(57)【要約】本発明は、チミジル酸合成酵素のレベルを指標として選択された患者に投与されることを特徴とする、テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウム及びカルボプラチンを含有する抗腫瘍剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）〜（２）の工程を含む、非小細胞肺癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とカルボプラチンの併用化学療法に対する治療効果を予測する方法：
（１）患者から採取された癌細胞を含み得る生体試料に含まれるチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量を測定する工程、
（２）上記工程（１）で得られた発現量が、予め設定したカットオフポイントと比較して低い場合、患者が当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
【請求項２】
テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウム配合剤における各有効成分のモル比が、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム＝１：０．４：１である請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法により当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に当該併用化学療法を実施することを特徴とする、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びカルボプラチンからなる抗腫瘍剤。
【請求項４】
請求項１又は２記載の方法により当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に当該併用化学療法を実施することを特徴とする、非小細胞肺癌の治療方法。
【請求項５】
請求項１又は２記載の方法により当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に当該併用化学療法を実施するための、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びカルボプラチンからなる抗腫瘍剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とカルボプラチンの併用化学療法に対する治療効果を予測する方法および当該併用化学療法に十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された患者に投与するための抗腫瘍剤に関する。また、本発明は、非小細胞肺癌の治療方法およびテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びカルボプラチンからなる抗腫瘍剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、進行非小細胞肺癌の併用化学療法による治療は、シスプラチンと第３世代抗癌剤（パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、ビノレルビン、あるいはイリノテカン）、あるいは、カルボプラチンとパクリタキセルとの併用が標準療法として用いられている（非特許文献１、２）。しかし、これら標準療法の奏効率は、１５．３〜３３．０%、無増悪生存期間は４ヶ月前後であり、治療効果は満足できるものではない現状である。【０００３】
さらに、標準療法以外にも、より強い治療効果を奏する進行非小細胞肺癌の併用化学療法が模索されており、例えば、ＴＳ−１（テガフール、ギメラシル及びオテラシルカリウム（モル比１：０．４：１）の配合剤）とカルボプラチンの併用について臨床試験が行われているが、当該臨床試験の奏効率は３３．０％と標準療法とほぼ同等の治療効果であることが報告されている（非特許文献３）。【０００４】
以上のとおり、進行非小細胞肺癌を治療する各種併用化学療法が精力的に開発されているが、現状においてその治療効果は満足できるものではなく、さらに顕著な治療効果を示す化学療法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．  ２０００；５（４）：２７４−９．
【非特許文献２】Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００７；１８（２）：３１７−２３．
【非特許文献３】Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ．  ２００７；１８（４）：４７１−６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来の治療法では満足な治療効果が得られていない進行非小細胞肺癌患者に対して、顕著な治療効果を発揮することができる非小細胞肺癌の抗腫瘍剤およびテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とカルボプラチンの併用化学療法に対する治療効果を予測する方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、非小細胞肺癌の治療方法およびテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びカルボプラチンからなる抗腫瘍剤の使用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、進行非小細胞肺癌における併用化学療法の治療効果（腫瘍縮小効果、無増悪生存期間延長効果あるいは延命効果など）の増強を狙って研究を重ねた結果、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びカルボプラチンの併用化学療法がチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量を指標とした患者選択により、既存の治療法よりも優れた治療効果を発揮することを見出し、本発明は完成に至った。【０００８】
すなわち本発明は、非小細胞肺癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とカルボプラチンの併用化学療法に対する治療効果を予測する方法、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びカルボプラチンからなる抗腫瘍剤、非小細胞肺癌の治療方法およびテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びカルボプラチンからなる抗腫瘍剤の使用を提供するものである。
項１.  下記工程（１）〜（２）の工程を含む、非小細胞肺癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とカルボプラチンの併用化学療法に対する治療効果を予測する方法：
（１）患者から採取された癌細胞を含み得る生体試料に含まれるチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量を測定する工程、
（２）上記工程（１）で得られた発現量が、予め設定したカットオフポイントと比較して低い場合、患者が当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
項２.    テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウムのモル比が１：０．４：１である項１記載の方法。
項３.    項１又は２記載の方法により当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に当該併用化学療法を実施することを特徴とする、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びカルボプラチンからなる抗腫瘍剤。
項４．  項１又は２記載の方法により当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に当該併用化学療法を実施することを特徴とする、非小細胞肺癌の治療方法。
項５．  項１又は２記載の方法により当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に当該併用化学療法を実施するための、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びカルボプラチンからなる抗腫瘍剤の使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とカルボプラチンの併用療法は、チミジル酸合成酵素を指標として選択した非小細胞肺癌患者に対して、従来の治療法に比べ飛躍的に優れた治療効果（腫瘍縮小効果、無増悪生存期間延長効果あるいは延命効果など）を得ることが期待できる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の予測方法は、患者のチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量に基づき、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とカルボプラチンの併用化学療法による治療に対して、より強い治療効果を示す可能性が高い患者を予測するものである。
【００１１】
本発明において「テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とカルボプラチンの併用化学療法」とは、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とカルボプラチンの両方の抗腫瘍剤を併用して投与する化学療法を意味する。なお、前記配合剤とカルボプラチンを併用投与する場合、配合剤とカルボプラチンは同時に投与してもよく、また、一定の間隔をあけて投与してもよい。
【００１２】
本発明において、「併用化学療法を選択するのに十分な治療効果」とは、標準療法（例えば、シスプラチン／ビノレルビンやカルボプラチン／パクリタキセルの併用化学療法）より優れた治療効果（腫瘍縮小効果、無増悪生存期間延長効果あるいは延命効果など）を示すことを意味する。このような治療効果を示すか否かは、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量がカットオフポイント以下か否かで判断でき、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量がカットオフポイント以下であれば、併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を有すると判断される。
【００１３】
本発明における有効成分であるテガフール（一般名、化学名：５−フルオロ−１−（２−テトラヒドロフリル）−２，４−（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン）は、公知の化合物であり、生体内で活性化を受けて抗腫瘍活性の本体である５−フルオロウラシルを放出する薬剤である。テガフールは、公知の方法、例えば特公昭４９−１０５１０号に記載されている方法に従って製造できる。
【００１４】
本発明における有効成分であるギメラシル（一般名、化学名：２，４−ジヒドロキシ−５−クロロピリジン）も、公知の化合物であり、それ自身全く抗腫瘍活性を有さないものであるが、５−フルオロウラシルが生体内において代謝されて不活性化されることを抑制するものであり、抗腫瘍効果を増強させることができる。
【００１５】
本発明における有効成分であるオテラシルカリウム（一般名、化学名：モノポタシウム  １，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−１，３，５−トリアジン−６−カルボキシレート）も公知の化合物であり、それ自身は抗腫瘍活性を有さないが、主に消化管に分布してその部位での５−フルオロウラシルの活性化を抑制することにより消化管障害を抑制するものである。
【００１６】
本発明における有効成分であるカルボプラチン（一般名、化学名：シス−ジアミン（１，１−シクロブタンジカルボキシレート）白金（II））は公知の白金錯体化合物であり、ＤＮＡ合成阻害作用により抗腫瘍効果を奏することが知られている。なお、カルボプラチンは公知の方法、例えば特公昭５６−０２９６７６公報に記載の方法により製造でき、さらにパラプラチン（登録商標、ブリストル・マイヤーズ社製）等の市販医薬品を用いても良い。
【００１７】
本発明における治療効果は、腫瘍縮小効果、無増悪生存期間延長効果あるいは延命効果などにより総合的に評価し、各効果は腫瘍縮小の程度、全生存期間、無増悪生存期間などにより判定することができる。無増悪生存期間は、無増悪生存期間の中央値（期間が長いほど治療効果が高い）により表すことができる。全生存期間は、全生存期間の中央値（期間が長いほど治療効果が高い）により表すことができる。
【００１８】
本発明において投与されるテガフール、ギメラシル及びオテラシルカリウムの割合は、それぞれの配合目的を奏する範囲であれば特に制限されず、例えば、特許第２６１４１６４号公報に記載されている公知の配合剤と同様の範囲で良く、テガフール１モルに対して、ギメラシルを０．１〜５モル程度、好ましくは０．２〜１．５モル程度とすればよく、オテラシルカリウムを０．１〜５モル程度、好ましくは０．２〜２モル程度とすればよい。特に好ましくは、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム（モル比）＝１：０．４：１である。
【００１９】
本発明において投与されるカルボプラチンの割合は、抗腫瘍効果を奏する範囲であれば特に制限されず、例えば、１日量としてテガフール１モルに対して、カルボプラチンを０．１〜５．０モル程度、好ましくは０．３〜３．０モル程度、特に好ましくは１．０〜２．５モル程度とすればよい。
【００２０】
本発明における各有効成分の投与量は、用法、患者の年齢、性別、病期、転移の有無、治療暦、他の抗腫瘍剤の有無などの条件により適宜選択されるが、テガフールの量が０.１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日程度、好ましくは０．２〜４０ｍｇ／ｋｇ／日程度、より好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日程度、ギメラシルの量が、０.０２〜３０ｍｇ／ｋｇ／日程度、好ましくは０．０５〜１２ｍｇ／ｋｇ／日程度、より好ましくは０．１〜６ｍｇ／ｋｇ／日程度、オテラシルカリウムの量が０.１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日程度、好ましくは０．２〜４０ｍｇ／ｋｇ／日程度、より好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日程度、カルボプラチンの量が０．０８〜２００ｍｇ／ｋｇ／日程度、好ましくは０．１５〜８０ｍｇ／ｋｇ／日程度、より好ましくは０．４〜４０ｍｇ／ｋｇ／日程度の範囲となる量を目安とするのが良い。また、各有効成分は１日に１回又は複数回に分けて投与される。また、各有効成分は同時又は間隔を空けて投与され、その投与順序は特に制限されない。
【００２１】
本発明において、テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウムは、一の剤型に製剤化した配合剤として提供される。また、本発明において、カルボプラチンは、それだけを製剤化した単剤であってもよく、テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウムと併せて一の剤型に製剤化した配合剤であってもよい。好ましくは、カルボプラチンのみを一の剤型に製剤化した単剤である。
【００２２】
本発明の製剤は、各有効成分が併用投与される限り、上記製剤ごとにそれぞれ個別に製造・包装・流通されるものでよく、また上記製剤のすべて又は一部を併用投与に適した単一のパッケージ（キット製剤）として製造・包装・流通されるものでもよい。
【００２３】
本発明における製剤の投与形態としては特に制限は無く、具体的には経口剤（錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤など）、注射剤、坐剤、貼付剤、軟膏剤等が例示できる。本発明の各有効成分を複数の剤型に製剤化する場合は、当該製剤はそれぞれ異なる投与形態であっても同一の投与形態であってよい。例えば、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤は経口剤、カルボプラチンを含有する製剤は注射剤とすることが好ましい。
【００２４】
本発明の製剤は、薬理学的に許容される担体を用いて、それぞれの投与形態において通常公知の製剤化方法により製造される。かかる担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、無痛化剤等を例示できる。
【００２５】
賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、イノシトール、デキストラン、ソルビトール、アルブミン、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム及びこれらの混合物等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール及びこれらの混合物等が挙げられる。結合剤としては、例えば、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖及びこれらの混合物等が挙げられる。希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類及びこれらの混合物等が挙げられる。安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸及びこれらの混合物等が挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ホウ酸、ブドウ糖、グリセリン及びこれらの混合物等が挙げられる。ｐＨ調整剤及び緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。無痛化剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン及びこれらの混合物等が挙げられる。溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。懸濁化剤としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム等が挙げられる。着色剤としては、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。矯味・矯臭剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
【００２６】
本発明における投与スケジュールは、患者の年齢、性別、病期、転移の有無、治療暦などの条件により適宜選択されるが、例えば、本発明の併用化学療法は、３週間のうちに、テガフール、ギメラシル及びオテラシルカリウムを１４日間連続投与後、７日間休薬し、その連続投与の初日にカルボプラチンを投与することを１サイクルとして１回又は複数回行うことが好ましい。
【００２７】
本発明の予測方法の対象となる患者は、非小細胞肺癌を有する患者であるが、原発巣が非小細胞肺癌であり、肺以外の臓器、組織に転移した非小細胞肺癌を有する患者であっても良い。
【００２８】
本発明のチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量測定において用いることができる生体試料としては、癌細胞を含む可能性がある試料であれば特に限定されず、体液（血液、尿等）、組織、その抽出物及び採取した組織の培養物などが例示できる。また、生体試料の採取方法は、生体試料の種類や癌種に応じた方法により適宜選択することができ、例えば薬剤の投与以前に得られた手術検体またはバイオプシー検体の腫瘍組織が例示できる。生体試料からのＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質の調製は、通常公知の方法により行うことができる。組織としては、特に肺が挙げられるが、肺から他の臓器や腹膜などに転移した場合には、転移した部位が対象の組織となる。
【００２９】
チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量測定は、癌細胞を含む可能性がある試料から癌細胞を分離し、癌細胞からチミジル酸合成酵素のタンパク質またはｍＲＮＡを分離し、チミジル酸合成酵素タンパク質を免疫学的に測定するか、あるいはｍＲＮＡをＰＣＲなどの増幅手段に増幅して検出することができる。
【００３０】
チミジル酸合成酵素遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、例えば薬剤の投与以前に得られた手術検体またはバイオプシー検体の腫瘍組織のホルマリン固定パラフィン包埋切片からトータルＲＮＡを抽出し、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ法によりベータアクチンなどの対照に対する比として定量することができる。
【００３１】
チミジル酸合成酵素は、ｄＵＭＰから葉酸を補酵素としてｄＴＭＰを合成する活性を有する酵素であり、ＤＮＡ合成時に必要な酵素として知られている。また、５−フルオロウラシルの標的酵素としても知られている。なお、ヒトのチミジル酸合成酵素の遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列は公知である（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：２０３５−２０４３（１９８５））。
【００３２】
本発明の予測方法は、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量を指標とするが、その発現量としてはｍＲＮＡの発現量であっても、タンパク質の発現量であってもよい。ここでｍＲＮＡの発現量は、チミジル酸合成酵素遺伝子と特異的にハイブリダイズするプローブ又はプライマーを用いて、ノーザンブロット法、定量的又は半定量的ＰＣＲ法（例えばＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダーゼーション法など公知の遺伝子発現量の測定法に従い測定することができる。前記発現量は、常に一定範囲の量を発現しているタンパク質／遺伝子（例えばβアクチンなどのハウスキーピング遺伝子又はその発現タンパク質）を基準として、比により評価することができる。
【００３３】
また、タンパク質発現量は、チミジル酸合成酵素を特異的に認識する抗体を用いて、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法、競合イムノアッセイ、二抗体サンドイッチアッセイ、蛍光免疫測定法、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタン・ブロッティング法、凝集アッセイ、サイトフルオロメトリー、免疫組織化学染色法など公知の免疫学的測定法を行うことにより測定することができる。免疫組織化学染色によってアッセイするために好ましい組織標本は、たとえば、組織試料の中でも特に、細胞塗沫、生検組織または臓器からの組織切片、およびインプリント標本を含む。組織標本はさまざまに保存することができ、たとえば、標本は新鮮、凍結、またはホルマリン、アルコールまたはアセトンまたは他の方法で固定および／またはパラフィン包埋および脱パラフィンされ得る。生検組織試料は、他の生検方法の中でも特に、たとえば、吸引、バイト、ブラシ、コーン、絨毛膜絨毛、内視鏡、切除、切開、針、経皮穿孔、および表面生検によって採取された試料であり得る。チミジル酸合成酵素タンパク質の発現量は、患者または患者以外のヒトの正常組織と比較して評価してもよい。また、免疫組織化学染色法の測定結果の判定は、例えば、以下の計算式により求められるＨスコア法が例示できる（Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．  １９８８；９０（３）：２３３−９）。
Ｈスコア＝Σ（染色強度×陽性細胞占有率（％））
（染色強度０：染色なし、１：弱い染色、２：中程度の染色、３：強い染色）
【００３４】
Ｈスコアは、０〜３００の値を取り得、Ｈスコアがカットオフポイントよりも低いと本発明の抗腫瘍剤を用いた化学療法に十分な無増悪生存期間の延長が見られることが明らかになった。
【００３５】
Ｈスコア法において判定する場合、事前にホルマリン固定パラフィン包埋ブロックの連続切片のうちの一枚についてヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を行い、癌細胞の有無や癌細胞と正常細胞との鑑別を病理医が実施し、癌細胞の部分のみをＨスコアの判定に用いる。染色強度の陰性コントロールや陽性コントロールに関しては、ホルマリン固定パラフィン包埋された細胞株（あらかじめ蛋白質発現量が明らかな数種の株）を用いることができる。または、コントロールの検体がない場合には、複数の検体を同時に評価し全体の標本の染色強度の分布を確認後、染色強度を設定する場合もある。評価部位に関しては、標本全体を評価することが望ましいが、代表的な１視野のみの評価でも可能である。また、組織試料としては、非小細胞肺癌の原発巣と転移巣のいずれの組織についても評価可能である。
【００３６】
Ｈスコア法以外にも、Ａｌｌｒｅｄ法（Ａｌｌｒｅｄ  ＤＣ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９８；１１：１５５−６８）など他のスコアリング法も用いることができるが、カットオフポイントは各方法において設定する必要がある。
Ａｌｌｒｅｄスコア＝陽性細胞占有率スコア＋染色強度スコア
（陽性細胞占有率スコア  ０：染色性なし、１：1％未満、２：１％−１０％未満、３：１０％−１／３未満、４：１／３−２／３未満、５：２／３以上）
（染色強度０：染色なし、１：弱い染色、２：中程度の染色、３：強い染色）
【００３７】
ノーザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダーゼーション法などの遺伝子発現量の測定法に用いられるプローブは、チミジル酸合成酵素遺伝子の塩基配列内の少なくとも１５塩基長〜全塩基長、好ましくは２０塩基長〜全塩基長、より好ましくは３０塩基長〜全塩基長の連続した塩基配列と特異的にハイブリダイズするように、通常公知のプローブ設計方法に従い上記各塩基長を有するポリヌクレオチドとして設計される。
【００３８】
ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法などの定量的又は半定量的ＰＣＲ法に用いられるプライマー、プローブの設計は、例えば以下のようにして行うことができる。
【００３９】
本発明のプライマー及びプローブは、チミジル酸合成酵素遺伝子の塩基配列内の少なくとも１０塩基長〜全塩基長、好ましくは１０〜１００塩基長、より好ましくは１０〜５０塩基長、さらに好ましくは１０〜３５塩基長の連続した塩基配列と特異的にハイブリダイズするように、通常公知のプライマー及びプローブ設計方法に従い上記各塩基長を有するポリヌクレオチドとして設計される。例えば、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現産物検出用のプライマー、すなわちＰＣＲのフォワードプライマー及びリバースプライマーは、チミジル酸合成酵素遺伝子のうちエキソン領域から設計及び合成することができる。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、チミジル酸合成酵素遺伝子の各エキソン領域のうち、一方を上流側のエキソン領域の塩基配列に基づき設計し（フォワードプライマー）、他方をその下流側のエキソン領域の塩基配列に基づき設計する（リバースプライマー）。例えば、チミジル酸合成酵素遺伝子のプライマーをエキソン１〜３に基づき設計する際において、フォワードプライマーをエキソン１領域の配列に基づいて設計する場合は、リバースプライマーは、その下流側のエキソン２又はエキソン３領域の配列に基づいて設計する。リバースプライマーは、チミジル酸合成酵素遺伝子のｍＲＮＡの配列に相補的となるように設計する。また、このプライマーとしては、各エキソン領域を含むチミジル酸合成酵素遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列の全て及びその一部の配列を用いることができるが、それぞれのエキソン領域からＰＣＲによる増幅効率を考慮してプライマーを設計するのが望ましい。
【００４０】
チミジル酸合成酵素遺伝子の発現産物検出用プローブとしては、上記プライマーを使用してＰＣＲ反応により、増幅されるチミジル酸合成酵素遺伝子の各一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズ可能なものであれば特に制限されない。チミジル酸合成酵素遺伝子の全エキソンの塩基配列あるいはその一部と相補的な配列を有するかあるいはストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なものであればよい。
【００４１】
なお、当該プローブは、チミジル酸合成酵素遺伝子と特異的にハイブリダイズするものであれば、完全に相補的である必要はない。かかるポリヌクレオチドとして、好ましくはチミジル酸合成酵素遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補ポリヌクレオチドと比較して、塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチドである。
【００４２】
なお、本発明において「特異的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されないことをいう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、通常公知の方法に従ってハイブリッドを形成する核酸の融解温度（Ｔｍ）などに基づいて決定することができる。具体的なハイブリダイズ状態を維持できる洗浄条件として通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件、より厳格には「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度の条件、さらに厳格には「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件が挙げられる。
【００４３】
また、ヒトにおけるチミジル酸合成酵素遺伝子の塩基配列が公知であるため、当該プローブ又はプライマーは、その塩基配列に基づいて、通常公知の合成方法、例えば市販のヌクレオチド合成機によって作製することができる。また、その塩基配列を鋳型としてＰＣＲ法によって調製することもできる。
【００４４】
また、当該プローブ又はプライマーは、チミジル酸合成酵素遺伝子を容易に検出できるように、通常慣用されている放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、または酵素で標識されていてもよい。
【００４５】
チミジル酸合成酵素タンパク質発現量を測定するための本発明の抗体は、ヒトチミジル酸合成酵素を特異的に認識するものであれば特に制限されず、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよく、Ｆａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片などの抗体断片であってもよい。また、当該抗体は、通常公知の方法に従って製造することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７），  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．１２−１１．１３）。また、公知の抗チミジル酸合成酵素抗体を使用できる（Ｇａｎ  Ｔｏ  Ｋａｇａｋｕ  Ｒｙｏｈｏ．１９９７；２４（６）：７０５−１２．）。
【００４６】
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とカルボプラチンの併用化学療法による治療を実施すべきか否か予測する工程において、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量が、予め設定したカットオフポイントと比較して、低い場合、患者が当該併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する。
【００４７】
本発明におけるカットオフポイントは、測定対象や測定方法の種類などの諸条件により変動するものであるため、条件に合わせて予め設定する必要がある。カットオフポイントは、測定対象（患者の数、年齢、性別、体重、健康状態、疾患の状態）や測定方法（遺伝子とタンパク質のいずれの発現産物を測定対象とするか、測定条件（例えば遺伝子発現産物（ｍＲＮＡ）の測定におけるプライマー、プローブの配列、標識の種類、発現産物がタンパク質の場合の抗体の種類及び感度など）、統計的手法などにより変動するため、本発明は、これらの諸条件により変動し得る任意のカットオフポイントを用いた発明を広く包含し、特定の値に限定されない。ここでカットオフポイントは、予め測定しておいたチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量から種々の統計解析手法により求めることができる。例えば、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とカルボプラチンの併用化学療法を受けた患者におけるチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量の平均値や中央値；テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とカルボプラチンの併用化学療法を受けた患者におけるチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量と、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とカルボプラチンの併用化学療法に対し一定以上の治療効果（奏効率、延命効果など）の有無との関係から感度と特異度の和が最大となるようＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）分析に基づき求められる値；テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とカルボプラチンの併用化学療法を受けた患者におけるチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量を用いて、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤とカルボプラチンの併用化学療法に対する治療効果（奏効率、延命効果など）との関係から、カイ二乗検定に基づき求められる値（このうちログランク検定でＰ値が最小となる値、Ｐ値がある水準以下になる値（例えば、Ｐ値が０．１以下になる値、Ｐ値が０．０５以下になる値）など）が例示できる。
【００４８】
その結果、本併用化学療法におけるチミジル酸合成酵素遺伝子のカットオフポイントは、例えば非小細胞肺癌患者から採取した癌細胞の部分のみを対象として免疫組織化学染色法により測定し、Ｈスコア法により算定した場合では、３０〜７０が好ましく、３０〜４５がより好ましく、４５が特に好ましい。
【実施例】
【００４９】
以下に、実施例を示し、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５０】
化学療法未施行のステージＩＩＩＢ期、ＩＶ期の進行非小細胞肺癌患者を対象としたＴＳ−１／カルボプラチン併用療法の臨床試験において付随研究としてバイオマーカー研究（チミジル酸合成酵素の蛋白質発現量の測定）を実施した。【００５１】
ＴＳ−１の１回投与量は、体表面積あたりから規定された以下の初回基準量とし、朝食後および夕食後の１日２回経口投与した。初回基準量は、体表面積が１．２５ｍ２未満の場合は４０ｍｇ／回（８０ｍｇ／日）、１．２５ｍ２以上〜１．５０ｍ２未満の場合は５０ｍｇ／回（１００ｍｇ／日）、１．５０ｍ２以上の場合は６０ｍｇ／回（１２０ｍｇ／日）とした。【００５２】
カルボプラチンの投与量は、以下のカルバートの式より血中濃度−時間曲線下面積（以下、ＡＵＣ）５ｍｉｎ・ｍｇ／ｍＬで算出した。【００５３】
・カルバート式
カルボプラチンの投与量（ｍｇ／ｂｏｄｙ）＝ＡＵＣ（ｍｉｎ・ｍｇ／ｍＬ）×〔クレアチニンクリアランス（ｍＬ／ｍｉｎ）＋２５〕【００５４】
・コッククロフト−ゴールト法
クレアチニンクリアランス（ｍＬ／ｍｉｎ）＝〔（１４０−年齢）×体重（ｋｇ）〕／（血清クレアチニン（ｍｇ／ｄＬ）×７２）【００５５】
女性の場合は計算されたクレアチニンクリアランスに０．８５を掛けた。【００５６】
ＴＳ−１を１４日間連日経口投与した後７日間休薬した。【００５７】
カルボプラチンを、ＴＳ−１の１４日間連続投与の初日に、２５０ｍＬの生理食塩水又は５％ブドウ糖液に混和し、１時間の静注により投与した。【００５８】
この２１日間を１コースとして、３コース以上６コースまで投与を行った。【００５９】
なお、コントールとして、パクリタキセル／カルボプラチン併用療法を行った。【００６０】
パクリタキセルの投与量は、体表面積に基づき２００ｍｇ／ｍ２とした。【００６１】
カルボプラチンの投与量は、上記カルバートの式よりＡＵＣ６ｍｉｎ・ｍｇ／ｍＬとした。女性の場合は計算されたクレアチニンクリアランスに０．８５を掛けた。【００６２】
２１日間を１コースとして、その初日にパクリタキセルは２００ｍｇ／ｍ２を５００ｍＬの生理食塩水又は５％ブドウ糖液に混和し、３時間で点滴静注し、カルボプラチンは、パクリタキセル投与終了直後より、２５０ｍＬの生理食塩水又は５％ブドウ糖液に混和して１時間で投与した。当該投与を、３コース以上６コースまでを行った。【００６３】
腫瘍縮小効果の判定はＲＥＣＩＳＴ基準（Ｒｅｖｉｓｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＷＨＯ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＷＨＯ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を用いた。本プロトコールでは骨転移の新病変出現はＰＤとした。なお、非標的病変の効果判定に腫瘍マーカーを用いない。
【標的病変の評価】
【００６４】
１）完全奏効：ＣＲ
全ての標的病変が腫瘍による二次的変化を含めて消失した場合。
２）部分奏効：ＰＲ
標的病変の最長径和が治療前の最長径和に比べ３０％以上縮小した場合。
３）安定：ＳＤ
６週以上にわたり、ＣＲ、ＰＲに該当する腫瘍縮小やＰＤに該当する腫瘍増大を認めない場合。
４）進行：ＰＤ
標的病変の最長径和が、それまでに観察された（ベースライン値を含む）最小測定値から２０％以上増大した場合（再発を含む）。
【非標的病変の評価】
【００６５】
１）完全奏効：ＣＲ
すべての非標的病変の消失。
２）不完全奏効：ＩＲ、安定：ＳＤ
非標的病変の残存
３）進行：ＰＤ
非標的病変の明らかな増大（再発を含む）。
【有効性の総合評価】
【００６６】
【表１】
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【００６７】
奏効率は、測定可能病変を有する適格例のうち上記に示したＲＥＣＩＳＴ基準にて最良総合効果がＣＲまたはＰＲのいずれかである患者の割合を奏効率とした。
【００６８】
無増悪生存期間は、登録日を起算日とし、増悪と判断された日またはあらゆる原因による死亡日のうち早い方までの期間を無増悪生存期間とした。いずれのイベントも観察されていない場合には最新の観察日をもって打ち切りとした。
【００６９】
手術あるいはバイオプシー検体の腫瘍組織のホルマリン固定パラフィン包埋切片を用いて、腫瘍組織中のチミジル酸合成酵素の蛋白質発現量を、免疫組織化学染色により、半定量した。一次抗体として、ヒトチミジル酸合成酵素に特異的に反応する抗ヒトチミジル酸合成酵素ウサギポリクローナル抗体を使用した（Ｇａｎ  Ｔｏ  Ｋａｇａｋｕ  Ｒｙｏｈｏ．１９９７；２４（６）：７０５−１２．）。蛋白質発現量の評価方法として、以下の計算式により求まるＨスコアを採用した。チミジル酸合成酵素の主たる局在部位である細胞質を評価した。
Ｈスコア＝Σ（染色強度×陽性細胞占有率（％））
（染色強度０：染色なし、１：弱い染色、２：中程度の染色、３：強い染色）
【００７０】
評価したＨスコアを用いて、ＴＳ−１／カルボプラチン併用群に対して上記最良総合効果がＣＲ又はＰＲを示す症例を予測するために、ＲＯＣ分析を利用して感度と特異度の和が最大となる最適なカットオフポイントを算出したところ、４５であった。
【００７１】
また、評価したＨスコアを用いて、ＴＳ−１／カルボプラチン併用群に対して上記最良総合効果がＣＲ又はＰＲを示す割合がカイ二乗検定により有意となるカットオフポイントを算出したところ３０〜７０であった。また、このうちログランク検定でＰ値が０．０５以下になる値は３０〜４５であった。算出したカットオフポイント（３０、４５、７０）を用いてチミジル酸合成酵素（ＴＳ）の低発現群と高発現群の２群に分けて生存期間解析を実施した。結果を表２〜表４に示す。
【００７２】
【表２】
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【００７３】
【表３】
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【００７４】
【表４】
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【００７５】
その結果、腫瘍組織中チミジル酸合成酵素の発現量の低い患者では、奏効率が６３．６〜１００％、無増悪生存期間の中央値が５．８〜７．０ヶ月となり、チミジル酸合成酵素による層別をしない場合（奏効率：４０．９％、無増悪生存期間の中央値：３．３ヶ月）に比較し、奏功率で約２０〜６０％上昇、無増悪生存期間の中央値で約２．５〜３．７ヶ月延長という顕著に高い治療効果が得られた。また、チミジル酸合成酵素の発現量の低い患者では、既存の化学療法剤による併用療法のうち最も優れた効果を示したパクリタキセル／カルボプラチン併用療法（奏効率：３７．５％、無増悪生存期間の中央値：３．３ヶ月）に比べても飛躍的に奏効率と無増悪生存期間が向上し、顕著に優れた治療効果が得られた。
【００７６】
以上のことから、チミジル酸合成酵素のレベルを指標として非小細胞肺癌患者を選択することにより、ＴＳ−１／カルボプラチンの治療効果が顕著に高くなることが判明した。
【国際調査報告】
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