(57)【要約】ヒアルロン酸合成促進剤及びメラニン産生抑制剤を提供する。本発明のヒアルロン酸合成促進剤及びメラニン産生抑制剤は、大豆サポニンを有効成分として含む。大豆サポニンは、大豆サポニンアグリコンであることが好ましい。さらに、大豆サポニンアグリコンは、ソーヤサポゲノールＡ及び／又はソーヤサポゲノールＢを含むことが好ましい。本発明のヒアルロン酸合成促進剤及びメラニン産生抑制剤は、経皮投与又は経口投与される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆サポニンを有効成分として含むことを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項２】
前記大豆サポニンがアグリコンであることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項３】
前記大豆サポニンアグリコンが、ソーヤサポゲノールＡ及び／又はソーヤサポゲノールＢを含むことを特徴とする、請求項２に記載のヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項４】
請求項１に記載のヒアルロン酸産生促進剤を含む経皮投与剤。
【請求項５】
請求項１に記載のヒアルロン酸産生促進剤を含む経口投与剤。
【請求項６】
ＤＤＭＰ−サポニン以外の大豆サポニンを有効成分として含むことを特徴とするメラニン生成抑制剤。
【請求項７】
大豆サポニンのアグリコンを有効成分として含むことを特徴とするメラニン生成抑制剤。
【請求項８】
前記大豆サポニンアグリコンが、ソーヤサポゲノールＡ及び／又はソーヤサポゲノールＢを含むことを特徴とする、請求項７に記載のメラニン生成抑制剤。
【請求項９】
請求項７に記載のメラニン生成抑制剤を含む経皮投与剤。
【請求項１０】
請求項７に記載のメラニン生成抑制剤を含む経口投与剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸産生促進剤及びメラニン生成抑制剤に関し、より詳細には、特定の大豆由来成分を含むヒアルロン酸産生促進剤及びメラニン生成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、主として表皮、真皮、及び皮下組織に分けられる。真皮は、表皮の下にあって皮膚構造を支えるために、コラーゲン、ヒアルロン酸等で構成される細胞外マトリックスと呼ばれる生体構造物で満たされている。この細胞外マトリックス成分は、線維芽細胞等によって産生される。若々しさが維持されている皮膚では、細胞外マトリックス成分の産生が促進され、皮膚の弾力性、水分保持とはりが保たれている。一方、しみ、しわ、たるみ、肌荒れといった症状に代表される皮膚の老化は、ヒアルロン酸等の細胞外マトリックス成分の減少とともに進行するといわれている。【０００３】
ヒアルロン酸は、グリコサミノグリカンの一種であって、硫酸基を持たず、グルクロン酸とＮ―アセチルグルコサミン残基が反復的に鎖形状で連結されている高分子物質である。【０００４】
ヒアルロン酸は、体内では皮膚、腱、筋肉、軟骨、脳、血管等に広範囲に分布する。細胞外マトリックスの主要構成成分であるヒアルロン酸は、細胞間隙に存在して細胞外液の保持、創傷治癒効果、関節の潤滑作用等を有することが知られている（非特許文献１）。ヒト皮膚におけるヒアルロン酸量は、加齢に伴って減少すると報告されており、皮膚でのヒアルロン酸の減少は老化による皮膚弾力低下及び水分含量減少の原因の１つであると考えられている（非特許文献２及び３）。【０００５】
ヒアルロン酸減少による状態を改善するために、ヒアルロン酸産生促進効果を有する種々の物質が提案されている。その例として、レチノイン酸、オオズキンカブリタケ抽出物（特許文献１）、サフラン抽出物（特許文献２）、ダービリア科ダービリア属に属する海藻の抽出物（特許文献３）、特定の配列を有するペプチド（特許文献４）等が挙げられる。【０００６】
前記レチノイン酸は、その有効性が知られているものの、皮膚炎等の副作用を引き起こすことから、安全性の問題が指摘されている。前記オオズキンカブリタケ抽出物及びサフラン抽出物のような植物由来物、若しくはダービリア科ダービリア属の海藻抽出物は、ヒアルロン酸産生促進効果が高くない。前記ペプチドもまた、その効果を得るために多量に摂取する必要があり、満足できる効果が得られ難い。【０００７】
一方、大豆イソフラボンアグリコンによるヒアルロン酸産生の促進が知られている（特許文献５）。人参サポニンの主要代謝産物である２０−Ｏ−β―Ｄ―グルコピラノシル―２０（Ｓ）―プロトパナキサジオール（化合物Ｋ）が、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を増加させ、ヒアルロン酸産生を促進することが知られている（特許文献６）。しかし、ソーヤサポゲノールについては、ヒアルロン酸の産生促進が報告されたことはない。【０００８】
皮膚のしみ、そばかす等の色素沈着が生じる原因には不明な点も多いが、紫外線、ホルモンバランスの乱れ等が誘因となって、表皮基底層にある色素細胞（メラノサイト）内のメラニン生成機能が亢進することが原因の一つとして考えられている。表皮細胞（ケラチノサイト）の受けた刺激がメラノサイトに伝えられると、メラノサイト内で、チロシンがチロシナーゼ等の作用によってドーパに、さらにドーパキノンを経て、メラニンへと変化する。生成されたメラニンは、メラノソームと呼ばれる小胞に蓄積される。蓄積したメラニンを含むメラノソームは、メラノサイトからケラチノサイトへと供与される。【０００９】
上記のような色素沈着を防止・改善作用を目的として、メラニン生成を抑制し、美白作用を発揮する種々の物質が提案されている。例えば、アスコルビン酸、グルタチオン、コウジ酸（特許文献７）、ダイウイキョウ抽出物（特許文献８）、コナゲニン（特許文献９）、酸性オリゴ糖（特許文献１０）等が挙げられる。【００１０】
しかし、前記アスコルビン酸は、酸化されやすく保存性が低い。前記グルタチオンには、特有の異臭が生じるという欠点がある。前記コウジ酸は、高濃度での使用の安全性に問題がある。前記ダイウイキョウ抽出物、コナゲニン及び酸性オリゴ糖は、効果を発揮するのに高い濃度を必要とし、満足すべき作用を有していないことが懸念されていた。【００１１】
一方、大豆イソフラボンがメラニン生成を抑制することが報告されている（特許文献１１）。また、２，３−ジヒドロ―３，５−ジヒドロキシ―６−メチル―４Ｈ−ピラン―４―オン及び２，３−ジヒドロ―３，５−ジヒドロキシ―６−メチル―４Ｈ−ピラン―４―オン―結合―サポニン（ＤＤＭＰ−サポニン）がメラニン生成を抑制することが知られている（特許文献１２）。しかし、ＤＤＭＰ−サポニン以外の大豆サポニンやソーヤサポゲノールによるメラニン生成抑制効果については報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００８−２２２６６４号公報
【特許文献２】特開２００５−２０６５１０号公報
【特許文献３】特開平９−１７６０３６号公報
【特許文献４】特開２００７−１４５８４５号公報
【特許文献５】特開２００１−３３５４５４号公報
【特許文献６】特表２００６−５１５３０３号公報
【特許文献７】特開昭５３−３５３８号公報
【特許文献８】特開平１１−３０２１４９号公報
【特許文献９】特再表２００７−０１１０６６号公報
【特許文献１０】特開２００９−１３０８４号公報
【特許文献１１】特公昭６０−１９８８５号公報
【特許文献１２】特開２００６−２８０７７号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】機能性糖質素材の開発と食品への応用、２００５年、p３２４-３２５
【非特許文献２】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５９（１）、１２７‐１３６、１９８７
【非特許文献３】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、３３（２）、１１９‐１２２、１９９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記したように、天然物や天然物由来の成分でヒアルロン酸産生促進作用及びメラニン生成抑制作用を発揮するものが探索されているが、現状のものでは満足されない。そこで、本発明の目的は、天然由来で安全なヒアルロン酸産生促進剤及びメラニン生成抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記の課題を解決するため、種々の天然物について鋭意検討した結果、大豆サポニンのソーヤサポゲノールがヒアルロン酸産生促進作用及びメラニン生成抑制作用を有することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、大豆サポニンを有効成分として含むことを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤を提供する。また、ＤＤＭＰ−サポニン以外の大豆サポニンを有効成分として含むことを特徴とするメラニン生成抑制剤を提供する。【００１６】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤及びメラニン生成抑制剤に使用する大豆サポニンは、アグリコンであることが好ましい。【００１７】
前記アグリコンは、ソーヤサポゲノールＡ及び／又はソーヤサポゲノールＢを含むことが特に好ましい。【００１８】
大豆サポニンは、脂肪蓄積抑制（ＫＡＷＡＮＯ−ＴＡＫＡＨＡＳＨＩ等．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｂｅｓiｔｙ．１０．２９３−３０２．１９８６）、血中脂質上昇抑制（有地ら．基礎と臨床．１６．１３５−１４２．１９８２）、抗酸化剤、細胞賦活剤及びコラーゲン産生促進（特開２００６−２１３６４９号公報）、アディポネクチン分泌促進（特開２００６−１４３６０９号公報）、レプチン分泌抑制（特開２００６−２２５３１２号公報）、異常蛋白質除去（特開２００２−１７９５９２号公報）、血糖値上昇抑制（特開２００５−１３９１１４号公報）がすでに知られている。しかし、大豆サポニンのヒアルロン酸産生促進作用及びメラニン生成抑制作用に関する報告は、これまでない。特に、アグリコンでソーヤサポゲノールのうち、ソーヤサポゲノールＡ及び／又はソーヤサポゲノールＢのヒアルロン酸産生促進作用及びメラニン生成抑制作用に関する報告は、これまで全くない。【００１９】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤及びメラニン生成抑制剤は、経皮投与又は経口投与されることが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤及びメラニン生成抑制剤は、大豆という天然植物に由来する成分であるため、副作用が少ない可能性が高く、長期間にわたって連続的に服用することにより、優れた美容効果を得ることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に、本発明のヒアルロン酸産生促進剤及びメラニン生成抑制剤（以下、ヒアルロン酸産生促進剤等という）の好適な実施形態を詳細に説明する。本発明のヒアルロン酸産生促進剤等は、大豆サポニンを有効成分とする。【００２２】
大豆サポニンは、大豆サポニン配糖体でもその大豆サポニンアグリコンでもよい。好ましくは大豆サポニンアグリコンである。特に好ましい大豆サポニンアグリコンは、ソーヤサポゲノールＡ及び／又はソーヤサポゲノールＢを含む。【００２３】
大豆サポニン配糖体は、大豆の子葉、胚芽又は全粒から、公知の方法によって抽出可能である。具体的には、大豆の子葉、胚芽又は全粒から、再表０３−７５９３９号公報等に記載の方法によって抽出及び精製する。【００２４】
大豆サポニン配糖体から糖鎖を除去することにより、大豆サポニンアグリコンであるソーヤサポゲノールが得られる。具体的には、大豆サポニン配糖体から酸処理、酵素処理等によってソーヤサポゲノールを得る。ソーヤサポゲノールは、化学合成によって得てもよい。【００２５】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤等に含有される大豆サポニンの含有量は、組成物の形態及び摂取量によって変わってくるが、通常、０．００００２〜１００重量％でよく、好ましくは０．０００３〜７０重量％、より好ましくは０．００３〜５０重量％の範囲である。大豆サポニンが０．００００２重量％以下であると、ヒアルロン酸増加及びメラニン生成抑制効果を得るのに必要な量を摂取できない場合がある。【００２６】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、必須成分の大豆サポニンに加えて、ヒアルロン酸産生を増加させることが知られている物質、例えばヤーコン等の植物、葛根等の生薬、Ｎ−アセチルグルコサミン、ペプチド、イソフラボンアグリコンの１種又は２種以上を添加してもよい。【００２７】
本発明のメラニン生成抑制剤は、メラニン生成を抑制することが知られている物質、例えばヤブコウジ科エンベリア等の植物、ウワウルシ等の生薬、Ｌ−システインの１種又は２種以上を添加してもよい。【００２８】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤等を医薬として用いる場合は、必須成分の大豆サポニン及び適宜のヒアルロン酸産生物質及び／又はメラニン生成抑制物質に加えて、医薬の助剤として汎用されるものを添加してもよい。例えば、剤形及び投与方法に応じて、汎用の賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、ビタミン、キサンチン誘導体、アミノ酸、ｐＨ調整剤、清涼化剤、懸濁化剤、粘稠剤、溶解補助剤、抗酸化剤、コーティング剤、可塑剤、界面活性剤、水、アルコール類、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料、香料、着色剤などを発明の効果を損なわない質的および量的範囲で添加することが可能である。【００２９】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤等は、医薬として使用するために、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錠、ドロップのような固形製剤や、ドリンク剤、水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ、ドライシロップのような液剤などの経口投与剤、あるいは液剤、水剤、乳剤、クリームのような経皮投与剤の形態に加工される。ソーヤサポゲノールは粉体なので、形態は固形製剤が望ましい。【００３０】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤等を医薬として使用する場合の摂取方法は、特に限定されない。例えば、経口摂取、経皮摂取、輸液、注射（筋肉内、腹腔内、皮下又は静脈）等である。好ましくは、患者の負担が少ない点で、錠剤、カプセル剤等の経口摂取である。【００３１】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤等を医薬に用いる場合には、症状に応じて、適宜、摂取量を設定すればよいが、一般に、予防薬として用いる場合は、１日あたりのソーヤサポゲノールの摂取量として、０．１〜１００ｍｇが好ましく、５〜５０ｍｇがさらに好ましい。治療薬として用いる場合は、５〜１２００ｍｇが好ましく、１５０〜９００ｍｇがさらに好ましい。【００３２】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤等を化粧品として用いる場合は、必須成分の大豆サポニン及び適宜のヒアルロン酸産生物質及び／又はメラニン生成抑制物質に加えて、化粧品の助剤として汎用されるものを添加してもよい。例えば、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，４−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、ペンチレングリコール、イソプレングリコール、グルコース、マルトース、フルクトース、キシリトール、ソルビトール、マルトトリオース、エリスリトール等の多価アルコール；メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、イソブチルアルコール等の低級アルコール；オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類；オリーブ油、トウモロコシ油、ツバキ油、マカデミアナッツ油、アボカド油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油等の油脂；カルナバロウ、キャンデリラロウ、ミツロウ、ラノリン等のロウ類；ソルビトール、マンニトール、グルコース、ショ糖、ラクトース、トレハロース等の糖類；カラギーナン、キサンタンガム、ゼラチン、ペクチン、アガロース、アルギン酸塩、デキストリン、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アラビアガム、カラヤガム、トラガントガム、タマリンドガム等の増粘剤；フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸、サリチル酸とその塩類、ソルビン酸とその塩類、デヒドロ酢酸とその塩類、クロルクレゾール、ヘキサクロロフェン等の防腐剤；ラウロイル硫酸ナトリウム、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等の非イオン界面活性剤、アルキルサルフェート塩、ノルマルドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンドデシルモノメチルアンモニウムクロライド等の陽イオン界面活性剤；ステロイド系及び非ステロイド系抗炎症剤；ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ等のビタミン類やジカプリル酸ピリドキシン、ジパルミチン酸ピリドキシン、ジパルミチン酸アスコルビル、モノパルミチン酸アスコルビル、モノステアリン酸アスコルビル等のビタミン誘導体；フラボノイド、カロテノイド等の抗酸化剤；スクワラン、スクワレン、流動パラフィン等の高級脂肪族炭化水素類；セラミド、セレブロシド、スフィンゴミエリン等のスフィンゴ脂質；コレステロール、フィトステロール等のステロール類；メチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、メチルシクロポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、オクタメチルシクロペンタシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、メチルハイドロジェンポリシロキサン等のシリコーン類；パラアミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸モノグリセリンエステル、アントラニル酸メチル、ホモメンチル−Ｎ−アセチルアントラニレート、パラメトキシケイ皮酸オクチル、エチル−４−イソプロピルシンナメート等の紫外線吸収剤；ベントナイト、スメクタイト、バイデライト、ノントロナイト、サポナイト、ヘクトライト、ソーコナイト、スチーブンサイト等の鉱物；ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛等の無機顔料；赤色２０２号、黄色４号、青色４０４号等の着色料；香料；香油等が挙げられる。【００３３】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤等を化粧品として使用するために、液剤、水剤、乳剤、乳液、クリーム、粉体のような経皮投与剤、あるいは散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錠、ドロップのような固形製剤やドリンク剤、水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ、ドライシロップのような液剤などの経口投与剤の形態に加工される。【００３４】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤等を化粧品として使用する場合の摂取方法は、経口摂取又は経皮摂取である。化粧品としての即効性の観点から、水剤、乳剤、乳液、クリームでの経皮投与が好ましい。【００３５】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤等を化粧品に用いる場合には、１日あたりのソーヤサポゲノールの摂取量として、０．００１〜１００ｍｇが好ましく、０．０５〜５０ｍｇがさらに好ましい。【００３６】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤等を機能性食品として用いる場合は、必須成分の大豆サポニン及び適宜のヒアルロン酸産生物質及び／又はメラニン生成抑制物質に加えて、機能性食品の添加剤として汎用されるものを添加してもよい。例えば、経口投与剤の形態に応じて、汎用の賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、ビタミン、キサンチン誘導体、アミノ酸、ｐＨ調整剤、清涼化剤、懸濁化剤、粘稠剤、溶解補助剤、抗酸化剤、コーティング剤、可塑剤、界面活性剤、水、アルコール類、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料、香料、着色剤などを発明の効果を損なわない質的および量的範囲で添加することが可能である。【００３７】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤等をサプリメント、機能性食品として使用するために、例えば、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、チュアブル錠、ドロップのような固形製剤や、ドリンク剤、水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ、ドライシロップのような液剤などの経口投与剤に加工される。ソーヤサポゲノールは粉体なので、形態は錠剤が望ましい。【００３８】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤等は、パン、米飯、スープ、総菜、菓子、キャンディ等の一般加工食品の加工時に原料に直接添加されてもよい。【００３９】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤等をサプリメント、機能性食品、健康食品又は一般食品に用いる場合には、安全性を考慮して、１日あたりのソーヤサポゲノールの摂取量として、０．１〜１００ｍｇが好ましく、５〜５０ｍｇがさらに好ましい。【００４０】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤等の配合例を示す。しかし、本発明は、以下の配合例に限定されるものではない。【００４１】
［配合例１］錠剤
【表１】
2010150612.tif 000002
【００４２】
［配合例２］カプセル
【表２】
2010150612.tif 000003
【００４３】
［配合例３］化粧水
【表３】
2010150612.tif 000004
【００４４】
［配合例４］クリーム
【表４】
2010150612.tif 000005
【実施例】
【００４５】
以下に、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
〔調製例１〕ソーヤサポゲノールの製造
市販の大豆サポニン製剤（（株）Ｊ−オイルミルズ製サポニンＡＺ−Ｂ：サポニンＡ群３１．９％、サポニンＢ群５２．９％）５０ｇに、３％塩酸含有メタノール１６００ｍＬを添加し、７０℃にて３時間保温した。保温後、反応混合物に水４０００ｍＬを添加し、ろ過した。ろ紙上の残留物に５００ｍＬの水を添加し、４規定及び０．１規定の水酸化ナトリウムで中和させた。さらに、ろ過を行い、ろ紙上の残留物にさらに水を添加し、乾燥させ、ソーヤサポゲノール粉末１５．３ｇを得た。【００４６】
粉末中のソーヤサポゲノール濃度をＲｕｐａｓｈｉｎｇｈｅらの方法（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．５１．５８８８−５８９４、２００３）に基づいて測定したところ、ソーヤサポゲノールＡが２７．３％、そしてソーヤサポゲノールＢが４９．８％であった。【００４７】
〔実施例１〕ヒアルロン酸産生促進剤
正常ヒト線維芽細胞を用いて、ソーヤサポゲノールのヒアルロン酸産生促進作用を以下の手順で試験した。
１．試験方法
正常ヒト線維芽細胞（倉敷紡績株式会社製）を１ウェル当たり２．０ｘ１０４個の細胞密度となるように９６穴マイクロプレートに播種した。播種２４時間後、表５に記載の濃度のソーヤサポゲノール粉末を含有する０．５重量％仔牛血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）と交換した。また、陽性コントロールとして５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用い、試験方法に問題がないことを確認した。４８時間試料含有培地で培養した後、培地上清を回収してヒアルロン酸量測定のＥＬＩＳＡに供した。細胞は０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液にて溶解後、タンパク量を定量した。【００４８】
２．ヒアルロン酸量の測定
培地上清中のヒアルロン酸量を、以下の方法にて測定した。ヒアルロン酸溶液をＥＬＩＳＡプレートに入れ、３７℃にて１時間コーティングした。その後、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を用いて４℃にて一昼夜ブロッキングした。一次抗体反応は、ビオチン標識されたヒアルロン酸結合性タンパク質（生化学工業（株）製）含有１％ＢＳＡ溶液とリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて希釈した培養上清及び検量線用ヒアルロン酸を加え、３７℃にて１時間反応させた。洗浄後、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識ストレプトアビジン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ）を１％ＢＳＡ溶液で希釈し、３７℃で１時間反応させた。次に０．３ｍｇ／ｍＬの２，２’−Ａｚｉｎｏｂｉｓ（３‐ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）  ｄｉａｍｍｏｕｎｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＡＢＴＳ）及び０．０３％の過酸化水素水を含むリン酸−クエン酸バッファー溶液（０．１Ｍ、ｐＨ４．０）を加えて２０分間反応させ、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。【００４９】
培地中のヒアルロン酸量は、同じＥＬＩＳＡプレートで測定した検量線から換算し、全細胞のタンパク量で培地中のヒアルロン酸量を除することによって単位タンパク量あたりのヒアルロン酸産生量として算出し、ヒアルロン酸産生促進作用を評価した。【００５０】
表５は、ソーヤサポゲノール粉末におけるヒト線維芽細胞に対するヒアルロン酸産生促進作用を試料未添加時における単位タンパク量当たりのヒアルロン酸産生量を１００としたときの相対値として評価した結果である。試料添加は各群ｎ＝６で試験を実施し、結果はそれぞれの平均値で示している。なお、統計処理については、試料未添加の対照群に対するＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ  検定を実施し、５％未満の危険率の場合＊を、１％未満の危険率の場合＊＊をつけた。【００５１】
【表５】
2010150612.tif 000006
【００５２】
表５に示されるように、ソーヤサポゲノール粉末濃度が高くなるにつれて、ヒアルロン酸産生促進作用が向上した。ソーヤサポゲノール粉末３．１３μｇ／ｍＬの低濃度の段階から陰性コントロールと比較して危険率１％未満で有意なヒアルロン酸産生促進作用が認められた。このことから、ソーヤサポゲノールは、ヒト線維芽細胞においてヒアルロン酸産生促進作用を有することが明らかとなった。【００５３】
〔実施例２〕メラニン生成抑制剤
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を用いて、ソーヤサポゲノールのメラニン産生抑制作用を以下の手順で試験した。
１．試験方法
Ｂ１６マウスメラノーマＦ０株（Ｂ１６Ｆ０）に５％仔牛血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ／５）を用いて１ウェル当たり２．０ｘ１０３個の細胞密度で６穴プレートに播種した。培養２４時間後、実施例１で使用したソーヤサポゲノール粉末を表６に記載の濃度で含有したＤＭＥＭ／５と交換した。５０ｍＭ乳酸ナトリウムを含有するＤＭＥＭ／５を用いたものを陽性コントロールとして培養し、試験方法に問題がないことを確認した。６日間培養後、トリプシンにて細胞を剥離し、細胞ペレットを作成した。【００５４】
２．目視による判定
細胞ペレットの色調を目視判定にてスコア化した。スコアは５段階にて判定しており、色調が白いものを１とした。色調が黒くなるに従い、スコアが上がっていき、最も黒いものを５と判定した。【００５５】
３．メラニン量の測定
細胞ペレットを５％トリクロロ酢酸含有ＰＢＳ（−）溶液、エタノール／ジエチルエーテル溶液（３／１，ｖ／ｖ）、ジエチルエーテルの順で洗浄した後、１Ｎ水酸化ナトリウムを添加して、１００℃、５分にて加熱溶解した。マイクロプレートリーダーを用いて４３０ｎｍの吸光度を測定した。メラニン量は、合成メラニン（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）を標準品として作成した検量線から算出した。また、タンパク質の定量を行い、全細胞のタンパク量でメラニン量を除することによって単位タンパク量あたりのメラニン量を算出した。【００５６】
表６は、ソーヤサポゲノール粉末におけるマウスＢ１６メラノーマ細胞に対するメラニン生成抑制作用をコントロールにおける単位タンパク量当たりのメラニン生成量を１００としたときの相対値として評価した結果を示したものである。試料添加は各群ｎ＝３で試験を実施し、結果はそれぞれの平均値で示している。なお、統計処理については、試料未添加の対照群に対するＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ  検定を実施し、５％未満の危険率の場合＊を、１％未満の危険率の場合＊＊をつけた。【００５７】
【表６】
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【００５８】
表６に示されるように、試料濃度が高くなるにつれてメラニン生成抑制作用が向上していった。ソーヤサポゲノール粉末０．２０μｇ／ｍＬといった低濃度の段階から陰性コントロールと比較して危険率１％未満で有意なメラニン生成抑制作用が認められた。また、白色度スコアもソーヤサポゲノール０．２０μｇ／ｍＬの段階から改善されており、このことからソーヤサポゲノールはメラノーマ細胞においてメラニン生成抑制作用が明らかとなった。
【国際調査報告】
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