(57)【要約】担体上に固定化されたキトサン、該キトサンに結合したニトリロ三酢酸（NTA）を含むNTA固定化担体であって、NTAに２価金属イオンを配位させて、ポリヒスチジン含有タンパク質を結合することのできるNTA固定化担体。
2010050439.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体上に固定化されたキトサン、該キトサンに結合したニトリロ三酢酸（NTA）（キトサン−NTA）を含むNTA固定化担体であって、NTAに２価金属イオンを配位させて、ポリヒスチジン含有タンパク質を結合することのできるNTA固定化担体。
【請求項２】
NTAが、担体上に固定化されたキトサンのアミノ基にグルタルアルデヒドを反応させ、次いで、N-(5-Amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acidを反応させることにより固定化された、請求項１記載のNTA固定化担体。
【請求項３】
担体が基板であり、基板上の複数箇所にキトサン-NTAが固定化された、請求項１または２記載のNTA固定化担体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のNTA固定化担体を含む、ポリヒスチジン含有タンパク質を精製または固定化するためのキット。
【請求項５】
さらに２価金属イオン溶液を含む、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
さらにポリヒスチジン含有タンパク質発現ベクターを含む、請求項４または５に記載のキット。
【請求項７】
請求項３のNTA固定化担体を含み、該NTA固定化担体上の複数箇所にポリヒスチジン含有タンパク質が結合したプロテインチップ。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のNTA固定化担体に２価金属イオンを配位させて、次いでポリヒスチジン含有タンパク質含有試料を該担体に負荷してポリヒスチジン含有タンパク質を該担体に特異的に結合させることを含む、ポリヒスチジン含有タンパク質の固定化方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のNTA固定化担体に２価金属イオンを配位させて、次いでポリヒスチジン含有タンパク質含有試料を該担体に負荷してポリヒスチジン含有タンパク質を該担体に特異的に結合させ、該タンパク質を溶出させることを含む、ポリヒスチジン含有タンパク質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒスチジン含有タンパク質を効率よく固定化したり、精製したりすることのできる担体、該担体を含むタンパク質固定化キットまたは精製用キットおよびタンパク質の固定化方法または精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組み換えタンパク質を効率よく固定化し、精製するためにアミノ末端などにポリヒスチジンタグを付加して融合タンパク質として発現させ、発現したタンパク質を２価の金属イオンとキレート結合を形成させて固定化したり精製したりする方法が知られている（特許文献１）。そして、２価の金属イオンとキレート結合を形成させるために、ニトリロ三酢酸（NTA）をゲルや基板などの担体上に直接結合させる技術が開発されている。また、プロテインアレイの作成法としてＤＮＡアレイ上でポリヒスチジン含有タンパク質を発現し、ガラス表面に直接Ni-NTAを修飾した基板上に固定化する方法もすでに開発されている（アレイ上における転写型プロテインアレイ）。しかし、これらの方法では固定化されるタンパク質の量が十分でなく、検出感度に問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００１-０８３１５５号公報
【発明の概要】
【０００４】
従来の転写型によるプロテインアレイ作成において、タンパク質固定化量は検出には十分ではない。そのため、本発明は、固定化されるタンパク質の量を高めるための技術を提供することを課題とする。
【０００５】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、担体上にキトサンを固定化し、該キトサンを介してニトリロ三酢酸（NTA）を固定化し、固定化されたNTAに２価金属イオンを配位させることにより、ポリヒスチジン含有タンパク質を効率よく固定化できることを見出して本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）担体上に固定化されたキトサン、該キトサンに結合したニトリロ三酢酸（NTA）を含むNTA固定化担体であって、NTAに２価金属イオンを配位させて、ポリヒスチジン含有タンパク質を結合することのできるNTA固定化担体。
（２）NTAが、担体上に固定化されたキトサンのアミノ基にグルタルアルデヒドを反応させ、次いで、N-(5-Amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acidを反応させることにより固定化された、（１）のNTA固定化担体。
（３）担体が基板であり、基板上の複数箇所にキトサン-NTAが固定化された、（１）または（２）のNTA固定化担体。
（４）（１）〜（３）のいずれかのNTA固定化担体を含む、ポリヒスチジン含有タンパク質を精製または固定化するためのキット。
（５）さらに２価金属イオン溶液を含む、（４）のキット。
（６）さらにポリヒスチジン含有タンパク質発現ベクターを含む、（４）または（５）のキット。
（７）（３）のNTA固定化担体を含み、該NTA固定化担体上の複数箇所にポリヒスチジン含有タンパク質が結合したプロテインチップ。
（８）（１）〜（３）のいずれかのNTA固定化担体に２価金属イオンを配位させて、次いでポリヒスチジン含有タンパク質含有試料を該担体に負荷してポリヒスチジン含有タンパク質を該担体に特異的に結合させることを含む、ポリヒスチジン含有タンパク質の固定化方法。
（９）（１）〜（３）のいずれかのNTA固定化担体に２価金属イオンを配位させて、次いでポリヒスチジン含有タンパク質含有試料を該担体に負荷してポリヒスチジン含有タンパク質を該担体に特異的に結合させ、該タンパク質を溶出させることを含む、ポリヒスチジン含有タンパク質の精製方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】各工程で得られた基板へのHis6-GFPの結合を示す蛍光像（写真）。（A）はHis6-GFPスポット直後、（B）は超純水洗浄後、（C）はイミダゾール処理後。
【図２】キトサン-NTA修飾基板、グルタルアルデヒド-NTA修飾基板およびポリアリルアミン-NTA修飾基板へのHis6-GFPの結合を示す蛍光像（写真）。（A）はHis6-GFPスポット直後、（B）は超純水洗浄後。
【図３】実施例３、４および比較例１で得られた基板へのHis6-GFPの結合を示す蛍光像（写真）。（A）はHis6-GFPスポット直後、（B）は超純水洗浄後。
【図４】キトサン-NTA修飾された各種基板上へのHis6-GFPの結合を示す蛍光像（写真）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明のNTA固定化担体は、担体上に固定化されたキトサン、該キトサンに結合したニトリロ三酢酸（NTA）を含むNTA固定化担体であって、NTAに２価金属イオンを配位させて、ポリヒスチジン含有タンパク質を結合することのできるNTA固定化担体である。
【０００９】
担体として用いることのできる素材としては、プラスチック、無機高分子、天然高分子およびセラミックなどが挙げられる。プラスチックとして具体的には、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミドおよびアクリル樹脂などが、無機高分子としては、ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル、およびグラファイト等が、天然高分子としては、セルロース、セルロース誘導体、アルギン酸およびアルギン酸塩等が、セラミックとしては、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素および炭化ホウ素等などを例示することができる。上記担体の形状としては、例えば、フィルム、平板、粒子、成型品（ビーズ、ストリップ、マルチウェルプレート、膜、スライド、細胞培養容器など）、ラテックスを挙げることができ、またその大きさについては特に制限はない。
【００１０】
キトサンは天然由来でも合成物であってもよい。アミノ基がNTAの固定化用にある程度intactであれば（保存されていれば）修飾体であってもよい。分子量も特には制限されないが、分子量が1万以上の高分子キトサンが好ましい。担体上へのキトサンの固定化方法は特に制限されないが、キトサンのアミノ基を介して担体上のカルボキシル基と結合させることが好ましい。例えば、担体をアミノシラン処理して担体をアミノ基で修飾し、該アミノ基にグルタルアルデヒドを反応させて担体上にカルボキシル基を形成し、このカルボキシル基とキトサンの一部のアミノ基を反応させて、キトサンを固定化することができる。そして、キトサンの残りのアミノ基を利用してNTAを結合させることが好ましい。NTAは、好ましくは、キトサンの残りのアミノ基にグルタルアルデヒドを反応させてカルボキシル基を形成し、これにNTAを含み、かつアミノ基を含む化合物を反応させることによって結合させることができる。このような化合物としては、N-(5-Amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid（AB-NTA）が挙げられる。
【００１１】
以下、本発明のNTA固定化担体の作成法を例示する。ガラスをアミノシラン、グルタルアルデヒド、キトサン、グルタルアルデヒド、AB-NTAの順で以下のように修飾する。
なお、キトサン修飾は２回以上行ってもよい。これにより、固定化量が増加し、固定化のムラも減らすことができる。
ガラス基板を洗浄するため１Ｍ水酸化ナトリウムに浸漬し３日間処理した後、超純水で３回、アセトン、エタノールで洗浄、風乾を行う。ガラス基板に3-Aminopropyltriethoxysilanを２時間蒸着反応させた後、１００℃で２時間加熱処理する。ガラス基板を緩衝液HEPESでｐＨ７に調整した２．５％グルタルアルデヒド溶液に浸漬し、一晩放置後、超純水で３回、エタノールで１回洗浄し風乾する。ガラス基板をHEPESでｐＨ８に調整した０．０５％（ｗ/ｖ）キトサン溶液に浸漬して一晩処理した後、超純水で洗浄する。これによりキトサンのアミノ基がグルタルアルデヒドのアルデヒド基と共有結合をし、アミノ基を豊富に含む多糖類であるキトサンで修飾されたことにより表面積が増大し、基板上に多数のアミノ基が得られる。再び緩衝液HEPESでｐＨ７に調整したグルタルアルデヒド溶液に浸漬し、一晩処理した後、超純水で３回、エタノールで１回洗浄し風乾する。次にHEPESでｐＨ８に調整した約１５０ｍＭのAB-NTAをガラス基板上に塗布し、パラフィルムをのせ一晩反応させる。これによりアルデヒド基とNTAのアミノ基が結合し、キトサンを介してガラス基板上にＮＴＡが固定される。
なお、基板の種類はガラス基板に限定されず、シリコンウエハ、ガラス状カーボン、ポリカーボネート、金属などの素材で作製された基板にも固定化することができる。
【００１２】
上記で得られたNTA固定化担体に２価の金属イオンの溶液を加えることにより、NTAに２価の金属イオンを配位させることができる。ここで２価の金属イオンとしては、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃａ2+、Ｃｏ2+、Ｍｇ2+などが挙げられ、Ｎｉ2+がより好ましい。これらの金属イオンは金属塩の溶液（例えば、NiCl2溶液）として加えることができる。そして、２価の金属イオンを配位させた本発明のNTA固定化担体はポリヒスチジン含有タンパク質の結合や精製に使用することができる。
【００１３】
ここで、ポリヒスチジンとはヒスチジンが２個以上連続したポリペプチド部位をいう。ヒスチジンの連続する個数としては、２個以上であれば、ポリヒスチジン部位を介して固定化されるタンパク質の機能に影響を及ぼさない範囲の個数でよいが、好ましくは６個である。ポリヒスチジンは固定化するタンパク質のどの部位に導入してもよいが、アミノ末端またはカルボキシ末端が好ましい。
【００１４】
固定化するタンパク質としては特に制限はないが、酵素、抗体、ペプチド、転写因子、受容体、ウイルス抗原、蛍光タンパク質、プロテインＡなどが挙げられる。また、ランダムなタンパク質をタンパク質ライブラリーとして用いてもよい。なお、本発明において固定化するタンパク質は化学合成したような非天然のものであってもよい。また、本発明において固定化するタンパク質にはペプチドも含まれる。
【００１５】
本発明のプロテインチップに固定化するタンパク質は、例えば、タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、網状赤血球破砕物（Reticulocyte Lysate）などのインビトロ、または大腸菌や昆虫細胞等の宿主細胞で発現させることによって得ることができる。また、化学合成することによっても得ることができる。本発明に好適なタンパク質であるポリヒスチジンを含むタンパク質は、例えば、目的タンパク質をコードするＤＮＡを公知のポリヒスチジン融合タンパク質発現用ベクター（ポリヒスチジンをコードする配列を含み、ポリヒスチジンとの融合タンパク質が発現するように目的タンパク質の遺伝子を組み込むためのベクター。例えば、ｐＥＴシリーズ、Ｎｏｖａｇｅｎ社）に組み込み、該ベクターで大腸菌等を形質転換して融合タンパク質を発現させることによって得ることができる。また、ポリヒスチジンをコードする配列を含むオリゴヌクレオチドとその相補鎖を合成し、両鎖をハイブリダイズさせて、目的タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターに融合タンパク質が発現されるように組み込み、これで大腸菌等を形質転換することによって融合タンパク質を発現させることによっても得ることができる。
【００１６】
得られたポリヒスチジン含有タンパク質を含む画分を２価の金属イオンを配位させたNTA固定化担体とインキュベートし、洗浄することで、ポリヒスチジン含有タンパク質をNTA固定化担体に結合させることができる。得られたポリヒスチジン含有タンパク質結合担体は、プロテインチップとして用いることもできる。例えば、酵素の場合酵素の阻害剤のアッセイに使用することもできる。また、抗体の場合、ELISAや抗原の精製などに使用することもできる。また、基板上に複数のキトサン-NTAが固定化された基板を用い、それにタンパク質を結合させることにより、プロテインアレイとしてマルチアッセイなどに使用することができる。
【００１７】
また、上記のようにしてポリヒスチジン含有タンパク質をNTA固定化担体に結合させ、洗浄を行った後、イミダゾールなどで溶出することによりポリヒスチジン含有タンパク質を精製することができる。本発明の担体を用いることにより、結合できるタンパク質の量を増やすことができるため、精製を効率よく行うことができる。
【００１８】
本発明のキットは、上記NTA固定化担体を含む、ポリヒスチジン含有タンパク質を精製または固定化するためのキットである。本発明のキットはさらに、２価金属イオン溶液や、ポリヒスチジン含有タンパク質発現ベクターや、イミダゾールなどを含んでもよい。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例を参照して本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例の態様に制限されない。【００２０】
実施例１
以下の手順で、NTA固定化基板を作成した。なお、固定化効率比較のため、各工程終了後の基板を保存した。【００２１】
ガラス基板洗浄（1M NaOH）
マスク済み、未修飾ガラス基板（MATSUNAMI SLIDE GLASSリングマーク）×６枚を1M  NaOH  80mlにつけ、3晩放置。
↓
超純水（ミリQ水）で3回、アセトンで１回、エタノールで１回洗浄、風乾。GFP（Green fluorescent protein（His6付加））スポット時の比較のために1枚保存。
↓
アミノシラン処理
デシケーター内でアミノシラン (1% 3-Aminopropyltriethoxysilane) 10mlとガラス基板5枚を入れ減圧し、アミノシランを蒸着。2時間放置。
↓
ガラス基板を100℃で2時間ベーク。GFPスポット時の比較のために1枚保存。
↓
グルタルアルデヒド処理
グルタルアルデヒド溶液（100ｍM HEPES pH7、 2.5v/v％ グルタルアルデヒド）100mlにガラス基板4枚をつけ、１晩放置。
↓
超純水×３、エタノールで洗浄、風乾。GFPスポット時の比較のために１枚保存。
↓
キトサン処理
キトサン溶液（100ｍM HEPES pH8、キトサン（SIGMA Cat. No.3646、85%以上脱アセチル化済）0.5％）100mlにガラス基板3枚をつけ、バットに入れたままスターラーで撹拌しながら1晩放置。
↓
超純水でガラス基板を洗浄。GFPスポット時の比較のために1枚保存。
↓
グルタルアルデヒド処理
グルタルアルデヒド溶液（100ｍM HEPES pH7、2.5v/v％ グルタルアルデヒド）80mlを作成し、ガラス基板2枚を入れバット中で撹拌しながら1晩放置。
↓
超純水×３、エタノールで洗浄、風乾。GFPスポット時の比較のために1枚保存。
↓
AB-NTA処理
AB-NTA（DOJINDO Cat. No. 340-08071）をエッペンドルフチューブに0.0015gはかり取ったものに、１M HEPES（pH8）を15μl、超純水を 35μlを加え、AB-NTA水溶液（300ｍM HEPES pH8）50μlを作成。（濃度0.11M）
↓
溶液から2μlを採り、pH試験紙でpH8付近になっていることを確認。
↓
ガラス基板1枚に7μl/wellでスポットし、上からパラフィルムをかけてタッパー中で一晩放置。
↓
超純水で洗浄。
↓
NiCl2処理
前もって作成した1.7M NiCl2水溶液を7μl/wellでスポットし、上からパラフィルムをかけて1時間放置。これにより、Ni2+イオンが配位したNTA固定化（Ni-NTA）基板を得た。【００２２】
GFPスポット
保存しておいた各工程後（NaOH洗浄後、アミノシラン処理後、グルタルアルデヒド処理１後、キトサン処理後、グルタルアルデヒド処理２後、AB-NTA処理後）の基板6枚の１wellに、GFP（Green fluorescent protein（His6付加）：3.0 mg/ml）それぞれ４μlをスポット、トランスイルミネーターで蛍光を確認。
↓
一時間放置したのち、超純水で洗浄し、蛍光を確認。（紫外光365nm）
↓
イミダゾール溶出
500ｍMイミダゾール30ml中に蛍光が確認できたNi-NTA基板を入れ、3晩攪拌しながら放置。
↓
超純水で洗浄後、蛍光を観察。GFPの溶出を確認。【００２３】
結果を図１に示した。
図１Aは各基板にスポットした時点での蛍光を示す。スポットした時点ではいずれの基板でもGFPの蛍光が見られた。なお、Ni-NTA修飾基板（右）ではスポットしたGFPが基板上に広がったため、蛍光が薄く見えている。
図１Bは超純水で洗浄後の蛍光を示す。Ni-NTA修飾基板ではGFPの吸着が確認できる。それ以外は超純水洗浄によってGFPが流出した。
図１Cはイミダゾール処理後の蛍光を示す。Ni-NTA修飾基板に固定化されたGFPの大部分が、イミダゾールによって溶出された。このことから、Hisタグ付きGFP（His6-GFP）タンパクがNi-NTAによって固定化されていることを確認した。【００２４】
実施例２
上記で作成されたキトサン-NTA修飾ガラス基板と共に、比較対象として次の2枚のNTA修飾ガラス基板にもHis6-GFPをスポットした。
グルタルアルデヒド-NTA修飾基板  
１回目のグルタルアルデヒド処理の後にAB-NTA修飾をしたもの。
ポリアリルアミン（PAA）-NTA修飾基板  
１回目のグルタルアルデヒド処理の後に、PAA（ポリアミン）溶液（100mM HEPES pH 8  0.15% PAA）に漬けてから、グルタルアルデヒドおよびAB-NTA修飾をしたもの。【００２５】
キトサン-NTA修飾基板、グルタルアルデヒド-NTA修飾基板およびポリアリルアミン-NTA修飾基板のそれぞれにNi2+イオンを配位させたのちに、His6-GFPを4μlスポットし、1時間放置後、超純水で各ガラス基板を洗浄してトランスイルミネーターで蛍光を観察した(紫外光波長：365nm)。【００２６】
結果を図２に示す。その結果、グルタルアルデヒド-NTA修飾基板およびポリアリルアミン-NTA修飾基板では超純水洗浄でGFPの蛍光がほとんど検出できなくなったのに対し、キトサン-NTA修飾基板では超純水洗浄後も強いGFPの蛍光が検出され、His6-GFPが効率よく固定化されていることがわかった。【００２７】
ガラス基板上をキトサンで修飾することにより表面積が増大し、またキトサン分子上に多数存在するアミノ基とＡＢ−ＮＴＡがグルタルアルデヒドにより架橋されるためＮｉ−ＮＴＡの修飾効率が増大し、より多くのＨｉｓタグ融合タンパク質の固定化が可能になった。またニッケル錯体とHisタグとの結合を用いているため、配向性があり、活性を保った状態でのタンパク質の固定化が期待できる。基板上に固定化されるタンパク量が増大することで、相互作用の検出に有効なプロテインアレイの作成ができる。実際に従来の方法では蛍光が検出できないほど少量だったGFPが、トランスイルミネーター上において肉眼で確認できるほどの量が基板上に吸着されている。【００２８】
実施例３
以下の手順（洗浄工程の記載省略）で、NTA固定化基板を作成した。
ガラス基板洗浄（1M NaOH）
マスク済み、未修飾ガラス基板（MATSUNAMI SLIDE GLASSリングマーク）を1M  NaOHに一日浸漬。
↓
アミノシラン処理
デシケーター内でアミノシラン (1% 3-Aminopropyltriethoxysilane) とガラス基板を入れ減圧し、2時間放置。
↓
ガラス基板を100℃で2時間ベーク。
↓
グルタルアルデヒド処理
グルタルアルデヒド溶液（100ｍM HEPES pH7、 0.5v/v％ グルタルアルデヒド）にガラス基板をつけ、３７℃で撹拌しながら３日間放置。
↓
キトサン処理
キトサン溶液（100ｍM HEPES pH8、キトサン（SIGMA Cat. No.3646、85%以上脱アセチル化済）0.05％）にガラス基板をつけ、37℃で撹拌しながら一日放置。
↓
グルタルアルデヒド処理
グルタルアルデヒド溶液（100ｍM HEPES pH7、0.5v/v％ グルタルアルデヒド）にガラス基板をつけ、３７℃で撹拌しながら一日放置。
↓
AB-NTA処理
AB-NTA溶液（300ｍM HEPES pH8、130mM AB-NTA濃度）をガラス基板に4箇所スポットし、上からパラフィルムをかけてタッパー中で一晩放置。
↓
NiCl2処理
1.35M NiCl2水溶液をスポットし、上からパラフィルムをかけて1時間放置。
↓
GFPスポット
GFP（His6付加：2.08 mg/ml）をスポットし一時間放置したのち、超純水で洗浄し、トランスイルミネーターで蛍光を確認。【００２９】
実施例４
以下の手順（洗浄工程の記載省略）で、NTA固定化基板を作成した。
ガラス基板洗浄（1M NaOH）
マスク済み、未修飾ガラス基板（MATSUNAMI SLIDE GLASSリングマーク）を1M  NaOHに一日浸漬。
↓
アミノシラン処理
デシケーター内でアミノシラン (1% 3-Aminopropyltriethoxysilane) とガラス基板を入れ減圧し、2時間放置。
↓
ガラス基板を100℃で2時間ベーク。
↓
グルタルアルデヒド処理
グルタルアルデヒド溶液（100ｍM HEPES pH7、 0.5v/v％ グルタルアルデヒド）にガラス基板をつけ、３７℃で撹拌しながら３日間放置。
↓
キトサン処理
キトサン溶液（100ｍM HEPES pH8、キトサン（SIGMA Cat. No.3646、85%以上脱アセチル化済）0.05％）にガラス基板をつけ、37℃で撹拌しながら一日放置。
↓
グルタルアルデヒド処理
グルタルアルデヒド溶液（100ｍM HEPES pH7、0.5v/v％ グルタルアルデヒド）にガラス基板をつけ、３７℃で撹拌しながら一日放置。
↓
キトサン処理
キトサン溶液（100ｍM HEPES pH8、キトサン（SIGMA Cat. No.3646、85%以上脱アセチル化済）0.05％）にガラス基板をつけ、37℃で撹拌しながら一日放置。
↓
グルタルアルデヒド処理
グルタルアルデヒド溶液（100ｍM HEPES pH7、0.5v/v％ グルタルアルデヒド）にガラス基板をつけ、３７℃で撹拌しながら一日放置。
↓
AB-NTA処理
AB-NTA溶液（300ｍM HEPES pH8）（AB-NTA濃度130mM）をガラス基板に4箇所スポットし、上からパラフィルムをかけてタッパー中で一晩放置。
↓
NiCl2処理
1.35M NiCl2水溶液をスポットし、上からパラフィルムをかけて1時間放置。
↓
GFPスポット
GFP（His6付加：2.08 mg/ml）をスポットし一時間放置したのち、超純水で洗浄し、トランスイルミネーターで蛍光を確認。【００３０】
比較例１
以下の手順（洗浄工程の記載省略）で、NTA固定化基板を作成した。
ガラス基板洗浄（1M NaOH）
マスク済み、未修飾ガラス基板（MATSUNAMI SLIDE GLASSリングマーク）を1M  NaOHに一日浸漬。
↓
アミノシラン処理
デシケーター内でアミノシラン (1% 3-Aminopropyltriethoxysilane) とガラス基板を入れ減圧し、2時間放置。
↓
ガラス基板を100℃で2時間ベーク。
↓
グルタルアルデヒド処理
グルタルアルデヒド溶液（100ｍM HEPES pH7、 0.5v/v％ グルタルアルデヒド）にガラス基板をつけ、３７℃で撹拌しながら３日間放置。
↓
分岐鎖ポリエチレンイミン（PEIb）処理
PEIb溶液（100ｍM HEPES pH8、分岐鎖ポリエチレンイミン0.5％）にガラス基板をつけ、37℃で撹拌しながら一日放置。
↓
グルタルアルデヒド処理
グルタルアルデヒド溶液（100ｍM HEPES pH7、0.5v/v％ グルタルアルデヒド）にガラス基板をつけ、３７℃で撹拌しながら一日放置。
↓
分岐鎖ポリエチレンイミン（PEIb）処理
PEIb溶液（100ｍM HEPES pH8、分岐鎖ポリエチレンイミン0.5％）にガラス基板をつけ、37℃で撹拌しながら一日放置。
↓
グルタルアルデヒド処理
グルタルアルデヒド溶液（100ｍM HEPES pH7、0.5v/v％ グルタルアルデヒド）にガラス基板をつけ、３７℃で撹拌しながら一日放置。
↓
AB-NTA処理
AB-NTA溶液（300ｍM HEPES pH8）（AB-NTA濃度130mM）をガラス基板に4箇所スポットし、上からパラフィルムをかけてタッパー中で一晩放置。
↓
NiCl2処理
1.35M NiCl2水溶液をスポットし、上からパラフィルムをかけて1時間放置。
↓
GFPスポット
GFP（His6付加：2.08 mg/ml）をスポットし一時間放置したのち、超純水で洗浄し、トランスイルミネーターで蛍光を確認。【００３１】
実施例３，４および比較例１（それぞれｎ＝４）について洗浄前と洗浄後の蛍光測定結果を図３に示した。
また、検量線を作成し、洗浄後のGFP固定化量を数値化したところ、表１のようになった。
その結果、PEIbで二重修飾した場合、洗浄によりGFPが遊離し、ほとんど固定化できなかったのに対し、キトサン修飾では洗浄後もGFPは固定化されており、固定化効率がよいことがわかった。そして、キトサン２重修飾の場合は固定化量が２倍以上に増加し、固定化のムラも少なくなることがわかった。【００３２】
【表１】
2010050439.tif 000003
PEIb二重修飾では固定化量が少なく検量範囲外であった。【００３３】
実施例５
シリコンウエハ、ガラス状カーボン、ポリカーボネートおよび金箔製の各基板に対して、キトサン-NTA修飾を行い、得られた各キトサン-NTA修飾基板に対してNiCl2水溶液をスポットした後、His6-GFPを結合させた。
なお、シリコンウエハ基板に対しては、実施例３と同様の手順でキトサン-NTA修飾を行った。
また、ガラス状カーボン基板に対しては、紙やすりで研磨後、超純水およびエタノールでそれぞれ洗浄した後、実施例３のアミノシラン処理以降の手順を行ってキトサン-NTA修飾を行った。
また、ポリカーボネート基板に対しては、超純水およびエタノールでそれぞれ洗浄した後、実施例３のアミノシラン処理以降の手順を行ってキトサン-NTA修飾を行った。
また、金箔基板に対しては、アミノシラン蒸着の代わりにシステイン溶液（0.67M L-cysteine, 0.5×TBE, 10mM NaCl）をスポットし、2時間インキュベート後、超純水で洗浄した後、実施例３のグルタルアルデヒド処理以降の手順を行ってキトサン-NTA修飾を行った。【００３４】
His6-GFPをスポットし、洗浄後に蛍光顕微鏡で観察した結果を図4に示す。
その結果、いずれの基板に対してもキトサン-NTAを介してHis6-GFPが効率よく結合していることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明によれば、キトサンによってガラス基板などの担体上に固定化されるタンパク量を増大させることができ、それにより、タンパク質相互作用の検出などに有効なプロテインアレイの作成が可能となる。また、タンパク質の大量精製も可能となる。
【図１】
2010050439.tif 000004
【図２】
2010050439.tif 000005
【図３】
2010050439.tif 000006
【図４】
2010050439.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月26日(2010.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体上に固定化されたキトサン、該キトサンのアミノ基にグルタルアルデヒドを反応させ、次いで、Ｎ−（５−Ａｍｉｎｏ−１−ｃａｒｂｏｘｙｐｅｎｔｙｌ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを反応させることにより結合したニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）（キトサン−ＮＴＡ）を含むＮＴＡ固定化担体であって、ＮＴＡに２価金属イオンを配位させて、ポリヒスチジン含有タンパク質を結合することのできるＮＴＡ固定化担体。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
担体が基板であり、基板上の複数箇所にキトサン−ＮＴＡが固定化された、請求項１記載のＮＴＡ固定化担体。
【請求項４】
請求項１または３に記載のＮＴＡ固定化担体を含む、ポリヒスチジン含有タンパク質を精製または固定化するためのキット。
【請求項５】
さらに２価金属イオン溶液を含む、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
さらにポリヒスチジン含有タンパク質発現ベクターを含む、請求項４または５に記載のキット。
【請求項７】
請求項３のＮＴＡ固定化担体を含み、該ＮＴＡ固定化担体上の複数箇所にポリヒスチジン含有タンパク質が結合したプロテインチップ。
【請求項８】
請求項１または３に記載のＮＴＡ固定化担体に２価金属イオンを配位させて、次いでポリヒスチジン含有タンパク質含有試料を該担体に負荷してポリヒスチジン含有タンパク質を該担体に特異的に結合させることを含む、ポリヒスチジン含有タンパク質の固定化方法。
【請求項９】
請求項１または３に記載のＮＴＡ固定化担体に２価金属イオンを配位させて、次いでポリヒスチジン含有タンパク質含有試料を該担体に負荷してポリヒスチジン含有タンパク質を該担体に特異的に結合させ、該タンパク質を溶出させることを含む、ポリヒスチジン含有タンパク質の精製方法。
【国際調査報告】
2010050439.tif 000008
2010050439.tif 000009
2010050439.tif 000010
2010050439.tif 000011