(57)【要約】  MMP-2を特異的に阻害することができる物質を提供する。β−アミロイド前駆体蛋白質分子のマトリックスメタロプロテアーゼ−２選択的阻害活性領域と、潜在型マトリックスメタロプロテアーゼに結合可能な組織メタロプロテアーゼ阻害物質とを含む融合分子。前記融合分子を含有する、医薬組成物、癌転移及び/又は血管新生抑制剤及び循環器系疾患の治療及び/又は予防薬、並びにマトリックスメタロプロテアーゼ−２阻害剤。
2010041617.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−アミロイド前駆体蛋白質分子のマトリックスメタロプロテアーゼ−２選択的阻害活性領域と、潜在型マトリックスメタロプロテアーゼ−２に結合可能な組織メタロプロテアーゼ阻害物質とを含む融合分子。
【請求項２】
β−アミロイド前駆体蛋白質分子のマトリックスメタロプロテアーゼ−２選択的阻害活性領域のN末端及び/又はC末端に１〜１０個のアミノ酸が付加されている請求項１記載の融合分子。
【請求項３】
潜在型マトリックスメタロプロテアーゼ−２に結合可能な組織メタロプロテアーゼ阻害物質が、組織メタロプロテアーゼ阻害物質２、３及び４からなる群より選択される請求項１又は２記載の融合分子。
【請求項４】
請求項１記載の融合分子をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項６】
請求項５記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項７】
請求項６記載の形質転換体を培養することを含む、融合分子の製造方法。
【請求項８】
請求項１記載の融合分子を含有する医薬組成物。
【請求項９】
請求項１記載の融合分子を含有する癌転移及び/又は血管新生抑制剤。
【請求項１０】
請求項１記載の融合分子を含有する循環器系疾患の治療及び/又は予防薬。
【請求項１１】
循環器系疾患が、心筋梗塞、動脈硬化及び肥大型心筋症からなる群より選択される請求項１０記載の治療及び/又は予防薬。
【請求項１２】
請求項１記載の融合分子を含有するマトリックスメタロプロテアーゼ−２阻害剤。
【請求項１３】
請求項１記載の融合分子を投与することを含む、癌転移及び/又は血管新生の抑制方法。
【請求項１４】
請求項１記載の融合分子を投与することを含む、循環器系疾患の治療及び/又は予防方法。
【請求項１５】
請求項１記載の融合分子を使用することを含む、マトリックスメタロプロテアーゼ−２の阻害方法。
【請求項１６】
医薬として使用するための、請求項１記載の融合分子。
【請求項１７】
癌転移及び/又は血管新生の抑制に使用するための、請求項１記載の融合分子。
【請求項１８】
癌転移及び/又は血管新生抑制剤を製造するための、請求項１記載の融合分子の使用。
【請求項１９】
循環器系疾患の治療及び/又は予防に使用するための、請求項１記載の融合分子。
【請求項２０】
循環器系疾患の治療及び/又は予防薬を製造するための、請求項１記載の融合分子の使用。
【請求項２１】
マトリックスメタロプロテアーゼ−２阻害剤として使用するための、請求項１記載の融合分子。
【請求項２２】
マトリックスメタロプロテアーゼ−２阻害剤を製造するための、請求項１記載の融合分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−アミロイド前駆体蛋白質由来マトリックスメタロプロテアーゼ−２インヒビターペプチドと組織メタロプロテアーゼ阻害物質との融合タンパク質及びその用途、より詳細には、β−アミロイド前駆体蛋白質分子のマトリックスメタロプロテアーゼ−２選択的阻害活性領域と、潜在型マトリックスメタロプロテアーゼ−２に結合可能な組織メタロプロテアーゼ阻害物質とを含む融合分子及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
マトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs）は細胞外マトリックスタンパク質に対し高い分解活性を持つタンパク質分解酵素であり、癌が浸潤・転移する際、細胞の移動を支えると考えられている（非特許文献１）。一方、ノックアウトマウスを用いた解析結果から、MMP-2が癌組織内での血管新生を促進することが示唆されている（非特許文献２）。したがって、MMPsは癌転移抑制剤や癌増殖抑制剤開発の上での恰好の標的分子であり、現在までにヒドロキサム酸誘導体をベースとした多くのMMPs阻害剤が製薬企業を中心に開発されて来た。【０００３】
従来開発されて来たMMPs阻害剤はその特異性の低さから、生体内で標的MMP以外のMMPsも阻害し、予想外の副作用を示すことが分かってきた。このため、現在、殆どの製薬企業がMMPs阻害剤開発から撤退している。加えて、MMPsの中には、癌の浸潤、転移を抑制するものがあり、特異性の低い阻害剤によって全てのMMPsが阻害されると、標的となるMMP活性抑制の効果が相殺された上、癌転移を助長する可能性さえ示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Werb,Z. (1997) Cell 91, 439-442
【非特許文献２】Ito,T et al. (1998) Cancer Res. 58, 1048-1051
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、MMP-2を特異的に阻害することができる物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、β-アミロイド前駆体蛋白質（APP）分子内の部分アミノ酸配列であるISYGNDALMP配列（APP-IP）にMMP-2に選択的なインヒビター活性があることを見出した(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 16, April 18, pp. 14020-14028, 2003)。このAPP-IPは従来のヒドロキサム酸系MMPs阻害剤や天然のインヒビタータンパク質であるTIMPsとは異なる阻害様式でMMP-2活性を阻害する。APP-IPと、潜在型MMP-2に結合可能な組織メタロプロテアーゼ阻害物質（例えば、TIMP-2）との融合タンパク質(図２)は、潜在型MMP-2に結合可能な組織メタロプロテアーゼ阻害物質（例えば、TIMP-2）がもつMMP-2結合部位とAPP-IPのMMP-2選択的阻害部位が相補的に生かされることにより、高親和性であり、かつ特異性の高いMMP-2インヒビターとなることが明らかになった。本発明はこれらに知見に基づいて完成されたものである。【０００７】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）β−アミロイド前駆体蛋白質分子のマトリックスメタロプロテアーゼ−２選択的阻害活性領域と、潜在型マトリックスメタロプロテアーゼ−２に結合可能な組織メタロプロテアーゼ阻害物質とを含む融合分子。
（２）β−アミロイド前駆体蛋白質分子のマトリックスメタロプロテアーゼ−２選択的阻害活性領域のN末端及び/又はC末端に１〜１０個のアミノ酸が付加されている（１）記載の融合分子。
（３）潜在型マトリックスメタロプロテアーゼ−２に結合可能な組織メタロプロテアーゼ阻害物質が、組織メタロプロテアーゼ阻害物質２、３及び４からなる群より選択される（１）又は（２）記載の融合分子。
（４）（１）記載の融合分子をコードするＤＮＡ。
（５）（４）記載のＤＮＡを含有するベクター。
（６）（５）記載のベクターを含む形質転換体。
（７）（６）記載の形質転換体を培養することを含む、融合分子の製造方法。
（８）（１）記載の融合分子を含有する医薬組成物。
（９）（１）記載の融合分子を含有する癌転移及び/又は血管新生抑制剤。
（１０）（１）記載の融合分子を含有する循環器系疾患の治療及び/又は予防薬。
（１１）循環器系疾患が、心筋梗塞、動脈硬化及び肥大型心筋症からなる群より選択される（１０）記載の治療及び/又は予防薬。
（１２）（１）記載の融合分子を含有するマトリックスメタロプロテアーゼ−２阻害剤。
（１３）（１）記載の融合分子を投与することを含む、癌転移及び/又は血管新生の抑制方法。
（１４）（１）記載の融合分子を投与することを含む、循環器系疾患の治療及び/又は予防方法。
（１５）（１）記載の融合分子を使用することを含む、マトリックスメタロプロテアーゼ−２の阻害方法。
（１６）医薬として使用するための、（１）記載の融合分子。
（１７）癌転移及び/又は血管新生の抑制に使用するための、（１）記載の融合分子。
（１８）癌転移及び/又は血管新生抑制剤を製造するための、（１）記載の融合分子の使用。
（１９）循環器系疾患の治療及び/又は予防に使用するための、（１）記載の融合分子。
（２０）循環器系疾患の治療及び/又は予防薬を製造するための、（１）記載の融合分子の使用。
（２１）マトリックスメタロプロテアーゼ−２阻害剤として使用するための、（１）記載の融合分子。
（２２）マトリックスメタロプロテアーゼ−２阻害剤を製造するための、（１）記載の融合分子の使用。
従来の低特異性MMPs阻害剤とは異なり、本発明の融合タンパク質は極めて特異性の高いMMP-2インヒビターであることから、このインヒビターは副作用が極めて少なく、かつ、有効な癌転移抑制剤および血管新生抑制剤として利用できる可能性が高い。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の融合タンパク質は、高親和性であり、かつ特異性の高いMMP-2インヒビターである。【０００９】
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2008‐262415の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】APP-IP-TIMP-2融合タンパク質のMP-2とMMP-9に対する阻害活性を示すグラフである。
【図２】APP-IP-TIMP-2融合タンパク質設計の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
【００１２】
本発明は、β−アミロイド前駆体蛋白質分子のマトリックスメタロプロテアーゼ−２選択的阻害活性領域(APP-IP)と、潜在型マトリックスメタロプロテアーゼ−２(潜在型MMP-2)に結合可能な組織メタロプロテアーゼ阻害物質(TIMP)とを含む融合分子を提供する。
【００１３】
APP-IPは、β-アミロイド前駆体蛋白質（APP）分子内の部分アミノ酸配列(ISYGNDALMP配列)であり、MMP-2に選択的なインヒビター活性がある(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 16, April 18, pp. 14020-14028, 2003)。このAPP-IPは従来のヒドロキサム酸系MMPs阻害剤や天然のインヒビタータンパク質であるTIMPsとは異なる阻害様式でMMP-2活性を阻害する。すなわち、MMP-2の基質認識部位と相互作用する際に、ヒドロキサム酸系MMPs阻害剤やTIMPsは基質ペプチドと同様のN末端-C末端配向で相互作用するがAPP-IPはこのN末端-C末端配向が逆向きになるように相互作用する（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 283, No. 15, April 11, pp. 10068-10078, 2008）。
【００１４】
APP-IPの由来生物は、ヒトが好ましいが、ヒトに限らず、他の哺乳動物（マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）であってもよい。
【００１５】
ヒトMMP-2は細胞内で生合成された後、細胞外に分泌されるが、分泌直後は６３１アミノ酸残基からなっており、その分子内のN末端側に”プロペプチド領域”と呼ばれる８０アミノ酸残基からなる分子内インヒビター領域を持っている。MMP-2のこの型を”潜在型”とよぶ。潜在型MMP-2は、プロペプチド領域があるために酵素活性を持たない。また、TIMPsなどのインヒビターが潜在型MMP-2の触媒活性部位に結合することはできない。一方、潜在型MMP-2が他のプロテアーゼの働きなどでそのプロペプチド領域が切断、除去されると、分子内インヒビターが剥がれ、酵素活性を持つようになる。潜在型MMP-2のN末端側８０アミノ酸残基が除去された５５１アミノ酸残基からなる型を活性型MMP-2とよぶ。
【００１６】
潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとしては、組織メタロプロテアーゼ阻害物質２、３、４(TIMP-2, 3及び4)などを例示することができる。TIMP-2, 3及び4のC末端側領域は、MMP-2のヘモペキシン様領域と結合できる。
【００１７】
組織メタロプロテアーゼ阻害物質２(TIMP-2)は、MMPsに対する生理的タンパク質インヒビターであり、ほぼ全てのMMPsに対し、阻害活性を持つ（Murphy, G., and Nagase, H. (2006) Cardiovasc. Res. 69, 562-573）。一方、TIMP-2は細胞膜結合型-1MMP (MT1-MMP)が触媒する潜在型MMP-2の活性化を促進する。TIMP-2による潜在型MMP-2の活性化促進の機序は、まず、潜在型MMP-2がTIMP-2およびMT1-MMPとともに３分子複合体を形成しつつ、細胞膜上に濃縮される。この３分子複合体の中では、MT1-MMPの活性部位にTIMP-2のインヒビター活性部位であるN末端領域が結合し、さらにTIMP-2のインヒビター活性部位ではないC末端領域に潜在型MMP-2のヘモペキシン様領域が結合している。次に、細胞膜上に濃縮された潜在型MMP-2を同じ細胞膜上のTIMP-2が結合していないMT1-MMP分子が限定分解により活性化する（Strongin, A. Y., Collier, I., Bannikov, G., Marmer B. L., Grant, G. A., and Goldberg, G. I. (1995) J. Biol. Chem. 270, 5331-5338）。
【００１８】
TIMP-2塩基配列（登録番号; NM003255.4  データベース; NCBI）(配列番号３)
TIMP-2のアミノ酸（登録番号; NP003246.1  データベース; NCBI）(配列番号４)
ヒトTIMP-2のアミノ酸配列と塩基配列をそれぞれ配列番号４及び３に示す。TIMP-2は細胞内で生合成された後、シグナルペプチドが切断されて、細胞外に分泌される（これが活性を持つ成熟型となる）ので、生合成直後はMetがN末端に存在するが、分泌後は２７番目のCysが１番となる。TIMP-2のアミノ酸残基のナンバリングは成熟型を基とするのが通常となっている。配列番号４のアミノ酸配列は、N末端にシグナルペプチド（１〜２６番目）を含む。配列番号３は、配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列である。
【００１９】
組織メタロプロテアーゼ阻害物質３および４(TIMP-３およびTIMP-４)もTIMP-2と同様、MMPsに対する生理的タンパク質インヒビターであり、ほぼ全てのMMPsに対し、阻害活性を持つ。加えて、TIMP-3はADAM10、ADAM12、ADAM17およびADAM-TS1、ADAM-TS4、 ADAM-TS5など、MMPs以外のファミリーに属するメタロプロテアーゼの活性も阻害する。また、TIMP-３およびTIMP-４はTIMP-2と同様にMMP-2の触媒活性部位以外の領域に結合することができる（Murphy, G., and Nagase, H. (2006) Cardiovasc. Res. 69, 562-573）。
【００２０】
TIMP-3塩基配列（登録番号; NM_000362.4  データベース;NCBI）(配列番号１０)
TIMP-3アミノ酸配列（登録番号; NP_000353.1  データベース; NCBI）(配列番号１１)
TIMP-4 塩基配列（登録番号;NM_003256.2  データベース：NCBI）(配列番号１２)
TIMP-4アミノ酸配列（登録番号; NP_003247.1  データベース; NCBI）(配列番号１３)
ヒトTIMP-3のアミノ酸配列と塩基配列をそれぞれ配列番号１１及び１０に示す。TIMP-3は細胞内で生合成された後、シグナルペプチドが切断されて、細胞外に分泌される（これが活性を持つ成熟型となる）ので、生合成直後はMetがN末端に存在するが、分泌後は２４番目のCysが１番となる。TIMP-3のアミノ酸残基のナンバリングは成熟型を基とするのが通常となっている。配列番号１１のアミノ酸配列は、N末端にシグナルペプチド（１〜２３番目）を含む。配列番号１０は、配列番号１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列である。
【００２１】
ヒトTIMP-4のアミノ酸配列と塩基配列をそれぞれ配列番号１３及び１２に示す。TIMP-4は細胞内で生合成された後、シグナルペプチドが切断されて、細胞外に分泌される（これが活性を持つ成熟型となる）ので、生合成直後はMetがN末端に存在するが、分泌後は３０番目のCysが１番となる。TIMP-4のアミノ酸残基のナンバリングは成熟型を基とするのが通常となっている。配列番号１３のアミノ酸配列は、N末端にシグナルペプチド（１〜２９番目）を含む。配列番号１２は、配列番号１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列である。
【００２２】
TIMP-2, 3及び4の由来生物は、ヒトが好ましいが、ヒトに限らず、他の哺乳動物（マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等）であってもよい。
【００２３】
APP-IPのN末端及び/又はC末端には、１〜１０個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸が付加されていてもよい。このようなアミノ酸の付加は、真核細胞を用いて本融合タンパク質を生合成させる際、N末端側のアミノ酸の付加によりシグナルペプチダーゼがAPP-IP配列内で切断する事を防ぐほか、生体内でアミノペプチダーゼの作用によりAPP-IP部分が削られる事を防ぐ目的を持つ。一方、C末端側のグリシン残基の挿入は潜在型MMP-2に結合可能なTIMP本体とAPP-IP部分の間に柔軟性の高いスペーサーを導入し、潜在型MMP-2に結合可能なTIMPのC末端領域とMMP-2のヘモペキシン様領域との結合に伴って、潜在型MMP-2に結合可能なTIMPのN末端側にあるAPP-IP部分が効率よくMMP-2の活性部位に近づけることを目的としてなされる。
【００２４】
APP-IPのN末端に付加するアミノ酸又はペプチドとしては、AGG、AGGG、AAGG、AAGGGなどが好ましいが、これらに限定されることはない。APP-IPのC末端に付加するアミノ酸又はペプチドとしては、GG、GGG、GGGGなどが好ましいが、これらに限定されることはない。
【００２５】
潜在型MMP-2に結合可能なTIMPは、APP-IPのC末端側に付加するとよい。
【００２６】
APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質は潜在型MMP-2に結合可能なTIMPがもつMMP-2結合部位とAPP-IPのMMP-2選択的阻害部位が相補的に生かされることにより、高親和性であり、かつ特異性の高いMMP-2インヒビターとなることを本発明者は明らかにした（後述の実施例参照）。MMP-2の触媒活性およびその活性に及ぼす阻害効果は過去の文献 (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 16, April 18, pp. 14020-14028, 2003) に従い、蛍光消光系合成ペプチド基質を用いて、測定する事が可能である。
【００２７】
APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質の一例（後述の実施例で作製した、APP-IPとTIMP-2との融合タンパク質）のアミノ酸配列を配列番号６に示す。このアミノ酸配列は、N末端にTIMP-2のシグナル配列(１〜２６番目)を有する。また、APP-IPのN末端にAAGG、C末端にGGGのアミノ酸配列が付加されている。配列番号６のアミノ酸配列からなる融合タンパク質が細胞内で生合成された後、シグナル配列(１〜２６番目)が切断されて、細胞外に分泌される（これが、成熟型となる）。成熟型のアミノ酸配列を配列番号７に示す。本発明の「APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合分子」は、成熟型のみならず、シグナル配列が存在するものも含む。
【００２８】
APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質の機能を保持する変異体（例えば、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個（通常、50個以内、好ましくは10個以内）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつAPP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質と同様の生物学的活性を有するタンパク質）も本発明に包含される。APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質の生物学的活性とは、例えば、MMP-2インヒビター活性を挙げることができる。
【００２９】
APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMP質との融合タンパク質は、公知の方法によって製造することができる。例えば、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを得、得られたＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んだ後、適当な宿主に導入し、形質転換された宿主を培養し、組換え蛋白質として生産させることにより、融合タンパク質を製造することができる（例えば、西郷薫、佐野弓子共訳、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳコンパクト版、分子生物学実験プロトコール、Ｉ、II、III、丸善株式会社：原著、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【００３０】
あるいはまた、本発明の融合タンパク質を公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
【００３１】
さらに、本発明は、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
【００３２】
APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質をコードする単離されたＤＮＡは、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。例えば、配列番号５の塩基配列で表されるＤＮＡ、配列番号６のアミノ酸配列（ヒト由来のAPP-IPとTIMP-2との融合タンパク質のアミノ酸配列）からなる融合タンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号５の塩基配列で表されるＤＮＡ）に相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつAPP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMP（例えば、TIMP-2）との融合タンパク質と同様の生物学的活性を有するタンパク質をコードするDNAなどを例示することができる。APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMP（例えば、TIMP-2）との融合タンパク質の生物学的活性とは、例えば、MMP-2インヒビター活性を挙げることができる。
【００３３】
配列番号６のアミノ酸配列からなる融合タンパク質をコードするDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAは、配列番号６のアミノ酸配列からなる融合タンパク質をコードするDNAに相補的なDNAの全部又は一部と少なくとも80%（好ましくは、少なくとも95%、より好ましくは、少なくとも98%）の同一性があるとよい。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行われる。核酸二本鎖又はハイブリッドの安定性は、融解温度Tm（プローブが標的DNAから解離する温度）で表される。この融解温度はストリンジェントな条件を定義するために用いられる。1%のミスマッチによりTmが１℃低下すると仮定すると、ハイブリダイゼーション反応の最終洗浄の温度を低くしなければならない。例えば、プローブと95%以上の同一性を有する配列を求める場合には、最終洗浄温度を５℃低くしなければならない。実際、1%のミスマッチにつき、0.5〜1.5℃の間でTmが変わることになる。ストリンジェントな条件の例としては、5x SSC/5x デンハルト溶液/1.0% SDS中68℃でハイブリダイズさせ、0.2x SSC/0.1%SDS中室温で洗浄することである。中程度にストリンジェントな条件の例としては、3x SSC中42℃で洗浄することである。塩濃度や温度は、プローブと標的核酸との同一性の最適なレベルを達成するために変更されうる。このような条件に関するさらなる指針として、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons. N.Y.)  at Unit 2.10を参照されたい。
【００３４】
配列番号６のアミノ酸配列からなる融合タンパク質をコードするDNAとしては、配列番号５の塩基配列で表されるDNAを例示することができる。
【００３５】
本発明のAPP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMP（例えば、TIMP-2）との融合タンパク質をコードする単離されたＤＮＡは、例えば、以下のようにして製造することができる。ヒトTIMP-2をコードするDNAを、その塩基配列（配列番号３）の中に含まれる制限酵素部位Eco52 IおよびPst Iで切断した後、この２つの制限酵素部位の間に一対の相補的な合成ＤＮＡ鎖（センス側：5'-GGCCGACGCCGCCGCAGGAGGAATTAGTTATGGTAATGATGCATTAATGCCAGGAGGAGGCTGCA-3'（配列番号８）  およびアンチセンス側：5'-GCCTCCTCCTGGCATTAATGCATCATTACCATAACTAATTCCTCCTGCGGCGGCGTC-3'（配列番号９））をアニーリングにより２本鎖化したものをDNAリガーゼを用いて挿入し、これをE.coliに導入してクローン化することで作製することができる。
【００３６】
APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMP（例えば、TIMP-2）との融合タンパク質の変異体をコードするＤＮＡは、融合タンパク質のコード領域の所望の部位を点突然変異誘発法により変異させることにより作製することができる。変異させた融合タンパク質のコード領域をPCRによって増幅する。得られたPCR産物がAPP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMP（例えば、TIMP-2）との融合タンパク質の変異体をコードするＤＮＡである。
【００３７】
本発明は、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを提供する。
【００３８】
APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターは、公知の方法（例えば、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法）により、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入することにより得られる。
【００３９】
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３， pGACAG）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，アデノウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫病原ウイルスなどを用いることができる。
【００４０】
発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジンなどを付加してもよい。
【００４１】
また、発現ベクターは、融合タンパク質発現ベクターであってもよい。種々の融合タンパク質発現ベクターが市販されており、pGEXシリーズ（アマシャムファルマシアバイオテク社）、pET CBD Fusion System 34b-38b（Novagen社）、pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b（Novagen社）、pET GST Fusion System 41 and 42（Novagen社）などを例示することができる。
【００４２】
APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを宿主に導入することにより、形質転換体を得ることができる。本発明は、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを含む形質転換体も提供する。
【００４３】
宿主としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、S2細胞、Sf細胞など）、動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK293細胞など）、植物細胞などを例示することができる。
【００４４】
組換えベクターを宿主に導入するには、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法（例えば、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、トランスフェクション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、エレクロトポレーション法、形質導入法、スクレープローディング法、ショットガン法など）または感染により行うことができる。
【００４５】
形質転換体を培地で培養し、培養物からAPP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質を採取することができる。融合タンパク質が培地に分泌される場合には、培地を回収し、その培地から融合タンパク質を分離し、精製すればよい。融合タンパク質が形質転換された細胞内に産生される場合には、その細胞を溶解し、その溶解物から融合タンパク質を分離し、精製すればよい。
【００４６】
融合タンパク質がタグとの融合タンパク質の形態で発現される場合には、タグ付き融合タンパク質を分離及び精製した後に、FactorXaや酵素（エンテロキナーゼ）処理をすることにより、タグを切断し、目的とする融合タンパク質を得ることができる。
【００４７】
融合タンパク質の分離及び精製は、公知の方法により行うことができる。公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度の差を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００４８】
APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質は、癌転移及び/又は血管新生抑制剤、循環器系疾患（例えば、心筋梗塞、動脈硬化、肥大型心筋症など）の治療及び/又は予防薬などの医薬として利用可能である。また、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質は、マトリックスメタロプロテアーゼ−２阻害剤として医薬又は試薬用途にin vivo又はin vitroで利用可能である。本発明は、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質を含む医薬組成物、癌転移及び/又は血管新生抑制剤、循環器系疾患の治療及び/又は予防薬、並びにマトリックスメタロプロテアーゼ−２阻害剤も提供する。
【００４９】
APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質は、マトリックスメタロプロテアーゼ−２(MMP-2)に対する特異的阻害剤であるので、MMP-2の生理機能解析などの基礎研究用試薬として利用することが可能である。
【００５０】
また、MMP-2は癌の浸潤・転移や癌組織における血管新生はもとより、急性心筋梗塞などの心臓血管系の疾患にも関わる可能性が示唆されている。したがって、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質はMMP-2が関わるこれらの疾患に対する治療薬としても応用できる。
【００５１】
APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質を癌転移及び/又は血管新生抑制剤、循環器系疾患（例えば、心筋梗塞、動脈硬化、肥大型心筋症など）の治療及び/又は予防薬などとして利用する場合には、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質を単独で、あるいは、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とともに、適当な剤型の医薬組成物として、哺乳動物（例えば、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、癌転移及び/又は血管新生抑制剤として使用する場合には、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質を１回量として0.001〜10 mg/kg体重、好ましくは、0.01〜1 mg/kg体重を、１週間に7回程度の頻度で、好ましくは1日に１回程度の頻度で、皮下注射（好ましくは、連続または隔日投与）するとよい。他の用途、他の非経口投与(例えば、経鼻投与)および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合にはその症状に応じて増量してもよい。
【００５２】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は常法により製造することができ、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有してもよい。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、庶糖、ステアリン酸マグネシウムなどがあげられる。
【００５３】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などがあげられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤型であるとよい。かかる注射剤は常法、すなわち本発明の融合タンパク質を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製される。注射用の水性液としては生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート80、HCO−50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil））などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は通常適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製することができる。
【００５４】
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、有効成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されるとよい。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられ、それぞれの投薬単位剤形当り通常0.01〜1 mgのAPP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質が含有されていることが好ましい。投薬単位の製剤中における有効成分の含量は、製剤の種類により異なるが、通常1〜100 重量％であり、好ましくは50〜100 重量％である。
【００５５】
上記の医薬組成物は、APP-IPと潜在型MMP-2に結合可能なTIMPとの融合タンパク質との配合により好ましくない相互作用を生じない限り、他の有効成分を含有してもよい。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００５７】
〔実施例１〕
APP-IP-TIMP-2融合タンパク質の製造方法：ヒトTIMP-2をコードするDNAを、その塩基配列（配列番号３）の中に含まれる制限酵素部位Eco52 IおよびPst Iで切断した後、この２つの制限酵素部位の間に一対の相補的な合成ＤＮＡ鎖（センス側：5'-GGCCGACGCCGCCGCAGGAGGAATTAGTTATGGTAATGATGCATTAATGCCAGGAGGAGGCTGCA-3'（配列番号８）およびアンチセンス側：5'-GCCTCCTCCTGGCATTAATGCATCATTACCATAACTAATTCCTCCTGCGGCGGCGTC-3'（配列番号９））をアニーリングにより２本鎖化したものをDNAリガーゼを用いて挿入し、APP-IP-TIMP-2融合タンパク質をコードするDNAを作製した。このタンパク質をコードするDNAを動物細胞発現用ベクターであるpcDNA3.1/Zeo(-)(Invitrogen社)あるいはE. coli発現用ベクターであるpFLAG-CTC(Sigma社)にそれぞれのマルチクローニング部位を利用して挿入した。 APP-IP-TIMP-2融合タンパク質は上記ベクター(APP-IP-TIMP-2-pFLAG-CTC)で形質転換したE. coli  DH5α株を1mMのisopropyl-β-D-thiogalactopylanosideの存在下、37°Cで５時間培養することにより、菌体内に封入体として発現させた。この菌体を超音波処理で破砕し、遠心分離により封入体を回収した。封入体として回収したAPP-IP-TIMP-2融合タンパク質を6Mグアニジン塩酸塩、20 mM dithiothreitol、5 mM  EDTAを含む50 mM Tris-HCl (pH 8.0)で溶解し、不溶物を遠心で取り除いた後、100倍容量のリフォールディング緩衝液（50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 M アルギニン、5 mM 還元型グルタチオン、1mM 酸化型グルタチオン、5 mM EDTA）中に迅速拡散させた後、4°Cで４８時間インキュベートすることにより、立体構造および分子内ジスルフィド結合を形成させた。この試料から透析によりアルギニンを除去した後、逆相HPLCを用いて分子内ジスルフィド結合が形成されたAPP-IP-TIMP-2融合タンパク質を単離・精製した。【００５８】
MMP-2、MMP-9、MMP-7およびMT1-MMP触媒ドメインに対する阻害活性の測定方法：MMP-2、MMP-7、MMP-9およびMT1-MMP触媒ドメインの触媒活性、およびそれらの活性に及ぼす阻害効果は過去の文献 (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 16, April 18, pp. 14020-14028, 2003) に従い、蛍光消光系合成ペプチド基質を用いて測定した。【００５９】
結果と考察
MMP-2、MMP-7、MMP-9およびMT1-MMP触媒ドメインの合成ペプチド基質水解活性に及ぼすAPP-IP-TIMP-2融合タンパク質の阻害効果を調べた結果、MMP-2の活性が本融合タンパク質により強く阻害され、そのIC50値（活性を50 % 阻害するために要するインヒビターの濃度）は約0.4 nMであった。また、2 nMのAPP-IP-TIMP-2の存在下ではMMP-2の活性はほぼ完全に阻害された。これに対し、MMP-7およびMMP-9の活性は400 nM のAPP-IP-TIMP-2の存在下においてもほぼ100 %に保たれ、全く阻害されない事が判明した（図１）。また、MT1-MMP触媒ドメインの活性は400 nM APP-IP-TIMP-2の存在下、約75 %が保たれており、APP-IP-TIMP-2のMT1-MMPに対する阻害効果はMMP-2に対する阻害効果と比較して、1/1000以下であることが判明した。一方、過去の文献(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 16, April 18, pp. 14020-14028, 2003)からMMP-2、MMP-7、MMP-9およびMT1-MMP触媒ドメインの合成ペプチド基質水解活性に及ぼすAPP-IPの阻害活性はそれぞれのIC50値が30 nM、 15 μM、20 μMおよび2 μMであることから、APP-IP-TIMP-2はAPP-IPに比べ、約75倍高いMMP-2阻害活性を持つのに対し、他のMMPsに対してはAPP-IP-TIMP-2とAPP-IPはほぼ同じ阻害効果を持つことが判明した。これは、APP-IP-TIMP-2融合タンパク質とMMP-2間の相互作用ではTIMP-2部分のC末端領域とMMP-2のヘモペキシン様領域との結合に補助される事により、APP-IP部分とMMP-2の触媒活性部位との相互作用が顕著に促進されたことを示唆している。また、TIMP-2はMMP-2とMMP-9の双方に対して高い阻害活性を持ち、それぞれの阻害定数が7.2 nMおよび 43 nMであることが報告されている（Olson, M. W., Gervasi, D. C., Mobashery, S., and Fridman, R. (1997) J. Biol. Chem. 272, 29975-29983）ことから、APP-IP-TIMP-2が400 nMの濃度でMMP-9を阻害しなかった事実は、 APP-IPをTIMP-2のN末端に付加した事により、TIMP-2が本来持っているMMPsインヒビター活性が完全に消失したことを示唆している。この結果は、TIMP-2のN末端Cys１のα-アミノ基がMMPの活性中心の亜鉛イオンに配位することがその阻害活性に重要であること（Fernandez-Catalan, C., Bode, W., Huber, R., Turk, D., Calvete, J. J., Lichte, A., Tschesche, H., and Maskos, K. (1998) EMBO J. 17, 5238-5248）、このα-アミノ基を化学修飾したり（Higashi, S., and Miyazaki, K. (1999) J. Biol. Chem. 274, 10497-10504）、TIMP-2のN末端にアラニンを１残基付加する（Wingfield, P. T., Sax, J. K., Stahl, S. J., Kaufman, J., Palmer, I., Chung, V., Corcoran, M. L., Kleiner, D. E., and Stetler-Stevenson, W. G. (1999) J. Biol. Chem. 274,21362-21368）と、TIMP-2のMMPs阻害活性が消失するという過去の報告とも良く一致する。以上の結果から、TIMP-2のN末端にAPP-IPを付加すると、特異性の低いTIMP-2のMMPs阻害活性が失われるとともに、APP-IPとMMP-2触媒部位との相互作用が促進され、結果としてMMP-2に対し，高い親和性と特異性をもつ阻害剤ができることが判明した。【００６０】
MMPsは癌転移抑制剤や癌増殖抑制剤開発の上での恰好の標的分子であり、現在までにヒドロキサム酸誘導体をベースとした多くのMMPs阻害剤が製薬企業を中心に開発されて来た。しかしながら、従来開発されて来たMMPs阻害剤はその特異性の低さから、生体内で標的MMP以外のMMPsも阻害し、予想外の副作用を示すことが分かってきた。加えて、MMPsの中には、癌の浸潤、転移を抑制するものがあり、特異性の低い阻害剤によって全てのMMPsが阻害されると、標的となるMMP活性抑制の効果が相殺された上、癌転移を助長する可能性さえ示されている（Overall, C. M., and Kleifeld, O. (2006) Nat. Rev. Cancer 6, 227-239）。こうした事実を踏まえると、MMP-2に対して特異性の高いAPP-IP-TIMP-2は副作用の極めて少ない癌転移抑制剤や癌増殖抑制剤となり得る可能性が高い。また、ノックアウトマウスを用いた解析結果から、MMP-2を欠損させたマウスには明らかな障害が見られないことが報告されている（Itoh, T., Ikeda, T., Gomi, H., Nakao, S., Suzuki, T., and Itohara, S. (1997) J. Biol. Chem. 272, 22389-22392）一方で、MMP-2欠損マウスでは癌組織内での血管新生が顕著に抑制されるとうい報告がある（Ito,T et al. (1998) Cancer Res. 58, 1048-1051）。これらの報告からもMMP-2を標的とした治療に副作用が少なく、癌組織内での血管新生抑制効果やそれに伴う癌の増殖抑制効果は大きいことが期待できる。さらに、MMP-2が欠損したマウスでは急性心筋梗塞後に起こる心破裂が抑制されること（Matsumura, S., Iwanaga, S., Mochizuki, S., Okamoto, H., Ogawa, S., and Okada, Y.(2005) J Clin Invest. 115, 599-609.）や血圧負荷により誘導される心肥大症の発症が抑制されることなどから（Matsusaka, H., Ide, T., Matsushima, S., Ikeuchi, M., Kubota, T., Sunagawa, K., Kinugawa, S., and Tsutsui, H. (2006) Hypertension. 47, 711-717）、APP-IP-TIMP-2融合タンパク質は循環器系疾患の治療及び/又は予防薬としても利用可能と考えられる。【００６１】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の融合タンパク質は、高親和性であり、かつ特異性の高いMMP-2インヒビターとして利用できる。MMP-2は癌の浸潤・転移や癌組織における血管新生はもとより、急性心筋梗塞などの心臓血管系の疾患にも関わる可能性が示唆されている。したがって、本発明の融合タンパク質はMMP-2が関わるこれらの疾患に対する治療薬としても応用できる。また、これまで個々のMMPに対する特異的阻害剤は開発されていないことから、この融合タンパク質をMMP-2の生理機能解析などの基礎研究用試薬として応用することもできる。
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
＜配列番号１＞
配列番号１は、ヒトAPP-IP(APP770の残基586-595を含む領域)をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、ヒトAPP-IP(APP770の残基586-595を含む領域)のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、ヒトTIMP-2をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。この配列は、配列番号４のアミノ酸配列（N末端にシグナルペプチド（１〜２６番目）が存在するヒトTIMP-2のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡの塩基配列である。
＜配列番号４＞
配列番号４は、ヒトTIMP-2のアミノ酸配列を示す。この配列は、N末端にシグナルペプチド（１〜２６番目）が存在する。
＜配列番号５＞
配列番号５は、ヒトAPP-IP(APP770の残基586-595を含む領域)とヒトTIMP-2との融合タンパク質（実施例で作製したもの。N末端にシグナルペプチド（１〜２６番目）が存在し、かつAPP-IPのN末端にAAGG、C末端にGGGのアミノ酸配列が付加されている）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、ヒトAPP-IP(APP770の残基586-595を含む領域)とヒトTIMP-2との融合タンパク質（実施例で作製したもの。N末端にシグナルペプチド（１〜２６番目）が存在し、かつAPP-IPのN末端にAAGG、C末端にGGGのアミノ酸配列が付加されている）のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、成熟型（シグナルペプチドが切断されている）のヒトAPP-IP(APP770の残基586-595を含む領域)とヒトTIMP-2との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号８＞
実施例で用いた合成ＤＮＡ鎖（センス側）の塩基配列を示す。
＜配列番号９＞
実施例で用いた合成ＤＮＡ鎖（アンチセンス側）の塩基配列を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、ヒトTIMP-3をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。この配列は、配列番号１１のアミノ酸配列（N末端にシグナルペプチド（１〜２３番目）が存在するヒトTIMP-3のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡの塩基配列である。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、ヒトTIMP-3のアミノ酸配列を示す。この配列は、N末端にシグナルペプチド（１〜２３番目）が存在する。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、ヒトTIMP-4をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。この配列は、配列番号１３のアミノ酸配列（N末端にシグナルペプチド（１〜２９番目）が存在するヒトTIMP-4のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡの塩基配列である。
＜配列番号１３＞
配列番号１３は、ヒトTIMP-4のアミノ酸配列を示す。この配列は、N末端にシグナルペプチド（１〜２９番目）が存在する。
【図１】
2010041617.tif 000003
【図２】
2010041617.tif 000004
【配列表】
2010041617000001.app
【国際調査報告】
2010041617.tif 000005
2010041617.tif 000006
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