(57)【要約】光学活性マンデル酸誘導体の製造方法としての、生体触媒を利用したマンデル酸誘導体のデラセミ化反応の提供。  ラセミ体のマンデル酸又はその誘導体をデラセミ化して光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法であって、マンデル酸オキシダーゼ、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換微生物を、補酵素再生系酵素の基質及び酸化型補酵素の存在下でラセミ体のマンデル酸又はその誘導体に作用させデラセミ化することを含む、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラセミ体のマンデル酸又はその誘導体をデラセミ化して光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法であって、マンデル酸オキシダーゼ、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換微生物を、補酵素再生系酵素の基質及び酸化型補酵素の存在下でラセミ体のマンデル酸又はその誘導体に作用させデラセミ化することを含む、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法であって、マンデル酸又はその誘導体が下記式（Ｉ）で表される方法：
2010098505.tif 000046
（式中Ｘは水素原子又はアルカリあるいはアルカリ土類金属を表し、Ｒはオルト位、メタ位又はパラ位が一個又は複数個置換されていることを意味し、置換基は水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜３個のアルキル基、アルコキシ基又はチオアルキル基、アミノ基、ニトロ基、メルカプト基、フェニル基、又はフェノキシ基を表す）。
【請求項２】
補酵素再生系酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１記載の光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法。
【請求項３】
形質転換微生物がマンデル酸オキシダーゼをコードする遺伝子を挿入した発現ベクター並びに（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素をコードする遺伝子を挿入した２遺伝子発現ベクターの２種類のベクターを用いて形質転換される、請求項１又は２に記載の光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法。
【請求項４】
マンデル酸オキシダーゼ、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素が微生物由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法。
【請求項５】
補酵素再生系酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法。
【請求項６】
マンデル酸オキシダーゼがシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物由来であり、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼがエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属微生物由来であり、補酵素再生系酵素がバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）微生物由来である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法。
【請求項７】
形質転換微生物が大腸菌である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法。
【請求項８】
ラセミ体のマンデル酸又はその誘導体をデラセミ化して光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、マンデル酸オキシダーゼ、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換微生物であって、マンデル酸又はその誘導体が下記式（Ｉ）で表される、形質転換微生物：
2010098505.tif 000047
（式中Ｘは水素原子又はアルカリあるいはアルカリ土類金属を表し、Ｒはオルト位、メタ位又はパラ位が一個又は複数個置換されていることを意味し、置換基は水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜３個のアルキル基、アルコキシ基又はチオアルキル基、アミノ基、ニトロ基、メルカプト基、フェニル基、又はフェノキシ基を表す）。
【請求項９】
補酵素再生系酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、請求項８記載の形質転換微生物。
【請求項１０】
形質転換微生物がマンデル酸オキシダーゼをコードする遺伝子を挿入した発現ベクター及び（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素をコードする遺伝子を挿入した２遺伝子発現ベクターの２種類のベクターを用いて形質転換された、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、請求項８又は９に記載の形質転換微生物。
【請求項１１】
マンデル酸オキシダーゼ、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素が微生物由来である、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
【請求項１２】
補酵素再生系酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
【請求項１３】
マンデル酸オキシダーゼがシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物由来であり、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼがエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属微生物由来であり、補酵素再生系酵素がバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）微生物由来である、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
【請求項１４】
大腸菌である、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品として重要な光学活性マンデル酸及びその誘導体の製造方法に関し、光学活性マンデル酸及びその誘導体の製造に関与する遺伝子を導入した微生物を用いた光学活性マンデル酸及びその誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性体は、医薬品を中心に年々その重要性を増している。光学活性体の合成法としては、（１）光学活性な原料（キラルプール）の使用、（２）ラセミ体を合成して光学分割する、（３）不斉合成の３つがあり、それぞれの特長を生かして使い分けられている。
最近の医薬品はしだいに複雑な化学構造をもつものが増加し、不斉中心も１つではなく、多いものでは４〜５個、あるいはそれ以上のものも少なくない。したがって、これらの化合物を合成するには１つの出発原料から最終製品まで順次合成を進めるのではなく、最終化合物をいくつかの成分に分割してそれぞれを別途に合成し、最後に結合して製品とする方法を採用することが効率的である。その結果、光学活性医薬中間体の需要が世界的に増加している。
生化学反応を利用して合成反応を行う触媒を総称して生体触媒とよぶ。近年、生体触媒が光学活性体合成のための触媒として利用されている。有用化合物の合成には、生体触媒として、単一の酵素から複数の酵素系、微生物の菌体、及び動植物培養細胞などが使われている。
これまでの一般的な生体触媒に加え、最近では新しい生体触媒が多数登場しはじめている。さまざまな生物から単離して得られるだけであった酵素も最近では、遺伝的に手を加えたものも現れてきた。補酵素のリサイクリングを必要とする酸化還元酵素は単離酵素ではなく、菌体を使うと、菌体内の酵素系で再生が可能であり実用的である。しかしながら、菌体には多くの酵素が存在するために、立体選択性が悪くなる場合も多い。このような場合に他の菌体の酵素の遺伝子を導入し、大量に発現させることにより、収率及び立体選択性を向上させることができる。また、補酵素再生系が弱い場合はその酵素も導入して反応速度を上昇させうる。
光学活性マンデル酸誘導体は、医薬中間体として有用である。例えば、マンデル酸のＲ体は、セファロスポリン系抗生物質「セファマンドール」の側鎖修飾剤として用いられる。また、ｏ−クロロマンデル酸のＲ体は、抗血小板剤「クロピドグレル」や抗真菌剤の原料となる。
光学活性マンデル酸誘導体を製造する方法として、以下のような方法が知られている。
（ａ）  ラセミ体の分別結晶による光学分割法（特許文献１を参照）
（ｂ）  クロマトグラフィーによる光学分割法（非特許文献１を参照）
（ｃ）  ラセミ体の一方を酸化することにより光学活性体を得る方法（特許文献２を参照）
（ｄ）  ニトリラーゼを用いる方法（特許文献３及び４を参照）
（ｅ）  ヒドロキシルニトリルリアーゼを用いる方法（特許文献５を参照）
（ｆ）  ベンゾイルギ酸誘導体の還元法（特許文献６及び７を参照）
（ｇ）  微生物を用いる方法（特許文献８を参照）
上記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の方法は、目的とする鏡像異性体を回収する一方で、不要な鏡像異性体を利用できないため、原料の半分を失う結果になる。つまり、原料を有効に利用できないため、コストを高める原因となる。不要な鏡像異性体を回収して、ラセミ化することで原料として再利用する方法も報告されているが、操作が煩雑である。上記（ｄ）の方法は、原料としてマンデロニトリル誘導体を必要とする。マンデロニトリル誘導体の合成には、シアン化ナトリウムが必要であり、そのシアン化ナトリウムは、ニトリラーゼを阻害するため、シアン化ナトリウム濃度のコントロールが必要となり、工業的な生産には適していない。上記（ｅ）の方法は、原料としてベンズアルデヒドとシアン化水素を原料とする。シアン化水素は人に対する毒性が高く、また、酵素に対する毒性も高いため、工業的な生産には適していない。また、上記（ｆ）の方法は、高い光学純度と収率でマンデル酸誘導体が得られるものの、ベンゾイルギ酸誘導体が不安定で光学活性マンデル酸誘導体より高価なことからコスト的に成立しないプロセスである。さらに、上記（ｇ）の方法においては、１種類の天然由来の微生物を用いており、長時間の培養を必要とし、酵素活性の点から高濃度の基質を用いることができず、短時間で効率的に大量の光学活性マンデル酸を製造することはできなかった。さらに、１００％の光学活性純度を達成することもできなかった。このように、従来の技術にはそれぞれ問題点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００１−７２６４４号公報
【特許文献２】特開平６−１６５６９５号公報
【特許文献３】特開平４−９９４９６号公報
【特許文献４】特開平６−２３７７８９号公報
【特許文献５】特開２００１−３５４６１６号公報
【特許文献６】特開２００４−６５０４９号公報
【特許文献７】特開２００３−１９９５９５号公報
【特許文献８】特開平６−７１９６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊａｎｕｓｚ  Ｄｅｂｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９８３，２８２，８３−８８
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、光学活性マンデル酸誘導体の製造方法として、生体触媒を利用したマンデル酸誘導体のデラセミ化反応の提供を目的とする。
本発明者らは、従来の光学活性マンデル酸及びその誘導体の製造方法の問題点を解消し、新たな光学活性マンデル酸及びその誘導体の製造方法を開発すべく鋭意検討を行った。
本発明者等は、生体触媒として、光学活性マンデル酸及びその誘導体の合成に関与する３種類の酵素遺伝子を導入し共発現させた大腸菌を用いて、３種類の酵素反応を組み合わせることにより、デラセミ化反応（ラセミ体を１００％の収率で一方の鏡像体に変換する反応）によりマンデル酸及びその誘導体をデラセミ化することができると考えた。３種類の酵素として、ラセミ体マンデル酸誘導体のうちＳ体のみを立体選択的に酸化し、ベンゾイルギ酸誘導体を生成するマンデル酸オキシダーゼ（ＭＯＸ）、補酵素ＮＡＤＨを消費してベンゾイルギ酸誘導体を立体選択的に酸化し、マンデル酸誘導体のＲ体のみを生成する（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ（（Ｒ）−ＭＤＨ）及びグルコースを酸化してグルコン酸を生成し、補酵素ＮＡＤＨを再生するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）等の補酵素再生系酵素を用いて、検討を行い上記の３種類の酵素をコードする遺伝子を導入した組換え大腸菌を用いることにより効率的にマンデル酸及びその誘導体のデラセミ化を行い、光学活性マンデル酸及びその誘導体を製造できることを見出した。本発明者等は、ＭＯＸと（Ｒ）−ＭＤＨ及びＧＤＨをコードする遺伝子を導入し、共発現させた大腸菌を「デラセミ化工場」と呼び、３段階に分けて構築した。まず、１段階目として、ＭＯＸをコードする遺伝子を導入し発現させた大腸菌である「酸化工場」を構築した。次いで、２段階目として、（Ｒ）−ＭＤＨをコードする遺伝子及びＧＤＨをコードする遺伝子を導入し共発現させた大腸菌である「還元工場」を構築した。最後に、３段階目として、上記の酸化工場と還元工場とを組み合わせてデラセミ化工場を構築し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  ラセミ体のマンデル酸又はその誘導体をデラセミ化して光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法であって、マンデル酸オキシダーゼ、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換微生物を、補酵素再生系酵素の基質及び酸化型補酵素の存在下でラセミ体のマンデル酸又はその誘導体に作用させデラセミ化することを含む、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法であって、マンデル酸又はその誘導体が下記式（Ｉ）で表される、形質転換微生物：
2010098505.tif 000002
（式中Ｘは水素原子又はアルカリあるいはアルカリ土類金属を表し、Ｒはオルト位、メタ位又はパラ位が一個又は複数個置換されていることを意味し、置換基は水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜３個のアルキル基、アルコキシ基又はチオアルキル基、アミノ基、ニトロ基、メルカプト基、フェニル基、又はフェノキシ基を表す）。
［２］酵素再生系酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、［１］の光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法。
［３］  形質転換微生物がマンデル酸オキシダーゼをコードする遺伝子を挿入した発現ベクター並びに（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素をコードする遺伝子を挿入した２遺伝子発現ベクターの２種類の発現ベクターを用いて形質転換される、［１］又は［２］の光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法。
［４］  マンデル酸オキシダーゼ、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素が微生物由来である、［１］〜［３］のいずれかの光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法。
［５］  補酵素再生系酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである、［１］〜［４］のいずれかの光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法。
［６］  マンデル酸オキシダーゼがシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物由来であり、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼがエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属微生物由来であり、補酵素再生系酵素がバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）微生物由来である、［１］〜［５］のいずれかの光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法。
［７］  形質転換微生物が大腸菌である、［１］〜［６］のいずれかの光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法。
［８］  ラセミ体のマンデル酸又はその誘導体をデラセミ化して光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、マンデル酸オキシダーゼ、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換微生物であって、マンデル酸又はその誘導体が下記式（Ｉ）で表される、形質転換微生物：
2010098505.tif 000003
（式中Ｘは水素原子又はアルカリあるいはアルカリ土類金属を表し、Ｒはオルト位、メタ位又はパラ位が一個又は複数個置換されていることを意味し、置換基は水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜３個のアルキル基、アルコキシ基又はチオアルキル基、アミノ基、ニトロ基、メルカプト基、フェニル基、又はフェノキシ基を表す）。
［９］  補酵素再生系酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、［８］の形質転換微生物。
［１０］  形質転換微生物がマンデル酸オキシダーゼをコードする遺伝子を挿入した発現ベクター及び（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素をコードする遺伝子を挿入した２遺伝子発現ベクターの２種類の発現ベクターを用いて形質転換された、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、［８］又は［９］の形質転換微生物。
［１１］  マンデル酸オキシダーゼ、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素が微生物由来である、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、［８］〜［１０］のいずれかの形質転換微生物。
［１２］  補酵素再生系酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、［８］〜［１１］のいずれかの形質転換微生物。
［１３］  マンデル酸オキシダーゼがシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物由来であり、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼがエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属微生物由来であり、補酵素再生系酵素がバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）微生物由来である、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、［８］〜［１２］のいずれかの形質転換微生物。
［１４］  大腸菌である、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、［８］〜［１３］のいずれかの形質転換微生物。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００９−０４６９９５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、デラセミ化工場によるマンデル酸誘導体のデラセミ化反応を示す図である。
図２は、酸化工場における反応を示す図である。
図３は、還元工場における反応を示す図である。
図４は、ＭＯＸの反応を示す図である。
図５は、（Ｒ）−ＭＤＨの反応を示す図である。
図６は、ＧＤＨの反応を示す図である。
図７は、ｍｏｘ遺伝子を含むｐＡＳＡ１の構造を示す図である。
図８は、ｐＡＳＡ１を用いて形質転換した大腸菌におけるＭＯＸの発現を示す図である。
図９は、酸化工場による生成物を示す図である。
図１０は、（Ｒ）−ｍｄｈ遺伝子を含むｐＥＴ３ａＲＭＤＨの構造を示す図である。
図１１は、ｐＥＴ３ａＲＭＤＨのコロニーＰＣＲの結果を示す図である。
図１２は、（Ｒ）−ｍｄｈ遺伝子におけるコドンの補正を示す図である。
図１３は、ｐＥＴ３ａＲＭＤＨを用いて形質転換した大腸菌における（Ｒ）−ＭＤＨの発現を示す図である。
図１４は、ｇｄｈ遺伝子を含むｐＡＣＹＣＧＤＨの構造を示す図である。
図１５は、ｐＡＣＹＣＧＤＨのコロニーＰＣＲの結果を示す図である。
図１６は、ｐＡＣＹＣＧＤＨを用いて形質転換した大腸菌における（Ｒ）−ＭＤＨの発現を示す図である。
図１７は、（Ｒ）−ＭＤＨとＧＤＨの２種類の共発現を示す図である。図１７Ａは２種類の発現用プラスミドによる共発現を示す図であり、図１７Ｂは１種類の発現用プラスミドによる共発現を示す図である。
図１８は、２種類の発現用プラスミドによる共発現の結果を示す図である。
図１９は、（Ｒ）−ｍｄｈ及びｇｄｈ遺伝子を含むｐＡＣＹＣＣＭＧの構造を示す図である。
図２０は、欠失変異導入部位の塩基配列を示す図である。
図２１は、ｐＡＣＹＣＣＭＧのコロニーＰＣＲの結果を示す図である。
図２２は、１種類の発現用プラスミドによる共発現の結果を示す図である。
図２３は、ＣＦＥによる反応を示す図である。
図２４は、還元工場による生成物を示す図である。
図２５は、ＭＯＸ、（ｒ）−ＭＤＨ及びＧＤＨの共発現を示す図である。
図２６は、ＭＯＸ、（ｒ）−ＭＤＨ及びＧＤＨの共発現の結果を示す図である。
図２７は、デラセミ化工場による生成物を示す図である。
図２８は、マンデル酸のデラセミ化反応の経時変化を示す図である（湿菌体０．５ｇ、基質濃度１０ｍＭ）。
図２９は、マンデル酸のデラセミ化反応の経時変化を示す図である（湿菌体０．５ｇ、基質濃度５０ｍＭ）。
図３０は、マンデル酸のデラセミ化反応の経時変化を示す図である（湿菌体０．５ｇ、基質濃度１００ｍＭ）。
図３１は、ＭＯＸの可溶化の確認の結果を示す図である。
図３２は、マンデル酸のデラセミ化反応の経時変化を示す図である（湿菌体０．５ｇ、基質濃度５００ｍＭ）。
図３３は、マンデル酸のデラセミ化反応の経時変化を示す図である（湿菌体２．５ｇ、基質濃度５００ｍＭ）。
図３４は、マンデル酸のデラセミ化反応の経時変化を示す図である（湿菌体５ｇ、基質濃度５００ｍＭ）。
図３５は、マンデル酸のデラセミ化反応の経時変化を示す図である（湿菌体１０ｇ、基質濃度３８５ｍＭ）。
図３６は、ｏ−クロロマンデル酸のデラセミ化反応の経時変化を示す図である（湿菌体０．５ｇ、基質濃度１０ｍＭ）。
図３７は、ｏ−クロロマンデル酸のデラセミ化反応の経時変化を示す図である（湿菌体０．５ｇ、基質濃度１００ｍＭ）。
図３８は、デラセミ化反応における鏡像体過剰率の経時間変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、デラセミ化反応の対象は、マンデル酸又はその誘導体である。マンデル酸の誘導体としては、以下の式Ｉで表される化合物が含まれる。
2010098505.tif 000004
（式中Ｘは水素原子又はアルカリあるいはアルカリ土類金属を表し、Ｒはオルト位、メタ位又はパラ位が一個又は複数個置換されていることを意味し、置換基は水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜３個のアルキル基、アルコキシ基又はチオアルキル基、アミノ基、ニトロ基、メルカプト基、フェニル基、又はフェノキシ基を表す）
以下の式ＩＩで表される化合物において、オルト位のＲがＨである化合物がマンデル酸であり、オルト位のＲがＣｌである化合物が０−クロロマンデル酸である。
【化２】
2010098505.tif 000005
2010098505.tif 000006
本発明における「光学活性マンデル酸又はその誘導体」とは、ある光学異性体が別の光学異性体より多く含まれるマンデル酸誘導体をいう。本発明において、好ましい光学活性マンデル酸誘導体は、５０％ｅｅ以上、好ましくは８０％ｅｅ以上、より好ましくは９０％ｅｅ以上、更に好ましくは９５％ｅｅ以上、特に好ましくは９７％ｅｅ以上の光学純度（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ  ｅｘｃｅｓｓ；ｅｅ）を有する。光学活性マンデル酸又はその誘導体の光学純度は、たとえば光学分割カラムなどを用いて確認することができる。本発明の「光学異性体」は、一般的に「光学活性体」及び「鏡像異性体」と呼ばれる場合もある。
本発明においては、微生物にマンデル酸又はその誘導体のデラセミ化に関与する３種類の酵素をコードする遺伝子を導入し、該３種類の酵素を共発現させる。
用いる３種類の酵素は、マンデル酸オキシダーゼ（ＭＯＸ）、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素である。
マンデル酸オキシダーゼは、ラセミ体のマンデル酸又はその誘導体のＳ体を立体選択的に酸化し、ベンゾイルギ酸誘導体を生成する（図２）。
ベンゾイルギ酸誘導体は上記の式（Ｉ）で表されるマンデル酸又はその誘導体に対して、以下の式（ＩＩ）で表される。
2010098505.tif 000007
（式中Ｘは水素原子又はアルカリあるいはアルカリ土類金属を表し、Ｒはオルト位、メタ位又はパラ位が一個又は複数個置換されていることを意味し、置換基は水素、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜３個のアルキル基、アルコキシ基又はチオアルキル基、アミノ基、ニトロ基、メルカプト基、フェニル基、又はフェノキシ基を表す）
マンデル酸オキシダーゼは、微生物由来のものを用いることができ、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｒｉｕｍ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドスポリディウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ミクロバテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属等に属する微生物が挙げられる。好適には、シュードモナス属微生物由来のものが用いられ、さらには、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来のものが用いられ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＡＴＣＣ１２６３３由来のものを用いることができる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＡＴＣＣ１２６３３由来のマンデル酸オキシダーゼについては、Ａｓｔｅｒｉａｎｉ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４，４３，１８８３−１８９０、Ｉｓａｂｅｌｌｅ  Ｅ．Ｌｅｈｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，３８，５８３６−５８４８、Ａｍｙ  Ｙ．Ｔｓｏｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９０，２９，９８５６−９８６２、Ｂｈａｒａｔｉ  Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，３２，１２９５９−１２９６７、Ｙａｎｇ  Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，３８（３８），１２３６７−１２３７６、Ｎａｒａｙａｎａｓａｍｉ  Ｓｕｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，４０（３３），９８７０−９８７８等に開示されている。
マンデル酸オキシダーゼ活性は、例えば、５０ｍＭトリス塩酸バッファーｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＣＰＩＰ（酸化型）、１ｍＭマンデル酸及び酵素を含む反応液を反応させ、ＤＣＰＩＰ（還元型）の増加による６００ｎｍの吸光度の上昇を測定することにより測定することができる。マンデル酸オキシダーゼの１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのマンデル酸をベンゾイルギ酸誘導体へ変換する酵素量とする。
（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼは、補酵素ＮＡＤＨを用いてベンゾイルギ酸誘導体を立体的に酸化し、マンデル酸又はマンデル酸誘導体のＲ体のみを生成する（図３）。マンデル酸オキシダーゼは、微生物由来のものを用いることができ、例えば、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｒｉｕｍ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロドスポリディウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ヤマダジマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ミクロバテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属等に属する微生物が挙げられる。好適には、エンテロコッカス属微生物由来のものが用いられ、さらには、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｓａｌｉｓ由来のものが用いられ、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｓａｌｉｓ  ＩＡＭ１００７１由来のものを用いることができる。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｓａｌｉｓ  ＩＡＭ１００７１由来の（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼについては、特開２００４−６５０４９、Ｙｕｓｕｋｅ  Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，６８（２），９４７−９５１、Ｙｕｓｕｋｅ  Ｗａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００８，７２（４），１０８７−１０９４等に開示されている。
（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ活性は、例えば、５０ｍＭトリス塩酸バッファーｐＨ７．５、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、１ｍＭマンデル酸及び酵素を含む反応液を反応させ、ＮＡＤＨの増加による３４０ｎｍの吸光度の上昇を測定することにより測定することができる。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのマンデル酸をベンゾイルギ酸誘導体へ変換する酵素量とする。
補酵素再生系酵素は、ＮＡＤＨ、ＨＡＤＰＨのような還元型の補酵素を必要とする酵素反応において、酵素反応の進行に伴い酸化型に変換されたＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ等の補酵素を還元型に変換する能力（補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素をいう。補酵素再生系酵素としては、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（図３）、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等を挙げることができる。この中でも、グルコースデヒドロゲナーゼが好ましく用いられる。
補酵素再生系酵素は微生物由来のものを用いることができ、例えば、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、チオバシラス属（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クロイッケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、リポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、モラキセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ハイホマイクロビウム属（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、アンシロバクター属（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ）等に属する微生物が挙げられる。好適には、バシラス属微生物由来のものが用いられ、さらには、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のものが用いられ、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＩＡＭ１３４８１由来のグルコースデヒドロゲナーゼを用いることができる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＩＡＭ１３４８１由来のグルコースデヒドロゲナーゼについては、Ｓ．−Ｈ．Ｂａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３，６１，３２９−３３５、Ｔａｄａｓｈｉ  Ｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，２００５，１６，１０７５−１０７８、Ｔａｄａｓｈｉ  Ｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００６，６２，６１４３−６１４９等に開示されている。
グルコースデヒドロゲナーゼ活性は、例えば、５０ｍＭトリス塩酸バッファーｐＨ７．５、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、１ｍＭ  Ｄ−グルコース及び酵素を含む反応液を反応させ、ＮＡＤＨの増加による３４０ｎｍの吸光度の上昇を測定することにより測定することができる。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのグルコースをグルコン酸へ変換する酵素量とする。補酵素再生能は、反応系にグルコース、スクロースなどの糖、有機酸、又はエタノール、イソプロパノールなどのアルコールを添加することにより増強できる。
これらの酵素をコードする遺伝子は、上記の微生物から公知の配列情報に基づいて、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法、化学的に合成する方法等の公知の方法を利用して調製することができる。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＡＴＣＣ１２６３３由来のマンデル酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１４及び１５に、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｓａｌｉｓ  ＩＡＭ１００７１由来の（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡの配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１６及び１７に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＩＡＭ１３４８１由来のグルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡの配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１８及び１９に示す。
また、配列番号１４に表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡと下記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであってマンデル酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号１６に表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡと下記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ及び配列番号１８に表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡと下記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであってグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも用いることができる。すなわち、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣとは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。あるいは、サザンブロッティング法によりニトロセルロース膜上にＤＮＡを転写、固定後、ハイブリダイゼーション緩衝液〔５０％フォルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０×デンハルツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ〕中で４２℃で一晩反応させることによりハイブリッドを形成することができるＤＮＡである。さらに、ＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、配列番号１４に表される塩基配列と少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有しており、マンデル酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号１６に表される塩基配列と少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有しており、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ及び配列番号１８に表される塩基配列と少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有しており、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも用いることができる。
本発明においては、上記の３種類の酵素をコードする遺伝子を１種類の微生物に導入し、３種類の酵素をコードする遺伝子を含む組換え微生物を作製する。
組換え微生物は、上記の酵素をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを用いて微生物を形質転換すればよい。
３種類の酵素をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入する組合せとしては以下の組合せがあり、いずれの組合せも取り得る。
（１）  ３種類の酵素をコードする遺伝子をそれぞれ、別々に３つの発現ベクターに挿入する。
（２）  ３種類の酵素をコードする遺伝子のうち、２種類の遺伝子を１つの発現ベクターに同時に挿入し（２遺伝子発現ベクター）、残りの１種類の遺伝子を別の発現ベクターに挿入する。この際、１つの発現ベクターに同時に挿入する２種類の遺伝子の組合せとして、（Ｒ）−ｍｄｈ遺伝子とｇｄｈ遺伝子、ｍｏｘ遺伝子とｇｄｈ遺伝子、及び（Ｒ）−ｍｄｈ遺伝子とｍｏｘ遺伝子の組合せをとり得る。補酵素を必要とする（Ｒ）−ＭＤＨと補酵素を再生するＧＤＨの活性がほぼ等しいことが望ましい。そこで、好ましくは（Ｒ）−ｍｄｈ遺伝子と補酵素を再生するｇｄｈ遺伝子を１つの発現ベクター中で共発現させるために、１つの発現ベクターに挿入する。
（３）  ３種類の酵素をコードする遺伝子を１つの発現ベクターに挿入する（３遺伝子発現ベクター）。
１つの発現ベクターに複数の遺伝子を挿入する際、別々のプロモーターで発現を制御してもよいし、１つのプロモーターの下流に複数の遺伝子を連結し、１つのプロモーターの制御により複数の遺伝子を発現させてもよい。好ましくは、異なるプロモーターでそれぞれの遺伝子の発現を制御する。この際、複数のマルチクローニングサイトを含む発現ベクターを用いればよい。
酵素をコードする遺伝子を挿入するための発現ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＵＣ１９，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９などのｐＵＣベクター、ｐＥＴ３ａ〜３ｄ，ｐＥＴ９ａ〜９ｄ、ｐＥＴ１１ａ〜１１ｄ、ｐＥＴｐＢＲ３２２などのｐＥＴベクター、ｐＡＣＹＣベクター、ｐＢＲ３２５などのｐＢＲベクター等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，ＹＥｐ２４，ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルス若しくはＲＮＡウイルス、ｐＣＩ−ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＺｅｏＳＶ等の動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
発現ベクターに酵素をコードする遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入して発現ベクターに連結する方法などが採用される。また、１つの発現ベクターに２種類又は３種類の酵素をコードする遺伝子を同時に挿入して、共発現させる場合、複数のマルチクローニングサイトを含む発現ベクターを用いればよい。複数のマルチクローニングサイトを含む発現ベクターとして、例えば、ｐＡＣＹＣ  Ｄｕｅｔ−１等が挙げられる。
酵素をコードする遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるように発現ベクターに組み込まれることが必要である。そこで、用いる発現ベクターには、プロモーター、上記酵素をコードする遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、イントロンの５’末端側に存在するスプライス供与部位及びイントロンの３’末端側に存在するスプライス受容部位からなるスプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを作動可能に連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
形質転換体は、酵素をコードする遺伝子を挿入した組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母が挙げられ、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはＳ１２１等の昆虫細胞が挙げられる。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ１、ＢＬ２１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法［Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を用いることができる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法［Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７５：１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｉｔｏｈ，Ｈ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３：１６３（１９８３）］等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓ１２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合、細菌のコドンの使用頻度やＧＣ含量を考慮して、コドンを補正してもよい。
上記形質転換宿主を導入した酵素をコードする遺伝子が発現可能な条件で培養することにより、宿主内で３種類の酵素が発現する。基質となるマンデル酸又はその誘導体、補酵素再生系酵素の基質及び補酵素を添加することにより、それぞれの酵素の触媒反応が起こり、デラセミ化反応が生じ、マンデル酸及びその誘導体が生成する。この際、酵素を十分発現させてから、マンデル酸又はその誘導体、補酵素再生系酵素の基質及び補酵素を添加してもよいし、酵素をコードする遺伝子を含む宿主を培養する際に、マンデル酸又はその誘導体、補酵素再生系酵素の基質及び補酵素を添加し、酵素の発現と酵素反応を同時に行わせてもよい。
酵素をコードする遺伝子を含む形質転換体宿主を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。例えば、大腸菌を培養する場合、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地等を用いればよい。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地として、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
また、３種類の酵素を含む形質転換体宿主の培養物を基質と反応させても、光学活性マンデル酸及びその誘導体を製造することができる。ここで、「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞又は細胞の破砕物のいずれをも意味する。
培養、酵素反応は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、２０〜４０℃、ｐＨ６．０〜９．０で数時間〜数日間行う。培地のｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行えばよい。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
例えば、３種類の酵素を含む微生物を湿重量で０．５ｇ添加し、マンデル酸又はその誘導体を１０ｍＭ〜１００ｍＭ添加することにより、数時間から２４時間培養することにより、すべての基質が反応し、光学純度９９％ｅｅ以上の光学活性マンデル酸又はその誘導体が収率１００％で得ることができる。
当業者ならば、適宜微生物、基質の添加量を決定し、所望のスケールで光学活性マンデル酸を製造することができる。
さらに、微生物を固定化してデラセミ化反応を行い、光学活性マンデル酸を製造することができる。
通常、酵素や微生物あるいは動植物細胞などの生体触媒を適当な不溶性の担体に保持させることを固定化とよび、固定化されたものを固定化生体触媒と称する。生体触媒を固定化する最大の利点は繰り返し使用や連続反応が可能になることである。また、適切に固定化することにより生体触媒の安定性を高めることも可能である。さらに、酵素固定化により以下のような様々な効果が期待できる。
（ｉ）  反応最適温度や熱安定性の向上
（ｉｉ）  基質親和性（Ｋｍ値）や最大反応速度（Ｖｍａｘ値）の変化
（ｉｉｉ）  反応最適ｐＨ域拡大やｐＨ安定性向上
（ｉｖ）  有機溶媒中での安定性向上や活性発現
（ｖ）  基質特異性、反応特異性、反応の位置特異性、立体特異性の変化
（ｖｉ）  補因子要求性やアロステリック制御の変化
（ｖｉｉ）  タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）による分解に対する抵抗性の向上
特に本発明は３種類の酵素を同時に導入した形質転換微生物を用いており、効率的に産生物を得ることができる。上記（ｉｉ）の具体的な効果に関して、数時間から２２時間の培養で、例えば、基質濃度５０ｍＭの場合は３時間、１００ｍＭの場合は１８時間、基質濃度３８５ｍＭの場合は２２時間で反応が完了し、光学純度９９％ｅｅ以上の光学活性マンデル酸又はその誘導体が収率１００％で得ることができる。また、３８５ｍＭという高濃度での反応が可能であり、収率：９９％、光学純度：１００％を実現することができる。従来の１種類の微生物を用いて光学活性マンデル酸を製造する方法（特開平６−７１９６号公報）においては、４０時間という長時間の培養を必要とし、基質濃度も本発明ほど高くできなかった。また、光学純度１００％を実現することもできなかった。本発明は、従来の微生物を用いる方法に対してより効率的に光学活性マンデル酸を製造することを可能にする。
微生物の固定化は、増殖を伴わない静止状態の微生物を固定化する場合と、生きた状態で増殖を示す微生物を固定化する場合に大別される。それぞれ、固定化静止菌体（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）、固定化増殖菌体（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｇｒｏｗｉｎｇ  ｃｅｌｌ）とよぶ。固定化静止菌体は、ある特定の菌体内酵素を利用する場合に適用される。微生物を生体触媒素子とするバイオリアクターの工業化では、固定化静止菌体を利用することが多い。この理由は、酵素を使用する場合は、菌体を破砕して取り出すという繁雑な操作が必要であるだけではなく、菌体内から取り出すことにより酵素の安定性が低下するためである。静止菌体の固定化には、担体結合法と包括法が用いられている。担体結合法では、担体に直接、あるいはプレポリマーやポリマーを介して保持させる方法が提案されている。包括法では、高分子ゲル中に保持する方法が用いられる。
製造した光学活性マンデル酸又はその誘導体は、一般的な分離精製方法により反応液から単離することができる。例えば、反応液から遠心分離によって宿主菌体などの不溶性物質を除去し、反応液のｐＨを酸性に調整し、酢酸エチル等の溶媒を用いて抽出し、脱水し、減圧乾固又は再結晶を行うことにより単離精製することができる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
酵素
以下の実施例で用いた酵素を表１に示す。
【表１】
2010098505.tif 000008
プライマー
以下の実施例でＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列を表２に示す。
【表２】
2010098505.tif 000009
2010098505.tif 000010
大腸菌の形質転換
また、以下の実施例において、大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）の形質転換は、ヒートショック法により行い、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換は、エレクトロポレーション法により行った。２種類の発現用プラスミドを用いる場合は、１種類の発現用プラスミドを用いて形質転換した大腸菌のエレクトロポレーション用コンピテントセルを作製し、もう１種類の発現用プラスミドを用いてさらに形質転換した。
酵素活性の測定
さらに、ＭＯＸ、（Ｒ）−ＭＤＨ及びＧＤＨの酵素活性は、以下の方法により測定した。
ＭＯＸの活性測定
１Ｕを１分間に１μｍｏｌのマンデル酸又はｏ−クロロマンデル酸をベンゾイルギ酸誘導体へ変換する酵素量と定義した。光路長１ｃｍセルに、１ｍＭ（ＲＳ）−マンデル酸又はｏ−クロロマンデル酸、１ｍＭ  ＤＣＰＩＰ（酸化型）、可溶化画分のサンプル、５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）及び蒸留水を、全量が１ｍｌとなるよう混合し、ＤＣＰＩＰ（酸化型）が吸収を有する６００ｎｍの吸光度の減少を測定した（図４）。
（Ｒ）−ＭＤＨの活性測定
１Ｕを１分間に１μｍｏｌのマンデル酸又はｏ−クロロマンデル酸をベンゾイルギ酸誘導体へ変換する酵素量と定義した。光路長１ｃｍセルに、１ｍＭ（ＲＳ）−マンデル酸又はｏ−クロロマンデル酸、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、可溶性画分のサンプル、５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）及び蒸留水を、全量が１ｍｌとなるよう混合し、ＮＡＤＨが吸収を有する３４０ｎｍの吸光度の増加を測定した（図５）。
ＧＤＨの活性測定
１Ｕを１分間に１μｍｏｌのグルコースをグルコン酸へ変換する酵素量と定義した。光路長１ｃｍセルに、１ｍＭ  Ｄ−グルコース、１ｍＭ  ＮＡＤ＋、可溶性画分のサンプル、５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）及び蒸留水を、全量が１ｍｌとなるよう混合し、ＮＡＤＨが吸収を有する３４０ｎｍの吸光度の増加を測定した（図６）。
以下の発現検討においては、培養液を８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより集菌し、上清を除いた後の湿菌体を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより洗浄した。再び上清を除き、湿菌体が１０％となるように５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、５分間×２回超音波破砕した．そして，破砕液を１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより、上清として可溶性画分（ＣＦＥ：無細胞抽出液）を、沈殿として不溶性画分を得た。これらのサンプルと破砕液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いた。また、可溶性画分のサンプルを（Ｒ）−ＭＤＨ及びＧＤＨの酵素活性測定に用いた。さらに、不溶性画分として得られた沈殿を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより洗浄した。上清を除き、不溶性画分として得られた沈殿が１０％となるように可溶化バッファーに懸濁することにより可溶化した。そして、懸濁液を１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより不溶物を除き、可溶化画分を得た。このサンプルをＭＯＸの酵素活性測定に用いた。
【実施例１】
【０００８】
酸化工場の構築
本実施例において酸化工場とは、ＭＯＸの遺伝子を導入し発現させた大腸菌を指す。デラセミ化工場構築の１段階目として酸化工場を構築し、マンデル酸のＳ選択的酸化反応を試みた（図２）。
（１）  ＭＯＸの発現
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＡＴＣＣ１２６３３由来ｍｏｘ遺伝子をベクターｐＵＣ１９のＥｃｏＲ  Ｉサイトへクローニングし、ＭＯＸの発現用プラスミドであるｐＡＳＡ１（図７）を構築した。
このｐＡＳＡ１を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＩＰＴＧを添加しての培養によりＭＯＸの発現を誘導した。また、コントロールとしてベクターｐＵＣ１９を用いて同様の実験を行った。培養終了後、タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、マンデル酸に対するＭＯＸの活性を上記方法により測定した。このとき、ＭＯＸは不溶性の膜タンパク質であるため、活性測定には不溶性画分を界面活性剤により可溶化した画分を用いた。その結果、ｐＡＳＡ１により約４０ｋＤａのＭＯＸが不溶性画分に発現し（図８）、酵素活性は湿菌体１ｇあたり２４Ｕ（コントロール：０Ｕ）であった。このようにして、ＭＯＸの発現に成功した。以下、酸化工場とは、上記の条件でＭＯＸの発現を誘導した大腸菌を指すものとする。
（２）  酸化工場による反応
次に、酸化工場を用いて、１０ｍＭ（ＲＳ）−マンデル酸、湿菌体（酸化工場）０．５ｇ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、蒸留水を、全量が５０ｍｌとなるよう混合して５００−ｍｌ三角フラスコに入れ、３０℃、１８０ｒｐｍで旋回し、マンデル酸のＳ選択的酸化反応を行った。そして、ＴＬＣにより反応の進行を分析した。このとき、基質であるマンデル酸と生成物であるベンゾイルギ酸は分離が困難なため、これらの分離を容易にするためにメチルエステル化したサンプルを分析に用いた。その結果、反応開始１７時間後には、酸化工場によりいくらかのマンデル酸がベンゾイルギ酸へ変換されたことが示唆された（図９）。そこで、ＰＬＣによりベンゾイルギ酸メチルとマンデル酸メチルを分取し、それぞれの構造を１Ｈ−ＮＭＲにより、マンデル酸メチルの光学純度をＨＰＬＣにより測定した。その結果、生成物はベンゾイルギ酸であり、残存基質は１００％ｅｅの（Ｒ）−マンデル酸であることがわかった。このようにして、酸化工場により目的のマンデル酸のＳ選択的酸化反応を進行させることに成功した。
【実施例２】
【０００９】
還元工場の構築
本実施例における還元工場とは、（Ｒ）−ＭＤＨとＧＤＨの遺伝子を導入し共発現させた大腸菌を指す。デラセミ化工場構築の２段階目として還元工場を構築し、ベンゾイルギ酸のＲ選択的還元反応を試みた（図３）。
（１）  ｐＥＴ３ａＲＭＤＨの構築
（Ｒ）−ＭＤＨの発現用プラスミドとして、ｐＥＴ３ａＲＭＤＨ（図１０）を構築した。ｐＥＴ３ａＲＭＤＨは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＩＡＭ  １００７１由来（Ｒ）−ｍｄｈ遺伝子領域をベクターｐＥＴ−３ａのＮｄｅ  Ｉ、Ｂａｍ  ＨＩサイトへクローニングすることにより構築した。
まず、表３に示す条件でＰＣＲを行い、（Ｒ）−ｍｄｈ遺伝子の５’末端から３’末端の下流１２０塩基までを増幅した。なお、ｐｒｉｍｅｒ１は、コドンを補正した（Ｒ）−ｍｄｈ遺伝子の５’末端に特異的な配列に、制限酵素Ｎｄｅ  Ｉサイトを含むアダプター配列を付加したものである。また、ｐｒｉｍｅｒ２は、（Ｒ）−ｍｄｈ遺伝子の３’末端の下流領域に特異的な配列に、制限酵素ＢａｍＨ  Ｉサイトを含むアダプター配列を付加したものである。
【表３】
2010098505.tif 000011
次に、得られたＰＣＲ産物（インサート）とベクターｐＥＴ−３ａを、表４に示す条件で制限酵素Ｎｄｅ  ＩとＢａｍＨ  Ｉにより消化した。
【表４】
2010098505.tif 000012
続いて、得られた２種類のＤＮＡ断片について、表５に示す条件でライゲーション反応を行った。
【表５】
2010098505.tif 000013
ライゲーション反応後、反応液を用いて大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換し、生育したコロニーについて以下のようにコロニーＰＣＲを行った。まず、爪楊枝を用いてプレート上のコロニーを滅菌蒸留水３０μｌに懸濁して９８℃で５分間加熱し、１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した上清を鋳型ＤＮＡ溶液とした。次に、この鋳型ＤＮＡ溶液を用いて表６に示す条件でＰＣＲを行った。
【表６】
2010098505.tif 000014
そして、目的のサイズのＤＮＡ断片が増幅したコロニー（図１１）からプラスミドを抽出し、シーケンシングにより塩基配列を解析した。なお、シーケンシングではベクターｐＥＴ−３ａに特異的なＴ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒプライマー又はＴ７  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒプライマーを用いた。
このとき、目的タンパク質の発現を最適化するために、使用頻度の低いコドン及びＧＣ含量の補正を行った。（Ｒ）−ｍｄｈ遺伝子の５’末端の２４塩基の配列を解析した。その結果、使用頻度の低いコドンが１ヶ所、ＧＣ含量の低いコドンに置換可能なコドンが１ヶ所あることがわかった（図１２）。そこで、これらのコドンを大腸菌で使用頻度が高くかつＧＣ含量の低いコドンへ補正した。
プラスミドの構築に成功したことは、コロニーＰＣＲ（図１１）とシーケンシングにより確認した。
（２）  （Ｒ）−ＭＤＨのクローニング及び発現
構築したｐＥＴ３ａＲＭＤＨを用いて大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）を形質転換し、ＩＰＴＧを添加しての培養により（Ｒ）−ＭＤＨの発現を誘導した。また、コントロールとしてベクターｐＥＴ−３ａを用いて同様の実験を行った。培養終了後、タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、マンデル酸に対する（Ｒ）−ＭＤＨの活性を上記方法により測定した。その結果、ｐＥＴ３ａＲＭＤＨにより約３５ｋＤａの（Ｒ）−ＭＤＨが発現し（図１３）、酵素活性は湿菌体１ｇあたり７４Ｕ（コントロール：０Ｕ）であった。このようにして、（Ｒ）−ＭＤＨの発現に成功した。
（３）  ｐＡＣＹＣＧＤＨの構築
まず、ＧＤＨの発現用プラスミドとして、ｐＡＣＹＣＧＤＨ（図１４）を構築した。ｐＡＣＹＣＧＤＨは，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＩＡＭ  １３４１８由来ｇｄｈ遺伝子をベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１のＭＣＳ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ）２のＮｄｅ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉサイトへクローニングすることにより構築した。
まず、表７に示す条件でＰＣＲを行い、ｇｄｈ遺伝子の５’末端から３’末端までを増幅した。なお、ｐｒｉｍｅｒ３は、ｇｄｈ遺伝子の５’末端に特異的な配列に、制限酵素Ｎｄｅ  Ｉサイトを含むアダプター配列を付加したものである。また、ｐｒｉｍｅｒ４は、ｇｄｈ遺伝子の３’末端に特異的な配列に、制限酵素Ｋｐｎ  Ｉサイトを含むアダプター配列を付加したものである。
【表７】
2010098505.tif 000015
次に、得られたＰＣＲ産物（インサート）とベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１を、表８に示す条件で制限酵素Ｎｄｅ  Ｉ次いでＫｐｎ  Ｉにより消化した。
【表８】
2010098505.tif 000016
続いて、得られた２種類のＤＮＡ断片について、表９に示す条件でライゲーション反応を行った。
【表９】
2010098505.tif 000017
ライゲーション反応後、反応液を用いて大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換し、生育したコロニーについて以下のようにコロニーＰＣＲを行った。まず、前項と同様に鋳型ＤＮＡ溶液を調製した。次に、この鋳型ＤＮＡ溶液を用いて表１０に示す条件でＰＣＲを行った。
【表１０】
2010098505.tif 000018
そして、目的のサイズのＤＮＡ断片が増幅したコロニー（図１５）からプラスミドを抽出し、シーケンシングにより塩基配列を解析した。なお、シーケンシングではベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１のＭＣＳ２に特異的なＤｕｅｔＵＰ２プライマー又はＴ７ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒプライマーを用いた。
プラスミドの構築に成功したことは、コロニーＰＣＲ（図１５）とシーケンシングにより確認した。
（４）  ＧＤＨのクローニング及び発現
ｐＡＣＹＣＧＤＨを用いて大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）を形質転換し、ＩＰＴＧを添加しての培養によりＧＤＨの発現を誘導した。また、コントロールとしてベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１を用いて同様の実験を行った。培養終了後、タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、ＧＤＨの活性を上記方法により測定した。その結果、ｐＡＣＹＣＧＤＨにより約３０ｋＤａのＧＤＨが発現し（図１６）、酵素活性は湿菌体１ｇあたり６．９Ｕ（コントロール：０Ｕ）であった。このようにして、ＧＤＨの発現に成功した。
【実施例３】
【００１０】
（Ｒ）−ＭＤＨとＧＤＨの共発現検討
（Ｒ）−ＭＤＨについては発現用プラスミドｐＥＴ３ａＲＭＤＨによる発現に成功し、また、ＧＤＨについては発現用プラスミドｐＡＣＹＣＧＤＨによる発現に成功した。そこで次に、これら２種類のタンパク質の共発現検討を行った。その方法として、２種類の発現用プラスミドによる共発現と、１種類の発現用プラスミドによる共発現を試み（図１７）、それらの結果を比較した。
（１）  ２種類の発現用プラスミドによる共発現（図１７Ａ）
２種類の発現用プラスミドによる共発現のためには、これまでに構築した（Ｒ）−ＭＤＨ発現用プラスミドｐＥＴ３ａＲＭＤＨとＧＤＨ発現用プラスミドｐＡＣＹＣＧＤＨを用いた。これらのプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）を形質転換し、ＩＰＴＧを添加しての培養により、（Ｒ）−ＭＤＨとＧＤＨの共発現を誘導した。また、コントロールとしてベクターｐＥＴ−３ａとｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１を用いて同様の実験を行った。培養終了後、タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、（Ｒ）−ＭＤＨとＧＤＨの活性をそれぞれ上記方法により測定した。その結果、ｐＥＴ３ａＲＭＤＨにより約３５ｋＤａの（Ｒ）−ＭＤＨが発現し、マンデル酸に対する酵素活性は湿菌体１ｇあたり２５０Ｕ（コントロール：０Ｕ）であった。また、ｐＡＣＹＣＧＤＨにより約３０ｋＤａのＧＤＨが発現し、酵素活性は湿菌体１ｇあたり２．８Ｕ／ｍｇ（コントロール：０Ｕ）であった（図１８）。
（２）  １種類の発現用プラスミドによる共発現（図１７Ｂ）
（ｉ）  ｐＡＣＹＣＭＧの構築
２種類の発現用プラスミドによる共発現のためには、新たに（Ｒ）−ＭＤＨとＧＤＨの共発現用プラスミドとしてｐＡＣＹＣＭＧを構築した（図１９）。ｐＡＣＹＣＧＤＨは、ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１のＭＣＳ１のＮｃｏ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉサイトへ（Ｒ）−ｍｄｈ遺伝子領域を、ＭＣＳ２のＮｄｅ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉサイトへｇｄｈ遺伝子をクローニングすることにより構築した。（Ｒ）−ＭＤＨとＧＤＨの共発現用プラスミドｐＡＣＹＣＭＧは以下のように構築した。
まず、表１１に示す条件でＰＣＲを行い、（Ｒ）−ｍｄｈ遺伝子の５’末端から３’末端の下流１２０塩基までを増幅した。なお、ｐｒｉｍｅｒ５は、コドンを補正した（Ｒ）−ｍｄｈ遺伝子の５’末端に特異的な配列に、制限酵素Ｎｃｏ  Ｉサイトを含むアダプター配列を付加したものである。また、ｐｒｉｍｅｒ６は、（Ｒ）−ｍｄｈ遺伝子の３’末端の下流領域に特異的な配列に、制限酵素Ｎｏｔ  Ｉサイトを含むアダプター配列を付加したものである。
【表１１】
2010098505.tif 000019
次に、得られたＰＣＲ産物（インサート）と、前項で構築したＧＤＨ発現用プラスミドｐＡＣＹＣＧＤＨ（ベクター）を、表１２に示す条件で制限酵素Ｎｃｏ  ＩとＮｏｔ  Ｉにより消化した。
【表１２】
2010098505.tif 000020
2010098505.tif 000021
続いて、得られた２種類のＤＮＡ断片について、表１３に示す条件でライゲーション反応を行った。
【表１３】
2010098505.tif 000022
ライゲーション反応後、反応液を用いて大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換し、生育したコロニーについて以下のようにコロニーＰＣＲを行った。まず、前項と同様に鋳型ＤＮＡ溶液を調製した。次に、この鋳型ＤＮＡ溶液を用いて表１４に示す条件でＰＣＲを行った。
【表１４】
2010098505.tif 000023
そして、目的のサイズのＤＮＡ断片が増幅したコロニー（図１９）からプラスミドを抽出し、シーケンシングにより塩基配列を解析した。なお、シーケンシングではベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１のＭＣＳ１に特異的なＡＣＹＣＤｕｅｔＵＰ１プライマー又はＤｕｅｔＤＯＷＮ１プライマーを用いた。
しかし、このようにして構築したプラスミドをそのまま発現に用いると、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳開始位置が、（Ｒ）−ｍｄｈ遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）ではなく、Ｎｃｏ  Ｉサイトに含まれる開始コドンとなり、コドンのフレームがずれてしまう。そこで、図２０に示す方法で４塩基の欠失変異を導入した。
まず、表１５に示す反応液組成と反応条件でプラスミド全体を増幅し、欠失変異を導入した。なお、ｐｒｉｍｅｒ７は、欠失変異を中央にしてその前に１１塩基、後に２３塩基ずつ付加したものである。また、ｐｒｉｍｅｒ８はｐｒｉｍｅｒ７の相補鎖である。
プラスミドの構築に成功したことは、コロニーＰＣＲ（図２１）とシーケンシングにより確認した。
【表１５】
2010098505.tif 000024
次に、反応液に制限酵素Ｄｐｎ  Ｉを加えて３７℃で１時間インキュベートし、鋳型ＤＮＡを切断した。なお、Ｄｐｎ  ＩはＡがメチル化された４塩基配列ＧＡＴＣを認識して切断する制限酵素である。鋳型ＤＮＡは大腸菌内で増殖しメチル化されているため切断されるが、ＰＣＲ産物はメチル化されていないため切断されない。
最後に、大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換し、生育したコロニーからプラスミドを抽出し、シーケンシングにより塩基配列を解析した。なお、シーケンシングでは上記と同様にＡＣＹＣＤｕｅｔＵＰ１プライマー又はＤｕｅｔＤＯＷＮ１プライマーを用いた。
（ｉｉ）  １種類の発現用プラスミドによる共発現
ｐＡＣＹＣＭＧを用いて大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）を形質転換し、ＩＰＴＧを添加しての培養により（Ｒ）−ＭＤＨとＧＤＨの共発現を誘導した。また、コントロールとしてベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１を用いて同様の実験を行った。培養終了後、タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、（Ｒ）−ＭＤＨとＧＤＨの活性をそれぞれ上記方法により測定した。その結果、ｐＡＣＹＣＭＧにより約３５ｋＤａの（Ｒ）−ＭＤＨが発現し、マンデル酸に対する酵素活性は湿菌体１ｇあたり６７Ｕ（コントロール：０Ｕ）であった。また、約３０ｋＤａのＧＤＨも発現し、酵素活性は湿菌体１ｇあたり６．７Ｕ（コントロール：０Ｕ）であった（図２２）。
（３）  上記（１）と（２）の結果の比較
（１）２種類のプラスミドによる共発現と、（２）１種類のプラスミドによる共発現の結果をまとめると、表１６のようになる。
【表１６】
2010098505.tif 000025
還元工場で補酵素を効率良く回転させ反応を進行させるためには、（Ｒ）−ＭＤＨ活性とＧＤＨ活性が同程度であることが望ましい。表１６より、どちらの方法でも（Ｒ）−ＭＤＨ活性よりＧＤＨ活性の方が低いが、その差は（１）より（２）の方が小さいことがわかる。また、実際に、（１）と（２）で調製した可溶性画分（ＣＦＥ：無細胞抽出液）を用いてベンゾイルギ酸のＲ選択的還元反応を試み、ＴＬＣにより反応の進行を分析した結果、反応開始１５時間後において、（１）では基質が残っているが、（２）では反応が十分に進行していることが示唆された（図２３）。これらの結果より、（Ｒ）−ＭＤＨとＧＤＨの共発現には、（２）の方法を採用することとした。以下、還元工場とは、１種類の発現用プラスミドｐＡＣＹＣＭＧにより上記の条件で（Ｒ）−ＭＤＨとＧＤＨの共発現を誘導した大腸菌を指すものとする。
ここで、発現量の差について考察する。表１６より、（１）では（Ｒ）−ＭＤＨとＧＤＨの発現量にかなり差があるが、（２）ではほとんど差がないことがわかる。これは、発現用プラスミドに用いたベクターのコピー数と関係していると考えられる。まず、（１）では（Ｒ）−ＭＤＨとＧＤＨとで発現用プラスミドが異なり、発現用プラスミドに用いたベクターのコピー数は、ＧＤＨのｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１よりも（Ｒ）−ＭＤＨのｐＥＴ−３ａの方が多い（表１６）。そのため、ＧＤＨよりも（Ｒ）−ＭＤＨの方が優先的に発現し、発現量にかなり差が出たと考えられる。また、（２）では（Ｒ）−ＭＤＨとＧＤＨの発現用プラスミドは同じものである。そのため、発現量にほとんど差が出なかったと考えられる。
【実施例４】
【００１１】
還元工場による反応
還元工場を用いて、１０ｍＭベンゾイルギ酸、２０ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．１ｍＭ  ＮＡＤＨ、湿菌体（還元工場）０．５ｇ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）及び蒸留水を、全量が５０ｍｌとなるよう混合して５００−ｍｌ三角フラスコに入れ、３０℃、１８０ｒｐｍで旋回することによりベンゾイルギ酸のＲ選択的還元反応を試みた。このとき、大腸菌内のＮＡＤＨにより反応は進行すると考えられるが、反応を促進させるため、文献（Ｔａｄａｓｈｉ  Ｅｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，２００５，１６，１０７５−１０７８：Ｔａｄａｓｈｉ  Ｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００６，６２，６１４３−６１４９）を参考に触媒量のＮＡＤＨを添加することとした。この文献に記載の研究では、カルボニル還元酵素とＧＤＨの遺伝子を導入し共発現させた大腸菌によるケトンの不斉還元が達成されたが、触媒量の補酵素の添加により反応が促進されたことが示されている。ＴＬＣにより反応の進行を分析した結果、反応開始１７時間後には、還元工場によりすべてのベンゾイルギ酸がマンデル酸に変換されたことが示唆された（図２４）。そこで、ＰＬＣによりマンデル酸メチルを分取し、構造を１Ｈ−ＮＭＲにより、光学純度をＨＰＬＣにより測定した。その結果、生成物は１００％ｅｅの（Ｒ）−マンデル酸であることがわかった。このようにして、還元工場により目的のベンゾイルギ酸のＲ選択的還元反応を進行させることに成功した。
【実施例５】
【００１２】
デラセミ化工場の構築
デラセミ化工場とは、ＭＯＸと（Ｒ）−ＭＤＨ、ＧＤＨの遺伝子を導入し共発現させた大腸菌を指す。デラセミ化工場構築の３段階目として、酸化工場と還元工場を組み合わせてデラセミ化工場を構築し、マンデル酸のデラセミ化反応を試みた（図１）。
（１）  ＭＯＸと（Ｒ）−ＭＤＨ，ＧＤＨの共発現
ＭＯＸについては、発現用プラスミドｐＡＳＡ１による発現に成功した。また、（Ｒ）−ＭＤＨとＧＤＨについては、共発現用プラスミドｐＡＣＹＣＭＧによる共発現に成功した。そこで次に、これらを組み合わせて、２種類の発現用プラスミドによる３種類のタンパク質の共発現検討を行った（図２５）。
これまでに構築したＭＯＸ発現用プラスミドｐＡＳＡ１と（Ｒ）−ＭＤＨとＧＤＨの共発現用プラスミドｐＡＣＹＣＭＧを用いて大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）を形質転換し、ＩＰＴＧを添加しての培養によりＭＯＸと（Ｒ）−ＭＤＨ、ＧＤＨの共発現を誘導した。また、コントロールとしてベクターｐＥＴ−３ａとｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１を用いて同様の実験を行った。培養終了後、タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、ＭＯＸと（Ｒ）−ＭＤＨ、ＧＤＨの活性をそれぞれ上記方法により測定した。その結果、ｐＡＳＡ１により約４０ｋＤａのＭＯＸが不溶性画分に発現し、酵素活性は湿菌体１ｇあたり９．９Ｕ（コントロール：０Ｕ）であった。また、ｐＡＣＹＣＭＧにより約３５ｋＤａの（Ｒ）−ＭＤＨが発現し、マンデル酸に対する酵素活性は湿菌体１ｇあたり２９０Ｕ（コントロール：０Ｕ／ｍｇ）であった。また、約３０ｋＤａのＧＤＨも発現し、酵素活性は湿菌体１ｇあたり１００Ｕ（コントロール：０Ｕ）であった（図２６）。このようにして、ＭＯＸと（Ｒ）−ＭＤＨ、ＧＤＨの共発現に成功した。以下、デラセミ化工場とは、上記の条件でＭＯＸと（Ｒ）−ＭＤＨ、ＧＤＨの共発現を誘導した大腸菌を指すものとする。
（２）  デラセミ化工場による反応
デラセミ化工場を用いて、１０ｍＭ（ＲＳ）−マンデル酸、２０ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．１ｍＭ  ＮＡＤＨ、湿菌体（デラセミ化工場）０．５ｇ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）及び蒸留水を、全量が５０ｍｌとなるよう混合して５００−ｍｌ三角フラスコに入れ、３０℃、１８０ｒｐｍで旋回することによりマンデル酸のデラセミ化反応を試みた。ＴＬＣにより反応の進行を分析した結果、反応開始１７時間後には、マンデル酸のみが検出され、ベンゾイルギ酸は検出されなかった（図２７）。マンデル酸は基質と生成物を兼ねており、また、ベンゾイルギ酸は中間体であることから、２つの可能性が示唆された。１つは、反応が全く進行しなかったという可能性である。もう１つは、１段階目の酸化反応で生成したすべてのベンゾイルギ酸が、２段階目の還元反応でマンデル酸に変換されたという可能性である。これを検証するために、ＰＬＣによりマンデル酸メチルを分取し、構造を１Ｈ−ＮＭＲにより、光学純度をＨＰＬＣにより測定した。その結果、生成物は１００％ｅｅ（コントロール：０％ｅｅ）の（Ｒ）−マンデル酸であることがわかった。すなわち、（ＲＳ）−マンデル酸のうちすべての（Ｓ）−マンデル酸が（Ｒ）−マンデル酸へ変換されたということである。このようにして、デラセミ化工場により目的のマンデル酸のデラセミ化反応を進行させることに成功した。
（３）  デラセミ化工場による反応の経時変化
デラセミ化工場によるマンデル酸のデラセミ化反応の経時変化を測定した。表１７に示した組成の反応液を５００−ｍｌ三角フラスコに入れ、３０℃、１８０ｒｐｍで旋回した。
【表１７】
2010098505.tif 000026
湿菌体０．５ｇを用いて基質濃度１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭにて反応を試み、反応中のマンデル酸とベンゾイルギ酸の収率、及びマンデル酸の光学純度をＨＰＬＣにより測定した（図２８〜３０）。なお、湿菌体１ｇは２００ｍｌ培養分に相当する。図２８〜３０より、基質濃度１０ｍＭと５０ｍＭでは約３時間、１００ｍＭでは約１８時間で反応が終了し、すべての基質濃度でマンデル酸の収率は９９％以上、光学純度は１００％ｅｅに達したことがわかる。しかし、経時変化を示すには、基質濃度１０ｍＭと５０ｍＭではデータ数が不十分である。そこで、データ数が十分な１００ｍＭでの経時変化について考察する。はじめの３時間で、マンデル酸の収率は最小値の６９％、ベンゾイルギ酸の収率は最大値の２８％、マンデル酸の光学純度は最大値の１００％ｅｅとなった。そして、その後の１５時間で、マンデル酸の収率は１００％、ベンゾイルギ酸の収率は１％となり、マンデル酸の光学純度は１００％ｅｅのまま変化しなかった。このことから、はじめの３時間は１段階目の酸化反応の方が２段階目の還元反応よりも速い速度で進行してベンゾイルギ酸が蓄積し、その後の１５時間は還元反応のみが進行したことがわかる。したがって、還元反応が律速段階であるといえる。その原因として、湿菌体中においては、酸化反応に関わるＭＯＸの活性が、還元反応に関わる（Ｒ）−ＭＤＨやＧＤＨの活性よりも高いということが考えられる。しかし、前述のとおり、デラセミ化工場の湿菌体１ｇあたりの酵素活性はＭＯＸが９．９Ｕ、（Ｒ）−ＭＤＨが２９０Ｕ、ＧＤＨが１００Ｕであり、この考えと矛盾しているようにみえる。ここで、活性測定に用いたサンプルについて考慮すると、以下のことが考えられる。まず、膜タンパク質であるＭＯＸについては、可溶化画分のサンプルを用いたため、２つの理由で活性が湿菌体中よりも低下した可能性がある。１つ目の理由は酵素量の減少である。ＭＯＸの可溶化をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認したところ、可溶化画分だけでなく沈殿にも含まれており、すべてが可溶化されたわけではないことがわかった（図３１）。２つ目の理由は酵素活性の低下である。ＭＯＸの可溶化は界面活性剤を用いて変性させることにより行ったため、膜結合部位だけでなく活性部位のコンフォメーションも変化して活性が低下した可能性がある。このように、湿菌体中における膜タンパク質の活性を正確に測定することは難しい。一方、細胞質タンパク質である（Ｒ）−ＭＤＨとＧＤＨについては、可溶性画分のサンプルを用いたため、活性は湿菌体中とほぼ同じであると考えられる。これらのことから、湿菌体中においては、実際には酸化反応に関わるＭＯＸの活性が、還元反応に関わる（Ｒ）−ＭＤＨやＧＤＨの活性よりも高い可能性が高い。さらに、（Ｒ）−ＭＤＨとＧＤＨの活性を比較すると、還元反応の律速酵素はＧＤＨであると考えられる。
【実施例６】
【００１３】
デラセミ化工場の利用
上記実施例により構築したデラセミ化工場をより利用価値の高いものとするために、次に、高基質濃度における反応や固定化静止菌体による反応、ｏ−クロロマンデル酸のデラセミ化反応に利用することを試みた。
（１）  高基質濃度における反応
デラセミ化工場によるマンデル酸のデラセミ化反応を、基質濃度５００ｍＭにて十分に進行させることを目標とした。そのためにまず、上記実施例と同様に湿菌体０．５ｇを用いて反応を試み、経時変化を測定した（図３２）。
表１８に示した組成の反応液を５００−ｍｌ三角フラスコに入れ、３０℃、１８０ｒｐｍで旋回した。
【表１８】
2010098505.tif 000027
2010098505.tif 000028
その結果、約３０時間後には反応が停止し、マンデル酸の収率は７２％、光学純度は５５％ｅｅに留まった。そこで次に、反応速度を増加させるために、湿菌体量を増加させることとした。湿菌体量を５倍の２．５ｇ、１０倍の５ｇとして反応を試み、経時変化を測定した（図３３及び図３４）。その結果、湿菌体量を５倍にするとマンデル酸の収率は７６％、光学純度は７７％まで上昇したが、湿菌体量をそれ以上増加させてもマンデル酸の収率と光学純度は上昇しなかった。これは、一般的な酵素の性質によるものと考えられる。基質濃度を大過剰に保った場合、酵素濃度が低い間は反応速度が酵素濃度に比例するが、酵素濃度が高くなると反応速度は一定値へと漸近していく。また、反応が途中で停止してしまった原因として、３種類の酵素それぞれの基質阻害や生成物阻害、失活などの影響が複雑に絡み合っていることが考えられる。したがって、さらなる考察をするためには、これらの事柄について詳細に解析する必要がある。このように、基質濃度５００ｍＭでは反応を十分に進行させることができなかった。そこで最後に、基質濃度３８５ｍＭにて湿菌体１０ｇを用いて反応を試み、経時変化を測定した（図３５）。その結果、約２２時間で反応が終了し、マンデル酸の収率は９９％以上、光学純度は１００％ｅｅに達し、ベンゾイルギ酸の収率は５％に留まった。このようにして、デラセミ化工場によるマンデル酸のデラセミ化反応を、基質濃度３８５ｍＭにて十分に進行させることに成功した。なお、基質濃度３８５ｍＭは５９ｇ／ｌに相当する。
（２）  ｏ−クロロマンデル酸のデラセミ化反応
デラセミ化工場によるｏ−クロロマンデル酸のデラセミ化反応の経時変化を測定した。湿菌体０．５ｇを用いて基質濃度１０ｍＭ、１００ｍＭにて反応を試み、反応中のｏ−クロロマンデル酸の収率と光学純度をＨＰＬＣにより測定した（図３６及び３７）。その結果、基質濃度１０ｍＭでは約４時間、１００ｍＭでは約２１時間で反応が終了し、どちらの基質濃度でもｏ−クロロマンデル酸の収率は１００％、光学純度は９９％ｅｅ以上に達した。反応終了後、ＰＬＣによりｏ−クロロマンデル酸を分取し、構造を１Ｈ−ＮＭＲにより、光学純度をＨＰＬＣにより測定した。その結果、生成物は確かに９９％ｅｅ以上のｏ−クロロ−（Ｒ）−マンデル酸であることがわかった。このようにして、デラセミ化工場によるｏ−クロロマンデル酸のデラセミ化反応を、基質濃度１００ｍＭにて十分に進行させることに成功した。なお、基質濃度１００ｍＭは１９ｇ／ｌに相当する。
【実施例７】
【００１４】
２種類の大腸菌（酸化工場と還元工場）によるマンデル酸のデラセミ化反応
上記方法にて２種類の大腸菌（酸化工場と還元工場）を調製した。次に、１０ｍＭ（ＲＳ）−マンデル酸、２０ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．１ｍＭ  ＮＡＤＨ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、湿菌体（酸化工場と還元工場）各０．５ｇ及び蒸留水を全量が５０ｍｌとなるよう混合し、５００ｍｌ−三角フラスコ中に反応液を調製した。そして、３０℃、１８０ｒｐｍで旋回して反応させ、上記方法によりマンデル酸の鏡像体過剰率の経時変化を測定した。
結果を図３８に示す。図３８に示すように、反応開始４時間後には鏡像体過剰率は１００％ｅｅに達した。しかし、定量はしていないが、１種類の大腸菌（デラセミ化工場）によるデラセミ化反応の場合と異なり、８時間経過しても中間体であるベンゾイルギ酸が微量残存しており、これは２２時間経過しても変わらなかった。
以上のように、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＩＡＭ  １００７１由来（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼとＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＩＡＭ  １３４１８由来グルコースデヒドロゲナーゼの共発現用プラスミドとして、ｐＡＣＹＣＭＧを構築した。ｐＡＣＹＣＭＧとＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＡＴＣＣ  １２６３３由来マンデル酸オキシダーゼの発現用プラスミドであるｐＡＳＡを用いて大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）を形質転換し、３種類の酵素を共発現させた。この大腸菌を用いてマンデル酸誘導体のデラセミ化反応を行った。その結果、基質がマンデル酸の場合は、基質濃度５９ｇ／ｌにて収率９２％で光学純度１００％ｅｅのＲ体が得られた。さらに、基質がｏ−クロロマンデル酸の場合は基質濃度１９ｇ／ｌにて収率１００％で光学純度１００％ｅｅのＲ体が得られた。このようにして、マンデル酸誘導体のデラセミ化反応の開発に成功した。
【産業上の利用可能性】
【００１５】
本発明の方法は、従来の技術と比較して画期的な２つの特徴を有する。第１の特徴は、コストが低い点である。デラセミ化反応では、安価なラセミ体を原料とし、さらに、不要な鏡像異性体のみをすべて目的とする鏡像異性体に変換するため、原料を有効に利用できる。また、補酵素再生系を導入しているため、高価な補酵素ＮＡＤＨをリサイクルすることができる。第２の特徴は、生体触媒を利用するため安全な点である。
【配列表フリーテキスト】
【００１６】
配列番号１〜１３  プライマー
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
2010098505.tif 000049
【図３】
2010098505.tif 000050
【図４】
2010098505.tif 000051
【図５】
2010098505.tif 000052
【図６】
2010098505.tif 000053
【図７】
2010098505.tif 000054
【図１０】
2010098505.tif 000055
【図１２】
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【図１４】
2010098505.tif 000057
【図１９】
2010098505.tif 000058
【図２０】
2010098505.tif 000059
【図２８】
2010098505.tif 000060
【図２９】
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【図３０】
2010098505.tif 000062
【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
2010098505.tif 000072
【図１３】
2010098505.tif 000073
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図３１】
2010098505.tif 000085
【手続補正書】
【提出日】平成22年12月3日(2010.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラセミ体のマンデル酸又はその誘導体をデラセミ化して光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法であって、マンデル酸オキシダーゼ、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換微生物であって、マンデル酸オキシダーゼをコードする遺伝子を挿入した発現ベクター並びに（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素をコードする遺伝子を挿入した２遺伝子発現ベクターの２種類のベクターを用いて形質転換された形質転換微生物を、補酵素再生系酵素の基質及び酸化型補酵素の存在下でラセミ体のマンデル酸又はその誘導体に作用させデラセミ化することを含む、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法であって、マンデル酸又はその誘導体が下記式（Ｉ）で表される方法：
2010098505.tif 000086
（式中Ｘは水素原子又はアルカリあるいはアルカリ土類金属を表し、Ｒはオルト位、メタ位又はパラ位が一個又は複数個置換されていることを意味し、置換基は水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜３個のアルキル基、アルコキシ基又はチオアルキル基、アミノ基、ニトロ基、メルカプト基、フェニル基、又はフェノキシ基を表す）。
【請求項２】
補酵素再生系酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１記載の光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
マンデル酸オキシダーゼ、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素が微生物由来である、請求項１又は２に記載の光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法。
【請求項５】
補酵素再生系酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項１、２及び４のいずれか１項に記載の光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法。
【請求項６】
マンデル酸オキシダーゼがシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物由来であり、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼがエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属微生物由来であり、補酵素再生系酵素がバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）微生物由来である、請求項１、２、４及び５のいずれか１項に記載の光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法。
【請求項７】
形質転換微生物が大腸菌である、請求項１、２及び４〜６のいずれか１項に記載の光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造する方法。
【請求項８】
ラセミ体のマンデル酸又はその誘導体をデラセミ化して光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、マンデル酸オキシダーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクター並びに（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素をコードする遺伝子を含む２遺伝子発現ベクターの２種類のベクターを含む形質転換微生物であって、マンデル酸又はその誘導体が下記式（Ｉ）で表される、形質転換微生物：
2010098505.tif 000087
（式中Ｘは水素原子又はアルカリあるいはアルカリ土類金属を表し、Ｒはオルト位、メタ位又はパラ位が一個又は複数個置換されていることを意味し、置換基は水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜３個のアルキル基、アルコキシ基又はチオアルキル基、アミノ基、ニトロ基、メルカプト基、フェニル基、又はフェノキシ基を表す）。
【請求項９】
補酵素再生系酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、請求項８記載の形質転換微生物。
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
マンデル酸オキシダーゼ、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素が微生物由来である、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、請求項８又は９に記載の形質転換微生物。
【請求項１２】
補酵素再生系酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、請求項８、９及び１１のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
【請求項１３】
マンデル酸オキシダーゼがシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物由来であり、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼがエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属微生物由来であり、補酵素再生系酵素がバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）微生物由来である、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、請求項８、９、１１及び１２のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
【請求項１４】
大腸菌である、光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、請求項８、９及び１１〜１３のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
【請求項１５】
ラセミ体のマンデル酸又はその誘導体をデラセミ化して光学活性マンデル酸又はその誘導体を製造するための、形質転換微生物を製造する方法であって、
マンデル酸オキシダーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクター並びに（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素をコードする遺伝子を含む２遺伝子発現ベクターを製造する工程、並びに
マンデル酸オキシダーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクター並びに（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素をコードする遺伝子を含む２遺伝子発現ベクターを用いて、微生物を形質転換する工程、
とを含む形質転換微生物を製造する方法。
【請求項１６】
補酵素再生系酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１５記載の形質転換微生物を製造する方法。
【請求項１７】
マンデル酸オキシダーゼ、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼ及び補酵素再生系酵素が微生物由来である、請求項１５又は１６に記載の形質転換微生物を製造する方法。
【請求項１８】
補酵素再生系酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の形質転換微生物を製造する方法。
【請求項１９】
マンデル酸オキシダーゼがシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物由来であり、（Ｒ）−マンデル酸デヒドロゲナーゼがエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属微生物由来であり、補酵素再生系酵素がバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）微生物由来である、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の形質転換微生物を製造する方法。
【請求項２０】
微生物が大腸菌である、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の形質転換微生物を製造する方法。
【国際調査報告】
2010098505.tif 000088
2010098505.tif 000089
2010098505.tif 000090
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