【事件の表示】
　特許第３１７２１５０号「ＧＡＢＡ含有飲食品の製造法」の請求項１ないし５に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３１７２１５０号の請求項１ないし５に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　特許第３１７２１５０号に係る発明についての出願は、平成１１年４月２２日（優先日　平成１０年４月２７日）に出願され、平成１３年３月２３日にその特許の設定登録がなされ、その後、特許異議申立人　田口サツキより請求項１ないし５の特許について特許異議の申立てがなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１４年６月１０日に訂正請求がなされたものである。
　
２．訂正の適否についての判断
ア．訂正の内容
訂正事項ａ
　特許請求の範囲の請求項１に記載の「乳類に、」を、「グルタミン酸を構成アミノ酸として含む蛋白質又はペプチドを含有する獣乳、大豆及びそれらの加工品から選ばれる乳類に、」と訂正する。
訂正事項ｂ
　特許明細書第２頁段落【０００７】に記載の「乳類に、」を、「グルタミン酸を構成アミノ酸として含む蛋白質又はペプチドを含有する獣乳、大豆及びそれらの加工品から選ばれる乳類に、」と訂正する。
イ．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否
　訂正事項ａは、「乳類に、」を、「グルタミン酸を構成アミノ酸として含む蛋白質又はペプチドを含有する獣乳、大豆及びそれらの加工品から選ばれる乳類に、」と限定するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とした明細書の訂正に該当し、また、上記訂正事項ｂは、特許請求の範囲の上記訂正事項ａの訂正に伴い、発明の詳細な説明の記載を特許請求の範囲の記載に整合させるものであるから。明瞭でない記載の釈明を目的とした明細書の訂正に該当するものである。
　そして、上記訂正事項ａ及びｂについては、願書に添付した明細書の段落【０００８】に「本発明飲食品の素材は、グルタミン酸を構成アミノ酸として含む蛋白質又はペプチドを含有するものである。」こと、及び「食品素材は蛋白質を含むものであれば特に制限されない・・・獣乳、大豆又はそれらの加工品、例えば脱脂粉乳、豆乳等が好ましい。」ことが記載されているから、これらの訂正は、願書に最初に添付した明細書に記載された事項の範囲内においてなされたものであり、また、実質的に特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。
ウ．むすび
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項で準用する特許法第１２６条第２項および第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議申立ての理由及び取消理由の概要
　特許異議申立人　田口サツキは、下記の甲第１号証〜甲第５号証を提出して、（１）訂正前の請求項１に係る特許発明は甲第１号証に記載された発明であるから、当該特許に係る発明は、特許法第２９条第１項第３号に掲げる発明に該当し、（２）同請求項１に係る特許発明は、甲第１号証および周知技術に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、（３）同請求項１に係る特許発明は、甲第２号証および周知技術に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、（４）訂正前の請求項２及び３に係る各特許発明は、いずれも、甲第１号証〜甲第４号証に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、（５）同請求項４に係る特許発明は、甲第１号証〜甲第５号証に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、（６）訂正前の請求項５に係る特許発明は甲第１号証に記載された発明であるから、当該特許に係る発明は、特許法第２９条第１項第３号に掲げる発明に該当し、（７）訂正前の請求項５に係る特許発明は、甲第１号証〜甲第５号証に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、さらに、（８）本件明細書の特許請求の範囲の記載に不備があり、訂正前の本件請求項１に係る特許は、特許法第３６条第６項第２号に規定する要件を満たしていない特許出願に対してなされたものであるから取り消されるべきであると主張しており、また、特許異議の申立ての理由と同趣旨の取消理由通知がなされた。
４．本件発明
　上記２．で示したように、上記訂正が認められるから、本件の請求項１ないし５に係る発明（以下、「本件発明１」ないし「本件発明５」という。）は、訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１ないし５に記載された事項により特定される次のとおりのものである。
「【請求項１】グルタミン酸を構成アミノ酸として含む蛋白質又はぺプチドを含有する獣乳、大豆及びそれらの加工品から選ばれる乳類に、グルタミン酸遊離活性を有する乳酸菌又はビフィドバクテリウム属細菌及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ生産能を有する乳酸菌を接種して培養することを特徴とするγ−アミノ酪酸含有発酵乳飲食品の製造法。
【請求項２】グルタミン酸遊離活性を有する乳酸菌又はビフィドバクテリウム属細菌が、２０％脱脂粉乳を基質として２５〜４０℃で２日間培養したとき、グルタミン酸を資化する分を差し引いて、少なくともタンパク質に対して０．５重量％以上のグルタミン酸を遊離するものである請求項１記載の製造法。
【請求項３】グルタミン酸デカルボキシラーゼ生産能を有する乳酸菌が、グルタミン酸又はその塩を１０００ｍｇ／１００ｍＬ添加した培地において２５〜４０℃で培養したとき、γ−アミノ酪酸を６００ｍｇ／１００ｍＬ以上産生する能力を持つものである請求項１又は２記載の製造法。
【請求項４】グルタミン酸遊離活性を有する乳酸菌又はビフィドバクテリウム属細菌が、Ｌ．カゼイ ＹＩＴ ９０２９、Ｌ．クレモリス ＹＩＴ ２００７及びＬ．ラクチス ＹＩＴ ２０２７から選ばれるものであり、グルタミン酸デカルボキシラーゼ生産能を有する乳酸菌が、Ｌ．ラクチス ＹＩＴ ２０２７である請求項１〜３のいずれか１項記載の製造法。
【請求項５】請求項１〜４のいずれか１項記載の方法により得られるγ−アミノ酪酸含有発酵乳飲食品。」
　
５．引用刊行物記載の発明
　当審で通知した取消理由通知で引用した刊行物１（特開平１０−２９５３９４号公報、甲第１号証と同じ）には、
「【請求項１】γ−アミノ酪酸の生成方法であって、発酵乳製品中の乳酸菌の脱炭酸酵素作用によりγ−アミノ酪酸を生成することを特徴とするγ−アミノ酪酸の生成方法。【請求項２】請求項１記載のγ−アミノ酪酸の生成方法において、発酵乳製品としてヨーグルトを使用することを特徴とするγ−アミノ酪酸の生成方法。・・・【請求項４】請求項１〜３のいずれか１項に記載のγ−アミノ酪酸の生成方法において、発酵乳製品にグルタミン酸ナトリウムを添加してγ−アミノ酪酸を生成することを特徴とするγ−アミノ酪酸の生成方法。」（第２頁第１欄第２〜１６行）との記載がある。
　同刊行物２（特開平７−２２７２４５号公報、甲第２号証と同じ）には、「【請求項５】牛乳にグルタミン酸又はその塩類を添加し、その牛乳にγ−アミノ酪酸を生成する能力を持つ乳酸菌を接種し培養して、牛乳を乳酸発酵させて発酵食品を得ることを特徴とする発酵食品の製造方法。」（第２頁第１欄第２９〜３２行）との記載、
「請求項５に記載の発明は、原料となる牛乳に最初からグルタミン酸又はその塩類を添加しておき、その牛乳にγ−アミノ酪酸を生成する能力を持つ乳酸菌を接種し培養して牛乳を乳酸発酵させ、ヨーグルトやチーズなどの発酵食品を得ることを特徴とする。」（第３頁第３欄第２３〜２８行）との記載、
「請求項５に記載の製造方法によれば、牛乳に添加されたグルタミン酸又はその塩類から、牛乳を乳酸発酵させる過程で増殖した乳酸菌による発酵作用により、γ−アミノ酪酸が生産される。尚、グルタミン酸を添加しないヨーグルト、チーズ、牛乳等については、同様の方法ではγ−アミノ酪酸が微量しか生産されない。」（第３頁第４欄第１７〜２２行）との記載、
「ヨーグルト中には、本来γ−アミノ酪酸は微量（０．００５％）しか含まれていないが、このヨーグルトにグルタミン酸ナトリウムを１％添加して３０℃で培養した。その結果、図８に示すように、ヨーグルト中の乳酸菌の発酵作用により、添加されたグルタミン酸がγ−アミノ酪酸に変換し、発酵開始３日目で０．２７％、１３日目で０．４１％のγ−アミノ酪酸を生産することができた。この場合、ヨーグルト中の乳酸菌はγ−アミノ酪酸を生成する能力を持つことが必要であることは勿論である。」（第５頁第７欄第８〜１７行）との記載、及び
「牛乳にグルタミン酸を添加し、その牛乳に乳酸菌を接種して培養することにより、γ−アミノ酪酸を多量に含有したヨーグルトを製造するようにしてもよい。」（第５頁第７欄第３５〜３８行）との記載がある。
　同刊行物３（乳酸菌研究集談会編「乳酸菌の科学と技術」、株式会社学会出版センター、１９９６年２月２８日、第１１１頁、第１９１〜１９６頁、第３１３頁、甲第３号証に同じ）には、
「乳酸菌は多くのアミノ酸を生合成により得ることが出来ないため、窒素源としての蛋白質を効率的に利用するための蛋白質分解系を備えている。乳業用乳酸菌の場合、まず最初に菌体表層に存在する菌体外プロティナーゼがカゼインなどの乳蛋白質を分解しペプチドを遊離する。更に、菌体外に存在すると考えられる複数のペプチダーゼがより短いペプチドやアミノ酸に分解し、」（第１１１頁第１４〜１８行）との記載、及び
「乳酸菌は多くのアミノ酸の合成能を欠いており、生育のために各種アミノ酸を必要とする。牛乳中には乳酸菌の生育のためには十分な遊離アミノ酸は存在せず、自らのプロテアーゼにより乳蛋白を分解しその一部を利用する。また、残りは遊離アミノ酸やペプチドとして発酵乳中に残る。」（第３１３頁下から６〜３行）との記載があり、又、第１９１〜１９６頁には、ラクトコッカス・ラクチス、Ｌ．ラクチス　サブスピーシーズ　クレモリスがプロテイナーゼ及びペプチダーゼにより蛋白質を分解してアミノ酸を生成することが記載されている。
　同刊行物４（種谷真一、木村利昭、相良康重著「食品・そのミクロの世界」、槙書店、１９９１年５月２０日発行、第７８−９１頁、甲第４号証と同じ）には、２種の乳酸菌を組み合わせて培養すると、単一の菌のときより乳の凝固時間が短くなり、発酵が促進されること、即ち、乳酸菌の共生について記載されている。（第９１頁）
　同刊行物５（「生物工学会誌」、第７５巻、第４号、第２３９−２４４頁、１９９７年４月発行、甲第５号証と同じ）の第２４３頁左欄第４〜１１行、第２４３頁右欄第２８〜２９行及び第２４４頁左欄第１０〜１３行には、Ｌ．ラクチスがγ−アミノ酪酸を生成することが記載されている。
　
６．対比・判断
（１）特許法第２９条について
ア、本件発明１について
ａ．刊行物１記載の発明との対比
　本件特許出願は、特許法第４１条に基づく優先権主張を伴う平成１１年４月２２日（優先日：平成１０年４月２７日、優先権主張番号：特願平１０−１１６７１１号）の出願であり、当該先の出願の出願当初の明細書には、「グルタミン酸を構成アミノ酸として含む蛋白質又はペプチドを含有する食品素材に、プロテアーゼ生産能を有する微生物及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ生産能を有する微生物を接種して培養することを特徴とするγ−アミノ酪酸含有飲食品の製造法。」（特許請求の範囲）が記載され、実施例１及び２には、乳類にＬ．ラクチス　ＹＩＴ　２０２７とＬ．クレモリス　ＹＩＴ　２００７を接種して培養した場合にγ−アミノ酪酸（以下、「ＧＡＢＡ」という。）を含有する飲食品が製造できることが記載されている。
　これに対し、刊行物１は平成１０年１１月１０日に出願公開されたものであり、本件特許出願前に日本国内又は外国において頒布された刊行物に該当しないから、本件発明１について、刊行物１記載の発明に基づく特許法第２９条第１項第３号及び同法第２９条第２項を適用することはできない。
　なお、念のため、本件発明１（以下、「前者」という。）が、刊行物１に記載された発明（以下、「後者」という。）と同一であるか否かについて検討しておく。
　両者を対比すると、いずれも乳酸菌の脱炭酸酵素（デカルボキシラーゼ）作用によりＧＡＢＡを生成させる点で一致しており、
（ｉ）前者はグルタミン酸遊離活性を有する乳酸菌又はビフィドバクテリウム属細菌を用いるのに対し、後者では使用する菌がグルタミン酸遊離活性を有する菌であると記載されていない点（相違点１）、及び（ｉｉ）前者ではグルタミン酸又はその塩類を添加する必要がないのに対し、後者ではこれらを添加している点（相違点２）で相違する。
　先ず、相違点１について検討する。
　刊行物１の実験例２には「加糖ヨーグルトのみ、及び牛乳のみの試料では、γ−アミノ酪酸は極少量か若しくは検出されなかったが、グルタミン酸ナトリウムを加えた試料においてはγ−アミノ酪酸の生成量が増加した」（段落【００２１】）と記載されており、グルタミン酸ナトリウムを添加しなければ、ＧＡＢＡは生成されないことは明らかである。また、上記記載において、極少量のＧＡＢＡが検出された点、例えば、グルタミン酸ナトリウムを添加しない場合に、一晩放置後、ＧＡＢＡが２．５４ｍｇ／１００ｇ生成していると記載されている点（表１、段落【００２０】）については、牛乳には約３．２ｍｇ／１００ｍＬの遊離グルタミン酸が存在しているといわれており（特許権者提出の参考資料１：乳業技術講座編集委員会編、「乳業技術講座　第１巻　牛乳」、第５７頁（表１．４２）、昭和４５年７月１日、朝倉書店）、これがグルタミン酸脱炭酸酵素の働きでＧＡＢＡに変換されたとすると、生成するＧＡＢＡ量は約２．２ｍｇ／１００ｍＬと算出される（１モルのグルタミン酸（分子量１４７．１）から１モルのＧＡＢＡ（分子量：１０３．１）が生成する）ことから、上記極少量のＧＡＢＡは、もともと牛乳中に存在するといわれている遊離グルタミン酸がＧＡＢＡに変換されたものであると考えられ、上記記載のみからは乳酸菌のグルタミン酸遊離能によって乳中から遊離したグルタミン酸がＧＡＢＡに変換されたものであるということはできない。
　したがって、前者の「グルタミン酸遊離活性を有する乳酸菌又はビフィドバクテリウム属細菌」が、後者に記載されているとはいえない。
　さらに、相違点２については、前者において、「グルタミン酸遊離活性を有する乳酸菌又はビフィドバクテリウム属細菌」を用いる目的は、外部からグルタミン酸又はその塩を添加することを必要とすることなく、乳類に含まれているグルタミン酸を遊離させて、これからＧＡＢＡを生成することにある。
　これに対して．後者においては、実施例１〜６の何れにおいてもグルタミン酸ナトリウムを添加しており、また、上記したとおり、刊行物１の段落【００２１】には、加糖ヨーグルト又は牛乳のみの試料では、ＧＡＢＡは微少量検出されるか、又は検出されなかったと記載されていることから、グルタミン酸ナトリウムの添加なしにはＧＡＢＡは生成されないことは明らかである。
　したがって、前者が、グルタミン酸又はその塩を発酵乳製品に添加した後に、乳酸菌の脱炭酸酵素作用によりＧＡＢＡを生成させるという後者と同一である、ということはできない。
ｂ．刊行物２記載の発明との対比
　次に、本件発明と刊行物２記載の発明を対比すると、両発明は、乳類にＧＡＢＡを生成し得る乳酸菌を接種して乳類を乳酸発酵させて発酵食品を得る点で一致しており、
（ｉ）前者はグルタミン酸遊離活性を有する乳酸菌又はビフィドバクテリウム属細菌を用いるものであるのに対して、後者においては、段落【００１５】に「請求項５に記載の製造方法によれば、牛乳に添加されたグルタミン酸又はその塩類から、・・・γ−アミノ酪酸が生産される。」と記載されているとおり、そこで使用されている「γ−アミノ酪酸を生成する能力を持つ乳酸菌」とは、添加されたグルタミン酸をＧＡＢＡへ変換する能力を有する乳酸菌であって、「グルタミン酸遊離活性を有する乳酸菌」でない点（相違点１）、及び
（ｉｉ）前者ではグルタミン酸又はその塩類を添加する必要がないのに対し、後者ではそれらを添加する必要がある点（相違点２）で相違する。
　そこで、上記相違点１について検討すると、刊行物２には、グルタミン酸デカルボキシラーゼ生産能に加えグルタミン酸遊離活性を有する乳酸菌を使用すること、又はグルタミン酸デカルボキシラーゼ生産能を有する乳酸菌とグルタミン酸遊離活性を有する乳酸菌を組み合わせて用いることについては何ら記載されておらず、また示唆もない。そして、刊行物４に２種の乳酸菌を組み合わせて培養すると、単一の菌のときよりも発酵が促進される（乳酸菌の共生）ことが記載されているとしても、このことから、上記「乳酸菌のグルタミン酸遊離活性」と「乳酸菌の脱炭酸酵素作用」を組み合わせることが周知の事項であったということもできない。
　また、上記相違点２については、上記したとおり、刊行物２の段落【００１５】には、「添加されたグルタミン酸又はその塩類から、・・・γ−アミノ酪酸が生産される」と記載されており、後者は、グルタミン酸又はその塩類を添加しなければＧＡＢＡを含有する発酵食品を得ることができないという認識の下になされたものであるから、後者からはグルタミン酸又はその塩類を添加しないでＧＡＢＡを生成させることは、当業者が容易に想到し得ることではない。
　一方、本件発明１は、「グルタミン酸遊離活性を有する乳酸菌又はビフィドバクテリウム属細菌」を使用することにより、食品が持つ味及び色調を損なうことなく、ＧＡＢＡを豊富に含有した飲食品を得るという顕著な効果を奏し得たものである。（特許明細書段落【０００６】及び参考資料２：「平成１３年５月３０日付け実験成績証明書」）
　以上のことから、本件発明１は、刊行物２記載の発明及び周知事項に基づいて当業者が容易に発明をすることができたということはできない。
イ、本件発明２及び３について
　刊行物３には、乳酸菌は多くのアミノ酸を生合成により得ることが出来ないため、窒素源としての蛋白質を効率的に利用するための蛋白質分解系を備えており、まず、菌体表層に存在するプロテイナーゼがペプチドを遊離し、さらに菌体外に存在すると考えられる複数のペプチダーゼが短いペプチドやアミノ酸に分解することが記載されているが（第１１１頁第１４〜１８行）、右記載のみからでは、ＧＡＢＡを生成するために十分な量のグルタミン酸が遊離されるのか否か明らかでない。
　又、刊行物４には、２種の乳酸菌を組み合わせたときの共生現象及びバリン、ヒスチジン、グリシンの遊離については記載されているものの（第９１頁）、ＧＡＢＡを生成するために十分な量のグルタミン酸が遊離されるのか否か明らかでない。
　そして、本件発明２及び３は本件発明１を引用する発明であるから、本件発明１と同様の理由により、刊行物１ないし４に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。
ウ、本件発明４について
　刊行物５には、グルタミン酸モノナトリウム塩（ＭＳＧ）が添加された条件下において、Ｌ．ラクチス等の乳酸菌がＧＡＢＡ生成能力を発揮することが記載されているが（第２４３頁右欄第２８〜２９行）、グルタミン酸又はその塩類を添加しない条件下で、乳類にグルタミン酸遊離活性を有する乳酸菌又はビフィドバクテリウム属細菌及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ生産能を有する乳酸菌を接種し、ＧＡＢＡを生成させることについては、何の記載もなく又示唆もない。さらに、同刊行物には、ヨーグルト中にＧＡＢＡ生産菌が存在していても、原料乳中に遊離のグルタミン酸がほとんどない場合にはＧＡＢＡの生成がなく、ＭＳＧを添加して培養するとＧＡＢＡを顕著に増加させるＧＡＢＡ生産菌が現れたことが記載されていることから（第２４１頁左欄下から第３行〜同右欄第２行）、刊行物５に記載のＧＡＢＡ生産法では、グルタミン酸又はその塩を添加する必要があることが明らかである。
　このため、刊行物５記載の発明から、グルタミン酸塩を添加することなく、グルタミン酸遊離活性を有する乳酸菌又はビフィドバクテリウム属細菌を用いて培地中にＧＡＢＡを生成させることは、当業者であっても容易に想到し得るということはできない。
　そして、本件発明４は本件発明１ないし３を引用する発明であるから、本件発明４が刊行物１ないし５記載の発明に基づいて当業者が容易に想到し得たということはできない。
エ、本件発明５について
　本件発明５は、請求項１ないし４を引用する発明であるから、本件発明１ないし４と同様の理由により、刊行物１に記載の発明であるということはできないし、また、刊行物１ないし５に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるということもできない。
　
（２）特許法第３６条について
　特許異議申立人は、特許法第３６条第６項第２号違反として、乳類の蛋白質にグルタミン酸が殆ど含まれていないか少量しか含まれていなければ、その乳類にグルタミン酸遊離活性を有する乳酸菌を摂取して培養しても、ＧＡＢＡ含有食品を効率よく得るという効果は得られないと主張している。
　しかしながら、上記点については、上記訂正請求により、本件発明１において、「乳類」は「グルタミン酸を構成アミノ酸として含む蛋白質又はペプチドを含有する獣乳、大豆及びそれらの加工品から選ばれる乳類」に限定された。
　したがって、本件発明１ないし５に係る特許は、特許法第３６条第６項第２号に規定する要件を満たさない特許出願にされたものであるとすることはできない。
　よって、異議申立人の主張は採用することができない。
　
７．むすび
　以上のとおりであるから、異議申立人の主張する理由及び提出した証拠方法によっては、本件発明１ないし５の特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件発明１ないし５の特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。　
【異議決定日】
平成１４年７月１８日（２００２．７．１８）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
訂正事項ａ
　特許請求の範囲の請求項１に記載の「乳類に、」とあるのを、特許請求の範囲の減縮を目的として、「グルタミン酸を構成アミノ酸として含む蛋白質又はペプチドを含有する獣乳、大豆及びそれらの加工品から選ばれる乳類に、」と訂正する。
訂正事項ｂ
　特許明細書第２頁段落【０００７】に記載の「乳類に、」を、不明瞭な記載の釈明を目的として、「グルタミン酸を構成アミノ酸として含む蛋白質又はペプチドを含有する獣乳、大豆及びそれらの加工品から選ばれる乳類に、」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
ＧＡＢＡ含有飲食品の製造法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　グルタミン酸を構成アミノ酸として含む蛋白質又はペプチドを含有する獣乳、大豆及びそれらの加工品から選ばれる乳類に、グルタミン酸遊離活性を有する乳酸菌又はビフィドバクテリウム属細菌及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ生産能を有する乳酸菌を接種して培養することを特徴とするγ−アミノ酪酸含有発酵乳飲食品の製造法。
　【請求項２】　グルタミン酸遊離活性を有する乳酸菌又はビフィドバクテリウム属細菌が、２０％脱脂粉乳を基質として２５〜４０℃で２日間培養したとき、グルタミン酸を資化する分を差し引いて、少なくともタンパク質に対して０．５重量％以上のグルタミン酸を遊離するものである請求項１記載の製造法。
　【請求項３】　グルタミン酸デカルボキシラーゼ生産能を有する乳酸菌が、グルタミン酸又はその塩を１０００ｍｇ／１００ｍＬ添加した培地において２５〜４０℃で培養したとき、γ−アミノ酪酸を６００ｍｇ／１００ｍＬ以上産生する能力を持つものである請求項１又は２記載の製造法。
　【請求項４】　グルタミン酸遊離活性を有する乳酸菌又はビフィドバクテリウム属細菌が、Ｌ．カゼイＹＩＴ９０２９、Ｌ．クレモリスＹＩＴ２００７及びＬ．ラクチスＹＩＴ２０２７から選ばれるものであり、グルタミン酸デカルボキシラーゼ生産能を有する乳酸菌が、Ｌ．ラクチスＹＩＴ２０２７である請求項１〜３のいずれか１項記載の製造法。
　【請求項５】　請求項１〜４のいずれか１項記載の方法により得られるγ−アミノ酪酸含有発酵乳飲食品。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【発明の属する技術分野】
　本発明は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を含有する飲食品の製造法に関する。
　【０００２】
　【従来の技術】
　哺乳類においては、ＧＡＢＡは、脳や脊髄に存在する抑制性の神経伝達物質であり、その生理効果については、脳の血流を活発にさせ、酸素供給量を増大させて脳の代謝機能を亢進する、脊髄の血管運動中枢に作用して血圧を降下させる、抗利尿ホルモンであるバソプレッシンの分泌を抑制して、血管を拡張して血圧を下げる、ＴＣＡサイクルの導入部に必要なヘキソキナーゼ活性を高め、糖代謝を促進させることに関与することなど（新編脳代謝賦活剤、大友英一編、医薬ジャーナル社（１９８７））が報告され、脳代謝賦活を目的に医薬品としても利用されている。
　【０００３】
　したがって、ＧＡＢＡを食品として摂取することにより高血圧症の改善が期待できることから、適当な処理を食品に施すことにより、ＧＡＢＡ含有量を増強させた食品もいくつか提唱されている。例えば、ＧＡＢＡ富化コメ胚芽（オリザ油化（株））（コメ胚芽を嫌気処理してＧＡＢＡ含量を０．３％に高めた食品）；ギャバロン茶（多社）（茶葉を嫌気処理してＧＡＢＡ含量を処理前の数十倍の２２０ｍｇ％に高めた茶）等が知られている。
　【０００４】
　一方、微生物を利用してＧＡＢＡを富化した食品の製造方法として、牛乳にグルタミン酸（塩）を添加し、ＧＡＢＡを生成する能力を持つ乳酸菌を接種し培養してＧＡＢＡを含有する発酵食品を得る方法（特開平７−２２７２４５号）、またグルタミン酸（ナトリウム）に酵母又はクロレラの細胞破砕液を作用させてＧＡＢＡを富化した食品素材を製造する方法（特開平９−２３８８５０号）などがある。
　【０００５】
　【発明が解決しようとする課題】
　しかしながら、従来の微生物を利用したＧＡＢＡ含有飲食品の製造法においては、いずれもグルタミン酸又はその塩を添加しており、食品の味を変化させてしまう、殺菌時などに熱が加わるとグルタミン酸と還元糖（糖質）がアミノカルボニル反応を起こし変色してしまう、作業性が悪く製造コストも高くなってしまう等の問題があった。
　従って、本発明の目的は味及び色調が良好なＧＡＢＡ含有飲食品の製造法を提供することにある。
　【０００６】
　【課題を解決するための手段】
　そこで本発明者らは、上記課題を解決すべく種々検討した結果、食品素材としてグルタミン酸を構成アミノ酸として含む蛋白質又はペプチドを含有するものを用い、これにプロテアーゼ生産能を有する微生物とグルタミン酸デカルボキシラーゼ生産能を有する微生物とを接種して培養すれば、ＧＡＢＡを豊富に含有し、かつ味を損なわず、色調の良好な飲食品が得られることを見出し、本発明を完成した。
　【０００７】
　すなわち、本発明は、グルタミン酸を構成アミノ酸として含む蛋白質又はペプチドを含有する獣乳、大豆及びそれらの加工品から選ばれる乳類に、グルタミン酸遊離活性を有する乳酸菌又はビフィドバクテリウム属細菌及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ生産能を有する乳酸菌を接種して培養することを特徴とするγ−アミノ酪酸含有発酵乳飲食品の製造法及びかくして得られる発酵乳飲食品を提供するものである。
　【０００８】
　【発明の実施の形態】
　本発明飲食品の素材は、グルタミン酸を構成アミノ酸として含む蛋白質又はペプチドを含有するものである。多くの食品素材中の蛋白質は、グルタミン酸を構成アミノ酸として含むので、食品素材は蛋白質を含むものであれば特に制限されない。例えば、肉類、魚介類、乳類が挙げられるが、カゼインタンパクには約２０％ものグルタミン酸が含まれており、大豆タンパク質にも豊富にグルタミン酸が含まれているので、獣乳、大豆又はそれらの加工品、例えば脱脂粉乳、豆乳等が好ましい。
　【０００９】
　プロテアーゼ生産能を有する微生物としては、食品に添加することができるプロテアーゼ生産菌であれば特に制限されないが、２０％脱脂粉乳を基質として２５〜４０℃で２日間培養したとき、グルタミン酸を資化する分を差し引いて、少なくともタンパク質に対して０．５重量％以上、特に０．７重量％以上のグルタミン酸を遊離するものが好ましい。中でもグルタミン酸遊離活性が高いのみならず、グルタミン酸要求性、すなわち、遊離のグルタミン酸を資化しＧＡＢＡ産生以外に用いてしまう活性の低いものが好ましい。より具体的にはラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等の細菌が挙げられる。この中でラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ（以下Ｌ．カゼイ））、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ（以下Ｌ．ラクチス））、ラクトコッカス・ラクチス　サブスピーシーズ．クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｓ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ（以下Ｌ．クレモリス））が好ましく、具体的にはＬ．カゼイＹＩＴ９０２９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１３６６）、Ｌ．ラクチスＹＩＴ２０２７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２２４）及びＬ．クレモリスＹＩＴ２００７（ＡＴＣＣ１９２５７）が挙げられる。
　【００１０】
　グルタミン酸デカルボキシラーゼ生産能を有する微生物としては、食品に添加することができるグルタミン酸デカルボキシラーゼ生産菌であれば特に制限されないが、グルタミン酸又はその塩を１０００ｍｇ／１００ｍＬ添加した培地において２５〜４０℃で培養したとき、ＧＡＢＡを６００ｍｇ／１００ｍＬ以上、特に８００ｍｇ／１００ｍＬ以上産生する能力を持つものが好ましい。この微生物も上記と同様にグルタミン酸要求性の低いものが特に好ましい。また、食品素材として乳類を用いる場合には、グルタミン酸デカルボキシラーゼ生産性の乳酸菌又はビフィドバクテリウム属細菌が好ましい。より具体的にはラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ビフィドバクテリウム属等の細菌が挙げられる。この中でラクトコッカス　ラクチスが好ましい。具体的にはＹＩＴ２０２７が挙げられる。
　【００１１】
　前記食品素材に上記２種を接種して培養するには、接種した微生物に適した条件を選択すればよい。また、上記２種の微生物を同時に接種して培養してもよいが、まずプロテアーゼ生産菌を接種して培養し、次いでグルタミン酸デカルボキシラーゼ生産菌を接種して培養してもよい。また、プロテアーゼ及びグルタミン酸デカルボキシラーゼの両者を生産する微生物、例えばＬ．ラクチスＹＩＴ２０２７を用いれば、用いる微生物は１種でよいが、ＧＡＢＡ生産能等から、２株以上を混合培養する方が好ましい。なお、両方の酵素を有する微生物の中には、遊離したグルタミン酸を、すぐにＧＡＢＡへと変換するものもあるため、この場合プロテアーゼ活性は見かけ上低くなってしまうことに留意すべきである。
　【００１２】
　また、乳類を含有する食品素材に、プロテアーゼ生産能を有する乳酸菌又はビフィドバクテリウム属細菌とグルタミン酸デカルボキシラーゼ生産能を有する乳酸菌又はビフィドバクテリウム属細菌とを同時あるいは順次接種して培養する際にも、用いる菌の増殖や酵素生産等に好適な条件を設定すればよい。一般には、３０〜３７℃で、２日〜１週間程度培養すればよく、乳濃度としては、無脂乳固形分換算で８重量％以上、特に８〜３０重量％程度が、ＧＡＢＡ生産能、乳の溶解性等の作業性、コスト面等から好ましい。このようにして得られた食品はＧＡＢＡを含有する発酵乳飲食品である。この発酵乳飲食品中にはカゼイン分解ペプチドが含まれており、ＧＡＢＡだけでなく当該カゼイン分解ペプチドも血圧効果作用を含めた種々の生理活性を有することが知られており、特に好ましい。
　【００１３】
　本発明は食品素材に含まれる蛋白質又はペプチドからプロテアーゼ生産菌の作用によりグルタミン酸を遊離させ、遊離したグルタミン酸をグルタミン酸デカルボキシラーゼ生産菌の作用によりＧＡＢＡに変換させるものである。このように２種の微生物を使用することにより、食品添加物であるグルタミン酸を添加する必要がないため、味、色調が変化せず、ＧＡＢＡ含量が高い飲食品が安価に得られる。
　【００１４】
　得られる飲食品としては発酵乳食品、発酵豆乳食品、漬物、納豆、酒類等が挙げられる。
　【００１５】
　【実施例】
　次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
　【００１６】
参考例１　プロテアーゼ生産能を有する微生物の選択
　脱脂粉乳の約３４％はタンパク質で、そのうちグルタミン酸が約２０％と高い。従って、脱脂粉乳溶液の発酵過程でグルタミン酸を遊離させる活性の高い乳酸菌を選択する。
材料と方法
使用菌株
　表１に示した菌株を３０℃あるいは３７℃で２回継代して用いた。
　【００１７】
培養条件：
　２０％脱脂粉乳溶液（１２１℃、１５分滅菌）で、３０℃あるいは３７℃で３日間培養した。
測定方法：
　アミノ酸自動分析装置（ＪＣＬ−３００日本電子（株））及びデータ処理装置（ＬＣ３０−ＤＫ１０日本電子（株））にてＧＡＢＡとグルタミン酸の定量を行った。アミノ酸の分離には強酸性陽イオン交換樹脂（パックドカラムＬＣＲ−６：ポリスチレン樹脂にスルホン酸基を導入したもの）を用い、定量はニンヒドリン発色法を利用した。
　２０％脱脂粉乳溶液中には、約１０００ｍｇ／１００ｍＬ程度のグルタミン酸が含まれており、培養前には１０ｍｇ／１００ｍＬ程度が遊離している。このため、グルタミン酸遊離率は、以下の式で算出した。
　【００１８】
　【数１】
　【００１９】
結果
　グルタミン酸の遊離を表１にまた、その際のＧＡＢＡ濃度を表２に示す。
　【００２０】
　【表１】
　【００２１】
　【表２】
　【００２２】
　グルタミン酸遊離活性は、３０℃で培養したＬ．カゼイＹＩＴ９０２９が最も高く、３日間培養で１．２重量％の遊離グルタミン酸が認められた。ＹＩＴ９０２９はペプチド鎖のＮ−末端からアミノ酸を１残基ずつ遊離するアミノペプチダーゼ活性が高くグルタミン酸の要求量が小さいことが考えられた。Ｌ．クレモリスＹＩＴ２００７（ＡＴＣＣ１９２５７Ｔ）あるいはＬ．ヘルベティカスＹＩＴ００８３（ＡＴＣＣ１５００９Ｔ）も、グルタミン酸遊離能が高かった。
　一方、Ｌ．ラクチスＹＩＴ２０２７とＳｔｒｅｐｔｃｕｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．サーモフィルス）ＹＩＴ２００１の培養においてはグルタミン酸が認められないがこれは前者では遊離したグルタミン酸がＧＡＢＡに変換されたためで、後者においては同化代謝されたものと考えられた。通常、１ｇのグルタミン酸からは約０．７ｇのＧＡＢＡが生産されることから、ＹＩＴ２０２７の実際のグルタミン酸遊離率は、培養２日目において約０．７１４％と考えられる。
　以上の検討結果より、ミルクタンパク質よりグルタミン酸を遊離する株としてＬ．カゼイＹＩＴ９０２９及びＬ．クレモリスＹＩＴ２００７及びＬ．ラクチスＹＩＴ２０２７が２日間培養したとき０．５重量％以上のグルタミン酸を遊離するので好ましいものといえる。
　【００２３】
参考例２
　表３に示す菌株を１０００ｍｇ／１００ｍＬのグルタミン酸ナトリウムを添加した２０％脱脂粉乳溶液で３０℃（ＹＩＴ２０２７のみ）あるいは３７℃（他の菌株全て）で３日間培養した。結果を表３に示す。グルタミン酸をＧＡＢＡに変換する株として、Ｌ．ラクチスＹＩＴ２０２７が好ましいものといえる。
　【００２４】
　【表３】
　【００２５】
実施例１
　加熱殺菌した３０％脱脂粉乳溶液に発酵乳由来のＬ．ラクチスＹＩＴ２０２７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２４４）とチーズ由来のＬ．クレモリスＹＩＴ２００７（ＡＴＣＣ　１９２５７）を１０対１の割合で接種し、３０℃で３日間培養した。ＧＡＢＡは、発酵前においては確認されなかったが、発酵終了後には３０ｍｇ／１００ｍＬに増加していた。
　【００２６】
実施例２
　加熱殺菌した乳糖を添加した豆乳に発酵乳由来のＬ．ラクチスＹＩＴ２０２７とチーズ由来のＬ．クレモリスＹＩＴ２００７を１０対１の割合で接種し、３０℃で３日間培養した。ＧＡＢＡは、発酵前においては確認されなかったが、発酵終了後には３２ｍｇ／１００ｍＬに増加していた。
　【００２７】
比較例１
　３０％脱脂粉乳溶液に終濃度１５ｇ／Ｌとなるようグルタミン酸（Ｎａ）を添加し、これを１００℃、３０分加熱殺菌した後Ｌ．ｌａｃｔｉｓ　ＹＩＴ２０２７を接種し、３０℃で３日間培養した。発酵終了後のＧＡＢＡ濃度は１０５ｍｇ／１００ｍＬであった。
　【００２８】
試験例１
　実施例１及び比較例１で得られた発酵乳を用い、下記処方のサンプルを調製した。これらの風味・色調を専門パネラー５名で官能評価した。
　【００２９】
　【表４】
　　（処方）
　　発酵乳　　　　　　　３０（重量％）
　　３０％ショ糖溶液　　３０
　　安定剤（ペクチン）　０．３
　　フレーバー　　　　　０．１
　　水　　　　　　　　　残量
　【００３０】
　風味評価はアミノ酸臭やコゲ臭等も含めた指標として、＋１：おいしい、０：普通、−１：まずいとし、色調は、＋１：色調がよい、０：やや色調が悪いが気にならない、−１：色調が悪いとした。その結果、本発明の発酵乳飲料は、グルタミン酸を添加したサンプルよりも風味・色調ともに良好であった。比較例のサンプルはややグルタミン酸風味が感じられた。
　【００３１】
　【表５】
　【００３２】
実施例３
　実施例１と同一の培地に、グルタミン酸遊離活性の低いＳ．サーモフィルスＹＩＴ２００１とグルタミン酸デカルボキシラーゼ活性の高いＬ．ラクチスＹＩＴ２０２７を１：１の割合で接種し、３０℃で３日間培養した。ＧＡＢＡは、発酵前においては確認されなかったが、発酵終了後には４ｍｇ／１００ｍＬに増加していた。
　【００３３】
比較例２
　実施例１と同一の培地に、グルタミン酸遊離活性の高いＬ．カゼイＹＩＴ２０２９とグルタミン酸デカルボキシラーゼ活性の低いラクトバチルスアシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｓｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＹＩＴ０１６８を１：１の割合で接種し、３０℃で３日間培養した。ＧＡＢＡは、発酵前においては確認されなかったが、発酵終了後には０．５ｍｇ／１００ｍＬに増加していた。
　【００３４】
実施例４
　ミルクタンパク質からグルタミン酸を遊離する活性の高いＬ．カゼイＹＩＴ９０２９とグルタミン酸からＧＡＢＡに変換する活性の高いＬ．ラクチスＹＩＴ２０２７を単独及び混合培養した。加熱殺菌した３０％脱脂粉乳溶液に両菌株を１：１の割合で接種し、３０℃で３日間培養した。このときのＧＡＢＡ産生量の培養経時変化を図１に示す。
　【００３５】
　３日間の培養においてＬ．ラクチスＹＩＴ２０２７は単独でもＧＡＢＡ産生濃度が１５ｍｇ／１００ｍＬに達した。また、Ｌ．カゼイＹＩＴ９０２９と混合培養を行うことにより２倍以上の３８ｍｇ／１００ｍＬまで増加し、混合培養の有用性が確認された。このときのグルタミン酸濃度は１ｍｇ／１００ｍＬであった。
　【００３６】
　更に菌株の接種比率を指数的に変化させてＧＡＢＡの産生を検討した。その結果、Ｌ．カゼイＹＩＴ９０２９とＬ．ラクチスＹＩＴ２０２７の比が１：１〜１０：１でＧＡＢＡ濃度が高くなることがわかった（表６）。
　【００３７】
　【表６】
３０％脱脂粉乳で、３０℃、３日間培養した。
　【００３８】
　以上の検討結果から、Ｌ．カゼイＹＩＴ９０２９とＬ．ラクチスＹＩＴ２０２７を同時に１：１の比率で接種し、培養することがＧＡＢＡ含量を高める有効な方法であることが明らかとなった。
　【００３９】
参考例２
　高血圧自然発症マウス（ＳＨＲ）に発酵乳を投与したときの血圧変化
　条件：１４週令、オス、５匹／群、飼料に１０％の本発明の凍結乾燥発酵乳（実施例４において、両菌株を１：１と接種し調整したもの）を混ぜて自由摂食させた。対照群、発酵乳群ともに飼料には食塩を１％添加した。結果を図２に示す。
　今回調製したＧＡＢＡ含有発酵乳を投与することにより、血圧上昇を抑える傾向が認められた。投与２１日目では、有意（ｐ＜０．０５）に血圧上昇を抑えていることがわかる。
　【００４０】
　【発明の効果】
　本発明によれば味、色調が良好なＧＡＢＡ含有飲食品が効率よく得られる。
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　菌株１種と２種の場合のＧＡＢＡ濃度の経時変化を示す図である。
　【図２】
　高血圧自然発症マウスに本発明の発酵乳を投与したときの血圧変化を示す図である。