(57)【要約】  癌及び喘息治療のための医薬組成物を提供する。  本発明の課題は、ムチンサブタイプ５ＡＣのｍＲＮＡを、ＲＮＡ干渉を介して開裂することのできるｓｉＲＮＡ、又はムチンサブタイプ５ＡＣに対する抗体を有効成分として含む、医薬組成物によって解決できる。本発明により、ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患の治療を効率よく行うことができる。ＭＵＣ５ＡＣが発現している癌、特には膵臓癌においては、本発明のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物は、癌の治療に効果的に用いることが可能である。また、本発明のｓｉＲＮＡ又は抗体は、喘息において、ＭＵＣ５ＡＣの発現又は機能を抑えることによって、喘息の症状を効果的に予防又は治療することが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムチンサブタイプ５ＡＣのｍＲＮＡを、ＲＮＡ干渉を介して開裂することのできるｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
前記ＲＮＡ干渉の標的ｍＲＮＡ領域が、配列番号１で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、配列番号３で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、配列番号５で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、配列番号７で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、配列番号９で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、配列番号１１で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、配列番号１６で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、及び配列番号２１で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、からなる群から選択されるｍＲＮＡ領域である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分の長さが１５〜４０ヌクレオチドである請求項１又は２に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分のアンチセンスＲＮＡ鎖が、前記標的ｍＲＮＡ領域の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ部分を含むか、又は前記標的ｍＲＮＡ領域の塩基配列に相補的な塩基配列において、１〜９個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるＲＮＡ部分を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分のアンチセンスＲＮＡ鎖が、前記標的ｍＲＮＡ領域の塩基配列に相補的な塩基配列における連続する少なくとも９塩基の塩基配列からなるＲＮＡ部分を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
二重鎖ＲＮＡ部分のアンチセンスＲＮＡ鎖が、配列番号２で表される塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号４で表される塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号６で表される塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号８で表される塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号１０で表される塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号１２で表される塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号１７で表される塩基配列からなるＲＮＡ、及び配列番号２２で表される塩基配列からなるＲＮＡ、からなる群から選択されるＲＮＡである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分において、
（ａ）二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖が、ヘアピンループを形成することのできるＲＮＡ部分によって結合しているｓｈＲＮＡ、
（ｂ）二重鎖ＲＮＡ部分の末端が平滑である二本鎖ヌクレオチド、又は
（ｃ）二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖の一方又は両方の３’末端に、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドが結合し、突出末端を形成している二本鎖オリゴヌクレオチド、
である請求項１〜６のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ部分と、その５’側に前記ＤＮＡの転写を制御することのできるプロモーターと、前記ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡの３’側にターミネーターとを含むＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項８に記載のＤＮＡ、及び請求項９に記載のベクターからなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項１１】
ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患の治療用である請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患が、癌又は喘息である請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記癌が、膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、及び大腸癌である請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項８に記載のＤＮＡ、及び請求項９に記載のベクターからなる群から選択される少なくとも１つを、ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患の治療が必要な対象に、有効量で投与することを含む、ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患を治療する方法。
【請求項１５】
ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患の治療用医薬としての、請求項１〜７のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１６】
ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患の治療用医薬としての、請求項８に記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患の治療用医薬としての、請求項９に記載のベクター。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項８に記載のＤＮＡ、及び請求項９に記載のベクターからなる群から選択される少なくとも１つの、ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患の治療用医薬組成物を製造するための使用。
【請求項１９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡにより、ＭＵＣ５ＡＣの発現をノックダウンした細胞。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡによりＭＵＣ５ＡＣの発現をノックダウンした細胞、及びＭＵＣ５ＡＣの発現した細胞を用いた、薬剤のスクリーニング方法。
【請求項２１】
前記薬剤が、抗癌剤又は喘息治療薬である、請求項２０に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ムチンサブタイプ５ＡＣ（以下、ＭＵＣ５ＡＣと称することがある）に特異的な短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）、及びそれらを含有する医薬組成物に関する。本発明のｓｉＲＮＡによれば、ＭＵＣ５ＡＣの発現を特異的に抑制することにより、癌及び喘息の治療を効果的に行うことが可能である。
【背景技術】
【０００２】
ムチンはコアタンパク質に高分子の糖鎖が修飾された糖タンパク質で、その分子量は１００〜１０００万にもなる巨大分子である。動物では口腔、気道、胃、腸管の粘膜に粘性物質として見られ、外界に接している内腔の柔らかい粘膜層を病原菌、異物、乾燥などから保護している。ヒトでは２１種のムチンが知られており、それぞれのムチン分子のコアタンパクには異なる繰り返し配列が存在している。この繰り返しのアミノ酸配列の領域はセリンとスレオニンに富み、ムチン型糖鎖が高頻度で結合している。ムチン型糖鎖は一般的に、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、フコース、シアル酸などから構成され、糖鎖はムチンの分子量の５０〜８０％以上を占め、ムチンのもつ粘性や保水力、タンパク質分解酵素への耐性など、さまざまな性質の要因となっている。【０００３】
ムチンの中で、ＭＵＣ５ＡＣは、コアタンパク質としてセリンとスレオニンに富んだ繰り返し配列を有し、正常組織では気管と胃の上皮細胞でのみ発現している。このＭＵＣ５ＡＣと疾患の関係については、癌組織において、ＭＵＣ５ＡＣが発現していることが知られており、特に、ＭＵＣ５ＡＣが膵臓の癌化に伴い膜結合型ムチンとして高率に発現することが報告されている（非特許文献１、及び非特許文献２）。また、喘息の患者において、気道のＭＵＣ５ＡＣの過剰分泌が、喘息の悪化につながることが報告されている（非特許文献３）。【０００４】
前記の膵臓癌は、難治性の癌として知られている。２０００年における膵臓癌罹患者数は、日本で１７，０００人、アメリカで３０，０００人であり、今後の膵臓癌罹患者数の予測でも、増加傾向にある。全癌腫に占める患者数の割合としてはそれほど多くはないものの、年齢調整死亡率を年齢調整罹患率で割った数を悪性度とした場合、１９９８年の膵臓癌の悪性度は全癌腫の中で最も高く、男性で９９．２％、女性で９４．６％であった。また、罹患者の５年生存率は男女ともに１０％程度と非常に低く、予後が悪い難治性の癌である。
現在の膵臓癌の標準的な治療法は、早期診断された場合の腫瘍部位を切除する外科療法のみが有効であるとされている。しかし、膵臓癌は、症状に乏しく、早期病変（１ｃｍ以下）の内視鏡や画像診断での診断は困難であり、膵臓癌特異的な腫瘍マーカーも存在しないことから、早期発見が難しく、手術可能例は約３０％程度にすぎない。また、進行癌では主に化学療法が施され、ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ（核酸合成阻害剤、イーライリリー社）が用いられているが、症状緩和効果のみで、腫瘍への根本的な治療効果はない。更に、外科療法に放射線療法を併用する場合もあるが、膵臓癌は放射線に対する感受性が低く、この治療法も有効ではない。このため、膵臓癌患者における腫瘍細胞の増殖を抑制し、ＱＯＬを改善することのできる有効な医薬組成物の開発が待ち望まれている。【０００５】
前記のように膵臓癌組織においてＭＵＣ５ＡＣが高い確率で発現しているが、ＭＵＣ５ＡＣが発現していない膵臓癌の患者において、リンパ浸潤、血管浸潤、及びリンパ節転移が見られ、そのため、ＭＵＣ５ＡＣの発現している膵臓癌患者の生存率がよいことが報告されている（非特許文献１）。従って、膵臓癌患者の生存率の観点からは、膵臓癌にＭＵＣ５ＡＣが発現していることが望ましいと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「インターナショナル・ジャーナル・オブ・ガストロインテストティナル・キャンサー（International Journal of Gastrointestinal Cancer）」（米国）２００３年、第３４巻、ｐ．９−１８
【非特許文献２】「インターナショナル・ジャーナル・オブ・オンコロジー（International Journal of Oncology）」（ギリシャ）２００４年、第２４巻、ｐ．１０７−１１３
【非特許文献３】「日本小児アレルギー学会誌」（日本）２００７年、第２１巻、ｐ．１８０−１８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、生体内において癌細胞の増殖を抑制することのできる有効な医薬組成物について鋭意検討を重ねた結果、ＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡにより、ＭＵＣ５ＡＣを発現している膵臓癌細胞の生体内での増殖、そして場合によっては膵臓癌の転移を顕著に抑制することができることを見出した。すなわち、前記非特許文献１より、膵臓癌患者の生存率の観点からは、膵臓癌にＭＵＣ５ＡＣが発現している方がよいと考えられるにもかかわらず、ＭＵＣ５ＡＣをノックダウンすることにより、癌の増殖を抑えることができることを見出した。本発明のｓｉＲＮＡは、癌患者における癌細胞に対する免疫応答を誘導することが可能であり、例えば、Ｂ細胞による癌細胞に対する抗体の産生、白血球（例えば、Ｂ細胞、又は顆粒球）の癌組織への浸潤、癌細胞に対する単核球、又は多核球の細胞障害性を効果的に誘導することが可能である。すなわち、本発明者らは、ＭＵＣ５ＡＣに対するｓｉＲＮＡを含む医薬組成物が、癌、特には、膵臓癌の治療薬として有用であることを見出した。更に、本発明のｓｉＲＮＡにより、喘息の患者の症状の改善に有用であることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明は、ムチンサブタイプ５ＡＣのｍＲＮＡを、ＲＮＡ干渉を介して開裂することのできるｓｉＲＮＡに関する。
本発明によるｓｉＲＮＡの好ましい態様においては、前記ＲＮＡ干渉の標的ｍＲＮＡ領域が、配列番号１で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、配列番号３で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、配列番号５で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、配列番号７で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、配列番号９で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、配列番号１１で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、配列番号１６で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、及び配列番号２１で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ、からなる群から選択されるｍＲＮＡ領域である。
本発明によるｓｉＲＮＡの別の好ましい態様においては、前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分の長さが１５〜４０ヌクレオチドである。
本発明によるｓｉＲＮＡの別の好ましい態様においては、前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分のアンチセンスＲＮＡ鎖が、前記標的ｍＲＮＡ領域の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ部分を含むか、又は前記標的ｍＲＮＡ領域の塩基配列に相補的な塩基配列において、１〜９個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるＲＮＡ部分を含み、より好ましくは、前記標的ｍＲＮＡ領域の塩基配列に相補的な塩基配列における連続する少なくとも９塩基の塩基配列からなるＲＮＡ部分を含む。
また、本発明は、二重鎖ＲＮＡ部分のアンチセンスＲＮＡ鎖が、配列番号２で表される塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号４で表される塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号６で表される塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号８で表される塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号１０で表される塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号１２で表される塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号１７で表される塩基配列からなるＲＮＡ、及び配列番号２２で表される塩基配列からなるＲＮＡ、からなる群から選択されるＲＮＡである、ｓｉＲＮＡにも関する。
本発明によるｓｉＲＮＡの好ましい態様においては、前記ｓｉＲＮＡの二重鎖ＲＮＡ部分において、（ａ）二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖が、ヘアピンループを形成することのできるＲＮＡ部分によって結合しているｓｈＲＮＡ、（ｂ）二重鎖ＲＮＡ部分の末端が平滑である二本鎖ヌクレオチド、又は（ｃ）二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖の一方又は両方の３’末端に、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドが結合し、突出末端を形成している二本鎖オリゴヌクレオチド、である。
また、本発明は前記ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ部分と、その５’側に前記ＤＮＡの転写を制御することのできるプロモーターと、前記ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡの３’側にターミネーターとを含むＤＮＡ、並びに前記のＤＮＡを含むベクターにも関する。【０００９】
更に、本発明は前記ｓｉＲＮＡ、前記ＤＮＡ、及び前記ベクターからなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含む、医薬組成物に関する。
本発明による医薬組成物の好ましい態様においては、ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患の治療用であり、好ましくはＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患が、癌又は喘息であり、より好ましくは前記癌が、膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、及び大腸癌である。【００１０】
本発明は、前記ｓｉＲＮＡ、前記ＤＮＡ、及び前記ベクターからなる群から選択される少なくとも１つを、ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患の治療が必要な対象に、有効量で投与することを含む、ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患を治療する方法に関する。
本発明の治療方法の好ましい態様においては、ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患が、癌又は喘息であり、より好ましくは前記癌が、膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、及び大腸癌である。【００１１】
本発明は、ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患の治療用医薬としての、前記ｓｉＲＮＡに関する。
本発明の治療用医薬としてのｓｉＲＮＡの好ましい態様においては、ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患が、癌又は喘息であり、より好ましくは前記癌が、膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、及び大腸癌である。【００１２】
本発明は、ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患の治療用医薬としての、前記ＤＮＡに関する。
本発明の治療用医薬としてのＤＮＡの好ましい態様においては、ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患が、癌又は喘息であり、より好ましくは前記癌が、膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、及び大腸癌である。【００１３】
本発明は、ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患の治療用医薬としての、前記ベクターに関する。
本発明の治療用医薬としてのベクターの好ましい態様においては、ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患が、癌又は喘息であり、より好ましくは前記癌が、膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、及び大腸癌である。【００１４】
本発明は、前記ｓｉＲＮＡ、前記ＤＮＡ、及び前記ベクターからなる群から選択される少なくとも１つの、ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患の治療用医薬組成物を製造するための使用に関する。
本発明の使用の好ましい態様においては、ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患が、癌又は喘息であり、より好ましくは前記癌が、膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、及び大腸癌である。【００１５】
更に、本発明は前記ｓｉＲＮＡにより、ＭＵＣ５ＡＣの発現をノックダウンした細胞に関する。
また、本発明は前記ｓｉＲＮＡによりＭＵＣ５ＡＣの発現をノックダウンした細胞、及びＭＵＣ５ＡＣの発現した細胞を用いた、薬剤のスクリーニング方法に関する。
本発明による薬剤のスクリーニング方法の好ましい態様においては、前記薬剤が、抗癌剤又は喘息治療薬である。
本明細書において、「ｓｉＲＮＡ」とは、小分子量干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を意味する。ｓｉＲＮＡは、少なくとも二重鎖のＲＮＡ部分を含み、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）と呼ばれる配列特異的な遺伝子発現抑制を誘導するものである。ＲＮＡ干渉により、ｓｉＲＮＡの標的となるｍＲＮＡが破壊され、そのｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現が抑制される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のｓｉＲＮＡによれば、ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患の治療を効率よく行うことができる。特には、ＭＵＣ５ＡＣが過剰に発現している癌細胞の生体内における増殖を効果的に抑制することができる。ＭＵＣ５ＡＣが発現している癌、特には膵臓癌においては、本発明のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物は、癌の治療に効果的に用いることが可能である。また、本発明のｓｉＲＮＡは、ＭＵＣ５ＡＣが発現している気管支の細胞において、ＭＵＣ５ＡＣの発現を効果的に抑制することができる。喘息において、ＭＵＣ５ＡＣの発現を抑えることによって、喘息の症状を効果的に予防又は治療することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ｏｈ−ｓｉＲＮＡ１〜ｏｈ−ｓｉＲＮＡ８を、ＳＷ１９９０株に導入し、４８時間後のＭＵＣ５ＡＣの遺伝子レベルでの発現を調べた電気泳動の写真である。陽性コントロールとして、ＧＡＰＤＨの発現を確認した。（レーン１：ｏｈ−ｓｉＲＮＡ１、レーン２：ｏｈ−ｓｉＲＮＡ２、レーン３：ｏｈ−ｓｉＲＮＡ３、レーン４：ｏｈ−ｓｉＲＮＡ４、レーン５：ｏｈ−ｓｉＲＮＡ５、レーン６：ｏｈ−ｓｉＲＮＡ６、レーン７：ｏｈ−ｓｉＲＮＡ７、レーン８：ｏｈ−ｓｉＲＮＡ８、レーン９：ｓｉＲＮＡがトランスフェクションされていないＳＷ１９９０株）
【図２】ＲＴ−ＰＣＲによるＳＷ１９９０ｓｉ株及びＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株におけるＭＵＣ５ＡＣの遺伝子レベルでの発現を調べた電気泳動の写真である。コントロールとして、ＧＡＰＤＨのｓｉ株及びＭｏｃｋ株における発現を確認した。
【図３】ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株及びＳＷ１９９０ｓｉ株におけるＭＵＣ５ＡＣのタンパク質レベルの発現をＦＡＣＳで解析した図である。
【図４】ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株及びＳＷ１９９０ｓｉ株（ＭＵＣ５ＡＣノックダウン株）の試験管内での増殖を示す図である。
【図５】ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株及びＳＷ１９９０ｓｉ株（ＭＵＣ５ＡＣノックダウン株）をヌードマウスに皮下移植した場合の、生体内での増殖を示す図である。
【図６】ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株及びＳＷ１９９０ｓｉ株（ＭＵＣ５ＡＣノックダウン株）を皮下移植した場合の腫瘍組織内への白血球の浸潤をＨＥ染色により示した図である。（Ａ）がｍｏｃｋ株を、（Ｂ）がｓｉ株を示す。
【図７】ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株及びＳＷ１９９０ｓｉ株（ＭＵＣ５ＡＣノックダウン株）を皮下移植した場合の腫瘍組織内へのＢ細胞、顆粒球、及びマクロファージの浸潤を免疫染色により示した図である。（Ａ）がＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株における好中球の浸潤、（Ｂ）がｓｉ株における好中球の浸潤、（Ｃ）がｍｏｃｋ株におけるＢ細胞の浸潤、（Ｄ）がｓｉ株におけるＢ細胞、（Ｅ）がｍｏｃｋ株におけるマクロファージの浸潤、（Ｆ）がｓｉ株におけるマクロファージの浸潤を示す。
【図８】ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株及びＳＷ１９９０ｓｉ株（ＭＵＣ５ＡＣノックダウン株）を皮下移植した場合の、ｓｉＲＮＡによるＢ細胞の抗体産生を示すＦＡＣＳ解析である。
【図９】ＳＷ１９９０ｓｉ株を移植されたマウスに、更にＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株を移植した場合の、生体内での増殖を示す図である。
【図１０】ＭＵＣ５ＡＣの発現したＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株による、マクロファージからのＰＧＥ２の産生を示すグラフである。
【図１１】ターゲット細胞としてＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株及びＳＷ１９９０ｓｉ株を用いた場合の、単核球及び多核球の細胞障害活性を示すグラフである。
【図１２】Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ由来脾細胞に対するＣｏｎＡのマイトジェン活性を、ＭＵＣ５ＡＣが抑制することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明のｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ及びベクター
本発明のｓｉＲＮＡは、二重鎖のＲＮＡ部分を有し、ＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡを、ＲＮＡ干渉を介して開裂することができる限り限定されるものではないが、ＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡである配列番号１で表される塩基配列からなる標的ｍＲＮＡ領域１、配列番号３で表される塩基配列からなる標的ｍＲＮＡ領域２、配列番号５で表される塩基配列からなる標的ｍＲＮＡ領域３、配列番号７で表される塩基配列からなる標的ｍＲＮＡ領域４、配列番号９で表される塩基配列からなる標的ｍＲＮＡ領域５、配列番号１１で表される塩基配列からなる標的ｍＲＮＡ領域６、配列番号１６で表される塩基配列からなる標的ｍＲＮＡ領域７、配列番号２１で表される塩基配列からなる標的ｍＲＮＡ領域８、において、ＲＮＡ干渉を介して開裂することができるｓｉＲＮＡが好ましい。標的ｍＲＮＡ領域としては、標的ｍＲＮＡ領域６が最も好ましい。表１に標的ｍＲＮＡ領域のヌクレオチドの塩基配列を示す。
【００１９】
【表１】
2010067882.tif 000002
【００２０】
また、ＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡは、プロセシングの違いにより、いくつかのスプライシングバリアントが知られている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．：ＮＭ  ０１７５１１、ＸＭ  ００１７１４７７４、ＮＭ＿００１１３４４２９、ＮＭ＿００１７１４１０４本発明のｓｉＲＮＡは、それぞれのバリアントが、前記の標的ｍＲＮＡ領域を有する場合、ＲＮＡ干渉を介してｍＲＮＡを開裂することができる。
【００２１】
二重鎖ＲＮＡ部分の長さは、塩基として、１５〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基、更に好ましくは１９〜２５塩基、最も好ましくは１９〜２１塩基である。二重鎖ＲＮＡ部分には、そのままｓｉＲＮＡとして機能するものも含まれるが、細胞内でＤｉｃｅｒにより切断されて、ｓｉＲＮＡとしてＲＮＡ干渉を誘導することのできる二重鎖ＲＮＡ部分も含むことができる。
【００２２】
二重鎖ＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ配列は、ＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡに細胞内でハイブリダイズできるものであれば、限定されず、前記標的ｍＲＮＡ領域の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ部分（以下、標的相補ＲＮＡ部分と称する）の塩基配列において、１〜９個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるＲＮＡ部分、及び／又は前記標的相補ＲＮＡ部分の塩基配列における連続する少なくとも９塩基、好ましくは少なくとも１０塩基、より好ましくは少なくとも１５塩基、最も好ましくは少なくとも１９塩基の塩基配列からなるＲＮＡ部分を含むＲＮＡであることができるが、好ましくは、ＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡの前記標的ｍＲＮＡ領域１〜８に対して、それぞれ完全に相補的な配列番号２で表される塩基配列からなるＲＮＡ部分（ｓｉＲＮＡ−１ａｓ）、配列番号４で表される塩基配列からなるＲＮＡ部分（ｓｉＲＮＡ−２ａｓ）、配列番号６で表される塩基配列からなるＲＮＡ部分（ｓｉＲＮＡ−３ａｓ）、配列番号８で表される塩基配列からなるＲＮＡ部分（ｓｉＲＮＡ−４ａｓ）、配列番号１０で表される塩基配列からなるＲＮＡ部分（ｓｉＲＮＡ−５ａｓ）、配列番号１２で表される塩基配列からなるＲＮＡ部分（ｓｉＲＮＡ−６ａｓ）、配列番号１７で表される塩基配列からなるＲＮＡ部分（ｓｉＲＮＡ−７ａｓ）、及び配列番号２２で表される塩基配列からなるＲＮＡ部分（ｓｉＲＮＡ−８ａｓ）、を含むＲＮＡ鎖であり、最も好ましくは、ｓｉＲＮＡ−６ａｓからなるＲＮＡ鎖である。それぞれの塩基配列を表２に示す。
【００２３】
【表２】
2010067882.tif 000003
【００２４】
アンチセンスＲＮＡ配列は、前記標的相補ＲＮＡ部分以外のＲＮＡ部分を含むことができ、そのＲＮＡ部分は、特に限定されるものではないが、ＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡであって、標的ｍＲＮＡ領域以外のＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ部分が好ましい。
【００２５】
また、アンチセンスＲＮＡ鎖の塩基配列は、標的ｍＲＮＡ領域における塩基配列に対して８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の相同性を有する。また、アンチセンスＲＮＡ部分は、ｓｉＲＮＡの全体のＧＣ含量が７０％以下、好ましくは３０〜７０％、３０〜６０％程度となるように設計されるのが好ましい。
【００２６】
二重鎖ＲＮＡ部分のセンスＲＮＡ配列は、アンチセンスＲＮＡ配列と細胞内でハイブリダイズすることのできるＲＮＡであれば、限定されず、例えば、アンチセンスＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列からなる塩基配列において１〜９個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるＲＮＡ鎖であることができ、最も好ましくは、アンチセンスＲＮＡの塩基配列に完全に相補的な塩基配列からなるセンスＲＮＡ配列である。
また、センスＲＮＡ配列は、前記標的ｍＲＮＡ領域（以下、センスＲＮＡ配列のＲＮＡを便宜的に、標的ＲＮＡ部分と称する場合がある）の塩基配列において、１〜９個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるＲＮＡ部分）、及び／又は前記標的ＲＮＡ部分の塩基配列における連続する少なくとも９塩基、好ましくは少なくとも１０塩基、より好ましくは少なくとも１５塩基、最も好ましくは少なくとも１９塩基の塩基配列からなるＲＮＡ部分を含むことができるが、好ましくは、二重鎖ＲＮＡ部分のセンスＲＮＡ配列は、ＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡにおける、前記標的ｍＲＮＡ領域１〜８のそれぞれの塩基配列、すなわち、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１６、及び配列番号２１で表される塩基配列からなるＲＮＡ部分（以下、それぞれｓｉＲＮＡ−１ｓ、ｓｉＲＮＡ−２ｓ、ｓｉＲＮＡ−３ｓ、ｓｉＲＮＡ−４ｓ、ｓｉＲＮＡ−５ｓ、ｓｉＲＮＡ−６ｓ、ｓｉＲＮＡ−７ｓ、及びｓｉＲＮＡ−８ｓと称する）を含むＲＮＡであり、最も好ましくは、ｓｉＲＮＡ−６ｓからなるＲＮＡ鎖である。それぞれの塩基配列を表３に示す。
【００２７】
【表３】
2010067882.tif 000004
【００２８】
また、センスＲＮＡ鎖は、前記標的ＲＮＡ部分以外のＲＮＡ部分を含むことができ、そのＲＮＡ部分は、特に限定されるものではないが、ＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡであって標的ｍＲＮＡ領域以外のＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡ塩基配列からなるＲＮＡ部分が好ましい。
【００２９】
本発明のｓｉＲＮＡの態様の１つとして、二重鎖のＲＮＡ部分の末端が平滑である二本鎖ヌクレオチドも含まれ、このようなｓｉＲＮＡは十分なＲＮＡｉ活性を示す。
【００３０】
また、本発明のｓｉＲＮＡの態様の１つとして、二重鎖のＲＮＡ部分と、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハングとからなり、突出末端を形成する二本鎖オリゴヌクレオチドも含まれる。前記オーバーハング部分は、それぞれ、５塩基以下の任意のヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド）であるが、２塩基のヌクレオチドが好ましい。ｓｉＲＮＡの３’側オーバーハングを構成するリボヌクレオチドとしては、例えば、ｕ（ウリジン）、ａ（アデノシン）、ｇ（グアノシン）、又はｃ（シチジン）のヌクレオチドを用いることができ、３’側のオーバーハングを構成するデオキシリボヌクレオチドとしては、例えば、ｄｔ（チミジン）、ｄａ（デオキシアデノシン）、ｄｇ（デオキシグアノシン）、又はｄｃ（デオキシシチジン）のヌクレオチドを用いることができる。
【００３１】
前記オーバーハングとしては、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端に、それぞれ独立して、１又は２塩基のｕ又はｄｔが付加されたオーバーハングが好ましく、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端に、それぞれ独立して、１又は２塩基のｕ又はｄｔが付加されたオーバーハングがより好ましく、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端に、２塩基のｕ又はｄｔが付加されたオーバーハングが特に好ましい。更に、具体的なオーバーハングとしては、例えばｕｇ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’などの塩基配列を挙げることができる。従って、オーバーハング二重鎖ｓｉＲＮＡとして、前記ｓｉＲＮＡ−１ｓ〜ｓｉＲＮＡ−８ｓの３’末端にｔｔ−３’が付加されたヌクレオチドと、前記ｓｉＲＮＡ−１ａｓ〜ｓｉＲＮＡ−８ａｓの３’末端にｔｔ−３’が付加されたヌクレオチドが、それぞれアニールしたオーバーハング二重鎖ｓｉＲＮＡを挙げることができ、具体的には、ＧＧＡＧＣＣＵＧＡＵＣＡＵＣＣＡＧＣＡｔｔ及びＵＧＣＵＧＧＡＵＧＡＵＣＡＧＧＣＵＣＣｔｔのアニールしたもの（ｏｈ−ｓｉＲＮＡ１）、ＧＣＡＧＧＣＡＣＵＵＣＵＣＣＣＡＧＧＡｔｔ及びＵＣＣＵＧＧＧＡＧＡＡＧＵＧＣＣＵＧＣｔｔのアニールしたもの（ｏｈ−ｓｉＲＮＡ２）、ＧＣＡＧＵＧＣＣＵＵＣＡＣＵＧＵＡＣＵｔｔ及びＡＧＵＡＣＡＧＵＧＡＡＧＧＣＡＣＵＧＣｔｔのアニールしたもの（ｏｈ−ｓｉＲＮＡ３）、ＡＣＡＣＣＡＡＧＣＵＧＡＣＡＣＣＣＡＵｔｔ及びＡＵＧＧＧＵＧＵＣＡＧＣＵＵＧＧＵＧＵｔｔのアニールしたもの（ｏｈ−ｓｉＲＮＡ４）、ＣＣＣＵＣＡＡＣＣＵＵＣＵＵＣＡＵＣＡｔｔ及びＵＧＡＵＧＡＡＧＡＡＧＧＵＵＧＡＧＧＧｔｔのアニールしたもの（ｏｈ−ｓｉＲＮＡ５）、ＵＵＵＧＡＧＡＧＡＣＧＡＡＧＧＡＵＡＣｔｔ及びＧＵＡＵＣＣＵＵＣＧＵＣＵＣＵＣＡＡＡｔｔのアニールしたもの（ｏｈ−ｓｉＲＮＡ６）、ＧＧＡＡＡＣＣＵＡＣＡＡＣＡＡＣＡＵＣｔｔ及びＧＡＵＧＵＵＧＵＵＧＵＡＧＧＵＵＵＣＣｔｔのアニールしたもの（ｏｈ−ｓｉＲＮＡ７）、並びにＣＡＵＣＡＡＣＡＵＣＡＵＣＣＡＵＧＵＣｔｔ及びＧＡＣＡＵＧＧＡＵＧＡＵＧＵＵＧＡＵＧｔｔのアニールしたもの（ｏｈ−ｓｉＲＮＡ８）を挙げることができる。
【００３２】
本発明のｓｉＲＮＡの態様の１つとして、二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖が、ヘアピンループを形成することのできるＲＮＡ部分によって結合しているショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ；以下、ｓｈＲＮＡと称する）が含まれる。ｓｈＲＮＡは、二重鎖ＲＮＡ部分を形成する前記センスＲＮＡ配列とアンチセンス配列が、ヘアピンループを形成することのできるＲＮＡ部分によって結合し、前記センスＲＮＡ配列とアンチセンス配列が二本鎖構造を形成している。ヘアピンループを形成するＲＮＡ部分の鎖長及び塩基配列は、ヘアピンループを形成することができるものである限り、限定されるものではないが、鎖長は好ましくは３〜２３であり、より好ましくは、３から１０であり、例えば、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＣＵＵＣＣＵＧＵＣＡ（配列番号３０）、ＣＣＡＣＣ、ＣＵＣＧＡＧ、ＣＣＡＣＡＣＣ、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＡＵＧ、ＣＣＣ及びＵＵＣＧからなる群より選択される少なくともひとつの塩基配列からなるＲＮＡを挙げることができる。前記ｓｉＲＮＡ−６ａｓ及びｓｉＲＮＡ−６ｓの二重鎖ＲＮＡ形成部分、ｓｉＲＮＡ−７ａｓ及びｓｉＲＮＡ−７ｓの二重鎖ＲＮＡ形成部分、並びにｓｉＲＮＡ−８ａｓ及びｓｉＲＮＡ−８ｓの二重鎖ＲＮＡ形成部分を含むｓｈＲＮＡ（以下、それぞれｓｈＲＮＡ６、ｓｈＲＮＡ７、及びｓｈＲＮＡ８と称する）の例を表４に示す。
【００３３】
【表４】
2010067882.tif 000005
【００３４】
本発明のｓｉＲＮＡは、公知の製造方法、例えば、化学合成、又は酵素合成法により製造することもできるし、あるいは、後述するように適当な発現ベクターに挿入し、遺伝子工学的に製造することもできる。
化学合成法としては、２’−ＡＣＥ（２’−ｂｉｓ（ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ）−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）又は２’−ＴＢＤＭＳ（２’−ｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｌｙｌ）等の保護基を用いた方法、酵素合成法としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼを使用する方法を挙げることができる。化学合成法又は酵素合成法により合成された２本鎖ＲＮＡは、安定化や標識化のために、化学修飾基により修飾することができる。
【００３５】
本発明のＤＮＡは、直鎖状ＤＮＡの形態で細胞内に導入され、細胞内でｓｉＲＮＡを生成することができるものである。特に限定されないが、例えば、前記二本鎖オリゴヌクレオチド又はｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ部分の５’側に前記ＤＮＡの転写を制御することのできるプロモーターと、３’側にターミネーターとを含むＤＮＡを挙げることができる。更に、このようなＤＮＡをベクターに挿入し、本発明のベクターを作製することができる。以下に、本発明のＤＮＡ及びベクターについて、ベクターの作製に基づいて説明する。
【００３６】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドを生成することのできるＤＮＡの場合、センス鎖及びアンチセンス鎖を異なる２つのプロモーターの制御下に配置し、個別にセンス鎖及びアンチセンス鎖を転写することができる。これらのＤＮＡをベクターに挿入する場合、（１）それぞれのＤＮＡを順方向に配置するタンデムタイプ、（２）ベクターのセンス鎖にて機能するプロモーター下にｓｉＲＮＡの一方のＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡが配置され、ベクターのアンチセンス鎖にて機能するプロモーター下にｓｉＲＮＡのもう一方のＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡが配置される対向タイプ、及び（３）センス鎖を発現するＤＮＡとアンチセンス鎖を発現するＤＮＡを別々のベクターに挿入するセパレートタイプを挙げることができる。
また前記ｓｈＲＮＡを生成することができるＤＮＡの場合、ｓｈＲＮＡの全長を発現することができるＤＮＡ、例えば、プロモーターの下流側にセンス鎖のＲＮＡをコードする配列、ヘアピンループをコードする配列、アンチセンス鎖のＲＮＡをコードする配列、ポリＴストレッチ配列、及びストップコドンからなる塩基配列を順番に有するＤＮＡを用いることができ、このＤＮＡをベクターに挿入することができる。
【００３７】
プロモーターとしては、恒常的に発現するためのプロモーターでもよく、特定の条件下で発現するためのプロモーターでもよく、特に限定されないが、例えば、ＲＮＡポリメラーゼIII（pol III）プロモーター（Brummerlkamp,T.R., et al., Science, 297, 1352-1354, 2002）、Ｕ６プロモーター（a） Lee NS. et al., Nature Biotech. 20, 500-505, 2002；b） Miyagishi M. & Taira K., Nature Biotech. 20, 497-500, 2002；c）Paul CP. et al., Nature Biotech. 20, 505-508, 2002）、Ｈ１プロモーター（Brummelkamp TR et al: Science 296, 550-553, 2002）、ｔＲＮＡプロモーター（Oshima K., et al., Cancer Research 63, 6809-6814, 15, 2003）などを挙げることができる。
【００３８】
本発明のベクターは、哺乳動物細胞内でＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡの発現を抑制することのできるｓｉＲＮＡを発現させるためのベクターであり、前記細胞内で効率良くｓｉＲＮＡを発現できるものであれば、骨格となるベクターは、特に限定されるものではない。前記骨格となるベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、直鎖状２本鎖ＤＮＡベクター並びに、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクター等のウイルスベクターを挙げることができる。
【００３９】
本発明のｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ及びベクターは、ｓｉＲＮＡとして、又は後述の医薬組成物として、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、又はカチオン脂質法を用いて目的の組織、又は細胞内に導入することが可能である。骨格となるベクターとして、ウイルスベクターを用いる場合は、目的の細胞へのウイルスベクターの感染によってｓｉＲＮＡを導入することが可能である。
【００４０】
本発明のＤＮＡ又はベクターは、細胞内においてｓｉＲＮＡを転写し、そのｓｉＲＮＡが作用するものである。細胞内におけるｓｉＲＮＡの発現は、一過的でも、安定的でも細胞内において有効に作用する。
【００４１】
《本発明のｓｉＲＮＡの作用》
後述の実施例で示されているように、本発明のｓｉＲＮＡであるｏｈ−ｓｉＲＮＡ１〜ｏｈ−ｓｉＲＮＡ８は、膵臓癌細胞ＳＷ１９９０においてＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡの発現を特異的に抑制した。更に、本発明のｓｉＲＮＡの１つの態様であるｓｈＲＮＡ６は、ＭＵＣ５ＡＣが発現している膵臓癌細胞ＳＷ１９９０においてＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡの発現、及びＭＵＣ５ＡＣのタンパク質の発現を顕著に抑制した。このｓｈＲＮＡ６が安定的に転写されている膵臓癌細胞ＳＷ１９９０株（以下、ＳＷ１９９０ｓｉ株と称することがある）は、コントロールのベクターが導入された膵臓癌細胞ＳＷ１９９０株（以下、ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株と称することがある）と比較すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖能は変わらなかった。すなわち、ＭＵＣ５ＡＣに対するｓｉＲＮＡであるｓｈＲＮＡ６によって、膵臓癌細胞自体の増殖には影響がなかった。また、ＳＷ１９９０ｓｉ株の接着性、遊走性、浸潤能なども、ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株と同じであった。
しかしながら、ＳＷ１９９０ｓｉ株と、ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株とをヌードマウスに皮下移植した場合の増殖性は明らかに異なっており、ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株では移植後、腫瘍体積が急激に増加したが、ＳＷ１９９０ｓｉ株では、腫瘍の体積は殆ど増加せず、増殖が抑制された。すなわち、ＭＵＣ５ＡＣに対するｓｉＲＮＡは、生体内において膵臓癌細胞の増殖を抑制することが可能である。
【００４２】
本発明のｓｉＲＮＡが、生体内で膵臓癌細胞の増殖を抑制することができる理由は、後述の実施例での解析により、以下のような理由が考えられる。しかしながら、本発明は以下の説明によって限定されるものではない。
通常生体内では、癌細胞に対する免疫反応が起こり、癌細胞を生体内から排除しようとする。しかしながら、ＭＵＣ５ＡＣを発現しているＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株では、ＭＵＣ５ＡＣにより、宿主の免疫機能が抑制され、癌細胞を排除することができない。一方、ＭＵＣ５ＡＣを発現していないＳＷ１９９０ｓｉ株では、宿主の免疫機能が抑制されないため、癌細胞の増殖が抑えられたものと考えられる。
具体的なＭＵＣ５ＡＣの免疫抑制機能としては、以下の作用を挙げることができる。ＭＵＣ５ＡＣが発現したＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株では腫瘍表面と内部に僅かに顆粒球の存在が認められたが、ＳＷ１９９０ｓｉ株では腫瘍内部への白血球の浸潤が観察された。これらの白血球は、主としてＢ細胞と顆粒球、単球／マクロファージなどであり、ＭＵＣ５ＡＣが、幅広い免疫担当細胞の活性を抑制していることが分かる。従って、顆粒球のうち９０％以上を占める好中球による免疫活性もＭＵＣ５ＡＣにより抑制される。
【００４３】
好中球は免疫担当細胞として、以下に詳述する重要な役割を果たしているが、本発明の医薬組成物、特に免疫抑制剤は、好中球の免疫活性を抑制することもできる。
好中球は主に細菌類の直接貪食や有莢膜細菌に対するオプソニン化後の貪食といった細菌に対する免疫のイメージが強いが、近年抗腫瘍作用を有することも報告されている。この好中球の抗腫瘍作用は、TNF related apoptosis inducing ligand（ＴＲＡＩＬ）を介したアポトーシス誘導によることが知られている。ＴＲＡＩＬは１９９５年にアポトーシス誘導能を持ち、ＴＮＦファミリー類似配列を持つサイトカインとして分離された。構造は２８１アミノ酸からなる約３０ｋＤａのII型細胞表面蛋白で、Ｆａｓリガンドと約２８％のホモロジーがある。様々な悪性腫瘍に対して、アポトーシス誘導能を示すが、正常細胞に対しては、細胞毒性を示さないことが大きな特徴であり、分子標的治療薬として期待されている分子の一つである。受容体としては、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（Death Recepter 4：ＤＲ４）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（Death Recepter 5：ＤＲ５）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３（Decoy Receptor 1：ＤｃＲ１）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４（Decoy Receptor 2：ＤｃＲ２）、Ｏｓｔｅｒｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ（ＯＰＧ）の５種類が存在する。ＤＲ４、５は細胞内にデスドメインを持ちアポトーシス誘導に関与する一方で、ＤｃＲ１、２はデコイ受容体でありアポトーシスを誘導しない。悪性腫瘍のみにアポトーシス誘導能を示すのは、この受容体の発現の違いが原因とする説もあるが、詳細は分かっていない。また好中球におけるＴＲＡＩＬの発現は、他の血球細胞と比べて有意に高いことが知られている。
【００４４】
また、マクロファージとＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株、又はマクロファージとＳＷ１９９０ｓｉ株とを共培養することによって、マクロファージから産生されるＰＧＥ２量を調べた。ＰＧＥ２産生量はＳＷ１９９０ｓｉ株との共培養時には、ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株の時の１／７〜１／１０にまで減少していた。すなわち、ＭＵＣ５ＡＣは、マクロファージからのＰＧＥ２の産生を亢進させ、免疫抑制を起こしている。
更に、ＳＷ１９９０ｓｉ株の移植されたマウスでは、膵臓癌細胞に対する特異抗体が産生されたが、ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株の移植されたマウスでは、膵臓癌細胞に対する特異抗体は、ほとんど産生されなかった。すなわち、ＭＵＣ５ＡＣは、Ｂ細胞の抗体産生作用を抑制している。
以上のことから、ｓｉＲＮＡによりＭＵＣ５ＡＣの発現を抑制することによって、ＭＵＣ５ＡＣによって抑制される宿主の免疫機能を誘導（回復）することができ、膵臓癌細胞の生体内での増殖を抑制することが可能であると考えられる。
【００４５】
前記のように、本発明者はＭＵＣ５ＡＣが宿主の免疫機能を抑制することで、免疫細胞からの攻撃を逃れ、癌細胞自身の増殖に適した環境を作り上げていることを見出した。すなわち、ＭＵＣ５ＡＣの免疫抑制作用が、（ａ）白血球（特には、好中球、Ｂ細胞、及びマクロファージ）の癌組織への浸潤の抑制、（ｂ）Ｂ細胞の抗体産生の抑制、（ｃ）単核球及び多核球の細胞障害活性の抑制、（ｄ）マイトジェン活性の抑制、（ｅ）プロスタグランジンＥ２の産生亢進、及び（ｆ）ＴＲＡＩＬを介するアポトーシスの抑制などによるものであり、幅広い免疫担当細胞に対して効果があることを見出した。
【００４６】
従って、本明細書は、ムチン５サブタイプＡＣを有効成分として含む、医薬組成物を開示する。
また、本明細書は、ムチン５サブタイプＡＣを有効成分として含む、免疫抑制剤を開示する。
前記免疫抑制剤の好ましい態様においては、白血球の機能を抑制する。
前記免疫抑制剤の好ましい態様においては、マイトジェン活性を抑制する。
前記免疫抑制剤の好ましい態様においては、プロスタグランジンの産生を亢進する。
前記免疫抑制剤の好ましい態様においては、Ｂ細胞の抗体産生を抑制する。
前記免疫抑制剤の好ましい態様においては、単核球及び多核球の細胞障害活性を抑制する。
前記免疫抑制剤の好ましい態様においては、アポトーシスを抑制する。
【００４７】
前記免疫抑制剤によれば、（１）臓器移植における移植臓器に対する拒絶反応の予防及び治療、（２）自己免疫疾患の予防及び治療、並びに（３）アレルギー性喘息の予防及び治療が可能である。前記医薬組成物、特に免疫抑制剤は、幅広い免疫担当細胞に対して抑制効果を有するため、免疫を抑制することによって改善する多様な疾患に対して効果がある。更に、前記免疫抑制剤の有効成分であるＭＵＣ５ＡＣは、元来、生体内に存在する糖たんぱく質であるため、従来の免疫抑制剤、例えば、サイクロスポリンＡで問題となっていた腎障害、細動脈障害、高血圧、糖尿病、及び高脂血症などの副作用が見られない。
【００４８】
前記医薬組成物、特に免疫抑制剤は、幅広い免疫担当細胞の機能を抑制することが可能であるので、例えば、自己免疫疾患を含む、免疫が関与していると考えられる疾患の治療又は予防に有用である。このような対象疾患としては、例えば、全身性エリセマトーデス、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎又はクローン病）、多発性硬化症、乾癬、慢性肝炎、膀胱ガン、乳ガン、子宮頸部ガン、慢性リンパ性白血症、慢性骨髄性白血病、大腸ガン、結腸ガン、直腸ガン、ヘリコバクターピロリ感染症、ホジキン病、インスリン依存性糖尿病、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、非ホジキン性リンパ腫、非小細胞肺ガン、卵巣ガン、消化性潰瘍、前立腺ガン、敗血症ショック、結核、不妊症、動脈硬化、ベーチュット病、喘息、アトピー性皮膚炎、腎炎、全身性真菌感染症、急性バクテリア髄膜炎、急性心筋梗塞、急性膵炎、急性ウイルス脳炎、成人呼吸促迫症候群、バクテリア肺炎、慢性膵炎、単純ヘルペスウイルス感染症、水痘−帯状疱疹ウイルス感染症、ＡＩＤＳ、ヒトパピローマウイルス感染症、インフルエンザ、侵襲性ブドウ状球菌感染症、末梢血管疾患、敗血症、間質性肝疾患、時局性回腸炎、又は多発性硬化症などを挙げることができる。
【００４９】
２．ｓｉＲＮＡが導入された細胞を用いた薬剤スクリーニング
本発明のノックダウン細胞及びＭＵＣ５ＡＣ発現細胞（例えば、ノックダウン株の親株）を用いると、試験物質がＭＵＣ５ＡＣを発現した細胞の増殖（例えば、抑制又は促進）、浸潤能、走化性、接着性又は形態などを修飾するか否かをスクリーニングすることができる。すなわち、ＭＵＣ５ＡＣ発現細胞及びノックダウン細胞と、試験物質とを接触させることにより、試験物質がネイティブなＭＵＣ５ＡＣに結合するか否かをスクリーニングすることが可能である。更に、ＭＵＣ５ＡＣ発現細胞及びノックダウン細胞の反応を比較することにより、試験物質がネイティブなＭＵＣ５ＡＣに結合し、ＭＵＣ５ＡＣ発現株の増殖、浸潤能、走化性、接着性又は形態などが影響を受けるか否かをスクリーニングすることができる。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法にかけることのできる試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術［Terrett, N. K. ら, Tetrahedron, 51, 8135-8137 (1995)］又は通常の合成技術によって得られた化合物群、ファージ・ディスプレイ法［Felici, F. ら, J. Mol. Biol., 222, 301-310 (1991)］などを応用して作製されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
【００５１】
まず、ＭＵＣ５ＡＣ発現株及びノックダウン株は、試験物質のネイティブなＭＵＣ５ＡＣへの結合のスクリーニングに用いることが可能である。試験物質が、ネイティブな抗原構造に結合するか否かの評価においては、目的抗原を発現していない細胞に目的抗原を過剰発現させた細胞を用いて評価するのが一般的である。しかしながら、ＭＵＣ５ＡＣのような超高分子糖タンパク質の場合、細胞に全長のタンパク質を高発現させることは容易ではない。従って、ＭＵＣ５ＡＣ高発現細胞株に対してｓｉＲＮＡを導入した本発明のＭＵＣ５ＡＣをノックダウンした細胞を陰性コントロールとして用い、ネイティブなＭＵＣ５ＡＣとの結合を検討することが好ましい。
【００５２】
更に、本発明のスクリーニング方法においては、ＭＵＣ５ＡＣ発現株及びノックダウン株と、試験物質とを接触させ、前記試験物質の存在下における、ＭＵＣ５ＡＣ発現株の増殖への影響を分析することにより、前記試験物質が、ＭＵＣ５ＡＣ発現株の増殖、浸潤能、走化性、接着性又は形態などを修飾するか否かを判断することができる。例えば、試験物質の不在下におけるＭＵＣ５ＡＣ発現株の増殖と比較して、試験物質の存在下における前記ＭＵＣ５ＡＣ発現株の増殖が減少する場合には、前記試験物質が、ＭＵＣ５ＡＣ発現株の増殖を抑制又は阻害すると判断することができる。一方、ＭＵＣ５ＡＣ発現株の増殖が上昇する場合には、前記試験物質が、ＭＵＣ５ＡＣ発現株の増殖を促進すると判断することができる。このような試験物質のＭＵＣ５ＡＣ発現株の増殖への影響は、ＭＵＣ５ＡＣの発現が抑制されたノックダウン株では、見られないはずであり、ノックダウン株は陰性コントロールとして用いることができる。
【００５３】
３．本発明の医薬組成物
本発明の医薬組成物は、有効成分として本発明のｓｉＲＮＡ、本発明のＤＮＡ、又は本発明のベクターを含むことができる。
【００５４】
本発明のｓｉＲＮＡ、あるいは、本発明のｓｉＲＮＡを投与対象内で転写可能なＤＮＡ又はベクターは、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ＭＵＣ５ＡＣの発現が関与する細胞増殖を伴う疾患の治療及び／又は予防が必要な対象［例えば、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）］に、有効量で投与することができる。例えば、本発明のｓｉＲＮＡ、あるいは、本発明のｓｉＲＮＡを投与対象内で転写可能なＤＮＡ又はベクターは、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ＭＵＣ５ＡＣの発現細胞の生体内での増殖を抑制することにより、癌、特には、膵臓癌を治療することができる。また、喘息においては、細胞内でのＭＵＣ５ＡＣの発現を抑制し、ＭＵＣ５ＡＣの分泌を抑制することにより、症状を改善することができる。
【００５５】
本発明の医薬組成物の対象となる疾患は、ＭＵＣ５ＡＣの過剰発現を伴う疾患であり、具体的には癌及び喘息を挙げることができる。癌の種類は、特に限定されることはないが、例えば、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病及び脳腫瘍を挙げることができる。本発明の医薬組成物は、特には膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、及び大腸癌を効率よく治療することができる。
【００５６】
本発明の医薬組成物の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００５７】
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明の医薬組成物は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の医薬組成物をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、これに限定されるものではないが、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で、有効成分を含有することができる。
本発明の医薬組成物を用いる場合の投与量は、例えば、使用する有効成分の種類、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
また、投与形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品（飲料を含む）、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。
【実施例】
【００５９】
以下に実施例及び比較例を示し本発明の具体的な説明を行うが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００６０】
《実施例１：オーバーハング二重鎖ｓｉＲＮＡによるＭＵＣ５ＡＣの発現抑制》
ＭＵＣ５ＡＣの発現している膵臓癌細胞株ＳＷ１９９０に、１９ｍｅｒのＲＮＡの３’末端にｔｔを付加したオーバーハング二重鎖ｓｉＲＮＡを導入し、ＭＵＣ５ＡＣの発現の抑制を検討した。標的ｍＲＮＡ領域１〜８に対応する８つのオーバーハング二重鎖ｓｉＲＮＡの配列を表５に示す。【００６１】
【表５】
2010067882.tif 000006
【００６２】
表５に示すｏｈ−ｓｉＲＮＡ１〜ｏｈ−ｓｉＲＮＡ８のそれぞれの１本鎖のＲＮＡを、定法により合成した。合成したセンスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡにアニーリングバッファーを添加し、９５℃で１分処理した後、３７度で１時間保温し、アニーリングさせ、それをＳＷ１９９０株へのトランスフェクションに用いた。
ＳＷ１９９０株を２×１０５／ｗｅｌｌで６ｗｅｌｌプレートに播種し、５０−９０％コンフルエントになるまで培養した。無血清ＤＭＥＭ培地２５０μＬに、最終濃度が１μＭになるようにｓｉＲＮＡを添加した（Ａ溶液）。無血清ＤＭＥＭ培地２５０μＬにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（インビトロジェン社）を５μＬ加え室温で５分間インキュベートした（Ｂ溶液）。Ａ溶液とＢ溶液を混合し室温で更に２０分間インキュベート後、２ｍＬの血清を含むＤＭＥＭ培地を加え、全量２．５ｍＬを細胞に添加した。４８時間培養後、細胞を回収した。
ｏｈ−ｓｉＲＮＡ１〜ｏｈ−ｓｉＲＮＡ８を導入したＳＷ１９９０株におけるＭＵＣ５ＡＣの発現は、ＲＴ−ＰＣＲによって検討した。回収したＳＷ１９９０株からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてトータルＲＮＡを抽出、及び精製した。ＭＵＣ５ＡＣの塩基配列に特異的なセンスプライマー５’−ＧＣＣＡＣＣＧＣＴＧＣＧＧＣＣＴＴＣＴＴＣ−３’（配列番号２６）及びアンチセンスプライマー５’−ＧＴＧＣＡＣＧＴＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣ−３’（配列番号２７）を使用し、SuperScript III First Strand Synthesis System（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に添付の使用説明書に従い、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＭＵＣ５ＡＣ  ｍＲＮＡの転写を検討した。コントロールとして、ＧＡＰＤＨの塩基配列に特異的なセンスプライマー５’−ＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧ−３’、（配列番号２８）及びアンチセンスプライマー及び５’−ＴＣＴＴＡＣＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＴ−３’（配列番号２９）を用い、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡを測定した。
図１に示すように、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしていないＳＷ１９９０細胞株に比べて、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＳＷ１９９０細胞株においては、ＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡの発現抑制が認められた。特にｏｈ−ｓｉＲＮＡ１及びｏｈ−ｓｉＲＮＡ６で、ｍＲＮＡの抑制が強かった。【００６３】
《実施例２：ｓｈＲＮＡ６、ｓｈＲＮＡ７、及びｓｈＲＮＡ８をコードするプラスミドベクターの構築》
（Ａ）前記標的ｍＲＮＡ領域６、７、及び８に対応するｓｈＲＮＡ６、ｓｈＲＮＡ７、及びｓｈＲＮＡ８を転写するベクターを構築するために、ｓｈＤＮＡ６−１（配列番号１３）及びｓｈＤＮＡ６−２（配列番号１４）、ｓｈＤＮＡ７−１（配列番号１８）及びｓｈＤＮＡ７−２（配列番号１９）、並びにｓｈＤＮＡ８−１（配列番号２３）及びｓｈＤＮＡ８−２（配列番号２４）のＤＮＡを常法により合成した。
ｓｈＲＮＡ６のセンス鎖：GATCCGTTTGAGAGACGAAGGATACTTCAAGAGAGTATCCTTCGTCTCTCAAATTTTTTGGAAA（配列番号１３）、アンチセンス鎖：AGCTTTTCCAAAAAATTTGAGAGACGAAGGATACTCTCTTGAAGTATCCTTCGTCTCTCAAACG（配列番号１４）、ｓｈＲＮＡ７のセンス鎖：GATCCGGAAACCTACAACAACATCTTCAAGAGAGATGTTGTTGTAGGTTTCCTTTTTTGGAAA（配列番号１８）、アンチセンス鎖：AGCTTTTCCAAAAAAGGAAACCTACAACAACATCTCTCTTGAAGATGTTGTTGTAGGTTTCCG（配列番号１９）、ｓｈＲＮＡ８のセンス鎖：GATCCGCATCAACATCATCCATGTCTTCAAGAGAGACATGGATGATGTTGATGTTTTTTGGAAA（配列番号２３）、アンチセンス鎖：AGCTTTTCCAAAAAACATCAACATCATCCATGTCTCTCTTGAAGACATGGATGATGTTGATGCG（配列番号２４）
ｓｈＤＮＡ６−１（配列番号１３）は、ヒトＭＵＣ５ＡＣｍＲＮＡの塩基配列の一部に相同的な塩基配列からなるＲＮＡ（センス鎖）をコードするＤＮＡと、前記塩基配列に相補的なＲＮＡ（アンチセンス鎖）をコードするＤＮＡと、これらのＤＮＡの間にループ部分のＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。更に、ｓｈＤＮＡ６−１は、前記のセンス鎖とループ部分とアンチセンス鎖からなるＤＮＡの３’側に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーターをコードするＤＮＡを、センス鎖５’末端に転写効率を上げるため、一塩基“ｇ”を含む。また、ベクターｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ３．１  ｎｅｏ（Ａｍｂｉｏｎ社）に挿入するために、５’末端側にＢａｍＨ  Ｉサイトと３’末端側にＨｉｎｄ  ＩＩＩサイトが存在する。ｓｈＤＮＡ６−２の塩基配列（配列番号１４）は、制限酵素サイト以外はｓｈＤＮＡ６−１（配列番号１３）の塩基配列に相補的で、５’末端側にＢａｍＨ  Ｉサイトと３’末端側にＨｉｎｄ  ＩＩＩサイトが存在するＤＮＡである。すなわち、ｓｈＤＮＡ６−１とｓｈＤＮＡ６−２をアニーリングさせて、ＢａｍＨ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩとで消化後、同制限酵素にて消化済みのｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ３．１  ｎｅｏベクターの切断部位に連結させ、ｓｈＲＮＡ６をコードするＤＮＡを含有するベクター（以下、ｓｈＲＮＡ６ベクターと称する）を得た。
また、ｓｈＤＮＡ６−１及びｓｈＤＮＡ６−２に代えて、ｓｈＤＮＡ７−１及びｓｈＤＮＡ７−２、又はｓｈＤＮＡ８−１及びｓｈＤＮＡ８−２を使用した以外は、同様の操作を繰り返し、ｓｈＲＮＡ７ベクター、及びｓｈＲＮＡ８ベクターを得た。【００６４】
《実施例３：ｓｈＲＮＡ６ベクターの膵臓癌細胞株ＳＷ１９９０への導入によるＭＵＣ５ＡＣノックダウン細胞株の作出》
（Ａ）膵臓癌細胞株ＳＷ１９９０に、実施例２で作製した３つのベクターのうち、ＳＷ１９９０株への一過性の発現の効率がよいｏｈ−ｓｉＲＮＡ６に対応するｓｈＲＮＡ６ベクターをトランスフェクションした。
膵臓癌細胞株ＳＷ１９９０は、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０（１００Ｕ／ｍＬペニシリンと１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン添加；以下、完全ＲＰＭＩ１６４０培地と称する）中で３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養及び維持した。それぞれの細胞を直径１０ｃｍの細胞培養ディッシュに１×１０６個播き、２４時問後、細胞が７０〜９０％コンフルエントの状態とした。ｓｈＲＮＡ６ベクター１１．２μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（インビトロジェン社）５６μＬに溶解し、細胞の入ったディッシュに添加し、３７℃にて培養した。２４時問後に前記の完全ＲＰＭＩ１６４０培地にＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（Ｇ４１８；ＧＩＢＣＯ社）を最終濃度４００μｇ／ｍＬになるように加えた培地に置換した。
（Ｂ）前記Ｇ４１８でのセレクションにより、ｓｈＲＮＡ６が安定的に転写されるＳＷ１９９０ｓｉ株を取得した。また、コントロールとして、ｓｈＲＮＡ６ベクターの代わりにｐＳｉｌｅｎｃｅｒ３．１ｎｅｏを用いた以外は、同様の操作を繰り返し、ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株を取得した。【００６５】
《実施例４：ＳＷ１９９０ｓｉ株におけるＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡの転写及びＭＵＣ５ＡＣの発現》
ＳＷ１９９０ｓｉ株におけるＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡの転写をＲＴ−ＰＣＲによって検討した。
ＳＷ１９９０ｓｉ株からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてトータルＲＮＡを抽出、及び精製したことを除いては、実施例１のＲＴ−ＰＣＲの操作を繰り返し、ＭＵＣ５ＡＣ及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡを測定した。
図２に示すように、ＳＷ１９９０ｓｉ株では、ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株と比べて有意に発現の抑制が見られた。【００６６】
タンパク質レベルでのＭＵＣ５ＡＣの発現は、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）により評価した。１０６ｃｅｌｌｓ／５０μＬに調整されたそれぞれの細胞に１μｇの抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体（Ｍ５＃１）を加え、氷上で３０分間インキュベートした。非結合抗体を洗浄後、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＦＩＴＣを加え、更に氷上で３０分間インキュベートした。非結合抗体を洗浄後、ＦＡＣＳによる解析を行った。
図３に示すようにＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株では確認されていたシフト（抗体が細胞に結合した）が、ＳＷ１９９０ｓｉ株では全く確認出来なかった。従って、これらの結果から、ＳＷ１９９０ｓｉ株はｓｉＲＮＡにより、遺伝子レベル及びタンパク質レベルにおいて、ＭＵＣ５ＡＣがノックダウンされ、ＭＵＣ５ＡＣの発現が消失していることが確認できた。【００６７】
《実施例５：ｓｉＲＮＡによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖の検討》
本実施例５では、前記ＳＷ１９９０ｓｉ株及びＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖能をＭＴＴアッセイによって検討した。
ＳＷ１９９０ｓｉ株及びＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株を１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌプレートに播種後、０、１、２、３、４、７日目にそれぞれＭＴＴ試薬（同仁化学研究所）を加え、３時間インキュベートした。培地を除去後、１００μＬのＤＭＳＯを加え、５７０−６３０ｎｍの吸光度を測定した。
図４に示すように、ＳＷ１９９０ｓｉ株及びＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株ともに、１日目、２日目、３日目では、同様の速度で増殖し、４日目以降はコンフレントになり、共に細胞増殖は停止した。すなわち、ＳＷ１９９０ｓｉ株及びＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、細胞の増殖速度に違いは見られなかった。
従って、ｓｉＲＮＡによるＭＵＣ５ＡＣの転写の抑制は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいては、癌細胞の増殖に影響を与えなかった。【００６８】
《実施例６：ｓｉＲＮＡによるｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞増殖の検討》
本実施例６では、前記ＳＷ１９９０ｓｉ株及びＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株のｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖能を、ヌードマウスへの移植により検討した。
ＳＷ１９９０ｓｉ株及びＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株を１０７ｃｅｌｌｓ／匹でヌードマウス（ｎ＝１０）に皮下移植後、経時的に腫瘍径と体重を測定し評価した。腫瘍体積は、以下の式を用いて算出した。
《式１》
腫瘍体積＝長径×（短径）２×０．５２３６【００６９】
ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株では移植後７、１８、２６、３２、３８、４１日目の腫瘍体積が、それぞれ１５７、１６３、３１６、５７５、１１７７、１５９８ｍｍ３で２６日目以降経時的に増加した（図５）。一方、ＳＷ１９９０ｓｉ株では腫瘍体積がそれぞれ１３７、１０９、１５９、１４３、１２０、１８１ｍｍ３であり、ほとんど増加を示さなかった（図５）。【００７０】
次に、ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株又はＳＷ１９９０ｓｉ株を１０６ｃｅｌｌｓ／匹でヌードマウスに尾静脈投与し、肺転移について検討した。ＳＷ１９９０ｓｉ株とＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株投与の３ヶ月間飼育後に剖検を行い、肺の組織表面の転移個数を肉眼で評価した。ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株移植群では転移数にバラツキがあるものの、ほぼ全ての個体で肺転移が確認できたが、ＳＷ１９９０ｓｉ株移植群では全ての個体で転移が確認できなかった（表６）。【００７１】
【表６】
2010067882.tif 000007
【００７２】
ｓｉＲＮＡは、膵臓癌の細胞の増殖を直接抑制することはできないが、生体内において膵臓癌細胞の増殖を抑えている。また、静脈内投与によって、肺における膵臓癌細胞の転移が見られなかったことから、本発明のｓｉＲＮＡは、膵臓癌の増殖を抑え、転移を抑制することもできる。【００７３】
《実施例７：ｓｉＲＮＡによる白血球の機能の誘導（回復）》
本実施例７では、ｓｉＲＮＡにより、膵臓癌細胞ＳＷ１９９０に対する免疫機能が誘導されることをＨＥ染色及び免疫染色によって検討した。
皮下移植４１日目のＳＷ１９９０ｓｉ株及びＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株が投与されたマウスの腫瘍組織切片を中性ホルマリン液で固定化後、定法により組織切片スライドを作製した。得られたスライドにＨＥ染色を行った。図６に示すように、ｍｏｃｋ株移植群では皮下付近で白血球の点在（赤丸部分）が確認できたが、腫瘍内部までの白血球の集積はみられなかった。一方、ｓｉ株移植群では皮下付近のみならず、腫瘍内部にまで白血球の集積が多数認められた。【００７４】
腫瘍に集積した白血球について、前記組織切片スライドを免疫染色し解析した。顆粒球、及びＢ細胞に対する一次抗体には、それぞれラット抗マウスＧｒ−１抗体、ラット抗マウスＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０抗体、及びラット抗マウスＦ４−８０抗体（それぞれ１μｇ／ｍＬ）を用いた。二次抗体にはａｎｔｉ−ｒａｔ  ＩｇＧ−ＨＲＰ（０．１μｇ／ｍＬ）を用い、ＤＡＢ（ＤＡＫＯ  Ｊａｐａｎ）を基質として発色を行った。その後、ヘマトキシニンによる核染色を行った。ＳＷ１９９０ｓｉ株の腫瘍組織には、多数の顆粒球、Ｂ細胞及びマクロファージの集積が認められた（図７）。一方、ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株の腫瘍組織にも僅かに免疫細胞の集積が認められたが、その数はｓｉ株移植腫瘍に比べ著しく少なかった（図７）。
従って、ｓｉＲＮＡは白血球、特には、Ｂ細胞、顆粒球、及びマクロファージの膵臓癌ＳＷ１９９０に対する免疫機能を誘導することがわかった。【００７５】
《実施例８：ｓｉＲＮＡによる膵臓癌細胞ＳＷ１９９０に対する特異抗体の産生》
ＭＵＣ５ＡＣによる抗体産生の抑制作用を検討した。ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株又はＳＷ１９９０ｓｉ株移植マウスの血液を採取後、ＥＬＩＳＡ法にて総ＩｇＧ濃度を測定し、ＦＡＣＳに用いるために濃度を調整した。ＦＡＣＳは、全匹数分（ｎ＝１０）を混和した抗体をＰＫ４５Ｐ細胞（ＭＵＣ５ＡＣ陰性膵臓癌細胞株）１０６個当たり１μｇ用いて実施例２に記載のＦＡＣＳと同様の方法で行った。
図８に示すように、ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株に比べて、ＳＷ１９９０ｓｉ株移植群では染色された細胞が多く、ピークが右側にシフトしていた。すなわち、ＳＷ１９９０ｓｉ株移植群では、ヒト細胞に対する高力価の抗体が産生されていたが、ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株が投与されてマウスでは、抗体産生が抑制されており、ｓｉＲＮＡにより膵臓癌細胞に対する抗体の産生が見られた。【００７６】
《実施例９》
本実施例９では、ＳＷ１９９０ｓｉ株の移植されたマウスで誘導されたＳＷ１９９０に対する免疫が、ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株に対しても有効であるか否かを検討した。具体的には、ＳＷ１９９０ｓｉ株を移植し免疫が誘導されたマウスに、更に、ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株を移植した。
ＳＷ１９９０ｓｉ株を１×１０７ｃｅｌｌｓ／匹でヌードマウスに皮下移植（右側）して、３５日後に逆側（左側）に１×１０７ｃｅｌｌｓ／匹でＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株を皮下移植して、腫瘍形成を観察した。図９に示すように、無処置群（コントロール群）におけるＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株の腫瘍体積は、移植１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６日目でそれぞれ５４、８２、１３７、３００、７０７、２１３１、３３６８ｍｍ３であった。一方、ＳＷ１９９０ｓｉ株移植群では、ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株の腫瘍体積が、それぞれ１７、１１、１７、４５、１１０、４７５、６１９ｍｍ３に留まった。すなわち、一回目に移植したＳＷ１９９０ｓｉ株により、マウス個体で免疫が誘導され、その免疫によりＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株の増殖が抑制されたと考えられる。【００７７】
《実施例１０：ｓｉＲＮＡによる免疫抑制の防止》
ｓｉＲＮＡにより、ＭＵＣ５ＡＣの発現がノックダウンされることにより、膵臓癌細胞が移植されたマウスにおける免疫抑制が防止される１つの機構として、ＭＵＣ５ＡＣのマクロファージからのＰＧＥ２産生に与える影響を検討した。
ヒト単球系前駆細胞Ｕ９３７株を１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで１２ｗｅｌｌプレートに播種後、５０ｎＭ  ｐｈｏｒｂｏｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）存在下でマクロファージに分化させた。４８時間後、培地をＰＭＡフリーの培地に交換し、更に２４時間インキュベートした。その後、それぞれのウェルにＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株又はＳＷ１９９０ｓｉ株をそれぞれ１０５、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し、２４時間の共培養後、培養上清のＰＧＥ２量をＰＧＥ２  ＥＩＡ  ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で測定した。結果を図１０に示す。
Ｕ９３７細胞株単独ではＰＧＥ２の産生が３６ｐｇ／ｍＬと殆ど産生されないが、ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株との共培養群では１×１０５ｃｅｌｌｓの時に１６７０ｐｇ／ｍＬ、５×１０５ｃｅｌｌｓの時に２９６５ｐｇ／ｍＬと細胞数依存的に優位に増加した。一方、ＳＷ１９９０ｓｉ株と共培養されたＵ９３７細胞株からは、１×１０５ｃｅｌｌｓの時に１６７ｐｇ／ｍＬ、５×１０５ｃｅｌｌｓの時に４０８ｐｇ／ｍＬであり、産生量は非常に低かった。また、ｍｏｃｋ株単独の場合、１×１０５ｃｅｌｌｓと５×１０５ｃｅｌｌｓの時にそれぞれ１９０ｐｇ／ｍＬと３１９ｐｇ／ｍＬ、ＳＷ１９９０ｓｉ株単独の場合、それぞれ１９０ｐｇ／ｍＬと２１４ｐｇ／ｍＬであった。
従って、ＭＵＣ５ＡＣの発現しているＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株と、マクロファージを培養することにより、マクロファージによるＰＧＥ２の産生が亢進し、免疫抑制が起こっていることが考えられた。一方、ＳＷ１９９０ｓｉ株では、ＭＵＣ５ＡＣが発現していないため、免疫抑制が起こらず、ＳＷ１９９０ｓｉ株の増殖が抑えられているものと考えられた。【００７８】
《実施例１１：ＳＷ１９９０ｓｉ株に対する単核球及び多核球の細胞障害活性》
本実施例１１は、ＳＷ１９９０ｓｉ株を標的細胞とした健常ヒト末梢血の細胞障害活性を５１Ｃｒリリース法で検討した。１０３／ｗｅｌｌの５１Ｃｒラベルしたｍｏｃｋ株又はｓｉ株（ターゲット細胞）と２．５×１０４／ｗｅｌｌの単核球又は多核球（エフェクター細胞）とを共培養し、２４時間後、ターゲット細胞より遊離した培養上清中の５１Ｃｒを測定した。その結果、単核球及び多核球ともに、ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株に対してよりもＳＷ１９９０ｓｉ株に対して強い細胞障害活性を示すことがわかった。すなわち、ｓｉＲＮＡによりＭＵＣ５ＡＣの発現が減少したＳＷ１９９０ｓｉ株に対して単核球及び多核球の細胞障害活性が亢進していることが分かった（図１１）。【００７９】
《実施例１２：ＭＵＣ５ＡＣ発現細胞からのＭＵＣ５ＡＣの分離及び精製》
ＳＷ１９９０細胞株を遠心分離にて集め、ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により細胞成分を抽出した。ＳＷ１９９０細胞株由来の細胞抽出液を限外濾過膜（ＭＷ：１０万）で濃縮後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００カラム、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００カラム、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラムによる分画を行った。ＭＵＣ５ＡＣ画分の分取は、抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体、抗シアリルＴｎ抗体、抗シアリルスイスＡ抗体を用いたＥＬＩＳＡ並びにｓｉ株のクロマトとの比較により進め、約９５％の純度のＭＵＣ５ＡＣを得た。【００８０】
《実施例１３：ＭＵＣ５ＡＣによるマイトジェン活性の抑制》
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ由来の脾細胞を溶血後、ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ、５×１０−５Ｍメルカプトエタノール）に５×１０６／ｍＬで懸濁し、１００μＬずつ９６ウェルプレートに撒いた（５×１０５／ｗｅｌｌ）。各ウェルにマイトジェンとしてコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を５μｇ／ｍＬと、ＭＵＣ５ＡＣ又はサイクロスポリンＡとを種々の濃度で加え、各ウェルの最終用量を２００μＬとした。９６ウェルプレ−トは、湿度１００％、二酸化炭素５％、空気９５％に保持された培養器内で３７℃、４８時間培養した。細胞数はＭＴＴアッセイにより測定した。その結果、図１２に示されるようにＭＵＣ５ＡＣは濃度依存的にリンパ球のマイトジェン活性を抑制した。サイクロスポリンＡの分子量が約１２００で、ＭＵＣ５ＡＣの分子量が数百万〜一千万である事を加味すると、ＭＵＣ５ＡＣの免疫抑制作用はサイクロスポリンＡに匹敵するものと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明の医薬組成物は、癌、特には膵臓癌、及び喘息の予防及び治療に用いることができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図４】
2010067882.tif 000008
【図５】
2010067882.tif 000009
【図９】
2010067882.tif 000010
【図１０】
2010067882.tif 000011
【図１１】
2010067882.tif 000012
【図１】
2010067882.tif 000013
【図２】
2010067882.tif 000014
【図３】
2010067882.tif 000015
【図６】
2010067882.tif 000016
【図７】
2010067882.tif 000017
【図８】
2010067882.tif 000018
【配列表】
2010067882000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年1月27日(2010.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
［図５］ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株及びＳＷ１９９０ｓｉ株（ＭＵＣ５ＡＣノックダウン株）をヌードマウスに皮下移植した場合の、生体内での増殖を示す図である。
［図６］ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株及びＳＷ１９９０ｓｉ株（ＭＵＣ５ＡＣノックダウン株）を皮下移植した場合の腫瘍組織内への白血球の浸潤をＨＥ染色により示した図である。（Ａ）がｍｏｃｋ株を、（Ｂ）がｓｉ株を示す。
［図７］ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株及びＳＷ１９９０ｓｉ株（ＭＵＣ５ＡＣノックダウン株）を皮下移植した場合の腫瘍組織内へのＢ細胞、顆粒球、及びマクロファージの浸潤を免疫染色により示した図である。（Ａ）がＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株における好中球の浸潤、（Ｂ）がｓｉ株における好中球の浸潤、（Ｃ）がｍｏｃｋ株におけるＢ細胞の浸潤、（Ｄ）がｓｉ株におけるＢ細胞、（Ｅ）がｍｏｃｋ株におけるマクロファージの浸潤、（Ｆ）がｓｉ株におけるマクロファージの浸潤を示す。
［図８］ＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株及びＳＷ１９９０ｓｉ株（ＭＵＣ５ＡＣノックダウン株）を皮下移植した場合の、ｓｉＲＮＡによるＢ細胞の抗体産生を示すＦＡＣＳ解析である。
［図９］ＳＷ１９９０ｓｉ株を移植されたマウスに、更にＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株を移植した場合の、生体内での増殖を示す図である。
［図１０］ＭＵＣ５ＡＣの発現したＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株による、マクロファージからのＰＧＥ２の産生を示すグラフである。
［図１１］ターゲット細胞としてＳＷ１９９０ｍｏｃｋ株及びＳＷ１９９０ｓｉ株を用いた場合の、単核球及び多核球の細胞障害活性を示すグラフである。
発明を実施するための形態
［００１８］
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明のｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ及びベクター
本発明のｓｉＲＮＡは、二重鎖のＲＮＡ部分を有し、ＭＵＣ５ＡＣのｍＲ
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
濃縮後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００カラム、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００カラム、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラムによる分画を行った。ＭＵＣ５ＡＣ画分の分取は、抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体、抗シアリルＴｎ抗体、抗シアリルスイスＡ抗体を用いたＥＬＩＳＡ並びにｓｉ株のクロマトとの比較により進め、約９５％の純度のＭＵＣ５ＡＣを得た。
［００８０］
《実施例１３：ＭＵＣ５ＡＣによるマイトジェン活性の抑制》
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ由来の脾細胞を溶血後、ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ、５×１０−５Ｍメルカプトエタノール）に５×１０６／ｍＬで懸濁し、１００μＬずつ９６ウェルプレートに撒いた（５×１０５／ｗｅｌｌ）。各ウェルにマイトジェンとしてコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を５μｇ／ｍＬと、ＭＵＣ５ＡＣ又はサイクロスポリンＡとを種々の濃度で加え、各ウェルの最終用量を２００μＬとした。９６ウェルプレートは、湿度１００％、二酸化炭素５％、空気９５％に保持された培養器内で３７℃、４８時間培養した。細胞数はＭＴＴアッセイにより測定した。その結果、ＭＵＣ５ＡＣは濃度依存的にリンパ球のマイトジェン活性を抑制した。サイクロスポリンＡの分子量が約１２００で、ＭＵＣ５ＡＣの分子量が数百万〜一千万である事を加味すると、ＭＵＣ５ＡＣの免疫抑制作用はサイクロスポリンＡに匹敵するものと考えられた。
産業上の利用可能性
［００８１］
本発明の医薬組成物は、癌、特には膵臓癌、及び喘息の予防及び治療に用いることができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【国際調査報告】
2010067882.tif 000019
2010067882.tif 000020
2010067882.tif 000021
2010067882.tif 000022
2010067882.tif 000023
2010067882.tif 000024