(57)【要約】  反応開始時からの測定を可能とする参照電極、測定電極および試料溶液導入部の位置関係を規定した電位差式酵素センサチップを提供し、さらに、反応開始時点を検出する方法を提供する。微量な試料を高精度に測定する。微量な試料をレート法により測定する。参照電極１０３を試料導入部１０２と測定電極１０４の間に配置すると、測定電極１０４より先に参照電極１０３に試料液が達するため、測定電極１０４に試料液が到達し試薬を溶解し反応が開始すると同時に測定電極１０４の表面電位の計測が可能となる。また、このときの電圧計１０６で観測される電圧の非連続的な変化を検出することで、測定電極１０４への試料液の到達を検知することができる。
2010052867.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を導入させる試料導入部と、前記試料を接触させる参照電極と、
測定試薬を有し、前記試料に接触させて前記参照電極との間の電位差を測定させる測定電極とを有するセンサチップであって、
前記参照電極と前記測定電極は、導入される前記試料が、前記参照電極の方が前記測定電極よりも先に到達するように配置されていることを特徴とするセンサチップ。
【請求項２】
請求項１に記載のセンサチップにおいて、前記参照電極と前記測定電極は、前記試料導入部から続く流路に配置されていることを特徴とするセンサチップ。
【請求項３】
請求項１に記載のセンサチップにおいて、さらに、前記参照電極と前記測定電極との間の電位差を測定する電圧計もしくは電界効果トランジスタを有することを特徴とするセンサチップ。
【請求項４】
請求項２に記載のセンサチップにおいて、前記参照電極と前記測定電極との間隔は、前記参照電極の大きさよりも離れて配置されていることを特徴とするセンサチップ。
【請求項５】
請求項１に記載のセンサチップにおいて、前記測定電極の測定試薬を一部又は全部を含まない試薬を備え、導入される前記試料に接触させて前記参照電極との間の電位差を測定するブランク電極を有することを特徴とするセンサチップ。
【請求項６】
請求項５に記載のセンサチップにおいて、前記ブランク電極は、前記参照電極と前記測定電極との間に配置されていることを特徴とするセンサチップ。
【請求項７】
請求項５に記載のセンサチップにおいて、前記試料導入部から続く流路から分岐した前記測定電極が配置された第１の流路と前記ブランク電極が配置された第２の流路とを有することを特徴とするセンサチップ。
【請求項８】
請求項５に記載のセンサチップにおいて、前記測定電極は前記測定試薬の異なる複数の測定電極であって、それぞれの測定電極に対し、前記試料導入部から続く流路から分岐した別の流路を設けたことを特徴とするセンサチップ。
【請求項９】
請求項１に記載のセンサチップにおいて、前記試料導入部から続く流路から分岐した前記参照電極が配置された第１の流路と前記測定電極が配置された第２の流路とを有することを特徴とするセンサチップ。
【請求項１０】
参照電極と、導入される試料と反応する測定試薬を有する測定電極とを備えたセンサチップ用い、前記参照電極と前記測定電極との間の電位差を測定する電位差測定方法であって、
前記試料を導入し、
前記試料を前記参照電極に接触させ、
前記参照電極に接触させた後、前記試料を前記測定電極に接触させ、
前記電位差の非連続的変化から連続的変化に移行する時点を検出し、
予め作成した前記試料の電位差と濃度との関係データを用い、検出された前記時点からの前記電位差の変化から、前記試料の濃度を求めることを特徴とする電位差測定方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の電位差測定方法において、前記非連続的変化と前記連続的変化を、前記電位差の時間変化を微分又は二次微分して検出することを特徴とする電位差測定方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の電位差測定方法において、
前記センサチップを測定装置に装着してから前記試料を導入し、
前記試料の濃度を求めた後に、前記測定装置に前記濃度を表示することを特徴とする電位差測定方法。
【請求項１３】
試料を接触させるセンサチップと、前記センサチップを装着させて前記試料の濃度を測定する測定装置を有する測定キットであって、
前記センサチップは、試料導入部と、前記試料を接触させる参照電極と、測定試薬を有し前記試料に接触させる測定電極と、前記参照電極と前記測定電極の電位を測定させる第１の端子を備え、前記参照電極と前記測定電極は、導入される前記試料が、前記参照電極の方が前記測定電極よりも先に到達するように配置されており、
前記測定装置は、前記センサチップの挿入口と、前記第１の端子からの電圧を検出する第２の端子と、前記試料の電位と濃度との関係データを備えたメモリと、前記第２の端子から検出された電圧を測定し、前記参照電極と前記測定電極との電位差の非連続的変化時点を検出し、検出された時点からの前記電位差の変化から前記試料の濃度を計算する計算処理部と、前記計算処理部にて求められた濃度を表示する表示部とを備えたことを特徴とする測定キット。
【請求項１４】
請求項１３の測定キットであって、前記測定装置は、前記センサチップの装着を検出する装着検出部を有し、前記計算処理部は、前記装着検出部による装着検出により電位の測定を開始することを特徴とする測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質を酵素等を用いて選択的に酸化還元反応させ、その際生じる表面電位を測定することにより、生体物質を高感度に測定することのできるセンサ、測定方法、及び測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
健康状態の把握と病気の早期発見を目的とし、健康診断において血液検査は広く行われている。その際、多数の検体を多項目にわたって分析するため、検体を総合病院や検査センターに集積し、単位時間当たりの検体処理能力の高い大型の生化学自動分析装置を用いて血液検査を行う。そのため、検体の運搬や検査待機の時間や検査結果集計・送付に要する時間を考慮すると、検体の採取から結果が出るまでには通常数日を要する。健康診断の場合、多くは半年や一年に一回といった頻度のためこの時間差は問題とならない。しかし、術中検査などの緊急検査、外来患者に対する検査、救急車内での検査、診療所での検査、自己血糖測定などの在宅での自己検査のような検体を採取したその場で検査結果が必要ないわゆるポイント・オブ・ケア・テスティング（POCT）に於いては、前記の生化学自動分析装置を用いた検査では検査の即時性に対応できない。その上、生化学自動分析装置は高価である上に専門の技師が操作を行う必要があるため、それぞれの現場に生化学自動分析装置を導入することは現実的ではない。POCTに必要とされる装置は、検査項目やスループットは生化学自動分析装置に及ばずとも、それぞれの現場に導入するためにより安価で、それぞれの現場に持ち運びできるためにより小型で、専門の技師でなくても操作が可能な装置である。【０００３】
POCT向けの検査装置で求められている検査項目は、従来の血液検査でも測定されている血中電解質のナトリウム、カリウム、塩素や、酸素分圧、炭酸ガス分圧、クレアチニン、アルカリフォスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、尿素窒素、乳酸脱水素酵素(LD)、ガンマ・グルタミルトランスフェラーゼ、コレステロール、ビリルビン、コリンエステラーゼ、中性脂肪、グルコース、ヘマトクリット等である。これらのうち、電解質とヘマトクリット以外の項目は、酵素反応などの化学反応を用いて測定するのが一般的である。現在市販されているPOCT向けの検査装置に適用されている酵素反応を用いた測定法は、呈色反応法と酸化還元電流法（酵素電極法）に分類できる。呈色反応法は生化学自動分析装置でも用いられているため、この測定法を用いたPOCT装置は開発が比較的容易である。しかし、呈色反応法には光学系が必須であるため、多項目を測定可能な装置では、装置は卓上サイズ程度となる。一方、酸化還元電流法は光学系を必要としない電気的な測定方法であるため、多項目を測定可能な装置であっても、手のひらサイズと小型にすることができる。【０００４】
酸化還元電流法では、金や白金などでできた作用電極と対向電極、作用電極の電位を一定に保つための参照電極の３つの電極が溶液中に配置され、溶液中には酵素と酸化還元物質が共存する。作用電極、対向電極、参照電極は、ポテンショスタットのような電流測定装置に接続され、作用電極と対向電極間に電圧を印加した際に変化する電流値を測定できるようになっている。溶液中に測定対象物質を含む試料（例えば、血液）が添加されると酵素の働きにより測定対象が酸化され、同時に酸化状態の酸化還元物質が還元される。作用電極に酸化還元物質を酸化可能な一定電圧を印加しておくと、還元状態の酸化還元物質は作用電極上で酸化され、作用電極に電流が流れる。酸化された酸化還元物質は再び酵素の働きで測定対象物質と反応し還元状態になる。この反応が繰り返されることで、酵素による測定対象物質の酸化反応を電流として検出することができる。その際、測定対象物質の濃度に応じた電流値が得られるように、すなわち反応系において測定対象濃度が反応律速となるように、十分な濃度の酸化還元物質、十分な大きさの作用電極が必要である。また、溶液の電気抵抗による電圧降下を最小限に抑えるため、対向電極と作用電極はなるべく近くに置くことが望ましい。さらに、構成を簡素化するために参照電極と対向電極をそれらの電極の役割を兼ね備えた一つの電極にすることもあり、その場合、対向電極での電圧の損失を最小にするためなるべく大きな対向電極を用いることが望ましい。【０００５】
血糖値を測定するグルコースセンサでは、必要とされる測定感度はそれほど高くないため、数滴の血液量で測定可能である(例えば特許文献１)。しかし、一般的な測定項目を有するPOCT向け検査装置では、測定感度を維持するためにより多くの血液量が必要である。例えば、POCT向け検査装置として開発されたi-Stat（非特許文献１）は、65μl程度の血液量を必要としていた。電極面積を小さくすることによって血液量を減らすことができるが、酸化還元電流法では電極面積を小さくすると信号(すなわち、電流値)が減少するため、単純に電極面積を小さくすることは困難であった。【０００６】
信号が電極面積に依存しない電気的測定法として、電位差計測法が知られている。電位差計測法は、金や白金などでできた測定電極(作用電極)と参照電極で構成され、測定溶液中に酵素と酸化還元物質が存在する(特許文献２)。また、測定電極と参照電極は、電圧計などの電圧を測定する装置に接続されている。測定溶液中に測定対象物質が添加されると、酵素反応により測定対象物質が酸化され、同時に酸化状態の酸化還元物質が還元される。その際に生じる測定電極の表面電位は次のネルンストの式に従う。【０００７】
【数１】
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【０００８】
上式には電極の面積が含まれず、表面電位は電極面積に依存しない。そのため、信号強度を減少させずに電極面積を小さくし、必要な検体の量を低減することができる。また、参照電極と測定電極との距離が、電流方式における電圧降下の問題とのように、測定精度に影響を及ぼすことは無い。【０００９】
酸化還元電流法と電位差計測法の違いは、信号の電極面積への依存性だけでなく、信号が酵素反応の反応速度依存か反応量依存かの違いもある。すなわち、酸化還元電流法では酵素反応の反応速度に比例した信号が得られるのに対し、電位差計測法では酵素反応により生成した還元物質(もしくは酸化物質)の量に依存した信号が得られる。そのため、酸化還元電流法では酵素反応の反応速度を測定するレート法しか用いることができないが、電位差計測法ではレート法に加えて反応産物総量を測定するエンドポイント法を用いることができる。酵素はその特性として基質が低濃度の領域では反応速度は基質濃度に比例するが、基質が高濃度になると反応速度が基質濃度に比例しなくなり更に高濃度になると一定となる。この境界の濃度をミカエリス定数と言うが、血中の測定対象物質濃度がミカエリス定数以上の場合、レート法による測定では試料を希釈して測定しなくてはならず、測定に必要な操作が複雑となる。一方、エンドポイント法では反応産物総量を測定するためこのような制約はなく、無希釈での測定が可能である。このような酵素の一つにコレステロール脱水素酵素があり、電位差計測法は原理的にコレステロールを無希釈で測定できる方法と言える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平2-245650号公報
【特許文献２】特表平9-500727号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Clin. Chem. 39/2 (1993), p.283-287
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記のような優位性を持つ電位差計測法を用いてチップ状の酵素センサの研究開発を行ったところ、酵素反応開始時点から電圧変化を測定することが精度向上において重要であるにもかかわらず、特許文献２のような電位差式酵素センサチップでは、参照電極と測定電極の試料溶液導入部に対する位置関係が規定されておらず、溶液の導入方法によっては反応開始時点から測定を開始することができないことが明らかとなった。その上、化学反応開始を検出する方法や試料液導入を検出する方法も知られていなかった。【００１３】
これに対し、電流式の酵素センサチップでは、測定感度が電極面積に依存するという問題点はあるものの、測定電極への電圧印加による測定電極上での酸化還元反応が化学反応開始のトリガーとなっているため、反応開始時点から測定を開始することに問題は生じていなかった。さらに、試料液の測定電極への到達は、測定電極に流れる電流がゼロで無くなる点を検出することにより行われていた。【００１４】
本発明では、反応開始時からの測定を可能とする参照電極、測定電極および試料溶液導入部の位置関係を規定した電位差式酵素センサチップを提供し、さらに、反応開始時点を検出する方法を提供する。微量な試料であっても、高精度な測定をすることを可能とする。反応開始時点が検出できることを利用して、微量な試料であっても測定対象物質濃度の算出にレート法を用いることを可能とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明では、導入される試料が、参照電極の方が測定電極よりも先に到達するように電極を配置した。試料導入部と測定電極の間に参照電極を配置する。参照電極と測定電極の間隔を、各電極の幅よりも広くする。分岐のない流路内にブランク電極を配置する場合は、参照電極と測定電極の間にブランク電極を配置する。分岐のない流路内にブランク電極を配置する場合は、参照電極とブランク電極と測定電極の間隔を、各電極の幅よりも広くする。流路を分岐させ、ブランク電極と測定電極を分岐させた流路にそれぞれ配置する。ブランク電極と測定電極を分岐させた流路にそれぞれ配置する場合は、試料導入部から参照電極までの実質的な距離を、試料導入部から他の電極までの実質的な距離よりも短くする等して、先に参照電極の方に試料が到達するようにする。測定電極やブランク電極を複数配置する場合は、それぞれの測定電極やブランク電極について、分岐させた別々の流路に配置する。参照電極と測定電極の間の電位差の非連続的な変化から反応開始時点を検出する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、導入される試料が、参照電極の方に測定電極よりも先に到達するようにしたことで、試料導入部から導入した溶液が参照電極、測定電極の順に接触するため、測定電極に溶液が接触した時点から測定を開始することができる。参照電極と測定電極の間隔を各電極の幅よりも広くすることで、溶液の接触する順番が前後することを抑制できる。分岐のない流路内にブランク電極を配置する場合に、参照電極と測定電極の間にブランク電極を配置することで、ブランク電極に溶液が接触した時点からブランク電極の電位の測定を開始することができたり、測定電極から溶出した酵素がブランク電極に混入するといったクロストークを抑制したりすることができる。分岐のない流路内にブランク電極を配置する場合に、参照電極とブランク電極の間隔を各電極の幅よりも広くすることで、溶液の接触する順番が前後することを抑制できる。流路を分岐させ、ブランク電極と測定電極を分岐させた流路にそれぞれ配置することで、ブランク電極と測定電極の間のクロストークを抑制することができる。ブランク電極と測定電極を分岐させた流路にそれぞれ配置する場合に、試料導入部から参照電極までの実質的な距離を試料導入部から他の電極までの実質的な距離よりも短くすることで、試料導入部から導入した溶液が参照電極に接触してからブランク電極や測定電極に接触するため、ブランク電極や測定電極に溶液が接触した時点からそれぞれの電位の測定を開始することができる。測定電極やブランク電極を複数配置する場合に、それぞれの測定電極やブランク電極を分岐させた別々の流路に配置することで、各電極間のクロストークを抑制することができる。参照電極と測定電極の間の電位差の非連続的な変化から反応開始時点を検出することで、溶液検知の電極など新たな電極を設けることなく、溶液の測定電極への到達および反応開始を検出することができる。これらの構成により、本発明は微量な試料であっても、高精度な濃度測定やレート法による測定をすることが出来るという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明による電位差式酵素センサチップの一例を示す図。
【図２】本発明による電位差式酵素センサチップを用いた測定フローの一例を示す図。
【図３】本発明による電位差式酵素センサチップの一例を示す図。
【図４】本発明による電位差式酵素センサチップを用いた測定フローの一例を示す図。
【図５】本発明による電位差式酵素センサチップの一例を示す図。
【図６】本発明による電位差式酵素センサチップを用いた測定フローの一例を示す図。
【図７】本発明による電位差式酵素センサチップの一例を示す図。
【図８】本発明による電位差式酵素センサチップを用いた測定フローの一例を示す図。
【図９】本発明による電位差式酵素センサチップの一例を示す図。
【図１０】本発明による電位差式酵素センサチップを用いた測定フローの一例を示す図。
【図１１】本発明による電位差式酵素センサチップを用いた測定装置の一例を示すブロック図。
【図１２】本発明による電位差式酵素センサチップの一例を示す図。
【図１３】本発明による測定装置の一例を示す図。
【図１４】本発明による電位差式酵素センサチップを用いた測定フローの一例を示す図。
【図１５】本発明による電位差式酵素センサチップおよび測定装置を用いて取得したデータを示す図。
【図１６】本発明による電位差式酵素センサチップおよび測定装置を用いて取得したデータを本発明によるデータ処理方法で処理した結果を示す図。
【図１７】本発明による電位差式酵素センサチップおよび測定装置を用いて取得した検量線を示す図。
【図１８】本発明による電位差式酵素センサチップおよび測定装置を用いて取得した検量線を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
【００１９】
図１は、本発明による電位差式酵素センサチップの一例を示す図である。本チップは、基板１０１、試料導入部１０２、参照電極１０３、測定電極１０４、流路１０５を有し、参照電極１０３と測定電極１０４は電圧計１０６に接続されている。流路１０５は中空であっても濾紙やゲルやビーズなどの担体が充填されていても良い。その際、必要に応じて流路を覆うように基板にシートを貼り付ける。参照電極１０３には、銀塩化銀電極などを用いる。測定電極１０４には、金、銀、白金といった貴金属を用いる。望ましくは、１１−フェロセニル−１−ウンデカンチオールのようなフェロセンを末端に有するアルカンチオールで修飾した金の電極を用いる。測定電極１０４の上もしくは周辺もしくは周辺の担体には試薬１０７が配置されている。望ましくは試薬は乾燥状態になっている。
【００２０】
図２のフローチャートを用いて図１のセンサチップを用いた測定の一例を示す。まず、試料導入部１０２から試料液を導入する（２０１）。導入された試料液は流路１０５中を図面の上から下に向かって展開し（２０２）、まず参照電極１０３に達する（２０３）。
この際、試料液を展開するための原動力は、毛管力や圧力や重力などその種類を問わない。さらに試料液は流路１０５中を展開し（２０４）、測定電極１０４に達する（２０５）。試料溶液は測定電極１０４に達するとほぼ同時に試薬１０７を溶解もしくは試薬１０７と混合し（２０６）、化学反応が開始される。そのため、反応開始と測定電極１０４への試料液の到達はほぼ同時となる。この化学反応により生じる測定電極１０４の表面電位変化を、電圧計１０６により参照電極１０３と測定電極１０４の間の電位差の変化として測定する（２０７）。試料液が参照電極１０３と測定電極１０４の両電極に達して初めて電圧計１０６により測定電極１０４の表面電位が計測可能となる。そのため、図１のセンサチップでは、測定電極１０４の表面電位が計測可能となる時点と化学反応が開始する時点がほぼ同時となり、化学反応開始の時点から測定電極１０４の表面電位が計測可能となる。一方、参照電極１０３と測定電極１０４の配置が逆の場合、試料液は測定電極に達してから参照電極に達する。化学反応は測定電極に試料液が達した時点で開始されるが、測定電極の表面電位が計測可能となるのは参照電極に試料液が達した時点となり、化学反応開始の時点から測定電極の表面電位を測定することはできない。そのため、図１のような電極の並びが望ましい。また、試料液が参照電極１０３の全表面に行き渡ってから測定電極１０４に接触するようにするために、参照電極１０３と測定電極１０４の間隔は、参照電極１０３の大きさよりも大きいことが望ましい。測定された表面電位の変化を用いて試料液中の測定対象物質濃度を算出する（２０８）。測定対象物質濃度の算出方法には、表面電位の絶対値だけでなく反応開始時点が検出できることを利用してレート法や反応過程のフィッティングを用いることもできる。電圧計１０６として電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）を用いてもよい。
【００２１】
図３は、本発明による電位差式酵素センサチップの一例を示す図である。本チップは、基板３０１、試料導入部３０２、参照電極３０３、ブランク電極３０４、測定電極３０５、流路３０６を有し、参照電極３０３とブランク電極３０４は電圧計３０７に、参照電極３０３とブランク電極３０５は電圧計３０８に接続されている。流路３０６は中空であっても濾紙やゲルやビーズなどの担体が充填されていても良い。その際、必要に応じて流路を覆うように基板にシートを貼り付ける。参照電極３０３には、銀塩化銀電極などを用いる。ブランク電極３０４および測定電極３０５には、金、銀、白金といった貴金属を用いる。望ましくは、１１−フェロセニル−１−ウンデカンチオールのようなフェロセンを末端に有するアルカンチオールで修飾した金の電極を用いる。ブランク電極３０４および測定電極３０５の上もしくは周辺もしくは周辺の担体には試薬３０９、３１０が配置されている。望ましくは試薬３０９、３１０は乾燥状態になっている。ブランク電極３０４に対応する試薬３０９には、測定電極３０５に対応する試薬３１０に含まれている酵素や触媒のうち一部もしくは全部が含まれていない。そのため、ブランク電極３０４と測定電極３０５の表面電位を比較することで、参照電極３０３の電位変動や試料中の妨害物質等の影響を取り除くことができる。
【００２２】
図４のフローチャートを用いて図３のセンサチップを用いた測定の一例を示す。まず、試料導入部３０２から試料液を導入する（４０１）。導入された試料液は流路３０６中を図面の上から下に向かって展開し（４０２）、まず参照電極３０３に達する（４０３）。
この際、試料液を展開するための原動力は、毛管力や圧力や重力などその種類を問わない。さらに試料液は流路３０６中を展開し（４０４）、ブランク電極３０４に達する（４０５）。試料液はブランク電極３０４に達するとほぼ同時にブランク電極３０４に対応する試薬３０９を溶解もしくは試薬３０９と混合し（４０６）、化学反応が開始される。さらに試料液は流路３０６中を展開し（４０８）、測定電極３０５に達し（４０９）、ここでも測定電極３０５に対応する試薬３１０を溶解もしくは試薬３１０と混合し（４１０）、化学反応が開始される。そのため、ブランク電極３０４への試料液の到達とブランク電極３０４に対応する試薬３０９と試料液との反応、また、測定電極３０５への試料液の到達と測定電極３０５に対応する試薬３１０と試料液との反応はほぼ同時となる。これら化学反応により生じるブランク電極３０４および測定電極３０５の表面電位変化を、電圧計３０７および電圧計３０８により参照電極３０３とブランク電極３０４および参照電極３０３と測定電極３０５の間の電位差の変化としてそれぞれ測定する（４０７、４１１）。図1の場合と同様に、ブランク電極３０４および測定電極３０５においてそれぞれの化学反応開始の時点からそれぞれの表面電位が計測可能となる。ここで、試料液の展開によりブランク電極３０４に対応する試薬３０９の一部が測定電極３０５上に混入してしまうことが考えられる。しかし、ブランク電極３０４に対応する試薬３０９に含まれている成分は、通常の場合、測定電極３０５に対応する試薬３１０にも含まれているため、大きな問題とはならない。ところが、ブランク電極３０４と測定電極３０５の配置が逆の場合、測定電極に対応する試薬３１０の一部がブランク電極上に混入してしまうことが考えられる。その場合、ブランク電極でも測定対象物質に応じた電位変化が生じてしまい、測定に大きな問題となる。そのため、図２のような電極の並びが望ましい。また、試料液が参照電極３０３の全表面に行き渡ってからブランク電極３０４に接触するようにするために、参照電極３０３とブランク電極３０４の間隔は、参照電極３０３の大きさよりも大きいことが望ましい。測定された表面電位の変化を用いて試料液中の測定対象物質濃度を算出する（４１２）。測定対象物質濃度の算出方法には、測定電極の表面電位の絶対値や測定電極とブランク電極の表面電位の差分だけでなく反応開始時点が検出できることを利用してレート法や反応過程のフィッティングを用いることもできる。電圧計３０７、３０８として電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）を用いてもよい。
【００２３】
図５は、本発明による電位差式酵素センサチップの一例を示す図である。本チップは、基板５０１、試料導入部５０２、参照電極５０３、ブランク電極５０４、測定電極５０５、流路５０６を有し、参照電極５０３とブランク電極５０４は電圧計５０７に、参照電極５０３と測定電極５０５は電圧計５０８に接続されている。流路５０５は中空であっても濾紙やゲルやビーズなどの担体が充填されていても良い。その際、必要に応じて流路を覆うように基板にシートを貼り付ける。参照電極５０３には、銀塩化銀電極などを用いる。ブランク電極５０４および測定電極５０５には、金、銀、白金といった貴金属を用いる。望ましくは、１１−フェロセニル−１−ウンデカンチオールのようなフェロセンを末端に有するアルカンチオールで修飾した金の電極を用いる。ブランク電極５０４および測定電極５０５の上もしくは周辺もしくは周辺の担体には試薬５０９、５１０が配置されている。望ましくは試薬５０９、５１０は乾燥状態で配置されている。ブランク電極５０４に対応する試薬５０９には、測定電極５０５に対応する試薬５１０に含まれている酵素や触媒のうち一部もしくは全部が含まれていない。そのため、ブランク電極５０４と測定電極５０５の表面電位を比較することで、参照電極５０３の電位変動や試料中の妨害物質等の影響を取り除くことができる。
【００２４】
図６のフローチャートを用いて図５のセンサチップを用いた測定の一例を示す。まず、試料導入部５０２から試料液を導入する（６０１）。導入された試料液は流路５０６を図面の上から下に向かって展開し（６０２）、まず参照電極５０３に達する（６０３）。この際、試料液を展開するための原動力は、毛管力や圧力や重力などその種類を問わない。さらに試料液は流路５０６中を展開し（６０４）、分岐を経てブランク電極５０４、測定電極５０５に達する（６０５、６０７）。試料液はブランク電極５０４に達するとほぼ同時にブランク電極５０４に対応する試薬５０９を溶解もしくは試薬５０９と混合し（６０６）、化学反応が開始される。また、試料液は測定電極５０５に達するとほぼ同時に測定電極５０５に対応する試薬５１０を溶解もしくは試薬５１０と混合し（６０８）、化学反応が開始される。そのため、ブランク電極５０４への試料液の到達とブランク電極５０４に対応する試薬５０９と試料液との反応、また、測定電極５０５への試料液の到達と測定電極５０５に対応する試薬５１０と試料液との反応はほぼ同時となる。これら化学反応により生じるブランク電極５０４および測定電極５０５の表面電位変化を、電圧計５０７および電圧計５０８により参照電極５０３とブランク電極５０４および参照電極５０３と測定電極５０５の間の電位差の変化としてそれぞれ測定する（６０９、６１０）。図1の場合と同様に、ブランク電極５０４および測定電極５０５においてそれぞれの化学反応開始の時点からそれぞれの表面電位が計測可能となる。ここで、ブランク電極５０４と測定電極５０５はそれぞれ分岐した流路に配置されているため、図２のセンサチップで懸念されたブランク電極と測定電極との間のクロストークは問題とならない。また、試料液が参照電極５０３の全表面に行き渡ってからブランク電極５０４や測定電極５０５に接触するようにするために、参照電極５０３とブランク電極５０４の間隔および参照電極５０３と測定電極５０５の間隔は、参照電極５０３の大きさよりも大きいことが望ましい。測定された表面電位の変化を用いて試料液中の測定対象物質濃度を算出する（６１１）。測定対象物質濃度の算出方法には、測定電極の表面電位の絶対値や測定電極とブランク電極の表面電位の差分だけでなく反応開始時点が検出できることを利用してレート法や反応過程のフィッティングを用いることもできる。電圧計５０７、５０８の代わりに、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）を用いてもよい。
【００２５】
図７は、本発明による電位差式酵素センサチップの一例を示す図である。本チップは、基板７０１、試料導入部７０２、参照電極７０３、ブランク電極７０４、測定電極Ａ７０５、測定電極Ｂ７０６、流路７０７を有し、参照電極７０３とブランク電極７０４は電圧計７０８に、参照電極７０３と測定電極Ａ７０５は電圧計７０９に、参照電極７０３と測定電極Ｂ７０６は電圧計７１０に、接続されている。流路７０７は中空であっても濾紙やゲルやビーズなどの担体が充填されていても良い。その際、必要に応じて流路を覆うように基板にシートを貼り付ける。参照電極７０３には、銀塩化銀電極などを用いる。ブランク電極７０４、測定電極Ａ７０５および測定電極Ｂ７０６には、金、銀、白金といった貴金属を用いる。望ましくは、１１−フェロセニル−１−ウンデカンチオールのようなフェロセンを末端に有するアルカンチオールで修飾した金の電極を用いる。ブランク電極７０４、測定電極Ａ７０５および測定電極Ｂ７０６の上もしくは周辺もしくは周辺の担体には試薬７１１、７１２、７１３が配置されている。望ましくは試薬７１１、７１２、７１３は乾燥状態で配置されている。ブランク電極７０４に対応する試薬７１１には、測定電極Ａ７０５に対応する試薬７１２や測定電極Ｂ７０６に対応する試薬７１３に含まれている酵素や触媒のうち一部もしくは全部が含まれていない。そのため、ブランク電極７０４と測定電極Ａ７０５もしくは測定電極Ｂ７０６の表面電位を比較することで、参照電極７０３の電位変動や試料中の妨害物質等の影響を取り除くことができる。試薬７１１、７１２、７１３の一例を挙げる。
【００２６】
試薬７１１：299μmol/lフェリシアン化カリウム、1μmol/lフェロシアン化カリウム、0.1Mリン酸カリウム(pH7) 1μlを滴下し乾燥試薬７１２：299μmol/lフェリシアン化カリウム、1μmol/lフェロシアン化カリウム、0.1Mリン酸カリウム(pH7)、10mg/ml グルコース脱水素酵素1μlを滴下し乾燥試薬７１３：299μmol/lフェリシアン化カリウム、1μmol/lフェロシアン化カリウム、0.1M Tris-HCl(pH8.5)、10mg/ml コレステロールエステラーゼ、10mg/ml コレステロール脱水素酵素1μlを滴下し乾燥試薬７１２、７１３に含まれる酵素は、表１のように測定対象に応じて変更する。その際、バッファーの種類、フェリシアン化カリウムの濃度、フェロシアン化カリウムの濃度は適宜変更する。
【００２７】
【表１】
2010052867.tif 000004
【００２８】
図８のフローチャートを用いて図７のセンサチップを用いた測定の一例を示す。まず、試料導入部７０２から試料液を導入する（８０１）。導入された試料液は流路７０７を図面の上から下に向かって展開し（８０２）、まず参照電極７０３に達する（８０３）。この際、試料液を展開するための原動力は、毛管力や圧力や重力などその種類を問わない。さらに試料液は流路７０７中を展開し（８０４）、分岐を経てブランク電極７０４、測定電極Ａ７０５、測定電極Ｂ７０６に達する（８０５、８０７、８０９）。試料液はブランク電極７０４に達するとほぼ同時にブランク電極７０４に対応する試薬７１１を溶解もしくは試薬７１１と混合し（８０６）、化学反応が開始される。また、試料液は測定電極Ａ７０５や測定電極Ｂ７０６に達するとほぼ同時に測定電極Ａ７０５や測定電極Ｂ７０６に対応する試薬７１２、７１３を溶解もしくは試薬７１２、７１３と混合し（８０８、８１０）、化学反応が開始される。そのため、ブランク電極７０４への試料液の到達とブランク電極７０４に対応する試薬と試料液との反応、また、測定電極Ａ７０５や測定電極Ｂ７０６への試料液の到達と測定電極Ａ７０５や測定電極Ｂ７０６に対応する試薬と試料液との反応はほぼ同時となる。これら化学反応により生じるブランク電極７０４、測定電極Ａ７０５および測定電極Ｂ７０６の表面電位変化を、電圧計７０８、電圧計７０９および電圧計７１０により参照電極７０３とブランク電極７０４、参照電極７０３と測定電極Ａ７０５および参照電極７０３と測定電極Ｂ７０６の間の電位差の変化としてそれぞれ測定する（８１１、８１２、８１３３）。図1の場合と同様に、ブランク電極７０４、測定電極Ａ７０５および測定電極Ｂ７０６においてそれぞれの化学反応開始の時点からそれぞれの表面電位が計測可能となる。ここで、ブランク電極７０４、測定電極Ａ７０５と測定電極Ｂ７０６はそれぞれ分岐した流路に配置されているため、図２のセンサチップで懸念されたブランク電極と測定電極との間のクロストークは問題とならない。また、試料液が参照電極７０３の全表面に行き渡ってからブランク電極７０４、測定電極Ａ７０５や測定電極Ｂ７０６に接触するようにするために、参照電極７０３とブランク電極７０４の間隔、参照電極７０３と測定電極Ａ７０５の間隔および参照電極７０３と測定電極Ｂ７０６の間隔は、参照電極７０３の大きさよりも大きいことが望ましい。測定された表面電位の変化を用いて試料液中の測定対象物質濃度を算出する（８１４）。測定対象物質濃度の算出方法には、測定電極の表面電位の絶対値や測定電極とブランク電極の表面電位の差分だけでなく反応開始時点が検出できることを利用してレート法や反応過程のフィッティングを用いることもできる。電圧計７０８、７０９、７１０の代わりに、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）を用いてもよい。また、本実施例の要領でブランク電極や測定電極をさらに多く設けることもできる。
【００２９】
図９は、本発明による電位差式酵素センサチップの一例を示す図である。本チップは、基板９０１、試料導入部９０２、参照電極９０３、ブランク電極９０４、測定電極９０５、流路９０６を有し、参照電極９０３とブランク電極９０４は電圧計９０７に、参照電極９０３と測定電極９０５は電圧計９０８に接続されている。流路９０５は中空であっても濾紙やゲルやビーズなどの担体が充填されていても良い。その際、必要に応じて流路を覆うように基板にシートを貼り付ける。参照電極９０３には、銀塩化銀電極などを用いる。ブランク電極９０４および測定電極９０５には、金、銀、白金といった貴金属を用いる。望ましくは、１１−フェロセニル−１−ウンデカンチオールのようなフェロセンを末端に有するアルカンチオールで修飾した金の電極を用いる。ブランク電極９０４および測定電極９０５の上もしくは周辺もしくは周辺の担体には試薬９０９、９１０が配置されている。望ましくは試薬９０９、９１０は乾燥状態で配置されている。ブランク電極９０４に対応する試薬９０９には、測定電極９０５に対応する試薬９１０に含まれている酵素や触媒のうち一部もしくは全部が含まれていない。そのため、ブランク電極９０４と測定電極９０５の表面電位を比較することで、参照電極９０３の電位変動や試料中の妨害物質等の影響を取り除くことができる。
【００３０】
図１０のフローチャートを用いて図９のセンサチップを用いた測定の一例を示す。まず、試料導入部９０２から試料液を導入する（１００１）。導入された試料液は流路９０６を図面の上から下に向かって展開し、それぞれの分岐を経てそれぞれの電極に達する（１００３、１００４、１００６）。この際、試料液を展開するための原動力は、毛管力や圧力や重力などその種類を問わない。試料導入部９０２からの距離に応じて、試料液は参照電極９０３、ブランク電極９０４、測定電極９０５の順に達する。すなわち、事象は１００３、１００４、１００６の順に起こる。試料液はブランク電極９０４に達するとほぼ同時にブランク電極９０４に対応する試薬９０９を溶解もしくは試薬９０９と混合し（１００５）、化学反応が開始される。また、試料液は測定電極９０５に達するとほぼ同時に測定電極９０５に対応する試薬９１０を溶解もしくは試薬９１０と混合し（１００７）、化学反応が開始される。そのため、ブランク電極９０４への試料液の到達とブランク電極９０４に対応する試薬９０９と試料液との反応、また、測定電極９０５への試料液の到達と測定電極９０５に対応する試薬９１０と試料液との反応はほぼ同時となる。これら化学反応により生じるブランク電極９０４および測定電極９０５の表面電位変化を、電圧計９０７および電圧計９０８により参照電極９０３とブランク電極９０４および参照電極９０３と測定電極９０５の間の電位差の変化としてそれぞれ測定する（１００８、１００９）。
【００３１】
各電極のうち参照電極９０３に最も早く試料液が到達するため、ブランク電極９０４および測定電極９０５においてそれぞれの化学反応開始の時点からそれぞれの表面電位が計測可能となる。ここで、ブランク電極９０４と測定電極９０５はそれぞれ分岐した流路に配置されているため、図２のセンサチップで懸念されたブランク電極と測定電極との間のクロストークは問題とならない。測定された表面電位の変化を用いて試料液中の測定対象物質濃度を算出する（１０１０）。測定対象物質濃度の算出方法には、測定電極の表面電位の絶対値や測定電極とブランク電極の表面電位の差分だけでなく、反応開始時点が検出できることを利用してレート法や反応過程のフィッティングを用いることもできる。電圧計９０７、９０８の代わりに、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）を用いてもよい。
【００３２】
図１１は、本発明による電位差式酵素センサチップを用いた測定装置の一例を示すブロック図である。測定部１１０１は図１に示した電位差式酵素センサチップと同一のものであり、測定部１１０１はデータ処理装置１１０２と接続されている。データ処理装置１１０２はメモリ１１０３と計算処理部１１０４を有する。測定部１１０１は本発明の他のセンサチップでも良い。データ処理装置１１０２ではアナログデジタル(AD)変換装置などによって測定部１１０１で計測される電位差を測定することができるようになっている。試料液導入前は流路１０５は乾燥状態であるため参照電極１０３と測定電極１０４の間の抵抗値はとても大きく、電圧計１０６の計測値は一定ではない。ここに試料液を導入すると、参照電極１０３と測定電極１０４の間の抵抗値は減少し、測定したい化学反応に応じた電位差を示すようになる。そのため、試料液が測定電極１０４に達する前は電圧計１０６により測定される電位差は非連続的な変化を示し、達した後は非連続的な変化を示さなくなる。電圧の非連続性な電位差の変化は、データ処理装置１１０２により、例えば電位差の時間変化の微分や二次微分を算出することで検出することができる。また、前述のように測定電極１０４に試料液が達するのと化学反応が開始するのはほぼ同時であるため、データ処理装置１１０２により検出される試料液が測定電極１０４に達した時点と化学反応が開始する時点はほぼ同時となり、これにより化学反応の開始を検出することもできる。また、ここでは図１に示した電位差式センサチップを用いた場合を例示したが、他の電位差式センサチップについても同様にしてデータ処理装置１１０２によって、ブランク電極や測定電極への試料液の到達を検出することができる。また、データ処理装置１１０２はパーソナルコンピュータであってもマイクロコンピュータであってもロジック回路であってもよく、微分や二次微分を行うに当たり、数値解析の手法を用いてもアナログ回路による微分回路を用いてもよい。
【００３３】
図１２および図１３は、本発明による電位差式酵素センサチップとその測定装置の一例を示す図である。電位差式酵素センサチップは、図３と同様な、流路１２０７が参照電極１２０３の先で分岐していて、分岐した流路の先にそれぞれブランク電極１２０４と測定電極１２０５がある構成となっている。電位差式酵素センサチップの作成法を簡単に述べる。シリコン基板１２０１上に、半導体製造装置を用いて３つの端子１２０２と参照電極１２０３、ブランク電極１２０４、測定電極１２０５を形成した。端子１２０２と電極１２０３、１２０４、１２０５の部材は、次に行う金薄膜形成時の接着性を考慮してクロムを用いた。各電極は端子１２０２と埋め込み配線１２１３により電気的に接続し、端子１２０２と電極１２０３、１２０４、１２０５以外の表面を窒化シリコンの膜で覆った。その後、各電極１２０３、１２０４、１２０５と端子１２０２にスパッタリングにより厚さ100nmの金薄膜を形成した。電極１２０３、１２０４、１２０５の表面を修飾するため、１１−フェロセニル−１−ウンデカンチオールを500μmol/lの濃度で溶解したエタノール溶液にセンサチップを１時間浸漬し、その後エタノールと純粋で２回ずつ洗浄し、窒素雰囲気下で乾燥させた。参照電極１２０３上に銀塩化銀を形成するために、参照電極１２０３上に銀塩化銀ペーストを塗布し一昼夜乾燥させさらに真空状態にして銀塩化銀ペーストに含まれる有機溶媒を除去した。このようにして作製したセンサチップ上に、セル１２０６の一部として流路１２０７をくり貫いた厚さ0.2mmのシリコーンゴムを貼り付けた。流路１２０７の一端を試料導入部１２１２とした。流路１２０７にブランク電極上の濾紙１２０９、測定電極上の濾紙１２１０、試料導入部の濾紙１２１１を配置した。濾紙の厚みは0.2mmで、ブランク電極上の濾紙１２０９、測定電極上の濾紙１２１０、試料導入部の濾紙１２１１を合わせると流路１２０７の形状と一致するようになっている。ブランク電極上の濾紙１２０９および測定電極上の濾紙１２１０は、濾紙をそれぞれの形状に加工した後に、それぞれブランク電極用の試薬および測定電極用の試薬を1μLずつ滴下し窒素雰囲気下で乾燥させてある。ブランク電極用の試薬は、299μmol/lフェリシアン化カリウム、1μmol/lフェロシアン化カリウム、0.1Mリン酸カリウム(pH7)の組成、測定電極用の試薬は、299μmol/lフェリシアン化カリウム、1μmol/lフェロシアン化カリウム、20mg/mlグルコール脱水素酵素、0.1Ｍリン酸カリウム(pH7)の組成となっている。濾紙を流路１２０７に配置した後、厚さ0.2ｍｍのシリコーンゴムを重ねて、セル１２０６およびセンサチップを完成させた。測定器は、表示部１３０１、チップ差込口１３０２、メモリ１３０５、計算処理部１３０６、電圧計１３０７を有する。電圧計１３０８のは端子１３０３と接続されていて、電圧計１３０８の読み取り値はメモリ１３０５に格納される。
【００３４】
図１４のフローチャートを用いて図１２および図１３のセンサチップとその測定装置を用いた測定の一例を示す。まず、センサチップをチップ差込口１３０２に差し込む（１４０１）。センサチップにある３つの端子１２０２が測定器内の端子１３０３と接触し（１４１０）、測定器内の電圧計１３０７により参照電極１２０３とブランク電極１２０４および参照電極１２０３と測定電極１２０５の間の電位差を測定できるようになる。また、センサチップが差し込まれたことは測定器内のスイッチ１３０４がチップにより押されることで検出される（１４１０）。これにより測定器は電極間の電位差の測定を開始する（１４１２、１４１５）。試料液の血清をセンサチップの試料導入部１２１２に接触させると、濾紙の毛管現象により試料液が流路内に吸引される（１４０２）。吸引された試料液は流路１２０７中を展開し（１４０３）、まず参照電極１２０３に達し（１４０４）、流路の分岐に達し、ブランク電極１２０４と測定電極１２０５にそれぞれ達する（１４０６、１４０８）。溶液が各電極に到達したことで、参照電極とブランク電極および参照電極と測定電極の間の電位差の変化が、非連続的なものから連続的なものになる。また、ブランク電極と測定電極に達した試料液は、各電極近傍にある試薬を溶解し（１４０７、１４０９）、化学反応が開始する。一方、計算処理部では電位変化の連続性を監視している（１４１３、１４１６）。電位の非連続的な変化から連続的な変化への移行を検知すると、測定している電位を電極の表面電位として記録し始める（１４１４、１４１７）。試料液が各電極に達したことの判定には、連続性に加えて、電圧の絶対値が適正な値であるかを参考にすることもできる。これにより、化学反応開始時から各電極の表面電位の測定を行うことができる。得られた表面電位から試料液中の測定対象物質濃度を算出し（１４１８）、表示部１３０１に表示する（１４１９）。
【００３５】
図１２の電位差式酵素センサチップと図１３の測定装置を用いて取得したデータとその処理結果を図１５(a)、(b)および図１６に示す。また、予め取得した検量線を図１７に示す。データはセンサチップを差し込んでからの時間を横軸に、参照電極との電位差を縦軸にプロットしたのが図１５(a)、同様の横軸と参照電極との電位差を時間で二次微分した値を縦軸にプロットしたのが図１５(b)である。グラフ外に描かれていた電位差が、10秒付近から200mV程度になっている。これは、導入部から導入した試料液がブランク電極および測定電極に到達したためである。このとき、二次微分においては、大きく変動していた値が0付近に収束してきている。各電極に液が達する前は参照電極とブランク電極および参照電極と測定電極の間の抵抗値は100MΩ以上であった。そのため、外来もしくは測定器そのものの発するノイズによって電圧計の測定値は大きく変動し、二次微分値は0から大きく離れた値を示していた。各電極に液が達すると参照電極とブランク電極および参照電極と測定電極の間の抵抗値は１MΩ程度と小さくなり、外来のノイズ成分は大きく減少した。そのため、二次微分値は0に近い値となり、電位差も通常観測される200mV程度に収束した。ここで、二次微分値の絶対値が10秒以上10mV/s2以下となったときの最初の点を測定開始点として、ブランク電極と測定電極の電位差の差分を図１６にプロットした。このようにして得られたデータから、測定開始後180秒におけるブランク電極と測定電極の電位差の差分46.2mVを得た。これは、予め取得した検量線(図１７)を用いると、グルコース濃度99mg/dLと求まる。
【００３６】
このような方法により反応開始時点を検出しない場合、試料導入後に使用者により手動でボタンを押してもらったり、センサチップのセットから10秒以内に試料を導入することなどの制限を設けたりしなくてはならない。このような使用者に依存する方法を用いると、測定開始時点に誤差が生じ、測定値の誤差につながる。図１６のデータでは、測定開始時点の検出が30秒ずれると、グルコース濃度にして2%の誤差を生じる。上記の方法により反応開始時点を検出する場合、測定開始時点の検出の誤差はとても小さくなる。データ間隔が1秒なので、±1秒の誤差があるとすると、測定開始時点の検出誤差は2秒であり、この場合図１６のデータでは0.2%の誤差となる。このように、上記の方法で反応開始時点を検出することで、測定誤差を低減させることができる。反応開始時点の検出を行わない場合、測定開始後180秒後とした反応終点を測定開始後300秒後とするなど測定時間を長くすることで測定誤差を低減させることができるが、測定時間が長くなることは使用者にとって不利益であり、また、測定時間を長くした場合でも、反応開始時点の検出を行った方が測定誤差を少なくできる。
【００３７】
図１８にレート法により取得した検量線を示す。横軸は吸光度法で測定したグルコース濃度、縦軸は反応初速度である。反応速度vを、電位がネルンストの式に従うことを利用し、電位差の差分Eから、
【００３８】
【数２】
2010052867.tif 000005
【００３９】
の式を用いて求め、反応開始5〜10秒の平均値を用いて反応初速度とした。図１６のデータからも同様にして反応初速度を求めたところ、図１８の検量線を用いるとグルコース濃度は106mg/dLと求まった。
【００４０】
レート法の測定結果とエンドポイント法の測定結果では7%程度の乖離が観測されたが、これはレート法での測定時間がエンドポイント法に比べて短いために生じた誤差であると考えられ、測定法間の本質的な違いを意味するものではない。
【符号の説明】
【００４１】
１０１，３０１，５０１，７０１，９０１…基板、１０２，３０２，５０２，７０２，９０２，１２０８…試料導入部、１０３，３０３，５０３，７０３，９０３，１２０３…参照電極、３０４，５０４，７０４，９０４，１２０４…ブランク電極、１０４，３０５，５０５，９０５，１２０５…測定電極、７０５…測定電極Ａ、７０６…測定電極Ｂ、１０５，３０６，５０６，７０７，１２０７…流路、１０６，３０７，３０８，５０７，５０８，７０８，７０９，７１０，９０７，９０８，１３０７…電圧計、１０７，３０９，３１０，５０９，５１０，７１１，７１２，７１３，９０９，９１０…試薬、１１０１…測定部、１１０２…データ処理装置、１１０３，１３０５…メモリ、１１０４，１３０６…計算処理部、１２０１…シリコン基板、１２０２，１３０３…端子、１２０６…セル、１２０９，１２１０，１２１１…濾紙、１３０１…表示部、１３０２…チップ差込口、１３０４…スイッチ。
【図１】
2010052867.tif 000006
【図２】
2010052867.tif 000007
【図３】
2010052867.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2010052867.tif 000014
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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