(57)【要約】【課題】  第１担体である磁性粒子には非特異的反応因子に対する抗体が固定されており、この磁性粒子が検体に混合され懸濁される。懸濁後、ピペットチップに懸濁液が吸い上げられ磁石がピペットチップに近接する。非特異的反応因子が結合した磁性粒子を磁石によって遠隔的に拘束し残液をウェルに排出して検体に含まれる夾雑物の除去処理が終了する。ウェルに排出された処理済みの検体は免疫学的測定に供される。処理済みの検体に抗体が固定された磁性粒子が混合され懸濁される。懸濁液がピペットチップに吸い上げられ磁石を用いて抗原が結合した磁性粒子が分離される。抗原が結合した磁性粒子は洗浄され、第２担体を含有する酵素標識化液に混合懸濁される。懸濁後、標識化され抗原が結合した磁性粒子は基質液に混合され、発光強度等が測定される。
2010074265.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の生体関連物質の測定システムであって、
検体に含まれる夾雑物に対して親和性を有する物質、該夾雑物を不活性化する物質、または検体中の生体関連物質に対して親和性を有する物質が固定された第１担体と、
生体関連物質の検出用試薬が固定された担体、および生体関連物質の検出用試薬を固相化してなる担体から選ばれる第２担体と、
を備えたことを特徴とする前記測定システム。
【請求項２】
生体関連物質が抗原または抗体である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
生体関連物質が核酸である、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
夾雑物が非特異的反応因子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５】
非特異的反応因子が、免疫グロブリン、Ｍタンパク質、異好抗体およびリウマチ因子からなる群から選択される少なくとも１つである請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
第１担体が、磁性粒子、ゲル、樹脂およびメンブレンからなる群から選択される少なくとも１つである請求項１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７】
前記磁性粒子を分注ノズルに装着した分注チップを用いて、分離、洗浄、または懸濁を行う請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
生体関連物質の検出用試薬が、前記生体関連物質に対する標識抗原若しくは標識抗体、または前記生体関連物質の増幅用プライマーおよびプローブを含むものである請求項１〜７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項９】
固相化が凍結乾燥により行われたものである請求項１〜８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
検体、第１担体および第２担体を、それぞれ別個の収容部に収容したことを特徴とする、請求項１〜９８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１１】
検体を収容する検体収容部と、
第１担体が収容された第１収容部と、
第２担体が収容された第２収容部と、
を略直線状に配列したことを特徴とする請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
検体を収容する検体収容部と、
第１担体が収容された第１収容部と、
第２担体が収容された第２収容部と、
を一体的にカートリッジ化したことを特徴とする請求項１０または１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記収容部が密閉可能なものである請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
検体に含まれる夾雑物に対して親和性を有する物質、該夾雑物を不活性化する物質、または検体中の生体関連物質に対して親和性を有する物質が固定された第１担体を予め収容した第１収容部と、
生体関連物質の検出用試薬が固定された担体、および生体関連物質の検出用試薬を固相化してなる担体から選ばれる第２担体を収容した第２収容部と、
検体を収容する検体収容部と、
を備えた試薬カートリッジ。
【請求項１５】
第１担体が磁性粒子である請求項１４に記載の試薬カートリッジ。
【請求項１６】
分注ノズルに装着した分注チップ内にて分離される磁性粒子を、予め複数の試薬を備えた試薬カートリッジウェルに移送する請求項１５に記載の試薬カートリッジ
【請求項１７】
固相化が凍結乾燥により行われたものである請求項１４〜１６のいずれか１つに記載の試薬カートリッジ。
【請求項１８】
前記収容部が密閉可能なものである請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の試薬カートリッジ。
【請求項１９】
検体を収容する検体収容部と、
第１担体が収容された第１収容部と、
第２担体が収容された第２収容部と、
を略直線状に配列したことを特徴とする請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の試薬カートリッジ。
【請求項２０】
検体中の生体関連物質を測定する前の検体の前処理方法であって、
検体中に含まれる夾雑物に対して親和性を有する物質、該夾雑物を不活性化する物質、または検体中の生体関連物質に対して親和性を有する物質が固定された第１担体を用いて前記検体を処理する工程を含む前記方法。
【請求項２１】
生体関連物質の検出用試薬が固定された担体、および生体関連物質の検出用試薬を固相化してなる担体から選ばれる第２担体を調製する工程をさらに含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
生体関連物質が抗原または抗体である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
生体関連物質が核酸である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
夾雑物が非特異的反応因子である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２５】
非特異的反応因子が、免疫グロブリン、Ｍタンパク質、異好抗体、およびリウマチ因子からなる群から選択される少なくとも１つである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
第１担体が、磁性粒子、ゲル、樹脂およびメンブレンからなる群から選択される少なくとも１つである請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
磁性粒子を、分注ノズルに装着した分注チップ内で、分離、洗浄、または懸濁処理を行う、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
生体関連物質の検出用試薬が、前記生体関連物質に対する標識抗原若しくは標識抗体、または前記生体関連物質の増幅用プライマーおよびプローブを含むものである請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
固相化が凍結乾燥により行われたものである請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の方法によって前処理された検体を測定デバイスに供して、検体中の生体関連物質を測定することを特徴とする生体関連物質の測定方法。
【請求項３１】
測定が免疫学的測定または核酸増幅法による測定である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
核酸増幅法がＰＣＲ法である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
検体の前処理と、この処理された検体の測定とを請求項１〜１２のいずれか１項に記載のシステムを用いて行う請求項２０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
検体の前処理と、この処理された検体の測定とを連続して行う請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
(a) 検体を収容する検体収容部と、
(b) 検体から標的核酸を補足する捕捉粒子を収容する第１収容部と、
(c) 標的核酸の検出用試薬を収容する第２収容部と、
(d) 前記検体を検体収容部に分注する分注機構、前記検体と補足粒子とを混合して検体から標的核酸を抽出する機構、および前記抽出された標的核酸と検出用試薬とを混合する機構と、
(e) 前記第２収容部に標的核酸と検出用試薬との混合流体よりも比重の小さい疎水性流体を注入する機構、前記各収容部を覆う蓋を脱着させる機構、標的核酸を蛍光させるための照射光を投射する機構および該照射光を受けた標的核酸からの光を受けて標的核酸を検出する機構、並びにこれらの機構を組み合わせた機構からなる群から選ばれるいずれかの機構とを備えた核酸測定装置。
【請求項３６】
前記捕捉粒子が磁性粒子であり、
前記磁性粒子を分注ノズルに装着した分注チップ内で、分離、洗浄、または懸濁を行う工程を制御する請求項３５に記載の核酸測定装置。
【請求項３７】
前記磁性粒子を分注チップ内に収容する請求項３５または３６に記載の核酸測定装置。
【請求項３８】
疎水性流体が、炭素数１６〜２０の鉱油である請求項３５に記載の装置。
【請求項３９】
前記(d)および(d)の機構は収容部の上部をスライドする機構を備えたものである請求項３５に記載の装置。
【請求項４０】
前記(d)の機構、前記(e)の機構、または前記(d)と(e)との組み合わせの機構は同一ノズル内に内蔵されたものである請求項３５〜３９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項４１】
前記検体収容部、第１収容部、および第２収容部を略直線状に配列したことを特徴とする請求項３５〜４０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項４２】
前記検出用試薬は、ＰＣＲ法または等温増幅法による核酸増幅用試薬および増幅産物の検出用試薬を含むものである請求項３５〜４１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項４３】
前記検出用試薬が予め凍結乾燥されたものである請求項３５〜４２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項４４】
前記第１および第２収容部をカートリッジ化したことを特徴とする請求項３５〜４３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項４５】
請求項３５〜４４のいずれか１項に記載の装置に供して核酸の抽出および検出を行うことを特徴とする核酸の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体関連物質を含有する検体を測定に供する前に前処理する方法、および検体中の生体関連物質の測定システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体作製法が確立されて以来、検体中から目的の生体関連物質を測定する方法として、エンザイムイムノアッセイなどの免疫学的測定法が主要な測定法となっている。このような免疫学的測定法は、高い特異性を有するために直接測定が可能となり、また、高感度に測定することができる。そして近年、これらの測定法は、採取した検体のセット後から測定結果を得るまで測定システムによって自動化されている。また、測定をより迅速化するため、従来よりも固相化抗体やコンジュゲートの濃度を高めた試薬が開発されている。しかしながら、より高濃度の試薬を使用することで、従来測定時に関係しなかった非特異的反応が生じることが多くなった。【０００３】
非特異的反応の原因として、対象物質の多様性、免疫類似物質の存在、抗原の多様性、さらに抗体の多様性が考えられる。免疫学的測定系には種々の非特異的反応を起こす物質として、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ型の異好抗体（異種動物間で反応する抗体：ＨＡＭＡ、抗ＢＳＡ抗体など）、生体成分（例えば、リウマチ因子、クリオグロブリン、Ｍタンパク質など）が存在し、免疫学的測定において非特異的反応の結果として偽陽性を示す場合がある（非特許文献１、２、３参照）。さらに、細菌の表面には糖鎖などの癌関連抗原が存在することから、細菌に感染した症例では、癌に罹患していないにも関わらず、癌の検査において偽陽性を示すことが少なくない。さらに、癌患者において臓器を摘出する際の術中の細菌感染などによる非特異的反応により偽陽性を示すこともある。【０００４】
また、妊娠時や肝臓、腎臓等の疾病罹患時に非特異的反応が生じることが多い。さらに、近年開発されている多くの試薬にリコンビナント抗原が使用されているが、これらリコンビナント抗原の作製の際に使用されている細菌成分の存在により、これら細菌に対する抗体が測定系に影響を与えることも知られている。一般に、免疫学的測定を行う際にこれら非特異的反応物質に対する阻害物質が加えられるが、試薬中に加えられる量には限度があるため必ずしも十分満足な阻害効果を得られるわけではない。このため、現在使用されている測定システムでは、非特異的反応因子を除去することが困難であり、非特異的反応を十分に阻害して測定することは困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍａｒｌｅｎ Ｂｏｕｉｌｌｏｎ， ｅｔ ａｌ．Ｒｅｄｕｃｅｄ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｄｏｎｏｒｓ ｗｉｔｈ ｆａｌｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＨＩＶ−１ ａｎｄ −２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＥＩＡ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｅｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＴＲＡＮＳＦＵＳＩＯＮ． ｖｏｌｕｍｅ ４２ Ａｕｇｕｓｔ ２００２ １０４６−１０５２．
【０００６】
【非特許文献２】Ｊｏｈａｎ Ｂｊｅｒｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ４８：４ ６１３−６２１(２００２)．
【０００７】
【非特許文献３】Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃｏｖｉｎｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．Ａｎ ＩｇＭ λ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｐｒｏｄｕｃｅｓ Ｆａｌｓｅ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙｓ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃｏｖｉｎｓｋｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ４６：８ １１５７−１１６１(２０００)．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、測定に供される検体の中から夾雑物を予め除去することができる前処理方法、および当該前処理された検体を用いる測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、検体を前処理した後に測定を行うことにより高感度に生体関連物質を測定できることを見出し、本発明を完成するに到った。即ち本発明は、
検体中の生体関連物質の測定システムであって、
検体に含まれる夾雑物に対して親和性を有する物質、該夾雑物を不活性化する物質、または検体中の生体関連物質に対して親和性を有する物質が固定された第１担体と、
生体関連物質の検出用試薬が固定された担体、および生体関連物質の検出用試薬を固相化してなる担体から選ばれる第２担体とを備えたことを特徴とするものである。【００１０】
本発明においては、生体関連物質は、抗原もしくは抗体であるか、または核酸であってよい。【００１１】
また、検体中の夾雑物は、非特異的反応因子であってもよく、非特異的反応因子は、免疫グロブリン、Ｍタンパク質、異好抗体およびリウマチ因子からなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。【００１２】
第１担体としては、例えば、磁性粒子、ゲル、樹脂およびメンブレンからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。また、この磁性粒子は分注ノズルに装着される分注チップ内に収容可能であることが好ましく、この場合、この磁性粒子を用いて分注チップ内で分離、洗浄、懸濁などの処理を行うことが好ましい。【００１３】
また、生体関連物質の検出用試薬は、前記生体関連物質に対する標識抗原若しくは標識抗体、または前記生体関連物質の増幅用プライマーおよびプローブを含むものであることが好ましい。【００１４】
本発明の１つの態様では、検出用試薬の固相化は凍結乾燥により実行することが好ましい。【００１５】
また、検体、第１担体、および第２担体は、それぞれ別個のウェルまたはチップなどの収容部に収容することが好ましい。【００１６】
さらに、本発明のシステムは、検体を収容する収容部（ウェルまたはチップ）と、第１担体が収容された収容部と、第２担体が収容された収容部と、を略直線状に配列したことを特徴とする。【００１７】
また、本発明のシステムは、検体を収容する検体収容部と、第１担体が収容された収容部と、第２担体が収容された収容部と、を一体的にカートリッジ化したことを特徴とする。【００１８】
上記システムにおいて、収容部は密閉可能とすることが好ましい。【００１９】
さらに、本発明のカートリッジは、検体に含まれる夾雑物に対して親和性を有する物質、該夾雑物を不活性化する物質、または検体中の生体関連物質に対して親和性を有する物質が固定された第１担体を予め収容した収容部と、生体関連物質の検出用試薬が固定された担体、および生体関連物質の検出用試薬を固相化してなる担体から選ばれる第２担体を収容した収容部と、検体を収容する検体収容部と、を備えたことを特徴とする。【００２０】
上記カートリッジにおいて、第１担体は磁性粒子であることが好ましい。【００２１】
また、このカートリッジにおいて、固相化は凍結乾燥により実行することが好ましい。【００２２】
このカートリッジにおいて、収容部は密閉可能なものであってもよい。【００２３】
さらに、このカートリッジは、検体を収容する検体収容部と、第１担体が収容された収容部と、第２担体が収容された収容部と、を略直線状に配列したことを特徴とする。【００２４】
本発明の前処理方法は、検体中の生体関連物質を測定する前の検体の前処理方法であって、検体中に含まれる夾雑物に対して親和性を有する物質、該夾雑物を不活性化する物質、または検体中の生体関連物質に対して親和性を有する物質が固定された第１担体を用いて前記検体を処理する工程を含むことを特徴とするものである。【００２５】
さらに、本発明の前処理方法は、生体関連物質の検出用試薬が固定された担体、および生体関連物質の検出用試薬を固相化してなる担体から選ばれる第２担体を調製する工程をさらに含むことを特徴とする。【００２６】
なお、上記前処理方法において、生体関連物質は、抗原もしくは抗体、または核酸であってもよい。【００２７】
夾雑物としては、例えば、非特異的反応因子が挙げられる。【００２８】
また、非特異的反応因子は、免疫グロブリン、Ｍタンパク質、異好抗体、およびリウマチ因子からなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。【００２９】
第１担体としては、例えば、磁性粒子、ゲル、樹脂およびメンブレンからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。【００３０】
また、生体関連物質の検出用試薬は、前記生体関連物質に対する標識抗原若しくは標識抗体、または前記生体関連物質の増幅用プライマーおよびプローブを含むものであることが好ましい。【００３１】
また、この前処理方法においては、固相化は凍結乾燥により実行することが好ましい。【００３２】
さらに、本発明においては、前処理された検体を測定デバイスに供して、検体中の生体関連物質を測定してもよい。
また、測定は免疫学的測定または核酸増幅法による測定であることが好ましい。【００３３】
核酸増幅法としては、例えば、ＰＣＲ法、または等温増幅法が挙げられる。核酸の増幅時には、ミネラルオイル等の疎水性流体によって、標的核酸含有溶液と増幅試薬との混合物をウェルやチップなどの収容部内にシール（封止）することが好ましい。【００３４】
本発明において、検体の前処理と、この処理された検体の測定とは連続して実行することができる。【００３５】
さらに本発明の核酸増幅装置では、
(a) 検体を収容する検体収容部と、
(b) 検体から標的核酸を補足する捕捉粒子を収容する第１収容部と、
(c) 標的核酸の検出用試薬を収容する第２収容部と、
(d) 前記検体を検体収容部に分注する分注機構、前記検体と補足粒子とを混合して検体から標的核酸を抽出する機構、および前記抽出された標的核酸と検出用試薬とを混合する機構と、
(e) 前記第２収容部に標的核酸と検出用試薬との混合流体よりも比重の小さい疎水性流体を注入する機構、前記各収容部を覆う蓋を脱着させる機構、標的核酸を蛍光させるための照射光を投射する機構および該照射光を受けた標的核酸からの光を受けて標的核酸を検出する機構、並びにこれらの機構を組み合わせた機構からなる群から選ばれるいずれかの機構とを備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、極めて高感度に生体関連物質を測定することができる。【００３７】
従来の検体の測定システムでは、夾雑物が検体から十分に除去されずに生体関連物質の測定が行われたが、本発明により、夾雑物を除去することができ、生体関連物質の測定感度を高めることが可能となる。また、本発明により、検体の前処理、および前処理された検体の生体関連物質の測定を自動的かつ連続的に行うことができる。さらに、従来は夾雑物の介入を避けるために測定用の検体に夾雑物を失活させる試薬を手動で添加する必要があったが、本発明によりこのような試薬を手動で添加する必要はなく極めて簡便に測定結果を取得することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】第１担体と第２担体との組み合わせを例示した説明図である。
【図２】夾雑物に対して親和性を有する物質が固定された第１担体を用いて夾雑物を除去する態様を概略的に説明する説明図である。
【図３】夾雑物を分解する物質によって夾雑物を分解する態様を概略的に示した説明図である。
【図４】生体関連物質に対して親和性を有する物質が固定された第１担体を用いて生体関連物質を抽出する態様を概略的に説明する説明図である。
【図５】生体関連物質に対して親和性を有する物質が固定された第２担体を用いて生体関連物質を抽出し標識化する態様を概略的に説明する説明図である。
【図６】非特異的反応因子に対する抗体が固定された磁性粒子を用いた前処理から検体に含まれる抗原の検出までの全工程を概略的に示した説明図である。
【図７】非特異的反応因子に対する抗体が固定された担体を用いた前処理から検体に含まれる抗原の検出までの全工程を概略的に示した説明図である。
【図８】非特異的反応因子に対する抗体が固定された磁性粒子を用いて行われる夾雑物の除去処理を説明する説明図である。
【図９】非特異的反応因子に対する抗体が固定された磁性粒子を用いて行われる夾雑物の除去処理のフローチャートである。
【図１０】非特異的反応因子に対する抗体が固定されたカラムを用いて行われる夾雑物の除去処理を説明する説明図である。
【図１１】非特異的反応因子に対する抗体が固定されたカラムを用いて行われる夾雑物の除去処理のフローチャートである。
【図１２】非特異的反応因子に対する抗体が固定されたメンブレンを用いて行われる夾雑物の除去処理を説明する説明図である。
【図１３】非特異的反応因子に対する抗体が固定されたメンブレンを用いて行われる夾雑物の除去処理のフローチャートである。
【図１４】還元剤が固定されたゲルを用いて行われる夾雑物の除去処理を説明する説明図である。
【図１５】還元剤が固定されたゲルを用いて行われる夾雑物の除去処理のフローチャートである。
【図１６】核酸と親和性を有するプローブが固定された磁性粒子を用いて行われる抽出処理を説明する説明図である。
【図１７】核酸と親和性を有するプローブが固定された磁性粒子を用いて行われる核酸抽出処理のフローチャートである。
【図１８】抗原に対する抗体が固定された磁性粒子、抗原に対する抗体が固定されたプレート、抗原に対する抗体が固定されたビーズを模式的に説明する説明図である。
【図１９】第２担体を用いて抗原を捕捉し標識化して検出する態様について概略的に説明する説明図である。
【図２０】磁性粒子を用いて行われる免疫学的測定を説明する説明図である。
【図２１】抗原分別固定チューブを用いて行われる免疫学的測定を説明する説明図である。
【図２２】測定システムを機能的にまとめたブロック図である。
【図２３】非特異的反応因子に対する抗体が固定された磁性粒子を用いて前処理が実行された後に続けて免疫学的測定を実行する際のフローチャートである。
【図２４】非特異的反応因子に対する抗体が固定されたカラムを用いて前処理が実行された後に続けて免疫学的測定を実行する際のフローチャートである。
【図２５】前処理用の磁性粒子や基質役を予め収容したカートリッジを利用する測定システムの概略図である。
【図２６】カートリッジを利用する測定システムの作動形態について概略的に説明する説明図である。
【図２７】カートリッジを利用する測定システムの前処理工程について示した説明図である。
【図２８】カートリッジを利用した測定工程について示した説明図である。
【図２９】別形態のカートリッジについて概略的に説明する説明図である。
【図３０】検体からの核酸の抽出から第２担体の調製までの前処理工程を概略的に示した説明図である。
【図３１】ライン状に並べられた複数のウェルが１２列並べられた処理部について概略的に説明する説明図である。
【図３２】測定システムを機能ごとに図示した機能ブロック図である。
【図３３】測定システムで実行される処理工程を示したフローチャートである。
【図３４】カートリッジを利用して核酸を前処理することができる測定システムの概略図である。
【図３５】マスターミクスチャを収容したウェルをカートリッジの長手方向に沿って一部切断したカートリッジの斜視断面図である。
【図３６】測定サンプルが収容されたウェルとマスターミックスが収容されたウェルとをカートリッジ本体から分離する態様について説明する説明図である。
【図３７】ライン状に並べられた複数のウェルを用いて核酸の検出を実行する態様について説明する説明図である。
【図３８】ウェルが配列された複数の処理ラインを有するカートリッジと、このカートリッジ上を処理ラインに沿って移動するノズルユニットとを示した斜視図である。
【図３９】ポンピング開口と、トリガー光照射用光ファイバと、検出用のレンズとを備えたノズルユニット先端部の斜視図である。
【図４０】ノズルユニット先端部を、光ファイバの延伸方向と平行な平面で切断した断面図である。
【図４１】核酸検出装置を機能ブロックごとにまとめた機能ブロック図である。
【図４２】ポンピング開口と、トリガー光照射用光ファイバと、検出用のレンズとを備えたノズルユニットを１本だけ備えた核酸検出装置を概略的に示した斜視図である。
【図４３】処理ラインごとに備えられた分注用のノズルと単一の核酸検出器とを別個に備えた核酸検出装置の要部を示した斜視図である。
【図４４】処理ラインごとに核酸の検出器を備えた核酸検出装置の斜視図である。
【図４５】分注用のノズルの外部に、光ファイバを備えた態様について示した断面図である。
【図４６】単一の検出器と、この検出器に各検出用ウェルを選択的に対応させる切り替え装置と、を備えた核酸検出装置の概略を示した説明図である。
【図４７】血清へのＡＦＰの添加に基づく、ＡＦＰ値を求めるための標準曲線を示したグラフである。
【図４８】ＰＢＳ緩衝液へのＡＦＰの添加に基づく、ＡＦＰ値を求めるための標準曲線を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
１．概要
本発明は、検体中の標的物質を測定するため、機能の異なる複数種類の担体を利用した検体の測定システムおよび検体の前処理方法に関するものである。本発明の測定システムは、生体関連物質を含有した検体に対して用いることができ、機能の異なる複数の担体を用いて検体を処理して標的である生体関連物質の測定を高い精度で実行するものである。機能の異なる複数の担体としては、例えば、検体に含まれる夾雑物に対して親和性を有する物質、夾雑物を不活性化する物質、または検体中の生体関連物質に対して親和性を有する物質が固定された第１担体と、生体関連物質の検出用の試薬が固定された担体、および生体関連物質の検出用の試薬を固相化してなる担体から選ばれる第２担体とを用いることができる。「親和性を有する」とは物質（物質Ａ、Ｂ）同士の相互間で化学的または物理的に相互作用して結びつきが強まることを意味する。また、「不活性化する」とは、保有する機能を呈さないようにすることを意味する。物質Ａと、物質Ａに対して親和性を有する物質Ｂとの組み合わせとして、例えば、抗原と抗体、リガンドと受容体、核酸とその相補鎖などが挙げられる。夾雑物を除去するための第１担体としては、例えば、非特異的反応因子に対する抗体が固定された物質（磁性粒子、カラム、濾材、高分子材料など）を備えたものが挙げられる。また、夾雑物を分解するための第１担体としては、例えば、非特異的反応因子を分解する還元剤を備えたものが挙げられる。また、生体関連物質を抽出するための第１担体としては、例えば、生体関連物質である核酸と親和性を有するプローブが固定された磁性粒子などが挙げられる。これら例示した第１担体を用いることで、検体からの夾雑物の除去や検体からの生体関連物質の抽出を実行することができる。
【００４０】
図１に示すように、第１の担体として、検体に含まれる夾雑物に対して親和性を有する物質が固定された担体、夾雑物を不活性化する物質が固定された担体、または検体中の生体関連物質に対して親和性を有する物質が固定された担体の３種が挙げられ、第２担体として、生体関連物質の検出用の試薬が固定された担体、生体関連物質の検出用の試薬を固相化してなる担体の２種が挙げられ、このため第１担体と第２担体との組み合わせは少なくとも６通り考えられ、これらの組み合わせを用いて検体を処理することで様々な処理態様を形成することができる。
図２〜５に本発明のシステムにおける原理の概略的な説明図を示す。例えば、図２に示すように、第１担体として、検体に含まれる夾雑物に対して親和性を有する物質が固定された担体を用いて検体を処理することにより担体が夾雑物を捕捉し、この担体を回収（除去）することにより検体から夾雑物を除去できる。また、図３に示すように、第１担体として、検体に含まれる夾雑物を不活性化する物質（不活化物質）が固定された担体を用いることにより検体中の夾雑物を分解することができ、これにより結果的に検体から夾雑物を除去することができる。生体関連物質の取得後、第２担体として、生体関連物質検出用の試料が固定された担体を用いることにより、検体中の生体関連物質を検出することができる。また、図４に示すように、第１担体として、検体中の生体関連物質に対して親和性を有する物質が固定された担体を用いることで検体から生体関連物質のみを抽出することができ、生体関連物質の測定時などにおける夾雑物による阻害を防止することができる。
本発明においては、図１に示したように、上記に例示した担体以外の第１、第２担体の組み合わせも可能であり、それぞれの組み合わせに応じて異なる処理を検体に対して実施することができる。また、夾雑物と親和性を有する物質が固定された第１担体を用いた後、さらに生体関連物質と親和性を有する物質が固定された第１担体を用いて検体を処理してもよい。
【００４１】
第１担体を用いて生体関連物質が取得された後、第２担体を用いて生体関連物質を測定することができる。第１担体は、検体中の生体関連物質の高純度化または抽出などを行うための担体であり、本発明の前処理に使用される担体である。第２担体は、生体関連物質を検出するための測定試薬が固定された、または固定化されてなる担体である。本発明においては、第２担体を調製せずに別途試薬と反応させて測定工程を実施することも可能であるが、装置による全自動化を行うことを考慮すると、第２担体を予め調製しておくことが好ましい。また、第２担体だけでなく第１担体も予め調製しておくことでさらに高い効率で利便性の高い作業を実現できる。
【００４２】
図５に示すように、生体関連物質と親和性を有する物質（親和性物質）が固定された第２担体を生体関連物質に結合させ、さらに、標識化物質が固定された第２担体を生体関連物質に結合させて生体関連物質を検出する。なお、生体関連物質と親和性を有する第１担体を用いた場合は、生体関連物質と親和性を有する第２担体の使用を省略可能な場合があり、この場合は第１担体を用いた処理が実施された検体に対して標識化物質が固定された第２担体を直ちに使用することができる。
【００４３】
また、本発明の前処理方法は、検体中の生体関連物質を測定する前の検体の前処理方法であって、検体中に含まれる夾雑物に対して親和性を有する物質、該夾雑物を不活性化する物質、または検体中の生体関連物質に対して親和性を有する物質が固定された第１担体を用いて前記検体を処理する工程を含むことを特徴とする。この前処理は、検体中に含まれる夾雑物を除去すること、および検体中に含まれる生体関連物質を抽出または精製することのいずれをも意味するものである。
【００４４】
さらに、本発明の前処理には、生体関連物質と親和性を有する物質、および／または生体関連物質を標識化する物質が固定された第２担体を調製する工程を含めることができる。第２担体の調製は、第１担体による処理と同時にまたは時期を前後して行うことができる。生体関連物質が抗原または抗体の場合には、後の測定工程で抗体または抗原を標識化して検出するための準備が整い、また生体関連物質が核酸の場合には、後の工程で核酸を標識化して検出するための準備が整うこととなる。
【００４５】
以上に述べたような前処理を実行した後に、測定工程が実行される。測定対象である生体関連物質が抗原または抗体である場合、第１担体として、検体中の夾雑物と親和性を有する物質が固定された磁性粒子、ゲル、メンブレンなどの保持体が挙げられ、第２担体として、当該抗原に対する抗体が固定された物質（磁性粒子、ビーズなど）が挙げられる。
また、生体関連物質がＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸の場合では、第１担体として検体中のＤＮＡ／ＲＮＡと親和性を有する物質が固定されたものが挙げられ、第２担体として、抽出、分離または精製されたＤＮＡ／ＲＮＡの特定の塩基配列部分を増幅測定するために必要な反応試薬（プローブ、プライマー、マスターミクスチャ等)が固相化されたものが挙げられる。
【００４６】
さらに具体的には、例えば、生体関連物質が腫瘍マーカー（例えばＣＡ１９−９）の場合、測定時における偽陽性反応を防止するために、第１担体として、反応阻害物質となるＩｇＭなどを除去するための夾雑物と結合する物質（例えば、ＩｇＭ抗体）を固定した担体（磁性粒子または非磁性固体）が使用される。そして、第２担体として、腫瘍マーカー抗体（例えば抗ＣＡ１９−９抗体）を固定した磁性または非磁性固体が使用される。測定は、第２担体が含まれる容器に、第１担体を用いて処理された生体関連物質（上記例ではＣＡ１９−９）および基質溶液を加えて測定する。
【００４７】
また、測定対象の生体関連物質が核酸（例えばインフルエンザウイルスＲＮＡ）の場合、第１担体として、ウイルスRNAの抽出、分離または精製を行うための磁性粒子が使用され、第２担体として、上記抽出、分離または精製されたＲＮＡの特定の塩基配列部分をPCRその他増幅測定するために必要な反応試薬を備えた担体が使用される。測定は、第２担体が含まれる容器に、第１担体を用いて処理された生体関連物質（上記例ではインフルエンザウイルスＲＮＡ）および増幅用反応試薬を加えて行う。
【００４８】
本発明は１つの態様において、このような検体中の非特異的反応因子を除去する処理、生体関連物質と親和性を有する、および／または生体関連物質を標識化する物質が固定された第２担体を調製する処理を１つの装置で連続して行うものである。これを実現した装置を、本発明では測定システムという。
【００４９】
図６に示すように、測定システムでは、前処理工程として、生体関連物質を含有する検体の処理工程、例えば夾雑物を除去する工程と、第２担体を調製する工程とが実行され、検体中の生体関連物質を検出する工程は、検体中の生体関連物質を標識化する標識化反応工程と標識化された生体関連物質を測定する測定工程とを有する。従って、測定システムでは、大別して（ｉ）第１担体を用いた検体の処理工程、（ｉｉ）第２担体の調製工程、（ｉｉｉ）前処理後に行われる測定工程、の３つの工程が実行され、基本的には（ｉ）の工程を前処理という。ただし、（ｉｉ）の工程を（ｉ）の工程と合わせて前処理工程とすることができる。（ｉ）の工程は、測定対象の生体関連物質の高純度化または抽出を行う試験管内環境を整える処理であり、（ｉｉ）の工程は生体関連物質を検出するための試薬が含まれる試験管内環境を整えるものと理解することができ、検体中の生体関連物質を測定可能にするための、いわばサンプルおよびサンプル測定試薬の準備工程を意味する。図６は第２担体の調製を前処理工程に含めて表示したものである。
【００５０】
第１担体を用いて検体を処理する工程は、夾雑物の除去工程、生体関連物質の高純度化または抽出工程を意味する。この工程は第２担体の調製に合わせて適宜選択することができる。例えば、（ａ）磁性粒子を利用して所望の生体関連物質を選択的に収集する手法、（ｂ）所望する複数種類の生体関連物質を同時に収集する手法などが可能である。検出の対象である生体関連物質が抗原または抗体などのタンパク質の場合は、主として、（１）非特異的反応因子に対する抗体が固定された磁性粒子を利用して非特異的反応因子を捕捉除去する手法、（２）非特異的反応因子に対する抗体が固定されたアフィニティゲルを利用して非特異的反応因子を捕捉除去する手法、（３）非特異的反応因子に対する抗体が固定されたフィルタを利用して非特異的反応因子を捕捉除去する手法、（４）非特異的反応因子に対する抗体が固定されたプラスチック担体を利用して非特異的反応因子を捕捉除去する手法、および（５）還元剤が固定されたゲルを用いて非特異的反応因子を分解する手法、などの態様がある。また、生体関連物質がＤＮＡやＲＮＡなどの核酸の場合は、標的核酸と結合可能なプローブが固定された磁性粒子を用いて標的核酸を抽出する手法などがある。
【００５１】
本発明の測定システムは、前処理工程に引き続き連続的に免疫学的測定または核酸測定などの測定を実行することができる。測定システムは、ノズル、分注チップであるピペットチップ、複数のウェルが配列されたウェルプレート等の収容部、ポンプ機構等を備える。収容部は、磁性粒子液、洗浄液、酵素標識液、基質液等を収容できる。ピペットチップ移動時の動きはモータやモータコントローラ等によって自動制御することができる。ウェルの材質は検出方法に鑑みて適宜選択するとよい。例えば、ＣＬＩＡ検査やＣＬＥＩＡ検査の場合は、相互の発光影響を受けない不透明な材質で形成し、ＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ）検査の場合は、透過光を扱う関係上、透明な材質で形成するとよい。なお、後述するが、非特異的反応因子を捕捉する磁性粒子とは、例えば、非特異的反応因子に対する抗体を表面に固定でき、Ｂ／Ｆ分離（結合体と非結合体との分離）等を行うための磁性物質をいう。
【００５２】
図６は、非特異的反応因子に対する抗体が固定されたアフィニティゲルを利用して非特異的反応因子を捕捉除去する手法を用いて検体を処理し、次いで磁性粒子を利用して所望の生体関連物質を選択的に収集する手法を用いて生体関連物質の標識化を行うプロセスの全体を示すものである。但し、第２担体の調製は、図６に示す順序でなくてもよく、夾雑物の除去工程中または除去工程前でもよい。図６に示した態様とは別の処理を行った場合については、図７に示した。図７は、非特異的反応因子に対する抗体が固定された磁性粒子を利用して非特異的反応因子を捕捉除去する手法を用いて検体の前処理を実行し、次いで磁性粒子を利用して所望の生体関連物質を選択的に収集する手法を用いて生体関連物質の検出を行うプロセスの全体を示すものである。測定対象である生体関連物質が核酸の場合は、検体中の標的核酸を測定する工程の前に、第１担体を用いて核酸を抽出する工程が実行される。以下に、前処理工程、および測定工程等の各工程等についてさらに詳しく説明する。
【００５３】
２．生体関連物質および検体
本発明において「生体関連物質」とは、測定工程における検出の対象となりうる物質であって、微生物、ウイルス、細胞、核酸、多糖、単純タンパク質、複合タンパク質、低分子などのあらゆる生体物質を意味する。
【００５４】
微生物には真菌および真正細菌および古細菌が含まれる。真菌としては、例えば、サッカロマイセス属、アスペルギルス属、カンジダ属に属する微生物などが挙げられる。真正細菌としては、例えば、マイコバクテリウム属、エッシェリヒア属、バチルス属、リステリア属、ビブリオ属、サルモネラ属、シュードモナス属、スタフィロコッカス属、マイコプラズマ属、リケッチア属、クラミジア属などに属する微生物が挙げられる。古細菌としては、例えば、サーモプラズマ属、ハロバクテリウム属、メタノバクテリウム属に属する微生物などが挙げられる。具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ種、アスペルギルス・ニデュランス種、カンジダ・アルビカンス種、マイコバクテリウム・ツベルクローシス種、マイコバクテリウム・アビウム種、マイコバクテリウム・イントラセルラー種、マイコバクテリウム・カンサシー種、エッシェリヒア・コリ種 、バチルス・セレウス種、バチルス・アンスラシス種、リステリア・モノサイトゲネス種、ビブリオ・パラヘモリティカス種、ビブリオ・コレラ種、サルモネラ・チフス種、シュードモナス・エレギノーサ種、スタフィロコッカス・アウレウス属、マイコプラズマ・ニューモニア種、リケッチア・プロワツェキイ種、クラミジア・トラコマチス種などを例示し得る。
【００５５】
ウイルスとしては、例えば、アデノウイルス科、バクテリオファージ科、レトロウイルス科に属するウイルスなどが挙げられる。具体的には、アデノウイルス、Ｔ７様ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ノロウイルス、ヒトロタウイルス、インフルエンザウイルスなどを例示し得る。細胞は動物細胞、植物細胞、昆虫細胞のいずれも含まれる。核酸としては、DNA、RNA、人工核酸などが挙げられる。多糖としては、デンプン、グリコーゲン、キチン、カラギーナンなどが挙げられる。タンパク質としては、抗原、抗体、酵素、色素タンパク質その他ポリペプチドなどが挙げられる。低分子としては、ヌクレオチド三リン酸またはデオキシヌクレオチド三リン酸などのヌクレオチド、グルコースまたはガラクトースなどの糖、グルタミン酸またはリジンなどのアミノ酸、フルオロセインまたはエチジウムブロマイドなどの色素、エピネフリンまたはペプチドホルモンまたはステロイドなどのホルモンが挙げられる。但し、上記生体関連物質は例示であり、これらの物質に限定されるものではない。検体はこれらの生体関連物質を含む限り特に限定されるものではなく、例えば、(ｉ) 痰、喀痰、唾液、口腔洗浄液、胃液、胸腔洗浄液、血液、血清、血漿、糞便、尿、髄液、精液等の臨床材料、(ｉｉ) 細胞溶解液、組織溶解液、細胞培養物、組織培養物等の生物材料、(ｉｉｉ) 家庭排水、工業排水などの排水、(ｉｖ) 海洋水、河川水、池水、湖水、地下水などの環境水、(ｖ) 飲用水、食物等洗浄液、および生体関連物質が存在し得る道具の洗浄用液、が検体に含まれる。「生体関連物質が存在し得る道具の洗浄用液」とは、生体関連物質の存在を確認したい箇所を拭き取った道具の洗浄用液、または生体関連物質の存在を確認したい箇所を洗い流した洗浄用液を意味し、例えば、調理用包丁の洗浄液、拭き取りクロス（台布巾）で物を拭き取った後の洗浄用液などが挙げられる。
【００５６】
本発明において、夾雑物の除去処理によって除去される非特異的反応因子は、処理対象となる検体に応じて種々考えられるが、検体として血清を使用するときは、免疫グロブリン、異好抗体、リウマチ因子（ＲＦ）、Ｍタンパク質などが非特異的反応因子となる。Ｍタンパク質は、単クローン性（モノクローナル）免疫グロブリンと同義であって１種類の免疫グロブリンが増加した場合に見られるそのタンパク質を指し、例えば、骨髄腫が産生する免疫グロブリンタンパク質は、多発性骨髄腫を代表する形質細胞異常増殖症患者の血清中に出現するＭタンパク質である。なおＭタンパクには、Ｍタンパクを産生する骨髄腫によりＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＢｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓタンパクの５種がある。また、異好抗体（heterophilic antibody:HA）はヒト抗体−動物抗体であり、健常なヒトにも通常、数パーセントの割合で存在する。異好抗体にはヒト抗体−マウス抗体（ＨＡＭＡ）、ヒト抗体−ヒツジ抗体（ＨＡＳＡ）、ヒト抗体−ヤギ抗体（ＨＡＧＡ）などがある。これらの異好抗体が検体中に存在する場合、マウス、ヤギ、ヒツジ、あるいはヤギ抗体を用いた免疫学的測定において偽陽性や偽陰性の非特異的反応を受けることとなる。検体から核酸を検出する場合は、抗体に代えて核酸の相補領域または相補領域を含む核酸を用いて目的の核酸を検出することができる。検出時に用いられる核酸の増幅には、例えばＰＣＲ法を適用できるが、これに限らず目的に合わせて適宜他の増幅方法（ＬＡＭＰ法等の等温増幅法）を用いるとよい。
【００５７】
３．第１担体を用いた検体処理
この処理によって、免疫学的測定分野で従来、回避できなかった偽陽性反応または偽陰性反応の原因となる非特異的反応因子を予め除去することができるため、極めて特異的かつ高感度に生体関連物質を検出することができる。第１担体として、磁性粒子、ゲル状部材、メンブレン、樹脂部材、線維体などを利用することができ、それぞれ適宜使い分けるとよい。後述するとおり、夾雑物の除去処理後、処理済の検体は免疫学的測定工程に供される。また、この処理によって核酸の測定分野では標的核酸を選択的に抽出することができ、測定時の検出感度を向上させることができる。第１担体としては、核酸捕捉用のプローブが固定された磁性粒子などを用いることができる。
【００５８】
３−１  非特異的反応因子に対する抗体が固定された磁性粒子による夾雑物の除去処理
図８は、非特異的反応因子に対する抗体が固定された磁性粒子を用いて行われる夾雑物の除去処理を示す図である。図８に示すように、ピペットチップ（分注チップ）１０は、例えば、先細りした細長い略円筒形状に形成され、測定システムに着脱自在に取り付けられる。磁性粒子は、例えば、分注用のノズルに装着されたピペットチップにて、分離、洗浄、懸濁等を行うときに用いられる。図８（ａ）に示すように、ピペットチップ１０は、ウェル１２に挿入される先端部１０ａ、測定システムのノズル（図示省略）に固定されるマウント部１０ｂ、先端部１０ａとマウント部１０ｂとの間に形成され外部磁場によって磁性粒子を収容する収容部１０ｃとを有する。先端部１０ａの内径は最も小さく、収容部１０ｃは、例えば、小径部と大径部とからなり、小径部の内径は先端部の内径よりも大きく、大径部の内径はマウント部の内径よりも小さく、そしてマウント部１０ｂの内径が最も大きい。ピペットチップの容量サイズはウェルのサイズに合わせて適宜決めることが望ましいが、例えば数マイクロリットルから数百マイクロリットルの容量とすると利便性の向上が期待できる。
【００５９】
夾雑物の除去処理を実行する測定システムは、収容部１０ｃの外周に接離可能に設けられ磁性粒子を磁力によって拘束する磁石Ｍ、ピペットチップ１０のマウント部１０ｂが取り付けられるノズル、ノズルに装着されたピペットチップ１０に液体の吸込や排出を実行させるためのポンプ機構等を備える。ここで、磁石Ｍは収容部１０ｃのうち小径部で磁性粒子を拘束することができる（図６、図７参照）。
【００６０】
図８（ｂ）に示すように、ピペットチップ１０がウェル１２に挿入されたとき、ピペットチップ１０とウェル１２との間には、例えば０．２ｍｍ〜０．５ｍｍ程度のクリアランスが設けられている。これによりピペットチップ挿入時における検体の外部との接触エリアを極力小さくでき、雑菌混入の危険性を低減している。なお、ピペットチップ１０の形状は適宜変更してよいが、ピペットチップ１０がウェル１２に挿入された際のウェル１２とピペットチップ１０との間のクリアランスは狭い方が好ましい。
【００６１】
磁性粒子１４は磁性を有し、その大きさは、例えば０．１μｍ〜１００μｍ、好ましくは０．１μｍ〜１０μｍ程度のサイズに形成されている。磁性粒子１４の、サイズ、質量、材料、構造、その性質（常磁性、超常磁性、強磁性等、フェリ磁性、磁力の大きさ）等は、その処理目的に応じて任意に定めてよい。この磁性粒子は、水酸化鉄、酸化鉄水和物、酸化鉄、混合酸化鉄、あるいは鉄、γ-Fe2O3, Fe3O4等によって形成することができる。
【００６２】
図９は、非特異的反応因子に対する抗体が固定された磁性粒子を用いて行われる夾雑物の除去処理のフローチャートを示す図である。図９に示すように、測定システムが上記のウェルとピペットチップとを用いて検体の前処理を行なう場合、まず、ウェルに収容された検体をピペットチップ１０で所定量吸引する。次に、この検体が吸引されたピペットチップ１０を前処理用磁性粒子液が収容されたウェル１２に移動させ、前処理用磁性粒子液を収容したウェル１２にピペットチップ１０内の検体を排出する。ピペットチップ１０を用いて検体と前処理用磁性粒子液との混合操作を繰り返し、吸込および排出させて流動撹拌しながら均一な懸濁液を形成する。撹拌終了から所要時間静置して、前処理用磁性体に固定された非特異的反応因子に対する抗体に、検体中の非特異的反応因子を結合させる。所定時間経過後、静置された懸濁液をピペットチップ１０内に吸い込む工程を実行する。
【００６３】
図８（ｃ）に示すように、ピペットチップ１０に吸い込まれた懸濁液はピペットチップ１０の収容部１０ｃに収容される。懸濁液に懸濁した前処理用磁性粒子１４は、ピペットチップ１０外部の磁石Ｍの磁場によって収容部１０ｃの内壁面上の一定部位に遠隔的に固定される。
【００６４】
懸濁液がピペットチップ１０内に収容された後、前処理用磁性粒子１４は磁石Ｍからの磁場によって一ヶ所に固定された状態で、残りの液体がウェル１２内に排出される。これにより、非特異的反応因子１５が結合した前処理用磁性粒子１４を検体から除去し、検体から夾雑物が除去処理された測定サンプルを取得することができる。このように非特異的反応因子１５に対する抗体が固定された磁性粒子１４を非特異的反応因子の除去に利用することにより、非特異的反応因子に対する抗体が固定された磁性粒子が非特異的反応因子に遭遇する頻度を高めることができ、効率よく非特異的反応因子を捕捉して除去することができる。
【００６５】
３−２  非特異的反応因子に対する抗体が固定されたアフィニティカラムによる夾雑物の除去処理
図１０は、非特異的反応因子に対する抗体が固定されたカラムを用いて行われる夾雑物の除去処理を示す図である。図１１は、非特異的反応因子に対する抗体が固定されたカラムを用いて行われる夾雑物の除去処理のフローチャートを示す図である。図１０および図１１に示すように、カラム含有ピペットチップ２０は非特異的反応因子を除去するためのカラム２４を有する。図１０（ａ）に示すように、カラム含有ピペットチップ２０の外形、寸法、材料は上記のピペットチップ１０と同様に形成されている。カラム２４にはペレット状に形成された多数のアフィニティ樹脂２６が含まれ、各アフィニティ樹脂２６には非特異的反応因子を捕捉するための抗体が結合されている。図１０（ｂ）に示すように、カラム２４に、ウェル１２に収容された検体を通すことで検体中の非特異的反応因子が上記の抗体と結合してカラム２４に捕捉される。カラム含有ピペットチップ２０内に検体を吸い込んだ後にカラム含有ピペットチップ２０から検体を排出する工程を所定回数繰り返すことで、より多くの非特異的反応因子をカラム２４で捕捉することができる。図１０（ｃ）に示すように、検体の吸込および排出を所定回数実行した後にウェル１２に排出することで、検体から非特異的反応因子を除去した測定サンプルを提供することができる。
【００６６】
３−３  非特異的反応因子に対する抗体が固定されたメンブレン等の濾材による夾雑物の除去処理
図１２は、非特異的反応因子に対する抗体が固定されたメンブレンを用いて行われる夾雑物の除去処理を示す図である。図１３は、非特異的反応因子に対する抗体が固定されたメンブレンを用いて行われる夾雑物の除去処理のフローチャートを示す図である。図１２および図１３に示すように、メンブレン含有ピペットチップ３０は非特異的反応因子を除去するためのメンブレン３４を有する。図１２（ａ）に示すように、メンブレン含有ピペットチップ３０の外形、寸法、材料は上記のピペットチップ１０と同様に形成されている。このメンブレン３４はシート状に形成され、メンブレン３４には非特異的反応因子に対する抗体が固定されている。図１２（ｂ）に示すように、メンブレン３４に検体を通すことで、検体中の非特異的反応因子は上記の抗体と結合してメンブレン３４に捕捉される。メンブレン含有ピペットチップ３０内にウェル１２内の検体を吸い込んだ後にメンブレン含有ピペットチップ３０から検体を排出する工程を所定回数繰り返すことで、より多くの非特異的反応因子をメンブレン３４で捕捉することができる。図１２（ｃ）に示すように、検体の吸込および排出を所定回数実行した後にウェル１２に排出することで、検体から非特異的反応因子を除去した測定サンプルを提供することができる。
【００６７】
３−４  還元剤が固定されたゲルによる夾雑物の除去処理
図１４は、還元剤が固定されたゲルを用いて行われる夾雑物の除去処理を示す図である。図１５は、還元剤が固定されたゲルを用いて行われる夾雑物の除去処理のフローチャートを示す図である。図１４および図１５に示すように、ゲル含有ピペットチップ４０は非特異的反応因子を分解するためのゲル４３を有する。図１４（ａ）に示すように、ゲル含有ピペットチップ４０の外形、寸法、材料は上記ピペットチップ１０と同様に形成されている。このゲル４３には，非特異的反応因子を分解するための還元剤（夾雑物を不活性化する物質）が固定されている。還元剤としては、例えば、トリス（２−カルボキシルエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、グルタチオン等を用いることができる。図１４（ｂ）に示すように、還元剤が固定されたゲルに検体を通すことで検体中の非特異的反応因子が還元剤によって分解される。ゲル含有ピペットチップ４０内にウェル１２内の検体を吸い込んだ後にゲル含有ピペットチップ４０から検体を排出する工程を所定回数繰り返すことで、より多くの非特異的反応因子を還元剤で分解することができる。図１４（ｃ）に示すように、検体の吸込および排出を所定回数実行した後、ウェル１２に排出することで非特異的反応因子を除去した検体を提供することができる。なお、上記ではゲルに還元剤を保持させ非特異的反応因子を分解した例を示したが、ゲルに非特異的反応因子に対する抗体を保持させてもよい。この場合、非特異的反応因子に対する抗体が固定されたゲルによって非特異的反応因子を捕捉して除去することができる。
【００６８】
３−５  その他（プラスチック部材による処理）
上記態様のほかにも、例えば、非特異的反応因子に対する抗体がプラスチック製の支持体に固定されているものでも検体を前処理することができる。例えば、支持体には、例えば複数の凹穴がマトリクス状に配列され、この凹穴内に非特異的反応因子に対する抗体が予め固定されている。検体中の非特異的反応因子がこの凹穴内に収容されると検体中の非特異的反応因子がこれに対する抗体と結合して固定される。この凹部内にピペットチップ先端部を浸漬させて液体を吸い上げることで、検体から非特異的反応因子が除去された測定サンプルを作製することができる。
【００６９】
３−６  核酸捕捉用のプローブが固定された磁性粒子を用いた標的核酸の抽出処理
図１６は核酸捕捉用のプローブが固定された磁性粒子（第１担体）を用いて行われる標的核酸の抽出処理について概略的に説明する説明図である。また、図１７は核酸補足用のプローブが固定された磁性粒子を用いて行われる標的核酸の抽出処理におけるフローチャートを示す図である。図１６に示すように、測定システムがウェルとピペットチップとを用いて検体の前処理を行なう場合、まず、ウェルに収容された検体をピペットチップ２２０で所定量吸引する。次に、この検体が吸引されたピペットチップ２２０を前処理用磁性粒子液が収容されたウェル２２２に移動させ、前処理用磁性粒子液を収容したウェル２２２にピペットチップ２２０内の検体を排出する。ピペットチップ２２０を用いて検体と前処理用磁性粒子液とを吸込排出させて均一に混合したな懸濁液を形成する。撹拌終了から所定時間静置して、前処理用磁性粒子２２４に固定されたプローブに、検体中の標的核酸２２５を結合させる。
【００７０】
図１６（ｃ）に示すように、所定時間の静置後、懸濁液はピペットチップ２２０に吸い込まれ収容部２２０ｃに収容される。懸濁液に含まれる前処理用磁性粒子２２４は、ピペットチップ２２０外部の磁石Ｍの磁場によって収容部２２０ｃの内壁面上の一定部位に遠隔的に固定される。懸濁液がピペットチップ２２０内に収容された後、前処理用磁性粒子２２４は磁石Ｍの磁場によって一ヶ所に固定された状態で、残りの液体がウェル２２２内に排出される。これにより、標的核酸２２５が結合した磁性粒子２２４を検体から取り出し、検体から標的核酸を抽出することができる。このように標的核酸と結合可能なプローブが固定された磁性粒子を標的核酸の抽出に用いることにより、効率よく標的核酸を捕捉して抽出することができる。
【００７１】
ウェルプレート上には複数のウェル１２が、例えば、一列、またはマトリクス状に配列されている。特定のウェル１２には検体が予め収容され、これと別のウェルには非特異的反応因子に対する抗体（以降、前処理用抗体という）が固定された所要量の磁性粒子（以降、前処理用磁性粒子という）を含む液体（以降、前処理用磁性粒子液という）が予め収容されている。
【００７２】
本発明において、測定サンプルの検出工程に移行する前に、生体関連物質と親和性を有する物質が固定された第２担体を調製する工程が実行される。図１８は、抗原に対する抗体が固定された磁性粒子、抗原に対する抗体が固定されたプレート、抗原に対する抗体が固定されたビーズを模式的に説明する説明図である。検出工程に移行する前に作製される第２担体としては、例えば図１８に示すように、（ａ）抗原４５に対する抗体４６が固定された磁性粒子Ｇ、（ｂ）抗原４５に対する抗体４６が固定されたプレートＰ、（ｃ）抗原４５に対する抗体４６が固定されたビーズＢなどが挙げられる。図１８（ａ）に示すように、抗原４５に対する抗体４６を磁性粒子Ｇに固定することで、第２担体を作製することができる。また、図１８（ｂ）に示すように、抗原４５に対する抗体４６をプレートＰに固定することにより、別の態様の第２担体を作製することができる。さらに、図１８（ｃ）に示すように、抗原４５に対する抗体４６をビーズＢに固定することにより、さらに別の態様の第２担体を作製することができる。このように第２抗体を予め作製することにより、次の測定工程をスムーズに実行することができ、検出精度の向上などが期待できる。作製された第２の抗体には、抗原４５が特異的に結合可能であり、抗原４５にはさらに蛍光反応または発光反応を起こす標識物質４７が抗原に対する別の抗体（二次抗体）を介して特異的に結合可能となっている。
【００７３】
４．生体関連物質の測定
生体関連物質の測定工程は、生体関連物質の標識化工程と、この標識化された生体関連物質の検出工程とを含む。以下に各工程について説明する。
４−１  標識化反応工程
標識化反応工程は標的生体関連物質の測定工程に含まれ、第２担体を用いて行われる。図１９は、第２担体を用いて抗原を捕捉し標識化して検出する態様について概略的に説明する説明図である。図１９に示すように、標識化反応工程では、検体から夾雑物の除去等の処理がなされた測定サンプルから生体関連物質を捕捉して標識が付与される。生体関連物質として例えば抗原を捕捉する場合、その標識として、抗原４５に結合する抗体４６が用いられる。抗原４５に標識４７を結合させた後、後述する検知工程が行われる。図１９（ａ）（ｂ）に示すように、第２担体として抗原４５に対する抗体４６が固定された磁性粒子Ｇを用いた場合、および第２担体として抗原４５に対する抗体４６が固定されたプレートＰを用いた場合は、例えば、標識化された抗原の検出は光電子増倍管（ＰＭＴ）４８を用いることで抗原の検出を実行することができる。また、図１９（ｃ）に示すように、第２担体として抗原４５に対する抗体４６が固定されたビーズＢを用いた場合は、例えば、光ファイバを利用したフォトンカウンタを用いることで抗原の検出を実行することができる。以下に、検体から抗原を捕捉して標識となる抗体を付与する２つの典型的な態様についてさらに具体的に説明する。
【００７４】
４−１−１  抗原に対する抗体が固定された磁性粒子を用いた抗原の標識化
ここでは第２担体として、抗原に対する抗体が固定された磁性粒子を用いて単一の抗原を捕捉して標識化する態様について説明する。検体の高純度化処理後、測定システムは標識化反応工程を含む測定工程を有する免疫学的測定を実行する。ウェルプレート上の第１のウェル（第１収容部）には検出目的である抗原に対する抗体（以降、特異的反応抗体という）が固定された所要量の磁性粒子（以降、特異的反応用磁性粒子という）を含む液体（以降、特異的反応用磁性粒子液という）が予め収容され、さらに別の第２のウェル（第２収容部）には抗原に対する標識化抗体（以降、標識抗体という）を含む液体（以降、標識化液という）が予め収容され、さらに別の第３のウェルには基質液が収容されている。
【００７５】
図２０は、磁性粒子を用いて行われる免疫学的測定を示す図である。図２０に示すように、夾雑物の除去等の前処理に使用されたピペットチップと同様の新たな別のピペットチップ５０がノズルに付け替えられて別のウェル内に収容された特異的反応用磁性粒子液をピペットチップ５０内に吸い込む。図２０（ａ）に示すように、特異的反応用磁性粒子液を内側に保持したピペットチップ５０は、測定サンプルを収容したウェル１２へ移動制御され先端部をこのウェル１２に浸漬する。磁石Ｍがピペットチップ５０から徐々に離間して特異的反応用磁性粒子を磁場による拘束から解き、特異的反応用磁性粒子液を測定サンプルに混合させる。特異的反応用磁性粒子液と測定サンプルとの混合液を吸込および排出して特異的反応用磁性粒子が均一に懸濁した懸濁液が形成される。図２０（ａ）〜図２０（ｂ）に示すように、懸濁液の形成後、懸濁液は、例えば３７℃で一定時間静置（インキュベーション）され、懸濁液内の抗原と特異的反応用磁性粒子に固定された特異的反応抗体とが特異的反応して結合する。なお、上記では特異的反応用磁性粒子液をピペットチップ５０に吸い込んで測定サンプルが収容された検体収容部（ウェル）１２に加えたが、測定サンプルをピペットチップ５０に吸い込んで特異的反応用磁性粒子液が収容されたウェルに加えてもよい。
【００７６】
図２０（ｂ）に示すように、静置後、懸濁液がピペットチップ５０内に収容される。懸濁液がピペットチップ５０内に収容された後、磁石Ｍがピペットチップ５０の収容部の外周に近づけられ、抗原が結合した特異的反応用磁性粒子（以降、抗原結合磁性粒子という）がピペットチップ５０の収容部内の一ヶ所に集められる。抗原結合磁性粒子の収集後、残り液体はウェル１２に排出され抗原結合磁性粒子のみがピペットチップ５０内に保持される。
【００７７】
図２０（ｂ）に示すように、抗原結合磁性粒子を保持したピペットチップ５０は、抗原結合磁性粒子を保持しつつ洗浄液を収容したウェル６０へと移動制御される。ピペットチップ５０先端部がウェル６０内の洗浄液に浸漬した後、磁石Ｍがピペットチップ５０の収容部の外周から徐々に離間しピペットチップ５０内の抗原結合磁性粒子が洗浄液と混合される。抗原結合磁性粒子が混合された洗浄液はピペットチップ５０によって吸込および排出されて流動撹拌される。撹拌後、抗原結合磁性粒子が混合された洗浄液がピペットチップ５０内に吸い込まれ、ピペットチップ５０の収容部の外周に磁石Ｍが接近し抗原結合磁性粒子が一ヶ所に集められる。抗原結合磁性粒子が一ヶ所に配置が拘束された後、残りの液体がウェル６０に排出される。
【００７８】
図２０（ｃ）に示すように、液体排出後、ピペットチップ５０は抗原結合磁性粒子を保持した状態で、抗原に対する標識化抗体（酵素標識抗体）を含む標識化液を収容したウェル６２に移動制御される。ピペットチップ５０の先端部が標識化液に浸漬した後、磁石Ｍがピペットチップ５０の収容部の外周から徐々に離間して抗原結合磁性粒子の拘束が解除される。抗原結合磁性粒子が混合された標識化液を吸込および排出させることで、抗原結合磁性粒子と標識化液とを混ぜ合わせて均一に懸濁することができる。懸濁後、懸濁液は、例えば３７℃で一定時間静置することで抗原に酵素標識抗体を結合させることができる。
【００７９】
図２０（ｄ）に示すように、一定時間静置（インキュベート）後、ピペットチップ５０はウェル６２内の懸濁液をゆっくりとピペットチップ５０内に吸い込む。ピペットチップ５０内に懸濁液を収容した後、磁石Ｍがピペットチップ５０に接近し、収容された懸濁液に懸濁した磁性粒子を一ヶ所に拘束する。この酵素標識抗体が結合した磁性粒子（以降、標識化抗体結合磁性粒子という）の拘束後、標識化磁性粒子を除く液体がウェル６２に排出され、標識化抗体結合磁性粒子のみがピペットチップ５０に残る。
【００８０】
この後、図２０（ｅ）に示すように、ピペットチップ５０は、標識化抗体結合磁性粒子を保持したまま洗浄液を収容した別のウェル６４へと移動制御され、磁石Ｍが徐々にピペットチップ５０から離間してウェル６４内の洗浄液と標識化抗体結合磁性粒子とが混合される（図２０（ｆ）参照）。既に述べた洗浄工程と同一手順で標識化抗体結合磁性粒子の洗浄が実行された後、標識化抗体結合磁性粒子を保持したピペットチップ５０が基質液を収容したウェル６７に移動制御され、後述する検出工程（図２０（ｇ）参照）が開始される。
【００８１】
なお、上記では抗原に対する抗体が固定された磁性粒子を夾雑物の除去等の処理が済んだ検体に混合して抗体に抗原を結合させた後に、標識化液を用いて抗原に酵素標識抗体を結合させたが、標識化の順序はこれに限らない。例えば、予め酵素標識抗体および抗体が固定された磁性粒子を用いてもよい。
【００８２】
４−１−２  抗体固定ビーズを複数用いた複数種類の抗原の同時的標識化反応工程
上記項目［４−１−１］では単一の抗原を捕捉して標識化したが、この工程では一度に複数種類の抗原を捕捉して標識化する態様について説明する。図２１は、抗原分別固定チューブを用いて行われる免疫学的測定を示す図である。図２１に示すように、管状に形成された透明な抗原分別固定チューブ７０は、抗原に対する抗体が予め固定された第２担体であるビーズ（以降、抗体固定ビーズという）と、一定個数の抗体固定ビーズを隔てて配置されるスペーサビーズ７２とを収容し、各ビーズはチューブに沿って一列に配列されている。抗体固定ビーズは、例えば、第１の抗体が固定された第１抗体固定ビーズ７４と、第２の抗体が固定された第２抗体固定ビーズ７６と、第３の抗体が固定された第３抗体固定ビーズ７８とがそれぞれ例えば３個ずつ連続して並び、各種類の抗体固定ビーズ７４、７６、７８間にはスペーサビーズ７２が配列されている。なお、ビーズの配列は適宜変更してよく、場合によってスペーサビーズは省略できる。
【００８３】
抗原分別固定チューブ７０は、上端部に測定システムのノズルにマウントされるマウント部（図示省略）が設けられ、下端は液体の吸込および排出が可能なように開口している。本発明の測定システムにはポンプ機構が備えられ、ノズルにマウントされた抗原分別固定チューブ７０に液体を吸い込ませる、または排出させることができるようになっている。
【００８４】
図２１（ａ）に示すように、抗原分別固定チューブ７０の下端がウェル１２に浸漬され、ウェル１２内の夾雑物の除去等の処理がなされた測定サンプルが抗原分別固定チューブ７０に吸い込まれると、第１〜第３の抗体にそれぞれ対応する第１〜第３の抗原が抗体に結合して第１〜第３抗体固定ビーズ７４、７６、７８に捕捉される。検体の吸込および排出を所定回数繰り返すことで各抗体固定ビーズ７４、７６、７８に抗原を確実に結合させる。
【００８５】
図２１（ｂ）に示すように、検体の吸込および排出を所定回数繰り返した後、別のウェル８０の洗浄液を吸い込み第１〜第３抗体固定ビーズ７４、７６、７８を洗浄する。図２１（ｃ）に示すように、第１〜第３抗体固定ビーズ７４、７６、７８の洗浄後、別のウェル８４内に収容された酵素標識化液に抗原分別固定チューブ７０の下端が浸漬され、酵素標識化液が抗原分別固定チューブ７０内に吸い込まれる。酵素標識化液は第１〜第３抗体に結合する各抗原に対応して酵素標識抗体が３種類混合されており、抗原分別固定チューブ７０内に酵素標識化液が吸い込まれると各酵素標識抗体は各抗原に結合する。図２１（ｄ）に示すように、酵素標識化液の吸込および排出が所定回数実行されると、別のウェル８４に収容された洗浄液の吸込および排出が行われて抗原および酵素標識抗体が結合した第１〜第３抗体固定ビーズ７４、７６、７８の洗浄が行われる。図２１（ｅ）に示すように、洗浄後、基質液を収容したウェル８６に抗原分別固定チューブが移動制御され後述する検出工程が開始される。上記では３種の酵素標識抗体の混合液が用いられたが、酵素標識化は、異なる種類の酵素標識抗体が収容された３つのウェルについて、順に酵素標識抗体の吸込および排出と洗浄とからなる工程を行うことで代替してもよい。
【００８６】
このように複数種類の抗体固定ビーズ７４、７６、７８が配列された抗原分別固定チューブ７０を用いて検体を処理することで、一度に複数の抗原を捕捉することができ、多項目同時検出を可能にするとともに、検体中の抗原の検出時間を短くすることができる。
【００８７】
上記では抗原に対する抗体が固定されたビーズ７４、７６、７８に夾雑物の除去等の処理がなされた検体を接触させて抗体に抗原を結合させた後に、標識化液を用いて抗原に酵素標識抗体を結合させたが、標識化の順序はこれに限らない。例えば、予め酵素標識抗体を固定したビーズを用いて抗原の補足工程を実行してもよい。
【００８８】
４−２  検出工程
酵素標識抗体が結合した抗原は、基質液に混合され基質を発色させ、吸光度等の検出が行われる。以下に、上記した磁性粒子を用いて抗原の標識化を行った場合と抗原分別固定チューブを用いて抗原の標識化を行った場合とのそれぞれに場合分けして検出工程を説明する。
【００８９】
４−２−１  磁性粒子およびピペットチップを利用した検出
本発明の測定システムは、例えばウェルの側面に特定波長の光束を照射する光照射部、光照射部から照射された光束を、ウェルを介して受光する受光部、受光部から出力される信号を処理して、例えば吸光度データ、あるいは発光強度データを形成する信号処理回路等を備える。
【００９０】
図２０（ｇ）に示すように、標識化抗体結合磁性粒子を保持したピペットチップ５０は、基質液を収容したウェル６７に移動制御される。ウェル６７内の基質液にピペットチップ５０の先端部が浸漬した後、磁石Ｍがピペットチップ５０の収容部の外周から離間して標識化抗体結合磁性粒子の拘束が解除され、標識化抗体結合磁性粒子が基質液と混合される。標識化抗体結合磁性粒子が基質液と混合された後、ピペットチップ５０内への混合液の吸込およびウェル６７への混合液の排出が所定回数実行され、標識化抗体結合磁性粒子が均一に分散した懸濁液が形成される。これにより標識化抗体結合磁性粒子と基質液とを均一に反応させることができる。
【００９１】
標識化抗体結合磁性粒子を基質液と反応させて基質を発色させ、その後、例えば、ウェル６７の側面から特定波長の光束を照射してその吸光度が検出される。なお、ＣＬＩＡ検査のように、発光状態が極めて短い検査法の場合には、液収納部を構成し、該液収容部にフィルタと吸水パッドを配設し、ピペットチップから液収容部内に前工程で吸引した洗浄液と共に磁性粒子を吐出して、フィルタに磁性粒子を捕集させた後、ノズルから過酸化水素水（Ｈ2Ｏ2）等の発光誘発液を供給して該磁性粒子を発光させ、分注時の発光をＰＭＴ等の光学測定装置で測定してもよい。
【００９２】
４−２−２  抗原分別固定チューブを利用した検出
図２１（ｅ）に示すように、第２担体である抗原分別固定チューブ７０を用いて複数の抗原を捕捉した場合には、複数の抗原の検出を一度に実行することができる。本発明の測定システムには特定波長の光束を照射する複数の光照射部、抗原分別固定チューブ７０を介して各光照射部からの光束を受光する複数の受光部、受光部からの出力信号を、例えば増幅してデジタル化して発光強度データを形成する信号処理回路等が備えられている。まず、基質液が収容されたウェル８６に抗原分別固定チューブ７０の下端が浸漬され、基質液が抗原分別固定チューブ７０内に吸い込まれる。基質液の吸込および排出を所定回数実行し十分に発光反応させる。光照射部および受光部は、例えば、各抗体固定ビーズ７４、７６、７８に対応して設けられている。光照射部および受光部は各抗体固定ビーズ７４、７６、７８を介して対向するように配列されている。光照射部からの光束が抗原分別固定チューブ７０の各ビーズ７４、７６、７８を介して受光部によって受光され、受光部からの出力信号を基にして、各ビーズ７４、７６、７８ごとの、例えば吸光度データあるいは発光強度データが形成される。
【００９３】
測定システム
５−１  免疫学的測定システム
本発明は、検体の前処理を行う前処理手段、および前処理手段によって前処理された検体について免疫学的測定を行う免疫学的測定手段を含む測定システムを提供するものであり、免疫学的測定手段は標識化反応手段、および検出手段を備える。本発明の測定システムは、検体の前処理工程から検出工程まで全自動化され、検体中の生体関連物質を自動的に検出することができる。すでに上記で説明したように、前処理工程、並びに測定工程（標識化反応を含むこともある）はそれぞれ複数のバリエーションが考えられ、これら前処理工程および測定工程の組み合わせに従って測定システムが構成される。
【００９４】
上述したように、本願の特徴である夾雑物の除去手段は主に５態様あり、（ｉ）非特異的反応因子に対する抗体が固定された磁性粒子を利用して非特異的反応因子を捕捉除去する手段、（ｉｉ）非特異的反応因子に対する抗体が固定されたアフィニティゲルを利用して非特異的反応因子を捕捉除去する手段、（ｉｉｉ）非特異的反応因子に対する抗体が固定されたフィルタを利用して非特異的反応因子を捕捉除去する手段、（ｉｖ）非特異的反応因子に対する抗体が固定されたプラスチックを利用して非特異的反応因子を捕捉除去する手段、（ｖ）還元剤が固定されたゲルを用いて非特異的反応因子を分解する手段、などの態様が可能である。標識化反応工程は、主に２態様あり（ｉ）磁性粒子およびピペットチップを利用した標識化反応手段、（ｉｉ）抗原分別固定チューブを利用した標識化反応手段、が可能となっている。
【００９５】
検出工程は、標識化反応手段において選択された手段に応じて選択され、例えば、標識化反応手段において（ｉ）磁性粒子およびピペットチップを利用した標識化反応手段を選択した場合には、磁性粒子およびピペットチップを利用した検出手段を選択することが好ましく、標識化反応手段において（ｉｉ）抗原分別固定チューブを利用した標識化反応手段を選択した場合には、抗原分別固定チューブを利用した検出手段を選択することが好ましい。また、（ｉ）磁性粒子およびピペットチップを利用した標識化反応手段と、（ｉｉ）抗原分別固定チューブを利用した標識化反応手段との両方を搭載した測定システムの製作も可能である。但し、この場合、ノズルに対するピペットチップと抗原分別固定チューブとの付け替え機構をさらに搭載するか、あるいはピペットチップ用のノズルと抗原分別固定チューブ用のノズルとの両方を搭載する。以上のように夾雑物の除去手段、標識化反応手段、および検出手段の組み合わせ次第で少なくとも１０通り以上の測定システムを設計可能であり、使用目的等に応じて適宜改変して製作するとよい。以下に、特に好ましい態様について示す。
【００９６】
図２２は、前処理工程を実行した後に、測定工程を実行する測定システムのブロック図である。以下に磁性粒子を利用したシステムについて説明する。測定システム１００は、中央制御部１０２、チップ位置制御部１０４、チップマウント制御部１０６、磁場制御部１０８、温度制御部１１０、ポンピング制御部１１２、計時部１１４、ＲＡＭ１１６、ＲＯＭ１１８、表示パネル１２０、操作インターフェース１２２などを備える。
【００９７】
チップ位置制御部１０４は、互いに直行したＸＹＺ軸を備え、ステッピングモータやサーボモータによってノズルの位置を制御する。Ｘ軸およびＹ軸はウェルプレートと略平行であって互いに直行し、Ｚ軸はウェルプレートと略垂直をなしている。ノズルの移動に際しては、例えば、ウェルプレートと略平行なこれらＸ軸上およびＹ軸上での移動と、ウェルプレートと略垂直なＺ軸上での移動との２段階でノズルが動かされる。
【００９８】
ＲＯＭ１１８には各種制御プログラムが格納されている。ユーザが操作インターフェース１２２を通して選択した動作モードに応じてＲＯＭ１１８から制御プログラムがＲＡＭ１１６に展開され、中央制御部１０２はこのＲＡＭ１１６に展開された制御プログラムを基にしてシステム１００の各部をコントロールしている。
【００９９】
表示パネル１２０はユーザに対して提示する必要のある項目を表示する。例えば、検体の夾雑物の除去処理時のポンピング回数、磁性粒子懸濁後の静置時間、ポンピング時の流速の緩急、吸込量および排出量、ピペットチップの移動速度の緩急などは表示パネル１２０に表示でき、ユーザはこの表示で確認することができる。もし各種設定内容を変更したい場合は、操作インターフェース１２２の操作を通して変更することができる。
【０１００】
計時部１１４は、ＲＯＭ１１８から読み出されたプログラムに応じて時間のカウントを行う。時間のカウントは、例えば、インキュベートを行うときやポンピングを行うときなどに行われ、これにより各工程が正確に実行される。
【０１０１】
磁場制御部１０８は、磁石１３０の配置を管理してピペットチップに付与する磁場の強さを制御する。磁場制御部１０８は、互いに直行したＸＹＺ軸を備え、ステッピングモータやサーボモータによって磁石１３０の配置を管理している。Ｘ軸およびＹ軸はウェルプレートと略平行であって互いに直行し、Ｚ軸はウェルプレートと略垂直をなしている。磁石１３０の移動に際しては、例えば、ウェルプレートと略平行なこれらＸ軸上およびＹ軸上での移動と、ウェルプレートと略垂直なＺ軸上での移動との２段階で磁石１３０の配置の調節が可能となっている。通常はＸ軸上およびＹ軸上での移動のみを行うが、オプションでＺ軸上の移動も可能となっている。
【０１０２】
温度制御部１１０はヒータ１３６、サーマルセンサ１３８などを備え、ピペットチップに収容された液体の温度を管理する。ヒータ１３６は温度制御部１１０からの供給電力によって発熱し、サーマルセンサ１３８はピペットチップ内に収容された液体の温度に応じて温度制御部１１０に温度信号を送出する。温度制御部１１０はサーマルセンサ１３８からの温度信号を基にして温度を検知してヒータ１３６への供給電力を調節する。
【０１０３】
チップマウント制御部１０６は、ノズルへのピペットチップの装着、およびノズルからのピペットチップの脱着を行う。チップマウント制御部１０６はウェルプレートからある程度離れた場所に配置され、万が一ピペットチップ交換時にピペットチップから液体が飛散した場合にコンタミネーションが発生しないようにされている。チップマウント制御部１０６はピペットチップを把持する把持部と、別の新たなピペットチップを準備するチップ準備部とを備える。把持部がピペットチップを把持しながらノズルがＺ軸に沿って上昇するとノズルからピペットチップが脱着される。次いで、むき出しになったノズルがＸ軸およびＹ軸上で移動して新たなピペットチップの上方に移動する。チップ準備部では新たなピペットチップがマウント部を上側に先端部を下側にした状態で姿勢が保持されており、ノズルがＺ軸に沿って下降することでノズルに新たなピペットチップのマウント部が装着される。なお、ノズルとピッペットチップとの係合態様としては、例えば、爪とこの爪が嵌入する切り欠きとを利用した係合形態、ボスとリブとを利用した係合形態、雄ネジと雌ネジとを利用した係合形態などがあり、適宜選択するとよい。
【０１０４】
ポンピング制御部１１２は、ポンプ１４０および圧力センサ１４６を備え、ノズルおよびこのノズルに装着されたピペットチップを介して行われる液体の吸込と排出とを制御する。ポンプ１４０は、シリンダ状に形成されたハウジングとこのハウジングに移動自在に嵌合されるピストン、このピストンを駆動させるモータとを備え、ハウジング内はノズルの開口と連通している。ピストンの動きは、例えばサーボモータによって制御され、サーボモータの駆動はポンピング制御部１１２からの駆動制御信号によって制御されている。ピストンが作動するとノズルの開口を通して液体の吸込または排出が可能となる。
【０１０５】
ノズルの開口内には圧力を検知する圧力センサ１４６が設けられ、圧力センサ１４６はポンピング制御部１１２に圧力信号を送出する。ポンピング制御部１１２はこの圧力センサ１４６からの圧力信号を基にして圧力をモニタリングしている。このような構成により、例えば、ピペットチップの先端部がウェル内の検体に浸漬した際、ポンピング制御部１１２によって検知された圧力が予め定められた閾値を上回り、これに応じてサーボモータに駆動制御信号が送出される。検体の吸込時および排出時も圧力センサ１４６からは常時、ポンピング制御部１１２に圧力信号が送出され、これによりポンピング制御部１１２は高い精度でサーボモータの駆動をコントロールすることができ、検体の吸圧や排圧が低すぎたり、高すぎたりすることをモニタリングし、これにより予め定められた範囲内で吸込、および排出が実行されているか管理することができる。なお、夾雑物の除去処理手段は、磁場制御部１０８、ポンピング制御部１１２、非特異的反応因子に対する抗体が固定された磁性粒子などによって構成される。撹拌手段は、ピペットチップ、ポンピング制御部１１２、ポンプ１４０、圧力センサ１４６等によって構成される。また、分取手段は、磁場制御部１０８、磁石１３０等によって構成される。
【０１０６】
上記構成の作用について説明する。夾雑物の除去処理工程が開始されると、ウェル１２の検体にピペットチップの先端部が浸漬し、圧力センサ１４６からの圧力信号を基にしてポンプ１４０が作動する。ピペットチップ内に検体が吸い込まれた後、ピペットチップが、前処理用磁性粒子液が収容されたウェル１２に移動制御され、ピペットチップ先端が前処理用磁性粒子液に浸漬される。圧力センサ１４６からの圧力信号を基にピペットチップの先端部の浸漬が検知されると、ポンプ１４０のピストンが作動してポンピングが開始される。ポンピングが開始されると、非特異的反応因子に対する抗体が固定された磁性粒子が拡散され、懸濁液が形成される。
【０１０７】
懸濁液が形成されてから所定時間経過後、ポンプ１４０を作動させて懸濁液をピペットチップ１０内に吸い上げる。ピペットチップ１０に吸い上げられてポンプ１４０が停止した後、磁石１３０がピペットチップの収容部に近づけられ、前処理用磁性粒子が内壁面上の一ヶ所に固定される。前処理用磁性粒子が磁石によって一ヶ所に固定された状態で、ポンプ１４０が作動して液体がウェル内に排出される。これにより、夾雑物が除去されかつ非特異的反応因子が結合した前処理用磁性粒子を検体から分取して測定に供される測定サンプルを作製できる。
【０１０８】
検体に含まれる夾雑物が除去された測定サンプルの取得後、測定サンプルに特異的反応用磁性粒子を添加して検体から抗原を抽出し、さらに抗原結合磁性粒子を酵素標識抗体で標識化し標識化抗体結合磁性粒子を取得する。取得された標識化抗体結合磁性粒子を基質液に添加され吸光度等が検出される。
【０１０９】
このように、非特異的反応因子に対する抗体が固定された磁性粒子が混合された検体がポンピングされることで検体が撹拌され、磁性粒子が検体中で移動するため非特異的反応因子に対する抗体が固定された磁性粒子が検体中の非特異的因子と遭遇する頻度が高まり、非特異的反応因子に対する抗体に非特異的反応因子をより確実に結合させることができる。そして、磁石を用いて非特異的反応因子が結合した磁性粒子を検体から分取することで、検体中から非特異的反応因子を効率よく除去できる。また、検体の前処理から免疫学的測定までを一括して連続的に行うことができ、ユーザに利便性の高いシステムを提供することができる。さらに、免疫学的測定工程で使用されるポンピング機構、チップ、ウェルに合わせて検体の前処理を実行するようにしたことから、免疫学的測定工程に前処理工程を統合したシステムを構築したときのポンピング機構等を兼用できるためシステムの巨大化を抑えることができる。
【０１１０】
また、上記したように、ポンピング時に駆動するピストンの動きは圧力センサ１４６からの圧力信号を基にサーボモータによって制御されているため、ポンピング時に吸い込まれる液体の量、排出される液体の量、吸圧、および排圧は高い精度で制御でき、液体の流動を迅速にコントロールすることができる。これにより、上記した磁性粒子の拡散を短時間で実行でき、前処理時間の短縮化等が可能となる。また、検体のポンピングは、ピペットチップの先端開口が検体に浸漬した状態で行われるため、検体の泡立ち低減や検体が接触する雰囲気の検体中への取り込みを低減することができる。
【０１１１】
また、ポンピングはピペットチップおよびウェルを用いて実行され、これらピペットチップやウェルのサイズは標識化反応工程や測定工程において使用されるピペットチップおよびウェルのサイズに合わせることができ、ピペットチップおよびウェルのサイズをそれぞれ統一することで測定システムのコンパクト化が期待できる。なお、上記では非特異的反応因子に対する抗体が固定された磁性粒子を用いたが、非特異的反応因子が固定されたマイクロサイズの小球を用いてもよい。この場合、この小球を通さないメッシュサイズを有するフィルタなどを使用することで検体から非特異的反応因子が固定された小球を分離することができる。
【０１１２】
また、抗原に対する抗体が固定された磁性粒子を用いて標識化反応工程を実行する測定システムは、磁石の移動パタンなどが異なること以外は基本的に図２２に示した構成と同様となる。
【０１１３】
このような装置を用いることで、例えば前処理工程では、ポンピングによって検体は非特異的反応因子に対する抗体が固定された担体または還元剤が固定された担体を流通することから、検体のポンピング回数に応答して非特異的反応因子に対する抗体が固定された担体または還元剤が固定された担体を流通する回数が増加して非特異的反応因子が非特異的反応因子に対する抗体または還元剤に遭遇する可能性が高まる。これにより、非特異的反応因子に対する抗体が固定された担体を用いた場合には、非特異的反応因子に対する抗体に非特異的反応因子をより確実に結合させて担体に非特異的反応因子を捕捉させることができ、還元剤が固定された担体を用いた場合には、非特異的反応因子をより確実に分解することができる。また、上記したように、ポンピング時に駆動するピストンの動きは圧力センサからの圧力検知信号を基にサーボモータによって制御されているため、ポンピング時に吸い込まれる液体の量、排出される液体の量、吸圧、および排圧は高い精度で制御でき、液体の流動を迅速にコントロールすることができる。これにより、上記した非特異的反応因子の捕捉または非特異的反応因子の分解を短時間で実行することができ、前処理に要する時間をより短くすることができる。また、ポンピングはピペットチップおよびウェルを用いて実行され、これらピペットチップやウェルのサイズは標識化反応工程において使用されるピペットチップおよびウェルのサイズに合わせることができ、ピペットチップおよびウェルのサイズをそれぞれ統一することで測定システムをよりコンパクトなものとすることができる。なお、ここで説明したシステムはあくまで一例であり、適宜変更してよい。
【０１１４】
このように測定システムを用いて免疫学的測定を自動で行う場合、前処理における検体の吸込や排出はピペットチップの先端部がウェル内に浸漬した状態で行うことで気泡の発生や検体の飛散を低減できる。また、第１担体を用いた夾雑物の除去処理工程、第２担体の調製工程、並びに標識化反応工程および測定工程の全てが、ウェル内とピペットチップ内、あるいはウェル内とピペットチップ内と抗原分別固定チューブ内といった装置内の限られた場所で一貫して実行されるため、処理工程が簡略化されるとともに、雑菌等の混入を低減できる可能性が高くコンタミネーションの低減が期待できる。
【０１１５】
上記の実施形態では、検体から、非特異的反応因子を除去する態様を例示したが、本発明はこれに限らず、検体から目的とする抗原を抽出してもよい。目的とする抗原と特異的反応する抗体が固定された磁性粒子を検体に添加し懸濁させ、懸濁後、検体をピペットチップ内に吸い込みピペットチップに磁石を近づけ、磁性粒子を拘束する。磁性粒子拘束後、ピペットチップ内の液体を排出し、磁性粒子と結合した抗原を洗浄することで、夾雑物を取り除くことができる。このような前処理も可能である。
【０１１６】
５−２  核酸の測定システム
また、上記では、免疫学的測定の前に検体から非特異的反応因子を除去する前処理工程を実施する測定システムを例示したが、本発明は、核酸の測定システムに用いることもできる。核酸の測定システムとして例えばスタンフォードタイプのシステムでは、プローブＤＮＡが配列されたマイクロアレイチップ上に、ターゲットＤＮＡ溶液をスポッティングしてハイブリダイズさせ、ターゲットＤＮＡ溶液がスポッティングされたマイクロアレイチップを受光素子やイメージセンサ等で検出して検出データを取得する。この取得された検出データのシグナルをより明確化するために、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーションをより確実にする必要がある。マイクロアレイチップ上のプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの確実なハイブリダイゼーションのためには、検体中の夾雑物をいかに除去できるが重要な課題の一つとなり、マイクロアレイチップ上にスポッティングされるターゲットＤＮＡ溶液中に混入した夾雑物が少なければ少ないほど、クオリティの高い検出データを取得することができる。このターゲットＤＮＡ溶液中の夾雑物を除去する前処理として本発明を用いることもできる。
【０１１７】
例えば、ターゲットＤＮＡ溶液に含まれる夾雑物を除去するため、ウェルにターゲットＤＮＡを含有した検体を収容し、検体中の夾雑物と親和性を有する物質が固定された磁性粒子を、ピペットチップを用いてウェル内の検体に添加しポンピングする。
【０１１８】
ポンピング後、検体をピペットチップ内に吸い込み、磁石をピペットチップに近づけて磁性粒子を拘束する。磁性粒子を拘束しつつ液体をウェルに排出することで、検体から夾雑物を除去することができる。この夾雑物が除去された検体からターゲットＤＮＡ溶液を作製することでターゲットＤＮＡ溶液に含まれる夾雑物を低減することができる。また、このターゲットＤＮＡ溶液の調製工程から検出データを取得する工程までを１つのシステムで一貫して自動化することで処理工程が簡略化されるとともに、コンタミネーションの防止のほか利便性の向上が期待できる。ここではターゲットとしてＤＮＡを例示したが、この技術はｃＲＮＡやｍＲＮＡ等の他の核酸ターゲットの調製の際にも用いることができる。
【０１１９】
実施態様
上記で説明したように、前処理工程、および測定工程におけるそれぞれの態様の組み合わせを変えることで、様々な態様の測定システムの製作が可能となる。前処理工程、標識化反応工程、および測定工程の可能な組み合わせのうちの一例について以下の実施態様に例示する。
【０１２０】
［実施態様１］
抗原として、消化器系の癌検査時に利用されるＣＡ１９−９を用いたものを例示する。当然ながら本発明はこれら実施態様に限定されるものではない。図２３は、非特異的反応因子に対する抗体が固定された磁性粒子を用いて前処理が実行された後に続けて免疫学的測定を実行する際のフローチャートを示す図である。図２３に示すように、検体として血清を用い、検体に含まれるグロブリン（非特異的反応因子）と結合可能なプロテインＡ（非特異的反応因子に対する抗体）またはプロテインＧ（非特異的反応因子に対する抗体）のうち少なくともどちらか一方が固定された磁性粒子（以降、前処理用磁性粒子という）を非特異的反応因子に対する抗体が固定された磁性粒子として用いて検体の前処理を行う。
【０１２１】
まず、ウェル内の血清中に前処理用磁性粒子（第１担体）を混合し吸引と吐出を繰り返して懸濁する。懸濁後、ピペットチップの収容部に懸濁液を吸い上げ、収容部に磁場を付与して磁性粒子を収容部の一ヶ所に拘束し残液をウェルに排液する。これにより、検体に含まれたグロブリンを前処理用磁性粒子のプロテインＡまたはプロテインＧに捕捉させて除去することができる。より高精度にグロブリンを除去したい場合にはこの夾雑物の除去処理工程を適宜繰り返せばよい。なお、検体に含まれるグロブリン等をより高い精度で除去する場合には、酵素等のタンパク除去剤の併用等も有効である。
【０１２２】
グロブリンを除去して取得された血清に、抗ＣＡ１９−９抗体を表面に固定した特異的反応用磁性粒子（第２担体）を混合し懸濁する。処理済の血清中のＣＡ１９−９抗原は抗ＣＡ１９−９抗体に結合し、これによりＣＡ１９−９抗原が特異的反応用磁性粒子に捕捉される。ピペットチップの収容部に懸濁液を吸い上げ、収容部に磁場を付与して抗原結合磁性粒子を収容部の一ヶ所に拘束し残液をウェルに排液する。収容部に保持されＣＡ１９−９抗原が結合した抗原結合磁性粒子を、別のウェルに収容された洗浄液に混合し洗浄する。洗浄後、ＣＡ１９−９抗原が結合した抗原結合磁性粒子に磁場を付与して洗浄液から分離する。洗浄液から分離された抗原結合磁性粒子を、別のウェルに収容された酵素標識抗ＣＡ１９−９抗体液に混合し懸濁する。これにより、ＣＡ１９−９抗原は、抗ＣＡ１９−９抗体および酵素標識抗ＣＡ１９−９抗体とサンドイッチ結合の形成が可能となる。
【０１２３】
サンドイッチ結合したＣＡ１９−９抗原を有する標識化抗体結合磁性粒子に磁場を付与して標識化抗体結合磁性粒子を懸濁液から分離する。分離された標識化抗体結合磁性粒子を洗浄液の入った別のウェルに混合し洗浄する。洗浄後、サンドイッチ結合したＣＡ１９−９抗原を有する標識化抗体結合磁性粒子に磁場を付与して洗浄液から分離する。標識化抗体結合磁性粒子を別のウェルに収容された基質液に混合し懸濁する。酵素反応時間の経過後、懸濁液を測光し吸光度、発光強度等を測定する。
【０１２４】
［実施態様２］
図２４は、非特異的反応因子に対する抗体が固定されたカラムを用いて前処理が実行された後に続けて免疫学的測定を実行する際のフローチャートを示す図である。図２４に示すように、実施態様１と同様、検体として血清を用い、検体に含まれるグロブリンと結合可能なプロテインＡまたはプロテインＧのうち少なくともどちらか一方が固定されたアフィニティカラム（第１担体）を用いて血清の処理を行う。ウェル内の血清をカラム含有ピペットチップ内に吸い込み、アフィニティカラムを通してピペットチップに収容された血清をウェルに排出する。このような血清の吸込および排出を所定の回数実行することで血清に含まれたグロブリンをアフィニティゲルのプロテインＡまたはプロテインＧに結合させて除去することができる。ウェルに排出された処理済みの血清はこの後、実施態様１と同様に反応工程を実施することができる。
【０１２５】
［実施態様３］
本態様では、前処理は、図８〜図１５で既に述べた夾雑物の除去処理方法のうちいずれかの方法を用いて実行し、測定は、図２１に示した抗原分別固定チューブを用いて複数の抗原について各抗体固定ビーズに同時的に抗原を結合させて実行する。一定時間経過後、別のウェルの洗浄液を吸い込み抗体固定ビーズを洗浄する。抗体固定ビーズの洗浄後、酵素標識化液が抗原分別固定チューブ内に吸い込まれる。酵素標識化液がチューブ内に吸い込まれ各抗原に酵素標識抗体が結合した後、別のウェルの洗浄液を吸い込み抗体固定ビーズを洗浄する。洗浄後、基質液が抗原分別固定チューブ内に吸い込まれる。十分な時間の経過後、サンドイッチ結合した各抗体固定ビーズの吸光度、または発光強度等が測定される。
【０１２６】
このように複数種類の抗体固定ビーズが配列された抗原分別固定チューブを用いて検体を処理することで、一度に複数の抗原を捕捉することができ、操作を簡略化できるとともに、検体中の抗原の検出時間を劇的に短縮化することができる。
【０１２７】
本発明においては、前処理は、図８〜図１５に例示した夾雑物の除去処理方法のうちいずれかの方法を用いて実行し、測定は、前処理後に、従来のＥＬＩＳＡによって実行してもよい。例えば、図８〜図１５に示した夾雑物の除去処理方法のうちいずれかの方法を用いて夾雑物の除去処理を実行する。別のウェルには抗原に対する抗体が予め固定されており、夾雑物の除去処理によって非特異的反応因子が除去された血清をこのウェルに加えると、処理済検体中の抗原がウェルの抗体に結合可能となる。洗浄後、酵素標識抗体を含有した標識化液体をこのウェルに添加し抗体結合した抗原に酵素標識抗体が結合可能となる。洗浄後、基質液を添加して発色させ、適宜発色反応停止液を添加する。発色したウェルが吸光度計測器にセットされ吸光度等が計測される。このような工程を実行する測定システムも可能である。
【０１２８】
［実施態様４］
検体の前処理から目的とする物質の検出までを行うために、本発明においては、検体を収容するための収容部、夾雑物を検体から取り除くための磁性粒子を予め収容しておくための収容部、検体中の抗原の標識化用の抗体が結合した磁性粒子を予め収容しておくための収容部、基質液を予め収容した収容部などを予め一体化した試薬カートリッジを用いて検体の前処理を含む一連の工程を実施してもよい。また、カートリッジを用いた検体の処理システムは、夾雑物の除去処理工程だけでなく、この夾雑物の除去処理工程に続く標識化反応工程やこの標識化反応工程を含む測定工程を一貫して実行できるようにしてもよい。このようなカートリッジを用いた測定システムについて以下に説明する。図２５は、前処理用の磁性粒子や基質液を予め収容したカートリッジを利用する測定システムの概略を示す図である。図２６は、カートリッジを利用する測定システムの作動形態について概略的に説明する図である。図２５、図２６に示すように、測定システム１５０は、磁石１５１、分注装置１５２、ヒートブロック１５３、検出装置１５４、配置制御装置、中央制御装置などを備える。
【０１２９】
分注装置１５２はポンプ１６０、ノズル１６２を備え、ノズル１６２にはピペットチップ１６４を着脱自在にマウントすることができる。検出装置１５４は光電子増倍管（以降、ＰＭＴという）１７２、光源１７０を備え、光源１７０からの光をＰＭＴ１７２で受光しこれに応答してＰＭＴ１７２から信号が出力される。図２６に示すように、例えば、ノズル１６２、後述するＰＭＴ１７２、および光源１７０は中央制御装置によって垂直方向で移動制御され、磁石１５１や試薬カートリッジであるカートリッジ１８０は中央制御装置によって水平方向で移動制御される。
【０１３０】
カートリッジ１８０は、細長く形成されたベースパネル１８１と複数の収容部１８２とを備え、パネル１８１の長手方向の一端から他端に向かって複数の収容部１８２が配列されている。カートリッジ１８０は、ベースパネル上に形成されたベース１８１と複数の収容部１８２とが一体に形成されている。各収容部１８２はベースパネル上に開口し、ピペットチップ１６４の受け入れが可能となっている。
【０１３１】
カートリッジ１８０に備えられる収容部１８２として、前処理用の磁性粒子液が収容された収容部、検体を収容するための収容部、標識化用の抗体が結合した磁性粒子液を収容した収容部、標識化用の磁性粒子に結合した抗原を洗浄するための洗浄液が収容された収容部、発色反応を引き起こすための基質液を収容した収容部などを備える。なお、カートリッジ１８０に備えられる収容部として上記を例示したが、収容部の種類はこれに限らない。例えば、前処理だけを実行できるようにカートリッジに収容部を備えてもよい。
【０１３２】
ベースパネル１８１（例えばその中央部）には吸光度を測定するための収容部１８２ａが設けられ、この収容部１８２ａの上側にはＰＭＴ１７２を装着するためのマウント１８４が配置されている。ベースパネル１８１や収容部１８２はアルミシール等によって遮光され、ＰＭＴ１７２はマウント１８４に光密に嵌合される。検出用の収容部１８２ａの底部は光源１７０と光密に嵌合可能であり、検出用の収容部１８２ａの底部に嵌合した光源１７０から放射される照射光をＰＭＴで受光してフォトンを計数することができる。
【０１３３】
カートリッジ１８０は図示しないカートリッジコントローラによってノズル１６２やＰＭＴ１７２に対する位置が決められる。カートリッジコントローラはカートリッジ１８０を水平方向に移動させて分注装置１５２や検出装置１５４に対するカートリッジ１８０の位置を決定する。カートリッジ１８０の配置が制御されることで、例えばピペットチップに対して適切にカートリッジを配置させることができ、夾雑物の除去処理工程、標識化反応工程、検出工程におけるピッペッティングや吸光度測定をスムーズに実行することができる。
【０１３４】
カートリッジ１８０の収容部１８２は、例えば、夾雑物の除去処理を行うための第１部１８７と、標識化反応工程や検出工程を行うための第２部１８８とを有する。なお、カートリッジ１８０にインキュベーションを行うためヒータ１５３の装着が可能な収容部を設けたが、このヒータ用の収容部は測定システムの目的に応じて適宜省略してよい。
【０１３５】
カートリッジ１８０を利用する測定システム１５０の作用について以下に説明する。カートリッジ１８０のマウント後、予めカートリッジ１８０の第１の収容部に収容された磁性粒子液がピペットチップ１６４内に吸い上げられて第２の収容部内に排出され、ポンピングされる。図２７は、カートリッジを利用する測定システムの前処理工程について示した図である。図２７に示すように、ポンピング後、第２の収容部内の液体がピペットチップ１６４内に吸い上げられて夾雑物が結合した磁性粒子が磁石１５１によって分離され、夾雑物が除去された測定サンプルが第３の収容部に排出される。第３の収容部には、標識化用の磁性粒子と測定サンプルとの混合液が収容され、この混合液がポンピングされ、ピペットチップ内に吸い上げられる。混合液の吸引後、磁石によって抗原が一体となった磁性粒子が分離され、第４の収容部に投入される。磁性粒子と一体となった抗原は、第４の収容部内に予め収容された洗浄液によって洗浄され、洗浄液と抗原との混合液はピペットチップ内に吸い上げられる。ピペットチップ内に吸い上げられたこの混合液から抗原と一体となった磁性粒子が磁石１５１によって分離され、抗原が検出用の第５の収容部１８２ａに投入される。
【０１３６】
図２８はカートリッジを利用する測定システムの測定工程について示した図である。図２８に示すように、第５の収容部１８２ａ内には基質液が予め収容されており、この基質液と抗原とが反応して発色し吸光度が検出される。なお、検体中の夾雑物を除去処理する際、メンブレン、アフィニティカラム、あるいは還元剤が固定されたゲルを用いて検体に含まれる夾雑物を除去処理したい場合には、ノズル１６２にメンブレンを備えたピペットチップ、アフィニティカラムを含有するピペットチップ、あるいは還元剤が固定されたゲルを含有するピペットチップを取り付けて検体を処理する。例えば図２８に示すように、メンブレンを備えたピペットチップ１９０を用いて検体に含まれる夾雑物を除去処理する場合は、ノズル１６２にメンブレンを備えたピペットチップ１９０を装着して検体を処理する。これにより、測定システム１５０における夾雑物の除去処理手法のバリエーションを確保でき、システムの利便性を高めることができる。
【０１３７】
以上のように、検体の前処理工程を含む一連の工程で必要となる収容部を予めカートリッジ１８０に設け、このカートリッジ１８０を測定システム１５０にマウントして使用することにより、ユーザは磁性粒子液や洗浄液等の調製に係る手間を省くことができ、測定システム１５０の運用における利便性を高めることができる。
【０１３８】
上記の態様では、ピペットチップを垂直方向で移動させカートリッジを水平方向で移動させて前処理を実行したが、前処理の実行手法はこれに限らない。例えば、カートリッジを固定し、ピペットチップを水平方向および垂直方向に移動させて検体の前処理を実行してもよい。カートリッジを固定することで、ウェル内の液体が外部に飛び出ないようにシステムを設計する手間が省け、より簡便な測定システムの提供が可能となる。
【０１３９】
上記の実施態様４では、中央部に基質液が予め収容された収容部１８２ａを設け、端部に培養用のヒータ１５３の装着が可能な収容部を設けたカートリッジ１８０を例示したが、カートリッジにおける収容部の配列順序はこれに限らない。図２９は、別形態のカートリッジについて概略的に示した図である。例えば、図２９に示すように、カートリッジがマウントされる測定システム本体の構成に合わせて適宜変更してよい。図２９に図示した形態では、カートリッジ２００の中央部にヒータ１５３の装着が可能な収容部２０２ａを設け、端部に基質液が予め収容された収容部２０２ｂを設けた。このように収容部の配列順序を処理内容に鑑みて適宜変更することでより効率的な検体の処理を行うことができる。
【０１４０】
また、上記の実施態様では、磁性粒子液を収容部１８２に予め収容させたが、磁性粒子液を予め保持したピペットチップを用いる、あるいは、検体中の夾雑物を吸着する担体を備えたピペットチップを用いて検体の前処理を実行してもよい。この場合、このようなピペットチップに合わせてカートリッジの収容部の構成を適宜変更する必要がある。
【０１４１】
また、上記では、第１部１８７と第２部１８０とが一体形成されたカートリッジ１８０を例示したが、第１部１８７と第２部１８８とを組み合わせ自在に構成してもよい。第１部１８７と第２部１８８とを組み合わせ自在な構成とすることで、検体について、夾雑物の除去処理だけを実行したい場合、前処理工程を除く標識化反応工程から検出工程までだけを実行したい場合、あるいは全工程を実行したい場合に、ユーザはそれぞれの場合に応じて第１部、第２部、第１部と第２部との組み合わせのいずれかを選択することができ、より利便性の高い測定システムを提供することができる。
【０１４２】
上記の実施態様では検出対象の抗原としてＣＡ１９−９を用いたものを例示したが、検出対象はこれに限らず、例えば、リウマチ因子、遊離サイロキシン（Ｆ−Ｔ４）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インスリン、α胎児性タンパク（ＡＦＰ）などの単純タンパクまたは複合タンパク、ステロイドホルモン、ペプチドホルモン等への適用もできる。
【０１４３】
６  核酸測定システム
本発明の別の例として、本発明を核酸検出分野に用いた態様について以下に説明する。検体から核酸を抽出しこの抽出された核酸を増幅して測定する場合、第１担体として標的核酸に対して親和性を有する物質が固定されたものを用いて検体から標的核酸を抽出し、第２担体として標的核酸の検出用試薬を固相化してなるものを用いて標的核酸を測定することができる。この測定システムでは、検体中の標的核酸を検出する工程の前に、第１担体を用いて核酸を抽出する工程が実行される。さらに、本発明のシステムでは、生体関連物質と親和性を有する、および／または生体関連物質を標識化する物質が固定された第２担体を調製する工程を含む。本発明の１つの態様では、このような第１担体を用いた核酸の抽出工程および第２担体の調製工程を含む前処理を１つのシステムで一貫して行うものである。以下、本発明を用いて核酸を検出する工程について説明する。
【０１４４】
図３０は、検体からの核酸の抽出から第２担体の調製までの前処理工程、並びに検出工程を概略的に示した図である。図３０に示すように、標的核酸の測定システムでは、（ｉ）標的核酸に対して親和性を有する物質が固定された担体（第１担体）を用いて検体から標的核酸を抽出する工程、（ｉｉ）生体関連物質と親和性を有するかあるいは生体関連物質を標識化する少なくともいずれかの機能を有する担体（第２担体）を調製する工程、（ｉｉｉ）調製された第２担体を用いて標的核酸を標識化して検出する工程、が行われ、好ましくは、前処理（ｉ）〜（ｉｉｉ）を一貫して行うものである。検体は、ユーザによって測定システムに備えられたウェル２５０に収容される。
【０１４５】
６−１  検体から標的核酸を抽出する工程
標的核酸を取得するため、核酸捕捉用のプローブが固定された第１担体である磁性粒子（以降、核酸捕捉用磁性粒子という）が備えられたピペットチップ（分注チップともいう）がノズルに装着される。ウェルに収容された検体がピペットチップに吸い上げられ、核酸捕捉用磁性粒子と混合される。混合後、核酸補足用磁性粒子に固定されたプローブに標的核酸が特異的に結合して核酸捕捉用磁性粒子に捕捉される。
【０１４６】
標的核酸が結合した核酸捕捉用磁性粒子がピペットチップ内に吸い上げられた状態で、ピペットチップに磁石が近づけられ核酸捕捉用磁性粒子がピペットチップ内に拘束される。核酸補足用磁性粒子が磁石によって拘束されたピペットチップがウェルから離れ、洗浄液を収容したウェルに移動して磁石が遠ざかることで、核酸捕捉用磁性粒子が洗浄液内に解放される。洗浄液によって核酸捕捉用磁性粒子を洗浄した後、試薬などを加えて標的核酸を磁性粒子から分離して標的核酸を取得することができる。
【０１４７】
６−２  取得された標的核酸を検出するための担体を調製する工程
他方、抽出された標的核酸を検出するために、生体関連物質と親和性を有しかつ生体関連物質を標識化する物質が固定された担体が調製される。標的核酸の検出では標的核酸の標識化および増幅が行われ、標識化法および増幅法としては、ＰＣＲ法、ＰＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＲＴ―ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法、ＲＣＡ法、ＮＡＳＢＡ法など公知の方法を用いることができる。リアルタイムＰＣＲ法は様々な手法が存在するが、例えばインターカレーション法、ハイブリダイゼーション法、ＬＵＸ法などが可能である。
【０１４８】
核酸の標識化および増幅には、核酸の標識化および増幅用のプローブやプライマーを含有する固相化されたマスターミクスチャ（ＭＭＸ）を用いることができる。リアルタイムＰＣＲ法を用いる場合、増幅処理する核酸の種類に合わせて核酸増幅用のプライマーやプローブを適宜選択することが好ましい。プローブ、プライマーとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、ＦＲＥＴプローブ、ＬＵＸプライマーなど種々のものを用いることができる。プローブは標的核酸を標識化するための標識を備えており、この標識を備えたプローブが標的核酸とハイブリダイズすることで標的核酸が標識化される。プライマーおよびプローブは検出対象の核酸の種類に応じて適宜設計することができる。例えば、リアルタイムＰＣＲ法としてハイブリダイゼーション法を用いる場合、標的核酸は、熱変性、アニーリング、および伸長反応が行われ、標的核酸が標識化される。
【０１４９】
本発明においては、標的核酸の検出を実行する前に、核酸の増幅に用いられる試薬を予め調製し、これを固相化してウェル内に収容することで、固相化された試薬（以降、固相化試薬という）を固定したウェル（第２担体）が作製される。核酸の増幅時にはこの固相化試薬に緩衝液、核酸等を注入することで標的核酸の標識化および増幅が開始される。大容量のマスターミクスチャを用いることにより、測定工程時、測定用サンプルを収容するためのウェルに分注することが可能となり、作業効率を向上させることができる。試薬を固相化する方法については特に限定しないが、試薬を凍結乾燥すると利便性が高まり、作業効率の改善が期待できる。
【０１５０】
マスターミクスチャの試薬を凍結乾燥する場合は、例えば、標的核酸を増幅するためのプライマーおよびプローブ、およびその保護安定させるためのサッカライド類やポリビニルピロリドンなどの保護安定化剤を混合させ、所定温度で冷却して減圧することで作製できる。調整時の圧力、冷却温度、および冷却時間は、目的とするマスターミクスチャの性質に合わせて適宜変更してよい。また、本発明においては、凍結乾燥したときに凍結乾燥品が容器内に固相として（第２担体として）固定化されるように、スクロース、ラクトース、またはトレハロース等を混合することが好ましい。これにより、例えば凍結乾燥された試薬を容器内壁に膜状に層設して固定することができる。
【０１５１】
６−３  標的核酸を検出する工程
標的核酸の検出は、固相化試薬を備えたウェルに標的核酸を注入して行われる。標的核酸の注入後、標的核酸が固相化試薬に含まれるプローブとハイブリダイズして検出が可能となり、例えば、発光、蛍光などを測定することで標的核酸を検出することができる。検出デバイスとして、例えば、イメージセンサを搭載した蛍光レーザ顕微鏡を用いることで標的核酸の画像データを取得でき、この画像データを適宜解析することで蛍光強度などを算出することができる。このように蛍光強度を算出することで標的核酸の検出を行うことができる。
【０１５２】
次に上記の各工程を自動的に実行するシステムについて説明する。上記の手順を自動的に実行する測定システムは、検体を収容し標的核酸を取得する測定サンプルの取得装置、取得された測定サンプルを、ＰＣＲ法等を用いて増幅して検出する検出装置を備える。
【０１５３】
測定サンプルの取得装置は、例えば、検体を収容するウェルや試薬を収容するウェルを有し、検体を収容するウェルには、組織、細胞、体液などユーザによって取得された検体が収容される。なお、検体が組織や細胞片の場合は、予め細かくしておくことが好ましい。
【０１５４】
試薬を収容するウェルは、複数のウェル、ピペットチップ、検体を溶解するための試薬、溶解された検体に投入され標的核酸と特異的に結合するプローブが固定された磁性粒子、磁性粒子をピペットチップ内に拘束するための磁石、標的核酸とこの核酸とプローブを介して特異的に結合した磁性粒子とを分離して溶出する溶出試薬などを備え、検体を収容するウェルに収容された検体から、ＤＮＡやＲＮＡなどの標的核酸を抽出する。
【０１５５】
さらに、試薬を収容するウェルは、検体から抽出された標的核酸を標識化および増幅するための固相化された試薬を収容するウェルを備え、ウェル内には、例えば、緩衝液、プライマー、プローブ、核酸ポリメラーゼ、蒸留水、洗浄液などを固相化して収容する。固相化された試薬は、例えば、各試薬を一体に混合しさらに凍結乾燥することで作製できる（凍結乾燥マスターミクスチャ）。
【０１５６】
標的核酸の抽出は、検体を溶解しこの溶液と、標的核酸と特異的に結合するプローブが固定された磁性粒子とを混合し、混合後に磁石を用いて標的核酸が結合した磁性粒子をピペットチップ内に拘束して分離し、この分離した磁性粒子を洗浄した後に標的核酸を溶出することで実行することができる。
【０１５７】
検出装置は検体から抽出された標的核酸を増幅して検出する動作を実行する。核酸の増幅手法としては、例えばリアルタイムＰＣＲ法が挙げられる。標的核酸の増幅は、試薬を収容するウェルに収容された凍結乾燥マスターミクスチャを用いてリアルタイムＰＣＲ法に従って実行することができる。検出装置は核酸増幅用の反応容器とこの反応容器の温度を調節する温度調節部などを備え、核酸の熱変性、アニーリング、伸長反応の各工程を繰り返し実行することができる。標的核酸の増幅後、標識化された標的核酸に、例えば、励起用の電磁波を照射する、蛍光反応用の基質液を添加してから標的核酸をスキャナなどでスキャンすることで標的核酸を検出することができる。
【０１５８】
上記システムをより具体化したものについて以下に説明する。図３１は標的核酸の抽出から検出まで実行するためのウェルを上部から示した図である。図３１に示すように、標的核酸の測定システム４８０は処理ラインを備え、図３１は第１処理ライン５００Ａから第１２処理ライン５００Ｌまでの１２列の処理ラインを例示した図である。各処理ライン５００Ａ〜５００Ｌでは、例えば、検体を収容するウェル５０２、溶解液を収容するウェル５０４、緩衝液を収容するウェル５０６、磁性粒子を収容するウェル５０８、検体から抽出された核酸を洗浄するための洗浄液やピペットチップを洗浄するための洗浄液が収容されたウェル５１０、磁性粒子と標的核酸とを分離する溶出液を収容したウェル５１２、検体から核酸を抽出してなる測定サンプルを一時的に収容するウェル５１４、測定サンプルを標識化して標的核酸を検出するための固相化されたマスターミクスチャを収容したウェル５１６が、配列されている。
【０１５９】
第１〜第１２処理ライン５００Ａ〜５００Ｌの上方には、各処理ライン５００Ａ〜５００Ｌに対応して１２個のノズルがライン方向Ｐ（図示省略）に移動自在に設けられ、各ノズルにピペットチップが適宜装着される。測定システム４８０は、例えば、ウェルを配置するスペースを外部から隔離するための遮蔽扉を備え、これら第１〜第１２処理ラインに設けられたウェルは、この隔離扉によって外部から遮断することができる。上記では１２列の処理ラインを備えた装置を例示したが、処理ラインの本数はこれに限らず、例えば、１本や２本でもよく、また、さらに処理能を高めるために２０本、３０本としてもよい。
【０１６０】
図３２に示すように、測定システム４８０は、中央制御部５３２、チップ位置制御部５３４、チップマウント制御部５３６、磁場制御部５３８、ＰＣＲユニット５４０、ポンピング制御部５４２、検出部５４５、ＲＡＭ５４８、ＲＯＭ５５０、表示パネル５５２、操作インターフェース５５４、計時部などを備える。
【０１６１】
チップ位置制御部５３４は、互いに直行したＸＹＺ軸を備え、ステッピングモータやサーボモータによってノズルの位置を制御する。ＸＹＺ軸は、例えば、Ｘ軸が処理ラインにおけるウェルの配列方向と略平行をなし、Ｙ軸がＸ軸と略垂直をなすとともに各列を横断する方向と略平行をなし、Ｚ軸はＸ軸およびＹ軸のなす面と略垂直をなしている。検体の処理が開始され各ノズルが移動する場合は、例えば、これらＸ軸上での移動と、Ｚ軸上での移動との２段階でノズルが駆動することで、各処理ライン５００Ａ〜５００Ｌに沿った処理が実行される。
【０１６２】
チップマウント制御部５３６は、ノズルへのピペットチップの装着、およびノズルからのピペットチップの脱着を行う。チップマウント制御部５３６はピペットチップを把持する把持部と、別の新たなピペットチップを準備するチップ準備部とを備える。把持部がピペットチップを把持しながらノズルがＺ軸に沿って上昇するとノズルからピペットチップが脱着される。むき出しになったノズルがＸ軸およびＹ軸上で移動して新たなピペットチップの上方に移動する。チップ準備部では新たなピペットチップがマウント部を上側に先端部を下側にした状態で姿勢が保持されており、ノズルがＺ軸に沿って下降することでノズルに新たなピペットチップのマウント部が装着される。
【０１６３】
ポンピング制御部５４２は、ポンプ５８０および圧力センサ５８２を備え、ノズルおよびこのノズルに装着されたピペットチップを介して行われる液体の吸込と排出とを制御する。ポンプ５８０は、シリンダ状に形成されたハウジングとこのハウジングに移動自在に嵌合されるピストン、このピストンを駆動させるモータとを備え、ハウジング内はノズルの開口と連通している。ピストンの動きは、例えばサーボモータによって制御され、サーボモータの駆動はポンピング制御部５４２からの駆動制御信号によって制御されている。ピストンが作動するとノズルの開口を通して流体の吸込または排出が可能となる。
【０１６４】
ノズルの開口内には圧力を検知する圧力センサ５８２が設けられ、圧力センサ５８２はポンピング制御部５４２に圧力信号を送出する。ポンピング制御部５４２はこの圧力センサ５８２からの圧力信号を基にして圧力をモニタリングしている。このような構成により、例えば、ピペットチップの先端部がウェル内の流体に浸漬した際、ポンピング制御部５４２によって検知された圧力が予め定められた閾値を上回り、これに応じてサーボモータに駆動制御信号が送出される。流体の吸込時および排出時も圧力センサ５８２からは常時、ポンピング制御部５４２に圧力信号が送出され、これによりポンピング制御部５４２は高い精度でサーボモータの駆動をコントロールすることができる。このような構造によりピペットチップの装着されたノズルは流体の吸い上げおよび吐き出しを実行することができ、流体の撹拌を行うことができる。
【０１６５】
ＲＯＭ５５０には各種制御プログラムが格納されている。ユーザが操作インターフェース５５４を通して選択したモードに応じてＲＯＭ５５０から読み出された制御プログラムがＲＡＭ５４８に展開され、中央制御部５３２はこのＲＡＭ５４８に展開された制御プログラムを基にして測定システム４８０の各部をコントロールしている。
ＲＯＭ５５０に記憶する処理プログラムとしては、例えば、（１）細胞やウイルスからＲＮＡを抽出しＰＣＲ反応後にＰＣＲ産物の検出を実行する第１プログラム、（２）血液等の生体サンプルからＤＮＡを抽出しＰＣＲ反応後にＰＣＲ産物の検出を実行する第２プログラム、（３）大腸菌等の細菌からプラスミドＤＮＡを抽出する第３プログラム、などがある。
【０１６６】
表示パネル５５２はユーザに対して提示する必要のある項目を表示する。例えば、核酸抽出時のポンピング回数、磁性粒子懸濁後の静置時間、ポンピング時の流速の緩急、吸込量および排出量、ピペットチップの移動速度の緩急などは表示パネル５５２に表示でき、ユーザはこの表示で確認することができる。もし各種設定内容を変更したい場合は、操作インターフェース５５４の操作を通して変更することができる。
【０１６７】
計時部５４５は、ＲＯＭ５５０から読み出されたプログラムに応じて時間のカウントを行う。時間のカウントは、例えば、ポンピングやＰＣＲ反応における熱変性、アニーリング、伸長反応を行うときなどに実行され、これにより各工程の実行期間が正確に管理される。
【０１６８】
磁場制御部５３８は、磁石５６０の配置を管理してピペットチップに付与する磁場の強さを制御する。磁場制御部５３８は、互いに直行したＸＹＺ軸を備え、ステッピングモータやサーボモータによって磁石５６０を位置決めする。Ｘ軸およびＹ軸はウェルが並べられた面と略平行であって互いに直行し、Ｚ軸はこの面と略垂直をなす。磁石５６０が移動するときは、例えば、Ｘ軸上およびＹ軸上での移動と、Ｚ軸上での移動との２段階で磁石５６０の位置決めが可能となっている。
【０１６９】
ＰＣＲユニット５４０は、サーマルセンサ５７０、温度制御部５７２、ヒータ５７４を備える。温度制御部５７２はサーマルセンサ５７０からの温度信号に基づき温度を検知する。サーマルセンサ５７０は、例えばマスターミクスチャを収容したウェル５１６の近傍に配置され、ウェル内に流体の温度に応じて温度信号を温度制御部に送出する。ヒータ５７４はウェル５１６の近傍に配置され、ヒータ５７４の通電は温度制御部５７２によって制御されている。温度制御部５７２はサーマルセンサ５７０からの温度信号に基づきヒータ５７４の通電をコントロールすることでウェル５１６内の流体の温度を制御する。これにより、適切な温度コントロールが要求されるＰＣＲ反応を迅速に実行することができる。ＰＣＲの反応サイクルは基本的に、熱変性ステップ、アニーリングステップ、伸長反応ステップの繰り返しによって構成され、温度制御部５７２は各ステップで流体が最適な温度となるようにヒータ５７４を用いて温度をコントロールする。ＰＣＲ反応における最適温度、反応時間、反応サイクル数に関するデータはＲＯＭに予め格納されており、ユーザによって選択された処理モードに対応して読み出され実行される。
【０１７０】
検出部５４５は、トリガー光源５９０、トリガー光源からのトリガー光をウェル内の液体に照射する導光部５９２、導光部５９２から照射された光によって蛍光した核酸からの光を受光するための受光部５９４、検出回路５９６などを備える。導光部５９２は、例えば光ファイバを用いて構成することができ、トリガー光源からのトリガー光を光ファイバ内で導光させることによりウェル内の液体にトリガー光を照射することができる。受光部５９４には例えばＣＣＤやＣＭＯＳ等のイメージセンサを用いることができ、蛍光した核酸からの光を受けて受光信号を検出回路５９６に出力する。検出回路５９６は受光部５９４からの受光信号を基にして核酸を検出する。
【０１７１】
本発明の核酸検出システムの作用について図３３のフローチャートを用いて説明する。ユーザによって選択された処理プログラムがＲＯＭ５５０から読み出され、この読み出された処理プログラムを基に測定システム４８０の各部が作動を開始する。ユーザは各処理ライン（図３１では第１〜第１２処理ライン５００Ａ〜５００Ｌ）のウェル５０２に取得した検体を手動で収容し、遮蔽扉によって第１〜第１２処理ライン５００Ａ〜５００Ｌを外部から遮蔽する。第１〜第１２処理ライン５００Ａ〜５００Ｌの遮蔽が検出されると検体の処理が開始され、第１〜第１２処理ライン５００Ａ〜５００Ｌに対応して設けられた１２個のノズルおよびピペットチップが駆動して検体と溶解液とを混合する。この混合液の撹拌後、磁性粒子を混合液に加えて撹拌する。
【０１７２】
磁性粒子の加えられた混合液が十分に撹拌された後、磁石を用いて磁性粒子をピペットチップ内に拘束し不要な液をピペットチップ外に排出して標的核酸が接合した磁性粒子を取得する。取得した磁性粒子は洗浄液が収容されたウェルに排出、洗浄され、洗浄後、磁性粒子と標的核酸との結合を切断する分離液に混合され撹拌される。磁性粒子が加えられた分離液が十分に撹拌された後、磁性粒子はピペットチップ内に拘束されて標的核酸が分離される。取得された標的核酸を含有する流体は測定工程に供される測定サンプルとしてウェル５１４に収容される。ウェル５１４に収容された測定サンプルはマスターミクスチャが予め収容されたウェル５１６に分注され、ＰＣＲ反応が実行される。ＰＣＲ反応工程では、熱変性ステップ、アニーリングステップ、伸長反応ステップが所定の回数だけ繰り返されて標的核酸に基づいたＰＣＲ産物の生成が実行され、所定回数の実行後、検出部５４５によってＰＣＲ産物の検出が実行される。
【０１７３】
以上のように、第１〜第１２処理ライン５００Ａ〜５００Ｌに代表される１２列の処理ラインを備えることで、１２個の検体を同時に処理することができ、検体の処理効率を高めることができる。また、検体の収容ウェル５０２、標的核酸抽出用の磁性粒子を収容したウェル、洗浄用のウェル、マスターミクスチャを収容したウェルをライン状に並べたことにより、ノズルおよびピペットチップを無駄なく駆動させることができ、処理時間を更に短期化することができる。また、ノズルおよびピペットチップが直線状に駆動するため、他のラインの検体の混入を防止でき、コンタミネーションを低減することがでえきる。
【０１７４】
上記では１２本の処理ラインを備えた測定システムを例示したが、処理ラインの本数はこれに限らず、これより多くても少なくてもよい。さらに、上記の実施形態では、１２列の処理ラインを備えた測定システムを例示したが、ライン状に処理する以外にも、例えば、検体の収容ブロック、磁性粒子と検体との反応ブロック、磁性粒子などを洗浄するための洗浄液の収容ブロック、作製された測定サンプルの収容ブロック、ＰＣＲ反応ブロック、増幅された標的核酸の測定ブロックなどを、例えば環状あるいは十字状に配置してもよい。
【０１７５】
また、システムの態様は上記に限らず適宜変更してよい。図３４は、カートリッジを利用して核酸を前処理することができる測定システムの概略を示した図である。例えば、図３４に示すように、検体収容部と試薬収容部とを一体化したカートリッジを用いて標的核酸を検出することもできる。以下に、検体収容部および試薬収容部を一体化したカートリッジを用いて検体を処理するシステムについて説明する。
【０１７６】
測定システム２６０は、システム本体２６２と、このシステム本体２６２に装填されるカートリッジ２６４とを備える。システム本体２６２は、カートリッジ２６４を保持するラック２６７、ラック２６７をシステム本体２６２から引き出された引き出し位置とシステム本体に収納した収納位置との間で移動制御する移動制御機構２７０、核酸を取得するための磁性粒子を備えたピペットチップ、カートリッジ２６４に対するピペットチップの配置を制御する配置制御機構２７３、ピペットチップの着脱などを行うチップ着脱制御部２７５、増幅された核酸をスキャンして検出するスキャナ２７７などを備える。ラック２６７は収納位置に位置するカートリッジ２６４を外部から遮断する蓋２８０を備え、これにより収納位置に位置するカートリッジ２６４などに雑菌が付着する危険性を低減している。
【０１７７】
カートリッジ２６４のウェルの配置形態は、ＤＮＡを抽出して増幅するかＲＮＡを抽出して増幅するかによって個数、順序、サイズなどが異なる。図３５は、上記の測定システムで用いられるカートリッジについて示した図であり、マスターミクスチャを収容したウェルをカートリッジの長手方向に沿って一部切断した斜視断面図である。例えば、ＤＮＡを抽出してＰＣＲ法を用いて増幅する場合、図３５に示すように、カートリッジ２６４には、検体を収容するウェル３００、検体からＤＮＡを抽出するための抽出試薬が予め収容されたウェル３０２、バッファが収容されたウェル３０４、抽出されたＤＮＡを洗浄するための洗浄液が収容されたウェル３０６、３０８、標的核酸抽出用の磁性粒子をＤＮＡと分離させＤＮＡを取得するための溶出液３１０、ピペットチップ３３０を洗浄するための洗浄液が収容されたウェル３１２、凍結乾燥されたマスターミクスチャが収容されたウェル３１４、標識化されたＤＮＡを蛍光検出させる場合に用いられる基質液が収容されたウェル３１６などが一体化されている。各ウェルの開口はアルミシール（図示省略）によって封止され、使用前に雑菌がウェル内に侵入しないようにされている。ウェル３１４内には凍結乾燥されたマスターミクスチャ３１８が容器内壁に膜状に設けられている。凍結乾燥されたマスターミクスチャ３１８をウェル３１４内に膜状に設ける手法としては、例えば、ウェル３１４内に凍結乾燥前のマスターミクスチャを収容した後、所定の凍結乾燥条件下で凍結乾燥を実行することでウェル３１４内に凍結乾燥されたマスターミクスチャ３１８を膜状に設けることができる。
【０１７８】
カートリッジ２６４がラック２６７に装填され核酸の自動検出が開始された後、ラック２６７がシステム本体２６２に収納され、カートリッジ２６４が外部から隔絶される。カートリッジ２６４がラック２６７によって収納位置に配置された後、アルミシールが剥離され、検体からのＤＮＡの抽出が実行される。カートリッジ２６４には凍結乾燥されたマスターミクスチャを備えたウェル３１４が予め設けられており、これによりＤＮＡ抽出後に速やかに前処理を終えることができ、次の測定工程へ移行することができる。
【０１７９】
このように、カートリッジを２６４用いて前処理を自動的に一貫して実行できることから、本発明においては手軽で利便性の高いシステムを提供することができる。また、磁性粒子を用いて検体から標的核酸を抽出するから不要物を核酸増幅前に予め低減して、より信頼性の高いＤＮＡ検出を実行することができる。
【０１８０】
また、上記では、検体からの標的核酸の抽出から核酸を抽出して測定サンプルを作製し、作製された測定サンプルを基にして標的核酸を検出する工程までを一貫して行ったが、測定サンプルを作製するまでの工程と、測定サンプルから標的核酸を測定する測定工程とを別の装置で実行してもよい。このようなシステムの一例としては、例えば、検体を収容し標的核酸を抽出し測定サンプルを取得するサンプル作製装置と、取得された測定サンプルを、核酸増幅法を用いて増幅して検出する検出装置とを備える測定システムが挙げられる。このようなシステムを用いる場合、図３６に示すように、ウェルカートリッジ６００から、測定サンプルを収容するウェル６１０とマスターミクスチャを収容したウェル６１２とが一体化された分離ユニット６１５を、カートリッジ本体６０８から例えば割断ラインＬに沿って割断して分離できるようにし、分離ユニット６１５を検出装置に装填することで標的核酸の検出を実行することができる。
検体を取得しウェルカートリッジ６００に収容してサンプル作製装置に装填すると検体の処理が開始されて、測定サンプルを収容するためのウェル６１０に測定サンプルが収容される。分離ユニット６１５がカートリッジ本体６０８から分離されて検出装置に装填されると、ウェル６１０内に収容された測定サンプルがマスターミクスチャを収容した４連ウェル６１２に注入される。測定サンプルがマスターミクスチャと混合された後、ＰＣＲ法に従って標的核酸を増幅し検出される。
このように、測定サンプルを収容するウェル６１０とマスターミクスチャを収容したウェル６１２とが一体化された分離ユニット６１５をカートリッジ本体６０８から分離できるようにすることで、測定サンプルを取得するまでの工程と、取得された測定サンプルから標的核酸を検出する工程とを別の装置で実行することができる。
これにより、サンプル作製装置の駆動スケジュールが検出装置の駆動スケジュールから独立し、第１の測定サンプルの作製後に第２の測定サンプルの作製にすぐさま移行することができ、標的核酸の検出を待つことなく測定サンプルをより自在に作製することができる。また、測定サンプルの一時保存なども可能となる。
【０１８１】
また、上記では１つの検体に対して１列のウェル群を対応させたが、１つの検体に対して複数列のウェル群を対応させてもよい。例えば、図３７に示すように、１つの検体に対して２列のウェルを対応させることもできる。測定システム６２０は、核酸の抽出時に用いられるウェル群を備えた核酸抽出部６２５、固相化された核酸増幅用試薬が収容されたウェル群を備えた固相化試薬収容部６３０、サーマルサイクラーに組み合わされる調温部６３５、トリガー光を照射して核酸の検出を行う検出部６４０、ノズルユニット６４５などを備える。ノズルユニット６４５はワークエリア６４５内で駆動し検体の吸い込みや吐出を行う。このようにウェルの配置を用いて核酸を測定してもよい。
【０１８２】
また、本発明の好ましい態様として、上記に説明した測定システムを用いて、各種ウイルス、例えば、インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７等）を検出することができる。インフルエンザウイルスの検出は、採取された検体（鼻腔内体液など）からのインフルエンザウイルスの抽出、およびマスターミクスチャの作製、リアルタイム ＲＴ−ＰＣＲ の実行、並びに検出の順で行われる。
【０１８３】
［インフルエンザウイルスＡ（Ｈ１Ｎ１）の検出におけるプローブおよびプライマー］
使用されるプローブおよびプライマーとしては
フォワードプライマー（InfＡ，SW InfＡ，SW Ｈ１，ＲnaseＰ）
リバースプライマー（InfＡ，SW InfＡ，SW Ｈ１，ＲnaseＰ）
Ｔａｑ Ｍａｎ プローブ（InfＡ，SW InfＡ，SW Ｈ１，ＲnaseＰ）
などを用いる。
従って、プライマーおよびプローブの組み合わせとしては
InfＡ：インフルエンザＡ型プライマーセットおよびＴａｑ Ｍａｎ プローブ
SW InfＡ：SW InfＡ型プライマーセットおよびＴａｑ Ｍａｎ プローブ
SW Ｈ１：SW Ｈ１型プライマーセットおよびＴａｑ Ｍａｎ プローブ
ＲnaseＰ：ヒューマンＲNaseP遺伝子（内部ポジティブコントロール）プライマーセットおよびＴａｑ Ｍａｎ プローブ
を用いる。
上記の４種類のプライマーおよびプローブの組み合わせを含有するマスターミクスチャをそれぞれ調製して、例えば、図３５に示したカートリッジ２６４の４連のウェル３１４に予め収容しアルミシールで封止しておくことで簡便な操作でインフルエンザウイルスＡ（Ｈ１Ｎ１）を検出できるシステム、およびこのシステムのためのカートリッジを提供することができる。
【０１８４】
なお、上記に示したカートリッジ２６４は、１つの検体について核酸の抽出から検出する前まで行うものについて示したが、複数のカートリッジ２６４を並列させて複数の検体を同時処理できるようにしてもよい。複数の検体を同時処理することで処理能力が向上し、さらに利便性の高いシステムを提供することができる。
【０１８５】
上記の図３１〜３７では、標的核酸とＰＣＲ反応用の試薬との混合溶液の温度を上昇／下降させて核酸増幅を行うＰＣＲ法を用いた態様について例示したが、本発明はこれに限らず、等温で核酸を増幅させる等温増幅法を用いてもよい。
本発明の核酸僧服装置は、
(a) 検体を収容する検体収容部と、
(b) 検体から標的核酸を補足する捕捉粒子を収容する第１収容部と、
(c) 標的核酸の検出用試薬を収容する第２収容部と、
(d) 前記検体を検体収容部に分注する分注機構、前記検体と補足粒子とを混合して検体から標的核酸を抽出する機構、および前記抽出された標的核酸と検出用試薬とを混合する機構と、
(e) 前記第２収容部に標的核酸と検出用試薬との混合流体よりも比重の小さい疎水性流体を注入する機構、前記各収容部を覆う蓋を脱着させる機構、標的核酸を蛍光させるための照射光を投射する機構および該照射光を受けた標的核酸からの光を受けて標的核酸を検出する機構、並びにこれらの機構を組み合わせた機構からなる群から選ばれるいずれかの機構とを備えることを特徴としており、上記（ａ）〜（ｅ）の構成の組み合わせを変えることにより様々な装置を実現できる。
以下に、標的核酸を等温増幅させる機構を備えた装置について説明する。なお、上記に示したＰＣＲ法を用いて標的核酸を増幅させる装置と同様の箇所については概略的な説明を記載しその詳細な説明については省略する。
【０１８６】
図３８は標的核酸の抽出から検出まで実行するための複数のウェルおよびノズルを示した斜視図である。図３８に示すように、一体的にカートリッジ化された各処理ライン７００Ａ〜７００Ｆでは、例えば、検体を収容するウェル７０２、溶解液を収容するウェル７０４、緩衝液を収容するウェル７０６、捕捉粒子である磁性粒子を収容するウェル７０８、検体から抽出された核酸を洗浄するための洗浄液やピペットチップを洗浄するための洗浄液が収容されたウェル７１０、磁性粒子と標的核酸とを分離するための試薬を含む溶出液を収容したウェル７１２、検体から核酸を抽出してなる標的核酸含有溶液を一時的に収容するウェル７１４、標的核酸を増幅させるための乾燥（例えば、凍結乾燥された試薬）された試薬（検出用試薬）を含有するウェル７１６、標的核酸含有溶液中の標的核酸を増幅することによって取得された増幅産物を検出するための検出用ウェル７１８が、配列されている。
【０１８７】
第１〜第６処理ライン７００Ａ〜７００Ｆの上方には、各処理ライン７００Ａ〜７００Ｆに対応して６個のノズルユニット７２０がライン方向Ｐに移動自在に設けられ、各ノズルユニット７２０にピペットチップ７３０が装着可能となっている。なお、処理ラインの本数は６本に限らず適宜変更してよい。
【０１８８】
図３９にノズルユニット７２０の先端部を示した部分斜視図を示す。図３９（ａ）に示すように、ノズルユニット７２０は、例えば、検体や標的核酸を含有した溶液等の流体を吸引／排出するポンピング開口７３０、標的核酸の増幅産物に蛍光反応用のトリガー光を照射するプラスチック光ファイバ（以降、ＰＯＦという）７３２、標的核酸からの光を受光するレンズ７３４などを備える。レンズ７３４はポンピング開口７３０内に配置され、ポンピング開口７３０の周囲には相互に等間隔を隔てて例えば８個のＰＯＦ７３２が配置されている。なお、ノズルユニットの形状は上記に限らず、例えば図３９（ｂ）や（ｃ）に示すようなものでもよい。図３９（ｂ）に示すように、ノズルユニット７６０の先端の中央部には、流体を吸引／排出するポンピング開口７６２とレンズ７６４とが備えられ、その周辺部には４つのトリガー光照射用のＰＯＦ７６７を備えている。また、図３９（ｃ）に示すように、ノズルユニット７７０の先端部の中央部にポンピング開口７７２とトリガー光照射用のＰＯＦ７７４とを備える構成としてもよい。
【０１８９】
図４０はノズルユニット７２０をポンピング開口７３０の延伸方向と平行な平面で切断した断面図である。図４０に示すように、ポンピング開口７３０の周囲には、例えば８個のＰＯＦが配置され、ポンピング開口７３０内の中央にはレンズ７３４および光学像伝達用のＰＯＦ７４０が配置されている。レンズ７４０は、検出用ウェル７４８内に収容された増幅産物含有溶液と対面し、ＰＯＦ７４０側に増幅産物溶液の光学像を結像する。レンズ７４０によって結像された光学像はＰＯＦ７４０中を伝わり、後述する再結像光学系（図４１参照）に入力される。レンズ７３４の周囲に、トリガー光を照射するＰＯＦ７３２を配置したことにより、画像の周辺部が暗くなるシェーディングが抑えられ、クオリティの高い増幅産物の画像の取得が可能となる。また、ノズルユニット全端部の構造は上記に限らず、図４０（ｂ）に示すような構造としてもよい。図４０（ｂ）に示すように、ノズルユニット７８０はポンピング開口７８２とトリガー光照射用のＰＯＦ７８４とを備える。このように、ポンピング開口、トリガー光照射用の光ファイバ、および／またはイメージセンサへ検体用ウェル内の光学像を伝達する光ファイバーとを一体化したノズルユニットと、直線状に配列された処理ラインにより、検体などのポンピングと標的核酸の増幅産物の検出とを兼ねるノズルユニットを処理ラインに沿って直線状に動かすだけで検体からの標的核酸の抽出から増幅産物の検出までを実行でき、装置のコンパクト化が期待できる。特に、ノズルユニットはポンピング開口と光ファイバーとにより細径化することができ、これにより隣り合うノズルユニット間の間隔および処理ライン間の間隔を狭めることができ、核酸検出装置を更にコンパクト化できる。
【０１９０】
図４１は標的核酸検出装置の機能ブロック図である。図４１に示すように、測定システム６８０は、中央制御部８３２、ノズル位置制御部８３４、チップマウント制御部８３６、磁場制御部８３８、等温制御ユニット８４０、ポンピング制御部８４２、計時部８４３、検出部８４５、ＲＡＭ８４８、ＲＯＭ８５０、表示パネル８５２、操作インターフェース８５４、再結像光学系８５６などを備える。
【０１９１】
ノズル位置制御部８３４は、互いに直行したＸＺ軸（２軸）を備え、第１、第２モータ８６１、８６２の２つのモータによってノズルユニット７２０の位置を制御する。ＸＺ軸は、例えば、Ｐ方向を向いたＸ軸は各処理ライン７００Ａ〜７００Ｆにおけるウェルの配列方向と略平行な方向をなし、Ｚ軸はＸ軸と略垂直をなしつつウェルの近位置と遠位置との間を結ぶ方向と略平行な方向に向けられている。検体の処理が開始され各ノズルユニット７２０が移動するとき、例えば、Ｘ軸上での移動と、Ｚ軸上での移動との２段階でノズル７２０が駆動することで、各処理ライン間を横断することなく各処理ライン７００Ａ〜７００Ｆに沿って処理を実行することができる。このとき、各ノズルユニット７２０が同時に作動することにより、より各処理ライン７００Ａ〜７００Ｆ間の検出環境を揃えることが可能となり、より正確な増幅産物の検出やその後の分析を実行することが可能となる。
【０１９２】
ＲＯＭ８５０に記憶する処理プログラムとしては、例えば、（１）細胞やウイルスからＲＮＡを抽出し増幅して増幅産物の検出を実行する第１プログラム、（２）血液等の生体サンプルからＤＮＡを抽出し増幅して増幅産物の検出を実行する第２プログラム、（３）細菌等からプラスミドＤＮＡを抽出する第３プログラムなどがあり、目的に応じてＲＯＭに記憶させるプログラムは適宜変更するとよい。
【０１９３】
計時部８４３は、ＲＯＭ８５０から読み出されたプログラムに応じて時間のカウントを行う。時間のカウントは、例えば、タイミングクロックに基づき標的核酸の等温増幅を行うときなどに実行され、これにより各工程の実行期間を正確に管理できる。
【０１９４】
等温制御ユニット８４０は、サーマルセンサ８７０、温度制御部８７２、ヒータ８７４を備える。温度制御部８７２はサーマルセンサ８７０からの温度信号に基づき温度を検知し、サーマルセンサ８７０は、例えば凍結乾燥された核酸増幅用試薬を収容したウェル７１６の近傍に配置され、ウェル７１６内に収容された標的核酸含有溶液の温度に応じて温度信号を温度制御部８７２に送出する。温度制御部８７２はサーマルセンサ８７０からの温度信号に基づきヒータ８７４の通電をコントロールすることでウェル７１６内の流体の温度を所定温度に制御する。これにより、一定温度が要求される等温増幅または温度を変化させるＰＣＲを実行することができる。
【０１９５】
検出部８４５は、トリガー光源８９０、ＰＯＦ７４０からの光を受光するためのイメージセンサ８９４、検出回路８９６などを備える。トリガー光源８９０からのトリガー光をＰＯＦ７３２内で導光させることにより検出用ウェル７１８内にトリガー光を照射することができる。イメージセンサ８９４には例えばＣＣＤやＣＭＯＳ等のイメージセンサを用いることができ、再結像光学系８５６からの光を受けて画像信号を検出回路８９６に出力する。検出回路８９６はイメージセンサ８９４からの受光信号を基に画像処理して核酸の検出判定を行う。
【０１９６】
次に本発明の核酸検出システムの作用について説明する。
ユーザによって選択された処理プログラムがＲＯＭ８５０から読み出され、この読み出された処理プログラムを基に核酸検出システム６８０の各部が作動する。ユーザは各処理ラインライン７００Ａ〜７００Ｆのウェル７０２に取得した検体を手動で収容し、図示しない遮蔽扉などによって第１〜第６処理ライン７００Ａ〜７００Ｆを外部から遮蔽する。第１〜第６処理ライン７００Ａ〜７００Ｆは、例えば、２列を検体から標的核酸を抽出し増幅後に検出するためのラインとして使用し、２列をネガティブ／ポジティブコントロール用として使用し、残り２列を検量線作成用に使用するなど適宜変えるとよい。第１〜第６処理ライン７００Ａ〜７００Ｆの遮蔽が検出されると検体の処理が開始され、ノズルユニット７２０が駆動して検体と溶解液とを混合する。この混合液の撹拌後、磁性粒子を混合液に加えて撹拌する。
【０１９７】
磁性粒子の加えられた混合液の撹拌後、磁性粒子を拘束して標的核酸が接合した磁性粒子を取得する。取得した磁性粒子は磁性粒子と標的核酸との結合を切断する分離液に混合され、混合後、標的核酸と磁性粒子とが分離され標的核酸が取得される。取得された標的核酸含有溶液は増幅工程に供するため一時的に７１４に収容される。ウェル７１４に収容された標的核酸含有溶液は核酸増幅用の試薬が予め収容されたウェル７１６に分注され、さらにミネラルオイルが分注され等温増幅反応が実行される。
【０１９８】
ここで、等温増幅反応としては、例えばＬＡＭＰ(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法が用いられる。周知のようにＬＡＭＰ法では鎖置換活性酵素と２対のプライマー（インナープライマーおよびアウタープライマー）とを用いて増幅産物を取得する。ＬＡＭＰ法は鋳型核酸の２本鎖から1本鎖への熱変性の必要がなく、増幅にかかる工程を等温度で実行することができる。さらに、ＰＣＲ法を用いた場合は約５分の増幅サイクルを少なくとも２５〜３０回程度繰り返し、ＬＡＭＰ法をはじめとする等温核酸増幅法では、３０分程度で検出に十分な増幅産物を取得することができる。プライマー設計に関する基本事項はＷＯ２０００／２８０８２号公報やＷＯ２００２／２４９０２号公報などに記載されている。
なお、等温増幅反応工程としては上記のＬＡＭＰ法以外にも例えば、
キメラプライマーを用いるＩＣＡＮ(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic Acid)法；
オープンサークルプローブ(Open Circle Probes : OCP)とＤＮＡリガーゼとプライマー対と鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとを用いて増幅産物を取得するＲＣＡ(Rolling Cycle Amplification)法；
２対のプライマーと制限酵素と鎖置換活性酵素とＳ化アナログ基質とを用いて増幅産物を得るＳＤＡ(Strand Displacement Amplification)法；
ＩＶＴ(In Vitro Transcription)法；
逆転写酵素などを用いてＲＮＡをトリミングしＲＮＡを増幅産物として取得するＴＲＣ(Transcription Reverse transcription Concerted amplification)法；
逆転写酵素やＲＮＡポリメラーゼなどの３種類の酵素と鋳型特異的プライマー対を用いてＲＮＡを増幅するＮＡＳＢＡ(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)法、
ＲＮＡとＤＮＡのキメラ構造を有するプライマーを用いて増幅産物を取得するＳＰＩＡ法など、一定の温度で標的核酸を増幅させる手法であればどのような方法でもよい。
【０１９９】
このようにＰＣＲ法の替わりに等温増幅反応工程を用いると、標的核酸の増幅のために核酸溶液を、室温から９４度、７２度、５５度といった温度に昇温あるいは降温させる必要がなく、このためサーマルサイクラーといった温度を比較的高温に昇温させる装置も不要となる点で好ましい。また、等温増幅法は、検出するのに十分な量の増幅産物を取得するまでにかかる時間が数十分程度であることから、標的核酸の抽出から検出までにかかる時間の短期化が十分に期待できる。
【０２００】
凍結乾燥された核酸増幅用試薬に抽出された標的核酸含有溶液を混合した後、ウェル７１６にはノズルユニット７２０によって疎水性流体が注入される。疎水性流体としては、例えば、ＣｎＨ２ｎ＋２（ｎは３〜２０の整数を示す）で示される鎖式飽和炭化水素、いわゆるミネラルオイルが挙げられ、好ましくはＣｎＨ２ｎ＋２（ｎは１６〜２０の整数を示す）の流動パラフィンが挙げられ、このような疎水性流体がウェル７１６に注入される。このミネラルオイルにより外部から核酸増幅用のウェル７１６内に夾雑物が侵入することを防止することができるとともに標的核酸含有溶液と等温増幅用試薬との混合溶液の蒸散を防ぐことができる。なお、ミネラルオイルの代わりまたはミネラルオイルと併用して、ウェル７１６の開口を塞ぐ固体形成されたシーラントを、ノズルユニット７２０を用いてウェル７１６の開口に装着してもよい。
【０２０１】
標的核酸の増幅後、増幅産物溶液がノズルユニット７２０によって検出用のウェル７１８に移送され、増幅産物の検出が行われる。
以上のように、検体の収容ウェル７０２、標的核酸抽出用の磁性粒子を収容したウェル、洗浄用のウェル、等温増幅用の凍結乾燥試薬を収容したウェルを順にライン状に並べたことにより、ノズルユニット７２０を無駄なく駆動させることができ、処理時間の更なる短期化が期待できる。また、ノズルユニット７２０およびピペットチップ７３０が直線状に駆動するため他の処理ラインの検体の混入を防止でき、コンタミネーションを低減することができる。また、６列の処理ラインで同時に
【０２０２】
また、標的核酸の検出装置の態様は上記に限らず様々な変更が可能である。例えば、上記の図３８では６列の処理ライン７００Ａ〜７００Ｆとそれらの処理ライン７００Ａ〜７００Ｆに対応する６つのノズルユニット７２０を備えたが、ノズルユニットの本数は１本でもよい。図４２は、１本のノズルユニットを備えた標的核酸の検出装置の概略を示した斜視図である。図４２に示すように、核酸検出装置９００は、１本のノズルユニット９０２を備える。ノズルユニット９０２は、第１ガイドレール９０４によってウェルの配列方向に沿って移動することができ、第２ガイドレール９０６に沿って第１〜第６処理ライン７００Ａ〜７００Ｆを横断する方向に沿って移動することができる。このような装置構成とすることでノズルユニットの個数を減らし低コストな装置としてもよい。
【０２０３】
また、上記の実施形態では、イメージセンサ８９４とトリガー光源８９０とを設けたが、イメージセンサの替わりに光電子増倍管を一体化した核酸検出装置としてもよい。
【０２０４】
また、分注用のノズルと標的核酸の検出器とを別個にしてもよい。図４３に示すように、核酸検出装置９１８は、第１〜第６処理ライン９２０Ａ〜９２０Ｆに対応した６本の分注ノズル９２２と、１基の核酸検出器９２４とを備える。各分注ノズル９２２はウェル９２６の配列方向に移動制御され、検出器９２４は、検出用のウェル９２７上で、第１〜第６処理ライン９２０Ａ〜９２０Ｆを横断する方向Ｓに移動可能に設けられている。このような装置構成とすることで効率的な処理が期待できる。
【０２０５】
また、核酸検出器は１個だけでなく、図４４に示すように各処理ラインに対応して設けることもできる。図４４に示すように、第１〜第６処理ライン９３０Ａ〜９３０Ｆに対応して核酸検出器９３２を備える。このような装置構成とすることで、検出器９３２の駆動機構が不要となるとともに、処理効率の更なる向上が期待できる。
【０２０６】
また、複数の処理ラインを備えた核酸増幅装置において標的核酸の増幅工程に等温増幅法を用いる場合、各ラインの核酸の増幅率が異なることがあり、この場合には、温度制御部によって反応温度を補正してもよい。増幅反応の温度を補正することにより各処理ラインの増幅率の調和が期待でき、標的核酸のより正確な定量が期待できる。
【０２０７】
また、上記ではノズルユニット７２０にポンピング開口７３０と増幅産物の光学像をイメージセンサ８９４に伝達するプラスチック光ファイバ７４０とを設けたが、このポンピング開口の外部に増幅産物の光学像をイメージセンサに伝達する光ファイバを設けてもよい。図４５はポンピング開口の外部に検出用ウェル内の光学像をイメージセンサに伝達する光ファイバを配置したユニットを光ファイバの延伸方向と略平行な平面で切断した断面図である。一体化ユニット１０００は、ノズル部１０１０と光ファイバ部１０２０とを有し、光ファイバ１０２０はノズル部１０１０の外部に配置されている。このようにノズル部１０１０の外部に光ファイバを配置したユニットとしてもよい。
【０２０８】
また、図４６に示すように、複数の検出用ウェルを備えた核酸検出装置において、それぞれの検出用ウェル内の増幅産物を検出できるようにそれぞれの検出用ウェルに光ファイバを配設しこれら複数の光ファイバを選択的に使用して、単一の検出器で標的核酸を検出するようにしてもよい。核酸検出装置１０５０は、単一のイメージセンサ１０５２、このイメージセンサ１０５２に検出用ウェル１０５４内の光学像を選択的に伝達する切り替え装置１０６０、分注用のノズル１０６２、標的核酸の抽出から増幅までを実行するための複数のウェルを配列した処理ライン１０６５などを備える。切り替え装置を切り換えて各検出用ウェル１０５４から増幅産物を検出することができ、このよな装置構成としてもよい。
【０２０９】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【０２１０】
実施例１
ＡＦＰ含有検体の処理
［目的］
ＨＡＭＡとヒトリウマチ因子(Human Rheumatoid Factor)(IgM)をProtein G 磁性粒子、またはanti-Human IgM磁性粒子を用いて夾雑物を除去処理し、この処理がＡＦＰ(α-fetoprotein)の値にどのような影響をおよぼすかを調べた。
［使用した試料および器具］
Anti-AFP HYb-2051 固定済みELISAプレート(F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE(442404,Nunc.))
血清コントロール(Liquichek Immunoassay Plus Control Level 2,Bio-Rad)
HAMA(Human Anti Mouse Antibody) 1mg/ml
Dynabeads Protein G (Dynal,Invitrogen)（磁性粒子）
BioMag anti-Human IgM (Bangs Laboratories,Inc.)（磁性粒子）
AFP抗原(Original conc. 4mg/ml)
AFP-HRP標識抗体(Original conc. 0.13mg/ml)
ブロックエース粉末 (1包:4g 100ml分 Cat.No.UK-B80 製造元:雪印乳業株式会社)
10x PBS
８連ピペット
ディスポーザブルプレート
SPECTRAMAX190 (Molecular Devices)& SoftMax Pro4.8
Nunc-Immuno Wash 8
TMB Peroxidase Substrate & Peroxidase Solution B(H2O2)(KPL:Kirkegaard & Perry Laboratories)
ELISA反応停止液(1.0N H2SO4)
Sucker
キムタオル
［実験内容］
下記のサンプルＮｏ．１〜Ｎｏ．６に示す検体を調製し、ＡＦＰ値の測定を行った。
［磁性粒子の結合能の算出］
各検体のＡＦＰ値を取得するにあたり、予め磁性粒子の結合能を計算した。
血清中の各イムノグロブリン含有量は、下記の表１の通りである。
【表１】
2010074265.tif 000003
血清５μｌ中には略０．０４〜０．１０ｍｇのＩｇＧが存在し、Dynabeads protein G に吸着させるには１００〜２５０μｌ beads が必要となる。
また、血清５μｌ中には略７．５μｇのＩｇＭが存在し、BioMag anti-Human IgM に吸着させるには５０μｌ beads が必要となる。
［洗浄液の作製］
ブロックエース粉末を略９０ｍｌのミリＱ水に溶解させた。溶解確認後、１００ｍｌメスシリンダーにて１００ｍｌにフィルアップ(fill up)した。10x PBS を１００ｍｌはかりとり、１Ｌメスシリンダーに入れ、ブロックエース粉末も加え、ミリＱ水を加えて１０００ｍｌにフィルアップ(fill up)した。
［各種検体における吸光度の測定］
本実験では、６種類の検体（サンプルＮｏ．１〜６）について吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡプレートの反応検体は５０μｌとし、血清にはLiquichek Immunoassay Plus Control Level 2 を用い、標識抗体AFP-HRP は１／８００、ｎ＝３とした。
［サンプルＮｏ．１］
コントロールとしてＰＢＳ(Phosphate buffered salinel)緩衝液を使用し、この溶液を、Dynabeads protein G で処理した検体、BioMag anti-Human IgMで処理した検体、および未処理の検体についてそれぞれ吸光度を測定した。
［サンプルＮｏ．２］
血清コントロールとして血清５μｌを含む溶液を使用し、この溶液を、Dynabeads protein G で処理した検体、BioMag anti-Human IgMで処理した検体、および未処理の検体についてそれぞれ吸光度を測定した。
［サンプルＮｏ．３］
血清５μｌとＨＡＭＡ１０％を含む溶液を調製して使用し、この溶液を、Dynabeads protein Gで処理した検体と未処理の検体とについてそれぞれ吸光度を測定した。
［サンプルＮｏ．４］
血清５μｌとリウマチ因子１０％を含む溶液を調製して使用し、この溶液を、BioMag anti-Human IgMで処理した検体と未処理の検体とについてそれぞれ吸光度を測定した。
[サンプルＮｏ．５]
血清５μｌとＨＡＭＡ１０％とＡＦＰ８０ｎｇ／ｍｌとを含む溶液を調製して使用し、この溶液を、Dynabeads Protein Gで処理した検体と未処理の検体とについてそれぞれ吸光度を測定した。
［サンプルＮｏ．６］
血清５μｌとリウマチ因子１０％とＡＦＰ８０ｎｇ／ｍｌとを含む溶液を調製して使用し、この溶液を、BioMag anti-Human IgMで処理した検体と未処理の検体とについてそれぞれ吸光度を測定した。
［結果］
以下の表２に示される測定結果を取得した。
【表２】
2010074265.tif 000004
［ＡＦＰ値の算出］
上記表２のＡｂｓ４５０ＴＭＢ値に基づきＡＦＰ値を算出した。ＡＦＰ値の算出に当たり図４７、４８から求められる数式
ｙ＝０．００６５ｘ＋０．２０８８      式（１）
ｙ＝０．００６８ｘ＋０．０５５４      式（２）
のうち、式（１）を用いて算出した。
算出されたＡＦＰ値を下記の表３に示す。
【表３】
2010074265.tif 000005
【０２１１】
［実験結果についての考察］
サンプルＮｏ．３の無処理（「No beads」処理）の場合のＡＦＰ値が示すように、ＨＡＭＡが存在することによりＡＦＰ値が上昇することからＨＡＭＡが偽陽性の因子である可能性が考えられる。
この考えを裏付けるため、ＨＡＭＡをDynabeads protein G で処理した結果、サンプルＮｏ．３のDynabeads Protein G で処理された場合のＡＦＰ値は７．００となり、ＡＦＰ値はサンプルＮｏ．２に示されたＡＦＰ値と同等のレベルにまで下がった。
これにより、ＨＡＭＡが偽陽性を引き起こす因子であることが裏付けられる。
なお、サンプルＮｏ．４のＡＦＰ値については、Bio Magで処理されたときのＡＦＰ値と、無処理（「No beads」処理）の場合のＡＦＰ値とでほとんど変わらなかった。
【０２１２】
［結論］
Protein G Dynabeads を用いて検体に含まれる夾雑物を除去処理することで、偽陽性の原因と考えられるIgM を検体から除去することができる。これにより検体中のＡＦＰの存在量をより正確に測定することが可能となる。
【符号の説明】
【０２１３】
１０  ピペットチップ
１２  ウェル
２０  カラム含有ピペットチップ
３０  メンブレン含有ピペットチップ
４０  ゲル含有ピペットチップ
５０  ピペットチップ（筒状チップ）
７０  抗原分別固定チューブ
７２  スペーサビーズ
１００  測定システム
１０２  中央制御部
１０６  チップマウント制御部
１０８  磁場制御部
１１２  ポンピング制御部
１３０  磁石
１４０  ポンプ
１４６  圧力センサ
１５０  測定システム
１５１  磁石
１５２  分注装置
１５３  ヒートブロック
１５４  検出装置
１６２  ノズル
１６４  ピペットチップ
１７０  ＰＭＴ
１７１  光源
１８０  カートリッジ
１８１  ベースパネル
１８２  収容部
２６０  測定システム
２６２  システム本体
２６４  カートリッジ
【図１】
2010074265.tif 000006
【図２】
2010074265.tif 000007
【図３】
2010074265.tif 000008
【図４】
2010074265.tif 000009
【図５】
2010074265.tif 000010
【図６】
2010074265.tif 000011
【図７】
2010074265.tif 000012
【図８】
2010074265.tif 000013
【図９】
2010074265.tif 000014
【図１０】
2010074265.tif 000015
【図１１】
2010074265.tif 000016
【図１２】
2010074265.tif 000017
【図１３】
2010074265.tif 000018
【図１４】
2010074265.tif 000019
【図１５】
2010074265.tif 000020
【図１６】
2010074265.tif 000021
【図１７】
2010074265.tif 000022
【図１８】
2010074265.tif 000023
【図１９】
2010074265.tif 000024
【図２０】
2010074265.tif 000025
【図２１】
2010074265.tif 000026
【図２２】
2010074265.tif 000027
【図２３】
2010074265.tif 000028
【図２４】
2010074265.tif 000029
【図２５】
2010074265.tif 000030
【図２６】
2010074265.tif 000031
【図２７】
2010074265.tif 000032
【図２８】
2010074265.tif 000033
【図２９】
2010074265.tif 000034
【図３０】
2010074265.tif 000035
【図３１】
2010074265.tif 000036
【図３２】
2010074265.tif 000037
【図３３】
2010074265.tif 000038
【図３４】
2010074265.tif 000039
【図３５】
2010074265.tif 000040
【図３６】
2010074265.tif 000041
【図３７】
2010074265.tif 000042
【図３８】
2010074265.tif 000043
【図３９】
2010074265.tif 000044
【図４０】
2010074265.tif 000045
【図４１】
2010074265.tif 000046
【図４２】
2010074265.tif 000047
【図４３】
2010074265.tif 000048
【図４４】
2010074265.tif 000049
【図４５】
2010074265.tif 000050
【図４６】
2010074265.tif 000051
【図４７】
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【図４８】
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【国際調査報告】
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