(57)【要約】  複数種類の酵素と酵素保護剤を含有する試薬溶液を凍結乾燥して比較的高い温度における保存安定性の良い鮮度測定用試薬キットを得る。  第一試薬及び第二試薬からなり、該第一試薬は、ＸＯＤとＮＰと酵素保護剤と発色剤とを含む第一試薬溶液の凍結物をガラス転移点温度（Ｔｇ）以下の温度で減圧乾燥させたものからなり、該第二試薬は、ＸＯＤとＮＰとＡＰと酵素保護剤と発色剤とを含む第二試薬溶液の凍結物をガラス転移点温度（Ｔｇ）以下の温度で減圧乾燥させたものからなり、該酵素保護剤はスクロース及び／又はゼラチンからなり、該発色剤はＨｘがＸＯＤによってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色するものからなる。
2010044365.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一試薬及び第二試薬からなり、該第一試薬は、キサンチンオキシダーゼ（Xanthine oxidase：ＸＯＤ）とヌクレオシドフォスフォリラーゼ(Nucleoside phosphorylase：ＮＰ）と酵素保護剤と発色剤とを含む第一試薬溶液の凍結物をガラス転移点温度（Ｔｇ）以下の温度で減圧乾燥させたものからなり、該第二試薬は、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）とヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＮＰ）とアルカリフォスファターゼ（Alkaline phosphatase：ＡＰ）と酵素保護剤と発色剤とを含む第二試薬溶液の凍結物をガラス転移点温度（Ｔｇ）以下の温度で減圧乾燥させたものからなり、該酵素保護剤はスクロース及び／又はゼラチンからなり、該発色剤はヒポキサンチン（Ｈｘ）がキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）によってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色するものからなることを特徴とする鮮度測定用試薬キット。
【請求項２】
前記第一試薬溶液の凍結物を減圧乾燥させる際の温度を時間の経過とともに上昇させ、前記第二試薬溶液の凍結物を減圧乾燥させる際の温度を時間の経過とともに上昇させていることを特徴とする請求項１に記載の鮮度測定用試薬キット。
【請求項３】
前記第一試薬溶液中、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）が０．１Ｕ／ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌの濃度範囲に、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＮＰ）が０．０５Ｕ／ｍｌ〜２０Ｕ／ｍｌの濃度範囲に、前記第二試薬溶液中、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）が０．１Ｕ／ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌの濃度範囲に、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＮＰ）が０．０５Ｕ／ｍｌ〜２０Ｕ／ｍｌの濃度範囲に、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）が５Ｕ／ｍｌ〜２００Ｕ／ｍｌの濃度範囲にあることを特徴とする請求項１に記載の鮮度測定用試薬キット。
【請求項４】
前記第一試薬溶液及び前記第二試薬溶液中、スクロースが５０ｍＭ〜４００ｍＭの濃度範囲にあることを特徴とする請求項３に記載の鮮度測定用試薬キット。
【請求項５】
前記第一試薬溶液及び前記第二試薬溶液中、ゼラチンが０．１〜２．０（ゼラチンｇ／試薬溶液１００ｍｌ）の濃度範囲にあることを特徴とする請求項３に記載の鮮度測定用試薬キット。
【請求項６】
前記第一試薬溶液及び前記第二試薬溶液中、発色剤が０．１ｍＭ〜０．６ｍＭの濃度範囲にあることを特徴とする請求項３に記載の鮮度測定用試薬キット。
【請求項７】
前記第一試薬溶液及び前記第二試薬溶液のｐＨが６．８〜８．５であることを特徴とする請求項３に記載の鮮度測定用試薬キット。
【請求項８】
前記発色剤がＷＳＴ−８であることを特徴とする請求項３に記載の鮮度測定用試薬キット。
【請求項９】
前記第一試薬溶液の凍結物が前記第一試薬溶液を液体窒素で急速冷凍させて得られたものであり、前記第二試薬溶液の凍結物が前記第二試薬溶液を液体窒素で急速冷凍させて得られたものであることを特徴とする請求項１に記載の鮮度測定用試薬キット。
【請求項１０】
前記第一試薬溶液及び前記第二試薬溶液が血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有していることを特徴とする請求項１に記載の鮮度測定用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚肉等の鮮度を容易に短時間で測定することができ、しかも保存安定性の高い鮮度測定用試薬キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、畜肉、魚肉又は鶏肉等の鮮度はＫ値が指標として使用されている。Ｋ値とはこれらの肉中におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びＡＴＰ分解生成物（ＡＤＰ，ＡＭＰ，ＩＭＰ，ＨｘＲ，Ｈｘ）の含有量に対するイノシン（ＨｘＲ）及びヒポキサンチン（Ｈｘ）の含有量の割合（％）、すなわち（ＨｘＲ＋Ｈｘ）×100／（ＡＴＰ＋ＡＤＰ＋ＡＭＰ＋ＩＭＰ＋ＨｘＲ＋Ｈｘ）で表される数値（％）である。ここで、ＡＤＰはアデノシン二リン酸、ＡＭＰはアデノシン一リン酸、ＩＭＰはイノシン酸、ＨｘＲとはイノシン、Ｈｘはヒポキサンチンである。【０００３】
このＫ値を求めるには畜肉、魚肉又は鶏肉中のＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＩＭＰ、ＨｘＲ、Ｈｘの全ての含有量を測定する必要がある。しかし、これらＡＴＰ及びＡＴＰ分解生成物の全ての含有量を測定するのは非常に面倒であるし、魚肉の場合、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰは、魚の死後、時間の経過とともにほとんどがＩＭＰ（イノシン酸）に分解しており、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰは非常に少なくなっているので、（ＨｘＲ＋Ｈｘ）×100／（ＩＭＰ＋ＨｘＲ＋Ｈｘ）で表される数値ＫｉがＫｉ≒ＫとしてＫ値の代わりに鮮度の指標として便宜的に用いられている。【０００４】
ここで、ＨｘＲとＨｘの含有量は、例えば特公昭６２−５０１２０号公報に記載されているように、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ（Nucleoside phosphorylase：ＮＰ）、キサンチンオキシダーゼ（Xanthine oxidase：ＸＯＤ）及び発色剤を含む組成液を肉汁に混合し、肉汁中のＨｘＲをヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＮＰ）でＨｘに分解させ、Ｈｘをキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）でキサンチンと尿酸に分解させ、発色剤をＨｘの分解に共役して発色させ、この発色の強度から求める方法が知られている。【０００５】
ＩＭＰとＨｘＲとＨｘの含有量は、例えば特開平９−２６２０９８号公報に記載されているように、アルカリフォスファターゼ（Alkaline phosphatase：ＡＰ）、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＮＰ）、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）を固定したリアクタに肉汁を含んだ試料液を通し、試料液中のイノシン酸（ＩＭＰ）をアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）でイノシン（ＨｘＲ）に分解し、イノシン（ＨｘＲ）をヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＮＰ）でヒポキサンチン（Ｈｘ）に分解し、ヒポキサンチン（Ｈｘ）をキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）でキサンチンと尿酸に分解させ、ヒポキサンチン（Ｈｘ）の濃度を発光試薬で測定することにより求める方法が知られている。【０００６】
しかし、上述した方法で使用されている各酵素（ＡＰ、ＮＰ、ＸＯＤ）は非常に不安定なものであり、時間とともにその活性が容易に低下し、また温度が高いとその活性が更に低下してしまうので、これらの酵素を含む組成物を試薬として商品化することは非常に困難であった。【０００７】
これらの酵素の不安定さに対しては、例えば特開平８−１３１１９６号公報、特表２０００−５１３９４０号公報、特再ＷＯ０２／００４６３３号公報、特開２００８−２０６４９１号公報に記載されているように、酵素の水溶液中に糖（トレハロース、スクロース等）や血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加し、これらを凍結乾燥させることにより、酵素を安定化させる技術がいくつか提案されている。【０００８】
しかし、糖の種類と酵素の種類との間には酵素の安定化について相性があり、糖と酵素の組合せの仕方によって酵素の安定化の程度が異なり、ある特定の酵素を安定化させる糖の種類や濃度は簡単にはわからない。そして、その酵素が複数種の混合物の場合、それらの酵素を安定化させる糖の種類や濃度は更にわからない。【０００９】
また、酵素を含む水溶液を凍結後、乾燥させて安定化させる場合、その条件、特に凍結後に温度を上昇させて凍結物を乾燥させる過程における条件も酵素の安定性に大きな影響があるが、その最適条件はわかっていない。そして、酵素が複数種の混合物になった場合、この最適条件は更にわからない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開昭６２−５０１２０号公報
【特許文献２】特開平９−２６２０９８号公報
【特許文献３】特開平８−１３１１９６号公報
【特許文献４】特表２０００−５１３９４０号公報
【特許文献６】特再ＷＯ０２／００４６３３号公報
【特許文献７】特開２００８−２０６４９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
解決しようとする課題は、魚肉等の鮮度を測定するためのものとして、高い温度で長時間保存しても酵素活性の低下が極めて少ない、魚肉等の鮮度を適切に測定するために必要な酵素活性を備えている保存安定性の高い鮮度測定用試薬キットが提供されていない点である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る鮮度測定用試薬キットは、鮮度測定用試薬キットに含まれる酵素の保存安定性を高めるために、酵素保護剤（糖及び／又はゼラチン）を含む酵素水溶液を急速冷凍させ、得られた凍結物を減圧下で該凍結物のガラス転移点温度（Ｔｇ）以下の温度で乾燥させたことを最も主要な特徴とする。【００１３】
すなわち、本発明に係る鮮度測定用試薬キットは第一試薬及び第二試薬からなり、該第一試薬は、キサンチンオキシダーゼ（Xanthine oxidase：ＸＯＤ）とヌクレオシドフォスフォリラーゼ(Nucleoside phosphorylase：ＮＰ）と酵素保護剤と発色剤とを含む第一試薬溶液を凍結乾燥させたものからなり、該第二試薬は、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）とヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＮＰ）とアルカリフォスファターゼ（Alkaline phosphatase：ＡＰ）と酵素保護剤と発色剤とを含む第二試薬溶液を凍結乾燥させたものからなる。【００１４】
ここで、前記第一試薬溶液及び前記第二試薬溶液は例えば液体窒素等で急速冷凍させ、その後、減圧しながら乾燥させる。この場合、試料温度（凍結乾燥機棚温度）を時間の経過とともに上昇させながら乾燥させると乾燥時間を短くすることができるので、試料温度を時間の経過とともに上昇させながらが乾燥させるのが好ましい。しかし、試料温度を乾燥によって得られたもののガラス転移点温度（Ｔｇ）以上にすると酵素活性が低下するので、試料温度は乾燥によって得られるもののガラス転移点温度（Ｔｇ）以下で上昇させる必要がある。【００１５】
また、前記酵素保護剤としてはスクロース及び／又はゼラチンを使用することができる。スクロースの濃度は５０ｍＭ〜４００ｍＭの範囲が好ましい。スクロースの濃度がこの範囲にある場合、保存安定性の良い試薬が得られるからである。また、ゼラチンの濃度は０．１〜２．０（ゼラチンｇ／試薬溶液１００ｍｌ）の範囲が好ましい。ゼラチンの濃度がこの範囲にある場合、保存安定性の良い試薬が得られるからである。【００１６】
また、前記発色剤としてはヒポキサンチン（Ｈｘ）がキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）によってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色するもの、例えば、テトラゾリウムブルー〔ＴＢ〕、ニトロテトラゾリウムブルー〔ニトロ−ＴＢ〕、テトラゾリウムバイオレット〔ＴＶ〕、ニトロブルーテトラゾリウム〔ＮＢＴ〕、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウム〔ＭＴＴ〕、２−（４−ヨ−ドフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩〔ＷＳＴ−１〕、２−（４−ヨ−ドフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩〔ＷＳＴ−３〕、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩〔ＷＳＴ−８〕、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム、３−（４,５−ジメチルチアゾ−ル−２−フェニル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩〔ＭＴＳ〕等の公知のホルマザン試薬を使用することができる。。【００１７】
発色剤の濃度は、発色剤がＷＳＴ−８の場合、０．１ｍＭ〜０．６ｍＭの範囲が好ましい。発色剤の濃度がこの範囲にある場合、安定した発色が得られるからである。なお、発色剤の濃度が０．６ｍＭを超えた場合、発色の強度が頭打ちになり、経済的に無駄なので、０．６ｍＭを上限としたが、０．６ｍＭを超える場合を排除するものではない。【００１８】
また、第一試薬溶液中及び第二試薬溶液中、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）は０．１Ｕ／ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌの濃度範囲が好ましく、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＮＰ）は０．０５Ｕ／ｍｌ〜２０Ｕ／ｍｌの濃度範囲が好ましく、第二試薬溶液中、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）は５Ｕ／ｍｌ〜２００Ｕ／ｍｌの濃度範囲が好ましい。【００１９】
キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）の濃度の下限を０．１Ｕ／ｍｌ、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＮＰ）の下限を０．０５Ｕｍｌ、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）の下限を５Ｕ／ｍｌとしたのは、これらの値未満になると酵素の安定性が落ちるからである。また、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）の上限を１０Ｕ／ｍｌ、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＮＰ）の上限を２０Ｕ／ｍｌ、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）の上限を２００Ｕ／ｍｌとしたのは、これらの値を超えると試薬の保存安定性が低くなってしまうからである。【００２０】
前記第一試薬溶液及び前記第二試薬溶液は血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有していてもよいし、含有していなくてもよい。【００２１】
第一試薬溶液と第二試薬溶液のｐＨはいずれも６．８〜８．５が好ましい。ｐＨを６．８〜８．５としたのは、上述した酵素が機能するｐＨの範囲は６．８〜８．５だからである。なお、第一試薬溶液と第二試薬溶液のｐＨはリン酸カリウム等の緩衝液を用いて６．８〜８．５の範囲とするのが好ましい。【００２２】
前記第一試薬及び前記第二試薬は各々紙に含浸させ、凍結乾燥させて２種類の試験紙とし、これらの試験紙を使用して魚肉等の鮮度を測定できるようにしてもよい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は、上述した２種及び３種の酵素を酵素保護剤とともに溶解させた試薬溶液を凍結させ、得られた凍結物をガラス転移点温度（Ｔｇ）以下の温度範囲で減圧乾燥させて各試薬を得たので、各試薬の保存安定性（残存活性）が高まり、各試薬を比較的高い温度で長期間にわたって保存することができるという利点がある。【００２４】
そして、各試薬を比較的高い温度（例えば、５５℃）で長期間にわたって保存することができるので、例えば水産加工工場や水産物を使う食品工場の原料品質検査に使用することができ、魚の鮮度をその場で個別に客観的に判別することができるという利点がある。【００２５】
また、各試薬を比較的高い温度（例えば、５５℃）で長期間にわたって保存することができるので、発展途上国等で冷蔵設備のない地域において魚の鮮度の判定に簡便に使用することができるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】［ＨｘＲ＋Ｈｘ］濃度（μＭ）と吸光度（４５４ｎｍ）との関係を示すグラフである。
【図２】［ＩＭＰ＋ＨｘＲ＋Ｈｘ］濃度（μＭ）と吸光度（４５４ｎｍ）との関係を示すグラフである。
【図３】本発明試薬キットで求めたＫｉ値とＨＰＬＣで求めたＫｉ値との相関を示すグラフである。
【図４】本発明試薬キットの保存期間とＫｉ値との関係を示すグラフである。
【図５】本発明試薬キットの仕様イメージを示す説明図である。
【図６】温度２５℃で貯蔵した第一試薬の貯蔵日数と残存活性との関係を示すグラフである。
【図７】温度２５℃で貯蔵した第二試薬の貯蔵日数と残存活性との関係を示すグラフである。
【図８】温度４０℃で貯蔵した第一試薬の貯蔵日数と残存活性との関係を示すグラフである。
【図９】温度４０℃で貯蔵した第二試薬の貯蔵日数と残存活性との関係を示すグラフである。
【図１０】温度５５℃で貯蔵した第二試薬の貯蔵日数と残存活性との関係を示すグラフである。
【図１１】温度５５℃で貯蔵した第二試薬の貯蔵日数と残存活性との関係を示すグラフである。
【図１２】第一試薬の貯蔵日数と残存活性との関係を各湿度毎に示すグラフである。
【図１３】第二試薬の貯蔵日数と残存活性との関係を各湿度毎に示すグラフである。
【図１４】酵素保護剤無しの酵素複合体（試薬キット）の貯蔵日数と各貯蔵日数における試薬キットを用いて求めた同一魚肉のＫｉ値との関係を示すグラフである。
【図１５】スクロース入りの酵素複合体（試薬キット）の貯蔵日数と各貯蔵日数における試薬キットを用いて求めた同一魚肉のＫｉ値との関係を示すグラフである。
【図１６】スクロース＋ゼラチン入りの酵素複合体（試薬キット）の貯蔵日数と各貯蔵日数における試薬キットを用いて求めた同一魚肉のＫｉ値との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
保存安定性の高い鮮度測定用試薬キットを提供するという目的を、簡易な方法で、酵素の基本的な活性を低下させることなく実現した。
【実施例１】
【００２８】
ヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＮＰ）を２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液(potassiumphosphate buffer) (ｐＨ＝７．８) に溶解してＮＰ液を調製した。また、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）を２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ＝７．８) に溶解してＸＯＤ液を調製した。そして、ＮＰ液及びＸＯＤ液は含まれている安定剤を透析して除去した。また、スクロース(Sucrose)を２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ＝７．８)  に溶解してスクロース液を調製した。また、ＷＳＴ−８（発色剤）を２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ＝７．８)に溶解してＷＳＴ−８（発色剤）液を調製した。【００２９】
次に、これらＮＰ液、ＸＯＤ液、スクロース液、ＷＳＴ−８（発色剤）液を全て混合して第一試薬溶液を調製し、この第一試薬溶液を２ｍｌのポリプロピレン製チューブに入れ、液体窒素に１分間浸漬し、急速冷凍させた。次に、このポリプロピレン製チューブを、上部のふたを開放した状態で、凍結乾燥機に入れ、乾燥させた。乾燥は、３．０×１０-2Torrの減圧下で行った。このときの温度は、−４０℃から３時間ごとに５℃ずつ５℃まで温度を上昇させ、５℃から３時間ごとに１０℃ずつ２５℃まで温度を上昇させた。次に、凍結乾燥機から乾燥物を取り出し、これをＰ２Ｏ５を入れたデシケーターに移し、７日間保存し、完全脱水して第一試薬を得た。【００３０】
また、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＮＰ）を２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ＝７．８)に溶解してＮＰ液を調製した。また、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）を２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ＝７．８)に溶解してＸＯＤ液を調製した。また、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）液を準備した。そして、ＮＰ液、ＸＯＤ液及びＡＰ液は透析して含まれている安定剤を除去した。また、スクロースを２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ＝７．８)に溶解してスクロース液を調製した。また、ＷＳＴ−８（発色剤）２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ＝７．８)に溶解してＷＳＴ−８（発色剤）液を調製した。【００３１】
次に、ＮＰ液、ＸＯＤ液、ＡＰ液、スクロース液、ＷＳＴ−８（発色剤）液を全て混合して第二試薬溶液を調製し、この第二試薬溶液を２ｍｌのポリプロピレン製チューブに入れ、液体窒素に１分間浸漬し、急速冷凍させた。次に、このポリプロピレン製チューブを、上部のふたを開放した状態で、凍結乾燥機に入れ、乾燥させた。乾燥は、３．０×１０-2Torrの減圧下で行った。このときの温度は、−４０℃から３時間ごとに５℃ずつ５℃まで温度を上昇させ、５℃から３時間ごとに１０℃ずつ２５℃まで温度を上昇させた。次に、凍結乾燥機から乾燥物を取り出し、これをＰ２Ｏ５を入れたデシケーターに移し、７日間保存し、完全脱水して第二試薬を得た。【００３２】
次に、６０ｍｇの第一試薬を１ｍｌの蒸留水に溶解し、そのうちの１５０μｌを分取し、これを魚肉絞り汁１５０μｌと混合し、混合液を分光光度計でＡｂｓ．＝４５４ｎｍで測定してその吸光度Ａを求めた。そして、図１に示すように、予め作成しておいた吸光度（Abs. at ４５４ｎｍ）と［ＨｘＲ＋Ｈｘ］濃度（μＭ）との関係から魚肉絞り汁中の［ＨｘＲ＋Ｈｘ］濃度Ａ（μＭ）を求めた。【００３３】
また、６０ｍｇの第二試薬を１ｍｌの蒸留水に溶解し、そのうちの１５０μｌを分取し、これを魚肉絞り汁１５０μｌと混合し、混合液を分光光度計でＡｂｓ．＝４５４ｎｍで測定してその吸光度Ａを求めた。そして、図２に示すように、予め作成しておいた吸光度（Abs. at ４５４ｎｍ）と［ＩＭＰ＋ＨｘＲ＋Ｈｘ］濃度（μＭ）との関係から魚肉絞り汁中の［ＩＭＰ＋ＨｘＲ＋Ｈｘ］濃度Ｂ（μＭ）を求めた。【００３４】
次に、（ＨｘＲ＋Ｈｘ）×１００／（ＩＭＰ＋ＨｘＲ＋Ｈｘ）＝Ｋｉ（％）であり、（ＨｘＲ＋Ｈｘ）は濃度Ａであり、（ＩＭＰ＋ＨｘＲ＋Ｈｘ）は濃度Ｂであることから、Ｋｉ値（＝Ａ／Ｂ）を求めた。【００３５】
また、同じ魚肉のＫｉ値を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で別に求め、本発明試薬キットで求めたＫｉ値とＨＰＬＣで求めたＫｉ値との相関を求めたところ、図３のグラフに示す通りであった。この図３のグラフに示された結果から、本発明の測定方法で求めたＫｉ値とＨＰＬＣで求めたＫｉ値とはＲ２＝０．９９６という高い相関関係が有ることがわかる。
【実施例２】
【００３６】
本発明試薬キットを５℃、２５℃、４０℃で５０日間保存し、この試薬キットを使って同じ魚肉（マアジ）のＫｉ値を求めたところ、図４に示す通りであった。この結果から、本発明試薬キットは４０℃で５０日まではかなり酵素活性の高い状態で保存できることがわかる。
【実施例３】
【００３７】
実施例１と同様の実験において、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）を５Ｕ／ｍｌ未満としたところ、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）によるＩＭＰの分解が不完全になるためか、得られるＫｉ値が不安定になり、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）が２００Ｕ／ｍｌを超えると試薬の保存安定性が悪くなった。これに対し、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）を５Ｕ／ｍｌ〜２００Ｕ／ｍｌとした場合はかかる不都合を生ずることなく、安定したＫｉ値が得られた。従って、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）は５Ｕ／ｍｌ〜２００Ｕ／ｍｌの範囲が最適範囲と考えられる。
【実施例４】
【００３８】
実施例１と同様の実験において、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＮＰ）を０．０５Ｕ／ｍｌ未満としたところ、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＮＰ）によるＨｘＲの分解が不完全になるためか、得られるＫｉ値が不安定になり、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＮＰ）が２０Ｕ／ｍｌを超えると試薬の保存安定性が悪くなった。これに対し、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＮＰ）を０．０５Ｕ／ｍｌ〜２０Ｕ／ｍｌとした場合はかかる不都合を生ずることなく、安定したＫｉ値が得られた。従って、ヌクレオシドフォスフォリラーゼ（ＮＰ）は０．０５Ｕ／ｍｌ〜２０Ｕ／ｍｌの範囲が最適範囲と考えられる。
【実施例５】
【００３９】
実施例１と同様の実験において、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）を０．１Ｕ／ｍｌ未満としたところ、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）によるＨｘの分解が不完全になるためか、得られるＫｉ値が不安定になり、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）が１０Ｕ／ｍｌを超えると試薬の保存安定性が悪くなった。これに対し、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）を０．１Ｕ／ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌとした場合はかかる不都合を生ずることなく、安定したＫｉ値が得られた。従って、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）は０．１Ｕ／ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌの範囲が最適範囲と考えられる。
【実施例６】
【００４０】
実施例１と同様の実験において、スクロースを５０ｍＭ未満としたところ、得られるＫｉ値が不安定になり、スクロースが４００ｍＭを超えると酵素液が結晶化してしまう。これに対し、スクロースを５０ｍＭ〜４００ｍＭとした場合はかかる不都合を生ずることなく、安定したＫｉ値が得られた。従って、スクロースは５０ｍＭ〜４００ｍＭの範囲が最適範囲と考えられる。
【実施例７】
【００４１】
実施例１と同様の実験において、ＷＳＴ−８（発色剤）を０．１ｍＭ未満としたところ、発色が不安定になり、ＷＳＴ−８（発色剤）が０．６ｍＭを超えた場合は濃度の増加にもかかわらず発色の度合いが頭打ちになってしまう。これに対し、ＷＳＴ−８（発色剤）を０．１ｍＭ〜０．６ｍＭとした場合はかかる不都合を生ずることなく、安定したＫｉ値が得られた。従って、ＷＳＴ−８（発色剤）は０．１ｍＭ〜０．６ｍＭの範囲が最適範囲と考えられる。
【実施例８】
【００４２】
実施例１と同様の実験において、ｐＨを６．８未満としたり、８．５を超えるようにした場合は酵素が機能しなくなるが、ｐＨを６．８〜８．５とした場合はかかる不都合を生ずることなく、安定したＫｉ値が得られた。従って、ｐＨは６．８〜８．５の範囲が最適範囲と考えられる。
【実施例９】
【００４３】
上記実施例では、試薬の発色強度は吸光光度計を用いて測定したが、図５に示すように、プレートリーダーの各セルに凍結乾燥させた各試薬粉末を分注し、ここに魚肉抽出物を適当量添加して発色させ、この発色強度を色サンプルと比較して［ＩＭＰ＋ＨｘＲ＋Ｈｘ］の濃度又は［ＨｘＲ＋Ｈｘ］の濃度を求めてもよい。また、プレートリーダーのセルに酵素液を分注し、この状態で酵素液を凍結乾燥させたものを試薬キットとして用いてもよい。
【実施例１０】
【００４４】
２００ｍＭのスクロース溶液１ｍｌ中に、又は、２００ｍＭのsucrose＋０．５％ゼラチン溶液１ｍｌ中に、０．０２ｍｇのヌクレオシドホスホリラーゼ(ＮＰ)と２ｍｇのキサンチンオキシダーゼ(ＸＯＤ)を溶解させて、０．３Unit/mlのＮＰ＋０．６Unit/mlのＸＯＤを含む第一試薬溶液を調製した。【００４５】
２００ｍＭのスクロース溶液１ｍｌ中に、又は、２００ｍＭのsucrose＋０．５％ゼラチン溶液1ｍｌ中に、１．５μlのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、０．０２ｍｇのヌクレオシドホスホリラーゼ(ＮＰ)及び２ｍｇのキサンチンオキシダーゼ(ＸＯＤ)を溶解させて、４５Unit/mlのＡＰ+０．３Unit/mlのＮＰ＋０．６Unit/mlのＸＯＤを含む第二試薬溶液を調製した。【００４６】
第一試薬溶液を２ｍｌのポリプロピレンチューブに１ｍｌ入れ、また、第二試薬溶液を２ｍｌの別のポリプロピレンチューブに１ｍｌ入れ、これらのポリプロピレンチューブを液体窒素に少なくとも１分間浸漬して急速冷凍し、得られた凍結物を−９０℃で保存した。【００４７】
次に、この凍結物を予め−４０℃に冷却された凍結乾燥機に移し、−４０℃から５℃まで５℃ずつ温度を上げて、５℃から２５℃まで１０℃ずつ温度を上げて、乾燥させた。各温度ステップにおいて、その温度は３時間保持した。また、乾燥機内の圧力は、乾燥プロセスの全体にわたって３．０×１０-2Torrに維持した。凍結物は、凍結乾燥によって、水分を失い、乾燥固形物になった。【００４８】
乾燥固形物中の残余の水分は、室温で７日間減圧デシケーター中のＰ２Ｏ５で更に除去させた。第一試薬溶液の凍結物から得られた乾燥固形物は第一試薬、第二試薬溶液の凍結物から得られた乾燥固形物は第二試薬として、乾いた窒素で置換したグローブボックス内に入れ、２５℃、４０℃、５５℃で、４５日間保存した。【００４９】
第一試薬６０ｍｇを蒸留水１ｍｌで戻し、それから75μlを分取し、それに４ｍＭのＨｘＲを７５μl加え、さらに２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液１５０μlを加えて第一試薬溶液を調製した。UV-VIS分光光度計を用いて、第一試薬溶液の２９２ｎｍにおける吸光度を、２０℃で測定し、酵素の活性を初期の活性から評価した。【００５０】
また、第二試薬６０mgを蒸留水１ｍｌで戻し、それから75μを分取し、それに４ｍＭのＩＭＰ+1ｍＭ ＭｇＣｌ2を７５μl加え、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液１５０μlを加えて第二試薬溶液を調製した。UV-VIS分光光度計を用いて、第二試薬溶液の２９２ｎｍにおける吸光度を、２０℃で測定し、酵素の活性を初期の活性から評価した。残存活性は、凍結乾燥する前の活性のパーセンテージとして表わした。【００５１】
貯蔵温度２５℃における第一試薬の０日〜４５日間の酵素としての残存活性は図６に示す通り、貯蔵温度２５℃における第二試薬の０日〜４５日間の酵素としての残存活性は図７に示す通り、貯蔵温度４０℃における第一試薬の０日〜４５日間の酵素としての残存活性は図８に示す通り、貯蔵温度４０℃における第二試薬の０日〜４５日間の酵素としての残存活性は図９に示す通り、貯蔵温度５５℃における第一試薬の０日〜４５日間の酵素としての残存活性は図１０に示す通り、貯蔵温度５５℃における第二試薬の０日〜４５日間の酵素としての残存活性は図１１に示す通りであった。【００５２】
図６〜図１１に示す結果から、第一試薬及び第二試薬は、スクロースを添加すると、無添加のものと比べて、いずれも残存活性が高まることがわかり、スクロース及びゼラチンを添加すると、スクロースのみを添加した試薬と比べて、いずれも残存活性が更に高まることがわかる。なお、第一試薬及び第二試薬の含水量は、カールフィッシャー水分計（737のKF、Herisau、スイス）を用いて計測した。また、第一試薬及び第二試薬の熱特性は、示差走査熱量測定装置（DSC-50：島津、社、日本）を用いて調べた。
【実施例１１】
【００５３】
スクロースとゼラチンを含む第一試薬、及びスクロースとゼラチンを含む第二試薬を作成し、これらを５５℃で０日〜４５日間、相対湿度０％、３３％及び５３％の各湿度環境下でそれぞれ貯蔵し、各湿度環境下における各試薬の残存活性を、貯蔵日数の経過に従って調べた。ここで、各試薬は実施例１０と同様の方法で作成し、各試薬の残存活性は実施例１０と同様の方法で調べた。【００５４】
第一試薬の各湿度環境下における残存活性は図１２に示す通り、第二試薬の各湿度環境下における残存活性は図１３に示す通りであった。図１２及び図１３に示す結果から、相対湿度０％の場合は相対湿度３３％、５３％の場合と比較して、残存活性が大幅に高いことがわかる。本試薬の残存活性を低下させないためには、相対湿度をできる限り０％に近づけた雰囲気中で保存する必要があることがわかる。
【実施例１２】
【００５５】
スクロースとゼラチンのいずれも含まない第一試薬、スクロースを含みゼラチンを含まない第一試薬（Ｔｇ：６５℃、ＭＴ：０．８１％）及びスクロースとゼラチンの両方を含む第一試薬（Ｔｇ：７７℃、ＭＴ：０．５％）を各作成し、５℃、２５℃、４０℃で０日〜１１２日間それぞれ貯蔵した。【００５６】
また、スクロースとゼラチンのいずれも含まない第二試薬、スクロースを含みゼラチンを含まない第二試薬（Ｔｇ：６５℃、ＭＴ：０．７８％）及びスクロースとゼラチンの両方を含む第二試薬（Ｔｇ：７６℃、ＭＴ：０．９９％）を各作成し、５℃、２５℃、４０℃で０日〜１１２日間それぞれ貯蔵した。ここで、第一試薬及び第二試薬の基本的な組成及び作成条件は実施例１０と同様とし、発色剤ＷＳＴ−８を添加したものである。【００５７】
０，５，１０，２０，３０および５０μMのイノシン(ＨｘＲ)を、２０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液の中に加えてＨｘＲの標準溶液を調製した。また、０，５，１０，２０，３０および５０μMのイノシン酸(ＩＭＰ)を、１ｍＭのＭｇＣｌ2とともに、２０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液中に加えてＩＭＰの標準溶液を調製した。ＨｘＲの標準溶液の実際のＨｘＲ濃度とＩＭＰの標準溶液の実際のＩＭＰ濃度は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて調べた。【００５８】
第一試薬溶液１５０μlを１５０μlのＨｘＲ(０，５，１０，２０，３０および５０μM)標準溶液に加え、UV-VIS分光測光器で４５４ｎｍの吸光度を２５℃で測定し、ＨｘＲの濃度と吸光度との関係を求め、これから標準曲線を作成した。また、第二試薬溶液１５０μlを１５０μlのＩＭＰ（０，５，１０，２０，３０および５０μM)標準溶液に加え、UV-VIS分光測光器で酵素混合液の４５４ｎｍの吸光度を２５℃で測定し、ＩＭＰの濃度と吸光度との関係を求め、これから標準曲線を作成した。【００５９】
１ｇの魚肉と１０％の過塩素酸４ｍｌをミンチ混合し、さらに、５％の過塩素酸４ｍｌを追加混合し、５℃、回転数2000rpmで１０分間遠心分離した。上澄みを取り、８Ｍ又は１ＭのＫＯＨで、ｐＨを６．８〜７．０に調整した。上澄み液を再び５℃、回転数２０００rpmで１０分間遠心分離した。試料溶液は、No.1のワットマン紙で濾過し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって等級付けされた蒸留水によって希釈し、２０ｍｌの魚エキスとした。希釈された試料溶液を０．６５μm-poreサイズのmilipore紙で再び濾過し、鮮度測定の前に−９０℃で保持した。【００６０】
次に、各貯蔵日数、各貯蔵温度における第一試薬及び第二試薬を用いて、同じ魚肉サンプルのＫｉ値を調べた。ここで、魚肉サンプルのＫｉ値は次のようにして求めた。まず、第一試薬及び第二試薬、各６０ｍｇを蒸留水１ｍｌで別々に戻し、それら１５０μlに魚エキス２０μlと、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液１３０μlを加えて第一試薬溶液、第二試薬溶液をそれぞれ調製した。【００６１】
UV-VIS分光光度計を使用し、第一試薬溶液、第二試薬溶液の４５４ｎｍの吸光度を２５℃で測定し、第一試薬溶液から得られた結果と第二試薬溶液から得られた結果を用いて、標準曲線からＨｘＲ＋Ｈｘの濃度を、ＩＭＰ＋ＨｘＲ＋Ｈｘの濃度をそれぞれ求めた。そして、下記数１で示す方程式にＨｘＲ＋Ｈｘの濃度及びＩＭＰ＋ＨｘＲ＋Ｈｘの濃度を入れ、Ｋｉ値を求めた。【００６２】
【数１】
2010044365.tif 000003
【００６３】
無添加の酵素複合体（第一試薬及び第二試薬）を用いて求めたＫｉ値は図１４に示す通り、スクロースを添加した酵素複合体（第一試薬及び第二試薬）を用いて求めたＫｉ値は図１５に示す通り、スクロースとゼラチンを添加した酵素複合体（第一試薬及び第二試薬）を用いて求めたＫｉ値は図１６に示す通りであった。【００６４】
図１４〜図１６に示す結果から、スクロースを添加した酵素複合体（第一試薬及び第二試薬）を用いて求めたＫｉ値は、無添加の酵素複合体（第一試薬及び第二試薬）を用いて求めたＫｉ値と比べ、バラツキが小さくなることがわかり、スクロースとゼラチンを添加した酵素複合体（第一試薬及び第二試薬）を用いて求めたＫｉ値のバラツキは更に小さくなることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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