(57)【要約】  同一種類の昆虫において、前記昆虫の生息地域を特定するためのメルクマールの作製方法であって、以下の工程：（ａ）２又はそれ以上の生息地域由来の、１又はそれ以上の昆虫のＤＮＡの塩基配列を決定する工程；（ｂ）上記工程（ａ）で決定した塩基配列をアラインメントする工程；（ｃ）上記工程（ｂ）のアラインメントの結果、アラインメントに供した全ての上記塩基配列において保存されている、１又はそれ以上の塩基からなる部位を、上記塩基配列から除外する工程；（ｄ）上記工程（ｃ）の除外の結果、残った部位の全部又はその一部をタイプ識別部位とする工程；（ｅ）上記工程（ｄ）で得られたタイプ識別部位について、互いに対応する塩基を比較し、完全に一致するタイプ識別部位を同一タイプに、そして完全に一致しないタイプ識別部位を別の１又はそれ以上のタイプに、タイプ分けする工程；及び（ｆ）上記工程（ｅ）でタイプ分けされたそれぞれのタイプについて、各タイプに属する昆虫が生息する地域を決定することにより、各タイプのタイプ識別部位をメルクマールとする工程；を含む、前記方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
同一種類の昆虫において、前記昆虫の生息地域を特定するためのメルクマールの作製方法であって、以下の工程：
（ａ）２又はそれ以上の生息地域由来の、１又はそれ以上の昆虫のＤＮＡの塩基配列を決定する工程；
（ｂ）上記工程（ａ）で決定した塩基配列をアラインメントする工程；
（ｃ）上記工程（ｂ）のアラインメントの結果、アラインメントに供した全ての上記塩基配列において保存されている、１又はそれ以上の塩基からなる部位を、上記塩基配列から除外する工程；
（ｄ）上記工程（ｃ）の除外の結果、残った部位の全部又はその一部をタイプ識別部位とする工程；
（ｅ）上記工程（ｄ）で得られたタイプ識別部位について、互いに対応する塩基を比較し、完全に一致するタイプ識別部位を同一タイプに、そして完全に一致しないタイプ識別部位を別の１又はそれ以上のタイプに、タイプ分けする工程；及び
（ｆ）上記工程（ｅ）でタイプ分けされた各タイプについて、各タイプに属する昆虫の生息地域から、各タイプの生息地域を決定することにより、各タイプのタイプ識別部位をメルクマールとする工程；
を含む、前記方法。
【請求項２】
同一種類の昆虫において、前記昆虫の生息地域がある地域か否かを特定するための地域識別メルクマールの作製方法であって、請求項１記載の工程にさらに：
（ｇ）請求項１記載の工程（ｆ）で得られたメルクマールについて、互いに対応する塩基を比較し、１のタイプのみに存在し、それ以外のタイプには存在しない塩基を抽出する工程；及び
（ｈ）上記工程（ｇ）で抽出した１又はそれ以上の塩基を、単独で又は複数個組み合わせて地域識別メルクマールとする工程；
を含む、前記方法。
【請求項３】
昆虫が鞘翅目に属する昆虫である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
昆虫がゴミムシダマシ科に属する昆虫である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
昆虫がコクヌストモドキである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡがミトコンドリア由来のＤＮＡである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ミトコンドリア由来のＤＮＡがＣＯＩ遺伝子及び／又はＮＤ５遺伝子である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法によって得られたメルクマールを有する領域の塩基配列と、被検体である昆虫から得られた塩基配列中の前記メルクマールを有する領域の塩基配列に対応する塩基配列を比較し、被検体の前記塩基配列中のメルクマールに対応する部位の塩基が、メルクマールの塩基と一致するかを解析し、被検体の生息地域を特定することからなる、被検体である昆虫の生息地域を特定するための方法。
【請求項９】
請求項１〜７の何れか１項記載の方法によって得られたメルクマールの塩基を表すデータと、前記塩基の塩基配列位置を表すデータとを含むメルクマールテーブルを解析用コン
ピュータプログラムが動作したコンピュータに格納するステップと、被検体である昆虫から得られた塩基を表すデータを含む被検体塩基配列リストを前記コンピュータに格納するステップと、前記メルクマールテーブルの前記塩基配列位置を表すデータを参照して、被検体塩基配列リストと、前記メルクマールテーブルとの間の対応する塩基配列位置にある塩基を表すデータ同士を前記コンピュータが比較するステップと、を含む、被検体である昆虫の生息地域を特定するための方法。
【請求項１０】
昆虫が鞘翅目に属する昆虫である、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
昆虫がゴミムシダマシ科に属する昆虫である、請求項８〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
昆虫がコクヌストモドキである、請求項８〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡがミトコンドリア由来のＤＮＡである、請求項８〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
ミトコンドリア由来のＤＮＡがＣＯＩ遺伝子及び／又はＮＤ５遺伝子である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜７の何れか１項記載の方法によって得られたメルクマールの塩基を表すデータと、前記塩基の塩基配列位置を表すデータとを含むメルクマールテーブルを備えた、被検体である昆虫の生息地域を特定するための解析用コンピュータプログラム。
【請求項１６】
被検体である昆虫から得られた塩基を表すデータを含む被検体塩基配列リストを格納する手段と、メルクマールテーブルの前記塩基配列位置を表すデータを参照して、被検体塩基配列リストと、前記メルクマールテーブルとの間の対応する塩基配列位置にある塩基を表すデータ同士を比較する手段と、を含む手段としてコンピュータを機能させる、請求項１５に記載の被検体である昆虫の生息地域を特定するための解析用コンピュータプログラム。
【請求項１７】
請求項１５又は１６記載の解析用コンピュータプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法によって得られたメルクマール。
【請求項１９】
コクヌストモドキの生息地域が日本国本州か否かを特定するための請求項２の作製方法により得られる地域識別メルクマールであって、配列番号１で示されるコクヌストモドキＣＯＩ遺伝子由来の塩基配列の５’末端から、第２２９番目の塩基がＧ、第２５３番目の塩基がＴ、第２９８番目の塩基がＧのいずれか又は２以上であり、及び／又は、配列番号８で示されるコクヌストモドキＮＤ５遺伝子由来の塩基配列の５’末端から、第２４８番目の塩基がＡである、前記地域識別メルクマール。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法により作製されたメルクマールを構成する塩基のうちの少なくとも１の塩基を含む、プライマー。
【請求項２１】
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法により作製されたメルクマールを構成する塩基のうちの少なくとも１の塩基を含む、プローブ。
【請求項２２】
コクヌストモドキの生息地域が日本国本州か否かを特定するための配列番号１７〜２９
に示される核酸を含む、請求項２０記載のプライマー。
【請求項２３】
請求項２０記載のプライマー及び／又は請求項２１記載のプローブを用いて、昆虫の生息地域を特定する方法であって、以下の：
（ａ）被検体である昆虫のＤＮＡを抽出する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）で抽出したＤＮＡを請求項２０記載のプライマー及び／又は請求項２１記載のプローブと接触させる工程；
（ｃ）ＤＮＡ断片を増幅する工程；及び
（ｄ）被検体である昆虫の生息地域を特定する工程；
を含む、前記方法。
【請求項２４】
請求項２０記載のプライマー及び請求項２１記載のプローブを用いて、昆虫の生息地域を特定する方法であって、以下の：
（ａ）被検体である昆虫のＤＮＡを抽出する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）で抽出したＤＮＡを請求項２０記載のプライマー及び請求項２１記載のプローブと接触させる工程；
（ｃ）リアルタイムＰＣＲを用いてＤＮＡ断片を増幅する工程； 
（ｄ）予めプローブに標識された蛍光物質を検出する工程；及び
（ｅ）被検体である昆虫の生息地域を特定する工程；
を含む、前記方法。
【請求項２５】
請求項２２記載のプライマーを用いて、コクヌストモドキの生息地域が日本国本州か否かを識別するための方法であって、以下の：
（ａ）被検体であるコクヌストモドキのＤＮＡを抽出する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）で抽出したＤＮＡを請求項２２記載のプライマーと接触させる工程；
（ｃ）ＤＮＡ断片を増幅する工程；及び
（ｄ）被検体であるコクヌストモドキが日本国本州に生息するコクヌストモドキかそれ以外の地域に生息するコクヌストモドキであるかを識別する工程；
を含む、前記方法。
【請求項２６】
請求項２１記載のプローブ及び前記プローブを挟んでこれを増幅しうる一対のプライマーを用いて、昆虫の生息地域を特定する方法であって、以下の：
（ａ）被検体である昆虫のＤＮＡを抽出する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）で抽出したＤＮＡを請求項２１記載のプローブ及び前記プローブを挟んでこれを増幅しうる一対のプライマーと接触させる工程；
（ｃ）リアルタイムＰＣＲを用いてＤＮＡ断片を増幅する工程； 
（ｄ）予めプローブに標識された蛍光物質を検出する工程；及び
（ｅ）被検体である昆虫の生息地域を特定する工程；
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同一種類の昆虫において、ＤＮＡ解析により前記昆虫の生息地域を特定するためのメルクマールの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
わが国は、世界最大の食料輸入国である。この食料には、食品のほか、大豆等の食品原料やとうもろこし等の飼料用穀物等も含まれる。そしてこれら食料がわが国に輸送される経路としては、輸出国からわが国までの輸送経路として飛行機による空輸、船舶による海上輸送が、また、輸出国内での陸路による輸送があげられる。【０００３】
ところで、輸入した食料を国内の倉庫に保管している際、害虫が発生する場合がある。この原因として、保管倉庫に生息している虫が混入した場合と輸出元あるいは経由地でそこに生息する虫が混入した場合とが考えられ、いかなる経路で害虫が混入したかを追跡することは、安全対策を講じる上で非常に重要である。しかしながら、昆虫の中には、分布域が世界各地に広がっているものもあり、このように、同一形態の昆虫が各地に生息している場合、発生した害虫がどこで混入したのか、つまりその害虫の生息地域を形態上の特徴から判断することは困難であり、その害虫が混入した原因を突き止めることも困難であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、同一種類の昆虫において、ＤＮＡ解析により前記昆虫の生息地域を特定するためのメルクマールの作製方法を提供する。【０００５】
上記のように、例えば食料を港湾倉庫に保管している間にコクヌストモドキが発生した場合に、国内に生息していた虫が港湾倉庫で混入したのか、又は輸出元あるいは経由地でそこに生息する虫が混入してきたものかを特定する手段がないのが現状であり、害虫の混入場所を特定する技術の開発が強く望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、日本国内及び世界各地由来のコクヌストモドキのミトコンドリア由来のＣＯＩ遺伝子及びＮＤ５遺伝子の塩基配列を解析したところ、各塩基配列中に生息地域に特有の多型が存在することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。【０００８】
（１）同一種類の昆虫において、前記昆虫の生息地域を特定するためのメルクマールの作製方法であって、以下の工程：
（ａ）２又はそれ以上の生息地域由来の、１又はそれ以上の昆虫のＤＮＡの塩基配列を決定する工程；
（ｂ）上記工程（ａ）で決定した塩基配列をアラインメントする工程；
（ｃ）上記工程（ｂ）のアラインメントの結果、アラインメントに供した全ての上記塩基配列において保存されている、１又はそれ以上の塩基からなる部位を、上記塩基配列から除外する工程；
（ｄ）上記工程（ｃ）の除外の結果、残った部位の全部又はその一部をタイプ識別部位とする工程；
（ｅ）上記工程（ｄ）で得られたタイプ識別部位について、互いに対応する塩基を比較し、完全に一致するタイプ識別部位を同一タイプに、そして完全に一致しないタイプ識別部位を別の１又はそれ以上のタイプに、タイプ分けする工程；及び
（ｆ）上記工程（ｅ）でタイプ分けされた各タイプについて、各タイプに属する昆虫の生息地域から、各タイプの生息地域を決定することにより、各タイプのタイプ識別部位をメルクマールとする工程；を含む、前記方法。【０００９】
（２）  同一種類の昆虫において、前記昆虫の生息地域がある地域か否かを特定するための地域識別メルクマールの作製方法であって、（１）記載の工程にさらに：
（ｇ）（１）記載の工程（ｆ）で得られたメルクマールについて、互いに対応する塩基を比較し、１のタイプのみに存在し、それ以外のタイプには存在しない塩基を抽出する工程；及び
（ｈ）上記工程（ｇ）で抽出した１又はそれ以上の塩基を、単独で又は複数個組み合わせて地域識別メルクマールとする工程；
を含む、前記方法。【００１０】
（３）昆虫が鞘翅目に属する昆虫である、（１）又は（２）記載の方法。
（４）昆虫がゴミムシダマシ科に属する昆虫である、（１）〜（３）のいずれか１記載の方法。
（５）昆虫がコクヌストモドキである、（１）〜（４）のいずれか１記載の方法。
（６）ＤＮＡがミトコンドリア由来のＤＮＡである、（１）〜（５）のいずれか１記載の方法。
（７）ミトコンドリア由来のＤＮＡがＣＯＩ遺伝子及び／又はＮＤ５遺伝子である、（６）記載の方法。【００１１】
（８）（１）〜（７）のいずれか１記載の方法によって得られたメルクマールを有する領域の塩基配列と、被検体である昆虫から得られた塩基配列中の前記メルクマールを有する領域の塩基配列に対応する塩基配列を比較し、被検体の前記塩基配列中のメルクマールに対応する部位の塩基が、メルクマールの塩基と一致するかを解析し、被検体の生息地域を特定することからなる、被検体である昆虫の生息地域を特定するための方法。【００１２】
（９）（１）〜（７）の何れか１記載の方法によって得られたメルクマールの塩基を表すデータと、前記塩基の塩基配列位置を表すデータとを含むメルクマールテーブルを解析用コンピュータプログラムが動作したコンピュータに格納するステップと、被検体である昆虫から得られた塩基を表すデータを含む被検体塩基配列リストを前記コンピュータに格納するステップと、前記メルクマールテーブルの前記塩基配列位置を表すデータを参照して、被検体塩基配列リストと、前記メルクマールテーブルとの間の対応する塩基配列位置にある塩基を表すデータ同士を前記コンピュータが比較するステップと、を含む、被検体である昆虫の生息地域を特定するための方法。【００１３】
（１０）昆虫が鞘翅目に属する昆虫である、（８）又は（９）記載の方法。
（１１）昆虫がゴミムシダマシ科に属する昆虫である、（８）〜（１０）のいずれか１記載の方法。
（１２）昆虫がコクヌストモドキである、（８）〜（１１）のいずれか１記載の方法。
（１３）ＤＮＡがミトコンドリア由来のＤＮＡである、（８）〜（１２）のいずれか１記載の方法。
（１４）ミトコンドリア由来のＤＮＡがＣＯＩ遺伝子及び／又はＮＤ５遺伝子である、（１３）記載の方法。【００１４】
（１５）（１）〜（７）の何れか１記載の方法によって得られたメルクマールの塩基を表すデータと、前記塩基の塩基配列位置を表すデータとを含むメルクマールテーブルを備えた、被検体である昆虫の生息地域を特定するための解析用コンピュータプログラム。
（１６）被検体である昆虫から得られた塩基を表すデータを含む被検体塩基配列リストを格納する手段と、メルクマールテーブルの前記塩基配列位置を表すデータを参照して、被検体塩基配列リストと、前記メルクマールテーブルとの間の対応する塩基配列位置にある塩基を表すデータ同士を比較する手段と、を含む手段としてコンピュータを機能させる、（１５）に記載の被検体である昆虫の生息地域を特定するための解析用コンピュータプログラム。
（１７）（１５）又は（１６）記載の解析用コンピュータプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。【００１５】
（１８）（１）〜（７）のいずれか１記載の方法によって得られたメルクマール。【００１６】
（１９）コクヌストモドキの生息地域が日本国本州か否かを特定するための（２）の作製方法により得られる地域識別メルクマールであって、配列番号１で示されるコクヌストモドキＣＯＩ遺伝子由来の塩基配列の５’末端から、第２２９番目の塩基がＧ、第２５３番目の塩基がＴ、第２９８番目の塩基がＧのいずれか又は２以上であり、及び／又は、配列番号８で示されるコクヌストモドキＮＤ５遺伝子由来の塩基配列の５’末端から、第２４８番目の塩基がＡである、前記地域識別メルクマール。【００１７】
（２０）（１）〜（７）のいずれか１項記載の方法により作製されたメルクマールを構成する塩基のうちの少なくとも１の塩基を含む、プライマー。
（２１）（１）〜（７）のいずれか１記載の方法により作製されたメルクマールを構成する塩基のうちの少なくとも１の塩基を含む、プローブ。
（２２）コクヌストモドキの生息地域が日本国本州か否かを特定するための配列番号１７〜２９に示される核酸を含む、（２０）記載のプライマー。【００１８】
（２３）（２０）記載のプライマー及び／又は（２１）記載のプローブを用いて、昆虫の生息地域を特定する方法であって、以下の：
（ａ）被検体である昆虫のＤＮＡを抽出する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）で抽出したＤＮＡを（２０）記載のプライマー及び／又は（２１）記載のプローブと接触させる工程；
（ｃ）ＤＮＡ断片を増幅する工程；及び
（ｄ）被検体である昆虫の生息地域を特定する工程；
を含む、前記方法。【００１９】
（２４）（２０）記載のプライマー及び（２１）記載のプローブを用いて、昆虫の生息地域を特定する方法であって、以下の：
（ａ）被検体である昆虫のＤＮＡを抽出する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）で抽出したＤＮＡを（２０）記載のプライマー及び（２１）記載のプローブと接触させる工程；
（ｃ）リアルタイムＰＣＲを用いてＤＮＡ断片を増幅する工程； 
（ｄ）予めプローブに標識された蛍光物質を検出する工程；及び
（ｅ）被検体である昆虫の生息地域を特定する工程；
を含む、前記方法。【００２０】
（２５）（２２）記載のプライマーを用いて、コクヌストモドキの生息地域が日本国本州か否かを識別するための方法であって、以下の：
（ａ）被検体であるコクヌストモドキのＤＮＡを抽出する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）で抽出したＤＮＡを（２２）記載のプライマーと接触させる工程；（ｃ）ＤＮＡ断片を増幅する工程；及び
（ｄ）被検体であるコクヌストモドキが日本国本州に生息するコクヌストモドキかそれ以外の地域に生息するコクヌストモドキであるかを識別する工程；
を含む、前記方法。
（２６）（２１）記載のプローブ及び前記プローブを挟んでこれを増幅しうる一対のプライマーを用いて、昆虫の生息地域を特定する方法であって、以下の：
（ａ）被検体である昆虫のＤＮＡを抽出する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）で抽出したＤＮＡを（２１）記載のプローブ及び前記プローブを挟んでこれを増幅しうる一対のプライマーと接触させる工程；
（ｃ）リアルタイムＰＣＲを用いてＤＮＡ断片を増幅する工程； 
（ｄ）予めプローブに標識された蛍光物質を検出する工程；及び
（ｅ）被検体である昆虫の生息地域を特定する工程；
を含む、前記方法。
【発明の効果】
【００２１】
コクヌストモドキの生息地域の識別が可能になったことで、食料にコクヌストモドキが混入した場合にその混入地域を推定することにより混入原因を解明することが可能となり、より有効な安全対策を迅速に立てられるようになることが期待できる。【００２２】
また、本発明の方法により作製されたメルクマールを構成する塩基の情報を用いて、生息地域を識別するためのプライマーやプローブを作製することができる。例えば、本発明のコクヌストモドキが日本国本州に生息するものか否かを特定するための本州産用プライマー及び海外産用プライマーを用いた場合、生息地域が不明のコクヌストモドキから抽出したＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲによる増幅を行うと、例えば、本州産用プライマーが陽性、海外産用プライマーが陰性であれば、該コクヌストモドキは本州産であると判別することができる。このように、当該プライマー及びプローブはまた、昆虫の生息地域を簡便に識別するのに役立つ。【００２３】
また、加工食品などでは、混入した昆虫のＤＮＡが断片化されていることが多い。ＤＮＡが断片化されると、ＰＣＲ増幅領域が分断されてしまう可能性があり、その場合には、ＰＣＲによる増幅ができず、ＤＮＡ解析もできないため、混入した昆虫の生息地域を判定することができない。そのため、予め解析対象のＤＮＡ領域であるＰＣＲ増幅断片を短く設定しておくことが望ましい。そのため、本発明のプライマー等はプライマーの領域を除いたＰＣＲ増幅産物の大きさを１〜２００塩基（ｂｐ）、好ましくは１〜１００塩基（ｂｐ）、さらに好ましくは１０〜５０塩基（ｂｐ）の短いものに設定することができる。このように、本発明のプライマー等を用いれば、上記ＤＮＡ断片化の影響を極力小さくできる上で好ましい。【００２４】
本発明では、加熱または加圧処理により人為的にコクヌストモドキのＤＮＡを劣化させた場合や、ガンマ線照射により人為的にコクヌストモドキのＤＮＡを劣化させた場合であっても、ＰＣＲによる増幅が観察され、またリアルタイムＰＣＲ法による生息地域の識別が可能であった。さらに、飼育中に自然死し、その後室温保管で５ヶ月経過したコクヌストモドキの場合であっても、ＰＣＲによる増幅が観察された。これらの結果から、本発明の応用範囲は極めて広いものとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、タイ産１及び沖縄産１のコクヌストモドキのミトコンドリアＣＯＩ遺伝子領域のＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。
【図２】図２は、カナダ産１のコクヌストモドキのミトコンドリアＣＯＩ遺伝子領域のＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。
【図３】図３は、千葉産１、浦和産１及び岡山産１のコクヌストモドキのミトコンドリアＣＯＩ遺伝子領域のＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。
【図４】図４は、タイ産２及びタイ産３のコクヌストモドキのミトコンドリアＣＯＩ遺伝子領域のＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。
【図５】図５は、カナダ産２、カナダ産３、沖縄産２、沖縄産３、千葉産２、千葉産３、岡山産２及び岡山産３、浦和産２、浦和産３のコクヌストモドキのミトコンドリアＣＯＩ遺伝子領域のＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。
【図６】図６は、タイ産４、タイ産５、沖縄産４、沖縄産５、カナダ産４及びカナダ産５のコクヌストモドキのミトコンドリアＣＯＩ遺伝子領域のＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。
【図７】図７は、宝塚産１、宝塚産２及び宝塚産３のコクヌストモドキのミトコンドリアＣＯＩ遺伝子領域のＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。
【図８】図８は、タイ産１のコクヌストモドキのミトコンドリアＮＤ５遺伝子領域のＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。
【図９】図９は、沖縄産１のコクヌストモドキのミトコンドリアＮＤ５遺伝子領域のＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。
【図１０】図１０は、タイ産２、タイ産３、岡山産１、浦和産１、千葉産１及びカナダ産１のコクヌストモドキのミトコンドリアＮＤ５遺伝子領域のＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。
【図１１】図１１は、浦和産２、浦和産３、岡山産２、岡山産３、千葉産２、千葉産３、沖縄産２、沖縄産３、カナダ産２及びカナダ産３のコクヌストモドキのミトコンドリアＮＤ５遺伝子領域のＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。
【図１２】図１２は、宝塚産１、宝塚産２及び宝塚産３のコクヌストモドキのミトコンドリアＮＤ５遺伝子領域のＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。
【図１３】図１３は、タイ産４、タイ産５、沖縄産４、沖縄産５、カナダ産４及びカナダ産５コクヌストモドキのミトコンドリアＮＤ５遺伝子領域のＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。
【図１４】図１４は、異なるプライマーの組合わせを用いた宝塚産１及びカナダ産１のコクヌストモドキのミトコンドリア領域のＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。
【図１５】図１５は、異なるプライマーの組合わせを用いた宝塚産１及びカナダ産１のコクヌストモドキのミトコンドリア領域のＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。
【図１６】図１６は、異なるプライマーの組合わせを用いた宝塚産１及びカナダ産１のコクヌストモドキのミトコンドリア領域のＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。
【図１７】図１７は、リアルタイムＰＣＲのデータ解析において本州産の標識に用いた蛍光色素（ＶＩＣ）の検出結果を示す図である。
【図１８】図１８は、リアルタイムＰＣＲのデータ解析において本州産の標識に用いた蛍光色素（ＶＩＣ）の検出結果を示す図である。
【図１９】図１９は、リアルタイムＰＣＲのデータ解析において海外産の標識に用いた蛍光色素（ＦＡＭ）の検出結果を示す図である。
【図２０】図２０は、リアルタイムＰＣＲのデータ解析において海外産の標識に用いた蛍光色素（ＦＡＭ）の検出結果を示す図である。
【図２１】図２１は、本発明の昆虫の生息地域を特定するための解析用コンピュータプログラムの概略図である。
【図２２】図２２は、昆虫の生息地域を特定するための解析用コンピュータプログラムに用いるコンピュータの概略図である。
【図２３】図２３は、昆虫の生息地域を特定するための解析用コンピュータプログラムに関するコンピュータが作動することを示す図である。
【図２４】図２４は、昆虫の生息地域を特定するための解析用コンピュータプログラムに用いるメルクマールテーブルを示す図である。
【図２５】図２５は、加熱または加圧処理により人為的に劣化させたコクヌストモドキ由来ＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。写真左は方法ＡのＰＣＲ（増幅サイズ435 bp）、写真右は方法ＢのＰＣＲ（増幅サイズ179 bp）の結果を示す。
【図２６】図２６は、自然死したコクヌストモドキ由来ＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。
【図２７】図２７は、ガンマ線照射により人為的に劣化させたコクヌストモドキ由来ＤＮＡの電気泳動のバンドを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本発明は、同一種類の昆虫において、前記昆虫の生息地域を特定するためのメルクマールの作製方法、当該メルクマール、当該メルクマールを用いて昆虫の生息地域を特定する方法、前記昆虫の生息地域を特定するためのプライマー及びプローブ及び昆虫の生息地域を特定するための解析用コンピュータプログラムに関する。
【００２７】
＜本発明の概要＞
本発明は、メルクマールを用いて同一種類の昆虫の生息地域を特定することを特徴とする。具体的には、被検体の昆虫のＤＮＡを抽出して、本発明のメルクマールの塩基配列に対応する領域の塩基配列を解析し、当該塩基配列がメルクマールと対応する塩基配列と一致するか否かを解析して、一致する場合は、被検体の昆虫の生息地域をメルクマール由来の生息地域と特定するものである。
【００２８】
＜本発明の昆虫＞
本発明の「同一種類の昆虫」とは、生息地域に特徴的な形態上の差異が認められない昆虫をいい、同一種の昆虫のみに限定されるものではなく、生息地域に特徴的な形態上の差異が認められない昆虫であればいずれの昆虫であってもメルクマール作製の対象とすることができる。現在の分類学では主として形態の差によって種を分類しているため、同一種に属する昆虫は同一の形態を有する。同一の形態を有する昆虫が世界各地域に分布している場合、これらの昆虫の生息地域をその形態的特徴から特定することは困難であった。本発明では、形態的特徴から容易に生息地域が特定できないような昆虫を分子生物学的観点から迅速かつ簡便にその生息地域を特定することを特徴とするものである。本発明の昆虫は、節足動物門のうちの、昆虫網の大部分を占める有翅昆虫亜網に属するものであり、好ましくは、鞘翅目、双翅目、膜翅目、鱗翅目、半翅目、直翅目、蜻蛉目に属する昆虫であるが、これらに限定されない。より具体的には、上記したように、カブトムシ等の鞘翅目（甲虫目）；ハエ、カ、アブ等の双翅目（ハエ目）；ハチ、アリ等の膜翅目（ハチ目）；チョウやガ等の鱗翅目（チョウ目）；セミ、カメムシ等の半翅目（カメムシ目）；バッタ、コオロギ等の直翅目（バッタ目）（などの仲間）；トンボ等の蜻蛉目（トンボ目）等があげられるがこれらに限定されない。
【００２９】
鞘翅目の中のゴミムシダマシ科（Tenebrionidae）に属するコクヌストモドキ（Tribolium castaneum）は、小麦粉などの穀粉をはじめ、菓子、パン類などその２次加工品の害虫として最も普遍的に知られ、家庭や食品店、製粉工場や飼料工場においてしばしば発生する昆虫であり、アメリカ大陸北部、シベリア、イギリスなどの年平均気温１５℃以下の寒冷地を除いて、ほぼ全世界的に分布している。そして国内外を問わず、生息地域に特徴的な形態上の差異は認められないため、本発明の昆虫として好ましい。
【００３０】
本発明のメルクマールの作製に用いる昆虫は、例えば昆虫販売業者や昆虫取扱業者から分譲又は購入することもできるし、倉庫や工場、家屋、あるいは雑木林や草むら等の野外で採集したものや、食料に混入していたものを使用することもできる。なお分譲又は購入、採集等により入手した昆虫は、各由来どうしが混じり合わないように由来ごとに隔離した状態で飼育する。
【００３１】
＜本発明の昆虫の生息地域＞
本発明の「昆虫の生息地域」とは、昆虫が生息している地をいう。昆虫の生息域と国とは必ずしも一致せず、同一国内であっても海で隔たれた地方や、隣接する地域であっても川や山脈等に隔たれた地域では、昆虫の多様性が見られる場合もある。その一方で、国が異なっても、同一大陸に属する場合は、複数の国にまたがって分子生物学的に同一の昆虫が生育する場合もある。さらに、世界的な輸送手段が発達した結果、空港や港湾等の物資の経由地では、荷積み時に混入した荷積み地域由来の昆虫が生息している場合もある。また、そのような荷積み地域由来の昆虫が混入した荷が、さらに工場等に輸送されて梱包を解かれた結果、当該工場等の周辺地域で生息する場合もある。従って、本発明の「地域」とは、国を基準とするものに加え、大陸、同一国内の地方や地域、空港や港湾等の物資の経由地、及び上記したような倉庫や工場等も含まれる。
【００３２】
＜本発明のメルクマール＞
本発明の「メルクマール」とは、昆虫の生息地域を特定するための指標をいい、下記に詳しく説明するように、１塩基多型に基づいてタイプ分けしたタイプごとに、相当する生息地域を決定する。なお、１のタイプに相当する生息地域は1地域であっても、また２以上の地域であってもよい。例えば、荷積み時に混入した荷積み地域由来の昆虫が経由地に生息している場合には、荷積み地域に生息する昆虫と経由地に生息する昆虫のタイプ識別部位は同じタイプに属すると考えられ、この場合、１のタイプに荷積み地域と経由地の２地域が相当することになる。また以下の実施例や表１に示すように、１の地域に複数のタイプが存在する場合があってもよい。具体的には、以下に示す表１によれば、日本国本州由来の塩基を除いては、各地域ごとにそれぞれ２種類のハプロタイプが存在することが示されている。ここで、ハプロタイプとは、同じ種類の生体でありながら、相同なＤＮＡ上で異なる多型、すなわち、複数の１塩基多型（ＳＮＰ）を含む塩基配列が異なる箇所全体のパターンを示す場合をいう。例えば、以下に示す表１のうち、日本２タイプの沖縄産２〜５と日本３タイプの沖縄産１、海外１タイプのタイ産1及び３〜５と海外２タイプのタイ産２、海外３タイプのカナダ産１、４及び５と海外４タイプのカナダ産２及び３がハプロタイプの関係にある。このような場合は、１の地域に複数のタイプが存在することになる。
【００３３】
本発明のメルクマール作製に用いる昆虫のＤＮＡ塩基配列（以下「シークエンスデータ」ともいう）は、ミトコンドリアＤＮＡに由来するものであっても、核ＤＮＡに由来するものであってもよい。特にミトコンドリアＤＮＡの場合には核ＤＮＡに比べて塩基置換の起こる速度が速く各生息地域間の差異が多く見出される可能性が高いと考えられ、しかも細胞あたりの数が多く大量に調製できるため、分析が容易であり、好ましい。
【００３４】
本発明のメルクマールの例としては、以下の表１に示すようなメルクマールがあげられる。表１はコクヌストモドキの２つのミトコンドリア遺伝子ＣＯＩ領域及びＮＤ５領域における１塩基多型の塩基解析の結果を示し、それぞれの生息地域に特徴的である、多型がＣＯＩ領域で１５個及びＮＤ５領域で５個見られ、現在のところ７タイプにタイプ分けされる。当該メルクマールを用いると、例えば、被検体であるコクヌストモドキのミトコンドリアＤＮＡのＣＯＩ領域（３７９塩基長）とＮＤ５領域（４７３塩基長）を解析し、どのタイプに属するかを判定することによって当該コクヌストモドキが生息する地域を特定することができる。現在判定が可能な地域として、日本国本州、沖縄、タイ、カナダをあげることができるが、さらに他の生息地域に由来するコクヌストモドキのミトコンドリアＤＮＡを解析し多型を調べることにより、メルクマールの種類を増やし、より多くの地域を判定することができる。
【００３５】
＜本発明のメルクマールの作製方法＞
本発明は、同一種類の昆虫において、前記昆虫の生息地域を特定するためのメルクマールの作製方法に関し、具体的には、以下の工程：
（ａ）２又はそれ以上の地域由来の、１又はそれ以上の昆虫のＤＮＡの塩基配列を決定する工程；
（ｂ）上記工程（ａ）で決定した塩基配列をアラインメントする工程；
（ｃ）上記工程（ｂ）のアラインメントの結果、上記塩基配列から、全ての上記塩基配列において保存されている、１又はそれ以上の塩基からなる部位を除外する工程；
（ｄ）上記工程（ｃ）の除外の結果、残った部位の全部又はその一部をタイプ識別部位とする工程；
（ｅ）上記工程（ｄ）で得られたタイプ識別部位について、互いに対応する塩基を比較し、完全に一致するタイプ識別部位を同じタイプに、そして完全に一致しないタイプ識別部位を別の１又はそれ以上のタイプに、タイプ分けする工程；及び
（ｆ）上記工程（ｅ）でタイプ分けされたタイプについて、各タイプに属する昆虫の生息地域から、各タイプの生息地域を決定することにより、各タイプのタイプ識別部位をメルクマールとする工程；
を含む。ただし、本発明はこれらの方法に限定されるものではなく、一般的に知られている他の方法を適宜改変して用いてもよい。
【００３６】
（ａ）２以上の生息地域由来の１以上の昆虫のＤＮＡの塩基配列を決定する工程
本発明におけるメルクマールの作製には、２又はそれ以上の生息地域由来の、１又はそれ以上の昆虫のＤＮＡを使用する。
【００３７】
本発明の「２又はそれ以上の生息地域由来のＤＮＡ」とは、同じ形態を有しかつ互いに生息地域が異なる昆虫のシークエンスデータを２又はそれ以上、好ましくは５以上、さらに好ましくは７以上用いる。使用する昆虫の生息地域はメルクマールの利用目的に応じて適宜、選択することができるが、各生息地域間での差異が見られるよう、なるべく地理的に隔離されていると考えられる地域ごとに選択するとよい。また、「１又はそれ以上の昆虫のＤＮＡ」とは、上記各生息地域由来の昆虫のシークエンスデータを１又はそれ以上、好ましくは３以上、より好ましくは５以上用いることを意味する。それにより、生息地域に特異的でかつ信頼性が高いメルクマールを作製することが可能となるからである。
【００３８】
本発明のメルクマール作製に用いる昆虫のシークエンスデータは、独自に昆虫から抽出したＤＮＡを常法に従って決定した塩基配列でもよい。以下、独自に昆虫からＤＮＡを抽出して塩基配列を決定する方法を例示する。
【００３９】
（１）昆虫の入手
まず、本発明で用いる「ＤＮＡ」は、昆虫の全体もしくは一部（触角、胸部、翅、脚等）からＤＮＡの抽出することにより行うことができる。好ましくは、ノミバエ等の小型昆虫については、1匹又は数匹の個体全体を使用し、イエバエやそれ以上の体長を有する大型昆虫では、昆虫の体の一部（触角、胸部（又はその筋肉）、前翅、後翅、脚等のいずれか）を使用する。
【００４０】
（２）ＤＮＡの抽出
ＤＮＡの抽出は、ＣＴＡＢ（Cetyltrimethyl ammonium bromide）法や市販キットのQiagen DNeasy Tissue Kit（キアゲン社）やISOPLANTII（ニッポンジーン社）等の当業界で公知の方法を用いて抽出することができる。操作性と経済性の点からＣＴＡＢ法が好ましい。
【００４１】
（３）ＤＮＡ断片の増幅
上記のように抽出したＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する。本発明で用いるＰＣＲ法は特に限定されず、公知のＰＣＲ法に加え、種々の改良方法を含む。以下はその一例である。すなわち、プライマーのセット、鋳型ＤＮＡの他にＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、各ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等の試薬類を混合してＰＣＲ反応液とする。ＰＣＲの１サイクルは、熱変性、アニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の延長（合成）反応の３つのステップからなる。各ステップはそれぞれ異なる、場合により同一の反応温度と反応時間を必要とし、これらは増幅すべきＤＮＡ領域の塩基配列、その長さ等により適宜決定される。このような操作は市販のthermal cyclerを用いて行うことができる。
【００４２】
本発明に使用するプライマーの一例としては、実施例に記載したような、昆虫の系統解析で用いられる既存のミトコンドリアチトクロームオキシダーゼサブユニット（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ）Ｉ（ＣＯＩ）遺伝子由来のプライマーセット（Ｌ６６２５／Ｈ７００５（配列番号１３及び１４））及び／又はＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ）５（ＮＤ５）遺
伝子由来のプライマーセット（Ｆ６９９９／Ｒ７４９５（配列番号１５及び１６））を用いることができる。
【００４３】
また、一部の昆虫種については、既存のプライマーでは目的とするバンドを増幅することができない場合があり、そのような場合は、メルクマールの塩基をはさむ形で、すなわちメルクマールの塩基を含有する領域をはさむ形で、適切なプライマーを設計し、用いる。上記プライマーは、より多くの昆虫種で目的とするバンドを増幅することができるものを選択することが好ましい。
【００４４】
（４）ＰＣＲによる増幅の確認
ＰＣＲの結果（ＰＣＲ産物）の評価方法として、特定のＤＮＡ断片を同定しうる任意の方法、例えば、電気泳動、ゲルろ過、ハイブリダイゼーションを用いて目的の大きさのＤＮＡ断片が増幅されていることを確認する。例えば、上記ミトコンドリアＣＯＩ遺伝子由来のプライマーセットを使用した場合は、大きさが４３５塩基長、同様にＮＤ５遺伝子由来のプライマーセットを使用した場合は、大きさが５１３塩基長が増幅されていることを確認する。
【００４５】
（５）ＰＣＲ産物の精製
増幅されたＰＣＲ産物は、サイクルシークエンス反応の鋳型として用いるために、余剰のプライマー等の反応に用いた成分と分離する。この精製は、例えば、市販のQIAquick PCR Purification Kit（キアゲン社）を使用し、その製品に添付のプロトコールに従って行うことができる。
【００４６】
（６）サイクルシークエンス反応及びシークエンス産物の精製
上記のように精製したＰＣＲ産物のシークエンスを行うため、それを鋳型にして、サイクルシークエンス反応を実施する。この方法は、ＰＣＲ法に類似し、thermal cyclerを用いて、熱変性、アニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の延長反応の３つのステップを繰り返し実施するが、どちらか１種類のプライマーを用い、塩基ごとに異なる４種類の蛍光色素で標識したターミネーター存在下で長さの異なる種々の１本鎖ＤＮＡを合成する方法である。サイクルシークエンスの方法は、例えば、市販のBigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（ABI社）を用いてよい。具体的には、当該キットの日本語版プロトコール（ｐ．２２「１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡのサイクルシークエンス」、ｐ．２５「ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００，９６００，２７００，２４００でのサイクルシークエンス」及びｐ．３８−４０「スピンカラム（やスピンプレート）での精製法」）に基いて実施することができる。なお、用いるプライマーの塩基配列は、目的のＤＮＡ断片のＰＣＲによる増幅に用いるものと同じでよい。すなわち、ＰＣＲ産物の精製液を必要があれば滅菌蒸留水で希釈したものに、所定の物質を加えて、サイクルシークエンス反応液を作製する。これをＰＣＲ用マイクロチューブに入れ、ＰＣＲ装置にセットし、変性（例えば、９６℃、１分）を行った後、変性（例えば、９６℃、１０秒）、アニーリング（例えば、５０℃、５秒）、鎖伸長（例えば、６０℃、４分）の反応を例えば２５回繰り返す。なお、反応終了後、サンプルをすぐに取り出せない場合には、サンプルブロックの温度を下げて保持してよい。
【００４７】
その後、上記で得られた反応液から、シークエンシング産物、すなわち１本鎖ＤＮＡの混合液を精製し、以降のシークエンサーに供する試料を調製する。この方法の一例として、CENTRISEP Spin Column（ABI社）を用いる方法があげられ、添付のプロトコールに従って操作し、目的の試料を得る。
【００４８】
（７）ＤＮＡ断片のシークエンス
上記Dye Terminator法で得られたシークエンス産物につき、シークエンスを行う。方法としては電気泳動法を用いるのが一般的であり、一例として、ABI PRISM 310 Genetic Analyzerを用いて電気泳動を行い、標識に用いた蛍光物質が塩基ごとに異なることを利用して、レーザー蛍光検出器により順次塩基配列を決定することがあげられる。
【００４９】
（８）塩基配列の解析
決定された塩基配列を解析し、シークエンスデータを得る。例えばミトコンドリアＣＯＩ遺伝子及びＮＤ５遺伝子由来のプライマーセットの場合、５’側（プライマーＬ６６２５、又はＦ６９９９側）と３’側（プライマーＨ７００５、又はＲ７４９５側）からそれぞれ３００〜６００塩基の長さのシークエンスデータが得られる。それぞれ得られたシークエンスデータを照合して正確な塩基配列を決定した。
【００５０】
本発明のメルクマールに用いる昆虫のシークエンスデータは、上記のように独自に昆虫から抽出したＤＮＡを常法に従って決定した塩基配列であっても、また公開データベースから得られる既知のシークエンスデータを用いてもよい。既知のシークエンスデータとしては、例えばＧｅｎｅＢａｎｋ（NIH genetic sequence database）や、ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）等のデータベースに登録されている昆虫のシークエンスデータを使用することができる。これらのデータベースから検索してダウンロードしたシークエンスデータはそのまま、又は連続した一定領域を取り出してからアラインメント（マルチプルアラインメント解析）に供することができる。その場合、データベースに登録されているシークエンスデータの由来する昆虫の採集地等、その生息地域が確認されているものを用いるのがよい。
【００５１】
（ｂ）塩基配列をアラインメントする工程
上記のようにして得られた実分析の結果や既知データについて、２以上の生息地域ごとに少なくとも１個体の昆虫のシークエンスデータを選択し、上記したアラインメントを行う。
【００５２】
本発明のアラインメントとは、個体ごとに得られた複数の塩基配列を横列に並べ、縦列に相同な座がくるように整列させて、互いに塩基配列の異同を調べることをいう。このような操作は、マルチプルアラインメントともいい、分子生物学の分野で、ある塩基配列中のモチーフの抽出、特定の塩基配列が有する構造又は機能の予測、進化系統樹の作成に慣用されるものである。従って、本発明のアラインメントは、ＤＮＡｓｐａｃｅ（日立ソフト社製）等の解析用コンピュータプログラムを用いる等、これらの解析に通常用いられるいかなる操作も含まれる。本発明においてアラインメントに供するシークエンスデータとしては、２０塩基以上、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは２０〜１００００塩基、さらに好ましくは５０〜５０００塩基の長さの塩基配列を用いることができる。
【００５３】
また本発明で用いる、複数の昆虫由来のシークエンスデータは、上記したようにアラインメントに供するため、共通した領域（以下「共通領域」ともいう）を含有するものでなければならない。そのため、例えば、実分析で得られたシークエンスデータすなわち所望のプライマーを用いて増幅されシークエンスされた領域を共通領域と定め、公開データベースからはこの領域を含むシークエンスデータを選択し、そのまま、又は連続した一定領域を取り出して使用する。より具体的には、種や亜種の名称と遺伝子によってコードされる蛋白質（酵素等）の名称等をキーワードにして検索するか、あるいは、実分析で得られたシークエンスデータに基づいて相同性検索（ＢＬＡＳＴ検索）を行い、実分析で得られたシークエンスデータの領域を有するシークエンスデータで選択しダウンロードする。ダウンロードしたシークエンスデータはそのまま、又は連続した一定領域を取り出してからアラインメント（マルチプルアラインメント解析）に使用することができる。この共通領域の選択にあたっては、特に制限はなく、ミトコンドリアＮＤ５遺伝子等の特定の機能又は構造を発現する領域であってもよく、遺伝子として機能していない領域であってもよい。各生息地域間で差異が多く見られる領域が予め分かっている場合は、当該領域を選択するのが好ましい。例えば、ミトコンドリアゲノムは、それ自体コピー数が多いことに加え、修復機能がなく、進化速度が速いため、各生息地域間での差異が多く見出される可能性が高いと考えられ、さらに母性遺伝であり系統関係をより反映しているとされており、好ましい。また、ミトコンドリアＣＯＩ遺伝子及びＮＤ５遺伝子は進化速度が速く、各生息地域間での差異が多く見出される可能性が高いと考えられ、メルクマールの共通領域として特に好ましい。また当該領域は、ＰＣＲ法で増幅可能な領域であることが好ましい。例えば、実施例に記載したプライマーを用いて増幅される領域があげられる。また共通領域の大きさは、シークエンスの信頼性が高い約２０〜２０００塩基、約５０〜１０００塩基、好ましくは、１００〜７００塩基、さらに好ましくは１００〜５００塩基である。
【００５４】
なお、メルクマールを作製するための共通領域は、１の領域に限定されるものではなく、複数の領域を選択することもできる。複数の領域を選択することによってより生息地域特性の高いメルクマールが作製できる。具体的には、以下の実施例に記載するように、コクヌストモドキのＣＯＩ遺伝子領域内及びＮＤ５遺伝子領域内において配列同士をインターネット上でＥＭＢＬ−ＥＢＩのＣｌｕｓｔａｌＷ２などの解析用コンピュータプログラムを用いてマルチプルアライメント解析を行い、各領域に１塩基多型（ＳＮＰ）が存在することを確認し、これらを組み合わせることにより、コクヌストモドキの生息地域に特有なメルクマールを作製することができる。
【００５５】
（ｃ）全ての上記塩基配列で保存されている塩基を除外する工程
このようにして、アラインメントした結果、上記塩基配列から、全ての上記塩基配列において保存されている、１又はそれ以上の塩基からなる部位を除外する。このように、全ての上記塩基配列で保存されている塩基の領域を除外することにより、１塩基多型の存在を明確に確認することができ、また、後の工程において１塩基多型に基づくタイプ分けを容易に行うことができる。
【００５６】
具体的には、アラインメントにより得られたデータから、全個体の塩基配列において塩基が保存されている部位を抽出する。「塩基が保存されている」とは、得られたアラインメントデータの縦列が全個体の塩基配列において全て同じ塩基であることを意味する。抽出された部位を全て除外する。保存された部位を全て除外する理由は以下のとおりである。
【００５７】
すなわち、同一形態である昆虫の塩基配列を比較する場合、大部分の塩基が全個体に共通して存在すると考えられる。しかし、本発明では、全個体に共通する部分を除いた１塩基多型の部分に着目することを特徴としており、当該１塩基多型が生息地域と相関性を有することを見出したことに基づいて、メルクマールを作製するものであるからである。
抽出する方法は、全個体の塩基配列において保存された塩基を抽出できる方法であれば、目視、機械操作等どのような方法を用いてもよい。
【００５８】
（ｄ）タイプ識別部位を作製する工程
上記の除外を行った後に残った部位の全部又はその一部をタイプ識別部位とする。本発明のタイプ識別部位は、同一形態であり、かつ、互いに異なる生息地域由来の昆虫の塩基配列全てにおいて、保存されていない塩基の部位の全部又はその一部からなる。「保存されていない塩基」とは、得られたアラインメントデータの縦列が全個体の塩基配列において全て同じ塩基でないことを意味し、１個体由来の塩基でも異なっている場合は保存されているとは判断されない。本発明のメルクマールにおけるタイプ識別部位とは、当該保存されていない塩基から構成されるが、著しく信頼性が低い部位や、生息地域特性にはほとんど関与しないと判断される部位等がある場合は、タイプ識別部位から当該部位を除いてもよい。タイプ識別部位に含まれる塩基数は、１個以上、好ましくは３〜５０個、より好ましくは５〜３０個、さらに好ましくは１５〜３０個である。
【００５９】
（ｅ）タイプ分けする工程
その後、全個体の上記タイプ識別部位において、互いに対応する塩基を比較し、タイプ分けする。すなわち、完全に一致するタイプ識別部位を同一タイプに、そして完全に一致しないタイプ識別部位を別の１又はそれ以上のタイプに、タイプ分けする。ここで「完全に一致するタイプ識別部位」とは、タイプ識別部位を構成する全塩基がすべて同じものを意味し、「完全に一致しないタイプ識別部位」とは、タイプ識別部位を構成する全塩基の中で一箇所以上、異なる塩基があるものを意味する。この結果、別のタイプは、1又はそれ以上であってもよい。
【００６０】
（ｆ）メルクマールを作製する工程
最後に、タイプ分けされたそれぞれのタイプについて、各タイプに属する昆虫が由来する生息地域から、各タイプの生息地域を決定することにより、各タイプのタイプ識別部位をメルクマールとすることができる。具体的には、あるタイプに属する昆虫が由来する生息地域及び他のタイプに属する昆虫が由来する生息地域との地理的関係や、あるタイプに属する昆虫の入手方法等の由来などを総合的に判断した上で、あるタイプに相当すると考える生息地域を決定する。
【００６１】
例えば以下の表１に示すようなコクヌストモドキのメルクマールの場合、一例として、日本１タイプに属する昆虫が由来する生息地域は浦和、岡山、千葉、宝塚であり、日本２タイプに属する昆虫が由来する生息地域は沖縄、また日本３タイプに属する昆虫が由来する生息地域も沖縄であり、海外１タイプに属する昆虫が由来する生息地域はタイである。このことから日本１タイプに相当すると考える生息地域は海で隔たれた日本国本州と決定し、日本１タイプのタイプ識別部位を日本国本州のメルクマールと決定することができる。また日本２タイプ及び日本３タイプのタイプ識別部位を沖縄のメルクマールと決定することができる。
【００６２】
なお、本発明のメルクマールは、それまでに蓄積されたシークエンスデータに新たなシークエンスデータを追加して上記メルクマール作製の工程（ｂ）以降を行うことにより、より精度が高いメルクマールに改良していくことができる。例えば、日本国本州の上記浦和、岡山、千葉、宝塚以外の地域に生息する昆虫のシークエンスデータを追加してメルクマールを作製することにより、場合によっては、日本１タイプとは別の本州のメルクマールが追加されることもあり得る。またタイ周辺の地理的に隔離されていない地域に生息する昆虫のシークエンスデータを追加してメルクマールを作製することにより、海外１タイプに相当する地域がタイからタイ及びその周辺地域に変更されることもありうる。
【００６３】
＜本発明の地域識別メルクマール＞
本発明ではまた、昆虫の生息する地域がある地域か否かを特定するための地域識別メルクマールを作製することもできる。
【００６４】
本発明の「地域識別メルクマール」とは、上記のように、昆虫の生息する地域がある地域か否かを特定するためのメルクマールをいい、例えば、一例としては、被検体である昆虫が日本国本州内を生息地域とするコクヌストモドキか、それ以外の地域に生息するコクヌストモドキかを判断できるようなメルクマールをいう。
【００６５】
本発明の「地域識別メルクマール」は、以下のように作製することができる。すなわち、上記＜本発明のメルクマールの作製方法＞に記載された方法で得られたメルクマールについて、互いに対応する塩基を比較し、１のタイプのみに存在し、それ以外のタイプには存在しない塩基を抽出する工程及び上記工程で抽出した１又はそれ以上の塩基を、単独で又は複数個組み合わせて地域識別メルクマールとする工程を含む方法である。なお、１のタイプのみに存在し、それ以外のタイプには存在しない塩基であれば本発明の地域識別メルクマールとすることが可能であるが、さらにそれ以外のタイプの塩基が同一である場合には、より精度の高い識別が可能となる。
【００６６】
本発明の地域識別メルクマールの例としては、以下の表１に示すようなメルクマールのうち、例えばＣＯＩ領域の第２２９番目の塩基は、日本１タイプがＧであるのに対し、それ以外のタイプではＡとなっており「第２２９番目の塩基がＧ」は日本１タイプを他のタイプと識別するための指標、すなわち地域識別メルクマールとすることができる。同様に第２５３番目の塩基がＴ、及び第２９８番目の塩基がＧ、ＮＤ５領域の第２４８番目の塩基がＡもそれぞれ日本１タイプに固有の塩基であり日本１タイプを他のタイプと識別するための指標とすることができる。また、例えばＣＯＩ領域の第２２番目の塩基は、カナダタイプ（海外３タイプ及び海外４タイプ）がＴであるのに対し、それ以外のタイプではＡとなっており「第２２番目の塩基がＴ」はカナダタイプをそれ以外のタイプと識別するための指標、すなわち地域識別メルクマールとすることができる。同様に第１４２番目の塩基がＧもカナダタイプに固有の塩基であり、カナダタイプをそれ以外のタイプと識別するための指標とすることができる。表１はコクヌストモドキの２つのミトコンドリア遺伝子ＣＯＩ領域及びＮＤ５領域における１塩基多型の塩基解析の結果を示す。当該メルクマールを用いると、例えば、被検体であるコクヌストモドキの（１）ＣＯＩ領域の第２２９番目の塩基がＧ、第２５３番目の塩基がＴ、第２９８番目の塩基がＧのいずれか又は２以上であり、及び／又は、（２）ＮＤ５領域の第２４８番目の塩基がＡであれば、当該コクヌストモドキが日本国本州を生息地域とするものであることがわかる。また被検体であるコクヌストモドキのＣＯＩ領域の第２２番がＴ及び／又は第１４２番目の塩基がＧであれば、当該コクヌストモドキがカナダを生息地域とするものであることがわかる。
【００６７】
本発明の地域識別メルクマールは、１の地域を特定するメルクマールは１の地域識別メルクマールとは限らず、複数の地域識別メルクマールであってもよい。
【００６８】
＜本発明のメルクマールを用いて昆虫の生息地域を特定する方法＞
本発明はまた、昆虫の生息地域を特定するための方法を提供する。具体的には、上記本発明のメルクマールを有する領域の塩基配列と、被検体である昆虫から得られた塩基配列中の前記メルクマールを有する領域の塩基配列に対応する塩基配列を比較し、被検体の前記塩基配列中のメルクマールに対応する部位の塩基が、メルクマールの塩基と一致するかを解析し、被検体の生息地域を特定することからなる、被検体である昆虫の生息地域を特定するための方法である。
【００６９】
（ａ）塩基配列の比較
本発明のメルクマールを用いて昆虫の生息地域を特定する方法では、まず、上記本発明のメルクマールを有する領域の塩基配列と、被検体である昆虫から得られた塩基配列中の前記メルクマールを有する領域の塩基配列に対応する塩基配列を比較する。
【００７０】
比較は、視覚的検査や数学的計算により行うことができる。又は、コンピュータプログラムを用いることもできる。
【００７１】
以下に、具体的な比較の方法を、解析用コンピュータプログラムを用いた場合について例示する。すなわち、上記の方法により得られたメルクマールの塩基を表すデータと、前記塩基の塩基配列位置を表すデータとを含むメルクマールテーブルを予め、SeqScape（ＡＢＩ社）等の解析用コンピュータプログラムが動作したコンピュータに格納する。格納するメルクマールテーブルは１つでも又は複数であってもよい。そして、被検体である昆虫から得られた塩基を表すデータを含む被検体塩基配列のリストを前記コンピュータに格納する。被検体由来の塩基配列については、上記＜本発明のメルクマールの作製方法＞「（ａ）２以上の生息地域由来の１以上の昆虫のＤＮＡの塩基配列を決定する工程」に記載したのと同様の方法で、ＤＮＡを抽出し、被検体の塩基配列を解析することにより得ることができる。この場合、被検体の塩基配列は、基準とするメルクマールと同じ領域を含むものを調製する。そして、前記メルクマールテーブルの前記塩基配列位置を表すデータを参照して、被検体塩基配列リストと、前記メルクマールテーブルとの間の対応する塩基配列位置にある塩基を表すデータを前記コンピュータで比較させる。比較は、前記解析用コンピュータプログラムにより両者の塩基配列をアラインメントすることにより行うことができる。
【００７２】
（ｂ）メルクマールと被検体の塩基の解析
本発明のメルクマールを用いて昆虫の生息地域を特定する方法では、上記の（ａ）の比較の後、被検体の前記塩基配列中のメルクマールに対応する部位の塩基が、メルクマールの塩基と一致するかを解析することにより、被検体の生息地域を特定する。
【００７３】
具体的には、被検体の塩基配列中のメルクマールに相当する部位の塩基と前記メルクマールの塩基が完全に一致するかを解析し、完全に一致する場合は、被検体は前記メルクマールが属する生息地域由来の昆虫であるといえる。また、完全一致しない場合であっても、被検体の生息地域を予測することができる。例えば、メルクマールの塩基のうち１又は数個が一致しない場合であってもそれ以外の塩基が一致する場合は、そのメルクマールの生息地域からある程度、地域を予測できる場合もある。
【００７４】
このように、本発明のメルクマールを用いると、被検体である昆虫の生息地域を特定することができる。コンピュータを用いて解析をする場合、予め複数の生息地域に関するメルクマールを有する領域の塩基配列が記録されている場合は、被検体の塩基配列を各生息地域の塩基配列と順次、比較・解析を行うことにより、簡易かつ迅速に被検体である昆虫の生息地域を特定することができる。
【００７５】
なお、メルクマールとして決定した特定の塩基をマーキングする等の標識することにより、上記した比較を容易に実行することもできる。すなわち、まず、着色された対照の塩基（メルクマール）を有する塩基配列と、被検体由来の塩基配列のアラインメントを行った後に、着色された塩基だけを抜き出して両者を比較した表を作成する。これにより塩基の種類と存在する位置の全てが一致するか否かの識別が容易になり、被検体である昆虫がそのメルクマールの生息地域に属するか否かということが容易に識別できる。なお、この方法は複数の被検体についての解析も同時にできるため好ましい。
【００７６】
＜昆虫の生息地域を特定するための解析用コンピュータプログラム＞
本発明は、コンピュータに、本発明の昆虫の生息地域を特定するための手順を実行させる解析用コンピュータプログラムをも提供する。
【００７７】
本発明のメルクマールを用いて昆虫の生息地域を特定するための解析用コンピュータプログラムは、メルクマールの塩基を表すデータ、及び前記塩基の塩基配列位置を示すデータを含むメルクマールテーブルを備えている。具体的には、解析に用いるホストコンピュータを、被検体である昆虫から得られた塩基を表すデータを含む被検体塩基配列リストを格納する手段（１）と、前記メルクマールテーブルの前記塩基配列位置を示すデータを参照して、被検体塩基配列リストと、前記メルクマールテーブルとの間の対応する塩基配列位置にある塩基を表すデータ同士を比較する手段（２）とを含む手段として、上記昆虫の生息地域の特定を実行するためにそのハードウェア資源を相互に協調させて機能させることができるコンピュータ用のプログラムである（図２１）。本発明に関する上記コンピュータは、入力装置（３）、出力装置（４）、記憶装置（５）、及びＣＰＵ（６）等、一般的なハードウェア資源を備えている（図２２）。本発明の手段が当該ハードウェア資源の組み合わせにより実現できることは、当業者には明らかであろう。
【００７８】
上記本発明の解析用コンピュータプログラムを用いて昆虫の生息地域を特定するためには、昆虫の各生息地域に関連した複数のメルクマールテーブルを備えていることが望ましい。ここで、１つのメルクマールテーブルは、１つの生息地域にのみ関連することも、２つ以上の生息地域に関連することもできる。また、本発明の解析用コンピュータプログラムは、ネットワークに接続されたコンピュータがアクセス可能な情報記憶手段（ＲＯＭ、ＲＡＭ等）に格納され、コンピュータを上記生息地域の特定に必要な手段として機能させ、必要な処理を実行させることができる。従って、本発明の解析用コンピュータプログラムは、本発明において使用するコンピュータ上、又はネットワークを介して利用できるような任意のプログラム言語で記載することができる。具体的には、SeqScape（ABI社）等の解析用コンピュータプログラムが動作したコンピュータに、各昆虫の生息地域ごとのメルクマールが格納されたものを用いてもよい。または、本発明の解析用コンピュータプログラムは、コンピュータを以下のように作動させることができるプログラムであってもよい。（図２３）。すなわち、メルクマールテーブルは少なくとも１つ以上存在し、予めコンピュータの記憶装置に格納されているか、または格納することができ（Ｓ０）、各々は番号で区別できる。また、メルクマールテーブルは、塩基配列中のメルクマールの塩基を表すデータを第１の列として、前記の塩基の塩基配列位置を示すデータを第２の列として含む（図２４）。例えば、塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃは、それぞれアスキーコードの「Ａ」「Ｔ」「Ｇ」「Ｃ」にコード化してデータとして表すことができる。なお、本明細書及び図面中、ｍ番目のメルクマールテーブルの第ｒ行第ｃ列のデータを、「メルクマールｍ［ｃ］［ｒ］」と表記する。
【００７９】
（ｉ）被検体塩基配列リストが記憶装置に格納される（Ｓ１）。なお、被検体塩基配列リストは、被検体である昆虫から得られた塩基を表すデータを含む（図２４）。なお、ｎ番目のデータは、塩基配列位置ｎの塩基に対応している。被検体塩基配列リストのｎ番目のデータを、「被検体塩基配列［ｎ］」と表記する。
【００８０】
（ｉｉ）記憶装置に記憶されている１つ以上のメルクマールテーブルのうち、１つを選択する。この処理は、例えばプログラム上では、比較するメルクマールテーブルの番号を示す変数ｍに、適当な値（ここでは、値１）を代入することで実現できる（Ｓ２）。
【００８１】
（ｉｉｉ）ｍ番目のメルクマールテーブルの全ての行の第１の列のデータと、それに対応する被検体塩基配列リストのデータとを比較する。この対応関係は、メルクマールテーブルの第２の列を参照することにより解決できる（図２４）。当該処理は、例えばプログラム上では、参照すべきメルクマールテーブルの行を示す変数ｒを用いて、ループ処理をすることで実現できる（Ｓ３〜Ｓ８）。
【００８２】
（ｉｖ）（ｉｉｉ）において、ｍ番目のメルクマールテーブルの全ての行を比較した後、比較したデータが全て一致した場合、このメルクマールテーブルに関連している地域を、被検体である昆虫の生息地域として特定できる。この場合、生息地域を特定できた場合の処理を実行する（Ｓ１０）。当該処理は、出力装置によるこのメルクマールテーブルに関連している地域の通知をすること等である。
【００８３】
（ｖ）（ｉｉｉ）において、ｍ番目のメルクマールテーブルに対する比較中、一度でも不一致のデータ同士が存在した場合、別のメルクマールテーブルに対し（ｉｉｉ）の処理を繰り返す（Ｓ１２）。既に全てのメルクマールテーブルについて繰り返していた場合（Ｓ１１）、完全一致するメルクマールテーブルがなかったときの処理を実行する（Ｓ１３）。この処理は、出力装置による適当なメッセージの通知をすること等である。
【００８４】
＜本発明のメルクマールを用いて昆虫の生息地域を特定する方法＞（ｂ）で説明しているように、メルクマールの塩基配列と被検体である昆虫のメルクマールに対応する領域の塩基配列とが完全一致しない場合であっても、被検体の生息地域を予測することができる。例えば、メルクマールの塩基のうち１又は数個が一致しない場合であってもそれ以外の塩基が一致する場合は、そのメルクマールの生息地域からある程度、地域を予測できる場合もある。従って、本発明の上記解析用コンピュータプログラムにおいては、メルクマールテーブルではなく、メルクマール中の、ある生息地域の昆虫においてのみ保存されている塩基を表すデータと、前記塩基の塩基配列位置を示すデータとを含む保存領域テーブルに対して上記の処理を実行することにより、被検体である昆虫の生息地域を特定することもできる。この保存領域テーブルのデータ構造は、メルクマールテーブルと同一である。
【００８５】
なお、本発明の解析用コンピュータプログラムをコンピュータ上で動作させるためには、本発明の解析用コンピュータプログラムの他に、通常のコンピュータネットワークを介して利用するのに必要なプログラム、例えば周知のオペレーティングシステム（ＯＳ）やインターネットブラウザプログラム等も使用される。周知のオペレーティングシステムには、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ｍａｃ  ＯＳ、Ｌｉｎｕｘ、ＦｒｅｅＢＳＤ、Ｓｏｌａｒｉｓ等があげられるが、これらに限定されない。
【００８６】
また、本発明の解析用コンピュータプログラムは、昆虫ごと、生息地域ごと等のメルクマールの標準データ及びそれを用いて特定を行うプログラムを分類ごとに格納して保存しておくことができる。これにより、被検体の生息する地域の特定を迅速に行うことができるため、好ましい。
【００８７】
＜コンピュータ読み取り可能な記録媒体＞
本発明の解析用コンピュータプログラムは、コンピュータ読み取り可能な記録媒体又はコンピュータに接続しうる記憶手段に記録しておくことができ、必要に応じて読み取ることにより、コンピュータ上で動作させ、使用することができる。従って、本発明の解析用コンピュータプログラムを含有するコンピュータ用記録媒体又は記憶手段も本発明に包含される。このような記録媒体又は記憶手段には、フレキシブルディスク、ハードディスク、メモリストレージ等の磁気的媒体、ＣＤ、ＤＶＤ等の光学的媒体、ＭＯ、ＭＤ等の磁気光学的媒体などがあるが、これらに限定されない。
【００８８】
また、本発明の解析用コンピュータプログラムは、情報伝送媒体を介して又はワイヤレスでネットワーク接続された別のコンピュータから必要に応じてダウンロードすることにより、コンピュータ上で実行させ、使用することができる。情報伝送媒体とは、本発明の解析用コンピュータプログラムを、プログラム情報を搬送波として伝搬させて供給するためのコンピュータネットワークシステムにおける通信媒体をいい、このような情報伝送媒体としては、１０ＢＡＳＥ−Ｔケーブル、１００ＢＡＳＥ−ＴＸケーブル、１０００ＢＡＳＥ−ＴＸケーブル等があげられるが、これらに限定されない。
【００８９】
本発明の解析用コンピュータプログラムは、情報伝送媒体を介して又はワイヤレスでネットワーク接続された別のコンピュータ上で動作させて、コンピュータ上で動作するクライアントプログラムによってアクセスすることにより、使用することができる。コンピュータネットワークシステムとしては、ＬＡＮ（Local Area Network）、インターネット等のＷＡＮ（Wide Area Network）、ＭＡＮ（Metropolitan Area Network）、イントラネット、ＳＡＮ（Storage Area Network）、無線通信ネットワーク等のシステムがあげられるがこれらに限定されない。通信媒体としては、光ファイバーや無線回線等があげられるが、これらに限定されない。クライアントプログラムとしては、ＷＥＢブラウザ、ターミナルソフト、本解析用コンピュータプログラム専用のクライアントソフト等があげられるが、これらに限定されない。
【００９０】
＜昆虫の生息地域を特定する方法に用いるプライマー及びプローブ＞
本発明はまた、昆虫の生息地域を特定する方法に用いるプライマー及びプローブを提供する。
【００９１】
本発明のメルクマールの１塩基多型が認められる塩基のうち、ある生息地域に特異的な塩基を選択して、当該塩基を中心にプライマー及びプローブを設計することができる。このプライマー及びプローブを用いて、被検体の昆虫由来のＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲによる増幅を行うと、増幅された場合（陽性）をその生息地域由来の昆虫と特定することができ、増幅がされなかった場合（陰性）は当該生息地域由来の昆虫ではないことがわかる。ある生息地域に特異的な塩基は、具体的には、上記<本発明の地域識別メルクマール>に記載された方法で選択することができる。
【００９２】
例えば、表１のコクヌストモドキのＣＯＩ遺伝子の解析領域において、５’末端から第２２９番目と２９８番目の塩基に１塩基多型が認められる。すなわち、日本１タイプでは、これらの塩基がＧであるのに対し、日本国本州以外の地域に生息するもの（以後、「海外産」と記載することもある）は、これらの塩基はＡである。この違いに着目して、以下の実施例に記載するように、例えば、日本１タイプに特異的なプライマー（以後、「本州産用プライマー」と記載することもある）及び海外産に特異的なプライマー（以後、「海外産用プライマー」と記載することもある）を設計することができる。具体的には、以下の実施例に示す配列番号１７〜２４に示される核酸を含むプライマーを設計することができる。このように、本発明の上記１塩基多型における塩基の違いがＡ及びＧであることから、本州産用プライマーで陽性を示し、かつ海外産用プライマーで陰性を示したものは、日本国本州に生息しているものであることがより精度よく特定できるため、好ましい。すなわち、１のタイプのみに存在し、それ以外のタイプには存在しない塩基であれば本発明のプライマーとすることが可能であるが、さらにそれ以外のタイプの塩基が同一である場合には、より精度の高い識別が可能となる。
【００９３】
本発明のプライマーは、具体的に、コクヌストモドキが日本国本州に生息しているものか否かを特定することもできる。具体的には、上記プライマーの対を適宜組合わせたり、各プライマーに含まれる塩基を改変等することにより、コクヌストモドキが日本国本州に生息しているものか否かを特定するプライマーを作製することができる。例えば、表１に示すように、コクヌストモドキのＮＤ５遺伝子の解析領域においては、５’末端から第２４８番目の塩基が日本１タイプではＡであるのに対し、海外産ではＧであり、以下の実施例に記載された配列番号２５〜２９に示される核酸を含むプライマー及び共通のプライマー（３’側）を設計することができる。このようなプライマー及びプローブを用いて、日本１タイプ、すなわち日本国本州に生息する昆虫由来のＤＮＡのみで陽性であり、それ以外の地域由来の昆虫由来のＤＮＡでは陰性であるプライマー及びプローブを作製することができる。例えば、この日本１タイプにのみ陽性結果をもたらすプライマーを用いることにより、被検体である昆虫が日本国本州に生息しているものか否かを特定することができる。
【００９４】
＜本発明のプライマーやプローブを用いて、昆虫の生息地域を特定する方法＞
本発明は、上記プライマーやプローブを用いて、昆虫の生息地域を特定する方法を提供する。具体的には、（ａ）被検体である昆虫のＤＮＡを抽出する工程；（ｂ）前記工程（ａ）で抽出したＤＮＡを本発明のプライマー及び／又はプローブと接触させる工程；（ｃ）ＤＮＡ断片を増幅する工程；及び（ｄ）被検体である昆虫の生息地域を特定する工程；を含む方法である。以下、各工程を具体的に説明する。
【００９５】
（ａ）被検体である昆虫のＤＮＡを抽出する工程は、上記＜本発明のメルクマールの作製方法＞「（ａ）２以上の生息地域由来の１以上の昆虫のＤＮＡの塩基配列を決定する工程」のうち、「（２）ＤＮＡの抽出」に記載したのと同様の方法で、ＤＮＡを抽出することができる。
【００９６】
（ｂ）抽出したＤＮＡを本発明のプライマー及び／又はプローブと接触させる工程
ＰＣＲの増幅反応に適する条件で接触させるのであれば、どのような方法を用いることができ、市販のキット等を用いてもよい。例えば、PerfectShot Ex Taq (Loading dye mix)（タカラバイオ株式会社）を用い、添付のマニュアルに準じてＰＣＲ反応液（５０μｌ；０．２ｍｌ容のマイクロチューブ）を調製し、適当な終濃度となるように、プライマー及び／又はプローブとテンプレート（鋳型ＤＮＡ）を添加してＰＣＲ反応液とすることができる。
【００９７】
（ｃ）ＤＮＡ断片を増幅する工程
ＤＮＡ断片の増幅は、公知の方法を用いてよい。例えばリアルタイムＰＣＲを用いることもできる。ＰＣＲの増幅条件としては、陽性になるべきプライマー及び／又はプローブと鋳型が増幅する条件であれば、どのような条件も用いることができる。例えば、上記のＰＣＲ反応液を用いて、９４℃、３分間の変性を行った後、変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、４５秒）、鎖伸長（７２℃、６０秒）の反応を４０回繰り返すようなＰＣＲ条件で行ってもよい。
【００９８】
（ｄ）被検体である昆虫の生息地域を特定する工程
被検体である昆虫の生息地域を特定するには、上記（ｃ）で行ったＰＣＲによる増幅の有無を確認し、その結果を解析することを行う。
【００９９】
具体的には、上記で得られたＰＣＲ反応液の適当量を適当な条件でアガロースゲル電気泳動に供した後、臭化エチジウム溶液中で染色して、ＵＶ照射下で増幅産物の写真撮影を行い、目的のＤＮＡ断片が増幅されているか否かを確認する。例えば、コクヌストモドキのＣＯＩ遺伝子の期待される大きさは１１０塩基長であり、ＮＤ５遺伝子の期待される大きさは１３９塩基長である。増幅された場合は、目的とするＤＮＡ断片のバンドが目視できるため、バンドが目視された場合は、被検体由来のＤＮＡは当該プライマーに対して陽性であると認められ、被検体である昆虫は、当該プライマーの生息地域に由来する昆虫であると特定することができる。
【０１００】
本発明はまた、工程（ｃ）のＤＮＡ断片を増幅する工程として、リアルタイムＰＣＲ法を用いることもできる。この場合、本発明のメルクマールの１塩基多型が認められる塩基のうち、ある生息地域に特異的な塩基を選択して、当該塩基を中心にして設計し、合成したプローブ及びプライマーを用いることができる。例えば、プライマー及びプローブの設計及び合成にはABI社のCustom TaqMan(R) Gene Expression/SNP Genotyping Assaysサービスを利用してもよい。このABI社のＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブを用いる場合の原理を以下に説明する。
【０１０１】
まず、ゲノム上でＳＮＰを含む領域を増幅できるＰＣＲプライマーを１セットとゲノムＤＮＡの１塩基変異に対応するＴａｑｍａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブを２種類用意する。基本的には、当該プライマーとアレル１とアレル２に相補的な配列を有する２種類のＴａｑｍａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ、鋳型ＤＮＡを混合し、ＰＣＲを行い、２種類のアレルのＳＮＰを検出する。具体的に、本発明で用いるプローブは、５’末端をＦＡＭ又はＶＩＣのリポーター蛍光色素でラベルしたほか、さらに３’末端に非蛍光性クエンチャー（ＮＦＱ）とＭｉｎｏｒ  Ｇｒｏｏｖｅ  Ｂｉｎｄｅｒ（ＭＧＢ）をつけたものである。すなわち、このプローブが単体で存在している場合、リポーター励起光（４８８ｎｍ）を照射するとリポーター蛍光色素が励起し蛍光（５３０−５６０ｎｍ前後）を発するが、このリポーターの蛍光波長がクエンチャーに吸収され、しかもクエンチャーは蛍光を発しないため、リポーターの蛍光が抑制される。このＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブをＰＣＲ反応に用いると、伸長ステップでＰＣＲプライマーと共に鋳型ＤＮＡにハイブリダイズした当該プローブが、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により加水分解される。その結果、リポーター蛍光色素が遊離し、リポーターの蛍光強度が増加するのに加え、ＮＦＱについているＭＧＢがプローブと鋳型ＤＮＡがハイブリダイズした小さな溝（隙間）に入り込んで結合する。これにより、プローブと鋳型ＤＮＡの結合力が高まり、Ｔｍ値が上昇する。Ｔｍ値が上がると短い配列でも、１塩基の差をより明確に識別することが可能になる。ＰＣＲの結果は、予めプローブに標識されている蛍光物質を検出する検出器を用いて、増幅の有無を確認することにより得ることができる。
【０１０２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０３】
１．昆虫からのシークエンスデータ
（ア）昆虫
ＤＮＡ抽出に用いた昆虫は、鞘翅目ゴミムシダマシ科に属するコクヌストモドキであり、日本を含む世界各地に生息し同一形態である昆虫として、また、小麦粉などの穀粉の大害虫として最も普遍的に知られる。本実施例で用いたコクヌストモドキは7地域に生息していたものを採集し、それぞれ個別に飼育したものである。その内訳は、千葉県内の新築家屋にて採集された千葉産、浦和の野外にて採集された浦和産、岡山県内の新築ではない家屋にて採集された岡山産、住化テクノサービス社が宝塚にて採集し、飼育したものを購入した宝塚産、沖縄県内で採集された沖縄産、２００６年５月にタイで購入したカシューナッツに混入していたタイ産、カナダから香港に輸出された小麦粉に混入していたカナダ産である。ＤＮＡの抽出には、通常、これらの昆虫の全体を用いた。【０１０４】
（イ）ＤＮＡ抽出
ＤＮＡ抽出にあたっては、以下に説明するように、ＣＴＡＢ法を用いて抽出したＤＮＡをＰＣＲで増幅して、シークエンスを行い、シークエンスデータを得た。【０１０５】
ＣＴＡＢ法によるＤＮＡの抽出方法は以下のとおりである。【０１０６】
２％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ（Calbiochem社製）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１．４Ｍ ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ（Polyvinylpyrrolidone）を組成とするＣＴＡＢ液を調製した。このＣＴＡＢ液６５０μｌを昆虫の検体と共にマイクロホモジナイザーに入れた。次に、この検体とＣＴＡＢ液の入ったマイクロホモジナイザーを内部の試料が浸るように６５℃の恒温水槽に漬けて１０分間インキュベートした。続いてマイクロホモジナイザーのガラス管（底が磨りガラス状）とセットになった、先端が球状で磨りガラスになったガラス棒（ガラス管の底に合うように加工されたもの）で検体をすりつぶした後、１ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ溶液２μｌを加え、６５℃、１時間インキュベートして昆虫の細胞を破砕した。これを、１．５ｍｌ容のマイクロチューブに移し変え、等量（６５０μｌ）のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、手で３分間転倒混和した。短時間の遠心分離（Beckman Allegra 21R Centrifuge F2402H；１５，０００ｒｐｍ（約１５，０００×ｇ）で１〜５分間））を行い、有機溶媒層（下層）と水層（上層）に分画し、水層（約４００μｌ）を新しいチューブに移した。等量のイソプロピルアルコールを加え、転倒混和後、上記と同様に遠心分離を行った。上清を捨て、沈殿を７０％エタノールでリンスし、乾燥させたものを、２０〜５０μｌのＴＥバッファーに溶解してＤＮＡ試料とした。【０１０７】
（ウ）ＰＣＲ
ＤＮＡ断片の増幅は、PerfectShot Ex Taq (Loading dye mix)（タカラバイオ株式会社）を用い、添付のマニュアルに準じてＰＣＲ反応液（５０μｌ；０．２ｍｌ容のマイクロチューブ）を調製した。ただし、プライマーとテンプレート（鋳型ＤＮＡ）の添加量（終濃度）、及びＰＣＲ条件は以下のようにした。
１）ミトコンドリアＣＯＩ遺伝子の解析
プライマーセット；
Ｌ６６２５  ５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＹＴＧＲＴＴＹＴＴＹＧＧＮＣＡＹＣＣ−３’（配列番号１３）１μＭ
Ｈ７００５  ５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＮＣＲＴＡＲＴＡＮＧＴＲＴＣＲＴＧ−３’（配列番号１４）１μＭ
テンプレート；１μｌ／５０μｌ反応液
このマイクロチューブをＰＣＲ装置（DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 9600;
旧Perkin Elmer社製又はTaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL）にセットして、ＰＣＲ増幅を以下の条件で行った。
変性：９４℃、１分
アニーリング：６０℃、１分
鎖伸長：７０℃、２分
上記反応を５０回繰り返した。なお、反応終了後、サンプルをすぐに取り出せない場合には、サンプルブロックの温度を４℃に下げて保持した。
２）ミトコンドリアＮＤ５遺伝子の解析
プライマーセット； 
Ｆ６９９９  ５’−ＡＡＡＣＡＧＴＴＡＡＡＭＣＡＲＴＷＧＡＡ−３’（配列番号１５）１μＭ
Ｒ７４９５  ５’−ＣＣＴＧＴＷＴＣＷＤＣＴＴＴＡＧＴＷＣＡ−３’（配列番号１６）１μＭ
テンプレート；１μｌ／５０μｌ反応液
このマイクロチューブをＰＣＲ装置（DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 9600;旧Perkin Elmer社製又はTaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL）にセットして、ＰＣＲ増幅を以下の条件で行った。
プレ変性：９４℃、３分間
変性：９４℃、３０秒
アニーリング：４５℃、４５秒
鎖伸長：７２℃、６０秒
プレ変性以外の上記反応を４０回繰り返した。なお、反応終了後、サンプルをすぐに取り出せない場合には、サンプルブロックの温度を４℃に下げて保持した。【０１０８】
（エ）ＰＣＲによる増幅の確認
上記で得られたＰＣＲ反応液の５μｌをアガロースゲル電気泳動に供した。この際、ミニゲル電気泳動システム「Ｍｕｐｉｄ」を用いて電気泳動を実施（ゲル；３％ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅ（ＦＭＣバイオプロダクツ社製、又はCambrex Bio Science Rockland社製、泳動条件；１００Ｖ、３０分）し、２μｇ／ｍｌ臭化エチジウム溶液中で約４０分間染色後、ＵＶ照射下で増幅産物の写真撮影を行い、目的のＤＮＡ断片（大きさが、ＣＯＩ；４３５塩基長、ＮＤ５；５１３塩基長）が増幅されていることを確認した（図１〜７（ＣＯＩ）、図８〜１３（ＮＤ５）で、それぞれ囲ったバンド）。【０１０９】
図１のレーン１はタイ産コクヌストモドキ−１を、レーン２は沖縄産コクヌストモドキ−１を、レーンＢは鋳型を添加していないブランクを、レーンＭは１００塩基長のｌａｄｄｅｒ  ｍａｒｋｅｒ（１００−ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を、それぞれ示す。図２のレーン１はカナダ産コクヌストモドキ−１を、レーンＢは鋳型を添加していないブランクを、レーンＭはサイズマーカー（１００−ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を、それぞれ示す。図３のレーン１は千葉産コクヌストモドキ−１を、レーン２は浦和産コクヌストモドキ−１を、レーン３は岡山産コクヌストモドキ−１を、レーンＢは鋳型を添加していないブランクを、レーンＭはサイズマーカー（１００−ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を、それぞれ示す。図４のレーン１はタイ産コクヌストモドキ−２を、レーン２はタイ産コクヌストモドキ−３を、レーンＢは鋳型を添加していないブランクを、レーンＭはサイズマーカー（１００−ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を、それぞれ示す。図５のレーン１〜１０はそれぞれ、コクヌストモドキのカナダ産−２、−３、沖縄産−２、−３、千葉産−２、−３、岡山産−２、−３、浦和産−２、−３を、レーンＢは鋳型を添加していないブランクを、レーンＭはサイズマーカー（１００−ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）をそれぞれ示す。図６のレーン１〜６はそれぞれ、タイ産コクヌストモドキ−４、−５、沖縄産コクヌストモドキ−４、−５、カナダ産コクヌストモドキ−４、−５を、レーンＢは鋳型を添加していないブランクを、レーンＭはサイズマーカー（１００−ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を、それぞれ示す。図７のレーン１は宝塚産コクヌストモドキ−１を、レーン２は宝塚産コクヌストモドキ−２を、レーン３は宝塚産コクヌストモドキ−３を、レーンＢは鋳型を添加していないブランクを、レーンＭはサイズマーカー（１００−ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を、それぞれ示す。図８のレーン１はタイ産コクヌストモドキ−１を、レーンＢは鋳型を添加していないブランクを、レーンＭはサイズマーカー（１００−ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を、それぞれ示す。図９のレーン１は沖縄産コクヌストモドキ−１を、レーンＭはサイズマーカー（１００−ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を、それぞれ示す。図１０のレーン１〜６は、タイ産コクヌストモドキ−２、−３、岡山産コクヌストモドキ−１、浦和産コクヌストモドキ−１、千葉産コクヌストモドキ−１、カナダ産コクヌストモドキ−１を、レーンＭはサイズマーカー（１００−ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を、それぞれ示す。図１１のレーン１〜１０は、コクヌストモドキの浦和産−２、−３、岡山産−２、−３、千葉産−２、−３、沖縄産−２、−３、カナダ産−２、−３を、レーンＢは鋳型を添加していないブランクを、レーンＭはサイズマーカー（１００−ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を、それぞれ示す。図１２のレーン１〜３は、宝塚産コクヌストモドキ−１、−２、−３を、レーンＢは鋳型を添加していないブランクを、レーンＭはサイズマーカー（１００−ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を、それぞれ示す。図１３のレーン１〜６は、コクヌストモドキのタイ産−４、−５、沖縄産−４、−５、カナダ産−４、−５を、レーンＢは鋳型を添加していないブランクを、レーンＭはサイズマーカー（１００−ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）を、それぞれ��す。【０１１０】
（オ）ＰＣＲ産物の精製
上記ＰＣＲ産物の精製にはQIAquick PCR Purification Kit（５０）（キアゲン社）を使用し、プロトコ−ルに基づいて以下の方法で行った。すなわち、ＰＣＲ反応液（残量約４５μｌ）にＰＢＩ緩衝液を５倍量（２２５μｌ）加えて、混和した。次に、この液をQIA quickspinに入れ、１３，０００ｒｐｍ（約１１，０００×ｇ）で１分間遠心分離した。ろ液を捨て、７５０μｌＰＥ緩衝液を添加した後、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。ろ液を捨て、再度１４，０００ｒｐｍ（約１３，０００×ｇ）で１分間遠心分離した。ろ液を捨て、新しい１．５ｍｌ容のマイクロチューブにカラムを移し、３０μｌＥＢ緩衝液を添加し、１分間放置後、１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、ろ液をサンプルとした。【０１１１】
（カ）サイクルシークエンス反応及びシークエンス産物の精製
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（ABI社）を用い、その日本語版プロトコール（第２２頁「１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡのサイクルシークエンス」、第２５頁「ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９７００、９６００、２７００、２４００でのサイクルシークエンス」及び第３８〜４０頁「スピンカラム（やスピンプレート）での精製法」）に基いて以下のように実施した。なお、用いたプライマーの塩基配列は、目的のＤＮＡ断片のＰＣＲによる増幅に用いたものと同じである。すなわち、ＰＣＲ産物の精製液を５〜２０ｎｇ／μｌになるように滅菌蒸留水で希釈し、このうちの２μｌにSequence premix（Big dye）を８μｌと１μＭに希釈した上記プライマー；Ｌ６６２５、Ｈ７００５（ＣＯＩ領域解析用）、又はＦ６９９９、Ｒ７４９５（ＮＤ５領域解析用）をそれぞれ単独で３．２μｌ添加し、滅菌蒸留水にて最終２０μｌに調整したサイクルシークエンス反応液を得た。これを０．２ｍｌ容のマイクロチューブ（ＰＣＲ用）に入れ、ＰＣＲ装置（DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 9600;旧Perkin Elmer社製）にセットして、変性（９６℃、１分）を行った後、変性（９６℃、１０秒）、アニーリング（５０℃、５秒）、鎖伸長（６０℃、４分）の反応を２５回繰り返した。なお、反応終了後、サンプルをすぐに取り出せない場合には、サンプルブロックの温度を４℃に下げて保持した。【０１１２】
シークエンス産物は、CENTRI-SEP SpinColumn（ABI社）にて精製した。すなわち、充填剤を室温で２時間以上膨潤させて前処理の完了しているCENTRI-SEP SpinColumnの中心部に上記シークエンス産物（約２０μｌ）を載せるように添加し、１．５ｍｌ容のマイクロチューブを下部に受け、２，７００ｒｐｍ（約５００×ｇ）、２分間遠心分離を行い、マイクロチューブ内に集まった溶液を精製ＤＮＡとして回収した。この溶液を減圧下で乾燥させた後、２０μｌのＴＳＲ又はＨｉ−Ｄｉホルムアミドを添加し、１０分間程度放置した後、よく混和した。この液を０．２ｍｌ容のマイクロチューブ（ＰＣＲ用）に移し、DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 9600にて変性（９５℃、２分）を行い、直ちに氷中に挿入して急冷し、そのまま１０分間以上放置した。【０１１３】
（キ）ＤＮＡシークエンス
ABI PRISM 310 Genetic Analyzerを使用し、「ABI PRISM 310 Genetic Analyzer操作ガイド」に基づいて実施した。すなわち、上記の急冷後の試料をサンプルチューブに移し、チューブセプタで蓋をし、４８穴サンプルトレーにセットした。その後は、操作ガイドに従ってダイターミネーター法によりシークエンスを実施した。【０１１４】
（ク）塩基配列の解析
５’側（プライマーＬ６６２５、又はＦ６９９９側）と３’側（プライマーＨ７００５、又はＲ７４９５側）からそれぞれ得られたシークエンスデータを照合して正確な塩基配列を決定した。こうして得られた配列データを以下に示した。
１）ＣＯＩ領域（全長３７９塩基）
日本１タイプ（配列番号１）：浦和産（１〜３）、岡山産（１〜３）、千葉産（１〜３）、宝塚産（１〜３）【０１１５】
【数１】
2010035686.tif 000002
日本２タイプ（配列番号２）：沖縄産（２〜５）【０１１６】
【数２】
2010035686.tif 000003
日本３タイプ（配列番号３）：沖縄産（１）【０１１７】
【数３】
2010035686.tif 000004
海外１タイプ（配列番号４）：タイ産（１、３〜５）【０１１８】
【数４】
2010035686.tif 000005
海外２タイプ（配列番号５）：タイ産（２）【０１１９】
【数５】
2010035686.tif 000006
海外３タイプ（配列番号６）：カナダ産（１，４，５）【０１２０】
【数６】
2010035686.tif 000007
海外４タイプ（配列番号７）：カナダ産（２，３）【０１２１】
【数７】
2010035686.tif 000008
２）ＮＤ５領域（全長４７３塩基）
日本１タイプ（配列番号８）：浦和産（１〜３）、岡山産（１〜３）、千葉産（１〜３）、宝塚産（１〜３）【０１２２】
【数８】
2010035686.tif 000009
日本２タイプ及び海外１、２タイプ（配列番号９）：沖縄産（２〜５）及びタイ産（１〜５）【０１２３】
【数９】
2010035686.tif 000010
日本３タイプ（配列番号１０）：沖縄産（１）【０１２４】
【数１０】
2010035686.tif 000011
海外３タイプ（配列番号１１）：カナダ産（１、４、５）【０１２５】
【数１１】
2010035686.tif 000012
海外４タイプ（配列番号１２）：カナダ産（２、３）【０１２６】
【数１２】
2010035686.tif 000013
上記塩基配列につき、それぞれの領域内（ＣＯＩ、又はＮＤ５）における配列をインターネット上でＥＭＢＬ−ＥＢＩのＣｌｕｓｔａｌＷ２などの解析用コンピュータプログラムを用いて比較した（マルチプルアラインメント解析）。その結果、上記配列のうち網掛けで示した、ＣＯＩ領域において１５箇所、ＮＤ５領域においては５箇所に１塩基多型（ＳＮＰ）が認められた。これらの多型を組み合わせることにより、７つのタイプにタイプ分けでき、各タイプに属する昆虫の由来地域等から総合的に判断し、各タイプに相当する生息地域を、日本国本州、沖縄、タイ、カナダと特定した。すなわち、日本１タイプ（浦和、岡山、千葉、宝塚の各地域３個体ずつ計１２個体；ハプロタイプＩ−１（ＣＯＩ−ＮＤ５の順、以下同じ）には主として日本の本州地域が、日本２タイプ（沖縄地域４個体；II−２）及び日本３タイプ（沖縄地域１個体；III−３（タイプＬ）には主として沖縄が、海外１タイプ（タイ地域４個体；IV−２）及び海外２タイプ（タイ地域１個体；III−２）には主としてタイが、海外３タイプ（カナダ地域３個体；Ｖ−４）及び海外４タイプ（カナダ地域２個体；VI−５）には主としてカナダが相当すると決定した（表１）。なお、日本国本州由来の塩基を除いては、各地域ごとにそれぞれ２種類のハプロタイプが存在することが示されている。例えば、以下に示す表１のうち、日本２タイプの沖縄産２〜５と日本３タイプの沖縄産１、海外１タイプのタイ産1及び３〜５と海外２タイプのタイ産２、海外３タイプのカナダ産１、４及び５と海外４タイプのカナダ産２及び３である。【０１２７】
【表１】
2010035686.tif 000014
なお、さらに詳細な解析の結果、以下のような地域別の特徴が明らかとなった。日本１タイプとは、主として日本国のうち、生息地域を本州地域とするタイプをいい、ＣＯＩ遺伝子領域の５’末端から数えて第２２９、２９８番目がＧであり、第２５３番目がＴ、ＮＤ５領域の２４８番目がＡであることを特徴とする。日本２タイプ及び日本３タイプとは、生息地域を主として沖縄周辺とするタイプをいうが、タイ国周辺をその生息地域とする海外１タイプ由来のＤＮＡと極めて類似することが示され、地理的関係からいっても、互いに近縁であることが示唆された。海外１タイプ及び海外２タイプについては、ＮＤ５遺伝子領域の第２４８番目がＧである以外は日本１タイプと一致する。海外３タイプ及び海外４タイプとは、主としてカナダ国周辺をその生息地域とするタイプをいい、ＣＯＩ遺伝子領域の第２２番目がＴ、第１４２番目がＧであることを特徴とする。【０１２８】
２．コクヌストモドキの生息地域が日本国本州か否かを特定するための方法に用いるプライマーの開発
ＣＯＩの解析領域において、５’−末端から２２９番目と２９８番目の塩基に違いが認められた。すなわち、日本1タイプでは、これらの塩基がＧであるのに対し、海外産である沖縄を含む海外に生息するものは、これらの塩基はＡである。この違いに着目して、下記の塩基配列において枠で囲った位置にそれぞれ特異的なプライマーを設計した。【０１２９】
【数１３】
2010035686.tif 000015
設計したプライマーを以下に記す。
KN識別用プライマー及び改良プライマー
Honndo-F     AATTATTGCTGTCCCAACCGGG（配列番号１７）
Honndo-F2    AATTATTGCTGTCCCAACCGAG（配列番号１８）
Honndo-R     GGAATACAAATCCTAGTGCC（配列番号１９）
Honndo-R2    GGAATACAAATCCTAGTGAC（配列番号２０）
Kaigai-F     AATTATTGCTGTYCCAACCGGA（配列番号２１）
Kaigai-F2    AATTATTGCTGTYCCAACCGAA（配列番号２２）
Kaigai-R     RGAATACAAATCCTAGTGCT（配列番号２３）
Kaigai-R2    RGAATACAAATCCTAGTGAT（配列番号２４）
また、ＮＤ５の解析領域においては、同様に２４８番目の塩基が日本１タイプではＡであるのに対し、海外産ではＧであり、枠で囲った位置に特異的なプライマー及び共通のプライマー（３’−側）を設計した（下記ＮＤ５領域の塩基配列）。【０１３０】
【数１４】
2010035686.tif 000016
ND-Honndo-F     GAGTCAATAAATGGAAGAAA（配列番号２５）
ND-Honndo-F2    GAGTCAATAAATGGAAGATA（配列番号２６）
ND-Kaigai-F     GAGTCAATAAATGGAAGAAG（配列番号２７）
ND-Kaigai-F2    GAGTCAATAAATGGAAGATG（配列番号２８）
ND-Kyoutsuu-R    TTTATGTCCGGGTTAGGGGCGAG（配列番号２９）
ＰＣＲ
ＤＮＡ断片の増幅は、PerfectShot Ex Taq (Loading dye mix)（タカラバイオ株式会社）を用い、添付のマニュアルに準じてＰＣＲ反応液（５０μｌ；０．２ｍｌ容のマイクロチューブ）を調製した。ただし、プライマーとテンプレート（鋳型ＤＮＡ）の添加量（終濃度）、及びＰＣＲ条件は以下のようにした。
プライマー；
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（１μＭ）／Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（１μＭ）の組み合わせとして、
１．Ｈｏｎｎｄｏ−Ｆ／Ｈｏｎｎｄｏ−Ｒ
２．Ｋａｉｇａｉ−Ｆ／Ｋａｉｇａｉ−Ｒ
３．ＮＤ−Ｈｏｎｎｄｏ−Ｆ／ＮＤ−Ｋｙｏｕｔｓｕｕ−Ｒ
４．ＮＤ−Ｋａｉｇａｉ−Ｆ／ＮＤ−Ｋｙｏｕｔｓｕｕ−Ｒ
テンプレート；１μｌ／５０μｌ反応液
１．日本国本州産の代表として、浦和産（１）から抽出したＤＮＡ
２．海外産の代表として、カナダ産（１）から抽出したＤＮＡ
このマイクロチューブをＰＣＲ装置（DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 9600；旧Perkin Elmer社製、又はTaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL）にセットして、ＰＣＲ増幅を以下の条件で行った。
プレ変性：９４℃、３分間
変性：９４℃、３０秒
アニーリング：４５℃、４５秒
鎖伸長：７２℃、６０秒
プレ変性以外の上記反応を４０回繰り返した。
なお、反応終了後、サンプルをすぐに取り出せない場合には、サンプルブロックの温度を４℃に下げて保持した。
３．ＰＣＲによる増幅の有無の確認と結果の解析
上記で得られたＰＣＲ反応液の５μｌをアガロースゲル電気泳動に供した。この際、ミニゲル電気泳動システム「Ｍｕｐｉｄ」を用いて電気泳動を実施（ゲル；３％ＮｕＳｉｅｖｅ ３：１ Ａｇａｒｏｓｅ（FMCバイオプロダクツ社製、又はCambrex Bio Science Rockland社製）、泳動条件；１００Ｖ、３０分）し、２μｇ／ｍｌ臭化エチジウム溶液中で約４０分間染色後、ＵＶ照射下で増幅産物の写真撮影を行い、目的のＤＮＡ断片（期待される大きさが、ＣＯＩ；１１０塩基長、ＮＤ５；１３９塩基長）が増幅されているか否かを確認した（図１４）。図１４において、各レーンの説明は以下のとおりである。【０１３１】
【表２】
2010035686.tif 000017
結果は、レーン１，５，７，１１において、期待される増幅産物が認められたが、ネガティブが期待されたレーン２，４，８，１０にも類似のバンドが認められた。
そこで、上記ＰＣＲ条件において、アニーリングの温度を４５℃から５５℃に変更してＰＣＲを実施したところ、レーン４と８のバンドが薄くなったが、レーン２と１０については、ポジティブなバンド（レーン１や１１）と同程度の濃さのバンドが認められていた（図１５）。図１５において、各レーンの説明は表２と同様である。
そこで次に、上記のように３’−末端の隣の塩基を別のＡやＴに置き換えて、特異性をやや減少させたプライマーを合成した。これらを同様に以下のような組み合わせで用いてＰＣＲを実施した。
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（１μＭ）／Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（１μＭ）の組み合わせとして、
１．Ｈｏｎｎｄｏ−Ｆ２／Ｈｏｎｎｄｏ−Ｒ２
２．Ｋａｉｇａｉ−Ｆ２／Ｋａｉｇａｉ−Ｒ２
３．ＮＤ−Ｈｏｎｎｄｏ−Ｆ２／ＮＤ−Ｋｙｏｕｔｓｕｕ−Ｒ
４．ＮＤ−Ｋａｉｇａｉ−Ｆ２／ＮＤ−Ｋｙｏｕｔｓｕｕ−Ｒ
その結果、レーン２のバンドが消失し、レーン１との対比が明確になった（図１６）。すなわち、日本１タイプが陽性となり、海外産が陰性となる条件を見つけることができた。図１６における、各レーンの説明は以下の表のとおりである。【０１３２】
【表３】
2010035686.tif 000018
【実施例２】
【０１３３】
リアルタイムＰＣＲ法を用いたコクヌストモドキの生息地域の識別検定
（ア）昆虫
本実施例で用いたコクヌストモドキは、埼玉県（浦和）の野外にて採集されたもの（浦和産２）、カナダから香港に輸出された小麦粉に混入していたもの（カナダ産４）である。【０１３４】
（イ）ＤＮＡ抽出
実施例１と同様にしてＤＮＡを抽出した。【０１３５】
（ウ）ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブの合成
ＣＯＩ遺伝子の５’末端から数えて第２２９番目の塩基が本州産ではＧであるのに対して海外産ではＡであることに注目して、以下のＭＧＢプローブを合成した。
本州産用（ＫＮ＿ＣＯ１−Ｃ２２９Ｖ１；レポーターダイＶＩＣ）
ＣＡＡＣＣＧＧＧＡＴＴＡＡＡＡ（配列番号３０）
海外産用（ＫＮ＿ＣＯ１−Ｃ２２９Ｍ１；レポーターダイＦＡＭ）
ＣＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＡＡＡＡ（配列番号３１）
また、以下のようなＰＣＲ用のプライマーを合成した。
ＫＮ＿ＣＯ１−Ｃ２２９Ｆ：
ＡＧＣＣＴＡＴＴＴＣＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＡＡＴ（配列番号３２）
ＫＮ＿ＣＯ１−Ｃ２２９Ｒ：
ＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＴＡＡＧＡＴＴＡＣＴＣＣＴＧＴＴＡＧＴＣＣ（配列番号３３）
これらの位置関係は以下のようになる。すなわち、以下の配列のうち、下線部分がプライマーに相当し、二重下線の部分がＭＧＢプローブに相当する。以下の配列は、プライマーセットを含め１７９塩基長の増幅断片に相当する。【０１３６】
【表４】
2010035686.tif 000019
なお、上記のプローブ及びプライマーの設計及び合成はABI社のCustom TaqMan(R) Gene Expression/SNP Genotyping Assaysサービスを利用した。【０１３７】
（エ）ＰＣＲ
Custom TaqMan(R) Gene Expression/SNP Genotyping Assaysサービス (TaqMan MGB probes, FAM and VIC dye-labeled)により作製されたプライマー及びプローブに添付のマニュアルに準じてＰＣＲを実施した。すなわち、TaqMan Universal PCR Master Mixを１２．５μｌ、４０ｘＡｓｓａｙＭｉｘを０．６２５μｌ、前記２０μｌに溶解したＤＮＡ試料０．５又は１μｌを単独又は混合して添加し、純水で最終２５μｌに調整した。これらの調製液をMicroAmp Optical 8-Tube Strip（０．２ｍｌ）に入れて、7500 Real-Time PCR Systemを用いて所定の条件（９５℃−１０分、（９２℃−１５秒及び６０℃−１分）×４０サイクル）にて、リアルタイムＰＣＲを実施した。【０１３８】
（オ）結果
図１７及び１８は本州産用の検出（ＶＩＣ）の場合であるが、浦和産２のＤＮＡの場合に、増幅を示す立ち上がりが認められた（Ａ，Ｂ）。これに対し、カナダ産４のＤＮＡの場合には増幅は認められなかった（Ｃ，Ｄ）。ここで、図１７は、１μｌのデータを示しており、Ａが浦和産２、Ｃがカナダ産４、Ｅがブランクをそれぞれ示す。図１８は、０．５μｌのデータを示しており、Ｂが浦和産２、Ｄがカナダ産４、Ｅがブランクをそれぞれ示す。一方、図１９，２０は海外産用の検出（ＦＡＭ）の場合であるが、カナダ産４の場合に顕著な立ち上がりが認められた（Ｃ，Ｄ）。一方、浦和産２の場合にはＰＣＲ増幅が認められなかった（Ａ，Ｂ）。ここで、図１９は、１μｌのデータを示しており、Ａが浦和産２、Ｃがカナダ産４、Ｅがブランクをそれぞれ示す。図２０は、０．５μｌのデータを示しており、Ｂが浦和産２、Ｄがカナダ産４、Ｅがブランクをそれぞれ示す。このように、日本国本州由来とそれ以外（海外由来）の場合を明確に区別することができた。
【実施例３】
【０１３９】
１．昆虫からのシークエンスデータ
（ア）昆虫
ＤＮＡ抽出に用いた昆虫は、鞘翅目ナガシンクイムシ科に属するコナナガシンクイムシであり、日本を含む世界各地に生息し同一形態である昆虫として、また、米、麦等のイネ科穀物を加害する、コクゾウムシ類と並ぶ大害虫として知られる。本実施例で用いたコナナガシンクイムシは日本国内及び中国国内に生息していたものを採集し、それぞれ個別に飼育したものである。【０１４０】
（イ）ＤＮＡ抽出〜（ク）塩基配列の解析
実施例１と同様の操作によりＣＯＩ領域のＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを実施して、シークエンスを行い、シークエンスデータを得た。得られた配列データを以下に示した。
１）ＣＯＩ領域（全長３７９塩基）
日本１タイプを配列番号３４とし、中国１タイプを配列番号３５として以下に示す。【０１４１】
【数１５】
2010035686.tif 000020
上記の配列中、「国産」と記載されているものが配列番号３４の日本１タイプであり、「中国産」と記載されているものが配列番号３５の中国１タイプである。【０１４２】
上記塩基配列について、実施例１と同様の操作により解析を行った。その結果、得られた３７９塩基中５’末端から数えて１６０番目の塩基に日本１タイプが「Ｔ」であり、中国１タイプが「Ｃ」であるＳＮＰ（一塩基多型）が認められた。
【実施例４】
【０１４３】
加熱または加圧処理した検体由来ＤＮＡのＰＣＲによる増幅確認
加熱または加圧処理によりコクヌストモドキのＤＮＡを人為的に劣化させた場合のＰＣＲによる増幅の有無、およびリアルタイムＰＣＲ法による生息地域識別の可否を検討した。
（ア）昆虫
本実施例では、実施例１に記載の住化テクノサービス社から購入したコクヌストモドキ（宝塚産；日本１タイプ）を用いた。
（イ）検体の処理
Ａ．ミリQ水１ml中（マイクロチューブ中）に上記昆虫を２匹入れ、３０分または６０分煮沸（電磁加熱機使用）後氷中で急冷した。【０１４４】
Ｂ．１００mlトールビーカーにミリQ水約３０mlと上記昆虫２匹を入れ、１２１℃、１５分の条件でオートクレーブ処理し、５０℃台で取り出し、自然放冷した。
（ウ）ＤＮＡ抽出
実施例１（イ）と同様にしてＤＮＡを抽出した。
（エ）ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭＧＢプローブ
実施例２（ウ）に記載したものを使用した。
（オ）ＰＣＲ
以下の３通りの方法で実施した。【０１４５】
Ａ．実施例１（ウ）に記載のミトコンドリアＣＯI遺伝子の解析に使用したプライマーセット（L6625/H7005、増幅サイズ435 bp）を用い、実施例１（ウ）と同様にして実施した。【０１４６】
Ｂ．実施例２（ウ）に記載のプライマーセット（KN_CO1-C229F/KN_CO1-C229R、増幅サイズ179 bp）を使用し、ABI社のVeriti 96 Well Thermal Cyclerを用いて所定の条件（95℃-1 min、（92℃-15sec＋60℃-1min）ｘ 40 cycles）にて、ＰＣＲを実施した。【０１４７】
Ｃ．実施例２と同様にしてＭＧＢプローブを用いたリアルタイムＰＣＲを実施した。
（カ）結果
煮沸３０分処理した検体では、上記Ａの方法において、メルクマール全体を比較することが可能な領域である４３５bpのサイズの増幅バンドが認められた（図２５ 写真左Lane２；矢印、表５）。しかし、煮沸６０分やオートクレーブ（１２１℃、１５分）処理した検体では、このバンドは認められなかった（図２５ 写真左Lane ３, ４、表５）。しかしながら上記Ｂの方法を実施したところ、いずれの場合にも日本１タイプを特定することが可能な領域である１７９ bpのバンドが認められた（図２５ 写真右；矢印、表５）。更にＭＧＢプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ（上記Ｃの方法）を行ったところ、いずれの検体を用いた場合でも、これら検体の特徴である日本１（本州）タイプのコクヌストモドキであることを明確に確認することができた（表６）。このように検体である昆虫のＤＮＡが断片化されてしまった場合、メルクマール全体を比較して生息地域を特定することが困難となるが、ある生息地域に特異的な塩基を選択して当該塩基を基準に設計されたプライマー及びプローブを用いることにより、断片化ＤＮＡであっても生息地域の識別検定が可能である。【０１４８】
【表５】
2010035686.tif 000021
【０１４９】
【表６】
2010035686.tif 000022
【実施例５】
【０１５０】
自然死個体由来ＤＮＡのＰＣＲによる増幅確認
自然死したコクヌストモドキＤＮＡのＰＣＲによる増幅の有無を検討した。
（ア）昆虫
本実施例では飼育中に自然死し、その後室温保管で５ヶ月経過したコクヌストモドキ（生息地域不明）を使用した。
（イ）ＤＮＡ抽出とＰＣＲ
上記昆虫の２個体から実施例１と同様にしてＤＮＡを抽出し、実施例４の（オ）Ａに記載の方法と同様にしてＰＣＲを行った。
（ウ）結果
上記２個体ともに、メルクマール全体を比較することが可能な領域である４３５ bpの増幅バンドが認められた（図２６、矢印）。
【実施例６】
【０１５１】
ガンマ線照射検体由来ＤＮＡのＰＣＲによる増幅確認
ガンマ線照射によりコクヌストモドキのＤＮＡを人為的に劣化させた場合のＰＣＲによる増幅の有無、およびリアルタイムＰＣＲ法による生息地域識別の可否を検討した。
（ア）昆虫
本実施例では、つくば市の精米所にて採取されたコクヌストモドキ（日本1タイプと非日本1タイプが混在）を用いた。
（イ）検体の処理
上記昆虫（日本1タイプと非日本1タイプが混在）にガンマ線照射装置（Nordion社製のGamma Cell 220）にて60-Coガンマ線を線源として照射して検体を調製した。線量（Gy）としては、１．５K,２Kの２水準を設定し、照射時間は、それぞれ８１０秒、１８分とした。なお、この照射条件による正確な線量を、アラニン素子（Allanine Pellet Dosimeter ES200-2106，Bruker Biospin）を用いて作成した検量線から求めたところ、それぞれ１６２３，２１４２Ｇｙであった。
（ウ）ＤＮＡ抽出とＰＣＲ
上記の通り、設定水準１．５KGyと２ KGyの条件下でダメージを受けた検体（各条件につき２検体を試験に供した。図２７および表７中ではそれぞれ１．５K-１, １．５K-２, ２K-１, ２K-２と表記）について実施例１と同様にしてＤＮＡを抽出し、実施例４の（オ）Ａ及びＣに記載の方法と同様にしてＰＣＲを行った。【０１５２】
（エ）結果
供試した４検体（それぞれ１．５K-１, １．５K-２, ２K-１, ２K-２）についてＤＮＡを抽出し、それを鋳型にしたときの通常のＰＣＲ（実施例４、（オ）Ａに記載の方法）を実施したところ、４検体中、２ KGy を照射した１検体を除き３検体に目的の４３５ bpのサイズの増幅バンドが認められず、ＤＮＡ断片化が進行していると考えられた（図２７、矢印）。そこで同じ鋳型ＤＮＡについて、ＭＧＢプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ（実施例４（オ）Ｃに記載の方法）を実施したところ、４検体いずれにもＰＣＲ反応が認められ、更に２K-１, ２K-２, １．５K-２が本州タイプであり、１．５K-１のみが非本州タイプであることがわかり、明確な生息地域識別まで可能であった（表７）。【０１５３】
【表７】
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【配列表フリーテキスト】
【０１５４】
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
配列番号１５：プライマー
配列番号１６：プライマー
配列番号１７：プライマー
配列番号１８：プライマー
配列番号１９：プライマー
配列番号２０：プライマー
配列番号２１：プライマー
配列番号２２：プライマー
配列番号２３：プライマー
配列番号２４：プライマー
配列番号２５：プライマー
配列番号２６：プライマー
配列番号２７：プライマー
配列番号２８：プライマー
配列番号２９：プライマー
配列番号３０：プローブ
配列番号３１：プローブ
配列番号３２：プライマー
配列番号３３：プライマー
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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