【事件の表示】
　特許第３１２７２１６号「クレアチンキナーゼ活性測定試薬及びクレアチンキナーゼ活性測定方法」の請求項１ないし４に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３１２７２１６号の請求項１ないし２に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第３１２７２１６号に係る発明についての出願は、平成８年６月２６日（優先権主張１９９５年６月２７日、日本国）を国際出願日とする出願であって、平成１２年１１月１０日にその特許の設定登録がなされ、その後、川上宣男及び楠本真純より特許異議申立がなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１３年１２月１０日に訂正請求がなされたものである。
　
II．訂正請求
１．訂正の内容
(1)特許請求の範囲の請求項１に係る記載、
「チオール化合物を含むクレアチンキナーゼ活性測定試薬において、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含有することを特徴とするクレアチンキナーゼ活性測定試薬。」を、
「チオール化合物を含むクレアチンキナーゼ活性測定試薬において、スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸もしくはポリチオン酸、又はこれらの塩を含有することを特徴とするクレアチンキナーゼ活性測定試薬。」と訂正する。
(2)特許請求の範囲の請求項２に係る記載、
「硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸が、スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸又はポリチオン酸である請求項１記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。」を、
「チオール化合物を含むクレアチンキナーゼ活性測定試薬において、スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸もしくはポリチオン酸、又はこれらの塩を０．０１〜０．２％含有することを特徴とするクレアチンキナーゼ活性測定試薬。」と訂正する。  
(3)請求項３及び請求項４を削除する。
　
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正事項(1)は、「硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸」を「スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸もしくはポリチオン酸」に訂正するものであるから特許請求の範囲の減縮に該当し、同(2)は、「０．０１〜０．２％含有」という事項を付加するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当し、また、同(3)は、請求項を削除するものであるから、特許請求の範囲の減縮に該当する。
　そして、この訂正は新規事項に該当せず、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
　
３．むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法１２０条の４,２項及び同条３項で準用する１２６条２項及び３項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
　
III．特許異議申立
１．川上宣男よりの特許異議申立
　特許異議申立人 川上宣男は、甲第１号証乃至甲第10号証を提出し、訂正前の本件請求項１乃至請求項４に係る発明は、甲第１号証乃至甲第８号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものである、或いは、甲第９号証又は甲第10号証に係る発明と同一であるから、特許法２９条２項の規定、或いは同法２９条の２の規定に違反する、また、請求項３乃至請求項４に係る発明は、特許法３６条６項に規定する要件を満たしていない、と主張している。
Ａ．甲各号証の記載内容
　甲第１号証（特公平５−３８６００号公報）は、「クレアチンキナーゼ定量用試薬」に関するもので、特許請求の範囲の項には、
(a)「クレアチンリン酸、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）、アデノシン二リン酸からなるクレアチンキナーゼ定量用試薬において、Ｎ−アセチルシステインと、Ｎ−アセチルシステイン以外のSH基含有化合物とを含有することを特徴とするクレアチンキナーゼ定量用試薬。」が、発明の詳細な説明の項には、
(b)「特にNACを含有せしめると、CK活性の賦活効果を高めるが、NACは比較的不安定な試薬であるため、溶液状態ではSH基が徐々に酸化されてCK活性賦活剤としての効果が長時間持続できなくなる。さらにNACの分解物はCK活性を阻害するという報告もあり（・・・）、活性賦活効果の減少とあわせてCK測定用試薬の溶液状態における不安定性の大きな原因となっている。」（２頁4欄10〜18行）、
(c)「NAC以外のSH試薬としては、例えば、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、メルカプトエタノール、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオグルコース、システインなどがあげられる。」（２頁４欄41行〜３頁５欄1行）、
(d)「本発明のCK定量用試薬は、NACとNAC以外のSH試薬を共存することによって、CKの活性賦活剤であるNACの安定化を可能にし、賦活効果を長時間持続させることと共に、CK活性を阻害するNACの分解物の生成を抑制することができる。そのため、本発明のCK測定用試薬は溶液状態でも長期間使用することが可能となり、一度に大量の試薬を調製しておくことができる。」（４頁８欄18〜25行）が記載されている。
　甲第２号証（「化学大辞典１」（昭和35年03月30日共立出版発行）340-341頁）には、
「亜硫酸水素ナトリウム」の項に、「強い還元性を示し、」、「製剤の酸化防止、安定、防腐用」、並びに「亜硫酸ナトリウム」の項に、「強い還元性をもつ。」、「各種製剤中に安定剤、酸化防止剤として加える。」が記載されている。
　甲第３号証（「衛生試験法・注解1990」（平成2年3月31日金原出版発行）473頁）には、「還元漂白剤には、亜硫酸Na（結晶および無水）、次亜硫酸Na、二酸化硫黄、ピロ亜硫酸ＫおよびNaがあり、いずれも亜硫酸塩である。これらの漂白剤は、酸化防止、変色防止および防腐効果も有し、広く多くの食品に使用されている。」（４７３頁【注解】の項左欄9行〜右欄4行）が記載されている。
　甲第４号証（特開平６−３２７７６号公報）は、「N-(D-α-メチル-β-メルカプトプロピオニル)-L-プロリンの酸化防止法」に係り、特許請求の範囲の項には、
「【請求項１】式（Ｉ）で示されるN-(D-α-メチル-β-メルカプトプロピオニル)-L-プロリンを含む水性媒体中に酸化防止剤を共存させることを特徴とするN-(D-α-メチル-β-メルカプトプロピオニル)-L-プロリンの酸化防止法。・・・
【請求項３】酸化防止剤として亜硫酸およびその塩を用いる請求項１の方法。」が、
　甲第５号証（特開平７−６１９２５号公報）は、「アミノ酸輸液製剤」に係り、
「上記システインやシスチン等の含硫アミノ酸を配合したアミノ酸製剤の調製に当たっては、製剤中に安定化剤として亜硫酸塩や重亜硫酸塩を添加配合して、上記硫化水素の発生を防止する手段が一般に採用されてきた。」（２頁1欄38〜42行）がそれぞれ記載されている。
　甲第６号証（「臨床化学」19巻2号1990年6月、184-188頁）には、ヒト血清中のクレアチンキナーゼ活性の測定についての勧告法が記載されている。
　甲第７号証（「Ｎ−アッセイ ＣＰＫ−Ｌ ニットーボー」1994年7月作成）には、「１．試薬の調製法」として、「(1)酵素試液（Ｒ−１）　酵素試液をそのまま使用します。開封後、冷蔵（２〜１０℃）保存で１ヶ月間使用可能です。　(2)基質液（Ｒ−２）　基質液をそのまま使用します。開封後、冷蔵（２〜１０℃）保存で１ヶ月間使用可能です。」、「貯法・有効期間」として「貯法：２〜１０℃で保管　有効期間：６ヶ月間。最終使用期限は容器ラベル及び外箱に表示。」との記載がある。
　甲第８号証（「メルクリキッドＣＫ」平成6年7月作成）には、「試薬調製法」として、「試薬試液−１：試薬１をそのまま使用します。開封後、２〜８℃で３０日間安定です。　試薬試液−２：試薬２をそのまま使用します。開封後、２〜８℃で３０日間安定です。」、「貯法・有効期間」として「２〜８℃保存で製造月より５ヶ月間」との記載がある。
　甲第９号証（特願平８−２１８１６号明細書（特開平８−２４２８９３号））は、「クレアチンキナーゼ活性測定用液状試薬」に係り、特許請求の範囲請求項１には、
「チオグリセロール、２−メルカプトエタノール、及び２−メルカプトエタンスルホン酸又はその塩からなる群より選ばれた少なくとも１以上の化合物を含んでなる液状試薬用クレアチンキナーゼ活性化剤。」が、
　甲第10号証（特願平８−５７３７３号明細書（特開平９−２４８１９９号））は、「クレアチンキナーゼ活性測定用試薬」に係り、特許請求の範囲請求項１には、
「次の反応式（１）（式中、CKはクレアチンキナーゼ、ADPはアデノシン二リン酸、ATPはアデノシン三リン酸を示す）に基づいてクレアチンキナーゼ活性を測定するための、クレアチンリン酸、ADP、チオール化合物及びマグネシウム塩類を含有する測定試薬において、安定化剤として二酸化イオウ誘導体を添加したことを特徴とするクレアチンキナーゼ活性測定用試薬。」が、発明の詳細な説明の欄には、
「二酸化イオウ誘導体としては、重亜硫酸塩、亜硫酸塩、二亜硫酸塩、チオ硫酸塩、亜二チオン酸塩が挙げられる。塩としてはアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩又はアンモニウム塩等が挙げられるが、その中でもナトリウム塩が好ましい。」（３頁3欄36〜40行）がそれぞれ記載されている。
Ｂ．対比・判断
(1)特許法２９条２項違反について
（本件発明１について）
　訂正後の請求項１に係る発明（以下、「本件発明１」という。）は、「チオール化合物を含むクレアチンキナーゼ活性測定試薬において、スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸もしくはポリチオン酸、又はこれらの塩を含有することを特徴とするクレアチンキナーゼ活性測定試薬。」に係るものである。
　甲第１号証は、クレアチンキナーゼ定量用試薬において、Ｎ−アセチルシステインと、Ｎ−アセチルシステイン以外のSH基含有化合物とを含有するクレアチンキナーゼ定量用試薬に係り、「Ｎ−アセチルシステイン以外のSH基含有化合物」として、「ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、メルカプトエタノール、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオグルコース、システイン」が例示されている。
　そこで、本件発明１と甲第１号証に係る発明とを対比すると、両者は、「チオール化合物を含むクレアチンキナーゼ活性測定試薬」において一致し、さらにこの試薬に、前者では、「スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸もしくはポリチオン酸、又はこれらの塩」を添加しているのに対し、後者では、「ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、メルカプトエタノール、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオグルコース、システイン」を添加している点で相違する。
　そこでこの相違点について以下に検討する。
　本件発明１に係る「スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸もしくはポリチオン酸、又はこれらの塩」について、本件発明１では、「Ｎ−アセチルシステインは溶液中では不安定であり、そのSH基が少しずつ酸化されることによりCKを活性化する能力が低下してしまい、CK活性の測定値も負の誤差を生じるようになる。更に、Ｎ−アセチルシステインの酸化物は、CKの活性を阻害するとの報告もある。」（本件特許公報段落【0010】）及び「従来のCK活性測定試薬及びCK活性測定方法は不安定なものであり、長期間測定に使用することができないものであった。また、チオール化合物であるＮ−アセチルシステインを安定化し長期間使用することができるとして開示されたCK活性測定試薬は、高価な物質、悪臭を放つ物質若しくは凍結乾燥に適さない物質などを使用するものであったり、又は溶血試料におけるアデニル酸キナーゼによる正の誤差を補正して正確な測定値を得ることができるダブルカイネチック法により測定を行えないという難点を有するものであった。」（同段落【0017】）という認識のもとに、上記物質を添加することにより、「本発明のCK活性測定試薬及びCK活性測定方法は、安価であり、悪臭を有さず、液状試薬と凍結乾燥試薬の両方の試薬形態に適用でき、溶血試料におけるアデニル酸キナーゼによる正の誤差を補正することができるダブルカイネティック法を適用でき、長期間安定でありかつ長期間正確にCK活性の測定を行うことができる」（同段落【0104】）という効果を奏しめるものである。
　一方、甲第１号証に係る「Ｎ−アセチルシステイン以外のSH基含有化合物」たる「ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、メルカプトエタノール、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオグルコース、システイン」は、Ｎ−アセチルシステインが不安定である（摘示事項(b)）という認識のもと、これらを添加することにより、「溶液状態でも長期間使用することが可能」とするものであるから、本件発明１に係る「スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸もしくはポリチオン酸、又はこれらの塩」と、甲第１号証に係る、「ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、メルカプトエタノール、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオグルコース、システイン」とを添加する目的は、軌を一にしているといえる。
　そして、甲第２号証及び甲第３号証には、亜硫酸ナトリウム及び亜硫酸水素ナトリウムが還元性を有し、安定剤や酸化防止剤として用いられること、甲第４号証には、SH化合物であるN-(D-α-メチル-β-メルカプトプロピオニル)-L-プロリン（カプトプリル）の酸化防止のために、亜硫酸及びその塩を用いること、並びに、甲第５号証には、システインやシスチン等の含硫アミノ酸を配合したアミノ酸製剤の調製に当たり、製剤中に安定化剤として亜硫酸塩や重亜硫酸塩を添加配合することが開示されている。
　しかし、甲第６号証と同一の文献であって甲第６号証に続く頁に記載された乙第１号証には、「Morinは、pH6-7の９種の緩衝液の検討から、ビス（2-ヒドロキシエチル）メタン［・・・、Bis-Tris］(pk6.4)が最も高いCK活性が得られ、高濃度での活性阻害も少ないなどの点でイミダゾールより優れていると報告した。また、CK活性はアニオンにより阻害をうけ、その程度が Ｉ-＞SO42-＞NO3-＞Br-＞SO3-＞Cl-＞酢酸＞F-の順であることから、酢酸を用いるべきであるとしている。」（193頁左欄6〜16行）との記載があり、これが、「日本臨床化学会」により表された文献であることに照らし、乙第１号証に接した者は、クレアチンキナーゼ活性測定試薬においては、「スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸もしくはポリチオン酸、又はこれらの塩」を添加することは、むしろ躊躇すると解される。
　そして、乙第３号証（「実験成績証明書(1)」）によれば、本件発明１に係る「二亜硫酸カリウム」では、所定の安定化効果を示したが、甲第１号証に係る「システイン」では、何も添加していない場合より安定性に劣る結果が示されている。
　しかるに、「システイン」は、還元性を有する物質として良く知られているところ、乙第３号証の結果を踏まえると、還元性を有する物質であっても、必ずしもクレアチンキナーゼ活性測定試薬にとって有用であるとはいえない。
　そうすると、甲第１号証に記載の事項に、甲第２号証乃至甲第５号証に記載の事項を適用、すなわち、甲第１号証の「ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、メルカプトエタノール、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオグルコース、システイン」に代えて、甲第２号証乃至甲第５号証の「スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸もしくはポリチオン酸、又はこれらの塩」を適用し、本件発明１のような構成を採用することは、当業者が容易に想到し得る域を超えているといえる。
　なお、特許異議申立人は、クレアチンキナーゼ活性測定試薬に格別の効果が認められるためには、甲第１号証、甲第７号証及び甲第８号証に記載の試薬との比較試験により、これらの試薬以上の効果が確認できなければならないと主張している。
　しかし、上述のように、本件発明１は、甲第１号証乃至甲第５号証に記載の事項から当業者が容易に想到し得るものではなく、また、本件明細書には、クレアチンキナーゼ活性測定試薬において相当の期間安定であることが実施例で具体的に開示されているから、甲第１号証、甲第７号証及び甲第８号証に記載の試薬と比較試験を実施するまでもないというべきである。
　更に、特許異議申立人は、本件明細書の(a)「チオグリセロールは溶液状のため凍結乾燥に適さない」、(b)「ジチオスレイトールが高価である」、及び(c)「メルカプトエタノールは悪臭を放つ」という評価は、甲第１号証に記載されたCK活性測定試薬を過小に評価し、或いは曲解している、と主張している。
　しかし、乙第１号証には、「２−メルカプトエタノール（・・・）は高活性化能を有するが悪臭である。」（１９５頁右欄下から8〜5行）、「ジチオトレイトール（・・・）やジチオエリトリトール（・・・）は高活性化能を有するが高価であり、・・・」（１９６頁左欄2〜4行）及び「チオグリセロール（・・・）は活性化能が高く安定、安価、低臭であるが溶液状のため凍結乾燥に適さない。」（同欄12〜15行）との記載があり、この記載は、本件明細書の上記(a)乃至(c)の評価と符合するものであり、また、特許異議申立人は、この評価を否定するに足る証拠を提出しているわけではないので、(a)乃至(c)の評価が、甲第１号証に記載されたCK活性測定試薬を過小に評価し、或いは曲解しているとはいえない。
（本件発明２について）
　訂正後の請求項２に係る発明（以下、「本件発明２」という。）は、本件発明１を更に限定したものであるから、上記本件発明１についての判断と同様の理由により、甲第１号証乃至甲第５号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
(2)特許法２９条の２違反について
　特許異議申立人の本件発明１及び２が、特許法２９条の２の規定に違反するという申立理由は、基礎出願明細書には、CK活性測定試薬を安定化させ正確な活性値を求めるうえで必須の要件であるpHについては一切触れられておらず、各種pHの試薬を用いた実験例及び長期保存性に関する実験例が追加された本件特許出願時をもって実質的に完成されたものであるから、その出願日は、現実に出願をなした平成８年６月26日となり、さすれば、甲第９号証或いは甲第10号証に係る特許明細書に記載された発明と同一であるというものである。
　しかし、本件特許の優先権主張の基礎となる先の出願の出願時の明細書（参考資料２）の「実施例１」には、具体的なpH値、すなわち、第１試薬としてpHを６．００に、第２試薬としてpHを８．００に調製することが記載されていること、並びに、本件発明１及び２は、特定のpHで実施するところに特徴があるものではないことを併せ考えると、本件特許の出願日（優先日）は、先の出願の出願時である平成７年６月27日と見るべきである。
　そうすると、甲第10号証に係る発明は、本件特許の出願日後に出願されたものであり、また、甲第９号証に係る発明は、優先日が平成７年１月13日であって、本件特許の出願日前に係るものであるが、甲第９号証に係る発明の明細書には、「チオグリセロール、２−メルカプトエタノール、及び２−メルカプトエタンスルホン酸又はその塩からなる群より選ばれた少なくとも１以上の化合物を含んでなる液状試薬用クレアチンキナーゼ活性化剤。」が記載されているだけで、本件発明に係る「スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸もしくはポリチオン酸、又はこれらの塩」について記載されているところはないのであるから、上記特許異議申立人の主張は失当というべきである。
(3)特許法３６条６項違反について
　平成13年12月10日付訂正請求により、訂正前の請求項３及び請求項４は削除されたので、もはや、本件明細書に特許法３６条６項の規定に違反するところはない。
２．楠本真純よりの特許異議申立
　特許異議申立人 楠本真純は、甲第１号証乃至甲第４号証を提出し、訂正前の本件請求項１乃至４に係る発明は、甲第１号証乃至甲第４号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条２項の規定に違反する、と主張している。
Ａ．甲各号証の記載内容
　甲第１号証（特開昭６１−２８９９００号公報）は、「１．」における甲第１号証の公開公報に相当し、その特許請求の範囲の項には、「クレアチンリン酸、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）、アデノシン二リン酸からなるクレアチンキナーゼ定量用試薬において、Ｎ−アセチルシステインと、Ｎ−アセチルシステイン以外のSH基含有化合物とを含有することを特徴とするクレアチンキナーゼ定量用試薬。」が記載されている。
　甲第２号証（「生化学辞典（第２版）」（1994年4月1日東京化学同人発行）78、168-169頁）には、「亜硫酸塩」の項に「強い還元あるいは酸化作用を示し、食品などの漂白に用いられる。」及び「また、ジスルフィド（-S-S-）結合に作用して開裂するいわゆるスルフィトリシスを行うなどタンパク質に対する反応も知られている。」が、「ＳＨ基」の項には「スルフヒドリル基、メルカプト基（・・・）、チオール基などともいう反応性に富む基で、酸化されてより安定なジスルフイドになりやすく、種々の試薬（SH試薬）とも反応する。・・・SH基をもつ低分子化合物としては・・・、システイン、・・・などがある。」が、それぞれ記載されている。
　甲第３号証（「化学大辞典４」（1987年2月15日共立出版発行）297-298頁）には、「システイン」の項に「中性または微アルカリ性で鉄あるいは銅イオンの存在で空気によりL-シスチンに酸化され、」が記載されている。
　甲第４号証（石黒正恒著「生物化学実験法８ ＳＨ基の化学修飾」（1989年11月20日学会出版センター発行）121-123頁）には、「表IV-1に生のタンパク質のジスルフィド結合を変性剤の共存しない状態で還元して,S-S結合の部分的な選択的開裂（ジスルフィド結合の化学修飾）を行った例を示した。」（121頁5〜7行）との記載とともに、「表IV-1　タンパク質ジスルフィドの選択的開裂例」には、試薬として、β-メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、亜硫酸塩等が使用されることが記載されている。
Ｂ．対比・判断
　本件発明１と甲第１号証に記載された発明とを対比すると、上述の「１．Ｂ．」と同様に、両者は、「チオール化合物を含むクレアチンキナーゼ活性測定試薬」において一致し、さらにこの試薬に、前者では、「スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸もしくはポリチオン酸、又はこれらの塩」を添加しているのに対し、後者では、「ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、メルカプトエタノール、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオグルコース、システイン」を添加している点で相違する。
　しかし、甲第２号証及び甲第４号証には、亜硫酸塩がジスルフィド結合を還元して開裂すること、並びに甲第２号証及び甲第３号証には、システインがSH基を有する化合物であるとの記載はあるものの、「１．Ｂ．」での判断と同様に、乙第１号証及び乙第３号証に記載の事項をふまえると、甲第１号証に記載の事項に甲第２号証乃至甲第４号証に記載の事項を適用して本件発明１のような構成を採用することは、当業者にとって困難なことといえる。
　したがって、本件発明１は、甲第１号証乃至甲第４号証に記載された発明の基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえないので、特許法２９条２項の規定に違反するところはない。
　本件発明２は、本件発明１を更に限定したものであるから、上記本件発明１についての判断と同様の理由により、甲第１号証乃至甲第４号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
４．まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明１乃至２についての特許を取り消すことはできない。
　また他に本件発明１乃至２についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１４年１月３０日（２００２．１．３０）
【訂正の要旨】
（訂正の趣旨）
（１）特許請求の範囲の請求項１に係る記載、「チオール化合物を含むクレアチンキナーゼ活性測定試薬において、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含有することを特徴とするクレアチンキナーゼ活性測定試薬。」を、特許請求の範囲の減縮を目的として、「チオール化合物を含むクレアチンキナーゼ活性測定試薬において、スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸もしくはポリチオン酸、又はこれらの塩を含有することを特徴とするクレアチンキナーゼ活性測定試薬。」と訂正する。
（２）特許請求の範囲の請求項２に係る記載、「硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸が、スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸又はポリチオン酸である請求項１記載のクレアチンキナーゼ活性測定試薬。」を、特許請求の範囲の減縮を目的として、「チオール化合物を含むクレアチンキナーゼ活性測定試薬において、スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸もしくはポリチオン酸、又はこれらの塩を０．０１〜０．２％含有することを特徴とするクレアチンキナーゼ活性測定試薬。」と訂正する。
（３）特許請求の範囲の減縮を目的として、請求項３及び請求項４を削除する。
（５４）【発明の名称】
クレアチンキナーゼ活性測定試薬及びクレアチンキナーゼ活性測定方法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　チオール化合物を含むクレアチンキナーゼ活性測定試薬において、スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸もしくはポリチオン酸、又はこれらの塩を含有することを特徴とするクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
　【請求項２】　チオール化合物を含むクレアチンキナーゼ活性測定試薬において、スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸もしくはポリチオン酸、又はこれらの塩を０．０１〜０．２％含有することを特徴とするクレアチンキナーゼ活性測定試薬。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は、長期間安定でありかつ正確に測定を行うことができるクレアチンキナーゼ活性測定試薬及びクレアチンキナーゼ活性測定方法に関するものである。
　本発明は、臨床検査分野において特に重要な生体由来試料中のクレアチンキナーゼ活性の測定に好適なものである。
　【０００２】
　【従来の技術】
　クレアチンキナーゼ（ＣＫ、クレアチンホスホキナーゼ、ＣＰＫ；以下ＣＫと略す）［Ｅ．Ｃ．２．７．３．２］は、アデノシン三リン酸〔ＡＴＰ〕又はアデノシン二リン酸〔ＡＤＰ〕を補酵素とし、下記の反応を触媒する酵素である。
　【０００３】
　【化１】
　【０００４】
　ＣＫは、骨格筋、心筋及び脳等に分布し、エネルギー代謝上重要な役割を果たしている酵素である。
　そして、このＣＫは二量体酵素であり、Ｍ型（筋型）とＢ型（脳型）のサブユニットの組み合わせにより、ＭＭ型（ＣＫ−３）、ＭＢ型（ＣＫ−２）及びＢＢ型（ＣＫ−１）の３種のアイソザイムが存在し、生体組織中では骨格筋にＭＭ型が、心筋にＭＭ型とＭＢ型が、脳にＢＢ型が多く存在する。
　【０００５】
　生体由来試料中のＣＫ活性は、急性心筋梗塞などの虚血性心疾患、多発性筋炎、進行性筋ジストロフィー症などの原発性筋疾患及び甲状腺機能異常などの疾病において高値となるため、生体由来試料中のＣＫ活性の測定はこれらの疾病の診断にとって大変有用なものである。
　【０００６】
　また、心筋に多く存在しているＣＫのＭＢ型アイソザイムの測定は、心筋梗塞に特異性の高い検査として重要視されており、更にＭ型サブユニットの組織型アイソフォームと血清型アイソフォームの比率の測定は、急性心筋梗塞の早期診断の指標として注目されてきている。
　【０００７】
　ＣＫ活性の測定は、下記の反応式（１）、（２）及び（３）で示される反応により生成するβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）〔ＮＡＤＨ〕又はβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）〔ＮＡＤＰＨ〕（ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨを総称して、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈとする）の生成速度を３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度より算出することにより行われる。
　また、下記の反応式（１）、（２）、（３）及び（４）で示される反応により生成するホルマザン色素の生成量を可視部の吸光度を測ることにより求める方法も行われている。
　【０００８】
　【化２】
　【０００９】
　しかしながら、ＣＫは血清等の生体由来試料中で、温度依存性の不可逆的失活と活性中心のＳＨ基がブロックされることによる可逆的失活により速やかに不活性化されるので、活性測定時にチオール化合物を存在させ、予備加温を行うことにより、ＣＫを活性化して活性を測定する必要がある。
　【００１０】
　このＣＫの活性化剤であるチオール化合物としては、種々のものが使用されてきたが、近年は無臭で取り扱い易く安価なことからＮ−アセチルシステインが広く用いられてきた。〔特開昭４９−１０６３９７号公報〕
　ところが、Ｎ−アセチルシステインは溶液中では不安定であり、そのＳＨ基が少しずつ酸化されることによりＣＫを活性化する能力が低下してしまい、ＣＫ活性の測定値も負の誤差を生じるようになる。
　更に、Ｎ−アセチルシステインの酸化物は、ＣＫの活性を阻害するとの報告もある。〔Ｇｅｒｈａｒｄｔら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，
３９
　【００１１】
　また、ＣＫの活性化剤として用いられる還元型グルタチオン及びジチオスレイトールなどの他のチオール化合物も溶液中で更に不安定であり、測定値に誤差を生じさせるようになるものであった。
　【００１２】
　このように、チオール化合物を含むＣＫ活性測定試薬及びチオール化合物を存在させるＣＫ活性測定方法は不安定なものであり、長期間測定に使用することができないものであった。
　【００１３】
　チオール化合物であるＮ−アセチルシステインを安定化することができ、３７℃での保存で最長１４日間使用することができる測定試薬として、ジチオスレイトール、メルカプトエタノール又はチオグリセロールなどのＮ−アセチルシステイン以外のチオール化合物（ＳＨ基含有化合物）とＮ−アセチルシステインとを含有するＣＫ測定試薬が開示されている。〔特開昭６１−２８９９００号公報〕
　しかしこれは、ジチオスレイトールが高価であること、メルカプトエタノールは悪臭を放つこと、そしてチオグリセロールは溶液状のため凍結乾燥に適さないことなどの難点を有するものであった。
　【００１４】
　また、やはりチオール化合物であるＮ−アセチルシステインを安定化することができ、４℃での保存で２８日間使用することが可能な測定試薬として、少なくともＮ−アセチルシステイン及びエチレンジアミン四酢酸塩を含む試薬群とマグネシウムを含む試薬群に分けて構成若しくは調製するＣＫ測定試薬が開示されている。〔特開昭６２−１０４５９８号公報〕しかしこれは、第１試薬中にマグネシウムが存在せずヘキソキナーゼ（又はグルコキナーゼ）及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼによる反応が進行しないため、第１試薬添加後の下記の反応式による試料ブランク反応の測定値を第２試薬添加後の測定値から差し引くことにより、溶血試料中のアデニル酸キナーゼによる正の誤差を補正して正確なＣＫ活性の測定値を得ることができる、ダブルカイネティック法と称される方法による測定を行えないという難点を有するものであった。
　【００１５】
　【化３】
　【００１６】
　なお、近年液状の測定試薬の需要が高まってきており、その製造、流通、保管及び使用の各段階を通じての長期間の安定化が望まれていた。
　【００１７】
　【発明が解決しようとする課題】
　前記のように、従来のＣＫ活性測定試薬及びＣＫ活性測定方法は不安定なものであり、長期間測定に使用することができないものであった。
　また、チオール化合物であるＮ−アセチルシステインを安定化し長期間使用することができるとして開示されたＣＫ活性測定試薬は、高価な物質、悪臭を放つ物質若しくは凍結乾燥に適さない物質などを使用するものであったり、又は溶血試料におけるアデニル酸キナーゼによる正の誤差を補正して正確な測定値を得ることができるダブルカイネティック法により測定を行えないという難点を有するものであった。
　【００１８】
　本発明者らは、この従来のＣＫ活性測定試薬及びＣＫ活性測定方法が有する難点の解消を目指して鋭意検討を行った結果、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を測定試薬に含有させることにより、長期間安定かつ正確にＣＫ活性を測定することができることを見出し、安価であり、悪臭を有さず、液状試薬と凍結乾燥試薬の両方の試薬形態に適用でき、ダブルカイネティック法により測定を行え、かつ長期間安定であって正確に測定を行うことができるＣＫ活性測定試薬及びＣＫ活性測定方法を完成するに至った。
　【００１９】
　【課題を解決するための手段】
　本発明は以下の発明を提供する。
　（１）　チオール化合物を含むＣＫ活性測定試薬において、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含有することを特徴とするＣＫ活性測定試薬。
　（２）　硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸が、スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸又はポリチオン酸である前記（１）のＣＫ活性測定試薬。
　（３）　チオール化合物を存在させるＣＫ活性測定方法において、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩の共存下で測定を行うことを特徴とするＣＫ活性測定方法。
　（４）　硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸が、スルホキシル酸、亜硫酸、チオ亜硫酸、チオ硫酸、亜ジチオン酸、二亜硫酸、ジチオン酸、二硫酸又はポリチオン酸である前記（３）のＣＫ活性測定方法。
　【００２０】
　本発明において、硫黄を中心原子とするオキソ酸とは、ＳＯｍ（ＯＨ）ｎ〔ｍ，ｎはそれぞれ整数〕で表されるプロトンとして解離しうる水素が酸素原子に結合した酸のことである。
　【００２１】
　また、本発明において、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸のこのチオ酸とは、前記の硫黄を中心原子とするオキソ酸の酸基に含まれる酸素原子の一部又は全部が硫黄原子で置換された化合物のことである。
　【００２２】
　本発明における、これらの硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸としては、例えば、スルホキシル酸〔Ｈ２ＳＯ２〕、亜硫酸〔Ｈ２ＳＯ３〕、チオ亜硫酸〔Ｈ２Ｓ２Ｏ２〕、チオ硫酸〔Ｈ２Ｓ２Ｏ３〕、亜ジチオン酸〔Ｈ２Ｓ２Ｏ４〕、二亜硫酸〔Ｈ２Ｓ２Ｏ５〕、ジチオン酸〔Ｈ２Ｓ２Ｏ６〕、二硫酸〔Ｈ２Ｓ２Ｏ７〕及びポリチオン酸〔Ｈ２ＳｘＯ６（ｘ＝３、４‥‥）〕などが挙げられる。
　【００２３】
　本発明において、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩のこれらの塩とは、前記の硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸のプロトンとして解離しうる水素の一部又は全部がアルカリ金属、アルカリ土類金属、その他の金属又は塩基性基で置換された化合物のことである。
　例えば、このアルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム及びセシウムなどが挙げられ、アルカリ土類金属としては、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム及びバリウムなどが挙げられ、そして塩基性基としては、アンモニウム基などが挙げられる。
　【００２４】
　これらの塩をより具体的に例示すると、亜硫酸アンモニウム〔（ＮＨ４）２ＳＯ３〕、亜硫酸カリウム〔Ｋ２ＳＯ３〕、亜硫酸カルシウム〔ＣａＳＯ３〕、亜硫酸水素アンモニウム〔ＮＨ４ＨＳＯ３〕、亜硫酸水素ナトリウム〔ＮａＨＳＯ３〕、亜硫酸ナトリウム〔Ｎａ２ＳＯ３〕、亜硫酸バリウム〔ＢａＳＯ３〕、亜硫酸ビスマス〔Ｂｉ２（ＳＯ３）３〕、亜硫酸水素カリウム〔ＫＨＳＯ３〕、チオ硫酸アンモニウム〔（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ３〕、チオ硫酸ナトリウム〔Ｎａ２Ｓ２Ｏ３〕、チオ硫酸バリウム〔ＢａＳ２Ｏ３〕、チオ硫酸マグネシウム〔ＭｇＳ２Ｏ３〕、チオ硫酸カルシウム〔ＣａＳ２Ｏ３〕、チオ硫酸カリウム〔Ｋ２Ｓ２Ｏ３〕、亜ジチオン酸ナトリウム〔Ｎａ２Ｓ２Ｏ４〕、亜ジチオン酸カリウム〔Ｋ２Ｓ２Ｏ４〕、亜ジチオン酸カルシウム〔ＣａＳ２Ｏ４〕、二亜硫酸ナトリウム〔Ｎａ２Ｓ２Ｏ５〕、二亜硫酸カリウム〔Ｋ２Ｓ２Ｏ５〕、二亜硫酸マグネシウム〔ＭｇＳ２Ｏ５〕、二亜硫酸カルシウム〔ＣａＳ２Ｏ５〕、ジチオン酸ナトリウム〔Ｎａ２Ｓ２Ｏ６〕、二硫酸カリウム〔Ｋ２Ｓ２Ｏ７〕、二硫酸ナトリウム〔Ｎａ２Ｓ２Ｏ７〕及び四チオン酸ナトリウム〔Ｎａ２Ｓ４Ｏ６〕などが挙げられる。
　【００２５】
　本発明において、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩は、チオール化合物を含むＣＫ活性測定試薬に含有させる。
　【００２６】
　また本発明において、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩は、チオール化合物と共存させてＣＫ活性の測定を行う。
　【００２７】
　この硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含有又は共存させる濃度は、０．００１〜１．０％が適当であり、０．００５〜０．５％が好ましく、０．０１〜０．２％が特に好ましい。
　【００２８】
　本発明は、１試薬系及び２試薬系などの多試薬系のいずれにおいても実施できるが、多試薬系の場合、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩は、少なくともチオール化合物を含む試薬に含有又は共存させる必要がある。しかし、チオール化合物を含まない試薬には含有又は共存させても、させなくてもどちらでも良い。
　【００２９】
　本発明において、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩は、１種類又は複数種類のものを含有又は共存させることができる。
　【００３０】
　本発明において、チオール化合物は、ＳＨ基を有する化合物で、ＣＫを活性化又は安定化することができ、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、ジチオスレイトール、還元型グルタチオン、システイン、ジチオエリスリトール、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム、チオグリセロール、２−チオグルコース、チオグリコール酸及び２−メルカプトエタノールなどが挙げられ、０．２〜１００ｍＭの濃度で含ませること又は存在させることが適当である。
　【００３１】
　本発明のＣＫ活性測定試薬及びＣＫ活性測定方法は、下記の反応によるＣＫ活性を測定するものであればいかなる測定原理のものにおいても実施することができ、かつ効果を得ることができる。
　【００３２】
　【化４】
　【００３３】
　例えば、下記の反応式（５）、（６）及び（７）で示される反応により生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成速度を３４０ｎｍにおける吸光度の１分間当たりの変化量より算出する測定原理のもの又は下記の反応式（５）、（６）、（７）及び（８）で示される反応により生成するホルマザン色素の生成量を可視部の吸光度を測ることにより求める測定原理のものなどにおいても実施することができる。
　【００３４】
　【化５】
　【００３５】
　これらの測定原理において実施する場合、クレアチンリン酸又はこの塩は５〜２５０ｍＭの濃度で、ＡＤＰ又はこの塩は０．５〜５０ｍＭの濃度で、グルコースは２〜２００ｍＭの濃度で、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼは１００〜３０，０００単位／Ｌの活性値で、ＮＡＤ＋若しくはＮＡＤＰ＋又はこれらの塩は０．２〜２０ｍＭの濃度で、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは１００〜３０，０００単位／Ｌの活性値で、テトラゾリウム塩は０．０２〜５ｍＭの濃度で、ジアホラーゼは１０〜１０，０００単位／Ｌの活性値で及び１−メトキシ−フェナジンメトサルフェートは０．００５〜１．０ｍＭの濃度で用いれば良い。
　【００３６】
　そして、ｐＨは、１試薬系にて測定を行う場合にはｐＨ５〜ｐＨ８が好ましく、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５とすることが特に好ましい。
　多試薬系にて測定を行う場合には試薬を混合した最終反応液のｐＨが、ｐＨ５〜ｐＨ８となるのが好ましく、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５となることが特に好ましい。例えば、２試薬系にて測定を行う場合、第１試薬はｐＨ５〜ｐＨ８の範囲内のｐＨとすることが好ましく、そして第２試薬はｐＨ６〜ｐＨ９の範囲内のｐＨとすることが好ましく、かつ第１試薬と第２試薬を混合した最終反応液のｐＨをｐＨ５〜ｐＨ８とするのが好ましく、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５とすることが特に好ましい。
　【００３７】
　なお、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼは、それぞれ前記の反応式（６）、（７）又は（８）の反応を触媒するものであれば、いかなる由来のもの及びいかなる調製法、操作法により得られたものをも使用することができる。
　【００３８】
　また、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼによる反応に必要なマグネシウムイオンを、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム又は硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩を含ませるか又は存在させることにより用いることができ、その濃度は０．５〜１５０ｍＭが適当である。
　【００３９】
　そして、エチレンジアミン四酢酸若しくはこの塩を０．１〜３０ｍＭの濃度で、ジアデノシンペンタリン酸若しくはこの塩を１〜１００μＭの濃度で、アデノシン一リン酸〔ＡＭＰ〕若しくはこの塩を０．５〜２５ｍＭの濃度で、イミダゾール若しくはグッド緩衝剤などの緩衝剤を１０〜５００ｍＭの濃度で含ませるか又は存在させることにより用いても良い。
　【００４０】
　更に、アルブミンなどのタンパク質、糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤、アジ化ナトリウムなどの防腐剤、妨害物質消去剤、界面活性剤、賦形剤あるいはその他の活性化剤等を含ませるか又は存在させても良い。
　【００４１】
　本発明のＣＫ活性測定試薬及びＣＫ活性測定方法においては、下記の反応を触媒する６−ホスホグルコノラクトナーゼを含ませるか又は存在させることもできる。この場合は前記の反応式（７）の反応を促進できる点で好ましい。
　【００４２】
　【化６】
　【００４３】
　この６−ホスホグルコノラクトナーゼは、いかなる由来のもの及びいかなる調製法、操作法により得られたものをも使用することができ、１０〜５０，０００単位／Ｌの活性値で用いれば良い。
　【００４４】
　本発明のＣＫ活性測定試薬及びＣＫ活性測定方法によりＣＫ活性の測定を行う場合において、ＣＫ活性を測定する生体由来試料としては、例えばヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、大便、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液若しくは心臓、脳等の臓器、毛髪、皮膚、爪、筋肉若しくは神経等の組織又は細胞などを挙げることができる。
　【００４５】
　本発明によりＣＫ活性の測定を行う場合、測定は反応速度法（レート法）又は終点法（エンドポイント法）のいずれによるものでも良く、測定ステップは１ステップ法又は２ステップ法などの多ステップ法のいずれでも良く、測定波長は紫外部及び可視部の適当な波長を使用することができ、測定反応の温度は３０℃又は３７℃など測定反応が進行しかつ測定反応に係わる酵素が熱により失活しない範囲内の温度を設定すれば良く、測定反応の開始方法はクレアチンリン酸若しくはこの塩などの基質を加えることにより行う方法又は生体由来試料を加えることにより行う方法などいずれの方法でも良く、そして測定の手法は用手法又は自動分析装置などの装置による方法のいずれをも用いることができる。
　【００４６】
　また、本発明によりＣＫ活性の測定を行うに当たり、溶血試料、ビリルビン高濃度試料又は乳び試料などの妨害物質含有試料における測定値の誤差を補正するため、試料ブランク値を差し引く方法により測定を行っても良く、例えば前記のダブルカイネティック法などを用いることもできる。
　【００４７】
　なお、本発明のＣＫ活性測定試薬及びＣＫ活性測定方法は、ＭＢ型アイソザイムなどのＣＫアイソザイムの測定及びＣＫのＭ型サブユニットのアイソフォームの測定においても実施することができ、かつ効果を得ることができる。
　この場合、Ｍ型若しくはＢ型のサブユニットを阻害する抗体又はＭ型サブユニットの組織型若しくは血清型のアイソフォームを阻害する抗体を生体由来試料に含まれるＣＫに作用させ、本発明のＣＫ活性測定試薬又はＣＫ活性測定方法によりＣＫ活性を測定することによって行うことができる。
　【００４８】
　【作用】
　本発明は、チオール化合物を含むＣＫ活性測定試薬において硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含有することを特徴とするＣＫ活性測定試薬及びチオール化合物を存在させるＣＫ活性測定方法において硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩の共存下で測定を行うことを特徴とするクレアチンキナーゼ活性測定方法であって、長期間安定かつ正確にＣＫ活性を測定することができるなどの効果を有するものであるが、その作用機序は現在のところ明らかではない。
　強いて挙げるならば、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩が含有又は共存することにより、チオール化合物が安定化されて、前記の効果が発現されるのではないかと推測される。
　【００４９】
　【実施例】
　以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこの実施例によって何ら限定されるものではない。
　【００５０】
　実施例１　血清試料のＣＫ活性の測定
　チオール化合物であるＮ−アセチルシステインを含み、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩である二亜硫酸カリウムを含有する本発明のＣＫ活性測定試薬を調製し、血清試料のＣＫ活性の測定を行った。
　【００５１】
（１）ＣＫ活性測定試薬及び血清試料の調製
▲１▼第１試薬の調製
　下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨを６．００（２０℃）に調整して第１試薬を調製した。
　　　　　　試薬成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　濃　度　
二亜硫酸カリウム（ナカライテスク社製）　　　　　　　　　　　　０．０３％
Ｎ−アセチルシステイン（べーリンガーマンハイム社製）　　　　２６．７ｍＭ
イミダゾール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩　　　　　　　　　　　　　２．０ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０ｍＭ
ＡＭＰ二ナトリウム塩　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６．６７ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩　　　　　　　　　　　　１３．３μＭ
Ｄ−グルコース（無水）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０．０ｍＭ
ＮＡＤＰ（酸化型）二ナトリウム塩　　　　　　　　　　　　　　２．６７ｍＭ
ヘキソキナーゼ（べーリンガーマンハイム社製、酵母由来）３，９００単位／Ｌ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ユニチカ社製、微生物由来）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２，０００単位／Ｌ
アジ化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５％
　【００５２】
▲２▼第２試薬の調製
　下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、０．１Ｎ酢酸でｐＨを８．００（２０℃）に調整して第２試薬を調製した。
　　　　　　試薬成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　濃　度　
クレアチンリン酸二ナトリウム塩　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｍＭ
イミダゾール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩　　　　　　　　　　　　　２．０ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０ｍＭ
Ｄ−グルコース（無水）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０．０ｍＭ
アジ化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５％
　【００５３】
▲３▼血清試料の調製
　ＣＫ活性値６，０７０単位／Ｌのヒト血清試料をそれぞれ０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、０．３ｍＬ、０．４ｍＬ、０．５ｍＬ、０．６ｍＬ、０．７ｍＬ、０．８ｍＬ及び０．９ｍＬ分注し、これらに生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）をそれぞれ０．９ｍＬ、０．８ｍＬ、０．７ｍＬ、０．６ｍＬ、０．５ｍＬ、０．４ｍＬ、０．３ｍＬ、０．２ｍＬ及び０．１ｍＬ加え混合して、１０段階に希釈された血清試料を調製した。
　【００５４】
（２）血清試料のＣＫ活性の測定
　測定は日立製作所社製７１５０型自動分析装置にて行い、前記のそれぞれの血清試料８μＬに第１試薬３００μＬを加え３７℃で５分間反応させた後、第２試薬を１００μＬ添加し３７℃で反応させ、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍにおける第１試薬添加後の試料ブランク反応の２分３６秒目（１３ポイント）から４分２４秒目（２２ポイント）までの吸光度の１分間当たりの変化量及び第２試薬添加後のＣＫ活性による反応の２分１２秒目（３６ポイント）から５分目（５０ポイント）までの吸光度の１分間当たりの変化量よりＣＫ活性値の算出を行った。（ダブルカイネティック法）
　なお、血清試料のＣＫ活性値は純水を試料とした時の吸光度の１分間当たりの変化量を試薬盲検値として、下記の計算式により求めた。
　【００５５】
　【数１】
　【００５６】
　また、比較のため従来のＣＫ活性測定試薬である二亜硫酸カリウムを含有しない第１試薬を調製し対照試薬として、前記と同様にして血清試料のＣＫ活性の測定を行った。
　【００５７】
　これらの１０段階に希釈した血清試料の測定結果を図１に示した。なお、この図１において、横軸は血清試料の希釈率を、縦軸はＣＫ活性値を表し、そして○は本発明のＣＫ活性測定試薬による測定値を、●は比較のための従来のＣＫ活性測定試薬である二亜硫酸カリウムを含有しない対照試薬による測定値を示す。
　【００５８】
　【図１】
　【００５９】
　この図より、本発明のＣＫ活性測定試薬によるＣＫ活性の測定では、検量線が原点を通る直線であり、５，９００単位／Ｌ以上まで直線性を有し、かつ硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含有しない従来のＣＫ活性測定試薬によるものと同一の測定値を示すことがわかり、ＣＫ活性の測定において充分な性能を持つことが確かめられた。
　【００６０】
　実施例２　従来のＣＫ活性測定試薬との相関
　本発明のＣＫ活性測定試薬による測定値と従来のＣＫ活性測定試薬である日本臨床化学会常用基準法ＣＫ活性測定試薬による測定値との相関を確かめた。
　【００６１】
（１）本発明のＣＫ活性測定試薬による測定
　実施例１の（１）の▲１▼及び▲２▼に記載した方法に従って第１試薬及び第２試薬を調製し、同じく実施例１の（２）に記載した方法に従って６９検体のヒト血清試料のＣＫ活性値の測定を行った。
　【００６２】
（２）日本臨床化学会常用基準法ＣＫ活性測定試薬による測定
▲１▼ＣＫ活性測定試薬の調製
ａ）第１試薬の調製
　下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、酢酸でｐＨを６．６０（３０℃）に調整して第１試薬を調製した。
　　　　　　試薬成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　濃　度　
Ｎ−アセチルシステイン（べーリンガーマンハイム社製）　　　　　　２３ｍＭ
イミダゾール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１１５ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩　　　　　　　　　　　　　２．３ｍＭ
酢酸マグネシウム（４水和物）　　　　　　　　　　　　　　　　１１．３ｍＭ
ＡＤＰ一カリウム塩　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．３ｍＭ
ＡＭＰ二ナトリウム塩　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．８ｍＭ
ジアデノシンペンタリン酸三リチウム塩　　　　　　　　　　　　１１．５μＭ
Ｄ−グルコース（無水）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２３ｍＭ
ＮＡＤＰ（酸化型）二ナトリウム塩　　　　　　　　　　　　　　　２．３ｍＭ
ヘキソキナーゼ（オリエンタル酵母工業社製、酵母由来）　３，４５０単位／Ｌ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（オリエンタル酵母工業社製、酵母由来）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１，７２５単位／Ｌ
　【００６３】
ｂ）第２試薬の調製
　下記の試薬成分を記載の濃度になるように純水に溶解して第２試薬を調製した。
　　　　　　試薬成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　濃　度　
クレアチンリン酸二ナトリウム塩　　　　　　　　　　　　　　　　３４５ｍＭ
　【００６４】
▲２▼血清試料のＣＫ活性の測定
　前記本実施例の（１）にて測定を行った６９検体のヒト血清試料を用い、それぞれの０．１０ｍＬに第１試薬２．００ｍＬを加え３７℃で５分間予備加温を行った後、３７℃で予備加温しておいた第２試薬を０．２０ｍＬ添加し３７℃で反応させ、日立製作所社製３２００型分光光度計を用いて測光した３４０ｎｍにおける第２試薬添加後のＣＫ活性による反応の２分目から４分目までの吸光度の１分間当たりの変化量より、ＣＫ活性値の算出を行った。
　なお、血清試料のＣＫ活性値は、第２試薬の替わりに純水を添加し同様に反応させた時の吸光度の１分間当たりの変化量を試料ブランク反応による変化量として、下記の計算式により求めた。
　【００６５】
　【数２】
　【００６６】
（３）得られた測定値の相関
　前記本実施例の（１）の本発明のＣＫ活性測定試薬による測定値と前記本実施例の（２）の日本臨床化学会常用基準法ＣＫ活性測定試薬による測定値との相関を図２に示した。なお、この図２において、横軸（ｘ軸）は日本臨床化学会常用基準法ＣＫ活性測定試薬による測定値を、縦軸（ｙ軸）は本発明のＣＫ活性測定試薬による測定値を表す。
　【００６７】
　【図２】
　【００６８】
　この図より、本発明のＣＫ活性測定試薬によるＣＫ活性の測定と、従来のＣＫ活性測定試薬である日本臨床化学会常用基準法ＣＫ活性測定試薬によるＣＫ活性の測定とでは、回帰式がｙ＝１．０３ｘ＋１．１、相関係数がｒ＝１．０００と大変良好な相関を示し、同一の測定値が得られることがわかった。
　従って、本発明のＣＫ活性測定試薬によるＣＫ活性の測定値は、臨床検査及び診断の場において、問題なく用いることができることが確かめられた。
　【００６９】
　実施例３　２５℃での安定性の確認
　本発明のＣＫ活性測定試薬を２５℃にて保存して、その安定性を確かめた。
　【００７０】
（１）ＣＫ活性測定試薬の調製
▲１▼第１試薬の調製
ａ）「０．０１％二亜硫酸Ｎａ試薬」及び「０．０３％二亜硫酸Ｎａ試薬」の調製
　実施例１の（１）の▲１▼に記載した方法に従い、０．０３％二亜硫酸カリウムに替えてそれぞれ０．０１％二亜硫酸ナトリウム又は０．０３％二亜硫酸ナトリウムを含有させた２種類の第１試薬を調製し、それぞれ「０．０１％二亜硫酸Ｎａ試薬」及び「０．０３％二亜硫酸Ｎａ試薬」とした。
　【００７１】
ｂ）「０．０１％亜硫酸水素Ｎａ試薬」及び「０．０３％亜硫酸水素Ｎａ試薬」の調製
　実施例１の（１）の▲１▼に記載した方法に従い、０．０３％二亜硫酸カリウムに替えてそれぞれ０．０１％亜硫酸水素ナトリウム又は０．０３％亜硫酸水素ナトリウムを含有させた２種類の第１試薬を調製し、それぞれ「０．０１％亜硫酸水素Ｎａ試薬」及び「０．０３％亜硫酸水素Ｎａ試薬」とした。
　【００７２】
ｃ）「０．０１％亜硫酸Ｎａ試薬」及び「０．０３％亜硫酸Ｎａ試薬」の調製
　実施例１の（１）の▲１▼に記載した方法に従い、０．０３％二亜硫酸カリウムに替えてそれぞれ０．０１％亜硫酸ナトリウム又は０．０３％亜硫酸ナトリウムを含有させた２種類の第１試薬を調製し、それぞれ「０．０１％亜硫酸Ｎａ試薬」及び「０．０３％亜硫酸Ｎａ試薬」とした。
　【００７３】
ｄ）「対照試薬」の調製
　比較のため、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩である二亜硫酸カリウムを含有しない第１試薬を実施例１の（１）の▲１▼に記載した方法に従い調製し、「対照試薬」とした。
　【００７４】
▲２▼第２試薬の調製
　実施例１の（１）の▲２▼に記載した方法に従って第２試薬を調製した。
　【００７５】
（２）ＣＫ活性測定試薬の保存
　前記（１）の▲１▼のａ）、ｂ）、ｃ）並びにｄ）の７種類の第１試薬及び前記（１）の▲２▼の第２試薬を、容量１００ｍＬの日立７１５０型自動分析装置用容器にそれぞれ注入し、蓋をして、２５℃の恒温装置内にて保存した。
　【００７６】
（３）保存したＣＫ活性測定試薬による測定
　前記（２）の保存した７種類の第１試薬及び第２試薬を用いて、２種類のヒト血清試料（試料１及び試料２）のＣＫ活性値を測定することにより、安定性を確かめた。
　保存開始時、保存１カ月後、保存１カ月２週後及び保存２カ月２週後の４時点において、実施例１の（２）に記載した方法に従ってＣＫ活性値の測定を行った。
　【００７７】
　この測定の結果を表１に示した。なお、この表において表示した値はＣＫ活性の測定値〔単位／Ｌ〕であり、またカッコ内の数値はその測定値の保存開始時の測定値に対する相対比率を表す。
　【００７８】
　【表１】
　【００７９】
　これより、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含有しない従来のＣＫ活性測定試薬は、２５℃での保存１カ月２週後では保存開始時に比べて９％も測定値が低下してしまい、また２５℃での保存２カ月２週後では１６〜１８％測定値が低下してしまうのに対して、本発明の硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含有するＣＫ活性測定試薬は、２５℃での保存１カ月２週後においては保存開始時に比べて測定値に変化はなく、また２５℃での保存２カ月２週後でも測定値の低下が抑えられていることがわかる。
　よって、本発明のＣＫ活性測定試薬による測定では、長期間安定かつ正確にＣＫ活性の測定を行えることが確かめられた。
　【００８０】
　実施例４　種々のｐＨのＣＫ活性測定試薬の２５℃での安定性の確認
　種々のｐＨの本発明のＣＫ活性測定試薬を２５℃にて保存して、その安定性を確かめた。
　【００８１】
（１）ＣＫ活性測定試薬の調製
▲１▼第１試薬の調製
ａ）「ｐＨ６．０試薬」の調製
　実施例１の（１）の▲１▼に記載した方法に従い、ｐＨが６．００（２０℃）の第１試薬を調製し、「ｐＨ６．０試薬」とした。
　【００８２】
ｂ）「ｐＨ６．３試薬」の調製
　ｐＨをｐＨ６．００からｐＨ６．３０（２０℃）に変える他は実施例１の（１）の▲１▼に記載した方法に従って第１試薬を調製し、「ｐＨ６．３試薬」とした。
　【００８３】
ｃ）「ｐＨ６．７試薬」の調製
　ｐＨをｐＨ６．００からｐＨ６．７０（２０℃）に変える他は実施例１の（１）の▲１▼に記載した方法に従って第１試薬を調製し、「ｐＨ６．７試薬」とした。
　【００８４】
ｄ）「対照試薬」の調製
　比較のため、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩である二亜硫酸カリウムを含有せず、ｐＨがそれぞれｐＨ６．００（２０℃）、ｐＨ６．３０（２０℃）又はｐＨ６．７０（２０℃）の３種類の第１試薬を、実施例１の（１）の▲１▼に記載した方法に従い調製し、それぞれ「対照ｐＨ６．０試薬」、「対照ｐＨ６．３試薬」、「対照ｐＨ６．７試薬」とした。
　【００８５】
▲２▼第２試薬の調製
　実施例１の（１）の▲２▼に記載した方法に従って第２試薬を調製した。
　【００８６】
（２）ＣＫ活性測定試薬の保存
　前記（１）の▲１▼のａ）、ｂ）、ｃ）並びにｄ）の６種類の第１試薬及び前記（１）の▲２▼の第２試薬を、容量１００ｍＬの日立７１５０型自動分析装置用容器にそれぞれ注入し、蓋をして、２５℃の恒温装置内にて保存した。
　【００８７】
（３）保存したＣＫ活性測定試薬による測定
　前記（２）の保存した６種類の第１試薬及び第２試薬を用いて、２種類のヒト血清試料（試料１及び試料２）のＣＫ活性値を測定することにより、安定性を確かめた。
　保存開始時及び保存１カ月後の２時点において、実施例１の（２）に記載した方法に従ってＣＫ活性値の測定を行った。
　【００８８】
　この測定の結果を表２に示した。なお、この表において表示した値はＣＫ活性の測定値〔単位／Ｌ〕であり、またカッコ内の数値はその測定値の保存開始時の測定値に対する相対比率を表す。
　【００８９】
　【表２】
　【００９０】
　これより、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含有しない従来のＣＫ活性測定試薬は、いずれも２５℃での保存１カ月後では保存開始時に比べて約１０％前後測定値が低下してしまうのに対して、本発明の硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含有するＣＫ活性測定試薬では、第１試薬のｐＨにかかわらずいずれのＣＫ活性測定試薬においても、２５℃での保存１カ月後では保存開始時に比べて測定値にほとんど変化がないことがわかる。
　よって、本発明のＣＫ活性測定試薬による測定では、ＣＫ活性測定試薬のｐＨにかかわらず長期間安定かつ正確にＣＫ活性の測定を行えることが確かめられた。
　【００９１】
　実施例５　５℃での安定性の確認
　本発明のＣＫ活性測定試薬を５℃にて保存して、その安定性を確かめた。
　【００９２】
（１）ＣＫ活性測定試薬の調製
▲１▼第１試薬の調製
ａ）「０．０１％二亜硫酸Ｎａ試薬」及び「０．０３％二亜硫酸Ｎａ試薬」の調製
　実施例１の（１）の▲１▼に記載した方法に従い、０．０３％二亜硫酸カリウムに替えてそれぞれ０．０１％二亜硫酸ナトリウム又は０．０３％二亜硫酸ナトリウムを含有させた２種類の第１試薬を調製し、それぞれ「０．０１％二亜硫酸Ｎａ試薬」及び「０．０３％二亜硫酸Ｎａ試薬」とした。
　【００９３】
ｂ）「０．０１％亜硫酸水素Ｎａ試薬」及び「０．０３％亜硫酸水素Ｎａ試薬」の調製
　実施例１の（１）の▲１▼に記載した方法に従い、０．０３％二亜硫酸カリウムに替えてそれぞれ０．０１％亜硫酸水素ナトリウム又は０．０３％亜硫酸水素ナトリウムを含有させた２種類の第１試薬を調製し、それぞれ「０．０１％亜硫酸水素Ｎａ試薬」及び「０．０３％亜硫酸水素Ｎａ試薬」とした。
　【００９４】
ｃ）「０．０１％亜硫酸Ｎａ試薬」及び「０．０３％亜硫酸Ｎａ試薬」の調製
　実施例１の（１）の▲１▼に記載した方法に従い、０．０３％二亜硫酸カリウムに替えてそれぞれ０．０１％亜硫酸ナトリウム又は０．０３％亜硫酸ナトリウムを含有させた２種類の第１試薬を調製し、それぞれ「０．０１％亜硫酸Ｎａ試薬」及び「０．０３％亜硫酸Ｎａ試薬」とした。
　【００９５】
ｄ）「対照試薬」の調製
　比較のため、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩である二亜硫酸カリウムを含有しない第１試薬を実施例１の（１）の▲１▼に記載した方法に従い調製し、「対照試薬」とした。
　【００９６】
▲２▼第２試薬の調製
　実施例１の（１）の▲２▼に記載した方法に従って第２試薬を調製した。
　【００９７】
（２）ＣＫ活性測定試薬の保存
　前記（１）の▲１▼のａ）、ｂ）、ｃ）並びにｄ）の７種類の第１試薬及び前記（１）の▲２▼の第２試薬を、容量１００ｍＬの日立７１５０型自動分析装置用容器にそれぞれ注入し、蓋をして、５℃の冷蔵庫内にて保存した。
　【００９８】
（３）保存したＣＫ活性測定試薬による測定
　前記（２）の保存した７種類の第１試薬及び第２試薬を用いて、２種類のヒト血清試料（試料１及び試料２）のＣＫ活性値を測定することにより、安定性を確かめた。
　硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩である二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム又は亜硫酸ナトリウムの濃度が０．０１％の第１試薬については保存開始時及び保存６カ月後の２時点において、また二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム又は亜硫酸ナトリウムの濃度が０．０３％の第１試薬については保存開始時、保存６カ月後及び保存９カ月後の３時点において、実施例１の（２）に記載した方法に従ってＣＫ活性値の測定を行った。
　【００９９】
　この測定の結果を表３に示した。なお、この表において表示した値はＣＫ活性の測定値〔単位／Ｌ〕であり、またカッコ内の数値はその測定値の保存開始時の測定値に対する相対比率を表す。
　【０１００】
　【表３】
　【０１０１】
　これより、硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含有しない従来のＣＫ活性測定試薬は、５℃での保存６カ月後では保存開始時に比べて７％も測定値が低下してしまい、また５℃での保存９カ月後では１４％測定値が低下してしまうのに対して、本発明の硫黄を中心原子とするオキソ酸若しくはこのチオ酸又はこれらの塩を含有するＣＫ活性測定試薬は、５℃での保存６カ月後においては保存開始時に比べて測定値にほとんど変化はなく、また５℃での保存９カ月後でも測定値の低下が抑えられていることがわかる。
　よって、本発明のＣＫ活性測定試薬による測定では、長期間安定かつ正確にＣＫ活性の測定を行えることが確かめられた。
　【０１０２】
　【発明の効果】
　本発明のＣＫ活性測定試薬及びＣＫ活性測定方法は、その安定性が著しく改善されたものである。
　【０１０３】
　例えば、従来のＣＫ活性測定試薬及びＣＫ活性測定方法は、２５℃での保存１カ月２週後では保存開始時に比べて９％も測定値が低下してしまい、また５℃での保存６カ月後では保存開始時に比べて７％も測定値が低下してしまって、長期間使用することができないのに対して、本発明のＣＫ活性測定試薬及びＣＫ活性測定方法はほとんど測定値の低下を示さず長期間正確な測定値を得ることができる。
　【０１０４】
　つまり、本発明のＣＫ活性測定試薬及びＣＫ活性測定方法は、安価であり、悪臭を有さず、液状試薬と凍結乾燥試薬の両方の試薬形態に適用でき、溶血試料におけるアデニル酸キナーゼによる正の誤差を補正することができるダブルカイネティック法を適用でき、長期間安定でありかつ長期間正確にＣＫ活性の測定を行うことができるという効果を有するものである。
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　本発明のＣＫ活性測定試薬による測定及び従来のＣＫ活性測定試薬による測定の直線性を示したグラフである。
　【図２】
　本発明のＣＫ活性測定試薬による測定と日本臨床化学会常用基準法ＣＫ活性測定試薬による測定との相関を示したグラフである。