(57)【要約】  本発明は、シリカ粒子中に複数の量子ドットを内包した量子ドット内包シリカナノ粒子であって、当該シリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドットの数が、当該シリカナノ粒子に内包された全量子ドットの数の１０〜７０％の範囲内であることを特徴とし、高輝度の量子ドット内包シリカナノ粒子、その製造方法およびそれを用いた生体物質標識剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカ粒子中に複数の量子ドットを内包した量子ドット内包シリカナノ粒子であって、当該シリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドットの数が、当該シリカナノ粒子に内包された全量子ドットの数の１０〜７０％の範囲内であることを特徴とする量子ドット内包シリカナノ粒子。
【請求項２】
前記シリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数が、当該シリカナノ粒子に内包された全量子ドット数の１５〜５５％の範囲内であることを特徴とする請求項１に記載の量子ドット内包シリカナノ粒子。
【請求項３】
前記シリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数が、当該シリカナノ粒子に内包された全量子ドット数の３０〜５０％の範囲内であることを特徴とする請求項２に記載の量子ドット内包シリカナノ粒子。
【請求項４】
前記量子ドットが、II−VI族化合物、III−Ｖ族化合物、又はIV族元素のいずれかを成分とする量子ドットであることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の量子ドット内包シリカナノ粒子。
【請求項５】
前記量子ドットが、ＩｎＰ又はＩｎＧａＰを成分とする量子ドットであることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の量子ドット内包シリカナノ粒子。
【請求項６】
前記量子ドットが、Ｓｉを成分とする量子ドットであることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の量子ドット内包シリカナノ粒子。
【請求項７】
請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の量子ドット内包シリカナノ粒子であって、その表面が有機分子により修飾されていることを特徴とする量子ドット内包シリカナノ粒子。
【請求項８】
請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の量子ドット内包シリカナノ粒子を製造する量子ドット内包シリカナノ粒子の製造方法であって、下記工程（ａ）〜（ｃ）を有することを特徴とする量子ドット内包シリカナノ粒子の製造方法。
工程（ａ）：含ケイ素アルコキシド化合物と量子ドットを混合して、量子ドット含有液を調製する工程。
工程（ｂ）：有機溶媒、水および塩基を混合して、混合液を調製する工程。
工程（ｃ）：前記工程（ｂ）で調製した混合液をかくはんしているところに、前記工程（ａ）で調製した量子ドット含有液を分割し、間欠的に添加し、反応させる工程。
【請求項９】
請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の量子ドット内包シリカナノ粒子と分子標識物質とを有機分子を介して結合されていることを特徴とする生体物質標識剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シリカ粒子中に複数の量子ドットを内包した高輝度の量子ドット内包シリカナノ粒子、その製造方法、およびそれを用いた生体物質標識剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
半導体ナノ粒子のうち、電子の波長（１０ｎｍ程度）より小さい粒子径を有するナノサイズの粒子は、量子サイズ効果として電子の運動に対するサイズ有限性の影響が大きくなってくるために、バルク体とは異なる特異な物性を示すことが知られている。一般に、ナノ・メートルサイズの半導体物質で量子閉じ込め（ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）効果を示す半導体ナノ粒子は、「量子ドット」とも称されている。このような量子ドットは、半導体原子が数百個から数千個集まった１０数ｎｍ程度以内の小さな塊であるが、励起源から光を吸収してエネルギー励起状態に達すると、量子ドットのエネルギーバンドギャップに相当するエネルギーを放出する。【０００３】
したがって、量子ドットは、量子サイズ効果によりユニークな光学特性を有することが知られている。具体的には、（１）粒子のサイズを制御することにより、様々な波長、色を発光させることができる。（２）吸収帯が広く、単一波長の励起光で様々なサイズの微粒子を発光させることができる。（３）蛍光スペクトルが良好な対称形である。（４）有機色素に比べて耐久性、耐退色性に優れる、といった特徴を有する。【０００４】
一方、小動物を対象としたｉｎ  ｖｉｖｏ光イメージングが注目されており、小動物の生体内の細胞を外部より、生体を傷つけることなく（非侵襲で）観察するような光学系装置が各メーカから販売され始めている。これは、生体内の観察したい部位に選択的に集まるような標識をつけた蛍光材料を生体内に注入し、外部より励起光を照射し出てきた発光を外部でモニターする方法である。生体物質を標識する手段として、分子標識物質をマーカー物質に結合した生体物質標識剤を用いる方法が検討されている。【０００５】
近年、上記マーカー物質として量子ドットを用いる方法が注目されている。例えば、極性官能基を有する高分子を量子ドットの表面に物理的および／又は化学的に結合した生体物質標識剤が検討されている（例えば特許文献１参照）。【０００６】
近年より高感度な生体物質検出を行うため、より高発光強度を有する生体物質標識剤が求められている。その一つとして複数の量子ドットを一つのシリカナノ粒子に内包させる技術が開示されている（例えば特許文献２および３参照）。【０００７】
ところが、特許文献２に開示されている方法により本発明者らが量子ドット内包シリカを作製し、発光強度を測定したところ、その発光強度は内包した量子ドットの個数から予想される値を下回っており、さらなる改善が必要であった。【０００８】
また、特許文献３に開示されている方法は、製造工程において非イオン性の界面活性剤を使用している。非イオン性の界面活性剤は、生体物質の変性などを引き起こす可能性があり、生体物質標識剤として量子ドット内包シリカを使用する場合、界面活性剤の除去工程を追加する必要があり、産業上の課題となっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００３−３２９６８６号公報
【特許文献２】特開２００３−３２１２２６号公報
【特許文献３】国際公開第２００７／０３４８７７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、高輝度の量子ドット内包シリカナノ粒子とその製造方法を提供することである。また、それを用いた生体物質標識剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、従来法で得られる量子ドット内包シリカナノ粒子は、シリカナノ粒子の中央部に量子ドットが集中していることが原因で、発光の強度の低下が起こっていることを見出した。複数量子ドットを、従来よりもシリカナノ粒子全体に分散させることで高輝度量子ドット内包シリカナノ粒子、およびそれを用いた生体物質標識剤を得ることができることを見出し、本発明に至った。【００１２】
すなわち、本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。【００１３】
１．シリカ粒子中に複数の量子ドットを内包した量子ドット内包シリカナノ粒子であって、当該シリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドットの数が、当該シリカナノ粒子に内包された全量子ドットの数の１０〜７０％の範囲内であることを特徴とする量子ドット内包シリカナノ粒子。【００１４】
２．前記シリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数が、当該シリカナノ粒子に内包された全量子ドット数の３０〜５０％の範囲内であることを特徴とする前記１に記載の量子ドット内包シリカナノ粒子。【００１５】
３．前記量子ドットが、II−VI族化合物、III−Ｖ族化合物、又はIV族元素のいずれかを成分とする量子ドットであることを特徴とする前記１又は前記２に記載の量子ドット内包シリカナノ粒子。【００１６】
４．前記量子ドットが、ＩｎＰ又はＩｎＧａＰを成分とする量子ドットであることを特徴とする前記１から前記３のいずれか一項に記載の量子ドット内包シリカナノ粒子。【００１７】
５．前記量子ドットが、Ｓｉを成分とする量子ドットであることを特徴とする前記１から前記４のいずれか一項に記載の量子ドット内包シリカナノ粒子。【００１８】
６．前記１から前記５のいずれか一項に記載の量子ドット内包シリカナノ粒子であって、その表面が有機分子により修飾されていることを特徴とする量子ドット内包シリカナノ粒子。【００１９】
７．前記１から前記６のいずれか一項に記載の量子ドット内包シリカナノ粒子を製造する量子ドット内包シリカナノ粒子の製造方法であって、下記工程（ａ）〜（ｃ）を有することを特徴とする量子ドット内包シリカナノ粒子の製造方法。
工程（ａ）：含ケイ素アルコキシド化合物と量子ドットを混合して、量子ドット含有液を調製する工程。
工程（ｂ）：有機溶媒、水および塩基を混合して、混合液を調製する工程。
工程（ｃ）：前記工程（ｂ）で調製した混合液をかくはんしているところに、前記工程（ａ）で調製した量子ドット含有液を分割し、間欠的に添加し、反応させる工程。【００２０】
８．前記１から前記６のいずれか一項に記載の量子ドット内包シリカナノ粒子と分子標識物質とを有機分子を介して結合させたことを特徴とする生体物質標識剤。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の上記手段により、高輝度の量子ドット内包シリカナノ粒子とその製造方法を提供することができる。また、それを用いた生体物質標識剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の量子ドット内包シリカナノ粒子は、シリカ粒子中に複数の量子ドットを内包した量子ドット内包シリカナノ粒子であって、当該シリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドットの数が、当該シリカナノ粒子に内包された全量子ドットの数の１０〜７０％の範囲内であることを特徴とする。この特徴は、請求項１から請求項８に係る発明に共通する技術的特徴である。
【００２３】
本発明の実施態様としては、本発明の効果発現の観点から、前記シリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数が、当該シリカナノ粒子に内包された全量子ドット数の３０〜５０％の範囲内であることが好ましい。
【００２４】
また、当該量子ドットが、II−VI族化合物、III−Ｖ族化合物、又はIV族元素のいずれかを成分とする量子ドットである態様であることが好ましい。この場合、当該量子ドットが、ＩｎＰ又はＩｎＧａＰを成分とする量子ドットであること、又は、Ｓｉを成分とする量子ドットであることが好ましい。さらに、本発明の量子ドット内包シリカナノ粒子は、その表面が有機分子により修飾されていることが好ましい。
【００２５】
本発明の量子ドット内包シリカナノ粒子の製造方法としては、少なくとも前記工程（ａ）〜（ｃ）を有する態様の製造方法であることが好ましい。
【００２６】
本発明の量子ドット内包シリカナノ粒子は、当該シリカナノ粒子と分子標識物質とを有機分子を介して結合させて生体物質標識剤として好適に用いることができる。
【００２７】
以下、本発明とその構成要素、および発明を実施するための最良の形態について詳細な説明をする。
【００２８】
〔シリカナノ粒子の製造方法〕
シリカナノ粒子は、例えば、非特許文献（ジャーナルオブコロイドサイエンス  ２６巻、６２ページ（１９６８年））に記載されているアンモニア水などを用いたアルカリ性条件下でテトラエトキシシランなどの含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解を行う「ストーバー法」と呼ばれる方法により製造することが好ましい。粒径は、添加する水、エタノール、アルカリ量などについて公知の反応条件を適用することで自在に調整でき、平均粒径３０〜８００ｎｍ程度にできる。また粒径のばらつきを示す変動係数は２０％以下とすることができる。
【００２９】
本発明において、平均粒径とは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めた。本願においては、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
【００３０】
〔量子ドット内包シリカナノ粒子の製造方法〕。
【００３１】
本発明の量子ドット内包シリカナノ粒子の製造方法としては、種々の態様の方法を採ることができ、特に制限はないが、基本的には、少なくとも下記工程（ａ）〜（ｃ）を有する態様の製造方法であることが好ましい。
【００３２】
工程（ａ）：含ケイ素アルコキシド化合物と量子ドットを混合して、量子ドット含有液を調製する工程。
【００３３】
工程（ｂ）：有機溶媒、水および塩基を混合して、混合液を調製する工程。
【００３４】
工程（ｃ）：前記工程（ｂ）で調製した混合液をかくはんしているところに、前記工程（ａ）で調製した量子ドット含有液を分割し、間欠的に添加し、反応させる工程。
【００３５】
当該方法は、ストーバー法によりシリカナノ粒子を製造する際に、テトラエトキシシランなどの含ケイ素アルコキシド化合物と量子ドットを予め混合し、さらにその混合液を間欠的に添加する点に特徴がある。
【００３６】
以下、本発明の量子ドット内包シリカナノ粒子の製造工程について、さらに詳しく説明する。
【００３７】
工程（１）：テトラエトキシシランなどの含ケイ素アルコキシド化合物と量子ドットを混合する。
【００３８】
工程（２）：エタノールなどの有機溶媒、水および塩基を混合する。
【００３９】
工程（３）：工程（２）で調製した混合液をかくはんしているところに、工程（１）で調製した量子ドット含有液を間欠的に添加し、反応を進行させる。
【００４０】
工程（４）：反応混合物から生成した量子ドット内包シリカナノ粒子を、ろ過もしくは遠心分離により回収する。
【００４１】
工程（５）：工程（４）で得られた量子ドット内包シリカナノ粒子を有機分子で修飾する。
【００４２】
工程（６）：工程（５）で得られた有機分子修飾した量子ドット内包シリカナノ粒子を分子標識物質と結合させ、生体物質標識剤を得る。
【００４３】
工程（１）で用いられる含ケイ素アルコキシド化合物として、テトラエトキシシラン、テトラメトキシシランといったテトラアルコキシドシラン、メチルトリメトキシシラン、メチルエトキシシラン、フェニルトリエトキシシランなどのトリアルコキシシランなどをあげることができる。また有機官能基を有する含ケイ素アルコキシド化合物をあげることができる。具体的にはメルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどがあげられる。
【００４４】
含ケイ素アルコキシド化合物は上記の１種もしくは２種以上を併用することもできる。
【００４５】
本発明の量子ドット内包シリカナノ粒子に用いられる量子ドットとしては、平均粒径が２〜１０ｎｍであり、かつ２００〜７００ｎｍの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、４００〜９００ｎｍの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示す態様の量子ドットであることが好ましい。
【００４６】
上記量子ドットとして、II−VI族化合物、III−Ｖ族化合物、又はIV族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「II−VI族量子ドット」、「III−Ｖ族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。）のいずれかを用いることができる。
【００４７】
具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
上記量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。以下本明細書中シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。例えばＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ２、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ２、Ｇｅ／ＺｎＳなどを用いることができるが、これらに限定されない。
【００４９】
量子ドットは必要に応じて、有機ポリマーなどにより表面処理が施されているものを用いてもよい。例えば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、表面アミノ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）などがあげられる。
【００５０】
III−Ｖ族量子ドットとしては、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＧａＰ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳを用いることが好ましい。中でもＩｎＰ又はＩｎＧａＰをコアとした量子ドットが、発光強度が強く好ましい。
【００５１】
また、IV族量子ドットとしては、Ｓｉ、Ｓｉ／ＳｉＯ２、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ、Ｇｅ／ＧｅＯ２、Ｇｅ／ＺｎＳを用いることが好ましい。中でもＳｉをコアとした量子ドットが、発光強度が強く好ましい。
【００５２】
含ケイ素アルコキシド化合物と量子ドットの混合比に制限はないが、最終的に得られるシリカナノ粒子中に１×１０−６〜１×１０−２ｍｏｌ／Ｌになるように混合することが好ましい。濃度が低すぎる場合は、十分な蛍光が得られない。また高すぎる場合、シリカ内で均一に分散できても濃度消光が起こってしまう。
【００５３】
工程（２）で用いられる有機溶媒として、通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で用いられるものであればよく、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが用いられる。１種もしくは２種以上の混合としてもよい。
【００５４】
また、工程（２）でもちられる塩基としては、通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で用いられるものであればよく、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどを用いることができ、それぞれ水溶液として用いてもよい。
【００５５】
含ケイ素アルコキシド化合物としてテトラエトキシシラン、有機溶媒としてエタノール、塩基としてアンモニア水を用いた場合のそれぞれの仕込みモル比を以下にあげる。テトラエトキシシランを１  ｍｏｌとした場合、エタノールをａ  ｍｏｌ、水をｒ  ｍｏｌ、アンモニアをｂ  ｍｏｌとすると、ａは２０〜４００、ｒは１０〜２００、ｂは１０〜４０で混合する。具体的には、前記非特許文献（ジャーナルオブコロイドサイエンス  ２６巻、６２ページ（１９６８年））に記載されている条件を適用することができる。
【００５６】
工程（３）において、反応温度は通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で適用される条件でよく、室温から５０度で行うことができる。
【００５７】
量子ドット含有液を間欠的に添加する方法としては、限定されるものはなくシリンジポンプ、滴下ロートなど用いればよい。
【００５８】
添加総量を２〜３０分割、好ましくは３〜２０分割、より好ましくは５〜１０分割し、１分〜１２０分間隔、好ましくは３分〜９０分間隔、より好ましくは５〜６０分間隔で添加することができる。
【００５９】
分割量および間隔を最適化することで、シリカ粒子内の量子ドットの分布を調整することができる。
【００６０】
分割量が少なすぎると、分割の効果がなく従来法と同様シリカ粒子の中央に量子ドットが集中してしまい、本発明の効果が十分に得られない。また分割量が多すぎると、含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応の進行が不均一になり、得られるシリカナノ粒子の粒径のばらつきが大きくなる。
【００６１】
添加間隔を短くすると、分割の効果がなく従来法と同様シリカ粒子の中央に量子ドットが集中してしまい、本発明の効果が十分に得られない。また添加間隔が長すぎると、含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応の進行が不均一になり、得られるシリカナノ粒子の粒径のばらつきが大きくなる。
【００６２】
工程（３）における反応時間は、通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で適用される条件でよく、３時間以上５０時間以下であることが好ましい、これより短いと反応は完結しておらず、収率が低下する。またこれより長いと反応が進行しすぎて、不溶物が形成することがある。
【００６３】
工程（４）における反応混合物から生成した量子ドット内包シリカナノ粒子の回収方法は、通常ナノ粒子の回収で行われるろ過もしくは遠心分離などを用いることができる。回収した量子ドット内包シリカナノ粒子は必要に応じて、未反応原料などを除くため、有機溶媒もしくは水により洗浄してもよい。
【００６４】
〔有機分子修飾〕
本発明に係る生体物質標識剤は、有機分子修飾された量子ドット内包シリカナノ粒子と、分子標識物質とが有機分子により結合されている。上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着および化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
【００６５】
量子ドット内包シリカナノ粒子の表面に結合しうる化合物として、例えば無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端にメルカプト基（チオール基）、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基などの官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどがあげられる。
【００６６】
また後述する生体物質標識剤として用いる場合、生体物質との非特異的吸着を抑制するためポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤（例えば、Ｇｅｌｅｓｔ社製ＰＥＧ−ｓｉｌａｎｅ  ｎｏ．ＳＩＭ６４９２．７）を用いることができる。シランカップリング剤を用いる場合、２種以上を併用してもよい。
【００６７】
量子ドット内包シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。例えば、得られた量子ドット内包シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温１２時間反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された量子ドット内包シリカナノ粒子を得ることができる。
【００６８】
〔生体物質標識剤〕
本発明に係る生体物質標識剤は、上述した量子ドット内包シリカナノ粒子と、分子標識物質と有機分子を介して結合させて得られる。
【００６９】
本発明に係る生体物質標識剤は分子標識物質が目的とする生体物質と特異的に結合および／又は反応することにより、生体物質の標識が可能となる。
【００７０】
当該分子標識物質としては例えば、ヌクレオチド鎖、タンパク質、抗体等が挙げられる。
【００７１】
具体例として、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した量子ドット内包シリカナノ粒子のアミ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を量子ドット内包シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］  ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）のような縮合剤を用いることもできる。
【００７２】
必要により有機分子修飾された量子ドット内包シリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例としてアミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した量子ドット内包シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した量子ドット内包シリカナノ粒子ができる。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００７４】
（内包された全量子ドット数に対する、シリカナノ粒子の中央部から半径の１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数の割合）
量子ドット内包シリカナノ粒子を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影すると、量子ドットとシリカとは電子線の透過率が異なるため、量子ドットは黒色に、シリカ部分は白色に観察される。【００７５】
このことはエネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＳ）によっても支持される。具体的には、ＴＥＭ像で白色に観察された部分についてＥＤＳを行うと、ケイ素および酸素に由来するピークが観察される。これに対しＴＥＭ像で黒色に観察された部分についてＥＤＳを行うと、ケイ素および酸素に加えて量子ドットに由来する元素のピークが観測された。具体的には量子ドットとしてＣｄＳｅ／ＺｎＳを用いた場合、カドミウム、セレン、亜鉛、および硫黄のピークが検出される。【００７６】
ＴＥＭ像中シリカナノ粒子内で黒色に観察された部分のすべて面積を合算した値（Ｉ）を求める。ついで、シリカナノ粒子の中央部から半径の１０％以内の同心円領域に存在する黒色部分の面積（II）を求める。（II）を（Ｉ）で除した数値に１００を乗じた値を、シリカナノ粒子に内包された量子ドット全体数に対するシリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数の割合と定義する。本願においては１０００個の粒子について、この割合を求め、その算術平均を用いた。【００７７】
（実施例１：ＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子）
下記工程（１）〜（４）含む方法により、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子を作製した。【００７８】
工程（１）ＣｄＳｅ／ＺｎＳデカン分散液（インビトロジェン社Ｑｄｏｔ登録商標６５５）１０μｌとテトラエトキシシラン４０μｌを混合する。【００７９】
工程（２）エタノール４ｍｌ、１４％アンモニア水１ｍｌを混合する。【００８０】
工程（３）工程２で作製した混合液を室温下かくはんしているところに、工程１で作製した混合液を５分割したものを１０分間隔で添加する。添加開始から１２時間かくはんを行う。【００８１】
工程（４）反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を行う。【００８２】
得られたＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径２００ｎｍ、変動係数は７％であった。ＴＥＭ観察を行ったところ、シリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数の内包された全量子ドット数に対する割合をもとめたところ１５％あった。【００８３】
（実施例２：ＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子）
下記工程（１）〜（３）含む方法により、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子を作製した。【００８４】
工程（１）ＣｄＳｅ／ＺｎＳデカン分散液（インビトロジェン社Ｑｄｏｔ登録商標６５５）１０μｌとテトラエトキシシラン４０μｌを混合する。【００８５】
工程（２）エタノール４ｍｌ、１４％アンモニア水１ｍｌを混合する。【００８６】
工程（３）工程２で作製した混合液を室温下かくはんしているところに、工程１で作製した混合液を５分割したものを２０分間隔で添加する。【００８７】
以下実施例１と同様の操作を行う。【００８８】
得られたＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１９０ｎｍ、変動係数は１０％であった。ＴＥＭ観察を行ったところ、内包された量子ドット全体数に対するシリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数の内包された全量子ドット数に対する割合をもとめたところ４０％であった。【００８９】
（実施例２−２：ＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子）
下記工程（１）〜（３）含む方法により、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子を作製した。【００９０】
工程（１）ＣｄＳｅ／ＺｎＳデカン分散液（インビトロジェン社Ｑｄｏｔ登録商標６５５）１０μｌとテトラエトキシシラン４０μｌを混合する。【００９１】
工程（２）エタノール４ｍｌ、１４％アンモニア水１ｍｌを混合する。【００９２】
工程（３）工程２で作製した混合液を室温下攪拌しているところに、工程１で作製した混合液を８分割したものを１５分間隔で添加する。添加開始から１２時間、攪拌を行う。【００９３】
以下実施例１と同様の操作を行う。【００９４】
得られたＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径２１０ｎｍ、変動係数は９％であった。ＴＥＭ観察を行ったところ、シリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数の内包された全量子ドット数に対する割合を求めたところ１０％あった。【００９５】
（実施例２−３：ＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子）
下記工程（１）〜（３）含む方法により、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子を作製した。【００９６】
工程（１）ＣｄＳｅ／ＺｎＳデカン分散液（インビトロジェン社Ｑｄｏｔ登録商標６５５）１０μｌとテトラエトキシシラン４０μｌを混合する。【００９７】
工程（２）エタノール４ｍｌ、１４％アンモニア水１ｍｌを混合する。【００９８】
工程（３）工程２で作製した混合液を室温下攪拌しているところに、工程１で作製した混合液を３分割したものを１５分間隔で添加する。添加開始から１２時間攪拌を行う。【００９９】
以下実施例１と同様の操作を行う。【０１００】
得られたＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径２１０ｎｍ、変動係数は９％であった。ＴＥＭ観察を行ったところ、シリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数の内包された全量子ドット数に対する割合を求めたところ７０％あった。【０１０１】
（比較例１：ＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子）
特許文献２に記載されている方法に準拠して、ＣｄＳｅ／ＺｎＳデカン分散液（インビトロジェン社Ｑｄｏｔ登録商標６５５）１０μｌとテトラエトキシシラン４０μｌ、エタノールを混合した。混合液をかくはんしているところに１４％アンモニア水１ｍｌを一度に添加した。【０１０２】
室温下１２時間かくはんしたのち、実施例１と同様の操作を行った。【０１０３】
得られたＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１８０ｎｍ、変動係数は９％であった。ＴＥＭ観察を行い、内包された量子ドット全体数に対するシリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数の割合をもとめたところ８５％であった。【０１０４】
（比較例２：ＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子）
下記工程（１）〜（３）含む方法により、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子を作製した。【０１０５】
工程（１）ＣｄＳｅ／ＺｎＳデカン分散液（インビトロジェン社Ｑｄｏｔ登録商標６５５）１０μｌとテトラエトキシシラン４０μｌを混合する
工程（２）エタノール４ｍｌ、１４％アンモニア水１ｍｌを混合する
工程（３）工程２で作製した混合液を室温下かくはんしているところに、工程１で作製した混合液を５０分割したものを３０分間隔で添加する。【０１０６】
以下実施例１と同様の操作を行う。【０１０７】
得られたＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径２００ｎｍ、変動係数は２５％であった。ＴＥＭ観察を行ったところ、内包された量子ドット全体数に対するシリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数の内包された全量子ドット数に対する割合をもとめたところ５％であった。【０１０８】
（実施例３：ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子）
下記工程（１）〜（３）含む方法により、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子を作製した。【０１０９】
工程（１）表面にカルボキシル基もつＩｎＧａＰ／ＺｎＳ水分散液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社ｅＦｌｕｏｒ登録商標７００ＮＣ（Ｃａｒｂｏｘｙｌ））１０μｌとテトラエトキシシラン４０μｌを混合する
工程（２）エタノール４ｍｌ、１４％アンモニア水１ｍｌを混合する
工程（３）工程２で作製した混合液を室温下かくはんしているところに、工程１で作製した混合液を５分割したものを１０分間隔で添加する。【０１１０】
以下実施例１と同様の操作を行う。【０１１１】
得られたＩｎＧａＰ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１４０ｎｍ、変動係数は８％であった。ＴＥＭ観察を行い、内包された量子ドット全体数に対するシリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数の割合をもとめたところ２５％であった。【０１１２】
（実施例３−２：ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子）
下記工程（１）〜（３）含む方法により、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子を作製した。【０１１３】
工程（１）表面にカルボキシル基もつＩｎＧａＰ／ＺｎＳ水分散液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社ｅＦｌｕｏｒ登録商標７００ＮＣ（Ｃａｒｂｏｘｙｌ））１０μｌとテトラエトキシシラン４０μｌを混合する
工程（２）エタノール４ｍｌ、１４％アンモニア水１ｍｌを混合する
工程（３）工程２で作製した混合液を室温下攪拌しているところに、工程１で作製した混合液を３分割したものを５分間隔で添加する。【０１１４】
以下実施例１と同様の操作を行う。【０１１５】
得られたＩｎＧａＰ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１６０ｎｍ、変動係数は５％であった。ＴＥＭ観察を行い、内包された量子ドット全体数に対するシリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数の割合を求めたところ７０％であった。【０１１６】
（比較例３：ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子）
特許文献２に記載されている方法に準拠して、表面にカルボキシル基もつＩｎＧａＰ／ＺｎＳ水分散液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のｅＦｌｕｏｒ登録商標７００ＮＣ（Ｃａｒｂｏｘｙｌ））１０μｌとテトラエトキシシラン４０μｌ、エタノール４ｍｌを混合する。混合液をかくはんしているところに１４％アンモニア水１ｍｌを一度に添加する。【０１１７】
室温下１２時間かくはんしたのち。実施例１と同様の操作を行った。【０１１８】
得られたＩｎＧａＰ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１８０ｎｍ、変動係数は１０％であった。ＴＥＭ観察を行い、内包された量子ドット全体数に対するシリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数の割合をもとめたところ９０％であった。【０１１９】
（実施例４：Ｓｉ内包シリカナノ粒子）
Ｓｉ量子ドットは、特開２００５−１７２４２９号公報に開示されているシリコンウェハーのＨＦエッチングにより製造した。【０１２０】
工程（１）Ｓｉ量子ドット水分散液１０μｌとテトラエトキシシラン４０μｌを混合する
工程（２）エタノール４ｍｌ、１４％アンモニア水１ｍｌを混合する
工程（３）工程２で作製した混合液を室温下かくはんしているところに、工程１で作製した混合液を５分割したものを２０分間隔で添加する。【０１２１】
以下実施例１と同様の操作を行う。【０１２２】
得られたＳｉ内包シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径２５０ｎｍ、変動係数は６％であった。ＴＥＭ観察を行い、内包された量子ドット全体数に対するシリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数の割合をもとめたところ５５％であった。【０１２３】
（比較例４：Ｓｉ内包シリカナノ粒子）
特許文献２に記載されている方法に準拠して、実施例４で用いたＳｉ量子ドット水分散液１０μｌとテトラエトキシシラン４０μｌ、エタノール４ｍｌを混合した。混合液をかくはんしているところに１４％アンモニア水１ｍｌを一度に添加した。【０１２４】
室温下１２時間かくはんしたのち。実施例１と同様の操作を行った。【０１２５】
得られたＳｉ内包シリカナノ粒子のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径２８０ｎｍ、変動係数は９％である。ＴＥＭ観察を行い、内包された量子ドット全体数に対するシリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数の割合をもとめたところ８０％である。【０１２６】
得られた量子ドット内包シリカナノ粒子それぞれ１ｍｇを純水５ｍｌに分散させ、蛍光測定を行う。蛍光強度は、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子は実施例１で得られたもの、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子は実施例３で得られたもの、Ｓｉ内包シリカナノ粒子は実施例４で得られたもの水分散液の蛍光強度をそれぞれ１００としたときの相対値として評価した。評価結果を表１〜３に示す。【０１２７】
【表１】
2010128604.tif 000002
【０１２８】
【表２】
2010128604.tif 000003
【０１２９】
【表３】
2010128604.tif 000004
【０１３０】
表１、２および３から、シリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数の内包された全量子ドット数に対する割合は８０％以上であるものは、蛍光強度が低いことが分かる。このことは、量子ドットがシリカナノ粒子の中央に集中しているため消光がおこるためといえる。【０１３１】
一方、シリカナノ粒子の中心部から半径１０％以内の同心円領域に存在する量子ドット数の内包された全量子ドット数に対する割合が、低すぎる場合も蛍光強度が低いことが分かる。この場合量子ドットがシリカナノ粒子の外周部に偏在しているため、消光が起こるといえる。【０１３２】
以上のことから本発明の量子ドット内包シリカナノ粒子の発光強度が高いのは量子ドットが均一にシリカナノ粒子内に全体により均一に分散しているためと分かる。【０１３３】
（実施例５：ＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子の有機分子修飾）
実施例１で得られたＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子１ｍｇを純水５ｍｌに分散させた。アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液１００μｌを添加し、室温で１２時間かくはんした。【０１３４】
反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を行った。【０１３５】
得られたアミノ基修飾したＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子のＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾できたことを確認できた。【０１３６】
アミノ基修飾したＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子１ｍｇを純水５ｍｌに分散させ、蛍光測定を行ったところ、反応前の蛍光強度を維持していた。【０１３７】
（実施例６：アミノ基修飾ＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子への抗体結合）
実施例５で得られたアミノ基修飾ＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子０．５ｍｇを純水０．５ｍｌに分散させたもの０．１ｍｌをＤＭＳＯ２ｍｌに添加した。そこへ、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）をいれ１時間反応させた。過剰のｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣなどを遠心分離により除去する、一方で、抗ｈＣＧ抗体を１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元処理を行い、ゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去した。【０１３８】
ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ処理したＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子と、ＤＴＴ処理した抗ｈＣＧ抗体を混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。ゲルろ過カラムにより未反応物を除去し、抗ｈＣＧ抗体が結合したＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子を得た。【０１３９】
抗ｈＣＧ抗体が結合したＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子０．１ｍｇを純水０．５ｍｌに分散させ、蛍光測定を行ったところ、反応前の蛍光強度を維持していた。【０１４０】
得られた抗ｈＣＧ抗体が結合したＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子を用いたイムノアッセイを下記の手順で行った。【０１４１】
１）マイクロプレート上ウェル内にアンチ−ｈαサブニットを固定化する
２）抗原であるｈＣＧを各ウェルに濃度を変えて入れる
３）過剰のｈＣＧを洗浄により除去後、各ウェルに抗ｈＣＧ抗体が結合したＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子分散液を入れる
４）過剰の抗ｈＣＧ抗体が結合したＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子を洗浄により除去する
５）マイクロプレートリーダーにより各ウェルの蛍光強度を測定する。【０１４２】
上記イムノアッセイの結果、抗原濃度に応じて蛍光強度が上昇した。すなわち、本発明で得られたＣｄＳｅ／ＺｎＳ内包シリカナノ粒子に結合した抗ｈＣＧ抗体は、抗原認識能を損なっていないことが言える。すなわち、この結果により、本発明の量子ドット内包シリカナノ粒子を用いた生体物質標識剤を提供することができることが分かる。
【国際調査報告】
2010128604.tif 000005
2010128604.tif 000006
2010128604.tif 000007
2010128604.tif 000008