(57)【要約】  本発明の課題は、腫瘍に対する同種造血幹細胞移植治療における免疫学的再構築促進剤あるいは感染症予防剤を提供することにある。本発明は、同種造血幹細胞移植によるＧＶＴ効果を維持しつつ、当該移植後の免疫学的再構築遅延の改善ないし感染症予防を可能とした。すなわち、免疫学的再構築が遅延した当該移植患者に、ＣＤ４＋細胞除去物質を当該移植後早期に投与することにより、その再構築を促進させることを可能とした。これにより、当該患者の感染症管理の早期終了および生存率の向上が見込まれ、副次的には、同種造血幹細胞移植に伴う合併症リスクを減らすことで、その適用をさらに拡大することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
同種造血幹細胞移植の移植片対腫瘍効果を保持する感染症予防剤であって、ＣＤ４陽性細胞を除去する物質を含有し、かつ、同種造血幹細胞移植を受けた腫瘍患者に移植と同日または移植後１〜約６０日目の間に、１日１回〜約６０日に１回投与されることを特徴とする感染症予防剤。
【請求項２】
移植後５〜１４日目の間に、１日１回〜１０日に１回投与されることを特徴とする請求項１記載の感染症予防剤。
【請求項３】
ＣＤ４陽性細胞を除去する物質が、ＣＤ４抗体またはその改変および／または修飾体である請求項１または請求項２記載の感染症予防剤。
【請求項４】
ＣＤ４抗体が、ヒト化抗ヒトＣＤ４抗体またはヒト型抗ヒトＣＤ４抗体である請求項３記載の感染症予防剤。
【請求項５】
ＣＤ４抗体が、１回当り１〜３０ｍｇ／ｋｇ投与されることを特徴とする請求項３記載の感染症予防剤。
【請求項６】
腫瘍が、造血系腫瘍である請求項１記載の感染症予防剤。
【請求項７】
造血系腫瘍が、急性白血病、骨髄腫または悪性リンパ腫である請求項６記載の感染症予防剤。
【請求項８】
同種造血幹細胞移植が、骨髄移植、末梢血幹細胞移植または臍帯血移植である請求項１記載の感染症予防剤。
【請求項９】
同種造血幹細胞移植のドナーが、ＨＬＡ適合血縁者、ＨＬＡ適合非血縁者、ＨＬＡ不適合血縁者またはＨＬＡ不適合非血縁者である請求項１記載の感染症予防剤。
【請求項１０】
同種造血幹細胞移植が、ミニ移植またはフル移植である請求項１記載の感染症予防剤。
【請求項１１】
同種造血幹細胞移植における移植前処置が、抗癌剤投与もしくは放射線照射またはそれらの組み合わせである請求項１記載の感染症予防剤。
【請求項１２】
感染症が、病原性ウイルス感染症、病原菌感染症、病原性真菌感染症または病原性寄生体感染症である請求項１記載の感染症予防剤。
【請求項１３】
感染症予防が、骨髄に対する移植片対宿主反応に基づく免疫学的再構築遅延を改善することからなる請求項１記載の感染症予防剤。
【請求項１４】
同種造血幹細胞移植の移植片対腫瘍効果を保持する免疫学的再構築促進剤であって、ＣＤ４陽性細胞を除去する物質を含有し、かつ、同種造血幹細胞移植を受けた腫瘍患者に移植と同日または移植後１〜約６０日目の間に、１日１回〜約６０日に１回投与されることを特徴とする免疫学的再構築促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍に対する同種造血幹細胞移植治療における免疫学的再構築促進剤または感染症予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞移植は、化学療法や放射線療法を組み合わせた前処置により、悪性腫瘍を死滅させた後、ドナーあるいは患者自身の造血幹細胞を輸注することにより新たな造血系を構築させる治療法である。そのうち、ドナーの造血幹細胞を輸注する同種造血幹細胞移植には、様々な造血器系腫瘍や他の治療法が期待できない固形腫瘍に対する抗腫瘍効果、すなわち、移植片対腫瘍効果（以下、ＧＶＴ効果と略記することがある。）が期待できる。しかしながら、同時に移植片対宿主病（以下、ＧＶＨＤと略記することがある。）と移植後の免疫学的再構築遅延に起因する感染症を伴うおそれがあり、これらがその癌免疫療法としての当該方法の適用拡大を制限している（非特許文献１および２）。【０００３】
ＧＶＨＤは、皮疹、黄疸、下痢を特徴とする症候群であり、活性化したドナーＴ細胞が皮膚、肝臓、腸管などに浸潤することにより惹起されると解されている。１９８０年代後半より急速に発展した免疫抑制剤の登場により、ＧＶＨＤの予防および治療成績は顕著に改善した。一方、ＧＶＨＤによる死亡率が低下した結果として、同種造血幹細胞移植後の免疫不全に伴う致死的感染症が、当該移植の予後を左右する重大な因子として顕在化してきた。しかしながら、当該移植後の免疫学的再構築遅延について、その発症機序や有効な治療法は未だ確立しておらず、現状では免疫グロブリン製剤や抗生剤の投与といった対症療法に依存せざるを得ない状況にある。【０００４】
本発明は、同種造血幹細胞移植後の免疫学的再構築促進あるいは感染症予防として、ＣＤ４陽性（以下、ＣＤ４＋と略記することがある。）細胞を除去する物質（以下、ＣＤ４＋細胞除去物質と略記することがある。）を適用しようとするものであるが、未だそのような報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ  ＷＤ，ネイチャー・レヴュー・イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），２００７年，第７巻，第５号，ｐ．３４０−３５２
【非特許文献２】Ａｂｒａｈａｍｓｅｎ  ＩＷ，ほか５名，ヘマトロジカ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ），２００５，第９０巻，第１号，ｐ．８６−９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、腫瘍に対する同種造血幹細胞移植治療における免疫学的再構築促進剤あるいは感染症予防剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、臨床経過においてＧＶＨＤの重症度と免疫学的再構築遅延が強い相関性を示すこと、さらにＧＶＨＤ発症時に骨髄抑制（血球減少）が顕現することを受けて鋭意研究を重ねた結果、
（１）同種造血幹細胞移植後に生じる骨髄組織における広範な出血と構造破壊および造血障害（以下、骨髄ＧＶＨＤと記載することがある。）が、骨髄におけるＴおよびＢリンパ球前駆細胞の分化および増殖を抑制し、当該リンパ球による細胞性免疫および液性免疫の回復を遅延していること、
（２）当該障害はドナーＣＤ４＋Ｔリンパ球により引き起こされること、
（３）当該移植後早期にＣＤ４＋Ｔ細胞を除去する処置により、当該障害が改善され、末梢におけるＴおよびＢリンパ球の再構築が促進されること、
（４）当該処置はＧＶＴ効果を阻害しないことを見いだし、本発明を完成させた。【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］同種造血幹細胞移植の移植片対腫瘍効果を保持する感染症予防剤であって、ＣＤ４陽性細胞を除去する物質を含有し、かつ、同種造血幹細胞移植を受けた腫瘍患者に移植と同日または移植後１〜約６０日目の間に、１日１回〜約６０日に１回投与されることを特徴とする感染症予防剤。
［２］移植後５〜１４日目の間に、１日１回〜１０日に１回投与されることを特徴とする前記［１］記載の感染症予防剤。
［３］ＣＤ４陽性細胞を除去する物質が、ＣＤ４抗体またはその改変および／または修飾体である前記［１］または前記［２］記載の感染症予防剤。
［４］ＣＤ４抗体が、ヒト化抗ヒトＣＤ４抗体またはヒト型抗ヒトＣＤ４抗体である前記［３］記載の感染症予防剤。
［５］ＣＤ４抗体が、１回当り１〜３０ｍｇ／ｋｇ投与されることを特徴とする前記［３］記載の感染症予防剤。
［６］腫瘍が、造血系腫瘍である前記［１］記載の感染症予防剤。
［７］造血系腫瘍が、急性白血病、骨髄腫または悪性リンパ腫である前記［６］記載の感染症予防剤。
［８］同種造血幹細胞移植が、骨髄移植、末梢血幹細胞移植または臍帯血移植である前記［１］記載の感染症予防剤。
［９］同種造血幹細胞移植のドナーが、ＨＬＡ適合血縁者、ＨＬＡ適合非血縁者、ＨＬＡ不適合血縁者またはＨＬＡ不適合非血縁者である前記［１］記載の感染症予防剤。
［１０］同種造血幹細胞移植が、ミニ移植またはフル移植である前記［１］記載の感染症予防剤。
［１１］同種造血幹細胞移植における移植前処置が、抗癌剤投与もしくは放射線照射またはそれらの組み合わせである前記［１］記載の感染症予防剤。
［１２］感染症が、病原性ウイルス感染症、病原菌感染症、病原性真菌感染症または病原性寄生体感染症である前記［１］記載の感染症予防剤。
［１３］感染症予防が、骨髄に対する移植片対宿主反応に基づく免疫学的再構築遅延を改善することからなる前記［１］記載の感染症予防剤。
［１４］同種造血幹細胞移植の移植片対腫瘍効果を保持する免疫学的再構築促進剤であって、ＣＤ４陽性細胞を除去する物質を含有し、かつ、同種造血幹細胞移植を受けた腫瘍患者に移植と同日または移植後１〜約６０日の間に、１日１回〜約６０日に１回投与されることを特徴とする免疫学的再構築促進剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明にかかる薬剤は、同種造血幹細胞移植によるＧＶＴ効果を維持しつつ、当該移植後の免疫学的再構築の促進ないし感染症予防を可能とした。
すなわち、ＣＤ４＋細胞除去物質を当該移植後早期に、当該移植を受けた腫瘍患者、特に免疫学的再構築が遅延した患者に投与することにより、その再構築を促進させることを可能とした。これにより、当該患者の感染症管理の早期終了および生存率の向上が見込まれる。副次的には、同種造血幹細胞移植に伴う合併症リスクを減らすことで、その適用をさらに拡大することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】骨髄ＧＶＨＤの発症機序の概念図である。
【図２】ＢＭＴおよびＧＶＨＤ群における、骨髄細胞（図中Ａ）、脾臓細胞（Ｂ）、胸腺細胞（Ｃ）の各々の総細胞数および骨髄における顆粒球（Ｄ）、単球（Ｇ）、赤芽球系細胞（ＣＤ７１＋およびＴｅｒ１１９＋／−）（ＦおよびＩ）、脾臓ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（ＥおよびＨ）、の各々の細胞数の経時的変化を示す。
【図３】ＢＭＴおよびＧＶＨＤ群における、ドナーＴ細胞（ＡおよびＢ）およびドナー骨髄由来細胞（ＣないしＦ）の各々の細胞数の経時的変化を示す（Ａ、Ｂ、ＤおよびＥは脾臓、ＣおよびＦは胸腺の結果である）。
【図４】ＢＭＴおよびＧＶＨＤ群における、骨髄（ＡおよびＣ）および脾臓（ＢおよびＤ）におけるＢ細胞数の経時的変化を示す。
【図５】骨髄総細胞（ＡおよびＣ）およびそのｃ−Ｋｉｔ（＋）Ｓｃａ−１（＋）分画（ＢおよびＤ）における血球分化に関与する因子（ＣＸＣＬ１２，Ｐａｘ５，Ｅ２ａ，Ｅｂｆ１，ＩＦＮｇａｍｍａ，ＩＬ−７Ｒ，Ｉｒｆ１，ＧＡＴＡ３）のｍＲＮＡ発現を示す。
【図６（Ａ）】ＢＭＴおよびＧＶＨＤ群における移植後１４日目の腸管免疫組織染色像（２００倍）を示す。
【図６（Ｂ）】ＢＭＴおよびＧＶＨＤ群における移植後１４日目の糞便中ＩｇＡ濃度（ＥＬＩＳＡによる）を示す。
【図７】ＧＶＨＤ動物モデルマウスの移植後２１日目骨髄切片のヘマトキシリン・エオシン染色像を示す。
【図８】ＢＭＴおよびＧＶＨＤ群における、骨髄でのＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ１２）発現を示す。
【図９】変異型ＦａｓＬを有するｇｌｄマウス由来脾臓Ｔ細胞と変異型Ｆａｓを有するｌｐｒマウス由来骨髄細胞を種々の組み合わせで用いた実験での、Ｂ細胞産生および経時的な体重変化を示す（図中、組み合わせ表記は[ＢＭ／ＳＰＬ]である。）。
【図１０】ＣＤ４抗体またはＣＤ８抗体投与によるＢ細胞数への影響を示す。
【図１１】ＣＤ４抗体またはＣＤ８抗体投与によるナイーブ（ＴＮ）またはエフェクター（ＴＥ）ＣＤ４＋Ｔ細胞数への影響を示す。
【図１２】ＣＤ４抗体投与による移植後１００日目の血清イムノグロブリン濃度への影響を示す。
【図１３】ＣＤ４抗体またはＣＤ８抗体投与による、ＧＶＨＤ動物モデルマウスの生存率（Ａ：Ｐ８１５細胞同時輸注時のＧＶＴ効果）、ＧＶＨＤスコア（Ｂ）および体重の経時的変化（Ｃ）への影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
移植片対宿主反応（以下、ＧＶＨ反応と略記することもある。）とは、移植されたドナーからの造血細胞が、その免疫応答によってレシピエントの臓器を攻撃することによって起こる反応であり、ドナーＴ細胞が皮膚、肝臓または腸管等に浸潤することにより惹起され、主な症状として、皮疹、黄疸および／または下痢を引き起こすことを特徴とする。本発明は、骨髄移植を受けた患者における免疫学的再構築遅延あるいは免疫機能低下が骨髄に対するＧＶＨ反応（以下、骨髄ＧＶＨ反応あるいは骨髄ＧＶＨＤと記載することがある。）に起因するという知見に基づく。その機序を図１に示す。すなわち、同種造血幹細胞移植後、輸注されたドナー造血幹細胞は骨髄微小環境に存在する骨髄造血ｎｉｃｈｅに定着し、増殖を経て各種白血球サブセットないしその前駆細胞を生み出す。骨髄ＧＶＨＤの機序としては、ドナーＴ細胞による骨髄造血ｎｉｃｈｅの障害による間接的な造血抑制と、ＩＦＮ、ＴＮＦ等の炎症性因子が血球系細胞の増殖・分化を抑制する直接的な造血抑制が考えられる。実施例に示すように、Ｆａｓ−ＦａｓＬ系路がドナーＴ細胞による骨髄ＧＶＨＤに部分的に関与し、さらには骨髄ＧＶＨＤの主原因となるドナーＴ細胞サブセットはＣＤ４＋細胞である。このような骨髄ＧＶＨＤは、レシピエントのＢ細胞産生・分化を停止させ、同時に顆粒球系細胞や、Ｔ細胞の産生も抑制することで、免疫学的再構築遅延に大きく関与し、移植後の感染症発症契機を増加させている。
【００１３】
移植片対腫瘍効果とは、移植されたドナーからの造血幹細胞に混入するＴ細胞が患者の癌もしくは腫瘍細胞を異物と認識して攻撃することによって認められる癌または腫瘍の増殖抑制ないし縮小・消失効果をいう。従って、この効果は、ＨＬＡ型が相違するドナーから採った細胞を輸注する同種移植でのみ認められる効果である。なお、この効果は、特に白血病に対する効果としては移植片対白血病効果（ＧＶＬ効果）と言われ、さらにはリンパ腫の場合には移植片対リンパ腫効果、多発性骨髄腫の場合には移植片対骨髄腫効果とも言われている。
【００１４】
本発明の薬剤の使用において、同種造血幹細胞移植を受けた腫瘍患者は、主に悪性腫瘍の患者を指すが、例えば、造血系腫瘍、大腸癌、腎臓癌（例えば、透明細胞カルシノーマ）、メラノーマ（例えば、転移性悪性メラノーマ）、前立腺癌（例えば、ホルモン難治性前立腺アデノカルシノーマ）、乳癌、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚若しくは眼窩内悪性メラノーマ、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管のカルシノーマ、子宮内膜カルシノーマ、子宮頚部カルシノーマ、膣カルシノーマ、外陰部カルシノーマ、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、柔組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形癌、膀胱癌、腎臓若しくは尿管の癌、腎盂カルシノーマ、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍新脈管形成、脊椎腫瘍、脳幹グリオーム、下垂体アデノーマ、カポシ肉腫、扁平上皮癌、扁平細胞癌、アスベスト誘発癌を含む環境誘発癌および上記の一以上の癌を有する患者が挙げられる。ここで、本発明の薬剤の使用が好適な腫瘍患者としては造血系腫瘍患者である。
【００１５】
造血系腫瘍としては、例えば、白血病および悪性リンパ腫等が挙げられる。白血病としては、例えば、リンパ性白血病（例えば、ヘアリーセル白血病、急性リンパ性白血病、前リンパ球性白血病、慢性リンパ性白血病（例えば、Ｂ細胞型慢性リンパ性白血病）、成人Ｔ細胞性白血病（成人Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病骨髄浸潤）、リンパ性白血病骨髄浸潤）、骨髄腫（例えば、形質細胞白血病、孤立性骨髄腫、多発性骨髄腫（例えば、ベンスジョーンズ型多発性骨髄腫、多発性骨髄腫性関節症、非分泌型多発性骨髄腫、骨髄腫腎、多発性骨髄腫骨髄浸潤））、骨髄異形成症候群（例えば、ＲＡＥＢ、ＲＡＥＢ−ｔ、不応性貧血、ＲＡＲＳ（原発性鉄芽球性貧血）、骨髄性白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性前骨髄球性白血病、好塩基球性白血病、好酸球性白血病、好中球性白血病、骨髄単球性白血病、慢性骨髄性白血病（例えば、慢性骨髄性白血病急性転化、慢性骨髄性白血病慢性期、慢性骨髄性白血病移行期、非定型慢性骨髄性白血病）、慢性骨髄単球性白血病（例えば、若年性骨髄単球性白血病）、骨髄性白血病骨髄浸潤）、急性白血病、慢性白血病、単球性白血病（例えば、急性単球性白血病、慢性単球性白血病）、くすぶり型白血病、レッテラー・ジーベ病、悪性組織球症、悪性肥満細胞腫、急性巨核芽球性白血病、形質細胞腫、骨髄線維症（例えば、急性骨髄線維症、原発性骨髄線維症、続発性骨髄線維症、特発性骨髄繊維症）、骨髄増殖性疾患、混合型白血病、髄膜白血病、赤白血病、単クローン性免疫グロブリン血症、低形成性白血病、二次性白血病、白血病性関節症、非定型的白血病、肥満細胞性白血病、肥満細胞腫症、クロウ・フカセ症候群などが挙げられ、悪性リンパ腫としては、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性リンパ腫（例えば、混合型びまん性リンパ腫、小細胞型びまん性リンパ腫、小切れ込み核細胞型びまん性リンパ腫、大細胞型びまん性リンパ腫、未分化型びまん性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、免疫芽球性リンパ節症、細網肉腫）、ホジキン病（例えば、リンパ球減少型ホジキン病、リンパ球優勢型ホジキン病、結節硬化型ホジキン病、混合細胞型ホジキン病）、リンパ腫、胃悪性リンパ腫、眼窩悪性リンパ腫、頚部悪性リンパ腫、甲状腺悪性リンパ腫、骨悪性リンパ腫、十二指腸悪性リンパ腫、縦隔悪性リンパ腫、小腸悪性リンパ腫、大腸悪性リンパ腫、脳悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（例えば、Ｔゾーンリンパ腫、セザリー症候群、レンネルトリンパ腫、菌状息肉症）、扁桃悪性リンパ腫、脾悪性リンパ腫、濾胞性リンパ腫（例えば、中細胞型濾胞性リンパ腫、混合型濾胞性リンパ腫、大細胞型濾胞性リンパ腫）、ＭＡＬＴリンパ腫、心臓悪性リンパ腫、結腸悪性リンパ腫、直腸悪性リンパ腫、悪性リンパ腫骨髄浸潤、悪性免疫増殖性疾患（例えば、アルファＨ鎖病、ガンマＨ鎖病、原発性マクログロブリン血症、免疫増殖性小腸疾患）、鼻腔悪性リンパ腫等が挙げられる。ここで、本発明の薬剤の使用が好適な造血系腫瘍としては、急性白血病、骨髄腫および悪性リンパ腫である。
【００１６】
本発明の薬剤の使用における同種造血幹細胞移植とは、ＨＬＡの型が一致あるいは類似している血縁者あるいは非血縁者の造血幹細胞を輸注して造血を再構築する方法である。造血幹細胞の採取あるいは入手には、あらかじめ血縁者のＨＬＡの型を検査あるいは骨髄バンク（例えば、日本骨髄バンク）もしくは臍帯血バンク（例えば、日本臍帯血バンクネットワーク）で患者のＨＬＡ型に一致もしくは類似するドナーを検索する必要がある。同種造血幹細胞移植は、ＧＶＴ効果が期待できるものの、ＧＶＨＤの発症が懸念されるため、本発明の薬剤が有効である。なお、造血幹細胞移植には、そのほかに、自己の造血幹細胞を輸注して造血を再構築する方法である自家造血幹細胞移植があるが、ＧＶＨＤの懸念がなく、ＧＶＴ効果があまりないという点で本発明の薬剤の必要性は低い。
【００１７】
造血幹細胞移植は、移植に用いる細胞の種類によって、骨髄移植、末梢血幹細胞移植および臍帯血移植の３種類に分類されるが、いずれの方法に対しても本発明の薬剤を使用することができる。骨髄移植は、骨髄液を移植することで造血幹細胞を移植するという方法である。骨髄液は、ドナーを全身麻酔し、骨髄穿刺針を用いて骨盤の背面側の左右３〜５ヶ所から体重あたり約１５〜２０ｍＬ採取できる。末梢血幹細胞移植は、Ｇ−ＣＳＦ投与により骨髄から血液中に大量に流出した末梢血幹細胞を移植するという方法である。末梢血幹細胞は、約１０μｇ／ｋｇ／日のＧ−ＣＳＦを４〜６日間皮下注射し、投与後４〜６日目に血液成分採血装置を用いて採取することができる。採取のタイミングは、血液中に含まれる造血幹細胞のマーカーであるＣＤ３４抗原陽性細胞数を測定して決定することができる。臍帯血移植は、臍帯血に含まれる造血幹細胞を移植する方法である。ＨＬＡ型の検査により患者に適合する臍帯血を臍帯血バンクから探すことができる。臍帯血移植は、臍帯血中から採取できる幹細胞の数は限られているが、他の移植に比べてＧＶＨＤが起こりにくく、そのため６個のＨＬＡのうち２個が不適合であっても移植できる。上記各々の移植方法や骨髄、末梢血幹細胞または臍帯血の採取、調製あるいは検索法は、造血幹細胞移植診療マニュアル，第１版（日本医学館  発行）あるいは造血細胞移植マニュアル，第三版改訂新版（日本医学館  発行）に基づき実施できる。
【００１８】
同種造血幹細胞移植のドナーは、ＨＬＡ型（ヒト白血球型抗原）に基づいて選択できる。同種造血幹細胞移植において考慮すべきＨＬＡ型は、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−ＤＲの３種類に対して両親から遺伝した型があるため、原則として６種類である。ＨＬＡ型の不適合は移植後の重篤なＧＶＨＤの原因となるため、これを適合させることが望ましい。しかし、ある程度の不適合は逆にＧＶＴ効果の増強につながるため、腫瘍の種類、患者の年齢や健康状態、移植する造血幹細胞の種類に応じて、適当なドナーを選定することが好ましい。ドナーの選定は、原則として以下の区分に基づき行われる。
（１）ＨＬＡ適合血縁者ドナー；ＨＬＡ型は遺伝するため、兄弟間では１／４の確率で適合する。そのため、一般的に、ＧＶＨＤや移植関連合併症の発症頻度は低い。同種造血幹細胞移植では、まず、血縁者から適合するドナーを探すことが好ましい。
（２）ＨＬＡ適合非血縁者ドナー；すべての型のＨＬＡ適合血縁者が見つからなかった場合には、骨髄バンクからＨＬＡ適合者（ＨＬＡ適合非血縁者ドナー）を探すことができる。
（３）ＨＬＡ不適合血縁者ドナー；６個のＨＬＡ型のうち５個が適合している血縁者ドナーからの同種造血幹細胞移植の成績は、ＨＬＡ適合非血縁者ドナーからのものに匹敵するため、すべてＨＬＡ型が適合する血縁者が見つからなかった場合でも、その一部が異なる血縁者ドナーも選定できる。
（４）ＨＬＡ不適合非血縁者ドナー；ＨＬＡ適合者あるいはＨＬＡ不適合血縁者から適当なドナーを探すことができなかった場合には、ＨＬＡ不適合非血縁者をドナーとして選択することもできる。ただし、このような場合、ＧＶＨＤの発症率が上昇するおそれがある。
【００１９】
さらに、ドナーの選定には、呼吸機能、循環機能、肝機能、各種病歴、感染症やアレルギーの有無等により判断することが好ましい。さらに詳細な判断基準については、造血幹細胞移植診療マニュアル，第１版（日本医学館  発行）あるいは造血細胞移植マニュアル，第三版改訂新版（日本医学館  発行）を参考にすることができる。
【００２０】
本発明の薬剤の使用における同種造血幹細胞移植は、移植前処置をも含む。ここで、移植前処置とは、癌細胞を死滅させるためあるいはドナーの造血幹細胞を生着し易いように患者の免疫を低下させるために、抗癌剤投与、放射線照射またはそれらを組み合わせた処置、さらに必要に応じて免疫抑制剤の投与を移植前に行う処置であり、造血幹細胞移植の約７〜１０日前から行うことができる。
【００２１】
本発明の薬剤の使用の移植前処置に適用できる抗癌剤として、例えば、アルキル化剤（例えば、シクロフォスファミド、ブスルファン、メルファラン、ハイドロキシウレア、塩酸ニムスチン、カルムスチン、ロムスチン、ラニムスチン、ナイトラミン、イホスファミド、メルファランチオテパ、カルボコン、ブスルファン、ダカルバジン、テモゾロミド、塩酸プロカルバジン、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド）、代謝拮抗剤（例えば、エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリビン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、メトトレキサート、メルカプトプリン、フルダラビン、フルオウラシル、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバミド、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン）、抗がん性抗生物質（例えば、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、ピラルビシン、ミトキサントロン、塩酸イダルビシン、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、アムルビシン、エピルビシン、ジノスタチンスチマラマー、ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン）、アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、エトポシド、イリノテカン、エトポシド、ソブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンブラスチン）、分子標的薬（例えば、イブリツモマブチウキセタン、イマチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、タミバロテン、トラスツズマブ、トレチノイン、パニツムマブ、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、リツキシマブ）、プラチナ製剤（例えば、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン）等が挙げられる。抗癌剤の投与プロトコールは、当該分野において一般に知られている方法に従って実施することができる。
【００２２】
本発明の薬剤の使用の移植前処置に適用できる放射線照射は、当該分野において一般に知られているプロトコールに従って実施することができる。例えば、照射方法としては、急性白血病、悪性リンパ腫または一部の固形癌に対しては全身照射により、一般的な固形癌に対しては局所的に照射するのが好ましい。必要な線量は、照射方法（単回か分割か）、腫瘍の種類や放射線に対する感受性等により異なるが、例えば、全身照射では、１０〜１２Ｇｙが標準的線量と言われている。一方、照射による臓器障害を低減するために、近年では分割照射が多く行われており、例えば、一回当りの照射量は約１．８〜２Ｇｙを、１日１または２回で約４〜７日照射することができる。分割照射は、均等分割法と不均等分割法があり、患者への負担や副作用、治療効果に応じて適宜変更することができる。また、放射線療法は抗癌剤投与と並行して行うこともできる。
【００２３】
本発明の薬剤の使用における抗癌剤の種類もしくは投与量または放射線照射量等は、腫瘍や造血幹細胞の種類あるいは患者の年齢もしくは健康状態によって選択でき、本発明の薬剤は、従来の強力な移植前処置を用いた「骨髄破壊的前治療を用いた同種造血幹細胞移植（フル移植）」、さらには移植前処置の強度を弱めることによって毒性を軽減できる「骨髄非破壊的移植前治療を用いた同種造血幹細胞移植（ミニ移植）」に対しても適用できる（造血幹細胞移植診療マニュアル，第１版（日本医学館  発行）あるいは造血細胞移植マニュアル，第三版改訂新版（日本医学館  発行）参照）。
【００２４】
さらに、急性ＧＶＨＤの発症を抑えるために、必要に応じて、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス等）を投与することができる。
【００２５】
本発明において、ＣＤ４＋細胞除去物質とは、例えば、ドナー由来のＣＤ４＋細胞を死滅させる物質、またはドナー由来のＣＤ４＋細胞の増殖もしくは機能を抑制する物質であって、例えば、補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣと略記する。）および／もしくは抗体依存性細胞傷害活性（以下、ＡＤＣＣと略記する。）を有するＣＤ４抗体またはサイトトキシンもしくは細胞傷害性薬物が付加されたＣＤ４抗体が挙げられる。
【００２６】
ここで、ＣＤ４＋細胞とは、ＣＤ４をその細胞表面に発現している免疫細胞を言うが、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋樹状細胞、ＣＤ４＋マクロファージ、ＣＤ４＋ＮＫＴ細胞等が挙げられる。特に、本発明における骨髄ＧＶＨＤの発症には、ＣＤ４＋Ｔ細胞の寄与が大きい。
【００２７】
ここで、ＣＤ４抗体は、ヒトＣＤ４に結合し、患者の血中あるいは各種組織からＣＤ４＋細胞を死滅ないし増殖もしくは機能を抑制することにより、減少ないし除去するものであればいずれのものであってもよいが、好ましくは、ヒト化抗ヒトＣＤ４抗体およびヒト型抗ヒトＣＤ４抗体である。
【００２８】
ここで、ヒト化抗ヒトＣＤ４抗体とは、例えば、マウスのような別の哺乳動物に由来する抗ヒトＣＤ４抗体の相補鎖決定領域（以下、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲと略記する。）をヒト抗体のフレームワーク（以下、ＦＲと略記する。）配列上に移植した抗体をいい、例えば、米国特許４８１６５６７、米国特許５２２５５３９および５５３０１０１ならびに米国特許５５８５０８９および６１８０３７０に記載された方法に基づき製造することができる。なお、別の哺乳動物に由来する抗ヒトＣＤ４抗体は、例えば、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇら，Ｎａｔｕｒｅ，１９７５年，第２５６巻，第５５１７号，４９５−４９７）によって作製できる。また、ヒト化抗ヒトＣＤ４抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域中のＦＲのアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３年，第５３巻，ｐ．８５１−８５６）。
【００２９】
一方、ヒト型抗ヒトＣＤ４抗体とは、ＣＤＲおよびＦＲ等すべての構成がヒトに由来する抗ヒトＣＤ４抗体であり、ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（米国特許５５４５８０６、５５６９８２５、５６２５１２６および５６３３４２５など参照）、ＫＭマウス（登録商標）（ＷＯ０２／４３４７８参照）、ゼノマウス（登録商標）（米国特許５９３９５９８、６０７５１８１、６１１４５９８、６１５０５８４および６１６２９６３参照）、ＴＣマウス（登録商標）（Ｔｏｍｉｚｕｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，第９７巻，第２号，ｐ．７２２−７２７参照）またはヒト免疫細胞を再構築したＳＣＩＤマウス（米国特許５４７６９９６および５６９８７６７参照）を用いて製造することができる。また、ヒト型抗ヒトＣＤ４抗体は、ヒトイムノグロブリン遺伝子ライブラリースクリーニングのためのファージディスプレイ法（米国特許５２２３４０９、５４０３４８４および５５７１６９８など参照）でも調製できる。
【００３０】
また、本発明におけるＣＤ４抗体には、上記抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ）′２、ＳｃＦｖのような抗体断片、Ｓｃ（Ｆｖ）２やダイアボディのような低分子化抗体も含まれる。
【００３１】
また、ＣＤ４抗体のアイソタイプとして、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥが挙げられるが、好ましくはＩｇＧであり、さらに好ましくはＡＤＣＣまたはＣＤＣがより強いＩｇＧ１またはＩｇＧ３である。
【００３２】
さらに、本発明におけるＣＤ４抗体は、ＦＲ内部の１個以上の残基または１個以上のＣＤＲ内部の１個以上の残基を変異させ、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的免疫原性を低下させることができる（米国特許公報２００３０１５３０４３参照）。
【００３３】
また、本発明におけるＣＤ４抗体は、その可変領域あるいは定常領域に改変あるいは修飾を施すことにより、抗原結合活性、安定性、生物学的半減期、補体固定活性、ＣＤＣ、Ｆｃレセプター結合活性および／またはＡＤＣＣを改変することができる。
【００３４】
本発明におけるＣＤ４抗体は、例えば、アミノ酸置換により可変領域ＦＲのグリコシル化部位を消失させ、抗原親和性を高めることができる（米国特許５７１４３５０および６３５０８６１参照）。また、ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基数を改変して、重鎖および軽鎖の集合を促進させるかまたは抗体安定性を増強することができる（米国特許５６７７４２５）。また、米国特許６２７７３７５または５８６９０４６および米国特許６１２１０２２に記載されているアミノ酸置換により、あるいは当該技術分野における公知の方法でＰＥＧ化することによって生物学的半減期を長くすることができる。
【００３５】
さらに、本発明におけるＣＤ４抗体は、例えば、Ｆｃ領域のアミノ酸置換により、抗体のエフェクター機能を改変することができ（米国特許５６２４８２１および５６４８２６０参照）、米国特許６１９４５５１に記載されている方法によりＣＤＣを増強することができ、ＷＯ９４／２９３５１に記載されている方法により補体固定活性を増強することができる。
【００３６】
また、本発明におけるＣＤ４抗体は、例えば、ＷＯ００／４２０７２に記載されている方法によりＡＤＣＣおよび／またはＦｃγレセプターに対する抗体の親和性を増強させることができ、同様に、米国特許公報２００４０１１０７０４、ＥＰ１１７６１９５、ＷＯ０３／０３５８３５またはＷＯ９９／５４３４２等に記載されている方法または細胞を用いることにより、グルコシル化の改変またはフコース残基を低減させて、抗体のＡＤＣＣを高めることもできる。
【００３７】
ここで、本発明におけるＣＤ４抗体として好ましくは、例えば、ＭＴＲＸ−１０１１Ａ、ＴＲＸ−１（ＷＯ２００２／１０２８５３参照）、Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ（ＷＯ９２／０９３０５参照）、ＢＴ−０６１、ｈｕＢ−Ｆ５、Ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ（ＷＯ９７／１３８５２参照）、４１６２Ｗ９４、ＣｌｅｎｏｌｉｘｉｍａｂまたはＫｅｌｉｘｉｍａｂ（ＷＯ９３／０２１０８参照）、ＡＤ−５１９またはＰＲＯ−５４２（ＷＯ９２／１３９４７参照）、Ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ（ＷＯ９６／３６３５９参照）が挙げられる。
【００３８】
さらに、本発明におけるＣＤ４抗体は、必要に応じて、ＣＤ４＋細胞を除去する能力を高めるために、サイトトキシンまたは細胞傷害性薬物のような細胞傷害分子を結合させることができる。サイトトキシンとしては、例えば、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジハイドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、マイタンシン、オーリスタチンまたはそれらの誘導体が挙げられる。より好ましくは、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、マイタンシン、オーリスタチンまたはそれらの誘導体である。一方、細胞傷害性薬物としては、例えば、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルカリ化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブチル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロソスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、シス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ））、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アンスラマイシン（ＡＭＣ））および有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン）が挙げられる。サイトトキシンまたは細胞傷害性薬物のＣＤ４抗体への結合は、当該技術分野において公知の方法で実施できる。
【００３９】
本発明の薬剤は、移植後の感染症、例えば、病原性ウイルス感染症、病原菌感染症、病原性真菌感染症、病原性寄生体感染症等の予防に用いることができる。ここで、病原性ウイルスとしては、例えば、ＨＩＶ、肝炎ウイルス（例えば、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＡＶ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶ、エプスタインバーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、おたふくかぜウイルス、ロタウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクチシニアウイルス、成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスまたはアルボウイルス脳炎ウイルスが挙げられる。また、病原菌としては、例えば、クラミジア、リケッチアバクテリア、マイコバクテリア、肺炎球菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、ニューモコッカス、髄膜炎菌、淋菌、大腸菌、エンテロコッカス、コノコッカス、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、コレラ、テタヌス、ボツリヌス、炭素菌、ペスト、レストスピラ症またはライムス病菌が挙げられる。病原性真菌としては、例えば、カンジダ（例えば、アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリス）、クリプトコッカスネオフォルマンス、アスパルギルス（例えば、フミガツス、ニゲル）、ムコラレス属（例えば、ムコル、アブスディア、リゾファス）、スポロスリックスシェンキ、ブラストマイセスデルマチチディス、パラコッキジオイデスブラシリエンシス、コッキジオイデスイミチスまたはヒストプラズマカプスラツムが挙げられる。さらに、病原性寄生体としては、例えば、赤痢アメーバ寄生体、大腸バランチジウム、ナエグレリアファウレリ、アカンテャモエーバ種、ジアルジアランビア、クリプトスポリジウム種、ニューモシスチスカリニ、プラスモディウムビバックス、バベシアミクロチ、トリパノゾーマブルーセイ、クルーズトリパノゾーマ、リューシュマニアドノヴァニ、トキシプラズマゴンジまたはブラジル鉤虫が挙げられる。
【００４０】
本発明において、有効成分であるＣＤ４＋細胞除去物質は、例えば、薬学的に許容できる担体とともに製剤化された組成物の注射剤あるいは輸液として、非経口投与経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮膚内、腹腔内、皮下または脊髄に投与できる。
【００４１】
ＣＤ４＋細胞除去物質の投与量は、例えば、約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは、約１〜約３０ｍｇ／ｋｇである。
【００４２】
一方、本発明の薬剤の投与時期は、同種造血幹細胞移植と同日または移植後１〜約６０日までであり、好ましくは移植後１〜約３０日までであり、より好ましくは移植後５〜１４日目の間であり、さらに好ましくは移植後５〜７日目の間である。なお、移植後約６０日以降であっても、慢性ＧＶＨＤに伴う骨髄抑制が認められる場合には追加的に投与してもよい。
【００４３】
本発明の薬剤は、１日１回〜約６０日に１回投与することが可能であるが、好ましくは１日１回であり、より好ましくは３日に１回であり、さらに好ましくは１０日に１回である。
【００４４】
本発明におけるＣＤ４＋細胞除去物質を含む注射剤あるいは輸液は、溶液、懸濁液または乳濁液として用いることができる。その溶剤として、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖溶液および等張液（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、プロピレングリコール等の溶液）等を用いることができる。さらに、この注射剤は、安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤、防腐剤、ｐＨ調整剤等を含んでいてもよい。安定剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン等を用いることができる。溶解補助剤としては、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０（登録商標）、ＨＣＯ−５０等）等を用いることができる。懸濁化剤としては、例えば、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。乳化剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等を用いることができる。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等を用いることができる。防腐剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等を用いることができる。
【００４５】
この注射剤あるいは輸液は、その最終工程において滅菌するかあるいは無菌操作法、例えば、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することによって製造することができる。また、注射剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存することもでき、用時に注射用蒸留水等を加えて再溶解して使用できる。
【００４６】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４８】
〔実施例１：同種造血幹細胞移植後ＧＶＨＤ発症動物モデルの作製〕
造血幹細胞移植の前日に、レシピエントマウス（６週齢，雌，Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ２  Ｆ１（ＢＤＦ１，Ｈ２ｄ／ｂ））に致死量の放射線（１１Ｇｙ）を３時間間隔で２分割照射した。このマウスに、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６，Ｈ２ｂ）由来Ｔ細胞除去骨髄細胞（５×１０６個）と脾臓Ｔ細胞（ＣＤ１１ｂ，Ｂ２２０，Ｔｅｒ１１９，ＮＫ１．１をネガティブ・セレクションした５×１０６個の細胞）を造血幹細胞として移植した（以下、ＧＶＨＤ群とする。）。なお、上記放射線照射されたレシピエントマウスに、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６，Ｈ２ｂ）由来Ｔ細胞除去骨髄細胞（５×１０６個）のみを移植した群をＢＭＴ群とした。【００４９】
〔実施例２：フローサイトメトリーによる移植後ドナー造血幹細胞由来骨髄造血の解析〕
実施例１において作製したマウスの各群の各個体から骨髄、脾臓および胸腺を採取し、移植後７〜２８日目までのドナー造血幹細胞由来骨髄造血をフローサイトメトリーにより経時的に解析した。フローサイトメトリーは当業者に公知の方法で行った。【００５０】
図２（Ａ）〜（Ｉ）は、ＢＭＴおよびＧＶＨＤ群における、骨髄細胞、脾臓細胞、胸腺細胞の各々の総細胞数および骨髄における顆粒球、単球、赤芽球系細胞（ＣＤ７１＋およびＴｅｒ１１９＋／−）、脾臓ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の各々の細胞数の経時的変化を示す。ＧＶＨＤ群での骨髄、脾臓および胸腺細胞総数の減少、ＢＭＴ群での脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞の回復およびＧＶＨＤ群での赤芽球系細胞の減少が認められた。【００５１】
〔実施例３：同種造血幹細胞移植後ＧＶＨＤ発症動物モデルの作製２〕
造血幹細胞移植の前日に、ＣＤ４５．２＋レシピエントマウス（６週齢，雌，Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ２  Ｆ１（ＢＤＦ１，Ｈ２ｄ／ｂ））に致死量の放射線（１１Ｇｙ）を３時間間隔で２分割照射した。このマウスに、ＣＤ４５．１＋ＣＤ４５．２＋コンジェニックマウス由来Ｔ細胞除去骨髄細胞（５×１０６個）とＣＤ４５．１＋コンジェニックマウス由来脾臓Ｔ細胞（ＣＤ１１ｂ，Ｂ２２０，Ｔｅｒ１１９，ＮＫ１．１をネガティブ・セレクションした５×１０６個の細胞）を造血幹細胞として移植した（以下、ＧＶＨＤ群とする。）。なお、上記放射線照射されたレシピエントマウスに、ＣＤ４５．１＋ＣＤ４５．２＋コンジェニックマウス由来Ｔ細胞除去骨髄細胞（５×１０６個）のみを移植した群をＢＭＴ群とした。【００５２】
〔実施例４：フローサイトメトリーによる移植後ドナー造血幹細胞由来骨髄造血の解析２〕
実施例３において作製したマウスの各群の各個体から骨髄、脾臓および胸腺を採取し、移植後７〜２８日目までのドナー造血幹細胞由来骨髄造血をフローサイトメトリーにより経時的に解析した。フローサイトメトリーは当業者に公知の方法で行った。【００５３】
図３（Ａ）〜（Ｆ）は、ＢＭＴおよびＧＶＨＤ群における、ドナーＴ細胞およびドナー骨髄由来細胞の各々の細胞数の経時的変化を示す。ＢＭＴ群に比べＧＶＨＤ群では、ドナー骨髄由来Ｔ細胞の回復が遷延している。なお、ＧＶＨＤ群におけるドナー骨髄由来Ｔ細胞は抑制されているが、ゆるやかに産生されている。【００５４】
図４（Ａ）〜（Ｄ）は、ＢＭＴおよびＧＶＨＤ群における、骨髄および脾臓におけるＢ細胞数の経時的変化を示す。ＧＶＨＤ群において、持続的にＢ細胞の極度の分化・産生障害が生じている。【００５５】
以上から、ＧＶＨＤ群においては、骨髄球系および赤芽球系細胞の減少、特にリンパ系前駆細胞の回復遅延による全身的なＴ細胞およびＢ細胞の回復遅延が認められ、これらの結果はＧＶＨＤにより免疫抑制が生じていることを示している。【００５６】
〔実施例５：リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる血球分化の解析〕
骨髄ＧＶＨＤが血球分化のどの段階を阻害しているかを明らかにするため、実施例１において作製したＧＶＨＤ動物モデルマウスの骨髄を採取し、その全ＲＮＡを当業者に公知の方法により調製して、血球分化に関与する因子（ＣＸＣＬ１２，Ｐａｘ５，Ｅ２ａ，Ｅｂｆ１，ＩＦＮｇａｍｍａ，ＩＬ−７Ｒ，Ｉｒｆ１，ＧＡＴＡ３）のｍＲＮＡ発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより解析した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは当業者に公知の方法で行った。【００５７】
図５（Ａ）〜（Ｄ）は、骨髄総細胞およびそのｃ−Ｋｉｔ（＋）Ｓｃａ−１（＋）分画を濃縮して解析したものを示す。ＧＶＨＤ群において、Ｂ細胞の分化増殖に必要な転写因子であるＰａｘ５、Ｅ２ａおよびＥｂｆ１発現の極度の減少が認められ、リンパ球前駆体の分化に必要なＩＬ−７Ｒの低下も認められた。この結果は、ＧＶＨＤの発症により、非常に早期の段階からＢ細胞の産生・分化が特異的にあるいは継続的に障害されていることを示している。【００５８】
〔実施例６：腸管免疫組織染色および糞便中ＩｇＡのＥＬＩＳＡ測定〕
ＧＶＨＤによる腸管免疫への影響を明らかにするため、実施例１において作製したＧＶＨＤ動物モデルマウスの腸管および糞便を採取し、腸管の免疫組織染色および糞便中ＩｇＡのＥＬＩＳＡ測定を行った。免疫組織染色およびＥＬＩＳＡは、当業者に公知の方法で行った。【００５９】
図６（Ａ）は、ＢＭＴおよびＧＶＨＤ群における移植後１４日目の腸管免疫組織染色像（２００倍）を示し、図６（Ｂ）は糞便中ＩｇＡ濃度を示す。ＧＶＨＤ群ではＢＭＴ群に比べ、明らかにＩｇＡ産生が低下（免疫組織染色上の矢印明部の消失）しており、便中ＩｇＡのＥＬＩＳＡ測定でも同様であった。これら結果は、ＧＶＨＤではＩｇＡ産生が障害されていることを示している。【００６０】
〔実施例７：ＧＶＨＤ発症時の骨髄における病理学的解析〕
実施例１で作製したＧＶＨＤ動物モデルマウスについて、移植後２１日目の骨髄切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った。ヘマトキシリン・エオシン染色は、当業者に公知の方法で行った。【００６１】
図７に示すように、ＧＶＨＤ群においては、明らかな有核細胞数（図面上黒色の影として表される細胞の数）の低下および点状の赤血球の集塊（矢印）が認められ、これはＧＶＨＤに伴う骨髄の特徴的所見であった。なお、示していないが、移植後２８日目のＧＶＨＤ群では、骨髄内の出血や血塊が著明となり、その正常な構築は著しく破壊されていた。【００６２】
一方、示していないが、移植後２１日目のＧＶＨＤ群で認められる細胞実質の顕著な低下と出血像は、ＣＤ４抗体投与群では改善し、骨髄有核細胞数の回復が認められ、点状の赤血球の集塊も減少した。なお、ＣＤ４抗体（ＧＫ１．５，Ｍｅｄｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、上記ＧＶＨＤ動物モデルマウスに対して、２００μｇを移植後４日目および６日目に各々１回ずつ腹腔内投与した。【００６３】
〔実施例８：骨髄組織におけるＧＶＨＤの作用部位の解析〕
骨髄組織におけるＧＶＨＤの作用部位を同定するために、実施例１において作製したＧＶＨＤ動物モデルマウスの骨髄を採取し、その全ＲＮＡを当業者に公知の方法により調製して、ＳＤＦ−１（ＣＸＣＬ１２）の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にて経時的に測定した。なお、ＳＤＦ−１は、造血幹細胞および各分化段階の血球系前駆細胞がその増殖・分化の場である骨髄間質と相互作用する際に必要とする造血関連分子の一つである。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、当業者に公知の方法で行った。【００６４】
図８（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、その発現はＧＶＨＤ群で顕著に低下した。この結果は、骨髄間質がＧＶＨＤのターゲットとなっていることを示している。これは、Ｂ細胞上において、ＳＤＦ−１のレセプターであるＣＸＣＲ４の発現がＧＶＨＤ群とＢＭＴ群で有意差がないことからも支持され、変異型Ｆａｓを有するｌｐｒマウス由来骨髄細胞を用いた移植実験でもＧＶＨＤ群ではＢ細胞産生を回復できないことからも裏付けられる。一方、ＣＤ４抗体投与群では、ＳＤＦ−１の発現低下は時間経過とともに改善傾向を示した（ＣおよびＤ）。【００６５】
〔実施例９：骨髄ＧＶＨＤを誘導するエフェクター分子の同定〕
造血幹細胞移植の前日に、レシピエントマウス（６週齢，雌，Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ２  Ｆ１（ＢＤＦ１，Ｈ２ｄ／ｂ））に致死量の放射線（１１Ｇｙ）を３時間間隔で２分割照射した。このマウスに、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６，Ｈ２ｂ）由来Ｔ細胞除去骨髄細胞（５×１０６個）ないしは変異型Ｆａｓを有するｌｐｒマウス由来T細胞除去骨髄細胞（５×１０６個）を移植骨髄として、またＧＶＨＤを誘導する場合には、通常の野生型（以下、ＷＴとする。）Ｂ６の脾臓Ｔ細胞（ＣＤ１１ｂ，Ｂ２２０，Ｔｅｒ１１９，ＮＫ１．１をネガティブ・セレクションした５×１０６個の細胞）ないし変異型ＦａｓＬを有するｇｌｄマウス由来脾臓Ｔ細胞（ＣＤ１１ｂ，Ｂ２２０，Ｔｅｒ１１９，ＮＫ１．１をネガティブ・セレクションした５×１０６個の細胞）を各種組み合わせて移植した（以下、ＧＶＨＤ群とする。）。なお、変異型ＦａｓＬを有するｇｌｄマウスと変異型Ｆａｓを有するｌｐｒマウスは日本ＳＬＣより入手した。【００６６】
図９中の［ＷＴ／−］、［ｌｐｒ／−］、［ＷＴ／ＷＴ］、［ｌｐｒ／ＷＴ］および［ＷＴ／ｇｌｄ］は、移植時の骨髄細胞と脾臓細胞の組み合わせを意味する［骨髄／脾臓］として表記した。【００６７】
上記マウスの各群の各個体から骨髄を採取し、移植後７〜２８日目までの血球分化をフローサイトメトリーにより経時的に解析した。フローサイトメトリーは当業者に公知の方法で行った。【００６８】
図９（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、ＷＴ／ｇｌｄ群ではＢ細胞の部分的な回復が認められ、この結果は骨髄ＧＶＨＤの発症にドナーＴ細胞のＦａｓＬが限定的に関与していることを示している。また、移植骨髄細胞に変異型Ｆａｓを有するｌｐｒマウス由来骨髄細胞を用いたｌｐｒ／ＷＴ群ではＢ細胞の回復を認めないことから、ＦａｓＬの標的が血球系細胞よりむしろ間質系細胞である可能性を得た。なお、Ｆａｓを発現しない骨髄を輸注したにもかかわらず、造血が回復しないことは、骨髄細胞が直接ドナーＴ細胞のＦａｓ−ＦａｓＬ系路によって障害されているというよりむしろ、骨髄細胞と直接干渉し、骨髄細胞の分化に必要な“畑”の役割を果たす造血環境である骨髄間質系細胞が障害されている可能性を示唆するものである。【００６９】
〔実施例１０：骨髄ＧＶＨＤを誘導するＴ細胞サブセットの同定〕
実施例１で作製したＧＶＨＤ動物モデルマウスに、実施例７記載のＣＤ４抗体（２００μｇ）またはＣＤ８抗体（５３−６．７，Ｍｅｄｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を移植後４日目および６日目に各々１回ずつ腹腔内投与し、ＧＶＨＤの改善を指標にその原因Ｔ細胞サブセットを同定した。【００７０】
図１０に示すように、ＣＤ４抗体投与により顕著なＢ細胞の回復が認められ、ＣＤ４がメインエフェクターであることが示唆された。一方、ＣＤ８抗体投与による効果は認められなかった。また、胸腺のＴ細胞分化をフローサイトメトリーで解析したところ、図１１（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、ＣＤ４抗体投与により胸腺でのナイーブＴ細胞の回復が促進された。なお、図１２に示すように、ＣＤ４抗体投与により移植後１００日目における各種免疫グロブリン産生の回復も認められた。【００７１】
〔実施例１１：ＣＤ４抗体による骨髄ＧＶＨＤおよびＧＶＴ効果への作用〕
ＣＤ４抗体投与によるＧＶＨＤおよびＧＶＴ効果への作用を確認するため、実施例１で作製したＧＶＨＤ動物モデルマウスに、骨髄移植２時間前にＰ８１５（ＤＢＡ２マウス由来肥満細胞腫（ＡＴＣＣ：ＴＩＢ−６４））を１×１０４個静注し、２００μｇの抗ＣＤ４抗体を移植後４日目および６日目に各々１回ずつ腹腔内投与し、当該マウスの生存、ＧＶＨＤスコアおよび体重変化を解析した。【００７２】
図１３（Ａ）〜（Ｃ）に示されるように、ＣＤ４抗体投与群ではＧＶＴ効果が損われることなく、ＧＶＨＤは抑制され（Ｂ）、移植後４０日近くまで１００％の生存率が維持された（Ａ）。なお、ＢＭＴ群では移植後１５〜２０日で、腫瘍細胞の肝臓や脊椎への転移により腫瘍死する。【００７３】
〔実施例１２：フル移植におけるＣＤ４抗体投与治療〕
各種化学療法（各種急性または慢性白血病の場合には、適当量のエンドキサンの単回投与、悪性リンパ腫では、適当量のメルファラン、エンドキサン、ラステット、デキサメタゾンの任意の組み合わせによる投与）の後、移植１〜３日前に全身放射線照射（以下、ＴＢＩとする。）を１２Ｇｙ（分割照射、１日４Ｇｙを３日間）で行い、造血幹細胞移植を行う。その後、好適には移植後５〜７日目の間に１日１回ずつ計３回、ＣＤ４抗体を投与する。【００７４】
〔実施例１３：ミニ移植におけるＣＤ４抗体投与治療〕
化学療法（フルダラビンおよびブスルファンの組み合わせ）の後、ＴＢＩは２〜４Ｇｙを移植前に１〜２日間で分割照射し、造血幹細胞移植を行う。その後、好適には移植後５〜７日目の間に１日１回ずつ計３回、ＣＤ４抗体を投与する。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明は、同種造血幹細胞移植に伴う合併症リスク、特に感染症を予防できる点で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図６（Ａ）】
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【図６（Ｂ）】
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【図７】
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【図９】
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【国際調査報告】
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