(57)【要約】  肝細胞を３次元的に培養し、簡便にスフェロイドを形成する技術、および、胆管排泄を担うトランスポーターＭＲＰ２の発現が従来法よりも高いスフェロイドを形成する技術を提供する。前記課題を解決するために、本発明者らは、ナノピラーシート上において肝細胞がスフェロイドを形成しやすくなる条件を見出した。具体的には、ＮＰシートに塗布するＩ型コラーゲンの濃度に関することである。また、形成したスフェロイドの排泄に関わる遺伝子の発現量を向上させる条件を見出した。具体的には予めスフェロイドを形成させた後に、生物学的マトリクスを重層することである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物肝細胞の培養方法において、
肝細胞の相当直径よりも小さい相当間隔を有するナノピラーシートに所定の濃度に希釈された、インテグリンと結合するタンパク質を塗布する工程と、
インテグリンと結合するタンパク質が塗布された上記ナノピラーシートに、所定の培地に所定の細胞密度に調製された肝細胞を播種する工程と、
所定時間周期で培地交換する工程を有し、
上記ナノピラーシートにインテグリンと結合するタンパク質を塗布する工程の後に、減圧工程を有することを特徴とする動物肝細胞の培養方法。
【請求項２】
請求項１に記載の動物肝細胞の培養方法において、
上記肝細胞を播種する工程では、上記肝細胞がナノピラーシートには接着するがアクチンストレスファイバーを形成するまではいかない範囲で接着させ、肝細胞スフェロイドを形成させることを特徴とする動物肝細胞の培養方法。
【請求項３】
請求項１に記載の動物肝細胞の培養方法において、
培養液中に、インシュリンおよびデキサメタゾンを添加することを特徴とする動物肝細胞の培養方法。
【請求項４】
請求項３に記載の動物肝細胞の培養方法において、
培養液中のインシュリンの濃度は１ｎＭ−１００ｎＭの範囲であって、およびデキサメタゾンの濃度は、１ｎＭ−２５０ｎＭの範囲であることを特徴とする動物肝細胞の培養方法。
【請求項５】
請求項１に記載の動物肝細胞の培養方法において、
前記肝細胞の播種密度が１×１０４−１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度であることを特徴とする動物肝細胞の培養方法。
【請求項６】
請求項１に記載の動物肝細胞の培養方法において、
前記肝細胞を相応表面処理を施したナノピラーシートに播種後、２４‐４８時間後に生物学的マトリクスを重層することを特徴とする動物肝細胞の培養方法。
【請求項７】
請求項６に記載の動物肝細胞の培養方法において、
生物学的マトリクスが、基底膜由来成分を含むことを特徴とする動物細胞の培養方法。
【請求項８】
請求項１に記載の動物肝細胞の培養方法において、
形成されたスフェロイドの直径が、３０−１００iｍ以下であることを特徴とする動物肝細胞の培養方法。
【請求項９】
請求項１に記載の動物肝細胞の培養方法において、
インテグリンと結合するタンパク質は、細胞外マトリクスの成分であることを特徴とする動物肝細胞の培養方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の動物肝細胞の培養方法において、
細胞外マトリクス成分は、Ｉ型コラーゲンを含むことを特徴とする動物肝細胞の培養方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の動物肝細胞の培養方法において、
前記Ｉ型コラーゲンの濃度は、１／１０６−１／１０８％（Ｗ／Ｖ）の範囲であることを特徴とする動物肝細胞の培養方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の動物肝細胞の培養方法において、
培地交換をする時間周期は４時間から２４時間であることを特徴とする動物肝細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養基材を用いて動物肝細胞を培養した肝細胞塊である３次元スフェロイド、あるいは組織様構造物の形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品開発の標準的なプロセスは大きく３つの段階に分けられる。第一段階は、医薬ニーズを調査し医薬品開発の対象とする病気を選択した後、疾病に有効な物質を探索し、目的とする医薬候補品を創出（スクリーニング）する段階である。続いて第二段階は、医薬候補品が対象とする病気の診断、治療に有効で安全であることを非臨床試験、臨床試験を通じて立証し、その評価成績を新薬承認申請書にまとめて国の承認を取得する段階である。そして第三段階が、承認された医薬品が市販されて医療に使用される段階である。この創薬過程を研究開発にかかるコストという観点で眺めてみると、全研究開発費の３０％から場合によっては５０％に相当する額が動物実験に費やされているという報告がある。【０００３】
動物実験は非臨床試験と一部の臨床試験や初期スクリーニングに用いられる。したがって、動物実験に代わる低コストな代替試験法の開発は、新薬一品目当たりの開発費が１，０００億円に迫ろうとする目下の状況下では、研究開発費の抑制という点でその削減効果が見込まれる。また、動物福祉・愛護の観点からも、特に昨今のEUの動きをみれば、動物実験の削減は社会的にはすでに寄り戻すことのできない大きな流れとなっている。さらに、細胞を利用したin vitro代替法は、従来の動物実験では理解が難しかった薬物あるいは化合物の体内動態の作用機序の解明、特に重要な指標のひとつである肝臓における代謝や解毒、胆管排泄の評価に有利であるとの指摘もある（非特許文献１）。【０００４】
このような背景のもと、これまでに細胞を利用した代替法のアプローチは盛んにとられてきたが、臨床反応を予測するには限界があるものが多い。これは、これらの培養法では、細胞が実際の生体内の構造を模擬した構造を取っていないためであると考えられている（非特許文献２）。したがって、より生体に近い３次元構造の構築とそれを用いたin vitroアッセイ系の確立が求められている。中でも、肝細胞を用いたin vitroアッセイへの期待が高く、重要なスクリーニング指標のひとつである肝臓における代謝や毛細胆管排泄の評価系が求められている。毛細胆管は、２つ以上の肝細胞によって囲まれた腔所であり、タイト結合により細胞間腔を閉じ、胆汁の漏れを防いでいる。肝臓は細胞膜上に発現したATP依存性トランスポーターによって、肝細胞から毛細胆管内への胆汁や代謝産物の輸送を行っている。このような胆管排泄量を測定する技術にサンドイッチ法があるが（非特許文献３）、現在までに充分な性能を示す実用化はなされていない。【０００５】
細胞の３次元構造を実現するためのデバイスとしてナノピラー細胞培養シート（以下、「ナノピラーシート」または「ＮＰシート」）がある（特許文献１）。ＮＰシートは、ナノインプリント技術の微細加工技術を応用して作製した、細胞培養、あるいは組織培養用の足場材料である。ナノピラーシートの特長は、人工的に設計した微細な立体構造を足場材料として用いることにより、三次元培養用デバイスとしての効果が期待できる点にある。ナノピラーシートを用いた細胞培養に関してはこれまでにいくつかの報告がなされている（特許文献２，３）。
【特許文献１】特開2004-170935号公報
【特許文献２】特開2006-223197号公報
【特許文献３】特開2008-054566号公報
【非特許文献１】J. Cell Biol. 101: 914-923 (1985)
【非特許文献２】J Biomol. Screen. 9: 273 - 285 (2004)
【非特許文献３】FASEB J 3: 174-177 (1989)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来のサンドイッチ培養法（以下、ＳＷ培養）は、肝細胞の底面にＩ型コラーゲン、肝細胞の上面に生物学的マトリクスを重層し、これら２種類の物質で細胞を挟んで２次元平面的に培養する方法であり、胆管に排泄された代謝産物を定量できるという特長を持っている。しかしながら、in vitro系のＳＷ培養では、計測のダイナミックレンジが狭く、微小な変動を計測できないことが問題となっている。これは、生体内から生体外にいったん取り出した肝細胞は本来の細胞機能が低下すること、培養ディッシュで再構成させた構造物では形成される毛細胆管の数が生体内と比べて少ないことが原因と考えられている。【０００７】
そこで、細胞を生体内組織の構造に近い３次元で培養することにより、上記問題点を解決する動きが急速に広まってきている。具体的には、ＮＰシートを用いた培養が試みられている。しかし、ＮＰシートを用いた細胞培養に関しても、特許文献２，３では、脂肪細胞の３次元培養、あるいは神経細胞の培養に関しての記述はあるが、肝細胞の培養は考慮されておらず、肝細胞培養に特化した記述はない。したがって、特許文献２、および３の方法を肝細胞培養に適用しようとする場合、所望のスフェロイドが形成されないという問題があった。【０００８】
これらの理由から、本発明は、生体に近い構造、機能を有する３次元肝細胞スフェロイドをＮＰシートを用いて形成させるための方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するために、ナノピラーシート上において肝細胞がスフェロイドを形成する条件を見出した。具体的には、ＮＰシートに塗布するＩ型コラーゲンを塗布することである。また、形成したスフェロイドの排泄に関わる遺伝子の発現量を向上させる条件を見出した。具体的には予めスフェロイドを形成させた後に、生物学的マトリクスを重層することである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明を適用することによって、ナノピラーシート上で簡便に肝細胞の３次元構造であるスフェロイドを形成できる。形成されたスフェロイドは、胆管排泄を担うトランスポーターＭＲＰ２の発現が従来法よりも高く、より生体に近い胆管排泄能を持つ。このようなスフェロイドを用いることによって、微量な排泄も計測できるダイナミックレンジの広い計測が可能になる。計測のダイナミックレンジが広がれば、創薬過程の薬物動態試験に適用することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】肝細胞スフェロイド培養の培養工程を示す図である。
【図２】Ｉ型コラーゲン溶液濃度を変えてコーティングした４種類のＮＰシート上で培養した肝細胞の位相差顕微鏡像を示す図である。
【図３】肝臓凍結組織切片，ＮＰスフェロイド，平面培養細胞の免疫組織化学を示す図である。
【図４】アンモニア代謝能を示す図である。
【図５】ＣＤＦＤＡを用いた胆管排泄計測の結果を示す図である。
【図６】リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析結果を示す図である。
【図７】自動培養装置の全体構成図である。
【図８】自動培養装置中の減圧部（Ａ）と培養部（Ｂ）を示す図である。
【図９】培養自動化の工程を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００１２】
１０１    ＮＰシート
１０２    細胞培養ディッシュ
１０３    接着剤
１０４    Ｉ型コラーゲン溶液
１０５    減圧用容器
１０６    減圧用ポンプ
１０７    洗浄用生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（−）；以下、ＰＢＳ（−））
１０８    培地
１０９    肝細胞
１１０    肝細胞スフェロイド
１１１    減圧チャンバー
１１２    減圧部投入・取出口
１１３    開閉バルブ
１１４    接続部
１１５    減圧ポンプ
１１６    インキュベータ
１１７    液化炭酸ガスボンベ
１１８    脱イオン水
１１９    投入口
１２０    取出口
１２１    内部投入口
１２２    内部取出口
１２３    保管室
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
培養基材を用いて肝細胞を培養し、肝細胞塊である３次元スフェロイド、あるいは組織様構造物の形成方法を実現するための最良の形態について、以下詳細に説明する。
【実施例１】
【００１４】
実施例１では、ＮＰシート上で肝細胞スフェロイドを形成するための工程を示す。【００１５】
＜肝細胞の調製＞
肝細胞の調製は、in situコラゲナーゼかん流法にしたがった。詳しくは以下の通りである。Ｆｉｓｈｅｒ３４４系雄ラット（７〜１０週齢）を、ペントバルビタール麻酔下で開腹し、門脈にカテーテルを挿入して前かん流液（Ｃａ２＋とＭｇ２＋不含，ＥＧＴＡを含むハンクス液）を注入する。同時に肝臓下部の下大静脈を切開して血液を放出させる。次に胸腔を開き、右心房に入る下大静脈を切開し、肝臓下部の下大静脈をかん止で止めてかん流を行なう。肝臓からの脱血が十分になされたことを確認した後にかん流を止める。かん流液をコラゲナーゼ溶液に換えて、かん流を行う。本実施例では０．０５％コラゲナーゼ含むハンクス液を用いてかん流を行うが、この限りではない。細胞間組織がコラゲナーゼにより消化されたことを確認した後、かん流を止める。肝臓を切り離し、冷したハンクス液中で細切りし、ピペッティングにより細胞まで分散する。次いでガーゼろ過により未消化の組織を除去する。細胞懸濁液は、５０Ｇ、１分の遠心分離を数回繰り返して非実質細胞を除去する。次いで等張パーコール液を使用して５００Ｇ、５分の遠心分離で傷害のある肝細胞を除去する。得られた肝細胞の生存率はトリパンブルー排除法で計測し、生存率８５％以上の肝細胞を培養に使用する。ここでは、生存率８５％以上の肝細胞を培養に使用するが、必ずしも当該条件に限られるものではないことはいうまでもない。また、肝細胞の調製は必ずしもin situコラゲナーゼかん流法に限られるものではない。【００１６】
さらに、ヒト肝細胞についても同様の方法で調製することが可能である。【００１７】
＜Ｉ型コラーゲンを塗布したＮＰシートの準備＞
培養ディッシュ（１０２）底面にＮＰシート（１０１）を貼り付ける（図１(a)）。ＮＰシート（１０１）の貼付は特に限定されるものではなく、例えば瞬間接着剤であってもよく、両面テープであってもよい。また、ＮＰシート（１０１）を貼付する容器も特に限定されるものではなく、市販の細胞培養用ディッシュであってもよく、チャンバースライドであってもよい。実施例１では、市販の細胞培養ディッシュ（１０２）に瞬間接着剤（１０３）でＮＰシート（１０１）を貼付した例を示す。ＮＰシート（１０１）は、後述する所定の頭頂部直径を有するＮＰシートを複数用いるものとする。【００１８】
次に、弱酸性溶液に溶解しているＩ型コラーゲンを所定の濃度まで滅菌水で希釈した希釈液（Ｉ型コラーゲン溶液）１０４の１−１．５ｍＬをチャンバースライドに貼付したＮＰシート（図１(a)）に添加する（図１(b)）。【００１９】
次に、添加したＩ型コラーゲンをＮＰシートに完全に吸着させるため、減圧用容器１０５内で減圧ポンプ１０６により減圧操作を施す（図１(c)）。減圧操作は０．０４気圧以下で行う。減圧時間は特に限定されるものではないが、本実施例では１０分間行う。減圧に用いる装置は特に限定するものではない。ここで希釈液の所定濃度の範囲は１／１０６％（Ｗ／Ｖ）以上１／１０８％（Ｗ／Ｖ）以下である。必ずしも当該範囲に限定されるものではないが、当該範囲以上であったり、当該範囲以下であるとスフェロイドが形成されない可能性がある。【００２０】
最後に、Ｉ型コラーゲンを除き、ＰＢＳ（−）１０７を加える（図１(d)）。この操作を３回行い、Ｉ型コラーゲンを洗浄する。【００２１】
＜肝細胞の培養＞
前述の通りin situコラゲナーゼかん流法により調製した肝細胞１０９を培地１０８に懸濁し、同じく前述の通り準備したＩ型コラーゲンを塗布したＮＰシートに播種する（図１(e)）。培地は特に限定されるものではないが、血清（ＦＣＳ）、インシュリン、デキザメタゾンを含んだ培地（以下、培地（１０％ＦＣＳ＋））を含むウィリアムズＥ培地を用いる。本実施例では、特に１０％ＦＣＳ、８．６ｎＭインシュリン、２５５ｎＭデキザメタゾンを含んだウィリアムズＥ培地を用いる。播種後、ＣＯ２インキュベータを用いて５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養を開始し、１８時間以上経過した後に、最初の培地交換を行い、以降２４時間毎に培地交換を行う。播種後１８時間目以降の培養に用いる培地は特に限定されるものではないが、本実施例では、培地（１０％ＦＣＳ＋）からＦＣＳを除いた培地（以下、培地（ＦＣＳ−））を用いる。また、肝細胞の播種密度は、本実施例では１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌとしたが、この濃度に限定されない。ここで、培養に用いるＮＰシートには、（１）頭頂部の直径が０．１８μｍのＮＰシート（以下、０．１８ＮＰ）、（２）同０．５μｍのＮＰシート（以下、０．５ＮＰ）、（３）同１．０ μｍのＮＰシート（以下、１．０ＮＰ）、（４）同２．０ μｍのＮＰシート（以下、２．０ＮＰ）の４種類とする。また、ＮＰシートに添加するＩ型コラーゲンの濃度は、（１）１／１０６％（Ｗ／Ｖ）以上、（２）１／１０６％（Ｗ／Ｖ）、（３）１／１０８％（Ｗ／Ｖ）、（４）１／１０８％（Ｗ／Ｖ）以下、の４種類とする。計１６種類の条件で培養を行う。条件によってはスフェロイド１１０が形成されるものもある（図１(f)）。１６種類の条件で培養した結果は図２に示す通りであり、これによりスフェロイド形成のための最適な条件が決まる。これによれば、いずれのＮＰシートを用いても、Ｉ型コラーゲン濃度が１／１０６％（Ｗ／Ｖ）以上１／１０８％（Ｗ／Ｖ）以下が最も好ましい条件であることが明らかとなった。
【実施例２】
【００２２】
実施例２では、実施例１で説明したＮＰ肝細胞スフェロイドの有効性を評価する。以下、各評価法について評価手順と評価結果の順で説明する。【００２３】
＜免疫染色＞
形成した肝細胞スフェロイドの構造が生体内の肝臓組織の構造に近いことを示すために免疫染色を行う。着目した分子は、細胞−細胞間接着タンパク質であるE−カドヘリンと細胞骨格タンパク質であるアクチンである。Ｅ−カドヘリンとは、細胞−細胞間の接着結合を担う膜タンパク質のひとつで、細胞同士が結合し合いより高次な組織を構築していく上で必須のタンパク質である。また、アクチンとは細胞同士が接着し高次構造を形成していく際に細胞に対して物理的な支持を与える細胞骨格タンパク質である。これらふたつのタンパク質の発現は組織が組織として成立していることを示すためには必須の指標である。【００２４】
免疫染色の手順を以下に示す。まず、実施例１にしたがって、Ｉ型コラーゲンを塗布したＮＰシートを用いて肝細胞スフェロイドを形成させる（以下、ＮＰ通常培養）。本実施例では、実施例１の結果より、目的とする骨格タンパク質であるアクチンと細胞−細胞間接着タンパクであるE-カドヘリンが、なかでも発達し、球形に近いスフェロイドを構築している２．０ＮＰに、１／１０６％（Ｗ／Ｖ）のＩ型コラーゲンを塗布し、スフェロイドを形成させたが、必ずしもこの条件に限定されるものではない。形成したスフェロイドをＰＢＳ（−）で３回洗浄し、固定する。本実施例では、４％パラフォルムアルデヒドを用いて１５間固定するが、必ずしもこの方法に限らない。ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、非イオン界面活性剤に５分間浸漬し細胞膜を破壊する。本実施例では、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘを用いたが必ずしもこの物質に限らない。ＰＢＳ（−）で３回洗浄後、ブロッキングを行う。本実施例では１％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）に３０分間浸漬してブロッキングを行ったが、必ずしもこの方法に限定されない。その後、１次抗体を作用させる。本実施例では、ラビット抗ヒトE-カドヘリンモノクローナル抗体を作用させが、必ずしも免疫動物種はラビットに限定されるものではなく、例えばマウスであってもゴートであってよい。また１次抗体の作用温度と時間は、本実施例では４℃で一昼夜行ったが、これらに限定されない。続いて、非イオン界面活性剤を含むＰＢＳ（−）で洗浄後、ＰＢＳ（−）のみで洗浄する。本実施例では０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳ（−）を用いたが、この物質に限定されない。その後、蛍光色素付きの２次抗体を作用させる。本実施例ではFITC付加抗ラビットIgG抗体を作用させるが、必ずしも免疫動物種はラビットに限定されるものではなく、例えばマウスであってもゴートであってよい。また、作用温度と時間は、本実施例では３７℃で１時間としたが、この方法に限定されない。続いて同様の方法を用いて洗浄する。次にアクチン繊維の染色を行う。本実施例ではローダミン付加ファロイジンを室温にて５分間作用させるが、作用時間はこの限りではない。ＰＢＳ（−）で１回洗浄し、核染色を行う。本実施例ではヘキスト３３３４２を室温にて５分間作用させるが、この方法に限定されない。最後にMilli-Q水で洗浄し、封入する。【００２５】
比較のため、ここで従来の平面培養によって得られる肝細胞に対し、免疫染色を行い、Ｅ−カドヘリン、およびアクチンの発現量について検証する。従来の平面培養とは以下の通りである。市販のコラーゲンコート培養ディッシュに肝細胞を１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で前出の培地に懸濁し播種する。播種後１８時間以上経過した後に、最初の培地交換を行い、以降２４時間毎に培地交換を行う。播種後１８時間目以降の培養に用いる培地は前出の通りである（以下、平面培養）。このような平面培養によって得られた細胞に対し、前出の通りの方法によって免疫染色を施す。【００２６】
同様に比較のため、凍結肝臓組織切片に対しても免疫染色を行い、Ｅ−カドヘリン、およびアクチンの発現量について検証する。凍結切片の調製方法は以下の通りである。ラットを開腹後、前かん流液により脱血するまでは実施例１の通りである。その後、肝臓の一部を切り取り、包埋剤を加えて−８０℃のフリーザーにて凍結する。凍結サンプルを用いて凍結ミクロトームにより切片を作製する。こうして得られた凍結切片に対し、前出の方法によって免疫染色を施す。【００２７】
以上のようにして調製したＮＰスフェロイド、平面培養、凍結切片の３種類の免疫染色の結果を図３に示す。肝臓切片（図３(a)）と同様に、肝細胞スフェロイド（図３(b)）においてもE-カドヘリンが細胞−細胞間に濃縮していることが明らかとなった。またE-カドヘリンと同様、アクチンについても、肝臓切片（図３(d)）とスフェロイド（図３(e)）で共に細胞膜の部分に局在しており、細胞膜を裏打ちしている様子が明らかとなった。それに対して，従来の平面培養では、生体の肝臓組織で発現しているE-カドヘリンが発現していないこと（図３(c)）、アクチンストレスファイバーを張っていること（図３(f)）が示され、本来の構造とは明らかに異なっていることがわかる。このように、従来の平面培養に対し、ＮＰシートによるスフェロイド培養によって、構造の面からは生体の組織に近づけることが可能となる。以上のように、ＮＰを用いた培養では、アクチンストレスファイバーを張らないこと、E-カドヘリンの発現が検出されたことから、細胞−細胞間の接着が細胞−基材間の接着よりも上回ったために、細胞−細胞間の接着が発達した３次元的な立体構造を形成したと思われる。【００２８】
＜アンモニア代謝能測定＞
次に、生体に近い構造を持つスフェロイドの機能を検証するため、肝臓の重要な機能であるアンモニア代謝能を測定する。生体内では、アンモニアは主に腸内や腎臓で生成され、血流に乗って肝臓にたどり着き、肝臓は尿素回路を利用してアンモニアを尿素に変換する。このような肝臓のアンモニア代謝能を測定するため、市販の専用キットを使用する。まず、前出の方法にしたがって、２．０ＮＰシートを用いたＮＰ通常培養によって肝細胞スフェロイドを形成させる。比較のため、前出の平面培養法にしたがって培養を行う。ともに、培養開始７２時間後にアンモニア培地に交換し、培地の一部をサンプリングする。培地交換後２４時間培養後に、同様に培地をサンプリングする。各サンプリング液に対し、キットの説明にしたがってサンプルを調製する。６３０ｎｍの吸光度を測定し、当該２４時間のアンモニア減少（代謝）量を算出する。なお、予めアンモニア濃度が既知のサンプルを使用して検量線を求めておく。一方、サンプリング時点での細胞数の測定は、細胞をSDSによって可溶化した後、ヘキスト33258を添加し蛍光強度を測定して求める（励起波長355 nm、蛍光波長460 nm）。本実施例では市販のキットを採用したが、いずれの方法であってもかまわない。【００２９】
このようにしてＮＰシートで再構成した３次元構造であるスフェロイドのアンモニア代謝能を測定したところ、従来の平面培養に比べてＮＰスフェロイドにおいて優位に高く，アンモニア代謝が活発に行われていることが明らかとなった（図４）。肝細胞本来に近い構造を取ることによって，同時に生体内での肝細胞が本来保持している極性を回復して機能の向上につながったと考えられる。【００３０】
＜毛細胆管排泄の検討＞
ＮＰによって形成したスフェロイドの肝機能を検証するため、肝臓の重要な機能の一つである毛細胆管への排泄能を測定する。本実施例では、毛細胆管を形成する細胞膜上に局在するタンパク質であるＭＲＰ２の基質である5-カルボキシ-2’，7’-ジクロロフルオレッセイン二酢酸（ＣＤＦＤＡ）を投与して胆管への排泄の有無を検証した。ＭＲＰ２が活性を持っていれば5-カルボキシ-2’，7’-ジクロロフルオレッセイン（ＣＤＦ）として胆管に排泄される。【００３１】
測定の方法は以下の通りである。まず、前出の方法にしたがって、２．０ＮＰシートを用いたＮＰ通常培養によって肝細胞スフェロイドを形成させる。比較のため、胆管排泄の定量計測で先行しているサンドイッチ培養（以下、ＳＷ培養）を採用した。ＳＷ培養は以下の通りである。市販のコラーゲンコート培養ディッシュに肝細胞を１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で前出の培地に懸濁し播種する。培養を開始し、４時間後に最初の培地交換を行い、２４時間後に生物学的マトリクスを含む培地（以下、生物学的マトリクス培地）に交換し、以降２４時間毎に前出の方法にしたがって培地交換を行い、培養する（模式図は図５(k)）。ともに、培養開始後２４、４８、７２、９６時間後に測定を行う。各時間において、細胞をハンクス液（含、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋）で1回洗浄しＣＤＦＤＡを含む培地に交換後、３７℃で２０分間インキュベーションする。ハンクス液（含、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋）で３回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察する。本測定は、必ずしも当該条件に限られるものではない。また、ここで生物学的マトリクスにはマトリゲル(登録商標)等を用いた例を示すが、必ずしもこれに限るものではないことは明らかである。【００３２】
測定の結果，２４時間の時点ではＮＰスフェロイド，ＳＷ培養ともに取り込まれたＣＤＦＤＡが細胞内に蓄積する様子が観察された（図５(a), (f)）。これは、播種後２４時間では胆管が形成されていないか、形成されていても機能を持ったＭＲＰ２が胆管部位で発現していないためと考えられる。その後、４８時間では細胞内と胆管の両方に蓄積されており（図５(b), (g)）、７２時間（図５(c), (h)）、９６時間（図５(d),(e),(i),(j)）では細胞内には残っておらず、胆管に排出される。これは，時間の経過と共に次第に胆管が形成されて、ＣＤＦＤＡがＣＤＦとして胆管に排出されたためと考えられる。この結果から、ＳＷ法と同様にＮＰスフェロイドにおいても胆管が形成され、機能を持ったＭＲＰ２が胆管に局在していることが明らかとなった。【００３３】
＜リアルタイムＰＣＲ＞
形成したスフェロイドが肝臓組織のような高次構造を維持していること、あるいは肝臓特異的な機能を保持していることを検証するために、リアルタイムＰＣＲ法を用いて定量的な遺伝子発現解析を行う。採取直後の肝細胞のターゲット遺伝子（表１）の発現量を測定し，その値を１としたときの各培養条件における発現量を算出し、発現量の比較を行う。【００３４】
【表１】
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【００３５】
３種類の培養条件の間で比較を行う（図６(b)）。ひとつは、前出の２．０ＮＰ上でのＮＰ通常培養（図６(b)，２．０ＮＰ）である。ふたつめは、２．０ＮＰ上に肝細胞を播種後４８時間目に生物学的マトリクスを重層化する条件（以下、ＮＰ生物学的マトリクス重層培養。図６(b)，２．０ＮＰ+Ｍ）である。生物学的マトリクスは細胞外マトリクスからの抽出成分であり、より生体に近い環境を提供するものとして、これまで細胞生物学の実験に使われてきた。また、前述のSW法においても生物学的マトリクスを用いることで肝機能の向上を実現している。これらのことから、ＮＰスフェロイドにも生物学的マトリクスを作用させることでより高い効果が期待できると考えた。同時に、これまでのセルラインを利用した検討より、スフェロイドが大きすぎると（直径５０μｍ以上）培地成分の浸透や酸素の供給という点で不利になり、スフェロイド内部から壊死してしまうことが明らかになっていることから、スフェロイドの直径を５０μｍ以下のまま維持することもスフェロイドの機能の向上に重要な要因であると考えた。以上の予備検討の結果、生物学的マトリクスを重層することで高機能化が期待でき、さらにスフェロイドの大きさを制御できる可能性が考えられたため、この方法を採用することとする。生物学的マトリクス重層培養の具体的な方法は以下の通りである。１０-6 ％（Ｗ／Ｖ）のＩ型コラーゲンを塗布したＮＰシートに肝細胞を播種する。培地（１０％ ＦＣＳ＋）を使用して培養を開始し、１８時間後に最初の培地交換を行い、２４時間後に無血清の培地（培地（１０％ ＦＣＳ−））に交換した。さらに２４時間後に生物学的マトリクス培地に交換し、以降２４時間毎に培地（１０％ ＦＣＳ−）を用いて培地交換を行い、９６時間培養した。そして３つめはSW培養である（図６(b)，ＳＷ）。【００３６】
実験のスキームを図６(b)に示す。このようにして得られた、ＮＰ通常培養、ＮＰ生物学的マトリクス重層培養、ＳＷ培養に対し、培養開始２４、４８、７２、９６時間後にスフェロイドおよび細胞をトリプシン処理により回収し、１，５００ ｒｐｍ、４℃で５分間遠心する。専用のキットを用いて全RNAを抽出する。１．０μｇの全ＲＮＡに対し、逆転写反応を行いｃＤＮＡサンプルを得る。得られたｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲを行う。内部標準遺伝子にはＴＢＰを、ターゲット遺伝子にはＭＲＰ２を採用し、採取直後の肝細胞の発現量を1としたときの、各条件の相対値を発現量とする。解析手法にΔΔCt法（1サイクルの検出の違いで増幅産物に2倍量の差があるという理論を使用する。検量線作成が不要のため、多サンプルを処理できるというメリットがある。比較Ct法とも言う。）を採用したが検量線法であってもかまわない。【００３７】
実験の結果、肝臓特異的なトランスポーターであるＭＲＰ２は、ＮＰスフェロイドに生物学的マトリクスを重層する２．０ＮＰ+Ｍの条件で、生物学的マトリクスを重層しない２．０ＮＰやＳＷ培養よりも高い発現を示した（図５(a)）。これは、単に生物学的マトリクスの重層のみが効果的であるのではなく、肝細胞がスフェロイドを予め形成しておくことの重要性を示唆するものである。
【実施例３】
【００３８】
実施例１で述べてきた一連の培養工程の自動化を実現する培養装置構成および、自動培養工程を以下説明する。自動培養装置全体構成図を図７、自動培養装置の中の減圧部と培養部の詳細を図８、培養自動化フローチャートを図９に示す。入力部で条件を入力し、表示部に表示させる。入力する条件は、Ｉ型コラーゲン注入部におけるＩ型コラーゲン注入量、減圧部における減圧チャンバー内圧力、減圧時間、液体注入・吸引部におけるコラーゲン液吸引量、注入洗浄液量、洗浄回数、細胞懸濁液注入部における細胞液注入量、培養部における培養部内温度、培養部内ＣＯ２濃度、培地交換までの培養時間（培地交換周期）、培地交換部における培養上清吸引量、交換用培地、交換用培地温度、培地交換量、および培養部と培地交換部の両方を制御するための総培養時間等である。表示部には、入力したこれらの情報が表示される。【００３９】
また、上記入力の条件は予め複数条件を組み合わせてメモリに記憶させておくことで入力を簡素化させることも可能である。複数条件を記憶させておいて、表示部を介してどの条件で工程を実行するかを選択するようにしても良い。【００４０】
入力された情報は制御部に伝送され、メモリ等に格納される。入力された情報に基づいて一連のコマンドをメモリから呼び出し、培養工程が開始される。尚、培養工程の動作制御については、制御部に搭載される中央処理装置において統括的に管理される。全工程はクリーンルーム内で行う。【００４１】
また、培養ディッシュのそれぞれには、バーコードもしくはRFIDタグ等が搭載され、工程を実行する装置の各々にこれらを読取る装置を設け、電子通信によって制御部において培養ディッシュのそれぞれの工程を管理するようにすることも可能である。【００４２】
ＮＰシートの搬送はロボットアーム、ベルトコンベア、あるいはその他の方法で行う。また、工程の一部が別個の機器で独立している場合には、操作者によって培養ディッシュを搬入出するようにしても良い。【００４３】
ＮＰシートが添付された培養ディッシュはまずＩ型コラーゲン注入部に送られ、投入・取出口から中に入れる。Ｉ型コラーゲン注入部には、Ｉ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲンを培養ディッシュに注入するノズルが具備されている。Ｉ型コラーゲン注入量は予めメモリに記憶されているが、ＮＰシート突起先端部が隠れる程度の量が望ましい。【００４４】
Ｉ型コラーゲンが注入された培養ディッシュは投入・取出口から外に出され、続いて減圧部（図８（Ａ）−１，２．図８（Ａ）−１は減圧部を上から見た図、図８（Ｂ）−２は減圧部を横から見た図である。）に送られる。減圧部投入・取出口（１１２）から培養ディッシュは減圧チャンバー（１１１）に入れられ、扉を閉られる。減圧動作制御は制御部で行う。具体的には、培養ディッシュをチャンバー（１１１）に投入後、減圧チャンバーと減圧ポンプ（１１５）との接続部（１１４）に付随する開閉バルブ（１１３）を開き、０．０４気圧以下に減圧する。１０分間以上減圧を行った後、開閉バルブ（１１３）を閉じ、大気圧を同程度になるのを待って、減圧操作は終了となる。当該減圧ポンプや扉、バルブの開閉動作は減圧操作終了後、減圧部投入・取出口（１１２）から出され、洗浄部に送られる。洗浄部には吸引ノズルを先端に保持した吸引装置、および注入ノズルを先端に保持した洗浄液が具備されている。洗浄液は何であってもかまわないが、本実施例ではＰＢＳ（−）を使用する。また各ノズルの先端部はコンタミを防ぐため交換可能である手段を持っている。洗浄部にてＩ型コラーゲン液の吸引、洗浄液の注入の後、洗浄液の吸引と注入を所定回数繰り返す。注入量および洗浄回数は予めメモリに記憶されている。【００４５】
洗浄操作終了後、培養ディッシュは細胞懸濁液注入部に送られる。細胞懸濁液注入部では、細胞懸濁液と、培養ディッシュに細胞懸濁液を注入するノズルが具備されている。予めメモリに記憶された所定量が注入される。また、細胞懸濁液注入部には、注入された細胞懸濁液が培養ディッシュに均一に播種されるように、ステージが上下左右に振動するような構成になっている。また細胞懸濁液注入部は断熱材を配し、制御部によって温度制御が可能である。【００４６】
細胞懸濁液が注入された培養ディッシュ（以降、培養細胞）は続いて培養部（図８（Ｂ）−１，２．図８（Ｂ）−１は減圧部を上から見た図、図８（Ｂ）−２は減圧部を横から見た図である。）に送られる。培養部はインキュベータ（１１６）内のＣＯ２濃度を一定に保つため、液化炭酸ガスボンベ（１１７）と炭酸ガスモニタを配している。また、インキュベータ内の湿度を一定に保つために脱イオン水（１１８）を配している。制御部によって温度制御と時間管理が可能である。培養部に送られた培養細胞は投入口（１１９）からインキュベータ内に送られ、内部投入口（１２１）を経て上段の保管室（１２３）に送られる。培養部では、インキュベーター内部を２区画に区切ることによって、大量の培養細胞の培養、およびＣＯ２濃度の変動を低く抑えることが可能になる。所定時間培養された培養細胞は内部取出口（１２２）、取出口（１２０）を経て培地交換部に送られる。【００４７】
培地交換部には吸引ノズルを先端に保持した吸引装置、および注入ノズルを先端に保持した培地が具備されている。培地交換部は制御部によって温度制御がなされる部屋がいくつかあり、培養細胞は目的に応じて所定の温度の培地交換室に送られ培地交換を行う。各ノズルの先端部はコンタミを防ぐため交換可能である手段を持っている。培地交換をし終えた培養細胞は再び培養部に送られ培養される。【００４８】
培養、および培地交換をそれぞれの所定時間、所定回数行い、所望のスフェロイドを得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
これまで細胞培養は２次元平面上での単層培養が主流であったが、生体内環境は３次元であり、この環境を模した細胞培養系および３次元構造を持った細胞群の形成が不可欠である。本発明は、ＮＰシートに塗布するＩ型コラーゲンの濃度を規定することにより、このような３次元構造をもった細胞塊であるスフェロイドの形成が容易となるだけでなく、本発明によって形成されたスフェロイドは、胆管排泄能を保持した生体の肝臓組織に近い機能を発現するスフェロイドであり、創薬スクリーニング分野での利用価値は高い。
【図１】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【国際調査報告】
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