(57)【要約】  本発明は、既存の治療法では効果が不十分な進行胃癌患者に対してチミジル酸合成酵素遺伝子、必要に応じてさらにチミジン加リン酸分解酵素遺伝子の発現量を指標として患者を選択することにより、重大な副作用を示すことなく、既存の治療法よりも優れた治療効果を発揮することができる、ＴＳ−１（テガフール、ギメラシル及びオテラシルカリウムを、モル比が１：０．４：１の配合剤）を含む胃癌の抗腫瘍剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）〜（２）を含む、胃癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた化学療法に対する治療効果を予測する方法：
（１）患者から採取された癌細胞を含み得る生体試料に含まれるチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量を測定する工程、
（２）上記工程（１）で得られた発現量が、予め設定したカットオフポイントと比較して低い場合、前記配合剤を単独で用いた化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測し、予め設定したカットオフポイントと比較して高い場合、前記配合剤にさらに他の抗腫瘍剤を併用する化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
【請求項２】
下記工程（１’）〜（２’）の工程を含む、胃癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた化学療法に対する治療効果を予測する方法：
（１’）患者から採取された癌細胞を含み得る生体試料に含まれるチミジル酸合成酵素遺伝子及びチミジン加リン酸分解酵素遺伝子の発現量を測定する工程、
（２’）上記工程（１’）で得られた発現量が、予め設定した対応するカットオフポイントと比較してともに低い場合、前記配合剤を単独で用いた化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測し、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量が高い場合、前記配合剤にさらに他の抗腫瘍剤を併用する化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
【請求項３】
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤における各有効成分のモル比が、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム＝１：０．４：１である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
他の抗腫瘍剤が、シスプラチンである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の方法により前記配合剤を単独で用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に投与することを特徴とする、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤からなる抗腫瘍剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載の方法により前記配合剤にさらに他の抗腫瘍剤を併用する化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に投与することを特徴とする、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びシスプラチンからなる抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を少なくとも使用する化学療法に対する治療効果を予測する方法、当該配合剤を用いた化学療法に十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された患者に投与するための抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
進行胃癌に対する化学療法として、５−フルオロウラシル、シスプラチン、イリノテカン、ドセタキセル、テガフール・ウラシル配合剤（商品名：ユーエフティー（登録商標））、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（商品名：ティーエスワン（登録商標）、以下、テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウムがモル比１：０．４：１で配合された製剤をＴＳ−１と称す。）などの抗腫瘍剤が臨床応用されてきたが、先般、従来日本において標準療法とされていたＴＳ−１単独療法とＴＳ−１とシスプラチンの併用療法の比較試験により、ＴＳ−１とシスプラチンの併用療法でより良い生存期間（１１ヶ月  ｖｓ  １３ヶ月）が得られることが公表され、ＴＳ−１とシスプラチンの併用療法が、進行胃癌に対する標準療法になり得ることが示唆された（非特許文献１）。また、ＴＳ−１は、チミジル酸合成酵素（ＴＳ）遺伝子、チミジン加リン酸分解酵素（ＴＰ）遺伝子の発現量が低い方が、ＴＳ−１を投与された癌患者の生存期間が長いことが知られている（非特許文献２）。【０００３】
しかしながら、ＴＳ−１とシスプラチンの併用療法は治療効果が高い反面、副作用も多く発症し、臨床において副作用と治療効果のバランスをとりながら治療を行うことが難しいという問題点があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．  ２００８；９（３）：２１５−２２１．
【非特許文献２】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．  ２００６；１１９：１９２７−１９３３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、進行胃癌患者に対して、強い延命効果を奏し、且つ副作用が少ない化学療法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、進行胃癌に対する化学療法について研究を重ねた結果、チミジル酸合成酵素（Thymidylate Synthase; ＴＳ）遺伝子（特にチミジル酸合成酵素遺伝子及びチミジン加リン酸分解酵素（Thymidine Phosphorylase; ＴＰ）遺伝子）の発現量を指標とすることにより、ＴＳ−１療法にさらに他の抗腫瘍剤（特にシスプラチン）を併用すべきか否かが判断できることを見出し、本発明は完成に至った。なお、チミジル酸合成酵素及びチミジン加リン酸分解酵素は、従来からＴＳ−１の治療効果と関連していることが知られているが（例えば、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１１９，１９２７−１９３３（２００６））、ＴＳ−１療法にさらにシスプラチンを併用させる際に、チミジル酸合成酵素及びチミジン加リン酸分解酵素が指標とできることは知られていない。【０００７】
すなわち本発明は、以下の胃癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた化学療法に対する治療効果を予測する方法、抗腫瘍剤を提供するものである。
項１．
下記工程（１）〜（２）を含む、胃癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた化学療法に対する治療効果を予測する方法：
（１）患者から採取された癌細胞を含み得る生体試料に含まれるチミジル酸合成酵素遺伝子の発現量を測定する工程、
（２）上記工程（１）で得られた発現量が、予め設定したカットオフポイントと比較して低い場合、前記配合剤を単独で用いた化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測し、予め設定したカットオフポイントと比較して高い場合、前記配合剤にさらに他の抗腫瘍剤を併用する化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
項２． 
下記工程（１’）〜（２’）の工程を含む、胃癌患者におけるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた化学療法に対する治療効果を予測する方法：
（１’）患者から採取された癌細胞を含み得る生体試料に含まれるチミジル酸合成酵素遺伝子及びチミジン加リン酸分解酵素遺伝子の発現量を測定する工程、
（２’）上記工程（１’）で得られた発現量が、予め設定した対応するカットオフポイントと比較してともに低い場合、前記配合剤を単独で用いた化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測し、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量が高い場合、前記配合剤にさらに他の抗腫瘍剤を併用する化学療法を選択するのに十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
項３．
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤における各有効成分のモル比が、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム＝１：０．４：１である、項１又は２記載の方法。
項４．
他の抗腫瘍剤が、シスプラチンである、項１〜３のいずれか１項記載の方法。
項５．
項１〜４のいずれか１項記載の方法により前記配合剤を単独で用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に投与することを特徴とする、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤からなる抗腫瘍剤。
項６．
項１〜４のいずれか１項記載の方法により前記配合剤にさらに他の抗腫瘍剤を併用する化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に投与することを特徴とする、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤及びシスプラチンからなる抗腫瘍剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の予測方法は、胃癌患者において治療効果と副作用を両方の観点から有効な化学療法の選択を可能にするものである。つまり、胃癌におけるＴＳ−１と他の抗腫瘍剤（特にシスプラチン）の併用療法では副作用を発症する可能性が高く、相対的に延命効果が低い患者に対し、副作用の発症を抑えつつ、強い延命効果を奏するＴＳ−１単独療法を提供することができ、ひいては患者のＱＯＬを顕著に改善するものである。【０００９】
ＴＳ−１単独療法よりもＴＳ−１とシスプラチンの併用療法が効果が高いことは、非特許文献１により公知であったが、本件特許では、ＴＳ低値（特にＴＳ低値かつＴＰ低値）の患者においてＴＳ−１単独療法の方がＴＳ−１とシスプラチンの併用療法よりも有効性或いは有効性と副作用の総合評価においてより優れていることを初めて見出したものである。ＴＳ−１の治療効果がＴＳ低値（特にＴＳ低値かつＴＰ低値）においてより優れていることは非特許文献２に開示されているが、ＴＳ遺伝子／ＴＰ遺伝子の発現量に基づきＴＳ−１単独療法とＴＳ−１／シスプラチン併用療法の有効性の優劣が大きく変化することは、非特許文献２には開示されていない。【００１０】
本発明によれば、ＴＳ−１とシスプラチンの併用療法がより有効である患者と、非特許文献１の開示に反しＴＳ−１単独療法がより有効な患者を明確に区別することができ、不要な化学療法を省くことができるため、医療経済的にも好ましい。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の予測方法は、患者のチミジル酸合成酵素（ＴＳ）遺伝子（特にチミジル酸合成酵素遺伝子及びチミジン加リン酸分解酵素（ＴＰ）遺伝子）の発現に基づき、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた化学療法に、さらに他の抗腫瘍剤（特にシスプラチン）を併用するべきか否か予測するものである。
【００１２】
本発明において「テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独で用いた化学療法」とは、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独投与する化学療法であり、「テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤にさらに他の抗腫瘍剤を併用する化学療法」とは、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤と他の抗腫瘍剤の両方の抗腫瘍剤を併用して投与する化学療法を意味する。ここで「他の抗腫瘍剤」とは、胃癌を治療することができる抗腫瘍剤であれば特に制限されず、例えば、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、オキサリプラチン、イリノテカン、ソラフェニブ、ゲフィチニブ、スニチニブ、ラパチニブ、エベロリムス、ペメトレキセド、トリメトレキサート、トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブなどが例示でき、このうちシスプラチンが好ましい。なお、前記配合剤と他の抗腫瘍剤を併用投与する場合、配合剤と他の抗腫瘍剤は同時に投与してもよく、一定の間隔をあけて投与してもよい。
【００１３】
本発明において、「テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独で用いた化学療法（以下、単独化学療法ということがある）を選択するのに十分な治療効果」とは、併用化学療法と比較して延命効果と副作用の総合評価において単独化学療法がより優れた治療効果を示すことを意味する。このような治療効果を示すか否かは、ＴＳ遺伝子（特にＴＳ遺伝子及びＴＰ遺伝子）の発現量がカットオフポイント以下か否かで判断でき、ＴＳ遺伝子（特にＴＳ遺伝子及びＴＰ遺伝子）の発現量がカットオフポイント以下であれば、単独化学療法を選択するのに十分な治療効果を有すると判断される。
【００１４】
本発明において、「テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤にさらに他の抗腫瘍剤を併用する化学療法（以下、併用化学療法ということがある）を選択するのに十分な治療効果」とは、併用化学療法による副作用の発現を許容できる程度の十分な治療効果（単独化学療法より優れた治療効果）を示すことを意味する。このような治療効果を示すか否かは、ＴＳ遺伝子（特にＴＳ遺伝子又はＴＰ遺伝子）の発現量がカットオフポイント以上か否かで判断でき、ＴＳ遺伝子（特にＴＳ遺伝子又はＴＰ遺伝子）の発現量がカットオフポイント超であれば、併用化学療法を選択するのに十分な治療効果を有すると判断される。
【００１５】
本発明における治療効果は、生存期間と副作用の総合評価により判定する。生存期間は、生存期間の中央値（期間が長いほど治療効果が高い）、１年生存率及び２年生存率（割合が大きいほど治療効果が高い）などにより表すことができる。副作用は、白血球減少、好中球減少、血小板減少、摂食障害、悪心、嘔吐、口内炎、色素沈着、下痢などが挙げられ、これらの発現率が低いほど、治療効果が優れていると判定する。
【００１６】
本発明における有効成分であるテガフール（一般名、化学名：５−フルオロ−１−（２−テトラヒドロフリル）−２，４−（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン）は、公知の化合物であり、生体内で活性化を受けて抗腫瘍活性の本体である５−フルオロウラシルを放出する薬剤である。テガフールは、公知の方法、例えば特公昭４９−１０５１０号に記載されている方法に従って製造できる。
【００１７】
本発明における有効成分であるギメラシル（一般名、化学名：２，４−ジヒドロキシ−５−クロロピリジン）も、公知の化合物であり、それ自身全く抗腫瘍活性を有さないものであるが、５−フルオロウラシルが生体内において代謝されて不活性化されることを抑制するものであり、テガフールの抗腫瘍効果を増強させることができる。
【００１８】
本発明における有効成分であるオテラシルカリウム（一般名、化学名：モノポタシウム  １，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−１，３，５−トリアジン−６−カルボキシレート）も公知の化合物であり、それ自身は抗腫瘍活性を有さないが、主に消化管に分布してその部位での５−フルオロウラシルの活性化を抑制することにより消化管障害を抑制するものである。
【００１９】
本発明における有効成分であるシスプラチン（一般名、化学名：（ＳＰ−４−２）ジアミンジクロロプラチナム）は公知の白金錯体化合物であり、ＤＮＡ合成阻害作用により抗腫瘍効果を奏することが知られている。なお、シスプラチンは公知の方法により製造でき、さらにブリプラチン（登録商標、ブリストル・マイヤーズ社製）等の市販医薬品を用いても良い。
【００２０】
本発明において投与されるテガフール、ギメラシル及びオテラシルカリウムの割合は、それぞれの配合目的を奏する範囲であれば特に制限されず、例えば、特許第２６１４１６４号公報に記載されている公知の配合剤と同様の範囲で良く、テガフール１モルに対して、ギメラシルを０．１〜５モル程度、好ましくは０．２〜１．５モル程度とすればよく、オテラシルカリウムを０．１〜５モル程度、好ましくは０．２〜２モル程度とすればよい。特に好ましくは、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム（モル比）＝１：０．４：１である。
【００２１】
本発明において投与されるシスプラチンの割合は、抗腫瘍効果を奏する範囲であれば特に制限されず、例えば、１日投与量として、テガフール１モルに対して、シスプラチンを０．０１〜５．０モル程度、好ましくは０．１〜２．０モル程度、特に好ましくは０．２〜１．５モル程度とすればよい。
【００２２】
本発明における各有効成分の投与量は、用法、患者の年齢、性別、病期、転移の有無、治療暦、他の抗腫瘍剤の有無などの条件により適宜選択されるが、テガフールの量が０.１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日程度、好ましくは０．２〜４０ｍｇ／ｋｇ／日程度、より好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日程度、ギメラシルの量が、０.０２〜３０ｍｇ／ｋｇ／日程度、好ましくは０．０５〜１２ｍｇ／ｋｇ／日程度、より好ましくは０．１〜６ｍｇ／ｋｇ／日程度、オテラシルカリウムの量が０.１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日程度、好ましくは０．２〜４０ｍｇ／ｋｇ／日程度、より好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日程度、シスプラチンの量が０．０８〜２００ｍｇ／ｋｇ／日程度、好ましくは０．１５〜８０ｍｇ／ｋｇ／日程度、より好ましくは０．４〜４０ｍｇ／ｋｇ／日程度の範囲となる量を目安とするのが良い。また、各有効成分は１日に１回又は複数回に分けて投与される。また、各有効成分は同時又は間隔を空けて投与され、その投与順序は特に制限されない。
【００２３】
本発明において、テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウムは、一の剤型に製剤化した配合剤として提供される。また、本発明において、シスプラチンは、それだけを製剤化した単剤であってもよく、テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウムと併せて一の剤型に製剤化した配合剤であってもよい。好ましくは、単剤である。
【００２４】
本発明の製剤は、各有効成分が併用投与される限り、上記製剤ごとにそれぞれ個別に製造・包装・流通されるものでよく、また上記製剤のすべて又は一部を併用投与に適した単一のパッケージ（キット製剤）として製造・包装・流通されるものでもよい。
【００２５】
本発明における製剤の投与形態としては特に制限は無く、具体的には経口剤（錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤など）、注射剤、坐剤、貼付剤、軟膏剤等が例示できる。本発明の各有効成分を複数の剤型に製剤化する場合は、当該製剤はそれぞれ異なる投与形態であっても同一の投与形態であってもよい。例えば、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、ソラフェニブ、ゲフィチニブ、スニチニブ、ラパチニブ、エベロリムスは経口剤、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、オキサリプラチン、イリノテカン、ペメトレキセド、トリメトレキサート、トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブをそれぞれ含有する製剤は注射剤とすることが好ましい。
【００２６】
本発明の製剤は、薬理学的に許容される担体を用いて、それぞれの投与形態において通常公知の製剤化方法により製造される。かかる担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、無痛化剤、安定化剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を例示できる。
【００２７】
賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、イノシトール、デキストラン、ソルビトール、アルブミン、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００２８】
滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００２９】
結合剤としては、例えば、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００３０】
崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００３１】
希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００３２】
安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００３３】
等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ホウ酸、ブドウ糖、グリセリン及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００３４】
ｐＨ調整剤及び緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００３５】
無痛化剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００３６】
着色剤としては、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。
【００３７】
矯味・矯臭剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
【００３８】
溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。
【００３９】
懸濁化剤としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム等が挙げられる。
【００４０】
本発明における投与スケジュールは、患者の年齢、性別、病期、転移の有無、治療暦などの条件により適宜選択されるが、例えば、本発明の配合剤の単独化学療法は、６週間のうちに、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を２８日間連続投与することを１コースとして１回又は複数回行うことが好ましく、本発明の併用療法は、５週間のうちに、テガフール、ギメラシル及びオテラシルカリウムを２１日間連続投与し、その連続投与の８日目にシスプラチンを投与することを１コースとして１回又は複数回行うことが好ましい。
【００４１】
本発明の予測方法の対象となる患者は、胃癌を有する患者であるが、原発巣が胃癌であり、胃以外の臓器、組織に転移した胃癌を有する患者であっても良い。
【００４２】
本発明の遺伝子発現量の測定において用いることができる生体試料としては、癌細胞を含む可能性がある試料であれば特に限定されず、体液（血液、尿等）、組織、その抽出物及び採取した組織の培養物などが例示できる。組織としては、特に胃が挙げられるが、胃から他の臓器や腹膜などに転移した場合には、転移した部位が対象の組織となる。また、生体試料の採取方法は、生体試料の種類や癌種に応じた方法により適宜選択することができる。生体試料からのＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質の調製は、通常公知の方法により行うことができる。
【００４３】
チミジル酸合成酵素は、ｄＵＭＰから葉酸を補酵素としてｄＴＭＰを合成する活性を有する酵素であり、ＤＮＡ合成時に必要な酵素として知られている。また、５−フルオロウラシルの標的酵素としても知られている。なお、ヒトのチミジル酸合成酵素の遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列は公知である（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：２０３５−２０４３（１９８５））。
【００４４】
本発明のチミジン加リン酸分解酵素は、チミジンをチミンとデオキシリボース−１−リン酸に可逆的に変換する酵素であり、こちらの酵素もＤＮＡ合成に関与していることが知られている。なお、ヒトのチミジン加リン酸分解酵素の遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列は公知である（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．１１（４），２１２５−２１３２（１９９１））。
【００４５】
本発明の予測方法は、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量、必要に応じてさらにチミジン加リン酸分解酵素遺伝子の発現量を指標とする。ここで遺伝子発現量は、ｍＲＮＡとタンパク質（酵素）のいずれかの発現量を意味する。ｍＲＮＡの発現量は、チミジル酸合成酵素遺伝子又はチミジン加リン酸分解酵素遺伝子と特異的にハイブリダイズするプローブ又はプライマーを用いて、ノーザンブロット法、定量的又は半定量的ＰＣＲ法（例えばＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダーゼーション法など公知の遺伝子発現量の測定法に従い測定することができる。前記発現量は、常に一定範囲の量を発現しているタンパク質／遺伝子（例えばβアクチンなどのハウスキーピング遺伝子又はその発現タンパク質）を基準として、比により測定ないし評価することができる。
【００４６】
また、タンパク質発現量は、チミジル酸合成酵素又はチミジン加リン酸分解酵素を特異的に認識する抗体を用いて、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法、蛍光免疫測定法、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタン・ブロッティング法、免疫組織化学染色法など公知の免疫学的測定法を行うことにより測定することができる。
【００４７】
ノーザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダーゼーション法などの遺伝子発現量の測定法に用いられるプローブは、チミジル酸合成酵素遺伝子又はチミジン加リン酸分解酵素遺伝子の塩基配列内の少なくとも１５塩基長〜全塩基長、好ましくは２０塩基長〜全塩基長、より好ましくは３０塩基長〜全塩基長の連続した塩基配列と特異的にハイブリダイズするように、通常公知のプローブ設計方法に従い上記各塩基長を有するポリヌクレオチドとして設計される。ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法などの定量的又は半定量的ＰＣＲ法に用いられるプライマー、プローブは、チミジル酸合成酵素遺伝子又はチミジン加リン酸分解酵素遺伝子の塩基配列内の少なくとも１０塩基長〜全塩基長、好ましくは１０〜１００塩基長、より好ましくは１０〜５０塩基長、さらに好ましくは１０〜３５塩基長の連続した塩基配列と特異的にハイブリダイズするように、通常公知のプライマーおよびプローブ設計方法に従い上記各塩基長を有するポリヌクレオチドとして設計される。
【００４８】
例えば、ＴＳ遺伝子またはＴＰ遺伝子の発現産物検出用のプライマー、すなわちＰＣＲのフォワードプライマー及びリバースプライマーは、ＴＳ遺伝子またはＴＰ遺伝子のうちエキソン領域から設計及び合成することができる。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、ＴＳ遺伝子またはＴＰ遺伝子の各エキソン領域のうち、一方を上流側のエキソン領域の塩基配列に基づき設計し（フォワードプライマー）、他方をその下流側のエキソン領域の塩基配列に基づき設計する（リバースプライマー）。例えば、ＴＳ遺伝子またはＴＰ遺伝子のプライマーをエキソン１〜３に基づき設計する際において、フォワードプライマーをエキソン１領域の配列に基づいて設計する場合は、リバースプライマーは、その下流側のエキソン２又はエキソン３領域の配列に基づいて設計する。リバースプライマーは、ＴＳまたはＴＰのｍＲＮＡの配列に相補的となるように設計する。また、このプライマーとしては、各エキソン領域を含むＴＳまたはＴＰのｍＲＮＡの塩基配列の全て及びその一部の配列を用いることができるが、それぞれのエキソン領域からＰＣＲによる増幅効率を考慮してプライマーを設計するのが望ましい。
【００４９】
ＴＳ遺伝子またはＴＰ遺伝子の発現産物検出用プローブとしては、上記プライマーを使用してＰＣＲ反応により、増幅されるＴＳ遺伝子またはＴＰ遺伝子の各一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズ可能なものであれば特に制限されない。ＴＳ遺伝子またはＴＰ遺伝子の全エキソンの塩基配列あるいはその一部と相補的な配列を有するかあるいはストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なものであればよい。
【００５０】
なお、当該プローブは、チミジル酸合成酵素遺伝子又はチミジン加リン酸分解酵素遺伝子と特異的にハイブリダイズするものであれば、完全に相補的である必要はない。かかるポリヌクレオチドとして、好ましくはチミジル酸合成酵素遺伝子又はチミジン加リン酸分解酵素遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補ポリヌクレオチドと比較して、塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチドである。
【００５１】
なお、本発明において「特異的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されないことをいう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、通常公知の方法に従ってハイブリッドを形成する核酸の融解温度（Ｔｍ）などに基づいて決定することができる。具体的なハイブリダイズ状態を維持できる洗浄条件として通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件、より厳格には「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度の条件、さらに厳格には「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件が挙げられる。
【００５２】
また、ヒトにおけるチミジル酸合成酵素遺伝子又はチミジン加リン酸分解酵素遺伝子の塩基配列が公知であるため、当該プローブ又はプライマーは、その塩基配列に基づいて、通常公知の合成方法、例えば市販のヌクレオチド合成機によって作製することができる。また、その塩基配列を鋳型としてＰＣＲ法によって調製することもできる。
【００５３】
また、当該プローブ又はプライマーは、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現産物（ｍＲＮＡ）を容易に検出できるように、通常慣用されている放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、または酵素で標識されていてもよい。
【００５４】
本発明の抗体は、チミジル酸合成酵素又はチミジン加リン酸分解酵素を特異的に認識するものであれば特に制限されず、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよく、Ｆａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片などの抗体断片であってもよい。また、当該抗体は、通常公知の方法に従って製造することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７），  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．１２−１１．１３）。例えば、ポリクローナル抗体の場合は、通常公知の方法に従って大腸菌で発現し精製したチミジル酸合成酵素又はチミジン加リン酸分解酵素又はその部分ポリペプチドを用いて、あるいは通常公知の方法に従って合成したチミジル酸合成酵素又はチミジン加リン酸分解酵素又はその部分ポリペプチドを用いて、実験動物に免疫し、該免疫動物の血清から通常公知の方法に従って得ることが可能である。一方、例えばモノクローナル抗体の場合は、通常公知の方法に従って大腸菌等で発現し精製したチミジル酸合成酵素又はチミジン加リン酸分解酵素又はその部分ポリペプチドを用いて、あるいは通常公知の方法に従って合成したチミジル酸合成酵素又はチミジン加リン酸分解酵素又はその部分ポリペプチドを用いて、実験動物に免疫し、該実験動物から得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマ細胞を合成し、該細胞中から得ることができる。
【００５５】
テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いる化学療法に、さらに他の抗腫瘍剤(例えばシスプラチン)を併用するべきか否かを予測する工程において、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量が、予め設定したカットオフポイントと比較して、低い場合、当該テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独で用いた化学療法が、延命効果と副作用の総合評価においてより優れた（即ち、単独化学療法を選択するのに十分な）治療効果を示す可能性が高いと予測し、高い場合、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤にさらに他の抗腫瘍剤(例えばシスプラチン)を併用する化学療法が当該配合剤単独の場合よりも延命効果と副作用の総合評価においてより優れた（即ち、併用療法を選択するのに十分な）治療効果を示す可能性が高いと予測する。また、後述する実施例のとおり、チミジル酸合成酵素遺伝子単独であっても延命効果と副作用の総合評価においてより優れた治療効果を示す治療法を予測できるが、チミジル酸合成酵素遺伝子及びチミジン加リン酸分解酵素遺伝子の両方の遺伝子を指標とすることがより好ましい。したがって、チミジル酸合成酵素遺伝子及びチミジン加リン酸分解酵素遺伝子の発現量が、予め設定した対応するカットオフポイントと比較して、ともに低い場合、当該テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を単独で用いた化学療法が、延命効果と副作用の総合評価においてより優れた（即ち、単独化学療法を選択するのに十分な）治療効果を示す可能性が高いと予測し、チミジル酸合成酵素遺伝子の発現量が高い場合、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤にさらにシスプラチンを併用する化学療法が当該配合剤単独の場合よりも延命効果と副作用の総合評価においてより優れた（即ち、併用療法を選択するのに十分な）治療効果を示す可能性が高いと予測する。
【００５６】
ここでカットオフポイントは、予め測定しておいたチミジル酸合成酵素遺伝子及びチミジン加リン酸分解酵素遺伝子の発現量から種々の統計解析手法により求めることができる。例えば、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた化学療法を受けた患者におけるチミジル酸合成酵素遺伝子及びチミジン加リン酸分解酵素遺伝子の発現量の平均値や中央値；テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた化学療法を受けた患者におけるチミジル酸合成酵素遺伝子及びチミジン加リン酸分解酵素遺伝子の発現量と、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた化学療法に対し一定以上の治療効果（延命効果）の有無との関係から感度と特異度の和が最大となるようＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）分析に基づき求められる値；テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた化学療法を受けた患者におけるチミジル酸合成酵素遺伝子及びチミジン加リン酸分解酵素遺伝子の発現量を用いて、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤を用いた化学療法に対する治療効果（延命効果）との関係から、カイ二乗検定に基づき求められる値（このうちログランク検定でＰ値が最小となる値、Ｐ値がある水準以下になる値（例えば、Ｐ値が０．１以下になる値、Ｐ値が０．０５以下になる値）など）が例示できる。
【００５７】
また、チミジル酸合成酵素、チミジン加リン酸分解酵素を含む多数の因子と治療効果の関係を求める場合、多変量解析で独立した治療効果の予測因子であると認識された場合には、その因子に基づき治療効果を予測することができる。本発明で用いる、ＴＳ遺伝子，ＴＰ遺伝子の発現量は、ＯＰＲＴ（orotate phosphoribosyltransferase）, ＤＰＤ(dihydropyrimidine dehydrogenase), ＵＰ(uridine phosphorylase)、ＶＥＧＦ(Vascular endothelial growth factor)，ＥＧＦＲ（epidermal growth factor receptor）などのＴＳ−１の活性に関与していると考えられている他の因子（非特許文献１）に対し、多変量解析により独立した治療効果の予測因子であることが本発明者により確認されている。
【００５８】
なお、具体的なカットオフポイントとしては、遺伝子発現量のベータアクチン遺伝子の発現量に対する比を用いた場合は、チミジル酸合成酵素遺伝子においては、４．４６×１０−３〜４．５８×１０−３が好ましく、４．４６×１０−３が特に好ましい。チミジン加リン酸分解酵素遺伝子においては、５．９０×１０−３〜１０．３２×１０−３が好ましく、７．０２×１０−３が特に好ましい。
【００５９】
本発明におけるカットオフポイントは、測定対象や測定方法の種類などの諸条件により変動するものであるため、条件に合わせて予め設定する必要がある。カットオフポイントは、測定対象（患者の数、年齢、性別、体重、健康状態、疾患の状態）や測定方法（遺伝子とタンパク質のいずれの発現産物を測定対象とするか、測定条件（例えば遺伝子発現産物（ｍＲＮＡ）の測定におけるプライマー、プローブの配列、標識の種類、発現産物がタンパク質の場合の抗体の種類及び感度など）、統計的手法などにより変動するため、本発明は、これらの諸条件により変動し得る任意のカットオフポイントを用いた発明を広く包含し、特定の値に限定されない。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
【実施例１】
【００６１】
未治療の切除不能または再発胃癌患者を対象としたＴＳ−１単独療法とＴＳ−１／シスプラチン併用療法の第III相試験においてバイオマーカー研究（チミジル酸合成酵素、チミジン加リン酸分解酵素の遺伝子発現量の測定）を実施した。【００６２】
ＴＳ−１単独療法は体表面積に従い、テガフール換算量で８０〜１２０ｍｇ／日のＴＳ−１を１日２回２８日間連日内服した後１４日間休薬し、ＴＳ−１／シスプラチン併用療法は、同量のＴＳ−１を１日２回２１日間連日内服しつつ８日目にシスプラチン６０ｍｇ／ｍ２を静脈内投与し、１４日間休薬した。【００６３】
ＴＳ−１の初回基準量（１回量）は体表面積に合わせて次の基準値（表１）とし、朝食後及び夕食後の１日２回に経口投与した。【００６４】
【表１】
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＊ＢＳＡ（ｍ２）＝（〔体重（ｋｇ）〕０．４２５×〔身長〕０．７２５）×０．００７１８４【００６５】
生存期間はランダム化の日を起算日とし、死亡日までの期間とした。解析時点で死亡の確認が取れない、または生存している患者に関しては、最新の観察日をもって打ち切りとした。【００６６】
遺伝子発現量は、薬剤の投与以前に得られたバイオプシー検体の腫瘍組織のホルマリン固定パラフィン包埋切片からＬＣＭ（ｌａｓｅｒ  ｃａｐｔｕｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）によって癌細胞を採取し、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ法によりベータアクチンに対する比として定量した。なお、以下の配列番号１〜９で示すプライマー及びプローブを用いた(表２)。【００６７】
【表２】
2010074240.tif 000003
【００６８】
カットオフポイントは、ＴＳ−１単独療法群の生存期間データを用いて、カイ二乗検定に基づき求め、ログランク検定でＰ値が最小となる値として算出し、その値を用いて高発現群と低発現群の２群に分けて生存期間解析を実施した。結果を表３及び表４に示す。なお、ログランク検定でＰ値が０．１以下になる値としては、チミジル酸合成酵素遺伝子においては、４．４６×１０−３〜４．５８×１０−３、チミジン加リン酸分解酵素遺伝子においては、５．９０×１０−３〜１０．３２×１０−３であった。【００６９】
【表３】
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【００７０】
【表４】
2010074240.tif 000005
【００７１】
その結果、腫瘍組織中チミジル酸合成酵素（ＴＳ）の遺伝子発現量の低い患者では、ＴＳ−１単独療法とＴＳ−１／シスプラチン併用療法はほぼ同等の治療効果であった。後述のとおり、ＴＳ−１単独療法は副作用の面で優れており、当該患者にはＴＳ−１単独療法が適していることが示された。【００７２】
一方、チミジル酸合成酵素（ＴＳ）遺伝子発現量の高い群では、ＴＳ−１／シスプラチン併用療法の方が、ＴＳ−１単独療法と比較してほぼ倍の生存期間の中央値を得ることができた（６．７ヶ月延長）。特に２年生存率では、ＴＳ−１単独療法が０％であるのに対し、ＴＳ−１／シスプラチン併用療法では３０％と驚異的な生存率を示した。このように当該患者にはＴＳ−１／シスプラチン併用療法が適していることが示された。【００７３】
さらに、チミジル酸合成酵素（ＴＳ）遺伝子発現量とチミジン加リン酸分解酵素（ＴＰ）遺伝子発現量がともに低い患者では、ＴＳ−１単独療法の方が、約２倍の生存期間の中央値を示すことから（８．８ヶ月延長）、当該患者にはＴＳ−１単独療法が適していることが示された。一方、チミジル酸合成酵素（ＴＳ）遺伝子発現量とチミジン加リン酸分解酵素（ＴＰ）遺伝子発現量のいずれかが高い群では、ＴＳ−１／シスプラチン併用療法の方が、約１．７倍の生存期間の中央値を示すことから（５．２ヶ月延長）、当該患者にはＴＳ−１／シスプラチン併用療法が適していることが示された。【００７４】
また、ＴＳ−１単独療法群とＴＳ−１／シスプラチン併用療法群における副作用を比較したところ、ＴＳ−１単独療法群において副作用が少ないことを確認した（表５）。【００７５】
【表５】
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【００７６】
以上のように、チミジル酸合成酵素及び／又はチミジン加リン酸分解酵素を指標として胃癌患者を選択することにより、ＴＳ−１単独療法でも標準療法（例えば、ＴＳ−１／シスプラチン併用療法等）に勝るとも劣らない飛躍的な治療効果が期待できることが明らかになった。また、言い換えれば、併用療法を必要とせず、ＴＳ−１単独療法でも十分な治療効果が期待できる患者を選択できるということであり、これは患者にとって医療経済的にも意義が大きい。
【配列表】
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【国際調査報告】
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