(57)【要約】  Zc3h12a遺伝子インヒビター、及びZc3h12aタンパク質インヒビターからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分として含む組成物は、免疫アジュバントとして使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Zc3h12a遺伝子インヒビター、及びZc3h12aタンパク質インヒビターからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分として含む免疫アジュバント組成物。
【請求項２】
さらに、その他の免疫アジュバントを含む請求項１に記載の免疫アジュバント組成物。
【請求項３】
Zc3h12a遺伝子インヒビター、及びZc3h12aタンパク質インヒビターからなる群より選ばれる少なくとも１種と、ワクチン抗原とを含むワクチン組成物。
【請求項４】
さらに、その他の免疫アジュバントを含む請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
請求項３に記載のワクチン組成物を動物に投与する、動物の免疫方法。
【請求項６】
個体から採取された免疫細胞と、Zc3h12a遺伝子インヒビター、及びZc3h12aタンパク質インヒビターからなる群より選ばれる少なくとも１種とを接触させて、免疫細胞を賦活化させる工程を含む、活性免疫細胞の製造方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法で製造された活性免疫細胞。
【請求項８】
ワクチン抗原の免疫原性を高めるための、Zc3h12a遺伝子インヒビター、及びZc3h12aタンパク質インヒビターからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物。
【請求項９】
Zc3h12a遺伝子インヒビター、及びZc3h12aタンパク質インヒビターからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物の、免疫アジュバントの製造のための使用。
【請求項１０】
Zc3h12a遺伝子インヒビター、及びZc3h12aタンパク質インヒビターからなる群より選ばれる少なくとも１種とワクチン抗原とを混合する工程を含む、ワクチン抗原の免疫原性を高める方法。
【請求項１１】
免疫賦活のための、Zc3h12a遺伝子インヒビター、及びZc3h12aタンパク質インヒビターからなる群より選ばれる少なくとも１種と、ワクチン抗原とを含む組成物。
【請求項１２】
Zc3h12a遺伝子インヒビター、及びZc3h12aタンパク質インヒビターからなる群より選ばれる少なくとも１種と、ワクチン抗原とを含む組成物の、ワクチン組成物の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫アジュバント組成物、ワクチン組成物、非ヒト動物の免疫方法、並びに活性免疫細胞製剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アジュバントはワクチン抗原と混合して投与されることにより、自然免疫を活性化したり、抗原提示させることにより抗原特異的な免疫反応の誘導を助ける。
動物実験用には種々のアジュバントが知られている。生物に由来しない一般化合物からなるアジュバントとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、ミョウバン、カルボキシビニルポリマーなどが、病原体などの抗原を吸着する性質を利用してアジュバントとして用いられている。しかし、これらの沈降性アジュバントは、接種部位が硬結し易い。また、流動パラフィン、ラノリン、フロイントなどが、油性物質が抗原水溶液を包んでミセルを形成する性質を利用してアジュバントとして用いられている。しかし、これらの油性アジュバントとワクチン抗原との混合物はミセルを含む乳濁液になるため、粘性が高く、接種時に疼痛を引き起こし、また、接種部位が硬結し易い。【０００３】
この他、エンドトキシンショックなどを引き起こし難い比較的安全な細菌である、Mycobacterium bovis BCGも利用されているが、BCG菌体は接種した部位に潰瘍を生じさせ易い。
一般に効果の強いアジュバントは毒性も強いため、安全でかつ効果的なアジュバントの開発が求められている。
天然物由来のアジュバントとして、特許文献１には、天然型のホスホジエステルバックボーン及びポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドと、分子量25000以上のβ-1,3-グルカンとからなる核酸／多糖複合体が、Th1細胞活性を優位にするサイトカインや抗体の産生を促進し、免疫アジュバントとして利用できることが示唆されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８-１００９１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新規な免疫アジュバント組成物を提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために研究を重ね、以下の知見を得た。
(i)  Zc3h12a遺伝子を破壊したホモノックアウトマウス（Zc3h12a-/-マウス）では、形質細胞数が増加しているとともに、肺への浸潤が認められた。また、血清中の免疫グロブリン濃度が増大し、自己抗体の生産が見られた。
(ii)  また、殆どのZc3h12a-/-マウスの脾臓のT細胞は、エフェクター／メモリー特性を示し、T細胞レセプター刺激に対する応答においてインターフェロンγを生産した。このように、Zc3h12aを破壊することにより、獲得免疫系が活性化し、形質細胞、メモリーT細胞が増加した。
(iii)  Zc3h12a-/- マウスから単離したマクロファージは、TLR(Toll-like receptor)リガンドに対する応答においてIL-6、IL-12p40の産生が大きく亢進していた。一方、TLRリガンドに対する応答においてTNFの生産は亢進していなかった。このように、Zc3h12aを破壊することにより、特定のサイトカインの産生が亢進した。
(iv)  Zc3h12a蛋白質はZinc finger領域を有し、RNAと結合した。
(iv)  Zc3h12a遺伝子は、N-末端ヌクレアーゼ領域と推定される領域を有しており、リボヌクレアーゼ活性を示す蛋白を発現した。特定のmRNAは分解することにより恒常性を維持しているところ、Zc3h12a-/-マウスでは、Zc3h12aのリボヌクレアーゼ活性が欠如することにより、特定のサイトカインを含む分子のmRNAの分解が抑制されて、その産生を亢進している。
(v)  従って、Zc3h12a遺伝子又はZc3h12a蛋白質のインヒビターは、免疫アジュバントとして好適に使用できる。【０００７】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の免疫アジュバント組成物、ワクチン組成物、並びに活性化免疫細胞製剤及びその製造方法を提供する。
項１．  Zc3h12a遺伝子インヒビター、及びZc3h12aタンパク質インヒビターからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分として含む免疫アジュバント組成物。
項２．  さらに、その他の免疫アジュバントを含む項１に記載の免疫アジュバント組成物。
項３．  Zc3h12a遺伝子インヒビター、及びZc3h12aタンパク質インヒビターからなる群より選ばれる少なくとも１種と、ワクチン抗原とを含むワクチン組成物。
項４．  さらに、その他の免疫アジュバントを含む項３に記載のワクチン組成物。
項５．  項３又は４に記載のワクチン組成物を非ヒト動物に投与する、動物の免疫方法。
項６．  個体から採取された免疫細胞と、Zc3h12a遺伝子インヒビター、及びZc3h12aタンパク質インヒビターからなる群より選ばれる少なくとも１種とを接触させて、免疫細胞を賦活化させる工程を含む、活性免疫細胞の製造方法。
項７．  項６に記載の方法で製造された活性免疫細胞。
項８．  ワクチン抗原の免疫原性を高めるための、Zc3h12a遺伝子インヒビター、及びZc3h12aタンパク質インヒビターからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物。
項９．  Zc3h12a遺伝子インヒビター、及びZc3h12aタンパク質インヒビターからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物の、免疫アジュバントの製造のための使用。
項１０．  Zc3h12a遺伝子インヒビター、及びZc3h12aタンパク質インヒビターからなる群より選ばれる少なくとも１種とワクチン抗原とを混合する工程を含む、ワクチン抗原の免疫原性を高める方法。
項１１．  免疫賦活のための、Zc3h12a遺伝子インヒビター、及びZc3h12aタンパク質インヒビターからなる群より選ばれる少なくとも１種と、ワクチン抗原とを含む組成物。
項１２．  Zc3h12a遺伝子インヒビター、及びZc3h12aタンパク質インヒビターからなる群より選ばれる少なくとも１種と、ワクチン抗原とを含む組成物の、ワクチン組成物の製造のための使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の免疫アジュバント組成物は、Zc3h12a遺伝子、又はZc3h12a蛋白質の機能を阻害することにより、自然免疫に加えて獲得免疫も賦活化する。従来のアジュバントは、主に、自然免疫のみ賦活化するものであったが、本発明の免疫アジュバント組成物は、自然免疫のみならず獲得免疫も賦活化するため、強力なアジュバントとなる。
また、Zc3h12a遺伝子、又はZc3h12a蛋白質のインヒビターであるため、siRNAのような核酸や低分子化合物とすることができ、安全性の高いものを設計できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】LPS誘導性に発現する遺伝子（LPS誘導性遺伝子）を、ノーザンブロットにより調べた結果を示す図（ａ）、及びZc3h12aの細胞内局在性をウェスタンブロットによる調べた結果を示す図（ｂ）である。
【図２】ａは、マウスZc3h12a遺伝子（Wild-type allele）、ターゲティングベクター（Targeting construct）及びターゲットアレル（Targeted allele）の模式図である。ｂは、ヘテロ接合体の交雑の子孫のサザンブロット分析の結果を示す図である。ｃは、LPSで刺激した野生型(WT)及びZc3h12a-/-マクロファージのＲＮＡをRT-PCRにより分析した結果を示す図である。
【図３】aは、野生型（Zc3h12a+/+）及びZc3h12a-/-マウスの生存率を調べた結果を示す図である。ｂは、野生型及びZc3h12a-/-マウスの脾臓（上）、腸間膜リンパ節（左下）及び鼠径リンパ節（右下）の切片の組織写真である。ｃは、野生型及びZc3h12a-/-マウスの肺、脾臓及びリンパ節の組織の組織写真である。
【図４】野生型(WT)及びZc3h12a-/-マウスの肝臓及び膵臓切片の組織写真である。
【図５】Zc3h12a-/-マウスにおける血清免疫グロブリン値(a)、及び抗核抗体及び抗二本鎖DNA抗体の生産（ｂ）の測定結果、並びに組織学的研究の結果（ｃ）を示す図である。
【図６】Zc3h12a-/-マウスの脾細胞を抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した結果を示す図である。
【図７】マウスの脾細胞を抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した結果を示す図である。
【図８】脾臓のＴ細胞における、CD3/CD28刺激への応答におけるインターフェロンγ（ａ）、IL-17（ｂ）及びIL-4（ｃ）の生産を調べた結果を示す図である。
【図９】マウスの脾細胞を抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した結果を示す図である。
【図１０】マウスの脾細胞を抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した結果を示す図である。
【図１１】野生型及びZc3h12a-/-骨髄キメラの脾細胞を抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した結果を示す図である。
【図１２】aは、刺激された腹腔マクロファージ由来のIL-6、IL-12p40及びTNF濃度を、ELISAで測定した結果を示す図である。ｂは、LPS刺激されたマクロファージ由来のRNAを用いて、ノーザンブロットによりIL-6、KC、TNF、IκBα、RANTES、IP-10及びβアクチンの発現を調べた結果を示す図である。
【図１３】野生型及びZc3h12a-/-の腹腔マクロファージのマイクロアレイ分析に基づき選択されたLPS誘導性遺伝子の発現のHeat map表示である。
【図１４】野生型及びZc3h12a-/-マクロファージにおけるLPS誘導性遺伝子のマイクロアレイ分析の結果得られたheat map表示及び樹状図である。
【図１５】電気泳動移動度シフト解析（EMSA）によって、LPSで刺激したZc3h12a-/-マクロファージの核抽出物における転写因子−DNA結合活性を測定した結果を示す図である。
【図１６】aは、Zc3h12aのmRNAを不安定化機構を調べたノーザンブロット分析の結果を示す図である。ｂは残存mRNAレベルの経時変化を示す図である。
【図１７】HEK293 Tet-off細胞に、プラスミドを形質導入し、IL-6の3’-UTRにおけるZc3h12a応答領域の決定するためにノーザンブロット分析を行なった結果を示す図（ａ）及び残存mRNAレベルの経時変化を調べた結果を示す図（ｂ）である。
【図１８】IL-6の3’-UTR及びその欠損コンストラクトの模式図である。
【図１９】RNAの安定性を調べるためにルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す図である。
【図２０】IL-6の3’-UTR及びそれを欠損させたコンストラクトの模式図である。
【図２１】IL-6の3’UTR (1-403) mRNAに対する結合を調べた結果を示す図である。
【図２２】Zc3h12変異タンパク質の発現量を、ノーザンブロット分析（ａ）又は免疫ブロッティング（ｂ）によって測定した結果を示す図である。
【図２３】IL-6の発現をノーザンブロット分析（ａ）又は免疫ブロット（ｃ）で測定した結果を示す図、及び残存mRNAレベルの経時変化を調べた結果を示す図（ｂ）である。
【図２４】マウス及びヒトZc3h12aにおけるN末端及びCCCHドメインの配列アライメントを示す図である。
【図２５】Zc3h12aのN末端ドメインの構造モデルを示す図である。
【図２６】Zc3h12aのエンドリボヌクレアーゼ活性を測定した結果を示す図である。
【図２７】Zc3h12aのエンドリボヌクレアーゼ活性を測定した結果を示す図である。
【図２８】IL-6の発現をノーザンブロット分析で測定した結果を示す図（a）及び残存mRNAレベルの経時変化を調べた結果を示す図（ｂ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）免疫アジュバント組成物
本発明の免疫アジュバント組成物は、Zc3h12a遺伝子のインヒビター、及びZc3h12a蛋白質のインヒビターからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分として含むものである。
【００１１】
Zc3h12a遺伝子
Toll-like receptor (TLR)は、微生物の成分を認識し、炎症及び免疫反応を引き起こすレセプターである。TLR刺激は、免疫反応の大きさと持続を制御する複合的な遺伝子発現を活性化する。Zc3h12a遺伝子は、TLR刺激により誘導される免疫反応のmodifierである。その塩基配列は、NCBIにおいて、アクセッション番号NM_025079として登録されている。
【００１２】
Zc3h12a遺伝子のインヒビター
このインヒビターは、Zc3h12a遺伝子の発現を阻害するものであればよく、低分子化合物、核酸、タンパク質、糖タンパク質などが挙げられる。特に、医薬品として使用し易い点で、低分子化合物が好ましい。また、設計が容易であり、毒性が少ない点で、siRNA、shRNA、stRNAのような核酸も好ましい。
siRNA、shRNAの設計方法は良く知られており、それぞれ、例えば、”Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., and Tuschl, T. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494-498.”、及び”Paddison, P. J., Caudy, A. A., Sachidanandam, R. & Hannon, G. J. Short hairpin activated gene silencing in mammalian cells. Methods Mol. Biol. 265, 85-100 (2004)”に記載されている。また、ABI社、Dharmacon社などに依頼すれば入手できる。
Zc3h12a遺伝子のインヒビターは、例えば、以下の方法でスクリーニングできる。Zc3h12a遺伝子発現プラスミド及びIL-6などの遺伝子の3’-UTRをluciferaseや蛍光蛋白質などを発現する遺伝子の下流に配したプラスミドを導入した試験細胞と被検物質とを接触させ、接触によりZc3h12a遺伝子の発現量が低下する被検物質を、ルシフェラーゼアッセイや蛍光検出によりスクリーニングすればよい。
また、制御領域及び構造遺伝子を含むZc3h12a遺伝子の発現プラスミドを導入した試験細胞と被検物質とを接触させ、接触によりZc3h12a遺伝子の発現量が低下する被検物質を、ウェスタンブロッティングやノーザンブロッティングによりスクリーニングすることもできる。
【００１３】
Zc3h12aタンパク質のインヒビター
Zc3h12aタンパク質のインヒビターは、このタンパク質の活性を阻害するものであればよく、低分子化合物、核酸、タンパク質、糖タンパク質などが挙げられる。特に、医薬品として使用し易い点で、低分子化合物が好ましい。
Zc3h12aタンパク質のインヒビターのスクリーニングは、例えば、被検物質の存在下、及び非存在下で、RNA分解活性の程度を比較し、RNA分解活性を低下させる物質を選択すればよい。
具体的には、まず、ヒトZc3h12a組み換え蛋白質を合成する。ヒトZc3h12a遺伝子（NCBI Accession number NM_025079）をpGEX-6P1などのプラスミドに組み込み、大腸菌（E. coli）BL21-Gold(DE3)pLysS (Stratagene社) を形質転換し、タンパク質を発現させる。タンパク質発現後、細胞を回収し、PBSに再懸濁した。超音波によって細胞を溶解させ、Triton X-100を最終濃度１％となるように加え、３０分間、４℃で穏やかに振とうしながらインキュベートする。次いで、遠心分離によって残骸を除去し、上澄みをGlutathion Sepharose 4B (GE Healthcare社)とともに３０分間４℃で、穏やかに振とうしながらインキュベートする。樹脂を回収し、PBSで５回洗浄した後、PreScission Protease cleavage buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA and 1μM DTT)に再懸濁する。PreScission Protease (GE Healthcare社) (80U)を加えて、穏やかに振とうしながら４時間４℃でインキュベートする。上澄みを回収し、Zc3h12aタンパク質溶液として、−８０℃で保存する。
次に、IL-6の3’-UTR conserved domainの配列と相同なRNAをin vitro転写法を用いて合成する。in vitro転写の際に[32P]標識RNA(5000 cpm)でラベルする。
このラベルしたRNAとZc3h12aタンパク質を、切断バッファー (25 mM Hepes, 50 mM KOAc, 5μM DTT)と、Rnasin plus (40U)(Promega社)の存在下、5 mM Mg(Oac)2 有り又はなしで、混合する。切断されたRNAをTRIzol (InvitroGen社)によって精製し、6% TBE-Urea gel (InvitroGen社)を用いるdenaturing PAGE及びオートラジオグラフィーによって分析する。切断されたRNAはより早く泳動されるRNAとして検出できる。このシステムに被検物質を作用させ、切断活性が低下する物質をスクリーニングすればよい。切断活性を検出する方法はこれに限らない。
Zc3h12aタンパク質のインヒビターは、その他の方法でもスクリーニングできる。例えば、Zc3h12a遺伝子発現プラスミド及びIL-6などの遺伝子の3’-UTRをluciferaseや蛍光蛋白質などを発現する遺伝子の下流に配したプラスミドを導入した試験細胞と被検物質とを接触させ、接触によりZc3h12a遺伝子の発現量が低下する被検物質を、ルシフェラーゼアッセイや蛍光検出によりスクリーニングすればよい。
【００１４】
製剤
免疫アジュバント組成物中の上記インヒビター濃度は、インヒビターの種類によって異なるが、例えば約10 μg/ml 〜100 mg/mlとすればよい。
免疫アジュバント組成物は、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤等の医薬的に許容できる希釈剤、助剤、担体等を含んでいてもよい。
また、本発明の免疫アジュバント組成物は、ヒトの飲食品、動物の飲料水や餌に含ませた状態で摂取するものであってもよい。即ち、本発明の免疫アジュバント組成物には、飲食品組成物も包含される。飲食品中の上記インヒビター濃度は、例えば約1μg/ml 〜100 mg/mlとすればよい。
本発明の免疫アジュバント組成物中の上記インヒビターが核酸である場合、このインヒビターはリポソーム製剤であってもよい。核酸を含むリポソーム製剤の調製方法は、良く知られており、例えば、”Whitehead KA, Langer R, Anderson DG.Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov. 2009 8(2):129-38.”に記載されている。
【００１５】
また、本発明の免疫アジュバント組成物には、上記インヒビターに加えて、公知の免疫アジュバントが含まれていてもよい。組み合わせられる免疫アジュバントは公知のものを制限無く使用できる。このような公知の免疫アジュバントとして、フロイントの完全アジュバント、結核菌体などの微生物死菌体、アムラアジュバントなどが挙げられる。また、天然型のホスホジエステルバックボーン及びポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドと、分子量25000以上のβ-1,3-グルカンとからなる核酸／多糖複合体、ヘモゾイン、βヘマチンなども挙げられる。併用する免疫アジュバントの組成物中の濃度は、例えば約1 μg/ml 〜100 mg/mlとすればよい。
本発明の免疫アジュバント組成物に複数の成分が含まれる場合、それらは、混合されていてもよく、別々に存在させてもよい。
【００１６】
（ＩＩ）ワクチン組成物
上記説明したインヒビターは、ワクチン抗原とともにワクチン組成物とすることができる。上記説明したインヒビターとワクチン抗原とを混合することにより、ワクチン抗原の免疫原性を高めることができる。また、このワクチン組成物は、上記説明したインヒビターに加えて、その他の免疫アジュバントも含んでいてよい。
ワクチンの種類は特に限定されず、公知のワクチンを制限無く使用できる。このような公知のワクチンとして、例えば、食物アレルゲン、ハウスダストアレルゲン、スギ花粉のような花粉アレルゲン、動物の体毛のようなアレルゲンなどのアレルギーワクチンが挙げられる。具体的には、花粉アレルゲンとして、スギ花粉アレルゲン（Cry j 1、Cry j 2）、ブタクサアレルゲン(Amba1、Amba2、Amba5、Ambt5、Ambp5)、カモガヤアレルゲン（Dacg2）等が挙げられ、食物アレルゲンとして、カゼイン、ラクトアルブミン、ラクトグロブリン、オボムコイド、オボアルブミン、コンアルブミン等が挙げられ、ハウスダストアレルゲンとして、ダニ類アレルゲン(Derf1、Derf2、Zen1、Derp1、Derp2）等が挙げられる。
【００１７】
感染症用のワクチンとしては、不活性化された完全ワクチン、サブユニットワクチン、トキソイド等が挙げられる。これらのワクチンは、細菌、ウイルス、リケッチア、寄生虫等の病原体に対して動物に免疫を生じさせる。
感染症用ワクチンとしては、ヒトを対象とする場合、例えば、A型、B型インフルエンザ等のインフルエンザ、ポリオウイルス、日本脳炎、結核菌、ヒトパピローマウイルス、マラリア原虫、SARS、ヒトに感染し得るトリインフルエンザ、腸チフス、パラチフス、ペスト、百日咳、発疹チフス等の感染症用ワクチンが挙げられる。また、非ヒト動物を対象とする場合、例えば、ウマインフルエンザウイルス、ウマヘルペスウイルス、ウマ脳髄膜炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、狂犬病、ネコ汎白血球減少症、ネコ鼻気管炎、感染性ウシ鼻気管炎、３型パラインフルエンザ、ウシのウイルス性下痢、ウシアデノウイルス、ブタパルボウイルス、イヌアデノウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌパルボウイルス、イヌパラインフルエンザ、トリインフルエンザ、ブルセラ症、ビブリオ症、レプトスピラ症、クロストリジウム感染症、サルモネラ症等の感染症用ワクチンが挙げられる。
また、ワクチンは癌ワクチンであってもよい。癌ワクチンは公知のものを制限なく使用でき、例えば、WT1、乳癌などにおけるHER2/neu、悪性黒色腫におけるMAGE、大腸癌におけるCEAなどが挙げられる。
【００１８】
ワクチン組成物は、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤等の医薬的に許容できる希釈剤、助剤、担体等を含んでいてもよい。
ワクチン組成物中の上記インヒビター濃度は、例えば約10μg/ml〜100 mg/mlとすればよい。また、その他の免疫アジュバントを併用する場合、この免疫アジュバントの濃度は、例えば約1μg/ml〜100 mg/mlとすればよい。また、ワクチン組成物中のワクチン濃度は、例えば約1μg/ml〜100 mg/mlとすればよい。
本発明のワクチン組成物には、飲食品組成物も包含される。飲食品組成物である場合、組成物中のインヒビター濃度は、例えば約1μg/ml〜100 mg/mlとすればよい。また、その他の免疫アジュバントを併用する場合、この免疫アジュバントの濃度は、例えば約1μg/ml 〜100 mg/mlとすればよい。また、ワクチン濃度は、例えば約1μg/ml 〜100 mg/mlとすればよい。
本発明のワクチン組成物に複数の成分が含まれる場合、それらは、混合されていてもよく、別々に存在させてもよい。
【００１９】
（ＩＩＩ）免疫アジュバント組成物、ワクチン組成物の使用方法
上記説明したワクチン組成物は、免疫アジュバント組成物とワクチン抗原とを混合して投与することができる。また、免疫アジュバント組成物とワクチン抗原とを別々に投与することもできる。これにより、動物を免疫することができる。換言すれば、動物の免疫（獲得免疫、自然免疫）を賦活化することができる。また、免疫アジュバント組成物中に、上記インヒビターとその他の免疫アジュバントとが含まれる場合、各アジュバントは別々に投与されてもよく、混合物として投与されてもよい。また、本発明の免疫アジュバント組成物、及び本発明のワクチン組成物は、医薬組成物である場合は、治療的に投与することができ、食品組成物である場合は、非治療的に投与することができる。
本発明の免疫アジュバント組成物、及びワクチン組成物は、免疫系を有するあらゆる動物（ヒト、非ヒト）を投与対象とすることができる。例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス等の哺乳動物；ニワトリ、アヒル、ガチョウ等の鳥類が挙げられる。
特に本発明の免疫アジュバント組成物、及びワクチン組成物は、ヒトのアレルギーワクチン及び感染症ワクチン、イヌ、ネコ等のペット動物のアレルギーワクチン及び感染症ワクチン、並びにウシ、ブタ、ニワトリ等の産業動物の感染症ワクチンとして有用である。
【００２０】
免疫アジュバント組成物、及びワクチン組成物は、経口、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内、気管内、皮膚などの経路によって接種できる。また、前述した通り、本発明の免疫アジュバント組成物、及びワクチン組成物は、ヒトの飲食品、動物の飲料水や餌に含ませた状態で摂取するものであってもよい。
本発明の免疫アジュバント組成物及びワクチン組成物は、単回投与されてもよいし、約2日間〜8週間の間隔で数回にわたって投与されてもよい。
ワクチン投与量は、対象とするアレルギーや感染症の種類、投与する動物種等により変えることができるが、１回投与量を数十ng〜数mgとすればよい。
インヒビターの投与量は、１回投与量を約1μg/ml〜100 mg/mlとすればよい。また、その他の免疫アジュバントを併用する場合、併用される免疫アジュバントの１回投与量は、約1μg/ml〜100 mg/mlとすればよい。
【００２１】
（ＩＶ）ワクチン細胞製剤
本発明の免疫アジュバント組成物は、個体から採取された免疫細胞（例えば、樹状細胞、リンパ球）と接触させ、これを賦活化するのに用いることができる。これにより、活性化された免疫細胞が得られる。活性化された免疫細胞を、人に投与することにより、免疫を賦活化し、ワクチン効果を期待できる。この活性化免疫細胞製剤は、通常、静脈内投与すればよい。
採取された免疫細胞は、例えば、RPMIのような培地を用いて、サイトカイン存在下の条件で、予備培養すればよい。次いで、免疫細胞と免疫アジュバント組成物とを混合し、その細胞の生育に適した温度、例えば約37℃で、約1〜24時間インキュベートすればよい。
免疫細胞と免疫アジュバント組成物との使用比率は、例えば、約1:1〜1:10000とすればよい。
【実施例】
【００２２】
実施例において使用した試薬及び試験方法は、以下の通りである。【００２３】
（試薬及び細胞）
マウスIL-4、IL-6、IL-12p40、IL-17、IFN-γ及びTNF測定のためのELISAキットは、R&D systems社から購入した。マウスANA抗体（抗核抗体）のELISAキットは、Alpha Diagnostic社から購入した。モノクローナル抗YY1抗体(H-10)及びＨＲＰ標識モノクローナル抗βチューブリン抗体（HRP-conjugated monoclonal anti-β-tubulin）抗体(D-10)は、SantaCruz社から購入した。ＨＲＰ標識抗FLAG抗体（HRP-conjugated anti-FLAG antibody）は、Sigma社から購入した。MALP-2を含むTLRリガンド、Poly I:C、Salmonella Minnesota Re595株由来のリポ多糖（LPS）、R-848及びCpGオリゴヌクレオチド(ODN1668)は、Kawagoe, T. et al. Sequential control of Toll-like receptor-dependent responses by IRAK1 and IRAK2. Nat Immunol 9, 684-91 (2008)に記載されたようにして得た。
腹腔滲出細胞（Peritoneal exudate cell）は、2 mlの4.0%チオグリコール酸培養液(Sigma社)を注入してから３日後のマウスの腹腔から、氷冷したHank's buffered salt solution (Invitrogen社)で洗浄することによって分離した。HEK293-tet-off 細胞株は、Clontech社から購入した。HEK293細胞は、ATCCより購入した。【００２４】
（発現プラスミド）
Zc3h12a cDNA（NCBIのAccession No. NM_153159）をpFLAG-CMV2ベクター(Invitrogen社)に挿入して、Zc3h12a発現プラスミドを調製した。pFLAG-CMV2ベクター(Invitrogen社)を、Zc3h12a発現プラスミドのコントロールの空プラスミドとして用いた。CCCHドメインのポイントミューテーション(C306R又はD141N)、及び削除は、上述したZc3h12a発現プラスミドを使用し、QuickChangeII Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene社)を用いて、このkitに添付の説明書に記載の方法に従って行った。IL-6の3’UTR配列の全長(1-403)又はその部分(1-70、58-173及び172-403のいずれか)を含むそれぞれのpGL3ベクターは、Dr. W. Zhao及びDr. K. Kirkwoodから提供された（Zhao, W., et al., p38alpha stabilizes interleukin-6 mRNA via multiple AU-rich elements. J Biol Chem 283, 1778-85 (2008)）。IL-6の3’UTR cDNAの部分(1-92、1-102、1-112、1-132、1-142及び122-197のいずれか)を、pGL3ベクターに、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法に従って挿入した。IL-6の3’UTR (77-108)配列を有する又は有さないβグロビン(1-130)の3’-UTR cDNA、及びIL-12p40 (1-781)、CalcR (1-1601)及びインターフェロンγ(1-631)の3’-UTR cDNAのそれぞれを、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法に従って、pGL3ベクターに挿入した。IL-6のCDS及びIL-6のCDS+3’ UTRを、それぞれMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法に従って、pTREtightベクター(Clontech社)に挿入し、pTREtight-IL6-CDS及びpTREtight-IL6-CDS+3’UTRを作製した。野生型及び変異型(D141N) Zc3h12a cDNAを（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法に従って、それぞれpGEX-6P1ベクター(GE Healthcare社)に挿入し、pGEX-6P1-Zc3h12a及びZc3h12a D141N変異プラスミドを作製した。IL-6の3’UTR cDNAを、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法に従ってpBluescriptのT7プロモーターの下流に挿入し、pBluescript-IL6 3’UTR (1-430)を作製した。【００２５】
（ELISA）
培地上澄み中のIL-4、IL-6、IL-12p40、IL-17、IFN-γ及びTNF-a、並びに血清中のマウスANA-抗体を、製造者のプロトコールに従ってELISAにより測定した。血清中のマウスのIgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3及び抗二本鎖DNA抗体のELISA測定は、Sato, S. et al. Essential function for the kinase TAK1 in innate and adaptive immune responses. Nat Immunol 6, 1087-95 (2005)、及びFukuyama, et al., The inhibitory Fcgamma receptor modulates autoimmunity by limiting the accumulation of immunoglobulin G+ anti-DNA plasma cells. Nat Immunol 6, 99-106 (2005)に記載の方法に従って行った。【００２６】
（ノーザンブロッティング、免疫ブロッティング及びEMSA）
ノーザンブロッティング、免疫ブロッティング及びEMSAは、Sato, S. et al. Essential function for the kinase TAK1 in innate and adaptive immune responses. Nat Immunol 6, 1087-95 (2005)に記載の方法に従って行った。【００２７】
（血液学的な値の測定）
野生型及びZc3h12a-/-マウスそれぞれから調製した血液の血液学的な分析は、エスアールエル（SRL Inc.）にて行った。【００２８】
（フローサイトメトリー）
フローサイトメトリー測定のための抗体は、BD社から購入した。脾臓の細胞懸濁液の調製は、フィルターと、穏やかなピペッティングによって行なった。表面染色のために、細胞を暗室に４℃で保持した。細胞を、氷冷したFACS buffer (2%FCS, 0.02% NaN3 in PBS)で洗浄し、各抗体と１５分間インキュベートし、次いでFACS bufferで３回洗浄した。FoxP3+調節性T細胞を、Mouse Regulatory T Cell Staining Kit (eBioscience社)を用いて、製造者の作製した使用説明書に従って染色した。細胞内サイトカインは、BD Cytofix/Cytoparm Plus Fixation/Permeabilization Kit (BD社)を用いて、製造者が作製した使用説明書に従って染色した。データは、Facs Calibur（登録商標）又はFacs Canto（登録商標）II flow cytometer（BD社)によって測定し、FlowJo（Tree Star社のソフトウェア）を使用して分析した。【００２９】
（RNAの安定性の測定）
mRNAの安定性は、以下の３種の異なる方法を使用して決定した。
（１）マクロファージにおけるmRNAの安定性
野生型及びZc3h12a-/-マウス由来の腹腔マクロファージ(1×106)を、それぞれLPS (100 ng/ml)で２時間刺激した。その後、アクチノマイシンＤ(2μg/ml)を培地に加えて転写を停止させ、所定期間において全RNAを調製した。このRNAを、ノーザンブロット分析に供し、IL-6、TNF、KC及びβアクチンmRNA値を測定した。
（２）Tet-off system  HEK293tet-off細胞(3×106)に、pTREtight-IL6-CDS（IL-6をコードする配列を有する）又はpTREtight-IL6-CDS+3’UTR（IL-6をコードする配列及び非翻訳領域の3’UTR配列を有する）と、Zc3h12aの野生型若しくは変異型の発現プラスミド又はコントロールの空プラスミドとを用いて形質移入した。３時間後、細胞を３つの60-mm皿に細分し、終夜培養した。pTREtirhtベクターからのmRNAの転写を、Dox (1μg/ml)を添加して停止させ、所定期間において全RNAを調製した。このRNAをノーザンブロット分析に供し、IL-6及びβ−アクチンmRNA値を測定した。
（３）ルシフェラーゼアッセイ
pGL3-IL-6 3’UTRプラスミド又はpGL3-empty（空）プラスミドと、Zc3h12a発現プラスミド又はコントロールの空プラスミドとを用いて、HEK293細胞に形質移入した。培養４８時間後、細胞を溶解させ、溶菌液におけるルシフェラーゼ活性を、Dual-luciferase reporter assay system (Promega社)によって測定した。ウミシイタケルシフェラーゼ（renilla-luciferase）遺伝子を、同時に内部コントロールとして形質移入した。【００３０】
（In vitroでのRNA切断アッセイ）
Zc3h12aの野生型及び変異体の切断活性は、Miyoshi, K., et al., In vitro RNA cleavage assay for Argonaute-family proteins. Methods Mol Biol 442, 29-43 (2008)に記載の方法に従って測定した。続いて、組換えZc3h12aタンパク質と、in vitroで転写された[32P]標識RNAとをインキュベートし、切断されたRNAを精製し、denaturing PAGE及びオートラジオグラフィーで分析した。
具体的には、組換えタンパク質及びin vitroで転写された[32P]標識RNA(5000 cpm)を、切断バッファー (25 mM Hepes, 50 mM KOAc, 5μM DTT)と、Rnasin plus (40U)(Promega社)の存在下、5 mM Mg(Oac)2 有り又はなしで、混合した。切断されたRNAをTRIzol (InvitroGen社)によって精製し、6% TBE-Urea gel (InvitroGen社)を用いるdenaturing PAGE及びオートラジオグラフィーによって分析した。【００３１】
（骨髄移植）
野生型（Wild-type）及びZc3h12a-/-マウスそれぞれから、骨髄細胞を調製した。調製した骨髄細胞を、致命的に照射されたCD45.1 C57BL/6マウス（大阪大学微生物病研究所感染動物実験施設にて繁殖）に静脈投与した。キメラマウスに、飲料水にネオマイシン及びアンピシリンを入れて４週間与えた。再構成後、少なくとも８週間でマウスを分析した。キメラマウスの脾細胞の９０％以上が、CD45.2陽性だった。【００３２】
（バクテリアにおけるZc3h12aタンパク質の発現）
pGEX-6P1-Zc3h12a又はZc3h12a D141N変異プラスミドで形質転換された大腸菌（E. coli）BL21-Gold(DE3)pLysS (Stratagene社)において、タンパク質を発現させた。タンパク質発現後、細胞を回収し、PBSに再懸濁した。超音波によって細胞を溶解させ、Triton X-100を最終濃度１％となるように加え、３０分間、４℃で穏やかに振とうしながらインキュベートした。次いで、遠心分離によって残骸を除去し、上澄みをGlutathion Sepharose 4B (GE Healthcare社)とともに３０分間４℃で、穏やかに振とうしながらインキュベートした。樹脂を回収し、PBSで５回洗浄した後、PreScission Protease cleavage buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA and 1μM DTT)に再懸濁した。PreScission Protease (GE Healthcare社) (80U)を加えて、穏やかに振とうしながら４時間４℃でインキュベートした。上澄みを回収し、組換えタンパク質溶液として、−８０℃で保存した。【００３３】
（[32P]標識RNAの合成）
IL-6の3’UTR配列を有するＲＮＡの合成のためのテンプレートとして、pBluescript-IL6 3’UTR (1-430)プラスミドを使用した。In vitro RNA合成及び[32P]標識化（ラベリング）は、Riboprobe in vitro Transcription system (Promega社)を用いて、製造者の作製した使用説明書に従って行なった。5’-末端の標識化は、標識化していないRNA及びKinase Max 5’-end labeling Kit (ambion社)を用いて、製造者の作製した使用説明書に従って行なった。3’-末端の標識化は、標識化していないRNAと、T4 RNA Ligase (Takara社)及び[32P]pCp (GE Healthcare社)とをインキュベートすることにより行なった。【００３４】
（RNA結合アッセイ）
[32P]標識RNA (1×106 cpm)と、組換えタンパク質又はBSA(Pierce社)とを、バッファー(25 mM Hepes, 50 mM KOAc, 5μM DTT)中で混合し、２０分間室温でインキュベートした。次いで、ヘパリンを最終濃度５μg/mlとなるように添加し、さらに１０分間インキュベートした。FUNA-UV-LINKER FS-800（フナコシ社）を使用して、氷上で、254 nmのUVを光源から5 cmの距離で２０分間照射することによりサンプルを架橋させた。架橋したサンプルを、２０分間室温でRNaseT (100 U)で処理し、次いで、RNaseA(1μg)で１５分間３７℃で処理した。消化後、[32P]標識RNAに結合したタンパク質を、SDS-PAGE及びオートラジオグラフィーによって分析した。【００３５】
（マイクロアレイ分析）
野生型マウス（日本クレアから購入）、MyD88-/-マウス（Adachi O, Kawai T, Takeda K, Matsumoto M, Tsutsui H, Sakagami M, Nakanishi K, Akira S. Targeted disruption of the MyD88 gene results in loss of IL-1- and IL-18-mediated function. Immunity. 1998 Jul;9(1):143-50.に記載の方法で作製）及びTrif-/-マウス（Yamamoto M, Sato S, Hemmi H, Hoshino K, Kaisho T, Sanjo H, Takeuchi O, Sugiyama M, Okabe M, Takeda K, Akira S. Role of adaptor TRIF in the MyD88-independent toll-like receptor signaling pathway. Science. 2003 Aug 1;301(5633):640-3に記載の方法で作製）由来の腹腔マクロファージを、100 ng/mlのLPSで０、１及び４時間刺激した。全RNAを、RNeasy kit (Qiagen社、Hilden, Germany)を用いて抽出し、全ＲＮＡの10μgから、T7-(dT) 24プライマーで予備刺激されたSuperScript Choice System (Invitrogen社、Carlsbad, CA)を用いて、二本鎖cDNAを合成した。これらのcDNAを、製造者(Enzo Diagnostics社、 Farmingdale, NY)の作製したプロトコールに従って、ビオチン化リボヌクレオチドの存在下で、T7 RNAポリメラーゼを用いて行なわれるin vitro転写反応によるビオチン標識cRNAの調製に使用した。cRNA産物を、RNeasy kit (Qiagen社)を用いて精製し、断片化し、製造者の作製したプロトコールに従ってAffymetrix mouse expression array A430 microarray chip(Affymetrix社、Santa Clara, CA)とハイブリダイズさせた。Zc3h12a-/-マクロファージにおけるLPS誘導性遺伝子の決定のために、腹腔マクロファージを100 ng/mlのLPSで刺激した。次いで、全RNAをTRIzol (Invitrogen Life Technologies社)で抽出し、RNeasy kitを用いてさらに精製した。精製したRNA100 ngから、Ovation Biotin RNA Amplification and Labeling System (Nugen社)を使用して、製造者が作製したプロトコールに従って、ビオチン標識cDNAを合成した。Affymetrix mouse Genome 430 2.0 microarray chipのハイブリダイゼーション、染色、洗浄及びスキャンは、製造者が作製した使用説明書に従って行なった。Robust multichip average (RMA) expression valuesを、R and Bioconductor affy packageを使用して計算した。階層的なクラスター化のために、刺激後０時間と比較して２又は５倍増加したプローブを選択した。RMA expression valueを、それぞれ０及び１に対する平均及び標準偏差に合うように、各プローブによって変換した。MyD88-/-及びTrif-/-マクロファージにおけるLPS誘導性遺伝子の分析のために、距離関数（distance function）としてPearson’s correlation coefficientを使用して、プローブ間の距離を計算した。Zc3h12a-/-マクロファージにおけるLPS誘導性遺伝子の分析のために、RMA値に対する主成分分析を行い、プローブ間のユークリッド距離（Euclidean distances）を、第一から第５の主成分を用いて計算した。これらの距離を用いて、ウォード法（Ward’s method）によって階層的なクラスター化を行なった。これらの計算及びheat map表示の作成は、R and Bioconductorを用いて行なった。【００３６】
（免疫組織化学検査）
10%ホルマリン中性バッファー溶液で組織を固定し、パラフィンで包埋し、そして５μｍの厚さの切片にした。切片をTarget Retrieval Solution (Dako社、 Glostrup, Denmark)中で、９８℃で４０分間加熱し、抗原の検出を促進した。切片を、マウスIgA（α鎖）に対するペルオキシダーゼ標識ヤギＩｇＧフラクション(peroxidase-conjugated goat IgG fraction)(MP Biomedicals社、LLC, Solon, OH)を抗体希釈液（商品名：ChemMate、Dako社）で１：５０に希釈したもの、又は、マウスIgG（分子全体)に対するペルオキシダーゼ標識ヤギアフィニティー精製F(AB’)2フラグメント（peroxidase-conjugated goat affinity purified F(AB’)2 fragment）(MP Biomedicals社)を抗体希釈液で１：２５に希釈したものと、室温で３０分間インキュベートした。マウスIgA及びIgGに対して免疫反応した細胞を、ジアミノベンジジン(Dako社)を用いて可視化した。切片を、ヘマトキシリンによって軽く対比染色した。染色した切片を、光学顕微鏡で観察した。【００３７】
（構造モデリング）
Zc3h12c N-末端ドメインのモデルは、以下のように構築した。
まず、BioInfoBank Meta Server (http://bioinfo.pl)に配列を提出し、トップ10のモデルを、デフォルトのセッティングを使用して構築した。次いで、SeSAW functional annotation server (http://pdbjs6.pdbj.org/SeSAW/)にそれぞれを提出し、最も高いスコアのモデルを選択することにより、ベストモデルを選択した。選択したモデルを、FFAS03 server (http://ffas.ljcrf.edu/ffas-cgi/cgi/ffas.pl)及びModeller（Eswar, N. et al. Comparative protein structure modeling using Modeller. Curr Protoc Bioinformatics Chapter 5, Unit 5 6 (2006)）を使用して、構造ゲノミクステンプレート（structural genomics template）2qipから構築した。最も高い3D Jury scoreも有するこのモデルは、フラップエンドヌクレアーゼ(例えば、PDB ID 1ut5)（Feng, M. et al. Roles of divalent metal ions in flap endonuclease-substrate interactions. Nat Struct Mol Biol 11, 450-6 (2004)）の活性部位においても保存されている、保存されたアスパラギン酸のクラスター(D141、D226、S242、D244、及びD248)を含んだ。静電的表面は、eF-surf server (http://ef-site.hgc.jp/eF-surf/)及びeF-site（Kinoshita, K. & Nakamura, H. eF-site and PDBjViewer: database and viewer for protein functional sites. Bioinformatics 20, 1329-30 (2004)）を使用して調製した。【００３８】
（実施例１）
LPS誘導性遺伝子としてのZc3h12aの同定
Toll-like receptors (TLRs)を誘導する遺伝子の発現を包括的に研究するために、野生型（ＷＴ）マウス、LPSで刺激したMyD88-/-マウス及びTRIF-/-マウスからのマクロファージを用いて、上述した方法でマイクロアレイ解析を行った。【００３９】
LPSで刺激後１又は４時間後のいずれかに、野生型細胞におけるより２倍以上上方制御された214の遺伝子を選択した。これらのLPS誘導性遺伝子の階層的クラスター化から、これらが３つの主要クラスターに分類されることがわかった（データは示さず）。これらのクラスターの中で、クラスターIIIの遺伝子は、MyD88依存的に急激に誘導された。このクラスターは、Tnf、Nfkbiz、Zfp36等を含んだ。クラスターIIIは、Zc3h12aをコードする遺伝子を含んだ（データは示さず）。【００４０】
次に、LPS (100 ng/ml)で所定時間刺激されたマクロファージ由来の全RNAを抽出し、Zc3h12a、IL-6、IκBζ及びβアクチンの発現を調べるためにノーザンブロットに供した。図１aに、結果を示す。ノーザンブロット分析により、Zc3h12a mRNAがLPS刺激の後、マウスのマクロファージにおいて急激に誘導されること、及び時間の経過と共に徐々に減少することを確認した（図１ａ）。Zc3h12a は、CCCH-type zinc finger (Zf)モチーフを有し、相同タンパク質Zc3h12b、c及びdとファミリーを形成する。【００４１】
さらに、Lipofectamine 2000 (Invitrogen社)を用いて、Flag-tagged Zc3h12aを用いて、又は用いずにHEK293細胞に形質移入した。このFlag-tagged Zc3h12aを用いて、又は用いずに形質移入されたHEK293細胞から、細胞質(CP)及び核抽出物(NE)を調製した。Zc3h12aの発現は、抗FLAG抗体を用いてウェスタンブロッティングで測定した。抗βチューブリン及び抗YY-1抗体を、CP及びNEそれぞれのコントロール（loading control）として使用した。結果を図１ｂに示す。この分画実験の結果は、Zc3h12aタンパク質が、核よりむしろ主に細胞質に局在することを示していた（図１ｂ）。【００４２】
（実施例２）
Zc3h12a-/-マウスの創製
生体内での免疫応答の制御におけるZc3h12aの機能的役割を研究するために、Zc3h12a欠損 (Zc3h12a-/-)マウスを創製した。【００４３】
Zc3h12aを含むゲノムDNAを、PCR法を用いてElongase (Invitrogen社)によってGSI-I胚性幹細胞由来ゲノムDNAから分離した。分離したZc3h12aを含むゲノムDNAについて、制限酵素マッピング及び配列（シークエンス）分析によって特徴を調べた。ターゲッティングベクターは、エクソン３を、CCCH type Zfドメインを含むエクソン５及びネオマイシン耐性遺伝子で置換することによってデザインした。1.1キロベース(kb)のClaI-BamI断片を、3'相同領域として使用し、5.9-kbのNotI-SalI断片を、5'相同領域として使用した。全量で30μgのNotIで直線化したベクターを、GSI-I胚性幹細胞にエレクトロポレーションにより導入した。G418（ナカライテスク社製）を用いて選択を行なった後、薬剤耐性のクローンを選択し、PCR及びサザンブロット分析によってスクリーニングした。これらのクローンをそれぞれ、C57BL/6マウス（日本クレアから購入）由来の胚盤胞にマイクロインジェクションし、偽妊娠させた雌のマウスに移植した。キメラ雄マウスとC57BL/6雌マウスとを交配した結果、生殖系列への突然変異遺伝子が伝播された。Zc3h12a-/-マウスを創製するために、生じたZc3h12a+/-マウスを交雑させた。全ての動物実験は、大阪大学  微生物病研究所の動物実験委員会の許可を得て行われた。【００４４】
図２ａに、マウスZc3h12a遺伝子（Wild-type allele）、ターゲティングベクター（Targeting construct）及びターゲットアレル（Targeted allele）の模式図を示す。図２ａ中、Ｈは、HindIIIを表す。図２ｂは、ヘテロ接合体の交雑の子孫のサザンブロット分析の結果である。ゲノムDNAをマウス胎仔由来線維芽細胞（MEF）から抽出し、HindIIIで切断し、電気泳動によって分離し、放射能標識したプローブとハイブリダイズさせた。サザンブロットでは、野生型(+/+)マウスでは、5.9 kbに単一のバンドが、ホモ接合型 (-/-)マウスでは、3.8 kbに単一のバンドが、ヘテロ接合型の(+/-)マウスでは、5.9 kb及び3.8 kbの両方のバンドが観察された。【００４５】
図２aに示す2種類のプライマー  Fw: ATATGAGTGACCCTTGTGGAACGAAGC（配列番号１）及びRev: TCTGTACACAGCATACATGTGTCCTCC（配列番号２）を使用して、Zc3h12a mRNAの発現を調べるために、RNAをRT-PCR分析に供した。βアクチン遺伝子の発現を、同じRNAを用いて分析した。
図２ｃに、LPS (100 ng/ml)で所定時間刺激した野生型(WT)（Zc3h12a+/+)及びZc3h12a-/-マクロファージのＲＮＡのRT-PCR分析の結果を示す。RT-PCR分析は、Zc3h12aの発現がZc3h12a-/-マクロファージにおいて抑制されることを示した（図２ｃ）。【００４６】
（実施例３）
Zc3h12a-/-マウスにおける、胎生期の自己免疫疾患の早期発症
Zc3h12a-/-マウスはメンデルの法則に従い生まれるが、その殆どは、成長が遅滞し、殆どのマウスが生後12週以内に自然に死亡した（図３ａ）。図３ａは、野生型（Zc3h12a+/+）及びZc3h12a-/-マウスの生存率を示す図である(n=10)。図３ｂは、野生型（Zc3h12a+/+）（上図）及びZc3h12a-/-マウス（下図）の脾臓（上）、腸間膜リンパ節（左下）及び鼠径リンパ節（右下）の写真である。Zc3h12a-/-マウスは、重篤な脾腫とリンパ節腫張を示した（図３ｂ）。図３ｃは、野生型（Zc3h12a+/+）及びZc3h12a-/-マウスの肺、脾臓及びリンパ節(LN)の組織写真である。図４は、野生型(WT)及びZc3h12a-/-マウスの肝臓及び膵臓切片のH & E染色の結果を示す。組織学的解析は形質細胞（プラズマ細胞）の肺、並びに胆管及び脾臓の経上皮への侵入を示した（図３ｃ及び図４）。形質細胞は、Zc3h12a-/-リンパ節(LN)及び脾臓にも蓄積した（図３ｃ）。LNにおいて、肉芽腫形成が見られ、マクロファージと融合した巨細胞の生成を認めた。これにもかかわらず、炎症の変化はZc3h12a-/- マウスの腸でも関節でも見られなかった(データは示さず)。【００４７】
表１に、血液細胞の評価結果を示す。Zc3h12a-/-マウスは、血液細胞及び血小板の増大と共に、重篤な貧血に罹患した（表１）。表１中の数値は、６サンプルの平均±標準偏差（S.D.）を表す。【００４８】
【表１】
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【００４９】
さらに、Zc3h12a-/-マウスは、テストした全てのイムノグロブリンアイソタイプについて過剰免疫グロブリン血症（高γグロブリン血症）になっていた。（図５ａ）。図５aに、Zc3h12a-/-マウスにおける血清免疫グロブリン値を示す。
Zc3h12a-/-マウスにおける抗核抗体（ＡＮＡ）及び抗二重鎖DNA抗体の生産を調べた結果を、図５ｂに示す。統計的優位性は、Student’s t-testによって決定した（*：P< 0.05、**：P< 0.01）抗核抗体及び抗二重鎖DNA抗体の生産が、Zc3h12a-/-マウスで見られた（図５ｂ）。
図５ｃに、抗IgG及び抗IgA抗体による、肺切片の免疫組織化学的検査の結果（組織写真）を示す。肺及び腸組織に侵入した形質細胞は、抗IgG又は抗IgA抗体で容易に染色された（図５ｃ）。【００５０】
図６に、Zc3h12a-/-マウスにおける細胞異常及び増強されたサイトカイン生産を調べた結果を示す。図６ａ−ｃは、フローサイトメトリーによる脾細胞の分析結果を示す。図６ａは、脾臓CD19+ B細胞におけるIgM及びIgDの発現を、図６ｂは、脾臓における形質細胞の割合を、及び、図６ｃは、脾臓T細胞におけるCD62L及びCD44の発現を、それぞれ示す。これらの結果については、３つの異なる実験において、同様の結果が得られた。【００５１】
図７ａは、野生型及びZc3h12a-/-マウスの脾細胞を、抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した結果を示す図である。図７ｂは、脾臓細胞を抗-Foxp3抗体及びCD4抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した結果を示す図である。
図８は、脾臓のＴ細胞における、CD3/CD28刺激への応答におけるインターフェロンγ、IL-17及びIL-4の生産を調べた結果を示す図である。エラーバーは、２組の標準偏差（S.D.）を示す。３つの異なる実験において、同様の結果が得られた。【００５２】
図９ａは、脾細胞を、抗CD4抗体で染色し、透過処理し、インターフェロンγ及びIL-17に対して染色し、フローサイトメトリーによって分析した結果を示す図である。脾細胞を、完全培地中、３７℃で４時間、50 ng/ml酢酸ミリスチン酸ホルボール(PMA)（Sigma社)、5 mM calcium ionophore A23187 (Sigma社)及びGolgistop（BD社）とインキュベートして刺激した後、上記分析に用いた。図中の数字は、四分円中の細胞の割合を示す。
図９ｂ、及び図１０ａ及びｂは、野生型及びZc3h12a-/-マウスの脾細胞を、抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した結果を示す図である。
図１１は、Zc3h12a-/-マウスにおける、形質細胞及びエフェクター/免疫記憶T細胞の蓄積における造血細胞の関与を調べた結果である。図１１に示す実験においては、野生型及びZc3h12a-/-骨髄キメラの脾細胞を、抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。【００５３】
フローサイトメトリー解析はCD19+ B細胞の約70%がIg+ではなく、IgM-IgD-であることを示したが、これは大抵のZc3h12a-/-マウスのB細胞が脾臓においてクラススイッチを起こすことを示している（図６ａ）。さらに、CD138+CD19dull 形質細胞はZc3h12a-/-マウスの脾臓に豊富に含まれる（図６ｂ）。加えて、CD69の発現は脾臓のCD3+ T cells及び末梢に蓄積されたCD44highCD62L- T細胞において、上方に制御されている（図６ｃ及び図７ａ）。それにもかかわらず、CD4+Foxp3+ regulatory T細胞の比率は、野生型マウスとZc3h12a-/-マウスとの間で同等であった（図７ｂ）。脾臓T細胞の抗CD3抗体による刺激により、インターフェロンγの生産が増大したが、IL-17は増大しなかった（図８及び図９ａ）。Ter119+赤芽細胞数はZc3h12a-/-マウスの脾臓で多かった。これは、おそらく貧血に対する応答を反映している（図９ｂ）。
しかし、T細胞に対するB細胞の比率、及びH CD8+細胞に対するCD4+細胞の比率はZc3h12a-/-マウス脾臓において変わらなかった（図１０ａ及びｂ）。造血細胞が疾患の進行に十分であるか否かを調べるために、Zc3h12a-/-マウスからの骨髄細胞をレシピエントのC57BL/6マウスに移植した。Zc3h12a-/- BMキメラは、遅れた、しかし重要なリンパ節症の発展と、形質細胞及びCD44highCD62L-T細胞の蓄積を示した。これは、造血細胞が、免疫不全の伸展に寄与することを示している（図１１）。
これらの結果は、Zc3h12aが、Igを生産する形質細胞及び肉芽腫の形成によって特徴付けられる重篤な免疫疾患の伸展に必須であることを示している。【００５４】
（実施例４）
次に、マクロファージからのサイトカインの生産について調べた。
野生型（Zc3h12a+/+）及びZc3h12a-/-マウスの腹腔マクロファージをMALP-2 (1、10 ng/ml)、Poly I:C (100μg/ml)、LPS (10、100 ng/ml)、R-848 (10 nM)及びCpG-DNA (0.1、1μM)のいずれかで２４時間刺激した。培地の上澄み中のIL-6、IL-12p40及びTNF濃度を、ELISAで測定した。結果を図１２aに示す。図１２aにおいて、“med”は、上記物質で刺激しなかったマクロファージ（コントロール）である。エラーバーは、２組の標準偏差（S.D.）を示す。３つの異なる実験において、同様の結果が得られた。
また、所定の期間LPS (100 ng/ml)によって刺激されたマクロファージ由来の全RNAを抽出し、IL-6、KC、TNF、IκBα、RANTES、IP-10及びβアクチンの発現を調べるためのノーザンブロットに供した。この結果を図１２ｂに示す。
図１３は、野生型（Zc3h12a+/+）及びZc3h12a-/-の腹腔マクロファージのマイクロアレイ分析に基づき選択されたLPS誘導性遺伝子の発現のHeat map表示である。【００５５】
さらに、野生型及びZc3h12a-/-マクロファージにおけるLPS誘導性遺伝子のマイクロアレイ分析を行なった。上述したように、野生型及びZc3h12a-/-マクロファージを、100 ng/ml LPSで０、１、２及び４時間刺激し、全RNAをAffymetrix mouse Genome 430 2.0 microarray chipを用いるマイクロアレイ分析に供した。データは、上述したように処理され、刺激から１、２又は４時間後のいずれかに、野生型又はZc3h12a-/-マクロファージにおけるより５倍以上上方制御された1045の遺伝子を、LPS誘導性遺伝子と定義した。遺伝子を階層的にクラスター化し、その結果得られたheat map及び樹状図を図１４に示した。図１４では、Zc3h12a-/-マクロファージにおけるよりも高発現の遺伝子のクラスターを、赤い四角で強調している。【００５６】
また、Zc3h12a-/-マクロファージにおいて、TLRシグナル経路の活性化が正常に行われるかを調べた。野生型及びZc3h12a-/-マクロファージをLPS (100 ng/ml)で所定時間刺激した。核抽出物を調製し、NF-κB及びAP-1に対する特異的なプローブ（Sato, S. et al. Essential function for the kinase TAK1 in innate and adaptive immune responses. Nat Immunol 6, 1087-95 (2005)に記載）を用いる電気泳動移動度シフト解析（EMSA）によって、転写因子−DNA結合活性を測定した。結果を図１５に示す。図１５に示す結果は、異なる３つの実験の典型的なものである。【００５７】
図１２ａに示すように、TLRリガンド、MALP2 (TLR2)、poly I:C (TLR3)、LPS (TLR4)、R848 (TLR7)及びCpG-DNA (TLR9)による刺激は、Zc3h12a-/-マクロファージにおいてIL-6及びIL-12p40の生産の高度な上昇を誘導したが、TNFの生産は誘導しなかった。ノーザンブロット分析から、Zc3h12a-/- マクロファージにおけるLPSへの応答において、TNF、KC又はIκBαではなく、IL-6のmRNAが顕著に増加したことがわかった（図１２ｂ）。野生型及びZc3h12a-/- マクロファージにおけるLPS誘導性遺伝子の発現における違いを評価するために、マイクロアレイ分析を行なった。マクロファージにおけるLPS誘導性遺伝子のマイクロアレイ解析は、殆どのLPS誘導性遺伝子が野生型細胞とZc3h12a-/-細胞で同等に発現したことを示した（図１４）。これにもかかわらず、遺伝子の特定のセットは、Zc3h12a-/-マクロファージにおいて高度に発現していた。これらは、IL-6、Ifng、Calcr、Sprr2dなどを含む（図１３）。野生型とZc3h12a-/-マクロファージとの間で、LPSによるNF-κB又はアクチベーター蛋白1 (AP-1)の活性化に違いは見出されなかった。このことは、Zc3h12aが最初のTLRシグナル経路の制御に関与していないことを示す（図１５）。【００５８】
（実施例５）
CCCH-type Zfモチーフを持つ蛋白質のいくつかは、ｍRNAスプライシング、ポリアデニル化、及びｍRNA崩壊の制御のようなｍRNAの代謝に関係していることが報告されている。このように、Zc3h12aがｍRNAの不安定性において役割をはたしているかもしれないと仮定し、この可能性をIL-6を用いて検討した。【００５９】
上述したように、野生型及びZc3h12a-/-マクロファージをＬＰＳで２時間刺激し、次いでアクチノマイシンＤで処理した。
図１６に、Zc3h12aが、１セットの遺伝子から、その3’-UTRを通してmRNAを不安定化することを示す結果を示す。図１６ａは、全RNA(10μg)を抽出し、IL-6、TNF、KC及びβアクチンプローブの発現を調べるためのRNAブロット分析に供した結果を示す図である。３つの異なる実験において、同様の結果が得られた。図１６ｂは、残存mRNAの経時変化を示す。図１６ｂにおいては、オートラジオグラフを定量し、IL-6、Tnf及びCxcl1のActbに対する比を、残存mRNAレベルの決定に使用した。【００６０】
TNF又はKC mRNAではなく、IL-6ｍRANの半減期は、Zc3h12a-/-マクロファージで野生型細胞に比べて増加していた（図１６ａ及びｂ）。これらの結果は、Zc3h12aがIL-6 mRNAを転写後に制御することを示唆している。【００６１】
（実施例６）
IL-6の3’-UTRにおけるZc3h12a応答領域の決定
Tet-On Gene Expression System (TAKARA)の説明書に記載の方法に従って、Zc3h12aの発現がIL-6 mRNAを調節するか調べるために、ウイルス転写因子VP-16 (tet-off 293 cells)のトランス活性化ドメインを融合させたテトラサイクリン応答性タンパク質を安定して発現するHEK293細胞を、テトラサイクリン反応性プロモーター(TRE)の調節下、3’ 非翻訳領域(UTR)を有するIL-6をコードする配列(CDS)を内部に有するプラスミド(pTREtight-IL6CDS+3’UTR)を用いて形質移入した。ドキソルビシン (Dox)と処理することによって、IL-6 mRNAの転写を停止させると、mRNAは、インキュベーション時間に依存的に崩壊した（図１７ａ）。Zc3h12aの過剰発現は、IL-6のmRNAの分解を非常に加速した（図１７ａ及びｂ）。対照的に、Zc3h12aは、3’-UTR配列を内部に有さないmRNA(pTREtight-IL6CDS)の発現には影響を与えなかった（図１７ａ及びｂ）。【００６２】
図１７は、EK293 Tet-off細胞に、pTREtight-IL6-CDS又はpTREtight-IL6-CDS+3’UTRと、Zc3h12a発現プラスミド又はコントロールの空プラスミドとを同時に形質導入し、該細胞から抽出したＲＮＡを用いてノーザンブロット分析を行った結果（ａ）及びオートラジオグラフを測定して残存ｍRNAを求めた結果（ｂ）である。
図１７ａにおいては、細胞は、形質移入から３時間後に分けられ、終夜インキュベートされた。次にDox (1μg/ml)処理を行ない、全RNAを調製し、ノーザンブロット分析によってIL-6及びβアクチンレベルを決定した。図１７ｂにおいては、オートラジオグラフを定量し、IL-6のActbに対する比を、残存mRNAレベルの決定に使用した。【００６３】
図１９は、ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す図である。エラーバーは、２組の標準偏差（S.D.）を示す。３つの異なる実験において、同様の結果が得られた。
図１９ａ及びｂにおいては、IL-6（図１９a）の3’-UTR及びb-Globinの3’-UTR(図１９ｂ)の種々の配列を内部に有するpGL3プラスミドと、Zc3h12発現プラスミド又はコントロールの空プラスミドとを用いて、HEK293細胞に形質移入し、４８時間後に該細胞の溶菌液のルシフェラーゼ活性を測定した。図１９ｃにおいては、HEK293細胞に、IL-6、IL-12p40、CTR又はインターフェロンγに対する3’-UTRを内部に有するpGL3と、Zc3h12a発現プラスミド又はコントロールの空プラスミドとを用いて形質移入し、４８時間後に該細胞の溶菌液のルシフェラーゼ活性を測定した。【００６４】
図１８は、IL-6の3’-UTR及びその欠損コンストラクトの模式図である。マウスIL-6 mRNAは、その3’-UTRに５つのアデニン−ウリジン−リッチエレメント(ARE)を含む（図１８）（Zhao, W. et al., p38alpha stabilizes interleukin-6 mRNA via multiple AU-rich elements. J Biol Chem 283, 1778-85 (2008)）。【００６５】
さらに、約３０ヌクレオチドを含む、種の間の保存エレメント（conserved element ：CE）が、IL-6 mRNAの不安定化に重要であることが報告されている（Paschoud, S. et al. Destabilization of interleukin-6 mRNA requires a putative RNA stem-loop structure, an AU-rich element, and the RNA-binding protein AUF1. Mol Cell Biol 26, 8228-41 (2006)）。Zc3h12aの応答に重要なIL-6の3’-UTR領域を調べるために、IL-6 3’-UTRのいくつかの領域を含む一連のルシフェラーゼレポーターコンストラクト (pGL3)を使用した（図１８）。全長のIL-6 3’-UTR (1-403)をレポーターに挿入した場合、ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼレポーターのみの場合と比較して減少した。Zc3h12aの共発現は、pGL3-IL-6 3’-UTR (1-403)のルシフェラーゼ活性をさらに減少させた（図１９ａ）。pGL3-IL-6 3’-UTR (1-70)及びpGL3-IL-6 3’-UTR (172-403)のルシフェラーゼ活性は、Zc3h12a の発現によって変化しなかったが、pGL3-IL-6 3’-UTR (56-173)のルシフェラーゼ活性は、Zc3h12aの存在によって減少した。IL-6 3’-UTR (56-173)は、２つのARE及びCEを含む（図１９ａ）。IL-6 3’-UTR (122-197)はZc3h12aによって不安定化せず、このことから、AREはZc3h12aが媒介するIL-6 mRNAの不安定化に重要でないことが示唆された。反対に、AREを含まないIL-6 3’-UTR (1-142)は、Zc3h12aの発現によって不安定化された（図１９ａ）。短くしたIL-6 3’-UTRを有するルシフェラーゼレポーターコンストラクトを使用することによって、IL-6 (1-92)ではなくIL-6 (1-102)が、Zc3h12aによって不安定化されることが分かった（図２０）。図２０に、IL-6の3’-UTR及びそれを欠損させたコンストラクトの模式図を示す。pGL3-β-グロビンの3’-UTRのルシフェラーゼ活性はZc3h12aの発現に影響されなかったが、IL-6 3’-UTR (77-108)をb-グロビン 3’-UTRに添加すると、Zc3h12aに応答した（図１９ｂ）。これらの結果は、IL-6 3’-UTRのCEが、Zc3h12aが媒介するmRNA不安定化に重要であることを示唆する。Zc3h12aの発現は、インターフェロンγの3’-UTRではなく、IL-12p40及びカルシトニンレセプター(CTR)の3’-UTRを有するレポーターのルシフェラーゼ活性を減少させた(図１９ｃ)。このことは、IL-6 IL-12p40及びCTR mRNAが、Zc3h12aに直接調節されることを示唆する。インターフェロンγは、IL-12の過剰発現によって、二次的に調節されるのかもしれない。【００６６】
（実施例７）
Zc3h12aが直接RNAと結合するかを、調べた。図２１に、UV架橋アッセイによるIL-6の3’UTR (1-403) mRNAに対する結合を調べた結果を示す。ウシ血清アルブミンン(BSA)ではなく、合成されたZc3h12aタンパク質は、in vitroで転写されたIL-6の3’-UTR (1-403)RNAと結合し、Zc3h12aがRNA結合能を有していることが示唆された（図２１）。【００６７】
（実施例８）
IL-6 mRNAの不安定化における、CCCH Zfモチーフの役割
Zc3h12aのCCCH配列がIL-6のmRNAの崩壊において重要な役割を果たすことについて実験を行なった。
図２２ａは、HEK293 Tet-off細胞に、pTREtight-IL6-CDS+3’UTRと、種々の量のFlag-Zc3h12a又はその変異体(C306R及びΔCCCH)をコードする発現プラスミドとを用いて、同時形質移入した後、細胞をDoxで所定時間処理し、IL-6の発現をノーザンブロット分析で決定した結果を示す。図２２ｂは、Zc3h12変異タンパク質の発現量を、免疫ブロッティングによって測定した結果を示す。図２２ｂ中の矢印は、発現したZc3h12a蛋白質を示す。
図２３ａは、HEK293 Tet-off細胞に、pTREtight-IL6-CDS+3’UTRと、Flag-Zc3h12a又はその変異体(C306R及びΔCCCH)をコードする発現プラスミドとを用いて同時形質移入し、次いで、細胞をDoxで所定時間処理し、IL-6の発現をノーザンブロット分析で測定した結果を示す。なお、オートラジオグラフを定量し、IL-6のActbに対する比を、残存mRNAレベルの決定に使用した（図２３ｂ）。図２３ｃは、Zc3h12a変異タンパク質の発現レベルを、免疫ブロットによって測定した結果を示す。【００６８】
CCCH ZfドメインにおけるC306R変異を内部に有するZc3h12ae及びCCCH ドメインがないZc3h12a (aa306-322を欠如)については、これらの変異体タンパク質は、タンパク質発現量が低い場合にはIL-6 mRNAを分解する活性が低下しているにもかかわらず（図２２）、IL-6 mRNAを不安定化することができた（図２３ａ−ｃ）。これらの結果は、CCCHモチーフがIL-6 mRNA崩壊の調節において役割を果たしていることを示唆した。【００６９】
図２４に、マウス及びヒトZc3h12aにおけるN末端及びCCCHドメインの配列アライメントを示す。図２４において、着色部分は、共通配列である。黒丸（●）は、他のPINドメイン構造に保存されたアスパラギン残基を示し、星印は、CCCH Zinc fingerを示す。配列アライメントは、Zc3h12aにおける（Zfドメイン(300-324)の直前の）保存されたN末端ドメイン(139-297)が、PINドメイン様SCOPスーパーファミリーに対する遠縁（remote homology）を共有することを示唆した（図２４）。他のPINドメイン構造に対するアライメントの後の構造モデリングは、Asp141、Asn144、Asp226、Asp244、及びAsp248によって形成される、マグネシウムの結合及び酵素活性に潜在的に重要な、保存された、負に荷電したポケットを明らかにした（図２４及び２５）。図２５は、構造モデリングによって作製した、Zc3h12aのN末端ドメインの構造モデルである。【００７０】
図２６及び図２７ａは、Zc3h12aのエンドリボヌクレアーゼ活性を測定した結果を示すデータである。これらの実験においては、合成されたRNAを、所定量のタンパク質（量を変化させた）と共にインキュベートした。図２６ａ−ｃ及び図２７ａ−ｂにおいて、左のレーンは、RNAのサイズマーカーである。図２６ａに、合成されたZc3h12a及びZc3h12a (D141N)の発現レベルを調べた結果を、図２６ｂに、5 mM Mg2+の存在下又は不在化における、IL-6の3’UTR mRNA (1-403)の分解におけるZc3h12aのリボヌクレアーゼ活性を調べた結果を、図２６ｃに、Zc3h12a及びZc3h12a (D141N)タンパク質のリボヌクレアーゼ活性を調べた結果をそれぞれ示す。
図２７ａは、組換えZc3h12aタンパク質の量を変化させた、5’末端標識又は3’末端標識されたIL-6の3’UTR mRNA (1-403)のin vitroでの切断アッセイの結果を示す。図２７ｂは、Zc3h12aのリボヌクレアーゼ活性の動態分析の結果である。図２７に示す実験においては、5’末端標識又は3’末端標識されたIL-6の3’UTR mRNA (1-403)を、組換えZc3h12aタンパク質と所定時間インキュベートした。【００７１】
図２８ａは、IL-6の発現をノーザンブロット分析で測定した結果を示す。HEK293 Tet-off 細胞に、pTREtight-IL6 full及びZc3h12a (D141N)を用いて同時形質移入した。次いで、細胞をDoxで所定時間処理し、IL-6の発現をノーザンブロット分析で測定した。図２８ｂは、残存mRNAレベルの経時変化を示す。【００７２】
これらの結果から、Zc3h12aタンパク質のN末端ドメインがリボヌクレアーゼであり、合成されたZc3h12aタンパク質がMg2+依存的にL-6の3’-UTR (1-403) mRNAに対してリボヌクレアーゼ活性を示すとの仮説を立てた（図２６ａ及びｂ）。Zc3h12aは、5’及び3’のいずれかが標識化されたRNAを、同様のキネッティックで分解し、Zc3h12aがエンドヌクレアーゼ活性を有することが示唆された（図２７）。様々な配列を有する標的RNAが、ほぼ完全に分解されたことから、Zc3h12aの活性は、in vitroではほとんど配列に依存しないようであった(データ示さず)。さらに、Zc3h12a D141N変異体は、RNAを分解せず、保存されたポケットが実際にリボヌクレアーゼ活性部位として機能していることが示唆された（図２６ａ及びｃ）。Zc3h12a D141N変異体はIL-6の3’-UTRを含むRNAを不安定化することができず、リボヌクレアーゼ活性がZc3h12aの機能に必須であることが示唆された（図２３ａ及び図２８）。【００７３】
（結論）
これらの実験結果は、Zc3h12aが、結果としてマウスの死亡をもたらす重度の自己免疫応答の発達の阻害に必須であることを明確に証明した。TNFではなく、IL-6及びIL-12p40の生産が、mRNAの崩壊不全によって、Zc3h12a-/-マクロファージにおいて非常に上昇した。CCCH-type zinc fingerタンパク質は、3’-UTRと結合することによって、mRNAの崩壊を調節することが示された。例えば、トリテトラプロリン (TTP) 及びそのホモログであるZfp36l1、Zfp36l2、及びZfp36l3は、TNF、GM-CSF、CXCL1などのmRNAの崩壊に重要である（Anderson, P. Post-transcriptional control of cytokine production. Nat Immunol 9, 353-9 (2008)、及びDatta, S. et al. Tristetraprolin regulates CXCL1 (KC) mRNA stability. J Immunol 180, 2545-52 (2008)）。加齢TTP-/-マウスは、TNFの生産によって、自己免疫性関節炎を発症する（Taylor, G. A. et al. A pathogenetic role for TNF alpha in the syndrome of cachexia, arthritis, and autoimmunity resulting from tristetraprolin (TTP) deficiency. Immunity 4, 445-54 (1996)）。しかしながら、TTP-/-細胞がTLR刺激の応答においてIL-6量を上昇させることを示した報告はない。興味深いことに、Zc3h12aの損失が、マクロファージにおけるTNF mRNAの発現に影響しないことは、TTP及びZc3h12aが、異なるサイトカインのmRNAの崩壊を調節していることを示唆した。Zc3h12aは、ARE以外のRNA配列を標的とした。そしてIL-6のAREは、未知のZc3h12aに依存しないメカニズムによって調節されているように見える。Zc3h12a-/-マウスにおいて観察された顕著な病理学的発見を考慮すると、IL-6及びIL-12p40以外の遺伝子も、発病に重要にかかわっているように思われた。他の刺激への応答、又は他の型の細胞におけるZc3h12aの標的遺伝子の道程は、Zc3h12a-/-マウスで観察された異常のメカニズムに関する知識を進歩させるであろう。また、Zc3h12aが単球走化性タンパク質１(MCP-1)誘導性タンパク質であることが報告され（Zhou, L. et al. Monocyte chemoattractant protein-1 induces a novel transcription factor that causes cardiac myocyte apoptosis and ventricular dysfunction. Circ Res 98, 1177-85 (2006)）、Zc3h12aタンパク質の過剰発現は、NF-κB活性化の阻害を通じてマクロファージにおけるサイトカイン生産を抑制することが示された（Liang, J. et al. A novel CCCH-zinc finger protein family regulates proinflammatory activation of macrophages. J Biol Chem 283, 6337-46 (2008)）。しかしながら、本実験はこの報告とは一致せず、Zc3h12aはmRNA崩壊に関与するが、TNFの調節には関与しないことを示した。【００７４】
Zc3h12aタンパク質は、IL-6のmRNAの崩壊を担う内在的なリボヌクレアーゼ化性を有する。このメカニズムは、他のAREが媒介するmRNA崩壊経路の制御と比較してユニークである。例えば、TTPは、ポリAテールを除去し、続くエクソヌクレアーゼによる標的mRNAの分解を促進するためのdeadenylasesを補充することが示されている（Anderson, P. Post-transcriptional control of cytokine production. Nat Immunol 9, 353-9 (2008)）。このように、Zc3h12a が少なくともin vitroでは配列特異性を示さないヌクレアーゼ活性を有することは、興味深いことである。標的特異性は、Zc3h12aの結合パートナーによって決定されるのかもしれない。又は、ある状態下では、Zc3h12aには、分解に好適な配列があるのかもしれない。Zc3h12aがmRNAの崩壊を誘導するメカニズムは、興味深いトピックである。リボヌクレアーゼドメインは、4のZc3h12ファミリーのメンバーにおいて保存されており、このタンパク質ファミリーのホモログは、Drosophila melanogaster (Gene ID: CG10889)、Caenorhabditis elegans (Gene ID: C30F12.1)等の微生物において見出された。このように、リボヌクレアーゼドメイン及びCCCH ZfドメインによるmRNA制御は、進化において保存されているようにみえる。【００７５】
別のRoquinと呼ばれるCCCH zinc-fingerモチーフを含むRING型ユビキチンリガーゼタンパク質は、ICOS共刺激分子の発現を調節することによる自己免疫の抑制に必須である（Vinuesa, C. G. et al. A RING-type ubiquitin ligase family member required to repress follicular helper T cells and autoimmunity. Nature 435, 452-8 (2005)）。Roquin及びいくつかのmicroRNAは、分解を抑制するために、ICOSの3’-UTR RNAセグメントを共有するようである（Yu, D. et al. Roquin represses autoimmunity by limiting inducible T-cell co-stimulator messenger RNA. Nature 450, 299-303 (2007)）。各CCCH Zfタンパク質が標的mRNAに特異性を有していると仮定すれば、60のCCCH-type Zfタンパク質が哺乳類のゲノムで確認されているので（Liang, J. et al. Genome-wide survey and expression profiling of CCCH-zinc finger family reveals a functional module in macrophage activation. PLoS ONE 3, e2880 (2008)）、mRNA崩壊の調節は、先天的な免疫応答の調節の点において、転写の調節と同様に重要かもしれない。
【図７】
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【図８】
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【図１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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