(57)【要約】  常在細菌叢を乱したり薬剤耐性菌を誘導することなく、バイオフィルム形成に対して有効に作用するバイオフィルム形成阻害剤を提供する。より具体的には、ブドウ球菌属に属するグラム陽性球菌由来のバイオフィルム形成に対して有効に作用するバイオフィルム形成阻害剤を提供する。さらには、該バイオフィルム形成阻害剤を用いて処理するバイオフィルム形成阻害方法を提供する。マツ科の植物に含まれるジテルペノイド化合物が、常在細菌叢を乱したり薬剤耐性菌を誘導することなく、有効にバイオフィルム形成に対して強い抑制効果を有し、有効なバイオフィルム形成阻害剤となりうる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジテルペノイド化合物を有効成分として含有するバイオフィルム形成阻害剤。
【請求項２】
ジテルペノイド化合物が、環状ジテルペノイド化合物である、請求項１に記載のバイオフィルム形成阻害剤。
【請求項３】
環状ジテルペノイド化合物が、アビエタン系ジテルペノイド化合物である請求項２に記載のバイオフィルム形成阻害剤。
【請求項４】
アビエタン系ジテルペノイド化合物が、アビエチン酸、デヒドロアビエチン酸、ネオアビエチン酸、ピマル酸、パラストリン酸、レボピマル酸及びこれらの薬理学上許容可能な誘導体のいずれか１種又は２種以上である請求項３に記載のバイオフィルム形成阻害剤。
【請求項５】
バイオフィルム形成阻害剤が、ロジンを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のバイオフィルム形成阻害剤。
【請求項６】
バイオフィルムが、ブドウ球菌属に属するグラム陽性球菌由来である請求項１〜７のいずれか１に記載のバイオフィルム形成阻害剤。
【請求項７】
ブドウ球菌属に属するグラム陽性球菌が、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌及び腐性ブドウ球菌から選択されるいずれかである請求項６に記載のバイオフィルム形成阻害剤。
【請求項８】
黄色ブドウ球菌が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）又はバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）である請求項７に記載のバイオフィルム形成阻害剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１に記載のバイオフィルム形成阻害剤で処理されてなる医療用用具。
【請求項１０】
バイオフィルム形成阻害剤で処理されてなる医療用用具が、当該医療用用具の表面をバイオフィルム形成阻害剤でコーティングされているか、又は当該医療用用具にバイオフィルム形成阻害剤が浸透しているものである請求項９に記載の医療用用具。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１に記載のバイオフィルム形成阻害剤を用いて処理する工程を含むバイオフィルム形成阻害方法。
【請求項１２】
バイオフィルム形成阻害剤を用いて処理する対象物が医療用用具である、請求項１１に記載のバイオフィルム形成阻害方法。
【請求項１３】
バイオフィルム形成阻害剤を用いて処理する対象物が排水処理設備である、請求項１１に記載のバイオフィルム形成阻害方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジテルペノイド化合物を有効成分として含有するバイオフィルム形成阻害剤に関する。さらには、該バイオフィルム形成阻害剤を用いて処理するバイオフィルム形成阻害方法に関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２００９−９７２０７号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
バイオフィルム(biofilm)は、細胞外マトリクスで覆われ、細胞同士あるいは細胞と表面・界面が接着することにより形成される生物集団である。バイオフィルムの形成は、医療分野、排水処理施設、一般家庭などで問題となっており、特に医療分野では大きな問題となっている。【０００４】
医療分野では、口内細菌によるバイオフィルムが歯周病に関連することから、歯科の分野でバイオフィルムに対する阻害剤が多く報告されている。例えば、カテキンの一種であるエピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＧＧ）が、歯周病関連細菌のエイケネラ・コローデンス (Eikenella corrodens) によるバイオフィルムの抑制剤として特許出願され、開示されている（特許文献１）。また、クランベリー抽出物が、歯周病の原因菌の一種であるポルフィロモナス・ジンジバリス (Porphyromonas gingivalis)やトレポネーマ・デンティコラ (Treponema denticola)によるバイオフィルムの抑制剤として特許出願され、開示されている（特許文献２）。【０００５】
細菌のうち、グラム陽性菌の多くは、しばしばヒトや環境に常在し、健常人にとってはほとんど問題にならない弱毒菌であるが、それら弱毒菌も免疫不全患者や易感染患者においては重篤な感染症を引き起こす場合がある。ブドウ球菌はグラム陽性の球菌で、ヒトの皮膚、鼻腔、消化管などの常在菌であるが、医療現場では主に易感染患者において手術部位感染、血流感染、呼吸器感染、尿路感染を惹起し、さらに心内膜炎、髄膜炎、敗血症などを引き起こす場合もあり、最も重要な病院感染起因菌の一つである。【０００６】
医療現場では、バイオフィルムが関与するカテーテル関連血流感染(CR-BSI)や尿道留置カテーテル関連尿路感染(UA-UTI)が問題となっている。感染は、ブドウ球菌などの細菌が血管カテーテルや尿路カテーテルなどの医療用デバイスに定着し、バイオフィルムを形成することによって引き起こされる。いったんバイオフィルムが形成されると、細菌が宿主の免疫系による攻撃から逃れたり、バイオフィルムが抗菌薬の浸透を妨げたりすることで治療が困難となる。黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)は、医療機関では主に易感染患者において手術部位感染、血流感染、呼吸器感染、尿路感染などの起因菌となり、感染部位によっては難治性となって時に死因となる場合もある。特に、院内感染の原因菌とされるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus：ＭＲＳＡ）の進入経路は、４７．８％が血液留置カテーテル、１３．９％が尿路カテーテル留置によるといわれており、難治化すると同時に、重症化することが問題となる。【０００７】
ブドウ球菌によるバイオフィルムを抑制する物質としては、直鎖セスキテルペンの一種であるファルネソール (farnesol)（非特許文献１）や、ベンジルイソキノリンアルカロイドの一種であるベルベリン(berberine)（非特許文献２）が報告されている。【０００８】
しかしながら、既に報告されているファルネソールやベルベリンは、黄色ブドウ球菌に抗菌活性を有することが知られており、報告されている濃度では、バイオフィルム形成を抑制する一方で、黄色ブドウ球菌の育成を抑制している可能性がある。また、ベルベリンは、NorAの基質となっている。NorAは黄色ブドウ球菌に主要な多剤排出ポンプであり、黄色ブドウ球菌の多剤耐性に寄与するといわれている。ベルベリンを常用することで、このNorAの発現が亢進し、多剤耐性変異株を誘導する可能性がある。ファルネソールやベルベリンのように、抗菌活性を有するものは、常在細菌叢を乱したり、やがては耐性獲得を誘導したりする点で問題が残されており、医薬品や医療器具などの医療用デバイスに実用化されているものはない。【０００９】
また、一般家庭やその他の施設などでも、例えば水周りや排水処理に関し、バイオフィルムの形成が問題となっている。このような場合にも、ヒトなどの生体に対して安全でありながら、バイオフィルムの形成を有効に阻害しうるバイオフィルム形成阻害剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開2008-13458号公報
【特許文献２】特開2007-91703号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 50: 1463-9 (2006)
【非特許文献２】Int J Antimicrobial Agents 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、常在細菌叢を乱したり薬剤耐性菌を誘導することなく、バイオフィルム形成に対して有効に作用するバイオフィルム形成阻害剤を提供することを課題とする。より具体的には、ブドウ球菌属に属するグラム陽性球菌由来のバイオフィルム形成に対して有効に作用するバイオフィルム形成阻害剤を提供することを課題とする。さらには、該バイオフィルム形成阻害剤を用いて処理するバイオフィルム形成阻害方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、マツ科の植物に含まれるジテルペノイド化合物が、常在細菌叢を乱したり薬剤耐性菌を誘導することなく、バイオフィルム形成に対して強い阻害作用を有することを見出し、本発明を完成した。【００１４】
即ち本発明は、以下よりなる。
１．ジテルペノイド化合物を有効成分として含有するバイオフィルム形成阻害剤。
２．ジテルペノイド化合物が、環状ジテルペノイド化合物である、前項１に記載のバイオフィルム形成阻害剤。
３．環状ジテルペノイド化合物が、アビエタン系ジテルペノイド化合物である前項２に記載のバイオフィルム形成阻害剤。
４．アビエタン系ジテルペノイド化合物が、アビエチン酸、デヒドロアビエチン酸、ネオアビエチン酸、ピマル酸、パラストリン酸、レボピマル酸及びこれらの薬理学上許容可能な誘導体のいずれか１種又は２種以上である前項３に記載のバイオフィルム形成阻害剤。
５．バイオフィルム形成阻害剤が、ロジンを含む、前項１〜４のいずれかに記載のバイオフィルム形成阻害剤。
６．バイオフィルムが、ブドウ球菌属に属するグラム陽性球菌由来である前項１〜７のいずれか１に記載のバイオフィルム形成阻害剤。
７．ブドウ球菌属に属するグラム陽性球菌が、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌及び腐性ブドウ球菌から選択されるいずれかである前項６に記載のバイオフィルム形成阻害剤。
８．黄色ブドウ球菌が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）又はバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）である前項７に記載のバイオフィルム形成阻害剤。
９．前項１〜８のいずれか１に記載のバイオフィルム形成阻害剤で処理されてなる医療用用具。
１０．バイオフィルム形成阻害剤で処理されてなる医療用用具が、当該医療用用具の表面をバイオフィルム形成阻害剤でコーティングされているか、又は当該医療用用具にバイオフィルム形成阻害剤が浸透しているものである前項９に記載の医療用用具。
１１．前項１〜８のいずれか１に記載のバイオフィルム形成阻害剤を用いて処理する工程を含むバイオフィルム形成阻害方法。
１２．バイオフィルム形成阻害剤を用いて処理する対象物が医療用用具である、前項１１に記載のバイオフィルム形成阻害方法。
１３．バイオフィルム形成阻害剤を用いて処理する対象物が排水処理設備である、前項１１に記載のバイオフィルム形成阻害方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のバイオフィルム形成阻害剤により、臨床上問題となるブドウ球菌属に属するグラム陽性球菌、例えば黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡを含む）、表皮ブドウ球菌及び腐性ブドウ球菌から選択される１種又は複数種のブドウ球菌由来のバイオフィルム形成を阻害することができる。該バイオフィルム形成阻害剤は抗菌剤と異なり、菌を殺すことなくバイオフィルムの形成のみを阻害する。この性質は１．皮膚をはじめ、各部位での常在細菌叢を乱さない、２．薬剤耐性菌を誘導しないという２つの利点を持っている。抗菌物質（抗菌薬や銀）を浸み込ませたカテーテルはすでに臨床応用されているが、いずれも抗菌性を目的としたもので、バイオフィルムの形成阻害を目的としたものはできていない。本発明のジテルペノイド化合物を有効成分として含有するバイオフィルム形成阻害剤を、医療用用具、例えばカテーテルなどの医療用デバイス、医療用ドレッシング材や医療用テープにコーティングしたり浸み込ませて用いる方法は、医療用用具に関連する感染症の新たな予防法になり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】各種黄色ブドウ球菌株について、各濃度のグルコースを含む培地で培養したときのバイオフィルム形成能を示す図である。（参考例１）
【図２】アビエチン酸及びその他の天然由来物質の、黄色ブドウ球菌（Ｎ３１５株）によるバイオフィルム形成阻害能を示す図である。（参考例２）
【図３】アビエチン酸及び６種の天然由来物質の、黄色ブドウ球菌（Ｎ３１５株）によるバイオフィルム形成阻害能を示す図である。（参考例３）
【図４】アビエチン酸の、黄色ブドウ球菌（Ｎ３１５株、Newman株）によるバイオフィルム形成阻害能を示す図である。（実施例１）
【図５】アビエチン酸の、黄色ブドウ球菌（Ｎ３１５株）によるバイオフィルム形成阻害能及び遊離菌の生菌数に及ぼす影響を示す図である。（実施例２）
【図６】アビエチン酸及びその類似化合物の、黄色ブドウ球菌（Ｎ３１５株）によるバイオフィルム形成阻害能及び遊離菌の生菌数に及ぼす影響を示す図である。（実施例３）
【図７】アビエチン酸、デヒドロアビエチン酸及びロジンの、黄色ブドウ球菌（Ｎ３１５株）によるバイオフィルム形成阻害能を示す図である。（実施例４）
【図８】アビエチン酸、デヒドロアビエチン酸及びロジンの、表皮ブドウ球菌（臨床分離株）によるバイオフィルム形成阻害能を示す図である。（実施例５）
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ジテルペノイド化合物を有効成分として含有するバイオフィルム形成阻害剤に関する。本発明においてバイオフィルム形成阻害剤に含有されるジテルペノイド化合物は、好ましくは環状ジテルペノイド化合物である。ジテルペノイド化合物には、ラブダン型、ピラマン型やアビエタン型などが知られているが、本発明のバイオフィルム形成阻害剤としては、アビエタン系ジテルペノイド化合物が特に好適である。アビエタン系ジテルペノイド化合物は、例えば松や杉などのマツ科(Pinaceae)の植物から抽出される化合物であり、しそ科の植物からも抽出可能な化合物である。そのような化合物として、具体的にはアビエチン酸、デヒドロアビエチン酸(dehydroabietic acid)、ネオアビエチン酸(neoabietic acid)、ピマル酸(pimaric acid)、パラストリン酸、レボピマル酸等が挙げられる。本発明において、アビエタン系ジテルペノイド化合物とは、上記化合物のほか、これらの薬理学上許容可能な誘導体のいずれかであってもよい。本発明において、薬理学上許容可能な誘導体とは、ジテルペノイド化合物、好ましくはアビエタン系ジテルペノイド化合物、より好ましくは上述の化合物と共通の基本骨格を有する誘導体であって、バイオフィルム形成阻害能を有する化合物をいう。本発明のジテルペノイド化合物は、上記植物から抽出した天然物由来であっても良いし、合成した化合物であっても良い。また、その全ての立体異性体（ジアステレオマー、エピマー、エナンチオマーなど）又はラセミ体を含む。
【００１８】
以下に、代表的なアビエタン系ジテルペノイド化合物であるアビエチン酸と、その類似化合物の例を示す。
【化１】
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【００１９】
【化２】
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【００２０】
本発明のバイオフィルム形成阻害剤における有効成分として用いる上記化合物は、商業的に入手してもよいが、天然物から抽出しても良い。天然物から抽出する場合は、該抽出物は公知の方法、又は今後開発されるあらゆる方法で製造することができる。例えば、抽出物は、水、有機溶剤又はこれらの混合物を用いて適当な方法で抽出することにより得ることができる。有機溶剤は特に制限されるものではなく、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等のアルコール類やアセトン、酢酸エチル、エチルエーテル等を挙げることができ、これらは１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用することもできる。これらの化合物は、例えば７０％アセトン水溶液及び１００％メタノールを溶剤として浸漬抽出することが好ましい。また、抽出した化合物は、さらに精製していても良い。例えば、カラムクロマトグラフィー等で精製したものであってもよい。また、ロジン（松の幹に傷をつけて得られる樹液を水蒸気蒸留して揮発性の物質を除いたもの）は単独又は酸を添加し、加熱することにより得ることができる。
【００２１】
本発明においてバイオフィルム形成阻害剤には、バイオフィルム形成阻害能を有するジテルペノイド化合物、好ましくはアビエタン系ジテルペノイド化合物、より好ましくは上述の化合物のうち、１種を単独で又は２種以上の混合物として配合することができる。また、本発明のバイオフィルム形成阻害剤には、バイオフィルム形成阻害能を有する上述の化合物が含有されるのであれば、化合物自体は精製されているものであってもよいし、天然物からの抽出物がそのまま含まれているものであっても良い。そのような抽出物の例として、ロジンを挙げることができる。本発明のバイオフィルム形成阻害剤は、ロジンを含んでいても良いし、ロジンそのものであってもよい。ロジンは、ジテルペン樹脂酸を約９０％程度含有し、その主成分はアビエチン酸である。即ちマツ科の植物に多量に含まれる松脂の不揮発性の成分であり、専門的には樹脂酸とよばれる各種異性体を主成分としたものである。ロジンは、マツ科の植物の分泌物から精油や揮発性物質を除いて作製することができる。ロジンは、天然ロジンでも良いし、各種の合成ロジンであってもよい。
【００２２】
本発明においてバイオフィルム形成阻害剤に含有されるジテルペノイド化合物は、バイオフィルムの形成を阻害しうる濃度であれば、どのような濃度で用いても良いが、本発明では、特に最小生育阻止濃度（minimum inhibitory concentration:MIC、以下単に「ＭＩＣ」ともいう。）よりも低い濃度において使用することができるのが特徴である。例えばＭＩＣの１／２以下、好ましくは１／４以下、より好ましくは１／８以下の濃度で使用することができる。このような低い濃度で、バイオフィルムの形成を阻害することができることで、常在細菌叢を乱したり薬剤耐性菌を誘導することを防ぐことができる。具体的には、アビエチン酸の濃度として、 ８〜６４ｐｐｍ、好ましくは１６〜３２ｐｐｍで使用することができる。他のジテルペノイド化合物では、デヒドロアビエチン酸、ネオアビエチン酸、ピマル酸の濃度として、２〜８ｐｐｍ、好ましくは２〜４ｐｐｍで使用することができる。
【００２３】
本発明のバイオフィルム形成阻害剤には、上記有効成分としてのジテルペノイド化合物が上記濃度で含有されていれば良く、特に限定されない。また、該ジテルペノイド化合物の溶媒としては、例えばジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、アルコール類、アセトン等が挙げられる。
【００２４】
本発明のバイオフィルム形成阻害剤が作用するバイオフィルムの由来は特に限定されないが、本発明のバイオフィルム形成阻害剤は、ブドウ球菌属(Staphylococcus)に属するグラム陽性球菌により形成されるものに対して特に阻害活性を有する。本発明のバイオフィルム形成阻害剤は、ブドウ球菌属のうち好ましくは、黄色ブドウ球菌 (S. aureus) 、表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)や腐性ブドウ球菌(S. saprophyticus) 由来のバイオフィルム形成を有効に阻害する。黄色ブドウ球菌の中には莢膜多糖を有する株があり、このような株はバイオフィルムを形成し、抗菌薬の到達が悪くなるため、その効果が低下することがある。本発明のバイオフィルム形成阻害剤は、黄色ブドウ球菌のうち、さらにはＭＲＳＡやバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（vancomycin-resistant Staphylococcus aureus：ＶＲＳＡ）由来のバイオフィルム形成阻害について有効に作用する。
【００２５】
本発明は、上記バイオフィルム形成阻害剤で処理されてなる医療用用具、例えば医療用デバイス、医療用ドレッシングや医療用テープにも及ぶ。バイオフィルム形成阻害剤で処理されてなる医療用用具とは、当該医療用用具の表面の一部若しくは全体をバイオフィルム形成阻害剤でコーティングされているか、又は医療用用具の一部若しくは全体にバイオフィルム形成阻害剤が浸透しているものをいう。
【００２６】
本発明において、医療用用具は、医療用に使用される装置、機器、デバイスなどが挙げられ、特に限定されない。例えば生体内に留置されうる医療用デバイス、すなわちインプラント (implant)が、バイオフィルムの形成により重篤な感染に結びつくことが危惧される。インプラントの例として、特に限定されないが、例えばカテーテル、人工歯（デンタルインプラント）、骨折・リウマチ等の治療で骨を固定するためのボルト、ペースメーカー、人工心臓弁、人工関節、ボイスプロテーゼ、コンタクトレンズ等が挙げられる。前記カテーテルとしては、尿道カテーテル、腹腔カテーテル及び中心静脈カテーテル等が挙げられる。このように、生体内に留置されうる医療用デバイスを、本発明のバイオフィルム形成阻害剤で処理することにより、留置される生体の常在細菌叢を乱したり、薬剤耐性菌を誘導することなく、効果的に医療用デバイスにおけるバイオフィルム形成が阻害される。また、特に生体内で留置させるためのものでなくとも、バイオフィルムの形成により、何らかの好ましくない影響を及ぼすことが危惧される医療用用具、例えば医療用デバイス、医療用ドレッシング材や医療用テープも、本発明の範囲に含まれる。
【００２７】
本発明は、バイオフィルム形成阻害剤を用いて処理する工程を含むバイオフィルム形成阻害方法にも及ぶ。ここで、バイオフィルム形成阻害剤を用いて処理する処理対象物は、上述の医療用デバイスのほか、バイオフィルムの形成が問題となりうるあらゆる物を処理対象物とすることができる。例えば、一般家庭やその他の事業所での排水処理設備には、ぬめり等のバイオフィルムに起因する汚染が問題となる。具体的には、炊事場、洗面所や風呂場などの水周りに係る設備、その他給水設備、排水管や排水溝などの排水設備が挙げられる。また、絆創膏の粘着付与剤や軟膏の基材、滑り止め、セッケンに混ぜるなどの用途に適用することができる。
【００２８】
上記において、処理するとは、処理対象物を本発明のバイオフィルム形成阻害剤と接触させる工程を含む。バイオフィルム形成阻害剤と接触させるとは、コーティングする、スプレーする、浸漬する、洗浄する等の操作をいう。処理対象物が医療用デバイスのように小規模のものであれば、該医療用デバイスの表面の一部にバイオフィルム形成阻害剤を塗布したりスプレーすることでコーティング処理を行ったり、浸漬させて浸み込ませたり、又は洗浄したりすることができる。処理対象物が給水設備や排水処理設備のように大規模の場合には、所望の部位に本発明のバイオフィルム形成阻害剤を流し込んだり、塗布したり、洗浄したりすることができる。このような場合に、バイオフィルム形成阻害剤に含まれる化合物自体は天然物からの抽出物がそのまま含まれているものであっても良い。
【００２９】
上記の場合に、必要に応じて、バイオフィルムを形成しうる菌に有効な消毒薬、例えばグルコン酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、両性界面活性剤、アルコール、次亜塩素酸ナトリウム、ポビドンヨード、グルタラールなどを併用して用いて処理しても良いし、上記処理の前後に処理しても良い。なお、ブドウ球菌に対する持続効果の面ではクロルヘキシジンが優れているといわれている。
【実施例】
【００３０】
以下に、本発明の理解をより確実にするために、本発明を完成するに至った経緯を参考例に示し、本発明の内容を具体的に実施例に示して詳細かつ具体的に説明するが、本発明は下記の実施例の範囲に限定されるものではないことは明らかである。【００３１】
（参考例１）バイオフィルムの作製
本参考例では、バイオフィルム形成阻害剤の有効成分をスクリーニングするために用いるバイオフィルムの産生条件を検討した。黄色ブドウ球菌の様々な菌株の細胞をそれぞれＢＨＩ（ブレインハートインヒュージョン）培地で希釈後、９６穴プレートに２００μｌずつ分注し、各々０．１〜２．０％となるようにグルコース(glucose)を加えた。これを３７℃で４８時間静置培養したのち、形成されたバイオフィルムをクリスタルバイオレット(crystal violet)を用いて染色した。蒸留水を用いて各ウェルを洗浄した後、ＤＭＳＯ２００μｌで溶出したクリスタルバイオレットについて５７０ｎｍの吸光度を計測し、バイオフィルムの形成能を測定した。【００３２】
上記の検討結果を図１に示した。その結果、さまざまな黄色ブドウ球菌の菌株のうち、黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株がバイオフィルム形成に適しているものと考え、以降の実施例において使用した。Ｎ３１５株はＭＲＳＡの標準株であり、すでに全ゲノム配列も決定されており、遺伝的解析も行いやすい株である。この株のバイオフィルム形成能をさらに高めるために１％グルコースを含む培地を用いて培養した。【００３３】
（参考例２）バイオフィルム形成阻害物質のスクリーニング
本参考例では、バイオフィルム形成阻害剤の有効成分であるバイオフィルム形成阻害物質を選別するためにスクリーニングを行なった。スクリーニングには３５種類の天然由来物質を用いた。まず最初に、これらの天然由来物質の黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株に対する最小生育阻止濃度（ＭＩＣ）を求め、生育に影響を与えないＭＩＣの１／８以下の濃度を培地に添加したときのバイオフィルムの形成能を確認した。各候補化合物は、１％ＤＭＳＯを含む培地で希釈した。黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株に対するＭＩＣは、表１に示した。【００３４】
【表１】
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【００３５】
黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株細胞をＢＨＩ（１％グルコース添加）培地で１００倍に希釈した後、９６穴プレートに２００μｌずつ分注し、さらに各試料溶液２μｌを加えた。ここで、候補化合物のうちオイゲノール及びケルセチン(quercetin)は最終濃度が１／１６ＭＩＣ、その他については１／８ＭＩＣとなるよう調整した。コントロールは試料も溶媒も含まないＢＨＩ培地とした。これらを３７℃で４８時間静置培養した。
形成されたバイオフィルムを、クリスタルバイオレットを用いて染色し、バイオフィルムの形成能を参考例１と同手法により測定した。物質名の後の数字は濃度を表し、単位はμｇ／ｍｌである。【００３６】
その結果、アビエチン酸(abietic acid, C20H30O2)、オイゲノール(eugenol, C10H12O2)、 カプサイシン(capsaicin, C17H27NO3)、ネロール(nerol, C10H18O)、ナリンゲニン(naringenin, C15H12O5)、シトロネロール(citronellol, C10H20O)、ジヒドロカプサイシン（dihydrocapzaicin,C18H29NO3）、ゲラニオール(geraniol, C10H18O)の８種類の物質にバイオフィルム形成阻害が認められた。特に、アビエチン酸は黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株によるバイオフィルム形成を強く阻害することが確認された。また精油成分であるシトロネロールもある程度バイオフィルム形成を阻害することが確認された。ここで、ゲラニオールは直鎖モノテルペノイドの一種であり、ネロールはモノテルペンの一種である。カプサイシンはアルカロイドのうちカプサイシノイドと呼ばれる化合物の一種である。また、オイゲノールはグアイアコールにアリル基が置換した構造を持つ、フェニルプロパノイドの一種である。ナリンゲニンはフラバノンであり、フラボノイドに属する。【００３７】
（参考例３）バイオフィルム形成阻害物質のスクリーニング（2）
本参考例では参考例２におけるスクリーニングの結果、黄色ブドウ球菌のＮ３１５株において、バイオフィルムの産生を比較的強く抑制し、菌の生育には大きな影響を与えなかったアビエチン酸、オイゲノール、カプサイシン、ネロール、シトロネロール、ゲラニオールの６種類の天然由来物について、ＭＩＣの１／８よりさらに低濃度の試料を用いてバイオフィルム形成阻害活性の濃度依存性を調べた。【００３８】
その結果、濃度依存的にバイオフィルム形成を抑制しているものはアビエチン酸とシトロネロールであることがわかった。低濃度で抑制作用を持つアビエチン酸を効果的なバイオフィルム形成阻害物質とした。【００３９】
（実施例１）アビエチン酸のバイオフィルム形成阻害作用の確認
本実施例は、参考例２及び３の結果に基づき、特にバイオフィルムの形成阻害作用の優れていたアビエチン酸について確認した。アビエチン酸のバイオフィルム形成阻害作用が黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株に特有のものであるかどうかを確認するためにメチシリン感受性黄色ブドウ球菌の病原性に関わる実験に用いられるNewman株のバイオフィルム形成に及ぼす効果も調べた。黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株細胞又はNewman株細胞をＢＨＩ（１％グルコース添加）培地で１００倍に希釈した後、９６穴プレートに２００μｌずつ分注し、さらに最終濃度が０、４、８、１６、３２μｇ／ｍｌとなるようアビエチン酸溶液２μｌ（溶媒であるＤＭＳＯの最終濃度は１％）を加えた。これらを３７℃で４８時間静置培養した。形成されたバイオフィルムを、クリスタルバイオレットを用いて染色し、バイオフィルムの形成能を参考例１と同手法により測定した。【００４０】
その結果、図４に示すようにＮ３１５株及びNewman株のいずれについても、バイオフィルム形成はアビエチン酸により阻害されることが確認された。【００４１】
（実施例２）アビエチン酸のバイオフィルム形成阻害作用の確認
本実施例ではアビエチン酸のバイオフィルム形成阻害作用と菌の生育抑制作用との関係を調べた。実施例１と同手法により黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株細胞をＢＨＩ（１％グルコース添加）培地で１００倍に希釈した後、９６穴プレートに２００μｌずつ分注し、さらに０、４、８、１６、３２μｇ／ｍｌのアビエチン酸溶液２μｌ（溶媒であるＤＭＳＯの最終濃度は１％）を加えた。コントロールは試料も溶媒も含まないＢＨＩ培地とした。これらを３７℃で４８時間静置培養した。形成されたバイオフィルムを、クリスタルバイオレットを用いて染色し、バイオフィルムの形成能を参考例１と同手法により測定した。また、ウェル内の培地中の菌数（浮遊菌）についても測定した。９６穴プレート各ウェルの培養上清を１０４分の１に滅菌生理食塩液で希釈した菌浮遊液を普通寒天培地に塗布し、３７℃で静置培養後のコロニー数をカウントし、菌数を測定した。生菌数はｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌで表した。【００４２】
その結果、図５に示すように、アビエチン酸の濃度が上昇するにつれて、バイオフィルム形成能は減少する一方、各ウェル中の浮遊菌数が上昇していることが確認された。これはアビエチン酸が黄色ブドウ球菌を殺すことなくバイオフィルム形成能だけを阻害したことを示している。【００４３】
（実施例３）アビエチン酸及びその類似物質のバイオフィルム形成阻害作用の確認
アビエチン酸にバイオフィルム形成阻害作用が認められたことから、本実施例ではアビエチン酸の類似化合物についても同様に確認した。実施例１と同手法により黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株細胞をＢＨＩ（１％グルコース添加）培地で１００倍に希釈した後、９６穴プレートに２００μｌずつ分注し、さらに各濃度のアビエチン酸、デヒドロアビエチン酸(dehydroabietic acid)、ネオアビエチン酸(neoabietic acid)、ピマル酸(pimaric acid)又はタンシノン(tanshinones)を各々２μｌ（溶媒であるＤＭＳＯの最終濃度は１％）加えた。コントロールは試料も溶媒も含まないＢＨＩ培地とした。また、１％ＤＭＳＯを含むＢＨＩ培地も比較対照とした。これらを３７℃で４８時間静置培養した。形成されたバイオフィルムを、クリスタルバイオレットを用いて染色し、バイオフィルムの形成能を参考例１と同手法により測定した。アビエチン酸及びその類似物質の構造式は、以下のとおりである。【００４４】
【化１】
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【００４５】
【化２】
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【００４６】
その結果、図６に示すようにアビエチン酸と同様にマツ科の植物に含まれるジテルペノイドである、デヒドロアビエチン酸、ネオアビエチン酸、ピマル酸については強いバイオフィルム形成阻害作用が認められた。また培地に添加した各アビエチン酸の類似化合物の添加濃度は、アビエチン酸の添加濃度が３２μｇ／ｍｌに対して、２〜４μｇ／ｍｌと低く、アビエチン酸よりも低濃度で効果を示した。【００４７】
（実施例４）ロジンのバイオフィルム形成阻害作用の確認（１）
アビエチン酸及びデヒドロアビエチン酸にバイオフィルム形成阻害効果があったことに基づいて、アビエチン酸を主成分として含むロジン（rosin）についても黄色ブドウ球菌に対してバイオフィルム抑制効果があるかどうか調べた。本実施例では、黄色ブドウ球菌はＮ３１５株細胞を用い、ロジンは和光純薬工業株式会社のものを用いた。用いたロジンの組成は、樹脂酸（80-97％）、不ケンカ物及びその他少量である。樹脂酸には主としてアビエチン酸、ネオアビエチン酸、パラストリン酸を含み、他にレボピマル酸、デヒドロアビエチン酸、ピマル酸などが含まれる。また、アビエチン酸及びデヒドロアビエチン酸についてもバイオフィルム抑制効果を確認した。アビエチン酸及びデヒドロアビエチン酸の最終濃度はＭＩＣの１／１６及び１／８、ロジンの最終濃度はＭＩＣの１／３２、１／１６及び１／８を用いた。【００４８】
黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株細胞をＢＨＩ（１％グルコース添加）培地で１００倍に希釈した後、９６穴プレートに２００μｌずつ分注し、さらに最終濃度が１６又は３２μｇ／ｍｌとなるようアビエチン酸溶液２μｌ（溶媒であるＤＭＳＯの最終濃度は１％）を加えた。デヒドロアビエチン酸については４又は８μｇ／ｍｌとなるよう、さらにロジンも最終濃度が８、１６又は３２μｇ／ｍｌとなるように溶液を２μｌ培地に加えた。次いで、これらを３７℃で４８時間静置培養した。形成されたバイオフィルムを、クリスタルバイオレットを用いて染色したのち、蒸留水を用いて各ウェルを洗浄した後、ＤＭＳＯ２００μｌで溶出したクリスタルバイオレットについて５７０ｎｍの吸光度を計測し、バイオフィルムの形成能を測定した。【００４９】
上記の結果、黄色ブドウ球菌において、アビエチン酸を主成分として含むロジンについてもアビエチン酸と同様のバイオフィルム抑制効果が認められた。ロジンはマツ科の植物の分泌物から精油や揮発性物質を除いた樹脂である。ジテルペン樹脂酸を９０％含有し、その主成分はアビエチン酸である。絆創膏の粘着付与剤や軟膏の基材、滑り止め、セッケンに混ぜるなど、用途は広い。【００５０】
（実施例５）ロジンのバイオフィルム形成阻害作用の確認（２）
黄色ブドウ球菌の代わりに、表皮ブドウ球菌（臨床分離株）を用いた他は、実施例４と同手法にて、表皮ブドウ球菌に対するアビエチン酸、デヒドロアビエチン酸及びロジンのバイオフィルム形成阻害作用を確認した。【００５１】
上記の結果、ロジンは表皮ブドウ球菌においても黄色ブドウ球菌と同様に、バイオフィルム形成阻害効果が認めた。【００５２】
表皮ブドウ球菌は殆どのヒトの表皮や鼻腔に常在し、病原性の殆どない菌である。しかしながら、皮膚に常在する表皮ブドウ球菌が体内異物装着時に易感染患者に感染した場合には重症感染症を起こすことがある。表皮ブドウ球菌は、黄色ブドウ球菌と同様に体内に留置されるカテーテル等への付着性が高くバイオフィルムを形成しやすい。カテーテル関連血流感染症の起因菌としては黄色ブドウ球菌より表皮ブドウ球菌の方が、割合が高い。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
以上詳述したように、本発明のバイオフィルム形成阻害剤により、臨床上問題となる黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡを含む）由来のバイオフィルム形成を阻害することができる。該バイオフィルム形成阻害剤は抗菌剤と異なり、菌を殺すことなくバイオフィルムの形成のみを阻害しうる。この性質は１．皮膚を始め各部位での常在細菌叢を乱さない、２．薬剤耐性菌を誘導しないという２つの利点を持っている。抗菌物質（抗菌薬や銀）を浸み込ませたカテーテルはすでに臨床応用されているが、いずれも抗菌性を目的としたもので、バイオフィルム形成阻害を目的としたものはできていない。【００５４】
本発明のジテルペノイド化合物を有効成分として含有するバイオフィルム形成阻害剤を、カテーテルをはじめとする各種医療用デバイスにコーティングしたり浸透させて用いる方法は、カテーテルなどの医療用デバイスに関連する感染症の新たな予防法になり得る。さらに、一般家庭を含む各施設の水周りにおいても、本発明のバイオフィルム形成阻害剤で処理することにより、効果的にバイオフィルムの形成を阻害しうる。【００５５】
また、アビエチン酸を主成分として含むロジンは、黄色ブドウ球菌や表皮ブドウ球菌に対してアビエチン酸と同様のバイオフィルム抑制効果が認められたことから、ロジンを含む本発明のバイオフィルム形成阻害剤は、絆創膏の粘着付与剤や軟膏の基材、滑り止め、セッケンに混ぜるなど、用途は広い。表皮ブドウ球菌は、黄色ブドウ球菌と同様に体内に留置されるカテーテル等への付着性が高くバイオフィルムを形成しやすい。カテーテル関連血流感染症の起因菌としては黄色ブドウ球菌より表皮ブドウ球菌の方が、割合が高い。これらのことから、本発明のバイオフィルム形成阻害剤を各種医療用デバイスにコーティングしたり浸透させて用いることで、バイオフィルムの形成が抑制された、安全性の高い医療用デバイスを提供することができる。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【国際調査報告】
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