(57)【要約】  ヒトＣＸＣＬ１タンパク質を高感度に検出することを課題とする。  ヒトＣＸＣＬ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の部分配列である配列番号１〜３で示されるアミノ酸配列のいずれか１つの配列領域を特異的に認識し、かつそれぞれ異なる配列領域を特異的に認識する２種類以上の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトＣＸＣＬ１又はその断片を測定するヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法及び、配列番号１〜３で示されるアミノ酸配列のいずれか一つの配列領域を特異的に認識する新規なアミノ酸配列を持つモノクローナル抗体又はその断片を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＸＣＬ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の部分配列である配列番号１〜３で示されるアミノ酸配列のいずれか１つの配列領域を特異的に認識し、かつそれぞれ異なる配列領域を特異的に認識する２種類以上の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトＣＸＣＬ１又はその断片を測定することを特徴とする、ヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。
【請求項２】
配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトＣＸＣＬ１タンパク質又はその断片を測定することを特徴とする、請求項１に記載のヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。
【請求項３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片及び配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトＣＸＣＬ１タンパク質又はその断片を測定することを特徴とする、請求項１又は２に記載のヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。
【請求項４】
配列番号２で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片及び配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトＣＸＣＬ１タンパク質又はその断片を測定することを特徴とする、請求項１又は２に記載のヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。
【請求項５】
前記試料が術後採取組織、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、リンパ液、涙液又は精液である、請求項１〜４のいずれかに記載のヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。
【請求項６】
前記配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識し、
軽鎖において、
ＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、
重鎖において、
ＣＤＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ２が配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ３が配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む、
抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
【請求項７】
軽鎖可変領域に配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
【請求項８】
前記配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識し、
軽鎖において、
ＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ２が配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ３が配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含み、
重鎖において、
ＣＤＲ１が配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ２が配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ３が配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む、
抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
【請求項９】
軽鎖可変領域に配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
【請求項１０】
前記配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識し、
軽鎖において、
ＣＤＲ１が配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ２が配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ３が配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含み、
重鎖において、
ＣＤＲ１が配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ２が配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ３が配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含む、
抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
【請求項１１】
軽鎖可変領域に配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
【請求項１２】
前記配列番号２で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識し、
軽鎖において、
ＣＤＲ１が配列番号２８で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ２が配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ３が配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含み、
重鎖において、
ＣＤＲ１が配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ２が配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ３が配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含む、
抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
【請求項１３】
軽鎖可変領域に配列番号３４で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号３５で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
【請求項１４】
前記配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識し、
軽鎖において、
ＣＤＲ１が配列番号３６で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ２が配列番号３７で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ３が配列番号３８で示されるアミノ酸配列を含み、
重鎖において、
ＣＤＲ１が配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ２が配列番号４０で示されるアミノ酸配列を含み、及び
ＣＤＲ３、が配列番号４１で示されるアミノ酸配列を含む、
抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
【請求項１５】
軽鎖可変領域に配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号４３で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＣＸＣＬ１タンパク質（以下、ヒトＣＸＣＬ１とする）を測定する方法に関する。より詳細には、ヒトＣＸＣＬ１を測定する方法であって、ヒトＣＸＣＬ１を構成するアミノ酸配列上の特定の３箇所の部分配列領域のいずれかに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片を組み合わせた免疫学的測定方法に関する。また、本発明は前述のヒトＣＸＣＬ１タンパク質を測定する方法に用いることができる、ヒトＣＸＣＬ１に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＣＸＣＬ１は、ＣＸＣファミリーに属するケモカインの一種である。このタンパク質は、血中では血小板に存在しており、他のＣＸＣファミリーと同様に炎症反応時に過剰発現することが知られている。【０００３】
近年、このヒトＣＸＣＬ１が腫瘍関連因子として機能することが報告された。それ故、尿中から定量的に検出することにより尿路上皮癌のマーカーとなり得ることが期待されている（非特許文献１、特許文献１）。さらに、ヒトＣＸＣＬ１は、大腸癌や、卵巣癌、悪性黒色腫などその他の悪性腫瘍患者の組織や血中において、遺伝子レベル、タンパク質レベルで変動することが報告されており（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）、尿路上皮癌のみならず、これらの癌を極早期及び／又は早期に検出し得る潜在性を秘めている。【０００４】
ところが、既存の酵素免疫学的測定法を用いた測定法では、前記癌を検出するには必要な感度が不足している。例えば、特許文献１に記載のＲ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社（以下Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社）製のヒトＣＸＣＬ１測定用キットは、その検出限界濃度が２０ｐｇ／ｍＬ前後であるのに対し、健常人尿中のヒトＣＸＣＬ１濃度はその検出限界に満たない。よって、より高感度なヒトＣＸＣＬ１の測定法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０２６８９５
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｉｒｏａｋｉ  Ｋａｗａｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ、２００８、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．１４、Ｎｏ．９、２５７９−２５８７
【非特許文献２】Ｇｏｎｇ  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、  ２００６、  ＰＮＡＳ、  ｖｏｌ１０３巻、Ｎｏ．４４号、１６４７２−１６４７７
【非特許文献３】Ｙｕ  Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ、２００６、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．１２巻、Ｎｏ．２０、５９５１−５９５９
【非特許文献４】Ｊｉｎｇ  Ｌｕａｎ  ｅｔ  ａｌ、１９９７、  Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  ｖｏｌ．６２、Ｎｏ．５、５８８−５９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明の一の態様では、ヒトＣＸＣＬ１をより高感度に検出する免疫学的測定法の提供を目的とする。より具体的には、ヒトＣＸＣＬ１を構成するアミノ酸配列のうち、特定の３箇所の配列のいずれかに特異的に結合する抗体又は抗原認識部分を組み合わせた免疫学的測定法により、ヒトＣＸＣＬ１をより高感度に検出する方法を実現することを目的とする。【０００８】
また、本発明のもう一つの態様は、ヒトＣＸＣＬ１を特異的に認識するモノクローナル抗体又はその断片の提供も目的とする。より具体的には、前述のヒトＣＸＣＬ１をより高感度に検出する方法に用いることが可能な、ヒトＣＸＣＬ１を特異的に認識する新規なアミノ酸配列を含み、かつ従来の抗体より高親和性のモノクローナル抗体又はその断片の提供も目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ヒトＣＸＣＬ１を構成するアミノ酸配列のうち、特定の３箇所の部分配列領域に特異的に結合するモノクローナル抗体又は抗原認識部分を組み合わせて免疫学的に測定することにより、従来よりも高感度にヒトＣＸＣＬ１を検出できることを見出した。また、前述のヒトＣＸＣＬ１上の３箇所の部分配列に特異的に結合する新規なアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体と、該抗体を産生するハイブリドーマの作製に成功した。さらに、該抗体を構成するアミノ酸配列をコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を決定した。これにより、組換え抗体とその組換え断片の作製が可能となった。本願発明は、上記知見に基づいて成されたものであり、すなわち以下を提供することである。【００１０】
（１）ヒトＣＸＣＬ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の部分配列である配列番号１〜３で示されるアミノ酸配列のいずれか１つの配列領域を特異的に認識し、かつそれぞれ異なる配列領域を特異的に認識する２種類以上の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトＣＸＣＬ１又はその断片を測定することを特徴とする、ヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。【００１１】
（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトＣＸＣＬ１タンパク質又はその断片を測定することを特徴とする、（１）に記載のヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。【００１２】
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片及び配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトＣＸＣＬ１タンパク質又はその断片を測定することを特徴とする、（１）又は（２）に記載のヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。【００１３】
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片及び配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を使用して、試料中のヒトＣＸＣＬ１タンパク質又はその断片を測定することを特徴とする、（１）又は（２）に記載のヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。【００１４】
（５）前記試料が術後採取組織、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、リンパ液、涙液又は精液である（１）〜（４）のいずれかに記載のヒトＣＸＣＬ１タンパク質の免疫学的測定方法。【００１５】
（６）配列番号３で示されるヒトＣＸＣＬ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の部分配列を特異的に認識するモノクローナル抗体又はその断片であって、その軽鎖において、ＣＤＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖において、ＣＤＲ１が配列番号７で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。【００１６】
（７）軽鎖可変領域に配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含む、（６）に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。【００１７】
（８）配列番号１で示されるヒトＣＸＣＬ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の部分配列を特異的に認識するモノクローナル抗体又はその断片であって、その軽鎖において、ＣＤＲ１が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖において、ＣＤＲ１が配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号１６示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。【００１８】
（９）軽鎖可変領域に配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含む、（８）に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。【００１９】
（１０）配列番号３で示されるヒトＣＸＣＬ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の部分配列を特異的に認識するモノクローナル抗体又はその断片であって、その軽鎖において、ＣＤＲ１が配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖において、ＣＤＲ１が配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含む、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。【００２０】
（１１）軽鎖可変領域に配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含む、（１０）に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。【００２１】
（１２）配列番号２で示されるヒトＣＸＣＬ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の部分配列を特異的に認識するモノクローナル抗体又はその断片であって、その軽鎖において、ＣＤＲ１が配列番号２８で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖において、ＣＤＲ１が配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含む、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。【００２２】
（１３）軽鎖可変領域に配列番号３４で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号３５で示されるアミノ酸配列を含む、（１２）に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。【００２３】
（１４）配列番号３で示されるヒトＣＸＣＬ１タンパク質を構成するアミノ酸配列の部分配列を特異的に認識するモノクローナル抗体又はその断片であって、その軽鎖において、ＣＤＲ１が配列番号３６で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号３７で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号３８で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖において、ＣＤＲ１が配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ２が配列番号４０で示されるアミノ酸配列を含み、及びＣＤＲ３が配列番号４１で示されるアミノ酸配列を含む、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。【００２４】
（１５）軽鎖可変領域に配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域に配列番号４３で示されるアミノ酸配列を含む、（１４）に記載の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、ヒトＣＸＣＬ１の濃度を従来よりも高感度に測定することができる。また、ヒトＣＸＣＬ１を特異的に認識する高親和性の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその断片を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】配列番号１〜３で示されるアミノ酸配列のいずれかを特異的に認識するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法と、市販キットを用いた従来法での免疫学的測定。
【図２】標識抗体として配列番号３で示されるアミノ酸配列を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ。
【図３】配列番号１、又は２で示されるアミノ酸配列を特異的に認識するモノクローナル抗体と、配列番号３で示されるアミノ酸配列を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いた尿中ヒトＣＸＣＬ１を検出するサンドイッチＥＬＩＳＡ。
【図４】配列番号２で示されるアミノ酸配列を特異的に認識する市販抗体を固相化し、ビオチン化標識した配列番号３で示されるアミノ酸配列を認識する本発明の抗体、又は市販のビオチン標識抗ヒトＣＸＣＬ１ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、緩衝液中のヒトＣＸＣＬ１を検出したグラフ。
【図５】本発明の５種類の抗体（ＩｇＧ１−１、ＩｇＧ１−３、ＩｇＧ１−１０、ＩｇＧ１−１４、ＩｇＧ２ｂ−１）、及び市販抗体を固相化し、ビオチン標識抗ヒトＣＸＣＬ１ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、緩衝液中のヒトＣＸＣＬ１を検出したグラフ。
【図６】本発明の５種類の抗体及び市販抗体を固相化し、ビオチン標識抗ヒトＣＸＣＬ１ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、血漿中のヒトＣＸＣＬ１を検出したグラフ。
【図７】本発明の５種類の抗体及び市販抗体を固相化し、ビオチン標識抗ヒトＣＸＣＬ１ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、尿中のヒトＣＸＣＬ１を検出したグラフ。
【図８】本発明の５種類の抗体及び市販抗体の膀胱癌細胞浸潤抑制能を示したグラフ（１）。
【図９】本発明の4種類の抗体及び市販抗体の膀胱癌細胞浸潤抑制能を示したグラフ（２）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２８】
１．抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体及びその断片
本明細書で使用する用語「ヒトＣＸＣＬ１」とは、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿００１５１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質又はその天然変異体を意味する。ここでいう「天然変異体」とは、自然界に存在する変異体であって、例えば、前記アミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたもの、前記アミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するものなどをいう。ここで「同一性」とは、二つのアミノ酸配列にギャップを導入して、又は導入しないで最も高い一致度となるように整列（アラインメント）させたときに、前記ギャップの数を含めた、一方のアミノ酸配列の全アミノ酸残基数に対する他方のアミノ酸配列の同一アミノ酸残基数の割合（％）をいう。また、「数個」とは、２〜１０の整数、例えば、２〜７、２〜５、２〜４、２〜３の整数をいう。天然変異体の具体例としては、ＳＮＰ（一塩基多型）等の多型に基づく変異体やスプライス変異体などが挙げられる。前記置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。保存的アミノ酸置換であれば、前記アミノ酸配列を有するヒトＣＸＣＬ１と実質的に同等な構造又は性質を有しうるからである。保存的アミノ酸とは、互いに、非極性アミノ酸（グリシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、トリプトファン）及び極性アミノ酸（非極性アミノ酸以外のアミノ酸）、荷電アミノ酸（酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）及び塩基性アミノ酸（アルギニン、ヒスチジン、リジン））及び非荷電アミノ酸（荷電アミノ酸以外のアミノ酸）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、分岐状アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン）、ならびに脂肪族アミノ酸（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン）などが知られている。
【００２９】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」とは、免疫グロブリン若しくはその断片に由来するフレームワーク領域（ＦＲ：Ｆｒａｍｅ  ｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）及び相補鎖決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を含み、抗原に特異的に結合し、かつそれを認識することのできるポリペプチドをいう。したがって、本発明の「抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体」とは、ヒトＣＸＣＬ１若しくはその断片に特異的に結合し、かつヒトＣＸＣＬ１若しくはその断片を認識できるポリペプチドをいう。「特異的に結合」とは、標的抗原（本発明においてはヒトＣＸＣＬ１若しくはその断片）のみと結合することを意味する。
【００３０】
典型的な免疫グロブリン分子は、重鎖及び軽鎖と呼ばれる２本のポリペプチド鎖の組がジスルフィド結合によって２組相互接続された四量体として構成される。重鎖は、Ｎ末側の重鎖可変領域（ＶＨ）とＣ末側の重鎖定常領域（ＣＨ）からなり、軽鎖は、Ｎ末側の軽鎖可変領域（ＶＬ）とＣ末側の軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。このうち、ＶＨ及びＶＬは、抗体の結合特異性に関与する点で特に重要である。このＶＨ及びＶＬは、いずれも約１１０個のアミノ酸残基から成り、その内部に抗原との結合特異性に直接関与する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と、可変領域の骨格構造として機能する４つのフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）を有している。相補鎖決定領域は、抗原分子と相補的な立体構造を形成し、抗体の特異性を決定することで知られている（Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｖｏｌ．１、ｅｄｓ．５、ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）。定常領域のアミノ酸配列が種内抗体間ではほとんど不変なのに対して、相補鎖決定領域のアミノ酸配列は各抗体間において変異性が高く、それ故、超可変領域（Ｈｙｐｅｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）とも呼ばれている。可変領域において、前記相補性決定領域とフレームワーク領域は、アミノ酸末端からカルボキシ末端方向にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配列されている。ＶＬ及びＶＨは、免疫グロブリン分子内において、相対して二量体を形成することによって抗原結合部位を形成している。免疫グロブリンには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤの各クラスが知られているが、本発明の抗体は、いずれのクラスであっても良い。好ましくはＩｇＧである。
【００３１】
本発明において有用な抗体は、鳥及び哺乳動物を含めたあらゆる動物源由来とすることができる。例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ロバ、ヒツジ、ラクダ、ウマ、ニワトリ、又はヒトなどが挙げられる。また、本発明の「モノクローナル抗体」は、化学的に、又は組換えＤＮＡ法を用いることによって合成したものであっても良い。例えば、キメラ抗体、及びヒト化抗体のような組換え抗体も本発明に含まれる。
【００３２】
キメラ抗体とは、ある抗体の定常領域を他の抗体の定常領域で置換した抗体である。例えば、抗ヒトＣＸＣＬ１マウスモノクローナル抗体において、その定常領域をヒト抗体の定常領域と置き換えた抗体が該当する。より具体的な例として、ＶＬがそれぞれ配列番号１０、１８、２６、３４、又は４２のいずれかで示される抗ヒトＣＸＣＬ１マウスモノクローナル抗体のＶＬにおけるアミノ酸配列を含み、かつＣＬが任意のヒト抗体のＣＬにおけるアミノ酸配列を含み、及び／又はＶＨがそれぞれ配列番号１１、１９、２７、３５、又は４３のいずれかで示される抗ヒトＣＸＣＬ１マウスモノクローナル抗体のＶＨにおけるアミノ酸配列を含み、かつＣＨが任意のヒト抗体のＣＨにおけるアミノ酸配列を含む抗体が挙げられる。
【００３３】
ヒト化抗体とは、ある抗体（通常、非ヒト抗体、例えば、マウス抗体）由来のＣＤＲ群をヒト抗体のＦＲ及び定常領域とを人為的に組合せたモザイク抗体である。例えば、抗ヒトＣＸＣＬ１マウスモノクローナル抗体の各ＣＤＲと任意のヒト抗体の各ＦＲと定常領域とを組合せた抗体が該当する。抗体の抗原結合特異性は、主として可変領域中のＣＤＲ群が担っていることから、前記ある抗体と同様の結合特性を有する組換え抗体を作製する際には、ある抗体の全アミノ酸配列を得る必要はない。すなわち、既存の組換えＤＮＡ技術を用いて、ある抗体由来の各ＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を、それぞれヒト抗体由来の対応するＣＤＲをコードするＤＮＡ配列と置き換えたモザイク抗体を調製し、それを発現させることにより、ある抗体の性質を模倣する組換え抗体を得ることができる。このような技術は、ＣＤＲグラフト抗体と呼ばれている。Ｎａｔｕｒｅ、１９８６、Ｖｏｌ．３２１、５２２。なお、本発明の抗ヒトＣＸＣＬ１抗体又はその断片は、ヒトＣＸＣＬ１又はその断片の検出に使用する場合には、必ずしもヒト化抗体である必要はなく、このグラフト抗体技術を用いて、ＦＲ及び定常領域がヒト以外の任意の動物の抗体由来のものとすることもできる。
【００３４】
さらに、本発明において「抗体」は、多重特異性抗体であってもよい。多重特異性抗体とは、多価抗体、すなわち抗原結合部位を一分子内に複数有する抗体において、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する抗体をいう。例えば、ＩｇＧのように２つの抗原結合部位を有する抗体において、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する二重特異性抗体（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体）が挙げられる。本発明においては、この多重特異性抗体は、それぞれの抗原結合部位がヒトＣＸＣＬ１上に存在する異なるエピトープと結合できることが好ましい。これらの抗体は、組換えＤＮＡ技術を用いて、公知方法によりＩｇＧ等を人工的に改変することにより得ることができる。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体又はその断片」における「その断片」とは、前記抗体の部分領域であって、該抗体が有する抗原特異的結合活性と実質的に同等の活性を有するポリペプチド鎖又はその複合体をいう。例えば、前述の抗原結合部位を少なくとも１つ包含する抗体部分、すなわち、少なくとも１つのＶＬと少なくとも１つのＶＨを有するポリペプチド鎖又はその複合体が該当する。具体例としては、免疫グロブリンを様々なペプチダーゼで切断することによって生じる多数の十分に特徴付けられた抗体断片等が挙げられる。より具体的な例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’等が挙げられる。Ｆａｂは、パパインによりＩｇＧ分子がヒンジ部のジスルフィド結合よりもＮ末端側で切断されることによって生じる断片であって、ＶＨ及びＣＨを構成する３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）のうちＶＨに隣接するＣＨ１からなるポリペプチドと、軽鎖から構成される。Ｆ（ａｂ’）２は、ペプシンによりＩｇＧ分子がヒンジ部のジスルフィド結合よりもＣ末端側で切断されることによって生じるＦａｂ’の二量体である。Ｆａｂ’は、Ｆａｂよりもヒンジ部を含む分だけＨ鎖が若干長いが実質的にはＦａｂと同等の構造を有する（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ  ｅｄ．、３ｄ  ｅｄ．、１９９３）。Ｆａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２をマイルドな条件下で還元し、ヒンジ領域のジスルフィド連結を切断することによって得ることができる。これらの抗体断片は、いずれも抗原結合部位を包含しており、抗原（すなわち本発明においてはヒトＣＸＣＬ１又はその断片）と特異的に結合する能力を有している。
【００３６】
本発明の前記「その断片」は、化学的に、又は組換えＤＮＡ法を用いることによって合成したものであってもよい。例えば、組換えＤＮＡ法を用いて新たに合成された抗体断片が挙げられる。具体的には、限定はしないが、本発明の抗体の一以上のＶＬ及び一以上のＶＨを適当な長さ及び配列を有するリンカーペプチド等を介して人工的に連結させた一量体ポリペプチド分子、又はその多量体ポリペプチドが該当する。このようなポリペプチドの例としては、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４−１９９５、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ参照）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）又はテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）等の合成抗体等が挙げられる。免疫グロブリン分子において、ＶＬ及びＶＨは、通常別々のポリペプチド鎖（軽鎖と重鎖）上に位置する。一本鎖Ｆｖは、これらの可変領域を十分な長さの柔軟性リンカーによって連結し、１本のポリペプチド鎖に包含した構造を有する合成抗体断片である。一本鎖Ｆｖ内において両可変領域は、互いに自己集合して１つの機能的な抗原結合部位を形成することができる。一本鎖Ｆｖは、それをコードする組換えＤＮＡを、公知技術を用いてファージゲノムに組み込み、発現させることで得ることができる。ダイアボディは、一本鎖Ｆｖの二量体構造を基本とした構造を有する分子である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８）。例えば、前記リンカーの長さが約１２アミノ酸残基よりも短い場合、一本鎖Ｆｖ内の２つの可変部位は自己集合できないが、ダイアボディを形成させることにより、すなわち、２つの一本鎖Ｆｖを相互作用させることにより、一方のＦｖ鎖のＶＬが他方のＦｖ鎖のＶＨと集合可能となり、２つの機能的な抗原結合部位を形成することができる（Ｍａｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ、２００５、Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．、２６：６４９−６５８）。さらに、一本鎖ＦｖのＣ末端にシステイン残基を付加させることにより、２本のＦｖ鎖同士のジスルフィド結合が可能となり、安定的なダイアボディを形成させることもできる（Ｏｌａｆｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ、２００４、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｒ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．、１７：２１−２７）。このようにダイアボディは二価の抗体断片であるが、それぞれの抗原結合部位は、同一エピトープと結合する必要はなく、それぞれが異なるエピトープを認識し、特異的に結合する二重特異性を有していても構わない。例えば、一方の抗原結合部位が、配列番号３６、３７、３８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ（それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３に相当）を含むＶＬと配列番号３９、４０、４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ（それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３に相当）を含むＶＨからなり、他方の抗原結合部位が、配列番号２８、２９、３０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ（それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３に相当）を含むＶＬと配列番号３１、３２、３３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ（それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３に相当）を含むＶＨからなっていてもよい。トリアボディ、及びテトラボディは、ダイアボディと同様に一本鎖Ｆｖ構造を基本としたその三量体、及び四量体構造を有する。それぞれ、三価、及び四価の抗体断片であり、多重特異性抗体であってもよい。
【００３７】
さらに、前記「その断片」は、ファージディスプレイライブラリーを用いて同定された抗体断片（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．３４８、５２２−５５４参照）であって、かつ抗原結合能力を有しているものが含まれる。この他、例えば、Ｋｕｂｙ、Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３ｒｄ  Ｅｄ．、１９９８、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、も参照されたい。
【００３８】
本発明は、ヒトＣＸＣＬ１に対する望ましい結合活性を備えた可変領域、及びそのＣＤＲを構成するアミノ酸配列を有する抗体又はその断片を提供する。すなわち、本発明は、配列番号４〜４３のいずれかに示すアミノ酸配列を含む免疫グロブリン可変領域を含む抗体又はその断片を提供する。
【００３９】
本発明の抗体又はその断片は、その軽鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４、５、６で示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号７、８、９で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
【００４０】
また、本発明の抗体又はその断片において、ＶＬとＶＨが、それぞれ配列番号１０、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
【００４１】
本発明の抗体又はその断片は、その軽鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１２、１３、１４で示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１５、１６、１７で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
【００４２】
また、本発明の抗体又はその断片において、ＶＬとＶＨが、それぞれ配列番号１８、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
【００４３】
本発明の抗体又はその断片は、その軽鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２０、２１、２２で示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２３、２４、２５で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
【００４４】
また、本発明の抗体又はその断片において、ＶＬとＶＨが、それぞれ配列番号２６、配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
【００４５】
本発明の抗体又はその断片は、その軽鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２８、２９、３０で示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３１、３２、３３で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
【００４６】
また、本発明の抗体又はその断片において、ＶＬとＶＨが、それぞれ配列番号３４、配列番号３５で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
【００４７】
本発明の抗体又はその断片は、その軽鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３６、３７、３８で示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３９、４０、４１で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
【００４８】
また、本発明の抗体又はその断片において、ＶＬとＶＨが、それぞれ配列番号４２、配列番号４３で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
【００４９】
本発明の抗体又はその断片は、修飾することができる。ここでいう「修飾」は、本発明の抗体又はその断片がヒトＣＸＣＬ１との特異的結合活性を有する上で必要な機能上の修飾（例えば、グリコシル化）、及び本発明の抗体又はその断片を検出する上で必要な標識のいずれをも含む。前記抗体標識には、例えば、蛍光色素（ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、蛍光タンパク質（例えば、ＰＥ、ＡＰＣ、ＧＦＰ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジン）による標識が挙げられる。また、本発明の抗体のグリコシル化は、標的抗原に対する抗体の親和性を調整するために改変されていてもよい。このような改変は、例えば、抗体配列内の一以上のグリコシル化部位を変更することで達成できる。より具体的に説明すると、例えば、ＦＲ内の一以上のグリコシル化部位を構成するアミノ酸配列に一以上のアミノ酸置換を導入して該グリコシル化部位を除去することにより、その部位のグリコシル化を喪失させることができる。このような脱グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させる上で有効である（米国特許第５７１４３５０号、及び同第６３５０８６１号）。
【００５０】
本発明の測定方法で使用されるモノクローナル抗体又はその断片は、ヒトＣＸＣＬ１又はその断片に対する特異的な結合活性を確実にするため、使用前に予め他の抗原（タンパク質又はその断片）との交差反応性を検証しておくことが好ましい。本発明の抗体又はその断片において、交差性を確認すべき抗原は、ＣＸＣファミリーに属するタンパク質、特に、ヒトＣＸＣＬ１と構造的に類似するヒトＣＸＣＬ２タンパク質、ヒトＣＸＣＬ３タンパク質が挙げられる。また、前記タンパク質以外にも、部分構造がヒトＣＸＣＬ１と共通する他のタンパク質についても本発明の測定方法で使用される抗体又はその断片の交差反応性を確認しておくことがより好ましい。交差反応の確認には、ヒトＣＸＣＬ１を抗原としたＥＬＩＳＡ法を使うことが可能である。反応特異性を試験すべき抗体、すなわち、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体、及びその断片とヒトＣＸＣＬ１との反応の場に、交差性を確認すべき他の抗原タンパク質を共存させれば、両者の競合状態を観察することによって交差性の確認を行うことができる。競合阻害の原理を利用したこのような交差性の確認方法は、すべての抗原について反応系を調製する必要がないのでスクリーニングを迅速に行うことができる。
【００５１】
２．モノクローナル抗体及びハイブリドーマ作製方法
本発明の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体又はその抗体を産生するハイブリドーマは、以下に記載する方法によって作製することができる。ただし、本方法に限定されるものではなく、当該分野で公知の他のあらゆる方法で作製することもできる。
【００５２】
Ａ．抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体作製方法
ヒトＣＸＣＬ１を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸部分配列領域と特異的に結合する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体を作製するには、ヒトＣＸＣＬ１の全長を免疫原としてモノクローナル抗体を作製し、その後、配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸部分配列領域と特異的に結合する抗体をスクリーニングする方法と、予め配列番号１、２、又は３で示されるヒトＣＸＣＬ１の部分配列を免疫原としてモノクローナル抗体を作製する方法がある。
【００５３】
Ａ１．ヒトＣＸＣＬ１の調製
まず、免疫原（抗原）として用いるヒトＣＸＣＬ１を調製する。ヒトＣＸＣＬ１は、天然型、組換え型、又はペプチド合成のようにアミノ酸配列の全部又は一部を化学的に合成したヒトＣＸＣＬ１のいずれであってもよい。
【００５４】
天然型ヒトＣＸＣＬ１は、血液若しくは尿のようなヒト体液をはじめとするヒト試料、又はヒト培養細胞の培養上清から公知のタンパク質分離・精製技術、例えばゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを用いて回収することができる。
【００５５】
組換え型ヒトＣＸＣＬ１は、該タンパク質をコードするＤＮＡを導入した微生物、昆虫細胞、又は動物細胞で発現させた後、当該細胞から公知のタンパク質分離・精製技術を用いて回収することができる。
【００５６】
合成ヒトＣＸＣＬ１は、例えば、公開ヒトＣＸＣＬ１アミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法などにより合成することができる。なお、ヒトＣＸＣＬ１のｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号Ｘ１２５１０として公開されている。この合成ヒトＣＸＣＬ１には、ＫＬＨ（スカシ貝ヘモシアニン）、ＯＶＡ（卵白アルブミン）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）などのキャリアータンパク質に連結させて使用してもよい。
【００５７】
また、最初から配列番号１〜３で示されるヒトＣＸＣＬ１の部分配列を免疫原とする場合も、免疫原は全長配列を免疫する場合と同様に、天然型であっても、組換え型であっても、又は化学的に合成したものであってもよい。
【００５８】
例えば、天然型ヒトＣＸＣＬ１の部分配列を免疫原として用いる場合は、まず、精製したヒトＣＸＣＬ１をトリプシンなどの適切なプロテアーゼで処理した後、逆相カラムでピークを分離分取する。分取した各ピークに含まれるペプチドのアミノ酸配列を質量分析器により決定し、配列番号１、２、又は３で示される部分配列又はその一部であるピークを免疫原として用いることが出来る。
【００５９】
また、組換え型ヒトＣＸＣＬ１のアミノ酸部分配列を免疫原として用いる場合は、前述したヒトＣＸＣＬ１をコードするＤＮＡ配列のうち、配列番号１〜３で示されるアミノ酸部分配列、又はさらにその一部をコードするＤＮＡ配列部分を、全長ヒトＣＸＣＬ１を作製する場合と同様に発現用ベクターに挿入し、各種細胞に導入することで、配列番号１〜３で示されるアミノ酸部分配列、又はその一部の組換え型ヒトＣＸＣＬ１を得ることが出来る。
【００６０】
以下では、配列番号１〜３で示される組換え型ヒトＣＸＣＬ１のアミノ酸部分配列（以下、ヒトＣＸＣＬ１部分配列という。）の調製について詳述する。
【００６１】
（ａ）組換え型ヒトＣＸＣＬ１部分配列をコードするポリヌクレオチドの調製
本ポリヌクレオチドの調製方法については、下記実施例１において詳述しているため、ここでは省略する。
【００６２】
ヒトＣＸＣＬ１部分配列の発現に用いるベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドを使用することができる。例えば、プラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（ｐＥＴ１６ｂ、ｐＧＥＸ６ｐ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられる。又はジとしては、λファージ（λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターも用いることができる。
【００６３】
上記ベクターにヒトＣＸＣＬ１部分配列をコードするポリヌクレオチドを挿入するには、例えば、精製した該ポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断し、適当な制限酵素で切断したベクター内部にＤＮＡリガーゼ等を用いて連結する方法がある。
【００６４】
（ｂ）ヒトＣＸＣＬ１部分配列発現ベクターの宿主内への導入
得られたヒトＣＸＣＬ１部分配列発現ベクターを、ヒトＣＸＣＬ１タンパク質を発現し得る宿主中に導入して、ヒトＣＸＣＬ１部分配列発現形質転換体を得る。使用する宿主については、使用したベクターに適する宿主であって、ヒトＣＸＣＬ１を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌（例えば、エシェリヒア・コリ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等）、酵母、昆虫細胞、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９８、Ｖｏｌ．１６０、３３９３−３４０２）などが好適に用いられる。細菌への前記ベクターの導入方法は、細菌に該ベクターを導入する公知の方法であれば特に限定されない。例えば、ヒートショック法、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。これらの技術は、いずれも当該分野で公知であり、様々な文献に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．  ｅｔ．ａｌ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。また、動物細胞の形質転換には、リポフェクチン法（ＰＮＡＳ、１９８９、Ｖｏｌ．８６、６０７７）、（ＰＮＡＳ、１９８７、Ｖｏｌ．８４、７４１３）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９７３、Ｖｏｌ．５２、４５６−４６７）、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。
【００６５】
細菌を宿主とする場合は、ヒトＣＸＣＬ１部分配列発現ベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、ヒトＣＸＣＬ１部分配列をコードするＤＮＡ配列、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する調節因子をコードする遺伝子が含まれていてもよい。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で機能できるものであればいずれを用いてもよい。
【００６６】
酵母、動物細胞、昆虫細胞などの真核細胞を宿主とする場合にも、同様に当技術分野で公知の手法に従ってヒトＣＸＣＬ１部分配列発現形質転換体を得ることができる。真核細胞において用いられるヒトＣＸＣＬ１部分配列発現ベクターには、プロモーター配列、ヒトＣＸＣＬ１部分配列をコードするＤＮＡ配列のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル（ドナー部位、アクセプター部位、ブランチポイント等）、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー配列、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などが連結されていてもよい。
【００６７】
（ｃ）形質転換体の培養及び組換え型ヒトＣＸＣＬ１部分配列の発現
続いて、上記作製した形質転換体を培養する。形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えば、微生物を宿主とする場合、培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、かつ生育、増殖可能なものであれば、特に限定はしない。天然培地、合成培地のいずれを用いることもできる。より具体的な例としては、ＬＢ培地が挙げられるが、もちろんこれに限定はされない。また、形質転換体の培養を選択的に行うために、必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。培養は、通常、通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。形質転換体がＣＨＯ細胞等の動物細胞である場合には、Ｇｉｂｃｏ社製ＤＭＥＭ培地に１×１０５細胞／ｍＬとなるように宿主細胞を接種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにて培養すればよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６８】
前記ヒトＣＸＣＬ１部分配列発現ベクターがタンパク質発現制御システム（例えば、宿主が微生物の場合、リプレッサー遺伝子及びオペレーター等が該当する）を含むタンパク質発現誘導型ベクターである場合には、前記形質転換体に所定の処理を行い、ヒトＣＸＣＬ１部分配列の発現を誘導させる必要がある。発現誘導の方法は、ベクターに含まれるタンパク質発現制御システムによって異なるため、そのシステムに適した誘導処理を行えばよい。例えば、細菌を宿主とするタンパク質発現誘導型ベクターにおいて最も一般的に利用されているタンパク質発現制御システムは、ｌａｃリプレッサー遺伝子及びｌａｃオペレーターからなるシステムである。本システムは、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）処理により発現を誘導することが可能である。このシステムを含むヒトＣＸＣＬ１発現ベクターを有する形質転換体において、目的とするヒトＣＸＣＬ１を発現させるためには、培地中に適当量（例えば、終濃度１ｍＭ）のＩＰＴＧを添加すればよい。
【００６９】
（ｄ）組換え型ヒトＣＸＣＬ１部分配列の抽出及び／又は回収
培養後、ヒトＣＸＣＬ１部分配列が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を回収して破砕することによりタンパク質を抽出することができる。また、ヒトＣＸＣＬ１部分配列が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去し、上清を使用すればよい。その後、一般的なタンパク質の精製方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で、又は適宜組合せて用いることにより、前記培養物中からヒトＣＸＣＬ１を単離精製することができる。ヒトＣＸＣＬ１部分配列が得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認すればよい。
【００７０】
Ａ２． 抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列抗体の産生細胞の作製
Ａ１で得られた免疫原を、緩衝液に溶解して免疫原溶液を調製する。この際、免疫を効果的に行うために、必要であればアジュバントを添加してもよい。アジュバントの例としては、市販の完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）等が挙げられ、これらを単独で又は混合して用いてもよい。
【００７１】
次に、前記調製した免疫原溶液を哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）、ウサギなどに投与し、免疫する。免疫原の投与方法としては、例えば、ＦＩＡ又はＦＣＡを用いた皮下注射、ＦＩＡを用いた腹腔内注射、又は０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを用いた静脈注射が挙げられるが、この限りでない。免疫原の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路などにより適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約３０〜２００μｇである。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１〜４週間間隔で、２〜６回、好ましくは３〜４回追加免疫を行う。初回免疫より後に、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法等により行い、抗体価がプラトーに達すれば、免疫原を静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から２〜５日後、好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採取する。
【００７２】
Ｂ．抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ作製方法
Ｂ１．免疫動物からの抗体産生細胞の回収と細胞融合
免疫動物から得た抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行うことで、抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列を特異的に認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製することができる。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、一般に入手可能なマウスなど由来の株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生育できる性質を有するものが好ましい。また、株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株である、Ｐ３Ｘ６２−Ａｇ．８株（ＡＴＣＣＴＩＢ９）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１株（ＪＣＲＢ９０８５）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ０００９）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３株（ＪＣＲＢ００２８）又はＳｐ２／０−Ａｇ１４株（ＪＣＲＢ００２９）などが挙げられる。
【００７３】
上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させるには、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを約１：１〜２０：１の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤としては、平均分子量１，５００〜４，０００Ｄａのポリエチレングリコール等を約１０〜８０％の濃度で使用することができる。また、場合によっては、融合効率を高めるためにジメチルスルホキシドなどの補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる（Ｎａｔｕｒｅ、１９７７、Ｖｏｌ．２６６、５５０−５５２）。
【００７４】
Ｂ２．目的とするハイブリドーマの選抜
細胞融合処理後の細胞から目的とする抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選別する方法としては、細胞懸濁液を、例えば、ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地などで適当に希釈後、９６ウェルマイクロタイタープレート上に２×１０６個／ウェル程度まき、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマのみを選択的に生育、増殖させることができるため、選択培地で培養開始後約１０日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして選択することができる。
【００７５】
ＨＡＴ培地で選択されたハイブリドーマは、まず、天然型又は組換え型ヒトＣＸＣＬ１、又は配列番号１〜３で示されるアミノ酸配列に対する結合活性を指標としてスクリーニングを行う。次いでヒトＣＸＣＬ１への結合活性を持つ抗体を産生するハイブリドーマについては、交差性の試験を行う。すなわち、他のＣＸＣファミリー等への結合活性を検証し、許容できるものを選択する。許容できる交差性とは、目的とする抗体の用途において、無視しうる程度の交差性を意味する。たとえば、免疫学的な測定に用いるためのモノクローナル抗体であれば、最終的な測定系において交差反応によるシグナル強度が、バックグラウンドレベルから特異的反応によるシグナル強度の１％未満に抑えられれば、事実上交差反応しないということができる。
【００７６】
ヒトＣＸＣＬ１への反応性や、他のＣＸＣファミリーとの交差反応性を確認するには、例えば、ＥＬＩＳＡ法を利用することができる。ＥＬＩＳＡ法では、抗原となるヒトＣＸＣＬ１又はその断片を固相化したマイクロプレートを用意し、これに前記ハイブリドーマの培養上清を適当に希釈した試料を加えて反応させる。十分に反応させた後にウェルを洗浄し、免疫グロブリンに対する２次抗体の標識体を加えて更に反応させる。再度ウェルを洗浄し、最終的にウェルに結合した２次抗体の標識を利用して測定すれば、培養上清中に存在する抗体の、抗原に対する結合活性を定量的に知ることができる。
【００７７】
Ｂ３．ハイブリドーマを用いた抗体産生
本発明におけるハイブリドーマは、マウスを用いて腹水化することにより抗体生産に用いることが出来る。具体的には、ハイブリドーマを作製する際に用いた融合パートナーに用いた細胞の由来のマウスや、ヌードマウスの腹腔内にハイブリドーマを接種し、腹水を適宜採取することにより、抗体を含む腹水液を回収することができる。より具体的には、Ｓｐ／０細胞を融合パートナーとしたハイブリドーマを、プリスタン接種後１０日間を経たＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔中に接種することにより、抗体を含む腹水液を回収できる。
【００７８】
また、本発明におけるハイブリドーマは、適した培地を用いて培養を行うことにより抗体生産に用いることが出来る。具体的には、Ｇｉｂｃｏ社製のハイブリドーマＳＦＭ培地中に１×１０５細胞／ｍＬとなるようにハイブリドーマを接種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにてハイブリドーマが死滅するまで培養することにより抗体を含む培養液上清を得ることが出来るが、この限りではない。
【００７９】
３．組換え抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体の作製方法
本発明の抗体又はその断片は、本発明で開示されたヒトＣＸＣＬ１部分配列を特異的に認識するモノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列を利用して、組換えＤＮＡ操作によって得ることもできる。
【００８０】
例えば、Ｂ２．の手法で取得した抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ由来の該抗体の可変領域をコードするアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を用いて、ＶＨ及びＶＬの塩基配列を任意のＣＬ、及びＣＨをコードする塩基配列にそれぞれ連結し、それぞれのポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入後、完全な免疫グロブリン分子として発現させることもできる。また、ＣＤＲグラフト抗体技術を用いて、Ｂ２．の手法で取得した可変領域内のＣＤＲのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、任意の免疫グロブリンの各ＦＲをコードするポリヌクレオチドを連結して適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入後、完全な免疫グロブリン分子として発現させてもよい。各ポリヌクレオチドは、化学的に合成することもできるし、長鎖ＤＮＡの合成法として知られている藤本らの手法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物細胞工学シリーズ７  植物ＰＣＲ実験プロトコール、１９９７、秀潤社、ｐ９５−１００）を採用することもできる。また、本発明で開示したＣＤＲはもともとマウスのイムノグロブリンに由来するので、連結するＣＬ、ＣＨ、及びＦＲ領域の配列はマウス由来が好適であるが、ヒトなど他の任意の動物由来であってもよい。このとき重鎖と軽鎖とが同一宿主細胞内で発現し、重鎖／軽鎖からなる２量体として産生できるようにすると便利である。具体的には、例えば、軽鎖発現ベクター及び重鎖発現ベクターにより細胞を共形質転換し、この形質転換細胞から本発明による抗体を得ることもできる。又は、上記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをそのまま適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入後、免疫グロブリン分子の断片として発現させることもできる。あるいは、上述したように、前記アミノ酸配列を含むＶＬ及びＶＨ、又は軽鎖及び重鎖をそれぞれコードするポリヌクレオチドを適当なリンカーで連結してファージに組み込んだ一本鎖Ｆｖとして、又はダイアボディ等の合成抗体断片として発現させてもよい。その他、近年開発された、遺伝子工学技術を活用して組換え抗体をファージ表面に発現させるファージディスプレイ抗体技術（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ、１９９５、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２、４１−５０、国際公開ＷＯ９７／１３８４４号、同９０−０２８０９号）により、人工的に重鎖、軽鎖をコードする遺伝子をシャッフリングさせ多様化した一本鎖Ｆｖ抗体をファージ融合タンパクとして発現させ、特異抗体を得ることもできる。
【００８１】
組換え抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドの調製、該ポリヌクレオチドを組み込んだベクター、該ベクターの宿主導入法については、上記「Ａ．ヒトＣＸＣＬ１抗体作製方法」に記載したような当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術を用いて行えばよい。目的とする組換え抗ヒトＣＸＣＬ１抗体又はその断片は、形質転換細胞の培養液中又は当該細胞内から得ることができる。
【００８２】
免疫グロブリン発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター（例えば、ＳＶ４０  ｖｉｒｕｓ  ｂａｓｅｄベクター、ＥＢ  ｖｉｒｕｓ  ｂａｓｅｄベクター、ＢＰＶ  ｂａｓｅｄベクター）等を用いることができるが、これらに限定されない。例えば、ＢＰＶ  ｂａｓｅｄベクターの１種であるＢＣＭＧＳ  Ｎｅｏベクターは、ＣＯＳ７細胞などに形質転換することによって外来遺伝子を効率良く発現する望ましいベクターである（烏山一「ウシパピローマウイルスベクター」、村松正実及び岡山博人編、実験医学別冊：遺伝子工学ハンドブック、１９９１、羊土社（日本）、２９７−２９９）。
【００８３】
前記ベクターは、抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドの他に、前記抗体又はその断片を発現する上で必要な制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニル化部位、スプライシング部位）、又は、必要であれば選択マーカーを含むことができる。
【００８４】
形質転換の宿主としては、上記「Ａ．抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体作製方法」に記載した宿主の他、Ｓｐ２／０（マウスミエローマ）細胞（Ｅｕｒｏｐｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓａｒｃｈ  Ｐｒｅｖｉｅｗ（１９９６）  Ｖｏｌ．５、５１２−５１９；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓａｒｃｈ（１９９０）Ｖｏｌ．５０、１４９５−１５０２）が好適に用いられる。
【００８５】
本発明における、抗体又はその断片を発現するベクターを含有する宿主細胞は、常法に従って培養を行うことにより、その培養液上清又は宿主細胞内に抗体を産生させることができる。具体的には、ＣＨＯ細胞を宿主とした場合にはＧｉｂｃｏ社製ＤＭＥＭ培地に１×１０５細胞／ｍＬとなるように宿主細胞を接種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにて培養することにより抗体を含む培養液上清を得ることが出来る。また、例えば宿主細胞を大腸菌とした場合には、ＬＢ培地など大腸菌の培養に用いられる一般的な培地に接種して培養し、タンパク質の発現を誘導することにより、培養液上清又は宿主細胞内に抗体を産生させることができる。
【００８６】
なお、発現産物である抗体又はその断片が定常領域を含む場合には、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム、抗イムノグロブリン抗体アフィニティーカラム等を用いて培養液上清や、細胞破砕液から精製・回収することができる。一方、可変領域のみで構成され、定常領域を含まない状態で発現させた場合には、前記精製方法は適用できないので、他の適当な精製方法を応用する。例えば、そのＣ末端にヒスチジンタグなどの精製に有利なタグ配列を融合させた構造として発現させれば、対応するリガンドを利用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製することが可能である。タグ融合タンパク質ではない場合は、硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーといったタンパク質精製の常法に従って精製することができる。
【００８７】
４．得られた抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体が認識するヒトＣＸＣＬ１上のエピトープの確認
得られた抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体が認識するヒトＣＸＣＬ１上のエピトープは、次のような方法によって確認することもできる。
【００８８】
まず、還元アルキル化したヒトＣＸＣＬ１と、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体を反応させて抗原抗体複合体を形成させた後、トリプシンなどの適切なプロテアーゼを用いて分解処理を行う。分解処理を受けても、抗体はトリプシン消化されにくいため、ＰｒｏｔｅｉｎＧセファロース等を用いて抗原抗体複合体を回収することができる。この際、抗原はプロテアーゼ処理により、抗体と結合して保護された部分以外は消化されているため、回収された抗原抗体複合体を、ＬＣ−ＭＳにより分析することで、抗体と結合して保護された部分、すなわち抗体が認識するヒトＣＸＣＬ１上のエピトープを同定することが出来る。
【００８９】
また、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体が認識するヒトＣＸＣＬ１上のエピトープは、例えば、合成ペプチドを用いた競合法によっても確認することが出来る。まず、ヒトＣＸＣＬ１を構成するアミノ酸配列のうち４〜８アミノ酸ずつの固相合成法等により合成ペプチドを調製する。前述のＥＬＩＳＡ法を利用したヒトＣＸＣＬ１に対する結合性を確認する実験において、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体を固相ヒトＣＸＣＬ１と反応させる際にこの合成ペプチドを作用させ、抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体の結合が阻害されることが確認されれば、当該合成ペプチドのアミノ酸配列が抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体の認識するエピトープであると判断できる。
【００９０】
５．ヒトＣＸＣＬ１検出方法
本発明では、このようにして得られたモノクローナル抗体、あるいはその断片を用いることにより、ヒトＣＸＣＬ１の免疫学的測定方法を実現できる。本発明の測定方法はヒトＣＸＣＬ１に対する特異性に優れ、ヒトＣＸＣＬ１の理想的な免疫学的測定方法を提供することができる。
【００９１】
本発明の測定方法で使用する「試料」とは、ヒトＣＸＣＬ１を含み得る様々な試料をいう。例えば、ヒトＣＸＣＬ１をコードするＤＮＡ又はその断片を含む培養細胞、培養細胞破砕液、培養液上清、あるいはヒト試料である。ヒト試料とは、ヒトから採取される組織（例えば、術後採取組織）や、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、リンパ液、涙液、精液等の体液等のあらゆるヒト由来の生体試料であり、好ましくは血液、血清、血漿又は尿である。また、本発明における試料は、液体試料のみならず固体試料であっても良い。たとえば、組織切片標本等を用いることができる。組織切片標本に本発明のヒトＣＸＣＬ１測定方法を行えば、ｉｎ  ｓｉｔｕでヒトＣＸＣＬ１の有無や局在を観察することができるので便利である。
【００９２】
本発明においては、ヒトＣＸＣＬ１を構成するアミノ酸配列の部分配列である配列番号１〜３で示されるアミノ酸配列のいずれか１つの配列領域を特異的に認識し、かつそれぞれ互いに異なる配列領域を特異的に認識する２種類以上の、好ましくは２種類の前述の抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体又はその断片を組み合わせて、より好ましくは配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体を含む組み合わせで使用することを特徴としている。それぞれがヒトＣＸＣＬ１の異なるアミノ酸配列領域を認識する抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体又はその断片を組合せることで、ヒトＣＸＣＬ１の検出感度の向上に寄与する。
【００９３】
本発明の免疫学的測定は、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた公知の免疫学的測定法、あるいは、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）、水晶振動子マイクロバランス測定法（ＱＣＭ法）により実施することができるが、標識抗体を用いた免疫学的測定法において好ましく適用される。
【００９４】
ＥＬＩＳＡ法は、酵素免疫吸着分析法とも呼ばれ、試料中に含まれる微量の標的抗原を、酵素標識した抗体又は抗原を用いて、当該酵素の作用を利用して抗原抗体反応を発色濃度や蛍光強度として検出し、標的抗原を定量する方法である。すなわち、本発明の抗体若しくはその断片、又はヒトＣＸＣＬ１若しくはその断片を固相担体に固定して、当該抗体等及びヒトＣＸＣＬ１等との免疫学的反応を酵素的に検出する方法である。直接法、間接法、サンドイッチ法等の方法があり、本発明はサンドイッチ法に適用される。ＥＬＩＳＡ法の測定方法については、公知の方法（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」、臨床病理刊行会、１９８３年、石川榮治ら編「酵素免疫測定法」、第３版、医学書院、１９８７年、北川常廣ら編「タンパク質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１酵素免疫測定法」、共立出版、１９８７年、入江實編「ラジオイムノアッセイ」、講談社サイエンティフィク、１９７４年、入江實編「続ラジオイムノアッセイ」、講談社サイエンティフィク、１９７９年）を参照されたい。前記固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。本発明の抗体若しくはその断片又はヒトＣＸＣＬ１若しくはその断片の固相担体への固定は、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用する方法等、公知の方法に従って結合させることにより達成できる。
【００９５】
前記標識物質としては、例えばＥＬＩＳＡ法の場合には、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミラーゼ又はビオチン−アビジン複合体等を、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、ジクロロトリアジンイソチオシアネート、Ａｌｅｘａ４８０又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８等を、そして放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができるが、この限りでない。
【００９６】
また、発光免疫測定法は、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。標識抗原と抗体との結合法は、ＥＬＩＳＡ法の場合にはグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法又は過ヨウ素酸法等の公知の方法を、放射免疫測定法の場合にはクロラミンＴ法、ボルトンハンター法等の公知の方法を用いることができる。
【００９７】
さらに、本発明の免疫学的測定方法は、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応又は粒子凝集反応等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、目視的に測る測定法により実施することもできる。その場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
【００９８】
本発明の免疫学的測定方法では、前述の抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体又はその断片の３種類の中から２種類を選択して使用することが好ましい。具体的方法について、配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いる場合を例に挙げて述べるが、本発明の実施の態様はこの限りでない。
【００９９】
例えば、ＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法に適用する場合は、まず配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を不溶性の担体に固相化する。固相化する抗体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するものであれば、１種類であっても数種類であっても良い。次に、抗体の固相化表面に、ヒトＣＸＣＬ１を含む試料を作用させ、固相化抗体とヒトＣＸＣＬ１の複合体を担体の表面に形成させる。その後、洗浄液を用いて十分に洗浄することで、試料中に存在するヒトＣＸＣＬ１以外の未結合の物質が除去される。さらに、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体の標識体を作製し、該標識抗体を、固相化抗体とヒトＣＸＣＬ１の複合体が結合した担体に作用させ、洗浄液を用いて十分に洗浄した後、標識を利用して検出することで試料中に存在したヒトＣＸＣＬ１を検出することができる。この際、標識抗体は配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体であれば、１種類であっても数種類であってもよいが、２種類以上使用することが好ましく、２種類使用することがより好ましい。また、配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体の由来する動物種が異なる場合は、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を標識しなくても、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識する抗体を認識する標識二次抗体を使用して、検出することもできる。
【０１００】
配列番号２で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いた場合についても上記と同様である。また、固相化に用いた抗体と標識に用いた抗体は、それぞれ逆に、標識と固相化に用いることも可能である。
【０１０１】
また、先に標識抗体とヒトＣＸＣＬ１を含む試料を混合して抗原抗体複合体を形成した後、固相化抗体に作用させることもできる。固相化する抗体をビオチン標識すれば、ビオチン化固相化抗体、ヒトＣＸＣＬ１を含む試料、ビオチン以外の標識を施した抗体を全て混合して抗原抗体複合体を形成した後、アビジンを固相化した担体に作用させることで、ビオチン化以外の標識を利用して抗原抗体複合体を検出することができる。
【０１０２】
さらに、本発明の免疫学的測定方法は、免疫クロマト用テストストリップを用いることもできる。免疫クロマト用テストストリップとは、例えば、試料を吸収しやすい材料からなる試料受容部、標識した本発明の診断薬を含有する試薬部、試料と診断薬との反応物が移動する展開部、展開してきた反応物を捕捉して呈色する提示部などから構成される。市販の妊娠診断薬等がこれと同様の形態を有する。本測定方法の原理は、以下の通りである。まず、試料受容部に試料を与えると、試料受容部は、試料を吸収して試料を試薬部にまで到達させる。続いて、試薬部において試料中のヒトＣＸＣＬ１と標識した前述の抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体又はその断片が抗原抗体反応し、形成された反応複合体が展開部を移動して提示部に到達する。提示部では、上記反応複合体と標識されたモノクローナル抗体とは別のＣＸＣＬ１部分配列を認識するもう１種類の抗ヒトＣＸＣＬ１部分配列モノクローナル抗体との反応が生じて捕捉され、反応複合体の標識による呈色が認められることになる。上記免疫クロマト用テストストリップは、侵襲性がきわめて低く、使用者に対し苦痛や試薬使用による危険性を一切与えないものであるため、家庭におけるモニターに使用することができ、その結果を各医療機関レベルで精査・治療（外科的切除等）し、転移・再発予防に結びつけることが可能となる。また現在、このテストストリップは、例えば特開平１０−５４８３０号公報に記載されるような製造方法により安価に大量生産できるものである。
【０１０３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いる場合を例に挙げて説明すると、まず、試料受容部にヒトＣＸＣＬ１を含む試料を与えると、試料受容部は該試料を吸収して該試料を試薬部にまで到達させる。続いて、試薬部において、試料中の尿路上皮癌細胞由来のヒトＣＸＣＬ１と標識された本発明の配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体との反応が起こり、反応した複合体が展開部を移動して提示部に到達する。提示部においては、上記反応複合体と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体との反応が起こって、呈色が認められることになる。
【０１０４】
また、本発明の測定方法は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）を用いることもできる。表面プラズモン共鳴現象とは、金属薄膜に特定の入射角度（共鳴角）でレーザー光を照射すると反射光強度が著しく減衰する現象をいう。ＳＰＲ現象の原理を利用したＳＰＲセンサは、金属薄膜表面上の吸着物を高感度に測定することができる。したがって、該金属薄膜表面上に予め抗体及び／又は標的抗原を固定化しておき、その金属薄膜表面上に試料を通過させることにより、抗原抗体反応の結果生じた試料通過前後の金属表面上の吸着物の差を検出することができる。置換法、間接競合法等が知られるが、いずれを用いてもよい。本技術は、当該分野において周知である。例えば、永田和弘、及び半田宏、生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法、シュプリンガー・フェアラーク東京、東京、２０００を参照されたい。
【０１０５】
さらに、本発明の測定方法は、水晶振動子マイクロバランス測定法（ＱＣＭ法）を用いることもできる。この方法は、晶振動子に取り付けた電極表面に物質が吸着するとその質量に応じて水晶振動子の共振周波数が減少する現象を利用するものである。該方法を用いたＱＣＭセンサは、水共振周波数の変化量によって極微量な吸着物を定量的に捕らえる質量測定センサである。本技術は、当該分野において周知である。例えば、Ｊ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｌｏｖｅ、Ｌ．Ａ．Ｅｓｔｒｏｆｆ、Ｊ．Ｋ．Ｋｒｉｅｂｅｌ、Ｒ．Ｇ．Ｎｕｚｚｏ、Ｇ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、２００５、Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ  ｏｆ  ａ  Ｆｏｒｍ  ｏｆ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ、１０５：１１０３−１１６９；森泉豊榮、中本高道、１９９７、センサ工学、昭晃堂、等を参照されたい。
【０１０６】
６．ヒトＣＸＣＬ１検出キット
また、本発明は、これら免疫学的な測定方法を実施するためのキットとして使用することができる。すなわち、本発明による抗体やその断片をはじめとして、該抗体や該断片、標識二次抗体、さらには標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、あるいは試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を組合せてキットとすることができる。
【実施例】
【０１０７】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。【０１０８】
（実施例１）  大腸菌による組換え型ヒトＣＸＣＬ１の調製
（ヒトＣＸＣＬ１遺伝子の調製）
抗体の免疫原として用いる組換え型ヒトＣＸＣＬ１を調製するために、まず、ＨＥＫ２９３細胞より、ヒトＣＸＣＬ１ ｍＲＮＡの調製を行った。ｍＲＮＡの調製は、Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ及びＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用し、詳細は付属のプロトコールに従った。【０１０９】
次に、逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、得られたトータルｍＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡを合成し、ヒトｃＤＮＡライブラリーを作製した。逆転写反応は、前記酵素に付属のプロトコールに従った。【０１１０】
続いて、得られたヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型に、配列番号４４及び４５に示す塩基配列からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。配列番号４４で示した塩基配列は、ヒトＣＸＣＬ１遺伝子の５’末端領域の一部とその上流側にＮｄｅＩ認識配列を含む。配列番号４５で示した塩基配列は、ヒトＣＸＣＬ１遺伝子の３’末端領域の一部とその下流側にＢａｍＨＩ認識配列を含む。ＰＣＲの反応液は、ＤＮＡポリメラーゼにＫＯＤ（東洋紡社製）を用いて、ｃＤＮＡライブラリー１０ｎｇと各プライマー１０ｐｍｏｌを含むようにＫＯＤに添付のプロトコールに従い調製した。反応条件は、９４℃の温度で１０分間加熱した後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間保つサイクルを３０回繰り返した後、最後に７２℃で４分間保温する条件で行った。増幅したＤＮＡ断片は、Ｑｕａｎｔｕｍ  ｐｒｅｐ  ＰＣＲ  Ｋｌｅｅｎ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を用いて精製した。この反応により全長約３００ｂｐのＰＣＲ産物を得た。【０１１１】
得られたＤＮＡ断片をＨｉｎｃＩＩ切断及びＢＡＰ処理した開環ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）内に組み込むためライゲーション反応を行った。ＤＮＡリガーゼにはＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を使用し、反応は付属のプロトコールに従った。続いて、ライゲーション反応後の溶液を用いて、コンピテント細胞の形質転換を行った。コンピテント細胞は、大腸菌株ＤＨ５α（タカラバイオ社製）を用い、詳細は付属のプロトコールに従って行った。形質転換処理後の菌は、抗生物質アンピシリンを１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢプレート上に塗布し、３７℃で一晩培養した。得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ液体培地で３７℃にて一晩培養し、ミニプレップによって目的とするｐＵＣ１１８＿ＣＸＣＬ１を得た。【０１１２】
次に、ｐＵＣ１１８＿ＣＸＣＬ１を、制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを用いて切断し、反応溶液のアガロース電気泳動を行った。泳動後、紫外線照射によって確認した約３００ｂｐの断片をゲルから切り出し、ＤＮＡ断片の抽出を行った。抽出はＰＣＲ  ＧＦＸ  Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて行った。抽出したＤＮＡ断片を、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩによる切断処理した発現ベクターｐＥＴ１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）（約６ｋｂ断片）内に組み込むため、ライゲーション反応を行った。続いて、ライゲーション反応後の溶液を用いたＤＨ５αの形質転換、形質転換体の培養、及びミニプレップを行い、目的とするｐＥＴ１６ｂ＿ＣＸＣＬ１を得た。それぞれの工程は前述の方法に従った。【０１１３】
（組換え型ヒトＣＸＣＬ１の調製）
組換え型ヒトＣＸＣＬ１を調製するために、ｐＥＴ１６ｂ＿ＣＸＣＬ１を用いて、大腸菌株Ｒｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ  ２（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）の形質転換を行った。得られた形質転換体を、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含むＬＢ培地３０ｍＬで３７℃にて一晩前培養を行った。次に、３Ｌの同培地に前培養を接種し、３７℃にて３時間培養し、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して３２℃にて６時間培養を行い、目的の組換え型ヒトＣＸＣＬ１の発現を誘導させた後、遠心分離により菌体を回収した。【０１１４】
得られた菌体をＰＢＳにて洗浄した後、Ｂ−ＰＥＲ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて不溶性画分を沈殿として調製した。詳細は付属のプロトコールに従った。次に不溶性画分をＩｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）にて可溶化した後、ＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社製）を用いてヒスチジンタグ融合ヒトＣＸＣＬ１を吸着させた。タンパク質の吸着したレジンを、１０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳにて洗浄した後、１Ｍイミダゾール溶液を用いて溶出した。【０１１５】
次に得られた溶出画分から、タンパク質のリフォールディングを行った。まず、６Ｍ  Ｕｒｅａを加えたＰＢＳ溶液に一晩透析した後、透析液中のＵｒｅａの終濃度が１ＭになるまでＰＢＳを透析液に段階的に添加して、希釈した。最後に新たに調製したＰＢＳ溶液に一晩透析し、得られたリフォールディング溶液についてアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルー染色により分子量約１０、０００Ｄａのヒスチジンタグ融合ヒトＣＸＣＬ１の精製を確認した。【０１１６】
（実施例２）  ヒトＣＸＣＬ１に対するマウスモノクローナル抗体の作製と選抜
（抗ヒトＣＸＣＬ１抗体産生マウスの作製）
実施例１で得られた１００μＬの０．３ｍｇ／ｍＬヒトＣＸＣＬ１溶液を１００μＬのＭＰＬ＋ＴＤＭ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ（Ｃｏｒｉｘａ社製）と混合し、全量を７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与した。２週間後、及び４週間後に同様に調製したヒトＣＸＣＬ１溶液を同量投与した。続いて、マウス尾部静脈より血液を１００μＬ採取し、一晩清置した後、５０００×ｇで５分遠心して上清を血漿として回収した。【０１１７】
９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに１００μＬの１μｇ／ｍＬ  ヒトＣＸＣＬ１溶液を入れ、一晩固相化した。ウェル中のタンパク溶液を廃棄後、４倍に希釈したＢｌｏｃｋＡｃｅ溶液（大日本住友製薬社製）を２００μＬ注ぎ、１時間室温で静置した。その後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ヒトＣＸＣＬ１固相化プレートとした。上記で得られた血漿を１００倍希釈し、前記ヒトＣＸＣＬ１固相化プレートのウェルに１００μＬ入れ、室温で１時間静置した。その後、ウェル中の溶液を廃棄し、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ溶液（Ｄａｋｏ社製）を１００μＬ入れ、さらに室温で１時間静置した。ウェル中の溶液を廃棄し、ＰＢＳ‐Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて１５分反応させた。反応によって生じる発色を４５０ｎｍの吸光度で確認し、発色した血液試料中において、ヒトＣＸＣＬ１に対する抗体が産生されていると判断した。【０１１８】
（抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体の作製）
ヒトＣＸＣＬ１に対する抗体の産生が確認されたマウスについて、上記と同様に調製したヒトＣＸＣＬ１溶液を腹腔投与し、３日後に脾臓の摘出を行った。摘出した脾臓にシリンジで穴を開け、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）を注入して脾臓細胞を押し出し、脾臓細胞液を得た。得られた脾臓細胞液を１２００ｒｐｍで７分間遠心した後に上清を除去し、ＲＰＭＩ１６４０培地にて洗浄した。再びＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁して細胞数をカウントし、脾臓細胞数の１／１０量のＳＰ２／０ミエローマ細胞液を調製した。両細胞液を混合し、２２００ｒｐｍで１０分遠心し、上清を廃棄した。細胞をタッピングしてほぐし、ＰＥＧ（ＲＯＣＨＥ社製）とＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ社製）を５：１で混合した溶液を１ｍＬ添加して攪拌した。以降の作業では、特に断りがない限り、溶液や培地は全て３７℃で保温したものを用いた。【０１１９】
ＰＥＧとＨＢＳＳを加えた細胞溶液に、ＲＰＭＩ１６４０培地９ｍＬを５分かけて添加し、ゆっくり混合した後、２２００ｒｐｍで１０分遠心し、上清を除去した。得られた沈殿細胞を、１５％ＦＣＳとＨＡＴ（ＲＯＣＨＥ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、９６ウェル細胞培養プレート（グライナー社製）に１ウェルあたり２００μＬ注ぎ、３７℃、５％ＣＯ２下で１週間培養した。【０１２０】
ＨＡＴ添加条件下で生育したコロニーを脾臓細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマと判断し、コロニーの生育しているウェルの上清を５倍希釈して、前記ヒトＣＸＣＬ１固相化プレートのウェルに１００μＬ添加し、前記と同様の方法で抗体産生の有無を確認した。抗体の産生が確認できたウェルを陽性とした。陽性ウェルのコロニーを１５％ＦＣＳとＨＴ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＲＰＭＩ培地に懸濁し、限界希釈法によって陽性クローンのクローニングを行った。クローニングの結果得られたハイブリドーマ７５種類について、ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）に馴化し、抗体の産生を行った。１００％ＳＦＭ培地６０ｍＬにハイブリドーマを１×１０５細胞／ｍＬになるように接種し、細胞が死滅するまで１０日間培養を行った後、培養液を３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、細胞を除去した。得られた培養上清について、ＭａｂＴｒａｐＫｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて含まれている抗体を精製した。【０１２１】
（抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体の選抜）
前記７５種類の精製抗体について、次のような手法でヒトＣＸＣＬ１と親和性の高い抗体を選抜した。まず、それぞれの精製抗体について１０μｇ／ｍＬ溶液を調製し、それぞれ１００μＬずつ９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに入れ、一晩固相化した。ウェル内の精製抗体溶液を廃棄後、４倍に希釈したＢｌｏｃｋＡｃｅ溶液（大日本住友製薬社製）を２００μＬ注ぎ、１時間、室温で静置した。その後、溶液を廃棄し、ＰＢＳ‐Ｔにて洗浄したものを精製抗体固相化プレートとした。次に、組換え型ヒトＣＸＣＬ１を１０００ｐｇ／ｍＬから１５ｐｇ／ｍＬまで段階希釈した抗原溶液を前記精製抗体固相化プレートの各ウェルに１００μＬずつ添加し、１時間、室温で反応させた。続いて、抗原溶液を廃棄してＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、１００μＬの５０μｇ／ｍＬビオチン標識抗ヒトＣＸＣＬ１ポリクローナル抗体（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）をウェルに入れ、１時間、室温で反応させた。ウェル内の溶液を廃棄してＰＢＳ‐Ｔで洗浄後、１００μＬのａｖｉｄｉｎ‐ＨＲＰ溶液（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）を３０分間室温で反応させた。さらに、ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ溶液を廃棄し、ＰＢＳ−Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて１５分反応させた。反応の停止は、１００μＬの２Ｎ硫酸溶液の添加によって行った。発色は、４５０ｎｍの吸光度の測定により確認した。発色反応が強かったウェルの精製抗体をヒトＣＸＣＬ１との親和性が高い抗体と判断した。この結果、ＩｇＧ１−１、ＩｇＧ１−３、ＩｇＧ１−１０、ＩｇＧ１−１４、ＩｇＧ２ｂ−１の５種類の抗体を選抜した。【０１２２】
（ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖ｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列の決定）
選抜した５種類の抗体について、軽鎖及び重鎖のｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列を決定した。まず、それぞれの抗体を産生するハイブリドーマを、１５％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下で１×１０６細胞／ｍＬになるまで培養した。その後、培養液を１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、細胞を回収した。回収したハイブリドーマよりｍＲＮＡを調製した。調製は、Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ及びＲＮｅａｚｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製））を使用し、詳細は付属のプロトコールに従った。次に、逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））を用いて、得られたＴｏｔａｌ  ｍＲＮＡを鋳型にＯｌｉｇｏ  ｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。【０１２３】
次に、各ハイブリドーマごとに得られたｃＤＮＡライブラリーを鋳型に、Ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いてＰＣＲを行い、増幅産物（マウス免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の提供するＺＥＲＯ  ＢＬＵＮＴ  ＰＣＲ  ＴＯＰＯ  ＶｅｃｔｏｒのＥｃｏＲＩサイトに挿入してライゲーションを行った。ライゲーションはＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を使用し、付属のプロトコールに従った。ライゲーション反応液を用いて、コンピテント細胞の形質転換を行った。コンピテント細胞は、ＤＨ５α（タカラバイオ社製）を用い、詳細は付属のプロトコールに従って行った。形質転換処理後の菌は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養した。各増幅産物由来の形質転換体を４クローンずつ１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一晩培養した。各培養液からミニプレップによってベクターＤＮＡ溶液を調製した結果、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを組み込んだベクター溶液を各増幅産物につき４種類ずつ得た。【０１２４】
得られたベクター溶液について、Ｍ１３プライマーを用いて、モノクローナル抗体をコードする領域のＤＮＡ配列解析を行った。解析は、３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。挿入領域に停止コドンのないクローンを目的のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ配列として判断し、前記５つの抗体（ＩｇＧ１−１、ＩｇＧ１−３、ＩｇＧ１−１０、ＩｇＧ１−１４、ＩｇＧ２ｂ−１）の軽鎖、重鎖のＤＮＡ配列を決定した。決定されたＤＮＡ配列について、大腸菌のコドン使用頻度にしたがってコードするアミノ酸配列を決定し、配列番号４〜４３に示す配列を得ることができた。【０１２５】
配列番号３６〜４３に示されるアミノ酸配列は、ＩｇＧ１−１をコードするアミノ酸配列として得られた。より詳細には、配列番号３６、３７、３８はそれぞれＩｇＧ１−１の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３をコードする。また、配列番号３９、４０、４１はそれぞれ、同じＩｇＧ１−１の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３をコードする。また、配列番号４２、４３はそれぞれＩｇＧ１−１の軽鎖可変領域全長、重鎖可変領域全長をコードする。【０１２６】
配列番号２８〜３５に示されるアミノ酸配列は、ＩｇＧ１−３をコードするアミノ酸配列として得られた。より詳細には、配列番号２８〜３３は、順にＩｇＧ１−３の軽鎖ＣＤＲ１〜３、重鎖ＣＤＲ１〜３をコードする。また、配列番号３４、３５はそれぞれＩｇＧ１−３の軽鎖可変領域全長、重鎖可変領域全長をコードする。【０１２７】
配列番号４〜１１に示されるアミノ酸配列は、ＩｇＧ１−１０をコードするアミノ酸配列として得られた。より詳細には、配列番号４〜９は、順にＩｇＧ１−１０の軽鎖ＣＤＲ１〜３、重鎖ＣＤＲ１〜３をコードする。配列番号１０、１１はそれぞれＩｇＧ１−１０の軽鎖可変領域全長、重鎖可変領域全長をコードする。【０１２８】
配列番号２０〜２７に示されるアミノ酸配列は、ＩｇＧ１−１４をコードするアミノ酸配列として得られた。より詳細には、配列番号２０〜２５は、順にＩｇＧ１−１４の軽鎖ＣＤＲ１〜３、重鎖ＣＤＲ１〜３をコードする。配列番号２６、２７はそれぞれＩｇＧ１−１４の軽鎖可変領域全長、重鎖可変領域全長をコードする。【０１２９】
配列番号１２〜１９に示されるアミノ酸配列は、ＩｇＧ２ｂ−１をコードするアミノ酸配列として得られた。より詳細には、配列番号１２〜１７は、順にＩｇＧ２ｂ−１の軽鎖ＣＤＲ１〜３、重鎖ＣＤＲ１〜３をコードする。配列番号１８、１９はそれぞれＩｇＧ２ｂ−１の軽鎖可変領域全長、重鎖可変領域全長をコードする。【０１３０】
（実施例３）  選抜した抗体が認識するヒトＣＸＣＬ１部分配列の解析
実施例２にて選抜した５つの抗体について、認識するヒトＣＸＣＬ１アミノ酸配列上のエピトープの解析を行った。【０１３１】
まず、１μｇ／μＬヒトＣＸＣＬ１溶液１００μＬに、終濃度が１０ｍＭになるようにＤＴＴを添加し、９５℃、５分間反応させてＣＸＣＬ１内のジスルフィド結合の還元を行い、次に、終濃度２０ｍＭのヨードアセトアミドを添加し、３７℃、遮光条件下にて３０分間チオール基のアルキル化反応を行った。得られた還元アルキル化ヒトＣＸＣＬ１２μｇに、実施例２にて選抜した抗体をそれぞれ２０μｇ添加し、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１００μＬにメスアップして攪拌混合しながら室温で１時間反応させた。【０１３２】
次に、トリプシン（プロメガ社製）、アミノペプチダーゼＭ（ＲＯＣＨＥ社製）、カルボキシペプチダーゼＹ（ＲＯＣＨＥ社製）を、それぞれ終濃度０．２μｇ、０．５μＵ、０．０２μｇとなるように添加し、３７℃で２時間以上反応させた後、予め１％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングしＰＢＳで洗浄しておいたＰｒｏｔｅｉｎＡ−ガラスビーズ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）とＮＰ−４０緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０）中で混合し、４℃で３０分間反応させた。【０１３３】
反応液を２５ｍＭ  炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、０．１％ギ酸  １００μＬを用いて抗原抗体複合体を溶出し、溶出液についてＱ−ＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｗａｔｅｒｓ−ＭｉｃｒｏＭａｓｓ社製）を用いてＬＣ−ＭＳ解析を行った。解析は機器に付属のプロトコールに従った。【０１３４】
その結果、実施例２で得られた各抗体が認識するヒトＣＸＣＬ１部分配列が判明したので表１に示す。【０１３５】
（参考例１）  市販抗体が認識するヒトＣＸＣＬ１部分配列の解析
市販のヒトＣＸＣＬ１検出キットであるＨｕｍａｎ ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ ａｌｐｈａ ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）に固相化用抗体として添付されているモノクローナル抗体について、実施例３と同様に認識するヒトＣＸＣＬ１アミノ酸配列上のエピトープの解析を行った。【０１３６】
その結果、市販抗体が認識するヒトＣＸＣＬ１部分配列が判明したので表１に示す。
【表１】
2010050554.tif 000002
【０１３７】
（実施例４）  モノクローナル抗体ＩｇＧ２ｂ−１とモノクローナル抗体ＩｇＧ１−１０を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１の検出
実施例３より、配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ２ｂ−１と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ１−１０のビオチン標識体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１の測定を行った。ＩｇＧ１−１０のビオチン化はＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ  Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて行い、詳細は付属のプロトコールに従った。まず、ＩｇＧ２ｂ−１の１０μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を調製した後、９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに１００μＬずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、１％ＢＳＡ‐ＰＢＳ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を２００μＬ注ぎ１時間室温で静置した。その後、ＰＢＳ‐Ｔにて洗浄し、精製抗体固相化プレートとした。次に組換え型ヒトＣＸＣＬ１を５００ｐｇ／ｍＬ〜７．８ｐｇ／ｍＬまで１％ＢＳＡ‐ＰＢＳを用いて段階希釈した抗原溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、１時間室温で反応させた。次に、ウェル内の抗原溶液を廃棄してＰＢＳ‐Ｔにて洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて希釈した１μｇ／ｍＬビオチン標識ＩｇＧ１−１０  １００μＬを１時間室温で反応させた。洗浄後、ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ溶液（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）１００μＬを３０分間室温で反応させた。Ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰの希釈も１％ＢＳＡ‐ＰＢＳを用いて行った。ＰＢＳ−Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて１５分反応させた後、２Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１に示す。【０１３８】
（実施例５）  モノクローナル抗体ＩｇＧ２ｂ−１とモノクローナル抗体ＩｇＧ１−１４を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１の検出
実施例３より、配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明したモノクローナル抗体ＩｇＧ２ｂ−１と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明したモノクローナル抗体ＩｇＧ１−１４のビオチン標識体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１の測定を行った。ＩｇＧ１−１４のビオチン化及びサンドイッチＥＬＩＳＡについては実施例４と同様に実施した。結果を図１に示す。【０１３９】
（実施例６）  モノクローナル抗体ＩｇＧ１−３とモノクローナル抗体ＩｇＧ１−１４を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１の検出
実施例３より、配列番号２で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ１−３と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ１−１４のビオチン標識体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１の測定を行った。ＩｇＧ１−１４のビオチン化及びサンドイッチＥＬＩＳＡについては実施例４と同様に実施した。結果を図１に示す。【０１４０】
（比較例１）  市販キットを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１検出
市販のヒトＣＸＣＬ１検出キットであるＨｕｍａｎ ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ ａｌｐｈａ ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）を用いて組換え型ヒトＣＸＣＬ１の測定を行った。当該キットは、抗ヒトＣＸＣＬ１マウスモノクローナル抗体（配列番号２で示されるアミノ酸配列を認識する。）を固相化し、検出はビオチン化標識ヤギポリクローナル抗体を用いるものである。固相化は、グライナー社製の９６ウェルポリスチレンプレートに行い、詳細な実験操作は付属のプロトコールに従った。結果を図１、図４及び図５に示す。【０１４１】
実施例４〜６、比較例１より、従来法の市販のヒトＣＸＣＬ１検出キットに比較して、本発明の免疫学的測定法では７．８ｐｇ／ｍＬのヒトＣＸＣＬ１を検出することが可能になっており、測定感度が上昇していることが判明した。【０１４２】
（実施例７）  モノクローナル抗体ＩｇＧ２ｂ−１と、モノクローナル抗体ＩｇＧ１−１０及びＩｇＧ１−１４の混合液を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１の検出
実施例３より、配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ２ｂ−１と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ１−１０のビオチン標識体、又はＩｇＧ−１０とＩｇＧ１−１４をそれぞれビオチン標識したビオチン標識体の混合液を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１の測定を行った。抗体のビオチン化及びサンドイッチＥＬＩＳＡについては実施例４と同様に実施した。その結果を図２に示す。【０１４３】
同じ配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を標識抗体として２種類用いることで、同じ濃度の１種類の抗体よりも各濃度におけるシグナルが上昇しており、同じ配列を認識する標識抗体を１種類用いるよりも２種類用いた方がヒトＣＸＣＬ１の測定感度が上昇することが判明した。【０１４４】
（実施例８）  モノクローナル抗体ＩｇＧ２ｂ−１と、モノクローナル抗体ＩｇＧ１−１０又はＩｇＧ１−１４を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による尿中に添加したヒトＣＸＣＬ１の検出
実施例３より、配列番号１で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ２ｂ−１と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ１−１０のビオチン標識体、又はＩｇＧ１−１４のビオチン標識体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による尿中に添加したヒトＣＸＣＬ１の測定を行った。ＩｇＧ１−１０及びＩｇＧ１−１４のビオチン化はＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ  Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて行い、詳細は付属のプロトコールに従った。まず、ＩｇＧ２ｂ−１の１０μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を調製した後、９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに１００μＬずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を２００μＬ注ぎ１時間室温で静置した。その後、ＰＢＳ−Ｔにて洗浄し、精製抗体固相化プレートとした。次に組換え型ヒトＣＸＣＬ１を当日採取したヒト尿に２５０ｐｇ／ｍＬとなるように添加し、３．９ｐｇ／ｍＬまで同ヒト尿を用いて段階希釈した抗原添加尿を各ウェルに１００μＬずつ添加し、１時間室温で反応させた。次に、ウェル内の抗原溶液を廃棄してＰＢＳ‐Ｔにて洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて希釈した１μｇ／ｍＬビオチン標識ＩｇＧ１−１０  １００μＬを１時間室温で反応させた。洗浄後、ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ溶液（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）１００μＬを３０分間室温で反応させた。Ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰの希釈も１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて行った。ＰＢＳ−Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて１５分反応させた後、２Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図３に示す。【０１４５】
（実施例９）  モノクローナル抗体ＩｇＧ１−３とモノクローナル抗体ＩｇＧ１−１４を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による尿中に添加したヒトＣＸＣＬ１の検出
実施例３より、配列番号２で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ１−３と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ１−１４のビオチン標識体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による尿中に添加したヒトＣＸＣＬ１の測定を行った。抗体のビオチン化及びサンドイッチＥＬＩＳＡについては実施例８と同様に実施した。結果を図３に示す。【０１４６】
（比較例２）  市販キットを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による尿中ヒトＣＸＣＬ１の検出
市販のヒトＣＸＣＬ１検出キットであるＨｕｍａｎ ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ ａｌｐｈａ ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）を用いて尿中に添加した組換え型ヒトＣＸＣＬ１の測定を行った。詳細な実験操作は付属のプロトコールに従い、ヒト尿に添加したＣＸＣＬ１溶液は実施例８と同様に調製した。結果を図３に示す。【０１４７】
実施例８〜９、比較例２より、従来法の市販のヒトＣＸＣＬ１検出キットに比較して、本発明の免疫学的測定法では尿中でも３１．２５ｐｇ／ｍＬのヒトＣＸＣＬ１を検出することが可能になっており、測定感度が上昇していることが判明した。【０１４８】
（実施例１０）  市販キットモノクローナル抗体とモノクローナル抗体ＩｇＧ１−１０を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＣＸＣＬ１の検出
実施例３において配列番号２で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した市販キットＨｕｍａｎ ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ ａｌｐｈａ ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）付属のマウスモノクローナル抗体と、配列番号３で示されるアミノ酸配列領域を特異的に認識することが判明した抗体ＩｇＧ１−１０のビオチン標識体を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法による緩衝液に添加したヒトＣＸＣＬ１の測定を行った。ＩｇＧ１−１０のビオチン化はＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ  Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて行い、詳細は付属のプロトコールに従った。まず、市販キット付属のマウスモノクローナル抗体の４μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を調製した後、９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに１００μＬずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を２００μＬ注ぎ１時間室温で静置した。その後、ＰＢＳ−Ｔにて洗浄し、精製抗体固相化プレートとした。次に組換え型ヒトＣＸＣＬ１を５００ｐｇ／ｍＬ〜７．８ｐｇ／ｍＬまで１％ＢＳＡ‐ＰＢＳを用いて段階希釈した抗原溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、１時間室温で反応させた。次に、ウェル内の抗原溶液を廃棄してＰＢＳ‐Ｔにて洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて希釈した１μｇ／ｍＬビオチン標識ＩｇＧ１−１０  １００μＬを１時間室温で反応させた。洗浄後、ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ溶液（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）１００μＬを３０分間室温で反応させた。Ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰの希釈も１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて行った。ＰＢＳ−Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて１５分反応させた後、２Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図４に示す。【０１４９】
配列番号２を認識する抗体として市販キット付属のモノクローナル抗体を用いた場合でも、配列番号３を認識する抗体と組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡ法においては、７．８ｐｇ／ｍＬのヒトＣＸＣＬ１を検出することが可能であることが判明した。また、市販キット付属のモノクローナル抗体と配列番号３を認識する抗体とを組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡ法では、市販キットで測定した場合（比較例１）よりも測定感度が上昇していることが判明した。【０１５０】
（実施例１１）  取得した抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＸＣＬ１の検出
実施例２にて選抜した５種類の抗体ＩｇＧ１−１、ＩｇＧ１−３、ＩｇＧ１−１０、ＩｇＧ１−１４、ＩｇＧ２ｂ−１について、それぞれ１０μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を調製した後、９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに１００μＬずつ入れ、一晩固相化した。翌日、前記溶液を廃棄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を２００μＬ注ぎ１時間室温で静置した。その後、ＰＢＳ−Ｔにて洗浄し、精製抗体固相化プレートとした。次に組換え型ヒトＣＸＣＬ１タンパク質を１２５ｐｇ／ｍＬから１５ｐｇ／ｍＬまで１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて段階希釈した抗原溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、１時間室温で反応させた。次に、ウェル内の抗原溶液を廃棄してＰＢＳ−Ｔにて洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて希釈した５０ｎｇ／ｍＬビオチン標識抗ヒトＣＸＣＬ１ポリクローナル抗体（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）１００μＬを１時間室温で反応させた。洗浄後、ａｖｉｄｉｎ‐ＨＲＰ溶液（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）１００μＬを３０分間室温で反応させた。Ａｖｉｄｉｎ‐ＨＲＰの希釈も１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて行った。ＰＢＳ−Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて１５分反応させた後、２Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図５に示す。【０１５１】
実施例１０、１１、及び比較例１より本発明の抗体ＩｇＧ１‐１、ＩｇＧ１‐３、ＩｇＧ１‐１０、ＩｇＧ１‐１４、ＩｇＧ２ｂ‐１は、いずれも市販抗体に比較してシグナルが強く、ヒトＣＸＣＬ１の検出能が高いことが判明した。【０１５２】
（実施例１２）  取得した抗体を用いた血漿中のヒトＣＸＣＬ１の検出
実施例２にて選抜した５種類の抗体ＩｇＧ１‐１、ＩｇＧ１‐３、ＩｇＧ１‐１０、ＩｇＧ１‐１４、ＩｇＧ２ｂ‐１を用いて、血漿に溶解したヒトＣＸＣＬ１の検出を行った。【０１５３】
まず、各抗体についてそれぞれ１０μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を調製した後、９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに１００μＬずつ入れて、一晩固相化した。翌日前記溶液を廃棄し、４倍に希釈した１％ＢＳＡ‐ＰＢＳ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を２００μＬ注ぎ、１時間室温で静置した。その後、ＰＢＳ‐Ｔにて洗浄し、精製抗体固相化プレートとした。【０１５４】
次に５００ｐｇ／ｍＬの組換え型ヒトＣＸＣＬ１タンパク質の血漿溶液を調製し、１２５ｐｇ／ｍＬまで同じ血漿で段階希釈した抗原血漿溶液の希釈系列を作製した。これを各ウェルに１００μＬずつ添加して１時間室温で反応させた後、抗原溶液を廃棄してＰＢＳ−Ｔで洗浄した。【０１５５】
続いて、１％ＢＳＡ‐ＰＢＳで希釈した５０ｎｇ／ｍＬビオチン標識抗ヒトＣＸＣＬ１ポリクローナル抗体（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）１００μＬを添加し、１時間室温で反応させた。洗浄後、１％ＢＳＡ‐ＰＢＳで希釈したａｖｉｄｉｎ‐ＨＲＰ溶液（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）１００μＬを３０分間室温で反応させた。ＰＢＳ‐Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて１５分反応させた後、２Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図６に示す。【０１５６】
（比較例３）  市販抗体を用いた血漿中のヒトＣＸＣＬ１の検出
市販の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体であるＭＡＢ２７５（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）を用いて、血漿に溶解したヒトＣＸＣＬ１の検出を行った。ＰＢＳで希釈した１０μｇ／ｍＬのＭＡＢ２７５溶液を調製し、それぞれ１００μＬずつ９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに入れ、一晩固相化した。以降は実施例６と同様の方法で行った。結果を図６に示す。【０１５７】
実施例１２、比較例３より、本発明の５種類の抗体が血漿に溶解したヒトＣＸＣＬ１についても検出可能なことがわかった。【０１５８】
（実施例１３）  取得した抗体を用いた尿中のヒトＣＸＣＬ１の検出
実施例２にて選抜した５種類の抗体ＩｇＧ１‐１、ＩｇＧ１‐３、ＩｇＧ１‐１０、ＩｇＧ１‐１４、ＩｇＧ２ｂ‐１を用いて、尿に溶解したヒトＣＸＣＬ１の検出を行った。【０１５９】
まず、各抗体についてそれぞれ１０μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を調製した後、９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに１００μＬずつ入れて、一晩固相化した。翌日前記溶液を廃棄し、４倍に希釈した１％ＢＳＡ‐ＰＢＳ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を２００μＬ注ぎ、１時間室温で静置した。その後、ＰＢＳ‐Ｔにて洗浄し、精製抗体固相化プレートとした。【０１６０】
次に５００ｐｇ／ｍＬの組換え型ヒトＣＸＣＬ１タンパク質の尿溶液を調製し、１２５ｐｇ／ｍＬまで同じ尿で段階希釈した抗原尿溶液の希釈系列を作製した。これを各ウェルに１００μＬずつ添加して１時間室温で反応させた後、抗原溶液を廃棄してＰＢＳ‐Ｔにて洗浄した。【０１６１】
続いて、１％ＢＳＡ‐ＰＢＳで希釈した５０ｎｇ／ｍＬビオチン標識抗ヒトＣＸＣＬ１ポリクローナル抗体（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）１００μＬを添加し、１時間室温で反応させた。洗浄後、１％ＢＳＡ‐ＰＢＳを用いて希釈したａｖｉｄｉｎ‐ＨＲＰ溶液（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）１００μＬを３０分間室温で反応させた。ＰＢＳ‐Ｔにて洗浄後、ＴＭＢ溶液１００μＬを入れて１５分反応させ、２Ｎ硫酸溶液１００μＬを添加して反応を停止させて、４５０ｎｍの吸収を測定した。結果を図７に示す。【０１６２】
（比較例４）  市販抗体を用いた尿中のヒトＣＸＣＬ１の検出
市販の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体であるＭＡＢ２７５（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）を用いて、尿に溶解したヒトＣＸＣＬ１の検出を行った。ＰＢＳで希釈した１０μｇ／ｍＬのＭＡＢ２７５溶液を調製し、それぞれ１００μＬずつ９６ウェルポリスチレンプレート（グライナー社製）のウェルに入れ、一晩固相化した。以降は実施例１３と同様の方法で行った。結果を図７に示す。【０１６３】
実施例１３、比較例４より、本発明の５種類の抗体のうち、４種類の抗体が、尿に溶解したヒトＣＸＣＬ１についても検出可能なことがわかった。【０１６４】
（実施例１４）  モノクローナル抗体ＩｇＧ１−１、ＩｇＧ１−３、ＩｇＧ１−１０、ＩｇＧ１−１４、ＩｇＧ２ｂ−１を用いた膀胱癌細胞の浸潤能の中和活性測定実験
実施例２にて選抜した５種類の抗体ＩｇＧ１−１、ＩｇＧ１−３、ＩｇＧ１−１０、ＩｇＧ１−１４、ＩｇＧ２ｂ−１について、膀胱癌細胞の浸潤能を抑制する中和活性の測定を行った。【０１６５】
まず、膀胱癌細胞であるＴ２４細胞を１０％ＦＣＳ、１２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に１．０×１０５細胞／ｍＬとなるように接種し、４０時間前培養を行った。培養後細胞を回収し、各抗体と混合した細胞溶液について、マトリゲルインベージョンチャンバー（ＢＤファルコン）を用いて浸潤能を測定した。詳細は付属のプロトコルに従った。マトリゲルインベージョンチャンバーには、２．０×１０５細胞／ｍＬのＰＢＳ懸濁液を１００μＬと終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように各抗体を添加し、３７℃、５％二酸化炭素の下、５時間浸潤培養を行った。培養後、チャンバー下部をディフクィック試薬（シスメックス社製）で染色し、チャンバー下部まで浸潤した膀胱癌細胞数を計測した。計測は顕微鏡で行い、０．８ｃｍ×０．６ｃｍを１視野として、５視野計測して合計した。測定はｎ＝２で行い、合計値を平均した結果を図８に示す。【０１６６】
（比較例５）  市販抗体を用いた膀胱癌細胞の浸潤能の中和活性測定実験
市販の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体であるＭＡＢ２７５（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）について、膀胱癌細胞の浸潤能を抑制する中和活性の測定を行った。方法は実施例１４と同様に行った。結果を図８に示す。【０１６７】
実施例１４及び比較例５より、本発明の５抗体は、市販抗体と同等または高い中和活性を示し、特にＩｇＧ１−１，ＩｇＧ１−１０、ＩｇＧ１−１４、ＩｇＧ２ｂ−１は高い活性を示した。【０１６８】
（実施例１５）  モノクローナル抗体ＩｇＧ１−３、ＩｇＧ１−１０、ＩｇＧ１−１４、ＩｇＧ２ｂ−１を用いた膀胱癌細胞の浸潤能の中和活性測定実験２
実施例２にて選抜した５種類の抗体のうち、ＩｇＧ１−３、ＩｇＧ１−１０、ＩｇＧ１−１４、ＩｇＧ２ｂ−１の４種類について、膀胱癌細胞の浸潤能を抑制する中和活性の測定を行った。なお実施例１４とは異なり、抗体を浸潤能測定の直前ではなく、前培養の段階から混合した。【０１６９】
まず、膀胱癌細胞であるＴ２４細胞を１０％ＦＣＳ、１２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に１．０×１０５細胞／ｍＬとなるように接種し、終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように各抗体を添加した後、４０時間培養を行った。培養後細胞を回収し、各抗体と混合した細胞溶液について、マトリゲルインベージョンチャンバー（ＢＤファルコン）を用いて浸潤能を測定した。以降は実施例１４と同様の実験を行い、浸潤培養時間のみ６．５時間に変更した。浸潤した細胞数の計測も実施例１４と同様に行い、結果を図８に示す。【０１７０】
（比較例６）  市販抗体を用いた膀胱癌細胞の浸潤能の中和活性測定実験２
市販の抗ヒトＣＸＣＬ１モノクローナル抗体であるＭＡＢ２７５（Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳ社製）について、膀胱癌細胞の浸潤能を抑制する中和活性の測定を行った。比較例７とは異なり、抗体を浸潤能測定の直前ではなく、前培養の段階から混合した。方法は実施例１５と同様に行った。結果を図９に示す。【０１７１】
実施例１５、比較例６より、本発明に含まれる４抗体は全て、市販抗体より高い中和活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１７２】
本発明によれば、ヒトＣＸＣＬ１の濃度を従来よりも高感度に測定することができるため、尿路上皮癌等の癌の検出に利用することができる。
【図１】
2010050554.tif 000003
【図２】
2010050554.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010050554.tif 000009
【図８】
2010050554.tif 000010
【図９】
2010050554.tif 000011
【配列表】
2010050554000001.app
【国際調査報告】
2010050554.tif 000012
2010050554.tif 000013
2010050554.tif 000014
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