【事件の表示】
　特許第３０５３７３１号「走査電子顕微鏡用生物試料作製方法および生物試料観察方法」の請求項１ないし２に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３０５３７３１号の請求項１ないし２に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　特許第３０５３７３１号の請求項１ないし２に係る発明についての出願は、平成６年４月１３日に特許出願され、平成１２年４月７日にその発明についての特許権の設定登録がされ、その後、その特許について、異議申立人株式会社日立製作所より特許異議の申立てがなされ、取消しの理由が通知され、その指定期間内である平成１３年７月２日に訂正請求がなされたものである。
　
２．訂正の適否についての判断
（１）訂正の内容
特許権者が求めている訂正の内容は以下のａ〜ｄのとおりである。
ア．訂正事項ａ
　特許請求の範囲の請求項１について、「表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させることを特徴とする走査電子顕微鏡用生物試料作製方法。」を「表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させることを特徴とする走査電子顕微鏡用生物試料作製方法。」と訂正する。
イ．訂正事項ｂ
　特許請求の範囲の請求項２について、「表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させ、温度上昇過程における試料の状態を走査電子顕微鏡により観察することを特徴とする生物試料観察方法。」を「表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させ、温度上昇過程における試料の状態を走査電子顕微鏡により観察することを特徴とする生物試料観察方法。」と訂正する。
ウ．訂正事項ｃ
　発明の詳細な説明の記載中【００１７】の【課題を解決するための手段】の欄の「この目的を達成する本発明の走査電子顕微鏡用生物試料作製方法は、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させることを特徴とする。また、本発明の生物試料観察方法は、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させ、温度上昇過程における試料の状態を走査電子顕微鏡により観察することを特徴とする。」を、「この目的を達成する本発明の走査電子顕微鏡用生物試料作製方法は、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させることを特徴とする。また、本発明の生物試料観察方法は、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させ、温度上昇過程における試料の状態を走査電子顕微鏡により観察することを特徴とする。」と訂正する。
エ．訂正事項ｄ
　発明の詳細な説明の記載中【００２９】の【発明の効果】の欄の「本発明は、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させるので、変形のない原形を維持した生物試料の走査電子顕微鏡像を得ることができ、従来のように化学固定を行なわないので試料の内部組織の観察が可能である。また、本発明においては、従来の固定、・・・出来上がった試料は保存が可能である。」を、「本発明は、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させるので、変形のない原形を維持した生物試料の走査電子顕微鏡像を得ることができ、従来のように化学固定を行なわないので試料の内部組織の観察が可能である。また、本発明においては、従来の固定、脱水、置換、臨界点乾燥及び凍結乾燥を行なわなくてすむので、薬品による危険がなくなる。また、本発明の試料作製は非常に簡単なので、試料の出来ぐあいが専門知識と習熟度に左右されず、試料作製時間は従来に比べ著しく軽減される。また、本発明は、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させ、温度上昇過程における試料の状態を走査電子顕微鏡により観察するので、試料作製の過程で試料が微妙に変形した場合、試料が変形したかどうかを知ることができ、走査電子顕微鏡で得られた生物試料の像が、原形（生体）を維持した生物試料の像かどうかを判断することができる。また、本発明においては化学固定を行なわないが、出来上がった試料は保存が可能である。」と訂正する。
　
（２）訂正の目的の適否、新規事項の有無、及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否
　上記訂正事項ａ〜ｄに関連する記載として、願書に添付した明細書（以下、「特許明細書」という。）の発明の詳細な説明の【００２０】には、「この冷却により、試料１２は水１８に覆われた状態で凍結する。試料の冷却が終わると、制御装置１４は排気装置３に排気信号を送り、排気装置３は試料室２を排気する。試料室２の真空度は真空ゲージ１７により測定され、その信号は制御装置１４に送られており、制御装置１４は試料室２の真空度を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空状態に設定する」という記載が存在することから、「凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置」する際の真空度として、「０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空」の条件を用いてなる発明は特許明細書に記載されているものと認められる。
　そうすると、上記訂正事項ａ，ｂは、特許明細書に記載された事項の範囲内において凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置する際の真空度を限定したものといえるから、特許請求の範囲の減縮を目的とした明細書の訂正に該当するものであって、新規事項の追加に該当せず、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
　また、上記訂正事項ｃ，ｄは、明りょうでない記載の釈明を目的とする明細書の訂正に該当するものであって、新規事項の追加に該当せず、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。
　
（３）むすび
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法等の一部を改正する法律（平成６年法律第１１６条）附則第６条第１項の規定によりなお従前の例によるとされる、特許法第１２０条の４第３項において準用する平成６年法律第１１６号による改正前の特許法第１２６条第１項ただし書、第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議の申立てについて
（１）本件発明
　特許第３０５１７３１号の請求項１、２に係る発明（以下、それぞれ「本件発明１」、「本件発明２」という。）は、訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１、２に記載された事項により特定される次のとおりのものである。
　
　請求項１「表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させることを特徴とする走査電子顕微鏡用生物試料作製方法。」　
　
　請求項２「表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させ、温度上昇過程における試料の状態を走査電子顕微鏡により観察することを特徴とする生物試料観察方法。」
　 
 （２）申立ての理由の概要
　特許異議申立人株式会社日立製作所は、証拠として甲第１号証（Journal　of　Microscopy，vol．161，Pt 2，February 1991，pp．327−335）（以下、「刊行物１」という。）、甲第２号証（第７回医学生物学のための走査電顕シンポジウム記録　Ｋ．TANAKA編、鳥取大学・医学部第二解剖学教室内青藍会発行、１９７８、第１３頁）（以下、「刊行物２」という。）を提出し、本件発明１及び本件発明２は、特許法第２９条第２項の規定に違反してなされたものであるから、特許を取り消すべき旨主張している。
　
（３）刊行物に記載された発明
　　当審において通知した取消しの理由で引用した刊行物１、２には、以下の事項が記載されている。
（３−１）刊行物１
（１ａ）　要約（３２７頁　SUMMARYの項）
「 走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）の設計における最近の進歩、例えば、電子銃の低収差レンズとの結合、そして、高安定性クライオ転移台（ｃｒｙｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｓｔａｇｅ）の有用性等は、低温低電圧ＳＥＭ（ＬＴＬＶＳＥＭ）を高解像度にすることを可能にする。我々は、このコンビネーションを使用して、非コート生体試料で結果を得た。
ゾウリムシの毛胞（trichocyst）が、凍結乾燥における温度を１７０Ｋから室温までの温度に上げる時におこる、この構造の収縮を観察する試験試料として使用された。高倍率の立体像が、冷凍、冷凍−置換（freeze−substitution）及び臨界点乾燥によって製造された毛胞から得られた。そして、引き続いてＬＴＬＶＳＥＭにより観察されて、ビームダメージおよびコンタミネーションは低かった。」
 （１ｂ）　冷凍乾燥法 (３３１頁１７行〜２４行）
 （１ｃ） 毛胞 (３３１頁２５行〜３０行）
「毛胞（trichocyst）は小さく（１×３μｍ）、蛋白質構造程度であり、ゾウリムシの細胞膜の直下に配置されている小胞体と結合している（Bannister，1972）。Ｃａ２+の離脱をきっかけとして、毛胞は数ミリ秒でオリジナルの長さの約９倍に広がる。圧縮された構造と広がった形状は、負引張りおよび凍結割断深部エッチング技法（negative−strain and freeze−fracture deep−etch techniques）で研究されている（Peterson et al．，1987）。」
  （１ｄ） 凍結試料 (３３１頁３８行〜４６行）
「生起する縮みの程度を測定するために、冷凍乾燥工程はＬＴＬＶＳＥＭによって観察される。
　良好な熱的および電気的伝導性を提供するために、穴が開けられた３ｍｍの金箔からなるディスクは、最初に試料支持部材として用いられた（図２）。しかしながら導電性のカーボンペイント１００μｍ層をコートしないと、金の背景に対して非コート試料はコントラストが低く見えた。ディスクは毛胞懸濁液の１小滴と共に約２分間インキュベートし、その上で蒸留水３滴で洗浄され、液体エタンの中に沈めることで凍結され、液体窒素中で貯蔵された。」
 （１ｅ） 凍結乾燥 （３３１頁４７行〜３３２頁２行）
「凍結試料は、それからガタンクライオ移送台（Gatan cryo−trasfer stage）に搭載され、顕微鏡内に導入され、カーボンの表面が可視可能となるまで（〜３０分）１７０Ｋで凍結乾燥された。凍結乾燥の間、試料像は１．５ｋＶ、１５０Ｋで記録された。コンタミネーションは、試料温度が低いため問題とならないが、ビームダメージがいくらか示されることに注目した。この理由のため、非点収差と焦点は調節機構で調節され、試料は、像が記録されないような低倍率で観察されただけであった。」
（１ｆ） 図３ (３３２頁３行〜９行、３３３頁）
「図３は、薄くなった氷表面から毛胞が最初に現れた像（図３ａ）、そしてそれが室温まで暖められた後、１５０Ｋまで再度冷やされ記録された像（図３ｂ）を示す、毛胞の一連の試料像である。図３ｃは、図３ｂの直後に記録された。図３ｂと図３ｃとの間の僅かな違いは、ビームダメージによるものであろう。これに対し、図３ａと図３ｂとの大きな違いは、結合水が除去された際の毛胞の構造における変化によるものであるかもしれない（MacKenzie，1972； Gross，1987）。」と記載され、図３には、「図３　温度を凍結乾燥が生じた１７０Ｋ（ａ）から、室温へ昇温した（そして顕微鏡写真を作成するために１５０Ｋに戻した、ｂ）際の、凍結乾燥された毛胞の収縮。（ｃ）は、（ｂ）の後直ちに作成されたもので、いくらかの追加的な収縮が見られるが、これは恐らくビームダメージにより生じた。（スケールバー＝２００ｎｍ）」と、説明されている。
　
（３−２）刊行物２
（２ａ） Ｃｒｙｏ−ＳＥＭ法　（７〜１２行）
「Ｃｒｙｏ−ＳＥＭ法はＥｃｈｌｉｎ等が１９７０年に、根井等が１９７１年に発表した方法で、試料を含水状態のまま観察できるという点において理想的な観察方法である。試料作製方法も比較的簡単であるが、その際十分注意しなければならないことは、凍結の課程でなるべく氷晶を作らぬことである。試料作製過程において人工産物を作らぬことをねらいとして考えられた方法であることを考慮すれば当然のことである。今回このＣｒｙｏ−ＳＥＭを用いて血球を観察したところ無蒸着にて良好な結果が得られたので報告する。」
（２ｂ） 材料と方法　（１３〜２３行）
「（材料と方法）
　 材料としてウサギ抹消血を用いた。採決後生理的食塩水で十分洗浄し、２．０％Gluter−aldehyde（in ０．１M Cacodylate Buffer pH７．４ 350mOs）で２時間固定後、0．1M Cacodylate Bufferに保存し検体とした。
　次に試料凍結技法について説明する。
１）血球浮遊液を試料台に滴下し、ロ紙にて液を吸取り水気をできるだけ少なくしておく。
２）試料台をキャリヤーにセットし、液体窒素中につける。（15〜20秒）
３）すばやく取り出して、霜が付かないようにカバーして予備排気室にセットしＲ．Ｐ．にて予備排気する。
４）鏡体内に高真空排気。像を観察しながら予備ヒーターで温度制御し氷の昇華を行なう。細胞表面が露出したならば撮影する。又金蒸着も可能である。」
　
（４）請求項１に係る発明について
　刊行物１において凍結乾燥されている試料のゾウリムシの毛胞は、「蒸留水３滴で洗浄され、液体エタンの中に沈めることで凍結され、液体窒素中で貯蔵された」凍結試料であって（前記（１ｄ）参照）、蒸留水洗浄後特に乾燥されているものでもないから、凍結前のその表面は当然水に覆われており、凍結により「表面を水に覆われた試料を凍結させ」た凍結試料になっているものと認められる。
 　そして、その凍結試料は、「生起する縮みの程度を測定するために、冷凍乾燥工程はＬＴＬＶ　ＳＥＭによって観察される。」（前記（１ｄ）参照）、「凍結試料は、それからガタンクライオ移送台（Gatan cryo−trasfer stage）に搭載され、顕微鏡内に導入され、カーボンの表面が可視可能となるまで（〜３０分）１７０Ｋで凍結乾燥された。凍結乾燥の間、試料像は１．５ｋＶ、１５０Ｋで記録された。」（前記（１ｅ）参照）、「図３は、薄くなった氷表面から毛胞が最初に現れた像（図３ａ）、そしてそれが室温まで暖められた後、１５０Ｋまで再度冷やされ記録された像（図３ｂ）を示す、毛胞の一連の試料像である。」（前記（１ｆ）参照）とあるように、該凍結試料は、「真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させ」られて乾燥されているものである。
　してみれば、本件発明１と刊行物１に記載された発明とを対比すると、両者は「表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させる走査電子顕微鏡用生物試料作製方法。」において一致し、前者は凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置する際の真空度を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に設定しているのに対して、後者が真空度の設定についての記載が存在しない点で相違する。
　しかしながら、刊行物２にも、凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置する際の真空度を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に設定する点について記載も示唆もなされていない。
　しかも、刊行物１に記載された発明では、本件発明１と共通した、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させる構成を採用しているにもかかわらず、作製された試料は前記（１ｆ）の記載にもあるように、収縮変形しているものである。それに対して、本件発明１は、表面を水で覆われ凍結された試料を真空引きされた試料室の中に配置する際の真空度を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に設定することにより、試料細胞を覆った氷が昇華して試料細胞が露出し試料細胞内部の氷が昇華したときに細胞内外の圧力差が少なく、このため、その圧力差によって細胞膜が壊れることはなく、変形のない原形を維持した観察試料を作製することができるという顕著な作用効果を奏するものと認められる。
　してみれば、本件発明１は、刊行物１及び２に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものではない。
　
（５）請求項２に係る発明について
　刊行物１には、前記（４）の如く、表面を水に覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を、真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させた、「凍結乾燥における温度を１７０Ｋから室温までの温度に上げる時におこる、この構造の収縮を観察」したことが記載されている（前記（１ａ）、（１ｄ）、（１ｅ）参照）が、温度上昇過程における試料の状態を走査電子顕微鏡で観察したかどうかは、明記されていない。
　本件発明２と刊行物１に記載された発明とを対比すると、両者は「表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させ、試料を走査電子顕微鏡により観察する生物試料観察方法。」において一致し、前者が凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置する際の真空度を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に設定してるのに対して、後者は真空度の設定についての記載が存在しない点、及び、前者が温度上昇過程における試料の状態を走査電子顕微鏡により観察しているのに対して、後者は温度上昇過程における試料の状態を走査電子顕微鏡で観察したかどうかが明記されていない点で相違する。
　刊行物２には、凍結させた試料を鏡体内で高真空排気し、像を観察しながら予備ヒーターで温度制御し氷の昇華を行い、細胞表面が露出したら撮影することがことが記載されているが（前記（２ｂ）参照）、凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置する際の真空度を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に設定する点については記載も示唆もされていない。しかもこの構成により、試料細胞を覆った氷が昇華して試料細胞が露出し試料細胞内部の氷が昇華したときに細胞内外の圧力差が少なく、このため、その圧力差によって細胞膜が壊れることはなく、また、試料作製の課程で試料が微妙に変形した場合、試料が変形したかどうかを知ることができ、走査電子顕微鏡で得られた生物試料の像が、原形を維持した生物試料の像かどうかを判断することができるという顕著な作用効果を奏するものと認められる。
　してみれば、本件発明２は、刊行物１及び２に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものではない。
　
（６）むすび
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件請求項１ないし２に係る発明の特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件請求項１、２に係る発明の特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。　
【異議決定日】
平成１３年１０月２５日（２００１．１０．２５）
【訂正の要旨】
訂正の要旨
＜訂正事項ａ＞
　特許請求の範囲の請求項１の記載
「表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させることを特徴とする走査電子顕微鏡用生物試料作製方法。」を、特許請求の範囲の減縮を目的として、
「表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させることを特徴とする走査電子顕微鏡用生物試料作製方法。」
と訂正する。
＜訂正事項ｂ＞
　特許請求の範囲の請求項２の記載
「表を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させ、温度上昇過程における試料の状態を走査電子顕微鏡により観察することを特徴とする生物試料観察方法。」を、特許請求の範囲の減縮を目的として、
「表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させ、温度上昇過程における試料の状態を走査電子顕微鏡により観察することを特徴とする生物試料観察方法。」
と訂正する。
＜訂正事項ｃ＞
　発明の詳細な説明の記載中【００１７】の【課題を解決するための手段】の欄の「この目的を達成する本発明の走査電子顕微鏡用生物試料作製方法は、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させることを特徴とする。また、本発明の生物試料観察方法は、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させ、温度上昇過程における試料の状態を走査電子顕微鏡により観察することを特徴とする。」を、明りょうでない記載の釈明を目的として、
「この目的を達成する本発明の走査電子顕微鏡用生物試料作製方法は、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させることを特徴とする。また、本発明の生物試料観察方法は、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させ、温度上昇過程における試料の状態を走査電子顕微鏡により観察することを特徴とする。」
と訂正する。
＜訂正事項ｄ＞
　発明の詳細な説明の記載中【００２９】の【発明の効果】の欄の「本発明は、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させるので、変形のない原形を維持した生物試料の走査電子顕微鏡像を得ることができ、従来のように化学固定を行なわないので試料の内部組織の観察が可能である。また、本発明においては、従来の固定、・・・出来上がった試料は保存が可能である。」を、明りょうでない記載の釈明を目的として、
「本発明は、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させるので、変形のない原形を維持した生物試料の走査電子顕微鏡像を得ることができ、従来のように化学固定を行なわないので試料の内部組織の観察が可能である。また、本発明においては、従来の固定、脱水、置換、臨界点乾燥及び凍結乾燥を行なわなくてすむので、薬品による危険がなくなる。また、本発明の試料作製は非常に簡単なので、試料の出来ぐあいが専門知識と習熟度に左右されず、試料作製時間は従来に比べ著しく軽減される。また、本発明は、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させ、温度上昇過程における試料の状態を走査電子顕微鏡により観察するので、試料作製の過程で試料が微妙に変形した場合、試料が変形したかどうかを知ることができ、走査電子顕微鏡で得られた生物試料の像が、原形（生体）を維持した生物試料の像かどうかを判断することができる。また、本発明においては化学固定を行なわないが、出来上がった試料は保存が可能である。」
と訂正する。
（５４）【発明の名称】
走査電子顕微鏡用生物試料作製方法および生物試料観察方法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させることを特徴とする走査電子顕微鏡用生物試料作製方法。
　【請求項２】　表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させ、温度上昇過程における試料の状態を走査電子顕微鏡により観察することを特徴とする生物試料観察方法。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】　本発明は、走査電子顕微鏡で水分を含んだ生物試料を観察するための走査電子顕微鏡用生物試料作製方法および生物試料観察方法に関する。
　【０００２】
　【従来の技術】　水分を含んだ生物試料を走査電子顕微鏡で観察する際、その試料はできるだけ生体時に近い状態に維持する必要がある。しかし、生物試料はその７０〜８０％が水分であり、試料を摘出後そのまま走査電子顕微鏡内に挿入すれば装置内が真空のため、水分が気化し乾燥による収縮変形を起こすことが多い。
　【０００３】　そこで、現在、生物試料を走査電子顕微鏡で観察する前に、生物試料に処理が行なわれる。図１（ａ）は、従来の生物試料作製の手順を説明するために示したものであり、従来の生物試料作製の手順は以下の通りである。
　【０００４】　▲１▼試料の摘出が行なわれる。試料の摘出は、試料が乾燥しないように手早く細分化する必要がある。
　【０００５】　▲２▼摘出した試料が洗浄される。洗浄する理由は、摘出した試料はそのままでは試料表面に粘液や細胞内顆粒が付着しており、走査電子顕微鏡で観察する際、試料の観察すべき部位が覆い隠される恐れがあるためである。通常は摘出した試料の端をピンセットでつまみ、そのまま緩衝液中で振り洗いをする（これを２〜３回繰り返す）。この洗浄にかかる時間は３０分程度である。
　【０００６】　▲３▼洗浄された試料は固定処理が行なわれる。固定とは、試料に化学的変化を与えて硬化させることである。生物試料を固定する場合、通常は１〜２．５％グルタールアルデヒド固定液、１％オスミウム固定液などが使用されるが、固定法としては固定液を一種類だけで固定する「単独固定」と二種類の固定液を使って順次固定する「二重固定」とがある。グルタールアルデヒド固定液は主にタンパク質のみの固定であるが、オスミウム酸固定液はタンパク質、脂質分が固定されるため比較的固く固定される。「単独固定」では、生物試料はグルタールアルデヒド固定液中で１〜２時間以上、オスミウム固定液中で１〜２時間以内放置される。また、「二重固定」では、生物試料はグルタールアルデヒド固定液中で１〜２時間以上放置される。
　【０００７】　▲４▼生物試料は、試料と化学反応しなかった固定液を除去するために、緩衝液で洗浄される。余分な固定液が残っていると試料を乾燥した際に、試料表面にオスミウム酸などの結晶が析出し観察の妨げになる。この洗浄にかかる時間は３０分〜２時間程度である。
　【０００８】　▲５▼生物試料中の水分をエチルアルコール、アセトンなどの有機溶媒と置換し除去する脱水処理が行なわれる。これは有機溶媒が水に比較して表面張力が１／３程度小さいことにより収縮変形による影響が小さく、乾燥時間が短いことによる。しかし、１００％の有機溶媒中に水分を含んだ試料を直接入れると脱水作用が急激に進み、試料が収縮変形するため、始めはアルコール（アセトン）などを精製水（純粋、蒸留水）で希釈し、５０％溶液とした中に水分を含む試料を浸し、脱水する。同様に６０％、７０％、８０％、９０％、９５％溶液を作り、順次高濃度の溶液中に試料を移し変えていく。試料を１つの溶液に浸す時間は５〜１５分程度である。最後に、生物試料を１００％のエチルアルコールの中に浸し脱水するが、試料を浸す時間は３０分程度で、２回脱水処理が行なわれる。なお、変形を起こしやすい試料は２％溶液から脱水処理が行なわれる。
　【０００９】　以上、試料の脱水処理までが終了したが、これ以降の手順は、臨界点乾燥法とｔ−ブチルアルコール凍結乾燥法により異なる。臨界点乾燥法の手順を▲６▼▲７▼で説明し、ｔ−ブチルアルコール凍結乾燥法の手順を▲８▼▲９▼で説明する。
　【００１０】　▲６▼脱水処理された生物試料は酢酸イソアミル（酢酸アミル）中に入れられ、約１５分間放置される。
　【００１１】　▲７▼▲６▼の置換処理が行なわれた試料は、耐圧容器内に入れられ、室温の状態で液体二酸化炭素が容器に満たされ、密閉した容器が臨界温度以上に加温されて容器の圧力は上昇し、容器の圧力がある圧力に達すると二酸化炭素は瞬間的に液体から気体に変移する。そして、そのまま気体を容器外に徐々に排出させると試料は乾燥する。
　【００１２】　▲８▼▲５▼の脱水処理が行なわれた試料は、ｔ−ブチルアルコールの中に入れられる。▲９▼ｔ−ブチルアルコールに置換された試料は、凍結乾燥装置の試料ステージ上に置かれ、ステージが５℃まで冷やされる（または冷蔵庫内に数十分放置してもよい）。ｔ−ブチルアルコールが凍結したら凍結乾燥装置内はゆっくりと排気され、凍結したｔ−ブチルアルコールは昇華する。昇華が終わり圧力が急激に下がり始めたらステージ温度が室温にもどされ、大気圧にすると乾燥した試料が出来上がる。
　【００１３】
　【発明が解決しようとする課題】　以上、従来の生物試料作製の手順を説明したが、図２はｔ−ブチルアルコール凍結乾燥法により処理されたアナベナの走査電子顕微鏡による２次電子像を示す図面代用写真である。図２（ａ）は、固定液が２％グルタールアルデヒドで、脱水が２０％アルコールから行なわれたアナベナの２次電子像であり、アナベナは収縮している。図２（ｂ）は同じ条件で処理されたアナベナの２次電子像であり、アナベナは変形している。このように、アナベナをｔ−ブチルアルコール凍結乾燥法により処理すると、アナベナは収縮又は変形して原形（生体）を維持しなくなる。又、収縮又は変形というようにこの方法においては再現性がない。図２（ｃ）は、固定液が２％グルタールアルデヒドで、脱水が１０％アルコールから行なわれたアナベナの２次電子像であるが、アナベナは収縮している。なお、臨界点乾燥法により処理された試料の２次電子像は挙げなかったが、臨界点乾燥法においてもｔ−ブチルアルコール凍結乾燥法と同じ問題が生ずる。
　【００１４】　また、従来においては、臨界点乾燥法やｔ−ブチルアルコール凍結乾燥法による試料作製の過程で試料が変形した場合、走査電子顕微鏡像を観察するまで試料の変形が確認できない。このため、せっかく試料を作製しても、その作業が無駄になる場合がある。
　【００１５】　また、臨界点乾燥法やｔ−ブチルアルコール凍結乾燥法による試料作製においては、化学固定を含む前処理作業と専門知識と習熟度が要求され、また、前述したように多くの処理時間が必要になる。
　【００１６】　本発明はこのような問題を解決する走査電子顕微鏡用生物試料作製方法および生物試料観察方法を提供することを目的とする。
　【００１７】
　【課題を解決するための手段】　この目的を達成する本発明の走査電子顕微鏡用生物試料作製方法は、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させることを特徴とする。また、本発明の生物試料観察方法は、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させ、温度上昇過程における試料の状態を走査電子顕微鏡により観察することを特徴とする。
　【００１８】
　【実施例】　以下、本発明の実施例を図面を用いて説明する。図３は本発明の実施例として示した走査電子顕微鏡の概略図である。図３において、１は走査電子顕微鏡の鏡筒、２は試料室、３は試料室２を排気する排気装置である。４は試料ステージで、試料ステージ４はＸ，Ｙ，およびＺ方向に移動可能である。５は吸熱器である。６はサーモモジュールで、サーモモジュール６は、Ｐ型半導体７とＮ型半導体８を金属電極９で接合したπ型直列回路からなるペルチエ素子を単数または複数並列してセラミック板１０で挟んで構成したものである。サーモモジュール６は、電流を矢印Ａの方向に流すとペルチエ効果によりその接合部で吸熱が生じ、その反対側で発熱が生じ、また、電流を矢印Ｂの方向に逆転して流すと、吸熱と発熱が逆転する。したがって、電流の向きを変えることにより、電子的に加熱と冷却が可能である。１１は試料ホルダ、１２は生物試料である。図４は試料ホルダ１１上に置かれた生物試料１２を示したものである。生物試料１２は水１８で覆われている。なお、水のかわりにアルコール溶液であってもよい。１３は試料ホルダ１１の温度を検出する温度検出器、１４は制御装置である。１５はメモリーであり、そのメモリー１５には、図１１のＴに示すような、試料ホルダ加熱開始から所定時間経過後における試料ホルダの目標温度が記憶されている。１６は電源、１７は真空ゲージである。
　【００１９】　以下、この装置の動作を説明する。
　【００２０】　制御装置１４は電源１６に冷却信号、すなわち、サーモモジュール６に電流を前記矢印Ａの向きに流すための信号を送る。この結果、サーモモジュール６上に位置する試料ホルダ１１は冷やされ、試料１２も冷やされる。試料ホルダ１１の温度は温度検出器１３で検出され、その検出信号は制御装置１４に送られている。制御装置１４は試料ホルダ１１の温度が−４５℃になると、電源１６への冷却信号の供給を停止する。制御装置１４が−４５℃の時点で冷却信号の供給を停止させる制御は、前記メモリー１５に記憶されたデータに基づくものである。この冷却により、試料１２は水１８に覆われた状態で凍結する。試料の冷却が終わると、制御装置１４は排気装置３に排気信号を送り、排気装置３は試料室２を排気する。試料室２の真空度は真空ゲージ１７により測定され、その信号は制御装置１４に送られており、制御装置１４は試料室２の真空度を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空状態に設定する。
　【００２１】　次に、制御装置１４は電源１６に加熱信号、すなわち、電流を前記矢印Ｂの向きに流すための信号を送る。この結果、サーモモジュール６上に位置する試料ホルダ１１は加熱され、試料１２も加熱される。試料ホルダ１１の温度は温度検出器１３で検出され、その検出信号は制御装置１４に送られている。制御装置１４は、メモリー１５に記憶されている温度と、温度検出器１３から送られてくる温度を比較し、試料の温度と略同一とみなし得る試料ホルダの温度がメモリー１５に記憶されたデータに基づいて予め設定された速度で徐々に上昇するように電源１６を制御する。このようにして、試料は室温である例えば１５℃になった時点で温度変化を終了する。
　【００２２】　ここで、加熱による試料１２の状態の変化及び生物試料が変形等を起こさない理由を説明する。
　【００２３】　アーチ状または平板状に凍結した氷は、試料室内の真空と試料ホルダの温度値の関係で昇華を始める。そのスピードは、ホルダの昇温カーブによる。昇華のスピードは、生物試料の細胞膜の構造により若干変更することが必要である。その理由は、細胞内の氷の昇華スピードに合わせるためである。そのバランスがくずれると、生物試料に収縮変形を誘発する。つまり、試料を覆った氷が昇華完了する前に試料内部の氷も全て昇華させることが重要である。
　【００２４】　ところで、試料内部の氷が昇華するにしたがって、入射電子線が試料の深部まで拡散し、内部で発生した反射電子が検出可能なため、光学顕微鏡のように内部組織の観察も可能である。なお、従来は化学固定を行なっていたため、化学反応により細胞の質量が大きくなって入射電子の拡散が行なわれにくくなり、内部観察が思うようにできなかった。また、試料加熱中の試料像は表示装置（図示せず）に表示され、オペレーターはこの像を観察することにより、温度上昇過程における試料の変形の有無を確認することができる。
　【００２５】　上述した温度処理が行なわれた試料の走査電子顕微鏡の低真空状態における反射電子像及び高真空状態における二次電子像の例をあげる。尚、前記温度処理が行なわれた試料を高真空状態で観察する場合には、チャージアップによる像の劣化を防ぐため、試料にはコーティングが施される。
　【００２６】　図５は、アオミドロの低真空状態における反射電子像を示す図面代用写真であり、アオミドロの収縮はなく、アオミドロは原形（生体）を維持している。また、本発明の試料作製においては、従来のように試料を化学固定しないので、アオミドロの内部がはっきりと観察できる。図６（ａ）は、水中に発生した藻の低真空状態における反射電子像を示す図面代用写真であり、図６（ｂ）は、その藻の高真空状態における２次電子像を示す図面代用写真である。この像からも明らかなように、藻の収縮はなく、藻はほとんど原形（生体）を維持している。図７（ａ），（ｂ）は、藻の低真空状態における反射電子像を示す図面代用写真であり、図７（ｃ）は、藻の高真空状態における２次電子像を示す図面代用写真である。図７は図６に示した写真の倍率より高い倍率の写真であるが、藻が原形（生体）を維持していることが一層理解できる。図８（ａ）は、藻の低真空状態における反射電子像を示す図面代用写真であり、図８（ｂ）は、藻の高真空状態における２次電子像を示す図面代用写真である。図９（ａ），（ｂ）は、ミジンコの低真空状態における反射電子像を示す図面代用写真であり、図１０（ａ），（ｂ）は、ミジンコの高真空状態における２次電子像を示す図面代用写真である。この像から明らかなように、ミジンコの変形はなく、ミジンコは原形（生体）をほとんど維持している。
　【００２７】　図１（ｂ）は、上述した本発明の生物試料作製の操作手順をまとめたものである。本発明の生物試料作製にかかる時間は、数時間程度であり、従来に比べ生物試料の作製時間は大幅に短縮される。
　【００２８】　なお、上記実施例においては、メモリー１５を設け、試料の温度上昇をメモリーに記憶された情報に基づいて制御したが、メモリーや制御手段を設けずに実施することもできる。その場合、試料の温度上昇を制御した場合と略同じような速度で試料の温度が上昇するように、周囲から試料ホルダヘの熱の流入速度や試料ホルダの熱容量を適切に選択することが必要である。また、試料の温度制御は、試料の温度が前記図１２の斜線の範囲内において上昇するように制御してもよい。また、以上の説明においては、試料の作製を走査電子顕微鏡内において行なったが、前記構成を備えた装置、すなわち、試料を冷却および加熱する手段、試料室を排気する手段などを備えた装置内で試料を作製してもよい。
　【００２９】
　【発明の効果】　本発明は、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させるので、変形のない原形を維持した生物試料の走査電子顕微鏡像を得ることができ、従来のように化学固定を行なわないので試料の内部組織の観察が可能である。また、本発明においては、従来の固定、脱水、置換、臨界点乾燥及び凍結乾燥を行なわなくてすむので、薬品による危険がなくなる。また、本発明の試料作製は非常に簡単なので、試料の出来ぐあいが専門知識と習熟度に左右されず、試料作製時間は従来に比べ著しく軽減される。また、本発明は、表面を水で覆われた試料を凍結させ、該凍結試料を０．０１Ｔｏｒｒ〜２Ｔｏｒｒの間の低真空に真空引きされた試料室の中に配置した状態で、該凍結試料を零度より高い温度まで昇温させ、温度上昇過程における試料の状態を走査電子顕微鏡により観察するので、試料作製の過程で試料が微妙に変形した場合、試料が変形したかどうかを知ることができ、走査電子顕微鏡で得られた生物試料の像が、原形（生体）を維持した生物試料の像かどうかを判断することができる。また、本発明においては化学固定を行なわないが、出来上がった試料は保存が可能である。
【図面の簡単な説明】
　【図１】　従来の生物試料作製の手順及び本発明の生物試料作製の手順を示したものである。
　【図２】　ｔ−ブチルアルコール凍結乾燥法により処理されたアナベナの低真空走査電子顕微鏡による反射電子像を示す図面代用写真である。
　【図３】　本発明の実施例として示した走査電子顕微鏡の概略図である。
　【図４】　試料ホルダ上に置かれた生物試料を示したものである。
　【図５】　本発明の処理がされたアオミドロの低真空状態における反射電子像を示す図面代用写真である。
　【図６】　本発明の処理がされた藻の走査電子顕微鏡像を示す図面代用写真である。
　【図７】　本発明の処理がされた藻の走査電子顕微鏡像を示す図面代用写真である。
　【図８】　本発明の処理がされた藻の走査電子顕微鏡像を示す図面代用写真である。
　【図９】　本発明の処理がされたミジンコの低真空状態における反射電子像を示す図面代用写真である。
　【図１０】　本発明の処理がされたミジンコの高真空状態における２次電子像を示す図面代用写真である。
　【図１１】　試料ホルダ加熱開始から所定時間経過後における試料ホルダ加熱温度を説明するために示したものである。
　【符号の説明】
１　鏡筒
２　試料室
３　排気装置
４　試料ステージ
５　吸熱器
６　サーモモジュール
７　Ｐ型半導体
８　Ｎ型半導体
９　金属電極
１０　セラミック板
１１　試料ホルダ
１２　試料
１３　温度検出器
１４　制御装置
１５　メモリー
１６　電源
１７　真空ゲージ
１８　水