【事件の表示】
　特許第３０１８３６４号「免疫化学アッセイへの二価陽イオンの使用」の請求項１ないし１０に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３０１８３６４号の請求項１ないし１０に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ．　手続の経緯
　本件特許第３０１８３６４号の請求項１ないし１０に係る発明の出願は、平成２年(1990年)１月１８日（パリ条約に基づく優先権主張　１９８９年１月１９日、ドイツ）に特許出願され、平成１２年１月７日にその発明について設定登録がなされ、その後、申立人北村二郎、及び申立人庄司翠より特許異議の申立てがなされ、取消理由が通知され、その指定期間内である平成１３年５月２１日に訂正請求がなされたものである。
　
II．　訂正請求の適否についての判断
１．訂正の内容
　本件訂正は、つぎの訂正事項からなる。
　特許請求の範囲の請求項１末尾の、
「方法。」を、
「方法であって、上記の免疫化学検出または測定がＥＬＩＳＡである免疫化学検出または測定中の免疫反応の特異性が改良された方法。」
と訂正する。
　
２．　明細書の記載事項の範囲
　本件の願書に添付した明細書には、「本発明による方法は、沈殿が分散液として、またはゲルまたは粒子凝集物として生成するもの、あるいはそれらを不存在とするもの、あるいは免疫化学反応が固相で行われるものである。好ましい方法は、固相免疫化学アッセイと呼ばれるものである。」という記載事項があり（本件特許公報３欄４７行〜４欄２行参照）、実施例１の記載には、「ＩＢＲおよびＩＰＶの原因体に対する抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ」という記載（本件特許公報４欄４８〜４９行参照）とともに、ＡＰコンジュゲート（抗−ウシ免疫グロブリン−アルカリ性ホスフアターゼコンジュゲートと呼ばれる市販ＡＧ試薬）と、ウシヘルペスウイルスＩ（ＢＨＶ　Ｉ）抗原（Ａｇ）および（陰性）コントロール抗原（ＣｏＡｇ）をコーテイングしたマイクロアッセイプレートを用いて、マイクロアッセイプレートのウエル中のコンジュゲートとして結合したＡＰの酵素活性を測定して、血清検体中のＩＢＲおよびＩＰＶの原因体に対する抗体を検出する例が記載されている（本件特許公報４欄４７行〜６欄２５行参照）。
　そうすると、この訂正事項は、願書に添付した明細書又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であり、特許請求の範囲の減縮を目的とするものといえる。そして、この訂正事項は、実質上特許請求の範囲を拡張するものでなく、変更するものでもない。
　
３．　訂正事項の検討結果
　したがって、上記訂正は、特許法１２０条の４第２項及び同条第３項において準用する平成６年法律第１１６号による改正前の特許法第１２６条第１項ただし書き及び第２項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
III．　本件発明
　本件特許の請求項１ないし１０に係る発明は、本件訂正明細書の特許請求の範囲に記載されたつぎのとおりのものである。
「　特許請求の範囲
　１）　生物学的材料中に含まれる被分析物質を未標識反応物質と接触させる際に二価陽イオンを５〜５００ｍｍｏｌ／ｌの濃度の溶解された形態で存在させることより成る上記被分析物質の免疫化学検出または測定のための方法であって、上記の免疫化学検出または測定がＥＬＩＳＡである免疫化学検出または測定中の免疫反応の特異性が改良された方法。
　２）　二価陽イオンがカルシウムおよび／またはマグネシウム塩である請求項１記載の方法。
　３）　塩がクロライドである請求項２記載の方法。
　４）　被分析物質が抗原である請求項１記載の方法。
　５）　被分析物質が抗体である請求項１記載の方法。
　６）　一つの反応物質が固相として存在する請求項１記載の方法。
　７）　塩が乾燥状態で吸収性マトリクス中に含まれるか、または免疫化学的方法において液体検体または他の液体によって溶解されている請求項２記載の方法。
　８）　塩が被分析物質を含有し、そして適切な場合にはその被分析物質の希釈に用いられる溶液に添加される請求項２記載の方法。
　９）　二価陽イオンが３０〜１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で存在する請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
　１０）　二価陽イオンが５０〜６０ｍｍｏｌ／ｌの濃度で存在する請求項１〜８のいずれかに記載の方法。」
　
IV．特許異議の申立てについて
１．　申立ての理由の概要
イ）申立人北村二郎の申立ての理由の概要
　本件特許の請求項１ないし１０に係る発明は、刊行物１〜４に記載された発明に該当し、特許法第２９条第１項第３号により特許を受けることができないものであり、また、当業者が甲第１〜４号証に記載された発明に基づいて容易に発明をすることができたものであり、特許法第２９条第２項により特許を受けることができないものである。
　
ロ）申立人庄司翠の申立ての概要
　本件特許の請求項１ないし６及び８〜１０に係る発明は、刊行物１に記載された発明に該当し、特許法第２９条第１項第３号により特許を受けることができないものである。
　
２．　引用刊行物
　刊行物１：　特開昭５６−２５５５号　（１９８１年１月１２日公開）
　刊行物２：　特開昭６２−２１１５５４号（１９８７年９月１７日公開）
　刊行物３：　Journal of Neurochemistry，Vol．２８，pp．1201−1205（1977）
　刊行物４：　Immunochemistry，Vol．１０，pp．43−49（1973）
　
３．　引用刊行物の記載事項
　前記引用刊行物には、次の事項が記載されている。
（１）　刊行物１の記載事項
（１ａ）　凝集試験用水性溶媒（特許請求の範囲１）
「　免疫反応に基づいて抗原又は抗体と検体とを水性溶媒中で混合し、その凝集反応を追跡して抗原や抗体を測定する凝集反応において、Ｂｅ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｓｒ＋＋、Ｂａ＋＋、Ｆｅ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｃｄ＋＋等２価金属イオンの１つ又は２つ以上を０．００１〜１．０Ｍの濃度に含むことを特徴とする凝集試験用水性溶媒。」
（１ｂ）　非特異的な凝集反応（２頁左上欄１３行〜末行）
「　これら多くの水性溶液中での凝集反応を利用した凝集試験は簡便でかつ測定感度も高いので、各種抗原や抗体の検査に広く利用されている。しかしこれら水性溶媒中での凝集試験に共通した欠点は、リポプロテインやフイブリノゲン又は部分変性をうけたタンパク質などの疑似反応物質が混在する検体においては、非特異的な凝集反応が起こって判定を誤りやすいことである。」
（１ｃ）　検出特異性（２頁右上欄１６行〜１８行）
「　本発明の目的は凝集試験における非特異的反応を消去し、極めて検出特異性の優れた凝集試験用水性溶媒を提供せんとするにある。」
（１ｄ）　塩化物（３頁左下欄〜４頁左上欄）
　第１表には、二価金属イオンとして、マグネシウムイオン又はカルシウムイオンの塩化物が例示されている。
  実施例１、実施例４では、二価金属イオンとして、マグネシウムイオンの塩化物が使用されている。
（１ｅ）　非特異凝集を著るしく抑制（３頁右下欄１０行〜１４行）
「　本発明によるときは免疫反応に基づく抗原または抗体と献体との凝集試験において、非特異凝集を著るしく抑制しうる水性溶媒を得ることができ、各種抗原や抗体の測定の測定に利用されている凝集試験を簡素化すると共に検出非特異性を顕著に高めうる効果を有す。」
　
（２）　刊行物２の記載事項
（２ａ）　検体中のヒトの肺表面活性物質の測定法（２頁左下欄８行〜下から３行）
「　即ち、本発明は、ヒトの肺表面活性物質のアポ蛋白を認識する第一のモノクローナル抗体と、該アポ蛋白を認識するが、第一のモノクローナル抗体とは異なる抗原部位と結合する第二のモノクローナル抗体を用いて免疫学的方法により、検体中のヒトの肺表面活性物質を測定する方法において、免疫反応を４０℃以上５０℃未満で行うことを特徴とする、検体中のヒトの肺表面活性物質の測定法、及びＭｇ＋＋イオンを免疫反応系に共存させることを特徴とする検体中のヒトの肺表面活性物質の測定法である。」
（２ｂ）　固相酵素免疫反応（２頁左下欄１９行〜２０行）
「　本発明によると、短時間の固相酵素免疫反応が可能となった。」
（２ｃ）　Ｍｇ＋＋イオンの共存（２頁右下欄９行〜１１行）
「　また、Ｍｇ＋＋イオンを免疫反応に共存させることにより、アポ蛋白と共に存在するリン脂質がとりさられ、抗体の反応性が増すものと思われる。」（２頁右下欄９行〜１１行）
（２ｄ）　短時間で簡便に測定（３頁右上欄８行〜１１行）
　「本発明の方法により、検体中の肺表面活性物質中のアボ蛋白を短時間で簡便に測定することができ、ＩＲＤＳ等、緊急性を要する疾患に、有用な測定法を提供しうるものと期待される。」
（２ｅ）　実施例２，第２図　（４頁右上欄５行〜１８行、５頁）
「実施例２
　　検体希釈、・・・希釈のための緩衝液を（ａ）０．２５Ｍ ＭｇＣｌ2、・・・ＴＢＳ緩衝液および・・・緩衝液にし、免疫反応を・・・免疫反応を行った。・・・
　第２図により、Ｍｇ＋＋存在緩衝液の方が、早く免疫反応を進行させることから、Ｍｇ＋＋添加効果は、明瞭である。」との記載と共に、Ｍｇ＋＋を存在させた場合には存在させない場合と比較して、早く免疫反応が進行し短い免疫反応時間で測定値がエンドポイントの高原状態に至ることが、第２図に図示されているが、Ｍｇ＋＋を存在させた場合と存在させない場合とで高原状態になった測定値に格別相違は認められない。
　
（３）　刊行物３の記載事項
　　刊行物３は、「ＭＯＯＲＥのＳ−１００蛋白のサンドイッチ免疫放射性測定法のカルシウムイオン依存」と題する論文であって、次の事項が記載されている。
（３ａ）　サンドイッチ免疫放射性測定法のアッセイプロトコル（１２０１頁右欄下から１０行〜１２０２頁左欄６行）
「　別の方法を指定しない限り、Ｓ−１００蛋白のサンドイッチ免疫放射性測定法は以下の通り行われた。標準溶液はｌｍｌあたりＳ−１００蛋白をそれぞれ０．０，０．４，１．０，４．０，１０．０，４０．０，１００．０ｎｇ含むものである。標準液と未知溶液（例．組織抽出物）は、ＥＤＴＡ−ＢＳＡ−緩衝液中において作成された。アッセイの際、これらの溶液はＣａ−ＢＳＡ−緩衝液で１：１となるように希釈された。アッセイは０．２ｍｌのＳ−１００蛋白標準液または未知抗原溶液を、抗体が被覆された試験管に添加されることにより行われた。試験管は室温で２４時間放置された（反応１）後、吸引され、２ｍｌ のＣａ−ＢＳＡ−緩衝液で２度洗浄された。０．２ｍｌ（１８，０００−２１，０００ｃ．ｐ．ｍ）のウサギ１２５Ｉ標識抗Ｓ−１００蛋白抗体のＣａ−ＢＳＡ−緩衝液溶液が試験管に添加され、室温でさらに４８時間放置された（反応２）。試験管は吸引され、３回の洗浄後、ガンマカウンター（SearleModel 1185）で４分間計数された。」
（３ｂ）　カルシウム濃度（１２０３頁左欄６行〜１２０３頁右欄４行）
「　アッセイの濃度−応答におけるカルシウムの効果は、濃度を変化させたカルシウムおよび／またはＥＤＴＡを含有するＢＳＡ緩衝液に、Ｓ−１００蛋白標準液をインキュベートすることにより試験された（反応１）。全ての場合において、洗浄液はＢＳＡ緩衝液であり、そして標識抗体（反応２）はＣａ−ＢＳＡ−緩衝液中に存在させた。」　
（３ｃ）　カルシウムの濃度−応答への影響（１２０３頁の図５）
　図５には、「図５．カルシウムの濃度−応答への影響。　ＥＤＴＡ、カルシウムともに添加されていない図５．Ｃの破線を除いては、全てのインキュベーション媒体に０．１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有させた。（Ａ，Ｂ）は、Ｃａ＋＋濃度が増加するにつれて、濃度−応答曲線が増大することを示す。（Ｃ）は、濃度−応答は、１．０ｍＭのＣａ＋＋濃度で最大に達することを示し、そしてＣａ＋＋濃度が増加すると、応答は次第に抑制されるようになる（Ｄ）。」
　
（４）　刊行物４の記載事項
　刊行物４は、「アンジオテンシンII−抗体反応におけるカルシウムの影響」と題する論文であって、次の事項が記載されている。
（４ａ）　放射能を測定（４３頁右欄下から１７行〜下から３行）　
「　抗原抗体反応はアンジオテンシンIIのラジオイムノアッセイにより試験された（Vallotton ｌ９６７，１９７０，１９７１）。０．５ｍ ｌ のｐＨ７．５に調整した０．１Ｍ トリス酢酸緩衝液（試験管の壁面への吸着を防ぐための０．５ｍｇリソゾームとともに）を含むシリコーン処理試験管に、１０μ１の１２５Ｉ標識アンジオテンシンII（１０−１４ｍｏｌｅに相当）および１０μｌの未精製の抗血清が加えられた。抗血清の希釈は、低濃度の２抗血清を除いては１２５Ｉ標識アンジオテンシンIIの４０〜８０％が結合するように選択された。４℃、１６時間のインキュベーション後、抗体未結合蛋白からの抗体結合蛋白の分離が、デキストラン−被覆チャコールへ抗体未結合蛋白を吸着することにより行われた。遠心分離とそれ続く分離後、抗体結合分（Ｂ）と抗体未結合分（Ｆ）の放射能が計数された。」
（４ｂ）　カルシウムの影響（４４頁左欄８行〜１４行）
「　カルシウムの影響を調べるために、ＣａＣｌ2を要求される終濃度になるようにトリス緩衝液中に溶解させた。希釈されていない抗血清中の内因性カルシウム濃度はおよそ１０−１３Ｍである；結果的に、外因性のカルシウムを加えない抗血清の終濃度は、抗血清の希釈度に依存して２×１０−６Ｍ〜２×１０−７Ｍに変化した。」
（４ｃ）　結果（４４頁右欄１２行〜下から１２行）
「（１）　各希釈濃度の抗血清を用いた際にカルシウムまたは ＥＤＴＡ の添加がアンジオテンシンIIの結合に与える影響（図１）
　アンジオテンシンII に対して免疫応答を示す１４匹のウサギのうち、７匹にはカルシウム存在下で最大の結合を示す抗体が現れた（No．５１２，５０５，４１１，５１３，５０４，４１２）。０．０１Ｍのカルシウムの添加による結合率の増加は４％（No．３０１）から３６％（No．５１２）と変化した。抗血清は１：５０（No．４１２）から １：１６００（No．５１３，５０２）の範囲の希釈度で試験された。その他の抗血清は、抗血清（No．５０２）の例に示すようにカルシウム非依存であった。」
　
４．　本件請求項１発明について
（１）　本件請求項１発明と刊行物１に記載された発明との対比
　本件特許の請求項１に係る発明（以下、「本件請求項１発明」という。）と刊行物１に記載された発明とを対比する。
　「ＥＬＩＳＡ」は、enzyme-linked immunosorbent assayの略である。そうすると、ＥＬＩＳＡとは、 immunosorbent （免疫収着固体）を使用する酵素免疫測定法ということができる。
  刊行物１に記載の免疫反応に基づく「凝集試験」法は、「免疫反応に基づいて抗原又は抗体と検体とを水性溶媒中で混合し、その凝集反応を追跡して抗原や抗体を測定する」ものであって、「凝集反応において、Ｂｅ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｓｒ＋＋、Ｂａ＋＋、Ｆｅ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｃｄ＋＋等２価金属イオンの１つ又は２つ以上を０．００１〜１．０Ｍの濃度に含むことを特徴とする」ものである。
　そうすると、本件請求項１発明は、刊行物１に記載された発明と、「　生物学的材料中に含まれる被分析物質を未標識反応物質と接触させる際に二価陽イオンを５〜５００ｍｍｏｌ／ｌの濃度の溶解された形態で存在させることより成る上記被分析物質の免疫化学検出または測定のための方法であって、免疫化学検出または測定中の特異性が改良された方法」である点で一致するものの、次の相違点で相違する。
　（相違点）
　本件請求項１発明では、免疫化学検出または測定がＥＬＩＳＡであって、その免疫反応の特異性が改良された方法であるのに対し、刊行物１に記載された発明では、免疫化学検出または測定が凝集試験法である点。
　
（２）　相違点についての検討
　この相違点について以下検討する。
　刊行物１に記載された凝集試験法では、凝集反応に先立ち、抗原又は抗体と検体との間に特異的に結合した抗原−抗体免疫複合体を形成する免疫反応が生じ、次いでそれらの複合体が集まり不溶性の沈降物を形成する凝集反応が生じるものではあるが、二価金属イオンを添加する目的は、上記記載（１ｂ）、（１ｅ）に記載されているように、非特異的な凝集反応を著しく抑制するためである。そして、それらの二価陽イオンの添加により、免疫反応における非特異的反応を抑制し、免疫反応の特異性を向上できることは記載されていないし、上記記載（１ｂ）に挙げられた具体的な疑似反応物質の例からも、二価陽イオンの添加により消去できる非特異的反応が凝集反応であるという刊行物１の上記記載にも関わらず、二価陽イオンの添加により消去できる非特異的反応は凝集反応に先立つ免疫反応の非特異的反応であると示唆されている、とすることもできない。
　一方、ＥＬＩＳＡは、免疫化学検出または測定の分野でよく知られた方法であるが、凝集反応を利用する方法ではない。そして、本件請求項１発明は、本件特許明細書の実施例の結果に具体的に示されているように、二価陽イオンの添加によりＥＬＩＳＡにおける免疫反応の特異性が改良された、という顕著な効果を奏するものである。
  そうすると、刊行物１に記載の、凝集試験法における凝集反応の非特異性を向上させるための二価陽イオンの添加という手段を、凝集反応は利用しないＥＬＩＳＡに適用して凝集反応とは異なる免疫反応の特異性を向上することが、当業者が容易に想到しえたということができない。
　
（３） 本件請求項１発明と刊行物２〜４に記載された発明との対比・検討
　刊行物２に記載された発明は、上記記載（２ｃ）〜（２ｅ）にあるように、ヒトの肺表面活性物質のサンドイッチ酵素免疫測定法において、Ｍｇ＋＋を存在させることにより、免疫反応性を高め短時間で簡便測定する方法であって、第２図に示された結果をみても、Ｍｇ＋＋の添加の有無より免疫反応の特異性に差は見られないものであり、ＥＬＩＳＡにおけるＭｇ＋＋の添加により免疫反応の特異性が改善されることを示唆するものではない。
　また、刊行物３に記載された発明も、上記記載（３ｃ）にあるように、Ｃａ＋＋の添加により、Ｓ−１００蛋白のサンドイッチ免疫放射性測定における測定値が増大し、反応性が改善されたことは記載されているものの、測定値がＣａ＋＋の添加により小さくなり免疫反応における特異性が改良されたとの記載はもちろんのこと、示唆もされていない。
　さらに、刊行物４にも、アンジオテンシンII に対して免疫応答を示すウサギであっても、Ｃａ＋＋の存在下におけるその抗体の反応性に相違があることを示すだけで、ＥＬＩＳＡにおける免疫反応の特異性の改良のためにＣＡ＋＋を添加することを示唆、教示する記載は存在しない。
　
（４）　まとめ
　したがって、本件請求項１発明は、刊行物１〜４に記載された発明と同一であるともいえないし、また刊行物１〜４に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるともいえない。　
　
５．　本件請求項２ないし１０に係る発明について
　請求項２ないし１０に係る各発明は、いずれも請求項１に係る発明をさらに限定する発明であるから、前記４．に記載したように、刊行物１〜４に記載された発明と同一であるともいえないし、また刊行物１〜４に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるともいえない。　
　
Ｖ．　むすび
  以上のとおりであるから、特許異議申立ての理由及び証拠によっては、本件請求項１ないし１０に係る特許を取り消すことができない。
　また、他に本件請求項１ないし１０に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１３年７月１７日（２００１．７．１７）
【訂正の要旨】
　訂正の要旨
訂正事項：
　特許請求の範囲の請求項１の記載：
「１　生物学的材料中に含まれる被分析物質を未標識反応物質と接触させる際に二価陽イオンを５〜５００ｍｍｏｌ／ｌの濃度の溶解された形態で存在させることより成る上記被分析物質の免疫化学検出または測定のための方法。」
を、
「１）　生物学的材料中に含まれる被分析物質を未標識反応物質と接触させる際に二価陽イオンを５〜５００ｍｍｏｌ／ｌの濃度の溶解された形態で存在させることより成る上記被分析物質の免疫化学検出または測定のための方法であって、上記の免疫化学検出または測定がＥＬＩＳＡである免疫化学検出または測定中の免疫反応の特異性が改良された方法。」　と訂正する。
（５４）【発明の名称】
免疫化学アッセイへの二価陽イオンの使用
（５７）【特許請求の範囲】
　１）生物学的材料中に含まれる被分析物質を未標識反応物質と接触させる際に二価陽イオンを５〜５００ｍｍｏｌ／ｌの濃度の溶解された形態で存在させることより成る上記被分析物質の免疫化学検出または測定のための方法であって、上記の免疫化学検出または測定がＥＬＩＳＡである免疫化学検出または測定中の免疫反応の特異性が改良された方法。
　２）二価陽イオンがカルシウムおよび／またはマグネシウム塩である請求項１記載の方法。
　３）塩がクロライドである請求項２記載の方法。
　４）被分析物質が抗原である請求項１記載の方法。
　５）被分析物質が抗体である請求項１記載の方法。
　６）一つの反応物質が固相として存在する請求項１記載の方法。
　７）塩が乾燥状態で吸収性マトリクス中に含まれるか、または免疫化学的方法において液体検体または他の液体によって溶解されている請求項２記載の方法。
　８）塩が被分析物質を含有し、そして適切な場合にはその被分析物質の希釈に用いられる溶液に添加される請求項２記載の方法。
　９）二価陽イオンが３０〜１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で存在する請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
　１０）二価陽イオンが５０〜６０ｍｍｏｌ／ｌの濃度で存在する請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
　本発明は二価または三価陽イオンを免疫化学的検出方法および生物学的材料中の被分析物質（ａｎａｌｙｔｅ）の測定方法に用いることに関する。
　既知の免疫化学アッセイ系は、免疫化学的反応に関与しないがこのタイプの反応結果に有益な効果を有するのに適したタンパク質、多糖類および／または界面活性剤を添加使用している。
　このタイプのアッセイ系の一つの選択である固相ＥＬＩＳＡの場合、必要とされる（緩衝溶液、インキュベーションミリュー（ｍｉｌｉｅｕ）であり）、そして被分析物質を含有し固相と接触させるインキュベーション媒質は、コンジュゲートのおよび／または検体の随伴物質の固相への非特異的結合が妨げられるような組成を有していなければならない。そのために、既知の添加剤、例えばタンパク質、例えばアルブミン、ＩｇＧ、カゼイン、加水分解ゼラチンおよびそれらの誘導体およびタンパク質混合物またはヒトまたは動物血清、および界面活性剤などがインキュベーション媒質に用いられている。
　ＥＰ　０，１５２，８４７はカルシウム塩およびポリオキシエチレンを共に含有する酵素−抗原および酵素−抗体コンジュゲートを記載しており、この場合、水性溶液中のコンジュゲートの安定性は両物質の添加によっては増大するがいずれか一方の物質単独では増大しない。
　ＤＥ　３，６３８，７６７は、ラクトフェリン、牛胎児血清、ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレート（ＲＴｗｅｅｎ　２０）および緩衝塩を含む固相免疫化学アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、の為のインキュベーション媒質を記載している。
　ＤＥ　３，８０７，４７８は免疫化学剤、特にそれに含まれるインキュベーション媒質、に対する有利な添加物としてアミン酸化物を記載している。
　このたび驚くべきことに、検体中の被分析物質の免疫化学反応による検出または測定に用いられる剤に対し、特に前述の添加物と共に添加して、該被分析物質の検出および測定の特異性を高める免疫化学反応に対する有益な効果をもたらすのに二価または三価陽イオンが適していることを見出した。
　従って、本発明は、生物学的材料中に含まれる被分析物質の免疫化学検出方法および免疫化学測定方法に、好ましくは水溶性マグネシウムおよび／またはカルシウム塩の、二価または三価陽イオンを用い、被分析物質を未標識反応物質と接触させる場合にそれら適切な塩を５〜５００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で溶解された形態で存在させることに関する。
　それらの群から好まれる水溶性マグネシウムまたはカルシウム塩は、それらの陰イオンが免疫反応を阻害しないものである。好ましい陰イオンはアセテート、クロライドおよびシトレート、特に好ましくはクロライド、である。
　本発明による方法は、沈殿が分散液として、またはゲルまたは粒子凝集物として生成するもの、あるいはそれらを不存在とするもの、あるいは免疫化学反応が固相で行われるものである。
　好ましい方法は、固相免疫化学アッセイと呼ばれるものである。
　これに関連して、固相とは非水溶性であって、一以上の反応物質が結合される担体である。被分析物質は反応物質に結合させることができ、あるいはいくつかの反応物質が担体に結合して存在している場合には、少くともそれらのうちの一つをそれ自身の結合により脱着させてそれを水性相中に放出させることができる。
　担体の例はラテックス粒子、顆粒状の膨潤性または非膨潤性物質、ビーズ、チューブ内側面、チューブ装置の特別な態様としてのマイクロアッセイプレート、および吸収性マトリクスと称すべき多孔性材料である。
　免疫化学方法においては、抗原および抗体が、被分析物としておよび反応物質として、用いられるほか反応物質または被分析物質に対するその他のバイオアフィニティ結合相手、例えばレクチン、補体、プロテインＡまたはＧ、および誘導体化されたビオチンおよびアビジンが用いられる。
　多価陽イオンは乾燥状態で検体受容装置に、例えば検体受容容器に、あるいはいわゆる“ドライ・ケミカル”アッセイ系における検体のための受容ゾーン例えば吸収性マトリクスに、あるいは、そのほかに緩衝塩および洗剤および適切な場合には同じく被分析物質を安定化する物質として安定化用添加物例えばタンパク質または多糖類を含有する水性溶液中に含まれていてもよく、そして該多価陽イオンは５〜５００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは３０〜１００ｍｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは５０〜６０ｍｍｏｌ／ｌ、の濃度で含まれる。
　検体とも称される被分析物質を含む生物学的材料の例は、生検または剖検で得た組織、血液細胞、血清または血漿、分泌物、ＣＳＦ、インフレームされたまたはされない組織、壊死生産物および代謝排泄物などである。
　好ましい免疫化学方法は、反応物質のうちの一つが固相に存在するものであるが、その場合には検体を多価陽イオンの存在下に固相と、そして適切な場合には固相上のもの以外の免疫化学反応物質および被分析物質検出用試薬と共に接触させ、次いでその固相を液相から分離しそして固相に結合した被分析物質を測定するかまたは未結合の被分析物質を測定する。
　以下の実施例では、（１）感染性ウシ鼻気管炎（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｂｏｖｉｎｅ　ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ（ＩＢＲ））または感染性膿疱性外陰部膣炎（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｐｕｓｔｕｌａｒ　ｖｕｌｖｏｖａｇｉｎｉｔｉｓ（ＩＰＶ））および（２）ウシ白血症の原因となる作用体に対する抗体の検出方法および測定方法に多価陽イオンを用いることの利点を説明する。
実施例
実施例１
ＩＢＲおよびＩＰＶの原因体に対する抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ
１．１　緩衝および試薬溶液
　以下の緩衝および試薬溶液を調整した：
１．１．１　ＰＢＳ−ＲＴｗｅｅｎ２０
　１０ｇ／ｌポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレート（ＲＴｗｅｅｎ２０）を含有する、リン酸緩衝生理学的食塩水、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）、すなわち１４０ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＣｌ中の１０ｍｍｏｌ／ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２。
１．１．２　検体希釈緩衝液（ＰＴ）
　４０ｇ／ｌ　ＲＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ。
１．１．３　５０ｍｍｏｌ／ｌ　ＭｇＣｌ２を含有する検体希釈緩衝液（ＰＴ−Ｍｇ）
　１０ｇ／ｌ　ＭｇＣｌ２×６Ｈ２ＯをＰＴに溶解した。
１．１．４　Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ
　５０ｍｍｏｌ／ｌ　ｔｒｉｓ、５０ｍｍｏｌ／ｌエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムの水性溶液をＨＣｌでｐＨ７．２に調節した。
１．１．５　ＡＰコンジュゲート
　抗−ウシ免疫グロブリン−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートと呼ばれ製品Ｎｏ．ＯＵＤＹ０１の下に入手できるＢｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ　ＡＧ試薬をＰＴで１：７０に希釈した。
１．１．６　ＡＰ基質溶液
　１００ｇ／ｌジエタノールアミン水溶液中の１．５ｇ／ｌ　ｐ−ニトロフェニルホスフェートをＨＣｌでｐＨ９．５に調節した。
１．２　ウシヘルペスウイルスＩ（ＢＨＶ　Ｉ）によるマイクロアッセイのコーティング
　使用マイクロアッセイプレートは丸底を有するＩｍｍｕｎｏｐ１ａｔｅｓ　ＩＩ　９６　Ｆ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉ１ｉｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ，製品Ｎｏ．２６２１６２）とした。ＢＨＶ　Ｉを増殖させたＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎細胞（ＭＤＢＫ細胞）の組織培養、およびＢＨＶ　Ｉを全く含まない組織培養を、Ｎｉｃｏｌａｉ−Ｓｃｈｏｌｔｅｎらがおたふくかぜ（流行性耳下腺炎）ウイルスについてＭｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．Ｉｍｍｕｎｏ１．１６８，８１〜９０，１９８０に記載した如く処理して以下ＢＨＶ　Ｉ抗原（Ａｇ）および（陰性）コントロール抗原（ｃｏＡｇ）と呼ばれる調製物を得た。コーティングには、５０μｇのＢＨＶ　Ｉ抗原（Ａｇ）およびｃｏＡｇを前述のマイクロアッセイプレートのウエルに交互に入れ、そしてそれらプレートを２０〜２５℃に２０時間放置した。それらウエルの内容物を次いで吸引により除去しそしてウエルを、充填後吸引を行うことによりＰＢＳ−ＴｗｅｅｎＲ２０で１回、そしてｔｒｉｓ／ＥＤＴＡで２回洗浄した。
１．３　ＩＢＲ／ＩＰＶの原因体に対するＩｇＭ、ＩｇＧ抗体の測定方法
　陽性コントロールをＰＴおよびＰＴ−Ｍｇ緩衝液を用いて１：４０乃至１：６４０の連続希釈液として希釈した。血清検体を前記緩衝液を用いて１：４４に希釈した。１５０μｌの各溶液をＡｇおよびｃｏＡｇでコーティングしたマイクロアッセイプレートのウエルに入れた。次にそのアッセイプレートを大気湿度を飽和させて３７℃で１時間維持した。次いでそれらウエルをＰＢＳ−（Ｒ）Ｔｗｅｅｎを用いて、ウエルを充填し該液体を吸引除去することにより、３回洗浄した。次いで、５０μｌのＡＰコンジュゲートを添加し、そしてそれらプレートを再び３７℃に１時間放置後、前述の如く洗浄した。ウエル中のコンジュゲートとして結合したＡＰの活性を測定するために、１００μｌのＡＰ基質溶液を添加し、マイクロアッセイプレートを３７℃に４５分間放置し、そして黄色溶液の４０５ｎｍにおける吸光度を、空のウエルを基準として用いて測定した。
　血清は、Ａｇでコーティングされたウエル内の有色溶液の吸光度とｃｏＡｇでコーティングされたウエル内の溶液の吸光度の差がプラス２００ミリ吸光度（ｍＥ）より大であるときは陽性と判定され、またその差がプラス２００ｍＥ以下または負であるときは陰性と判定された。コントロール血清の力価をこの差が２００ｍＥである希釈度とした。従って２００ｍＥの数値はカットオフと呼ばれる。
１．４結果
　測定結果を表に示す。これより、検体希釈緩衝液ＰＴにＭｇＣｌ２を添加すると、１：６４０に希釈された二つのコントロール血清の場合に、Ａｇでコーティングされたウエル内またはｃｏＡｇでコーティングされたウエル内のいずれにおいても吸光度差が全く生じないことが明らかである。しかしながら、１：４４に希釈された血清の場合には、ＭｇＣｌ２の添加は、ＡｇでコーティングされたウエルおよびｃｏＡｇでコーティングされたウエルのいずれについてもその吸光度の絶対値が該添加物を含まない緩衝液を用いたときの吸光度の絶対値よりも低く有利である。特に、ｃｏＡｇでコーティングされたウエル内で、吸光度が低下することは、バックグラウンド吸光度が減少したこと、従ってアッセイの特異度が増大したことを意味する。
実施例２
ウシ自血病の原因体に対する抗体の検出方法
２．１　緩衝溶液
　以下の検体希釈緩衝液を調製した。
２．１．１　ＳＴＤ
　１０ｍｌ／ｌ牛胎児血清、１８ｍｍｏｌ／ｌクエン酸三ナトリウム×２Ｈ２Ｏ、１０ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＣｌ、４０ｇ／ｌ　１−アルキル（Ｃ８〜Ｃ１８）アミノ−３−ジメチルアミノプロパン３−Ｎ−オキサイドの水性溶液。
２．１．２　ＳＴＤ−Ｍｇ
　５０ｍｍｏｌ／ｌ　ＭｇＣｌ２、すなわち１０ｇ／ｌ　ＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、を２．１．１に記載の検体希釈液に溶解した。
２．１．３　ＳＴＤ−Ｃａ
　６８ｍｍｏｌ／ｌ　ＣａＣｌ２、すなわち１０ｇ／ｌ　ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、を２．１．１に記載の検体希釈液に溶解した。
２．２ウシ白血症ウイルス（ＢＬＶ）によるマイクロアッセイプレートのコーティング
　マイクロアッセイプレートは実施例１．２で使用したものと同じにした。ＢＬＶは永久羊胎児腎セルラインを用いて増殖させ、そしてＮｉｃｏｌａｉ−ＳｃｈｏｌｔｅｎらがおたふくかぜウイルスについてＭｅｄ．　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｉｍｍｕｎｏ１．１６８，８１〜９０，１９８０に記載した如く処理してＢＬＶ抗原の調製物を得た。コーティングには、５０μｌのＢＬＶ抗原を各ウエルに入れた。ウイルス不含羊腎細胞の調製物によるコーティングは行わなかった。次いで、ウエルの内容物を吸引により除去しそしてそれらウエルを、充填後吸引を行うことにより、ＰＢＳ−（Ｒ）Ｔｗｅｅｎで１回、そしてｔｒｉｓ／ＥＤＴＡで２回洗浄した。
２．３　ＢＬＶに対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体の測定方法
　ＳＴＤ、ＳＴＤ−ＭｇＣｌ２およびＳＴＤ−ＣａＣｌ２緩衝液を用いてＢＬＶ−陽性牛血清の１：２０希釈液を調製した。１５０μｌのこれら希釈液を実施例２．２に記載のマイクロアッセイプレートのＢＬＶ抗原でコーティングされたウエル内に移した。そのマイクロアッセイプレートを実施例１．３に記載の如くに更に処理した。
２．４　結果
　二つの被分析物質−陰性血清はＳＴＤ中ではそれぞれ０．４６Ｅおよび０．４８Ｅの吸光度を与えることが判明した。ＳＴＤ−ＭｇおよびＳＴＤ−Ｃａ中では、この数値はそれぞれ０．１４Ｅおよび０．２２Ｅに、すなわちそれぞれ６９．６％および５４．２％減少した。これとは対照的に、ＢＬＶ−特異抗体を含む牛血清により得られた吸光度はＳＴＤ中で１．２８Ｅ、ＳＴＤ−Ｍｇ中で１．０６Ｅ、ＳＴＤ−Ｃａ中で１．０２Ｅであった。すなわち、ＳＴＤ中で得られた数値はこの場合にはそれぞれわずか１７．２％および２０．３％しか減少しなかった。
　それらの結果を併せ考慮すれば、被分析物質−陽性および−陰性血清についての吸光度差が検体希釈媒質中のＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２の影響の下に大きくなる、すなわち、このアッセイ系の特異性が明らかに向上していることが明らかである。