(57)【要約】要約  培養細胞を消費することなく培養細胞の評価やバイオマーカーのスクリーニングをすることができる新規な手段が開示されている。本発明の培養細胞の評価方法は、無血清培地中で細胞を培養し、該細胞から培養液中に放出される核酸の少なくとも１種を測定することを含む。また、本発明のバイオマーカーのスクリーニング方法は、無血清培地中で細胞を培養し、該細胞から培養液中に放出される核酸を測定することを含む。指標とする核酸は、例えばマイクロＲＮＡである。
2011001906.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無血清培地中で細胞を培養し、該細胞から培養液中に放出される核酸の少なくとも１種を測定することを含む、培養細胞の評価方法。
【請求項２】
前記核酸がマイクロＲＮＡである請求項１記載の方法。
【請求項３】
配列表の配列番号１、３〜５、７〜１９、４１〜４４に示される塩基配列からなるマイクロRNAの少なくとも１種を測定する請求項２記載の方法。
【請求項４】
配列表の配列番号１、３〜５、７〜１９に示される塩基配列からなるマイクロRNAの少なくとも１種を測定する請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は哺乳動物由来細胞であり、前記無血清培地は、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、セロトニンレセプターに対するリガンドとを含む培地である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
内皮細胞分化遺伝子ファミリーレセプターに対する前記リガンドが、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）及びその塩、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）並びに内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターのアゴニストから成る群より選択される少なくとも１種である請求項５記載の方法。
【請求項７】
セロトニンレセプターに対する前記リガンドが、セロトニン、その塩及びセロトニンレセプターのアゴニストから成る群より選択される少なくとも１種である請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
幹細胞の分化を評価する方法である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
配列番号１、４１〜４４に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を指標として幹細胞の分化を評価する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
配列番号１又は４４に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として骨細胞への分化を評価する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として骨細胞への分化を評価する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
配列番号４１に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として脂肪細胞への分化を評価する請求項９記載の方法。
【請求項１３】
配列番号４２に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として組織細胞への分化を評価する請求項９記載の方法。
【請求項１４】
配列番号４３に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として幹細胞の分化の有無を評価する請求項９記載の方法。
【請求項１５】
細胞障害を評価する方法である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号３〜５に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を指標として培養細胞への障害を評価する請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記培養細胞が肝細胞である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
培養細胞への化学物質・生物由来物質・環境刺激等による効果・影響・毒性等を評価する方法である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
がん細胞の有無を評価する方法である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
がん細胞の悪性度を評価する方法である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
配列番号７〜１９に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を指標とする請求項１９又は２０記載の方法。
【請求項２２】
前記がん細胞が大腸がん細胞である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
無血清培地中で細胞を培養し、該細胞から培養液中に放出される核酸を測定することを含む、バイオマーカーのスクリーニング方法。
【請求項２４】
配列表の配列番号１、３〜５、７〜１９、４１〜４４に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を測定する請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
配列表の配列番号１、３〜５、７〜１９に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を測定する請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養細胞から培養液中へ放出されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの核酸を指標とした培養細胞の評価方法およびバイオマーカーのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養細胞の評価は、培養した細胞の免疫染色や、細胞内に発現しているタンパク質や遺伝子などを解析する方法で評価されている。例えば、胚性幹細胞は、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧなどを標的とした免疫染色法で、胚性幹細胞から分化誘導した細胞は、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧの遺伝子発現量の減少や組織特異的な遺伝子の増加から評価している。【０００３】
免疫染色法、遺伝子発現量などの細胞を使用した評価方法は、培養した細胞を固定、溶解などしなければならないということから、経時的な変化を評価するためには、同一条件で培養する培養細胞を多量に準備しなければならない。そして、経時的に培養した細胞を消費しなければならないという問題点がある。【０００４】
新しい治療法として注目されている再生医療（細胞医療）分野では、移植細胞の評価は、同一条件で培養した細胞を細胞染色などで間接的に評価しなければならないという問題点がある。移植に用いる細胞自体を評価することは従来法では不可能である。【０００５】
近年、ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたヘアピン型に折りたたまれた６０から１００塩基程度のＲＮＡ（前駆体マイクロＲＮＡ）がＲＮＡ分解酵素で分解され、１７から２４塩基の一本鎖ＲＮＡなったｍｉＲＮＡが注目されている。このｍｉＲＮＡは、自身と相補的な塩基配列をもったメッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻害する機能を有しており、幹細胞から組織細胞への分化（非特許文献１）や各組織がん細胞の判定（特許文献１）で重要な役割を果たしているという報告がされている。さらに、このｍｉＲＮＡが血液中に存在している報告（非特許文献２）があり、がん等の疾病に対する診断・予後予測等に利用できる可能性があることも注目されている。【０００６】
培養細胞の培養には、培養効率を高める観点から、血清を添加した培地が一般的に使用される。添加した血清由来の核酸と培養細胞から放出された核酸との区別が難しいことから、これまでに培養細胞から放出された核酸で細胞を評価する方法やバイオマーカーのスクリーニング方法は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−１００６８７号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Exp. Hematol. 2008;36:1354-1369
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008;105:10513-8
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、培養細胞を消費することなく培養細胞の評価やバイオマーカーのスクリーニングをすることができる新規な手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者は、鋭意研究の結果、培養細胞から培養液中にｍｉＲＮＡ等の核酸が放出されていることを見出し、さらに、幹細胞、分化した組織細胞、薬剤処理、がん細胞の悪性度進展等に応じて、培養液中に放出されるｍｉＲＮＡ等の核酸の量や種類が異なることを見出した。そして該ｍｉＲＮＡ等の核酸を指標とすれば細胞の状態を評価できることを見出し、本願発明を完成した。また、無血清培地で該ｍｉＲＮＡ等の核酸を測定すれば、バイオマーカーのスクリーニングを行えることを見出し、本願発明を完成させた。【００１１】
すなわち、本発明は、無血清培地中で細胞を培養し、該細胞から培養液中に放出される核酸の少なくとも１種を測定することを含む、培養細胞の評価方法を提供する。本法は無血清培地で細胞を培養するので、幹細胞、がん細胞などのバイオマーカー候補となる核酸を容易に見出すことが可能な、スクリーニング方法を提供する。【００１２】
より具体的には、本発明は以下の発明を提供する。
(1)  無血清培地中で細胞を培養し、該細胞から培養液中に放出される核酸の少なくとも１種を測定することを含む、培養細胞の評価方法。
(2)  前記核酸がマイクロＲＮＡである(1)記載の方法。
(3)  配列表の配列番号１、３〜５、７〜１９、４１〜４４に示される塩基配列からなるマイクロRNAの少なくとも１種を測定する(2)記載の方法。
(4)  配列表の配列番号１、３〜５、７〜１９に示される塩基配列からなるマイクロRNAの少なくとも１種を測定する(3)記載の方法。
(5)  前記細胞は哺乳動物由来細胞であり、前記無血清培地は、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、セロトニンレセプターに対するリガンドとを含む培地である(1)ないし(4)のいずれか１つに記載の方法。
(6)  内皮細胞分化遺伝子ファミリーレセプターに対する前記リガンドが、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）及びその塩、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）並びに内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターのアゴニストから成る群より選択される少なくとも１種である(5)記載の方法。
(7)  セロトニンレセプターに対する前記リガンドが、セロトニン、その塩及びセロトニンレセプターのアゴニストから成る群より選択される少なくとも１種である(5)又は(6)記載の方法。
(8)  幹細胞の分化を評価する方法である(1)ないし(7)のいずれか１つに記載の方法。
(9)  配列番号１、４１〜４４に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を指標として幹細胞の分化を評価する(8)記載の方法。
(10)  配列番号１又は４４に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として骨細胞への分化を評価する(9)記載の方法。
(11)  配列番号１に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として骨細胞への分化を評価する(10)記載の方法。
(12)  配列番号４１に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として脂肪細胞への分化を評価する(9)記載の方法。
(13)  配列番号４２に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として組織細胞への分化を評価する(9)記載の方法。
(14)  配列番号４３に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡを指標として幹細胞の分化の有無を評価する(9)記載の方法。
(15)  細胞障害を評価する方法である(1)ないし(7)のいずれか１つに記載の方法。
(16)  配列番号３〜５に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を指標として培養細胞への障害を評価する(15)記載の方法。
(17)  前記培養細胞が肝細胞である(16)記載の方法。
(18)  培養細胞への化学物質・生物由来物質・環境刺激等による効果・影響・毒性等を評価する方法である(1)ないし(7)のいずれか１つに記載の方法。
(19)  がん細胞の有無を評価する方法である(1)ないし(7)のいずれか１つに記載の方法。
(20)  がん細胞の悪性度を評価する方法である(1)ないし(7)のいずれか１つに記載の方法。
(21)  配列番号７〜１９に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を指標とする(19)又は(20)記載の方法。
(22)  前記がん細胞が大腸がん細胞である(21)記載の方法。
(23)  無血清培地中で細胞を培養し、該細胞から培養液中に放出される核酸を測定することを含む、バイオマーカーのスクリーニング方法。
(24)  配列表の配列番号１、３〜５、７〜１９、４１〜４４に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を測定する(23)に記載の方法。
(25)  配列表の配列番号１、３〜５、７〜１９に示される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの少なくとも１種を測定する(24)に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、培養液中に放出される核酸を指標とした新規な細胞評価法およびバイオマーカーのスクリーニング方法が提供された。本発明の方法によれば、細胞を評価のためだけに消費する必要がないため、評価のために別途培養細胞を用意する必要がなく、手間とコストを大幅に軽減できる。貴重な細胞サンプルを消費しないで済むという点も大きな利点である。さらに、本発明によれば、実際に使用する細胞自体を直接評価することができるため、再生医療等の分野での細胞評価にも極めて有用である。また、バイオマーカーを容易にスクリーニングするために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１において、間葉系幹細胞から骨細胞または脂肪細胞を分化誘導した際の培養液中ｍｉＲＮＡ量のパターンを調べた結果である。
【図２】実施例２において、ヒト肝臓がん由来の培養細胞を四塩化炭素処理することで細胞障害を与えた際の培養液中ｍｉＲＮＡ量のパターンを調べた結果である。
【図３】実施例３において、ヒト大腸がん由来細胞株ＳＷ４８０およびそのリンパ節転移巣細胞株ＳＷ６２０の培養液中ｍｉＲＮＡ量をｈｓａ−ｍｉＲ−１６量で補正した相対発現量でパターンを調べた結果である。
【図４】実施例４において、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞から骨細胞または脂肪細胞を分化誘導した際の培養液中ｍｉＲＮＡ量のパターンを調べた結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において、細胞の評価とは、細胞の状態を評価することであり、細胞の分化、化学物質・生物由来物質（例えば核酸、タンパク質およびその断片、糖質、脂質、ビタミン類等）・環境刺激（例えば温度の低下または上昇、湿度の低下または上昇、圧力の低下または上昇、酸素濃度の低下または上昇、ＣＯ２濃度の低下または上昇、紫外線照射、放射線照射等）等による効果・影響・毒性等、がん細胞の有無、がん細胞の悪性度等の種々の状態の評価が包含される。また、本発明においてバイオマーカーとは、細胞、組織、生体等の状態変化を定性・定量的に把握するための指標となる生体由来の物質（例えば核酸、タンパク質およびその断片、糖質、脂質、ビタミン類等）である。
【００１６】
本発明の方法で測定される核酸は、培養細胞から培養液中に放出されるものであればいかなる種類のものであってもよく、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、好ましくはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。本発明において、ｍｉＲＮＡとは、ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子から転写されヘアピン型に折りたたまれた６０〜１００塩基程度のＲＮＡがＲＮＡ分解酵素で１７〜２４塩基程度に分解された一本鎖のＲＮＡであり、自身と相補的な塩基配列をもったメッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻害する機能を有している。ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は公知であり、ｍｉＲＮＡ自体も種々のものが公知である。
【００１７】
測定対象となるｍｉＲＮＡの具体例としては、配列表の配列番号１、３〜５、７〜１９に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡを挙げることができる。これらはいずれも、下記実施例において、細胞の分化、細胞障害、がん細胞の有無、がん細胞の悪性度進展等に応じて培地中存在量が変化することが具体的に確認されているものである。もっとも、測定対象となる核酸はこれらのｍｉＲＮＡに限定されるものではない。
【００１８】
例えば、下記実施例に記載されるように、配列番号１、４１〜４４に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡ（hsa-miR-145、hsa-miR-130a、hsa-miR-143、hsa-miR-214、hsa-miR-365）は、細胞の分化の指標として用いることができる。より具体的には、配列番号１及び４４のｍｉＲＮＡ（hsa-miR-145、hsa-miR-365）は幹細胞から骨細胞への分化の指標として、配列番号４１のｍｉＲＮＡ（hsa-miR-130a）は脂肪細胞への分化の指標として、それぞれ用いることができる。配列番号４２のｍｉＲＮＡ（hsa-miR-143）は、骨細胞および脂肪細胞のいずれに分化した場合でも多く測定されるため、骨細胞および脂肪細胞等の組織細胞への分化の指標として用いることができる。配列番号４３のｍｉＲＮＡ（hsa-miR-214）は、分化誘導前の未分化幹細胞の培養液中で多く測定されるため、幹細胞の分化の有無の指標として用いることができる。
【００１９】
配列番号３〜５に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡ（hsa-miR-16、hsa-miR-21、hsa-miR-122）は、細胞障害、例えば化学物質による細胞毒性等があり、より具体的には薬剤処理による肝細胞障害の指標として用いることができる。
【００２０】
配列番号７〜１９に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡ（hsa-miR-20a、hsa-miR-892a、hsa-miR-22*、hsa-miR-19a、hsa-miR-484、hsa-miR-638、hsa-miR-125b、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-138、hsa-miR-186、hsa-miR-223）は、がんの悪性度、より具体的には大腸がんの悪性度の指標として用いることができる。配列番号７〜１９のうち、配列番号７、１０〜１５に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡ（hsa-miR-20a、hsa-miR-19a、hsa-miR-484、hsa-miR-638、hsa-miR-125b、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-532-3p）はがんの悪性度にかかわらず共通して培養液中に検出され、がん細胞の有無の指標として用いることができる。配列番号８、９に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡ（hsa-miR-892a、hsa-miR-22*）は原発部由来の細胞株培養液中に特異的に検出され、配列番号１６〜１９に示される塩基配列からなるｍｉＲＮＡ（hsa-miR-142-3p、hsa-miR-138、hsa-miR-186、hsa-miR-223）はより悪性度の高い転移巣由来の細胞株培養液中に特異的に検出される。
【００２１】
上記したｍｉＲＮＡは、いずれか１種類のみを測定してもよいし、また、複数種類を測定してもよい。評価目的に応じて測定する核酸の種類は適宜選択することができる。例えば、幹細胞の骨細胞への分化を評価したい場合には、骨細胞への分化の指標となるhsa-miR-145及びhsa-miR-365と組み合わせて、未分化細胞の指標となるhsa-miR-214及び組織細胞への分化の指標となるhsa-miR-143を測定してもよい。
【００２２】
本発明において培養される細胞は、試験管内培養（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）条件下で培養できる細胞であれば特に限定されないが、好ましくは哺乳動物由来の細胞である。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で培養できるのであれば、哺乳動物より摘出した組織を形成する細胞も含まれる。
【００２３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養できる哺乳類由来の細胞としては、幹細胞（胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞など）、組織前駆細胞および組織細胞（骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、神経細胞、筋肉細胞、血液系細胞、繊維芽細胞、肝臓細胞など）、がん細胞およびがん由来細胞株（ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ−７、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、Ｃａｃｏ−２、ＣＨ−４、ＣＨ−５、ＣｏＬｏ−２０５、Ｈｃ１１０、ＰＭＰ−１など）を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
本発明で細胞の培養に用いる培地は、一般に無血清培地と呼ばれる、添加剤としての動物血清を含まない培地であればよい。公知の基本培地にその他添加剤（動物血清を除く）を含有した組成を有するものを用いることができる。基本培地の組成は、培養するべき細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、イーグル培地のような最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地α（ＭＥＭ−α）、間葉系細胞基礎培地（ＭＳＣＢＭ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２およびＦ−１０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地などが挙げられる。これらの培地は、いずれもこの分野において周知の培地である。
【００２５】
基本培地に加えるその他の添加剤としては、アミノ酸類、無機塩類、ビタミン類および炭素源や抗生物質等の他の添加剤を挙げることができる。これらの添加剤の使用濃度は特に限定されず、通常の哺乳動物細胞用培地に用いられる濃度で用いることができる。
【００２６】
アミノ酸類としては、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンおよびＬ−バリンを挙げることができる。
【００２７】
無機塩類としては、塩化カルシウム、硫酸銅、硝酸鉄（III）、硫酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウム等を挙げることができる。
【００２８】
ビタミン類としては、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ４、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１３、ビタミンＢ１５、ビタミンＢ１７、ビタミンＢｈ、ビタミンＢｔ、ビタミンＢｘ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ、ビタミンＭおよびビタミンＰを挙げることができる。
【００２９】
他の添加剤としては、（１）繊維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、内皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）等の増殖因子、（２）ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンおよびカナマイシン等の抗生物質、（３）グルコース、ガラクトース、フルクトースおよびスクロース等の炭素源、（４）マグネシウム、鉄、亜鉛、カルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、セレン、コバルト、スズ、モリブデン、ニッケルおよびケイ素等の微量金属）、（５）β−グリセロリン酸、デキサメタゾン、ロシグリタゾン、イソブチルメチルキサンチン、および５−アザシチジン等の幹細胞分化誘導剤、（６）２−メルカプトエタノール、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼおよびＮ-アセチルシステイン等の抗酸化剤、並びにアデノシン ５'−一リン酸、コルチコステロン、エタノールアミン、インスリン、還元型グルタチオン、リポ酸、メラトニン、ヒポキサンチン、フェノールレッド、プロゲステロン、プトレシン、ピルビン酸、チミジン、トリヨードチロニン、トランスフェリンおよびラクトフェリン等の他の添加剤を挙げることができる。
【００３０】
無血清条件で動物細胞を培養できる培地や培養法は種々のものが公知であり、本発明ではそのいずれを用いてもよい。とりわけ、無血清でも哺乳動物細胞を効果的に増殖できる培地として、内皮細胞分化遺伝子（Ｅｄｇ）ファミリーレセプターに対するリガンドと、セロトニンレセプターに対するリガンドとを含む培地（以下、便宜的にこの培地を「高効率無血清培地」と呼ぶ）を好ましく用いることができる。
【００３１】
高効率無血清培地は、上記の通り、必須成分の一つとしてＥｄｇファミリーレセプターに対するリガンドを含む。Ｅｄｇファミリーレセプターとは、その遺伝子配列の相同性が高いＧタンパク質共役型のレセプターの一群であり、現在までにヒト、マウス、ヒツジなどの哺乳類でＥｄｇ−１からＥｄｇ−８までが同定されている（Science. Vol. 294，pp. 1875-1878，2001、及びJ Biol Chem. Vol. 277, No.29, pp. 25851-25854, 2002）。これらのうち、Ｅｄｇ−２、Ｅｄｇ−４およびＥｄｇ−７はＬＰＡレセプターとして機能し、Ｅｄｇ−１、Ｅｄｇ−３、Ｅｄｇ−５、Ｅｄｇ−６およびＥｄｇ−８はＳ１Ｐレセプターとして機能することが知られている。また、「レセプターに対するリガンド」とは、該レセプターと特異的に結合する物質であり、生体内に存在する天然のリガンドのみならず、アゴニストやアンタゴニストとして知られる天然または合成された他の化合物をも包含する。
【００３２】
Ｅｄｇファミリーレセプターに対するリガンド（以下、便宜的に「Ｅｄｇリガンド」と呼ぶことがある）としては、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびその塩、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）並びにＥｄｇファミリーレセプターのアゴニストからなる群より選択される１または複数種の化合物が好ましい。
【００３３】
Ｅｄｇファミリーレセプターのアゴニストとは、Ｅｄｇファミリーレセプターと結合してＬＰＡおよびＳ１Ｐと同様に作用する物質であり、例えばジヒドロスフィンゴシン１リン酸、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、スフィンゴシルホスホリルコリン、アルキルＬＰＡアナログ、ＦＴＹ７２０などが挙げられる。
【００３４】
ＬＰＡとは、下記の一般式（Ｉ）：
Ｒ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＰＯ４Ｈ２                    （Ｉ）
（式中、Ｒは、炭素数１０〜３０のアルキル基、炭素数１０〜３０のアルケニル基または炭素数１０〜３０のアシル基である）
で表される化合物である。
【００３５】
上記の式（Ｉ）のＲ基についてのアシル基の炭素数は、カルボニル基の炭素数を含まない。
【００３６】
ＬＰＡの塩としては、従来公知の塩を用いることができ、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、アンモニウム塩などが挙げられる。
【００３７】
ＬＰＡまたはＬＰＡの塩としては、例えば１−オレオイルリゾホスファチジン酸ナトリウム塩、ＬＰＡカリウム塩などが挙げられる。
【００３８】
Ｅｄｇリガンドは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
【００３９】
また、上記した高効率無血清培地は、さらに、セロトニンレセプターに対するリガンド（以下、便宜的に「セロトニンリガンド」と呼ぶことがある）を含む。セロトニンレセプターは主に中枢神経系にあるGタンパク質結合レセプターの一種である。セロトニンリガンドとしては、セロトニン、その塩およびセロトニンアゴニストから選択される１または複数種の化合物が好ましい。セロトニンは、５−ヒドロキシトリプタミンともよばれ、神経伝達物質として作用することが知られている。セロトニンアゴニストとは、セロトニンレセプターと結合してセロトニンと同様に作用することが知られている物質であり、例えばイプサピロン、ゼロピン、ブスピロン、１−［２−（４−アミノフェニル）エチル］−４−（３−ビフルオロメチルフェニル）ピペラジン（ＰＡＤＤ）、Ｎ，Ｎ−ジプロピル−５−カルボキシアミドトリプタミン（ＤＰ−５ＣＴ）、α−メチル−５−ヒドロキシトリプタミン（ＨＴ）、２−メチル−５−ＨＴなどが挙げられる。セロトニンの塩は、従来公知の塩を用いることができ、例えば塩酸塩などが挙げられる。
【００４０】
セロトニンリガンドは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
【００４１】
培地中のＥｄｇリガンドの濃度（複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、通常、0.01〜100μM程度である。Ｅｄｇリガンドが、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびその塩から成る群より選択される少なくとも１種である場合には、その培地中の濃度は、0.25〜10μMが好ましい。また、Ｅｄｇリガンドが、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）である場合には、その培地中の濃度は、0.01μM〜0.2μMが好ましい。また、培地中のセロトニンリガンドの濃度（複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、0.1〜100μMが好ましく、0.25〜20μMがさらに好ましい。
【００４２】
高効率無血清培地は、抗酸化剤をさらに含むことが好ましい。抗酸化剤の好ましい例としては、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、Ｌ−システイン、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼおよび２−メルカプトエタノールから成る群より選ばれる少なくとも１種、さらに好ましくは、Ｎ−アセチルシステインおよびＬ−システインから成る群より選ばれる少なくとも１種を挙げることができる。これらの抗酸化剤は、アポトーシス阻害作用を有することが知られており、従って、培養細胞の維持、増殖に有効である。抗酸化剤は、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
【００４３】
培地中の抗酸化剤の濃度（複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、0.01mM〜10mMが好ましく、さらに好ましくは0.1mM〜1mMである。
【００４４】
高効率無血清培地は、動物血清アルブミンをさらに含むことが好ましい。アルブミンは、血清の主要成分であり、血液中では薬物の輸送等の役割を担っていることが知られている。動物血清アルブミンを含むことにより、培養細胞の増殖が一層促進される。動物血清アルブミンの好ましい例として、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などが挙げられる。これらのアルブミンは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
【００４５】
培地中のアルブミンの濃度（複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、0.0001〜１０重量％が好ましく、0.0001〜１重量％がさらに好ましい。
【００４６】
高効率無血清培地は、成長因子をさらに含むことが好ましい。成長因子を含むことにより、培養細胞の増殖が一層促進される。成長因子の好ましい例としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等を挙げることができ、さらに好ましい例として、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）および上皮成長因子（ＥＧＦ）を挙げることができる。これらの成長因子自体は、いずれもこの分野において周知である。成長因子は、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。特に、下記実施例に具体的に示されるように、成長因子として血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）と塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の２種類のみを含むものでも間葉系幹細胞の増殖が十分に達成されるので、間葉系幹細胞の培養に用いられる培地では、培地中に含まれる成長因子は、これら２種類の成長因子だけでも十分である。
【００４７】
高効率無血清培地は、さらに、血小板由来成長因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）に対するリガンド（ＰＤＧＦ）を含んでいてもよく、特に、間葉系幹細胞を培養する培地では、これを含むことが好ましい。ＰＤＧＦＲは、主に間葉系細胞にあるチロシンキナーゼ関連型受容体の一種であり、これに対するリガンドを含むことにより、間葉系幹細胞を効率良く細胞を増殖させることができる。ＰＤＧＦＲのリガンドとしては、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤなどが挙げられ、これらはいずれも周知である。ＰＤＧＦＲのリガンドは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
【００４８】
高効率無血清培地は、塩基性線維芽細胞成長因子レセプター（ＦＧＦＲ）に対するリガンド（ＦＧＦ）を含んでいてもよく、特に、間葉系幹細胞を培養する場合には、これを含むことが好ましい。ＦＧＦＲは、主に間葉系細胞に存在することが知られており、これに対するリガンドを含むことにより、間葉系幹細胞の寿命を改善させる。ＰＤＧＦＲのリガンドとしては、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）と酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）など、計20種以上存在することが知られている。例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−４などが挙げられる。特に、ｂＦＧＦは組織の形成に強く関与していることが知られている。これらはいずれも周知である。
【００４９】
成長因子の濃度（複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、0.1〜100ng/mLが好ましく、1〜10ng/mLがさらに好ましい。
【００５０】
高効率無血清培地は、界面活性剤をさらに含んでいてもよい。低濃度の界面活性剤を含むことにより、細胞膜への悪影響を減じる効果等があると考えられる。一方、高濃度の界面活性剤を培地に添加すると、細胞増殖阻害や細胞死の誘導をすることが知られている。界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（商品名Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80等）、アルキルフェノキシポリエチレングリコール（商品名Triton X-100等）、アルキルフェニルポリエチレングリコール（商品名Triton X-114、NP-40等）の非イオン性界面活性剤が好ましい。界面活性剤は、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
【００５１】
界面活性剤の濃度（複数種類のものが含まれる場合にはその合計濃度）は、通常、0.1〜100ng/mLであり、好ましくは1〜10ng/mLである。
【００５２】
高効率無血清培地は、上記したＥｄｇリガンドおよびセロトニンリガンド、好ましくは、さらに、上記した抗酸化剤、動物血清アルブミン、成長因子および界面活性剤の１種以上を含むことを除き、公知の哺乳動物細胞用培地と同様でよい。従って、基本的に、公知の基本培地に、上記した２種類の必須成分、好ましくはさらに上記した好ましい成分の１種以上を添加することにより、高効率無血清培地を得ることができる。公知の基本培地の例は上記の通りである。任意の添加剤も上記の通りであり、上記した添加剤の１種または複数種を含むことができる。また、公知の基本培地と同様に、分化誘導剤を添加して分化誘導培地として用いることもできる。分化誘導剤の例は上記したが、上記の例示に限定されず、分化誘導により調製すべき細胞の種類に応じて、公知の分化誘導剤から適宜選択して用いることができる。
【００５３】
本発明の培養細胞の培養自体は、従来と同様な方法で行うことができ、通常、３０〜３７℃の温度、および５％ＣＯ２環境下、および５〜２１％Ｏ２環境下で行われる。また、分化誘導に必要な培養時間は、用いる分化誘導剤や細胞の種類等により適宜設定され、また、細胞の様子を観察しながら適宜選択することができる。
【００５４】
培養液中の核酸の抽出は、この分野で周知の常法を用いて行うことができる。液体試料からの核酸抽出のための各種試薬キット類が市販されており、それらを用いて容易に行うことができる。
【００５５】
核酸の測定方法自体は周知である。例えば、プライマーを用いた核酸増幅法による測定法としては、リアルタイムＰＣＲやNASBA法等を挙げることができる。また、プローブを用いた測定法としては、ノーザンブロット、サザンブロットの他、固相化プローブを用いたアレイ解析法等を挙げることができる。本発明の方法では周知のいずれの測定法を用いてもよい。リアルタイムＰＣＲによる測定法の具体的な例としては、下記実施例に記載されるように、培養液から抽出したＲＮＡ試料の３’末端にプライマーサイトを導入してｃＤＮＡを調製した後、各種ｍｉＲＮＡに特異的なプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより、ｍｉＲＮＡの有無ないしはその量を測定することができる。配列番号１〜１９に示す塩基配列からなるｍｉＲＮＡに特異的なプライマーとしては、例えば、配列番号２２〜４０に示す塩基配列からなるものを用いることができる。また、Applied Biosystems社が開発した市販のTaqMan Probe microRNA Assaysを用いることができる。該キットは、公知の各種ｍｉＲＮＡに対応しており、所望のｍｉＲＮＡをリアルタイムＰＣＲにより測定できる。なお、本発明において、「測定」には、検出、定量、半定量が包含される。
【００５６】
細胞の変化によって培養液中への放出が開始される核酸を測定する場合には、経時的に培養液の一部を採取して核酸を測定し、核酸が検出されるかどうかを調べればよい。核酸量の変化を測定する場合には、例えば、培養開始時を基準時とし、基準時の核酸量を１として、基準時以降の培養液中核酸量を相対評価することにより、核酸量の変化を測定することができる。相対評価の基準とする時点または核酸量は適宜設定することができる。内標準物質（例えば、miR-16など）で核酸量を補正することで評価することができる。例えば、幹細胞と該幹細胞由来の組織細胞から放出される核酸量およびパターン等を解析することで、幹細胞および該幹細胞由来の組織細胞の評価が可能となる。薬剤処理量等によって、細胞から放出される核酸量およびパターン等を解析することで、薬剤の効果・毒性の評価が可能となる。悪性度の異なるがん細胞から放出される核酸量およびパターン等を解析することで、がん細胞の悪性度の評価が可能となる。がん細胞と正常な組織細胞から放出されてくる核酸量およびパターン等を解析することで、がん細胞の有無を評価することが可能となる。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００５８】
実施例１：マイクロＲＮＡサンプルの調製および解析１
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＬＯＮＺＡ社製）を２００００細胞／ｃｍ２の細胞密度となるように１２穴培養プレートの培養容器に播種し、血清不含の維持培地、骨細胞分化誘導培地または脂肪細胞分化誘導培地で２１日間培養することにより、骨細胞または脂肪細胞への分化誘導を行った。用いた各培地の組成は以下の通りである。
維持培地：
ＭＥＭ−Ａｌｐｈａ（和光純薬社製）に細胞維持用添加剤（最終濃度：５μＭ ＬＰＡ(Cayman社製)、１０μＭ セロトニン（ＳＩＧＭＡ社製）、１ｎＭ ＰＤＧＦ(和光純薬社製)、２．５ｎＭ ｂＦＧＦ（和光純薬社製））を含んだ無血清培地。
骨細胞分化誘導培地：
ＤＭＥＭ（和光純薬社製）に骨細胞分化誘導剤（最終濃度：１０ｍＭ β-グリセロリン酸（ＳＩＧＭＡ社製）、１００ｎＭ デキサメタゾン、1ｍＭ ビタミンＣ（和光純薬社製）、５μＭ ＬＰＡ(Cayman社製)）を添加した無血清培地。
脂肪細胞分化誘導培地：
ＤＭＥＭ（和光純薬社製）に脂肪細胞分化誘導剤（最終濃度：１μＭ デキサメタゾン、１μＭ ロシグリタゾン、５００μＭ イソブチルメチルキサンチン、１μＭ インスリン、５μＭ ＬＰＡ(Cayman社製)）を添加した無血清培地。【００５９】
培養開始後１４日目から２１日目までの７日間培養した培養液を回収し、０．２２μｍのフィルターにて浮遊した細胞を除去し、サンプルとした。【００６０】
サンプル２５０μＬに対して７５０μＬのTriZOL LS試薬（インビトロジェン社製）と混和した後、クロロホルム２００μＬを添加、激しく攪拌、１２０００ｘｇにて遠心分離してその上清を回収した。この上清に、イソプロパノール５００μＬを加え、マイナス３０℃にて１２時間以上静置後に１２０００ｘｇにて遠心分離して上清を廃棄した。そして、７５％エタノール溶液５００μＬを添加後、１２０００ｘｇにて遠心分離、上清を廃棄して核酸サンプルを回収した。【００６１】
この核酸サンプルを１４μＬのＨ２Ｏに溶解後、Poly(A) Tailing Kit（Ambion社製）にてｍｉＲＮＡにPoly(A) Tailingを修飾した（Poly(A)miRNA）。【００６２】
このPoly(A)miRNA溶液に１００μＬのＨ２Ｏを添加後、３７５μＬのTriZOL LS試薬（インビトロジェン社製）を添加、クロロホルム１００μＬを添加、激しく攪拌、１２０００ｘｇにて遠心分離してその上清を回収した。この上清に、イソプロパノール５００μＬを加え、マイナス３０℃にて１２時間以上静置後に１２０００ｘｇにて遠心分離して上清を廃棄した。そして、７５％エタノール溶液５００μＬを添加後、１２０００ｘｇにて遠心分離、上清を廃棄してPoly(A)miRNAサンプルを回収した。【００６３】
このPoly(A)miRNAサンプルを１０μＬのＨ２Ｏに溶解、ＲＴプライマー（5’-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTVN-3’、配列番号２０）およびSuper Script II逆転写酵素（インビトロジェン社製）にてＲＮＡをＤＮＡに逆転写し、２５μＬのＨ２Ｏを添加してｃＤＮＡサンプルを得た。【００６４】
このｃＤＮＡサンプル中に含まれるhsa-miR-145、hsa-miR-24およびhsa-miR-16を、Platinum SYBR Green（インビトロジェン社製）を使用したリアルタイムＰＣＲ法にて確認した。プライマーは以下のものを使用した。
hsa-miR-145（配列番号１）：フォワード（CCGCGTCCAGTTTTCCCAGGAA、配列番号２２）
hsa-miR-24（配列番号２）：フォワード（CCGCTGGCTCAGTTCAGCAG、配列番号２３）
hsa-miR-16（配列番号３）：フォワード（CGCGCTAGCAGCACGTAAAT、配列番号２４）
リバース共通（GCGAGCACAGAATTAATACGAC、配列番号２１）【００６５】
結果を図１に示す。図１より、培養細胞外へ放出されるｍｉＲＮＡが存在していることが確認された。そして、培養細胞から放出されるｍｉＲＮＡ量のパターンが、組織細胞種によって変化することが確認された。例えば、間葉系幹細胞が骨細胞に分化と共にhsa-miR-145の放出量が著しく上昇する。この結果は、培養細胞の変化（幹細胞の分化）によって、放出されるｍｉＲＮＡ量のパターンが変化することを示唆するものである。つまり、放出されるｍｉＲＮＡを解析することで、間葉系幹細胞からの分化誘導の進行度の予測を可能にすることを示唆するものである。骨細胞への分化確認は、アリザインレッドＳ染色、脂肪細胞への分化確認は、オイルレッドＯ染色にて確認した。【００６６】
実施例２：マイクロＲＮＡサンプルの調製および解析２
ヒト肝臓がん由来の細胞株（ＨｕＨ−７、ＡＴＣＣより購入）を２００００細胞／ｃｍ２の細胞密度となるように１２穴培養プレートの培養容器に播種し、肝組織および肝細胞に障害を与えることで知られている四塩化炭素を、World J Gastroenterol. 2008 Jun 21;14(23):3693-709にて用いられている比較的低濃度である０〜１０００μＭで添加した血清不含の維持培地で７日間培養した。維持培地は実施例１と同様のものを用いた。【００６７】
７日間培養した培養液を回収し、遠心処理をした上清を０．２２μｍのフィルターにて細胞を除去し、サンプルとした。【００６８】
実施例１同様にPoly(A)miRNAサンプルのｃＤＮＡサンプルを得た。【００６９】
このｃＤＮＡサンプル中に含まれるhsa-miR-21、hsa-miR-122、hsa-miR-451およびhsa-miR-16を、Platinum SYBR Green（インビトロジェン社製）を使用したリアルタイムＰＣＲ法にて確認した。プライマーは以下のものを使用した。
hsa-miR-21（配列番号４）：フォワード（GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG、配列番号２５）
hsa-miR-122（配列番号５）：フォワード（GCGCTGGAGTGTGACAATGGT、配列番号２６）
hsa-miR-451（配列番号６）：フォワード（GCCGCAAACCGTTACCATTACT、配列番号２７）
hsa-miR-16（配列番号３）：フォワード（CGCGCTAGCAGCACGTAAAT、配列番号２４）
リバース共通（GCGAGCACAGAATTAATACGAC、配列番号２１）【００７０】
結果を図２に示す。図２より、幹細胞以外の培養細胞でも細胞外に放出されるｍｉＲＮＡが存在していることが確認された。そして、培養細胞の障害依存的に、細胞から放出されるｍｉＲＮＡの上昇が確認された。この結果は、培養細胞の変化、例えば薬剤処理によって、培養液中へ放出されるｍｉＲＮＡ量のパターンが変化することを示唆するものである。つまり、本法は、培養液中へ放出されるｍｉＲＮＡ量を解析することで、薬剤等の効果または毒性を評価することが可能であることを示唆するものである。【００７１】
実施例３：マイクロＲＮＡサンプルの調製および解析３
ヒト大腸がん由来の細胞株およびそのリンパ節転移巣細胞株（ＳＷ４８０およびＳＷ６２０、ＡＴＣＣより購入）を２００００細胞／ｃｍ２の細胞密度となるように６穴培養プレートの培養容器に播種し、血清不含の維持培地で３日間培養した。維持培地は実施例１と同様のものを用いた。【００７２】
３日間培養した培養液を回収し、遠心処理をした上清を０．２２μｍのフィルターにて細胞を除去し、サンプルとした。【００７３】
実施例１と同様にPoly(A)miRNAサンプルのｃＤＮＡサンプルを得た。【００７４】
このｃＤＮＡサンプル中に含まれるhsa-miR-20a、hsa-miR-892a、hsa-miR-22*、hsa-miR-19a、hsa-miR-484、hsa-miR-638、hsa-miR-125b、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-138、hsa-miR-186、hsa-miR-223を、Platinum SYBR Green（インビトロジェン社製）を使用したリアルタイムＰＣＲ法にて確認した。プライマーは以下のものを使用した。
hsa-miR-20a（配列番号7）：フォワード（CCGCCGCTAAAGTGCTTATAGTG、配列番号28）
hsa-miR-892a（配列番号8）：フォワード（CCGCCACTGTGTCCTTTCTGC、配列番号29）
hsa-miR-22*（配列番号9）：フォワード（CCGCGAGTTCTTCAGTGGCAA、配列番号30）
hsa-miR-19a（配列番号10）：フォワード（CCGCCTGTGCAAATCTATGCA、配列番号31）
hsa-miR-484（配列番号11）：フォワード（CCGTCAGGCTCAGTCCCCT、配列番号32）
hsa-miR-638（配列番号12）：フォワード（CCGCAGGGATCGCGGGC、配列番号33）
hsa-miR-125b（配列番号13）：フォワード（CCGCGTCCCTGAGACCCTAA、配列番号34）
hsa-miR-339-5p（配列番号14）：フォワード（CCGTCCCTGTCCTCCAGGA、配列番号35）
hsa-miR-532-3p（配列番号15）：フォワード（CCCTCCCACACCCAAGGCT、配列番号36）
hsa-miR-142-3p（配列番号16）：フォワード（CCGCCTGTAGTGTTTCCTACTTT、配列番号37）
hsa-miR-138（配列番号17）：フォワード（CCGGCAGCTGGTGTTGTGAA、配列番号38）
hsa-miR-186（配列番号18）：フォワード（CCGCCGCAAAGAATTCTCCTTTT、配列番号39）
hsa-miR-223（配列番号19）：フォワード（CCGCCGTGTCAGTTTGTCAAATA、配列番号40）
リバース共通（GCGAGCACAGAATTAATACGAC、配列番号21）【００７５】
結果を図３に示す。ＳＷ６２０は、リンパ節転移巣細胞株であるため、もとの大腸がん由来細胞株ＳＷ４８０よりも悪性度が高い。図３より、がん細胞の悪性度進展により細胞から放出されるmiRNAの増減が確認された。この結果は、がん細胞の悪性度進展によって、培地中へ放出されるｍｉＲＮＡ量のパターンが変化することを示唆するものである。また、がんの悪性度進展に関わらず、がん細胞から共通に放出されているmiRNAが存在することが確認された。この結果は、がん細胞が共通に放出しているmiRNAの存在を示唆するものであり、即ち、がん細胞の有無を評価することが可能であることを示唆するものである。【００７６】
実施例４：マイクロＲＮＡサンプルの調製および解析４
実施例１同様、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＬＯＮＺＡ社製）を２００００細胞／ｃｍ２の細胞密度となるように１２穴培養プレートの培養容器に播種し、血清不含の維持培地、骨細胞分化誘導培地または脂肪細胞分化誘導培地で２１日間培養することにより、骨細胞または脂肪細胞への分化誘導を行った。【００７７】
分化誘導開始後１４日目から２１日目までの７日間培養した培養液を回収し、０．２２μｍのフィルターにて浮遊した細胞を除去し、サンプルとした。【００７８】
サンプル２５０μＬに対して７５０μＬのTrizol LS試薬（インビトロジェン社製）と混和した後、クロロホルム２００μＬを添加、激しく攪拌、１２０００ｘｇにて遠心分離してその上清を回収した。この上清に、イソプロパノール５００μＬを加え、マイナス３０℃にて１２時間以上静置後に１２０００ｘｇにて遠心分離して上清を廃棄した。そして、７５％エタノール溶液５００μＬを添加後、１２０００ｘｇにて遠心分離、上清を廃棄して核酸サンプルを回収した。【００７９】
この核酸サンプルを１４μＬのＨ２Ｏに溶解後、ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ＲＴプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にてｃＤＮＡサンプルを得た。【００８０】
このｃＤＮＡサンプルをＴａｑＭａｎ（登録商標） ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅａｌｔｉｍｅプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用したリアルタイムＰＣＲ法にて定量し、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６にて補正することで確認した。プローブは、以下の各ASSAY IDで入手可能な市販のＴａｑＭａｎ（登録商標） ＭｉｃｒｏＲＮＡ ＡＳＳＡＹ Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。
hsa-miR-130a（配列番号４１）：０００４５４ （ASSAY ID）
hsa-miR-143（配列番号４２）：００２２４９ （ASSAY ID）
hsa-miR-214（配列番号４３）：００２３０６ （ASSAY ID）
hsa-miR-365（配列番号４４）：００１０２０ （ASSAY ID）
hsa-miR-16（配列番号３）：０００３９１ （ASSAY ID）【００８１】
結果を図４に示す。図４より、間葉系幹細胞から細胞外へ放出されるｍｉＲＮＡは、脂肪細胞や骨細胞等の組織細胞へ分化することで変化することが確認された。この結果は、放出されるｍｉＲＮＡを解析することで間葉系幹細胞、組織細胞の品質評価を可能とすることを示唆するものである。以下が間葉系幹細胞から分化誘導したときの各組織細胞のマーカー候補である。
未分化細胞（非誘導）：hsa-miR-214
組織細胞（骨および脂肪細胞）：hsa-miR-143
骨細胞：hsa-miR-365
脂肪細胞：hsa-miR-130a
【図１】
2011001906.tif 000003
【図２】
2011001906.tif 000004
【図３】
2011001906.tif 000005
【図４】
2011001906.tif 000006
【配列表】
2011001906000001.app
【国際調査報告】
2011001906.tif 000007
2011001906.tif 000008
2011001906.tif 000009
2011001906.tif 000010