(57)【要約】  本発明は、微生物、好適にはビフィドバクテリウムでポリペプチドを効率的に分泌発現する方法およびその手段を提供する。具体的には、本発明は、（i）ビフィドバクテリウム属細菌由来のcbaH遺伝子のプロモーター、ビフィドバクテリウム属細菌由来のrplJ遺伝子のプロモーターおよびビフィドバクテリウム・ブレーベ由来のhup遺伝子のプロモーターからなる群より選択されるプロモーター、（ii）ビフィドバクテリウム属細菌由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列およびビフィドバクテリウム属細菌由来のamyB遺伝子産物のシグナル配列からなる群より選択されるシグナル配列をコードするDNA、ならびに（iii）ポリペプチドをコードするDNAまたは該DNAを挿入するためのクローニング部位、を含むことを特徴とする発現カセットを提供する。
2010126073.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（i）、（ii）および（iii）を含むことを特徴とする発現カセット。
（i）ビフィドバクテリウム属細菌由来のcbaH遺伝子のプロモーター、ビフィドバクテリウム属細菌由来のrplJ遺伝子のプロモーターおよびビフィドバクテリウム属細菌由来のhup遺伝子のプロモーターからなる群より選択されるプロモーター、
（ii）ビフィドバクテリウム属細菌由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列およびビフィドバクテリウム属細菌由来のamyB遺伝子産物のシグナル配列からなる群より選択されるシグナル配列をコードするDNA、
（iii）ポリペプチドをコードするDNA、または該DNAを挿入するためのクローニング部位
【請求項２】
（iii）にポリペプチドをコードするDNAが挿入された、請求項１記載の発現カセット。
【請求項３】
（ii）と（iii）との間に、ビフィドバクテリウム属細菌由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列に続く１〜20個の連続するアミノ酸をコードするDNAが連結されている、請求項１または２記載の発現カセット。
【請求項４】
（ii）と（iii）との間に、配列番号９に示されるアミノ酸配列をコードするDNAが連結されている、請求項１または２記載の発現カセット。
【請求項５】
以下の（i）、（ii）、（iii）および（iv）を含むことを特徴とする発現カセット。
（i）ビフィドバクテリウム属細菌由来の遺伝子のプロモーター、
（ii）ビフィドバクテリウム属細菌由来の遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNA、
（iii）ビフィドバクテリウム属細菌由来の遺伝子産物のシグナル配列に続く１〜20個の連続するアミノ酸をコードするDNA、
（iv）ポリペプチドをコードするDNA、または該DNAを挿入するためのクローニング部位
【請求項６】
（iv）にポリペプチドをコードするDNAが挿入された、請求項５記載の発現カセット。
【請求項７】
プロモーターが、ビフィドバクテリウム属細菌由来のcbaH遺伝子のプロモーター、ビフィドバクテリウム属細菌由来のrplJ遺伝子のプロモーターおよびビフィドバクテリウム属細菌由来のhup遺伝子のプロモーターからなる群より選択される、請求項５または６記載の発現カセット。
【請求項８】
ポリペプチドが、インターロイキン-10（IL-10）、インターロイキン-2（IL-2）、TRAIL/Apo2-L、I型インターフェロン、インターロイキン-4（IL-4）拮抗変異体、およびR-spondinsからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の発現カセット。
【請求項９】
ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、IL-10をコードするDNAとを含有する、請求項８記載の発現カセット。
【請求項１０】
ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターまたはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のhup遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列に続く１〜20個の連続するアミノ酸をコードするDNAまたはLEISSTCDAをコードするDNAと、IL-10をコードするDNAとを含有する、請求項８記載の発現カセット。
【請求項１１】
ビフィドバクテリウム・ブレーベ由来のhup遺伝子プロモーターまたはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、IL-2をコードするDNAとを含有する、請求項８記載の発現カセット。
【請求項１２】
ビフィドバクテリウム・ブレーベ由来のhup遺伝子プロモーターまたはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列に続く１〜20個の連続するアミノ酸をコードするDNAと、IL-2をコードするDNAとを含有する、請求項８記載の発現カセット。
【請求項１３】
ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のrplJ遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、IL-4拮抗変異体をコードするDNAとを含有する、請求項８記載の発現カセット。
【請求項１４】
ビフィドバクテリウム・ブレーベ由来のhup遺伝子プロモーターまたはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のhup遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス由来のamyB遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、TRAIL/Apo2-LをコードするDNAとを含有する、請求項８記載の発現カセット。
【請求項１５】
ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のhup遺伝子プロモーターまたはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、I型インターフェロンをコードするDNAとを含有する、請求項８記載の発現カセット。
【請求項１６】
ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のhup遺伝子プロモーターまたはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列に続く１〜20個の連続するアミノ酸をコードするDNAまたはLEISSTCDAをコードするDNAと、I型インターフェロンをコードするDNAとを含有する、請求項８記載の発現カセット。
【請求項１７】
ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、R-spondinsをコードするDNAとを含有する、請求項８記載の発現カセット。
【請求項１８】
ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列に続く１〜20個の連続するアミノ酸をコードするDNAまたはLEISSTCDAをコードするDNAと、R-spondinsをコードするDNAとを含有する、請求項８記載の発現カセット。
【請求項１９】
ビフィドバクテリウム属細菌においてポリペプチドを分泌発現させるために使用される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の発現カセット。
【請求項２０】
請求項２〜４および６〜１９のいずれか１項に記載の発現カセットを含有する発現ベクター。
【請求項２１】
請求項２〜４および６〜１９のいずれか１項に記載の発現カセットまたは請求項２０記載の発現ベクターを含む組換え微生物。
【請求項２２】
微生物がビフィドバクテリウム属細菌である、請求項２１記載の微生物。
【請求項２３】
請求項２１または２２記載の微生物を含む医薬組成物。
【請求項２４】
疾患または障害を治療するための、請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２５】
疾患または障害が炎症性腸疾患または腫瘍疾患である、請求項２４記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項２〜４および６〜１９のいずれか１項に記載の発現カセットまたは請求項２０記載の発現ベクターを含む組換え微生物を培養し、得られる培養物からポリペプチドを採取することを特徴とするポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドの微生物での分泌発現に関する。特に、本発明は、疾患または障害を治療または予防する目的で、ポリペプチドを粘膜および／または腫瘍組織へデリバリーするために用いるビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）等のグラム陽性細菌における、ポリペプチドの分泌発現のための手段および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、さまざまな組換え微生物について、疾患の治療または予防の目的に、それらの有用性が検討されてきた（非特許文献１）。例えば、有用ポリペプチドの粘膜へのデリバリーを目的として、ラクトコッカス（Lactococcus）、ラクトバシラス（Lactobacillus）やビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）などを用いた方法が検討されてきた（非特許文献２、３、４）。また、腫瘍治療を目的として、プロドラッグ変換酵素を発現するクロストリジウム（Clostridium）、サルモネラ（Salmonella）やビフィドバクテリウムを用いた方法などが、検討されてきた（非特許文献５、６、７）。さらには、大腸菌（Escherichia coli）を用いたRNAiのデリバリーも検討されている（非特許文献８）。組換え微生物を用いる方法は、有効な核酸やポリペプチドを全身投与する場合の毒性や血中半減期の問題を克服し、効果的に核酸やポリペプチドを送達するための手段となり得る。さらに、製造の過程において、精製など大きな費用がかかる工程を省略することができ、組換えタンパク質製品と比べて容易かつ／または安価に有用性を提供し得る。【０００３】
これらの宿主微生物の中で、ビフィドバクテリウムは、プロバイオティクスにも用いられる病原性を持たない常在菌で、偏性嫌気性菌であり、粘膜と腫瘍の両方へのデリバリーに利用できるため、安全性、生物学的封じ込め、および汎用性の観点から、優れた特性を持つと考えられる。【０００４】
さらに、ビフィドバクテリウムは、消化管耐性のための改良が人工的になされていない非共生細菌であるラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）と比べ、腸管での持続性が圧倒的に優れ、疾患の治療や予防にとって好ましい体内動態を示す可能性が示唆されている（非特許文献９）。したがって、炎症性腸疾患治療などのために消化管粘膜へ有用なポリペプチドをデリバリーする目的において、組換えL. lactisに比べてビフィドバクテリウムの方が優れている可能性が考えられる。【０００５】
ビフィドバクテリウムは、静脈内に投与した場合、非常に高い選択性をもって腫瘍でのみ生残増殖する（非特許文献１０）。これは、ひとつには腫瘍が低酸素領域を有するためと考えられている。この性質を利用して、腫瘍治療を目的として、プロドラッグである5-フルオロシトシン（5-FC）を5-フルオロウラシル（5-FU）に転換できる大腸菌シトシンデアミナーゼ（CD）を、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）のhup遺伝子のプロモーターを使用して、特に分泌することなく産出するビフィドバクテリウムが作製され、この菌を用いた腫瘍治療効果の検討が行われている（特許文献１）。この方法に関しては、酵素CDによってビフィドバクテリウム自らが産生する5-FUが、腫瘍細胞のみならず菌にも作用するため、菌が自殺することにより治療効果が制限される。このことを考慮して、インビトロで5-FU耐性菌が取得されている（特許文献２）。しかし、インビボで抗腫瘍効果を発揮するためには、5-FUが細胞の酵素により変換された活性代謝産物、5-fluoro-UTP（5-FUTP）または5-fluoro-dUMP（5-FdUMP）が必要である（非特許文献１１）。これらもまた菌に毒性を発揮し、やはり薬効は制限される可能性がある。また、この方法は、ビフィドバクテリウムとは別に、生体への大量の5-FCの投与が必要であり、制約が大きい。したがって、腫瘍治療用途においても、より効果的な方法として、有用なポリペプチドを分泌発現するビフィドバクテリウムの使用が求められている。【０００６】
一般に、細菌において、異種ポリペプチドの分泌発現、特に生物学的に活性を持ったポリペプチドの分泌発現には多くのボトルネックがあり、異種ポリペプチドそれぞれ固有の問題のために、分泌発現が困難である場合が多い。しかし、特にバシラス・サブティリス（Bacillus subtilis）やラクトコッカス・ラクティスなどにおいては非常に多くの研究の蓄積がある（非特許文献１２、１３、１４）。【０００７】
一方、ビフィドバクテリウムを用いた分泌発現についての報告は、それらと比較すると非常に少ない。例えば、ビフィドバクテリウムにおいて、B.longumのhup遺伝子のプロモーターとガラクトシダーゼのシグナル配列を使用してインターロイキン-10（IL-10）の分泌発現が試みられているが、培養上清中の濃度が22 pg/mlと極めて低かったことが報告されている（非特許文献１５）。同様に、hup遺伝子のプロモーターを使用して、塩基性線維芽細胞成長因子（FGF-2）の分泌発現が試みられ、培養上清をトリクロロ酢酸で沈殿してウェスタンブロッティングでタンパク質を検出できたことが報告されている（非特許文献１６）。また、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（B. adolescentis）のamyB遺伝子のプロモーターおよびシグナル配列を使用して、外来ポリペプチドを分泌発現する試みが報告されている（非特許文献１７、１８）。ここで、培養上清中のポリペプチドは、活性形態でまたは硫安沈殿された形態でSDS-PAGEで検出されている。【０００８】
さらに、大腸菌のプロモーターを用いた、ビフィドバクテリウムでのエンドスタチンの発現が報告されている。この報告ではシグナル配列が使用されておらず、菌体破砕物から精製を行った後にウェスタンブロッティングで発現タンパク質が検出されている（非特許文献１９）。最近、同じ発現系でTRAIL/Apo2-Lが発現され、担癌マウスにおいてその菌の効果が示されている。しかしながら、TRAIL/Apo2-Lの発現量や比活性、さらにはTRAIL/Apo2-Lがどのようにして大腸菌プロモーターの制御下で発現し、シグナル配列なしでビフィドバクテリウムの菌体外に作用するのかは示されていない（非特許文献２０）。また、特許文献１においては、B. longumでのインターロイキン-2（IL-2）とエンドスタチンの発現についての示唆はあるが、それらの実際の発現については現在まで報告されていない。【０００９】
要約すると、従来にはない医療価値を提供できる可能性のある組換え細菌を使用した治療方法が検討されている中で、ビフィドバクテリウムは他にはない優れた特性を持つ宿主と考えられるが、異種のポリペプチドの分泌発現に関しては、必ずしも満足のいく状況ではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】日本国特許第3642755号
【特許文献２】国際公開WO2006/109619号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Vassaux G, et al. J Pathol. 2006. 208(2):290-8.
【非特許文献２】Remaut E, et al. Bioscience and Microflora. 2006. 25(3):81-97.
【非特許文献３】Liu X, et al. Appl Environ Microbiol. 2008. 74(15):4626-35.
【非特許文献４】Takata T, et al. J Gene Med. 2006. 8(11):1341-6.
【非特許文献５】Wei MQ, et al. Cancer Lett. 2008. 259(1):16-27.
【非特許文献６】Nemunaitis J, et al. Cancer Gene Ther. 2003. 10(10):737-44.
【非特許文献７】Sasaki T, et al. Cancer Sci. 2006. 97(7):649-57.
【非特許文献８】Xiang S, et al. Nat Biotechnol. 2006. 24(6):697-702.
【非特許文献９】Watson D, et al. BMC Microbiol. 2008. 8:176.
【非特許文献１０】Kimura NT, et al. Cancer Res. 1980. 40(6):2061-8.
【非特許文献１１】Erbs P, et al. Cancer Res. 2000. 60(14):3813-22.
【非特許文献１２】Bolhuis A, et al. Appl Environ Microbiol. 1999. 65(7):2934-41.
【非特許文献１３】Li W, et al. Res Microbiol. 2004. 155(8):605-10.
【非特許文献１４】Morello E, et al. J Mol Microbiol Biotechnol. 2008. 14(1-3):48-58.
【非特許文献１５】Reyes Escogido ML, et al. Biotechnol Lett. 2007. 29(8):1249-53.
【非特許文献１６】Shkoporov AN, et al. Biotechnol Lett. 2008. 30(11):1983-8.
【非特許文献１７】Park MS, et al. Lait 2005. 85:1-8.
【非特許文献１８】Moon GS, et al. Appl Environ Microbiol. 2005. 71(9):5630-2.
【非特許文献１９】Xu YF, et al. Cancer Gene Ther. 2007. 14(2):151-7.
【非特許文献２０】Hu B, et al. Cancer Gene Ther. 2009. 16(8):655-63.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、有用なポリペプチドをビフィドバクテリウムで効率的に分泌発現させることによって、医療をはじめとした用途に、従来にはない大きな利用価値を持つ技術を提供できると考えた。しかしながら、ビフィドバクテリウムにおいて従来利用されていたプロモーターおよびシグナル配列ならびにそれらの組み合わせは、有用なポリペプチドを分泌発現させるために必ずしも満足のいくものではなかった。【００１３】
そこで本発明の第一の目的は、有用なポリペプチドを微生物、好適にはビフィドバクテリウムで効率的に分泌発現する方法およびその手段を提供することにある。第二には、有用なポリペプチドを粘膜および／または腫瘍組織へデリバリーする手段を含む医薬組成物を提供することにある。第三には、該医薬組成物を利用することによる、疾患または障害の治療および予防のための手段および方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、ビフィドバクテリウムにおいて、生物活性のある有用なポリペプチドを効率よく分泌発現させ得るプロモーターとシグナル配列の組み合わせを得る目的で鋭意検討を重ねた。その結果、従来知られていた発現カセットと比較して、生物活性をもった有用なポリペプチドを高いレベルで分泌発現させることができるプロモーターとシグナル配列との組み合わせを見出した。また、シグナル配列の後に、特定の遺伝子のシグナル配列の後のおよそ１〜20アミノ酸をコードするDNAを挿入した場合には、ポリペプチドの分泌発現効率がさらに高まることを見出した。さらに本発明者らは、動物実験において、該発現カセットを含む発現ベクターが導入されたビフィドバクテリウムが、そのわずか一回の投与でも、長期の抗腫瘍効果を示すことを見出した。【００１５】
すなわち本発明は以下の（１）〜（６）である。【００１６】
（１）以下の（i）、（ii）および（iii）を含むことを特徴とする発現カセット。
（i）ビフィドバクテリウム属細菌由来のcbaH遺伝子のプロモーター、ビフィドバクテリウム属細菌由来のrplJ遺伝子のプロモーターおよびビフィドバクテリウム属細菌由来のhup遺伝子のプロモーターからなる群より選択されるプロモーター、
（ii）ビフィドバクテリウム属細菌由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列およびビフィドバクテリウム属細菌由来のamyB遺伝子産物のシグナル配列からなる群より選択されるシグナル配列をコードするDNA、
（iii）ポリペプチドをコードするDNA、または該DNAを挿入するためのクローニング部位【００１７】
上記発現カセットにおいて、（iii）にポリペプチドをコードするDNAが挿入されていることが好ましい。【００１８】
また、プロモーターは、好ましくはビフィドバクテリウム属細菌由来のcbaH遺伝子のプロモーターまたはビフィドバクテリウム属細菌由来のhup遺伝子産物のプロモーターである。シグナル配列は、好ましくはビフィドバクテリウム属細菌由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列である。【００１９】
上記発現カセットは、（ii）シグナル配列をコードするDNAと（iii）ポリペプチドをコードするDNAまたは該DNAを挿入するためのクローニング部位との間に、ビフィドバクテリウム属細菌由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列に続く１〜20個の連続するアミノ酸をコードするDNAが連結されていてもよい。【００２０】
あるいは上記発現カセットは、（ii）シグナル配列をコードするDNAと（iii）ポリペプチドをコードするDNAまたは該DNAを挿入するためのクローニング部位との間に、配列番号９に示されるアミノ酸配列をコードするDNAが連結されていてもよい。【００２１】
（２）以下の（i）、（ii）、（iii）および（iv）を含むことを特徴とする発現カセット。
（i）ビフィドバクテリウム属細菌由来の遺伝子のプロモーター、
（ii）ビフィドバクテリウム属細菌由来の遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNA、
（iii）ビフィドバクテリウム属細菌由来の遺伝子産物のシグナル配列に続く１〜20個の連続するアミノ酸をコードするDNA、
（iv）ポリペプチドをコードするDNA、または該DNAを挿入するためのクローニング部位【００２２】
上記発現カセットにおいて、（iv）にポリペプチドをコードするDNAが挿入されていることが好ましい。【００２３】
また、プロモーターは、好ましくはビフィドバクテリウム属細菌由来のcbaH遺伝子のプロモーター、ビフィドバクテリウム属細菌由来のrplJ遺伝子のプロモーターおよびビフィドバクテリウム属細菌由来のhup遺伝子のプロモーターからなる群より選択される。【００２４】
上記（１）または（２）の発現カセットにおいて、ポリペプチドは、好ましくはインターロイキン-10（IL-10）、インターロイキン-2（IL-2）、TRAIL/Apo2-L、I型インターフェロン（IFN-βなど）、インターロイキン-4（IL-4）拮抗変異体、およびR-spondinsからなる群より選択される。【００２５】
上記（１）または（２）の発現カセットは、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、IL-10をコードするDNAとを含有する。【００２６】
上記（１）または（２）の発現カセットは、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターまたはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のhup遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列に続く１〜20個の連続するアミノ酸をコードするDNAまたはLEISSTCDAをコードするDNAと、IL-10をコードするDNAとを含有する。【００２７】
上記（１）または（２）の発現カセットは、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ由来のhup遺伝子プロモーターまたはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、IL-2をコードするDNAとを含有する。【００２８】
上記（１）または（２）の発現カセットは、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ由来のhup遺伝子プロモーターまたはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列に続く１〜20個の連続するアミノ酸をコードするDNAと、IL-2をコードするDNAとを含有する。【００２９】
上記（１）または（２）の発現カセットは、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のrplJ遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、IL-4拮抗変異体をコードするDNAとを含有する。【００３０】
上記（１）または（２）の発現カセットは、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ由来のhup遺伝子プロモーターまたはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のhup遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス由来のamyB遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、TRAIL/Apo2-LをコードするDNAとを含有する。【００３１】
上記（１）または（２）の発現カセットは、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のhup遺伝子プロモーターまたはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、I型インターフェロンをコードするDNAとを含有する。【００３２】
上記（１）または（２）の発現カセットは、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のhup遺伝子プロモーターまたはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列に続く１〜20個の連続するアミノ酸をコードするDNAまたはLEISSTCDAをコードするDNAと、I型インターフェロンをコードするDNAとを含有する。【００３３】
上記（１）または（２）の発現カセットは、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、R-spondinsをコードするDNAとを含有する。【００３４】
上記（１）または（２）の発現カセットは、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列をコードするDNAと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列に続く１〜20個の連続するアミノ酸をコードするDNAまたはLEISSTCDAをコードするDNAと、R-spondinsをコードするDNAとを含有する。【００３５】
また上記（１）または（２）の発現カセットは、ビフィドバクテリウム属細菌においてポリペプチドを分泌発現させるために使用される。【００３６】
（３）上記（１）または（２）の発現カセットを含有する発現ベクター。【００３７】
（４）上記（１）もしくは（２）の発現カセットまたは上記（３）の発現ベクターを含む組換え微生物。【００３８】
上記微生物は、例えばビフィドバクテリウム属細菌である。【００３９】
（５）上記（４）の微生物を含む医薬組成物。【００４０】
上記医薬組成物は、疾患または障害を治療するために用いることができる。かかる疾患または障害は、好ましくは炎症性腸疾患または腫瘍疾患である。【００４１】
（６）上記（１）もしくは（２）の発現カセットまたは上記（３）の発現ベクターを含む組換え微生物を培養し、得られる培養物からポリペプチドを採取することを特徴とするポリペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【００４２】
本発明によれば、安全性、体内動態および生物学的封じ込めなどさまざまな点において優れた特性を有するビフィドバクテリウムにおいて、種々の有用なポリペプチドを、活性な状態でかつ効率よく分泌発現させ得る発現カセットが提供される。また、該発現カセットを含み、有用なポリペプチドを分泌発現する微生物が提供される。該微生物は、ヒトを含む動物に投与することにより粘膜および／または腫瘍組織へ有用なポリペプチドを効率的にデリバリーするための医薬組成物に用いることができる。これにより、疾患の治療および／または予防を効率的に行い得る。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】pKKT427のマップを示す。
【図２】pBSM4（A）とpBSM11（B）のマップを示す。
【図３】発現カセットの構成の一例を示す。
【図４】培養上清中IL-10のウェスタンブロット像を示す。
【図５】MC/9細胞増殖アッセイにおける、培養上清中IL-10のin vitro生物活性を示す。Aのグラフは陽性対照の市販のIL-10タンパク質の活性である。
【図６】培養上清中IL-10のウェスタンブロット像（B. breve）を示す。
【図７】培養上清中IL-10のウェスタンブロット像（pBSM4）を示す。
【図８】さまざまな長さのシグナル配列後挿入配列を用いた場合の培養上清中IL-10のウェスタンブロット像を示す。
【図９】MC/9細胞増殖アッセイにおける、培養上清中IL-10のin vitro生物活性を示す。Aのグラフは陽性対照の市販のIL-10タンパク質の活性である。Bのグラフはシグナル配列後挿入配列の長さが0から3の場合の活性である。Cのグラフはシグナル配列後挿入配列の長さが６から16の場合の活性である。
【図１０】培養上清中IL-2のウェスタンブロット像を示す。
【図１１】CTLL/2細胞増殖アッセイにおける、培養上清中IL-2のin vitro生物活性を示す。Aのグラフは陽性対照の市販のIL-2タンパク質の活性である。
【図１２】培養上清中または細胞質中のIL-4拮抗変異体のウェスタンブロット像を示す。
【図１３】培養上清中TRAIL/Apo2-Lのウェスタンブロット像（経時変化）を示す。
【図１４】培養上清中TRAIL/Apo2-Lのウェスタンブロット像（発現カセットAからD）を示す。
【図１５】培養上清中TRAIL/Apo2-Lのウェスタンブロット像（発現カセットAとE）を示す。
【図１６】COLO 205細胞アポトーシスアッセイにおける、培養上清中TRAIL/Apo2-Lのin vitro生物活性を示す。Aのグラフは陽性対照の市販の組換え可溶化型hTRAIL/Apo2-Lの活性である。
【図１７】培養上清中TRAIL/Apo2-Lのウェスタンブロット像（pBSM11）を示す。
【図１８】培養上清中または細胞質中のIFN-βのウェスタンブロット像を示す。
【図１９】I型インターフェロン活性アッセイにおける、培養上清中IFN-βのin vitro生物活性を示す。Aのグラフは陽性対照の市販の組換えhIFN-β1aの活性である。
【図２０】培養上清中または細胞質中のR-spondin 2 dCのウェスタンブロット像を示す。
【図２１】TRAIL/Apo2-L発現ビフィドバクテリウム（hupプロモーター）のin vivo腫瘍成長抑制効果（4回投与、矢印）を示す。
【図２２】実施例１１の試験での体重変化を示す。
【図２３】TRAIL/Apo2-L発現ビフィドバクテリウム（cbaHプロモーター）のin vivo腫瘍成長抑制効果（単回投与、矢印）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下に本発明について詳細に説明する。本願は、2009年4月28日に出願された日本国特許出願第2009-108839号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【００４５】
本発明は、微生物においてポリペプチドを発現および分泌させるために有用な、プロモーターとシグナル配列の組み合わせ、そして場合によりさらにポリペプチドおよび／またはシグナル配列に続く配列、をコードする発現カセットと、その利用に関する。
【００４６】
本明細書において「発現カセット」とは、目的とするポリペプチドが発現し得るように、該ポリペプチドをコードするDNAとその発現を調節するプロモーター等の種々の調節エレメントとが、宿主微生物または宿主細胞中で機能し得る状態で連結されているDNA配列をいう。ここで「機能し得る状態で連結されている」とは、ポリペプチドをコードするDNAが、プロモーターの制御下で、そして場合により他の調節エレメントの制御下で、発現されるように、発現カセットまたは発現ベクターに含まれる各構成要素が連結されていることを意味する。
【００４７】
本発明に係る発現カセットは、プロモーターを含む。本明細書で言う「プロモーター」とは、特定の転写開始点（+1）からRNAポリメラーゼに転写を開始させる機能を担っているDNA配列を意味する。また、この領域以外に、発現調節のためにRNAポリメラーゼ以外のタンパク質が会合するために必要な領域を含んでいてもよい。また本明細書中で「プロモーター領域」と記載する場合があるが、これは本明細書で言うプロモーターを含む領域のことを示す。
【００４８】
本発明の一実施形態では、プロモーターは、ビフィドバクテリウム属細菌由来のcbaH遺伝子のプロモーター、ビフィドバクテリウム属細菌由来のrplJ遺伝子のプロモーターおよびビフィドバクテリウム属細菌由来のhup遺伝子のプロモーターからなる群より選択される。ビフィドバクテリウム属細菌由来のhup遺伝子のプロモーターは、好ましくはビフィドバクテリウム・ブレーベ由来のhup遺伝子のプロモーターである。
【００４９】
ビフィドバクテリウム属細菌由来のcbaH遺伝子のプロモーターとしては、B. longum 105-AのcbaH遺伝子のプロモーター領域（配列番号１）が挙げられる。この配列は、Accession Number AE014295のBifidobacterium longum NCC2705, complete genomeに含まれる、locus tag BL0796の、共役胆汁酸ヒドロラーゼ（conjugated bile acid hydrolase）すなわち胆汁酸塩ヒドロラーゼ（bile salt hydrolase）をコードするcbaH遺伝子のプロモーター領域と100％一致する。また、Accession Number ABQ81846の特許出願公開EP1227152-A1のBifidobacterium longum NCC2705 related nucleotide sequence SEQ ID:1102にも含まれている。また、Accession Number CP000605のBifidobacterium longum DJO10A, complete genomeに含まれる、locus tag BLD_0536の共役胆汁酸ヒドロラーゼをコードするcbaH遺伝子のプロモーター領域とも100％一致する。また、Accession Number AF148138 のBifidobacterium longum SBT2928の胆汁酸塩ヒドロラーゼ（bsh）遺伝子のプロモーター領域とも100％一致する。
【００５０】
ビフィドバクテリウム属細菌由来のrplJ遺伝子のプロモーターとしては、B. longum ATCC 15707のrplJ遺伝子のプロモーター領域（配列番号２）が挙げられる。この配列は、Accession Number AE014295のBifidobacterium longum NCC2705, complete genomeに含まれる、locus tag BL1549の、50Sリボソームタンパク質L10をコードするrplJ遺伝子のプロモーター領域と100％一致する。また、Accession Number CP000605のBifidobacterium longum DJO10A, complete genomeに含まれる、locus tag BLD_1667のリボソームタンパク質L10をコードするrplJ遺伝子のプロモーター領域とも100％一致する。
【００５１】
ビフィドバクテリウム属細菌由来のhup遺伝子のプロモーターとしては、B. breve ATCC15700のhup遺伝子のプロモーター領域（配列番号３）が挙げられる。また、場合によっては、特許文献１（特許第3642755号）に開示されているB. longum ATCC15707のhup遺伝子のプロモーター領域（配列番号１３）を使用することも可能である。
【００５２】
プロモーターは、上記例示した配列の一部でも、または上記例示した配列の全体もしくは一部にさらなる配列が付加されていても、所望のプロモーター活性を発揮することができることがある。従って、本発明においては、上記例示した配列（例えば配列番号１、２および３で示されるDNA配列）の全部またはその一部を含むものをプロモーターとして使用することができる。即ち、プロモーター活性を有する限り、上記例示した配列（例えば配列番号１から３で示されるDNA配列）のいかなるDNA断片であってもよく、あるいは、上記例示した配列（例えば配列番号１から３で示されるDNA配列）の一部を含むいかなるDNA断片であってもよい。
【００５３】
また、プロモーターは、所望のプロモーター活性を有する限り、１もしくは数個の塩基に変異を含んでもよい。例えば、上記例示した配列（例として配列番号１から３に示される塩基配列）において、１もしくは数個、好ましくは１〜10個、より好ましくは１〜５個の塩基の欠失、置換もしくは付加を有する配列からなるプロモーターを用いることができる。そのようなプロモーターは、上記例示した配列に基づいて、当技術分野で公知の方法、例えば部位特異的突然変異誘発法により、プロモーター活性を維持しつつ配列の異なる変異体を作製することができる。
【００５４】
また例えば、上記例示した配列（例えば配列番号１から３に示す塩基配列）からなるDNAに相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAも、プロモーター活性を有する限り用いることができる。上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNA」としては、上記例示した配列（例えば配列番号１から３に示す塩基配列）と約70％以上、好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA等が挙げられる。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、ナトリウム濃度が、10mM〜300mM、好ましくは20〜200mMであり、温度が25℃〜70℃、好ましくは42℃〜55℃での条件をいう。
【００５５】
ここで「プロモーター活性」とは、プロモーター（領域）に、発現可能な状態でDNAを連結し、宿主に導入した際、宿主内において該DNAからのRNAの転写を開始させる能力および機能を有することを示す。ある配列がプロモーター活性を有するか否かは、当技術分野で公知の方法によって確認することができる。例えば、種々のレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子（LUC）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（CAT）、βグルクロニダーゼ（GUS）遺伝子（uidA）等をプロモーターの下流域に連結したベクターを作製し、当該ベクターを宿主に導入した後、当該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認することができる。プロモーター活性は、例えば配列番号１〜３に示される塩基配列からなるプロモーターが機能する条件と同一の条件でほぼ同程度のプロモーター活性（例えば約0.01〜100倍の活性）が維持されていることが好ましい。このような所望の活性を有するプロモーターの作製は、当業者に公知である。
【００５６】
また本発明に係る発現カセットは、シグナル配列をコードするDNAを含有する。本明細書で言う「シグナル配列」とは、タンパク質分子に含まれるペプチド配列で、細胞質内で生合成されたポリペプチドの分泌を指示する構造である。これは、シグナルペプチド、分泌シグナル、局在シグナル、あるいは輸送（移行）シグナルなどとも呼ばれる。
【００５７】
本発明の一実施形態では、シグナル配列は、ビフィドバクテリウム属細菌由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列およびビフィドバクテリウム属細菌由来のamyB遺伝子産物のシグナル配列からなる群より選択される。
【００５８】
例えばビフィドバクテリウム属細菌由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列としては、B. longum 105-AのBL1181遺伝子産物のシグナル配列（配列番号４）が挙げられる。これは、Accession Number NP_696350のBifidobacterium longum NCC2705のhypothetical protein BL1181の推定シグナル配列と100％一致する。また、Accession Number ZP_00121020のBifidobacterium longum DJO10AのCOG3942: 表面抗原（Surface antigen）の推定シグナル配列とも100％一致する。この配列番号４に示されるシグナル配列をコードするDNAの一例としては、配列番号６に示される塩基配列を有するDNAが挙げられる。
【００５９】
また例えばビフィドバクテリウム属細菌由来のamyB遺伝子産物のシグナル配列として、非特許文献１８に開示されているB. adolescentis INT-57のamyB遺伝子産物のシグナル配列（配列番号５）が挙げられる。これは、Accession Number AAP69820のBifidobacterium adolescentisのamyB遺伝子産物であるα-アミラーゼ（alpha-amylase）の推定シグナル配列である。またこれはAccession Number ADX45166のKR2004087056-AのSEQ ID NO 2のBifidobacterium sp. タンパク質分泌関連α-アミラーゼタンパク質（Protein secretion-related alpha amylase protein）の一部である。それは、Accession Number ADX45166 AEN03241のKR2006014660-AのSEQ ID NO 1のBifidobacterium adolescentis アミラーゼシグナルペプチド（amylase signal peptide）である。それは、Accession Number AEN03244のKR2006014660-AのSEQ ID NO 4のBifidobacterium adolescentis アミラーゼ（Amylase）の一部でもある 。Accession Number ZP_02029407のBifidobacterium adolescentis L2-32のhypothetical protein BIFADO_01864の推定シグナル配列と97％一致する。この配列番号５に示されるシグナル配列をコードするDNAの一例としては、配列番号７に示される塩基配列を有するDNAが挙げられる。
【００６０】
本発明のシグナル配列には、所望のシグナル配列としての活性を有する限り、上記例示した配列（例えば配列番号４〜５に示される配列）の変異体も含まれる。そのような変異体には、ビフィドバクテリウム属細菌の他の菌種のオルソログの相当する配列も含まれる。
【００６１】
ここでシグナル配列としての活性とは、ポリペプチドの小胞体膜への移行と膜透過に寄与する機能を意味し、シグナル配列を有するポリペプチドは、シグナル認識粒子によって認識されて小胞体内腔へと送られ、膜を透過して分泌される。ある配列がシグナル配列としての活性を有するか否かは、当技術分野で公知の方法により、例えば連結したポリペプチドの培養上清中への分泌を、ELISA法やウェスタンブロッティング法でそのポリペプチドに対する抗体を用いて検出することにより、あるいは該ポリペプチドが酵素活性を有する場合、酵素活性を測定することにより確認することができる。
【００６２】
また、シグナル配列をコードするDNAとポリペプチドをコードするDNAの間に、特定のシグナル配列の後に続く配列をコードするDNA、またはLEISSTCDAをコードするDNAを挿入すると、ポリペプチドの分泌発現効率が著しく向上する場合がある。本明細書においては特に、そのようなポリペプチドの分泌を促進する活性を有する配列を「シグナル配列後挿入配列」と呼ぶ。かかるシグナル配列後挿入配列としては、例えばビフィドバクテリウム属細菌由来の遺伝子産物（タンパク質）のシグナル配列に続く１〜20個の連続するアミノ酸をコードするDNAが挙げられる。
【００６３】
配列番号８は、B. longum 105-AのBL1181遺伝子産物のシグナル配列に続く16アミノ酸からなるペプチド配列である。この配列は、上記Accession Number NP_696350のBifidobacterium longum NCC2705のhypothetical protein BL1181の推定シグナル配列とAccession Number ZP_00121020のBifidobacterium longum DJO10AのCOG3942: 表面抗原の推定シグナル配列に続く16アミノ酸と100％一致する。この配列番号８に示されるシグナル配列後挿入配列をコードするDNAの一例としては、配列番号１０に示される塩基配列を有するDNAが挙げられる。
【００６４】
また、シグナル配列後挿入配列としては、アミノ酸LEISSTCDAからなるペプチド配列（配列番号９）（以後、LEISSと呼ぶ）を用いることも可能である。この配列は、L. Lactisにおける異種タンパク質の分泌に関する論文で示されている人工配列である（Le Loir Y,et al. J Bacteriol. 1998. 180(7):1895-903.）。この配列番号９に示されるシグナル配列後挿入配列をコードするDNAの一例としては、配列番号１１に示される塩基配列を有するDNAが挙げられる。
【００６５】
本発明のシグナル配列後挿入配列には、所望の分泌促進活性を有する限り、シグナル配列に続く１〜20個の連続するアミノ酸のうち任意の個数のアミノ酸をコードするDNAを用いることができる。例えば好ましくは1〜18個、さらに好ましくは1〜16個の連続するアミノ酸をコードするDNAが挙げられる。また、上記例示した配列（例えば配列番号８〜９に示される配列）の変異体も用いることができる。該変異体には、欠失変異体および延長変異体も含まれる。さらに、該変異体には、ビフィドバクテリウム属細菌の他の菌種のオルソログの相当する配列も含まれる。
【００６６】
ここである配列または変異体が、本発明におけるシグナル配列後挿入配列として用いることができるか否かは、例えばシグナル配列に該候補配列を連結し、その後に続くポリペプチドの培養上清中での分泌量向上を、該ポリペプチドに対する抗体を用いたELISA法やウェスタンブロッティング法で検出することにより、あるいは該ポリペプチドが酵素活性を有する場合、酵素活性を測定することにより確認することができる。
【００６７】
本発明に係る発現カセットは、ポリペプチドの発現および分泌のために、ポリペプチドをコードするDNA、またはそのようなDNAを挿入するためのクローニング部位を含有する。
【００６８】
本明細書で言う「ポリペプチド」は、２以上のアミノ酸からなるポリペプチドであれば特に限定されず、あらゆる生物に由来するあらゆる機能・活性を有するポリペプチドを意味する。
【００６９】
このようなポリペプチドの具体例としては、タンパク質ホルモンまたはペプチドホルモン、例えば、成長ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、インスリン、ソマトスタチン、カルシトニン、バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド、アドレノメデュリン、レプチン、グルカゴン様ペプチド（GLP）-1〜2またはインスリン様成長因子（IGF）-1〜2など、エリスロポエチン（EPO）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、肝細胞因子（SCF）、トロンボポエチン（TPO）、白血球抑制因子（LIF）、オンコスタチンM（OSM）、毛様体神経栄養因子（CNTF）、インターロイキン（IL）1〜35、I〜III型インターフェロン（IFN）、腫瘍壊死因子（TNF）スーパーファミリータンパク質、例えば、TNF-α、CD40、TRAIL/Apo2-L、FAS ligandまたはRANKLなど、ケモカイン、例えばCCL1〜28またはCXCL1〜17など、線維芽細胞成長因子（FGF）1〜23、肝細胞増殖因子（HGF）、インスリン様成長因子（IGF）-1〜2、ケラチン細胞増殖因子（KGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、トランスフォーミング増殖因子（TGF）-βスーパーファミリータンパク質、例えばTGF-βまたは骨形成タンパク質（BMP）1〜15など、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）ファミリー、例えばVEGF-Aから-Eなど、神経栄養因子、例えば神経成長因子（NGF）など、R-spondin 1〜4、Trefoil因子 1〜3、上皮増殖因子（EGF）ファミリータンパク質、例えばEGFまたはニューレグリン-1〜4、結合組織成長因子（CTGF）、組織プラスミノーゲン活性化因子（t-PA）、ウロキナーゼ、免疫グロブリン、例えばラクダ科VHH抗体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
あるいは、「ポリペプチド」は、上記のポリペプチドに対するレセプターまたはアンタゴニストであってもよい。
【００７１】
あるいは、「ポリペプチド」は、細胞内タンパク質または酵素、例えばプロドラッグ変換酵素、例えば大腸菌または酵母のシトシンデアミナーゼ（CD）またはグルクロニダーゼなど、そして抗原性ポリペプチド（すなわち免疫応答を誘発されるところの対象）、そして発光性タンパク質（ルシフェラーゼなど）、そして毒素、例えば緑膿菌外毒素（PE）であってもよい。
【００７２】
さらに、「ポリペプチド」は、上記のポリペプチドの部分ペプチド、変異体、または融合体であってもよい。例えば、CDまたはp53などと、タンパク質トランスダクションドメイン（PTD）、例えばVP22またはTATなどとの融合ポリペプチドであってもよい。
【００７３】
本発明の一実施形態では、ポリペプチドは、IL-10、IL-2、IL-4拮抗変異体、TRAIL/Apo2-L、I型IFN（IFN-α、β、ω）またはR-spondinsであることが好ましい。
【００７４】
IL-10は、抗炎症性のサイトカインである。これまで炎症性腸疾患で組換えIL-10の臨床試験が試みられてきたが、大きな成功を収めるには至っていない（World J Gastroenterol. 2004 Mar 1;10(5):620-5.）。一方で、IL-10を分泌発現するL. lactisは、経口投与されることによって消化管でのみIL-10が作用するなどの利点を持つ可能性があり、炎症性腸疾患での臨床試験が試みられているところである(非特許文献２：Remaut E, et al. Bioscience and Microflora. 2006. 25(3):81-97.)。したがって、IL-10を分泌発現するビフィドバクテリウムも炎症性腸疾患の治療薬になる可能性が考えられる。腸管での持続性が優れている可能性があること（非特許文献９：Watson D, et al. BMC Microbiol. 2008. 8:176.）や偏性嫌気性菌であることが、L. lactisに対するビフィドバクテリウムの利点となりうる。また、他の粘膜部位における疾患にも有用である可能性がある。
【００７５】
IL-2は、NK細胞やT細胞を増殖させて、抗腫瘍免疫を賦活化しうる。IL-2の局所投与は、多くの臨床試験で効果が見られている（Den Otter W, et al. Cancer Immunol Immunother. 2008. 57(7):931-50.）。IL-2を全身投与すると全く抗腫瘍効果がないが、腫瘍局所へデリバリーすると有効であるという動物モデルでの報告もある（Marlind J, et al. Clin Cancer Res. 2008. 14(20):6515-24.）。したがって、ビフィドバクテリウムは静脈内投与すると腫瘍局所にのみ生残し増殖することから（Kimura NT, et al. Cancer Res. 1980. 40(6):2061-8.）、IL-2を発現するビフィドバクテリウムは腫瘍の効果的な治療薬になる可能性があると考えられる。また、IL-2を分泌発現するビフィドバクテリウムは、ワクチンのアジュバントとしての利用も考えられる。
【００７６】
多くの上皮癌細胞や癌幹細胞は、TRAIL/Apo2-Lなどにより誘導されるアポトーシスに対し耐性であるが、それは腫瘍細胞由来のIL-4を介していることが示唆されている（Todaro M, et al. Cell Death Differ. 2008. 15(4):762-72., Todaro M, et al. Cell Stem Cell. 2007. 1(4):389-402.）。したがって、IL-4拮抗変異体は腫瘍の治療に有用である可能性がある。また、IL-4は多くの免疫反応に関わっていることから、IL-4拮抗変異体は免疫疾患にも有用である可能性がある。さらにIL-4拮抗変異体は、ビフィドバクテリウムに分泌発現させることによって腫瘍または粘膜局所で選択的に作用させることにより、より高い薬効で、より低い毒性を実現できる可能性がある。
【００７７】
TRAIL/Apo2-Lは、腫瘍細胞上の受容体DR4および／またはDR5と相互作用し、腫瘍細胞にアポトーシスを誘導する（Ashkenazi A, et al. Nat Rev Drug Discov. 2008. 7(12):1001-12.）。したがって、TRAIL/Apo2-Lを含むDR4およびDR5のアゴニストは腫瘍治療に有用であると考えられ、臨床試験が実施されている。TRAIL/Apo2-Lを分泌発現するビフィドバクテリウムは、腫瘍へ選択的にターゲティングすることにより、副作用や持続性などの面で治療薬として利点を持つ可能性がある。
【００７８】
I型IFNは、腫瘍に対して直接または血管新生阻害や免疫を介した間接作用により抗腫瘍効果を発揮する（Gresser I. Biochimie. 2007. 89(6-7):723-8., Ferrantini M, et al. Biochimie. 2007. 89(6-7):884-93.）。また、I型IFNは抗ウイルス剤として広く使用されている。これらのことから、I型IFNを分泌発現するビフィドバクテリウムは、抗腫瘍剤および抗ウイルス剤としても使用されうる。
【００７９】
R-spondin 1から4（R-spondins）の投与は似たように腸の肥大をもたらす生物活性を持ち（Kim KA, et al. Cell Cycle. 2006. 5(1):23-6.）、R-spondin 1は炎症性腸疾患モデルで有効である（Zhao J, et al. Gastroenterology. 2007. 132(4):1331-43.）。このことから、R-spondinsは腸の疾患治療に使用できる可能性がある。IL-10の場合と同様、R-spondinsを分泌発現するビフィドバクテリウムは、R-spondinタンパク質製剤に対して利点を持つ可能性がある。さらに、腸以外の粘膜部位の疾患の治療にも使用できる可能性がある（Zhao J, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009. 106(7):2331-6.）。
【００８０】
後述するような疾患または障害の治療または予防においてヒトを対象とする場合には、IL-10、IL-2、IL-4拮抗変異体、TRAIL/Apo2-L、I型IFN（IFN-α、β、ω）またはR-spondinsは、ヒトのオルソログであることが好ましい。
【００８１】
上述したポリペプチドは全て公知であり、当業者であれば、そのアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列を、公知の文献または公のデータベース（GenBankなど）から適宜入手することができる。
【００８２】
あるいは、本発明に係る発現カセットは、ポリペプチドをコードするDNAを挿入するためのクローニング部位を含有するものであってもよい。そのようなクローニング部位は当技術分野で公知であり、例えば、様々な制限酵素により認識される部位を含むマルチクローニング部位を利用することができる。このようなクローニング部位を含有する発現カセットの場合、所望のポリペプチドをコードするDNAを、そのクローニング部位を介して発現カセットに挿入することが容易となる。
【００８３】
上記の各構成要素の組み合わせは、発現させようとするポリペプチドの種類、使用するベクターの種類、宿主微生物の種類などによって、所望の分泌発現が達成されるように選択することができる。例えば、適当なプロモーターおよびシグナル配列をコードするDNAを、発現させようとするポリペプチドをコードするDNAと連結して発現ベクターを調製し、その発現ベクターを適当な微生物に導入して、微生物におけるポリペプチドの発現量、好ましくは分泌量を測定することによって、所望の分泌発現が達成されるかを確認することができる。
【００８４】
特定のポリペプチドに関して、最適な分泌発現を達成することができるプロモーターおよびシグナル配列、そして任意によりシグナル配列後挿入配列の組み合わせを以下に例示するが、これらに限定されるものではない：
（i）IL-10の発現には、以下が好ましい：
ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列との組み合わせ、あるいはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターまたはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のhup遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列と、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列後挿入配列またはLEISSTCDAをコードする配列の組み合わせ。
【００８５】
（ii）IL-2の発現には、以下が好ましい：
ビフィドバクテリウム・ブレーベ由来のhup遺伝子プロモーターまたはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列との組み合わせ、あるいは
ビフィドバクテリウム・ブレーベ由来のhup遺伝子プロモーターまたはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列と、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列後挿入配列の組み合わせ。
【００８６】
（iii）IL-4拮抗変異体の発現には、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のrplJ遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列との組み合わせが好ましい。
【００８７】
（iv）TRAIL/Apo2-Lの発現には、ビフィドバクテリウム・ブレーベ由来のhup遺伝子プロモーターまたはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のhup遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス由来のamyB遺伝子産物のシグナル配列との組み合わせが好ましい。
【００８８】
（v）I型インターフェロン、特にIFN-βの発現には、以下が好ましい：
ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のhup遺伝子プロモーターまたはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列との組み合わせ、あるいはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のhup遺伝子プロモーターまたはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列と、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列後挿入配列またはLEISSTCDAをコードする配列の組み合わせ。
【００８９】
（vi）R-spondins、特にdC型R-spondin2の発現には、以下が好ましい：
ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列との組み合わせ、あるいはビフィドバクテリウム・ロンガム由来のcbaH遺伝子プロモーターと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列と、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のBL1181遺伝子産物のシグナル配列後挿入配列またはLEISSTCDAをコードする配列の組み合わせ。
【００９０】
本発明に係る発現カセットには、上述した構成要素のほかに、所望によりエンハンサー配列などのシスエレメント、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）、相同配列などが含まれてもよい。
【００９１】
「ターミネーター配列」とは、転写を終結させる活性をもつDNA配列であり、ポリペプチドをコードするDNAの下流に連結することが好ましいが、必ずしも必要ではない。
【００９２】
本発明の一実施形態では、ターミネーター配列として、B.longum ATCC 15707のhup遺伝子のターミネーター配列（Tanaka K, et al. Biosci Biotechnol Biochem. 2005. 69(2):422-5.）を用いることができるが、当技術分野で公知の他のターミネーター配列を用いることも可能である。
【００９３】
「選択マーカー」は、形質転換された細胞のみを選択するために使用される。例えば、アンピシリン耐性、クロラムフェニコール耐性、エリスロマイシン耐性、ネオマイシン耐性、スペクチノマイシン耐性、またはテトラサイクリン耐性などの薬剤耐性マーカーが挙げられる。好適には、スペクチノマイシン耐性遺伝子（SpR）またはクロラムフェニコール耐性遺伝子（CmRもしくはcat）が使用される。形質転換された細胞のみを選択するためには、必ずしも薬剤耐性マーカーを使用する必要はなく、例えば、栄養要求性による検出、導入された発現カセットもしくは発現ベクターのPCR法などによる検出、またはポリペプチド産物のELISAもしくはウェスタンブロッティングなどによる検出などによっても形質転換細胞を選択することができる。
【００９４】
また、ポリペプチドを微生物細胞の表層に提示させる場合は、表層提示用配列を連結することが好ましい。表層提示用配列としては、例えばバシラス・サブティリス（Bacillus subtilis）のポリ-γ-グルタミン酸の生合成に関わるタンパク質であるPgsAの膜貫通型アンカー配列（Narita J, et al. Appl Environ Microbiol. 2006. 72(1):269-75.）、さらにはLPXTG 細胞壁アンカリングモチーフやペプチドグリカン結合ドメイン（Ramasamy R, et al. Vaccine. 2006. 24(18):3900-8.）などが知られている。
【００９５】
上述した各構成要素を連結する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、精製された各構成要素のDNAを適当な制限酵素で切断し、リガーゼなどを用いて連結する方法を採用することができる。あるいは合成PCR法により連結する方法を採用することもできる。
【００９６】
本発明は、上記の発現カセットを含有する発現ベクターも提供する。本明細書において「発現ベクター」とは、目的とするポリペプチドをコードするDNAを転写せしめるプロモーターおよび他の適当な配列からなる発現のためのユニット（発現カセット）が挿入されたベクターをいい、目的とするポリペプチドをコードするDNAが挿入されたものを含む。また本明細書において「ベクター」とは、遺伝子組換え技術に用いられる、それに挿入された核酸分子を宿主細胞内へ導入させるための核酸分子をいい、ベクターには、限定されるものではないが、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、および人工染色体などが含まれる。
【００９７】
本発明の一実施形態では、ベクターは、pTB6（Matsumura H, et al. Biosci Biotechnol Biochem. 1997. 61(7):1211-2., Tanaka K, et al. Biosci Biotechnol Biochem. 2005. 69(2):422-5.）のレプリコンを含むビフィドバクテリウムと大腸菌とのシャトルベクターpKKT427が挙げられるが（図１；Yasui K, et al. Nucleic Acids Res. 2009. 37(1):e3.）、特に限定されない。
【００９８】
また本発明の他の実施形態では、ベクターは、pTB4（Imamoto F and Kano Y, "Bifizusukin no Kenkyu" (in Japanese), ed. by Mitsuoka T, JapanBifidus Foundation, Tokyo, Japan, 1994, pp. 150-157.）のレプリコンを含むビフィドバクテリウムと大腸菌とのシャトルベクターpBSM4およびpBSM11が挙げられる（図２AおよびB）。ここでpBSM4とpBSM11は、マルチクローニングサイトの向きが互いに逆になったものである。
【００９９】
ベクターに各構成要素または発現カセットを挿入するには、例えば、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、ベクターDNAの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する。ベクターが宿主微生物において自律複製されるか（染色体外）、またはベクター上のDNAが宿主微生物のゲノムに組み込まれるように（染色体内）、ベクターを構築する必要がある。
【０１００】
発現ベクターにおいて、連結される発現カセットまたはそれぞれの構成要素は、単数であっても複数であってもよい。また、宿主微生物に導入される発現ベクターは、一種類であっても複数種類であってもよい。
【０１０１】
発現ベクター（核酸構築物）の構築についての遺伝子工学の基本操作については、市販の実験書、例えば、Molecular Cloning, 2nd ed.（Sambrook, J et al. 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press.）またはMolecular Cloning, 3rd ed.（Sambrook, J et al. 2001. Cold Spring Harbor Laboratory Press.）などに記載された方法に従って行うことができる。
【０１０２】
さらに本発明は、上記の発現カセットまたは上記の発現ベクターを含む組換え微生物を提供する。本明細書で言う「組換え微生物」は、本発明の発現カセットまたは発現ベクター（核酸構築物）を含み、該発現カセットまたは発現ベクターにコードされるポリペプチドを分泌発現し得る微生物である。かかる組換え微生物の作製に用いることができる宿主微生物は、導入される発現カセットまたは発現ベクターからポリペプチドを分泌発現することができる微生物であれば特に限定されるものではなく、好適にはグラム陽性細菌である。グラム陽性細菌には、例えばビフィドバクテリウム属細菌、ラクトコッカス属細菌、ラクトバシラス属細菌、クロストリジア属細菌、バシラス属細菌などが含まれ、より好適には微生物はビフィドバクテリウム属細菌である。あるいは、微生物にはグラム陰性細菌のサルモネラ属細菌（腸内細菌科）、エシェリキア属細菌なども含まれる。
【０１０３】
本発明で用いられるビフィドバクテリウム属細菌は、該属に属する菌株のいずれでもよい。例えば、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（B. adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B．bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B．breve）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（B. catenulatum）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（B. dentium）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B．infantis）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（B. lactis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B．longum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（B．pseudolongum)、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム（B. thermophirum）などが挙げられる。これらの菌は、いずれも市販されているか、または寄託機関から容易に入手することができる。あるいは、これらの菌は、生体から採取することもできる。さらには、これらの変異体、またはこれらから育種された菌を用いてもよい。
【０１０４】
本発明の一実施形態では、ビフィドバクテリウム属細菌は、B.longum 105-A（Matsumura H, et al. Biosci Biotechnol Biochem. 1997. 61(7):1211-2.）またはB.breve ATCC 15700（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）より入手可）である。
【０１０５】
組換え微生物の培養には、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよく、当業者であれば使用する株に適切な公知の培地を適宜選ぶことができる。ビフィドバクテリウム属細菌の培養には、例えば以下の組成の滅菌された培地を使用することができる。
【０１０６】
「MRS液体培地」
Lactobacilli MRS Broth（Difco Laboratories, Detroit, MI）
50 mM Sucrose
3.4 mg/ml L-Ascorbic Acid Sodium Salt
0.2 mg/ml L-Cysteine Hydrochloride
また「MRS寒天培地」は、上記MRS液体培地に、Bacto Agar（Difco Laboratories）が1.5％の割合になるように混合されたものである。「MRS-HEPES培地」は、上記MRS液体培地と0.5 M HEPES Buffer Solution（pH 7.2〜7.5）を1:1で混合したものである。形質転換され、薬剤耐性マーカーを持つ菌は、選択マーカーに応じて各種薬剤を加えておくことにより、選択的に培養できる。例えば、スペクチノマイシンは100μg/ml、クロラムフェニコールは2.5μg/mlで使用される。
【０１０７】
ビフィドバクテリウム属細菌の培養は、約30〜40℃程度、好ましくは約37℃程度において、嫌気条件下で行う。嫌気条件下とは、ビフィドバクテリウム属細菌が増殖可能な程度の低酸素環境下のことであり、例えば嫌気チャンバー、嫌気ボックスまたはアネロパック（三菱ガス化学、東京）などの脱酸素剤を入れた密閉容器または袋などを使用することにより得られる。
【０１０８】
発現カセットまたは発現ベクターを宿主微生物に導入するための形質転換方法は、公知のいずれの方法も用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法等が挙げられる。本発明においては、エレクトロポレーション法を用いるのが好ましい。形質転換体は、例えば選択マーカーに応じた薬剤を含有する培地（ビフィドバクテリウム属細菌の場合にはMRS寒天培地など）を使用して、コロニーとして分離できる。
【０１０９】
上述のようにして作製された、本発明に係る発現カセットまたは発現ベクターを含む組換え微生物は、発現カセットまたは発現ベクターにコードされるポリペプチドを高レベルで発現し、分泌する。本明細書で言う「分泌」とは、細胞が代謝産物を細胞外へ排出することを意味するが、細胞表層への提示も含む。好ましくは、ポリペプチドは、1mlあたり、ナノグラム（ng）からマイクログラム（μg）のオーダーで分泌発現される。そのため、本発明に係る発現カセットを含む発現ベクター、および／または該発現ベクターを含む組換え微生物は、該ポリペプチドを送達するために用いることができる。例えばビフィドバクテリウム属細菌は、ヒトに投与された場合に粘膜および／または腫瘍組織もしくは細胞に局在化することが知られているため、本発明に係る発現カセットまたは発現ベクターを含む組換えビフィドバクテリウム属細菌は、それにコードされるポリペプチドの粘膜および／または腫瘍組織もしくは細胞への局所送達に有用である。
【０１１０】
従って、本発明は、本発明に係る組換え微生物を含む医薬組成物も提供する。本発明に係る医薬組成物は、溶液もしくは懸濁液、または粒状もしくは粉状の乾燥物をそのまま、より一般的には、有効成分である組換え微生物と１または２以上の製剤用添加物とを含む組成物の形態である。
【０１１１】
本発明に係る医薬組成物は、例えば、共生細菌を宿主とした遺伝子治療に使用することができる。
【０１１２】
本発明に係る医薬組成物において、組換え微生物は、生きた状態または生きていない状態で使用することができる。
【０１１３】
該組換え微生物は、公知の後処理を行ってもよい。例えば、所望により、遠心分離などにより粗精製を行った後、適当な溶媒に溶解または懸濁させてもよい。また、所望により、凍結乾燥または噴霧乾燥を行い、粉状物または粒状物にしてもよい。
【０１１４】
本発明に係る医薬組成物は、所望の投与経路に応じて、適当な剤形とすることができる。例えば経口投与に適する製剤の例としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ剤、溶液剤、カプセル剤または懸濁剤などを挙げることができる。非経口投与に適する製剤の例としては、例えば、注射剤、点滴剤、吸入剤、噴霧剤、坐剤、経粘膜吸収剤などを挙げることができる。このような組成物は、それ自体製剤学の分野で周知または慣用の方法に従って製造することが可能である。
【０１１５】
本発明に係る医薬組成物は、例えば食品または飼料などに配合されてもよい。医薬組成物を配合する食品の形態および種類は特に限定されるものではない。例えば、固体状食品、ゼリー状食品、液状食品、カプセル状食品、乳製品（ヨーグルト等）など様々な形態の食品に配合することができる。
【０１１６】
本発明に係る医薬組成物は、各種疾患や障害の治療または予防を目的として、生体に投与することができる。本発明に係る医薬組成物の投与対象となる被験体は、ヒトに限定されず、脊椎動物、具体的には、哺乳動物、例えば霊長類（サル、チンパンジーなど）、家畜動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなど）、ペット用動物（イヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラットなど）、さらには爬虫類および鳥類も含む。
【０１１７】
本発明に係る医薬組成物は、消化管の疾患、例えば小腸（十二指腸、空腸、回腸）、および大腸（盲腸、結腸、直腸）などの消化管の疾患の治療または予防のために投与される。より好適には炎症性腸疾患、例えば、消化性潰瘍（十二指腸潰瘍）、胃腸管の粘膜炎、潰瘍性大腸炎、非感染性大腸炎、感染性大腸炎、クローン病、好ましくは潰瘍性大腸炎およびクローン病に適用される。
【０１１８】
本発明に係る医薬組成物は、腫瘍、より好適には各種固形癌の治療または予防のために投与される。固形癌としては、例えば大腸癌、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、膵島細胞癌、絨毛癌、結腸癌、腎細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、卵巣癌、子宮癌、絨毛癌、甲状腺癌、悪性カルチノイド腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、メラノーマ、および扁平上皮癌などが挙げられる。
【０１１９】
本発明に係る医薬組成物により治療または予防の対象となる疾患または障害は、単独であっても、併発したものであっても、上記以外の他の疾病を併発したものであってもよい。
【０１２０】
また本発明に係る医薬組成物は、ワクチン、またはワクチンに伴う免疫誘導のためのアジュバントとして使用できる。
【０１２１】
本発明の医薬組成物の投与経路は特に限定されず、経口投与または非経口投与などが挙げられる。非経口投与としては、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内および患部局所、例えば腫瘍内などの投与経略を挙げることができる。
【０１２２】
本発明の医薬組成物の投与量および投与頻度は特に限定されず、治療すべき病態の種類、投与経路、患者の年齢および体重、症状、および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択することが可能である。
【０１２３】
本発明の医薬組成物は、他の医薬、治療または予防法等と併用してもよい。このような他の医薬は、本発明の医薬組成物と共に一製剤を成していてもよいし、また、別々の製剤であって同時にまたは間隔を空けて投与してもよい。
【０１２４】
本発明に係る医薬組成物は、投与される動物自体は代謝することができないが、該医薬組成物に含まれる組換え微生物が利用できる栄養源を併用してもよい。例えば、ビフィドバクテリウム属細菌の増殖促進剤として、ラクツロース（Lactulose）またはラクトNビオースなどが挙げられる。
【０１２５】
本発明に係る医薬組成物に含まれる組換え微生物は、適当な抗生物質で殺すことができる。従って、本発明に係る医薬組成物を被験者に投与した後、一定の時間を置いて、抗生物質を被験者に投与することによって、被験者体内から組換え微生物を除去することができる。
【０１２６】
またさらに本発明に係る発現カセット、発現ベクターおよび組換え微生物は、所望のポリペプチドを工業的に生産するために使用することも当然可能である。具体的には、本発明に係る発現ベクターを含む組換え微生物を培養し、得られる培養物からポリペプチドを採取することにより、ポリペプチドを製造することができる。培養後、ポリペプチドが菌体外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体を除去する。ポリペプチドが菌体内または菌体の細胞表面上に生産される場合には、菌体を破砕することによりタンパク質を抽出する。ポリペプチドは、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、単離精製することができる。
【０１２７】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。以下の実施例の結果から、異種ポリペプチドの分泌発現、特に生物活性を持ったポリペプチドの分泌発現は、発現カセットの構成要素、すなわちプロモーター領域およびシグナル配列、また場合によりシグナル配列後挿入配列のそれぞれに大きく影響を受けることがわかる。
【実施例１】
【０１２８】
マウスIL-10を分泌発現する組換えB. longum 105-A
（１）マウスIL-10分泌発現用ベクターの構築
ビフィドバクテリウムプラスミドレプリコンがpTB6系のシャトルベクターpKKT427（元京都薬科大学・加納康正教授より供与；図１）のマルチクローニングサイト（MCS）のHindIIIとNotIの間に、発現カセットを挿入した。発現カセットは、HindIII、プロモーター領域、シグナル配列、シグナル配列後挿入配列、BamHIサイト、マウスIL-10 cDNA、終止コドン、SpeIサイト、ターミネーター、そしてNotIサイトの順に連結されている（図３）。したがって、発現されるタンパク質にはBamHIのGGATCCがコードするアミノ酸GSが挿入されている。また、マウスIL-10 cDNAは、元のシグナル配列を除いたものである。ここで、活性に不要なシステインの好ましくない反応を除去した方がよいという文献（Ball C, et al. Eur Cytokine Netw. 2001. 12(1):187-93.）を参考に、149番目のシステインがチロシンに置換された変異体（mIL-10 C149Y）を使用した（配列番号１５）。ターミネーター配列は、B. longum ATCC 15707のhup遺伝子のターミネーターをもとに、該配列が元来持っているSpeIサイトに一塩基変異を入れた配列番号１２を利用した。比較対照として、特許文献１（特許第3642755号）のプロモーター領域であるB. longum ATCC15707のhup遺伝子のプロモーター領域（配列番号１３）を使用した。BamHIサイト前までの発現カセットの組み合わせを表１に示す。
【表１】
2010126073.tif 000003
【０１２９】
なお、発現カセットの構築手順は次の通りである。末端にSpeIサイトとNotIサイトを付加したターミネーター配列を、PCR法で人工合成した。その合成DNA断片を、制限酵素SpeIとNotIで消化し、pBluescript II（Stratagene, La Jolla, CA）のマルチクローニングサイトのSpeIとNotIの間に挿入した。末端にBamHIサイトとSpeIサイトを付加したmIL-10 C149Y cDNAを、マウスIL-10 cDNA（Open BioSystems, Huntsville, AL）を鋳型として、PCR法で変異を導入して合成した。そのPCR増幅DNA断片を、制限酵素BamHIとSpeIで消化し、ターミネーターが既に挿入されているpBluescript IIのマルチクローニングサイトのBamHIとSpeIの間に挿入した。そして、cDNAとターミネーターを含むBamHIからNotIまでの断片を、pBluescript II からpKKT427のマルチクローニングサイトのBamHIとNotIの間に移しかえた。プロモーター領域は、B. longumゲノムからPCR法で増幅した。BL1181のシグナル配列およびシグナル配列後挿入配列も、B. longumゲノムからPCR法で増幅した。amyBのシグナル配列は、PCR法で人工合成した。プロモーター領域からシグナル配列まで、あるいはシグナル配列後挿入配列までは、それらPCR増幅DNA断片を鋳型として、末端にHindIIIサイトとBamHIサイトを付加して、PCR法で合成した。そのPCR増幅DNA断片を、制限酵素HindIII とBamHIで消化し、cDNAとターミネーターが既に挿入されているpKKT427のマルチクローニングサイトのHindIIIとBamHIの間に挿入した。そして、マウスIL-10分泌発現用ベクターを完成させた。PCR酵素には、KOD Plus Ver.2（Toyobo, Osaka, Japan）を使用した。完成したベクターの発現カセットは、全て配列を確認した。【０１３０】
（２）組換えB. longum 105-Aの培養上清中マウスIL-10タンパク質の検出
表１のAからHの各発現カセットを含むpKKT427を、B. longum 105-A（元京都薬科大学・加納康正教授より供与）に形質転換した。なお、ビフィドバクテリウムの形質転換のためのエレクトロポレーションは、12 kV/cm、25μF、200 Ωの条件で行った。また、ビフィドバクテリウムを培養するための培地として、MRS寒天培地を使用したが、これは、MRS液体培地（Lactobacilli MRS Broth（Difco Laboratories, Detroit, MI）、50 mMショ糖、3.4 mg/ml L-アスコルビン酸ナトリウム塩、および0.2 mg/ml L-システイン塩酸塩）に、Bacto Agar（Difco Laboratories）が1.5％の割合になるように混合したものである。スペクチノマイシンを添加する場合には、100μg/mlで添加した。【０１３１】
スペクチノマイシン含有MRS寒天培地に生えてきたコロニーを、各発現カセットにつき4クローンずつ拾った。各クローンをスペクチノマイシン含有MRS液体培地で前培養した後、MRS-HEPES培地（MRS液体培地と0.5 M HEPES Buffer Solution（pH 7.2〜7.5）を1:1で混合したもの）で希釈し、600nmの吸光度（OD600nm）で0.1に希釈した。37℃で6時間培養後、培養上清および菌体を回収した。菌体は、PBSで1回洗浄後、培養上清と等量のPBSで懸濁し、超音波破砕した。【０１３２】
培養上清および菌体破砕上清の各10μlを還元条件下でSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）後、PVDF膜に転写し、ウェスタンブロッティング法でマウスIL-10を検出した。一次抗体には、抗マウスIL-10抗体（PeproTech, Rocky Hill, NJ）を使用し、ECL plusウェスタンブロッティング検出試薬（GE Healthcare UK Ltd., Little Chalfont, Buckinghamshire, England）を用いた。陰性対照（Ctrl）には、発現カセットが入っていないpKKT427で形質転換されたB. longum 105-Aの培養上清を用いた。陽性対照には、市販の組換えmIL-10 C149Y（R&D Systems, Minneapolis, MN）を用いた。【０１３３】
図４に、イメージアナライザーLAS-3000（Fujifilm, 東京）で取得した、培養上清中IL-10のウェスタンブロット像を示す。ここで明瞭に示される通り、予想される分子量の位置にバンドが検出され、発現量の順番は、A < H < B < E < C < D < F < Gであった。同一発現カセットの4クローン間での差はほとんどなかった（data not shown）。特にシグナル配列後挿入配列を使用したクローン（C、D、F、G）では、IL-10タンパク質は、菌体中よりも上清中に多く含まれた（data not shown）。【０１３４】
ウェスタンブロット像上の各バンドを、陽性対照の市販の組換えマウスIL-10のバンドを標準として、LAS-3000に付属のソフトウェア、Image Gauge Ver. 4.0（Fujifilm, 東京）で解析すると、表２に示されるように、培養上清中IL-10濃度が算出された。従来の技術としては、B. longum NCC 2705のhup遺伝子のプロモーターとB. bifidum DSM 20215のβ-ガラクトシダーゼのシグナル配列を使用したヒトIL-10の分泌発現が報告されているが、培養上清中に検出された濃度は22 pg/mlであった（非特許文献１５：Reyes Escogido ML, et al. Biotechnol Lett. 2007. 29(8):1249-53.）。これに比べると、今回の系がはるかに優れていることは明らかである。また、プロモーターおよびシグナル配列の組み合わせと、シグナル配列後挿入配列の有無のそれぞれの効果が明確に示されている。
【表２】
2010126073.tif 000004
【０１３５】
（３）組換えB. longum 105-Aの培養上清中マウスIL-10の生物活性測定
マウス肥満細胞株MC/9（ATCC CRL-8306）を用いた増殖アッセイにより、培養上清中マウスIL-10の生物活性を測定した。はじめに、培養上清をNAPカラム（GE Healthcare）を用いたゲルろ過により、DMEM培地にバッファー交換した。MC/9細胞を1 X 104 cells/wellで96穴プレートにまいた。バッファー交換した溶液、あるいはバッファー交換した溶液を同バッファーで希釈して得られた希釈液を、MC/9細胞培養液の10％の容量で各ウェルに添加した。バッファー交換した溶液のMC/9細胞培養液中の最終濃度が、0〜10％（v/v）の各濃度となるようにした。72時間培養して、CellTiter-Glo（Promega, Madison, WI）を用いてアッセイを行った。陰性対照（Ctrl）には、発現カセットが入っていないpKKT427で形質転換されたB. longum 105-Aの培養上清を用いた。陽性対照には、市販の組換えmIL-10 C149Y（R&D Systems）を用いた。【０１３６】
アッセイの結果は図５に示される通りであった。バッファー交換した溶液の10％添加だと、培養上清中成分が多く含まれるためと考えられるが、増殖促進効果の伸びが抑えられた。2％添加の値で計算してみると、市販mIL-10 C149Yタンパク質（図５A）に対して、比活性はFとGがそれぞれ196％と42％であった（図５B）。また、10％添加の値で計算してみると、EはFに対して127％であった。したがって、シグナル配列後挿入配列を用いないEとシグナル配列後挿入配列にBL1181を用いたFは、市販のmIL-10 C149Yと生物活性が遜色なかった。一方、シグナル配列後挿入配列にLEISSを用いたGは、生物活性が低かった。【０１３７】
以上の結果から、本発明により、従来技術をはるかに上回るレベルでの、IL-10のビフィドバクテリウムでの分泌発現が可能になることが判る。IL-10タンパク質の分泌発現や他の異種タンパク質の菌体内発現が報告されているB. longumのhupのプロモーター領域に比べて、cbaHのプロモーター領域の方が優れていた。また、他の異種タンパク質の分泌発現への利用が報告されているamyBのシグナル配列に比べて、BL1181のシグナル配列の方が優れていた。さらに、シグナル配列後挿入配列の分泌促進効果は両者とも著しかった。しかしながら、IL-10の生物活性の点では、BL1181のシグナル配列後挿入配列を用いた方が優れていた。
【実施例２】
【０１３８】
マウスIL-10を分泌発現するB. breve ATCC 15700
（１）組換えB. breve ATCC 15700の培養上清中マウスIL-10タンパク質の検出
IL-10分泌発現用の実施例１の発現カセットが、ビフィドバクテリウム属のB. longum以外の菌種においても高い能力を持つかどうかを検証した。B. breve ATCC 15700を用いて、実施例１と同じように、表１の発現カセットFとHの発現をウェスタンブロッティングで観察した。結果は図６に示されている通り、B. longumにおけるのと同程度の高い分泌発現がB. breveにおいても観察された。【０１３９】
（２）組換えB. breve ATCC 15700の培養上清中マウスIL-10タンパク質の検出
ウェスタンブロット像上の各バンドを、実施例１と同じように解析すると、表３に示されるように、培養上清中IL-10濃度が算出された。
【表３】
2010126073.tif 000005
【０１４０】
以上の結果から、表１に示される発現カセットFとHは、B. longumに限定されず、ビフィドバクテリウム属の他の菌種であるB. breveにおいても、IL-10の高い分泌発現能力を持つことが示された。
【実施例３】
【０１４１】
pTB4系ベクターでマウスIL-10を分泌発現する組換えB. longum 105-A
（１）マウスIL-10分泌発現用pTB4系ベクターの構築
IL-10分泌発現用の実施例１の発現カセットが、実施例１のpTB6系プラスミド以外のビフィドバクテリウムプラスミド系ベクターにおいても高い能力を持つかどうかを検証した。ビフィドバクテリウムプラスミドレプリコンがpTB4系のpBSM4（元京都薬科大学・加納康正教授から入手したpBS423（加納康正、外６名、日本乳酸菌学会2008年度大会・一般講演６）にマルチクローニングサイト（MSC）を挿入したもの；図２A）のマルチクローニングサイト（MSC）のHindIIIとNotIの間に、実施例１の表１の中で上清中の生物活性が一番高かった発現カセットである発現カセットFを挿入した。【０１４２】
（２）組換えB. longum 105-Aの培養上清中マウスIL-10タンパク質の検出
発現カセットFでのIL-10の分泌発現について、実施例１と同じようにウェスタンブロッティングにより、pBSM4を用いた形質転換体4クローンをpKKT427 を用いた形質転換体と比較した。結果は図７に明確に示されている通り、pTB4系のpBSM4を用いた場合も、pTB6系のpKKT427を用いた場合とほぼ同等の分泌発現量であった。【０１４３】
以上の結果から、本発明の発現カセットの成果は、pTB6系のpKKT427ベクターを使用した場合に限定されるものでないことがわかる。このことはTRAIL/Apo2-Lの分泌発現の場合として、実施例８にも示される。
【実施例４】
【０１４４】
さまざまな長さのBL1181のシグナル配列後挿入配列を用いてマウスIL-10を分泌発現する組換えB. longum 105-A
実施例１の表１の発現カセットF 、すなわちcbaHのプロモーター領域、BL1181のシグナル配列、BL1181のシグナル配列後挿入配列の組み合わせにおいて、シグナル配列後挿入配列の長さを変えて、マウスIL-10の分泌発現量を検討した。【０１４５】
BL1181遺伝子産物のシグナル配列に続く、シグナル配列の直後から数えて、０、１、２、３、６、９、12、16個の連続するアミノ酸が、BL1181遺伝子産物のシグナル配列とBamHIサイトの間に挿入されるように、HindIIIサイトからBamHIサイトまでを、BamHI側のプライマーを変えることによってPCR法で人工合成することにより、発現カセットを構築した。【０１４６】
実施例１と同様に、mIL-10 C149Yを、pKKT427を用いてB. longum 105-Aで分泌発現させた。培養上清を、NAPカラムを用いたゲルろ過により、PBS/0.1％ BSAにバッファー交換し、ウェスタンブロッティング法で、分泌されたマウスIL-10タンパク質を検出した。図８に、バッファー交換した溶液中IL-10のウェスタンブロット像を示す。ここで示される通り、シグナル配列後挿入配列がない場合と比べて、シグナル配列後挿入配列が１、２、３、６、９、12、16個の場合の効果が明確に示されている。【０１４７】
実施例１と同様に、マウス肥満細胞株MC/9を用いた増殖アッセイにより、分泌されたマウスIL-10の生物活性を測定した。バッファー交換した溶液のアッセイの結果は図９に示される通りであった。ここで示される通り、シグナル配列後挿入配列がない場合と比べて、シグナル配列後挿入配列が１、２、３、６、９、12、16個のアミノ酸の場合の効果が明確に示されている。【０１４８】
以上の結果から、本発明により、BL1181遺伝子産物のシグナル配列に続く配列を用いる場合、シグナル配列後挿入配列の長さが、１から16アミノ酸のいずれの場合においても、分泌発現を著しく促進する効果を持つことが示された。
【実施例５】
【０１４９】
ヒトIL-2を分泌発現するB. longum 105-A
（１）ヒトIL-2分泌発現用ベクターの構築
pKKT427（図１）のマルチクローニングサイトのHindIIIとNotIの間に、発現カセットを挿入した。発現カセットは、HindIII、プロモーター領域、シグナル配列、シグナル配列後挿入配列、BamHIサイト、ヒトIL-2 cDNA、終止コドン、SpeIサイト、ターミネーター、そしてNotIサイトの順に連結されている（図３）。したがって、発現されるタンパク質にはBamHIのGGATCCがコードするアミノ酸GSが挿入されている。また、ここで用いられたヒトIL-2 cDNAは、元のシグナル配列を除いたものであり、活性に不要システインを除いた変異体（hIL-2 C145S）（Wang A, et al. Science. 1984. 224(4656):1431-3.）である（配列番号１６）。ターミネーター配列は、B. longum ATCC 15707のhup遺伝子のターミネーターをもとに、該配列が元来持っているSpeIサイトに一塩基変異を入れた配列番号１２を利用した。BamHIサイト前までの発現カセットの組み合わせを表４に示す。
【表４】
2010126073.tif 000006
【０１５０】
（２）組換えB. longum 105-Aの培養上清中ヒトIL-2タンパク質の検出
実施例１と同様に、菌の培養上清のウェスタンブロッティング解析を行った。一次抗体には、抗ヒトIL-2ポリクローナル抗体（R&D Systems）を使用した。陽性対照には、市販の組換えhIL-2 C145S（R&D Systems）を用いた。陰性対照（Ctrl）には、発現カセットが入っていないpKKT427で形質転換されたB. longum 105-Aの培養上清を用いた。図１０に、ウェスタンブロット像を示す。ここで明瞭に示される通り、予想される分子量の位置にバンドが検出され、発現量の順番は、A < C < B < E < Dであった。【０１５１】
ウェスタンブロット像上の各バンドを、実施例１と同じように解析すると、表５に示されるように、培養上清中IL-2濃度が算出された。ビフィドバクテリウムでのIL-2の発現は、知りうる限り、今回が初めての報告である。
【表５】
2010126073.tif 000007
【０１５２】
（３）組換えB. longum 105-Aの培養上清中ヒトIL-2の生物活性測定
マウス細胞傷害性T細胞株CTLL-2（ATCC TIB-214）を用いた増殖アッセイにより、培養上清中ヒトIL-2の生物活性を測定した。はじめに、培養上清をNAPカラム（GE Healthcare）を用いたゲルろ過により、PBS/0.1％ BSAにバッファー交換した。CTLL-2細胞を1 X 104cells/wellで96穴プレートにまいた。バッファー交換した溶液を、同バッファーで希釈した。その希釈液を細胞培養液の10％の容量で各ウェルに添加し、CTLL-2細胞培養液中のIL-2の最終濃度が0.01〜10ng/mlの各濃度になるようにした。24時間培養して、CellTiter-Glo（Promega）を用いてアッセイを行った。陰性対照（Ctrl）には、発現カセットが入っていないpKKT427で形質転換されたB. longum 105-Aの培養上清を用いた。陽性対照には、市販の組換えhIL-2 C145S（R&D Systems）を用いた。【０１５３】
アッセイの結果は図１１AおよびBに示される通りであった。市販のIL-2タンパク質に対する比活性は、表６の通りであり、市販のIL-2タンパク質と遜色がなかった。また、BL1181シグナル配列後挿入配列は活性低下をもたらさなかった。
【表６】
2010126073.tif 000008
【０１５４】
以上の結果から、IL-2の分泌発現においては、B. breveのhup遺伝子のプロモーター領域あるいはB. longumのcbaHのプロモーター領域、BL1181のシグナル配列およびBL1181のシグナル配列後挿入配列の組み合わせが特に優れていることが示された。
【実施例６】
【０１５５】
ヒトIL-4拮抗変異体を分泌発現するB. longum 105-A
（１）ヒトIL-4拮抗変異体分泌発現用ベクターの構築
pKKT427（図１）のマルチクローニングサイトのHindIIIとNotIの間に、発現カセットを挿入した。発現カセットは、HindIII、プロモーター領域、シグナル配列、シグナル配列後挿入配列、BamHIサイト、ヒトIL-4拮抗変異体cDNA、終止コドン、SpeIサイト、ターミネーター、そしてNotIサイトの順に連結されている（図３）。したがって、発現されるタンパク質にはBamHIのGGATCCがコードするアミノ酸GSが挿入されている。また、ここで用いられたヒトIL-4拮抗変異体cDNAは、ヒトIL-4の元のシグナル配列を除いた、3箇所のアミノ酸が置換された変異体（hIL4 T13D/R121D/Y124D）（米国特許第6,028,176号）である（配列番号１７）。ターミネーター配列は、B. longum ATCC 15707のhup遺伝子のターミネーターをもとに、該配列が元来持っているSpeIサイトに一塩基変異を入れた配列番号１２を利用した。BamHIサイト前までの発現カセットの組み合わせを表７に示す。
【表７】
2010126073.tif 000009
【０１５６】
（２）組換えB. longum 105-Aの培養上清中ヒトIL-4拮抗変異体タンパク質の検出
実施例１と同様に、菌の培養上清のウェスタンブロッティング解析を行った。一次抗体には、抗ヒトIL-4抗体（R&D Systems）を使用した。陰性対照には、発現カセットが入っていないpKKT427で形質転換されたB. longum 105-Aの培養上清を用いた（Ctrl）。陽性対照には、市販の組換えhIL-4（rhIL4）（R&D Systems）を用いた。【０１５７】
図１２に、ウェスタンブロット像を示す。IL-4拮抗変異体の発現は、IL-10（実施例１）やIL-2（実施例５）では有用なcbaHプロモーター領域とBL1181シグナル配列の組み合わせBでは観察されなかった。一方、rplJプロモーター領域とBL1181シグナル配列の組み合わせCでは、予想された分子量に分泌発現が観察された。ウェスタンブロット像上のCの#1のバンドを、実施例１と同じように解析すると、その上清中濃度は、49 ng/mlであった。ビフィドバクテリウムでのIL-4拮抗変異体の発現は、知りうる限り、今回が初めての報告である。【０１５８】
以上の結果から、IL-4拮抗変異体の分泌発現においては、rplJプロモーター領域とBL1181シグナル配列の組み合わせが優れていることが示された。
【実施例７】
【０１５９】
ヒトTRAIL/Apo2-Lを分泌発現するB. longum 105-A
（１）ヒトTRAIL/Apo2-L分泌発現用ベクターの構築
pKKT427（図１）のマルチクローニングサイトのHindIIIとNotIの間に、発現カセットを挿入した。発現カセットは、HindIII、プロモーター領域、シグナル配列、シグナル配列後挿入配列、BamHIサイト、ヒトTRAIL/Apo2-L cDNA、終止コドン、SpeIサイト、ターミネーター、そしてNotIサイトの順に連結されている（図３）。したがって、発現されるタンパク質にはBamHIのGGATCCがコードするアミノ酸GSが挿入されている。また、ここで用いられたヒトTRAIL/Apo2-L cDNAは、アミノ酸114-281の可溶化型（Ashkenazi A, et al. J Clin Invest. 1999. 104(2):155-62.）である（配列番号１８）。ターミネーター配列は、B. longum ATCC 15707のhup遺伝子のターミネーターをもとに、該配列が元来持っているSpeIサイトに一塩基変異を入れた配列番号１２を利用した。BamHIサイト前までの発現カセットの組み合わせを表８に示す。
【表８】
2010126073.tif 000010
【０１６０】
（２）組換えB. longum 105-Aの培養上清中ヒトTRAIL/Apo2-Lタンパク質の検出
実施例１と同様に、菌の培養上清のウェスタンブロッティング解析を行った。一次抗体には、ビオチン化抗ヒトTRAIL/Apo2-L抗体（R&D Systems）を使用した。陽性対照には、市販の組換え可溶化型hTRAIL/Apo2-L（PeproTech）を用いた。図１３に、表８の発現カセットAでの、各培養時間のウェスタンブロット像を示す。培養時間9時間では、幾分分解産物が見られている。培養時間6時間の培養上清中TRAIL/Apo2-Lの濃度は、1.08μg/mlと計算された。以下、培養時間6時間の培養上清について解析した。【０１６１】
図１４に、表８の発現カセットAからDのウェスタンブロット像を示す。また、図１５には、表８の発現カセットAとEのウェスタンブロット像を示す。図１４および１５において、Ctrlは、発現カセットが入っていないpKKT427で形質転換されたB. longum 105-Aの培養上清を示す。表９は、発現カセットAでの培養上清中TRAIL/Apo2-Lの濃度を100として、各発現カセットでの培養上清中TRAIL/Apo2-L濃度の比を示す。
【表９】
2010126073.tif 000011
【０１６２】
その他のプロモーター領域、シグナル配列およびシグナル配列後挿入配列の組み合わせも数多く試された。しかし、hupのプロモーター領域やcabHのプロモーター領域を上回る分泌発現量は得られなかった。また、例えばLactococcus lactisのP1プロモーターと usp45のシグナル配列（Steidler L, et al. Science. 2000. 289(5483):1352-5.）の組み合わせなど、異なる属で優良である発現カセットも、ビフィドバクテリウムでは、試みられた限り、上記AからEの組み合わせに遠く及ばなかった（data not shown）。【０１６３】
（３）組換えB. longum 105-Aの培養上清中ヒトTRAIL/Apo2-Lの生物活性測定
ヒト結腸直腸腺癌細胞株COLO 205（ATCC CCL-222）を用いたアポトーシスアッセイにより、培養上清中ヒトTRAIL/Apo2-Lの生物活性を測定した。COLO 205細胞を1 X 104 cells/wellで96穴プレートにまき、一晩接着させた。その後、フィルターろ過した組換えB. longum 105-Aの培養上清、またはフィルターろ過した培養上清をMRS-HEPES培地で希釈した液を、COLO 205細胞培養液の10％の容量で各ウェルに添加した。添加した組換えB. longum 105-Aの培養上清のCOLO 205細胞培養液中の最終濃度が、0〜10％（v/v）の各濃度になるようにした。24時間培養して、CellTiter-Glo（Promega, Madison, WI）を用いてアッセイを行った。陰性対照（Ctrl）には、発現カセットが入っていないpKKT427で形質転換されたB. longum 105-Aの培養上清を用いた。陽性対照には、市販の組換え可溶化型hTRAIL/Apo2-L（PeproTech）を用いた。【０１６４】
発現カセットAからDのアッセイの結果は図１６に示されるとおりであった。amyBのシグナル配列で分泌されたTRAIL/Apo2-Lは生物活性を持っていたが、予想外に、BL1181のシグナル配列で分泌されたものは生物活性が失われていた。【０１６５】
以上の結果から、TRAIL/Apo2-Lのビフィドバクテリウムでの分泌発現においては、cbaH遺伝子のプロモーター領域またはhup遺伝子のプロモーター領域、より好適にはB. breveのhup遺伝子のプロモーター領域と、amyBのシグナル配列の組み合わせが特に優れていることが示された。
【実施例８】
【０１６６】
pTB4系ベクターでヒトTRAIL/Apo2-Lを分泌発現するB. longum 105-A
（１）ヒトTRAIL/Apo2-L分泌発現用pTB4系ベクターの構築
TRAIL/Apo2-L分泌発現用の実施例７の発現カセットが、実施例７のpTB6系プラスミド以外のビフィドバクテリウムプラスミド系ベクターにおいても高い能力を持つかどうかを検証した。ビフィドバクテリウムプラスミドレプリコンがpTB4系のpBSM11（元京都薬科大学・加納康正教授から入手したpBS423（加納康正、外６名、日本乳酸菌学会2008年度大会・一般講演６）にマルチクローニングサイト（MSC）を挿入したもの；図２B）のマルチクローニングサイトのHindIIIとNotIの間に、実施例７の表８の中で上清中の生物活性が一番高かった発現カセットである発現カセットEを挿入した。【０１６７】
（２）組換えB. longum 105-Aの培養上清中ヒトTRAIL/Apo2-Lタンパク質の検出
発現カセットEでのTRAIL/Apo2-Lの分泌発現について、実施例１と同じようにウェスタンブロッティングにより、pBSM11を用いた形質転換体とpKKT427を用いた形質転換体を比較した。結果は図１７に明確に示されている通り、pTB4系のpBSM11を用いた場合も、pTB6系のpKKT427を用いた場合とほぼ同等の分泌発現量であった。【０１６８】
（３）組換えB. longum 105-Aの培養上清中ヒトTRAIL/Apo2-Lの生物活性測定
ヒト結腸直腸腺癌細胞株COLO 205（ATCC CCL-222）を用いたアポトーシスアッセイにより、培養上清中ヒトTRAIL/Apo2-Lの生物活性を測定した。はじめに、培養上清をNAPカラム（GE Healthcare）を用いたゲルろ過により、RPMI培地にバッファー交換した。COLO 205細胞を1 X 104 cells/wellで96穴プレートにまき、一晩接着させた。バッファー交換した溶液が各濃度になるよう同バッファーで希釈した。その希釈液をCOLO 205細胞培養液の10％の容量で各ウェルに添加した。24時間培養して、CellTiter-Glo（Promega, Madison,WI）を用いてアッセイを行った。陰性対照（Ctrl）には、発現カセットが入っていないpKKT427で形質転換されたB. longum 105-Aの培養上清を用いた。陽性対照には、市販の組換え可溶化型hTRAIL/Apo2-L（PeproTech）を用いた。pTB6系のpKKT427を用いた場合の細胞毒性（Cytotoxicity）を100とした時のpTB4系のpBSM11を用いた場合の細胞毒性の比活性は97であり、培養上清中TRAIL/Apo2-Lの生物活性ほぼ同等であった。【０１６９】
以上の結果から、本発明の発現カセットの成果は、pTB6系のpKKT427ベクターを使用した場合に限定されるものでないことがわかる。このことはIL-10の分泌発現の場合として、実施例３にも示される。
【実施例９】
【０１７０】
ヒトIFN-βを分泌発現するB. longum 105-A
（１）ヒトIFN-β分泌発現用ベクターの構築
pKKT427（図１）のマルチクローニングサイトのHindIIIとNotIの間に、発現カセットを挿入した。発現カセットは、HindIII、プロモーター領域、シグナル配列、シグナル配列後挿入配列、BamHIサイト、ヒトIFN-βcDNA、終止コドン、SpeIサイト、ターミネーター、そしてNotIサイトの順に連結されている（図３）。したがって、発現されるタンパク質にはBamHIのGGATCCがコードするアミノ酸GSが挿入されている。また、ここで用いられたヒトIFN-βcDNAは、元のシグナル配列を除いたものである（配列番号１９）。ターミネーター配列は、B. longum ATCC 15707のhup遺伝子のターミネーターをもとに、該配列が元来持っているSpeIサイトに一塩基変異を入れた配列番号１２を利用した。BamHIサイト前までの発現カセットの組み合わせを表１０に示す。
【表１０】
2010126073.tif 000012
【０１７１】
（２）組換えB. longum 105-Aの培養上清中ヒトIFN-βタンパク質の検出
実施例１と同様に、菌の培養上清のウェスタンブロッティング解析を行った。但しここでは、8時間培養後の培養上清および菌体を回収した。一次抗体には、ビオチン化抗ヒトIFN-βヤギポリクローナルIgG（R&D Systems）を使用した。陽性対照には、市販の組換えhIFN-β1a（PBL InterferonSource, Piscataway, NJ）を用いた。陰性対照（Ctrl）には、発現カセットが入っていないpKKT427で形質転換されたB. longum 105-Aの培養上清を用いた。図１８に、ウェスタンブロット像を示す。シグナル配列後挿入配列を用いた場合（発現カセットB〜E）のみ、主に予想された分子量に、分泌発現が観察された。【０１７２】
予想された分子量のバンドを実施例１と同じように解析すると、表１１に示されるように培養上清中IFN-β濃度が算出された。ビフィドバクテリウムでのI型IFNの発現は、知りうる限り、今回が初めての報告である。
【表１１】
2010126073.tif 000013
【０１７３】
（３）組換えB. longum 105-Aの培養上清中ヒトIFN-βの生物活性測定
iLite alphabeta Kit（Neutekbio, Galway, Ireland）を用いたレポーター遺伝子アッセイにより、BとDの培養上清中ヒトIFN-βの生物活性を測定した。はじめに、培養上清をNAPカラム（GE Healthcare）を用いたゲルろ過により、DMEM培地にバッファー交換した。アッセイの結果は図１９AおよびBに示されるとおりであった。計算された培養上清中のインターフェロン活性は、Bの#1が5.6 X 105IU/ml、#2が2.4 X 105IU/ml、Dの#1が1.9 X 104 IU/ml、#2が1.3 X 104 IU/mlであった。この結果から、インターフェロンの比活性としては、LEISSよりBL1181のシグナル配列後挿入配列を用いた方が優れていることが判る。【０１７４】
以上の結果から、シグナル配列後挿入配列を付加することによって、付加しない場合には分泌発現が検出できなかったIFN-βが高いレベルで分泌発現できるようになる、シグナル配列後挿入配列の劇的な効果が明らかである。そして、IFNの生物活性に関しては、LEISSよりBL1181のシグナル配列後挿入配列の方が優れていた。
【実施例１０】
【０１７５】
ヒトR-spondin 2を分泌発現するB. longum 105-A
（１）ヒトR-spondin 2分泌発現用ベクターの構築
pKKT427（図１）のマルチクローニングサイトのHindIIIとNotIの間に、発現カセットを挿入した。発現カセットは、HindIII、プロモーター領域、シグナル配列、シグナル配列後挿入配列、BamHIサイト、ヒトR-spondin 2 dC cDNA、タグ配列、終止コドン、SpeIサイト、ターミネーター、そしてNotIサイトの順に連結されている（図３）。したがって、発現されるタンパク質にはBamHIのGGATCCがコードするアミノ酸GSが挿入されている。また、ここで用いられたヒトR-spondin 2 cDNAは、ヒトR-spondin 2のシグナル配列およびC末端の電荷に富むアミノ酸が多い領域をコードする配列を除いたdC型（R-spondin 2 dC）である（配列番号20；WO2007/013666号）。タグ配列は、V5タグとポリヒスチジンタグを含む人工配列をコードするDNAである（配列番号21）。ターミネーター配列は、B. longum ATCC 15707のhup遺伝子のターミネーターをもとに、該配列が元来持っているSpeIサイトに一塩基変異を入れた配列番号１２を利用した。BamHIサイト前までの発現カセットの組み合わせを表１２に示す。
【表１２】
2010126073.tif 000014
【０１７６】
（２）組換えB. longum 105-Aの培養上清中ヒトR-spondin 2タンパク質の検出
実施例１と同様に、菌の培養上清のウェスタンブロッティング解析を行った。但しここでは、8時間培養後の培養上清および菌体を回収した。検出用抗体には、HRP標識抗ポリヒスチジンマウスモノクローナル抗体（R&D Systems）を使用した。陽性対照には、精製組換えR-spondin 2 dCタンパク質（WO2007/013666号）を用いた。陰性対照（Ctrl）には、発現カセットが入っていないpKKT427で形質転換されたB. longum 105-Aの培養上清を用いた。図２０に、ウェスタンブロット像を示す。菌体内の残存がかなりあったものの、予想された分子量に、分泌発現が観察された。【０１７７】
予想された分子量のバンドを実施例１と同じように解析すると、表１３に示されるように培養上清中R-spondin 2濃度が算出された。この結果から、シグナル配列後挿入配列LEISSは、分泌させるタンパク質量としては、BL1181より優れていることが判る。ビフィドバクテリウムでのR-spondinsの発現は、知りうる限り、今回が初めての報告である。
【表１３】
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【０１７８】
以上の結果から、本発明によってR-spondin 2がビフィドバクテリウムで分泌発現しうることが判った。
【実施例１１】
【０１７９】
ヒトTRAIL/Apo2-L発現ビフィドバクテリウムのin vivo腫瘍成長抑制効果（１）
7週齢の雌のBALB/cヌードマウス（Charles River Laboratories Japan, Yokohama, Japan）に、5 X 106のCOLO 205細胞（ATCC CCL-222）を皮下移植し、よく確立された腫瘍を得た。その腫瘍組織を採取し、切断することによって、約3 mm3角のCOLO 205腫瘍片を得た。その腫瘍片を7週齢の雌のBALB/cヌードマウスに皮下移植し、担癌マウスを得た。マウスは、腫瘍サイズが平均243 mm3に達した時（day 0）に群分けされた（n = 8）。腫瘍体積は、Day 0で100％に正規化された。Day 1、4、8および11に、注射器を用いて約2 X 108 cfuの菌50μlを腫瘍内に投与した。なお、別の２群には、同容量のビヒクル（PBS）のみ、または発現カセットが入っていない空のpKKT427で形質転換された組換えB. longum 105-Aを腫瘍内に投与した。使用したビフィドバクテリウム菌は、遠心およびPBSへの再懸濁によって調製した。全てのマウスには、体内のビフィドバクテリウムの栄養補助のために、週3回1 mlの20％ラクツロース（Sigma-Aldrich, St Louis, MO）を腹腔に投与した。【０１８０】
図２１は、発現カセットが入っていない空のpKKT427で形質転換された陰性対照の組換えB. longum 105-A（Ctrl）と比較して、hupプロモーター領域とamyBシグナル配列で可溶化型ヒトTRAIL/Apo2-Lを分泌発現するB. longum 105-A（表８のA）（TRAIL）が、確立した腫瘍の成長を明らかに抑制したことを示す。データは、平均 + SEMで表示されている。【０１８１】
図２２は、同じ実験の体重変化を示す。全群で餌の交換によると考えられる体重の増減が見られるが、TRAIL/Apo2-L発現菌投与群で体重の減少が小さかった。
【実施例１２】
【０１８２】
ヒトTRAIL/Apo2-L発現ビフィドバクテリウムのin vivo腫瘍成長抑制効果（２）
7週齢の雌のBALB/cヌードマウス（Charles River Laboratories Japan, Yokohama, Japan）に、5 X 106のCOLO 205細胞を皮下移植し、よく確立された腫瘍を得た。その腫瘍組織を採取し、切断することによって、約3 mm3角のCOLO 205腫瘍片を得た。その腫瘍片を7週齢の雌のBALB/cヌードマウスに皮下移植し、担癌マウスを得た。マウスは、腫瘍サイズが平均444 mm3に達した時（day 0）に群分けされた。腫瘍体積は、Day 0で100％に正規化された。Day 0に注射器を用いて約2 X 108 cfuの菌50μlを腫瘍内に投与した。使用したビフィドバクテリウム菌は、遠心およびPBSへの再懸濁によって調製した。マウスには、体内のビフィドバクテリウムの栄養補助のために、週3回1 mlの20％ラクツロース（Sigma-Aldrich, St Louis, MO）を腹腔に投与した。【０１８３】
図２３は、陰性対照の組換えB. longum 105-A（Ctrl）（n = 4）と比較して、cbaHプロモーター領域とamyBのシグナル配列で可溶化型ヒトTRAIL/Apo2-Lを分泌発現するB. longum 105-A（表８のC）（TRAIL）（n = 5）が、確立した腫瘍の成長をわずか単回の投与で抑制したことを示す。データは、平均 + SEMで表示されている。【０１８４】
実施例１１および１２の結果から、可溶化型TRAILを発現するビフィドバクテリウムが、腫瘍治療に有用である可能性が示された。【０１８５】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、その全文を参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１８６】
本発明により、ビフィドバクテリウムにおいてポリペプチドを効率的に分泌発現させ得る発現カセットが提供される。かかる発現カセットは、ポリペプチドを分泌発現する組換え微生物の作製に有用である。またかかる組換え微生物は、ヒトを含む動物の疾患の治療および／または予防をするための医薬品または医薬品を構成する成分として利用され得る。そして疾患に対する新たな治療法および／または予防法を提供し得る。また、上記発現カセットおよび組換え微生物は、工業的なポリペプチドの生産にも利用され得る。
【配列表フリーテキスト】
【０１８７】
配列番号８：合成ペプチド（シグナル配列後挿入配列）
配列番号９：合成ペプチド（シグナル配列後挿入配列）
配列番号１０：合成DNA（シグナル配列後挿入配列）
配列番号１１：合成DNA（シグナル配列後挿入配列）
配列番号１２：合成ターミネーター配列
配列番号１４：合成DNA
配列番号１５：合成DNA（マウスインターロイキン10成熟ペプチドC149Y変異体cDNA）
配列番号１６：合成DNA（ヒトインターロイキン2成熟ペプチドC145S変異体cDNA）
配列番号１７：合成DNA（ヒトインターロイキン4成熟ペプチドT13D/R121D/Y124D変異体cDNA）
配列番号２０：合成DNA（ヒトdC型R-spondin2 成熟ペプチドcDNA）
配列番号２１：合成DNA（タグ配列）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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