(57)【要約】【課題】癌の分子標的療法における新規な手法として、従来とは異なる標的分子の発現・機能を制御することによる、癌の予防・治療手段を提供する。また、前記標的分子を用いた、癌の予防・治療活性を有する物質をスクリーニングする手段を提供する。【解決手段】本発明の一形態によれば、配列番号：２または配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体を含有する、癌細胞の細胞接着阻害剤が提供される。本発明の他の形態によれば、配列番号：２または配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドを含有する、癌細胞の細胞接着阻害剤が提供される。本発明のさらに他の形態によれば、配列番号：２または配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性を阻害する物質を含有する、癌細胞の細胞接着阻害剤が提供される。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体を含有する、癌細胞の細胞接着阻害剤。
【請求項２】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドを含有する、癌細胞の細胞接着阻害剤。
【請求項３】
配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体を含有する、癌細胞の細胞接着阻害剤。
【請求項４】
配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドを含有する、癌細胞の細胞接着阻害剤。
【請求項５】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性を阻害する物質を含有する、癌細胞の細胞接着阻害剤。
【請求項６】
配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性を阻害する物質を含有する、癌細胞の細胞接着阻害剤。
【請求項７】
癌の予防または治療に用いられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項８】
他の抗癌剤と併用された際に、癌細胞の前記抗癌剤に対する感受性を向上させるのに用いられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項９】
癌が白血病である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項１０】
前記白血病が急性骨髄性白血病である、請求項９に記載の阻害剤。
【請求項１１】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性を阻害することを含む、癌細胞の細胞接着阻害方法。
【請求項１２】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現および／または活性を阻害することを含む、癌細胞の細胞接着阻害方法。
【請求項１３】
配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性を阻害することを含む、癌細胞の細胞接着阻害方法。
【請求項１４】
配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現および／または活性を阻害することを含む、癌細胞の細胞接着阻害方法。
【請求項１５】
癌の予防または治療に用いられる、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の阻害方法。
【請求項１６】
癌細胞の細胞接着阻害剤の製造のための、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性を阻害する物質の使用。
【請求項１７】
癌細胞の細胞接着阻害剤の製造のための、配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性を阻害する物質の使用。
【請求項１８】
癌細胞の細胞接着阻害剤の製造のための、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現および／または活性を阻害する物質の使用。
【請求項１９】
癌細胞の細胞接着阻害剤の製造のための、配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現および／または活性を阻害する物質の使用。
【請求項２０】
前記細胞接着阻害剤が、癌の予防用または治療用である、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドを用いる、癌細胞の細胞接着を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項２２】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドが、それを産生する細胞の形態で提供される、請求項２１に記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体、並びに、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるいずれかをさらに用いる、請求項２２に記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドを用いる、癌細胞の細胞接着を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項２５】
配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドが、それを産生する細胞の形態で提供される、請求項２４に記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体、並びに、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるいずれかをさらに用いる、請求項２５に記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】
癌の予防または治療のための物質のスクリーニングに用いられる、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な癌の予防・治療剤、癌細胞の細胞接着阻害剤に関する。詳細には、本発明は、新規標的タンパク質の発現および／または活性を調節する物質を含有する癌の予防・治療剤、癌細胞の細胞接着阻害剤に関する。また、本発明は、前記標的タンパク質または当該標的タンパク質をコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）の発現を検出しうる物質を含有する癌の診断剤に関する。さらに、本発明は、前記標的タンパク質または当該標的タンパク質をコードする核酸を用いた、癌の予防・治療のための物質や癌細胞の細胞接着阻害物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学の急速な発展に伴って、「分子標的薬」と呼ばれる新しいタイプの薬剤の開発が進められており、いくつかの商品が既に上市されている。【０００３】
例えば、癌を例に挙げると、従来の抗癌剤は、主としてＤＮＡ合成や細胞周期の特定の段階を標的とするものであった。これは、正常細胞と比較して増殖がより活発であるという癌細胞の性質を利用し、癌細胞に対して特異的な毒性を発揮させようとするものである。よって、癌細胞ではないが癌細胞と同等の増殖速度を有する細胞（例えば、骨髄中の幼若造血細胞、口腔粘膜細胞、消化管上皮細胞、毛嚢細胞）なども、従来の抗癌剤によって障害を受けてしまい、これによって骨髄抑制（白血球減少、血小板減少）、消化器障害、脱毛などの副作用が生じるという問題があった。【０００４】
これに対し、上述した「分子標的薬」は、癌細胞において特異的に（または過剰に）発現している分子を標的とし、当該分子への選択的な作用によって抗癌性を発揮するというものである。したがって、分子標的薬を用いた癌治療によれば、従来の抗癌剤を用いる場合と比較して、上述したような副作用の発生が抑えられるという利点がある。【０００５】
分子標的薬としての新規な抗癌剤を開発するための手段としては、癌細胞・癌組織における遺伝子・タンパク質の発現解析・機能解析が効果的である。かような解析によって、特定の治療剤・治療法に対する有効性の判断や、新たな創薬ターゲットの探索が可能となると考えられる。【０００６】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ；Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）は、血液癌である白血病の１種であり、骨髄系の造血細胞が腫瘍化し、分化・成熟能を失う疾患である。分化・成熟能を喪失した造血細胞は、幼若なままの形態をとることから、「芽球」とも称される。ＡＭＬにおいては、この芽球が骨髄内に蓄積することで、正常な血球の産生能が低下する。その結果、赤血球不足に起因する貧血・息切れ・動悸・顔面蒼白といった症状や、血小板不足に起因する歯茎からの出血・鼻血・消化管からの下血や吐血・脳出血といった症状が発現する。さらに、白血球の不足に起因して、感染に対する免疫が低下し、高熱やだるさといった症状が発現するようになる。【０００７】
１９７６年に提唱されたＦＡＢ（Ｆｒｅｎｃｈ−Ａｍｅｒｉｃａｎ−Ｂｒｉｔｉｃｈ）分類によれば、ＡＭＬは、骨髄細胞に占める芽球の割合が３０％以上である状態と定義される。一方、染色体や遺伝子変異も含めた新たな白血病の分類法として世界保健機関（ＷＨＯ）により発表されたＷＨＯ分類によれば、芽球の割合が２０％以上の状態がＡＭＬと定義されている。【０００８】
白血病の発症メカニズムを説明するために、いわゆる「白血病幹細胞」の概念が近年提唱されている。この概念によれば、自己複製能が顕著に増強された造血幹細胞のうちごく小数の細胞が、白血病細胞を供給するための「幹細胞」として機能し、自己複製および限定的な分化を繰り返しつつ、白血病細胞を供給し続けることにより、白血病の病態が発現するのだと説明される。【０００９】
そして、ＡＭＬにおける白血病幹細胞は、細胞接着分子を介して骨髄の骨内膜領域に定着することで化学療法剤により誘発されるアポトーシスから逃れる、すなわち、化学療法剤に対して耐性を獲得することが報告されている（例えば、非特許文献１を参照）。【００１０】
従来、化学療法を経たＡＭＬ患者において、微小残存病変（ＭＲＤ；Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｉｄｕａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ）に起因して病態が再発することが知られていた。そして、かような再発をもたらす薬剤耐性の獲得の原因の１つとして、白血病細胞表面に存在するＶＬＡ（Ｖｅｒｙ  Ｌａｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ）−４の、骨髄間質細胞（骨芽細胞）表面のフィブロネクチンとの接着が関与していることが明らかとされた。かような知見に基づき、ＶＬＡ−４を標的としたＡＭＬの治療法・再発予防法が提案されている。例えば、ＶＬＡ−４特異的な抗体（ＶＬＡ−４中和抗体）を投与することで、ＶＬＡ−４とフィブロネクチンとの接着を阻害し、これによりＡＭＬの治療・予防を行なうことが提案されている（例えば、非特許文献２を参照）。なお、ＶＬＡ−４は、インテグリンファミリーのα４サブユニットとβ１サブユニットとから構成されるヘテロ二量体タンパク質であり、これらのうちβ１サブユニットが、骨髄の骨芽細胞との接着に関与している。【００１１】
さらに、本発明者らは、マウスの骨髄腫瘍（白血病）におけるレトロウイルス組み込みの部位として、Ｅｖｉ１（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ−１）遺伝子を同定した（非特許文献３を参照）。【００１２】
Ｅｖｉ１遺伝子は、上述したようにマウス白血病のウイルス挿入部位から単離された、３０９９ｂｐからなる遺伝子（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００７９６３）であり、１０３２アミノ酸からなるタンパク質（Ｅｖｉ１タンパク質）をコードしている（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０３１９０８）。ヒトにおける相同遺伝子（ＥＶＩ１遺伝子）は、４８７３ｂｐからなる遺伝子（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１１０５０７７、配列番号：１）であり、１１１５アミノ酸（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１０９８５４７、配列番号：２）からなるタンパク質（ＥＶＩ１タンパク質）をコードしている。Ｅｖｉ１タンパク質・ＥＶＩ１タンパク質は、それぞれマウス・ヒトの造血幹細胞や白血病細胞の核内に主として発現していることが確認されている。【００１３】
ここで、ＥＶＩ１遺伝子と癌との関係について、本発明者らは、ヒトのＡＭＬにおいて、ＥＶＩ１遺伝子が位置する３番染色体長腕（３ｑ２６）での転位によるＥＶＩ１遺伝子の活性化がみられることがあることを発見した（非特許文献４を参照）。その後、ＥＶＩ１遺伝子が種々のタイプの細胞において、細胞の増殖／分化における重要な役割を担っていることが明らかにされ、また、ＥＶＩ１遺伝子が骨髄の造血幹細胞においても発現し、造血幹細胞の制御に関わっていることも明らかとなった（例えば、非特許文献５を参照）。本発明者らは、このＥＶＩ１遺伝子がＧＡＴＡ−２遺伝子の発現を制御することによって、造血幹細胞の増殖に関与していることを明らかにした（非特許文献６を参照）。また、近年、ＥＶＩ１遺伝子が造血幹細胞や形質転換白血病細胞の増殖における重要な制御因子であることが報告されている（非特許文献７を参照）。ただし、かような知見に基づくＡＭＬ等の癌の治療・予防に関する具体的な手法の提案はなされていない。なお、ヒトのＡＭＬの約２〜３割でＥＶＩ１遺伝子の活性化がみられ、かようなＡＭＬは難治性で再発頻度も高いことが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５，１３１５−１３２１（２００７）
【非特許文献２】Ｍａｔｓｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９，１１５８−１１６５（２００３）
【非特許文献３】Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５４（６），８３１−８４０（１９８８）
【非特許文献４】Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８９（９），３９３７−３９４１（１９９２）
【非特許文献５】Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８，１６３５−１６４０（２０００）
【非特許文献６】Ｙｕａｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２４，１９７６−１９８７（２００５）
【非特許文献７】Ｇｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３（２），２０７−２２０（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述したように、従来、ＶＬＡ−４（α４／β１インテグリン）を標的としたＡＭＬの治療法・再発予防法は提案されている。しかしながら、ＥＶＩ１遺伝子や当該遺伝子が直接コードするｍＲＮＡ・タンパク質、その他ＥＶＩ１遺伝子に関連した遺伝子や当該遺伝子がコードするｍＲＮＡ・タンパク質を標的としたＡＭＬの治療法・再発予防法は知られていない。より効果的で、かつ副作用の少ない治療法・再発予防法のバリエーションを増やすことにより医療技術の進歩に貢献するという観点からは、ＶＬＡ−４以外の分子を標的とする新規な分子標的療法の開発が依然として熱望されているのが現状である。【００１６】
そこで本発明は、癌の分子標的療法における新規な手法として、従来とは異なる標的分子の発現・機能を制御することによる、癌の予防・治療手段を提供することを目的とする。また本発明は、前記標的分子を用いた、癌の予防・治療活性を有する物質をスクリーニングする手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を行なった。その結果、ＥＶＩ１遺伝子やＥＶＩ１タンパク質の発現・機能を抑制することにより、抑制された細胞の細胞接着能が低下することを見出した。同様に、二量体を形成することが従来知られているインテグリンのα６サブユニットおよびβ４サブユニットを構成する各タンパク質（それぞれ、ＩＴＧＡ６タンパク質およびＩＴＧＢ４タンパク質）の発現・機能を抑制したり、当該タンパク質をコードする遺伝子（それぞれ、ＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子）の発現・機能を抑制したりすることによっても、抑制された細胞の細胞接着能が低下することを見出した。このように、ＥＶＩ１遺伝子・タンパク質やＩＴＧＡ６／ＩＴＧＢ４遺伝子・タンパク質が癌の予防・治療のための標的となりうることを実証し、本発明を完成させるに至った。【００１８】
すなわち、本発明の一形態によれば、配列番号：２または配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体を含有する、癌細胞の細胞接着阻害剤が提供される。【００１９】
本発明の他の形態によれば、配列番号：２または配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドを含有する、癌細胞の細胞接着阻害剤が提供される。【００２０】
本発明のさらに他の形態によれば、配列番号：２または配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性を阻害する物質を含有する、癌細胞の細胞接着阻害剤が提供される。【００２１】
ここで、上述した阻害剤は、例えば、癌の予防または治療に用いられる。また、上述した阻害剤は、他の抗癌剤と併用された際に、癌細胞の前記抗癌剤に対する感受性を向上させるのに用いられるものであってもよい。上述した癌は、白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））でありうる。【００２２】
本発明のさらに他の形態によれば、配列番号：２または配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性を阻害することを含む、癌細胞の細胞接着阻害方法が提供される。【００２３】
本発明のさらに他の形態によれば、配列番号：２または配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現および／または活性を阻害することを含む、癌細胞の細胞接着阻害方法が提供される。【００２４】
本発明のさらに他の形態によれば、癌細胞の細胞接着阻害剤の製造のための、配列番号：２または配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質の発現および／または活性を阻害する物質の使用が提供される。【００２５】
本発明のさらに他の形態によれば、癌細胞の細胞接着阻害剤の製造のための、配列番号：２または配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現および／または活性を阻害する物質の使用が提供される。ここで、上述した細胞接着阻害剤は、癌の予防用または治療用でありうる。【００２６】
本発明のさらに他の形態によれば、配列番号：２または配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドを用いる、癌細胞の細胞接着を阻害する物質のスクリーニング方法が提供される。ここで、配列番号：２または配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドは、それを産生する細胞の形態で提供されうる。この際、配列番号：２または配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体、並びに、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるいずれかがさらに用いられてもよい。さらに、上述したスクリーニング方法は、癌の予防または治療のための物質のスクリーニングに用いられうる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、癌の分子標的療法における新規な手法として、従来とは異なる標的分子の発現・機能を制御することによる、癌の予防・治療手段が提供されうる。また、本発明によれば、前記標的分子を用いた、癌の予防・治療活性を有する物質をスクリーニングする手段が提供されうる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】実施例１−１におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図２】実施例１−１におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図３】実施例１−２における細胞接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図４】参考例１におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図５】実施例２−１におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図６】実施例２−２における細胞接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図７】参考例２における細胞増殖アッセイの結果を示すグラフである。
【図８】実施例３−１における細胞接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図９】実施例３−１におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１０】実施例３−２における細胞接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図１１】参考例３−１におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１２】参考例３−２における細胞接着アッセイの結果を示すグラフである。
【図１３】参考例３−３における細胞増殖アッセイの結果を示すグラフである。
【図１４】参考例４−１におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１５】参考例４−２におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１６】参考例４−３におけるＤＮＡマイクロアレイ評価の結果を示す図である。
【図１７】参考例４−４におけるＤＮＡマイクロアレイ評価の結果を示す図である。
【図１８】参考例５におけるＷＳＴ法による薬剤耐性アッセイの結果を示すグラフである。
【図１９】参考例５におけるＷＳＴ法による薬剤耐性アッセイの結果を示すグラフである。
【図２０】実施例４におけるＷＳＴ法による薬剤耐性アッセイの結果を示すグラフである。図２０（ａ）は、ＡＭＬ１（ｓｈＬｕｃ）を培養した結果を示すグラフであり、図２０（ｂ）は、ＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）を培養した結果を示すグラフである。
【図２１】参考例６において、ＮＣＢＩの遺伝子発現バンク（ＧＥＯ）からヒトＡＭＬ患者の骨髄細胞における遺伝子発現データを収集した結果を示すグラフである。図２１（ａ）は、ＩＴＧＡ６遺伝子の発現量データを示し、図２１（ｂ）は、ＩＴＧＢ４遺伝子の発現量データを示す。
【図２２】参考例７において、ＮＣＢＩの遺伝子発現バンク（ＧＥＯ）からヒトにおける各種の骨髄／末梢血細胞における遺伝子発現データを収集し、ＩＴＧＡ６遺伝子の発現量を比較した結果を示すグラフである。
【図２３】参考例７において、ＮＣＢＩの遺伝子発現バンク（ＧＥＯ）からヒトにおける各種の骨髄／末梢血細胞における遺伝子発現データを収集し、ＩＴＧＢ４遺伝子の発現量を比較した結果を示すグラフである。
【図２４】参考例８におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図２５】実施例５におけるＦＡＣＳ法による測定結果を示すグラフである。図２５（ａ）は、ＡＭＬ１（ｓｈＬｕｃ）細胞を用いたＦＡＣＳの結果を示し、図２５（ｂ）は、ＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）細胞を用いたＦＡＣＳの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明者らが本発明を完成させるに至った経緯を概説すれば、まず、本発明者らは、ＥＶＩ１遺伝子の発現を抑制することにより、各種のヒト白血病細胞におけるインテグリンの発現が抑制され、当該細胞の細胞接着能が低下することを見出した。具体的には、ＥＶＩ１遺伝子の発現抑制により、インテグリンのα６サブユニットおよびβ４サブユニットの発現が抑制されることが判明した。
【００３０】
ここで、ヒトインテグリンのα６サブユニットを構成するタンパク質（ＩＴＧＡ６タンパク質）は、５６８０ｂｐからなるＩＴＧＡ６遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１０７９８１８、配列番号：３）によりコードされており、１０９１アミノ酸（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１０７３２８６、配列番号：４）からなっている。マウスにおける相同タンパク質（Ｉｔｇａ６タンパク質）は、４２０５ｂｐからなるＩｔｇａ６遺伝子（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００８３９７）によりコードされており、１０７３アミノ酸（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０３２４２３）からなっている。
【００３１】
また、ヒトインテグリンのβ４サブユニットを構成するタンパク質（ＩＴＧＢ４タンパク質）は、５６９５ｂｐからなるＩＴＧＢ４遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１００５６１９、配列番号：５）によりコードされており、１８０５アミノ酸（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１００５６１９、配列番号：６）からなっている。マウスにおける相同タンパク質（Ｉｔｇｂ４タンパク質）は、６１６０ｂｐからなるＩｔｇｂ４遺伝子（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１００５６０８）によりコードされており、１８０２アミノ酸（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１００５６０８）からなっている。なお、本発明者らは、上述したＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子が、ＥＶＩ１陽性細胞において特異的に発現していることを確認している。
【００３２】
上述した結果から、本発明者らは、ＩＴＧＡ６遺伝子・タンパク質、並びに、ＩＴＧＢ４遺伝子・タンパク質が、白血病細胞などの癌細胞における細胞接着能の発揮に関与しているのではないかとの仮説を設定した。その上で、ＩＴＧＢ４遺伝子の発現を抑制したり、ＩＴＧＢ４タンパク質の活性を中和抗体によって阻害したりすることにより、ヒト白血病細胞の細胞接着能が低下することを確認し、上記仮説を実証した。なお、ＩＴＧＡ６遺伝子やＩＴＧＡ６タンパク質について、上述したような確認実験は行なっていないが、ＩＴＧＡ６遺伝子の発現はＥＶＩ１の発現抑制によりＩＴＧＢ４遺伝子と同様に抑制されることや、ＩＴＧＡ６遺伝子の各種細胞における発現の特異性がＩＴＧＢ４遺伝子と同様であることなどを考慮すると、ＩＴＧＡ６遺伝子・タンパク質においても、上述したようなＩＴＧＢ４遺伝子・タンパク質と同様の結果が得られる蓋然性は極めて高いものと考えられる。
【００３３】
ここで、ＥＶＩ１遺伝子が発現しているＡＭＬ細胞では、インテグリンの発現が亢進していることが知られている。そこで本発明者らは、かような知見に鑑み、骨髄に対する白血病細胞の細胞接着能の発揮に、インテグリンが関与しているのではないかとの仮説を設定した。その上で、ＥＶＩ１陰性細胞にＥＶＩ１遺伝子を導入することにより、当該細胞の細胞接着能が上昇し、この際にＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子の発現も増加することを確認した。これと併せて、ＡＭＬの臨床検体を用いた実験においても、ＥＶＩ１遺伝子の発現とＩＴＧＡ６遺伝子・ＩＴＧＢ４遺伝子の発現との間に相関が確認され、上記仮説は実証された。
【００３４】
上述したいくつかの知見に基づき、本発明者らは、本発明を完成させるに至ったものである。以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されることはない。
【００３５】
本発明において用いられるタンパク質（「本発明のタンパク質」とも称する）は、配列番号：２、配列番号：４、もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。本発明のタンパク質は、ヒトや他の温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉（例、平滑筋、骨格筋）、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、白色脂肪組織、褐色脂肪組織）など］等から単離・精製されるタンパク質であってもよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成されたタンパク質であってもよいし、あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を導入された形質転換体から産生される組換えタンパク質であってもよい。
【００３６】
配列番号：２、配列番号：４、もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２、配列番号：４、もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、いっそう好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性（ホモロジー；ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（すなわち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０（１９９０）を参照）。
【００３７】
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７（１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３（１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
【００３８】
より好ましくは、配列番号：２、配列番号：４、もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：２、配列番号：４、もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、いっそう好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性（アイデンティティ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ））を有するアミノ酸配列である。
【００３９】
本発明で用いられるタンパク質は、配列番号：２、配列番号：４、もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、かつ配列番号：２、配列番号：４、もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質である。
【００４０】
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などが挙げられる。ここで「実質的に同質」とは、それらの性質が定性的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、本発明のタンパク質の活性が同等であることが好ましいが、これらの活性の程度（例、約０．０１〜約１００倍、好ましくは約０．１〜約１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）や、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００４１】
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、それ自体公知の方法に準じて行なうことができる。例えば、後述する本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法において用いられる方法等に従って行なうことができる。
【００４２】
また、本発明で用いられるタンパク質としては、例えば、（ｉ）配列番号：２、配列番号：４、もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列中の１個または２個以上（例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：２、配列番号：４、もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列に１個または２個以上（例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：２、配列番号：４、もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列に１個または２個以上（例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：２、配列番号：４、もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列中の１個または２個以上（例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
【００４３】
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、特に限定されない。
【００４４】
本発明で用いられるタンパク質の好ましい例としては、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有するヒトＥＶＩ１（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１０９８５４７）あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋにＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０３１９８９として登録されているマウスホモログ）、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するヒトＩＴＧＡ６（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１０７３２８６）あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋにＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０３２４２３として登録されているマウスホモログ）、配列番号：６で表されるアミノ酸配列を含有するヒトＩＴＧＢ４（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１００５６１９）あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋにＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１００５６０８として登録されているマウスホモログ）などが挙げられる。
【００４５】
本明細書において、タンパク質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載される。配列番号：２、配列番号：４、もしくは配列番号：６で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質を初めとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。
【００４６】
ここで、Ｃ末端がエステル（−ＣＯＯＲ）である場合におけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
【００４７】
本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
【００４８】
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
【００４９】
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質の部分アミノ酸配列を有するペプチドであり、かつ該タンパク質と実質的に同質の活性を有する限り、いずれのものであってもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同義である。また、「実質的に同質の活性」の測定は、前記した本発明で用いられるタンパク質の場合と同様に行うことができる。
【００５０】
例えば、本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは１５０個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
【００５１】
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１個または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１個または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１個または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１個または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５、４、３もしくは２）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
【００５２】
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここで、Ｃ末端がエステル（−ＣＯＯＲ）である場合におけるＲとしては、本発明で用いられるタンパク質について前記したと同様のものが挙げられる。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば、Ｃ末端のエステルと同様のものなどが用いられる。
【００５３】
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断されて生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
【００５４】
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作製のための抗原としても用いることができる。
【００５５】
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドは遊離体であってもよいし、塩であってもよい（以下、特に断らない限り同様である）。かような塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００５６】
本発明で用いられるタンパク質は、前述したヒトや他の温血動物の細胞または組織から、それ自体公知のタンパク質の精製方法を用いて精製することにより、製造されうる。具体的には、例えば、哺乳動物の組織または細胞を界面活性剤の存在下でホモジナイズし、得られる組織の粗抽出物画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等に付すことにより、本発明で用いられるタンパク質が調製されうる。
【００５７】
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
【００５８】
ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。すなわち、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドを構成しうる部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のタンパク質（ペプチド）を製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法が挙げられる。
（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
このようにして得られたタンパク質（ペプチド）は、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などが挙げられる。
【００５９】
上記方法で得られるタンパク質（ペプチド）が遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にタンパク質（ペプチド）が塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００６０】
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチド、あるいはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などが挙げられる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、それ自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
【００６１】
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行った後に樹脂に添加することができる。
【００６２】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用されうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適当な混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用されうることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜約５０℃の範囲である。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００６３】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択されうる。
【００６４】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００６５】
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
【００６６】
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
【００６７】
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
【００６８】
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００６９】
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜約４０℃の温度で行われるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００７０】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
【００７１】
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
【００７２】
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
【００７３】
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドは、本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
【００７４】
さらに、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドは、それをコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養し、得られる培養物から該タンパク質または該部分ペプチドを分離精製することによって製造することもできる。本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドはＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該ポリヌクレオチドは二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
【００７５】
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターなど）のあらゆる細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など］由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡ画分および全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分をそれぞれ鋳型として用い、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（以下、「ＰＣＲ法」とも称する）および逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を用いたＲＴ−ＰＣＲ法によって直接増幅することもできる。あるいは、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
【００７６】
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１、配列番号：３、もしくは配列番号：５で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：２、配列番号：４、もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであればよい。
【００７７】
配列番号：１、配列番号：３、もしくは配列番号：５で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１、配列番号：３、もしくは配列番号：５で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、いっそう好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性（ホモロジー（ｈｏｍｏｌｏｇｙ））を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００７８】
本明細書における塩基配列の相同性は、例えば、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
【００７９】
ハイブリダイゼーションは、それ自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
【００８０】
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９〜約２０ｍＭで、温度が約５０〜約７０℃、好ましくは約６０〜約６５℃の条件を意味する。特に、ナトリウム塩濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
【００８１】
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡは、好ましくは、配列番号：１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１１０５０７７）あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋにＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００７９６３として登録されているマウスホモログ）、配列番号：３で表される塩基配列を含有するＤＮＡ（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１０７９８１８）あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋにＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００８３９７として登録されているマウスホモログ）、配列番号：５で表される塩基配列を含有するＤＮＡ（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１００５６１９）あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋにＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１００５６０８として登録されているマウスホモログ）などが挙げられる。
【００８２】
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）としては、前述した本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれであってもよい。
【００８３】
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１、配列番号：３、もしくは配列番号：５で表される塩基配列の部分塩基配列、または配列番号：１、配列番号：３、もしくは配列番号：５で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、かつ本発明で用いられるタンパク質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡなどが用いられる。配列番号：１、配列番号：３、もしくは配列番号：５で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとは、前記と同義である。また、ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件としては、前記と同様のものが用いられる。
【００８４】
本発明で用いられるタンパク質およびその部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に「本発明のタンパク質」とも称する場合がある）をコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全部の領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００８５】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等のそれ自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
【００８６】
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００８７】
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００８８】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
【００８９】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
【００９０】
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００９１】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、「ＳＶ４０ｏｒｉ」とも称する）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、「ｄｈｆｒ」とも称する）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、「Ａｍｐｒ」とも称する）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、「Ｎｅｏｒ」とも称する、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
【００９２】
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ末端側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
【００９３】
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
【００９４】
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
【００９５】
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５，８７（１９８４）〕などが用いられる。
【００９６】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
【００９７】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞〔以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｖｏ，１３，２１３−２１７（１９７７）〕などが用いられる。
【００９８】
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１５巻，５９２（１９８５）〕。
【００９９】
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−１，ＣＯＳ−３，ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、「ＣＨＯ細胞」とも称する），ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞とも称する），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，マウスＡＴＤＣ５細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞，ヒト２９３細胞、ヒトＨｅＬａ細胞などが用いられる。
【０１００】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【０１０１】
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【０１０２】
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【０１０３】
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【０１０４】
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール，２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
【０１０５】
このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
【０１０６】
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜約８が望ましい。
【０１０７】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
【０１０８】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜約４３℃で約３〜約２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
【０１０９】
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜約４０℃で約６〜約２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
【０１１０】
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜約８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜約３５℃で約２４〜約７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【０１１１】
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜約６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜約５日間行い、必要に応じて通気（例えば、５％ＣＯ２）や撹拌を加える。
【０１１２】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜約２０％の胎仔牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜約８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜約４０℃で約１５〜約６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【０１１３】
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成させることができる。
【０１１４】
上記培養物からの本発明のタンパク質の分離精製は、例えば、下記の方法により行なうことができる。
【０１１５】
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
【０１１６】
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、それ自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【０１１７】
このようにして得られる本発明のタンパク質が遊離体で得られた場合には、それ自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合にはそれ自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
【０１１８】
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
【０１１９】
このようにして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウェスタンブロッティングなどにより測定することができる。
【０１２０】
さらに、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドは、それをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞タンパク質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。あるいは、さらにＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、カルモジュリンまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを鋳型としても合成することができる。無細胞タンパク質（転写／）翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液はＰｒａｔｔ Ｊ．Ｍ．ら，“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ”，Ｈａｍｅｓ Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓＳ．Ｊ．編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ １７９−２０９（１９８４）に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはＥ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）やＲＴＳ ５００ Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ Ｆ．Ｂ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１７９，１６０−１６１（１９５７）あるいはＥｒｉｃｋｓｏｎ Ａ．Ｈ．ら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６，３８−５０（１９９６）等に記載の方法を用いることができる。
【０１２１】
タンパク質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ら（１９８４）前述）や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞タンパク質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ Ａ．Ｓ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８））、透析法（木川ら，第２１回日本分子生物学会，ＷＩＤ６）、あるいは重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭＷｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃｏｒｅ ｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開２０００−３３３６７３）等を用いることができる。
【０１２２】
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体（以下、「本発明の抗体」とも称する）は、本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチドを認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡであり、特に好ましくはＩｇＧである。
【０１２３】
また、本発明の抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等のフラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
【０１２４】
本発明で用いられるタンパク質またはその部分ペプチド（以下、抗体の説明においては、これらを単に「本発明のタンパク質」とも称する）に対する抗体は、それ自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【０１２５】
以下に、本発明の抗体の免疫原調製法、および当該抗体の製造法について説明する。
【０１２６】
（１）抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、上記した本発明のタンパク質またはその部分ペプチド、あるいはそれと同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチドなど、いずれのものも使用されうる（以下、これらを単に「本発明の抗原」とも称する）。
【０１２７】
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドは、上記した通り、例えば、（ａ）ヒト、サル、ラット、マウス、ニワトリなどの温血動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（ｂ）ペプチド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、（ｃ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養、あるいは（ｄ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸を鋳型として無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成することによって製造される。
【０１２８】
（ａ）温血動物の組織または細胞から本発明のタンパク質を調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、粗分画物（例えば、膜画分、可溶性画分）をそのまま抗原として用いることもできる。あるいは酸、界面活性剤またはアルコールなどで抽出を行い、得られる抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することもできる。得られた本発明のタンパク質をそのまま免疫原とすることもできるし、ペプチダーゼ等を用いた限定分解により部分ペプチドを調製してそれを免疫原とすることもできる。
【０１２９】
（ｂ）化学的に本発明の抗原を調製する場合、該合成ペプチドとしては、例えば上述の（ａ）の方法を用いて天然材料より精製した本発明のタンパク質と同一の構造を有するもの、具体的には、該タンパク質のアミノ酸配列において３個以上、好ましくは６個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチドなどが用いられる。
【０１３０】
（ｃ）ＤＮＡを含有する形質転換体を用いて本発明の抗原を製造する場合、該ＤＮＡは、公知のクローニング方法〔例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法など〕に従って作製することができる。該クローニング方法としては、（１）本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列に基づきデザインしたＤＮＡプローブを用い、ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーション法により該抗原をコードするＤＮＡを単離するか、（２）本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列に基づきデザインしたＤＮＡプライマーを用い、ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により該抗原をコードするＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを宿主に適合する発現ベクターに挿入する方法などが挙げられる。該発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を適当な培地中で培養することにより、所望の抗原を得ることができる。
【０１３１】
（ｄ）無細胞転写／翻訳系を利用する場合、上記（ｃ）と同様の方法により調製した抗原をコードするＤＮＡを挿入した発現ベクター（例えば、該ＤＮＡがＴ７、ＳＰ６プロモーター等の制御下におかれた発現ベクターなど）を鋳型とし、該プロモーターに適合するＲＮＡポリメラーゼおよび基質（ＮＴＰｓ）を含む転写反応液を用いてｍＲＮＡを合成した後、該ｍＲＮＡを鋳型として公知の無細胞翻訳系（例えば、大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽等の抽出液）を用いて翻訳反応を行なわせる方法などが挙げられる。塩濃度等を適当に調整することにより、転写反応と翻訳反応とを同一反応液中で一括して行なうこともできる。
【０１３２】
免疫原としては、本発明のタンパク質の完全な分子やその部分アミノ酸配列を有するペプチドを用いることができる。部分アミノ酸配列としては、例えば３個以上の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上、いっそう好ましくは６個以上の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。あるいは、該アミノ酸配列としては、例えば２０個以下の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは１８個以下、より好ましくは１５個以下、いっそう好ましくは１２個以下の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。これらのアミノ酸残基の一部（例えば、１個〜数個）は置換可能な基（例えば、Ｃｙｓ残基、水酸基等）によって置換されていてもよい。免疫原として用いられるペプチドは、このような部分アミノ酸配列を１個〜数個含むアミノ酸配列を有する。
【０１３３】
あるいは、本発明のタンパク質を発現する温血動物細胞自体を、本発明の抗原として直接用いることもできる。温血動物細胞としては、上記（ａ）項で述べたような天然の細胞、上記（ｃ）項で述べたような方法で形質転換した細胞などを用いることができる。形質転換に用いる宿主としては、ヒト、サル、ラット、マウス、ハムスター、ニワトリなどから採取した細胞であれば何れのものでも良く、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ７、ＣＨＯ−Ｋ１、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｂａｌｂ３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、Ｌ９２９、ＳＰ２／０、Ｐ３Ｕ１、Ｂ１６、またはＰ３８８などが好ましく用いられる。本発明のタンパク質を発現する天然の温血動物細胞または形質転換した温血動物細胞は、組織培養に用いられる培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０）または緩衝液（例えば、ハンクス緩衝塩類溶液（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｌｕｔｉｏｎ；ＨＢＳＳ））に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であればいずれの方法でもよく、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。
【０１３４】
本発明の抗原は、免疫原性を有していれば不溶化したものを直接免疫することもできるが、分子内に１個〜数個の抗原決定基しか有しない低分子量（例えば、分子量約３，０００以下）の抗原（すなわち、本発明のタンパク質の部分ペプチド）を用いる場合には、これらの抗原は通常、免疫原性の低いハプテン分子であるため、適当な担体（キャリアー）に結合または吸着させた複合体として免疫することができる。担体としては天然または合成の高分子を用いることができる。天然高分子としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のサイログロブリン、例えばニワトリのオボアルブミン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などが用いられる。合成高分子としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または共重合物などの各種ラテックスなどが挙げられる。
【０１３５】
該キャリアーとハプテンとの混合比は、担体に結合あるいは吸着させた抗原に対する抗体が効率よく産生されれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテンに対する抗体の作製にあたり常用されている上記の天然もしくは合成の高分子キャリアーを、重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。
【０１３６】
また、ハプテンとキャリアーのカップリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同士を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同士を架橋するＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基どうしを架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）など）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
【０１３７】
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入、皮下注射、皮内注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独で、あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常１〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ニワトリが挙げられる。抗Ｉｇ抗体産生の問題を回避するためには、投与対象と同一種の哺乳動物を用いることが好ましいが、モノクローナル抗体作製には一般にマウスおよびラットが好ましく用いられる。
【０１３８】
ヒトに対する人為的免疫感作は倫理的に困難であることから、本発明の抗体がヒトを投与対象とする場合には、（ｉ）後述する方法に従って作製されるヒト抗体産生動物（例えば、マウス）を免疫してヒト抗体を得る、（ｉｉ）後述する方法に従ってキメラ抗体、ヒト化抗体もしくは完全ヒト抗体を作製する、あるいは（ｉｉｉ）体外免疫法とウイルスによる細胞不死化、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマ作製技術、ファージディスプレイ法等とを組み合わせてヒト抗体を得ることが好ましい。なお、体外免疫法は、通常の免疫では抗体産生が抑制される抗原に対する抗原を取得できる可能性があることや、ｎｇ〜μｇオーダーの抗原量で抗体を得ることが可能であること、免疫が数日間で終了することなどから、不安定で大量調製の困難な抗原に対する抗体を得る方法として、非ヒト動物由来の抗体を調製する場合にも好ましく用いられうる。
【０１３９】
体外免疫法に用いられる動物細胞としては、ヒトおよび上記した温血動物（好ましくはマウス、ラット）の末梢血、脾臓、リンパ節などから単離されるリンパ球、好ましくはＢリンパ球等が挙げられる。例えば、マウス細胞やラット細胞の場合、４〜１２週齢程度の動物から脾臓を摘出・脾細胞を分離し、適当な培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、ハムＦ１２培地等）で洗浄した後、抗原を含む胎仔ウシ血清（ＦＣＳ；５〜２０％程度）添加培地に浮遊させて４〜１０日間程度ＣＯ２インキュベーターなどを用いて培養する。抗原濃度としては、例えば０．０５〜５μｇが挙げられるがこれに限定されない。同一系統の動物（１〜２週齢程度が好ましい）の胸腺細胞培養上清を常法に従って調製し、培地に添加することが好ましい。
【０１４０】
ヒト細胞の体外免疫では、胸腺細胞培養上清を得ることは困難であるため、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６等数種のサイトカインおよび必要に応じてアジュバント物質（例えば、ムラミルジペプチド等）を抗原とともに培地に添加して免疫感作を行なうことが好ましい。
【０１４１】
モノクローナル抗体の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物（例えば、マウス、ラット）もしくは動物細胞（例えば、ヒト、マウス、ラット）から抗体価の上昇が認められた個体もしくは細胞集団を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取もしくは体外免疫後４〜１０日間培養した後に細胞を回収して抗体産生細胞を単離し、これと骨髄腫細胞とを融合させることにより抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清中の抗体価の測定は、例えば標識化抗原と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。
【０１４２】
骨髄腫細胞は多量の抗体を分泌するハイブリドーマを産生しうるものであれば特に制限はないが、自身は抗体を産生もしくは分泌しないものが好ましく、また、細胞融合効率が高いものがより好ましい。また、ハイブリドーマの選択を容易にするために、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）感受性の株を用いることが好ましい。例えばマウス骨髄腫細胞としてはＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１等が、ラット骨髄腫細胞としてはＲ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３等が、ヒト骨髄腫細胞としてはＳＫＯ−００７、ＧＭ１５００−６ＴＧ−２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、ＵＣ７２９−６等が挙げられる。
【０１４３】
融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）］に従って実施することができる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧなどが用いられる。ＰＥＧの分子量は特に制限はないが、低毒性でかつ粘性が比較的低いＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００が好ましい。ＰＥＧ濃度としては例えば１０〜８０％程度、好ましくは３０〜５０％程度が例示される。ＰＥＧの希釈用溶液としては無血清培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０）、５〜２０％程度の血清を含む完全培地、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液等の各種緩衝液を用いることができる。所望によりＤＭＳＯ（例えば、１０〜２０％程度）を添加することもできる。融合液のｐＨとしては、例えば４〜１０程度、好ましくは６〜８程度が挙げられる。
【０１４４】
抗体産生細胞（脾細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常１：１〜２０：１程度であり、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で通常１〜１０分間インキュベート（例えば、ＣＯ２インキュベート）することにより効率よく細胞融合を実施できる。
【０１４５】
抗体産生細胞株はまた、リンパ球を形質転換しうるウイルスに抗体産生細胞を感染させて該細胞を不死化することによっても得ることができる。そのようなウイルスとしては、例えばエプスタイン−バー（ＥＢ）ウイルス等が挙げられる。大多数の人は伝染性単核球症の無症状感染としてこのウイルスに感染した経験があるので免疫を有しているが、通常のＥＢウイルスを用いた場合にはウイルス粒子も産生されるので、適切な精製を行なうべきである。ウイルス混入の可能性のないＥＢシステムとして、Ｂリンパ球を不死化する能力を保持するがウイルス粒子の複製能力を欠損した組換えＥＢウイルス（例えば、潜伏感染状態から溶解感染状態への移行のスイッチ遺伝子における欠損など）を用いることもまた好ましい。
【０１４６】
マーモセット由来のＢ９５−８細胞はＥＢウイルスを分泌しているので、その培養上清を用いれば容易にＢリンパ球を形質転換することができる。この細胞を例えば血清およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）添加培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で培養した後、濾過もしくは遠心分離等により培養上清を分離し、これに抗体産生Ｂリンパ球を適当な濃度（例えば、約１０７細胞／ｍＬ）で浮遊させて、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で通常０．５〜２時間程度インキュベートすることにより抗体産生Ｂ細胞株を得ることができる。ヒトの抗体産生細胞が混合リンパ球として提供される場合、大部分の人はＥＢウイルス感染細胞に対して傷害性を示すＴリンパ球を有しているので、形質転換の頻度を高めるためには、例えばヒツジ赤血球等とＥロゼットを形成させることによってＴリンパ球を予め除去しておくことが好ましい。また、可溶性抗原を結合したヒツジ赤血球を抗体産生Ｂリンパ球と混合し、パーコール等の密度勾配を用いてロゼットを分離することにより標的抗原に特異的なリンパ球を選別することができる。さらに、大過剰の抗原を添加することにより抗原特異的なＢリンパ球はキャップされて表面にＩｇＧを提示しなくなるので、抗ＩｇＧ抗体を結合したヒツジ赤血球と混合すると抗原非特異的なＢリンパ球のみがロゼットを形成する。従って、この混合物からパーコール等の密度勾配を用いてロゼット非形成層を採取することにより、抗原特異的Ｂリンパ球を選別することができる。
【０１４７】
形質転換によって無限増殖能を獲得したヒト抗体分泌細胞は、抗体分泌能を安定に持続させるためにマウスもしくはヒトの骨髄腫細胞と戻し融合させることができる。骨髄腫細胞としては上記と同様のものが用いられうる。
【０１４８】
ハイブリドーマのスクリーニング、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、５〜２０％ＦＣＳを含む動物細胞用培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で行われる。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンの濃度としては、例えばそれぞれ約０．１ｍＭ、約０．４μＭおよび約０．０１６ｍＭ等が挙げられる。ヒト−マウスハイブリドーマの選択にはウワバイン耐性を用いることができる。ヒト細胞株はマウス細胞株に比べてウワバインに対する感受性が高いため、１０−７〜１０−３Ｍ程度で培地に添加することにより未融合のヒト細胞を排除することができる。
【０１４９】
ハイブリドーマの選択にはフィーダー細胞やある種の細胞培養上清を用いることが好ましい。フィーダー細胞としては、ハイブリドーマの出現を助けて自身は死滅するように生存期間が限られた異系の細胞種、ハイブリドーマの出現に有用な増殖因子を大量に産生しうる細胞を放射線照射等して増殖力を低減させたものなどが用いられる。例えば、マウスのフィーダー細胞としては、脾細胞、マクロファージ、血液、胸腺細胞等が挙げられ、ヒトのフィーダー細胞としては、末梢血単核細胞等が挙げられる。細胞培養上清としては、例えば上記の各種細胞の初代培養上清や種々の株化細胞の培養上清が挙げられる。
【０１５０】
また、ハイブリドーマは、抗原を蛍光標識して融合細胞と反応させた後、蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ）を用いて抗原と結合する細胞を分離することによっても選択することができる。この場合、標的抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマを直接選択することができるため、クローニングの労力を大いに軽減することが可能である。
【０１５１】
標的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローニングには、種々の方法が用いられうる。
【０１５２】
アミノプテリンは多くの細胞機能を阻害するため、できるだけ早く培地から除去することが好ましい。マウスやラットの場合、ほとんどの骨髄腫細胞は１０〜１４日以内に死滅するため、融合２週間後からはアミノプテリンを除去することができる。ただし、ヒトハイブリドーマについては通常融合後４〜６週間程度はアミノプテリン添加培地で維持される。ヒポキサンチン、チミジンはアミノプテリン除去後１週間以上後に除去するのが望ましい。すなわち、マウス細胞の場合、例えば融合７〜１０日後にヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）添加完全培地（例えば、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０）の添加または交換を行なう。融合後８〜１４日程度で目視可能なクローンが出現する。クローンの直径が１ｍｍ程度になれば培養上清中の抗体量の測定が可能となる。
【０１５３】
抗体量の測定は、例えば標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチド（抗原決定基として用いた部分アミノ酸配列を含む）を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ）、酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素）、蛍光物質（例えば、フルオレスカミン、フルオレセインイソチオシアネート）、発光物質（例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン）などで標識した抗免疫グロブリン（ＩｇＧ）抗体（もとの抗体産生細胞が由来する動物と同一種の動物由来のＩｇＧに対する抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法、抗ＩｇＧ抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、上記と同様の標識剤で標識した標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチドを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法などによって行なうことができる。
【０１５４】
クローニング方法としては限界希釈法が通常用いられるが、軟寒天を用いたクローニングやＦＡＣＳを用いたクローニング（上述）も可能である。限界希釈法によるクローニングは、例えば以下の手順で行なうことができるが、これに限定されない。
【０１５５】
上記のようにして抗体量を測定して陽性ウェルを選択する。適当なフィーダー細胞を選択して９６ウェルプレートに添加しておく。抗体陽性ウェルから細胞を吸い出し、完全培地（例えば、１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓ添加ＲＭＰＩ１６４０）中に３０細胞／ｍＬの密度となるように浮遊させ、フィーダー細胞を添加したウェルプレートに０．１ｍＬ（３細胞／ウェル）加え、残りの細胞懸濁液を１０細胞／ｍＬに希釈して別のウェルに同様にまき（１細胞／ウェル）、さらに残りの細胞懸濁液を３細胞／ｍＬに希釈して別のウェルにまく（０．３細胞／ウェル）。目視可能なクローンが出現するまで２〜３週間程度培養し、抗体量を測定・陽性ウェルを選択し、再度クローニングする。ヒト細胞の場合はクローニングが比較的困難であるため、１０細胞／ウェルのプレートも調製しておく。通常２回のサブクローニングでモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができるが、その安定性を確認するためにさらに数ヶ月間定期的に再クローニングを行うことが望ましい。
【０１５６】
ハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養することができる。インビトロでの培養法としては、上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、細胞密度を例えば１０５〜１０６細胞／ｍＬ程度に保ちながら、また、ＦＣＳ濃度を徐々に減らしながら、ウェルプレートから徐々にスケールアップしていく方法が挙げられる。
【０１５７】
インビボでの培養法としては、例えば、腹腔内にミネラルオイルを注入して形質細胞腫（ＭＯＰＣ）を誘導したマウス（ハイブリドーマの親株と組織適合性のマウス）に、５〜１０日後に１０６〜１０７細胞程度のハイブリドーマを腹腔内注射し、２〜５週間後に麻酔下で腹水を採取する方法が挙げられる。
【０１５８】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、それ自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法［例：塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ、ＱＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など］に従って行なうことができる。
【０１５９】
以上のようにして、ハイブリドーマを温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、モノクローナル抗体を製造することができる。
【０１６０】
本発明の抗体を癌の予防・治療に利用する場合、該抗体は抗腫瘍活性を持つものでなければならないため、得られたモノクローナル抗体の抗腫瘍活性の程度について調べる必要がある。抗腫瘍活性は、抗体の存在下および非存在下における癌細胞の増殖、細胞接着、アポトーシス誘導などを比較することにより測定することができる。
【０１６１】
好ましい実施形態において、本発明の抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用される。このため、本発明の抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体（具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体など）であり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、後述する方法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、上記したヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定にかつ低コストで提供するためには、後述するヒト抗体産生動物（例えば、マウス）またはファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。
【０１６２】
（ｉ）キメラ抗体の作製
本明細書において「キメラ抗体」とは、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）の配列がある哺乳動物種に由来し、定常領域（ＣＨおよびＣＬ）の配列が他の哺乳動物種に由来する抗体を意味する。可変領域の配列は、例えばマウス等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種由来であることが好ましく、定常領域の配列は投与対象となる哺乳動物種由来であることが好ましい。
【０１６３】
キメラ抗体の作製法としては、例えば米国特許第６，３３１，４１５号明細書に記載の方法あるいはそれを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、まず、上述のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（例えば、マウス−マウスハイブリドーマ）から、常法に従ってｍＲＮＡもしくは全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成する。次いで、該ｃＤＮＡを鋳型として、適当なプライマー（例えば、センスプライマーとしてＶＨおよびＶＬの各Ｎ末端配列をコードする塩基配列を含むオリゴＤＮＡ、アンチセンスプライマーとしてＣＨおよびＣＬのＮ末端配列をコードする塩基配列とハイブリダイズするオリゴＤＮＡ（例えばＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：８８−８９，１９９１参照））を用い、常法に従ってＰＣＲでＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを増幅・精製する。同様の方法により、他の哺乳動物（例えば、ヒト）のリンパ球等より調製したＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法によりＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを増幅・精製する。常法を用いてＶＨとＣＨ、ＶＬとＣＬをそれぞれ連結し、得られたキメラＨ鎖ＤＮＡおよびキメラＬ鎖ＤＮＡを、それぞれ適当な発現ベクター（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウス骨髄腫細胞等で転写活性を有するプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等）を含むベクターなど）に挿入する。両鎖をコードするＤＮＡは別個のベクターに挿入してもよいし、１個のベクターにタンデムに挿入してもよい。得られたキメラＨ鎖およびキメラＬ鎖発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては、動物細胞、例えば上記したマウス骨髄腫細胞の他、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル由来のＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ラット由来のＧＨＳ細胞などが挙げられる。形質転換には、動物細胞に適用可能ないかなる方法を用いてもよいが、好ましくはエレクトロポレーション法などが挙げられる。宿主細胞に適した培地中で一定期間培養後、培養上清を回収して上記と同様の方法で精製することにより、キメラモノクローナル抗体を単離することができる。あるいは、宿主細胞としてウシ、ヤギ、ニワトリ等のトランスジェニック技術が確立し、かつ家畜（家禽）として大量繁殖のノウハウが蓄積されている動物の生殖系列細胞を用い、常法によってトランスジェニック動物を作製することにより、得られる動物の乳汁もしくは卵から容易にかつ大量にキメラモノクローナル抗体を得ることもできる。さらに、トウモロコシ、イネ、コムギ、ダイズ、タバコなどのトランスジェニック技術が確立し、かつ主要作物として大量に栽培されている植物細胞を宿主細胞として、プロトプラストへのマイクロインジェクションやエレクトロポレーション、無傷細胞へのパーティクルガン法やＴｉベクター法などを用いてトランスジェニック植物を作製し、得られる種子や葉などから大量にキメラモノクローナル抗体を得ることも可能である。
【０１６４】
得られたキメラモノクローナル抗体をパパインで分解すればＦａｂが、ペプシンで分解すればＦ（ａｂ’）２がそれぞれ得られる。
【０１６５】
また、マウスＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを適当なリンカー、例えば１〜４０アミノ酸、好ましくは３〜３０アミノ酸、より好ましくは５〜２０アミノ酸からなるペプチド（例：［Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）ｍ］ｎもしくは［（Ｇｌｙ）ｍ−Ｓｅｒ］ｎ（ｍは０〜１０の整数、ｎは１〜５の整数）等）をコードするＤＮＡを介して連結することによりｓｃＦｖとすることができ、さらにＣＨ３をコードするＤＮＡを適当なリンカーを介して連結することによりｍｉｎｉｂｏｄｙモノマーとしたり、ＣＨ全長をコードするＤＮＡを適当なリンカーを介して連結することによりｓｃＦｖ−Ｆｃとすることもできる。このような遺伝子工学的に修飾（共役）された抗体分子をコードするＤＮＡは、適当なプロモーターの制御下におくことにより大腸菌や酵母などの微生物で発現させることができ、大量に抗体分子を生産することができる。
【０１６６】
マウスＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを１つのプロモーターの下流にタンデムに挿入して大腸菌に導入すると、モノシストロニックな遺伝子発現によりＦｖと呼ばれる二量体を形成する。また、分子モデリングを用いてＶＨおよびＶＬのＦＲ中の適当なアミノ酸をＣｙｓに置換すると、両鎖の分子間ジスルフィド結合によりｄｓＦｖと呼ばれる二量体が形成される。
【０１６７】
（ｉｉ）ヒト化抗体
本明細書において「ヒト化抗体」とは、可変領域に存在する相補性決定領域（ＣＤＲ）以外のすべての領域（すなわち、定常領域および可変領域中のフレームワーク領域（ＦＲ））の配列がヒト由来であり、ＣＤＲの配列のみが他の哺乳動物種由来である抗体を意味する。他の哺乳動物種としては、例えばマウス等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種が好ましい。
【０１６８】
ヒト化抗体の作製法としては、例えば米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号および第５，６９３，７６２号に記載される方法あるいはそれらを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、上記キメラ抗体の場合と同様にして、ヒト以外の哺乳動物種（例えば、マウス）由来のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを単離した後、常法により自動ＤＮＡシークエンサー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製等）を用いてシークエンスを行い、得られる塩基配列もしくはそこから推定されるアミノ酸配列を公知の抗体配列データベース［例えば、Ｋａｂａｔ ｄａｔａｂａｓｅ（Ｋａｂａｔら，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ編，第５版，１９９１参照）等］を用いて解析し、両鎖のＣＤＲおよびＦＲを決定する。決定されたＦＲ配列に類似したＦＲ配列を有するヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖をコードする塩基配列［例：ヒトκ型Ｌ鎖サブグループＩおよびヒトＨ鎖サブグループＩＩもしくはＩＩＩ（Ｋａｂａｔら，１９９１（上述）を参照）］のＣＤＲコード領域を、決定された異種ＣＤＲをコードする塩基配列で置換した塩基配列を設計し、該塩基配列を２０〜４０塩基程度のフラグメントに区分し、さらに該塩基配列に相補的な配列を、前記フラグメントと交互にオーバーラップするように２０〜４０塩基程度のフラグメントに区分する。各フラグメントをＤＮＡシンセサイザーを用いて合成し、常法に従ってこれらをハイブリダイズさせ、ライゲーションすることにより、ヒト由来のＦＲと他の哺乳動物種由来のＣＤＲを有するＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを構築することができる。より迅速かつ効率的に他の哺乳動物種由来ＣＤＲをヒト由来ＶＨおよびＶＬに移植するには、ＰＣＲによる部位特異的変異誘発を用いることが好ましい。そのような方法としては、例えば特開平５−２２７９７０号公報に記載の逐次ＣＤＲ移植法等が挙げられる。このようにして得られるＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを、上記キメラ抗体の場合と同様の方法でヒト由来のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡとそれぞれ連結して適当な宿主細胞に導入することにより、ヒト化抗体を産生する細胞あるいはトランスジェニック動植物を得ることができる。
【０１６９】
ヒト化抗体もキメラ抗体と同様に遺伝子工学的手法を用いてｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、Ｆｖなどに改変することができ、適当なプロモーターを用いることで大腸菌や酵母などの微生物でも生産させることができる。
【０１７０】
ヒト化抗体作製技術は、例えばハイブリドーマの作製技術が確立していない他の動物種に好ましく投与しうるモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されている動物やイヌやネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。
【０１７１】
（ｉｉｉ）ヒト抗体産生動物を用いた完全ヒト抗体の作製
内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子をノックアウト（ＫＯ）した非ヒト温血動物に機能的なヒトＩｇ遺伝子を導入し、これを抗原で免疫すれば、該動物由来の抗体の代わりにヒト抗体が産生される。従って、マウス等のようにハイブリドーマ作製技術が確立している動物を用いれば、従来のマウスモノクローナル抗体の作製と同様の方法によって完全ヒトモノクローナル抗体を取得することが可能となる。まず、ヒトＩｇのＨ鎖およびＬ鎖のミニ遺伝子を通常のトランスジェニック（Ｔｇ）技術を用いて導入したマウスと、内因性マウスＩｇ遺伝子を通常のＫＯ技術を用いて不活性化したマウスとを交配して得られたヒト抗体産生マウス（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１７，３９１−３９７（１９９６）を参照）を用いて作製されたヒトモノクローナル抗体のいくつかは既に臨床段階にあり、現在までのところ抗ヒトＩｇヒト抗体（ＨＡＨＡ）の産生は報告されていない。
【０１７２】
その後、Ａｂｇｅｎｉｘ社［商品名：ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１５，１４６−１５６（１９９７）；米国特許第５，９３９，５９８号等を参照）］やＭｅｄａｒｅｘ社［商品名：Ｈｕ−Ｍａｂ Ｍｏｕｓｅ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４，８４５−８５１（１９９６）；米国特許第５，５４５，８０６号等を参照）］が酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターを用いてより大きなヒトＩｇ遺伝子を導入したＴｇマウスを作製し、よりレパートリーに富んだヒト抗体を産生し得るようになった。しかしながら、ヒトＩｇ遺伝子は、例えばＨ鎖の場合、約８０種のＶ断片、約３０種のＤ断片および６種のＪ断片が様々に組み合わされたＶＤＪエクソンが抗原結合部位をコードすることによりその多様性を実現しているため、その全長はＨ鎖が約１．５Ｍｂ（１４番染色体）、κＬ鎖が約２Ｍｂ（２番染色体）、λＬ鎖が約１Ｍｂ（２２番染色体）に達する。ヒトにおけるのと同様の多様な抗体レパートリーを他の動物種で再現するためには、各Ｉｇ遺伝子の全長を導入することが望ましいが、従来の遺伝子導入ベクター（プラスミド、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ等）に挿入可能なＤＮＡは通常数ｋｂ〜数百ｋｂであり、クローニングしたＤＮＡを受精卵に注入する従来のトランスジェニック動物作製技術では全長の導入は困難であった。
【０１７３】
Ｔｏｍｉｚｕｋａら（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１６，１３３−１４３（１９９７））は、Ｉｇ遺伝子を担持するヒト染色体の自然断片（ｈＣＦ）をマウスに導入して（染色体導入（ＴＣ）マウス）、完全長ヒトＩｇ遺伝子を有するマウスを作製した。すなわち、まず、Ｈ鎖遺伝子を含む１４番染色体およびκＬ鎖遺伝子を含む２番染色体を例えば薬剤耐性マーカー等で標識したヒト染色体を有するヒト−マウスハイブリッド細胞を４８時間程度紡錘糸形成阻害剤（例えば、コルセミド）で処理して、１本〜数本の染色体もしくはその断片が核膜に被包されたミクロセルを調製し、微小核融合法によりマウスＥＳ細胞に染色体を導入する。薬剤を含む培地を用いてヒトＩｇ遺伝子を有する染色体もしくはその断片を保持するハイブリッドＥＳ細胞を選択し、通常のＫＯマウス作製の場合と同様の方法によりマウス胚へ顕微注入する。得られるキメラマウスからコートカラーを指標にする等して生殖系列キメラを選択し、ヒト１４番染色体断片を伝達するＴＣマウス系統（ＴＣ（ｈＣＦ１４））およびヒト２番染色体断片を伝達するＴＣマウス系統（ＴＣ（ｈＣＦ２））を樹立する。常法により内因性Ｈ鎖遺伝子およびκＬ鎖遺伝子をＫＯされたマウス（ＫＯ（ＩｇＨ）およびＫＯ（Ｉｇκ））を作製し、これら４系統の交配を繰り返すことにより、４種の遺伝子改変をすべて有するマウス系統（ダブルＴＣ／ＫＯ）を樹立することができる。
【０１７４】
上記のようにして作製されるダブルＴＣ／ＫＯマウスに、通常のマウスモノクローナル抗体を作製する場合と同様の方法を適用すれば、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することができる。しかしながら、κＬ鎖遺伝子を含むｈＣＦ２がマウス細胞内で不安定なため、ハイブリドーマ取得効率は通常のマウスの場合に比べて低いという欠点がある。
【０１７５】
一方、前記Ｈｕ−Ｍａｂ ＭｏｕｓｅはκＬ鎖遺伝子の約５０％を含むが、可変領域クラスターが倍加した構造を有するため完全長を含む場合と同等のκ鎖の多様性を示し（他方、Ｈ鎖遺伝子は約１０％しか含まないのでＨ鎖の多様性は低く、抗原に対する応答性が不十分である）、かつＹＡＣベクター（Ｉｇκ−ＹＡＣ）によりマウス染色体中に挿入されているので、マウス細胞内で安定に保持される。この利点を生かし、ＴＣ（ｈＣＦ１４）マウスとＨｕ−Ｍａｂ Ｍｏｕｓｅとを交配してｈＣＦ１４とＩｇκ−ＹＡＣとを安定に保持するマウス（商品名：ＫＭマウス）を作製することにより、通常のマウスと同等のハイブリドーマ取得効率および抗体の抗原親和性を得ることができる。
【０１７６】
さらに、より完全にヒトにおける多様な抗体レパートリーを再現するために、λＬ鎖遺伝子をさらに導入したヒト抗体産生動物を作製することもできる。かかる動物は、上記と同様の方法でλＬ鎖遺伝子を担持するヒト２２番染色体もしくはその断片を導入したＴＣマウス（ＴＣ（ｈＣＦ２２））を作製し、これと上記ダブルＴＣ／ＫＯマウスやＫＭマウスとを交配することにより得ることもできるし、あるいは、例えばＨ鎖遺伝子座とλＬ鎖遺伝子座とを含むヒト人工染色体（ＨＡＣ）を構築してマウス細胞に導入することにより得ることもできる（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８，１０８６−１０９０（２０００））。
【０１７７】
本発明の抗体を医薬品として利用する場合はモノクローナル抗体であることが好ましいが、ポリクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体がポリクローナル抗体である場合には、ハイブリドーマの利用を要しないので、ハイブリドーマ作製技術は確立されていないがトランスジェニック技術は確立されている動物種、好ましくはウシ等の有蹄動物を用いて、上記と同様の方法によりヒト抗体産生動物を作製すれば、より大量のヒト抗体を安価に製造することも可能である（例えば、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０，８８９−８９４（２００２）を参照）。得られるヒトポリクローナル抗体は、ヒト抗体産生動物の血液、腹水、乳汁、卵など、好ましくは乳汁、卵を採取し、上記と同様の精製技術を組み合わせることによって精製することができる。
【０１７８】
（ｉｖ）ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体の作製
完全ヒト抗体を作製するもう１つのアプローチは、ファージディスプレイを用いる方法である。この方法はＰＣＲによる変異がＣＤＲ以外に導入される場合があり、そのため臨床段階で少数のＨＡＨＡ産生の報告例があるが、その一方で宿主動物に由来する異種間ウイルス感染の危険性がない点や抗体の特異性が無限である（禁止クローンや糖鎖などに対する抗体も容易に作製可能）等の利点を有している。
【０１７９】
ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーの作製方法としては、例えば、以下のものが挙げられるが、これに限定されない。
【０１８０】
用いられるファージは特に限定されないが、通常繊維状ファージ（Ｆｆバクテリオファージ）が好ましく用いられる。ファージ表面に外来タンパク質を提示する方法としては、ｇ３ｐ、ｇ６ｐ〜ｇ９ｐのコートタンパク質のいずれかとの融合タンパク質として該コートタンパク質上で発現・提示させる方法が挙げられるが、よく用いられるのはｇ３ｐもしくはｇ８ｐのＮ末端側に融合させる方法である。ファージディスプレイベクターとしては、１）ファージゲノムのコートタンパク質遺伝子に外来遺伝子を融合した形で導入して、ファージ表面上に提示されるコートタンパク質をすべて外来タンパク質との融合タンパク質として提示させるものの他、２）融合タンパク質をコードする遺伝子を野生型コートタンパク質遺伝子とは別に挿入して、融合タンパク質と野生型コートタンパク質とを同時に発現させるものや、３）融合タンパク質をコードする遺伝子を有するファージミドベクターを持つ大腸菌に野生型コートタンパク質遺伝子を有するヘルパーファージを感染させて融合タンパク質と野生型コートタンパク質とを同時に発現するファージ粒子を産生させるものなどが挙げられるが、１）の場合は大きな外来タンパク質を融合させると感染能力が失われるため、抗体ライブラリーの作製のためには２）または３）のタイプが用いられる。
【０１８１】
具体的なベクターとしては、Ｈｏｌｔら（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１，４５−４４９（２０００））に記載されるものが例示される。例えば、ｐＣＥＳ１（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，１８２１８−１８２３０（１９９９）を参照）は、１つのラクトースプロモーターの制御下にｇ３ｐのシグナルペプチドの下流にκＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡとｇ３ｐシグナルペプチドの下流にＣＨ３をコードするＤＮＡ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ｃ−ｍｙｃ ｔａｇ、アンバー終止コドン（ＴＡＧ）を介してｇ３ｐコード配列とが配置されたＦａｂ発現型ファージミドベクターである。アンバー変異を有する大腸菌に導入するとｇ３ｐコートタンパク質上にＦａｂを提示するが、アンバー変異を持たないＨＢ２１５１株などで発現させると可溶性Ｆａｂ抗体を産生する。また、ｓｃＦｖ発現型ファージミドベクターとしては、例えばｐＨＥＮ１（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，５８１−５９７（１９９１））等が用いられる。
【０１８２】
一方、ヘルパーファージとしては、例えばＭ１３−Ｋ０７、ＶＣＳＭ１３等が挙げられる。
【０１８３】
また、別のファージディスプレイベクターとして、抗体遺伝子の３’末端とコートタンパク質遺伝子の５’末端にそれぞれシステインをコードするコドンを含む配列を連結し、両遺伝子を同時に別個に（融合タンパク質としてではなく）発現させて、導入されたシステイン残基同士によるＳ−Ｓ結合を介してファージ表面のコートタンパク質上に抗体を提示しうるようにデザインされたもの（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ社のＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭ技術）等も挙げられる。
【０１８４】
ヒト抗体ライブラリーの種類としては、ナイーブ／非免疫（ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）ライブラリー、合成ライブラリー、免疫ライブラリー等が挙げられる。
【０１８５】
ナイーブ／非免疫ライブラリーは、正常なヒトが保有するＶＨおよびＶＬ遺伝子をＲＴ−ＰＣＲ法により取得し、それらをランダムに上記のファージディスプレイベクターにクローニングして得られるライブラリーである。通常、正常人の末梢血、骨髄、扁桃腺などのリンパ球由来のｍＲＮＡ等が鋳型として用いられる。疾病履歴などのＶ遺伝子のバイアスをなくすため、抗原感作によるクラススイッチが起こっていないＩｇＭ由来のｍＲＮＡのみを増幅したものを特にナイーブライブラリーと呼んでいる。代表的なものとしては、ＣＡＴ社のライブラリー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，５８１−５９７（１９９１）；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４，３０９−３１４（１９９６９を参照）、ＭＲＣ社のライブラリー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２，４３３−４５５（１９９４）を参照）、Ｄｙａｘ社のライブラリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９（上述）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１４，７９６９−７９７４（２０００）を参照）等が挙げられる。
【０１８６】
合成ライブラリーは、ヒトＢ細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、Ｖ遺伝子断片の、例えばＣＤＲ３等の抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするＤＮＡで置換し、ライブラリー化したものである。最初から機能的なｓｃＦｖやＦａｂを産生するＶＨおよびＶＬ遺伝子の組み合わせでライブライリーを構築できるので、抗体の発現効率や安定性に優れているとされる。代表的なものとしては、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ社のＨｕＣＡＬライブラリー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９６，５７−８６（２０００）を参照）、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ社のライブラリー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８，８５２（２０００）を参照）、Ｃｒｕｃｅｌｌ社のライブラリー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，３９３８（１９９５）；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２７２，２１９−２３３（２００３）を参照）等が挙げられる。
【０１８７】
免疫（ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）ライブラリーは、癌、自己免疫疾患、感染症等の患者やワクチン接種を受けた者など、標的抗原に対する血中抗体価が上昇したヒトから採取したリンパ球、あるいは上記体外免疫法により標的抗原を人為的に免疫したヒトリンパ球等から、上記ナイーブ／非免疫ライブラリーの場合と同様にしてｍＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ法によってＶＨおよびＶＬ遺伝子を増幅し、ライブラリー化したものである。最初から目的の抗体遺伝子がライブラリー中に含まれるので、比較的小さなサイズのライブラリーからでも目的の抗体を得ることができる。
【０１８８】
ライブラリーの多様性は大きいほどよいが、現実的には、以下のパンニング操作で取り扱えるファージ数（１０１１〜１０１３ファージ）と通常のパンニングでクローンの単離および増幅に必要なファージ数（１００〜１，０００ファージ／クローン）を考慮すれば、１０８〜１０１１クローン程度が適当であり、約１０８クローンのライブラリーで通常１０−９オーダーのＫｄ値を有する抗体をスクリーニングすることができる。
【０１８９】
標的抗原に対する抗体をファージディスプレイ法で選別する工程をパンニングという。具体的には、例えば、抗原を固定化した担体とファージライブラリーとを接触させ、非結合ファージを洗浄除去した後、結合したファージを担体から溶出させ、大腸菌に感染させて該ファージを増殖させる、という一連の操作を３〜５回程度繰り返すことにより抗原特異的な抗体を提示するファージを濃縮する。抗原を固定化する担体としては、通常の抗原抗体反応やアフィニティークロマトグラフィーで用いられる各種担体、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス、金属などからなるマイクロプレート、チューブ、メンブレン、カラム、ビーズなど、さらには表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサーチップなどが挙げられる。抗原の固定化には物理的吸着を用いてもよく、また、通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。例えばビオチン−（ストレプト）アビジン系等が好ましく用いられる。標的抗原である内因性リガンドがペプチドなどの小分子である場合には、抗原決定基として用いた部分が担体との結合により被覆されないように特に注意する必要がある。非結合ファージの洗浄には、ＢＳＡ溶液などのブロッキング液（１−２回）、Ｔｗｅｅｎ等の界面活性剤を含むＰＢＳ（３−５回）などを順次用いることができる。クエン酸緩衝液（ｐＨ５）などの使用が好ましいとの報告もある。特異的ファージの溶出には、通常酸（例えば、０．１Ｍ塩酸など）が用いられるが、特異的プロテアーゼによる切断（例えば、抗体遺伝子とコートタンパク質遺伝子との連結部にトリプシン切断部位をコードする遺伝子配列を導入することができる。この場合、溶出するファージ表面には野生型コートタンパク質が提示されるので、コートタンパク質のすべてが融合タンパク質として発現しても大腸菌への感染・増殖が可能となる）や可溶性抗原による競合的溶出、あるいはＳ−Ｓ結合の還元（例えば、前記したＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭでは、パンニングの後、適当な還元剤を用いて抗体とコートタンパク質とを解離させることにより抗原特異的ファージを回収することができる）による溶出も可能である。酸で溶出した場合は、トリスなどで中和した後で溶出ファージを大腸菌に感染させ、培養後、常法によりファージを回収する。
【０１９０】
パンニングにより抗原特異的抗体を提示するファージが濃縮されると、これらを大腸菌に感染させた後プレート上に播種してクローニングを行なう。再度ファージを回収し、上述の抗体価測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ等）やＦＡＣＳあるいはＳＰＲを利用した測定により抗原結合活性を確認する。
【０１９１】
選択された抗原特異的抗体を提示するファージクローンからの抗体の単離・精製は、例えば、ファージディスプレイベクターとして抗体遺伝子とコートタンパク質遺伝子の連結部にアンバー終止コドンが導入されたベクターを用いる場合には、該ファージをアンバー変異を持たない大腸菌（例えば、ＨＢ２１５１株）に感染させると、可溶性抗体分子が産生されペリプラズムもしくは培地中に分泌されるので、細胞壁をリゾチームなどで溶解して細胞外画分を回収し、上記と同様の精製技術を用いて行うことができる。Ｈｉｓ−ｔａｇやｃ−ｍｙｃ ｔａｇを導入しておけば、ＩＭＡＣや抗ｃ−ｍｙｃ抗体カラムなどを用いて容易に精製することができる。また、パンニングの際に特異的プロテアーゼによる切断を利用する場合には、該プロテアーゼを作用させると抗体分子がファージ表面から分離されるので、同様の精製操作を実施することにより目的の抗体を精製することができる。
ヒト抗体産生動物およびファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体作製技術は、他の動物種のモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されている動物やイヌやネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。非ヒト動物においては標的抗原の人為的免疫に対する倫理的問題が少ないので、免疫ライブラリーの利用がより有効である。
【０１９２】
（３）ポリクローナル抗体の作製
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質もしくはペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
【０１９３】
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアータンパク質とハプテンとの混合比は、キャリアータンパク質に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜約２０、好ましくは約１〜約５の割合でカップリングさせる方法が用いられる。
【０１９４】
また、ハプテンとキャリアータンパク質のカップリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
【０１９５】
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体として、あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約１〜約６週毎に１回ずつ、計約２〜約１０回程度行なわれる。
【０１９６】
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
【０１９７】
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【０１９８】
目的のポリヌクレオチドの標的領域と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、すなわち、目的のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、該目的ポリヌクレオチドに対して「アンチセンス」であるということができる。
【０１９９】
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ（以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを「本発明のＤＮＡ」とも称する））の塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）の塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制しうる作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよい。
【０２００】
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の塩基配列と、オーバーラップする領域に関して、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性（ホモロジー（ｈｏｍｏｌｏｇｙ））を有する塩基配列である。ここで「相同性」とは、前記した本発明のＤＮＡの場合と同義である。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列のうち、（ａ）翻訳阻害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、本発明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、（ｂ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、イントロンを含む本発明のＤＮＡの全塩基配列の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。
【０２０１】
具体的には、配列番号：１、配列番号：３、もしくは配列番号：５で表わされる塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチド、好ましくは、例えば、配列番号：１、配列番号：３、もしくは配列番号：５で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
【０２０２】
本発明のＤＮＡの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチド（以下、「本発明のアンチセンスポリヌクレオチド」とも称する）は、クローン化した、あるいは決定された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づいて、設計・合成されうる。かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子（以下、単に「本発明の遺伝子」とも称する）の複製または発現を阻害することができる。すなわち、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明の遺伝子から転写されるＲＮＡ（ｍＲＮＡまたは初期転写産物）とハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセシング）または機能（タンパク質への翻訳）を阻害することができるか、あるいは本発明の遺伝子に関連するＲＮＡとの相互作用を介して本発明の遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明の遺伝子に関連するＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明の遺伝子に関連するＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明の遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。
【０２０３】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの標的領域は、アンチセンスポリヌクレオチドがハイブリダイズすることにより、結果として本発明のタンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該タンパク質をコードするｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１０塩基程度、長いものでｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約１０〜約４０塩基、特に約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、これに限定されない。具体的には、本発明の遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’末端６−ベースペア・リピート、５’末端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’末端非翻訳領域、３’末端パリンドローム領域または３’末端ヘアピンループなどが、アンチセンスポリヌクレオチドの好ましい標的領域として選択されうるが、本発明の遺伝子内のいかなる領域も対象として選択されうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもできる。
【０２０４】
さらに、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質のｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡである本発明の遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害しうるものであってもよい。あるいはＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成してＲＮａｓｅＨによる分解を誘導するものであってもよい。
【０２０５】
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスポリヌクレオチドを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。また、各ヌクレオチドの糖（デオキシリボース）は、２’−Ｏ−メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、塩基部分（ピリミジン、プリン）も化学修飾を受けたものであってもよく、配列番号：１、配列番号：３、もしくは配列番号：５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするものであればいずれのものでもよい。
【０２０６】
アンチセンスポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであってもよく、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいてもよい。このような修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってもよい。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基が、ハロゲンや脂肪族基などで置換されていたり、またはエーテル、アミンなどの官能基に変換されたりしていてもよい。
【０２０７】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては、核酸の硫黄誘導体、チオホスフェート誘導体、ポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものなどが挙げられる。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、以下のように設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンスポリヌクレオチドをより安定なものにする、アンチセンスポリヌクレオチドの細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、また、もし毒性があるような場合はアンチセンスポリヌクレオチドの毒性をより小さなものにする。このような修飾は、例えばＰｈａｒｍ Ｔｅｃｈ Ｊａｐａｎ，８，２４７頁または３９５頁（１９９２）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）などで数多く報告されている。
【０２０８】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化を加えられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していてもよく、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができる。かような付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大させたりするような脂質（例えば、リン脂質、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するのに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’末端または５’末端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができる。その他の基としては、核酸の３’末端または５’末端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、これに限定されない。
【０２０９】
本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムもまた、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに包含されうる。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡを意味するが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているため、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限り、ＤＮＡもまた、「リボザイム」の概念に包含されうる。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーへッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。本発明のタンパク質のｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡへリカーゼと特異的に結合しうるウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（１０），５５７２−５５７７（２００１）］。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９（１３），２７８０−２７８８（２００１）］。
【０２１０】
本明細書においては、本発明のタンパク質のｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的なオリゴＲＮＡとその相補鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ、いわゆるｓｉＲＮＡもまた、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに包含されるものとして定義される。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Ｎａｔｕｒｅ，４１１（６８３６），４９４−４９８（２００１）］、リボザイムの代替技術として汎用されている。ｓｉＲＮＡは標的となるｍＲＮＡの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例えば、ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて適宜設計することができる。
【０２１１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムは、本発明の遺伝子のｃＤＮＡ配列もしくはゲノムＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。ｓｉＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼを用いてライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。あるいは、ｓｉＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を適当な長さ（例えば約３〜約１０塩基）のリンカーを介して連結したＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）として合成し、導入する動物細胞内の酵素ダイサー（ｄｉｃｅｒ）などによってプロセシングされるように設計することもできる。さらには、センス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡがそれぞれ別個のＵ６やＨ１などのＰｏｌ ＩＩＩ系プロモーターの制御下におかれた発現ベクター、あるいは上記センス鎖とアンチセンス鎖とをリンカーを介して連結したＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡがＰｏｌ ＩＩＩ系プロモーターの制御下におかれた発現ベクターとして調製し、動物細胞内で発現させ、ｓｉＲＮＡを形成させてもよい。
【０２１２】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、本発明の遺伝子を導入した形質転換体、生体内や生体外の本発明の遺伝子発現系、または生体内や生体外の本発明のタンパク質翻訳系を用いて調べることができる。
【０２１３】
以下に、本発明のタンパク質またはその部分ペプチド（以下、単に「本発明のタンパク質」とも称する）、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、単に「本発明のＤＮＡ」とも称する）、上述の本発明の抗体、上述の本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの用途を説明する。
【０２１４】
本発明のタンパク質は、癌組織で発現が増加するので、疾患マーカーとして利用することができる。すなわち、癌組織における早期診断、症状の重症度の判定、疾患進行の予測のためのマーカーとして有用である。
【０２１５】
さらに、本発明のタンパク質（ＥＶＩ１、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４）について、その発現および／または活性を阻害することにより、癌細胞の細胞接着が阻害される。このため、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、本発明の抗体、あるいは上記タンパク質の発現および／または活性を阻害する物質（例えば、低分子化合物）を含有する医薬は、癌細胞の細胞接着阻害剤、従って、癌（例えば、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、造血器腫瘍（例えば、急性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病等）など）の予防・治療剤（好ましくは、造血器腫瘍の予防・治療剤、より好ましくは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の予防・治療剤）として用いられうる。また、他の実施形態として、上記医薬は、当該医薬以外の抗癌剤と併用された際に、癌細胞の前記抗癌剤に対する感受性を向上させるための剤（薬剤感受性向上剤）としても用いられうる。なお、本明細書において「癌細胞」とは、将来的に癌化するように方向づけられている細胞をも含む概念として用いられる。
【０２１６】
後述する実施例に記載のように、本発明者らがＩＴＧＡ６遺伝子・タンパク質およびＩＴＧＢ４遺伝子・タンパク質の発現をヒト造血幹細胞とヒト白血病細胞とで比較したところ、これらの遺伝子・タンパク質は造血幹細胞には発現せず、白血病細胞のみに高度に発現していることが確認された。従って、本発明においては、特にＩＴＧＡ６（タンパク質＝配列番号：４、遺伝子＝配列番号：３）およびＩＴＧＢ４（タンパク質＝配列番号：６、遺伝子＝配列番号：５）を標的とすることが、副作用の低減効果も得られるという観点からはより好ましい。このことは、以下の本発明の抗体や本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに関する形態についても同様である。
【０２１７】
本発明の抗体（中和抗体）は、本発明のタンパク質の活性を中和することができる。このため、本発明の抗体（中和抗体）は、癌細胞の細胞接着阻害剤、癌（例えば、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、造血器腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、造血器腫瘍（例えば、急性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病等）など）の予防・治療剤（好ましくは、造血器腫瘍の予防・治療剤、より好ましくは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の予防・治療剤）として用いられうる。また、他の実施形態として、本発明の抗体（中和抗体）は、当該抗体以外の抗癌剤と併用された際に、癌細胞の前記抗癌剤に対する感受性を向上させるための剤（薬剤感受性向上剤）としても用いられうる。なお、本発明において「中和」とは、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）、癌細胞の増殖シグナルの阻害（狭義の中和活性）、アポトーシスの誘導など（これらに限定されない）を包括した概念として定義される。
【０２１８】
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防・治療剤、細胞接着阻害剤、薬剤感受性向上剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例えば、血管内投与、皮下投与、筋肉内投与など）に投与することができる。
【０２１９】
本発明の抗体は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体およびその塩と薬理学的に許容されうる担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってもよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
【０２２０】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含してもよい。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
【０２２１】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していてもよい。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、ショ糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【０２２２】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
【０２２３】
本発明の抗体を含有する上記製剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与経路などによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【０２２４】
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容されうる担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例えば、血管内注射、皮下注射など）に適する剤形として提供される。
【０２２５】
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【０２２６】
さらに、本発明の抗体は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例えば、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、５−フルオロウラシル等）、抗癌性抗生物質（例えば、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシド、イリノテカンなどと併用してもよい。本発明の抗体および上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。かような形態において、本発明の抗体は、癌細胞の上記薬剤に対する感受性を向上させるための剤（薬剤感受性向上剤）として機能しうる。ただし、かような機能が発揮される形態のみに本発明の技術的範囲が限定されるわけではない。
【０２２７】
（２）アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明の遺伝子の転写産物に相補的に結合し、該遺伝子の発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質または本発明の遺伝子の機能や作用を抑制し、癌細胞の細胞接着を阻害することができる。このため、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、癌細胞の細胞接着阻害剤、癌（例えば、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、造血器腫瘍（例えば、急性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病等）など）の予防・治療剤（好ましくは、造血器腫瘍の予防・治療剤、より好ましくは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の予防・治療剤）として使用することができる。また、他の実施形態として、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、当該アンチセンスポリヌクレオチド以外の抗癌剤と併用された際に、癌細胞の前記抗癌剤に対する感受性を向上させるための剤（薬剤感受性向上剤）としても用いられうる。
【０２２８】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤、細胞接着阻害剤、薬剤感受性向上剤などとして使用する場合には、それ自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
【０２２９】
また、例えば、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
【０２３０】
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。
【０２３１】
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与経路などにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約０．１〜約１００ｍｇ投与する。
【０２３２】
本発明のタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を含むポリヌクレオチド（「本発明のセンスポリヌクレオチド」とも称する）および本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明の遺伝子の発現状況を調べるための診断用ヌクレオチドプローブ（もしくはプライマー）として使用することもできる。
【０２３３】
（３）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質は、癌組織で発現が亢進しており、さらに、ＥＶＩ１、ＩＴＧＡ６、またはＩＴＧＢ４タンパク質の発現および／または活性を阻害すると、癌細胞の細胞接着が阻害されうる。従って、ＥＶＩ１、ＩＴＧＡ６、またはＩＴＧＢ４タンパク質の発現および／または活性を阻害する化合物またはその塩は、癌細胞の細胞接着阻害剤、癌（例えば、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、造血器腫瘍（例えば、急性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病等）など）の予防・治療剤（好ましくは、造血器腫瘍の予防・治療剤、より好ましくは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の予防・治療剤）として用いられうる。
【０２３４】
従って、本発明のタンパク質（ＥＶＩ１、ＩＴＧＡ６、およびＩＴＧＢ４）は、該タンパク質の発現および／または活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
【０２３５】
すなわち、本発明の他の形態によれば、本発明のタンパク質を用いる、該タンパク質の発現および／または活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法が提供される。
【０２３６】
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする場合、該スクリーニング方法は、
（ａ−１）単離された本発明のタンパク質の活性を、被験物質の存在下と非存在下とで比較する方法と、
（ａ−２）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下で培養し、両条件下における本発明のタンパク質の活性を比較する方法とに大別される。
【０２３７】
上記（ａ−１）のスクリーニング方法において用いられる本発明のタンパク質は、上記した本発明のタンパク質またはその部分ペプチドの製造方法を用いて、単離・精製することができる。
【０２３８】
上記（ａ−２）のスクリーニング方法において用いられる本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、それを生来発現しているヒトもしくは他の温血動物細胞またはそれを含む生体試料（例えば、血液、組織、臓器等）であれば特に制限はないが、例えば、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ等が挙げられる。非ヒト動物由来の血液、組織、臓器等の場合は、それらを生体から単離して培養してもよいし、あるいは生体に被験物質を投与し、一定時間経過後にそれら生体試料を単離してもよい。
【０２３９】
また、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、上記の遺伝子工学的手法により作製された各種の形質転換体が例示される。宿主としては、例えば、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。
【０２４０】
被験物質としては、例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
【０２４１】
上記（ａ−１）のスクリーニング方法における本発明のタンパク質の活性の測定は、例えば、（ｉ）本発明のタンパク質、または（ｉｉ）本発明のタンパク質および被験物質を、本発明のタンパク質により細胞接着が活性化される温血動物細胞と接触させ、該細胞における細胞接着の程度を測定することによって行なうことができる。また、上記（ａ−２）のスクリーニング方法における本発明のタンパク質の活性の測定は、該本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞における細胞接着を測定することによって行うことができる。
【０２４２】
細胞接着の程度を指標とする場合には、細胞を適当な培地または緩衝液に懸濁し、被験物質を添加し（あるいは添加せずに）、さらに酸化ストレス（例えば、Ｈ２Ｏ２添加）等の刺激を加えて、通常約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約６〜７２時間インキュベートした後、アポトーシス（細胞死）誘導率を測定する。
【０２４３】
細胞接着は、例えば、被験物質の存在下／非存在下における細胞数を検出することにより調べることができる。具体的には、例えば、ＰＢＳ洗浄後における残存細胞数を測定することにより、細胞接着の程度を比較することが可能となる。
【０２４４】
例えば、上記（ａ−１）のスクリーニング方法において、被験物質の存在下における本発明のタンパク質の活性が、被験物質の非存在下における活性に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害された場合に、該被験物質を、本発明のタンパク質の活性阻害物質として選択することができる。
【０２４５】
上述のように、本発明のタンパク質（ＥＶＩ１、ＩＴＧＡ６、およびＩＴＧＢ４タンパク質）の発現を阻害する物質は、癌細胞の細胞接着阻害、従って癌の予防・治療に有効である。
【０２４６】
すなわち、本発明のさらに他の形態によれば、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞における該タンパク質の発現を、被験物質の存在下と非存在下で比較する、癌細胞の細胞接着阻害物質、癌の予防・治療物質のスクリーニング方法が提供される。
【０２４７】
本発明のタンパク質の発現量は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるポリヌクレオチド（すなわち、上述した本発明のタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド（本発明のセンスポリヌクレオチド）、あるいは本発明のアンチセンスポリヌクレオチド）を用いてそのｍＲＮＡを検出することにより、転写レベルで測定することもできる。あるいは、該発現量は、上述した本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質を検出することにより、翻訳レベルで測定することもできる。
【０２４８】
従って、より具体的には、本発明によれば、
（ｂ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下で培養し、両条件下における本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡの量を、本発明のセンスもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを用いて測定・比較する、癌細胞の細胞接着阻害物質、癌の予防・治療物質のスクリーニング方法、および
（ｃ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下で培養し、両条件下における本発明のタンパク質の量を、本発明の抗体を用いて測定・比較する、癌細胞の細胞接着阻害物質、癌の予防・治療物質のスクリーニング方法が提供される。
【０２４９】
上記（ｂ）および（ｃ）のスクリーニング方法において、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、上記（ａ−２）のスクリーニング方法において用いられるのと同様のものが好ましく用いられる。
【０２５０】
例えば、本発明のタンパク質のｍＲＮＡ量またはタンパク質量の測定は、具体的には以下のようにして行うことができる。
【０２５１】
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリなど）に対して、薬剤（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、Ｆａｓ、抗癌剤など）あるいは物理化学的ストレス（例えば、ＵＶ、活性酸素、虚血など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、あるいは臓器から単離した組織または細胞を得る。
【０２５２】
得られた細胞に含まれる本発明のタンパク質のｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法などの手法を用いることにより定量することができ、あるいはそれ自体公知のノーザンブロット解析により定量することもできる。一方、本発明のタンパク質量は、ウェスタンブロット解析や以下に詳述する各種イムノアッセイ法を用いて定量することができる。
【０２５３】
（ｉｉ）本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換体を上記の方法に従って作製し、該形質転換体に含まれる本発明のタンパク質またはそれをコードするｍＲＮＡを、上記（ｉ）と同様にして定量、解析することができる。
【０２５４】
本発明のタンパク質の発現量を変化させる物質のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト温血動物に対して、薬剤あるいは物理化学的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理化学的ストレスと同時に被験物質を投与し、投与から一定時間が経過した後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、該動物から単離した細胞に含まれる本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量、または本発明のタンパク質の量を定量、解析することにより、あるいは
（ｉｉ）形質転換体を常法に従って培養する際に被験物質を培地中に添加し、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、該形質転換体に含まれる本発明のタンパク質のｍＲＮＡ量または本発明のタンパク質の量を定量、解析することにより行なうことができる。
【０２５５】
被験物質としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これらのは新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
【０２５６】
上記（ｃ）のスクリーニング方法における本発明のタンパク質の量の測定は、具体的には、例えば、
（ｉ）本発明の抗体と、試料液および標識化された本発明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質を検出することにより試料液中の本発明のタンパク質を定量する方法や、
（ｉｉ）試料液と、担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された別の本発明の抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、試料液中の本発明のタンパク質を定量する方法等が挙げられる。
【０２５７】
上記（ｉｉ）の定量法においては、２種の抗体は本発明のタンパク質の異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ末端部を認識する抗体であれば、他方の抗体として本発明のタンパク質のＣ末端部と反応するものを用いることができる。
【０２５８】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレセインイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジン系を用いることもできる。
【０２５９】
試料液としては、本発明のタンパク質が細胞内に局在する場合は、細胞を適当な緩衝液に懸濁した後、超音波処理または凍結融解などによって細胞を破壊して得られる細胞破砕液が、本発明のタンパク質が細胞外に分泌される場合には、細胞培養上清がそれぞれ用いられる。必要に応じて、破砕液や培養上清から本発明のタンパク質を分離・精製した後に定量を行なってもよい。また、標識剤の検出が可能である限り、無傷細胞を試料として用いてもよい。
【０２６０】
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、特に制限されず、試料液中の抗原量に対応した、抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる。感度、特異性の点で、例えば、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。
【０２６１】
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化・固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
【０２６２】
サンドイッチ法においては不溶化した本発明の抗体に試料液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の量もしくは活性を測定することにより、試料液中の本発明のタンパク質を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序で行っても、また、同時に行ってもよいし、時間をずらして行ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相化抗体あるいは標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【０２６３】
本発明の抗体は、サンドイッチ法以外の測定システ厶、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどにも用いることができる。
【０２６４】
競合法では、試料液中の本発明のタンパク質と標識した本発明のタンパク質とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定することにより、試料液中の本発明のタンパク質を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチレングリコールや前記抗体（１次抗体）に対する２次抗体などを用いてＢ／Ｆ分離を行う液相法、および、１次抗体として固相化抗体を用いるか（直接法）、あるいは１次抗体は可溶性のものを用い、２次抗体として固相化抗体を用いる（間接法）固相化法とが用いられる。
【０２６５】
イムノメトリック法では、試料液中の本発明のタンパク質と固相化した本発明のタンパク質とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後、固相と液相を分離するか、あるいは試料液中の本発明のタンパク質と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化した本発明のタンパク質を加えて未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し試料液中の抗原量を定量する。
【０２６６】
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。試料液中の本発明のタンパク質の量がわずかであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【０２６７】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
【０２６８】
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ａ））、同書Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｂ））、同書Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｃ））、同書Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
【０２６９】
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、細胞における本発明のタンパク質の生産量を感度よく定量することができる。
【０２７０】
例えば、上記（ｂ）および（ｃ）のスクリーニング法において、被験物質の存在下における本発明のタンパク質（ＥＶＩ１、ＩＴＧＡ６およびＩＴＧＢ４）の発現量（ｍＲＮＡ量またはタンパク質量）が、被験物質の非存在下における場合に比べて、約２０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害された場合、該被験物質を、本発明のタンパク質の発現阻害物質として選択することができる。
【０２７１】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明のタンパク質またはその部分ペプチド（以下、単に「本発明のタンパク質」とも称する）を含有する。本発明のタンパク質は上述のいずれかの方法を用いて、単離・精製されたものであってもよいし、あるいは上述のように、それを産生する細胞（温血動物細胞）の形態で提供されてもよい。
【０２７２】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明のタンパク質を産生する細胞における該タンパク質の発現量を測定するために、上述の本発明の抗体、あるいは本発明のセンスもしくはアンチセンスポリヌクレオチドをさらに含有することもできる。
【０２７３】
該スクリーニング用キットは、上記に加えて、任意で、反応緩衝液、ブロッキング液、洗浄用緩衝液、標識試薬、標識検出試薬などを含むことができる。
【０２７４】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる、本発明のタンパク質の発現および／または活性阻害物質（遊離体であっても塩の形態であってもよい）は、癌細胞の細胞接着阻害剤、癌（例えば、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、造血器腫瘍（例えば、急性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病等）など）の予防・治療剤（好ましくは、造血器腫瘍の予防・治療剤、より好ましくは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の予防・治療剤）として、低毒性で安全な医薬として有用である。
【０２７５】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
【０２７６】
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、ショ糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
【０２７７】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記化合物またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
【０２７８】
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記化合物が含有されていることが好ましい。
【０２７９】
なお、上述した各組成物は、上記化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【０２８０】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
【０２８１】
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のタンパク質の発現および／または活性阻害物質を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０．１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜約５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜約２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該阻害物質の１回投与量は、投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のタンパク質の発現および／または活性阻害物質を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜約３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜約１０ｍｇを癌病変部に注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０２８２】
（４）癌の診断剤
本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識することができる。このため、当該抗体は、被験液中の本発明のタンパク質の定量などに使用されうる。従って、上述の本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の発現阻害物質のスクリーニング方法において、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞の代わりに、被験温血動物から採取した生体試料（例、血液、血漿、尿、生検など）を用いてイムノアッセイを実施することにより、該動物体内における本発明のタンパク質の発現の程度を調べることができ、ひいては癌の診断に用いることができる。イムノアッセイの結果、該試料中の本発明のタンパク質の増加が検出された場合は、癌（例えば、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、造血器腫瘍（特に、ＡＭＬ）など）を発症しているか、あるいは将来発症する可能性が高いと診断することができる。
【０２８３】
同様に、前記した本発明のセンスもしくはアンチセンスポリヌクレオチドは、プローブもしくはプライマーとして使用することにより、ヒトまたは他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）における本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができる。このため、当該ポリヌクレオチドは、例えば、該ＤＮＡの増幅やｍＲＮＡの発現過多などの遺伝子診断剤、特に癌の診断剤として有用である。本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくは対応するアンチセンスポリヌクレオチドは、プローブもしくはプライマーとして必要な長さ（例えば、約１５塩基以上）を有する限り特に制限されない。
【０２８４】
本発明のセンスもしくはアンチセンスポリヌクレオチドを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、それ自体公知のノーザンハイブリダイゼーション法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＤＧＧＥ法、ＲＮａｓｅプロテクション法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法などにより実施されうる。
【０２８５】
例えば、被験温血動物の細胞から抽出したＲＮＡ画分についてのノーザンハイブリダイゼーション法や定量的ＲＴ−ＰＣＲ法による診断の結果、本発明のタンパク質の発現増加が検出された場合、癌（例えば、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、造血器腫瘍（特に、ＡＭＬ）など）を発症しているか、あるいは将来発症する可能性が高いと診断することができる。
【０２８６】
（５）本発明のタンパク質を含有する医薬
本発明のタンパク質は癌細胞において過剰に発現していることから、癌患者の免疫系を活性化するために本発明のタンパク質を癌ワクチンとして用いることもできる。
【０２８７】
例えば、強力な抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を本発明のタンパク質の存在下で培養し、該タンパク質を貪食させた後に、再び患者の体内に戻す、いわゆる養子免疫療法などが好ましく適用されうる。体内に戻された樹状細胞は癌抗原特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導、活性化することにより癌細胞を死滅させることが可能である。
【０２８８】
また、本発明のタンパク質は、例えば癌（例えば、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、造血器腫瘍（特に、ＡＭＬ）など）の予防または治療のためのワクチン製剤として、安全に、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ブタ）に投与することもできる。
【０２８９】
該ワクチン製剤は、通常、本発明のタンパク質および生理学的に許容されうる担体を含有する。担体としては例えば、水、食塩水（生理食塩水を含む）、緩衝液（例、リン酸緩衝液）、アルコール（例、エタノール）などの液体の担体があげられる。
【０２９０】
ワクチン製剤は、通常のワクチン製剤の製造方法に従って調製することができる。
【０２９１】
通常、本発明のタンパク質は、生理学的に許容されうる担体に溶解または懸濁される。また、本発明のタンパク質と生理学的に許容されうる担体とを別々に調製し、用時それらを混合して用いてもよい。
【０２９２】
ワクチン製剤には、本発明のタンパク質および生理学的に許容されうる担体に加え、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウムゲル、血清アルブミンなど）、防腐剤（例えば、チメロサールなど）、無痛化剤（例えば、ブドウ糖、ベンジルアルコールなど）などを配合させてもよい。また、本発明のタンパク質に対する抗体産生を促進させるために、例えばサイトカイン（例えば、インターロイキン−２などのインターロイキン類、インターフェロン−γなどのインターフェロン類など）をさらに配合させてもよい。
【０２９３】
ワクチン製剤として用いる際、本発明のタンパク質は活性体として用いてもよいが、抗原性を高めるために該タンパク質を変性させてもよい。本発明のタンパク質の変性は、通常、加熱処理、タンパク質変性剤（例えば、ホルマリン、塩酸グアニジン、尿素）による処理により行われる。
【０２９４】
得られたワクチン製剤は低毒性であり、通常注射剤として、例えば皮下、皮内、筋肉内に投与してもよく、また癌細胞塊またはその近傍に局所的に投与してもよい。
【０２９５】
本発明のタンパク質の投与量は、例えば対象疾患、投与対象、投与経路などによって異なるが、例えば本発明のタンパク質を癌に罹患した成人（体重６０ｋｇ）に皮下的に注射剤として投与する場合、１回当たり通常０．１〜３００ｍｇ程度、好ましくは１００〜３００ｍｇ程度である。ワクチン製剤の投与回数は１回でもよいが、抗体産生量を高めるために、約２週間〜約６ヶ月の間隔をあけて、該ワクチン製剤を２〜４回投与することもできる。
【０２９６】
（６）ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「本発明の外来性ＤＮＡ」とも称する）またはその変異ＤＮＡ（「本発明の外来性変異ＤＮＡ」とも称する）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
【０２９７】
すなわち、本発明のさらに他の形態によれば、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターが提供される。
【０２９８】
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、「本発明のＤＮＡ転移動物」とも称する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞とそれ自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
【０２９９】
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病態動物モデル系の作製の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統、ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統、ＢＤＦ１系統、Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統、ＢＡＬＢ／ｃ系統、ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
【０３００】
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが挙げられる。
【０３０１】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
【０３０２】
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
【０３０３】
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
【０３０４】
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例えば、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【０３０５】
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
【０３０６】
上記のＤＮＡ発現調節を行うプロモーターとしては、例えば、（ｉ）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（ｉｉ）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１、Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般に「Ｔｉｅ２」と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
【０３０７】
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（一般に「ターミネーター」と称される）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
【０３０８】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
【０３０９】
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
【０３１０】
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
【０３１１】
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
【０３１２】
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することができる。
【０３１３】
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
【０３１４】
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【０３１５】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
【０３１６】
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する予防・治療剤、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、造血器腫瘍（特に、ＡＭＬ）など）の予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
【０３１７】
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することができる。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラクトは、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【０３１８】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
【０３１９】
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
【０３２０】
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症に対する予防・治療剤、例えば癌（例えば、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、造血器腫瘍（特に、ＡＭＬ）など）の予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
【０３２１】
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
（ｉ）組織培養のための細胞源としての使用、
（ｉｉ）本発明のＤＮＡ転移動物の組織中ＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたペプチド組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性についての解析、
（ｉｉｉ）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（ｖ）本発明の変異タンパク質の単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
【０３２２】
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
【０３２３】
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行うことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、細胞接着などとの関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
【０３２４】
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行うために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【０３２５】
（７）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
【０３２６】
すなわち、本発明によれば、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）第（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出する、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法が提供される。
【０３２７】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、「本発明のノックアウトＤＮＡ」とも称する）非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞（以下、「ＥＳ細胞」とも称する）をいう。
【０３２８】
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【０３２９】
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部または全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊したりすることにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【０３３０】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、「本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞」または「本発明のノックアウトＥＳ細胞」とも称する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、「ターゲティングベクター」とも称する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
【０３３１】
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、現在一般的に使用されているマウスのＥＳ細胞の場合、免疫学的背景がはっきりしていないため、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用いられうる。
【０３３２】
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
【０３３３】
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行うことが望ましい。
【０３３４】
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行うことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
【０３３５】
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
【０３３６】
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ線維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１〜１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１〜０．５％トリプシン／０．１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行うが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
【０３３７】
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ及びＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ、第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．Ｃ．Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
【０３３８】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知の方法により測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
【０３３９】
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【０３４０】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
【０３４１】
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
【０３４２】
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のへテロ発現不全個体同士を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
【０３４３】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
【０３４４】
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。
【０３４５】
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１、ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
【０３４６】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
【０３４７】
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなりうるため、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【０３４８】
（９ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
【０３４９】
すなわち、本発明によれば、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定する、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病（例えば、癌など）に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法が提供される。
【０３５０】
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが挙げられる。
【０３５１】
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これらは新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【０３５２】
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
【０３５３】
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【０３５４】
例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、造血器腫瘍など）に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、試験化合物非投与群と癌の発症の程度の違いや癌の治癒度合いの違いを上記組織で経時的に観察する。
【０３５５】
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の上記疾患症状が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上改善した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
【０３５６】
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【０３５７】
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例えば、無機酸、有機酸など）や塩基（例えば、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【０３５８】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。
【０３５９】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
【０３６０】
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の乳癌患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜約５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜約２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の乳癌患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜約３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜約１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０３６１】
（９ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明によれば、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出する、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法が提供される。
【０３６２】
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
【０３６３】
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
【０３６４】
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
【０３６５】
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
【０３６６】
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
【０３６７】
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【０３６８】
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現を阻害したり、該タンパク質の機能を阻害したりすることができるので、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、造血器腫瘍（特に、ＡＭＬ）など）の予防・治療剤として有用である。
【０３６９】
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【０３７０】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
【０３７１】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
【０３７２】
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与経路などにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の乳癌患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜約５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜約２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の乳癌患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜約３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜約１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０３７３】
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療剤の開発に大きく貢献することができる。
【０３７４】
また、本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有するＤＮＡを用いて、その下流に種々のタンパク質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作製すれば、特異的にそのタンパク質を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【０３７５】
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものである。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【０３７６】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ＥＶＩ１をコードするＤＮＡ（ＣＤＳ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：２〕
ＥＶＩ１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
ＩＴＧＡ６をコードするＤＮＡ（ＣＤＳ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
ＩＴＧＡ６のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
ＩＴＧＢ４をコードするＤＮＡ（ＣＤＳ）の塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
ＩＴＧＢ４のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７〕
配列番号８とともにｓｈＥＶＩ１を形成するＲＮＡ配列を示す。
〔配列番号：８〕
配列番号７とともにｓｈＥＶＩ１を形成するＲＮＡ配列を示す。
〔配列番号：９〕
ヒトＥＶＩ１遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
ヒトＥＶＩ１遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
ヒトβ−アクチン遺伝子の増幅に用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
ヒトβ−アクチン遺伝子の増幅に用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
配列番号１４とともにｓｈＥＶＩ１を形成するＲＮＡ配列を示す。
〔配列番号：１４〕
配列番号１３とともにｓｈＥＶＩ１を形成するＲＮＡ配列を示す。
【実施例】
【０３７７】
以下、実施例および参考例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらに限定されない。【０３７８】
なお、以下の例で用いられる細胞株のうち、Ｕ９３７、Ｋ５６２、ＨＮＴ３４、ＨＬ６０、２９３Ｔ、ＭＣ３Ｔ３については、独立行政法人理化学研究所の細胞バンクより購入した。また、ＭＯＬＭ１については、株式会社林原生物化学研究所より購入した。さらに、ＡＭＬ１については、カリフォルニア大学サンディエゴ校（ＵＣＳＤ）より供与されたものである。これらのうち、Ｕ９３７、Ｋ５６２、ＨＮＴ３４、ＨＬ６０、ＭＯＬＭ１、ＡＭＬ１については、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ニチレイ株式会社製）が添加されたＲＰＭＩ１６４０（１８９−０２０２５；和光純薬工業株式会社製）にて培養を行なった。ＭＣ３Ｔ３については、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ニチレイ株式会社製）が添加されたαＭＥＭ（１２５６１；インビトロジェン株式会社製）にて培養を行なった。また、２９３Ｔについては、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳにて培養を行なった。【０３７９】
実施例１−１：ＥＶＩ１遺伝子のｓｈＲＮＡ導入によるＡＭＬ１細胞株におけるインテグリン遺伝子の発現抑制
（ＥＶＩ１発現抑制ＡＭＬ１細胞の樹立）
ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）由来であるＡＭＬ１細胞株に対して、ＥＶＩ１遺伝子のｍＲＮＡを切断する活性を有するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であるｓｈＥＶＩ１をトランスフェクションすることにより、ＥＶＩ１発現抑制ＡＭＬ１細胞株（以下、「ＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）」とも称する）を樹立した。【０３８０】
具体的には、まず、ＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ  ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ−ＺｓＧｒｅｅｎ（クローンテック社製）の、ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ−ＺｓＧｒｅｅｎベクターのＢａｍＨ１−ＥｃｏＲ１サイトに、ｓｈＥＶＩ１（センス鎖：ＧＡＵＣＵＣＵＣＵＡＡＧＧＣＵＧＡＡＣＵＡＧＣＡＧＵＣＡＡＧＡＧＡＣＵＧＣＵＡＧＵＵＣＡＧＣＣＵＵＡＧＡＵＵＵＵＵＵＧ（配列番号：７）、アンチセンス鎖：ＡＡＵＵＣＡＡＡＡＡＡＵＣＵＡＡＧＧＣＵＧＡＡＣＵＡＧＣＡＧＵＣＵＣＵＵＧＡＡＣＵＧＣＵＡＧＵＵＣＡＧＣＣＵＵＡＧＡＧＡ（配列番号：８）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００６ Ｊｕｎ １５；２５(２５)：３５６５−７５に開示）を挿入し、ｓｈＥＶＩ１レトロベクターを作製した。次いで、このｓｈＥＶＩ１レトロベクター１０μｇ、およびｐ１０Ａ１パッケージングベクター（クローンテック社製）１０μｇを、Ｈｙｌｉｍａｘリポソーム試薬（同仁科学研究所製）を用いて２９３Ｔ細胞株に導入し、ｓｈＥＶＩ１を含むレトロウイルスを作製した。そして、得られたレトロウイルスを１０５個のＡＭＬ１細胞に感染させて、ＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）を樹立した。なお、コントロール細胞として、ＲＮＡｉ−Ｒｅａｄｙ  ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ−ＺｓＧｒｅｅｎ（クローンテック社製）に付属のコントロールベクター（ｓｈＬｕｃ）を同様の手法によりトランスフェクションしたもの（以下、「ＡＭＬ１（ｓｈＬｕｃ）」とも称する）を樹立した。【０３８１】
（インテグリン発現抑制の確認）
上記で樹立したＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）およびＡＭＬ１（ｓｈＬｕｃ）を安定に培養したものを、遠心分離によりそれぞれ回収し、培地を除去した後、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）（インビトロジェン社製）１ｍＬを添加した。次いで、クロロホルム５００μＬを添加し、１５０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離した後、上層を別のチューブに移し、２−プロパノール５００μＬを添加して、１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、８０％エタノールを用いて洗浄した。得られたＲＮＡをＲＮａｓｅフリーの水に溶解させ、分光光度計にて波長２６０ｎｍでＲＮＡ量を測定した後、このＲＮＡ１μｇを逆転写酵素（ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ３（インビトロジェン社製））を用いてｃＤＮＡに変換した。【０３８２】
得られたそれぞれのｃＤＮＡをテンプレートとして、これをＰＣＲ法により増幅し、アガロースゲル電気泳動により遺伝子の発現量を確認した。具体的には、ポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ  ＥＸｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）を用い、ＰＣＲ装置としてはＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＤＩＣＥ（タカラバイオ株式会社製）を用いた。また、ＰＣＲによる増幅前に、β−アクチンにより、各ｃＤＮＡを補正した。ＰＣＲの際に用いたプライマーの塩基配列は以下の通りである：
（ヒトＥＶＩ１）
フォワード：ＣＧＡＡＡＧＣＧＡＧＡＡＴＧＡＴＣＴＣＣ（配列番号：９）
リバース：ＧＧＡＡＧＡＣＧＴＡＧＴＧＣＴＧＡＡＣＡ（配列番号：１０）
（ヒトβ−アクチン）
フォワード：ＡＡＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＧＧＣＴＧＣＴ（配列番号：１１）
リバース：ＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＴＣＧＧＣ（配列番号：１２）
（インテグリンファミリー）
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００５）１２：８０３−８１３に開示のもの。【０３８３】
アガロースゲル電気泳動の結果を図１に示す。図１に示すように、ＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）では、ＡＭＬ１（ｓｈＬｕｃ）と比較して、ＥＶＩ１遺伝子の発現が抑制された。これは、ｓｈＥＶＩ１の添加によるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の作用によるものと考えられる。また、図１に示すように、ＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）では、ＡＭＬ１（ｓｈＬｕｃ）と比較して、ＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子を含む各種インテグリンファミリーの遺伝子発現が抑制された。さらに、カドヘリンファミリーの１種であるＶＥカドヘリン遺伝子の発現も抑制されたことがわかる。これらは、ＥＶＩ１遺伝子の発現が抑制されたことによるものと考えられる。【０３８４】
なお、ｓｈＬｕｃもｓｈＥＶＩ１も投与されないＡＭＬ１細胞をコントロールとして加え、ＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）についてトリプリケートで実験を行なった結果を図２に示す。図２に示すように、上記と同様に、ＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）ではＥＶＩ１遺伝子の発現抑制と、これに伴う各種インテグリンファミリーおよびＶＥカドヘリンの遺伝子発現の抑制が確認された。【０３８５】
実施例１−２：ＥＶＩ１遺伝子のｓｈＲＮＡ投与によるＡＭＬ１細胞株の細胞接着能の低下
上記で樹立したＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）（トリプリケート）およびＡＭＬ１（ｓｈＬｕｃ）について、その細胞接着能を評価した。【０３８６】
具体的には、９６穴プレートの各ウェルに、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳで４０倍に希釈したｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤバイオサイエンス社製）を１００μＬずつ加え、４℃にて６時間インキュベートした後、ＰＢＳにて２回洗浄を行なった。この各ウェルに、上記の細胞を１００００個／１００μＬずつ加えた。そして、３７℃にて２時間インキュベートした後、ＰＢＳにて３回洗浄を行なった。その後、各ウェルにＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳを９０μＬずつ、Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ ８（同仁科学研究所製）を１０μＬずつ加え、３７℃にて３０分間インキュベートした後、分光光度計を用いて波長４５０ｎｍで測定を行なった。【０３８７】
図３は、上述した細胞接着アッセイの結果を示すグラフである。図３に示すように、ＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）の細胞接着能（総細胞数に対する接着細胞数の比）は、ＡＭＬ１（ｓｈＬｕｃ）に対して、約３１〜６０％低下していることがわかる。このことから、本発明者らは、ＥＶＩ１遺伝子やこれがコードするタンパク質、各種インテグリンファミリーに属する遺伝子やこれらがコードするタンパク質が、急性骨髄性白血病細胞における細胞接着能の発揮に関与しているのではないかとの仮説を設定した。【０３８８】
参考例１：各種細胞間でのインテグリンファミリー遺伝子の発現比較
ＥＶＩ１遺伝子を発現していない細胞株として、ヒト由来のＨＬ６０細胞株、ヒト由来のＵ９３７細胞株、およびヒト由来のＫ５６２細胞株を安定に培養したものを準備した。一方、ＥＶＩ１遺伝子を発現している細胞株として、ヒト急性骨髄性白血病由来のＡＭＬ１細胞株（上述）、ヒト由来のＭＯＬＭ１細胞株、およびヒト由来のＨＮＴ３４細胞株を安定に培養したものを準備した。これらの細胞株について、上述した実施例１−１と同様の手法により、ＥＶＩ１遺伝子および各種インテグリンファミリー遺伝子の発現を確認した。【０３８９】
アガロースゲル電気泳動の結果を図４に示す。図４に示すように、ＥＶＩ１陽性の細胞株（ＡＭＬ１、ＭＯＬＭ１およびＨＮＴ３４）において、ＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子が特異的に発現していることがわかる。この結果から、本発明者らは、ＥＶＩ１遺伝子に加えて、インテグリンファミリーの特にＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子およびこれらがコードするタンパク質が、急性骨髄性白血病における細胞接着能の発現に関与しているのではないかとの仮説を設定した。【０３９０】
実施例２−１：ｓｈＥＶＩ１導入によるＨＮＴ３４細胞株におけるインテグリン遺伝子の発現抑制
ヒト由来であるＨＮＴ３４細胞株に対し、遺伝子導入システムであるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（アマクサバイオシステムズ社製）を用いて、上述した実施例１−１で用いたｓｈＥＶＩ１を導入して、ＥＶＩ１発現抑制ＨＮＴ３４細胞株（以下、「ＨＮＴ３４（ｓｈＥＶＩ１）」とも称する）を樹立した。同様に、コントロール細胞として、ｓｈＬｕｃを導入した細胞株（以下、「ＨＮＴ３４（ｓｈＬｕｃ）」とも称する）も樹立した。これらの細胞株について、上述した実施例１と同様の手法により、ＥＶＩ１遺伝子および各種インテグリンファミリー遺伝子の発現を確認した。【０３９１】
アガロースゲル電気泳動の結果を図５に示す。図５に示すように、ＨＮＴ３４細胞株へのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒによるｓｈＥＶＩ１の導入によっても、上述した実施例１−１や実施例１−２と同様に、ＥＶＩ１遺伝子や各種インテグリンファミリー遺伝子の発現が抑制されることが確認される。【０３９２】
実施例２−２：ＥＶＩ１遺伝子のｓｈＲＮＡ投与によるＨＮＴ３４細胞株の細胞接着能の低下
上記で樹立したＨＮＴ３４（ｓｈＥＶＩ１）およびＨＮＴ３４（ｓｈＬｕｃ）について、上述した実施例１−２と同様の手法により、その細胞接着能を評価した。【０３９３】
図６は、上述した細胞接着アッセイの結果を示すグラフである。図６に示すように、ＨＮＴ３４（ｓｈＥＶＩ１）の細胞接着能（総細胞数に対する接着細胞数の比）は、ＨＮＴ３４（ｓｈＬｕｃ）に対して、約７６％低下していることがわかる。このように、ＨＮＴ３４細胞株においても、上述した実施例１−２と同様の結果が得られた。【０３９４】
参考例２：ＥＶＩ１遺伝子のｓｈＲＮＡ投与によるＨＮＴ３４細胞株の細胞増殖能への影響
上記で樹立したＨＮＴ３４（ｓｈＥＶＩ１）およびＨＮＴ３４（ｓｈＬｕｃ）について、その細胞増殖能を評価した。【０３９５】
具体的には、９６穴プレートの各ウェルに、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳで希釈した細胞を１０００個／１００μＬずつ加えた。そして、３７℃にて適当な時間インキュベートした後、Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ ８（同仁科学研究所製）を１０μＬずつ加え、３７℃にて３０分間インキュベートした後、分光光度計を用いて波長４５０ｎｍで測定を行なった。【０３９６】
図７は、上述した細胞増殖アッセイの結果を示すグラフである。図７に示すように、コントロール細胞株であるＨＮＴ３４（ｓｈＬｕｃ）とＥＶＩ１発現抑制細胞株であるＨＮＴ３４（ｓｈＥＶＩ１）との間で、細胞増殖能に有意な差は確認されなかった。このことから、ＥＶＩ１遺伝子は、細胞の増殖には関与していないものと考えられる。【０３９７】
実施例３−１：ＩＴＧＢ４遺伝子のｓｈＲＮＡ投与によるＡＭＬ１細胞株の細胞接着能の低下
上述した実施例２−１と同様の手法により、ＡＭＬ１細胞株に対して、ＩＴＧＢ４遺伝子のｍＲＮＡを切断する活性を有するｓｈＲＮＡ（以下、「ｓｈＩＴＧＢ４」とも称する）をトランスフェクションすることにより、ＩＴＧＢ４発現抑制ＡＭＬ１細胞株（以下、「ＡＭＬ１（ｓｈＩＴＧＢ４）」とも称する）を樹立した。なお、用いたｓｈＩＴＧＢ４の塩基配列は以下の通りである。【０３９８】
センス鎖：ＧＡＵＣＵＣＣＧＡＧＵＵＧＣＧＵＧＧＧＧＵＧＵＧＵＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＡＣＡＣＡＣＵＣＣＧＵＧＣＡＧＣＵＣＵＵＵＵＵＧ（配列番号：１３）
アンチセンス鎖：ＡＡＵＵＣＡＡＡＡＡＧＡＧＣＵＧＣＡＣＧＧＡＧＵＧＵＧＵＣＵＣＵＣＵＵＧＡＡＧＡＣＡＣＡＣＣＣＣＡＣＧＣＡＡＣＵＣＧＧＡ（配列番号：１４）
コントロール細胞としては、上述した実施例１−１において樹立したＡＭＬ１（ｓｈＬｕｃ）を用いた。【０３９９】
上記で樹立したＡＭＬ１（ｓｈＩＴＧＢ４）およびＡＭＬ１（ｓｈＬｕｃ）について、上述した実施例１−２と同様の手法により、その細胞接着能を評価した。【０４００】
図８は、上述した細胞接着アッセイの結果を示すグラフである。図８に示すように、ＡＭＬ１（ｓｈＩＴＧＢ４）の細胞接着能（総細胞数に対する接着細胞数の比）は、ＡＭＬ１（ｓｈＬｕｃ）に対して、ほぼゼロにまで低下していることがわかる。この結果から、ＩＴＧＢ４遺伝子が急性骨髄性白血病細胞における細胞接着能の発揮に関与しているとの仮説は実証された。【０４０１】
なお、ＡＭＬ１（ｓｈＩＴＧＢ４）におけるＩＴＧＢ４遺伝子の発現を、上述した実施例１−１と同様の手法により確認した。その結果、図９に示すＰＣＲ−アガロースゲル電気泳動の結果に示されるように、ＡＭＬ１（ｓｈＩＴＧＢ４）においては、ＡＭＬ１（ｓｈＬｕｃ）と比較して、ＩＴＧＢ４遺伝子の発現が抑制された。【０４０２】
実施例３−２：β４インテグリン中和抗体によるＡＭＬ１細胞株の細胞接着能の低下
ヒト由来であるＡＭＬ１細胞株に対して、β４インテグリン中和抗体を投与することにより、当該細胞株の細胞接着能に対する影響を評価した。【０４０３】
具体的には、細胞１００００個／１００μＬに対して、中和抗体としてβ４インテグリンクローンＡＳＣ３抗体（ミリポア社製、ＭＡＢ２０５８）を最終濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように加え、４℃にて３０分間インキュベートした後、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳで洗浄した。次いで、１００μＬのＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳで懸濁し、マトリゲル（登録商標）がコートされてなる９６穴プレートのウェルに加え、３７℃にて２時間インキュベートした後、ＰＢＳにて３回洗浄を行なった。ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳを９０μＬ、Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ ８（同仁科学研究所製）を１０μＬずつ加え、３７℃にて３０分間インキュベートした後、分光光度計を用いて波長４５０ｎｍにて測定した。なお、コントロールとしては、β４インテグリンクローンＡＳＣ３抗体に代えて、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体または抗β１インテグリン抗体を投与した細胞株を用いた。【０４０４】
図１０は、上述した細胞接着アッセイの結果を示すグラフである。図１０に示すように、ＡＭＬ１細胞の細胞接着能（総細胞数に対する接着細胞数の比）は、抗ＦＬＡＧ Ｍ２投与群および抗β１インテグリン抗体投与群に対して、それぞれ約９０％および約９４％低下していることがわかる。この結果から、ＩＴＧＢ４タンパク質が急性骨髄性白血病細胞における細胞接着能の発揮に関与しているとの仮説は実証された。【０４０５】
参考例３−１：ＥＶＩ１遺伝子の導入によるＵ９３７細胞株におけるインテグリン遺伝子の発現の亢進
ＥＶＩ１遺伝子を発現していないＵ９３７細胞株に対して、ＥＶＩ１遺伝子を導入することにより、各種インテグリンファミリー遺伝子の発現が増加するかどうかを調べた。【０４０６】
具体的には、ＥＶＩ１遺伝子をＵ９３７細胞に導入することによりＥＶＩ１遺伝子発現Ｕ９３７細胞（以下、「Ｕ９３７（ＥＶＩ１）」とも称する）を樹立し、このＵ９３７（ＥＶＩ１）における各種インテグリンファミリー遺伝子の発現を調べた。なお、コントロールとしては、ＧＦＰ遺伝子を導入したＵ９３７細胞（以下、「Ｕ９３７（ＧＦＰ）」とも称する）を用いた。【０４０７】
アガロースゲル電気泳動の結果を図１１に示す。図１１に示すように、ＥＶＩ１陰性であるＵ９３７細胞株に対してＥＶＩ１遺伝子を導入することにより、ＩＴＧＡ６遺伝子、ＩＴＧＢ３遺伝子、およびＩＴＧＢ４遺伝子の発現が亢進することがわかる。【０４０８】
参考例３−２：ＥＶＩ１遺伝子の導入によるＵ９３７細胞株の細胞接着能の向上
Ｕ９３７細胞株、並びに、上記で樹立したコントロールであるＵ９３７（ＧＦＰ）およびＥＶＩ１導入細胞株であるＵ９３７（ＦＬＡＧ−ＥＶＩ１）について、上述した実施例２−１と同様の手法により、ＥＶＩ１遺伝子の導入による細胞接着能への影響を評価した。【０４０９】
図１２は、上述した細胞接着アッセイの結果を示すグラフである。図１２に示すように、Ｕ９３７（ＦＬＡＧ−ＥＶＩ１）の細胞接着能（総細胞数に対する接着細胞数の比）は、Ｕ９３７細胞株およびＵ９３７（ＧＦＰ）に対して、それぞれ約２．３倍および約３．０倍に向上していることがわかる。このことから、ＥＶＩ１遺伝子の発現がインテグリンの発現を介して細胞接着能の向上に関与していることが示される。【０４１０】
参考例３−３：ＥＶＩ１遺伝子の導入によるＵ９３７細胞株の細胞増殖能への影響
Ｕ９３７細胞株、並びに、上記で樹立したコントロールであるＵ９３７（ＧＦＰ）およびＥＶＩ１導入細胞株であるＵ９３７（ＦＬＡＧ−ＥＶＩ１）について、上述した参考例２と同様の手法により、ＥＶＩ１遺伝子の導入による細胞増殖能への影響を評価した。【０４１１】
図１３は、上述した細胞増殖アッセイの結果を示すグラフである。図１３に示すように、コントロール細胞株であるＵ９３７細胞株およびＵ９３７（ＧＦＰ）と、ＥＶＩ１発現亢進細胞株であるＵ９３７（ＦＬＡＧ−ＥＶＩ１）との間で、細胞増殖能に有意な差は確認されなかった。このことからも、ＥＶＩ１遺伝子は、細胞の増殖には関与していない可能性が高いと考えられる。【０４１２】
参考例４−１：各種細胞株におけるＥＶＩ１遺伝子並びにＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子の発現の相関
ＥＶＩ１遺伝子をまったくまたはほとんど発現していない細胞株として、Ｕ９３７、Ｋ５６２、ＫＧ１、ＨＥＬ、ＨＬ−６０、Ｋ０５２、ＴＨＰ−１、ＦＫＨ−１、Ｋ０５１、ＮＨ、およびＯＩＨ−１を準備した。一方、ＥＶＩ１遺伝子を高度に発現している細胞株として、ＡＭＬ−１、ＨＮＴ−３４、Ｋａｓｕｍｉ３、およびＭＯＬＭ−１を準備した。【０４１３】
上記で準備した各種の細胞株について、ＥＶＩ１遺伝子および各インテグリンファミリー遺伝子の発現を確認した。【０４１４】
アガロースゲル電気泳動の結果を図１４に示す。図１４に示すように、ＥＶＩ１遺伝子を高度に発現している細胞株（ＡＭＬ１、ＨＮＴ３４、ｋａｓｕｍｉ３、ＭＯＬＭ１）においては、ＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子の双方の発現が見られ、これらの間に相関が存在することが示された。【０４１５】
参考例４−２：臨床検体におけるＥＶＩ１遺伝子並びにＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子の発現の相関
臨床検体として、ＥＶＩ１遺伝子を発現していない急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞を３サンプル、ＥＶＩ１遺伝子を高度に発現しているＡＭＬの１種であるｔ（３；７）のＡＭＬ細胞を４サンプル、同様にＥＶＩ１遺伝子を高度に発現しているＡＭＬの１種である３ｑ２１ｑ２６症候群のＡＭＬ細胞を３サンプル準備した。なお、細胞株コントロールとして、ＥＶＩ１遺伝子を発現していないＢｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ(ＢＭ)細胞、およびＥＶＩ１遺伝子を高度に発現しているＣＤ３４陽性細胞を併せて準備した。【０４１６】
上記で準備したサンプルおよび細胞株コントロールについて、ＥＶＩ１遺伝子および各インテグリンファミリー遺伝子の発現を確認した。【０４１７】
アガロースゲル電気泳動の結果を図１５に示す。図１５に示すように、ＥＶＩ１遺伝子を高度に発現している臨床検体サンプルにおいては、ＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子の双方の発現が見られる傾向が確認され、これらの間に相関が存在することが示された。【０４１８】
参考例４−３：ＤＮＡマイクロアレイを用いた各種細胞株におけるＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子の発現の確認（図１６）
ＥＶＩ１遺伝子を発現していない細胞株として、ＨＥＬ、ＨＬ６０、Ｋ０５２、ＴＨＰ−１、ＦＫＨ−１、Ｋ０５１、ＮＨ、ＯＩＨ−１を準備した。一方、ＥＶＩ１遺伝子を高度に発現している細胞株として、ＡＭＬ１、ＨＮＴ３４、ＭＯＬＭ１、Ｋａｓｕｍｉ３を準備した。これらの細胞株について、ＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子の発現を、アフィメトリクス社製のジーンチップ（Ｇｅｎｅ−ｃｈｉｐ）のマニュアルに従ってＤＮＡマイクロアレイにより検出した。【０４１９】
具体的には、まず、各細胞からｃＤＮＡを作製し、Ｏｎｅ−ｃｙｃｌｅ ｔａｒｇｅｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（アフィメトリクス社製）によりビオチン標識ｃＲＮＡ合成を行なった。次いで、作製した３０μＬ ｃＲＮＡ（１５μg）を９４℃にて３５分間反応させて断片化を行ない、ハイブリダイゼーション溶液（３００μＬ）に添加した。その後９９℃にて５分間、および４５℃にて５分間反応を行なった後に遠心し、上清をヒトゲノムジーンチップ（ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｇｅｎｅ−ｃｈｉｐ）（Ｕ１３３Ａ）とハイブリダイゼーションさせた。洗浄後、ジーンチップスキャナ（ｇｅｎｅ−ｃｈｉｐ ｓｃａｎｎｅｒ）（アフィメトリクス社製）によりスキャンを行ない、データの数値化を行なった。なお、データの数値化の際には、βアクチンを標準として用い、補正を行なった。【０４２０】
上述したＤＮＡマイクロアレイの結果を図１６に示す。図１６に示すように、ＥＶＩ１遺伝子を発現している細胞群においてＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子が高発現していることが確認され、これらの間に相関が存在することが示された。【０４２１】
参考例４−４：ＤＮＡマイクロアレイを用いた臨床検体におけるＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子の発現の確認（図１７）
臨床検体として、ＥＶＩ１遺伝子を発現していない急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞を１０サンプル、ＥＶＩ１遺伝子を高度に発現しているＡＭＬ細胞を１２サンプル準備した。
上記で準備したサンプルおよび細胞株コントロールについて、ＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子の発現を、上述した参考例４−３と同様の手法により、ＤＮＡマイクロアレイにより確認した。【０４２２】
上述したＤＮＡマイクロアレイの結果を図１７に示す。図１７に示すように、ＥＶＩ１遺伝子を高発現している臨床検体では、ＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子の発現が亢進していることが検出され、これらの間に相関が存在することが示された。【０４２３】
参考例５：ＡＭＬ１細胞株の細胞接着と薬剤（ＶＰ１６、Ａｒａ−Ｃ）耐性
骨芽細胞の存在が、ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）由来であるＡＭＬ１細胞株の薬剤耐性に及ぼす影響を調べた。【０４２４】
具体的には、水溶性ホルマザンを生成するＷＳＴ法により、培地中に骨芽細胞が存在する場合と存在しない場合とについて、エトポシド系抗癌剤の１種であるＶＰ１６（５μＭ）の存在下におけるＡＭＬ１細胞株の生存能を評価した。なお、培地中に骨芽細胞が存在すると、ＡＭＬ１細胞株は骨芽細胞を介して培養皿に固定化される。一方、培地中に骨芽細胞が存在しないと、ＡＭＬ１細胞株は培養皿には固定化されず、浮遊状態で増殖することになる。【０４２５】
図１８は、上述したＷＳＴ法による薬剤耐性アッセイの結果を示すグラフである。図１８に示すように、ＶＰ１６存在下での培養では、培地中に骨芽細胞が存在すると、これが存在しないときと比較して、ＡＭＬ１細胞株の生存率が有意に向上することがわかる。換言すれば、ＡＭＬ１細胞株のＶＰ１６に対する薬剤耐性の獲得には、骨芽細胞の存在（つまり、細胞接着）が必須であることが示唆される。【０４２６】
また、抗癌剤として、ＶＰ１６に代えて分化誘導型抗癌剤の１種であるＡｒａ−Ｃを用いた場合についても、骨芽細胞の存在がＡＭＬ１細胞株の薬剤耐性に及ぼす影響を調べた。具体的には、抗癌剤として、ＶＰ１６に代えてＡｒａ−Ｃ（１μｇ／ｍＬ）を用いたこと以外は、上記と同様の手法により、ＷＳＴ法による薬剤耐性アッセイを行なった。【０４２７】
図１９は、上述したＷＳＴ法による薬剤耐性アッセイの結果を示すグラフである。図１９に示すように、Ａｒａ−Ｃ存在下での培養でも、培地中に骨芽細胞が存在すると、これが存在しない場合と比較して、ＡＭＬ１細胞株の生存率が有意に向上することがわかる。換言すれば、ＡＭＬ１細胞株のＡｒａ−Ｃに対する薬剤耐性の獲得にも、骨芽細胞の存在（つまり、細胞接着）が必須であることが示唆される。【０４２８】
実施例４：ｓｈＥＶＩ１のＲＮＡ干渉作用による骨芽細胞媒介性薬剤耐性の消失
上述した参考例５（Ａｒａ−Ｃ存在下）において、ＡＭＬ１細胞株に代えて上記で樹立したＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）細胞およびＡＭＬ１（ｓｈＬｕｃ）細胞をそれぞれ用い、同様の手法によりＷＳＴ法による薬剤耐性アッセイを行なった。【０４２９】
図２０は、上述したＷＳＴ法による薬剤耐性アッセイの結果を示すグラフである。図２０（ａ）は、ＡＭＬ１（ｓｈＬｕｃ）を培養した結果を示すグラフであり、図２０（ｂ）は、ＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）を培養した結果を示すグラフである。図２０（ａ）（ｂ）に示す結果から、ＡＭＬ１（ｓｈＬｕｃ）では参考例５と同様に骨芽細胞の存在によりＡｒａ−Ｃに対する薬剤耐性が獲得される（図２０（ａ））のに対し、ＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）ではこの薬剤耐性が消失することがわかる。これは、ＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）では白血病の原因遺伝子と目されるＥＶＩ１遺伝子の発現がｓｈＥＶＩ１のＲＮＡ干渉作用により抑制され、その結果、骨芽細胞を介した細胞接着が阻害されることによるものと考えられる。この結果から、本実施例におけるような、ＥＶＩ１遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞接着阻害剤として作用し、癌細胞の薬剤耐性を軽減させるのに有用であることが示される。【０４３０】
参考例６：ＡＭＬ患者におけるインテグリン遺伝子の発現
アメリカ合衆国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の遺伝子発現バンク（ＧＥＯ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ）から、ヒトＡＭＬ患者の骨髄細胞における遺伝子発現データを５５例収集した。そして、これらのデータをＡＭＬ完治群（３０例）とＡＭＬ再発群（２５例）とに分け、それぞれの群の間で、ＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子の発現量に有意差があるか否かを、対応のないｔ検定により統計的に評価した。【０４３１】
図２１は、収集した発現量データを示すグラフである。図２１（ａ）は、ＩＴＧＡ６遺伝子の発現量データを示し、図２１（ｂ）は、ＩＴＧＢ４遺伝子の発現量データを示す。図２１に示す結果から、再発群では有意にＩＴＧＡ６遺伝子の発現量が多いことがわかる。【０４３２】
参考例７：ヒト骨髄／末梢血細胞におけるインテグリン遺伝子の発現
ＮＣＢＩの遺伝子発現バンク（ＧＥＯ）から、ヒトにおける各種の骨髄／末梢血細胞における遺伝子発現データを３０例（１５種×２）収集した。そして、これらのデータにおけるＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子のそれぞれの発現量を比較した。【０４３３】
図２２および図２３は、収集した発現量データを示すグラフである。図２２は、ＩＴＧＡ６遺伝子の発現量データを示し、図２３は、ＩＴＧＢ４遺伝子の発現量データを示す。図２２および図２３に示す結果から、ＩＴＧＡ６遺伝子およびＩＴＧＢ４遺伝子のいずれも、ＣＤ３４陽性である造血幹細胞における発現量は低いことがわかる。このことから、本発明の細胞接着阻害剤は正常な造血幹細胞に対しては作用せず、ＡＭＬ細胞のみに対して特異的に作用して、骨髄内への接着を阻害できることが期待される。【０４３４】
参考例８：ヒトＣＤ３４陽性細胞／白血病細胞におけるインテグリン遺伝子の発現
上述した参考例７に示す結果を受けて、ヒト臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞（造血幹細胞）およびＡＭＬ１細胞におけるインテグリンファミリー遺伝子の発現を比較した。ここで、ＣＤ３４陽性細胞（「ＣＤ３４＋」とも称する）については、ヒト臍帯血より分離し、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔｕｒｅ（ステムセル社製）を培地として用いて培養した。なお、インテグリン遺伝子の発現量の比較については、上述した実施例１−１と同様のＰＣＲ法により行なった。【０４３５】
本参考例におけるアガロースゲル電気泳動の結果を図２４に示す。なお、上述したように、図２４におけるＵ９３７およびＫ５６２はヒト由来のＥＶＩ１非発現細胞株であり、ＨＮＴ３４はヒト由来のＥＶＩ１発現細胞株である。図２４に示すように、ＣＤ３４陽性細胞（造血幹細胞）におけるＩＴＧＢ４遺伝子の発現量は低いことが確認され、この結果は上述した参考例７における結果と整合するものである。【０４３６】
実施例５：ＡＭＬ１細胞移植ＮＯＧマウスの大腿骨へのＡＭＬ１細胞の集積
上記で樹立したＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）細胞をＮＯＧマウス（登録商標）へ移植し、移植後におけるマウス大腿骨へのＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）細胞の集積を調べた。ここで、ＮＯＧマウスとは、ヒト化モデルマウスの作製に適した重度免疫不全マウスであり、実験動物中央研究所より入手可能である。【０４３７】
具体的には、ＮＯＧマウスにそれぞれ６００万個のＡＭＬ１（ｓｈＬｕｃ）細胞およびＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）細胞を静脈より注入し、１ヶ月後に大腿骨骨髄を回収した。そして、ＦＡＣＳにより横軸を蛍光強度としたグラフを作成し、蛍光強度の低い（より０に近いピーク）から蛍光強度の高い細胞がどの程度存在するか解析を行った。【０４３８】
図２５は、ＦＡＣＳ法による測定結果を示すグラフである。図２５（ａ）は、ＡＭＬ１（ｓｈＬｕｃ）細胞を用いたＦＡＣＳの結果を示し、図２５（ｂ）は、ＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）細胞を用いたＦＡＣＳの結果を示す。図２５に示すように、ＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）細胞の存在率（９．５％）は、ＡＭＬ１（ｓｈＬｕｃ）細胞の場合（３３％）と比較して低いことがわかる。これは、ＡＭＬ１（ｓｈＥＶＩ１）細胞ではＥＶＩ１遺伝子の発現がｓｈＥＶＩ１のＲＮＡ干渉作用により抑制され、その結果、ITGA6/B4の発現が低下し、マウス大腿骨骨髄への生着が低下していると考えられる。この結果から、本実施例におけるような、ＥＶＩ１遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞接着阻害剤として作用し、白血病細胞の骨髄への集積を防止するのに有用であることが示される。【０４３９】
なお、本出願は、２００９年２月２４日に出願された日本国特許出願第２００９−０４１２０４号に基づいており、その開示内容は、参照により全体として引用されている。
【図１】
2010098166.tif 000003
【図２】
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【図３】
2010098166.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010098166.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年10月7日(2010.10.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体を含有する、癌細胞の細胞接着阻害剤。
【請求項２】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドを含有し、白血病の予防または治療に用いられる、癌細胞の細胞接着阻害剤。
【請求項３】
配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体を含有し、白血病の予防または治療に用いられる、癌細胞の細胞接着阻害剤。
【請求項４】
配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセンスポリヌクレオチドを含有し、白血病の予防または治療に用いられる、癌細胞の細胞接着阻害剤。
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
癌の予防または治療に用いられる、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項８】
他の抗癌剤と併用された際に、癌細胞の前記抗癌剤に対する感受性を向上させるのに用いられる、請求項１〜４および７のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項９】
癌が白血病である、請求項１〜４、７および８のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項１０】
前記白血病が急性骨髄性白血病である、請求項９に記載の阻害剤。
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
（削除）
【請求項２０】
（削除）
【請求項２１】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドを用いる、癌細胞の細胞接着を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項２２】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドが、それを産生する細胞の形態で提供される、請求項２１に記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体、並びに、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるいずれかをさらに用いる、請求項２２に記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドを用いる、癌細胞の細胞接着を阻害する物質のスクリーニング方法であって、前記癌が白血病である、方法。
【請求項２５】
配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドが、それを産生する細胞の形態で提供される、請求項２４に記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
配列番号：４もしくは配列番号：６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質あるいはその部分ペプチドに対する抗体、並びに、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されるいずれかをさらに用いる、請求項２５に記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】
癌の予防または治療のための物質のスクリーニングに用いられる、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２８】
他の抗癌剤と併用された際に、癌細胞の前記抗癌剤に対する感受性を向上させるのに用いられ、前記抗癌剤がＡｒａ−Ｃである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の阻害剤。
【国際調査報告】
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