(57)【要約】  本発明は、新規なノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質および当該タンパク質をコードする核酸を提供する。本発明はさらに、当該タンパク質をコードする核酸を含むベクター、および当該ベクターで形質転換した宿主細胞を提供すると共に、組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を製造する方法を提供する。本発明はまた、当該タンパク質を特異的に認識する抗体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−５１１、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、単離されたタンパク質。
【請求項２】
ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する単離されたタンパク質であって：
（ａ）配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−５１１、からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−５１１、からなる群より選択されるアミノ酸配列と９７％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
を含んでなる、前記単離されたタンパク質。
【請求項３】
配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、からなる群より選択される塩基配列を含んでなる核酸によってコードされる、単離されたタンパク質。
【請求項４】
ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する単離されたタンパク質であって：
（ａ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、からなる群より選択される塩基配列において、１または複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を含む塩基配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、からなる群より選択される塩基配列と９７％以上の同一性を有する塩基配列；または、
（ｃ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列；
を含んでなる核酸によってコードされる、前記単離されたタンパク質。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質であって、前記タンパク質はノイラミニダーゼ活性を有しており、ここで、該ノイラミニダーゼ活性は、糖鎖の非還元末端にα２，６結合で存在するシアル酸残基を選択的に切断する活性である、前記タンパク質。
【請求項６】
ノイラミニダーゼ活性についての反応至適ｐＨが、ｐＨ５．０〜ｐＨ７．０の範囲である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質。
【請求項７】
ノイラミニダーゼ活性についての反応至適温度が、２５℃〜４０℃の範囲である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質。
【請求項８】
β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性についての反応至適ｐＨが、ｐＨ４．０〜ｐＨ９．０の範囲である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質。
【請求項９】
β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性についての反応至適温度が、３０℃〜４０℃の範囲である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１０】
フォトバクテリウム属に属する微生物由来である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１１】
配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−５１１、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項１２】
ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸であって：
（ａ）配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−５１１、からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−５１１、からなる群より選択されるアミノ酸配列と９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
を含んでなるタンパク質をコードする、前記単離された核酸。
【請求項１３】
配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、からなる群より選択される塩基配列を含んでなる、前記単離された核酸。
【請求項１４】
ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸であって：
（ａ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、からなる群より選択される塩基配列において、１または複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を含む塩基配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、からなる群より選択される塩基配列と９７％以上の同一性を有する塩基配列；または
（ｃ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列；
を含んでなる、前記単離された核酸。
【請求項１５】
請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項１７】
ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する組換えタンパク質の製造方法であって、以下の工程：
１）請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載の核酸を含んでなる発現ベクターで宿主細胞を形質転換し；
２）得られた形質転換細胞を培養し；そして、
３）培養した形質転換細胞またはその培養上清から、ノイラミニダーゼおよび／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質を単離する；
ことを含んでなる、前記製造方法。
【請求項１８】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のタンパク質を特異的に認識する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質、当該タンパク質をコードする核酸、当該タンパク質をコードする遺伝子で形質転換した微生物を用いる当該酵素の製造方法、および当該タンパク質を特異的に認識する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖とは種々の糖、例えばガラクトースやＮ−アセチルグルコサミン等の単糖で構成される化合物である。糖タンパク質や糖脂質等の糖鎖（以下、複合糖質糖鎖）は、生体内において非常に重要な機能を有している。これまでの研究により、糖鎖の中でもとりわけ、シアル酸という単糖を含む糖鎖が、重要な機能を発現すると考えられている。例えば、主に哺乳類細胞において、シアル酸を含む糖鎖は分化や発生における細胞間および細胞−細胞外マトリックス間のシグナル伝達や複合糖質のタグとして機能する重要な分子であることや、シアル酸を含有する複合糖質が、脳や神経細胞におけるシナプス形成、神経発達ひいては学習能力の向上に深く関与することが示されている。シアル酸は、ノイラミン酸のアシル誘導体の総称で、その構造中にカルボキシル基を有する酸性単糖の一種である。これまでに５０種類以上の分子種が確認されており、それらは主に哺乳動物、棘皮動物や細菌などから見出されている。これまでに知られている代表的なシアル酸として、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、デアミノノイラミン酸（ＫＤＮ）が挙げられる。これらシアル酸の中で、通常ヒトの生体内に認められるシアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸のみである。特殊な例として、一部のがん化した細胞においてＮ−グリコリルノイラミン酸が存在することが知られている。【０００３】
ノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）は、複合糖質糖鎖の非還元末端に存在するシアル酸残基を遊離させる反応を触媒する酵素である。これまでに動物、微生物、ウイルス等から、多くのノイラミニダーゼタンパク質が見つかっており、また、ノイラミニダーゼタンパク質をコードする遺伝子がクローニングされている。シアル酸の結合様式としては、α２，３結合、α２，６結合、α２，８結合の３種類が知られているが、これまでに報告されているノイラミニダーゼは、シアル酸の結合様式に関係なく、シアル酸を含む複合糖質糖鎖よりシアル酸を切断する場合がほとんどである。少数の例外として、結合様式がα２，３結合であるシアル酸を半選択的に切断するノイラミニダーゼの報告もあるが、結合様式がα２，６結合であるシアル酸を選択的または優先的に切断するノイラミニダーゼに関しては、これまでに報告例はない。【０００４】
糖転移酵素は、生体内において複合糖質糖鎖の生合成に関与する酵素である。糖蛋白質や糖脂質などの糖鎖中に見出されるシアル酸は、シアル酸転移酵素と呼ばれる一群の糖転移酵素によって糖受容体基質となるそれぞれの糖鎖に転移される。【０００５】
これまでに報告されているシアル酸転移酵素はいくつかのグループに分類されているが、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素及びその遺伝子に関して、動物、特に哺乳類由来のものが多く報告されている（Hamamoto, T. , et al., Bioorg. Med. Chem., 1, 141−145 (1993); Weinstein, J. , et al., J. Biol. Chem., 262, 17735−17743 (1987)）。しかし、これらの動物由来の酵素は極めて糖受容体基質特異性が高く、生体内においてシアル酸を転移できる糖鎖構造は限られている。すなわち、シアル酸転移酵素の反応の結果、生じる糖蛋白質、糖脂質はきわめて限定される。一方、海洋性細菌由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素及びその遺伝子としては、フォトバクテリウム・ダムセラ（Photobacterium damselae）に属する微生物から分離されたものが報告されている（国際公開第ＷＯ９８／３８３１５号；米国特許６２５５０９４号公報、Yamamoto, T., et al., J. Biochem., 120, 104−110 (1996)）。これら海洋性微生物由来のシアル酸転移酵素は、上述の動物由来の酵素と比較して、極めて糖受容体基質特異性が広く、動物由来のシアル酸転移酵素ではシアル酸を転移できない糖鎖にもシアル酸を転移できることが示されている。すなわち、動物細胞内で微生物由来のシアル酸転移酵素を発現させた場合、細胞内で生じる糖タンパク質、糖脂質の構造はきわめて広範囲にわたることが期待できる。【０００６】
しかし、これまでに知られている多くの海洋性微生物由来シアル酸転移酵素の至適反応温度は３０℃以下であり、それ以上の温度領域では急速にその酵素活性が失われることが示されている。一般に、哺乳動物細胞の生育の至適温度は３７℃付近であるため、海洋性細菌由来のシアル酸転移酵素を組み込んだ発現ベクターを用いて動物細胞を形質転換し、その動物細胞を適正な環境下で成育させた場合において、それらの細胞内で海洋性微生物由来のシアル酸転移酵素蛋白質が発現しても酵素活性が得られない、という問題がある。そこで、反応至適温度が動物細胞の生育温度に近い海洋性微生物由来のシアル酸転移酵素およびその遺伝子が求められている。また、新たなシアル酸含有糖鎖の機能を明らかにする上で、糖鎖の合成は重要であるが、未だ糖鎖の合成には問題点が多い。この問題を解決する手段の一つとして、これまでに非常に多くの遺伝子が取得され組換え酵素として発現されている動物由来の各種糖転移酵素と、糖受容体基質特異性が広く且つ至適温度が３７℃付近である微生物由来のシアル酸転移酵素を組み合わせることが考えられるが、これまでのところ、その至適温度を３７℃付近に有する海洋性微生物由来のシアル酸糖転移酵素の報告は無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ９８／３８３１５号パンフレット
【特許文献２】米国特許６２５５０９４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hamamoto, T. , et al., Bioorg. Med. Chem., 1, 141−145 (1993)
【非特許文献２】Weinstein, J. , et al., J. Biol. Chem., 262, 17735−17743 (1987)
【非特許文献３】Yamamoto, T., et al., J. Biochem., 120, 104−110 (1996)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、ビブリオ科フォトバクテリウム属に属する微生物に由来する、ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する新規なタンパク質、及びそれをコードする核酸を提供することである。更に具体的には、本発明は、α２，６結合のシアル酸を特異的に切断するノイラミニダーゼ活性、および／または、反応至適温度が３０℃から４０℃であるβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する新規なタンパク質、及びそれをコードする核酸を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは日本全国から４，０００菌株以上の微生物を分離し、その性質について鋭意研究に努めた結果、フォトバクテリウム（Photobacterium）属に属する微生物の菌株から、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を生産する菌株を見出した。次に公知の遺伝子であるフォトバクテリウム・ダムセラ（Photobacterium damselae）ＪＴ０１６０株由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子やフォトバクテリウム・レイオグナシィ（Photobacterium leiognathi）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子等のＤＮＡ配列情報を参考にプローブを作成し、当該菌株から新規なα２，６−シアル酸転移酵素遺伝子をクローニングした。この新規遺伝子を大腸菌で発現させた結果、当該遺伝子はβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードし、その酵素タンパク質の反応至適温度が３０℃から４０℃であることを見出した。この新規な組換え酵素を精製し詳細に解析した結果、本組換え酵素は、シアル酸を単糖や糖鎖中のガラクトース残基、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基などにα２，６結合で効率よく転移させることも見出し、さらに本組換え酵素は、α２，６結合しているシアル酸を特異的に切断するノイラミニダーゼ活性をも有することを見出し、本発明を完成させた。本発明は至適反応温度が３５℃から４０℃である、新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素であり、および／またはα２，６結合しているシアル酸を特異的に切断するノイラミニダーゼを提供し、そして、当該酵素をコードする核酸、ならびに、当該酵素活性を有するポリペプチドを製造する方法を提供する。【００１１】
すなわち、本発明は以下の通りである。【００１２】
態様１：配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−５１１、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、単離されたタンパク質。【００１３】
態様２：ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する単離されたタンパク質であって：
（ａ）配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−５１１、からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−５１１、からなる群より選択されるアミノ酸配列と９７％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
を含んでなる、前記単離されたタンパク質。【００１４】
態様３：配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、からなる群より選択される塩基配列を含んでなる核酸によってコードされる、単離されたタンパク質。【００１５】
態様４：ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する単離されたタンパク質であって：
（ａ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、からなる群より選択される塩基配列において、１または複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を含む塩基配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、からなる群より選択される塩基配列と９７％以上の同一性を有する塩基配列；または、
（ｃ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列；
を含んでなる核酸によってコードされる、前記単離されたタンパク質。【００１６】
態様５：請求項１ないし４のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質であって、前記タンパク質はノイラミニダーゼ活性を有しており、ここで、該ノイラミニダーゼ活性は、糖鎖の非還元末端にα２，６結合で存在するシアル酸残基を選択的に切断する活性である、前記タンパク質。【００１７】
態様６：ノイラミニダーゼ活性についての反応至適ｐＨが、ｐＨ５．０〜ｐＨ７．０の範囲である、態様１ないし４のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。【００１８】
態様７：ノイラミニダーゼ活性についての反応至適温度が、２５℃〜４０℃の範囲である、態様１ないし４のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。【００１９】
態様８：β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性についての反応至適ｐＨが、ｐＨ４．０〜ｐＨ９．０の範囲である、態様１ないし４のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。【００２０】
態様９：β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性についての反応至適温度が、３０℃〜４０℃の範囲である、態様１ないし４のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。【００２１】
態様１０：フォトバクテリウム属に属する微生物由来である、態様１ないし４のいずれか１つに記載の単離されたタンパク質。【００２２】
態様１１：配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−５１１、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする、単離された核酸。【００２３】
態様１２：ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸であって：
（ａ）配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−５１１、からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−５１１、からなる群より選択されるアミノ酸配列と９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
を含んでなるタンパク質をコードする、前記単離された核酸。【００２４】
態様１３：配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、からなる群より選択される塩基配列を含んでなる、前記単離された核酸。【００２５】
態様１４：ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸であって：
（ａ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、からなる群より選択される塩基配列において、１または複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を含む塩基配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、からなる群より選択される塩基配列と９７％以上の同一性を有する塩基配列；または
（ｃ）配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列；
を含んでなる、前記単離された核酸。【００２６】
態様１５：態様１１ないし１４のいずれか１つに記載の核酸を含んでなる発現ベクター。【００２７】
態様１６：態様１５に記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。【００２８】
態様１７：ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する組換えタンパク質の製造方法であって、以下の工程：
１）態様１１ないし１４のいずれか１つに記載の核酸を含んでなる発現ベクターで宿主細胞を形質転換し；
２）得られた形質転換細胞を培養し；そして、
３）培養した形質転換細胞またはその培養上清から、ノイラミニダーゼおよび／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質を単離する；
ことを含んでなる、前記製造方法。【００２９】
態様１８：態様１ないし１０のいずれか１つに記載のタンパク質を特異的に認識する抗体。
【発明の効果】
【００３０】
本発明は、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する新規なタンパク質およびそれをコードする核酸を提供することにより、生体内において重要な機能を有することが明らかにされている糖鎖の合成・生産手段を提供するという観点において貢献する。シアル酸は、生体内の複合糖質糖鎖において非還元末端に存在することが多く、糖鎖機能という観点から極めて重要な糖である。このため、シアル酸転移酵素は糖転移酵素の中でも最も需要が高い酵素の一つであり、本発明の新規なシアル酸転移酵素の提供は、そのような高い需要に応えるものである。本発明のタンパク質はまた、α２，６結合しているシアル酸を特異的に切断するノイラミニダーゼ活性をも有する。α２，６結合しているシアル酸を選択的に切断するノイラミニダーゼは、本発明により初めて見出されたものである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１−１】図１−１は、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子（配列番号３）を含む発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養し、得られた菌体から調製した粗酵素液を、ピリジルアミノ化ラクトース（ＰＡ−ラクトース）およびＣＭＰ−シアル酸に反応させた反応溶液のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。保持時間が３．７３９分のピークはＰＡ−ラクト−ス、４．０２５分のピークはＰＡ−６’−シアリルラクトースである。
【図１−２】図１−２は、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子（配列番号３）を含む発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養し、得られた菌体から調製した粗酵素液を、ピリジルアミノ化ラクトースと混合させた場合のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。図１−１の実験に対してシアル酸供与体であるＣＭＰ−シアル酸を反応液に混合していない対照実験の結果である。保持時間が３．７４２分のピークはＰＡ−ラクトースである。
【図１−３】図１−３は、ＰＡ−ラクトースの標品のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。ＰＡ−ラクトースは、保持時間３．７４２分のピークとして現れる。
【図１−４】図１−４は、公知の酵素であるPhotobacterium damselae JT0160株由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をＰＡ−ラクトースおよびＣＭＰ−シアル酸に反応させた反応溶液（ピリジルアミノ化α２，６−シアリルラクトースが生成されている）のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。保持時間が３．７４５分のピークはＰＡ−ラクトース、４．０６０分のピークはＰＡ−６’−シアリルラクトースである。
【図１−５】図１−５は、公知の酵素であるPhotobacterium damselae JT0160株由来のα２，６−シアル酸転移酵素をＰＡ−ラクトースに反応させた反応溶液のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。図１−４の実験に対し、ＣＭＰ−シアル酸を反応液に混合していない対照実験である。保持時間が３．７４５分のピークはＰＡ−ラクト−スである。
【図２−１】図２−１は、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来の組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０（配列番号４）の酵素活性における反応ｐＨの影響を示すグラフである。用いた緩衝液の種類、ｐＨ範囲は以下の通りである。酢酸バッファー（ｐＨ４．０−５．０）、カコジル酸バッファー（ｐＨ５．０−６．０）、ビス−トリスバッファー（ｐＨ６．０−７．０）、リン酸バッファー（ｐＨ７．０−８．０）、ＴＡＰＳバッファー（ｐＨ８．０−９．０）、ＣＨＥＳバッファー（ｐＨ９．０−１０．０）、ＣＡＰＳバッファー（ｐＨ１０．０−１１．０）。
【図２−２】図２−２は、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来の組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０（配列番号４）の酵素活性における反応温度の影響を示すグラフである。
【図３−１】図３−１は、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子（配列番号３）を含む発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養し、得られた菌体から調製した精製酵素液を、ピリジルアミノ化ラクトース（ＰＡ−ラクトース）およびＣＭＰ−シアル酸に反応させ、経時的にサンプリングした反応溶液のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。保持時間が３．７３７〜３．７３９分のピークはＰＡ−ラクトース、４．０１８分のピークはＰＡ−６’−シアリルラクトースである。
【図３−２】図３−２は、シアル酸の結合様式がα２，６結合であるPA-Sugar Chain 023、PA-Sugar Chain 022、PA-Sugar Chain 021標品およびシアル酸を有さないPA-Sugar Chain 001標品（いずれもタカラバイオ製）のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。各々、保持時間が２５．１９６分、１９．２１０分、２１．８７７分、１３．８６３分のピークとして検出される。
【図３−３】図３−３は、シアル酸の結合様式がα２，３結合であるPA-Sugar Chain 029標品およびシアル酸を有さないPA-Sugar Chain 026標品（いずれもタカラバイオ製）のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。各々、保持時間が４．８４７分および３．７３０分のピークとして検出される。
【図３−４】図３−４は、シアル酸の結合様式がα２，８結合であるPA-Sugar Chain 034標品（タカラバイオ製）のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。保持時間が５．３３３分のピークとして検出される。
【図３−５】図３−５は、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子（配列番号３）を含む発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養し、得られた菌体から調製した精製酵素液を、PA-Sugar Chain 023と反応させた場合のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。保持時間が１３．８６６分のピークはPA-Sugar Chain 001に相当するピークである。
【図３−６】図３−６は、PA-Sugar Chain 023標品をバッファーと反応させた場合ののＨＰＬＣ分析結果を示す図である。図３−３の実験に対する対照実験の結果である。PA-Sugar Chain 023は保持時間が２５．２０８分のピークとして現れる。
【図３−７】図３−７は、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子（配列番号３）を含む発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養し、得られた菌体から調製した精製酵素液を、PA-Sugar Chain 029と反応させた場合のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。保持時間が４．８５６分のピークはPA-Sugar Chain 029に相当するピークである。
【図３−８】図３−８はＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子（配列番号３）を含む発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養し、得られた菌体から調製した精製酵素液を、PA-Sugar Chain 034と反応させた場合のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。保持時間が５．３３４分のピークはPA-Sugar Chain 034に相当するピークである。
【図４−１】図４−１は、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来の組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０（配列番号４）が有するノイラミニダーゼ活性について、該酵素活性における反応ｐＨの影響を示すグラフである。用いた緩衝液の種類、ｐＨ範囲は以下の通りである。酢酸バッファー（ｐＨ４．０−５．０）、カコジル酸バッファー（ｐＨ５．０−６．０）、ビス−トリスバッファー（ｐＨ６．０−７．０）、リン酸バッファー（ｐＨ７．０−８．０）、ＴＡＰＳバッファー（ｐＨ８．０−９．０）、ＣＨＥＳバッファー（ｐＨ９．０−１０．０）、ＣＡＰＳバッファー（ｐＨ１０．０−１１．０）。
【図４−２】図４−２は、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来の組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０（配列番号４）が有するノイラミニダーゼ活性について、該酵素活性における反応温度の影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００３３】
定義
本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。
【００３４】
本明細書においてタンパク質、核酸または抗体等の分子について「単離された」とは、当該分子の天然状態で付随する成分を実質的に含まない状態であることを意味する。そのような状態としては、例えば、当該分子を天然に産生する種由来の他の分子を実質的に含まない状態、当該分子を天然に産生する種とは異なる種の細胞もしくは確立された培養細胞系によって発現される状態、または化学的に合成される状態、などが挙げられる。また、分子が「単離された」状態にある場合には、当該分子は当該技術分野において周知の技術により、天然状態で付随する成分を実質的に含まないように精製されていてもよい。本明細書において、ある成分を「実質的に含まない」とは、天然状態と比較して当該成分の含有量が減少している状態を意味する。ある成分を「実質的に含まない」状態には、例えば、当該成分を完全に含まない場合、検出限界以下の量で含む場合、または、含有量が天然状態の１％以下、５％以下、１０％以下、２５％以下、５０％以下、７５％以下もしくは９０％以下に低減されている場合が含まれる。
【００３５】
本明細書において「タンパク質」とは、ペプチド結合によって互いに連結している２以上のアミノ酸残基を含んでなる分子を意味する。また、本明細書において「タンパク質」の語は、「ポリペプチド」とも記載され得る。
【００３６】
本明細書において「核酸」とは、２以上のヌクレオチドで構成されるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を意味する。また、本明細書において「核酸」の語は、「ポリヌクレオチド」とも記載され得る。ＤＮＡの塩基配列で記載された核酸についてＲＮＡが意図される場合には、ＤＮＡの塩基配列のチミンをウラシルに置き換えて理解すべきであることは当業者に理解されよう。
【００３７】
本明細書において「β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素」とは、シチジン１リン酸（ＣＭＰ）−シアル酸からシアル酸を、複合糖質糖鎖もしくは遊離の糖鎖中のガラクトース残基の６位、ラクトースもしくはＮ−アセチルラクトサミンなどのオリゴ糖に存在するガラクトースの６位、またはガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミンもしくはマンノースなどの複合糖質を構成しうる単糖であって６位の炭素に水酸基を有する単糖の６位、に転移させる活性を有するタンパク質を意味する。本明細書において「β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性」とは、β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素について上述した活性を意味する。
【００３８】
本明細書において「ノイラミニダーゼ」とは、複合糖質糖鎖または遊離の糖鎖中の非還元末端に存在するシアル酸を当該糖鎖から切断する活性を有するタンパク質を意味する。また、ノイラミニダーゼは、当該技術分野においてシアリダーゼとも称される。シアル酸と糖鎖の結合様式としては、α２，３結合、α２，６結合、およびα２，８結合の３種類が知られている。したがって、ノイラミニダーゼは、シアル酸と糖鎖の間のα２，３結合、α２，６結合、およびα２，８結合からなる群より選択される少なくとも１つの結合を切断する活性を有していてもよい。また、本明細書において「ノイラミニダーゼ活性」とは、タンパク質についての活性であって、複合糖質糖鎖または遊離の糖鎖中の非還元末端に存在するシアル酸を当該糖鎖から切断する反応を触媒する活性を意味する。好ましい態様において、本発明のタンパク質は、シアル酸と糖鎖の間のα２，６結合を選択的に切断するノイラミニダーゼ活性を有していてもよい。
【００３９】
本明細書において、「ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質」とは、ノイラミニダーゼ活性またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性のいずれか一方を有するタンパク質、または両方の活性を有するタンパク質を含んでいてよい。
【００４０】
本明細書において「シアル酸」とは、シアル酸ファミリーに属するノイラミン酸誘導体を示す。具体的には、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、５−デアミノ−５−ヒドロキシノイラミン酸（ＫＤＮ）、ジシアル酸（ジＮ−アセチルノイラミン酸：Ｎｅｕ５Ａｃα２，８（９）Ｎｅｕ５Ａｃ）などを示す。
【００４１】
本明細書において「ベクター」とは、それに連結させた核酸を宿主細胞内に導入するために用いることが可能な核酸である。また、「発現ベクター」は、ベクターにより導入された核酸がコードするタンパク質の発現を導くことが可能なベクターである。ベクターには、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が含まれる。
【００４２】
本明細書において、「宿主細胞」とは、ベクターにより遺伝子導入または形質転換を受ける細胞を意味する。宿主細胞は、使用するベクターに応じて当業者が適切に選択することが可能である。宿主細胞は、例えば、大腸菌（E.coli）などの原核生物由来であることが可能であり、あるいは、酵母などの単細胞真核生物、植物細胞、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞または昆虫細胞）などの、真核生物由来の細胞であることが可能である。
【００４３】
タンパク質
本発明は、ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する、新規なタンパク質を提供する。
【００４４】
一態様において、本発明のタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質である。また、本発明のタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であってもよい。配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列において、１−１５番目のアミノ酸配列を除去し、そのＮ末端にメチオニンを付加した配列である。後述の実施例２において示すように、配列番号４のアミノ酸を含んでなるタンパク質（ＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０）も、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質（ＳＨＩＺ１１９−Ｎ０Ｃ０）と同様のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を保持した。このことは、配列番号２のうち少なくともアミノ酸１６−５１１が存在すればβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の活性を保持しうることを示すものである。よって、本発明のタンパク質は、配列番号２のアミノ酸１−５１１中のアミノ酸１−１５の全部又は一部を欠失しているアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、あるいは、配列番号２のアミノ酸１６−５１１のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であってもよい。
【００４５】
別の態様において本発明のタンパク質は、配列番号１の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質である。また、本発明のタンパク質は配列番号３の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であってもよい。配列番号３の塩基配列は、配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６の塩基配列の５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）を付加した配列に相当する。配列番号１および配列番号３の塩基配列は、それぞれ、配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列をコードする。したがって、配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６の塩基配列は、配列番号１のアミノ酸１６−５１１をコードする。よって、本発明のタンパク質は、配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であってもよい。
【００４６】
本発明はまた、上記の本発明のタンパク質の変異体であって、ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する変異体タンパク質をも包含する。このような変異体タンパク質もまた、本発明のタンパク質に含まれる。
【００４７】
本発明の変異体タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号２のアミノ酸１６−５１１からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。置換は保存的置換であってもよく、これは特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、ＧｌｎおよびＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。
【００４８】
アミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加による変異体は、野生型タンパク質をコードするＤＮＡに、例えば周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, p.6487−6500, 1982参照、引用によりその全体を本明細書に援用する）を施すことにより作成することができる。本明細書において、「１または複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入および／または付加できる程度のアミノ酸を意味し、限定するものではないが、好ましくは20個以下、15個以下、10個以下、または7個以下、より好ましくは5個以下である。
【００４９】
部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天にプレーティングし、ファージを含有する単一細胞からプラークを形成させる。そうすると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養してＤＮＡを回収する。
【００５０】
なお、酵素などの生物活性ポリペプチドのアミノ酸配列にその活性を保持しつつ１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、および遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、置換、挿入または付加し、次いで連結する方法もある。
【００５１】
本発明の変異体タンパク質はまた、配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６からなる群より選択される塩基配列において、１または複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を含む塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であって、ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。ヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加は、部位特異的変位誘発のほか上述した方法により行うことができる。
【００５２】
本発明の変異体タンパク質はさらに、配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−５１１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上または９９．５％、より好ましくは９９．８％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。
【００５３】
または、本発明の変異体タンパク質は、配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６からなる群より選択される塩基配列と、少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上または９９．５％、より好ましくは９９．８％以上の同一性を有する核酸によってコードされるタンパク質であって、ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。
【００５４】
２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Needleman, S. B. 及びWunsch, C. D. （J. Mol. Biol., 48: 443−453, 1970）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Henikoff, S. 及びHenikoff, J. G. （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915−10919, 1992）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００５５】
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばAltschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389−3402, 1997）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）、あるいはDNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。または、２つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス製）などのプログラム、または、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。その際、検索はデフォルト値を用いてよい。
【００５６】
２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（unary）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、SchwartzおよびDayhoff監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Atlas of Polypeptide Sequence and Structure）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、GribskovおよびBurgess, Nucl. Acids Res., 14: 6745, 1986の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（WoottonおよびFederhenのＳＥＧプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；WoottonおよびFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」Methods Enzymol., 266: 544−71も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ClaverieおよびStates（Computers and Chemistry, 1993）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（KarlinおよびAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００５７】
本発明の変異タンパク質はまた、配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質であって、ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質であってもよい。
【００５８】
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第３版，第６−７章，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Stark’s solution）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および例えば、約４０℃−６０℃、０．５−６×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。高度にストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。
【００５９】
一般に、高度にストリンジェントな条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６５℃−６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。
【００６０】
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ECL direct labeling & detection system（Amersham社製）を使用したハイブリダイゼーション等が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションとしては、例えば、キット中のハイブリダイゼーションバッファーにブロッキング試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、４２℃で４時間行い、洗浄は、０．４％  ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ中で、５５℃で２０分を二回、２ｘＳＳＣ中で室温、５分を一回行う、という条件が挙げられる。
【００６１】
シアル酸転移酵素活性は、公知の手法、例えば、J. Biochem., 120, 104−110 (1996)（引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている方法で測定してもよい。例えば、糖供与体基質としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を、そして糖受容体基質としてラクトースを用いて酵素反応を行い、反応生成物であるシアリルラクトースの量を評価することで酵素活性を評価することができる。なお、シアル酸転移酵素についての酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に１マイクロモルのシアル酸を転移する酵素量である。
【００６２】
糖受容体基質に転移したシアル酸の結合様式の決定方法としては、限定するわけではないが、ピリジルアミノ化糖鎖を用いる手法、反応生成物の核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）による分析など、当業者に公知の手法のいずれかを用いて行うことができる。ピリジルアミノ化糖鎖を用いる手法は、ピリジルアミノ化糖鎖を糖受容体基質として酵素反応を行うことを含む。具体的には、ピリジルアミノ化ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ、タカラバイオ製）を糖受容体基質、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを糖供与体基質として用いて酵素反応を行い、反応生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、反応生成物の保持時間からシアル酸が転移された位置を特定する。
【００６３】
ノイラミニダーゼ活性は、公知の手法で測定してもよい。例えば、シアル酸含有糖鎖に対しノイラミニダーゼを作用させてシアル酸加水分解反応を行い、反応生成物である、シアル酸が脱離した糖鎖の量または遊離のシアル酸の量を評価することで酵素活性を評価することができる。なお、ノイラミニダーゼについての酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に１マイクロモルのシアル酸を遊離させる酵素量である。
【００６４】
ノイラミニダーゼの基質特異性、すなわち、当該ノイラミニダーゼが切断するシアル酸の糖鎖への結合様式を決定する方法としては、限定するわけではないが、ピリジルアミノ化糖鎖を用いる方法が挙げられる。より具体的には、シアル酸がα２，３結合、α２，６結合、α２，８結合しているＰＡ糖鎖（例えば、タカラバイオより市販されているPA-Sugar Chain 029、PA-Sugar Chain 023、PA-Sugar Chain 034などのピリジルアミノ化糖鎖）をそれぞれ基質に用いてノイラミニダーゼを作用させて酵素反応を行う。反応生成物を高速液体クロマトグラフィーで分析し、反応生成物の保持時間及びピーク面積から、シアル酸が切断された量を算出する。
【００６５】
本発明の一態様において本発明のタンパク質は、フォトバクテリウム属に属する微生物由来である。本発明のタンパク質は、フォトバクテリウム属に属する微生物であれば特に限定されるものではなく、フォトバクテリウム属に属する新種の微生物由来のタンパク質であってもよい。好ましい態様において、本発明のタンパク質はフォトバクテリウム・レイオグナシィ（Photobacterium leiognathi）に属する微生物由来である。
【００６６】
本発明のタンパク質は、以下に列挙する酵素学的性質および理化学的性質のいずれか１つを有することを特徴としてもよい。本発明のタンパク質のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性についての至適ｐＨは、特に限定されないが、ｐＨ４．０〜９．０の範囲、好ましくはｐＨ５．０〜９．０、ｐＨ５．０〜８．０、ｐＨ４．０〜８．０、ｐＨ４．０〜６．０、ｐＨ４．５〜６．０、ｐＨ５．０〜６．０、さらに好ましくはｐＨ５．０である。本発明のタンパク質のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性についての至適温度は、特に限定されないが、３０℃〜４０℃の範囲であり、好ましくは、３５℃〜４０℃、３５℃〜３８℃、さらに好ましくは３５℃である。本発明のタンパク質のノイラミニダーゼ活性についての至適ｐＨは、特に限定されないが、ｐＨ５．０〜ｐＨ７．０の範囲、好ましくはｐＨ６．０〜７．０、さらに好ましくはｐＨ６．０である。本発明のタンパク質のノイラミニダーゼ活性についての至適温度は、特に限定されないが、２５℃〜４０℃の範囲、好ましくは３０℃〜４０℃、さらに好ましくは３５℃である。また、本発明のタンパク質の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で５０，０００±５，０００Ｄａ程度である。
【００６７】
また、本発明のタンパク質には以下のタンパク質も含まれる。
（１）配列番号２、配列番号２のアミノ酸１６−５１１、配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（２）配列番号２、配列番号２のアミノ酸１６−５１１、配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列と９７％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（３）配列番号１、配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、配列番号３からなる群より選択される塩基配列と、９７％以上の同一性を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質；または
（４）配列番号１、配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、配列番号３からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質。
【００６８】
なお、本発明のタンパク質は、ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するが、シアル酸転移酵素活性の方がノイラミニダーゼ活性よりも比活性が大きいため、ＣＭＰ−シアル酸を添加した反応系ではＣＭＰ−シアル酸がシアル酸転移酵素として機能し、シアル酸が結合した糖鎖をつくることができる。
【００６９】
また、ＣＭＰ−シアル酸が反応系に存在しない場合は、シアル酸転移酵素活性は機能しないため、本発明のタンパク質はノイラミニダーゼとしてのみ働き、シアル酸結合糖鎖からシアル酸を加水分解することができる。
【００７０】
核酸
本発明は、ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸を提供する。
【００７１】
一態様において、本発明の核酸は、配列番号２、配列番号４（配列番号２のアミノ酸１−１５のアミノ酸配列を除去しそのＮ末端にメチオニンを付加した配列）、および配列番号２のアミノ酸１６−５１１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする核酸である。本発明の核酸はまた、配列番号１、配列番号３（配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６の塩基配列の５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）を付加した配列）、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６からなる群より選択される塩基配列を含んでなる核酸であってもよい。
【００７２】
本発明の核酸は、上記の核酸の変異体であって、ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。そのような核酸の変異体もまた、本発明の核酸に含まれる。
【００７３】
そのような核酸の変異体は、配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−５１１からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質、をコードする核酸である。本発明の核酸の変異体はまた、配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６からなる群より選択される塩基配列において、１またはそれより多くのヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を含む塩基配列を含んでなる核酸である。アミノ酸またはヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／付加は、上述した方法により導入することができる。
【００７４】
また、そのような核酸の変異体は、配列番号２、配列番号４、および配列番号２のアミノ酸１６−５１１からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上または９９．５％、より好ましくは９９．８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質、をコードする核酸である。本発明の核酸の変異体はまた、配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６からなる群より選択される塩基配列と、少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上または９９．５％、より好ましくは９９．８％以上の同一性を有する核酸であって、該核酸はノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする、前記核酸である。ここで、アミノ酸配列または塩基配列の同一性は、上記に示した方法で決定することができる。
【００７５】
そのような核酸の変異体はさらに、配列番号１、配列番号３、および配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件、または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む核酸であって、該核酸はノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする、前記核酸であってもよい。ここで、ストリンジェントな条件または高度にストリンジェントな条件とは、上記で定義したとおりである。
【００７６】
また、本発明の核酸には以下の核酸も含まれる。
（１）配列番号２、配列番号２のアミノ酸１６−５１１、配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする核酸；
（２）配列番号２、配列番号２のアミノ酸１６−５１１、配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列と９７％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする核酸；
（３）配列番号１、配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、配列番号３からなる群より選択される塩基配列と、９７％以上の同一性を有する核酸；または
（４）配列番号１、配列番号１のヌクレオチド４６−１５３６、配列番号３からなる群より選択される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなる核酸。
【００７７】
本発明のタンパク質を発現する微生物
本発明者らは、ビブリオ科フォトバクテリウム属に属する微生物が新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を発現し、そして当該酵素がノイラミニダーゼ活性をも有することを見いだした。よって本発明は、ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質を発現する微生物を提供する。本発明の微生物は、フォトバクテリウム属に属し、ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有する微生物である。ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質を生産する能力を有するフォトバクテリウム属に属する微生物の例としては、フォトバクテリウム・レイオグナシィ（Photobacterium leiognathi)  ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株が挙げられる。なお、上記のフォトバクテリウム属の微生物は一般に海洋性細菌であり、海水中または海産の魚介類から分離される。
【００７８】
本発明の微生物は、例えば以下に説明するようなスクリーニング法を用いて分離することができる。海水、海砂、海泥あるいは海産魚介類を微生物源とする。海水、海砂、海泥はそのままもしくは滅菌海水で希釈し、接種源とする。海産魚介類は表面の粘液等をループで擦り採って接種源としたり、内臓器を滅菌海水中で磨砕した液を接種源としたりする。これらをマリンブロスアガー２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）や塩化ナトリウム添加ニュートリエントアガー培地（ベクトン・ディッキンソン製）などの平板培地上に塗布し、様々な温度条件下で生育する海洋性微生物を取得する。常法に従い、得られた微生物を純粋培養した後、マリンブロス２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）や塩化ナトリウム添加ニュートリエントブロス培地（ベクトン・ディッキンソン製）などの液体培地を用い、それぞれの微生物を培養する。微生物が十分生育した後に、培養液から菌体を遠心分離によって集める。集めた菌体に界面活性剤である０．２％トリトンＸ−１００（関東化学製）を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、菌体を懸濁する。この菌体懸濁液を氷冷下、超音波処理し細胞を破砕する。この細胞破砕液を酵素溶液として、常法にしたがってシアル酸転移活性を測定し、シアル酸転移活性を有する菌株を得ることができる。
【００７９】
本発明で記す反応温度が３５℃から４０℃という特徴を有するβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を生産するフォトバクテリウム属  ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株は上記のスクリーニング法を用いることで得られた。
【００８０】
本発明のタンパク質を製造する方法
本発明は、本発明のノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質を製造する方法にも関する。好ましい態様において本発明の方法は、本発明のタンパク質を生産する。
【００８１】
（1）組換えタンパク質を製造する方法
本発明は、本発明の核酸を含む発現ベクター、および当該発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。そして、本発明は、当該発現ベクターを含有する宿主細胞を、組換えタンパク質の発現に適する条件下で培養して、発現された組換えタンパク質を回収することによりノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する組換えタンパク質を製造する方法も提供する。
【００８２】
本発明の組換えタンパク質を製造するためには、使用する宿主に応じて選ばれた発現ベクターに、哺乳動物、微生物、ウィルス、または昆虫遺伝子等から誘導された適当な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に機能可能に連結した、ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を挿入する。調節配列の例として、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに、転写および翻訳の開始および終結を制御する適切な配列が挙げられる。
【００８３】
本発明のベクターに挿入される、ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸配列は、上述した本発明の核酸の塩基配列である。この配列は、リーダー配列を含んでいても、含んでいなくてもよい。リーダー配列を含む場合、配列番号１のヌクレオチド１−４２に相当するリーダー配列であってもよく、また他の生物源由来のリーダー配列に置き換えてもよい。リーダー配列を置き換えることによって、発現したタンパク質を宿主細胞の外に分泌させるように発現システムを設計することも可能である。
【００８４】
また、本発明のノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する組換えタンパク質は、当該タンパク質をコードする核酸に続いて、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧＴＭタグ（アミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１７）を含むタグ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどをコードする核酸を連結した核酸をベクターに挿入することにより、融合タンパク質として発現することも可能である。本発明の酵素をこのような融合タンパク質として発現させることにより、当該酵素の精製および検出を容易にすることができる。
【００８５】
本発明のタンパク質の発現に適する宿主細胞には、原核細胞、酵母または高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主で用いる適切なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Pouwelsら、Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)（引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている。
【００８６】
原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌または枯草菌が含まれる。大腸菌のような原核細胞を宿主として使用する場合、本発明のタンパク質は、原核細胞内での組換えポリペプチドの発現を容易にするためにＮ末端メチオニン残基を含むようにしてもよい。このＮ末端メチオニンは、発現後に組換えタンパク質から切り離すこともできる。
【００８７】
原核宿主細胞内で用いる発現ベクターは、一般に１または２以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するか、または独立栄養要求性を付与する遺伝子である。原核宿主細胞に適する発現ベクターの例には、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）のような市販のプラスミドまたはそれらから誘導されるものが含まれる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定するのが容易である。適切なプロモーターならびにβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素をコードする核酸のＤＮＡ配列が、このｐＢＲ３２２ベクター内に挿入される。他の市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals, スウェーデン、ウプサラ）およびｐＧＥＭ１（Promega Biotech.、米国、ウイスコンシン州、マディソン）などが含まれる。
【００８８】
原核宿主細胞用の発現ベクターにおいて通常用いられるプロモーター配列には、ｔａｃプロモーター、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）プロモーター、ラクトースプロモーター（Changら、Nature 275:615, 1978;およびGoeddelら、Nature 281:544, 1979、引用によりその全体を本明細書に援用する。）などが含まれる。
【００８９】
また、本発明の組換えタンパク質を酵母宿主内で発現させてもよい。好ましくは、サッカロミセス属（Saccharomyces、例えば、S. cerevisiae ）を用いるが、ピキア属（Pichia）またはクルイベロミセス属（Kluyveromyces）のような他の酵母の属を用いてもよい。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドからの複製起点の配列、自立複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能なマーカー遺伝子を含有することが多い。酵母α因子リーダー配列を用いて、組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素タンパク質の分泌を行わせることもできる。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適する他のリーダー配列も知られている。酵母を形質転換する方法は、例えば、Hinnenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929−1933, 1978（引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている。
【００９０】
哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系を用いて、本発明の組換えタンパク質を発現することもできる。哺乳動物起源の株化細胞系も用いることができる。哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳制御配列は、ウィルスゲノムから得ることができる。通常用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウィルス、アデノウイルス２などから誘導される。ＳＶ４０ウィルスゲノム、例えば、ＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、およびポリアデニル化部位から誘導されるＤＮＡ配列を用いて、哺乳動物宿主細胞内での構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を与えてもよい。哺乳動物宿主細胞内で用いるためのベクターは、例えば、OkayamaおよびBerg（Mol. Cell. Biol., 3: 280, 1983、引用によりその全体を本明細書に援用する。）の方法で構築することができる。
【００９１】
本発明のノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質を産生する１つの方法は、当該タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、当該タンパク質が発現する条件下で培養することを含む。次いで、用いた発現系に応じて当該タンパク質を培養培地または細胞抽出液から回収する。
【００９２】
ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する組換えタンパク質を精製する操作は、用いた宿主の型および本発明のタンパク質を培養培地中に分泌させるかどうかといった要因に従って適宜選択される。例えば、組換えタンパク質を精製する操作には、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、ハイドロキシアパタイトカラム、ＣＤＰ−ヘキサノールアミンアガロースカラム、ＣＭＰ−ヘキサノールアミンアガロースカラム、疎水性カラム等のカラムクロマトグラフィーおよびネイティブ−ＰＡＧＥ等、またはそれらの組み合わせが含まれる。また、組換えタンパク質に精製を容易にするタグなどを融合させて発現させた場合には、アフィニティークロマトグラフィーによる精製方法を利用してもよい。例えば、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧＴＭタグ、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などを融合させた場合には、それぞれ、Ｎｉ−ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）カラム、抗ＦＬＡＧ抗体を連結したカラム、またはグルタチオンを連結したカラム、などを用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００９３】
ノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有する組換えタンパク質は電気泳動的に単一バンドになるまで精製してもよいが、部分精製品でも十分な活性を有するため、本発明のβ−ガラクトシド−２，６−シアル酸転移酵素は精製品であってもよく、または部分精製品であってもよい。
【００９４】
抗体
本発明は、本発明のノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質に対する抗体を提供する。本発明の抗体は、本発明のタンパク質、またはそのフラグメント、に対して作製してもよい。ここで、本発明のタンパク質のフラグメントは、当該酵素のアミノ酸配列中、少なくとも６アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、または少なくとも３０アミノ酸を含む配列を有するフラグメントである。
【００９５】
抗体は、本発明のタンパク質またはそのフラグメントを、当該技術分野において抗体作製のために用いられる動物、例えば、限定されるわけではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギなどに免疫して作製してもよい。抗体はポリクローナル抗体であっても、またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、当業者に周知の抗体作製方法に基づいて作製することができる。
【００９６】
本発明の抗体のフラグメントもまた、本発明の抗体に含まれる。抗体のフラグメントとしては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')２、Ｆｖ、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むフラグメントが挙げられる。
【００９７】
本発明の抗体は、本発明のノイラミニダーゼ活性および／またはβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をアフィニティー精製により回収するのに用いることができる。本発明の抗体は、本発明のタンパク質を、ウエスタンブロッティングやＥＬＩＳＡなどのアッセイにおいて検出するのに用いることもできる。
【実施例】
【００９８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。【００９９】
実施例１：  β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を生産する微生物のスクリーニングと菌株の同定
（１）スクリーニング 
海水、海砂、海泥あるいは海産魚介類を接種源とした。この接種源をマリンブロスアガー２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）からなる平板培地上に塗布し、１５℃、２５℃もしくは３０℃で生育する微生物を取得した。常法に従い、得られた微生物を純粋培養した後、マリンブロス２２１６培地（ベクトン・ディッキンソン製）からなる液体培地を用いてそれぞれの微生物を培養した。微生物が十分成育した後に、培養液から菌体を遠心分離によって集めた。集めた菌体に、０．２％トリトンＸ−１００（関東化学製）を含む２０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、菌体を懸濁した。この菌体懸濁液を氷冷下、超音波処理し細胞を破砕した。この細胞破砕液を粗酵素溶液としてシアル酸転移活性を測定し、シアル酸転移活性を有する菌株ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株を得た。【０１００】
シアル酸転移活性は、J. Biochem., 120, 104−110 (1996) （引用によりその全体を本明細書に援用する）に記載されている方法で測定した。具体的には、糖供与体基質ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（７０ｎｍｏｌ、１４ＣでＮｅｕＡｃをラベルしたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ  約２０，０００ｃｐｍを含む。ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を表す）、糖受容体基質としてラクトース（１．２５μｍｏｌ）、ＮａＣｌを０．５Ｍ濃度になるように添加し、および上記に記した方法で調製した酵素を含む反応溶液（３０μｌ）を用いて酵素反応を行った。酵素反応は２５℃で１０分間から１８０分間程度行った。反応終了後、反応溶液に１．９７ｍｌの５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加え、この溶液をＤｏｗｅｘ１×８（ＰＯ４３−  フォーム、０．２×２ｃｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ製）カラムに供した。このカラムの溶出液（０〜２ｍｌ）に含まれる反応生成物、すなわち、シアリルラクトースに含まれる放射活性を測定することで、酵素活性を算出した。酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に１マイクロモルのシアル酸を転移する酵素量である。【０１０１】
次に、シアル酸の結合様式を明らかにするために、ＰＡ−ラクトースを基質とする反応を行った。得られた粗酵素液を用い、ピリジルアミノ化糖鎖を糖受容体基質として酵素反応を行った。ピリジルアミノ化糖鎖としては、ピリジルアミノ化ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ、タカラバイオ製）を用い分析した。５μｌの粗酵素液に１．５μｌの５ｍＭ  ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃおよび１．５μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌ糖受容体基質を加え、２５℃下で１８時間反応させた。反応終了後、１００℃で２分間反応溶液を処理することにより酵素を失活させた。その後、ＨＰＬＣで反応生成物の分析を行った。ＨＰＬＣシステムとしてShimadzu LC10A（島津製作所製）を用い、分析カラムにはTakara PALPAK Type R（タカラバイオ製）を用いた。０．１５％  Ｎ−ブタノールを含む１００ｍＭ  酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ５．０）で平衡化したカラムに７２μｌの溶出液Ａ（１００ｍＭ  酢酸−トリエチルアミン、ｐＨ５．０）を加えた反応液を注入した。ピリジルアミノ化糖鎖の溶出には溶出液Ａ（１００ｍＭ  酢酸−トリエチルアミン、ｐＨ５．０）および溶出液Ｂ（０．５％、ｎ−ブタノールを含む１００ｍＭ  酢酸−トリエチルアミン、ｐＨ５．０）を用い、３０〜５０％溶出液Ｂの直線濃度勾配法（０〜２０分）および１００％溶出液Ｂ（２１〜３５分）により、順次ピリジルアミノ化糖鎖を溶出した。なお、分析は以下の条件で行った（流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出：蛍光（Ｅｘ：３２０ｎｍ、Ｅｍ：４００ｎｍ））。その結果、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株はβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有することが明らかとなった（図１−１〜図１−５）。【０１０２】
（２）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析によるＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株の細菌学的同定
ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株から、常法により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列を増幅し、塩基配列を決定した。【０１０３】
ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列はフォトバクテリウム・レイオグナシィ（Photobacterium leiognathi）基準株ＡＴＣＣ２５５２１の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列に最も相同性が高く、その相同率は９９．８％であることが明らかとなった。これらの結果から、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株はビブリオ科フォトバクテリウム属に属する微生物で、フォトバクテリウム・レイオグナシィに属すると同定した。【０１０４】
実施例２：ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のクローニングと塩基配列決定、および当該遺伝子の大腸菌での発現
（１）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株におけるβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログの存在の確認
β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素活性を有することが明らかとなっているＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株において、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子（Yamamoto et al. (1996) J. Biochem 120: 104−110）、またはＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子（PCT/JP2006/315850）のホモログが存在するかどうかを明らかにするため、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションを実施した。【０１０５】
まず、ハイブリダイゼーションの効率を高めるために、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株自身のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子断片をプロ−ブにすることを試みた。具体的には、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子やＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子に高く保存されている塩基配列をプライマーに用い、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行なうことによって、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株自身のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子断片を得た。
ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである。
2,6 consensus 691−701F（５’−GATGATGGTTC−３’（11 mer）：配列番号５) 
2,6 consensus 1300−1310R（５’−GTCATCATCAA−３’（11 mer）：配列番号６）  
2,6 consensus 688−702F（５’−TAYGATGATGGTTCW−３’（15 mer）：配列番号７）  
2,6 consensus 1288−1311R（５’−YGTCATCATCAANACYTCAAATGA−３’（24 mer）：配列番号８）  【０１０６】
ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株のゲノムＤＮＡは、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株の菌体ペレット約０．５ｇから、Qiagen Genomic−tip 500/G（Qiagen社製）を用い、キット添付の説明書きに従って、約１００μｇのゲノムＤＮＡを調製した。【０１０７】
ＰＣＲの反応条件は以下のように設定した。５０μｌの反応液中に、鋳型となるＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株のゲノムＤＮＡ  １μｌ、１０×  Ex Taq buffer ５μｌ、２．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ  ４μｌ、プライマー  各1０ピコモル、Takara Ex Taq（Takara社製）０．５μｌをそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００（ASTEK製）を用いて、９６℃  ３分を１回、９６℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ２分を３０回、７２℃  ６分を１回行った。その結果、プライマー2,6 consensus 688−702Fとプライマー2,6 consensus 1288−1311Rのプライマーセットによって、およそ６００ｂｐのＰＣＲ産物が増幅された。このＰＣＲ産物を、ベクター  pCR4TOPO（Invitrogen社製）にクローニングした。ライゲーション反応はベクターキット添付の説明書きに従った。大腸菌ＴＢ１にエレクトロポレーション法を用いてＤＮＡを導入し、常法（Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, ２ｎｄ edition）に従いプラスミドＤＮＡ（SHIZ119 688-1311/pCR4）を抽出した。インサートの確認されたクローンに関して、Ｍ１３プライマー（Takara社製）を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer社製）で、ＰＣＲ産物の塩基配列をその両端から決定した。その結果、このＤＮＡ断片が、フォトバクテリウム・レイオグナシィＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子と９５％、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子と７０％、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子と７０％の相同性を有することを確認した。このようにクローニングされたＤＮＡ断片をプローブとして、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株のゲノミックサザンハイブリダイゼーションを実施した。ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株のゲノムＤＮＡ  数μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｄｅＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＳｐｈＩでそれぞれ消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動で分画した。泳動後、ゲルを０．４Ｍ  ＮａＯＨを用いたアルカリブロッティングに供試し、ＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋  ナイロンメンブレンフィルター（ＧＥヘルスバイオサイエンス社製）に転写した。このフィルターに関して、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のホモログ断片（ＳＨＩＺ１１９  ６８８−１３１１／ｐＣＲ４のＥｃｏＲＩ断片）をプローブとして用い、サザンハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション実験はECL direct labeling & detection system（ＧＥヘルスバイオサイエンス社製）を使用した。キット添付の説明書きに従ってプローブをラベリングした。ハイブリダイゼーションは、キット中のhybridization bufferにBlocking試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、３７℃（通常４２℃）で４時間行った。洗浄は、０．４％  ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ中で、５０℃（通常５５℃）で２０分を２回、２ｘＳＳＣ中で室温、５分を１回行った。シグナルの検出は、キット添付の説明書きに従った。その結果、全ての制限酵素消化でバンドが検出された。そのうちＳｐｈＩ消化では約３．４ｋｐｂ、ＰｓｔＩ消化では１．０���ｂｐと比較的小さいバンドが得られた。これらより、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株には、フォトバクテリウム・レイオグナシィＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来、およびＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のホモログが存在することが明らかとなった。【０１０８】
（２）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株におけるβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログを含むゲノム断片のサブクローニング
上記より、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログの全長を含み、かつプラスミドベクターへの導入が容易であると考えられた３．４ｋｂｐ  ＳｐｈＩ断片をプラスミドベクターｐＵＣ１８へ挿入し、コロニーハイグリダイゼーションによりスクリーニングを行った。【０１０９】
ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株のゲノムＤＮＡを再度ＳｐｈＩで消化し、ＴＡＥ緩衝液中で低融点アガロース（SeaPlaqueGTG）を用いてアガロースゲル電気泳動を行った。次に３．４ｋｂｐ付近のＤＮＡ断片を含む部分のゲルを切り出し、このゲルと等量(ｖ／ｗ)の２００ｍＭ  ＮａＣｌを加え、７０℃で１０分処理し、ゲルを融解した。このサンプルをフェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出を各１回行い、さらにエタノール沈殿によって１．６ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。この断片をLigation kit（Takara社製）を用いて、あらかじめ脱リン酸化処理を行ったプラスミドベクターｐＵＣ１８のＳｐｈＩ部位にライゲーションした。ライゲーション反応後、ＤＮＡをエレクトロポレーションによって大腸菌ＴＢ１に形質転換し、１００mｇ／ｍＬ  アンピシリン、およびＸ−ｇａｌ (５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＡ寒天培地で培養した。ＤＮＡ断片が挿入されたと考えられた白色コロニー３００個を上記抗生物質入りの別のＬＡ寒天培地に接種した。コロニーが形成されたプレートの表面にＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレンフィルター（ＧＥヘルスバイオサイエンス社製）を接触させ、コロニーをメンブレンに転写した。その後、メンブレン添付の説明書きに従ってアルカリ処理によってＤＮＡを変性させ、メンブレン上に固定させた。このメンブレンに対し、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子のホモログ断片（SHIZ119 688-1311/pCR4のＥｃｏＲＩ断片）をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーションを行った結果、８つのコロニーにシグナルが検出された。なお、プローブのラベリング、ハイブリダイゼーション条件は、ECL systemによる上記と同様の方法で行った。【０１１０】
これらのコロニーをアンピシリン含有ＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養し、常法（Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, ２ｎｄedition（引用によりその全体を本明細書に援用する））に従いプラスミドを抽出し、制限酵素分析により、３つのクローンにおいて３．４ｋｂｐ断片の挿入を確認した。【０１１１】
（３）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログの全塩基配列の決定
上記でインサートＤＮＡが確認されたプラスミドの３つに関して、Ｍ１３プライマー（Takara社製）を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer社製）で、３．４ｋｂｐ  ＳｐｈＩ断片の両端の塩基配列を決定した。得られたＤＮＡ配列を、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７（ゼネティックス社製）を用いて、アミノ酸配列に翻訳し、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のＧｅｎｅＢａｎｋデータベースに対して、ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索を行った。その結果、片方のＤＮＡ配列から翻訳されたアミノ酸配列が、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素のアミノ酸配列と有意な相同性を示した。相同性を示した領域の方向性から、３．４ｋｐｂ  ＳｐｈＩ断片の中には完全なＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログが含まれることが示唆された。【０１１２】
次に、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来同酵素遺伝子ホモログのＤＮＡ配列を完全に決定するため、３．４ｋｂｐ  ＳｐｈＩ断片から得られたＤＮＡ配列を基に、５種のプライマー：
SHIZ−119−26 412−431F（５’−GAGTATTCACAGAATGAGCG−３’（20 mer）：配列番号９）
SHIZ−119−26 521−540F（５’−CACAAGAACTTGTAGATGCA−３’（20 mer）：配列番号１０）
SHIZ−119−26 325−344F（５’−GTTGTTGCCCCAACACTAGA−３’（20 mer）：配列番号１１）
SHIZ−119−26 640−659F（５’−CTAGGTAGAGAGCATGATCT−３’（20 mer）：配列番号１２）
SHIZ−119−26 671−690F（５’−GTCATCCAAGAGGAGGAATT−３’（20 mer）：配列番号１３）
を合成し、塩基配列決定に用いた。【０１１３】
これらのプライマーを用いて、塩基配列を決定した結果、配列表の配列番号３の配列を得た。この配列は、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全塩基配列である。フォトバクテリウム属  ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログのＯＲＦは、１５３６塩基対からなり、５１１個のアミノ酸をコードしていた。このアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７を用いてＤＮＡ配列、およびアミノ酸配列の解析を行ったところ、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログのＤＮＡ配列は、フォトバクテリウム・レイオグナシィＪＴ−ＳＨＩＺ−１４５株由来β−ガラクトシド−α２，６シアル酸転移酵素遺伝子に対して、塩基配列・アミノ酸配列ともに９５％、フォトバクテリウム・ダムセラＪＴ０１６０株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子に対して、塩基配列では６７％、アミノ酸配列では６６％の相同性を示した。さらに、ＪＴ−ＩＳＨ−２２４株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子に対して、塩基配列では６４％、そしてアミノ酸配列では５６％の相同性を示した。【０１１４】
（４）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログ発現ベクターの構築
クローン化した遺伝子が、シアル酸転移酵素活性を有するタンパク質をコードするか否かを調べるため、同遺伝子ホモログの全長、およびＮ末端側のシグナルペプチドをコードする部分を除去したタイプの遺伝子を発現ベクターに組み込み、大腸菌内でタンパク質を生産させ、この発現タンパク質の活性を測定した。【０１１５】
ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログのコードするアミノ酸配列について、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７で解析を行ったところ、Ｎ末端の１５アミノ酸がシグナルペプチドであると予測された。そこで、遺伝子全長（本実施例においてＳＨＩＺ１１９−Ｎ０Ｃ０と表記する）をクローン化するためのプライマー、
SHIZ119 N0 Bsp（５’−GCGCGTCATGAAAAGAATATTTTGTTTAGTCTCTGC−３’（36 mer）：配列番号１４）、
SHIZ119 C0 Bam（５’−ATTAAGGATCCCTAATATTGAGCAATACAC−３’（30 mer）：配列番号１５）、
さらにシグナルペプチド部分のアミノ酸が除かれたタイプのタンパク質をコードする遺伝子（本実施例においてＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０と表記する）をクローン化するためのプライマー
SHIZ119 N1 Pci（５’−GGGACATGTGTAATGATAATCAGAATACAG−３’（30 mer）：配列番号１６）、
SHIZ119 C0 Bam（５’−ATTAAGGATCCCTAATATTGAGCAATACAC−３’（30 mer）：配列番号１５）、
を設計、合成した。３．４ｋｂｐ  ＳｐｈＩ断片を含むプラスミドを鋳型に、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行い、発現ベクターに組み込むためのＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子ホモログを増幅した。ＰＣＲの反応条件は以下のように設定した。５０μｌの反応液中に、鋳型ＤＮＡ  ５００ｎｇ、１０×  PyroBest buffer II  ５μｌ、２．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ  ４μｌ、プライマー  各５０ｐｍｏｌ、PyroBest DNA Polymerase（Takara社製）０．５μｌをそれぞれ含み、プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−７００(ＡＳＴＥＫ製)を用いて、９６℃  ３分を１回、９６℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ２分を１０回、７２℃  ６分を１回行った。その結果、ＳＨＩＺ１１９−Ｎ０Ｃ０でおよそ１．５ｋｂ、ＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０でおよそ１．４５ｋｂのＰＣＲ産物が増幅された。これらのＰＣＲ産物を、ベクターpCR4BluntTOPO（Invitrogen社製）にクローニングした。ライゲーション反応はベクターキット添付の説明書きに従った。大腸菌ＴＢ１にエレクトロポレーション法を用いてＤＮＡを導入し、常法（Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, ２ｎｄ edition）に従いプラスミドＤＮＡを抽出した。インサートの確認されたクローンに関して、Ｍ１３プライマー（Takara社製）を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer社製）で、ＰＣＲ産物の塩基配列をその両端から決定した。その結果、変異のないＳＨＩＺ１１９−Ｎ０Ｃ０、およびＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０がクローニングされたことを確認した。【０１１６】
塩基配列が確認されたＳＨＩＺ１１９−Ｎ０Ｃ０、ならびにＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０のクローンについて、制限酵素ＢｓｐＨＩとＢａｍＨＩ（ＳＨＩＺ１１９−Ｎ０Ｃ０の場合）、または制限酵素ＰｃｉＩとＢａｍＨＩ（ＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０の場合）で二重消化した後、上述と同様にＤＮＡ断片をゲル精製した。大腸菌発現用ベクターはｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia LKB製）を用いた。このベクターを制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで二重消化しゲル精製したものを、上記のように調製したＳＨＩＺ１１９−Ｎ０Ｃ０ならびにＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０のＤＮＡ断片とLigation Kit（Takara社製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＴＢ１に形質転換した。常法に従いプラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素分析を行い、ＤＮＡ断片の発現ベクターへの組み込みを確認し、ＳＨＩＺ１１９−Ｎ０Ｃ０/ｐＴｒｃ９９Ａ、ならびにＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０/ｐＴｒｃ９９Ａを完成した。【０１１７】
（５）発現誘導と活性測定
上記で得られた２種類の発現ベクターを用いて、タンパク質発現誘導実験を行った。各クローンが組み込まれた発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａをもつ大腸菌ＴＢ１の単一コロニーを、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地（６ｍｌ）に接種し、Ａ６００＝０．５程度になるまで３０℃で菌を前培養し、その後ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド、和光純薬工業社製）を最終濃度で１ｍＭとなるように加え発現誘導を開始し、３０℃でさらに一晩振とう培養した。培養液２ｍｌ中の菌体を遠心分離によって集めた。この菌体を、４００μｌの０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ  ビストリス緩衝液（ｐＨ６.０）に懸濁し、氷冷下で超音波破砕した。得られた破砕液を粗酵素液としシアル酸転移活性の測定に供試した。方法は、J. Biochem., 120, 104−110 (1996) （引用によりその全体を本明細書に援用する）の記載に従った。具体的には、糖供与体基質であるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（７０ｎｍｏｌ、１４ＣでＮｅｕＡｃをラベルしたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ  約２０，０００ｃｐｍを含む。ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を表す）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、糖受容体基質である１２０ｍＭ ラクトース、さらに上記に記した方法で調製した粗酵素液５μｌを混和し、３０℃で３０分間反応させた。その後、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）１．９７ｍｌで反応を停止させ、この溶液をＤｏｗｅｘ１×８（ＰＯ４３− フォーム、０．２×２ｃｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ製）カラムに供した。カラムの溶出液に含まれる反応生成物、すなわち、シアリルラクトースに含まれる放射活性を測定することで、酵素活性を算出した。２反復で測定を行ったところ、ＳＨＩＺ１１９−Ｎ０Ｃ０、ならびにＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０を含む大腸菌の粗酵素液中には、糖供与体であるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ中の１４ＣでラベルされたＮｅｕＡｃを糖受容体基質であるラクトースに転移する活性、即ちシアル酸転移酵素活性が存在することが示された。ネガティブコントロールとしてインサートが挿入されていないｐＴｒｃ９９Ａベクターを大腸菌に組み込んだ破砕液を用いたところ、ネガティブコントロールの放射活性は１７０であったのに対し、ＳＨＩＺ１１９−Ｎ０Ｃ０は８５６０から８９９０、ＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０は７７８６から８４４６であった。【０１１８】
以上のことから、クローン化したホモログは、シアル酸転移酵素をコードする遺伝子であることが明らかとなった。【０１１９】
【表１】
2010143713.tif 000002
【０１２０】
（６）β−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移活性の確認
上記（５）のＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０/ｐＴｒｃ９９Ａを導入した大腸菌で発現されたシアル酸転移酵素がβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移活性を有するかどうか調べた。実施例１と同様に、糖受容体としてピリジルアミノ化ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ、タカラバイオ社製PA-Sugar Chain 026）を用い、酵素反応を行った。その結果、実施例１と同様に、ＰＡ−６’−シアリルラクト−ス（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＰＡ）が検出された。これらの結果から、フォトバクテリウム属  ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株のβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素遺伝子がクローニングされ、かつ、大腸菌内で発現されたことが証明された。【０１２１】
実施例３：ＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０クローンが組み込まれた発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａをもつ大腸菌ＴＢ１からのβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の抽出、精製
（１）抽出及び精製
ＬＢＡｍｐ平板培地上で継代培養したＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０クローンが組み込まれた発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａをもつ大腸菌ＴＢ１のコロニーから菌体をループで採取し、３０μｌの×２００アンピシリン（４００ｍｇ／２０ｍｌ）を添加した６ｍｌ−ＬＢ液体培地１０ｍｌに接種し、３０℃、毎分１８０回転で８時間振とう培養した。【０１２２】
本培養は、以下の手順で実施した。１．５ｍｌの×２００アンピシリン（４００ｍｇ／２０ｍｌ）＋３００μｌの１Ｍ  ＩＰＴＧ（１．１９２ｇ／５ｍｌ）を添加した３００ｍｌ−ＬＢ培地を１０００ｍｌ容のコブ付フラスコに３００ｍｌ張り込み、これを９本（合計２．７Ｌ）用意した。各々のフラスコに前培養液１２ｍｌを接種し、３０℃、毎分１８０回転で２４時間振とう培養した。培養液を遠心分離し、菌体を回収した。【０１２３】
この菌体を、９９０ｍｌの０．３％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ  Bis−Tris緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、１．６ｇ／２６ｍｌとし、氷冷下で超音波破砕した。菌体破砕液を４℃、１００，０００×ｇで１時間、遠心分離を行い、上清を得た。【０１２４】
この粗酵素液を、０．３％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ  Bis−Tris緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したHiLoad 26/10 Q Sepharose HP（Amersham社製）陰イオン交換カラムに吸着させ、０．３％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ  Bis−Tris緩衝液（ｐＨ７．０）から１Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液へ直線濃度勾配法で溶出させた。その結果、塩化ナトリウム濃度が０．３６Ｍ付近で溶出された酵素活性を有する画分を回収した。【０１２５】
回収した画分を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈し、予め０．３％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したハイドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に吸着させ、０．３％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）から０．３３６％トリトンＸ−１００を含む５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）へ直線濃度勾配法で溶出させ。その結果、リン酸緩衝液濃度が１２５ｍＭ付近に溶出された酵素活性を有する画分を回収した。【０１２６】
その後に、この酵素活性を示す画分を、MonoQ 5/50 GL（Amersham社製）陰イオン交換カラムに吸着させ、０．３３６％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭ  Bis−Tris緩衝液（ｐＨ６．０）から１Ｍ  塩化ナトリウムを含む同緩衝液へ直線濃度勾配法で溶出させ酵素活性を有する画分を回収した。【０１２７】
酵素活性を示す画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（アクリルアミドゲルの濃度は１２．５％）した結果、目的酵素は単一のバンドを示し、約５３，０００の分子量を示した。【０１２８】
粗酵素液からのＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０クローンのβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の精製について、上述したそれぞれの精製工程を経た試料の酵素活性を表２に示す。酵素活性は、実施例１に記載したのと同様にJ. Biochem. 120, 104−110(1996)に記載されている方法に準じて、測定した。また、タンパク質の定量はCoomassie Protein Assay Reagent（PIERCE製）を用いて、添付されたマニュアルにしたがってタンパク質の定量を行った。酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に１マイクロモルのシアル酸を転移する酵素量とした。【０１２９】
【表２】
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【０１３０】
実施例４：ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の酵素活性の至適ｐＨ、至適温度
実施例３で調製した精製酵素を用い、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素ＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０の至適ｐＨ、至適温度を調べた。【０１３１】
（１）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の酵素活性の至適ｐＨ
酢酸バッファー（ｐＨ４．０−５．０）、カコジル酸バッファー（ｐＨ５．０−６．０）、ビスートリスバッファー（ｐＨ６．０−７．０）、リン酸バッファー（ｐＨ７．０−８．０）、TAPSバッファー（ｐＨ８．０−９．０）、CHESバッファー（ｐＨ９．０−１０．０）、CAPSバッファー（ｐＨ１０．０−１１．０）をそれぞれ調製し、これらを用いて、３０℃で各ｐＨにおける酵素活性を測定した。【０１３２】
その結果、図２−１に示すように、ｐＨ５．０において、酵素活性が最大であった。なお、各ｐＨにおける酵素活性はｐＨ５．０における酵素活性を１００とする相対活性で示した。【０１３３】
（２）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の酵素活性の至適温度
カコジル酸バッファー（ｐＨ５．０）を用いて、５℃から５０℃までの５℃毎の反応温度において、酵素活性を測定した。【０１３４】
その結果、図２−２に示すように、３５℃において、酵素活性が最大であった。なお、各温度における酵素活性は３５℃における酵素活性を１００とする相対活性で示した。【０１３５】
実施例５：ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の糖受容体基質特異性
実施例３で調製したＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素ＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０の精製酵素を用いて、各種の単糖／二糖類を糖受容体基質として、シアル酸転移反応を行った。反応は、J. Biochem., 120, 104-110 (1996)に記載されている方法に従って行った。【０１３６】
糖受容体基質として用いた単糖は、メチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（Gal−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Gal−β−OMe）、メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（Glc−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Glc−β−OMe）、メチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Man−α−OMe）、メチル−β−Ｄ−マンノピラノシド（Man−β−OMe）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（GalNAc）、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）の８種類を用いた。二糖類として、ラクトース（Gal−β1,4−Glc）、Ｎ−アセチルラクトサミン（Gal−β1,4−GlcNAc）及びGal−β1,3−GalNAcの３種類を用いた。【０１３７】
その結果、今回糖受容体基質として用いた１１種類の単糖及び二糖の中では、メチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン及びGal−β1,3−GalNAcにシアル酸が効率よく転移していることが明らかとなった（表３）。なお、各受容体基質に対する相対活性は、ラクトースに対するシアル酸転移活性を１００とした場合を示す。【０１３８】
【表３】
2010143713.tif 000004
【０１３９】
実施例６：ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０が有するノイラミニダーゼ活性の確認と基質特異性
ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素を用いて、ノイラミニダーゼ活性の測定を行った。【０１４０】
（１）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０が有するノイラミニダーゼ活性の確認
実施例３で調整したＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素の精製酵素液を用い、実施例２（６）を行っている過程において、長時間の反応を行うと、反応産物（ＰＡ−６’−シアリルラクトース、保持時間４．０２分）のシグナルが、反応時間の増加に伴って減少し、元の糖受容体基質であるＰＡ−ラクトースのシグナル（保持時間３．７３分）が増加した（図３−１）。【０１４１】
以上のことから、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素ＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０は、ノイラミニダーゼ活性をも有することが明らかとなった。【０１４２】
（２）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシドα２，６シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０が有するノイラミニダーゼ活性の基質特異性
ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０が有するノイラミニダーゼ活性の特異性を明らかにするために、表４に示したシアル酸がα２，３、α２，６、α２，８結合しているＰＡ糖鎖（タカラバイオ製PA-Sugar Chain 029、PA-Sugar Chain 023、PA-Sugar Chain 034）を基質に用いて反応を行った。【０１４３】
ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０の精製酵素液（シアル酸転移酵素活性で０．６Ｕ相当）に１．５μｌの１０ｐｍｏｌ／μｌのＰＡ糖鎖を加え、３０℃下で１８時間反応させた。反応終了後、１００℃で２分間反応溶液を処理することにより酵素を失活させた。その後、ＨＰＬＣで反応生成物の分析を行った。PA-Sugar Chain 023を基質に用いた場合は、実施例１と同条件でピリジルアミノ化糖鎖の溶出および分析を行った。PA-Sugar Chain 029およびPA-Sugar Chain 034を基質に用いた場合の溶出は、溶出液Ａ（１００ｍＭ  酢酸−トリエチルアミン、ｐＨ５．０）および溶出液Ｂ（０．５％、ｎ−ブタノールを含む１００ｍＭ  酢酸−トリエチルアミン、ｐＨ５．０）を用い、０〜１００％溶出液Ｂの直線濃度勾配法（０〜３５分）、１００％溶出液Ｂ（３５〜５０分）、および１００〜３０％溶出液Ｂの直線濃度勾配法（５１〜７５分）により行った。分析は実施例１と同条件で行った。結果を、図３−２〜図３−８に示す。以上よりＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシドα２，６シアル酸転移酵素ＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０が有するノイラミニダーゼ活性は、α２，６結合しているシアル酸に特異的であることが明らかとなった。【０１４４】
【表４】
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【０１４５】
実施例７：ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０が有するノイラミニダーゼ活性の至適ｐＨ、至適温度
実施例３で調製した精製酵素を用い、ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０が有するノイラミニダーゼ活性の至適ｐＨ、至適温度を調べた。【０１４６】
（１）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０が有するノイラミニダーゼ酵素活性の至適ｐＨ
実施例４と同じバッファーを使用し、反応温度３５℃で各ｐＨにおける酵素活性を測定した。【０１４７】
その結果、図４−１に示すように、ｐＨ６．０において、ノイラミニダーゼ活性が最大であった。なお、図中の各ｐＨにおける酵素活性はｐＨ６．０における酵素活性を１００とする相対活性で示した。【０１４８】
（２）ＪＴ−ＳＨＩＺ−１１９株由来組換えβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素Ｎ１Ｃ０が有するノイラミニダーゼ酵素活性の至適温度
カコジル酸バッファー（ｐＨ６．０）を用いて、５℃から５０℃までの５℃毎の反応温度において、ノイラミニダーゼ酵素活性を測定した。【０１４９】
その結果、図４−２に示すように、３５℃において、酵素活性が最大であった。なお、図中の各温度における酵素活性は３５℃における酵素活性を１００とする相対活性で示した。
【産業上の利用可能性】
【０１５０】
本発明は、新規なβ−ガラクトシド−α２，６−シアル酸転移酵素およびそれをコードする核酸を提供することにより、生体内において重要な機能を有することが明らかにされている糖鎖の合成・生産手段を提供する。特に、シアル酸は、生体内の複合糖質糖鎖において非還元末端に存在することが多く、糖鎖機能という観点から極めて重要な糖であるため、シアル酸転移酵素は糖転移酵素の中でも最も需要が高い酵素の一つである。本発明の新規なシアル酸転移酵素は、糖鎖を応用した医薬品、機能性食品等の開発に利用することが可能である。【０１５１】
また、上述の核酸がコードするポリペプチドはα２，６結合しているシアル酸を特異的に切断するノイラミニダーゼ活性をも有しており、生体内に含まれるα２，６結合しているシアル酸の定量等に利用することが可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０１５２】
配列番号１：ＳＨＩＺ１１９−Ｎ０Ｃ０をコードする核酸配列
配列番号２：ＳＨＩＺ１１９−Ｎ０Ｃ０のアミノ酸配列
配列番号３：ＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０をコードする核酸配列
配列番号４：ＳＨＩＺ１１９−Ｎ１Ｃ０のアミノ酸配列
配列番号５：プライマー、2,6 consensus 691-701F
配列番号６：プライマー、2,6 consensus 1300-1310R
配列番号７：プライマー、2,6 consensus 688-702F
配列番号８：プライマー、2,6 consensus 1288-1311R
配列番号９：プライマー、SHIZ-119-26 412-431F
配列番号１０：プライマー、SHIZ-119-26 521-540F
配列番号１１：プライマー、SHIZ-119-26 325-344F
配列番号１２：プライマー、SHIZ-119-26 640-659F
配列番号１３：プライマー、SHIZ-119-26 671-690F
配列番号１４：プライマー、SHIZ119 N0 Bsp
配列番号１５：プライマー、SHIZ119 C0 Bam
配列番号１６：プライマー、SHIZ11 N1 Pci
配列番号１７：ＦＬＡＧＴＭタグ
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2010143713.tif 000024
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