【事件の表示】
　特許第３１２６７９８号「光学活性インドリジン誘導体及びその製法」の請求項１に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３１２６７９８号の請求項１に係る特許を取り消す。
【理　由】
１．手続の経緯
　特許第３１２６７９８号の請求項１に係る発明は、平成４年３月３１日に特許出願され、平成１２年１１月２日にその特許権の設定登録がなされ、その後、特許異議申立人　石井宏司により特許異議の申立てがなされ、取消しの理由が通知され、その指定期間内である平成１３年１２月１４日に訂正請求がなされたものである。
　
２．訂正の適否の判断
（１）訂正の内容
　特許請求の範囲の請求項１の記載について、「エチル　（Ｓ）−２−アシルオキシ−２−［６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル］ブタノエート。」とあるのを、「エチル　（Ｓ）−２−アルキルカルボニルオキシ（ただし、アルキルカルボニルオキシ基のアルキル部分は炭素数１〜６である）−２−［６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル］ブタノエート。」と訂正する。
　
（２）訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正事項は、「アシルオキシ」を「アルキルカルボニルオキシ（ただし、アルキルカルボニルオキシ基のアルキル部分は炭素数１〜６である）」とし、アシルオキシを限定するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とした明細書の訂正に該当する。
　上記訂正事項については、願書に添付した明細書の段落【００１４】に「一般式（１）で表される化合物のアシル基ＲＣＯのＲは炭素数１〜６のアルキル基が好ましく、」と記載されているから、上記訂正は願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内においてなされたものであり、また、実質的に特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。
　
（３）むすび
　したがって、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項において準用する特許法第１２６条第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議の申立てについて
（１）本件発明
　上記２．で示したように上記訂正が認められるから、本件の請求項１に係る発明（以下、「本件発明１」という。）は、上記訂正請求に係る訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１に記載された事項により特定されるとおりの、次のものである。
「エチル　（Ｓ）−２−アルキルカルボニルオキシ（ただし、アルキルカルボニルオキシ基のアルキル部分は炭素数１〜６である）−２−［６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル］ブタノエート。」
　
（２）異議申立ての理由の概要
　異議申立人　石井宏司は、下記の甲第１号証及び甲第２号証を提出して、
ア．本件特許明細書の特許請求の範囲の請求項１に記載された発明は、甲第１又は２号証に記載された発明と同一であり、特許法第２９条第１項第３号の規定に該当し特許を受けることができない、
イ．本件特許明細書の特許請求の範囲の請求項１に記載された発明は、甲第１又は２号証に記載された発明に基づいて当業者が容易になし得た発明であるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない、
ウ．本件特許明細書は、本件化合物の中間体としての有用性の点においてその記載に不備があるので、本件特許出願当時の特許法第３６条第４項及び第５項に規定する要件を満たしていない、
から、本件特許発明は、取り消されるべきものである旨主張している。
　
（３）刊行物記載の発明
刊行物１（甲第１号証）：寺沢弘文ら、「有機合成化学協会誌」第４９巻、第１１号、１０１３〜１０２０頁、（１９９１年）
刊行物２（甲第２号証）：Akio Ejima, et al, J. Chem. Soc.,Perkin Trans.I,1990, p27-31
　
　当審において通知した取消理由で引用した刊行物１には、
ア．図７にラセミ体の化合物２１が記載され（第１０１５頁左欄）、また、この化合物２１の６位のシアノ基を還元してジアゾ化及びアセトキシメチル化した後、得られた化合物２２を加水分解して６−ヒドロキシメチル体とし、さらにブタン酸のカルボキシル基と閉環させてラクトン環を形成させることにより化合物１８とすることが記載され、
イ．この化合物１８の光学分割について、化合物１８はアミンの存在下でラクトン環が開環して、当該アミンとの反応によりアミド体２６（Ｓ体アミンとのアミド）又はアミド体２９（Ｒ体アミンとのアミド）がそれぞれ形成されることが記載され（第１０１５頁右欄第１〜１３行）、また
ウ．「また、最近宮寺らにより、市販酵素パパインを用いた有機溶媒２層系における酵素的不斉水解反応によって、化合物３４の水解反応がほぼ定量的に進行し、光学純度が９９％ｅ．ｅ．以上の３５が得られることも報告されている。」（第１０１５頁右欄下から２行目〜第１０１６頁左欄第３行目）との記載、及び
エ．「その結果、Ｎ−アリールスルホニル基を有するプロリンを導入した化合物３８ａ〜３８ｄを用いた反応において、４４〜６４ｄ．ｅ．の不斉収率で目的とするＳ配置を有する化合物４１を得ることができた。」（第１０１６頁左欄「不斉合成法」の項第１２〜１５行）との記載がある。
　また、上記刊行物２には、
オ．「新規なジアステレオ選択的なエチル化方法により（Ｓ）−カンプトテシンの全合成が記載される。」（第２７頁第４行、適宜、スキーム２等を参照のこと）との記載、
カ．「酢酸及びＤＭＦの混合物中で化合物（５）を酢酸ナトリウムで処理してアセテート体（７）を得た。これをヨウ化エチルでエチル化してエチル誘導体（８）を得た。・・・（スキーム１）」（第２７頁左欄「環Ｅの新たな形成」の項、６〜９行目）との記載、
キ．「そして、立体制御ユニットとしてＮ−トシル−（Ｒ）−プロリン（１７）を用いて化合物（１８）をエチル化すると、定量的に化合物（１９）と化合物（２０）のジアステレオマー混合物が８２：１８の比で生成した。次いで、所望のジアステレオマー（１９）が、プロパン−２−オールの処理により、化合物（１８）から５６％の収率で簡単に単離された。（スキーム３）。」（第２７頁右欄第８〜１４行）との記載、及び
ク．「化合物（１９）を還元し、次いで化合物（１２）について記載した方法と同様にＮａＮ０２で処理して、化合物（１９）から収率７４％で、光学活性のトリエステル体（２２）を得た。トリエステル（２２）を加水分解してラクトン化することにより、Ｓ配置の光学活性ヒドロキシラクトン体（２３）を収率９０％で得た；［α］Ｄ ＋１０９．７°（ｃ０．７６クロロホルム中）Ｎ−トシル−（Ｒ）−プロリン（１７）はラセミ化無しに収率６６％で回収でき、再使用することができた。」（第２７頁右欄下から１０〜３行目）との記載があり、
ケ．エチル　２−アセトキシ−２−［６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３、５−テトラヒドロインドリジン−７−イル］ブタノエート（化合物（８））の具体的な製造方法及び確認データが、第２９頁左欄下から７行目〜同頁右欄第１１行に記載されている。
　
（４）判断
〈異議申立人の上記主張３．（２）アについて〉
　本件発明１に係る化合物（以下、「前者」という。）と、刊行物１記載の化合物２１（上記摘記事項３．（３）ア．）及び刊行物２記載の化合物８（上記摘記事項３．（３）ケ．）（以下、共に、「後者」という。）とを対比すると、後者は前者のアルキルカルボニルオキシ基のアルキル部分の炭素数が１である化合物に相当するものであり、ただ、前者が光学活性な化合物であるのに対して、後者はラセミ体である。
　しかしながら、ラセミ体は、光学的対掌体の等量からなる光学不活性の物質をいうから、引用例にラセミ体が開示されているということは、同時に同ラセミ体を形成している一対の光学的対掌体の一方である（Ｓ）−インドリジン誘導体が開示されているに等しいといえるから、刊行物１及び２には本願発明の化合物が開示されているといえる。
　この点について、特許権者は、ラセミ体であってもＳ体とＲ体の各々の光学活性体に分割して単離できるとは限らないものであり、本件発明は、特殊な光学分割法によって、本件発明化合物を光学純度９０％ｅｅ以上の高純度で得ることに成功し、しかもこれがカンプトテシン誘導体の合成原料になり得る物性を有することを明らかにしたものであると主張する。（平成１３年１２月１４日付け特許異議意見書第４頁第１４〜２９行）
　しかしながら、本件発明１は物の発明であるから、物としての同一性を判断するに当たっては、引用刊行物には物の構成が開示されていれば十分であると考えられ、また、従来から種々のラセミ分割の方法が行われてきていることを考慮すれば、本件発明１の光学純度の高いものを提供する行為は、方法の発明としてはともかくとして、物の発明として新規性を有するとすることは相当でないと考えられる。（東京高裁平成３年（行ヶ）８号、平成３年１０月１日）
　また、カンプトテシン誘導体の合成原料になり得るという点については、引用例２に化合物（８）からカンプトテシン（１）を合成する経路が開示されているから（上記摘記事項３．（３）オ．）、この点も格別特異な事柄とはいえない。
　したがって、本件発明１は上記刊行物に記載された発明である。
　
〈異議申立人の上記主張３．（２）イについて〉
　本件発明１が上記刊行物に記載された発明であることは、上記したとおりである。
　
〈異議申立人の上記主張３．（２）ウについて〉
　異議申立人は、本件化合物から目的の最終化合物を製造し得ることは具体的に記載されていないから、本件明細書には本件化合物の中間体としての有用性が具体的に記載されていないと主張しているので、この点について検討する。
　本件明細書の段落【００２４】には、「かくして得られる化合物（１）を、公知の方法、例えば、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ＰＥＲＫＩＮ　ＴＲＡＮＳ．１　２７（１９９０）記載の方法により、カンプトテシン誘導体（３）へと導くことができる。」（特許公報第３頁第６欄第４８行〜第４頁第７欄第１行）と記載されている。この引用文献は刊行物２（甲第２号証）であり、この文献の第２８頁のスキーム２には、本件発明の化合物のラセミ体（８）からラセミ体のカンプトテシン（１）を合成する経路が記載されている。また、刊行物１（甲第１号証）の第１０１４頁の図５には、このカンプトテシンから最終化合物であるＣＰＴ−１１を合成する方法も記載されており、ラセミの化合物（８）からＣＰＴ−１１を製造することは公知の方法であったといえる。
　したがって、本件発明の光学活性体を用いて刊行物２に記載された経路によりＣＰＴ−１１を合成し得ることは当業者にとって明らかであり、また、本件発明の化合物の有用性も明らかであるから、本願明細書の記載が不備であるということはできない。
　
（５）むすび
　以上のとおりであるから、本件発明１に係る特許は、特許法第２９条第１項第３号の規定により特許を受けることができない。
　したがって、本件発明１についての特許は拒絶の査定をしなければならない特許出願に対してなされたものと認められる。
　よって、特許法等の一部を改正する法律（平成６年法律第１１６号）附則第１４条の規定に基づく、特許法等の一部を改正する法律の一部の施行に伴う経過措置を定める政令（平成７年政令第２０５号）第４条第２項の規定により、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１４年５月１４日（２００２．５．１４）
【訂正の要旨】
　訂正の要旨
（１）特許請求の範囲の請求項１の記載について、「エチル　（Ｓ）−２−アシルオキシ−２−［６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル］ブタノエート。」とあるのを、特許請求範囲の減縮を目的として、
「エチル　（Ｓ）−２−アルキルカルボニルオキシ（ただし、アルキルカルボニルオキシ基のアルキル部分は炭素数１〜６である）−２−［６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル］ブタノエート。」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
光学活性インドリジン誘導体及びその製法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　エチル　（Ｓ）−２−アルキルカルボニルオキシ（ただし、アルキルカルボニルオキシ基のアルキル部分は炭素数１〜６である）−２−〔６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル〕ブタノエート。
　【請求項２】　下記一般式（２）
　【化１】
（式中、ＲＣＯはアシル基を示す）
で表わされるエチル　２−アシルオキシ−２−〔６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル〕ブタノエートのラセミ体にアスペルギルス属由来の酵素並びにアスペルギルス属に属する微生物の菌体、培養物及びこれらの分画物からなる群から選ばれる１種又は２種以上を反応させることを特徴とする下記一般式（１）
　【化２】
（式中、ＲＣＯはアシル基を示す）
で表わされるエチル　（Ｓ）−２−アシルオキシ−２−〔６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル〕ブタノエートの製法。
　【請求項３】　下記一般式（２）
　【化３】
（式中、ＲＣＯはアシル基を示す）
で表わされるエチル　２−アシルオキシ−２−〔６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル〕ブタノエートのラセミ体にアスペルギルス属由来の酵素並びにアスペルギルス属に属する微生物の菌体、培養物及びこれらの分画物からなる群から選ばれる１種又は２種以上を反応させてＲ体のみを分解してＳ体を残存させ、Ｒ体の分解物とＳ体を分離することを特徴とする下記一般式（１）
　【化４】
（式中、ＲＣＯはアシル基を示す）
で表わされるエチル　（Ｓ）−２−アシルオキシ−２−〔６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル〕ブタノエートの製法。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は光学活性エチル　２−アシルオキシ−２−〔６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル〕ブタノエート及びその製法に関し、さらに詳しくは合成抗癌剤として有用なカンプトテシン誘導体の重要な合成中間体である該化合物及びその製法に関する。
　【０００２】
　【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
　下記一般式（３）
　【０００３】
　【化５】
　【０００４】
で表わされるカンプトテシン誘導体は抗癌剤として有用なものであることが知られている。
　【０００５】
　そこで、上記カンプトテシン誘導体（３）の製造に有用な中間体を穏和な条件下で簡便に得る方法の開発が望まれていた。
　【０００６】
　【課題を解決するための手段】
　本発明者らは、かかる実情に鑑み鋭意検討した結果、後述する特定属由来の酵素、特定属に属する微生物の菌体等がエチル　２−アシルオキシ−２−〔６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル〕ブタノエートのＲ体にのみ作用して分解し、Ｓ体のみを残存させることを見出し、本発明を完成するに至った。
　【０００７】
　すなわち、本発明は光学活性エチル　２−アシルオキシ−２−〔６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル〕ブタノエートを提供するものである。
　【０００８】
　さらに、本発明は、下記一般式（２）
　【０００９】
　【化６】
　【００１０】
（式中、ＲＣＯはアシル基を示す）
で表わされるエチル　２−アシルオキシ−２−〔６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル〕ブタノエートのラセミ体にアスペルギルス属由来の酵素並びにアスペルギルス属に属する微生物の菌体、培養物及びこれらの分画物からなる群から選ばれる１種又は２種以上を反応させることを特徴とする光学活性エチル　２−アシルオキシ−２−〔６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル〕ブタノエートの製法を提供するものである。
　【００１１】
　上記光学活性エチル　２−アシルオキシ−２−〔６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル〕ブタノエートは、特に下記一般式（１）
　【００１２】
　【化７】
　【００１３】
（式中、ＲＣＯはアシル基を示す）
で表わされるエチル　（Ｓ）−２−アシルオキシ−２−〔６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル〕ブタノエートであることが好ましい。
　【００１４】
　本発明に使用される上記一般式（２）、ひいては一般式（１）で表わされる化合物のアシル基ＲＣＯのＲは炭素数１〜６のアルキル基が好ましく、なかでもメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基であることが特に好ましい。
　【００１５】
　上記化合物（２）のラセミ体は、公知の方法、例えばＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ＰＥＲＫＩＮ　ＴＲＡＮＳ．Ｉ　２７（１９９０）記載の方法により製造することができる。
　【００１６】
　本発明には、アルペルギルス属由来の酵素並びにアスペルギルス属に属する微生物の菌体、培養物及び分画物が使用される。
　【００１７】
　アスペルギルス属由来の酵素としては、本発明の反応機構から、酵素として働くのはエステラーゼ本体と考えられるが、純粋なものを得ることは困難である。本発明においては、エステラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミダーゼ等として市販されている酵素が使用できる。
　【００１８】
　アスペルギルス属に属する微生物の培養物としては、当該微生物を適当な培地で培養したものを挙げることができる。上記微生物の分画物としては菌体又は培養物を水又は適当な緩衝液で抽出したもの；液体培地で培養を行なった場合には培養物の濾液、該抽出液又は濾液に硫安又はアルコールを加えることにより得られる沈澱物；該抽出液又は濾液をゲル濾過、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー等を用いて分画したもの；菌体の破砕物；及び該破砕物を前記の分画方法を用いて分画したもの等を挙げることができる。
　【００１９】
　本発明は、まず化合物（２）のラセミ体を水とメタノール、エタノール等の有機溶媒との混合溶媒に懸濁し、次いでアスペルギルス属由来の酵素並びにアルペルギルス属に属する微生物の菌体、培養物及びこれらの分画物からなる群から選はれる１種又は２種以上を静かに加え、攪拌して反応させることにより行なう。
　【００２０】
　反応は、通常５〜６０℃、好ましくは３０〜５０℃、ｐＨ４〜９好ましくは６〜７で２０〜９６時間攪拌することにより行なえばよい。
　【００２１】
　使用される化合物（２）のラセミ体の濃度は０．１〜１重量％（以下単に％という）が好ましく、０．１〜０．２％が特に好ましい。
　【００２２】
　上記酵素、菌体、培養物、分画物等の使用量は特に限定されないが化合物（２）のラセミ体に対し重量比で１〜３０倍が適当である。
　【００２３】
　上記反応終了後、反応液を濾過、減圧濃縮、カラムクロマトグラフィー等の手段を用いることにより、目的化合物（１）を単離することができる。
　【００２４】
　かくして得られる化合物（１）を、公知の方法、例えばＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ＰＥＲＫＩＮ　ＴＲＡＮＳ．Ｉ　２７（１９９０）記載の方法により、カンプトテシン誘導体（３）へと導くことができる。
　【００２５】
　【発明の効果】
　本発明は、穏和な条件下で反応を行なわせることができ、しかも該反応時に副反応がほとんど生じないため、高純度の目的化合物を簡便に得ることができる。従って、本発明は工業的に有用なものである。
　【００２６】
　【実施例】
　以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　【００２７】
実施例１
　エチル　（Ｓ）−２−アセトキシ−２−〔６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル〕ブタノエート（化合物（１））の製造
　エチル　２−アセトキシ−２−〔６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル〕ブタノエート（化合物（２））のラセミ体３００ｍｇを１０％メタノール（０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を含む）３００ｍｌに懸濁し、プロテアーゼＰ−３（アスペルギルス−ソジャエ由来、天野製薬（株）製）３．０ｇを加え３０℃で４日間攪拌した。反応終了後、クロロホルム１００ｍｌを加え１０分間攪拌し、変性蛋白をセライト濾過により除いた。濾液を分液し、水層を抽出（クロロホルム１００×２）後、有機層を集め乾燥留去した。残渣をシリカゲルカラムで精製することにより目的化合物（１）１２５ｍｇ（収率４２％）を得た。
　【００２８】
　ＩＲ、ＦＴ−ＮＭＲ、ＭＳデータを以下に示す。
　ＩＲνｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：２２２５，１７５０，１６４０
　ＦＴ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３中のδ（ｐｐｍ））：０．８５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．２３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．２７（３Ｈ，ｓ）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．２−２．７（４Ｈ，ｍ）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．０−４．５（８Ｈ，ｍ）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６．４２（１Ｈ，ｓ）
　ＭＳ（ｍ／ｚ）：３９０（Ｍ＋）
　【００２９】
　次に、化合物（１）の光学純度を測定するため、化合物（１）をＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ＰＥＲＫＩＮ　ＴＲＡＮＳ．Ｉ　２７（１９９０）に記載の方法、すなわち、ニトリルの還元反応、ニトロソ経由転移反応及び閉環反応により、（Ｓ）−４−エチル−６，６−（エチレンジオキシ）−１，４，７，８−テトラヒドロ−４−ヒドロキシピラノ［３，４−ｆ］インドリジン−３，１０−（６Ｈ）−ジオンに誘導した。光学異性体分離カラムを用い、下記分析条件により、該化合物の光学純度を測定した。
　分析条件
　カラム：ＵＬＴＯＲＯＮ　ＥＳ−ＯＶＭ
　　　　　（信和化工（株）製）
　移動相：２．５％　エタノール
　　　　　（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を含む）
　流速：１．０ｍｌ／分
　波長：３００ｎｍ
　上記分析により、目的化合物（１）の光学純度は９８％ｅ．ｅ．であることがわかった。
　【００３０】
実施例２
　エチル　（Ｓ）−２−アセトキシ−２−〔６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル〕ブタノエート（化合物（１））の製造
　エチル　２−アセトキシ−２−〔６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル〕ブタノエート（化合物（２））のラセミ体３００ｍｇを１０％メタノール（０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を含む）３００ｍｌに懸濁し、プロテアーゼ（アスペルギルス−オリザエ由来、シグマ社製）６．０ｇを加え３０℃で４日間攪拌した。実施例１と同様の操作を行ない目的化合物（１）１２０ｍｇ（収率４０％）を得た。目的化合物（１）の光学純度は、９６％ｅ．ｅ．であった。
　【００３１】
参考例
　ポテトデキストロース寒天培地２ｍｌを試験管に分注しカビ菌体（アスペルギルス−キャンディダス　ＩＦＯ−４３１０　財団法人発酵研究所から購入）を接種して３０℃で４日間静置培養した。
　次に、三角フラスコ中の小麦ふすま８ｇに上記培養カビ菌体を接種し、さらに３０℃で４日間静置培養した。蒸留水３０ｍｌを加えて、３０℃で３時間振盪後遠心分離（１０００−３０分）して、カビ抽出液を得た。
　【００３２】
実施例３
　エチル　（Ｓ）−２−アセトキシ−２−〔６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル〕ブタノエート（化合物（１））の製造
　エチル　２−アセトキシ−２−〔６−シアノ−１，１−（エチレンジオキシ）−５−オキソ−１，２，３，５−テトラヒドロインドリジン−７−イル〕ブタノエート（化合物（２））のラセミ体１００ｍｇを１０％メタノール（０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を含む）９０ｍｌに懸濁し、上記抽出液１０ｍｌを加え３０℃で４日間攪拌した。実施例１と同様の操作を行ない目的化合物（１）３８ｍｇ（収率３８％）を得た。目的化合物（１）の光学純度は、９０％ｅ．ｅ．であった。