(57)【要約】  本発明は、生物学的試料中のＨＨＶ−６の潜伏感染中間段階転写物によってコードされる小タンパク質（Ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｇｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｏｆ  ＨＨＶ−６）（ＳＩＴＨ−１）の抗体を検出する方法を提供する。  本発明の方法は、  １）  ＳＩＴＨ−１タンパク質を準備し；  ２）  工程１）で準備したＳＩＴＨ−１タンパク質を担体に結合し；  ３）  生物学的試料２を、工程２）で作成したＳＩＴＨ−１タンパク質が結合した担体に接触させ、ＳＩＴＨ−１タンパク質抗体を検出することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中のＨＨＶ−６の潜伏感染中間段階転写物によってコードされる小タンパク質（Ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｇｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｏｆ  ＨＨＶ−６）（ＳＩＴＨ−１）の抗体を検出する方法であって、
１）  ＳＩＴＨ−１タンパク質を準備し；
２）  工程１）で準備したＳＩＴＨ−１タンパク質を担体に結合し；
３）  生物学的試料を、工程２）で作成したＳＩＴＨ−１タンパク質が結合した担体に接触させ、ＳＩＴＨ−１タンパク質抗体を検出する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
ＳＩＴＨ−１タンパク質が以下のグループから選択される、請求項１の方法。
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）  配列番号１のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質；
（ｃ）  配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質；
（ｄ）  配列番号２の塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｅ）  配列番号２の塩基配列において１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加を含む塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質；
（ｆ）  配列番号２の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質；及び
（ｇ）  配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされ、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質
【請求項３】
請求項１の工程３）において、工程２）で作成したＳＩＴＨ−１タンパク質が結合した担体に、
（ａ）  生物学的試料、及び
（ｂ）  工程１）のＳＩＴＨ−１タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する；
請求項１又は２に記載の検出方法
【請求項４】
請求項１の工程２）において、ＳＩＴＨ−１タンパク質を、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を利用して担体に結合することを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項５】
請求項１の工程３）において、工程２）で作成したＳＩＴＨ−１タンパク質が結合した担体に、
（ａ）  生物学的試料、並びに
（ｂ−ｉ）  工程１）又は２）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、又は
（ｂ−ｉｉ）  工程１）又は２）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する；
請求項４に記載の検出方法
【請求項６】
請求項３の工程３（ｂ）又は請求項５の工程３（ｂ−ｉ）において、細胞破砕抽出液として、任意のベクターを含む細胞から抽出した細胞破砕抽出液を添加する、請求項３ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ビオチン結合性タンパク質がタマビジン又はその変異体である、請求項４ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
生物学的試料が、血液、血清、脳脊髄液、唾液、咽頭拭い液、汗、尿、涙、リンパ液、精液、腹水、及び母乳からなる群から選択される、請求項１ないし６のいずれか７項に記載の方法。
【請求項９】
生物学的試料中のＨＨＶ−６の潜伏感染中間段階転写物によってコードされる小タンパク質（Ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｇｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｏｆ  ＨＨＶ−６）（ＳＩＴＨ−１）の抗体を検出するための担体であって、前記ＳＩＴＨ−１タンパク質を結合した担体。
【請求項１０】
ＳＩＴＨ−１タンパク質と担体とがビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を利用して結合していることを特徴とする、請求項９に記載の担体。
【請求項１１】
生物学的試料中のＨＨＶ−６の潜伏感染中間段階転写物によってコードされる小タンパク質（Ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｇｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｏｆ  ＨＨＶ−６）（ＳＩＴＨ−１）の抗体を検出するためのキットであって、
Ａ）  前記ＳＩＴＨ−１タンパク質が結合している担体；並びに、
Ｂ）  Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液を含む、生物学的試料を希釈するための剤
を含むキット。
【請求項１２】
Ａ）の担体が、ＳＩＴＨ−１タンパク質がビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を利用して結合している担体であり、そして、
Ｂ)の剤が、
ｉ）  Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、又は
ｉｉ）  Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を含む、生物学的試料を希釈するための剤である、
請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
生物学的試料中のＨＨＶ−６の潜伏感染中間段階転写物によってコードされる小タンパク質（Ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｇｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｏｆ  ＨＨＶ−６）（ＳＩＴＨ−１）の抗体を検出するためのキットであって、
Ａ）  前記ＳＩＴＨ−１タンパク質；
Ｂ）  Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質を固定化するための担体；並びに
Ｃ）  Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液を含む、生物学的試料を希釈するための剤
を含むキット。
【請求項１４】
Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質がビオチン化されており、
Ｂ）の担体が、ビオチン結合性タンパク質と直接的又は間接的に結合しており、
Ｃ）の剤が、
ｉ）  Ａ）又はＢ）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、又は
ｉｉ）  Ａ）又はＢ）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を含む、生物学的試料を希釈するための剤である、
請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的試料中のＨＨＶ−６の潜伏感染中間段階転写物によってコードされる小タンパク質（Ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｇｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｏｆ  ＨＨＶ−６）（ＳＩＴＨ−１）の抗体を定性的、及び／又は、定量的に検出する方法に関する。本発明の方法により、特に生物学的試料中に微量に存在し、通常は検出が困難なＳＩＴＨ−１タンパク質の抗体の検出も可能である。
【背景技術】
【０００２】
ヘルペスウイルス科のウイルスは、コアタンパク質のまわりに分子量８０〜１５０×１０6ダルトンの複鎖線状ＤＮＡが１６２個のカプソメアからなる直径約１００ｎｍの２０面体のカプシドの中に入っており、このヌクレオカプシドをエンベロープがとり囲み全体として約１５０〜２００ｎｍの大きさのウイルスである。ヘルペスウイルスは、ほとんどすべての哺乳動物や両生類において見出されており、特に、ヒトを宿主とするヘルペスウイルス科のウイルスは、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ；ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）と称される。ＨＨＶは、それぞれα（単純ヘルペスウイルス、水痘・帯状ヘルペスウイルス等）、β（サイトメガロウイルス等）、及びγ（ＥＢウイルス等）亜科に分類される。【０００３】
このようなヘルペスウイルスは、「潜伏感染（ｌａｔｅｎｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」を特徴とする。「潜伏感染」とは、ウイルスが宿主細胞内で感染性のウイルス粒子を産生せずに、存続し続ける感染状態をいうが、この潜伏感染においても、ウイルス遺伝子及び該ウイルス遺伝子の存在を補助する遺伝子産物は宿主細胞内に保持されている。潜伏感染を示すヘルペスウイルスは、宿主が何らかの原因（例えば、加齢、体調不良（疲労を含む））で、ウイルス粒子の産生が再開され多量のウイルスが複製されることが知られている（再活性化）。【０００４】
すなわち、ヘルペスウイルスは、宿主に異常がなければ潜伏感染を続けるが、ひとたび宿主の身体に変調が生じ、宿主の危機を察知すると、別の健常な宿主を探すべく再活性化するという特異な性質を有する。【０００５】
このようなヘルペス科のウイルスの生態を検討するためには、ウイルスの潜伏感染・再活性化に関する理解が不可欠である。しかし、ヘルペスウイルスのなかで、潜伏感染に関する知見が多いのはγ−ヘルペスウイルスに属するＥＢウイルスのみであり、その他のものに関しては不明な点が多い。【０００６】
特に、β−ヘルペスウイルスの潜伏感染に関与する因子については、本発明者らの一部が以前に明らかにした知見以外の情報は得られていないのが実情である。例えば、非特許文献１には、ＨＨＶ−６は末梢血中の比較的分化度の高いマクロファージにおいて潜伏感染することが開示されており、宿主におけるＨＨＶ−６の潜伏感染部位が明らかにされている。また、非特許文献２には、ＨＨＶ−６は初感染時に非常に高率に脳内に移行し、持続感染・潜伏感染を生じることが記載されている。非特許文献３には、ＨＨＶ−６の潜伏感染時に発現する遺伝子（潜伏感染遺伝子）について開示されており、該遺伝子がウイルスの潜伏感染と再活性化を制御する働きを有することが示唆されている。【０００７】
非特許文献４には、ＨＨＶ−６の潜伏感染状態には、比較的安定で遺伝子発現が活発な状態である「中間段階：ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｇｅ」が存在し、潜伏感染遺伝子とこの遺伝子にコードされるタンパク質（潜伏感染遺伝子タンパク質）が多量に発現することが示されている。さらに非特許文献５では、慢性疲労症候群患者の血清中に中間段階で発現が亢進する潜伏感染遺伝子タンパク質に対する抗体が存在することが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｏｎｄｏ．  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｔａｔｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ６  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ,  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：１４０１−１４０８，  １９９１
【非特許文献２】Ｋｏｎｄｏ．  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ６  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆｅｂｒｉｌｅ  ｃｏｎｖｕｌｓｉｏｎｓ．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １６７：１１９７−１２００，  １９９３
【非特許文献３】Ｋｏｎｄｏ．  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ６  ｌａｔｅｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ．,  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７６：  ４１４５−４１５１，  ２００２
【非特許文献４】Ｋｏｎｄｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔａｇｅ  ｏｆ  Ｂｅｔａ−Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  Ｌａｔｅｎｃｙ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ６．,  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：  ２２５８−２２６４，  ２００３
【非特許文献５】近藤一博著、「ヘルペスウイルス感染と疲労」、ウイルス、第５５巻第１号  ｐ９−１８  ２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らの一部は、ＨＨＶ−６の潜伏感染に特異的な遺伝子が活発に発現する中間段階（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｇｅ）において発現する新規の遺伝子と、そこにコードされる新規のタンパク質Ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｏｆ  ＨＨＶ−６  （ＳＩＴＨ）−１を同定した。そして、これら遺伝子及び該遺伝子がコードするタンパク質ＳＩＴＨ−１の機能解析を行ったところ、（ｉ）ＳＩＴＨ−１タンパク質は細胞内カルシウム濃度を上昇させる機能を有すること、（ｉｉ）またこれらＳＩＴＨ−１タンパク質に対する抗体が、気分障害患者では有意に検出される一方、健常者ではほとんど検出されない、という新事実を見出し、特許出願を行った（ＰＣＴ／ＪＰ２００８／６７３００）。【００１０】
このように、人体からの生物学的試料に含まれる、ＳＩＴＨ−１タンパク質に対する抗体を検出することにより、精神障害などの診断に利用できることが示された。【００１１】
ところで、上記ＳＩＴＨ−１タンパク質に対する血清抗体価は、ＳＩＴＨ−１タンパク質を発現させた２９３Ｔ細胞を抗原として、通常行われる蛍光抗体法により測定を行った。本発明者らはさらに研究を続け、蛍光抗体法では、ＳＩＴＨ−１発現哺乳類細胞の作成、プレパラートの作成が必要であり、多くの労力が必要であること、ＳＩＴＨ−１タンパク質に対するヒト血清中の抗体価が低く、検出作業には技術的な熟練が必要なこと、ＳＩＴＨ−１タンパク質は不安定で慎重な取り扱いが必要なこと等を見出した。また、蛍光抗体法では、血清検体との反応後に、蛍光を顕微鏡下で目視判定するため煩雑であり、多くの検体を同時処理するには不向きであった。さらに血清検体によっては非特異的な結合が問題となり、しばしば測定が困難な場合があった。【００１２】
このような本発明者らの新たな知見を踏まえ、本発明は、生物学的試料中のＳＩＴＨ−１タンパク質に対する抗体を、簡便に、かつ、定性的、及び／又は、定量的に検出する方法を提供することを目的とする。【００１３】
本発明は特に、生物学的試料中にＳＩＴＨ−１タンパク質に対する抗体を、バックグラウンドシグナルを抑えつつ、簡便に、かつ、定性的、及び／又は、定量的に検出・測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、ＳＩＴＨ−１タンパク質を担体に結合した系が抗体検出に有効であることを見いだし、本発明を想到した。【００１５】
特に、当該系において、生物学的試料中に微量に存在するＳＩＴＨ−１タンパク質抗体を検出するためには、バックグラウンドシグナルへの対処が問題となるため、さらに、これを低下させる工夫を行った。具体的には、生物学的試料に細胞破砕抽出液を添加することにより非特異結合を下げることができた。またＳＩＴＨ−１タンパク質をビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を用いて担体に固定化した場合においては、生物学的試料に細胞破砕抽出液に加えビオチン結合性タンパク質を添加すると、非特異結合を下げる効果がより顕著であった。あるいはこの場合、ビオチン結合性タンパク質を添加する代わりに、遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を添加しても同様の効果が得られた。【００１６】
本発明は、以上の知見に基づき、ＳＩＴＨ−１タンパク質を担体に固定化した系において、非特異結合を減少させた、より感度の高い、ＳＩＴＨ−１タンパク質抗体の検出方法を提供するものである。【００１７】
限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。【００１８】
［態様１］
生物学的試料中のＨＨＶ−６の潜伏感染中間段階転写物によってコードされる小タンパク質（Ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｇｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｏｆ  ＨＨＶ−６）（ＳＩＴＨ−１）の抗体を検出する方法であって、
１）  ＳＩＴＨ−１タンパク質を準備し；
２）  工程１）で準備したＳＩＴＨ−１タンパク質を担体に結合し；
３）  生物学的試料を、工程２）で作成したＳＩＴＨ−１タンパク質が結合した担体に接触させ、ＳＩＴＨ−１タンパク質抗体を検出する
ことを含む、前記方法。【００１９】
［態様２］
ＳＩＴＨ−１タンパク質が以下のグループから選択される、態様１の方法。
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）  配列番号１のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質；
（ｃ）  配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質；
（ｄ）  配列番号２の塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｅ）  配列番号２の塩基配列において１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加を含む塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質；
（ｆ）  配列番号２の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質；及び
（ｇ）  配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされ、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質【００２０】
［態様３］
態様１の工程３）において、工程２）で作成したＳＩＴＨ−１タンパク質が結合した担体に、
（ａ）  生物学的試料、及び
（ｂ）  工程１）のＳＩＴＨ−１タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する；
態様１又は２に記載の検出方法【００２１】
［態様４］
態様１の工程２）において、ＳＩＴＨ−１タンパク質を、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を利用して担体に結合することを特徴とする、態様１ないし３のいずれか１項に記載の検出方法。【００２２】
［態様５］
態様１の工程３）において、工程２）で作成したＳＩＴＨ−１タンパク質が結合した担体に、
（ａ）  生物学的試料、並びに
（ｂ−ｉ）  工程１）又は２）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、又は
（ｂ−ｉｉ）  工程１）又は２）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する；
態様４に記載の検出方法【００２３】
［態様６］
態様３の工程３（ｂ）又は態様５の工程３（ｂ−ｉ）において、細胞破砕抽出液として、任意のベクターを含む細胞から抽出した細胞破砕抽出液を添加する、態様３ないし５のいずれか１項に記載の方法。【００２４】
［態様７］
ビオチン結合性タンパク質がタマビジン又はその変異体である、態様４ないし６のいずれか１項に記載の方法。【００２５】
［態様８］
生物学的試料が、血液、血清、脳脊髄液、唾液、咽頭拭い液、汗、尿、涙、リンパ液、精液、腹水、及び母乳からなる群から選択される、態様１ないし７のいずれか１項に記載の方法。【００２６】
［態様９］
生物学的試料中のＨＨＶ−６の潜伏感染中間段階転写物によってコードされる小タンパク質（Ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｇｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｏｆ  ＨＨＶ−６）（ＳＩＴＨ−１）の抗体を検出するための担体であって、前記ＳＩＴＨ−１タンパク質を結合した担体。【００２７】
［態様１０］
ＳＩＴＨ−１タンパク質と担体とがビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を利用して結合していることを特徴とする、態様９に記載の担体。【００２８】
［態様１１］
生物学的試料中のＨＨＶ−６の潜伏感染中間段階転写物によってコードされる小タンパク質（Ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｇｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｏｆ  ＨＨＶ−６）（ＳＩＴＨ−１）の抗体を検出するためのキットであって、
Ａ）  前記ＳＩＴＨ−１タンパク質が結合している担体；並びに、
Ｂ）  Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液を含む、生物学的試料を希釈するための剤
を含むキット。【００２９】
［態様１２］
Ａ）の担体が、ＳＩＴＨ−１タンパク質がビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を利用して結合している担体であり、そして、
Ｂ)の剤が、
ｉ）  Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、又は
ｉｉ）  Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を含む、生物学的試料を希釈するための剤である、
態様１１に記載のキット。【００３０】
〔態様１３〕
生物学的試料中のＨＨＶ−６の潜伏感染中間段階転写物によってコードされる小タンパク質（Ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｇｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｏｆ  ＨＨＶ−６）（ＳＩＴＨ−１）の抗体を検出するためのキットであって、
Ａ）  前記ＳＩＴＨ−１タンパク質；
Ｂ）  Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質を固定化するための担体；並びに
Ｃ）  Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液を含む、生物学的試料を希釈するための剤
を含むキット。【００３１】
〔態様１４〕
Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質がビオチン化されており、
Ｂ）の担体が、ビオチン結合性タンパク質と直接的又は間接的に結合しており、
Ｃ）の剤が、
ｉ）  Ａ）又はＢ）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、又は
ｉｉ）  Ａ）又はＢ）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を含む、生物学的試料を希釈するための剤である、
態様１３に記載のキット。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の方法により、生物学的試料中のＳＩＴＨ−１タンパク質抗体の検出において、バックグラウンドシグナルを抑え、より高感度な検出を安定的に行うことができる。本発明の方法により、特に生物学的試料中に微量に存在し、通常の方法では検出が困難なＳＩＴＨ−１タンパク質抗体の検出・測定も可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１はＢｉｏＥａｓｅタグ（ビオチン化タグ）融合ＳＩＴＨ−１タンパク質の発現を示す。具体的には、図１ＡはＳＩＴＨ−１タンパク質検出のためのウェスタンブロッティングの結果、図１Ｂはビオチン化タンパク質検出のための活性染色の結果である。
【００３４】
ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１タンパク質を発現させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を超音波破砕し、得られた大腸菌粗抽出液画分を、２０μｇ総タンパク質／レーンとなるようＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％  アクリルアミドゲル）で展開し、その後ＰＶＤＦ膜に転写した。【００３５】
具体的には、図１Ａが抗ＳＩＴＨ−１抗体（１／１０００希釈）を反応後、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識抗ウサギＩｇＧ抗体（１／１０００希釈）を反応させ、その後ＡＰによる染色を行った。図１Ｂは、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（１／１０００希釈）反応後の染色像である。図１Ａ、図１ＢともにＣｏｎｔｒｏｌは発現ベクターのみをもつ大腸菌由来の抽出サンプルを示す。ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１タンパク質の位置を矢印で示した。【００３６】
図１ＢのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ染色では、太いバンドが２本検出された。下方のバンドは、図１Ａの抗ＳＩＴＨ−１抗体で検出されないことから、ＳＩＴＨ−１部位の一部が分解されたＢｉｏＥａｓｅタグ付きタンパク質であると考えられた。
【図２】図２は、各種の血清希釈液の非特異結合へ及ぼす効果を表すグラフである。血清を、ＰＢＳで希釈した区を白四角（破線）、ＰＢＳに精製タマビジン２（ＴＭ２）を加えた液で希釈した区を白四角（実線）、発現ベクターのみを持つ大腸菌破砕抽出液で希釈した区をアスタリスク（破線）、発現ベクターのみを持つ大腸菌破砕抽出液に精製ＴＭ２を加えた液で希釈した区をアスタリスク（実線）、ＴＭ２を発現させた大腸菌破砕抽出液で希釈した区を黒丸（実線）で示した。各グラフの縦軸（ルミネッセンス）は抗ＳＩＴＨ−１抗体の検出量を示し、横軸は段階希釈した抗ＳＩＴＨ−１抗体の希釈割合を示す。
【図３】図３は、図２に示した結果から、抗ＳＩＴＨ−１抗体の希釈割合それぞれに関して、Ｓ／Ｎ比を求めたグラフである。
【００３７】
血清を、ＰＢＳで希釈した区を白四角（破線）、ＰＢＳに精製タマビジン２（ＴＭ２）を加えた液で希釈した区を白四角（実線）、発現ベクターのみを持つ大腸菌破砕抽出液で希釈した区をアスタリスク（破線）、発現ベクターのみを持つ大腸菌破砕抽出液に精製ＴＭ２を加えた液で希釈した区をアスタリスク（実線）、ＴＭ２を発現させた大腸菌破砕抽出液で希釈した区を黒丸（実線）で示した。
【図４】図４は、ビオチン化ＳＩＴＨ−１を結合したＴＭ２プレートを用いた場合のヒト血清中の抗ＳＩＴＨ−１抗体価測定の結果を示す。ヒト血清を、ＴＢＳ−Ｔ（トリスバッファー生理食塩水、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）にカゼイン１％を含む溶液で希釈したものをＴＭ２プレートに接触させた。
【図５】図５は、ビオチン化ＳＩＴＨ−１を結合したＴＭ２プレートを用いた場合のヒト血清中の抗ＳＩＴＨ−１抗体価測定の結果を示す。ヒト血清を、大腸菌粗抽出液で希釈したものをＴＭ２プレートに接触させた。
【図６】図６は、ビオチン化ＳＩＴＨ−１を結合したＴＭ２プレートを用いた場合のヒト血清中の抗ＳＩＴＨ−１抗体価測定の結果を示す。ヒト血清を、５ｍｇ全タンパク質／ｍｌのＴＭ２発現大腸菌粗抽出液で希釈したものをＴＭ２プレートに接触させた。
【図７】図７は、Ｈｉｓタグ融合ＳＩＴＨ−１タンパク質を結合させたニッケルプレートを用いた場合の抗ＳＩＴＨ−１ウサギ血清中の抗ＳＩＴＨ−１抗体価測定の結果を示す。抗ＳＩＴＨ−１ウサギ血清は、０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で１００倍希釈したものを加えた。対照として、何も発現させていない大腸菌、並びにＨｉｓタグＥＧＦＰを用いた。
【図８】図８は、Ｈｉｓタグ融合ＳＩＴＨ−１タンパク質を結合させたニッケルプレートを用いた場合の抗ＳＩＴＨ−１ウサギ血清中の抗ＳＩＴＨ−１抗体価測定の結果を示す。抗ＳＩＴＨ−１ウサギ血清は、０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で５００倍希釈したものを加えた。対照として、何も発現させていない大腸菌、並びにＨｉｓタグＥＧＦＰを用いた。
【図９】図９は、Ｈｉｓタグ融合ＳＩＴＨ−１タンパク質を結合させたニッケルプレートを用いた場合のヒト血清中の抗ＳＩＴＨ−１抗体価測定の結果を示す。ヒト血清は、１００倍希釈したものを加えた。対照として、ＨｉｓタグＥＧＦＰを用いた。また、血清希釈液は、１％ＢＳＡ、又は大腸菌粗抽出液を用いた。
【図１０】図１０は、Ｈｉｓタグ融合ＳＩＴＨ−１タンパク質を結合させたニッケルプレートを用いた場合のヒト血清中の抗ＳＩＴＨ−１抗体価測定の結果を示す。ヒト血清は、５００倍希釈したものを加えた。対照として、ＨｉｓタグＥＧＦＰを用いた。また、血清希釈液は、１％ＢＳＡ、又は大腸菌粗抽出液を用いた。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
Ｉ．生物学的試料中のＳＩＴＨ−１の抗体を検出する方法
本発明は、生物学的試料中のＨＨＶ−６の潜伏感染中間段階転写物によってコードされる小タンパク質（Ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｓｔａｇｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｏｆ  ＨＨＶ−６）（ＳＩＴＨ−１）の抗体を検出する方法を提供する。
【００３９】
本発明の検出方法は、
１）  ＳＩＴＨ−１タンパク質を準備し；
２）  工程１）で準備したＳＩＴＨ−１タンパク質を担体に結合し；
３）  生物学的試料を、工程２）で作成したＳＩＴＨ−１タンパク質が結合した担体に接触させ、ＳＩＴＨ−１タンパク質抗体を検出する
ことを含む。
【００４０】
１．生物学的試料
本発明は、生物学的試料中のＳＩＴＨ−１タンパク質の抗体を検出する方法に関する。
【００４１】
本発明における生物学的試料としては、ヒト、ＨＨＶ−６が感染する実験動物由来、あるいはＳＩＴＨ−１遺伝子を導入した実験動物に由来し、検出対象となるＳＩＴＨ−１タンパク質抗体が含まれうるものであれば特段限定されない。具体的には、ヒト、ＨＨＶ−６が感染する実験動物（サルなど）、あるいはＳＩＴＨ−１遺伝子を導入した実験動物（マウスなど）から採取された細胞、組織又はその破片等を含む試料、例えば体液、さらに好ましくは、血液、血清、脳脊髄液、唾液、咽頭拭い液、汗、尿、涙、リンパ液、精液、腹水、及び母乳などである。
【００４２】
これらの体液は、必要に応じ希釈して用いる。希釈率は通常１０倍ないし１００００倍程度、好ましくは１００倍ないし１０００倍程度であるが、これに限定されない。希釈するための溶液は任意の緩衝液が使用されうるが、適当なブロッキング剤を含んでも良い。ブロッキング剤としては、非特異的な結合を抑制する効果が高いものが良く、ＢＳＡやカゼイン等、当業者に周知のブロッキング剤を使用することができる。
【００４３】
本発明により、例えば、従来の方法では非特異結合が多く、検出や正確な定量が困難であった、自己免疫性疾患の患者、あるいは健常人ではあるが、自己抗体などのバックグラウンドが高い被検者由来の試料からのＳＩＴＨ−１タンパク質抗体の測定も可能となる。ＳＩＴＨ−１タンパク質抗体は抗体価が低く、血清の希釈率を抑制することが必要となり、その結果、血清中成分に由来する非特異的な結合も増加してしまうため、既存の方法では当該抗体の検出や定量は困難であるが、本発明の方法によって容易に検出、あるいはより正確に定量することが可能となる。
【００４４】
２．ＳＩＴＨ−１タンパク質
本発明において、ＳＩＴＨ−１タンパク質とは、Ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｏｆ  ＨＨＶ−６  （ＨＨＶ−６の潜伏感染中間段階転写物によってコードされる小タンパク質）と、その変異体を意味する。
【００４５】
ＰＣＴ／ＪＰ２００８／６７３００の記載内容に基づくＳＩＴＨ−１
（１）ＳＩＴＨ−１タンパク質、核酸
ＳＩＴＨ−１タンパク質、核酸の構造及び機能は、ＰＣＴ／ＪＰ２００８／６７３００に開示されており、その全内容が本明細書中に援用される。
ＳＩＴＨ−１は、ヘルペスウイルスの潜伏感染に関与する因子、より詳細にはヘルペスウイルスの潜伏感染時に特異的に発現するタンパク質である。ここで「ヘルペスウイルスの潜伏感染時に特異的に発現する」とは、ヘルペスウイルスが感染している宿主において、ヘルペスウイルスが潜伏感染している（増殖感染していない）際に、特異的に、ヘルペスウイルス由来の遺伝子又は遺伝子産物が発現することをいう。
【００４６】
ＳＩＴＨ−１のタンパク質は、好ましくは、以下のグループから選択される。
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）  配列番号１のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質；
（ｃ）  配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質；
（ｄ）  配列番号２の塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｅ）  配列番号２の塩基配列において１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加を含む塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質；
（ｆ）  配列番号２の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質；及び
（ｇ）  配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされ、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質
【００４７】
ＳＩＴＨ−１のタンパク質は典型的には、配列番号１のアミノ酸配列を有する。配列番号１のアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号２の塩基配列からなる核酸によりコードされる。
【００４８】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＳＩＴＨ−１タンパク質は、後述する参考例に示すように、ヒトヘルペスウイルス−６（ＨＨＶ−６）の潜伏感染時に特異的に発現するタンパク質として単離・同定されたものである。ＳＩＴＨ−１タンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、１５９アミノ酸からなる、分子量約１７．５ｋＤａのタンパク質である。
【００４９】
ＳＩＴＨ−１タンパク質は、ＳＩＴＨ−１遺伝子の核酸によってコードされている。このＳＩＴＨ−１遺伝子のｃＤＮＡは、配列番号３に示すように、１７９５塩基対（約１．７９ｋｂｐ）のサイズを有しており、９５４番目から９５６番目の塩基配列が開始コドン（Ｋｏｚａｋ  ＡＴＧ）であり、１４３１番目から１４３３番目の塩基配列が終止コドン（ＴＡＡ）である。したがって、上記ＳＩＴＨ−１核酸は、配列番号３に示す塩基配列のうち、９５４番目から１４３０番目までの塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として有しており、このＯＲＦは、４７７塩基対（約０．４８ｋｂｐ）のサイズを有している。ＳＩＴＨ−１のｃＤＮＡのうち、ＯＲＦ領域を表す塩基配列を配列番号３に示す。なお、配列番号２に示す塩基配列は、ストップコドンの３塩基を含んで記載している。
【００５０】
ＳＩＴＨ−１核酸は、ＨＨＶ−６が潜伏感染している細胞の細胞質において常に発現している一方、増殖感染細胞では発現が認められない。ＳＩＴＨ−１タンパク質をコードする核酸は、これまでに報告したＨＨＶ−６潜伏感染特異的遺伝子（Ｈ６ＬＴ）と相補鎖の関係にあるＤＮＡにコードされ、その発現は、ＨＨＶ−６の潜伏感染の中間段階において増強する。これらの事実から、ＳＩＴＨ−１タンパク質は、ＨＨＶ−６の潜伏感染時に特異的に発現するタンパク質であると考えられる。
【００５１】
ＳＩＴＨ−１タンパク質は、宿主タンパク質であるＣＡＭＬ（ｃａｌｃｉｕｍ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  ｌｉｇａｎｄ、Ａｃｃｅｓｉｏｎ  ＃；  Ｕ１８２４２）と結合し、グリア細胞内カルシウム濃度を上昇させる。ＣＡＭＬは宿主生体内において、脳とリンパ球に多く存在し、細胞内のカルシウム濃度を上昇させることが知られているタンパク質である。また、ＳＩＴＨ−１タンパク質の発現による細胞内カルシウム濃度の上昇は、潜伏感染細胞内の全般的なシグナル伝達の活性化をもたらし、ＨＨＶ−６の効率的な再活性化に寄与するものと考えられる。
【００５２】
ＨＨＶ−６は脳内のグリア細胞で潜伏感染することが知られており、潜伏感染時や活性の高い潜伏感染状態である中間段階にあるＨＨＶ−６がＳＩＴＨ−１を発現させると、グリア細胞内のカルシウム濃度が上昇するものと考えられる。脳の細胞における細胞内カルシウム濃度の上昇は、気分障害などの精神障害と大いに関係するものと考えられている（理研年報２００３）。
【００５３】
ＳＩＴＨ−１タンパク質は、宿主のタンパク質であるＣＡＭＬと結合する活性を保持し、細胞内カルシウム濃度を上昇させる機能を有するものである。また、ＳＩＴＨ−１タンパク質を、このタンパク質が最も強く発現すると考えられる脳内のグリア細胞で発現させることにより、精神障害を誘導できる。それゆえ、ＳＩＴＨ−１タンパク質は、ヘルペスウイルスの潜伏感染時又は再活性化初期に発現し、宿主に精神障害を生じさせる機能を有すると考えられる。
【００５４】
（ｂ）ＳＩＴＨ−１タンパク質の変異体の一例として、配列番号１のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ＳＩＴＨ−１タンパク質と同様の細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質であってもよい。
【００５５】
具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１５個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個））のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質である。ここで、アミノ酸配列が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ１若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味する。当該欠失、置換及び／又は付加は、これらのうち２種以上が同時に生じてもよいが、当該欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的に小さいほど好ましい。
【００５６】
上記のうち、置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよい。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、Ｌｙｓ及びＡｒｇ、Ｇｌｕ及びＡｓｐ、Ｇｌｎ及びＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。
【００５７】
非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができるが、この場合は、本発明のタンパク質の生物学的機能を保持するために、アミノ酸のヒドロパシー指数（ヒドロパシーアミノ酸指数）を考慮することが好ましい（Ｋｙｔｅら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １５７：１０５−１３１（１９８２））。また、非保存的置換の場合は、親水性に基づいてアミノ酸の置換を行ってもよい。
【００５８】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．』（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （２００１））等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。本明細書において、「１又は複数のアミノ酸」とは、好ましくは。部位特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入及び／又は付加できる程度のアミノ酸を意味する。
【００５９】
なお、タンパク質のアミノ酸配列に、その活性を保持しつつ１又は複数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは付加を導入する方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂して選択されたヌクレオチドを除去、置換若しくは付加した後に連結する方法があげられる。
【００６０】
（ｃ）本発明のＳＩＴＨ−１タンパク質の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質であってもよい。
【００６１】
アミノ酸配列の同一性は、好ましくは、少なくとも、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％、より好ましくは９９．３％である。
【００６２】
２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査及び数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，  Ｓ．  Ｂ．  及びＷｕｎｓｃｈ，  Ｃ．  Ｄ．  （Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：  ４４３−４５３，  １９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｓ．  及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｊ．  Ｇ．  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：  １０９１５−１０９１９，  １９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
【００６３】
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  ２５，  ｐ．３３８９−３４０２，  １９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。又は、２つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）などのプログラム、又は、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。その際、検索はデフォルト値を用いてよい。
【００６４】
（ｅ）本発明のＳＩＴＨ−１タンパク質の変異体は、配列番号２の塩基配列において１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加を含む塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質であってもよい。
【００６５】
具体的には、配列番号２に示す塩基配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、１〜１２０個、１〜９０個、１〜６０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１５個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個））のヌクレオチドが欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列を含む核酸であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードしている塩基配列を含む核酸を用いることもできる。ここで、塩基配列においてヌクレオチドが欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ１若しくは複数の塩基配列中の位置において、１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換及び／又は付加があることを意味する。当該欠失、置換、挿入及び／又は付加は、これらのうち２種以上が同時に生じてもよいが、当該欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的に小さいほど好ましい。
【００６６】
（ｆ）本発明のＳＩＴＨ−１タンパク質の変異体は、配列番号２の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質であってもよい。
【００６７】
塩基配列の同一性は、好ましくは、少なくとも、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％、より好ましくは９９．３％である。
【００６８】
２つの塩基配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、又はより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２：  ３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの塩基配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、塩基配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。
【００６９】
（ｇ）本発明のＳＩＴＨ−１タンパク質の変異体は、配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされ、かつ、細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するタンパク質であってもよい。
【００７０】
ハイブリダイゼーション条件の強さは、主としてハイブリダイゼーション条件、より好ましくは、ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件によって決定される。本明細書における「ストリンジェントな条件」には、中程度又は高度にストリンジェントな条件が含まれる。
【００７１】
具体的には、中程度にストリンジェントな条件としては、例えばハイブリダイゼーション条件として、１×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ、４２℃〜５５℃の条件、より好ましくは、１×ＳＳＣ〜３×ＳＳＣ、４５℃〜５０℃の条件、最も好ましくは、２×ＳＳＣ、５０℃の条件があげられる。ハイブリダイゼーション溶液中に、例えば、約５０％のホルムアミドを含む場合には、上記温度よりも５ないし１５℃低い温度を採用する。洗浄条件としては、０．５×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ、４０℃〜６０℃があげられる。ハイブリダイゼーション及び洗浄時には、一般に、０．０５％〜０．２％、好ましくは約０．１％ＳＤＳを加えてもよい。
【００７２】
高度にストリンジェント（ハイストリンジェント）な条件としては、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含む。例えば、ハイブリダイゼーション条件として、０．１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、５５℃〜６５℃の条件、より好ましくは、０．１×ＳＳＣ〜１×ＳＳＣ、６０℃〜６５℃の条件、最も好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６３℃の条件があげられる。洗浄条件として、０．２×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、５０℃〜６８℃、より好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６０〜６５℃があげられる。
【００７３】
ハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び５０％ホルムアミド中４２℃の条件でプレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して一晩４２℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で２０分間の洗浄を３回行うという条件があげられるが、これらに限定されない。
【００７４】
（２）ＳＩＴＨ−１に対する抗体
ＳＩＴＨ−１に対する抗体は、ＳＩＴＨ−１タンパク質又はその変異体、あるいはそれらの部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得られる。公知の方法としては、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗらの「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８））」、岩崎らの「単クローン抗体  ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」）に記載の方法が挙げられる。このようにして得られる抗体は、ＳＩＴＨ−１タンパク質の検出・測定などに利用できる。
【００７５】
用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体及びヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００７６】
用語「ＳＩＴＨ−１タンパク質を認識する抗体」は、ＳＩＴＨ−１タンパク質に特異的に結合し得る完全な分子及び抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）2フラグメント）を含むことを意味する。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）2並びにＳＩＴＨ−１抗体の他のフラグメントは、本明細書中で開示される方法、又は公知の方法に従って使用され得る。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。
【００７７】
気分障害患者、又は、気分障害の可能性のある個体は、ＳＩＴＨ―１タンパク質の発現量が増加しており、その結果ＳＩＴＨ−１抗体価も上昇していると考えられる。本発明は、一態様において、生物学的試料中のＳＩＴＨ−１抗体を検出することにより、気分障害患者又は気分障害の可能性のある個体を同定することを可能にする。
【００７８】
３．ＳＩＴＨ−１タンパク質を結合した担体
本発明の検出方法は、
１）ＳＩＴＨ−１タンパク質を準備し、
２）工程１）で準備したＳＩＴＨ−１タンパク質を担体に結合して、
ＳＩＴＨ−１タンパク質を結合した担体を利用する。
【００７９】
ＳＩＴＨ−１タンパク質の準備
ＳＩＴＨ−１抗体を検出するための、ＳＩＴＨ−１タンパク質の準備は、タンパク質を調製するための公知の方法を用いて行うことができる。限定するわけではないが、例えば、以下のように調製することができる。
【００８０】
ＳＩＴＨ−１タンパク質を発現させるには、ＳＩＴＨ−１タンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込んで、所望の宿主細胞で発現させることにより得ることができる。宿主細胞としては哺乳類細胞（例えば、非限定的に、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、チャイニーズハムスター等の齧歯類、あるいはイヌなどに由来する細胞）、昆虫細胞（バキュロウイルスを利用した発現系やＤｒｏｓｏｐｈｉｌａの系など）、酵母、大腸菌、植物、枯草菌などを挙げることができる。好ましくは大腸菌を挙げることができる。また、例えば、ヒトであればＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、２９３Ｔ、齧歯類であればＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、その他哺乳類であればＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ、昆虫細胞であればＳｆ９、Ｓ２などの確立された培養細胞系を好ましく利用することもできる。あるいはまた、小麦胚芽抽出液や昆虫細胞抽出液などを利用した無細胞発現系を用いてタンパク質を発現させることもできる。
【００８１】
発現ベクターに関しては、用いる宿主細胞に適したものを、当業者は適宜選択することができる。
【００８２】
発現させたＳＩＴＨ−１タンパク質は精製してもよい。また、後述のアビジン−ビオチン結合のような強い結合を利用して担体へ固定化する場合には、予め精製する必要はなく、アビジンあるいはビオチンを結合させた担体に直接ＳＩＴＨ−１タンパク質発現細胞抽出液を反応させ、精製と固定化を同時に行うこともできる。
【００８３】
ＳＩＴＨ−１タンパク質の精製方法として、当業者に周知の方法を使用できる。通常のイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせて用いてもよいが、精製用のタグ配列を用いてもよい。この場合、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、セルロース結合タンパク質、キチン結合タンパク質、チオレドキシン結合タンパク質等との融合タンパク質としてＳＩＴＨ−１タンパク質を大腸菌や哺乳類などの任意の宿主で発現させ、各々グルタチオン、マルトース、セルロース、キチン、チオレドキシンとの親和性を利用して（例えばグルタチオン固定化カラムを用いて）精製してもよい。
【００８４】
また予めＳＩＴＨ−１との融合部位にプロテアーゼの認識部位を導入しておけば、精製後にタグ配列を当該プロテアーゼで処理することにより、除去することもできる。プロテアーゼとしては、例えばエンテロキナーゼやＦａｃｔｏｒ  Ｘａなど当業者に周知のものでよい。この他、ＨｉｓＴａｇやＦｌａｇＴａｇ、あるいはＳｔｒｅｐ（ＩＩ）−Ｔａｇ等を用いて、各々イオン化したニッケル、抗Ｆｌａｇ抗体、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎが固定化したカラムを用いて精製してもよい。さらに精製度を上げるために、複数のタグをＳＩＴＨ−１タンパク質に融合させ、精製法を組み合わせてもよい。例えば、ＳＩＴＨ−１タンパク質の末端にＨｉｓＴａｇとＢｉｏＥＡＳＥTM等のビオチン化配列を融合させ、宿主で組換えタンパク質として発現させた後、ニッケルカラムで精製を行い、さらに低親和性アビジンや低親和性ストレプトアビジン（例えばＳＡムテイン、Ｒｏｃｈｅ社）カラムで精製してもよい。
【００８５】
担体
固体担体を構成する材料は、セルロース、テフロン（登録商標）、ニトロセルロース、アガロース、高架橋球形アガロース、デキストラン、キトサン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリプロピレン、ナイロン、ポリビニリデンジフルオライド、ラテックス、ポリスチレンラテックス、シリカ、ガラス、ガラス繊維、金、白金、銀、銅、鉄、ステンレススチール、フェライト、シリコンウエハ、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリ乳酸、樹脂、多糖類、タンパク質（アルブミン等）、炭素又はそれらの組合せ、などを含むがこれらに限定されない。また、一定の強度を有し、組成が安定し、かつ非特異結合が少ないものが好ましい。
【００８６】
固体担体の形状は、マイクロビーズ、磁性ビーズ、薄膜、微細管、フィルター、プレート、マイクロプレート、カーボンナノチューブ、センサーチップなどを含むがこれらに限定されない。薄膜やプレートなどの平坦な固体担体は、当該技術分野で知られているように、ピット、溝、フィルター底部などを設けてもよい。
【００８７】
発明の一態様において、マイクロビーズは、約２５ｎｍ〜約１ｍｍの範囲の球体直径を有しうる。好ましい態様では、ビーズは約５０ｎｍ〜約１０μｍの範囲の直径を有する。
限定されるものではないが、例えば、高い検出感度が望まれる場合においては、検出すべき物質とこれに特異的に結合する物質との接触頻度や洗浄操作の容易性といった観点から、固体担体として上記のようなビーズを好ましくは使用することができる。
【００８８】
ＳＩＴＨ−１タンパク質と担体を結合する方法
工程１）で準備したＳＩＴＨ−１タンパク質を担体に結合させる。
ＳＩＴＨ−１タンパク質と担体とを結合する方法としては、タンパク質を担体に結合するための任意の方法を採用することが可能である。例えば、これに限定されるわけではないが疎水結合、共有結合、様々なタグを用いる方法、あるいは、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を利用する方法、などがある。疎水結合、共有結合を利用する場合、ＳＩＴＨ−１タンパク質を予め精製することが好ましい。
【００８９】
疎水結合を利用する場合、担体の疎水性表面と、ＳＩＴＨ−１タンパク質の疎水性部分との相互作用を利用して結合させる。具体的には、ＳＩＴＨ−１タンパク質溶液を例えば、マイクロプレート等（例えばこれらに限定されるわけではないが、Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ？  Ｐｌａｔｅ  （Ｎｕｎｃ社）、ＳｐｅｃｔｒａＰｌａｔｅ−９６  ＨＢ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）、あるいはＲｅａｃｔｉ−ＢｉｎｄTM  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ  Ｃｏｒｎｅｒ  Ｎｏｔｃｈ（ＰＩＥＲＣＥ社）等）の担体表面に直接接触させ、一定時間置くことでＳＩＴＨ−１タンパク質の疎水性部分と担体の疎水性部分との相互作用により結合、固定化させる。
【００９０】
一方、共有結合の場合は、担体の表面に官能基を配置させ、これとＳＩＴＨ−１タンパク質中の官能基とを結合させる。このような結合のために、様々な官能基が表面に配置された各種担体が市販されており、好ましく用いることができる。例えばこれらに限定されるわけではないが、官能基が表面に配置されたマイクロプレートとしては、無水マレイン酸プレートとして例えばＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）Ｍａｌｅｉｃ  Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ（ＰＩＥＲＣＥ社）が、活性型アミノ基プレートとして例えばＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ（商標）−Ａｍｉｎｏ  Ｍｏｄｕｌｅｓ／Ｐｌａｔｅｓ（Ｎｕｎｃ社）が、あるいはカルボキシル基プレートとして例えばＥＬＩＳＡ用プレートＭＳ−８７９６Ｆ（９６ウェル・Ｃタイプ・平底・カルボ）（住友ベークライト社）が挙げられる。ＳＩＴＨ−１タンパク質と固体担体の連結は、担体に添付された説明書に従えばよい。具体的には、これに限定されるわけではないが、以下のような、当業者に公知のタンパク質と固体担体のカップリング法を用いて行うことができる。例えば、表面をカルボキシル基が露出するよう修飾された固体担体のカルボキシル基とタンパク質のアミノ基を、架橋試薬である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下でカップリング反応させることにより、タンパク質と固体担体を連結することができる。あるいは、表面がＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）により活性エステル化された固体担体にタンパク質を、一級アミノ基を含まないｐＨ６．５〜９の緩衝液中で混和し、固体担体表面のカルボキシル基とタンパク質のアミノ基を結びつけることができる。あるいは、架橋試薬ＢＳ３（ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート）やＤＳＳ（ジスクシンイミジルスベレート）を用いて、固体担体表面のアミノ基とタンパク質のアミノ基を、あるいは架橋試薬ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル  ３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート）やＧＭＢＳ（Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）を用いて、固体担体表面のアミノ基とタンパク質のチオール基を結びつけることができる。
【００９１】
この他、遺伝子工学を用いてＳＩＴＨ−１と固定化用のタグを融合させることもできる。これら固定化のタグとして例えば、後述のアビジン−ビオチン結合を利用する方法の他、ＨｉｓＴａｇ、ＨａｌｏＴａｇ（商標）、Ｆｌａｇ等が利用できる。例えばＨｉｓＴａｇの場合、ニッケルイオン化した担体表面に複数（通常５−１０個）のヒスチジンを融合したＳＩＴＨ−１を反応させ、ＨｉｓＴａｇとニッケルイオンの親和性を利用して固定化すれば良い。
【００９２】
ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を利用した、ＳＩＴＨ−１タンパク質の担体への結合
本発明におけるＳＩＴＨ−１タンパク質の担体への結合方法としては、任意の方法を好適に用いることができる。しかし、最も好ましくは、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を利用する。本発明において、「ビオチン−ビオチン結合性タンパク質の間の結合」を「アビジン−ビオチン結合」と呼称する場合がある。
【００９３】
ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を利用した、ＳＩＴＨ−１タンパク質の担体への結合方法として、例えば、Ａ）ビオチン結合性タンパク質が結合した担体に、ビオチン化したＳＩＴＨ−１タンパク質を結合する方法、Ｂ）ビオチン結合性タンパク質の多くが四量体であることを利用し、ビオチンが結合した担体にビオチン結合性タンパク質を結合させ、さらにビオチン化したＳＩＴＨ−１タンパク質を結合する方法、Ｃ）ビオチンが結合した担体に、ビオチン結合性タンパク質−ＳＩＴＨ−１融合タンパク質を結合する方法などが挙げられる。
【００９４】
以下、詳述する。
【００９５】
ビオチン
「ビオチン」とは、Ｄ−［（＋）−ｃｉｓ−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ−（３，４）−イミダゾール−４−吉草酸］の一般名称である。ビタミンＢ群に分類される水溶性ビタミンの一種で、Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ7（ビタミンＢ7）とも呼ばれる、あるいは、ビタミンＨ、補酵素Ｒとも言われることもある。ビオチンは卵白中に含まれる糖タンパク質の一種、アビジンと非常に強く結合し、その吸収が阻害される。そのため、生卵白の大量摂取によってビオチン欠乏症を生じることがある。
【００９６】
本明細書中において「ビオチン」とは、上記ビオチンの他、イミノビオチン（ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ）（Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：４６６６−４６６８）や、デスチオビオチン（ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ）（Ｈｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３０８：  ３４３−３５７）、あるいはビオシチン（ｂｉｏｃｙｔｉｎ）やＢｉｏｔｉｎ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ等のビオチン類縁体も含む。
【００９７】
ビオチン−アビジン（ビオチン結合性タンパク質）複合体を用いたシステムは、生化学、分子生物学、組織免疫学やＤＮＡ分析、あるいは臨床検査などの分野で広く利用されている。本発明において、ＳＩＴＨ−１タンパク質を担体に結合する方法の一つとして、アビジン−ビオチン結合を利用して、担体に結合させる方法が挙げられる。
【００９８】
ビオチン結合性タンパク質
ビオチン結合性タンパク質としては、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＡＶＲタンパク質（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，（２００２），  ３６３：  ６０９−６１７）、ブラダビジン（Ｂｒａｄａｖｉｄｉｎ）（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，（２００５），  ２８０：  １３２５０−１３２５５）、リザビジン（Ｒｈｉｚａｖｉｄｉｎ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  （２００７），４０５：３９７−４０５）、タマビジン（ＷＯ０２／０７２８１７）やこれらの変異体等、ビオチンと強く結合するタンパク質であれば、いずれも好適に使用することができる。好ましくは、ビオチンとの解離定数（ＫＤ）が１０-8Ｍ以下、さらに好ましくは１０-10Ｍ以下、さらに好ましくは１０-12Ｍ以下である。但し、被検試料に添加するビオチン結合性タンパク質、ならびに担体ブロッキングに使用するビオチン結合性タンパク質については、この限りではない。
【００９９】
ビオチン結合性タンパク質として、特に、大腸菌で高発現するタマビジンとその変異体を好ましく用いることができる。タマビジンは、食用キノコである担子菌タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ）から発見されたビオチン結合性タンパク質である（ＷＯ０２／０７２８１７、Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  ＦＥＢＳ  Ｊ  ２７６：  １３８３−１３９７）。タマビジンの変異体としては、例えば、高結合能・低非特異結合タマビジン（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／６４３０２）等が挙げられる。
【０１００】
本発明における「タマビジン」は、タマビジン１（ＴＭ１）、タマビジン２（ＴＭ２）、又はそれらの変異体を意味する。具体的には、本発明のタマビジンは典型的には、配列番号５もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号４もしくは配列番号６の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、であってよい。
【０１０１】
あるいは、本発明のタマビジンは、配列番号５もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は、配列番号４もしくは配列番号６の塩基配列を含んでなる核酸によってコードされるタンパク質、の変異体であって、タマビジン１又は２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質、あるいは、高結合能・低非特異結合の活性を有するタンパク質であってよい。本明細書において、タマビジン１、タマビジン２、及びそれらの変異体を総称して、単にタマビジンと呼ぶことがある。
【０１０２】
タマビジン１又は２の変異体は、配列番号５又は７のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、タマビジン１又は２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質であってもよい。
【０１０３】
「１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加」の定義については、ＳＩＴＨ−１タンパク質について上述した通りである。
【０１０４】
タマビジン１又は２の変異体はさらに、配列番号７又は５のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、より好ましくは９９．３％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、タマビジン１又は２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質、あるいは、高結合能・低非特異結合の活性を有するタンパク質であってもよい。
【０１０５】
「アミノ酸配列の同一性％」の定義については、ＳＩＴＨ−１タンパク質について上述した通りである。
【０１０６】
タマビジンの変異体には、さらに、以下のものも含まれる。
（ｉ）配列番号４もしくは配列番号６の塩基配列において、１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加を含む塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、タマビジン１又は２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質、あるいは、高結合能・低非特異結合の活性を有するタンパク質；
（ｉｉ）配列番号４もしくは配列番号６の塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、タマビジン１又は２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質、あるいは、高結合能・低非特異結合の活性を有するタンパク質
（ｉｉｉ）配列番号４もしくは配列番号６の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされ、かつ、タマビジン１又は２と同様のビオチン結合活性を有するタンパク質、あるいは、高結合能・低非特異結合の活性を有するタンパク質
「１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加」、塩基配列の「８０％以上の同一性」、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」等の定義については、ＳＩＴＨ−１タンパク質について上述した通りである。
【０１０７】
なお、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を利用してＳＩＴＨ−１タンパク質を担体に結合させる場合、そのために利用する「ビオチン結合性タンパク質」は、ビオチン結合能を有していることが好ましい。よって、限定されるわけではないが、上記タマビジン１又はタマビジン２の変異体は、これらの野生型を利用して融合タンパク質を形成した場合と比較して、ビオチン結合活性が大きく減少していないことが好ましい。
【０１０８】
よって、非限定的に、タマビジン１の変異体は、配列番号５のアミノ酸配列において、Ｎ１４、Ｓ１８、Ｙ３４、Ｓ３６、Ｓ７８、Ｗ８２、Ｗ９８、Ｗ１１０、Ｄ１１８が改変されないことが好ましい。なお表記の、例えばＹ３４は、配列番号５のアミノ酸配列の第３４番目のチロシン残基を意味する。あるいは、これらを改変する場合には、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが好ましく、例えばアスパラギン（Ｎ１４）の場合は、グルタミン（Ｑ）やアスパラギン酸（Ｄ）へ、好ましくはアスパラギン酸へ、セリン（Ｓ１８、Ｓ３６、Ｓ７８）の場合は、スレオニン（Ｔ）あるいはチロシン（Ｙ）へ、好ましくはスレオニンへ、チロシン（Ｙ３４）の場合は、セリン（Ｓ）やスレオニン（Ｔ）あるいはフェニルアラニン（Ｆ）へ、好ましくはフェニルアラニンへ、トリプトファン(Ｗ８２、Ｗ９８、Ｗ１１０)の場合は、フェニルアラニン（Ｆ）へ、アスパラギン酸（Ｄ１１８）の場合は、グルタミン酸（Ｅ）やアスパラギン（Ｎ）へ、好ましくはアスパラギンへ、それぞれ改変することが好ましい。
【０１０９】
また、タマビジン２の変異体は、配列番号７のアミノ酸配列において、４つのトリプトファン残基（Ｗ６９、Ｗ８０、Ｗ９６、Ｗ１０８）が改変されないことが好ましい。あるいは、これらを改変する場合には、性質あるいは構造が類似したアミノ酸、例えばフェニルアラニン（Ｆ）への改変が好ましい。また、ビオチンと直接相互作用すると考えられるアミノ酸残基（Ｎ１４、Ｓ１８、Ｙ３４、Ｓ３６、Ｓ７６、Ｔ７８、Ｄ１１６）についても改変されないことが望ましい。あるいは、これらを改変する場合にはビオチンとの結合を維持できるよう、性質あるいは構造が類似したアミノ酸に改変することが好ましく、例えばアスパラギン（Ｎ１４）の場合は、グルタミン（Ｑ）やアスパラギン酸（Ｄ）へ、好ましくはアスパラギン酸へ、アスパラギン酸（Ｄ４０）の場合は、アスパラギン（Ｎ）へ、セリン（Ｓ１８、Ｓ３６、Ｓ７６）の場合は、スレオニン（Ｔ）あるいはチロシン（Ｙ）へ、好ましくはスレオニンへ、チロシン（Ｙ３４）の場合は、セリン（Ｓ）やスレオニン（Ｔ）あるいはフェニルアラニン（Ｆ）へ、好ましくはフェニルアラニンへ、スレオニン（Ｔ７８）の場合は、セリン（Ｓ）やチロシン（Ｙ）へ、好ましくはセリンへ、アスパラギン酸（Ｄ１１６）の場合は、グルタミン酸（Ｅ）やアスパラギン（Ｎ）へ、好ましくはアスパラギンへ、それぞれ改変することが好ましい。
【０１１０】
本発明において、好ましいタマビジン改変体には以下のものが含まれる。（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／６４３０２）。
【０１１１】
配列番号７に記載のアミノ酸配列、あるいはこの配列中に１から数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列、又はこの配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ビオチン結合活性を示すタンパク質において、以下のグループ
１）配列番号７の１０４番目のアルギニン残基；
２）配列番号７の１４１番目のリジン残基；
３）配列番号７の２６番目のリジン残基；及び
４）配列番号７の７３番目のリジン残基
から選択される１又は複数の残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質である。
【０１１２】
より好ましくは、配列番号７において、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）；
配列番号７において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ）；
配列番号７において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｋ１４１Ｅ）；並びに、
配列番号７において、４０番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、１０４番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、１４１番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質（Ｄ４０Ｎ−Ｒ１０４Ｅ−Ｋ１４１Ｅ）、
からなるグループから選択される、改変型ビオチン結合タンパク質である。
【０１１３】
ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体
ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を利用した、ＳＩＴＨ−１タンパク質の担体への結合方法として、例えば、Ａ）ビオチン結合性タンパク質が結合した担体に、ビオチン化したＳＩＴＨ−１タンパク質を結合する方法、Ｂ）ビオチン結合性タンパク質の多くが四量体であることを利用し、ビオチンが結合した担体にビオチン結合性タンパク質を結合させ、さらにビオチン化したＳＩＴＨ−１タンパク質を結合する方法、Ｃ）ビオチンが結合した担体に、ビオチン結合性タンパク質−ＳＩＴＨ−１融合タンパク質を結合する方法などが挙げられる。
【０１１４】
ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体を作製する方法として、ビオチン結合性タンパク質を、担体に直接結合させても良い（上記態様Ａ）。あるいは、ビオチン結合性タンパク質が予め固定化された担体を購入しても良い（上記態様Ａ）。あるいはまたビオチン化した担体に、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を利用して、ビオチン結合性タンパク質を結合させてもよい（上記態様Ｂ）。あるいはまたビオチン化した担体に、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を利用して、ビオチン結合性タンパク質−ＳＩＴＨ−１融合タンパク質を結合させてもよい（上記態様Ｃ）。
【０１１５】
ビオチン結合性タンパク質を直接結合させる方法としては、上記ＳＩＴＨ−１タンパク質と担体を結合する方法において詳しく記載したような、疎水結合や共有結合を用いる方法などがある。あるいはまた、ＮＥＷ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｌａｔｅキット（住友ベークライト社）のようなマイクロプレートに、キット添付の説明書きに従ってビオチン結合性タンパク質を直接結合、固定化させても良い。なお、アビジンやストレプトアビジンは例えばＳＩＧＭＡ社等から市販されている。
【０１１６】
ビオチン結合性タンパク質を固定化した担体としては、例えば、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ？  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｐｌａｔｅｓ  （ＰＩＥＲＣＥ社）、Ｎｕｎｃ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  ９６  Ｍｉｃｒｏ  Ｗｅｌｌ？  Ｐｌａｔｅｓ  （Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ社）等のマイクロプレート類、あるいはＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  （Ｄｙｎａｌ社）、ＭａｇｎａＢｉｎｄ？  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｂｅａｄｓ  （ＰＩＥＲＣＥ社）等の磁性ビーズ類などの市販品も挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【０１１７】
また、ビオチン結合性タンパク質は、上述のように、担体をビオチン化し、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を利用して、結合させることもできる。
【０１１８】
担体をビオチン化する方法として、例えば、ビオチン化試薬を用いる方法が挙げられる。ビオチン化試薬として例えば、ＰＩＥＲＣＥ社製の（カッコ内は順にリンカー長、反応基）  ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（１３．５Å、１級アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（２２．４Å、１級アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（３０．５Å、１級アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  ＰＦＰ−Ｂｉｏｔｉｎ（９．６Å、アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＯ2−Ｂｉｏｔｉｎ（２９．１Å、チオール基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ2  Ａｍｉｎｅ（２０．４Å、カルボキシル基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ3−ＬＣ  Ａｍｉｎｅ（２２．９Å、カルボキシル基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  Ｂｉｏｔｉｎ−Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（１５．７Å、アルデヒド基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  Ｂｉｏｔｉｎ−ＬＣ−Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（２４．７Å、アルデヒド基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  ＮＨＳ−Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ（１３．５Å、１級アミン）などを利用できるが、これらに限定されるものではない。
【０１１９】
上記ビオチン化試薬を用いて、マイクロプレート、微小ビーズ、あるいはセンサーチップなど所望の担体に、公知の方法を使用してビオチンを結合させることができる。例えば、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、トシル基、エポキシ基、マレイミド基、活性化エステルなど種々の官能基を持つ担体（例えば磁性ビーズ、セファロースビーズ、アガロースビーズ、ラテックスビーズ、マイクロタイタープレートなど）を用いる方法がある。この場合例えば、ＮＨＳエステルを含むビオチン化試薬を用いる場合は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）のような有機溶媒か、ｐＨ７−９のリン酸緩衝液で溶解し、アミノ基を持つ固定化担体に添加することによってビオチンを結合させることができる。また、例えばアミノ基を含むビオチン化試薬を用いる場合は、ＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）  ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）のようなカルボジイミドを用いて固定化担体のカルボキシル基を活性化エステルに変換させた後、ｐＨ５付近の緩衝液で溶解したビオチン化試薬を添加して、ビオチンを結合させてもよい。なお、ビオチン化した固定化担体は、好ましくは未反応の官能基を不活性化した後、ＢＳＡなどでブロッキングする。
【０１２０】
また、ビオチン化された市販担体を利用することもできる。ビオチン化されたマイクロプレートとしては、例えば、Ｒｅａｃｔｉ−ＢｉｎｄTM  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  Ｐｌａｔｅｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を利用できるが、これに限定されるものではない。ビオチン化された微小ビーズとしては、例えば、磁性ビーズとして、ＢｉｏＭａｇ  Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）が、ナノ磁性ビーズとして、コアフロント社製のｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ  ｂｉｏｔｉｎ、ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−ｓｉｌｉｃａ  ｂｉｏｔｉｎが、ポリスチレン製マイクロビーズとして、Ｂｅａｄｌｙｔｅ（登録商標）  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｅａｄｓ（Ｕｐｓｔａｔｅ社製）が、アガロースとしてＳｉｇｍａ社製の、Ｂｉｏｔｉｎ  Ａｇａｒｏｓｅ、２−ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅが、高架橋アガロースとして、Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（バイオリサーチテクノロジー社製）を利用できるが、これらに限定されるものではない。
【０１２１】
担体とビオチンと繋ぐリンカーの長さは、少なくとも５Åより長いことが好ましく、より好ましくは１３．５Å以上である。
【０１２２】
ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質
本発明においては、ＳＩＴＨ−１タンパク質にビオチンを結合させ、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質を作製して、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を利用して、ビオチン結合性タンパク質が結合した担体に結合させてもよい。
【０１２３】
ビオチン結合性タンパク質が結合した担体は、上述のように、ビオチン結合性タンパク質を、担体に直接結合させても、ビオチン結合性タンパク質が予め固定化された担体を購入しても良い（態様Ａ）。あるいはまたビオチン化した担体に、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を利用して、ビオチン結合性タンパク質を結合させてもよい（態様Ｂ）。
【０１２４】
ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質の作製方法としては、特に限定するものではない。例えば、ビオチン標識キット（例えば、非限定的に、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  ＮＨＳ−Ｌｃ−Ｂｉｏｔｉｎ  ＰＩＥＲＣＥ社）や、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２  （ＤＯＪＩＮＤＯ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＩＮＣ．社）など）を用いてＳＩＴＨ−１タンパク質にビオチンを結合させてもよい。あるいはＳＩＴＨ−１遺伝子を、ビオチン化配列を含むペプチドをコードするＤＮＡと融合し、この融合遺伝子を発現するベクターを構築、任意の宿主においてビオチン化配列との融合タンパク質として発現させることにより、ビオチン化ＳＩＴＨ−１を作製してもよい
（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３：９６４０−９６４５．）。
【０１２５】
このようなベクターとしてこれに限定されるわけではないが、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＢｉｏＥａｓｅ（商標）タグが含まれるベクターが挙げられる。このうち哺乳類細胞発現用には、ｐｃＤＮＡ（商標）６ベクターが、大腸菌発現用にはｐＥＴ１０４ベクターが、あるいはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現用にはｐＭＴ／ＢｉｏＥａｓｅベクターがある。
【０１２６】
さらには、好ましくは、上述の担体をビオチン化する際に用いた方法と同様の方法を、ＳＩＴＨ−１タンパク質のビオチン化にあたっても、利用することができる。すなわち、ビオチン化試薬を用いる方法が挙げられる。ビオチン化試薬として例えば、ＰＩＥＲＣＥ社製の（カッコ内は順にリンカー長、反応基）  ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（１３．５Å、１級アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（２２．４Å、１級アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（３０．５Å、１級アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  ＰＦＰ−Ｂｉｏｔｉｎ（９．６Å、アミン）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＯ2−Ｂｉｏｔｉｎ（２９．１Å、チオール基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ2  Ａｍｉｎｅ（２０．４Å、カルボキシル基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ3−ＬＣ  Ａｍｉｎｅ（２２．９Å、カルボキシル基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  Ｂｉｏｔｉｎ−Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（１５．７Å、アルデヒド基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  Ｂｉｏｔｉｎ−ＬＣ−Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（２４．７Å、アルデヒド基）、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）  ＮＨＳ−Ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ（１３．５Å、１級アミン）などを利用できるが、これらに限定されるものではない。
【０１２７】
このようなビオチン化試薬を用いて、ＳＩＴＨ−１タンパク質に、公知の方法を使用してビオチンを結合させることができる。例えば、ＮＨＳエステルを含むビオチン化試薬を用いる場合は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）のような有機溶媒か、ｐＨ７−９のリン酸緩衝液で溶解し、ＳＩＴＨ−１タンパク質に添加することによってビオチンを結合させることができる。また、例えばアミノ基を含むビオチン化試薬を用いる場合は、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド  ヒドロキシクロリド）のようなカルボジイミドを用いて、ＳＩＴＨ−１タンパク質のカルボキシル基を活性化エステルに変換させた後、ｐＨ５付近の緩衝液で溶解したビオチン化試薬を添加して、ビオチンを結合させてもよい。
【０１２８】
なお、このようにビオチン化試薬を用いてビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質を作製する場合は、予め上述のようにＳＩＴＨ−１タンパク質を精製しておくことが好ましい。
【０１２９】
ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質の担体への結合
本発明においては、ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体と、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質を準備し、両者を接触させることにより、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を介して担体にＳＩＴＨ−１タンパク質を結合させることができる。
【０１３０】
限定されるわけではないが、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質の担体への結合は例えば、以下のようにして行うことが可能である。ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質を含む細胞破砕粗抽出液を、０．１ｍｇ／ｍｌないし５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌないし２ｍｇ／ｍｌの総タンパク質濃度で準備する。これを、４℃ないし４０℃で、好ましくは１５℃ないし３０℃で、５分ないし２時間、好ましくは３０分ないし１時間、ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体と接触させる。この操作により、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質が、ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体に固定化される。さらにその後、０．０５％ないし１％、好ましくは０．１％ないし０．３％のＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を含むＰＢＳあるいはＴＢＳなどの緩衝液中で、余分な細胞破砕粗抽出物を洗浄することが好ましい。
【０１３１】
なお、このように細胞破砕粗抽出液を接触させることにより、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質を結合させる場合、事実上、精製と固定化を同時に行ったことになる。従って、この場合、別途の精製作業は不要である。
【０１３２】
あるいはまた、０．１μｇ／ｍｌないし５μｇ／ｍｌの濃度に調製した精製ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質を、ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体と接触させてもよい。
【０１３３】
４．生物学的試料のＳＩＴＨ−１タンパク質が結合した担体への接触
本発明の方法は、工程２）においてＳＩＴＨ−１タンパク質が結合した担体を準備した後に、工程３）として、生物学的試料を、工程２）で作成したＳＩＴＨ−１タンパク質が結合した担体に接触させ、ＳＩＴＨ−１タンパク質抗体を検出する。
【０１３４】
生物学的試料と担体との接触は特に限定されず、任意の方法で行うことが可能である。一般に、担体を利用した検出方法において、バックグラウンドシグナルの原因となる非特異結合を低減させるため、細菌成分抽出液を検出用試薬に含有させる方法（特開昭５９−９９２５７）、被検物質に特異的に結合する組換えタンパク質産生に使用したベクターと同種でありかつ当該タンパク質をコードする遺伝子を含まないベクターが導入された宿主細胞の培養成分を試料に添加する方法（特開平８−４３３９２）、被検物質に特異的に結合する組換えタンパク質を産生した細胞と同種であり、かつ当該タンパク質を含まない細胞からの水抽出液を加熱処理した後、その水溶性画分を試料に添加する方法（特開２００４−３０１６４６）などが知られている。
【０１３５】
細胞抽出液の添加
従来の方法では、自己免疫性疾患の患者、あるいは健常人ではあるが、自己抗体などのバックグラウンドが高い被検者由来の試料からのＳＩＴＨ−１タンパク質抗体の測定は、非特異結合が多く、困難であった。
【０１３６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、このような被検者由来の試料であっても、生物学的試料を担体に接触させる際に、細胞破砕抽出液を存在させることにより、ＳＩＴＨ−１タンパク質抗体の測定を行うことができることを見いだした。
【０１３７】
よって、本発明は一態様として、好ましくは、工程３）において、工程２）で作成したＳＩＴＨ−１タンパク質が結合した担体に、
（ａ）  生物学的試料、及び
（ｂ）  工程１）のＳＩＴＨ−１タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する。
【０１３８】
特に、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を用いてＳＩＴＨ−１タンパク質を担体に結合した系において、以下の方法により、一層顕著な効果が得られる。
【０１３９】
工程３）において、工程２）で作成したＳＩＴＨ−１タンパク質が結合した担体に、
（ａ）  生物学的試料、及び
（ｂ）  工程１）又は２）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する。
【０１４０】
細胞破砕抽出液が由来する細胞は、大腸菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞など、特段の制限はないが、ＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞であることが好ましい。例えば、ＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を大腸菌で調製した場合、細胞破砕抽出液も大腸菌から調製することが望ましい。また、無細胞系により、ＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させた場合は、使用した細胞破砕抽出液をそのまま、あるいは所望の緩衝液に懸濁して、使用することができる。
【０１４１】
また、ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質は、遺伝子工学技術により発現させたものではなく、本来的にこれらのタンパク質を有する細胞から抽出・精製したものであってもよい。例えば、ビオチン結合性タンパク質としてタマビジンを用いる場合、担子菌タモギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｃｏｎｕｃｏｐｉａｅ）細胞の細胞破砕抽出液を利用することもできる。このように、ビオチン結合性タンパク質及び／又はＳＩＴＨ−１タンパク質を本来的に含む細胞の破砕抽出液も、本発明の細胞抽出液に含まれる。
【０１４２】
また、細胞破砕抽出液を調製するための細胞は、任意のベクター、好ましくは空ベクターを含んでもよい。空ベクターとは、ＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させた時に用いたベクターと同種で、かつこれらのタンパク質をコードする遺伝子を含まないベクターであってもよく、また、例えば、これらの空ベクターにさらに任意の核酸を含む、任意のベクターであってもよい。また、ＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させた時に用いたベクターとは、別種のベクターであってもよい。
【０１４３】
細胞の破砕抽出液としては、細胞に由来する成分であれば特に制限されず、例えば、そのタンパク質成分、糖質成分、脂質成分又はその混合成分を使用することができる。好ましくは、細胞の可溶性抽出物を使用することができる。
【０１４４】
細胞の破砕抽出液の調製方法としては、特に制限されず、各種の方法を使用することができる。通常、適切な培地で培養した細胞を、超音波などの物理的手段あるいは界面活性剤などを用いた化学的手段あるいは酵素処理等で破砕若しくは可溶化し、遠心分離又は濾過等の操作により、可溶性成分として調製することができる。また、保存寿命をのばすためには、遠心分離又は濾過等により清澄にした液に、例えばプロテアーゼインヒビターの添加、又はオートクレーブ処理等の加熱処理を施して、細胞由来の各種酵素等を抑制又は失活させることが好ましい。細胞の破砕抽出液を加える濃度は、生じる非特異反応の強さに応じて変えてもよく、該非特異反応を吸収するに充分な濃度を適宜設定することができる。
【０１４５】
細胞破砕抽出液を調製する具体的な方法の例としては、これに限定されるわけではないが、例えば大腸菌細胞の場合、大腸菌（ベクターを含んでもよく、またベクターにはビオチン結合性タンパク質をコードする遺伝子を含んでも良い）を、抗生物質を含むＬＢ培地に接種し、ＯＤ６００における吸光度が０．１ないし１、好ましくは０．３ないし０．８に達するまで、２５℃ないし３７℃で振とう培養した後、０．０１ｍＭないし５ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭないし１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに４℃ないし３７℃、好ましくは１５℃ないし３７℃、より好ましくは２５℃ないし３７℃で、２時間ないし４８時間、好ましくは４時間ないし２４時間振とう培養を行う。培養液から遠心にて菌体を回収し、菌体を所望の緩衝液中に懸濁後、破砕し、破砕液を遠心し、その上清を大腸菌粗抽出液として回収すればよい。
【０１４６】
生物学的試料に、細胞破砕粗抽出液を混合する場合、限定されるわけではないが、試料に、所望の緩衝液（ＢＳＡやカゼイン、市販のブロッキング剤などを含んでも良い）で０．０５ｍｇ／ｍｌないし５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌないし５ｍｇ／ｍｌの総タンパク質濃度に調製した細胞破砕粗抽出液を、４℃ないし３７℃で、好ましくは１５℃ないし３０℃で、１分ないし２４時間、好ましくは１０分ないし４時間、より好ましくは３０分ないし２時間反応させる。なお、生物学的試料が血清等の場合、通常血清を細胞破砕抽出液で１０倍から１００００倍、好ましくは１００倍から１０００倍、より好ましくは１００倍から５００倍に希釈して用いる。
【０１４７】
ビオチン結合性タンパク質の添加
本発明者は、生物学的試料を担体に接触させる際に、細胞破砕抽出液とともに、さらに、ビオチン結合性タンパク質を同時に存在させるとより好ましいことを見いだした。
【０１４８】
よって、本発明はその好ましい一態様において、工程３）において、工程２）で作成したＳＩＴＨ−１タンパク質が結合した担体に、
（ａ）  生物学的試料、並びに
（ｂ−ｉ）  工程１）又は２）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、又は
（ｂ−ｉｉ）  工程１）又は２）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する。
【０１４９】
本発明の方法において、生物学的試料にビオチン結合性タンパク質を添加することにより、効果的にバックグラウンドシグナルを抑制することができる。
【０１５０】
このようなビオチン結合性タンパク質は、上述のビオチン結合性タンパク質のいずれであってもよく、特段の制限はない。また、野生型であっても変異体であってもよく、ビオチン結合能は野生型と比較して、同等であっても、高くてもよく、低くてもよい。
また、添加の態様として、ビオチン結合性タンパク質（天然由来でも、遺伝子工学的に発現させたものでもよい）の粉末を直接添加してもよく、適当な液に溶解してから添加してもよい。また例えば、ビオチン結合性タンパク質を試料に直接添加するのではなく、試料と細胞破砕抽出液の混合物をビオチン結合性タンパク質を固定した担体で処理する（例えばカラムに通す）態様でもよい（工程ｂ−ｉ）。
【０１５１】
ビオチン結合性タンパク質を細胞破砕粗抽出液に添加する場合、限定されるわけではないが、ビオチン結合性タンパク質の濃度は最終濃度で、１μｇ／ｍｌないし５００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌないし１００μｇ／ｍｌで添加する。当該細胞中でビオチン結合性タンパク質を遺伝子工学的に発現させる場合の、ビオチン結合性タンパク質の濃度に関しても、これに限定されるわけではないが、同様の濃度であっても良い。
【０１５２】
あるいは、ビオチン結合性タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入し発現させ、当該宿主細胞を破砕して得られたビオチン結合性タンパク質を含む細胞抽出液として使用してもよい（工程ｂ−ｉｉ）。この場合、ビオチン結合性タンパク質は所望の宿主で、当業者に周知の方法で発現させれば良いが、工程１）又は２）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を遺伝子工学的に発現させた場合は、その宿主と同種のものが好ましい。また、ビオチン結合性タンパク質と、ＳＩＴＨ−１タンパク質又はビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質を遺伝子工学的に発現させた宿主が異なる場合は、これに限定されるわけではないが、生物学的試料に添加・反応させる細胞抽出液は、両方の宿主細胞由来のものを使用することもできる。
【０１５３】
宿主が大腸菌の場合、ビオチン結合性タンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込み、これを大腸菌に導入し、タンパク質発現を誘導しつつ、大腸菌の培養を行なう。発現ベクターや宿主大腸菌株、培地成分、ＩＰＴＧ濃度や培養温度などの誘導条件は、適宜選択することが可能である。
【０１５４】
担体への生物学的試料等の添加
担体への生物学的試料、細胞破砕抽出液、及びビオチン結合性タンパク質の添加は任意の方法で行うことができる。ただし、生物学的試料が担体と接触するのと同時、あるいはそれよりも前に、生物学的試料が細胞破砕抽出液及びビオチン結合性タンパク質と接触しなければならない。すなわち、生物学的試料が、担体と接触するのと同時、あるいはそれより前に細胞破砕抽出液が十分に接触すればよく、細胞破砕抽出液由来の成分は必ずしも最終的に生物学的試料とともに担体に添加される必要はない。例えば、細胞破砕抽出液成分を結合した担体を作成し、そこへ生物学的試料を処理したものを使用してもよい。具体的には、生物学的試料を担体と接触させる前に、細胞破砕抽出液成分カラムに通す、などの態様が挙げられる。
【０１５５】
なお、添加後は、特に限定されるわけではないが、生物学的試料及び細胞破砕抽出液を、担体と、１０℃ないし３０℃で、好ましくは２０℃ないし３０℃で、１０分ないし４時間、好ましくは３０分ないし２時間反応させる。
【０１５６】
５．ＳＩＴＨ−１タンパク質抗体の検出方法
本発明の検出方法は、工程３）においてＳＩＴＨ−１タンパク質の抗体を検出する。
【０１５７】
ＳＩＴＨ−１タンパク質抗体を検出する方法は、当業者が適切に選択できる。好ましいものとして、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）や放射性イムノアッセイ法（ＲＩＡ）などのイムノアッセイ法、表面プラズモン共鳴法などのようなアッセイ法が挙げられる。ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を用いて固定化されたＳＩＴＨ−１タンパク質に対し、生物学的試料を反応させた後、当該ＳＩＴＨ−１タンパク質抗体を検出する。
【０１５８】
イムノアッセイにおいて、抗原であるＳＩＴＨ−１タンパク質を固定化し、生物学的試料中に存在するＳＩＴＨ−１タンパク質抗体を反応させ、当業者に周知の方法で検出される。例えば、ＳＩＴＨ−１タンパク質に結合したＳＩＴＨ−１タンパク質抗体に対し、ヒト抗体を認識し結合する例えば抗ヒト抗体を二次抗体として用いて検出する。この際、この抗ヒト抗体は、蛍光や酵素、あるいは放射性同位元素で標識しておき、最終的に蛍光量や酵素活性、あるいは放射性量を測定することで、間接的に抗体の量を測定、定量する。
【０１５９】
上記標識は当業者に周知の方法で行えばよく、また市販の、蛍光や酵素標識された抗ヒト抗体等を用いてもよい。蛍光標識としては例えばフルオレセイン及びローダミンなどによる標識や、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）などの蛍光タンパク質による標識も考えられる。酵素標識としてはペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ、あるいはルシフェラーゼやグルコースオキシダーゼ等が利用され得るがこれらに限定されない。これらの酵素による測定のための基質は市販されており、例えばペルオキシダーゼの場合、ＴＢＡやケミルミネッセンス用の基質を用いることが出来る。また、放射性同位元素として例えば、ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、イオウ（35Ｓ）、及びトリチウム（3Ｈ）、核酸の場合はリン（32Ｐ）などが挙げられる。
【０１６０】
生物学的試料（サンプル）中に存在する抗体の量は、例えば、直線回帰コンピューターアルゴリズムを使用して、標準的な調製物（例えば臨床検体の場合、健常者の標準試料若しくは典型的な患者の標準試料）中に存在する量との比較によって簡易に算出され得る。抗体を検出するためのこのようなアッセイ法は、例えば、ＥＬＩＳＡについて、Ｉａｃｏｂｅｌｌｉら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  １１：  １９−３０  （１９８８）  に記載されている。
【０１６１】
あるいは、ＳＩＴＨ−１抗体価が低い場合や、非特異結合によるバックグラウンドシグナルの影響が大きくなる場合、抗体の量は、実施例に示したように測定値から、抗原を固相化していない区の測定値を差し引くことで、より正確に求めることが出来る。例えば、生物学的試料中の、ＳＩＴＨ−１抗体が少ない場合（抗体価が低い場合）や、血清などの生物学的試料そのものに非特異的な結合が多い場合には、非特異結合によるバックグラウンドシグナルの影響が大きくなる。そのため、測定値よりバックグラウンドシグナルを適切に差し引くことで、検出したい物質をより正確に測定することが可能になる。差し引くバックグラウンドは実験系に応じて当業者が適切に判断しうる。
【０１６２】
例えば実施例２ないし４に記載したように、ＳＩＴＨ−１抗原を固定化した担体における測定値から、ＳＩＴＨ−１抗原を固定化していない区（ただしＳＩＴＨ−１抗原を固定化した区と同様に、ＢＳＡなどによるブロッキング操作は行われ、かつ抗ＳＩＴＨ−１抗体を含む血清（生物学的試料）を添加した区）の測定値を差し引く態様も有効である。
あるいは好ましくは、ヒトが抗体を有しない任意のタンパク質（制限されるものではないが、例えばＧＦＰなどを挙げることができる）を固定化した区の測定値を差し引くことで、より正確に求めることが出来る。固定化の方法としては、特に限定はされないが、対象のタンパク質をビオチン化し、ビオチン結合性タンパク質が結合した担体に、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合により固定化することが好ましい。
本発明の検出方法は、血清中において抗体価の低いＳＩＴＨ−１タンパク質抗体を特異的に検出することが可能である。
【０１６３】
ＩＩ．ＳＩＴＨ−１タンパク質が結合した担体
本発明はまた、生物学的試料中のＳＩＴＨ−１タンパク質抗体を検出するための担体を提供する。
【０１６４】
本発明の担体は、ＳＩＴＨ−１タンパク質を結合した担体であり、結合方法としては、上述のとおり、疎水結合、共有結合、アビジン‐ビオチン結合などを利用する方法、様々なタグを用いる方法などが挙げられる。
【０１６５】
本発明の担体は、より好ましくは、ＳＩＴＨ−１タンパク質と担体とが、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、ことを特徴とする。本発明の担体は、好ましくは、
１）  ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体、及び、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質を準備し；
２）  ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程１）で準備した担体にビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質を結合させる
方法によって調製される。１）のビオチン結合性タンパク質は、直接担体に結合していても、ビオチンを介して担体に結合していてもよい。
【０１６６】
ＩＩＩ．キット
本発明はまた、生物学的試料中のＳＩＴＨ−１タンパク質抗体を検出するためのキットを提供する。本発明のキットは、
Ａ）  前記ＳＩＴＨ−１タンパク質が結合している担体；並びに、
Ｂ）  Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液を含む、生物学的試料を希釈するための剤
を含む。
【０１６７】
「ＳＩＴＨ−１タンパク質が結合している担体」については上述の通りである。
【０１６８】
生物学的試料を希釈するための剤は、細胞破砕抽出液（及びビオチン結合性タンパク質）そのものであってよく、あるいは、細胞破砕抽出液を生物学的試料とともにさらに希釈する剤であって、適当な緩衝液や市販の細胞希釈液あるいは血清希釈液などの溶剤を含んでもよい。
【０１６９】
また、本発明のキットは、好ましくは、
Ａ）の担体が、ＳＩＴＨ−１タンパク質がビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を利用して結合している担体であり、そして、
Ｂ)の剤が、
ｉ）  Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、又は
ｉｉ）  Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を含む。
【０１７０】
「ＳＩＴＨ−１タンパク質がビオチン−ビオチン結合性タンパク質間結合を利用して結合している担体」については上述の通りである。
【０１７１】
また、「  Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液」、「ビオチン結合性タンパク質」「ＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液」についても上述の通りである。
【０１７２】
また、本発明のキットは、
Ａ）  前記ＳＩＴＨ−１タンパク質；
Ｂ）  Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質を固定化するための担体；並びに
Ｃ）  Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液を含む、生物学的試料を希釈するための剤
を含む。
【０１７３】
「前記ＳＩＴＨ−１タンパク質」については、疎水結合、共有結合等を利用して担体と結合させる場合においては、精製していることが好ましい。また、上述の、様々なタグを用いる方法、ビオチン−ビオチン結合性タンパク質間の結合を利用する方法を用いる場合には、上述のように、当該タグやビオチンを結合させたＳＩＴＨ−１タンパク質が好ましい。
【０１７４】
「  Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質を固定化するための担体」については、上述の担体を利用することができるが、「前記ＳＩＴＨ−１タンパク質」と結合させるための処理がなされた担体が好ましい。
【０１７５】
「  Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液」、「生物学的試料を希釈するための剤」についても上述の通りである。
【０１７６】
上記本発明のキットは、好ましくは、
Ａ）のＳＩＴＨ−１タンパク質がビオチン化されており、
Ｂ）の担体が、ビオチン結合性タンパク質と直接的又は間接的に結合しており、
Ｃ）の剤が、
ｉ）  Ａ）又はＢ）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、又は
ｉｉ）  Ａ）又はＢ）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を含む、生物学的試料を希釈するための剤
である。
【０１７７】
ＳＩＴＨ−１タンパク質のビオチン化の方法、ビオチン結合性タンパク質と直接的又は間接的に結合している担体については、上述のとおりである。
【０１７８】
また、「  Ａ）又はＢ）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液」、「ビオチン結合性タンパク質」、「  Ａ）又はＢ）のＳＩＴＨ−１タンパク質、ビオチン化ＳＩＴＨ−１タンパク質、及び／又はビオチン結合性タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液」、「生物学的試料を希釈するための剤」についても上述の通りである。
【実施例】
【０１７９】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。【０１８０】
本明細書中の実施例１ないし３では、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）由来のＳＩＴＨ−１タンパク質とビオチン化配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＢｉｏＥａｓｅタグ）との融合タンパク質を大腸菌で発現させ、そこから得られた大腸菌粗抽出液を直接タマビジン２（以下、「ＴＭ２」と記載する）固定化マイクロプレートに反応させ、融合タンパク質をタマビジン−ビオチン結合によりマイクロプレートに結合させた。【０１８１】
こうして得られたＳＩＴＨ−１タンパク質結合プレートに、大腸菌粗抽出液で希釈したヒト血清（ウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体を含む。市販のヒト血清には抗ＳＩＴＨ−１抗体が含まれないので、本試験では市販のヒト血清にウサギの抗ＳＩＴＨ−１抗体（抗血清）を段階希釈して加えたものを検体として用いた。）を反応させ、ヒト血清中に含まれる抗ＳＩＴＨ−１抗体価を測定した。【０１８２】
実施例１  ＳＩＴＨ−１とビオチン化配列（ＢｉｏＥａｓｅタグ）との融合タンパク質発現用ベクターの構築
ＳＩＴＨ−１タンパク質のＮ末側に、ＢｉｏＥａｓｅタグが配置された融合タンパク質をコードする遺伝子を設計した。このＢｉｏＥａｓｅタグは生体内（この場合大腸菌）において生体中のビオチン化酵素によってビオチン化される配列を含むペプチドタグである。ＢｉｏＥａｓｅ−ＳＩＴＨ−１融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に、コードする塩基配列を配列番号９に示す。【０１８３】
１−１．プライマーの設計
ＢｉｏＥａｓｅ−ＳＩＴＨ−１融合遺伝子構築のために、まず、ＳＩＴＨ−１遺伝子を増幅させるためのプライマーを設計した。即ち、ＳＩＴＨ−１タンパク質のＮ末端部位をコードするＤＮＡ配列からなるプライマー（ＳＩＴＨ１ＮｔｅｒｍＧＷ−Ｆ）と、ＳＩＴＨ−１タンパク質のＣ末端部位を逆向きにコードするＤＮＡ配列からなるプライマー（ＳＩＴＨ１ＣｔｅｒｍＧＷ−Ｒ）を設計した。【０１８４】
ＳＩＴＨ−１とＢｉｏＥａｓｅタグとの融合遺伝子構築用プライマーを表１にまとめた。【０１８５】
【表１】
2010114029.tif 000002
【０１８６】
（配列番号１０−１１）
１−２．ＰＣＲ
ＳＩＴＨ−１遺伝子（ＯＲＦ）（配列番号２）がＦＬＡＧタグをつけた発現ベクター（ＰＣＴ／ＪＰ２００８／６７３００）のＤＮＡを鋳型にして、プライマーＳＩＴＨ１ＮｔｅｒｍＧＷ−ＦとＳＩＴＨ１ＣｔｅｒｍＧＷ−Ｒを用いてＳＩＴＨ−１部位の増幅を行った。ＰＣＲ反応条件は、２０μｌの反応液中に鋳型ＤＮＡを５００ｎｇ、１０(ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ社）を２μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰを１．６μｌ、プライマーを各２０ｐｍｏｌｅｓ、５Ｕ／μｌ  ＥｘＴａｑを０．１μｌ添加し、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ）を用いて９６℃３分を１回、９５℃で１分，６０℃で１分，７２℃で２分を２０回、７２℃６分を１回行った。その結果、４７７ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。【０１８７】
１−３．クローニング
ＰＣＲによって得られたＳＩＴＨ−１遺伝子を、ベクターｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。ライゲーション反応はベクターキット添付の説明書に従った。大腸菌ＴＢ１にエレクトロポレーション法を用いてＤＮＡを導入し、常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。インサートの存在が確認されたプラスミドに関してＭ１３プライマー（ＴａＫａＲａ社）と、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Ｍｏｄｅｌ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いて塩基配列を決定し、設計した遺伝子の配列と比較して、変異がないことを確認した。【０１８８】
ＳＩＴＨ−１遺伝子が組み込まれたプラスミドをエントリークローンとし、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてＢｉｏＥａｓｅタグ融合タンパク質発現ベクターであるｐＥＴ１０４．１デスティネーションベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と組換え反応を行った。組換え産物を大腸菌ＴＢ１に形質転換し、プラスミドＤＮＡを抽出し、このプラスミドをさらに大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。得られた大腸菌コロニーを鋳型に、ＳＩＴＨ１ＮｔｅｒｍＧＷ−ＦとＳＩＴＨ１ＣｔｅｒｍＧＷ−Ｒを用いてＰＣＲによる挿入遺伝子部位の増幅を行い、挿入遺伝子の有無を確認した。【０１８９】
以上の方法で、ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１タンパク質発現用のベクターＢｉｏＥａｓｅ−ＳＩＴＨ１／ｐＥＴ１０４．１を完成させた。【０１９０】
１−４．大腸菌発現
ＢｉｏＥａｓｅ−ＳＩＴＨ１／ｐＥＴ１０４．１を導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、又は対照としてｐＴｒｃ９９Ａのみを導入した大腸菌ＢＬ２１を、抗生物質アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地５０ｍｌに接種し、ＯＤ６００における吸光度が０．５に達するまで３０℃で振とう培養した。その後、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で５時間振とう培養した。培養液５０ｍｌから遠心にて菌体を回収した。菌体は０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）３ｍｌ中に懸濁後、超音波により破砕した。破砕液を遠心（１５，０００ｒｐｍ）し、その上清を大腸菌粗抽出液とした。【０１９１】
ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１タンパク質の発現を確認するため、粗抽出液中に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングによるＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１の検出にはウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体（未発表）とアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）を用いた。【０１９２】
結果を図１Ａに示す。ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１発現大腸菌からは、対照には存在しない約３０ｋＤａのバンドが検出された。このサイズはＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１の分子量２８．６ｋＤａとほぼ一致した。【０１９３】
さらに抗ＳＩＴＨ−１抗体の代わりに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを用いて、シグナルを検出した。結果を図１Ｂに示す。対照ではシグナルが殆ど検出されなかった一方で、ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１を発現させた大腸菌粗抽出液からは、ストレプトアビジンと反応する（従ってビオチン化されていると考えられる）タンパク質に由来する太いバンドが２本検出された。しかもそのうち上のバンドは先のウェスタンブロッティングの際に検出されたバンドとほぼ同じサイズであった。以上のことから、ビオチン化ＳＩＴＨ−１の発現に成功したことが示された。【０１９４】
なお、上記に加え、後のＥＬＩＳＡ実験に用いるため、ｐＴｒｃ９９ＡやＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ（ＷＯ  ０２／０７２８１７）を導入した大腸菌ＢＬ２１に関しても上記と同様に、ＩＰＴＧ存在下で培養後、大腸菌粗抽出液を調製した。【０１９５】
実施例２  ＥＬＩＳＡによるヒト血清中抗ＳＩＴＨ−１抗体の検出
精製ＴＭ２をＮｅｗ  ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅキット（住友ベークライト）を用いてマイクロプレートに固定化した。固定化方法はキット添付の説明書に従った。【０１９６】
実施例１で得られたＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１タンパク質を発現した大腸菌粗抽出液を全タンパク質濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ  （ｐＨ７．４）で調製後、ＴＭ２固定化プレート（住友ベークライト、Ｎｅｗ  ＥＬＩＳＡ）に１００μｌ添加した。室温で１時間静置することにより、タマビジン−ビオチン結合によりＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１タンパク質をＴＭ２固定化プレートに結合した。その後、プレートの各ウェルを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液（ＴＢＳＴ）で３回洗浄し、５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ／ＴＢＳＴ  溶液を各ウェルに２５０μｌ添加し、室温で１時間静置し、ブロッキングを行った。その後、各ウェルはＴＢＳＴで３回洗浄した。【０１９７】
次に、ヒト血清（Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  ｐｏｏｌ，Ｃｏｓｍｏ−Ｂｉｏ社製）をＰＢＳ、又は実施例１の（１−４）で調製した１ｍｇ総可溶性タンパク質／ｍｌのｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液、又は１ｍｇ総可溶性タンパク質／ｍｌのＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液で１００倍希釈した溶液に、ウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体を体積比で１／５００、１／１０００、１／２０００、１／４０００、１／８０００となるように段階希釈して加えた。この（抗ＳＩＴＨ−１抗体を含む）希釈したヒト血清を、ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１タンパク質をビオチン-タマビジン２結合を用いて固定化したプレートに、１００μｌずつ添加し、１時間室温で反応させた。
ウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体（抗血清）の血清中抗体価は、典型的なうつ病（気分障害）患者の血清中抗ＳＩＴＨ−１抗体価に比べ、およそ５０倍程度高いと推定される。従って市販（健常者）ヒト血清に体積比で１／５０量のウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体（抗血清）を混ぜると、典型的なうつ病患者血清の擬似検体となると考えられる。よって、上記の抗体希釈率は、うつ病患者血清をおよそ１０倍から８０倍希釈して用いる場合と同程度とみなすことができる。
さらに、血清の希釈に用いた大腸菌粗抽出液中におけるＴＭ２の効果を確認するために、ＰＢＳ若しくは上記ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液に、最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように、精製ＴＭ２を加えた溶液を調製し、これを用いてヒト血清を１００倍希釈した溶液に、上記と同様、ウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体を体積比で１／５００、１／１０００、１／２０００、１／４０００、１／８０００となるように段階希釈して加え、ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１を固定化したプレートに１００μｌずつ添加し、１時間室温で反応させた。また対照として、何も結合させていないＴＭ２固定化プレートに上記ブロッキング操作を行った後、上記と同様にＰＢＳ溶液や、ｐＴｒｃ９９Ａ導入あるいはＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液（１ｍｇ総可溶性タンパク質／ｍｌ）、さらに精製ＴＭ２を加えたＰＢＳや、精製ＴＭ２を加えたｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液で、１００倍希釈したヒト血清に、段階的に希釈したウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体を加えたものを１００μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。【０１９８】
上記のように各種の希釈液で希釈したヒト血清に、ウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体を段階希釈して加えたものを、担体に固定化したＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１タンパク質と反応させた後、ＴＢＳＴで３回洗浄した。その後、ＳＩＴＨ−１に結合したウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体、ならびに各ウェル中で非特異的に結合していると考えられる血清中のヒトＩｇＧを、それぞれ検出するために、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、ならびにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を、それぞれＴＢＳＴで５０００倍希釈した混合溶液を１００μｌずつ添加し、１時間室温で静置した。その後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ活性を検出した。活性は各ウェルに、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＩＥＲＣＥ）を１００μｌずつ添加し、５分間室温で静置した後発光量をプレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ社製）によって測定した。なお、データ値としては、ウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体の各濃度区それぞれにおいて、対照区サンプル（ＴＭ２プレートにＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１を固定していないが、ＢＳＡによりブロッキング操作は行なわれ、かつ各濃度の抗ＳＩＴＨ−１抗体を含むヒト血清を処理した区）の各発光量の測定も併せて行い、その対照区の値を、ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１を固定化した区の発光量の値から差し引いた。これを血清中に含まれる抗ＳＩＴＨ−１抗体の検出量とした。さらに、各血清希釈液の効果の比較を行うために、Ｓ／Ｎ比を以下に示す式によって算出した。
Ｓ／Ｎ比＝抗ＳＩＴＨ−１抗体を各濃度で加えた区の抗ＳＩＴＨ−１抗体検出量／抗ＳＩＴＨ−１抗体を加えない区の抗ＳＩＴＨ−１抗体検出量【０１９９】
従って、Ｓ／Ｎ比が大きいほど検出感度が高いことを示している。【０２００】
結果を図２、図３に示す。血清中に含まれる抗ＳＩＴＨ−１抗体は、血清をＰＢＳで希釈した区では、非特異結合が多く、抗ＳＩＴＨ−１抗体を添加していない区でも高い発光量が検出された。また、この非特異結合は５０μｇ／ｍｌ  ＴＭ２存在下でも改善されなかった。一方、血清をｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液やＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液、あるいはｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液に５０μｇ／ｍｌ  ＴＭ２を添加したもので希釈した区においては、ＳＩＴＨ−１抗体を加えない区におけるルミネッセンス値が相当低く、非特異結合が劇的に減少していた（図２）。【０２０１】
また図３に示したように、Ｓ／Ｎ比に関しては特にｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液に５０μｇ／ｍｌ  ＴＭ２を添加した区とＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ導入大腸菌粗抽出液を添加した区において高かった。【０２０２】
以上のことから、ＴＭ２プレートにＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１を固定化したプレートを用いた測定系において、ＴＭ２含有大腸菌粗抽出液でヒト血清を希釈することで、ヒト血清由来の非特異結合を減少させ、極めて低い濃度の抗ＳＩＴＨ−１抗体も感度良く定量的に検出できることが示された。【０２０３】
実施例３．患者由来の血清検体を用いたＥＬＩＳＡ分析
３−１．ＴＭ２プレートとビオチン化ＳＩＴＨ−１を使用したヒト血清中抗ＳＩＴＨ−１抗体価測定
ＳＩＴＨ−１抗体を持つことが判っている患者血清６例（慢性疲労症候群２例、うつ病３例、クローン病１例）と、健常人ではあるが、自己抗体などのバックグラウンドが高いため、蛍光抗体法では判別が難しかった血清６例を用いて血清抗体価測定を行なった。なお、患者血清及び健常人コントロール血清は、東京慈恵会医科大学、大阪大学医学系研究科、又は大阪市立大学医学系研究科の倫理委員会の承認を得て採取、検査を行なった。【０２０４】
患者の抗ＳＩＴＨ−１抗体価は、蛍光抗体で４０倍〜１６０倍のものを使用した。この検討で健常人コントロールの血清は、４０倍〜８０倍の抗核抗体又は抗細胞質抗体を持ち、蛍光抗体法によるＳＩＴＨ−１抗体測定に困難を生じた検体６例を用いた。【０２０５】
蛍光抗体法は以下のように実施した。蛍光抗体法に使用する抗原は、ＳＩＴＨ−１発現ベクター（クロンテック社製ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターのＥＧＦＰ部分をＳＩＴＨ−１のｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅで置き換えたもの）を、Ｌａｂ−Ｔｅｋ社製８チャンバースライドで培養した２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、２４時間後に冷アセトンで５分間固定したものを用いた。血清は、ヒト血清を０．２％  ＢＳＡと０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−：カルシウムとマグネシウムを含まない）で、２０倍、４０倍、８０倍、１６０倍と２倍毎に希釈し、１次抗体とした。１次抗体と抗原を３７℃、１時間反応後、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）において３０分間の洗浄を３回行った。２次抗体は、インビトロジェン社製Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８  抗ヒトＩｇＧを５００倍希釈し、３７℃、１時間反応させた。０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）において３０分間の洗浄を行った後、蛍光顕微鏡で観察を行なった。ＳＩＴＨ−１特有の染色像を示す１次抗体の最大希釈倍率をもって、蛍光抗体による抗体価とした。【０２０６】
ＴＭ２  ＮＥＷプレートを用いたＥＬＩＳＡ法は、実施例２の方法に準じた。ＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１発現大腸菌粗抽出液を、２ｍｇ全タンパク質／ｍｌとなるように０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）で希釈し、ＴＭ２  Ｎｅｗ  ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌずつ添加した。室温で１時間静置することでタマビジン−ビオチン結合によりＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１タンパク質を結合した。その後、プレートの各ウェルを０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液（ＴＢＳＴ）で３回洗浄した。こうして組換えＳＩＴＨ−１タンパク質が固定化されたプレートを作成した。【０２０７】
次に、上記患者由来ヒト血清を、以下の溶液１）−３）のいずれかで１００倍希釈した。【０２０８】
１）ＴＢＳ−Ｔ（トリスバッファー生理食塩水、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０）にカゼイン１％を含む溶液；
２）大腸菌粗抽出液
ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を、大腸菌（ＢＬ２１）ペレット１グラムあたり５ｍｌ使用した溶解液を、３，０００ｇ、１０分間遠心分離した上清（ＩＰＴＧ誘導なし）
３）実施例１のように調製した５ｍｇ全タンパク質／ｍｌのＴＭ２発現大腸菌粗抽出液（ＩＰＴＧ誘導有り）
これらをＢｉｏＥａｓｅタグ融合ＳＩＴＨ−１タンパク質を結合したプレートに１００μｌずつ添加し、１時間室温で静置し、さらにＴＢＳＴで３回洗浄した。【０２０９】
対照として、血清を含まないＰＢＳ、もしくは血清を含まない大腸菌粗抽出液、もしくは血清を含まないＴＭ２発現大腸菌粗抽出液を１００μｌずつ添加し、１時間室温で静置し、さらにＴＢＳＴで３回洗浄した。【０２１０】
その後、２次抗体として、抗ヒトＩｇＧ・ＨＲＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）をＴＢＳＴで５０００倍希釈した溶液を１００μｌずつ添加し、１時間室温で静置した。その後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ活性を検出するために、ＴＭＢ１  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢｉｏＦＸ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて発色反応を行なった。なお各試験区の吸光度から、発色液ＴＭＢ１のみを入れたウェルの吸光度を差し引いた。【０２１１】
観察された吸光度を図４−図６に示す。図４に示す通り、血清を、カゼインを含むＴＢＳ−Ｔで希釈（前処理）して、ＥＬＩＳＡに供した場合、吸光度が、患者：３．５６±０．１２、健常人：３．６５±０．１９となり、患者と健常人で大きな差が見られなかった。これに対し、図５に示す通り、血清を大腸菌粗抽出液で希釈したものでは、吸光度が患者：１．８４±１．１４、健常人：１．２６±０．１４となり、患者の方がより大きな値を示す傾向が見られた。さらに、図６に示す通り、血清をＴＭ２発現大腸菌粗抽出液で希釈した場合では、吸光度が患者：１．０５±０．２７、健常人：０．４３±０．０９となり、有意な差（０．１％危険率で有意差あり）が見られた。【０２１２】
この検討では、蛍光抗体法では判別が難しかった血清を用いているにも関わらず、患者と健常人との間に十分な差が出ており、ＴＭ２プレートとビオチン化ＳＩＴＨ−１、そして、特に血清希釈液としてＴＭ２発現大腸菌粗抽出液を用いたＥＬＩＳＡ法が実用的な方法であることが示唆された。【０２１３】
３−２．ニッケルプレートとＨｉｓタグ融合ＳＩＴＨ−１タンパク質を使用したヒト血清中抗ＳＩＴＨ−１抗体価測定
本実施例では、ＥＬＩＳＡ用プレートとして市販されているＱＩＡＧＥＮ社のニッケルプレートに、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を付加したＳＩＴＨ−１タンパク質を用いて、ＥＬＩＳＡ法による抗体測定を行なった。【０２１４】
ＨｉｓタグＳＩＴＨ−１タンパク質は、ＳＩＴＨ−１タンパク質が大腸菌内において不溶性の封入体（インクルージョンボディ）を形成することを予防する目的で、ｐＥＴ−３２ａ−ｒｕ（＋）  ＤＮＡ  より得た、１０９アミノ酸からなるＴｒｘ・Ｔａｇ（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）との融合タンパク質として発現させた。【０２１５】
大腸菌コールドショックベクターｐＣｏｌｄ  Ｉ（ＴａＫａＲａバイオ社製）に、ｐＥＴ−３２ａ（＋）ＤＮＡより得た、１０９アミノ酸からなるＴｒｘ（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）を、Ｈｉｓタグとフレームを合わせて挿入した。さらにＴｒｘの下流に、ＳＩＴＨ−１又はＥＧＦＰを、フレームを合わせて挿入した。こうして、Ｈｉｓタグ−Ｔｒｘ−ＳＩＴＨ−１、Ｈｉｓタグ−Ｔｒｘ−ＥＧＦＰを構築した。完成したプラスミドを大腸菌（ＢＬ２１）に導入した。この大腸菌をＬＢ液体培地中（終濃度  １．０ｍＭ  となるようにＩＰＴＧ  を添加）で、１５℃で２４時間振とう培養し、タンパク質発現を誘導した。大腸菌ペレットを遠心分離にて回収した後、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を、大腸菌ペレット１グラムあたり５ｍｌ使用し、大腸菌タンパク質を抽出し、この抽出液を、３，０００ｇ、１０分間遠心分離した上清を、Ｈｉｓタグ・ＳＩＴＨ−１タンパク質発現大腸菌粗抽出液として使用した。【０２１６】
ニッケルプレートを用いたＥＬＩＳＡ法は以下のように行った。Ｎｉ−ＮＴＡ  ＨｉｓＳｏｒｂ  Ｓｔｒｉｐｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）へ、上記Ｈｉｓタグ・ＳＩＴＨ−１発現大腸菌粗抽出液を、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ（−），  ０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０溶液で３回洗浄後、抗ＳＩＴＨ−１ウサギ血清、又は上記患者由来のヒト血清を加え、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ（−），  ０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液で３回洗浄後、２次抗体として、抗ウサギＩｇＧ・ＨＲＰ抗体（ロッシュ社製、５，０００倍希釈）、又は抗ヒトＩｇＧ・ＨＲＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、５，０００倍希釈）を用いた。発色反応は、ＴＭＢ１  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢｉｏＦＸ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて行なった。【０２１７】
まず、ニッケルプレートと、ＨｉｓタグＳＩＴＨ−１タンパク質の有用性を確認するために、抗ＳＩＴＨ−１ウサギ血清を使用して、ＥＬＩＳＡ法による抗体測定を行なった。      【０２１８】
ウサギ血清は、１００倍希釈と５００倍希釈のものを用いた。結果を各々図７及び８に示す。その結果、ウサギ血清を用いた場合は、ニッケルプレートとＨｉｓタグＳＩＴＨ−１タンパク質が抗体測定に使用可能であることが示された。【０２１９】
次に、上記３−１．で用いたヒト血清（患者血清６例と健常人コントロール血清６例）を用いて、ニッケルプレートとＨｉｓタグＳＩＴＨ−１タンパク質を用いた抗体測定を行なった。非特異結合を確認するための、タンパク質のコントロールとして、ＨｉｓタグＥＧＦＰタンパク質を使用した。【０２２０】
血清は、１００倍希釈と５００倍希釈の両者について検討を行なった。希釈剤としては、１％  牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と、上記（３−１）で使用したのと同様の大腸菌粗抽出液を使用した。なお、血清反応に用いたバッファーはＰＢＳ（−）で、ブロッキングは０．２％  ＢＳＡを含むＰＢＳで行った。また洗浄は、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（−）で行なった。【０２２１】
結果を図９及び１０に示す。血清を１００倍希釈したものでは、１％  ＢＳＡ、大腸菌粗抽出液共に、患者と健常人で抗体価に大きな差は見られなかった。一方血清を５００倍希釈したものでは、（３−１）による方法に比して、その差は小さかったものの、１％  ＢＳＡ、大腸菌粗抽出液共に、患者の方が健常人よりも高い抗体価を示す傾向が見られた。【０２２２】
実施例４  磁性ビーズを用いたＥＬＩＳＡによるヒト血清存在下での抗ＳＩＴＨ−１抗体の検出
本実施例では、非常に薄い濃度のＳＩＴＨ−１抗体を検出する場合について、ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１をビオチン化磁性ビーズへ固定化した系における各種血清希釈液の効果を調査した。【０２２３】
４−１．プライマーの設計
ＳＩＴＨ１−ＴＭ２融合遺伝子構築のために、まず、ＳＩＴＨ−１とＴＭ２の両遺伝子をリンカー（５ｘｌｉｎｋｅｒ：  ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号１２）を介し融合させるためのプライマーを設計した。【０２２４】
即ち、５’側にＳＩＴＨ−１の  Ｃ末端部位、中央にリンカー、３’側にＴＭ２の  Ｎ末端部位をコードするＤＮＡ配列からなるプライマー（ＳＩＴＨ１Ｃ−５ｘｌｉｎｋ−ＴＭ２Ｎ−Ｆ）（配列番号１３）、５’側にＴＭ２  のＮ末端部位、リンカー、３’側にＳＩＴＨ−１の  Ｃ末端部位を逆向きにコードするＤＮＡ配列からなるプライマー（ＳＩＴＨ１Ｃ−５ｘｌｉｎｋ−ＴＭ２Ｎ−Ｒ）（配列番号１４）を設計した。【０２２５】
次に、ＳＩＴＨ−１のＮ末端部位を含む５’部分と、その上流にＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素切断部位（ＣＣＡＴＧＧ）が配置されたプライマー（ＳＩＴＨ１  ５’  ＥｃｏＲＩ−Ｆ（配列番号１５）、また、ＴＭ２遺伝子の３’部分とその下流にＢａｍＨ  Ｉ制限酵素切断部位（ＧＧＡＴＣＣ）をコードする配列からなるプライマー（ＴＭ２ＣｔｅｒｍＢａｍ）（配列番号１６）を設計した。ＳＩＴＨ−１とＴＭ２との融合遺伝子構築用プライマーを表２にまとめた。【０２２６】
【表２】
2010114029.tif 000003
【０２２７】
４−２．ＰＣＲ
ＳＩＴＨ１−ＴＭ２融合遺伝子を構築するために、二段階のＰＣＲを行った。【０２２８】
一段階目のＰＣＲは、ＳＩＴＨ−１遺伝子（ＯＲＦ）（配列番号２）がＦＬＡＧ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  （ＳＩＧＭＡ）に組み込まれているプラスミドを鋳型にして、プライマーＳＩＴＨ１  ５’  ＥｃｏＲＩ−ＦとＳＩＴＨ１Ｃ−５ｘｌｉｎｋ−ＴＭ２Ｎ−Ｒを用いてＳＩＴＨ−１部位の増幅を、また、ＴＭ２遺伝子がベクターｐＴｒｃ９９Ａに組み込まれたプラスミド（ＷＯ０２／０７２８１７）を鋳型にして、プライマーＳＩＴＨ１Ｃ−５ｘｌｉｎｋ−ＴＭ２Ｎ−ＦとＴＭ２ＣｔｅｒｍＢａｍを用いてＴＭ２部位の増幅をそれぞれ行った。【０２２９】
ＰＣＲ反応は、上記実施例１−２．と同様に行った。その結果、ＳＩＴＨ−１部分においては、５７９ｂｐ、ＴＭ２部分においては５２８ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。これらのＰＣＲ産物を鋳型にして、プライマーＳＩＴＨ１  ５’  ＥｃｏＲＩ−ＦとＴＭ２ＣｔｅｒｍＢａｍを用いて二段階目のＰＣＲを行った。その結果、９９０ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。【０２３０】
４−３．クローニング
ＰＣＲによって得られたＳＩＴＨ１−ＴＭ２融合遺伝子をベクターｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に、上記実施例１−３と同様にクローニングした。さらに、融合遺伝子が組み込まれたプラスミドをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで二重消化し、融合遺伝子が含まれるＤＮＡ断片を回収した。この断片を予めＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化しておいた大腸菌用の発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にクローニングした。以上のように、ＳＩＴＨ−１とＴＭ２の融合タンパク質発現用のベクターＳＩＴＨ１−ＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａを完成させた。発現用のベクターＳＩＴＨ１−ＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａ中のＳＩＴＨ１−ＴＭ２をコードする塩基配列を配列番号１７に、コードされるアミノ酸配列を配列番号１８に示す。【０２３１】
ＳＩＴＨ１−ＴＭ２は、５'側については、ＥｃｏＲＩ部位を用いてｐＴｒｃ９９Ａに組み込んだため、翻訳開始メチオニンの後ろに２つのアミノ酸残基が付加されている（配列番号１７の塩基番号４−９、配列番号１８のアミノ酸残基番号２−３）。次いで、ＳＩＴＨ−１の配列（配列番号１７の塩基番号１０−４８３、配列番号１８のアミノ酸残基番号４−１６１）、５ｘｌｉｎｋｅｒ（配列番号１７の塩基番号４８４−５５８、配列番号１８のアミノ酸残基番号１６２−１８６）、ＴＭ２の配列（Ｍｅｔを除去したもの）（配列番号１７の塩基番号５５９−９８１、配列番号１８のアミノ酸残基番号１８７−３２６）が続く。【０２３２】
４−４．大腸菌発現
ＳＩＴＨ１−ＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａを導入した大腸菌ＢＬ２１を、上記実施例１−４．と同様に培養した。培養液５０ｍｌから遠心にて菌体を回収した。菌体は０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）３ｍｌ中に懸濁後、超音波により破砕した。破砕液を遠心（１５，０００ｒｐｍ）し、その上清を大腸菌粗抽出液とした。ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１タンパク質の発現をウェスタンブロッティングにより確認した。【０２３３】
ＳＩＴＨ−１の検出にはウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体（大腸菌で発現させたＳＩＴＨ−１を精製し、ウサギに免疫して作成した抗ＳＩＴＨ−１抗体（抗血清））とアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）を各々１０００倍希釈して用いた。その結果、ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１発現大腸菌からは３５ｋＤａ付近にバンドが検出された。このサイズはＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１の分子量３４．８ｋＤａとほぼ一致した。なお、ｐＴｒｃ９９ＡやＴＭ２／ｐＴｒｃ９９Ａを導入した大腸菌ＢＬ２１（Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）ＦＥＢＳ  Ｊ．２７６：１３８３−１３９７）に関しても上記と同様に、ＩＰＴＧ存在下で培養後、大腸菌粗抽出液を調製した。【０２３４】
４−５．ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１固定化磁性ビーズの調製
磁性ビーズのＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ａｍｉｎｅ  （ＤｙｎａｌＢｉｏｔｅｃｈ社製）１ｍＬ（３０ｍｇビーズ／ｍＬ）に、１０ｍＭ  ＮＨＳ−Ｌｃ−Ｌｃ−Ｂｉｏｔｉｎ  （ＰＩＥＲＣＥ社製）１ｍＬを添加した。室温で３０分間転倒混和することでアミノ基とＮＨＳ活性エステル基を反応させ、ビオチンと磁性ビーズを共有結合させた。その後、磁性ビーズを０．１％  ＢＳＡ／  ０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０／  ＰＢＳ溶液で２回洗浄し、最後にＰＢＳ緩衝液に懸濁した。得られた磁性ビーズ（３０ｍｇビーズ／ｍＬ  ＰＢＳ）をビオチン化磁性ビーズとした。【０２３５】
ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１を上述の実施例４−４と同様に大腸菌で発現させ、調製した大腸菌粗抽出液を、総可溶性タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ  （ｐＨ７．４）で希釈し、ここにビオチン化磁性ビーズを添加した。室温で１時間転倒混和することで、タマビジンービオチン結合によりＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１を磁性ビーズに固定化した。その後、磁性ビーズを０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ緩衝液（ＴＴＢＳ）で３回洗浄した。【０２３６】
さらに、ＴＭ２が発現した大腸菌（Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  ＦＥＢＳ  Ｊ  ２７６：  １３８３−１３９７）の粗抽出液を、総可溶性タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）で希釈し、ここへビオチン化磁性ビーズを添加した。室温で１時間転倒混和することで、タマビジンービオチン結合によりＴＭ２を固定化した。上記と同様に洗浄後、完成したＴＭ２固定化磁性ビーズ（３０ｍｇビーズ／ｍＬ  ＰＢＳ）は血清サンプル固有の非特異結合を差し引くために用いられた。【０２３７】
４−６．磁性ビーズを用いたＥＬＩＳＡ分析
市販のヒト血清（Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  ｐｏｏｌ、Ｃｏｓｍｏ−Ｂｉｏ社製）に、実施例２のウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体を１／５０量加えて、ＳＩＴＨ−１抗体を含むヒト血清を調製した。一方、ＳＩＴＨ−１抗体を加えないヒト血清を対照とした。【０２３８】
ヒト血清もしくは、ウサギＳＩＴＨ−１抗体を含むヒト血清を、ＰＢＳもしくは、総可溶性タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）で調整したｐＴｒｃ９９Ａベクター産物発現大腸菌粗抽出液、もしくは総可溶性タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）で調整したＴＭ２発現大腸菌粗抽出液で、１０００倍に希釈した溶液に、さらに、最終濃度が２％（ｗ／ｖ）となるようにＢＳＡを添加した。なお、上記実施例２においては、ヒト血清を１００倍希釈した後に、その希釈後の血清に対する体積比で０．０００２５から０．００２となるようにウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体を加えた。しかしながら、本実施例４−６では、ウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体をヒト血清に１／５０量（体積比で０．０２）を加えてから、１０００倍希釈しているので、ウサギＳＩＴＨ−１抗体の希釈率は１／５００００となる。従って、上記の抗体希釈率は、うつ病患者血清をおよそ１０００倍希釈して用いる場合と同程度となる。【０２３９】
こうして調製した希釈血清１ｍＬに、ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１固定化磁性ビーズ、もしくはＴＭ２固定化磁性ビーズを各１０μｌずつ添加し、１時間室温で転倒混和し反応させた。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、磁性ビーズに固定化したＳＩＴＨ−１抗原に結合したウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体を検出するために、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を、また、各磁性ビーズに非特異結合しているヒトＩｇＧを検出するために、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を、それぞれ２％ＢＳＡを含むＴＢＳＴで５０００倍希釈してから混合し、このペルオキシダーゼ標識二次抗体混合溶液を各磁性ビーズに１０００μｌずつ添加し、１時間室温で転倒混和した。その後さらにＴＢＳＴで３回洗浄し、検出試薬１  ｓｔｅｐ  ＥＬＩＳＡ  ｕｌｔｒａＴＭＢ  （ＰＩＥＲＣＥ）を１００μｌ添加し、室温で１分間反応させた。２Ｍ硫酸を１００μｌ添加することで反応を停止させ、発色度合い（波長４５０ｎｍにおける吸光度、Ａ４５０）をプレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ社製）によって測定した。測定は処理区ごとに２回実施し平均値を求めた。【０２４０】
データ値としては、ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１固定化磁性ビーズにおいて、各血清希釈液（ＰＢＳ、ｐＴｒｃ９９Ａベクター産物発現大腸菌粗抽出液、ＴＭ２発現大腸菌粗抽出液）を用いた場合のＡ４５０の値から、各血清希釈液ごとにそれぞれ、ＴＭ２固定化磁性ビーズを用いた場合のＡ４５０の値を差し引いたものを用いた。結果を表３に示す。【０２４１】
【表３】
2010114029.tif 000004
【０２４２】
その結果、表３に示したように、ヒト血清中のＳＩＴＨ−１抗体のＡ４５０の値（Ｓ）は、血清希釈液としてＰＢＳを用いた場合が、最も高い値を示したが、同時にＳＩＴＨ−１抗体を含まない血清におけるＡ４５０値（Ｎ）も極めて高く、結果、ＰＢＳではＳ／Ｎ比（ウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体を加えたヒト血清における発色度合い／ウサギ抗ＳＩＴＨ−１抗体を加えない血清における発色度合い）は最も低かった。【０２４３】
一方、ｐＴｒｃ９９Ａベクター産物発現大腸菌粗抽出液、またはＴＭ２発現大腸菌粗抽出液を血清希釈液として用いた場合は、ＳＩＴＨ−１抗体を含まない血清におけるＡ４５０値がＰＢＳを用いた場合より遥かに低く、非特異結合を大きく抑制することができた。このことから、ＴＭ２融合ＳＩＴＨ−１固定化磁性ビーズを用いた場合、ｐＴｒｃ９９Ａベクター産物発現大腸菌粗抽出液、またはＴＭ２発現大腸菌粗抽出液をヒト血清に混合することで、非特異結合を減少させて抗ＳＩＴＨ−１抗体を検出できることが示された。
【配列表フリーテキスト】
【０２４４】
配列番号１：ＳＩＴＨ−１のアミノ酸配列。【０２４５】
配列番号２：ＳＩＴＨ−１  ＯＲＦの塩基配列。【０２４６】
配列番号３：ＳＩＴＨ―１  ｃＤＮＡの塩基配列。【０２４７】
配列番号４：タマビジン１の塩基配列。【０２４８】
配列番号５：タマビジン１のアミノ酸配列。【０２４９】
配列番号６：タマビジン２の塩基配列。【０２５０】
配列番号７：タマビジン２のアミノ酸配列。【０２５１】
配列番号８：ＢｉｏＥａｓｅ−ＳＩＴＨ−１融合タンパク質のアミノ酸配列【０２５２】
配列番号９：ＢｉｏＥａｓｅ−ＳＩＴＨ−１融合タンパク質をコードする塩基配列【０２５３】
配列番号１０：ＰＣＲ用プライマーＳＩＴＨ１ＮｔｅｒｍＧＷ−Ｆ【０２５４】
配列番号１１：ＰＣＲ用プライマーＳＩＴＨ１ＮｔｅｒｍＧＷ−Ｒ【０２５５】
配列番号１２：５×リンカー【０２５６】
配列番号１３：ＰＣＲ用プライマーＳＩＴＨ１Ｃ−５ｘｌｉｎｋ−ＴＭ２Ｎ−Ｆ【０２５７】
配列番号１４：ＰＣＲ用プライマーＳＩＴＨ１Ｃ−５ｘｌｉｎｋ−ＴＭ２Ｎ−Ｒ【０２５８】
配列番号１５：ＰＣＲ用プライマーＳＩＴＨ１Ｃ−  ５’  ＥｃｏＲＩ−Ｆ【０２５９】
配列番号１６：ＰＣＲ用プライマーＴＭ２ＣｔｅｒｍＢａｍ【０２６０】
配列番号１７：ＳＩＴＨ−１−ＴＭ２の塩基配列【０２６１】
配列番号１８：ＳＩＴＨ−１−ＴＭ２のアミノ酸配列
【図１】
2010114029.tif 000005
【図２】
2010114029.tif 000006
【図３】
2010114029.tif 000007
【図４】
2010114029.tif 000008
【図５】
2010114029.tif 000009
【図６】
2010114029.tif 000010
【図７】
2010114029.tif 000011
【図８】
2010114029.tif 000012
【図９】
2010114029.tif 000013
【図１０】
2010114029.tif 000014
【配列表】
2010114029000001.app
【国際調査報告】
2010114029.tif 000015
2010114029.tif 000016
2010114029.tif 000017
2010114029.tif 000018