(57)【要約】  従来の無細胞タンパク質合成系において合成困難であったタンパク質についても合成することができ、且つ、タンパク質の合成量を向上させる。  特定の化合物、例えばトリメチルグリシン、L-カルニチン及びサルコシン等の化合物を含む無細胞タンパク質合成溶液において、無細胞タンパク質合成を行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式(I)〜(V)で示される化合物のうち１以上の化合物を含む無細胞タンパク質合成溶液。
【化１】
2010147111.tif 000012
【請求項２】
上記化合物は、カルニチン、サルコシン及びトリメチルグリシンからなる群から選ばれる１以上の化合物であることを特徴とする請求項１記載の無細胞タンパク質合成溶液。
【請求項３】
タンパク質合成能を有する無細胞タンパク質合成溶液と、
下記構造式(I)〜(V)で示される化合物のうち１以上の化合物とを含む無細胞タンパク質合成キット。
【化２】
2010147111.tif 000013
【請求項４】
上記化合物は、上記無細胞タンパク質合成溶液に混合されていることを特徴とする請求項３記載の無細胞タンパク質合成キット。
【請求項５】
上記化合物は、カルニチン、サルコシン及びトリメチルグリシンからなる群から選ばれる１以上の化合物であることを特徴とする請求項３記載の無細胞タンパク質合成キット。
【請求項６】
合成対象のタンパク質をコードする遺伝子を導入することができる発現ベクターをさらに含むことを特徴とする請求項３記載の無細胞タンパク質合成キット。
【請求項７】
下記構造式(I)〜(V)で示される化合物のうち１以上の化合物を含み、タンパク質合成能を有する無細胞タンパク質合成溶液中でタンパク質合成を行う、タンパク質の合成方法。
【化３】
2010147111.tif 000014
【請求項８】
上記化合物は、カルニチン、サルコシン及びトリメチルグリシンからなる群から選ばれる１以上の化合物であることを特徴とする請求項７記載のタンパク質合成方法。
【請求項９】
下記構造式(I)〜(V)で示される化合物のうち１以上の化合物を無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質合成の促進剤として使用する方法。
【化４】
2010147111.tif 000015
【請求項１０】
上記化合物は、カルニチン、サルコシン及びトリメチルグリシンからなる群から選ばれる１以上の化合物であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、in vitroタンパク質合成系とも称される無細胞タンパク質合成溶液、無細胞タンパク質合成キット及び所望のタンパク質を無細胞系（in vitro）で合成するタンパク質合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質を合成する技術の一つとして無細胞タンパク質合成系（in vitroタンパク質合成系）が知られている。一方、生細胞に所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入し、細胞内或いは培養液中に合成されたタンパク質を分離精製するタンパク質合成系も知られている。ところが、後者のタンパク質合成系においては、使用する細胞の生育を阻害するタンパク質等の合成ができないといった問題がある。これに対して、無細胞タンパク質合成系では、生細胞に対して毒性を有するようなタンパク質であっても合成することができるといった利点がある。【０００３】
しかしながら、無細胞タンパク質合成系においても、合成することが困難なタンパク質、十分な合成量が得られないタンパク質があることが知られている。特許文献１には、無細胞タンパク質合成反応を促進するためにエネルギー源を維持する方法が考案されているが、合成困難なタンパク質については必ずしも奏功するとは限らない。合成困難なタンパク質を合成するための方法として特許文献２には、DNA（mRNA）配列を変更する技術が開示されるが、タンパク質ごとに設計が必要となり汎用性の面では限界がある。また特許文献３には、反応系に鋳型DNA量を多く含ませることで、タンパク質の合成量を増やす技術が開示されているが、合成困難なタンパク質について合成を可能とする技術ではなく、また、タンパク質の合成量の向上効果も低いと言える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平05-076381号公報
【特許文献２】特表2006-508672号公報
【特許文献３】特開平11-056363号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上のように、無細胞タンパク質合成系において、十分なタンパク質合成量を達成できるような技術は知られていなかった。そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、従来の無細胞タンパク質合成系において合成量が低いタンパク質について、その合成量を向上させることができる無細胞タンパク質合成溶液、無細胞タンパク質合成キット及びタンパク質合成方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、タンパク質の合成量を顕著に向上させることができる化合物群を見いだし、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明に係る無細胞タンパク質合成溶液は、下記構造式(I)〜(V)で示される化合物のうち１以上の化合物を含むものである。本発明に係る無細胞タンパク質合成溶液は、当該化合物を含む以外は従来公知の無細胞タンパク質合成溶液と同様の構成とすることができる。なお、本明細書において、本発明に係る無細胞タンパク質合成溶液という場合、下記構造式(I)〜(V)で示される化合物のうち１以上の化合物を含む組成であり、従来、無細胞タンパク質合成系と称される如何なる溶液とも区別される。【０００８】
一方、本発明に係る無細胞タンパク質合成キットは、タンパク質合成能を有する無細胞タンパク質合成溶液と、下記構造式(I)〜(V)で示される化合物のうち１以上の化合物とを含んでいる。
【化１】
2010147111.tif 000002
【０００９】
本発明に係る無細胞タンパク質合成キットにおいて、上記化合物は、無細胞タンパク質合成溶液に予め混合されていてもよい。また、本発明に係る無細胞タンパク質合成キットは、上記化合物を含む溶液と、無細胞タンパク質合成溶液とそれぞれ独立した溶液として含んでいてもよい。【００１０】
本発明に係る無細胞タンパク質合成溶液及び無細胞タンパク質合成キットにおいて、上記化合物としては、カルニチン、サルコシン及びトリメチルグリシンからなる群から選ばれる１以上の化合物を挙げることができる。【００１１】
また、本発明に係る無細胞タンパク質合成キットは、合成対象のタンパク質をコードする遺伝子を導入することができる発現ベクターをさらに含むものであってもよい。【００１２】
一方、本発明に係るタンパク質の合成方法は、上記構造式(I)〜(V)で示される化合物のうち１以上の化合物を含み、タンパク質合成能を有する無細胞タンパク質合成溶液中でタンパク質合成を行うものである。【００１３】
また、本発明に係る無細胞タンパク質合成溶液は、上記構造式(I)〜(V)で示される化合物のうち１以上の化合物を含んでいる。【００１４】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-142368号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、従来の無細胞タンパク質合成系において合成困難であったタンパク質でも合成することができ、且つ、タンパク質の合成量も向上させることができる無細胞タンパク質合成溶液、無細胞タンパク質合成キット及びタンパク質合成方法を提供することができる。本発明にかかる無細胞タンパク質合成溶液、無細胞タンパク質合成キット及びタンパク質合成方法によれば、煩雑な操作を必要とせず、あらゆる種類のタンパク質を大量に合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】G.zeae由来FDH(GzFDH)/pET23b(+)の構築の工程を示す模式図である。
【図２】市販の無細胞タンパク質合成反応液において、ベタイン（トリメチルグリシン）の存在若しくは非存在下でFDH合成を行い、その後FDH活性を測定した結果を示す特性図である。
【図３】大腸菌由来S30画分を用いた無細胞タンパク質合成反応液において、異なる濃度のベタイン（トリメチルグリシン）の存在若しくは非存在下で鋳型cDNAからFDH合成を行い、その後FDH活性を測定した結果（下段）及びウェスタンブロットの結果（上段）を示す特性図である。
【図４】図３に示したウェスタンブロットの結果を用いてFDH合成量を定量した結果を示す特性図である。
【図５】大腸菌由来S30画分を用いた無細胞タンパク質合成キットにおいて、異なる濃度のベタイン（トリメチルグリシン）の存在若しくは非存在下で鋳型mRNAからFDH合成を行い、その後FDH活性を測定した結果（上段）及びウェスタンブロットの結果（下段）を示す特性図である。
【図６】図５に示したウェスタンブロットの結果を用いてFDH合成量を定量した結果を示す特性図である。
【図７】トリメチルグリシン、L-カルニチン、サルコシン及びコリンについてタンパク質合成促進能を比較した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
構造式(I)〜(V)で示される化合物
本発明に係る無細胞タンパク質合成溶液は、下記構造式(I)〜(V)で示される化合物のうち１以上の化合物を含んでいる。また、本発明に係る無細胞タンパク質合成キットは、タンパク質合成能を有する無細胞タンパク質合成溶液と、下記構造式(I)〜(V)で示される化合物のうち１以上の化合物とを含んでいる。
【化２】
2010147111.tif 000003
【００１９】
ここで、上記構造式(I)〜(V)においてR1〜R3は炭素数１〜４、好ましくは１〜２、より好ましくは１のアルキル基である。特にR1〜R3のうち少なくとも１つがメチル基であることがより好ましい。また、上記構造式(III)及び(V)においてR4はアミノ酸の側鎖（水素を除く）である。R4としては、特に、グリシンの側鎖、セリンの側鎖、スレオニンの側鎖、アスパラギンの側鎖及びグルタミンの側鎖であることが好ましい。その理由は、これらアミノ酸の側鎖は中性且つ親水性であるからである。
【００２０】
また、上記構造式(I)及び(IV)におけるｎ並びに上記構造式(II)におけるn1とn2の和は１〜４、好ましくは１〜２、より好ましくは１である。ｎの値及びn1とn2の和が上記範囲を上回ると無細胞タンパク質合成溶液中へ溶解しがたくなり好ましくない。
【００２１】
上記構造式(I)〜(V)で示される化合物は、合成対象のタンパク質をコードするmRNA若しくはcDNAを含む無細胞タンパク質合成溶液に存在することで、従来方法では合成困難であったタンパク質の合成を可能とし、且つ、タンパク質の合成量を向上させるといった効果を奏する。
【００２２】
ここで、上記構造式(I)に示される化合物としては、トリメチルグリシン等を挙げることができる。なかでも、上記構造式(I)で示される化合物としてはトリメチルグリシンを使用することが好ましい。
【００２３】
上記構造式(II)に示される化合物としては、L-カルニチン等を挙げることができる。なかでも、上記構造式(II)で示される化合物としてはL-カルニチンを使用することが好ましい。
【００２４】
上記構造式(III)に示される化合物としては、トリメチルセリン、トリメチルアスパラギン、トリメチルスレオニン及びトリメチルグルタミン等を挙げることができる。
【００２５】
上記構造式(IV)に示される化合物としては、サルコシン等を挙げることができる。なかでも、上記構造式(IV)で示される化合物としてはサルコシンを使用することが好ましい。
【００２６】
また、上述した構造式(I)〜(V)に示す化合物は、単独で使用されても良いし、複数種類を混合して使用しても良い。特に、上述した構造式(I)〜(V)に示す化合物としては、L-カルニチンを使用することが好ましい。L-カルニチンを使用した場合には、タンパク質の合成量を特に顕著に向上させることができる。
【００２７】
なお、上述した構造式(I)〜(V)に示す化合物に含まれるトリメチルグリシンは、US 5,545,539に示されるように、GCリッチの領域をPCR（DNAポリメラーゼ反応）によって増幅する際に反応系に添加されると、アニールや伸長反応における問題を解決して不正確な増幅を防止することが知られている。しかしながら、上述した構造式(I)〜(V)に示す化合物は、DNAポリメラーゼ反応とは無関係である無細胞タンパク質合成系においてタンパク質合成に貢献することができる。特に、合成対象のタンパク質をコードするmRNAをタンパク質合成溶液に添加してタンパク質合成を行う場合（すなわち、転写反応を行わない系）であっても、合成困難であったタンパク質の合成を可能とし、且つ、タンパク質の合成量を向上させるといった効果を奏する。
【００２８】
また、後述する無細胞タンパク質合成溶液における、構造式(I)〜(V)に示す化合物の濃度は、特に限定されないが、例えば10〜3000mMとすることができ、100〜2000mMとすることが好ましく、200〜1000mMとすることがより好ましい。構造式(I)〜(V)に示す化合物の濃度が上記範囲を下回る場合には、合成困難であったタンパク質の合成が困難となるか、又は、タンパク質の合成量を向上できない虞がある。また、構造式(I)〜(V)に示す化合物の濃度が上記範囲を上回る場合には、タンパク質合成に関与する酵素群への阻害作用による反応性の低下や溶液粘度の上昇による作業性の低下といった不都合が生じる虞がある。
【００２９】
無細胞タンパク質合成溶液
無細胞タンパク質合成溶液とは、合成目的のタンパク質をコードする遺伝子のmRNAやDNAを加えることで、当該タンパク質を合成することができる溶液を意味する。本発明において、無細胞タンパク質合成溶液としては、特に限定されず、従来、無細胞タンパク質合成系と称される如何なる溶液でも使用することができる。一般に、無細胞タンパク質合成系は、植物、細菌、動物細胞若しくは昆虫細胞等の抽出液に、核酸、アミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液及びその他の添加剤を加えた溶液が使用されている。特に抽出液としては、植物組織若しくは植物細胞、細菌、動物細胞若しくは昆虫細胞等の抽出液であって、リボソーム等のタンパク質合成機構を含む抽出液である。換言すれば、無細胞タンパク質合成溶液とは、合成目的のタンパク質をコードする遺伝子のmRNA若しくはDNAを添加することで、当該タンパク質を合成できる抽出液を含む意味である。
【００３０】
無細胞タンパク質合成溶液は、従来公知の手法によって調製したものを使用しても良いし、市販の無細胞タンパク質合成キットに含まれる無細胞タンパク質合成溶液を使用しても良い。
【００３１】
無細胞タンパク質合成溶液を作製する際には、例えば、先ず上記抽出液を準備する。抽出液を得るには、大腸菌、植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球、昆虫由来細胞等に代表される細胞を単離し、これを公知の手法によって破砕する。その後、遠心分離等の手法によって不溶物質を除去する。そして、必要に応じて内在性のDNA及びRNAを公知の手法によって分解し、透析等の手法によって内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシド等を除去したり、pHや塩濃度を調整したりする。得られた抽出液は、リボソームを含むタンパク質合成能を保持している。なお、大腸菌を使用した場合、得られた抽出液はS30抽出物と称される場合もある。
【００３２】
なお、具体的には大腸菌の抽出液は、Pratt, J. M. et al., Transcription and Translation, Hames, 179-209, B. D. & Higgins, S. J., eds, IRL Press, Oxford (1984)に記載の方法等に準じて調製することもできる。コムギ胚芽抽出液の作製法としては、例えばJohnston, F. B. et al., Nature, 179, 160-161 (1957)、あるいはErickson, A. H. et al., (1996) Meth. In Enzymol., 96, 38-50等に記載の方法を用いることができる。なお、細胞からの抽出液の作製方法は、上述した手法に限定されず、如何なる手法を適用しても良い。
【００３３】
上述のように抽出液を準備した後、タンパク質合成に必要な成分を添加することで無細胞タンパク質合成溶液を調製することができる。なお、タンパク質合成に必要な成分は、上記抽出液と別に保存しておき、使用の際に混合しても良い。タンパク質合成に必要な成分としては、特に限定されないが、Tris-酢酸、DTT、NTPs（ATP、CTP、GTP及びUTP）、RNAポリメラーゼ、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、少なくとも一種のアミノ酸（天然の２０種類のアミノ酸の外それらの誘導体を含む）、ポリエチレングリコール（PEG）、葉酸、cAMP、tRNA、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、グルタミン酸カリウム及び至適濃度の酢酸マグネシウム等を挙げることができる。なお、別途準備したmRNAからタンパク質の合成を行う場合、mRNAの原料となるNTPs（ATP、CTP、GTP及びUTP）やRNAポリメラーゼは必要ないことに留意する。なお、タンパク質合成に必要な成分としては、上記で列挙した成分以外にも防腐剤やその他の成分が含まれていても良い。
【００３４】
一方、市販の無細胞タンパク質合成キットに含まれる無細胞タンパク質合成溶液を使用することもできる。市販の無細胞タンパク質合成キットとしては、例えばPromega社製のTNT T7 Insect Cell Extract Protein Expression System、TNT Coupled Reticulocyte Lysate Systems、TnT Coupled Wheat Germ Extract Systems、E. coli T7 S30 Extract System for Circular DNA、E. coli S30 Extract System for Circular DNA、E. coli S30 Extract Sysytem for Linear Templates等を挙げることができる。また、市販の無細胞タンパク質合成溶液としては、例えばRoche社製のRTS 500 Rapid Translation System等を挙げることができる。
【００３５】
無細胞タンパク質合成溶液、キット及びタンパク質合成方法
本発明に係る無細胞タンパク質合成溶液は、上述した構造式(I)〜(V)に示す化合物のうち１以上の化合物を含む以外は、上述した無細胞タンパク質合成溶液と同様な組成とすることができる。本発明に係る無細胞タンパク質合成溶液は、上述した構造式(I)〜(V)に示す化合物のうち１以上の化合物を含むことで、上述した従来公知の無細胞タンパク質合成溶液において合成困難であったタンパク質を合成することができる。
【００３６】
また、本発明に係る無細胞タンパク質合成キットは、上述した無細胞タンパク質合成溶液と上述した構造式(I)〜(V)に示す化合物のうち１以上の化合物とを含んでいる。無細胞タンパク質合成キットにおいて、当該化合物は、上述した従来、無細胞タンパク質合成系と称される溶液（無細胞タンパク質合成溶液）に予め添加された状態（上述した本発明に係る無細胞タンパク質合成溶液と同義）であっても良いし、使用する際に当該化合物を無細胞タンパク質合成溶液に添加するように別途準備されていても良い。すなわち、本発明に係る無細胞タンパク質合成キットとは、上述した構造式(I)〜(V)に示す化合物を含む１以上の溶液から構成され、物品として提供されるものを意味する。
【００３７】
また、無細胞タンパク質合成キットにおいて、上述した無細胞タンパク質合成溶液は、上述した抽出液と、上述したタンパク質合成に必要な成分とを予め混合した溶液としても良い。若しくは、上述したタンパク質合成に必要な成分は、使用する際に上述した抽出液と混合するように別途準備されていても良い。すなわち、本発明に係る無細胞タンパク質合成キットには、上述した抽出液と、上述したタンパク質合成に必要な成分と、上述した構造式(I)〜(V)に示す化合物のうち１以上の化合物とが別途独立して提供される形態も含まれる。
【００３８】
合成目的のタンパク質としては、なんら限定されず、いかなるタンパク質であっても良い。特に、従来の無細胞タンパク質合成系において合成困難であったタンパク質を合成対象とすることが好ましい。例えば、ステムループ等の二次構造を形成するために、従来の無細胞タンパク質合成系では合成できなかったタンパク質を合成対象とすることができる。
【００３９】
本発明に係る無細胞タンパク質合成キットは、合成目的のタンパク質をコードする遺伝子をDNAとして添加するものであっても良いし、当該遺伝子をmRNAとして添加するものであっても良い。
【００４０】
当該遺伝子をDNAとして添加する場合には、無細胞タンパク質合成溶液は翻訳能のみならず転写能、すなわち当該DNAからmRNAを合成するための機構を保持している必要がある。一方、当該遺伝子をmRNAとして添加する場合には、転写能は必要ではなく翻訳能を有していれば良い。
【００４１】
なお、本発明に係る無細胞タンパク質合成キットは、合成目的のタンパク質をコードするDNAを組み込むための発現ベクターを備えるものであっても良い。発現ベクターとしては、無細胞タンパク質合成溶液が由来する細胞において機能するものが好ましい。すなわち、大腸菌から無細胞タンパク質合成溶液を調製した場合、大腸菌において機能することが知られているあらゆる発現ベクターを使用することができる。植物、動物細胞又は昆虫細胞を使用した場合も同様である。
【００４２】
本発明に係る無細胞系タンパク質合成キットを使用して目的タンパク質を合成する際には、上述した構造式(I)〜(V)に示す化合物のうち１以上の化合物と無細胞タンパク質合成溶液と当該タンパク質をコードするDNA及び/又はmRNAと混合した後、特に限定されないが、通常、１０〜４０℃程度、好ましくは３０℃〜３７℃程度の温度下でインキュベートする。インキュベートによる合成時間は、特に限定されないが、通常、３０分〜２４時間程度とする。なお、攪拌や振とうしながらインキュベートしてもよい。
【００４３】
本発明に係る無細胞タンパク質合成キットによれば、従来の無細胞タンパク質合成系において合成することができなかったタンパク質を合成することが可能となり、また、従来の無細胞タンパク質合成系を使用した場合と比較して大量のタンパク質を合成することができる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。【００４５】
〔実施例１〕
本実施例では、ジベレラ菌（Gibberella zeae）由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させる際に、所定の化合物によるタンパク質合成促進効果を検討した。【００４６】
（１）試薬
試薬は、特に記載の無い場合ナカライテスク社製を使用した。【００４７】
・リン酸カリウム緩衝液（KPB） pH7.5
＜SolutionA＞0.5M  KH2PO4  13.6g/200ml
＜SolutionB＞0.5M  K2HPO4  26.13g/300ml
0.5M KPB pH7.5は16mlのSolutionAと84mlのSolutionBを混合した。【００４８】
・Expressway Plus expression system（Invitrogen社製）
・1.62M ギ酸ナトリウム（ギ酸Na）
5.5g/50ml 0.5M KPB pH7.5
・16.2mM NAD
581mg/50mlとなるように0.5M KPB pH7.5に溶解した。【００４９】
・mPMS（DOJINDO社製）  methoxy PMS 0.5mg/ml
・WST1（DOJINDO社製）  8mg/ml
・PD培地
Potato dextrose broth(Difco社製) 24g/L。pH7に調整後オートクレーブして使用した。【００５０】
・100mM MgCl2
MgCl2・6H2O 2.03g/100ml。オートクレーブして使用した。【００５１】
・KOD-Plus-：KOD-Plus-Polymerase [1U/μl]（TOYOBO社製）
25mM MgSO4、2mM dNTP、10×Buffer
・Pfx Platinum Polymerase [2.5U/μl](Invitrogen社製)
10Xbuffer、10Xenhancer、2.5mM dNTP、50mM MgSO4
・Pyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）
・Triton X-100
・100mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP（タカラバイオ社製）
・RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN社製）
・RNA PCR Kit（タカラバイオ社製）
・MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）
・MinElute PCR Purification Kit（QIAGEN社製）
・dH2O：DNase/RNase Free Distilled Water(Invitrogen社製)
・制限酵素NdeI/EcoRI（タカラバイオ社製）
・DNA Ligation kit ver2.1、solutionI（タカラバイオ社製）
・JM109 Competent Cells（タカラバイオ社製）
・pET-23b(+) vector （Novagen社製）
・pT7 Blue T-vector（Novagen製）
・大腸菌ワンショットBL21（Star）コンピテントセル（invitrogen社製）
・シャペロン発現用プラスミド
TaKaRa Chaperone Plasmid Set（TaKaRa社製）
Plasmid  pG-KJE8 
Chaperone   dnaK-dnaJ-grpE-groES-groEL
・破砕用ガラスビーズ YGBLA-01低アルカリ(0.1)（安井機械社製）
・透析膜（三光純薬株式会社製）透析膜サイズ：18/32
・Transcend tRNA（Promega社製）
・Transcend Non-Reactiove Translation Detection System（Promega社製）
・25%（W/V）グルコース（Wako社製）
・34mg/ml クロラムフェニコール（エタノールに溶解）
・15mg/ml チアミン（Wako社製）
・1M IPTG
・5μg/ml テトラサイクリン
・2.2ｍM Tris-acetate(pH8.2)（SIGMA社製）  滅菌して使用した。【００５２】
・1M 酢酸マグネシウム(pH7.0) 
・3.6M 酢酸カリウム(pH7.0) 
・1M DTT（Wako社製）
・50μg/ml PMSF（エタノールに）
・50mM NTP  200mM ATP,CTP,GTP,CTPをそれぞれ等量ずつ混和。【００５３】
200ｍM  ATP（ヤマサ醤油社製）
200mM  CTP（Roche社製）
200mM  UTP（Roche社製）
200mM  GTP
・1M  Hepes-KOH （pH7.5）
・3M  グルタミン酸カリウム
・2M  酢酸アンモニウム
・20mg/ml  E.coli ｔRNA（Roche社製） 
・1mg/ml   リファンピシン（Wako社製）
・5M  クレアチンリン酸（Wako社製）
・12mg/ml クレアチンキナーゼ（Wako社製）
12.12g/1.01ml(165 units/mg、2000 units使用)
・アミノ酸ミックス（totalを1mlとして下記組成）
RPM1 1640 50×（SIGMA社製）      800μl
50mM グルタミン（協和発酵工業社製）100μl
50mM アラニン（協和発酵工業社製）  100μl
・5.7M ベタイントリメチルグリシン（Fluka社製）
・60% PEG6000（W/V）
・LB（Cm）プレート（totalを200mlとして下記組成）
LB Broth,Lennox （Difco社製）   4g
34mg/ml  クロラムフェニコール   117.6μｌ
Agar,Powder（Wako社製）        3g
dH2O                            200ml
オートクレーブ滅菌後にクロラムフェニコールを添加しプレートに分注した。【００５４】
・LB（Cm)液体培地（totalを48.3mlとして下記組成）
LB液体培地（LB Broth (Difco社製) 20g/l） 48ml
34mg/ml  クロラムフェニコール  28.16μl
・Growth培地（本培養用）（totalを1Lとして下記組成）
KH2PO4                  5.6g
K2HPO4                  28.9g
Yeast extract（Difco社製）10g
ｄH2O（溶液が1Lになるように添加）
20μg/ml  クロラムフェニコール  
培地600mlに対して25%(W/V) グルコースを24ml、15mg/ml チアミンを600μl添加した。【００５５】
・Wash buffer
10mM Tris-acetate(pH 8.2)
12mM 酢酸マグネシウム(pH7.0)
60mM KCl
1mM DTT
50μg/ml PMSF
・Lysis buffer
10mM Tris-acetate(pH 8.2)
12mM 酢酸マグネシウム(pH7.0)
60mM 酢酸カリウム(pH7.0)
1mM DTT  
・Preincubation buffer
1.2M Tris-acetate(pH 8.2) 
47mM 酢酸マグネシウム(pH7.0)
15mM DTT
アミノ酸ミックス
12mM ATP
100mM クレアチンリン酸
0.4mg/ml クレアチンキナーゼ
・ Dialysis buffer
10mM Tris-acetate(pH 8.2)
12mM 酢酸マグネシウム(pH7.0)
60mM 酢酸カリウム(pH7.0)
1mM DTT
50μg/ml PMSF
（２）Gibberella zeae FDH遺伝子のクローニング
（２−１）  微生物株
Gibberella zeaeは独立行政法人製品評価技術基盤機構の関連機関であるNITE Biological Resource Center（以下NBRCと記載）に保存されている株（NBRC No. 4474）を購入し、指定される方法で復元したものをPD（Potato Dextrose）培地を用いて培養した。【００５６】
（２−２） ギ酸脱水素酵素遺伝子の単離
（２−２−１） ギ酸脱水素酵素遺伝子の増幅
２−１の方法で培養して得た菌体をRNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN社製）を用いてTotal RNA（mRNA、rRNA及びtRNA等を含む）を調製した。まず、RNA PCR Kit（タカラバイオ社製）を用いてTotal RNAを鋳型としたcDNA合成をおこなった。表１に反応液組成を示す。
【表１】
2010147111.tif 000004
【００５７】
上記組成の反応液を用いて、50℃で2時間、その後99℃で5分間、その後4℃とする反応サイクルでcDNAの合成反応を行った。【００５８】
次に、合成されたcDNAを鋳型とし、Pyrobest DNA polymeraseを用いてPCRをおこなった。反応液50μl中の成分組成を表２に示す。
【表２】
2010147111.tif 000005
【００５９】
上記組成の反応液を用いて、95℃で1分、その後、95℃で30秒、60℃で30秒及び72℃で1分を１サイクルとして２５サイクル繰り返し、その後72℃で10分、その後4℃とする反応サイクルでPCRを行った。なお、本PCRにおいては、一対のプライマーとしてGib FDH1-F-NdeI（forward）：CGC CAT ATG GTC AAG GTT CTT GCA GTT C（配列番号１）及びGib FDH1-R(reverse)：CTA TTT CTT CTC ACG CTG ACC（配列番号２）を使用した。【００６０】
（２−２−２） ギ酸脱水素酵素遺伝子のクローニング及び構造解析
アガロースゲル電気泳動により得られた各種PCR産物のサイズを確認後、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いてアガロースゲルより精製したPCR産物をpT7 Blue T-vector（Novagen製）、JM109 competent cells（タカラバイオ社製）を用いてサブクローニングした（GzFDH/pT7）（図１参照）。単離したギ酸脱水素酵素遺伝子配列（配列番号３）はデータベース上に公開されている配列（Genbank No. XP_386303）とアミノ酸レベルで１００％の一致を示していた。なお、単離したギ酸脱水素酵素遺伝子がコードするギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列を配列番号４に示した。【００６１】
（２−２−３） ギ酸脱水素酵素遺伝子発現用ベクターの作製
２−２−２で作製されたプラスミド（FDH/pT7）を制限酵素NdeI/EcoRIで処理した。表３に反応液組成を示す。制限酵素処理の反応条件としては37℃で2時間とした。
【表３】
2010147111.tif 000006
【００６２】
反応後の溶液を0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、NdeI/EcoRI断片としてベクターから切り出されたギ酸脱水素酵素遺伝子（約1.1kb）をMinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いて精製した。次にFDH/pT7と同様に制限酵素処理した遺伝子発現用ベクターpET23b(+)（Novagen社製）のNdeI/EcoRI部位にDNA Ligation kit Ver.2.1（タカラバイオ社製）を用いて上記ギ酸脱水素酵素遺伝子断片を導入後、JM109 competent cells（タカラバイオ社製）によるサブクローニングを行った（FDH/pET23b(+)）（図１参照）。【００６３】
（３） 無細胞タンパク質合成
（３−１） 鋳型DNAの調製
前項（２）で取得したジベレラ由来FDH遺伝子導入ベクターを鋳型とし、以下の条件でPCRを行った。反応液50μl中の成分組成を表４に示す。なお、本PCRにおいては、一対のプライマーとしてSingle-F：CGATCCCGCGAAATTAATACGACT（配列番号５）及びSingle-R1：TCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG（配列番号６）を使用した。
【表４】
2010147111.tif 000007
【００６４】
上記組成の反応液を用いて、94℃で2分、その後、94℃で15秒及び60℃で1分30秒を１サイクルとして３０サイクル繰り返し、その後68℃で2分、その後4℃とする反応サイクルでPCRを行った。増幅された約1.4kbpの断片をMinElute PCR Purification Kitで精製し翻訳反応に使用した。【００６５】
（３−２） 鋳型mRNAの調製
前項３−１で取得したジベレラ由来FDH遺伝子およびT7プロモーター／ターミネーターを含むDNA断片を鋳型とし以下の条件で転写反応を行った。転写反応にはMEGAscript kit（Ambion社製）を用いた。反応液20μl中の成分組成を表５に示す。
【表５】
2010147111.tif 000008
【００６６】
上記転写反応は、37℃で3時間行った。その後、反応液にTURBO DNase 1μlを添加し、37℃で15分間維持した。その後、dH2Oを9μl及びLithium chloride precipitation solutionを30μl添加し、-20℃で30分間維持した。その後、13000 xGで遠心分離を15分間実施し、上清を除去した。沈殿物を70％エタノールでリンスした後、dH2O 20μlに溶解した。【００６７】
（３−３）大腸菌S30画分の調製
前培養
発現プラスミドpG-KJE8を大腸菌BL21(DE3)star株に導入した。形質転換した大腸菌はLB（Cm）プレートでシングルコロニー化し、LB(Cm)液体培地（150ml/500ml フラスコ）で培養した後にグリセロールストックにして-80℃で保存した。なお、前培養では、34mg/ml クロラムフェニコールを88μl添加した後、37℃で終夜振とう（130rpm）しながら培養した。【００６８】
本培養
前培養液30mlをGrowth培地600mlに添加し、37℃で3.5時間（A600≒1.5となるまで）振とう（130rpm）しながら培養した。その後、T7 RNAポリメラーゼ誘導用のIPTGを添加（600ml/2L フラスコ1本あたり）した。その後、シャペロン誘導用試薬として5μg/mlのテトラサイクリン600μl（終濃度5ｎg/ml）及び500mg/mlのL-アラビノース600μl（終濃度500μg/ml）を添加（600ml/2Lフラスコ1本あたり）した。そして、30℃で1.5時間（A600≒3〜4となるまで）振とう（130rpm）しながら培養した。【００６９】
集菌及び洗浄
培養終了後、250ml遠心管に培養液を移し、遠心分離（7000rpm、7分、4℃）（BECKMAN JA-14）により上清を除去した。菌体を10mlのWash Bufferに懸濁した後、遠心分離（7000rpm、7分、4℃）（BECKMAN JA-14）により上清を除去した。【００７０】
破砕
菌大量10gを9mlのLysis Bufferに懸濁して、破砕チューブ（安井機器社製）に移した。ここに、ガラスビーズ（安井機器社製）19gを追加し、安井機器社製マルチビーズショッカー（On 60秒→Off 60秒を１サイクルとして４サイクル）により菌体を破砕した。【００７１】
超延伸（S30の調製）
得られた破砕液を遠心分離（6000rpm、10分、4℃）（BECKMAN JA-12）し、上清を回収した。さらに、２回の超遠心（16000rpm（30900G）で25分（4℃）、その後、17000rpm（34957G）で35分（4℃））（BECKMAN JA-20）し、上清を回収した。【００７２】
プレインキュベーション
超遠心で得られた上清（S30画分）の15%量のPreincubation Bufferを加え、28℃で1.5時間保温した。【００７３】
透析
透析によりS30画分を調製するための透析膜を以下のように準備した。まず、S30画分10mlに対して15cm程度の透析膜を準備（S30画分液量[ml]＋5cm程度）した。レンジでdH2Oに浸した透析膜を沸騰させスタラーで攪拌（2時間以上）した。その後、Dialysis Bufferに入れてスタラーで攪拌（5分以上）した。【００７４】
透析は以下のように行った。先ず、1L プラスチックビーカーにDialysis Buffer 500mlを入れ、S30画分を透析膜に7分目くらいまで入れ、専用クリップで閉じた。その後、45分、4℃でスタラーで攪拌（透析膜がゆっくり回転する程度のスピード）した。その後、
Dialysis Buffer500mlを交換し、50mlコーニングチューブに回収した。そして、遠心（6900rpm、10分、4℃）（BECKMAN JA-12） した後、上清を回収し、1mlずつ分注して-80℃保存した。【００７５】
（３−４） 無細胞翻訳反応
（３−４−１）  Expressway plus expression system(Invitrogen社製)による翻訳反応
３−１及び３−２で調製した鋳型DNAまたは鋳型mRNA断片と、Expressway cell-free E.coli expression systemを用い翻訳反応（転写／翻訳共役反応）を行った。反応液10μl中の反応組成を表６に示す。なお反応温度を25℃とし、反応時間を2時間とした。なお、表６に示した組成と、更に0.5Mトリメチルグリシンを加えた組成の２通りで反応を行った。
【表６】
2010147111.tif 000009
【００７６】
（３−４−２）  S30画分による翻訳反応
３−１および３−２で調製した鋳型DNAまたは鋳型mRNA断片と、３−３で調製した大腸菌由来S30画分を用い翻訳反応（または転写／翻訳共役反応）を行った。反応液11.12μl中の反応組成を表７に示す。なお反応温度を25℃とし、反応時間を1.5時間とした。
【表７】
2010147111.tif 000010
【００７７】
なお、上記反応液組成において、ベタイン（トリメチルグリシン）は終濃度を〜0.5Mとなるように調整し、Mg(OAc)2は終濃度を10mMとなるように調整した。また、上記反応液組成において、鋳型としてmRNAを使用する場合、その量を1μgとした。【００７８】
また、上述した反応組成に0.2μｌ Transcend tRNA（Promega社製）を加え、翻訳反応（または転写／翻訳共役反応）を行った。翻訳反応液2μｌをSDS-PAGE（還元）に供し、 Transcend Non-Reactiove Translation Detection Systemを用いたブロッティング法によって合成産物を検出した。また合成量をSigmaScanProにより定量した。【００７９】
（４） 合成タンパク質の検出
ギ酸脱水素酵素遺伝子の発現強度を、ギ酸脱水素酵素活性（FDH活性）を測定することで評価した。なお、FDHによるギ酸分解反応は次式で示される。【００８０】
HCOO- ＋ NAD+ → CO2 ＋ NADH
ここに電子伝達物質であるMethoxy PMS（mPMS）と、酸化還元発色指示薬であるWST1（共にDOJINDO社製）を加えることで次式のように反応が進むため、波長438nmの吸光度で黄色ホルマザンを測定することで、ギ酸分解量の定量が可能となる。なお黄色ホルマザンの吸光係数はNADHの約６倍であり、NADHの直接測定よりも高感度での定量が可能となる。【００８１】
NADH ＋ mPMS → NAD+ ＋ mPMS（還元型）
mPMS（還元型） ＋ WST1 → mPMS ＋ 黄色ホルマザン（37000/M・cm、438nm）
そして、プレートリーダー（Spectrafluor Plus：TECAN社製）で吸光度430nmを測定することで黄色ホルマザンを定量し、無細胞タンパク質合成系において発現したFDH活性、すなわちFDHの合成量を評価することができる。【００８２】
（４−１）FDH活性測定
表８に示す組成の反応液を用いてFDH活性を測定した。反応条件は、サーマルサイクラー37℃で加熱（30分程度）し、その後、チューブを取り出し氷につけて反応停止させた。その後、プレートリーダー（Spectrafluor Plus：TECAN社製）で吸光度430nmを測定することでFDH活性を検出した。
【表８】
2010147111.tif 000011
【００８３】
３−１で調製した鋳型DNAを用いて行った３−４−１の結果を図２に示す。図２に示すように、トリメチルグリシン存在下で無細胞タンパク質合成を行った場合には、トリメチルグリシン非存在下と比較してFDH活性が大幅に向上しており、タンパク質の合成量が増加していることが確認された。【００８４】
また、３−１で調製した鋳型DNAを用いて行った３−４−２におけるSDS-PAGEの結果を図３上段に示し、FDH活性測定結果を図３下段に示す。また、SDS-PAGEの結果からタンパク質合成量を測定した結果を図４に示す。なお、図４においては、タンパク質の合成量を、トリメチルグリシンを添加しない場合の合成量を１とする相対値で示している。【００８５】
図３及び４に示すように、トリメチルグリシン存在下で無細胞タンパク質合成を行った場合にはトリメチルグリシン非存在下と比較してFDH活性及びFDH合成量が大幅に向上しており、また、トリメチルグリシン濃度に依存してFDH活性及びFDH合成量が向上していた。【００８６】
さらに、３−２で調製した鋳型mRNAを用いて行った３−４−２におけるFDH活性測定結果を図５上段に示し、SDS-PAGEの結果を図５下段に示す。また、SDS-PAGEの結果からタンパク質合成量を測定した結果を図６に示す。なお、図６においては、タンパク質の合成量を、トリメチルグリシンを添加しない場合の合成量を１とする相対値で示している。【００８７】
図５及び６に示すように、トリメチルグリシン存在下で無細胞タンパク質合成を行った場合にはトリメチルグリシン非存在下と比較してFDH活性及びFDH合成量が大幅に向上しており、また、トリメチルグリシン濃度に依存してFDH活性及びFDH合成量が向上していた。【００８８】
以上の結果から、無細胞タンパク質合成系においてトリメチルグリシンは、目的タンパク質をコードする遺伝子の翻訳効率を向上させる作用を示すことが確認された。【００８９】
さらに、３−２で調製した鋳型ｍRNAを用いて行った３−４−２において、トリメチルグリシンに代えてL-カルニチン（Car）、サルコシン（Sar）及びコリン（Chol、 (CH3)3N+CH2CH2OH Cl）を用いてタンパク質合成を行った結果を図７に示す。図７に示した結果から、L-カルニチン、サルコシン及びコリンのうちいずれかの化合物を存在させることによって、無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質合成能が向上することが明らかとなった。特に、L-カルニチンを使用した場合には、無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質合成能が顕著に優れていることが確認できた。この結果から、無細胞タンパク質合成系においてL-カルニチン、サルコシン及びコリンは、トリメチルグリシンと同様に、目的タンパク質をコードする遺伝子の翻訳効率を向上させる作用を示すことが確認できた。【００９０】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
2010147111.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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