(57)【要約】  この発明は、原核生物で産生された組換えヒト骨形成蛋白質(BMP)を、0.01mM以上から330mM以下の濃度範囲の塩酸溶液に溶解する工程を含むことを特徴とする、改善された保存安定性を有する組換えヒトBMPを製造する方法、上記方法で製造された組換えヒトBMP、並びに、この組換えヒトBMPを含有する医薬製剤及びキットを提供する。
2010098421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
原核生物で産生された組換えヒト骨形成蛋白質(BMP)を、0.01mM以上から330mM以下の濃度範囲の塩酸溶液に溶解する工程を含むことを特徴とする、改善された保存安定性を有する組換えBMPを製造する方法。
【請求項２】
塩酸溶液のpH範囲が0.2以上4.6以下である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
塩酸溶液のpH範囲が3.7以上4.6以下である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
原核生物が大腸菌である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
BMPが組換えBMP-2である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
BMPの塩酸溶液を乾燥することをさらに含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
乾燥が凍結乾燥である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法で製造された、改善された保存安定性を有する組換えヒト骨形成蛋白質(BMP)。
【請求項９】
組換えBMPがBMP-2である、請求項8に記載の組換えヒト骨形成蛋白質。
【請求項１０】
凍結乾燥されている、請求項8又は9に記載の組換えヒト骨形成蛋白質。
【請求項１１】
水で再溶解したときのpH範囲が3.7以上4.6以下である、請求項8〜10のいずれか1項に記載の組換えヒト骨形成蛋白質。
【請求項１２】
請求項8〜11のいずれか1項に記載の組換えヒト骨形成蛋白質(BMP)を含有する医薬製剤。
【請求項１３】
凍結乾燥製剤である、請求項12に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
骨の再生又は治療に使用される、請求項12又は13に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
請求項8〜11のいずれか1項に記載の組換えヒト骨形成蛋白質及びリン酸カルシウム系骨補填材をそれぞれ別個の容器に含んでなる、骨の再生又は治療のためのキット。
【請求項１６】
リン酸カルシウム系骨補填材がヒドロキシアパタイト、β-TCP又はα-TCPである、請求項15に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された保存安定性を有する組換えヒト骨形成蛋白質に関する。【０００２】
本発明はまた、上記組換えヒト骨形成蛋白質を含有する医薬製剤又はキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
骨形成蛋白質(Bone Morphogenetic Protein; BMP)は、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)スーパーファミリーに属する蛋白質であり、骨の形成、器官の形成（歯、心臓、目、軟骨などの形成）などの重要な生物学的役割を担っている。BMPにはいくつかのメンバーが知られており、いずれのメンバーも、3個のジスルフィド結合（「システインノット」と呼ばれる）と1個の分子間ジスルフィド結合を形成する、高度に保存されたシステイン残基をもつ。BMPは、1分子あたり1個のシステインノット、1個のα-ヘリックス、少なくとも4個のβ-シートで構成され、これによってモノマーはダイマーを形成することができる。すなわち、BMPは、活性型として、単一のBMPメンバーからなるホモダイマー、又は2つの異なるBMPメンバーからなるヘテロダイマー、の形態をとる。【０００４】
BMPは、細胞内で前駆体であるプレプロBMPとして合成されたのち、細胞膜に輸送され、プロセシングされて成熟蛋白質の形態で細胞外に分泌される。この分泌蛋白質は、BMPのI型又はII型受容体のリガンドとして該受容体に結合し、これによって細胞内にBMPシグナルが伝達される。【０００５】
BMPを製造するためには、一般的な遺伝子組換え技術が使用される。ベクターを介してBMPをコードするDNAを原核又は真核生物細胞に導入し、該細胞中で該DNAを発現、翻訳して組換えBMPを得ることができる（特許文献1、2及び3、非特許文献1）。前述したように、BMPは、活性型となるために、ダイマー構造を形成する必要があるが、このとき正しいジスルフィド結合の形成とともに正しい立体配置にフォールディングされねばならない（特許文献4）。【０００６】
組換えBMPを、原核生物細胞を使用して製造するときには、真核生物細胞を使用するときと異なり、生成される組換え蛋白質は糖鎖をもたない。BMPメンバーの多くはたとえ糖鎖がなくても生物活性を保持することが知られているが、BMPは比較的疎水性の高い蛋白質であるため、糖鎖のない組換えBMPは、凝集を起こし易く、また、弱酸性からアルカリ性域の水に対する溶解性が悪いという欠点をもつ。また、前述したように、BMPは、活性をもつためには、正しくフォールディングされたダイマーを形成されねばならないので、原核生物細胞を使用して組換えBMPを製造するときには、BMPを製造する工程及び医薬品に製剤化する工程において、蛋白質をいかに安定化するかが課題となっている。【０００７】
一般に蛋白質の安定化のために、糖類、アミノ酸類、蛋白質類、界面活性剤などを蛋白質と並存させることが知られており、その効果の程度は蛋白質の種類ごとに異なる。組換えBMPについても、例えばトレハロースが安定化剤として使用可能であることが報告されている（特許文献5）。具体的に、この特許文献は、緩衝剤を使用してBMP溶液のpHを約2.5〜約4.5に制御するとともにトレハロースを添加し、凍結乾燥することを記載している。【０００８】
BMPを医療で使用するときには、ヒドロキシアパタイト、β-リン酸三カルシウム（β-TCP）、α-リン酸三カルシウム（α-TCP）などのリン酸カルシウムからなる骨補填材をBMP溶液で含浸させ、これを骨疾患部位に埋め込むなどの処置を行う（特許文献6）。これによって骨折部位や骨欠損部位での骨の再生又は治療が可能になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表2004-514,441号公報
【特許文献２】国際公開WO 2006/125,868号パンフレット
【特許文献３】国際公開WO 1999/18,196号パンフレット
【特許文献４】欧州特許第433,225号
【特許文献５】特開2008-231,091号公報
【特許文献６】特表2005-509,494号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】R. Ruppert et al., Eur. J. Biochem. 237:295-302 (1996)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記背景技術の欄で述べたように、原核生物細胞で産生された組換えヒトBMPは、凝集し易くかつ中性領域のpHの水又はバッファーに対する溶解性が非常に低いという欠点があり、実用化のための1つの障害になっている。その反面、そのような組換えヒトBMPは、糖鎖を含まないために、培養自体が容易であるとともに増殖能に優れた原核生物細胞を使用することによって製造することができるという利点がある。また、異種真核生物細胞で作られた組換えヒトBMPの場合にみられるようなヒト型糖鎖と異なる炭水化物が、人体に及ぼすネガティブな影響を考慮する必要がないという利点もある。しかし、糖鎖を含まない組換えヒトBMPは、凝集性や溶解性の課題に加えて、貯蔵時の活性低下及び沈殿形成を含めた貯蔵安定性や、生体内で骨の再生や修復という持続的効能に関して解決すべき課題が多く存在している。【００１２】
したがって、本発明は、上記課題のなかで特に組換えBMPの凝集性、溶解性及び貯蔵安定性の課題を一度に解決する方法を提供することを目的とする。【００１３】
本発明はまた、上記方法で製造された、かつ実用可能な組換えヒトBMP、それを含む医薬製剤、及び骨の再生又は治療用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、要約すると、以下の特徴を含む。【００１５】
本発明は、第1の態様において、原核生物で産生された組換えヒト骨形成蛋白質(BMP)を、0.01mM以上から330mM以下の濃度範囲の塩酸溶液に溶解する工程を含むことを特徴とする、改善された保存安定性を有する組換えBMPを製造する方法を提供する。【００１６】
本発明は、その実施形態において、塩酸溶液のpH範囲が0.2以上4.6以下である上記方法を提供する。【００１７】
本発明では、上記方法で、好適な塩酸溶液のpH範囲が3.7以上4.6以下である。【００１８】
本発明はさらに、別の実施形態において、原核生物が大腸菌である上記方法を提供する。【００１９】
本発明はさらに、別の実施形態において、BMPが組換えBMP-2である上記方法を提供する。【００２０】
本発明はさらに、別の実施形態において、BMPの塩酸溶液を乾燥することをさらに含む上記方法を提供する。【００２１】
本発明の上記方法では、好適な乾燥が凍結乾燥である。【００２２】
本発明はまた、第2の態様において、上記の方法で製造された、改善された保存安定性を有する組換えヒト骨形成蛋白質(BMP)を提供する。【００２３】
本発明は、その実施形態において、組換えBMPがBMP-2である上記組換えヒトBMPを提供する。【００２４】
本発明は、別の実施形態において、上記蛋白質が凍結乾燥されている上記組換えヒトBMを提供する。【００２５】
本発明は、別の実施形態において、上記蛋白質を水で再溶解したときのpH範囲が3.7以上4.6以下である上記組換えヒトBMPを提供する。【００２６】
本発明は、第3の態様において、上記定義の組換えヒトBMPを含有する医薬製剤を提供する。【００２７】
本発明はさらに、別の実施形態において、凍結乾燥製剤である上記医薬製剤を提供する。【００２８】
本発明はさらに、別の実施形態において、骨の再生又は治療に使用される上記医薬製剤を提供する。【００２９】
本発明は、第3の態様において、上記組換えヒトBMP及びリン酸カルシウム系骨補填材をそれぞれ別個の容器に含んでなる、骨の再生又は治療のためのキットを提供する。【００３０】
本発明の上記キットでは、リン酸カルシウム系骨補填材がヒドロキシアパタイト、β-リン酸三カルシウム（β-TCP）又はα-TCPである。【００３１】
本明細書で使用される「組換えヒトBMP」という用語は、遺伝子組換え技術によって製造されたヒトBMPを指し、このとき組換え体は、原核生物細胞を用いて成熟型蛋白質として生成され、その後、活性を有するダイマーとしてリフォールディングされ、及び精製された蛋白質をいう。【００３２】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-047176号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００３３】
本発明により、原核生物細胞により製造された組換えヒト骨形成蛋白質(BMP)の凝集性、溶解性及び保存安定性の課題が同時に解決される。これによって、該組換えヒトBPMが骨の再生及び治療のために使用可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】この図は、大腸菌細胞産生組換えヒトBMP-2を0.5mM又は1mM塩酸水溶液に溶解して作製された5mg/mlのBMP-2溶液、或いは1回又は2回凍結融解（-80℃冷凍）したBMP-2溶液、のそれぞれを5℃にて開始時及び3ヶ月間にわたって保存したとき、或いは40℃にて3ヶ月間にわたって保存したとき、の蛋白質の安定性を確認するためのSDS-PAGEによる電気泳動図である。開始時（図1A）及び3ヵ月後（図1B）の各レーンは、次のサンプルの結果を示す。開始時：レーン1、1mM塩酸、5℃；レーン2、1mM塩酸、凍結融解1回；レーン3、1mM塩酸、凍結融解2回；レーン4、0.5mM塩酸、5℃；レーン5、0.5mM塩酸、凍結融解1回；レーン6、0.5mM塩酸、凍結融解2回。3ヵ月後：レーン1、1mM塩酸、40℃；レーン2、0.5mM塩酸、40℃；レーン3、1mM塩酸、5℃；レーン4、0.5mM塩酸、5℃；レーン5、1mM塩酸、凍結融解1回；レーン6、0.5mM塩酸、凍結融解1回。レーンMは、分子量マーカーを示す。
【図２】この図は、大腸菌細胞産生組換えヒトBMP-2を0.5mM塩酸水溶液に溶解して作製された5mg/mlのBMP-2溶液を1回又は2回凍結融解（-80℃冷凍）したのち逆相HPLCで分析した結果を示す。図2A及び図2Bはそれぞれ、1回又は2回凍結融解したときのクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００３６】
上記のとおり、本発明は、原核生物で産生された組換えヒト骨形成蛋白質(BMP)を、0.01mM以上から330mM以下の濃度範囲の塩酸溶液に溶解する工程を含むことを特徴とする、改善された保存安定性を有する組換えヒトBMPを製造する方法を提供する。
【００３７】
（組換えヒト骨形成蛋白質）
本発明の方法で使用する原料としての組換えヒト骨形成蛋白質(以下、「BMP」とも称する)には、BMPファミリー又はGDFファミリーに属し、かつ骨形成を誘導する能力、或いは骨の再生及び修復能力、を有するすべてのメンバーが包含される。本発明のBMPには、例えば、BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7（OP-1とも呼ばれる）、BMP-8b（OP-2とも呼ばれる）、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-15などのBMPファミリーメンバー、GDFファミリーメンバーのGDF-5などが含まれる。
【００３８】
本発明において、好ましいヒトBMPファミリーメンバー及びヒトGDFファミリーメンバーは、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-8b及びGDF-5であり、より好ましいメンバーは、BMP-2、BMP-4、BMP-6及びBMP-7であり、さらに好ましいメンバーは、BMP-2である。
【００３９】
上記BMPは、上記背景技術の欄で述べたように、一般に、システインノットと呼ばれる3個のジスルフィド結合と、1個の分子間ジスルフィド結合とを形成する、高度に保存されたシステイン残基をもつ。BMPは、1分子あたり1個のシステインノット、1個のα-ヘリックス、少なくとも4個のβ-シートで構成され、これによってモノマーはダイマーを形成することができる。ダイマーは、BMPの活性型であり、単一のBMPメンバーからなるホモダイマー又は2つの異なるBMPメンバーからなるヘテロダイマーのいずれかである。例えば、ホモダイマーを形成するBMPは、BMP-2、BMP-4及びBMP-7であり、ヘテロダイマーを形成するBMPは、BMP-6である。
【００４０】
上記のヒトBMPファミリーメンバー及びヒトGDFファミリーメンバーのプレプロ体のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、GenBank(NCBI、米国)に登録されており、以下の登録番号(Accession Number)を有している。
【００４１】
ヒトBMP-2: NM_001200（配列番号1及び2）
ヒトBMP-4: D30751（配列番号3及び4）
ヒトBMP-6: NM_001718（配列番号5及び6）
ヒトBMP-7: NM_001719（配列番号7及び8）
ヒトBMP-8b: NM_001720（配列番号9及び10）
ヒトGDF-5: NM_000557（配列番号11及び12）
ヒトBMP-9： AF188285
ヒトBMP-10： NM_14482
ヒトBMP-11： AF100907
ヒトBMP-15： NM_005448
本発明で使用される用語組換えヒト「BMP」は、天然型ヒトBMP、その変異体、及びその誘導体のいずれかを指すものとする。
【００４２】
ヒトBMPの成熟型領域は、上記プレプロ体のアミノ酸配列中のC末端側の約110〜約140残基からなり、生体内では、プレプロ体のRX1X2R(R=Arg； X1, X2=任意アミノ酸)配列のC末側で切断されて成熟型となる。ヒトBMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, BMP-8b及びGDF-5の成熟型アミノ酸配列は以下の通りである。
【００４３】
ヒトBMP-2 (配列番号2の残基283〜396) (114アミノ酸)
ヒトBMP-4 (配列番号4の残基293〜408) (116アミノ酸)
ヒトBMP-6 (配列番号6の残基375〜513) (139アミノ酸)
ヒトBMP-7 (配列番号8の残基293〜431) (139アミノ酸)
ヒトBMP-8b (配列番号10の残基264〜402) (139アミノ酸)
ヒトGDF-5 (配列番号12の残基382〜501) (120アミノ酸)
変異体は、上記天然型ヒトBMPファミリーメンバー及び天然型ヒトGDFファミリーメンバーの成熟型アミノ酸配列において、1若しくは複数、好ましくは1若しくは数個、のアミノ酸が付加、置換、挿入又は欠失によって得られる蛋白質であって、対応の天然型ヒトBMPがもつ生物学的活性を有する蛋白質である。アミノ末端にはメチオニン(M)残基が結合していてもよいし、結合していなくてもよい。ここで、数個とは、2〜10、好ましくは2〜5の範囲の整数を指す。或いは、変異体は、上記天然型ヒトBMPファミリーメンバー又は天然型ヒトGDFファミリーメンバーの各成熟型アミノ酸配列と85％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは92％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上又は99％以上の配列同一性を有し、かつ、天然型BMPと同様の生物学的活性（骨誘導活性）を有する。
【００４４】
ヒトBMPは、本来の生物学的活性(骨誘導)を実質的に保持し、かつ複数のジスルフィド結合によって形成される立体構造を実質的に変化させない範囲でアミノ酸の付加、置換、挿入又は欠失が可能である。特にアミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましく、構造的、電気的、疎水性/親水性などの化学的又は物理的性質が同類のアミノ酸群間での置換が望ましい。そのような保存的アミノ酸群は公知である。例えば、塩基性アミノ酸群にはアルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれ、酸性アミノ酸群にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、芳香族アミノ酸群にはフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンが含まれ、分枝状アミノ酸群には、バリン、ロイシン及びイソロイシンが含まれ、疎水性アミノ酸群にはバリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリンなどが含まれ、極性アミノ酸群にはセリン、トレオニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、システイン、チロシンなどが含まれる。
【００４５】
或いは、ヘパリン結合能を改善するように改変されたヒトBMP変異体も本発明の変異体に包含される(特開2008-086319、特開2009-011323、特許第4155711号)。
【００４６】
本明細書で使用される配列に関する「同一性」という用語は、2つの関連するアミノ酸配列について、対応するアミノ酸の相同率が最大となるように、ギャップを導入するか又はギャップを導入しないでアミノ酸を整列させるとき、ギャップの数も含めた総アミノ酸数に対する同一アミノ酸数の百分率(％)を意味する。このような同一性は、BLASTやFASTAなどの公知のアルゴリズムを使用して決定することができるし、また、GenBank(NCBI、米国)などの遺伝子バンクにアクセスし、同アルゴリズムを使用することによって相同な蛋白質を検索することもできる。利用しうる関連の文献として、例えば、S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)、J. Devereux、J. et al., Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984)、などを挙げることができる。
【００４７】
本発明で使用可能な組換えヒトBMPは、天然型BMP及びその変異体の誘導体も含む。誘導体は、蛋白質の化学修飾によって得ることができる。修飾は、糖鎖以外の修飾基、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)の蛋白質への結合によって行うことができる。PEGの分子量は、特に限定されないが、例えば約4,000以上約100,000以下、好ましくは約5,000以上約50,000以下である。修飾基の結合は、モノマーの二量体化を妨げないようにシステイン残基以外の部位、例えば蛋白質のリジン残基のε-アミノ基、或いは、蛋白質のアミノ末端又はカルボキシル末端で行うことができる。
【００４８】
本発明で使用される組換えヒトBMPは、ベクターを介する遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。ベクターには、ヒトBMP又はその変異体をコードするDNAの他に、制御配列、選択マーカー配列などを含ませることができる。制御配列には、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、複製開始点、シャイン−ダルガルノ(SD)配列などが含まれる。プロモーターの例は、ファージ由来のT3プロモーター、T5プロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなど、細菌由来のlacプロモーター、trpプロモーター、アルカリプロテアーゼプロモーター、α-アミラーゼプロモーターなどを含む。また、選択マーカーには、例えば薬剤耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等）などが含まれる。
【００４９】
ベクターは、例えばプラスミド、ファージなどを含み、より具体的にはpBR系、pUC系、pBluescript、バクテリオファージなどである。
【００５０】
本発明の組換えヒトBMP又はその変異体をコードするDNAを含むベクターで形質転換するための宿主細胞は、原核生物細胞であり、これには例えば大腸菌、枯草菌、シュードモナス属細菌などの細菌、好ましくは大腸菌が含まれる。
【００５１】
原核生物細胞の培養は、大腸菌、枯草菌、シュードモナス属細菌などの公知の培養条件で行うことができる。炭素源、窒素源、微量元素などを含む最適pHの液体培地中、細胞に適した培養温度及び培養時間にて培養を行う。炭素源には、例えばデンプン、ふすま、グルコース、ラクトース、スクロースなどが含まれる。また、窒素源には、例えば酵母エキス、ペプトン、魚肉エキス、尿素、アンモニウム塩、アミノ酸類などが含まれる。無機塩及び微量元素には、例えば鉄イオン、銅イオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイオンなどの金属イオンなどが含まれる。培養温度は、通常、20℃から40℃の範囲内である。
【００５２】
本発明の組換えヒトBMP又はその変異体は、形質転換宿主細胞を破壊し抽出した液から回収することができる。細胞外に組換え蛋白質を分泌可能に遺伝子操作した場合には、培地から目的の蛋白質を回収する。回収した蛋白質をリフォールディングし精製処理にかける。精製は、ヘパリン親和性クロマトグラフィーなどのアフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、HPLC、塩析、透析、限外ろ過、電気泳動、等電点電気泳動などを用いて行うことができる。
【００５３】
（組換えヒトBMPの安定化）
本発明の方法は、組換えヒトBMPを、0.01mM以上から330mM以下の濃度範囲の塩酸溶液に溶解することを含む。
【００５４】
上記濃度範囲の塩酸溶液は、製薬上許容可能な塩酸を、滅菌水で希釈することによって作製することができる。上記濃度範囲の塩酸溶液のpH範囲は、測定環境(例えば装置、水、温度など)によって幾分変動はあるが、25℃で測定したとき、約0.2以上約5.1以下、好ましくは0.2以上4.6以下であり、より好ましくは、3.7以上4.6以下である。
【００５５】
組換えヒトBMPの濃度は、沈殿を生じず溶解可能な範囲であれば特に制限されないが、通常、1mg/ml〜20mg/ml、好ましくは3mg/ml〜15mg/ml、より好ましくは5mg/ml〜10mg/mlである。
【００５６】
上記濃度又はpH範囲に調整された塩酸溶液を攪拌しながら、これに組換えヒトBMPを少量ずつ加えてBMP溶液を作製する。このとき、塩酸溶液の温度は、約0℃〜約30℃、好ましくは約4℃〜約20℃、より好ましくは約4℃〜約10℃である。
【００５７】
上記の手法で作製された組換えヒトBMPの塩酸溶液は、そのまま冷蔵保存(例えば5℃)することによって3ヶ月以上安定に保存することが可能である。ここで「安定に」とは、電気泳動測定(後述の実施例参照)により蛋白質の分解が実質的に認められないこと、及び/又は、Biacore測定（GE Healthcare;後述の実施例参照）によりBMPレセプターであるactivine type II receptor (ACTRII)への結合能が実質的に保持されることを意味する。或いは、安定性の確認は、逆相HPLC（例えば、C4カラム；移動相A, 0.1% TFA；移動相B, 100%アセトニトリル；流速, 1ml/min；グラジエント, 0%Aから100%B, 20min）によって行うことも可能である。
【００５８】
上記溶解工程に続いて、組換えヒトBMPの塩酸溶液から水を除去する乾燥工程を付加することができる。
【００５９】
乾燥は、減圧下での水分蒸発、凍結乾燥などを含む。水分蒸発の場合には、蛋白質の分解を抑制するために、組換えヒトBMPの塩酸溶液の温度が30℃以下、好ましくは20℃以下、より好ましくは10℃以下であるべきである。好ましい乾燥は、凍結乾燥である。この手法は、BMP塩酸溶液を凍結したのち、真空下で水分を蒸発させることを含む。
【００６０】
本発明の方法では、糖類、蛋白質、界面活性剤、アミノ酸などの安定化剤を添加することなく凍結乾燥しても、実質的にBMP活性を損なうことがない。特開2008-231091号公報によれば、蛋白質を凍結乾燥するときの蛋白質の損傷について記載されており、BMP蛋白質に安定化剤としてトレハロースを添加することが推奨されていることに鑑みれば、本発明の方法は、非常に簡易であり、また、かような安定化剤を添加することなく蛋白質を安定に製造することができる点で驚くべきことである。
【００６１】
本発明の方法で製造された溶液又は固体形態の組換えヒトBMPは、10℃以下、好ましくは4℃又は5℃の低温下で3ヶ月以上にわたって安定に保存することができる。組換えヒトBMPは、たとえ凍結融解しても実質的に完全に活性を保持するし、また、40℃での保存では50％以上、通常60％以上の残存活性を有する。
【００６２】
本発明の方法では、原核生物細胞、好ましくは大腸菌、で製造された組換えヒトBMPが使用されるが、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの真核生物細胞で製造される場合と比べて、大量生産が可能であるという利点を有する一方、糖鎖のない組換え蛋白質であるために、凝集性、溶解性、保存安定性など解決すべき課題があり、実用化がなされていなかった。本発明は、これらの課題を同時に解決することを可能にする。
【００６３】
（組換えヒトBMP）
上記の方法で作製された組換えヒトBMPは、改善された保存安定性を有する。蛋白質の形態は、上記濃度又はpH範囲内の塩酸溶液又は乾燥固体のいずれでもよく、好ましくは凍結乾燥固体である。
【００６４】
本発明の組換えヒトBMPは、上記のとおり、BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7（OP-1とも呼ばれる）、BMP-8b（OP-2とも呼ばれる）、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-15などのヒトBMPファミリーメンバー、ヒトGDFファミリーメンバーのGDF-5など、並びに、これらのメンバーの実質的に同等の生物学的活性をもつ変異体及び誘導体が含まれ、好ましいメンバーは、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-8b及びGDF-5であり、より好ましいメンバーは、BMP-2、BMP-4、BMP-6及びBMP-7であり、さらに好ましいメンバーは、BMP-2である。これらの天然型ヒトBMP蛋白質、変異体及び誘導体については、上記組換えヒト骨形成蛋白質の欄で説明したとおりである。
【００６５】
本発明の組換えヒトBMPは、原核生物細胞、好ましくは大腸菌、で製造されるため、糖鎖を含まない蛋白質である。該蛋白質を上記塩酸溶液で処理することによって得られる本発明の組換えヒトBMPは、塩酸溶液又は凍結乾燥固体の形態で3ヶ月間冷蔵(5℃)保存しても、又は冷凍保存しても、実質的に失活しない。また、水で再溶解したときのpH範囲が、好ましくは3.7以上4.6以下であるという特徴も有している。さらにまた、本発明の組換えヒトBMPには、糖類、蛋白質、界面活性剤、アミノ酸などの安定化剤、或いはグリシンバッファなどの緩衝剤、などの物質を敢えて加えなくとも安定であるという特徴も有する。また、本発明の組換えヒトBMPでは、塩基性アミノ酸残基やN末端アミノ基と塩酸とが反応して四級塩を形成している。総じて、本発明の方法で製造された組換えヒトBMPは、実質的に凝集を起こし難く、未処理の組換えBMPと比べて高い保存安定性を有する。
【００６６】
(医薬製剤又はキット)
本発明はさらに上記の方法で製造された組換えヒトBMPを含有する医薬製剤又はキットを提供する。
【００６７】
本発明の医薬製剤は、BMPの塩酸溶液の形態であってもよいし、或いはBMPの塩酸溶液を乾燥した固体の形態でもよい。好ましい形態は、凍結乾燥形態である。医薬製剤に安定化剤を添加することは可能であるが、安定化剤が不在であっても冷蔵下で保存されるならば長期間にわたって安定に存在しうる。それゆえ、凍結乾燥製剤であれば、賦形剤、担体、添加剤などは実質的に不要であり、そのまま医療用途に使用可能である。本発明の製剤には、しかしながら必要に応じて、製薬上許容される、賦形剤、担体、添加剤、他の骨誘導活性を有する薬剤、骨疾患治療剤などの物質を加えることも可能である。
【００６８】
本発明の医薬製剤は、骨の誘導活性を有するため、骨の再生、修復又は治療に使用されうる。
【００６９】
骨の再生のためには、骨形成蛋白質(BMP)、幹細胞及び足場が必要である。足場としては、例えばポリ乳酸(PLA)、ポリラクチルグリコレート(PLGA)、PLA-PEG、PLGA-PEG（ここでPEGは、ポリエチレングリコールを表す）などの合成ポリマー、ヒアルロン酸、コラーゲン、アテロコラーゲンなどの天然高分子、ヒドロキシアパタイト、β-リン酸三カルシウム(β-TCP)、α-TCPなどのリン酸カルシウムなどが挙げられる。実際には、多孔性の足場（例えば、顆粒、スポンジ、ブロック、ゲルなどの形態をもつ）とBMP溶液(溶媒：例えば滅菌水又は生理食塩水)を混ぜて、骨の患部、例えば骨折部位、欠損部位、障害部位などに埋め込むことによって、内在性幹細胞の作用によって骨組織が再生されると考えられる。足場が顆粒の場合には、整形外科で使用するとき3〜5mmメッシュの篩を通過する粒径サイズのもの、一方、歯科で使用するとき0.5〜1.5mmメッシュの篩を通過する粒径サイズのものが、一般に使用される。本発明の医薬製剤には、BMPと足場を混合した形態、足場にBMPを塗布した形態、足場にBMPを吸着させた形態などが含まれる。
【００７０】
本発明の方法によって得られた安定化組換えヒトBMPのヒトでの臨床投与量（単回の埋植または注入）は、投与部位や欠損の大きさ、組み合わせる足場（コラーゲン、骨補填材、高分子ゲル等）によって至適量は異なるが、一般に骨補填体積1cm3あたり0.2〜3mg程度（ダイマーとしての重量）であり、例えば補填体積が0.5〜20cm3程度の部位の場合、0.1〜60mg/患者の範囲である。しかし、投与量は、患者の性別、年齢、体重、重篤度などの諸条件によって変化可能である。
【００７１】
本発明の医薬製剤は、骨欠損の再生や補填、骨折の早期治癒、軟骨、腱、靭帯、椎間板、半月板、歯槽骨などの骨の障害部位の再生及び治療などのために使用できる。BMPは、骨誘導能が高く、低侵襲性であり、品質管理や供給が安定するという利点があるため、上記のような医療用途での使用が期待される。
【００７２】
本発明は、組換えヒトBMP及びリン酸カルシウム系骨補填材をそれぞれ別個の容器に含んでなる、骨の再生又は治療のためのキットを提供する。
【００７３】
リン酸カルシウム系骨補填材は、例えばヒドロキシアパタイト、β-TCP及びα-TCPなどの骨補填材を含むが、これらに限定されない。
【００７４】
キットにはさらに、使用説明書、注射用水を含むシリンジ、滅菌済みトレー、滅菌済みスパチュラなどを含んでもよい。この場合、シリンジのなかでBMPを溶解し、トレー内のリン酸カルシウム系骨補填材(顆粒)にまんべんなくふりかけ、スパチュラで混ぜ合わせる。このようなキットは、治療の直前にBMPを再構成又は再溶解することを意図したものである。
【００７５】
(実施例)
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって制限されないものとする。
【実施例１】
【００７６】
BMPの安定化のための塩酸溶液の最適濃度及びpH範囲の決定
大腸菌BL-21を利用して、N末端領域に特徴的な配列を含むヒト骨形成タンパク質（BMP）2遺伝子の成熟型領域（配列番号2の283位〜396位のアミノ酸配列）を含む遺伝子を発現させ、既知の方法を用いて封入体の回収、リフォールディング、二量体の回収を行った。最終精製後の組換えヒトBMP溶液は、適当な濃度の塩酸溶液に置換することによって、最終産物とした。この大腸菌で新たに生産されたBMP溶液の酸安定性と温度安定性を中心的に、生化学的手法によりその特徴付けを試みた。【００７７】
BMP溶液は、最終的に塩酸溶液で置換するため、まず塩酸に対するBMPの安定性の確認を行った。その方法として、BMP溶液の最終濃度が5mg/mlになるように、1mM、10mM、100mM、1M、4M、12Mの塩酸で溶解した。各BMP溶液から、0時間後、24時間後、48時間後、120時間後に採取し、２−メルカプトエタノールを含む還元条件でSDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）用試料を作成した。SDS-PAGEは、各レーンにBMPが5μgとなるように添加し、200Vの定電圧で45分間泳動した。その後、クマシーブリリアントブルー（CBB）で染色し、13kDa付近に検出されるBMPの分解等を観察した。その結果、1mMから100mMでは、120時間後でも全く変化が観察されなかった。一方1Mの塩酸濃度では、120時間後までに若干の分解が観察され、12Mのいわゆる濃塩酸では、0時間目からBMPの分解が観察され、48時間以降はほとんどのBMPが分解された。【００７８】
SDS-PAGEの結果から、BMPは塩酸に対して比較的強そうであることが示唆されたが、見た目の変化がなくても活性が失活している可能性もあることから、BMP受容体の1つであるアクチビン受容体II型B（ActRIIB）（ドイツ国Wuerzburg Universityより入手）をリガンドしたBiacore分析を行った（BMC Structural Biology 2007 Feb 12;7:6., A silent H-bond can be mutationally activated for high-affinity interaction of BMP-2 and activin type IIB receptor, Weber D, Kotzsch A, Nickel J, Harth S, Seher A, Mueller U, Sebald W, and Mueller TD）。その結果、SDS-PAGEの結果と同様に、1mMから100mMでは、全くActRIIBへの結合能が変化しなかったのに対して、1Mでは、80％程度の結合能、4Mでは70％（0時間）から50％（120時間後）、12Mでは50％（0時間）から0％（120時間後）へ結合能が減少することがわかった(表1)。これらの結果から、BMP溶液の溶媒置換に、100mM以下の塩酸がまったく問題ないことが明らかとなった。
【表１】
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【００７９】
上記のこれらの実験において、１M以上の塩酸による溶媒置換では、白濁して一部のBMPが沈殿してしまう現象が生じた。そこで次にBMPの白濁を伴わない塩酸の溶解限界濃度の検索を行った。その結果、5mg/mlの条件下では330mM以下の塩酸濃度では白濁が生じないことが判明した。この際のpHが0.2であったことから、塩酸で置換されたBMP溶液のpHが、0.2〜4.6の範囲となることが重要であることが分かった。
【実施例２】
【００８０】
BMPの安定性の分析
これまでBMPのようなタンパク質の安定的な保存には、-80℃で冷凍保存することが常識であった。多くのタンパク質は、上記の温度で安定に保存できる一方で、使用による繰り返しの凍結融解によって、その機能が失われることがたびたび問題となることがあった。また、長期の安定保存のために凍結乾燥が行われることもよくあるが、同作業もタンパク質には多大な悪影響を与える場合があるために、血清アルブミンなどの保護タンパク質や何らかの賦形剤を入れることが一般的であった。これらの一般的常識をふまえ、BMPが、様々な温度による保存、凍結融解の繰り返し、および凍結乾燥に対して、どのような特性を有しているのか分析した。【００８１】
最終濃度が5mg/mlになるように、0.5mMと1mMの塩酸で組換えヒトBMP-2（実施例1参照）の溶液を作成し、-80℃による冷凍保存、5℃による冷蔵保存および40℃の定温装置にBMP溶液を保存した。各BMP溶液から、0日後、1週間後、2週間後、3週間後、4週間後、2ヶ月後および3ヶ月後に採取し、2−メルカプトエタノールを含む還元条件でSDS-PAGE用試料を作成した。SDS-PAGEは、各レーンにBMPが5μgとなるように添加し、200Vの定電圧で45分間泳動した。その後、CBBで染色し、13kDa付近に検出されるBMPの分解等を観察した。-80℃での冷凍保存と凍結融解の繰り返し、および5℃による冷蔵保存は、3ヶ月後でも全く変化がないことが分かった。40℃による高温保存では、ある程度の分解が進んでいることが確認された(図1)。【００８２】
さらに詳しく分析するために、C4カラム(Grace Vydac 214TP54;5μmポア)を用いた逆相のHPLC分析をおこなった。移動相Aには、0.1％のトリフルオロ酢酸（TFA）入りの精製水、移動相Bには100％アセトニトリルを使用した。流速は1ml/minで、試料の添加後に移動相Aで15分間洗浄し、20分で0％Bから100％Bになるようなグラジエント溶出を行い、278nmでその溶出液を検出した。添加試料は、100ugのBMPを5mlの移動相Aで希釈し、その全量をカラムに添加した。その結果、SDA-PAGEの結果ど同様に主要ピークの保持時間・ピーク面積に顕著な差異は検出されなかった(図2)。【００８３】
そこでBiacore分析によりActRIIBへの結合を測定したところ、SDS-PAGE/HPLCの結果と同様、-80℃および5℃で3ヶ月間保存したBMP溶液の活性がまったく同等であり、-80℃という特別な環境でなくとも、一般的な冷蔵庫で十分に安定保存できるという驚くべき特徴を有していることが判明した。一方、40℃の保存でも、60〜70％程度のActRIIBへの結合活性を保持していた。(表2)
【表２】
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【００８４】
凍結乾燥によるBMPへの影響を調べるために、最終精製後0.5mMの塩酸で置換したBMP溶液を、5mg/mlとなるように等量ずつ分注し、一度も凍結乾燥しない試料、1回の凍結乾燥をした試料、および1回目の凍結乾燥後に0.5ｍMの塩酸で再溶解し、さらに2回目の凍結乾燥した試料を用いて、Biacore分析によるActRIIBへの結合活性を測定した。その結果、BSAなどの保護タンパク質および賦形剤の添加がなくても、凍結乾燥による受容体への結合活性に影響が全くないことが判明した(表3)。
【表３】
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【００８５】
以上の結果から、本発明者らが作製した大腸菌を利用し生産したBMPの最大の特徴としては、pHが4.6から0.2となるように塩酸で綺麗に溶解し、5℃以下の温度でActRIIBへの結合能を失うことなく、安定に保存できるBMP製剤であると結論付けられた。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明により、大腸菌などの原核生物細胞で製造された組換えヒトBMPを医療目的に使用可能になった。BMPは骨の再生及び治療のために有用な蛋白質であるので、医療分野においての役割が期待される。【００８７】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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