(57)【要約】  ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフを利用して人工ＲＮＰナノ構造体を構築する方法及び、ＲＮＡ分子の構造変化を蛋白質で誘導する方法を提供することを目的とする。ＲＮＡ分子の特異的な構造変化を蛋白質分子で誘導する方法であって、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を含んでなる非天然のＲＮＡ分子に、該ＲＮＡ分子のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合するアミノ酸配列を含む蛋白質分子を添加することを特徴とする方法。
2010010862.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ分子の特異的な構造変化を蛋白質分子で誘導する方法であって、
ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を含んでなる非天然のＲＮＡ分子に、該ＲＮＡ分子のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合するアミノ酸配列を含む蛋白質分子を添加することを特徴とする方法。
【請求項２】
特異的に構造変化するＲＮＡ分子であって、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を含んでなる非天然のＲＮＡ分子。
【請求項３】
請求項２に記載の特異的に構造変化するＲＮＡ分子の製造方法であって、
所望の構造変化が知られているＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフを選択するステップと、
ＲＮＡ分子の塩基配列を決定するステップであって、上記ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列と、足場塩基配列とを、コンピュータ分子モデリング法を用いて配置することにより決定するステップと、
上記決定するステップにより得られた塩基配列に基づき、ＲＮＡ分子を製造するステップと
を含む方法。
【請求項４】
請求項２に記載の特異的に構造変化するＲＮＡ分子であって、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を含んでなる非天然のＲＮＡ分子と、
該ＲＮＡ分子のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合するアミノ酸配列を含む蛋白質分子と
を含んでなる、ＲＮＡ分子の特異的な構造変化を蛋白質分子で誘導するためのキット。
【請求項５】
前記ＲＮＡ−蛋白質複合体形成に競合するＲＮＡ分子をさらに含む請求項４に記載のキット。
【請求項６】
請求項２に記載の特異的に構造変化するＲＮＡ分子であって、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を含んでなる非天然のＲＮＡ分子と、
該ＲＮＡ分子のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合するアミノ酸配列と、機能性蛋白質とを含んでなる蛋白質分子と
を含む機能性ＲＮＡ−蛋白質複合体。
【請求項７】
前記機能性蛋白質が、マーカー蛋白質、膜透過性蛋白質、腫瘍に特異的な蛋白質、治療効果を有する蛋白質、特定の細胞表面を認識する抗体から選択される一以上である請求項７に記載の機能性ＲＮＡ−蛋白質複合体。
【請求項８】
ＲＮＡ−蛋白質複合体ナノ構造体を作成する方法であって、
ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を含んでなる非天然のＲＮＡ分子に、該ＲＮＡ分子のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合するアミノ酸配列を含んでなる蛋白質分子と、任意選択的に金属イオンとを添加することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフを利用して人工ＲＮＰナノ構造体を構築する方法、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフを利用したＲＮＡ分子の特異的な構造変化を蛋白質分子で誘導する方法、及びこの方法に用いるためのＲＮＡ分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム科学の進展により、蛋白質やＲＮＡなどの生体分子の構造、機能に関する情報が蓄積している。そのような増加していく情報を活用し、これまでの還元的、分析的な生物学とは対照的に、「合成」を通して生命システムを理解しようとする合成生物学（シンセティックバイオロジー）の気運が高まっている。中でも、生体分子や遺伝子回路を人工的に構成、または再構成することは、生命科学研究にとどまらず産業応用の面からも非常に注目されている。【０００３】
ナノテクノロジーの分野において生体分子を用いたナノスケール構造体の構築が行われており、また蛋白質工学の分野では分子設計による酵素の新規創成が試みられている。それらの試みにおいて使用されている「材料」は核酸あるいは蛋白質である。【０００４】
生体分子を用いたナノスケール構造体構築の先行技術が知られている。この技術においては、三種類のＤＮＡ鎖を組み合わせたＤＮＡ多面体の形成が報告されている（非特許文献１を参照）。しかし、ＤＮＡは構造が単純であり、構造体の設計が容易である反面、構造体を作成する部品としてのバリエーションが少ないという問題があった。【０００５】
ほかに、ＲＮＡのＫｉｓｓｉｎｇ−ｌｏｏｐと相補鎖間での二本鎖形成を利用したＲＮＡジグソーパズルの作成が報告されている（非特許文献２を参照）。ＲＮＡはＤＮＡと比較して多彩な構造、機能を有し、かつその分子自体の構造も比較的単純であるため、構造体の設計、合成により適している。しかし、構造体を作成する部品としてのバリエーションは十分であるとはいえない。【０００６】
生体分子材料としては蛋白質も考えられるが、蛋白質は複雑な構造を持つため、分子設計するのが難しいという問題がある。【０００７】
生体分子や遺伝子回路を人工的に構成、または再構成する材料として有用な、所望の構造変化が期待できる、有用な生体分子材料の報告は未だに存在しない。
【非特許文献１】Ｈｅ  Ｙ，  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００８  Ｍａｒ  １３；４５２（７１８４）：１９８−２０１．
【非特許文献２】Ｃｈｗｏｒｏｓ  Ａ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００４  Ｄｅｃ  １７；３０６（５７０４）：２０６８−７２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、人工ＲＮＡ−蛋白質ナノ構造体を設計、構築し、かつＲＮＡ分子の構造変化を蛋白質で誘導する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものである。すなわち、本発明は、一実施の形態によれば、ＲＮＡ分子の特異的な構造変化を蛋白質分子で誘導する方法であって、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を含んでなる非天然のＲＮＡ分子に、該ＲＮＡ分子のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合するアミノ酸配列を含む蛋白質分子を添加することを特徴とする方法である。ここで、該ＲＮＡ分子のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合するアミノ酸配列とは、該ＲＮＡ分子に導入したＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフに由来する、蛋白質を構成するアミノ酸配列をいい、また、該アミノ酸配列に若干の変異を導入したアミノ酸配列も含まれる。若干の変異とは、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用に影響を与えない程度の変異をいう。【００１０】
本発明は、別の実施の形態によれば、特異的に構造変化するＲＮＡ分子であって、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を含んでなる非天然のＲＮＡ分子である。【００１１】
本発明は、また別の実施の形態によれば、上述の特異的に構造変化するＲＮＡ分子の製造方法であって、所望の構造変化が知られているＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフを選択するステップと、ＲＮＡ分子の塩基配列を決定するステップであって、上記ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列と、足場塩基配列とを、コンピュータ分子モデリング法を用いて配置することにより決定するステップと、上記決定するステップにより得られた塩基配列に基づき、ＲＮＡ分子を製造するステップとを含む方法である。足場塩基配列とは、特異的な構造変化が生ずるＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列以外の塩基配列をいう。【００１２】
本発明は、さらにまた別の実施の形態によれば、ＲＮＡ分子の特異的な構造変化を蛋白質分子で誘導するためのキットであって、上述の特異的に構造変化するＲＮＡ分子であって、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を含んでなる非天然のＲＮＡ分子と、該ＲＮＡ分子のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合するアミノ酸配列を含む蛋白質分子とを含んでなる。【００１３】
前記キットが、前記ＲＮＡ−蛋白質複合体形成に競合するＲＮＡ分子をさらに含むことが好ましい。ここで、競合するＲＮＡは、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を有するものである。【００１４】
本発明は、さらにまた別の実施の形態によれば、機能性ＲＮＡ−蛋白質複合体であって、上述の特異的に構造変化するＲＮＡ分子であって、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を含んでなる非天然のＲＮＡ分子と、該ＲＮＡ分子のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合するアミノ酸配列と、機能性蛋白質とを含んでなる蛋白質分子とを含む。【００１５】
前記機能性蛋白質が、マーカー蛋白質、膜透過性蛋白質、腫瘍に特異的な蛋白質、治療効果を有する蛋白質、特定の細胞表面を認識する抗体から選択される一以上であることが好ましい。【００１６】
本発明は、さらにまた別の実施の形態によれば、ＲＮＡ−蛋白質複合体ナノ構造体を作成する方法であって、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を含んでなる非天然のＲＮＡ分子に、該ＲＮＡ分子のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合するアミノ酸配列を含んでなる蛋白質分子と、任意選択的に金属イオンとを添加することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の効果として、ＲＮＡ分子の構造変化を蛋白質で誘導することができる。また、蛋白質により誘導可能なＲＮＡ分子、及びそのＲＮＡ分子からなる構造体を構築することができる。さらには、蛋白質により誘導可能なＲＮＡ分子と、該蛋白質との複合体による機能性分子を提供することができる。これらの方法または、分子は、いずれも、生体分子、多機能性ナノ構造体、または遺伝子回路を人工的に構成、または再構成する材料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、第１実施形態による、ＲＮＡ分子１の構造変化を蛋白質分子２で誘導する方法を概略的に示す図である。
【図２】図２は、Ｌ７ＡｅとＢｏｘＣ／Ｄとにより形成される複合体を示すリボンダイアグラムである。
【図３】図３中、（ａ）は、固定されていない状態のＢｏｘＣ／Ｄ配列の状態を概略的に示す図であり、（ｂ）は、Ｌ７Ａｅにより６０℃に屈曲した構造に固定されたＢｏｘＣ／Ｄ配列の状態を概略的に示す図である。
【図４】図４は、ＢｏｘＣ／Ｄ配列の屈曲部分を拡大した模式図である。
【図５】図５は、ＲＮＡ分子１が蛋白質分子２で誘導されてできた正八面体の構造体を示す模式図である。
【図６】図６は、機能性蛋白質分子がＲＮＡ分子に配置されたＲＮＡ−蛋白質複合体を示す図である。
【図７】図７は、第４実施形態による、ＲＮＡ分子に複数の異なる機能性蛋白質分子を配置する方法を概略的に示す図である。
【図８】図８は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ２．０を用いて描写したＲＮＡ分子の二次構造を示す図である。
【図９】図９は、実施例１においてコンピュータ分子設計した、ＲＮＡ分子の一次配列を示す図であり、（ａ）はＬｏｎｇ  ｃｈａｉｎの一次配列を示し、（ｂ）Ｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎの一次配列を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例１においてコンピュータ分子設計した、ＲＮＡ分子の二次構造を示す図である。
【図１１】図１１は、ゲルシフトアッセイによるＲＮＰ構造体形成を確認した結果を示す図である。
【図１２】図１２は、原子間力顕微鏡を用いて、バッファーのみを含む溶液を観察した結果を示す顕微鏡写真である。
【図１３】図１３は、原子間力顕微鏡を用いて、ＲＮＡ分子のみを含む溶液を観察した結果を示す顕微鏡写真であり、ＲＮＡ分子は環状で存在することがわかる。
【図１４】図１４は、原子間力顕微鏡を用いて、Ｌ７Ａｅのみを含む溶液を観察した結果を示す顕微鏡写真であり、Ｌ７Ａｅは点状に観察できる。
【図１５】図１５は、原子間力顕微鏡を用いて、ＲＮＡ分子とＬ７Ａｅを含む溶液を観察した結果を示す顕微鏡写真であり、ＲＮＡ分子とＬ７Ａｅによる三角形の構造体が生成していることがわかる。
【図１６】図１６は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ２．０を用いて描写した大きなＬ７−３ｋａｋｕの図であり、３つのＬ７Ａｅ−ＢｏｘＣ／Ｄを４８塩基対のＲＮＡで連結した三角形である。
【図１７】図１７は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ２．０を用いて描写したＬ７−３ｋｉｓｓのリボンダイアグラムであり、三角形の一辺は１０ｎｍである。
【図１８】図１８は、Ｌ７Ａｅ−ＢｏｘＣ／Ｄ  モチーフ、Ｋｉｓｓｉｎｇ−ｌｏｏｐモチーフによる三角形形成の仮定的なスキームを示す図である。
【図１９】図１９は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ２．０を用いて描写したＤｅｌｉｖｅｒｙ−３ｋａｋｕの図であり、一つの角には蛍光蛋白質ＧＦＰが結合しており、二つの角にはポリアルギニンモチーフが結合している。
【図２０】図２０は、実施例７においてコンピュータ分子設計した、分割したＤｅｌｉｖｅｒｙ−３ｋａｋｕを構成するＲＮＡ分子の二次構造を示す図である。
【符号の説明】
【００１９】
１    ＲＮＡ分子
２    蛋白質分子
２ａ  融合蛋白質分子
２ｂ  融合蛋白質分子
２ｃ  融合蛋白質分子
３    機能性蛋白質分子
４    機能性蛋白質分子
５    機能性蛋白質分子
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に、本発明を、実施形態を挙げて詳細に説明する。しかし、以下の説明は本発明を限定するものではない。【００２１】
２０世紀後半から現在に至る、分子生物学の急速な発展により、膨大な数の遺伝子が同定され、それらがコードする蛋白質を中心に、さまざまな生体高分子の機能が明らかにされて来た。さらにはＤＮＡ、ＲＮＡおよび蛋白質の詳細な立体構造が解明され、それらは分子間の相互作用および選択的な化学反応により機能することが原子レベルで証明された。よって、これらの相互作用および化学反応を自在に制御することができれば、新しい病気治療法や、エネルギー問題などを解決する方法が開発できるはずである。【００２２】
これを実現する手法としては、ターゲットとなる分子の機能を、分子間相互作用により、直接制御する機能をもつ新しい分子をデザイン・作成し、それにより細胞や組織を制御することがあげられる。ＲＮＡは多様な立体構造を形成できる。蛋白質に加え、ＲＮＡには酵素機能をもつものがあり、その機能と構造の相関関係は、立体構造の解析を通じて詳細に解明されて来た。また、４種の基本ユニット（塩基）で作られるＲＮＡは、シンプルな構築原理により形成される。よって、ナノブロックとしての高度な立体構造を持つ分子の設計・構築に広くＲＮＡを用いることができる。しかしながら、ＲＮＡ単独では、モチーフの数に限りがあり、作成できる構造が限定されている。一方、２０種もの基本ユニット（アミノ酸）で作られる蛋白質は、ＲＮＡよりはるかに多彩かつ複雑な立体構造および機能をもつ。現在、天然の蛋白質の構造が、膨大な数、高分解能で解析されているものの、その分子設計・構築は難しく、単純な構造を持つものに限られている。これらから、現時点では、ナノスケールで、複雑な機能と構造を持つ３Ｄオブジェクトとしては、ＲＮＰ（ＲＮＡ−蛋白質複合体）を設計・構築することが、現実的であり、具体的には「分子設計により作成する人工ＲＮＡ」と「天然の構造既知の蛋白質」を組み合わせることが、分子デザインによる機能をもつ分子の開発へ向けての実現性の高い手法である。【００２３】
本発明者らは、ナノスケールの構造体や酵素のような機能性分子を設計・構築するための材料として、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフ（ＲＮＰ）を用いることを考え、この材料を応用した人工的な分子を構築し、ナノ構造体を設計、及び作成することにより、発明を完成するに至った。核酸に比べてＲＮＰは構造的に多様であり、設計の容易なＲＮＡを基本骨格として設計することで、核酸のみでは作れない複雑な構造も比較的容易に設計・構築できると考えられる。【００２４】
本発明は、第１実施形態によれば、ＲＮＡ分子の構造変化を蛋白質で誘導する方法であって、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を有するＲＮＡ分子に、該塩基配列に特異的に結合する蛋白質を含む分子を添加する工程から構成される。【００２５】
本実施形態による方法のスキームを、図１に概略的に示す。図１に示すスキームによれば、蛋白質の非存在下において、環状で存在するＲＮＡ分子１に、蛋白質２を添加することによって、一つの角に一つの蛋白質２が結合した三角形状のＲＮＡ分子に、特異的に誘導することができる。なお、図１は、概略的なものであって、本発明は、特定の形状から、別の特定の形状への誘導に限定されるものではない。以下に、本発明により構造変化が誘導されるＲＮＡ分子の構成、その調製方法、及びＲＮＡ分子の構造変化を蛋白質で誘導する方法について詳細に説明する。【００２６】
［ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を有するＲＮＡ分子の構成］
本実施形態による方法において用いる、蛋白質によりその構造変化が誘導されるＲＮＡ分子は、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を有するＲＮＡ分子である。さらに具体的には、本実施形態による構造変化が誘導されるＲＮＡ分子は、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列と、それ以外の塩基配列である足場塩基配列とを含んでなる非天然の分子である。なお、足場塩基配列、ＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフの各々は、天然に存在する分子の配列から抽出することができる。ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列は、ＲＮＡ分子において、蛋白質との結合により構造変化を生ずる部分として機能する。足場塩基配列は、ＲＮＡ分子において、ナノ構造体の骨格として作用し、構造変化を生じない部分である。本実施形態によるＲＮＡ分子は、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を含むものであればよいが、蛋白質に非特異的に結合するＲＮＡ塩基配列などの部分を含まないことが好ましい。【００２７】
［１．ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列］
ここで、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列とは、天然の、既知のＲＮＡ−蛋白質複合体における、ＲＮＡと蛋白質との相互作用モチーフの、ＲＮＡ側の配列として知られている塩基配列と、試験管内進化法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法）により得られた人工的なＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフにおけるＲＮＡ側の配列である塩基配列とが含まれる。ＲＮＡ−蛋白質複合体とは、生体において多数確認されている蛋白質とＲＮＡとの会合体であり、複雑な構造を持つ３Ｄオブジェクトである。【００２８】
天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列は、通常、約５〜３０塩基で構成されており、特定の蛋白質の特定のアミノ酸配列と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成することが知られている。このような天然のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列は、以下の表１及び表２、及びウェブサイト上で利用できるデータベース：ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂｋ２６．ｂｓｅ．ｋｙｕｔｅｃｈ．ａｃ．ｊｐ／ｊｏｕｈｏｕ／ｉｍａｇｅ／ｄｎａ−ｐｒｏｔｅｉｎ／ｒｎａ／ｒｎａ．ｈｔｍｌから、所望の構造変化を生ずるモチーフを選択することができる。本実施形態において好ましく用いられるＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフは、Ｘ線結晶構造解析またはＮＭＲによる構造解析が既に行われているモチーフ、あるいは構造解析がなされている相同蛋白質の立体構造から立体構造を推定可能なモチーフである。さらに、蛋白質がＲＮＡの二次構造及び塩基配列を特異的に認識するモチーフであることがのぞましい。【００２９】
【表１】
2010010862.tif 000003
【００３０】
【表２】
2010010862.tif 000004
【００３１】
人工のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列とは、人工的に設計したＲＮＡ−蛋白質複合体における、ＲＮＡと蛋白質との相互作用モチーフの、ＲＮＡ側の塩基配列である。このような塩基配列は、通常、約５〜３０塩基で構成されており、特定の蛋白質の特定のアミノ酸配列と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成するように設計する。また、以下の表３に挙げる塩基配列も知られており、これらもまた本発明のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列として用いることができる。【００３２】
【表３】
2010010862.tif 000005
【００３３】
人工のＲＮＡ−蛋白質複合体は、分子デザイン方法、または試験管内進化法、あるいはそれらの両方を併用することで作成することができる。試験管内進化法では、様々な配列多様性をもつ分子ライブラリーから、機能性ＲＮＡを選別し、その遺伝子（ＤＮＡ）を増幅、転写するといった反応を繰り返すことで、アプタマーやリボザイムを得ることができる。従って、分子デザインであらかじめ目的の機能構造をもったＲＮＰに適応したＲＮＡ−蛋白質相互作用モチーフを天然ＲＮＰ分子から抽出、または試験管内進化法により人工的に作成することが可能となる。【００３４】
本実施形態において、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列は、その塩基配列の由来となるＲＮＡ−蛋白質複合体の解離定数Ｋｄが、約０．１ｎＭ〜約１μＭ程度であるものが好ましい。この理由は、ＲＮＡ-蛋白質相互作用の親和性が高く、構造変化を誘導した後も、その状態を保持することが可能となるからである。【００３５】
具体的なＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列としては、ＲＮＡのメチル化やシュードウリジン化といったＲＮＡ修飾に関わることが知られている、超高熱硫酸還元古細菌由来Ｌ７Ａｅ（配列番号１）（Ｍｏｏｒｅ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．  １２，  ｐｐ．  ８０７−８１８  （２００４））が結合する塩基配列である、５’ＧＧＧＣＧＵＧＡＵＧＣＧＡＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣ３’（配列番号２）、アミノアシル化を行う酵素であって、自身のｍＲＮＡに結合し、翻訳を阻害するフィードバック阻害を持つことが知られている、大腸菌由来Ｔｈｒｅｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ｃｅｌｌ  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｍａｓｓ．）  ｖ９７，  ｐｐ．３７１−３８１  （１９９９））が結合する塩基配列である、５’ＧＧＣＧＵＡＵＧＵＧＡＵＣＵＵＵＣＧＵＧＵＧＧＧＵＣＡＣＣＡＣＵＧＣＧＣＣ３’などの塩基配列（配列番号３）が挙げられるが、これらには限定されない。【００３６】
なお、これらのＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列が決まると、同一のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフに由来するアミノ酸配列は同時に決定され、これらは、生理条件下で、特異的、かつ非共有結合的な結合を生ずる。【００３７】
ところで、このような天然のもしくは人工のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフは、ＲＮＡと、蛋白質とが複合体を形成する前と、複合体形成後では、ＲＮＡの構造が変化することが知られている。上記Ｌ７Ａｅが結合する塩基配列である、５’ＧＧＧＣＧＵＧＡＵＧＣＧＡＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣ３’（配列番号４）（以下、ＢｏｘＣ／Ｄという）と、Ｌ７Ａｅとの複合体を例に挙げて、その複合体形成時の構造変化につき、説明する。Ｌ７ＡｅとＢｏｘＣ／Ｄとは、図２のような複合体を形成することが知られている（Ｍｏｏｒｅ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．  １２，  ｐｐ．  ８０７−８１８  （２００４））。特に、Ｌ７Ａｅは、相補配列部分が二本鎖を形成した状態のＢｏｘＣ／Ｄ配列に特異的に結合することが知られている。【００３８】
二本鎖を形成した状態のＢｏｘＣ／Ｄ配列は、Ｌ７Ａｅが結合する前は、フレキシブルな固定されない構造をもつ分子である。このようなＢｏｘＣ／Ｄ配列の状態を、図３（ａ）に、概略的に示す。ここで、二本鎖を形成したＢｏｘＣ／Ｄ配列に、Ｌ７Ａｅを添加すると、ＢｏｘＣ／Ｄ配列とＬ７Ａｅとが相互作用して、複合体を形成する。すると、このＢｏｘＣ／Ｄ配列は６０℃に屈曲した構造に固定される。このような状態におけるＢｏｘＣ／Ｄ配列とＬ７Ａｅとを、図３（ｂ）に、概略的に示す。さらに、詳細にみると、この６０℃に屈曲した構造は、上記配列中、５’側から６番目のｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ部位の塩基Ｕを中心にして、形成される。屈曲部分を拡大した模式図を、図４に示す。これが、ＢｏｘＣ／Ｄ配列とＬ７ＡｅとのＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフにおいて知られている特異的な構造変化である。【００３９】
なお、ＢｏｘＣ／Ｄ配列とＬ７ＡｅとのＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフは一例であり、上記表に挙げたそのほかのＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフも、それぞれ特異的な構造変化をすることが知られている。例えば、３−ｗａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ（３−ウエイージャンクション）構造をとる、バチルス菌由来Ｓ１５（ＲＮＡ：ＧＧＧＣＧＧＣＣＵＵＣＧＧＧＣＵＡＧＡＣＧＧＵＧＧＧＡＧＡＧＧＣＵＵＣＧＧＣＵＧＧＵＣＣＡＣＣＣＧＵＧＡＣＧＣＵＣ（配列番号５））（蛋白質：ＭＰＩＣＫＥＥＫＱＫＶＩＱＥＦＡＲＦＰＧＤＴＧＳＴＥＶＱＶＡＬＬＴＬＲＩＮＲＬＳＥＨＬＫＶＨＫＫＤＨＨＳＨＲＧＬＬＭＭＶＧＱＲＲＲＬＬＲＹＬＱＲＥＤＰＥＲＹＲＡＬＩＥＫＬＧＩ（配列番号６））、蛋白質の結合により角度が９０度に折れ曲がった構造をとる、高度好熱性細菌由来Ｌ１蛋白質（ＲＮＡ：ＧＧＧＡＧＵＧＡＡＧＧＡＧＧＣＵＵＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＡＣＵＵＣＡＣＵＣＣＣ（配列番号７））（蛋白質：ＰＫＨＧＫＲＹＲＡＬＬＥＫＶＤＰＮＫＩＹＴＩＤＥＡＡＨＬＶＫＥＬＡＴＡＫＦＤＥＴＶＥＶＨＡＫＬＧＩＤＰＲＲＳＤＱＮＶＲＧＴＶＳＬＰＨＧＬＧＫＱＶＲＶＬＡＩＡＫＧＥＫＩＫＥＡＥＥＡＧＡＤＹＶＧＧＥＥＩＩＱＫＩＬＤＧＷＭＤＦＤＡＶＶＡＴＰＤＶＭＧＡＶＧＳＫＬＧＲＩＬＧＰＲＧＬＬＰＮＰＫＡＧＴＶＧＦＮＩＧＥＩＩＲＥＩＫＡＧＲＩＥＦＲＮＤＫＴＧＡＩＨＡＰＶＧＫＡＳＦＰＰＥＫＬＡＤＮＩＲＡＦＩＲＡＬＥＡＨＫＰＥＧＡＫＧＴＦＬＲＳＶＹＶＴＴＴＭＧＰＳＶＲＩＮＰＨＳ（配列番号８））（Ｎｅｖｓｋａｙａ，  Ｎ．，Ｔｉｓｈｃｈｅｎｋｏ，  Ｓ．，Ｖｏｌｃｈｋｏｖ，  Ｓ．，Ｋｌｊａｓｈｔｏｒｎｙ，  Ｖ．，Ｎｉｋｏｎｏｖａ，  Ｅ．，Ｎｉｋｏｎｏｖ，  Ｏ．，Ｎｉｋｕｌｉｎ，  Ａ．，Ｋｏｈｒｅｒ，  Ｃ．，Ｐｉｅｎｄｌ，  Ｗ．，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，  Ｒ．，Ｓｔｏｃｋｌｅｙ，  Ｐ．，Ｇａｒｂｅｒ，  Ｍ．，Ｎｉｋｏｎｏｖ，  Ｓ．  （２００６）  Ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ１  ｗｉｔｈ  ＲＮＡ．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．   ３５５：  ７４７−７５９）、ＲＮＡ二本鎖が６０度に折れ曲がった構造をとる、ヒト由来Ｕ１Ａ（ＲＮＡ：ＧＧＣＡＧＡＧＵＣＣＵＵＣＧＧＧＡＣＡＵＵＧＣＡＣＣＵＧＣＣ（配列番号９））（蛋白質：ＡＶＰＥＴＲＰＮＨＴＩＹＩＮＮＬＮＥＫＩＫＫＤＥＬＫＫＳＬＨＡＩＦＳＲＦＧＱＩＬＤＩＬＶＳＲＳＬＫＭＲＧＱＡＦＶＩＦＫＥＶＳＳＡＴＮＡＬＲＳＭＱＧＦＰＦＹＤＫＰＭＲＩＱＹＡＫＴＤＳＤＩＩＡＫＭＫＧＴＦＶ（配列番号１０））などが知られている。【００４０】
本実施形態においては、一つのＲＮＡ分子に、同一の複数のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列が配置されていてもよい。または、一つのＲＮＡ分子に、異なる複数の種類のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列が配置されていてもよい。一つのＲＮＡ分子に、異なる複数のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を配置することで、一つのＲＮＡ分子に対し、複数種類の構造変化部分を導入し、複数種類の構造変化を誘導することが可能となる。【００４１】
［ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列以外の塩基配列］
本実施形態によるＲＮＡ分子を構成する、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列以外の塩基配列は、構造変化を生じない部分である。別の表現としては、構造変化を生ずる部分を配置するための、足場となる部分ともいえる。このような構造変化を生じない塩基配列は、人工的な塩基配列であってもよく、または天然由来の塩基配列であってもよい。構造変化を生じない部分として好ましい配列は、例えば、複雑な立体構造をとらない配列、ワトソン−クリック型の塩基対形成による二本鎖、ｔＲＮＡ、３−ｗａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ｋｉｓｓｉｎｇ−ｌｏｏｐやｌｏｏｐ−ｒｅｃｅｐｔｏｒのようなＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用モチーフ等が挙げられるが、これらには限定されない。構造変化を生じない部分である塩基配列は、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列との関係で、その長さ、配置位置等を適宜決定することができる。なお、長さ、配置位置等の決定を含めた本実施形態に用いるＲＮＡ分子の製造方法は、後述する。【００４２】
［構造変化を誘導する蛋白質分子］
本実施形態による方法において用いる、構造変化を誘導する蛋白質分子は、上記ＲＮＡ分子のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列と同一のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフに由来するアミノ酸配列を含む蛋白質分子である。ここで、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列は、構造変化が誘導されるＲＮＡ分子が有するＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列と、特異的に相互作用するものである。すなわち、ＲＮＡ分子と、構造変化を誘導する蛋白質分子とは、ＲＮＡ−蛋白質複合体を形成するように選択される。
なお、本実施形態において、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列と、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列とを選択する際には、既知のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の配列に、変異を導入したものであってもよい。当業者であれば、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフにおいて、相互作用特性を変えない範囲の変異を、適宜決定し、導入することができる。例えば、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列のみに１〜５塩基程度の変異を導入してもよい場合があり、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列のみに１〜５ペプチド程度の変異を導入してもよく、両方に変異を導入することも可能である。なお、このような変異の数は、使用するＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフによっても異なり、これらの値に限定されるものではない。【００４３】
蛋白質分子は、そのようなアミノ酸配列を有するものであれば、そのほかに機能性蛋白質を含む、融合蛋白質分子であってもよい。機能性蛋白質としては、マーカー機能を有する蛍光蛋白質類、治療効果を有するアポトーシス誘導型蛋白質等が挙げられるが、これらには限定されない。このような蛋白質分子は、所望の蛋白質の既知のＤＮＡ配列情報に基づき、ベクター等を用いて、当業者が適宜製造することができる。【００４４】
なお、構造変化が誘導されるＲＮＡ分子が、一つのＲＮＡ分子に、異なる複数の種類のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列が配置されているものである場合には、それぞれに対応する、異なる複数の種類のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列を有する蛋白質分子が必要となる。【００４５】
［ＲＮＡ分子の構造変化の誘導］
ＲＮＡ分子の構造変化の誘導は、液体中で行うことができる。さらに詳細には、大気圧下、４〜８０℃、ｐＨ３．５〜１０．５の生理条件下の液体であれば行うことができる。本実施形態による方法は、上記ＲＮＡ分子を含む生理条件下の液体に、上記蛋白質分子を混合することで行うことができる。混合量は、ＲＮＡ分子上の相互作用するＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列の数、相互作用時のモル比等によって決定することがでる。なお、ＲＮＡ−蛋白質複合体の相互作用時のモル比は、各ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフに固有である。【００４６】
［ＲＮＡ分子の構造変化の誘導の確認］
本実施形態にかかる方法においては、ＲＮＡ分子の構造変化の誘導が実際に行われたかを確認することができる。確認は、蛋白質分子を混合する前と後とで、ＲＮＡ分子を含む溶液を、当業者には既知の所定の方法でサンプルにし、ゲル電気泳動法や原子間力顕微鏡で観察することにより、実施することができる。原子間力顕微鏡によれば、原子レベルで構造を視認することができるため、ＲＮＡ分子に導入したＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフから予測される構造変化が生じているのか否かを簡単に判別することができる。【００４７】
［ＲＮＡ分子の構造変化の誘導例］
次に、蛋白質によるＲＮＡ分子の特異的な構造変化の誘導例を挙げて説明する。
一例として、ＲＮＡ分子として、上記ＢｏｘＣ／Ｄ配列を等間隔で３つ有する環状の二本鎖ＲＮＡ分子を設計することができる。この場合、蛋白質の非存在下では、環状のＲＮＡ二本鎖分子として、生理条件下の液体中に存在する。ここに、Ｌ７Ａｅ分子を、ＲＮＡ分子の三倍モル量以上添加する。これによって、３つのＬ７Ａｅ分子が二本鎖ＲＮＡ分子に結合し、６０度の角を等間隔で三つ持った構造体、すなわち正三角形が誘導される。【００４８】
別の例として、ＲＮＡ分子として、上記ＢｏｘＣ／Ｄ配列を等間隔で３つ有する環状の二本鎖ＲＮＡ分子と、蛋白質であるＬ７Ａｅ分子が二つ融合したＬ７Ａｅダイマーとを設計することができる。この場合、Ｌ７Ａｅダイマーの非存在下では、ＲＮＡ分子は、環状のＲＮＡ二本鎖分子として、生理条件下の液体中に存在する。ここに、Ｌ７Ａｅダイマーを、二本鎖ＲＮＡ分子４分子に対し、Ｌ７Ａｅダイマー６分子以上となるようなモル量で添加する。これによって、６個のＬ７Ａｅダイマーが、四分子のＲＮＡ分子に結合し、正八面体の構造体が誘導される。この場合の模式図を、図５に示す。図５において、各辺を構成するのが、ＲＮＡ分子であり、頂点に位置するのが、Ｌ７Ａｅダイマーである。このような正八面体の形成は、ＲＮＡ分子とＬ７Ａｅダイマーを混合するだけで、自発的に行われるものである。【００４９】
また、正方形のＲＮＰをデザインすることもできる。蛋白質Ｌ１に結合するＲＮＡモチーフを二本鎖ＲＮＡの４辺の頂点に挿入する。蛋白質比存在下では、環状の構造をとると予想されるが、Ｌ１蛋白質が各頂点に結合することで、正方形状のＲＮＰ分子が形成できると予想できる。【００５０】
本発明の第１実施形態による方法によれば、特定の非天然のＲＮＡ分子、蛋白質分子を設計することにより、特定のＲＮＡ分子の特異的な構造変化を蛋白質で誘導することができる。このようなＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフを利用した、非天然のＲＮＡ分子構造の制御はこれまでに報告がなく、生体分子や遺伝子回路を人工的に構成、または再構成する材料等に用いるためのツールとして、有望である。【００５１】
次に、本発明の第２実施形態として、ＲＮＡ分子材料を製造する方法につき、説明する。第２実施形態によれば、上述の特異的に構造変化するＲＮＡ分子の製造方法であって、所望の構造変化が知られているＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフを選択するステップと、ＲＮＡ分子の塩基配列を決定するステップであって、上記ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列と、足場塩基配列とを、コンピュータ分子モデリング法を用いて配置することにより決定するステップと、上記決定するステップにより得られた塩基配列に基づき、ＲＮＡを製造するステップとを含む。【００５２】
本実施形態において製造するＲＮＡ分子は、上記第一の形態で述べた特徴を有する、蛋白質分子によりその構造変化が誘導されるＲＮＡ分子である。【００５３】
所望の構造変化が知られているＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフを選択するステップでは、導入したい構造変化を実現しうるＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフを、前述の表またはデータベースから選択する。例えば、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフで導入可能なＲＮＡ分子の構造変化としては、６０度の屈曲、９０度の屈曲、二本鎖ＲＮＡから一本鎖ＲＮＡへの変化、一本鎖ＲＮＡから二本鎖ＲＮＡへの変化等が挙げられるが、これらには限定されない。一つのＲＮＡ分子に対して、複数の構造変化を実現させることもでき、その場合には、所望の、複数の異なるＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフを組み合わせて選択することができ、複数の同一のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフを導入することができる。【００５４】
ＲＮＡ分子材料の塩基配列を決定するステップは、コンピュータ分子モデリング法により行うことができる。これには、市販の分子モデリングソフトウェアを用いることができる。コンピュータ分子モデリングにおいては、まず、所望のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフの三次元立体構造を取得する。そして、構造変化導入後のＲＮＡ−蛋白質複合体が、所望の構造体を形成するように、一つまたは複数のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列と、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列以外の塩基配列とを決定してゆく。ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列以外の塩基配列は、特には、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を配置するための足場としての役割を果たすため、望ましくない二次構造や三次構造等を形成しないように、そのような二次構造等を形成しないことが既知の配列を選択することができる。その後、設計された配列を持つＲＮＡが取りうる二次構造を予測し、設計した二次構造が最も安定な構造であることおよび他に安定な二次構造をとらないことを確認する。これには、ｗｅｂ上で使用する核酸の二次構造予測プログラムｍｆｏｌｄ（ｈｔｔｐ：／／ｍｆｏｌｄ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｒｎａ−ｆｏｒｍ１．ｃｇｉ）を好適に用いることができる。【００５５】
上記決定するステップにより得られた塩基配列に基づき、ＲＮＡ分子を製造するステップでは、得られた塩基配列から、既知の方法によって、ＲＮＡ分子を製造する。所定のＲＮＡ配列が与えられていれば、これに基づいてＲＮＡ分子を製造することは当業者には通常行われることであり、例えば、ＰＣＲによって鋳型ＤＮＡを合成し、ＲＮＡ合成酵素を用いた転写反応によりＲＮＡ分子を製造することができる。そのほかに、約３０塩基程度の短い鎖長ＲＮＡであれば、化学合成法により直接ＲＮＡを合成することもできる。このような方法により、ＲＮＡ分子を製造することができる。【００５６】
このようにして製造された構造変化が誘導されるＲＮＡ分子は、第１実施形態に用いることができるほか、後述するキットとして、構造変化を誘導する蛋白質分子と一緒に、分子材料として用いることができる。【００５７】
本発明の第２実施形態によれば、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフのデータベース、コンピュータ分子モデリング法、遺伝子工学的方法を組み合わせて、構造変化が誘導されるＲＮＡ分子を設計し、製造することができる。かかる方法によれば、高い精度で分子設計をすることができるため、所望の構造変化が誘導されるＲＮＡ分子を、容易に、かつ正確に設計することができる。また、遺伝子工学的方法により、そのようなＲＮＡ分子を実際に大量に生産することができる。第２実施形態による方法は、所望のＲＮＡ分子を製造する際に、非常に有用である。【００５８】
本発明は、第３実施形態によれば、ＲＮＡ分子の構造変化を蛋白質分子で誘導するためのキットであって、上述の特異的に構造変化するＲＮＡ分子と、該ＲＮＡ分子が有するＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合するアミノ酸配列を含む蛋白質分子とを含んでなる。【００５９】
このようなキットにおいて、特異的に構造変化するＲＮＡ分子及びＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列を含む蛋白質分子は、上記第１実施形態において説明した任意のものであってよい。【００６０】
本実施形態によるキットには、任意的な構成成分として、ＲＮＡ−蛋白質複合体形成に競合するＲＮＡ分子を含んでもよい。具体的なＲＮＡ−蛋白質複合体形成に競合するＲＮＡの塩基配列は、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を有するものとすることができる。【００６１】
本実施形態において、キットに含まれる特異的に構造変化するＲＮＡ分子及びＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列を含む蛋白質分子は、所定の条件下で混合すると複合体を形成する。この結合は水素結合による安定な、かつ特異的な非共有結合である。しかし、この溶液に、ＲＮＡ−蛋白質複合体形成に競合するＲＮＡ分子を添加することによって、簡単に結合を抑制し、ＲＮＰ構造の形成を制御することができる。【００６２】
本発明の第３実施形態にかかるキットによれば、生理条件下でＲＮＡ分子の特異的な構造変化を誘導することができる。また、任意選択的な成分であるＲＮＡ−蛋白質複合体形成に競合するＲＮＡ分子を含むことにより、ＲＮＰナノ構造の可逆的な構造変化が可能になる。【００６３】
本発明は、第４実施形態によれば、上述の機能性ＲＮＡ−蛋白質複合体であって、特異的に構造変化するＲＮＡ分子と、該ＲＮＡ分子が有するＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合するアミノ酸配列と、機能性蛋白質とを含む蛋白質分子とを含んでなる。【００６４】
図６に、第４実施形態による機能性ＲＮＡ−蛋白質複合体を模式的に示す。図示する複合体は、各辺が第１実施形態において詳述した構造変化が誘導される、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を有するＲＮＡ分子１から構成される三角形の３つの頂点に、当該塩基配列に特異的に結合するアミノ酸配列部分２と、機能性蛋白質分子３、４、５とを含んでなる融合蛋白質分子が結合している。機能性蛋白質分子３、４、５は３つとも種類が異なっている。【００６５】
ここで、機能性蛋白質とは、所定の機能が知られている蛋白質のことをいい、例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰなどの蛍光蛋白質類、ポリアルギニンモチーフなどの膜透過性機能を有する蛋白質類、組織特異的に発現している膜蛋白質に結合する蛋白質類、アポトーシス誘導蛋白質等、特定の疾患に治療効果を有する蛋白質等、癌細胞表面に特異的に結合する抗体が挙げられるが、これらには限定されない。【００６６】
このような複合体は、第１実施形態で説明したようにＲＮＡ分子を設計し、かつ該ＲＮＡ分子に導入したＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合するアミノ酸配列を含む蛋白質分子に、任意の機能性蛋白質分子を結合させた融合蛋白質分子を製造し、ＲＮＡ分子と融合蛋白質分子とを混合することで得ることができる。たとえば、第１実施形態で例示したＬ７Ａｅ−ＢｏｘＣ／ＤをＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフとして用いる場合には、Ｌ７Ａｅ蛋白質と任意の蛋白質またはペプチドとの融合蛋白質分子を作製しておけば、第１実施形態で例示したＲＮＡ鎖と混合するだけで、任意の複数の機能を持つＲＮＡ−蛋白質複合体が容易に作製できる。このように、複数種類の機能性蛋白質分子を、一つのＲＮＡ分子に結合させる場合には、添加する複数種類の機能性蛋白質分子のモル比を変化させることで、結合する機能性蛋白質分子の数や種類を制御することができる。例えば、図６に示す複合体は、ＢｏｘＣ／Ｄ配列を等間隔に３つ有する環状のＲＮＡ分子１に、機能性蛋白質分子を添加することによって形成させることができるが、この複合体は、機能性蛋白質分子３、４、５を、等モルで加えることにより得られる。また、図示はしないが、図６と同じＲＮＡ分子を用いた場合でも、機能性蛋白質分子３、４のみが、１：２の比率で結合した複合体を形成させたい場合には、機能性蛋白質分子３と、機能性蛋白質分子４とを、１：２の比率で添加することで、三角形の一つの角に機能性蛋白質分子３が、三角形の残り二つの角に機能性蛋白質分子４が結合した複合体を形成することができる。【００６７】
機能性ＲＮＡ−蛋白質複合体構築の概略的なスキームを、図７に示す。図７は、ＲＮＡ分子に、異なる三種の機能性蛋白質分子２ａ、２ｂ、２ｃを添加する場合のスキームである。このように、機能性蛋白質分子が融合したＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の蛋白質分子を一種類添加するたびに、ＲＮＡ分子の構造を変化させ、最終的に所望の形状の機能性ＲＮＡ−蛋白質複合体を作成することができる。【００６８】
機能性ＲＮＡ−蛋白質複合体の作製において、たとえば、膜透過性ペプチドや組織特異的に発現している膜蛋白質に結合する蛋白質を用いれば、特定の細胞へと上記のような複合体を届けるデリバリーに利用することができる。また、ＧＦＰやＹＦＰなどの蛍光蛋白質を用いれば、複合体のデリバリーを可視化して観察できるという利点もある。さらに、アポトーシス誘導蛋白質を癌細胞に届けるといった治療薬としての利用が考えられる。図６に示す複合体のように、複数の異なる機能の蛋白質を結合した複合体は、これらの利点を全て併せ持つものといえる。また、ＲＮＡと蛋白質とは、特異的、かつ非共有結合的な結合により結合されているため、従来の共有結合的な結合と比較して、フレキシブルな結合態様による複合体とすることができる。したがって、ＲＮＡ結合モチーフをもつ任意の蛋白質を自在に交換(インストール)することができ、機能性ＲＮＡ−蛋白質複合体のモジュラーエンジニアリングが可能となる。また、本手法で設計したＲＮＡ分子は、後述の実施例、図１６でも示されるように、安定な二本鎖を形成し、末端ヌクレオチドの水酸基を細胞内に存在するＲＮａｓｅから保護することが可能になる。このため、細胞内で安定に存在することが期待できる。【００６９】
本発明は、第５実施形態によれば、ＲＮＡ−蛋白質複合体ナノ構造体を作成する方法であって、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を有するＲＮＡ分子に、該ＲＮＡ分子のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合するアミノ酸配列を含む蛋白質分子と、必要な場合には、マグネシウムやカルシウムなどの金属イオンとを添加することを特徴とする。【００７０】
本実施形態においては、第１実施形態と同様に、ＲＮＡ分子の特異的な構造変化を蛋白質分子で誘導することにより、ＲＮＡ−蛋白質複合体ナノ構造体を作成する。ＲＮＡ分子の設計により所望の構造体を得ることができ、具体的な構造体としては、第１実施形態で例示した正三角形、正八面体、正方形等が挙げられるが、これらには限定されない。【００７１】
別の例として、ＲＮＡ分子と、蛋白質分子と、金属イオンとを添加することによる、ＲＮＡ−蛋白質複合体ナノ構造体の作成方法を挙げることもできる。この方法は、ＲＮＡ分子に足場塩基配列として、Ｋｉｓｓｉｎｇ−ｌｏｏｐ配列を導入した場合に好ましく用いられる。このとき、一つのＲＮＡ分子は、蛋白質分子により構造変化が導入されて、一つのＲＮＡ−蛋白質複合体を形成する。そして、金属イオンの添加によって、一つのＲＮＡ−蛋白質複合体は、別のＲＮＡ−蛋白質複合体と相互作用する。このような、Ｋｉｓｓｉｎｇ−ｌｏｏｐ配列を用いた場合に、金属イオンはＲＮＡ分子同士を、非共有結合的に連結することができる。これにより、複数のＲＮＡ分子が結合したＲＮＡ−蛋白質複合体ナノ構造体を製造することができる。このような、複数の分子を結合する物質は、導入されるモチーフ等にもよるが、ほかに、ＲＮＡループ・レセプターモチーフが挙げられる。【００７２】
この場合にも、第４実施形態で説明したのと同様に、蛋白質分子を、機能性蛋白質を融合させた融合蛋白質とすることができる。【００７３】
本発明の第５実施形態によれば、単にＲＮＡ分子に構造変化を導入し、複合体を形成するのみならず、いくつかの複合体を組み合わせてナノ構造体を作成する方法を提供することができる。このような方法によれば、より多くの所望のナノ構造体を作成することができ、生体分子や遺伝子回路を人工的に構成するためのツールとしてより応用しやすいといえる。【００７４】
［実施例］
ＲＮＰを用いたナノ構造体創製の方法を示す。本手法は、蛋白質のみあるいはＲＮＡのみを用いる場合よりも容易に、ナノスケールの構造体や機能性分子の創製が行える技術である。以下に、具体的実験例を挙げる。
【実施例１】
【００７５】
［ＲＮＰナノ構造体のコンピュータ分子設計］
ＲＮＰナノ構造体の分子設計には分子モデリングソフトウェアであるＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ２．０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）を用いた。まず、分子設計に用いるＲＮＰモチーフの三次元立体構造として、Ｌ７Ａｅ−ＢｏｘＣ／Ｄの構造が記述されたｐｄｂファイルをＴｈｅ  ＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）より取得した（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＲＬＧ）。取得したファイルに含まれるＢｏｘＣ／Ｄの３塩基目、５塩基目および２１塩基目の５’ブロモウリジンは、実際に合成するＲＮＡに合わせてウリジンに置換した。配列任意の直鎖状の二本鎖ＡへリックスＲＮＡの分子モデルを生成し、頂点となる３つのＬ７Ａｅ−ＢｏｘＣ／Ｄが同一平面状に配置されるように二本鎖の長さを調節し辺部分に挿入した。ＢｏｘＣ／Ｄを連結する二本鎖の長さは２６塩基対である。辺部分の二本鎖の配列は、望まない二次構造を形成しないよう、類似の試みを行ったＲ．  Ｐ．  ＧｏｏｄｍａｎらのＤＮＡ四面体の辺の配列に置換した（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００５，  ３１０，  １６６１−１６６５）。【００７６】
図８（ａ）は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ２．０を用いて描写した  Ｌ７−３ｋａｋｕ を上面から見た図であり、図８（ｂ）は、図８（ａ）を９０度回転させた三角形側面の図である。ＲＮＡは１１４  ｎｔのｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ（図９（ａ））および１５０  ｎｔのｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎ（図９（ｂ））からなり、これらのＲＮＡの相補的な対合により、３つのＢｏｘＣ／Ｄを持つ環状ＲＮＡ鎖が形成される。これらのＢｏｘＣ／Ｄ配列にＬ７Ａｅが結合することで環状になったＲＮＡの三箇所が６０度に固定され三角形が形成されると期待される。形成されるＲＮＡ三角形の一辺の長さは約１０ｎｍである（図１０）。分子モデルを設計した後、モデルの構造の妥当性を評価するため、Ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌを用いてエネルギー最小化計算を行った。設計した分子モデルの構造とエネルギー最小化計算後の構造を重ね合わせたところ構造上の差異はほとんどなかったため、設計した分子モデルはエネルギー的に安定であることが確認できた。
【実施例２】
【００７７】
［ＲＮＰナノ構造体の合成・構築］
［Ｌ７Ａｅの作製］
ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフの蛋白質、Ｌ７ＡｅはＡｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｈｕｔｔｅｎｈｏｆｅｒ氏から譲り受けたプラスミド（配列番号１１）を利用して発現させた。そのプラスミドはＡ．Ｆｕｌｇｉｄｕｓ氏からＬ７Ａｅ  Ｆｗｄ（５’−ＣＴＧＡＣＡＴＡＴＧＴＡＣＧＴＧＡＧＡＴＴＴＧＡＧＧＴＴＣ−３’）（配列番号１２）、Ｌ７Ａｅ  Ｒｅｖ（５’−ＣＴＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＴＴＡＡＴＣ−３’）（配列番号１３）のプライマーを使って増幅したインサートを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＥＴ−２８ｂ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込み作製されていた。発現精製法は以下に示す。まず、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換した。得られたコロニーを２５μｇ／ｍＬカナマイシン、１００μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振蕩培養した。続いて培養液全量を２５μｇ／ｍＬカナマイシン、１００μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ培地５００ｍＬに植え継いだ。Ｏ．Ｄ．６００が０．６〜０．７になるまで３７℃で振蕩培養し、その後、発現誘導をするため１Ｍ  ＩＰＴＧを５００μＬ加え（最終濃度１ｍＭ）、３０℃で一晩振蕩培養した。遠心分離（４℃、６０００ｒｐｍ、２０分）で菌体を回収し、ソニケーションバッファー（５０ｍＭ  Ｎａ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）５ｍＬを加え、超音波処理を行い、菌体を破砕した。なお、超音波処理は、氷上で冷却後、１５秒間超音波を当てる、という操作を６回繰り返した。その後、８０℃、１５分で、不純蛋白質を変性させた。遠心分離（４℃、６０００ｒｐｍ、２０分）を行い、上清を回収し、ヒスチジンタグが付いた蛋白質をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてバッチ法により精製した。具体的には、まず上清とＮｉ−ＮＴＡ  １ｍＬを混合し、４℃で１時間撹拌を行った。その後、カラムに充填し、ｗａｓｈバッファー（５０ｍＭ  Ｎａ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ８．０）４ｍＬで２回洗浄した。５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭのｉｍｉｄａｚｏｌｅを含む溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｎａ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０にｉｍｉｄａｚｏｌｅを加えて作製）を１ｍＬずつ２回で段階的に溶出させた。確認は１７％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより行った。続いて、マイクロコンＹＭ−３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、蛋白質の濃縮を行い、透析バッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、５％  グリセロール、ｐＨ７．５）に置換した。また、蛋白質の濃度はプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で決定した。【００７８】
［ＲＮＡの合成］
ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎの鋳型ＤＮＡは、Ｌ  Ｆｗｄ（１０μＭ、５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＧＣＡＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＧＧＣＧＴＧＡＴＧ−３’配列番号１４）１．５μＬ、Ｌ  Ｒｅｖ（１０μＭ、５’−ＴＴＧＣＴＡＣＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＣＣＧＧＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＣＣＧＴＡＧＡＧＧＣＴＣ−３’配列番号１５）１．５μＬ、Ｌ  ｔｅｍｐｌａｔｅ（１ｎｇ／μＬ、５’−ＧＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＧＧＣＧＴＧＡＴＧＡＧＣＣＡＴＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＴＣＣＡＡＴＧＧＣＧＴＧＡＴＧＡＧＣＣＴＣＴＡＣＧＧＧＡＡＧＡＧＣ−３’配列番号１６）１μＬ、ＫＯＤ＋（ＴＯＹＯＢＯ）１μＬ、１０×ＫＯＤ＋  ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  １．６μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ４μＬ、超純水３４．４μＬを混合し、９４℃  １５秒、５５℃  ３０秒、６８℃  ６０秒の３ステップで１５サイクルＰＣＲを行い作製した。ｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎの鋳型ＤＮＡ合成は、まずＳ  ｔｅｍｐｌａｔｅ（１ｎｇ／μＬ、５’−ＧＣＣＴＴＴＧＣＧＣＣＴＴＧＣＴＡＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＣＧＧＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＣＣＧＴＡＧＡＧＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＴＧＧＡＣＴＴＣ−３’配列番号１７）１μＬ、Ｓ  Ｒｅｖ（１０μＭ、５’−ＴＧＴＡＡＴＣＧＧＴＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＴＣＣＡＡＴＧＧＴＣＡＧＡＧ−３’配列番号１８）５μＬ、Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）１μＬ、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  １０μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ８μＬ、超純水７５μＬを混合し、９４℃  ３０秒、５５℃  ３０秒、６８℃  ３０秒の３ステップで５サイクルＰＣＲを行った。合成されたＤＮＡ鎖は、フェノール抽出、ジエチルエーテル抽出、エタノール沈殿を行い精製した。【００７９】
次に、このＤＮＡ（１ｎｇ／μＬ）１μＬを鋳型とし、Ｓ  Ｆｗｄ（１０μＭ、５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＣＴＴＴＧＣＧＣＣＴＴＧＣＴＡＣＧ−３’配列番号１９）１．５μＬ、Ｓ  ｎｅｗ  Ｒｅｖ（１０μＭ、５’−ＴＧＴＡＡＴＣＧＧＴＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＧＡＧＧ−３’配列番号２０）１．５μＬ、ＫＯＤ＋（ＴＯＹＯＢＯ）１μＬ、１０×ＫＯＤ＋  ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  １．６μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ４μＬ、超純水３４．４μＬを混合し、９４℃  １５秒、５５℃  ３０秒、６８℃  ６０秒の３ステップを１５サイクルでＰＣＲを行い、鋳型ＤＮＡを合成した。それぞれの鋳型ＤＮＡは、４％アガロースゲル電気泳動で合成できたことを確認し、フェノール抽出、ジエチルエーテル抽出、エタノール沈殿を行い精製した。精製した鋳型ＤＮＡは８μＬの超純水に溶解し、転写に用いた。転写にはＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）  （Ａｍｂｉｏｎ）を用い、以下の通り行った。鋳型ＤＮＡ  ８μＬ、Ｔ７  １０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、Ｔ７  ＡＴＰ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（７５ｍＭ）  ２μＬ（ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰに関しても同様）、Ｔ７  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  ２μＬを混合した全２０μＬを３７℃で一晩反応させた。反応後は、ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ  １μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートし、鋳型ＤＮＡを分解させた。反応液に、１１５μＬの超純水と１５μＬ酢酸アンモニウムストップ溶液を加え、さらにフェノール処理、ジエチルエーテル抽出、エタノール沈殿を行い精製した。沈殿を２０μＬの変性色素（８０％ホルムアミド、０．１７％  ＸＣ、０．２７％  ＢＰＢ）に溶解し、１０％  ポリアクリルアミド（１／３０  ビスアクリルアミド）変性ゲル電気泳動で分離した。目的のサイズのバンドを切り出し、５００μＬの溶出緩衝液（０．３Ｍ  酢酸ナトリウム、ｐＨ  ７．０）を加え、３７℃で一晩インキュベートし溶出した。溶出したＲＮＡは再びフェノール抽出、ジエチルエーテル抽出およびエタノール沈殿を行って精製し、超純水に溶かして以降の実験に用いた。
【実施例３】
【００８０】
［ゲルシフトアッセイによるＲＮＰ構造体形成の確認］
ＲＮＡと蛋白質の結合の確認は、二種類のＲＮＡの濃度がそれぞれ２ｎｇ／μＬ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、３％グリセロール、蛋白質１００〜１０００ｎＭの反応条件で、以下のように行った。５×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、７５０ｍＭ  ＫＣｌ、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１５％  グリセロール）２μＬと、ｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎおよびｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ（ともに１０ｎｇ／μＬ）２μＬずつを混合し、８０℃で３分間加熱してＲＮＡを変性させた後、氷上に置いて急冷してフォールディングさせた。Ｌ７Ａｅを加え、超純水で反応液量を１０μＬにし、氷上で１５分間静置してＲＮＡとＬ７Ａｅ（１００ｎＭ、３００ｎＭ、１０００ｎＭ）を結合させた。色素（０．２５％  ＢＰＢ、０．２５％  ＸＣ、３０％  グリセロール）を１μＬ加え、非変性５％ポリアクリルアミドゲルに重層し、４℃で３〜４時間電気泳動を行った。泳動後、ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎで染色し、ＦＬＡ−７０００（ＦＵＪＩ  ＦＩＬＭ）でバンドを確認した。結果を図１１に示す。その結果、ｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎとｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎが結合したＲＮＡに３つのＬ７Ａｅが結合していることが示唆された。
【実施例４】
【００８１】
［原子間力顕微鏡による構造体の観察］
原子間力顕微鏡で観察するための試料は以下のように調製した。５×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、７５０ｍＭ  ＫＣｌ、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１５％  グリセロール）２μＬとｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎおよびｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ（ともに１０ｎｇ／μＬ）２μＬずつを混合し、８０  ℃で３分間加熱してＲＮＡを変性させた後、氷上に置いて急冷してフォールディングさせた。３μＬの超純水と１μＬの１０μＭ  Ｌ７Ａｅ（最終濃度１０００ｎＭ）を混合後、氷上で１５分間静置してＲＮＡとＬ７Ａｅを結合させた。反応液２μＬに１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）１８μＬを加えて１０倍に希釈し、一回の測定にはこの希釈液１０μＬを使用した。試料は雲母基板上に固定化して観察した。まず、雲母基盤表面に２０μＬの１０ｍＭスペルミジンを滴下し、室温で１０分間静置した。窒素ガスでスペルミジンを吹き飛ばして乾燥させた後、試料１０μＬを滴下して室温で１０分間静置し、試料を雲母片表面に付着させた。１ｍＬの超純水で雲母片表面を洗い流し、窒素ガスを吹き当てて乾燥させた。この雲母基盤を原子間力顕微鏡（Ｖｅｅｃｏ社製）にセットして走査し、５００ｎｍ×５００ｎｍのスケールで画像化した。原子間力顕微鏡の制御及び画像の処理にはＮａｎｏ  ｓｃｏｐｅ（Ｖｅｅｃｏ社製）を用いた。結果を図１２、図１３、図１４、図１５に示す。その結果、単独では楕円状で存在したＲＮＡ分子（図１３）が、蛋白質Ｌ７ＡｅとＲＮＡ分子とが共存した場合（図１５）には三角形の構造体を形成することが観察でき、蛋白質Ｌ７Ａｅ存在下でのみ設計通りの三角形の構造体が確認できた。【００８２】
また、得られた画像をもとに、観察されたＲＮＡまたはＲＮＰ構造体の粒径および高さの分布を測定し解析した。その結果、ＲＮＡのみの場合（サンプル数Ｎ＝１２１、粒径の平均値＝２６．１５ｎｍ、標準偏差σ＝４．６２、高さの平均値＝１．８０ｎｍ、標準偏差σ＝０．６６）と比較して、Ｌ７Ａｅ添加時の方が分布のばらつき（標準偏差）が小さく、粒径、高さともに一定の値付近に収束していた（サンプル数Ｎ＝１２２、粒径の平均値＝２４．２６ｎｍ、標準偏差σ＝２．６８、高さの平均値＝１．２４ｎｍ、標準偏差σ＝０．２０）。この実験解析から、それのみでは強固な単一の構造を取り得ない、フレキシブルな構造をもつＲＮＡが、Ｌ７Ａｅ蛋白質と結合することにより設計通りの三角形構造を安定に形成したことが明らかとなった。
【実施例５】
【００８３】
［大きなＬ７−３ｋａｋｕのコンピュータ分子設計］
実施例１と同様に、分子モデリングソフトウェアであるＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ２．０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）を用いて、３つのＬ７Ａｅ−ＢｏｘＣ／Ｄモチーフが同一平面状で正三角形を形成するよう、４８ｂｐのＲＮＡ二本鎖でつないだ大きなＬ７−３ｋａｋｕを設計した。図１６は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ２．０を用いて描写した大きなＬ７−３ｋａｋｕの図である。この大きなＬ７−３ｋａｋｕにおいて、三角形はＲＮＡ二本鎖で構成され、ＲＮＡが形成する三角形の一辺は約１７ｎｍ、４８ｂｐであった。【００８４】
コンピュータ分子設計の結果、ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎの配列は、ＧＧＣＧＣＡＡＡＧＧＣＣＵＧＵＡＡＵＣＧＧＧＣＧＣＣＧＡＧＣＧＧＣＧＵＧＡＵＧＡＧＣＵＧＵＵＣＡＣＣＧＧＣＡＵＣＧＵＧＣＣＣＡＵＣＡＵＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＵＧＡＡＧＵＣＣＡＡＵＧＧＣＧＵＧＡＵＧＡＧＣＣＵＣＵＡＣＧＧＧＡＡＧＡＧＣＡＵＧＣＣＣＡＵＣＣＧＣＣＵＧＡＵＣＧＡＧＣＵＧＡＡＵＧＧＣＧＡＵＧＧＣＧＵＧＡＵＧＡＧＣＡＵＧＧＵＧＡＧＣＡＡＧＵＡＧＣＡＡ（配列番号２１）、ｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎの配列は、ＧＧＣＣＵＵＵＧＣＧＣＣＵＵＧＣＵＡＣＵＵＧＣＵＣＡＣＣＡＵＧＣＵＣＵＧＡＣＣＡＵＣＧＣＣＡＵＵＣＡＧＣＵＣＧＡＵＣＡＧＧＣＧＧＡＵＧＧＧＣＡＵＧＣＵＣＵＵＣＣＣＧＵＡＧＡＧＧＣＵＣＵＧＡＣＣＡＵＵＧＧＡＣＵＵＣＡＵＵＵＣＣＵＣＣＵＣＧＣＡＵＧＡＵＧＧＧＣＡＣＧＡＵＧＣＣＧＧＵＧＡＡＣＡＧＣＵＣＵＧＡＣＣＧＣＵＣＧＧＣＧＣＣＣＧＡＵＵＡＣＡ（配列番号２２）と決定された。【００８５】
また、異なる配列の組み合わせから構成される、大きなＬ７−３ｋａｋｕを設計及び作成した。その際に利用したｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ及びｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎの配列は以下の通りである。ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎの配列は、５’−ＧＧＡＣＧＡＧＣＵＧＵＡＣＡＣＣＡＵＧＧＵＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＣＧＵＧＡＵＧＡＧＣＵＣＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＵＣＡＣＡＵＧＡＵＣＵＡＣＵＵＣＧＧＣＵＵＣＧＧＣＧＵＧＡＵＧＡＧＣＣＣＵＧＵＧＣＵＧＣＵＧＣＣＣＧＡＵＡＡＣＣＡＣＵＡＣＣＵＧＣＣＡＵＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＣＣＵＧＧＧＣＧＵＧＡＵＧＡＧＣＡＵＵＣＣＡＣＣＣＡＧＡＧＣＧＣ−３’（配列番号２８、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ、１８０ｎｔ）に、ｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎの配列は、５’−ＧＧＵＧＵＡＣＡＧＣＵＣＧＵＣＣＧＣＧＣＵＣＵＧＧＧＵＧＧＡＡＵＧＣＵＣＵＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣＣＧＵＧＧＧＵＧＡＵＧＧＣＡＧＧＵＡＧＵＧＧＵＵＡＵＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＣＵＣＵＧＡＣＣＧＡＡＧＣＣＧＡＡＧＵＡＧＡＵＣＡＵＧＵＧＡＵＣＧＣＧＣＵＵＣＵＣＧＵＵＧＧＧＧＵＣＣＵＵＧＧＡＧＣＵＣＵＧＡＣＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＵＣＡＣＣＡＵ−３’（配列番号２９、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ、１７１ｎｔ）を作成した。【００８６】
［ＲＮＡの合成］
ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎの鋳型ＤＮＡは、Ｌ  Ｆｗｄ（２μＭ、５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＣＧＴＧＡＴＧＡＧＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＡＴＣＴＡＣＴＴＣＧＧＣＴＴ−３’、配列番号３０、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ、１０９ｎｔ）１０μＬ、Ｌ  Ｒｅｖ（２μＭ、５’−ＧＣＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＡＴＧＧＣＡＧＧＴＡＧＴＧＧＴＴＡＴＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＣＧＡＡＧＣＣＧＡＡＧＴＡＧＡＴＣＡＴＧＴＧ−３’、配列番号３１、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ、１０９ｎｔ）１０μＬ、Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）０．５μＬ、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ４μＬ、超純水２１．５μＬを混合し、９４℃  ３０秒間、４８℃  １分間、７２℃  ３０秒間の３ステップで５サイクルＰＣＲを行い作製した。【００８７】
ｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎの鋳型ＤＮＡは、Ｓ  Ｆｗｄ（２μＭ、５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＧＣＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＧＡＡＴＧＣＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＴＧＡＴＧＧＣＡＧＧＴＡＧＴＧＧＴＴＡＴＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡ−３’（配列番号３２、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ、１０５ｎｔ））１０μＬ、Ｓ  Ｒｅｖ（２μＭ、５’−ＡＴＧＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＴＣＡＧＡＧＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＡＴＣＴＡＣＴＴＣＧＧＣＴＴＣＧＧＴＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＡＴＡＡＣＣ−３’（配列番号３３、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ、１０４ｎｔ））１０μＬ、Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）０．５μＬ、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ４μＬ、超純水２１．５μＬを混合し、９４℃  ３０秒間、５６℃  １分間、７２℃  ３０秒間の３ステップで５サイクルＰＣＲを行い作製した。合成された鋳型ＤＮＡ鎖は、非変性６％アクリルアミドゲル（１／３０  ビスアクリルアミド）で電気泳動を行い、目的のサイズのバンドを切り出した。切り出したゲル片に５００μＬの溶出緩衝液（０．１％  ＳＤＳ、０．３Ｍ  酢酸ナトリウム、ｐＨ  ７．０）を加え、３７℃で一晩インキュベートしＤＮＡを溶出した。その後フェノール抽出、ジエチルエーテル抽出およびエタノール沈殿を行い、２０μＬの超純水に溶かして、８μＬを以下の転写反応に用いた。【００８８】
転写にはＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）を用い、以下の通り行った。鋳型ＤＮＡ  ８μＬ、Ｔ７  １０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、Ｔ７  ＡＴＰ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（７５ｍＭ）  ２μＬ（ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰに関しても同様）、Ｔ７  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  ２μＬを混合した全２０μＬを３７℃で一晩反応させた。反応後は、ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ  １μＬ加え、３７℃で１５分間インキュベートし、鋳型ＤＮＡを分解させた。反応液に２０μＬの変性色素（８０％ホルムアミド、０．１７％  ＸＣ、  ０．２７％  ＢＰＢ）を加え、１０％  ポリアクリルアミド（１／３０  ビスアクリルアミド）変性ゲル電気泳動で分離した。目的のサイズのバンドを切り出し、５００μＬの溶出緩衝液（０．１％  ＳＤＳ、０．３Ｍ  酢酸ナトリウム、ｐＨ  ７．０）を加え、３７℃で一晩インキュベートし溶出した。溶出したＲＮＡはフェノール抽出、ジエチルエーテル抽出およびエタノール沈殿を行い、超純水に溶かして以降の実験に用いた。【００８９】
［ゲルシフトアッセイによるＲＮＰ構造体形成の確認］
実施例３と同様に、ＲＮＡと蛋白質の結合をゲルシフトアッセイで確認した。二種類のＲＮＡの最終濃度はそれぞれ５０ｆｍｏｌ／μＬ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、３％グリセロール、蛋白質１００〜１０００ｎＭの反応条件で、以下のように行った。５×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、７５０ｍＭ  ＫＣｌ、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１５％  グリセロール）２μＬと超純水６μＬ、ｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎおよびｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ（ともに１ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬずつを混合し、８０℃で３分間加熱してＲＮＡを変性させた後、氷上に置いて急冷してフォールディングさせた。１μＬのＬ７Ａｅを加え、氷上で１５分間静置してＲＮＡとＬ７Ａｅ（最終濃度１００ｎＭ、３００ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ）を結合させた。色素（０．２５％  ＢＰＢ、０．２５％  ＸＣ、３０％  グリセロール）を１μＬ加え、非変性５％ポリアクリルアミドゲルに重層し、室温で３〜４時間電気泳動を行った。泳動後、ゲルをＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩＩで染色し、ＦＬＡ−７０００（ＦＵＪＩ  ＦＩＬＭ）でバンドを確認した。その結果、ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎとｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎが結合したＲＮＡに３つのＬ７Ａｅが結合していることが示唆された。【００９０】
［原子間力顕微鏡による構造体の観察］
実施例４と同様に、試料を以下のように調製し原子間力顕微鏡で観察した。５×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、７５０ｍＭ  ＫＣｌ、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１５％  グリセロール）２μＬと超純水６μＬ、ｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎおよびｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ（ともに１ｐｍｏｌ／μＬ）０．５μＬずつを混合し、８０  ℃で３分間加熱してＲＮＡを変性させた後、室温に１０分間置きフォールディングさせた。１μＬの７．５μＭ  Ｌ７Ａｅ（最終濃度７５０ｎＭ）を混合後、室温で１５分間静置してＲＮＡとＬ７Ａｅを結合させた。反応液２μＬに１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）１８μＬを加えて１０倍に希釈し、一回の測定にはこの希釈液１０μＬを使用した。試料は雲母基板上に固定化して観察した。まず、雲母基盤表面に２０μＬの１０ｍＭスペルミジンを滴下し、室温で１０分間静置した。窒素ガスでスペルミジンを吹き飛ばして乾燥させた後、試料１０μＬを滴下して室温で１０分間静置し、試料を雲母片表面に付着させた。１ｍＬの超純水で雲母片表面を洗い流し、窒素ガスを吹き当てて乾燥させた。この雲母基盤を原子間力顕微鏡（Ｖｅｅｃｏ社製）にセットして走査した。原子間力顕微鏡の制御及び画像の処理にはＮａｎｏ  ｓｃｏｐｅ（Ｖｅｅｃｏ社製）を用いた。その結果、ＲＮＡのみの場合には、ＲＮＡ同士が自己集合または会合したと考えられる大きな環状構造体や直鎖状の構造体が観察された。対して、Ｌ７Ａｅ存在下ではそれらの構造体の減少と、コンピューターデザイン通りの三角形構造体の形成が観察され、Ｌ７Ａｅ存在下で設計通りにＲＮＰ構造体形成が行われていることが確認できた。
【実施例６】
【００９１】
［Ｌ７−３ｋｉｓｓのコンピュータ分子設計］
実施例１と同様に、分子モデリングソフトウェアであるＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ２．０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）を用いて、３つのＬ７Ａｅ−ＢｏｘＣ／ＤモチーフをＫｉｓｓｉｎｇ−ｌｏｏｐモチーフでつないだ三角形である、Ｌ７−３ｋｉｓｓを設計した。Ｋｉｓｓｉｎｇ−ｌｏｏｐモチーフは、Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｃｏａｘｉａｌｌｙ  ｓｔａｃｋｅｄ  ｋｉｓｓｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＩＶ−１  ＲＮＡ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ，  Ｅｒｉｃ  Ｅｎｎｉｆａｒ，  Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｗａｌｔｅｒ，  Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｅｈｒｅｓｍａｎｎ，  Ｃｈａｎｔａｌ  Ｅｈｒｅｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｄｕｍａｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．８，  Ｎｕｍｂｅｒ  １２，  １０６４−１０６８，２００１により知られており、互いに逆相補配列を持つ二つのループが、ループ間での塩基対形成とスタッキングで安定に結合したモチーフである。このＬ７−３ｋｉｓｓは、ＲＮＰ  モチーフおよびＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用モチーフを利用した構造変化制御の例として設計した。【００９２】
設計の前提として、図１８に、Ｌ７Ａｅ−ＢｏｘＣ／Ｄ  モチーフ、Ｋｉｓｓｉｎｇ−ｌｏｏｐモチーフによる三角形形成の仮定的なスキームを示す。中央部にＢｏｘＣ／Ｄモチーフを有し、二本鎖を形成するループ状のＲＮＡは、Ｌ７ＡｅやＭｇ２＋イオンの非存在下では、ループ状で存在すると考えられる。このループ状のＲＮＡに、Ｌ７Ａｅを添加すると、６０度の屈曲構造を呈する屈曲ループＲＮＡに、特異的に構造変化すると考えられる。さらに、Ｍｇ２＋イオンを添加すると、Ｋｉｓｓｉｎｇ−ｌｏｏｐモチーフにより、三角形を形成すると考えられる。なお、ループ状のＲＮＡに、Ｌ７Ａｅを添加することなく、Ｍｇ２＋イオンのみを添加すると、ループ状のＲＮＡのままで、Ｋｉｓｓｉｎｇ−ｌｏｏｐモチーフにより相互作用し、非特異的な様々な形状を構成すると考えられる。この方法では、前の設計と異なり、短いＲＮＡのフラグメントを混ぜただけで自己集合して、構造体を形成できるという利点がある。【００９３】
図１７は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ２．０を用いて描写したＬ７−３ｋｉｓｓのリボンダイアグラムである。このＬ７−３ｋｉｓｓにおいて、一つの三角形は３つのＲＮＡ鎖からなり、３つのＲＮＡ鎖は同一の配列とした。ＲＮＡが形成する三角形の一辺は約１０ｎｍであった。３つのＲＮＡ鎖は、Ｌ７Ａｅにより、６０度の屈曲構造を呈し、ｋｉｓｓｉｎｇ−ｌｏｏｐ相互作用によりホモトリマーを形成し、三角形となった。【００９４】
コンピュータ分子設計の結果、３つの同一のＲＮＡの配列は、ＣＵＡＣＧＧＧＡＡＧＣＧＣＧＣＡＣＣＣＧＵＡＧＡＧＧＣＵＣＵＧＡＣＣＣＧＧＡＵＧＧＧＣＡＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＣＣＡＵＣＣＧＧＧＣＧＵＧＡＵＧＡＧＣＣＵ（配列番号２３）と決定された。
【実施例７】
【００９５】
［Ｄｅｌｉｖｅｒｙ−３ｋａｋｕのコンピュータ分子設計］
実施例１と同様に、分子モデリングソフトウェアであるＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ２．０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）を用いて、３つのＬ７Ａｅ−ＢｏｘＣ／Ｄモチーフが同一平面状で正三角形を形成するよう、２６ｂｐのＲＮＡ二本鎖でつなぎ、かつ３つのＬ７Ａｅのうち、一つには蛍光蛋白質ＧＦＰを結合させ、二つにはポリアルギニンモチーフを結合させた、Ｄｅｌｉｖｅｒｙ−３ｋａｋｕを設計した。図１９は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ２．０を用いて描写したＤｅｌｉｖｅｒｙ−３ｋａｋｕの図である。図中、左上の角、及び右上の角に、ポリアルギニンモチーフが融合したＬ７Ａｅが結合しており、左下の角に蛍光蛋白質ＧＦＰが融合したＬ７Ａｅが結合している、このＤｅｌｉｖｅｒｙ−３ｋａｋｕにおいて、三角形はＲＮＡ二本鎖で構成され、ＲＮＡが形成する三角形の一辺は約１０ｎｍであった。【００９６】
コンピュータ分子設計の結果、ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎの配列は、５’−ＧＧＣＧＣＡＡＡＧＧＣＣＵＧＵＡＡＵＣＧＧＣＧＵＧＡＵＧＡＧＣＣＡＵＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＵＧＡＡＧＵＣＣＡＡＵＧＧＣＧＵＧＡＵＧＡＧＣＣＵＣＵＡＣＧＧＧＡＡＧＡＧＣＡＵＧＣＣＣＡＵＣＣＧＧＧＣＧＵＧＡＵＧＡＧＣＧＵＡＧＣＡＡ−３’（配列番号２４）、ｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎの配列は、５‘−ＧＧＣＣＵＵＵＧＣＧＣＣＵＵＧＣＵＡＣＧＣＵＣＵＧＡＣＣＣＧＧＡＵＧＧＧＣＡＵＧＣＵＣＵＵＣＣＣＧＵＡＧＡＧＧＣＵＣＵＧＡＣＣＡＵＵＧＧＡＣＵＵＣＡＵＵＵＣＣＵＣＣＵＣＧＣＡＵＧＧＣＵＣＵＧＡＣＣＧＡＵＵＡＣＡ−３’（配列番号２５）、Ｌ７Ａｅ−蛍光蛋白質ＧＦＰのペプチド配列は、ＶＰＥＤＭＱＮＥＡＬＳＬＬＥＫＶＲＥＳＧＫＶＫＫＧＴＮＥＴＴＫＡＶＥＲＧＬＡＫＬＶＹＩＡＥＤＶＤＰＰＥＩＶＡＨＬＰＬＬＣＥＥＫＮＶＰＹＩＹＶＫＳＫＮＤＬＧＲＡＶＧＩＥＶＰＣＡＳＡＡＩＩＮＥＧＥＬＲＫＥＬＧＳＬＶＥＫＩＫＧＬＱＫＰＦＴＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＹＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹ（配列番号２６）、Ｌ７Ａｅ−ポリアルギニンモチーフのペプチド配列は、ＥＤＭＱＮＥＡＬＳＬＬＥＫＶＲＥＳＧＫＶＫＫＧＴＮＥＴＴＫＡＶＥＲＧＬＡＫＬＶＹＩＡＥＤＶＤＰＰＥＩＶＡＨＬＰＬＬＣＥＥＫＮＶＰＹＩＹＶＫＳＫＮＤＬＧＲＡＶＧＩＥＶＰＣＡＳＡＡＩＩＮＥＧＥＬＲＫＥＬＧＳＬＶＥＫＩＫＧＬＱＫＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２７）と決定された。【００９７】
また、３箇所の頂点部位に確実に３種類の異なるＬ７Ａｅ融合蛋白質を結合させるため、分割したＤｅｌｉｖｅｒｙ−３ｋａｋｕの設計も行った。ＲＮＡを三角形の辺部分で３つに分割したもので、辺部分の粘着末端間の塩基対形成により三角形が構築される。それぞれの頂点ごとにＬ７Ａｅ融合蛋白質を結合させた後、それら３種類のＲＮＡ−蛋白質複合体を混合することにより、３つの異なる蛋白質を１つずつ持つＤｅｌｉｖｅｒｙ−３ｋａｋｕが得られる。３つのパーツはそれぞれ２本のＲＮＡ鎖からなり、三角形全体は計６種類のＲＮＡ鎖からなる。図２０は、実施例７においてコンピュータ分子設計した、分割したＤｅｌｉｖｅｒｙ−３ｋａｋｕを構成するＲＮＡ分子の二次構造を示す図である。【００９８】
分割したＤｅｌｉｖｅｒｙ−３ｋａｋｕを構成する６種類のＲＮＡはそれぞれ、ｃｈａｉｎ  Ａ−Ｌｏｎｇの配列は、５’−ＧＧＣＧＣＡＡＡＧＧＣＣＵＧＵＡＡＵＣＧＧＵＧＣＧＡＵＧＡＧＣＣＡＵＧＣＧＡ−３’（配列番号３４、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ、３８ｎｔ）、ｃｈａｉｎ  Ａ−Ｓｈｏｒｔの配列は、５’−ＧＧＣＵＵＣＡＵＵＵＣＣＵＣＣＵＣＧＣＡＵＧＧＣＵＣＵＧＡＣＣＧＡＵＵＡＣＡ−３’（配列番号３５、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ、３８ｎｔ）、ｃｈａｉｎ  Ｂ−Ｌｏｎｇの配列は、５’−ＧＧＡＧＧＡＡＡＵＧＡＡＧＣＣＣＡＡＵＧＧＣＧＵＧＡＵＧＡＧＣＣＵＣＵＡＣＧ−３’（配列番号３６、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ、３８ｎｔ）、ｃｈａｉｎ  Ｂ−Ｓｈｏｒｔの配列は、５’−ＧＧＣＡＵＧＣＵＣＵＵＣＣＣＧＵＡＧＡＧＧＣＵＣＵＧＡＣＣＡＵＵＧ−３’（配列番号３７、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ、３３ｎｔ）、ｃｈａｉｎ  Ｃ−Ｌｏｎｇの配列は、５’−ＧＧＡＡＧＡＧＣＡＵＧＣＣＣＡＵＣＣＧＧＧＵＧＣＧＡＵＧＡＧＣＧＵＡＧＣＡＡ−３’（配列番号３８、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ、３８ｎｔ）、ｃｈａｉｎ  Ｃ−Ｓｈｏｒｔの配列は、５’−ＧＧＣＣＵＵＵＧＣＧＣＣＵＵＧＣＵＡＣＧＣＵＣＵＧＡＣＣＣＧＧＡＵＧ−３’（配列番号３９、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ、３４ｎｔ）と決定された。
【図１】
2010010862.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年5月20日(2010.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ分子の特異的な構造変化を蛋白質分子で誘導する方法であって、
（１）（１−１）所望の構造変化が知られているＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフを選択するステップと、
（１−２）ＲＮＡ分子の塩基配列を決定するステップであって、上記ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列と、足場塩基配列とを、コンピュータ分子モデリング法を用いて配置することにより決定するステップと、
（１−３）上記決定するステップにより得られた塩基配列に基づき、ＲＮＡ分子を製造するステップと
を含む、特異的な構造変化を生ずる非天然のＲＮＡ分子を製造するステップと
（２）上記（１）で製造されたＲＮＡ分子であって、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を含んでなる非天然のＲＮＡ分子に、該ＲＮＡ分子のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合するアミノ酸配列と機能性蛋白質とを含む蛋白質分子を添加するステップと
を含む方法。
【請求項２】
上記ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列が、ＢｏｘＣ／Ｄ配列であり、上記アミノ酸配列が、Ｌ７Ａｅのアミノ酸配列であり、上記非天然のＲＮＡ分子に、３つのＢｏｘＣ／Ｄ配列が等間隔で配置されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（１）所望の構造変化が知られているＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフを選択するステップと、
（２）ＲＮＡ分子の塩基配列を決定するステップであって、上記ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列と、足場塩基配列とを、コンピュータ分子モデリング法を用いて配置することにより決定するステップと、
（３）上記決定するステップにより得られた塩基配列に基づき、ＲＮＡ分子を製造するステップと
を含む製造方法により得られる、特異的な構造変化を生ずるＲＮＡ分子であって、ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を含んでなる非天然のＲＮＡ分子。
【請求項４】
上記ＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列が、ＢｏｘＣ／Ｄ配列であり、上記非天然のＲＮＡ分子に、３つのＢｏｘＣ／Ｄ配列が等間隔で配置されている、請求項３に記載の非天然のＲＮＡ分子。
【請求項５】
請求項３、または４に記載の非天然のＲＮＡ分子と、
該ＲＮＡ分子のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合するアミノ酸配列と機能性蛋白質とを含む蛋白質分子と
を含んでなる、ＲＮＡ分子の特異的な構造変化を蛋白質分子で誘導するためのキット。
【請求項６】
前記ＲＮＡ−蛋白質複合体形成に競合するＲＮＡ分子をさらに含む請求項５に記載のキット。
【請求項７】
請求項３、または４に記載の非天然のＲＮＡ分子と、
該ＲＮＡ分子のＲＮＡ−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列に特異的に結合するアミノ酸配列と機能性蛋白質とを含む蛋白質分子と
を含む機能性ＲＮＡ−蛋白質複合体。
【請求項８】
前記機能性蛋白質が、マーカー蛋白質、膜透過性蛋白質、腫瘍に特異的な蛋白質、治療効果を有する蛋白質、特定の細胞表面を認識する抗体から選択される一以上である請求項７に記載の機能性ＲＮＡ−蛋白質複合体。
【請求項９】
前記蛋白質分子に、３種類の機能性蛋白質が含まれ、３種類の機能性蛋白質が、それぞれ、マーカー蛋白質、膜透過性蛋白質、治療効果を有する蛋白質である、請求項７に記載の機能性ＲＮＡ−蛋白質複合体。
【請求項１０】
ＲＮＡ−蛋白質複合体ナノ構造体を作成する方法であって、
請求項４に記載の非天然のＲＮＡ分子であって、さらにＫｉｓｓｉｎｇ  ｌｏｏｐモチーフを配置したＲＮＡ分子に、Ｌ７Ａｅのアミノ酸配列と機能性蛋白質とを含む蛋白質分子と、Ｍｇ２＋とを添加することを特徴とする方法。
【国際調査報告】
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