(57)【要約】  植物由来の成分を含有し、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス及び免疫不全ウイルスに対する優れた感染性抑制作用及び増殖阻害作用を有する抗インフルエンザウイルス剤、抗ＲＳウイルス剤及び抗免疫不全ウイルス剤の提供。カバノキ科植物及び／又はセンダン科植物の抽出物あるいはこれらの葉の乾燥粉末を含有することを特徴とする抗インフルエンザウイルス剤、抗ＲＳウイルス剤及び抗免疫不全ウイルス剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カバノキ科植物及び／又はセンダン科植物の抽出物を含有することを特徴とする抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項２】
カバノキ科植物の抽出物がハンノキ植物葉あるいは幹の水性抽出物である、請求項１記載の抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項３】
センダン科植物の抽出物がセンダン植物葉あるいは幹の水性抽出物である、請求項１又は２記載の抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項４】
カバノキ科植物及び／又はセンダン科植物の乾燥粉末を含有することを特徴とする抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項５】
カバノキ科植物の乾燥粉末がハンノキ植物葉あるいは幹の乾燥粉末である、請求項４記載の抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項６】
センダン科植物の乾燥粉末がセンダン植物葉あるいは幹の乾燥粉末である、請求項４又は５記載の抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項７】
インフルエンザウイルスが、Ａ／スペイン型インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４：Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ホンコン型インフルエンザウイルス（Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１／１００：Ｈ３Ｎ２）、トリインフルエンザウイルス（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ−Ｑ／Ｆ１１９−３／９７：Ｈ５Ｎ３）及びＢ型インフルエンザウイルス（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８）からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項記載の抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項８】
インフルエンザウイルスが、ブタインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１亜型、パラインフルエンザウイルス３型及びパラインフルエンザウイルス１型からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項記載の抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項９】
カバノキ科植物及び／又はセンダン科植物の抽出物を含有することを特徴とする抗ＲＳウイルス剤。
【請求項１０】
カバノキ科植物及び／又はセンダン科植物の乾燥粉末を含有することを特徴とする抗ＲＳウイルス剤を提供する。
【請求項１１】
カバノキ科植物及び／又はセンダン科植物の抽出物を含有することを特徴とする抗免疫不全ウイルス剤。
【請求項１２】
カバノキ科植物及び／又はセンダン科植物の乾燥粉末を含有することを特徴とする抗免疫不全ウイルス剤を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスの消毒薬又は予防若しくは治療薬として好適な抗インフルエンザウイルス剤、特に、植物由来の成分を含有し、インフルエンザウイルスに対する優れた感染性抑制作用及び増殖阻害作用を有する抗インフルエンザウイルス剤に関するものである。また、本発明は、ＲＳウイルスに対する消毒薬又は予防若しくは治療薬として好適な抗ＲＳウイルス剤、特に、植物由来の成分を含有し、ＲＳウイルスに対する優れた感染性抑制作用及び増殖阻害作用を有する抗ＲＳウイルス剤に関する。また、本発明は、免疫不全ウイルスに対する消毒薬又は予防若しくは治療薬として好適な抗免疫不全ウイルス剤、特に、植物由来の成分を含有し、免疫不全ウイルスに対する優れた感染性抑制作用及び増殖阻害作用を有する抗免疫不全ウイルス剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
今世紀においても依然として流行している、最大のウイルス性伝染病であるインフルエンザウイルス感染症に対する基本的な対策は、感染が流行する前にワクチンを接種して予防するのが中心的な柱であり、それに次ぐ戦略はタミフル（登録商標）やリレンザ（登録商標）で代表される治療薬の利用である。しかしながら、流行するウイルスは激しく変異するので、ワクチンの効果を大きく揺るがすことが多い。また、上記の治療薬も、臨床においては、患者がインフルエンザに感染して一定時間経過し、症状が十分に現われてから使用されるので、満足のいくものではない。さらに、これらの治療薬は比較的高価であるため、世界的に問題となっているトリインフルエンザウイルスに対する消毒薬等として用いることは、経済的に見ても現実的ではない。インフルエンザウイルス感染症に対する上記２つの対策を埋めるインフルエンザ予防・治療薬あるいは消毒薬は、今のところ世界的に発見されていない。もし、有効な予防・治療薬あるいは消毒薬があり、それを世界的に利用する方策が確立されれば、感染者人口は国の内外を問わず3分の1程度に減少させることができ、インフルエンザ感染に伴う死亡人口も大幅に減少することが出来る。【０００３】
ＲＳウイルス（respiratory syncytial virus: RSV）は、乳児急性気道感染症（細気管支炎、肺炎等）の主な原因ウイルスとして知られている。ＲＳウイルスは１本のマイナス（−）鎖ＲＮＡを遺伝子として有し、パラミクソウイルス科に属するウイルスである。ＲＳウイルスは物理的接触や飛沫感染により気道に感染し、数日間の潜伏期間の後、発熱、鼻水、咳などで発症し、通常は１−２週間で軽快する。しかし、２歳以下の乳幼児や高齢者では、しばしば上気道炎から下気道炎に進展して細気管支炎、肺炎を発症し、特に６ヶ月以下の乳児では入院加療を必要とするほどに重症化し得る。
ＲＳウイルス感染症が重症化した場合の有効な治療法は確立されておらず、リバビリンのエアロゾルを噴霧投与する等の治療法が試みられているが、有意に効果を示すものであるとの結論は得られていない。また、リバビリンの抗ウイルス作用の作用機序は明らかではなく、貧血、ヘモグロビン減少等の極めて重大な副作用の問題が存在する。【０００４】
一方、我々が直面している他の難病としてＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）が挙げられる。ＡＩＤＳは、レトロウイルスに属するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）がヒトの免疫細胞に感染し免疫細胞を破壊することにより発症する。
ＨＩＶ感染者は日本国内及び世界中で増加し続けており、ＡＩＤＳ発症患者数も同様に増加し続けている。しかし、ＡＩＤＳの予防／治療は化学合成的に得られた薬剤等の投与による限定的なものであり、また、原因ウイルスが極端に変異しやすいことによりワクチン開発や治療剤の開発は極めて困難である。従って、抗免疫不全ウイルス剤によるＡＩＤＳの効果的な治療および予防が要求されている。
抗ＨＩＶ剤として実用化されている薬剤には、ＡＺＴ（アジトチミジン）等の核酸系逆転写酵素阻害剤等があるが、これらの薬剤は治療に際して強い副作用を示し、例えば、患者の造血機能を阻害し、多くの患者に極度の貧血作用を発症させることが知られている。【０００５】
このような状況において、本発明は、これらの問題を解決する道を天然資源の活用に求めたものである。
特許文献１及び２は、カバノキ科のハンノキ属に属する植物の抽出物が、皮膚老化防止効果を有することを開示するが、これらが抗インフルエンザウイルス作用、抗ＲＳウイルス作用及び抗免疫不全ウイルス作用を有することは未だ知られていない。【０００６】
【特許文献１】特許第3615001号公報
【特許文献２】特許第2988803号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、植物成分から単離された化合物を有効成分とし、強力な抗インフルエンザウイルス作用を有する、比較的安価で有用な抗インフルエンザウイルス剤を提供することを目的とする。また、本発明は、植物成分から単離された化合物を有効成分とし、強力な抗ＲＳウイルス作用を有する、比較的安価で有用な抗ＲＳウイルス剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、植物成分から単離された化合物を有効成分とし、強力な抗免疫不全ウイルス作用を有する、比較的安価で有用な抗免疫不全ウイルス剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、本発明者らが植物成分における活性を研究している過程で得た、２種の植物成分、すなわち、カバノキ科植物及び／又はセンダン科植物の抽出物、あるいは、これらの植物の乾燥粉末を用いることにより上記課題を解決できるとの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、カバノキ科植物及び／又はセンダン科植物の抽出物を含有することを特徴とする抗インフルエンザウイルス剤を提供する。また、本発明は、カバノキ科植物及び／又はセンダン科植物の抽出物を含有することを特徴とする抗ＲＳウイルス剤を提供する。さらに、本発明は、カバノキ科植物及び／又はセンダン科植物の抽出物を含有することを特徴とする抗免疫不全ウイルス剤を提供する。
本発明はまた、カバノキ科植物及び／又はセンダン科植物の乾燥粉末を含有することを特徴とする抗インフルエンザウイルス剤を提供する。
本発明はまた、カバノキ科植物及び／又はセンダン科植物の乾燥粉末を含有することを特徴とする抗ＲＳウイルス剤を提供する。
本発明はまた、カバノキ科植物及び／又はセンダン科植物の乾燥粉末を含有することを特徴とする抗免疫不全ウイルス剤を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、強力な抗インフルエンザウイルス作用を有し、比較的安価で有用な抗インフルエンザウイルス剤を提供することができる。また、本発明によれば、強力な抗ＲＳウイルス作用を有し、比較的安価で有用な抗ＲＳウイルス剤を提供することができる。また、本発明によれば、強力な抗免疫不全ウイルス作用を有し、比較的安価で有用な抗免疫不全ウイルス剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明で用いるカバノキ科植物は、カバノキ科（Betulaceae）に属する植物であって、主に温帯に分布する。これらのうち、特に、ハンノキ（Alnus）植物を用いるのが好ましい。本発明では、カバノキ科植物の葉又は幹を用いることがより好ましい。また、本発明で用いるセンダン科植物は、センダン科（Meliaceae）に属する植物であって、主として熱帯から亜熱帯、温帯にかけて分布する。これらのうち、特に、センダン（Melia azedarach L.）植物を用いるのが好ましい。本発明では、センダン科植物の葉又は幹を用いることがより好ましい。抗インフルエンザウイルス剤、抗ＲＳウイルス剤又は抗免疫不全ウイルス剤の有効成分として用いる際には、カバノキ科植物とセンダン科植物は、各々単独で又は組み合わせて用いることができる。【００１１】
本発明において、カバノキ植物及びセンダン科植物を抗インフルエンザ剤、抗ＲＳウイルス剤又は抗免疫不全ウイルス剤の有効成分として使用する場合には、これらを乾燥した後、微細に粉砕して粉末、顆粒などの固形状にした乾燥粉末、顆粒粉末等として用いる又は幹を鋸で輪切りにした際に生じるおがくずを用いるか、あるいは直接に水で抽出し水性抽出物として用いることができる。抽出に使用する水の量は任意とすることができるが、５分の１〜１０倍量で用いるのがよく、特に約２倍量で用いるのが好ましい。又、抽出は、特に、ミキサーなどで攪拌しながら粉砕して行うのがよい。ミキサーでの撹拌時間は、当業者が適宜定めることができるが、例えば、５分間であってもよい。撹拌後、この粉砕液を遠心分離して上清を回収して抽出液を得ることができる。遠心分離の際の回転数及び時間は、当業者が適宜定めることができるが、例えば、４,５００rpmで２０分間であってもよい。得られた上清は、そのまま用いてもよいが、凍結保存し、使用前に濾過滅菌フィルターで濾過滅菌してもよい。
カバノキ植物及びセンダン科植物を乾燥粉末として用いる際には、乾燥させた後、ミルミキサーにかけて粉砕するのが好ましい。乾燥の温度及び時間は、当業者が適宜定めることができるが、例えば、６５℃で一晩乾燥させてもよい。粉砕された乾燥粉末は、概して約０．２ｍｍ〜約２ｍｍ程度の大きさである。粉砕後、使用するまで、例えばシリカゲルの入ったガラス瓶等の中で、乾燥状態を保つようにして保存することができる。【００１２】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、ヒトインフルエンザウイルス及びトリインフルエンザウイルスを初めとするあらゆる型のインフルエンザウイルスに対して効果を示すが、特に、Ａ／スペイン型インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４：Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ホンコン型インフルエンザウイルス（Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１／１００：Ｈ３Ｎ２）、トリインフルエンザウイルス（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ−Ｑ／Ｆ１１９−３／９７：Ｈ５Ｎ３）及びＢ型インフルエンザウイルス（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８）からなる群より選択されるインフルエンザウイルスに対して、極めて優れた活性を示す。また、本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、ブタインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１亜型、パラインフルエンザウイルス３型及びパラインフルエンザウイルス１型からなる群より選択されるインフルエンザウイルスに対しても、極めて優れた活性を示す。【００１３】
本発明の抗免疫不全ウイルス剤は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）を初めとするあらゆる型の免疫不全ウイルスに対して効果を示す。
免疫不全ウイルスの属するレトロウイルス科（retrovirus）に配されている属は７つ存在する。ネコ免疫不全ウイルスＦＩＶは、ヒトＨＩＶ−１型、ヒトＨＩＶ−２型、サル免疫不全ウイルスＳＩＶ、ウマ伝染性ウイルス等の属するレンチウイルスの１つとして分類されている。レトロウイルス科ウイルスの逆転写酵素のアミノ酸配列の進化学的分析によって、ＦＩＶはヒトＨＩＶ−１型及びヒトＨＩＶ−２型と遺伝学的に類似することが知られている。また、ウイルスを構成する重要なgag、pol、vit、rev及びenv等のタンパク構成素因も互いに類似し、抗ヒト免疫不全ウイルス剤のスクリーニングにＦＩＶをモデルウイルスして利用できることが知られている（Fields Virology, Vol.2. pp.2095-2102 (2001), Lippincott Williams & wilkins, Ronald C. Desrosiers）。【００１４】
尚、本発明の抗インフルエンザウイルス剤、抗ＲＳウイルス剤又は抗免疫不全ウイルス剤は、これらに加えて、医薬上あるいは鶏畜上許容される各種の物質、例えば、賦形剤、希釈剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等を補助剤として含むことができる。具体的には、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及びその他の糖類、タルク、ミルク蛋白、ゼラチン、澱粉、セルロース及びその誘導体、動物及び植物油、ポリエチレングリコール、グリセロールなどがあげられる。【００１５】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤、抗ＲＳウイルス剤又は抗免疫不全ウイルス剤の有効成分であるカバノキ科植物及び／又はセンダン科植物の抽出物の希釈倍率は、使用目的・条件等に応じて当業者が適宜定めることができるが、例えば、２倍〜２００００倍であることが好ましく、より好ましくは１０倍〜５０００倍、より好ましくは５００倍〜２０００倍であってもよい。本発明の抗インフルエンザウイルス剤、抗ＲＳウイルス剤又は抗免疫不全ウイルス剤は、経口投与又は噴霧してもよいが、これらに限定されるものではない。経口投与の量は、使用目的・条件等により当業者が適宜定めることができるが、例えば、体重１ｋｇ当たり０．０１ｍＬ〜４０ｍＬであることが好ましく、より好ましくは体重１ｋｇ当たり０．１ｍＬ〜２０ｍＬ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり０．２ｍＬ〜１０ｍＬである。噴霧量も、同様に、使用目的・条件等により当業者が適宜定めることができるが、例えば、噴霧する面積を基準として、０．００１ｍＬ／ｍ2〜５０ｍＬ／ｍ2であることが好ましく、より好ましくは０．０１ｍＬ／ｍ2〜２０ｍＬ／ｍ2、より好ましくは０．１ｍＬ／ｍ2〜１０ｍＬ／ｍ2である。【００１６】
同様に、本発明の抗インフルエンザウイルス剤、抗ＲＳウイルス剤又は抗免疫不全ウイルス剤の有効成分であるカバノキ科植物及び／又はセンダン科植物の乾燥粉末の使用量も、使用目的・条件等に応じて当業者が適宜定めることができ、本発明の抗インフルエンザウイルス剤、抗ＲＳウイルス剤又は抗免疫不全ウイルス剤を養鶏場のケージの消毒薬として使用する場合には、当業者は、対象物中のインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス又は免疫不全ウイルスのウイルス力価を本願の実施例に記載された細胞感染系を用いたプラークアッセイ法あるいはタイトレーション法等により測定し、測定された力価に基づいて使用量を定めることもできる。当該乾燥粉末の使用量は、例えば、対象物に対して１回の使用につき０．０１ｍｇ〜５００ｇであることが好ましくは、より好ましくは０．１ｍｇ〜１００ｇ、より好ましくは０．２ｍｇ〜１０ｇ、より好ましくは２．５ｍｇ〜１ｇ、最も好ましくは５ｍｇ〜５００ｍｇである。【００１７】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤、抗ＲＳウイルス剤又は抗免疫不全ウイルス剤は、例えば、養鶏場の地上やケージ類の消毒剤として、あるいは餌等に混ぜて鶏に経口投与することもできる。本発明の抗インフルエンザウイルス剤、抗ＲＳウイルス剤又は抗免疫不全ウイルス剤の有効成分であるカバノキ科植物及びセンダン科植物は、動物にとっても安全性の高いものであるため、特に有用である。また、本発明の抗インフルエンザウイルス剤、抗ＲＳウイルス剤又は抗免疫不全ウイルス剤は、インフルエンザウイルス感染症、ＲＳウイルス感染症又は免疫不全ウイルス感染症の予防用のうがい薬、鼻腔内予防液等として、あるいは家庭内、学校内、病院内、交通機関等の消毒薬として用いることができ、さらに、調理器具や肉等の食品類の消毒薬として用いることもできる。本発明の抗インフルエンザウイルス剤、抗ＲＳウイルス剤又は抗免疫不全ウイルス剤を消毒薬として用いる際には、例えば、抽出した液をガス充填スプレー缶あるいはその他の噴霧器で対象物に噴霧することができる。また、本発明の抗インフルエンザウイルス剤、抗ＲＳウイルス剤又は抗免疫不全ウイルス剤を、吸引濾過装置等の中の布やフィルタ等に吸着させておくことにより、インフルエンザウイルス、抗ＲＳウイルス剤又は抗免疫不全ウイルス剤を不活化するのに有効な濾過装置を提供することもできる。またハンノキ及びセンダンの幹にも高い抗インフルエンザ活性が認められたことから、これらの幹の繊維を利用して布あるいは袋を作り、その中にハンノキやセンダンの乾燥葉粉末を入れることで空気中のウイルスを濾過滅菌することもできる。さらにハンノキ及びセンダンの葉や幹あるいはそれらの乾燥粉末を塩酸ポリヘキサニドや界面活性剤などで加工して利用することもでき、それによって、これらのウイルス不活化作用が勝ることはあっても、劣ることはない。
次に本発明を実施例により詳細に説明する。
【実施例】
【００１８】
実施例１
サンプルの調製
（植物サンプルの抽出）
ハンノキ植物葉を採集後に生の状態で秤量し、水道水で軽く洗浄した。生葉の質量に対して２倍量の純水を加え、家庭用のミキサーで５分間粉砕した。この粉砕液を４,５００rpmで２０分間遠心分離して上清を回収した。この上清を凍結保存し、試験前に０．２μmのろ過滅菌フィルターでろ過滅菌して各試験に使用した。
センダン植物葉を採集後に秤量し流水中で洗浄した。洗浄した葉は65℃で一晩乾燥させ、使用するまで密封・遮光保存した。この乾燥葉をミルミキサーにかけて粉砕し、その乾燥粉末1gに対して9mlの割合で純水を加えて115℃、30分、1kg/cm2の条件でオートクレーブにかけた。その後、超音波ホモジナイザーで5分間処理した後、5000rpmで30分間の遠心分離を行い、その上清を回収した。この上清は試験に使用するまで凍結保存し、使用前に0.2μmのろ過滅菌フィルターでろ過滅菌して試験に使用した。
（植物サンプルの乾燥処理）
ハンノキ植物葉及びセンダン植物葉を採集した後、それぞれ水道水で軽く洗浄し、６５℃で一晩乾燥させた。この乾燥葉を家庭用のミルミキサーにかけて細かく粉砕し、試験に使用するまでシリカゲルの入ったガラス瓶に入れて保存した。また、ハンノキ植物及びセンダン植物の幹を、それぞれ採集後に鋸で幹を輪切りにし、その時に生じたおがくずを採集した。採集したおがくずを、６５℃で一晩乾燥させて、試験に使用するまでシリカゲルの入ったガラス瓶に入れて保存した。【００１９】
実施例２
In vitroでの抗インフルエンザウイルス活性の評価
（細胞と培養）
イヌの腎臓細胞由来のMadine Darby Canine Kidney(ＭＤＣＫ)細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地を用いて７５cm2フラスコ中で継代維持した。
（試験ウイルス液の作成）
抗インフルエンザウイルス活性試験には、Ａ／スペイン型インフルエンザウイルス(A/PR/8/34：H1N1)、Ａ／ホンコン型インフルエンザウイルス(A/Moscow/1/100：H3N2)、トリインフルエンザウイルス(A/duck/Singapore-Q/F119-3/97：H5N3)、及びＢ型インフルエンザウイルス(B/Yamagata/16/88)を用いた。A/PR/8/34、A/Moscow/1/100及びB/Yamagata/16/88の試験ウイルス液の調製は、以下のとおり行った。７５cm2のフラスコに、ＭＤＣＫ細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭで２日間培養した。次に、この培養細胞をＰＢＳで洗浄し、発育鶏卵で増殖させた各ウイルス液を、５μg/mlのアセチルトリプシンを含むＭＥＭで１,０００倍に希釈して、ＭＤＣＫ細胞に３７℃で３０分間吸着させた。その後、５μg/mlのアセチルトリプシンを含むＭＥＭを１０ml加え、３７℃で４日間静置した。ＭＤＣＫ細胞がほとんど感染し、培養面から細胞が剥離しているのを確認した後、培地を回収した。回収した培地を遠心分離にかけ、細胞の残渣を沈殿させた後、上清を回収して−８０℃で凍結保存し、抗インフルエンザウイルス活性試験のウイルス液として使用した。A/duck/Singapore-Q/F119-3/97は、11日齢の発育鶏卵で増殖させ、回収したウイルスを−８０℃で凍結保存し、抗インフルエンザウイルス活性試験のウイルス液として使用した。評価試験の前に両ウイルスのウイルス力価をプラーク法により測定した。【００２０】
実施例３
抗インフルエンザウイルス活性試験−１
ハンノキ植物葉抽出液のin vitroでのインフルエンザウイルスに対する増殖阻止効果を、プラーク法によりA/PR/8/34、A/Moscow/1/100、A/duck/Singapore-Q/F119-3/97及びB/Yamagata/16/88を対象として評価した。評価に用いたＭＤＣＫ細胞は、直径６０mmのプラスチックシャーレに、１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭで２日間、３７℃で培養した。２倍で段階希釈した被検体と３００ PFU/０．２mlに希釈したウイルス接種液を、等量混合して３０分間静置した。対照には被検体と同量のＭＥＭを加えた。各希釈倍率につき２枚のプラスチックシャーレを使用した。培養細胞の培養液を取り除き、ＰＢＳで培養面を洗浄した後、被検体とウイルスの混合液を細胞に添加して３０分間吸着させた。その後、接種液を取り除き、重層用の寒天培地を５mlずつ加え室温で固めた。その後、３７℃で３日間培養し、３．６％のホルマリンで細胞を固定して、メチレンブルー染色を行い、プラーク数を計測した。被検体の入っていない対照区のプラーク数からプラーク形成阻止率を算出し、被検体の抗インフルエンザウイルス活性の評価を行った。プラーク形成阻止率は次のように算出した。
プラーク形成阻止率＝各希釈点での平均プラーク数/対照の平均プラーク数×１００【００２１】
その結果を表１に示す。表１に見られるように、ハンノキ植物葉の抽出液は、広い範囲のインフルエンザウイルスのプラーク形成を強く阻害することが明らかとなった。１９３０年代から１９４０年代にわたってヒトにおいて世界中で流行したＡ/スペイン型系統を代表するA/PR/8/34（H1N1：以下PR-8）ウイルスは、発育鶏卵やＭＤＣＫ細胞において増殖の速い代表的なＡ型インフルエンザウイルスとして広く利用されているが、ハンノキ植物葉の抽出物は、２,０００倍以上という極めて高い希釈倍率においても、同ウイルスの５０％以上のプラーク形成を阻害した。また、現在もヒトの世界で流行しているＡ/香港型のA/Moscow/1/100に対しても、高いプラーク形成阻害活性を示した。さらに、現在世界の各地のトリで流行し、しかも、ヒトの間で一過性の伝染が確認されているトリH5N1ウイルスと同系統のA/duck/Singapore-Q/F119-3/97(H5N3：H5トリインフルエンザウイルス)のプラーク形成も強く阻害し、そのプラーク阻害活性は1,024-2,048であった。さらに、ハンノキ植物葉のプラーク形成阻害活性は、Ｂ型インフルエンザのB/Yamagata/16/88にも及び、そのプラーク形成阻害活性は512であった。以上のように、ハンノキ植物葉の抽出物はＡ及びＢ型インフルエンザウイルスに対して、広い増殖阻害活性を示すことから、抗インフルエンザウイルス剤の有効成分として有用であることが示された。【００２２】
実施例４
抗インフルエンザ活性試験−２
ハンノキ植物葉及びセンダン植物葉の抽出液のin vitroでのインフルエンザウイルス増殖阻止効果を、A/PR/8/34及びA/duck/Singapore-Q/F119-3/97を対象に、継日的に測定した。１０倍及び５０倍に希釈した被検体と、３００ PFU/０．２mlに調製したウイルス液を等量混合して、３０分間室温で処理した。その処理液を、ウイルス接種液として使用した。増殖阻止効果の測定に際し、直径１００mmのプラスチックシャーレにＭＤＣＫ細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭで２日間、３７℃で培養した。培養細胞の培養液を取り除き、ＰＢＳで培養面を洗浄した後、０．２mlのウイルス接種源を細胞に添加し、３０分間吸着させた。その後、１０mlの２μg/mlトリプシンを含むＭＥＭを添加した。ウイルス接種日を０日としてて４日目まで、毎日培養液中のウイルス濃度をＨＡ価を測定して評価した。ＨＡ価の測定では、９６穴のプラスチックプレートの１列目に被検体を１００μl、２列目から１２列目までに５０μlのＰＢＳを分注した。次に、被検体５０μlを採り、２列目から１２列目まで、２倍の希釈倍率で段階希釈した。次に、ニワトリから採取した０．５％の赤血球液を５０μlずつ添加して、３０分間静置し、赤血球凝集反応によりＨＡ価を測定した。【００２３】
上記の実験系によって、４日間にわたってウイルスの増殖が連続的に進行していく細胞システム中でのハンノキ植物葉の抽出液の抗ウイルス作用を調べることができる。この結果を図１及び図２に示した。ハンノキ植物葉の抽出液が存在しない場合のA/PR/8/34ウイルスは、感染後２日目から急激に増殖し、その値はHA活性にして２,０４８の頂点に達し、それ以降４日間にわたって１,０２４という高い値を維持することが明らかとなった。同様に、Ｈ５トリインフルエンザウイルス（A/duck/Singapore-Q/F119-3/97）の場合も、感染後２日目に１６のHA価、３日目に１２８のHA価となりピークに達した。一方、両ウイルスの増殖システム中に、ハンノキ植物葉の抽出液の１０倍希釈液を添加したものでは、増殖は完全に停止し、４日目になってもHA活性は全く認められなかった。従って、ハンノキ植物葉の抽出液は、使用したすべてのウイルスの増殖阻止の目安となるプラーク形成を強く阻害しただけでなく、ヒトのPR-8とトリインフルエンザウイルスの全増殖サイクルを完全に破壊できることが示された。これらのことから、ハンノキ植物葉の抽出液は、インフルエンザウイルスの感染及び増殖の両方を阻害する作用を有することが示された。【００２４】
実施例５
抗インフルエンザ活性試験−３
１ｇのハンノキ植物及びセンダン植物の乾燥葉と幹の粉末（おかくず）にどの程度のウイルス不活化能力があるのかについて、A/PR/8/34及びA/duck/Singapore-Q/F119-3/97を対象に評価した。まず、１５mlの遠沈管に１ｇの被検体を入れ、そこに、１０2、１０3、１０4及び１０5 PFU/mlに調製したウイルス液を９ml加えた。室温で３０分間静置した後、３,０００rpmで１５分間遠心分離して上清を回収し、この上清を、０．２μmのろ過滅菌フィルターでろ過し、ウイルス接種源としてプラーク感染価を測定した。プラーク感染価の測定に際し、直径６０mmのプラスチックシャーレに、ＭＤＣＫ細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭで２日間、３７℃で培養した。培養細胞の培養液を取り除き、ＰＢＳで培養面を洗浄した後、０．２mlのウイルス接種源を細胞に添加し、３０分間吸着させた。その後、接種液を取り除き、重層用の寒天培地を５mlずつ加えて室温で固めた。その後、３７℃で３日間培養し、３．６％のホルマリンで細胞を固定してメチレンブルー染色を行い、プラーク数を計測した。被検体処理をしていない対照区のウイルス量、処理区のウイルス量からウイルス失活量を次のように算出した。
ウイルス失活量(PFU/ml)＝対照区ウイルス量(PFU/ml)−処理区ウイルス量(PFU/ml)【００２５】
その結果を表２に示す。ハンノキ植物葉及びセンダン植物葉の乾燥粉末１gは、２８から３．６×１０4のウイルス粒子の感染性を１００％破壊し、この作用は、ヒトH1及びH5トリインフルエンザウイルスにまで広範に認められることが示された。従って、本発明の抗インフルエンザ剤を用いることにより、養鶏場のみならず、養鶏場付近の湖沼の地上に散乱する糞等に含まれるトリインフルエンザウイルスを死滅させることで、鶏の感染被害を予防することもできる。また、ハンノキ植物及びセンダン植物の幹の粉末（おかくず）は、それぞれ１ｇで、５．１×１０4以上のＨ１インフルエンザウイルスと３．６×１０4以上のＨ５トリインフルエンザウイルスの感染性を破壊した。従って、これらもまた、トリインフルエンザの消毒剤として利用することができる。【００２６】
実施例６
抗インフルエンザ活性試験−４
ハンノキ植物及びセンダン植物の乾燥葉と一定濃度に調製したウイルス液との混合比を変えて、どの程度のウイルス不活化能力があるか、A/PR/8/34及びA/duck/Singapore-Q/F119-3/97を対象に評価した。被検体：ウイルス液の混合比は、１：２０、１：５０、１：１００、１：２００、及び１：１,０００とした。１５mlの遠沈管に、それぞれ０．２５、０．１、０．０５、０．０２５及び０．００５ｇずつ被検体を入れ、１０6 PFU/mlに調製したウイルス液を、それぞれ４．７５、４．９、４．９５、４．９７５及び４．９９５ml加えた。室温で３０分間静置した後、３,０００rpmで１５分間遠心分離し、上清を回収した。この上清を、０．２μmのろ過滅菌フィルターでろ過し、ウイルス接種源として試験−１と同様に、プラーク感染価を測定しウイルス失活量を算出した。【００２７】
その結果を表３に示す。ハンノキ植物葉の乾燥粉末に関しては、０．００５ｇで５．０２×１０5という極めて高いウイルス感染価を失活させることができることが示された。
また、０．００２５ｇでは、５．０５×１０5のウイルス感染価を失活させることができることが示された。さらに、０．０５ｇにおいては、５．０５×１０5以上のウイルスを完全に消失させることができた。これに対して、センダン植物葉の乾燥粉末に関しては、０．００５ｇで、５．０５×１０5以上のウイルスを１００％死滅させることができ、ハンノキ植物葉の乾燥粉末と比較して、ウイルスの失活能力がより高いことが明らかとなった。【００２８】
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【００２９】
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【００３０】
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【００３１】
実施例７
抗インフルエンザウイルス活性試験−５（ブタインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１亜型）
ブタインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１亜型のＡ／ｓｗｉｎｅ／８８株を１００倍希釈してＭＤＣＫ細胞に接種し、接種前に２倍段階希釈しておいたセンダン抽出液（実施例１で調製したもの）と等量混合した。ウイルス感染後５日間にわたってウイルス増殖をＨＡ活性を指標として調べた。その結果、センダン抽出液で処理していないウイルス対照の増加が２日後に１６倍、３日後に６４倍、さらに４日後に６４倍という値に達した。これに対し、センダン抽出液で処理したウイルスの増殖は５日間にわたって全て検知されず、センダン抽出液がブタインフルエンザウイルスの増殖を完全に阻止していることが明らかとなった。【００３２】
実施例８
抗インフルエンザウイルス活性試験−６（パラインフルエンザウイルス３型及び１型）
センダン及びハンノキの抽出液（実施例１で調製したもの）のパラインフルエンザウイルス３型及び１型に対する増殖阻止効果について、センダン抽出液とハンノキ抽出液をパラミクソウイルス科のパラインフルエンザウイルス３型（東芝株）を２００〜４００プラーク形成単位になるように調整し、これに２倍段階希釈したセンダン抽出液を等量混合し、３０分間反応させた後にＶＥＲＯ細胞に接種し、３日間培養してプラークを形成させてプラーク数を測定し、得られた値を基にしてプラーク形成阻止率を計算することにより調べた。表４にその結果を示したが、センダン抽出液によるプラーク形成率は、該抽出液を32,768倍に希釈しても50％以上高い増殖阻止率を示し、センダン成分が極めて効率良くパラインフルエンザウイルス３型の増殖を阻害することが認められた。【００３３】
また、センダン抽出物はパラインフルエンザウイルスの１型に対しても増殖阻害効果があることも明らかとなった。さらに、同じ方法によって、ハンノキ抽出物（実施例１で調製したもの）がパラインフルエンザウイルスに対する増殖阻止作用をどの程度示すかについても調べたが、同成分のパラインフルエンザウイルス３型（株名５７−３４）に対する増殖阻害作用は、512倍の希釈で50％以上のプラーク阻止率を示すという極めて強い作用であった。以上のことから、ハンノキ抽出液の増殖阻害効果はセンダン抽出液の１／１００程度ではあったが、明らかにパラインフルエンザウイルスの増殖を阻止していることが示された。このことからセンダンとハンノキの成分はパラミクソウイルス科のほとんどのウイルスの増殖に影響を与えることが強く示唆され、特に同科のＲＳウイルスの増殖も阻止できるものと考えられた。これらの結果から、本発明の抽出物は院内感染が特に問題となるＲＳウイルスやパラインフルエンザウイルスの消毒に極めて有用であることが強く示唆された。【００３４】
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【００３５】
実施例９
抗免疫不全ウイルス活性試験（免疫不全ウイルスに対するセンダンエキスの増殖阻止効果）
センダンの成分がレトロウイルス科の免疫不全ウイルスに対する増殖をどの程度阻止するかを明らかにするため、抗ヒト免疫不全ウイルス剤のスクリーニングにモデルウイルスとして代替して使用できることが知られるネコ免疫不全ウイルスＦＩＶを使用して以下のとおり試験を行った。センダン抽出液を、１００倍に希釈したネコ免疫不全ウイルスに加えて３０分反応させた後、ＣｒＦＫ細胞（クランデル猫腎培養細胞）に接種し、ウイルス感染によって起こる細胞病原性効果（Cytopathic effect：ＣＰＥ）の出現を調べた。結果を表５に示したが、ネコ免疫不全ウイルスによる細胞病原性阻止効果は、６４倍希釈のサンプルにおいても完全に阻止されていることが示された。以上の成績は、センダン抽出液が免疫不全ウイルスを含む幅広いエンベロープウイルスに対しても有意義な殺傷効果を奏し、有用な消毒剤／治療・予防剤として広く利用できることを強く示唆した。【００３６】
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【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】被検体(ハンノキ植物葉の水性抽出物の１０倍希釈液)及び対照群のＨ１ヒトインフルエンザウイルス（A/PR/8/34）接種後のＨＡ価を経日的に示したグラフである。
【図２】被検体(ハンノキ植物葉の水性抽出物の１０倍希釈液)及び対照群のＨ５トリインフルエンザウイルス（A/duck/Singapore-Q/F119-3/97）接種後のＨＡ価を経日的に示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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