(57)【要約】本発明は、糞便から直接回収した核酸から標的核酸を検出する場合に、信頼性の高い検出結果を簡便に得るための方法、及び当該方法を利用した疾患、特に大腸癌の検査方法を提供する。本発明の動物由来の標的核酸の検出方法は、（ａ）一定量の糞便を採取する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において採取された糞便から核酸を回収し、一定容量の核酸溶液を調製する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）において調製された核酸溶液から一定容量の溶液を分取し、この分取された溶液中の標的核酸を検出する工程とを有することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便試料から糞便を排泄した動物由来の標的核酸を検出する方法であって、
（ａ）  一定量の糞便を採取する工程と、
（ｂ）  前記工程（ａ）において採取された糞便から核酸を回収し、一定容量の核酸溶液を調製する工程と、
（ｃ）  前記工程（ｂ）において調製された核酸溶液から一定容量の溶液を分取し、この分取された溶液中の標的核酸を検出する工程と、
を有することを特徴とする動物由来の標的核酸の検出方法。
【請求項２】
前記工程（ａ）が下記工程（ａ’）であり、前記工程（ｃ）において検出された標的核酸の量を、前記工程（ａ）において採取された糞便量に基づいて補正することを特徴とする請求項１記載の動物由来の標的核酸の検出方法。
（ａ’）糞便を採取し、糞便量を測定する工程。
【請求項３】
前記補正が、前記工程（ｃ）において検出された標的核酸の量を、前記工程（ａ’）において採取された糞便量で除することによりなされることを特徴とする請求項２記載の動物由来の標的核酸の検出方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）が下記工程（ａ’）であり、前記工程（ｂ）が下記工程（ｂ’−１）であることを特徴とする請求項１記載の動物由来の標的核酸の検出方法。
（ａ’）糞便を採取し、糞便量を測定する工程。
（ｂ’−１）前記工程（ａ’）において採取された糞便から核酸を回収し、前記工程（ａ’）において採取された糞便量に比例した容量の核酸溶液を調製する工程。
【請求項５】
前記工程（ｂ’−１）が下記工程（ｂ’−２）であることを特徴とする請求項４記載の動物由来の標的核酸の検出方法。
（ｂ’−２）前記工程（ａ’）において採取された糞便又はその固形成分に、前記工程（ａ’）において採取された糞便量に比例した容量の抽出用溶液を混合し、当該抽出用溶液に抽出した核酸を回収し、前記工程（ａ’）において採取された糞便量に比例した容量の核酸溶液を調製する工程。
【請求項６】
前記工程（ａ）が下記工程（ａ’）であり、前記工程（ｂ）が下記工程（ｂ”）であることを特徴とする請求項１記載の動物由来の標的核酸の検出方法。
（ａ’）糞便を採取し、糞便量を測定する工程。
（ｂ”）前記工程（ａ’）において採取された糞便又はその固形成分に、前記工程（ａ’）において採取された糞便量に比例した容量の抽出用溶液を混合して核酸を抽出した後、当該抽出用溶液から一定容量の溶液を分取し、この分取された溶液中の核酸を回収し、一定容量の核酸溶液を調製する工程。
【請求項７】
糞便量が、重量、体積、固形成分体積、及び吸光度からなる群より選択される１以上の測定値により規定されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の動物由来の標的核酸の検出方法。
【請求項８】
前記標的核酸がＲＮＡであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の動物由来の標的核酸の検出方法。
【請求項９】
前記標的核酸がヒト由来の核酸であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の動物由来の標的核酸の検出方法。
【請求項１０】
前記標的核酸が消化器系疾患のマーカー遺伝子由来の核酸であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の動物由来の標的核酸の検出方法。
【請求項１１】
前記標的核酸が癌のマーカー遺伝子由来の核酸であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の動物由来の標的核酸の検出方法。
【請求項１２】
前記標的核酸が大腸癌のマーカー遺伝子由来の核酸であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の動物由来の標的核酸の検出方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか記載の動物由来の標的核酸の検出方法を用いて、疾患の罹患の有無を検査する方法であり、
前記標的核酸を前記疾患のマーカー遺伝子由来の核酸とし、
請求項１〜８のいずれか記載の動物由来の標的核酸の検出方法により検出された当該標的核酸の量から、予め設定された閾値に基づき、糞便が採取された動物が前記疾患に罹患しているか否かを判定することを特徴とする疾患の検査方法。
【請求項１４】
大腸癌の罹患の有無を、糞便中の大腸癌のマーカー遺伝子由来の核酸を検出することにより検査する方法であって、
前記標的核酸を、大腸癌患者において発現量が増大する大腸癌マーカー遺伝子由来の核酸とし、
請求項１〜８のいずれか記載の動物由来の標的核酸の検出方法を行って検出された標的核酸の量が、予め設定された閾値以上である場合に、当該糞便が採取されたヒトは大腸癌に罹患していると判定し、前記閾値未満である場合に、大腸癌に罹患していないと判定することを特徴とする大腸癌の検査方法。
【請求項１５】
前記標的核酸が、ＣＯＸ２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）遺伝子由来核酸であることを特徴とする請求項１４記載の大腸癌の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糞便中に含まれる動物由来の核酸を高精度に検出するための方法、及び該検出方法を利用した大腸癌の検査方法に関する。
本願は、２００９年７月６日に日本国に出願された特願２００９−１５９８４８号に基づき優先権を主張し、それらの内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子解析は、近年の遺伝子操作技術や遺伝子組換え技術等の進歩に伴い、医療、学術研究、産業等の多くの分野において広く応用されている。例えば、糞便、唾液や血液等の体液、口腔粘膜や子宮粘膜等の粘膜や粘液等の生体試料中に含まれるＲＮＡやＤＮＡを回収し、各試料間の核酸の特徴を比較することによって、癌や、細菌（バクテリア）・ウィルス・寄生虫等による感染症等の疾患を診断することが行われている。【０００３】
遺伝子解析は、通常、試料中に、解析対象である標的遺伝子と相同的な塩基配列を有する核酸（標的遺伝子由来核酸）が存在するか否かを検出することにより行われるが、臨床検査における検体等のように、検体が微量である場合や試料中の核酸濃度が非常に薄い場合には、試料中の標的遺伝子由来核酸を増幅して解析を行うことが多い。このような核酸の増幅には、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）法が最も一般的に用いられている。例えば、遺伝病、疾病感受性、癌等の診断において、異常細胞特異的なｍＲＮＡ等の標的核酸をＰＣＲ増幅して検出する方法が、広く用いられている。【０００４】
結腸直腸癌は、日本では死亡原因の第１位、米国では癌による死亡原因の第２位である。米国では結腸直腸癌が毎年約１３０万人に発見されており、約５万人が死亡し、死亡原因の第３位となっている。このため、癌対策が急務である。
大部分の直腸結腸癌は、はじめは小さな良性腺腫から、悪性腫瘍へと数十年かけてゆっくりと進行するため、早期に発見されれば外科的処置が有効であり、完治可能となる。例えば良性腺腫であれば、開腹手術よりも低侵襲である内視鏡的切除も可能である。また、悪性腫瘍であっても、早期であれば内視鏡的切除が可能であり、さらには進行癌でも外科的処置が多くの場合有効である。この緩やかな進行のために、予防及び介入の機会が多くある。したがって、結腸直腸腺腫・腫瘍は、早期の検出・除去によって罹患率と死亡率を大幅に下げることが可能である。【０００５】
しかしながら、現在行われている腺腫・癌の検出方法、例えば、結腸・直腸腺腫・腫瘍のスクリーニング検査法（便潜血検査、注腸Ｘ線造影検査、Ｓ状結腸内視鏡検査、全大腸内視鏡検査等）には様々な問題が存在している。
例えば便潜血検査は、便中に含まれる血液を検査し、流血している腺腫・腫瘍を間接的に検出するものである。しかし、早期腺腫・腫瘍の場合には偽陰性となりやすいため、感度は十分とはいえない。また、腺腫・腫瘍以外の原因による腸管出血（痔など）があった場合に偽陽性となってしまうため、特異度が高いとはいえない。
注腸造影検査は、下剤で前処置を十分行った後、肛門からバリウムと空気を注入し、Ｘ線写真をとるものである。この検査方法では、癌の正確な位置や大きさ、腸の狭さの程度等がわかるため、形の大きな進行癌は検出できる一方、形の小さな早期癌や平らな扁平癌は検出しにくいという欠点がある。
Ｓ状結腸内視鏡検査、全大腸内視鏡検査は、下剤で前処置を十分行った後、ビデオスコープで腸内観察する方法である、この検査方法のための前処置には、２〜３リットルの下剤を服用することが必要であるため、被検者に辛い負担となる。さらに、検査中、穿孔が発生する場合があり、そのため本方法はスクリーニング検査として不適とされている。
このように、上記のような現在の検査法は、腺腫・癌の検診方法として必要十分な性能を満たしているとは言えない。そこで、侵襲度が低く、感度・特異度の高い検査方法が望まれている。【０００６】
近年、糞便中の癌遺伝子を増幅し、解析することによって大腸癌を検出する方法が開示されている。例えば、特許文献１及び非特許文献１には、癌細胞由来の核酸に多く観察される非アポトーシス性ＤＮＡを検出することによって大腸癌を検査する方法、特に、Ａｌｕ反復領域・アルフォイド反復領域や、ｐ５３等の癌関連遺伝子の断片長の差異に基づいて大腸癌を検査する方法が開示されている。【０００７】
このように、糞便中の癌細胞由来の核酸等の核酸を解析するためには、糞便から高品質の核酸を回収することが重要である。例えば、糞便中には、消化残留物やバクテリアが大量に含まれているため、核酸は非常に分解されやすいという問題がある。また、糞便から回収された核酸に、糞便中の夾雑物が持ち込まれることにより、解析精度が損なわれるという問題もある。このため、より信頼性の高い核酸解析結果を得るために、糞便から、分解等を防止しつつ精製度の高い核酸を回収するための方法の開発がなされている。【０００８】
例えば特許文献２には、糞便をゲル氷点未満の温度まで冷却することによって便の構造を安定化させ、この状態の糞便からの細胞を分離し、そこから抽出したＤＮＡを解析する方法が開示されている。その他、糞便試料からＲＮＡを回収する方法として、非特許文献２には、糞便試料からタンパク質等の夾雑物を除去した後、フェノールとカオトロピック塩を用いてＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡをさらにシリカ含有固形支持体に吸着させることにより回収する方法が開示されている。【０００９】
また、糞便から細胞を分離回収せずに、糞便から直接核酸を回収する方法もある。例えば特許文献３には、糞便中の癌遺伝子を解析するための、糞便サンプルの調整方法が開示されている。これは、糞便サンプルを、糞便質量１に対して、少なくとも５の溶媒比でホモジナイズした後、ＤＮＡを、細菌のＤＮＡを含めて回収する方法である。また、特許文献４には、採取された糞便をＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、調製された懸濁物から直接ＲＮＡを抽出し、癌遺伝子であるＣＯＸ２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）遺伝子の転写産物を検出する方法が開示されている。【００１０】
さらに、糞便中には、胆汁酸やその塩等の、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等の核酸増幅反応に対して阻害作用を有する物質が含まれている（例えば、非特許文献３参照。）。例えば、大人の平均的な排泄糞便量は、約２００〜４００ｇ／日とされるが、健常人ではその糞便中に２００〜６５０ｍｇ／日の胆汁酸が排泄されるという報告がある。すなわち、便１ｇあたりに換算した場合、健常人で約０．５ｍｇ〜３．２５ｍｇ、患者でその１０倍の胆汁酸が含まれることになる。一方で、胆汁酸塩によるＰＣＲの阻害効果は、５０μｇ／ｍＬ程度の濃度で生じるとの報告もある。したがって、糞便から核酸を抽出し、それをＰＣＲ等で増幅する場合は、増幅効率を向上させるために、胆汁酸塩等の核酸増幅反応阻害物質のキャリーオーバーを防止することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２００５−５１４０７３号公報
【特許文献２】特表平１１−５１１９８２号公報
【特許文献３】特表２００２−５３９７６５号公報
【特許文献４】日本国特許第４１３４０４７号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ボイントン（Boynton）、外３名、２００３年、クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry ）、第４９巻第７号、第１０５８〜１０６５ページ。
【非特許文献２】アレクサンダー（Alexander）、外１名、１９９８年、ダイジェスティブ・ディシーシズ・アンド・サイエンシズ（Digestive Diseases and Sciences）、第４３巻第１２号、第２６５２〜２６５８ページ。
【非特許文献３】ウィルソン（Wilson IG）、アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY）、１９９７年、第６３巻、第３７４１〜３７５１ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
特許文献２記載の方法においては、糞便試料を冷却しながら細胞を分離している。この分離操作を冷却せずに行うと、糞便試料の変質等により正しい検出結果を得ることができなくなってしまうためであり、糞便試料の変質を効果的に防止するためには、採便直後に冷却することが重要である。しかしながら、検診等のように家庭において採便が行われる場合には、採取後速やかに糞便試料を冷却することは非常に困難であり、現実的ではない。
また、特許文献２記載の方法や非特許文献２記載の方法において行われているように、糞便から夾雑物を除去し、標的となる遺伝子を持つ細胞を分離し、そこから核酸を回収する方法には、細胞を分離する工程が煩雑であり、検査のコストアップにつながるという問題に加えて、細胞を分離する工程後に回収される核酸は、収量が低く、工程による収量の損失が大きいという問題もある。このため、糞便から核酸を回収する場合には、ヒト由来細胞と細菌由来細胞を区別せず、混在した状態で回収するほうが望ましい。【００１４】
特許文献３及び４に記載されている方法では、糞便から細胞を分離する工程なしに核酸を回収している。しかしながら、糞便から直接核酸を回収した場合には、細胞を分離した後に回収する方法に比べて、回収後の核酸に糞便中の夾雑物が大量に持ち込まれてしまうにもかかわらず、これらの方法では、胆汁酸や胆汁酸塩等の核酸増幅反応阻害物質のキャリーオーバーについては、一切考慮されておらず、核酸解析結果の信頼性が十分ではないという問題がある。【００１５】
本発明は、糞便中の解析対象である標的核酸を検出する方法であって、煩雑な細胞分離操作を要することなく、糞便から直接核酸を回収した場合であっても、信頼性の高い検出結果を簡便に得ることができる方法、及び当該方法を利用した疾患、特に大腸癌の検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、糞便から直接回収した核酸を核酸検出反応に用いる方法において、糞便量当たり所定の核酸溶液量となるように糞便から核酸を回収し、この回収された核酸溶液のうちの所定容量を核酸検出反応に用いることにより、糞便から回収された核酸を定量し、一定量の核酸を核酸検出反応に用いた場合よりも、信頼性の高い検出結果が得られることを見出し、本発明を完成させた。【００１７】
すなわち、本発明は、
（１）  糞便試料から糞便を排泄した動物由来の標的核酸を検出する方法であって、（ａ）一定量の糞便を採取する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において採取された糞便から核酸を回収し、一定容量の核酸溶液を調製する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）において調製された核酸溶液から一定容量の溶液を分取し、この分取された溶液中の標的核酸を検出する工程と、を有することを特徴とする動物由来の標的核酸の検出方法、
（２）  前記工程（ａ）が下記工程（ａ’）であり、前記工程（ｃ）において検出された標的核酸の量を、前記工程（ａ）において採取された糞便量に基づいて補正することを特徴とする前記（１）記載の動物由来の標的核酸の検出方法；（ａ’）糞便を採取し、糞便量を測定する工程、
（３）  前記補正が、前記工程（ｃ）において検出された標的核酸の量を、前記工程（ａ’）において採取された糞便量で除することによりなされることを特徴とする前記（２）記載の動物由来の標的核酸の検出方法、
（４）  前記工程（ａ）が下記工程（ａ’）であり、前記工程（ｂ）が下記工程（ｂ’−１）であることを特徴とする前記（１）記載の動物由来の標的核酸の検出方法；（ａ’）糞便を採取し、糞便量を測定する工程、（ｂ’−１）前記工程（ａ’）において採取された糞便から核酸を回収し、前記工程（ａ’）において採取された糞便量に比例した容量の核酸溶液を調製する工程、
（５）  前記工程（ｂ’−１）が下記工程（ｂ’−２）であることを特徴とする前記（４）記載の動物由来の標的核酸の検出方法；（ｂ’−２）前記工程（ａ’）において採取された糞便又はその固形成分に、前記工程（ａ’）において採取された糞便量に比例した容量の抽出用溶液を混合し、当該抽出用溶液に抽出した核酸を回収し、前記工程（ａ’）において採取された糞便量に比例した容量の核酸溶液を調製する工程、
（６）  前記工程（ａ）が下記工程（ａ’）であり、前記工程（ｂ）が下記工程（ｂ”）であることを特徴とする請求項１記載の動物由来の標的核酸の検出方法；（ａ’）糞便を採取し、糞便量を測定する工程、（ｂ”）前記工程（ａ’）において採取された糞便又はその固形成分に、前記工程（ａ’）において採取された糞便量に比例した容量の抽出用溶液を混合して核酸を抽出した後、当該抽出用溶液から一定容量の溶液を分取し、この分取された溶液中の核酸を回収し、一定容量の核酸溶液を調製する工程、
（７）  糞便量が、重量、体積、固形成分体積、及び吸光度からなる群より選択される１以上の測定値により規定されることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の動物由来の標的核酸の検出方法、
（８）  前記標的核酸がＲＮＡであることを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれか記載の動物由来の標的核酸の検出方法、
（９）  前記標的核酸がヒト由来の核酸であることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか記載の動物由来の標的核酸の検出方法、
（１０）  前記標的核酸が消化器系疾患のマーカー遺伝子由来の核酸であることを特徴とする前記（１）〜（９）のいずれか記載の動物由来の標的核酸の検出方法、
（１１）  前記標的核酸が癌のマーカー遺伝子由来の核酸であることを特徴とする前記（１）〜（９）のいずれか記載の動物由来の標的核酸の検出方法、
（１２）  前記標的核酸が大腸癌のマーカー遺伝子由来の核酸であることを特徴とする前記（１）〜（９）のいずれか記載の動物由来の標的核酸の検出方法、
（１３）  前記（１）〜（８）のいずれか記載の動物由来の標的核酸の検出方法を用いて、疾患の罹患の有無を検査する方法であり、前記標的核酸を前記疾患のマーカー遺伝子由来の核酸とし、前記（１）〜（８）のいずれか記載の動物由来の標的核酸の検出方法により検出された当該標的核酸の量から、予め設定された閾値に基づき、糞便が採取された動物が前記疾患に罹患しているか否かを判定することを特徴とする疾患の検査方法、
（１４）  大腸癌の罹患の有無を、糞便中の大腸癌のマーカー遺伝子由来の核酸を検出することにより検査する方法であって、前記標的核酸を、大腸癌患者において発現量が増大する大腸癌マーカー遺伝子由来の核酸とし、前記（１）〜（８）のいずれか記載の動物由来の標的核酸の検出方法を行って検出された標的核酸の量が、予め設定された閾値以上である場合に、当該糞便が採取されたヒトは大腸癌に罹患していると判定し、前記閾値未満である場合に、大腸癌に罹患していないと判定することを特徴とする大腸癌の検査方法、
（１５）  前記標的核酸が、ＣＯＸ２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）遺伝子由来核酸であることを特徴とする前記（１４）記載の大腸癌の検査方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の動物由来の標的核酸の検出方法により、夾雑物の多い糞便から直接回収した核酸を核酸検出反応に用いる場合であっても、従来になく信頼性の高い検出結果を得ることができる。また、糞便から回収した核酸の定量工程及び濃度調整工程が省略されるため、標的核酸の検出にかかる労力及びコストが削減される上に、コンタミネーション等のリスクも低減される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】一定量の糞便を採取可能な採便容器の一態様を示した図である。
【図１Ｂ】一定量の糞便を採取可能な採便容器の一態様を示した図である。
【図１Ｃ】一定量の糞便を採取可能な採便容器の一態様を示した図である。
【図１Ｄ】一定量の糞便を採取可能な採便容器の一態様を示した図である。
【図１Ｅ】一定量の糞便を採取可能な採便容器の一態様を示した図である。
【図２Ａ】実施例１において、各サンプルから回収されたＲＮＡ中のＣＯＸ２遺伝子の発現量（コピー数）を示したグラフである。
【図２Ｂ】実施例１において、各サンプルから回収されたＲＮＡ中のＣＯＸ２遺伝子の発現量（コピー数）を示したグラフである。
【図３】ペレットの高さと固形成分体積との相関を示したグラフである。
【図４Ａ】実施例２において、各サンプルから回収されたＲＮＡ中のＣＯＸ２遺伝子の発現量（コピー数）を示したグラフである。
【図４Ｂ】実施例２において、各サンプルから回収されたＲＮＡ中のＣＯＸ２遺伝子の発現量（コピー数）を示したグラフである。
【図５Ａ】実施例３において、各サンプルから回収されたＲＮＡ中のＣＯＸ２遺伝子の発現量（コピー数）を示したグラフである。
【図５Ｂ】実施例３において、各サンプルから回収されたＲＮＡ中のＣＯＸ２遺伝子の発現量（コピー数）を示したグラフである。
【図５Ｃ】実施例３において、各サンプルから回収されたＲＮＡ中のＣＯＸ２遺伝子の発現量（コピー数）を示したグラフである。
【図５Ｄ】実施例３において、各サンプルから回収されたＲＮＡ中のＣＯＸ２遺伝子の発現量（コピー数）を示したグラフである。
【図５Ｅ】実施例３において、各サンプルから回収されたＲＮＡ中のＣＯＸ２遺伝子の発現量（コピー数）を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
一般的に、核酸解析において用いられる各種反応の反応系には、一定量の核酸が含まれるように調製される。これは、反応系に適当量の核酸が存在しない場合には、十分な検出感度が担保されないと考えられているためであり、反応系にどの程度の量の核酸を添加するかは、経験的に決定されている。また、比較的近似した複数の検体を解析する場合には、各反応系に用いる核酸量を一定量に揃えておくことにより、各検体間の結果を比較検討しやすくなる。
【００２１】
従来法では、糞便から回収した核酸を用いる場合にも、その他の生体試料から回収された核酸と同様に、回収された核酸から一定量の核酸を核酸解析の反応系に用いていた。具体的には、例えば、特定の遺伝子の発現産物（ｍＲＮＡ）を標的核酸とした場合に、糞便中の標的核酸を検出するためには、まず、糞便からＲＮＡを抽出して定量した後、得られたＲＮＡを適宜希釈して一定濃度のＲＮＡ溶液を調製し、このＲＮＡ溶液を用いて逆転写反応を行った後、得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行うことにより標的核酸を検出していた。
【００２２】
これに対して本発明の標的核酸の検出方法は、糞便から回収された核酸を、逆転写反応や核酸増幅反応等の核酸検出反応に用いる際に、一定量の核酸を用いるのではなく、回収に供された糞便量を基準とし、予め設定された一定量の糞便から回収された核酸を用いることを特徴とする。回収に供された糞便量を基準とすることにより、実際に回収された核酸量を基準とした場合よりも信頼性の高い検出結果が得られる理由は明らかではないが、核酸検出反応の反応系に持ち込まれる糞便由来の阻害物質の量を適当量に抑制することができるためではないかと推察される。
【００２３】
糞便から核酸を回収する際に、回収された核酸へ持ち込まれる糞便由来の阻害物質量は、核酸回収操作に供された糞便の量や状態、回収操作に依存し、実際に回収された核酸量とはほとんど相関しない。そもそも、糞便はヘテロジニアス、つまり、多種多様な成分が不均一に存在しているため、同一人から採取した糞便であっても、採取する部位によって、回収される核酸量が変動し易い。これに対して、回収する条件が同じである場合には、一定量の糞便から回収された核酸へ持ち込まれる阻害物質量は、回収された核酸量が多い場合と少ない場合とにおいて、あまり大きな違いはなく、その存在量の範囲は個体差の範囲に収まる。
【００２４】
つまり、糞便から回収された核酸量が十分であった場合には、その後の核酸検出反応に用いられる核酸量は、回収された核酸のうちのごく一部で済むため、反応系へ持ち込まれる阻害物質量も、ごく少量で済む。逆に、回収された核酸量が少量であった場合には、回収された核酸の大部分が核酸検出反応に用いられることになるため、過剰量の阻害物質が反応系へ持ち込まれてしまう。この結果、反応系へ添加した核酸量は等量であるにもかかわらず、反応系に持ち込まれた阻害物質量が異なるために、糞便から十分量の核酸が回収された場合には標的核酸が検出されたにも関わらず、少量の核酸が回収された場合には標的核酸が検出されない（すなわち、擬陰性）、という結果が生じてしまう。
【００２５】
本発明の動物由来の標的核酸の検出方法においては、核酸検出反応に用いられる核酸量を、予め設定された一定の量の糞便から回収された核酸量とすることにより、反応系へ持ち込まれる阻害物質量を適当な量に抑制することができる。さらに、多数の検体を処理する場合にも、各糞便から同じ条件で核酸を回収し、予め設定した一定量の糞便から回収された量に相当する核酸量を、続く核酸検出反応に用いることにより、反応系に持ち込まれた阻害物質による影響を、個体差程度に抑えることができる。
【００２６】
なお、本発明及び本願明細書において、阻害物質とは、核酸解析において汎用されている核酸増幅反応に対して阻害的に作用する物質を意味する。具体的には、胆汁酸、胆汁酸塩等が挙げられる。また、本発明において、核酸増幅反応とは、ＰＣＲ等のようなＤＮＡポリメラーゼによる核酸伸長を伴う増幅反応を意味する。
【００２７】
また、糞便には腸内常在菌等のバクテリアが大量に含まれており、糞便から回収された核酸の大部分は、バクテリア由来の核酸である。つまり、糞便から回収された核酸量（重量又は濃度）は、その糞便を排泄した動物由来の核酸の存在を反映しているものではなく、これらを基準とすることは、バクテリア由来の核酸を基準とすることになるため、かえって検出結果にノイズを与えることになる。本発明の標的核酸の検出方法は、回収された核酸量を基準としないことにより、従来法よりも核酸検出反応により得られた検出結果のノイズを低減させることができる。
【００２８】
特に、本発明は、大腸癌患者又はその疑いのある者（大腸癌罹患の有無の判別が要される被検者を含む）から採取された糞便に対して行われることが好ましい。大腸癌患者と健常人では胆汁酸の総量は変らないという報告もなされているものの（Mudd DG, et al.、An international journal of gastroenterology and hepatology、第２１巻、第５８７〜５９０ページ。）、実際に核酸増幅反応等の効率の比較を行なってみると（例えば、後記実施例４等参照。）、健常人に比べて大腸癌患者では、こうした阻害が多く見られ、通常の組織を用いた検査方法と同様に回収された核酸量を基準とした場合には、癌の検出感度・特異度に悪影響を及ぼすことがわかってきたためである。
【００２９】
具体的には、本発明の動物由来の標的核酸の検出方法（以下、「本発明の検出方法」ということがある。）は、糞便試料から動物由来の標的核酸を検出する方法であって、下記工程（ａ）〜（ｃ）を有することを特徴とする。
（ａ）  一定量の糞便を採取する工程と、
（ｂ）  前記工程（ａ）において採取された糞便から核酸を回収し、一定容量の核酸溶液を調製する工程と、
（ｃ）  前記工程（ｂ）において調製された核酸溶液から一定容量の溶液を分取し、この分取された溶液中の標的核酸を検出する工程。
以下、工程ごとに説明する。
【００３０】
まず、工程（ａ）として、予め設定された一定量の糞便を採取する。採取する糞便の量は、特に限定されるものではないが、例えば、重量として１０ｍｇ〜１ｇであることが好ましい。糞便量があまりに多くなってしまうと、採取作業に手間がかかり、採便容器も大きくなってしまうため、取り扱い性等が低下するおそれがある。逆に糞便量があまりに少量である場合には、糞便中に含まれる大腸剥離細胞等の哺乳細胞数が少なくなりすぎるため、必要な核酸量を回収できず、目的の核酸解析の精度が低下するおそれがある。また、前述したように、糞便はヘテロジニアスであるため、哺乳細胞の局在の影響を避けるために、採糞時には、糞便の広範囲から採取することが好ましい。
【００３１】
なお、本発明の検出方法に供される糞便は、動物のものであれば特に限定されるものではないが、哺乳動物由来のものであることが好ましく、ヒト由来のものであることがより好ましい。例えば、定期健診や診断等のために採取されたヒトの糞便であることが好ましいが、家畜や野生動物等の糞便であってもよい。また、採取後一定期間保存されたものであってもよいが、採取直後のものであることが好ましい。さらに、採取された糞便は、排泄直後のものであることが好ましいが、排泄後時間を経たものであってもよい。
【００３２】
工程（ａ）において、糞便量は、各検体間で比較可能な測定値により規定される量であれば特に限定されるものではなく、例えば、糞便の重量であってもよく、体積（容量）であってもよく、固形成分体積であってもよい。糞便の重量や体積は、常法により測定することができる。また、固形成分体積は、例えば、遠心分離処理やフィルター濾過等の処理等の公知の固液分離処理により、糞便から液体成分を除去した後の残渣（固形成分）の体積を常法により測定することができる。
【００３３】
また、糞便量は、検体間で比較可能であればよく、物理的に厳密な量である必要はない。例えば、糞便をそのまま、又は適当な溶媒を添加して懸濁液として、遠心分離処理を行い、ペレット（沈殿した固形成分）の高さを、各糞便の固形成分体積の測定値としてもよい。その他、糞便を適当な溶媒に投入して得られた懸濁液又はその上清の吸光度を、各糞便の固形成分体積の測定値としてもよい。これは、溶液中に固形成分が多いほど、吸光度が大きくなることを利用している。
【００３４】
糞便の採取方法は特に限定されるものではなく、最終的に所定量の糞便が採取可能ないずれの方法を用いてもよい。例えば、所定の体積量の糞便が回収可能な採便棒を含む公知の採便容器を用いることができる。糞便を採取する採便容器に、予め、抽出用溶液を添加しておくことにより、糞便採取後速やかに核酸抽出工程を行うことができる。その他、採取した糞便は、工程（ｂ）を行うまで、適当な保存用溶液中に懸濁させた状態で保存していてもよい。例えば、採便容器に予め適当な保存用溶液を添加しておき、この採便容器に採取した糞便を投入することにより、採便容器内で糞便を保存することができ、また、核酸抽出・解析工程を行う場所まで輸送することもできる。
【００３５】
図１は、所定量（体積）の糞便が回収可能な採便棒と一体化した採便容器の一態様を示した図である。先端が尖っている採便棒１３と一体化した蓋１２と、容器本体１１とを有する採便容器である。採便棒１３には、糞便Ｅを一定量採取し得る穴１３ａが空いている。また、採便棒１３上をスライドすることにより穴１３ａの蓋となり得る可動蓋１３ｂも付いている。図１Ａのように、まず、採便棒１３を、可動蓋１３ｂを穴１３ａよりも蓋１２側に寄せて、穴１３ａが完全に開口している状態とした後に、糞便Ｅに押し付ける。すると、図１Ｂに示すように、穴１３ａに糞便Ｅが充填される。この状態で、可動蓋１３ｂをスライドさせて穴１３ａに蓋をすることにより、穴１３ａの容量の糞便を正確に採取することができる（図１Ｃ）。その後、可動蓋１３ｂを元の位置に戻して穴１３ａが完全に開口している状態とした後に（図１Ｄ）、蓋１２を容器本体１１に収納する（図１Ｅ）。容器本体１１に、予め適当な保存用溶液Ｓを添加しておいた場合には、蓋１２の収納により採取された糞便は保存用溶液Ｓに浸漬される結果、次の工程（ｂ）まで安定して保存することが可能になる。このような採便容器は、家庭でも安全に取り扱うことが出来る。
【００３６】
次に、工程（ｂ）として、工程（ａ）において採取された糞便から核酸を回収し、一定容量の核酸溶液を調製する。本発明においては、糞便を、細胞や夾雑物等の分離操作を行うことなく、糞便に含まれている全ての生物種の核酸、主に当該糞便を排泄した動物由来の核酸と腸内常在菌等のバクテリア由来の核酸とを同時に糞便から抽出し回収する。ここで、糞便に含まれている核酸としては、動物由来の核酸とバクテリア由来の核酸に加えて、当該動物が摂取した食物由来の核酸等が挙げられる。
【００３７】
工程（ｂ）においては、糞便から回収した核酸を、最終的に予め設定された一定量の核酸溶液として調製すればよく、糞便からの核酸の回収方法は、特に限定されるものではなく、当該技術分野において公知の方法の中から適宜選択して用いることができる。糞便から回収する核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡの両方であってもよい。本発明においては、特にＲＮＡを回収することが好ましい。
【００３８】
例えば、糞便又はその固形成分に、抽出用溶液を添加することにより、糞便由来の固形成分（以下、単に「固形成分」ということがある。）中のタンパク質を変性させ、この固形成分中の哺乳細胞や腸内常在菌等の細胞から核酸を溶出させた後、この溶出させた核酸を回収することにより、糞便由来の固形成分から核酸を回収することができる。
【００３９】
抽出用溶液を添加する前に、採取された糞便にその他の溶液、例えば、適当な保存用溶液を添加して懸濁液としていた場合には、当該懸濁液から固形成分を回収し、この回収した固形成分に抽出用溶液を添加する。懸濁液からの固形成分の回収は、遠心分離処理やフィルター濾過等の処理等の公知の固液分離処理により行うことができる。なお、回収された固形成分を、適当なバッファーにより洗浄した後に、抽出用溶液を添加してもよい。
【００４０】
抽出用溶液としては、固形成分中のタンパク質を変性させ、この固形分中の哺乳細胞や腸内常在菌等の細胞から、核酸を抽出用溶液中に溶出させることが可能な溶液であれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において用いられているいずれの溶液を用いてもよい。例えば、カオトロピック塩、有機溶媒、界面活性剤等の、通常タンパク質の変性剤として用いられている化合物を有効成分として適当な溶媒に添加した溶液を、抽出用溶液として用いることができる。なお、これらの有効成分は２種類以上を組み合わせたものであってもよい。
【００４１】
抽出用溶液の有効成分となり得るカオトロピック塩としては、例えば、塩酸グアニジン、グアニジンイソチオシアネート、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びトリクロロ酢酸ナトリウム等がある。抽出用溶液の有効成分となり得る界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤であることが好ましい。該非イオン性界面活性剤として、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ＣＨＡＰＳ（３−［３−コラミドプロピルジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホネート）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０等がある。カオトロピック塩や界面活性剤の濃度は、固形成分から核酸を溶出可能な濃度であれば、特に限定されるものではなく、糞便量（固形成分量）と抽出用溶液との混合比や、回収された核酸の検出方法等を考慮して、適宜決定することができる。
【００４２】
抽出用溶液の有効成分となり得る有機溶媒としては、フェノールであることが好ましい。フェノールは中性であってもよく、酸性であってもよい。酸性のフェノールを用いた場合には、ＤＮＡよりもＲＮＡを選択的に水層に抽出することができる。
【００４３】
これらの有効成分を添加して抽出用溶液を調製する溶媒としては、例えば、リン酸バッファーやトリスバッファー等を用いることができる。高圧蒸気滅菌等により、ＤＮａｓｅを失活させた薬剤であることが好ましく、さらにプロテイナーゼＫ等のタンパク質分解酵素を含有させた薬剤であることがより好ましい。一方、ＲＮＡを回収する場合には、該溶出用薬剤として、例えば、クエン酸バッファー等を用いることができるが、ＲＮＡは非常に分解されやすい物質であるため、チオシアン酸グアニジンや塩酸グアニジン等のＲＮａｓｅ阻害剤を含有したバッファーを用いることが好ましい。
【００４４】
糞便又はその固形成分に添加される抽出用溶液の量は、特に限定されるものではなく、工程（ａ）において採取された糞便量、抽出用溶液の種類等を考慮して、適宜決定することができる。
【００４５】
糞便又はその固形成分と抽出用溶液とは、速やかに混合することが好ましい。なお、糞便等と抽出用溶液を混合する方法は、物理的手法により混合する方法であれば、特に限定されるものではない。例えば、予め抽出用溶液を入れておいた密閉可能な容器に、採取された糞便等を投入して密閉した後、該容器を上下に転倒させることにより、混合してもよく、該容器をボルテックス等の振とう機にかけることにより混合してもよい。
【００４６】
固形成分から抽出用溶液に溶出された核酸を回収し、この回収された核酸を予め設定された一定容量の核酸溶液調製用溶媒に溶解させることにより、核酸溶液を調製する。核酸溶液調製用溶媒として用いられる溶媒は、通常、精製された核酸の溶液を調製するために用いられる溶媒の中から、その後の検出方法を考慮して適宜決定することができる。このような溶媒として、例えば、精製水等が挙げられる。
【００４７】
抽出用溶液に溶出させた核酸の回収は、例えば、エタノール沈殿法や塩化セシウム超遠心法等の公知の手法で行うことができる。このようにして回収した核酸に、水等の適当な溶媒を適宜添加することにより、一定容量の核酸溶液を調製することができる。
【００４８】
また、抽出用溶液に溶出させた核酸を無機支持体に吸着させた後、この吸着させた核酸を、一定容量の溶媒を用いて無機支持体から溶出させることにより、一定容量の核酸溶液を調製することができる。核酸を吸着させる無機支持体は、核酸を吸着することができる公知の無機支持体を用いることができる。また、該無機支持体の形状も特に限定されるものではなく、粒子状であってもよく、膜状であってもよい。該無機支持体として、例えば、シリカゲル、シリカ質オキシド、ガラス、珪藻土等のシリカ含有粒子（ビーズ）や、ナイロン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ニトロセルロース等の多孔質膜等がある。吸着させた核酸を無機支持体から溶出させる溶媒は、回収する核酸の種類やその後の核酸解析方法等を考慮して、これらの公知の無機支持体から核酸を溶出するために通常用いられている溶媒を適宜用いることができる。該溶出用溶媒として、特に精製水であることが好ましい。なお、核酸を吸着させた無機支持体は、核酸を溶出させる前に、適当な洗浄バッファーを用いて洗浄することが好ましい。
【００４９】
核酸を回収する前に、核酸が溶出された抽出用溶液から、変性させたタンパク質を除去してもよい。核酸を回収する前に、予め変性させたタンパク質を除去することにより、回収される核酸の品質を向上させることができる。抽出用溶液からのタンパク質の除去は、公知の手法で行うことができる。例えば、遠心分離により、変性タンパク質を沈殿させて上清のみを回収することにより、変性タンパク質を除去することができる。また、クロロホルムを添加し、ボルテックス等により充分に攪拌混合させた後に遠心分離を行い、変性タンパク質を沈殿させて上清のみを回収することにより、単に遠心分離を行う場合よりも、より完全に変性タンパク質を除去することができる。
【００５０】
なお、工程（ｂ）は、核酸抽出キット等の市販のキットを用いて行うこともできる。市販の核酸抽出キットでは、一般的に、所定量の糞便から、所定量の抽出用溶液を用いて核酸を抽出し、所定量の核酸溶液として核酸を回収する方法が採用されているためである。
【００５１】
さらに、工程（ｃ）として、工程（ｂ）において調製された核酸溶液から一定容量の溶液を分取し、この分取された溶液中の標的核酸を検出する。つまり、この分取された一定容量の溶液を、逆転写反応や核酸増幅反応等の核酸検出反応に用いる。このように、工程（ｃ）において調製された核酸溶液の濃度にかかわらず、予め設定された容量の核酸溶液を核酸検出反応に用いることにより、過剰量の糞便由来の阻害物質が、核酸検出反応の反応系に持ち込まれることを防止することができる。さらに、従来法のように、ＵＶ測定等により核酸溶液の濃度を測定した後、一定濃度に希釈釈する工程を要しないため、検出操作にかかる時間と手間を減らし、それに伴うコンタミネーションや核酸の分解のリスクを下げることができる。
【００５２】
例えば健康診断では、通常、被検者が糞便を目分量で採取するため、定められた一定量の糞便を採取することは困難な場合も多い。このように採取される糞便量にばらつきがある場合であっても、最終的に検出された標的核酸量を、糞便量に基づいて補正することにより、本発明の効果を得ることができる。これは、本発明の効果が、核酸検出反応へ供される核酸溶液を一定量の糞便量から回収された核酸とすることにより、核酸検出反応へ核酸とともに持ち込まれる糞便由来の阻害物質量を一定量の糞便量から持ち込まれる量に揃えることによって得られる効果であると推察されるためである。
【００５３】
具体的には、まず、工程（ａ’）として、適当量の糞便を採取し、この糞便量を測定する。糞便量の測定は、工程（ａ）と同様に、各検体間で比較可能な測定値により規定される量であれば特に限定されるものではない。中でも、糞便の重量、体積（容量）、固形成分体積、及び吸光度からなる群より選択される１種以上を測定することが好ましい。
その後、採取された糞便を用いて、工程（ｂ）及び（ｃ）を行った後、検出された標的核酸の量を、回収された糞便量で除することにより、採取された糞便量のばらつきによる測定結果のばらつきを補正することができ、予め一定量の糞便を回収した場合と同様に、阻害物質による影響が低減された信頼性の高い検出結果が得られる。
【００５４】
その他、採取される糞便量にばらつきがある場合に、抽出用溶液に溶出させた核酸を回収し、核酸溶液を調製する際に、採取された糞便量に比例した容量となるように核酸溶液を調製することによっても、採取された糞便量のばらつきを補正することができる。ここで、「糞便量に比例した容量」とは、単位糞便量当たりから回収された核酸が、一定の容量の核酸溶液に調製されることを意味する。例えば、採取された３検体の糞便量が、それぞれ１ｇ、１．５ｇ、２ｇとばらついていた場合であって、糞便量が１ｇであった検体から回収された核酸を１００μＬの核酸溶液に調製した場合には、糞便量が１．５ｇであった検体から回収された核酸を１５０μＬ（１．５×１００μＬ）の核酸溶液に調製し、糞便量が１．５ｇであった検体から回収された核酸を２００μＬ（２×１００μＬ）の核酸溶液に調製する。
【００５５】
さらに、採取された糞便又はその固形成分に添加する抽出用溶液の液量を、採取された糞便量に比例した容量となるようにした後、抽出用溶液に溶出させた核酸を回収し、核酸溶液を調製する際に、採取された糞便量に比例した容量となるように核酸溶液を調製することにより、採取された糞便量のばらつきに依存した核酸へ持ち込まれる阻害物質量のばらつきをより効果的に低減することができる。
【００５６】
また、採取された糞便又はその固形成分に添加する抽出用溶液の液量を、採取された糞便量に比例した容量となるようにした後、当該抽出用溶液から一定容量の溶液を分取し、この分取された溶液中の核酸を回収し、一定容量の核酸溶液を調製することによっても、最終的に回収された核酸溶液に持ち込まれる阻害物質量のばらつきを低減させることができる。
【００５７】
複数の糞便検体をこのように調製することにより、いずれの検体においても、得られた核酸溶液の一定容量に含まれる核酸及び阻害物質の量は、一定量の糞便中に含まれていた核酸及び阻害物質の量に相当する。このため、それぞれの核酸溶液から分取された一定容量の溶液を核酸検出反応に用いることにより、各反応系に持ち込まれる阻害物質量の検体間の差が、糞便中に含まれる阻害物質量の濃度の個体差程度に抑えられ、予め一定量の糞便を回収した場合と同様に、阻害物質による影響が低減された信頼性の高い検出結果が得られる。
【００５８】
標的核酸の検出方法は、特に限定されるものではなく、特定の核酸の検出及び解析に用いられている公知のいずれの手法を用いて行ってもよい。例えば、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を用いて増幅反応産物を解析することにより特定の塩基配列領域を検出する方法等がある。その他、ＲＮＡを回収した場合には、糞便から回収したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを、逆転写反応によりｃＤＮＡ化した後、得られたｃＤＮＡを用いて、ＤＮＡと同様にして解析に用いることができる。
【００５９】
なお、本発明における標的核酸とは、検出又は定量等の解析対象である核酸であり、ＰＣＲ等の通常核酸の解析に用いられる手法によって解析可能な程度に明らかになっている塩基配列を有する核酸であれば、特に限定されるものではない。例えば、動物由来のＤＮＡやｍＲＮＡ等がある。標的核酸としては、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであることが好ましい。また、本発明においては、糞便を排泄する動物由来の核酸であれば特に限定されるものではないが、哺乳細胞由来の核酸であることが好ましく、ヒト由来の核酸であることがより好ましい。
【００６０】
例えば、適当な標的核酸を設定することにより、癌遺伝子等がコードされている塩基配列領域や、マイクロサテライトを含む塩基配列領域等の遺伝的変異の有無を検出することができ、これにより、癌の発症の有無を調べることができる。糞便試料から回収されたＤＮＡを用いた場合には、例えば、ＤＮＡ上のメチル化や、塩基の挿入、欠失、置換、重複、又は逆位等の変異を検出することができる。また、回収されたＲＮＡを用いた場合には、例えば、ＲＮＡ上の塩基の挿入、欠失、置換、重複、逆位、又はスプライシングバリアント（アイソフォーム）等の変異を検出することができる。また、ＲＮＡ発現量を検出することもできる。特に、ｍＲＮＡの発現解析、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異解析、及びＤＮＡのメチル化の解析等を行うことが好ましい。なお、これらの解析は、当該分野において公知の方法により行うことができる。また、Ｋ−ｒａｓ遺伝子変異解析キット、メチル化検出キット等の市販の解析キットを用いてもよい。
【００６１】
本発明においては、糞便から回収される核酸であることから、大腸、小腸、胃等の消化管細胞由来の核酸を標的核酸とすることが好ましく、大腸剥離細胞由来の核酸を標的核酸とすることがより好ましい。
【００６２】
特に、新生物性転化（癌を含む）のマーカー遺伝子や炎症性消化器疾患のマーカー遺伝子由来の核酸を標的核酸とすることが好ましく、大腸癌のマーカー遺伝子由来の核酸を標的核酸とすることがより好ましい。なお、「遺伝子由来の核酸」とは、当該遺伝子のゲノムＤＮＡや、ｍＲＮＡ等の発現産物を意味する。該新生物性転化を示すマーカーとして、例えば、ＣＯＸ２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）遺伝子、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、シアリルＴｎ抗原（ＳＴＮ）等の公知の癌マーカーや、ＡＰＣ遺伝子、ｐ５３遺伝子、Ｋ−ｒａｓ遺伝子等の変異の有無等がある。また、ｐ１６、ｈＭＬＨＩ、ＭＧＭＴ、ｐ１４、ＡＰＣ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥＳＲ１、ＳＦＲＰ２等の遺伝子のメチル化の検出も、大腸疾患の診断マーカーとして有用である（例えば、Lind et al.、「A CpG island hypermethylation profile of primary colorectal carcinomas and colon cancer cell lines」、Molecular Cancer、２００４年、第３巻第２８章参照。）。一方、炎症性消化器疾患を示すマーカーとして、例えば、ＣＯＸ２遺伝子由来核酸等がある。
【００６３】
このような特定の疾患のマーカー遺伝子由来の核酸を標的核酸とし、本発明の検出方法を用いて検出することによって、癌や炎症性疾患等の疾患の罹患の有無や病症の進行度等を検査することができる。例えば、糞便中の標的核酸量について、予め閾値を設定しておき、この閾値に基づき、本発明の検出方法を用いて検出された標的核酸の量から、当該疾患に罹患しているか否か等を判定することができる。この際に用いられる閾値は、例えば、当該疾患に罹患していないことが分かっている集団から採取された糞便と、当該疾患に罹患していることが分かっている集団から採取された糞便とに対して、本発明の検出方法を行って標的核酸量を求め、両集団の測定値を比較することにより、適宜設定することができる。
【００６４】
例えば、ＣＯＸ２遺伝子由来の核酸等の、大腸癌患者において発現量が増大する（発現が誘導される場合も含む）大腸癌のマーカー遺伝子由来核酸を標的核酸として、採取された糞便に対して本発明の検出方法を行い、検出された標的核酸量と予め設定された閾値を比較する。標的核酸量が当該閾値以上である場合に、当該糞便が採取されたヒトは大腸癌に罹患していると判定することができる。逆に、標的核酸量が当該閾値未満である場合に、当該糞便が採取されたヒトは大腸癌に罹患していないと判定することができる。大腸癌患者において発現量が減少するマーカー遺伝子由来核酸を標的核酸とし、検出された標的核酸量が予め設定された閾値以下である場合に大腸癌に罹患しており、当該閾値超の場合には大腸癌に罹患していないと判定することもできる。
【実施例】
【００６５】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、ＭＫＮ４５細胞は、常法により培養したものを用いた。【００６６】
［実施例１］大腸癌関連遺伝子発現解析への応用１
健常人の糞便をよく混ぜて均一化した後、糞便試料１ｇ中にＭＫＮ４５細胞が１×１０５個含むように調整し、混合した。ＭＫＮ４５細胞は胃癌由来であるが、大腸癌細胞同様、ＣＯＸ２遺伝子を高発現するため、今回はこの混合した糞便試料を、大腸癌患者から採取された糞便の擬似試料として用いた。
混合した糞便試料から、１サンプル当たり１ｃｍ３ずつ、計６サンプルを、それぞれ１５ｍＬ遠心チューブ（ファルコン社製）に量りとり、次の工程まで4℃で保存した。糞便試料の採取は、図１に記載の採便ジグ（蓋１２と一体化した採便棒１３）であって、糞便１ｃｍ３を採取し得る穴１３ａとその蓋となり得る可動蓋１３ｂを備える採便棒１３を用いて行った。
その後、各チューブに３ｍＬの抽出用溶液（酸性フェノールグアニジン溶液）を加えて懸濁し、さらに１２，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離処理を行った。該遠心分離処理により得た上清（水層）を、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）のＲＮＡ回収用カラムに通し、添付のプロトコールに従って該ＲＮＡ回収用カラムの洗浄操作及びＲＮＡ溶出操作を行うことにより、ＲＮＡを５０μＬのＲＮＡ溶液として回収した。
ナノドロップ（ナノドロップ社製）を用いて、各ＲＮＡ溶液の濃度を測定し、回収された全ＲＮＡ量の定量を行った。各ＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度の測定結果を表１に示した。これらの６サンプルのＲＮＡ溶液は、一定体積の糞便から抽出したものであり、同程度の濃度になると考えられたが、サンプルによりばらつきが生じていた。【００６７】
【表１】
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【００６８】
市販の逆転写反応キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、回収されたＲＮＡ溶液中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。この際、逆転写反応に用いたＲＮＡ量を、（ａ）回収されたＲＮＡ溶液の濃度に関わらず、１μＬのＲＮＡ溶液を、逆転写反応の反応溶液に添加する条件と、（ｂ）一の逆転写反応の反応溶液に１μｇのＲＮＡが添加されるように、ＲＮＡ溶液の濃度に応じて、反応溶液に添加するＲＮＡ溶液量を変えた条件との２種類の反応条件で行った。【００６９】
得られたｃＤＮＡをテンプレートとしてリアルタイムＰＣＲを行い、ＣＯＸ２遺伝子の発現産物（ｍＲＮＡ）の検出を行った。リアルタイムＰＣＲのプライマーは、アプライドバイオシステム社製のＣＯＸ２プライマープローブＭＩＸ（カタログＮｏ：Ｈｓ００１５３１３３＿ｍ１）を用いた。具体的には、０．２ｍＬの９６ウェルＰＣＲプレートに、各ｃＤＮＡを１μＬずつ分取した。その後、各ウェルに８μＬの超純水と１０μＬの核酸増幅試薬「ＴａｑＭａｎ  ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」（アプライドバイオシステム社製）を添加し、さらに、１μＬのＣＯＸ２プライマープローブＭＩＸ（アプライドバイオシステム社製）をそれぞれ添加して混合し、ＰＣＲ反応溶液を調製した。該ＰＣＲプレートを、ＡＢＩリアルタイムＰＣＲ装置に設置し、９５℃で１０分間処理した後、９５℃で１分間、５６．５℃で１分間、７２℃で１分間の熱サイクルを４０サイクル行った後、さらに７２℃で７分間処理することにより、経時的に蛍光強度を計測しながらＰＣＲを行った。【００７０】
蛍光強度の計測結果を分析して、各サンプルから回収されたＲＮＡ中のＣＯＸ２遺伝子の発現量を算出し、図２のグラフに示した。図２Ａは、逆転写反応に用いたＲＮＡ量が条件（ａ）の場合の結果であり、図２Ｂは、条件（ｂ）の場合の結果である。この結果、条件（ａ）の場合のほうが、条件（ｂ）の場合よりも、サンプル間の差が少なく、ばらつきが小さいことがわかった。そもそもこれらの６サンプルは、同一の糞便試料からＲＮＡを回収したものであり、したがって、理論上は、各サンプルに含まれるＣＯＸ２遺伝子の発現産物量は、ほぼ等しい。つまり、これらの結果から、反応溶液中に添加するＲＮＡ量を揃えた条件（ｂ）の方法よりも、回収されたＲＮＡの濃度に関わらず一定容量のＲＮＡ溶液を逆転写反応に加えた条件（ａ）の方法、すなわち本発明の検出方法のほうが、正確性に優れた結果が得られ、遺伝子発現の検出に適していることがわかった。
条件（ｂ）において、反応溶液中に添加するＲＮＡ量を揃えたにも関わらず、サンプル間のばらつきが大きくなったのは、サンプルによって添加するＲＮＡ液量が変わると、反応液に持ち込まれる阻害物質量も変化し、正確な発現量が測定できなかったためと考えられる。加えて、糞便に含まれるＲＮＡのほとんどは細菌由来のものであるために、ＲＮＡ濃度を測定して１μｇ分のＲＮＡ量を添加したとしても、標的であるヒト由来核酸が一定量含まれるとは限らないことも、正確な検出結果が得られ難い原因と推察される。【００７１】
［実施例２］大腸癌関連遺伝子発現解析への応用２
健常人の糞便をよく混ぜて均一化した後、１サンプル当たり１ｇずつ、計６サンプルを量りとった。このうちの５サンプルに、ＭＫＮ４５細胞を、それぞれ、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６個含むように添加し、よく混合した。残る１サンプルにはＭＫＮ４５細胞を添加しなかった。これらの６サンプルを、それぞれ１５ｍＬ遠心チューブ（ファルコン社製）に充填した５ｍＬの７０％エタノール溶液に懸濁させた。
各サンプルの糞便由来の固形成分体積を、吸光度と沈殿した糞便のペレットの高さの２通りの測定法により測定した。具体的には、得られた懸濁液を２５℃で１日静置し、その上清を波長４５０ｎｍで吸光度を測定した。その後、２，０００×ｇで１０分間遠心処理を行い、沈殿した糞便のペレットの高さをスマートセンサー（オムロン）により測定した。図３は、予め、固形成分体積量既知の糞便に対して、同様にエタノール懸濁液を調製し、遠心分離処理後のペレットの高さを測定して得られた、ペレットの高さと固形成分体積との相関グラフである。この相関グラフを用いて、測定されたペレット高さから、各サンプルの予想される固形成分体積を求めた。【００７２】
各サンプルからＲＮＡを回収するために、上清を除去した後、固形成分に３ｍＬの抽出用溶液（酸性フェノールグアニジン溶液）を加えて懸濁した。その後、実施例１と同様にして、ＲＮＡを５０μＬのＲＮＡ溶液として回収し、各ＲＮＡ溶液の濃度を測定し、回収された全ＲＮＡ量の定量を行った。
表２に、各サンプルのＭＫＮ４５細胞の含有量、吸光度、予想される固形成分体積、及びＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度を示す。この結果、ＲＮＡ濃度のサンプル間の差が大きいことが確認された。ここで、糞便に含まれるＲＮＡのほとんどは細菌由来のものであるため、ＭＫＮ４５細胞の添加量は、回収されたＲＮＡ量にはほとんど影響しないと考えられる。よって、おそらく、各サンプルにおけるＲＮＡ濃度の差は、サンプル便中の細菌の存在のばらつきが反映されたものとかんがえられる。【００７３】
【表２】
2011004517.tif 000003
【００７４】
市販の逆転写反応キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、回収されたＲＮＡ溶液中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。この際、実施例１と同様に、逆転写反応に用いたＲＮＡ量を、（ａ）回収されたＲＮＡ溶液の濃度に関わらず、１μＬのＲＮＡ溶液を、逆転写反応の反応溶液に添加する条件と、（ｂ）一の逆転写反応の反応溶液に１μｇのＲＮＡが添加されるように、ＲＮＡ溶液の濃度に応じて、反応溶液に添加するＲＮＡ溶液量を変えた条件との２種類の反応条件で行った。
その後、得られたｃＤＮＡをテンプレートとして実施例１と同様のプロトコールでリアルタイムＰＣＲを行った。蛍光強度の計測結果を分析して、各サンプルから回収されたＲＮＡ中のＣＯＸ２遺伝子の発現量を算出し、図４のグラフに示した。図４Ａは、逆転写反応に用いたＲＮＡ量が条件（ａ）の場合の結果であり、図４Ｂは、条件（ｂ）の場合の結果である。また、図４Ａ中の直線は、各測定値から求めた近似直線である。この結果、図４Ａに示すように、ＲＮＡ濃度に関わらず、１μＬを逆転写反応に用い、ＣＯＸ２発現量を確認した条件（ａ）の場合、糞便に添加したＭＫＮ４５細胞量が多いほど、ＣＯＸ２遺伝子の発現量が高くなり、相関のある結果が得られた。一方、ＲＮＡ１μｇ分を逆転写反応に添加した条件（ｂ）の場合、ＭＫＮ４５細胞添加量とＣＯＸ２遺伝子のコピー数の間に相関が見られなかった。これは、サンプルごとに逆転写反応液に添加されるＲＮＡ溶液量が異なるため、持ち込まれる阻害物質量も異なり、この結果、阻害物質による影響がサンプル間で異なっていたためと考えられる。その他、ＲＮＡを１μｇとなるように添加する際、ほとんどのサンプルは２μＬ以上のＲＮＡ溶液を逆転写反応液に加える必要があり、このために、抽出したＲＮＡに含まれる糞便由来の反応阻害物質がその分、多量に反応液に持ち込まれたことも、結果に悪影響を及ぼした可能性があると考えられる。
つまり、これらの結果からも、実施例１と同様に、サンプルによって、核酸検出反応へ供されるＲＮＡ溶液の液量が変わると、反応液に持ち込まれる糞便由来の阻害物質量も変化し、糞便中の遺伝子の発現量を正確に測定できず、本発明の検出方法を用いることにより、正確性に優れた結果が得られ、遺伝子発現の検出に適していることが明らかである。【００７５】
［実施例３］大腸癌関連遺伝子発現解析への応用３
健常人の糞便をよく混ぜて均一化した後、１サンプル当たり約１ｇずつ目分量で、計６サンプルを量りとった。このうちの５サンプルに、ＭＫＮ４５細胞を、それぞれ、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６個含むように添加し、よく混合した。残る１サンプルにはＭＫＮ４５細胞を添加しなかった。
これらの６サンプルの重量を測定した後、実施例２と同様にして、７０％エタノール溶液に懸濁させた後、吸光度とペレット高さを測定し、図３の相関グラフを利用して、各サンプルの予想される固形成分体積を求めた。その後、さらに実施例２と同様にして、各サンプルからＲＮＡを５０μＬのＲＮＡ溶液として回収し、各ＲＮＡ溶液の濃度を測定し、回収された全ＲＮＡ量の定量を行った。表３に、各サンプルのＭＫＮ４５細胞の含有量、重量、吸光度、予想される固形成分体積、及びＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度を示す。【００７６】
【表３】
2011004517.tif 000004
【００７７】
市販の逆転写反応キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、回収されたＲＮＡ溶液中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。この際、実施例１と同様に、逆転写反応に用いたＲＮＡ量を、（ａ）回収されたＲＮＡ溶液の濃度に関わらず、１μＬのＲＮＡ溶液を、逆転写反応の反応溶液に添加する条件と、（ｂ）一の逆転写反応の反応溶液に１μｇのＲＮＡが添加されるように、ＲＮＡ溶液の濃度に応じて、反応溶液に添加するＲＮＡ溶液量を変えた条件との２種類の反応条件で行った。
その後、得られたｃＤＮＡをテンプレートとして実施例１と同様のプロトコールでリアルタイムＰＣＲを行った。蛍光強度の計測結果を分析して、各サンプルから回収されたＲＮＡ中のＣＯＸ２遺伝子の発現量を算出し、図５のグラフに示した。図５Ａは、逆転写反応に用いたＲＮＡ量が条件（ａ）の場合の結果であり、図５Ｂは、条件（ｂ）の場合の結果である。この結果、実施例１及び２と同様に、条件（ｂ）の場合、ＭＫＮ４５細胞添加量とＣＯＸ２遺伝子のコピー数の間に相関が見られなかった。一方、条件（ａ）の場合には、条件（ｂ）の場合よりも、ＭＫＮ４５細胞添加量とＣＯＸ２遺伝子のコピー数の間に直線性が見られたが、目分量で採取された糞便であり、糞便量にばらつきがあったため、算出されたＣＯＸ２遺伝子の発現量（コピー数）にばらつきがみられた。【００７８】
そこで、リアルタイムＰＣＲにより算出された発現量を、糞便量で補正した。図５Ｃは、図５Ａに示す発現量を表３記載の糞便量（重量）で補正した発現量を示しており、図５Ｄは、図５Ａに示す発現量を、表３記載の糞便量（吸光度）で補正した発現量を示しており、図５Ｅは、図５Ａに示す発現量を、表３記載の糞便量（予想される固形分体積）で補正した発現量を示している。なお、本実施例において「糞便量で補正する」とは、発現量を各糞便量で除することを意味する。また、図５Ｃ〜Ｅ中の直線は、各測定値から求めた近似直線である。
この結果、図５Ｃ〜Ｅからも明らかであるように、ＭＫＮ４５細胞添加量とＣＯＸ２遺伝子のコピー数に、それぞれ強い相関のある結果が得られた。
これらの結果から、初期糞便量（採取された糞便量）がばらついている場合でも、逆転写反応に加えるＲＮＡ液量を一定にすることにより、阻害物質の影響を減らし、さらに得られた結果を糞便量で補正することにより、より正確な発現量が検出できることが明らかである。【００７９】
［実施例４］臨床検体を用いたＧＡＰＤＨの検出
５人の大腸癌患者の便２０ｇをそれぞれ回収し、別々によくかき混ぜ、均一化した。これを０．５ｃｃずつ小分けにし、５本の便サンプル（Ｃ１〜Ｃ５）を得た。また、５人の健常人の便も同様に０．５ｃｃずつ小分けし、５本の便サンプル（Ｎ１〜Ｎ５）を得た。
これらのサンプルからＲＮＡを回収した。具体的には、各サンプルに、３ｍＬのフェノール混合物「Ｔｒｉｚｏｌ」（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を添加し、３０秒間以上ホモジナイザーで十分に混合した後、３ｍＬのクロロホルムを添加した。さらにボルテックスを用いて十分に混合した後、１２，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離処理を行った。該遠心分離処理により得た上清（水層）を、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）のＲＮＡ回収用カラムに通し、添付のプロトコールに従って該ＲＮＡ回収用カラムの洗浄操作及びＲＮＡ溶出操作を行うことにより、ＲＮＡを、５０μＬのＲＮＡ溶液として回収した。ナノドロップ（ナノドロップ社製）を用いて、各ＲＮＡ溶液の濃度を測定し、回収された全ＲＮＡ量の定量を行った。【００８０】
市販の逆転写反応キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、回収されたＲＮＡ溶液中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。この際、逆転写反応に用いたＲＮＡ量の反応条件を、（ａ）回収されたＲＮＡ溶液の濃度に関わらず、０．５μＬ又は０．２５μＬのＲＮＡ溶液を、逆転写反応の反応溶液に添加する条件と、（ｂ）一の逆転写反応の反応溶液に１μｇ、０．５μｇ、０．２５μｇ、又は０．１２５μｇのＲＮＡが添加されるように、ＲＮＡ溶液の濃度に応じて、反応溶液に添加するＲＮＡ溶液量を変えた条件とで、それぞれ行った。
その後、得られたｃＤＮＡをテンプレートとし、ヒトＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の発現量をＰＣＲにより測定した。具体的には、ｃＤＮＡに、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ (Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、ヒトＧＡＰＤＨ検出用ｐｒｉｍｅｒ ｐｒｏｂｅ ｓｅｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）をそれぞれ添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。該ＰＣＲ溶液に対して、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によるＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲの熱サイクルは、取り扱い説明書に従った。定量は、濃度既知のスタンダードプラスミドによる希釈系列を鋳型として得られた蛍光強度の結果に基づいて行った。【００８１】
表４に、逆転写反応に用いたＲＮＡ量が条件（ａ）の場合の、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量の測定結果を、逆転写反応に用いたＲＮＡ溶液量ごとに示した。表４中、「ＲＮＡ重量」は、逆転写反応の反応溶液に添加されたＲＮＡ重量を意味する。この結果、逆転写反応に用いたＲＮＡ溶液量が０．２５〜０．５μＬである場合に、全ての検体において、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量に希釈直線性が見られた。よって、少なくとも０．５μＬ以下のＲＮＡ溶液を添加した場合には、糞便由来の阻害物質による阻害効果が無いことがわかった。【００８２】
【表４】
2011004517.tif 000005
【００８３】
【表５】
2011004517.tif 000006
【００８４】
一方、表５に、逆転写反応に用いたＲＮＡ量が条件（ｂ）の場合の、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量の測定結果を、逆転写反応に用いたＲＮＡ量ごとに示した。表５中、「添加容量」は、逆転写反応の反応溶液に添加されたＲＮＡ溶液量を意味する。これらの結果に対して、逆転写反応の反応溶液に添加したＲＮＡ量が１μｇの場合と０．５μｇの場合、０．５μｇの場合と０．２５μｇの場合を、それぞれ比較し、希釈直線性を検討した。
この結果、大腸癌検体（サンプルＣ１〜Ｃ５）においては、添加したＲＮＡ量とＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量に希釈直線性を示したのは、０．２５μｇと０．５μｇの間ではサンプルＣ５のみであり、０．１２５μｇと０．２５μｇの間ではサンプルＣ５とＣ２のみであった。これらの結果から、逆転写反応及びその後のＰＣＲにおいて、阻害物質の影響を受けていないといえるのは、サンプルＣ５とＣ２を、ＲＮＡ添加量が０．１２５μｇとなるように添加した場合のみであり、その他のデータは阻害物質の影響を受けており、データの信頼性に欠けることが分かった。
なお、大腸癌検体のうち、希釈直線性が比較的良好であったサンプルＣ２及びＣ５は、糞便から回収されたＲＮＡ溶液が比較的高濃度であったこと、及び表４の結果から、表５に示す大腸癌検体に希釈直線性が観察されなかったのは、添加したＲＮＡ溶液量が０．５μＬ以上であり多すぎたためと推察される。ここで、回収されたＲＮＡ量の差は、主に糞便中の細菌量の個体差によるため、核酸検出反応の反応系に重量を基準としてＲＮＡを添加する場合には、糞便中の阻害物質濃度の個人差と回収ＲＮＡ（細菌ＲＮＡ）濃度の個人差の両方の要因を考慮に入れる必要があり、阻害物質の影響を無くすためには、希釈倍率をより高くする（核酸検出反応の反応液へ添加する量を十分に少なくする）必要があることがわかった。特に、本実施例においては、２０μＬ容量の逆転写反溶液に、回収したＲＮＡ溶液５０μＬのうちの０．２５μＬを添加した場合には、糞便から持ち込まれる阻害物質の影響がほとんどなくなったことから、本実施例のようなスケールで糞便からＲＮＡを回収した場合には、回収されたＲＮＡ溶液は、８０倍（２０μＬ／０．２５μＬ）程度希釈されるように核酸検出反応へ添加されることが好ましい。【００８５】
これに対して、健常人検体（サンプルＮ１〜Ｎ５）に対しても同様に希釈直線性を検討したところ、サンプルＮ２についてのみ、０．２５μｇと０．５μｇの間で希釈直線性が見られなかったが、その他については希釈直線性が見られた。
このように、癌患者と健常人とでは、阻害物質による影響に差があり、大腸癌検体のほうが、健常人検体に比べて阻害の影響が大きいという結果となった。これは、糞便中に含まれている阻害物質の量が、大腸癌患者のほうが健常人よりも多いためではないかと推察される。特に、回収されたＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度が薄い検体の場合には、逆転写反応の反応溶液に添加される容量が増え、持ち込まれる阻害物質量も増大するために、その影響が顕著になった。【００８６】
出発サンプルの量が同じであり、かつ同一回収法でＲＮＡを回収した場合、回収されるＲＮＡ溶液に存在する阻害物質の濃度は、個人間の差の分だけばらつく。そのため、阻害物質の影響が出ないＲＮＡ溶液の添加量を設定する必要があるが、本発明の検出方法のように、核酸検出反応へ持ち込むＲＮＡを、容量を基に決定することにより、このような阻害物質の影響を排除した適当な条件を容易に設定することができる。【００８７】
［実施例５］臨床検体を用いたＣＯＸ２の検出
実施例４において合成されたｃＤＮＡをテンプレートとし、癌患者の糞便中に特異的に発現が見られるヒトＣＯＸ２の発現量をＰＣＲにより測定した。具体的には、ヒトＧＡＰＤＨ検出用ｐｒｉｍｅｒ ｐｒｏｂｅ ｓｅｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に代えて、ヒトＣＯＸ２遺伝子の検出用ｐｒｉｍｅｒ ｐｒｏｂｅ ｓｅｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた以外は、実施例４と同様にしてＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ解析を行った。【００８８】
表６に、逆転写反応に用いたＲＮＡ量が条件（ａ）の場合の、ＣＯＸ２遺伝子の発現量の測定結果を、逆転写反応に用いたＲＮＡ溶液量ごとに示した。表６中、「ＲＮＡ重量」は、表４と同じである。この結果、個人差から想定される阻害の影響範囲をはずれ、阻害がない範囲で検出ができた。
一方、表７に、逆転写反応に用いたＲＮＡ量が条件（ｂ）の場合の、ＣＯＸ２遺伝子の発現量の測定結果を、逆転写反応に用いたＲＮＡ量ごとに示した。表７中、「添加容量」は、表５と同じである。この結果、大腸癌検体（サンプルＣ１〜Ｃ５）では、ＲＮＡの添加量が０．１２５μｇであっても阻害の影響によってシグナルの低下が見られる検体と、希釈によって（すなわち、ＲＮＡ添加量が少なすぎることにより）シグナルの低下が見られる検体が混在していた。つまり、条件（ｂ）の場合では、得られた検出結果は、条件（ａ）の場合よりも信頼性に劣ることが確認された。
なお、健常人検体（Ｎ１〜Ｎ５）では、そもそもＣＯＸ２の発現はほとんど見られなかったことから、重量を基準にＲＮＡを投入したとしても、阻害物質の影響が少ないことが推測された。そのため、ＣＯＸ２の発現量を検出する場合には、特異度には殆ど影響しないと考えられた。【００８９】
【表６】
2011004517.tif 000007
【００９０】
【表７】
2011004517.tif 000008
【００９１】
［実施例６］臨床検体を用いてＭＹＢＬ２を検出した場合の感度・特異度
大腸癌患者２９例及び健常人２９例を対象とした。糞便は、採便後１５ｍｌチューブに０．５ｃｃずつ分取し、その後、実施例５と同様にして、各糞便サンプルからＲＮＡを、５０μＬのＲＮＡ溶液として回収した。ナノドロップ（ナノドロップ社製）を用いて、各ＲＮＡ溶液の濃度を測定し、回収された全ＲＮＡ量の定量を行った。
ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、回収されたＲＮＡ溶液中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。この際、逆転写反応に用いたＲＮＡ量を、（ａ）回収されたＲＮＡ溶液の濃度に関わらず、１μＬのＲＮＡ溶液を、逆転写反応の反応溶液に添加する条件と、（ｂ）一の逆転写反応の反応溶液に１μｇのＲＮＡが添加されるように、ＲＮＡ溶液の濃度に応じて、反応溶液に添加するＲＮＡ溶液量を変えた条件との２種類の反応条件で行った。
その後、得られたｃＤＮＡをテンプレートとし、ヒトＭＹＢＬ２（ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ ｌｉｋｅ ２）の発現量をＰＣＲにより測定した。具体的には、ｃＤＮＡに、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ (Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、ヒトＭＹＢＬ２検出用ｐｒｉｍｅｒ ｐｒｏｂｅ ｓｅｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）をそれぞれ添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。該ＰＣＲ溶液に対して、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によるＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲの熱サイクルは、取り扱い説明書に従った。定量は、濃度既知のスタンダードプラスミドによる希釈系列を鋳型として得られた蛍光強度の結果に基づいて行い、５０コピー以上を陽性（ＭＹＢＬ２の発現産物が検出された）とした。【００９２】
この結果、反応溶液中に添加するＲＮＡ量を１μｇに揃えた条件（ｂ）の場合には、ＭＹＢＬ２の発現産物は、大腸癌２９例中の１０例で検出され、健常人２９例中１例で検出された（感度３４％、特異度９７％）。これに対して、回収されたＲＮＡの濃度に関わらず一定容量のＲＮＡ溶液を逆転写反応に加えた条件（ａ）の場合には、大腸癌２９例中１５例で検出され、健常人２９例中１例が検出され、条件（ｂ）の場合よりも大きな感度の上昇が見られた（感度５２％、特異度９７％）。この実施例より、糞便から細菌由来の核酸とともに回収した癌細胞由来の核酸から癌関連遺伝子を検出する場合、本発明の検出方法のように、抽出した核酸の容量を基準に解析した場合の方が、試験成績が向上することがわかった。【００９３】
［実施例７］大腸癌関連遺伝子発現解析への応用４
健常人の糞便をよく混ぜて均一化した後、糞便試料１ｇ中にＭＫＮ４５細胞が１×１０４個含むように調整し、混合した。この糞便試料を、シリンジで１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬの容量になるように、それぞれ４本ずつ分取した。これらの１２サンプルの重量を測定したところ、１ｍＬ採取した４サンプルの重量が０.８ｇ、０．７ｇ、０．８ｇ、０．８ｇであり、２ｍＬ採取した４サンプルの重量が１．７ｇ、１．６ｇ、１．７ｇ、１．６ｇであり、３ｍＬ採取した４サンプルの重量が２．６ｇ、２．５ｇ、２．６ｇ、２．５ｇであった。
各容量の４サンプルのうち、２サンプルからＲＮＡを回収するために、糞便１ｇ当たり６ｍＬ容量になるように抽出用溶液（酸性フェノールグアニジン溶液）を加えて懸濁した。また、各容量の残りの２サンプルは、重量に関係なく、サンプル当たり６ｍＬ容量の抽出用溶液（酸性フェノールグアニジン溶液）を加えて懸濁した。これらの懸濁液に、さらに６ｍＬのクロロホルムを添加し、混合後、１２，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離処理を行った。該遠心分離処理により得た水層から、添加した抽出用溶液の量に関わらず、それぞれ一定量（２ｍＬ）ずつ分取し、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＲＮＡを５０μＬのＲＮＡ溶液として回収した。ナノドロップ（ナノドロップ社製）を用いて、各ＲＮＡ溶液中のＲＮＡ濃度を測定し、回収された全ＲＮＡ量の定量を行った。【００９４】
市販の逆転写反応キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、回収されたＲＮＡ溶液の濃度に関わらず、１μＬのＲＮＡ溶液を逆転写反応の反応溶液に添加して逆転写反応を行い、回収されたＲＮＡ溶液中のＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをテンプレートとして実施例１と同様のプロトコールでリアルタイムＰＣＲを行った。
この結果、サンプルから回収されたＲＮＡ１μＬ当たりのＣＯＸ２遺伝子の発現量（コピー数）は、回収した糞便の重量に合わせて抽出用溶液の液量を変化させた６サンプルのうち、１ｍＬ採取した２サンプルで８３３コピー及び７８６コピーであり、２ｍＬ採取した２サンプルで７８０コピー及び７９１コピーであり、３ｍＬ採取した２サンプルで７７０コピー及び８１１コピーであった。一方、糞便重量にかかわらず一定量の抽出用溶液を添加した６サンプルのうち、１ｍＬ採取した２サンプルで８２１コピー及び８１６コピーであり、２ｍＬ採取した２サンプルで１５８２コピー及び１６４０コピーであり、３ｍＬ採取した２サンプルで２４４５コピー及び２４５１コピーであった。【００９５】
糞便重量にかかわらず一定量の抽出用溶液を添加した６サンプルの結果を、糞便重量で補正した。具体的には、糞便試料１ｍＬの４サンプルの平均重量である０．８ｇを１として補正係数を作成し、各発現量（コピー数）を補正係数で除した。この結果、１ｍＬ採取した２サンプルで８２１（８２１／１）コピー及び８１６（８１６／１）コピーとなり、２ｍＬ採取した２サンプルで７４４（１５８２／２．１２５）コピー及び８２０（１６４０／２）コピーであり、３ｍＬ採取した２サンプルで７５２（２４４５／３．２５）コピー及び７８４（２４５１／３．１２５）コピーであった。
測定されたＣＯＸ２遺伝子の発現量（コピー数）を表８に示す。表中、（ａ）欄が回収した糞便の重量に合わせて抽出用溶液の液量を変化させた６サンプルの結果であり、（ｂ）欄が糞便重量にかかわらず一定量の抽出用溶液を添加した６サンプルの結果である。【００９６】
【表８】
2011004517.tif 000009
【００９７】
これらの結果から、糞便に転嫁する抽出用溶液の量を、糞便量に比例して変化せることにより、標的核酸を検出する際のサンプル間の差が小さくなることがわかった。一方で、初期糞便（核酸回収のために採取された糞便）の重量がほぼ同一であれば、得られた標的核酸の発現量に対して、糞便重量のバラツキを補正することにより、より正確な値が得られると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明の検出方法を用いることにより、糞便中の標的核酸を正確かつ簡便に検出することができるため、特に臨床検査等の分野において利用が可能である。
【符号の説明】
【００９９】
１１…容器本体、１２…蓋、１３…採便棒、１３ａ…穴、１３ｂ…可動蓋、Ｅ…糞便、Ｓ…保存用溶液。
【図１Ａ】
2011004517.tif 000010
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2011004517.tif 000016
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2011004517.tif 000019
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【国際調査報告】
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