(57)【要約】本発明は、軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病、例えば関節炎、変形性関節症など、の予防または治療のための、より有効でしかも安全な薬剤を用いた治療を提供する。詳細には、本発明はフコイダンを有効成分として含む軟骨生成促進剤、グルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカン生成促進剤、および軟骨損傷に由来する疾病の予防または治療剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコイダンを有効成分として含有する軟骨生成促進剤。
【請求項２】
該フコイダンの分子量が８，０００〜４００，０００である、請求項１に記載の軟骨生成促進剤。
【請求項３】
該フコイダンの分子量が５０，０００〜１５０，０００である、請求項１に記載の軟骨生成促進剤。
【請求項４】
フコイダンを有効成分として含有する、グルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカン生成促進剤。
【請求項５】
該フコイダンの分子量が８，０００〜４００，０００である、請求項２に記載のグルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカン生成促進剤。
【請求項６】
該フコイダンの分子量が５０，０００〜１５０，０００である、請求項２に記載のグルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカン生成促進剤。
【請求項７】
フコイダンを有効成分として含有する、軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病を予防または治療するための医薬または獣医薬組成物。
【請求項８】
該フコイダンの分子量が８，０００〜４００，０００である、請求項７に記載の医薬または獣医薬組成物。
【請求項９】
該フコイダンの分子量が５０，０００〜１５０，０００である、請求項７に記載の医薬または獣医薬組成物。
【請求項１０】
軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病を予防または治療するための医薬または獣医薬組成物の製造におけるフコイダンの使用。
【請求項１１】
該フコイダンの分子量が８，０００〜４００，０００である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
該フコイダンの分子量が５０，０００〜１５０，０００である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病を予防または治療するために、動物対象に有効量のフコイダンを投与することを含む、方法。
【請求項１４】
該フコイダンの分子量が８，０００〜４００，０００である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該フコイダンの分子量が５０，０００〜１５０，０００である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、平成２１年３月２５日に日本国特許庁に出願された出願番号２００９−７３８５６号の優先権の利益を主張する。優先権基礎出願はその全体について、出典明示により本明細書の一部とする。【０００２】
本発明は、フコイダンを有効成分として含有する、軟骨生成促進剤、グルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカンの生成促進剤ならびに軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病の予防または治療剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
軟骨は軟骨基質と、その中に点在する軟骨細胞からなる組織である。軟骨基質は水、コラーゲン、プロテオグリカンなどから構成される。プロテオグリカンは、グルコサミノグリカンとよばれる多糖類および蛋白質より構成される複合体である。軟骨はその弾性により、生体内で様々な機能を果たしている。【０００４】
軟骨損傷に由来する疾病は変形関節症、関節炎、リウマチ等多岐にわたる。これらの疾病の治療剤として、グルコサミン（非特許文献１参照）、グルクロン酸（特許文献１参照）等多数の有効成分が知られている。【０００５】
フコイダンは、海藻（例えばもずく、マコンブ等）に含有される多糖類であり、これらの海藻類を喫食することにより、古くから摂取されてきたものである。フコイダンは、免疫賦活作用、癒着防止作用および抗炎症作用等多数の生理活性機能を有する（特許文献２、特許文献３等参照）ものである。【０００６】
また、特許文献４には、フコイダンが骨や軟骨の形成作用を促すとの記載がされている。しかしながら、特許文献４はあくまで骨形成促進剤の開示にとどまるものである。骨を誘導するには骨芽細胞が必要であり、軟骨を誘導するには軟骨芽細胞が必要である。骨芽細胞も軟骨芽細胞も未分化の細胞から異なった系で分化・誘導されるが、骨芽細胞と軟骨芽細胞は全く異なる細胞で性質、役割も異なる。骨芽細胞はＩ型コラーゲンを産生し、アルカリフォスファターゼ活性により石灰化を行い骨化する。軟骨芽細胞は軟骨細胞の前駆細胞でＩＩ型コラーゲンやグリコサミノグリカンを産生、軟骨細胞に分化・誘導される。この軟骨細胞は細胞周辺にプロテオグリカンを合成することにより骨芽細胞による石灰化・骨形成を阻止し、軟骨を形成する。軟骨の形成には骨化を阻止する必要があり、軟骨形成は軟骨細胞のプロテオグリカンの合成促進で骨の形成とは全く相違する生態現象である。すなわち、特許文献４には、フコイダンが軟骨形成促進を行うことと逆の作用が開示されている。【０００７】
特許文献４の実施例には、セルライン化した細胞に直接フコイダン等を投与した結果が示されている。しかしながら、経口摂取等の通常の投与形態では、フコイダンが直接骨芽細胞に接触することはあり得ない。すなわち、特許文献４には、実際の生体でフコイダンを投与した場合にどのような作用が得られるかは全く開示されていない。【０００８】
以上のように、フコイダン自体に軟骨生成促進作用があるとの知見は存在しない。
【特許文献１】特開２００４−１０５３３号公報
【特許文献２】特開２００５−８２８０６号公報
【特許文献３】特開２００５−５０８８９３号公報
【特許文献４】特開２００４−１０５３３号公報
【非特許文献１】ＴＡＭＡＩら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ、２００２、ｖｏｌ．４８、ｐ．３６９〜３７８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
関節症は患者数が多く、さらに日本では高齢化により、老人性関節症の患者数が今後さらに増加することが予想される。このような中で、軟骨損傷を修復できるより有用な治療剤への要望がいまだ存在している。また、このような治療剤は、安全で副作用がなく、日常的な摂取で疾病を予防できるものであればなお好ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、上記課題を解決しうる物質としてフコイダンを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）フコイダンを有効成分として含有する軟骨生成促進剤、
（２）該フコイダンの分子量が８，０００〜４００，０００である、（１）に記載の軟骨生成促進剤、
（３）該フコイダンの分子量が５０，０００〜１５０，０００である、（１）に記載の軟骨生成促進剤、
（４）フコイダンを有効成分として含有する、グルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカン生成促進剤、
（５）該フコイダンの分子量が８，０００〜４００，０００である、（２）に記載のグルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカン生成促進剤、
（６）該フコイダンの分子量が５０，０００〜１５０，０００である、（２）に記載のグルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカン生成促進剤、
（７）フコイダンを有効成分として含有する、軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病を予防または治療するための医薬または獣医薬組成物、
（８）該フコイダンの分子量が８，０００〜４００，０００である、（７）に記載の医薬または獣医薬組成物、
（９）該フコイダンの分子量が５０，０００〜１５０，０００である、（７）に記載の医薬または獣医薬組成物、
（１０）軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病を予防または治療するための医薬または獣医薬組成物の製造におけるフコイダンの使用、
（１１）該フコイダンの分子量が８，０００〜４００，０００である、（１０）に記載の使用、
（１２）該フコイダンの分子量が５０，０００〜１５０，０００である、（１０）に記載の使用、
（１３）軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病を予防または治療するために、動物対象に有効量のフコイダンを投与することを含む、方法、
（１４）該フコイダンの分子量が８，０００〜４００，０００である、（１３）に記載の方法、
（１５）該フコイダンの分子量が５０，０００〜１５０，０００である、（１３）に記載の方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、フコイダンを有効成分として含有する軟骨生成促進剤、グルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカンの生成促進剤、ならびに軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病の予防または治療剤が提供される。これらは、例えば、変形性関節症、老人性関節症、関節リウマチなどの予防および治療に有効である。さらにこれらは海藻に含まれる天然物質であるフコイダンを有効成分とするので、安全性が高く、副作用も見られない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、コントロール群、フコイダン投与群における損傷の治癒程度を目視により評価し、比較したものである。
【図２】図２は、コントロール群、フコイダン投与群の滑車溝近位をアルシアンブルー染色した結果を表す図である。１、２、３は各群のウサギの個体、上段がコントロール群、下段がフコイダン群を示す。
【図３】図３は、コントロール群、フコイダン投与群の滑車溝遠位をアルシアンブルー染色した結果を表す図である。１、２、３は各群のウサギの個体、上段がコントロール群、下段がフコイダン群を示す。
【図４】図４は、コントロール群、フコイダン投与群の滑車溝近位をサフラニン−Ｏ染色した結果を表す図である。１、２、３は各群のウサギの個体、上段がコントロール群、下段がフコイダン群を示す。
【図５】図５は、コントロール群、フコイダン投与群の滑車溝遠位をサフラニン−Ｏ染色した結果を表す図である。１、２、３は各群のウサギの個体、上段がコントロール群、下段がフコイダン群を示す。
【図６】図６は、損傷部位標本のアルシアンブルー染色画像およびサフラニン−Ｏ染色画像を解析した結果を表す図である。
【図７】図７は、コントロール群および分子量２３９，０００、３３０，０００のフコイダンを投与した損傷部位標本について、アルシアンブルー染色画像およびサフラニン−Ｏ染色画像を解析した結果を表す図である。
【図８】図８は、コントロール群、分子量の異なる各フコイダン投与群における損傷の治癒程度を目視により評価し、比較したものである。
【図９】図９は、コントロール群、分子量の異なる各フコイダン投与群における損傷部位標本のアルシアンブルー染色画像を解析した結果を表す図である。
【図１０】図１０は、コントロール群、分子量の異なる各フコイダン投与群における損傷部位標本のサフラニン−Ｏ染色画像を解析した結果を表す図である。
【図１１】図１１は、コントロール群、分子量８，０００および５０，０００の群の損傷部位をアルシアンブルー染色した結果を表す図である。下段は上段四角部分の拡大画像を示す。
【図１２】図１２は、分子量１４６，０００、２３９，０００および３３０，０００の群の損傷部位をアルシアンブルー染色した結果を表す図である。下段は上段四角部分の拡大画像を示す。
【図１３】図１３は、分子量４００，０００および１，０００，０００の群の損傷部位をアルシアンブルー染色した結果を表す図である。下段は上段四角部分の拡大画像を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明者らは、フコイダンが軟骨生成を促進し、軟骨の損傷を回復する機能を有することを見出した。さらに、フコイダンが軟骨基質中のグルコサミノグルカンおよびプロテオグリカンの生成を促進することを見出した。フコイダンは、海藻（例えばもずく、マコンブ等）に含有される多糖類であり、これらの海藻類を喫食することにより、古くから摂取されてきたものである。フコイダンは、免疫賦活作用、癒着防止作用および抗炎症作用等多数の生理活性機能を有するものであるが、フコイダン自体に軟骨生成促進作用があるとの知見は存在していない。【００１５】
本発明は第一の態様において、フコイダンを有効成分として含有する軟骨生成促進剤を提供する。【００１６】
本発明は第二の態様において、フコイダンを有効成分として含有するグルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカン生成促進剤を提供する。【００１７】
本発明は第三の態様において、フコイダンを有効成分として含有する、軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病の予防または治療剤を提供する。【００１８】
本発明の軟骨生成促進剤、グルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカンの生成促進剤、ならびに軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病の予防または治療剤は、軟骨損傷に関連する症状、例えば変形関節症、老人性関節症、関節リウマチ、変形性脊椎症、関節捻挫および靭帯損傷などの予防または治療に有用である。【００１９】
本発明の軟骨生成促進剤、グルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカンの生成促進剤、ならびに軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病の予防または治療剤において有効成分として用いられるフコイダンは、精製品であってもよく、粗精製品、例えばもずくなどの海藻からの抽出物であってもよい。海藻などのフコイダン含有素材からのフコイダンの抽出方法および手段は公知である。本発明に使用されるフコイダンは固体（例えば、粉末、顆粒など）、液体（例えば、フコイダン水溶液、フコイダン懸濁液、海藻からの抽出液など）、半固体（例えば、ペーストなど）のいずれであってもよい。本発明において、フコイダン含有素材が有効成分として含まれていてもよい。好ましいフコイダン含有素材の例としては、海藻類、とくに褐藻類が挙げられる。フコイダン含有褐藻類としては、もずく（例えば、沖縄もずく、糸もずくなど）、ワカメ、メカブ（ワカメの胞子葉）、アラメ、ガゴメ、マコンブ、クロメ、カジメ、ミツイシコンブ、ヨレモク、ヒジキ、ホンダワラ、ヤツマタモク、アカモク、ヒバマタ、ウミトラノオなどが例示されるが、これらに限定されない。【００２０】
本発明の軟骨生成促進剤、グルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカンの生成促進剤、ならびに軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病の予防または治療剤は医薬組成物の形態であってもよい。その投与方法は特に限定されず、経口、注射、経皮等いずれの方法であってもよいが、経口投与が好ましい。経口投与剤の場合、濃縮液、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤などの様々な経口用剤形に処方することができる。これらの剤形の製法は公知であり、混合、溶解、粉砕、打錠、乾燥等のプロセスを適宜用いることができ、目的に応じた担体や賦形剤を使用することができる。本発明の経口投与剤に香料、甘味料、着色料などを適宜添加してもよい。本発明の経口投与剤はそのまま投与することもできるが、有効成分であるフコイダンはそれ自体無味無臭であるので、飲食物、例えば、みそ汁、茶、その他の食べ物または飲料に本発明の経口投与剤を随意に添加して投与することもできる。【００２１】
本発明の軟骨生成促進剤、グルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカンの生成促進剤、ならびに軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病の予防または治療剤は飲食物の形態であってもよい。フコイダンはそれ自体無味無臭であるので、風味に影響することなく様々な飲食物を製造することができる。例えば、フコイダン粉末あるいはもずくなどからのフコイダン抽出物を添加したみそ汁やスープを製造することができる。また例えば、もずくなどからのフコイダン抽出物を濃縮してパックに詰める、あるいは凍結乾燥等の処理をして粉末あるいは顆粒などの形態にして適当な包装や容器に入れる等の処理加工を施して、利用者が自ら任意の飲食物に添加して摂取する形態としてもよい。【００２２】
さらに、本発明の軟骨生成促進剤、グルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカンの生成促進剤、ならびに軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病の予防または治療剤は、フコイダンまたはフコイダン含有素材を含むサプリメントであってもよい。サプリメントは当業者に公知の方法にて、錠剤、カプセル剤、顆粒、粉末などの形態にすることができる。このように、本発明の飲食物を用いれば、利用者または患者は抵抗なく日常的に長期間にわたりフコイダンを摂取することができ、上記疾病の予防および治療に資することができる。本発明の飲食物は機能性食品としても有用である。【００２３】
本発明の軟骨生成促進剤、グルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカンの生成促進剤、ならびに軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病の予防または治療剤の投与量は当業者が容易に決定することができる。例えば、変形性関節症、老人性関節症、関節リウマチなどの、目的とする疾病の予防または治療効果を観察しながら、投与されるフコイダンの量を決定することができる。本発明の剤により投与されるフコイダンの量（乾燥重量）は、成人の場合、通常１日に約０．３ｇまたはそれ以上、好ましくは約１ｇまたはそれ以上である。【００２４】
本発明の軟骨生成促進剤、グルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカンの生成促進剤、ならびに軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病の予防または治療剤には、フコイダンのみならず、１種またはそれ以上の他の有効成分が含まれていてもよい。他の有効成分の例としては、公知の抗炎症薬、その他軟骨損傷に由来する疾病の治療剤（例えばグルコサミンなど）、などが挙げられる。【００２５】
さらに本発明は、軟骨生成促進剤、グルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカンの生成促進剤、ならびに軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病の予防または治療剤の製造におけるフコイダンの使用を提供する。【００２６】
本発明は他の態様において、フコイダンを有効成分として含有する軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病を予防または治療するための獣医薬を提供する。当該獣医薬は獣医薬組成物の形態であってもよい。その投与方法は特に限定されず、経口、注射、経皮等いずれの方法であってもよいが、経口投与が好ましい。経口投与剤の場合、濃縮液、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤などの様々な経口用剤形に処方することができる。これらの剤形の製法は公知であり、混合、溶解、粉砕、打錠、乾燥等のプロセスを適宜用いることができ、獣医薬上許容される担体や賦形剤を使用することができる。本発明の経口投与剤に香料、甘味料、着色料などを適宜添加してもよい。当該獣医薬には、フコイダンのみならず、１種またはそれ以上の他の有効成分が含まれていてもよい。他の有効成分の例としては、公知の抗炎症薬、その他軟骨損傷に由来する疾病の治療剤（例えばグルコサミンなど）、などが挙げられる。【００２７】
さらに本発明は、軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病を予防または治療するための獣医薬の製造におけるフコイダンの使用を提供する。【００２８】
さらに本発明は、ヒトを含むまたは含まない動物対象における軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病の予防または治療のための方法であって、該動物に有効量のフコイダンを投与することを含む方法を提供する。【００２９】
本発明の有効成分としてのフコイダンの好ましい分子量範囲は８，０００〜１，０００，０００であり、例えば８，０００〜２５０，０００、２５０，０００〜５００，０００、５００，０００〜７５０，０００、７５０，０００〜１，０００，０００、８，０００〜３５０，０００、３５０，０００〜１，０００，０００、５０，０００〜１，０００，０００、１５０，０００〜１，０００，０００、２５０，０００〜１，０００，０００、４００，０００〜１，０００，０００などである。より好ましい分子量範囲は８，０００〜４００，０００であり、例えば、８，０００〜１５０，０００、１５０，０００〜２５０，０００、２５０，０００〜３５０，０００、３５０，０００〜４００，０００、５０，０００〜３５０，０００、５０，０００〜４００，０００、１５０，０００〜３５０，０００、１５０，０００〜４００，０００、２５０，０００〜４００，０００などである。さらに好ましい分子量範囲は８，０００〜２５０，０００であり、例えば、８，０００〜５０，０００、５０，０００〜１００，０００、１００，０００〜２００，０００、８，０００〜１５０，０００、１５０，０００〜２５０，０００、５０，０００〜２５０，０００などである。そのうえさらに好ましい分子量範囲は５０，０００〜１５０，０００であり、例えば５０，０００〜１００，０００、１００，０００〜１５０，０００などである。最も好ましい分子量は、１５０，０００である。【００３０】
フコイダンの分子量は公知の方法、例えばゲルろ過クロマトグラフィーを用いて測定することができる。通常は、分子量測定の際に既知分子量を有するプルランをマーカーとして用いる。高分子化合物の分子量は平均分子量、数平均分子量あるいは重量平均分子量で表されることが一般的であるが、本明細書において、特に断らないかぎり、分子量というときは重量平均分子量を意味する。重量平均分子量は、公知の手段・方法により計算することができ、例えばゲルろ過クロマトグラフィーのパターンから計算することができる。【００３１】
本明細書において、分子量を数値で表す場合、その数値の約±２０％の幅を含むものとする。例えば、分子量５０，０００という場合には、約４０，０００〜約６０，０００の分子量が含まれる。【００３２】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００３３】
実施例１：損傷モデル作製
供試動物として、白色ウサギ（体重約２．０ｋｇ）の雌を各群につき３羽用いた。入手後１週間環境に慣らせ、その後、メデトミジン０．１ｍｇ／ｋｇを皮下注射し、ケタラール２５ｍｇ／ｋｇを筋肉内注射した。このような注射麻酔下の供試ウサギの左側膝関節部を剪毛、消毒後、膝関節外側からアプローチし、関節包をあけて、膝蓋骨を内側に移動させることによって膝関節部を完全に露出した。そして、Ｔａｍａｉらの実験（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ、２００２、ｖｏｌ．４８、ｐ．３６９〜３７８）を参考に、滑車溝近位、滑車溝遠位および内側滑車陵の計３箇所に直径２ｍｍ、深さ４ｍｍの孔をハンドドリルによってあけた。その後、よく洗浄し、関節包を３−０ＰＤＳ（ポリジオキサノン）を用いて縫合した。また、皮下組織と皮膚は一緒にステンレスワイヤーで縫合した。術後はアチパメゾール０．５ｍｇ／ｋｇを一日２回希釈し皮下に注射し覚醒させた。【００３４】
手術日から、フコイダン投与群のウサギには毎日フコイダン１ｇを溶かした水（５０ミリリットル）を最初自然摂取させ、その後は水を自由摂取させた。これを３週間続けた。また、コントロール群には水のみを与えた。この間フコイダン投与群に副作用等の兆候を示すものは全く見あたらなかった。【００３５】
３週間の投与期間終了後にフコイダン投与群およびコントロール群それぞれの供試ウサギを安楽死させ、手術部を露出させた。
【実施例２】
【００３６】
実施例２：肉眼による治癒程度の観察
実施例１の損傷モデルにおける左大腿骨の手術部を肉眼でよく観察した。３週間後の治癒程度を見ると、フコイダン投与群では良好に治療しているものが多く、コントロール群では治癒していないものが多く見受けられた。損傷の治癒程度を表１に基づき点数化して評価した。
【表１】
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【００３７】
結果は図１の通りとなった。この結果によると、滑車溝近位および遠位においてフコイダン投与群が良好な治癒結果を示した。コントロール群の損傷部位は膠原線維、線維芽細胞などで充填されていたのに対し、フコイダン投与群の損傷部位は軟骨芽細胞、軟骨組織に置換されていた。
【実施例３】
【００３８】
実施例３：組織学的観察
実施例１の損傷モデルにおける左側大腿骨を採材し、１０％中性緩衝ホルマリン水溶液（ホルムアルデヒド液）で固定した後、５％ギ酸溶液によって振とう下で脱灰した。脱灰終了後、５％硫酸ナトリウム溶液で中和し、水洗した後脱水した。脱灰の完了した組織片を修復部位が縦断面になるように切り出しを行った。その後定法にしたがってパラフィン包埋を実施し、ミクロトームにて５μｍに薄切した。得られた組織片を用いて、アルシアンブルー（ＡＢ）染色およびサフラニン−Ｏ（ＳＯ）染色を実施し、組織学的観察のための標本とした。標本について顕微鏡観察、および画像解析を実施した。画像解析は、修復部位の２００倍画像をＰｈｏｔｏｇｒａｂ  ａｂ−３００  ｖｅｒｓｉｏｎ１．０（マッキントッシュソフトウェア、アドビシステム、東京）を用いてデジタル化し、画素数として２０，０００ピクセルを無作為に６ヶ所設定し、その中の目的とする色調の占めるピクセル数を測定した。求めた数値について統計処理（ｔ−検定）を実施した。【００３９】
（ａ）アルシアンブルー染色観察結果
図２および図３は、それぞれ滑車溝近位および遠位のアルシアンブルー染色標本の顕微鏡観察結果である。フコイダン投与群においては修復部分がブルーに染色（図の濃色部分）されており、グルコサミノグリカンが多く含まれていることが示された。一方、コントロール群においてはほとんど染色されなかった。【００４０】
（ｂ）サフラニン−Ｏ染色観察結果
図４および図５は、それぞれ滑車溝近位および遠位のサフラニン−Ｏ染色標本の顕微鏡観察結果である。フコイダン投与群においては修復部分が染色（図の濃色部分）されており、プロテオグリカンが多く含まれていることが示された。一方、コントロール群においてはほとんど染色されなかった。【００４１】
（ｃ）画像解析結果
図６は、アルシアンブルー染色画像およびサフラニン−Ｏ染色画像を上記方法で解析した結果である。この結果によれば、フコイダン投与群はどちらもコントロール郡に比較して有意に高い値を示し、グルコサミノグリカンおよびプロテオグリカンがフコイダン投与群において有意に多く存在していることが示された。【００４２】
以上の実施例２、３の結果より、フコイダン投与群においては、軟骨組織におけるグルコサミノグリカンおよびプロテオグリカンの生成が促進され、軟骨組織の修復が促進されたものと考えられる。
【実施例４】
【００４３】
実施例４：分子量２３９，０００、３３０，０００のフコイダンでの効果の比較
実施例１の損傷モデル作製において、フコイダン投与群として、分子量２３９，０００および３３０，０００のフコイダンをそれぞれ投与した。各々の投与群、およびコントロール群について、実施例３の方法に従ってアルシアンブルー染色およびサフラニン−Ｏ染色を実施し、画像解析を行った。【００４４】
図７は、分子量の異なるフコイダンを投与した群、およびコントロール群について、アルシアンブルー染色画像およびサフラニン−Ｏ染色画像を上記方法で解析した結果である。この結果によれば、フコイダン投与群はどちらもグルコサミノグリカンおよびプロテオグリカンの生成が促進されているが、分子量の小さい分子量２３９，０００のフコイダンを投与した群がより高いグルコサミノグリカンおよびプロテオグリカン生成を示した。
【実施例５】
【００４５】
実施例５：分子量の異なるフコイダンにおける効果の比較１−損傷モデル作製
実施例１の損傷モデル作製において、フコイダン投与群として、分子量８，０００、５０，０００、１４６，０００、２３９，０００、３３０，０００、４００，０００および１，０００，０００のフコイダンをそれぞれ投与した損傷モデル群を作製した。
【実施例６】
【００４６】
実施例６：分子量の異なるフコイダンにおける効果の比較２−肉眼による治癒程度の観察
実施例５の各損傷モデル群における左大腿骨の手術部を、肉眼でよく観察した。各損傷モデル群について、実施例２の基準に基づいて治癒程度を評価した。求めた数値について、ターキー−クラマー（Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ）法による多重比較検定を実施した。結果は図８の通りとなった。この結果によると、全てのフコイダン投与群がコントロール群に比べて良好な治癒結果を示した。特に、分子量５０，０００、１４６，０００および４００，０００の群がより良好な結果を示した。
【実施例７】
【００４７】
実施例７：分子量の異なるフコイダンにおける効果の比較３−組織学的観察
実施例５の各損傷モデル群の組織学的観察を、実施例３の方法に従って行った。ターキー−クラマー法による多重比較検定を実施した。画像解析結果を図９および１０に示す。この結果が示す通り、全てのフコイダン投与群がコントロール群に比べて良好な治癒結果を示した。特に、分子量５０，０００、１４６，０００および２３９，０００の群がより良好な結果を示した。最も良好な結果を示したのは分子量１４６，０００の群であった。【００４８】
図１１〜１３にコントロール群、各損傷モデル群のアルシアンブルー染色標本の顕微鏡観察結果を示す。フコイダン投与群に観察される白く抜けた点は軟骨芽細胞を現している。下段の拡大画像が示すとおり、各損傷モデルにおいて、軟骨芽細胞が活性化されていることが観察できた。最も良好な結果を示した分子量１４６，０００の群では、軟骨芽細胞がより活性化されていることが観察できた。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、フコイダンを有効成分として含む軟骨生成促進剤、グルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカンの生成促進剤ならびに軟骨損傷および軟骨損傷に由来する疾病の予防または治療剤である。例えば医薬組成物や飲食物を提供するものなので、医薬品や飲食物等の分野において利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年2月10日(2011.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコイダンを有効成分として含有し、経口投与される軟骨生成促進剤。
【請求項２】
該フコイダンの分子量が８，０００〜４００，０００である請求項１に記載の軟骨生成促進剤。
【請求項３】
該フコイダンの分子量が５０，０００〜２５０，０００である請求項１に記載の軟骨生成促進剤。
【請求項４】
該フコイダンの分子量が５０，０００〜１５０，０００である請求項１に記載の軟骨生成促進剤。
【請求項５】
フコイダンを有効成分として含有し、経口投与されるグルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカン生成促進剤。
【請求項６】
該フコイダンの分子量が８，０００〜４００，０００である請求項５に記載のグルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカン生成促進剤。
【請求項７】
該フコイダンの分子量が５０，０００〜２５０，０００である請求項５に記載のグルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカン生成促進剤。
【請求項８】
該フコイダンの分子量が５０，０００〜１５０，０００である請求項５に記載のグルコサミノグリカンおよび／またはプロテオグリカン生成促進剤。
【国際調査報告】
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