用いることなく、防黴・防腐効果などを示すことが知られており、これら効果は、パネトーネ種に生息している乳酸菌やその発酵産物などにより付与されることが知られている（特許文献５）。【０００６】
パンなどの飲食品に利用することでカビ発生防止効果を奏する方法として、乳酸菌の菌体および油脂を水性媒体中で反応させて得られる生成物のリパーゼ処理物を利用する方法が知られている（特許文献６）。また、アルコール飲料などでは食品用防菌剤や虫歯予防剤として、ストレプトマイセス・フルビシムス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ  ｆｕｌｖｉｓｓｉｍｕｓ）ＦＥＲＭ  Ｐ−１６３４７の培養物の利用が挙げられ、これが食中毒原因菌である黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・オウレウス、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に対しても増殖抑制効果を有すること示されている（特許文献７）。【０００７】
また、ラクトバチルス・アシドフィルスグループ乳酸菌Ｌ−５５株は、大腸菌、黄色ブドウ球菌、枯草菌、リステリア菌などの細菌に対する抗菌物質産生能を有し、ヨーグルトなどの食品に添加する乳酸菌として一般的に挙げられているが、パンに対する効果については不明である（特許文献８）。【０００８】
伝統的なパネトーネ種は、小麦粉等を用いた培地に、それぞれの地域の気候・風土の中で自然に着生した乳酸菌や酵母等を増殖させたものである。通常、種継ぎにより維持される。このため、地域の気候や風土により、特有の菌叢が構成されたものとなっている。従来、これらのパネトーネ種より特定の乳酸菌を分離・培養し、小麦粉を主とした液状あるいは生地状とした培地に接種、発酵させたものが研究されており（特許文献９、１０）、製品が市販されている。【０００９】
サワー種は複数菌種の乳酸菌と酵母が共存して生育しており人工的には再現しがたい微生物環境を構成することで、その特性を発揮している。これらの種は各々の特定地域・環境でのみ安定な種継ぎが可能なものとされており、地域や扱い方法などが変わることで容易に変化する。また、本来存在しないはずの微生物などが混入・増殖し、種としての機能を失うこともある。【００１０】
サワー種より乳酸菌を分離・純粋培養し、これを種として用いた場合、最初に調製するサワー種の安定性は向上させることができるが、種継ぎを繰り返すと、やはり同様の原因でサワー種の性質が最初とは異なってくるという問題が生じ易い（特許文献１１）。【００１１】
さらに、サワー種用乳酸菌を純粋培養する場合、菌種により、特別な栄養培地を用意しなければならない等の煩雑さがある。例えば代表的なサワー種用乳酸菌であるラクトバチルス・サンフランシスエンシスの栄養培地は数種類知られているが、（１）調製に手間がかかること、（２）培地成分のロット差による培養収量のぶれが大きいこと、（３）増殖量が充分でなく、大量培養に適さないこと、などの問題点が挙げられる。また、パン生地種の製品形態としては、液種や生地種があるが、これらの種は保存状況により、消費期限内であっても性能が一定しないという問題があった。【００１２】
また、食中毒菌として知られている黄色ブドウ球菌は、ヒトの皮膚やその傷口などに棲息している。このため、調理パンなどの調理を手作業で行うような食品が食中毒を引き起こすことが多い。黄色ブドウ球菌による食中毒は、菌が増殖するときに産生される耐熱性の毒素が要因とされている。加熱により菌が死滅しても毒素の活性は失われないため、予防には菌の増殖そのものを抑制することが重要と考えられる。しかしながら、従来、黄色ブドウ球菌の増殖を効果的に抑制する手段は知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００４−０８１２１２号公報
【特許文献２】特開昭６３−１４６７４２号公報
【特許文献３】特開２００３−１６９６８０号公報
【特許文献４】特開昭６３−１１２９７７号公報
【特許文献５】特開２００２−２９１４６６号公報
【特許文献６】国際公開第２００５／１０４８７９号公報
【特許文献７】特開２００２−０００２６１号公報
【特許文献８】特開２００３−２３０３７６号公報
【特許文献９】特開２００６−１５８３８２号公報
【特許文献１０】特開２００７−２４４２７４号公報
【特許文献１１】特開平５−２５２９３７号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】「乳酸菌の科学と技術」、乳酸菌研究集談会編、学会出版センター、１９９６年４月発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
市販の乳酸菌を利用した製パン用製品の防黴効果は必ずしも十分と言えるものではなく、黴等の増殖を効果的に抑制し、安全かつ食品の風味への影響が少ない、新規乳酸菌の探索とその製品開発が強く望まれている。また、乳酸菌の菌種によっては、共存する酵母により防黴効果が変わるとの報告もあり、汎用されている市販酵母を用いても防黴効果に影響しないことも望まれる。よって、防黴効果が十分に期待できる乳酸菌を用いた、長期保存可能な凍結乾燥菌末などを作製し、これを利用した発酵方法によるパン製造法を確立することが重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は上記の問題点に鑑みて為されたものであって、本発明者等が見出した新規なラクトバチルス・サンフランシスエンシスＷＢ１００６（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＷＢ１００６）（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１２４６）である菌株に関するものである。【００１７】
また、本発明は、以下の（１）から（９）の菌学的性質を有する菌株：
（１）グラム陽性
（２）桿菌
（３）運動性なし
（４）無胞子
（５）通性嫌気性
（６）カタラーゼ陰性
（７）生育温度  １０〜２８℃
（８）生育ｐＨ  ５．５〜９．０
（９）マルトースを資化してＤ（＋）−乳酸、Ｌ（＋）−乳酸、エタノール及び炭酸ガスを生成
に関する。【００１８】
本発明は、また、前記菌株の培養物、その含有物または凍結乾燥菌末に関する。前記菌株は生菌であることが好ましい。【００１９】
本発明は、また、前記菌株を培地に接種して培養することを特徴とする菌株の培養方法に関する。【００２０】
本発明は、また、前記培養物、その含有物またはその凍結乾燥菌末を発酵させる工程を有することを特徴とする食品の製造方法および該製造方法により得られた食品に関する。【００２１】
本発明は、また、前記菌株、培養物、含有物、または凍結乾燥菌末を有効成分として含む、黴及び黄色ブドウ球菌の増殖を抑制する食品添加物に関する。【００２２】
前記食品添加物は、加熱を経た後にも黴及び黄色ブドウ球菌の増殖を防止することが好ましい。【００２３】
また、本発明は、前記食品添加物を含む食品に関する。【００２４】
前記食品は、菌株により食品材料を発酵させたものであることが好ましい。【００２５】
また、本発明は、黴及び黄色ブドウ球菌の増殖抑制効果を得るために、乳酸菌、小麦粉、及び水を含む混合物を発酵させることによる元種の製造方法であって、前記乳酸菌がグルコース以外の１種類の糖を主に資化し、別の糖を微弱に資化する乳酸菌である製造方法に関する。【００２６】
前記製造方法において、前記混合物は、さらにイーストを含むものであることが好ましい。【００２７】
前記製造方法において、前記乳酸菌は、１０〜１５℃で生育可能な乳酸菌であることが好ましい。【００２８】
本発明は、また、前記の方法で製造した元種を使用して中種を製造し、次いで最終生地を製造する工程からなる、食品の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明のラクトバチルス・サンフランシスエンシスＷＢ１００６を使用して、食パンなどの食品を製造すると、従来防黴性が確認されているラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）またはラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を使用して製造した食パンと比較して、防黴性や、黄色ブドウ球菌の増殖抑制作用が高く、風味および食感にも優れている。特に、本発明の菌株をパンに配合した場合、パン生地の焼成や調理パンの調理等の加熱処理を経ても、黴及び黄色ブドウ球菌に対する増殖抑制効果が維持されている。よって、本発明の菌株をパン生地に配合すると、高温での焼成・調理等を経て製造されたパンにおいても、黄色ブドウ球菌自体の増殖が抑制され、分解除去が困難な耐熱性毒素の産生を根本的に防止することが可能となる。【００３０】
また、本発明の菌株は、種継ぎ維持の必要がなく、保存も容易である凍結乾燥菌末によって安定な元種を作製することも可能である。これまでイタリア北部の伝統的製法で作られていたパネトーネの特徴である日持ち及び防黴効果を、本発明のラクトバチルス・サンフランシスエンシスＷＢ１００６により、より簡便に再現できることは本発明の菌株の大きな効果である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】比較例１〜２及び実施例１で製造したパンにおけるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの胞子形成箇所数の経時変化を表すグラフである。
【図２】比較例３及び実施例２で製造したパンにおけるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの胞子形成箇所数の経時変化を表すグラフである。
【図３】比較例３及び実施例２で製造したパンにおける黄色ブドウ球菌数の増加率を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（Ｉ）菌株
本発明の菌株であるラクトバチルス・サンフランシスエンシスＷＢ１００６は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７１１として２００８年１０月２９日付で寄託されたものであり、受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１２４６として２０１０年４月８日付で国際寄託に移管されたものである。
【００３３】
本発明のラクトバチルス・サンフランシスエンシスＷＢ１００６は、製パン用のパネトーネ元種中から分離・発見された乳酸菌である。ＷＢ１００６は、パネトーネ元種中に存在している数種の乳酸菌のなかでも優れた防黴性を示す菌株である。従来、パネトーネ独特の風味、食感と長期間の日持ち性は、数種類の乳酸菌が組み合わさることで発揮されると考えられているが、ＷＢ１００６は、単独で用いた場合も、このような効果を発揮する。
【００３４】
本発明のラクトバチルス・サンフランシスエンシスＷＢ１００６の菌学的性質を以下に示す。
（１）グラム陽性
（２）桿菌
（３）運動性なし
（４）無胞子
（５）通性嫌気性
（６）カタラーゼ陰性
（７）生育温度  １０〜２８℃  （至適生育温度  ２５℃）
（８）生育ｐＨ  ５．５〜９．０
（９）マルトースを資化してＤ（＋）−乳酸、Ｌ（＋）−乳酸、エタノール及び炭酸ガスを生成
また、極微弱であるが、培養条件によってはグルコースも資化する。
【００３５】
本発明の菌株は、グラム陽性、無胞子、通性嫌気性、カタラーゼ陰性の桿菌であり、糖から乳酸とエタノールを生成することから、絶対ヘテロ発酵型（ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ  ｈｅｔｅｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ）のラクトバチルス属に属するものと考えられる。
【００３６】
本発明の菌株の培養的性質を以下に示す。
（１）１％マルトース加ＭＲＳ寒天平板培地
コロニーは、２５℃、３〜４日間培養で直径約２〜３ｍｍまたはそれ以下の円形、半レンズ状突起、不透明の灰白色、やや乾燥した形状である。
（２）ＭＹＰ液体培地
２５℃、２４時間培養で菌体が増殖して培地が白濁し、綿毛状の沈殿を生ずる。
（３）ＭＹＰ寒天培地（穿刺培養）
穿刺によって一様に生育する。
【００３７】
本発明の菌株の生理・生化学的性質を以下に示す。
（１）生育温度    １０〜２８℃  （至適生育温度  ２５℃）
（２）生育ｐＨ域    ５．５〜９．０
（３）酸素との関係    通性嫌気性。酸素存在下でも嫌気的条件でも生育できる。
（４）生育必須物質    上記ＭＹＰ液体培地中、マルトース、酵母エキスおよび脂肪酸、特に不飽和脂肪酸を必須要求する。
（５）糖類発酵性
マルトースを資化し、酸およびガスを産生する。
（６）リトマスミルク：不変
（７）硝酸塩の還元：陰性
（８）ゼラチンを液化しない。
（９）ウレアーゼ：陰性
（１０）カタラーゼ：陰性
（１１）でんぷんを加水分解しない。
（１２）マルトースからの生成物：Ｌ（＋）−乳酸、Ｄ（＋）−乳酸、エタノール
【００３８】
本発明の菌株とラクトバチルス・サンフランシスエンシスＪＣＭ５６６８の糖資化性を比較すると、本発明の菌株はマルトースに非常に特化しており、通常の培養条件においては、グルコースをほとんど資化しないという特徴を有する。一方、ラクトバチルス・サンフランシスエンシスＪＣＭ５６６８は、マルトースおよびグルコースを共にする。
【００３９】
本発明の菌株は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析により、ラクトバチルス・サンフランシスエンシスの標準菌株であるラクトバチルス・サンフランシスエンシスＪＣＭ５６６８（ＪＡＰＡＮ  ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ、独立行政法人  理化学研究所）と１５６４ｂｐ中、９７％以上の相同性を示すことが好ましく、９９％以上の相同性を示すことがより好ましい。
【００４０】
本発明では、前記菌株を、培養物、その含有物、または凍結乾燥菌末として使用する。本発明の菌株は、パネトーネ種から入手可能であり、例えばパン製造に用いられるパネトーネ種から公知の方法により単離することができる。例えば、パネトーネ元種を滅菌した生理食塩水に段階的に希釈し、ＭＹＰ寒天培地や１％マルトース加ＭＲＳ寒天培地などの分離用寒天培地（１０ｐｐｍのシクロヘキシミドおよび１０ｐｐｍのアジ化ナトリウムを加えたもの）に塗布し（接種）、培養することによりコロニーを分離して単離することができる。
【００４１】
本発明の菌株であれば、菌株を培地に接種するだけで培養することができる。種継ぎを毎日行わなくても、サワー種の性質が初期の性質を維持できるので、簡単に培養することができる。また、本発明の菌株であれば、特別な栄養培地を用意する必要がないので調製に手間がかからず、そのため培地成分のロット差による培養収率のぶれがなく、大量培養も可能である。ここで、培養に使用する培地には目的に応じて寒天培地及び液体培地を選択することができる。本発明の菌株は、生育の促進のために、その培地に酵母エキスやＴｗｅｅｎ８０を含むことが好ましい。培養温度は１０℃〜２８℃、好ましくは２３℃〜２８℃、より好ましくは２５℃で、増殖可能ｐＨはｐＨ５．５〜９．０、好ましくはｐＨ５．５〜７．０である。培養時間は２〜４日間が好ましい。本発明の菌株の培養温度帯は２８℃以下であって、ラクトバチルス・サンフランシスエンシスＪＣＭ５６６８の培養温度帯３０〜３５℃よりも低く、大規模な保温設備を必要としない点で優れている。本発明の菌株は、単一種で培養することもできるが、他の菌株の増殖に影響を与えないので、複数種の酵母と培養することもできる。他の酵母としては、サッカロマイセス・セルビシエ、サッカロマイセス・イグジグースなどが挙げられる。
【００４２】
菌株の培養物とは、菌株そのものを培養して得られたものである。
【００４３】
菌株の含有物とは、菌株を含む粉状、液状、生地状、もしくは固形状の製品である。
【００４４】
菌株の凍結乾燥菌末とは、急速に凍結させた後に、減圧状態で水分を昇華させて得られた粉末のことである。菌株の凍結温度としては、温度は−５０〜−８０℃が好ましく、減圧時の圧力は１５〜１００Ｐａが好ましい。
【００４５】
菌株は、培養物、その含有物、または凍結乾燥菌末中で、乳酸菌の生育過程で産生される物質（発酵産物）を利用するという観点から、生菌であることが好ましい。
【００４６】
（ＩＩ）菌株の用途（食品添加物）
本発明の菌株、及びその培養物、含有物、及び凍結乾燥菌末を有効成分として配合し、食品添加物を製造することができる。本発明の食品添加物は、食品の製造時及び保存時に、特定の目的をもって添加されるものをいい、後述のパン等の食品に添加されるものであればよく、特に限定されるものではないが、例えば、抗菌剤、抗黴剤が挙げられる。
【００４７】
本発明の食品添加物は、黴及び黄色ブドウ球菌の食品における増殖を抑制する効果を示す。なお、ここで、増殖を抑制するとは、細胞分裂を阻害することをいう。
【００４８】
本発明の食品添加物は幅広い黴に対して増殖抑制効果を示し、アスペルギルス属、ペニシリウム属、アースリニウム属、アクレモニウム属、アルタナリア属、エクソフィアラ属、エピコッカム属、オーレオバシディウム属、カーブラリア属、クラドスポリウム属、ケトミウム属、ゲオトリクム属、スポロスリックス属、トリコデルマ属、トリコフィートン属、ドレクスレラ属、ニグロスポラ属、ニューロスポラ属、ピキア属、ピソマイセス属、フィアロフォラ属、フォーマ属、フサリウム属、ペシロミセス属、ペスタロチオプシス属、ボトリチス属、ムコール属、モナスカス属、モニリエラ属、ユーロチウム属、ロドトルラ属及びワレミア属に属する黴の増殖を抑制する。この中でも、アスペルギルス属、ペニシリウム属に対する増殖抑制効果が高く、特に、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、及びペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）に対しては顕著な増殖抑制効果を示す。また、本発明の食品添加物は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、カンディダ  アルビカンスに対しても強力な増殖抑制効果を示す。
【００４９】
本発明の食品添加物の形態は、特に限定されるものではなく、粉末状、液体状、固体状のいずれであってもよい。また、本発明の食品添加物は、有効成分として本発明の菌株、培養物、含有物、凍結乾燥菌末を含有することを特徴とするが、その他の成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、製造用剤、保存料、酸化防止剤、抗菌剤、抗黴剤等に一般的に含まれるものが挙げられ、特に限定されるものではないが、食品添加物を固体状とする場合、例えば賦形剤、結合剤、製造助剤等が挙げられる。
【００５０】
本発明の食品添加物の黴及び黄色ブドウ球菌に対する増殖効果は、食品を加熱処理した場合でも失われることがない。ここで、加熱処理の具体的方法は特に限定されるものではなく、オーブンによる焼成、加圧条件での加熱、及び湿熱による処理のいずれも行い得る。本発明における加熱処理は品温８０℃以上による加熱を意味し、好ましくは品温９０℃以上による加熱を意味する。
【００５１】
（ＩＩＩ）食品の製造方法
本発明の菌株を使用して、食品を製造することができる。食品としては、特に限定されないが、発酵産物を効率的に生成できる発酵を伴う点で、たとえば、パン、デニッシュ、パネトーネなどの各種ベーカリー製品、ケーキ、ワッフルなどの生菓子製品、マドレーヌ、フィナンシェなどの半生菓子製品、クッキーなど干菓子製品などが好ましい。
【００５２】
パン・菓子類の製法としては、特に限定されないが、製造段階において本発明の菌株の発酵が促進され、食品中で発酵産物が生成・蓄積されることが好ましい。前記菌株、若しくは菌株の含有物を使って全ての製パン法に使用することができるが、たとえば、黴の増殖を抑制する点で、菌株の含有物を配合した中種法がさらに好ましい。
【００５３】
中種法は、具体的には、元種を中種に添加して発酵させた後に、さらにその他の原料を添加し、混捏、成形、発酵して最終生地とした後、焼成、冷却工程を経ることからなる。
【００５４】
本発明において、元種とは、小麦粉、水及び乳酸菌を含む混合物を捏ね上げ、発酵させたものをさす。前記混合物には、さらにイーストが含有されていてもよいが、イーストを含有しない元種においても十分な効果が得られる。なお、本発明において、イーストは特に限定されるものではなく、パン製造に通常使用されるサッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を使用することができる。
【００５５】
元種の製造法としては、特に限定されないが、黴及び黄色ブドウ球菌の増殖を抑制するために、乳酸菌による、発酵産物の良好な生成を促すことが可能な方法であることが好ましい。元種に含まれる、小麦粉に対する水の配合比率は、一般的な製パン法上、小麦粉を１００とした場合に５０〜１２０であることが好ましい。元種に含まれる、小麦粉に対する本発明の菌末の配合比率は、小麦粉を１００とした場合に１〜２であることが、本発明菌による発酵産物が良好に生成されるので好ましい。元種に含まれる、小麦粉に対するイーストの配合比率は、小麦粉を１００とした場合に０．１〜０．２であることが、イーストによる発酵が適度に行なわれ、風味が良いパンが得られるので好ましい。
【００５６】
元種の製造工程は特に限定されるものではないが、前記混合物を捏ね上げる温度としては、乳酸菌の活性を理由として、１８〜３２℃が好ましく、２０〜３０℃がさらに好ましい。前記混合物を捏ね上げた後、発酵させる温度としては、乳酸菌の活性が最大になるので、１８〜３２℃が好ましく、２５〜３０℃がさらに好ましい。混合物を発酵させる湿度としては、生地の表面が乾かないことを理由として、５０〜１００ＲＨ％が好ましく、７０〜８０ＲＨ％がさらに好ましい。混合物を発酵させる時間としては、充分な菌数の増殖を理由として、８〜４８時間が好ましく、１２〜２４時間がさらに好ましい。
【００５７】
元種を発酵させる乳酸菌としては、菌学的性質として、グルコース以外の１種類の糖を主に資化し、前記と異なる糖であって、グルコースを含む糖を微弱に資化する性質を有する乳酸菌であることが、発酵食品を製造する上でイーストなどの酵母と栄養を奪い合わずに十分な効果を得られる点で好ましい。さらに、前記乳酸菌としては、菌学的性質として、生育温度範囲として１０〜１５℃で生育する性質を有する乳酸菌が、保存安定性効果を示す発酵産物を得るために好ましい。前記乳酸菌として、マルトースを主に資化し、グルコースを微弱に資化する性質を有する乳酸菌がより好ましく、ラクトバチルス・サンフランシスエンシスＷＢ１００６株であることが特に好ましい。なお、マルトースを主に資化し、グルコースを微弱に資化する性質とは、主要な炭素源としてマルトースを必要とし、グルコースが欠乏しても生育にほとんど影響がない性質をいう。具体的には、マルトース含有培地で培養を開始した２４時間後に容易に増殖が確認でき、グルコース含有培地で培養を開始した４８時間以降に、遠心集菌により目視でわずかに増殖が確認できるような性質を指す。
【００５８】
中種の製造方法、及び元種を中種に添加して発酵させる方法は、特に限定されるものではなく、一般的な製パン法で言われる中種法を採用することができる。元種を中種に添加して発酵させた後に添加するその他の原料は特に限定されるものではなく、例えば、食塩、砂糖、脱脂粉乳、ショートニング、水、製パン改良剤、乳製品など、パン製造に通常使用される原料が挙げられる。混捏、分割、成形、発酵、焼成、冷却は、特定の方法により行う必要はなく、一般的な製パン法で言われる中種法で行うことができる。
【００５９】
本発明の菌株を凍結乾燥菌末として調製し、パン種として使用する場合、培養には前述のＭＹＰ液体培地を用いることができる。このＭＹＰ液体培地を用いて得られた凍結乾燥菌末は、安定性が良好である。また、ＭＹＰ液体培地の培養液は、製パン時の液種としても使用できる。その際、菌液は、１０〜２０％スキムミルク液に懸濁することで安定性が向上する。
【実施例】
【００６０】
以下に、実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。【００６１】
１．ラクトバチルス・サンフランシスエンシスＷＢ１００６の分離方法
パン製造に用いられるパネトーネ元種を滅菌した生理食塩水に段階的に希釈し、ＭＹＰ寒天培地や１％マルトース添加ＭＲＳ寒天培地などの分離用寒天培地（１０ｐｐｍのシクロヘキシミドおよび１０ｐｐｍのアジ化ナトリウムを加えたもの）に塗布し、培養することにより分離した。培養条件は２５℃で、２〜４日間培養し形成したコロニーを分離した。【００６２】
２．菌学的性質の同定
ラクトバチルス・サンフランシスエンシスＷＢ１００６の形態的性質をＭＹＰ液体培地により、同定した。ＭＹＰ液体培地はマルトース  １０ｇ、酵母エキス  ５ｇ、ペプトン  １ｇ、酢酸ナトリウム  １ｇ、グルタミン酸ナトリウム  １ｇ、硫酸マグネシウム  ２００ｍｇ、硫酸マンガン  ２０ｍｇ、硫酸第一鉄  １０ｍｇ、塩化ナトリウム  １０ｍｇ、Ｔｗｅｅｎ８０  ０．２５ｇを水  １０００ｍｌに加え、１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ６．６に調整したものを使用した。【００６３】
ＭＹＰ液体培地での２４時間培養において、１．０〜５．０×０．４μｍの長桿菌であり、単一または連鎖状に存在した。胞子は形成せず、非運動性で、グラム陽性であった。各種菌学的特性の同定は、「乳酸菌実験マニュアル」（朝倉書店）に従い、また、分類同定の基準としてバージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）Ｖｏｌ．２（１９８６）を参照した。得られた菌学的性質を以下に示す。【００６４】
（１）グラム陽性
（２）桿菌
（３）運動性なし
（４）無胞子
（５）通性嫌気性
（６）カタラーゼ陰性
（７）生育温度  １０〜２８℃  （至適生育温度  ２５℃）
（８）生育ｐＨ  ５．５〜９．０
（９）マルトースを資化してＤ（＋）−乳酸、Ｌ（＋）−乳酸、エタノール及び炭酸ガスを生成する。
また、極微弱であるが、培養条件によってはグルコースも資化した。【００６５】
３．培養的性質の同定
本発明のラクトバチルス・サンフランシスエンシスＷＢ１００６の培養的性質を、（１）から（３）の各培地で調べた。
（１）１％マルトース加ＭＲＳ寒天平板培地
上記培地はＤｉｆｃｏ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ  ｂｒｏｔｈ  １０００ｍｌにさらにマルトース１０ｇおよび寒天１５ｇを添加されてなる培地である。コロニーは、２５℃、３−４日間培養で直径約２〜３ｍｍまたはそれ以下の円形、半レンズ状突起、不透明の灰白色、やや乾燥した形状であった。
（２）ＭＹＰ液体培地
２５℃、２４時間培養で菌体が増殖して培地が白濁し、綿毛状の沈殿を生じた。
（３）ＭＹＰ寒天培地（穿刺培養）
ＭＹＰ寒天培地はＭＹＰ液体培地１０００ｍｌにさらに寒天１５ｇを添加されてなる培地である。穿刺によって一様に生育した。【００６６】
４．生理・生化学的性質の同定
各種菌学的性質の同定は、「乳酸菌実験マニュアル」（朝倉書店）に従って行った。得られた生理・生化学的性質を以下に示す。【００６７】
本発明の菌株の生理・生化学的性質を以下に示す。
（１）生育温度  １０〜２８℃  （至適生育温度  ２５℃）
（２）生育ｐＨ域  ５．５〜９．０
（３）酸素との関係
通性嫌気性。酸素存在下でも嫌気的条件でも生育できる。
（４）生育必須物質
上記ＭＹＰ液体培地中、マルトース、酵母エキスおよび脂肪酸、特に不飽和脂肪酸を必須要求する。
（５）糖類発酵性
マルトースを資化し、酸およびガスを産生する。
（６）リトマスミルク：不変
（７）硝酸塩の還元：陰性
（８）ゼラチンを液化しない。
（９）ウレアーゼ：陰性
（１０）カタラーゼ：陰性
（１１）でんぷんを加水分解しない。
（１２）マルトースからの生成物：Ｌ（＋）−乳酸、Ｄ（＋）−乳酸、エタノール【００６８】
５．遺伝学的解析
本発明のラクトバチルス・サンフランシスエンシスＷＢ１００６の遺伝子学的解析を次のように行った。ラクトバチルス・サンフランシスエンシスＷＢ１００６の分類学的位置を確認する為に、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列データと既知種の配列データとを比較した。ＤＮＡの抽出は、ＭＹＰ液体培地で、２５℃、２４時間培養した菌液を定法に従って抽出した。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析の結果より、ラクトバチルス・サンフランシスエンシスの標準菌株であるラクトバチルス・サンフランシスエンシスＪＣＭ５６６８（ＪＡＰＡＮ  ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ、独立行政法人  理化学研究所）と１５６４ｂｐ中９９．７％の相同性を示した。【００６９】
６．ラクトバチルス・サンフランシスエンシスＷＢ１００６と標準菌株の比較
本発明の菌株とラクトバチルス・サンフランシスエンシスＪＣＭ５６６８の糖資化性を比較したところ、本発明菌は炭素源としてマルトースに非常に特化しており通常の培養条件においては、グルコースをほとんど資化しなかった。一方、ラクトバチルス・サンフランシスエンシスＪＣＭ５６６８は、マルトースおよびグルコースを共に資化した。また、本発明の菌株の培養温度帯も低く、生育温度は２８℃以下であり、特に２５℃にて良好な生育を示すが、ラクトバチルス・サンフランシスエンシスＪＣＭ５６６８の至適生育温度は、３０〜３５℃であった。よって、公知の菌株と比較すると一致しないので本発明の菌株は新規なラクトバチルス・サンフランシスエンシスＷＢ１００６と命名した。【００７０】
実施例１（パンの製造）
ＭＹＰ液体培地には、マルトースは和光純薬工業株式会社製の「マルトース一水和物」、酵母エキスはＤｉｆｃｏ社製の「酵母エキス（Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）」、ペプトンはＤｉｆｃｏ社製の「ペプトン（Ｐｅｐｔｏｎｅ，Ｂａｃｔｏ  ＴＭ）」、酢酸ナトリウムは和光純薬工業株式会社製の「酢酸ナトリウム三水和物」、グルタミン酸ナトリウムは和光純薬工業株式会社製の「Ｌ−グルタミン酸一ナトリウム」、硫酸マグネシウムは和光純薬工業株式会社製の「硫酸マグネシウム七水和物」、硫酸マンガンは和光純薬工業株式会社製の「硫酸マンガン（ＩＩ）  四水和物」、硫酸第一鉄は和光純薬工業株式会社製の「硫酸鉄（ＩＩ）  七水和物」、塩化ナトリウムは和光純薬工業株式会社製の「塩化ナトリウム」、Ｔｗｅｅｎ８０は和光純薬工業株式会社製の「ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート」を使用した。【００７１】
また製パンには、小麦粉は日本製粉株式会社製の「イーグル」、イーストはオリエンタル酵母株式会社の「ＵＳイースト」、食塩は財団法人塩事業センター製の「食塩」、砂糖は三井製糖株式会社製の「グラニュー糖ＧＨＣ１」、脱脂粉乳はジェイティフーズ株式会社製の「ミルファイン」、ショートニングは株式会社ＡＤＥＫＡ製の「プレミアムショートＣＦ」、製パン改良剤はオリエンタル酵母株式会社の「ドーナチュラルＧＦ」を使用した。【００７２】
パンの製造は、中種法で行った。下記表１に示す配合割合で原料を混合し、この混合物を２４℃にて捏ね上げ、２８℃、７５ＲＨ％で１２時間発酵させ、元種とした。【００７３】
【表１】
2010119874.tif 000002
【００７４】
次に、上記の元種と表２記載の原料とを混合し、中種を調製した。ミキシング条件は、低速３分・中速１分（Ｌ３Ｍ１）であり、２４℃で捏上した後、２８℃、７５ＲＨ％で４時間発酵させた。【００７５】
【表２】
2010119874.tif 000003
【００７６】
前記中種を用い、表３に示す配合割合で原材料を混合、本捏後、フロアータイム２０分後に分割重量２２０ｇで生地を分割し、ベンチタイム２０分後に成形後、２斤食パン型に生地６個型詰めし、ホイロ発酵（３５℃、７５ＲＨ％、６０分）、焼成（上火２００℃、下火２３０℃、３２分）を行い、食パンを製造した。本捏のミキシング条件は、低速３分・中速３分・高速１分・ショートニング添加後低速２分、中速２分、高速１分であり、２６℃で捏ね上げた。【００７７】
【表３】
2010119874.tif 000004
【００７８】
比較例１（パンの製造）
実施例１において、元種に含まれる本発明の菌株を全く加えない以外は、実施例１と同様の方法でパンを作製した。【００７９】
比較例２（パンの製造）
実施例１において、元種に本発明の菌株ではなく、Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ  ＪＣＭ５６６８（標準株）を使用した以外は、実施例１と同様の方法でパンを作製した。【００８０】
試験例１（乳酸菌を配合するパンの防黴性の評価）
［試験方法］
実施例１及び比較例１〜２で得られたパンを用いて、黴の強制汚染試験を行った。黴としては、著名なＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（以下、Ａ．ｎｉｇｅｒと略す。）を試験菌株とした。各食パンをスライスし、４０箇所に約５０胞子ずつ植菌し、胞子の形成が確認された箇所を数え、胞子形成に要した日数を測定した。比較例１〜２は、汚染約３日後から黴の胞子形成が確認された。しかし、本発明の菌株を使用した食パンである実施例は、汚染約３５日後においても、黴の胞子形成が確認されなかった。試験結果を表４及び図１に示した。【００８１】
よって、試験例より、本発明の菌株をパンに種として用いることにより、従来よりも高い防黴効果が得られることが証明された。【００８２】
【表４】
2010119874.tif 000005
【００８３】
実施例２（パンの製造）
実施例２は、実施例１と同様にＭＹＰ液体培地及び製パン材料を用いた。パンの製造方法は、中種法を用いた。下記表５に示す配合割合で原料を混合し、この混合物を２４℃にて捏ね上げ、２８℃、７５ＲＨ％で１２時間発酵させ、元種とした。【００８４】
【表５】
2010119874.tif 000006
【００８５】
次に、上記表５の元種と表６記載の原料とを混合し、中種を調製した。ミキシング条件は、低速３分であり、２４℃で捏上後、２８℃、７５ＲＨ％で４時間発酵させた。【００８６】
【表６】
2010119874.tif 000007
【００８７】
表６に示した中種を用い、下記表７に示す配合割合で原料を混合し、本捏を実施した。本捏後に分割重量２２０ｇで生地を分割し、ベンチタイム２０分後に成形後、型詰めし、ホイロ発酵（３５℃、７５ＲＨ％、６０分）、焼成（下火１７５℃、上火２００℃、２０分）を行い、食パンを製造した。本捏のミキシング条件は、低速３分・中速２分・ショートニング添加後低速２分・中速１分で、２６℃で捏上げた。【００８８】
【表７】
2010119874.tif 000008
【００８９】
比較例３（パンの製造）
実施例２において、元種に含まれる本発明の菌株を全く加えない以外は、実施例２と同様の方法でパンを作製した。【００９０】
試験例２（乳酸菌を配合するパンの防黴性の評価）
実施例２および比較例３で得られたパンを用いて、黴の強制汚染試験を行った。黴としては、著名なＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（以下、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍと略す）を試験菌株とし、試験例１と同様の方法にて防黴性を評価した。比較例３は、汚染約３日後から黴の胞子形成が確認され、全ての接種箇所より胞子形成が確認できた。実施例２は、汚染約６日後に胞子形成が確認され、７〜１０日後も一部の箇所より胞子形成が確認できた。実施例２は、比較例３に比べて、汚染箇所が増加する傾向は非常にゆるやかであった。試験結果を表８及び図２に示す。【００９１】
【表８】
2010119874.tif 000009
【００９２】
次に、本発明の菌株を配合した実施例２で製造したパン、及び菌株を配合しなかった比較例３で製造したパンを用い、食中毒菌として知られている黄色ブドウ球菌の増殖抑制作用を検討した。【００９３】
試験例３（乳酸菌を配合するパンの黄色ブドウ球菌の増殖抑制作用）
［試験方法］
黄色ブドウ球菌として、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＪＣＭ２４１３  （以下、黄色ブドウ球菌と略す）を試験菌株として用いた。【００９４】
前述の比較例３及び実施例２の各食パンをスライスし、食パン内部を２．５ｃｍ×２．５ｃｍ  角にカットし（２．５〜２．８ｇ／サンプル）、約１０００個／５００μＬ／サンプルの黄色ブドウ球菌を接種した。試験菌を接種したパンは密閉容器にて、３５℃、２４時間培養した。培養後、サンプルをＰＢＳ（−）にて懸濁し、ブドウ球菌分離用培地（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｎｏ．１１０、日水製薬）にて、生菌数を測定し、乳酸菌無添加パン（比較例３）における増殖を１００％とした場合の本発明菌配合パン（実施例２）における増殖割合を比較した。結果を表９および図３に示した。表中の黄色ブドウ球菌数は、ｎ＝４で試験を行い、その平均値を示す。【００９５】
【表９】
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【００９６】
比較例３において黄色ブドウ球菌は、３×１０８個／サンプルに増殖していた。本発明の菌株を配合したパンである実施例２においては、黄色ブドウ球菌は２．０×１０６  個／サンプルであり、比較例３に対して、増加率は１００分の１以下であった。上記試験より、本発明の菌株をパンに配合することで、黄色ブドウ球菌の増殖が抑制されることが証明された。【００９７】
また、試験例１−３から、本発明の菌株を中種に配合した場合、焼成によりパンを製造した後であっても、黴及び黄色ブドウ球菌に対する増殖抑制効果を有していることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
黴だけでなく黄色ブドウ球菌など細菌の増殖を効果的に抑制することができ、安全かつ食品の風味への影響が少なく、保存安定性に優れた効果を持つ凍結乾燥菌末として用いることができ、誰もが簡便に安定したサワー種およびパンなどの食品を製造できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年10月5日(2011.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
本発明の食品添加物は幅広い黴に対して増殖抑制効果を示し、アスペルギルス属、ペニシリウム属、アースリニウム属、アクレモニウム属、アルタナリア属、エクソフィアラ属、エピコッカム属、オーレオバシディウム属、カーブラリア属、クラドスポリウム属、ケトミウム属、ゲオトリクム属、スポロスリックス属、トリコデルマ属、トリコフィートン属、ドレクスレラ属、ニグロスポラ属、ニューロスポラ属、ピキア属、ピソマイセス属、フィアロフォラ属、フォーマ属、フサリウム属、ペシロミセス属、ペスタロチオプシス属、ボトリチス属、ムコール属、モナスカス属、モニリエラ属、ユーロチウム属、ロドトルラ属及びワレミア属に属する黴の増殖を抑制する。この中でも、アスペルギルス属、ペニシリウム属に対する増殖抑制効果が高く、特に、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、及びペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)に対しては顕著な増殖抑制効果を示す。また、本発明の食品添加物は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)に対しても強力な増殖抑制効果を示す。
【国際調査報告】
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