(57)【要約】ヒトの肺組織より構成細胞を単離抽出する工程、及び、得られた単離細胞より肺組織幹細胞を分離培養する工程を含む、II型肺胞上皮細胞マーカー及び幹細胞マーカーを同時に発現する細胞の調製方法、該調製方法によって得られた、肺胞上皮細胞に分化することが出来るヒト肺組織幹細胞、該ヒト肺組織幹細胞を培養することから成る、ヒト肺上皮細胞への分化誘導方法、該分化誘導方法によって調製されたヒト肺胞上皮細胞、該ヒト肺組織幹細胞又はヒト肺胞上皮細胞を用いることを特徴とする、スクリーニング方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの肺組織より構成細胞を単離抽出する工程、及び、得られた単離細胞より肺組織幹細胞を分離培養する工程を含む、II型肺胞上皮細胞マーカー及び幹細胞マーカーを同時に発現する細胞の調製方法。
【請求項２】
該細胞がSP-C+/CD90+細胞である、請求項１記載の調製方法。
【請求項３】
該細胞がヒト肺胞上皮細胞に分化することが出来るヒト肺組織幹細胞であることを特徴とする、請求項１又は２記載の調製方法。
【請求項４】
単離抽出する工程において、ヒトの肺組織から胸膜を剥離除去した後、肺組織内へ中性プロテアーゼ溶液を注入し、その後、コラゲナーゼ、中性プロテアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼを含む溶液中で細胞を溶解することを含む、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項５】
ヒト肺組織幹細胞を分離培養する工程において、マウス胎児線維芽細胞から成るフィーダー細胞を用いて培養することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製方法によって得られた、ヒト肺胞上皮細胞に分化することが出来るヒト肺組織幹細胞、又は、該細胞を継代培養して得られるヒト肺組織幹細胞。
【請求項７】
請求項６記載のヒト肺組織幹細胞を培養することから成る、ヒト肺上皮細胞への分化誘導方法。
【請求項８】
再構成基底膜組成物を用いる培養によって、I型肺胞上皮細胞が再構成基底膜組成物内部に、II型肺胞上皮細胞が再構成基底膜組成物下部から得られることを特徴とする、請求項７記載の分化誘導方法。
【請求項９】
再構成基底膜組成物がマウス肉腫から抽出した可溶性基底膜調製品である、請求項７又は８記載の分化誘導方法。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の分化誘導方法によって調製されたヒト肺胞上皮細胞、又は、該ヒト肺胞上皮細胞を継代培養して得られるヒト肺胞上皮細胞。
【請求項１１】
請求項５記載のヒト肺組織幹細胞又は請求項９記載のヒト肺胞上皮細胞を用いることを特徴とする、スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト肺組織幹細胞の調製方法及びヒト肺胞上皮細胞への分化誘導方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、人工多能性幹細胞（Induced Pluripotent Stem Cell）、即ち、iPS細胞が開発され、患者固有の遺伝情報を持つ幹細胞樹立が可能となった（特許文献１及び２）。このiPS細胞を用いることにより、難治性疾患に対する新たな病態解明・創薬につなげることが出来るのではないかと大きな期待が持たれている。実際に、筋ジストロフィーなど難治性疾患症例よりiPS細胞が樹立され、病態解明へ向けた研究が世界的に進められている。iPS細胞は遺伝子が主たる要因となる疾患の解明には大きな力を発揮する。【０００３】
しかしながら、多くの疾患の発症には「遺伝」的因子の他に、「環境」及び「加齢」の因子が大きくかかわっている。 iPS細胞の樹立には所謂「山中因子」導入による細胞の初期化を必要とするために「環境」又は「加齢」によって生じたエピジェネティックな情報は失われてしまう。そのため、各臓器より組織固有の幹細胞を抽出し、このエピジェネティックな情報を残したまま解析することは、高齢者疾患に多い「環境」「加齢」因子による疾患に対する病態解明・創薬に極めて重要である。つまり、このような組織幹細胞はiPS細胞でカバーできない部分を埋める重要な鍵を握るものである。【０００４】
ところで、組織の修復・再生には、組織固有の幹細胞・前駆細胞の適切な増殖と分化が必要である。肺胞上皮の修復過程では、II型肺胞上皮細胞 (II型細胞) はI型肺胞上皮細胞 (I型細胞) の前駆細胞として機能する。すなわち，肺損傷後，増殖したII型細胞は，I型細胞へと分化することによって、損傷をうけた上皮を覆っていくと考えられている(非特許文献１〜６)。しかしながら、II型細胞は自己複製能と多分化能を有する幹細胞とは考えられていない。【０００５】
近年，マウス肺では自己複製能と細気管支のクララ細胞、I型及びII型細胞への分化能をもつ幹細胞 (Bronchioalveolar Stem Cells, BASCs) が同定された(非特許文献７)。また、本発明者等は、マウス肺損傷モデルにおいて、肺組織幹細胞マーカーを発現する幹細胞群が損傷後に増殖し，肺胞上皮への修復過程に関与することを報告した(非特許文献８及び９)。【０００６】
更に、これまでに、ヒト肺組織由来の幹細胞としては線維芽細胞様の間葉系幹細胞が報告されている（非特許文献１０）のみであり、ヒト肺組織から肺胞上皮細胞に分化できる幹細胞の報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第4183742号明細書
【特許文献２】特開2008-307007号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Adamson, I.Y., and Bowden, D.H. 1974. The type 2 cell as progenitor of alveolar epithelial regeneration. A cytodynamic study in mice after exposure to oxygen. Lab Invest 30:35-42.
【非特許文献２】Evans, M.J., Cabral, L.J., Stephens, R.J., and Freeman, G. 1975. Transformation of alveolar type 2 cells to type 1 cells following exposure to NO2. Exp Mol Pathol 22:142-150.
【非特許文献３】Aso, Y., Yoneda, K., and Kikkawa, Y. 1976. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice. Lab Invest 35:558-568.
【非特許文献４】Anderson, W.R., and Thielen, K. 1992. Correlative study of adult respiratory distress syndrome by light, scanning, and transmission electron microscopy. Ultrastruct Pathol 16:615-628.
【非特許文献５】Ware, L.B., and Matthay, M.A. 2000. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med 342:1334-1349.
【非特許文献６】Kawanami, O., Ferrans, V.J., and Crystal, R.G.  1982. Structure of alveolar epithelial cells in patients with fibrotic lung disorders. Lab Invest 46:39-53.
【非特許文献７】Kim, C.F., Jackson, E.L., Woolfenden, A.E., Lawrence, S., Babar, I., Vogel, S., Crowley, D., Bronson, R.T., and Jacks, T. 2005. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung cancer. Cell 121:823-835.
【非特許文献８】Kubo, H., Hegab, A.E., He, M., Ishizawa, K., and Yamada, M. 2008. Endogenous lung stem cells increased after lung injury. Proc Am Thorac Soc 5:362-363.
【非特許文献９】Hegab, A.E., Kubo, H., Yamaya, M., Asada, M., He, M., Fujino, N., Mizuno, S., and Nakamura, T. 2008. Intranasal HGF administration ameliorates the physiologic and morphologic changes in lung emphysema. Mol Ther 16:1417-1426.
【非特許文献１０】Lama, V.N., Smith, L., Badri, L., Flint, A., Andrei, A., Murray, S., Wang, Z., Liao, H., Toews, G.B., Krebsbach, P.H., Peters-Golden, M., Pinsky, D.J., Martinez, F.J., and Thannickal, V.J. 2007. Evidence for tissue-resident mesenchymal stem cells in human adult lung from studies of transplanted allografts. J Clin Invest 117:989-996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
肺胞上皮系に分化できる幹細胞は肺傷害後の組織修復に関与する細胞であるので、再生医療等の臨床上も非常に重要な細胞である。更に、このような細胞はヒト肺組織幹細胞を同定する新たなマーカー発見の材料としても有用であり、この細胞の分化シグナル等を解析することによって、新たな創薬につなげられると考える。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
今回、本発明者は、ヒトの成人末梢肺組織中に肺胞上皮系への分化を示す幹細胞が存在することを初めて見出し、かかるヒト肺幹細胞の分離同定，培養法，肺胞上皮への分化誘導法を確立することに成功し、本発明を完成した。【００１１】
即ち、本発明は以下の各態様に係るものである。【００１２】
（態様１）ヒトの肺組織より構成細胞を単離抽出する工程、及び、得られた単離細胞より肺組織幹細胞を分離培養する工程を含む、II型肺胞上皮細胞マーカー及び幹細胞マーカーを同時に発現する細胞の調製方法。
（態様２）上記の調製方法によって得られた、ヒト肺胞上皮細胞に分化することが出来るヒト肺組織幹細胞、又は、該細胞を継代培養して得られるヒト肺組織幹細胞。
（態様３）上記のヒト肺組織幹細胞を培養することから成る、ヒト肺上皮細胞への分化誘導方法。
（態様４）上記の分化誘導方法によって調製されたヒト肺胞上皮細胞、又は、該ヒト肺胞上皮細胞を継代培養して得られるヒト肺胞上皮細胞。
（態様５）上記のヒト肺組織幹細胞又はヒト肺胞上皮細胞を用いることを特徴とする、スクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、ヒトの成人末梢肺組織中に肺胞上皮系への分化を示す、II型肺胞上皮細胞マーカー及び幹細胞マーカーを同時に発現する細胞、例えば、SP-C+/CD90+細胞であるヒト肺幹細胞の分離同定・培養等を含む調製方法、及び、該ヒト肺組織幹細胞から肺胞上皮への分化誘導方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒト肺における肺胞上皮の表現型をもつ間葉系幹細胞様の細胞群の存在を示すグラフ及び写真。
【図２】SP-C+/CD90+細胞はin vitroで自己複製能を有することを示すグラフ及び写真。
【図３】SP-C+/CD90+細胞がin vitroで肺胞上皮細胞への分化能を有することを示すグラフ及び写真。
【図４】SP-C+/CD90+細胞が肺胞壁に存在することを示すグラフ及び写真。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の第一の態様は、ヒトの肺組織より構成細胞を単離抽出する工程、及び、得られた単離細胞より肺組織幹細胞を分離培養する工程を含む、II型肺胞上皮細胞マーカー及び幹細胞マーカーを同時に発現する細胞、例えば、SP-C+/CD90+細胞の調製方法に係る。本願明細書の実施例で示されるように、このようなSP-C+/CD90+細胞は、自己複製能に加えて、本発明による分化誘導方法によってI型肺胞上皮細胞及びII型肺胞上皮細胞に分化する分化能を有する、ヒト肺組織幹細胞である。
【００１６】
単離抽出する工程における好適な方法として、ヒトの肺組織から胸膜を剥離除去した後、肺組織内へ、例えば、Bacillus polymyxa由来の酵素（EC 3.4.24.4）であるDispase II又は Dispase I（登録商標：Roche Applied Science，Mannheim，Germany）又はDISPASE（登録商標：合同酒精（株））等の適当な中性プロテアーゼの溶液を注入し、その後、コラゲナーゼ、該中性プロテアーゼ、及び、デオキシリボヌクレアーゼI及びデオキシリボヌクレアーゼII等のエンドヌクレアーゼのような適当なデオキシリボヌクレアーゼを含む溶液中でインキュベートすることを含む方法を挙げることが出来る。特に、肺組織内へ注入する中性プロテアーゼとしてDispase II、細胞を溶解するための中性プロテアーゼとしてはDISPASE, デオキシリボヌクレアーゼとしてはデオキシリボヌクレアーゼIを使用することが好ましい。
【００１７】
更に、肺組織幹細胞を分離培養する工程において、例えば、当業者に公知の任意の方法で調製されるフィーダー細胞、特に、C57BL/6マウス胎児線維芽細胞から成るフィーダー細胞を用いて培養することが好ましい。市販されている適当なフィーダー細胞を使用することも出来る。又、２継代目以降の培養に際しては、フィーダー細胞を用いずに、フィーダー細胞馴化培地を使用することができる。尚、上記分離培養工程の前に、得られた単離細胞から当業者に公知の任意の方法で血球系細胞（例えば、CD45陽性細胞）を除去することが好ましい。ヒトの肺組織は、患者への事前承諾等を得た上で、手術の際に切除した組織の一部等から入手することが出来る。
【００１８】
本発明方法によって調製して得られたヒト肺組織幹細胞は、本明細書の実施例に記載のような、当業者に公知の任意の方法で継代培養することによって、多分化能を維持しつつ、自己複製（増殖）させることが可能である。従って、本発明の第二の態様は、かかる調製方法によって得られた、肺胞上皮細胞に分化することが出来、且つ、自己複製能を有するヒト肺組織幹細胞、例えば、SP-C+/CD90+細胞、又は、該細胞を適当な期間、継代培養して得られるヒト肺組織幹細胞に係る。
【００１９】
本発明の第三の態様としては、上記のヒト肺組織幹細胞を培養することから成る、ヒト肺上皮細胞への分化誘導方法に係る。再構成基底膜組成物を用いて培養することによって、I型肺胞上皮細胞が再構成基底膜組成物内部に、II型肺胞上皮細胞が再構成基底膜組成物下部から得られることができる。
【００２０】
ここで、「再構成基底膜組成物」とは、in vivoで細胞層下に存在する薄い膜状の細胞外マトリックスに含まれる、ラミニン、コラーゲンIV、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等のタンパク質及び糖タンパク質、及び、各種細胞増殖因子、活性化因子等を含む、適当な細胞組織から抽出・調製して得られるものである。例えば、マトリゲル（登録商標）（Matrigel, BD Biosciences)のようなマウス肉腫から抽出した可溶性基底膜調製品を挙げることができる。このような再構成基底膜組成物としては、当業者に公知の物質を使用することが出来る。
【００２１】
本発明の第四の態様は、かかる分化誘導方法によって得られた、I型肺胞上皮細胞又はII型肺胞上皮細胞である。尚、本発明方法によって分化誘導されたヒト肺上皮細胞は、当業者に公知の任意の方法で適当な期間、継代培養することができる。従って、本発明は、このように継代培養して得られるヒト肺胞上皮細胞にも係る。
【００２２】
尚、本発明の調製方法、分化誘導方法、及び、継代培養におけるその他の条件・手段等は当業者に公知の任意のものを適宜選択することが出来る。
【００２３】
本発明の第五の態様は、かかるヒト肺組織幹細胞又はヒト肺胞上皮細胞を用いることを特徴とする、各種のスクリーニング方法に係る。例えば、ヒト肺組織幹細胞の分化誘導を促進・阻害する物質のスクリーニング方法に有利に使用することが出来る。
【００２４】
本発明のスクリーニングは当業者に公知の任意の方法で行うことが出来る。
【００２５】
本発明のスクリーニング方法は、例えば、以下の工程で実施することが出来る。
(a)ヒト肺組織幹細胞又はヒト肺胞上皮細胞に被検物質を接触させる工程、
(b)該細胞における分化誘導を観察又は測定する工程、及び
(c)該分化誘導を促進又は阻害する物質を選択する工程、を含む前記方法。
【００２６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。又、特に記載のない場合には、以下の実施例は、当該技術分野における常法及び当業者に公知の標準的な方法に従い実施した。又、本明細書中に参考文献などとして引用された文献の記載内容は本明細書の開示内容の一部を構成するものである。
【実施例】
【００２７】
［方法］
ヒト肺細胞の分離：ヒト肺細胞は過去の報告(10)に従い、いくらかの改良を加え分離した。本操作はクリーンベンチ内で行い、使用される器具は事前にオートクレーブにて滅菌処理した。提供された肺組織をペニシリン (最終濃度100 単位／ml)、ストレプトマイシン (最終濃度100 μg/ml)、アンホテリシンB (最終濃度0.25 ug/ml、Invitrogen、Carlsbad、CA) を含むリン酸緩衝液 (PBS, 和光純薬、大阪、日本) にて洗浄した。胸膜を鈍的に剥離した後、肺組織を約1 cm x 1 cm x 1 cmに切離し、シリンジと27ゲージの針を用いてDispase II (最終濃度 2.0 U/ml、Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 2 mlを注入し、8 mlのDispase II、1 mlのCollagenase/Dispase (最終濃度1 mg/ml、Roche Applied Science)、1 mlのDeoxyribonuclease I (最終濃度0.1 mg/ml、Sigma-Aldrich, St. Luis, MO) をあらかじめ加えた50 mlのコニカルチューブへ移し、37℃で60分間振盪した。酵素処理した肺組織を剪刀にて鋭的に細切した後、18、20ゲージの針を各々3回通し、アンホテリシンB (最終濃度2.5 μg/ml) を添加した基本培地を10 ml加え、100 μmのセルストレイナー (BD Biosciences, San Jose, CA) を通し細胞懸濁液を作成した。基本培地はDulbecco’s Modified Eagle Medium、DMEM (Invitrogen)、10% ウシ胎児血清、FBS (Invitrogen)、1% アミノ酸 (Invitrogen)、ペニシリン (最終濃度100 単位/ml)、ストレプトマイシン (最終濃度 100 μg/ml、Sigma-Aldrich) より構成される。この細胞懸濁液を4℃、1500 rpmで5分遠心分離した後、上清を棄て、赤血球溶血緩衝液 (Roche Applied Science) 3 ml加え、室温で3分間反応させた。アンホテリシンBを添加した基本培地を10 ml加え、4℃、1500 rpmで5分遠心分離し、上清を棄てた後、再度同様の溶血反応を行った。 アンホテリシンB添加基本培地を10 ml加え、4℃、1500 rpmで5分遠心分離し上清を棄て、アンホテリシン添加基本培地10 mlを加え、40 umのセルストレイナー (BD Biosciences) を通し、単一細胞懸濁液を作成した。【００２８】
全肺細胞からの血球系細胞の除去：抗CD45抗体でコートされたマイクロビーズを用い、Magnetic Cell Sorting Systemにて全肺細胞からCD45陽性細胞を除去した (Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、Germany)。【００２９】
マウス胎児線維芽細胞の分離：妊娠13または14日の雌マウス (C57BL/6) を頸椎脱臼にて犠牲死させ70％エタノールにて洗浄した。ペニシリン (最終濃度100 単位／ml)、ストレプトマイシン (最終濃度100 μg/ml)、アンホテリシンB (最終濃度0.25 μg/ml、Invitrogen、Carlsbad、CA) を含むリン酸緩衝液 (PBS、和光純薬、大阪、日本) を5 ml入れたペトリ皿に、摘出した子宮を移した。胎児を胎盤より分離し、脳と心臓を切離した後、50 mlのコニカルチューブにいれ、0.25% トリプシン／EDTA (Sigma-Aldrich) 2 mlを加え、37℃で30分振盪した。トリプシンを不活化するため10 mlの基本培地を加え、剪刀にて細切した後、18、20ゲージの針をシリンジにて各々3回通し、100 μmのセルストレイナー (BD Biosciences) を通し細胞懸濁液を作成した。この細胞懸濁液を4℃、1500 rpmで5分遠心分離した後、上清を棄て、赤血球溶血緩衝液 (Roche Applied Science) 3 ml加え、室温で3分間反応させた。基本培地を10 ml加え、4℃、1500 rpmで5分遠心分離し、上清を棄てた後、再度同様の溶血反応を行った。基本培地を10 ml加え、4℃、1500 rpmで5分遠心分離し上清を棄て、基本培地10 mlを加え、40 μmのセルストレイナー (BD Biosciences) に通し、単一細胞懸濁液を作成した。1-2 x 106個の細胞を0。1% (w/v) のゼラチンでコートした10 cmの培養皿に播種し培養した。1-3継代の細胞を液体窒素に凍結保存した。【００３０】
フィーダー細胞の作成：フィーダー細胞はマイトマイシンCにて増殖を停止させたマウス胎児線維芽細胞である。2-4継代目のコンフルエントなマウス胎児線維芽細胞に基本培地で希釈した10 ug/mlのマイトマイシンC (Sigma-Aldrich) を加え、37℃で2時間培養しフィーダー細胞を作成した。フィーダー細胞は液体窒素に凍結保存した。【００３１】
肺組織幹細胞培養：フィーダー細胞を6ウエルプレート (BD Falcon) に、1 x 104 個/cm2 の密度で播種し24時間培養し、ウエルの底面に接着させた。血球系細胞を除去した肺細胞1-5 x 105 個/cm2 をフィーダー細胞でコートしたプレートに播種し、基本培地にて5％ CO2、37℃にて培養した。はじめの7日間は0.25 μg/mlのアンホテリシンBを添加した。紡錘形の細胞がコンフルエントになった後、0.25 %トリプシン／EDTA (Sigma-Aldrich) にて細胞を剥離し、フィーダー細胞でコートした10 cmの培養皿へ継代した。また、コロニーをピックアップして継代する場合は、0.01%トリプシン／EDTAを加え、紡錘形の細胞よりなるコロニーを27ゲージの針にて周囲から剥離しピペットにて吸引し、フィーダー細胞でコートした6ウエルプレートへ播種した。2継代目以降は、培養皿をフィーダー細胞でコートせず、培地としてフィーダー細胞馴化培地を使用した。フィーダー細胞馴化培地は、フィーダー細胞を基本培地で3日間培養した上清を0.45 μmのフィルターで濾過したものと基本培地を1:1で混合したものである。-80℃で凍結保存した。【００３２】
フローサイトメトリー：４〜５継代目の細胞について細胞表面または細胞内抗原をFACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences) にて解析した。抗体は以下のものを使用した。 FITC-labeled anti-human CD45, FITC-labeled anti-human CD105 (Biolegend, San Diego, CA), FITC-labeled anti-human CD31, PE-labeled anti-human CD73, APC-labeled anti-human CD90, PE-labeled anti-human c-kit  (BD Biosciences, San Jose, CA)、PE-labeled anti-human CD133/1 (Miltenyi Biotec、 Bergisch Gladbach、 Germany)、 rabbit anti-human pro SP-C polyclonal antibody  (Millipore Corporation, Billerica, MA) 、及び、 FITC-labeled goat anti-rabbit IgG as second antibody (Vector, Burlingame, CA)。細胞内蛋白を染色する場合は、fixation and permeabilization kitを使用した (Immunotech sas, Marseille Cesex 9, France)。正常ウサギIgG (1 μg/ul, Dako, Glostrup, Denmark) をSP-C染色のisotype controlとして用いた。【００３３】
蛍光免疫染色：５〜６継代目の細胞をカルチャースライドグラス (BD Falcon) 上にて培養した。ヒト肺組織はOCTコンパウンドに包埋し、凍結切片を作成した。3 μmの厚さでクライオスタットにて薄切した。いずれも、100% アセトンを用い-20℃で10分間固定した後、室温で30分間、5％ ヤギ血清でブロッキングを行った。 rabbit anti-human pro SP-C polyclonal antibody (1:1000、Millipore Corporation)、mouse anti-human CD90 antibody (1:50、Serotec) を4℃で一晩反応させ、2次抗体として、FITC-goat anti-rabbit IgG (1:100、Vector)、Alexa Fluora 647-goat anti-mouse IgG (1:100、Molecular Probe) を室温で30分反応させた。【００３４】
限界希釈法：1ウエルあたり、1、10または100個の細胞 (5継代目) を96ウエルプレート (Corning Incorporated、 Corning、 NY) へ播種し基本培地にて14日間培養した。X軸に1ウエルあたり播種した細胞の個数をプロットし、Y軸にコロニーが形成されなかったウエルの割合をプロットした。回帰直線を引き、Y軸の37%と対応するX軸の値から、1つのコロニー形成細胞を含む細胞の個数を求めた(11)。1ウエルあたり1細胞として播種したウエルより得られたコロニーは、継代しフィーダー馴化培地にて培養を継続した。7継代目の細胞について細胞表面および細胞内蛋白の表現型を決定し、凍結保存をした。【００３５】
肺胞上皮細胞への分化：肺胞上皮細胞への分化能を検討するため、1ウエルあたり1 x 106個の細胞 (５〜６継代目) を氷冷した基本培地1 mlに浮遊させ、Matrigel（登録商標） (BD Biosciences) 1 mlと氷上にてよく混合させ12ウエルプレートに播種し37℃で30分間かけてゲル化させた。その後、37℃に温めた基本培地1 mlを静かにMatrigel上に入れ、37℃で培養を続けた。7日後、Matrigel内とMatrigel下の細胞をそれぞれ分けて回収し、RNAを抽出した。Matrigel内の細胞は、冷却したPBS液でMatrigelを破砕し、そのPBSで洗浄、回収した。この操作では、Matrigel下の細胞は遊離しないため、次にMatrigel下の細胞をEDTA/Trypsin液で浮遊させ、回収した。【００３６】
統計解析：GraphPad Prism Ver 5。0b (GraphPad Software、 San Diego、 CA) を使用した。限界希釈法は、非線形回帰により回帰式、R2を求めた。年齢とSP-C+/CD90+細胞の割合との相関については、Spearmanの順位相関係数を求めた。【００３７】
［結果］
結果1：ヒト肺には、肺胞上皮の表現型をもつ間葉系幹細胞様の細胞群が存在する。
血球系細胞を除去したヒト肺構成細胞をフィーダー上で培養すると、紡錘形の細胞が増殖し、約7日後にコロニーを形成した (Fig. 1a)。これらの細胞は継代することができ、２〜３週後にはコンフルエントに達した。これらの細胞表面マーカーの発現をフローサイトメトリーにて解析した (Fig.1b)。多くの細胞が、ヒト間葉系幹細胞マーカーとして知られているCD73、CD90、CD105を発現していた(12)。血球および血管内皮のマーカーである、CD45、CD34、CD31及びVEGF receptor type 2の発現は認められなかった。また、組織幹細胞マーカーであるc-kit(13) およびCD133(14) の発現も認めなかった。以上のことから、得られた細胞群は間葉系幹細胞様の表面マーカーを有していた。CD90は、Thy-1とも呼ばれ、GPI結合膜蛋白であり、間葉系幹細胞だけでなく、CD34を発現する造血系幹細胞(15)や肝の幹細胞(16)のマーカーとして知られている。また、surfactant protein-C (SP-C) はII型肺胞上皮細胞に特異的に発現することが知られている(17)。そこで、得られた細胞群が肺胞上皮の表現型を有するかを検討するため、SP-CとCD90の二重染色を免疫蛍光抗体法にて行った (Fig. 1c)。SP-C/CD90両陽性細胞が認められ、SP-C (緑色) は細胞内に顆粒状に染色され、CD90 (赤色) は細胞膜に沿って部分的に染色された。そして、フローサイトメトリーでは、大部分の細胞がSP-C+/CD90+細胞であった (Fig.1d)。以上の検討から、ヒト肺には、II型肺胞上皮細胞のマーカーであるSP-Cと、幹細胞マーカーであるCD90を同時に発現する新規細胞群が存在することが明らかになった。【００３８】
結果2：SP-C+/CD90+細胞はin vitroで自己複製能を示す。
組織幹細胞は、その組織より分離され、自己複製能とより成熟した細胞への分化能を示す細胞と定義される(18)。我々は、SP-C+/CD90+細胞がヒト肺組織幹細胞の候補であると考え、まず自己複製能について検討した。Fig. 2aに示すように、限界希釈により得られた単一細胞から、10日後、コロニー形成が認められた。次に、SP-C+/CD90+細胞を多く含む細胞群に関し、コロニー形成能を有する細胞の頻度を決定するため、限界希釈法を行った (Fig.2b)。コロニー形成能をもつ細胞は、患者1、2では各々、細胞6、131個に1個の割合で含まれることが明らかになった。1ウエルに1個の細胞を播種したウエルよりできた2次コロニーについてフローサイトメトリーにてSP-C、CD90の発現を解析すると、Fig。 2cに示すように、元の細胞群と同様の発現パターンを示した。以上のことから、SP-C+/CD90+細胞はin vitroで自己複製能を示すことが示された。【００３９】
結果3：SP-C+/CD90+細胞はin vitroで肺胞上皮細胞への分化を示す。
SP-C+/CD90+細胞の肺胞上皮細胞への分化能を検討するため、SP-C+/CD90+細胞を多く含む細胞群をMatrigelにて7日間培養し、Matrigel内、Matrigel下の各々の細胞からRNAを抽出しRT-PCRにてmRNA発現の変化について検討した。Fig。3aに示すように、Matrigel内ではI型細胞のマーカーであるAQP5の発現が増強し、Matigel下ではII型細胞のマーカーであるSP-Cの発現が増強した。以上のことから、Matrigel内ではI型細胞へ、Matrigel下ではII型細胞への誘導が認められた。【００４０】
結果4：SP-C+/CD90+細胞は肺胞壁に存在する。
SP-C+/CD90+細胞の局在を決定するため、ヒト肺組織の凍結切片を作成し蛍光免疫染色を行った。Fig 4aに示すように、SP-C+/CD90+細胞は肺胞壁に存在した。共焦点レーザー顕微鏡による観察では、SP-Cは細胞内に染色され、CD90は細胞表面に部分的に認められ、ヒト肺より分離したSP-C+/CD90+細胞と同一の染色パターンを示した (Fig.4b)。SP-C+/CD90+細胞の割合を検討するため、血球系細胞を除去した後の肺細胞をフローサイトメトリーで解析した。Fig.4cに示すように、SP-C+/CD90+細胞は、0.45% ± 0.34% (mean ± S.D.) 含まれ、年齢と有意な逆相関を示すことが分かった (Fig. 4d)。以上の検討より、SP-C+/CD90+細胞は、肺胞壁に存在し、年齢とともに数の減少を認めることが明らかになった。【００４１】
［参考文献］
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【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明より、ヒト肺組織には、SP-C+/CD90+細胞が存在し、自己複製能と肺胞上皮細胞への分化能を示すヒト組織幹細胞であることが明らかになった。また、SP-C+/CD90+細胞は、年齢とともにその数が低下することが分かった。このような肺胞上皮系に分化できる幹細胞は肺傷害後の組織修復に関与する細胞であるので、再生医療等の臨床上も非常に重要な細胞である。更に、このような細胞はヒト肺組織幹細胞を同定する新たなマーカー発見の材料としても有用であり、本発明で得られたヒト組織幹細胞の分化シグナル等を解析することによって、新たな創薬を提供することが可能となる。
【図１】
2010119819.tif 000003
【図２】
2010119819.tif 000004
【図３】
2010119819.tif 000005
【図４】
2010119819.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成24年1月14日(2012.1.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの肺組織より構成細胞を単離抽出する工程、及び、得られた単離細胞より肺組織幹細胞を分離培養する工程を含む、II型肺胞上皮細胞マーカーSP-C及び幹細胞マーカーCD90を同時に発現し、ヒト肺胞上皮細胞に分化することが出来るヒト肺組織幹細胞の調製方法。
【請求項２】
単離抽出する工程において、ヒトの肺組織から胸膜を剥離除去した後、肺組織内へ中性プロテアーゼ溶液を注入し、その後、コラゲナーゼ、中性プロテアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼを含む溶液中で細胞を溶解することを含む、請求項１に記載の調製方法。
【請求項３】
ヒト肺組織幹細胞を分離培養する工程において、マウス胎児線維芽細胞から成るフィーダー細胞を用いて培養することを含む、請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の調製方法によって得られた、ヒト肺胞上皮細胞に分化することが出来るヒト肺組織幹細胞、又は、該細胞を継代培養して得られるヒト肺組織幹細胞。
【請求項５】
請求項４記載のヒト肺組織幹細胞を培養することから成る、ヒト肺上皮細胞への分化誘導方法。
【請求項６】
再構成基底膜組成物を用いる培養によって、I型肺胞上皮細胞が再構成基底膜組成物内部に、II型肺胞上皮細胞が再構成基底膜組成物下部から得られることを特徴とする、請求項５記載の分化誘導方法。
【請求項７】
再構成基底膜組成物がマウス肉腫から抽出した可溶性基底膜調製品である、請求項５又は６記載の分化誘導方法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の分化誘導方法によって調製されたヒト肺胞上皮細胞、又は、該ヒト肺胞上皮細胞を継代培養して得られるヒト肺胞上皮細胞。
【請求項９】
請求項４記載のヒト肺組織幹細胞又は請求項８記載のヒト肺胞上皮細胞を用いることを特徴とする、スクリーニング方法。
【国際調査報告】
2010119819.tif 000007
2010119819.tif 000008
2010119819.tif 000009
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