(57)【要約】  測定対象物が発する自家蛍光を除去するために、まず、強度変調したレーザ光の照射を受けた測定対象物が発する蛍光の強度が、レーザ光で照射された測定対象物の発する自家蛍光の強度に比べて高くなるように、第１の波長帯域で測定対象物の蛍光を受光し、さらに、第１の波長帯域と異なる第２の波長帯域で自家蛍光を受光する。生成した第１の蛍光の蛍光信号と自家蛍光の蛍光信号を、レーザ光の変調信号とミキシングすることにより、第１の蛍光データおよび自家蛍光の蛍光データを生成する。この自家蛍光の蛍光データに予め定められた定数を乗算して得られる結果を、第１の蛍光データから減算して、第３の蛍光データを生成する。この第３の蛍光データを用いて蛍光強度を算出する。
2010084720.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物がレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光し、受光した蛍光の蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置であって、
測定対象物が励起して蛍光を発する波長のレーザ光を、設定された周波数で強度変調して、測定対象物の照射光として出射する光源部と、
照射光に照射された測定対象物が発する第１の蛍光の強度が、レーザ光で照射された測定対象物の発する第２の蛍光の強度に比べて高くなるように、前記第１の蛍光に対応して設定された第１の波長帯域で前記第１の蛍光を受光し、第１の蛍光信号を出力する第１の受光素子と、前記第１の波長帯域と異なる第２の波長帯域で測定対象物の発する第２の蛍光を受光し、第２の蛍光信号を出力する第２の受光素子とを含む受光部と、
出力した前記第１の蛍光信号を、レーザ光を前記周波数で強度変調する変調信号とミキシングすることにより、前記第１の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第１の蛍光データを生成するとともに、出力した前記第２の蛍光信号を前記変調信号とミキシングすることにより、前記第２の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第２の蛍光データを生成する第１の処理部と、
生成した前記第２の蛍光データに予め定められた定数を乗算して得られる結果を、前記第１の蛍光データから減算して、第３の蛍光データを生成する蛍光除去部と、生成された前記第３の蛍光データを用いて前記第１の蛍光の蛍光強度を算出する蛍光強度算出部とを含む第２の処理部と、を有することを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
前記測定対象物は、蛍光色素が測定対象粒子に付着して構成され、
前記第１の蛍光は、前記蛍光色素が発する蛍光であり、
前記第２の蛍光は、前記測定対象粒子が発する自家蛍光、あるいは、前記測定対象粒子を懸濁する溶液の自家蛍光である、請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
前記第２の波長帯域は、前記第１の蛍光の持つ波長の範囲から外れた領域に設定される請求項２に記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
前記蛍光除去部で用いる前記定数は、蛍光色素が付着していない測定対象粒子について、前記光源部と前記受光部と前記第１の処理部とを用いて得られる、測定対象粒子の発する自家蛍光の前記第１の波長帯域における蛍光データを、測定対象粒子の発する自家蛍光の前記第２の波長帯域における蛍光データで除算して得られる比の値である請求項２または３に記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記第２の処理部は、蛍光強度の他、前記第３の蛍光データを用いて前記第１の蛍光の蛍光緩和時間を算出する蛍光緩和算出部を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
測定対象物がレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光し、受光した蛍光の蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出方法であって、
測定対象物が励起して蛍光を発する波長のレーザ光を、設定された周波数で強度変調して、測定対象物の照射光として出射するステップと、
照射光に照射された測定対象物が発する第１の蛍光の強度が、レーザ光で照射された測定対象物の発する第２の蛍光の強度に比べて高くなるように、前記第１の蛍光に対応して設定された第１の波長帯域で前記第１の蛍光を受光し、第１の蛍光信号を生成するとともに、前記第１の波長帯域と異なる第２の波長帯域で測定対象物の発する第２の蛍光を受光し、第２の蛍光信号を生成するステップと、
生成した前記第１の蛍光信号を、レーザ光を前記周波数で強度変調する変調信号とミキシングすることにより、前記第１の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第１の蛍光データを生成するとともに、生成した前記第２の蛍光信号を前記変調信号とミキシングすることにより、前記第２の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第２の蛍光データを生成するステップと、
生成した前記第２の蛍光データに予め定められた定数を乗算して得られる結果を、前記第１の蛍光データから減算して、第３の蛍光データを生成し、生成された前記第３の蛍光データを用いて前記第１の蛍光の蛍光強度を算出するステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項７】
前記測定対象物は、蛍光色素が測定対象粒子に付着して構成され、
前記第１の蛍光は、前記蛍光色素が発する蛍光であり、
前記第２の蛍光は、前記測定対象粒子が発する自家蛍光、あるいは、前記測定対象粒子を懸濁する溶液の自家蛍光である、請求項６に記載の蛍光検出方法。
【請求項８】
前記第２の波長帯域は、前記第１の蛍光の持つ波長の範囲から外れた領域に設定される請求項７に記載の蛍光検出方法。
【請求項９】
前記定数は、蛍光色素が付着していない測定対象粒子を用いた処理方法により得られ、
前記処理方法は、
前記レーザ光を、前記周波数で強度変調して、前記測定対象物の照射光として出射するステップと、
前記第１の波長帯域で前記自家蛍光を受光し、第１の自家蛍光信号を生成するとともに、前記第２の波長帯域で前記自家蛍光を受光し、第２の自家蛍光信号を生成するステップと、
生成された前記第１の自家蛍光信号の、前記第２の自家蛍光信号に対する比率を前記定数として算出するステップと、を含む請求項７または８に記載の蛍光検出方法。
【請求項１０】
さらに、蛍光強度の他、前記第３の蛍光データを用いて前記第１の蛍光の蛍光緩和時間を算出するステップを含む請求項６〜９のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定対象物がレーザ光の照射を受けることにより発する蛍光を受光し、このとき得られる複数の蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置および蛍光検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療、生物分野では、レーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光をフォトマルチプライヤやアバランシュフォトダイオード等の光電変換器を用いて受光して、細胞や遺伝子等の測定対象物の種類や頻度や特性を分析するフローサイトメータが広く用いられている。【０００３】
具体的には、フローサイトメータは、懸濁液中の細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質等を含んだ測定対象物を蛍光試薬でラベル化し、圧力を与えて毎秒１０ｍ以内程度の速度で管路内を流れるシース液に測定対象物を流してラミナーシースフローを形成する。フローサイトメータは、このフロー中の測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付着した蛍光色素が発する蛍光を受光し、この蛍光をラベルとして識別することで生体物質等を特定する。【０００４】
このフローサイトメータでは、例えば、細胞内のＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白質等の細胞内相対量を計測し、またこれらの働きを短時間で解析することができる。また、特定のタイプの細胞や染色体を蛍光によって特定し、特定した細胞や染色体のみを生きた状態で短時間で選別収集するセル・ソータ等が用いられる。
これの使用においては、より多くの測定対象物を、短時間に正確に蛍光の情報から特定することが要求されている。【０００５】
例えば、細胞や人工的に作製されたマイクロビーズ等のサンプルを計測する場合、測定したい情報は、サンプルに標識した蛍光色素の蛍光の情報（蛍光色や蛍光強度）である。しかし、照射するレーザ光によって発する蛍光は、標識に用いた蛍光色素のみが発するのではなく、細胞やマイクロビーズ等のサンプル自体が発し、あるいは、これらのサンプルを懸濁しているバッファー液自体も発する。これらサンプル自体あるいはバッファー液の発する蛍光の波長帯域は広く、蛍光色素が発する蛍光の波長帯域と重なる場合が多い、このため、サンプル自体あるいはバッファー液の発する蛍光は、除去すべき自家蛍光である。
自家蛍光は、通常、蛍光色素の発する蛍光に比べて蛍光強度は極めて弱いが、場合によっては強い蛍光強度を持つ。この場合、蛍光色素の発する蛍光に比べて依然として蛍光強度が十分に弱ければ、蛍光色素の発する蛍光を十分なＳＮ比で計測することができる。しかし、蛍光色素の発する蛍光の蛍光強度が十分に強くない場合、ＳＮ比が低下し、この蛍光の計測が難しくなる。自家蛍光が弱くても、同様に蛍光色素の発する蛍光が弱ければ同様の問題が発生する。【０００６】
下記特許文献１では、以下の蛍光強度算出方法が記載されている。
すなわち、レーザ光の強度を所定の周波数で時間変調して標識サンプルに照射し、このときの標識サンプルの蛍光を受光波長帯域の異なる複数の検出センサで受光することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサから収集する。レーザ光を照射した標識サンプルの蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの伝達関数のパラメータを用いて補正変換行列を作成する。各検出センサから収集された、位相情報を含む検出値の組をベクトルとし、このベクトルに、作成された補正変換行列から作成される逆行列を作用させて標識サンプルが発する蛍光の蛍光強度を求める。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−１２７４１５号公報
【０００８】
上記方法では、正確な蛍光強度を算出することができるが、補正変換行列を作成し、その行列の逆行列を計算する必要があるため、迅速かつ容易に蛍光強度を求めることは難しい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、測定対象物がレーザ光の照射を受けることにより発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行うとき、迅速かつ容易に蛍光強度を求めることのできる蛍光検出装置および蛍光検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様は、測定対象物がレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光し、受光した蛍光の蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置であって、
（Ａ）測定対象物が励起して蛍光を発する波長のレーザ光を、設定された周波数で強度変調して、測定対象物の照射光として出射する光源部と、
（Ｂ）照射光に照射された測定対象物が発する第１の蛍光の強度が、レーザ光で照射された測定対象物の発する第２の蛍光の強度に比べて高くなるように、前記第１の蛍光に対応して設定された第１の波長帯域で前記第１の蛍光を受光し、第１の蛍光信号を出力する第１の受光素子と、前記第１の波長帯域と異なる第２の波長帯域で測定対象物の発する第２の蛍光を受光し、第２の蛍光信号を出力する第２の受光素子とを含む受光部と、
（Ｃ）出力した前記第１の蛍光信号を、レーザ光を前記周波数で強度変調する変調信号とミキシングすることにより、前記第１の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第１の蛍光データを生成するとともに、出力した前記第２の蛍光信号を前記変調信号とミキシングすることにより、前記第２の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第２の蛍光データを生成する第１の処理部と、
（Ｄ）生成した前記第２の蛍光データに予め定められた定数を乗算して得られる結果を、前記第１の蛍光データから減算して、第３の蛍光データを生成する蛍光除去部と、生成された前記第３の蛍光データを用いて前記第１の蛍光の蛍光強度を算出する蛍光強度算出部とを含む第２の処理部と、を有する。【００１１】
さらに、本発明の別の態様は、測定対象物がレーザ光の照射を受けて発する蛍光を受光し、受光した蛍光の蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出方法であって、
（Ｅ）測定対象物が励起して蛍光を発する波長のレーザ光を、設定された周波数で強度変調して、測定対象物の照射光として出射するステップと、
（Ｆ）照射光に照射された測定対象物が発する第１の蛍光の強度が、レーザ光で照射された測定対象物の発する第２の蛍光の強度に比べて高くなるように、前記第１の蛍光に対応して設定された第１の波長帯域で前記第１の蛍光を受光し、第１の蛍光信号を生成するとともに、前記第１の波長帯域と異なる第２の波長帯域で測定対象物の発する第２の蛍光を受光し、第２の蛍光信号を生成するステップと、
（Ｇ）生成した前記第１の蛍光信号を、レーザ光を前記周波数で強度変調する変調信号とミキシングすることにより、前記第１の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第１の蛍光データを生成するとともに、生成した前記第２の蛍光信号を前記変調信号とミキシングすることにより、前記第２の蛍光信号の、前記変調信号に対する位相遅れと強度振幅を含む第２の蛍光データを生成するステップと、
（Ｈ）生成した前記第２の蛍光データに予め定められた定数を乗算して得られる結果を、前記第１の蛍光データから減算して、第３の蛍光データを生成し、生成された前記第３の蛍光データを用いて前記第１の蛍光の蛍光強度を算出するステップと、を有する。
【発明の効果】
【００１２】
上述の蛍光検出装置および蛍光検出方法は、従来に比べて、第１の蛍光について迅速かつ容易に蛍光強度を算出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイトメータの概略構成図である。
【図２】図１に示すフローサイトメータに用いる光源部の一例を示す概略構成図である。
【図３】図１に示すフローサイトメータに用いる受光部の一例を示す概略構成図である。
【図４】蛍光蛋白の発する蛍光のスペクトラムＳと、レーザ光Ｌの波長と、第１の波長帯域と、第２の波長帯域と、の関係を示す図である。
【図５】図１に示すフローサイトメータに用いる制御・処理部を中心に示したフローサイトメータの主要部の概略構成図である。
【図６】図１に示すフローサイトメータに用いる分析装置の一例を示す概略構成図である。
【図７】自家蛍光の除去方法を説明する模式図である。
【符号の説明】
【００１４】
１０  フローサイトメータ
１２  試料
２０  信号処理装置
２２  レーザ光源部
２２ａ  光源
２３ａ，２６ｂ  ダイクロイックミラー
２３ｂ．２６ａ  レンズ系
２４，２６  受光部
２６ｃ1，２６ｃ2  バンドパスフィルタ
２７ａ，２７ｂ  光電変換器
２８  制御・処理部
３０  管路
３２  回収容器
３４  レーザドライバ
４８ａ，４８ｂ  パワースプリッタ
４０  信号生成部
４２  信号処理部
４４  システムコントローラ
４６  発振器
５０，５２，５４ａ，５４ｂ，６４  アンプ
５８ａ，５８ｂ  ＩＱミキサ
６２  ローパスフィルタ
６６  Ａ／Ｄ変換器
８０  分析装置
８１  ＣＰＵ
８２  メモリ
８３  分析部
８６  自家蛍光除去部
９０  蛍光強度算出部
９２  位相遅れ算出部
９４  蛍光緩和時間算出部
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を好適に用いたフローサイトメータを基に詳細に説明する。
図１は、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。
【００１６】
フローサイトメータ１０は、レーザ光を測定対象とする試料１２に照射し、試料１２が発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理する信号処理装置２０と、信号処理装置２０で得られた処理結果から蛍光強度や蛍光緩和時間を算出する分析装置（コンピュータ）８０とを有する。
【００１７】
以降では、試料１２として細胞に蛍光蛋白Ｘが付着したものを用いて以降説明する。試料１２は、バッファー液に浸された状態で、シース液とともに流されてラミナーシースフローを作り、フローセルを流れ、レーザ光に照射される。しかし、本発明では、試料１２の替わりに、２つ以上の蛍光色素が発する蛍光に対してこれらの蛍光色素が付着している各細胞やバッファー液等が発する自家蛍光を除去することもできる。
【００１８】
信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４，２６と、制御・処理部２８と、管路３０と、を有する。
制御・処理部２８は、レーザ光源部２２からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させる制御部、及び試料１２からの蛍光信号を処理する信号処理部を含む。管路３０は、高速流を形成するシース液に含ませて試料１２を流してラミナーシースフローを形成する。
管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内に試料１２中の特定の細胞等の生体物質を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
【００１９】
レーザ光源部２２は、所定の波長のレーザ光、例えばλ＝４０８ｎｍのレーザ光を出射する部分である。レーザ光は、管路３０中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられ、この集束位置で試料１２の測定点が形成される。
【００２０】
図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す図である。
レーザ光源部２２は、可視光帯域の波長を有し、強度変調したレーザ光を出射する部分である。
レーザ光源部２２は、光源（レーザダイオード）２２ａを有する。光源２２ａは、波長４０８ｎｍのレーザ光ＬをＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、かつこのＣＷレーザ光Ｌの強度を所定の周波数で強度変調しながら出射する。さらに、レーザ光源部２２は、レンズ系２３と、レーザドライバ３４と、を有する。
レンズ系２３は、レーザ光Ｌを管路３０中の測定点に集束させる。レーザドライバ３４は、レーザ光源部２２を駆動する。
【００２１】
このレーザ光Ｌを出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。レーザ光Ｌは、例えば５〜１００ｍＷ程度の出力である。レーザ光Ｌの強度変調に用いる周波数（変調周波数）は、その周期が蛍光緩和時間に比べてやや長い、例えば１０〜２００ＭＨｚである。
【００２２】
レーザ光源部２２は、レーザ光Ｌが蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光Ｌによって励起される蛍光蛋白Ｘは細胞に付着（結合）されている。この試料１２が管路３０の測定点を通過する際、測定点でレーザ光Ｌの照射を受けて特定の波長で、蛍光蛋白Ｘが蛍光を発する。
【００２３】
受光部２４は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、光電変換器を備える。光電変換器は、測定点を通過する試料１２によってレーザ光が前方散乱することにより、試料１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する。この受光部２４から出力される検出信号は、制御・処理部２８および分析装置８０に供給され、試料１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号、処理開始のＯＮ信号、ＯＦＦ信号として用いられる。
【００２４】
一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ管路３０中の試料１２の移動方向に対して垂直方向に配置されており、測定点にて照射された試料１２が発する蛍光を受光する複数の光電変換器を備える。
図３は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
【００２５】
図３に示す受光部２６は、試料１２からの蛍光信号を集束させるレンズ系２６ａと、ダイクロイックミラー２６ｂと、バンドパスフィルタ２６ｃ１，２６ｃ２と、光電子増倍管等の光電変換器（受光素子）２７ａ,２７ｂと、を有する。
レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光を光電変換器２７ａ，２７ｂの受光面に集束させるように構成されている。
ダイクロイックミラー２６ｂは、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ１，２６ｃ２でフィルタリングして光電変換器２７ａ，２７ｂで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー２６ｂの反射波長帯域およびバンドパスフィルタ２６ｃ１，２６ｃ２の透過波長帯域が設定されている。
【００２６】
バンドパスフィルタ２６ｃ１，２６ｃ２は、各光電変換器２７ａ，２７ｂの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、蛍光蛋白Ｘの発する蛍光に対応して設定されている。波長帯域は、例えばレーザ光源部２２から出射した４０８ｎｍのレーザ光Ｌの照射によって蛍光蛋白Ｘが発する蛍光を主に受光するための４９４ｎｍ〜５３５ｎｍの第１の波長帯域ＦＬ1である。また、４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの第２の波長帯域ＦＬbである。第１の波長帯域ＦＬ1は、レーザ光Ｌで照射された試料１２のうち、蛍光蛋白Ｘの発する蛍光の蛍光強度が、細胞やバッファー液自体が発する自家蛍光の蛍光強度に比べて高くなるように、蛍光蛋白Ｘに対応して設定されている。同様に、第２の波長帯域ＦＬbは、レーザ光Ｌで照射された試料１２のうち、自家蛍光の蛍光強度が、蛍光蛋白Ｘが発する蛍光の蛍光強度に比べて高くなるように設定されている。なお、第２の波長帯域ＦＬbは、後述するように自家蛍光の蛍光データを効果的に除去するために、蛍光蛋白Ｘが発する蛍光の持つ波長の範囲から外れた領域に設定されることが好ましい。
図４には、一例として、蛍光蛋白Ｘの発する蛍光のスペクトラムＳと、レーザ光Ｌの波長４０８ｎｍと、第１の波長帯域ＦＬ1と、第２の波長帯域ＦＬbと、を示している。
【００２７】
自家蛍光は、極めて幅の広いブロードなスペクトル分布を成しており、第１の波長帯域ＦＬ1および第２の波長帯域ＦＬbにも分布している。したがって、第１の波長帯域ＦＬ1では、蛍光蛋白Ｘの発する蛍光と自家蛍光が受光される。一方、蛍光蛋白Ｘの発する蛍光は、自家蛍光の蛍光スペクトル分布に比べてスペクトル分布が狭い。このため、波長帯域ＦＬ1で支配的となる蛍光蛋白Ｘの蛍光の蛍光強度が、細胞やバッファー液の自家蛍光の蛍光強度に比べて小さくなる領域、あるいは、蛍光蛋白Ｘの蛍光の波長が存在しない領域が存在する。この領域が波長帯域ＦＬbとして設定の対象となる。
【００２８】
光電変換器２７ａ，２７ｂは、例えば光電子増倍管等のセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換する受光素子である。ここで、受光する蛍光は、所定の周波数で強度変調を受けたレーザ光の励起により基づくものなので、出力される蛍光信号も所定の周波数で強度が変動する信号となる。この蛍光信号は、制御・処理部２８に供給される。
【００２９】
制御・処理部２８は、図５に示すように、信号生成部４０と、信号処理部４２と、制御部であるシステムコントローラ４４と、を有する。
信号生成部４０は、レーザ光Ｌの強度を所定の周波数ｆで変調するための変調信号を生成する。
具体的には、信号生成部４０は、発振器４６、パワースプリッタ４８及びアンプ５０，５２を有する。信号生成部４０は、生成されパワースプリッタ４８で分割された変調信号をアンプ５０で増幅した後、レーザ光源部２２のレーザドライバ３４に供給するとともに、パワースプリッタ４８で分割されアンプ５２で増幅した変調信号を信号処理部４２に供給する。信号処理部４２に変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換機２７ａ，２７ｂから出力される蛍光信号を検波するための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、所定の周波数の信号であり、１０〜２００ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。発振器４６は、周波数ｆの信号を発振し変調信号を生成する。
【００３０】
信号処理部４２は、光電変換器２７ａ，２７ｂから出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射により蛍光蛋白Ｘが発する蛍光の蛍光データと細胞等の発する自家蛍光の蛍光データを抽出する。アンプ５４ａ，５４ｂ，６４と、パワースプリッタ５６と、ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂと、ローパスフィルタ６２と、を有する。
【００３１】
アンプ５４ａ，５４ｂは、光電変換器２７ａ，２７ｂから出力される蛍光信号を増幅する。ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂは、増幅された蛍光信号のそれぞれを信号生成部４０から供給された正弦波信号である変調信号を参照信号として、蛍光信号とミキシングする。
パワースプリッタ５６は、信号生成部４０から供給された変調信号を２分割し、ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂに分配する。
【００３２】
ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂは、光電変換器２７ａ，２７ｂから供給される蛍光信号を、信号生成部４０から供給される変調信号を参照信号としてミキシングするデバイスである。具体的には、ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂのそれぞれは、参照信号を蛍光信号（ＲＦ信号）と乗算して、蛍光信号の、変調信号と同相の成分を含む信号と、蛍光信号の、変調信号に対して９０度位相のシフトした成分を含む信号とを生成する。同相の成分を含む信号は、変調信号と蛍光信号をミキシングすることにより生成され、９０度位相のシフトした成分を含む信号は、９０度位相のシフトした変調信号と蛍光信号をミキシングすることにより生成される。
【００３３】
ローパスフィルタ６２は、ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂで生成された信号の低周波信号をろ過する部分である。このろ過により、蛍光信号の、変調信号と同相の成分（Ｒｅ成分）と、蛍光信号の、変調信号に対して９０度位相のシフトした成分（Ｉｍ成分）が、蛍光データとして取り出される。取り出されたＲｅ成分およびＩｍ成分は、アンプ６４で増幅された後、分析装置８０に送られる。Ｒｅ成分およびＩｍ成分は、光電変換器２７ａ，２７ｂに設定された第１の波長帯域、第２の波長帯域毎に得られるので、第１の波長帯域のＲｅ成分およびＩｍ成分の組と、第２の波長帯域のＲｅ成分およびＩｍ成分の組とが分析装置８０に送られる。
【００３４】
システムコントローラ４４は、信号生成部４０に所定の周波数の変調信号を生成させるように制御する他、各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサイトメータ１０の全動作を管理する。
【００３５】
分析装置８０は、信号処理部４２から供給されたＲｅ成分およびＩｍ成分をＡ／Ｄ変換し、ＡＤ変換されたＲｅ成分、Ｉｍ成分から、蛍光強度を求め、さらに、蛍光のレーザ光に対する位相遅れ角度を求め、この位相遅れ角度から蛍光緩和時定数（蛍光緩和時間）を求める。分析装置８０は、具体的に、Ａ／Ｄ変換器６６と、分析部８３とを有する。分析装置８０は、ＣＰＵ８１とメモリ８２を有するコンピュータで構成され、メモリ８２に記憶されたプログラムを読み出して起動することにより、分析部８３がソフトウェアモジュールとして形成される。勿論、分析部８３の各部分を専用回路で構成することもできる。
【００３６】
図６は、分析部８３の概略の構成を示す図である。
分析部８３は、自家蛍光除去部８６と、蛍光強度算出部９０と、位相遅れ算出部９２と、蛍光緩和時間算出部９４とを有する。
【００３７】
自家蛍光除去部８６は、制御部４４から供給されたＲｅ成分、Ｉｍ成分を複素表示で表した蛍光データを用いて、第１の波長帯域ＦＬ１および第２の波長帯域ＦＬbにおける蛍光の情報から、試料１２中の細胞やバッファー液が自ら発する自家蛍光の情報を除去する部分である。具体的には、生成した第２の波長帯域ＦＬbの蛍光データに、予め設定された第１の定数（複素数）を乗算し、この乗算結果を、第１の波長帯域ＦＬ１の蛍光データから減算することにより、第１の波長帯域ＦＬ１の蛍光データから自家蛍光の蛍光データを除去する。
【００３８】
ここで、第１の定数は、蛍光蛋白Ｘが付着していない細胞について、光源部２２と受光部２４と制御・処理部２８とを用いて得られる。この第１の定数は、上記細胞の発する自家蛍光の第１の波長帯域ＦＬ1における蛍光データを、上記細胞の発する自家蛍光の第２の波長帯域ＦＬbにおける蛍光データで除算して得られる比の値である。
【００３９】
例えば、自家蛍光の第１の波長帯域ＦＬ１における蛍光データを複素数表示でａ1ｅiθ1とし、自家蛍光ＦＬbの第２の波長帯域における蛍光データを複素数表示でａbｅiθbとしたとき、上記第１の定数は、ａ1／ａb・ｅi(θ1-θb)となる。
また、試料１２を計測したとき求められる第２の波長帯域ＦＬbにおける蛍光データを複素数表示でＡbｅiΘbとし、第１の波長帯域ＦＬ１における蛍光データを複素数表示でＡ1ｅiΘ1とする。このとき、Ａ1ｅiθ1−ａ1／ａb・ｅi(θ1-θb)・ＡbｅiΘbが計算される。この計算結果が第１の波長帯域ＦＬ１の蛍光データから自家蛍光の蛍光データが除去された蛍光データとなる。
このように、試料１２の測定で得られる第２の波長帯域ＦＬbの蛍光データに第１の定数を乗算して、ａ1／ａb・ｅi(θ1-θb)・ＡbｅiΘbを得ることで、第１の波長帯域ＦＬ1に含まれる自家蛍光の蛍光データを推定することができる。この第１の定数は、分析装置８０のメモリ８４に記憶されている。
【００４０】
図７は、自家蛍光の除去方法を説明する模式図である。図中、縦軸をＩｍ成分、横軸をＲｅ成分にとり、ベクトル表示で示している。第１の波長帯域ＦＬ1における自家蛍光の蛍光データＢ1は、第２の波長帯域ＦＬbにおける蛍光データに第１の定数を乗算して得られたものである。この蛍光データＢ1を、計測により得られた第１の波長帯域ＦＬ1の蛍光データＡ1’から差し引くことで、図中点線で表される求めるべき蛍光データＡ1が算出される。
こうして、自家蛍光の蛍光データが除去された蛍光データは蛍光強度算出部９０．位相遅れ算出部９２に供給される。
【００４１】
蛍光強度算出部９０は、蛍光データＡ1について、複素数の絶対値を求めることで、蛍光強度を算出する部分である。
位相遅れ算出部９２は、蛍光データＡ1について、複素数の偏角（ｔａｎ-1（蛍光データのＩｍ成分／蛍光データのＲｅ成分)）を、位相遅れθとして算出する部分である。
蛍光緩和時間算出部９４は、位相遅れ算出部９２で算出されたθを用いて、蛍光緩和時間τをτ＝１／（２πｆ）・ｔａｎ（θ）の式にしたがって算出する部分である。ここで、ｆは、レーザ光Ｌの強度変調に用いた周波数である。蛍光緩和時間τをτ＝１／（２πｆ）・ｔａｎ（θ）の式にしたがって算出することができるのは、蛍光現象が、１次の緩和過程に沿った変化を示すからである。
算出された蛍光強度、位相遅れθおよび蛍光緩和時間τは、図示されないプリンタやディスプレイに結果情報として出力される。また、この結果情報は、試料１２が管路３０の測定点を通過する度に測定される結果として、統計処理の対象とされる。
フローサイトメータ１０は以上のように構成される。
【００４２】
次に、フローサイトメータ１０で行われる蛍光検出方法について説明する。
まず、蛍光蛋白Ｘがレーザ光Ｌを吸収し、自家蛍光に対して強い強度で蛍光するような波長を持つレーザ光Ｌを用意し、周波数ｆで強度変調して、光源部２２から出射する。
【００４３】
次に、照射光に照射された蛍光蛋白Ｘが発する蛍光に対して、蛍光蛋白Ｘの発する蛍光の蛍光強度が自家蛍光の蛍光強度に比べて高くなるように、蛍光蛋白Ｘに対応して設定された第１の波長帯域ＦＬ1を用いて受光部２６で受光するとともに、第１の波長帯域ＦＬ1と異なる第２の波長帯域ＦＬｂで細胞等の発する自家蛍光を受光する。これにより、第１の波長帯域ＦＬ1及び第２の波長帯域ＦＬｂに対応した蛍光信号を出力する。
出力した蛍光信号のそれぞれを、制御・処理部２８において、周波数ｆの変調信号とミキシングすることにより、変調信号に対する蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含む蛍光データＡ1’を生成する。さらに、第２の波長帯域ＦＬbの蛍光信号を、周波数ｆの変調信号とミキシングすることにより、変調信号に対する蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含む蛍光データＢ1’を生成する。
【００４４】
生成した蛍光データＡ1’および蛍光データＢ1’は、さらに、分析装置８０において、自家蛍光の除去処理が行われる。この処理では、蛍光データＢ1’に、上述の第１の定数（複素数）が乗算され、この乗算結果である蛍光データＢ1が、蛍光データＡ1’から減算されることにより、自家蛍光除去後の蛍光データＡ1が算出される。この蛍光データＡ1が蛍光強度算出部９０および位相遅れ算出部９２に送られ、蛍光強度および位相遅れθが算出される。さらに、算出された位相遅れθを用いて蛍光緩和時間算出部９４において蛍光緩和時間τが算出される。
【００４５】
なお、第１の定数は、細胞の発する自家蛍光の波長帯域ＦＬ1における蛍光データを、細胞の発する自家蛍光の第２の波長帯域ＦＬbにおける蛍光データで除算して得られる比の値（複素数）である。上記蛍光データは、蛍光蛋白Ｘが付着（結合）していない細胞について、フローサイトメータ１０を用いて予め得られたものである。
【００４６】
このように、本実施形態の蛍光検出装置および蛍光検出方法は、第１の蛍光の強度が第２の蛍光の強度に比べて高くなるように設定された第１の波長帯域で第１の蛍光と第２の蛍光を受光して第１の蛍光信号を生成するとともに、第１の波長帯域と異なる第２の波長帯域で第２の蛍光を受光して第２の蛍光信号を生成する。自家蛍光による蛍光データを除去するとき、試料１２の測定で得られる第２の波長帯域ＦＬbの蛍光データに第１の定数を乗算することで、第１の波長帯域ＦＬ1に含まれる自家蛍光の蛍光データを推定し、この蛍光データを除算する演算を行うだけで済むので、迅速かつ容易に自家蛍光を除去することができる。
特に、第２の蛍光を、測定対象粒子の発する、波長帯域の広いブロードなスペクトル分布を持つ自家蛍光とすることにより、第１の蛍光から迅速かつ容易に自家蛍光を除去することができる。
【００４７】
以上、本発明の蛍光検出装置および蛍光検出方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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