(57)【要約】  本発明は、ドライアイ、特に重篤な上皮障害に伴うドライアイの予防・治療に有用な眼科用組成物を提供する。具体的には、アラニン、アスパラギン、グルタミン、及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸、好ましくは、アラニン、アスパラギン、及びグルタミンから選択される２又は３種のアミノ酸、アルギニン、アスパラギン、及びグルタミンの３種のアミノ酸、またはアルギニンおよびグルタミンの２種を含有することを特徴とする眼科用組成物、ならびに眼表面疾患、特に角結膜上皮障害の予防・治療用としての眼科用組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラニン、アスパラギン、グルタミン及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸を含有することを特徴とする眼科用組成物。
【請求項２】
上記アミノ酸が、アラニン、アスパラギン及びグルタミンから選択される２又は３種のアミノ酸である請求項１記載の眼科用組成物。
【請求項３】
上記アミノ酸が、アラニン、アスパラギン及びグルタミンの３種である請求項２記載の眼科用組成物。
【請求項４】
上記アミノ酸が、アルギニン、アスパラギン及びグルタミンの３種である請求項１記載の眼科用組成物。
【請求項５】
上記アミノ酸が、アルギニンとグルタミンとの組み合わせである請求項１記載の眼科用組成物。
【請求項６】
眼表面疾患の予防・治療用である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の眼科用組成物。
【請求項７】
眼表面疾患が、角結膜上皮障害である請求項６記載の眼科用組成物。
【請求項８】
アラニン、アスパラギン、グルタミン及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸を含有する組成物の有効量を眼表面疾患を有する患者に投与することを特徴とする、眼表面疾患の予防・治療方法。
【請求項９】
眼表面疾患が、角結膜上皮障害である請求項８記載の予防・治療方法。
【請求項１０】
眼表面疾患予防・治療剤の製造のためのアラニン、アスパラギン、グルタミン及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸を含有する組成物の使用。
【請求項１１】
眼表面疾患が、角結膜上皮障害である請求項１０記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、眼科用組成物、特にドライアイを伴う眼表面疾患の予防・治療に有用な眼科用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
涙液は、角膜や結膜からなる眼球表面を覆って角結膜の湿潤性を保持し、乾燥を防いでいる。しかしながら、近年、涙液減少症に伴う角結膜表面の乾燥、コンタクトレンズ装用時の眼の乾燥、あるいはＯＡ機器の操作中に起きる眼の乾燥等により、疲労感、異物感を始めとした種々の症状、すなわち、ドライアイ症状を訴える人が増えている。ドライアイは、しばしば角膜上皮細胞の障害による角膜上皮障害や角膜上皮糜爛等を伴い、重篤な場合は角膜潰瘍や眼感染症を発症させることもある。【０００３】
一般的に、ドライアイ治療の第一選択は人工涙液の点眼である。これまでに種々の人工涙液が提案されており、塩化ナトリウムなどの塩類を主眼とした人工涙液、ヒドロキシエチルセルロース、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸を含む点眼剤等が従来知られている。しかし、これらの人工涙液の点眼のみでは症状が改善しないケースが多い。ドライアイは、乾燥（涙液量の減少）だけでなく涙液の組成（即ち、涙液の質）の異常が大きく関与していると考えられる。これに対して、従来型の点眼剤に特定のアミノ酸を添加した点眼剤も開発されているが（特許文献１〜３）、ドライアイ、特に重篤な上皮障害に伴うドライアイに対して、満足な治療効果が得られる人工涙液は未だ無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００７／０４８５２３号パンフレット
【特許文献２】特開２００６−１０４１１４
【特許文献３】国際公開第１９９６／１９２１１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、ドライアイ、特に重篤な上皮障害に伴うドライアイの予防・治療に有用な眼科用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ドライアイ患者群およびＶＤＴ（Ｖｉｓｕａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ）作業により急性のドライアイ状態を惹起した群（ＶＤＴ作業群）の涙液中のアミノ酸組成を分析した結果、健常者の涙液と比較して、特定のアミノ酸が有意に低減していることを見出した。そこで本発明者らは、ヒト角膜上皮細胞を種々のアミノ酸組成の培地を用いて培養し、各アミノ酸の細胞増殖促進及び創傷治癒効果を試験した結果、前記特定のアミノ酸が顕著な角膜上皮障害治療効果を有することを確認して、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］アラニン、アスパラギン、グルタミン及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸を含有することを特徴とする眼科用組成物。
［２］上記アミノ酸が、アラニン、アスパラギン及びグルタミンから選択される２又は３種のアミノ酸である上記［１］記載の眼科用組成物。
［３］上記アミノ酸が、アラニン、アスパラギン及びグルタミンの３種である上記［２］記載の眼科用組成物。
［４］上記アミノ酸が、アルギニン、アスパラギン及びグルタミンの３種である上記［１］記載の眼科用組成物。
［５］上記アミノ酸が、アルギニンとグルタミンとの組み合わせである上記［１］記載の眼科用組成物。
［６］眼表面疾患の予防・治療用である、上記［１］〜［５］のいずれか１つに記載の眼科用組成物。
［７］眼表面疾患が、角結膜上皮障害である上記［６］記載の眼科用組成物。
［８］アラニン、アスパラギン、グルタミン及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸を含有することを特徴とする眼科用組成物の有効量を眼表面疾患を有する患者に投与することを特徴とする、眼表面疾患の予防・治療方法。
［９］眼表面疾患が、角結膜上皮障害である上記［８］記載の予防・治療方法。
［１０］眼表面疾患予防・治療剤の製造のためのアラニン、アスパラギン、グルタミン及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸を含有する組成物の使用。
［１１］眼表面疾患が、角結膜上皮障害である上記［１０］記載の使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、症状として中軽度のドライアイだけでなく、従来の人工涙液を頻回点眼しても症状の改善が認められなかったドライアイ、特に重篤な上皮障害に伴うドライアイに対して治療効果を有する。さらにドライアイ発症を未然に防止する予防的効果を期待できる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下において、本発明について詳細に説明する。
本発明は、アラニン、アスパラギン、グルタミン及びアルギニンのうちの少なくとも１種のアミノ酸を含有することを特徴とする眼科用組成物（以下、本発明の眼科用組成物と略記する場合もある。）、特にドライアイを伴う眼表面疾患の予防・治療に有用な眼科用組成物を提供する。本明細書において、ドライアイとは、涙液（層）の質的又は量的な異常により、引き起こされた角結膜上皮障害を指す。
【００１０】
本発明の眼科用組成物の有効成分であるアラニン、アスパラギン、グルタミン及びアルギニンは、遊離体であってもよいし、薬理学的に許容される塩であってもよい。そのような塩としては、例えば、生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属、アルカリ土類金属）などとの塩が用いられ、アルカリ金属塩（例：ナトリウム塩、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例：カルシウム塩、マグネシウム塩）などが好ましく例示される。本明細書においては、以後単にアミノ酸名で記載する場合、特に矛盾しない限りは、当該アミノ酸の塩をも包含する意味で用いられていると解すべきである。またＬ−アラニルグルタミンのように、細胞に対し本発明の眼科用組成物の有効成分であるアミノ酸と同等の効果を示すことが知られているペプチドを用いることもできる。
【００１１】
本発明の眼科用組成物の有効成分であるアラニン、アスパラギン、グルタミン及びアルギニン（以下、有効アミノ酸ともいう）は、そのうちの１種のみを用いてもよいが、２または３種以上を組み合わせて使用すると効果が高く、好ましい。そのような好ましい組み合わせとしては、２種類の組み合わせの場合、アスパラギンとアラニン、アスパラギンとグルタミン、アスパラギンとアルギニン、アラニンとグルタミン、アラニンとアルギニン、グルタミンとアルギニンの組み合わせ、３種類の組み合わせの場合、アスパラギンとアラニンとグルタミン、アスパラギンとアラニンとアルギニン、アラニンとグルタミンとアルギニン、アルギニンとアスパラギンとグルタミンの組み合わせ、４種類の組み合わせの場合、アスパラギンとアラニンとグルタミンとアルギニンの組み合わせが挙げられる。好ましくは、本発明の眼科用組成物の有効アミノ酸の組み合わせとしては、アラニン、アスパラギン及びグルタミンから選択される２又は３種のアミノ酸からなる組み合わせである。また、別の好ましい組み合わせでは、アラニンとグルタミン、グルタミンとアルギニン、アラニンとグルタミンとアルギニン、アスパラギンとグルタミンとアルギニン、アラニンとアスパラギンとグルタミンとアルギニンの組み合わせである。
【００１２】
本発明の眼科用組成物における有効アミノ酸の濃度は、角結膜上皮細胞の増殖促進及び／又は創傷治癒効果が得られ、かつ細胞毒性が出ない範囲であれば、特に制限されないが、通常有効アミノ酸の総和として、０．０５ｍＭ〜１０００ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜８００ｍＭ、さらに好ましくは０．３ｍＭ〜２００ｍＭ、特に好ましくは、０．５ｍＭ〜１００ｍＭである。各有効アミノ酸濃度は、所望の効果が発揮される限り特に限定されない。通常、各有効アミノ酸濃度は、０．１μＭ〜８００ｍＭ、好ましくは０．５μＭ〜１００ｍＭ、さらに好ましくは１μＭ〜６００μＭ、特に好ましくは１μＭ〜５００μＭの範囲から適宜選択することができる。アラニンの場合、例えば、０．５μＭ〜６００ｍＭ、好ましくは１μＭ〜５００ｍＭ、さらに好ましくは、特に好ましくは８μＭ〜１５０ｍＭ、就中、１０μＭ〜１００ｍＭであり、アスパラギンの場合、例えば、１μＭ〜３００ｍＭ、好ましくは、５μＭ〜１５０ｍＭ、より好ましくは、１０μＭ〜１００ｍＭ、アルギニンの場合、例えば、０．１μＭ〜２００ｍＭ、好ましくは０．５μＭ〜１００ｍＭ、より好ましくは、３μＭ〜５０ｍＭ、グルタミンの場合、例えば、１μＭ〜６００ｍＭ、好ましくは５μＭ〜５００ｍＭ、より好ましくは、１０μＭ〜２００ｍＭ、就中、１２〜１５０μＭである。
【００１３】
本発明の眼科用組成物は、眼の局所組織に投与することができる製剤であればよく、例えば、点眼剤、貼付剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤等が挙げられるが、好ましくは、点眼剤である。本発明の眼科用組成物が点眼剤である場合には、適宜基材が用いられてもよい。点眼剤に用いられる基材としては、リン酸緩衝液、ハンクスバッファー、生理食塩水、灌流液（例えば、ビーエスエスプラス（日本アルコン株式会社）、オペガードネオキット（千寿製薬株式会社））、人工涙液などが挙げられる。ビーエスエスプラスを基材として使用する場合には、オキシグルタチオン溶液を添加せずに、希釈液だけを使用することもできる。
【００１４】
本発明の眼科用組成物は、角結膜上皮障害の予防・治療効果を有する他の薬剤をさらに含有していてもよい。そのような併用薬剤としては、例えば、角膜保護剤（例：ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸又はその塩）、免疫抑制／抗炎症剤（例：シクロスポリン、ステロイド）等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００１５】
また、本発明の眼科用組成物は、任意の他の活性成分、例えば、抗アレルギーまたは抗ヒスタミン成分、充血除去成分、局所麻酔薬成分、ビタミン成分、有効アミノ酸以外のアミノ酸成分（例：バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、シトルリン、オルニチン、シスチン、タウリン、グリシン）などをさらに含有していてもよい。そのような他の活性成分としては、自体公知の各種薬剤を適宜使用することができる。
【００１６】
さらに本発明の眼科用組成物は、緩衝剤、等張化剤、保存剤、溶解補助剤、安定化剤、キレート剤、増粘剤、ｐＨ調整剤等の各種添加剤を適宜配合することができる。
【００１７】
緩衝剤としては、例えば、ホウ酸またはその塩（ホウ砂等）、クエン酸またはその塩（クエン酸ナトリウム等）、酒石酸またはその塩（酒石酸ナトリウム等）、グルコン酸またはその塩（グルコン酸ナトリウム等）、酢酸またはその塩（酢酸ナトリウム等）、リン酸またはその塩（リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等）、グルタミン酸やイプシロンアミノカプロン酸等の各種アミノ酸およびトリス緩衝剤等、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００１８】
等張化剤としては、例えば、ソルビトール、マンニトール、グリセリン、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙げられる。
【００１９】
保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ソルビン酸またはその塩、グルコン酸クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、塩化セチルピリジニウム、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン、クロロブタノール等が挙げられる。
【００２０】
溶解補助剤としては、例えば、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリソルベート８０（商品名：Ｔｗｅｅｎ８０）等が挙げられる。
【００２１】
安定化剤としては、例えば、エデト酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、シクロデキストリン、縮合リン酸またはその塩、亜硫酸塩、クエン酸またはその塩、ジブチルヒドロキシトルエン等が挙げられる。
【００２２】
キレート剤としては、例えば、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、縮合リン酸またはその塩（縮合リン酸ナトリウム等）等が挙げられる。
【００２３】
増粘剤としては、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸等が挙げられる。
【００２４】
ｐＨ調整剤としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸またはその塩（ホウ砂）、塩酸、クエン酸またはその塩（クエン酸ナトリウム、クエン酸二水素ナトリウム等）、リン酸またはその塩（リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム等）、酢酸またはその塩（酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム等）、酒石酸またはその塩（酒石酸ナトリウム等）等が挙げられる。
【００２５】
本発明の眼科用組成物のｐＨは、３〜１０、好ましくはｐＨ５〜８となるように調整される。
【００２６】
本発明の眼科用組成物は、眼痛、開眼困難、異物感、疲労感等の軽減、ならびに視力、結膜充血、角膜上皮の状態の改善などに優れた効果を発揮する。従って、本発明の眼科用組成物は、眼表面疾患、特に角結膜上皮障害の予防・治療剤として有用である。
角結膜上皮障害としては、例えば、乾燥によって引き起こされる角膜上皮障害（例えば、涙液減少症、眼乾燥症、マイボーム腺機能不全、シェーグレン症候群、乾性角結膜炎、眼瞼炎、スティーブンス−ジョンソン症候群、ＶＤＴ作業に関連したドライアイ等のドライアイ症候群、または、ドライアイに伴う角結膜上皮障害、瘢痕性角結膜上皮症、角膜上皮糜爛、角膜潰瘍、眼瞼縁炎、眼類天疱瘡、春季カタル、アレルギー性結膜炎等）のほか、紫外線による角膜上皮障害（例えば、角膜炎、雪目等）、化学物質による化学外傷、点眼剤中に含まれる薬物（例えば、保存剤、点眼麻酔薬、プロスタグランジン、アミノグリコシド系抗生物質、β遮断薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬等）起因性の角膜上皮障害（例えば、点状表層角膜炎、角膜潰瘍等）などが挙げられる。
【００２７】
本発明の眼科用組成物はさらに、目の疲れ、目のかわき、目のかすみ、目のかゆみ、結膜充血、コンタクトレンズ着用時の不快感等の予防または改善するための点眼用組成物としても用いることができる。
【００２８】
本発明の眼科用組成物は、ヒト、ヒト以外の動物〔例えば、ヒト以外の哺乳類（ブタ、ウシ、ウマ、イヌ等の家畜および愛玩動物）等〕における上記疾患または状態を予防・治療するために用いることができる。
【００２９】
本発明の眼科用組成物の投与量は、剤形、対象疾患、投与対象の動物種、年齢、性別、体重、症状などに依存して変化し得るが、例えば、成人（例えば、体重６０ｋｇ）の場合、１日あたり、組成物中のアミノ酸総量に換算して、通常０．１μｇ〜２．０ｇの範囲であり、好ましくは０．５μｇ〜１．８ｇ、さらに好ましくは１．０μｇ〜１．５ｇの範囲である。
【００３０】
本発明の眼科用組成物の１日あたりの用量は、一度にもしくは数回に分けて投与することができる。例えば、点眼剤として使用する場合には、本発明の眼科用組成物を、重症ドライアイ患者に対しては１日あたり５〜２０回、好ましくは１６〜１８回（概ね、一時間に１回）、中軽症ドライアイ患者に対しては１日あたり２〜１０回、好ましくは３〜７回投与する。１回あたりの投与量としては、一つの眼あたり１〜３滴（５０〜１５０μＬ）、好ましくは１〜２滴（５０〜１００μＬ）投与することができる。また投与期間は特に限定されない。
【００３１】
本明細書および図面において、アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００３２】
Ｇｌｙ        ：グリシン
Ａｌａ        ：アラニン
Ｖａｌ        ：バリン
Ｌｅｕ        ：ロイシン
Ｉｌｅ        ：イソロイシン
Ｓｅｒ        ：セリン
Ｔｈｒ        ：スレオニン
Ｃｙｓ        ：システイン
Ｍｅｔ        ：メチオニン
Ｇｌｕ        ：グルタミン酸
Ａｓｐ        ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ        ：リジン
Ａｒｇ        ：アルギニン
Ｈｉｓ        ：ヒスチジン
Ｐｈｅ        ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ        ：チロシン
Ｔｒｐ        ：トリプトファン
Ｐｒｏ        ：プロリン
Ａｓｎ        ：アスパラギン
Ｇｌｎ        ：グルタミン
Ｏｒｎ        ：オルニチン
Ｃｉｔ        ：シトルリン
(Ｃｙｓ)２     ：シスチン
Ｔａｕ        ：タウリン
【００３３】
以下に、実施例および試験例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
[参考例]  涙液中のアミノ酸含量の測定
健常者とドライアイ患者の間、および健常者のＶＤＴ作業前とＶＤＴ作業後の間で、被験者の涙液中に含有されるアミノ酸量の比較検討を行った。
健常者、ドライアイ患者および健常者のＶＤＴ作業前とＶＤＴ作業後（作業時間２時間）の各被験者から、毛細管を用いて眼から０．５μＬの涙液を採取した。得られた涙液を蒸留水で１０倍に希釈後、４倍量のアセトニトリルを添加し、振とう撹拌を行った。撹拌後、該混合液を１０，０００Ｇで１分間、高速遠心した。上清を採取後、凍結保存することでサンプルとした。解凍後のサンプル各５μＬに、内部標準物質（濃度既知のアミノ酸）５μＬ、ホウ酸緩衝液３０μＬを加えた。サンプル中のアミノ酸のアミノ基を標識するために、アミノ基誘導体化試薬（ｐ‐トリメチルアンモニウムアリニル‐Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジカルバメートアイオダイド）１０μＬを加え、５５℃で１０分間保温した。その後、０．２％酢酸５０μＬを加えて反応を終結させた。高速液体クロマトグラフ‐タンデム質量分析計（ＡＰＩ４０００ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、涙液中のアミノ酸含量を分析した。測定の対象としたアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、トリプトファン、ヒスチジン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、オルニチン、シトルリン、シスチン、タウリンである。
健常者およびドライアイ患者の各被験者の涙液中の測定対象となったアミノ酸総量を１００とした場合、各アミノ酸の構成比率を計算した。結果を表１に示す。
また、健常者の安静時涙液と２時間ＶＤＴ作業を行い、仮性ドライアイ状態にしたときの涙液中のそれぞれの各アミノ酸濃度（μＭ）を測定した。結果を表２に示す。【００３５】
【表１】
2010107069.tif 000002
【００３６】
【表２】
2010107069.tif 000003
【００３７】
上記の測定結果から、ドライアイ患者の涙液では、健常者の涙液に比してＧｌｎ、Ａｒｇ、Ａｓｐの比率が有意に低下していることが分かった。さらに、ドライアイ患者の涙液では、健常者の涙液に比してＯｒｎ、Ｔａｕ等の比率が上昇していることも分かった。また、ＶＤＴ作業によるドライアイ状態の涙液では、安静時に比してＡｓｎ、Ａｌａ、Ｔａｕが有意に低下していることが分かった。【００３８】
［２×Ｚｅｒｏ培地の調製］
二段蒸留水４００ｍＬにＺｅｒｏ培地粉末[ ＣａＣｌ２(ａｎｈｙｄ) ２００ｍｇ，  Ｆｅ(ＮＯ３)３・９Ｈ２Ｏ  ０．１ｍｇ，  ＫＣｌ  ４００ｍｇ，  ＭｇＳＯ４(ａｎｈｙｄ) ９７．６７ｍｇ，  ＮａＣｌ  ６４００ｍｇ，  ＮａＨＰＯ４・Ｈ２Ｏ  １２５ｍｇ，  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  １１０ｍｇ，  Ｄ−Ｃａ  ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ  ４ｍｇ，  Ｃｈｏｌｉｎｅ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ４ｍｇ，  Ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ４ｍｇ，  Ｉ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ７．２ｍｇ，  Ｎｉａｃｉｎａｍｉｄｅ  ４ｍｇ，  Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ  ０．４ｍｇ，  Ｔｈｉａｍｉｎｅ  ＨＣｌ  ４ｍｇ，  Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ  ＨＣｌ  ４ｍｇ]を溶解させ、さらにＮａＨＣＯ３  ３．７ｇおよびＧｌｕｃｏｓｅ  １ｇを添加して溶解させた。培地をＨＣｌ（塩酸）でｐＨ７．４に調整し、二段蒸留水で５００ｍＬにまでメスアップした。その後、０．２２μｍ滅菌フィルターで滅菌濾過した後、４℃で保存した。
［アミノ酸含有培地の調製］
上記の２×Ｚｅｒｏ培地に適宜アミノ酸粉末を添加して溶解させた後、０．２２μｍ滅菌フィルターにて滅菌処理し、４℃保存した。例えば、全２０種のアミノ酸を含有する培地（以下、Ｆｕｌｌ培地と表記）の場合、２×Ｚｅｒｏ培地（５０ｍＬ）にＦｕｌｌ培地粉末［Ｇｌｙｃｉｎｅ  ３．０ｍｇ，  Ｌ-Ａｌａｎｉｎｅ  ３．５６ｍｇ，  Ｌ-Ｓｅｒｉｎｅ  ４．２ｍｇ，  Ｌ-Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ９．５ｍｇ，  Ｌ-Ｃｙｓｔｉｎｅ  ２ＨＣｌ  ６．３ｍｇ，  Ｌ-Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ３．０ｍｇ，  Ｌ-Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ５８．４ｍｇ，  Ｌ-Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  ５．２８ｍｇ，  Ｌ-Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ ５．８８ｍｇ，  Ｌ-Ａｓｐａｒｔｉｃ  Ａｃｉｄ  ５．３２ｍｇ，  Ｌ-Ｖａｌｉｎｅ  ９．４ｍｇ，  Ｌ-Ｌｅｕｃｉｎｅ  １０．５ｍｇ，  Ｌ-Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ  １０．５ｍｇ，  Ｌ-Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ６．６ｍｇ，  Ｌ-Ｔｙｒｏｓｉｎｅ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ  １０．４ｍｇ，  Ｌ-Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  １６ｍｇ，  Ｌ-Ｌｙｓｉｎｅ-ＨＣｌ  １４．６ｍｇ，  Ｌ-Ａｒｇｉｎｉｎｅ-ＨＣｌ  ８．４ｍｇ，  Ｌ-Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ＨＣｌ-Ｈ２Ｏ  ４．２ｍｇ，  Ｌ-Ｐｒｏｌｉｎｅ  ４．６ｍｇ］を溶解させ、滅菌水で１００ｍＬまでメスアップした後、０．２２μｍ滅菌フィルターにて滅菌処理し、４℃保存することで調製した。一部のアミノ酸が欠損したアミノ酸含有培地についても、上記と同様に必要なアミノ酸粉末を２×Ｚｅｒｏ培地に溶解させるか、あるいは、前もって調製したアミノ酸溶液を無菌的に添加することで調製した。必須アミノ酸と１〜４種の非必須アミノ酸を含む添加培地についても、上記と同様に必要なアミノ酸粉末を２×Ｚｅｒｏ培地に溶解させるか、あるいは、前もって調整したアミノ酸溶液を無菌的に添加することで調整した。【００３９】
［実験例１］  ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒト角膜上皮細胞増殖に対するアミノ酸の効果の検討−１
５μｇ／ｍＬインスリン（ＧＩＢＣＯ）、０．１μｇ／ｍＬコレラトキシン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）および５μＬ／ｍＬペニシリン‐ストレプトマイシン溶液（ナカライテスク）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ）を用いて、ＳＶ４０不死化ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥＴＣＯ）の予備培養を５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２日間行った。予備培養後、該培養細胞を０．２５％トリプシンを用いて回収し、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、ＥｐｉＬｉｆｅ培地を用いて、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２日間培養した。その後、Ｚｅｒｏ培地に培地交換し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１日培養した。続いて、各検体培地に再度培地交換し、３日間培養を続けた（５％ＣＯ２、３７℃）。各検体培地のアミノ酸組成を欠損培地については表３、添加培地については表４に示す。【００４０】
培養３日目の時点において細胞増殖を観測した。具体的には、２．５％グルタルアルデヒドで１５分間処理することで細胞を固定し、０．５％メチレンブルーで１５分間処理することで細胞を染色した。メチレンブルーを抽出するため、０．３３Ｎ塩酸を２００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、撹拌機上で撹拌した。６３０ｎｍの吸光度を測定することで細胞増殖を分析した。吸光度の測定結果を欠損培地については表３に、添加培地については表４にそれぞれ示す。なお、表３及び表４に示した吸光度は、各培地についてそれぞれ６ｗｅｌｌ（ｎ＝６）培養して吸光度を測定し、その平均値を示した。【００４１】
【表３】
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【００４２】
【表４】
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【００４３】
［実験例２］  ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒト角膜上皮細胞増殖に対するアミノ酸の効果の検討−２
検体培地の処方を変更した以外は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒト角膜上皮細胞増殖に対するアミノ酸の効果の検討―１と同様の操作を行った。検体培地の処方及び吸光度の測定結果を表５に示す。【００４４】
【表５】
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【００４５】
上記実験例１及び実験例２の結果、ＡｒｇがＦｕｌｌ培地から欠損した場合に、その他のアミノ酸が欠損した場合と比較して著しくヒト角膜上皮細胞の増殖が抑制されていることが分かった。また、表５から必須アミノ酸培地にグルタミンとアルギニン、アスパラギンとアラニン、アスパラギンとアラニンとグルタミン、アスパラギンとアラニンとアルギニン、アラニンとグルタミンとアルギニン、アルギニンとアスパラギンとグルタミン、およびアスパラギンとアラニンとグルタミンとアルギニンの組み合わせで添加した場合、必須アミノ酸培地にＴａｕを添加したものと同程度以上の細胞増殖効果が得られることが分かった。なお、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける系では、培地中に含まれるアミノ酸の濃度の総和は、約１８ｍＭ未満であるのが好ましい。約１８ｍＭよりアミノ酸の総濃度が高い培地中で細胞培養を行った場合には、アミノ酸添加の効果よりも、細胞毒性が強く発現する傾向にある。【００４６】
［実験例３］  創傷治癒に対するアミノ酸の効果の検討
５μｇ／ｍＬインスリン（ＧＩＢＣＯ）、０．１μｇ／ｍＬコレラトキシン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）および５μＬ／ｍＬペニシリン‐ストレプトマイシン溶液（ナカライテスク）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ）を用いて、ＳＶ４０不死化ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥＴＣＯ）の予備培養を５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２日間行った。予備培養後、該培養細胞を０．２５％トリプシンを用いて回収し、６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、ＥｐｉＬｉｆｅ培地を用いて、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２週間培養した。その後、Ｚｅｒｏ培地に培地交換し、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１日間培養した。コンフルエント状態でマイクロピペットチップ（１０００μＬ）の先端にて細胞を直線状に擦過し、創傷モデルを作製した。創傷作製後、検体培地に交換し、４８時間培養を行った。創傷箇所の回復状態を位相差顕微鏡を用いて検討した。具体的には、創傷幅の測定をＩｍａｇｅＪイメージ解析ソフト（ＮＩＨ）を用いて行った。各群については合計６箇所の測定を行った。検体培地の処方及び、０ｈｒにおける創傷幅を１００とした４８時間後の創傷幅の割合（創傷治癒改善率）及び、４８時間後のＦｕｌｌ培地における創傷治癒改善率を１００とし、４８時間後のＺｅｒｏ培地における創傷治癒率を０とした場合の各培地における４８時間後の創傷治癒改善率の相対比（創傷治癒相対比）を表６に示す。【００４７】
【表６】
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【００４８】
その結果、Ｆｕｌｌ培地からアルギニンを欠損させた培地では、グルタミン及びグルタミン酸の２種を欠損させた培地に比べて創傷治癒率が顕著に低減していることが分かった。すなわち、角膜上皮損傷治癒に対してもアルギニンの寄与が高いことが示唆された。【００４９】
［実施例１］  アミノ酸含有点眼液の調製
各アミノ酸含有点眼液およびコントロールとして使用したアミノ酸非含有点眼液の処方を表７に示す。【００５０】
【表７】
2010107069.tif 000008
【００５１】
［試験例１］  アミノ酸含有点眼液の安全性確認試験
Ｄｒａｉｚｅ法（Ｊ．Ｈ．Ｄｒａｉｚｅ，Ｇ．Ｗｏｏｄａｒｄ  ａｎｄ  Ｈ．Ｏ．Ｃａｌｖｅｒｙ(１９４４):ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏｐｉｃａｌｌｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ  ａｎｄ  ｍｕｃｏｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，８２，３７７−３９０）に従い、日本白色種雄ウサギ９羽を用い、実施例１で調製した各アミノ酸含有点眼液およびアミノ酸非含有点眼液を結膜嚢内へ７日間点眼投与し、その眼刺激性を検討した。
点眼はそれぞれ左眼に対してのみ行い、右眼は無処置対照とした。点眼投与は１００μＬ／眼を1時間ごとに８回／日行った。点眼投与直後に約一秒間閉眼し、瞬目の有無を観察した。投与後の洗眼は実施しなかった。眼反応は、各投与日における最終投与後にＤｒａｉｚｅ法による判定基準に従ってスリットランプを用いて観察した。この操作を７日間繰り返した。また、点眼投与開始前および最終投与日の投与後には角膜障害度検査を行った。【００５２】
以下の項目について評価を行った。
（１）一般状態
各投与日の最終投与後に一日一回、全被験対象について一般状態を観察した。
（２）体重測定
投与開始日および実験終了日（投与７日目）に電子天秤（ＰＭ１１−Ｋ，メトラー・メレド株式会社）を用いて全被験対象について測定した。
（３）眼反応の観察
各投与日の最終投与後（８回目）にスリットランプを用いて両眼を表８に示す基準に従って観察した。角膜障害度検査として投与７日後の投与終了後、全被験対象について両眼をフルオレセインナトリウム（フローレス試験紙（登録商標））による角膜染色を実施し、角膜の損傷の有無をスリットランプにて観察した。【００５３】
【表８】
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【００５４】
以下に結果を示す。
［アミノ酸含有点眼液１］
投与１日より投与７日目まで観察した結果、角膜、虹彩および結膜に異常は認められなかった。しかし、投与直後に行った瞬目の観察では、アミノ酸含有点眼液１投与群のうち、一個体のみで投与３日目の２、３回目および投与６日目の３回目に瞬目が観察された。他の個体では瞬目は観察されなかった。この群の合計評価点はいずれも０であり、眼刺激性の評価区分は無刺激物に該当した。
［アミノ酸含有点眼液２］
投与１日より投与７日目まで観察した結果、角膜、虹彩および結膜に異常は認められなかった。また、投与直後の瞬目は一度も観察されなかった。この群の合計評点はいずれも０であり、眼刺激性の評価区分は無刺激物に該当した。
［アミノ酸非含有点眼液］
投与１日目より投与７日目まで観察した結果、角膜、虹彩および結膜に異常は認められなかった。また、投与直後の瞬目は一度も認められなかった。この群の合計評点はいずれも０であり、眼刺激性の評価区分は無刺激物に該当した。
以上より、アミノ酸配合点眼液１、および２はいずれも眼刺激性がないものと判断できた。【００５５】
［実施例２］  点眼剤としての本発明の眼科用組成物の製造試験
下表９に示す通り、各アミノ酸を配合する点眼剤を作製する。【００５６】
【表９】
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【００５７】
［試験例２］  アミノ酸を含有した点眼剤を用いた臨床試験
実施例２に記載の各製造例のアミノ酸含有点眼剤を被験者に投与し、投与後の被験者の自覚症状または他覚所見について被験者間での比較を行う。具体的には、各被験者の片眼に製造例１、２、４および５のいずれかの点眼剤を投与し、対照として他眼に製造例１０の点眼剤を投与する。点眼投与は健常者および重症ドライアイ患者には、１回１〜２滴（５０〜１００μＬ）／眼を１時間ごとに行う。１日当たりの投与回数は１６〜１８回である。中軽症ドライアイ患者およびＶＤＴ作業者には、１回１〜２滴（５０〜１００μＬ）／眼を４〜６回／日投与する。なお、上記重症ドライアイ患者は、シルマー試験Ｉ法の値が５ｍｍ以下であり、且つローズベンガル染色スコア（Ｖａｎ  Ｂｉｊｓｔｅｒｖｅｌｄのスコア）が９点である患者を意味し、中症ドライアイ患者はシルマー試験Ｉ法の値が５ｍｍ以下であり、且つローズベンガル染色スコア（Ｖａｎ  Ｂｉｊｓｔｅｒｖｅｌｄのスコア）が６〜８点である患者を意味する。軽症ドライアイ患者は、シルマー試験Ｉ法の値が５ｍｍより多く、且つローズベンガル染色スコア（Ｖａｎ  Ｂｉｊｓｔｅｒｖｅｌｄのスコア）が３〜５点であるドライアイ患者を意味する。【００５８】
【表１０】
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【００５９】
投与開始してから１週間後、２週間後、及び４週間後の３点で下記項目について評価を行う。
（１）自覚症状
乾燥感、異物感、眼痛、疲労感の有無
（２）他覚所見
視力の改善の有無、細隙燈顕微鏡による各結膜異常所見の有無、フルオレセイン染色による角結上皮障害の有無（特に、瞼裂間の結膜の点状染色（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ  ｐｕｎｃｔｕａｔｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  :  ＣＰＳ））、ローズベンガル、あるいは、リサミグリーン染色による角結膜上皮の変性若しくは傷害された細胞の有無、ＢＵＴ（涙膜破壊時間）、涙液油層の分布の観察（ドライアイ観察装置ＤＲ−１ＴＭ（興和社製）による）【００６０】
［実施例３］  アミノ酸含有点眼液の調製
下表１１に示した処方のアミノ酸含有点眼液を調製した。【００６１】
【表１１】
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【００６２】
［試験例３］  アミノ酸を含有した点眼剤を用いた臨床試験
実施例３で調製したアミノ酸含有点眼液を被験者に投与し、投与後の被験者の自覚症状または他覚所見の評価を行った。具体的には、各被験者にアミノ酸含有点眼液３またはアミノ酸含有点眼液４を１回１〜２滴（５０〜１００μＬ）／眼、６回／日点眼投与した。被験者は、シルマー試験Ｉ法の値が５ｍｍ以上と涙液量は正常であるが、ＢＵＴ（涙液膜破壊時間）が５秒以下と顕著な短縮を示し、且つ角結膜上皮障害はないか、あっても軽微な症例で、眼乾燥感などの自覚症状が非常に強いＢＵＴ短縮型ドライアイ患者であった。
投与開始してから８週間後に下記項目について評価を行った。
（１）自覚症状
乾燥感、頭痛、眼の奥の痛み、異物感、眼が開けられない、疲れ目、充血、目やに、痒み、眩しい、流涙、かすみ、目が重い、不快感
スコア  ０：気にならない
１：少し気になる
２：気になる
３：非常に気になる
（２）他覚所見
（ｉ）ＳＰＫ（Ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  Ｐｕｎｃｔａｔｅ  Ｋｅｒａｔｉｔｉｓ；点状表層角膜炎）のＡＤ分類【００６３】
【表１２】
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【００６４】
（ｉｉ）ＢＵＴ（ＢｒｅａｋＵｐ  Ｔｉｍｅ；涙液膜破壊時間）
結果を表１３に示す。【００６５】
【表１３】
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【００６６】
表１３に示すように、アミノ酸含有点眼液３を投与した被験者１の右眼およびアミノ酸含有点眼液４を投与した被験者１の左眼ともに、投与８週間後にＳＰＫがＤ２からＤ１に改善されていた。また、アミノ酸含有点眼液３を投与した被験者２の左右眼および被験者３の左右眼において、投与８週間後にＢＵＴが延長した。さらに、すべての被験者の左右眼において、自覚症状のスコアが減少した。以上の結果から、アルギニン、グルタミンを含むアミノ酸含有点眼液３およびアラニン、アスパラギン、グルタミンを含むアミノ酸含有点眼液４はドライアイの治療に有効であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明によれば、従来の人工涙液を頻回点眼しても症状の改善が認められなかったドライアイ、特に重篤な上皮障害に伴うドライアイに対して治療効果が得られる。具体的には、自覚症状（眼痛、開眼困難、異物感、疲労感等）の軽減、ならびに他覚所見（視力、結膜充血、角膜上皮の状態）の改善に優れた効果を発揮する。
本出願は、日本で出願された特願２００９−０６５２８４（出願日：平成２１年３月１７日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【国際調査報告】
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