(57)【要約】  本願では、微生物菌体や酵素等の生体触媒を用いて製造されたアミノ酸を単離する事無く、アミノ酸を含む反応物がｐＨ４以下になるように酸性化処理を行い、その後、塩基性条件下にアミノ基の保護反応を行ってＮ−保護アミノ酸を得る。これにより、生体触媒を用いて製造されたアミノ酸に対して、直接（アミノ酸を単離することなく）保護反応を行う場合であっても、当量〜小過剰量の保護試剤の使用で、定量的に効率よく高品質のＮ−保護アミノ酸を製造することが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体触媒を用いて製造されたアミノ酸を単離すること無く、アミノ酸を含む反応物がｐＨ４以下になるように酸性化処理を行い、その後、塩基性条件下にアミノ基の保護反応を行うことを特徴とする、Ｎ−保護アミノ酸の製造法。
【請求項２】
アミノ酸が、ｔｅｒｔ−ロイシンであることを特徴とする、請求項１記載のＮ−保護アミノ酸の製造法。
【請求項３】
アミノ基の保護に用いる保護試剤が、Ｎ−アルコキシカルボニル化剤、Ｎ−カルバモイル化剤、またはＮ−アシル化剤であることを特徴とする、請求項１または２記載のＮ−保護アミノ酸の製造法。
【請求項４】
アミノ基の保護に用いる保護試剤が、クロロギ酸メチル、クロロギ酸エチル、クロロギ酸ベンジル、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルのいずれかであることを特徴とする請求項３記載のＮ−保護アミノ酸の製造法。
【請求項５】
生体触媒が、アミノ酸脱水素酵素、アミノ基転移酵素、エステラーゼ、アシラーゼ、アミダーゼ、ヒダントイナーゼ、ニトリラーゼ、または該酵素の生産能を有する微生物の培養物である請求項１〜４のいずれかに記載のＮ−保護アミノ酸の製造法。
【請求項６】
生体触媒が、アミノ酸脱水素酵素、または該酵素の生産能を有する微生物の培養物である請求項５記載のＮ−保護アミノ酸の製造法。
【請求項７】
アミノ酸脱水素酵素が、ロイシン脱水素酵素、アラニン脱水素酵素、フェニルアラニン脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、バリン脱水素酵素、リシン脱水素酵素、またはアスパラギン酸脱水素酵素であることを特徴とする請求項６記載のＮ−保護アミノ酸の製造法。
【請求項８】
アミノ酸脱水素酵素がバシラス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）由来である事を特徴とする請求項７記載のＮ−保護アミノ酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品または農薬の中間体として有用なＮ−保護アミノ酸の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸は天然・非天然を問わず、医薬品や農薬の原料または中間体として汎用的に利用されている非常に有用な化合物である。【０００３】
これらアミノ酸を原料または中間体として利用する場合、所望の反応に供する前に、当該反応での副反応を抑えるため、分子内に存在するカルボキシル基または／及びアミノ基に保護基を導入する。【０００４】
この保護基導入においては、アミノ基の保護の場合、通常、塩基性条件下で、保護試剤を理論当量〜小過剰量用いることにより、速やか、かつ、ほぼ定量的にＮ−保護アミノ酸を得ることが可能である（非特許文献１、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−１３１５８９公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】日本化学会編  第５版実験科学講座１６、２２１−２２６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
高い光学純度の光学活性アミノ酸が得られる等の理由から、しばしば、生体触媒を用いてアミノ酸の製造が行われる。生体触媒を用いるアミノ酸の製造は通常水系で行われるが、水系で反応を行った場合、水への溶解性が高いアミノ酸と共存する水溶性の無機塩の分離、アミノ酸と菌体・蛋白成分の分離という煩雑な操作が必要となる等の理由から、その単離精製は非効率で困難である。また、これらの単離精製で回収できないアミノ酸がコスト面に不利を招くことは言うまでもない。従って、アミノ酸の保護体を得ることを目的とした場合、生産効率や費用等の観点から、反応液をそのまま用いてアミノ基の保護を行うことが望ましい。【０００８】
しかし、発明者らの検討によれば、生体触媒を用いて製造されたアミノ酸の場合、従来の方法では、当量〜小過剰量の保護試剤を使用するだけでは、定量的にＮ−保護アミノ酸が製造できない場合があることがわかった。特に、得られたアミノ酸を単離精製することなく、直接そのアミノ基の保護を行う際にこの傾向は強くなり、意外にも、過剰の保護試剤を存在させたとしても、当該保護反応が進行しにくくなることがわかった。これらは商業的な規模での生産において、製造効率の低下、高コスト化を招き、有用なアミノ酸保護体を安価に市場に供給する事を阻害するものと考えられる。【０００９】
本発明は、上記に鑑み、効率よく高品質のＮ−保護アミノ酸を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、この技術課題について鋭意検討した結果、生体触媒を用いて製造されたアミノ酸から効率よくＮ−保護アミノ酸を製造する為には、保護反応の前に酸性化処理を経る事が非常に有効であることを見出した。【００１１】
すなわち、本発明は、生体触媒を用いて製造されたアミノ酸を単離する事無く、アミノ酸を含む反応物がｐＨ４以下になるように酸性化処理を行い、その後、塩基性条件下にアミノ基の保護反応を行うＮ−保護アミノ酸の製造法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明にかかる方法によれば、生体触媒を用いて製造されたアミノ酸に対して、直接（アミノ酸を単離することなく）保護反応を行う場合であっても、当量〜小過剰量の保護試剤の使用で、定量的に効率よく高品質のＮ−保護アミノ酸を製造することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
まず、本発明で使用するアミノ酸について説明する。
【００１４】
本発明において使用できるアミノ酸としては、特に制約なく、具体的には、グリシン、アラニン、３−クロロアラニン、β−アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、ノルロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、フェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、チロシン、ジヨードチロシン、トレオニン、アロトレオニン、セリン、ホモセリン、イソセリン、プロリン、ヒドロキシプロリン、３，４−デヒドロプロリン、トリプトファン、チロキシン、メチオニン、ホモメチオニン、シスチン、ホモシスチン、α−アミノ酪酸、β−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、アスパラギン酸、アスパラギン酸−β−シクロヘキシルエステル、アスパラギン酸−β−メチルエステル、アスパラギン酸−β−イソプロピルエステル、アスパラギン酸−β−ベンジルエステル、グルタミン酸、グルタミン酸−γ−シクロヘキシルエステル、グルタミン酸−γ−メチルエステル、グルタミン酸−γ−イソプロピルエステル、グルタミン酸−γ−ベンジルエステル、リジン、ヒドロキシリジン、オルニチン、ヒドロキシオルニチン、アルギニン、ヒスチジン、アンチカプシン、アダマンチルグリシン、タウリン、γ−ホルミル−Ｎ−メチルノルバリン、Ｎg−トシルアルギニン、Ｏ−ベンジルセリン、Ｏ−ベンジルトレオニン、Ｎin−ホルミルトリプトファン、２−（２−アミノ−４−チアゾリル）−２−ヒドロキシイミノ酢酸、２−（２−アミノ−４−チアゾリル）−２−メトキシイミノ酢酸、２−（２−アミノ−４−チアゾリル）−２−グリオキシ酢酸、２−（２−アミノ−４−チアゾリル）−２−ペンテン酸、３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸、３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸、フェニルグリシン、４−ヒドロキシフェニルグリシン、４−クロロフェニルグリシン、４−クロロフェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、３−（１−ナフチル）アラニン、３−（２−ナフチル）アラニン、クレアチン、アゼチジン−２−カルボン酸、オルシルアラニン、エルゴチオネイン、ランチオニン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン等を挙げることができる。
【００１５】
グリシンを除くアミノ酸には、光学異性体や立体異性体が存在するが、本発明はその立体を問わずに使用することができ、言うまでもなく、それらの混合物や、ラセミ体であっても良い。
【００１６】
また、これらアミノ酸のカルボキシル基については他の官能基に変換されていても良く、具体的には、アミド体やエステル体に変換されていても好適に使用することが出来る。
【００１７】
本発明で使用する生体触媒を用いたアミノ酸の製造は、たとえば以下の方法で実施することが出来るが、これらに特に限定されるものではない。
１）対応するケト酸に、アミノ酸脱水素酵素、または該酵素の生産能を有する微生物の培養物を作用させ、Ｄ体またはＬ体選択的にアミノ化する。本反応に使用されるアミノ酸脱水素酵素としては、例えば、ロイシン脱水素酵素、アラニン脱水素酵素、フェニルアラニン脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、バリン脱水素酵素、リシン脱水素酵素、アスパラギン酸脱水素酵素などが挙げられる。
２）対応するケト酸に、アミノ基転移酵素、または該酵素の生産能を有する微生物の培養物を作用させ、Ｄ体またはＬ体選択的にアミノ化する。
３）ＤＬ−アミノ酸アルキルエステルに、エステラーゼまたは該酵素の生産能を有する微生物の培養物を作用させ、Ｄ体またはＬ体を選択的に加水分解する。
４）Ｌ−Ｎ−アシルアミノ酸にアシラーゼまたは該酵素の生産能を有する微生物の培養物を作用させ、Ｄ体またはＬ体を選択的に加水分解する。
５）ＤＬ−アミノ酸アミドにアミダーゼ、または該酵素の生産能を有する微生物の培養物を作用させ、Ｄ体またはＬ体を選択的に加水分解する。
６）５−置換ヒダントインにヒダントイナーゼ、または該酵素の生産能を有する微生物の培養物あるいはその処理物を作用させ、Ｄ体またはＬ体を選択的に加水分解する。
７）α−アミノニトリル化合物にニトリラーゼ、または該酵素の生産能を有する微生物培養物を作用させ、Ｄ体またはＬ体を選択的に加水分解する。
８）ＤＬ−アミノ酸に、Ｄ体又はＬ体を選択的に分解する微生物の培養物を作用させ、一方の立体のアミノ酸を分解する。
９）ＤＬ−アミノ酸にＤまたはＬ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、および補酵素再生能を有する酵素、または該酵素の生産能を有する微生物の培養物を作用させて、理論収率１００％にてＤＬ−アミノ酸をＤ体またはＬ体のアミノ酸へと変換する。
【００１８】
尚、本発明で言う「生体触媒」とは、アミノ酸の製造に利用される、上述のアミノ酸脱水素酵素等の酵素や、当該酵素の産生能を有する微生物の培養物またはその処理物を意味する。ここで、「微生物の培養物」とは、菌体を含む培養液或いは培養菌体を意味し、「その処理物」とは、物理的手法、酵素などで破砕して得た菌体の破砕物、破砕物から遠心分離などで不溶成分を除去して得た粗抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体等を意味する。
【００１９】
「アミノ酸の製造に利用される酵素」としては、例えば、アミノ酸脱水素酵素、アミノ基転移酵素、エステラーゼ、アシラーゼ、アミダーゼ、ヒダントイナーゼ、ニトリラーゼが挙げられる。
【００２０】
アミノ酸脱水素酵素としては、例えば、ロイシン脱水素酵素、アラニン脱水素酵素、フェニルアラニン脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、バリン脱水素酵素、リシン脱水素酵素、アスパラギン酸脱水素酵素が挙げられる。
【００２１】
具体的には、製造するアミノ酸がバリン、ロイシン、イソロイシン、ノルバリン、ノルロイシンやｔｅｒｔ−ロイシンなどの脂肪族アミノ酸の場合、アミノ酸脱水素酵素としては、ロイシン脱水素酵素、バリン脱水素酵素が好適である。製造するアミノ酸がフェニルアラニン、チロシンやホモフェニルアラニン、アダマンチルグリシンなどの芳香族アミノ酸の場合、使用するアミノ酸脱水素酵素としてはフェニルアラニン脱水素酵素が好適である。製造するアミノ酸がグルタミン酸、６−ヒドロキシノルロイシンなどの場合、グルタミン酸脱水素酵素が好適である。製造するアミノ酸がα−アミノ酪酸、α−アミノ吉草酸、セリン、グリシン、３−クロロアラニン、３−フルオロアラニンなどの場合、アラニン脱水素酵素が好適である。
【００２２】
このうち、ロイシン脱水素酵素としては、当該酵素活性を有するものであれば、いずれも利用できるが、例えば、バシラス属（Bacillus）、サーモアクチノマイセス属（Thermoactinomyces）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）微生物由来の酵素が挙げられ、好ましくは、バシラス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バシラス・セレウス（Bacillus celeus）、バシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）、サーモアクチノマイセス・インターメディス（Thermoactinomyces intermedis）、クロストリジウム・サーモセチカム（Clostridium thermoaceticum）、さらに好ましくはバシラス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）ＮＢＲＣ３３４１株由来の酵素が挙げられる。
【００２３】
フェニルアラニン脱水素酵素としては、当該酵素活性を有するものであれば、いずれも利用できるが、例えば、バシルス属（Bacillus）、スポロサルシナ属（Sporosarcina）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、サーモアクチノマイセス属（Thermoactinomyces）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、ノカルディア属（Nocardia）、ミクロバクテリウム属（Microbacterium）微生物由来の酵素が挙げられる。好ましくは、バシラス・バディウス（Bacillus badius）、バシラス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）、スポロサルシナ・ウレアエ（Sporosarcina ureae）、ロドコッカス・マリス（Rhodococcus maris）、サーモアクチノマイセス・インターメディウス（Thermoactinomyces intermedius）、さらに好ましくは、バシラス・バディウス（Bacillus badius）ＩＡＭ１１０５９株由来の酵素が挙げられる。
【００２４】
他の脱水素酵素等についても、所望の酵素活性を有するものであればいずれも使用することができる。
【００２５】
なお、上記の各微生物は、特許微生物寄託機関やその他研究機関から入手可能である。例えば、ＮＢＲＣ番号で特定される微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門、ＩＡＭ番号で特定される微生物は、東京大学分子細胞生物学研究所細胞機能情報研究センターより入手可能である。
【００２６】
上記「アミノ酸の製造に利用される酵素の産生能を有する微生物」としては、野生株または変異株のいずれでもあり得る。あるいは、遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導された微生物もあり得る。
【００２７】
遺伝子操作された微生物としては、例えば、上記アミノ酸の製造に利用される酵素をコードするＤＮＡを有するベクターで形質転換された形質転換体が挙げられる。
【００２８】
アミノ酸の製造に利用される酵素がアミノ酸脱水素酵素の場合、該酵素とともに、該酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素の産生能を有する微生物が好ましく、例えば、アミノ酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ、および該酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素をコードするＤＮＡを有するベクターで形質転換された形質転換体が挙げられ、好ましくは、補酵素再生する能力を有する酵素がギ酸脱水素酵素、またはグルコース脱水素酵素である形質転換体が挙げられ、さらに好ましくは、前記ギ酸脱水素酵素がチオバチラス  エスピー（Thiobacillus sp.）由来である上記形質転換体、前記グルコース脱水素酵素がバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来である上記形質転換体が挙げられる。ベクターを導入する宿主としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞が挙げられ、形質転換の容易さや酵素の発現効率の観点からは細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。
【００２９】
例えば、アミノ酸の製造に利用される酵素がロイシン脱水素酵素の場合、生体触媒として使用される微生物としては、ロイシン脱水素酵素をコードするＤＮＡを有するベクターで形質転換された形質転換体、好ましくは、ロイシン脱水素酵素をコードするＤＮＡと上記ギ酸脱水素酵素をコードするＤＮＡを有するベクターで形質転換された形質転換体が挙げられ、例えば、ロイシン脱水素酵素として、バシラス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）ＮＢＲＣ３３４１株由来の酵素を使用したＷＯ２００７／０１５５１１号記載のエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴＬＢ）が挙げられる。
【００３０】
上記酵素や微生物の培養物を、ケト酸等に作用させる際は、例えば、以下のようにして行うことができる。ただし、以下の方法に限定されるものではない。
【００３１】
水などの適当な溶媒中に、対応するケト酸、ギ酸アンモニウムや硫酸アンモニウムなどのギ酸およびアンモニアを含む無機塩類、ＮＡＤ＋などの補酵素、および上記アミノ酸脱水素酵素およびギ酸脱水素酵素の生産能を有する上記微生物の培養液またはその培養液から取得した培養菌体を添加して、ｐＨ調整下、攪拌して反応する。
【００３２】
この反応は１０〜７０℃、好ましくは２０〜６０℃の温度で行われ、反応液のｐＨは４〜１２、好ましくは６〜１０に維持する。ケト酸は０．１％〜６０％（ｗ／ｗ）、好ましくは１％〜３０％（ｗ／ｗ）の仕込み濃度で添加するとよい。また、ケト酸は一括添加してもよいし、分割添加してもよい。
【００３３】
上記のようにして製造されたアミノ酸を含む反応物は、通常、水溶液の形態で得られるが、有機溶剤が共存していてもよく、更には、無機塩が共存していてもよい。また、本発明にかかる方法おいては、得られたアミノ酸を単離することなく、アミノ酸を含む溶液やスラリーの形態で保護反応を行えばよいが、直接保護反応に供せずとも、不溶物の濾過等の精製を目的とした操作を経てもかまわない。具体的には、経由可能な操作としては、蛋白質等不溶物の濾過、溶媒留去、活性炭処理、遠心沈降による菌体分離、イオン交換樹脂による無機塩類の除去などが挙げられる。尚、これらの操作は必ずしも酸性化処理の前に行う必要は無く、酸性化処理の後でも好適に実施でき、更に複数の処理を組み合わせることも可能である。
【００３４】
次に酸性化処理について説明する。この処理によれば、Ｎ−保護アミノ酸の製造効率を高めることが可能である。
【００３５】
酸性化処理で使用できる酸としては、特に制限は無いが、通常は、例えば、塩酸、硫酸、硝酸等の鉱酸や、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の有機酸を使用する。これらの酸は、単独で使用しても混合して使用しても良い。
【００３６】
酸の添加形態については特に問わず、酸のみを添加しても、酸を水及び／または有機溶剤で希釈して用いてもよい。酸を有機溶剤で希釈して用いる場合、該有機溶剤は、酸と反応しないものであれば、特に制限はない。具体的には、メタノール、エタノール、２−プロパノール、トルエン等が使用可能な有機溶剤として挙げられる。
【００３７】
なお、これらの酸は、局部的に強酸性にならないように、攪拌等に注意して混合するのが好ましい。
【００３８】
本発明では、これら酸の添加により、溶液ｐＨを４以下、好ましくは３以下、さらに好ましくは２以下に調整する。これにより、理論当量〜小過剰量の保護試剤の使用においても、Ｎ−保護アミノ酸を効率よく得ることが可能になる。
【００３９】
溶液のｐＨを保持する時間は、好ましくは５分以上、更に好ましくは３０分以上である。言うまでもなく、長時間の保持は製造効率を損なうことから、最適な保持時間を容易な実験によって設定すればよい。
【００４０】
一連の操作温度は特に規定されないが、簡便な操作性を得るために、通常は０〜５０℃の範囲内に設定する。
【００４１】
このような酸性化処理を経たアミノ酸は、理論当量〜小過剰量の保護試剤を用いることで、速やか、かつ、ほぼ定量的にアミノ基の保護を行うことが出来る。
【００４２】
アミノ基の保護に用いる保護試剤としては、特に制限はなく、公知のものが使用でき、例えばＮ−アルコキシカルボニル化剤、Ｎ−カルバモイル化剤、Ｎ−アシル化剤を用いることができる。より具体的には、ハロギ酸アルキル、二炭酸ジアルキル、アルキルイソシアネート、無水カルボン酸、アルキルカルボニルハライドが好適に使用され、中でも汎用性の観点からはクロロギ酸メチル、クロロギ酸エチル、クロロギ酸ベンジル、二炭酸ジメチル、二炭酸ジエチル、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルイソシアネート、イソプロピルイソシアネート、フェニルイソシアネート、塩化ベンゾイル、塩化アセチル、無水酢酸が特に好適に使用される。
【００４３】
保護反応条件は公知の条件が適用できる。最適な条件は、アミノ酸と用いる保護試剤の組み合わせによって異なる為、一概には規定できないが、通常は、塩基性条件下に行い、反応ｐＨについては８〜１４、好ましくは９〜１４であり、反応温度については、−５〜９０℃、好ましくは０〜５０℃である。
【００４４】
また、保護試剤は、通常０．９５当量以上１．２０当量以下になるようにし、好ましくは０．９８当量以上１．１０当量以下、更に好ましくは０．９９当量以上１．０５当量以下である。
【００４５】
以上のようにして、生体触媒を用いて製造されたアミノ酸から効率よくＮ−保護アミノ酸を製造することが可能である。
【００４６】
なお、このような保護反応によって製造されたＮ−保護アミノ酸は、その後、晶析、分別蒸留、カラムクロマトグラフィー等の一般的な方法によって精製・単離することが出来る。
【実施例】
【００４７】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない
。【００４８】
（参考例１）ロイシン脱水素酵素活性を有する微生物の培養菌体を用いたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの製造
バクト・トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）、バクト・イーストエキス１．０％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ０．５％（ｗ／ｖ）の組成からなる２ｘＹＴ培地（ｐＨ７）５０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。【００４９】
ＷＯ２００７／０１５５１１号に記載の方法に従って得たロイシン脱水素酵素およびギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴＬＢ）を植菌後、３７℃で３０時間、振とうして好気的に培養し、ロイシン脱水素酵素およびギ酸脱水素酵素活性を有する微生物の培養液を得た。培養液から遠心分離により菌体を集菌し、培養液上清にて菌体濃度が培養液の２０倍になるように懸濁した。１Ｌ容のセパラブルフラスコに、３，３−ジメチル−２−オキソ−ブタン酸（ＤＭＯＢ）４０ｇを入れ、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨを７．３に調整後、ギ酸アンモニウム１９．４ｇ、硫酸アンモニウム８．２ｇ、硫酸亜鉛・７水和物４０ｍｇ、ＮＡＤ６１ｍｇ、イオン交換水２５６ｇおよびギ酸脱水素酵素活性３２００ｕ分の上記菌体懸濁液を添加し、攪拌条件下、５５重量％硫酸にてｐＨを７．３にコントロールしながら３３℃にて、１９時間反応を行った。生成したＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの光学純度、含量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析した結果、光学純度１００％ｅ．ｅ．のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン３８．８ｇを含有する菌体反応液が得られた。更に、得られた菌体反応液の一部から、遠心分離により菌体を除去し、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを含む水溶液を得た。参考までに、蛋白含量は０．０〜１．１ｍｇ／Ｌであった。【００５０】
ＨＰＬＣ分析は、カラムとして、ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、住化分析センター社製）を用い、移動層としては、２ｍＭ硫酸銅水溶液とメタノールを容量比で９５：５に混合した溶液を用い、流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎとし、カラム温度は４０℃とし、検出は２１０ｎｍにて分析を行った。【００５１】
（実施例１）
参考例に従って得られたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン２．４８ｇ（１８．４ｍｍｏｌ）を含む菌体反応液を、濃塩酸でｐＨ４．０に調整した。２時間攪拌した後、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．０とし、遠心沈降により菌体成分を分離した。【００５２】
次に、得られた上澄み液を、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０．６に調整した。その後、４０℃以下を維持しつつ減圧濃縮し、溶液量を３０．１ｇに調整した。【００５３】
この溶液に対して、氷冷攪拌下、クロロギ酸メチル１．７８ｇ（１８．８ｍｍｏｌ、１．０２当量）をゆっくりと加えた。この時、クロロギ酸メチルを添加するに従いｐＨが低下したが、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を並行して添加することにより、溶液のｐＨは９．５〜１０．５に維持した。クロロギ酸メチルの添加終了後、１時間撹拌した後、ＨＰＬＣ分析をした結果、変換率は９８％であった。【００５４】
なお、変換率は、以下の計算式を用いて計算した。
変換率（％）＝（生成したＮ−保護−アミノ酸のピーク面積値）／（アミノ酸のピーク面積値＋生成したＮ−保護−アミノ酸のピーク面積値）×１００【００５５】
ＨＰＬＣ分析は、カラムとして、ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫＳＣＸ（２５０ｍｍ  Ｘ  ４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．）を用い、移動相としては、リン酸緩衝液（ｐＨ＝３．３）とアセトニトリルを容量比で９５：５に混合した溶液を用い、流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎとし、カラム温度は、３５℃とし、検出器として、示差屈折率計を用いて、分析を行った。【００５６】
以下の実施例においても同様の計算を行った。【００５７】
（実施例２）
参考例に従って得られたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン３．０１ｇ（２３．０ｍｍｏｌ）を含む水溶液を、濃塩酸でｐＨ２．０に調整した後、２時間保持した。次に、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０．６に調整した後、４０℃以下を維持しつつ減圧濃縮し、溶液量を２９．７ｇに調整した。【００５８】
この溶液に対して、氷冷攪拌下、クロロギ酸メチル２．１９ｇ（２３．１ｍｍｏｌ、１．０１当量）をゆっくりと加えた。この時、クロロギ酸メチルを添加するに従いｐＨが低下したが、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を並行して添加することにより、溶液のｐＨは９．８〜１２．９に維持した。クロロギ酸メチルの添加終了後、２時間撹拌した後、ＨＰＬＣ分析をした結果、変換率は９９％であった。【００５９】
（実施例３）
参考例に従って得られたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン１．９６ｇ（１４．９ｍｍｏｌ）を含む菌体反応液を、濃塩酸でｐＨ４．０に調整した。１時間攪拌した後、遠心沈降により菌体成分を分離した。【００６０】
次に、得られた上澄み液を、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０．６に調整した。その後、４０℃以下を維持しつつ減圧濃縮し、溶液量を２０．１ｇに調整した。【００６１】
この溶液に対して、氷冷攪拌下、クロロギ酸エチル１．６３ｇ（１５．０ｍｍｏｌ、１．０１当量）をゆっくりと加えた。この時、クロロギ酸エチルを添加するに従いｐＨが低下したが、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を並行して添加することにより、溶液のｐＨは８．９〜１２．８に維持した。クロロギ酸エチルの添加終了後、２時間撹拌した後、ＨＰＬＣ分析をした結果、変換率は９６％であった。【００６２】
（実施例４）
参考例に従って得られたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン２．０５ｇ（１５．６ｍｍｏｌ）を含む水溶液を、濃硫酸でｐＨ２．０に調整した後、３０分保持した。次に、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０．７に調整した後、４０℃以下を維持しつつ減圧濃縮し、溶液量を１９．８ｇに調整した。【００６３】
この溶液に対して、攪拌下、２５℃以下を維持しつつ、クロロギ酸ベンジル２．７０ｇ（１５．８ｍｍｏｌ、１．００当量）をゆっくりと加えた。この時、クロロギ酸ベンジルを添加するに従いｐＨが低下したが、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を並行して添加することにより、溶液のｐＨは９．９〜１２．５に維持した。クロロギ酸ベンジルの添加終了後、２時間撹拌した後、ＨＰＬＣ分析をした結果、変換率は９７％であった。【００６４】
（実施例５）
参考例に従って得られたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン２．０３ｇ（１５．５ｍｍｏｌ）を含む水溶液を、濃硫酸でｐＨ２．０に調整した後、３０分保持した。次に、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０．７に調整した後、４０℃以下を維持しつつ減圧濃縮し、溶液量を１９．６ｇに調整した。【００６５】
この溶液に対して、攪拌下、室温で、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル３．４１ｇ（１５．６ｍｍｏｌ、１．００当量）をゆっくりと加えた。この時、ジ−ｔｅｒｔ−ジカーボネートを添加するに従いｐＨが低下したが、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を並行して添加することにより、溶液のｐＨは９．５〜１０．５に維持した。二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルの添加終了後、２．５時間撹拌した後、ＨＰＬＣ分析をした結果、変換率は９９％であった。【００６６】
（比較例１）
参考例に従って得られたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン３．０１ｇ（２３．０ｍｍｏｌ）を含む水溶液を、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０．６に調整した後、４０℃以下を維持しつつ減圧濃縮し、溶液量を３０．３ｇに調整した。【００６７】
この溶液に対して、氷冷攪拌下、クロロギ酸メチル２．２０ｇ（２３．３ｍｍｏｌ、１．０１当量）をゆっくりと加えた。この時、クロロギ酸メチルを添加するに従いｐＨが低下したが、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を並行して添加することにより、溶液のｐＨは１０．０〜１３．０に維持した。クロロギ酸メチルの添加終了後、２時間撹拌した後、ＨＰＬＣ分析をした結果、変換率は８６％であった。【００６８】
（比較例２）
参考例に従って得られたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン３．０１ｇ（２３．０ｍｍｏｌ）を含む水溶液を、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０．６に調整した後、４０℃以下を維持しつつ減圧濃縮し、溶液量を３０．３ｇに調整した。【００６９】
この溶液に対して、氷冷攪拌下、クロロギ酸メチル２．２０ｇ（２３．３ｍｍｏｌ、１．０１当量）をゆっくりと加えた。この時、クロロギ酸メチルを添加するに従いｐＨが低下したが、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を並行して添加することにより、溶液のｐＨは１０．０〜１３．０に維持した。クロロギ酸メチルの添加終了後、２時間撹拌した後、ＨＰＬＣ分析をした結果、変換率は８６％であった。【００７０】
この反応液のｐＨを、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を並行添加してｐＨ１０．０〜１３．０に維持しつつ、クロロギ酸メチル０．５９ｇを更に追加した（総使用量２．７９ｇ、計２９．５ｍｍｏｌ、１．２８当量）。添加終了後、２時間攪拌し、ＨＰＬＣ分析した結果、変換率は９０％であった。【００７１】
さらに同様に、クロロギ酸メチル１．２８ｇを追加した（総使用量４．０７ｇ、計４３．１ｍｍｏｌ、１．８７当量）。添加終了後、２時間攪拌した後、ＨＰＬＣ分析した結果、変換率は９４％であった。【００７２】
この結果から、酸性化処理を行わない場合、過剰の保護試剤を存在させたとしても、保護反応が十分進行しないことがわかる。【００７３】
（比較例３）
参考例に従って得られたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン２．０５ｇ（１５．６ｍｍｏｌ）を含む水溶液を、濃硫酸でｐＨ５．１に調整した後、３０分保持した。次に、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０．６に調整した後、４０℃以下に維持しつつ減圧濃縮し、溶液量を１９．５ｇに調整した。【００７４】
この溶液に対して、氷冷攪拌下、クロロギ酸メチル１．４９ｇ（１５．８ｍｍｏｌ、１．０１当量）をゆっくりと加えた。この時、クロロギ酸メチルを添加するに従いｐＨが低下したが、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を並行して添加することにより、溶液のｐＨは９．９〜１１．４に維持した。クロロギ酸メチルの添加終了後、２時間撹拌した後、
ＨＰＬＣ分析をした結果、変換率は８９％であった。【００７５】
（比較例４）
参考例に従って得られたＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン１．５２ｇ（１１．６ｍｍｏｌ）を含む水溶液を、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１０．６に調整した後、４０℃以下に維持しつつ減圧濃縮し、溶液量を１５．７ｇに調整した。【００７６】
この溶液に対して、攪拌下、室温で、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル２．６３ｇ（１２．１ｍｍｏｌ、１．０４当量）をゆっくりと加えた。この時、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルを添加するに従いｐＨが低下したが、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を並行して添加することにより、溶液のｐＨは９．６〜１０．５に維持した。二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルの添加終了後、２．５時間撹拌した後、ＨＰＬＣ分析をした結果、変換率は９２％であった。
【国際調査報告】
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