(57)【要約】  中分子（ＭＭＷ）アディポネクチンに交差性を示さず、高分子（ＨＭＷ）アディポネクチンのみに特異的に反応するモノクローナル抗体を開示する。本発明のモノクローナル抗体は、ＨＭＷアディポネクチンを抗原として用いて作製することができる。本発明のモノクローナル抗体によれば、簡便で、高精度且つ汎用性の高いＨＭＷアディポネクチン分析用試薬を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子アディポネクチンと特異的に反応することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２】
高分子アディポネクチンを抗原として用いることを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、高分子アディポネクチンの免疫学的分析方法。
【請求項４】
ラテックス凝集法である、請求項３に記載の免疫学的分析方法。
【請求項５】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を含む、高分子アディポネクチンの免疫学的分析用試薬。
【請求項６】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を担持させたラテックス粒子を含む、請求項５に記載の免疫学的分析用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な高分子アディポネクチン特異的モノクローナル抗体、及びそれを用いる高分子アディポネクチンの選択的分析（特に測定）方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アディポネクチンは、脂肪細胞において特異的に発現される分泌タンパク質であり、抗動脈硬化作用、インスリン抵抗性改善作用が報告されている。近年では、癌、炎症、メタボリックシンドロームとの関与も示されており生体の防御因子として作用すると考えられている。ヒトアディポネクチンは、２４４個のアミノ酸残基から形成され、単量体での分子量は約２８ｋＤａであることが知られている。一方、血液中におけるアディポネクチンは、３量体（ＬＭＷ：Low molecular weight）を基本骨格とし、それの重合した６量体（ＭＭＷ：Middle molecular weight）、そして、さらにそれらが複数重合した多量体（ＨＭＷ：High molecular weight）として存在していることが確認されている。【０００３】
これらのアディポネクチンの各分子量体は、有する生理活性も異なっている。例えば、Ｃ２Ｃ１２細胞株におけるＮＦ−κＢの活性化能は、ＨＭＷおよびＭＭＷでは観察されるが、ＬＭＷでは観察されないことが報告されている。また、アディポネクチン分泌に変異を有するヒトが、ＨＭＷアディポネクチンを形成出来ず低アディポネクチン血症及び糖尿病を発症すること、冠動脈疾患患者では、健常者に比し多量体アディポネクチンの存在比が低下することが報告されている。さらに、ダイエットの前後で血液中濃度が変動するのは、ＨＭＷであることも報告されている。したがって、ＨＭＷアディポネクチンのみを検出することが、アディポネクチンの研究及び種々の疾患の研究においては重要である。【０００４】
通常、タンパク質分子は、そのタンパク質を抗原として特異的に認識するモノクローナル抗体により単離することができる。しかし、抗原が、アディポネクチンのように同一の単量体からなる種々の形態の多量体が混在するものである場合、特定サイズの分子のみに特異的な抗体を見つけることは困難である。抗体は抗原の一次アミノ酸配列を認識する場合が多いので、抗原が多量体の場合、抗体は一般的に、それを構成する単量体の一次アミノ酸配列を認識する。一方、アディポネクチンは、同一の単量体からなるので、アディポネクチン単量体を認識する抗体は、同時にあらゆる形態のアディポネクチン多量体を認識することとなる。また、たとえモノクローナル抗体が立体構造を認識する場合でも、ＨＭＷアディポネクチンのように基本骨格が多数重合する分子では、他の分子との交差は避けがたい。【０００５】
したがって、一般的な抗体を利用する場合、特定サイズのアディポネクチン分子のみを検出することは困難である。【０００６】
特定分子サイズのアディポネクチンを定量するには、従来、ゲル濾過等の前処理により分子量ごとに分画し、各ピークを検出する方法や、特定のプロテアーゼにより特定分子を消化後検出する方法が一般的であった。また、ゲル濾過やプロテアーゼ等の前処理を要しないＥＬＩＳＡ技術も開発されているが、ＭＭＷへの交差が見られ、ＨＭＷ特異的とは言い難い。したがって、簡易な前処理法で、又は前処理なしに、特定分子サイズのアディポネクチンのみを検出できる手法が求められている。【０００７】
公知の特定分子サイズのアディポネクチンの測定法としては、上記のようなゲル濾過法以外に、以下の２種の方法が知られている。
（１）ＬＭＷおよびＭＭＷを分解する酵素による前処理を行い、酵素分解されずに残ったアディポネクチンを測定することによって、ＨＭＷだけを検出する方法（特許文献１）。
（２）アディポネクチン単量体には反応しないが、３量体及び／又はそれが凝集した構造を有する高分子アディポネクチンを認識する抗体を用い、当該高分子アディポネクチン抗原だけを検出する方法（特許文献２）。【０００８】
しかしながら、酵素による前処理の場合、数十分の酵素処理時間が必要であり、且つ至適時間を超える長時間のインキュベートを行った場合、混在するプロテアーゼにより標的分子自体が分解される危惧があるため、インキュベートの時間を厳密に規定する必要がある。さらに、酵素による処理は、標的抗原のタイプに応じて至適な種類の分解酵素を選択する必要があるため、汎用性のある方法とはいい難い。【０００９】
一方、公知の高分子アディポネクチンを認識する抗体を利用する場合でも、高分子体（ＨＭＷ）とともに他の多量体構造（ＬＭＷやＭＭＷ）も一緒に認識されてしまうため、純粋にＨＭＷのみを検出できる方法とは言い難い。ＨＭＷアディポネクチンのみを特異的に認識する抗体は、これまで知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００５／０３８４５７号パンフレット
【特許文献２】特許第３６２４２１６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来の前処理不要型のＨＭＷ検出用ＥＬＩＳＡには、ＭＭＷを大量に含有する検体においてＭＭＷに交差性を示す問題点が存在するため真にＨＭＷ特異的な測定が困難であること、更にＥＬＩＳＡではＨＭＷ選択制が強い抗体であっても、ラテックス標識することによりＨＭＷ選択性を失うものがあり、ラテックスにより簡易にＨＭＷアディポネクチンを測定することは極めて困難であった。そこで本発明の課題は、ＭＭＷアディポネクチンに交差性を示さず、ＨＭＷアディポネクチンのみを選択的に検出若しくは定量するためのモノクローナル抗体および、簡便で、高精度且つ汎用性の高い高分子アディポネクチン分析用試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、より簡便にＨＭＷアディポネクチンのみを選択的に検出若しくは定量できる高分子アディポネクチン分析用ラテックス試薬の構築および、それに用いるモノクローナル抗体のスクリーニングを実施した。その結果、サンドイッチＥＬＩＳＡ系にて比較的ＨＭＷ特異性の強い抗体でも、ラテックス試薬として評価した場合には全くＨＭＷ特異性を示さないことが確認されたため、ヒト血液中アディポネクチンのＨＭＷ画分だけを用いて新たにモノクローナル抗体を作製した。本モノクローナル抗体は、他の大腸菌組替アディポネクチンにより作製したモノクローナル抗体に比し、ウエスタンブロッティング解析では同等の反応性を有していても、サンドイッチＥＬＩＳＡ系で評価すると極めてＨＭＷ特異性が強いことを見出した。更には、これを用いたアディポネクチン分析用ラテックス試薬を構築した結果、本試薬はＭＭＷに交差性を示さずにＨＭＷアディポネクチンを選択的に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１３】
本発明は、
［１］高分子アディポネクチンと特異的に反応することを特徴とするモノクローナル抗体、
［２］高分子アディポネクチンを抗原として用いることを特徴とする、［１］のモノクローナル抗体の製造方法、
［３］［１］のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、高分子アディポネクチンの免疫学的分析方法、
［４］ラテックス凝集法である、［３］の免疫学的分析方法、
［５］［１］のモノクローナル抗体を含む、高分子アディポネクチンの免疫学的分析用試薬、
［６］［１］のモノクローナル抗体を担持させたラテックス粒子を含む、［５］の免疫学的分析用試薬
に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の新規モノクローナル抗体によれば、より簡便に、且つ、正確に、高分子（ＨＭＷ）アディポネクチンのみを選択的に分析（検出若しくは定量）できる高分子アディポネクチン分析用試薬（特にはラテックス試薬）及び分析方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】公知モノクローナル抗体を用いる各種ＥＬＩＳＡキットを用いて、ヒト血清（ＭＭＷ低値検体）のゲル濾過画分中のアディポネクチン量を測定した結果を示すグラフである。
【図２】図１と同じＥＬＩＳＡキットを用いて、ヒト血清（ＭＭＷ高値検体）のゲル濾過画分中のアディポネクチン量を測定した結果を示すグラフである。
【図３】公知モノクローナル抗体ＡＮＯＣ９１２１を用いて作製したラテックス試薬により、ヒト血清のゲル濾過画分中のアディポネクチン量を測定した結果を示すグラフである。
【図４】図１と同じＥＬＩＳＡキットに加え、本発明のＥＬＩＳＡキットを用いて、ヒト血清（ＭＭＷ低値検体）のゲル濾過画分中のアディポネクチン量を測定した結果を示すグラフである。
【図５】図４と同じＥＬＩＳＡキットを用いて、ヒト血清（ＭＭＷ高値検体）のゲル濾過画分中のアディポネクチン量を測定した結果を示すグラフである。
【図６】本発明のモノクローナル抗体Ｃｌｏｎｅ８Ｄを用いて作製した、本発明のラテックス試薬により、ヒト血清のゲル濾過画分中のアディポネクチン量を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体は、高分子アディポネクチンと特異的に反応する。本明細書において、「高分子アディポネクチンと特異的に反応する」とは、高分子アディポネクチンと反応するが、３量体アディポネクチンと反応せず、６量体アディポネクチンと実質的に反応しないことを意味する。なお、本明細書では、高分子アディポネクチン、６量体アディポネクチン、３量体アディポネクチンを、それぞれ、ＨＭＷアディポネクチン、ＭＭＷアディポネクチン、ＬＭＷアディポネクチン（または、単に、ＨＭＷ、ＭＭＷ、ＬＭＷ）と称することがある。
【００１７】
また、本明細書において、「高分子アディポネクチン」とは、ＬＭＷ及び／又はＭＭＷの重合体を基本骨格とした多量体であって、非変性下で分画するときに約４４０ｋＤａ以上に分画され（すなわち、ＨＭＷとＭＭＷとの境界が約４４０ｋＤａ）、６７０ｋＤａ近辺にピークを有する前記多量体を意味する。
なお、前記分子量は、後述の比較例および実施例で実施したゲル濾過により決定される値であり、そのゲル濾過条件は以下のとおりである。
カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ（ＧＥ  ヘルスケア  バイオサイエンス）
移動層（溶媒）：Ｄ−ＰＢＳ
送液速度：１ｍＬ／ｍｉｎ
分子量マーカー：  
（１）ウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin）：67,000(Da)
（２）アルドース（Aldolase）：158,000
（３）カタラーゼ（Catalase）：232,000
（４）フェリチン（Ferritin）：440,000
（５）チログロブリン（Thyroglobulin）：669,000
（６）ブルーデキストラン２０００（Blue Dextran 2000）：2,000,000
【００１８】
本明細書において、「６量体アディポネクチン（ＭＭＷ）と実質的に反応しない」とは、ヒト血清を非変性下で分画するときに、４００ＫＤａ近辺にピークを有し、約２５０〜４４０ｋＤａに溶出する分子に反応性を示さない事を言う。
【００１９】
本発明のＨＭＷアディポネクチン特異的抗体の作製法としては、免疫原として生体から直接採取され、ＨＭＷに分画されたアディポネクチンを使用すること以外、従来のモノクローナル抗体の作製法に準じて行うことができる。
【００２０】
免疫原として使用する生体試料は、ＨＭＷアディポネクチンを含有する可能性のある生物学的液体である限り、特に限定されるものではないが、例えば、生体から直接採取することにより得られる生体液［例えば、血液（すなわち、全血）、血清、血漿、尿、髄液、又は分泌液など］、あるいは、生体から採取した生体材料（例えば、臓器、組織、又は細胞など）を処理して得られる生体材料由来液（例えば、臓器、組織、若しくは細胞の各種抽出液、又は組織若しくは細胞の各種培養液など）などを挙げることができる。
【００２１】
免疫原としてのＨＭＷアディポネクチン画分は、上記生体試料を用いて、ＨＭＷアディポネクチンを含む様々な分子量のアディポネクチンを分取した後、ゲルろ過クロマトグラフィーによって、ＨＭＷを分取することによって調製できる。ＨＭＷアディポネクチンを含む様々な分子量のアディポネクチンの採取には、ＨＭＷアディポネクチンを認識する抗体を固定したアフィニティークロマトグラフィーを使用することができる。固定化する抗体は、少なくともＨＭＷアディポネクチンを認識できる抗体であれば良く、ＭＭＷやＬＭＷアディポネクチンも認識しても良い。アフィニティークロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィーの具体的な方法は、使用する抗体や生体試料の量などに合わせて適宜実施することができる。また、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分取した後、アフィニティークロマトグラフィーにより分取しても良い。
【００２２】
このように作製したＨＭＷアディポネクチンモノクローナル抗体は、免疫グロブリン分子自体のほか、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖ等、公知の方法に従って調製し、ＨＭＷアディポネクチンの選択的測定法に使用することができる。
【００２３】
本発明により分析可能な被検試料は、ＨＭＷアディポネクチンを含有する可能性のある生物学的液体である限り、特に限定されるものではないが、例えば、生体から直接採取することにより得られる生体液［例えば、血液（すなわち、全血）、血清、血漿、尿、髄液、又は分泌液など］、あるいは、生体から採取した生体材料（例えば、臓器、組織、又は細胞など）を処理して得られる生体材料由来液（例えば、臓器、組織、若しくは細胞の各種抽出液、又は組織若しくは細胞の各種培養液など）などを挙げることができる。
【００２４】
ＨＭＷアディポネクチンは、例えば、正常ヒト血中には、数μｇ／ｍＬ〜数十μｇ／ｍＬの濃度で存在する。あるいは、予備実験等により処理液（例えば、抽出用溶液又は培養用溶液）の量を適宜選択することにより、得られる生体材料由来液中のＨＭＷアディポネクチン濃度を数μｇ／ｍＬ〜数十μｇ／ｍＬとすることができる。
このように、本発明により分析可能な生物学的液体（特に血液）は、ＨＭＷアディポネクチンを数μｇ／ｍＬ〜数十μｇ／ｍＬの濃度で含むが、本発明のＨＭＷアディポネクチン分析用試薬により、前希釈することなく、分析することができる。
【００２５】
本発明のＨＭＷアディポネクチン分析法としては、公知の免疫学的測定方法を使用することができる。免疫学的測定方法としては、ＥＬＩＳＡ法やＲＩＡ法、免疫凝集法やイムノクロマト法などが挙げられる。ラテックスを使用した免疫凝集法について、より具体的に記載する。
【００２６】
本発明で用いるラテックス粒子としては、公知のラテックス粒子、例えば、ポリスチレン、又はスチレンースチレンスルホン酸塩共重合体等からなるラテックス粒子を挙げることができる。ＨＭＷアディポネクチンに対する特異的抗体を担持するラテックスの平均粒径は、例えば、被検試料である生物学的液体の種類、ＨＭＷアディポネクチンの含有濃度、又は測定機器などに応じて、通常、０．０５〜１．０μｍの範囲で適宣選択することができる。
【００２７】
例えば、血中ＨＭＷアディポネクチンを分析する場合には、正常ヒト検体中に数μｇ〜数十μｇ／ｍＬと高濃度にＨＭＷアディポネクチンが存在することから、前記ラテックス粒径を適宜選択することにより、血中ＨＭＷアディポネクチンの測定系の測定範囲が保証可能となる。例えば、粒径が０．１μｍ以下では、臨床的意義の高い５μｇ／ｍＬ以下の測定正確性が保証されないことがあり、粒径が０．５μｍ以上では、正常高値検体の測定ができなくなることがある。従って、血中ＨＭＷアディポネクチンの測定系としては、平均粒径０．１〜０．５μｍのラテックス粒子が好ましい。
【００２８】
本発明のＨＭＷアディポネクチン分析用ラテックス試薬は、ＨＭＷアディポネクチンに対する特異的なモノクローナル抗体を担持したラテックス粒子懸濁液を含む限り、その形態は特に限定されるものではないが、例えば、ＨＭＷアディポネクチン特異的抗体を感作したラテックス粒子と緩衝液との両方を含む１液系の試薬；あるいは、緩衝液である第１試薬と、ＨＭＷアディポネクチン特異的抗体を感作したラテックス粒子を含む第２試薬とで構成される２液系の試薬など、種々の形態であることができる。
【００２９】
本発明のＨＭＷアディポネクチン分析方法は、アディポネクチンを含む可能性のある生物学的液体を取得した後、取得した前記生物学的液体に対して前希釈及び／又は前処理することなく、取得した状態のままで、あるいは、所望により適当な処理を実施した後、本発明のＨＭＷアディポネクチンに対する特異的抗体を担持したラテックス粒子懸濁液（好ましくは、本発明のＨＭＷアディポネクチン分析用ラテックス試薬）と接触させることができる。
【００３０】
例えば、本発明方法の好適態様の１つである、自動分析測定装置を用いるＨＭＷアディポネクチン分析方法は、
（１）アディポネクチンを含む可能性のある生物学的液体を取得する工程、及び（２）前記工程で取得した生物学的液体を、前記工程で取得した状態のままで、あるいは、適当な前希釈及び／又は前処理を実施した後、自動分析測定装置内において、ＨＭＷアディポネクチンに対する特異的抗体を担持したラテックス粒子懸濁液と接触させ、ラテックス粒子の凝集度合いを光学的に分析する工程
を含む。
【００３１】
各種生物学的液体、例えば、血液中のＨＭＷアディポネクチン測定は、従来の測定方法であるラジオイムノアッセイ又はエンザイムイムノアッセイを用いた場合には、例えば、５００〜５０００倍に検体を希釈するステップを必要としている。それに対して、本発明のＨＭＷアディポネクチン分析方法では、例えば、ラテックス粒子の粒径を適宜選択する（例えば、血中ＨＭＷアディポネクチンの場合には、０．１〜０．５μｍの粒径が好ましい）ことにより、検体の前希釈や前処理を必要とせず、原液を試料としてラテックス凝集反応を実施することが可能である。
【００３２】
本発明のＨＭＷアディポネクチン分析方法においては、ＨＭＷアディポネクチンに対する特異的抗体を担持したラテックス粒子（例えば、本発明のＨＭＷアディポネクチン分析用ラテックス試薬）を用いて凝集反応を行い、生じた凝集の度合い（凝集度）を光学的に分析（特には測定）することにより、生物学的液体中（例えば、血中）のＨＭＷアディポネクチンの量を分析（特には測定）することができる。ラテックス粒子の凝集度を光学的に分析する具体的方法においては、例えば、目視的に観察するか、あるいは、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を測定する光学機器を用いて測定を行うことができる。好ましい測定波長は３００〜８００ｎｍである。測定方法は、公知の方法に従い、用いるラテックス粒子の大きさ（平均粒径）若しくは濃度の選択、又は反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度の増加又は減少を測定することにより行うことができる。また、これらの方法を併用することも可能である。
【００３３】
一般的に、ラテックス凝集反応の測定系に存在させるＨＭＷアディポネクチンに対する特異的抗体感作ラテックスの濃度は、例えば、共存する塩、タンパク質、又は糖類等の添加物の濃度によって適宜選択することができる。一般には、反応系の最終液量の濃度として、ＨＭＷアディポネクチンに対する特異的抗体感作ラテックスが好ましくは０．０５〜１０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１〜２ｍｇ／ｍＬになるように、調製することができる。ＨＭＷアディポネクチンに対する特異的抗体感作ラテックスの濃度が低すぎると、凝集反応の低濃度測定が充分でなくなることがあり、高すぎると、凝集反応の高濃度測定が充分でなくなり、再現性が悪くなることがある。
【００３４】
本発明においては、ＨＭＷアディポネクチンに対する特異的抗体感作ラテックスの凝集反応に影響を与える他の因子を調節することによって、ラテックス粒子凝集反応を更に精密に測定し、低濃度域及び高濃度域の定量可能範囲を更に拡張させることができる。ラテックス凝集反応に影響を与える他の因子としては、例えば、ラテックス粒子の濃度、ラテックス粒子上の抗体感作量、又はラテックス粒子の粒径等を挙げることができる。
【００３５】
本発明のＨＭＷアディポネクチン分析方法におけるラテックス凝集反応の条件は、通常の条件と同様であってよく、反応媒体としては、各種生物学的液体中のＨＭＷアディポネクチン分析に応じた各種緩衝液が適宜選択することができる。血中ＨＭＷアディポネクチンを分析する場合には、この緩衝液は、血中ＨＭＷアディポネクチンを失活させることがなく、しかも、ラテックス凝集反応を阻害しないようなイオン強度やｐＨを有するものであれば、特に限定されるものではない。例えば、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、又はトリス緩衝液などが使用可能である。反応のｐＨは、５〜１０、特に６〜８が好ましい。反応温度は０〜５０℃、特に２０〜４０℃が好ましい。反応時間は適宜決定することができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００３７】
《比較例１》
公知のモノクローナル抗体
本発明のモノクローナル抗体との比較のために、公知モノクローナル抗体として、大腸菌組み替えアディポネクチン抗原をマウスに感作して作製した２種のモノクローナル抗体ＡＮＯＣ９１２１、Ｃｌｏｎｅ５Ａを使用した。両モノクローナル抗体のヒト血中アディポネクチンへの反応性を表１にまとめた。両抗体共に非還元下のウエスタンブロッティングでは血中のＭＭＷ，ＨＭＷを同等に検出可能である。しかしながら、同一抗体同士のサンドイッチＥＬＩＳＡではＣｌｏｎｅ５Ａは血液中の全ての分子を認識するが、ＡＮＯＣ９１２１同士のサンドイッチＥＬＩＳＡではＭＭＷへの弱い交差が見られた。【００３８】
【表１】
2010128657.tif 000002
【００３９】
公知モノクローナル抗体における問題点−１：ＭＭＷへの交差反応性
先に作製したＡＮＯＣ９１２１同士のサンドイッチＥＬＩＳＡキットおよび、前処理を必要としない市販の高分子アディポネクチンＥＬＩＳＡキット（富士レビオ）を用いて、二種類のヒト血清のゲル濾過画分を測定した。また、総アディポネクチンの測定はヒトアディポネクチンＥＬＩＳＡキット（大塚製薬株式会社）を使用した。
本明細書の比較例および実施例で実施したゲル濾過は、特に断らない限り、以下の条件で実施した。
カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ（ＧＥ  ヘルスケア  バイオサイエンス）
移動層（溶媒）：Ｄ−ＰＢＳ
送液速度：１ｍＬ／ｍｉｎ
分子量マーカー：
（１）ウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin）：67,000(Da)
（２）アルドース（Aldolase）：158,000
（３）カタラーゼ（Catalase）：232,000
（４）フェリチン（Ferritin）：440,000
（５）チログロブリン（Thyroglobulin）：669,000
（６）ブルーデキストラン２０００（Blue Dextran 2000）：2,000,000【００４０】
ＭＭＷの含有比が高くない血清サンプルを用いた場合の結果を図１に、ＭＭＷの含有比が高い血清サンプルを用いた場合の結果を図２に、それぞれ示す。図１及び図２において、ＡはＡＮＯＣ９１２１を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を、Ｂは市販の高分子アディポネクチンＥＬＩＳＡキット（富士レビオ）の結果を、Ｃは総アディポネクチン測定用のヒトアディポネクチンＥＬＩＳＡキット（大塚製薬株式会社）の結果を示す。
その結果、図１に示すようにＭＭＷの高くないサンプルでは、ＡＮＯＣ９１２１  ＥＬＩＳＡキット、市販の高分子アディポネクチンＥＬＩＳＡキット共に高分子（Ｈ）の特異測定が可能であった。一方、図２に示すようなＭＭＷ高値サンプルでは、ＭＭＷへの交差反応性が両キット共に確認されるため、ＨＭＷ特異測定は困難となる。
なお、上記のゲル濾過条件において、ＨＭＷ画分、ＭＭＷ画分、及びＬＭＷ画分は、それぞれ、分子量が、＞約４４０ｋＤａ、約２５０〜４４０ｋＤａ、＜約２５０ｋＤａの画分である。【００４１】
《比較例２》
公知モノクローナル抗体における問題点−２：ラテック試薬化の問題
ＥＬＩＳＡにてＭＭＷ反応性を有するものの、ＨＭＷ特異性の高いＡＮＯＣ９１２１モノクローナル抗体を用いてラテックス試薬の調製を試みた。
（１）ＡＮＯＣ９１２１モノクローナル抗体感作ラテックス試薬の調製
ＡＮＯＣ９１２１モノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で０．０１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した液９ｍＬに、平均粒径０．２μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％）１ｍＬを添加し、室温にて６０分間攪拌した。次いで、この液に、ウシ血清アルブミンを０．５重量％含有するトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、室温にて６０分間攪拌した後、この混合液を２００００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させ、ＡＮＯＣ９１２１モノクローナル抗体感作ラテックス液を調製した。【００４２】
（２）緩衝液の調製
０．５％（重量％）濃度でウシ血清アルブミンを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に、０．９％（重量％）濃度の塩化ナトリウムを添加して緩衝液とした。【００４３】
（３）ＨＭＷアディポネクチン分析用ラテックス試薬
本比較例で使用するヒトアディポネクチン抗原測定試薬は、（２）で調製した緩衝液からなる第１試薬と、（１）で調製したＡＮＯＣ９１２１モノクローナル抗体感作ラテックスからなる第２試薬とからなる２液系の試薬として構成した。【００４４】
アディポネクチンの測定
（１）アディポネクチン分画の測定
ヒト血清中のアディポネクチン分画（ＭＭＷ低値サンプル）３５μＬに、アディポネクチン測定用試薬の調製（２）で調製した緩衝液９０μＬを混合し、３７℃で適時保持した後、アディポネクチン測定用試薬の調製（１）で調製したＡＮＯＣ９１２１モノクローナル抗体感作ラテックス液９０μＬを添加攪拌し、この後、５分後の波長５７０ｎｍでの吸光度を測定した。この間の吸光度の変化量を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。標準アディポネクチン抗原液から得られるΔＡｂｓとその抗原濃度とから検量線を作成した。その検量線を用いて、被検サンプルのΔＡｂｓからアディポネクチン値を計算した。測定は、日立自動分析装置７１７０型を用いて行った。【００４５】
この際、市販のヒトアディポネクチン  ラテックスキット（三菱化学ヤトロン）を使用して、総アディポネクチンの測定も同時に行った。測定して得られた吸光度について、２試薬間のピークを比較するため、１０９番目のフラクション吸光度が一致するように、ＡＮＯＣ９１２１抗体感作ラテックス試薬での測定吸光度を補正した。【００４６】
図３に、このようにして作製されたＡＮＯＣ９１２１を用いたＨＭＷアディポネクチン分析用ラテックス試薬を用いてヒト血清中のアディポネクチン分画を評価した結果（図３のＥ）に示す。
既に市販している総アディポネクチン分析用ラテックス試薬の結果（図３のＤ）と比較すると、ＡＮＯＣ９１２１を用いたアディポネクチン分析用ラテックス試薬は、ＬＭＷに相当する分画に反応性を示さなかったものの、ＨＭＷ、ＭＭＷ共に総アディポネクチン分析用ラテックス試薬と同等に検出することが明らかとなり、ＭＭＷ低値サンプルでもＭＭＷを検出してしまい、ＥＬＩＳＡの性能を再現することはできなかった。【００４７】
ＥＬＩＳＡの結果がラテックス試薬に反映されなかった理由として、一次抗体と反応させ、次いで二次抗体と反応させるＥＬＩＳＡに比し、ラテックス試薬では同時に凝集が開始する等の反応原理の違いに起因する事が考えられるが、ＨＭＷに対する特異性や親和性の低さも原因と成りうると考える。【００４８】
《実施例１》
（１）免疫原の調製および新規モノクローナル抗体の作製
既に試行した大腸菌組み替えアディポネクチンによる抗体作製では、ＨＭＷ特異性の高いモノクローナル抗体の作製は困難と判断し、ヒト血液中アディポネクチンからＨＭＷ画分だけを抽出しモノクローナル抗体の作製を行った。ヒト血液中総アディポネクチンの精製には、前述のＡＮＯＣ９１２１結合カラムを用いた。同カラムは、３〜１０ｍｇ／ｍＬの精製ＡＮＯＣ９１２１をＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂの４ｇとカップリングする事で作製し、リン酸緩衝液で洗浄後の同カラムに５〜２０ｍＬのヒト血清をアプライした。リン酸緩衝液で余分な血清成分を洗浄除去後、溶出液にてヒト血液中アディポネクチンを溶出した。溶出液としては数ｍｏｌ／Ｌ尿素等の蛋白変性剤や、カオトロピックイオン、また数ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム溶液が使用可能であるが、本実施例では６ｍｏｌ／Ｌ尿素を使用した。更に、溶出されたアディポネクチンは、ゲル濾過精製により、ＨＭＷ画分のうち、ＨＭＷのピークよりも高分子量側だけを回収することで、ヒト血中アディポネクチンのＨＭＷを精製した。【００４９】
精製されたヒト血中ＨＭＷアディポネクチンは、フロイント完全アジュバンド若しくはフロイント不完全アジュバンドと共に、マウスＢａｌｂ／Ｃに１〜１０μｇ／個体を隔週で数回程度免疫した。マウスより脾臓を摘出後、定法に従いマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１とポリエチレングリコール法を用いて融合させ、ハイブリドーマを作製した。
作製されたハイブリドーマから、より天然（Ｎａｔｉｖｅ）型のアディポネクチンに特異性の高いモノクローナル抗体をスクリーニングするため、全く変性の起きていないアディポネクチンとして血液中のアディポネクチンを利用した。詳細には、Ｆｃ部分を消化したＡＮＯＣ９１２１  Ｆ（ａｂ’）２を作製し、ＡＮＯＣ９１２１  Ｆ（ａｂ’）２固相プレートを作製した。本Ｆ（ａｂ’）２プレートに、適宜希釈したヒト血清を反応させ、続いてハイブリドーマの培養上清を反応させた。更にホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体を添加しインキュベートした後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンの発色の強度を測定することにより、天然型のアディポネクチンに特異性、親和性共に高いモノクローナル抗体ｃｌｏｎｅ８Ｄを産生するマウス−マウスハイブリドーマＣｌｏｎｅ８Ｄをスクリーニングした。【００５０】
（２）新規に作製したモノクローナル抗体のウエスタンブロッティングによる評価
血液中より精製したＨＭＷアディポネクチン画分を用いて作製した、抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体Ｃｌｏｎｅ８Ｄを用いてヒト血中のアディポネクチン分子を、ウエスタンブロッティングにより解析した。サンプルとして、非還元非加熱条件下および２−メルカプトエタノールによる還元条件下でヒト血液を電気泳動し、これに前述のＡＮＯＣ９１２１、Ｃｌｏｎｅ５Ａ、およびＣｌｏｎｅ８Ｄの３種類の抗体を反応させ、染色した。ヒト血中アディポネクチンは、非還元非加熱条件下では、ＨＭＷやＭＭＷ、ＬＭＷ等の多様な形態で存在する一方、還元条件下では、３量体以上の形態が消失し、単量体である約２８，０００Ｄａの形態若しくは２量体相当の分子として存在する。モノクローナル抗体ＡＮＯＣ９１２１は、非還元非加熱条件下および還元下において、これら全ての分子量体を認識した。一方モノクローナル抗体Ｃｌｏｎｅ５Ａおよび今回ヒト血中アディポネクチンを用いて作製したＣｌｏｎｅ８Ｄは、還元変性された単量体を認識しないが、非還元非加熱条件下の高分子量体を認識する事が示されたが、ウエスタンブロッティングで評価する限りでは高分子量体への反応性は３者の間に大きな差異は見られなかった。【００５１】
《実施例２》
新規に作製したモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡによる評価
Ｃｌｏｎｅ８Ｄを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを構築し、ＨＭＷ特異性を従来のサンドイッチＥＬＩＳＡと比較した。詳しくは、リン酸緩衝液に５〜１０μｇ／ｍＬ濃度で希釈したＣｌｏｎｅ８Ｄを、市販９６穴ＥＬＩＳＡプレートに添加し一晩固相化反応を行った。続いて、０．１〜１％のウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝液にてブロッキング操作を行った。この抗体固相プレートに、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケア）を用いてＨＰＬＣ分画したヒト血清を反応させ、洗浄後ビオチン標識したＣｌｏｎｅ８Ｄを反応させた。更にＨＲＰ結合ストレプトアビジンを添加し、インキュベートした後、過剰量のＨＲＰ結合ストレプトアビジンを洗浄した。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンの添加により得られる発色の強度を測定することにより、各画分のアディポネクチン量を決定した。
更に、同一画分を、比較例１で使用した、ＡＮＯＣ９１２１同士のサンドイッチＥＬＩＳＡキット、前処理を必要としない市販の高分子アディポネクチンＥＬＩＳＡキット（富士レビオ）で測定しＭＭＷへの交差性を確認した。また、総アディポネクチンの測定にはヒトアディポネクチンＥＬＩＳＡキット（大塚製薬株式会社）を使用した。その結果を図４及び図５に示す。Ｃｌｏｎｅ８Ｄを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（図４及び図５のＦ）は他の測定法に比し、図５に示すようなＭＭＷ低値の検体だけでなく、図６に示すようなＭＭＷを大量に含有する検体においてもＭＭＷへの交差性を示さずＨＭＷ特異的な測定が可能であった。【００５２】
《実施例３》
新規モノクローナル抗体を用いた高分子アディポネクチン分析用ラテックス試薬の調製
（１）Ｃｌｏｎｅ８Ｄモノクローナル抗体感作ラテックス試薬の調製
Ｃｌｏｎｅ８Ｄモノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で０．０１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した液９ｍＬに、平均粒径０．２μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％）１ｍＬを添加し、室温にて６０分間攪拌した。次いで、この液に、ウシ血清アルブミンを０．５重量％含有するトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、室温にて６０分間攪拌した後、この混合液を２００００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを添加し、ラテックスを懸濁させ、Ｃｌｏｎｅ８Ｄモノクローナル抗体感作ラテックス液を調製した。【００５３】
（２）緩衝液の調製
０．５％（重量％）濃度でウシ血清アルブミンを含有する０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に、０．９％（重量％）濃度の塩化ナトリウムを添加して緩衝液とした。【００５４】
（３）ＨＭＷアディポネクチン分析用ラテックス試薬
本実施例で使用するヒトアディポネクチン抗原測定試薬は、（２）で調製した緩衝液からなる第１試薬と、（１）で調製したＣｌｏｎｅ８Ｄモノクローナル抗体感作ラテックスからなる第２試薬とからなる２液系の試薬として構成した。【００５５】
アディポネクチンの測定
（１）アディポネクチン分画の測定
ヒト血清中のアディポネクチン分画３５μＬに、アディポネクチン測定用試薬の調製（２）で調製した緩衝液９０μＬを混合し、３７℃で適時保持した後、アディポネクチン測定用試薬の調製（１）で調製したＣｌｏｎｅ８Ｄモノクローナル抗体感作ラテックス液９０μＬを添加攪拌し、この後、５分後の波長５７０ｎｍでの吸光度を測定した。この間の吸光度の変化量を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。標準アディポネクチン抗原液から得られるΔＡｂｓとその抗原濃度とから検量線を作成した。その検量線を用いて、被検サンプルのΔＡｂｓからアディポネクチン値を計算した。測定は、日立自動分析装置７１７０型を用いて行った。【００５６】
この際、市販のヒトアディポネクチン  ラテックスキット（三菱化学ヤトロン）を使用して、総アディポネクチンの測定も同時に行った。測定して得られた吸光度について、２試薬のピークを比較するため、１０９番目のフラクション吸光度が一致するように、Ｃｌｏｎｅ８Ｄ抗体感作ラテックス試薬での測定吸光度を補正した。
結果を図６に示す。図６において、Ｄは市販のヒトアディポネクチン  ラテックスキット（三菱化学ヤトロン）の結果を、Ｇは本発明のＣｌｏｎｅ８Ｄ抗体感作ラテックス試薬の結果を示す。本試薬を用いてヒト血清アディポネクチンのゲル濾過画分を測定した結果、ＨＭＷ特異的なラテックス凝集反応を確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明のモノクローナル抗体は、アディポネクチンの分析の用途に用いることができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【受託番号】
【００５８】
マウス−マウスハイブリドーマＣｌｏｎｅ８Ｄは、国際寄託当局としての独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、平成２１年（２００９年）３月５日に寄託（受領番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０６）されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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