(57)【要約】  【課題】環境中に存在するインテグロンの簡易、低廉かつ高精度な検出手段の提供。  【解決手段】クラス１〜クラス４のインテグロンのうち、複数のクラスのインテグロンにそれぞれ存在する所定領域の配列を同時に増幅しうるプライマー対を提供する。このプライマー対を用いて所定条件で核酸増幅を行い、ＤＮＡ断片の増幅の有無を検出することにより、環境中などから、簡易、低廉かつ高精度にインテグロンを検出できる。本発明に係る手段を用いて環境試料からインテグロンを検出することにより、環境中におけるインテグロンの汚染状況を検出できる。また、本発明は、未知・未同定のインテグロンを検出する手段としても有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラス１〜クラス４のインテグロンのうち、複数のクラスのインテグロンにそれぞれ存在する所定領域の配列を同時に増幅しうる一又は二以上のプライマー対を用いて核酸増幅を行う手順を含むインテグロン検出方法。
【請求項２】
環境中におけるインテグロンの汚染状況を検出するインテグロン汚染検出方法であって、
クラス１〜クラス４のインテグロンのうち、複数のクラスのインテグロンにそれぞれ存在する所定領域の配列を同時に増幅しうる一又は二以上のプライマー対を用いて核酸増幅を行い、環境試料からインテグロンを検出する手順を含むインテグロン汚染検出方法。
【請求項３】
前記核酸増幅を定量ＰＣＲにより行う請求項２記載のインテグロン汚染検出方法。
【請求項４】
前記増幅した核酸をＤＧＧＥ法により解析する手順を含む請求項２記載のインテグロン汚染検出方法。
【請求項５】
フォワードのプライマーに配列番号１〜４のいずれかの配列を少なくとも含むＤＮＡ断片を、リバースのプライマーに配列番号５〜８のいずれかの配列を少なくとも含むＤＮＡ断片を、それぞれ一対又は二以上の対で用いて核酸増幅を行う請求項２記載のインテグロン汚染検出方法。
【請求項６】
クラス１〜クラス４のインテグロンのうち、複数のクラスのインテグロンにそれぞれ存在する所定領域の配列を同時に増幅しうるプライマー対。
【請求項７】
請求項６記載のプライマー対を用いて核酸増幅を行うことにより得られた核酸。
【請求項８】
請求項７記載の核酸の全長又は部分長と実質的に同一の塩基配列又はその相補配列を有する一本鎖核酸が少なくとも固定化されたＤＮＡチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クラス１〜クラス４のインテグロンのうち、複数のクラスのインテグロンにそれぞれ存在する所定領域の配列を同時に増幅しうるプライマー対、該プライマー対を用いて核酸増幅を行う手順を含むインテグロン検出方法、環境中におけるインテグロンの汚染状況を環境試料から前記手順により検出するインテグロン汚染検出方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌などの病原性微生物が抗生物質などの薬剤に対して抵抗力を持つことを薬剤耐性という。薬剤耐性菌の出現は、感染症などの治療を困難なものにしている。また、近年、複数の薬剤に対し抵抗性を有する多剤耐性菌も出現・拡散しつつあり、難治性感染症や院内感染症の原因菌として重要になっている。その他、食中毒起因菌などでも、多剤耐性菌の出現が報告されている。【０００３】
細菌の薬剤耐性化機構、特に多剤耐性化機構の一つとして、インテグロンの存在が知られている。【０００４】
インテグロンは、外因性遺伝子カセットを挿入可能な構造を有するＤＮＡ領域である。一般的に、（１）インテグラーゼをコードする領域、（２）獲得した一又は複数の遺伝子カセットをコードする領域、（３）獲得遺伝子を発現させるプロモーター、以上３つの配列領域を含む。【０００５】
インテグラーゼは、インテグラーゼをコードする領域の下流に遺伝子カセットを挿入する酵素である。インテグラーゼの働きで薬剤耐性遺伝子のカセットが挿入されると、その細菌は薬剤耐性を獲得する。また、インテグロンは、複数の薬剤耐性遺伝子を効率よく取り込むことができる遺伝子構造であり、複数の薬剤耐性遺伝子のカセットがインテグロンに集積されると、その細菌は多剤耐性化する。【０００６】
インテグロンは、トランスポゾンと違い、その構造自体が遺伝子上を移動する能力はないと考えられているが、通常、プラスミドやトランスポゾン上に存在するため、獲得遺伝子（薬剤耐性遺伝子など）とともに、同一の菌種間、さらには菌種を越えて、水平伝播される可能性を有している。【０００７】
現在のところ、インテグロンは、インテグラーゼをコードする領域の相同性に基づき、クラス１からクラス５に分類されている。【０００８】
これらのインテグロンは、環境中にも広く存在し、また、薬剤暴露の頻繁な環境や、下水処理施設などで検出されることが知られている。【０００９】
本発明の関連文献として、例えば、特許文献１には、微生物検査室における日常的診断用の臨床検体からの通常の細菌病原体および抗生物質耐性遺伝子を迅速に検出及び同定するための特異的および普遍的プローブおよび増幅プライマーについて、記載されている。非特許文献１には、インテグロンの概要が、非特許文献２〜３には、インテグラーゼの共通配列などが記載されている。なお、非特許文献４には、後述の実施例で用いた既知のプライマーが記載されている。
【特許文献１】特開２００７−１２５０３２号公報
【非特許文献１】Dider Mazel, “Integrons: agents of bacterial evolution”, Naturevol.4 :608-620 (2006)
【非特許文献２】S. E. Nunes-Duby, et al “Similarities and differences among 105members of the Int family of site-specific recombinases”, Nucleic AcidResearch, 1998, Vol. 26, No.2, 391-406
【非特許文献３】F. Drouin, et al, “The IntI-Like Tyrosine Recombinase of Shewanella oneidensisIs Active as Integron Integrase”, Journal of Bacteriology, Mar. 2002, Vol.184,No.6 p1811-1815
【非特許文献４】Xu, H. et al, (2007), J. Bacteriol., 189, 6276-6283
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述の通り、インテグロンは、環境中にも広く存在し、また、薬剤暴露の頻繁な環境や、下水処理施設などで検出されることが知られている。また、インテグロンは、同一の菌種間、さらには菌種を越えて、水平伝播される可能性を有している。【００１１】
そのため、例えば、環境中で多剤耐性遺伝子カセットを有するインテグロンが出現し、それらのインテグロンが菌種を超えて伝播された場合、新しい多剤耐性の病原菌が出現し、かつ人間の生活領域を含む環境中に広く拡散する可能性がある。従って、そのようなリスクを未然に防止するために、環境中におけるインテグロンの汚染状況を検出する手段が必要である。【００１２】
一方、上述の通り、インテグロンは、現在のところ、クラス１からクラス５まで分類され、同定されているものだけでも多種類ある。それに対し、所定の環境中に含まれる多種多様なインテグロンの存在の有無を、簡易、低廉かつ高精度に検出する手段はほとんど知られていない。【００１３】
そこで、本発明は、環境中に存在するインテグロンを簡易、低廉かつ高精度に検出する手段を提供することなどを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、特定のクラス又は特定の種類のインテグロンだけでなく、複数のクラスのインテグロンを同時に検出する手段として、複数のクラスのインテグロンにそれぞれ存在する所定領域の配列を同時に増幅しうるプライマー対を作製し、かつ、それらのプライマー対を用いて核酸増幅を行うことにより、クラス１〜クラス４のインテグロンにそれぞれ存在する所定領域の配列を同時に増幅させることに成功した。【００１５】
そこで、本願では、クラス１〜クラス４のインテグロンのうち、複数のクラスのインテグロンにそれぞれ存在する所定領域の配列を同時に増幅しうるプライマー対、並びに該プライマー対を用いて核酸増幅を行う手順を含むインテグロン検出方法を提供する。【００１６】
このプライマー対を用いて所定条件で核酸増幅を行い、ＤＮＡ断片などの増幅の有無を検出することにより、環境中などから、簡易、低廉かつ高精度にインテグロンを検出できる。【００１７】
本発明は、特定のクラス又は特定の種類のインテグロンを特異的に核酸増幅法で検出するのではなく、複数のクラスのインテグロンを同時に検出する手段である。従って、例えば、本発明に係る手段を用いて環境試料からインテグロンを検出することにより、環境中におけるインテグロンの汚染状況を検出できる。【００１８】
また、本発明は、未知・未同定のインテグロンを検出する手段としても有効である。本発明に係るプライマー対は、特定のクラス又は特定の種類のインテグロンだけでなく、インテグロン全般の検出に有効である。従って、本発明に係る手段を採用することにより、未知・未同定のクラスや未知・未同定の種類のインテグロンを検出できる可能性がある。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、環境中などに存在するインテグロンを簡易、低廉かつ比較的高精度に検出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
＜本発明に係るプライマー対＞
本発明に係るプライマー対は、クラス１〜クラス４のインテグロンのうち、複数のクラスのインテグロンにそれぞれ存在する所定領域の配列を同時に増幅しうるプライマー対を全て包含する。例えば、クラス１〜クラス４のインテグロンにそれぞれ存在する所定領域の配列を同時に増幅しうるプライマー対が好適である。【００２１】
本発明に係るプライマー対は、例えば、クラス１〜クラス４のインテグロンの共通配列に基づいて設計してもよい。但し、本発明に係るプライマー対は、クラス１〜クラス４のインテグロンのうち、複数のクラスのインテグロンにそれぞれ存在する所定領域の配列を同時に増幅しうるプライマー対であればよい。即ち、全クラスのインテグロンにおける所定領域の配列と完全に相同的である必要はなく、また、全クラス又はいずれかのクラスのインテグロンと非相同的な配列を一部に含んでいてもよい。【００２２】
その他、配列の一部を４種類の通常の塩基と特異的に結合しない塩基に置換したＤＮＡ断片を用いてもよい。ここで、４種類の通常の塩基とは、アデニン、グアニン、シトシン、チミンをいう。【００２３】
４種類の塩基と特異的に結合しない塩基は、特に限定されない。例えば、そのような塩基として、イノシンを用いることができる。【００２４】
本発明に係る好適なプライマー対は、フォワードのプライマーが配列番号１〜４のいずれかの配列を少なくとも含むＤＮＡ断片であり、リバースのプライマーが配列番号５〜８のいずれかの配列を少なくとも含むＤＮＡ断片であるプライマー対である。【００２５】
本発明に係るプライマーは、上述の各配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸断片も全て包含する。ストリンジェントな条件は、各プライマーの長さ、Ｔｍ値などに基づき、公知技術より取得できる。【００２６】
＜本発明に係るインテグロン検出方法＞
本発明に係るインテグロン検出方法は、一又は二以上の本発明に係るプライマー対を用いて核酸増幅を行う手順を含むものを全て包含する。核酸増幅手段としては、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、以下同じ）、定量ＰＣＲを用いた方法などを採用できる。定量ＰＣＲとしては、例えば、リアルタイムＰＣＲなどを採用できる。【００２７】
この方法は、既知のインテグロン（例えば、クラス１〜クラス４の既知のインテグロン）が試料中などに存在するかどうかを検出する手段として用いることができる。【００２８】
また、この方法は、未知のインテグロン（例えば、クラス１〜クラス５に属しない未知・未同定のインテグロン）を探索する手段としても用いることができる。【００２９】
上述の通り、本発明に係るプライマー対は、インテグロン全般の検出に有効である。従って、本発明に係る手段を採用することにより、未知・未同定のクラスや種類のインテグロンを検出できる可能性がある。【００３０】
なお、核酸増幅の設定条件などは、公知の知見に基づき行えばよく、例えば、プライマーのＴｍ値、増幅部分の長さ（ｂｐ）に応じて、適宜設定すればよい。また、プライマーは、一対のみを用いてもよく、二以上の対をカクテルして用いてもよい。【００３１】
カクテルのプライマー対を用いる場合、各プライマーを等量ずつ添加してもよいし、目的などに応じて、プライマーごとに例えば１０〜１００倍の濃度差をつけて添加してもよい。一般的に、環境中では、クラス１インテグロンの構成比が他のクラスと比較して大きい場合が多い。その場合、例えば、クラス１以外のインテグロンを増幅させやすいプライマー対を、クラス１インテグロンを増幅させやすいプライマー対の濃度よりも１０〜１００倍多く添加することにより、クラス１以外のインテグロンを高感度に検出できる可能性がある。【００３２】
本発明に係るプライマー対を用いて核酸増幅を行った場合、そのＰＣＲ産物は、ほぼ単一のバンド（ほぼ同一の分子量）で得られる。従って、例えば、核酸増幅を定量ＰＣＲにより行うことにより、試料中のインテグロンを定量的に検出・評価できる。【００３３】
定量ＰＣＲは、公知の方法により、行うことができる。例えば、本発明に係るプライマー対で増幅するＤＮＡ鋳型（ポジティブコントロール）を用いて鋳型の濃度を振ってリアルタイムＰＣＲを行い、各濃度における増幅曲線を取得し、その閾値と濃度に基づいて検量線を作成する。同時に、試料を鋳型として定量ＰＣＲを行って、増幅曲線を取得し、その閾値から検量線に基づき、インテグロンの含有濃度を推定する。【００３４】
また、本発明に係る核酸増幅を行った場合に得られるＰＣＲ産物を、ＤＧＧＥ法（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｇｒａｎｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、以下同じ）で解析することにより、そのＰＣＲ産物を構成する複数の核酸をそれぞれ分離・同定できる。【００３５】
ＤＧＧＥ法による解析は、公知の方法により、行うことができる。例えば、グアニン又はシトシンが豊富な４０塩基対程度の配列（以下、「ＧＣクランプ」とする。）を一方のプライマーの５’末端に付加し、ＰＣＲを行う。そして、そのＰＣＲ産物をＤＧＧＥ法により電気泳動することにより、ゲル内で、そのＰＣＲ産物を構成する複数の核酸がそれぞれのバンドとして分離される。ゲル内からそのバンドを切り出し、公知手段により、核酸を抽出、シーケンシングを行い、既知のインテグロンにおける同一領域の配列と比較することにより、インテグロンのクラス・由来・種・バリエーションなどに関する知見を得ることができる。【００３６】
＜本発明に係るインテグロン汚染検出方法＞
本発明に係るインテグロン汚染検出方法は、一又は二以上の本発明に係るプライマー対を用いて核酸増幅を行い、環境試料からインテグロンを検出する手順を含むものを全て包含する。【００３７】
上述の通り、環境中におけるインテグロンの汚染状況を検出することは、多剤耐性菌が人間の生活領域を含む環境中に広く拡散するリスクを評価する手段として有効である。本発明に係る手段を用いて環境試料からインテグロンを検出することにより、環境中におけるインテグロンの汚染状況を検出できる。【００３８】
また、例えば、核酸増幅を定量ＰＣＲにより行ってもよい。これにより、環境中などにおけるインテグロンの汚染状況を定量的に検出・評価できる。【００３９】
その他、本発明に係る核酸増幅を行った場合に得られるＰＣＲ産物を、ＤＧＧＥ法で解析してもよい。これにより、環境試料中に存在するインテグロンのそれぞれのクラス・由来・種・バリエーションなどに関する知見を得ることができるため、より詳細なインテグロンの汚染状況を検出・評価できる。【００４０】
＜本発明に係る核酸増幅により得られた核酸などについて＞
本発明は、上述の本発明に係るプライマー対を用いて核酸増幅を行うことにより得られた核酸をすべて包含する。【００４１】
上述の通り、本発明に係るプライマー対を用いることにより、既知及び未知のものを含め、複数のインテグロンにそれぞれ存在する所定領域の配列（ほぼ同一の領域・長さの配列）を同時に増幅しうる。【００４２】
従って、例えば、バイオセンサーなどにおいて、本発明で得られた種々の核酸をプローブ（検出子）として、環境試料中などの核酸とそれぞれハイブリダイゼーションさせることにより、インテグロンの存在やインテグロンのクラス・由来・種・バリエーションなどに関する知見を比較的簡易かつ低廉に取得できる可能性がある。なお、バイオセンサーの構成は公知技術を採用できる。【００４３】
また、本発明は、例えば、本発明に係るプライマー対を用いて核酸増幅を行うことにより得られた一種又は複数種の核酸の全長又は部分長と実質的に同一の塩基配列又はその相補配列を有する一本鎖核酸を、それぞれ基板上などに固定化することにより、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）にも適用できる。【００４４】
例えば、各クラス・各種・各バリエーションのインテグロンの配列のうち、本発明に係る核酸増幅により増幅される領域の全長又はその部分長の配列を有するＤＮＡを基板上などに並べて配置することにより、環境試料中に含有したインテグロンのクラス・種・バリエーションなどを一回又は少数回の実験で検出・同定できる可能性がある。なお、ＤＮＡチップの基板などに核酸プローブを固定化などする方法は、公知手段を採用できる。【００４５】
その他、本発明に係る核酸を蛍光プローブなどとして用いてもよい。例えば、本発明に係るプライマー対を用いて核酸増幅を行うことにより得られた核酸の部分長（ＰＣＲ産物内部領域）と実質的に同一の塩基配列又はその相補配列を有する一本鎖核酸の両末端をそれぞれ蛍光レポーター及びクエンチャー（励起エネルギー吸収剤）で修飾し、それを蛍光プローブとして用いることにより、より高精度に定量ＰＣＲなどを行うことができる。なお、蛍光レポーターに用いる蛍光物質、クエンチャー、核酸の修飾方法、プローブ設計方法などについては、公知技術を採用できる。【００４６】
本発明に係る核酸は、本発明に係るプライマー対を用いて核酸増幅を行うことにより増幅される領域の核酸であればよく、既知及び未知の各クラス・各種・各バリエーションのインテグロンにおける該領域の配列をすべて包含する。また、本発明に係る核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸自体だけでなく、目的・用途などに応じてそれらに所定の修飾を施した核酸も広く包含される。【００４７】
例えば、配列番号９又は２２の塩基配列の全長又は部分長と実質的に同一の塩基配列又はその相補配列を有する一本鎖核酸は、クラス１インテグロン又は同クラスの既知又は未知のインテグロンを検出するためのプローブとして、バイオセンサー、ＤＮＡチップ、蛍光プローブなどに利用できる。【００４８】
例えば、配列番号１０、２０、又は、２１の塩基配列の全長又は部分長と実質的に同一の塩基配列又はその相補配列を有する一本鎖核酸は、クラス３インテグロン又は同クラスの既知又は未知のインテグロンを検出するためのプローブとして、バイオセンサー、ＤＮＡチップ、蛍光プローブなどに利用できる。【００４９】
例えば、配列番号１１〜１９のいずれかの塩基配列の全長又は部分長と実質的に同一の塩基配列又はその相補配列を有する一本鎖核酸は、未知のインテグロンを検出するためのプローブとして、バイオセンサー、ＤＮＡチップ、蛍光プローブなどに利用できる。【００５０】
なお、本発明に係る核酸は、バイオセンサー、ＤＮＡチップ、蛍光プローブなどの用途で用いる場合のみに狭く限定されない。
【実施例１】
【００５１】
実施例１では、本発明に係るプライマーを用いて、環境試料からのインテグロン検出を試みた。【００５２】
まず、下水汚泥１〜２ｍＬを遠心（１０，０００ｒｐｍ、５分間）し、「Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏ−Ｔｅｋ，  Ｉｎｃ．製、以下同じ）」を用いて、付属プロトコルに従い、沈降画分から鋳型ＤＮＡ試料を調製した。【００５３】
次に、鋳型ＤＮＡについて、ＰＣＲを行った。本発明に係るプライマーとして、配列番号１〜８のプライマーを同時にＰＣＲカクテルに添加した。また、対照として、既知のクラス１〜クラス４のインテグロン検出用プライマーを、それぞれ、ＰＣＲカクテルに添加した（非特許文献２参照）。【００５４】
ＰＣＲカクテルの組成を表１に、ＰＣＲの温度サイクルを表２に示す。なお、表１中、「Gene Amp dNTP MIX」、「Gene Amp 10× PCR Gold Buffer」、「AmpliTaq Gold DNA
polymerase」はApplied Biosystems社製である。
【表１】
2010041444.tif 000002
【表２】
2010041444.tif 000003
【００５５】
次に、ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドを用いて染色し、トランスイルミネーターを用いて可視化した。【００５６】
結果を図１に示す。【００５７】
図１は、本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲを行った際のＰＣＲパターンを示す図面代用写真である。【００５８】
図中、レーン１はサイズマーカー（１００〜１，０００ｂｐ）を、レーン２はサイズマーカー（５００〜５，０００ｂｐ）を、レーン３は既知のクラス１インテグロン検出用プライマーを用いて増幅した場合におけるＰＣＲパターンを、レーン４は既知のクラス２インテグロン検出用プライマーを用いて増幅した場合におけるＰＣＲパターンを、レーン５は既知のクラス３インテグロン検出用プライマーを用いて増幅した場合におけるＰＣＲパターンを、レーン６は配列番号１〜４のプライマーを一度に用いて増幅した場合におけるＰＣＲパターンを、それぞれ表す。なお、図中の矢印は、プライマー設計に基づき、検出が予想されるバンドの位置を表す。【００５９】
図１に示す通り、レーン３〜レーン５では、予想された位置にバンドが検出された。この結果は、実験に用いた下水汚泥に、クラス１、クラス２、クラス３のインテグロンが含まれていたことを示す。なお、クラス１及びクラス２のインテグロンについては、シーケンシングを行い、塩基配列を確認した。その他、レーン５では、予想された位置以外のバンドも検出された。これは、クラス３インテグロン検出用のプライマーを用いた場合の副産物であると推測する。【００６０】
一方、図１のレーン６に示す通り、本発明に係るプライマーを用いて増幅した場合、プライマー設計に基づき検出が予想される位置（４８０ｂｐ付近）に、ほぼ単一のバンドが検出された。
【実施例２】
【００６１】
実施例２では、実施例１において本発明に係るプライマーで増幅したＰＣＲ産物を制限酵素で処理し、その消化パターンからどのクラスのインテグロンが増幅されたか、検討を行った。【００６２】
まず、上記ＰＣＲ産物を、「ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス株式会社製、以下同じ）」を用いて、付属プロトコルに従い、精製した。最終の溶出スケールは２０μＬとした。【００６３】
次に、ＢｃｉＶＩ、ＥｃｉＩ、ＰｖｕＩＩの３種類の制限酵素を用いて、３７℃、１時間、その精製物を消化した。そして、その消化物を、アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドを用いて染色し、トランスイルミネーターを用いて可視化した。【００６４】
ここで、制限酵素処理を行った場合における予想されるバンドの位置について、図２を用いて以下説明する。図２は、本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲを行った場合に得られるＰＣＲ産物の制限酵素地図である。【００６５】
上述の通り、試料中にインテグロンが含まれている場合、ＰＣＲを行うと、プライマー設計に基づき、４８０ｂｐ付近にバンドが検出される。そのＰＣＲ産物について制限酵素処理を行うと、図２に示す通り、クラス１インテグロンが増幅された場合にはそれぞれ１１２、９５、１５８、１１７ｂｐに４つのバンドが、クラス２インテグロンが増幅された場合には４８２ｂｐの単一のバンドが、クラス３インテグロンが増幅された場合にはそれぞれ１１２、３７０ｂｐの２つのバンドが、クラス４インテグロンが増幅された場合にはそれぞれ２１０、２７５ｂｐの２つのバンドが、検出されることが予想される。【００６６】
結果を図３に示す。【００６７】
図３は本発明に係るプライマーを用いて行ったＰＣＲ産物を制限酵素処理した場合における消化パターンを示す図面代用写真である。【００６８】
図中、レーン１はサイズマーカー（１００〜１，０００ｂｐ）を、レーン２は実施例１で得たＰＣＲ産物（制限酵素未処理のもの；４８０ｂｐ）を、レーン３はサイズマーカー（１００〜１，０００ｂｐ）を、レーン４は実施例１で得たＰＣＲ産物を制限酵素処理した場合における消化パターンを、それぞれ表す。【００６９】
図３のレーン４では、少なくとも６本の明瞭なバンドが検出された。【００７０】
そのうち、矢印イで示すバンド（４８０ｂｐ付近）はクラス２インテグロン由来の断片、矢印ロで示すバンド（３７０ｂｐ付近）はクラス３インテグロン由来の断片、矢印ハで示すバンド（２１０ｂｐ付近）はクラス４インテグロン由来の断片、矢印ニで示すバンド（１６０ｂｐ付近）はクラス１インテグロン由来の断片であると推測する。【００７１】
この結果は、本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲを行った場合、クラス１〜クラス４の全てのインテグロンが増幅されたことを示す。即ち、本実験結果は、本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、複数の異なるクラスのインテグロンを同時に検出できることを示す。
【実施例３】
【００７２】
実施例３では、本発明に係るプライマーを用いて、下水汚泥以外の環境試料からのインテグロン検出を試みた。【００７３】
本実施例では、環境試料に浄化槽汚泥を用いた。浄化槽汚泥１〜２ｍＬを遠心（１０，０００ｒｐｍ、５分間）し、「Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」を用いて沈降画分から鋳型ＤＮＡ試料を調製し、実施例１と同様の手順でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドを用いて染色し、トランスイルミネーターを用いて可視化した。【００７４】
結果を図４に示す。【００７５】
図４は、環境試料に浄化槽汚泥を用いてＰＣＲを行った際のＰＣＲパターンを示す図面代用写真である。図中の各記載は図１のものと同様である。【００７６】
図４のレーン６に示す通り、本発明に係るプライマーを用いて増幅した場合、図１と同様、プライマー設計に基づき検出が予想される位置（４８０ｂｐ付近）に、ほぼ単一のバンドが検出された。【００７７】
続いて、単一のバンドとして検出されたＰＣＲ産物を実施例２と同様の手順で制限酵素処理し、その消化パターンからどのクラスのインテグロンが増幅されたか、検討を行った。【００７８】
結果を図５に示す。【００７９】
図５は環境試料に浄化槽汚泥を用いて行ったＰＣＲ産物を制限酵素処理した場合における消化パターンを示す図面代用写真である。図中の各記載は図３のものと同様である。【００８０】
図５のレーン４では、少なくとも６本の明瞭なバンドが検出された。この結果は、図３と同様、本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲを行った場合、クラス１〜クラス４の全てのインテグロンが増幅されたことを示す。即ち、本実験結果は、本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、下水汚泥以外の環境試料についても、複数の異なるクラスのインテグロンを同時に検出できることを示す。
【実施例４】
【００８１】
実施例４では、下水汚泥及び浄化槽汚泥由来のＰＣＲ産物についてクローン解析を行い、該試料中のインテグロンのクラスの多様性を調査した。【００８２】
まず、実施例１などと同様に、下水汚泥及び浄化槽汚泥１〜２ｍＬをそれぞれ遠心（１０，０００ｒｐｍ、５分間）し、「Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」を用いて、付属プロトコルに従い、沈降画分から鋳型ＤＮＡ試料を調製した。【００８３】
次に、各ＰＣＲ産物を「ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」を用いて精製し、クローニングベクターに組み込み、ライブラリーを作製した。そして、得られた各クローンについて、シーケンシングを行い、ＧｅｎＢａｎｋデータベースの配列データと照合した。【００８４】
結果を表３に示す。
【表３】
2010041444.tif 000004
【００８５】
表３に示す通り、クローン解析の結果、下水汚泥及び浄化槽汚泥のいずれにおいても、汚泥中に存在するインテグロンは、主にクラス１のものであった。特に、浄化槽汚泥では、塩基配列が解読できたクローンのうち、その大半（９４％）をクラス１インテグロンが占めた。また、下水汚泥では、クラス３インテグロンの配列が６クローン確認された。ＰＣＲ産物として得られたクラス１インテグロンの部分配列を配列番号９に、クラス３インテグロンの部分配列を１０に、それぞれ示す。【００８６】
ＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行った結果、塩基配列を決定した領域（４００〜５００塩基）の配列とＧｅｎＢａｎｋデータベースの配列データとの間で有意な相同性を示さなかったクローンが、下水汚泥由来のＰＣＲ産物中には１種類３１クローン（未知配列Ａ）、浄化槽汚泥由来のＰＣＲ産物中には２種類５クローン（未知配列Ｂ、Ｃ）存在した。ＰＣＲ産物として得られた未知配列Ａの配列を配列番号１１〜１６に（６つのバリエーション）、未知配列Ｂの配列を配列番号１７及び１８に（２つのバリエーション）、未知配列Ｃの配列を配列番号１９に、それぞれ示す。【００８７】
ＦＡＳＴＡを用いて再度相同性検索を行った結果、未知配列Ａは、大腸菌のプラスミド上に存在するクラス１インテグロンのインテグラーゼ領域の配列（アクセッション番号：ＥＵ６７５６８６）と６５．５％の相同性が認められた。【００８８】
同様に、未知配列Ｂは「Serratia marcescens」のクラス３インテグロンのインテグラーゼ領域の配列（アクセッション番号：ＡＦ４１６２９７）と６７．６％の相同性が認められた。【００８９】
同様に、未知配列Ｃは「Xanthomonas campestris」のインテグロンのインテグラーゼ領域の配列（アクセッション番号：ＡＦ３２４４８３）と６６．７％の相同性が確認されたほか、「Shigella flexneri」のクラス１インテグロンのインテグラーゼ領域（アクセッション番号：ＡＹ５７４１９５）とも６５．０％の相同性が確認された。【００９０】
これらの結果は、Ａ、Ｂ、Ｃの各未知配列がインテグロン類由来のバンドであることを示唆する。即ち、本発明が、新規・未知なインテグロンの検出にも有効であることを示唆する。
【実施例５】
【００９１】
実施例５では、下水汚泥及び浄化槽汚泥由来のＰＣＲ産物について、ＤＧＧＥ法による解析を試みた。【００９２】
まず、フォワードのプライマー（配列番号１〜４）の５’側上流に４０ｂｐのＧＣクランプを付加したプライマーをそれぞれ作製した。【００９３】
次に、下水汚泥又は浄化槽汚泥から実施例１などと同様の方法で鋳型ＤＮＡ試料を調製し、実施例１などと同様の手順・条件でＰＣＲを行った。フォワードのプライマーとしてＧＣクランプを付加した配列番号１〜４の各プライマーを、リバースのプライマーとして配列番号５〜８の各プライマーを、同時にＰＣＲカクテルに添加した。【００９４】
次に、そのＰＣＲ産物を用いて、ＤＧＧＥ解析を行った。ゲルには、ＤＮＡ変性剤の濃度勾配を２５〜６５％（７Ｍ尿素、４０％ホルムアミド（脱イオン）を１００％とする。）に調製した８％ポリアクリルアミドゲルを用いた。泳動槽を６０℃に保温し、泳動電圧１００Ｖで１２時間電気泳動を行った。泳動後、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（登録商標、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）でゲルを染色し、観察した。【００９５】
また、ゲル中のバンドを観察した後、それらのバンドを切り出し、ＤＮＡの塩基配列を決定した。ＤＮＡの回収は、切り出したゲルをＴＥ緩衝液１００μＬの中に一晩浸透し、ＤＮＡを溶出させて行った。塩基配列の決定方法は、実施例４と同様の方法で行った。【００９６】
結果を図６に示す。図６は、下水汚泥及び浄化槽汚泥由来のＰＣＲ産物について、ＤＧＧＥ解析を行った結果を示す電気泳動写真である。図中、レーン１は下水汚泥をサンプルに用いた場合の結果を、レーン２は浄化槽汚泥をサンプルに用いた場合の結果をそれぞれ表わす。「２５％〜６５％」は変性剤濃度勾配を、符号「イ」〜「ト」は、バンドの位置をそれぞれ表わす。【００９７】
図６に示す通り、レーン１（下水汚泥）では「イ」〜「ニ」の４つのバンドが、レーン２（浄化槽汚泥）では「ホ」〜「ト」の３つのバンドがそれぞれ観察された。【００９８】
各バンドについて、塩基配列を解読した結果、「イ」、「ロ」のバンド中のＤＮＡがクラス３インテグロンのであること、及び、判読した４８２塩基中８塩基で両者の配列が相違することが分かった。「イ」のバンドから得られたＤＮＡの配列（クラス３インテグロンの部分長配列）を配列番号２０に、「ロ」のバンドから得られたＤＮＡの配列（同じく、クラス３インテグロンの部分長配列）を配列番号２１に、それぞれ示す。【００９９】
また、レーン１の「ハ」、「ニ」のバンド中のＤＮＡ、及び、レーン２の「ホ」、「ヘ」、「ト」のバンド中のＤＮＡがクラス１インテグロンであること、及び、これらがすべて同じ塩基配列であることが分かった。これらのバンドから得られたＤＮＡの配列（クラス１インテグロンの部分長配列）を配列番号２２に示す。【０１００】
以上の結果は、本発明に係るＰＣＲ−ＤＧＧＥ法を用いることにより、インテグロンの多様性を可視化、プロファイリングできることを示す。
【実施例６】
【０１０１】
実施例６では、本発明に係るプライマー対について、各クラスのインテグロンに対する検出性能の選択性について、検討を行った。【０１０２】
まず、クラス１及びクラス２インテグロンのインテグラーゼ領域のＤＮＡを調製した。下水汚泥を用いて実施例１などと同様の方法で鋳型ＤＮＡ試料を調製し、既知のクラス１インテグロン検出用プライマー又は既知のクラス２インテグロン検出用プライマーを用いてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物を「ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧＦＸ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」を用いて精製した。【０１０３】
次に、（ａ）フォワードに配列番号１及び２の二種類のプライマー、リバースに配列番号５及び６の二種類のプライマー、（ｂ）フォワードに配列番号３及び４の二種類のプライマー、リバースに配列番号７及び８の二種類のプライマー、（ｃ）フォワードに配列番号１〜４の四種類のプライマー、リバースに配列番号５〜８の四種類のプライマー、のいずれかを用いて、下水汚泥由来のＤＮＡを鋳型として、実施例１などと同様の方法により、ＰＣＲを行った。【０１０４】
結果を図７及び図８に示す。それぞれ、図７はクラス１インテグロンのインテグラーゼ領域を鋳型ＤＮＡに用いてＰＣＲを行った際のＰＣＲパターンを示す図面代用写真、図８はクラス２インテグロンのインテグラーゼ領域を鋳型ＤＮＡに用いてＰＣＲを行った際のＰＣＲパターンを示す図面代用写真である。【０１０５】
図７中、レーン１はサイズマーカー（１００〜１，０００ｂｐ）を、レーン２はサイズマーカー（５００〜５，０００ｂｐ）を、レーン３は既知のクラス１インテグロン検出用プライマーを用いて増幅した場合におけるＰＣＲパターンを、レーン４はフォワードに配列番号１及び２の二種類のプライマー、リバースに配列番号５及び６の二種類のプライマーを用いて増幅した場合におけるＰＣＲパターンを、レーン５はフォワードに配列番号３及び４の二種類のプライマー、リバースに配列番号７及び８の二種類のプライマーを用いて増幅した場合におけるＰＣＲパターンを、レーン６はフォワードに配列番号１〜４の四種類のプライマー、リバースに配列番号５〜８の四種類のプライマーを用いて増幅した場合におけるＰＣＲパターンを、それぞれ表わす。【０１０６】
図８中、レーン３は既知のクラス２インテグロン検出用プライマーを用いて増幅した場合におけるＰＣＲパターンを表わす。他のレーンは図７と同様である。【０１０７】
両図中、星印は既知のクラス１又はクラス２インテグロン検出用プライマーを用いて増幅した場合における予想されるバンドの位置を、矢印は配列番号１〜８のプライマーを用いて増幅した場合に予想されるバンドの位置を、それぞれ表わす。【０１０８】
図７では、フォワードに配列番号１及び２の二種類のプライマー、リバースに配列番号５及び６の二種類のプライマーを用いてＰＣＲを行った場合、クラス１インテグロンを検出できたが（レーン４）、フォワードに配列番号３及び４の二種類のプライマー、リバースに配列番号７及び８の二種類のプライマーを用いてＰＣＲを行った場合、クラス１インテグロンを検出できなかった（レーン５）。【０１０９】
一方、図８では、フォワードに配列番号１及び２の二種類のプライマー、リバースに配列番号５及び６の二種類のプライマーを用いてＰＣＲを行った場合、及び、フォワードに配列番号３及び４の二種類のプライマー、リバースに配列番号７及び８の二種類のプライマーを用いてＰＣＲを行った場合、いずれも、クラス２インテグロンを検出できた（レーン４、レーン５）。【０１１０】
以上より、本発明に係るプライマー対は、単独で又は複数を混合して用いることにより、複数の異なるクラスのインテグロンを同時に検出できる。
【実施例７】
【０１１１】
実施例７では、本発明に係るプライマー対を用いて環境試料中からインテグロンを検出する際における検出感度について、検討した。【０１１２】
下水汚泥由来のＤＮＡ、浄化槽汚泥由来のＤＮＡ、及び、クラス１及びクラス２インテグロンのインテグラーゼ領域のＤＮＡを、それぞれ実施例１、３、６と同様の方法で調製した。【０１１３】
各ＤＮＡをそれぞれ１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇ、１０ｆｇ、１ｆｇ、１００ａｇになるように調整し、実施例１と同様の方法でＰＣＲを行った。そして、それらのＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドを用いて染色し、トランスイルミネーターを用いて可視化した。【０１１４】
その結果、いずれのサンプルでＰＣＲを行った場合でも、鋳型ＤＮＡを１００ｆｇ以上添加した場合に目的のバンドの増幅を確認できた。従って、環境試料から少なくとも１００ｆｇのＤＮＡを取得できる場合、本発明に基づいて、インテグロンを検出可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
上述の通り、インテグロンは、環境中にも広く存在し、また、薬剤暴露の頻繁な環境や、下水処理施設などで検出されることが知られている。そのため、例えば、下水処理などでも分解されずに残存したインテグロンによって薬剤耐性遺伝子クラスターが様々な細菌に付与されたり、未知の多剤耐性病原菌が出現したりする可能性がある。従って、そのようなリスクを未然に防止するために、環境中におけるインテグロンの汚染状況を検出する手段が必要である。【０１１６】
本発明では、一度の検出操作で、環境中の複数種類のインテグロンを同時に検出できるため、環境中における広汎な検査、リスク評価などが可能である。例えば、各種廃水や環境中におけるインテグロンの汚染状況の検査、堆肥などの安全性の評価、空調設備中の薬剤耐性菌の検出などに適用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】実施例１において、本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲを行った際のＰＣＲパターンを示す図面代用写真。
【図２】本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲを行った場合に得られるＰＣＲ産物の制限酵素地図。
【図３】実施例２において、本発明に係るプライマーを用いて行ったＰＣＲの産物を制限酵素処理した場合における消化パターンを示す図面代用写真。
【図４】実施例３において、環境試料に浄化槽汚泥を用いてＰＣＲを行った際のＰＣＲパターンを示す図面代用写真。
【図５】実施例３において、環境試料に浄化槽汚泥を用いて行ったＰＣＲ産物を制限酵素処理した場合における消化パターンを示す図面代用写真。
【図６】実施例５において、下水汚泥及び浄化槽汚泥由来のＰＣＲ産物について、ＤＧＧＥ解析を行った結果を示す電気泳動写真。
【図７】実施例６において、クラス１インテグロンのインテグラーゼ領域を鋳型ＤＮＡに用いてＰＣＲを行った際のＰＣＲパターンを示す図面代用写真。
【図８】実施例６において、クラス２インテグロンのインテグラーゼ領域を鋳型ＤＮＡに用いてＰＣＲを行った際のＰＣＲパターンを示す図面代用写真。
【図１】
2010041444.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010041444.tif 000011
【図８】
2010041444.tif 000012
【配列表】
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【国際調査報告】
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2010041444.tif 000014
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