(57)【要約】  皮下脂肪と真皮との相互作用に基づいて、たるみ、しわ等の皮膚の弾性の低下を伴う皮膚状態の悪化を防止する美容方法を開発する。  本発明は、皮下脂肪の増加を抑制するステップを含むことを特徴とする、皮膚の弾性特性の低下の防止方法を提供する。本発明の皮膚の弾性特性の低下の防止方法において、前記皮下脂肪の増加を抑制するステップは、温熱刺激を与えるステップを含む場合がある。本発明の皮膚の弾性特性の低下の防止方法において、前記皮下脂肪の増加を抑制するステップは、皮下脂肪の増加を抑制する組成物を被験者に投与するステップを含む場合がある。本発明は、本発明の皮膚の弾性特性の低下の防止方法を皮膚に適用することを特徴とする、皮膚の弾性の低下を伴う皮膚状態の悪化を防止する美容方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮下脂肪の増加を抑制するステップを含むことを特徴とする、皮膚の弾性特性の低下の防止方法。
【請求項２】
前記皮下脂肪の増加を抑制するステップは、温熱刺激を与えるステップを含むことを特徴とする、請求項１に記載の皮膚の弾性特性の低下の防止方法。
【請求項３】
前記皮下脂肪の増加を抑制するステップは、皮下脂肪の増加を抑制する組成物を被験者に投与するステップを含むことを特徴とする、請求項１に記載の皮膚の弾性特性の低下の防止方法。
【請求項４】
請求項１ないし３に記載の皮膚の弾性特性の低下の防止方法を皮膚に適用することを特徴とする、皮膚の弾性の低下を伴う皮膚状態の悪化を防止する美容方法。
【請求項５】
皮下脂肪の増加を抑制するステップを含むことを特徴とする、真皮層の細胞外マトリクス成分の減少の防止方法。
【請求項６】
前記皮下脂肪の増加を抑制するステップは、温熱刺激を与えるステップを含むことを特徴とする、請求項５に記載の真皮層の細胞外マトリクス成分の減少の防止方法。
【請求項７】
前記皮下脂肪の増加を抑制するステップは、皮下脂肪の増加を抑制する組成物を被験者に投与するステップを含むことを特徴とする、請求項５に記載の真皮層の細胞外マトリクス成分の減少の防止方法。
【請求項８】
前記細胞外マトリクス成分は、コラーゲン、エラスチン及びヒアルロン酸のうち少なくとも１つであることを特徴とする、請求項５ないし７のいずれか１つに記載の細胞外マトリクス成分の減少の防止方法。
【請求項９】
請求項５ないし８に記載の真皮層の細胞外マトリクス成分の減少の防止方法を皮膚に適用することを特徴とする、しわ及びたるみを防止する美容方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は美容方法に関し、特に、皮下脂肪の増加を抑制することによって皮膚の弾性特性の低下を防止する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は表皮、真皮、皮下組織等から構成されている。皮膚は体の内側を支える支持組織としても機能しており、その物性は外界からの物理的刺激に対する防御や、内部組織の定位などに重要である。この皮膚の物性、特に皮膚粘弾性が何らかの原因により低下することで、たるみの増悪に繋がることが示されている（非特許文献１)。従来皮膚の粘弾性の低下に関しては紫外線や加齢の影響が検討されてきたが、皮下脂肪の影響に関しては知られていなかった。例えば、非特許文献２は、「顔面においては、皮下脂肪が厚いほどたるみ量が少ない傾向が認められるとの結果に基づいて、顔面部程度の皮下脂肪量であれば、形態的にふっくらとして皮膚に緊張を与えはりのある形状となり、たるみを抑える方向に作用する。しかし、体幹部のように皮下脂肪量が顔面部の１０倍にもなってしまうとその重さを皮膚が支えきれなくなり、重力の影響を受けて垂れ下がった形状となり、たるみの発生へ影響していることが考えられる。」との仮説を提唱した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ａｈｎ，Ｓ．ら、Ｓｋｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：２８０−２８４．
【非特許文献２】Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｍ．ら、香粧会誌、２１：１９０−１９６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
たるみ、しわ等の皮膚の粘弾性の低下を伴う皮膚状態の悪化は美容上の重大な関心事であるが、その有効な防止方法はこれまでほとんどなかった。皮下脂肪と真皮との相互作用に基づいて、たるみ、しわ等の皮膚の弾性の低下を伴う皮膚状態の悪化を防止する美容方法を開発することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、皮下脂肪の増加にともなって、皮膚の弾性特性が低下することを見出した。また皮下脂肪の増加した真皮層においては、マトリックス分解酵素（ＭＭＰ）が増加し、線維芽細胞の数が減少することを見出した。また、肥大化脂肪細胞は、線維芽細胞の増殖だけでなく、線維芽細胞による細胞外マトリクス成分の産生をも抑制することを見出した。これらの発見は、皮下脂肪の増加にともない、真皮層、とくに真皮層の細胞外マトリクスを構成するコラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸等の細胞外マトリクス成分が減少すると、皮膚の粘弾性が低下することを示す。そこで皮下脂肪の増加を抑制することにより、皮膚の弾性特性の低下を防止する方法と、該方法を皮膚に適用することによって、皮膚の粘弾性の低下を伴う皮膚状態の悪化を防止する美容方法とに関する本発明を想到した。【０００６】
本発明は、皮下脂肪の増加を抑制するステップを含むことを特徴とする、皮膚の弾性特性の低下の防止方法を提供する。【０００７】
本発明の皮膚の弾性特性の低下の防止方法において、前記皮下脂肪の増加を抑制するステップは、温熱刺激を与えるステップを含む場合がある。【０００８】
本発明の皮膚の弾性特性の低下の防止方法において、前記皮下脂肪の増加を抑制するステップは、皮下脂肪の増加を抑制する組成物を被験者に投与するステップを含む場合がある。【０００９】
本発明は、本発明の皮膚の弾性特性の低下の防止方法を皮膚に適用する、皮膚の弾性の低下を伴う皮膚状態の悪化を防止する美容方法を提供する。【００１０】
本発明は、皮下脂肪の増加を抑制するステップを含む、真皮層の細胞外マトリクス成分の減少の防止方法を提供する。【００１１】
本発明の真皮層の細胞外マトリクス成分の減少の防止方法において、前記皮下脂肪の増加を抑制するステップは、温熱刺激を与えるステップを含む場合がある。【００１２】
本発明の真皮層の細胞外マトリクス成分の減少の防止方法において、前記皮下脂肪の増加を抑制するステップは、皮下脂肪の増加を抑制する組成物を被験者に投与するステップを含む場合がある。【００１３】
本発明は、本発明の真皮層の細胞外マトリクス成分の減少の防止方法を皮膚に適用する、皮膚の弾性の低下を伴う皮膚状態の悪化を防止する美容方法を提供する。【００１４】
本発明の真皮層の細胞外マトリクス成分の減少の防止方法において、前記細胞外マトリクス成分は、コラーゲン、エラスチン及びヒアルロン酸のうち少なくとも１つの場合がある。【００１５】
本発明は、本発明の真皮層の細胞外マトリクス成分の減少の防止方法を皮膚に適用することを含む、しわ及びたるみを防止する美容方法を提供する。【００１６】
本発明は、皮下脂肪の増加を抑制する組成物を含む、皮膚の弾性の低下を伴う皮膚状態の悪化を防止するための組成物を提供する。【００１７】
本明細書において「しわ」とは、肌のトラブルの一種であって、皮表の線状陥没が作り出す紋様が、特定の領域に集中して、かつ、大きさ及び配列の不規則性をもって存在する状態を指す。【００１８】
本明細書において「たるみ」とは、肌のトラブルの一種であって、皮膚の張りが失われて、眼又は口の周囲と頬下とを含む顔の全域、顎、首等に皮膚の膨らみが観察される状態を指す。【００１９】
本明細書において「マトリクス分解酵素（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＭＭＰ）」とは、金属、特に亜鉛と結合し、細胞外マトリクスの構成成分のほとんどを切断する活性を有するＭＭＰファミリーに属する酵素をいう。ＭＭＰには２５個以上のファミリーのメンバー酵素が同定されている。ＭＭＰのメンバー酵素のアミノ酸及びポリヌクレオチド配列については、ＯＭＩＭ（登録商標、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ）データベースを含む米国ＮＣＢＩのサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/gquery）から検索することができる。ＭＭＰファミリーのメンバーのうち、ＭＭＰ２及び９はタイプＩＶコラーゲンを主に分解する酵素である。ＭＭＰ３はタイプＩＶコラーゲンの他、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニンを分解する酵素である。ＭＭＰ１２は不溶性エラスチンを分解する酵素である。ＭＭＰ１３は軟骨に含まれるタイプＩＩコラーゲンを分解する酵素である。ＭＭＰ１４はＭＭＰ２の前駆体を切断する酵素である。ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９及びＭＭＰ１４は白色脂肪細胞で発現するが、これらのうちＭＭＰ１４遺伝子のノックアウトマウスは白色脂肪細胞の分化異常を起こすとの報告がある（Ｃｈｕｎ，  Ｔ−Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ，１２５：５７７−５９１．）。【００２０】
本発明における皮下脂肪の増加を抑制するステップは、食餌制限、運動、温熱刺激、皮下脂肪の増加を抑制する組成物の被験者への投与を含むがこれらに限定されないさまざまな手段によって達成される。【００２１】
本発明における温熱刺激は、皮下脂肪の増加を抑制するいずれかの条件での温熱刺激をいう。皮下脂肪に４１ないし４３°Ｃ、３０ないし９０分間の温熱刺激を与えることが好ましく、皮下脂肪に４１．５ないし４３°Ｃ、６０分間の温熱刺激を与えることがさらに好ましい。前記温熱刺激は、本発明の発明者によって２００８年１０月１７日に特許商標庁に出願された米国特許出願第１２／２５３，７５８号明細書に詳しく説明され、該明細書は引用によりその全体が本明細書に取り込まれる。【００２２】
本発明における皮下脂肪の増加を抑制する組成物は、脂質蓄積阻害剤、脂質合成阻害剤、食欲抑制剤、脂肪細胞の分化抑制剤、脂肪細胞の増殖抑制剤、脂質代謝改善剤等を含むが、これらに限られない。前記脂質蓄積阻害剤には、膵臓で産生されるリパーゼの阻害剤（特開２００１−２２６２７４）、肝臓と血中のトリグリセリドの分解と排泄を促進するエラスターゼ等が含まれるが、これらに限られない。前記脂質合成阻害剤には、プラバスタチンナトリウムのようなＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬と、核内受容体のＰＰＡＲ−αに作用して、脂質合成に関わる蛋白の合成を制御するフィブラート系薬剤とが含まれるが、これらに限られない。前記食欲抑制剤には、マジンドール、レプチン等が含まれるが、これらに限られない。前記脂肪細胞の分化抑制剤には、アカネ、アマチャ等の抽出物（特開２００２−１３８０４４）等が含まれるが、これらに限られない。前記脂肪細胞の増殖抑制剤には、ジホモ−γ−リノレン酸（特開２００６−３０６８１３）等が含まれるが、これらに限られない。前記脂質代謝改善剤には、ピオグリタゾンのようなチアゾリジン系インスリン感受性改善剤等が含まれるが、これらに限られない。【００２３】
本発明において、真皮層、皮下脂肪及び皮筋の厚さと、皮膚の弾性特性と、真皮細胞外マトリクス成分の量と、マトリックス分解酵素量と、線維芽細胞数との測定は、美容分野の当業者に周知のいかなる測定方法を使用して実施されてもかまわない。【００２４】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】背側皮膚の組織標本における真皮層の厚さを示すグラフ。
【図２】背側皮膚の組織標本における皮筋部分の厚さを示すグラフ。
【図３】給餌期間終了後の耳介先端部皮膚における真皮層の厚さを示すグラフ。
【図４】背側皮膚の真皮細胞の単位面積あたりの細胞数を表すグラフ。
【図５】実験群及び対照群の皮膚組織におけるざまざまなＭＭＰファミリー遺伝子の発現量を示すグラフ。
【図６Ａ】キュートメーターの測定結果の一般的な波形図。
【図６Ｂ】高脂肪食実験群ヘアレスマウス（ＨＦＤ）と、対照群ヘアレスマウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とのＵｆ及びＵａを比較したグラフ。
【図６Ｃ】高脂肪食実験群ヘアレスマウス（ＨＦＤ）と、対照群ヘアレスマウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とのＵａ／Ｕｆと、Ｕｒ／Ｕｆと、Ｕｒ／Ｕｅとを比較したグラフ。
【図７Ａ】起き上がった状態のヒトの下頬部皮膚を示す写真。
【図７Ｂ】仰臥状態のヒトの下頬部皮膚を示す写真。
【図７Ｃ】下頬部の皮膚の超音波断層写真。
【図８Ａ】皮膚の粘弾性特性（Ｕｅ）と皮下脂肪層厚との相関関係を示すグラフ。
【図８Ｂ】皮膚の粘弾性特性（Ｕｒ）と皮下脂肪層厚との相関関係を示すグラフ。
【図８Ｃ】皮膚の粘弾性特性（Ｕｆ）と皮下脂肪層厚との相関関係を示すグラフ。
【図８Ｄ】皮膚の粘弾性特性（Ｕａ）と皮下脂肪層厚との相関関係を示すグラフ。
【図８Ｅ】皮膚の粘弾性特性（Ｕａ／Ｕｆ）と皮下脂肪層厚との相関関係を示すグラフ。
【図８Ｆ】皮膚の粘弾性特性（−Ｕｖ／Ｕｒ）と皮下脂肪層厚との相関関係を示すグラフ。
【図９Ａ】皮膚の粘弾性特性（Ｕｒ）と年齢との相関関係を示すグラフ。
【図９Ｂ】皮膚の粘弾性特性（−Ｕｖ）と年齢との相関関係を示すグラフ。
【図９Ｃ】皮膚の粘弾性特性（−（Ｕｆ−Ｕａ））と年齢との相関関係を示すグラフ。
【図９Ｄ】皮膚の粘弾性特性（Ｕａ／Ｕｆ）と年齢との相関関係を示すグラフ。
【図９Ｅ】皮膚の粘弾性特性（Ｕｒ／Ｕｅ）と年齢との相関関係を示すグラフ。
【図９Ｆ】皮膚の粘弾性特性（Ｕｒ／Ｕｆ）と年齢との相関関係を示すグラフ。
【図１０Ａ】３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化誘導始後１０日目（左）と、２５日目（右）とがオイルレッドＯ染色された顕微鏡写真。
【図１０Ｂ】３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化誘導開始後の脂肪蓄積量の変化を示すグラフ。
【図１０Ｃ】共培養実験の模式図。
【図１１】共培養下の線維芽細胞の増殖に対する脂肪細胞に分化誘導された３Ｔ３−Ｌ１細胞の影響を示すグラフ。
【図１２】共培養下の線維芽細胞のコラーゲン産生に対する脂肪細胞に分化誘導された３Ｔ３−Ｌ１細胞の影響を示すグラフ。
【図１３】共培養下の線維芽細胞のエラスチン産生に対する脂肪細胞に分化誘導された３Ｔ３−Ｌ１細胞の影響を示すグラフ。
【図１４】共培養下の線維芽細胞のヒアルロン酸産生に対する脂肪細胞に分化誘導された３Ｔ３−Ｌ１細胞の影響を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は請求の範囲の記載によってのみ限定される。
【００２７】
以下の実施例に説明される研究は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）のガイドラインに従って資生堂リサーチセンターの倫理委員会によって承認された後に実施された。
【実施例１】
【００２８】
背側皮膚の真皮層及び皮下脂肪の細胞数計測
材料及び方法
ヘアレスマウス（ＨＲ−１、雄６週齢、星野実験動物飼育所）を用いた。実験群として６匹のヘアレスマウスに高脂肪食（脂質３０％含有、オリエンタル酵母工業株式会社）を１２週間給餌して高脂肪食が真皮層の厚さに及ぼす影響を調べた。対照群として６匹のヘアレスマウスに通常食を１２週間給餌した。給餌期間終了後に、実験群及び対照群のヘアレスマウスの背側及び耳介先端部の皮膚を採取した。採取された皮膚を１０％ホルマリン固定後、パラフィン包埋し、薄切切片を作製してヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色を行なった。薄切切片の作製及びＨＥ染色は、当業者に周知の標準的な方法に従って実施された。【００２９】
結果
背側皮膚の組織学的所見
前記給餌期間終了後に採取された背側の皮膚から薄切切片を作製し、ＨＥ染色を行なって組織標本を作成し、光学顕微鏡で観察した。対照群と比較して実験群の背側皮膚の組織標本では、皮下脂肪が増加し、真皮層が顕著に減少することが観察された。この結果から、皮下脂肪の増加にともなって真皮層は減少する傾向が認められた。【００３０】
図１は、前記背側皮膚の組織標本における真皮層の厚さを示すグラフである。実験群及び対照群の６匹の動物個体の背側皮膚の真皮層の厚さの測定値の平均値は、それぞれ、実験群では２８０μｍであり、対照群では３８０μｍであった。前記グラフの誤差棒は実験群及び対照群のそれぞれ６匹の動物個体の真皮層の厚さの測定値の標準偏差を示す。また、グラフ中でアステリスク（＊＊＊）で表される実験群及び対照群の平均値の有意差についてステューデントｔ検定を行ったところ、ｐ値は０．１％未満であった。そこで対照群と比較して実験群における真皮層が減少していることは統計学的に有意である。この結果から、背側皮膚においては皮下脂肪の増加にともなって真皮層が顕著に減少することが示された。【００３１】
図２は、前記背側皮膚の組織標本における皮筋部分の厚さを示すグラフである。実験群及び対照群の６匹の動物個体の背側皮膚の皮筋部分の厚さの測定値の平均値は、それぞれ、実験群では５７μｍであり、対照群では５２μｍであった。前記グラフの誤差棒は実験群及び対照群のそれぞれ６匹の動物個体の皮筋部分の厚さの測定値の標準偏差を示す。実験群及び対照群の平均値は統計学的に有意な差がなく（ｎ．ｓ．）、実験群及び対照群の皮筋部分の厚さに差がないことがわかった。なお、実験群及び対照群の表皮層の厚さについても同様に差がなかった（図示されない）。これらの結果から、背側皮膚組織の厚さの変化は真皮層だけに特異的であるといえる。そこで真皮層の減少は、高脂肪食を給餌されたマウス個体の成長及び肥満に伴う物理的な伸展のためでないと考えられる。【００３２】
耳介先端部皮膚の組織学的所見
背側皮膚における真皮層の顕著な減少と皮下脂肪の増加との因果関係を調べるために皮下脂肪の無いマウスの耳介先端部の組織が検討された。図３は前記給餌期間終了後の耳介先端部皮膚における真皮層の厚さを示すグラフである。実験群及び対照群の６匹の動物個体の耳介先端部の真皮層の厚さの測定値の平均値は、それぞれ、実験群では３２μｍであり、対照群では３０μｍであった。前記グラフの誤差棒は実験群及び対照群のそれぞれ６匹の動物個体の真皮層の厚さの測定値の標準偏差を示す。実験群及び対照群の平均値は統計学的に有意な差がなく（ｎ．ｓ．）、皮下脂肪が存在しない耳介先端部において実験群及び対照群の真皮層の厚さに差がないことがわかった。【００３３】
以上の組織学的所見から、真皮層の減少の原因が皮下脂肪の増加による可能性が示唆された。そこで、さらにいかなる機序で真皮層が減少したのかを検討した。
【実施例２】
【００３４】
真皮層の細胞数計測
図４は前記背側皮膚の真皮細胞の単位面積あたりの細胞数を表すグラフである。実験群及び対照群の６匹の動物個体の背側皮膚の単位面積あたりの真皮細胞数の平均値は、それぞれ、１．３個及び２個であった。本実験条件の誤差棒は単位面積あたりの真皮細胞数の標準偏差を示す。また、グラフ中でアステリスク（＊＊）で表される実験群及び対照群の単位面積あたりの真皮細胞数の平均値の有意差についてステューデントｔ検定を行ったところ、ｐ値は１％未満であった。そこで実験群における線維芽細胞の減少は対照群と比較して統計学的に有意である。この結果から、脂肪細胞の増加にともなって線維芽細胞の数は顕著に減少することが示された。
【実施例３】
【００３５】
マトリックス分解酵素遺伝子の発現量の定量的分析
材料及び方法
前記給餌期間終了後に、実験群及び対照群のヘアレスマウスの背側皮膚組織を採取し、定法に従って、該組織からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。該ｃＤＮＡを鋳型とするリアルタイムＰＣＲ法によってさまざまなＭＭＰ遺伝子の発現量を測定した。前記ＭＭＰ遺伝子の発現量はグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の発現量で標準化され、対照群での発現量を１００％とした。【００３６】
結果
図５は、実験群及び対照群の皮膚組織におけるざまざまなＭＭＰファミリー遺伝子の発現量を示すグラフである。本実施例では、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３及びＭＭＰ１４遺伝子の発現量が測定された。その結果、対照群の発現量と比較して、ＭＭＰ２の相対発現量は１２０％、ＭＭＰ３の相対発現量は１５０％、ＭＭＰ９の相対発現量は１３０％、ＭＭＰ１１の相対発現量は１８０％、ＭＭＰ１２の相対発現量は１７０％、ＭＭＰ１３の相対発現量は１２０％、ＭＭＰ１４の相対発現量は１５０％であった。前記グラフの誤差棒は実験群及び対照群のそれぞれ６匹の動物個体の発現量測定値の標準偏差を示す。図５のグラフから、通常食を給餌されたヘアレスマウスよりも、高脂肪食を給餌されたヘアレスマウスの方がいずれのＭＭＰ遺伝子についても発現量が多いことが明かになった。この結果から、前記ＭＭＰ遺伝子の発現量の増大にともなって真皮層は減少することが示された。【００３７】
背側組織標本を高倍率の光学顕微鏡で観察すると、真皮層と皮下脂肪との境界が、対照群では比較的平坦であるのに対し、実験群では真皮層に皮下脂肪がくいこむように陥入する像が認められた（図示されない）。そこで、主にコラーゲンで形成される真皮層の細胞外マトリクスがＭＭＰによって分解されることにより、真皮の層状構造に乱れが生じて皮下脂肪細胞の浸潤を許していることが示唆される。
【実施例４】
【００３８】
マウス皮膚粘弾性特性の測定
陰圧吸引による非侵襲的な生体皮膚粘弾性測定装置であるキュートメーター（Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ）ＭＰＡ５８０（登録商標、ドイツ、ケルン市、Ｃｏｕｒａｇｅ  ａｎｄ  Ｋｈａｚａｋａ）が用いられた。マウスでは、ペントバルビタールの腹腔内注射によって麻酔がかけられたマウスに２ｍｍ径のプローブを用いて５０ｍｂａｒの陰圧で２秒間背中の皮膚が吸引され、その後、常圧に戻して２秒間の緩和時間で皮膚が戻る様子が、波形図で記録された。皮膚粘弾性のパラメーターは、Ｄｅｌｅｉｘｈｅ−Ｍａｕｈｉｎ、Ｆ．ら、（Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １９：１３０−１３３（１９９４））に基づいて決定された。【００３９】
結果
図６Ａはキュートメーターの測定結果の一般的な波形図である。縦軸は皮膚の変位の相対値を表し、横軸は時間経過である。波形の上向きの部分は陰圧で吸引された皮膚の変形状態を表し、波形の下向きの部分は陰圧が解除されたときの皮膚が戻る状態を表す。Ｕｆは最大吸引値（ｆｉｎａｌ  ｄｉｓｔｅｎｔｉｏｎ）、Ｕｅは弾性変形成分（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｄｉｓｔｅｎｔｉｏｎ）、Ｕｖは粘弾性成分（ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃ  ｃｒｅｅｐ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ｔｈｅ  ｅｌａｓｔｉｃ  ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、Ｕｒは弾性回復成分（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ）、Ｕａは全変形回復値（ｆｉｎａｌ  ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ）を表す。【００４０】
図６Ｂは、実施例１で説明された高脂肪食を１２週間給餌されたヘアレスマウス（ＨＦＤ）と、通常食を１２週間給餌されたヘアレスマウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とのＵｆ（最大吸引値）及びＵａ（全変形回復値）を比較したグラフである。図６Ｃは、高脂肪食を１２週間給餌された実験群のヘアレスマウス（ＨＦＤ）と、通常食を１２週間給餌された対照群のヘアレスマウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）とのＵａ／Ｕｆ（粘弾性変形を含む皮膚の全弾性度）と、Ｕｒ／Ｕｆ（生物学的弾性度）と、Ｕｒ／Ｕｅ（全弾性度）とを比較したグラフである。図６Ｂ及びＣから、実験群の皮膚弾性パラメーターは、対照群より有意に減少していた。グラフの誤差棒は、実験群及び対照群のそれぞれ６匹の動物個体の皮膚弾性パラメーターの標準偏差を示す。グラフ中の記号（＋、＊、＊＊及び＊＊＊）で表される実験群及び対照群の平均値の有意差についてステューデントｔ検定を行ったところ、ｐ値は、それぞれ、１０％未満、５％未満、１％未満及び０．１％未満であった。そこで対照群と比較して実験群における皮膚弾性度のパラメーターが減少していることは統計学的に有意である。
【実施例５】
【００４１】
ヒトの顔面皮膚の粘弾性特性の測定
被検者
健康な女性ボランティア被検者を、３０歳代１７名、４０歳代３６名及び５０歳代１７名集めた。これらの女性被検者は、ＢＭＩが１７．１ないし３６．２ｋｇ／ｍ２で、薬の服用がなく、外科手術を受けた経験がなく、非喫煙者で、糖尿病歴がない。【００４２】
図７Ａは被検者が座位の下頬部皮膚を示す写真である。波線はマリオネットライン（たるみが重力に逆らえなくなってできるしわ）を表し、矢印は凸状の頬の領域を表し、矢尻は下顎の輪郭を表す。図７Ｂは同じ被検者が仰臥状態で首を４５度傾げて頬を水平にしたときの下頬部皮膚を示す写真である。白丸は、口角から３ｃｍ離れた頬の中心を表す。被検者が座位では下頬部の皮膚は重力のために垂れ下がってたるみが観察される（図７Ａ）が、同じ被検者が仰臥状態で首を４５度傾げて頬を水平にしたときにはたるみは観察されない。そこで、被検者が仰臥状態で首を４５度傾げて頬を水平にして、頬の中央（図７Ｂの白丸）でキュートメーターによる皮膚粘弾性特性測定と、超音波断層撮影（エコー）による皮下脂肪層厚の測定とが行われた。【００４３】
皮膚粘弾性特性の測定
実施例４と同じキュートメーターを用いて顔面の皮膚粘弾性特性の測定を行った。測定の手順は、加える陰圧が４００ｍｂａｒであること、口角から３ｃｍの頬の中心の皮膚を、被検者が仰臥状態で首を４５度傾げて頬を水平にした状態で測定することを除いて、実施例４と同じであった。【００４４】
顔面の皮下脂肪層厚の測定
被検者が仰臥状態で首を４５度傾げて頬を水平にした状態で、口角から３ｃｍの頬の中心の皮膚に超音波用ジェルの薄層を塗布され、その上に超音波断層撮影装置（Ｐｒｏｓｏｕｎｄ  ａｌｐｈａ５（登録商標）、アロカ）の１３ＭＨｚプローブが皮膚に垂直に押し当てられ、皮下組織がＢモードで撮影された。皮下脂肪層厚は、真皮の下から口腔粘膜の上までの、表情筋の薄い層を含む距離として定義される。【００４５】
結果
図８ＡないしＦは、顔面皮膚の弾性特性と皮下脂肪層厚との相関関係を示すグラフである。それぞれの点は被検者ごとの皮膚の弾性特性パラメーターと顔面の皮下脂肪層厚とを表す。データはピアソンの相関係数を算出して評価された。いずれの皮膚弾性パラメーターについても、顔面の皮下脂肪層厚との間で統計的に有意な負の相関が認められた。図９ＡないしＦは、顔面の皮膚の弾性特性と年齢との相関関係を示すグラフである。それぞれの点は被検者ごとの顔面の皮膚の弾性特性パラメーターと年齢とを表す。データはピアソンの相関係数を算出して評価された。いずれの皮膚弾性パラメーターについても、年齢との間で統計的に有意な負の相関が認められた。ここで、顔面の皮下脂肪層厚と年齢との間には何らの相関関係も認められなかった（図示されない）。そこで、顔面の皮下脂肪層厚の増大は、年齢とは独立に顔面の皮膚の弾性特性に関与する可能性がある。
【実施例６】
【００４６】
ヒトの下頬部のたるみの評価
たるみの程度は、Ｅｚｕｒｅ、Ｔ．ら（Ｓｋｉｎ  Ｒｅｓ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１５：２９９−３０５（２００９））の基準に従って評価された。簡潔には、座位で撮影された被検者の下頬部の写真が頬の膨満領域の垂れ下がりの程度と、マリオネットラインの形成の程度とについての基準を基にして、６段階に評価された。【００４７】
結果
顔面の皮膚弾性特性のパラメーターのＵａ／Ｕｒと、下頬部のたるみの程度との相関係数ｒは−０．３５８で、スペアマン検定でのｐ値は０．００２であった。一方、皮下脂肪層厚と、下頬部のたるみの程度との相関係数ｒは０．４４２で、スペアマン検定でのｐ値は１×１０−４であった。したがって、皮下脂肪層厚の増大と、顔面皮膚弾性特性の低下とは、両方とも、顔面皮膚のたるみとの間で統計的に有意な相関関係が認められた。
【実施例７】
【００４８】
共培養下の線維芽細胞の増殖及び細胞外マトリクス成分産生に対する脂肪細胞の影響
線維芽細胞としてマウス３Ｔ３−Ｌ１細胞が使用され、脂肪細胞として、培養下で３Ｔ３−Ｌ１から分化誘導された脂肪細胞が使用された。３Ｔ３−Ｌ１細胞はウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が１０％添加されたダルベッコ変法ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培養液で増殖された。３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化誘導は以下のとおり処理された。すなわち、共培養用の６穴マルチウェルプレート（セルカルチャーインサート・コンパニオンプレート、ＢＤファルコン）に１ウェルあたり７．５×１０４個の３Ｔ３−Ｌ１細胞が播種され、インスリン、デキサメタゾン及びイソブチルメチルキサンチン（最終濃度それぞれ０．２、０．３及び２００マイクロモル）を含むＦＢＳ１０％添加ＤＭＥＭ培養液中、３７°Ｃで２日間培養された。その後前記細胞は、インスリン（０．２マイクロモル）のみを含むＦＢＳ１０％添加ＤＭＥＭ培養液中、３７°Ｃで２日間培養された。分化誘導処理後の３Ｔ３−Ｌ１細胞はＦＢＳ１０％添加ＤＭＥＭ培養液中、３７°Ｃで培養された。分化誘導処理された３Ｔ３−Ｌ１の脂肪細胞は、分化誘導処理開始後７日目又は２０日目に、分化誘導処理されない３Ｔ３−Ｌ１の線維芽細胞との共培養に供された。分化誘導処理されないままＦＢＳ１０％添加ＤＭＥＭ培養液中で培養された３Ｔ３−Ｌ１の線維芽細胞は、ウェル内に懸架可能な容器（細胞は透過できないが、培養液中の成分は自由に透過できる、セルカルチャーインサート、孔径１．０μｍ、孔密度１．６×１０６個／ｃｍ２、ＢＤファルコン）に、１ウェルあたり３×１０４個播種された。前記脂肪細胞及び線維芽細胞は、両方とも、ＦＢＳ０．５％添加ＤＭＥＭ培養液に切り替えられてから１２時間後に共培養された。対照実験では、前記容器中に播種された線維芽細胞が、ＦＢＳ０．５％添加ＤＭＥＭ培養液のウェル中で単独培養された。２日間の共培養の後、前記容器内の線維芽細胞が回収され、細胞増殖がアラマーブルー法で定量された。線維芽細胞によるコラーゲン、エラスチン及びヒアルロン酸産生は、それぞれ、Ｉ型コラーゲン、エラスチン及びヒアルロン酸合成酵素の遺伝子発現量がＲＴ−ＰＣＲ法によって定量測定された。【００４９】
結果
図１０Ａは、３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化誘導開始後１０日目（左）と、２５日目（右）とにオイルレッドＯで染色された顕微鏡写真である。白い線で囲まれた範囲が１個の脂肪細胞である。図１０Ｂは、分化誘導開始後の脂肪蓄積量の変化を示すグラフである。図１０Ａ及びＢから明らかなとおり、分化誘導１０日目で既に脂肪細胞が形成されていた。その後、分化誘導２５日目になると、脂肪細胞は肥大化し、脂肪蓄積量はピークに達する。以下では、分化誘導１０日目前後の脂肪細胞を小型脂肪細胞といい、分化誘導２５日目前後の脂肪細胞を肥大化脂肪細胞という。【００５０】
図１０Ｃは共培養実験の模式図である。マルチウェルプレートの各ウェルに３Ｔ３−Ｌ１から分化した脂肪細胞が培養され、分化誘導開始７日目又は２０日目から２日間、分化誘導されない３Ｔ３−Ｌ１の線維芽細胞が播種された容器が前記各ウェルに懸架される。前記容器は、細胞を透過しないが培養液成分を透過できる膜を有する。そこで、前記線維芽細胞及び脂肪細胞は可溶性因子を介して相互作用をすることができる。【００５１】
図１１は、共培養下の線維芽細胞の増殖に対する脂肪細胞の影響を示すグラフである。単独培養での線維芽細胞の増殖率と、小型脂肪細胞又は肥大化脂肪細胞との共培養での線維芽細胞の増殖率とが、３個のウェルについて測定された。グラフの高さは前記増殖率の平均値を示し、グラフの誤差棒は前記増殖率の標準偏差を示す。単独培養での線維芽細胞の増殖率と、脂肪細胞との共培養での線維芽細胞の増殖率との平均値の有意差（＊＊）についてステューデントｔ検定を行ったところ、ｐ値は１％未満であった。図１１から明らかなとおり、小型脂肪細胞は線維芽細胞の増殖に影響を与えなかったが、肥大化脂肪細胞は統計的に有意に線維芽細胞の増殖を抑制した。【００５２】
図１２は、共培養下のコラーゲン産生に対する脂肪細胞の影響を示すグラフである。単独培養でのウェルあたりのコラーゲン遺伝子発現量と、脂肪細胞との共培養でのウェルあたりのコラーゲン遺伝子発現量とが、３個のウェルについて測定された。グラフの高さは前記コラーゲン遺伝子発現量の平均値を示し、グラフの誤差棒は前記コラーゲン遺伝子発現量の標準偏差を示す。線維芽細胞の単独培養でのウェルあたりのコラーゲン遺伝子発現量と、脂肪細胞との共培養でのウェルあたりのコラーゲン遺伝子発現量との３個のウェルについての平均値の有意差（＊＊）についてステューデントｔ検定を行ったところ、ｐ値は１％未満であった。図１２から明らかなとおり、小型脂肪細胞はコラーゲン産生に影響を与えなかったが、肥大化脂肪細胞は統計的に有意にコラーゲン産生を抑制した。【００５３】
図１３は、共培養下のエラスチン産生に対する脂肪細胞の影響を示すグラフである。単独培養でのウェルあたりのエラスチン遺伝子発現量と、脂肪細胞との共培養でのウェルあたりのエラスチン遺伝子発現量とが、３個のウェルについて測定された。グラフの高さはエラスチン遺伝子発現量の平均値を示し、グラフの誤差棒は標準偏差を示す。線維芽細胞の単独培養でのウェルあたりのエラスチン遺伝子発現量と、脂肪細胞との共培養でのウェルあたりのエラスチン遺伝子発現量との３個のウェルについての平均値の有意差（＊＊）についてステューデントｔ検定を行ったところ、ｐ値は１％未満であった。図１３から明らかなとおり、小型脂肪細胞は線維芽細胞のエラスチン産生に影響を与えなかったが、肥大化脂肪細胞は統計的に有意にエラスチン産生を抑制した。【００５４】
図１４は、共培養下の線維芽細胞のヒアルロン酸産生に対する脂肪細胞に分化誘導された３Ｔ３−Ｌ１細胞の影響を示すグラフである。単独培養でのウェルあたりのヒアルロン酸合成酵素の遺伝子発現量と、脂肪細胞との共培養でのウェルあたりのヒアルロン酸合成酵素の遺伝子発現とが、３個のウェルについて測定された。グラフの高さはヒアルロン酸合成酵素の遺伝子発現量の平均値を示し、グラフの誤差棒はヒアルロン酸合成酵素の遺伝子発現量の標準偏差を示す。線維芽細胞の単独培養でのウェルあたりのヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現量と、脂肪細胞との共培養でのウェルあたりのヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現量との３個のウェルについての平均値の有意差（＊＊）についてステューデントｔ検定を行ったところ、ｐ値は１％未満であった。図１４から明らかなとおり、小型脂肪細胞は線維芽細胞のヒアルロン酸産生に影響を与えなかったが、肥大化脂肪細胞は統計的に有意にヒアルロン酸産生を抑制した。【００５５】
以上の結果から、肥大化脂肪細胞は、線維芽細胞の増殖だけでなく、線維芽細胞による細胞外マトリクス成分の産生をも抑制した。そこで生体内で皮下脂肪層厚が増大すると、真皮の線維芽細胞の増殖が抑制され、真皮の細胞外マトリクス産生が抑制されるため、真皮層の減少や、皮膚の弾性特性の低下が起こることが示唆される。すると、皮下脂肪の増加を抑制することによって、真皮層の減少を防止することができる。皮下脂肪の増加を抑制することによって、皮膚の弾性特性の低下を防止することができる。皮下脂肪の増加を抑制することによって、皮膚の弾性の低下を伴う皮膚状態の悪化を防止することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年3月28日(2011.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮下脂肪の増殖を抑制する組成物を含む、皮膚の弾性特性の低下を防止するための組成物であって、
前記皮下脂肪の増殖を抑制する組成物は、脂質蓄積阻害剤、脂質合成阻害剤、食欲抑制剤、脂肪細胞の分化抑制剤、脂肪細胞の増殖抑制剤、及び、脂質代謝改善剤からなる群から選択される１種類又は２種類以上の組成物を含むことを特徴とする、皮膚の弾性特性の低下を防止するための組成物。
【請求項２】
前記脂質蓄積阻害剤は、リパーゼの阻害剤、及び／又は、エラスターゼであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記脂質合成阻害剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、及び／又は、核内受容体のＰＰＡＲ−αに作用して、脂質合成に関わる蛋白の合成を制御する薬剤であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記食欲抑制剤は、マジンドール、及び／又は、レプチンであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記脂肪細胞の分化抑制剤は、アカネ、及び／又は、アマチャの抽出物であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記脂肪細胞の増殖抑制剤は、ジホモ−γ−リノレン酸であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記脂質代謝改善剤は、チアゾリジン系インスリン感受性改善剤であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１つに記載の組成物を含むことを特徴とする、皮膚の弾性の低下を伴う皮膚状態の悪化を防止するための美容用組成物。
【請求項９】
皮下脂肪の増殖を抑制する組成物を含む、真皮層の細胞外マトリクス成分の減少を防止するための組成物であって、
前記皮下脂肪の増殖を抑制する組成物は、脂質蓄積阻害剤、脂質合成阻害剤、食欲抑制剤、脂肪細胞の分化抑制剤、脂肪細胞の増殖抑制剤、及び、脂質代謝改善剤からなる群から選択される１種類又は２種類以上の組成物を含むことを特徴とする、真皮層の細胞外マトリクス成分の減少を防止するための組成物。
【請求項１０】
前記脂質蓄積阻害剤は、リパーゼの阻害剤、及び／又は、エラスターゼであることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記脂質合成阻害剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、及び／又は、核内受容体のＰＰＡＲ−αに作用して、脂質合成に関わる蛋白の合成を制御する薬剤であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記食欲抑制剤は、マジンドール、及び／又は、レプチンであることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記脂肪細胞の分化抑制剤は、アカネ、及び／又は、アマチャの抽出物であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記脂肪細胞の増殖抑制剤は、ジホモ−γ−リノレン酸であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
前記脂質代謝改善剤は、チアゾリジン系インスリン感受性改善剤であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細胞外マトリクス成分は、コラーゲン、エラスチン及びヒアルロン酸のうち少なくとも１つであることを特徴とする、請求項９ないし１５のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１７】
請求項９ないし１６のいずれか１つに記載の組成物を含むことを特徴とする、しわ及びたるみを防止するための美容用組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成23年9月9日(2011.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮下脂肪の増殖を抑制する組成物を含む、真皮層の細胞外マトリクス成分の減少を防止するための組成物であって、
前記皮下脂肪の増殖を抑制する組成物は、脂質合成阻害剤、食欲抑制剤、脂肪細胞の分化抑制剤、脂肪細胞の増殖抑制剤、及び、脂質代謝改善剤からなる群から選択される１種類又は２種類以上の組成物を含むことを特徴とする、真皮層の細胞外マトリクス成分の減少を防止するための組成物。
【請求項２】
前記脂質合成阻害剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、及び／又は、核内受容体のＰＰＡＲ−αに作用して、脂質合成に関わる蛋白の合成を制御する薬剤であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記食欲抑制剤は、マジンドール、及び／又は、レプチンであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記脂肪細胞の分化抑制剤は、アカネ、及び／又は、アマチャの抽出物であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記脂肪細胞の増殖抑制剤は、ジホモ−γ−リノレン酸であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記脂質代謝改善剤は、チアゾリジン系インスリン感受性改善剤であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞外マトリクス成分は、コラーゲン、エラスチン及びヒアルロン酸のうち少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１つに記載の組成物。