(57)【要約】  (a)配列表の配列番号３〜９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド (b)前記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、及び(c)前記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドのポリペプチド類から選択されかつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含有する免疫誘導剤は、癌の治療用及び／又は予防用として使用される。また、上記ポリペプチドは、癌患者の血清中に特異的に存在する抗体と反応するので、試料中の該抗体を測定すれば、生体内の癌を検出することができる。
2010005069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)ないし(c)のポリペプチド類から選択されかつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含有する免疫誘導剤。
(a)配列表の配列番号３〜９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(b)前記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(c)前記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
【請求項２】
前記(b)のポリペプチドが、前記(a)のポリペプチドと９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドである、請求項１記載の免疫誘導剤。
【請求項３】
前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号３〜９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドである、請求項１記載の免疫誘導剤。
【請求項４】
前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号３〜９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項３記載の免疫誘導剤。
【請求項５】
前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号３〜９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中のaa1-34又はaa52-75の領域内の連続する７個以上のアミノ酸から成るポリペプチド又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドである請求項３記載の免疫誘導剤。
【請求項６】
前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６又は配列番号１１７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列表の配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６又は配列番号１１７に示されるアミノ酸配列を部分配列として含み、アミノ酸残基数が８〜１２であるポリペプチドである、請求項５記載の免疫誘導剤。
【請求項７】
１又は複数の前記ポリペプチドを有効成分として含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
【請求項８】
前記ポリペプチドが抗原提示細胞の処理剤である、請求項７記載の免疫誘導剤。
【請求項９】
動物の癌の治療用及び／又は予防用である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
【請求項１０】
前記癌が、CD179ｂ遺伝子を発現する癌である、請求項９に記載の免疫誘導剤。
【請求項１１】
前記癌が乳癌、白血病又はリンパ腫である、請求項１０記載の免疫誘導剤。
【請求項１２】
免疫増強剤をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
【請求項１３】
前記免疫誘導活性を有するポリペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞。
【請求項１４】
前記免疫誘導活性を有するポリペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞。
【請求項１５】
以下の(a)ないし(c)のポリペプチド類から選択されかつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを個体に投与することを含む、免疫誘導方法。
(a)配列表の配列番号３〜９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(b)前記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(c)前記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
【請求項１６】
生体から分離された試料に対して行う方法であって、以下の(a)ないし(c)の少なくともいずれか１つのポリペプチドの発現を測定することを含む、癌の検出方法。
(a)配列表の配列番号３〜９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチドに対する抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有する、生体内で生産されるポリペプチド
(b)前記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチドに対する抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有する、生体内で生産されるポリペプチド
(c)前記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドに対する抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有する、生体内で生産されるポリペプチド
【請求項１７】
前記ポリペプチドの発現の測定は、前記試料に含まれ得る、測定すべき前記ポリペプチドに対し前記生体内で誘導された抗体を免疫測定することにより行われる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
生体から分離された試料に対して行う方法であって、癌患者由来の試料中の配列表の配列番号１または配列番号４〜９４のうち偶数の配列番号に示される塩基配列を有するコード領域を有するCD179b遺伝子の発現を調べ、健常者由来の試料中の該遺伝子の発現量と比較することを含む、癌の検出方法。
【請求項１９】
以下の(a)ないし(c)のいずれかのポリペプチドに対して生体内で誘導される抗体と抗原抗体反応するポリペプチドを含む癌検出用試薬。
(a)配列表の配列番号３〜９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(b)前記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(c)前記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療及び／又は予防剤等として有用な新規な免疫誘導剤に関する。また、本発明は、新規な癌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩によって、癌に反応する細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原類、癌抗原をコードする遺伝子類などが同定されており、抗原特異性免疫療法への期待が高まっている（非特許文献１）。【０００３】
免疫療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるペプチド、ポリペプチド又はタンパクは、正常細胞にはほとんど存在せず、癌細胞に特異的に存在していることが必要とされる。1991年、ベルギー国Ludwig研究所のBoonらは、自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたcDNA発現クローニング法によりCD8陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原MAGE1を単離した（非特許文献２）。その後、癌患者の生体内で自己の癌に反応して産生される抗体が認識する腫瘍抗原を遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定する、SEREX(serological identifications of antigens by recombinant expression cloning)法が報告され（非特許文献３；特許文献１）、この方法により、いくつかの癌抗原が単離されている（非特許文献４〜９）。さらに、その一部をターゲットにして癌免疫療法の臨床試験が開始されている。【０００４】
一方、ヒトと同様、イヌやネコにも乳腺癌、白血病、リンパ腫など多数の腫瘍が知られており、イヌやネコの疾病統計でも上位にランクされている。しかしながらイヌやネコの癌に対する有効な治療薬及び予防薬は現在のところ存在しない。大部分のイヌやネコの腫瘍は、進行して腫瘤が大きくなってから飼い主が気付くケースがほとんどで、来院して外科的手術により切除したり、人体薬（抗癌剤など）を投与しても、すでに手遅れで処置後まもなく死亡することが多い。このような現状の中で、イヌやネコに有効な癌の治療薬及び予防薬が入手可能になれば、イヌの癌に対する用途が開かれると期待される。【０００５】
また、癌は早期発見できれば治療成績が良いため、癌患者の体力的、経済的負担なく、血清や尿などを用いて簡便に検査できる癌の検出方法が求められている。血液や尿を用いた癌検出法として、最近では腫瘍マーカーなどの腫瘍生産物を測定する方法が普及してきた。腫瘍生産物とは、腫瘍に関連する抗原、酵素、特定のタンパク質、代謝産物、腫瘍遺伝子、腫瘍遺伝子生産物および腫瘍抑制遺伝子などをさし、癌胎児性抗原CEA、糖タンパク質CA19-9、CA125、前立腺特異抗原PSA、甲状腺で産生されるペプチドホルモンであるカルシトニンなどが一部の癌で腫瘍マーカーとして癌検出に活用されている（非特許文献１０）。しかし多くの癌種においては、癌検出に有用な腫瘍マーカーは存在しない。また、現在知られている腫瘍マーカーの大部分は、体液中にはごく微量（pg/mLオーダー程度）しか存在しないため、それらを検出するためには、高感度な測定法や特殊な技術が必要とされる。このような現状の中で、各種癌を簡便な操作で高感度に検出できる新規な癌検出手段が提供されれば、各種癌に対する診断用途が開かれると期待される。【０００６】
CD179bは免疫グロブリンの代替軽鎖の一部であり、B細胞の前駆細胞（プレB細胞およびプロB細胞）の膜表面に発現していることが知られている。B細胞の分化に伴い消滅し、成熟B細胞では発現しない。しかしながら、CD179bは、プレB細胞が癌化した白血病（プレB細胞性白血病）細胞において発現していることが知られている（非特許文献１０、１１）。またCD179bは、プレB細胞が癌化したリンパ腫（プレB細胞性リンパ腫）細胞においても発現しており、プレB細胞性リンパ腫の診断マーカーとして利用されうることが知られている（非特許文献１２）。しかしながら、プレB細胞性白血病細胞以外の白血病細胞、プレB細胞性リンパ腫以外のリンパ腫および乳癌細胞等において特異的に発現しているという報告はない。また、CD179bに対する免疫を増強することが癌の治療及び／又は予防に有用であることを示唆する報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第5698396号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】秋吉毅,「癌と化学療法」、1997年、第２４巻、ｐ551-519
【非特許文献２】Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647(1991)
【非特許文献３】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813(1995)
【非特許文献４】Int.J.Cancer,72:965-971(1997)
【非特許文献５】Cancer Res., 58:1034-1041(1998)
【非特許文献６】Int.J.Cancer, 29:652-658(1998)
【非特許文献７】Int.J.Oncol.,14:703-708(1999)
【非特許文献８】Cancer Res., 56:4766-4772(1996)
【非特許文献９】Hum. Mol. Genet６：33-39 (1997)
【非特許文献１０】Adv. Immunol., 63:1-41(1996)
【非特許文献１１】Blood, 92:4317-4324(1998)
【非特許文献１２】Modern Pathology,17:423-429(2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、癌の治療及び／又は予防剤等として有用な新規なポリペプチドを見出し、該ポリペプチドの、免疫誘導剤への使用を提供することである。さらに本発明の目的は、癌の診断に有用な癌の検出手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、イヌの乳癌組織由来cDNAライブラリーと同一患犬の血清を用いたSEREX法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするcDNAを取得し、そのcDNAを基にして、配列表の配列番号５〜９３のうち奇数の配列番号（すなわち配列番号５、７、９、１１、１３、１５、・・・９１又は９３）で示されるアミノ酸配列を有するイヌCD179bポリペプチドを作製した。また、取得した遺伝子のヒト相同性遺伝子を基にして、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するヒトCD179bポリペプチドを作製し、同様にウシ相同性遺伝子を基にして配列番号９５で示されるアミノ酸配列を有するウシCD179bポリペプチドを作製した。そしてこれらCD179bポリペプチドが乳癌、白血病およびリンパ腫細胞に特異的に発現していることを見出した。さらにまた、これらCD179bを生体に投与することによって、生体内にCD179bに対する免疫細胞を誘導することができること、およびCD179bを発現する生体内の腫瘍を退縮させることができることを見出した。さらにまた、CD179bポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドを発現可能に含む組換えベクターが、CD179bを発現する癌に対し生体内で抗腫瘍効果を誘導することを見出した。【００１１】
さらにまた、CD179bタンパク中の部分ポリペプチドが、抗原提示細胞により提示されて、該ペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を活性化および増殖させる能力（免疫誘導活性）を有すること、このため、該ペプチドが癌の治療および／または予防に有用であり、また該ペプチドと接触した抗原提示細胞や、該抗原提示細胞と接触したＴ細胞が癌の治療および／または予防に有用であることを見出した。さらにまた、上記CD179bタンパクのアミノ酸配列を基に作製された組換えポリペプチドが、担癌生体中の血清とのみ特異的に反応することから癌を検出できることを見出した。以上のことにより、本願発明を完成させるに至った。【００１２】
したがって、本発明は、以下の特徴を有する。【００１３】
(1)以下の(a)ないし(c)のポリペプチド類から選択されかつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含有する免疫誘導剤。
(a)配列表の配列番号３〜９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(b)上記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(c)上記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド。【００１４】
(2)上記(b)のポリペプチドが、上記(a)のポリペプチドと９５％以上の配列同一性を有するポリペプチドである、上記(1)の免疫誘導剤。【００１５】
(3)上記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号３〜９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドである、上記(1)の免疫誘導剤。【００１６】
(4)上記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号３〜９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、上記(3)の免疫誘導剤。【００１７】
(5)上記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号３〜９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中のaa1-34又はaa52-75の領域内の連続する７個以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドである、上記(3)の免疫誘導剤。【００１８】
(6)上記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列表の配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６又は配列番号１１７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列表の配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６又は配列番号１１７に示されるアミノ酸配列を部分配列として含み、アミノ酸残基数が８〜１２であるポリペプチドである、上記(5)の免疫誘導剤。【００１９】
(7)１又は複数の上記ポリペプチドを有効成分として含有する、上記(1)〜(6)のいずれかの免疫誘導剤。【００２０】
(8)上記ポリペプチドが抗原提示細胞の処理剤である、上記(7)の免疫誘導剤。【００２１】
(9)動物の癌の治療用及び／又は予防用である、上記(1)〜(8)のいずれかの免疫誘導剤。【００２２】
(10)上記癌が、CD179ｂ遺伝子を発現する癌である、上記(9)の免疫誘導剤。【００２３】
(11)上記癌が乳癌、白血病又はリンパ腫である、上記(10)の免疫誘導剤。【００２４】
(12)免疫増強剤をさらに含む、上記(1)〜(11)のいずれかの免疫誘導剤。【００２５】
(13)上記免疫誘導活性を有するポリペプチドとＨＬＡ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞。【００２６】
(14)上記免疫誘導活性を有するポリペプチドとＨＬＡ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞。【００２７】
(15)以下の(a)ないし(c)のポリペプチド類から選択されかつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを個体に投与することを含む、免疫誘導方法。
(a)配列表の配列番号３〜９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(b)上記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(c)上記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド。【００２８】
(16)生体から分離された試料に対して行う方法であって、以下の(a)ないし(c)の少なくともいずれか１つのポリペプチドの発現を測定することを含む、癌の検出方法。
(a)配列表の配列番号３〜９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(b)上記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(c)上記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド。【００２９】
(17)上記ポリペプチドの発現の測定は、前記試料に含まれ得る、測定すべき上記ポリペプチドに対し上記生体内で誘導された抗体を免疫測定することにより行われる上記(16)に記載の方法。【００３０】
(18)生体から分離された試料に対して行う方法であって、癌患者由来の試料中の配列表の配列番号１または配列番号４〜９４のうち偶数の配列番号に示される塩基配列を有するコード領域を有するCD179b遺伝子の発現を調べ、健常者由来の試料中の該遺伝子の発現量と比較することを含む、癌の検出方法。【００３１】
(19)以下の(a)ないし(c)のいずれかのポリペプチドに対して生体内で誘導される抗体と抗原抗体反応するポリペプチドを含む癌検出用試薬。
(a)配列表の配列番号３〜９５のうち奇数の配列番号に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(b)上記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有し、かつ７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(c)上記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
【発明の効果】
【００３２】
本発明により、癌の治療及び／又は予防等に有用な新規な免疫誘導剤が提供される。後述の実施例において具体的に示されるように、本発明で用いられるポリペプチドを担癌動物に投与すると、該担癌動物体内において免疫細胞を誘導することができ、さらに、既に生じている癌を縮小もしくは退縮させることができる。【００３３】
また、本発明により、新規な癌の検出方法が提供される。本発明の方法により試料中の前記ポリペプチドの発現を測定すれば、眼に見えない小さいサイズの癌や体内深部の癌も検出することができるため、健康診断等における癌の早期発見にも有用である。また、癌治療後の患者の経過観察に本発明の方法を利用すれば、再発した癌を早期に検出することもできる。さらに、本発明の方法によれば、腫瘍の増大や周辺組織への浸潤、リンパ節及び遠隔臓器への癌の転移といった、癌の進行度の診断も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】CD179bタンパクをコードする遺伝子の、正常組織および腫瘍細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号１；CD179bタンパクをコードする遺伝子の発現パターン、参照番号２；ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現パターンを示す。なお、図１中、縦軸の参照番号１は、上記で同定した遺伝子の発現パターンを、参照番号２は、比較対照であるGAPDH遺伝子の発現パターンを示す。
【図２】図２中、横軸の参照番号３、４、５、６、７、８、９、１０は、それぞれ配列番号１０８、１０９、１１０、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７のペプチドをパルスしたＴ２細胞からの刺激によるHLA-A0201陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞のIFN-γ産生能を示す。参照番号１１は、配列番号１１８の陰性コントロールのペプチド（本発明の範囲外の配列であるペプチド）についての結果を示す。
【図３】図３中、横軸の参照番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９は、それぞれ配列番号１０８、１０９、１１０、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７を用いて刺激したHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞のＮａｍａｌｗａ細胞に対する細胞障害活性を示す。参照番号２０は陰性コントロールのペプチド（配列番号１１８）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を示す。
【図４】図４中、横軸の参照番号２１、２２、２３、２４、２５は、それぞれ配列番号１１０、１１１、１１２、１１５、１１６のペプチドをパルスしたＪＴＫ−ＬＣＬ細胞からの刺激によるHLA-A24陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞のIFN-γ産生能を示す。参照番号２６は、配列番号１１８の陰性コントロールのペプチドについての結果を示す。
【図５】図５中、横軸の参照番号２７、２８、２９、３０、３１は、それぞれ配列番号１１０、１１１、１１２、１１５、１１６のペプチドを用いて刺激したHLA-A24陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞のＪＴＫ−ＬＣＬ細胞に対する細胞障害活性を示す。参照番号３２は陰性コントロールのペプチド（配列番号１１８）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
＜ポリペプチド＞
本発明の免疫誘導剤に有効成分として含まれるポリペプチドとしては、以下(a)、(b)及び(c)のポリペプチド類から選択される1もしくは複数のポリペプチドが挙げられる。
(a)配列表の配列番号３〜９５のうち奇数の配列番号（すなわち、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の連続する７個以上のアミノ酸からなり、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチド
(b)上記(a)のポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有する、かつ７個以上のアミノ酸からなる、免疫誘導活性を有するポリペプチド
(c)上記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含む、免疫誘導活性を有するポリペプチド。
【００３６】
本明細書において使用される「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が多いポリペプチド分子のみならず、アミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）や、全長分子も包含され、本発明では、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５の全長からなるタンパク質も包含される。
【００３７】
本明細書において使用される「アミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸残基が特定の順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、配列番号３に示されるLeu Leu Arg Pro ・・(中略)・・ Ala Glu Cys Serのアミノ酸配列を持つ、１７６アミノ酸残基のサイズのポリペプチドを意味する。また、例えば、「配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」を「配列番号３のポリペプチド」と略記することがある。「塩基配列を有する」という表現についても同様である。
【００３８】
本明細書で使用される「免疫誘導活性」とは、生体内でインターフェロン等のサイトカインを分泌する免疫細胞を誘導する能力を意味する。
【００３９】
上記ポリペプチドが免疫誘導活性を有するか否かは、例えば公知のエリスポット(ELISPOT)アッセイ等を用いて確認することができる。具体的には、例えば後述の実施例に記載されるように、免疫誘導活性を評価すべきポリペプチドを投与した生体から末梢血単核球等の細胞を得て、該細胞を該ポリペプチドと共存培養し、該細胞からのIFN-γ、インターロイキン(IL)などのサイトカイン及び/又はケモカインの産生量を特異抗体を用いて測定することにより、該細胞中の免疫細胞数を測定することができるので、これにより免疫誘導活性を評価することができる。
【００４０】
あるいは、後述の実施例に記載されるように、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５のアミノ酸配列を基に作製した組換えポリペプチドを担癌動物に投与すると、その免疫誘導活性により腫瘍を縮小又は退縮させることもできる。よって、上記免疫誘導活性は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５のポリペプチドを発現する癌細胞の増殖を抑制し又は癌組織（腫瘍）を縮小若しくは消滅させる能力（以下、「抗腫瘍活性」という）として評価することもできる。ポリペプチドの抗腫瘍活性は、例えば後述の実施例に具体的に記載されるように、実際に該ポリペプチドを担癌動物に投与して腫瘍が縮小又は退縮されるか否かを調べることよって確認することができる。
【００４１】
あるいは、上記ポリペプチドで刺激したＴ細胞（すなわち、該ポリペプチドを提示する抗原提示細胞と接触させたＴ細胞）が、生体外で腫瘍細胞に対して細胞障害活性を示すか否かを調べることによって、ポリペプチドの抗腫瘍活性を評価することもできる。Ｔ細胞と抗原提示細胞との接触は、後述するように、両者を液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。細胞障害活性の測定は、例えばInt.J.Cancer,58:p317,1994に記載された５１Ｃｒリリースアッセイと呼ばれる公知の方法により行なうことができる。
【００４２】
上記ポリペプチドを癌の治療及び／又は予防用途に用いる場合には、特に限定されないが、抗腫瘍活性を指標として免疫誘導活性を評価することが好ましい。
【００４３】
本発明が開示する配列表の配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５にそれぞれ示されるアミノ酸配列は、イヌ乳腺癌由来cDNAライブラリーと同一患犬の血清を用いたSEREX法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチド、および該ポリペプチドのヒト相同因子（ホモログ）として単離された、CD179bのアミノ酸配列である（後述の実施例１参照）。上記(a)のポリペプチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の連続する７個以上、好ましくは連続する８、９又は１０個以上のアミノ酸からなる、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチドである。なお、この分野で公知の通り、約７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば抗原性及び免疫原性を発揮できる。従って、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５のアミノ酸配列中の連続する７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば、免疫誘導活性を有し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。
【００４４】
癌抗原ポリペプチドを投与することによる免疫誘導の原理として、ポリペプチドが抗原提示細胞に取り込まれ、その後該細胞内でペプチダーゼによる分解を受けてより小さな断片となり、該細胞の表面上に提示され、それを細胞障害性Ｔ細胞等が認識し、その抗原を提示している細胞を選択的に殺していくということが知られている。抗原提示細胞の表面上に提示されるポリペプチドのサイズは比較的小さく、アミノ酸数で７〜３０程度である。従って、抗原提示細胞上に提示させるという観点からは、上記(a)のポリペプチドとしては、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５で示されるアミノ酸配列中の連続する７〜３０程度であることが好ましい態様のひとつであり、より好ましくは８〜３０もしくは９〜３０程度のアミノ酸からなるものであれば十分である。これら比較的小さなサイズのポリペプチドは、抗原提示細胞内に取り込まれることなく、直接抗原提示細胞上の細胞表面に提示される場合もある。
【００４５】
また、抗原提示細胞に取り込まれたポリペプチドは、該細胞内のペプチダーゼによりランダムな位置で切断を受けて、種々のポリペプチド断片が生じ、これらのポリペプチド断片が抗原提示細胞表面上に提示されるので、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５の全長領域のように大きなサイズのポリペプチドを投与すれば、抗原提示細胞内での分解によって、抗原提示細胞を介する免疫誘導に有効なポリペプチド断片が必然的に生じる。従って、抗原提示細胞を介する免疫誘導にとっても、サイズの大きなポリペプチドを用いることができ、アミノ酸数を３０以上、さらに好ましくは１００以上、さらに好ましくは２００以上、さらに好ましくは配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５の全長領域のポリペプチドとしてもよい。
【００４６】
さらに、本発明のポリペプチドは、HLAの各型の結合モチーフを有する８〜１２個、好ましくは９〜１０個のアミノ酸からなるエピトープペプチドを検索しうる照合媒体、例えばBioinformatics & Molecular Analysis Selection (BIMAS)のHLA Peptide Binding Predictions (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html)によって照合し、エピトープペプチドとなりうるペプチドをスクリーニングすることができる。具体的には、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５で示されるアミノ酸配列中のaa1-34又はaa52-75の領域内の連続する７個以上のアミノ酸から成るポリペプチドが好ましく、さらに配列番号３のポリペプチドにおいては、配列番号１０８〜１１７で示されるポリペプチドがより好ましい。
【００４７】
上記(b)のポリペプチドは、上記(a)のポリペプチドのうちの少数のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加及び／又は挿入されたポリペプチドであって、元の配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、９９％以上、又は99.5％以上の配列同一性を有し、かつ、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換、欠失、付加又は挿入された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性又は免疫原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。従って、上記(b)のポリペプチドも免疫誘導活性を発揮し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。また、上記(b)のポリペプチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５で示されるアミノ酸配列のうち、１個ないし数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたポリペプチドであることも好ましい。
【００４８】
本明細書中、アミノ酸配列又は塩基配列に関する「配列同一性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列（又は塩基配列）のアミノ酸残基（又は塩基）ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列（又は塩基配列）を整列させ、一致したアミノ酸残基数（又は一致した塩基数）を全アミノ酸残基数（又は全塩基数）で除したものを百分率(%)で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばBLAST、FASTA、CLUSTAL W等の周知のプログラムを用いて行なうことができる(Karlin及びAltschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:2264-2268, 1993; Altschulら, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997)。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数（又は全塩基数）は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基（又は塩基）として数えた残基数（又は塩基数）となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数（又は全塩基数）が、比較する２つの配列間で異なる場合には、同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数（又は全塩基数）で、一致したアミノ酸残基数（又は塩基数）を除して算出される。
【００４９】
アミノ酸残基の置換において、好ましい置換は保存的アミノ酸置換である。天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp, His)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換、すなわち保存的置換、であればポリペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、本発明の上記(a)のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、免疫誘導活性を維持できる可能性が高くなる。
【００５０】
上記(c)のポリペプチドは、上記(a)又は(b)のポリペプチドを部分配列として含み、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチドである。すなわち、上記(a)又は(b)のポリペプチドの一端又は両端に他のアミノ酸又はポリペプチドが付加されたものであって、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドも、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる
上記のポリペプチドは、例えば、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t―ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。
【００５１】
上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号４の塩基配列を有するDNAは、イヌ染色体DNA又はcDNAライブラリーを鋳型として使用し、配列番号４に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてPCRを行うことにより調製することができる。配列番号１の塩基配列を有するDNAであれば、上記鋳型としてヒト染色体DNA又はcDNAライブラリーを使用することで同様に調製できる。PCRの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応行程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。PCRの手法、条件等については、例えばAusubelら, Short Protocols in Molecular Biology, 第3版, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons（特に第15章）に記載されている。また、本明細書中の配列表の配列番号１〜９５に示される塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてヒト、イヌやウシなどのcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のDNAを単離することができる。cDNAライブラリーは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。上記したプローブ又はプライマーの調製、cDNAライブラリーの構築、cDNAライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning, 第２版, Current Protocols in Molecular Biology (1989年)、Ausubelら（上記）等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたDNAから、上記(a)のポリペプチドをコードするDNAを得ることができる。また、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。従って、上記した(b)のポリペプチドや(c)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列も容易に特定することができるので、そのようなポリヌクレオチドも、市販の核酸合成機を用いて常法により容易に合成することができる。
【００５２】
上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞COS 1、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO、ヒト胎児腎臓細胞株HEK293、マウス胎仔皮膚細胞株NIH3T3、等の哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、マルチクローニングサイト、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、栄養相補遺伝子、等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、pUC系、pBluescriptII、pET発現システム、pGEX発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするDNAをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、上記DNAがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)など）との融合タンパク質として発現させることもできる。
【００５４】
宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（A）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBVベクター、pRS、pcDNA3、pMSG、pYES2等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするDNAをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、上記DNAがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてpIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C1等を用いた場合には、Hisタグ（例えば(His)6〜(His)10）、FLAGタグ、mycタグ、HAタグ、GFPなど各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。
【００５５】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション等の周知の方法を用いることができる。
【００５６】
宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
以上の方法によって得られるポリペプチドには、上述した通り、他の任意のタンパク質との融合タンパク質の形態にあるものも含まれる。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）やHisタグとの融合タンパク質などが例示できる。このような融合タンパク質の形態のポリペプチドも、上記 (c)のポリペプチドとして本発明の範囲に含まれる。さらに、形質転換細胞で発現されたポリペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。このような翻訳後修飾されたポリペプチドも、免疫誘導活性を有する限り、本発明の範囲に含まれる。この様な翻訳修飾としては、N末端メチオニンの脱離、N末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
【００５８】
＜免疫誘導剤＞
後述の実施例に具体的に記載される通り、上記した免疫誘導活性を有するポリペプチドを担癌動物に投与すると、既に生じている腫瘍を縮小又は退縮させることができる。従って、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療用及び／又は予防用として用いることができる。
【００５９】
本明細書で使用される「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。
【００６０】
この場合、対象となる癌としては、CD179b遺伝子を発現している癌、例えば配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５のポリペプチドをコードする遺伝子を発現している癌であり、好ましくは、乳癌、白血病及びリンパ腫である。これらの特定の癌には、例えば、乳癌（乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌等）、白血病（慢性型リンパ球性白血病等）、リンパ腫（消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫等）等が包含されるが、これらに限定されない。
【００６１】
上記のポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を免疫誘導のための治療方法として用いることができる。また動物の癌の治療及び／又は予防を目的とした治療方法としても用いることができ、免疫増強剤をさらに含む治療方法としても用いることができる。
【００６２】
また、対象となる動物は、哺乳動物であり、例えば霊長類、ペット動物、家畜類、競技用動物などを含む哺乳動物であり、ヒト、イヌおよびネコが好ましい。
【００６３】
本発明の免疫誘導剤の生体への投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。癌の治療目的で該免疫誘導剤を用いる場合には、抗癌作用を高めるため、後述の実施例に記載するように、治療対象となる腫瘍の近傍の所属リンパ節に投与することもできる。投与量は、免疫誘導するのに有効な量であればよく、例えば癌の治療及び／又は予防に用いるのであれば、癌の治療及び／又は予防に有効な量であればよいし、また、動物の体重、性別（雄又は雌）、症状などに応じて変化させうる。癌の治療及び／又は予防に有効な量は、腫瘍の大きさや症状等に応じて適宜選択されるが、通常、対象動物に対し１日当りの有効量として0.0001μｇ〜1000μｇ、好ましくは0.001μｇ〜1000μｇであり、１回又は数回に分けて投与することができる。好ましくは、数回に分け、数日ないし数月おきに投与する。
【００６４】
後述の実施例に具体的に示されるとおり、本発明の免疫誘導剤は、既に形成されている腫瘍を縮小又は退縮させることができる。従って、発生初期の少数の癌細胞にも抗癌作用を発揮し得るので、癌の発症前や癌の治療後に用いれば、癌の発症や再発を防止することができる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療と予防の双方に有用である。
【００６５】
本発明の免疫誘導剤は、ポリペプチドのみから成っていてもよいし、各投与形態に適した、薬理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤等の添加剤を適宜混合させて製剤することもできる。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。添加剤の具体例としては、生理緩衝液のような希釈剤；砂糖、乳糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等のような賦形剤；シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、ポリビニルクロリド、トラガント等のような結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ等の滑沢剤等が挙げられるが、これらに限定されない。製剤形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などの非経口剤などを挙げることができる。これらの製剤は一般的に知られている製法によって作ることができる。
【００６６】
本発明の免疫誘導剤は、生体内での免疫学的応答を強化することができる免疫増強剤と組み合わせて用いることができる。免疫増強剤は、本発明の免疫誘導剤に含まれていてもよいし、別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与してもよい。
【００６７】
ここで、患者は、動物、特に哺乳動物であり、好ましくはヒト、イヌ及びネコである。
【００６８】
上記免疫増強剤としては、例えばアジュバントを挙げることができる。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外またはマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得るので、抗癌作用を高めることができる。従って、特に、本発明の免疫誘導剤を癌の治療及び／又は予防に用いる場合、免疫誘導剤は、有効成分たる上記ポリペプチドに加えてさらにアジュバントを含むことが好ましい。多数の種類のアジュバントが当業界で周知であり、いずれのアジュバントでも用いることができる。アジュバントの具体例としては、ＭＰＬ（SmithKline Beecham）、サルモネラ属のSalmonella minnesota Re 595リポ多糖類の精製および酸加水分解後に得られる同類物；ＱＳ２１（SmithKline Beecham）、Quillja saponaria抽出物から精製される純ＱＡ−２１サポニン；ＰＣＴ出願WO96/33739（SmithKline Beecham）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８およびＱＳ−Ｌ１（Soら、Molecules and Cells、1997、第7巻、p.178-186）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；ビタミンＥ；モンタニド；ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、Kreigら、Nature、第374巻、p.546-549）；ポリＩＣ及びその誘導体（ポリＩＣＬＣ等）ならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルション、などが挙げられる。なかでも、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体並びにＣｐＧオリゴヌクレオチドが好ましい。上記アジュバントとポリペプチドの混合比は、典型的には約１：１０〜１０：１，好ましくは約１：５〜５：１、さらに好ましくは約１：１である。ただし、アジュバントは上記例示に限定されず、当業界で公知の上記以外のアジュバントも本発明の免疫誘導剤を投与する際に用いられ得る（例えば、Goding著, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice、第2版、1986年）。ポリペプチドおよびアジュバントの混合物またはエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。
【００６９】
また、上記免疫増強剤としては、上記アジュバント以外にも、対象の免疫応答を刺激する因子を用いることもできる。例えば、リンパ球や抗原提示細胞を刺激する特性を有する各種サイトカインを免疫増強剤として本発明の免疫誘導剤と組み合わせて用いることができる。そのような免疫学的応答を増強可能な多数のサイトカインが当業者に公知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγおよびＦｌｔ３リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。このような因子も上記免疫増強剤として用いることができ、本発明の免疫誘導剤に含ませて又は別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与することができる。
【００７０】
＜抗原提示細胞＞
下記実施例において具体的に記載されるように、本発明で用いられる上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドを抗原提示細胞に提示させることができる。すなわち、上記した(a)ないし(c)のポリペプチドは、抗原提示細胞の処理剤として利用し得る。ここで、抗原提示細胞としては、樹状細胞、Ｂ細胞及びマクロファージが例示され、ＭＨＣクラスI分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞を好ましく用いることができる。また、処理剤とは、抗原提示細胞をパルスする薬剤を指し、パルスされた抗原提示細胞は、末梢血リンパ球を刺激する能力をもつことができるので、ワクチンとして使用しうる。
【００７１】
種々のＭＨＣクラスI分子が同定されており、周知である。ヒトにおけるＭＨＣ分子はＨＬＡと呼ぶ。ＨＬＡクラスI分子としては、HLA-A、HLA-B、HLA-Cを挙げることができ、より具体的には、HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602などを挙げることができる。
【００７２】
ＭＨＣクラスI分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞は、周知の方法により末梢血から調製することができる。例えば、骨髄、臍帯血あるいは患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）とIL-3（あるいはIL-4）を用いて樹状細胞を誘導し、その培養系に腫瘍関連ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。
【００７３】
この樹状細胞を有効量投与することで、癌の治療に望ましい応答を誘導できる。用いる細胞としては、健康人から提供された骨髄や臍帯血、患者本人の骨髄や末梢血等を用いることができるが、患者本来の自家細胞を使う場合は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。末梢血または骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やＣＤ４陽性細胞等が含まれている。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で10〜1000ng/mL程度が好ましく、さらに好ましくは20〜500ng/mL程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒトの体温である37℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、5％CO2を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常3日〜2週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。
【００７４】
上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをインビトロで接触させる方法自体は、周知の方法により行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を、上記ポリペプチドを含む培養液中で培養することにより行なうことができる。培地中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常、１μg/mlないし100μg/ml程度、好ましくは5μg/mlないし20μg/ml程度である。培養時の細胞密度は特に限定されないが、通常、10３細胞/mlから107細胞/ml程度、好ましくは5x10４細胞/mlから５x106細胞/ml程度である。培養は、常法に従い、３７℃、５％CO2雰囲気中で行なうことが好ましい。なお、抗原提示細胞が表面上に提示できるペプチドの長さは、通常、最大で３０アミノ酸残基程度である。従って、特に限定されないが、抗原提示細胞とポリペプチドをインビトロで接触させる場合、該ポリペプチドをおよそ３０アミノ酸残基以下の長さに調製してもよい。
【００７５】
上記したポリペプチドの共存下において抗原提示細胞を培養することにより、ペプチドが抗原提示細胞のＭＨＣ分子に取り込まれ、抗原提示細胞の表面に提示される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞を調製することができる。このような抗原提示細胞は、生体内又はインビトロにおいて、Ｔ細胞に対して該ポリペプチドを提示し、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。
【００７６】
上記のようにして調製される、上記ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体とを含む抗原提示細胞を、Ｔ細胞とインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。これは、上記抗原提示細胞とＴ細胞とを液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を液体培地に懸濁して、マイクロプレートのウェル等の容器に入れ、これにＴ細胞を添加して培養することにより行なうことができる。共存培養時の抗原提示細胞とＴ細胞の混合比率は、特に限定されないが、通常、細胞数の比率で１：１〜１：１００程度、好ましくは１：５〜１：２０程度である。また、液体培地中に懸濁する抗原提示細胞の密度は、特に限定されないが、通常、１００〜１０００万細胞/ml程度、好ましくは１００００〜１００万細胞/ml程度である。共存培養は、常法に従い、３７℃、５％CO2雰囲気中で行なうことが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、通常、２日〜３週間、好ましくは４日〜２週間程度である。また、共存培養は、IL-2、IL-6、IL-7及びIL-12のようなインターロイキンの１種又は複数の存在下で行なうことが好ましい。この場合、IL-2及びIL-7の濃度は、通常、5U/mlから20U/ml程度、IL-6の濃度は通常、500U/mlから2000U/ml程度、IL-12の濃度は通常、5ng/mlから20ng/ml程度であるが、これらに限定されるものではない。ここで、「U」は活性単位を表す。上記の共存培養は、新鮮な抗原提示細胞を追加して１回ないし数回繰り返してもよい。例えば、共存培養後の培養上清を捨て、新鮮な抗原提示細胞の懸濁液を添加してさらに共存培養を行なうという操作を、１回ないし数回繰り返してもよい。各共存培養の条件は、上記と同様でよい。
【００７７】
上記の共存培養により、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞が誘導され、増殖される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞を調製することができる。
【００７８】
後述の実施例に記載される通り、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５のポリペプチドをコードする遺伝子は、乳癌細胞、白血病細胞およびリンパ腫細胞に特異的に発現している。従って、これらの癌種においては、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５のポリペプチドが正常細胞よりも有意に多く存在していると考えられる。癌細胞内に存在するポリペプチドの一部が癌細胞表面上のＭＨＣ分子に提示され、上記のようにして調製した細胞障害性Ｔ細胞が生体内に投与されると、これを目印として細胞障害性Ｔ細胞が癌細胞を障害することができる。また、上記ポリペプチドを提示する抗原提示細胞は、生体内においても該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができるので、該抗原提示細胞を生体内に投与することによっても、癌細胞を障害することができる。すなわち、上記ポリペプチドを用いて調製された上記細胞障害性Ｔ細胞や上記抗原提示細胞もまた、本発明の免疫誘導剤と同様に、癌の治療及び／又は予防剤として有用である。
【００７９】
上記した単離抗原提示細胞や単離Ｔ細胞を生体に投与する場合には、これらの細胞を異物として攻撃する生体内での免疫応答を回避するために、治療を受ける患者から採取した抗原提示細胞又はＴ細胞を、上記のように上記(a)ないし(c)のポリペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。
【００８０】
抗原提示細胞又は単離Ｔ細胞を有効成分として含む癌の治療及び／又は予防剤の投与経路は、静脈内投与や動脈内投与のような非経口投与が好ましい。また、投与量は、症状や投与目的等に応じて適宜選択されるが、通常1個〜10兆個、好ましくは100万個〜10億個であり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。製剤は、例えば、細胞を生理緩衝食塩水に懸濁したもの等であってよく、他の抗癌剤やサイトカイン等と併用することもできる。また、製剤分野において周知の１又は２以上の添加剤を添加することもできる。
【００８１】
＜遺伝子ワクチン＞
また、上記(a)ないし(c)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象動物の体内で発現させることによっても、該生体内で抗体生産や細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができ、ポリペプチドを投与するのと同等の効果が得られる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、上記の(a)、(b)及び(c)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含むものであってもよい。このような、抗原ポリペプチドを発現可能な組換えベクターは、遺伝子ワクチンとも呼ばれる。
【００８２】
遺伝子ワクチンを製造するために用いるベクターは、対象動物細胞内（好ましくは哺乳動物細胞内）で発現可能なベクターであれば特に限定されず、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、遺伝子ワクチンの分野で公知のいかなるベクターを用いてもよい。なお、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡ等のポリヌクレオチドは、上述した通り、常法により容易に調製することができる。また、ベクターへの該ポリヌクレオチドの組み込みは、当業者に周知の方法を用いて行なうことができる。
【００８３】
遺伝子ワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重１ｋｇ当たり、遺伝子ワクチンの重量で0.1μg〜100mg程度、好ましくは1μg〜10mg程度である。
【００８４】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込み、これを対象動物に感染させる方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
【００８５】
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００８６】
本発明で用いられる上記ポリペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するin vivo方法、および対象動物からある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo方法がある（日経サイエンス，１９９４年４月，ｐ２０−４５、月刊薬事，１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３−４８、実験医学増刊，１９９４年，第１２巻，第１５号、およびこれらの引用文献等）。in vivo方法がより好ましい。
【００８７】
in vivo方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができるし、あるいは、腫瘍の存在する患部に直接投与することもできる。in vivo方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には、有効成分である本発明の上記ペプチドをコードするＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、該ＤＮＡを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【００８８】
なお、本発明において、「配列番号１に示される塩基配列」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列の他、これと相補的な配列も包含する。従って、「配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、その相補的な塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、及びこれらから成る二本鎖ポリヌクレオチドが包含される。本発明で用いられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製する場合には、適宜いずれかの塩基配列を選択することとなるが、当業者であれば容易にその選択をすることができる。
【００８９】
＜癌の検出＞
本発明の癌を検出する方法として、生体から分離された試料を用いて、本発明で用いられるポリペプチドの発現を測定する。上記試料を用いてポリペプチドの発現を測定する方法としては、試料中に含まれる該ポリペプチドに対する抗体を免疫測定する方法（第１の方法）、試料中に含まれる該ポリペプチド自体を免疫測定する方法（第２の方法）、及び試料中に含まれる該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを測定する方法（第３の方法）が挙げられる。本発明の方法では、これらのいずれの方法でポリペプチドの発現を測定してもよい。なお、本発明において、「測定」という語には、検出、定量及び半定量のいずれもが包含される。
【００９０】
ここで、CD179bはイヌ乳癌由来cDNAライブラリーと同一患犬の血清を用いたSEREX法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体（癌特異的抗体）と結合するポリペプチドとして同定されたものである（実施例１参照）。すなわち、担癌犬生体ではCD179bに対する抗体が特異的に誘導されている。従って、担癌生体内のCD179bに対する抗体を測定することで、CD179bを発現する癌を検出することもできる（実施例７参照）。また、上記第２の方法により抗原たるCD179bを測定することでも、イヌの癌を検出できる。また、下記実施例に記載される通り、該抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは癌、特に乳癌および白血病細胞において正常組織よりも有意に高発現しているため（実施例１参照）、該ｍＲＮＡを測定することによっても、イヌの癌を検出することができる。なお、前述のように、CD179bは、B細胞の前駆細胞（プレB細胞）の膜表面に発現していることが知られており、従ってプレB細胞が癌化した白血病（プレB細胞性白血病）細胞において発現していることが報告されているが、プレB細胞性白血病細胞以外の白血病細胞および乳癌細胞において発現しているという事実が本発明で初めて見出された。これにより、CD179bの発現を調べることで、プレB細胞性白血病細胞以外の白血病やリンパ腫および乳癌の検出が可能になった。
【００９１】
上記第１の方法において、試料中に存在し得る上記癌特異的抗体の測定は、該抗体と抗原抗体反応する抗原物質を用いた免疫測定により容易に行うことができる。免疫測定法自体は下記に詳述するとおり周知の常法である。免疫測定の抗原物質として、上記(a)ないし(c)のポリペプチドを用いることができる。また、抗体には交叉反応性があり、実際に免疫原となった抗原物質以外の分子であっても、分子上に免疫原のエピトープと類似した構造が存在すれば、その分子は免疫原に対して誘導された抗体と抗原抗体反応により結合し得る。例えば、アミノ酸配列の相同性が高いポリペプチド同士では、エピトープの構造も類似している場合が多く、その場合には両者は同一の抗原性を示し得る。下記実施例に具体的に記載される通り、配列番号３のヒト由来ポリペプチドは、担癌イヌ体内で誘導された上記抗体と抗原抗体反応する。従って、本発明の第１の方法では、免疫測定の抗原として、いずれの哺乳動物由来の相同因子を用いることもできる。
【００９２】
通常、タンパク質等のような、複雑な構造をとる分子量の大きい抗原物質の場合、分子上に構造の異なる複数の部位が存在している。従って、生体内では、そのような抗原物質に対し、複数の部位をそれぞれ認識して結合する複数種類の抗体が生産される。すなわち、生体内でタンパク質等の抗原物質に対して生産される抗体は、複数種類の抗体の混合物であるポリクローナル抗体である。なお、本発明において「ポリクローナル抗体」といった場合には、抗原物質を体内に含む生体由来の血清中に存在する抗体であって、該抗原物質に対して該生体内で誘導された抗体を指す。
【００９３】
試料中の抗体の測定は、上記したポリペプチドを抗原として用いた免疫測定により容易に行うことができる。免疫測定自体はこの分野において周知であり、反応様式で分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法等がある。また、標識で分類すると、放射免疫測定、蛍光免疫測定、酵素免疫測定、ビオチン免疫測定等があり、いずれの方法を用いても上記抗体の免疫測定を行うことができる。特に限定されないが、サンドイッチELISAや凝集法は、操作が簡便で大掛かりな装置等を必要としないため、本発明の方法における上記抗体の免疫測定方法として好ましく適用することができる。抗体の標識として酵素を用いる場合、酵素としては、ターンオーバー数が大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たす物であれば特段の制限はなく、通常の酵素免疫測定法に用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β―ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3´,5,5´―テトラメチルベンジシンを、また酵素としてはアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトルフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては125Iや3H等の通常ラジオイムノアッセイで用いられている物を使用することができる。蛍光色素としては、フルオロレッセンスイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられる物を使用することができる。
【００９４】
なお、これらの免疫測定法自体は周知であり、本明細書で説明する必要はないが、簡単に記載すると、例えば、サンドイッチ法では、抗原として用いる上記ポリペプチドを固相に不動化し、血清等の試料と反応させ、洗浄後、適当な二次抗体を反応させ、洗浄後、固相に結合した二次抗体を測定する。抗原ポリペプチドを固相に不動化することにより、未結合の二次抗体を容易に除去することができるため、本発明の癌の検出方法の態様として好ましい。二次抗体としては、例えば試料がイヌ由来であれば、抗イヌIgG抗体を用いることができる。二次抗体を上記に例示した標識物質で標識しておくことにより、固相に結合した二次抗体を測定することができる。こうして測定した二次抗体量が血清試料中の上記抗体量に相当する。標識物質として酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって抗体量を測定できる。標識物質として放射性同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定することができる。
【００９５】
本発明の第２の方法では、生体から得た試料中に含まれ得る、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５に示されるポリペプチドが測定される。上述した通り、癌患者においては、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５に示されるポリペプチド若しくはその相同因子と抗原抗体反応する癌特異的抗体の量が有意に多いが、このことは、癌患者体内において、該癌特異的抗体の抗原たるこれらのポリペプチド又はその相同因子の産生量が有意に多いことを示している。従って、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５に示されるポリペプチド若しくはその相同因子を測定することによっても、上記第１の方法と同様に、生体内の癌を検出することができる。
【００９６】
試料中のポリペプチドの測定は、周知の免疫測定法により容易に行なうことができる。具体的には、例えば、配列番号３〜９５のうち奇数の配列番号に示される配列から成るポリペプチド又はその相同因子と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を作製し、これを用いて免疫測定を行うことにより、試料中に存在し得る配列番号３〜９５のうち奇数の配列番号に示される配列から成るポリペプチド又はその相同因子を測定することができる。免疫測定方法自体は、上述した通り周知の常法である。
【００９７】
ここで、「抗原結合性断片」とは、抗体分子中に含まれるFab断片やF(ab´)2断片のような、抗原との結合能を有する抗体断片を意味する。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナルでもよいが、免疫測定等のためには、再現性が高いモノクローナル抗体が好ましい。ポリペプチドを免疫原とするポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製方法は周知であり、常法により容易に行うことが出来る。例えば、ポリペプチドをキーホールリンペットヘモシアン（KLH）やカゼイン等のキャリアタンパク質に結合させたものを免疫原とし、アジュバントと共に動物に免疫することにより、該ポリペプチドに対する抗体を誘起することができる。免疫した動物から採取した脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５に示されるポリペプチド又はその相同因子と結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これを増殖させて、培養上清から上記タンパク質を対応抗原とするモノクローナル抗体を得ることが出来る。なお、上記の方法は周知の常法である。
【００９８】
本発明の第３の方法では、生体から得た試料中に含まれ得る、CD179bをコードするｍＲＮＡが測定される。下記実施例に具体的に示される通り、CD179bをコードするｍＲＮＡは、癌、特に乳癌および白血病細胞において有意に高発現している。従って、試料中の該ｍＲＮＡを測定することによっても、生体内の癌を検出することができる。
【００９９】
本発明の検出方法では、上記のとおりに測定したポリペプチドの発現量に基づいて、対象生体が癌であるか否か等を判断する。癌の検出は、対象生体におけるポリペプチドの発現を測定するのみでも可能であるが、検出精度を高める観点からは、１ないし複数の健常者試料におけるポリペプチドの発現量（抗体量、ポリペプチド量又はｍＲＮＡ量）を調べて健常者基準値を取得し、対象生体の測定値を該健常者基準値と比較することが好ましい。さらに検出精度を高めたい場合には、癌を罹患していることがわかっている多数の患者から得た試料についてポリペプチド発現量を調べて癌患者基準値を取得し、対象生体の測定値を健常者基準値及び癌患者基準値の双方と比較してもよい。上記基準値は、例えば、各試料におけるポリペプチド発現量を数値化し、その平均値を算出することによって定めることができる。なお、健常者基準値と癌患者基準値は、予め多数の健常者及び癌患者についてポリペプチド発現量を調べて定めておくことができる。そのため、本発明の方法で基準値との比較を行なう場合には、予め定めた基準値を用いてもよい。
【０１００】
本発明の検出方法では、他の癌抗原や癌マーカーによる検出を組み合わせて用いてもよい。これにより、癌の検出精度をさらに高めることができる。
【０１０１】
本発明の検出方法によれば、生体内の癌を検出することができる。本発明の方法によれば眼に見えない小さいサイズの腫瘍や体内深部の腫瘍をも検出できるので、癌の早期発見に有用である。また、癌の治療後経過観察中の患者について本発明の検出方法を適用すれば、癌の再発があった場合にその癌を早期に検出することができる。
【０１０２】
また、担癌生体において、本発明で測定対象となる上記所定のポリペプチドを発現する癌細胞の数が増加すればそれだけ、該生体内における該ポリペプチド及びそのｍＲＮＡの蓄積量が増大し、血清中に上記ポリペプチドに対する抗体が多く産生される。一方、癌細胞の数が減少すればそれだけ、生体内の該ポリペプチド及びそのｍＲＮＡの蓄積量が減少し、血清中の上記ポリペプチドに対する抗体が減少する。従って、上記所定のポリペプチドの発現量が多い場合には、腫瘍の増大や癌の転移が生じている、すなわち癌の進行度が進んでいると判断することができる。
【０１０３】
また、下記実施例に示される通り、同一種類の腫瘍において、悪性型では良性型よりも有意に上記抗体量が多い。そのため、上記所定のポリペプチドの発現量が多い場合には、癌の悪性度がより高いと判断することができる。すなわち、本発明の方法によれば、癌の悪性度を検出することもできる。
【０１０４】
さらに、上記所定のポリペプチドの発現量の増減を指標として、癌の治療効果をモニタリングすることもできる。従って、癌の治療中や治療後の個体について、上記ポリペプチドの発現量を観察することで、抗癌剤の治療効果や、腫瘍摘出後の残存腫瘍有無、さらに経過観察でも転移・再発をいち早く知る手がかりが得られる。適切に治療できている場合には、ポリペプチドの発現量は治療前の担癌状態よりも低下するので、その生体に対し行なった（行なっている）治療の効果が良好であると判断することができる。ポリペプチド発現量が上昇又は維持されている場合、あるいは一旦低下した後さらに上昇が見られた場合には、治療効果が不十分と判断することができ、他の治療方法への変更や抗癌剤投与量の変更等、治療方法選択の有用な判断材料となる。
【０１０５】
本発明の癌の検出方法の対象となる癌としては、CD179bを発現している癌（ただし、プレB細胞性のものを除く）であり、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、白血病（好ましくは慢性型リンパ球性白血病、ただしプレB細胞性のものを除く）リンパ腫（好ましくは消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫、中細胞型リンパ腫または多中心型リンパ腫、ただしプレB細胞性のものを除く）などを挙げることができるが、これらに限定されない。また、本発明の方法の対象となる生体は哺乳動物であり、ヒトやイヌ、ネコが好ましい。
【０１０６】
本発明の方法に供する試料としては、血液、血清、血漿、腹水、胸水などの体液、組織、細胞が挙げられる。特に、上記第１の方法及び第２の方法においては、血清、血漿、腹水及び胸水を好ましく用いることができ、また、ｍＲＮＡを測定する上記第３の方法においては、組織試料及び細胞試料が好ましい。
【０１０７】
第１の方法で免疫測定の抗原として用いられる上記したポリペプチドは、癌検出試薬として提供することができる。該試薬は、上記ポリペプチドのみから成っていてもよく、また、該ポリペプチドの安定化等に有用な各種添加剤等を含んでいてもよい。また、該試薬は、プレートやメンブレン等の固相に固定化した状態で提供することもできる。
【０１０８】
第２の方法で配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、・・・９３又は９５に示されるポリペプチド又はその相同因子を免疫測定する際に用いられる、該ポリペプチド又はその相同因子と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片も、癌検出試薬として提供することができる。この場合の癌検出試薬も、上記抗体又は抗原結合性断片のみから成るものであってもよく、また、該抗体又は抗原結合性断片の安定化等に有用な各種添加剤等を含んでいてもよい。また、該抗体又は抗原結合性断片は、マンガンや鉄等の金属を結合させたものであってもよい。そのような金属結合抗体又は抗原結合性断片を体内に投与すると、抗原タンパク質がより多く存在する部位に該抗体又は抗原結合性断片がより多く集積するので、MRI等によって金属を測定すれば、抗原タンパク質を産生する癌細胞の存在を検出することができる。
【０１０９】
さらにまた、第３の方法でｍＲＮＡの測定に用いられる上記した癌検出用ポリヌクレオチドも、癌検出試薬として提供することができる。この場合に癌検出用試薬も、該ポリヌクレオチドのみから成るものであってもよく、また、該ポリヌクレオチドの安定化等に有用な各種添加剤等を含んでいてもよい。該試薬中に含まれる該癌検出用ポリヌクレオチドは、好ましくはプライマー又はプローブである。
【実施例】
【０１１０】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の具体例に制限されないものとする。【０１１１】
実施例１：ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパクの取得
（１）ｃＤＮＡライブラリの作製
手術により摘出したイヌの乳腺癌組織から酸−グアニジウム−フェノール−クロロフォルム法（Acid guanidium-Phenol-Chloroform法）により全ＲＮＡを抽出し、Oligotex-dT30 mRNA purification Kit（宝酒造社製）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡ  ＲＮＡを精製した。【０１１２】
この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてイヌ乳腺癌由来ｃＤＮＡファージライブラリを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリの作製にはcDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNA Synthesis Kit,ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit（STRATAGENE社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリのサイズは２．９９×１０５ｐｆｕ／ｍｌであった。【０１１３】
（２）血清によるｃＤＮＡライブラリのスクリーニング
上記作製したイヌ乳腺癌由来ｃＤＮＡファージライブラリを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに２３４０クローンとなるように宿主大腸菌（XL1-Blue MRF´）に感染させ、４２℃、３〜４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−D−チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Hybond C Extra: GE Healthecare Bio-Science社製）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（10mM Tris-HCl,150mM NaCl pH7.5）に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２〜３時間反応させた。【０１１４】
上記患犬血清としては、上記乳腺癌を摘出された同一の患犬および他の乳腺癌患犬より採取した血清計３検体をそれぞれ用いた。これらの血清は−８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ ZAP Express ファージを宿主大腸菌（XL1-BLue MRF´）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃、一晩培養した。次いで0.5M NaClを含む0.2M NaHCO3 pH8.3のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をNHS-カラム (GE Healthecare Bio-Science社製）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液・反応させ、大腸菌およびファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５００倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。【０１１５】
かかる処理血清と上記融合タンパク質をブロットしたメンブレンをＴＢＳ−Ｔ（0.05% Tween20/TBS）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５０００倍希釈を行ったヤギ抗イヌＩｇＧ（Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated: BETHYL Laboratories社製）を、室温1時間反応させ、NBT/BCIP反応液（Roche社製）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５mmのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（100mM NaCl、10mM MgClSO4、50mM Tris-HCl、0.01% ゼラチン pH7.5）５００μlに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧと反応する９２８２０個のファージクローンをスクリーニングして、４５個の陽性クローンを単離した。【０１１６】
（３）単離抗原遺伝子の相同性検索
上記方法により単離した４５個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（XL1-Blue MRF´）を吸光度OD600が１．０となるよう調製した溶液２００μlと、精製したファージ溶液２５０μlさらにExAssist helper phage (STRATAGENE社製)１μlを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍｌ添加し３７℃で２．５〜３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心を行い上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（SOLR）を吸光度OD600が１．０となるよう調製した溶液２００μlと、精製したファージ溶液１０μlを混合した後３７℃で１５分間反応させ、５０μlをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃一晩培養した。トランスフォームしたSOLRのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地３７℃にて培養後、QIAGEN plasmid Miniprep Kit(キアゲン社製）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。【０１１７】
精製したプラスミドは、配列番号９６に記載のＴ３プライマーと配列番号９７に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号４〜９２の偶数番号に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列（配列番号５〜９３の奇数番号）を用いて、相同性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を行い既知遺伝子との相同性検索を行った結果、得られた４５個全ての遺伝子がCD179bをコードする遺伝子であることが判明した。４５個の遺伝子間の相同性は、塩基配列９４〜９９％、アミノ酸配列９６〜９９％であった。この遺伝子のヒト相同因子をコードする遺伝子との相同性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列６２〜８２％、アミノ酸配列６９〜８０％であった。ヒト相同因子の塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２及び３に示す。また、この遺伝子のウシ相同因子をコードする遺伝子との相同性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列６８〜８２％、アミノ酸配列５６−７７％であった。ウシ相同因子の塩基配列を配列番号９４に、アミノ酸配列を配列番号９５に示す。なお、ヒト相同因子をコードする遺伝子とウシ相同因子をコードする遺伝子との相同性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列６２％、アミノ酸配列７２％であった。【０１１８】
（４）各組織での発現解析
上記方法により得られた遺伝子に対しイヌおよびヒトの正常組織および各種細胞株における発現をRT-PCR(Reverse Transcription-PCR)法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織５０〜１００ｍｇおよび各細胞株５〜１０×１０６個の細胞からTRIZOL試薬（invitrogen社製）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてSuperscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR（invitrogen社製）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ヒト正常組織（脳、海馬、精巣、結腸、胎盤）のｃDNAは、ジーンプールｃDNA（invitrogen社製）、QUICK-Clone cDNA（クロンテック社製）およびLarge-Insert cDNA Library（クロンテック社製）を用いた。ＰＣＲ反応は、取得したイヌ遺伝子に特異的なプライマー（配列番号９８および９９に記載）及びそのヒト相同遺伝子に特異的なプライマー（配列番号１００および１０１に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル0.25μl、上記プライマーを各2μM、0.2mM各dNTP、0.65UのExTaqポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μlとし、Thermal Cycler(BIO RAD社製）を用いて、９４℃〜３０秒、６０℃〜３０秒、７２℃〜３０秒のサイクルを３０回繰り返して行った。なお、上記した配列番号９８及び９９に示す塩基配列を有する遺伝子特異的プライマーは、配列番号４の塩基配列中の３２番〜３４１番を増幅するものであり、配列番号４〜９２の偶数番号に示されるイヌCD179ｂ遺伝子全てに共通の領域を増幅するものであった。また、配列番号１００及び１０１に示す塩基配列を有する遺伝子特異的プライマーは配列番号１の塩基配列中の２１６番〜７３８番塩基の領域を増幅するものであった。比較対照のため、GAPDH特異的なプライマー（配列番号１０２および１０３に記載）も同時に用いた。その結果、図１に示すように、取得したイヌ遺伝子は、健常なイヌ組織では全く発現が見られず、一方イヌ乳癌組織で強い発現が見られた。ヒト相同遺伝子の発現では、ヒト正常組織で発現が確認できたのは骨髄のみで、ヒト癌細胞では白血病細胞株および乳癌細胞株で発現が検出され、CD179bが白血病細胞株と乳癌細胞株に特異的に発現していることが確認された。【０１１９】
なお、図１中、縦軸の参照番号１は、上記で同定した遺伝子の発現パターンを、参照番号２は、比較対照であるGAPDH遺伝子の発現パターンを示す。【０１２０】
実施例２：イヌおよびヒト新規癌抗原タンパクの作製
（１）組換えタンパク質の作製
実施例１で取得した配列番号４の遺伝子を基に、以下の方法にて組換えタンパク質を作製した。PCRは、実施例１で得られたファージミド溶液より調製し配列解析に供したベクターを１μl、NdeIおよびKpnI制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号１０４および１０５に記載）を各0.4μM、0.2mM dNTP、1.25UのPrimeSTAR HSポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μlとし、Thermal Cycler (BIO RAD社製)を用いて、９８℃〜１０秒、６８℃〜４０秒のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記2種類のプライマーは、配列番号５のアミノ酸配列５番〜１２０番アミノ酸をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたDNAを２％アガロースゲルにて電気泳動し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて約３５０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。【０１２１】
精製したDNA断片をクローニングベクターpCR-Blunt（invitrogen社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをNdeIおよびKpnI制限酵素で処理し、QIAquick Gel Extraction Kitで精製後、目的遺伝子配列を、NdeI、KpnI制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターpET30b（Novagen社製）に挿入した。このベクターの使用によりHisタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ  ＩＰＴＧによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた。【０１２２】
また、配列番号１の遺伝子を基に、以下の方法にてヒト相同遺伝子の組換えタンパク質を作製した。PCRは、実施例１で作製した各種組織・細胞ｃDNAよりRT-PCR法による発現が確認できたｃDNAを１μl、EcoRIおよびSalＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号１０６および１０７に記載）を各０．４μＭ, 0.2mM dNTP，１．２５ＵのPrimeSTAR HSポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μlとし、Thermal Cycler (BIO RAD社製)を用いて、９８℃〜１０秒、６８℃〜４０秒のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記2種類のプライマーは、配列番号３のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたDNAを２％アガロースゲルにて電気泳動し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて約５４０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。【０１２３】
精製したDNA断片をクローニングベクターpCR-Blunt（invitrogen社製）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをEcoRＩおよびSalＩ制限酵素で処理し、QIAquick Gel Extraction Kitで精製後、目的遺伝子配列を、EcoRＩ、SalＩ制限酵素で処理した大腸菌用発現ベクターpET30a（Novagen社製）に挿入した。このベクターの使用によりHisタグ融合型の組換えタンパク質が産生できる。このプラスミドを発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、１ｍＭ  ＩＰＴＧによる発現誘導を行うことで目的タンパク質を大腸菌内で発現させた。【０１２４】
(２)組換えタンパク質の精製
上記で得られた、配列番号１および配列番号４を発現するそれぞれの組換え大腸菌を30μg/mL カナマイシン含有LB培地にて600nmでの吸光度が0.7付近になるまで37℃で培養後、イソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド終濃度が1 mMとなるよう添加し、30℃で20時間培養した。その後4800rpmで10分間遠心し集菌した。この菌体ペレットをリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、さらに4800rpmで10分間遠心し菌体の洗浄を行った。【０１２５】
この菌体をリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、氷上にて超音波破砕を行った。大腸菌超音波破砕液を7000rpmで20分間遠心分離し、得られた上清を可溶性画分、沈殿物を不溶性画分とした。【０１２６】
不溶性画分を4％Triton-X100溶液にて懸濁し7000rpmで20分間遠心した。本操作を2回繰り返し、脱プロテアーゼ操作を行った。【０１２７】
この残渣を6Mグアニジン塩酸塩含有20ｍMリン酸緩衝液(pH8.0)に懸濁し、4℃で20時間静置しタンパク質を変性させた。この変性操作後、7000rpmで20分間遠心して得られた可溶性画分を、定法に従って調製したニッケルキレートカラム（担体：Chelateing Sepharose(商標) Fast Flow（GE Health Care社）、カラム容量5mL、平衡化緩衝液：6Mグアニジン塩酸塩含有20mMリン酸緩衝液(pH8.0)）に添加した。未吸着画分をカラム容量の10倍量の6Mグアニジン塩酸塩含有20mMリン酸緩衝液(pH8.0)と10ｍMイミダゾール含有20mMリン酸緩衝液(pH8.0)にて洗浄操作を行った後、直ちに、4段階に分けた50mM-500mMイミダゾール段階的濃度勾配にて溶出を行い精製画分とし、以降この精製画分を投与試験用の材料とした。【０１２８】
上記方法によって得られた精製標品のうち、200μｌを１ｍｌの反応用緩衝液（20mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 2mM CaCl2 pH7.4）に分注を行った後、エンテロキナーゼ（Novagen社製）2μｌ添加した後、室温にて一晩静置・反応を行い、Hisタグを切断し、Enterokinase Cleavage Capture Kit(Novagen社製)を用いて添付プロトコールに従って精製を行った。次に、上記方法によって得られた精製標品1.2mlを、限外ろ過NANOSEP 10K OMEGA（PALL社製）を用いて、生理用リン酸緩衝液（日水製薬社製）置換した後、HTタフリンアクロディスク0.22μm（PALL社製）にて無菌ろ過を行い、これを以下の実験に用いた。【０１２９】
実施例３：組換えタンパク質の担癌患犬に対する投与試験
（１）抗腫瘍評価
表皮に腫瘤を持つ担癌患犬（乳癌）に対して、上記で精製した組換えタンパクの抗腫瘍効果の評価を行った。【０１３０】
上記の通り精製した組換えポリペプチド100μg（0.5ml）に等量の不完全フロイントアジュバント（和光純薬社製）を混合して癌治療剤を調製した。これを初回投与、３日後および７日後に腫瘍近傍の所属リンパ節に計３回投与を行った。その結果、癌治療剤投与時点で、大きさが約５５ｍｍ３であった腫瘤が、癌治療剤初回投与から１０日後には３０ｍｍ３に、２０日後には１６ｍｍ３に、３０日後には１０ｍｍ３まで縮小した。【０１３１】
また、別の乳腺癌の患犬に対して、上記イヌ由来ポリペプチド100μg（0.5ml）に、0.5mlの不完全フロイントアジュバントを混合したものを上記と同様にして計３回投与した。また同時にイヌインターロイキン１２を100μgずつ皮下投与した。その結果、癌治療剤投与時点で、大きさが約１５５ｍｍ３であった腫瘤が、癌治療剤初回投与から２４日後には完全に退縮した。【０１３２】
（２）免疫誘導能評価
上記（１）での投与試験で抗腫瘍効果が得られた患犬の血液を、癌治療剤投与前並びに初回投与から１０日後及び３０日後の各時点で採取し、常法に従って末梢血単核球を分離し、それを用いたIFNγのエリスポットアッセイ法により、投与した各組換えタンパクについて免疫誘導能の評価を行った。【０１３３】
ミリポア社製の96穴プレート（MultiScreen-IP, MAIPS4510）に70%エタノールを100μＬ/穴ずつ添加し、５分間静置し吸引除去後、滅菌水で洗浄し、200mM Sodium Bicarbonate(pH8.2)を300μＬ/穴添加し５分間静置後、吸引除去しプレートを洗浄した。次に200mM Sodium Bicarbonateに添加した抗イヌインターフェロンγモノクローナル抗体（R&D社製、clone142529, MAB781）を0.5μg/穴ずつ添加し、３７℃で一晩インキュベートし、一次抗体を固相化した。一次抗体を吸引除去後、ブロッキング溶液（1%BSA-5%スクロース-200mM Sodium Bicarbonate(pH8.2)）を300μＬ/穴ずつ添加し４℃にて一晩インキュベートしてプレートをブロッキングした。ブロッキング溶液を吸引除去後、10%牛胎児血清を含むRPMI培地（Invitrogen社製）を300μＬ/穴ずつ添加して５分間静置し培地を吸引除去した。その後、10%牛胎児血清を含むRPMI培地に懸濁した各々のイヌ末梢血単核球を5x105細胞/穴ずつプレートに添加し、これにそれぞれの投与に用いたイヌ由来ポリペプチドもしくはヒト由来ポリペプチドを10μＬ/穴ずつ添加し、３７℃、5%CO2の条件下で２４時間培養することにより、末梢血単核球中に存在し得る免疫細胞からインターフェロンγを産生させた。培養後、培地を除去し、洗浄液（0.1%Tween20-200mM Sodium Bicarbonate(pH8.2)）を用いてウエルを６回洗浄した。上記ブロッキング溶液にて1000倍に希釈したラビット抗イヌポリクローナル抗体をそれぞれのウエルに100μＬずつ添加し４℃にて一晩インキュベートした。上記洗浄液で３回ウエルを洗浄した後、上記ブロッキング溶液にて1000倍に希釈したHRP標識抗ラビット抗体をそれぞれのウエルに100μＬずつ添加し、３７℃で２時間反応させた。上記洗浄液で３回ウエルを洗浄した後、コニカイムノステイン（コニカ社製）にて発色させ、ウエルを水洗して反応を停止させた。反応停止後、メンブレンを乾燥させ、KSエリスポット（カールツァイツ社製）を用いて出現したスポット数をカウントした。その結果、ポリペプチド投与前の末梢血単核球ではスポットが検出されなかった。一方、ポリペプチドを投与後の患犬においては、投与１０日後および３０日後の末梢血単核球でそれぞれ１８個、８７個のスポットが検出された。【０１３４】
以上の結果から、投与患犬におい、投与した組換えタンパクに特異的に反応してインターフェロンγを産生する免疫細胞が誘導されていることが確認でき、これらの免疫細胞を中心とした免疫反応により、上記（１）に示す抗腫瘍効果が発揮されたものと考えられる。【０１３５】
実施例４：CD179b由来ペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導
（１）HLA-A0201とHLA-A24に結合するペプチドモチーフの予測
ヒトCD179bタンパク質のアミノ酸配列の情報をGenBankから得た。HLA-A0201とHLA-A24結合モチーフ予測のため、公知のＢＩＭＡＳソフト（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/で利用可能）を用いたコンピューター予測プログラムを用いてヒトCD179bタンパク質のアミノ酸配列を解析し、HLA-A0201分子に結合可能と予想される配列番号１０８から配列番号１１０と配列番号１１３から配列番号１１７に示すペプチド８種類と、HLA-A24分子に結合可能と予想される配列番号１１０から配列番号１１２及び配列番号１１５と配列番号１１６に示すペプチド５種類を選択した。【０１３６】
（２）ペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導
HLA-A0201陽性の健常人から末梢血を分離し、Lymphocyte separation medium（OrganonpTeknika, Durham, NC）に重層して1,500rpmで室温で２０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する画分を回収し、冷リン酸塩緩衝液中で３回（またはそれ以上）洗浄し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得た。得られたＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培地（Life Technololgies社製）２０ｍｌに懸濁し、培養フラスコ（Falcon社製）中に３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間付着させた。非付着細胞はＴ細胞調製に用い、付着細胞は樹状細胞を調製するために用いた。【０１３７】
付着細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中でＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で培養した。６日後にＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に交換してさらに２日間培養した後得られた非付着細胞集団を樹状細胞として用いた。【０１３８】
調製した樹状細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中に１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁し、上記（１）にて選択したHLA-A0201分子に結合可能と予想される配列番号１０８から配列番号１１０、配列番号１１３から配列番号１１７に示すペプチドを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、９６穴プレートを用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、Ｘ線照射（３０００ｒａｄ）し、ＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄し、１０％ヒトＡＢ血清（Nabi, Miami, FL）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞づつ添加した。さらに調製したＴ細胞集団を１穴当りそれぞれ１×１０６細胞添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。７日後、それぞれの培養上清を捨て、上記と同様にして得た各ペプチドで処理後Ｘ線照射した樹状細胞を１０％ヒトＡＢ血清（Nabi, Miami, FL）、ＩＬ−７（１０Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）およびＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ、Genzyme, Cambridge, MA）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し（細胞密度：１×１０５細胞／ｍｌ）、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞づつ添加し、さらに培養した。同様の操作を７日間おきに４〜６回繰返した後刺激されたＴ細胞を回収し，フローサイトメトリーによりＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導を確認した。【０１３９】
HLA-A24分子に結合可能と予想される配列番号１１０、１１１、１１２、１１５、１１６に示すペプチドについても、HLA-A24陽性の健常人の末梢血から誘導した樹状細胞とＴ細胞集団を用いて上記と同様の方法にて、ペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導を試みた。【０１４０】
なお、陰性コントロールとして、本発明の範囲外の配列であるペプチド（配列番号１１８）を使用した。【０１４１】
実施例５：HLA-A0201陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激するCD179b由来細胞障害性Ｔ細胞抗原エピトープの決定
（１）IFN-γ産生能
上記で誘導したＴ細胞の内、増殖が見られたＴ細胞それぞれについて、ペプチドエピトープに対する特異性を調べるために、各ペプチドを用いてパルスした、HLA-A0201分子を発現するＴ２細胞（Salter RD et al.,Immunogenetics, 21:235-246(1985)、ＡＴＣＣより購入）（１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＩＭ−Ｖ培地中各ペプチドを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養）５×１０４個に対して、５×１０３個のＴ細胞を添加し、１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地中で９６穴プレートにて２４時間培養した。培養後の上清を取って、IFN-γの産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果、ペプチドをパルスしていないＴ２細胞を用いた穴の培養上清に比べて、配列番号１０８から配列番号１１０又は配列番号１１３から配列番号１１７のペプチドをパルスしたＴ２細胞を用いた穴の培養上清において、IFN-γ産生が確認された（図２）。この結果から、上記ペプチドは特異的にHLA-A0201陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、IFN-γ産生を誘導する能力を有するＴ細胞エピトープペプチドであることが判明した。【０１４２】
なお、図２中、横軸の参照番号３、４、５、６、７、８、９、１０は、それぞれ配列番号１０８、１０９、１１０、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７のペプチドをパルスしたＴ２細胞からの刺激によるHLA-A0201陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞のIFN-γ産生能を示す。参照番号１１は、配列番号１１８の陰性コントロールのペプチドについての結果を示す。【０１４３】
（２）細胞障害性評価
次に、本発明で用いられる配列番号１０８から配列番号１１０および配列番号１１３から配列番号１１７のペプチドが、HLA-A0201陽性でCD179bを発現する腫瘍細胞上のHLA-A0201分子上に提示されるものであるか、また本ペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞がHLA-A0201陽性でCD179bを発現する腫瘍細胞を障害することができるかを検討した。CD179bの発現が確認されているＢ細胞白血病細胞株、Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＡＴＣＣより購入）を１０６個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％ウシ胎児血清（キブコ社製）を含むＲＰＭＩ培地（キブコ社製）で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個ずつ添加し、さらにこれに後１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で懸濁された５×１０４個の各ペプチドで刺激されたHLA-A0201陽性のペプチドエピトープ反応性のＣＤ８陽性Ｔ細胞をそれぞれ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定することによって、各ペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を算出した。その結果、本ペプチドで刺激されたHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞がＮａｍａｌｗａ細胞に対する細胞障害活性を有することが判明した（図３）。陰性コントロールのペプチド（配列番号１１８）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞は、細胞障害活性を示さなかった。従って、本発明で用いられる各ペプチド（配列番号１０８から配列番号１１０ならびに配列番号１１３から配列番号１１７）は、HLA-A0201陽性でCD179bを発現する腫瘍細胞上のHLA-A0201分子上に提示されるものであり、さらに本ペプチドは、このような腫瘍細胞を障害することができるＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞を誘導する能力があることが明らかになった。【０１４４】
なお、細胞障害活性は、上記のように、本発明で用いられる各ペプチドで刺激誘導されたＣＤ８陽性Ｔ細胞１０５個とクロミウム５１を取り込ませた１０３個のＢ細胞白血病株Ｎａｍａｌｗａとを混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、以下計算式＊により算出したＣＤ８陽性Ｔ細胞のＮａｍａｌｗａ細胞に対する細胞障害活性を示した結果である。【０１４５】
＊式：細胞障害活性（％）＝ＣＤ８陽性Ｔ細胞を加えた際のＮａｍａｌｗａ細胞からのクロミウム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロミウム５１遊離量×１００。【０１４６】
なお、図３中、横軸の参照番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９は、それぞれ配列番号１０８、１０９、１１０、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７を用いて刺激したHLA-A0201陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞のＮａｍａｌｗａ細胞に対する細胞障害活性を示す。参照番号２０は陰性コントロールのペプチド（配列番号１１８）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を示す。【０１４７】
実施例６：HLA-A24陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激するCD179b由来細胞障害性Ｔ細胞抗原エピトープの決定
（１）IFN-γ産生能
実施例５（１）と同様に、実施例３（２）で誘導したペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞について、ペプチドエピトープに対する特異性を調べるために、配列番号１１０、１１１、１１２、１１５、１１６のペプチドを用いてパルスした、HLA-A24分子を発現するＪＴＫ−ＬＣＬ細胞（理化学研究所より購入）（１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＩＭ−Ｖ培地中各ペプチドを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養）５×１０４個に対して、５×１０３個の上記Ｔ細胞を添加し、１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地中で９６穴プレートにて２４時間培養した。培養後の上清を取って、IFN-γの産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果、ペプチドをパルスしていないＪＴＫ−ＬＣＬ細胞を用いた穴の培養上清に比べて、配列番号１１０、１１１、１１２、１１５、１１６のペプチドをパルスしたＪＴＫ−ＬＣＬ細胞を用いた穴の培養上清において、IFN-γ産生が確認された（図４）。この結果から、上記ペプチドは特異的にHLA-A24陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、IFN-γ産生を誘導する能力を有するＴ細胞エピトープペプチドであることが判明した。【０１４８】
なお、図４中、横軸の参照番号２１、２２、２３、２４、２５は、それぞれ配列番号１１０、１１１、１１２、１１５、１１６のペプチドをパルスしたＪＴＫ−ＬＣＬ細胞からの刺激によるHLA-A24陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞のIFN-γ産生能を示す。参照番号２６は、配列番号１１８の陰性コントロールのペプチドについての結果を示す。【０１４９】
（２）細胞障害性評価
次に、本発明で用いられる配列番号１１０、１１１、１１２、１１５、１１６のペプチドが、HLA-A24陽性でCD179bを発現する細胞上のHLA-A24分子上に提示されるものであるか、また本ペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞がHLA-A24陽性でCD179bを発現する細胞を障害することができるかを実施例５（２）と同様の方法で検討した。HLA-A24陽性でCD179bを発現するＪＴＫ−ＬＣＬ細胞を１０６個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個づつ添加し、さらにこれに１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で懸濁された５×１０４個の各ペプチドで刺激されたHLA-A24陽性のペプチドエピトープ反応性のＣＤ８陽性Ｔ細胞をそれぞれ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定することによって、各ペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を算出した。その結果、本ペプチドで刺激されたHLA-A24陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞がＪＴＫ−ＬＣＬ細胞に対する細胞障害活性を有することが判明した（図５）。従って、本実施例で用いられた各ペプチド（配列番号１１０、１１１、１１２、１１５、１１６）は、HLA-A24陽性でCD179bを発現する細胞上のHLA-A24分子上に提示されるものであり、さらに本ペプチドは、このような細胞を障害することができるＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞を誘導する能力があることが明らかになった。陰性コントロールのペプチド（配列番号１１８）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞は、細胞障害性を示さなかった。【０１５０】
なお、図５中、横軸の参照番号２７、２８、２９、３０、３１は、それぞれ配列番号１１０、１１１、１１２、１１５、１１６のペプチドを用いて刺激したHLA-A24陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞のＪＴＫ−ＬＣＬ細胞に対する細胞障害活性を示す。参照番号３２は陰性コントロールのペプチド（配列番号１１８）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を示す。【０１５１】
実施例７：組換えタンパク質を用いた癌検出
（１）イヌの癌検出
悪性腫瘍の確認された患犬153頭と健常犬264頭の血液を採取し、血清を分離した。実施例２で作製したイヌ由来癌抗原タンパク（配列番号５のアミノ酸配列中：５番〜１２０番）と抗イヌIgG抗体を用いてELISA法にて該ポリペプチドに特異的に反応する血清中のIgG抗体価を測定した。【０１５２】
作製したポリペプチドの固相化は、リン酸緩衝化生理食塩水にて100μg/mLに希釈した組換えタンパク質溶液を96穴イモビライザーアミノプレート（ヌンク社製）に100μL/well添加し、4℃で一晩静置して行った。ブロッキングは、ブロックエース粉末（ＤＳファ−マバイオメディカル株式会社製）４ｇを精製水１００ｍｌに溶解した溶液を精製水で４倍希釈したもの（以下ブロッキング溶液）を100μL/well加え、室温で1時間振とうした。希釈にブロッキング溶液を用いた1000倍希釈血清を100μL/well添加し、室温で3時間振とうして反応させた。0.05%Tween20（和光純薬工業社製）含有リン酸緩衝化生理食塩水（以下PBS-T）で3回洗浄し、ブロッキング溶液にて3000倍希釈したHRP修飾イヌIgG抗体(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated:BETHYL Laboratories社製)を100μL/well加え、室温で1時間振とうして反応させた。PBS-Tで３回洗浄し、HRP基質 TMB（1-Step  Turbo  TMB（テトラメチルベンジジン）、PIERCE社）を100μl/well添加し、室温で30分間酵素基質反応させた。その後、0.5M硫酸溶液（シグマアルドリッチジャパン社製）を100μl/well加えて反応停止後、マイクロプレートリーダーにて450nmの吸光度測定を行った。コントロールとしては、作製した組換えタンパク質を固相化しないもの、担癌犬血清を反応させないものを上記と同様に行い比較することとした。【０１５３】
上記癌検出に用いた癌種として、病理診断で悪性と確定診断がされている、乳癌112検体、リンパ腫31検体および白血病10検体を用いた。【０１５４】
これら担癌犬生体由来の血清は、有意に高い組換えタンパク質に対する抗体価を示した。本検出法による悪性判断を健常犬平均値の２倍以上とした場合、乳癌で61検体(54%)で、リンパ腫で21検体(71%)で、白血病で7検体(70%)でそれぞれ悪性と判断できることが判った。また、病理診断で良性と確定診断がされている、乳腺腫瘍患犬30頭の血清を用いて同様に検査したところ、健常犬平均値の２倍以上の値が検出された検体数は0であった。【０１５５】
同様にして、実施例２で作製したヒト由来癌抗原タンパク（配列番号３のアミノ酸配列）と抗イヌIgG抗体を用いてELISA法にて、上記各担癌犬血清サンプル中の該ポリペプチドに特異的に反応するIgG抗体価を測定したところ、乳癌で56検体(50%)で、リンパ腫で18検体(58%)で、白血病で5検体(50%)でそれぞれ悪性と判断できることが判った。【０１５６】
また、末期癌患犬より採取した胸水、腹水を用いて、上記と同様の検出を行った結果、血清を用いた本検出法による結果と同様の値を検出することができ、癌と診断することができた。【０１５７】
（２）ヒトの癌検出
上記で用いたヒト由来癌抗原タンパク（配列番号３のアミノ酸配列）と抗ヒトIgG抗体を用いて、上記と同様にして、該ポリペプチドに特異的に反応する健常人血清中のIgG抗体価を測定した。2次抗体は、HRP修飾抗ヒトIgG抗体(HRP-Goat Anti-Human IgG(H+L) Conjugate: Zymed Laboratories社製)をブロッキング溶液にて10000倍希釈して用いた。ポジティブコントロールとしてリン酸緩衝化生理食塩水にて50μg/mlに調製した卵白アルブミン抗原を固相化したものを用いた。その結果、450nmでの吸光度は、卵白アルブミン抗原に対して健常人７人の平均で0.45と高い値を示した。一方、上記ポリペプチドに対しては0と全く検出されなかった。【０１５８】
さらに、上記と同様にして、悪性乳癌を患っている患者由来の血清17検体（Promeddx社から購入）に対して、上記と同様にしてヒト由来癌抗原タンパク（配列番号３のアミノ酸配列）に特異的に反応する血清中のIgG抗体価を測定した。その結果、450nmでの吸光度は、上記ポリペプチドに対して乳癌患者１７人の平均で0.28と高い値を示した。従って、ヒトにおいても、本手法によって癌を検出できることが判った。
【産業上の利用可能性】
【０１５９】
本発明は、乳癌、白血病、リンパ腫などの癌（腫瘍）に対して抗腫瘍活性を発揮するポリペプチドを含む免疫誘導剤を提供するため、癌の治療に有用である。また、本発明は新規な癌の検出手段を提供するため、癌の診断に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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