(57)【要約】  以下の工程（１）〜（３）を含む糖液の製造方法により、これまで廃液として扱われていたセルロース含有バイオマスの水熱処理液を糖液の製造に活用することができる。工程（１）：セルロース含有バイオマスを水熱処理後、水熱処理液とセルロース含有固形分に分離する工程。工程（２）：工程（１）のセルロース含有固形分に糸状菌由来セルラーゼを添加してセルロースを加水分解後、糖化残さと糖液に分離する工程。工程（３）：工程（１）の水熱処理液で工程（２）の糖化残さを洗浄して、糖化残さに吸着した糸状菌由来セルラーゼを水熱処理液中に溶出させた後、固液分離により糸状菌由来セルラーゼを含む溶液成分を得る工程。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース含有バイオマスからの糖液の製造方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含む、糖液の製造方法。
工程（１）：セルロース含有バイオマスを水熱処理後、水熱処理液とセルロース含有固形分に分離する工程。
工程（２）：工程（１）のセルロース含有固形分に糸状菌由来セルラーゼを添加してセルロースを加水分解後、糖化残さと糖液に分離する工程。
工程（３）：工程（１）の水熱処理液で工程（２）の糖化残さを洗浄して、糖化残さに吸着した糸状菌由来セルラーゼを水熱処理液中に溶出させた後、固液分離により糸状菌由来セルラーゼを含む溶液成分を得る工程。
【請求項２】
工程（３）で得られた溶液成分を限外濾過膜に通じて濾過することにより非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収するとともに、透過液として糖液を得る工程（４）を含む、請求項１に記載の糖液の製造方法。
【請求項３】
工程（４）で回収した糸状菌由来セルラーゼを工程（２）のセルロース加水分解に再利用する、請求項２に記載の糖液の製造方法。
【請求項４】
糸状菌由来セルラーゼがトリコデルマ由来セルラーゼである、請求項１から３のいずれかに記載の糖液の製造方法。
【請求項５】
工程（１）の水熱処理が１２０〜２４０℃の温度範囲での処理である、請求項１から４のいずれかに記載の糖液の製造方法。
【請求項６】
工程（３）の水熱処理液が無機イオン、酢酸および／またはフルフラールを合計１ｇ／Ｌ以上含む、請求項１から５のいずれかに記載の糖液の製造方法。
【請求項７】
工程（３）において３０〜７０℃の水熱処理液で糖化残さを洗浄する、請求項１から６のいずれかに記載の糖液の製造方法。
【請求項８】
工程（２）として膜分離によって糖化残さと糖液を分離し、工程（３）として該膜面上の糖化残さに対して水熱処理液を垂直方向に通水させて糖化残さを洗浄して糸状菌由来セルラーゼを含む溶液成分を得る、請求項１から７のいずれかに記載の糖液の製造方法。
【請求項９】
膜分離がプレス濾過またはベルトフィルターによる膜分離である、請求項８に記載の糖液の製造方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の方法により糖液を製造する工程および該糖液を発酵原料として化学品を生産する能力を有する微生物を培養して化学品を製造する工程を含む、化学品の製造方法。
【請求項１１】
セルロース含有バイオマスを水熱処理して水熱処理物を固液分離する水熱処理装置、該水熱処理装置より排出されるセルロース含有固形分を糸状菌由来セルラーゼにより加水分解する加水分解装置、該加水分解装置で得られるセルロース含有固形分の加水分解物を固液分離する糖液回収装置、ならびに糖液回収装置で分離された糖化残さと該水熱処理装置より排出される水熱処理液を混合、保温および固液分離する酵素回収装置を含む、糖液製造装置。
【請求項１２】
糖液回収装置および酵素回収装置が一体化した装置である、請求項１１に記載の糖液製造装置。
【請求項１３】
糖液回収装置および酵素回収装置が一体化した装置が、プレス濾過装置またはベルトフィルター装置である、請求項１２に記載の糖液製造装置。
【請求項１４】
膜分離装置がプレス濾過装置またはベルトフィルター装置である、請求項１３に記載の糖液製造装置。
【請求項１５】
前記酵素回収装置が、糸状菌由来セルラーゼと糖液に分離する限外濾過膜分離装置を含む、請求項１１から１４のいずれかに記載の糖液製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、セルロース含有バイオマスを酸処理、水熱処理、アルカリ処理などで前処理した後、糸状菌由来セルラーゼを添加し加水分解することで糖液を製造する方法が広く検討されている。しかしながら、こうした糸状菌由来セルラーゼを使用する方法の欠点として、糖化酵素の使用量が多く、かつ価格も高いため、糖液製造コストが増大するという課題がある。【０００３】
本課題を解決する手法として、セルロース加水分解に使用した糸状菌由来セルラーゼを回収再利用する方法が提案されている。例えば、スピンフィルターによる連続固液分離を行い、得られた糖液を限外濾過膜に通じて濾過し、糸状菌由来セルラーゼを回収する方法（特許文献１）、酵素糖化の段階において界面活性剤を投入することで糸状菌由来セルラーゼ吸着を抑制し回収効率を向上させる方法（特許文献２）、酵素糖化後の残さを通電処理することで糸状菌由来セルラーゼ成分を回収する方法（特許文献３）、糖化残さを二次加水分解することにより吸着酵素の回収量を高める方法（特許文献４）、回収セルラーゼをまず添加し、一次加水分解を行い、その後未使用セルラーゼを添加し二次加水分解を繰り返し行うことによって、回収酵素量、糖生成量を高める方法（特許文献５）などが開示されているが根本的な課題解決には至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−８７３１９号公報
【特許文献２】特開昭６３−８７９９４号公報
【特許文献３】特開２００８−２０６４８４号公報
【特許文献４】ＷＯ２０１１／１１５０３９号
【特許文献５】ＷＯ２０１１／１１５０４０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
セルロース含有バイオマスから糖液を製造する際のセルロース含有バイオマスの前処理として水熱処理を採用する場合、セルロース含有バイオマスを水熱処理後に糸状菌セルラーゼでセルロースを加水分解する際に希薄なオリゴ糖とフラン系化合物、芳香族化合物などの酵素糖化阻害物質を含む大量の水熱処理液が排出されていた。【０００６】
そこで本発明は、セルロース含有バイオマスの糖化プロセスの際に、これまで廃液となっていた水熱処理液の活用手段を見出すこと、またセルロース含有固形分の加水分解における酵素使用量を削減することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、セルロース含有バイオマスの水熱処理により得られる水熱処理液が、糖化プロセスからセルロース加水分解のための糸状菌由来セルラーゼを回収するための溶出液として利用できることを見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［１５］の構成を有する。
［１］セルロース含有バイオマスからの糖液の製造方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含む、糖液の製造方法。
工程（１）：セルロース含有バイオマスを水熱処理後、水熱処理液とセルロース含有固形分に分離する工程。
工程（２）：工程（１）のセルロース含有固形分に糸状菌由来セルラーゼを添加してセルロースを加水分解後、糖化残さと糖液に分離する工程。
工程（３）：工程（１）の水熱処理液で工程（２）の糖化残さを洗浄して、糖化残さに吸着した糸状菌由来セルラーゼを水熱処理液中に溶出させた後、固液分離により糸状菌由来セルラーゼを含む溶液成分を得る工程。
［２］工程（３）で得られた溶液成分を限外濾過膜に通じて濾過することにより非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収するとともに、透過液として糖液を得る工程（４）を含む、［１］に記載の糖液の製造方法。
［３］工程（４）で回収した糸状菌由来セルラーゼを工程（２）のセルロース加水分解に再利用する、［２］に記載の糖液の製造方法。
［４］糸状菌由来セルラーゼがトリコデルマ由来セルラーゼである、［１］から［３］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［５］工程（１）の水熱処理が１２０〜２４０℃の温度範囲での処理である、［１］から［４］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［６］工程（３）の水熱処理液が無機イオン、酢酸および／またはフルフラールを合計１ｇ／Ｌ以上含む、［１］から［５］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［７］工程（３）において３０〜７０℃の水熱処理液で糖化残さを洗浄する、［１］から［６］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［８］工程（２）として膜分離によって糖化残さと糖液を分離し、工程（３）として該膜面上の糖化残さに対して水熱処理液を垂直方向に通水させて糖化残さを洗浄して糸状菌由来セルラーゼを含む溶液成分を得る、［１］から［７］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［９］膜分離がプレス濾過またはベルトフィルターによる膜分離である、［８］に記載の糖液の製造方法。
［１０］［１］から［９］のいずれかに記載の方法により糖液を製造する工程および該糖液を発酵原料として化学品を生産する能力を有する微生物を培養して化学品を製造する工程を含む、化学品の製造方法。
［１１］セルロース含有バイオマスを水熱処理して水熱処理物を固液分離する水熱処理装置、該水熱処理装置より排出されるセルロース含有固形分を糸状菌由来セルラーゼにより加水分解する加水分解装置、該加水分解装置で得られるセルロース含有固形分の加水分解物を固液分離する糖液回収装置、ならびに糖液回収装置で分離された糖化残さと該水熱処理装置より排出される水熱処理液を混合、保温および固液分離する酵素回収装置を含む、糖液製造装置。
［１２］糖液回収装置および酵素回収装置が一体化した装置である、［１１］に記載の糖液製造装置。
［１３］糖液回収装置および酵素回収装置が一体化した装置が膜分離装置である、［１２］に記載の糖液製造装置。
［１４］膜分離装置がプレス濾過装置またはベルトフィルター装置である、［１３］に記載の糖液製造装置。
［１５］前記酵素回収装置が、糸状菌由来セルラーゼと糖液に分離する限外濾過膜分離装置を含む、［１１］から［１４］のいずれかに記載の糖液製造装置。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、水熱処理液に含まれるバイオマス抽出成分の効果によって、酵素糖化残さに吸着した糸状菌由来セルラーゼの回収酵素量・活性が向上し、セルロース含有バイオマスを原料とする糖液の製造工程に使用する酵素使用量を削減できることができる。また、糸状菌由来セルラーゼを回収するために水熱処理液で酵素糖化残さに吸着した糸状菌由来セルラーゼを溶出させることで水熱処理液に含まれるオリゴ糖の糖化も可能になるため、製造プロセス全体の糖収率も向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の糖液の製造方法のブロックフローを示す図面である。
【図２】図２は、本発明の糖液の製造方法を実施する装置一例（糖液回収装置および酵素回収装置としてプレス濾過装置を使用した場合）を示す図面である。
【図３】図３は、本発明の糖液の製造方法を実施する装置一例（酵素回収装置として限外濾過膜装置を追加した場合）を示す図面である。
【図４】図４は、図１〜３の糖液の製造装置の詳細を示す図面である。
【図５】図５は、回収酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、染色したゲルの写真である。
【図６】図６は、工程（２）の固液分離と、工程（３）の糖化残さの洗浄と固液分離を同一装置（膜分離装置）で行う際の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明を実施するための形態に関し、工程ごとに詳細に説明する。
【００１２】
［工程（１）］セルロース含有バイオマスを水熱処理後、水熱処理液とセルロース含有固形分に分離する工程
セルロース含有バイオマスとは、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンコブ、稲わら、麦わら、椰子殻、などの草本系バイオマス、あるいは樹木、ポプラ、廃建材などの木質系バイオマス、さらに藻類、海草、など水生環境由来のバイオマスのことを指す。こうしたバイオマスには、セルロースおよびヘミセルロース（以下、セルロースとヘミセルロースの総称として「セルロース」という。）の他に芳香族高分子であるリグニン等を含有している。
【００１３】
本工程では、後段の工程２での酵素糖化効率を向上させるために、セルロース含有バイオマスの水熱処理を行う。水熱処理とは、セルロース含有バイオマス固形物含量が０．１〜５０重量％となるよう水を添加し、反応温度が１００〜４００℃の範囲で、１秒〜６０分の範囲でセルロース含有バイオマスを水熱処理することでセルロース含有バイオマス中に存在するヘミセルロースの加水分解を行うこと、リグニンの可溶化を促進しセルロースおよびヘミセルロースが酵素分解されやすい状態にすることを目的とするものである。なお、本工程での水熱処理の反応温度は特に制限はなく、セルロース含有バイオマスの種類に応じて適宜酵素糖化効率が高くなる最適温度を設定すればよく、通常、１２０℃〜２４０℃の範囲、好ましくは１８０℃〜２４０℃の範囲である。また、水熱処理において、硫酸、塩酸、酢酸、などの酸、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、などのアルカリを添加してもよいが、添加量は最小限となることが好ましく、最終濃度２重量％未満で実施することがより好ましく、最終濃度１重量％未満で実施することがさらに好ましい。なお、水熱処理の際に酸またはアルカリを添加した場合、後段の糖化酵素の添加あるいは加水分解の前段階で中和することが好ましい。酸、アルカリを水熱処理時に添加することによって、水熱処理における温度をより低い条件で実施することが可能になる。
【００１４】
水熱処理の回数は特に限定されず、１回以上行えばよい。また、水熱処理を２回以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件設定にて実施してもよい。
【００１５】
本工程では、水熱処理後、水熱処理液とセルロース含有固形分に分離する。セルロース含有バイオマスを水熱処理すると、副産物としてフルフラール、ＨＭＦ、バニリン、グアイアシルアルコール、シリンガ酸、クマル酸、フェルラ酸、酢酸、ギ酸、無機イオンなどの酵素糖化を阻害する低分子化合物（以下、これらを総称して酵素糖化阻害物質という。）が生じるが、水熱処理物を水熱処理液とセルロース含有固形分に固液分離することにより酵素糖化阻害物質を水熱処理液側に分離することができる。固液分離の手法は、プレス濾過、ベルトフィルター、Ｐｎｅｕｍａｐｒｅｓｓ、スクリュープレス、遠心分離、スクリューデカンタなどを使用することができ、また、水熱処理の装置内にスクリュープレスのような分離機能を有する場合、その水熱処理の過程で、水熱処理液とセルロース含有固形分に分離することも可能である。また、セルロース含有固形分は、水などで洗浄を行うことでより完全に酵素糖化阻害物質を除去することができる。水熱処理後、固液分離によって得られたセルロース含有固形分は、さらにアルカリ処理、酸処理などを行ってもよい。
【００１６】
［工程（２）］工程（１）のセルロース含有固形分に糸状菌由来セルラーゼを添加してセルロースを加水分解後、糸状菌由来セルラーゼを含む糖化残さと糖液に分離する工程
工程（２）では、工程（１）にて固液分離したセルロース含有固形分に糸状菌由来セルラーゼを添加し、セルロースの加水分解後、糖化残さと糖液に分離する。
【００１７】
本工程で使用する糸状菌由来セルラーゼは、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、βグルコシダーゼ、などグルコースがβ１−４結合した糖ポリマーを加水分解することができるセルラーゼ酵素群とキシラナーゼ、キシロシダーゼなどキシロースがβ１−４結合した糖ポリマーを加水分解することできるヘミセルラーゼ酵素群を含むことを特徴とする。
【００１８】
セロビオハイドラーゼとは、セルロースの末端部分から加水分解していくことを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．９１としてセロビオハイドラーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００１９】
エンドグルカナーゼとは、セルロース分子鎖の中央部分から加水分解することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．４、ＥＣ３．２．１．６、ＥＣ３．２．１．３９、ＥＣ３．２．１．７３としてエンドグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２０】
エキソグルカナーゼとは、セルロース分子鎖の末端から加水分解することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．７４、ＥＣ３．２．１．５８としてエキソグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２１】
βグルコシダーゼとは、セロオリゴ糖あるいはセロビオースに作用することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．２１としてβグルコシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２２】
キシラナーゼとは、ヘミセルロースあるいは特にキシランに作用することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．８としてキシラナーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２３】
キシロシダーゼとは、キシロオリゴ糖に作用することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．３７としてキシロシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２４】
また、糸状菌由来セルラーゼは、前記以外のバイオマス分解に関与する他の酵素成分をも含んでいてもよい。他の酵素成分としては、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、キシランエステラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、キチナーゼなどを例示することができる。本発明で使用する糖化酵素は、セルロース含有固形分の加水分解に対する比活性が高いものが好ましく使用できる。
【００２５】
糸状菌由来セルラーゼは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、ファネロカエーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、白色腐朽菌、褐色腐朽菌、などに由来するセルラーゼを使用することができる。本発明では、こうした糸状菌由来セルラーゼの中でも、セルロース分解活性が高いトリコデルマ由来の糸状菌由来セルラーゼを使用することが好ましい。
【００２６】
また、トリコデルマ属微生物は特に限定されないが、具体的にはトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＱＭ９４１４）、トリコデルマ・リーセイＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉＱＭ９１２３）、トリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ−３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉＲｕｔ  Ｃ−３０）、トリコデルマ・リーセイＰＣ３−７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＰＣ３−７）、トリコデルマ・リーセイＡＴＣＣ６８５８９（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＡＴＣＣ６８５８９）、トリコデルマ・リーセイＣＬ−８４７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉＣＬ−８４７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ７７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＭＣＧ７７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ８０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉＭＣＧ８０）、トリコデルマ・ビリデＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ９１２３）を例示することができる。また、前述のトリコデルマ属に由来する微生物であって、これらを変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施し、糖化酵素生産性が向上した変異株であってもよい。
【００２７】
トリコデルマ由来セルラーゼとしては、粗酵素物が好ましく使用される。粗酵素物は、トリコデルマ属の微生物が糖化酵素を産生するよう調整した培地中で、任意の期間該微生物を培養した培養上清に由来する。使用する培地成分は特に限定されないが、セルラーゼの産生を促進するために、セルロースあるいはキシランを添加した培地が一般的に使用できる。そして、粗酵素物として、培養液をそのまま、あるいは菌体を除去したのみの培養上清が好ましく使用される。
【００２８】
トリコデルマ属微生物は、強力なセルラーゼ成分を培養液中に生産する一方で、βグルコシダーゼに関しては、細胞内あるいは細胞表層に保持していることにより培養液中のβグルコシダーゼ活性は低いため、粗酵素物に、さらに異種または同種のβグルコシダーゼを添加してもよい。異種のβグルコシダーゼとしては、アスペルギルス属由来のβグルコシダーゼが好ましく使用できる。アスペルギルス属由来のβグルコシダーゼとして、ノボザイム社より市販されているＮｏｖｏｚｙｍｅ１８８などを例示することができる。粗酵素物に異種または同種のβグルコシダーゼを添加する方法としては、トリコデルマ属の微生物に遺伝子を導入し、その培養液中に産生されるよう遺伝子組換えされたトリコデルマ属の微生物を培養し、その培養液を単離する方法でもよい。
【００２９】
糸状菌由来セルラーゼによる加水分解反応温度は、１５〜１００℃の範囲が好ましく、４０〜６０℃がより好ましく、５０℃が最も好ましい。また、加水分解反応時のｐＨは、ｐＨ３〜９の範囲が好ましく、ｐＨ４〜５．５がより好ましく、ｐＨ５が最も好ましい。ｐＨ調整には、酸あるいはアルカリを目的のｐＨとなるように添加し調整することができ、また、適宜緩衝液を使用してもよい。その他、セルロース含有固形分の加水分解では、とセルラーゼおよびヘミセルラーゼとの接触を促進させるため、また加水分解物の糖濃度を均一にするため攪拌混合を行うことが好ましい。セルロース前処理物の固形分濃度は、１〜２５重量％の範囲であることが好ましい。
【００３０】
さらに本工程では、糸状菌由来セルラーゼによる加水分解物を糖化残さと本発明の目的物である糖液に分離する。加水分解物の固液分離は、公知の固液分離手法により実施することができるが、好ましくは膜分離による固液分離であり、より好ましくはプレス濾過またはベルトフィルターによる固液分離では分離された水熱処理液に含まれる固形分あるいは濁質成分が比較的少なくすることができる。こうした固液分離は１以上の複数手法組み合わせて実施してもよく、効率的に糸状菌由来セルラーゼを含む糖化残さを回収できる手段であれば限定されない。
【００３１】
なお、糸状菌由来セルラーゼの大部分は糖化残さに吸着しているが、少量は糖液中に残っており、糖液中から糖化酵素を回収する工程を加えてもよい。その際、糖液については、遠心分離法もしくはプレス濾過などの濾過法にて１回目の固液分離した後、さらに精密濾過膜によって膜濾過することによってさらに固形物を除去しておけば、糖液から後述の限外濾過膜により糸状菌由来セルラーゼを回収する場合に限外濾過膜のファウリングを抑制することができる。
【００３２】
［工程（３）］工程（１）の水熱処理液で工程（２）の糖化酵素を含む糖化残さを洗浄して、糖化残さに結合した糸状菌由来セルラーゼを水熱処理液中に溶解させた後、固液分離により糸状菌由来セルラーゼを含む溶液成分を得る工程
工程（３）では、水熱処理液で糖化残さを洗浄することで、水熱処理液中に含まれるバイオマス抽出成分を活用して糖化残さに吸着（結合）してある糸状菌由来セルラーゼを水熱処理液中に溶出（脱離）させる。その一方で、水熱処理液に含まれる糖以外の成分による効果により、糖化残さに吸着したセルラーゼおよびヘミセルラーゼの水熱処理液中への脱離が促進される。これは水熱処理液に含まれる無機イオン、酢酸および／またはフルフラール濃度が高い程、糖化残さに吸着した糸状菌由来セルラーゼの脱離効果が高いからである。工程（３）での水熱処理液には無機イオン、酢酸および／またはフルフラールそれらが合計１ｇ／Ｌ以上含まれる水熱処理液であることが好ましい。また、水熱処理液で糖化残さを洗浄することの別の効果として、水熱処理液中に含まれるオリゴ糖が、糖化残さに吸着した糸状菌由来セルラーゼの作用によって加水分解される。水熱処理液の加水分解によって主にキシロースの量が増大する。
【００３３】
糖化残さの洗浄は、３０〜７０℃の水熱処理液で洗浄することが好ましい。３０〜７０℃の水熱処理液を使用することで、糖化残さに吸着した酵素成分の脱着を促進する効果、さらに、前述したとおり糖化残さに吸着した酵素成分の作用により水熱処理液に含まれるオリゴ糖が加水分解される効果を有するためである。なお、水熱処理液のより好ましい温度は４０〜６０℃の範囲である。
【００３４】
工程（３）の固液分離は公知の固液分離を使用できるが、前記工程（２）と同様に膜分離による固液分離が好ましく、プレス濾過またはベルトフィルターがより好ましい。特に、工程（２）および（３）を膜分離による固液分離とする場合、工程（２）で膜分離により糖化残さと糖液の固液分離を行った後、該膜面上の糖化残さに対し、水熱処理液を通水することで水熱処理液による糖化残さの洗浄と固液分離を行うことができるため、工程（２）と（３）を同一の装置で実施することが可能になる。
【００３５】
糖化残さへの水熱処理液を通水は、膜面上の糖化残さに対して水熱処理液を垂直方向に通水させることが好ましく、それにより糖化残さ内に早い水熱処理液の流れを発生させることができるため、糖化残さに吸着したより多くの酵素成分の回収が可能になる。また、一度糖化残さを通水したものを再度循環して通水させることが好ましく、それによりさらにより多くの酵素成分の回収が可能になる。
【００３６】
工程（３）の洗浄液は、固液分離し、溶液成分を限外濾過膜に通じて濾過し、非透過液として、糸状菌由来セルラーゼを分離・回収、さらに濃縮を行うことができる（工程（４））。一方で、限外濾過膜の透過液として、糖液を得ることができる。工程３の固液分離は、スクリューデカンタなどの遠心分離法、加圧・吸引濾過などの濾過法、あるいは精密濾過などの膜濾過法といった公知の固液分離手法により実施することができる。こうした固液分離は１以上の複数手法組み合わせて実施してもよく、効率的に糖化残さを除去する手段であれば限定されない。但し、後段の限外濾過膜のファウリングを抑制するという観点において、固液分離後の溶液成分には極力固形物が含まれないことが好ましく、具体的には遠心分離法もしくはプレス濾過などの濾過法にて１回目の固液分離した後、得られた溶液成分を、さらに精密濾過膜によって膜濾過することで、完全に固形物を除去することが好ましい。精密濾過膜とは、メンブレンフィルトレーションとも呼ばれ、圧力差を駆動力として、微粒子懸濁液から０．０１〜１０μｍ程度の粒子を分離除去できる分離膜である。精密濾過膜の表面には０．０１〜１０μｍの範囲の細孔を有し、その細孔以上の微粒子成分は膜側に分離除去することができる。精密濾過膜の材質は、酢酸セルロース、芳香族ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリアクリロニトリル、セラミック、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））などが例示できるが特に限定されるものではないが、対汚性、薬品耐性、強度、濾過性といった観点において、ポリフッ化ビニリデン製の精密濾過膜であることが好ましい。
【００３７】
次に、前記、固液分離で得られた溶液成分を限外濾過膜処理する。限外濾過膜とは、一般的に細孔径１．５ナノメートルから２５０ナノメートルの範囲であって、分子量１，０００〜２００，０００の範囲の水溶性高分子を非透過液として阻止することが可能な分離膜のことを指す。限外濾過膜は、糸状菌由来セルラーゼを回収できる分画分子量であればよく、好ましい分画分子量は１，０００〜１００，０００Ｄａ、より好ましくは１０，０００〜３０，０００Ｄａである。限外濾過膜の素材としては、ポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）、ポリフッ化ビニルデン（ＰＶＤＦ）、再生セルロースなどの素材の膜を使用することができるが、セルロースは、セルラーゼによる分解を受けるため、ＰＥＳ、ＰＶＤＦなどの合成高分子を素材とした限外濾過膜を使用することが好ましい。限外濾過膜形状は、チューブラー式、スパイラルエレメント、平膜などが好ましく使用できる。限外濾過膜の濾過は、クロスフロー方式、デッドエンド濾過方式が挙げられるが、ファウリングあるいはフラックスの面でクロスフロー濾過方式が好ましい。
【００３８】
なお、限外濾過膜によって分離、回収された糸状菌由来セルラーゼは、工程２のセルロース含有固形物において再利用することができる。再利用に際して、未使用のセルラーゼあるいはヘミセルラーゼを回収酵素と併せて添加、使用してもよく、また、それ以外の酵素成分を別途添加してもよい。
【００３９】
［糖濃縮工程］
本発明の糖液の製造方法で得られた糖液は、さらにＷＯ２０１０／０６７７８５号に記載される方法である、ナノ濾過膜および／または逆浸透膜に通じて濾過することにより、非透過液として、糖成分が濃縮された濃縮糖液を得ることができる。
【００４０】
ナノ濾過膜とは、ナノフィルター（ナノフィルトレーション膜、ＮＦ膜）とも呼ばれるものであり、「一価のイオンは透過し、二価のイオンを阻止する膜」と一般に定義される膜である。数ナノメートル程度の微小空隙を有していると考えられる膜で、主として、水中の微小粒子や分子、イオン、塩類等を阻止するために用いられる。
【００４１】
逆浸透膜とは、ＲＯ膜とも呼ばれるものであり、「一価のイオンを含めて脱塩機能を有する膜」と一般に定義される膜である。数オングストロームから数ナノメートル程度の超微小空隙を有していると考えられる膜で、主として海水淡水化や超純水製造などイオン成分除去に用いられる。
【００４２】
本発明で使用されるナノ濾過膜あるいは逆浸透膜の素材には、酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマー、ポリサルホンなどの高分子素材を使用することができるが、前記１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。
【００４３】
本発明で用いるナノ濾過膜は、スパイラル型の膜エレメントが好ましく使用される。好ましいナノ濾過膜エレメントの具体例としては、例えば、酢酸セルロース系のナノ濾過膜エレメントであるＧＥ  Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製ＧＥｓｅｐａ、ポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜エレメントのＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜エレメントのＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００、ＮＦ−２７０またはＮＦ−４００、あるいは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とする東レ株式会社製ナノ濾過膜のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜エレメントＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０が挙げられ、より好ましくはＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、ＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００またはＮＦ−４００、あるいはＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０であり、さらに好ましくはＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０である。
【００４４】
本発明で使用される逆浸透膜の素材としては、酢酸セルロース系のポリマーを機能層とした複合膜（以下、酢酸セルロース系の逆浸透膜ともいう）またはポリアミドを機能層とした複合膜（以下、ポリアミド系の逆浸透膜ともいう）が挙げられる。ここで、酢酸セルロース系のポリマーとしては、酢酸セルロース、二酢酸セルロース、三酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース等のセルロースの有機酸エステルの単独もしくはこれらの混合物並びに混合エステルを用いたものが挙げられる。ポリアミドとしては、脂肪族および／または芳香族のジアミンをモノマーとする線状ポリマーまたは架橋ポリマーが挙げられる。
【００４５】
本発明で使用される逆浸透膜の具体例としては、例えば、東レ株式会社製ポリアミド系逆浸透膜モジュールである超低圧タイプのＳＵＬ−Ｇ１０、ＳＵＬ−Ｇ２０、低圧タイプのＳＵ−７１０、ＳＵ−７２０、ＳＵ−７２０Ｆ、ＳＵ−７１０Ｌ、ＳＵ−７２０Ｌ、ＳＵ−７２０ＬＦ、ＳＵ−７２０Ｒ、ＳＵ−７１０Ｐ、ＳＵ−７２０Ｐの他、逆浸透膜としてＵＴＣ８０を含む高圧タイプのＳＵ−８１０、ＳＵ−８２０、ＳＵ−８２０Ｌ、ＳＵ−８２０ＦＡ、同社酢酸セルロース系逆浸透膜ＳＣ−Ｌ１００Ｒ、ＳＣ−Ｌ２００Ｒ、ＳＣ−１１００、ＳＣ−１２００、ＳＣ−２１００、ＳＣ−２２００、ＳＣ−３１００、ＳＣ−３２００、ＳＣ−８１００、ＳＣ−８２００、日東電工株式会社製ＮＴＲ−７５９ＨＲ、ＮＴＲ−７２９ＨＦ、ＮＴＲ−７０ＳＷＣ、ＥＳ１０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｕ、ＥＳ１５−Ｄ、ＥＳ１５−Ｕ、ＬＦ１０−Ｄ、アルファラバル製ＲＯ９８ｐＨｔ、ＲＯ９９、ＨＲ９８ＰＰ、ＣＥ４０４０Ｃ−３０Ｄ、ＧＥ製ＧＥ  Ｓｅｐａ、Ｆｉｌｍｔｅｃ製ＢＷ３０−４０４０、ＴＷ３０−４０４０、ＸＬＥ−４０４０、ＬＰ−４０４０、ＬＥ−４０４０、ＳＷ３０−４０４０、ＳＷ３０ＨＲＬＥ−４０４０、ＫＯＣＨ製ＴＦＣ−ＨＲ、ＴＦＣ−ＵＬＰ、ＴＲＩＳＥＰ製ＡＣＭ−１、ＡＣＭ−２、ＡＣＭ−４などが挙げられる。
【００４６】
ナノ濾過膜および／または逆浸透膜を使用して、糖液を濃縮する効果として、糖液中の糖濃度を高めるとともに、透過液として発酵阻害物質を除去できるという利点を有する。ここでいう発酵阻害物質とは、後段発酵工程で発酵を阻害する糖以外の成分のことを指し、具体的には、芳香族化合物、フラン系化合物、有機酸、１価無機塩などを例示することができる。こうした代表的な、芳香族化合物およびフラン系化合物の例としては、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、バニリン、バニリン酸、シリンガ酸、コニフェリルアルデヒド、クマル酸、フェルラ酸などを例示できる。有機酸、無機塩としては、酢酸、ギ酸、カリウム、ナトリウムなどを例示することができる。濃縮糖液の糖濃度は、ナノ濾過膜および／または逆浸透膜の処理条件によって、５０ｇ／Ｌ〜４００ｇ／Ｌの範囲で任意に設定することができ、濃縮糖液の用途等に応じて任意に設定すればよい。また前述した発酵阻害物質をより除去したい場合、糖液あるいは濃縮糖液に加水し、ナノ濾過膜および／または逆浸透膜で目的の糖濃度となるまで濃縮すればよく、この際、透過液として発酵阻害物質を除去することができる。なお、逆浸透膜に比べ、ナノ濾過膜を使用した方が、発酵阻害物質の除去効果が高いため好ましい。ナノ濾過膜を使用するか、あるいは逆浸透膜を使用するかは、混合糖液に含まれる発酵阻害物質の濃度、あるいは後段発酵で影響を鑑みて選択すればよい。
【００４７】
［糖液の用途］
本発明により得られた糖液を発酵原料として化学品を生産する能力を有する微生物を生育させることで、各種化学品を製造することができる。ここでいう発酵原料として微生物を生育させるとは、糖液に含まれる糖成分あるいはアミノ源を微生物の栄養素として利用し、微生物の増殖、生育維持を行うことを意味している。化学品の具体例としては、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。こうした化学品は、糖液中の糖成分を炭素源として、その代謝の過程において生体内外に化学品として蓄積生産する。微生物によって生産可能な化学品の具体例として、エタノール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、グリセロールなどのアルコール、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸などの有機酸、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、カダベリンなどのアミン化合物を挙げることができる。さらに、本発明の糖液は、酵素、抗生物質、組換えタンパク質などの生産に適用することも可能である。こうした化学品の製造に使用する微生物に関しては、目的の化学品を効率的に生産可能な微生物であればよく、大腸菌、酵母、糸状菌、担子菌などの微生物を使用することができる。
【００４８】
［装置］
本発明の糖液の製造方法を実施するための装置に関して、図１〜４に基づき説明する。
【００４９】
図１は、セルロース含有バイオマスを水熱処理して水熱処理物を固液分離する水熱処理装置（１）、該水熱処理装置より排出されるセルロース含有固形分を糸状菌由来セルラーゼにより加水分解する加水分解装置（１４）、該加水分解装置で得られるセルロース含有固形分の加水分解物を固液分離する糖液回収装置（２３）、ならびに該糖液回収装置で分離された糖化残さと該水熱処理装置より排出される水熱処理液を混合、保温および固液分離する酵素回収装置（２８）を含む、糖液製造装置である。
【００５０】
図２は、特に糖液回収装置および酵素回収装置の固液分離において、プレス濾過装置（２４、３５）を含む装置例であり、図３は、さらに糸状菌由来セルラーゼと糖液に分離する限外濾過膜分離装置（４０）を含む装置例である。
【００５１】
次に、図１〜３の糖液製造装置を詳細に説明するために、図４を使用して装置構成に関し、説明する。セルロース含有バイオマスを水熱処理して水熱処理物を固液分離する水熱処理装置（１）は、水熱処理を行うための保温加圧容器（２）と、前記保温加圧容器（２）を加熱するための加熱装置（３）、バイオマスを保温加圧容器（２）に投入するための原料フィーダー（４）、保温加圧容器内でセルロース含有バイオマスを混合するための攪拌装置（５）、保温加圧容器（２）の圧力開放するための圧力開放槽（７）、水熱処理物を水希釈するための水希釈槽（８）、水熱処理物を圧力開放槽（７）から水希釈槽（８）に移送する移送装置（６）、水熱処理物を固液分離する固液分離装置（１０）、固液分離装置（１０）に水熱処理物を移送するポンプ（９）、固液分離装置（１０）の内部に設置された分離膜（１１）、水熱処理液の排出を調製するバルブ（１２）を具備する装置であることが好ましい。加熱装置（３）は、セルロース含有バイオマスを所定の温度（１７０℃〜２２０℃）まで保温加圧容器（２）を加熱できることが好ましい。攪拌装置（５）は、セルロース含有バイオマスを保温加圧容器（２）内部を連続的に移動させることができ、かつ、温度、セルロース系バイオマス、水を均一化できるものが好ましい。また、原料フィーダー（４）より新たなセルロース含有バイオマスを連続的、あるいは断続的に保温加圧容器（２）に投入することで、セルロース含有バイオマスの連続的な水熱処理が可能になる。固液分離装置（１０）は、遠心分離、濾過、沈降分離などがあるが、分離膜（１１）を使用する分離方式が、高い固形物濃度のセルロース含有固形分を得ることができるため好ましい。分離膜（１１）の素材は、金属メッシュ、織布、不織布などから適宜選定できる。分離されたセルロース含有固形分は、固形物であるため、加水分解装置（１４）への位相は、ベルトコンベア（１３）を使用することが好ましい。
【００５２】
該水熱処理装置より排出されるセルロース含有固形分を糸状菌由来セルラーゼにより加水分解する加水分解装置（１４）に関しては、セルロース含有固形分の糸状菌由来セルラーゼの加水分解を行うための混練装置（１５）を使用して、セルロース含有固形分と糸状菌由来セルラーゼの均一混合ならびに粘度低下のための一次加水分解を行うことが好ましい。混練装置（１５）は、攪拌移液装置（１６）および加水分解のための温度を設定するための加温装置（１７）を有していることが好ましい。また、混練装置（１５）による一次加水分解に引き続き、攪拌槽（１９）にて、攪拌装置（１８）にて攪拌混合しながら、二次加水分解を行う。攪拌槽（１９）には、混練装置（１５）と同じく、加温装置（２０）を有していることが好ましい。攪拌槽（１９）の下部には、バルブ（２１）を介して、移液のためのポンプ（２２）を有することが好ましい。
【００５３】
該加水分解装置で得られるセルロース含有固形分の加水分解物を固液分離する糖液回収装置（２３）は、糖液と糖化残さを分離するための固液分離装置（２４）、さらに固液分離装置には分離のための分離膜（２５）、バルブ（２６）を有していてもよい。糖化残さは、ベルトコンベア（２７）にて、酵素回収装置（２８）に移液する。
【００５４】
糖液回収装置で分離された糖化残さと該水熱処理装置より排出される水熱処理液を混合、保温および固液分離する酵素回収装置（２８）は、水熱処理液を熱交換するための熱交換器（２９）、水熱処理液を糖化残さと混合、保温する保温槽（３１）、攪拌装置（３２）、保温装置（３０）を有することが好ましい。保温槽（３１）は、バルブ（３３）およびポンプ（３４）を介して、固液分離装置（３５）に連結しており、糖化残さと回収酵素に分離される。固液分離装置（３５）は、分離膜（３６）を有していることが好ましく、バルブ（３８）にて回収酵素液を調節することができる。分離された糖化残さは、洗浄液槽（３７）の洗浄液によって洗浄され、糖化残さ中の酵素成分を回収する。また、固液分離した糖化残さは、ベルトコンベア（３９）で排出される。排出された糖化残さは、ボイラに移送され、蒸気・電力に変換され、糖液製造に使用されることが好ましい。酵素回収装置（２８）は、糸状菌由来セルラーゼと糖液に分離する限外濾過膜分離装置（４０）をさらに含むことが好ましい。また、限外濾過膜分離装置（４０）には、糖液貯槽（４１）、精密濾過膜ポンプ（４２）および精密濾過膜モジュール（４３）を設置することで限外濾過の前処理として微粒子成分の除去を行うことが好ましい。精密濾過膜モジュール（４３）の濾液は、精密濾過膜濾液槽（４４）にいったん回収し、さらに限外濾過膜ポンプ（４５）を介して限外濾過膜モジュール（４６）に供することで、セルラーゼおよびヘミセルラーゼ成分を非透過液として分離・回収することができる。分離された酵素成分は、精密濾過膜濾液槽（４４）に酵素濃縮液として回収できる。また、回収した酵素濃縮液は、ポンプ（４７）にて、回収酵素として、セルロース加水分解装置（１４）に総液される。一方、限外濾過膜モジュール（４６）の透過液は、各種発酵生産のための原料となる糖液として使用することができる。
【００５５】
また、図６に工程（２）の固液分離と工程（３）の固液分離を同一装置（膜分離装置）で実施する場合の模式図を示す。工程（２）で得られた加水分解物を膜分離装置４８（好ましくは、プレス濾過装置またはベルトフィルター装置）に加水分解物供給ライン５０を通じて供給する。膜分離装置４８には膜４９が設置されており、膜側からの加圧もしくは透過側からの陰圧によって、膜４９の非透過側に糖化残さが分離され、透過側に糖液が分離される。得られた糖液は回収ライン５１で回収される。さらに膜面上に分離された糖化残さに対し、工程（２）と同じ、加水分解物供給ライン５０あるいは、これとは独立した水熱処理供給ライン５１を通じて、水熱処理液を糖化残さに供給することができる。糖化残さに供給された水熱処理液は、膜側からの加圧もしくは透過側からの陰圧によって、糖化残さを透過し、さらに膜の透過側に回収される。その際、糖化残さの水熱処理液による洗浄が可能である。また、洗浄液は、回収ライン５１より回収可能であり、また回収された洗浄液は、さらに加水分解物供給ライン５０または水熱処理供給ライン５１を通じて、糖化残さに複数回通水させることができる。
【実施例】
【００５６】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５７】
（参考例１）糖濃度の測定
糖液に含まれるグルコースおよびキシロース濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｌｕｎａ  ＮＨ２（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
移動相：ミリＱ：アセトニトリル＝２５：７５（流速０．６ｍＬ／分）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：３０℃。【００５８】
（参考例２）糸状菌由来セルラーゼの回収酵素活性の測定方法
工程（３）で回収できる糸状菌由来セルラーゼの回収酵素量は、１）結晶セルロース分解活性、２）セロビオース分解活性、３）キシラン分解活性、の３種の分解活性（以下、活性値という。）を測定することにより定量した。【００５９】
１）結晶セルロース分解活性
酵素液（所定条件で調整）に対し、結晶セルロースであるアビセル（メルク社製、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）を１ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）を１００ｍＭとなるよう添加し、５０℃で２４時間反応させた。反応液は１ｍＬチューブで調整し、前記条件にて回転混和しながら反応を行った。反応後、チューブを遠心分離し、その上清成分のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度は、参考例２に記載の方法に準じて測定した。結晶セルロース分解活性は、生成したグルコース濃度（ｇ／Ｌ）をそのまま活性量として使用し、回収酵素量の比較に使用した。【００６０】
２）セロビオース分解活性
酵素液に対し、セロビオース（和光純薬工業株式会社製）５００ｍｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）を１００ｍＭとなるよう添加し、５０℃で０．５時間反応させた。反応液は１ｍＬチューブで調整し、前記条件にて回転混和しながら反応を行った。反応後、チューブを遠心分離し、その上清成分のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度は、参考例２に記載の方法に準じて測定した。セロビオース分解活性は、生成したグルコース濃度（ｇ／Ｌ）をそのまま活性量として使用し、回収酵素量の比較に使用した。【００６１】
３）キシラン分解活性
酵素液に対し、キシラン（Ｂｉｒｃｈ  ｗｏｏｄ  ｘｙｌａｎ、和光純薬工業株式会社製）１０ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）を１００ｍＭとなるよう添加し、５０℃で４時間反応させた。反応液は１ｍＬチューブで調整し、前記条件にて回転混和しながら反応を行った。反応後、チューブを遠心分離し、その上清成分のキシロース濃度を測定した。キシロース濃度は、参考例２に記載の方法に準じて測定した。キシロース分解活性は、生成したキシロース濃度（ｇ／Ｌ）をそのまま活性量として使用し、回収酵素量の比較に使用した。【００６２】
（参考例３）無機イオン濃度、芳香族化合物、酢酸・ギ酸・乳酸の測定
糖液に含まれるカチオンおよびアニオン濃度、芳香族化合物濃度、酢酸・ギ酸濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。【００６３】
１）カチオン分析
カラム：Ｉｏｎ  Ｐａｃ  ＡＳ２２（ＤＩＯＮＥＸ社製）
移動相：４．５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／１．４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（流速１．０ｍＬ／分）
反応液：なし
検出方法：電気伝導度（サプレッサ使用）
温度：３０℃。【００６４】
２）アニオン分析
カラム：Ｉｏｎ  Ｐａｃ  ＣＳ１２Ａ（ＤＩＯＮＥＸ社製）
移動相：２０ｍＭメタンスルホン酸（流速１．０ｍＬ／分）
反応液：なし
検出方法：電気伝導度（サプレッサ使用）
温度：３０℃。【００６５】
３）芳香族化合物分析
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ  ＨｉｄｒｏＲＰ  ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製）
移動相：アセトニトリル−０．１％  Ｈ３ＰＯ４（流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：ＵＶ（２８３ｎｍ）
温度：４０℃。【００６６】
４）酢酸・ギ酸・乳酸分析
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｈ（株式会社島津製作所製）の直列
移動相：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ  ビストリス、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。【００６７】
（参考例４）セルロース含有バイオマスの水熱処理物中の構成糖分析方法
ＬＡＰ法（“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｌｉｇｎｉｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｍａｓｓ，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＬＡＰ）”）を参考に、次に示す方法で組成を分析した。【００６８】
試料の適量を分取し、上記の参考例２の方法で含水率を測定した。次に、参考例２の含水率を算定後、得られた乾燥試料を、６００℃の温度で強熱し灰分率を求めた。【００６９】
また、試料をステンレス型バットに移し、実験室雰囲気でおおよそ平衡状態になるまで風乾し、これをウィレーミルにより粉砕し、ふるいにより粒径を約２００〜５００μｍ」に調整した。本状態調節後の試料を６０℃の温度で真空乾燥し、絶乾質量を補正することによって、各成分の絶乾ベースでの含有量を算定した。この分析用試料０．３ｇを天秤でビーカーにはかりとり、これに濃度７２％の硫酸３ｍＬを加え、３０℃の温度でときどき攪拌しながら１時間放置した。この反応液を、精製水８４ｍＬで耐圧瓶に完全に移した後、１２０℃の温度で１時間、オートクレーブで加熱分解した。加熱分解後、分解液と残渣を、濾別し、濾液と残渣の洗浄液に加えて１００ｍＬに定容したものを検液とした。また、加熱分解時、糖の過分解を補正するために単糖を用いた添加回収試験を並行して行った。検液中の単糖（キシロース、アラビノース、マンノース、グルコース、ガラクトース）については、高速液体クロマトグラフ法（ＧＬサイエンス製  ＧＬ−７４００、蛍光検出）により定量を行った。得られた分解液の単糖濃度と試料分解量から、試料中の構成糖量を算定した。【００７０】
（実施例１）水熱処理の条件設定（工程（１））
稲わらを奈良機械製作所製のロータリーカッターミル・ＲＣＭ−４００（８ｍｍメッシュ）にて回転速度４２０回転／分で粉砕した。その後、水熱処理を行った。装置は、日本電熱株式会社製の爆砕装置（反応器２Ｌサイズ）を使用した。蒸気発生装置は４０ｋＷの電気ボイラを使用した。設定した処理圧力を設定すると一義的に処理温度も決定するため、反応条件は、表１の通り処理圧力および処理時間を変更して各種条件を検討した。本条件で１回２００ｇの粉砕した稲ワラを投入し、表１の条件下で反応を行い、爆砕処理した含水した固形分を２Ｌの水を加えて攪拌し、日立工機株式会社製のラボ用遠心分離機“ＨｉｍａｃＣＦ７Ｄ２”を用いて５０００ｒｐｍで水熱処理液とセルロース含有固形分に分離した。分離したセルロース含有固形分の構成糖分析を行った。その後、各爆砕処理物について、含水率を測定し、水および１Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業株式会社製）を添加してｐＨを４．６〜５．０の範囲に調整し、最終的に固形分濃度が５％となるように水をさらに添加しスラリー液を調整した。さらに、スラリー液に各爆砕処理物の乾燥重量に対して酵素重量が１００分の１となるようにジェネンコア製の糸状菌由来セルラーゼ（トリコデルマ由来セルラーゼ）“アクセルレースデュエット”（酵素濃度：４０ｇ／Ｌ）を添加して、グルコース成分およびキシロース成分の糖化率を測定した。結果を表１に示す。【００７１】
【表１】
2013172446.tif 000003
【００７２】
表１の結果から、セルロース含有バイオマスとして稲わらを使用した場合のとしては、１８０〜２４０℃の温度範囲で行うことが好ましいことが判明した。【００７３】
（実施例２）水熱処理液およびセルロース含有固形分の調製（工程（１））
実施例１記載の試験番号７の条件（２１５℃、５分の条件）で得られた水熱処理物に関して、３０００Ｇで１０分遠心分離を行い、水熱処理液を分離回収し、得られた固形物にさらに水を添加し、遠心分離、上清を除去する一連の操作を２回行った。得られた固形物をセルロース含有固形分として、以下、実施例および比較例に使用した。【００７４】
（比較例１）セルロース含有固形分と水熱処理液を混合した場合の加水分解
実施例２のセルロース含有固形分１ｇに対し、実施例１で使用した“アクセルレースデュエット”が１ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．３５ｇ／Ｌの最終濃度となるように添加し、５０℃、２４時間、加水分解を行った。また、セルロース含有固形分の固形物濃度は、１０ｗｔ％になるよう実施例２で得られた水熱処理液を添加し調製した。また加水分解時のｐＨは、ｐＨ４．６〜５．４の範囲となるよう希硫酸および希水酸化ナトリウムで調製した。得られた加水分解物は、遠心分離を行い、糖液８ｇと、糖化残さ２ｇに分離した。糖液のグルコース濃度を測定した結果を表２に示す。【００７５】
【表２】
2013172446.tif 000004
【００７６】
（実施例３）セルロース含有固形分の加水分解（工程（２））
実施例２のセルロース含有固形分１ｇに対し、実施例１で使用した“アクセルレースデュエット”が１ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、０．３５ｇ／Ｌの最終濃度となるように添加し、５０℃、２４時間、加水分解を行った。セルロース含有固形分の固形物濃度は、１０ｗｔ％になるようＲＯ水を添加し調製した。また加水分解時のｐＨは、ｐＨ４．６〜５．４の範囲となるよう希硫酸および希水酸化ナトリウムで調製した。得られた加水分解物は、遠心分離を行い、糖液８ｇと、糖化残さ２ｇに分離した。糖液のグルコース濃度を測定した結果を表３に示す。【００７７】
【表３】
2013172446.tif 000005
【００７８】
比較例１のセルロース含有固形分と水熱処理液を混合した場合の加水分解の結果（表２）と比較すると、同一糖化酵素量でのグルコース生成量は、実施例３のセルロース含有固形分のみの方が多くなることが判明した。すなわち、水熱処理液中には、セルロース含有固形分の加水分解を阻害する成分が含まれており、分離することでグルコース生成量、および糖生成量が増大することが示された。【００７９】
（比較例２）水熱処理液の酵素糖化
実施例２で得られた水熱処理液に対して、実施例１で使用した“アクセルレースデュエット”が０．０４ｇ／Ｌ〜０．８ｇ／Ｌの最終濃度となるように添加し、５０℃、２４時間、加水分解を行った。反応後、水熱処理液を遠心分離し、上清成分のグルコースおよびキシロース濃度の測定を実施した。得られた分析結果を表４に示す。【００８０】
【表４】
2013172446.tif 000006
【００８１】
結果、酵素濃度が増えるに伴って、グルコース、キシロース生成量が増大することが判明した。また、５０℃、２４時間の反応では、酵素濃度が０．１６ｇ／Ｌ以上になっても糖生成量が大きく増大しないことが判明した。つまり、５０℃、２４時間の反応で、水熱処理液の十分な加水分解を行うためには、０．１６ｇ／Ｌの酵素添加が必要であることが判明した。【００８２】
（実施例４）水熱処理液による糖化残さの洗浄（工程（３））
実施例３での“アクセルレースデュエット”添加濃度が０．８ｇ／Ｌの場合に得られた糖化残さ２ｇ（含水）に対して、水熱処理液を１：４、１：８の重量比率で添加し、５０℃で、０時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間保温し、糖化残さを洗浄した。洗浄後、各反応時間の洗浄液を遠心分離（８０００Ｇ、２０分）にて上清を回収し（１：４の場合：８ｇ、１：８の場合：１６ｇ）洗浄液中に含まれるグルコースおよびキシロース濃度を参考例１の手法にて測定した。この結果を表５および表６に示す。【００８３】
（比較例３）ＲＯ水による糖化残さの洗浄
実施例４の糖化残さ重量２ｇ（含水）に対して、ＲＯ水を１：４、１：８の比率で添加し、５０℃で、０時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間保温後、遠心分離（８０００Ｇ、２０分）にて上清を回収した（１：４の場合：８ｇ、１：８の場合：１６ｇ）。各上清のグルコースおよびキシロース濃度を参考例１の手法にて測定した結果を表５および表６に示す。【００８４】
【表５】
2013172446.tif 000007
【００８５】
【表６】
2013172446.tif 000008
【００８６】
表５および６に示すように、糖化残さに水熱処理液を添加して保温する場合、グルコースおよびキシロースの生成量が増大することが判明した。水熱処理液に対する糖化残さの比率（糖化残さ：水熱処理液を１：４、１：８）を変化させ同様の検討を行ってみたが、いずれにおいてもグルコースおよびキシロースの生成量が増大することが判明した。また、糖化残さにＲＯ水を添加して保温するだけでも糖生成量、特にグルコース生成量が増大することが判明した。【００８７】
一方、実施例４では比較例３と比較してキシロースの生成量が増大することが判明した（表６）。これは水熱処理液中のキシランあるいはキシロオリゴ糖が、糖化残さに吸着した酵素成分の作用により加水分解されたためと考えられた。これは前述の比較例２の水熱処理液に糸状菌由来セルラーゼを添加することで、特にキシロースの生成量が著しく増加する傾向とも一致する。【００８８】
（実施例５）水熱処理液による糖化残さ洗浄液からの酵素回収（工程（４））
実施例３の“アクセルレースデュエット”添加濃度が０．８ｇ／Ｌの場合に得られた糖化残さ２ｇ（含水）に対して、水熱処理液を１：４の重量比率で添加し、５０℃で、２４時間、保温し、糖化残さを洗浄した。洗浄後、各反応時間の洗浄液を遠心分離（８０００Ｇ、２０分）にて上清を回収し、８ｇの洗浄液を得た。前記洗浄液８ｇをさらにマイレクスＨＶフィルターユニット濾過（ミリポア社、３３ｍｍ、ＰＶＤＦ製、細孔径０．４５μｍ）を使用して濾過を行った。得られた濾液は、分画分子量１００００の限外濾過膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製  ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０  材質：ＰＥＳ）で濾過し、膜画分が１ｍＬになるまで４５００Ｇにて遠心した。蒸留水１０ｍＬを膜画分に添加し、再度膜画分が０．５ｍＬになるまで４５００Ｇにて遠心した。この後、膜画分から酵素を回収した。回収酵素の各活性は、参考例２に準じて測定した。また比較のため、“アクセルレースデュエット”（０．８ｇ／Ｌ）のみの各酵素活性を参考例２に準じて測定を行い、その際の活性を１００（％）として、相対値としてセルラーゼおよびヘミセルラーゼの活性を表７にまとめた。【００８９】
（比較例４）セルロース含有固形分の加水分解で得られた糖液を限外濾過膜に通じて濾過した場合の糸状菌由来セルラーゼの回収
実施例３での“アクセルレースデュエット”添加濃度が０．８ｇ／Ｌの場合に得られた糖液（８ｇ）を、さらにマイレクスＨＶフィルターユニット（ミリポア社、３３ｍｍ、ＰＶＤＦ製、細孔径０．４５μｍ）を使用して濾過を行った。得られた濾液は、分画分子量１００００の限外濾過膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製  ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０  材質：ＰＥＳ）で濾過し、膜画分が０．５ｍＬになるまで４５００Ｇにて遠心した。蒸留水１０ｍＬを膜画分に添加し、再度膜画分が０．５ｍＬになるまで４５００Ｇにて遠心した。この後、膜画分から酵素を回収した。回収酵素の各活性は、参考例４に準じて測定した（表７）。【００９０】
（比較例５）ＲＯ水による糖化残さ洗浄液からの酵素回収
実施例３の“アクセルレースデュエット”添加濃度が０．８ｇ／Ｌの場合に得られた糖化残さ２ｇ（含水）に対して、ＲＯ水を１：４で添加し、５０℃で２４時間加水分解）をさらにマイレクスＨＶフィルターユニット（ミリポア社、３３ｍｍ、ＰＶＤＦ製、細孔径０．４５μｍ）を使用して濾過を行った。得られた濾液は、分画分子量１００００の限外濾過膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製  ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２０  材質：ＰＥＳ）で濾過し、膜画分が１ｍＬになるまで４５００Ｇにて遠心した。蒸留水１０ｍＬを膜画分に添加し、再度膜画分が０．５ｍＬになるまで４５００Ｇにて遠心した。この後、膜画分から酵素を回収した。回収酵素の各活性は、参考例４に準じて測定した（表７）。【００９１】
【表７】
2013172446.tif 000009
【００９２】
セルロース含有固形分由来の糖液から回収された酵素活性と、水熱処理液による糖化残さ洗浄液から回収された酵素活性を比較すると、水熱処理液による糖化残さ洗浄液から回収された回収酵素の各活性（アビセル分解活性、セロビオース分解活性、キシラン分解活性）の方が高いことが判明した。すなわち、水熱処理液に含まれる成分によって酵素回収が促進されたものと考えられた。【００９３】
（実施例６）水熱処理液の成分分析
水熱処理液に含まれる無機イオン濃度を参考例３の手順にて測定を実施した。その結果は表８に示すとおり水熱処理液には無機イオンが１ｇ／Ｌ以上含まれ、特にカリウム成分を多く含むことが判明した。【００９４】
【表８】
2013172446.tif 000010
【００９５】
次に、芳香族成分および有機酸の分析を参考例３の手順にて測定を実施した。その結果は表９に示すとおり、芳香族成分の内、特にフルフラールの成分量が１ｇ／Ｌ以上含まれることが判明した。また、有機酸の内、酢酸成分が１ｇ／Ｌ以上含まれることが判明した。すなわち、水熱処理液の成分分析の結果、水熱処理液の添加における酵素回収性の改善は、水熱処理液に有効量含まれる無機イオン、フルフラール、酢酸の濃度と関係性があることが示された。【００９６】
【表９】
2013172446.tif 000011
【００９７】
（実施例７）回収酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離解析
比較例４、比較例５、実施例５の各回収酵素液に関して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を実施した。各回収酵素液には、サンプル調整液緩衝液（Ｅｚ  Ａｐｐｌｙ、ＡＴＴＯ社）を添加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｅ−ＰＡＧＥＬ、１５％  ゲル濃度、ＡＴＴＯ社）を行った。染色は、クマシーブリリアントブルー（ＢｉｏＳａｆｅｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｓｔａｉｎ、ＢｉｏＲＡＤ社）にて行った。なお分子量を測定するために、分子量マーカー（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＰｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、  Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ、ＢｉｏＲＡＤ社）を使用した。結果を、図５に示す。比較例４および比較例５に対して、実施例５の回収酵素成分の方が増大していることが確認できた。また、分子量マーカーとの比較により、実施例５にて回収が向上している成分は、セロビオハイドラーゼ成分、キシラナーゼ成分であることが確認できた（図５）。【００９８】
（実施例８）糖液を発酵原料とするエタノール発酵生産
実施例４で得られた糖液を発酵原料として使用して、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｃｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＯＣ−２：ワイン酵母）によるエタノール発酵試験を行った。前述酵母をＹＰＤ培地（２％  グルコース、１％  酵母エキス（Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ／ＢＤ社）、２％  ポリペプトン（日本製薬株式会社製）にて、１日間２５℃で前培養を行った。次に、得られた培養液を、第一の糖液に対し、１％となるように添加した。微生物を添加後、２５℃で２日間インキュベートした。この操作で得られた培養液に含まれるエタノール蓄積濃度は、ガスクロマトグラフ法（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ−２０１０キャピラリーＧＣ  ＴＣ−１（ＧＬ  ｓｃｉｅｎｃｅ）  １５  ｍｅｔｅｒ  Ｌ．＊０．５３ｍｍ  Ｉ．Ｄ．，ｄｆ１．５μｍを用いて、水素塩イオン化検出器により検出・算出して評価。）で測定した。その結果、培養液中には８ｇ／Ｌのエタノールが含まれることが確認できた。すなわち、本発明の糖液発酵原料としてエタノールが製造できることが確認できた。【００９９】
（実施例９）糖液を発酵原料とする乳酸発酵生産
実施例４で得られた糖液を発酵原料として使用して、乳酸菌であるラクトコッカス・ラクティスＪＣＭ７６３８株を２４時間、３７℃の温度で静置培養した。培養液に含まれるＬ−乳酸濃度を参考例３の条件で分析した結果、Ｌ−乳酸が１１ｇ／Ｌ蓄積していることが確認され、本発明の糖液により乳酸生産が可能であることが確認できた。【０１００】
（実施例１０）水熱処理液による糖化残さの洗浄（工程（３））：水熱処理液の温度による影響
実施例３での“アクセルレースデュエット”添加濃度が０．８ｇ／Ｌの場合に得られた糖化残さ２ｇ（含水）に対して、水熱処理液を１：４の重量比率で添加し、温度を４℃、２５℃、４０℃、６０℃、７０℃、８０℃の各温度で保温し、糖化残さを洗浄した。洗浄後、各反応時間の洗浄液を遠心分離（８０００Ｇ、２０分）にて上清を回収し、８ｇの洗浄液を得た。各洗浄液に含まれるグルコースおよびキシロース濃度を参考例１の手法にて測定した。この結果を表１０および１１に示す。【０１０１】
【表１０】
2013172446.tif 000012
【０１０２】
【表１１】
2013172446.tif 000013
【０１０３】
洗浄時の水熱処理液の温度としては、４０〜６０℃の範囲が最も水熱処理液中のオリゴ加水分解が進み、洗浄液中のグルコース、キシロースともに増加するため好ましいことが確認できた。【０１０４】
（実施例１１）水熱処理液による糖化残さ洗浄液（実施例１０）からの酵素回収（工程（４））
実施例１０で得られた各洗浄液８ｇを、実施例５と同じ手順で限外濾過膜によって濾過して洗浄液中の酵素を回収した。回収酵素の各活性は、参考例２に準じて測定した。また比較のため、“アクセルレースデュエット”（０．８ｇ／Ｌ）のみの各酵素活性を参考例２に準じて測定を行い、その際の活性を１００（％）として、相対値としてセルラーゼおよびヘミセルラーゼの活性を表１２にまとめた。【０１０５】
【表１２】
2013172446.tif 000014
【０１０６】
洗浄時の水熱処理液の温度としては、４０〜６０℃の範囲が最も洗浄液中の酵素活性（アビセル分解活性、セロビオース分解活性、キシラン分解活性）が向上するため好ましいことが確認できた。【０１０７】
（実施例１２）プレス濾過装置を使用した水熱処理液による糖化残さの洗浄（工程（３））、洗浄液からの酵素回収（工程（４））
実施例２のセルロース含有固形物１００ｇに対して、“アクセルレースデュエット”が０．８ｇ／Ｌ、の最終濃度となるように添加し、５０℃、２４時間、加水分解を行った。このとき、セルロース含有固形分の固形物濃度は、１０ｗｔ％になるようＲＯ水を添加し調製した（合計１０Ｌ）。得られた加水分解物１０Ｌは、プレス濾過は小型フィルタプレス装置（薮田産業製フィルタプレス  ＭＯ−４）を用いた。ろ布はポリエステル製織布（薮田産業製  Ｔ２７３１Ｃ）を使用した。スラリー液１０Ｌを小型タンクの中に入れて下から圧縮空気で曝気しながら液投入口を開いてエアーポンプ（タイヨーインタナショナル製  ６６０５３−３ＥＢ）で徐々に濾室内にスラリー液を投入した。スラリー投入後、フィルタプレス濾液を糖液として回収した（（工程（３）））。水熱処理液は、付設されているダイヤフラムを膨らませて圧搾工程を行った。徐々に圧搾圧力を上昇させていき、０．５ＭＰａまで上昇させてから約３０分間放置して濾液を糖液としてさらに回収した。濾液として回収できた糖液は７Ｌであった。次に濾室に分離された糖化残さに対して、予め５０℃に保温しておいて、水熱処理液５Ｌを通水および循環を行った。水熱処理液を小型タンクに入れ、液投入口を開いて、エアーポンプで濾室内に分離された糖化残さに水熱処理液を通水した。通水後、徐々に得られた濾液は、再度５０℃に保温した後、小型タンクに戻す循環操作を繰り返した。この操作を定期的に２時間行った後、再度、徐々に圧搾圧力を上昇させていき、０．５ＭＰａまで上昇させてから約３０分間放置して洗浄液５Ｌを回収した。【０１０８】
得られた洗浄液５Ｌは、ステリカップＨＶフィルターユニット（ミリポア社製）を使用して濾過を行った。得られた濾液は、分画分子量１００００の限外濾過膜（ＧＥ製  ＳＥＰＡ  ＰＷシリーズ  機能面材質：ポリエーテルスルホン）の平膜をセットした小型平膜濾過装置（ＧＥオスモニクス製“Ｓｅｐａ”（登録商標）  ＣＦ  ＩＩ  Ｍｅｄ／Ｈｉｇｈ  Ｆｏｕｌａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）に通じて濾過し、回収酵素と糖液成分に分離した。濾過は、原水側流速２．５Ｌ／分、膜フラックスが０．１ｍ／Ｄと一定になるように操作圧力を制御しながら５Ｌのうち４．５Ｌを濾液として分離するとともに、０．５Ｌを回収酵素として回収した。回収酵素の活性は、参考例１に準じて測定を行った。比較のため、アクセルレースデゥエット（０．８ｇ／Ｌ）のみの各酵素活性を参考例２に準じて測定を行い、その際の活性を１００（％）として、相対値としてセルラーゼおよびヘミセルラーゼの活性を表１３にまとめた。【０１０９】
（比較例６）プレス濾過装置を使用したＲＯ水による糖化残さの洗浄、洗浄液からの酵素回収
実施例１２と同じ手順で、前記水熱処理液の代わりに、ＲＯ水を同じ手順で通水および循環を行った。また実施例１２と同じ手順で洗浄液より回収酵素を得た。このときの回収酵素活性を１として表１３に示す。比較のため、アクセルレースデゥエット（０．８ｇ／Ｌ）のみの各酵素活性を参考例２に準じて測定を行い、その際の活性を１００（％）として、相対値としてセルラーゼおよびヘミセルラーゼの活性を表１３にまとめた。【０１１０】
【表１３】
2013172446.tif 000015
【０１１１】
表１３に示すように水熱処理液で糖化残さを洗浄する場合（実施例１２）、ＲＯ水で同じ操作を行った場合（比較例５）と比較して回収酵素量が大きく増大した。
【産業上の利用の可能性】
【０１１２】
本発明の糖液の製造方法によって得られた糖液は、各種化学品の発酵原料として使用することができる。
【符号の説明】
【０１１３】
１  水熱処理装置
２  保温加圧容器
３  加熱装置
４  原料フィーダー
５  攪拌装置
６  移送装置
７  圧力開放槽
８  水希釈槽
９  ポンプ
１０  固液分離装置
１１  分離膜
１２  バルブ
１３  ベルトコンベア
１４  加水分解装置
１５  混練装置
１６  攪拌移液装置
１７  加温装置
１８  撹拌装置
１９  攪拌槽
２０  加温装置
２１  バルブ
２２  ポンプ
２３  糖液回収装置
２４  固液分離装置
２５  分離膜
２６  バルブ
２７  ベルトコンベア
２８  酵素回収装置
２９  熱交換器
３０  保温装置
３１  保温槽
３２  撹拌装置
３３  バルブ
３４  ポンプ
３５  固液分離装置
３６  分離膜
３７  洗浄液槽
３８  バルブ
３９  ベルトコンベア
４０  限外濾過膜装置
４１  糖液貯槽
４２  精密濾過膜ポンプ
４３  精密濾過膜モジュール
４４  精密濾過膜濾液槽
４５  限外濾過膜ポンプ
４６  限外濾過膜モジュール
４７  ポンプ
４８  膜分離装置
４９  膜
５０  加水分解物供給ライン
５１  回収ライン
５２  水熱処理液供給ライン
【図１】
2013172446.tif 000016
【図２】
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【図３】
2013172446.tif 000018
【図４】
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【図６】
2013172446.tif 000020
【図５】
2013172446.tif 000021
【国際調査報告】
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2013172446.tif 000023
2013172446.tif 000024
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