(57)【要約】【課題】本発明の課題は、癌の治療及び診断のための新規な手段を提供することにある。【解決手段】TMPRSS11Eに対するモノクローナル抗体を取得し、本抗体はTMPRSS11Eのネイティブフォームに結合し、フローサイトメトリーにてTMPRSS11Eは癌細胞株で細胞膜上に高発現する事を見出した。本抗体は抗体依存性細胞傷害活性（ADCC活性）、インターナライズ活性による高腫瘍効果を示し、治療標的として有望である。また、本抗体はプロテアーゼ活性の中和活性を有し、TMPRSS11Eの機能阻害による効果も期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
TMPRSS11Eタンパク質に結合する抗体。
【請求項２】
細胞傷害活性を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害活性（ADCC活性）である請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性（CDC活性）である請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
インターナライズ活性を有することを特徴とする請求項１〜４いずれかに記載の抗体。
【請求項６】
細胞傷害性物質が結合していることを特徴とする請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
中和活性を有することを特徴とする請求項１〜６いずれかに記載の抗体。
【請求項８】
以下のいずれかに記載のTMPRSS11Eタンパク質に結合する抗体。
（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（２）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（３）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（４）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（５）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（６）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（７）（１）の重鎖可変領域と（４）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（８）（２）の重鎖可変領域と（５）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（９）（３）の重鎖可変領域と（６）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（１０）（１）から（９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体であって、（１）から（９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
（１１）（１）から（９）のいずれかに記載の抗体が結合するTMPRSS11Eタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
【請求項９】
配列番号２の159-423番目のアミノ酸配列からなるエピトープを認識することを特徴とする請求項１〜７いずれかに記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９いずれかに記載の抗体を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項１１】
抗癌剤である請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
肺癌または子宮頸癌または食道癌を対象とする抗癌剤である請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
以下の工程を含む癌の診断方法。
(a)被験者から単離された試料を準備する工程、
(b)上記試料におけるTMPRSS11Eタンパク質又はTMPRSS11E遺伝子の発現量を検出する工程。
【請求項１４】
肺癌または子宮頸癌または食道癌を診断するためのものである、請求項１３に記載の診断方法。
【請求項１５】
請求項１〜９いずれかに記載の抗体を含む癌の診断薬。
【請求項１６】
肺癌または子宮頸癌または食道癌を診断するためのものである、請求項１５に記載の診断薬。
【請求項１７】
癌の診断または治療において使用するための、請求項１〜９いずれかに記載の抗体。
【請求項１８】
癌が、肺癌または子宮頸癌または食道癌である、請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれかに記載の抗体を使用する、癌の治療方法。
【請求項２０】
肺癌または子宮頸癌または食道癌を治療するためのものである、請求項１９に記載の癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、日本特許出願２００９−１００１６３（２００９年４月１６日出願）に基づく優先権を主張しており，この内容は本明細書に参照として取り込まれる。【０００２】
本発明は、抗TMPRSS11E抗体、及び前記抗体を利用した癌の診断と治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
TMPRSS11E(別名DESC1)は、２型膜貫通性のセリンプロテアーゼファミリーに属する。扁平上皮癌で発現が低下する新規遺伝子として発見された(Lang  and  Schuller,  2001;  Sedghizadeh  et  al.,  2006)。精製した可溶型TMPRSS11Eはプロテアーゼ活性を示し、またTMPRSS11Eを強制発現させた細胞で細胞浸潤能が上昇する事が報告された(Viloria  et  al.,  2007)。本論文ではポリクローナル抗体を用いた免疫組織染色の結果、正常腎臓、正常肝臓での強い染色に加え、一部の腎臓癌、乳癌での染色が報告されている。
しかしながら、TMPRSS11Eをターゲットとした抗体が抗癌剤などの医薬組成物として有効であるか否かは報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Lang,  J.C.  and  Schuller,  D.E.  (2001)  Differential  expression  of  a  novel  serine  protease  homologue  in  squamous  cell  carcinoma  of  the  head  and  neck.  Br  J  Cancer  84,  237-43.
【非特許文献２】Sedghizadeh,  P.P.,  Mallery,  S.R.,  Thompson,  S.J.,  Kresty,  L.,  Beck,  F.M.,  Parkinson,  E.K.,  Biancamano,  J.  and  Lang,  J.C.  (2006)  Expression  of  the  serine  protease  DESC1  correlates  directly  with  normal  keratinocyte  differentiation  and  inversely  with  head  and  neck  squamous  cell  carcinoma  progression.  Head  Neck  28,  432-40.
【非特許文献３】Viloria,  C.G.,  Peinado,  J.R.,  Astudillo,  A.,  Garcia-Suarez,  O.,  Gonzalez,  M.V.,  Suarez,  C.  and  Cal,  S.  (2007)  Human  DESC1  serine  protease  confers  tumorigenic  properties  to  MDCK  cells  and  it  is  upregulated  in  tumours  of  different  origin.  Br  J  Cancer  97,  201-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、癌の治療及び診断のための新規な手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
今回我々は、TMPRSS11Eに対するモノクローナル抗体を初めて取得した。本抗体はTMPRSS11Eのネイティブフォームに結合し、フローサイトメトリーにてTMPRSS11Eは癌細胞株で細胞膜上に高発現する事を見出した。本抗体は抗体依存性細胞傷害活性（ADCC活性）、インターナライズ活性による高腫瘍効果を示し、治療標的として有望であることを示した。また、本抗体はプロテアーゼ活性の中和活性を有し、TMPRSS11Eの機能阻害による効果も期待される。【０００７】
すなわち、本発明は、これらの知見に基づいてなされたものであり、抗TMPRSS11E抗体を用いた癌の診断と治療に関する。本発明は、以下の[１]〜[２０]を提供する。
[１]TMPRSS11Eタンパク質に結合する抗体。
[２]細胞傷害活性を有することを特徴とする[１]に記載の抗体。
[３]細胞傷害活性が、抗体依存性細胞傷害活性（ADCC活性）である[２]に記載の抗体。
[４]細胞傷害活性が、補体依存性細胞傷害活性（CDC活性）である[２]に記載の抗体。
[５]インターナライズ活性を有することを特徴とする[１]〜[４]いずれかに記載の抗体。
[６]細胞傷害性物質が結合していることを特徴とする[５]に記載の抗体。
[７]中和活性を有することを特徴とする[１]〜[６]いずれかに記載の抗体。
[８]以下のいずれかに記載のTMPRSS11Eタンパク質に結合する抗体。
（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（２）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（３）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（４）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（５）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（６）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（７）（１）の重鎖可変領域と（４）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（８）（２）の重鎖可変領域と（５）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（９）（３）の重鎖可変領域と（６）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（１０）（１）から（９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体であって、（１）から（９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
（１１）（１）から（９）のいずれかに記載の抗体が結合するTMPRSS11Eタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
[９]配列番号２の159-423番目のアミノ酸配列からなるエピトープを認識することを特徴とする[１]〜[７]のいずれかに記載の抗体。
[１０][１]〜[９]いずれかに記載の抗体を有効成分として含む医薬組成物。
[１１]抗癌剤である[１０]に記載の医薬組成物。
[１２]肺癌または子宮頸癌または食道癌を対象とする抗癌剤である[１１]に記載の医薬組成物。
[１３]以下の工程を含む癌の診断方法。
(a)被験者から単離された試料を準備する工程、
(b)上記試料におけるTMPRSS11Eタンパク質又はTMPRSS11E遺伝子の発現量を検出する工程。
[１４]肺癌または子宮頸癌または食道癌を診断するためのものである、[１３]に記載の診断方法。
[１５][１]〜[９]のいずれかに記載の抗体を含む癌の診断薬。
[１６]肺癌または子宮頸癌または食道癌を診断するためのものである、[１５]に記載の診断薬。
[１７]癌の診断または治療において使用するための、[１]〜[９]のいずれかに記載の抗体。
[１８]癌が、肺癌または子宮頸癌または食道癌である、[１７]または[１８]に記載の抗体。
[１９][１]〜[９]のいずれかに記載の抗体を使用する、癌の治療方法。
[２０]肺癌または子宮頸癌または食道癌を治療するためのものである、[１９]に記載の癌の治療方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、癌、とくに肺癌または子宮頸癌または食道癌の治療と診断のための新規な手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、正常組織及び癌細胞株におけるTMPRSS11E  mRNA量を示す。
【図２】図２は、フローサイトメトリーによるキメラ化抗TMPRSS11E抗体の結合活性を示す。
【図３】図３は、フローサイトメトリーによる抗TMPRSS11E抗体の癌細胞株に対する結合活性を示す。
【図４】図４は、癌細胞株に対する抗TMPRSS11E抗体によるADCC活性を示す。
【図５】図５は、Hum-ZAPを用いた抗TMPRSS11E抗体による抗腫瘍効果を示す。
【図６】図６は、抗TMPRSS11E抗体によるプロテアーゼ中和活性を示す。
【図７】図７は、抗TMPRSS11E抗体によるイムノブロット解析を示す。
【図８】図８は、抗TMPRSS11E抗体による免疫組織化学解析を示す。
【図９】図９は、フローサイトメトリーによる抗TMPRSS11E抗体のSK-Hep1親株およびTMPRSS11E発現株に対する結合活性を示す。
【図１０】図１０は、抗TMPRSS11E抗体による抗腫瘍効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．TMPRSS11E
TMPRSS11E(別名DESC1)は、２型膜貫通性のセリンプロテアーゼファミリーに属する。
本発明で用いられるTMPRSS11Eタンパク質の由来は特に限定されず、公知のTMPRSS11Eタンパク質のいずれを用いることも可能である。好ましくは、TMPRSS11Eタンパク質はヒトTMPRSS11Eである。ヒトTMPRSS11Eのアミノ酸配列とこれをコードする塩基配列は当該分野において公知であり、公共のデータベースであるGenBankやUnigene等に、例えば、GenBank  Accession  No:NM 014058（塩基配列＝配列番号１、アミノ酸配列＝配列番号２）として登録されている。
【００１１】
発明者らは、抗TMPRSS11E抗体を用いた発現解析の結果、TMPRSS11Eが肺癌または子宮頸癌または食道癌の組織で発現していることを見出した。
【００１２】
２．抗TMPRSS11E抗体
２．１  抗TMPRSS11E抗体
本発明で用いられる抗TMPRSS11E抗体は、TMPRSS11Eタンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは特に限定されない。具体的には、非ヒト動物の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの抗体が使用できる。本発明において使用される抗TMPRSS11E抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。抗体のTMPRSS11Eタンパク質への結合は特異性の高いものであることが好ましく、特にヒトTMPRSS11Eに特異的であることがより好ましい。
【００１３】
本発明で使用される抗TMPRSS11E抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として取得できる。本発明で使用される抗TMPRSS11E抗体としては、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、及び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるもの等を含む。
【００１４】
本発明の抗TMPRSS11E抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子で修飾してもよい。また、後述するように、細胞傷害活性を有する化学療法剤や放射性化学物質等で修飾してもよい。
【００１５】
本発明で用いられるTMPRSS11Eを認識する抗体の例として、例えば以下の抗体を挙げることができる。
（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（２）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（３）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体。
（４）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（５）配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（６）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体。
（７）（１）の重鎖可変領域と（４）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（８）（２）の重鎖可変領域と（５）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（９）（３）の重鎖可変領域と（６）の軽鎖可変領域を含む抗体。
（１０）（１）から（９）のいずれかに記載の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体であって、（１）から（９）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体。
（１１）（１）から（９）のいずれかに記載の抗体が結合するTMPRSS11Eタンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
【００１６】
本発明において、本発明の抗体と同等の活性を有するとは、TMPRSS11Eへの結合活性、中和活性、インターナライズ活性及び／又はTMPRSS11Eを発現する細胞への細胞傷害活性（ADCC活性、CDC活性など）が同等であることをいう。本発明において活性が同等とは、必ずしも活性が同一であることは要求されず、例えば上述の（１）〜（９）のいずれかの活性と比較して50%以上、好ましくは70%以上、さらに好ましくは90%以上の活性を有していればよい。活性の上限は特に限定されず、例えば1000%以下、500%以下、300%以下、150%以下、100%以下などの例をあげることができる。
【００１７】
本発明の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体も本発明の範囲内であり、人為的に作製されたものでも、自然的に生じたものであってもよい。ポリペプチドに変異を導入する方法は、あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法の一つである、例えば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh,  T.  et  al.  (1995)  Gene  152,  271-275、Zoller,  MJ,  and  Smith,  M.(1983)  Methods  Enzymol.  100,  468-500、Kramer,  W.  et  al.  (1984)  Nucleic  Acids  Res.  12,  9441-9456、Kramer  W,  and  Fritz  HJ(1987)  Methods.  Enzymol.  154,  350-367、Kunkel,TA(1985)  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  82,  488-492、Kunkel  (1988)  Methods  Enzymol.  85,  2763-2766）などを用いて、当業者であれば、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明の抗体のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。
【００１８】
このような変異体において、変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内）である。
【００１９】
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質に基づいて、次のような分類が確立している。
疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、
親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）
（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
【００２０】
あるアミノ酸配列に対する１又は数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが、元のポリペプチドの生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark,  D.  F.  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  (1984)  81,  5662-5666、Zoller,  M.  J.  and  Smith,  M.,  Nucleic  Acids  Research  (1982)  10,  6487-6500、Wang,  A.  et  al.,  Science  224,  1431-1433、Dalbadie-McFarland,  G.  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  (1982)  79,  6409-6413）。すなわち、一般に、あるポリペプチドを構成するアミノ酸配列中、各群に分類されたアミノ酸の間で相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いといわれている。本発明において、上記アミノ酸群の群内のアミノ酸間の置換を保存的置換と言う。
【００２１】
また本発明は、上述の（１）〜（９）いずれかの抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体もまた提供する。上述の（１）〜（９）の抗体の具体的な例として、本願実施例に記載されたTM094、TM191、EA230の抗体を挙げることができる。すなわち本発明は、TM094、TM191、EA230が認識するエピトープと同一のエピトープを認識する抗体も提供する。
【００２２】
被験抗体が、ある抗体とエピトープを共有することは、両者の同じエピトープに対する競合によって確認することができる。抗体間の競合は、交叉ブロッキングアッセイなどによって検出される。例えば競合ELISAアッセイは、好ましい交叉ブロッキングアッセイである。
【００２３】
具体的には、交叉ブロッキングアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェル上にコートしたTMPRSS11Eタンパク質を、候補の競合抗体の存在下、又は非存在下でプレインキュベートした後に、本発明の抗TMPRSS11E抗体が添加される。ウェル中のTMPRSS11Eタンパク質に結合した本発明の抗TMPRSS11E抗体の量は、同じエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体（被験抗体）の結合能に間接的に相関している。すなわち同一エピトープに対する被験抗体の親和性が大きくなればなる程、本発明の抗TMPRSS11E抗体のTMPRSS11Eタンパク質をコートしたウェルへの結合量は低下し、一方、被験抗体のTMPRSS11Eタンパク質をコートしたウェルへの結合量は増加する。
【００２４】
ウェルに結合した抗体量は、予め抗体を標識しておくことによって、容易に測定することができる。たとえば、ビオチン標識された抗体は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質を使用することにより測定できる。ペルオキシダーゼなどの酵素標識を利用した交叉ブロッキングアッセイを、特に競合ELISAアッセイと言う。抗体は、検出あるいは測定が可能な他の標識物質で標識することができる。具体的には、放射標識あるいは蛍光標識などが公知である。
【００２５】
さらに被験抗体が本発明の抗TMPRSS11E抗体と異なる種に由来する定常領域を有する場合には、ウェルに結合したいずれかの抗体を、いずれかの定常領域を認識する標識抗体によって測定することもできる。あるいは同種由来の抗体であっても、クラスが相違する場合には、各クラスを識別する抗体によって、ウェルに結合した抗体を測定することができる。
【００２６】
候補の競合抗体の非存在下で実施されるコントロール試験において得られる結合活性と比較して、候補抗体が、少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも80％、抗TMPRSS11E抗体の結合をブロックできるならば、該候補競合抗体は本発明の抗TMPRSS11E抗体と実質的に同じエピトープに結合するか、又は同じエピトープへの結合に対して競合する抗体である。
【００２７】
また、本発明の抗体の好ましい態様として、TMPRSS11Eの159番目のSerから423番目のIleまでの領域または42番目のTyrから191番目のArgまでの領域を認識する抗体を挙げることができる。
【００２８】
このような抗体は高い細胞傷害活性、インターナライズ活性および／または中和活性を有していることから、医薬品、特に抗癌剤として有用である。
【００２９】
２．２  遺伝子組換え型抗TMPRSS11E抗体
抗体がヒトに投与される場合、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体とすることができる。遺伝子組換え型抗体とは、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体などを含む。これらの改変抗体は、公知の方法を用いて製造することができる。
【００３０】
（１）キメラ抗体
キメラ抗体とは、互いに由来の異なる可変領域と定常領域を連結した抗体をいう。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス−ヒト−異種キメラ抗体である。マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結させ、これを発現ベクターに組み込むことによって、キメラ抗体を発現する組換えベクターが作製できる。該ベクターにより形質転換された組換え細胞を培養し、組み込まれたDNAを発現させることによって、培養中に生産される当該キメラ抗体を取得できる。
【００３１】
キメラ抗体の定常領域には、ヒト抗体のものが使用される。例えば重鎖においては、Cγ１、Cγ２、Cγ３、Cγ４、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、及びCεを定常領域として利用することができる。また軽鎖においてはCκ、及びCλを定常領域として使用できる。これらの定常領域のアミノ酸配列、ならびにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体自体の安定性、あるいは抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト抗体定常領域中の１又は数個のアミノ酸を置換、欠失、付加及び／又は挿入することができる。
【００３２】
（２）ヒト化抗体
一般にキメラ抗体が、ヒト以外の動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とから構成されるのに対して、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来抗体の相補性決定領域（CDR；complementarity  determining  region）と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR；framework  region）及びヒト抗体由来の定常領域とから構成される。ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
【００３３】
抗体の可変領域は、通常、４つのFRにはさまれた３つのCDRで構成されている。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い相同性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるといわれている。
【００３４】
ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばオーバーラップエクステンションPCR（Overlap  Extension  PCR）が公知である。オーバーラップエクステンションPCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライマーに、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加されたプライマーを用いる。プライマーは４つのFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRのヒトFRへの移植においては、マウスのFRと相同性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機能の維持において有利であるといわれている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているFRのアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。
【００３５】
また連結される塩基配列は、互いにインフレームで接続されるようにデザインされる。それぞれのプライマーによってヒトFRが個別に合成される。その結果、各FRにマウスCDRをコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、ヒト抗体遺伝子を鋳型として合成された産物のオーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。
【００３６】
最終的に３つのCDRと４つのFRが連結された可変領域遺伝子は、その5’末端と3'末端にアニールし適当な制限酵素認識配列を付加されたプライマーによってその全長が増幅される。上記のように得られたDNAとヒト抗体定常領域をコードするDNAとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト化抗体発現用ベクターが作成できる。このベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、組換え細胞を培養し、ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、ヒト化抗体が培養細胞の培養物中に産生される（欧州特許公開EP  239400  、国際公開WO  96/02576参照）。
【００３７】
上記のように作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、CDRを介して連結されたときに該CDRが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト抗体のFRが好適に選択できる。必要に応じ、ヒト化抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法で測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択できる（Sato,  K.et  al.,  Cancer  Res,  1993,  53,  851-856）。
【００３８】
（３）低分子化抗体
本発明の抗体には、TMPRSS11Eタンパク質に結合する限り、IgG（IgG1、IgG2、IgG4など）に代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、又は、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。本発明の抗体は、抗体の全長分子に限られず、TMPRSS11Eタンパク質に結合する限り、低分子化抗体又はその修飾物であってもよい。
【００３９】
低分子化抗体は、全長抗体（whole  antibody、例えばwhole  IgG等）の一部分が欠損している抗体断片を含む。TMPRSS11E抗原への結合能を有する限り、抗体分子の部分的な欠損は許容される。本発明における抗体断片は、重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（VL）のいずれか、又は両方を含んでいることが好ましい。また、本発明における抗体断片はCDRを含んでいることが好ましい。本発明の抗体断片に含まれるCDRの数は特に限定されないが、重鎖CDR1、CDR2、CDR3、軽鎖CDR1、CDR2、CDR3の６つを少なくとも含んでいることが好ましい。
【００４０】
VH又はVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入を含むことができる。さらにTMPRSS11E抗原への結合能を有する限り、VH及びVLのいずれか、又は両方の一部を欠損させることもできる。また、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single  chain  Fv）、ダイアボディー、sc(Fv)2（single  chain  (Fv)2）、scFv-Fcなどを挙げることができる。本発明において好ましい低分子化抗体はダイアボディー又はsc(Fv)2である。これら抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の低分子化抗体に含まれる。
【００４１】
抗体の断片は、抗体を酵素で処理して抗体断片を生成させることによって得ることができる。消化酵素は、抗体断片の特定の位置を切断し、特定の構造の抗体断片を与える。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知であり、パパイン消化の場合、F(ab)2又はFabを、ペプシン消化の場合、F(ab’)2又はFab’を与える。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Co,  M.S.  et  al.,  J.  Immunol.（1994）152,  2968-2976、Better,  M.  &  Horwitz,  A.  H.  Methods  in  Enzymology（1989）178,  476-496、Plueckthun,  A.  &  Skerra,  A.  Methods  in  Enzymology（1989）178,  497-515、Lamoyi,  E.,  Methods  in  Enzymology（1986）121,  652-663、Rousseaux,  J.  et  al.,  Methods  in  Enzymology（1986）121,  663-669、Bird,  R.  E.  et  al.,  TIBTECH（1991）9,  132-137参照）。
【００４２】
酵素的に得られた抗体断片に対して、遺伝子工学的手法を利用すると、抗体の任意の部分を欠失させることができる。本発明における低分子化抗体は、TMPRSS11Eに対する結合親和性を有する限り、任意の領域を欠失した抗体断片であることができる。
【００４３】
i)ダイアボディー
ダイアボディーは、遺伝子融合により構築された二価（bivalent）の抗体断片を指す（Holliger  P  et  al.,  Proc.Natl.Acad.Sci.USA  90:  6444-6448  (1993)、EP404,097号、WO93/11161号等）。ダイアボディーは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中で重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がリンカーにより結合されている。ダイアボディーにおけるリンカーは、一般に、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が互いに結合できない位に短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、例えば、5残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされる重鎖可変領域と軽鎖可変領域とは、単鎖可変領域フラグメントを形成できず、別の単鎖可変領域フラグメントと二量体を形成する。その結果、ダイアボディーは2つの抗原結合部位を有することとなる。
【００４４】
ii）scFv
scFvは、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結することにより得られる。scFvにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Huston,  J.  S.  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A,  1988,  85,  5879-5883）。scFvにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、本明細書に記載されたいずれの抗体由来であってもよい。可変領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば３から25残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。具体的には、たとえば後述のペプチドリンカー等を用いることができる。
【００４５】
両鎖の可変領域は、たとえば上記のようなPCR法によって連結することができる。PCR法による可変領域の連結のために、まず次のDNAのうち、全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするDNAが鋳型として利用される。
抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするDNA配列、及び
抗体の軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするDNA配列
【００４６】
増幅すべきDNAの両端の配列に対応する配列を有するプライマーの一対を用いたPCR法によって、重鎖と軽鎖の可変領域をコードするDNAがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするDNAを用意する。ペプチドリンカーをコードするDNAもPCRを利用して合成することができる。このとき利用するプライマーの5'側に、別に合成された各可変領域の増幅産物と連結できる塩基配列を付加しておく。次いで、［重鎖可変領域DNA］−［ペプチドリンカーDNA］−［軽鎖可変領域DNA］の各DNAと、アセンブリーPCR用のプライマーを利用してPCR反応を行う。
【００４７】
アセンブリーPCR用のプライマーは、［重鎖可変領域DNA］の5’側にアニールするプライマーと、［軽鎖可変領域DNA］の3'側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわちアセンブリーPCR用プライマーとは、合成すべきscFvの全長配列をコードするDNAを増幅することができるプライマーセットである。一方［ペプチドリンカーDNA］には各可変領域DNAと連結できる塩基配列が付加されている。その結果、これらのDNAが連結され、さらにアセンブリーPCR用のプライマーによって、最終的にscFvの全長が増幅産物として生成される。一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞が常法に従って取得できる。また、その結果得られる組換え細胞を培養して該scFvをコードするDNAを発現させることにより、該scFvが取得できる。
【００４８】
iii)scFv-Fc
scFv-FcはscFvにFc領域を融合させた低分子化抗体である（Cellular  &  Molecular  Immunology  2006；  3：439-443）。scFv-Fcに用いられるscFvの由来は特に限定されないが、例えばIgM由来のscFvを用いることができる。また、Fcの由来は特に限定されないが、例えばヒトIgG（ヒトIgG1など）を用いることができる。従って、scFv-Fcの好ましい態様の例として、IgM抗体のscFv断片と、ヒトIgG1のCH2(たとえば、Cγ2)とCH3（たとえば、Cγ3)をヒトIgG1のヒンジ領域（Hγ)で連結させたscFv-Fcを挙げることができる。
【００４９】
iv)sc(Fv)2
sc(Fv)2は、2つの重鎖可変領域（VH）及び2つの軽鎖可変領域（VL）をリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson  et  al、J  Immunol.  Methods  1999；231：177-189）。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となる。
【００５０】
また２つのVH及び２つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましい。
【００５１】
2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］
【００５２】
抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー（例えば、Protein  Engineering,  9(3),  299-305,  1996参照）に開示されるリンカー等を用いることができる。複数のリンカーは、同じでもよいし、異なるリンカーを用いることもできる。本発明においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。通常、ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基は、1から100アミノ酸、好ましくは3から50アミノ酸、さらに好ましくは5から30アミノ酸、特に好ましくは12から18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。
【００５３】
ペプチドリンカーを構成するアミノ酸配列は、scFvの結合作用を阻害しない限り、任意の配列とすることができる。例えば、ペプチドリンカーの場合次のようなアミノ酸配列を利用することができる。
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号２１）
Ser・Gly・Gly・Gly（配列番号２２）
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号２３）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号２４）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号２５)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号２６）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号２７）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号２８）
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（配列番号２９）)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（配列番号３０）)n
［nは１以上の整数である］。
【００５４】
ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。たとえば上記のペプチドリンカーの長さを決定するnは、通常１〜５、好ましくは１〜３、より好ましくは１又は２である。
【００５５】
よって本発明において特に好ましいsc(Fv)2の態様としては、例えば、以下のsc(Fv)2を挙げることができる。
［VH］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VL］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VH］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VL］。
【００５６】
あるいは、合成化学物リンカー（化学架橋剤）を利用して可変領域を連結することもできる。ペプチド化合物などの架橋に通常用いられている架橋剤を本発明に利用することができる。例えば次のような化学架橋剤が公知である。これらの架橋剤は市販されている。N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、
ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、
ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、
ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、
ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、
エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、
エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−EGS）、
ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−DST）、
ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、及び
ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）など。
【００５７】
３．抗TMPRSS11E抗体の活性
（１）細胞障害活性
癌などの細胞増殖性疾患の治療においては、抗体は、そのエフェクター活性を維持していることが望ましい。すなわち、本発明における好ましい抗体は、TMPRSS11Eに対する結合親和性とエフェクター機能の両方を有する。抗体のエフェクター機能には、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent  cell-mediated  cytotoxicity：ADCC）活性及び補体依存性細胞傷害（complement-dependent  cytotoxicity：CDC）活性が含まれる。本発明における治療用の抗体は、特に好ましくは、ADCC活性及びCDC活性のいずれか、又は両方をエフェクター機能として備える。
【００５８】
本発明の抗体が治療目的で用いられる場合、抗体は好ましくは細胞傷害活性を有する抗体である。
本発明における細胞傷害活性としては、例えば、ADCC活性、CDC活性などを挙げることができる。本発明において、ADCC活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのFc部分にFcγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に傷害を与える活性を意味する。一方、CDC活性とは補体系による細胞傷害活性を意味する。
【００５９】
抗TMPRSS11E抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current  protocols  in  Immunology,  Chapter7.  Immunologic  studies  in  humans,  Editor,  John  E,  Coligan  et  al.,  John  Wiley  &  Sons,  Inc.,(1993)等）。
【００６０】
具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製が実施される。
i）エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地（Invitrogen社製）中で脾臓細胞が分離される。10％ウシ胎児血清（FBS、HyClone社製）を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×106/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製できる。
ii）補体溶液の調製
Baby  Rabbit  Complement（CEDARLANE社製）を10％  FBS含有培地（Invitrogen社製）にて10倍希釈し、補体溶液が調製できる。
iii）標的細胞の調製
TMPRSS11Eタンパク質を発現する細胞を0.2  mCiの51Cr-クロム酸ナトリウム（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）とともに、10％  FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより、該標的細胞を放射性標識できる。TMPRSS11Eタンパク質を発現する細胞としては、TMPRSS11Eタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、肺癌細胞、子宮頸癌、食道癌細胞等を利用することができる。放射性標識後、細胞を10％  FBS含有RPMI1640培地にて３回洗浄し、細胞濃度を2×105/mlに調製することによって、該標的細胞が調製できる。
【００６１】
ADCC活性、又はCDC活性は下記に述べる方法により測定できる。ADCC活性の測定の場合は、96ウェルＵ底プレート（Becton  Dickinson社製）に、標的細胞と、抗TMPRSS11E抗体を50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、エフェクター細胞100μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で4時間培養する。抗体の終濃度は0又は10μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンター（COBRAII  AUTO-GAMMA、MODEL  D5005、Packard  Instrument  Company社製）で放射活性を測定する。細胞傷害活性（%）は得られた値を使用して(A-C)  /  (B-C)  x  100の計算式に基づいて計算できる。Aは各試料における放射活性（cpm）、Bは1％  NP-40（nacalai  tesque社製)を加えた試料における放射活性（cpm）、Cは標的細胞のみを含む試料の放射活性（cpm）を示す。
【００６２】
一方、CDC活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート（Becton  Dickinson社製）に、標的細胞と、抗TMPRSS11E抗体を50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、補体溶液100μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で4時間培養する。抗体の終濃度は0又は3μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞傷害活性はADCC活性の測定と同様にして計算できる。
【００６３】
一方、抗体コンジュゲートによる細胞傷害活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート（Becton  Dickinson社製）に、標的細胞と、抗TMPRSS11E抗体コンジュゲートを50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。炭酸ガスインキュベーター内で1から4時間培養する。抗体の終濃度は0又は3μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞傷害活性はADCC活性の測定と同様にして計算できる。
【００６４】
（２）コンジュゲート抗体
抗体に化学療法剤、毒性ペプチド或いは放射性化学物質などの細胞傷害性物質を結合することも可能である。このような抗体修飾物（以下、抗体コンジュゲートと称する。）は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
【００６５】
抗TMPRSS11E抗体に結合させて細胞傷害活性を機能させる化学療法剤としては、たとえば次のような化学療法剤が例示できる：アザリビン（azaribine）、アナストロゾール（anastrozole）、アザシチジン（azacytidine）、ブレオマイシン（bleomycin）、ボルテゾミブ（bortezomib）、ブリオスタチン-1（bryostatin-1）、ブスルファン（busulfan）、カンプトテシン（camptothecin）、10-ヒドロキシカンプトテシン（10-hydroxycamptothecin）、カルムスチン（carmustine）、セレブレックス（celebrex）、クロラムブシル（chlorambucil）、シスプラチン（cisplatin）、イリノテカン（irinotecan）、カルボプラチン（carboplatin）、クラドリビン（cladribine）、シクロホスファミド（cyclophosphamide）、シタラビン（cytarabine）、ダカルバジン（dacarbazine）、ドセタキセル（docetaxel）、ダクチノマイシン（dactinomycin）、ダウノマイシングルクロニド（daunomycin  glucuronide）、ダウノルビシン（daunorubicin）、デキサメタゾン（dexamethasone）、ジエチルスチルベストロール（diethylstilbestrol）、ドキソルビシン（doxorubicin）、ドキソルビシンブルクロニド（doxorubicin  glucuronide）、エピルビシン（epirubicin）、エチニルエストラジオール（ethinyl  estradiol）、エストラムスチン（estramustine）、エトポシド（etoposide）、エトポシドグルクロニド（etoposide  glucuronide）、フロキシウリジン（floxuridine）、フルダラビン（fludarabine）、フルタミド（flutamide）、フルオロウラシル（fluorouracil）、フルオキシメステロン（fluoxymesterone）、ゲムシタビン（gemcitabine）、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート（hydroxyprogesterone  caproate）、ヒドロキシウレア（hydroxyurea）、イダルビシン（idarubicin）、イフォスファミド（ifosfamide）、ロイコボリン（leucovorin）、ロムスチン（lomustine）、メクロレタミン（mechlorethamine）、メドロキシプロゲステロンアセテート（medroxyprogesterone  acetate）、メゲストロールアセテート（megestrol  acetate）、メルファラン（melphalan）、メルカプトプリン（mercaptopurine）、メトトレキセート（methotrexate）、ミトキサントロン（mitoxantrone）、ミトラマイシン（mithramycin）、ミトマイシン（mitomycin）、ミトタン（mitotane）、フェニルブチレート（phenylbutyrate）、プレドニゾン（prednisone）、プロカルバジン（procarbazine）、パクリタキセル（paclitaxel）、ペントスタチン（pentostatin）、セムスチン（semustine）、ストレプトゾシン（streptozocin）、タモキシフェン（tamoxifen）、タキサン類（taxanes）、タキソール（taxol）、テストステロンプロピオネート（testosterone  propionate）、サリドマイド（thalidomide）、チオグアニン（thioguanine）、チオテパ（thiotepa）、テニポシド（teniposide）、トポテカン（topotecan）、ウラシルマスタード（uracil  mustard）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビノレルビン（vinorelbine）、ビンクリスチン（vincristine）。
【００６６】
好ましい化学療法剤は、低分子の化学療法剤である。低分子の化学療法剤は、抗体への結合の後も、抗体の機能に干渉する可能性が低い。本発明において、低分子の化学療法剤は、通常100〜2000、好ましくは200〜1000の分子量を有する。ここに例示した化学療法剤は、いずれも低分子の化学療法剤である。これらの本発明における化学療法剤は、生体内で活性な化学療法剤に変換されるプロドラッグを含む。プロドラッグの活性化は酵素的な変換であっても、非酵素的な変換であっても良い。
【００６７】
また、抗体を毒性ペプチドで修飾することもできる。毒性ペプチドの例としては、例えば、次のものを挙げることができる。ジフテリアトキシンＡ鎖(Diphtheria  toxin  A  Chain)(Langone  J.J.,et  al.,Methods  in  Enzymology,93,307-308,1983)、シュードモナスエキソトキシン(Pseudomonas  Exotoxin)(Nature  Medicine,2,350-353,1996)、リシン鎖(Ricin  A  Chain)(Fulton  R.J.,et  al.,J.Biol.Chem.,261,5314-5319,1986;Sivam  G.,et  al.,Cancer  Res.,47,3169-3173,1987;Cumber  A.J.et  al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;Wawrzynczak  E.J.,et  al.,Cancer  Res.,50,7519-7562,1990;Gheeite  V.,et  al.,J.Immunol.Methods,142,223-230,1991);無糖鎖リシンＡ鎖(Deglicosylated  Ricin  A  Chain)(Thorpe  P.E.,et  al.,Cancer  Res.,47,5924-5931,1987);アブリンＡ鎖(Abrin  A  Chain)(Wawrzynczak  E.J.,et  al.,Br.J.Cancer,66,361-366,1992;Wawrzynczak  E.J.,et  al.,Cancer  Res.,50,7519-7562,1990;Sivam  G.,et  al.,Cancer  Res.,47,3169-3173,1987;Thorpe  P.E.,et  al.,Cancer  Res.,47,5924-5931,1987);ゲロニン(Gelonin)(Sivam  G.,et  al.,Cancer  Res.,47,3169-3173,1987;Cumber  A.J.et  al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;WawrzynczakE.J.,et  al.,Cancer  Res.,50,7519-7562,1990;Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ポークウイード抗ウィルス蛋白（PAP-s;Pokeweed  anti-viral  protein  fromseeds)(Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ブリオジン(Briodin)(Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);サポリン(Saporin)(Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);モモルジン(Momordin)(Cumber  A.J.,et  al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;Wawrzynczak  E.J.,et  al.,Cancer  Res.,50,7519-7562,1990;Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);モモルコキン(Momorcochin)(Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ジアンシン３２(Dianthin  32)(Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ジアンシン３０(Dianthin  30)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);モデッシン(Modeccin)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);ビスカミン(Viscumin)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);ボルケシン(Volkesin)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);ドデカンドリン(Dodecandrin)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);トリチン(Tritin)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);ルフィン(Luffin)(Stirpe  F.,Barbieri  L.,FEBS  letter  195,1-8,1986);トリコキリン(Trichokirin)(Casellas  P.,et  al.,Eur.J.Biochem.176,581-588,1988;Bolognesi  A.,et  al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992)。
【００６８】
本発明において放射性化学物質とは、放射性同位体を含む化学物質のことをいう。放射性同位体は特に限定されず、如何なる放射性同位体を用いてもよいが、例えば、32P、14C、125I、3H、131I、186Re、188Reなどを用いることが可能である。
【００６９】
また別の態様では、一又は二以上の低分子化学療法剤と毒性ペプチドをそれぞれ組み合わせて抗体の修飾に使用できる。抗TMPRSS11E抗体と上記の低分子化学療法剤との結合は共有結合又は非共有結合が利用できる。これら化学療法剤を結合した抗体の作製方法は公知である。
【００７０】
タンパク質性の薬剤や毒素は、遺伝子工学的な手法によって抗体と結合することができる。具体的には、たとえば上記毒性ペプチドをコードするDNAと抗TMPRSS11E抗体をコードするDNAをインフレームで融合させて発現ベクター中に組み込んだ組換えベクターが構築できる。該ベクターを適切な宿主細胞に導入することにより得られる形質転換細胞を培養し、組み込んだDNAを発現させて、毒性ペプチドを結合した抗TMPRSS11E抗体を融合タンパク質として得ることができる。抗体との融合タンパク質を得る場合、一般に、抗体のC末端側にタンパク質性の薬剤や毒素が配置される。抗体と、タンパク質性の薬剤や毒素の間には、ペプチドリンカーを介在させることもできる。
【００７１】
（３）二重特異性抗体
さらに、本発明の抗体は二重特異性抗体（bispecific  antibody）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体を言う。本発明において、二重特異性抗体はTMPRSS11E分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有することができる。このような二重特異性抗体は、１分子のTMPRSS11Eに対して２分子の抗体分子が結合できる。その結果、より強力な細胞傷害作用を期待できる。
【００７２】
あるいは、一方の抗原結合部位がTMPRSS11Eを認識し、他方の抗原結合部位が細胞傷害性物質を認識する二重特異性抗体とすることもできる。細胞傷害性物質には、具体的には、化学療法剤、毒性ペプチド或いは放射性化学物質等が含まれる。このような二重特異性抗体は、TMPRSS11Eを発現している細胞に結合する一方で、細胞傷害性物質を捕捉する。その結果、細胞傷害性物質をTMPRSS11E発現細胞に直接作用させることができる。すなわち細胞傷害性物質を認識する二重特異性抗体によって、腫瘍細胞を特異的に傷害し、腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。
【００７３】
また本発明においては、TMPRSS11E以外の抗原を認識する抗原結合部位と組み合わせた二重特異性抗体を用いることもできる。たとえば、TMPRSS11Eと同様に標的とする癌細胞の細胞表面に特異的に発現する抗原であって、TMPRSS11Eとは異なる抗原を認識するような抗原結合部位と組み合わせて二重特異性抗体とすることができる。
【００７４】
二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれが重鎖と軽鎖を有する１／２分子であっても良いし、重鎖のみからなる１／４分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。
【００７５】
抗体の抗原結合活性（Antibodies  A  Laboratory  Manual.  Ed  Harlow,  David  Lane,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  1988）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
【００７６】
（４）糖鎖の改変
本発明の抗体は糖鎖が改変された抗体であってもよい。抗体の糖鎖を改変することにより抗体の細胞傷害活性を増強できることが知られている。糖鎖が改変された抗体としては、例えば、糖鎖が修飾された抗体（WO99/54342など）、糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体（WO00/61739、WO02/31140など）、バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体（WO02/79255など）などが公知である。
【００７７】
（５）インターナライズ活性
また、本発明の抗体はインターナライズ活性を有していてもよい。本発明において「インターナライズ活性を有する抗体」とは、TMPRSS11Eに結合した際に細胞内（細胞質内、小胞内、他の小器官内など）に輸送される抗体を意味する。
【００７８】
抗体がインターナライズ活性を有するか否かは当業者に公知の方法を用いて確認することができ、例えば、標識物質を結合した抗TMPRSS11E抗体をTMPRSS11Eを発現する細胞に接触させ該標識物質が細胞内に取り込まれたか否かを確認する方法、細胞傷害性物質を結合した抗TMPRSS11E抗体をTMPRSS11Eを発現する細胞に接触させ該TMPRSS11E発現細胞に細胞死が誘導されたか否かを確認する方法、などにより確認することができる。
【００７９】
インターナライズ活性を有する抗体は例えば上述の細胞傷害性物質を結合することにより、後述する抗癌剤などの医薬組成物として用いることができる。
【００８０】
（６）中和活性
また、本発明の抗体は中和活性を有していてもよい。本発明において中和活性とは、TMPRSS11Eが有するプロテアーゼ活性を阻害する活性のことをいう。中和活性の測定は当業者に公知の方法で行うことが可能であり、例えば、実施例に記載の方法で測定することが可能である。
【００８１】
４．  抗TMPRSS11E抗体の作製
４．１  モノクローナル抗体産生ハイブリドーマによる抗TMPRSS11E抗体の作製
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、公知技術にしたがい、以下のようにして作製できる。まず、TMPRSS11Eタンパク質、あるいは後述するその部分ペプチドを感作抗原として使用し、通常の免疫方法にしたがって動物を免疫する。得られた免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させてハイブリドーマを得る。さらにこのハイブリドーマから、通常のスクリーニング法により、目的とする抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって、抗TMPRSS11E抗体を産生するハイブリドーマを選択する。選択したハイブリドーマから所望の抗TMPRSS11Eモノクローナル抗体を得る。具体的には、以下のようにして行う。
【００８２】
（１）TMPRSS11Eタンパク質の調製
まず、TMPRSS11E遺伝子を発現させることによって、抗体取得の感作抗原として使用されるTMPRSS11Eタンパク質が取得できる。すなわち、TMPRSS11Eをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は培養上清中から、目的のヒトTMPRSS11Eタンパク質を公知の方法で精製する。精製した天然のTMPRSS11Eタンパク質、あるいは、TMPRSS11Eタンパク質の所望の部分ポリペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質を免疫原として利用することもできる。免疫原とする融合タンパク質を製造するために、例えば、抗体のFc断片やペプチドタグなどを利用することができる。融合タンパク質を発現するベクターは、所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド断片をコードする遺伝子をインフレームで融合させ、当該融合遺伝子を発現ベクターに挿入することにより作製することができる。融合タンパク質の作製方法はMolecular  Cloning  2nd  ed.（Sambrook,J  et  al.,  Molecular  Cloning  2nd  ed.,  9.47-9.58,  Cold  Spring  Harbor  Lab.  press,  1989）に記載されている。
【００８３】
このようにして精製されたTMPRSS11Eタンパク質を、哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として使用できる。TMPRSS11Eの部分ペプチドもまた感作抗原として使用できる。たとえば、次のようなペプチドを感作抗原とすることができる。
・ヒトTMPRSS11Eのアミノ酸配列に基づいて化学合成によって取得されたペプチド。
・TMPRSS11E遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによって取得されたペプチド。
・TMPRSS11Eタンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによって取得されたペプチド。
【００８４】
部分ペプチドとして用いるTMPRSS11Eの領域及び大きさは限定されない。感作抗原とするペプチドを構成するアミノ酸の数は、少なくとも３以上、たとえば、５以上、あるいは６以上であることが好ましい。より具体的には、８〜５０、好ましくは１０〜３０残基のペプチドを感作抗原とすることができる。
【００８５】
（２）TMPRSS11Eタンパク質による免疫
TMPRSS11Eタンパク質あるいはその部分ペプチドを感作抗原として、哺乳動物を免疫する。免疫される哺乳動物は、特に限定されないが、モノクローナル抗体を細胞融合法によって得るためには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して免疫動物を選択するのが好ましい。一般的には、げっ歯類の動物が免疫動物として好ましい。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギを免疫動物とすることができる。その他、サル等を免疫動物とすることもできる。
【００８６】
上記の動物は、公知の方法にしたがい、感作抗原により免疫できる。例えば、一般的方法として、感作抗原を腹腔内又は皮下に注射することにより哺乳動物を免疫することができる。具体的には、該感作抗原が哺乳動物に4から21日毎に数回投与される。感作抗原は、PBS（Phosphate-Buffered  Saline、リン酸緩衝食塩水）や生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈されて免疫に使用される。さらに、感作抗原はアジュバントとともに投与されてもよい。例えばフロイント完全アジュバントと混合し、乳化して、感作抗原とすることができる。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用できる。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、該感作抗原ペプチドをアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
【００８７】
（３）DNA免疫
モノクローナル抗体は、DNA免疫（DNA  Immunization）によっても得ることができる。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子が発現できるような態様で構築されたベクターDNAを当該免疫動物に投与し、免疫抗原を免疫動物の生体内で発現させることによって、免疫刺激を与える方法である。蛋白質抗原を投与する一般的な免疫方法と比べて、DNA免疫には、次のような優位性を期待できる。
・TMPRSS11Eのような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激を与えることができる。
・免疫抗原を精製する必要が無い。
【００８８】
DNA免疫によって本発明のモノクローナル抗体を得るには、まず、TMPRSS11Eタンパク質を発現するDNAを免疫動物に投与する。TMPRSS11EをコードするDNAは、PCRなどの公知の方法によって合成することができる。得られたDNAを適当な発現ベクターに挿入し、免疫動物に投与する。発現ベクターとしては、たとえばpcDNA3.1などの市販の発現ベクターを利用することができる。ベクターを生体に投与する方法も、一般に用いられている方法を利用することができる。たとえば、発現ベクターを吸着させた金粒子を、遺伝子銃（gene  gun）で細胞内に打ち込むことによってＤＮＡ免疫を行うことができる。
【００８９】
（４）ハイブリドーマの作製
上述のように哺乳動物が免疫され、血清中における所望の抗体量の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用できる。
【００９０】
上記の免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下HGPRT欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下TK欠損と省略する）などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（以下HAT感受性と省略する）を有する。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるため、HAT選択培地中でも増殖するようになる。
【００９１】
HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン（以下8AGと省略する）、あるいは5'ブロモデオキシウリジンを含む培地を用いて、選択することができる。正常な細胞はこれらのピリミジンアナログをDNA中に取り込んでしまうので死滅するが、これらの酵素を欠損した細胞は、これらのピリミジンアナログを取り込めないので選択培地の中で生存することができる。この他、G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオキシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。例えば、以下のようなミエローマ細胞を、本発明におけるモノクローナル抗体の製造に利用することができる。
P3（P3x63Ag8.653）（J.  Immunol.（1979）123,  1548-1550）、
P3x63Ag8U.1（Current  Topics  in  Microbiology  and  Immunology（1978）81,  1-7）、
NS-1（Kohler.  G.  and  Milstein,  C.  Eur.  J.  Immunol.（1976）6,  511-519）、
MPC-11（Margulies.  D.H.  et  al.,  Cell（1976）8,  405-415）、
SP2/0（Shulman,  M.  et  al.,  Nature（1978）276,  269-270）、
FO（de  St.  Groth,  S.  F.  etal.,  J.  Immunol.  Methods（1980）35,  1-21）、
S194（Trowbridge,  I.  S.  J.  Exp.  Med.（1978）148,  313-323）、
R210（Galfre,  G.  et  al.,  Nature（1979）277,  131-133）等。
【００９２】
基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler.  G.  and  Milstein,  C.、Methods  Enzymol.（1981）73,  3-46）等に準じて、免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われる。
【００９３】
より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、細胞融合を実施できる。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等を使用することができる。さらに融合効率を高めるために、所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を加えることもできる。
【００９４】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定できる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。細胞融合に用いる培養液としては、例えば、ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液を利用することができる。さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を培養液に添加することができる。
【００９５】
細胞融合法においては、免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液を混合することによって、目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。細胞融合法においては、例えば平均分子量1000から6000程度のPEGを、通常30から60％（w/v）の濃度で添加することができる。続いて、上記に挙げた適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより、ハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去される。
【００９６】
細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって、このようにして得られたハイブリドーマを選択することができる。例えばHGPRTやTKの欠損を有する細胞は、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択できる。すなわち、HAT感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞を選択的に増殖させることができる。目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、目的とするハイブリドーマを選択することができる。ついで、通常の限界希釈法を実施することによって、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを実施できる。
【００９７】
目的とする抗体のスクリーニング及び単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって好適に実施できる。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の96ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させる。次いで担体を洗浄した後に、酵素で標識した二次抗体等を反応させる。培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれる場合、二次抗体はこの抗体を介して担体に結合する。最終的に担体に結合する二次抗体を検出することによって、目的とする抗体が培養上清中に存在しているかどうかが決定できる。抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法等によりクローニングすることが可能となる。この際、抗原としては、免疫に用いたものを始め、実質的に同質なTMPRSS11Eタンパク質が好適に使用できる。たとえばTMPRSS11Eを発現する細胞株、可溶型TMPRSS11Eなどを抗原として利用することができる。
【００９８】
ヒトTMPRSS11Eに対する抗体の産生には、国際公開WO03/104453に記載された方法を利用することもできる。
【００９９】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫することによって上記ハイブリドーマを得る方法以外に、ヒトリンパ球を抗原感作して目的とする抗体を得ることもできる。具体的には、まずインビトロにおいてヒトリンパ球をTMPRSS11Eタンパク質で感作する。次いで免疫感作されたリンパ球を適当な融合パートナーと融合させる。融合パートナーには、たとえばヒト由来であって永久分裂能を有するミエローマ細胞を利用することができる（特公平1-59878号公報参照）。
【０１００】
さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に対して抗原となるTMPRSS11Eタンパク質を投与するか、又はTMPRSS11Eを当該動物中において発現するように構築されたDNAによって免疫することによって、抗TMPRSS11Eヒト抗体を得ることもできる。免疫動物の抗体産生細胞は、適当な融合パートナーとの細胞融合やエプスタインバーウイルスの感染などの処理によって不死化させることができる。このようにして得られた不死化細胞から、TMPRSS11Eタンパク質に対するヒト抗体を単離することができる（国際公開WO  94/25585、WO  93/12227、WO  92/03918、WO  94/02602参照）。さらに不死化された細胞をクローニングすることにより、目的の反応特異性を有する抗体を産生する細胞をクローニングすることもできる。トランスジェニック動物を免疫動物とするときには、当該動物の免疫システムは、ヒトTMPRSS11Eを異物と認識する。したがって、ヒトTMPRSS11Eに対するヒト抗体を容易に得ることができる。
【０１０１】
（５）ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の取得
以上のようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することができる。また、該ハイブリドーマを液体窒素中で長期にわたって保存することもできる。
【０１０２】
目的とするモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から得ることができる。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水としてモノクローナル抗体を得ることもできる。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適している。
【０１０３】
４．２  遺伝子工学的手法による抗TMPRSS11E抗体の作製
（１）抗体遺伝子のクローニング
抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子を利用することにより、遺伝子工学的手法を用いて、抗体を作製することもできる。クローニングした抗体遺伝子は、適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって抗体として発現させることができる。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている（例えば、Vandamme,  A.  M.  et  al.,  Eur.J.  Biochem.（1990）192,  767-775参照）。
【０１０４】
たとえば、抗TMPRSS11E抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗TMPRSS11E抗体の可変領域をコードするcDNAを得ることができる。そのためには、通常、まずハイブリドーマから全RNAが抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば次のような方法を利用することができる。
・グアニジン超遠心法（Chirgwin,  J.  M.  et  al.,  Biochemistry（1979）18,  5294-5299）
・AGPC法（Chomczynski,  P.et  al.,  Anal.  Biochem.（1987）162,  156-159）。
【０１０５】
抽出されたmRNAは、mRNA  Purification  Kit  （GEヘルスケアバイオサイエンス製）等を使用して精製することができる。あるいは、QuickPrep  mRNA  Purification  Kit  （GEヘルスケアバイオサイエンス製）などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマから全mRNAを得ることもできる。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体可変領域をコードするcDNAを合成することができる。その際、抗体遺伝子に共通な配列より選び出した任意の15-30塩基の配列をプライマーとして用いることができる。cDNAは、AMV  Reverse  Transcriptase  First-strand  cDNA  Synthesis  Kit（生化学工業社製）等によって合成することができる。また、cDNAの合成及び増幅のために、5’-Ampli  FINDER  RACE  Kit（Clontech製）及びPCRを用いた5’-RACE法（Frohman,  M.  A.  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA（1988）85,  8998-9002、Belyavsky,  A.et  al.,  Nucleic  Acids  Res.（1989）17,  2919-2932）を利用することができる。さらにこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが導入できる。
【０１０６】
得られたPCR産物から目的とするcDNA断片が精製され、次いでベクターDNAと連結される。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製できる。そして、cDNAの塩基配列を、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認することができる。
【０１０７】
また、抗体の可変領域をコードする遺伝子を得るために、cDNAライブラリーを利用することもできる。まず抗体産生細胞から抽出されたmRNAを鋳型としてcDNAを合成し、cDNAライブラリーを得る。cDNAライブラリーの合成には市販のキットを用いるのが便利である。実際には、少数の細胞のみから得られるmRNAは極めて微量なので、それを直接精製すると収率が低い。したがって通常は、抗体遺伝子を含まないことが明らかなキャリアRNAを添加した後に精製される。あるいは一定量のRNAを抽出できる場合には、抗体産生細胞のRNAのみでも効率よく抽出することができる。たとえば10以上、あるいは30以上、好ましくは50以上の抗体産生細胞からのRNA抽出には、キャリアRNAの添加は必要でない場合がある。
【０１０８】
得られたcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法によって抗体遺伝子が増幅される。抗体遺伝子をPCR法によって増幅するためのプライマーが公知である。たとえば、論文（J.  Mol.  Biol.  (1991)  222,  581-597）などの開示に基づいて、ヒト抗体遺伝子増幅用のプライマーをデザインすることができる。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列となる。したがって、サブクラスが不明のcDNAライブラリーを鋳型とするときには、あらゆる可能性を考慮してPCR法が行われる。
【０１０９】
具体的には、たとえばヒトIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重鎖としてγ１〜γ５、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーを利用することができる。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側のプライマーにはヒンジ領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。一方5'側のプライマーには、各サブクラスに応じたプライマーを用いることができる。
【０１１０】
重鎖と軽鎖の各サブクラスの遺伝子増幅用プライマーによるPCR産物は、それぞれ独立したライブラリーとする。こうして合成されたライブラリーを利用して、重鎖と軽鎖の組み合せからなるイムノグロブリンを再構成することができる。再構成されたイムノグロブリンの、TMPRSS11Eに対する結合活性を指標として、目的とする抗体をスクリーニングすることができる。
【０１１１】
（２）宿主細胞への抗体遺伝子の導入
抗TMPRSS11E抗体を製造するために、クローニングされた抗体遺伝子を、発現制御領域の制御下で発現するように発現ベクターに組み込む。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。次いで、この発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することによって、抗TMPRSS11E抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞を得ることができる。
【０１１２】
抗体遺伝子の発現にあたり、抗体重鎖及び軽鎖をコードするDNAは、それぞれ別の発現ベクターに組み込むことができる。重鎖と軽鎖が組み込まれたベクターを、同じ宿主細胞に同時に形質転換（co-transfect）することによって、重鎖と軽鎖を備えた抗体分子を発現させることができる。あるいは重鎖及び軽鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（国際公開WO  94/11523参照）。
【０１１３】
単離した抗体遺伝子を適当な宿主に導入して抗体を作製するための宿主と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発明に応用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が使用できる。具体的には、本発明に利用することができる動物細胞としては、次のような細胞を例示することができる。
i)  哺乳類細胞：CHO、COS、ミエローマ、BHK（baby  hamster  kidney）、Hela、Vero、HEK293、Ba/F3、HL-60、Jurkat、SK-HEP1など
ii)  両生類細胞：アフリカツメガエル卵母細胞など
iii)  昆虫細胞：sf9、sf21、Tn5など。
【０１１４】
植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム（Nicotiana  tabacum）などのニコティアナ（Nicotiana）属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細胞の形質転換には、カルス培養した細胞を利用することができる。
【０１１５】
さらに真菌細胞としては、次のような細胞を利用することができる：
酵母：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces  serevisiae）などのサッカロミセス（Saccharomyces  ）属、メタノール資化酵母（Pichia  pastoris）などのPichia属、
糸状菌：アスペスギルス・ニガー（Aspergillus  niger）などのアスペルギルス（Aspergillus）属。
【０１１６】
あるいは原核細胞を利用した抗体遺伝子の発現系も公知である。たとえば、細菌細胞を用いる場合、大腸菌（E.  coli）、枯草菌などの細菌細胞を本発明に利用することができる。
【０１１７】
哺乳類細胞を用いる場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その3’側下流にポリAシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human  cytomegalovirus  immediate  early  promoter/enhancer）を挙げることができる。
【０１１８】
また、その他に、ウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等を、抗体発現のために使用することができる。プロモーター／エンハンサーを利用することができるウイルスとして、具体的には、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40（SV40）等を示すことができる。
【０１１９】
SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277,  108）を利用することができる。また、HEF1αプロモーター／エンハンサーはMizushimaらの方法（Nucleic  Acids  Res.（1990）18,  5322）により、容易に目的とする遺伝子発現に利用することができる。
【０１２０】
動物細胞を用いて抗体を産生させる場合に、細胞外への分泌のために必要とされるシグナル配列としては、抗体の重鎖遺伝子又は軽鎖遺伝子のシグナル配列を用いることが望ましい。また、IL-3やIL-6などの分泌タンパク質が有するシグナル配列を用いることも可能である。
【０１２１】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばlacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1989）341,  544-546  ;  FASEBJ.（1992）6,  2422-2427）を利用することができる。あるいはaraBプロモーターはBetterらの方法（Science（1988）240,  1041-1043）により、目的とする遺伝子の発現に利用することができる。
【０１２２】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei,  S.  P.  et  al.,  J.  Bacteriol.（1987）169,  4379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、尿素やグアニジン塩酸塩の様なタンパク質変性剤を使用することによって所望の結合活性を有するように、抗体の構造が組み直される（refolded）。
【０１２３】
発現ベクターに挿入される複製起源としては、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）等の由来のものを用いることができる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクター中に、選択マーカーを挿入することができる。具体的には、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等のような選択マーカーを利用することができる。
【０１２４】
（３）宿主細胞からの抗体の取得
これらの発現ベクターを宿主細胞に導入し、次に、形質転換された宿主細胞をインビトロ又はインビボで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。
【０１２５】
上述のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法を単独で使用することによって又は適宜組み合わせることによって精製できる。例えば、プロテインAカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies  A  Laboratory  Manual.  Ed  Harlow,  David  Lane,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  1988）。
【０１２６】
４．３  トランスジェニック動物による抗体産生
組換え型抗体の産生には、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物を利用することもできる。すなわち目的とする抗体をコードする遺伝子を導入された動物から、目的とする抗体を得ることができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築できる。乳汁中に分泌されるタンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどを利用することができる。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片はヤギの胚へ注入され、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ（又はその子孫）が産生する乳汁から、乳汁タンパク質との融合タンパク質として、所望の抗体を取得できる。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに適宜使用できる（Ebert,  K.M.  et  al.,  Bio/Technology（1994）12,699-702）。
【０１２７】
５．医薬組成物
TMPRSS11Eは肺癌、子宮頸癌、食道癌等の癌組織で特異的に高発現し、抗TMPRSS11E抗体は、癌細胞特異的な細胞傷害活性を有する。したがって、抗TMPRSS11E抗体は、これらのTMPRSS11Eを発現する癌の治療に有用である。
【０１２８】
すなわち、本発明は、TMPRSS11Eタンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。ある実施形態において、前記医薬組成物は細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤である。本発明の細胞増殖抑制剤及び抗癌剤は、癌を罹患している対象又は罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。
【０１２９】
本発明の医薬組成物（例えば、抗癌剤）において用いられる抗TMPRSS11E抗体は特に限定されず、例えば上述した任意の抗TMPRSS11E抗体を用いることができる。
【０１３０】
本発明において、「TMPRSS11Eに結合する抗体を有効成分として含有する」とは、抗TMPRSS11E抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、抗TMPRSS11E抗体の含有率を制限するものではない。
【０１３１】
本発明の医薬組成物は、細胞傷害性物質が結合した抗TMPRSS11E抗体を有効成分としてもよい。前記医薬組成物は、例えば、細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤として利用できる。本発明の細胞増殖抑制剤及び抗癌剤は、癌を罹患している対象又は罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。
【０１３２】
本発明において、「細胞傷害性物質が結合した抗TMPRSS11E抗体を有効成分として含有する」とは、細胞傷害性物質が結合した抗TMPRSS11E抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、細胞傷害性物質が結合した抗TMPRSS11E抗体の含有率を制限するものではない。
【０１３３】
本発明の医薬組成物が対象とする疾患が癌の場合、対象となる癌は特に限定されないが、肺癌、子宮頸癌、食道癌であることが好ましい。癌は原発巣及び転移巣のいずれであってもよい。
【０１３４】
本発明の医薬組成物は、経口、非経口投与のいずれかによって患者に投与することができる。好ましくは非経口投与である。係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって、本発明の医薬組成物を全身又は局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1  kgあたり0.0001  mgから1000  mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000  mgの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
【０１３５】
本発明の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's  Pharmaceutical  Science,  latest  edition,  Mark  Publishing  Company,  Easton,  U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられる。さらにこれらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を担体として挙げることができる。
【０１３６】
本発明の抗TMPRSS11E抗体は、TMPRSS11E発現細胞と接触させることによりTMPRSS11E発現細胞に傷害を引き起こす又は細胞の増殖を抑制することができる。こうした利用方法も、本発明の範囲である。用いられる抗体は、特に限定されず、例えば上述した任意の抗体を用いることが可能である。抗TMPRSS11E抗体が結合する細胞は、TMPRSS11Eが発現している細胞であれば特に限定されない。本発明における好ましいTMPRSS11E発現細胞は癌細胞である。より好ましくは、肺癌細胞または子宮頸癌または食道癌細胞である。上記方法は、これらの癌の、原発巣及び転移巣のいずれに対しても適用することができる。
【０１３７】
本発明において「接触」は、例えば、試験管内で培養しているTMPRSS11E発現細胞の培養液に抗体を添加することにより行われる。また本発明において「接触」はさらに、TMPRSS11E発現細胞を体内に移植した非ヒト動物や内在的にTMPRSS11Eを発現する癌細胞を有する動物に投与することによっても行われる。
【０１３８】
抗TMPRSS11E抗体の接触によってTMPRSS11E発現細胞に引き起こされた細胞傷害を評価又は測定する方法として、以下の方法が好適に使用される。試験管内において該細胞傷害活性を評価又は測定する方法としては、上記のADCC活性、CDC活性などの測定法を挙げることができる。抗TMPRSS11E抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current  protocols  in  Immunology,  Chapter  7.  Immunologic  studies  in  humans,  Editor,  John  E,  Coligan  et  al.,  John  Wiley  &  Sons,  Inc.,(1993)等）。活性の測定に際しては、対照抗体として抗TMPRSS11E抗体と同一のアイソタイプを有する抗体で該細胞傷害活性を有しない抗体を、抗TMPRSS11E抗体と同様に使用して、抗TMPRSS11E抗体が対照抗体よりも強い細胞傷害活性を示す場合に活性を有すると判定することができる。
【０１３９】
抗体のアイソタイプは、その抗体のアミノ酸配列の重鎖定常領域の配列で規定される。生体内においては、抗体産生Ｂ細胞の成熟化の際に起こる染色体上の遺伝子組み換えにより生じるクラススイッチによって抗体のアイソタイプが最終的に決定される。アイソタイプの相違が抗体の生理的・病理的機能の相違に反映される。具体的には、例えば、細胞傷害活性の強度は抗原の発現量と共に、抗体のアイソタイプによっても影響されることが知られている。従って、上記記載の細胞傷害活性の測定に際しては、対照として用いられる抗体は被験抗体と同一のアイソタイプを用いることが好ましい。
【０１４０】
また、生体内で細胞傷害活性を評価、あるいは測定するために、例えばTMPRSS11E発現癌細胞を非ヒト被検動物の皮内又は皮下に移植後、当日又は翌日から毎日又は数日間隔で被験抗体を静脈又は腹腔内に投与する。腫瘍の大きさを経日的に測定することにより細胞傷害活性を判定することができる。試験管内での評価と同様に同一のアイソタイプを有する対照抗体を投与し、抗TMPRSS11E抗体投与群における腫瘍の大きさが対照抗体投与群における腫瘍の大きさよりも有意に小さい場合に細胞傷害活性を有すると判定することができる。非ヒト被検動物としてマウスを用いる場合には、胸腺を遺伝的に欠損してそのＴリンパ球の機能を欠失したヌード（nu/nu）マウスを好適に用いることができる。当該マウスを使用することにより、投与された抗体による細胞傷害活性の評価・測定に当たって被検動物中のTリンパ球の関与を除くことができる。
【０１４１】
６．診断薬（診断方法）
また、本発明はTMPRSS11Eタンパク質又はTMPRSS11Eタンパク質をコードする遺伝子を検出することを特徴とする癌の診断方法を提供する。種々の癌組織あるいは癌細胞株において、TMPRSS11Eの顕著な発現亢進が確認されている。したがって、TMPRSS11Eは、癌を特異的に検出するためのマーカーとして有用である。
【０１４２】
本発明の診断方法の具体例の一つとして、以下の工程を含む癌の診断方法を挙げることができる。
(a)被験者から単離された試料を準備する工程、
(b)上記試料におけるTMPRSS11Eタンパク質又はTMPRSS11E遺伝子の発現量を検出する工程。本発明の方法においては、さらに
(c)上記TMPRSS11Eタンパク質又はTMPRSS11E遺伝子の発現量に基づいて、被験者が癌である可能性を評価する工程、
を含んでも良い。
【０１４３】
６．１  TMPRSS11Eタンパク質又はTMPRSS11Eタンパク質をコードする遺伝子の検出
本発明の方法の1つの態様においては、試料中のTMPRSS11Eタンパク質を検出することにより癌の診断が行われる。TMPRSS11Eタンパク質の検出はTMPRSS11Eタンパク質を認識する抗体を用いて行われることが好ましい。
【０１４４】
本発明において検出とは、定量的又は定性的な検出を含む。例えば、定性的な検出としては、次のような測定を挙げることができる。
・単にTMPRSS11Eタンパク質が存在するか否かの測定
・TMPRSS11Eタンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定
・TMPRSS11Eタンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定など。
【０１４５】
一方、定量的な検出とは、TMPRSS11Eタンパク質の濃度の測定、TMPRSS11Eタンパク質の量の測定などを挙げることができる。
【０１４６】
本発明における被検試料は、TMPRSS11Eタンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されない。具体的には、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましい。さらに好ましい試料は、ヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、組織などが例示できる。好ましい試料は、生物の体から採取された組織若しくは細胞が固定化された標本又は細胞の培養液などの被検試料から得られる試料である。
【０１４７】
本発明によって診断される癌は、特に制限されることはなく如何なる癌でもよい。具体的には、肺癌、子宮頸癌、食道癌などを挙げることができる。本発明においては、これらの癌の原発病巣、及び転移病巣のいずれをも診断することができる。
【０１４８】
本発明においては、被検試料中にタンパク質が検出された場合に、そのレベルを指標として癌が診断される。具体的には、陰性コントロール又は健常者と比較して被検試料中に検出されるTMPRSS11Eタンパク質の量が多い場合に、被検者が癌である、又は将来癌を羅患する可能性が高いことが示される。すなわち本発明は、次の工程を含む癌の診断方法に関する。
(1)  被検者から採取された生体試料中のTMPRSS11E発現レベルを検出する工程、及び
(2)  (1)で検出されたTMPRSS11Eの発現レベルが、対照と比較して高い場合に被検者が癌を有すると判定される工程。
【０１４９】
本発明において、対照とは、比較の基準となる試料をいい、陰性コントロールや健常者の生体試料が含まれる。陰性コントロールは、健常者の生体試料を採取し、必要に応じて混合することによって得ることができる。対照のTMPRSS11Eの発現レベルは、被検者の生体試料におけるTMPRSS11Eの発現レベルと平行して検出することができる。あるいは、予め、多数の健常者の生体試料におけるTMPRSS11Eの発現レベルを検出し、健常者における標準的な発現レベルを統計学的に決定することができる。具体的には、たとえば、平均値±２×標準偏差(S.D.)、あるいは平均値±３×標準偏差(S.D.)を標準値として用いることもできる。統計学的に、平均値±２×標準偏差(S.D.)は80％の、また平均値±３×標準偏差(S.D.)は90％の健常者の値を含む。
【０１５０】
あるいは、対照におけるTMPRSS11Eの発現レベルを、ROC曲線を利用して設定することができる。ROC曲線(receiver  operating  characteristic  curve；受信者操作特性曲線）は、縦軸に検出感度を、横軸に擬陽性率（すなわち"１−特異度"）を示すグラフである。本発明においては、生体試料中のTMPRSS11Eの発現レベルを判定するための基準値を連続的に変化させたときの、感度と擬陽性率の変化をプロットすることによって、ROC曲線を得ることができる。
【０１５１】
なおROC曲線を得るための「基準値」は、統計学的な解析のために一時的に利用される数値である。ROC曲線を得るための「基準値」は、一般的には、選択しうる全ての基準値をカバーできる範囲内で、連続的に変化させられる。たとえば、解析される集団のTMPRSS11Eの測定値の最小値と最大値の間で、基準値を変化させることができる。
【０１５２】
得られたROC曲線に基づいて、所望の検出感度、並びに精度を期待できる標準値を選択することができる。ROC曲線などによって統計学的に設定された標準値は、カットオフ値(cut-off  value)とも呼ばれる。カットオフ値に基づく癌の検出方法においては、上記工程(2)において、(1)で検出されたTMPRSS11Eの発現レベルが、カットオフ値と比較される。そして、カットオフ値よりも(1)で検出されたTMPRSS11Eの発現レベルが高いときに、被検者の癌が検出される。
【０１５３】
本発明において、TMPRSS11Eの発現レベルは、任意の方法によって決定することができる。具体的には、TMPRSS11EのmRNAの量、TMPRSS11Eタンパク質の量、またはTMPRSS11Eタンパク質の生物学的な活性を評価することによって、TMPRSS11Eの発現レベルを知ることができる。TMPRSS11EのmRNAやタンパク質の量は、本明細書に記載したような方法によって決定することができる。
【０１５４】
本発明においては、特に好適な被検者はヒトである。なおヒト以外の動物を被験者とするときは、当該動物種のTMPRSS11Eタンパク質が検出される。
【０１５５】
被検試料に含まれるTMPRSS11Eタンパク質の検出方法は、特に限定されないが、抗TMPRSS11E抗体を用いた、以下に例示されるような免疫学的方法により検出することが好ましい。
酵素結合免疫吸着法（ELISA）、
ラジオイムノアッセイ（RIA）、
エンザイムイムノアッセイ（EIA）、
蛍光イムノアッセイ（FIA）、
発光イムノアッセイ（LIA）、
免疫沈降法（IP）、
免疫比濁法（TIA）、
ウエスタンブロット（WB）、
免疫組織化学（IHC）法、
免疫拡散法（SRID）、
ドットブロット法、
スロットブロット法。
【０１５６】
これらの手法の中で、免疫組織化学（IHC）法は、癌に羅患した患者から取得した組織若しくは細胞を固定化した切片上でTMPRSS11Eタンパク質を検出する工程を含み、癌の診断方法として好ましい免疫学的アッセイ法の一つである。免疫組織化学（IHC）法などの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法である。
【０１５７】
TMPRSS11Eは、癌細胞において特異的に発現が増強している膜タンパク質であることから、抗TMPRSS11E抗体によって、癌細胞、あるいは癌組織を検出することができる。上記の免疫組織学的な解析によって、生体から採取された細胞や組織に含まれる癌細胞が検出される。
【０１５８】
別な好ましい態様では、生体内の癌組織を抗TMPRSS11E抗体によって検出することもできる。この方法は、具体的には、(1)放射性同位元素等の標識物質で標識されたTMPRSS11Eタンパク質に結合する抗体を被検者に投与する工程と、(2)該標識物質の集積を検出する工程を含む。生体内に投与した抗体を追跡するために、抗体は、検出可能に標識することができる。たとえば蛍光物質や発光物質、あるいは放射性同位元素で標識された抗体の生体における挙動を追跡することができる。蛍光物質や発光物質で標識された抗体は、内視鏡や腹腔鏡を利用して観察することができる。放射性同位元素は、その放射活性を追跡することによって、抗体の局在を画像化することができる。本発明において、生体内における抗TMPRSS11E抗体の局在は、癌細胞の存在を表している。
【０１５９】
生体内の癌を検出するために抗体を標識する放射性同位元素として、陽電子放出核種を利用することができる。たとえば18F、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr、及び124Iのような陽電子放出核種で抗体を標識することができる。これらの陽電子放出核種による抗TMPRSS11E抗体の標識には、公知の方法（Acta  Oncol.  32,  825-830,  1993）を利用することができる。
【０１６０】
陽電子放出核種で標識された抗TMPRSS11E抗体がヒトや動物に投与された後に、PET（ポジトロン断層撮影装置）により、その放射性核種が放射する放射線が体外から計測され、コンピュータートモグラフィーの手法で画像に変換される。PETは、薬物の体内挙動などに関するデータを非侵襲的に得るための装置である。PETによって、放射強度をシグナル強度として定量的に画像化することができる。上記のようにPETを使用することによって、患者から試料を採取することなく特定の癌で高発現する抗原分子を検出できる。抗TMPRSS11E抗体は、上記の核種の他に11C、13N、15O、18F、45Ti等の陽電子放出核種を用いた短寿命核種によって放射標識することもできる。
【０１６１】
医療用サイクロトロンによる上記核種を用いた短寿命核種の生産、短寿命放射標識化合物の製造技術等に関する研究開発が進められている。これらの技術により抗TMPRSS11E抗体を種々の放射性同位元素によって標識することができる。患者に投与された抗TMPRSS11E抗体は、各部位の病理組織に対する抗TMPRSS11E抗体の特異性に従って原発巣及び転移巣に集積する。抗TMPRSS11E抗体が陽電子放出核種で標識されていれば、その放射活性を検出することにより、該原発巣及び転移巣の存在が放射活性の局在によって検出される。該診断用途に用いる場合には25-4000  keVのガンマ粒子又は陽電子放射量の活性値が適切に使用できる。また、適切な核種を選択して、さらに大量に投与すれば治療効果も期待できる。放射線による抗癌作用を得るためには、70-700  keVのガンマ粒子又は陽電子放射量値を与える核種を使用できる。
【０１６２】
６．２  TMPRSS11Eタンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出
本発明の方法の別の態様においては、TMPRSS11Eのポリヌクレオチドの発現を検出する。本発明において検出されるポリヌクレオチドは特に限定されないが、mRNAが好ましい。本発明において検出とは、定量的又は定性的な検出を含む。例えば、定性的な検出として、次のような測定操作を挙げることができる。
・単にTMPRSS11EのmRNAが存在するか否かの測定、
・TMPRSS11EのmRNAが一定の量以上存在するか否かの測定、
・TMPRSS11EのmRNAの量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定など。
【０１６３】
一方、定量的な検出とは、TMPRSS11EのmRNAの濃度の測定、TMPRSS11EのmRNAの量の測定などを挙げることができる。
【０１６４】
本発明における被検試料としては、TMPRSS11EのmRNAが含まれる可能性のある任意の試料を利用することができる。哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、組織などが例示できる。好ましい試料は生物の体から採取された組織若しくは細胞が固定化された標本又は細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。
【０１６５】
生物の体から採取された組織、若しくは細胞が固定化された標本、又は細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料を用いる場合には、インシトゥーハイブリダイゼーション法が好適に用いられる。インシトゥーハイブリダイゼーション法は、細胞や組織内の特定のDNAやRNAの有無若しくは分布及びその発現の強弱を確認する手法として発展してきた。原理としては細胞内の特定の核酸配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸が特異的に複合体を形成する性質を利用したものである。当該プローブに予め放射性同位元素（RI）や抗原物質（ハプテン）等を標識しておくことにより、当該標識の検出を通じてハイブリダイゼーションした箇所が識別可能となることから、インシトゥーハイブリダイゼーション法は細胞内DNAやRNAなどの検出等に用いられている。プローブの標識としては好適にはRIによる標識を用いることができる。さらに好適な例としては、非放射性物質のビオチンやジゴキシゲニン等のハプテン等を利用した蛍光標識を用いることができる。特に好適な例としてはFISHと呼ばれる蛍光インシトゥーハイブリダイゼーション（fluorescence  in  situ  hibridization）による検出法が用いられる。
【０１６６】
本発明によって診断される癌は、特に制限されない。具体的には、肺癌、子宮頸癌、食道癌などを挙げることができる。本発明においては、これらの癌の原発病巣、及び転移病巣のいずれをも診断することができる。
【０１６７】
本発明においてはTMPRSS11E遺伝子を発現する任意の動物種を被験者とすることができる。特に好適な被検者はヒトである。なおヒト以外の動物種を被験者とするときには、当該動物種のTMPRSS11Eの遺伝子が検出される。
【０１６８】
以下に検出方法の具体的な態様を記載する。まず、被検者から試料を調製する。次いで、該試料に含まれるTMPRSS11EのmRNAを検出する。本発明においては、mRNAから合成したcDNAを検出することもできる。本発明においては、被検試料中にTMPRSS11EのmRNAやTMPRSS11EをコードするcDNAが検出された場合、癌の可能性があると判定される。たとえば、陰性コントロール又は健常者と比較して、被検試料中に検出されるTMPRSS11EのmRNAやTMPRSS11EをコードするcDNAの量が多い場合に、被検者が癌である、又は将来癌を羅患する可能性が高いことが示される。
【０１６９】
ｍRNAを検出する方法は、公知である。具体的には、例えば遺伝子チップ、cDNAアレイ、及びメンブレンフィルターから選ばれる固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法等を本発明に利用することができる。
【０１７０】
上記した本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもできる。自動化することによって、短時間に多数の試料を検査することができる。
【０１７１】
６．３  癌の診断のためのキット
本発明は、被検試料中のTMPRSS11Eタンパク質を検出するための試薬を含む、癌の診断のための診断薬又はキットも提供する。本発明の診断薬は、少なくとも抗TMPRSS11E抗体を含む。
【０１７２】
本発明の癌の診断用試薬と、TMPRSS11Eの検出に用いられるその他の要素を組み合わせることによって、癌の診断のためのキットとすることができる。すなわち本発明は、TMPRSS11Eに結合する抗体と、該抗体とTMPRSS11Eとの結合を検出する試薬を含み、さらにTMPRSS11Eを含む生体試料からなる対照試料を含んでいてもよい、癌の診断のためのキットに関する。本発明のキットには、さらに測定操作を説明するための指示書をキットに添付することもできる。
【０１７３】
以下、実施例により、本発明について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１７４】
[実施例１]    リアルタイムPCRを用いたTMPRSS11EのmRNA発現解析
肺癌細胞株h2009、h2087、h2122、h209はATCCより購入した。添付資料に記載の条件下で培養後１×10７個相当の細胞を回収し、Trizol（Invitrogen社）を用いて全  RNAを調製した。1μgの全  RNAについて、DNase  I  (Invitrogen社）処理後、SuperScript  III  First  Strand  Synthesis  System  for  RT-PCR  (Invitrogen社)  を用いoligo  (dT)  をプライマーとしてcDNAを合成した。表1に示す各種正常組織全  RNAに関しても同様の方法でcDNAを合成した。【０１７５】
【表１】
2010119691.tif 000002
【０１７６】
これらのcDNAを用い、SYBR  Green  Iを用いたインターカレーター法によるリアルタイムPCRを実施した。すなわち3.3ngの全  RNA相当を由来とするcDNAを鋳型とし、SYBR（登録商標）Premix  Ex  Taq（Takara社）、センスプライマー（配列番号３１）、アンチセンスプライマー（配列番号３２）を含む20μlの反応液に対し、95  ℃で5秒、60℃で30秒からなるサイクルを33回行った。事前に精製したPCR産物を鋳型としたサンプルをもとに標準曲線を作成し、その定量値からサンプルのcDNA量を換算した。図１に示すように、TMPRSS11EのmRNAは肺癌株であるh2009、h2087、h2122、h209で高値を示し、正常組織では扁桃、食道、子宮頸部に限局していた。【０１７７】
[実施例2]  抗TMPRSS11E抗体の作製
TMPRSS11E（Accession  No.  NM  014058）は423アミノ酸からなる二型膜タンパク質である。塩基配列を配列番号１、アミノ酸配列を配列番号２に示す。細胞外領域にトリプシン様セリンプロテアーゼドメイン及びSEAドメインを有する。今回ある種の癌でTMPRSS11Eが高発現している事を見出したので、抗TMPRSS11E抗体の作製に着手した。【０１７８】
1.  ヒトTMPRSS11E発現細胞株の樹立
はじめにTMPRSS11E全長遺伝子をクローニングした。すなわちH2009のcDNAを鋳型として、5’端にEcoRI認識配列、kozak配列を付加したセンスプライマー、3'端にタグ配列とNotI配列を付加したアンチセンスプライマーを設計し、10xKOD-Plus  buffer、2mM  dNTPs、25mM  MgSO4、KOD-Plus（Takara社製）を含む反応液に対し、94  ℃で30秒、50℃で10秒、72℃で1.5分からなるサイクルを35回行った。PCR反応による増幅産物はpGEM-T  Easy  Vector  System  I（Promega社）を用いてpGEM-T  easyに挿入した。配列はABI3730  DNA  Analyzerにより確認した。これをEcoRI、NotIにより切断後、pMCNベクターへクローニングした。pMCNベクターは、マウスCMVプロモータ（Accession  No.  U68299）下で発現誘導可能で、ネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれている。エレクトロポレーション法により本発現プラスミドDNAをDG44細胞およびBa/F3細胞へ導入し、定常発現株を500μg/mL  ジェネテシン  での選抜により樹立した。DG44細胞はInvitrogen社、Ba/F3は理化学研究所より購入した。【０１７９】
2.  可溶型ヒトsTMPRSS11Ep1／マウスIgG2a  Fc融合蛋白の作製
免疫原としてセリンプロテアーゼドメインを含むsTMPESS11Ep1領域（Ser159-Ile423）とマウスIgG2aFcの融合蛋白を作製した。5'端にEcoRI認識配列、kozak配列、マウスIL3シグナル配列を付加したセンスプライマーと、CpoI認識配列を付加したアンチセンスプライマーを用いたPCR反応を行った。pGEM-T  Easyにクローニングし塩基配列を確認した後、EcoRI、CpoIにより消化した断片をpMCDN mIgG2aFcにクローニングした。pMCDN mIgG2aFcはpMCNベクターを由来とし、EcoRI,  NotI認識部位にマウス重鎖IgG2aのヒンジ以下のFc配列を挿入し、CpoI認識配列でsTMPRSS11Ep1とmIgG2aFc配列が連結される。配列番号３３で表される配列はsTMPRSS11Ep1 mIgG2aFcの塩基配列を、配列番号３４で表される配列はsTMPRSS11Ep1 mIgG2aFcのアミノ酸配列を示す。
pMCDN sTMPRSS11Ep1 mIgG2aFcをDG44細胞（Invitrogen社）へエレクトロポレーション法により導入し、500μg/mL  ジェネテシン  での選抜により、定常発現細胞を樹立した。定常発現細胞の大量培養を実施し、培養上清からsTMPRSS11Ep1 mIgG2aFc蛋白を精製した。培養上清をHi  Trap  rProtein  A  (GE社製)カラムにチャージし、結合バッファー（20mM  リン酸ナトリウム  (pH7.0)）にて洗浄後、溶出バッファー（0.1M  グリシン-HCl  (pH2.7)）で溶出した。溶出は中和バッファー（1M  Tris-HCl(pH9.0)）を加えたチューブへ行い直ちに中和した。次にSuperdex  200  HR  26/60(GE社)によるゲルろ過を行い、PBSに置換した。精製蛋白の定量はDC  protein  assay  (BIO-RAD社)を用い、添付のウシIgGをスタンダードとして換算した。【０１８０】
3.  抗TMPRSS11E抗体の作製
Balb/cマウス、もしくはMRL/MpJUmmCrj-lpr/lprマウス（以下、MRL/lprマウス、日本チャールズ・リバーより購入）を免疫動物として用いた。6週齢より免疫を開始し、初回免疫にはsTMPRSS11Ep1 mIgG2aFcを50μg/匹となるように調製し、フロイント完全アジュバント（FCA、ベクトンディッキンソン社）を用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。2週間後に25μg/匹となるように調製したものをフロイント不完全アジュバント（FIA、ベクトンディッキンソン社）でエマルジョン化したものを皮下に投与した。以降１週間間隔で追加免疫を２から3回行った。最終免疫の４日後、脾臓細胞を摘出し、マウスミエローマ細胞P3-X63Ag8U1（P3U1、ATCCより購入）と2:1になるように混合し、PEG1500（ロシュ・ダイアグノスティック社）を徐々に加える事により細胞融合を行った。慎重にRPMI1640培地（GIBCO  BRL社）を加えPEG1500を希釈し、遠心操作によりPEG1500を除去した後、10％FBS入りRPMI1640にて懸濁したものを100μL  /ウェルとなるように96穴培養プレートに播種した。翌日、100μL  /ウェルとなるように10％FBS、1  x  HAT  media  supplement  (SIGMA社）、0.5  x  BM-Condimed  H1  Hybridoma  cloning  supplement  (ロシュ・ダイアグノスティック社）を含むRPMI1640  (以降、HAT培地）を添加した。2,  3日後に培養液の半分をHAT培地に置き換え、7日後の培養上清を用いてスクリーニングを行った。スクリーニングは上記樹立したTMPRSS11E発現DG44細胞を用いたフローサイトメトリーにより行った。陽性クローンについては親株であるDG44細胞には結合しないことを確認後、限界希釈法によりモノクローン化した。樹立されたハイブリドーマ、TM094、TM191はRoche社のIsostripを用いてアイソタイプを決定した結果、いずれもIgG1,  kappaであった。【０１８１】
抗体の精製は、FBS(Ultra  low  IgG)（GIBCO  BRL社）を血清として用いたHAT培地にて培養したハイブリドーマの培養上清を、上記と同様にHi  Trap  ProteinG  HPを用い行った。溶出画分については、PD-10カラム（Amersham社）を用いてPBSに置換した後、4℃で保管した。精製抗体の定量はDC  protein  assay  (BIO-RAD社)を用い、添付のウシIgGをスタンダードとして換算した。【０１８２】
[実施例3]  抗TMPRSS11E抗体可変領域遺伝子配列の決定
TM094、TM191について抗体可変領域遺伝子の配列を決定した。全  RNAは、RNeasy  Plant  Mini  Kits（QIAGEN社）を用いて１×10７細胞のハイブリドーマより抽出した。１μｇの全  RNAを使用して、SMART  RACE  cDNA  Amplification  Kit（CLONTECH社）、マウスIgG1定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG1（配列番号３５）またはマウスκ鎖定常領域塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドkappa（配列番号３６）を用い、５’末端側遺伝子断片を増幅した。逆転写反応は42℃で１時間30分間反応した。PCR溶液50μLは、５μLの10×Advantage  2  PCR  Buffer、５μＬの10×Universal  Primer  A  Mix、0.2mM  dNTPs（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）、１μＬのAdvantage  2  Polymerase  Mix（以上、CLONTECH社製）、2.5μＬの逆転写反応産物、10pmoleの合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG1またはkappaを含有し、94℃の初期温度にて30秒間そして94℃にて５秒間、72℃にて３分間のサイクルを５回反復し、94℃にて５秒間、70℃にて10秒間、72℃にて３分間のサイクルを５回反復し、さらに94℃にて５秒間、68℃にて10秒間、72℃にて３分間のサイクルを25回反復した。最後に反応産物を72℃で７分間加熱した。各PCR産物はQIAquick  Gel  Extraction  Kit（QIAGEN社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、pGEM-T  Easyベクターへクローニングし、塩基配列を決定した。TM094の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号３７、アミノ酸配列を配列番号３８、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号３９、アミノ酸配列を配列番号４０に示す。TM191の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号４１、アミノ酸配列を配列番号４２、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号４３、アミノ酸配列を配列番号４４に示す。【０１８３】
[実施例4]  抗TMPRSS11Eマウス−ヒトキメラ化抗体の作製
各抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列をヒト重鎖およびヒト軽鎖定常領域配列に連結した。重鎖については可変領域の５’末端側塩基配列に相補的でコザック配列、EcoRI部位を有する合成オリゴヌクレオチド、およびNheI部位を有する３’末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRを行った。軽鎖については可変領域の５’末端側塩基配列に相補的でコザック配列、BamHI部位を有する合成オリゴヌクレオチド、およびBsiWI部位を有する３’末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRを行った。得られたPCR産物を抗体発現プラスミドpMCDN G1kにクローニングした。pMCDN G1kは、pMCDNベクターにヒトIgG1定常領域がクローニングされており、NheI部位によりマウス重鎖可変領域とヒト重鎖（γ１鎖）定常領域が連結する構造を持つ。また、もう一つマウスCMVプロモータを含む発現ユニット、及びヒトκ鎖定常領域が挿入されており、BsiWI部位によりマウス軽鎖可変領域とヒト軽鎖（κ鎖）定常領域が連結する構造を持つ。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子、抗TMPRSS11Eマウス―ヒトキメラ化抗体遺伝子を発現する。キメラ化TM094の重鎖の塩基配列を配列番号４５に、アミノ酸配列を配列番号４６に、キメラ化TM094の軽鎖の塩基配列を配列番号４７に、アミノ酸配列を配列番号４８に示す。キメラ化TM191の重鎖の塩基配列を配列番号４９に、アミノ酸配列を配列番号５０に、キメラ化TM191の軽鎖の塩基配列を配列番号５１に、アミノ酸配列を配列番号５２に示す。【０１８４】
pMCDN G1k TM094、pMCDN G1k TM191をDG44細胞へエレクトロポレーションにより導入した。500μg/mL  ジェネテシン  での選抜により、抗TMPRSS11Eキメラ化抗体定常発現CHO細胞を樹立した。次に培養上清よりHi  Trap  rProtein  Aカラムを用いて精製を行った。精製抗体(chi.TM094(DG)、chi.TM191(DG))はPD-10カラムにてPBSにバッファー交換し、  DC  Protein  Assayにより定量し、4℃で保管した。【０１８５】
[実施例5]  低フコース抗TMPRSS11Eマウス−ヒトキメラ化抗体の作製
抗体のADCC活性を増強する方法としては、抗体の糖鎖を改変する方法が知られている。例えば、WO  99/54342には、抗体のグリコシル化を修飾することによりADCC活性を改良することが記載されている。また、WO  00/61739には、抗体の糖鎖におけるフコースの存否によりADCC活性を調節することが記載されている。WO  02/31140には、YB2/0細胞において抗体を産生せしめることにより、α-1,6コアーフコースを含まない糖鎖を有する抗体を調製することが記載されている。WO2005/017155においては、フコーストランスポーター遺伝子をノックアウトしたCHO細胞（CHO FTKO）に関する実施例が記載されており、同様にα-1,6コアーフコースを含まない糖鎖を有する抗体を生産することが可能である。
上記構築した抗TMPRSS11Eマウスーヒトキメラ化抗体発現プラスミドをCHO FTKO細胞へエレクトロポレーション法により導入し、500μg/mL  ジェネテシン  での選抜により、抗TMPRSS11Eキメラ化抗体定常発現CHO FTKO細胞を樹立した。次に培養上清よりHi  Trap  rProtein  Aカラムを用いて精製を行った。精製抗体(chi.TM094(FTKO)、chi.TM191(FTKO))はPD-10カラムにてPBSにバッファー交換し、  DC  Protein  Assayにより定量し、4℃で保管した。【０１８６】
[実施例6]  抗TMPRSS11E抗体のフローサイトメトリーによる結合活性評価
上記構築したTMPRSS11E定常発現細胞、その親株に対する結合をフローサイトメトリーにより評価した。5x105個相当の細胞に適当な濃度に希釈した抗TMPRSS11E抗体を加え、氷上で１時間反応させた。細胞を遠心により洗浄後、FITC標識抗ヒトIgG抗体を添加し氷上で１時間反応させた。細胞を遠心により洗浄後、2μg/mL  ヨウ化プロピジウムを含む培地に懸濁し、ベクトンディッキンソン社のFACS  Caliburに供した。図２に示すように全ての抗体は、Ba/F3親株に対して結合せず、TMPRSS11E強制発現株には濃度依存的な強い結合活性を示した。この事からこれら抗体はTMPRSS11Eに特異的に結合する事が判明した。キメラ化抗体と低フコース型キメラ化抗体の結合活性は同等であった。次に、種々の癌細胞株に対する結合活性をフローサイトメトリーにより評価した。図3に示すように、肺癌株であるh2009、h2087、子宮癌株であるME-180（ATCCより購入）、大腸癌株であるcolo201（Japanese  Collection  of  Research  Bioresourcesより購入）に対し結合活性を示した。これら癌細胞株において、TMPRSS11EがRNAレベルのみならず、蛋白レベルでも高発現している事が判明した。DAKO社のQIFIKITを用いて細胞あたりの抗原発現数を概算した結果、H2009では約26,000分子、ME-180では約40,000分子の発現があり、抗体医薬の標的抗原として十分な発現をしている事が判明した。【０１８７】
[実施例7]抗TMPRSS11E抗体の抗体依存性細胞介在性細胞傷害  (ADCC)活性の測定
1.  全長ヒトCD16定常発現細胞の樹立
全長ヒトCD16  (RefSeq  ID、NM＿000569)を哺乳細胞発現用ベクター(pMCDN)にクローニングした(pMCDN/CD16)。pMCDN/CD16をNK-92細胞(ATCCより購入、CRL-2407)へエレクトロポレーションにより導入し、500  μg/ml  ジェネテシンでの選抜により、全長ヒトCD16を定常的に発現するNK-92細胞株(CD16-NK92)を樹立した。CD16-NK92細胞の培養には500  μg/ml  ジェネテシン、ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen社)、0.2  mM  イノシトール(Sigma社)、0.1  mM  2-メルカプトエタノール(Invitrogen社)、0.02  mM  葉酸(Sigma社)、100  U/ml  組換えヒトインターロイキン-2  (Peprotech社)、10%  ウマ血清(Invitrogen社)、10%  ウシ胎児血清(Invitrogen社)を含むAlpha  minimum  essential  medium  without  ribonucleosides  and  deoxyribonucleosides  with  L-glutamine培地(Invitrogen社)を用いた。【０１８８】
2.  抗TMPRSS11E抗体のADCC活性の測定
H2009、colo201細胞を96ウェル平底プレートの各ウェルに50μlずつ添加し、5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて2日間培養した。10%  ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI1640培地(以下、培地と称する。)  にChromium-51  (Code  No.  CJS4、GEヘルスケアバイオサイエンス社)を240μCi/ml添加した溶液を各ウェルに10μlずつ添加し、引き続き1時間培養した。各ウェルを300μlの培地で洗浄したあと100μlの培地を添加した。次に、抗TMPRSS11E抗体またはコントロールヒトIgG1抗体(Cat.  No.  PHP010、Serotec社)を50μlずつ添加した。続いて培地にて1×106個/mlに懸濁されたCD16-NK92細胞を50μlずつ添加した。該プレートは5%炭酸ガスインキュベーター中で37℃にて4時間培養後、上清100μlの放射活性をガンマカウンター（1480  WIZARD  3”、Wallac社）にて測定した。下式に基づいて特異的クロム遊離率を決定した。
特異的クロム遊離率（%）=(A-C)×100/(B-C)
Aは各ウェルの放射活性(cpm)、Bは100μl  の2%  Nonidet  P-40溶液（Code  No.252-23、Nacalai  Tesque社）を添加したウェルの放射活性(cpm)の平均値、Cは100μlの培地を添加したウェルの放射活性(cpm)の平均値を示す。試験は重複して行い、特異的クロム遊離率の平均値及び標準偏差を算出した。
M  E-180については、20μg/mLのCalcein-AM（DOJINDO社）により標識し、同様の方法で抗体、エフェクター細胞を作用させ、上清100μLの蛍光度をARVO（WALLAC社）を用いて計測し、特異的Calcein-AM遊離率（%）を算出した。
図４に示すように、各癌細胞株に対し、抗TMPRSS11E抗体によるADCC活性が認められた。また、低フコース化によりADCC活性の増強が確認された。【０１８９】
[実施例8]  Hum-ZAPを用いた抗TMPRSS11E抗体による抗腫瘍効果
次に、TMPRSS11Eを標的としたイムノトキシンが抗腫瘍効果を示す事ができるか、Hum-ZAPを用いて評価した。Hum-ZAPは、抗ヒトIgG抗体に蛋白合成阻害のトキシンであるサポリンを結合させたもので、Advanced  Targeting  Systems社製のものを用いた。前日にh2009、ME-180細胞を500個/  50μL/  ウェルで96ウェルプレートに蒔き込み、100ngのHum-ZAPと100ngの抗TMPRSS11Eキメラ化抗体(TM094、TM191)を混合したものを添加した。96時間培養後にCell  Count  Reagent  SF  (Nacalai  Tesque社）を10μL添加し、2時間後に450nmの吸光度を測定した。図５に示すように、Hum-ZAP単独では増殖抑制が認められないものの、抗TMPRSS11E抗体に依存して、抗腫瘍効果が認められた。【０１９０】
[実施例9]  抗TMPRSS11E抗体によるプロテアーゼ活性中和活性
TMPRSS11Eは2型セリンプロテアーゼファミリーに属し、プロテアーゼドメインを有する。TMPRSS11Eに結合する抗体はこの機能を中和する可能性がある。Enzchek  Gelatinase  /Collagenase  Assay  Kit  (Molecular  Probes社)を用いて、プロテアーゼ評価系を構築した。上記構築した可溶型ヒトsTMPRSS11Ep1／マウスIgG2a  Fc融合蛋白（11E-Fc）600ngに対し1μgのTM191を添加し4℃で1時間放置した。これをキット添付のマニュアルに従い、蛍光物質で標識されたDQ-Gelatinを添加し、室温で反応させ継時的に蛍光度を測定した。図６に示すように、11E-Fc非存在下では蛍光度の上昇は認められず、11E-Fcの添加に依存して蛍光度の上昇が確認された。11E-FcにコントロールIgGを添加したサンプルでは変化が認められなかったが、TM191と混合すると蛍光度の上昇が認められなくなった。この事から、TM191は、TMPRSS11Eのプロテアーゼ活性を中和する活性を有していることが判明した。【０１９１】
[実施例10]  抗TMPRSS11E抗体によるイムノブロット解析
TMPRSS11EのSEAドメイン(Tyr42-Arg191)の領域とマウスIgG2a  Fc領域の融合蛋白を上記方法に従い作製した。これをBalb/cマウス、MRL/lprマウスへ免疫し、上記と同様の方法でハイブリドーマを樹立した。スクリーニングには、New  England  Biolabs社のpMALc2xベクターを用い、MBPとSEAドメインの融合蛋白質として大腸菌にて発現、精製したものを固相化したELISAにより行った。強い結合活性を示したEA230を産生するハイブリドーマよりRNAを抽出し、上記方法に従い抗体可変領域の遺伝子配列を決定した。EA230の重鎖可変領域の塩基配列を配列番号５３、アミノ酸配列を配列番号５４、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号５５、アミノ酸配列を配列番号５６に示す。
Ba/F3、TMPRSS11E発現Ba/F3(BaF/TMPRSS11E)、TMPRSS11E陰性癌細胞株VMRC-LCD、TMPRSS11E陽性癌細胞株h2009、ME-180の細胞ライセートを作製した。細胞1x106個に対しNP-40  Lysis  Buffer  (0.5%  (v/v)  Nonidet  P40,  20mM  Tris-HCl  (pH7.5),  150mM  NaCl,  5mM  EDTA)を50μL添加し、4℃で15分放置後、遠心（14,000rpm,  15min）後の上清をライセートとして使用した。細胞2x105個相当のライセートをSDS-PAGEにより分離後、Trans-Blot  SD  Semi-Dry  Electrophoretic  Transfer  Cell  (BIO-RAD社)を用いてイモビロン-P（Millipore社）へトランスファーした。メンブレンをTBS-T（0.05%  Tween20,  TBS）で軽く洗った後、5%スキムミルク入りTBS-Tで1時間振とうした。TBS-Tで約10分間振とうした後、1%スキムミルク入りTBS-Tで希釈した0.5μg/mLのEA230抗体を加え１時間振とうした。TBS-Tで洗い（10分間x3回）、1%スキムミルク入りTBS-Tで1/2000に希釈したHRP-抗マウスIgG抗体（GE社）で1時間振とう後、TBS-Tで洗った（10分x3回）。発色はECL-Plus  (GE社)を用いて行い、Hyperfilm  ECL（GE社）を用いて現像した。図７に示すように、EA230はBa/F3親株には反応せず、TMPRSS11E強制発現株では50数kＤａ位置にバンドが検出された。TMPRSS11Eの予想分子量は47.7kDaであるため、おそらく糖鎖修飾を受けたTMPRSS11Eが検出されていると考えられる。すなわち、EA230はイムノブロットでTMPRSS11Eを特異的に検出できる。癌細胞株においても同様のバンドが検出され、確かに癌細胞株ではTMPRSS11Eが高発現していることが確認された。【０１９２】
[実施例11]  抗TMPRSS11E抗体による免疫組織化学（immunohistochemistry(IHC)）解析
臨床癌組織でのTMPRSS11Eの発現を評価する目的で、EA230を用いてIHC解析を行った。肺癌組織アレイとしてTest  slide,  Lung  cancer  tissues  with  corresponding  normal  tissues  (ISU  ABXIS社,  A716II）、子宮頸癌組織アレイとしてMultiple  (uterine  cervix)  cervical  squamous  cancer  tissue  array  (Biomax社,  CR803)、食道癌組織アレイとしてHuman  Common  Cancers  Array（SuperBioChips社,  MA1）を使用した。染色はDAKO社のEnvision  Kitを用いた。組織を脱パラフィン処理後、10mM  クエン酸バッファー（pH6.0）でオートクレーブ（120℃,  10min）による賦活化処理を行い、添付のマニュアルに従い、10μg/mLのEA230を用いて染色を行った。図８に示すように、肺癌および子宮頸癌および食道癌で癌組織の強い染色が認められた。このことから臨床癌組織においてもTMPRSS11Eは高発現している事が判明した(Lang  and  Schuller,  2001)。染色は細胞膜に限局しており、TMPRSS11Eは抗体医薬の標的抗原として有望であると考えられた。【０１９３】
[実施例12]  抗TMPRSS11E抗体によるin  vivo抗腫瘍効果
1.  マウスIgG2ak型TM191の作製
実施例4で作製したヒトーマウスキメラ型TM191発現プラスミドよりTM191のＨ鎖およびＬ鎖可変領域配列を切り出し、pMCDN  mG2akベクターへクローニングした。pMCDN  mG２akベクターは、pMCDNベクターにマウスIgG2a定常領域がクローニングされており、NheI部位によりマウスＨ鎖可変領域と定常領域が連結する構造を持つ。また、もう一つmouse  CMVプロモータを含む発現ユニット、及びマウスκ鎖定常領域が挿入されており、BsiWI部位によりマウスＬ鎖可変領域と定常領域が連結する構造を持つ。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子、マウスIgG2a型TM191抗体遺伝子を発現する。マウスIgG2a型TM191のH鎖の塩基配列を配列番号５７に、アミノ酸配列を配列番号５８に、マウスkappa型TM191のL鎖の塩基配列を配列番号５９に、アミノ酸配列を配列番号６０に示す。pMCDN  mG2ak  TM191をDG44細胞、及びCHO  FTKOへエレクトロポレーションにより導入した。500μg/mL  Geneticin  での選抜により定常発現CHO細胞を樹立した。次に培養上清よりHi  Trap  rProtein  Aカラムを用いて精製を行った。精製抗体(TM191  mIgG2ak  (DG)、TM191  mIgG2ak  (FTKO))はPD-10カラムにてPBSにバッファー交換し、  DC  Protein  Assayにより定量し、4℃で保管した。【０１９４】
2.  TMPRSS11E発現肝癌細胞株の樹立
肝癌細胞株であるSK-Hep-1細胞はATCCより購入し、D-MEM  (SIGMA),  10%  FBS  (BOVAGEN),  1%  penicillin-streptomyicin  (GIBCO)にて培養した。実施例２でクローニングした全長TMPRSS11E遺伝子をpCOSII-Zeoベクターへクローニングした。pCOSII-Zeoベクターはゼオシン耐性遺伝子が組み込まれている。作製したTPMRSS11E発現プラスミドをエレクトロポレーション法によりSK-Hep-1細胞へ導入し、800μg/mL  Zeocinで選抜し、限界希釈法によりTMPRSS11E発現株を樹立した。図９に示すようにflowcytometryにおいて、親株であるSK-Hep1へはTM191は結合せず、TMPRSS11E強制発現株に対しては強い結合を示した。【０１９５】
3.  TMPRSS11E発現細胞のin  vivo抗腫瘍効果
3.1.  ヒト肝臓癌移植マウスモデルの作製
あらかじめ前日に抗アシアロGM1抗体（和光純薬社）0.2mgを腹腔内投与したC.B-17/Icr-scidマウス（メス、腫瘍移植時6週齢、日本クレア）56匹に、1.2で取得されたTMPRSS11E発現肝癌細胞株を5E6cells/mouse(培地（D-MEM  (SIGMA),  10%  FBS  (BOVAGEN),  1%  penicillin-streptomyicin  (GIBCO),  400μg/mL  geneticin  (GIBCO),  800μg/mL  Zeocin  (Invitrogen)）とマトリゲルで1:1混和した細胞懸濁液)で皮下に移植した。
移植14日目にノギスで腫瘍サイズ（長径x短径x  短径(mm3)）と体重を測定し、１群6匹の全6群に群分けし、投与を開始した。【０１９６】
3.2.  抗体の投与と測定
1.で調製された抗体TM191  mIgG2ak  (DG)、TM191  mIgG2ak  (FTKO)を、投与する当日にPBS(-)（SIGMA）を用いて0.5mg/mL(5mg/kg投与群)、あるいは2.5mg/mL(25mg/kg投与群)になるように調製し、3.1で群分けしたマウスに10mL/kgにて、尾静脈より投与した。投与は週に1回、全4回行った。その間および最終投与１週間後までの間、週に2回、腫瘍サイズと体重の測定を行った。【０１９７】
3.3.  結果
TM191  mIgG2ak  (DG)、TM191  mIgG2ak  (FTKO)の投与により5mg/kg投与群、25mg/kg投与群ともに皮下に移植したヒト肝臓癌は有意に増殖が阻害された（図１０）。【０１９８】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１９９】
本発明の抗体は、抗癌剤として、および癌の診断薬として用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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