(57)【要約】【課題】新規な血管新生制御剤，及び血管新生制御剤のスクリーニング方法，並びにスクリーニング用キットを提供すること。【解決手段】（Ｉ）BAZFの発現及び／又は（II）BAZFによるCBF-1の阻害を、制御する物質を含む血管新生制御剤，又はBAZFが関与する血管新生制御を利用した、血管新生制御剤のスクリーニング方法，並びに血管新生制御剤のスクリーニング用キットである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ｉ）及び／又は（II）を、制御する物質を含むことを特徴とする、血管新生制御剤。
（Ｉ）BAZFの発現
（II）BAZFによるCBF-1の阻害
【請求項２】
（Ｉ）及び／又は（II）を制御する物質が、（Ｉ）及び／又は（II）を、阻害する物質であることを特徴とする、請求項１記載の、血管新生制御剤。
【請求項３】
（Ｉ）及び／又は（II）を制御する物質が、（Ｉ）及び／又は（II）を、促進する物質であることを特徴とする、請求項１記載の、血管新生制御剤。
【請求項４】
下記（Ｍ−１）乃至（Ｍ−３）のステップを含むことを特徴とする、血管新生制御剤のスクリーニング方法。
（Ｍ−１）BAZF遺伝子と、被験物を共存させるステップ
（Ｍ−２）被験物が、BAZFの発現に及ぼす影響を確認するステップ
（Ｍ−３）BAZFの発現に影響を及ぼす被験物を選択するステップ
【請求項５】
下記（Ｎ−１）乃至（Ｎ−３）のステップを含むことを特徴とする、血管新生制御剤のスクリーニング方法。
（Ｎ−１）下記（Ａ）及び（Ｂ）と、被験物を共存させるステップ
（Ａ）BAZF及び／又は、BAZFの330-465位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（Ｂ）CBF-1及び／又は、CBF-1の１-178位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（Ｎ−２）被験物が、（Ａ），（Ｂ）間の相互作用に及ぼす影響を確認するステップ
（Ｎ−３）（Ａ），（Ｂ）間の相互作用に影響を及ぼす被験物を選択するステップ
【請求項６】
下記（Ｘ）又は（Ｙ）を含むことを特徴とする、血管新生制御剤のスクリーニング用キット。
（Ｘ）BAZF遺伝子
（Ｙ）下記の（ｙ−１）及び（ｙ−２）
（ｙ−１）BAZF，BAZFの330-465位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド，及びこれらのいずれかをコードする遺伝子からなる群から選択される一種以上
（ｙ−２）CBF-1，CBF-1の１-178位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド，及びこれらのいずれかをコードする遺伝子からなる群から選択される一種以上
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生制御剤，及びそのスクリーニング方法，並びにスクリーニング用キットに関するものであり、更に詳しくは、BAZFが関与する血管新生を阻害又は促進する薬剤，及びそのスクリーニング方法，並びにスクリーニング用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、癌の発育には、血管新生が関係していることが知られており、この血管新生の制御が、癌の治療にとって重要な役割を果たすと考えられていた。【０００３】
血管新生の促進には、VEGF（Vascular endothelial growth factor：血管内皮細胞増殖因子）（非特許文献１）が関与していること知られていた。
また逆に、血管新生の阻害には、Notch１シグナル経路（非特許文献２）が関与していることが知られていた。【０００４】
しかし、これらは、それぞれ別個に認識されているに過ぎず、その相関については全く知られていなかった。
血管新生その他の生理現象には、複数の制御システムが関与していることが普通であるが、それらの制御システムは、必ずしも相関しているとは限らないからである。【０００５】
一方、血管内皮細胞等にも発現が見られるタンパク質として、BAZF（Bcl-6 associated Zinc finger protein）が知られている。
このBAZFは、Bcl-6と同様の転写抑制活性を有するほか、Bcl-6とヘテロ２量体を形成して機能し、T細胞等の免疫系にも何らかの影響を及ぼすこと等が知られているが、血管新生との関わりは、全く知られていなかった（非特許文献３）。【０００６】
【非特許文献１】Antiangiogenesis to treat cancer and intraocular neovascular disorders (Shojaei F, Ferrara N, Lab Invest. 87, 227-30, 2007)
【非特許文献２】The multifaceted role of Notch in cancer (Roy M, Pear W, Aster J, Curr. Opin. Genet. Dev., 17, 52-9, 2007)
【非特許文献３】Aberrant regulation of hematopoiesis by T cells in BAZF-deficient mice (Broxmeyer HE, Sehra S, Cooper S, Mol. Cell. Biol., 27, 5275-5285, 2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者等は、上述の課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)をVEGFで刺激することによって、Notch1シグナルを一時的に遮断し得ること（つまり、血管新生の、アクセル（VEGF刺激）とブレーキ（Notch1シグナル伝達）の間に、ある種の相関があること），更には、その遮断に、VEGFシグナルによって発現が増加するBAZFが関与しており、BAZFが、Notch1シグナル伝達経路の下流にあるCBF-1に結合し、CBF-1を壊すタンパク質“Cull3（E-3リガーゼ）”とCBF-1との複合体形成を促進することによって、CBF-1の血管新生のブレーキ機能を解除すること等を見いだし、本発明を達成したものであって、その目的とするところは、新規な血管新生制御剤，及び血管新生制御剤のスクリーニング方法，並びにスクリーニング用キットを提供するにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述の目的は、下記の第一〜第六の発明によって達成される。【０００９】
〈第一の発明〉
下記（Ｉ）及び／又は（II）を、制御する物質を含むことを特徴とする、血管新生制御剤。
（Ｉ）BAZFの発現
（II）BAZFによるCBF-1の阻害【００１０】
〈第二の発明〉
（Ｉ）及び／又は（II）を制御する物質が、（Ｉ）及び／又は（II）を、阻害する物質であることを特徴とする、第一の発明記載の、血管新生制御剤。【００１１】
〈第三の発明〉
（Ｉ）及び／又は（II）を制御する物質が、（Ｉ）及び／又は（II）を、促進する物質であることを特徴とする、第一の発明記載の、血管新生制御剤。【００１２】
〈第四の発明〉
下記（Ｍ−１）乃至（Ｍ−３）のステップを含むことを特徴とする、血管新生制御剤のスクリーニング方法。
（Ｍ−１）BAZF遺伝子と、被験物を共存させるステップ
（Ｍ−２）被験物が、BAZFの発現に及ぼす影響を確認するステップ
（Ｍ−３）BAZFの発現に影響を及ぼす被験物を選択するステップ【００１３】
〈第五の発明〉
下記（Ｎ−１）乃至（Ｎ−３）のステップを含むことを特徴とする、血管新生制御剤のスクリーニング方法。
（Ｎ−１）下記（Ａ）及び（Ｂ）と、被験物を共存させるステップ
（Ａ）BAZF及び／又は、BAZFの330-465位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（Ｂ）CBF-1及び／又は、CBF-1の１-178位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（Ｎ−２）被験物が、（Ａ），（Ｂ）間の相互作用に及ぼす影響を確認するステップ
（Ｎ−３）（Ａ），（Ｂ）間の相互作用に影響を及ぼす被験物を選択するステップ【００１４】
〈第六の発明〉
下記（Ｘ）又は（Ｙ）を含むことを特徴とする、血管新生制御剤のスクリーニング用キット。
（Ｘ）BAZF遺伝子
（Ｙ）下記の（ｙ−１）及び（ｙ−２）
（ｙ−１）BAZF，BAZFの330-465位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド，及びこれらのいずれかをコードする遺伝子からなる群から選択される一種以上
（ｙ−２）CBF-1，CBF-1の１-178位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド，及びこれらのいずれかをコードする遺伝子からなる群から選択される一種以上
【発明の効果】
【００１５】
本発明の血管新生制御剤は、血管新生を制御（阻害又は促進）できるため、不必要な血管新生が一因となる癌，糖尿病性網膜症，リューマチや、逆に血管新生の不足が原因となる虚血性心疾患（狭心症，心筋梗塞等），脳梗塞，閉塞性動脈硬化症等，血管新生に関わる疾患の予防又は治療剤として有用である。
また本発明の血管新生制御剤のスクリーニング方法は、従来、血管新生阻害剤の標的であったVEGFよりも、より下流の物質を標的とした血管新生制御剤を得ることができるため、より副作用の少ない薬剤を得ることができる。
更に、本発明の血管新生制御剤のスクリーニング用キットによって、候補化合物の血管新生制御能が、簡便に検査できる。
【作用】
【００１６】
本発明者等は、HUVECをVEGFで刺激することによって、Notch1シグナルを一時的に遮断し得ることを見いだした。
【００１７】
すなわち、Notch1シグナルによって発現が促進される筈のHEY2遺伝子, HES1遺伝子の、発現抑制が認められた（試験例１，図１等参照）。
【００１８】
つまり、このことは、血管新生の抑制をすることが知られているNotch1シグナルを、VEGFが遮断し得ること，つまり、これまで独立の制御機構と考えられて来たNotch1シグナル経路（ブレーキ）と、VEGFシグナル伝達経路（アクセル）の間に、関連があったこと意味している。
【００１９】
更に、本発明者等は、このVEGF刺激によるHEY2, HES1 遺伝子の発現抑制が、BAZFによるものであることを見いだした。
【００２０】
すなわち、
１）VEGFによる刺激によって、HUVEC におけるBAZFの発現量が増加すること（試験例２，図２等参照）
２）HUVEC へのBAZF遺伝子の導入によって、血管新生の一つの指標である「血管の分岐数」が上昇すること（試験例３，４，及び図３，４，５等参照）
３）VEGFを添加しても、BAZFの発現を阻害すれば、HUVECにおける血管分岐数は、増加しないこと（試験例５，図６，７，８等参照）
等が確認された。
【００２１】
つまり、これらは、BAZFが、「VEGFによる血管新生促進作用」の制御の鍵となると同時に、「Notch1シグナルによる血管新生阻害作用」の制御の役割をも担っていることを意味する。
【００２２】
更に本発明者等は、BAZFが、どのようにNotch1シグナルを制御しているかについて検討を進めた結果、BAZFは、「Notch1の細胞内ドメイン（N1ICD）」との相互作用（結合）が知られている「核内転写調節因子であるCBF-1」と、結合し得ることを見いだした（試験例６，７，図９，１０等参照）。
【００２３】
CBF-1とは、Notch1シグナルと協調して、HEY1，HEY2, HES1 遺伝子の発現を促進していることが知られている、核内転写調節因子の一種である。
【００２４】
つまり、試験例６，７の結果は、BAZFによる血管新生の促進が、N1ICDとCBF-1の相互作用を阻害することによるものである可能性を示唆している。
【００２５】
従って、上記（Ｉ）及び／又は（II）を、制御する物質によって、本発明の血管新生制御剤を得ることが可能となる。
【００２６】
また、本発明者等は、BAZFとCBF-1との相互作用に関わるアミノ酸部位をそれぞれ絞り込むことに成功した（試験例８,図１１〜１５等参照）
すなわち、BAZFの場合は、330-465位に相当するポリペプチド内，CBF-1の場合は、１-178位に相当するポリペプチド内に、それぞれ結合部位があることが確認できた。
【００２７】
従って、全長の「BAZF」あるいは「BAZFの330-465位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド」と、「CBF-1」あるいは「CBF-1の１-178位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド」との間の、相互作用を制御し得る物質であれば、血管新生を制御することができると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】VEGF刺激による、HUVECにおける「Notch1シグナルの遮断」を示す図である。
【図２】VEGF刺激による、HUVEC における「BAZFの発現量の増加」を示す図である。
【図３】アデノウイルスベクターを用いた、HUVEC へのBAZF遺伝子の導入による、「血管の分岐数」の上昇を、微分干渉顕微鏡写真によって示す図である。尚、図中の白いバーは、１００μｍを表す。
【図４】図３の「血管の分岐数」の上昇を数値によって示す図である。
【図５】外来VEGFの添加量毎（0，0.1，1，10ng/ml）の、HUVEC へのBAZF遺伝子導入による「血管の分岐数」の上昇の差を、微分干渉顕微鏡写真によって示す図である。
【図６】VEGF存在下での、BAZFの発現阻害による、HUVECにおける血管分岐数の増加防止効果を、微分干渉顕微鏡写真によって示す図である。尚、図中の白いバーは、５００μｍを表す。
【図７】図６の「HUVECにおける血管分岐数の増加防止効果」を、数値によって示す図である。尚、図中の＊＊＊は、「有意差検定：p＜0.001」を表す。
【図８】VEGF存在下での、BAZFの発現阻害による、HUVECにおける血管分岐数の増加防止（細胞間ネットワークの形成阻害）効果の経時的な変化を、微分干渉顕微鏡下でのタイムラプスイメージによって示す図である。
【図９】BAZFが、CBF-1に結合すことを示す図である。
【図１０】BAZFが、実際に細胞内で、CBF-1に結合し、共局在していることを、蛍光顕微鏡写真によって示す図である。
【図１１】BAZF中の、CBF-1の結合領域を調べるために用いた、各種のBAZFの部分フラグメントを示す模式図である。
【図１２】CBF-1が、BAZFの、BTB領域では無く、ZnF領域に結合することを示す図である。
【図１３】CBF-1が、BAZFのZnF領域の中でも特に、330-465位に相当するポリペプチド領域内に結合することを示す図である。
【図１４】CBF-1中の、BAZFの結合領域を調べるために用いた、各種のCBF-1の部分フラグメントを示す模式図である。
【図１５】BAZFが、CBF-1の１-178位に相当するポリペプチド領域内に結合することを示す図である。
【図１６】FLAG-BAZFを発現させるための、プラスミドベクターpME18s- FLAG-BAZFの模式図である。
【図１７】AdBAZF を発現させるための、「pAxCAwt-BAZF」ベクターの模式図を表す。
【図１８】BAZF をGFPと同時に発現させるための、プラスミドベクター「BAZF-pIRES2-AcGFP-1」の模式図を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。【００３０】
［血管新生制御剤］
本発明の血管新生制御剤は、下記（Ｉ）及び／又は（II）を、制御する物質を含むことを特徴とする、血管新生制御剤である。
本発明の血管新生制御剤には、試験管内等の実験系において血管新生を制御するための、実験・研究用試薬の他、血管新生に関わる疾患の予防又は治療薬も含まれる。【００３１】
（Ｉ）BAZFの発現
（II）BAZFによるCBF-1の阻害【００３２】
CBF-1の阻害とは、CBF-1のタンパク質としての機能を阻害することを意味するが、より具体的には、例えば、CBF-1のタンパク質としての安定性を低下させることによって、CBF-1が、N1ICDと相互作用することを阻害することを意味する。【００３３】
本発明において、「制御」には、「阻害（抑制）」及び「促進」が含まれる。
従って、「（Ｉ）及び／又は（II）を、制御する物質」としては、「（Ｉ）及び／又は（II）を、阻害する物質」及び「（Ｉ）及び／又は（II）を、促進する物質」が挙げられる。【００３４】
（（Ｉ）及び／又は（II）を、阻害する物質）
（Ｉ）及び／又は（II）を、阻害する物質としては、具体的には、下記のようなものが挙げられるが、必ずしもこれらに限られるものでは無い。【００３５】
（ｉ）BAZF遺伝子に対するsiRNA遺伝子，アンチセンスDNA，アンチセンスRNA，デコイDNA，デコイRNA
（ｉｉ）BAZF抗体
（ｉｉｉ）BAZFの330-465位に相当するアミノ酸配列部分を抗原決定基とする抗体
（ｉｖ）CBF-1の１-178位に相当するアミノ酸配列部分を抗原決定基とする抗体【００３６】
（ｉ）のBAZF遺伝子に対するsiRNA遺伝子としては、例えば配列番号１（sense：5' aguuuaucuguaaauauaaTT 3'）及び配列番号２（antisense:5' uuauauuuacagauaaacuGA 3'）（いずれも小文字はRNA，大文字はDNAを表す。）からなる二本鎖の遺伝子等が挙げられるが、これに限られるものでは無い。
その他のBAZF遺伝子に対するsiRNA遺伝子は、公知のRNAi技術の知見に基づいて、適宜設計することが可能である。
（ｉ）のBAZF遺伝子に対するアンチセンスDNA，アンチセンスRNAとは、BAZFのDNAセンス鎖やRNAに相補的なオリゴヌクレオチド（修飾ヌクレオチドを含む）であって、BAZF遺伝子の転写や翻訳を特異的に阻害するものであり、公知の遺伝子組換技術等によって適宜設計することができる。
（ｉ）のデコイDNA，デコイRNAとは、BAZF DNA上の転写調節因子結合部位と類似の配列を有しており、転写調節因子と結合して転写調節因子がBAZFのDNAに結合するのを、おとりとなって阻害し、その結果、転写を特異的に阻害するものであり、公知の遺伝子組換技術等によって適宜設計することができる。【００３７】
（ｉｉ）〜（ｉｖ）の抗体は、公知の方法に従い、BAZF，BAZFの330-465位に相当するアミノ酸配列部分，CBF-1の１-178位に相当するアミノ酸配列部分等を抗原として、適当な宿主に免疫すること等によって、作製することができるが、公知の抗体として購入することもできる。【００３８】
例えば、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のBAZF抗体としては、BAZFのホモログ（同族体）であるBcl-6の抗体等も使用でき、例えば、「sc-7388（Bcl-6（D-8）」，（Santa Cruz Biotechnology,Inc.，カリフォルニア州，USA），「sc-858（Bcl-6（N-3）」（Santa Cruz Biotechnology,Inc.，カリフォルニア州，USA），BCL6B mouse polyclonal antibody A01, （Abnova社、catalog ID H00255877-A01）等として購入することができる。【００３９】
（（Ｉ）及び／又は（II）を、促進する物質）
（Ｉ）及び／又は（II）を、促進する物質としては、具体的には、下記のようなものが挙げられるが、必ずしもこれらに限られるものでは無い。【００４０】
（ｉ）BAZF遺伝子
（ｉｉ）BAZFタンパク質【００４１】
本発明において「遺伝子」とは、アデニン（A），グアニン（G）等のプリン塩基や、チミン（T），ウラシル（U），シトシン（C）等のピリミジン塩基やそれらの修飾塩基を構成要素として含むポリヌクレオチドであり、一本鎖又は二本鎖のDNA，cDNA，一本鎖又は二本鎖のRNA，一本鎖DNAと一本鎖RNAからなるハイブリッド体，RNAとDNAが結合して一本鎖となったキメラ体をも含むものである。【００４２】
尚、ヒトBAZFの、遺伝子及びアミノ酸の配列は、「Cloning and characterization of the human BAZF gene, a homologue of the BCL6 oncogene.（Biochem. Biophys. Res. Commun. 291 (3), 567-573 (2002)）」等に記載されており、また、「NCBI GENE accession number; NM 181844」として、NCBI（メリーランド州，米国）等から入手可能である。
【００４３】
遺伝子は、プラスミド，ウイルスベクター等の形態で用いることができ、その際には、一本鎖であっても二本鎖であっても構わない。【００４４】
これらの遺伝子は、常法に従い、DNA合成装置や形質転換細胞等を用いて人工的に合成する，天然に存在するポリヌクレオチドを抽出する，天然からの抽出ポリヌクレオチドの塩基の一部を欠失，置換，付加, 挿入する，目的とする配列と相補的な配列を用い、逆転写酵素やDNAポリメラーゼ，RNAポリメラーゼ等によって目的の配列のものを合成させる，これらの方法で得られたポリヌクレオチドの塩基を修飾する等の方法によって製造することができる。【００４５】
尚、本発明において抗体とは、モノクローナル、ポリクローナル、もしくはキメラ抗体やヒト化抗体のいずれであっても良く、ファージ抗体であっても良い。【００４６】
（その他の成分）
本発明の血管新生制御剤には、上記の、「（Ｉ）及び／又は（II）を制御する物質」の他、本発明の目的を阻害しない範囲で、他の成分を含有させることができ、例えば、以下のようなものが挙げられる。【００４７】
賦形剤，滑沢剤，結合剤，崩壊剤，安定剤，矯味矯臭剤，希釈剤，界面活性剤，乳化剤，可溶化剤，吸収促進剤，保湿剤，吸着剤，充填剤，増量剤，付湿剤，防腐剤等。
賦形剤としては、有機系賦形剤及び無機系賦形剤等が挙げられる。【００４８】
（剤形）
本発明の血管新生制御剤の剤形は、例えば錠剤，カプセル剤，顆粒剤，散剤，丸剤，トローチ，もしくはシロップ剤，注射剤等の形態が挙げられる。【００４９】
（有効成分の含有量）
本発明の血管新生制御剤中の、有効成分（「（Ｉ）及び／又は（II）を制御する物質」）の含有量は、剤形によって様々であり、一概に限定できず、各種剤形化が可能な範囲で、投与量との関係で適宜選択すれば良いが、例えば液剤の場合、好ましくは０．０００１〜１０（ｗ／ｖ％），より好ましくは０．００１〜５（ｗ／ｖ％），特に注射剤の場合、好ましくは０．０００２〜０．２（ｗ／ｖ％），より好ましくは０．００１〜０．１（ｗ／ｖ％），固形剤の場合、好ましくは０．０１〜５０（ｗ／ｗ％），より好ましくは０．０２〜２０（ｗ／ｗ％）等として調製できるが、必ずしもこの範囲に限定されるものでは無い。【００５０】
（製造方法）
本発明の血管新生制御剤は、上記の成分を用いて、周知の方法で製剤化することができる。【００５１】
（合剤）
また、本発明の血管新生制御剤は、公知の血管新生制御剤との合剤とすることもできる。
公知の血管新生制御剤としては、例えば下記のようなものが挙げられる。【００５２】
〈血管新生阻害剤〉
Notch1，Notch1遺伝子，CBF-1，CBF-1遺伝子，HEY1，HEY1遺伝子，HEY2,HEY2遺伝子，HES1，HES1 遺伝等【００５３】
〈血管新生促進剤〉
Notch1シグナル阻害剤（製品名DAPT：N-[N-（3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl）-S-phenylglycine t -Butyl Ester）等のγ−セクレターゼ阻害剤等]，VEGF，VEGF遺伝子等【００５４】
DAPTは、γ−セクレターゼによるNotch1膜内部位切断機能を阻害することで、その細胞内ドメイン（N1ICD）の発生を抑制し、Notch1シグナルを遮断することが知られている物質である。【００５５】
（投与経路）
本発明の血管新生制御剤の投与経路としては、全身投与と局所投与があり、いずれでも良く、具体的には、経口投与，静注等の静脈投与，筋注等の筋肉内投与,  経皮投与，経鼻投与，皮内投与，皮下投与，腹腔内投与，直腸内投与，粘膜投与，吸入，関節腔内投与等が挙げられ、治療目的の疾患，症状等に応じて、適宜選択することができる。【００５６】
（投与方法）
本発明の血管新生制御剤が、siRNA等を含む遺伝子治療剤の形態を取っている場合には、例えば、プラスミドを用いる場合、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）, リポソーム法, リポフェクチン法, マイクロインジェクション法, リン酸カルシウム法, エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法, リポソーム法が好ましい。【００５７】
ウイルスベクターを用いる場合、公知の方法に従って、ウイルスに、目的とする遺伝子を組み込むことによって行うことができる。【００５８】
ウイルスベクターに用いるウイルスとしては、例えば、無毒化した、レトロウイルス，アデノウイルス，アデノ関連（随伴）ウイルス，ヘルペスウイルス，センダイウイルス，ワクシニアウイルス，ポックスウイルス，ポリオウイルス，シンビスウイルス，ＳＶ４０，免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等の、各種ＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスが挙げられる。
ウイルスの中では、レトロウイルス，アデノウイルス，アデノ関連ウイルス，ワクシニアウイルス等が好ましく、特に感染効率が高いアデノウイルスが好ましい。【００５９】
遺伝子を実際に医薬として作用させるには、当該遺伝子を直接体内に導入する「ｉｎ  ｖｉｖｏ法」の他、ヒトかから採集した細胞に当該遺伝子を導入し、その後、遺伝子導入細胞を体内に戻すという、「ｅｘ  ｖｉｖｏ法」等がある。
「ｉｎ  ｖｉｖｏ法」は費用や手間が少なく、簡便である点で好ましく、「ｅｘ  ｖｉｖｏ法」は、遺伝子の細胞内への導入効率が良いという点で好ましいが、血管新生を制御する際には、「ｉｎ  ｖｉｖｏ法」が好ましと考えられる。【００６０】
「ｉｎ  ｖｉｖｏ法」により投与する場合は、治療目的の疾患，症状等に応じた適当な投与経路を選択することができる。投与経路としては、例えば、静脈，動脈，皮下，皮内，筋肉内等が挙げられる。【００６１】
「ｉｎ  ｖｉｖｏ法」によって投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとることができる。一般的には遺伝子を含有する注射剤等の形態が好ましく、必要に応じて、注射剤等に常用されている各種の成分等を加えることもできる。【００６２】
また、遺伝子を含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤，凍結剤，遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態として用いることができる。【００６３】
（投与量）
本発明の血管新生制御剤の投与量は、投与経路，症状，年齢，体重，血管新生制御剤の形態等によって異なるが、例えば、血管新生制御剤中の有効成分の量が、処置を必要としている対象体重１ｋｇ当たり好ましくは０．００５〜５００ｍｇ，より好ましくは、０．１〜１００ｍｇ，但し、成人に対して１日あたり、下限として好ましくは０．０１ｍｇ（より好ましくは０．１ｍｇ），上限として、好ましくは２０ｇ（より好ましくは２０００ｍｇ，更に好ましくは５００ｍｇ，特に好ましくは１００ｍｇ）となるように、１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。【００６４】
尚、本発明の血管新生制御剤中の有効成分が、遺伝子の場合、例えば、遺伝子として０．０００１〜１００ｍｇ，好ましくは、０．００１〜１０ｍｇ等を、数日乃至数ヶ月に１回程度等投与するのが好ましい。【００６５】
本発明の血管新生制御剤を適用し得る疾病としては、血管新生制御剤が、血管新生阻害剤の場合には、癌，糖尿病性網膜症，リューマチ等が挙げられる。
また、本発明の血管新生制御剤が、血管新生促進剤である場合には、虚血性心疾患（狭心症，心筋梗塞等），脳梗塞，閉塞性動脈硬化症等が挙げられる。【００６６】
［血管新生制御剤のスクリーニング方法］
本発明の血管新生制御剤のスクリーニング方法は、下記（Ｍ−１）乃至（Ｍ−３）のステップを含むことを特徴とする、血管新生制御剤のスクリーニング方法である。【００６７】
（Ｍ−１）BAZF遺伝子と、被験物を共存させるステップ
（Ｍ−２）被験物が、BAZFの発現に及ぼす影響を確認するステップ
（Ｍ−３）BAZFの発現に影響を及ぼす被験物を選択するステップ【００６８】
また、本発明の血管新生制御剤の他のスクリーニング方法は、下記（Ｎ−１）乃至（Ｎ−３）のステップを含むことを特徴とする、血管新生制御剤のスクリーニング方法である。【００６９】
（Ｎ−１）下記（Ａ）及び（Ｂ）と、被験物を共存させるステップ【００７０】
（Ａ）BAZF及び／又は、BAZFの330-465位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（Ｂ）CBF-1及び／又は、CBF-1の１-178位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド【００７１】
（Ｎ−２）被験物が、（Ａ），（Ｂ）間の相互作用に及ぼす影響を確認するステップ【００７２】
（Ｎ−３）（Ａ），（Ｂ）間の相互作用に影響を及ぼす被験物を選択するステップ【００７３】
（Ｎ−２）において、被験物が、（Ａ），（Ｂ）間の相互作用に及ぼす影響を確認するには、（Ａ），（Ｂ）間の「相互作用」の有無を確認する事が必要となる。この「相互作用」の有無の確認は、例えば、（Ａ），（Ｂ）間（タンパク質間）の「結合」を確認することによって行うことができる。
タンパク質間の結合の確認は、公知の方法によって実施することができる。【００７４】
公知の方法としては、例えば、共免疫沈降法，ウエスタンブロット法，ビーズを用いたプルダウン法，質量分析計を用いた方法，蛍光または発光標識を用いたイメージング方法，又は酵母ツーハイブリッド法等が挙げられ、これらを、それぞれ単独で，あるいは適宜組み合わせて用いることもできる。【００７５】
（Ａ）の「BAZFの330-465位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド」とは、BAZFの330-465位に相当するアミノ酸配列の前後に、更に別のアミノ酸が付加されているポリペプチドでも良いことを意味している。【００７６】
また、（Ｂ）の「CBF-1の１-178位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド」とは、同様に、CBF-1の１-178位に相当するアミノ酸配列の前後に、更に別のアミノ酸が付加されているポリペプチドでも良いことを意味している。【００７７】
尚、（Ａ）として、「BAZFの330-465位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド」を，（Ｂ）として、「CBF-1の１-178位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド」を用いることができるのは、上述した通り、BAZF及びCBF-1との相互作用に関わるアミノ酸部位が、それぞれ、BAZFの330-465位に相当するポリペプチド内及びCBF-1の１-178位に相当するポリペプチド内にあることが本発明者等によって、確認されたからである。【００７８】
但し、生体内と同じ血管新生制御機構を、より正確に再現し、より有効な血管新生制御剤をスクリーニングするには、全長（野生型）のBAZF及びCBF-1，もしくはこれに近いポリペプチドを用いることが好ましい。【００７９】
本発明で言うスクリーニングには、複数候補の中から、目的の血管新生制御剤を選択するための、いわゆる一次スクリーニングの他、公知の血管新生制御剤の、血管新生制御効果を確認するための、二次スクリーニング（再評価又は確認試験）も、含まれる。【００８０】
［血管新生制御剤のスクリーニング用キット］
本発明の血管新生制御剤のスクリーニング用キットは、下記（Ｘ）又は（Ｙ）を含むことを特徴とするものである。【００８１】
（Ｘ）BAZF遺伝子
（Ｙ）下記の（ｙ−１）及び（ｙ−２）【００８２】
（ｙ−１）BAZF，BAZFの330-465位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド，及びこれらのいずれかをコードする遺伝子からなる群から選択される一種以上
（ｙ−２）CBF-1，CBF-1の１-178位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド，及びこれらのいずれかをコードする遺伝子からなる群から選択される一種以上【００８３】
尚、（Ｘ）を含むキットは、（Ｍ−１）乃至（Ｍ−３）のステップを含む上記スクリーニング方法において用いることが出来る。【００８４】
また、（Ｙ）を含むキットは、（Ｎ−１）乃至（Ｎ−３）のステップを含む上記スクリーニング方法において用いることが出来る。【００８５】
但し、本発明のスクリーニング方法の項でも記載した通り、生体内と同じ血管新生制御機構を、より正確に再現し、より有効な血管新生制御剤をスクリーニングするためには、（ｙ−１）としては、全長（野生型）のBAZFもしくはこれに近いポリペプチド，あるいはこれらのいずれかをコードする遺伝子を、（ｙ−２）としては、CBF-1，もしくはこれに近いポリペプチド，あるいはこれらのいずれかをコードする遺伝子を、それぞれキットに用いることが好ましい。【００８６】
本発明のキットには、上記の遺伝子やタンパク質の他、遺伝子の発現に必要な各種の細胞や培地，各種のアミノ酸等の他、タンパク質相互作用の確認のための方法（共免疫沈降法，ウエスタンブロット法，ビーズを用いたプルダウン法，質量分析計を用いた方法，蛍光または発光標識を用いたイメージング方法，又は酵母ツーハイブリッド法等）において、一般的に必要とされる試薬等を、必要に応じて、適宜含ませることが好ましい。【００８７】
尚、上記のスクリーニング方法やスクリーニング用キットにおいても、遺伝子とは、一本鎖又は二本鎖のDNA，cDNA，RNA，これらのハイブリッド体，キメラ体等を含むものである。
【実施例】
【００８８】
本発明の実施例を挙げるに先だって、本発明者等が確認した、VEGF刺激とNotch1シグナルの関係や、それとBAZFとの関わり等に関する試験結果を示す。【００８９】
［試験例１：VEGFによる、Notch1シグナル伝達系の阻害］
2.6 x 104（cells／cm2）のHUVECに、VEGF-A（50 ng/ml）を添加し、37℃，CO2 5％(牛胎児血清 10％，basic FGF 10 ng/ml, Heparin 18mU/ml，Hydrocortisone 1μg/ml，L-Glutamine 10 mM，Amphotericin B 0.25μg/ml，ペニシリン60μg/ml，ストレプトマイシン 100μg/mlを含むMCDB131培地（インビトロジェン  コーポレーション，カリフォルニア州，米国）))という条件下、培養を行うことよって、Notch1 シグナルが、その発現を促進するHEY2遺伝子，HES1遺伝子の発現の経時的変化について検討した。
尚、VEGF-Aとは、A, B, C, D, Eと５つあるVEGFアイソフォームの一つである。【００９０】
尚、遺伝子発現量は、定量-PCR法を用いて測定した。【００９１】
その結果、添加後２−６時間といった比較的早い時間においてHEY2, HES1遺伝子の発現阻害が認められた（図１）。このことはVEGF 刺激が、一時的にNotch1 シグナルを遮断しうることを示している。【００９２】
尚、同じくNotch シグナルの標的遺伝子であるHEY1遺伝子については、HEY2, HES1遺伝子ほど明確には、VEGFによる発現抑制は見られなかったが、VEGF未添加に比べると、増加が抑制される傾向にあった（図示せず）。【００９３】
［試験例２：VEGF刺激によるBAZFの発現誘導］
2.6 x 104（cells／cm2）のHUVECに、VEGF-A（50 ng/ml）を添加し、37℃，CO2 5％ (牛胎児血清 10％、basic FGF 10 ng/ml, Heparin 18mU/ml，Hydrocortisone 1μg/ml，L-Glutamine 10 mM，Amphotericin B 0.25μg/ml，ペニシリン60μg/ml, ストレプトマイシン 100μg/mlを含むMCDB131培地)という条件下、培養を行うことよって、経時的なBAZFの発現量を調べた。【００９４】
BAZF発現量の測定は、後述する実施例４の「BAZFに対する抗体」を用いた、ウエスタンブロット法によって行った。【００９５】
その結果、VEGF 添加後２時間くらいから、BAZFの発現量が上昇し、４時間をピークとする発現パターンが示された（図２）。【００９６】
尚、コントロールとして、βアクチンを用いた。【００９７】
［試験例３：BAZFによる血管の分岐数の上昇−１］
後述する実施例２の血管新生制御剤（促進剤）を用いてHUVEC に遺伝子導入を行った。【００９８】
具体的には、2.6 x 104（cells／cm2）のHUVECに、後述する実施例２の血管新生制御剤（促進剤）（MOI 0〜1000）を添加し、37℃，CO2 5％ (牛胎児血清 10％，basic FGF 10 ng/ml，Heparin 18mU/ml，Hydrocortisone 1μg/ml，L-Glutamine 10 mM，Amphotericin B 0.25μg/ml，ペニシリン60μg/ml，ストレプトマイシン 100μg/mlを含むMCDB131培地)という条件下、培養を行った。【００９９】
BAZF発現量の測定は、後述する実施例４の「BAZFに対する抗体」を用いた、ウエスタンブロット法によって行った。【０１００】
その結果、BAZFの過剰発現によって、外部からVEGF を添加していない状態でも、血管内皮細胞の突起形成伸長が認められた（図３，４はBAZF の発現量と突起数との関係を示す）。【０１０１】
尚、図３中のMOI（multiplicity of infection）とは、ベクター感染価（１細胞に感染が成立して１ヒット）を示す。
また、図４中の「ＷＢ：Anti-BAZF」とは、抗BAZF抗体を用いた、ウエスタンブロット法を意味する。【０１０２】
このことは、本発明の血管新生制御剤（BAZF遺伝子及びBAZF）が、血管新生促進剤として有用であることを示すものである。【０１０３】
［試験例４：BAZFによる血管の分岐数の上昇−２］
実施例３及び比較例２の血管新生制御剤（促進剤）を、それぞれ、各種濃度（0，0.1，1，10ng/ml）のVEGF-Aを添加したHUVECに導入した。【０１０４】
具体的には、2.6 x 104（cells／cm2）のHUVECに、実施例３（BAZF-pIRES2-AcGFP-1）又は比較例２（pIRES2-AcGFP-1）の血管新生制御剤（抑制剤）（30nM）を、各々添加し、37℃，CO2 5％ (牛胎児血清 10％，basic FGF 10 ng/ml，Heparin 18mU/ml，Hydrocortisone 1μg/ml，L-Glutamine 10 mM，Amphotericin B 0.25μg/ml，ペニシリン60μg/ml，ストレプトマイシン 100μg/mlを含むMCDB131培地)という条件下、培養を行った。【０１０５】
導入は、遺伝子導入試薬を用いた、公知のリポフェクション法により行った。【０１０６】
その結果、比較例２の血管新生制御剤（促進剤）を導入したHUVECと違って、実施例３の血管新生制御剤（促進剤）を導入し、BAZF を過剰発現したHUVEC では、通常なら反応しない低濃度VEGFにおいても、HUVEC間のネットワーク形成を認めた（図５）。【０１０７】
このこともまた、本発明の血管新生制御剤（BAZF遺伝子及びBAZF）が、血管新生促進剤として有用であることを示すものである。【０１０８】
［試験例５：BAZF発現阻害による血管分岐数の上昇抑制］
後述する実施例１，比較例１，対照例１の血管新生制御剤（阻害剤）をHUVEC に導入し、血管内皮ネットワーク形成への影響について検討した。【０１０９】
具体的には、2.6x104（cells／cm2）のHUVECに実施例１，比較例１，対照例１の血管新生制御剤（阻害剤）（各50 ng/ml）を添加し、37℃，CO2 5％ (牛胎児血清 10％，basic FGF 10 ng/ml，Heparin 18mU/ml，Hydrocortisone 1μg/ml，L-Glutamine 10 mM，Amphotericin B 0.25μg/ml，ペニシリン60μg/ml, ストレプトマイシン 100μg/mlを含むMCDB131培地)という条件下、培養を行った。【０１１０】
その結果、通常VEGF 刺激によってマトリゲル（登録商標，ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー，ニュージャージー州，米国）（コラーゲンを含むマトリックス）上でネットワーク形成を示す血管内皮は、実施例１によって、完全に阻害されることを確認した（図６，７）。【０１１１】
つまり、このことは、本発明の血管新生制御剤（BAZFのsiRNA遺伝子）が、BAZF の発現阻害によって、血管新生阻害剤として作用することを示すものである。【０１１２】
更にその変化を経時的に観察したところ、比較例１を導入したコントロール細胞では、細胞同士が集積した後、突起を形成して近くの細胞とネットワークを形成した（図８上段）。
これに対して、実施例１を導入したBAZF 発現阻害細胞では、細胞集積後の突起形成が認められないままでいた（図８下段）。【０１１３】
尚、図８上下段の、▲印は、細胞-細胞接着（コンタクト）部分を示す。【０１１４】
このことは、血管新生開始時に突起を伸ばすTip cellの抑制を示唆するものであり、本発明の血管新生制御剤は、Tip cell制御剤としても用いることができることを示している。【０１１５】
［試験例６：BAZFとCBF-1 との分子間相互作用の確認］
2.6x104（cells／cm2）のHUVECに、FLAGタグ（登録商標，シグマ−アルドリッチ・コーポレイション，セントルイス州，米国）のついたBAZF （FLAG-BAZF）を発現させるための、「pME18s-FLAG-BAZFプラスミドベクター」2.0μgを導入後、抗FLAG 抗体（Monoclonal ANTI-FLAGR M2 antibody，シグマ−アルドリッチ・コーポレイション，セントルイス州，米国）で免疫沈降を行った。【０１１６】
pME18s-FLAG-BAZFプラスミドベクターは、図１６で表される。【０１１７】
次に、細胞を磨り潰し、沈降してきたタンパク質を、後述する実施例４の抗BAZF抗体，あるいは抗CBF-1抗体（SUH/CBF1/RBP-Jκ Rabbit polyclonal antibody，製品コードab25949，Abcam社，ケンブリッジ，英国）を用いてウエスタンブロット法で分析した。結果を、図９に示す。【０１１８】
図９中のIPとは、免疫沈降を意味する。
図９中のWBとは、ウエスタンブロット法を意味する。
図９中のanti-FLAGとは、抗FLAG抗体を意味する。
図９中のanti-BAZFとは、抗BAZF抗体を意味する。
図９中のanti-CBF-1とは、抗CBF-1抗体を意味する。【０１１９】
図９では、抗BAZF抗体あるいは抗CBF-1抗体による検出バンドが、それぞれBAZFあるいはCBF-1に相当するバンドの位置に現れていた。このことは、BAZFとCBF-1とが、共沈している，つまり相互作用（結合）していることを示している。【０１２０】
［試験例７：HUVEC におけるBAZF 及びCBF-1 の局在性の確認］
2.6x104（cells／cm2）のHUVECに、FLAGタグ（登録商標，シグマ−アルドリッチ・コーポレイション，セントルイス州，米国）のついたBAZF （FLAG-BAZF）を発現させるための、「pME18s-FLAG-BAZFプラスミドベクター」（図１６）2.0μｇを導入後、HUVEC におけるBAZF 及びCBF-1 の存在位置を、細胞免疫染色法にて検討したところ、細胞核内で点状に共局在することが確認された（図１０）。【０１２１】
具体的には、抗FLAG マウス抗体（Monoclonal ANTI-FLAGR M2 antibody，シグマ−アルドリッチ・コーポレイション，セントルイス州，米国）を、FLAG-BAZFに反応させ、次いで、FITC標識した二次抗体（FITC-conjugated Affinipure 抗マウスIgG (H+L)ロバ抗体 (catalog NO. 711-095-151，ジャクソン・イムノリサーチ研究所，ペンシルバニア州，米国,)）で、BAZFの存在位置を確認した。【０１２２】
また、抗CBF-1ウサギ抗体（SUH/CBF1/RBP-Jκ ウサギポリクローナル抗体，製品コードab25949，Abcam社，ケンブリッジ，英国）及びCy3標識した二次抗体(Cy3-conjugated Affinipure (F(ab’)2 Fragment 抗ウサギIgG (H+L)ロバ抗体 (catalog NO. 711-166-152，ジャクソン・イムノリサーチ研究所，ペンシルバニア州，米国)))を用いて、CBF-1の存在位置を確認した。【０１２３】
FITC標識した二次抗体と、Cy3標識した二次抗体の検出は、それぞれ、次の波長条件で行った。
FITC標識した二次抗体（FLAG-BAZFの検出）：488 nm(アルゴンレーザー)/505-530 nm（BPフィルター）
Cy3標識した二次抗体（CBF-1の検出）：543nm(HeNeレーザー)/560-615 nm 【０１２４】
尚、図１０中の、最右図の「Hoechst33342」とは、Hoechst33342（細胞膜浸透性のDNA結合色素（Beckman Coulter，東京，日本））を用いた試験結果であり、色素によって着色された染色体の局在する部分が、細胞核であることを示す図である。【０１２５】
Hoechstについては、以下の条件で検出した。
405 nm(レーザーダイオード)/420-480 nm【０１２６】
その結果、BAZFがCBF-1と、分子内で、共局在していることが確認された（図１０）。【０１２７】
［試験例８：BAZFとCBF-1の結合部位の確認］
BAZFとCBF-1の、一部アミノ酸配列を除いた各種の改良フラグメントを用い（図１１，図１４）、BAZFとCBF-1の結合領域を、ＧＳＴプルダウン法によって検討した。【０１２８】
（BAZFにおけるCBF-1の結合領域の検討）
具体的には、GST（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）とCBF-1の融合タンパク質を大腸菌中で発現させ、この大腸菌を磨り潰したものをグルタチオンビーズ（Glutathione-Sepharose 4B beads（GE Healthcare，英国））と混合し、洗浄する。
そして、公知のペプチドタグであるV5タグ（GKPIPNPLLGLDST（配列番号５））で標識した各種のBAZFフラグメント（図１１）と混合後、洗浄し、電気泳動を行い、下記の抗体及び基質等を用いて検出した結果を、図１２（右図）及び図１３（右図）に示す。【０１２９】
［一次抗体］
抗V5マウスモノクローナル抗体（カタログ番号R960-25，インビトロジェン  コーポレーション，カリフォルニア州，米国）
［二次抗体］
抗マウスIgGウサギ抗体−HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ) −コンジュゲート (カタログ番号 W402B, プロメガ, Madison, WI, USA)
［HRP基質］
ECL Plus Western Blotting Detection Reagents（製品コードRPN2132, GE ヘルスケアバイオサイエンス(株)，英国）【０１３０】
尚、比較のため、細胞中で、各フラグメント遺伝子を発現させた後、細胞を磨り潰して、その溶解物中のタンパク質を検出する、Cell lysates分析も行った（図１２左図，図１３左図）。【０１３１】
図１２によって、CBF-1は、BAZFの、BTB領域では無く、Zinc フィンガー領域に結合することが分かった。
また、図１３によって、Zinc フィンガー領域の中でも、特にBAZFの330-465位に相当するアミノ酸配列を含む領域に結合することが分かった。【０１３２】
（CBF-1におけるBAZFの結合領域の検討）
上述のGSTとCBF-1の融合タンパク質に変えて、GSTとBAZFとの融合タンパク質を大腸菌中で発現させ、この大腸菌を磨り潰したものをグルタチオンビーズ（Glutathione-Sepharose 4B beads（GE Healthcare，英国））と混合し、洗浄する。
そして、V5タグで標識した各種のCBF-1フラグメント（図１４）を用いて、上記と同様の実験を行い、その結果を図１５に示した。【０１３３】
尚、ここでも、比較のため、Cell lysates分析を行った（図１５左図）。【０１３４】
図１５によって、BAZFは、CBF-1の、リプレッサー機能を有するリプレッションドメインでは無く、アミノ末端側の178アミノ酸の領域で結合することが明らかとなった（図１５右図）。【０１３５】
尚、図１３，１５中のanit-V5とは、上記の抗V5抗体を意味する。【０１３６】
図１１，１２中のBTBとは、ジンクフィンガータンパク質（BAZF）中の、BTB領域を意味する。【０１３７】
図１１〜１３中のZnFとは、ジンク(Zn)フィンガータンパク質（BAZF）中の、Znフィンガーモチーフ領域を意味する。【０１３８】
図１１，１３中のΔCTとは、C末端から15個のアミノ酸を欠失させたフラグメントを意味する。【０１３９】
図１５中のFullとは、V5-CBF-1（標識した全長CBF-1）を意味する。【０１４０】
［実施例１：血管新生制御剤（阻害剤）］
実施例１として、配列番号１（sense：5' aguuuaucuguaaauauaaTT 3'），及び配列番号２（antisense: 5' uuauauuuacagauaaacuGA 3'）（いずれも小文字はRNA，大文字はDNAを表す。）からなる二本鎖の「BAZF遺伝子に対するsiRNA遺伝子」を含有する、血管新生制御剤（阻害剤）を製造した。
具体的には、以下の様に行った。【０１４１】
siRNAオリゴ専用のトランスフェクション試薬CodeBreaker（登録商標，プロメガ社，ウィスコンシン州，米国）4μlと、Opti MEM (登録商標，インビトロジェン  コーポレーション，カリフォルニア州，米国) 625μlを混合し、15分間室温でインキュベートした。これに、最終濃度が30 nM になるように配列番号１及び配列番号２からなる二本鎖siRNA遺伝子を添加し、ピペッティングで混合し、15分間室温でインキュベートすることによって、siRNA-CodeBreaker complexからなる、実施例１の血管新生制御剤（阻害剤）を製造した。【０１４２】
［比較例１］
また、配列番号１及び配列番号２に変えて、配列番号３（sense: 5' uucuccgaacgugucacguTT 3'）及び配列番号４（antisense: 5' acgugacacguucggagaaTT 3'）（いずれも小文字はRNA，大文字はDNAを表す。）で示される二本鎖の「コントロールsiRNA遺伝子」（商品名：Negative control siRNA 1027310，キアゲン社，デュッセルドルフ，ドイツ）を用いて、比較例１の血管新生制御剤（阻害剤）を製造した。【０１４３】
［対照例１］
尚、対照例１（Mock）として、CodeBreaker（登録商標，プロメガ社，ウィスコンシン州，米国）4μlと、Opti MEM (インビトロジェン  コーポレーション，カリフォルニア州，米国) 625μlを混合し、試薬のみ（CodeBreaker：登録商標，プロメガ社，ウィスコンシン州，米国）を含む血管新生制御剤（阻害剤）を製造し、上述の試験例に用いた。【０１４４】
［実施例２：血管新生制御剤（促進剤）］
BAZF のcDNA を組み込んだアデノウイルスベクター（AdBAZF）を作製し、実施例２の血管新生制御剤（促進剤）とした。【０１４５】
具体的には、pAxCAwt（アデノウイスル発現ベクター，タカラバイオ株式会社，日本）に、BAZF遺伝子を組み込んだpAxCAwt-BAZFを作製し（図１７）、これをHEK293細胞（ヒト胎児腎細胞由来細胞株の、組換アデノウイスル作製用宿主。）中で発現させることによって、AdBAZFを作製した。【０１４６】
［実施例３：血管新生制御剤（促進剤）］
CMVプロモーター等を含むプラスミドベクターである、pIRES2-AcGFP-1（タカラバイオ株式会社製，日本）に、BAZF のcDNA を組み込んだプラスミドベクター（BAZF-pIRES2-AcGFP-1）を作製し（図１８）、実施例３の血管新生制御剤（促進剤）とした。【０１４７】
［比較例２］
また、BAZFのcDNAを導入しない、pIRES2-AcGFP-1プラスミドベクターを、比較例２とした。【０１４８】
［実施例４：BAZF抗体］
ニュージーランドホワイトラビット（雄）に、ヒト由来BAZFのBTBドメインの一部に相当する配列番号６（LSLPGGPEARGFAPLL ：BAZFの78〜93位）で表されるペプチドフラグメント１００μｇを、１週間に１回の割合で５週間免疫し、最後の免疫から１週間後に採血し血清を分離し、BAZFを結合させたアフィニティークロマトグラフィーで精製することによって、BAZFに対するポリクローナル抗体を得た。
この抗体を、上記試験例の、BAZF検出用一次抗体として用いた。
尚、この抗体は、本発明の血管新生制御（阻害）剤としても使用可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
本発明は、血管新生制御剤，及びそのスクリーニング方法，並びにスクリーニング用キットに関するものであり、更に詳しくは、BAZFが関与する血管新生を、阻害又は促進する薬剤及びそのスクリーニング方法，スクリーニング用キットに関するものである。
【配列表フリーテキスト】
【０１５０】
（小文字はRNA，大文字は、DNAを表す。）
配列番号１：BAZF siRNA sense：5' aguuuaucuguaaauauaaTT 3' 
配列番号２：BAZF siRNA antisense: 5' uuauauuuacagauaaacuGA 3'
配列番号３：Control siRNA sense: 5'uucuccgaac gugucacguT T3'
配列番号４：Control siRNA antisense: 5'acgugacacg uucggagaaT T3'
配列番号５：V5 Peptide Tag：GKPIPNPLLGLDST
配列番号６：a part of BTB domain of human BAZF：LSLPGGPEARGFAPLL
【図１】
2010018764.tif 000002
【図２】
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【図７】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【配列表】
2010018764000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月14日(2010.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ＩＩ）を、制御する物質を含むことを特徴とする、血管新生制御剤。
（ＩＩ）ＢＡＺＦによるＣＢＦ−１の阻害
【請求項２】
（ＩＩ）を制御する物質が、下記（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）の少なくとも一種であることを特徴とする、請求項１記載の、血管新生制御剤。
（ｉｉｉ）ＢＡＺＦの３３０−４６５位に相当するアミノ酸配列部分を抗原決定基とする抗体
（ｉｖ）ＣＢＦ−１の１−１７８位に相当するアミノ酸配列部分を抗原決定基とする抗体
【請求項３】
下記（ｉ）を含むことを特徴とする、血管新生制御剤。
（ｉ）配列番号１及び２の二本鎖からなる遺伝子
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
下記（Ｎ−１）乃至（Ｎ−３）のステップを含むことを特徴とする、血管新生制御剤のスクリーニング方法（但し、（Ａ）がＢＡＺＦであり、（Ｂ）がＣＢＦ−１である組み合わせを除く。）。
（Ｎ−１）下記（Ａ）及び（Ｂ）と、被験物を共存させるステップ
（Ａ）ＢＡＺＦ及び／又は、ＢＡＺＦの３３０−４６５位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（Ｂ）ＣＢＦ−１及び／又は、ＣＢＦ−１の１−１７８位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（Ｎ−２）被験物が、（Ａ），（Ｂ）間の相互作用に及ぼす影響を確認するステップ
（Ｎ−３）（Ａ），（Ｂ）間の相互作用に影響を及ぼす被験物を選択するステップ
【請求項６】
下記（Ｙ）を含むことを特徴とする、血管新生制御剤のスクリーニング用キット。
（Ｙ）下記の（ｙ−１）及び（ｙ−２）
（但し、（ｙ−１）がＢＡＺＦ又はＢＡＺＦをコードする遺伝子であり、（ｙ−２）がＣＢＦ−１又はＣＢＦ−１をコードする遺伝子である組み合わせを除く。）
（ｙ−１）ＢＡＺＦ，ＢＡＺＦの３３０−４６５位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド，及びこれらのいずれかをコードする遺伝子からなる群から選択される一種以上
（ｙ−２）ＣＢＦ−１，ＣＢＦ−１の１−１７８位に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド，及びこれらのいずれかをコードする遺伝子からなる群から選択される一種以上
【国際調査報告】
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