(57)【要約】【課題】大容量型の尿酸トランスポーターを特定し、それを基に、尿酸輸送関連疾患及び炎症関連疾患の早期治療や予防に寄与するものとして、尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法とそれを実施する評価キットと、検査体と薬とを提供すること。【解決手段】  ABCG2を有するタンパク質から成り、尿酸を選択的・ATP依存的に排出する能力を備える尿酸トランスポーターとする。尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法としては、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ABCG2タンパク質をコードする遺伝子の変異を検知する工程を備える。V12M、R113X、Q126X、Q141K、F208S、G268R、E334X、S441N、L447V、S486N、F506SfsX4、R575X、C608Xの少なくともいずれかにＳＮＰがある場合に、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を有すると評価してもよい。V12MにＳＮＰがある場合は、その変異自体では尿酸輸送能の変化を来さないが、他のＳＮＰと連鎖不平衡の関係にあるために、他のＳＮＰと異なり、逆に素因を有しない可能性があると評価可能である。【選択図】図８
2010150525.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿酸のトランスポーターであって、
ABCG2タンパク質から成り、尿酸を選択的・ATP依存的に排出する能力を備える
ことを特徴とする尿酸トランスポーター。
【請求項２】
尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を有するか否かを評価する方法であって、
被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ABCG2タンパク質をコードする遺伝子の変異を検知する工程を有する
ことを特徴とする尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法。
【請求項３】
ABCG2タンパク質をコードする遺伝子の変異の検知が、
ＳＮＰまたはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型の検知である
請求項２に記載の尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法。
【請求項４】
遺伝子多型の検知に、ダイレクトシークエンス法、ＢＡＣアレイＣＧＨ法、ＦＩＳＨ法、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、インベーダー法、ＨＲＭ法、SmartAmp法、Q-probe法（QP法）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、モレキュラービーコン法、ＲＣＡ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法のいずれかを用いる
請求項３に記載の尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法。
【請求項５】
少なくともV12M、R113X、Q126X、Q141K、F208S、G268R、E334X、S441N、L447V、S486N、F506SfsX4、R575X、C608Xのいずれかのアミノ酸変異を生じさせるＳＮＰがある場合に、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を有すると評価する
請求項２ないし４のいずれかに記載の尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法。
【請求項６】
Q126X単独、または、Q126X 及びQ141Kの組み合わせのいずれかのアミノ酸変異を生じさせるＳＮＰがある場合に、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を有すると評価する
請求項５に記載の尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法。
【請求項７】
ABCG2の機能不全を含む機能変化がある場合に、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を有すると評価する
請求項２ないし４のいずれかに記載の尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法。
【請求項８】
ABCG2の機能不全を含む機能変化が、請求項５に記載のアミノ酸変異以外の遺伝子変異によるABCG2の機能変化、ABCG2のプロモーターや非翻訳領域(UTR)を含むエクソン、イントロンにおける遺伝子変異による発現量変化などに基づくABCG2の機能変化、または、転写因子を含む制御因子の変化または化合物によるABCG2の機能変化、CNV（コピー数多型）及びDNAメチル化を含むエピジェネティックな変化によるABCG2の機能変化、micro RNA及びnoncoding RNAを含むRNAによるABCG2の機能変化、ABCG2タンパク質の安定化機構の変化によるABCG2の機能変化のいずれかである。
請求項７に記載の尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法。
【請求項９】
血清中尿酸濃度が所定値以上の場合に、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を高く有すると評価する
請求項２ないし８のいずれかに記載の尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法。
【請求項１０】
血清中尿酸濃度の閾値が、6.0〜9.0mg/dl、より好ましくは7.0〜8.0mg/dlの間にあるいずれかの値である
請求項９に記載の尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法。
【請求項１１】
高尿酸血症を、尿酸産生亢進型、腎外における尿酸排泄低下型、腎臓における尿酸排泄低下型と、混合型とに分類し、ABCG2の機能評価に基づき高尿酸血症の分類を特定する
請求項２ないし１０のいずれかに記載の尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法。
【請求項１２】
尿酸輸送関連疾患及び炎症関連疾患が、高尿酸血症、痛風、リウマチ、変形性関節症、不妊症、脳卒中、虚血性心疾患、不整脈、光線過敏症、慢性腎臓病のいずれかである
請求項２ないし１１のいずれかに記載の尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法。
【請求項１３】
尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を有するか否かを評価するキットであって、
被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ABCG2遺伝子のV12M、R113X、Q126X、Q141K、F208S、G268R、E334X、S441N、L447V、S486N、F506SfsX4、R575X、C608Xの少なくともいずれかにおけるＳＮＰ、またはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型を検知する手段を備える
ことを特徴とする尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価キット。
【請求項１４】
尿酸の輸送動態を検査する生体であって、
ABCG2遺伝子を欠損させた非ヒト動物、または、ヒトABCG2遺伝子または非ヒトABCG2遺伝子を過剰発現させた非ヒト動物、V12M、R113X、Q126X、Q141K、F208S、G268R、E334X、S441N、L447V、S486N、F506SfsX4、R575X、C608Xのうちの少なくともいずれかの変異を含むヒトABCG2遺伝子または非ヒトABCG2遺伝子を過剰発現させた非ヒト動物、ABCG2遺伝子を欠損させた非ヒト細胞株またはヒト細胞株、ヒトABCG2遺伝子または非ヒトABCG2遺伝子を過剰発現させた非ヒト細胞株またはヒト細胞株、V12M、R113X、Q126X、Q141K、F208S、G268R、E334X、S441N、L447V、S486N、F506SfsX4、R575X、C608Xのうちの少なくともいずれかの変異を含むヒトABCG2遺伝子または非ヒトABCG2遺伝子を過剰発現させた非ヒト細胞株またはヒト細胞株、或いはそれら細胞株より調製した細胞膜小胞である
ことを特徴とする検査体。
【請求項１５】
尿酸の輸送動態を検査する非ヒト動物であって、
尿酸代謝酵素ウリカーゼの阻害剤であるオキソン酸含有飼料により飼育された
請求項１４に記載のマウス。
【請求項１６】
尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を低減する薬剤であって、
ABCG2タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドを細胞内に導入可能な形態で有する
ことを特徴とする尿酸輸送関連疾患及び炎症関連疾患薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿酸トランスポーター、並びに、それに関連する尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法とそれを実施する評価キット、また、それに関連する検査体と薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、痛風患者が増加し、発症も若年化している。痛風は、尿酸モノナトリウム結晶の組織沈着に起因する疾患であり、関節の炎症として発症することが多い。また、高尿酸血症患者によくみられ、遺伝的要素があることが以前より知られている。
痛風は、高血圧、肥満、糖尿病、冠動脈疾患、脳血管疾患、腎疾患などを合併することが多い。また、炎症に関連する疾患には、リウマチや不妊症などもあり、これらの早期治療や予防が求められている。【０００３】
本発明者は、機能的遺伝解析を用いて、２種類の尿酸トランスポーター、すなわち尿酸トランスポーター遺伝子1（URAT1/SLC22A12）及びグルコーストランスポーター9（GLUT9/SLC2A9）における機能喪失型突然変異が腎性低尿酸血症を引き起こすことを実証した（それぞれMIM220150及びMIM612076）（非特許文献１〜２）。これらの知見や腎における発現パターンからも、URAT1及びGLUT9がヒトにおける腎尿酸再吸収を媒介することが示されている。【０００４】
しかし、そのような解析ではその他の尿酸トランスポーターは同定されていず、血清中尿酸濃度（SUA）を上昇させ、痛風や高尿酸血症の主要病因となる変異が認められる尿酸トランスポーターは依然として不明であった。【０００５】
尿酸トランスポーターに関連する従来技術には特許文献１があり、トランスポーターとしてのABCG2に関連する従来技術には特許文献２〜４があるが、従来技術におけるABCG2は薬物のトランスポーターとしての開示であり、尿酸輸送や尿酸輸送関連疾患及び炎症関連疾患素因に関与するものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−９３０６７  「腎臓及び胎盤型尿酸トランスポーターとその遺伝子」
【特許文献２】特開２００７−６０９６７  「遺伝子多型の検出方法および薬物のスクリーニング方法」
【特許文献３】特開２００４−１６０４２  「ＡＢＣＧ２タンパク質が関与する薬物吸収の異常の遺伝子診断に用いることができる変異型ポリヌクレオチドおよび核酸分子」
【特許文献４】特表２００５−５２９６１８  「ＡＢＣＧ２多型による薬物輸送能の予測方法」
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Enomoto A, Kimura H, Chairoungdua A,et al. Molecular identification of a renal urate anion exchanger that regulatesblood urate levels. Nature 2002;417:447-52.
【非特許文献２】Matsuo H, Chiba T, Nagamori S, et al. Mutationsin glucose transporter 9 gene SLC2A9 cause renal hypouricemia. Am J Hum Genet2008;83:744-51.
【非特許文献３】Kondo C, Suzuki H, Itoda M, et al. Functionalanalysis of SNPs variants of BCRP/ABCG2. Pharm Res 2004;21:1895-903.
【非特許文献４】Maekawa K, Itoda M, Sai K, et al. Geneticvariation and haplotype structure of the ABC transporter gene ABCG2 in aJapanese population. Drug Metab Pharmacokinet 2006;21:109-21.
【非特許文献５】Wang H, Lee EW, Cai X, Ni Z, Zhou L, Mao Q.Membrane topology of the human breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2)determined by epitope insertion and immunofluorescence. Biochemistry2008;47:13778-87.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、大容量型の尿酸トランスポーターを特定し、それを基に、尿酸輸送関連疾患及び炎症関連疾患の早期治療や予防に寄与するものとして、尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法とそれを実施する評価キットと、それに関連する検査体と薬とを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の尿酸トランスポーターは、ABCG2を有するタンパク質から成り、尿酸をATP依存的に排出する能力を備えることを特徴とする。【００１０】
少なくともQ126Xに一塩基多型（ＳＮＰ）のないものが好ましい。【００１１】
本発明の尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法は、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を有するか否かを評価する方法であって、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ABCG2タンパク質をコードする遺伝子の変異を検知する工程を有することを特徴とする。なお、尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因とは、厳密には、尿酸輸送関連疾患素因and/or炎症関連疾患素因を意味する。【００１２】
ここで、ABCG2タンパク質をコードする遺伝子の変異の検知として、ＳＮＰまたはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型の検知を用いてもよい。【００１３】
遺伝子多型の検知には、ダイレクトシークエンス法、ＢＡＣアレイＣＧＨ法、ＦＩＳＨ法、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、インベーダー法、ＨＲＭ法、SmartAmp法、Q-probe法（QP法）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、モレキュラービーコン法、ＲＣＡ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法のいずれかが有用である。【００１４】
被験者を、例えば日本人、黒人、白人としてもよい。環太平洋地域住民や他の人種にも同様に適用可能である。【００１５】
V12M、R113X、Q126X、Q141K、F208S、G268R、E334X、S441N、L447V、S486N、F506SfsX4、R575X、C608Xの少なくともいずれかにＳＮＰがある場合に、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を有すると評価してもよい。V12MにＳＮＰがある場合は、その変異自体では尿酸輸送能の変化を来さないが、他のＳＮＰと連鎖不平衡の関係にあるために、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因が他のＳＮＰと異なり、逆に有しない可能性があると間接的に評価してもよい。【００１６】
特に、Q126X単独、または、Q126X 及びQ141Kの組み合わせにＳＮＰがある場合に、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を有すると評価してもよい。【００１７】
また、上記のアミノ酸変異を生じさせるＳＮＰに限らず、ABCG2の機能不全を含む機能変化がある場合に、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を有すると評価してもよい。【００１８】
そのようなABCG2の機能不全を含む機能変化としては、上記のアミノ酸変異以外の遺伝子変異によるABCG2の機能変化、ABCG2のプロモーターや非翻訳領域(UTR)を含むエクソン、イントロンにおける遺伝子変異による発現量変化などに基づくABCG2の機能変化、または、転写因子などの制御因子の変化や化合物などによるABCG2の機能変化、CNV（コピー数多型）及びDNAメチル化を含むエピジェネティックな変化によるABCG2の機能変化、micro RNA及びnoncoding RNAを含むRNAによるABCG2の機能変化、ABCG2タンパク質の安定化機構の変化によるABCG2の機能変化などが挙げられる。【００１９】
血清中尿酸濃度が所定値以上の場合に、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を高く有すると評価してもよい。【００２０】
血清中尿酸濃度の閾値としては、例えば6.6や7.0や8.0 mg/dlなど、6.0〜9.0mg/dl、より好ましくは7.0〜8.0mg/dlの間にあるいずれかの値が好適である。【００２１】
また、高尿酸血症を、尿酸産生亢進型と、腎外尿酸排泄低下型と、腎臓尿酸排泄低下型と、それらのいずれかの混合型とに分類し、ABCG2の機能評価に基づき高尿酸血症の分類を特定して、原因に応じた治療に寄与させてもよい。ここで、尿や血液の所見も併用してもよい。【００２２】
尿酸輸送関連疾患及び炎症関連疾患としては、高尿酸血症、痛風、リウマチ、変形性関節症、不妊症、脳卒中、虚血性心疾患、不整脈、光線過敏症、慢性腎臓病などが挙げられる。【００２３】
本発明の尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価キットは、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を有するか否かを評価するキットであって、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ABCG2遺伝子のV12M、R113X、Q126X、Q141K、F208S、G268R、E334X、S441N、L447V、S486N、F506SfsX4、R575X、C608Xの少なくともいずれかにおけるＳＮＰ、またはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型を検知する手段を備えることを特徴とする。【００２４】
本発明の非ヒト動物は、尿酸の輸送動態を検査する非ヒト動物であって、ABCG2遺伝子を欠損させたことを特徴とする。
本発明の尿酸輸送動態検査方法は、ABCG2遺伝子を欠損させた非ヒト動物を用い、その血清中尿酸濃度を測定してもよい。【００２５】
同様に、ヒトABCG2遺伝子または非ヒトABCG2遺伝子を過剰発現させた非ヒト動物、V12M、R113X、Q126X、Q141K、F208S、G268R、E334X、S441N、L447V、S486N、F506SfsX4、R575X、C608Xのうちの少なくともいずれかの変異を含むヒトABCG2遺伝子または非ヒトABCG2遺伝子を過剰発現させた非ヒト動物、ABCG2遺伝子を欠損させた非ヒト細胞株またはヒト細胞株、ヒトABCG2遺伝子または非ヒトABCG2遺伝子を過剰発現させた非ヒト細胞株またはヒト細胞株、V12M、R113X、Q126X、Q141K、F208S、G268R、E334X、S441N、L447V、S486N、F506SfsX4、R575X、C608Xのうちの少なくともいずれかの変異を含むヒトABCG2遺伝子または非ヒトABCG2遺伝子を過剰発現させた非ヒト細胞株またはヒト細胞株、或いはそれら細胞株より調製した細胞膜小胞を用いても行える。【００２６】
尿酸の輸送動態を検査する非ヒト動物としては、尿酸代謝酵素ウリカーゼの阻害剤であるオキソン酸含有飼料により飼育されたマウスが有用である。【００２７】
本発明の尿酸輸送関連疾患及び炎症関連疾患薬は、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を低減する薬剤であって、ABCG2タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入可能な形態で有することを特徴とする。【００２８】
同様に、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を低減する薬剤であって、ABCG2タンパク質に相当するポリペプチドを細胞内に導入可能な形態で有することを特徴としてもよい。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によると、大容量型の尿酸トランスポーターが得られると共に、尿酸輸送に関連する疾患の早期治療や予防に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ヒトABCG2遺伝子の遺伝子構造に基づいてデザインした変異解析用プライマーの説明図
【図２】阻害物質に対する[3H]ES輸送を示すグラフ
【図３】（ａ）時間に対する[14C]尿酸輸送を示すグラフ、（ｂ）尿酸濃度に対する[14C]尿酸輸送を示すグラフ
【図４】高尿酸血症患者において確認されたヒトABCG2のトポロジーモデル及び非同義的変異部位示す説明図
【図５】ABCG2の配列解析の結果を示す説明図
【図６】突然変異を起こしたABCG2の尿酸輸送解析の結果を示すグラフ
【図７】Q141Kについての量的形質遺伝子座（QTL）解析結果を示すグラフ。（ａ）は男性及び女性、（ｂ）は男性、（ｃ）は女性。
【図８】腎及び腸における尿酸排出モデルを示す説明図
【図９】一般住民（健康診断受検者）におけるABCG2の予測される機能低下の出現頻度を示す表
【図１０】男性の痛風患者におけるABCG2の機能低下の関連性を示す表
【図１１】ABCG2の機能と発症年齢の関係を示すグラフ
【図１２】ABCG2の変異別の人種による差異を示す表
【図１３】マウスAbcg2による[14C]尿酸の輸送を示すグラフ
【図１４】野生型マウスとAbcg2欠損マウスでの血中尿酸値及び尿中尿酸値を示すグラフ
【図１５】痛風及び高尿酸血症患者におけるABCG2の機能と尿中尿酸排泄量との関係を示すグラフ
【図１６】各ABCG2予測機能の高尿酸血症の症例における従来型の臨床分類の割合を示すグラフ
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明者は、非特許文献１〜２などに開示した知見の延長として、尿酸の高容量トランスポーターを見出し、本発明に至った。
以下に、本発明の根拠となる実証実験を示して、本発明を説明する。なお、本発明の実施形態は、後述の例に限らず、従来公知の技術を適宜援用して設計変更可能である。
また、ここでは、被験者として主に日本人の例を挙げるが、他の人種においても同様に適用可能である。台湾の原住民を含む環太平洋地域では、痛風の発症率が高いことが知られていて、本発明で注目する遺伝子ABCG2は、痛風発症を認める台湾21家系の連鎖解析で見い出された第４染色体長腕の遺伝子領域の中にある、という経緯もある。【００３２】
ATP結合カセットサブファミリーGメンバー2である遺伝子ABCG2/BCRPは、染色体4qにある痛風感受性の座（MIM138900）に存在し、腸や、肝臓、腎臓など様々な組織の頂端膜に発現する多選択性トランスポーターをエンコードする機能を有する。また、ABCG2は、構造が尿酸と似ているヌクレオチド類似体のトランスポーターでもある（非特許文献３）。
そこで以下のように、ABCG2がヒトにおいて初めて確認された尿酸排出トランスポーターであり、その一般的な変異体が血清中尿酸濃度（SUA）を上昇させることを示し、ABCG2遺伝子について臨床遺伝学的解析を実施した。【００３３】
ABCG2が尿酸の取扱い及び痛風の発症に影響を及ぼすか否かを確認するため、分子機能に基づく臨床遺伝学的（FBCG）解析を実施した。
被験者から採血した全末梢血細胞より高分子量ゲノムＤＮＡを抽出した。血清中尿酸濃度に関する量的形質遺伝子座（QTL）解析では、日本人739例を対象として一般的な機能障害性変異体Q141Kについて遺伝子型解析を実施した。ABCG2の機能低下の頻度を調べるために、別の日本人の健康診断受診者2150名（男性1042名、女性1108名）についてABCG2の遺伝子解析を実施した。
関連試験では、日本人の高尿酸血症男性228例（痛風161例を含む）及び対照日本人男性（SUA≦7.0mg/dl）数百例以上について、遺伝子型解析を実施した。痛風については、男性の症例700例以上及び対照日本人男性（SUA≦7.0mg/dl）1800例以上について解析した。
女性の痛風症例、高尿酸血症の症例もあわせて解析した。全痛風患者は、臨床的に原発性痛風と診断された。血清中尿酸濃度が8.0 mg/dlを超えている者は、高尿酸血症例として選択した。日本人以外におけるABCG2の機能低下の存在と頻度を調べるために、白人199名、黒人98名についても遺伝子解析を実施した。【００３４】
野生型のABCG2 cDNAをpcDNA3.1（+）ベクタープラスミド（Invitrogen社、カリフォルニア州カールズバッド）のNhe I部位及びApa I部位に挿入し、5’末端にmyc-tag配列をつなげた。膜小胞を作製するため、FuGENE6（Roche Diagnostics社、インディアナ州インディアナポリス）を用いて、ABCG2発現ベクターまたは空のベクターを一時的にHEK293細胞に遺伝子導入した。48時間後に細胞を採取し、標準的な方法で膜小胞を分離した。[3H]エストロン-3-硫酸（ES、500 nM）及び[14C]尿酸（28 μM）取り込み試験を実施した。【００３５】
特定部位の突然変異誘発により、ABCG2発現ベクター上にABCG2の変異体（V12M、R113X、Q126X、Q141K、F208S、G268R、E334X、S441N、L447V、S486N、F506SfsX4、R575X、C608X）を作製し、これらを尿酸輸送解析に用いた。800倍に希釈した抗myc-tag抗体（Roche
Diagnostics社）を用いて、膜小胞（20 μg）のウエスタンブロット解析を行った。【００３６】
ABCG2において候補変異体を見つけるため、日本人高尿酸血症患者80例を対象として、ABCG2遺伝子の全コーディング領域及びイントロンとエクソンの境界について、突然変異解析を実施した。
図１は、ヒトABCG2遺伝子の遺伝子構造に基づいてデザインした変異解析用プライマーの説明図である。
これらのプライマーを用いたPCRにより、ゲノムDNAを増幅させた。3130×1 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて、PCR産物の塩基配列を解析した。7700検出器（Applied Biosystems社）を用いた対立遺伝子鑑別アッセイ（Custom Taqman MGB、Applied Biosystems社）やLightCycler 480（Roche Diagnostics社）を用いた融解解析（HRM法）による遺伝子解析も実施した。【００３７】
統計解析の計算には、いずれもソフトウェアR及びSPSS(SPSS Japan Inc.)を使用した。マン・ホイットニー検定及びクラスカル・ワリス検定を用いて、ABCG2のＳＮＰの様々な遺伝型における臨床的共片量の差を比較した。カイ二乗検定及びフィッシャーの正確確率検定を用いて、痛風症例と対照例の試料における遺伝型の頻度及び対立遺伝子頻度の差を比較した。EMアルゴリズムを用いてハプロタイプを推定した。ABCG2の機能低下による痛風などの疾患リスクの検討は、ロジスティック回帰分析を用いて評価を実施した。【００３８】
ABCG2発現細胞より作製した膜小胞を用いて、典型的な基質であるES（エストロン）のABCG2を介した輸送に対する尿酸の阻害作用について検討した。
図２は、阻害物質に対する[3H]ES輸送を示すグラフである。
ABCG2の典型的な基質である［3H］エストロン-3-硫酸（ES、500 nM）輸送に対する阻害作用について、小胞輸送アッセイシステムを用いて検討した。ESのほかに、別の基質3’-アジド-3’-デオキシチミジン（AZT）が確認された。ES輸送も尿酸により阻害され、ABCG2を介した尿酸輸送の可能性が示唆された。【００３９】
尿酸がABCG2の基質であるか否か実証するため、同位体［14C］で標識した尿酸を用いて、輸送アッセイを実施した。
図３（ａ）は、時間に対する[14C]尿酸輸送を示すグラフであり、図３（ｂ）は、尿酸濃度に対する[14C]尿酸輸送を示すグラフである。
図３（ａ）に示す通り、ABCG2発現小胞ではATP依存性尿酸輸送が確認されたが、対照小胞では確認されなかった。これは、ABCG2による直接的な高容量性尿酸輸送の初めての実証である。ES輸送に対する阻害作用が軽度なため、尿酸は大容量型のABCG2基質であると考えられた。実際に、図３（ｂ）に示す通り、1mM以下の濃度では、ABCG2を介した尿酸輸送はほとんど飽和には達しなかった。【００４０】
典型的なABCG2基質、例えばES、4-硫酸メチルウンベリフェロン、及びE3040硫酸等の硫酸抱合体は、小容量型（Km値約20μM）のABCG2によって輸送される。動態解析によると、ABCG2は尿酸の飽和性輸送をKm 8.24±1.44mM及びVmax6.96±0.89 nmol/分/mg（蛋白質）で媒介しているので、ABCG2を介した大容量型輸送が高尿酸状態下で依然として機能していると言える。
これらの知見は、新たに同定されたABCG2の大容量型尿酸エクスポーターという生理学的役割を合理的に説明するものである。【００４１】
図４は、高尿酸血症患者において確認されたヒトABCG2のトポロジーモデル及び非同義的変異部位示す説明図、図５は、ABCG2の配列解析の結果を示す説明図である。
高尿酸血症患者80例を対象としてABCG2遺伝子の全コーディング領域の塩基配列を解析し、アミノ酸に変化がみられた５種類の変異（V12M、Q126X、Q141K、S441N、F506SfsX4）を発見した。なお、#はN結合糖鎖部位（N596）を示し、*はジスルフィド結合のシステイン残基（C592、C603、C608）を示す。【００４２】
V12M、Q126X、Q141Kは、細胞内のN末端領域に存在するＳＮＰである。このようなＳＮＰの対立遺伝子頻度は日本人において非常に多く、Q141K 31.9%、V12M 19.2%、Q126X 2．8%であるとの報告がある（非特許文献４）。ハーディー・ワインベルグ平衡に基づいてこれらのデータを計算すると、このようなマイナータイプの対立遺伝子を有する日本人の推定頻度は、Q141K 53.6%、V12M 34.7%、Q126X 5.5%となった。なお、図示のトポロジーモデルは、ヒトABCG2の膜トポロジー決定に関する最近の報告に基づくものである（非特許文献５）。【００４３】
図６は、突然変異を起こしたABCG2の尿酸輸送解析の結果を示すグラフである。
ABCG2の機能に対する尿酸輸送活性の作用を明らかにするため、野生型及び変異体ABCG2蛋白質を発現している膜小胞を用いて、５種類の変異体の尿酸輸送活性について調べた。
ATP依存性尿酸輸送は、Q141Kでほぼ半減（46.7%）し、Q126X、G268R、S441N、F506SfsX4ではほとんど消失した。ウエスタンブロット解析によると、Q141K変異体におけるABCG2蛋白質発現は半減（45.2%）し、Q126Xでは膜小胞上に蛋白質は発現しなかった。また、F208S、E334X、L447V、S486N、R575X、C608X変異により、ABCG2のATP依存性尿酸輸送は顕著に減少し、そのうちF208S、E334X、L447V、S486N、R575Xではほとんど消失していた。【００４４】
Q141Kの尿酸輸送活性が半減したのはABCG2蛋白質の発現が半減したためと考えられ、これはES輸送に関する非特許文献３の開示と一致している。
Q126X変異体において尿酸輸送が消失したのは、蛋白質発現が全く認められなかったことが原因と考えられる一方で、野生型ABCG2と比べてV12Mの尿酸輸送及び蛋白質発現は変化しなかった。これらのデータは、ABCG2蛋白質発現がどの程度減少したかが、尿酸輸送活性に直接影響を及ぼすことを明確に証明している。【００４５】
図７は、Q141Kについての量的形質遺伝子座（QTL）解析結果を示すグラフであり、（ａ）は男性及び女性、（ｂ）は男性、（ｃ）は女性に関する。
男性被験者245例及び女性被験者494例から成る日本人739例を対象として、ABCG2における高頻度の機能障害性変異体Q141Kについて、血清中尿酸濃度の量的形質遺伝子座（QTL）解析を実施した。C/C、C/A、A/Aは、それぞれQ141Kの野生型被験者、ヘテロ接合体変異保有者、ホモ接合体変異保有者を示す。【００４６】
Q141Kのマイナータイプの対立遺伝子が増加するに従い、血清中尿酸濃度は顕著に増加した（p=6.00×10-5、図７（ａ））。血清中尿酸濃度の著明な増加は、男性（p=0.0144）及び女性（p＝0.0137）被験者のどちらにも認められた。また、Q141Kは、年齢、体格指数、性別等、その他の臨床パラメータとは特に関連は認められなかった。
これらの知見によると、ABCG2は血清中尿酸濃度を低下させる生理学的機能を有し、その機能については、ABCG2のＳＮＰに起因する個人差が大きいと考えられる。【００４７】
図８は、腎及び腸における尿酸排出モデルを示す説明図である。
体内の尿酸の3分の2が腎から正常に排出され、3分の1が腸管に入り、そこで尿酸分解される。ヒトの腎では、尿酸は双方向に再吸収され、尿酸トランスポーターを介して分泌される。
ABCG2は、近位尿細管細胞（腎）管腔側、肝細胞胆管側（肝）、及び腸細胞（腸）に発現する。障害モデルでは、先端側のABCG2に多いＳＮＰは、尿酸排出を減少させ、血清中尿酸濃度を増加させる。この障害モデルに基づき、ABCG2が尿排出を介して腎における尿酸排出を媒介する生理学的尿酸排出モデルを提案する。
このモデルでは、ABCG2は胆管及び腸分泌によって腸における尿酸排出を媒介すると考えられる。近位尿細管細胞では、その他の尿酸トランスポーター（URAT1及びGLUT9）が腎における尿酸再吸収を媒介する。GLUT9L（GLUT9のアイソフォーム1）及びGLUT9S（GLUT9アイソフォーム2）の位置は、極性を有するMDCK（マディンダービーイヌ腎）細胞に関する観察結果に基づく。【００４８】
日本人の高尿酸血症男性228例（痛風161例を含む）についてABCG2のＳＮＰについて遺伝子型解析を行った。また、マイナータイプの対立遺伝子は対立遺伝子1、メジャータイプの対立遺伝子は対立遺伝子2とすると、Q126Xにおける対立遺伝子1はT、対立遺伝子2はCである。Q141Kにおける対立遺伝子1はA、対立遺伝子2はCである。V12Mにおける対立遺伝子1はA、対立遺伝子2はGである。Q126Xは痛風のリスクを有意に増加させることが分かった。機能障害性ＳＮＰであるQ141Kも、痛風リスクを有意に増加させた。痛風症例においては、どちらかの変異を、８割以上の症例に認めた。高尿酸血症の症例の関連解析においても同様の所見を認めた。また、Q126Xのホモ接合変異が認められる痛風患者もあり、この他に、痛風を認めない無症候性高尿酸血症においてもQ126Xのホモ接合変異が認められる症例があり、共に血清尿酸値は10mg/dl以上であった。【００４９】
また、V12M、Q126X、Q141Kのハプロタイプ頻度解析により、マイナータイプの遺伝子Q126XとQ141Kは１つのハプロタイプに併存しないことがわかった。
Q126のハプロタイプは、非リスクハプロタイプと比べて、痛風リスクを著明に増加させる。Q141Kは、独立した別のリスクハプロタイプに認められる。
すなわち、Q126XとQ141Kは、独立の危険因子であり、Q126XまたはQ141KそれぞれのＳＮＰを調べるだけで、それが乗っているハプロタイプがリスクハプロタイプか否かを容易に評価できる。
また、マイナータイプの遺伝子V12M（V12MにＳＮＰがある場合）は、その変異自体では尿酸輸送能の変化を来さないにも関わらず、他のＳＮＰと連鎖不平衡の関係にあるために、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因が他のＳＮＰと異なり、逆に有しない可能性があると間接的に評価してもよいことがわかった。【００５０】
図９は、一般住民（健康診断受検者）におけるABCG2の予測される機能低下の出現頻度を示す表である。受検者の半数以上に、ABCG2の機能低下を認めたが、4分の1以下の機能低下は、1.2〜1.7％程度にしか認められなかった。ABCG2の予測される機能低下は、男女とも、同様に認められた。
図１０は、男性の痛風患者におけるABCG2の機能低下の関連性を示す表である。ABCG2の機能が下がるほど、発症リスクが高くなることが明らかである。図１０に示されるように、ABCG2の機能低下は、痛風症例の8割近くに認められ、2.7倍以上の痛風リスクの上昇が認められた。痛風症例の3割近くには、ABCG2機能の2分の1以下の低下が認められ、4.8倍以上の痛風リスクの上昇が認められた。さらに、4分の1以下の機能低下は、痛風症例の5％以上に認められ、リスクが10倍以上に増加することが認められた。軽度の機能低下でも、有意な痛風発症リスクの増加を認めること、さらに、機能の低下が強いほど、発症リスクが著明に増加することが分かった。女性の痛風症例の解析においても、ABCG2の機能低下を認める例は多く認められ、その発症に関与していることが示唆された。【００５１】
図１１は、ABCG2の機能と発症年齢の関係を示すグラフである。
700例以上の痛風症例の解析により、ABCG2の機能が下がるほど、痛風の発症年齢が若くなることが明らかである。また、ABCG2の機能が1/4の場合は、20才代以下の若年で発症するリスクが正常の20倍以上となることも分かった。ABCG2の機能が1/2、3/4の場合でも20才代以下の若年で痛風を発症するリスクが極めて高いことが分かった。
ABCG2の機能低下は、痛風の若年発症に密接に関連しているので、そのリスクの早期認知は、発症の早期予防や発症した際の早期治療及び症状悪化の防止に有用である。従って、ABCG2機能低下型SNPの解析や、それに基づくABCG2の機能の予測は、痛風などの疾患の発症リスク予測に重要である。【００５２】
図１２は、ABCG2の変異別の人種による差異を示す表である。
リスクとなる変異であるQ126Xは、黒人に多く、白人にも認められた。Q141Kは、逆に、黒人に少なく、白人の方が多かった。また、ホモは白人にのみ検出された。従って、２つの変異の組み合わせの解析は、黒人においても極めて重要であり、白人においても解析する価値があることがわかった。なお、痛風の症例に絞って解析すれば、頻度が高まる可能性がある。【００５３】
また、ABCG2の予測される機能が1/4以下は、Q126X変異の多い黒人には、日本人と同程度に多く認められることがわかった。黒人には、他の人種より、Q141Kが少ないために3/4機能の方が少ない（10％程度）。白人には、Q126X変異が少ないため、1/4以下機能は認められにくいが、Q141Kが多いために、黒人に比べて3/4機能が多いことがわかった（15％程度）。
これらの結果から、日本人のみでなく、黒人や白人においても同様に、ABCG2機能低下型SNPの解析や、それに基づくABCG2の機能の予測は、痛風などの疾患の発症リスク予測に重要である。【００５４】
ABCG2の尿酸動態における役割を明らかにするため、動物モデルを用いて解析を行った。マウスを用い、そのAbcg2がヒトのABCG2と同様に尿酸輸送能を有するかについて、細胞膜小胞を用いた輸送実験により確かめた。
ヒトを含む一部の霊長類以外の大部分の哺乳類は、尿酸代謝酵素のウリカーゼを有しるので、マウスをそのまま用いることはヒトの尿酸動態を反映したモデルとしては不適切であるため、ウリカーゼ阻害剤であるオキソン酸カリウムを連日投与したマウスを用いた。その投与には、MF飼料(オリエンタル酵母，Tokyo，Japan)に、オキソン酸カリウム(TokyoChemical
Industry，Tokyo，Japan)を2.0% (w/w)添加したオキソン酸含有飼料を用いて飼育することで行った。【００５５】
マウスAbcg2発現ベクターは、N末端にmycタグの配列が付加されたマウスAbcg2のcDNAを増幅し、pGEM T-Easy Vector (Promega，Madison, WI)へ組み込んだ後、制限酵素処理によってpcDNA3.1(+)ベクターのNot Iサイトへ組み込むことにより構築した。【００５６】
作成したmyc-mAbcg2/pcDNA3.1(+)ベクターによるマウスAbcg2の発現を確認するため、極性細胞であるLLC-PK1細胞に一過性に導入し、局在パターンの観察を行った。抗myc抗体により免疫染色し共焦点顕微鏡で観察したところ、マウスAbcg2はLLC-PK1細胞における頂端膜表面に局在し、生体における局在と一致した。
また、マウスAbcg2がヒトABCG2と同様に尿酸を輸送することを確認するため、マウスmyc-Abcg2発現ベクターを一過性導入したHEK293細胞を回収し細胞膜小胞を調製した。マウスmyc-Abcg2の発現を確認するため、ウエスタンブロッティングを行ったところ、約85kDaの位置にバンドが観察された。【００５７】
オキソン酸含有試料で飼育した野生型のFVBマウスとAbcg2欠損マウス(体重27-32 g)から摘出した小腸を3分割し、最上流部分を用いて輸送実験を行った。腸管の一方を5 mlシリンジに、他方を2.5 mlシリンジに接続し、mucosal側溶液として予め37℃に温めておいたRinger Buffer 5 mlを5 mlシリンジから入れ、腸管の管腔中を満たした。放射性同位体で標識した尿酸を0.02 μCi/ml (放射性同位体尿酸最終濃度400 nM)含むpH7.4のRinger Bufferを、酸素二酸化炭素混合ガスを通気させながら37℃で30分温めた後、腸管をセッティングした時を0分として実験を開始した。【００５８】
図１３は、マウスAbcg2による[14C]尿酸の輸送を示すグラフである。
細胞膜小胞を用い、放射性同位体標識された尿酸を基質とした輸送実験を行ったところ、マウスAbcg2もヒトABCG2と同様尿酸を輸送することが確認された。また、250μM、500μM、1mM、1.5 mM、2 mM、4 mMの各尿酸濃度において輸送実験を行ったところ、この濃度範囲では飽和性が見出されなかった。これにより、マウスAbcg2は、高濃度の尿酸存在下でも機能し得る高容量性尿酸トランスポーターであることが示された。【００５９】
図１４は、野生型マウスとAbcg2欠損マウスでの血中尿酸値及び尿中尿酸値を示すグラフである。
オキソン酸含有飼料を2週間以上与えた野生型マウスとAbcg2欠損マウスの血中尿酸値を比較したところ、野生型マウスに比べAbcg2欠損マウスの血中尿酸値は有意に上昇していた（図１４（ａ））。ヒトと同様、マウスにおいてもAbcg2機能が低下することによる血中尿酸値上昇が確認されたため、ヒトの尿酸動態を反映したモデルとして使用可能である。また、血中尿酸値の有意な上昇（図１４（ｂ））に伴い、尿中尿酸値も有意ではないながらも上昇傾向を示した（図１４（ｃ））。腎機能の指標となるクレアチニンの尿中濃度および血中濃度で補正した尿中尿酸値/血中尿酸値の比は、Abcg2欠損マウスで有意に上昇していた。この結果は、Abcg2欠損による血中尿酸値上昇の原因が、尿中尿酸排泄量の低下では説明できないことを示している。【００６０】
野生型マウス及びAbcg2欠損マウスより単離した小腸を用いた尿酸輸送実験を行った。
尿中排泄以外の尿酸の排泄経路としては、腸管からの尿酸分泌が知られているので、野生型マウス及びAbcg2欠損マウスより小腸を単離し、放射性同位体標識された尿酸の輸送実験を行った。その結果、野生型マウス及びAbcg2欠損マウスともに30分まで直線的な尿酸輸送が見られ、30分における尿酸の輸送量はAbcg2欠損マウスにおいて有意に減少していた。このことから、マウスAbcg2が小腸において尿酸の輸送に関与していることが示唆された。【００６１】
図１５は、痛風及び高尿酸血症患者（医師により診断された症例）におけるABCG2の機能と尿中尿酸排泄量(UUAV）との関係を示すグラフである。
ABCG2の機能が落ちるほど、尿中尿酸排泄量が増加する傾向があることがわかる。尿中尿酸排泄量の増加は、尿酸産生亢進型(Overproduction type）と言われていた高尿酸血症の特徴である。【００６２】
図１６は、各ABCG2予測機能の高尿酸血症の症例における従来型の臨床分類の割合を示すグラフである。
ABCG2の機能が低下するほど、尿酸産生亢進型(Overproduction type)と混合型(Mixed type)が含まれる割合が高いといえる。また、尿酸産生亢進型(Overproduction type)と混合型(Mixed type)には、ABCG2の機能が低下している患者が多く（８割以上）、逆に、尿中への尿酸排泄低下型(Underexcretion
type)では、ABCG2の機能が低下している患者が少ないことがわかる。
従来の産生亢進型には、ABCG2の何らかの機能低下が、約８〜９割の症例に認められることがわかった。混合型においても、ABCG2の何らかの機能低下が、約７〜８割の症例に認められることがわかった。【００６３】
ABCG2の機能の評価に基づき、より正確で新しい臨床的な高尿酸血症の分類が可能となった。
すなわち、従来の分類で尿酸産生亢進型(Overproduction type)と扱われていたものの多くは、実は、産生亢進があったのではなく、ABCG2の機能低下に起因する尿酸の腎外排泄低下が病因であったことがわかり、その際、従来の尿酸産生亢進型と同様に、腎臓においては尿酸排泄亢進型(Renaloverecretion
type)となることがわかった。
従来の産生亢進型には、ABCG2の何らかの機能低下が認められることが多いため、尿酸の腎外排泄の低下に起因するタイプ（腎外における尿酸排泄低下型）が多くを占めることがわかった。【００６４】
従来は、尿酸の排泄経路としては、尿中への排泄が重要であり、血中尿酸値の上昇は主に尿中への尿酸排泄量の低下と尿酸の産生の亢進により生じるとされていた。臨床の現場においても、血中尿酸値上昇は尿酸尿中排泄低下型と尿酸産生亢進型に分類して考えられていた。ABCG2は腎臓において尿酸排泄の機能を担っていて、ABCG2の欠損により尿中尿酸排泄クリアランスが低下しているという予測や議論が主流であった。
それに対し、本発明者は、オキソン酸含有試料を与えたAbcg2欠損マウスにおいて、腎機能の指標となるクレアチニンの尿中濃度及び血中濃度で補正した場合には、尿中尿酸値/血中尿酸値比は有意に上昇していた。この結果は、腎臓からの尿酸排泄ではAbcg2機能低下による血中尿酸値の上昇を説明できず、腎臓以外の臓器からのAbcg2による尿酸排泄の低下により血中尿酸値が上昇していることを示している。また、ABCG2機能低下により血中尿酸値が上昇している患者において、尿中尿酸排泄クリアランスは低下するどころかむしろ上昇傾向を示していることを見出した。【００６５】
尿以外の排泄経路については、汗腺からは無視できる程度の尿酸しか排泄されていないという報告があり、尿酸は尿中排泄以外の経路では主に糞中に排泄されると考えられている。糞中に出る経路として、唾液、胃液、胆汁から分泌される尿酸は1日に体内から排泄される尿酸のそれぞれ5%程度以下であると考えられているので、これらの経路が遮断されたとしても血中尿酸値の上昇は説明しにくい。これらのことから、ABCG2欠損による血中尿酸値の上昇には、小腸における尿酸排泄の低下が寄与している可能性が高く、実際、小腸を用いた輸送実験の結果から、Abcg2が小腸からの尿酸排泄に関与していることが示唆された。
なお、腸管を用いた輸送実験において小腸のうち上流部を用いたのは、ヒトでは小腸の上部でABCG2の発現が高いという報告があったことに基づく。実際、小腸の下部を用いて行った結果も、尿酸輸送は上流部に比べて弱く、野生型マウスとAbcg2欠損マウスで差がない傾向が見られた。このことは、Abcg2による尿酸の腸管分泌がその発現分布に対応していて、主に小腸上部で行われていることを示唆している。【００６６】
ABCG2の小腸からの尿酸排泄への関与は、消化管のABCG2を誘導または活性化することにより血中尿酸値が低下できることを示唆するので、腎不全の患者にも使用できる新たな血中尿酸値低下薬の開発に寄与する。
また、従来の臨床分類では尿酸産生亢進型と分類されていた高尿酸血症患者の一部は、消化管からの尿酸排泄低下が原因である可能性を含むので、本発明は高尿酸血症の正確な病型の診断・把握と、治療薬の適切かつ有効な使用や、病態に基づく治療薬の開発に寄与する。【００６７】
現在、痛風治療としては、発作時にはNSAIDsを用いた対症療法が行われる他、予防的には血中尿酸値を低く保つ目的で、尿酸産生を抑制するアロプリノール、尿酸再吸収阻害薬であるベンズブロマロン、プロベネシドなどが使用されている．しかし、尿中排泄を促進する薬物には、副作用として尿路結石のリスクが伴う。高尿酸血症の改善や痛風発症リスクの低下には、ABCG2を阻害することは望ましくなく、ABCG2の発現誘導・機能亢進を起こす薬剤がより適切であり、または、ABCG2の機能を低下させず、URAT1、GLUT9の発現低下・機能阻害を起こす薬物がより適切である。
また、高尿酸血症の臨床分類および治療薬の選択が、ABCG2のSNPのタイピングまたは、尿酸排泄の評価（蓄尿による詳細な尿酸排泄量の評価、スポット尿における簡易的な尿酸排泄パターンの評価。後者は、体重等の体格により補正をすることでより信頼性を高めることが可能である。）により、より適切に実施可能である。【００６８】
以上から、ABCG2遺伝子のQ126X変異と、他の機能低下型変異との組み合わせは、原発性痛風の主要原因であると同定される。これらの知見は、Q126Xなど、実質的に尿酸排出を阻害し、痛風を引き起こすABCG2の非機能性変異体の重要性を示唆している。
従って、本発明では、大容量型の尿酸トランスポーターとしては、ABCG2を有するタンパク質から成り尿酸を選択的・ATP依存的に排出する能力を備えるもの、好ましくは、少なくともQ126Xなどの機能低下型ＳＮＰがないものを提供する。
また、Q126Xなどの機能消失型変異や機能半減型の変異(Q141K)の組み合わせが、血清中尿酸濃度の上昇と痛風の発症に重要な役割を担っているが、簡易な検査処理上は、Q126Xなどの機能消失型変異を１つであれば、痛風など尿酸輸送関連疾患及び炎症関連疾患の素因があると評価することもできる。【００６９】
本発明による尿酸輸送関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法は、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を有するか否かを評価する方法であって、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ABCG2タンパク質をコードする遺伝子の変異を検知する工程を有する。
ABCG2タンパク質をコードする遺伝子としては、V12M、R113X、Q126X、Q141K、F208S、G268R、E334X、S441N、L447V、S486N、F506SfsX4、R575X、C608Xが挙げられ、ＳＮＰまたはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型が検知された場合に素因を有すると評価する。【００７０】
また、上記のアミノ酸変異を生じさせるＳＮＰに限らず、ABCG2の機能不全を含む機能変化がある場合に、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を有すると評価してもよい。【００７１】
そのようなABCG2の機能不全を含む機能変化としては、上記のアミノ酸変異以外の遺伝子変異によるABCG2の機能変化、ABCG2のプロモーターや非翻訳領域(UTR)を含むエクソン、イントロンにおける遺伝子変異による発現量変化などに基づくABCG2の機能変化、または、転写因子などの制御因子の変化や化合物などによるABCG2の機能変化、CNV（コピー数多型）及びDNAメチル化を含むエピジェネティックな変化によるABCG2の機能変化、micro RNA及びnoncoding RNAを含むRNAによるABCG2の機能変化、ABCG2タンパク質の安定化機構の変化によるABCG2の機能変化などが挙げられる。【００７２】
尿酸輸送関連疾患及び炎症関連疾患としては、高尿酸血症、痛風、リウマチ、変形性関節症、不妊症、脳卒中、虚血性心疾患、不整脈（心房細動を含む）、光線過敏症、慢性腎臓病などに適用できる。
例えば、不妊症、光線過敏症が、ABCG2の機能低下のある高尿酸血症の家系の解析において見いだされた。また、心房細動が、ABCG2の機能低下を認める症例において認められることが確認された。これらの疾患が、ABCG2の機能低下との関連がある可能性が示唆される。【００７３】
また、血清中尿酸濃度が高い方が尿酸輸送関連疾患及び炎症関連疾患を生じやすいので、例えば8.0 mg/dlなどの所定値以上の場合に、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を高く有すると評価してもよい。この閾値は、7や9など適宜設定変更可能である。【００７４】
なお、ABCG2遺伝子には、ヒト由来ｃＤＮＡや、相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、尿酸輸送能を有するポリペプチドをコードするヒト由来の同質遺伝子、哺乳動物におけるそれらの相同物も含まれる。【００７５】
遺伝子多型を決定するには、ヒト血液または組織を材料として、ダイレクトシークエンス法や、ＢＡＣアレイＣＧＨ法、ＦＩＳＨ法、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、インベーダー法、ＨＲＭ法、SmartAmp法、Q-probe法（QP法）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、モレキュラービーコン法、ＲＣＡ法、ＵＣＡＮ法、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法などが利用できる。【００７６】
ダイレクトシークエンシング法などによると、ゲノムＤＮＡから直接ＳＮＰを検出することができる。
また、クローンや、ＰＣＲ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＲＣＫ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法などにより、特定のゲノムＤＮＡ領域を増幅した後に、少なくとも多型部位を含む対立遺伝子の一部の塩基配列の決定、多型部位に特異的にハイブリダイズするプローブによる検出、多型部位を含む遺伝子断片の分子量の測定を行ったりしてもよい。
増幅産物は、塩基配列の決定、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法等による分子量の測定、制限酵素断片長の解析、ＳＳＣＰによる検出、電気泳動などによって、ＳＮＰを決定することができる。【００７７】
例えば、ＴａｑＭａｎ法は、アレル特異的なオリゴヌクレオチドと鋳型とのハイブリダイゼーションとＰＣＲ法を同時に行い、蛍光エネルギー移動現象を用いてＳＮＰを検出する方法である。蛍光色素と消光物質により標識したアレル特異的プローブを標的部位にハイブリダイズさせて、この部位を含む領域を増幅するように設計したプライマーでＰＣＲを行うと、プライマーからの伸長反応が進むと同時に、Ｔａｑポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性によりハイブリダイズしたプローブが切断される。蛍光色素が消光物質と離れると蛍光が生じ、またＰＣＲ反応により鋳型が増幅するため、蛍光強度は指数関数的に増強する。２種類のアレルに特異的なプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば、１回のアッセイでホモ接合体とヘテロ接合体とを区別することもできる。【００７８】
インベーダー法は、２種類のオリゴヌクレオチドを用い、これらのプローブが鋳型ＤＮＡと形成する特異的な構造を認識して切断する酵素反応に基づく方法である。目的塩基配列の第１の部位に実質的に相補的なインベーダープローブと、3'末端側が目的塩基配列の第２の部位と実質的に相補的であり5'末端側には鋳型と非相補的で一本鎖を形成するフラップを含むアレルプローブとの２種類の異なるプローブで、目的とする塩基配列を認識する。これらのプローブが鋳型の隣接する領域にハイブリダイズすると、ＳＮＰ部位にインベーダープローブの3'末端が侵入し、この構造が酵素により切断されてフラップが遊離する。遊離したフラップはあらかじめ標識しておくことにより定量することができる。フラップ−ＦＲＥＴプローブを２組用意し、異なる蛍光色素で標識することにより、１回のアッセイで各ホモ接合体とヘテロ接合体とを区別することができる。【００７９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法は、ＳＮＰ部位に隣接するプライマーを作製し、ＰＣＲ増幅させた試料ＤＮＡを鋳型として、ｄｄＮＴＰを用いて１塩基分だけプライマー伸長反応を行い、伸長反応生成物の質量分析により、付加したｄｄＮＴＰを識別する方法である。プライマーの蛍光標識を必要とすることなく、短時間で大量の試料を処理することができる。【００８０】
ＲＣＡ法は、環状の一本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼがその上を移動しながら長い相補鎖ＤＮＡを合成していくＤＮＡ増幅手段を、ＳＮＰタイピングに応用した方法である。ＳＮＰの識別をＲＣＡ法による増幅の有無で行う。すなわち、ゲノムＤＮＡとアニールし、環状になりうる一本鎖プローブをゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせて連鎖反応を行う。プローブの端を識別したいＳＮＰの部位としておけば、その部位がマッチしていれば連結され環状となってＲＣＡによる増幅が起こるが、ミスマッチであれば連結されず環状とならないためＲＣＡ増幅は起こらない。この２種類の増幅反応を識別することによってＳＮＰを決定することができる。【００８１】
ＤＮＡチップ法は、多型部位を含むオリゴヌクレオチドプローブをマイクロアレイ上に配置したＤＮＡチップを用いて、ＰＣＲ増幅させた蛍光標識ｃＤＮＡやｃＲＮＡとハイブリダイゼーションする方法である。多くのＳＮＰを迅速に検出することができる。【００８２】
アミノ酸配列の多型を決定する方法には、例えば、二次元電気泳動法やマイクロフルーイディクス法によるプロテオーム解析、質量分析装置を用いたペプチドマッピングとアミノ酸配列分析、プロテインシークエンサーによるアミノ酸配列分析、プロテインチップを用いてポリペプチドとリガンドとの相互作用を検出する方法などが利用できる。【００８３】
例えば、二次元電気泳動法は、一般的には、一次元目に等電点電気泳動を、二次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うものであり、１枚のゲルで数千のタンパク質を分離することができる。等電点電気泳動には、両性担体や固定化ｐＨ勾配ゲルストリップを用いる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、１種類のｐＨの緩衝液を用いる連続緩衝液系と、複数のｐＨの緩衝液を用いる不連続緩衝液系とがある。また、分離するタンパク質の種類によって、低ＢＩＳ濃度ゲル電気泳動、濃度勾配ゲル電気泳動、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどを用いることができる。分離されたタンパク質は、クーマシーブルー染色や銀染色や蛍光試薬を用いてゲル上で感度よく検出できる。また、ABCG2ポリペプチドに対する抗体を用いたウエスタンブロッティング法も利用可能である。【００８４】
質量分析方法の一つであるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法は、タンパク質試料とシナピン酸等のレーザー光を吸収するマトリクスとの混合、乾燥後に強力なパルスレーザー光を照射し、マトリクスからのエネルギー移動によるタンパク質試料のイオン化を行い、初期加速による試料分子イオンの飛行時間差でイオンの分子量を分析する方法である。ペプチドを質量分析計内部で断片化し、断片の質量解析からアミノ酸配列やアミノ酸組成などを得るためには、質量分離部を複数連結したタンデム質量分析法が利用され、エレクトロスプレーイオン化法を用いた三連四重極型やハイブリッド型やイオントラップ型分析計等も用いられる。【００８５】
プロテインチップ法は、基板上に並べたタンパク質や、ペプチド、抗体、発現タンパク質などと試料との相互作用を、包括的かつ迅速に行うことができる。【００８６】
本発明による評価キットは、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を有するか否かを評価するキットであって、被験者のヒト遺伝子を含む試料を用い、ABCG2遺伝子のV12M、R113X、Q126X、Q141K、F208S、G268R、E334X、S441N、L447V、S486N、F506SfsX4、R575X、C608Xの少なくともいずれかにおけるＳＮＰ、またはそれと連鎖不均衡の関係にある遺伝子多型を検出する手段を備える。
すなわち、ABCG2遺伝子多型を含むポリヌクレオチド、または多型を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマー対、多型を検出するためのポリヌクレオチドとして提供してもよい。【００８７】
なお、ポリヌクレオチドとは、ポリリボヌクレオチドとポリデオキシリボヌクレオチドの双方を含み、それらは非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ、修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよく、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、未プロセッシングＲＮＡ、それらの断片などが挙げられる。
また、ポリペプチドとは、２以上のアミノ酸がペプチド結合で連結されたものであり、比較的短鎖のペプチドまたはオリゴペプチドと呼ばれるものからタンパク質と呼ばれる長鎖のものまでを含む。ポリペプチドには、遺伝的にコードされている２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸や、修飾されたアミノ酸を含んでもよい。その修飾には、ペプチド結合の主鎖、アミノ酸側鎖、アミノ末端、カルボキシル末端において、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ビオチン化、脂質や脂質誘導体との共有結合、架橋結合の生成、ジスルフィド結合、糖鎖の付加、ＧＰＩアンカーの付加、リン酸化及びプレニル化などが挙げられる。【００８８】
本発明による尿酸輸送動態検査方法は、ABCG2遺伝子を欠損させた非ヒト動物を用い、その血清中尿酸濃度を測定する工程を有する。また、ABCG2遺伝子を欠損させた非ヒト動物を、尿酸の輸送動態を検査する手段として提供してもよい。
非ヒト動物としては、マウスなどの哺乳類等が挙げられ、その生体を構成している組織や細胞も含む。また、試料としては、生物に由来するポリヌクレオチドを含有するものであって、組織や細胞から採取される体液、皮膚、毛根、粘膜、内臓、胎盤、臍帯血等を含む。
同様に、ヒトABCG2遺伝子または非ヒトABCG2遺伝子を過剰発現させた非ヒト動物、V12M、R113X、Q126X、Q141K、F208S、G268R、E334X、S441N、L447V、S486N、F506SfsX4、R575X、C608Xのうちの少なくともいずれかの変異を含むヒトABCG2遺伝子または非ヒトABCG2遺伝子を過剰発現させた非ヒト動物、ABCG2遺伝子を欠損させた非ヒト細胞株またはヒト細胞株、ヒトABCG2遺伝子または非ヒトABCG2遺伝子を過剰発現させた非ヒト細胞株またはヒト細胞株、V12M、R113X、Q126X、Q141K、F208S、G268R、E334X、S441N、L447V、S486N、F506SfsX4、R575X、C608Xのうちの少なくともいずれかの変異を含むヒトABCG2遺伝子または非ヒトABCG2遺伝子を過剰発現させた非ヒト細胞株またはヒト細胞株、或いはそれら細胞株より調製した細胞膜小胞を用いてもよい。【００８９】
本発明による尿酸輸送関連疾患及び炎症関連疾患薬は、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を低減する薬剤であって、ABCG2タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入可能な形態で有するか、または、ABCG2タンパク質に相当するポリペプチドを細胞内に導入可能な形態で有するものである。前者によると、長期間にわたって安定に尿酸輸送を改善させることができ、後者によると、注射等の投与によって簡便に尿酸輸送を改善させることができる。【００９０】
なお、ポリヌクレオチドを細胞内に導入可能な形態とは、ポリヌクレオチドが細胞内に導入され、細胞内のABCG2遺伝子がABCG2を発現するようにコードされているABCG2を発現すること可能とする形態を意味する。同様に、ポリペプチドを細胞内に導入可能な状態とは、ポリペプチドが細胞内に導入され、細胞内のABCG2と同様な機能を発揮することを可能とする形態を意味する。【００９１】
ABCG2ポリヌクレオチドは、既知のヌクレオチド配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いて既存のcDNAライブラリーをスクリーニングする方法や、オリゴヌクレオチドプライマーを用いたRT-PCR等の方法によって取得することができる。【００９２】
V12M、R113X、Q126X、Q141K、F208S、G268R、E334X、S441N、L447V、S486N、F506SfsX4、R575X、C608XのいずれにもＳＮＰのないABCG2、少なくともQ126XにＳＮＰのないABCG2が好ましく、そのポリヌクレオチドを細胞内に導入可能な状態にするためには、例えば、むき出しDNAとする方法や、組換えウイルスベクターの形態で製剤化する方法が用いられる。ウイルスベクターには、バキョロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、ピコルナウイルス科などのウイルスのゲノムに由来するものが利用できる。【００９３】
また、生体より取り出した組織または細胞にポリヌクレオチド発現ベクターを導入した後に、生体に戻すようにしてもよい。そのような場合は、ポリヌクレオチドを組込んだ発現ベクターを、例えばマイクロインジェクション法やエレクトロポーレーション法などのトランスフェクションにより細胞内に導入する方法が利用できる。【００９４】
ウイルスベクターや発現ベクターにおけるポリヌクレオチドは、全身性または組織特異的に発現するプロモーター支配下に連結してもよい。また、ウイルスベクターを腎臓特異的に感染させる場合には、経皮的に動脈にカテーテルを挿入して、X線でカテーテルの位置を確認しながら腎臓動脈にカテーテルを挿入して組換えベクターを導入することが可能である。【００９５】
ABCG2ポリペプチドは、前記のABCG2ポリヌクレオチドを用いた遺伝子工学的方法により作成することができる。すなわち、ポリヌクレオチドを有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行うことによりインビトロでABCG2ポリペプチドを得ることができる。また、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組換えれば、大腸菌や枯草菌等の原核細胞や、酵母や、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞の発現産物としてABCG2ポリペプチドを得ることができる。
また、ABCG2ポリペプチドは、公知の化学合成法に準じて合成することもできる。【００９６】
ABCG2ポリペプチドは、ペプチド誘導体として提供してもよい。この誘導体には、合成や精製を促進するための修飾、物理、化学的安定化を促進するための修飾、生体内の代謝に対する安定性と不安定性、条件付けの等の活性化修飾などを含む。
ペプチド誘導体におけるその他の修飾には、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、脂質結合、硫酸化、セレノイル化などが含まれる。より具体的には、ペプチド誘導体は、ABCG2ポリペプチドの活性を破壊せず、またこれを含有する組成物に毒性を与えない範囲において、残基の側鎖またはN末端基もしくはC末端基として生じる機能性基として調製することができる。例えば、体液中でポリペプチドの残存を延長するポリエチレングリコール側鎖を含む誘導体、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたはアミンと反応することによるカルボキシル基のアミド、アシル部分と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のN−アシル誘導体またはアシル部分と形成される遊離の水酸基のO−アシル誘導体などが挙げられる。【００９７】
ABCG2ポリペプチドはまた、薬理学的に許容し得る塩として提供してもよい。この塩には、ポリペプチドのカルボキシル基の塩とアミノ基の酸付加塩の双方を含む。
カルボキシル基の塩は、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄、亜鉛などの無機塩や、トリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジン、プロカインなどのアミンを用いて形成された有機塩基との塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば塩酸や硫酸などの鉱酸との塩、酢酸やシュウ酸などの有機酸との塩が挙げられる。【００９８】
このようなABCG2ポリペプチドを細胞内に導入可能な形態に製剤化するには、例えば、ポリペプチドのN末端側に細胞膜通過ペプチドを連結させた融合ポリペプチドの利用が挙げられる。細胞膜通過ペプチドとしては、HIV-1・TATのPTDや、ショウジョウバエのホメオボックスタンパク質アンテナペディアのPTDを使用することができる。融合ポリペプチドは、例えば、ABCG2ポリヌクレオチドとPTDポリヌクレオチドとを連結して作製した融合ポリヌクレオチドを用いて、遺伝子工学的に作製することができる。また、EDCやβ−アラニン等の架橋剤を介して、ポリペプチドとPTDペプチドを結合させる方法によって細胞膜通過ペプチドを連結した融合ポリペプチドを作成することもできる。このような融合ポリペプチドは、経皮的に動脈にカテーテルを挿入して、X線でカテーテルの位置を確認しながら腎臓動脈にカテーテルを挿入して組換えベクターを導入することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明によると、尿酸輸送能の不全或いはそれに起因する状態または疾患を生じ得る素因を有するか否かを有効に評価するので、尿酸輸送に関連する様々な疾病の予防や早期治療に寄与する。また、発症後であっても、好ましくない他の作用を起こすことなく、尿酸輸送に関連する疾患の治療に寄与する。そのため、高尿酸血症や、痛風、リウマチ、変形性関節症、不妊症、脳卒中、虚血性心疾患、不整脈（心房細動を含む）、光線過敏症、慢性腎臓病などの炎症関連疾患や、合併症として発症しやすい高血圧や、肥満、糖尿病、冠動脈疾患、脳血管疾患、腎疾患などにも有効であり、産業上有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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