【事件の表示】
　特許第２９９３９６７号「ダニアレルゲンのクローニング」の請求項１ないし４に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２９９３９６７号の請求項１ないし３に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第２９９３９６７号に係る出願は、１９８８年６月１７日（パリ条約による優先権主張１９８７年６月１７日、オーストラリア国）を国際出願日とする出願であって、平成１１年１０月２２日にその特許の設定登録がなされ、その後、原田清子及び沢村嘉朗より特許異議申立がなされ、取消理由通知がなされ、訂正請求がなされたものである。
II．訂正請求
１．訂正の内容
(1)　特許請求の範囲の請求項１に係る記載
「第１図もしくは第７図に示されたアミノ酸配列または第１図のアミノ酸残基１〜２２２もしくは第７図のアミノ酸残基１〜１２９に対応するその成熟部分を含むデルマトファゴイデス属のタンパクアレルゲンをコードする単離された核酸。」を、
「第１図に示されたアミノ酸配列または第１図のアミノ酸残基１〜２２２に対応するその成熟部分を含むデルマトファゴイデス属のタンパクアレルゲンをコードする単離された核酸。」と訂正する。  
(2)同請求項２に係る記載
「第１図または第７図に示されたヌクレオチド配列または第１図のヌクレオチド塩基１〜７３５もしくは第７図のヌクレオチド塩基７２〜５０６に対応するコード領域を含む、デルマトファゴイデス属のタンパクアレルゲンをコードする単離された核酸。」を、
「第１図に示されたヌクレオチド配列または第１図のヌクレオチド塩基１〜７３５に対応するコード領域を含む、デルマトファゴイデス属のタンパクアレルゲンをコードする単離された核酸。」と訂正する。
(3)同請求項３を削除する。
(4)同請求項４に係る記載
「タンパクアレルゲン又は抗原性ペプチドを製造する方法であって、
ａ）請求項１〜３のいずれかに記載の核酸で形質転換された宿主細胞を適当な培地中で培養して細胞および該タンパクアレルゲンまたはその抗原性ペプチドを含む培地の混合物を製造する工程；および
ｂ）該混合物を精製して単離されたタンパクアレルゲンまたは抗原性ペプチドを製造する工程を含む方法。」を、
「タンパクアレルゲン又は抗原性ペプチドを製造する方法であって、
ａ）請求項１または２に記載の核酸で形質転換された宿主細胞を適当な培地中で培養して細胞および該タンパクアレルゲンまたはその抗原性ペプチドを含む培地の混合物を製造する工程；および
ｂ）該混合物を精製して単離されたタンパクアレルゲンまたは抗原性ペプチドを製造する工程を含む方法。」と訂正する。
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正事項(1)、(2)は、択一的記載の要素である「第７図」、「第７図のアミノ酸残基１〜１２９」、及び「第７図のヌクレオチド塩基７２〜５０６」を削除するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当し、同(3)は、請求項を削除するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当し、また、同(4)は、(1)乃至(3)の訂正に伴う訂正である。
　そして、これらの訂正は新規事項に該当せず、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
３．むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法１２０条の４,２項、及び同条３項で準用する１２６条２項、３項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
　
III．特許異議申立
１．原田清子よりの特許異議申立
　特許異議申立人 原田清子は、甲第１号証乃至甲第３号証を提出し、（１）訂正前の本件請求項１乃至３に係る発明は、甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから特許法２９条２項の規定に違反する、或いは、（２）同請求項３に係る発明に関し、明細書又は図面の記載が不備であるから同法３６条３項及び４項に規定の要件を満たしていない、と主張している。
　　　　　　　　　記
甲第１号証：Mite Allergy-A World-Wide Problem、The UCB Institute of Allergy、pp.27-29,09-1987
甲第２号証：Int.Archs Allergy appl.Immun.,vol.83,pp.384-389,1987
甲第３号証：オーストラリア特許出願明細書（PI12523、1987年6月17日出願）
Ａ．甲各号証の記載内容
　甲第１号証には、「表３．ダニアレルゲンのＮ−末端配列」の「第２群アレルゲン」の項に、
「DerpII：D1QVDVKD?AN10HEIKKVLPG20     
　　　　　　　・・・
　DerpII：?HGSEP?IIH30RGKPFQLEAV40    」が、
　甲第２号証には、家塵埃ダニ、デルマトファゴイデス・プテロニッシヌスからpolyA+mRNAを抽出し、in vitro翻訳を行うこと、抗血清を得ること、抗ヒトIgE特異的試薬を用いてin vitro翻訳産物を免疫沈降し得ることが、それぞれ記載されている。
（なお、甲第３号証は、本件の優先権主張の基礎とされたオーストラリア特許出願明細書である。）
Ｂ．判断
（１）特許法２９条２項について
　特許異議申立人は、オーストラリアにおける出願明細書（甲第３号証）には、DerpＩに関する発明が記載されているのみであり、DerpIIアレルゲンのアミノ酸配列、またはこれをコードする核酸配列は、勿論のこと、DerpII自体に関する記載が存在しないから、DerpIIに係る発明についての特許要件を判断すべき時点は、優先権の主張が認められない現実の出願日を基準とすべきであり、そうすると、DerpIIをコードする核酸に係る訂正前の請求項１乃至２に係る発明は、甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものである、と主張している。
　しかし、訂正後の本件特許請求の範囲の請求項１乃至２に係る発明（以下、「本件発明１乃至２」という。）は、「第１図に示されたアミノ酸配列または第１図のアミノ酸残基１〜２２２に対応するその成熟部分を含むデルマトファゴイデス属のタンパクアレルゲンをコードする単離された核酸」乃至「第１図に示されたヌクレオチド配列または第１図のヌクレオチド塩基１〜７３５に対応するコード領域を含む、デルマトファゴイデス属のタンパクアレルゲンをコードする単離された核酸」であるところ、「第１図」は、本件明細書の記載に徴し、デルマトファゴイデス・プテロニシヌス由来の「DerpI」に係るアミノ酸配列或いはヌクレオチド配列に関するものであって、「DerpII」に係るアミノ酸配列或いはヌクレオチド配列は含まれないことになった。
　したがって、もはや特許異議申立人の上記主張は採用できないから、本件発明１及び２は、甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
　また、本件請求項３に係る発明（以下、「本件発明３」という。）は、本件発明１及び２を引用する「方法」に関するものであるから、本件発明１及び２についての判断と同様の理由により、甲第１号証及び甲第２号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
（２）特許法３６条３項及び４項について
　訂正前の請求項３は、上記訂正請求にて削除されたので、もはや特許法３６条３項及び４項に関する異議申立には理由がない。
２．沢村嘉朗よりの特許異議申立
　特許異議申立人 沢村嘉朗は、甲第１号証乃至甲第６号証を提出し、（１）訂正前の本件請求項１乃至４に係る発明は、特許法１７条の２、３項の規定に違反する、（２）同請求項１乃至４に係る発明は、甲第１号証乃至甲第６号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから特許法２９条２項の規定に違反する、或いは、（３）同請求項３に係る発明に関し、明細書又は図面の記載が不備であるから同法３６条４項に規定の要件を満たしていない、と主張している。
　　　　　　　　　記
甲第１号証：特表平３−５０１９２０号公報
甲第２号証：本件優先権書類
甲第３号証：Mite Allergy-A World-Wide Problem、The UCB Institute of Allergy、pp.27-29,09-1987
甲第４号証：Int.Archs Allergy appl.Immun.,vol.83,pp.384-389,1987
甲第５号証：「最新遺伝子操作実験実用ハンドブック」（昭和60年11月8日ジャテック出版発行）
甲第６号証：「特定技術分野の審査の運用指針」「第２章 生物関連発明」
Ａ．判断
（１）特許法１７条の２，３項について
　特許異議申立人は、訂正前の請求項３に係る「請求項１または２に記載の核酸によってコードされるタンパクアレルゲンを認識する抗体によって認識されるタンパクアレルゲンをコードする核酸」は本件特許の願書に最初に添付した明細書又は図面には全く開示がない事項である、と主張している。
　しかし、訂正前の請求項３は、上記訂正請求にて削除されたので、もはや特許法１７条の２，３項に関する異議申立には理由がない。
（２）特許法２９条２項について
　甲第３号証及び甲第４号証は、「１．」の甲第１号証及び甲第２号証に相当し、甲第５号証には、一般的な遺伝子組換え技術が記載されているものの、「DerpI」に関し言及するところは全くなく、また、甲第６号証は、「特定技術分野の審査の運用指針」である。
　そうすると、本件発明１乃至３は、甲第３号証乃至甲第６号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
　なお、甲第１号証は、本件の公表公報、及び甲第２号証は、本件優先権書類であるところ、「１．（１）」で判断したように、本件発明１乃至３は、甲第１号証及び甲第２号証を根拠に、本件発明１乃至３が、当業者にとって容易に発明をすることができたとはいえない。
（３）特許法３６条４項について
　訂正前の請求項３は、上記訂正請求にて削除されたので、もはや特許法３６条４項に関する異議申立には理由がない。
３．まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明１乃至３についての特許を取り消すことはできない。
　また他に本件発明１乃至３についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年１０月１６日（２００１．１０．１６）
【訂正の要旨】
（訂正の要旨）
　特許請求の範囲請求項１乃至４を特許請求の範囲の減縮を目的として以下のとおり訂正する。
（１）　特許請求の範囲の請求項１に係る記載「第１図もしくは第７図に示されたアミノ酸配列または第１図のアミノ酸残基１〜２２２もしくは第７図のアミノ酸残基１〜１２９に対応するその成熟部分を含むデルマトファゴイデス属のタンパクアレルゲンをコードする単離された核酸。」を、「第１図に示されたアミノ酸配列または第１図のアミノ酸残基１〜２２２に対応するその成熟部分を含むデルマトファゴイデス属のタンパクアレルゲンをコードする単離された核酸。」と訂正する。
（２）同請求項２に係る記載「第１図または第７図に示されたヌクレオチド配列または第１図のヌクレオチド塩基１〜７３５もしくは第７図のヌクレオチド塩基７２〜５０６に対応するコード領域を含む、デルマトファゴイデス属のタンパクアレルゲンをコードする単離された核酸。」を、「第１図に示されたヌクレオチド配列または第１図のヌクレオチド塩基１〜７３５に対応するコード領域を含む、デルマトファゴイデス属のタンパクアレルゲンをコードする単離された核酸。」と訂正する。
（３）同請求項３を削除する。
（４）同請求項４に係る記載「タンパクアレルゲン又は抗原性ペプチドを製造する方法であって、ａ）請求項１〜３のいずれかに記載の核酸で形質転換された宿主細胞を適当な培地中で培養して細胞および該タンパクアレルゲンまたはその抗原性ペプチドを含む培地の混合物を製造する工程；およびｂ）該混合物を精製して単離されたタンパクアレルゲンまたは抗原性ペプチドを製造する工程を含む方法。」を、「タンパクアレルゲン又は抗原性ペプチドを製造する方法であって、ａ）請求項１または２に記載の核酸で形質転換された宿主細胞を適当な培地中で培養して細胞および該タンパクアレルゲンまたはその抗原性ペプチドを含む培地の混合物を製造する工程；およびｂ）該混合物を精製して単離されたタンパクアレルゲンまたは抗原性ペプチドを製造する工程を含む方法。」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
ダニアレルゲンのクローニング
【発明の詳細な説明】
　本発明は、ダニアレルゲンのクローニングに関するものであり、詳しくは、家塵埃ダニ（ハウス・ダスト・マイト）アレルゲンをコードしているＤＮＡのクローニングおよび発現に関するものである。
　デルマトファゴイデス（
Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ
Ｄ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ
Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ
Ｄｅｒｐ
　ほとんどの人口の５〜１０％が喘息、即ち、家塵埃ダニ、デルマトファゴイデス・プテロニシヌスに対するアレルギーと密接に関連していることが多い症状を呈する。この型のアレルギーは、ダニの成分と反応するＩｇＥ抗体によって媒介される。したがって、ハチ刺創に対する類似のアレルギーを、ハチ毒物を繰返し投与し、漸次的に増量することによって脱感作することができるのとほとんど同じ様にして、喘息に関して脱感作治療が成功するであろうという可能性がある。
　したがって、本発明は、このような脱感作治療およびアレルギーの検出に関する診断試験に用いるのに適している家塵埃ダニのアレルゲン、特に、
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
　本発明は、デルマトファゴイデス属の家塵埃ダニのアレルゲンの抗原性を示すポリペプチドもしくはその少なくとも１つのエピトープを含むペプチドとして発現され得るヌクレオチド配列、またはストリンジェンシー（厳格性）の高い条件下でこのような配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子を提供するものである。１つの具体的な態様では、このヌクレオチド配列は家塵埃ダニの主要な
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
　本発明に至る研究において、デルマトファゴイデス・プテロニシヌス由来の
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ　ｍｉｃｒｏｃｅｒｕｓ
Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ　ｍａｙｎｅｉ
　また、本発明は、上記のようなヌクレオチド配列およびこれと機能的に連結している発現調節配列を含むバクテリオファージのような発現ベクターを提供するものでもある。さらに、本発明は、上記発現ベクターを含む宿主細胞を提供するものである。
　さらに、本発明は、デルマトファゴイデス属の家塵埃ダニのアレルゲン、特に主要な
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
　上記合成タンパクまたはポリペプチド、特に上記融合タンパクの製造方法は、上記発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程、および培養物から合成タンパクまたはポリペプチドを回収する工程からなる。
　本明細書で用いる「合成」という用語は、本明細書に記載のヌクレオチド配列のクローニングおよび発現によって産生されたタンパクまたはポリペプチドに用いる。
　本発明に従って産生された合成タンパクもしくはポリペプチド、即ち「合成アレルゲン」は、天然アレルゲンの抗原性を示す。例えば、主要なアレルゲン
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
　具体的には、合成アレルゲンは、天然ダニアレルゲンとの抗原類似性およびダニに対するアレルギーを有するヒトの血清から得たＩｇＥと反応する能力によって示されるように、インビトロおよびインビボでの診断試薬として用いることができる。また、これらは、成熟
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
　本発明のその他の特徴は、発明を例示するために記載した以下の実施例から明らかとなろう。図面については、以下のとおりである。
　第１図は、ｃＤＮＡ　λｇｔ１１ｐ１（１３Ｔ）のヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配列を示す。右側の番号は、ヌクレオチドの位置であり、配列の上の番号はアミノ酸の位置である。正のアミノ酸残基番号は、トレオニンから始まる分泌された成熟
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
　第２図は、クローン　λｇｔ１１ｐ１（１３Ｔ）のｃＤＮＡ挿入物の制限地図およびＤＮＡ配列決定のストラテジーを示す。矢印は、配列が読まれた方向を示す。
　第３図は、
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｆ
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｆ
　第４図は、抗
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
　第５図は、アレルギ性血清中のＩｇＥとクローンｐＧＥＸ−ｐ１（１３Ｔ）との反応を示す。ｐＧＥＸまたはｐＧＥＸ−ｐ１の一夜培養液をブロス中１／１０に希釈し、３７℃で２時間増殖させた。これらをＩＰＴＧによって誘発し、３７℃で２時間増殖させた。バクテリアをペレット化し、培養培地の容量の１／１０になるようにＰＢＳ中に再懸濁させた。バクテリアを凍結／解凍および音波処理によって溶菌した。ダニ−アレルギー性血清または非アレルギー性血清を用いて、これらのリゼイト２μｌでラジオイムノ・ドット−ブロットを行った。１列目のドットは、ｐＧＥＸを含む大腸菌からのものであり、２〜４列目のドットは、ＰＧＥＸ−ｐ１（１３Ｔ）によって感染した大腸菌の異なる培養物からのものである。ｐＧＥＸ−Ｐ１（１３Ｔ）に対する反応性は、非アレルギー性血清ではなくアレルギー性血清中のＩｇＥとで見られる。ベクター対照に対する反応性または非アレルギー性血清との反応性は見られなかった。
　第６図は、プラークラジオイムノアッセイにおいて
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
　第７図は、λｇｔ１１ｐＩＩ（Ｃｌ）のｃＤＮＡのヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配列を示す。右側の番号はヌクレオチドの位置であり、上の番号はアミノ酸の位置である。アミノ酸に関する正の番号は、既知の
Ｄｅｒｐ
　第８図は、
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｆ
Ｄｅｒｆ
　
実施例１
材料および方法
ｃＤＮＡのクローニングおよび発現
　コモンウエルス・シーラム・ラボラトリーズ（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）［パークビル、オーストラリア］によって培養されたダニ　デルマトファゴイデス・プテロニシヌスからポリアデニル化ｍＲＮＡを単離し、キット［アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、インターナショナル、バックス］を用いてＲＮＡ−ａｓｅ　Ｈ法（５）によってｃＤＮＡを合成した。ＥｃｏＲＩリンカーを付加した後、ｃＤＮＡをλｇｔ１１にライゲートし、大腸菌Ｙ１０９０（ｒ−）［プロメガ・バイオテック（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）、マディソン、ウィスコンシン］に植えつけ、５×１０５の組換え体ライブラリーをつくった。ウサギ抗−
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
　すなわち、ゲル濾過、クロマトフォーカス処理（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）、およびＴＳＫ　３０００　ＳＷカラムによる高速液体タンパククロマトグラフィー、次いで高速逆相液体クロマトグラフィーによって
Ｄｅｒｐ
ゲノムＤＮＡの単離
　改良グアニジウム−ＨＣｌ／塩化セシウム（ＣｓＣｌ）法（１５）によってダニゲノムＤＮＡの抽出を行った。液体窒素および砂の存在下、生きているダニ１０ｇを粉砕し、ペーストを形成した。次いで、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に入れた６Ｍグアニジン・塩酸塩８ｍｌを添加し、混合物をホモジナイズし、ソーバル（Ｓｏｒｖａｌ）ＳＳ３４ローター中、１０，０００ｒｐｍで３０分間回転させた。上清を回収し、ＣｓＣｌパッド（１０ｍＭ　ＥＤＴＡ中、４．８Ｍ　ＣｓＣｌ５ｍｌ）上に積層し、ＳＷ４１　Ｔ１ローター［ベックマン・インストゥルメンツ・インコーポレイテッド（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）、フラートン、カリフォルニア］中、１５℃で１６時間、３７，０００ｒｐｍで遠心分離した。相内のＤＮＡバンドを回収し、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）ＨＣｌ／１ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）中、１：１５に希釈した。標準的な方法によって、ＣｓＣｌ中のゲノムＤＮＡのバンディングを行った。
λｇｔ１１ｐ１　ｃＤＮＡクローンからのＤＮＡの単離
　迅速な単離方法によって、λｇｔ１１ｐ１クローン由来のファージＤＮＡを調製した。透明なファージプレートリゼイト（１ｍｌ）と、２．５Ｍ　ＮａＣｌに入れた２５重量／容量％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）２７０μｌとを混合し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、混合物をマイクロヒュージ［エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ連邦共和国］中で５分間回転させ、上清を除去した。このペレットを、１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１００ｍＭ　ＮａＣｌを含有する１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００μｌに溶解した。このＤＮＡ調製物をフェノール／クロロホルム（１：１）で３回抽出し、ＤＮＡをエタノールによって沈澱させた。
ＤＮＡハイブリダイゼーション
　ニック翻訳によって３２Ｐで核酸を放射性標識化した（１０）。供給者によって推奨された条件を用いて、適切な制限酵素でＤＮＡ試料を消化した。ゼータ−プローブ（Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ）膜［バイオ−ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、リッチモンド、カリフォルニア］を用いてサザーン・ブロットを作成した。製造者の推奨に従って、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、ポストハイブリダイゼーション洗浄を行った（ブレチン１２３４、バイオ−ラッド・ラボラトリーズ）。
クローニングおよびＤＮＡ配列
　クローンλｇｔ１１ｐ１からプラスミドｐＵＣ８へ、０．８ｋｂ　ｃＤＮＡ挿入物をクローンするために、ＥｃｏＲＩ制限酵素でファージＤＮＡを消化し、次いで、ＥｃｏＲＩ消化ｐＵＣ８　ＤＮＡにライゲートし、大腸菌ＪＭ８３を形質転換するために用いた。得られた組換えプラスミドをｐＨＤＭ　１と命名した。
　ＤＮＡ配列分析用のクローンを得るために、ｃＤＮＡ挿入物をｐＨＤＭ　１から単離し、Ｍ１３から誘導された配列決定用ベクターｍｐ１８およびｍｐ１９とライゲートした（１６）。大腸菌ＪＭ１０７を用いて形質転換を行い、ジデオキシヌクレオチド鎖成長停止反応法によって配列決定を行った（１１）。
結果
　いくつかのファージクローンがウサギの抗
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
　
Ｄｅｒｐ
　ヌクレオチド分析によって予想されるアミノ酸配列を第１図に示す。タンパクのデータ−ベースを調査することによって、
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
　８５７−ｂｐ　ｃＤＮＡ挿入物を放射能標識化し、家塵埃ダニからのＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡのサザーンブロットに対してハイブリダイズし、１．５、０．５および０．３５ｋｂのバンドに対するハイブリダイゼーションが見られた（データーは示さない）。ｃＤＮＡ挿入物の制限酵素地図に示すように（第２図）、内部ＥｃｏＲＩ部位がなく、観察された複数のハイブリダイゼーションバンドは、
Ｄｅｒｐ
　Ｎ−末端は、デルマトファゴイデス・ファリナーエ（
Ｄｅｒｆ
　λｇｔ１１ｐ１（１３Ｔ）によって産生されるタンパクを試験するために、Ｙ１０８９（ｒ−）をファージで溶原化し、この細菌を３０℃でブロス培養物中で増殖させた。温度切替えおよびイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によってファージを誘導し（６）、培養物の容量の１／２０になるようにバクテリアをＰＢＳ中に懸濁させて、抗原調製のために音波処理した。７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって試験して、λｇｔ１１ｐ１（１３Ｔ）がＭｒ　１１６Ｋβ−ガラクトシダーゼバンドを生じず、代わりに、２４ｋＤａ部分に相当する
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
　
実施例２
アレルギー性血清からのＩｇＥと反応性のあるＤｅｒｐ　Ｉ　ｃＤＮＡ産物の発現
　
Ｄｅｒｐ
　
実施例３
Ｄｅｒｐ　ＩをコードするｃＤＮＡクローンからの産物での処理によるＤｅｒｐ　Ｉに対するＩｇＥ抗体応答の抑制
　λｇｔ１１ｐ１（１３Ｔ）によって溶原化した大腸菌を増殖させ、温度切替えによって誘導し、２４ｋｄ　
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
２日前にマウスに前注射し、０日目に
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
＊マン・ホワイトネイ（Ｍａｎｎ　Ｗｈｉｔｎｅｙ）分析。
　
実施例４
λｇｔ１１ｐ１（１３Ｔ）からのｃＤＮＡのフラグメントによるＤｅｒｐ　Ｉ抗原決定因子の発現
　
Ｄｅｒｐ
ＥｃｏＩ
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
　
実施例５
主要なダニアレルゲンＤｅｒｐ　ＩＩをコードしているｃＤＮＡのクローニングおよび発現
　前述のλｇｔ１１におけるデルマトファゴイデス・プテロニシヌスｃＤＮＡライブラリーを、ニトロセルロースリフト（６）を用いてプラークラジオイムノアッセイによってスクリーニングした。特異的抗血清を用いる代わりに用いた血清は家塵埃ダニに対してアレルギー性であるヒトからのものであった。血清（１／２に希釈）を大腸菌で吸収した。反応性を検出するため、１２５Ｉ標識化モノクローナル抗ＩｇＥを用いた［２×１０６ｃｐｍ／ｍｌを有する３０ｎｇ／ｍｌ（計数効率約３０％）］。１時間後、フィルターを洗浄し、オートラジオグラフィーにかけた。この方法を用いて、ヒトＩｇＥと反応する４つのクローンを単離した。それらがＤＮＡハイブリダイゼーションと関連しており、アレルギー性血清のパネルに対して同一の反応性パターンを有することがわかった。第６図には、アレルギー性血清（ＡＭ）（最上列）または非アレルギー性（ＷＴ）に対するプラークラジオイムノアッセイにおけるＩｇＥ反応性を示す。ここで、クローン１、３および８は、アレルギー性血清に対してだけ、強く反応する。ａｍｐ　１セグメント（１列目にある）は、λｇｔ１１ベクター対照である。最下列は１２５Ｉブドウ球菌タンパクＡによって測定されたウサギ抗
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｐ
Ｄｅｒｆ
Ｄｅｒｐ
引用文献
（５７）【特許請求の範囲】
１．
第１図
第１図のアミノ酸残基１〜２２２
２．
第１図
第１図のヌクレオチド塩基１〜７３５
３
ａ）
請求項１または２
ｂ）該混合物を精製して単離されたタンパクアレルゲンまたは抗原性ペプチドを製造する工程
を含む方法。