(57)【要約】  網羅性及び迅速性の高いレトロエレメント多型検出手段を提供することを目的として、レトロエレメントによって生じた多型を検出する方法であって、以下の（１）〜（５）の工程を含むことを特徴とする多型の検出方法を提供する、（１）多型の検出対象とする複数のゲノムDNAを、ゲノムDNAごとに、レトロエレメント内部に少なくとも一つの切断部位を持つ制限酵素で処理する工程、（２）制限酵素によって切断されたDNA断片を自己環化させる工程、（３）自己環化させたDNA断片を鋳型としてインバースPCRを行う工程、（４）増幅されたDNA断片のレトロエレメントの周辺配列の塩基配列を決定する工程、（５）決定したレトロエレメントの周辺配列を、多型の検出対象とするゲノムDNA間で比較、又はデータベース上のゲノムDNAと比較し、特定のゲノムDNAに含まれていたレトロエレメントの周辺配列を検出する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムDNAに含まれるレトロエレメントの周辺配列を含むDNA断片を作製する方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とするDNA断片の作製方法、（１）DNA断片の作製対象とするゲノムDNAを、レトロエレメント内部に少なくとも一つの切断部位を持つ制限酵素で処理する工程、（２）制限酵素によって切断されたDNA断片を自己環化させる工程、（３）下記の第一及び第二のプライマーを用い、自己環化させたDNA断片を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、第一及び第二のプライマーは、レトロエレメントの末端とその末端に最も近い制限酵素切断部位との間の領域にハイブリダイズするプライマーで、第一のプライマーは制限酵素切断部位側に位置し、制限酵素切断部位方向にDNAを伸長させるように設計されており、第二のプライマーはレトロエレメントの末端側に位置し、レトロエレメントの末端方向にDNAを伸長させるように設計されている。
【請求項２】
工程（３）において増幅されたDNA断片を制限酵素で処理し、第一のプライマー側の末端を切除することを特徴とする請求項１に記載のDNA断片の作製方法。
【請求項３】
制限酵素が、工程（１）で使用した制限酵素と同一の制限酵素であることを特徴とする請求項２に記載のDNA断片の作製方法。
【請求項４】
レトロエレメントが、L1又はSVAであり、工程（３）において使用する第一及び第二のプライマーが、レトロエレメントの3’末端と3’末端に最も近い制限酵素切断部位との間の領域にハイブリダイズするプライマーであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のDNA断片の作製方法。
【請求項５】
工程（３）において使用する第二のプライマーに、ゲノムDNAを識別するための配列が付加されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のDNA断片の作製方法。
【請求項６】
ポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物を電気泳動し、その電気泳動像がスメアになるプライマーを工程（３）において使用する第一及び第二プライマーとすることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載のDNA断片の作製方法。
【請求項７】
対象とするレトロエレメントがゲノムDNA間で多型を生じ易いレトロエレメントであり、そのレトロエレメントに含まれ、そのレトロエレメントと同一のファミリーに属するレトロエレメントに含まれない配列と同一又は相補的な配列を含むプライマーを工程（３）において使用する第一及び第二プライマーとすることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載のDNA断片の作製方法。
【請求項８】
ゲノムDNAに含まれるレトロエレメントのゲノムDNA上の位置を決定する方法であって、以下の（１）〜（５）の工程を含むことを特徴とするレトロエレメントの位置決定方法、（１）レトロエレメントの位置決定の対象とするゲノムDNAを、レトロエレメント内部に少なくとも一つの切断部位を持つ制限酵素で処理する工程、（２）制限酵素によって切断されたDNA断片を自己環化させる工程、（３）下記の第一及び第二のプライマーを用い、自己環化させたDNA断片を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、第一及び第二のプライマーは、レトロエレメントの末端とその末端に最も近い制限酵素切断部位との間の領域にハイブリダイズするプライマーで、第一のプライマーは制限酵素切断部位側に位置し、制限酵素切断部位方向にDNAを伸長させるように設計されており、第二のプライマーはレトロエレメントの末端側に位置し、レトロエレメントの末端方向にDNAを伸長させるように設計されている、（４）増幅されたDNA断片のレトロエレメントの周辺配列の塩基配列を決定する工程、（５）決定したレトロエレメントの周辺配列の塩基配列とゲノムデータベースとを比較し、レトロエレメントのゲノム上の位置を決定する工程。
【請求項９】
工程（３）において増幅されたDNA断片を制限酵素で処理し、第一のプライマー側の末端を切除することを特徴とする請求項８に記載のレトロエレメントの位置決定方法。
【請求項１０】
制限酵素が、工程（１）で使用した制限酵素と同一の制限酵素であることを特徴とする請求項９に記載のレトロエレメントの位置決定方法。
【請求項１１】
レトロエレメントが、L1又はSVAであり、第一及び第二のプライマーが、レトロエレメントの3’末端と3’末端に最も近い制限酵素切断部位との間の領域にハイブリダイズするプライマーであることを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか一項に記載のレトロエレメントの位置決定方法。
【請求項１２】
工程（３）において使用する第二のプライマーに、ゲノムDNAを識別するための配列が付加されており、工程（４）においてレトロエレメントの周辺配列と共にゲノムDNAを識別するための配列の塩基配列を決定することを特徴とする請求項８乃至１１のいずれか一項に記載のレトロエレメントの位置決定方法。
【請求項１３】
ポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物を電気泳動し、その電気泳動像がスメアになるプライマーを工程（３）において使用する第一及び第二プライマーとすることを特徴とする請求項８乃至１２のいずれか一項に記載のレトロエレメントの位置決定方法。
【請求項１４】
対象とするレトロエレメントがゲノムDNA間で多型を生じ易いレトロエレメントであり、そのレトロエレメントに含まれ、そのレトロエレメントと同一のファミリーに属するレトロエレメントに含まれない配列と同一又は相補的な配列を含むプライマーを工程（３）において使用する第一及び第二プライマーとすることを特徴とする請求項８乃至１３のいずれか一項に記載のレトロエレメントの位置決定方法。
【請求項１５】
レトロエレメントによって生じた多型を検出する方法であって、以下の（１）〜（５）の工程を含むことを特徴とする多型の検出方法、（１）多型の検出対象とする複数のゲノムDNAを、ゲノムDNAごとに、レトロエレメント内部に少なくとも一つの切断部位を持つ制限酵素で処理する工程、（２）制限酵素によって切断されたDNA断片を自己環化させる工程、（３）下記の第一及び第二のプライマーを用い、自己環化させたDNA断片を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、第一及び第二のプライマーは、レトロエレメントの末端とその末端に最も近い制限酵素切断部位との間の領域にハイブリダイズするプライマーで、第一のプライマーは制限酵素切断部位側に位置し、制限酵素切断部位方向にDNAを伸長させるように設計されており、第二のプライマーはレトロエレメントの末端側に位置し、レトロエレメントの末端方向にDNAを伸長させるように設計されている、（４）増幅されたDNA断片のレトロエレメントの周辺配列の塩基配列を決定する工程、（５）決定したレトロエレメントの周辺配列を、多型の検出対象とするゲノムDNA間で比較、又はデータベース上のゲノムDNAと比較し、特定のゲノムDNAに含まれていたレトロエレメントの周辺配列を検出する工程。
【請求項１６】
工程（３）において増幅されたDNA断片を制限酵素で処理し、第一のプライマー側の末端を切除することを特徴とする請求項１５に記載の多型の検出方法。
【請求項１７】
制限酵素が、工程（１）で使用した制限酵素と同一の制限酵素であることを特徴とする請求項１６に記載の多型の検出方法。
【請求項１８】
レトロエレメントが、L1又はSVAであり、工程（３）において使用する第一及び第二のプライマーが、レトロエレメントの3’末端と3’末端に最も近い制限酵素切断部位との間の領域にハイブリダイズするプライマーであることを特徴とする請求項１５乃至１７のいずれか一項に記載の多型の検出方法。
【請求項１９】
工程（３）において使用する第二のプライマーに、ゲノムDNAを識別するための配列が付加されており、工程（４）において各ゲノムDNA由来のDNA断片を混合した後、レトロエレメントの周辺配列と共にゲノムDNAを識別するための配列の塩基配列を決定することを特徴とする請求項１５乃至１８のいずれか一項に記載の多型の検出方法。
【請求項２０】
ポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物を電気泳動し、その電気泳動像がスメアになるプライマーを工程（３）において使用する第一及び第二プライマーとすることを特徴とする請求項１５乃至１９のいずれか一項に記載の多型の検出方法。
【請求項２１】
対象とするレトロエレメントがゲノムDNA間で多型を生じ易いレトロエレメントであり、そのレトロエレメントに含まれ、そのレトロエレメントと同一のファミリーに属するレトロエレメントに含まれない配列と同一又は相補的な配列を含むプライマーを工程（３）において使用する第一及び第二プライマーとすることを特徴とする請求項１５乃至２０のいずれか一項に記載の多型の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レトロエレメントの周辺配列を含むDNA断片の作製方法、レトロエレメントのゲノムDNA上の位置の決定方法、及びレトロエレメントによって生じた多型の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNA配列解読技術が進み、ヒトゲノム配列には個人差があることが明らかになっている。個人間のゲノム配列の相違（以下、「ゲノム多型」という）が、病気の罹りやすさや、薬剤に対する感受性や耐性などの、生化学的な個人体質の違いを生み出す主要因であると考えられている。そこで現在では、ヒトゲノムに存在する全てのゲノム多型をデータベース化し、個人のゲノム配列情報と照合させることで、診断技術の向上および医療の個別化を目指す研究が進んでいる。このゲノム科学をベースとする次世代医療を実現するためには、ゲノム多型を効率よく検出する技術が必須である。【０００３】
ゲノム多型は、その発生メカニズムから大きく３種類（一塩基多型、コピー数多型、レトロエレメント（以下、「RE」という）多型）に分類される。これらのうち前者２つの多型を効率よく検出する技術はすでに確立され、すでに市場に出回っているのに対して、RE多型を網羅的に検出する技術の開発は進んでいない。その主要因は、REが長い間「がらくたDNA」と呼ばれ、その生物学的重要性が軽視されていたためであるが、過去10年ほどの間に、REが多くの遺伝子の機能や制御に深く関わっていることが徐々に明らかになってきた。さらにRE多型が疾患の原因であった症例も年々増加している。RE多型の重要性が明確になった今こそ、RE多型検出法を１日でも早く構築し、個別化医療に必要なゲノム解析技術を整備することで、生活の質（Quality of Life）の向上に貢献すべきである。【０００４】
REの多型検出法としては、多型を生み出す可能性のある各REファミリーに対するプローブを用いるサザンブロティング法が容易に考えられるが、その低い解像度のため、検出できるRE多型の数は少なく、その網羅性はかなり低い。さらにこの方法では、多型の有無を確認できるだけであり、そのゲノム内位置情報は得られないという致命的な欠点がある。【０００５】
また、RE多型候補ゲノム領域を、候補ゲノム領域に対して、個別にプライマーを用意してPCR増幅後にアガロース電気泳動より検出する方法が一般的であるが（非特許文献１）、この方法では膨大な数のプライマーを用意する必要があるため、実用的ではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J.S. Myers et al., Am. J. Hum. Genet., Volume 71, (2002), Pages312-326.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、網羅性及び迅速性の高いRE多型検出手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、インバースPCRを利用してREの周辺配列を決定し、それによりRE多型を検出するという発想を得た。しかし、通常のインバースPCRによって増幅される断片は、RE内部配列が末端に存在し、その後に周辺配列が続くので、末端から配列を決定していく場合、REの周辺配列だけでなくREの内部配列の配列も決定しなければならないという問題がある。この問題は、配列決定可能な塩基の長さが限られている場合に特に深刻化する。例えば、Illumina社製のGenome Analyzerは、高速シークエンスが可能な装置であるが、読み取り可能な配列の長さは35〜50塩基対程度であるため、REの内部配列が長い場合には、REのゲノム上の位置を決定できるほどの長さのREの周辺配列情報を得られない可能性がある。さらに、多型REの隣接配列は、RE多型を生み出すレトロトランスポゾン挿入の際に大きく改変及び修飾されているため、REから少し離れた周辺配列情報を得る必要がある。【０００９】
本発明者は、以上のような問題点を初めて認識し、そして、この問題点は、（１）REを制限酵素で処理し、（２）それによって生じるDNA断片の中からREの末端を含むDNA断片を鋳型としてインバースPCRを行い、（３）その増幅産物を前記した制限酵素で処理することにより解消できることを見出した。【００１０】
また、本発明者は、ゲノムDNA上のREの周辺配列をインバースPCRによって増幅させた場合、プライマーによっては、増幅産物に偏りが生じ、REの周辺配列を網羅的に増幅できないことがあることを見出した。そして、この問題は、予め候補とするプライマーを幾つか合成しておき、それらによるPCR増幅産物を電気泳動し、その電気泳動像がスメアになるプライマーを選択することによって解決できることも見出した。【００１１】
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。【００１２】
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔２１〕を提供する。
〔１〕ゲノムDNAに含まれるレトロエレメントの周辺配列を含むDNA断片を作製する方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とするDNA断片の作製方法、（１）DNA断片の作製対象とするゲノムDNAを、レトロエレメント内部に少なくとも一つの切断部位を持つ制限酵素で処理する工程、（２）制限酵素によって切断されたDNA断片を自己環化させる工程、（３）下記の第一及び第二のプライマーを用い、自己環化させたDNA断片を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、第一及び第二のプライマーは、レトロエレメントの末端とその末端に最も近い制限酵素切断部位との間の領域にハイブリダイズするプライマーで、第一のプライマーは制限酵素切断部位側に位置し、制限酵素切断部位方向にDNAを伸長させるように設計されており、第二のプライマーはレトロエレメントの末端側に位置し、レトロエレメントの末端方向にDNAを伸長させるように設計されている。
〔２〕工程（３）において増幅されたDNA断片を制限酵素で処理し、第一のプライマー側の末端を切除することを特徴とする〔１〕に記載のDNA断片の作製方法。
〔３〕制限酵素が、工程（１）で使用した制限酵素と同一の制限酵素であることを特徴とする〔２〕に記載のDNA断片の作製方法。
〔４〕レトロエレメントが、L1又はSVAであり、工程（３）において使用する第一及び第二のプライマーが、レトロエレメントの3’末端と3’末端に最も近い制限酵素切断部位との間の領域にハイブリダイズするプライマーであることを特徴とする〔１〕乃至〔３〕のいずれかに記載のDNA断片の作製方法。
〔５〕工程（３）において使用する第二のプライマーに、ゲノムDNAを識別するための配列が付加されていることを特徴とする〔１〕乃至〔４〕のいずれかに記載のDNA断片の作製方法。
〔６〕ポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物を電気泳動し、その電気泳動像がスメアになるプライマーを工程（３）において使用する第一及び第二プライマーとすることを特徴とする〔１〕乃至〔５〕のいずれかに記載のDNA断片の作製方法。
〔７〕対象とするレトロエレメントがゲノムDNA間で多型を生じ易いレトロエレメントであり、そのレトロエレメントに含まれ、そのレトロエレメントと同一のファミリーに属するレトロエレメントに含まれない配列と同一又は相補的な配列を含むプライマーを工程（３）において使用する第一及び第二プライマーとすることを特徴とする〔１〕乃至〔６〕のいずれかに記載のDNA断片の作製方法。
〔８〕ゲノムDNAに含まれるレトロエレメントのゲノムDNA上の位置を決定する方法であって、以下の（１）〜（５）の工程を含むことを特徴とするレトロエレメントの位置決定方法、（１）レトロエレメントの位置決定の対象とするゲノムDNAを、レトロエレメント内部に少なくとも一つの切断部位を持つ制限酵素で処理する工程、（２）制限酵素によって切断されたDNA断片を自己環化させる工程、（３）下記の第一及び第二のプライマーを用い、自己環化させたDNA断片を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、第一及び第二のプライマーは、レトロエレメントの末端とその末端に最も近い制限酵素切断部位との間の領域にハイブリダイズするプライマーで、第一のプライマーは制限酵素切断部位側に位置し、制限酵素切断部位方向にDNAを伸長させるように設計されており、第二のプライマーはレトロエレメントの末端側に位置し、レトロエレメントの末端方向にDNAを伸長させるように設計されている、（４）増幅されたDNA断片のレトロエレメントの周辺配列の塩基配列を決定する工程、（５）決定したレトロエレメントの周辺配列の塩基配列とゲノムデータベースとを比較し、レトロエレメントのゲノム上の位置を決定する工程。
〔９〕工程（３）において増幅されたDNA断片を制限酵素で処理し、第一のプライマー側の末端を切除することを特徴とする〔８〕に記載のレトロエレメントの位置決定方法。
〔１０〕制限酵素が、工程（１）で使用した制限酵素と同一の制限酵素であることを特徴とする〔９〕に記載のレトロエレメントの位置決定方法。
〔１１〕レトロエレメントが、L1又はSVAであり、第一及び第二のプライマーが、レトロエレメントの3’末端と3’末端に最も近い制限酵素切断部位との間の領域にハイブリダイズするプライマーであることを特徴とする〔８〕乃至〔１０〕のいずれかに記載のレトロエレメントの位置決定方法。
〔１２〕工程（３）において使用する第二のプライマーに、ゲノムDNAを識別するための配列が付加されており、工程（４）においてレトロエレメントの周辺配列と共にゲノムDNAを識別するための配列の塩基配列を決定することを特徴とする〔８〕乃至〔１１〕のいずれか一項に記載のレトロエレメントの位置決定方法。
〔１３〕ポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物を電気泳動し、その電気泳動像がスメアになるプライマーを工程（３）において使用する第一及び第二プライマーとすることを特徴とする〔８〕乃至〔１２〕のいずれかに記載のレトロエレメントの位置決定方法。
〔１４〕対象とするレトロエレメントがゲノムDNA間で多型を生じ易いレトロエレメントであり、そのレトロエレメントに含まれ、そのレトロエレメントと同一のファミリーに属するレトロエレメントに含まれない配列と同一又は相補的な配列を含むプライマーを工程（３）において使用する第一及び第二プライマーとすることを特徴とする〔８〕乃至〔１３〕のいずれかに記載のレトロエレメントの位置決定方法。
〔１５〕レトロエレメントによって生じた多型を検出する方法であって、以下の（１）〜（５）の工程を含むことを特徴とする多型の検出方法、（１）多型の検出対象とする複数のゲノムDNAを、ゲノムDNAごとに、レトロエレメント内部に少なくとも一つの切断部位を持つ制限酵素で処理する工程、（２）制限酵素によって切断されたDNA断片を自己環化させる工程、（３）下記の第一及び第二のプライマーを用い、自己環化させたDNA断片を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、第一及び第二のプライマーは、レトロエレメントの末端とその末端に最も近い制限酵素切断部位との間の領域にハイブリダイズするプライマーで、第一のプライマーは制限酵素切断部位側に位置し、制限酵素切断部位方向にDNAを伸長させるように設計されており、第二のプライマーはレトロエレメントの末端側に位置し、レトロエレメントの末端方向にDNAを伸長させるように設計されている、（４）増幅されたDNA断片のレトロエレメントの周辺配列の塩基配列を決定する工程、（５）決定したレトロエレメントの周辺配列を、多型の検出対象とするゲノムDNA間で比較、又はデータベース上のゲノムDNAと比較し、特定のゲノムDNAに含まれていたレトロエレメントの周辺配列を検出する工程。
〔１６〕工程（３）において増幅されたDNA断片を制限酵素で処理し、第一のプライマー側の末端を切除することを特徴とする〔１５〕に記載の多型の検出方法。
〔１７〕制限酵素が、工程（１）で使用した制限酵素と同一の制限酵素であることを特徴とする〔１６〕に記載の多型の検出方法。
〔１８〕レトロエレメントが、L1又はSVAであり、工程（３）において使用する第一及び第二のプライマーが、レトロエレメントの3’末端と3’末端に最も近い制限酵素切断部位との間の領域にハイブリダイズするプライマーであることを特徴とする〔１５〕乃至〔１７〕のいずれか一項に記載の多型の検出方法。
〔１９〕工程（３）において使用する第二のプライマーに、ゲノムDNAを識別するための配列が付加されており、工程（４）において各ゲノムDNA由来のDNA断片を混合した後、レトロエレメントの周辺配列と共にゲノムDNAを識別するための配列の塩基配列を決定することを特徴とする〔１５〕乃至〔１８〕のいずれかに記載の多型の検出方法。
〔２０〕ポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物を電気泳動し、その電気泳動像がスメアになるプライマーを工程（３）において使用する第一及び第二プライマーとすることを特徴とする〔１５〕乃至〔１９〕のいずれかに記載の多型の検出方法。
〔２１〕対象とするレトロエレメントがゲノムDNA間で多型を生じ易いレトロエレメントであり、そのレトロエレメントに含まれ、そのレトロエレメントと同一のファミリーに属するレトロエレメントに含まれない配列と同一又は相補的な配列を含むプライマーを工程（３）において使用する第一及び第二プライマーとすることを特徴とする〔１５〕乃至〔２０〕のいずれか一項に記載の多型の検出方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法により、ゲノムDNA配列の個人間の違いに大きな影響を与えるRE多型を網羅的かつ迅速に検出することが可能になる。RE多型以外にも、RE配列周辺のゲノムDNA配列の個人間の違いを網羅的にかつ迅速に検出することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明のRE多型の検出方法の原理を示す図である。
【図２】実施例で得られた４クローンの塩基配列を示す図である。制限酵素認識配列の下流にL1周辺配列が存在する。
【図３】AluYa5の周辺配列をPCRで増幅させた場合の増幅産物の電気泳動像。図３ＡはプライマーとしてRE101とRE102を用いており、図３Ｂはプライマーとして及びRE19とRE20を用いている。図３Ａでは、１２０塩基対付近のバンドが見られる一方、図３Ｂでは特定の目立ったバンドはなく、スメアが確認される。
【図４】プライマーとしてRE101とRE102を用いた場合の増幅産物のゲノム内の位置を示す図。図中の丸印１つが１クローンに相当する（合計１８５クローン）。水平方向に複数の丸印が重なっている箇所では、丸印の数のクローンが同一AluYa5部位から得られたことを意味する。また、第７染色体の長腕テロメア付近の大きな丸印は、その箇所にあるAluYa5部位由来のクローンが、３０個得られたことを示す。この第７染色体のAluYa5での局所的増幅が、図３Ａにおける120塩基対長のバンド（矢印）の由来である。
【図５】プライマーとしてRE19とRE20を用いた場合の増幅産物のゲノム内の位置を示す図。丸印１つが１クローンに相当する（合計７９クローン）。水平方向に複数の丸印が重なっている箇所では、丸印の数のクローンが同一AluYa5部位から得られたことを意味する。広くAluYa5部位が同定されたという今回の結果は、図３Ｂにおいて電気泳動パターンがスメアとなったことと一致している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
最初に本発明の多型検出方法の原理を図１によって説明する。なお、図１は本発明の一態様を示すものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００１７】
まず、多型の検出対象とするゲノムDNAをRE内部に切断部位を持つ制限酵素で処理する（図１Ａ）。これにより、ゲノムDNAは、複数のDNA断片に切断される（図１Ｂ）。各DNA断片は、リガーゼにより自己環化させる（図１Ｃ）。環化したDNA断片は多数生じるが、その中のREの3’末端を含むものに着目し、この断片に含まれるREに対応したインバースPCR用のプライマーを設計する（図１Ｃ）。この際、REの3’末端側のプライマーには、ゲノムDNAを識別するための配列を付加しておく（図１Ｃ）。以上のようなプライマーを用いてインバースPCRを行うことにより、一方の末端にREの内部配列を持ち、他方の末端にゲノムDNAを識別するための配列を持つDNA断片が増幅される（図１Ｄ）。このDNA断片を最初に使用したものと同一の制限酵素で処理する。これにより、一方の末端にREの周辺配列を持ち、他方の末端にゲノムDNAを識別するための配列を持つDNA断片が生じる（図１Ｅ）。このようなDNA断片を、多型の検出対象とするゲノムDNAごとに作製し、それらを混合した後、REの周辺配列とゲノムDNAを識別するための配列の塩基配列を決定する。ゲノムDNAを識別するための配列により、各々のREの周辺配列がどのゲノムDNAに由来するものか判別することが可能なので、その情報に基づき、REの周辺配列をゲノムDNA間で比較する。これにより、REの多型を検出することができる。
【００１８】
次に、本発明の多型検出方法を工程ごとに説明する。
【００１９】
工程（１）では、多型の検出対象とする複数のゲノムDNAを、ゲノムDNAごとに、RE内部に少なくとも一つの切断部位を持つ制限酵素で処理する。
【００２０】
本発明の多型検出方法は、主としてヒトゲノムDNAの多型の検出を目的とするものであるため、ゲノムDNAは、ヒトゲノムDNAであることが好ましい。但し、ヒト以外の生物、例えば、ラット、マウス、サルのゲノムDNAであってもよい。
【００２１】
REの種類は特に限定されないが、前述のように、本発明の多型検出方法は主としてヒトゲノムDNAの多型の検出を目的とするので、ヒトゲノムDNA内で転移活性のあるREであることが好ましい。このようなREのファミリーとしては、L1、Alu、SVA、HERVなどが知られている（Trends in Genetics, Mills, R.E., et al., 2005）。これらのREファミリーは、多数のサブファミリーを含んでいる。例えば、L1は、L1HS、L1PA2、L1PA3などのサブファミリーを含んでおり、Aluは、AluSc、AluSg、AluSp、AluSq、AluSx、AluSz、AluY、AluYa、AlyYb、AluYc、AluYd、AluYe、AluYf、AluYg、AluYh、AluYi、AluYj、AluYa5、AluYb8、AluYc1などのサブファミリーを含んでおり、SVAは、SVA-B、SVA-C、SVA-D、SVA-E、SVA-Fなどのサブファミリーを含んでおり、HERVは、HERV-Kなどのサブファミリーを含んでいる。L1における多型の生じ易いサブファミリーとしてはL1HS、L1PA2、L1PA3などを例示でき、Alu における多型の生じ易いサブファミリーとしてはAluYa5、AluYb8、AluYc1、AluYなどを例示でき、SVAにおける多型の生じ易いサブファミリーとしてはSVA-E、SVA-Fなどを例示でき、HERVにおける多型の生じ易いサブファミリーとしてはHERV-Kなどを例示できる。
【００２２】
制限酵素は、RE内部に少なくとも一つの切断部位を持つものであれば特に制限されないが、（１）認識部位と切断部位が一致しているクラスIIであり、（２）認識配列が回文配列であり、（３）切断末端が突出末端であることが好ましい。認識配列の長さは特に限定されないが、生じるDNA断片の長さは500塩基対以下であることが好ましいので、認識配列の長さは４〜６塩基であることが好ましい。実際に使用する制限酵素は、多型の検出対象とするREの種類に応じて決めればよい。例えば、多型の検出対象をL1とした場合は、BfaI、MseI、SimIなどを使用すればよく、多型の検出対象をAluとした場合は、Tsp509I、TaqI、BstYIなどを使用すればよく、多型の検出対象をSVA とした場合は、Csp6Iなどを使用すればよく、多型の検出対象をHERVとした場合は、XhoIなどを使用すればよい。
【００２３】
工程（２）では、制限酵素によって切断されたDNA断片を自己環化させる。DNA断片の自己環化は、常法に従い、リガーゼなどを用いて行うことができる。
【００２４】
工程（３）では、第一及び第二のプライマーを用い、自己環化させたDNA断片を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行う。
【００２５】
第一及び第二のプライマーは、REの末端とその末端に最も近い制限酵素切断部位との間の領域にハイブリダイズするプライマーで、第一のプライマーは制限酵素切断部位側に位置し、制限酵素切断部位方向にDNAを伸長させるように設計されており、第二のプライマーはREの末端側に位置し、REの末端方向にDNAを伸長させるように設計されている。このようなプライマーは、REの配列情報などに基づき、適宜設計可能である。
【００２６】
第一及び第二のプライマーは、上記のようなプライマーであればよいが、下記の（Ａ）及び／又は（Ｂ）のようなプライマーであることがより好ましい。
【００２７】
（Ａ）ゲノムDNA上のREの周辺配列に対しインバースPCRを行ったときに、ゲノム内の特定のRE配列だけが優先的に増幅され、REの周辺配列を網羅的に増幅できない場合がある。このような場合、PCRの増幅産物を電気泳動すると、その電気泳動像に特定の長さのバンドが検出される。一方、増幅に偏りがなく、ゲノム内に散在する数多くのREの周辺配列を網羅的に増幅できる場合は、増幅産物の電気泳動像は「スメア」になる。従って、予め候補とするプライマーを幾つか合成しておき、それらによるPCR増幅産物を電気泳動し、その電気泳動像が「スメア」になるプライマーを第一及び第二のプライマーとすることにより、REの周辺配列を網羅的に増幅できる。ここで、「スメア」とは、全長が異なり、かつそれぞれの長さの違いが１から２０塩基対までのDNA断片の混合物が電気泳動される場合に観察される電気泳動像を形容する分子生物学用語をいう。英語の「smear（（油などを）塗り付ける）」に由来するように、電気泳動方向に沿って泳動レーンの上にDNA断片が塗り付けられたような泳動像が「スメア」である。また「スメア」の幅は、PCR増幅産物であるDNA断片の全長の範囲に相当する。
【００２８】
（Ｂ）本発明は、ゲノム多型の検出を主な目的とするため、増幅の対象とするレトロエレメントは、ゲノムDNA間で多型を生じ易いレトロエレメントであることが好ましい。この多型を生じ易いレトロエレメントを増幅させる場合、同時にこのレトロエレメントと同一のファミリーに属する他のレトロエレメントも増幅されてしまうことがある。これを避けるため、増幅の対象とするレトロエレメントに含まれ、同一のファミリーに属する他のレトロエレメントに含まれない配列と同一又は相補的な配列を含むプライマーを第一及び第二プライマーとすることが好ましい。
【００２９】
第一のプライマーの5'末端には、ビオチンなどをあらかじめ化学修飾することで、目的とするPCR産物だけをストレプトアビジンにより濃縮精製が可能になる。これにより、ゲノムDNAや処理途中で分断したPCR産物から、REの周辺配列を含むDNA断片を分離精製できる。
【００３０】
第二のプライマーには、ゲノムDNAを識別するための配列が付加されていることが好ましい。この配列の長さは特に限定されないが、３〜５塩基であることが好ましい。ゲノムDNAを識別するための配列は、第一のプライマーに付加してもよい。
【００３１】
「REの末端とその末端に最も近い制限酵素切断部位との間の領域」は、REの5’末端側と3’末端側に二つ存在し、これらいずれの領域に基づいてプライマーを設計してもよい。但し、L1とSVAについては、5’末端側の領域に基づいてプライマーを設計することも可能であるが、3’末端側の領域に基づいてプライマーを設計することが好ましい。これは、RE多型を生み出す可能性のあるこれらレトロトランスポゾンの多くが、5’末端領域を欠失した形で転移することが多いため、3’末端側の領域に基づいてプライマーを設計した方が、網羅的にRE多型を検出できるからである。
【００３２】
ポリメラーゼ連鎖反応の条件は特に限定されず、一般的なインバースPCR法と同様の条件でよい。
【００３３】
増幅されたDNA断片の第一のプライマー側の末端には、REの内部配列が存在するので、これを切断、除去するため、増幅されたDNA断片を制限酵素で処理することが好ましい。使用する制限酵素は、工程（１）で使用した制限酵素と同一の制限酵素が好ましい。この制限酵素を用いることにより、REの内部配列を完全に除去できる。工程（１）で使用した制限酵素と同一の制限酵素の代わりに、この制限酵素の切断部位付近を切断する制限酵素を用いてもよい。このような制限酵素はREの内部配列を基に適宜選択可能である。なお、切断部位付近とは、切断部位から、通常、1〜1000塩基範囲内を意味し、好適には、1〜100塩基範囲内を意味し、更に好適には1〜20塩基範囲内を意味し、特に好適には1〜10塩基範囲内を意味する。
【００３４】
工程（４）では、REの周辺配列の塩基配列を決定する。
【００３５】
塩基配列を決定する方法は特に限定されず、常法に従って行うことができるが、迅速な配列決定が可能な「次世代シークエンサー」を用いて行うことが好ましい。「次世代シークエンサー」を用いた方法の中でも、ビーズまたはガラス基盤上に固定化された１分子DNAを鋳型に相補鎖を１塩基あるいは２塩基ずつ伸長させる際に、相補鎖に取り込まれた塩基の種類を蛍光あるいは化学発光により識別することで、固定化されたDNAの塩基配列を特定する方法（Illumina社製のGenome Analyzerを用いた方法）が好ましい。
【００３６】
決定する塩基配列の長さは、REのゲノム上の位置を特定できる長さであれば特に限定されないが、５０〜１００塩基対とするのが好ましく、２５〜３５塩基対とするのが更に好ましい。
【００３７】
工程（３）で第二のプライマーに、ゲノムDNAを識別するための配列を付加した場合には、REの周辺配列のほかに、この配列の塩基配列も決定する。この配列を付加した場合には、ゲノムDNAごとに塩基配列情報を振り分けることができるので、各ゲノムDNA由来のDNA断片を混合し、一度にREの周辺配列の塩基配列を決定することも可能になる。前述したIllumina社製のGenome Analyzerは、DNA断片の両端の塩基配列の解読が可能であり、REの周辺配列と識別のための配列の両方の塩基配列を同時に決定することができるため、この工程において使用するシークエンサーとして好適である。
【００３８】
工程（５）では、決定したREの周辺配列を、多型の検出対象とするゲノムDNA間で比較、又はデータベース上のゲノムDNAと比較し、特定のゲノムDNAに含まれていたREの周辺配列を検出する。データベースとしては、ヒトゲノム配列に関わるデータベースを使用することができる。使用するヒトゲノム配列に関わるデータベースはどのようなものでもよく、例えば、UCSC Genome Browser、Ensembl genome Browserなどを使用できる。
【００３９】
本発明には、以上の多型検出方法のほか、「REの周辺配列を含むDNA断片を作製する方法」や「REのゲノムDNA上の位置を決定する方法」も含まれる。「REの周辺配列を含むDNA断片を作製する方法」は、多型検出方法の工程（１）〜（３）を実施すればよく、「REのゲノムDNA上の位置を決定する方法」は、多型検出方法の工程（１）〜（４）を実施し、決定したREの周辺配列の塩基配列とゲノムデータベースとを比較し、REのゲノム上の位置を決定すればよい。ゲノムデータベースとしては、例えば、UCSC Genome Browser、Ensembl genome Browserなどを使用できる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。【００４１】
〔実施例１〕  L1の周辺配列の決定
ヒトゲノム中に含まれるREであるL1の周辺配列の塩基配列を以下のようにして決定した。【００４２】
L1多型を生み出す可能性のあるL1サブファミリー（L1HSおよびL1PA2）のコンセンサス配列をレトロエレメント・データベースであるRepbase（http://www.girinst.org/repbase/index.html）から取得し、それらの配列に基づき、制限酵素としてBfaIを選択した。【００４３】
HeLa細胞由来のゲノムDNA（1 mg）をBfaI制限酵素により、37℃で2時間反応させたのち、80℃で不活性化し、Qiagen社PCR Purification Kitにより精製した際に50μlのバッファーで溶出した。そのうち5μlのゲノムDNA溶液を、5μlのLigation Mix(Wako)と混合し、16℃で5分間の自己環化反応を行った。【００４４】
このゲノムDNA溶液1μlを、全量50μlのPCR反応を行った。プライマーは、公共のプライマー設計ウェブサイトPrimer3（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3www.cgi）により複数設計した。それらの配列を以下に示す：
Forward primer: REp001: GTGCACATGTACCCTAAAACTTAGA（配列番号１）
Reverse primer: REp002: GTGCGCTGCACCCACTAAC（配列番号２）
反応液には、ゲノムDNA以外にREp001（0.3μM）、REp002（0.3μM）、1xGXL Buffer(Takara)、dNTPs（各0.2mM）、Primerstar GXL(Takara;1.25U)が含まれている。PCR反応は、98℃で10秒、68℃で2分を5サイクル後に、98℃で10秒、65℃で15秒、68℃で2分を35サイクル行った。その後、1kb以下のDNAを1％アガロース電気泳動で分離後、Qiagen社のGel Extraction Kitにより精製した。精製したDNA断片を、Invitrogen社のTA TOPO Cloningによりクローニング後、BigDye terminator cycle sequencing kit (ABI)を用いてM13 Forward primerにより伸長反応後、ABI Sequencer 3100により塩基配列を決定した。【００４５】
配列が得られた4クローンの塩基配列を図２に示す。これらの4クローンのうち3クローンはL1HSの3’末端領域を含んでおり、残りの1クローンはL1PA2の3’末端領域を含んでいた。また、L1周辺配列は４クローンごとに全く異なっていた。このことから、これら4つのL1はゲノムDNA上の全く異なる位置に存在していると考えられる。また、クローンの配列中には、BfaIも存在していることから、PCR反応産物をBfaIで処理することにより、高速シークエンサーで容易に解読可能な末端にL1周辺配列を持つDNA断片を作製できると考えられる。【００４６】
〔実施例２〕  増幅産物の電気泳動像とゲノム内位置
二組のプライマーを用いて、レトロエレメントAluYa5の周辺配列をPCRで増幅し、その増幅産物の電気泳動像を得た。また、各増幅産物の塩基配列を決定し、ゲノム内の位置を決定した。【００４７】
（１）DNAの制限酵素処理
ヒトゲノム（200 ng）をTsp509I制限酵素により全量50 μlの反応系で65℃、2時間反応させたのち、2%のアガロースゲルにて電気泳動を行い、600 bp以下のフラグメントを切り出した。QIAGEN Gel Extraction Kitにより精製した際に50 μlのTris-HCl（pH8.0）にて溶出した。【００４８】
（２）ライゲーション反応
上記の制限酵素処理済みDNA溶液1 μlを使用した。反応は 1xT4 DNA ligation Buffer（Takara) Takara T4 DNA ligase （200 U）を含む溶液中で行い、全量100 μlの反応系で16℃ 18時間の反応を行った。QIAGEN PCR purification kitを使用して精製した際に、25 μlのTris-HCl（pH8.0）にて溶出した。【００４９】
（３）PCR
上記のライゲーション後溶液25 μl中20 μlを使用して、全量50 μlのPCR反応を行った。プライマーは、RE101とRE102、及びRE19とRE20の二組を用いた。プライマー配列を以下に示す。【００５０】
Forward primer（RE101）：GATCTCCTGACCTCGT（配列番号３）
Reverse primer（RE102）：ACCATCCCGGCTAAAAC（配列番号４）
Forward primer（RE19）：CTACAGGCGCCCGCCACT（配列番号５）
Reverse primer（RE20）：TGCAGTGAGCCGAGATCC（配列番号６）
RE19とRE20は、多型の生じ易いAluYa5のみを増幅し、同じAluファミリーに属し、多型の生じ得ないAluSやAluJを増幅しないようにするため、AluYa5コンセンサス配列中の148から165番目までと224から241番目までのそれぞれの塩基配列に基づいて設計されている。これらの配列中には、148番目、155番目、165番目、236番目、241番目にAluYa5に特異的な配列が含まれる。【００５１】
反応液には、ゲノムDNA以外にForward primer（0.2 μM）、Reverse primer（0.2 μM）、1xGXL Buffer（Takara）、dNTP（各0.25 mM）、PrimeSTAR GXL（Takara;0.75 U）が含まれている。PCR反応は、98℃で10秒、50℃で15秒、68℃で30秒を30サイクル行った。その後、600 bp以下のDNAを4%アガロース電気泳動で分離後（図３Ａ及びＢ）、QIAGEN Gel Extraction Kitにより精製した。【００５２】
精製したDNA断片を、Invitrogen社のTA TOPO Cloningによりクローニング後、BigDye terminator cyclesequencing kit（ABI）を用いてM13 Forward primerにより伸長反応後、Sequencer 3100（ABI）により塩基配列を決定し、ゲノム内の位置を決定した（図４及び図５）。【００５３】
図に示すように、電気泳動像がスメアになったRE19とRE20を用いた場合の方が、特定のバンドが検出されたRE101とRE102を用いた場合よりも、網羅的にAluYa5を増幅することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明により、RE多型に関する情報を容易に取得することが可能になる。このようなRE多型に関する情報は、新規な遺伝子診断薬の開発、及び再生医療などに用いられる細胞の品質管理などに有用である。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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