【事件の表示】
　特許第２８４０８５２号「Ｃ反応性蛋白質に対するモノクローナル坑体」の請求項１ないし４に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２８４０８５２号の請求項１ないし４に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　特許第２８４０８５２号に係る発明についての出願は、平成１年４月２５日に特許出願され、平成１０年１０月２３日に特許の登録がなされ、その後、その特許について、岡田浩司（申立番号１）、林純（申立番号２）、須賀京子（申立番号３）及び株式会社シノテスト（申立番号４）より特許異議の申立てがなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間である平成１１年１１月２９日に訂正請求がなされ、上申書が提出された後、訂正拒絶理由が通知され、意見書が提出され、更に、平成１３年７月３１日付け上申書が提出されたものである。
　
２．訂正の適否についての判断
（１）訂正の内容
ａ．特許請求の範囲の請求項１〜４に記載の
「１．Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応するモノクローナル抗体。
　２．不溶性担体に固定させることにより、Ｃ反応性蛋白質との間で抗原抗体反応に基づく凝集反応を起すことのできるモノクローナル抗体。
　３．Ｃ反応性蛋白質で免疫したマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞との融合によって形成され、Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応するモノクローナル抗体を分泌することを特徴とする、ハイブリドーマ細胞。
　４．Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応するモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、血漿中のＣ反応性蛋白質の免疫定量法。」を、
「１．Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応し、且つ不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を起すことができるモノクローナル抗体。
　２．不溶性担体に固定させることにより、１種類のみでＣ反応性蛋白質との間で抗原抗体反応に基づく凝集反応を起すことのできるモノクローナル抗体。
　３．Ｃ反応性蛋白質で免疫したマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞との融合によって形成され、Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応し、且つ不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を起すことができるモノクローナル抗体を分泌することを特徴とする、ハイブリドーマ細胞。
　４．Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応し、且つ不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を起すことができるモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、血漿中のＣ反応性蛋白質の免疫定量法。」に訂正する。
　
（２）訂正の目的の適否、新規事項の有無及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否
　上記訂正事項ａ．は、請求項１において「反応する」を「反応し、且つ不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を起すことができる」と、請求項２において「固定させることにより、Ｃ反応性蛋白質との間で」を「固定させることにより、１種類のみでＣ反応性蛋白質との間で」と、請求項３において「反応するモノクローナル抗体」を「反応し、且つ不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を起すことができるモノクローナル抗体」と、及び請求項４において「反応するモノクローナル抗体」を「反応し、且つ不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を起すことができるモノクローナル抗体」と、それぞれ構成要件を直列的に付加するものであるから特許請求の範囲の減縮に該当する。
　そして、上記訂正事項ａ．に関し、本件明細書の発明の詳細な説明には、「本発明者は、１種類のモノクローナル抗体だけを用いてＣＲＰと凝集反応を起こさせることを目標にして研究を行ったところ、・・・このモノクローナル抗体が前記の目的を達成することを見出した。」（本件特許公報第３欄第１６〜２１行）と記載されており、さらに、「凝集反応によるＣＲＰ定量法はこの発明による抗ＣＲＰモノクローナル抗体１種類のみを用い、これを公知の化学結合法・・・又は物理吸着法によって、通常用いる不溶性担体［例えば、ラテックス（例えば、ポリスチレンラテックス粒子）］に結合させて複合体を形成する。」（本件特許公報第４欄第３７〜４３行）と記載されており、また実施例５及び６（特許公報第８欄第４５行目〜第１０欄第１４行目）により、本発明のモノクローナル抗体を単独でラテックス粒子に固定した場合に、ＣＲＰの存在下にラテックスの凝集が生ずることが証明されていることから、上記訂正は新規事項に該当せず、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。
　
（３）独立特許要件
　後述の「３．特許異議申立てについて」の項で記載する判断の理由により、訂正後の特許請求の範囲に記載されている事項により構成される発明は、特許出願の際独立して特許を受けることができない発明とすることはできない。
　
（４）むすび
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項で準用する平成６年法律第１１６号による改正前の特許法第１２６条第1項ただし書、第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議申立てについて
（１）申立てについての概要
ａ．異議申立人　岡田浩司は、訂正前の請求項１に係る発明は甲第１号証に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号に該当し、特許を受けることができない、同請求項１ないし４に係る発明は甲第２号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、また、本件明細書の記載には不備があるから、請求項１ないし４に係る特許は特許法第３６条第３及び４項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してなされたものであるため、請求項１ないし４に係る発明の特許は取り消すべきものである旨主張している。
記
甲第１号証：The Journal of Immunology, Vol 131, 2411-2415, (1983)
甲第２号証：特開昭６２−１９２６６１号公報
参考資料１：「１つのＣＲＰ分子に複数の抗体固定化ラテックスが立体障害なしに結合した状態を示す概念図」
参考資料２：「２つのＣＲＰ分子に２つの抗体固定化ラテックスが立体障害なしに結合した状態を示す概念図」
　
ｂ．異議申立人　林純は、訂正前の請求項１ないし４に係る発明は甲第１〜３号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、また、本件明細書の記載には不備があるから、請求項１ないし４に係る特許は特許法第３６条第３ないし５項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してなされたものであるため、請求項１ないし４に係る発明の特許は取り消すべきものである旨主張している。
　　　　　　　　　　　　　　　　記
甲第１号証：特開昭６２−４９８号公報
甲第２号証：HYBRIDOMA, Vol. 7, No. 2, 185-191, (1988)
甲第３号証：The Journal of Immunology, Vol 131, 2411-2415, (1983)
　
ｃ．異議申立人　須賀京子は、訂正前の請求項１ないし４に係る発明は甲第１〜３号証に記載された発明であるから、特許法第２９条第１項第３号に該当し、特許を受けることができない、同請求項１ないし４に係る発明は甲第１〜３号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、また、本件明細書の記載には不備があるから、請求項１ないし４に係る特許は特許法第３６条第３及び４項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してなされたものであるため、請求項１ないし４に係る発明の特許は取り消すべきものである旨主張している。
記
甲第１号証：The Journal of Immunology, Vol 131, 2411-2415, (1983)
甲第２号証：特開昭６２−３６３９９号公報
甲第３号証：特開昭６２−２１８８６６号公報
参考資料１：nature structural biology, volume 3, number 4, April 4
参考資料２：平成１０年６月１５日付けの意見書
　
ｄ．異議申立人　株式会社シノテストは、訂正前の請求項２に係る発明は甲第１〜９号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、また、本件明細書の記載には不備があるから、請求項１、３及び４に係る特許は特許法第３６条第３及び４項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してなされたものであるため、請求項１、３及び４に係る発明の特許は取り消すべきものである旨主張している。
記
甲第１号証：特開昭６２−２１８８６４号公報
甲第２号証：The Journal of Immunology, Vol 131, 2411-2415, (1983)
甲第３号証：特開昭６２−４９８号公報
甲第４号証：特開昭５８−１２７１６７号公報
甲第５号証：特開昭６１−６６１６３号公報
甲第６号証：特開昭６２−１２８５７号公報
甲第７号証：特開昭６２−４６２６２号公報
甲第８号証：特開昭６３−７８０６６号公報
甲第９号証：「単クローン抗体」、岩崎辰夫ら著、第３０〜１４３頁、講談社、昭和５８年２月２０日発行
　
（２）本件発明
　本件特許の請求項１ないし４に係る発明は、訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１ないし４に記載された事項により特定されるとおりのものである（上記２（１）の「訂正の内容」を参照。以下、本件発明１ないし４という。）
　
（３）甲各号証に記載された発明
　異議申立人がそれぞれ提出した甲号証の記載内容を整理すると、以下のとおりである。
刊行物１：The Journal of Immunology, Vol 131, 2411-2415, (1983)　（岡田、須賀の甲第１号証、林の甲第３号証、（株）シノテストの甲第２号証）
刊行物２：特開昭６２−１９２６６１号公報（岡田の甲第２号証）
刊行物３：特開昭６２−４９８号公報（林の甲第１号証、（株）シノテストの甲第３号証）
刊行物４：HYBRIDOMA, Vol. 7, No. 2, 185-191, (1988)（林の甲第２号証）
刊行物５：特開昭６２−３６３９９号公報（須賀の甲第２号証）
刊行物６：特開昭６２−２１８８６６号公報（須賀の甲第３号証）
刊行物７：特開昭６２−２１８８６４号公報（（株）シノテストの甲第１号証）
刊行物８：特開昭５８−１２７１６７号公報（（株）シノテストの甲第４号証）
刊行物９：特開昭６１−６６１６３号公報（（株）シノテストの甲第５号証）
刊行物１０：特開昭６２−１２８５７号公報（（株）シノテストの甲第６号証）
刊行物１１：特開昭６２−４６２６２号公報（（株）シノテストの甲第７号証）
刊行物１２：特開昭６３−７８０６６号公報（（株）シノテストの甲第８号証）
刊行物１３：「単クローン抗体」、岩崎辰夫ら著、第３０〜１４３頁、講談社、昭和５８年２月２０日発行（（株）シノテストの甲第９号証）
　上記刊行物１には、２種類のＣＲＰモノクローナル抗体、ＨＤ２−４及びＥＡ４−１が記載されており、第２４１３頁の図２Ｆには、平面状にある（すなわち、Ａ面またはＢ面が紙面に平行に位置している）２つのＣＲＰ分子に渡ってモノクローナル抗体（ＨＤ２−４）が結合していることを示す免疫電子顕微鏡写真が掲載されている。そして、図２Ｆについて「図２Ｆは、２つのＣＲＰ分子が平面にある類似立体配置を示す。」（第２４１２頁、右欄、第１７〜１９行）と記載されている。
  さらに、該刊行物には、「Ｃ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）を、そのフォスフォコリン（ＰＣ）結合部位もしくは第二の無関係部位に特異的なモノクローナルＩｇＧ抗体またはＦａｂ抗体フラグメントと反応させた。生じた免疫複合体を、ネガティブ染色電子顕微鏡法により観察した。モノクローナル　抗ＰＣ結合部位抗体は、５つのＣＲＰサブユニットのそれぞれの単一エピトープに結合していた。そのＰＣ結合部位は、当該分子の平らな表面（Ａ面）のうちの一つの中央付近に位置していることが判明した。第二のモノクローナル抗体（ＰＣ結合部位とは無関係）は、ＣＲＰ分子の別の平らな表面（Ｂ面）に対しわずかに外側（すなわちＰＣ結合部位の反対側）にあるエピトープに結合していた（ＣＲＰサブユニット当たり１つ）。従って、ＰＣ結合部位とＰＣ非結合部位は、互いにほとんど垂直に向いており、ＣＲＰ分子の平面に関して互いに反対側に位置している。」（第２４１１頁、左欄第１〜１７行）との記載、及び
「未反応のＣＲＰ、ＩｇＧ、及びモノクローナル抗体のＦａｂフラグメントの形態は、容易に判別できるものである。（Ｆｉｇｕｒｅ ｌ）以前報告（１５）されたように、ＣＲＰはネガティブに像形成されたものとして環状の５量体分子として見えたので、分子の面はカーボン付着膜の面に対して平行であったが（Ｆｉｇ．１Ａ ）、まれに、”垂直に（ｏｎ　ｅｄｇｅ）”前記の膜に付いたＣＲＰが観察された。（Ｆｉｇ．１Ｂ，矢印のもの）いくつかのものにおいて、ＣＲＰの個々のサブユニットは、深い割れ目、又は窪みの領域を示すポケット状の像を、そのサブユニットの中央部に持つように見える。しかしながら、単純化のため、ここで示すＣＲＰ分子の模式図（モデル）において、各々のサブユニットは球として描写され、ＩｇＧはＹ字形の構造として表され（Ｆｉｇ．１Ｃ）、そしてＦａｂフラグメントは小さく、時折、くぼんだ球、又は２裂片からなる構造である。（Ｆｉｇ．１Ｄ）」（第２４１１頁右欄の下から第７行〜第２４１２頁左欄第７行）との記載がある。
　上記刊行物２には、「（１）免疫比濁法によりＣＲＰを測定するに際して、抗体として抗ＣＲＰモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、免疫比濁法によるＣＲＰの測定法。　（２）ゲル内及び液相中での抗原との反応において濁度を形成する抗ＣＲＰモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の免疫比濁法によるＣＲＰの測定法。　（３）認識する抗原決定基の異なる複数種類の抗ＣＲＰモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の免疫比濁法によるＣＲＰの測定法。」（特許請求の範囲）なる記載、及び
「ａ）　抗ＣＲＰモノクローナル抗体産生細胞の作製　患者血清を原料とし、これを硫安分画、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、Ｃａ２十沈澱、セファクリルＳ−３００ゲル濾過により精製したＣＲＰをＢＡＬＢ／Ｃ系マウスに免疫し、その脾細胞をマウス骨髄腫細胞（Ｐ３ＵＩ）と融合し、限界稀釈法により５種類のモノクローナル抗体産生細胞株（ＣＲＢ１７、ＣＲＢ１８、ＣＲＢ１９、ＣＲＢ２０、ＣＲＢ２３）を得た。
ｂ）　抗ＣＲＰモノクローナル抗体の精製　マウス腹水中で産生させたモノクローナル抗体を硫安分画、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、プロティンＡセルファロースＣＬ−４Ｂにより精製したものを実験に使用した。尚、抗体産生細胞を無血清培地で培養した培養上清を濃縮し、５０％飽和硫安で分画してモノクローナル抗体を回収し、これを実験に供することもできる。」（第２頁右上欄第１９行〜左下欄第１４行）との記載、及び
「上記ｂ）項に記載の方法により精製された５種類の抗ＣＲＰモノクローナル抗体をそれぞれ単独で用い且つ標準血清（ＣＲＰ濃度が１．０、５．０及び１０．０ｍｇ／ｄｌのもの）を用いて濁度形成を調べた結果は、第１図のグラフに示される通りであり、モノクローナル抗体の種類に応じて差はあるが、何れのモノクローナル抗体も濁度を形成することが判明した。」（第３頁左上欄第１５行〜右上欄第２行）との記載があり、第１図にその結果が示されている。
  上記刊行物３には、「（１）ヒトＣ反応性蛋白（Ｃ　Ｒｅａｃｔｉｖｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）に対して特異性があることを特徴とする雑種細胞系によって産生されたモノクローナル抗体。　（２）ヒトＣ反応性蛋白と沈澱反応を生じる特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。　（３）ヒトＣ反応性蛋白に対し特異性を有しヒトＣ反応性蛋白と沈澱反応を生じる雑種細胞系によって産生されたモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＳＲＩＤによるヒトＣ反応性蛋白抗原の定量法。」（特許請求の範囲）との記載、
「本発明のヒトＣＲＰに対するモノクローナル抗体はリンパ球細胞と哺乳動物（マウスやラット等）に由来する骨髄腫細胞との間の融合細胞から得ることができる。」（第２頁左上欄第１１〜１４行）との記載、
「次に沈降反応を示した５つのクローン・・・を精製し精製抗原との沈降反応をみるとＣＲＰ１ｍｇ／ｍｌ　１０μｌに対して各クローン共に５ｍｇ／ｍｌ　１０μｌでシャープな沈降線を形成した。」（第６頁右下欄第１１〜１５行）との記載があり、また、得られた２５のハイブリドーマ（ＣＲＢＩ〜ＣＲＢ２５）のうち、６つのクローンのモノクローナル抗体において、ＣＲＰと強い反応性が認められたことが記載されている。（第６頁右上欄第５行〜左下欄第７行、及び第１−Ｃ図）
  上記刊行物４には、ヒトＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）に対するモノクローナル抗体１３種についてその性質を調べたところ、その交差反応性から表３に示されている、以下の３つのグループ（Ｉ−ＩＩＩ）に分けられることが記載されている。（第１８８頁）
　「グループＩ：ＢＢ９−２，ＲＬ１−２８，ＲＬ１−１７，ＣＡ３−５，ＲＬ３−５２，ＡＧ１１−１，ＢＦ８−５、
　グループＩＩ：ＨＤ２−４，ＲＬ１−３８，ＢＧ１０−５，ＣＡ１−１
　グループＩＩＩ：ＡＣ１２−２，ＡＦ７−３」
　上記刊行物５には、「本発明者は、本発明に先立って見出された抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体ＣＲＢ１７、ＣＲＢ１８、ＣＲＢ１９，ＣＲＢ２０，ＣＲＢ２１，ＣＲＢ２３について、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法でＣＲＰとモノクローナル抗体の間で一旦、沈降反応を行い、このゲルを様々な塩濃度、ｐＨの緩衝液に浸漬し、この沈降線が消失するもの（抗原抗体反応が解離する）がアフイニテイークロマトグラフイーに使用できると考えて検討したところ、弱酸性下で解離したのはＣＲＢ１８であった。」（第２頁右上欄第９〜１８行）との記載がある。
　上記刊行物６には、「１．抗ヒトＣ反応性タンパク抗体が感作された不溶性担体とトリアルキルアミン、その塩及び第４級アンモニウム塩から選ばれる少なくとも一種の水溶性化合物とを組み合わせてなるヒトＣ反応性タンパク定量用試薬。」（特許請求の範囲）との記載、及び
「また、抗ＣＲＰ抗体としては、ウサギ、ヒツジ、ヤギ等の動物由来の多価抗体、モノクローナル抗体などが使用される。」（第２頁左下欄第１２〜１５行）との記載がある。
　上記刊行物７には、「１．試料及び抗ヒトＣ反応性タンパク抗体を感作した不溶性担体を混合して混合液として、この混合液中にトリアルキルアミン、その塩及び第４級アンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも一種の水溶性化合物を共存させて抗原−抗体反応によるラテックス凝集反応を起こさせて、吸光度を測定し、この測定値から試料中のヒトＣＲＰを定量することを特徴とするヒトＣ反応性タンパクの定量法。」（特許請求の範囲）との記載、及び
「また、抗ＣＲＰ抗体としては、ウサギ、ヒツジ、ヤギ等の動物由来の多価抗体、モノクロナール抗体などが使用される。」（第２頁左下欄最終行〜右下欄第３行）との記載がある。
　上記刊行物８の実施例１（第４頁左下欄第８行〜右下欄第９行）には、抗ＨＢｓモノクローナル抗体をヒツジ赤血球に感作した抗ＨＢｓモノクローナル抗体感作ヒツジ赤血球が、ＨＢｓ抗原陽性ヒト血漿中のＨＢｓ抗原と、抗原抗体反応に基づく凝集反応を起こしたことが、また、実施例２（第４頁右下欄第１０行〜第５頁左上欄第２行）には、抗ＨＢｅモノクローナル抗体感作ヒツジ赤血球が、ＨＢｅ抗原陽性ヒト血漿中のＨＢｅ抗原と、抗原抗体反応に基づく凝集反応を起こしたことが記載されている。
　更に、実験例１（第５頁左下欄第７行〜右下欄最終行）、表１（第６頁左上欄）、実験例２（第６頁右上欄第１行〜最終行）、及び表２（第６頁左下欄）には、抗ＨＢｓ抗原ａヒトモノクローナル抗体感作赤血球、抗ヒトＩｇＧマウスモノクローナル抗体感作赤血球、及び抗ヒトアルブミンマウスモノクローナル抗体感作赤血球が、それぞれ対応する抗原と抗原抗体反応に基づく凝集反応を起こしたことが記載されている。
　上記刊行物９の第２頁右下欄の下から第６行〜第３頁左上欄最終行には、抗狂犬病ウイルス糖蛋白抗原モノクローナル抗体の製造法が記載されており、また、第３頁右上欄第１行〜左下欄最終行及び第１表には、抗狂犬病ウイルス糖蛋白抗原モノクローナル抗体を感作したヒツジ赤血球が、狂犬病ウイルス糖蛋白抗原と凝集反応を起こし、これにより狂犬病ウイルス糖蛋白抗原の凝集価を測定できたことが記載されている。
　上記刊行物１０の第２頁右下欄の下から第７行〜第３頁左上欄第９行には、抗ヒトフエリチンモノクローナル抗体の製造法が記載されており、また、第３頁左上欄第１０行〜右上欄第１３行には、抗ヒトフエリチンモノクローナル抗体を感作したヒツジ赤血球が、検体中のヒトフエリチンと凝集反応を起こし、その１．９５μｇ／ｍｌまで測定可能であったことが記載されている。
　上記刊行物１１の第４頁左上欄の下から第４行〜左下欄第２行（実施例１）及び第４頁右下欄の下から第１０行〜第５頁左下欄第４行（比較例２及び比較試験２）には、ｈＣＧに対するモノクローナル抗体を感作したラテックスが、ｈＣＧと凝集反応を起こしｈＣＧの測定を行うことができたことが記載されている。
　上記刊行物１２の製造例１、製造例２、及び製造例３（第３頁左下欄第３行〜第５頁右下欄第１５行）には、抗Ｄダイマー、Ｄモノマーモノクローナル抗体の製造法が、実験例１（第６頁右下欄第２行〜第７頁左上欄第６行）には、この抗Ｄダイマー、Ｄモノマーモノクローナル抗体をポリスチレンラテックス粒子に感作した感作ポリスチレンラテックス粒子の製造法が、実験例２（第７頁左上欄第７行〜左下欄第６行）には、抗Ｄダイマー、Ｄモノマーモノクローナル抗体を感作したポリスチレンラテックス粒子が、被検体と凝集反応を起こしスライド凝集法による測定ができたことが、及び実験例３（第７頁左下欄第７行〜第８頁右上欄第８行）には、抗Ｄダイマー、Ｄダイマーモノクローナル抗体を感作したポリスチレンラテックス粒子が、被検体中ＤダイマーもしくはＤダイマーの立体構造を保持する分画と凝集反応を起こしラテックス比濁法（ＬＰＩＡ）による測定が行えたことが記載されている。
　上記刊行物１３には、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎが発明した抗体産生Ｂ細胞ハイブリドーマによるモノクローナル抗体（単クローン抗体）の製造法、すなわち、抗原を免疫化したマウスの脾臓細胞（Ｂ細胞）とマウスミエローマ細胞とを細胞融合させ、ハイブリドーマ（融合細胞）を選択し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニング及びクローニングし、更に目的とする抗体を産生するハイブリドーマを培養し、そしてこのハイブリドーマより抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を得ることによる、モノクローナル抗体の製造法が具体的に説明されている。
　
（４）判断
ア、明細書の記載不備について
　異議申立人は、本件明細書の記載は以下の点で不備であると主張する。
（ａ）ＣＲＰの各サブユニットが低円柱状であって表面が円形上面（Ａ面）と円形底面（Ｂ面）と側面（Ｃ面）から構成されるということは確認されていないし、ＣＲＰサブユニットは球状であるから、どの部位がＣＲＰの側面に相当するのか不明である。
（ｂ）抗体の反応部位がＣＲＰの平面上の比較的外側に位置する場合、１つのＣＲＰ分子に複数の抗体固定化ラテックスが立体障害なしに結合してラテックス凝集反応が起こることもあり得るし、また刊行物１の第２４１３頁の図２の１に示されているように、２つのＣＲＰ分子に渡って２つのインタクトのモノクローナル抗体（ＨＤ２−４）がそれぞれ両Ｆａｂアームにおいて結合し、２つのＦｃアームが反対方向外向きに突出していると、抗体がラテックスに固定化されていてもラテックス凝集反応が起こり得るから、従来の２種のモノクローナル抗体（Ａ抗体及びＢ抗体）のいずれか一方を不溶性担体に結合させてからＣＲＰ含有試料に混合しても凝集反応は起こさない、とする前提はそれ自体不確定なものである。
（ｃ）本件実施例では、The Journal of Immunology, Vol 131, 2411-2415, (1983)記載の方法に準じて、Ａ抗体及びＢ抗体を調製し抗体ラテックス複合体を得て次のマスキングに用いたと記載している点について、同じモノクローナル抗体を調製することは殆ど不可能であるといえる。即ち、実施例４で対象として使用している「Ａ面に特異的な抗体」及び「Ｂ面に特異的な抗体」とはいかなるものか不明である。
（ｄ）本件発明の抗ＣＲＰ特異モノクローナル抗体「ＣＲＰ−１」、「ＣＲＰ−２」、「ＣＲＰ−３」及び「ＣＲＰ−４」は、「ＣＲＰの側面に特異的に反応するモノクローナル抗体」であることが直接証明されていない。
（ｅ）請求項２に係る発明については、ＣＲＰの側面に特異的に反応することを要件としていないから、同項には、発明の構成に欠くことができない事項が記載されていないし、また「不溶性担体に固定させることによりＣ反応性蛋白質との間で抗原抗体反応に基づく凝集反応を起こすことのできる」は結果の記載であって、そのような抗体が有すべき構成が特定されていない。
　先ず、（ａ）の点について検討すると、異議申立人が主張するように、ＣＲＰの各サブユニットは球状であると表現されており、この球状のサブユニットについては何処までが「側面」部位であるのかは必ずしも明らかでない。しかしながら、刊行物１によれば、ＣＲＰ分子は５個のサブユニットが集合して構成され、この分子の全体的な形状は、図示されたスケール棒の長さからみて、平面の直径がおよそ１００Åであり、厚さが２０Åであるほぼ円柱状の形状ともいえるものであると理解することができ、同刊行物のＦｉｇ．１のＢにおいて、基体上に立っている分子がある比率で存在することから、側面といえる部位が存在することは理解できることである。
　更に、特許権者が提出した、Nature Structural Biology, Vol.3, p.346, 1996（乙第１号証）には、ヒトＣＲＰのＸ線結晶構造解析データが報告されており、これをダウンロードした後、３次元構造解析ソフトＲａｓＭｏｌにより視覚化した図（乙第２号証）に依れば、Ａ面及びＢ面とは異なる面、即ちＣ面（側面）が存在すると考えることができる。
　このため、「側面」なる記載を使用したということのみからは、本件明細書の記載が不備であるということはできない。
　次に、（ｂ）について検討する。異議申立人は、従来のモノクローナル抗体をラテックスに固定化したものであっても、立体障害なしにラテックス凝集反応が起こり得ると主張しているが、乙第５号証、乙第６号証及び乙第１２号証に記載の実験結果からみて、公知の入手し得るモノクローナル抗体は全て１種類のみではラテックス凝集反応を生じ得ないものであり、また測定レベルの感度が全く得られないものである。そして、本件特許出願時には、かかる「不溶性担体に固定化させることにより１種類のみで凝集反応を起こすことができるモノクローナル抗体」であり、測定レベルの感度が得られるモノクローナル抗体が知られていなかったから、２種の公知のモノクローナル抗体（Ａ抗体及びＢ抗体）がＣＲＰの上面及び底面に反応するという刊行物１の記載事項をも考慮して、本件発明のモノクローナル抗体と不溶性担体との反応性を特許権者の如く考えること自体は必ずしも不適切であるということはできず、この点で明細書の記載が不備であるということはできない。
　（ｃ）について、本件特許出願時にはＡ抗体及びＢ抗体は良く知られており、これらのモノクローナル抗体が極めて特異な抗体であるということはできないから、刊行物１記載の方法に準じて調製したモノクローナル抗体がＡ面及びＢ面に反応するモノクローナル抗体であることの蓋然性は高いので、この点で明細書の記載が不備であるとまではいうことはできない。
　そして、刊行物１に記載のＢ面に対する抗体であると報告されているＨＤ２−４モノクローナル抗体について、実際にＡＴＣＣよりクローンＨＢ−８３を購入し、抗ＣＲＰ抗体を調製して、そのラテックス凝集反応性を検討した結果においても、凝集反応は生じないことが確認されているのである。（乙第５号証及び乙第６号証）
　（ｄ）について、ＣＲＰについては、側面といえるような部位が存在すると考えられることは上記（ａ）で述べたとおりであり、また、上述の如く、従来公知のＣＲＰの上面及び底面に反応するモノクローナル抗体（Ａ抗体及びＢ抗体）のいずれもが不溶性担体に固定化させることにより１種類のみで凝集反応を起こすことができ、しかも測定レベルの感度を得ることができるという作用を有するものでなかったから、本件発明のモノクローナル抗体の反応がＣＲＰのＡ面及びＢ面以外の「側面」に結合するという「抗体が有する構成的特徴」に基づくものであるとすることは蓋然性の高いことであるといえる。
　このため、この点についての、異議申立人の主張する「直接証明している記載」がないとしても、この点で明細書の記載が不備であるとまではいえない。
　（ｅ）について、請求項２記載の発明は「不溶性担体に固定化させることにより１種類のみでＣ反応性蛋白質との間で抗原抗体反応に基づく凝集反応を起こすことができるモノクローナル抗体」であり、該発明は、不溶性担体に固定化させた場合、１種類のみではＣＲＰとの間で抗原抗体反応に基づく凝集反応を生じない、或いはそれによりＣＲＰを定量することができない、公知のモノクローナル抗体と区別し得るから、例え、側面に特異的に反応することが明記されていなくとも、発明の構成に欠くことのできない事項が記載されていないということはできない。
　なお、この点については、本件特許権者が、「Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応する」ことと、「不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を起こすことができる」こととは同義であると主張しているとおり、請求項２記載の発明は「Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応する」ものであることはいうまでもないことである。（平成１３年６月４日付意見書第３頁第１６〜２１行及び平成１３年７月３１日付上申書第３頁第１３〜１５行）
イ、刊行物（甲号証）記載の発明との対比
（特許法２９条１項３号について）
　本件発明１ないし４は、ＣＲＰとの間で「不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を起すことができるモノクローナル抗体」である点及びこれを使用する点に特徴があるところ、この点については、何れの刊行物にも教示するところはない。
　ところで、抗ＣＲＰモノクローナル抗体については、刊行物１に２種類の抗体（ＨＤ２−４及びＥＡ４−１）が、刊行物２に５種類の抗体（ＣＲＢ１７，ＣＲＢ１８，ＣＲＢ１９，ＣＲＢ２０、及びＣＲＢ２３）が、刊行物３には、強い反応性を認めた６種のクローン（ＣＲＢ１７，ＣＲＢ１８，ＣＲＢ１９，ＣＲＢ２０、ＣＲＢ２１及びＣＲＢ２３）とこれらから精製した５種類の抗体（ＣＲＢ１７，ＣＲＢ１８，ＣＲＢ１９，ＣＲＢ２０及びＣＲＢ２３）が、刊行物４には１３種類の抗体（ＢＢ９−２，ＲＬ１−２８，ＲＬ１−１７，ＣＡ３−５，ＲＬ３−５２，ＡＧ１１−１，ＢＦ８−５、ＨＤ２−４，ＲＬ１−３８，ＢＧ１０−５，ＣＡ１−１、ＡＣ１２−２，ＡＦ７−３）が、及び刊行物５には６種類の抗体（ＣＲＢ１７，ＣＲＢ１８，ＣＲＢ１９，ＣＲＢ２０、ＣＲＢ２１及びＣＲＢ２３）が記載されている。
　そこで、これらのＣＲＰモノクローナル抗体について検討すると、刊行物１記載のモノクローナル抗体は、明細書に記載されているとおり何れも不溶性担体に結合させてからＣＲＰ含有試料と混合しても凝集反応が起こらないものであり（本件特許公報第２頁第３欄８〜１１行）、このことは乙第６号証（平成１２年１２月８日付実験報告書）からも確認し得ることである。
　また、刊行物２、３及び５に記載の発明は何れも同一の出願人によるものであって、これらの刊行物に記載された抗体は溶液中での比濁反応、或いはゲル中での沈降反応を生じるものであるが、何れのモノクローナル抗体もラテックス凝集反応は生じないこと、即ち不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を生じないことは、乙第３号証（平成１１年１１月２６日付け実験報告書）及び乙第４号証（「米国において提出したDeclarationの写し」）より明らかである。なお、これらの乙号証では、「ＣＲＢ２１」を不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を生じないことが具体的に確認されていないが、このハイブリドーマは寄託されておらず、比較実験は困難なものである。（平成１３年６月４日付け意見書第５頁第１２行）
　さらに、刊行物４には１３種類のモノクローナル抗体が記載されているが、乙第１２号証によれば、上記抗体のうち、入手不可能であった「ＡＧ１１−１」を除いて、これに代えて送付されてきた「ＣＡ１１−１」を含めて、同刊行物に記載された抗ＣＲＰモノクローナル抗体は、１種類の抗体を用いてはラテックス凝集反応によりＣＲＰの定量ができず、ラテックス凝集反応を実施できなかったことが認められる。
　以上のとおりであるから、本件発明１ないし４は、刊行物１ないし５に記載された発明であるとはいえない。
（特許法２９条２項について）
（本件発明１について）
　本件発明１は、「Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応すること」及び「不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を起こすことができること」を特徴とするモノクローナル抗体であるところ、刊行物１乃至１３には、いずれもその点について開示するところはなく、また、刊行物１乃至刊行物１３に記載の事項を組み合わせても、本件発明１に係る構成を導き出すことはできない。
　即ち、刊行物１には、モノクローナル抗体ＨＤ２−４及びＥＡ４−１が記載されているものの、不溶性担体に固定した場合に１種類のみで凝集反応を生じさせることのできることについては何ら記載されておらず、又、かかる事項を窺わせる記載も全くない。
　刊行物２には、ゲル内及び液相中でのＣＲＰとの反応において濁度を形成する抗ＣＲＰモノクローナル抗体が記載されているが、この反応においては、モノクローナル抗体はラテックス等の不溶性担体に結合させることなく、そのまま用いているにすぎないものである。
　刊行物３には、沈降反応を生じることのできるモノクローナル抗体が記載されているが、この沈降反応はオクテロニー反応及びＳＲＩＤ（Single Radial Immunodiffusion）といったゲル内での沈降線形成反応であって、ラテックス等の不溶性担体に固定化した後の凝集反応についての記載は存在しない。しかも、これらのモノクローナル抗体は、上記したとおり、現実にラテックス凝集反応を生じないものである。
　刊行物４には、生理的カルシウム濃度においてのみヒトＣＲＰ分子上に出現するエピトープを認識するモノクローナル抗体及びカルシウムに依存せずＣＲＰ分子上に存在するエピトープを認識するモノクローナル抗体が記載されているにすぎず、モノクローナル抗体を用いた凝集反応については何ら記載されていない。
　刊行物５には、刊行物３と同様に、ゲル内で凝集反応を起こすことのできるモノクローナル抗体が記載されているのみである。
　刊行物６及び７には、抗ヒトＣＲＰ抗体を用いてラテックス凝集法によりＣＲＰを測定することが記載され、抗ＣＲＰ抗体としては多価抗体、モノクローナル抗体などが使用されるとの記載が存在する。ところで、これらの刊行物に記載の発明は、「抗ＣＲＰ抗体を感作した不溶性担体のラテックス試薬は、感度が高く、また該ラテックス試薬自体の吸光度が高いため、・・・試料中のＣＲＰ濃度が少し高くなるだけで、吸光度の増加速度と試料中のＣＲＰ濃度が対応せず、ＣＲＰを正確に定量することができない」（刊行物６の第２頁右上欄第４〜１１行及び刊行物７の第２頁右上欄第１１〜１８行）という問題等を解決するために、抗ＣＲＰ抗体が感作された不溶性担体と共に「トリアルキルアミン、その塩及び第４級アンモニウム塩からなる群から選ばれる少なくとも一種の水溶性化合物」（刊行物６及び７の特許請求の範囲の請求項１）を組み合わせて使用するものである。しかしながら、上述の問題点がＣＲＰモノクローナル抗体にも共通して存在するとは直ちには想到できず、しかも「抗ＣＲＰ抗体を感作した不溶性のラテックス試薬」として、実施例ではポリクローナル抗体が記載されているだけであって、ラテックス凝集反応でＣＲＰを測定する場合には、どのような抗体が必要であるのか、それをどのように作製するのかといった技術的事項は何ら記載または示唆されていないから、上記両刊行物における、「モノクローナル抗体」という、いわば１行記載ともいえる記載に格別の技術的意義を見いだすことはできず、このため、これらの刊行物の記載に基づいて当業者が本件発明を容易に想到し得たということはできない。
　さらに、刊行物８は「逆受身モノクローナル抗体赤血球凝集反応用抗原検出試薬」に関するものであり、刊行物９は「狂犬病ウイルス抗原の測定方法」に関するものであり、刊行物１０は「ヒトフェリチン測定試薬」に関するものであり、刊行物１１は「妊娠診断用乾燥試薬」に関するものであり、刊行物１２は「ＦＤＰ（フィブリン分解産物）の測定法」に関するものであり、更に刊行物１３はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎによる抗体産生Ｂ細胞ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の製造法を詳細に記載するものであって、何れの刊行物もＣＲＰのモノクローナル抗体について記載するものではない。
　そして、従来の公知のモノクローナル抗体を用いてＣ反応性蛋白質を定量する場合には、複数のモノクローナル抗体を利用したサンドイッチアッセイ等を用いることが必要であったところ（本件特許公報第２頁第３欄１１〜１４行）、本件発明１は、１種類のモノクローナル抗体だけを用いてＣ反応性蛋白質と凝集反応を起こすことができるという顕著な効果を奏するものである。
　してみれば、本件発明１は刊行物１ないし刊行物１３に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
（本件発明２について）
　本件発明２も、「不溶性担体に固定させることにより、１種類のみでＣ反応性蛋白質との間で抗原抗体反応に基づく凝集反応を起すこと」を特徴とするものであり、かかる構成が容易に想到し得ないことは、本件発明１について述べたとおりである。
（本件発明３及び４について）
  本件発明３は、「不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を起すことができるモノクローナル抗体を分泌することを特徴とするハイブリドーマ細胞」に係る発明であり、また、本件発明４は「不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を起すことができるモノクローナル抗体を用いることを特徴とする血漿中のＣ反応性蛋白質の免疫定量法」に係る発明であるところ、これらの発明も（本件発明１について）の項で述べたとおりの理由により、当業者が容易になし得たものとはいえない、
　
（５）むすび
　以上のとおりであるから、本件発明１ないし４の特許は、特許異議の申立ての理由及び証拠によっては取り消すことはできない。
　また、他に本件発明１ないし４の特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１４年７月１２日（２００２．７．１２）
【訂正の要旨】
　訂正の要旨
ａ．特許請求の範囲の請求項１〜４に記載の
「１．Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応するモノクローナル抗体。
　２．不溶性担体に固定させることにより、Ｃ反応性蛋白質との間で抗原抗体反応に基づく凝集反応を起すことのできるモノクローナル抗体。
　３．Ｃ反応性蛋白質で免疫したマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞との融合によって形成され、Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応するモノクローナル抗体を分泌することを特徴とする、ハイブリドーマ細胞。
　４．Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応するモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、血漿中のＣ反応性蛋白質の免疫定量法。」とあるのを、特許請求範囲の減縮を目的として、
「１．Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応し、且つ不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を起すことができるモノクローナル抗体。
　２．不溶性担体に固定させることにより、１種類のみでＣ反応性蛋白質との間で抗原抗体反応に基づく凝集反応を起すことのできるモノクローナル抗体。
　３．Ｃ反応性蛋白質で免疫したマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞との融合によって形成され、Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応し、且つ不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を起すことができるモノクローナル抗体を分泌することを特徴とする、ハイブリドーマ細胞。
　４．Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応し、且つ不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を起すことができるモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、血漿中のＣ反応性蛋白質の免疫定量法。」と訂正する。
（５４）【発明の名称】
Ｃ反応性蛋白質に対するモノクローナル抗体
（５７）【特許請求の範囲】
　１．　Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応
し、且つ不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を起すことができる
　２．　不溶性担体に固定させることにより、
１種類のみで
　３．　Ｃ反応性蛋白質で免疫したマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞との融合によって形成され、Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応
し、且つ不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を起すことができる
　４．　Ｃ反応性蛋白質の側面に特異的に反応
し、且つ不溶性担体に固定化した場合に１種類のみで凝集反応を起すことができる
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
　この発明は、Ｃ反応性蛋白質と特異的に反応する新規モノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞、およびそのモノクローナル抗体を用いる免疫定量法に関する。
〔従来の技術〕
　Ｃ反応性蛋白質（略称ＣＲＰ）は急性期蛋白質の一種であって、組織破壊を伴うような炎症性疾患等の際には血中濃度が急増するが、正常人血中には微量（１μｇ／ｍｌ以下）しか認められないので、各種の化膿症やリウマチ性疾患等の診断に広く利用されている。このＣＲＰは、第１図に示すように、５つの円盤状サブユニット（分子量約２１，０００）からなる５量体であり、ＣＲＰに対するモノクローナル抗体としては既に２種類のものが製作されている（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ　１３１，２４１１−２４１５）。すなわち、円盤状サブユニットの円形上面（第１図のＡ面：以下単にＡ面と称することがある）には特異的に反応するが円盤状サブユニットの円形底面（第１図のＢ面：以下単にＢ面と称することがある）には反応しないモノクローナル抗体、及び円盤状サブユニットの円形底面（Ｂ面）には特異的に反応するが円盤状サブユニットの円形上面（Ａ面）とは反応しないモノクローナル抗体である。しかしながら、前者のモノクローナル抗体又は後者のモノクローナル抗体のいずれか一方を不溶性担体に結合させてからＣＲＰ含有試料と混合しても凝集反応を起こさない。従って、上記の公知モノクローナル抗体を用いてＣＲＰを定量する場合には、両方のモノクローナル抗体を利用したサンドイッチアッセイ等を用いることが必要であった。
〔発明が解決しようとする課題〕
　本発明者は、１種類のモノクローナル抗体だけを用いてＣＲＰと凝集反応を起こさせることを目標にして研究を行ったところ、従来公知のモノクローナル抗体とは別異の部位でＣＲＰの円盤状サブユニットと特異的に反応する新規モノクローナル抗体を見出し、このモノクローナル抗体が前記の目的を達成することを見出した。従って、本発明の目的は、前記の新規モノクローナル抗体、そのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、及びそのモノクローナル抗体を用いる免疫定量法を提供することにある。
〔課題を解決するための手段〕
　前記の目的は、本発明により、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）の側面に特異的に反応するモノクローナル抗体、すなわち、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）において円盤状サブユニットの側面（第１面のＣ面：以下単にＣ面と称することがある）に特異的に反応するモノクローナル抗体によって達成される。
　更に前記の目的は、本発明により、不溶性担体に固定させることにより、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）との間で抗原抗体反応に基づく凝集反応を起すことのできるモノクローナル抗体によって達成することができる。ＣＲＰの側面に特異的に反応する前記のモノクローナル抗体は、これを不溶性担体に固定させるとＣＲＰとの間で凝集反応を起こすことができる。
　更に本発明は、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）で免疫したマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞との融合によって形成され、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）の側面に特異的に反応するモノクローナル抗体を分泌することを特徴とする、ハイブリドーマ細胞にも関する。
　更に本発明はＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）の側面に特異的に反応するモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、血漿中のＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）の免疫定量法にも関する。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　ＣＲＰに対するモノクローナル抗体である本発明による抗ＣＲＰモノクローナル抗体は、新規なマウス・ハイブリドーマ細胞をイン・ビトロ（例えば培地中）またはイン・ビボ（例えばマウスの腹腔内）で培養することによって製造することができる。
　ここで用いるマウス・ハイブリドーマ細胞は、一般的にはＣＲＰで免疫したマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とを、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方法〔Ｎａｔｕｒｅ，第２５６巻４９５頁（１９７５年）参照〕により細胞融合して製造することが可能である。
　また、上記のハイブリドーマ細胞を培養する培地としては、ハイブリドーマ細胞の培養に適した任意の培地を用いることができ、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ；以下ＤＭＥと記す。）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸および抗生物質（ペニシリンＧとストレプトマイシン）を含む培地が用いられる。
　上記のハイブリドーマ細胞の培養は、イン・ビトロの場合には例えば培地中で５％ＣＯ２濃度および３７℃で約３日間、またイン・ビボ例えばマウスの腹腔内で培養する場合には約１４日間実施する。
　このようにして製造された培養液またはマウスの腹水からモノクローナル抗体を分離、精製する場合には、蛋白質の単離、精製に一般的に用いられる方法を用いることが可能である。そのような方法としては、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、凍結乾燥の方法等がある。
　このようにして得られた抗ＣＲＰモノクローナル抗体は、他の血漿蛋白とは反応しないで、ＣＲＰとだけ特異的に結合する能力を有する。しかも、この発明による抗ＣＲＰモノクローナル抗体は円盤状サブユニットの円形上面（Ａ面）又は円形底面（Ｂ面）とは反応せず、側面（Ｃ面）とのみ特異的に反応する。更に、この抗ＣＲＰモノクローナル抗体は、これを不溶性担体に固定させると、ＣＲＰとの間で凝集反応を起こすことができるので、ＣＲＰの免疫定量用試薬として有用である。例えば、凝集反応によるＣＲＰ定量法はこの発明による抗ＣＲＰモノクローナル抗体１種類のみを用い、これを公知の化学結合法（架橋剤としてカルボジイミド、グルタルアルデヒド等を用いる）又は物理吸着法によって、通常用いる不溶性担体〔例えばラテックス（例えばポリスチレンラテックス粒子）〕に結合させて複合体を形成する。この抗ＣＲＰモノクローナル抗体結合不溶性担体複合体の既知一定量と未知量のＣＲＰを含有する水性試料（例えば血清、血漿、尿）の一定量とを、適当な反応容器例えばスライド板上あるいは反応セル中で接触させる。こうして形成される凝集の程度からＣＲＰ濃度の定量を行うことができる。例えばスライド板の場合には目視的に、反応セルの場合は特定の波長を用いて分光学的に凝集反応を測定し、被検試料中のＣＲＰ濃度を定量することができる。
　また、この発明の抗ＣＲＰモノクローナル抗体と別異の抗ＣＲＰモノクローナル抗体（例えば円盤状サブユニットの円形上面又は円形底面と特異的に反応するモノクローナル抗体）とを用いて各種のＣＲＰ含有水性試料の免疫定量法を実施することができる。
〔実施例〕
　次に、この発明を実施例により更に詳細に説明するが、この発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
実施例１
　（ａ）免疫化した脾臓細胞の調製：
　ＣＲＰ免疫原溶液〔ペルフリーズ社（米国）〕（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量のフロインド氏完全アジュバントと乳化するまで混合し、その混合液２００μｌをマウス腹腔内に投与することにより免疫を行なった（第１回免疫）。３０日経過後、該マウスに上記と同様の混合液２００μｌをマウス腹腔内に投与した（第２回免疫）。第２回免疫から２１日経過後、ＣＲＰ免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量の生理食塩水で希釈し、その希釈液２００μｌを、該マウスの静脈内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、脾臓を無菌的にマウスから取り出し、次の細胞融合工程に使用した。
　（ｂ）細胞融合：
　無菌的に摘出した上記の脾臓を、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地５ｍｌを入れたシャーレに入れた。次に、脾臓を１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍｌで還流して脾臓細胞を流出させた後、この脾臓細胞懸濁液をナイロンメッシュに通した。この脾臓細胞を５０ｍｌ遠心チューブに集め、５００×ｇで１０分間遠心した。こうして得たペレットにヘモライジング溶液（１５５ｍＭ　ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ　ＫＨＣＯ３、１ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ　ｐＨ　７．０）４ｍｌを加え、懸濁させた。０℃で５分間放置して懸濁液中の赤血球を破壊させた。１５％ウシ胎児血清１０ｍｌを含むＤＭＥ培地を加えてから遠心分離した。こうして得た細胞ペレットをＤＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生きている脾臓細胞数を測定した。
　一方、予め培養しておいたマウスミエローマ細胞（骨髄腫細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（理化学研究所ジーンバンク細胞銀行）約２×１０７個に上記脾臓細胞１×１０８個を加え、ＤＭＥ培地中でよく混合し、遠心分離を行なった（５００×ｇ、１０分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、４０％ポリエチレングリコール４０００溶液（３８℃に保温）０．５ｍｌを滴下し、遠心チューブを手で１分間穏やかに回転することによってポリエチレングリコール溶液と細胞ペレットを混合させた。次に３８℃に保温しておいたＤＭＥ培地を３０秒毎に１ｍｌ加えて、チューブを穏やかに回転させた。この操作を１０回繰返した後、１５％ウシ胎児血清２０ｍｌを含むＤＭＥ培地を加えて、遠心分離（５００×ｇ、１０分間）を行なった。上清を除去した後、細胞ペレットを１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にアミノプテリン４×１０−７Ｍ、チミジン１．６×１０−５Ｍ、ヒポキサンチン１×１０−４Ｍになるように添加したもの）で、遠心法によって２回洗浄後、４０ｍｌの上記ＨＡＴ培地に懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウエル細胞培養プレートの各ウエルに２００μｌずつ分注し、３７℃、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で各ウエルの培地を約１００μｌ除き、新たに上記のＨＡＴ培地１００μｌを加えることによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを選択した。８日目から１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６×１０−５Ｍ、ヒポキサンチン１×１０−４Ｍになるように添加したもの）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するとともに、１０日目に、下述のＥＬＩＳＡ法により、ＣＲＰ抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。
　（ｃ）ハイブリドーマの樹立
　ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無はＥＬＩＳＡ法により測定した。９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（ＩｍｍｕｌｏｎＩＩ、日本ダイナテック株式会社）の各ウエルに、前述のＣＲＰ免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．０５、生理食塩水で希釈した）５０μｌずつを分注し、２５℃で２時間放置した。次に、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０−生理食塩水で３回洗浄し後、各ウエルに培養上清５０μｌを加え、２５℃で１時間反応させた。
　次に、Ｔｗｅｅｎ　２０−生理食塩水で２００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（ダコ社、デンマーク）５０μｌを各ウエルに加えた。反応終了後、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０−生理食塩水で各ウエルを３回洗浄し、０．５ｍＭアミノアンチピリン、１０ｍＭフェノール及び０．００５％過酸化水素水を含む溶液２５０μｌを各ウエルに加え、２５℃で３０分間反応させ、各ウエルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、１９２ウエル中４ウエルに抗体産生が認められた。その４ウエル中の各ハイブリドーマを２４ウエルプレートに写し、１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地で４〜５日間培養した。その後、再度ＥＬＩＳＡ法によって抗ＣＲＰ抗体の産生の有無を確認してから限界希釈法によりクローニングした。限界希釈法は、ＨＴ培地でハイブリドーマが５個／ｍｌとなるように希釈した細胞浮遊液を、予め正常ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔細胞がウエルあたり２×１０４個分注してある９６ウエルプレートの各ウエルに１００μｌずつ分注した。１０日後、ＥＬＩＳＡ法によって抗ＣＲＰ特異的抗体を産生するハイブリドーマのクローンをスクリーニングした。その結果、各ハイブリドーマにつき、２０〜４０個の抗体産生クローンが得られた。これらのクローンの中から、増殖のよい、抗体分泌能の高い、しかも安定なクローンを選び、前述と同様の方法で再クローンを行い、抗ＣＲＰ特異的抗体産生ハイブリドーマＣＲＰ−１，ＣＲＰ−２，ＣＲＰ−３及びＣＲＰ−４を樹立した。これらのハイブリドーマは１９８９年４月１３日から工業技術院微生物工業技術院に寄託されている。寄託番号は以下のとおりである。
　　　　
ハイブリドーマ
　　　寄　託　番　号　　　
　　　　　ＣＲＰ−１　　　　微工研菌寄第１０６６１号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０６６１）
　　　　　ＣＲＰ−２　　　　微工研菌寄第１０６６２号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０６６２）
　　　　　ＣＲＰ−３　　　　微工研菌寄第１０６６３号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０６６３）
　　　　　ＣＲＰ−４　　　　微工研菌寄第１０６６４号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０６６４）
実施例２：モノクローナル抗体の製造
　（ａ）イン・ビトロ法
　マウスハイブリドーマＣＲＰ−１，ＣＲＰ−２，ＣＲＰ−３及びＣＲＰ−４を、それぞれ１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地で３７℃、５％二酸化炭素雰囲気中において７２〜９６時間培養した。培養物を遠心分離（１００００×ｇ、１０分）後、上清に固形の硫酸アンモニウムを５０％最終濃度になるように徐々に加えた。混合物を氷冷下で３０分間撹拌した後、６０分間放置し、遠心分離（１００００×ｇ、１０分）後、得られた沈渣を少量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量の１０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析した。これを、１０ｍＭリン酸緩衝液ですでに平衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに充填した。モノクローナル抗体の溶出は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の間で濃度勾配法により行なった。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析した。ウシ血清ＩｇＧを除くために、透析物をやぎ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムに通した。次に通過液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したプロテインＡ−セファロース４Ｂのカラムに充填した。カラムをｐＨ３．５の緩衝液で溶出して、精製した抗ＣＲＰ特異抗体ＣＲＰ−１（同様にしてＣＲＰ−２，ＣＲＰ−３及びＣＲＰ−４）の溶液を得た。
　（ｂ）イン・ビボ法
　プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍｌを１０〜１２週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与後１４〜２０日目のマウス腹腔内にインビトロで増殖させたハイブリドーマＣＲＰ−１，ＣＲＰ−２，ＣＲＰ−３又はＣＲＰ−４をマウス１匹あたり２×１０６細胞となるように接種した。
　各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから約１０〜１５ｍｌの腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜１０ｍｇ／ｍｌであった。覆腹中のモノクローナル抗体の精製は、上記のインビトロ精製法と同様の方法（但し、ヤジ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムを通す操作を除く）で行なった。
実施例３：モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス及び特異性の同定
　抗ＣＲＰ特異モノクローナル抗体ＣＲＰ−１，ＣＲＰ−２，ＣＲＰ−３及びＣＲＰ−４の免疫グロブリン・クラス及び特異性の同定はそれぞれオクテロニー免疫拡散法及びエンザイムイムノアッセイ法により行った。結果は表１に示す通りである。
実施例４：抗体と不溶性担体（ラテックス）との結合及び反応部位の確認
　ラテックス溶液（２％、Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社：粒径０．４８２μｍ）２ｍｌと、ＣＲＰ−１抗体２．０ｍｇ／ｍｌを含有する水溶液２ｍｌとを混合し、約１時間撹拌した。遠心後（２０，０００ｇ、１０分間）、沈殿を０．１％ＢＳＡ溶液に懸濁し、約１時間撹拌した。再び遠心（２０，０００ｇ、１０分間）した後、沈殿を水に懸濁し、約２時間撹拌した。こうして、ＣＲＰ−１抗体−ラテックス複合体含有液を得た。同様にしてＣＲＰ−２抗体、ＣＲＰ−３抗体及びＣＲＰ−４抗体を用いて複合体含有液を調製した。
　それとは別に、前述のＴｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌ　１３１，２４１１−２４１５）に準じて、ＣＲＰのＡ面に特異的に反応し、Ｂ面とは反応しないモノクローナル抗体（Ａ抗体）及びＣＲＰのＢ面に特異的に反応し、Ａ面とは反応しないモノクローナル抗体（Ｂ抗体）を調製し、上記操作と同様にして複合体含有液を得た。
　これら複合体含有液３０μｌと、２０μｇ／ｍｌのＣＲＰ含有液３０μｌとをスライドガラス上で混合し、凝集像を目視的に観察した。その結果、Ａ抗体及びＢ抗体においては凝集は認められず、それに対して本発明のＣＲＰ−１，２，３及び４の各抗体においては凝集が確認された。本発明のＣＲＰ−１，２，３及び４抗体は、従来のＡ面にのみ特異的な抗体及びＢ面にのみ特異的な抗体とは、明らかに異る性質であることがわかる。
　そこで、ＣＲＰのＡ面を対応する抗体でマスキングしたＣＲＰ　２０μｇ／ｍｌ含有液、及びＣＲＰのＢ面を対応する抗体でマスキングしたＣＲＰ　２０μｇ／ｍｌ含有液を調製し、これらの液３０μｌに、上記の抗体複合体含有液３０μｌを加え、スライドガラス上で混合したところ、本発明によるＣＲＰ−１，２，３及び４各抗体において、凝集が確認された。このことは、本発明の各抗体の特異的反応部位が、ＣＲＰのＡ面、及びＢ面とは異る部位であること、又、本発明の各抗体複合体において、ＣＲＰとの反応により凝集を示すことから、本抗体は、ＣＲＰの側面部位に特異的に反応していることを示唆するものである。
実施例５：スライド凝集反応による定量
　実施例４で調製した抗体−ラテックス複合体含有液３０μｌと種々な濃度のＣＲＰを含有する水溶液３０μｌとをスライドガラス上で混合し、揺動して３分後に凝集像を目視的に判定した。結果を以下の表２に示す。
表２において＋は凝集ありを、そして−は凝集なしを各々意味する。
実施例６：分光学的方法による測定
　実施例４で調製したモノクローナル抗体ＣＲＰ−１，ＣＲＰ−２，ＣＲＰ−３及びＣＲＰ−４で感作したラテックス（粒径０．４８２μｍ、ダウ社、ドイツ）を用い、自動分析機（注：一般名）（ＬＰＩＡ　Ｌ−１：三菱化成社）によって凝集反応速度のヒトＣＲＰ濃度依存性を調べた。ヒトＣＲＰとしてはペルフリーズ社（アメリカ）から市販のものを用い、濃度０．０４μｇ／ｍｌ〜８０μｇ／ｍｌのヒトＣＲＰを含有する１２種の水溶液を調製した。結果を第２図に示す。第２図から明らかなように、４種類のラテックスの各々は、ＣＲＰ濃度に依存した凝集反応速度（Ｖ値：単位時間当りの透過度変化）を示した。
【図面の簡単な説明】
　第１図はＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）の構造を模式的に示す説明図であり、第２図は凝集反応速度とＣＲＰ濃度との関係を示すグラフである。