(57)【要約】【課題】  少量の有機溶媒を用いてコンピュータによる自動制御により、迅速かつ効率的に多種・多量のリポソームを調製する装置等を提供すること。【解決手段】  円筒状の反応容器２と、偏心モータ３と、ヒータ４と、真空ポンプ１０と、有機溶媒を反応空間に送液するシリンジポンプＳＰ３と、水溶液を反応空間に送液するシリンジポンプＳＰ４と、超音波処理装置６と、各機構を所定のプログラムに従って自動制御するコンピュータ１５を備えた多機能リポソーム自動製造装置１によって達成される。【選択図】          図１
2010044399.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構成を備えた多機能リポソーム自動製造装置；
円筒状の反応容器と、
この反応容器の反応空間に貯留された溶液に渦流を発生させる偏心モータと、
前記反応容器を所定の温度とするヒータと、
前記反応容器に設けられ前記反応空間に水溶液を導入可能な水溶液ラインと、
前記水溶液ラインの他端に設けられて前記水溶液を貯留しておく第１ボトルと、
前記第１ボトル内の水溶液を前記水溶液ラインを経由して前記反応空間に移動させる第１ポンプと、
前記反応容器に設けられ前記反応空間内に不活性ガスを導入可能な不活性ガスラインと、
前記反応空間内を減圧する減圧ラインと、
この減圧ラインを通じて前記反応空間内を減圧する真空ポンプと、
前記反応容器に設けられ前記反応空間に脂質を溶解させた有機溶媒を導入可能な脂質ラインと、
前記脂質ラインの他端に設けられて前記有機溶媒を貯留しておく第２ボトルと、
前記第２ボトル内の有機溶媒を前記脂質ラインを経由して前記反応空間に移動させる第２ポンプと、
前記有機溶媒を回収する有機溶媒回収装置と、
前記偏心モータとヒータと第１ポンプと第２ポンプとを制御可能なコンピュータとを備えており、
前記コンピュータによる制御により、前記不活性ガスを前記反応容器内に導入し、前記偏心モータを駆動させ前記反応空間に貯留された脂質を溶解させた有機溶媒に渦流を発生させた状態で、前記反応空間を減圧させて前記有機溶媒を前記反応空間から気化させて前記有機溶媒回収装置によって回収し、前記反応容器の内壁に脂質の薄膜を形成させた後、前記反応空間に不活性ガスを導入した状態で、前記反応容器内に水溶液を導入し前記偏心モータを駆動させて渦流を発生させて、前記脂質薄膜と前記水溶液とでリポソームを作製する。
【請求項２】
請求項１に記載の多機能リポソーム自動製造装置であって；
前記水溶液ラインにおいて、前記反応容器とは逆側の端部では複数のラインに分岐されており、それら各ラインの端部には、水を主成分とする溶媒を貯留可能な水系ボトルと、
この水系ボトル内の溶媒を前記水溶液ラインを通して前記反応空間内に移動させる水系ポンプとが設けられており、
前記各水系ポンプは前記コンピュータによって制御可能とされており、
前記脂質ラインにおいて、前記反応容器とは逆側の端部では複数のラインに分岐されており、それら各ラインの端部には、有機溶媒を主成分とする溶媒を貯留可能な有機系ボトルと、
この有機系ボトル内の溶媒を前記脂質ラインを通して前記反応空間内に移動させる有機系ポンプとが設けられており、
前記各有機系ポンプは前記コンピュータによって制御可能である。
【請求項３】
請求項１または２に記載の多機能リポソーム自動製造装置であって；
前記反応空間内に貯留された水溶液を吸引して移動可能な溶液移動ラインと、前記水溶液を吸引すると共に前記コンピュータによって制御される移動用ポンプとが設けられており、
前記溶液移動ラインの他端には、前記水溶液に超音波を照射すると共に前記コンピュータによって制御される超音波処理装置が設けられている。
【請求項４】
請求項１または２に記載の多機能リポソーム自動製造装置を用いてリポソームを製造する方法であって、下記工程を備えたことを特徴とするリポソーム製造方法、
（１）反応容器内部の反応空間に不活性ガスを導入し、前記反応空間内において前記反応空間に貯留した脂質を溶解させた有機溶媒に渦流を発生させながら、前記反応空間内を減圧させて前記有機溶媒を前記反応空間から気化させて前記反応容器の内壁に脂質の薄膜を調製する薄膜調製工程、
（２）前記反応空間に不活性ガスを導入し、水性液体を脂質の薄膜に加えて、前記反応空間内においてこの水性液体に渦流を発生させて第１リポソームを調製する第１リポソーム調製工程。
【請求項５】
請求項３に記載の多機能リポソーム自動製造装置を用いてリポソームを製造する方法であって、下記工程を備えたことを特徴とするリポソーム製造方法、
（１）反応容器内部の反応空間に不活性ガスを導入し、前記反応空間内において前記反応空間に貯留した脂質を溶解させた有機溶媒に渦流を発生させながら、前記反応空間内を減圧させて前記有機溶媒を前記反応空間から気化させて前記反応容器の内壁に脂質の薄膜を調製する薄膜調製工程、
（２）前記反応空間に不活性ガスを導入し、水性液体を脂質の薄膜に加えて、前記反応空間内においてこの水性液体に渦流を発生させて第１リポソームを調製する第１リポソーム調製工程、
（３）前記超音波処理装置により前記第１リポソームに超音波を照射して第２リポソームを調製する第２リポソーム調製工程。
【請求項６】
請求項３に記載の多機能リポソーム自動製造装置を用いてリポソームを製造する方法であって、下記工程を備えたことを特徴とするリポソーム製造方法、
（１）反応容器内部の反応空間に不活性ガスを導入し、前記反応空間内において前記反応空間に貯留した脂質を溶解させた有機溶媒に渦流を発生させながら、前記反応空間内を減圧させて前記有機溶媒を前記反応空間から気化させて前記反応容器の内壁に脂質の薄膜を調製する薄膜調製工程、
（２）前記反応空間に不活性ガスを導入し、水性液体を脂質の薄膜に加えて、前記反応空間内においてこの水性液体に渦流を発生させて第１リポソームを調製する第１リポソーム調製工程、
（４）前記超音波処理装置により懸濁液体に超音波を照射しつつ、前記第１リポソームを前記超音波処理装置に添加して第３リポソームを調製する第３リポソーム調製工程。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一つに記載の多機能リポソーム自動製造装置を用いて、請求項４〜請求項６のいずれか一つに記載のリポソームから第４リポソームを製造する方法であって、下記工程を備えたことを特徴とするリポソーム製造方法、
（５）前記反応空間に不活性ガスを導入し、第１リポソーム〜第３リポソームのうちの一つのリポソーム懸濁液に渦流を発生させつつ、水性液体を加えて、前記反応空間内において第４リポソームを調製する第４リポソーム調製工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、偏心モータと超音波処理装置とコンピュータとを用いた自動制御可能な多機能リポソーム自動製造装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、脂質によって形成される二分子膜の閉鎖小胞である。リポソームは、生体膜と類似の構造を有するため、従来から様々な研究材料として用いられてきている。
リポソーム内部の水相には、水溶性の薬効成分・抗体・酵素・遺伝子などを封じ込めることができる。また、リポソーム二分子膜内には、油溶性のタンパク質や薬効成分などを保持できる。また、リポソーム二分子膜表面には、DNAやRNAなどを結合させることができる。このような特徴があるので、リポソームは、医療・化粧品・食品などの分野で用いられてきている。近年には、リポソーム製剤を薬物送達システム（DDS）に利用するための研究が盛んになされている。更に、リポソームの脂質二分子膜にタンパク質やペプチドを組み込んで、それらの作用を評価する研究が行われている。
リポソームの製造方法は、例えばボルテックス処理法、超音波処理法、逆相蒸発法、エタノール注入法、押し出し法、界面活性剤法、静置水和法等が知られている（非特許文献１、２）。これらの製造方法は、リポソームの構造に応じて、適宜に利用される。超音波処理法は、リポソームに関する研究の創成期から現在まで使用されている。このため、この方法を用いたリポソーム製造装置が開発されている（特許文献１）。また、超臨界流体を用いたリポソーム製造装置も開発されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平４−２９３５３７号公報
【特許文献２】特開２００５−１６２７０２号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】寺田  弘、吉村  哲郎、「ライフサイエンスにおけるリポソーム  実験マニュアル」、シュプリンガー・フェアラーク東京(1992)
【非特許文献２】V. P. Torchilin, V. Weissig 編, ”Liposemes”, Oxford University Press (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に開示された超音波処理法によるリポソーム製造装置では、自動制御できなければ、一回に超音波処理できる溶液量が少量に限られるという欠点があった。特許文献２に開示された超臨界流体法によるリポソーム製造装置では、高圧に耐える容器などが必要であり、装置が大掛かりになるという欠点があった。
上記欠点のため、リポソームを調製する場合には、現在でもほとんどは手作業で行われている。リポソームを手作業で調製するときには、先ずリポソームを構成する脂質を有機溶媒に溶解させる。次に、脂質−有機溶媒溶液をフラスコに入れ、フラスコを回転させながら、フラスコ内を減圧して有機溶媒を徐々に気化させて飛ばす。有機溶媒が気化すると、フラスコ内壁に脂質からなる薄膜が調製される。この手順は、良質なリポソームを製造するためには、薄く均一な脂質薄膜を調製することが重要であるという理由に依るものである。このため、なるべく大きな底面積を備えた丸底フラスコが利用される。上記方法では、脂質薄膜を広く張るために、多量の有機溶媒が使われているため、環境にも好ましくない。【０００６】
上記方法で脂質薄膜を製造するのには、手間と時間とを要する。このため、多種類または多量のリポソームを製造するのは大変な労力が必要であった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、少量の有機溶媒を用いてコンピュータによる自動制御で、迅速かつ効率的に多種・多量のリポソームを調製する装置等を提供することである。本発明者は、円筒型の反応容器と偏心モータとを備えた比較的小型の機械装置を作製した。この装置に、更に超音波処理装置を組み込み、これらをコンピュータで自動制御するリポソーム自動製造装置を発明した。この装置は、各種のリポソームを迅速かつ効率的に製造できる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、円筒型の反応容器と偏心モータと超音波処理装置とをコンピュータで制御する構成により、MLV（multilamellar vesicles：多重層リポソーム）、LUV（large unilamellar vesicles：大きな単層リポソーム）、SUV（small unilamellar vesicles：小さな単層リポソーム）、GUV（giant unilamellar vesicles：巨大な単層リポソーム）などの各種リポソームの製造を可能とする装置を完成させた。【０００８】
こうして、第１の発明に係る多機能リポソーム自動製造装置は、下記特徴を備えている。
すなわち、円筒状の反応容器と、
この反応容器の反応空間に貯留された溶液に渦流を発生させる偏心モータと、
前記反応容器を所定の温度とするヒータと、
前記反応容器に設けられ前記反応空間に水溶液を導入可能な水溶液ラインと、
前記水溶液ラインの他端に設けられて前記水溶液を貯留しておく第１ボトルと、
前記第１ボトル内の水溶液を前記水溶液ラインを経由して前記反応空間に移動させる第１ポンプと、
前記反応容器に設けられ前記反応空間内に不活性ガスを導入可能な不活性ガスラインと、
前記反応空間内を減圧する減圧ラインと、
この減圧ラインを通じて前記反応空間内を減圧する真空ポンプと、
前記反応容器に設けられ前記反応空間に脂質を溶解させた有機溶媒を導入可能な脂質ラインと、
前記脂質ラインの他端に設けられて前記有機溶媒を貯留しておく第２ボトルと、
前記第２ボトル内の有機溶媒を前記脂質ラインを経由して前記反応空間に移動させる第２ポンプと、
前記有機溶媒を回収する有機溶媒回収装置と、
前記偏心モータとヒータと第１ポンプと第２ポンプとを制御可能なコンピュータとを備えており、
前記コンピュータによる制御により、前記不活性ガスを前記反応容器内に導入し、前記偏心モータを駆動させ前記反応空間に貯留された脂質を溶解させた有機溶媒に渦流を発生させた状態で、前記反応空間を減圧させて前記有機溶媒を前記反応空間から気化させて前記有機溶媒回収装置によって回収し、前記反応容器の内壁に脂質の薄膜を形成させた後、前記反応空間に不活性ガスを導入した状態で、前記反応容器内に水溶液を導入し前記偏心モータを駆動させて渦流を発生させて、前記脂質薄膜と前記水溶液とでリポソームを作製する。【０００９】
本発明においては、次の特徴を備えることが好ましい。
すなわち、前記水溶液ラインにおいて、前記反応容器とは逆側の端部では複数のラインに分岐されており、それら各ラインの端部には、水を主成分とする溶媒を貯留可能な水系ボトルと、
この水系ボトル内の溶媒を前記水溶液ラインを通して前記反応空間内に移動させる水系ポンプとが設けられており、
前記各水系ポンプは前記コンピュータによって制御可能とされており、
前記脂質ラインにおいて、前記反応容器とは逆側の端部では複数のラインに分岐されており、それら各ラインの端部には、有機溶媒を主成分とする溶媒を貯留可能な有機系ボトルと、
この有機系ボトル内の溶媒を前記脂質ラインを通して前記反応空間内に移動させる有機系ポンプとが設けられており、
前記各有機系ポンプは前記コンピュータによって制御可能である。
また、次の特徴を備えることが好ましい。
すなわち、前記反応空間内に貯留された水溶液を吸引して移動可能な溶液移動ラインと、前記水溶液を吸引すると共に前記コンピュータによって制御される移動用ポンプとが設けられており、
前記溶液移動ラインの他端には、前記水溶液に超音波を照射すると共に前記コンピュータによって制御される超音波処理装置が設けられている。【００１０】
本発明においては、不活性ガスラインと減圧ラインとは、三方以上のコックを用いることにより、同じラインとできる。
本発明によれば、コンピュータ制御により、反応空間内に脂質を溶解させた有機溶媒（脂質−有機溶媒溶液）を貯留しておき、偏心モータを駆動させて、この脂質−有機溶媒溶液に渦流を発生させた状態で有機溶媒を気化させることにより、反応容器の内壁に脂質の薄膜が調製される。
従来の方法では、脂質を溶解させた有機溶媒を丸底フラスコに入れ、窒素気流下または減圧下で有機溶媒を徐々に除去し、フラスコ底部に脂質の薄膜をつくっていたことから、手間の掛かるものであった。本発明者らは、嵩高い丸底フラスコを用いる代わりに円筒型容器を用いた。円筒型容器の底面に宛（あて）がった偏心モータを用いて円筒型容器に偏心回転運動を与えることによって、容器内部の脂質-有機溶媒溶液に渦流を発生させる。この渦流を発生させながら、真空ポンプを用いて容器および系内を減圧して有機溶媒を気化・除去し、脂質の薄膜を調製することに成功した。【００１１】
このように、偏心モータを駆動させて、円筒型容器内の反応空間の溶液に渦流を発生させた状態では、溶液は容器内壁に沿って上方へ展開される。この状態で反応空間を減圧させると、溶液の表面積が大きいので、有機溶媒を急速に除去できる。加えて、円筒型容器内壁に薄くかつ広く広がった脂質薄膜を調製できる。脂質薄膜を形成させた円筒型容器内に緩衝液などの水溶液を入れ、偏心モータを駆動させて、反応空間の水溶液に渦流を発生させると、脂質薄膜が水和・剥離してリポソームを製造できる。
脂質組成、溶媒組成、水溶液組成、及び円筒型容器容量・温度・偏心モータ駆動条件（即ち渦流特性）等の装置の操作条件を調節することによって、各種リポソームを調製できる。従来は、前後方向又は左右方向に反応容器を振とうさせつつ反応空間を低圧として、有機溶媒を除去するシステムが知られていた。本発明では、偏心モータを用いることにより、溶液を広く容器内壁に沿って展開しながら有機溶媒を除去する。このため、内部空間の有機溶媒の突沸を防ぐことができ、かつ急速に除去できるので好適な方法である。偏心モータは、有機溶媒の除去とリポソーム製造とに併用できるので、製造装置の構造を簡易化できる。【００１２】
リポソームの製造中に反応容器を着脱する必要がないので、製造装置をコンピュータにより完全自動化することが可能となる。連続運転を行うことにより、リポソームを大量生産できる。また、渦流を発生させながら脂質薄膜を調製するので、容器内壁に沿って溶媒が広く展開する。このため、少量の有機溶媒の使用量が少量で済むので、従来の手作業に依る方法に比べると、環境への負荷が少ない。
リポソームを製造するほとんど全ての工程を閉鎖系とできるので、反応空間を減圧、脱酸素、窒素置換、及び滅菌できる。このため、微生物などが混入するおそれ（コンタミネーション）が小さくなり、医薬品などの製造にも応用できる。【００１３】
上記構成によれば、脂質ラインと、水溶液ラインとが分岐されているので、それぞれのラインを洗浄するときに便利である。
リポソームとは、前述のMLV、LUV、SUV、GUVの各種リポソームであって、（１）水溶性薬物、抗体、酵素、遺伝子などを脂質二分子膜で囲まれた水相に封入したリポソーム、（２）油溶性薬物を脂質二分子膜内に取り込んだリポソーム、（３）機能性タンパク質・ペプチド・生体高分子等を膜に結合・表在・または貫通した状態として有するリポソーム、（４）何も封入物を有さない未封入リポソームなどを意味する。更に、（５）抗原となるタンパク質・ペプチド・生体高分子等を膜に有するリポソームワクチンを意味する。リポソームワクチンとは、生体内に取り込ませることにより、膜に有する抗原に対する抗体を作製させて、ワクチンとなるものを意味する。本発明では、上記いずれの用途を持つ多目的のリポソームを意味する。【００１４】
複数の水系ボトルと複数の有機系ボトルとを別々に設ければ、複数の水系溶媒及び有機溶媒を用意できるので、リポソームを製造する際のオプションが豊富となり、種々のリポソームを製造できる。水系溶媒と有機溶媒とのラインが分かれているので、それぞれのラインの洗浄が容易となる。【００１５】
超音波処理装置とは、液体に超音波を照射することにより、液体内部に含まれる物質（例えば、細菌、ウイルスなど）を分散・破壊したり、脂質にリポソーム（特に、SUV）を形成させる装置である。本発明によれば、コンピュータによる自動制御ができるので、細菌・ウイルスなどの抗原に超音波を照射している状態で、リポソームを形成するための脂質溶液を添加できる。一般に、超音波照射によって分散している物質（例えば、タンパク質）が、超音波照射の停止によって再凝集するまでの時間はミリ秒オーダーである。このため、従来のように、手作業で超音波照射した物質にリポソーム溶液を添加する場合には、リポソーム溶液の添加時に再凝集が始まっている（或いは終了している）可能性が高く、一旦分散した物質を上手くリポソームに組み込むことができなかった。本発明では、物質を分散した状態で、リポソームを導入できるので、その分散状態を反映したリポソーム（第３リポソーム）を調製できる。
リポソームワクチンとは、特定の感染症を起こす病原体（細菌、ウイルスなど）の抗原を、予めヒト・イヌ・ネコ・魚などの動物に接種することにより、免疫力を付与して、その感染症の予防に用いるものであり、リポソームをキャリアとして抗原を運搬するものを意味している。リポソームは、抗原を内部の水相内に保持したり、脂質二分子膜中に埋んだり、脂質二分子膜表面に結合させたりすることができるので、各種抗原をできるだけ元の形を有した状態で免疫細胞に提示できると考えられる。このため、従来のワクチンに比べると、高い免疫効果が期待できる。【００１６】
本発明に係るリポソーム製造方法は、上記多機能リポソーム自動製造装置を用いてリポソームを製造する方法であって、下記工程（１）及び（２）を備えたことを特徴とする。
（１）反応容器内部の反応空間に不活性ガスを導入し、前記反応空間内において前記反応空間に貯留した脂質を溶解させた有機溶媒に渦流を発生させながら、前記反応空間内を減圧させて前記有機溶媒を前記反応空間から気化させて前記反応容器の内壁に脂質の薄膜を調製する薄膜調製工程、
（２）前記反応空間に不活性ガスを導入し、水性液体を脂質の薄膜に加えて、前記反応空間内においてこの水性液体に渦流を発生させて第１リポソームを調製する第１リポソーム調製工程である。【００１７】
また、本発明に係るリポソーム製造方法は、上記多機能リポソーム自動製造装置において超音波処理装置が設けられているものを用いてリポソームを製造する方法であって、下記工程（１）〜（３）を備えたことを特徴とする。
（１）反応容器内部の反応空間に不活性ガスを導入し、前記反応空間内において前記反応空間に貯留した脂質を溶解させた有機溶媒に渦流を発生させながら、前記反応空間内を減圧させて前記有機溶媒を前記反応空間から気化させて前記反応容器の内壁に脂質の薄膜を調製する薄膜調製工程、
（２）前記反応空間に不活性ガスを導入し、水性液体を脂質の薄膜に加えて、前記反応空間内においてこの水性液体に渦流を発生させて第１リポソームを調製する第１リポソーム調製工程、
（３）前記超音波処理装置により前記第１リポソームに超音波を照射して第２リポソームを調製する第２リポソーム調製工程である。【００１８】
また、本発明に係るリポソーム製造方法は、上記多機能リポソーム自動製造装置において超音波処理装置が設けられているものを用いてリポソームを製造する方法であって、下記工程（１）、（２）及び（４）を備えたことを特徴とする。
（１）反応容器内部の反応空間に不活性ガスを導入し、前記反応空間内において前記反応空間に貯留した脂質を溶解させた有機溶媒に渦流を発生させながら、前記反応空間内を減圧させて前記有機溶媒を前記反応空間から気化させて前記反応容器の内壁に脂質の薄膜を調製する薄膜調製工程、
（２）前記反応空間に不活性ガスを導入し、水性液体を脂質の薄膜に加えて、前記反応空間内においてこの水性液体に渦流を発生させて第１リポソームを調製する第１リポソーム調製工程、
（４）前記超音波処理装置により懸濁液体に超音波を照射しつつ、前記第１リポソームを前記超音波処理装置に添加して第３リポソームを調製する第３リポソーム調製工程である。【００１９】
また、本発明に係るリポソーム製造方法は、上記多機能リポソーム自動製造装置を用いて、第１リポソーム〜第３リポソームから第４リポソームを製造する方法であって、下記工程（５）を備えたことを特徴とする。
（５）前記反応空間に不活性ガスを導入し、第１リポソーム〜第３リポソームのうちの一つのリポソーム懸濁液に渦流を発生させつつ、水性液体を加えて、前記反応空間内において第４リポソームを調製する第４リポソーム調製工程である。【００２０】
「水性液体」とは、緩衝液、水溶性物質（化合物、遺伝子、タンパク質（抗体、酵素など）、糖類、多糖類、薬効成分など）を溶解した水溶液などを意味する。「懸濁液体」とは、難溶性物質（化合物、薬効成分、多糖類、細菌、ウイルスなど）を水（緩衝液を含む）に懸濁させた液体などを意味する。
第１リポソームとは、(i)MLV、LUV及びGUV、(ii)水溶性物質を内部に、油溶性物質を膜内に封入したMLV,LUV及びGUV、(iii)抗原を封入したリポソームワクチン（MLV及びLUV）、(iv)膜表面をPEG・糖鎖等で修飾したMLV、LUV及びGUVなどを意味する。
第２リポソームとは、(i)SUV、(ii)水溶性物質を内部に、油溶性物質を膜内に封入したSUV、(iii)抗原を封入したSUV、(iv)膜表面をPEG・糖鎖等で修飾したSUVなどを意味する。
第３リポソームとは、(i)リポソームを効率的に作製したリポソーム、(ii)細菌及びウイルス表面抗原を提示したリポソームワクチン、(iii)凝集性の強いもの（例えば、大分子量タンパク質、多糖類、ウイルス由来抗原、膜タンパク質など）を用いた場合には、その物質を超音波処理破砕した物質を封入したリポソームなどを意味する。
第４リポソームとは、再構成リポソームを意味し、(i)タンパク質及びペプチドを結合したMLV、SUV、LUV及びGUV、(ii)抗原結合リポソームワクチン（MLV、SUV及びLUV）、(iii)組換えプロテオリポソーム（バキュロウイルス融合MLV、SUV、LUV及びGUV）などを意味する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、偏心モータと超音波処理装置とコンピュータなどを用いることにより、自動制御できる多機能リポソーム自動製造装置を提供できる。この装置によれば、連続運転により、多種・多量のリポソームを迅速かつ的確に製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】多機能リポソーム自動製造装置の構成概要を示す図である。
【図２】コンピュータの制御構成を示す図である。
【図３】製造装置の斜視図である。
【図４】製造装置の正面図である。
【図５】製造装置の側面図である。
【図６】製造装置の平面図である。
【図７】製造装置の裏面において、蓋を外して内部を見せたときの様子を示す図である。
【図８】製造装置の骨格部と、ヒータとを示す斜視図である。
【図９】ヒータまわりの側面図である。
【図１０】超音波処理装置および偏心モータの側面図である。
【図１１】揺動保持機構の斜視図である。
【図１２】揺動保持機構の背面図である。
【図１３】揺動保持機構の側面図である。
【図１４】製造装置の写真図である。
【図１５】リポソーム（MLV：第１リポソーム）の製造工程を示すフローチャートである。
【図１６】超音波処理によるリポソーム（SUV：第２リポソーム）の製造工程を示すフローチャートである。
【図１７】不活化ウイルスを用いたリポソームワクチン（第３リポソーム）の製造工程を示すフローチャートである。
【図１８】偏心モータを用いたペプチド結合リポソーム（第４リポソーム）の製造工程を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施できる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶ。
＜多機能リポソーム自動製造装置＞
１．多機能リポソーム自動製造装置の接続構成
図１を参照しつつ、多機能リポソーム自動製造装置（リポソームワクチン自動製造装置）１の構成概要について説明する。なお、以下では、単に製造装置１という。製造装置１は、クロロホルムに溶解させた脂質を薄膜化させた後、所定の水溶液（例えば、適当な緩衝液など）中において、その脂質薄膜からリポソームを製造する等という操作をコンピュータにより自動的に行える。
【００２４】
製造装置１には、反応空間２Ａを備えた円筒型反応容器２と、この反応空間２Ａ内において反応空間２Ａに貯留された溶液に渦流を発生させる偏心軸を備えた偏心モータ３と、反応容器２に熱風または冷風を吹き付けるヒータ４と、反応容器２の温度を測定する温度センサ５が設けられている。反応容器２の上部には、蓋体８が取り付けられており、この蓋体８を貫通する四本のラインＴ１〜Ｔ４が取り付けられている。以下には説明の便宜として、ラインに適当な名称を付しているが、各ラインはその名称に記載された役割のみを果たすのではなく、コンピュータ１５の制御に基づき、別の役割を果たすことがある。
【００２５】
二本のラインＴ１、Ｔ３の端部は、反応容器２の下方まで延設されており、それぞれ洗浄液を回収するための洗浄液回収用ラインＴ１、及びリポソーム溶液を超音波処理装置６に運ぶ操作などを行う溶液回収用ラインＴ３とされている。残り二本のラインＴ２、Ｔ４の端部は、反応容器２の上方に位置しており、それぞれ抗原または緩衝液を反応容器２に滴下する操作などを行う運搬用ラインＴ２、及び不活性ガスを反応容器２に吹き込んだり、反応容器２を低圧とするため真空装置と接続するための気体操作用ラインＴ４とされている。ラインＴ１の途中には、ピンチバルブＰＶ３が設けられており、その他端側には洗浄液回収ボトルＢ９が接続されている。ラインＴ２の途中には、ピンチバルブＰＶ２と、四方コネクタＪＴ１が設けられており、このコネクタＪＴ１から三本のラインＴ２１〜Ｔ２３が分枝されている。
【００２６】
分枝ラインＴ２１には、ロータリーバルブＲＶ３が設けられている。製造装置１には、６個のロータリーバルブＲＶ１〜ＲＶ６が設けられている。各ロータリーバルブＲＶ１〜ＲＶ６の内部には、ロータリー機構が備えられており、コンピュータ１５の制御によりロータリー機構を回転移動させることにより、ロータリーバルブＲＶ１〜ＲＶ６の周囲に記載した番号１〜４のうち、番号１−２、２−３、３−４、４−１のいずれかの通路を接続できる。図１では、全てのロータリーバルブＲＶ１〜ＲＶ６は、通路１−２が接続した状態としてある。ロータリーバルブＲＶ３には、シリンジポンプＳＰ３と、ボトルＢ３と、分枝ラインＴ２１１が接続されている。
【００２７】
分枝ラインＴ２２の端部には、ピンチバルブＰＶ８が設けられている。ピンチバルブＰＶ８は三方弁であり、ここにはロータリーバルブＲＶ４と三方コネクタＪＴ４からのラインが接続されている。ロータリーバルブＲＶ４には、シリンジポンプＳＰ４と、ボトルＢ４と、分枝ラインＴ２２１が接続されている。分枝ラインＴ２３には、ロータリーバルブＲＶ５が設けられており、ここにはシリンジポンプＳＰ５と、二本の分枝ラインＴ２３１、Ｔ２３２が接続されている。
ラインＴ３には、ピンチバルブＰＶ１が設けられており、その先には三方コネクタＪＴ２が設けられている。このコネクタＪＴ２から二本のラインＴ３１、Ｔ３２が分枝されている。分枝ラインＴ３１には、ロータリーバルブＲＶ１が設けられており、ここにはシリンジポンプＳＰ１と、ボトルＢ１と、ラインＴ４２１が接続されている。
【００２８】
分枝ラインＴ３２には、ロータリーバルブＲＶ２が設けられており、ここにはシリンジポンプＳＰ２と、ボトルＢ２と、二本のラインＴ４２２、Ｔ３２１が接続されている。ラインＴ３２１は、超音波処理装置６に向かう三方コネクタＪＴ４に接続されている。コネクタＪＴ４には、超音波処理装置６に溶液を送液するためのラインＴ３３と、ピンチバルブＰＶ８に接続するラインＴ２２２が接続されている。ラインＴ３３の途中には、ピンチバルブＰＶ６が設けられている。
ラインＴ４には、真空ポンプ１０と有機溶媒回収装置１１と空気乾燥管１３に連結するラインＴ４１と、不活性ガスとしての窒素を供給するガスボンベ９に連結するラインＴ４３とが連結されている。各ラインＴ４１、Ｔ４３の途中には、ポートバルブＶ１、Ｖ３が設けられている。ラインＴ４１の途中には、圧力センサＳ１と、外気にライン内の圧力を開放するポートバルブＶ２が設けられている。
【００２９】
ガスボンベ９から導出されたラインは二本に分枝された後、それぞれレギュレータＲ１、Ｒ２及びニードルバルブＮＶ１、ＮＶ２を経由して、ポートバルブＶ４に接続される。ポートバルブＶ４には、ラインＴ４２が接続されている。このラインＴ４２には、順に流量計５０、ラインＴ４３、リリーフバルブＲＶ、圧力計Ｓ２、ポートバルブＶ６、Ｖ５が接続されている。ラインＴ４２の端部は、マニホールド６０が接続されている。マニホールド６０には、ラインＴ４２の他にも、６個のロータリーバルブＲＶ１〜ＲＶ６からのラインＴ４２１、Ｔ４２２、Ｔ２１１、Ｔ２２１、Ｔ２３１、Ｔ２１１、及び二個のチューブポンプＰ７、Ｐ８からのラインＴ４２３、Ｔ４２４が接続されている。チューブポンプＰ７、Ｐ８には、それぞれボトルＢ７、Ｂ８が接続されている。
【００３０】
超音波処理装置６には、サンプルを低温に保つために、循環装置１２からの冷却水を循環させる循環水供給ラインＴ５１と回収ラインＴ５２が接続されており、更に超音波処理すべき溶液を供給および回収するためのサンプル供給用ラインＴ３３と回収用ラインＴ６が接続されている。また、超音波処理装置６にサンプルを供給するときにガス圧を開放するラインＴ７とピンチバルブＰＶ７が接続されている。ラインＴ６には、ピンチバルブＰＶ５と四方コネクタＪＴ３が設けられている。コネクタＪＴ３には、ピンチバルブＰＶ４を備えた回収用ボトルＢ１０に連結されるラインと、ロータリーバルブＲＶ５に接続する分枝ラインＴ２３２と、ロータリーバルブＲＶ６に接続する分枝ラインＴ６１が接続されている。ロータリーバルブＲＶ６には、シリンジポンプＳＰ６、ボトルＢ６、及び分枝ラインＴ２１１が接続されている。
図１中において、二つのボトルＢ２、Ｂ５は、本実施形態においては使用する必要がないため、接続を解除した状態とされている。但し、各ボトルＢ２，Ｂ５は、それぞれロータリーバルブＲＶ２、ＲＶ５に接続されているので、必要に応じて、シリンジポンプＳＰ２、ＳＰ５の駆動により、溶液の流出入を行える。
【００３１】
図２に示すように、製造装置１には、液晶装置１５Ａ、ＣＰＵ１６、制御用基板１６Ａ、記憶装置１７、及びＩ／Ｏポート１８を備えたコンピュータ１５が設けられている。コンピュータ１５は公知のものであるため、構成の詳細については説明を省略する。コンピュータ１５は、偏心モータ３、ヒータ４、温度センサ５、超音波処理装置６、ピンチバルブＰＶ１〜ＰＶ８、ロータリーバルブＲＶ１〜ＲＶ６、シリンジポンプＳＰ１〜ＳＰ６、ポートバルブＶ１〜Ｖ６、圧力センサＳ１、チューブポンプＰ７〜Ｐ８、真空ポンプ１０、有機溶媒回収装置１１、及び循環装置１２と接続されており、上記各装置からの信号の入力及び／または各装置に対する信号出力を行うことにより、予め決められたプログラムの内容に従って、各装置の駆動を制御できる。また、液晶装置１５Ａには、圧力センサが組み込まれており、所定のプログラムの実行により、所定の画面を表示すると共に、適当なパラメータを入力できる。
【００３２】
２．多機能リポソーム自動製造装置の機械構成
次に、図３〜図１３を参照しつつ、製造装置１の機械構成について説明する。なお、図示の煩雑さを避けるために、ライン類の一部の表示については割愛した。
製造装置１について、図３には斜視図を、図４には正面図を、図５には側面図を、図６には平面図を、図７には裏面図（蓋を外して内部を見せたもの）を、図８には骨格部とヒータを示した。図９にはヒータまわりの側面図を、図１０には超音波処理装置および偏心モータの側面図を、図１１〜図１３には、それぞれ揺動保持機構の斜視図・背面図・側面図を示した。
図７および図８に示すように、本体部１９は、棒状材（例えば、アルミなどの金属製のもの）を用いて骨格部１９Ａが形成されており、その骨格部１９Ａが板材（例えば、ステンレス製）からなる表面被覆部１９Ｂにより覆われている。図３および図４に示すように、本体部１９の内部には、コンピュータ１５、ライン類Ｔなどが収納されている。本体部１９の中央には、縦方向に溝部２０が設けられている。溝部２０の奥側には、鉛直方向に支持柱２１が立てられており、その上部には前方に向かって支持部材２２が設けられ、ここには超音波処理装置６が設置されている。支持柱２１の下端は、水平方向に広がる支持台２３に取り付けられており、この支持台２３の前方（図１０において左側）には、偏心モータ３が固定されている。
【００３３】
図１０〜図１３に示すように、支持柱２１の下端付近には、揺動保持機構２４が設けられている。揺動保持機構２４は、反応容器２を揺動可能に支持する。揺動保持機構２４には、支持柱２１から水平方向前方に突き出す支持部２５と、支持部２５を上下方向に貫通する孔部（図示せず）に組み付けられた二本の柱体２６，２７と、両柱体２６，２７の周囲に遊挿されたスプリング２８，２９と、両柱体２６，２７を連結すると共に柱体２７の側方に張り出す連結板材３０と、連結板材３０から斜め前方に突設された容器固定具３１などが設けられている。支持部２５には、上下方向に貫通するとともに後方中央部が開放された取付孔部２５Ａが設けられており、ここには支持柱２１が挿通される。取付孔部２５Ａの後方には、支持部２５を横方向に貫通するネジ止め孔２５Ｂが設けられており、ここに図示しないネジを組み付けることで、支持部２５を支持柱２１の所定の位置に固定できる。短い方の柱体２６には、ナット２６Ａ，２６Ｂが組み付けられている。ナット２６Ａ，２６Ｂの組付けにより、柱体２６が支持部２５に固定される。柱体２６の上端には、上端突部２６Ｃが設けられている。連結板材３０には、柱体２６を通す孔部が設けられており、この孔部の周縁にゴム部材３０Ｃが取り付けられている。連結板材３０が規定量以上の移動を行おうとしたときには、柱体２６がゴム部材３０Ｃに弾性的に接触することで、規定量以上の動きを規制する。
【００３４】
連結板材３０において長い柱体２７が組み付けられた周囲には、上下方向に円筒状のストッパ部３０Ａ，３０Ｂが突設されている。柱体２７において連結部材３０よりも上部には、スプリング２９が設けられており、その上方から揺動規制プレート３２が組み付けられる。揺動規制プレート３２の上部には、カムレバー３３が柱体２７を側方に貫通する軸体３３Ａによって軸止されている。スプリング２９は、連結板材３０と揺動規制プレート３２との間に所定の力で押圧されて固定されている。反応容器２が規定量以上の揺動を行おうとすると、各ストッパ部３０Ａ，３０Ｂが支持部２５の上面または揺動規制プレート３２の下面に当接する。このため、反応容器２の揺動が、所定の範囲内に収まるようになっている。
【００３５】
容器固定具３１には、反応容器２を挟み付ける二股状の挟持部３１Ａと、両挟持部３１Ａの基端部分に架設されるとともに所定の力で反応容器２を固定する締付部３１Ｂと、挟持部３１Ａの基端部分から後方に延設されたシャフト部３１Ｃが設けられている。締付部３１Ｂは、シャフト部材とネジ部材とから構成されており、ネジ部材を締め付けることにより、両挟持部３１Ａを適度な力で固定する。挟持部３１Ａにおいて、反応容器２に当接する部分には、適当な弾性を備えた部材（例えば、シリコンゴムなど）が覆い付けられている。シャフト部３１Ｃは、連結部材３０の上部に固定されたシャフトホルダ３４に挿通されて固定されている。両スプリング２８，２９の作用によって、揺動保持機構２４は、反応容器２が偏心モータ３の駆動に応じて所定の範囲内において揺動を可能としながら、保持できる。
【００３６】
図３および図４などに示すように、本体部１９の前面において、溝部２０を挟んだ左右両側には、ロータリーバルブＲＶ１〜ＲＶ６及びシリンジポンプＳＰ１〜ＳＰ６が設けられている。これらの下方には、ボトルＢ１〜Ｂ６が、ボトルホルダ３６に嵌め込まれた状態で設置されている。
溝部２０を構成する壁面の奥側下方には、温度センサ５を設置するためのセンサ用孔部２０Ａと、ヒータ４を設置するためのヒータ用孔部２０Ｂとが開放されている。図７〜図９に示すように、ヒータ４はドライヤー形状のものである。ヒータ４は、反応容器２の下端付近に向かって温風を吹き付けることにより、反応空間２Ａの環境を所定の温度まで上昇させる。ヒータ４は、本体部１９の下面板４０に固定された固定用板材４１に組付けられている。固定用板材４１の上面側には、上方に開放するＣ字状の凹部４１Ａが設けられている。凹部４１Ａにはヒータ４が装着されており、凹部４１Ａを形成する固定用板材４１の両端にヒータ４がネジ止めされている。ヒータ４の先端は、保護板材４２に挿通されている。保護板材４２の上端には棒状の固定具４３が取付けられ、固定具４３の上部が、溝部２０の上端に架設された板材４４に固定されることで位置決めされている（図３を参照）。
【００３７】
本体部１９の上面において、溝部２０を挟んだ左右両側には、ロータリーバルブＲＶ１〜ＲＶ６、ピンチバルブＰＶ１〜ＰＶ８、各種ラインを一纏めとしたバルブ集合体４５，４６が設置されている。その奥側には、横一列のボトル用溝部４７が設けられており、ここにはボトルＢ７〜Ｂ１０、及び予備ボトルＢ１１が装着されている。本体部１９の上面奥側は、手前に向かって突設されており、ここには図示左から、チューブポンプＰ７，Ｐ８、圧力計Ｓ２などが設置されている。図示右側には、液晶装置１５Ａと、製造装置１のメインスイッチＳＷが設けられている。
図５に示すように、本体部１９の左側面には、電気接続用のソケット４８、外部電子機器との接続口４９、窒素ガス流量計５０、窒素ガス導入口５１、真空ポンプ接続口５２、及び冷却水導入口及び導出口５３などが設けられている。
上記構成を持つ実際の製造装置１の写真図を図１４に示した。図示中央には、本体部分が、左側には有機溶媒回収装置が、右側には超音波処理装置の制御部が、それぞれ写されている。
【００３８】
＜リポソームの製造＞
製造装置１を用いてリポソームを製造する方法、および制御方法（アルゴリズム）について説明する。
１−１．偏心モータによるリポソーム（第１リポソーム）の製造
偏心モータ３を用いて、コンピュータ１５による自動制御により、第１リポソームのひとつであるMLVを調製した。
予めボトルＢ４（第１ボトル）に緩衝液を、ボトルＢ３（第２ボトル）にリピドクロロホルム溶液を貯留させておいた。
リピドクロロホルム溶液として、クロロホルムに溶解したリン脂質（ジオレオイルホスファチジルコリン 25μmol、及びジオレオイルホスファチジルセリン 25μmol）2.5mlを用いた。緩衝液として、10mM HEPES-NaOH / 175mM NaCl（pH7.5）10.0mlを用いた。各ボトルをセット後、コンピュータ１５の液晶装置１５Ａを操作してMLVを製造した。
【００３９】
MLVの製造アルゴリズムを図１５に示した。初期設定Ｓ１００において、ロータリーバルブＲＶ１〜ＲＶ６を４−１間と、ピンチバルブＰＶ１〜ＰＶ３を閉止、ポートバルブＶ１〜Ｖ３を閉止、ポートバルブＶ４、Ｖ６を開放して窒素を流し、レギュレータＡＲ１＝１ｋＰａ，ＡＲ２＝０.５ｋＰａとし、真空ポンプ１０・有機溶媒回収装置１１を駆動状態、ヒータ４及び偏心モータ３を停止状態とした。
次に、系内を窒素で置換処理した（Ｓ１１０）。このステップでは、ポートバルブＶ１，Ｖ２およびピンチバルブＰＶ２を開放して、ルートＴ４２、マニホールド６０、ルートＴ２１１，Ｔ２２１，Ｔ２３１、ルートＴ２１，２２，２３、ルートＴ２に窒素ガスを流し、反応容器２内を窒素で置換した。
【００４０】
次に、ボトルＢ３のリピドクロロホルム溶液を反応容器２に送液した（Ｓ１２０）。このステップでは、ポートバルブＶ１を閉止し、ロータリーバルブＲ３を２−３の位置としておき、シリンジポンプＳＰ３（第２ポンプ）を吸引駆動させて、ボトルＢ３内のリピドクロロホルム溶液を吸い込んだ後、ロータリーバルブＲＶ３を３−４の位置に回転させ、ピンチバルブＰＶ２を開放して、シリンジポンプＳＰ３を排出駆動させて、ラインＴ２１（脂質ライン）とラインＴ２を通して、リピドクロロホルム溶液を反応容器２に送液した。
次に、薄膜調製を行った（Ｓ１３０）。このステップでは、ポートバルブＶ２を閉止、ポートバルブＶ１を開放した状態として、反応空間２Ａを真空ポンプ１０と連結しつつ、偏心モータ３とヒータ４とを駆動させた。こうして、反応空間２Ａを高温としながら、偏心モータ３で反応空間２Ａ内においてリピドクロロホルム溶液に渦流を発生させた状態において、真空ポンプ１０を駆動させ反応空間２Ａを減圧させてクロロホルムを反応空間２Ａから気化させて、反応容器２の内壁に脂質の薄膜を調製した。
【００４１】
次に、系内の窒素置換処理を行った（Ｓ１４０）。このステップでは、前述のＳ１１０と同等の処理に加えて、ヒータ４の熱源を切断して、冷風を送ることにより、反応容器２の冷却処理を同時に実施した。
次に、緩衝液を反応容器２へ送液した（Ｓ１５０）。このステップでは、まずロータリーバルブＲＶ４を２−３の位置として、シリンジポンプＳＰ４を吸引駆動させて、ボトルＢ４内の緩衝液を吸い込んだ後、ロータリーバルブＲＶ４を３−４の位置に回転させ、ピンチバルブＰＶ８とピンチバルブＰＶ２とを開放操作した後、シリンジポンプＳＰ４（第１ポンプ）を排出駆動させて、ラインＴ２１１（水溶液ライン）とラインＴ２を通して、緩衝液を反応容器２に送液した。この送液操作のときには、ポートバルブＶ１，Ｖ３を閉止し、ポートバルブＶ２を開放しておくことにより、送液に伴う反応空間２Ａ内の気体を逃がした。
次に、偏心モータ３を駆動させて、MLVを製造した（Ｓ１６０）。このときには、緩衝液によるリピド薄膜の剥離効率を向上させるために、偏心モータ３を正逆両方向に交互に駆動させた。
最後に、ステップ１１０（Ｓ１１０）と同じ操作により、系内を窒素で置換した。こうして、緩衝液を用いて平均粒径534nmのMLVを製造することができた。
【００４２】
１−２．LUV及びGUV（第1リポソーム）の製造
上記１−１の製造工程に基づき、LUV及びGUVの製造を行った。図１５に記載の行程に従い、適当な変更を行うことにより、平均粒径が約400nmのLUV、及び平均粒径が約20μmのGUVを製造できた。
１−３．水溶性物質封入リポソーム（第1リポソーム）の製造
上記１−１の製造工程において、Ｓ１５０に用いた緩衝液に代えて、酵素（ルシフェラーゼ）を溶解させたものを用い、その他の工程については同様に行った。その結果、酵素を封入したMLVを製造できた。また、上記１−２の工程に従ったところ、酵素を封入したGUVを製造できた。
次に、上記酵素に代えて、薬効成分（バルビタール）、抗原（緑色蛍光タンパク質）、抗体（抗緑色蛍光タンパク質抗体）、または核酸（pBR322ベクター）を用いて、上記と同様の操作を行ったところ、薬効成分、抗原、抗体、または核酸を封入したMLV及びGUVを製造できた。
【００４３】
１−４．油溶性物質膜内封入リポソーム（第1リポソーム）の製造
上記１−１の製造工程において、Ｓ１２０に用いた「リピドクロロホルム溶液」に代えて、「リピド＋油溶性物質／クロロホルム溶液」を用い、その他の工程については同様に行った。油溶性物質として、α−トコフェロールを用いた。その結果、油溶性物質を膜内に封入したMLVを製造できた。上記１−２の工程に従ったところ、油溶性物質を膜内に封入したLUV及びGUVを製造できた。
１−５．エバポレータとしての使用
上記１−１の製造工程において、Ｓ１２０の「リピドクロロホルム溶液」に代えて、「油溶性物質＋揮発性有機溶媒」を用いた。油溶性物質として、リノール酸を用い、揮発性有機溶媒として、エタノールを用いた。こうして、Ｓ１００〜Ｓ１４０を実施し、揮発性有機溶媒を適度に揮発させたところ、油溶性物質を濃縮することができた。こうして、「薄膜調製」に代えて、「油溶性物質の濃縮」を行うことができた。このように、本実施形態の製造装置１をエバポレータとして使用できた。
【００４４】
２−１．超音波処理によるリポソーム（第２リポソーム）の製造
次に、図１６を参照しつつ、第２リポソームのひとつであるSUVの製造工程について説明する。この工程は、上記Ｓ１６０の後に、反応容器２内に緩衝液を用いたMLVを含む状態から始めた。但し、コンピュータ１５に設定したプログラムを適当に変更することにより、適当な初期状態（例えば、任意のボトルにMLVを回収した状態）から本工程を実施することもできる。
初期設定Ｓ２００においては、超音波処理を行う際のパラメータ（溶液量、超音波処理容器サイズ、超音波チップの種類、超音波チップの容器内の位置など）を設定した。また、循環装置１２を駆動させることにより、超音波処理装置６を所定の温度（例えば、0℃）に冷却した。
【００４５】
次のステップ（Ｓ２１０）では、系内を窒素で置換処理した。この処理は、前述のステップ（Ｓ１１０）と同様の工程を実施した。
次に、反応容器２内のMLVをシリンジポンプＳＰ２を用いて回収した（Ｓ２２０）。このステップでは、ガスボンベ９からの不活性ガスをラインＴ４から反応容器２内に導入しつつ、シリンジポンプＳＰ２を吸引駆動した。すなわち、ポートバルブＶ３，Ｖ４のみを開放し、所定量の窒素ガスをラインＴ４から反応容器２に導入した。また、ピンチバルブＰＶ１を開放し、ロータリーバルブＲＶ２を３−４の位置とした状態で、シリンジポンプＳＰ２を吸引駆動した。
【００４６】
次に、MLVを超音波処理装置６に送液した（Ｓ２３０）。ロータリーバルブＲＶ２を２−３の位置に回転させ、ピンチバルブＰＶ６，ＰＶ７を開放した状態で、シリンジポンプＳＰ２を排出駆動することにより、MLVをラインＴ３２１，Ｔ３３を通じて、超音波処理装置６に送液した。また、系内のMLVを超音波処理装置６に送り出すために、窒素ガスの加圧処理を行った。この加圧処理では、ラインＴ４２、マニホールド６０、ラインＴ３２１，Ｔ２２２、ジョイントＪＴ４、およびラインＴ３３を通じて、窒素ガスを超音波処理装置６に送った。つまり、ポートバルブＶ４，Ｖ６を開放し（Ｖ３は閉止）、ロータリーバルブＲＶ２を１−２位置、ロータリーバルブＲＶ４を４−１位置とし（その他のロータリーバルブについては、１位置を閉止した状態としておく）、ピンチバルブＰＶ８を図１の上下方向に開放し、ピンチバルブＰＶ６，ＰＶ７を開放状態とした。
【００４７】
次に、超音波処理装置６を駆動させて、MLVの超音波処理を行った（Ｓ２４０）。超音波処理は、適当な条件で実施できるが、例えば出力レベル１から３に漸増し、１分間の駆動と、１分間の休止とを１０回に渡って繰り返した。
最後に、超音波処理装置６内のSUVを回収した（Ｓ２５０）。このステップでは、超音波処理装置６に窒素ガスを送り込みつつ、シリンジポンプＳＰ６により回収操作を行った。すなわち、ポートバルブＶ４，Ｖ６を開放し（Ｖ３は閉止）、ロータリーバルブＲＶ２を１−２位置（その他のロータリーバルブについては、１位置を閉止した状態としておく）、ピンチバルブＰＶ６，ＰＶ７を開放状態として、窒素ガスを送りつつ、ピンチバルブＰＶ５を開放し（ＰＶ４は閉止）、ロータリーバルブＲＶ６を３−４位置として、シリンジポンプＳＰ６を吸引駆動した。その後、ロータリーバルブＲＶ６を２−３位置に回転させ、シリンジポンプＳＰ６を排出駆動させることにより、SUVをボトルＢ６に回収した。こうして、平均粒径53nmのSUVを製造することができた。
【００４８】
２−２．水溶性物質封入SUV（第２リポソーム）の製造
上記２−１の製造工程において、Ｓ２２０に用いたMLVに代えて、上記１−３で製造した水溶性物質封入MLVを用い、その他の工程については同様に行った。その結果、水溶性物質を封入したSUVを製造できた。
水溶性物質として、酵素（ルシフェラーゼ）、薬効成分（バルビタール）、抗原（緑色蛍光タンパク質）、抗体（抗緑色蛍光タンパク質抗体）、または核酸（pBR322ベクター）を用いて、上記と同様の操作を行ったところ、酵素、薬効成分、抗原、抗体、または核酸を封入したSUVを製造できた。
２−３．油溶性物質膜内封入SUV（第２リポソーム）の製造
上記２−１の製造工程において、Ｓ２２０に用いたMLVに代えて、上記１−４で製造した油溶性物質膜内封入MLVを用い、その他の工程については同様に行った。その結果、油溶性物質を膜内に封入したSUVを製造できた。
【００４９】
３−１．不活化ウイルスを用いたリポソームワクチン（第３リポソーム）の製造
図１７を参照しつつ、第３リポソームのひとつである不活化コイヘルペスウイルスを用いたリポソームワクチンの製造工程について説明する。この工程では、ウイルス懸濁液を超音波処理しつつ、MLVを添加できる。
スタートＡから、初期設定（Ｓ３００）の後、反応容器２を用いてリピド薄膜を調製した（Ｓ３１０）。次に、反応容器２に緩衝液を送液し（Ｓ３２０）、偏心モータ３を駆動させることにより、MLVを調製した（Ｓ３３０）。これらのステップ（Ｓ３００〜Ｓ３３０）は、前述のＳ１００〜Ｓ１７０と同様の工程を実施することにより行った。
リピドクロロホルム溶液として、クロロホルムに溶解したリン脂質（ジオレオイルホスファチジルコリン 25μmol、及びジオレオイルホスファチジルセリン 2.5μmol）及びコレステロール12.5μmol 2.5mlを用いた。また、緩衝液として、10mM HEPES-NaOH / 100mM NaCl（pH7.5）10.0mlを用いた。各ボトルをセット後、コンピュータ１５の液晶装置１５Ａを操作してMLVを製造した。
【００５０】
一方、スタートＢでは、初期設定（Ｓ３４０）の後、ウイルス懸濁液を超音波処理装置６に送液（Ｓ３５０）した後、超音波処理装置６を駆動（Ｓ３６０）することにより、ウイルスを超音波処理した。これらのステップ（Ｓ３４０〜Ｓ３６０）は、前述のＳ２００〜Ｓ２４０と同様の工程を実施することにより行った。
次に、超音波処理装置６を駆動させながら、反応容器２内のMLVを超音波処理装置６に送液した（Ｓ３７０）。このステップは、前述のＳ２１０〜Ｓ２３０と同様の工程を実施することにより行った。
次に、所定の超音波処理を行うことにより、コイヘルペスウイルスリポソームワクチンを調製した（Ｓ３８０）。リポソームワクチンは、光学顕微鏡観察により確認された。
【００５１】
最後に、リポソームワクチンを回収した（Ｓ３９０）。このステップは、前述のＳ２５０と同様の工程により実施した。こうして、リポソームワクチンをボトルＢ６に回収した。
一般に、超音波処理により拡散させたタンパク質などの粒子は、数ミリ秒の単位で再凝集する。このため、そのように再凝集しやすい粒子を抗原とする場合には、超音波処理後に極めて速やかに（或いは、超音波処理中に）リポソームと混合させる必要がある。従来の装置では、このような要求に応えることは困難であったが、本実施形態の製造装置１によれば、図１７に示す工程を実施することにより、拡散させた粒子を再凝集させることなくリポソームと接触させることが可能となった。
【００５２】
３−２．リポソームワクチン（第３リポソーム）の製造
上記３−１の製造工程において、Ｓ３５０に用いた「ウイルス懸濁液」に代えて、「細菌懸濁液」を用い、その他の工程については同様に行った。「細菌懸濁液」として、大腸菌を懸濁させたものを用いた。
その結果、細菌を提示したリポソームワクチンを製造できた。
３−３．リポソームを効率的に作製したリポソーム（第３リポソーム）の製造
次に、リポソーム（特に、SUV）を効率的に製造する工程について説明する。この製造工程では、図１７のＳ３００〜Ｓ３３０の実施後に、Ｓ３７０〜Ｓ３９０を実施する（つまり、スタートＢ〜Ｓ３６０までの工程は省略する）。このようにすれば、SUVを効率的に製造できる。
具体的には、上記３−１の工程において、（スタートＢ〜Ｓ３４０〜Ｓ３６０を実施することなく）Ｓ３００〜Ｓ３３０及びＳ３７０〜Ｓ３９０を実施した。
こうして、SUVを効率的に製造できた。
【００５３】
３−４．細菌破砕装置としての使用
上記３−１の製造工程において、Ｓ３５０に用いた「ウイルス懸濁液」を「細菌懸濁液」に代え、Ｓ３００〜Ｓ３３０、Ｓ３７０、Ｓ３８０を除いた以外は同様の工程を行った。細菌懸濁液として、大腸菌を懸濁させた液を用いた。
すなわち、スタートＢから初め、Ｓ３４０、Ｓ３５０、Ｓ３６０、Ｓ３９０を実施した。こうして、細菌を超音波装置で破砕できた。
このように、本実施形態の製造装置１を細菌破砕装置として使用できた。
【００５４】
４−１．偏心モータを用いたペプチド結合リポソーム（第４リポソーム）の製造
次に、図１８を参照しつつ、第４リポソームのひとつであるペプチド結合リポソームの製造工程について説明する。この工程は、上記Ｓ１６０あるいはＳ２４０の後に、適当なボトルにMLV、LUV、GUV、あるいはSUVを回収した状態から始めた。但し、コンピュータ１５に設定したプログラムを適当に変更することにより、適当な初期状態（例えば、反応容器２に予めMLV、LUV、GUV、あるいはSUVを含ませた状態）から本工程を実施することもできる。
この場合、リピッドクロロホルム溶液として、クロロホルムに溶解したリン脂質（ジオレオイルホスファチジルコリン 25μmol、ジオレオイルホスファチジルセリン 25μmol、NHS-ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン10μmol）2.5mLを用いて薄膜を作製し、10mM 酢酸−酢酸Na/175mM NaCl（pH5.0）10mLを用いて製造したMLV、LUV、GUV、あるいはSUVを用いた。NHS-DSPEは、弱アルカリ性環境（pH8.0程度）において、タンパク質・ペプチドのアミノ基と反応して共有結合を形成する。
リポソームの脂質二分子膜に結合させる水溶性ペプチドとして、配列番号１に記載の7個のアミノ酸からなるペプチド（Lys-Lys-Asp-Ser-Glu-Pro-Tyr：β−リポトロピン断片）を選択した。このペプチドは、シグマ社から購入した。
【００５５】
初期設定（Ｓ４００）の後、前述のステップ（Ｓ１１０）と同様の工程で系内を窒素置換した（Ｓ４１０）。
次に、予め調製し、ボトルに回収しておいたMLVあるいはSUV（リポソーム）を反応容器２へ送液した（Ｓ４２０）。次に、反応用緩衝液100mM Tris-HCl/100mM NaCl(pH8.0)10mLを反応容器２に送液し（Ｓ４３０）、ステップ１１０（Ｓ１１０）に従って、系内を窒素置換処理した（Ｓ４４０）。
次に、偏心モータ３を駆動させて、反応容器２内のリポソームに渦流を発生させた（Ｓ４５０）。偏心モータ３を駆動させて撹拌した状態のまま、ペプチド溶液を反応容器２へ送液し（Ｓ４６０）、しばらくの間、偏心モータ３を駆動させた状態として、反応容器２内でリポソームとペプチドとを反応させた（Ｓ４７０）。
次に、ステップ１１０（Ｓ１１０）に従って、系内を窒素置換処理し（Ｓ４８０）、偏心モータ３の駆動を止めて静止させた（Ｓ４９０）。
最後に、反応容器２内の溶液を回収した（Ｓ５００）。
こうして、結合率が約５０％のペプチド結合リポソーム（第４リポソーム）を製造することができた。
【００５６】
４−２．タンパク質（抗原等）結合リポソーム（第４リポソーム）の製造
上記４−１の製造工程において、Ｓ４６０に用いた「ペプチド溶液」に代えて、「タンパク質（抗原等）溶液」を用い、その他の工程については同様に行った。「タンパク質（抗原等）溶液」として、緑色蛍光タンパク質を緩衝液に溶解させたものを用いた。その結果、タンパク質（抗原等）結合リポソームを製造できた。
４−３．核酸結合リポソーム（第４リポソーム）の製造
上記４−１の製造工程において、Ｓ４２０に用いた「MLV、LUV、GUVあるいはSUV」に代えて「カチオニックリポソーム」を、Ｓ４６０に用いた「ペプチド溶液」に代えて「核酸溶液」を用い、その他の工程については同様に行った。「カチオニックリポソーム」として「リポフェクトアミン（インビトロジェン社）」を、「核酸溶液」としてpBR322ベクターを緩衝液に溶解させたものを用いた。
その結果、核酸結合リポソームを製造できた。
【００５７】
４−４．組換えプロテオリポソーム（第４リポソーム）の製造
上記４−１の製造工程において、Ｓ４３０に用いた「反応用緩衝液100mM Tris-HCl/100mM NaCl(pH8.0)」に代えて「反応用緩衝液10mM CH3COOH-CH3COONa/10mM NaCl (pH4.0)」を、Ｓ４６０に用いた「ペプチド溶液」に代えて「膜タンパク質搭載バキュロウイルス懸濁液」を、それぞれ用い、その他の工程については同様に行った。
上記「膜タンパク質搭載バキュロウイルス懸濁液」は、本願発明者の発明に係る特許出願（WO2007/094395-A1）に開示された技術によって製造したものを用いた。
その結果、組換えプロテオリポソームを製造できた。
【００５８】
４−４．バイオリアクターとしての使用
次に、本実施形態の製造装置１をバイオリアクターとして使用する一例について説明する。
上記４−１の製造工程において、Ｓ４３０に用いた「反応用緩衝液100mM Tris-HCl/100mM NaCl(pH8.0)」に代えて「反応用緩衝液（10mM CH3COOH-CH3COONa/10mM NaCl (pH5.6)」を、Ｓ４６０に用いた「ペプチド溶液」に代えて「ホスホリパーゼＤ（シグマＰ８８０４）溶液」を、それぞれ用い、その他の工程については同様に行った。本工程においては、Ｓ４２０の「MLV、LUV、GUVあるいはSUV」は、「LUVあるいはSUV」と読み替えた。
本工程によって、脂質二分子膜の外側のみがＰＣ（ホスファチジルコリン）からＰＡ(ホスファチジン酸)に変換された。
このように、本実施形態の製造装置１をバイオリアクターとして使用できた。
【００５９】
本実施形態によれば、迅速かつ効率的に多種・多量のリポソームを調製する製造装置１を提供できた。製造装置１は、円筒型の反応容器２と偏心モータ３を備えた比較的小型の機械装置部分と、超音波処理装置６とを組み込んで、コンピュータ１５により自動制御することにより、各種のリポソーム（特に、リポソームワクチン）を迅速かつ効率的に製造できた。
【符号の説明】
【００６０】
１…多機能リポソーム自動製造装置（リポソームワクチン自動製造装置）
２…反応容器
２Ａ…反応空間
３…偏心モータ
４…ヒータ
５…温度センサ
６…超音波処理装置
９…不活性ガスボンベ
１０…真空ポンプ
１１…有機溶媒回収装置
１５…コンピュータ
２４…揺動保持機構
Ｂ１〜Ｂ１０…ボトル
ＳＰ１〜ＳＰ７…シリンジポンプ
Ｔ４１…ライン（減圧ライン）
Ｔ４２…ライン（不活性ガスライン）
Ｔ４３…ライン（不活性ガスライン）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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