【事件の表示】
　特許第２５２１８５１号「ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の生物学的に活性な組み換え体の生産」に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２５２１８５１号の請求項１ないし１６に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続きの経緯
　本件特許2521851号は、特願平3-73389号の特許出願（優先権主張1990年4月6日、ＵＳ、同年7月2日、ＵＳ、同年10月9日、ＵＳ）に係るものであって、平成8年5月31日にその発明について特許権の設定登録がされ、その後リジェネロン　ファーマシューティカルズ　インコーポレイテッドから特許異議の申立てがされたところ、当審において２回取消理由の通知がなされ、その指定期間内に意見書が提出されると共に明細書の訂正請求がなされた。次いで、取消理由を兼ねた訂正拒絶理由が通知されて、新たな訂正請求がなされたものであり、先の訂正請求は取り下げられた。
　
２．訂正の請求
　本件訂正の要旨は、特許請求の範囲の減縮を目的として請求項１〜１８のうち請求項６及び７を削除して、それに伴い以降の請求項を繰り上げると共に各請求項の記載を訂正明細書に記載された請求項１〜１６の通りに訂正することを求めるものであり、当該訂正は、願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内において特許請求の範囲を減縮に相当するものであって、特許請求の範囲を拡張又は変更するものでもないと認められる。
　そして、後述する如く、訂正後の請求項１〜１６に記載される発明は、取消理由通知で提示した下記刊行物１〜４に記載された発明から容易に想到できたものともいえない上に、他に特許を受けることができない理由を発見しないから（下記３．参照）、本件特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
  したがって、前記訂正は適法なものであると認められる。
　
  　　　　　　　　　　                          記
刊行物１：特表昭63-501291号公報（甲第１号証）
刊行物２：Gene，[70](1988),p.57-65（甲第２号証）
刊行物３：特開平1-257491号公報
刊行物４：Biochem.J.,250(2)p.429-434(1988)
　
３．特許異議申立等について
（１）本件発明
　本件特許に係る発明は、前記特許明細書の訂正が認められることから、訂正明細書の請求項１〜１６に記載された事項により特定されたとおりのものである。（以下、下記請求項１に記載された発明を「本件発明」という。）
　
「【請求項１】　原核細胞内で組換えにより発現させた神経栄養性タンパク質を再生・復元する方法であって、前記タンパク質が実質的に完全な生物学的活性を獲得し、前記神経栄養性タンパク質がＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーの神経栄養性タンパク質のひとつであり、以下の工程；
（ａ）変性剤および還元剤を前記神経栄養性タンパク質を含有する溶液に添加することにより、該溶液中ですべての分子内および分子間ジスルフィド結合を破壊して、遊離チオールを形成させ、
（ｂ）ジスルフィド含有化合物で前記遊離チオールを酸化して、混合ジスルフィド結合を形成させ、
（ｃ）チオール含有化合物の存在下でポリエチレングリコールを含有する緩衝液により前記溶液を希釈し、そして
（ｄ）前記神経栄養性タンパク質を単離する
を含む前記の方法。」
                                          
（２）異議申立の理由及び判断：
（２−１）異議申立人は、甲第１，２号証（上記刊行物１，２）及び甲第３〜８号証を提出し、（イ）訂正前の請求項１〜１８に記載された発明は甲第１〜５号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明し得るものであり、また（ロ）甲第６〜７号証の記載事項からみて訂正前の本願は特許法第３６条第４項及び第５項に規定する要件を満たしていない旨主張している。
                      　　　　　　　          記
甲第３号証：BioTechiques,3：298-306(1985)
甲第４号証：J.Biol.Chem.,261：13838-13843(1986)
甲第５号証：Bio/Technology,7：495-501(1989)
甲第６号証：Eur.J.Immunol.,18：193-197(1988)
甲第７号証：リジェネロン社タンパク質科学グループKevin　Bailey博士による実験結果
甲第８号証：「タンパク質分子」第99-129頁、岩波書店(1985)　
　
　そこで、以下（イ）（ロ）の主張について検討する。
（２−２）（イ）について：
　甲第２号証にはＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーの神経栄養性タンパク質のひとつであるβ−ＮＧＦを大腸菌宿主で産生させた結果、ミスマッチしたジスルフィド結合の存在で生物活性が低下していることが記載されており、甲第１号証には溶液中でジスルフィド結合を１度切断して正しい結合に再形成する「ジスルフィドシャフリング法」が、多重ジスルフィド結合を持つ組換体ポリペプチドであるタウマチンに対しても適用できること、及びその際にグリセリンを含有させた溶液中で再生すると収率がよいことも記載されていることからみて、大腸菌宿主で産生した組換えＮＧＦ等に対しても「ジスルフィドシャフリング法」を適用し、かつ溶液中にグリセリンもしくは公知のエチレングリコール（刊行物４）を含有させてみようとすることは当業者が容易に想到できるとはいえる。
　しかしながら、本件発明においては、ＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーの神経栄養性タンパク質組換え体に「ジスルフィドシャフリング法」を適用する際に、溶液中にポリエチレングリコールを含有させることを特徴とするものであり、この点については甲第３〜５号証にも、また刊行物３，４にも記載されておらず、この点が本件優先日前の技術常識であったということもできない。
　そして、本件発明は、ＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーの神経栄養性タンパク質組換え体を再生するための溶液中にポリエチレングリコールを含有させることではじめて、訂正された特許明細書【0129】に記載されるような高い再生効率が実現できたものであると認められる以上、甲第１〜５号証及び刊行物３〜４の記載に基づいて当業者が容易に想到できたものとはいえない。　
  また、本件発明と同様にポリエチレングリコールを用いる点を必須の構成要件としている訂正後の請求項９及び１３に記載された発明、並びに訂正後の請求項１、９もしくは１３を引用する他の請求項に記載された発明も、同様に甲第１〜５号証及び刊行物３，４の記載事項から当業者が容易に想到できるものとはいえない。
　なお、異議申立人は当審のＦａｘ．による審尋に対して米国特許第4961969号明細書中にインターフェロンβを再生する際の安定化添加剤の例としてポリエチレングリコールが記載されている点を指摘しているが、そもそも当該米国特許明細書自体の発行日は本件優先権主張日以降である。また、対応するオーストラリア国特許公開公報が、本件優先日前に発行されたことが示されているが、たとえポリエチレングリコールについて上記米国特許明細書と同一の記載がなされていたとしても、実施例で用いたという具体例ではなく単なる例示としての記載であり、ＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーの神経栄養性タンパク質組換え体の再生の用いた場合の顕著な効果を予測させるものではないから、この証拠をもって本件発明の進歩性が否定されるものではない。
　
（２−３）（ロ）について：
　特許異議申立人は、訂正前の請求項１等に記載される「ＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーの神経栄養性タンパク質」のうち、実施例として具体的に効果が確認されているのはＮＧＦのみであることから、ファミリー内の他の神経栄養性タンパク質、例えばＢＤＮＦについての開示が不十分であって、その再生に適切な方法を見出すことは、当業者に過度な実験を要求する旨主張している。
　しかしながら、訂正後の本件明細書【0011】には、「同様の製造上の困難性がＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質のそれぞれの構成タンパク質にもあてはまると考えられる。なぜならば、これまでに記載されたこの群のタンパク質はシステインアミノ酸残基を同じ位置に配置して有しており、従って恐らくＮＧＦと同じ分子内ジスルフィド結合のパターンを形成すると考えられるからである。」と記載されており、分子内のジスルフィド結合を解裂し再結合することで正しい２次構造を再構築する「ジスルフィドシャフリング法」においては、対象となる分子内のシステイン残基の数と位置が最も重要なファクターであることは明らかであるから、上記推論は当業者にとって十分納得できるものである。
　そうであるから、訂正後の請求項１等に記載された発明について、その具体的な実施例はＮＧＦのみであっても、同じ分子内ジスルフィド結合パターンを有すると推定されるＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の他の神経栄養性タンパク質も同様に実施可能であるとするのが自然であり、下記に述べるように甲第６〜８号証の記載事項を勘案しても当該認定は翻らない。
　甲第６号証にはG-CSFとIL-6について１部の特定領域でアミノ酸相同性が高いものの他の領域では有意な相同性が見出されずそもそも両者間の進化的関係が希薄であることが示されており、両者はたまたま１部の特定領域で相同性が見出されたため過去に共通の祖先遺伝子の存在が期待されていたにすぎず全配列の相同性もないのだから、両者間の構造、機能の差異をもって、本件のＮＧＦ／ＢＤＮＦ群ファミリー内の各物質に関して論ずることには無理がある。
　甲第７号証によればＮＧＦとＢＤＮＦとではリフォールディングに用いる尿素の至適濃度が異なるとはいえるが、一般にどのような技術でも対象化合物が異なれば細かな条件設定のレベルではそれぞれの至適範囲は異なることは当業者がしばしば経験することであることからみて、変性剤である尿素の至適濃度条件が相違する程度の実験結果から直ちに、ＢＤＮＦに対してはＮＧＦと同様のジスルフィドシャフリング法」が適用できないとまでいうことはできない。
　また、一般的な「タンパク質の変性と再生」技術が記載されている甲第８号証については、異議申立書中に同号証に基づいた具体的な主張が何らなされていないので、そもそも立証の趣旨が不明であるが、同号証の記載を検討しても同様である。　
　以上述べたとおり、異議申立人の主張（ロ）も採用できない。
　
（２−４）まとめ：
　したがって、異議申立人の主張（イ）、（ロ）はいずれも採用しない。
　
４．結論：
　以上の通りであるから、特許異議申立ての理由及び証拠によっては、本件請求項１〜１６に記載された発明に係る特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する
【異議決定日】
平成１３年８月２３日（２００１．８．２３）
【訂正の要旨】
　訂正の要旨
▲１▼　訂正事項ａ
　特許請求の範囲の請求項１の「（ｃ）チオール含有化合物の存在下で前記溶液を希釈し」を「（ｃ）チオール含有化合物の存在下でポリエチレングリコールを含有する緩衝液で前記溶液を希釈し」と訂正する。
▲２▼　訂正事項ｂ
　現特許請求の範囲の請求項１１（訂正後の請求項９）の「約３．２〜４．２モル尿素」の前に「ポリエチレングリコールを含む、」を挿入する。
▲３▼　訂正事項ｃ
　現特許請求の範囲の請求項１５（訂正後の請求項１３）の「グリコール含有試薬」を「ポリエチレングリコール」と訂正する。
▲４▼　訂正事項ｄ
　特許請求の範囲の請求項６及び７を削除する。
（５４）【発明の名称】
ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の生物学的に活性な組み換え体の生産
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　原核細胞内で組換えにより発現させた神経栄養性タンパク質を再生・復元する方法であって、前記タンパク質が実質的に完全な生物学的活性を獲得し、前記神経栄養性タンパク質がＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーの神経栄養性タンパク質のひとつであり、以下の工程；
（ａ）変性剤および還元剤を前記神経栄養性タンパク質を含有する溶液に添加することにより、該溶液中ですべての分子内および分子間ジスルフィド結合を破壊して、遊離チオールを形成させ、
（ｂ）ジスルフィド含有化合物で前記遊離チオールを酸化して、混合ジスルフィド結合を形成させ、
（ｃ）チオール含有化合物の存在下で
ポリエチレングリコールを含有する緩衝液により
（ｄ）前記神経栄養性タンパク質を単離する
を含む前記の方法。
　【請求項２】　神経栄養性タンパク質がＮＧＦ、ＢＤＮＦまたはＮＧＦ−３である、請求項１記載の神経栄養性タンパク質を再生・復元する方法。
　【請求項３】　原核細胞が細菌である、請求項１記載の神経栄養性タンパク質を再生・復元する方法。
　【請求項４】　細菌が大腸菌である、請求項３記載の神経栄養性タンパク質を再生・復元する方法。
　【請求項５】　上記（ｃ）の工程で得られる再生混合物が嫌気的条件下に維持される、請求項１記載の神経栄養性タンパク質を再生・復元する方法。
　【請求項
６
　【請求項
７
　【請求項
８
　【請求項
９
前記神経栄養性タンパク質を８モル尿素含有２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ約３．０、中に約０．６ｍｇ／ｍｌの濃度まで溶解させ、
８モル尿素含有１Ｍトリス溶液、ｐＨ約８．５、を加えて前記溶液のｐＨを上げ、約５〜１５ｍＭの濃度までジチオトレイトールを加えて前記神経栄養性タンパク質を還元し、
約１５〜５０ｍＭの濃度まで酸化型のグルタチオンまたはシスチンを加えて前記神経栄養性タンパク質を酸化し、
ポリエチレングリコールを含む、
グルタチオンまたはシスチンの濃度に対して約２〜３倍のシステインを加えて前記神経栄養性タンパク質のジスルフィド相互変換を触媒させ、そして
前記反応混合物から前記神経栄養性タンパク質を単離する
を含む前記の方法。
　【請求項
１０
９
　【請求項
１１
９
　【請求項
１２
１１
　【請求項
１３
前記神経栄養性タンパク質を含有する溶液にジチオトレイトールまたはβ−メルカプトエタノールを加え、
前記溶液に酸化型グルタチオンまたはシスタミンを加え、
ポリエチレングリコール
システインまたは２−メルカプトエチルアミンを加えて最終再生混合物を生成させ、
前記最終再生混合物を脱気し、そして
前記最終再生混合物から前記神経栄養性タンパク質を単離する
を含む前記の方法。
　【請求項
１４
１３
　【請求項
１５
１３
　【請求項
１６
１５
【発明の詳細な説明】
　【０００１】〔発明の分野〕本発明は、生物学的に活性な形をした、ヒトＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の組み換え体の生産方法に関する。さらに、本発明は、この群のタンパク質のこれまで報告されていないメンバーを同定し、かつ続いてこれらのタンパク質を生産する方法について開示する。
〔発明の背景〕神経栄養性因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ）は神経系または神経系によって刺激された非神経組織に存在する天然タンパク質であり、その機能は神経細胞および／またはグリア細胞の生存を促進し、それらの表現型分化を維持することである（Ｖａｒｏｎ　ａｎｄ　Ｂｕｎｇｅ　１９７８　Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　１：３２７；Ｔｈｏｅｎｅｎ　ａｎｄ　Ｅｄｇａｒ　１９８５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：２３８）。この生理学的役割ゆえに、神経栄養性因子はアルツハイマー病やパーキンソン病のような種々の神経変性性疾患に、あるいは脳卒中や脊髄への物理的外傷のような外傷性障害後に起こる神経細胞の変性および分化機能の低下を治療するのに有用でありうる（Ａｐｐｅｌ　１９８１　Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　１０：４９９）。
　【０００２】特定の神経栄養性因子が神経損傷の治療に有用でありうるためには、そのクラスの損傷を受けた神経細胞がその因子に反応しなければならない。一般に、異なる神経栄養性因子は異なるクラスの神経細胞に別々に影響を及ぼす。従って、様々な形態の病気または傷害に現れうる各クラスの損傷ニューロンを治療するためには、種々の異なる神経栄養性因子を手中にすることが得策である。
　【０００３】所定の神経栄養性因子は、正確なニューロン特異性をもつことのほかに、薬物治療に使用するに足る量で入手できなければならない。さらに、神経栄養性因子はタンパク質であるので、外来タンパク質に対する免疫応答を避けるために、ヒト形態のタンパク質のみをヒト患者に投与することが望ましいだろう。神経栄養性因子は一般に組織中に微量で存在し（例えば、Ｈｏｆｅｒ　ａｎｄ　Ｂａｒｄｅ　１９８８　Ｎａｔｕｒｅ　３３１：２６１；Ｌｉｎら１９８９　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１０２３）、しかもヒト組織は抽出のために簡単には入手できないので、製剤量のヒト神経栄養性因子をヒト組織から直接製造することは不都合であろう。代わるべき手段として、神経栄養性因子のヒト遺伝子を単離し、その遺伝子を無限量のヒトタンパク質を生産しうる組み換え発現系を確立するための土台として使用することが望ましいであろう。
　【０００４】アミノ酸配列において密接な関係があるが、異なる（一部重複するが）組の応答性ニューロンに影響を及ぼす２種類の神経栄養性因子は記載されている（Ｌｅｉｂｒｏｃｋら　１９８９　Ｎａｔｕｒｅ　３４１：１４９）。これらの２種類の神経栄養性因子は：（１）神経成長因子（ＮＧＦ）および（２）脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）である。明らかに、ＮＧＦとＢＤＮＦは両方とも比較的大きい前駆体として合成され、その後これらの前駆体はタンパク質分解的切断によるプロセッシングを受けて成熟神経栄養性因子を生ずる（Ｅｄｗａｒｄｓ　ｅｔ　ａｌ，１９８６　Ｎａｔｕｒｅ　３１９：７８４；Ｌｅｉｂｒｏｃｋら　１９８９　同上）。これまでに報告されたＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性因子のメンバーの遺伝子は、ＮＧＦの場合がヒトと種々の動物遺伝子であり（Ｓｃｏｔｔら　１９８３　Ｎａｔｕｒｅ　３０２：５３８；Ｕｌｌｒｉｃｈら　１９８３　Ｎａｔｕｒｅ　３０３：８２１；Ｍｅｉｅｒら　１９８６　ＥＭＢＯ　Ｊ．５：１４８９）、そしてＢＤＮＦの場合がブタ遺伝子であるにすぎない（Ｌｅｉｂｒｏｃｋら　１９８９　同上）。成熟ＮＧＦと成熟ＢＤＮＦとの間にはアミノ酸配列に有意な類似性があり、例えば６個すべてのシステインアミノ酸残基の相対位置は試験した全部の種からの成熟ＮＧＦおよびＢＤＮＦにおいて一致している（Ｌｅｉｂｒｏｃｋら　１９８９　同上）。ヒト形態のＮＧＦとＢＤＮＦを比較して、その類似性を強調する図７を参照されたい。これは、ジスルフィド結合の位置から決定して、これら２種類のタンパク質の三次元構造が類似していることを示唆している。両方の成熟タンパク質はまた塩基性等電点（ｐＩ）を共有する。
　【０００５】ＮＧＦは少なくとも基底前脳のコリン作動性ニューロンにとっての神経栄養性因子である（ＨｅｆｔｉおよびＷｉｌｌ　１９８７　Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ　Ｔｒａｎｓｍ．Ｓｕｐｐｌ（ＡＵＳＴＲＩＡ）２４：３０９）。アルツハイマー病の進行中に起きる、ＮＧＦ応答性の基底前脳コリン作動性ニューロンの機能的不活性化および変性はこの病気と関連した認識・記憶欠損の主因であると考えられる（ＨｅｆｔｉおよびＷｉｌｌ　１９８７　同上）。ＮＧＦはアルツハイマー病に関係した動物モデルにおいて基底前脳コリン作動性ニューロンの変性を阻止してその機能を回復させることが示されており、これに基づいてアルツハイマー病におけるこれらのニューロンの変性を阻止してその機能を回復させるための治療薬として提案されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓら　１９８６　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：９２３１；Ｈｅｆｔｉ　１９８６　Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　６：２１５５；　Ｋｒｏｍｅｒ　１９８７　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：２１４；　Ｆｉｓｃｈｅｒら　１９８７　Ｎａｔｕｒｅ３２９：６５）。
　【０００６】ＢＤＮＦは末梢神経系の知覚ニューロンのための神経栄養性因子である（Ｂａｒｄｅ　１９８９　Ｎｅｕｒｏｎ　２：１５２５）。これに基づけば、ＢＤＮＦはいろいろな末梢神経障害に現れる知覚神経細胞の損傷と関連した感覚喪失の治療に有用であることが分かるであろう（Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇら　１９８３　“Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ　ｏｆ　Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　Ｎｅｒｖｅｓ”Ｆ．Ａ．Ｄａｖｉｓ　Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．）。
　【０００７】医薬開発に必要とされる、完全に生物学的に活性で、構造的に修飾されていない成熟ＮＧＦを大量に生産しうる組み換え発現系は非常に望ましい。昆虫細胞におけるＮＧＦの組み換え発現を記載している、欧州特許公開第ＥＰ８９１１３７０９号を参照されたい。生物学的に活性な成熟ＮＧＦは、ヒトまたは動物ＮＧＦ遺伝子が真核細胞発現系により発現される場合に生産できる（例えば、Ｅｄｗａｒｄｓら　１９８８　Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｎ．Ｂｉｏｌ．８：２４５６）。かかる系では、初めに全長ＮＧＦ前駆体が合成され、その後タンパク質分解によるプロセッシングを受けて、三次元的に正しく折りたたまれ、完全に生物学的に活性な成熟ＮＧＦを生成する。しかしながら、真核細胞発現系はしばしば細胞のグラム当たりのタンパク質収量が比較的低く、製造に使用するには割合経費がかさむ。
　【０００８】対照的に、細菌のような原核細胞を使う発現系では一般に細胞のグラム当たりの発現タンパク質の量が比較的多く、製造に使用するのに割合費用がかからない。しかしながら、完全に生物学的に活性で、構造的に修飾されていない成熟ＮＧＦを生産しうる適切な細菌発現系は記載されていない。カナダ国特許第１２２０７３６号に細菌発現系が開示されている。しかし、発現されたタンパク質を再生（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）する方法は何も提示されていない。この失敗はたぶん一般的に細菌発現系と関係した問題、並びに細菌内でＮＧＦを生産させるために使用した特定の技法と関係した問題にまでさかのぼることができよう。
　【０００９】細菌は、より小さい正しい成熟タンパク質を生成させるために、適切なタンパク分解的フラグメントを行ってＮＧＦ前駆体タンパク質のような前駆体タンパク質を正しくプロセッシングすることができない。それ故に、細菌に成熟ＮＧＦを生産させるためには、より大きい前駆体形ではなく、成熟タンパク質をコードするＮＧＦ　ＤＮＡ配列の部分だけを発現させることが必要である。これをエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）で行った場合は、比較的大量の成熟ヒトＮＧＦタンパク質が生産された（例えば、Ｉｗａｉら　１９８６　Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３４：４７２４；Ｄｉｃｏｕら．１９８９　Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，Ｒｅｓ．２２：１３；ＥＰ出願第１２１３３８号を参照されたい）。不運にも、細菌により発現されたタンパク質は生物学的活性がほとんどないか、あるいは全くなかった。
　【００１０】細菌発現ＮＧＦを再生するプロトコルは欧州特許出願第３３６３２４号に記載されており、ここでは細菌内で生産された成熟ＮＧＦに若干の生物学的活性を回復させている。しかしながら、このプロトコルは重大な欠点をもっている。成熟ヒトＮＧＦは、多くの真核細胞発現系が高価であり、しばしば十分量の成熟ＮＧＦを生産しないので、一般に医薬用途に充分な量で得ることができない。これまでに開示された細菌発現系は、生物学的に活性で化学的に修飾されていない成熟ＮＧＦを医薬用途に充分な量で生産していない。ヒト成熟ＮＧＦはアルツハイマー病の治療に有用であると思われるので、科学界および臨床医学界はこの物質が自由に入手できないことを痛切に感じている。生物学的に活性なヒト成熟ＮＧＦが入手できないことは、アルツハイマー病治療薬としてのＮＧＦの今後の開発における臨床的障害であるとして、ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｎ　Ａｇｉｎｇ（国立老化研究所）が集めた、一流の科学者達のグループによって指摘された（Ｐｈｅｌｐｓら　１９８９　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４３：１１）。
　【００１１】同様の製造上の困難がＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質のそれぞれの構成タンパク質にもあてはまると考えられる。なぜならば、これまでに記載されたこの群のタンパク質はシステインアミノ酸残基を同じ位置に配置して有しており、従って恐らくＮＧＦと同じ分子内ジスルフィド結合のパターンを形成すると考えられるからである（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉら　１９７３　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１２：１００）。
　【００１２】かかる神経栄養性タンパク質の明白な価値並びに上記のような大量の生物学的活性タンパク質の生産に対する目下の制限を考慮すると、次のことを提供することが望ましいであろう：（１）ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質のすべての構成タンパク質、すなわちこれら２種類のタンパク質が互いに関係があるとされた方法と類似した方法でＮＧＦおよびＢＤＮＦに構造的に関係があるタンパク質の同定、単離および特性決定；（２）ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の天然に存在するすべてのヒトタンパク質（特にヒトＢＤＮＦを含む）の同定、単離および特性決定；（３）ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の任意のすべてのタンパク質をコードする遺伝子（特にかかる群のすべてのタンパク質をコードするヒト遺伝子）の単離および特性決定；（４）これらのヒトタンパク質の成熟（プロセッシングを受けた）形態を多量に生産する、Ｅ．ｃｏｌｉのような微生物中に組み換え発現系を確立するためのヒト遺伝子の使用方法；（５）生物学的特異活性を獲得させるためにＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質のタンパク質を再生する方法；および（６）ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質のいずれか１種またはこれらのタンパク質の任意の組合わせからなる神経学的疾患を治療するための医薬組成物。
〔発明の要約〕本発明は、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の生物学的に活性なメンバーの生産方法、ヒトＢＤＮＦをコードする遺伝子の核酸配列およびヒトＢＤＮＦの推定アミノ酸配列、並びにこの群の神経栄養性タンパク質の以前に報告されていないメンバー（ＮＧＦ−３を含む）をコードする遺伝子の核酸配列およびかかるタンパク質の推定アミノ酸配列に関する。
　【００１３】効率のよい細菌発現系、特にＥ．ｃｏｌｉにおけるＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の発現方法を記載する。さらに、細菌により生産された生物学的に不活性な成熟ヒト神経栄養性タンパク質に生物学的活性を回復させる方法が記載される。より詳細には、ＮＧＦの発現方法および生物学的に活性な形をしたヒト成熟ＮＧＦの効果的な再生が記載される。ここでＮＧＦ−３と呼ばれる、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の以前には報告されていないメンバーが同定され、ＮＧＦ−３をコードするヒト遺伝子の核酸配列が同定され、そしてＮＧＦ−３の推定アミノ酸配列が記載される。
　【００１４】また、本発明は、いろいろな神経変性性疾患に現れる神経細胞の変性および分化機能の低下を治療するための医薬製剤として価値あるＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質のすべてのメンバーの精製形の生産をも包含する。本出願は、実質的に図１に示される核酸配列から成るヒト脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）をコードする遺伝子、並びに１９６位および／または６６８位のＧをＡで置き換えたこの配列を記載し、特許請求している。さらに、実質的に図１に示されるアミノ酸配列から成る成熟ヒト脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）、並びにアミノ酸６６のバリンをメチオニンで置き換えそして／またはアミノ酸２２３のアルギニンをリジンで置き換えたこの配列も記載する。ヒト成熟ＮＧＦ−３は図７に示されるアミノ酸配列から成り、ヒト成熟ＮＧＦ−３をコードする遺伝子は図６に示される核酸配列から成っていた。
　【００１５】神経栄養性タンパク質を再生・復元する（その際、タンパク質は実質的に完全な生物学的活性を獲得する）方法は、前記神経栄養性タンパク質にいろいろな三次元コンホメーションおよび分子内ジスルフィド結合パターンをとらせる（反応媒体を生成させ、ここで実質的にすべての前記タンパク質はエネルギー的に最も安定した形をとるであろう）；そして前記反応媒体から前記神経栄養性タンパク質を単離することから成っている。
　【００１６】ヒト神経栄養性タンパク質の生物学的に活性な成熟形を生産するための細菌細胞発現系は：前記タンパク質をコードする遺伝子をベクターに挿入し；前記遺伝子を発現させて前記タンパク質の生物学的に不活性な形態を形成させ；そして前記の生物学的に不活性な形態を再生・復元することを含んで成る。ヒトの神経学的疾患を治療するための医薬組成物は、許容しうる製剤上の担体中に生物学的に活性なヒトＮＧＦ−３、ヒトＢＤＮＦおよび／またはヒトＮＧＦを含有する。
　【００１７】上記の一般的記載および以下の詳細な記載は単なる例示および説明であって、特許請求した本発明を制限するものでないことを理解すべきである。本明細書に組み込まれてその一部を構成する添付図面は本発明のいろいろな実施態様を例示し、そして詳細な説明と合わせて本発明の原理を理解する上で役立つであろう。
　〔図面の簡単な説明〕図１は、ヒトＢＤＮＦの核酸および推定アミノ酸配列を示す。成熟（プロセッシングを受けた）形ＢＤＮＦの推定アミノ酸配列は太字で示してある。
　【００１８】図２は、ベクターｐＴ５Ｔを用いたＥ．ｃｏｌｉにおけるヒト成熟（プロセッシングを受けた）ＮＧＦの発現を示す。詳細は実施例２で説明する。図３は、真核細胞により生産された成熟ヒトＮＧＦの変性および再生の際の、それぞれの生物学的活性の低下および回復を示す。図４は、細菌発現ベクターｐＴ５Ｔのいくつかの特徴を示す。特徴は描写したにすぎず、正確な比率で描いたものではない。ＮＧＦ挿入物はＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の任意のメンバーを示す。
　【００１９】図５は、細菌発現ベクターｐＴ３ＸＩ−２のいくつかの特徴を示す。特徴は描写したにすぎず、正確な比率で描いたものではない。ＮＧＦ挿入物はＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の任意のメンバーを示す。図６は、ＮＧＦ−３の核酸配列とＮＧＦおよびＢＤＮＦの配列との比較である。点線で示したギャップはアミノ酸配列を整合させるために用いたギャップの位置に相当する（図７を参照）。ＰＣＲにより得られたＮＧＦ−３の部分核酸配列には下線が引いてある。
　【００２０】図７は、ＮＧＦ−３のアミノ酸配列とＮＧＦおよびＢＤＮＦの配列との比較である。成熟タンパク質の推定配列は太字で示してある。ＢＤＮＦまたはＮＧＦの成熟配列において下線が引いてある各アミノ酸はＮＧＦ−３の対応アミノ酸と同一である。ＮＧＦ−３の成熟配列において下線が引いてある各アミノ酸はＮＧＦとＢＤＮＦの両方の対応アミノ酸と同一である。点線で示したギャップは整合を高めるために配列中に置かれた。ＢＤＮＦ、ＮＧＦおよびＮＧＦ−３に存在する６個のシステインは３種類すべてのタンパク質で同じ位置にあり、かっこでくくってある。
　【００２１】図８は、ヒトＢＤＮＦ挿入物を含むかまたは含まないプラスミドｐＳＧ５でトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の抽出物の、Ｅ１０ニワトリ背根神経節ニューロンを使ったバイオアッセイを示す。図９は、Ｅ１１ニワトリ胚交感神経節ニューロンに対するバイオアッセイを用いた、昆虫細胞により生産されたヒト組み換えＮＧＦの用量一応答曲線を示す。
　【００２２】図１０は、Ｅ１１ニワトリ胚交感神経節ニューロンに対するバイオアッセイを用いた、Ｅ．ｃｏｌｉにより生産されたヒト組み換えＮＧＦの最終再生混合物の連続希釈物の生物学的活性を示す。図１１は、（Ａ）１００ｎｇの天然の、昆虫細胞により生産されたＮＧＦを加えた図１０でアッセイした最終再生混合物５０μｌ；および（Ｂ）天然の、昆虫細胞により生産されたＮＧＦを加えなかった最終再生混合物５０μｌ；の逆相高性能液体クロマトグラフィーによる分析を示す。天然の、昆虫細胞により生産されたＮＧＦが普通にこのカラムを流れる位置は符号ＮＧＦと矢印で示してある。
　【００２３】図１２は、精製前の最終再生混合物を逆相ＨＰＬＣによりＣ４カラムでクロマトグラフィーにかけた場合のタンパク質の溶離プロフィール（２１４ｎｍでの光学濃度）を示す。適切に再生されたＮＧＦは約３７％のアセトニトリルで溶離する最大タンパク質ピークである。図１３は、透析および濃縮後であるがＳ−セファロース前の最終再生混合物を逆相ＨＰＬＣによりＣ４カラムでクロマトグラフィーにかけた場合のタンパク質の溶離プロフィール（２１４ｎｍでの光学濃度）を示す。適切に再生されたＮＧＦは約３７％のアセトニトリルで溶離する最大タンパク質ピークである。
　【００２４】図１４は、Ｓ−セファロースで精製後の最終再生混合物を逆相ＨＰＬＣによりＣ４カラムでクロマトグラフィーにかけた場合のタンパク質の溶離プロフィール（２１４ｎｍでの光学濃度）を示す。適切に再生されたＮＧＦは約３７％のアセトニトリルで溶離する最大タンパク質ピークである。主ピークの直後に溶離する小さいタンパク質ピークは、逆相ＨＰＬＣによるクロマトグラフィー中に形成された適正に再生されたＮＧＦの単量体である。
〔好適な実施態様の説明〕本発明の原理を理解する上で、以下の実施例と合わせて、役に立つ本発明の目下の好適な実施態様を詳細に説明する。
　【００２５】本発明は、ある“群（ｆａｍｉｌｙ）”の神経栄養性タンパク質の同定および生産を多面的に記載する。ＮＧＦおよびＢＤＮＦは、おそらく生物におけるそれらの生理学的役割を異にする（すなわち、各メンバーは異なる組の応答性ニューロンに影響を及ぼす）構造的に関連した神経栄養性タンパク質の一群を規定すると思われる。神経系に対する種々の形態の損傷によりその機能を損なわれた異なる神経細胞型を治療するのに利用できる１そろいの神経栄養性タンパク質を得るためには、このＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の任意のそしてすべての付加的なメンバーの遺伝子を単離することが大いに望まれるであろう。
　【００２６】ヒトを治療するにはヒトタンパク質を使用することが望ましい。この原理によれば、ヒトタンパク質を製造するにはＢＤＮＦのヒト遺伝子を得ることが望ましいであろう。また、この原理、およびいろいろな神経学的症状を治療するためには異なるニューロン特異性を備えた１そろいの神経栄養性タンパク質を有することが望ましいという上記原理によれば、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の任意のそしてすべての付加的なメンバーのヒト遺伝子を得ることが望ましいであろう。
　【００２７】生物学的に活性な細菌発現ＮＧＦが得られないということはこの分野における大きな障害である。この生物学的活性が欠如する理由は、成熟ＮＧＦタンパク質が自然に正しい三次元構造をとりかつ正しい分子内ジスルフィド結合を形成する（両方とも生物学的活性に必要不可欠である）ことができないということらしい。従って、完全な生物学的活性に必要とされる三次元構造と分子内ジスルフィド結合パターンを細菌発現成熟ＮＧＦに回復させることができる再生プロトコルを開発することが必要であろう。
　【００２８】欧州特許出願第３３６３２４号に記載されたＮＧＦの再生プロトコルは十分にこの問題を解決していない。このプロトコルは高ｐＨにさらし（ｐＨ１３が推薦される）−−細菌により生産されたＮＧＦの正しくないジスルフィド結合を破壊すると思われる−−その後ｐＨを低下させるものである−−正しい分子内ジスルフィド結合形成の機会を与えると思われる。このプロトコルで採用している高ｐＨへの暴露は、グルタミンおよびアスパラギン（成熟ヒトＮＧＦ中に７個存在する）のアミン側鎖の排除並びにアスパラギン−グリシン、アスパラギン−セリンおよびアスパラギン−トレオニン隣接対（成熟ヒトＮＧＦ中に２個存在する）の広範な化学的変化を含む、タンパク質の広範な修飾を引き起こすことが知られている。これらの化学的修飾のほかに、この再生法はＮＧＦの生物学的活性の約１／１０か回復させないことが明らかになった。従って、欧州特許出願第３３６３２４号に記載されたプロトコルは、完全に生物学的に活性で、化学的に修飾されていない成熟ヒトＮＧＦを得るには不十分であることが明らかである。苛酷な条件を使用しないタンパク質の再生・復元プロトコルは数多く存在するが、かかる方法はどれもＮＧＦにうまく当てはまらなかった。再生法の一般的記載については、Ｈ．Ｋｏｈｎｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．１８５，ｐ．（１９９０）を参照されたい。
　【００２９】これらの考察に基づくと、完全に生物学的に活性で、化学的に修飾されていない成熟ヒトＮＧＦを細菌中に大量に生産できる製造システムは、医薬用途に適した生物学的に活性で修飾されていない形におけるＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の任意のタンパク質を同様に大量に生産させるのに有用であろう。
１．ヒトＢＤＮＦの単離本発明の一実施態様では、ＢＤＮＦの前駆体および成熟体をコードするヒト遺伝子を得るための方法が提供される。本発明はヒトＢＤＮＦの前駆体および成熟体、並びにかかるタンパク質をコードする遺伝子を包含する。本明細書全体を通して、神経栄養性タンパク質の成熟体はタンパク分解的フラグメント後に自然界に存在するような生物学的に活性な形のタンパク質を意味する。神経栄養性タンパク質の前駆体はタンパク分解的フラグメント前のヒト遺伝子によりコードされるタンパク質を意味する。以下の実施例１で説明する、この実施態様の好適な形式では、ブタＢＤＮＦをコードする核酸配列の種々の領域に基づいて、鎖長約１５−３０塩基の合成オリゴヌクレオチドＢＤＮＦ−１、ＢＤＮＦ−２、ＢＤＮＦ−２Ａ、ＢＤＮＦ−２Ｂ、ＢＤＮＦ−３、ＢＤＮＦ−４およびＢＤＮＦ−５が作製された。これらのブタＢＤＮＦオリゴヌクレオチドは、ヒトＢＤＮＦ遺伝子の介在セグメントを増幅させるために、鋳型としてヒトゲノムＤＮＡを用いるポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）においてプライマーとしていろいろな組合わせで使用される。増幅されたフラグメントをサブクローニングし、サブクローンはＰＣＲで用いた２つのプライマー間に存在する配列を表す別のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするものについてスクリーニングされる。
　【００３０】このスクリーニングで単離した陽性サブクローンは、ＢＤＮＦ遺伝子の部分としてのそれらとの同一性を確認するために配列決定できる。１以上のこれらの増幅フラグメントを使って、ＢＤＮＦのヒト遺伝子を得るためにヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングできる。ヒトゲノムクローンのサブクローン化制限フラグメントは、ヒトＢＤＮＦの前駆体および成熟体をコードする核酸配列および推定アミノ酸配列を得るために配列決定される。これらの方法により得られた、本発明の範囲に含まれるヒトＢＤＮＦの核酸配列および推定アミノ酸配列を図１に示す。
　【００３１】２．ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の以前に報告されていないメンバーの同定本発明の一実施態様では、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の以前に報告されていない新メンバーの前駆体および成熟体をコードするヒト遺伝子を得るための方法が提供される。所望のヒトＤＮＡ配列は、ヒトＮＧＦまたはＢＤＮＦと同一でないが、この群のありうる限定性特徴に関してＮＧＦまたはＢＤＮＦと明らかに関係があるタンパク質をコードする未報告の任意のすべての配列である。かかる特徴には１以上の次のこと、すなわち、適当なバイオアッセイでの神経栄養性活性；アミノ酸の同一性および保存的置換の両方を含むアミノ酸配列における有意な相同性；アミノ酸配列中のシステイン残基の保存された位置；タンパク質分泌のための疎水性シグナル配列；成熟体へのタンパク分解的プロセッシングのためのシグナル配列；および／またはプロセッシングを受けたタンパク質の塩基性等電点；が包含される。
　【００３２】Ａ．この実施態様の好適な一形式では、鎖長約１５−４０塩基の数種類の合成オリゴヌクレオチドが動物およびヒトＮＧＦおよびＢＤＮＦをコードする核酸配列の保存および可変領域に基づいて作製される。これらのＮＧＦ／ＢＤＮＦオリゴヌクレオチドは、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群のメンバーのヒト遺伝子の介在セグメントを増幅させるために、鋳型としてヒトゲノムＤＮＡまたは神経系の種々の別々の領域から作製したヒトｃＤＮＡライブラリーを用いるＰＣＲにおいてプライマーとしていろいろな組合わせで使用できる。
　【００３３】神経系の別々の領域からのｃＤＮＡを使うことは、（１）ＮＧＦおよびＢＤＮＦに関するメッセージを多量に含まない領域がＮＧＦおよびＢＤＮＦそれら自体からＰＣＲにより増幅されたフラグメントのバックグラウンドを減ずることができる；および（２）所望のニューロン集団に影響を及ぼす神経栄養性因子が神経系の予測しうる領域に存在すると思われる；ので有利である。
　【００３４】増幅されたフラグメントをサブクローニングし、そして個々のサブクローンは（ａ）オリゴヌクレオチドプライマー間に存在するＤＮＡ配列を表す縮重オリゴヌクレオチドとのポジティブハイブリダイゼーションによるか、あるいは（ｂ）ＮＧＦまたはＢＤＮＦから増幅されるとほぼ予想される大きさの挿入物を含有するサブクローンを検出するための制限マッピングにより選択できる。
　【００３５】かかる選択されたサブクローンは、それらがＮＧＦ／ＢＤＮＦ群のＮＧＦ、ＢＤＮＦまたは新メンバーの遺伝子部分であるかどうか調べるために配列決定できる。サブクローン化され増幅されたフラグメントがＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の新メンバーであると思われる場合は、このフラグメントを放射性標識して、推定上の新しい神経栄養性タンパク質のヒト遺伝子を得るためにヒトゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用できる。このヒト遺伝子は新しい神経栄養性タンパク質の前駆体および成熟体をコードする核酸配列および推定アミノ酸配列を得るために配列決定できる。
　【００３６】Ｂ．この実施態様の２番目の好適な形式では、上記のようにＰＣＲで増幅されたフラグメントのサブクローンを、ＮＧＦまたはＢＤＮＦ遺伝子に特有の非縮重断片を数種類のそれぞれを用いてスクリーニングできる。このスクリーニングの目的は、すでに特性決定されたＮＧＦおよびＢＤＮＦメンバーから増幅された断片を排除することにより、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の新タンパク質の遺伝子から増幅された断片の単離を容易にすることである。この方法でＮＧＦおよびＢＤＮＦと異なると同定された増幅断片は配列決定してそれらの同一性を確認でき、そして適当な場合には、上記のようにヒト遺伝子を得るのに使用できる。
　【００３７】Ｃ．この実施態様の３番目の好適な形式では、ヒトゲノムライブラリーおよび神経系の種々の別々の領域から作製されたヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群のありうる新しいメンバーを含有するクローンをつきとめることができる。かかるライブラリーはＮＧＦまたはＢＤＮＦをコードするヒトＤＮＡ配列の一部を使って、あるいは動物およびヒトＮＧＦまたはＢＤＮＦをコードする核酸配列の種々の保存および可変領域に基づいて作製された、鎖長約１５−４０塩基の合成オリゴヌクレオチドの１つを使ってスクリーニングできる。これらのライブラリーのスクリーニングにおいてハイブリダイゼーションの緊縮性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）を低下させると、プローブはＮＧＦおよびＢＤＮＦ配列を含有するクローンとハイブリダイズするばかりでなく、類似の（たぶん関係がある）配列ともハイブリダイズできる。ＮＧＦおよびＢＤＮＦのメッセージを多量に含まない神経系の領域からのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることは、ＮＧＦおよびＢＤＮＦクローンのバックグラウンドを減らすのに得策であろう。これらのスクリーニングで同定されたクローンは、それらがＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の新しいメンバーの遺伝子であるかどうか判定するために配列決定できるし、あるいはすでに知られたＮＧＦおよびＢＤＮＦの遺伝子である可能性があるものを排除するために、それらは先行する節で述べたようにさらにスクリーニングすることができる。
　【００３８】この実施態様の３つの好適な形式はそれぞれＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の新しいヒトタンパク質の前駆体および成熟体をコードする核酸配列および推定アミノ酸配列を得るのに使用できる。本発明はＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の以前に報告されたことのない任意のすべてのタンパク質を包含するものである。
　【００３９】ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の新しいメンバーが上記方法を使って同定されている。以下の実施例４で説明するように、また図６に示すように、以前に報告されたことのないタンパク質ＮＧＦ−３をコードする完全な核酸配列が同定された。図６に示した核酸配列に基づいて、成熟および前駆体ＮＧＦ−３の完全な推定アミノ酸配列が得られた。配列決定されたＮＧＦ−３遺伝子を参考にして推定された、ＮＧＦ−３のアミノ酸配列を図７に示す。
　【００４０】さらに、本発明はここに記載した神経栄養性タンパク質と生物学的に均等な任意の起源の神経栄養性タンパク質を包含する。好適な実施態様においては、本発明は成熟ヒト神経栄養性タンパク質を包含する。本明細書全体を通して、神経栄養性タンパク質への言及はＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質のメンバーとして同定され、ここに記載されたタンパク質のことを指すと解釈されるべきである。
　【００４１】本明細書および請求の範囲で用いる“生物学的に均等”とは、神経細胞またはダリア細胞の生存を促進しかつそれらの表現型分化を維持する能力をもつ（しかし、必ずしもここに記載した天然の神経栄養性タンパク質と同程度である必要はない）本発明物質を意味する。本明細書および請求の範囲で用いる“実質的に相同”とは、以前に報告された任意の神経栄養性タンパク質が示す相同度を越えた天然神経栄養性タンパク質との相同度を意味する。好ましくは、相同度は７０％以上、より好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％、９５％または９９％以上である。特に好適なグループの神経栄養性タンパク質は天然タンパク質と９５％以上相同である。ここに記載した相同の百分率は、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｖｏｌ．５，ｐ．１２４（１９７２），Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されるように、その整合を助けるために、１００アミノ酸の鎖長に４つのギャップを導入した場合に、比較される配列中の同一のアミノ酸残基と整合する２つの配列の小さい方に存在するアミノ酸残基の百分率として計算される。また、ここに記載したタンパク質に対する抗体との交差反応によって単離できる神経栄養性タンパク質、あるいは記載したタンパク質の遺伝子またはセグメントとのハイブリダイゼーションにより遺伝子を単離しうる神経栄養性タンパク質も実質的に相同なものとして包含される。
　【００４２】３．遺伝子発現本発明の一実施態様においては、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質のメンバーのヒト遺伝子（ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＧＦ−３のヒト遺伝子を含む）は、各遺伝子によりコードされる成熟ヒト神経栄養性タンパク質を製造するための組み換え発現系を確立するのに使用できる。この実施態様の好適な形式では、発現が微生物、特にＥ．ｃｏｌｉ内で行われる。
　【００４３】それぞれの神経栄養性タンパク質の遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ内での効率のよい発現を促進するために修飾できる。かかる修飾（以下で詳細に説明する）には、制限するものではないが、次のもの：（ｉ）遺伝子中に存在しうる付加的なコード配列および非コード配列を除去することによる、推定された成熟（プロセッシングを受けた）形態のタンパク質だけをコードするＤＮＡ配列の作製；（ｉｉ）Ｅ．ｃｏｌｉにより優先的に利用されるコドンヘのヒトコドンの変更；（ｉｉｉ）Ｅ．ｃｏｌｉにおける効率のよい翻訳を促進するための翻訳カプラーの付加；（ｉｖ）その後の連結反応およびクローニングに便利な新しい制限部位の挿入；および（ｖ）Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＤＮＡの効率のよい発現を促進するよう設計された数種の発現ベクターの１種またはそれ以上へのＤＮＡの挿入；が包含される。最終的な発現構築物を適当なＥ．ｃｏｌｉ株中に形質転換し、そして成熟神経栄養性タンパク質を生産する形質転換体がスケールアップおよび製造のために選択できる。本発明の好適な実施態様に従った、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＮＧＦの発現を以下の実施例２に記載する。
　【００４４】Ａ．総論かかる神経栄養性タンパク質を直接生産するのに、天然または合成ＤＮＡ配列を使用できる。本発明の一実施態様では、別の形態の神経栄養性因子（活性部位がここに記載した神経栄養性タンパク質と生物学的に等しい様式で機能する）を生産できる。一般的発現方法は：１．神経栄養性活性を有するタンパク質またはその前駆体の生産を宿主細胞に指示できるＤＮＡ配列の作製；
２．宿主細胞へ移してその中で複製させることができるベクター（このベクターはＤＮＡ配列またはその前駆体を発現させるのに必要なオペレーション要素を含有）への前記ＤＮＡ配列のクローニング；
３．神経栄養性タンパク質またはその前駆体をコードするＤＮＡを発現しうる宿主細胞への、合成ＤＮＡ配列およびオペレーション要素を含有するベクターの移入；
４．ベクターを増幅させかつタンパク質またはその前駆体を発現させる条件下での宿主細胞の培養；
５．前記タンパク質またはその前駆体の収穫；そして６．前記タンパク質に活性三次構造をとらせ、それによりこのものが生物学的活性を保有するか、または生物学的活性を有するタンパク質ヘプロセッシングできる；ことを含んで成る。
　【００４５】Ｂ．ＤＮＡ配列この方法での使用を意図されるＤＮＡ配列は実施例１、２および４で部分的に論じられる。図６はヒトＮＧＦ、ＢＤＮＦ、およびＮＧＦ−３をコードする完全な核酸配列を示す。これらの配列には合成および天然ＤＮＡ配列、およびそれらの組合わせも包含されることが意図される。天然配列にはさらにｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡセグメントも包含される。
　【００４６】ｃＤＮＡまたはゲノムポリヌクレオチド配列によりコードされるものと同一のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の合成的作製手段は、特にここに含まれる教示内容に照らして、当業者に一般に知られている。ポリヌクレオチドの合成に関する現在の技術の例として、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．，およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１）およびＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．２２：１８５９（１９８１）、並びにＡＢＩオリゴヌクレオチド合成機についている説明書を挙げることができる（これらは参考文献としてここに詳細にとり込まれる）。
　【００４７】これらの合成配列は以下で詳述する天然配列と同一であっても、異なるヌクレオチドを含んでいてもよい。一実施態様においては、その合成配列が本発明の天然ＤＮＡ配列に見られるものと異なるヌクレオチドを含有する場合は、これらの異なる配列はここに記載した神経栄養性タンパク質と同じ一次構造を有するポリペプチドを依然としてコードすることが意図される。別の実施態様では、異なるヌクレオチドを含有する合成配列はここに記載した神経栄養性タンパク質と同じ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするであろう。
　【００４８】さらに、そのＤＮＡ配列は天然配列の断片、すなわち自然界に存在しかつ本発明者らによって初めて単離・精製されたポリヌクレオチドの断片であってもよい。一実施態様においては、そのＤＮＡ配列はｃＤＮＡライブラリーから分離された制限断片である。別の実施態様においては、そのＤＮＡ配列はヒトゲノムライブラリーから分離される。この実施態様で有用なかかるライブラリーの例はＷｙｍａｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，２８８０−２８８４に記載されている。
　【００４９】所望の神経栄養性タンパク質をコードするＤＮＡ配列はいくつかの異なる方法で得ることができる。ヒトｃＤＮＡライブラリーおよびヒトゲノムライブラリーを神経栄養性タンパク質遺伝子またはその遺伝子産物と結合しうる少なくとも１種のプローブを使って検索できる。プローブと結合するその能力によって前記タンパク質をコードする遺伝子を同定した後、その遺伝子を単離して、宿主細胞内でその遺伝子を維持・発現させるのに必要なオペレーション要素に連結することができる。
　【００５０】遺伝子配列を同定・単離する別の方法はポリメラーゼ・チェイン・リアクションの使用による。実施例１で説明するように、ヒトＢＤＮＦをコードする天然ＤＮＡ配列は、ブタＢＤＮＦの核酸配列から設計された数種の合成オリゴヌクレオチドを作製し、そしてヒトＢＤＮＦ配列の増幅断片を同定するためのポリメラーゼ・チェイン・リアクションにおいてこれらのプライマー対を利用することにより同定・単離された。ＰＣＲにより得られた増幅断片は次にヒトＢＤＮＦの全核酸配列をクローニングするのに使用された。
　【００５１】実施例４で説明するように、ヒトＮＧＦ−３をコードする天然ＤＮＡ配列は、ヒトおよび動物ＮＧＦおよびＢＤＮＦの核酸配列から設計された合成オリゴヌクレオチドを作製し、そして以前に報告されたことのないヒトＮＧＦ−３配列の増幅断片を同定するためのポリメラーゼ・チェイン・リアクションにおいてこれらのプライマーを利用することにより同定・単離された。ＰＣＲにより得られた増幅断片はヒトＮＧＦ−３の全核酸配列をクローニングするのに使用された。
　【００５２】ヒトゲノムＤＮＡライブラリーからこれらの方法により単離された、ここに記載のヒトＢＤＮＦタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列はプラスミドｐＳＹＮ２３に挿入された。このプラスミドは、ブダペスト条約に従って、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州ロックビル）に１９９１年３月２０日受託番号４０９９２号として寄託されている。このＤＮＡ配列は、２２３部位のアミノ酸に対応するコドンがＡＧＡでなくＡＡＡとなっている点を除き図１に記述されている。
　【００５３】ヒトゲノムＤＮＡライブラリーからこれらの方法により単離された、ここに記載のＮＧＦ−３タンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列はプラスミドｐＳＹＮ３０に挿入された。このプラスミドは、ブダペスト条約に従って、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州ロックビル）に１９９１年３月２０日受託番号４０９９１号として寄託されている。このＤＮＡ配列は、以下の実施例４で詳述する。
　【００５４】Ｃ．ベクター（ｉ）微生物、特にＥ．ｃｏｌｉ本発明での使用が意図されるベクターには上記のＤＮＡ配列を好適な又は必要なオペレーション要素と共に挿入しうる任意のベクターが包含され、このベクターは次に宿主細胞に移入されて、かかる細胞中で複製できる。特に、これらのベクターはすべて次の特徴の一部または全部をもつことが好適である：（１）最少の宿主生物配列を有する；（２）所望の宿主内に安定した状態で維持・増殖される；（３）所望の宿主内に高コピー数で存在しうる；（４）対象の遺伝子の転写を促進するように配置された調節可能なプロモーターを有する；（５）ＤＮＡ配列が挿入される部位から離れたプラスミドの部位に存在する選択可能な特徴をコードするマーカーＤＮＡ配列を少なくとも１つ有する；および（６）転写を終結させることができるＤＮＡ配列を有する。
　【００５５】本発明のクローニングベクターは種々のオペレーション要素を含有する。これらの“オペレーション要素”には次のものが含まれる：調節遺伝子、プロモーター、転写ターミネーター、非翻訳配列、リボソーム結合部位、リーダー配列および翻訳カプラー、翻訳ターミネーター、選択マーカー。実際に、これらのベクターの単離、作製および相互交換が容易にできる方法でそれらを構築することが可能である。
　【００５６】ここで論じるオペレーション要素は、従来の文献とここに含まれる教示内容に照らして、当業者により日常的に選択される。これらのオペレーション要素の一般的な例はＢ．Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８３）（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されている。適当なオペレーション要素の種々の例は先に論じたベクターに存在し、上記ベクターの基本的特徴を論じる刊行物を通して明らかになろう。
　【００５７】上記ベクターの必要かつ所望の全構成成分の合成および単離後に、当業者に一般的に知られた方法によりベクターが作製される。かかるベクターの作製は当業者によって行われる職務の範囲内であると考えられ、それだけで過度の実験なしに実施することが可能である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（１９８４）（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されるように、同様のＤＮＡ配列が適当なクローニングベクターに連結されている。
　【００５８】以下の実施例２には、成熟、ヒトＮＧＦをコードする核酸配列を含有する２種類のベクターの作製が記載される。適当な核酸配列が挿入されたベクターはｐＴ５ＴおよびｐＴ３ＸＩ−２と呼ばれるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターである。ベクターｐＴ５Ｔ：ＮＧＦの細部を図４に、そしてベクターｐＴ３ＸＩ−２：ＮＧＦの細部を図５に示す。
　【００５９】本発明のクローニングベクターの構築においては、各ベクターに多コピー数のＤＮＡ配列とそれに付随するオペレーション要素を挿入できる点にさらに留意されたい。かかる実施態様では、宿主生物が所望の神経栄養性タンパク質をベクター当たり比較的多量に生産するであろう。ベクターに挿入できるＤＮＡ配列のコピー数は、その大きさ故に、適当な宿主細胞に移入されそこで複製および転写される作製ベクターの能力によってのみ制限される。
　【００６０】（ｉｉ）その他の微生物Ｅ．ｃｏｌｉ以外の微生物において使用するのに適したベクターも本発明の意図するものである。かかるベクターを表１に示す。さらに、いくつかの好適なベクターを以下で論じる。ここに記載したこれら微生物ベクターは、従来の文献とここに含まれる教示内容に照らして、当業者により日常的に使用される。かかるベクターの作製は当業者によって行われる職務の範囲内であると考えられ、それだけで過度の実験なしに実施することが可能である。
　【００６１】
　【表１】
　【００６２】１．Ｂａｃｋｍａｎ，Ｋ．，Ｐｔａｓｈｎｅ，ＭおよびＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．Ｐｒｃｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７３，４１７４−４１７８（１９７６）．２．ｄｅ　Ｂｏｅｒ，Ｈ．Ａ．，Ｃｏｍｓｔｏｃｋ，Ｌ．Ｊ．，およびＶａｓｓｅｒ，Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０，２１−２５（１９８３）．３．Ｓｈｉｍａｔａｋｅ，Ｈ．およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ　２９２，１２８−１３２（１９８１）．４．Ｄｅｒｏｍ，Ｃ．，Ｇｈｅｙｓｅｎ，Ｄ．およびＦｉｅｒｓ，Ｗ．Ｇｅｎｅ１７，４５−５４（１９８２）．５．Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ，Ｒ．Ａ．およびＥｍｔａｇｅ，Ｓ．Ｇｅｎｅ　９，２７−４７（１９８０）．６．Ｂｒｏｓｉｕｓ，Ｊ．，Ｄｕｌｌ，Ｔ．Ｊ．，Ｓｌｅｅｔｅｒ，Ｄ．Ｄ．およびＮｏｌｌｅｒ，Ｈ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．１４８　１０７−１２７（１９８１）．７．Ｎｏｒｍａｎｌｙ，Ｊ．，Ｏｇｄｅｎ，Ｒ．Ｃ．，Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｓ．Ｊ．およびＡｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ３２１，２１３−２１９（１９８６）．８．Ｂｅｌａｓｃｏ，Ｊ．Ｇ．，Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｇ．，ｖｏｎ　Ｇａｂａｉｎ，Ａ．およびＣｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．Ｃｅｌｌ４６，２４５−２５１（１９８６）．９．Ｓｃｈｍｅｉｓｓｎｅｒ，Ｕ．，ＭｃＫｅｎｎｅｙ，Ｋ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　Ｍ．およびＣｏｕｒｔ，Ｄ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７６，３９−５３（１９８４）．１０．Ｍｏｔｔ，Ｊ．Ｅ．，Ｇａｌｌｏｗａｙ，Ｊ．Ｌ．およびＰｌａｔｔ，Ｔ．ＥＭＢＯ　Ｊ．４，１８８７−１８９１（１９８５）．１１．Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．およびＢｏｔｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｃｅｌｌ　２０，７４９−７６０（１９８０）．１２．Ｍｏｖｖａ，Ｎ．Ｒ．，Ｋａｋａｍｕｒａ，Ｋ．およびＩｎｏｕｙｅ，Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４３，３１７−３２８（１９８０）．１３．Ｓｕｒｉｎ，Ｂ．Ｐ．，Ｊａｎｓ，Ｄ．Ａ．，Ｆｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｌ，Ｓｈａｗ，Ｄ．Ｃ．，Ｃｏｘ，Ｇ．Ｂ．およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７，７７２−７７８（１９８４）．１４．Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７５，３７３７−３７４１（１９７８）．１５．Ｐｅｄｅｎ，Ｋ．Ｗ．Ｃ．Ｇｅｎｅ　２２，２７７−２８０（１９８３）．１６．Ａｌｔｏｎ，Ｎ．Ｋ．およびＶａｐｎｅｋ，Ｄ．Ｎａｔｕｒｅ　２８２，８６４−８６９（１９７９）．１７．Ｙａｎｇ，Ｍ．，Ｇａｌｉｚｚｉ，Ａ．，およびＨｅｎｎｅｒ，Ｄ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１１（２），２３７−２４８（１９８３）．１８，Ｗｏｎｇ，Ｓ．−Ｌ．，ＰｒｉｃｅＣ．Ｗ，Ｇｏｌｄｆａｒｂ，Ｄ．Ｓ．，およびＤｏｉ，Ｒ．Ｈ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１，１１８４−１１８８（１９８４）．１９．Ｗａｎｇ，Ｐ．−Ｚ．およびＤｏｉ，Ｒ．Ｈ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１，８６１９−８６２５，（１９８４）．２０．Ｌｉｎ，Ｃ．−Ｋ．，Ｑｕｉｎｎ，Ｌ．Ａ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．（９Ｂ），ｐ．１９８（１９８５）．２１．Ｖａｓａｎｔｈａ，Ｎ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ｄ．，Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．，Ｂａｎｎｅｒ，Ｃ．，Ｎａｇｌｅ，Ｊ．，およびＦｉｌｐｕｌａ，Ｄ．Ｊ．Ｂａｃｔ．１５９（３），８１１−８１９（１９８４）．２２．Ｐｌａｖａ，Ｉ．，Ｓａｒｖａｓ，Ｍ．，Ｌｅｈｔｏｖａａｒａ，Ｐ．，Ｓｉｂａｚｋｏｖ，Ｍ．，およびＫａａｒｉａｉｎｅｎ，Ｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７９，５５８２−５５８６（１９８２）．２３．Ｗｏｎｇ．Ｓ．−Ｌ．，Ｐｒｉｃｅｅ，Ｃ．Ｗ，，Ｇｏｌｄｆａｒｂ，Ｄ．Ｓ．，およびＤｏｉ，Ｒ．Ｈ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ　８１，１１８４−１１８８（１９８４）．２４．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｍ．Ａ．，Ｙａｓｂｉｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｆ．Ｅ．Ｇｅｎｅ　２９，２１−４６（１９８４）．２５．Ｖａｓａｎｔｈａ，Ｎ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ｄ．，Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．，Ｂａｎｎｅｒ，Ｃ．Ｎａｇｌｅ，Ｊ．，およびＦｉｌｕｌａ，Ｄ．Ｊ．Ｂａｃｔ．１５９（３），８１１−８１９（１９８４）．２６．Ｙａｎｓｕｒａ，Ｄ．Ｇ．およびＨｅｎｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．ＰＮＡＳ　８１，４３９−４４３（１９８４）．２７．Ｇｒａｙ，Ｇ．Ｌ．，ＭｃＫｅｏｗｎ，Ｋ．Ａ．，Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ｊ．Ｓ．，Ｓｅｅｂｕｒｇ，Ｐ．Ｈ．およびＨｅｙｎｅｋｅｒ，Ｈ．Ｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６１−１６５（１９８４）．２８．Ｌｏｒｙ，Ｓ．，およびＴａｉ，Ｐ．Ｃ．Ｇｅｎｅ　２２，９５−１０１（１９８３）．２９．Ｌｉｕ，Ｐ．Ｖ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１３０（ｓｕｐｐｌ），５９４−５９９（１９７４）．３０．Ｗｏｏｄ，Ｄ．Ｇ．，Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｆ．，およびＴｉｎｄｏｌ，Ｍ．Ｂ．Ｊ．Ｂａｃｔ．１４５，１４４８−１４５１（１９８１）．３１．Ｓｔ．Ｊｏｈｎ，Ｔ．Ｐ．およびＤａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５２，２８５−３１５（１９８１）．３２．Ｈｏｐｐｅｒ，Ｊ．Ｅ．，およびＲｏｗｅ，Ｌ，Ｂ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３，７５６６−７５６９（１９７８）．３３．Ｄｅｎｉｓ，Ｃ．Ｌ．，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｊ．およびＹｏｕｎｇ，Ｅ．Ｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，１１６５−１１７１（１９８３）．３４．Ｌｕｔｓｄｏｒｆ，Ｌ．およびＭｅｇｎｅｔ，Ｒ．Ａｒｃｈｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１２６，９３３−９４４（１９６８）．３５．Ｍｅｙｈａｃｋ，Ｂ．，Ｂａｊｗａ，Ｎ．，Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｈ．およびＨｉｎｎｅｎ，Ａ．ＥＭＢＯ．Ｊ．６，６７５−６８０（１９８２）．３６．Ｗａｔｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１２，５１４５−５１６４（１９８４）．３７．Ｇｅｒｂａｎｄ，Ｃ．およびＧｕｅｒｉｎｅａｕ，Ｍ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１，２１９−２２８（１９８０）．３８．Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．，Ｈｉｃｋｓ，Ｊ．Ｂ．およびＦｍｋ，Ｇ．Ｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７５，１９２９−１９３３（１９７８）．３９．Ｊａｂｂａｒ，Ｍ．Ａ．，Ｓｉｖａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｎ．およびＮａｙａｋ，Ｄ．Ｐ　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２，２０１９−２０２３（１９８５）．（ａ）シュードモナスベクター広範囲のグラム陰性細菌内で自律複製する数種のベクタープラスミドが、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属宿主におけるクローニングベヒクルとして使用するのに好適である。これらのうちのいくつかはＴａｉｔ，Ｒ．Ｃ．，Ｃｌｏｓｅ，Ｔ．Ｊ．，Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ，Ｒ．Ｃ．，Ｈａｇｉｙａ，Ｍ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．，およびＫａｄｏ，Ｃ．Ｉ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｙ，１９８３，ｐ．２６９−２７５；Ｐａｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｎ．Ｊ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｒａｅｇｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ｐ．１６３−１８５（１９８１）；およびＳａｋａｇｕｃｋｉ，ｋ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　９６：３１−４５（１９８２）（それぞれ参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されている。
　【００６３】特に好適な構築は、Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ，Ｍ．，Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｓ．，および　ＴｉｍｍｉｓＫ．Ｎ．，Ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　ＣｏｍｍｅｒｃｉａｌＩｍｐｏｒｔａｎｃｅ，Ｔｉｍｍｉｓ，Ｋ．Ｎ．およびＰｕｈｌｅｒ，Ａ．編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ　ＨｏｌｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ（１９７９）（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されるプラスミドＲＳＦ１０１０およびその誘導体を用いるであろう。このＲＳＦ１０１０の利点は、それがＥ．ｃｏｌｉとシュードモナス種の両方に容易に形質転換されかつ安定した状態で維持される、比較的小型の、高コピー数プラスミドであるということである。この系では、エシェリヒアのところで述べたようなＴａｃ発現系を使用することが好適であろう。何故ならば、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｔｒｐプロモーターは、Ｓａｋａｇｕｃｋｉ，ｋ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　９６：３１−４５（１９８２）およびＧｒａｙ，Ｇ．Ｌ．，ＭｃＫｅｏｗｎ，Ｋ．Ａ，，Ｊｏｎｅｓ　Ａ．Ｊ．Ｓ．，Ｓｅｅｂｕｒｇ，Ｐ．Ｈ．，ａｎｄ　Ｈｅｙｎｅｋｅｒ，Ｈ．Ｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂ．１９８４，ｐ．１６１‐１６５（両方とも参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されるように、シュードモナスＲＮＡポリメラーゼにより容易に認識されると思われるからである。転写活性はプロモーターを例えばＥ．ｃｏｌｉまたはシュードモナス・アエルギノザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ｔｒｐプロモーターと交換することにより最大限に高めることができる。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃＩ遺伝子も調節を行うためにこのプラスミドに包含されよう。
　【００６４】翻訳は神経栄養性タンパク質の細胞内発現をもたらすように選ばれた種類の任意の高度発現タンパク質の開始部位だけでなく、任意のシュードモナスタンパク質の翻訳開始にも連結することができる。宿主シュードモナス種の制限マイナス株を利用できない場合には、Ｅ．ｃｏｌｉから単離したプラスミド構築物による形質転換効率が低い。従って、Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ，Ｍ．，らＰｌａｓｍｉｄｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ，ｐ．４１１−４２２，ＴｉｍｍｉｓおよびＰｕｈｌｅｒ編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ（１９７９）（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されるように、シュードモナス・クローニングベクターは所望の宿主の形質転換に先立って別の種のｒ−ｍ＋株を通過させることが望ましい。
　【００６５】（ｂ）バチルスベクターさらに、バチルス属宿主における好適な発現系はクローニングベヒクルとしてのプラスミドｐＵＢ１１０の使用を包含する。他の宿主ベクター系と同様に、バチルスでは本発明の神経栄養性タンパク質を細胞内タンパク質または分泌タンパク質として発現させることが可能である。この実施態様は両方の発現系を包含する。バチルスとＥ．ｃｏｌｉの両方において複製するシャトルベクターは、Ｄｕｂｎａｕ，Ｄ．，Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔ．，Ｃｏｎｔｅｎｔｅ，Ｓ．，およびＳｈｉｖａｋｕｍａｒ，Ａ．Ｇ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．２，ＳｅｔｌｏｗおよびＨｏｌｌａｎｄｅｒ編，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐ．１１５−１３１（１９８０）（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されるように、種々の遺伝子の構築および試験に利用できる。Ｂ．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からの神経栄養性タンパク質の発現および分泌に関しては、α−アミラーゼのシグナル配列が好ましくはこのタンパク質のコード領域に連結される。細胞内タンパク質の合成に関しては、移動可能なＤＮＡ配列がα−アミラーゼリーダー配列のリボソーム結合部位に翻訳共役されよう。
　【００６６】これらの構築物の転写は好ましくはα−アミラーゼプロモーターまたはその誘導体により指示される。この誘導体は天然α−アミラーゼプロモーターのＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含有するが、またｌａｃオペレーター領域も組み込む。ペニシリナーゼ遺伝子プロモーターとｌａｃオペレーターから構築された同様のハイブリッドプロモーターは、Ｙａｎｓｕｒａ，Ｄ．Ｇ．およびＨｅｎｎｅｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆ　Ｂａｃｉｌｉｉ，Ｇａｎｅｓａｎ，Ａ．ＴおよびＨｏｃｈ，Ｊ．Ａ．，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，ｐ．２４９−２６３（１９８４）（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されるように、バチルス宿主において調節可能な様式で機能することが示されている。Ｅ，ｃｏｌｉのｌａｃＩ遺伝子も調節を行うためにこのプラスミドに含まれよう。
　【００６７】（ｃ）クロストリジウムベクタークロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　）による発現に好適な構築物の一つは、Ｓｑｕｉｒｅｓ，Ｃ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：４６５−４７１（１９８４）（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されるプラスミドｐＪＵ１２中で行われ、この構築物はＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：４６０−４６４（１９８４）（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されるＨｅｅｆｎｅｒ，Ｄ．Ｌ，らの方法によりクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）に形質転換される。転写はテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーターにより指示される。翻訳は他の宿主で使用するのに適したベクターについて先に概説した方法と厳密に類似した方法でこの同じｔｅｔｒ遺伝子のシャイン・ダルガーノ配列に連結される。
　【００６８】（ｄ）酵母ベクター酵母に導入された外来ＤＮＡの維持は、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｄ．およびＤａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．，ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ，ＪｏｎｅｓおよびＢｒｏａｃｈ，編，ｐ．６０７−６３６（１９８２）（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されるいくつかの方法で行うことができる。サッカロミセス属の宿主生物で使用するのに適した一発現系は２ミクロンプラスミド上に神経栄養性タンパク質遺伝子を保有する。この２ミクロン環状プラスミドの利点にはｃｉｒ’株に導入した場合の比較的高いコピー数および安定性が含有される。これらのベクターは好ましくはＥ．ｃｏｌｉでの複製および選択を可能にするために、ｐＢＲ３２２由来の複製起点および少なくとも１つの抗生物質耐性マーカーを組み込んでいる。さらに、このプラスミドは好ましくは酵母のＬＥＵ２欠損変異株において同じ目的をとげるために、２ミクロン配列および酵母ＬＥＵ２遺伝子を有しよう。
　【００６９】組み換え神経栄養性タンパク質を最終的に酵母に発現させようとする場合は、初めにクローニングベクターをＥ．ｃｏｌｉに移し、そこでベクターを複製させ、そして増巾後にベクターを回収して精製することが好適である。その後、ベクターはタンパク質の最終的発現のために酵母に移入されよう。
（ｉｉｉ）哺乳動物細胞神経栄養性タンパク質のｃＤＮＡは哺乳動物細胞によるタンパク質発現用の遺伝子として役立てられよう。それはＫｏｚａｋ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ１５：８１２５−８１３２（１９８７）（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されるようなリボソーム結合に効果的な配列をもつべきであり、さらにプロセッシングされた形における成熟タンパク質を細胞外へ導くリーダー配列（セクション３（ａ）（ｖｉ）参照）のコード能力をもつべきである。完全なｃＤＮＡ配列を担持するＤＮＡ制限断片は、Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｌ．，Ｃｅｌｌ　５２：３０３−３０５（１９８８）およびＫａｄｏｎａｇａ，Ｊ．Ｔ．らＣｅｌｌ　５１：１０７９−１０９０（１９８７）（両方とも参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されるような、転写プロモーターおよび転写エンハンサーを有する発現ベクターに挿入できる。タンパク質の構成的発現が細胞の増殖に有害である場合、プロモーターはプラスミドｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａカタログ番号２７４５０６０１）におけると同様に調節可能であることができる。ベクターは、そのベクターから転写されたｍＲＮＡが適正にプロセッシングされるように、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ（１９８７）（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されるような、完全なポリアデニル化シグナルを有するべきである。最後に、ベクターはＥ．ｃｏｌｉでの複製および選択ができるように、ｐＢＲ３２２由来の複製起点および少なくとも１つの抗生物質耐性マーカーを有しよう。
　【００７０】神経栄養性タンパク質を生産する安定した細胞株を選別するために、発現ベクターは薬剤耐性マーカーのような選択マーカーの遺伝子を担持できるし、またはＡｕｓｕｂｅｌら同上に記載されるようなｄｈｆｒ細胞系を形質転換するための、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子のような、欠損細胞系用の補足遺伝子を担持できる。あるいはまた、選択マーカーを担持する別個のプラスミドを発現ベクターと同時に形質転換に使用することもできる。
　【００７１】Ｄ．宿主細胞／形質転換このようにして得られたベクターは適当な宿主細胞へ移入される。これらの宿主細胞は微生物、昆虫細胞または哺乳動物細胞でありうる。本発明の好適な実施態様では、使用される宿主細胞は微生物でありそしてより詳しくはＥ．ｃｏｌｉ細胞である。
　【００７２】（ｉ）微生物外因性ＤＮＡをとり込みかつそれらの遺伝子と付随するオペレーション要素を発現しうる任意の微生物を選択できると考えられる。宿主生物を選択した後、ベクターを当業者に一般的に知られた方法を使って宿主生物に移入する。かかる方法の例はＲ．Ｗ．Ｄａｖｉｓら，ＡｄｖａｎｃｅｄＢａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９８０）（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に見ることができる。一実施態様では、温度調節が上記のようなオペレーション要素の使用を介した遺伝子発現の調節手段として意図されるので、形質転換は低温で起こることが好適である。他の実施態様においては、浸透調節遺伝子がベクターに挿入された場合は、外来性遺伝子の適切な制御を確保するために、形質転換期間中塩濃度の調節が必要であろう。
　【００７３】宿主微生物が通性嫌気性菌または好気性菌であることが好適である。この方法で使用するのに好ましい詳細な宿主には酵母および細菌が包含される。詳細な酵母にはサッカロミセス属のもの、特にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれる。詳細な細菌にはバチルス属、エシェリヒア属、およびシュードモナス属のもの、特にバチルス・ズブチリスおよびエシェリヒア・コリが包含される。他の宿主細胞は表Ｉに示してある。
　【００７４】（ｉｉ）哺乳動物細胞ベクターはリン酸カルシウム：ＤＮＡ共沈、エレクトロポレーション、またはプロトプラスト融合のようないくつかの技法により培養下の哺乳動物細胞に導入できる。好適な方法はＡｕｓｕｂｅｌら同上に記載されるようなリン酸カルシウム共沈法である。
　【００７５】形質転換可能であり、しかもｃＤＮＡ配列を転写・翻訳し、前駆体神経栄養性タンパク質をプロセッシングしそして成熟タンパク質を分泌することができる安定した細胞型が数多く存在する。しかしながら、細胞型は、もし起こるとしたら、分泌タンパク質のグリコシル化およびアミノ酸残基の翻訳後修飾に関して変動できよう。従って、理想的な細胞型は天然分子と同一の組み換え神経栄養性タンパク質を生産するものである。
Ｅ．工学的に作製された細胞の培養神経栄養性タンパク質の発現に適した条件下宿主細胞を培養する。これらの条件は一般に宿主細胞に特異的であり、かかる細胞の増殖条件に関する刊行された文献および本明細に含まれる教示に照らして、通常の技術を有する者が容易に決定できる。例えば、　Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，第８版，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄは、参考文献として詳細に本文にとり込まれるが、これには細菌培養条件に関する情報が載っている。酵母および哺乳動物細胞の培養に関する同様の情報は、　Ｐｏｌｌａｃｋ，Ｒ．ＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（１９７５）から得られ、これは参考文献として詳細に本文にとり込まれる。
　【００７６】ＤＮＡ配列の発現調節に必要な任意の条件は、ベクター内に挿入されるかまたはベクター中に存在する任意のオペレーション要素に依存し、形質転換および培養段階で効力を発揮するであろう。ある実施態様に於ては、ＤＮＡ配列の発現を阻害する適当な調節条件の存在下細胞を高密度に増殖させる。最適な細胞密度に達したときに、周囲の条件をＤＮＡ配列の発現に適した条件に変化させる。こうして、宿主細胞が最適密度近くまで増殖した後の一定時間に神経栄養性タンパク質を生産させること、およびその結果生じるタンパク質をその発現に必要な調節条件を誘導した後の一定時期に収集することが意図される。
４．発現した組換えタンパク質の再生本発明の好ましい実施態様に於ては、組換え成熟神経栄養性タンパク質を収集後、その活性構造をとらせる前に精製する。当該タンパク質を最初に精製する場合は再生タンパク質を高収率で回収することが容易になると本発明者らは考えるので、この実施態様が好ましい。しかしながら、もう一つの好ましい別の実施態様に於いては、精製前に神経栄養性タンパク質を再生してその活性構造をとることを可能にすることができる。さらに別の好ましい実施態様に於ては、このタンパク質は培養培地から回収した時点で、再生された活性な状態で存在する。
　【００７７】ある特定の状況に於ては、成熟神経栄養性タンパク質は、宿主微生物内で発現し、細胞壁または細胞膜を通って、または細胞周辺腔へ輸送される時点で、当該タンパク質の適正で、活性な構造をとるであろう。このことは、一般に、適当なリーダー配列をコードするＤＮＡが当該の組換えタンパク質をコードするＤＮＡに連結されている場合に起こるであろう。
　【００７８】本発明のある実施態様に於ては、微生物内で生産されたタンパク質は実質的な生物活性を欠く可能性があり、したがってこれを再生して、神経栄養性タンパク質にＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の一員として期待される生物学的特異活性を付与する必要があろう。予想される特異活性は、真核細胞で発現されたタンパク質について観察されるかあるいはまた、天然起源から精製された同一または関連タンパク質について観察されるもののどちらかである（例えば、マウス顎下腺ＮＧＦおよびブタ脳ＢＤＮＦ）。
　【００７９】微生物で発現されたタンパク質に生物活性がないのは、分子内ジスルフィド結合が正しく形成されないことに関係している場合が多い。このような実施態様の好ましい一局面に於ては、Ｅ．コリ内で生産された組換え神経栄養性タンパク質を再生して、分子内ジスルフィド結合の正確な配置および予想される生物学的特異活性を得ることができる。
　【００８０】好ましい局面に於ては、組換えタンパク質を以下の工程を用いて再生することができる：（１）微生物内で生産された成熟神経栄養性タンパク質に関して生じたあらゆる分子内または分子間ジスルフィド結合、および／またはあらゆる非共有結合性相互作用を、まず破壊する。これを行うために、タンパク質を十分な変性剤（例えば、塩酸グアニジンまたは尿素）、および十分な還元剤（例えば、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、またはシステイン）に曝してタンパク質を変性させ、非共有結合性相互作用を破壊し、ジスルフィド結合を還元する。
　【００８１】（２）成熟神経栄養性タンパク質を変性および還元した後、還元タンパク質に存在する遊離のチオール基を大過剰のジスルフィド含有試薬（例えば、グルタチオンまたはシスチン）の添加によって酸化する。この反応により、成熟神経栄養性タンパク質中の各システイン残基が酸化剤の単量体形とジスルフィド結合を形成するものである混合ジスルフィド結合が形成される。この工程によって、後続のプロセッシングで神経栄養性タンパク質に間違った分子内ジスルフィド結合が形成されるのを阻止できる。
　【００８２】（３）次に、変性剤および酸化剤を所定濃度に希釈し、そしてジスルフィド結合の架け変えを触媒するためにチオール含有試薬（例えばシステイン）を添加する。その目的は、変性剤濃度を十分に低下させて神経栄養性タンパク質が様々な三次元構造をとることを可能にする環境を作ることであり、また酸化／還元ポテンシャルを調整してジスルフィド結合の形成および破壊を可能にする環境を作ることである。成熟神経栄養性タンパク質の正しい三次元構造およびジスルフィド結合パターンは、他のありうるコンホーメーションに比べてエネルギー的により安定であると考えられている。したがって、神経栄養性タンパク質が様々な三次元コンホーメーションおよび分子内ジスルフィド結合パターンをとることを可能にする条件により、神経栄養性タンパク質のかなりの割合が正しい分子内ジスルフィド結合パターン、正しい三次元構造、を再生し、したがって生物学的に活性となることが可能となろう。
　【００８３】好ましい実施態様に於ては、組換え神経栄養性タンパク質を尿素含有バッファー中に０．１−２ｍｇ／ｍｌ濃度となるように溶解する。もし必要ならば、ジスルフィド結合の架け換えを促進するために、やはり尿素を含有する高ｐＨバッファー溶液を添加することによって、かかる溶液のｐＨをアルカリ性となす。還元剤を最終濃度約１−１５ｍＭとなるように添加する。次に、酸化剤を最終濃度約１５−５０ｍＭとなるように添加する。神経栄養性タンパク質含有溶液を５−２０倍に希釈し、その溶液がジスルフィド含有試薬より２−３倍多いチオール含有試薬を含有するような濃度まで、チオール含有試薬を加える。
　【００８４】組換え神経栄養性タンパク質の再生に関するもっとも好ましい実施態様に於いては、最終的な再生混合物を脱気し、そして嫌気性条件で再生が起こるようにする。さらに、本発明のもっとも好ましい実施態様に於いては、ＮＧＦ溶液は再生前に他のタンパク質から実質的に精製される。この文脈で実質的に精製されるとは、その溶液が、ＮＧＦ再生の速度または効率を妨げる宿主細胞タンパク質を実質的に含まないことを意味する。そして最終的に、本発明の好ましい実施態様に於いては、グリコール含有試薬もまた再生混合物に包含される。
　【００８５】これらの方法は穏やかで、神経栄養性タンパク質の化学的修飾をもたらすべきでない。このプロトコルで変性剤として尿素を用いる場合は、生じる可能性のあるシアン酸イオンを尿素溶液をＤＯＷＥＸ１‐Ｘ８（ＢｉｏＲａｄ）のような陰イオン交換カラムに通すことによって除去することが重要である。シアン酸イオンを除去しないと、タンパク質中のアミノ基が修飾される可能性がある（Ｓｔａｒｋ　１９６７　ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１１：１２５）。
　【００８６】最終再生溶液に於ける変性剤、酸化剤、チオール試薬およびそれらの濃度の選択および最適濃度は、正しく再生され生物学的に活性な神経栄養性タンパク質の割合をモニターすることによって実験的に決定される。最終再生溶液に於ける目標は、好ましいコンホーメーションおよびジスルフィド結合パターンが達成されるまで、神経栄養性タンパク質にジスルフィド結合の架け換えとコンホーメーション変化が起こり得る制御された環境を与えることである。上記した最適な再生にとって好ましい条件は、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質のすべてについて実質的に同一であることが予想されるが、それはこれらのタンパク質が、成熟タンパク質中の全部で６個のシステイン残基の相対位置を含めて、アミノ酸配列に於いて密接に関連しているためであり、したがって同一のジスルフィド結合パターンをとると推定されるからである。
　【００８７】本発明の再生に関する実施態様により、生物学的に活性な神経栄養性タンパク質を生じないことが示されている望ましい発現系において神経栄養性タンパク質を発現できる。本発明の方法を行った後、細菌で発現された組換え神経栄養性タンパク質は、最低１０％の生物活性を獲得するであろう。より好ましい実施態様に於いては、神経栄養性タンパク質は少なくとも３０％の生物活性を得るであろう。最も好ましい実施態様に於いては、当該タンパク質は少なくとも５０％の生物活性を有するであろう。
　【００８８】下記の実施例３は、この再生プロトコルが細菌で生産される成熟ＮＧＦの再生に有効であることを示す実験について、以下のように説明する：（１）真核細胞発現件で生産されるかあるいは天然起源から精製された、正しく折りたたまれ完全に生物学的に活性な成熟ＮＧＦを上記のように変性させてジスルフィド結合を還元し、生物活性を失わせる。このＮＧＦは変性および還元以前は生物学的に活性であったので、生物活性の喪失によって変性および再生が起こったことを証明できる；（２）変性させ還元させたＮＧＦを、本文記載のプロトコルにしたがって再生し、生物活性が回復されたことを判定する。生物活性の回復は、変性され還元されたタンパク質の適正な再生にかかっていると推定される。細菌細胞発現系も含めて、上記のどの起源に由来する成熟ＮＧＦも、変性および還元後は構造的に区別できないと主張されている。したがって、真核細胞発現系または天然起源のいずれかに由来する変性され還元された成熟ＮＧＦを適正に再生できることは、細菌細胞で生産された成熟ＮＧＦをうまく再生できることを示す（実施例３および図３参照）。
　【００８９】実施例３Ｂは、上記と同様の方法を用いた、Ｅ．コリを使用する細菌発現系で生産された成熟ＮＧＦの再生の成功を説明する。再生されたＮＧＦは完全に生物学的に活性で、逆相高性能液体クロマトグラフィーで天然型の、昆虫細胞で生産されたＮＧＦの位置で移動する。
５．組換え神経栄養性タンパク質の精製最も利用し易く、高収率で生物学的に活性なタンパク質を生じることが経験的に確認されている、成熟神経栄養性タンパク質を再生するための上記プロトコルは、組換えタンパク質の精製の段階に適用できる。
　【００９０】本発明の一実施態様に於いては、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の組換え体は、タンパク質化学の標準的な技法によって、その組換えタンパク質が医薬製剤中に使用するに十分に純粋となるまで発現宿主細胞の抽出物から精製できる。かかる純度は、調製物中の全タンパク質の最低９０％が神経栄養性タンパク質であること、そして好ましくは全タンパク質の最低９５％が神経栄養性タンパク質であることと定義される。好ましい実施態様に於いては、組換えタンパク質の精製に用いられる方法には、下記の一部またはすべてが包含されうるが、それらに限定されない：イオン交換クロマトグラフィー（例、Ｑ−、Ｓ−、およびＤＥＡＥ−セファロースイオン交換カラム）、ゲル浸透クロマトグラフィー（例、セファロースサイジングカラム）、クロマトフォーカシング（例、Ｍｏｎｏ‐Ｐカラム）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（例、オクチル−、およびフェニル−セファロースＨＩＣカラム）、アフィニティークロマトグラフィー（例、亜鉛、銅、および水銀金属−アフィニティーカラム）。
６．医薬製品の製剤前記のように、本発明の神経栄養性タンパク質は、治療剤としての使用を意図されており、したがって製薬上許容される担体中で製剤化されることが意図される。本発明の一実施態様に於いては、神経栄養性タンパク質を化学的に修飾して、その分子の薬動学的性質を向上させることができる。一例は、ポリエチレングリコールのような高分子量ポリマー物質の神経栄養性タンパク質への結合である。神経栄養性タンパク質は、治療すべき神経細胞障害の種類に応じて、個別にか、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の別の神経栄養性タンパク質と組み合わせてか、または他の神経栄養性タンパク質または他の治療薬と組み合わせて投与できる。
　【００９１】本発明の治療用組成物は注射によって非経口的に、または埋め込まれたポンプからの持続的な注入によって鞘内に投与することが好ましい。また、非経口的徐放性製剤、吸入ミスト、経口で活性な製剤、または坐薬のような他の有効な投与形態も意図される。好ましい担体の一つは生理食塩溶液であるが、他の製薬上許容される担体も使用できることが意図される。好ましい実施態様の一つに於いては、担体および神経栄養性タンパク質が生理学的に適合する徐放性製剤を構成することが意図される。かかる担体に於ける主要な溶媒は本質的に水性であっても非水性であってもよい。さらに、担体は、製剤のｐＨ、浸透性、粘度、透明度、色、無菌性、安定性、溶解速度、またはにおいを改変もしくは維持するために、他の薬理学的に許容される賦形剤をも含有できる。同様に、担体はさらに、神経栄養性タンパク質の安定性、溶解速度、放出または吸収を改変もしくは維持するために、他の薬理学的に許容される賦形剤をも含有できる。かかる賦形剤は、単位量または複数同量における非経口投与用製剤に、あるいは埋め込まれたポンプからの持続的または定期的注入によるかまたは鞘膜内への定期的な注射による鞘膜内デリバリーのための製剤に通常慣用的に使用される物質である。
　【００９２】ひとたび治療用組成物が製剤化されると、その組成物は溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水もしくは凍結乾燥した粉末として、滅菌バイアル中に保存できる。かかる製剤は、すぐ使用できる形でまたは投与直前に再構成を必要とする形態で保存できる。かかる製剤の好ましい保存は、少なくとも４℃程度の低温で行われ、−７０℃が好ましい。また、神経栄養性タンパク質を含有するかかる製剤は生理的ｐＨまたはその付近で保存され投与されるのが好ましい。現在では、約ｐＨ５．５より低いｐＨ、および約８．０より高いｐＨで製剤を保存し、投与することは望ましくないと考えられている。
　【００９３】神経栄養性タンパク質を含有する製剤を非経口的に投与する方法は、皮下または筋肉内ルートによることが好ましい。望ましい量の神経栄養性タンパク質を得るには、毎日繰り返しまたはより低頻度で皮下または筋肉内注射を行うことができる。約０．０１ｍｇ／ｋｇより低い用量で毎日神経栄養性タンパク質を投与することは効果がなく、一方１ｍｇ／ｋｇより高い用量で毎日投与することは望ましくない副作用をもたらすと考えられている。また、神経栄養性タンパク質を含有するある種の製剤を経口投与することも意図される。この様式で経口投与される神経栄養性タンパク質はカプセル封入されることが好ましい。カプセル化された神経栄養性タンパク質は、固体投与形の製剤化に通例用いられる担体を用いてまたは用いずして製剤化できる。カプセルは、その製剤の活性部分が、生物利用可能性が最大となり、そして全身に行きわたる前の分解が最小となる時点で胃腸管内に放出されるように設計されることが好ましい。神経栄養性タンパク質の吸収を促進するために、付加的な賦形剤を包含することができる。希釈剤、香料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も使用できる。
　【００９４】投与様式に関わらず、特定の用量が患者のおよその体重にしたがって算出される。上記各製剤が関わる治療に適した用量を決定するのに必要な計算の一層の改善は、当業者によってルーチンに行われ、それは過度の実験を行うことなく当業者によってルーチンに行われる業務の範囲内である。生物試験では、本発明の神経栄養性タンパク質を用いても、毒性作用はまったく観察されない。
実施例１：ＢＤＮＦのヒト遺伝子の単離、配列決定および発現Ａ．ヒトＢＤＮＦ遺伝子の部分を増幅するためのポリメラーゼ・チェイン・リアクションの利用ブタＢＤＮＦについて報告された核酸配列に基づいて、以下のオリゴヌクレオチドを合成した（Ｌｅｉｂｒｏｃｋら、１９８９上記）。
ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として用い、以下の組合せの合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行った：ＢＤＮＦ−１およびＢＤＮＦ−３；ＢＤＮＦ−２ＡおよびＢＤＮＦ−３；ＢＤＮＦ−２ＢおよびＢＤＮＦ−３；ＢＤＮＦ−２ＡおよびＢＤＮＦ−４；ＢＤＮＦ−２ＢおよびＢＤＮＦ−４；および、ＢＤＮＦ−１およびＢＤＮＦ−４。反応産物を電気泳動にかけ、そして放射性標識ＢＤＮＦ−５をプローブとして用いてＤＮＡ（サザン）プロットを探査し、ヒトＢＤＮＦに相当する可能性のある増幅フラグメントを同定した。詳細については本実施例の実施補遺参照。
　【００９５】おおよそ予想される分子量の位置に、プライマーとしてＢＤＮＦ−１／ＢＤＮＦ−３、ＢＤＮＦ−２Ａ／ＢＤＮＦ−３、およびＢＤＮＦ−２Ｂ／ＢＤＮＦ−３を用いた反応でＢＤＮＦ−５とハイブリッド形成するバンドが存在した。電気泳動したＢＤＮＦ−１／ＢＤＮＦ−３反応混合物に由来する、ハイブリッド形成したサザンバンドの位置のＤＮＡをゲルから切り出し、一部をとって、配列決定プライマーとしてＢＤＮＦ−１およびＢＤＮＦ−３を用いて直接配列決定し、ＢＤＮＦコード領域内のヒト遺伝子の部分配列を得た（図１）。この増幅されたＤＮＡの残りをＳｍａＩ切断ファージＭ１３ｍｐ１０にサブクローニングし、放射性標識ＢＤＮＦ−５とのハイブリッド形成に基づいて陽性サブクローンを選択した。二つの相互に無関係な、反対方向の陽性サブクローン、ＢＤＮＦ−ＰＣＲ１および２を配列決定し、ＢＤＮＦコード領域内におけるヒト遺伝子の配列を得た（図１）。
Ｂ．ＢＤＮＦヒト遺伝子をクローニングするためのＰＣＲ増幅ＤＮＡの使用増幅されハイブリッド形成したサザンバンドの位置にあるＤＮＡを放射性標識し、これを用いてファージラムダＥＭＢＬ３におけるヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。６個の陽性クローンがプラーク精製された。クローン＃３由来ＤＮＡを下記の制限酵素で別々に消化した：ＨｉｎｆＩ；ＡｌｕＩ；ＲｓａＩ；およびＮｃｏＩ／Ｓａｕ３ＡＩ。これらの酵素を選択したのは、それらがＢＤＮＦコード配列をＭ１３にクローニングするのに適した大きさのいくつかのフラグメントに切断するからである。ＢＤＮＦコード配列を含有する制限フラグメントをファージＭ１３ｍｐ１０にサブクローニングし、配列決定して、ＢＤＮＦコード領域に於けるヒト遺伝子の配列を確認した（図１）。図１はまた、前駆体および成熟（プロセシングを受けた）ヒトＢＤＮＦタンパク質の推定アミノ酸配列をも示す。図１で提案された切断部位はＮＧＦおよびブタＢＤＮＦの既知配列、およびＮＧＦおよびブタＢＤＮＦの既知アミノ酸配列における切断部位の類似性に基づく。
　【００９６】ＰＣＲ増幅フラグメントから得られたＢＤＮＦ配列（図１）、およびヒトゲノムＤＮＡクローンから得られたＢＤＮＦ配列は第１９６位の核酸が異なる。ヒトゲノムクローンは１９６位のＧの代わりにＡを有し、これによってアミノ酸６６がバリンからメチオニンに変化する。この相違は前駆体で生じ、ＢＤＮＦの生物学的活性形である成熟型では起こらない。一つの塩基対および一つのアミノ酸のこの変化は、ヒトゲノム内のＢＤＮＦ配列に於ける対立遺伝子の差異を表す可能性がある。
　【００９７】付加的なクローンの配列決定によって、図１に示すのと同一の配列が得られた。ただし、２２３位のアミノ酸はアルギニン（Ｒ）の代りにリジン（Ｋ）であり、そのコドンはＡＧＡの代わりにＡＡＡであった。この差異はヒトＢＤＮＦの生物学的に活性な成熟型に生じる。これは、この位置での代替ヒト対立遺伝子を表すのかもしれない。
Ｃ．ＣＯＳ−７細胞に於ける生物学的に活性なＢＤＮＦの発現本発明者らが得たヒトＢＤＮＦ遺伝子が、実際に生物学的に活性なＢＤＮＦをコードしていることを確認するために、その遺伝子を一時的にＣＯＳ−７細胞で発現させ、そして発現された物質を、ブタ脳から精製されたＢＤＮＦの既知性質である、培養中のニワトリ胚（１０日）後根神経節ニューロンの生存を促進する能力に関してアッセイした（Ｂａｒｄｅら、１９８２Ｔｈｅ　ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ　１：５４９）。
　【００９８】
１．ヒトＢＤＮＦ発現のためのＤＮＡ構築物の作製上記Ｂ項のように作製し、オリゴヌクレオチドＢＤＮＦ−１およびＢＤＮＦ−３を用いるＰＣＲによってヒトゲノムＤＮＡから増幅した、ヒトＢＤＮＦコード配列を含有するゲル精製ＤＮＡを、ＣＯＳ細胞発現ベクターｐＳＧ５（Ｇｒｅｅｎら、１９８８Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：３６９）に連結した。プラスミドｐＳＧ５を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、付着末端を４種すべてのデオキシリボヌクレオチドの存在下でＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで処理することにより平滑化した。次に、完全なＢＤＮＦコード配列を含有するゲル精製ＤＮＡを、末端を平滑化したｐＳＧ５に連結した。ＣＯＳ細胞内へのトランスフェクションに際して、ＳＶ４０極初期プロモーターからＢＤＮＦ前駆体タンパク質を発現できる挿入ＤＮＡの方向は、制限マッピングによって同定される。望ましい方向において、ＢＤＮＦ挿入物はＢａｍＨＩおよびＢｇ１ＩＩで消化後にベクターから分離できる。
　【００９９】２．ＣＯＳ細胞のトランスフェクションＢＤＮＦコード挿入物を有するｐＳＧ５由来ＤＮＡおよび同挿入物を有しない同ＤＮＡをアルカリ溶解および続くＣｓＣｌ密度遠心によって調製した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、上記）。製品使用説明書（ＢＲＬ）のプロトコルＣにしたがって、リポフェクチンを用いてこのプラスミドＤＮＡをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。ＢＤＮＦコード挿入物を含有しないプラスミドＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞培養物を陰性対照として使用した。
　【０１００】３．発現産物のバイオアッセイトランスフェクション２４時間後、細胞を皿から掻き取り、短時間の遠心によって収集した。細胞ペレットを氷上で、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ　ＰＭＳＦ、および０．１μＭペプスタチン含有２０ｍＭ　リン酸ナトリウム、ｐＨ６．７中での短時間の音波処理によって抽出した。各培養物からの細胞抽出物の連続希釈物を、ニワトリ胚（１０日）後根神経節ニューロンを用いて生物活性についてアッセイした（実施例３の実験補遺参照）。有意な生物活性が、ＢＤＮＦ挿入物を含有するｐＳＧ５を用いてトランスフェクションした細胞の抽出物中に検出されたが、挿入物を含有しないｐＳＧ５でトランスフェクションした細胞の抽出物では検出されなかった（図８）。これらの結果は、クローニングされた遺伝子が生物学的に活性なＢＤＮＦを発現しうることを示す。
Ｄ．Ｅ．コリに於ける成熟ヒトＢＤＮＦの発現図１に示されるヒト成熟、ＢＤＮＦ遺伝子をＥ．コリ発現ベクターに挿入し、かかるベクターをＥ．コリ宿主細胞に導入し、そして下記実施例２記載の方法にしたがって、ＮＧＦ遺伝子に代えてＢＤＮＦ遺伝子を用いることによって、ヒト成熟ＢＤＮＦを生産する遺伝子の発現を達成する。
実施例１の実験補遺１．分子生物学の方法実質的にはＳａｉｋｉら、１９８８　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７の記載にしたがってポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲ反応産物を２％アガロースゲルで電気泳動し、そしてＤＮＡ（サザン）ブロッティングのためにＺｅｔａ‐Ｂｉｎｄメンブラン（ＢｉｏＲａｄ）上に移した。適当な増幅バンドをもとのゲルから切り取り、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて末端を修復することにより、サブクローニング用に調製した。次に、平滑末端としてクローニングするか、またはプライマーに制限部位が入れてあれば適当な酵素で消化後にクローニングした。かかるフラグメントを、適当に切断しホスファターゼ処理したＭ１３ｍｐ１０ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にサブクローニングした。キナーゼ処理によってオリゴヌクレオチドを放射性標識した（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８２））。オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成条件は、６Ｘ　ＳＳＣＰ、２Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１００ｍｃｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ（非特異的競合剤として）、ｐＨ８．０とした。ハイブリッド形成の温度、およびハイブリッド形成したプロットおよびフィルター洗浄の緊縮条件は、その相対的なＧＣ含量比に基づき各オリゴヌクレオチドプローブに応じて個々に調整された。長い放射性標識ＤＮＡプローブをランダムプライミングにより調製した［Ａ．Ｐ．ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＢ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２，６（１９８３）］。かかるプローブを用いたハイブリッド形成条件は：６５℃で、５Ｘ　ＳＳＣＰ、２Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、２５０μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、ｐＨ８．０とし；０．１Ｘ　ＳＳＣＰおよび０．１％ＳＤＳ中６５℃で洗浄した。配列決定はＭ１３ベクターに於ける両方向のサブクローンから調製された一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、ジデオキシチェインターミネーター法［Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４，５４６３（１９７７）］によって行った。
実施例２：Ｅ．コリに於ける組換えＮＧＦの生産成熟型の（プロセシングされた）ヒトＮＧＦをコードする合成遺伝子をＢｒｉｔｉｓｈ　Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。この遺伝子は様々な制限部位を挿入するために行われたヒト核酸配列内での変化以外は、ＮＧＦについて報告されたヒト核酸配列（Ｕｌｌｒｉｃｈら、１９８３上記）と同一であり、これはプラスミドＢＢＧ２６内で供給される。
　【０１０１】このプラスミドでＥ．コリＤＨ５アルファ株を形質転換し、後続の操作に十分な量のプラスミドを生産した。適当な発現ベクターに挿入するためにこの合成遺伝子を修飾する目的で、以下の二つのオリゴヌクレオチドを合成した：
　【０１０２】
　【０１０３】これらオリゴヌクレオチドは５’末端で１個のＢａｍＨＩ部位を、そして３’末端で一個のＥｃｏＲＩ部位を有する。この合成ＮＧＦ遺伝子の５’末端付近に唯一のＥｃｏＲＩ部位が存在する。ＢＢＧ２６を制限酵素ＥｃｏＲＩに接触させた後、この合成オリゴヌクレオチドをＥｃｏＲＩ部位のすぐ５’側で切断されたプラスミドと連結することができ、したがってＮＧＦコード配列の５部分を置き換えることができる。コード配列の５’末端をこのように置換することによって、上流の翻訳カップラーの挿入が可能となり（上記オリゴヌクレオチド配列を参照）、またＥ．コリで好んで用いられるコドンの置換が可能となる（ｄｅＢｏｅｒおよびＫａｓｔｅｌｅｉｎ　Ｆｒｏｍ　Ｇｅｎｅｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＳｔｅｐｓＤｉｃｔａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍａｘｉｍａｌ　Ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（１９８６）ＤａｖｉｓおよびＲｅｚｎｉｋｏｆｆ編、ｐｐ．２２５−２８３，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，ＮＹ）。これらの変化はＮＧＦ配列の効率的な発現を促進するために設計される。
　【０１０４】オリゴヌクレオチドＮＧＦ−ＡおよびＮＧＦ−Ｂをキチーゼ処理し、ともにアニーリングした後、ＥｃｏＲＩ切断されたホスファターゼ処理したプラスミドＢＢＧ２６に連結し、そしてこの混合物をホスファターゼ処理した。この混合物を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、修飾されたＮＧＦコード配列を含有する約３９０ｂｐ　ＢａｍＨＩフラグメントをゲル精製した。このフラグメントを、ゲル精製されＢａｍＨＩ切断しそしてフォスファターゼ処理された二つの異なるＥ．コリ発現ベクターの各々に連結した、すなわち（１）ｐＴ５Ｔと呼ばれるＴ７ファージプロモーター系に基づくベクター；または（２）ｐＴ３ＸＩ−２と呼ばれる、トリプトファンおよびラクトースの両方で誘導されるハイブリッド「Ｔａｃ」プロモーターに基づくベクター（詳細については本実施例の実験補遺および図４および図５参照）。この結果、ｐＴ５Ｔ：ＮＧＦまたはｐＴ３ＸＩ−２：ＮＧＦのいずれかが生成した。
　【０１０５】ｐＴ５Ｔ：ＮＧＦを用いてＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。この菌株（ＳｔｕｄｉｅｒおよびＭｏｆｆａｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）１８９：１１３−１３０に記載）は、除去できない溶原ラムダバクテリオファージ上にＩＲＴＧ誘導可能なｌａｃプロモーターの制限下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する。ｐＴ５Ｔベクター内の挿入物はＴ７ファージプロモーターの制御下にあるので、これは結局挿入配列の発現をｌａｃプロモーターの制御下に置くことになり、したがって発現はイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導可能である。形質転換体を釣り上げ、増殖させ、そして３２Ｐ−標識３９０−ｂｐ　ＢａｍＨＩフラグメントとハイブリッド形成させてどの形質転換体がＮＧＦ挿入物を担持するかを判定した。８個の陽性形質転換体が選択され、増殖させ、そしてベクターＤＮＡを単離して配列決定した。８個の各々がベクター中に正しい挿入物を正しい方向で有していた。２個を別々に、１５ｍｃｇ／ｍｌテトラサイクリン含有ルリアブロス中で光学濃度（Ｏ．Ｄ．）約０．６となるまで増殖させた後、培養物を最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ添加によって誘導した。各培養物の試料を誘導後２時間から２１時間まで一定間隔で採り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファー（０．０２５％ブロモフェノールブルー、１０％グルセロール、１％β−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、０．０６２５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８）中で溶解させた。各試料を還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって電気泳動し、そしてＮＧＦの生成を正しい分子量位置にクマシーブリリアントブルー染色バンドが出現することおよびマウス顎下腺ＮＧＦ（Ｓｉｇｍａ）に対する抗体を用いたウェスタンプロット分析の両者によってモニターした。陰性対照として、誘導しない同一培養物から、およびＮＧＦ挿入物を含有しないｐＴ５Ｔベクターで形質転換した細菌の培養物から、試料を採取した。図２に示す結果は、形質転換体ｐＴ５Ｔ：ＮＧＦ−１８がプロセシングされたＮＧＦに予想される分子量位置で抗−ＮＧＦ抗血清によっても認識されるタンパク質バンドを生じることを示す（レーンの分類：ｐＴ５Ｔ：ＮＧＦ−１８　ＩＰＴＧによる誘導２，４，８，１０，および２１時間）。予想通り、ＮＧＦ挿入物を含有しないｐＴ５Ｔで形質転換された細菌（レーンの分類：ｐＴ５Ｔ　ｕ（非誘導）およびｉ（誘導））、またはＩＰＴＧの存在による誘導を行わないｐＴ５Ｔ：ＮＧＦ−１８（レーン分類：ｐＴ５Ｔ：ＮＧＦ−１８　ＩＰＴＧによる誘導０時間）では、このバンドは検出されない。
　【０１０６】ｐＴ３ＸＩ−２：ＮＧＦを用いてファージー耐性Ｅ．コリＫ−株、ＪＭ１０７を形質転換した。１３個の形質転換体をｐＴ５Ｔ：ＮＧＦ形質転換体と同様に増殖させそして３個がヒト成熟ＮＧＦタンパク質を発現することが、ｐＴ５Ｔ：ＮＧＦ形質転換体に関して上記したと同様に、細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによりクマシーブリリアントブルー染色および抗−マウスＮＧＦ抗血清による免疫染色後に判明した。
　【０１０７】Ｅ．コリＪＭ１０７に於てｐＴ３ＸＩ−２：ＮＧＦにより生産された組換えＮＧＦのアミノ酸末端アミノ酸配列によって、アミノ末端メチオニンが生産されたＮＧＦの少なくとも８５％で発現の間に除去されていたことが示された。これは、生産されたＮＧＦが、プロセシングされた成熟ヒトＮＧＦの正しいアミノ末端を有することを示している。
　【０１０８】本文記載のようにして生産されたＮＧＦが、下記実施例３記載の方法によって判定されるように、検出可能な生物活性を何ら有しないことが明らかとなった。ベクターｐＴ５Ｔ：ＮＧＦまたはベクターｐＴ３ＸＩ−２：ＮＧＦのいずれかによって生産されたタンパク質を神経成長刺激活性について調べ、そしてバキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞で生産された組換えｈβＮＧＦを対照として用いた。陽性対照は１．１ｍｇ／ｍｌの濃度で半−最大ニューロン生存を生じた。対照的に、Ｅ．コリでこれら二つのベクターから生産されたポリペプチドは約３，６００ｍｇ／ｍｌの濃度でもいずれも何ら有意な生物活性を示さなかった。
実施例２の実験補遺１．″Ｔ７プロモーター″系に基づく発現ベクター、ｐＴ５Ｔの説明（このベクターの特徴については図４参照）Ｔ７プロモーターに基づく発現ベクターｐＴ５Ｔは、実質的にはｐＪＵ１００３と同一であるが［Ｓｑｕｉｒｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：１６２９７−１６３０２］、ただしＴ７プロモーターの５′側の唯一のＢｇｌＩＩ部位とテトラサイクリン耐性遺伝子内のＣｌａＩ部位の間に短い一続きのＤＮＡが存在する。このＤＮＡの配列は以下の通りである：
　【０１０９】
　【０１１０】２．ｐＴ３ＸＩ−２の説明：ハイブリッド「Ｔａｃ」プロモーター系を用いたｐＫＫ２２３−３の修飾（このベクターの特徴については図５参照））この構築のための出発プラスミドはＰｈａｒｍａｃｉａから購入したプラスミドｐＫＫ２３３−３であった。プラスミドｐＫＫ２２３−３はテトラサイクリン耐性遺伝子の一部を担持する。この機能しない遺伝子を、プラスミドｐＢＲ３２２上に担持される完全なテトラサイクリン耐性遺伝子で置換した。プラスミドＰＫＫ２３３−３をＳｐｈＩで完全に消化しそしてＢａｍＨＩで部分消化した。４．４キロ塩基対フラグメントをゲル精製しそして以下の配列：
　【０１１１】
　【０１１２】を有する合成アダプターおよびｐＢＲ３２２（ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，カタログ番号２７−４８９１−０１）のテトラサイクリン耐性遺伝子のＣｌａＩ、ＳｐｈＩ消化物由来ＤＮＡの５３９塩基対フラグメントと混合した。生成するプラスミドをｐＣＪ１と命名した。次に、Ｍｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓより入手したＸｈｏＩリンカーをプラスミドｐＣＪ１のＰｖｕＩＩ部位に挿入しプラスミドｐＣＪＸ−１を作製した。この挿入によってプラスミドのコピー数を制御するｒｏｐ遺伝子が破壊される。ｌａｃ１遺伝子を含有するＥｃｏＲＩフラグメントをプラスミドｐＭＣ９［Ｃａｌｏｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８３），８０：３０１５−３０１９］から精製した後、以下の配列を有するＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩアダプターを用いてＸｈｏＩ部位に挿入した：
　【０１１３】
　【０１１４】次に、プラスミドｐＣＪＸ−１のＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ部位間のポリリンカー配列を以下に示すポリリンカー配列で置き換えた：
　【０１１５】
　【０１１６】かくして得られたプラスミドベクターをｐＣＪＸＩ−１と呼んだ。最後にテトラサイクリン耐性遺伝子を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ認識部位が亜硫酸水素塩変異誘発によって破壊された同様の遺伝子で置換した。次のような方法を用いてｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子を変異させた。プラスミドｐＢＲ３２２をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、次に亜硫酸水素ナトリウムで変異誘発した［ＳｈｏｒｔｌｅおよびＮａｔｈａｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７８）５：２１７０−２１７４］。変異誘発されたＤＮＡを連結して環状ＤＮＡを形成させ、次にＨｉｎｄＩＩＩで切断して変異誘発を受けなかったプラスミドをすべて線状とした。Ｅ．コリＪＭ１０９［Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ（１９８５）３３：１０３−１１９］をこのプラスミドで形質転換した後、選択培地に塗布した。プラスミドをテトラサイクリン耐性コロニーから単離し、そしてテトラサイクリン耐性遺伝子内のＨｉｎｄＩＩＩ部位の欠失に関して検査した。成功裡に変異したプラスミドをｐＴ１と命名した。同様な方法によりｐＴ１中のＢａｍＨ１部位を変異誘発し、プラスミドｐＴ２を生成させた。次にプラスミドｐＴ２を変異誘発させて、ＳａｌＩ部位を除去してプラスミドｐＴ３を作製した。変異テトラサイクリン耐性遺伝子を担持するｐＴ３のＣｌａＩ／ＢｓｍＩフラグメントを単離し、ｐＣＪＸ−１の相同フラグメントを置換するのに使用し、ｐＴ３ＸＩ−２を作製した。変異したテトラサイクリン耐性遺伝子は機能するタンパク質を従前通りコードする。
３．ｐＴ３ＸＩ−２−φ１０ＴＣ３ＦＧＦｓｙｎの形成（ＮＧＦのためのｔａｃプロモーターベクターの調製）最初に、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の「遺伝子」を合成した。この「遺伝子」はＳｏｍｍｅｒら（１９８７　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．１４１：６７）によって報告されたｂＦＧＦと同一の配列をコードするが、Ｅ．コリでよく発現される遺伝子に偏って見られるコドンを用いる。この遺伝子の構造はそのコード部分の前に、翻訳の効率的な開始を保証するための翻訳カップラー配列（Ｓｑｕｉｒｅｓら、１９８８，上記、参照）がくるようになっている。
　【０１１７】ｂＦＧＦ合成遺伝子をまずベクターＭ１３ｍｐ１８のＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入し、配列決定した。この遺伝子の構造は以下の通りである：
　【０１１８】
　【０１１９】遺伝子の一部の特徴を強調している。次にこの遺伝子をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化によって単離し、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−切断ｐＪＵ１００３（Ｓｑｕｉｅｒｓら、１９８８，上記）に挿入してｐＪＵ１００３−ｓｙｎＦＧＦを生成させた。このプラスミドをＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｂＦＧＦ遺伝子を担持するＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを単離した。このフラグメントを、下記のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩリンカーを用いて、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐＴ３ＸＩ−２に連結した：５′ＡＡＴ　ＴＣＣ　ＡＣＡ　ＡＣＧ　ＧＴＴ　ＴＣＣ　ＣＴ　３′　ＧＧ　ＴＧＴ　ＴＧＣ　ＣＡＡ　ＡＧＧ　ＧＡＧ　ＡＴＣ　５′新たに得られたプラスミドをｐＴ３ＸＩ−２−φ１０ＴＣ３ＦＧＦｓｙｎと命名する。
４．ＴａｃプロモーターベクターへのＮＧＦ発現構築物の挿入ｐＴ３ＸＩ−２−φ１０ＴＣ３ＦＧＦｓｙｎをＢａｍＨＩで切断し、その結果７．４ｋｂｐの発現ベクターが線状となり、約０．５ｋｂｐのｂＦＧＦ　ＤＮＡフラグメントが放出された。修飾されたＮＧＦコード配列を含有する３９０ｂｐ　ＢａｍＨＩフラグメントを、ゲル精製したＢａｍＨＩ切断ベクターＤＮＡフラグメントに連結し、プラスミドｐＴＸ３Ｉ−２：ＮＧＦを生成させた。
実施例３：ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群メンバーの神経栄養性タンパク質の再生Ａ．真核細胞で生産されるかまたは天然起源から精製された成熟ＮＧＦの再生本発明の一実施態様は、細菌で生産された不活性で成熟型の組換えＮＧＦを再生し、生物活性を回復させる能力に関する。これが可能であることを立証するために、真核細胞発現系で生産されるかまたは天然起源から精製された完全に生物学的に活性な成熟ＮＧＦが、変性およびジスルフィド結合の還元によってその生物活性が破壊された後で、うまく再生できるということをまず最初に確立した。この証明は二つの理由から重要である：（１）完全に変性させ還元した後で、細菌で生産された成熟ＮＧＦ（もともと不活性）、または天然起源から精製された成熟ＮＧＦ（もともと活性）が、不活性でありそして構造的に区別できないことを提起することは合理的である。これらは構造的に区別できないので、真核細胞または天然起源由来の変性および還元された成熟ＮＧＦが成功裡に再生できることは、細菌から発現された成熟ＮＧＦをも変性および還元後にやはり成功裡に再生できることを示す。
　【０１２０】（２）完全な長さを有するＮＧＦ前駆体は細菌内で、真核細胞発現系に於けると同様にタンパク分解的にプロセシングを受けて正しい成熟ＮＧＦを生成させることができない。したがって細菌では成熟ＮＧＦのコード配列を直接発現させる必要があり、完全な長さの前駆体のコード配列を発現させる必要はない。成熟ＮＧＦが真核細胞および天然起源において生ずるような完全な長さの前駆体として最初に合成される場合にのみその正しい折りたたみを生じそして生物学的な活性を発揮するであろうことは理論的には可能である。このことは、細菌で生産された成熟タンパク質がうまく再生されるあらゆる可能性を排除するものであろう。しかしながら、変性および還元された成熟ＮＧＦが、ここで立証されたように成功裡に再生されることは、適正な再生が完全な長さの前駆体によって決まるのではないことを証明している。
　【０１２１】２種類のもともとは生物学的に活性な成熟ＮＧＦを変性および還元後に再生することに成功した、すなわち（１）雄マウス顎下腺から精製された成熟（ベータ）ＮＧＦ（ＳＩＧＭＡ）および（２）欧州特許公告ＥＰ８９１１３７０９号記載の方法にしたがって真核細胞で生産された組換えヒト成熟ＮＧＦ。図３は、上記のように生産された組換えヒト成熟ＮＧＦがニワトリ胚交感神経節ニューロンの生存をＮＧＦに予想される濃度で促進することを示す（Ｇｒａｅｅｎｅ　１９７７　Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．５８：９６−１１３）。図３はまた、この生物活性が変性およびジスルフィド結合の還元後に失われることをも示している。図３はさらに、変性および還元されたタンパク質が本文記載の方法により再生された後、完全な生物活性をとり戻すことを示している。マウス顎下腺から精製された成熟βＮＧＦを用いて実質的に同様の結果が得られた。これら再生の成功は、細菌で生産された成熟ＮＧＦの再生可能性を強く示している。
　【０１２２】１．ＮＧＦ再生のプロトコルＮＧＦを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ（０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，０．０４Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４、０．０２Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）に溶解し、塩酸グァニジンを最終濃度３Ｍとなるまで添加することにより変性させた。２５℃で３０分後、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を最終濃度５．６ｍＭとなるまで添加し、そして２５℃でさらに２時間インキュベーションを続行した（５０ｍＭ　ＤＴＴもほぼ同様に良好な結果を伴って使用されている）。次に、酸化型グクタチオンを最終濃度５０ｍＭとなるまで添加し、２５℃で１０分間インキュベートした。この溶液をｐＨ調整なしの、０．２％ヒト血清アルブミン含有０．６％トリス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ／Ｍａｎｎｈｅｉｍ　６０４−２０５）で７倍に希釈した。Ｌ−システインを最終濃度２０または３０ｍＭとなるまで添加して、同様の良好な結果を得た。この再生混合物を２５℃で１６−２０時間インキュベートした後、この物質をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０濃度装置（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて濃縮し、バッファーをＰＢＳと交換した。
　【０１２３】２．再生後のＮＧＦ生物活性のアッセイ未処理の出発ＮＧＦ、３Ｍグァニジンおよび５．６ｍＭ　ＤＴＴ含有変性バッファー中に残るＮＧＦ、および変性させ次に再生させたＮＧＦを、本実施例の実験補遺に記載されるようにして、分離したＥ１１ニワトリ胚腰椎交感神経鎖神経節由来のニューロンの生存を促進する能力についてアッセイした。図３はこのバイオアッセイの結果を示す。変性および還元されたＮＧＦは４５０ｎｇ／ｍｌで半最大生物活性を示したが、出発ＮＧＦおよび再生ＮＧＦはそれぞれ０．５および１．０ｎｇ／ｍｌで半最大生物活性を示した。これらの結果は、変性および化学的還元が組換えヒト成熟ＮＧＦの生物活性を約１，０００倍低下させること、および再生過程により、バイオアッセイの実験誤差の約２倍以内で、出発ＮＧＦで見られた生物活性がこの物質に回復されることを示している。
Ｂ．Ｅ．コリ細胞で生産された成熟ヒトＮＧＦの再生上記実施例２に記載のようにしてＥ．コリ細胞で発現された成熟ＮＧＦは生物学的に不活性である。以下に記載する方法にしたがって、かかるＮＧＦを再生して生物学的に活性なＮＧＦを生成させる。
　【０１２４】１．再生のための出発物質の調製実施例２記載のＪＭ１０７中のｐＴ３Ｘ１−２：ＮＧＦ由来のＥ．コリ細胞ペースト１０ｇを、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０，５０ｍｌ中に再懸濁しそして１６，０００ｐｓｉで２回フレンチプレスにかけた。細胞抽出物を１６，０００×ｇで２０分間遠心沈澱させ、上清を捨てた。ペレットを１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０，１００ｍＭ中でホモジナイズした。再懸濁したペレットを上記のように遠心分離して上清を捨てた。このペレットを再度ｐＨ７．０の１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，１００ｍｌ中でホモジナイズした。再懸濁したペレットを上記のように遠心分離して上清を捨てた。このペレットを５０ｍｌトリス中の４Ｍ尿素、ｐＨ８．０，３０ｍｌおよび０．２％β−メルカプトエタノールでホモジナイズした。上記のように、再懸濁したペレットを遠心分離し上清を捨てた。ペレットを８Ｍ尿素を含有する２０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．０の３０ｍｌでホモジナイズした。再懸濁したペレットを上記のように遠心分離し、上清を氷上に置いた。ペレットを８Ｍ尿素を含有する２０ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ３．０の３０ｍｌ中でホモジナイズし、上記のように遠心分離し、上清を氷上に置いた。この上清は−８０℃で保存できる。
　【０１２５】２．Ｅ．コリ抽出物の再生上記の最終上清抽出物に、４分の１量の８Ｍ尿素含有１Ｍトリス、ｐＨ８．５を添加した。ジチオトレイトールを最終濃度５−１５ｍＭとなるまで添加し、その溶液を２５℃で１時間放置した。次に、シスチン（または酸化型グルタチオン）を最終濃度１５−５０ｍＭとなるまで添加し、この溶液を２５℃で１０−１５分放置した。９容の３．２−４．２Ｍ尿素含有１００ｍＭＮａ２ＨＰＯ４を添加した後、シスチン（またはグルタチオン）の最終濃度の２−３倍のシステインを加えた。この溶液を一晩４℃に保持した。これらの条件は活性ＮＧＦを還元も変性もさせない。
　【０１２６】前記条件は許容できることが判明した濃度範囲および代替試薬を提供する。以下は代表的な再生実験の一例を示す：４０ｍｌの上記Ｅ．コリ抽出物（クマシーブリリアントブルー染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのレーザーデンシトメトリーによる測定で、約６５０μｇｍ／ｍｌのＮＧＦを含有する）に１０ｍｌの８ｍＭ尿素含有１Ｍトリス、ｐＨ８．５を加えた。２ｍｌの４００ｍＭジチオトレイトールを添加しそしてこの溶液を２５℃で１時間放置した。４ｍｌの６００ｍＭ酸化型グルタチオンを添加し、この溶液を２５℃で１５分間放置し、この時点で４５０ｍｌの３．２Ｍ尿素含有１００ｍＭＮａ２ＨＰ０Ｏ，ｐＨ８．３を添加し、続いて６ｍｌの１Ｍシステインを添加した。この溶液を４℃で１６時間放置した。この溶液は以下で最終再生混合物と呼ぶ。
２ａ．Ｅ．コリで生産された成熟ヒトＮＧＦの抽出および再生に関する別法以下の方法がすでに提示された方法よりも好ましい、なぜなら結果的に再生の効率および速度が有意に高く、また正しく再生された生物学的に活性な成熟ヒトＮＧＦをより高収率で生ずるためである。
ＮＧＦ抽出ＮＧＦを生産するＥ．コリ細胞（実施例２に記載）を１０容量／重量（例えば１リッター／１００ｇｍ細胞ペースト）の１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０中で、フレンチプレスまたはゴーリンミルによって破壊した。溶解物を１６，０００×ｇで２０分間遠心分離してペレットから上清を分離した。このペレットを１０倍容の１０ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０中でホモジナイズし、上記のように遠心することによってさらに２回再抽出した。そのペレットをもう一度上記のように抽出した。洗浄されたペレットを５容量／重量の２Ｍ尿素含有２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０で抽出しそして上記のように遠心した。上清を捨てた。
　【０１２７】このペレットから、１０容量／重量の８Ｍ尿素含有２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３．０を用いてＮＧＦを抽出しそして上記のように遠心した。ペレットを最後に４容量／重量の８Ｍ尿素含有２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３．０で上記のように再抽出する間に、上清を氷上に保持した。このＣＵ（クエン酸尿素）抽出物中におけるＮＧＦは総タンパク質の約５０％であった。
　【０１２８】代表的な再生は以下のように行われた：２０ｍｌの８Ｍ尿素含有１Ｍトリス、ｐＨ８．５を、約２ｍｇ／ｍｌのＮＧＦを含有するＣＵ抽出物８０ｍｌに添加した。ジチオトレイトールまたはβ−メルカプトエタノールを最終濃度５ｍＭとなるまで添加し、この混合物を３０−６０分間２５℃に保持した。次に酸化型グルタチオンまたはシスチンを最終濃度２０ｍＭとなるまで添加し、反応混合物を１０−１５分間２５℃に保持した。次に、１９容の希釈バッファー（１００ｍＭＮａ２ＨＰＯ４，１０ｍＭエタノールアミン、ｐＨ８．３，４．６Ｍ尿素、および１５．８％ポリエチレングリコール３００）を添加した。システインまたは２−メルカプトエチルアミンを最終濃度３ｍＭとなるまで添加した。３−５サイクルの脱気およびアルゴンパージにより、最終的な再生混合物を真空下で脱気しそして精製アルゴンでパージした。この混合物をガスが侵入しないようにシールし、アルゴン下９℃で１−７日間保持した。
　【０１２９】最終再生混合物中におけるシステイン（または２−メルカプトエチルアミン）対酸化型グルタチオン（またはシスタミン）の比率を最適にすることが賢明である。最適比率（代表的には２−１０の間）は、最終反応混合物を保持する温度を包含するいくつかの要因の如何に応じて変動し得る。０−２５℃の温度で再生ＮＧＦが生じる；しかしながら、好ましい温度は４−９℃の間である。希釈工程では３ｘから８０ｘの最終希釈度でＮＧＦを生じる；しかしながら、２０ｘまたはそれ以上の希釈度が再生される総ＮＧＦの％が最も高くなる。ポリエチレングリコール２００，３００および１０００が２５％までの最終濃度で使用される場合に再生ＮＧＦを生じる；しかしながら、ポリエチレングリコール２００または３００を１５％の最終濃度で用いる場合の収率の方がより高い。エチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコールをポリエチレングリコールの代わりに使用できる；しかしながら、再生効率はポリエチレングリコール３００と比べておよそ３分の２に低下する。最終再生混合物中の尿素濃度は４から６Ｍの間をとることができるが、４．５−６．０Ｍで最高収率の再生ＮＧＦを生ずる。再生混合物におけるｐＨが８から１０までの範囲で再生が起こるが、ｐＨ１０が最も速い再生を生ずる。最終再生混合物中のリン酸バッファー濃度は、１００から３００ｍＭの間で最低に維持され、この間リン酸塩バッファー対エタノールアミンの比は１０：１に維持される。
　【０１３０】上記のようにして行われた再生の結果、代表的には当初量の約３０％以上のＮＧＦが正しく再生された生物活性型を生じた。Ｅ．コリから抽出されたＮＧＦを上記のように尿素およびメルカプトエタノール中で変性および還元し、次にＲＰ−ＨＰＬＣ（約４３％アセトニトリルで単一ピークとして出現）で精製する場合再生効率は出発ＮＧＦの６０％以上に増加する。このことは、Ｅ．コリ抽出物中の混入物が、部分的に再生効率を妨げることを示している。例えばイオン交換クロマトグラフィーのようなＲＰ−ＨＰＬＣ以外の方法による再生に先立ちＮＧＦの精製を行う場合も再生効率を高めることができる。
３．再生効率の測定最終再生混合物中のＮＧＦの総量を以下のように測定した：還元条件下で泳動したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルをクマシーブリリアントブルーで染色後、レーザーデンシトメトリースキャンを行った。このゲルに於て、一部のレーンはＮＧＦ目盛り用標準物質（実施例３で述べるバキュロウイルス、昆虫細胞−産物）を様々な濃度で含有し、一方、他の一部のレーンは最終再生混合物の一定部分を含有した。レーザーデンシトメトリーの光学濃度とＮＧＦ標準タンパク質量との間に定量的な関係を確立することによって、未知試料中のＮＧＦ量を測定できる。
　【０１３１】最終再生混合物中で正しく再生されたＮＧＦ量は以下のようにして測定した：最終再生混合物の連続希釈物を実施例３の実験補遺に記載のアッセイで、インビトロでニワトリ胚交感神経鎖ニューロンの生存促進能について検査した。同じアッセイである濃度範囲の標準昆虫細胞生産ＮＧＦもニューロン生存促進能について検査した。バイオアッセイで半最大生存を生ずる最終再生混合物の希釈度を半最大生存を生ずるのに必要な標準ＮＧＦと同一濃度の正しく再生されたＮＧＦを含有するとみなした。
　【０１３２】これらの方法を用いて、上記の実験的な再生で正しく再生されたＮＧＦ量を測定した。バイオアッセイに於ては、半最大生存を生ずるのに３．７ｎｇ／ｍｌの昆虫細胞生産ＮＧＦが必要であった。１：１５００の希釈度の最終再生混合物が半最大生存を生じたことから、その最終再生混合物は（１５００×３．７＝）５５５０ｎｇ／ｍｌの活性ＮＧＦを含有すると結論された。最終再生混合物中のＮＧＦの総量はレーザーデンシトメトリーによって５２０００ｎｇ／ｍｌと概算され、このことは約１１％の再生効率を示している。
　【０１３３】図９は標準昆虫細胞生産ＮＧＦのバイオアッセイ結果を示し、このＮＧＦは３．７ｎｇ／ｍｌで半最大生存を生じた。図１０は最終再生混合物のバイオアッセイ結果を示し、この試料は１：１５００の希釈度で半最大生存を生じた。
４．Ｅ．コリで生産された再生ＮＧＦの精製および特性決定逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて、最終再生混合物中の生物学的に活性な再生ＮＧＦの精製および特性決定を行った。ＲＰ−ＨＰＬＣ条件は以下の通りであった、すなわち溶媒Ａ＝水中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；溶媒Ｂ＝アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ（すべてＨＰＬＣ等級試薬）；カラム＝ＶｙＤｅｃ　Ｃ４＃２１４ＴＰ５４；流量＝毎分１ｍｌ。試料は時間０で注入しそして以下のプログラムで濃度勾配を展開した：
引き続いて再生試料を分析するためにカラムの目盛りづけをする目的で、天然に存在するＮＧＦおよび還元ＮＧＦの位置を決定した。％Ｂは、カラム溶離剤中の溶媒Ｂ量である。昆虫細胞により生産された天然型ＮＧＦの試料は約３４％Ｂで溶出した。変性され還元された昆虫細胞生産ＮＧＦの試料は約４３％Ｂで溶出した。このＮＧＦは、２００ｍＭトリス、ｐＨ８．５中の６Ｍ塩酸グアニジンおよび５０ｍＭジチオトレイトールに曝すことによって変性および還元された。個々のＲＰ−ＨＰＬＣカラムは、これら二つの試料が溶出する正確な％Ｂを決定するために、これら標準物質を用いた別々の目盛りを要した。
　【０１３４】上記再生実験から得られた最終再生混合物５０μｌにおいて、天然ＮＧＦの位置でタンパク質ピークが出現した（図１１Ｂ）。再生前には、この位置にタンパク質は全く溶出しなかった。１００ｎｇの天然型昆虫細胞生産ＮＧＦを別の５０μｌ試料に添加した場合、この位置のＮＧＦピークの大きさは約二倍となった（図１１Ａ）。このことにより、再生後に出現するタンパク質は天然型ＮＧＦと同じ位置で溶出することが確認され、また５０μｌの最終再生混合物中にこの物質が約１００ｎｇ存在することも示された。交感神経ニューロン生存アッセイに於て、ＲＰ−ＨＰＬＣ濃度勾配から収集したフラクションの生物活性をアッセイした場合、このピークだけが検出可能な生物活性を示した。このことにより、最終再生混合物中におけるこのタンパク質のＮＧＦとしての同一性がさらに確認される。このピークの比活性は、天然型混合細胞生産ＮＧＦで観察されたそれの範囲内であった（別の日に行われた別々のアッセイに於て、半最大生存０．５−５ｎｇ／ｍｌ）。このように、Ｅ．コリ由来の再生ＮＧＦは天然型昆虫細胞生産ＮＧＦの位置で溶出し、完全に生物学的に活性である。
　【０１３５】再生が上記実施例３．Ｂ．２ａ．におけるようにして行われる場合は、再生ＮＧＦの精製を以下のようにして行うことができる。最終再生混合物を、例えば中空繊維フィルター／濃縮器のような濃縮装置を用いて約２０倍に濃縮する。次にこの濃縮物を１０−２０倍容の尿素含有バッファーで透析する。使用するバッファーは５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０であり、これは再生ＮＧＦがこのバッファー中に可溶せでかつこのバッファー中で安定であり、そしてそのｐＨが後続の陽イオン交換クロマトグラフィーに適しているためである。透析バッファーは、透析後の最終尿素濃度が１．５−２Ｍとなるに十分な尿素を包含する。これによって、逆相ＨＰＬＣにより判定されるように、Ｅ．コリタンパク質および正しく再生されなかったＮＧＦを沈澱させることが可能となる。
　【０１３６】透析した試料を遠心して沈澱をペレットとし、次に５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中のＳ−セファロースにかける。このカラムを洗浄し、０．０５−１．５Ｍ　ＮａＣｌの直線塩濃度勾配を用いて溶出させる。ＮＧＦは逆相ＨＰＬＣによって均質となるまで精製させる。図１２は最終再生混合物の逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）タンパク質プロフィールを示す。正しく再生されたＮＧＦが主要なタンパク質ピークであり、約３７％アセトニトリルで溶出する。図１３は、濃縮および透析後ではあるがＳ−セファロースでのクロマトグラフィー前の最終再生混合物のＲＰ−ＨＰＬＣタンパク質プロフィールを示す。約４７％アセトニトリルで溶出する（図１２）再生されないＮＧＦを包含する、図１２で見られる他のタンパク質の混入が有意に減少しそして正しく再生されたＮＧＦは実質的に純粋である。図１４は、Ｓ−セファロースでのクロマトグラフィー後の試料のＲＰ−ＨＰＬＣタンパク質プロフィールを示す。ほとんどすべての混入タンパク質が除去されている。再生ＮＧＦの主要ピークのすぐ後に溶出する小ピークは、再生されたＮＧＦの単量体である。約３７％アセトニトリルで溶出する主要ピークは再生ＮＧＦの二量体である。
　【０１３７】逆相−精製されたＮＧＦのニワトリ胚交感神経細胞生存バイオアッセイに於ける比活性は、Ｅ．Ｄ．５０＝０．１７±０．０１ｎｇ／ｍｌであった。比較すると、昆虫細胞で生産されたヒト組換えＮＧＦ（実施例３記載）の比活性は、Ｅ．Ｄ．５０：０．２６±０．０２ｎｇ／ｍｌであった。このことは、Ｅ．コリで生産され、ここで記載される方法によって再生および精製された再生ＮＧＦが完全に生物学的に活性であることを証明している。
　【０１３８】Ｃ．成熟ヒトＢＤＮＦの再生上記実施例１Ｄに記載されるようにして、Ｅ．コリで生産された組換え成熟ヒトＢＤＮＦを、上記実施例３Ｂ記載の方法にしたがって再生することにより生物学的に活性なものにする。
Ｄ．成熟ＮＧＦ−３の再生下記実施例４記載のような成熟ヒトＮＧＦ−３を、上記実施例３Ｂ記載の方法にしたがって再生することにより生物学的に活性となす。
実施例３の実験補遺１．ＮＧＦおよびＢＤＮＦのバイオアッセイニワトリ胚交感神経鎖および後根神経節の培養物を前記のようにして調製した（ＣｏｌｌｉｎｓおよびＬｉｌｅ　１９８９Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５０２：９９）。簡単に説明すると、交感神経または後根神経節を、加湿環境中、３８℃で８−１１日間インキュベートされた、病原体に汚染されていない受精卵から取り出した。その神経節を、最初に１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７．２を含有し２価カチオンを含有しないハンクス平衡塩類溶液に３７℃で１０分間曝し、次に上記のように改変されたハンクス平衡塩類溶液中０．１２５％バクトトリプシン１：２５０（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）の溶液に３７℃で１２分間曝すことによって化学的に解離させた。ウシ胎児血清を最終濃度１０％となるまで添加することによってトリプシン処理を停止させた。この処理後、神経節を、１０％ウシ胎児血清および１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２を含有し炭酸水素塩を含有しないダルベッコ高グルコース改変イーグル培地からなる溶液に移し、約１０回ガラス製パストゥールピペットを通して粉砕することにより機械的に解離させた。このパストゥールピペットの開口部は予め口焼きされ、そのピペットを満たすのに２秒かかるように直径にすぼめられている。次に、解離した神経節を１００ｍｍ直径の組織培養皿内の培養培地（１０％ウシ胎児血清、４ｍＭグルタミン、６０ｍｇ／１ペニシリン−Ｇ、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２を添加したダルベッコ改変イーグル培地）に塗布して３時間おいた（培養皿当り解離神経節４０）。皿に付着する非ニューロン細胞を付着しない神経細胞から分離するために、このようにプレ塗布を行った。３時間後、付着しない神経細胞を遠心によって収集し、培養培地に再懸濁し、９６ウェルミクロタイター組織培養プレートの半分の領域に、ウェル当り１５００個の神経細胞の密度で、ウェル当り５０μｌとして塗布した。塗布の前に、そのミクロタイターウェルは１０ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．４に溶解したポリ−Ｌ−オルニチンの１ｍｇ／ｍｌ溶液に４℃で一晩曝し、蒸留水で洗浄しそして風乾しておいた。
　【０１３９】神経栄養活性に関してアッセイすべき試料の連続希釈物１０μｌを各ウェルに添加し、その皿を７．５％ＣＯ２含有加湿環境下３７℃で２０時間インキュベートした。１８時間後、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２を含有し炭酸水素塩を含まないダッベッコ高グルコース改変イーグル培地中のテトラゾリウム色素ＭＴＴの１．５ｍｇ／ｍｌ溶液を、ウェル当り１５μｌ添加し、培養物を３７℃のインキュベーターに戻して４時間置いた。次に、６．７ｍｌの１２Ｍ　ＨＣｌを１リッターのイソプロパノールに溶解した溶液７５μｌを添加し、そして各ウェルの内容物を３０回ピペットを通して粉砕して細胞を破壊し、色素を懸濁させた。自動ミクロタイターリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）を用いて、５７０ｎｍでの吸光度を各ウェルに関する６９０ｎｍの標準値と比較して測定した。何ら神経栄養性物質を加えなかったウェルの吸光度（陰性対照）を試料含有ウェルの吸光度から引算した。得られた吸光度は、各ウェル内に生存する細胞数と比較し、そして色素還元能を有する神経細胞として定義される。ｍｌ当りの栄養ユニット（ＴＵ）で表される栄養活性の濃度は、神経細胞の最大生存の５０％を生ずる希釈度と定義された。例えば、１：１００，０００希釈した場合に試料が５０％最大生存を生ずる場合、その力価は１００，０００ＴＵ／ｍｌと定義された。比活性は、ｍｌ当りの栄養ユニット数を未希釈試料のｍｌ当りのタンパク質濃度で割ることによって決定された。
実施例４：ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の新規メンバー、ＮＧＦ−３のクローニングＡ．ＮＧＦ−３のＤＮＡフラグメントを増幅するためのポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）の利用種々の種の成熟（プロセシングされた）ＮＧＦおよびブタおよびヒトのＢＤＮＦをコードする核酸配列の高度に保存された領域に基づいて、二つの部分的に縮重したオリゴヌクレオチド、ＮＮＦ−１およびＮＮＦ−３を合成した。これらをヌクレオチドの配列、および増幅フラグメントのサブクローニングを容易にするために挿入された５′制限部位を以下に示す。（Ｉ＝イノシン）
　【０１４０】
　【０１４１】ＮＮＦ−１およびＮＮＦ−３をＰＣＲ（実施例１の実験補遺参照）のプライマーとして用い、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とした。ＰＣＲ産物を３％アガロースゲルで電気泳動し、そして予想される大きさの１５０−２００ｂｐ付近の蛍光ＤＮＡバンドをゲルから切り出し、平滑末端連結によってＳｍａＩ−切断ファージＭ１３ｍｐ１０にクローニングした。生成する連結反応液をＥ．コリＴＧ１株上に塗布し、２連のリフトをとった。第一のリフトは、ＰＣＲによって得られたランダムに標識したヒトＢＤＮＦコード配列と高い緊縮条件下でハイブリッド形成した（実施例１参照）。第二のリフトは、Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｂｉｏｔｅｃｈから入手したランダムに標識したヒトＮＧＦ成熟タンパク質コード配列と高い緊縮条件下にハイブリッド形成した（実施例１参照）。いずれか一方のプローブとハイブリッド形成したプラークは、それ以上追跡しなかった。べータ−ガラクトシダーゼを生産できないことによって示される、挿入物を含有する残りすべてのプラークを配列決定した。かかるプラークの一つ内のファージ、ＮＮＦ−１８、は１３６ｂｐの増幅されたＤＮＡフラグメントをオリゴヌクレオチドＮＮＦ−１およびＮＮＦ−３の間に含有し、このフラグメントはヒトＮＧＦと５３％等しく、ヒトＢＤＮＦと４４％同一なタンパク質フラグメントをコードしていた（図７）。アミノ酸相同性の一部はＮＧＦおよびＢＤＮＦの双方に対するものであり、また一部はＮＧＦまたはＢＤＮＦの一方に対する相同性である（図７）。ＮＧＦ−３フラグメントは、ＮＧＦおよびＢＤＮＦの二つが相互に担持するのとほぼ等しい相同性をＮＧＦまたはＢＤＮＦに対して有する（図７）。図６で、このフラグメントのＤＮＡ配列に下線を付し、ここでＮＧＦおよびＢＤＮＦと比較する。これらの相同性に基づけば、このフラグメントはＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の新規メンバーの遺伝子から増幅されたと結論された。この新規遺伝子およびタンパク質をＮＧＦ−３と命名した。
　【０１４２】Ｂ．ＮＧＦ−３のヒト遺伝子をクローニングするためのＰＣＲ増幅ＤＮＡの利用上記のようにしてＰＣＲによって増幅されたＮＧＦ−３のＤＮＡフラグメントを、３２Ｐ−ｄＣＴＰの存在下ＰＣＲ増幅を行うことにより放射性標識し、そしてこれを用いてラムダＦＩＸＩＩのヒトゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログｎｏ．９４６２０３）をスクリーニングした。クローニングを繰り返すことによって、１−２×１０６個のプラークから６個の陽性クローンを精製した。制限酵素ＨｉｎｃＩＩを用いた、一陽性クローン由来のＤＮＡの部分消化物をベクターＭ１３にサブクローニングした。放射性標識ＰＣＲフラグメントとハイブリッド形成した数個のＭ１３サブクローンを上記実施例１Ｂ記載の方法にしたがって両方向から配列決定して、ヒトＮＧＦ−３の完全な核酸配列（図６）および推定アミノ酸配列（図７）を得た。
　【０１４３】
Ｃ．Ｅ．コリでの成熟ヒトＮＧＦ−３の発現上記実施例４Ｂ記載のようにして得られたヒト成熟ＮＧＦ−３遺伝子をＥ．コリ発現ベクターに挿入し、そのベクターをＥ．コリ宿主細胞に導入しそして上記実施例２記載の方法に従い、ＮＧＦ−３遺伝子をＮＧ
【図面】