(57)【要約】  ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチド若しくはその改変体、又はそれをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬；ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはその部分断片、又はペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含有する、心筋壊死を伴う疾患の検査薬を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドを有効成分として含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
【請求項２】
［ａ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
［ｂ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド；又は
［ｃ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド
を有効成分として含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
【請求項３】
前記医薬が心臓機能改善作用を有する、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
前記医薬が心臓再生促進作用を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項５】
治療に有効量のペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドを治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。
【請求項６】
［ａ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
［ｂ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド；又は
［ｃ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド
からなる群から選んだ、治療に有効量のポリペプチドを治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。
【請求項７】
前記方法が心臓機能改善作用を有する、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が心臓再生促進作用を有する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドの使用。
【請求項１０】
心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、
［ａ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
［ｂ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド；又は
［ｃ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド
の使用。
【請求項１１】
前記医薬が心臓機能改善作用を有する、請求項９又は１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬が心臓再生促進作用を有する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするポリヌクレオチドを含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
【請求項１４】
［ａ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｂ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｃ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
［ｄ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
を含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
【請求項１５】
前記医薬が、心臓機能改善作用を有する、請求項１３又は１４に記載の医薬。
【請求項１６】
前記医薬が、心臓再生促進作用を有する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１７】
治療に有効量のペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするポリヌクレオチドを、治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。
【請求項１８】
［ａ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｂ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｃ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
［ｄ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
からなる群から選んだ、治療に有効量のポリヌクレオチドを治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。
【請求項１９】
前記方法が、心臓機能改善作用を有する、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、心臓再生促進作用を有する、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項２２】
心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、
［ａ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｂ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｃ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
［ｄ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
の使用。
【請求項２３】
前記医薬が、心臓機能改善作用を有する、請求項２１又は２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記医薬が、心臓再生促進作用を有する、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
［ａ］ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ、若しくはその部分断片であるＤＮＡ；
［ｂ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、若しくはその部分断片であるＤＮＡ；又は
［ｃ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列における連続した５〜６０塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体、前記オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体
を含有する、心筋壊死を伴う疾患の検査薬。
【請求項２６】
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含有する、心筋壊死を伴う疾患の検査薬。
【請求項２７】
（１）検査対象より取得した生体試料から検査検体由来ＤＮＡ又はｃＤＮＡを調製する工程、
（２）［ａ］ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ、若しくはその部分断片であるＤＮＡ；
［ｂ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、若しくはその部分断片であるＤＮＡ；又は
［ｃ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列における連続した５〜６０塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体、前記オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体
を用いて、前記検査検体由来ＤＮＡ又はｃＤＮＡにおける、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドをコードするＤＮＡの変異を検出する工程、及び
（３）前記変異に基づいて、心筋壊死を伴う疾患のリスク、種類、程度、及び／又は状態を判定する工程
を含む、心筋壊死を伴う疾患の検査方法。
【請求項２８】
（１）検査対象より取得した生体試料から検査検体由来ＤＮＡ又はｃＤＮＡを調製する工程、
（２）［ａ］ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ、若しくはその部分断片であるＤＮＡ；
［ｂ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、若しくはその部分断片であるＤＮＡ；又は
［ｃ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列における連続した５〜６０塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体、前記オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体
を用いて、前記検査検体由来ＤＮＡ又はｃＤＮＡにおける、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドをコードするＤＮＡを特異的に増幅し、その発現量を分析する工程、及び
（３）前記発現量に基づいて、心筋壊死を伴う疾患の程度及び／又は状態を判定する工程
を含む、心筋壊死を伴う疾患の検査方法。
【請求項２９】
（１）検査対象より取得した生体試料から検体を調製する工程、
（２）ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて、前記検体中のペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドの発現量及び／又は構造変化を検出する工程、及び
（３）前記発現量及び／又は構造変化に基づいて、心筋壊死を伴う疾患の危険性、原因、程度、及び／又は状態を判定する工程
を含む、心筋壊死を伴う疾患の検査方法。
【請求項３０】
（i）請求項１又は２に記載のポリペプチドを発現する細胞における前記ポリペプチドの発現量と、（ii）前記ポリペプチドを発現する細胞と試験物質を接触させた場合の前記ポリペプチドの発現量とを比較し、前記ポリペプチドの発現量を増大させる物質を選択することを特徴とする、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬のスクリーニング方法。
【請求項３１】
（i）請求項１又は２に記載のポリペプチドを発現する細胞の機能と、（ii）前記ポリペプチドを発現する細胞と試験物質を接触させた場合の細胞の機能とを比較し、細胞の機能を制御する活性を有する物質を選択することを特徴とする、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬のスクリーニング方法。
【請求項３２】
前記細胞が、ペリオスチンをコードする遺伝子を欠如している細胞である、請求項３０又は３１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３３】
心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬が、心臓機能改善作用を有する物質である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬が、心臓再生促進作用を有する物質である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法によって得られる化合物、又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項３６】
請求項３５に記載の化合物、又はその薬理学的に許容される塩を含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
【請求項３７】
心臓機能改善作用を有する医薬である、請求項３６に記載の心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
【請求項３８】
修復心臓再生促進作用を有する医薬である、請求項３６に記載の心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
【請求項３９】
治療に有効量の請求項３５に記載の化合物、又はその薬理学的に許容される塩を治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。
【請求項４０】
心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、請求項３５に記載の化合物、又はその薬理学的に許容される塩の使用。
【請求項４１】
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を特異的に認識する抗体。
【請求項４２】
請求項４１に記載の抗体を用いることを特徴とする、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の免疫学的検出又は定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質、あるいは、該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含有する心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬及び検査薬に関する。また、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ及びＲＮＡ）を利用した心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬のスクリーニング方法、該スクリーニング方法により得られる医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞は先進諸国において最も大きな問題となっている生活習慣病の一種である。心筋梗塞は、発症率及び致死率の高い疾患であり、日本において、急性心筋梗塞発症数は年間約１５万人おり、そのうち約３割が死亡していると推定されている。心不全患者の回復率も依然として悪く、効果的な治療法の確立が求められている。更に、心筋梗塞を起こした組織がどのように修復されるのかについて、その詳細な機序は不明であった。【０００３】
ペリオスチンは、重力や荷重による刺激を受けると骨を再生する機構において、重要な役割を果たすと考えられているタンパク質である（非特許文献１）。更に、ヒトペリオスチン抗体を使用して、ヒトの病理組織を網羅的に調べたところ、ヒトやマウスの心筋梗塞を起こした組織にもペリオスチンが作られていることがわかった（非特許文献２）。【０００４】
非特許文献１において、ペリオスチンのＣ末端側の欠如を有する数種類のバリアントが存在していることが報告された。また、ペリオスチンは骨芽細胞のリクルートメントと接着において重要な役割を果たしていることが示唆された。しかし、いずれのペリオスチンバリアントにおいても、機能との関係は考慮も示唆もされていない。【０００５】
特許文献１において、数種の正常組織において、ペリオスチンのＣ末端側の欠如を有する数種類のバリアントが存在していることが報告された。また、骨転移を有する乳癌患者や子癇前症、多様な肺癌において、ペリオスチンの発現量が非常に高いことが報告された。しかし、いずれのペリオスチンバリアントにおいても、それらの癌における機能、あるいは、診断用途との関係は考慮も示唆もされていない。【０００６】
一方、非特許文献３において、ペリオスチン欠如マウスで心破裂が起きやすくなることが報告された。次いで、非特許文献４において、ラットの心筋細胞にペリオスチンタンパク質を反応させると、心筋細胞が増えることが報告された。このことから、ペリオスチンは、心臓において、重要な役割を果たしていることが予想されている。しかし、数種類存在していると考えられるペリオスチンバリアントの心臓における役割については指摘されていない。【０００７】
【特許文献１】特表２００５−５０００５９号公報
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ミネラル・リサーチ（Journal of bone and mineral research）」，（米国），1999年，第14巻，第7号，p. 1239-1249
【非特許文献２】「アーカイブス・オブ・オーラル・バイオロジー（Archives of oral biology）」，（英国），2005年，第50巻，第12号，p.1023-1031
【非特許文献３】「サーキュレーション・リサーチ（Circulation research）」，（米国），2007年，第101巻，第3号，p. 313-321
【非特許文献４】「ネイチャー・メディスン（Nature medicine）」，（米国），2007年，第13巻，第8号，p. 962-969
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
心筋梗塞後の、心破裂の防止及び／又は梗塞部位の修復を促進することができれば、心筋梗塞からの改善や回復を早めることができ、死亡率を低下させることへと繋がる。こうした活性を有する分子の特定とそれを利用した心臓機能を改善する薬剤及び検査薬の開発が望まれている。これは、梗塞部位で起こっているような心筋壊死を伴う心筋炎や心筋症（例えば拡張型心筋症）にとっても有効であると考えられる。
即ち、本発明は、心筋梗塞後の心破裂の防止及び／又は心筋壊死部位の修復を促進する物質を心筋梗塞、又は心筋壊死を伴う公知の疾患（心筋梗塞や心筋炎や心筋症など）の治療のための医薬及び検査薬として提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究し、細胞外マトリックスタンパク質であるペリオスチンに着目し、その機構の一端を明らかにした。
まず、ペリオスチンの心臓での発現を調べてみると、ペリオスチンタンパク質は、マウスの発生過程においては心臓に発現しているが、成獣の心筋層ではその発現は消失していた。次に、マウスに対して左室下行冠動脈を結さつする心筋梗塞モデルを作製した。結さつ後３日後からペリオスチンタンパク質は心筋層と梗塞層の境界部位に発現が見られるようになり、７日目には心筋梗塞層内における発現が急激に増加した。ペリオスチンにはスプライシングバリアントが多数報告されており、その検討を行ったところ、心筋梗塞急性期にはＣ末端を一部欠いたΔｂΔｅというアイソフォーム［以下、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質と称する。また、別称として、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチド、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）、ΔｂΔｅの名称も併用することがある］が特異的に発現していることが明らかとなった。【００１０】
更に、ペリオスチンが心筋梗塞発症時に果たす役割を検討するため、ペリオスチン遺伝子欠損マウスを作製した。ペリオスチン遺伝子欠損マウスでは、少なくとも１６週齢までには心臓の機能・形態に異常は見られなかったが、このマウスに急性心筋梗塞を誘導したところ、急性期における梗塞修復能力が低く、野生型マウス（３１．３％）と比較して著しく心臓破裂を頻発した（６８．１％）。更に、心筋層の剛性を調べてみると、生理的条件下では野生型と欠損マウスに差は見られないものの、心筋梗塞が起こった部位の剛性は欠損マウスにおいて顕著に減少していることがわかった。その一方で、慢性期においては心室拡張が抑制された。以上のことから、ペリオスチンの欠損は心臓の形態形成や心機能に関して生理的条件下では影響をあたえないものの、ペリオスチンが心筋梗塞後の梗塞修復及び心室リモデリングに対して重要な役割を果たしていることが示された。【００１１】
この原因を調べたところ、ペリオスチン欠損マウスの心筋梗塞部位では、細胞外基質タンパク質であるＩ型コラーゲンやフィブロネクチンの沈着が減少し、コラーゲン細線維形成も未熟であるだけでなく、細胞外基質の産生源であるビメンチン／αＳＭＡ（α smooth muscle actin）陽性の心臓線維芽細胞数自体も減少していた。更に、ペリオスチン欠損マウスの心筋梗塞部位のこうした現象が、ペリオスチンによって直接回復させることができるかどうかを確かめるため、梗塞部位にΔｂΔｅ遺伝子を導入したところ、梗塞部位でのαＳＭＡ陽性の心臓線維芽細胞が増加して、心破裂の発症頻度を改善することができた。これらの結果より、ペリオスチンは梗塞部位への心臓線維芽細胞の細胞移動とコラーゲンの細線維形成に重要な役割を果たしていると考えられた。【００１２】
細胞移動にはＦＡＫ（Focal
Adhesion Kinase）のリン酸化が重要であるといわれていることから、本発明者らはペリオスチン欠損マウスの心筋梗塞部位でのリン酸化に注目した。すると、興味深いことに、梗塞時には、野生型に比べてＦＡＫのリン酸化が大きく減少していることがわかった。より詳細にペリオスチンとＦＡＫとの関係を検討するため、培養条件下でΔｂΔｅを添加して検討を行った。その結果、添加時にはＦＡＫのリン酸化亢進が見られたが、αＶインテグリンを阻害することでＦＡＫのリン酸化、及びペリオスチンによって誘導される線維芽細胞の遊走も阻害された。こうした実験結果から、ペリオスチンが関係するシグナル伝達機構にはαＶインテグリンやＦＡＫが関っており、急性心筋梗塞の修復において、ペリオスチンによる線維芽細胞の梗塞部位への移動・活性化とコラーゲンの細線維形成が重要であることが明らかとなった。
以上の知見に述べたように、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）が梗塞部位の修復に特異的な活性を有していることを示すことを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の（１）〜（４２）を提供するものである。【００１３】
（１）ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドを有効成分として含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
（２）［ａ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
［ｂ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド；又は
［ｃ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド
を有効成分として含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
（３）前記医薬が心臓機能改善作用を有する、（１）又は（２）の医薬。
（４）前記医薬が心臓再生促進作用を有する、（１）〜（３）の医薬。
（５）治療に有効量のペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドを治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。
（６）［ａ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
［ｂ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド；又は
［ｃ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド
からなる群から選んだ、治療に有効量のポリペプチドを治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。
（７）前記方法が心臓機能改善作用を有する、（５）又は（６）の方法。
（８）前記方法が心臓再生促進作用を有する、（５）〜（７）の方法。
（９）心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドの使用。
（１０）心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、
［ａ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
［ｂ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド；又は
［ｃ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド
の使用。
（１１）前記医薬が心臓機能改善作用を有する、（９）又は（１０）の使用。
（１２）前記医薬が心臓再生促進作用を有する、（９）〜（１１）の使用。
（１３）ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするポリヌクレオチドを含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
（１４）［ａ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｂ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｃ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
［ｄ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
を含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
（１５）前記医薬が、心臓機能改善作用を有する、（１３）又は（１４）の医薬。
（１６）前記医薬が、心臓再生促進作用を有する、（１３）〜（１５）の医薬。
（１７）治療に有効量のペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするポリヌクレオチドを、治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。
（１８）［ａ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｂ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｃ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
［ｄ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
からなる群から選んだ、治療に有効量のポリヌクレオチドを治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。
（１９）前記方法が、心臓機能改善作用を有する、（１７）又は（１８）の方法。
（２０）前記方法が、心臓再生促進作用を有する、（１７）〜（１９）の方法。
（２１）心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするポリヌクレオチドの使用。
（２２）心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、
［ａ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｂ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｃ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
［ｄ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
の使用。
（２３）前記医薬が、心臓機能改善作用を有する、（２１）又は（２２）の使用。
（２４）前記医薬が、心臓再生促進作用を有する、（２１）〜（２３）の使用。
（２５）［ａ］ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ、若しくはその部分断片であるＤＮＡ；
［ｂ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、若しくはその部分断片であるＤＮＡ；又は
［ｃ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列における連続した５〜６０塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体、前記オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体
を含有する、心筋壊死を伴う疾患の検査薬。
（２６）ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含有する、心筋壊死を伴う疾患の検査薬。
（２７）（１）検査対象より取得した生体試料から検査検体由来ＤＮＡ又はｃＤＮＡを調製する工程、
（２）［ａ］ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ、若しくはその部分断片であるＤＮＡ；
［ｂ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、若しくはその部分断片であるＤＮＡ；又は
［ｃ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列における連続した５〜６０塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体、前記オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体
を用いて、前記検査検体由来ＤＮＡ又はｃＤＮＡにおける、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドをコードするＤＮＡの変異を検出する工程、及び
（３）前記変異に基づいて、心筋壊死を伴う疾患のリスク、種類、程度、及び／又は状態を判定する工程
を含む、心筋壊死を伴う疾患の検査方法。
（２８）（１）検査対象より取得した生体試料から検査検体由来ＤＮＡ又はｃＤＮＡを調製する工程、
（２）［ａ］ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ、若しくはその部分断片であるＤＮＡ；
［ｂ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、若しくはその部分断片であるＤＮＡ；又は
［ｃ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列における連続した５〜６０塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体、前記オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体
を用いて、前記検査検体由来ＤＮＡ又はｃＤＮＡにおける、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドをコードするＤＮＡを特異的に増幅し、その発現量を分析する工程、及び
（３）前記発現量に基づいて、心筋壊死を伴う疾患の程度及び／又は状態を判定する工程
を含む、心筋壊死を伴う疾患の検査方法。
（２９）（１）検査対象より取得した生体試料から検体を調製する工程、
（２）ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて、前記検体中のペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドの発現量及び／又は構造変化を検出する工程、及び
（３）前記発現量及び／又は構造変化に基づいて、心筋壊死を伴う疾患の危険性、原因、程度、及び／又は状態を判定する工程
を含む、心筋壊死を伴う疾患の検査方法。
（３０）（i）（１）又は（２）に記載のポリペプチドを発現する細胞における前記ポリペプチドの発現量と、（ii）前記ポリペプチドを発現する細胞と試験物質を接触させた場合の前記ポリペプチドの発現量とを比較し、前記ポリペプチドの発現量を増大させる物質を選択することを特徴とする、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬のスクリーニング方法。
（３１）（i）（１）又は（２）に記載のポリペプチドを発現する細胞の機能と、（ii）前記ポリペプチドを発現する細胞と試験物質を接触させた場合の細胞の機能とを比較し、細胞の機能を制御する活性を有する物質を選択することを特徴とする、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬のスクリーニング方法。
（３２）前記細胞が、ペリオスチンをコードする遺伝子を欠如している細胞である、（３０）又は（３１）のスクリーニング方法。
（３３）心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬が、心臓機能改善作用を有する物質である、（３０）〜（３２）の方法。
（３４）心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬が、心臓再生促進作用を有する物質である、（３０）〜（３２）の方法。
（３５）（３０）〜（３４）の方法によって得られる化合物、又はその薬理学的に許容される塩。
（３６）（３５）の化合物、又はその薬理学的に許容される塩を含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
（３７）心臓機能改善作用を有する医薬である、（３６）の心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
（３８）修復心臓再生促進作用を有する医薬である、（３６）の心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
（３９）治療に有効量の（３５）の化合物、又はその薬理学的に許容される塩を治療対象に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防方法。
（４０）心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、（３５）の化合物、又はその薬理学的に許容される塩の使用。
（４１）ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を特異的に認識する抗体。
（４２）（４１）の抗体を用いることを特徴とする、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の免疫学的検出又は定量方法。【００１４】
本発明の更に別の側面によれば、治療に有効量の上記（１）又は（２）に記載のポリペプチドを、ヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療のための方法が提供される。
本発明の更に別の側面によれば、心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、上記ポリペプチドの使用が提供される。【００１５】
本発明の更に別の側面によれば、治療に有効量の上記（６）に記載のポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）を、ヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、心筋壊死を伴う疾患の治療のための方法が提供される。
本発明の更に別の側面によれば、心筋壊死を伴う疾患の治療のための遺伝子治療剤の製造における、上記ポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）の使用が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を有効成分として含有する心筋壊死を伴う疾患の治療剤、該タンパク質をコードするＤＮＡを有効成分として含有する心筋壊死を伴う疾患の治療剤、該タンパク質又は該ＤＮＡを利用した心筋壊死を伴う疾患の治療剤のスクリーニング方法、該ＤＮＡ又は該タンパク質を特異的に認識する抗体を用いた心筋壊死を伴う疾患の検査薬及び検査方法及びモニタリング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ペリオスチンの全長構造と、Ｃ末端のＣＴドメインにおける各種スプライシングバリアントの各構造を模式的に示すと共に、急性心筋梗塞後の各種バリアントの発現量を示す説明図である。
【図２】ペリオスチンノックアウトマウスの作成のために、ペリオスチン遺伝子のエクソン１の欠失方法を説明する説明図である。
【図３】急性心筋梗塞を引き起こしたペリオスチンノックアウトマウス（ペリオスチン−／−）において、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質又は全長ペリオスチンの効果を示すグラフである。直線ａは、Ａｄ−ｎｌｓＬａｃＺベクター（コントロール）を投与したマウスの結果を示し、直線ｂは、Ａｄ−ΔｂΔｅウイルスを投与したマウスの結果を示し、直線ｃは、Ａｄ−Ｆｕｌｌウイルスを投与したマウスの結果を示す。
【図４】ヒト・全長ペリオスチンのＣＴドメインの塩基配列（配列番号１４）及びアミノ酸配列（配列番号１５）を示すと共に、各領域ａ１〜ｆ２の位置を示す説明図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の医薬に含有されるタンパク質としては、天然体であるペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質、又はそれらの改変体（modified proteins）を挙げることができる。ペリオスチンのＣ末端に位置するＣＴドメインは、図１（マウス・ペリオスチン）又は図４（ヒト・ペリオスチン）に示すように、領域ａ１（塩基番号１〜６９）、領域ａ２（塩基番号７０〜１１５）、領域ｂ（塩基番号１１６〜１９６）、領域ｃ１（塩基番号１９７〜２８６）、領域ｃ２（塩基番号２８７〜３７６）、領域ｄ（塩基番号３７７〜４５４）、領域ｅ（塩基番号４５５〜５３８）、領域ｆ１（塩基番号５３９〜５７９）、領域ｆ２（塩基番号５８０〜６１５）からなる。なお、各領域の後に示す括弧内の数値は、ヒト・ペリオスチンのＣＴドメインをコードする塩基配列（図４及び配列番号１４）における塩基番号である。ペリオスチンのＣ末端におけるバリアントとして、領域ｂがスプライシングにより除去されたペリオスチンバリアント（Δｂ）タンパク質、領域ｅがスプライシングにより除去されたペリオスチンバリアント（Δｅ）タンパク質、領域ｂ及び領域ｅがスプライシングにより除去されたペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質等が知られている。【００１９】
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質、又はその改変体は、心筋壊死部位を修復する活性を有するタンパク質であれば、天然物由来のタンパク質でも、遺伝子工学的手法により製造されたタンパク質であってもよく、例えば、天然由来の該タンパク質としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ラット、マウスなどあらゆる哺乳動物由来のペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を挙げることができる。なお、天然体のペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質は、Ｎ末端にシグナル配列を有する前駆体として翻訳されるが、本発明においては、前駆体、あるいは、シグナル配列が切断された成熟体のいずれも使用可能である。【００２０】
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の具体例としては、例えば、配列番号２（前駆体）又は配列番号３（成熟体）で表されるヒト・ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質、配列番号５（前駆体）又は配列番号６（成熟体）で表されるマウス・ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質、配列番号８（前駆体）又は配列番号９（成熟体）で表されるラット・ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を挙げることができる。【００２１】
また、本発明の医薬に含有されるペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質、又はそれらの改変体としては、例えば、
［ａ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（好ましくは、配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド、より好ましくは、配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）；
［ｂ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み（好ましくは、配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり）、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド；又は
［ｃ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド（好ましくは、配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチド）
を挙げることができる。【００２２】
配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとしては、配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列に様々なポリペプチド配列又はオリゴペプチド配列を付加した融合タンパク質を挙げることができる。融合タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質、オリゴ・ヒスチジン、抗体ペプチドエピトープ、ヒト免疫グロブリン定常領域、プロテインＡ、シグナル配列などを結合した融合タンパク質を挙げることができる。また、融合タンパク質は公知の手法により特異的に切断可能な配列を有することもできる。【００２３】
配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドを構成するポリペプチドは、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc.Natl.
Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。【００２４】
欠失、置換、若しくは付加されるアミノ酸の数は１以上であり、上限は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換、及び／又は付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個である。【００２５】
本発明の医薬に含有されるタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、若しくは付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、及び／又は付加が同時に生じてもよく、置換若しくは付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどが挙げられる。【００２６】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン。
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸。
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン。
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸。
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン。
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン。
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。【００２７】
配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドにおいては、配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有していることが好ましい。【００２８】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin
and AltschulによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Pro. Natl. Acad. Sci. USA,
90, 5873 (1993)］やＦＡＳＴＡ［Methods Enzymol., 183, 63 (1990)］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。【００２９】
本発明の医薬に含有されるポリペプチドが、心破裂の防止及び／又は心筋壊死部位を修復する活性を有しているか否を確認する方法としては、以下の方法に限定されるものではないが、予めペリオスチン遺伝子をノックアウトしたペリオスチンノックアウト動物を使用すること以外は、公知の心筋梗塞モデルの手法を利用して確認することができる。例えば、後述の実施例に示すように、左室下行冠動脈の結紮（LAD ligation；Michael, 1995 Am J Physiol
Heart Circ Physiol. 269:H2147-2154）により急性心筋梗塞を引き起こすことができる。上記活性の確認を行うポリペプチド（以下、評価対象ポリペプチドと称する）、あるいは、前記ポリペプチドをコードする遺伝子を、ペリオスチンノックアウト動物に投与した後、上記手法により心筋梗塞を発症させ、梗塞部位（心筋壊死部分）の状態を目視により、あるいは、公知の各種指標に基づいて、観察・測定することにより、心筋壊死部位を修復する活性を有しているか否かを確認することができる。なお、評価対象ポリペプチド又はその遺伝子を投与する時期は、前記のように、心筋梗塞発症前に行うこともできるし、あるいは、心筋梗塞発症後（又は同時）に行うこともできる。【００３０】
梗塞部位の修復の具体的指標としては、ウイルスを用いた遺伝子移入、又はペリオスチンタンパク質の投与による心筋梗塞部の修復を、例えば、αＳＭＡ（α smooth muscle actin）陽性細胞数、コラーゲンの量とその架橋度合い、組織学的解析による組織修復の度合いに基づいて、あるいは、心筋梗塞後の生存率に基づいて、検討することができる。例えば、心筋梗塞後の生存率を指標とした場合、心筋梗塞から１週間経過後の生存率として４０％以上（好ましくは５０％以上）である場合に、心筋壊死部位を修復する活性を有していると判定することができる。【００３１】
本発明の医薬においては、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質又はそれらの改変体に加えて、例えば、ペリオスチンバリアント（Δｂ）タンパク質、ペリオスチンバリアント（Δｅ）タンパク質、完全長ペリオスチン（Ｆｕｌｌ）タンパク質を含有させることもできる。ペリオスチンバリアント（Δｂ）タンパク質、ペリオスチンバリアント（Δｅ）タンパク質、完全長ペリオスチン（Ｆｕｌｌ）タンパク質は、心筋壊死部位を修復する活性を有するタンパク質であれば、天然物由来のタンパク質でも、遺伝子工学的手法により製造されたタンパク質であってもよく、例えば天然由来の該タンパク質としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ラット、マウスなどあらゆる哺乳動物由来のペリオスチンタンパク質及びペリオスチンバリアントタンパク質を挙げることができる。【００３２】
完全長ペリオスチン（Ｆｕｌｌ）タンパク質の具体例としては、例えば、配列番号１０（前駆体）又は配列番号１１（成熟体）で表されるヒト・完全長ペリオスチン（Ｆｕｌｌ）タンパク質、配列番号１２（前駆体）又は配列番号１３（成熟体）で表されるマウス・完全長ペリオスチン（Ｆｕｌｌ）タンパク質を挙げることができる。【００３３】
以下、本発明で用いるポリペプチドの具体的態様として、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を用いる場合を例にとって本発明を更に説明するが、本発明はこれらの態様に限定されるものではなく、これまで説明した種々のポリペプチドを用いて実施することができる。【００３４】
１．ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の取得方法
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）のように、完全長ｃＤＮＡが公知である場合、該完全長ｃＤＮＡをもとに、必要に応じて、該タンパク質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製しても良いし、該完全長ｃＤＮＡの配列情報を基に、例えばヒト胎盤あるいは肺由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ヒトペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするｃＤＮＡを単離することができる。得られたｃＤＮＡが全長ｃＤＮＡでない場合は、このクローンをプローブとしたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングや、ＲＡＣＥ法［rapid amplification of cDNA ends; Frohman MA et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 85, 8998 (1988)］により全長のｃＤＮＡを取得することができる。【００３５】
得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列をＤＮＡシークエンサー等を用いて決定し、その塩基配列について各フレームでアミノ酸配列に翻訳した後、公知のペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）のアミノ酸配列と比較することにより、取得されたｃＤＮＡがペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡであるかを確認することができる。取得されたペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡを用いて、上記したように必要に応じて適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。【００３６】
該ＤＮＡ断片、あるいは完全長ｃＤＮＡを発現ベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、該タンパク質の組換発現ベクターを作製する。具体的には、例えば、配列番号２（ヒト配列）、配列番号５（マウス配列）、配列番号８（ラット配列）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするｃＤＮＡであって、配列番号１（ヒト配列）、配列番号４（マウス配列）、配列番号７（ラット配列）で表される塩基配列を含む完全長ｃＤＮＡが挿入された発現ベクターを作製する。【００３７】
該組換発現ベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞内に導入する。宿主細胞としては、目的とするＤＮＡを発現できるものは全て用いることができ、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属、セラチア（Serratia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、バチルス（Bacillus）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属等に属する細菌、クルイベロミセス（Kluyveromyces）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロマイセス（Shizosaccharomyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、シワニオミセス（Schwanniomyces）属等に属する酵母や動物細胞、昆虫細胞等を用いることができる。【００３８】
発現ベクターとしては、宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、該ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。【００３９】
細菌を宿主細胞として用いる場合は、該ＤＮＡ組換発現ベクターは該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該ポリペプチドのＤＮＡ及び転写終結配列より構成された組換発現ベクターであることが好ましい。ベクターにはプロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００４０】
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＫＫ２３３−２（Amersham Pharmacia Biotech社製）、ｐＳＥ２８０（Invitrogen社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Promega社製）、ｐＱＥ−８（QIAGEN社製）、ｐＫＹＰ１０［特開昭58-110600］、ｐＫＹＰ２００［Agricultural Biological
Chemistry, 48, 669 (1984)］、ｐＬＳＡ１［Agric. Biol.
Chem., 53, 277 (1989)］、ｐＧＥＬ１［Proc. Natl.Acad.
Sci. USA, 82, 4306 (1985)］、pBluescript II SK(-)（Stratagene社製）、ｐＧＥＸ（Amersham
Pharmacia Biotech社製）、ｐＥＴ−３（Novagen社製）、ｐＴｅｒｍ２（USP4686191、USP4939094、USP5160735)、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［J.
Bacteriol., 172, 2392 (1990)］等を例示することができる。【００４１】
発現ベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したものを用いることが好ましい。【００４２】
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐtrp）、ｌａｃプロモーター（Ｐlac）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌｅｔＩプロモーター［Gene, 44, 29 (1986)］、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。【００４３】
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードする部分のＤＮＡの塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように置換することにより、目的とするポリペプチド又はタンパク質の生産率を向上させることができる。上記ポリペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。【００４４】
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、ミクロバクテリウム属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammoniagenes、Brevibacterium immariophilum
ATCC14068、Brevibacterium
saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-0110等を挙げることができる。【００４５】
組換発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)］、プロトプラスト法［特開昭63-248394］、又はGene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等を挙げることができる。【００４６】
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC37419）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。【００４７】
プロモーターとしては、酵母中で機能するものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ
１プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等を挙げることができる。【００４８】
宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）等を挙げることができる。【００４９】
組換発現ベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Methods. in Enzymol., 194, 182 (1990)、スフェロプラスト法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1929 (1978)］、酢酸リチウム法［J. Bacteriol., 153, 163 (1983)］、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)に記載の方法等を挙げることができる。【００５０】
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pｃＤＮＡ１．１（Invitrogen社製）、ｐＣＤＭ８（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０７［特開平3-22979；Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ（Invitrogen社製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochem., 101,
1307 (1987)］、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。【００５１】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。【００５２】
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７［特開昭63-299］等を挙げることができる。【００５３】
組換発現ベクターの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できるいかなる方法も用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)、Virology, 52, 456 (1973)］等を用いることができる。【００５４】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、例えばバキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ，ア・ラボラトリー・マニュアル（Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーサプルメント１−３８（1987-1997）、Bio/Technology, 6, 47
(1988)等に記載された方法によって、ポリペプチド又はタンパク質を発現することができる。【００５５】
即ち、組換え遺伝子導入ベクター及びバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、更に組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチド又はタンパク質を発現させることができる。遺伝子導入用ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃIII（ともにInvitrogen社製）等を挙げることができる。バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）等を用いることができる。【００５６】
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［Baculovirus
Expression Vectors, A Laboratory Manual、W.H.Freeman and
Company，New York, (1992)］、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉｇｈ ５（Invitrogen社製）等を用いることができる。【００５７】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法［特開平2-227075］、リポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)］等を挙げることができる。【００５８】
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞又は昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチド又はタンパク質を得ることができる。【００５９】
該タンパク質のＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地中で培養し、培養物中に目的ポリペプチド又は目的タンパク質を生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチド又はタンパク質を採取することにより、目的ポリペプチド又は目的タンパク質を製造することができる。ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）を製造するための形質転換体を培地中で培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。【００６０】
上記形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母等の真核生物を宿主細胞とする場合、これら形質転換体を培養する培地は、該宿主細胞が資化し得る炭素源、窒素源、無機物等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。【００６１】
炭素源としては、それぞれの宿主細胞が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類を用いることができる。【００６２】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等が用いられる。【００６３】
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。【００６４】
培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００６５】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを有する発現ベクターを用いた形質転換体を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを有する発現ベクターを用いた形質転換体を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを有する発現ベクターを用いた形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。【００６６】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［The Journal of the American Medical Association, 199, 519
(1967)］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Science, 122, 501 (1952)］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Virology, 8, 396 (1959)］、１９９培地［Proceeding
of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)］又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。【００６７】
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００６８】
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Pharmingen社製）、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（Life
Technologies社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもJRH Biosciences社製）、Grace's Insect Medium［Grace, T.C.C.,Nature, 195,
788 (1962)］等を用いることができる。培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００６９】
形質転換体の培養物から、目的ポリペプチド又は目的タンパク質を単離精製するには、通常のポリペプチド又はタンパク質の単離、精製法を用いればよい。例えば、ポリペプチド又はタンパク質が、細胞内に溶解状態で産生した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のポリペプチド又はタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Amersham Pharmacia Biotech社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、ポリペプチド又はタンパク質の精製標品を得ることができる。【００７０】
また、ポリペプチド又はタンパク質が細胞内に不溶体を形成して産生した場合は、細胞を回収後破砕し、遠心分離することにより、沈殿画分としてポリペプチド又はタンパク質の不溶体を回収する。回収したポリペプチド又はタンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。可溶化液を希釈あるいは透析して、可溶化液中のタンパク質変性剤の濃度を下げることにより、ポリペプチド又はタンパク質の構造を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチド又はタンパク質の精製標品を得る。【００７１】
ポリペプチド又はタンパク質あるいはその糖修飾体等が細胞外に分泌された場合には、培養上清から、該ポリペプチド又はタンパク質あるいはその糖修飾体等を回収することができる。即ち、培養物から遠心分離等の手法により培養上清を回収し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。【００７２】
このようにして取得されるポリペプチド又はタンパク質として、例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド等を挙げることができる。【００７３】
また、該ポリペプチド又はタンパク質を、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、米国Advanced ChemTech社製、Perkin-Elmer社製、Amersham Pharmacia Biotech社製、米国Protein
Technology Instrument社製、米国Synthecell-Vega社製、米国PerSeptive社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用し合成することもできる。【００７４】
２．ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を特異的に認識する抗体の作製
上記１で取得されるポリペプチド又はタンパク質の部分断片精製標品、あるいは配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９で表されるアミノ酸配列を用いて、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を認識する抗体を作製することができる。【００７５】
（１）ポリクローナル抗体の作製
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質又は該タンパク質の部分断片ポリペプチドの精製標品、あるいは該タンパク質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。特に完全長のペリオスチン配列と異なる領域を抗原とすることが好ましいが、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を特異的に認識できれば、共通する配列を抗原としても良い。投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。【００７６】
該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（keyhole limpet haemocyanin）や牛チログロブリンなどのキャリアタンパク質に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。【００７７】
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法［酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６年）、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］等で確認する。【００７８】
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿［Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
(1988)］、又はＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡ又はＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独又は組み合わせて処理する方法があげられる。作製した抗体の特異性を上げるために、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）カラムでアフィニティー精製を行ったり、完全長ペリオスチンや他のペリオスチンバリアントで吸収精製を行うことが好ましい。【００７９】
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産生細胞の調製
免疫原としては、前記ポリクローナル抗体の作製で使用可能なタンパク質やペプチドが使用できる。前記免疫に用いたタンパク質又は部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス又はラットを抗体産生細胞の供給源として供する。該抗体価を示したマウス又はラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。【００８０】
該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。【００８１】
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウス又はラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す）［Curr. Topics. Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978)、Europ. J. Immunol., 6, 511 (1976)］、SP2/0-Ag14(SP-2)［Nature, 276, 269 (1978)］、P3-X63-Ag8653(653)［J. Immunol., 123, 1548 (1979)］、P3-X63-Ag8(X63)［Nature, 256, 495 (1975)］等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地［RPMI-1640培地にグルタミン（1.5 mmol/L）、２−メルカプトエタノール（5×10-5 mol/L）、ジェンタマイシン（10μg/mL）及び牛胎児血清（FCS）（CSL社製、10%）を加えた培地（以下、正常培地という）に、更に８−アザグアニン（15μg/mL）を加えた培地］で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。【００８２】
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地又はＰＢＳ（リン酸二ナトリウム1.83 g、リン酸一カリウム0.21 g、食塩7.65 g、蒸留水1 L、pH7.2）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。【００８３】
得られた沈殿画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングリコール−１０００（PEG-1000）２ｇ、ＭＥＭ ２ｍＬ及びジメチルスルホキシド（DMSO）０．７ｍＬを混合した溶液を０．２〜１ｍＬ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。【００８４】
添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地［正常培地にヒポキサンチン（10-4 mol/L）、チミジン（1.5×10-5 mol/L）及びアミノプテリン（4×10-7 mol/L）を加えた培地］１００ｍＬ中に懸濁する。【００８５】
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μＬ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。【００８６】
培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ［Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
Chapter 14 (1988)］等に述べられている酵素免疫測定法により、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）の全長あるいは部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。【００８７】
酵素免疫測定法の具体例として、以下の方法を挙げることができる。免疫の際、抗原に用いたペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）の全長あるいは部分断片ポリペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（ｄ）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、更に第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラット又は抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行い、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）に特異的に反応するものを本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。更に、完全長ペリオスチンや他のペリオスチンバリアントとの反応性を検討し、該タンパク質に反応しないハイブリドーマを選択することが好ましい。【００８８】
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものを本発明で用いるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株として選択する。【００８９】
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Pristane）0.5 mLを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８〜１０週令のマウス又はヌードマウスに、（ｃ）で取得したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。【００９０】
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。得られた上清より、ポリクローナル抗体で用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。【００９１】
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキット又はラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。ポリペプチド量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。【００９２】
３．ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡを用いたペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）遺伝子のｍＲＮＡの検出方法
該検出方法に用いられるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、もしくはそれらから得られるＤＮＡ断片等が挙げられる。以下、これらを本発明に用いるＤＮＡとも称する。該遺伝子のｍＲＮＡの発現量や構造変化を検出する方法としては、例えば（１）ノーザンブロット法、（２）ｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、（３）定量的ＰＣＲ法、（４）デファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、（５）ＤＮＡチップ法、（６）ＲＮａｓｅ保護アッセイ法などの方法等があげられる。【００９３】
上記方法による分析に供する検体としては、心筋壊死を伴う疾患の患者並びに健常者より取得した心臓組織、血液（末梢血、冠状静脈洞採血等）、その血清、唾液等の生体試料、あるいは該生体試料から細胞を取得して試験管内の適当な培地中で培養した初代培養細胞試料から取得したｍＲＮＡあるいは全ＲＮＡが用いられる（以後、該ｍＲＮＡ及び全ＲＮＡを検体由来ＲＮＡと称する）。また、生体試料から取得した組織を、パラフィンあるいはクリオスタット切片として単離したものを用いることもできる。【００９４】
ノーザンブロット法では、検体由来ＲＮＡをゲル電気泳動で分離後、ナイロンフィルター等の支持体に転写し、本発明に用いるＤＮＡより調製した標識プローブを用いて、ハイブリダイゼーション並びに洗浄を行うことで、該遺伝子ｍＲＮＡに特異的に結合したバンドを検出することにより、該遺伝子ｍＲＮＡの発現量並びに構造の変化を検出することができる。ハイブリダイゼーションを行う際には、プローブと検体由来ＲＮＡ中の該遺伝子ｍＲＮＡが安定なハイブリッドを形成する条件でインキュベーションする。偽陽性を防ぐためには、ハイブリダイゼーション並びに洗浄工程は高ストリンジェントな条件で行うことが望ましい。この条件は、温度、イオン強度、塩基組成、プローブの長さ、及びホルムアミド濃度等の多数の因子により決定される。これらの因子は、例えば、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている。【００９５】
ノーザンブロット法に用いる標識プローブは、例えば、公知の方法（ニック・トランスレーション、ランダム・プライミング又はキナージング）により放射性同位体、ビオチン、蛍光基、化学発光基等を、本発明に用いるＤＮＡあるいは該ＤＮＡの配列から設計したオリゴヌクレオチドに取り込ませることで調製することができる。標識プローブの結合量は該遺伝子ｍＲＮＡの発現量を反映することから、結合した標識プローブの量を定量することで該遺伝子ｍＲＮＡの発現量を定量することができる。また、標識プローブ結合部位を分析することで、該遺伝子ｍＲＮＡの構造変化を知ることができる。【００９６】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、上記標識プローブと、生体から取得した組織をパラフィンあるいはクリオスタット切片として単離したものを用いてハイブリダイゼーション及び洗浄の工程を行うことにより、該遺伝子のｍＲＮＡの発現量を検出する方法である。ｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法で、偽陽性を防ぐためには、ハイブリダイゼーション並びに洗浄工程は高ストリンジェントな条件で行うことが望ましい。この条件は、温度、イオン強度、塩基組成、プローブの長さ、及びホルムアミド濃度等の多数の因子により決定される。これらの因子は、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載されている。【００９７】
定量的ＰＣＲ法、デファレンシャル・ハイブリダイゼーション法又はＤＮＡチップ法等の該遺伝子のｍＲＮＡの検出法は、検体由来ＲＮＡに、オリゴｄＴプライマーあるいはランダムプライマー及び逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成することに基づいた方法で行うことができる（以後、該ｃＤＮＡを検体由来ｃＤＮＡと称する）。検体由来ＲＮＡがｍＲＮＡの場合は、上記いずれのプライマーも用いることができるが、該検体由来ＲＮＡが全ＲＮＡである場合は、オリゴｄＴプライマーを用いる。【００９８】
定量的ＰＣＲ法では、検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとし、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、該遺伝子のｍＲＮＡ由来のＤＮＡ断片を増幅する方法である。増幅ＤＮＡ断片の量は該遺伝子のｍＲＮＡの発現量を反映することから、アクチンやＧ３ＰＤＨ（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）等をコードするＤＮＡを内部コントロールとして置くことで該遺伝子のｍＲＮＡの量を定量することが可能である。また、増幅ＤＮＡ断片をゲル電気泳動により分離することで、該遺伝子のｍＲＮＡの構造の変化を知ることもできる。本検出法では、標的配列を特異的にかつ効率的に増幅する適当なプライマーを用いることが望ましい。適当なプライマーは、プライマー間の結合やプライマー内の結合を起こさず、アニーリング温度で標的ｃＤＮＡと特異的に結合して、変性条件で標的ｃＤＮＡからはずれる等の条件に基づき設計することができる。増幅ＤＮＡ断片の定量は増幅産物が指数関数的に増加しているＰＣＲ反応の内に行うことが必要である。このようなＰＣＲ反応は、各反応ごとに生産される該増幅ＤＮＡ断片を回収してゲル電気泳動で定量分析することで知ることができる。【００９９】
デファレンシャル・ハイブリダイゼーション法［Trends in Genetics, 7, 314-317 (1991)］やＤＮＡチップ法［Genome Research, 6, 639-645 (1996)］は、検体由来ｃＤＮＡをプローブとして、本発明に用いるＤＮＡを固定化させたフィルター又はスライドガラスあるいはシリコンなどの基板に対して、ハイブリダイゼーション並びに洗浄を行うことにより、該遺伝子ｍＲＮＡの発現量の変動を検出する方法である。いずれの方法もフィルター又は基板上に、アクチンやＧ３ＰＤＨなどの内部コントロールを固定化することで、対照検体と標的検体の間での該遺伝子のｍＲＮＡの発現の違いを正確に検出することができる。また対照検体と標的検体由来のＲＮＡを基にそれぞれ異なる標識ｄＮＴＰを用いて標識ｃＤＮＡ合成を行い、フィルター又は基板に二つの標識ｃＤＮＡプローブを同時にハイブリダイズさせることにより正確な該遺伝子のｍＲＮＡの発現量の定量を行うことができる。【０１００】
ＲＮａｓｅ保護アッセイ法は、以下の方法により行う。まず、本発明に用いるＤＮＡの３’末端にＴ７プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどのプロモーター配列を結合し、ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ
ｖｉｔｒｏの転写系により標識したｒＮＴＰを用いて、標識したアンチセンスＲＮＡを合成する。該標識アンチセンスＲＮＡを検体由来ＲＮＡと結合させて、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成させた後、ＲＮａｓｅで消化し、消化から保護されたＲＮＡ断片をゲル電気泳動によりバンドを形成させ検出する。得られたバンドを定量することで、該遺伝子のｍＲＮＡの発現量を定量することができる。【０１０１】
４．ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的検出又は定量方法
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を特異的に認識する抗体（ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）を用いて、微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞又は組織の細胞内あるいは細胞外に発現したペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を免疫学的に検出及び定量する方法としては、蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法や免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、免疫凝集法［単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック）（１９８７）、続生化学実験講座５
免疫生化学研究法（東京化学同人）（１９８６）］などが挙げられる。【０１０２】
上記方法による分析に供する検体としては、心筋壊死を伴う疾患の患者並びに健常者より取得した心臓組織、血液（末梢血、冠状静脈洞採血等）、その血清、唾液等の生体試料、あるいは該生体試料から細胞を取得して試験管内の適当な培地中で培養した初代培養細胞試料から取得したタンパク質、また、生体試料から取得した組織を、パラフィンあるいはクリオスタット切片として単離したものを用いることもできる。【０１０３】
蛍光抗体法とは、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の存在の有無を検討するために、上記試料あるいは抽出物に、本発明で用いる抗体を反応させ、更にフルオレシン・イソチオシアネート（FITC）などの蛍光物質でラベルした抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する方法である。【０１０４】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）とは、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の存在の有無を検討するために、上記試料あるいは抽出物に、本発明で用いる抗体を反応させ、更にペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。【０１０５】
放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）とは、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の存在の有無を検討するために、上記試料あるいは抽出物に、本発明で用いる抗体を反応させ、更に放射線標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法である。【０１０６】
免疫細胞染色法、免疫組織染色法などの免疫組織化学染色法とは、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の存在の有無を検討するために、上記試料あるいは抽出物に、本発明で用いる抗体を反応させ、更にＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法である。【０１０７】
ウェスタンブロッティング法とは、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の存在の有無を検討するために、上記試料あるいは抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
(1988)］で分画した後、該ゲルをＰＶＤＦ膜あるいはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に本発明で用いる抗体を反応させ、更にＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいはその断片を反応させた後、確認する方法である。【０１０８】
ドットブロッティング法とは、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の存在の有無を検討するために、上記試料あるいは抽出物をニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜にペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を特異的に認識する抗体を反応させ、更にＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素標識を施した抗マウスＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、確認する方法である。【０１０９】
免疫沈降法とは、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の存在の有無を検討するために、上記試料あるいは抽出物をペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を特異的に認識する抗体と反応させた後、プロテインＧ−セファロース等イムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる方法である。【０１１０】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法とは、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を特異的に認識する抗体で、抗原認識部位の異なる２種類の抗体のうち、あらかじめ一方の抗体をプレートに吸着させ、もう一方の抗体をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチンなどの酵素で標識しておき、抗体吸着プレートに、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の存在の有無を検討するために、上記試料あるいは抽出物を反応させた後、標識した抗体を反応させ、結合した標識物質により検出を行う方法である。【０１１１】
免疫凝集法とは、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を特異的に認識する抗体で、抗原認識部位の異なる２種類の抗体（もしくは１種類）をラテックス粒子、あるいはリポソームに固定化させ、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の存在の有無を検討するために、上記試料あるいは抽出物を反応させた後、凝集した粒子の濁度を吸光度等により検出を行う方法である。【０１１２】
５．ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡの変異同定方法
当該方法に用いられるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、もしくはそれらから得られるＤＮＡ断片等があげられる。【０１１３】
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）遺伝子座中に存在する心筋壊死を伴う疾患の患者の原因となる変異の存在の有無を評価するための最も明確な試験は、対照集団からの遺伝子と心筋壊死を伴う疾患の患者からの遺伝子とを直接比較することである。【０１１４】
具体的には心筋壊死を伴う疾患の患者ならび健常人から、心臓組織、血液（末梢血、冠状静脈洞採血等）、その血清、唾液等のヒト生体試料あるいは、該生体試料から樹立した初代培養細胞由来の試料を集め、該生体試料並びに該初代培養細胞由来試料中からＤＮＡを抽出する（以後、該ＤＮＡを検体由来ＤＮＡと称する）。該検体由来ＤＮＡは、直接あるいは配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いて増幅したペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡを試料ＤＮＡとして用いることができる。別法として、該検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーによりＰＣＲを行うことで増幅したＤＮＡ断片を試料ＤＮＡとして用いることができる。【０１１５】
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡに心筋壊死を伴う疾患の原因となる変異があるかどうかを検出する方法として、野生型対立遺伝子を有するＤＮＡ鎖と変異対立遺伝子を有するＤＮＡ鎖とのハイブリダイズにより形成されるヘテロ二本鎖を検出する方法を用いることができる。【０１１６】
ヘテロ二本鎖を検出する方法としては、（１）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘテロ二本鎖検出法［Trends Genet., 7, 5 (1991)］、（２）一本鎖コンフォメーション多型解析法［Genomics, 16, 325-332 (1993)］、（３）ミスマッチの化学的切断法（CCM, chemical cleavage of mismatches）［Human
Genetics (1996), Tom Strachan and Andrew P. Read, BIOS Scientific Publishers
Limited］、（４）ミスマッチの酵素的切断法［Nature Genetics, 9,
103-104 (1996)］、（５）変性ゲル電気泳動法［Mutat. Res., 288,
103-112 (1993)］等の方法を挙げることができる。【０１１７】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘテロ二本鎖検出法は、検体由来ＤＮＡあるいは検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いたＰＣＲによって、２００ｂｐよりも小さい断片としてペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡの断片を増幅し、該増幅ＤＮＡ断片を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、変異を有さないホモ二本鎖と泳動度を比較する方法である。ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡの変異によりヘテロ二本鎖が形成された場合は、変異を持たないホモ二本鎖よりもゲルの移動度が遅く、それらはホモ二本鎖と異なるバンドとして検出することができる。該電気泳動には、市販のゲル［Hydro-link, MDE（FMC社製）など］を用いることもできる。また、２００ｂｐよりも小さいＤＮＡ断片を用いたヘテロ二本鎖検出法では、１塩基の挿入、欠失及び置換を検出可能である。ヘテロ二本鎖解析は、次に述べる一本鎖コンフォメーション多型解析と組み合わせた１枚のゲルで行うことが望ましい。【０１１８】
一本鎖コンフォメーション多型解析（ＳＳＣＰ解析；single strand conformation polymorphism analysis）は、検体由来ＤＮＡ又は検体由来ｃＤＮＡをテンプレートに、配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いたＰＣＲにより、２００ｂｐよりも小さい断片として増幅したペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡを変性後、未変性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動する方法である。ＤＮＡの増幅を行う際にプライマーを放射性同位体あるいは蛍光色素で標識するか、又は未標識の増幅産物を銀染色することにより、増幅したペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡをバンドとして検出することができる。野生型の泳動パターンとの相違を明らかにするために、コントロールの検体も同時に電気泳動すると、塩基配列に変異を持った断片を移動度の違いから検出することができる。【０１１９】
ミスマッチの化学的切断法（ＣＣＭ法）は、検体由来ＤＮＡあるいは検体由来ｃＤＮＡをテンプレートに、配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーでペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡ断片を増幅させ、該増幅ＤＮＡ断片と配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡに放射性同位体あるいは蛍光色素をとり込ませた標識ＤＮＡとをハイブリダイズさせ、四酸化オスミウムで処理することでミスマッチしている場所のＤＮＡの一方の鎖を切断させ塩基配列の変異を検出する方法である。ＣＣＭ法は最も感度の高い検出法の１つであり、キロベースの長さの検体にも適応できる。【０１２０】
上記の四酸化オスミウムの代わりにＴ４ファージリゾルベースとエンドヌクレアーゼＶＩＩのような細胞内でミスマッチの修復に関与する酵素とＲＮａｓｅＡと組み合わせることで、酵素的にミスマッチを切断することもできる。【０１２１】
変性ゲル電気泳動法（denaturing
gradient gel electrophoresis：DGGE法）は、検体由来ＤＮＡ又は検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅したペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡ断片を化学的変性剤の濃度勾配や温度勾配を有するゲルを用いて電気泳動する方法である。増幅したＤＮＡ断片はゲル内を一本鎖に変性する位置まで移動し、変性後は移動しなくなる。ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡに変異がある場合とない場合では増幅したＤＮＡのゲル内での移動度が異なることから、変異の存在を検出することが可能である。ＰＣＲに使用するそれぞれのプライマーにポリ（Ｇ：Ｃ）端末を付けて検出感度を上げることもできる。【０１２２】
心筋壊死を伴う疾患の原因遺伝子を検出する別の方法として、タンパク質短縮試験（protein truncation test：ＰＴＴ法）［Genomics, 20,
1-4 (1994)］がある。該試験によりタンパク質の欠損を生み出すフレームシフト突然変異、スプライス部位突然変異、ナンセンス突然変異を特異的に検出することができる。ＰＴＴ法は、配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡの５’末端にＴ７プロモーター配列と真核生物翻訳開始配列をつないだプライマーを設計し、該プライマーを用いて検体由来ＲＮＡより逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法でペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするｃＤＮＡを作製する。該ｃＤＮＡを用い、in vitro転写、翻訳を行うとタンパク質が生産される。該タンパク質をポリアクリルアミド電気泳動して、該タンパク質の泳動位置が完全長タンパク質に相当する位置にあれば欠損を生み出す変異は存在せず、該タンパク質に欠損がある場合は、完全長タンパク質より短い位置に該タンパク質は泳動され、該位置より欠損の程度を知ることができる。【０１２３】
検体由来ＤＮＡ及び検体由来ｃＤＮＡの塩基配列を決定するために配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡに基づいて設計したプライマーを用いることが可能である。決定された塩基配列を解析することにより、検体由来ＤＮＡ又は検体由来ｃＤＮＡに心筋壊死を伴う疾患の原因となる変異があるか否かを判別することができる。【０１２４】
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）遺伝子のコード領域以外の変異は、該遺伝子の付近又はその中のイントロン及び調節配列などの、非コード領域を検査することによって検出することができる。非コード領域中の変異に起因する心筋壊死を伴う疾患は、上記に記載した方法と同様の方法により検出することができる。【０１２５】
このようにして非コード領域における変異の存在が示唆された該遺伝子については、配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡをハイブリダイゼーションのプローブとして用いることにより、クローン化することができる。非コード領域における変異は上述のいずれかの方法に準じて探索することができる。【０１２６】
見出された変異は、Handbook
of Human Genetics Linkage. The John Hopkins University Press, Baltimore (1994)に記載された方法に従い統計処理を行うことで、心筋壊死を伴う疾患との連鎖があるＳＮＰｓ（シングル・ヌクレオチド・ポリモルフィズム）として同定することができる。また、心筋壊死を伴う疾患の病歴を持つ家族から、先に示した方法に従いＤＮＡを取得し、変異を検出することで、心筋壊死を伴う疾患の原因遺伝子を同定することができる。【０１２７】
６．ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡを用いた心筋壊死を伴う疾患の検査方法
上記方法に用いられるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、もしくはそれらから得られるＤＮＡ断片等があげられる。
心筋壊死を伴う疾患の原因は、ヒトのいずれかの組織における遺伝子の変異を検出することによって確認することができる。例えば、生殖細胞系に変異がある場合、当該変異を遺伝した個人は、心筋壊死を伴う疾患を発症し易い傾向である可能性がある。当該変異は、該個人の体のいずれかの組織から抽出したＤＮＡを試験することによって検出することができる。例えば、ヒトから採血した血液の細胞からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを用いて、遺伝子の変異を検出することにより、心筋壊死を伴う疾患のリスクを検査することができる。また、羊膜細胞を採取してＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを用いて、遺伝子の変異を検出することにより、出生前の心筋壊死を伴う疾患のリスクを検査することができる。【０１２８】
また、心筋壊死を伴う疾患を発症した患者の、病巣部位の生体組織からＤＮＡを取得し、遺伝子の変異を検出することにより、心筋壊死を伴う疾患の種類を検査し、投与する薬物の選択などに利用することができる。生体組織からのＤＮＡは、周囲の正常組織から遊離した病巣部位の組織を単離してトリプシンなどで処理し、得られた細胞を適当な培地で培養し、培養した細胞から染色体ＤＮＡ並びにｍＲＮＡを抽出することにより取得することができる。【０１２９】
また、心筋壊死を伴う疾患を発症した患者より取得した心臓壊死部位の組織、血液（末梢血、冠状静脈洞採血等）、その血清、尿、便、唾液などの生体試料そのものあるいは、該生体試料から取得した細胞からＤＮＡあるいはｍＲＮＡを抽出し、該ＤＮＡあるいはｍＲＮＡを用いて、遺伝子の発現量を検出することにより、心筋壊死を伴う疾患の程度や状態を検査し、適時、検査を行うことで、その状態をモニタリングすることができる。
具体的には、該遺伝子の発現量が、統計的有意差をもって健常人よりも高いときには、心筋壊死を伴う疾患を発症したとみなすことができる。また、心筋梗塞のような心筋壊死を伴う疾患のモニタリングとしては、該遺伝子の発現量が非常に高い時には心破裂などの危険な状態であり、減少している時には安定期にあること等から、適当な治療方針を決定することができる。【０１３０】
以下、検査を目的としてヒト検体から上記いずれかの方法で取得したＤＮＡを検査検体由来ＤＮＡと称する。また、検査を目的としてヒト検体から上記いずれかの方法で取得したＲＮＡより合成したｃＤＮＡを検査検体由来ｃＤＮＡと称する。
配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、及び検査検体由来ＤＮＡあるいは検査検体由来ｃＤＮＡを用い、上記５のペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡの変異を検出する方法に準じた方法により心筋壊死を伴う疾患の検査を行うことができるが、上記５の方法により、心筋壊死を伴う疾患との因果関係が見出された変異を検査検体由来ＤＮＡ又は検査検体由来ｃＤＮＡが有しているか否かを検査する方法としては、（１）制限酵素部位の検出、（２）対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを利用する方法（ASO：allele specific oligonucleotide
hybridization）、（３）対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ（ARMS：amplification refractory mutation system）、（４）オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（OLA：oligonucleotide ligation assay）、（５）PCR-PHFA法（PCR-preferential homoduplex
formation assay）、（６）オリゴＤＮＡアレイを用いる方法［タンパク質核酸酵素、43, 2004-2011 (1998)］等の方法が挙げられる。【０１３１】
以下、（１）〜（６）について記す。制限酵素部位の検出は、以下に記載の方法に従い行うことができる。すなわち、単一塩基の変化により制限酵素部位が消失又は発生する場合は、検査検体由来ＤＮＡあるいは検査検体由来ｃＤＮＡを、配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲで増幅したのち、制限酵素で消化し、得られた制限酵素切断ＤＮＡ断片を正常人の場合と比較することで簡便に変異を検出することができる。更に詳細に塩基の変化を検査する方法としては、配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列情報並びに上記５の方法により同定された変異の情報を組合せることでオリゴヌクレオチドプロ−ブを設計し、該オリゴヌクレオチドプローブをフィルターに結合させてハイブリダイズを行うリバースドットブロット法で変異を検出する方法を挙げることができる。【０１３２】
対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（ＡＳＯ）を利用する方法は、短い合成ＤＮＡプローブが、完全に対合する塩基配列とのみハイブリダイズする特徴を利用した方法で、１塩基の変異を容易に検出することができる。具体的には、配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列と、上記５で同定された塩基の変異に基づき設計したオリゴヌクレオチドをフィルターに結合させ、検査検体由来ＤＮＡあるいは検査検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして用い、配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列を用いて設計したプライマーと標識したｄＮＴＰを用いたＰＣＲにより得られる増幅ＤＮＡ断片をプローブに用いてハイブリダイズを行うリバースドットブロット法を挙げることができる。【０１３３】
リバースドットブロットとは、スライドガラス又はシリコンなどの基盤に直接、測定対象とするＤＮＡに対応する変異のないＤＮＡの塩基配列と別途同定された該ＤＮＡの変異に基づき設計したオリゴヌクレオチドを合成して、高密度のアレイであるＤＮＡチップを用いて、少量の検査検体由来ＤＮＡあるいは検査検体由来ｃＤＮＡを反応させて多様な変異をより簡便に検出する方法である。本方法は、大規模な診断目的に適した変異検出法である。【０１３４】
塩基の変異は、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）法によって以下に示す方法によっても検出できる。
調べようとするペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡの変異部位をその３’末端に有する２０塩基程度のオリゴヌクレオチド、及び該変異部位に続く２０塩基程度のオリゴヌクレオチドを、配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に基づき設計、合成する。このとき、例えば、前者のオリゴヌクレオチドの５’末端にはビオチンを、後者のオリゴヌクレオチドの３’末端にはジゴケシゲニンなどの異なる標識体を付加しておく。次に検査検体由来ＤＮＡあるいは検査検体由来ｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に基づき設計したプライマーを用い、ＰＣＲによりペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡを増幅する。次に該増幅ＤＮＡ断片と上記２本のオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせる。ハイブリダイズ後、ＤＮＡリガーゼで２本のオリゴヌクレオチドを連結させる。連結反応後、２本鎖ＤＮＡを熱変性させて得られるビオチン標識一本鎖ＤＮＡを、例えばアビジンに結合するＤＮＡとして回収する。変位部位を有する増幅ＤＮＡ断片とハイブリダイズした上記２種類のオリゴヌクレオチドは上記連結反応により連結しているので、その３’末端にジゴケシゲニンを有するＤＮＡとして得られ、該結合ＤＮＡを簡単に検出することができる。よって、変位を有するペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡを迅速、簡便に検出可能である。ＯＬＡは電気泳動や遠心分離操作が不要なために、多数のサンプルを効果的に短期間で検査するのに適した変異検出法である。【０１３５】
また、以下のＰＣＲ−ＰＨＦＡ法により微量な変異遺伝子を定量的かつ容易に検出することができる。
ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法は、遺伝子増幅法（ＰＣＲ）、非常に高い特異性を示す液相でのハイブリダイゼーション、及びＥＬＩＳＡと同様の操作でＰＣＲ産物を検出するＥＤ−ＰＣＲ（enzymatic detection of PCR product）の３つを組み合わせた方法である。ＤＮＰ（dinitrophenyl）標識及びビオチン標識したプライマーセットを用いて、配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを行い、両末端標識増幅ＤＮＡ断片を調製する。次に、標識プライマーと同じ塩基配列を有する未標識プライマーセットを用いて、検査検体由来ＤＮＡあるいは検査検体由来ｃＤＮＡをテンプレートに増幅して得られる非標識増幅ＤＮＡ断片を、該標識増幅ＤＮＡ断片と混合する。このとき非標識増幅ＤＮＡ断片は標識増幅ＤＮＡ断片に対し、２０〜１００倍の大過剰量を用いる。そして該混合物を熱変性処理後、１℃／５分〜１０分間程度の緩やかな温度勾配で冷却し、完全な相補鎖を優先的に形成させる。こうして再形成された標識ＤＮＡは、ビオチンを介してストレプトアビジン固定化ウエルに捕獲吸着させ、ＤＮＰを介して酵素標識抗ＤＮＰ抗体を結合させて酵素による発色反応により検出する。検体中に標識ＤＮＡと同じ配列の遺伝子が存在しない場合は、元の２本鎖の標識ＤＮＡが優先的に再形成されて発色を示す。これに対し、同じ塩基配列の遺伝子が存在する場合は、相補鎖の置換がランダムに生じるため再形成される標識ＤＮＡは減少するので、発色は著しく低下する。これにより、既知の変異・多型遺伝子の検出・定量が可能となる。【０１３６】
また、心筋壊死を伴う疾患の程度や状態を検査するために、検査検体由来ＤＮＡ又は検査検体由来ｃＤＮＡ中の遺伝子の発現量を検査する方法としては、前記３に記載の方法が挙げられる。例えば、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）を特異的に増幅することができるプライマーを使用して、定量ＰＣＲ法やマイクロアレイ法など、公知の技術を使用することができる。具体的には、配列番号２０と配列番号２１を組み合わせて行うことができる。【０１３７】
７．ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を特異的に認識する抗体を用いた心筋壊死を伴う疾患の検査方法
ヒト生体試料での、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の発現量の変化並びに発現しているタンパク質の構造変化を同定することは、心筋壊死を伴う疾患を発症する危険性を知るためや既に発症した心臓機能低下の原因やその程度や状態を知り、その状態をモニタリングして治療に役立てる上で有用である。
具体的には、該タンパク質の発現量あるいは構造変化の程度が、統計的有意差をもって健常人よりも高いときには、心筋壊死を伴う疾患を発症したとみなすことができる。また、心筋梗塞のような心筋壊死を伴う疾患のモニタリングとしては、該タンパク質の発現量あるいは構造変化の程度が非常に高い時には心破裂などの危険な状態であり、減少している時には安定期にあること等から、適当な治療方針を決定することができる。【０１３８】
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の発現量や構造変化を検出して検査する方法としては、上記４に記載した蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法や免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、免疫凝集法などがあげられる。【０１３９】
上記方法による診断に供する検体としては、患者より取得した心臓病巣部位の組織、血液（末梢血、冠状静脈洞採血等）、その血清、尿、便、唾液などの生体試料そのものあるいは、該生体試料から取得した細胞並びに細胞抽出液が用いられる。また、生体試料から取得した組織を、パラフィンあるいはクリオスタット切片として単離したものを用いることもできる。【０１４０】
８．ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、又は該タンパク質のいずれかを認識する抗体を用いた心筋壊死治療薬のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法に用いられるタンパク質としては、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）を挙げることができる。ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）としての活性を有するタンパク質であれば、天然物由来のタンパク質でも、遺伝子工学的手法により製造されたタンパク質であってもよく、例えば天然由来の該タンパク質としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ラット、マウスなどあらゆる哺乳動物由来のペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）を挙げることができる。
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）の具体的例としては、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。【０１４１】
本発明のスクリーニング方法に用いられるＤＮＡとしては、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡを挙げることができる。該ＤＮＡは、上記本発明のスクリーニング方法に用いられるタンパク質をコードするＤＮＡであればいずれでもよい。
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡの具体的例としては、配列番号１、配列番号４、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。【０１４２】
本発明のスクリーニング方法に用いられる抗体としては、上記本発明のスクリーニング方法に用いられるタンパク質、又はそのポリペプチド断片を認識する抗体を挙げることができる。【０１４３】
（１）ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質に特異的に作用する化合物のスクリーニング
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を発現するように形質転換した微生物、動物細胞、又は昆虫細胞、及び精製したペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質は、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）に特異的に作用する化合物をスクリーニングするために有用である。スクリーニングにより得られた化合物は、心筋壊死治療薬として有用である。【０１４４】
上記スクリーニングの１つの方法は、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を生産するように形質転換した動物細胞（以後、探索用形質転換体と称する）において、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）の活性化を特異的に誘導する化合物を選択することである。ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）の活性化を検出する方法としては、該探索用形質転換体の細胞応答を測定する方法を挙げることができる。【０１４５】
具体的な細胞の応答としては、例えば、（１）細胞遊走活性、（２）ＦＡＫ（Focal Adhesion Kinase）のリン酸化、（３）コラーゲン産生などを指標とすることができる。
前記（１）では、初代培養したマウスの心筋繊維芽細胞の細胞遊走能に対するペリオスチンの効果を、例えば、インビトロ細胞遊走アッセイ（in-vitro cell migration assay）で検定する。その際、ペリオスチンとしては、精製タンパク質か、あるいは、細胞に発現ベクターを移入した形質転換体（トランスフェクタント）が分泌する細胞上清を用いることができる。ペリオスチンバリアントは細胞遊走活性があるため、細胞遊走能でその活性を検定することができる。
前記（２）では、例えば、マウス胎児由来細胞（例えば、C3H10T1/2）の血清除去した細胞培養液中にペリオスチンタンパク質を加えて１時間処理し、ペリオスチンが細胞に与える効果として、ＦＡＫのリン酸化をウェスタンブロットで検出する。ペリオスチンバリアントは細胞上のインテグリンに結合し、細胞を活性化するが、その細胞応答はＦＡＫのリン酸化の度合いで検定できる。
前記（３）では、例えば、マウス胎児由来細胞（例えば、C3H10T1/2）、マウス骨芽細胞様細胞（例えば、MC3T3-E1）、マウス歯根膜細胞株（例えば、A9）にペリオスチン遺伝子を導入し、その形質転換体によるコラーゲンの産生を市販キット（例えば、Sircol Collagen Assay Kit；フナコシ）で測定する。また、同じ３種類の細胞を用いて、ペリオスチンとして精製タンパク質か、細胞に発現ベクターを移入した形質転換体が分泌する細胞上清でこれらの細胞を処理し、コラーゲンの架橋量を検定することができる。【０１４６】
また、精製したペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質、又は該タンパク質の一部を構成するポリペプチドは、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質に特異的に結合する標的化合物を選択するのに用いることができる。例えば、該タンパク質を固相担体等に固定しておき、被験試料を接触させた後、十分に該プレートを洗浄し、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質に結合している化合物を該タンパク質から遊離させることにより、標的化合物を選択することができる。【０１４７】
上記スクリーニングのもう１つの方法としては、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の一部を構成するペプチドを多数、プラスチックピン又はある種の固体支持体上で高密度に合成し、該ペプチドに選択的に結合する化合物あるいはタンパク質を効率的にスクリーニングする方法がある（ＷＯ84/03564）。【０１４８】
（２）ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡの転写あるいは翻訳を調節する化合物のスクリーニング方法
心臓由来の初代培養細胞又は分化誘導させた心筋細胞で、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）遺伝子のｍＲＮＡあるいはペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の発現を促進する活性を有する化合物も、心筋壊死治療薬として有用である。【０１４９】
心臓由来の初代培養細胞（心筋細胞及び心臓線維芽細胞を含む）又は分化誘導させた心筋細胞（例えば、骨髄細胞などの前駆細胞から分化誘導させた心筋細胞、ＥＳ細胞から分化誘導させた心筋細胞、体細胞を多能性幹細胞とした後更に分化誘導させた心筋細胞）と種々の被験試料を接触させた場合と、被験試料を接触させない場合での該細胞におけるペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定、比較することでペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）遺伝子の転写を抑制又は促進する物質をスクリーニングすることができる。ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、上記３のＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＲＮase保護アッセイ法により検出することができる。【０１５０】
また、心臓由来の初代培養細胞又は分化誘導させた心筋細胞と種々の被験試料を接触させた場合と、被験試料を接触させない場合での該細胞におけるペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の発現量を測定、比較することでペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）遺伝子の転写もしくは翻訳を抑制又は促進する物質をスクリーニングすることができる。ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の発現量は、上記４のペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を特異的に認識する抗体を用いた蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法や免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、免疫凝集法により測定することができる。【０１５１】
上記の方法により取得した化合物は、左室下行冠動脈結紮（LAD ligation）を行った後、再灌流を行う虚血再灌流（Ishemmia-reperfusion）などの心筋梗塞モデル動物に薬剤として投与し、該動物の心筋壊死部位の修復度や心機能低下の抑制度合いなどを、公知の方法に従って測定することにより、該化合物のその心筋梗塞への治療効果を評価することが可能である。【０１５２】
９．ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を有効成分として含有する心筋壊死の治療及び／又は予防のための医薬
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質又はそれらの改変体は、心筋壊死を伴う種々の疾患において、壊死部位の修復をすることや、その修復を促進して心機能の低下を抑制することに用いることができる。心筋壊死を伴う疾患としては、心筋梗塞や心筋炎（例えばウイルス性心筋炎）や心筋症（例えば拡張型心筋症）など、公知の疾患を挙げることができる。【０１５３】
本発明の医薬では、先述した上記ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質又はそれらの改変体であれば、天然由来のものでも、遺伝子工学的手法によって製造された組み換えタンパク質であってもよい。天然由来のペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質としては、例えばヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、マウス、ラット、マウスなどあらゆる哺乳動物由来のペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）を挙げることができるが、ヒト心筋壊死の治療及び／又は予防のための医薬、すなわち心臓機能改善剤、心臓再生促進剤として用いる場合は、ヒト由来のペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）とアミノ酸配列が一致するタンパク質を用いることが好ましい。【０１５４】
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を有効成分として含有する心筋壊死の治療のための医薬は、有効成分として該タンパク質のみを含むものであってもよいが、他のペリオスチンバリアントや完全長のペリオスチンを共含しても良い。また、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましくは水、あるいは食塩、グリシン、グルコース、ヒトアルブミン等の水溶液等の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。また、製剤溶液を生理的条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、薬理学的に許容される添加剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム等を添加することもできる。また、凍結乾燥して貯蔵し、使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。【０１５５】
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、あるいは口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内及び静脈内等の非経口投与を挙げることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。【０１５６】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば乳剤及びシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。【０１５７】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該ポリペプチドそのもの、ないしは受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ該ポリペプチドを微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該ポリペプチド及び用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。【０１５８】
投与量又は投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。【０１５９】
１０．上記８のスクリーニング方法により得られた化合物を有効成分として含有する心筋壊死の治療のための医薬
上記８のスクリーニング方法により得られた化合物を有効成分として含有する心筋壊死の治療及び／又は予防のための医薬は、該有効成分を単独で投与することも可能ではあるが、通常は該有効成分を薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましい医薬製剤形態等は、及び投与方法等は、上記９のとおりである。【０１６０】
１１．ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質をコードするＤＮＡを含有する心筋壊死用遺伝子治療剤
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質をコードするＤＮＡを心筋壊死の遺伝子治療薬とてして用いる方法としては、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、上記９に記載した常法に従って製剤化、処方及び投与する方法、あるいは非ウイルス遺伝子移入法により投与する方法を挙げることができる。【０１６１】
組換えウイルスベクターは、以下に記載の方法に従い作製することができる。ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の完全長ｃＤＮＡをもとに、必要に応じて、該タンパク質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。該ＤＮＡ断片、あるいは完全長ｃＤＮＡをウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスベクターを造成する。【０１６２】
ＲＮＡウイルスベクターの場合には、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）の完全長ｃＤＮＡに相同なＲＮＡ断片を調製し、それらをウイルスベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、組換えウイルスを造成する。ＲＮＡ断片は、２本鎖のほか、ウイルスベクターの種類に応じて、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のどちらか一方の鎖を選択する。例えば、レトロウイルスベクターの場合は、センス鎖に相同なＲＮＡを、センスウイルスベクターの場合には、アンチセンス鎖に相同なＲＮＡを選択する。【０１６３】
該組換えウイルスベクターを、該ベクターに適合したパッケージング細胞に導入する。パッケージング細胞としては、ウイルスのパッケージングに必要なタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠損している組換えウイルスベクターの該欠損するタンパク質を補給できる細胞であればいかなるものでもよい。例えば、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３などを用いることができる。パッケージング細胞で補給するタンパク質としては、レトロウイルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなど、レンチウイルスベクターの場合はＨＩＶウイルス由来のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆなど、アデノウイルスベクターの場合はアデノウイルス由来のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂなど、アデノ随伴ウイルスの場合はＲｅｐ（ｐ５，ｐ１９，ｐ４０）、Ｖｐ（Ｃａｐ）などのタンパク質があげられる。【０１６４】
ウイルスベクターとしては、上記パッケージング細胞において組換えウイルスが生産でき、標的細胞でペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。プラスミドベクターとしてはＭＦＧ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92,6733-6737 (1995)］、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ［Nucleic Acids Res., 18, 3587-3596 (1990)］、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ、ＣＬＧ［Journal of Virology, 72, 8150-8157 (1998)］、ｐＡｄｅｘ１［Nucleic Acids Res., 23, 3816-3821 (1995)］等が用いられる。プロモーターとしては、ヒト組織中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
パッケージング細胞への組換えウイルスベクターの導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法［特開平2-227075号公報］、リポフェクション法［Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 84, 7413 (1987)］等を挙げることができる。【０１６５】
また、上記組換えウイルスベクターの投与方法としては、上記９の方法に加え、リポソームデリバリーを用いる直接的イン・ビボ（in vivo）遺伝子移入と組み合わせることにより、心臓病巣にウイルスベクターを指向させるようにすることもできる。
すなわち、適当なサイズのペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするＤＮＡを、アデノウイルス・ヘキソンタンパク質に特異的なポリリジン−コンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウイルスベクターに結合させることにより、ウイルスベクターを調製することができる。該ウイルスベクターは安定に標的細胞に到達し、エンドソームにより細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され効率的に遺伝子を発現させることができる。【０１６６】
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）遺伝子のＤＮＡは、非ウイルス遺伝子移入法によっても病巣に輸送することができる。
当該分野で公知の非ウイルス遺伝子移入法には、リン酸カルシウム共沈法［Virology, 52, 456-467 (1973)；Science,
209, 1414-1422 (1980)］、マイクロインジェクション法［Proc. Natl.
Acad. Sci. USA，77,
5399-5403 (1980)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77, 7380-7384 (1980)；Cell, 27, 223-231 (1981)；Nature, 294,
92-94 (1981)］、リポソームを介した膜融合−介在移入法［Proc. Natl.Acad. Sci.
USA，84, 7413-7417 (1987)；Biochemistry, 28, 9508-9514 (1989)；J.
Biol. Chem., 264, 12126-12129 (1989)；Hum. Gene Ther.,
3, 267-275, (1992)；Science, 249,
1285-1288 (1990)；Circulation, 83, 2007-2011
(1992)］あるいは直接ＤＮＡ取り込み及び受容体−媒介ＤＮＡ移入法［Science, 247,1465-1468
(1990)；J. Biol. Chem., 266, 14338-14342 (1991)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87, 3655-3659 (1991)；J. Biol. Chem., 264,
16985-16987 (1989)；BioTechniques, 11, 474-485
(1991)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87, 3410-3414 (1990)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88, 4255-4259 (1991)；Proc. Natl. Acad. Sci.
USA，87, 4033-4037 (1990)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88, 8850-8854 (1991)；Hum. Gene Ther., 3,
147-154 (1991)］等を挙げることができる。【０１６７】
リポソームを介した膜融合−介在移入法ではリポソーム調製物を標的とする組織に直接投与することにより、当該組織の局所的な遺伝子の取り込み及び発現が可能であることが腫瘍に関する研究において報告されている［Hum. Gene Ther.3, 399-410 (1992)］。従って同様の効果が心臓病巣でも期待される。ＤＮＡを心臓病巣に直接標的化するには、直接ＤＮＡ取り込み技術が好ましい。受容体−媒介ＤＮＡ移入は、例えば、ポリリジンを介して、タンパク質リガンドにＤＮＡ（通常、共有的に閉環したスーパーコイル化プラスミドの形態をとる）をコンジュゲートすることによって行う。リガンドは、標的細胞又は組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンド−ＤＮＡコンジュゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合及びＤＮＡ−タンパク質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。ＤＮＡの細胞内破壊を防止するために、アデノウイルスを同時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもできる。
【実施例】
【０１６８】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【０１６９】
《実施例１：急性心筋梗塞後の梗塞部位における種々のペリオスチンバリアントの発現検討》
急性心筋梗塞後の梗塞部位におけるペリオスチンバリアントの発現を検討するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに急性心筋梗塞を起こさせた後（０、１、２、３、４、５、６、７、１４、２８日後）のこの梗塞部位におけるｍＲＮＡを精製し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は電気泳動により分析した。急性心筋梗塞は、実施例２の（３）に記載する方法に従って、左室下行冠動脈の結さつにより引き起こした。【０１７０】
図１に示すように、ペリオスチンはＣ末端において種々バリアントが存在しており、各バリアントとペリオスチンの機能との相関が考えられたことから、Ｃ末端に注目して、
ペリオスチンバリアント（Δｂ）：領域ｂの位置にスプライシングがあるもの
ペリオスチンバリアント（Δｅ）：領域ｅの位置にスプライシングがあるもの
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）：領域ｂ及び領域ｅの位置にスプライシングがあるもの
完全長ペリオスチン：スプライシングがないもの
が判別できるように、下記プライマーを設計した。なお、配列番号１２［マウス・全長ペリオスチンのｃＤＮＡ配列（シグナル含む）］において、塩基番号１９００〜１９６８が領域ａ１、１９６９〜２０１３が領域ａ２、２０１４〜２０９４が領域ｂ、２０９５〜２１８４が領域ｃ１、２１８５〜２２７４が領域ｃ２、２２７５〜２３５２が領域ｄ、２３５３〜２４３６が領域ｅ、２４３７〜２４７８が領域ｆ１、２４７９〜２５１４が領域ｆ２である。【０１７１】
配列番号１６：
Ｐ１Ｆ  ５’−ｇａｔａａａａｔａｃａｔｃｃａａａｔｃａａｇｔｔｔｇｔｔｃｇ−３’
配列番号１７：
Ｐ１Ｒ  ５’−ｃｇｔｇｇａｔｃａｃｔｔｃｔｇｇｔｃａｃｃｇｔｔｔｃｇｃ−３’
配列番号１８：
Ｐ２Ｆ  ５’−ｃｔｇａａａａａｃａｇａｃｔｃｇｇｇａａｇａａｃｇ−３’
配列番号１９：
Ｐ２Ｒ  ５’−ａａａｃｔｃｔｇｔｇｇｔｃｔｇｇｃｃｔｃｔｇｇｇ−３’
配列番号２０：
Ｐ３Ｆ  ５’−ｇａｔａａａａｔａｃａｔｃｃａａａｔｃａａｇｔｔｔｇｔｔｃｇ−３’
配列番号２１：
Ｐ３Ｒ  ５’−ａａａｃｔｃｔｇｔｇｇｔｃｔｇｇｃｃｔｃｔｇｇｇ−３’
配列番号２２：
ｇａｐｄｈＦ  ５’−ａｃｔｔｔｇｔｃａａｇｃｔｃａｔｔｔｃｃ−３’
配列番号２３：
ｇａｐｄｈＲ  ５’−ｔｇｃａｇｃｇａａｃｔｔｔａｒｒｇｃｔｇ−３’【０１７２】
領域ｂのスプライシングの有無は、上記プライマーＰ１Ｆ及びプライマーＰ１Ｒの組合せ（プライマーセット１）を使用して判別することができる。図１において、２３６ｂｐに検出されるバンドは、ｂの位置にスプライシングが起こってないものであり、１５５ｂｐに検出されるバンドは、ｂの位置にスプライシングが起こっているものである。
領域ｅのスプライシングの有無は、上記プライマーＰ２Ｆ及びプライマーＰ２Ｒの組合せ（プライマーセット２）を使用して判別することができる。３２５ｂｐに検出されるバンドは、ｅの位置にスプライシングが起こってないものであり、２４１ｂｐに検出されるバンドは、ｅの位置にスプライシングが起こっているものである。
領域ｂ及び領域ｅの同時スプライシングの有無は、上記プライマーＰ３Ｆ及びプライマーＰ３Ｒの組合せ（プライマーセット３）を使用して判別することができる。６８５ｂｐに検出されるバンドは、ｂ及びｅのいずれの位置にもスプライシングが起こってないものであり、４９３ｂｐに検出されるバンドは、ｂ及びｅの位置に同時にスプライシングが起こっているものである。なお、４９３ｂｐと６８５ｂｐの間に薄く検出されているバンドは、ｂ又はｅの位置にスプライシングが起こっているものである。
コントロールとして、ＧＡＰＤＨの発現を、プライマーｇａｐｄｈＦ及びプライマーｇａｐｄｈＲの組合せを使用して確認した。【０１７３】
図１に示すように、急性心筋梗塞後３日後及び４日後では、ｂ及びｅの位置にスプライシングが起こっているペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）のみが発現していた。次いで５日後及び７日後では、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）に加え、ペリオスチンバリアント（Δｂ）あるいはペリオスチンバリアント（Δｅ）の発現も少し増加した。２８日後には、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）の発現は減少し、ペリオスチンバリアント（Δｂ）あるいはペリオスチンバリアント（Δｅ）あるいは完全長ペリオスチンの発現が増加した。
このことから、急性心筋梗塞から回復される過程で、各スプライスバリアントの機能の違いがあり、特に、傷害の回復初期には、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）が重要な役割を果たしていることが予想された。【０１７４】
《実施例２：ペリオスチンノックアウトマウスの作製と性状観察》
本実施例では、Kitajima et
al, 2000 development. 127:3215-3226に記載された方法に従って、ペリオスチンノックアウトマウスを、Ｃｒｅ組み換えによって作製した。具体的な手順を以下に示す。【０１７５】
（１）ターゲティングベクターの作製
ペリオスチン遺伝子のエクソン１を含むＢＡＣクローンは、定法に従って、マウスＣ５７ＢＬ６／Ｊ  ＢＡＣライブラリーから単離した。ターゲティングの工程を図２に示す。まず、７．３ｋｂ（XhoI-EcoRI）断片及び１．２ｋｂ（XbaI-BglII）断片の二つの相同遺伝子断片を、PGK-Neo-PGK-DT-Aカセットにサブクローニングした。直鎖化されたベクター（50μg）を、Yagi et al., 1993 Anal Biochem.
214:70-76に記載の方法に従って、ＴＴ２  ＥＳ細胞にエレクトロポレーションした。この中から、Ｇ４１８耐性ＥＳクローンを２クローン選択し（#51及び#1051）、ｎｅｏ特異的プライマーＰＧＫ−Ｒ及びペリオスチンゲノミックプライマーＰｅｒｉ−Ｒ４を使用して、ＰＣＲにより相同組み換えが起こっていることを確認した。更に、これらのクローンについて、定法に従ってサザンブロット法によっても確認した。
これらの検討により、ペリオスチンノックアウトマウス作製用のターゲティングベクターが作製できていることがわかった。
配列番号２４：
ＰＧＫ−Ｒ  ５’−ＣＴＡＡＡＧＣＧＣＡＴＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴ−３’
配列番号２５：
Ｐｅｒｉ−Ｒ４  ５’−ＧＣＡＣＣＴＧＣＣＴＣＴＴＣＣＣＡＡＴＴＡＣＡＧＧ−３’【０１７６】
（２）ペリオスチンノックアウトマウスの作製
次に、Kitajima et al,
2000 Development. 127:3215-3226に記載の方法に従って、凝集方法によって、キメラマウスを作製した。キメラのジャームラインは、上記で作製したＥＳ細胞クローン（#51あるいは#1051）を使用して作製した。ＴＴ２遺伝子バックグラウンド（アグーチコート色素によってモニターされる）の高い寄与によって、ＩＣＲマウスに育種された。＃５１キメラマウスは、ｎｅｏカセットを除くために、Sakai and Miyazaki, 1997 Biochem. Biophys. Res. Commun. 237:318-324に記載のＣＡＧ−Ｃｒｅマウスと交配させ、それらの樹立マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに育種された。その結果、ペリオスチン遺伝子を欠如した対立遺伝子を持つマウスは、少なくとも６世代の間に、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに戻し交配された。【０１７７】
ペリオスチン＋／＋マウス（ペリオスチン野生マウス）及びペリオスチン−／−マウス（ペリオスチンノックアウトマウス）の遺伝子型を調べるために、ペリオスチン遺伝子のイントロン内の特異的なプライマーを使用してＰＣＲを行った。ペリオスチン野生マウスの検出のためには、プライマーＷｉｌｄ−ＦとプライマーＷｉｌｄ−Ｒとの組合せを使用した。ペリオスチンノックアウトマウスの検出のためには、プライマーＮｏｃｋ−ＦとプライマーＮｏｃｋ−Ｒとの組合せを使用した。
この検討により、ノックアウトマウスが作製できていることを確認した。
配列番号２６：
Ｗｉｌｄ−Ｆ  ５’−ｇｔｔｃｔｔａｃａｇａａａｇｃａｇａａｇｇａｔａｃ−３’
配列番号２７：
Ｗｉｌｄ−Ｒ  ５’−ｔｔａａａｔｃａｃｔｃｃａｃａｇｃａｇａａｃａｃｇ−３’
配列番号２８：
Ｎｏｃｋ−Ｆ  ５’−ｃａｔｇａｔａｇｃｔｔｃｔｃｔｃｃｃａｇｔｔｃｔｃ−３’
配列番号２９：
Ｎｏｃｋ−Ｒ  ５’−ｃｔｔｇｃａａｔａａｇｔａａａａｃａｇｃｔｃｃｃｃ−３’【０１７８】
（３）ペリオスチンノックアウトマウスの性状観察
上記のようにして作製したペリオスチンノックアウトマウスの性状を検討した。ペリオスチンノックアウトマウスの胚形成は、見かけ上正常であった。生まれた後も、切歯の萌出（eruption）以外は、繁殖性を含めて健康に見えた。更に、これらのマウスは、２，３週間以上生存した。また、成長した心臓において検討したが、８週令あるいは１０週令のマウスでも、心筋・心室運動・弁機能・脈動・血圧における心筋細胞の異常はなく、大人の心筋においても重要な症状は認められなかった。【０１７９】
そこで、上記のノックアウトマウスに、左室下行冠動脈の結さつにより、急性心筋梗塞を引き起こした（LAD ligation法）。前記操作は、Michael, 1995 Am J
Physiol Heart Circ Physiol. 269:H2147-2154に記載の方法に従って行ったが、具体的手順を以下に示す。麻酔下において、８週令マウスに挿管し、げっ歯類用の人工呼吸器（SAR-830AP, CWE社製）に固定した。中程度の胸開術を行い、左室下行冠動脈を選び、７−０ナイロン縫合糸で動脈の周りを回り縛った。梗塞は、左室（ＬＶ）の変色から明らかであった。最後に、胸穴を閉じた。生理的な測定、組織学的、生物学的分析は、生き残っているマウスでのみ検討した。少なくとも５匹のマウスから心中央部（mid-part）セクションを使用して、上記文献（Michael et al, 1995）に記載の方法によって、梗塞の大きさ決定したり、危険性のある領域を調べた。【０１８０】
正常なコントロールの状態と、急性心筋梗塞の後において、ペリオスチン−／−マウス（ペリオスチンノックアウトマウス）と、ペリオスチン＋／−マウス（ペリオスチンキメラマウス）と、ペリオスチン＋／＋マウス（ペリオスチン正常マウス）の間で、体重や心拍数に大きな違いはなかった。更に、急性心筋梗塞の後、１日後、７日後、２８日後において、ペリオスチンノックアウトマウスとペリオスチン正常マウスの間で梗塞の大きさに違いはなかった。これらの結果を表１に示す。
表１における各測定項目に関して、ＢＷは体重（ｇ）を意味し、以下、同様に、ＨＲは心拍数（拍／分）を、ＬＶＥＤＤは左室拡張末期径（ｍｍ）を、ＬＶＥＳＤは左室収縮末期径（ｍｍ）を、ＡＷは前壁厚（ｍｍ）を、ＰＷは後壁厚（ｍｍ）を、ＦＳは左室径短縮率（％）を、ＩＳは梗塞の大きさ（％）を、それぞれ、意味する。また、表１に示す記号「ａ」は、急性心筋梗塞を引き起こしたペリオスチン＋／＋マウスに対してＰ＜０．０５であることを示す。【０１８１】
【表１】
2010007701.tif 000002
【０１８２】
一方、急性心筋梗塞の後、ペリオスチンノックアウトマウスの生存率は、ペリオスチン正常マウスよりも非常に低かった。なお、ペリオスチンキメラマウスは、ペリオスチン正常マウスと同程度であった。これらの結果を図３に示す。この結果から、ペリオスチンノックアウトマウスでは有意に心破裂が観察され、該ノックアウトマウスではペリオスチンが無いために、梗塞部位が修復されずに力学的に弱い組織になっており、その結果として心破裂しやすくなっていたことを明らかにした。【０１８３】
《実施例３：ペリオスチンノックアウトマウスへのペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）の発現》
（１）ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）発現用アデノウイルスの作製
市販の発現用キット（Adeno-X
expression system2; BD Bioscience社製）を使用して、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）発現用アデノウイルスベクターとしてＡｄ−ΔｂΔｅベクターを、全長ペリオスチン発現用ウイルスベクターとしてＡｄ−Ｆｕｌｌベクターを、コントロール用としてＡｄ−ｎｌｓＬａｃＺベクターを、それぞれ、作製した。ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質をコードするｃＤＮＡとしては、配列番号４で表される塩基配列からなるｃＤＮＡを使用し、全長ペリオスチンをコードするｃＤＮＡとしては、配列番号１２で表される塩基配列からなるｃＤＮＡを使用した。
ウイルスの精製は、Ugai, 2005
BBRC. 331:1053-1060の記載の方法に従って、塩化セシウム法により行った。【０１８４】
（２）ペリオスチンノックアウトマウスでのペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）の発現と性状観察
急性心筋梗塞（LAD ligation法による）を起こさせる１日前に、上記で作製した各ウイルス（Ａｄ−ΔｂΔｅウイルス、Ａｄ−Ｆｕｌｌウイルス、又はＡｄ−ｎｌｓＬａｃＺウイルス）を含む溶液（1.6×1010 pfu, 100μL）をペリオスチンノックアウトマウスに尾静脈注射にて投与した。【０１８５】
急性心筋梗塞を起こさせた後、それぞれのウイルスを投与したペリオスチンノックアウトマウスの性状を観察した。ペリオスチンノックアウトマウスにＡｄ−ΔｂΔｅウイルスを投与すると心破裂が約５０％まで回復した。一方で、Ａｄ−Ｆｕｌｌウイルスを投与した場合は、約３０％、Ａｄ−ｎｌｓＬａｃＺウイルスを投与した場合は、約２０％程度しか回復しなかった。
全長ペリオスチンでは、心破裂の度合いも梗塞の修復も改善されなかったが、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）では、いずれも有意に改善された。このことから、急性心筋梗塞からの回復において、特にペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１８６】
本発明は、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防、更には、心筋壊死を伴う疾患の検査やモニタリングの用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【０１８７】
配列表の配列番号１６〜２９の各塩基配列はプライマー配列であり、具体的には、プライマーＰ１Ｆ（配列番号１６）、プライマーＰ１Ｒ（配列番号１７）、プライマーＰ２Ｆ（配列番号１８）、プライマーＰ２Ｒ（配列番号１９）、プライマーＰ３Ｆ（配列番号２０）、プライマーＰ３Ｒ（配列番号２１）、プライマーｇａｐｄｈＦ（配列番号２２）、プライマーｇａｐｄｈＲ（配列番号２３）、プライマーＰＧＫ−Ｒ（配列番号２４）、プライマーＰｅｒｉ−Ｒ４（配列番号２５）、プライマーＷｉｌｄ−Ｆ（配列番号２６）、プライマーＷｉｌｄ−Ｒ（配列番号２７）、プライマーＮｏｃｋ−Ｆ（配列番号２８）、プライマーＮｏｃｋ−Ｒ（配列番号２９）である。
【図１】
2010007701.tif 000003
【図２】
2010007701.tif 000004
【図３】
2010007701.tif 000005
【図４】
2010007701.tif 000006
【配列表】
2010007701000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年4月21日(2011.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドを有効成分として含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
【請求項２】
［ａ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
［ｂ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド；又は
［ｃ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド
を有効成分として含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
【請求項３】
前記医薬が心臓機能改善作用を有する、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
前記医薬が心臓再生促進作用を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項５】
心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドの使用。
【請求項６】
心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、
［ａ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
［ｂ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド；又は
［ｃ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチド
の使用。
【請求項７】
前記医薬が心臓機能改善作用を有する、請求項５又は６に記載の使用。
【請求項８】
前記医薬が心臓再生促進作用を有する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするポリヌクレオチドを含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
【請求項１０】
［ａ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｂ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｃ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
［ｄ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
を含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
【請求項１１】
前記医薬が、心臓機能改善作用を有する、請求項９又は１０に記載の医薬。
【請求項１２】
前記医薬が、心臓再生促進作用を有する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１３】
心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）をコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項１４】
心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、
［ａ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｂ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［ｃ］配列番号３、配列番号６、又は配列番号９で表されるアミノ酸配列との同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、心筋壊死部位を修復する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
［ｄ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
の使用。
【請求項１５】
前記医薬が、心臓機能改善作用を有する、請求項１３又は１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬が、心臓再生促進作用を有する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
［ａ］ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ、若しくはその部分断片であるＤＮＡ；
［ｂ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、若しくはその部分断片であるＤＮＡ；又は
［ｃ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列における連続した５〜６０塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体、前記オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体
を含有する、心筋壊死を伴う疾患の検査薬。
【請求項１８】
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含有する、心筋壊死を伴う疾患の検査薬。
【請求項１９】
（１）検査対象より取得した生体試料から検査検体由来ＤＮＡ又はｃＤＮＡを調製する工程、
（２）［ａ］ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ、若しくはその部分断片であるＤＮＡ；
［ｂ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、若しくはその部分断片であるＤＮＡ；又は
［ｃ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列における連続した５〜６０塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体、前記オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体
を用いて、前記検査検体由来ＤＮＡ又はｃＤＮＡにおける、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドをコードするＤＮＡの変異を検出する工程、及び
（３）前記変異に基づいて、心筋壊死を伴う疾患のリスク、種類、程度、及び／又は状態を判定する工程
を含む、心筋壊死を伴う疾患の検査方法。
【請求項２０】
（１）検査対象より取得した生体試料から検査検体由来ＤＮＡ又はｃＤＮＡを調製する工程、
（２）［ａ］ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ、若しくはその部分断片であるＤＮＡ；
［ｂ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡ、若しくはその部分断片であるＤＮＡ；又は
［ｃ］配列番号１、配列番号４、又は配列番号７で表される塩基配列における連続した５〜６０塩基からなる配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体、前記オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド若しくはその誘導体
を用いて、前記検査検体由来ＤＮＡ又はｃＤＮＡにおける、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドをコードするＤＮＡを特異的に増幅し、その発現量を分析する工程、及び
（３）前記発現量に基づいて、心筋壊死を伴う疾患の程度及び／又は状態を判定する工程
を含む、心筋壊死を伴う疾患の検査方法。
【請求項２１】
（１）検査対象より取得した生体試料から検体を調製する工程、
（２）ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて、前記検体中のペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）ポリペプチドの発現量及び／又は構造変化を検出する工程、及び
（３）前記発現量及び／又は構造変化に基づいて、心筋壊死を伴う疾患の危険性、原因、程度、及び／又は状態を判定する工程
を含む、心筋壊死を伴う疾患の検査方法。
【請求項２２】
（i）請求項１又は２に記載のポリペプチドを発現する細胞における前記ポリペプチドの発現量と、（ii）前記ポリペプチドを発現する細胞と試験物質を接触させた場合の前記ポリペプチドの発現量とを比較し、前記ポリペプチドの発現量を増大させる物質を選択することを特徴とする、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬のスクリーニング方法。
【請求項２３】
（i）請求項１又は２に記載のポリペプチドを発現する細胞の機能と、（ii）前記ポリペプチドを発現する細胞と試験物質を接触させた場合の細胞の機能とを比較し、細胞の機能を制御する活性を有する物質を選択することを特徴とする、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬のスクリーニング方法。
【請求項２４】
前記細胞が、ペリオスチンをコードする遺伝子を欠如している細胞である、請求項２２又は２３に記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬が、心臓機能改善作用を有する物質である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬が、心臓再生促進作用を有する物質である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法によって得られる化合物、又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項２８】
請求項２７に記載の化合物、又はその薬理学的に許容される塩を含有する、心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
【請求項２９】
心臓機能改善作用を有する医薬である、請求項２８に記載の心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
【請求項３０】
修復心臓再生促進作用を有する医薬である、請求項２８に記載の心筋壊死を伴う疾患の治療又は予防のための医薬。
【請求項３１】
心筋壊死を伴う疾患の治療のための医薬の製造における、請求項２７に記載の化合物、又はその薬理学的に許容される塩の使用。
【請求項３２】
ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質を特異的に認識する抗体。
【請求項３３】
請求項３２に記載の抗体を用いることを特徴とする、ペリオスチンバリアント（ΔｂΔｅ）タンパク質の免疫学的検出又は定量方法。
【国際調査報告】
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2010007701.tif 000009
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