(57)【要約】  培養液中の試料−培養液界面における水分子の配列構造や、大気中，雰囲気中，真空中等でも試料表面の凹凸、分子やたんぱく質などの組成分布や配列構造などの物理情報を高空間分解能で計測する。探針（１）と、試料（３）を載置する試料ホルダ（１１）と、前記探針の位置を周期的に変位させる振動子（２）と、前記試料において前記探針により計測される領域に光を入射するパルス発振型レーザーの光源（２７，２８）と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測する検出器（２５）と、制御装置（２６）とを備える走査プローブ顕微鏡において、前記制御装置は、前記振動子による前記探針位置の周期的変位の振幅を減少させるとともに、前記探針と前記試料との相対距離を短縮し、前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、探針増強検出効率を最適化する。
2014033844.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を周期的に変位させる振動子と、前記試料において前記探針により計測される領域に光を入射するパルス発振型レーザーの光源と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測する検出器と、前記試料ホルダを移動する走査機構と、制御装置とを備える走査プローブ顕微鏡において、
前記制御装置は、前記探針と前記試料との相対距離を制御し、前記探針と前記試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、探針増強検出効率を最適化することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項２】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記制御装置は、前記振動子による前記探針位置の周期的変位の振幅を減少させるとともに、前記探針と前記試料との相対距離を短縮し、前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、探針増強検出効率を最適化することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項３】
請求項２記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記制御装置は、前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させるために、探針振動のフィードバックをオフにし、強制的に前記探針を前記試料に近づけ、前記探針の振幅が小さくなった時点で前記パルス発振レーザー光が照射されるようにすることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項４】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料表面に生じた近接場光中に前記探針を配置して、試料表面近傍の光の電場強度を増幅することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項５】
請求項４記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料に対して、前記探針側からパルスレーザー光を入射させ、反射したパルスレーザー光を前記探針側で検出するようにしたことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項６】
請求項４記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記探針と対向する位置に、上面に前記試料を設置するプリズムを設け、前記試料に対して、前記プリズム側からパルスレーザー光を入射させ、全反射したパルスレーザー光を前記プリズム側で検出するようにしたことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項７】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記パルスレーザー光は、第一のパルスレーザー光と第二の波長可変パルスレーザー光であり、前記出力光は和周波光であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項８】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記出力光は前記パルスレーザー光の第二高調波であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項９】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記出力光は前記パルスレーザー光のラマン散乱光であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１０】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記パルスレーザー光は、第一のパルスレーザー光と第二の波長可変パルスレーザー光であり、前記出力光はコヒーレントアンチストークスラマン散乱光であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１１】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料ホルダは、培養液を保持・循環させる機能を有することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１２】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
少なくとも前記探針、前記振動子、前記試料ホルダおよび前記走査機構は、培養装置または検査装置内に設けられていることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１３】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料は、前記培養液中で培養される生体分子・生体細胞・生体組織などの生体材料であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１４】
探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を周期的に変位させる振動子と、前記試料において前記探針により計測される領域に光を入射するパルス発振型レーザーの光源と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測する検出器と、前記試料ホルダと前記探針の相対位置を制御する走査機構と、制御装置とを備える走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法において、
前記振動子による前記探針位置の周期的変位の振幅を減少させるとともに、前記探針と前記試料との相対距離を短縮し、前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、探針増強検出効率を最適化することを特徴とする走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法において、
前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させるために、探針振動のフィードバックをオフにするステップと、強制的に前記探針を前記試料に近づけるステップと、前記探針の振幅が小さくなった時点で前記パルス発振レーザー光を照射するステップを有することを特徴とする走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養液中の試料−培養液界面における水分子の配向分布、および、培養液中の試料表面の凹凸、電位分布、分子やたんぱく質などの組成分布や配列構造などの物理情報を高空間分解能で計測する走査プローブ顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養液中における生体基板材料への細胞の接着やその後の伸展・分化などの生体反応を計測・評価・制御する場合に、生体分子・生体組織・生体基板材料などの水和現象が重要である。このとき、水和構造は、水を主成分とする培養液中における試料−培養液界面において、試料表面と水分子の相互作用、および、水分子間での水素結合を含む相互作用から形成される三次元構造を示している。人工血管の内壁と赤血球との癒着などに代表されるいわゆる生体適合性は、この水和構造と密接に関連していると考えられている（例えば、非特許文献１）。さらに、培養液中の試料表面の凹凸、電位分布、分子やたんぱく質などの組成分布や配列構造などは、培養液中における生体分子・生体組織・生体基板材料などの生体反応に関して、特に、重要な特性である。【０００３】
培養液中における生体分子・生体組織・生体基板材料などの試料−培養液界面を観察・計測する手法として、従来は、光学顕微鏡、および、ラマン分光法、第二高調波法、和周波分光法などの非線形光学顕微鏡が用いられている。特に、和周波分光法では、試料−培養液界面における水和構造に関する水分子の配列構造を計測できる。非線形光学顕微鏡としては、例えば、特許文献１では、プローブとターゲットとの間の相互作用を、界面付近の水分子、溶媒分子、または、標識物質による第二高調波光や和周波光による表面選択性の非線形光学法が開示されている。しかし、これらの光学顕微鏡、および、非線形光学顕微鏡における空間分解能は１００ｎｍよりも大きく、典型的には１μｍ程度である。【０００４】
一方、走査プローブ顕微鏡は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ：Ａｔｏｍｉｃ Ｆｏｒｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を基礎としている。走査プローブ顕微鏡の一例である、走査ケルビンプローブ顕微鏡では、導電性探針を持ったカンチレバーと試料との間に働く静電場力をカンチレバーのたわみとして検出しながら、探針を試料表面上で走査することにより静電場力分布をマッピングする手法である。探針には静電場力以外に原子間力等も加わっており、静電場力を他の相互作用から分離する必要がある。そのために、まず、カンチレバーを振動させ、探針と試料の接触時に働く原子間力により減少する振動振幅を一定に保つように探針−試料間距離を調整する。これにより試料表面の高さ方向の位置が決定され、そこから一定の距離だけ探針を試料表面から離した状態で、カンチレバーの振動の位相変化から長距離力である静電場力を検出する（例えば、特許文献２）。走査プローブ顕微鏡では、探針をプローブと呼ぶことがある。【０００５】
走査プローブ顕微鏡では、一般的に、凹凸計測で１ｎｍ程度の空間分解能、静電場、および、光計測で１０ｎｍ程度の空間分解能が期待できる。しかし、探針と試料との相互作用領域が探針先端部の直径程度に限定されるために、特に、非線形光学法のようにシグナルが弱い物理量を用いる走査プローブ顕微鏡の実現は一般的に困難である。【０００６】
この弱いシグナルを補償してラマン分光法を走査プローブ顕微鏡で実現するために、探針による表面増強ラマン散乱を用いる探針増強ラマン検出法に関する文献が開示されている。特許文献３では、サンプル表面に発生させたエバネッセント場にプローブを挿入し、プローブ先端でエバネッセント場を散乱させて散乱光を検出する近接場顕微鏡において、表面増強ラマン散乱を効率良く誘起する均一な金属粒子を再現性よくコーティングした近接場顕微鏡用プローブが開示されている。【０００７】
非特許文献２では、先端がナノメートル径の金属探針に光を照射することで、その先端のナノ空間に光を閉じこめることができ、さらにナノ光源として分子を照明することで、分子からのラマン散乱光をナノ空間分解能で検出できることが示されている。特に、共鳴現象である局在プラズモンポラリトンが探針先端に励起されるので、光の電場強度が増強され、ラマン散乱の散乱断面積が実効的に増大することで、弱散乱性が補償され（探針増強ラマン検出法）、１５ｎｍの空間分解能が実現されると示されている。【０００８】
特許文献４では、試料にレーザー光を集光させてラマン散乱光を発生させ、近接または接触させた探針によりラマン散乱光を増強し散乱させて、散乱された散乱光からラマンスペクトルを検出する、探針増強ラマン検出法を用いた紫外近接場光学顕微鏡が開示されている。このとき、励起レーザー光は紫外・深紫外レーザー光であり、探針先端の材料は励起レーザーの波長で誘電率が−２以下である金属で、例えば、シリコン製の探針の表面に真空蒸着した、膜厚が約２５ｎｍで金属粒子直径が１０〜２０ｎｍであるアルミニウム薄膜が好ましいとしている。【０００９】
特許文献５では、試料をプローブ（探針）で走査しつつ、光照射によりプローブ近傍に発生する近接場光を検出する近接場光学顕微鏡により、探針−試料間距離によって表面に吸着した分子の分振動の変化がラマン散乱の変化として観測可能であることが開示されている。このとき光源はＨｅ−Ｃｄ（波長４４１ｎｍ）等のレーザー等であり、探針は３５ｎｍの銀を蒸着したプローブが用いられている。【００１０】
特許文献６では、光プローブ顕微鏡において、レーザーに同期して検出される光信号の最大値をホールドする技術が開示されている。【００１１】
しかし、これらの文献において、第二高調波法や和周波分光法を用いた走査プローブ顕微鏡は開示されておらず、また、ラマン分光法による高空間分解能の走査プローブ顕微鏡も開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表２００４−５３０１０５号公報
【特許文献２】特開２０１１−２７５８２号公報
【特許文献３】特開２００６−７１４４８号公報
【特許文献４】特開２０１０−２８６３９７号公報
【特許文献５】特開２０１０−７１８７１号公報
【特許文献６】特開２００２−３１０８８０号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】北野博巳，源明誠、高分子、５８巻、２００９年、ｐ．７４
【非特許文献２】井上康志  外、表面科学、２６巻、２００５年、ｐ．６６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、培養液中における生体分子・生体組織・生体基板材料などの試料−培養液界面における水和構造に関する水分子の配列構造を高空間分解能で計測し、さらに、大気中，雰囲気中，真空中等でも試料表面の凹凸、分子やたんぱく質などの組成分布や配列構造などの物理情報を高空間分解能で計測する走査プローブ顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本願において開示される発明のうち代表的なものを挙げれば、次の通りである。【００１６】
本発明の走査プローブ顕微鏡は、探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を周期的に変位させる振動子と、前記試料において前記探針により計測される領域に光を入射するパルス発振型レーザーの光源と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測する検出器と、前記試料ホルダを移動する走査機構と、制御装置とを備える走査プローブ顕微鏡において、前記制御装置は、前記探針と前記試料との相対距離を制御し、前記探針と前記試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、探針増強検出効率を最適化することを特徴とするものである。【００１７】
本発明の走査プローブ顕微鏡において、前記制御装置は、前記振動子による前記探針位置の周期的変位の振幅を減少させるとともに、前記探針と前記試料との相対距離を短縮し、前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、探針増強検出効率を最適化するものが好ましい。【００１８】
また、本発明の走査プローブ顕微鏡を用いた計測方法は、探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を周期的に変位させる振動子と、前記試料において前記探針により計測される領域に光を入射するパルス発振型レーザーの光源と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測する検出器と、前記試料ホルダと前記探針の相対位置を制御する走査機構と、制御装置とを備える走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法において、前記振動子による前記探針位置の周期的変位の振幅を減少させるとともに、前記探針と前記試料との相対距離を短縮し、前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、探針増強検出効率を最適化することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、培養液中で生体分子・生体組織・生体基板材料などと培養液の界面における水や分子との相互作用を高空間分解能で計測することが可能となる。また、大気中，雰囲気中，真空中等でも試料表面の凹凸、分子やたんぱく質などの組成分布や配列構造などの物理情報を高空間分解能で計測することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の実施例１の走査プローブ顕微鏡の概略構成図である。
【図２】本発明の実施例１の走査プローブ顕微鏡の動作を説明する図である。
【図３Ａ】探針増強効果が無い場合の、検出器出力の探針−試料間距離依存を示すプロットである。
【図３Ｂ】探針増強効果がある場合の、検出器出力の探針−試料間距離依存を示すプロットである。
【図３Ｃ】探針の振動とパルス発振レーザー光の繰り返しを同期させて、探針増強効果を最適化した場合の、検出器出力の探針−試料間距離依存を示すプロットである。
【図４】本発明の実施例１の他の走査プローブ顕微鏡の概略構成図である。
【図５】本発明の実施例１の他の走査プローブ顕微鏡の概略構成図である。
【図６】本発明の実施例２の走査プローブ顕微鏡の概略構成図である。
【図７】本発明の実施例４の、試料ホルダおよび電極部分の一例を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、試料表面に生じた近接場光（エバネッセント光）中に探針を配置して、探針からの近接場光と試料からの近接場光とにより試料表面近傍の光の電場強度を増幅することにより微弱なシグナル光を補償する探針増強検出法による走査プローブ顕微鏡において、和周波分光法（ＳＦＧ）、第二高調波法（ＳＨＧ）やその他の線形・非線形光学分光法を用いるときに、探針増強効果が探針−試料間距離に強く依存するために、探針−試料間距離に依存する検出光強度を計測することにより、探針増強効果を最適化することが可能であるという新たな知見に基づくものである。
【００２２】
本発明を、以下の実施例を用いて詳細に説明する。なお、発明を実施するための形態に記載され、本実施例に未記載の事項も本実施例に適用することができる。
【実施例１】
【００２３】
本実施例では、走査プローブ顕微鏡の一形態としての、探針増強走査和周波顕微鏡を開示する。図１は、本発明の実施例１の走査プローブ顕微鏡の概略構成図である。探針１は振動子２に設置され、試料３との相対位置は振動子２により制御される。探針１は、入射する光中に置かれたときに、先端近傍に近接場光強度が増幅・集中する材料が選択される。また、ラマン分光法や和周波分光法などのようにラマン散乱を用いる場合は、表面増強ラマン散乱を有効に用いることができる、金、銀、銅、アルミなどの金属やそれらの化合物が用いられる。シリコン探針に厚さ１〜２０ｎｍの金薄膜を蒸着した探針は、有効な探針の候補として用いられる。また、本実施例においては、振動子２は主に試料３の垂直方向に振動し、探針１と試料３の距離は３００ｎｍ以下で制御され、また、振動子２の固有振動数は２００ｋＨｚ〜２ＭＨｚが用いられる。本実施例では、振動子２として、長手方向に伸縮する水晶振動子が用いられるが、原子間力顕微鏡などの走査プローブ顕微鏡で一般的に用いられるチューニングフォーク型の水晶振動子、ピエゾ素子による振動子、カンチレバーにピエゾ素子を配置した振動子などを用いることができる。【００２４】
ＳＨＧ，ＳＦＧおよびその他の非線形光学現象は光強度の２乗に比例することが公知である。よって、探針増強走査和周波顕微鏡に於いても、連続発振レーザー（ＣＷレーザー）より、パルス当りの強度が強いパルス発振レーザーを使った方が圧倒的に信号検出は有利になる。例えば、探針増強ラマンに用いられている波長５３２ｎｍ，５０ｍＷのＣＷレーザーの１秒当たりの光子数は１．３４×１０１７個になる。それに対し、ＳＦＧには波長５３２ｎｍで０．１〜１ｍＪのパルス発振レーザーが用いられる。１ｍＪの場合のパルス発振レーザーピーク出力を考えると１パルス当りに含まれる光子数は２．６８×１０１５個となる。ＳＦＧで用いる場合のパルス発振レーザーのパルス幅は２０−３０ｐｓである。このパルス幅（２０ｐｓ）時間当たりに含まれる先のＣＷレーザー中の光子数は２．７×１０６個となり、ＣＷレーザーに比べてパルス発振レーザーでは９桁以上光子数が多くなる。よって、ＳＨＧ，ＳＦＧ等の非線形光学特性のマッピングにはパルス発振レーザーを用いる方が圧倒的に有利となる。【００２５】
しかし、効率よくＳＦＧまたはＳＨＧ等の信号を検出するには探針先端が試料表面に充分近づいている必要がある。特許文献５によると探針と試料間距離が２６．５ｎｍ以上ではラマン信号の増強効果が現れないとされている。また、その距離が２６．５ｎｍ以下では増強効果が指数関数的に増大する事が示されているので、図１に示した探針１と試料３の表面間距離はおよそ２ｎｍ程度以下になることが望ましい。探針１と試料３の表面間距離は振動子２によって制御され振動しているが、その振動周期は２００ｋＨｚ〜２ＭＨｚであり、一般的なパルス発振レーザーの発振周期５０Ｈｚ〜２００ｋＨｚとは必ずしも同期しない。これを同期させる方法として、通常、フィードバックにより一定となっている探針振動のフィードバックをオフにし、強制的に探針１を試料３へ近づけその間に働く原子間力により、位相にずれが生じ探針の振幅が小さくなるが、この探針の振幅はＡＦＭ機構により常にモニター可能であるので、探針の振幅が１ｎｍ以下になるときにレーザーパルスが照射されるようにパルス発振レーザーに探針振動を同期させることで探針増強効果の最大化が実現できる。図２に、以上の探針−試料間距離とパルス発振レーザーの発振同期模式図を示す。図２に示すように、探針はタッピンングモードで探針−試料間距離０〜数十ｎｍ程度間を振動している。時刻３５でフィードバックを切り、強制的に探針を試料に近づける。振幅が十分小さくなった時点でＡＦＭモードのフィードバックにより、短針−試料間距離が一定（２ｎｍ以下程度）になる時刻３６に同期させてパルス発振レーザーを同期させる。その後、時刻３７で探針振動のフィードバックをかける。そして、この動作を繰り返す。【００２６】
この同期による信号の最大化は探針増強走査和周波顕微鏡だけでなく、以下の実施例で示す探針増強走査第二高調波顕微鏡、および、その他の非線形光学特性による探針増強走査光プローブ顕微鏡でも使うことができる。【００２７】
振動子２により探針１は、振動子２の固有振動数近傍の周波数（固有振動数の±１％程度以内）で、試料３の表面に対して垂直方向に振動させられる。探針１と試料３との間の相互作用（力）により、振動子２に印加する電圧と振動子２の実際の振動振幅には位相差が生じるが、その位相差は、本実施例では、振動子２に印加する交流電圧と振動子２に流入する電流との位相差により、探針−試料間の相互作用（力）がわかり、探針−試料間距離がわかる。また、この位相差を一定にしながら、走査機構３１により試料３と探針１との相対位置を試料に垂直方向と試料の平面方向に走査することにより、走査プローブ顕微鏡の一方式である原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を構成でき、試料表面の凹凸が計測できる。探針１と試料３の距離は、一般的には、最近接位置で０ｎｍ（接触）から１００ｎｍの距離まで接近するが、探針１を試料３の内部までめり込ませることも可能である。また、振動子２の振動振幅が一定の量だけ減少するようにしながら、走査機構３１により試料３と探針１との相対位置を試料に垂直方向と試料の平面方向に走査することにより、探針１と試料３の距離を最近接位置で０ｎｍとすることもできる（タッピングモードＡＦＭ）。探針１は配線４により探針用電源５に接続され、探針１と試料３との間に交流電圧と直流電圧を印加することができる。本実施例では、試料３として、表面処理を行ったポリカーボネートを用い、また、探針１と試料３との間に印加する電圧は用いない。【００２８】
試料ホルダ１１は、培養液注入口１２と培養液回収口１３とを備え、培養液１４を、保持、または、交換できる。培養液１４のかわりに、水、または、溶媒を用いることもできる。符号１７は培養液供給排出機構を示しており、培養液供給容器１８から試料ホルダ１１に新しい培養液を供給し、また、試料ホルダ１１から培養液排出容器１９へ使用済みの培養液を排出する。【００２９】
探針１が近接する試料３の領域近傍にパルス発振レーザー光、または、同期して入力する複数のパルス発振レーザー光を入力し、フィルター付検出器２５で出力光２４の強度を計測する。本実施例では、波長５３２ｎｍの緑色パルス発振レーザー光である第一のパルス発振レーザー光２２と、波長が２．３〜１０ミクロンで可変の赤外パルス発振レーザー光である、第二のパルス発振レーザー光２３を同期して入力する。出力光２４をフィルター付検出器２５に入力して、第一のパルス発振レーザー光２２の周波数と第二のパルス発振レーザー光２３の周波数との和の周波数（和周波）の強度を計測する。第二のパルス発振レーザー光２３の周波数に依存する和周波の出力光２４の強度を記録することにより和周波分光ができる。本実施例では、波数が３２００カイザーのピークと波数が３４００カイザーのピークを比較して、ポリカーボネートと培養液１４との界面における４面体配位した水分子と非対称結合した水分子の配向の割合を議論できる。【００３０】
ＡＦＭを構成して、探針１と試料３が十分に近接している場合には、局在プラズモンポラリトンが探針１の先端に励起され光の電場強度が増強されることに起因する探針増強効果により、和周波の出力光２４の強度が飛躍的に増強される（探針増強和周波分光法）。さらに、探針１により試料３の表面の一部を走査しながら特定の波数における和周波の出力光２４の強度を計測することにより、試料３と培養液１４との界面における水分子の配向の空間分布を高空間分解能でマッピングできる（探針増強走査和周波顕微鏡）。本実施例においては、探針増強効果により和周波の出力光２４は１００００倍に増強され、走査和周波顕微鏡の空間分解能は１０ｎｍとなる。【００３１】
ここで、本実施例の走査プローブ顕微鏡において、探針増強効果を最適化して検出器出力を最大に調整する手法を開示する。探針１、および、試料３の表面に生ずる近接場光（エバネッセント光）は、表面から距離が離れるに従い指数関数的に強度が減少する。したがって、探針増強効果は、探針１と試料３の距離が十分に近い場合だけに期待できる。本実施例においては、探針１と試料３の距離が２０ｎｍ以下であるときに探針増強効果が起こる。振動子２により探針１を１ｎｍ程度の距離で微小振動させ、探針１と試料３の距離（探針−試料間距離）を計測する。制御装置２６により、走査機構３１を制御して探針１と試料３の最近接位置を変化させながら、フィルター付検出器２５の出力を計測する。【００３２】
図３Ａ〜Ｃは、本実施例の走査プローブ顕微鏡により測定された検出器出力の探針−試料間距離依存を示すプロットである。図３Ａは、探針１と試料３の距離が比較的離れていて探針増強効果が無い場合で、探針−試料間距離が大きいときに、探針１により遮られるパルス発振レーザー光が少なくなり、探針が光を遮らない幾何学的条件による出力光極大４１を示す。つまり、探針１が試料３に近づくと光が遮られるので、探針が近づくにつれて出力が小さくなる。図３Ｂは、探針１と試料３の距離が十分に近く探針増強効果がある場合で、探針−試料間距離が大きいときには、探針１により遮られるパルス発振レーザー光が少なくて、探針が光を遮らない幾何学的条件による出力光極大４１を示すが、探針−試料間距離が小さいときには、探針増強効果による出力光極大４２を示す。パルス発振レーザー光の入射位置、入射角度、出力光角度、複数のパルス発振レーザー光の同期条件、探針１の材料や形状、振動子２の振動数、振幅、振動子２の振動とパルス発振レーザー光との同期条件など、探針増強効果を変化させる実験パラメタは、探針増強効果による出力光極大４２を最適化するように設定すれば良い。さらに、図３Ｃでは、通常の測定モードとして、振動子２により探針１を振動させ、探針−試料間距離が最近接位置になったときに同期してパルス発振レーザー光を入射する場合に、探針１の振動とパルス発振レーザー光の繰り返しを同期させて、探針増強効果を最適化する場合を示している。この例は、一例として、パルス発振レーザー光の繰り返し周波数が、探針１の振動数の１／３の場合を示している。このとき、制御装置２６により、探針１の振動とフィルター付検出器２５の出力の振動の位相差を、適宜、設定する必要があるが、その位相差の値は、図３Ａ，Ｂで示す測定により設定することが本質的に重要である。探針と試料間の距離に応じて、検出器出力は図３Ａおよび図３Ｂのように変化し、さらに、探針増強効果による出力光極大４２の大きさが変化する。出力光極大４２の大きさが大きくなるように、パルス発振レーザー光の入射位置、入射角度、出力光角度、複数のパルス発振レーザー光の同期条件、探針１の材料や形状、振動子２の振動数、振幅、振動子２の振動とパルス発振レーザー光との同期条件など、探針増強効果を変化させる実験パラメタを調整すればよい。【００３３】
実施例１の走査プローブ顕微鏡は、細胞培養装置内部で使うこともできる。このときは図４に示すように、試料ホルダ１１，振動子２，走査機構３１などを細胞培養装置３２の内部に設け、レーザー発振器２７，２８および検出器２５は培養装置３２の外に配置する。そして、パルス発振レーザー光２２，２３及び出力光２４は窓３３を通して照射または検出される。窓材は、パルス発振レーザー光及び出力光それぞれの波長に合わせて、これらの光を透過する例えば光学ガラス，石英ガラス等を用いる事ができる。【００３４】
以上の実施例では主に生体分子・生体組織・生体基板材料と培養液との界面の計測・評価について述べたが、半導体デバイス（例えばＰ−Ｎ接合界面）の界面評価、電池の電極−電解液界面などの計測・評価にも用いることができる。特に、電池の電極−電解液界面は生体材料−培養液界面と同様の表面と液体分子の界面であり、応用が期待できる。電極−電解液界面の計測の場合は、図４と同様に電解液の供給排出機構があってもよいが、固体界面の評価のみに用いる場合は、図５に示すように液の供給排出機構は必要ない。図５は、走査プローブ顕微鏡を半導体検査装置３２の内部に設けたもので、図４の液の供給排出機構を備えておらず、また、試料ホルダ１１も、液を保持する構造を備えていない。【００３５】
本実施例によれば、探針増強走査光プローブ顕微鏡において、パルス幅時間当たりに含まれる光子数が多いパルス発振レーザーの光を用いることにより、高感度に検出することができる。また、探針と試料間の距離を短縮し、探針と試料間の距離が短縮したときにパルス発振レーザー光が照射されるようにしたことで、探針増強効果を最適化し、高感度に検出することができる。
【実施例２】
【００３６】
本実施例では、走査プローブ顕微鏡の一形態として、全反射法による探針増強走査和周波顕微鏡を開示する。図６は、本発明の実施例２の走査プローブ顕微鏡の概略構成図である。実施例１の走査プローブ顕微鏡と異なる部分を中心に説明する。本実施例においては、試料３はプリズム２１の上面に設置される。試料ホルダ１１は、底が無いリング状の形状、または、プリズム２１と接する部分の厚みが非常に薄く、かつ、パルス発振レーザー光を良く透過する材料を用いる。試料３は、厚みが薄く、かつ、パルス発振レーザー光を良く透過する材料に限定する。プリズム２１の円筒面にほぼ垂直に入力するパルス発振レーザー光、または、同期して入力する複数のパルス発振レーザー光は、プリズム上面、または、試料表面において全反射して、出力光２４として散乱される。フィルター付検出器２５で出力光２４の強度を計測する。本実施例では、波長５３２ｎｍの緑色パルス発振レーザー光である第一のパルス発振レーザー光２２と、波長が２．３〜１０ミクロンで可変の赤外パルス発振レーザー光である、第二のパルス発振レーザー光２３を同期して入力する。出力光２４をフィルター付検出器２５に入力して、第一のパルス発振レーザー光２２の周波数と第二のパルス発振レーザー光２３の周波数との和の周波数（和周波）の強度を計測する。第二のパルス発振レーザー光２３の周波数に依存する和周波の出力光２４の強度を記録することにより和周波分光ができる。本実施例では、波数が３２００カイザーのピークと波数が３４００カイザーのピークを比較して、ポリカーボネートと培養液１４との界面における４面体配位した水分子と非対称結合した水分子の配向の割合を測定する。
【実施例３】
【００３７】
本実施例では、走査プローブ顕微鏡の一形態として、探針増強走査第二高調波顕微鏡、および、その他の線形・非線形光学特性による探針増強走査光プローブ顕微鏡を開示する。本実施例では、実施例１と同様に、図１を用いて説明する。【００３８】
本実施例における探針増強走査第二高調波顕微鏡では、探針１が近接する試料３の領域近傍に波長１０６４ｎｍの赤外パルス発振レーザー光である第一のパルス発振レーザー光２２を入力する。出力光２４をフィルター付検出器２５に入力して、第一のパルス発振レーザー光２２の周波数の２倍の周波数の光強度を計測する。試料３として、培養した神経細胞を用い、ＡＦＭにより神経細胞の凹凸を計測しながら、第二高調波強度をマッピングすることにより、走査第二高調波顕微鏡が構成でき、神経細胞の神経活動強度をマッピングできる。このとき、実施例１と同様に探針増強効果を最適化することができ、探針増強走査第二高調波顕微鏡が構成できる。【００３９】
本実施例における探針増強走査ラマン顕微鏡では、探針１が近接する試料３の領域近傍に波長５３２ｎｍの緑色パルス発振レーザー光である第一のパルス発振レーザー光２２を入力する。出力光２４をフィルター付検出器２５に入力して、ラマン散乱光の光強度を計測する。試料３として、培養した肝細胞を用い、ＡＦＭにより肝細胞の凹凸を計測しながら、ラマン散乱をしらべることにより、肝細胞中の分子やたんぱく質などの組成分布をマッピングできる。このとき、実施例１と同様に探針増強効果を最適化することができ、探針増強走査ラマン顕微鏡が構成できる。【００４０】
本実施例における探針増強走査ＣＡＲＳ顕微鏡では、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）を用いる。探針１が近接する試料３の領域近傍に角振動数が異なる第一のパルス発振レーザー光２２（角振動数ω１）と、第二のパルス発振レーザー光２３（角振動数ω２）を同期して入力する。出力光２４をフィルター付検出器２５に入力して、ＣＡＲＳ光の光強度を計測する。ＡＦＭにより試料３の凹凸を計測しながら、ＣＡＲＳ光の光強度をしらべることにより、試料３の分子やたんぱく質などの組成分布をマッピングできる。このとき、実施例１と同様に探針増強効果を最適化することができ、探針増強走査ＣＡＲＳ顕微鏡が構成できる。
【実施例４】
【００４１】
本実施例では、走査プローブ顕微鏡に用いる試料ホルダおよび電極部分の一例を開示する。【００４２】
図７は、本発明の走査プローブ顕微鏡に用いる、試料ホルダおよび電極部分の一例を示す概略構成図である。制御装置２６により制御するバイポテンショスタット５１は、探針電極５２、試料電極５３、作用電極５４、参照電極５５を制御する。培養液１４の電位を参照電極５５により計測して、培養液１４に対する探針１の電圧を探針電極５２により印加して、また、培養液１４に対する試料３の電圧を試料電極５３で印加する。このとき、培養液１４と参照電極５５の間に流れる電流はほとんど零である。培養液１４と試料３の間に電流を流し、例えば、化学反応を生じさせるためには、作用電極５４−試料電極５３間の電流を用いる。探針１と試料３の間に電圧を印加する場合は、探針電極５２と試料電極５３の間に電圧を印加する。本発明の実施例の走査プローブ顕微鏡において、走査トンネル顕微鏡を構成する場合は、探針電極５２と試料電極５３の間の電圧、および、電流を印加電圧、および、トンネル電流として用いる。また、試料３に電荷注入を行う場合には電荷注入電極５６を用いる。【００４３】
実施例１と同様に、振動子２を固有振動数近傍の周波数（固有振動数の±１％程度以内）で振動させ、試料３の表面に対して垂直方向に探針１を振動させる。振動子２に印加する交流電圧と振動子２に流入する電流との位相差により、探針１と試料３の間の相互作用（力）がわかり、探針−試料間距離がわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
培養液中で生体分子・生体組織・生体基板材料と培養液との界面を計測・評価することが可能となり、また、培養基板、水浄化膜、培養細胞の評価に適用できる。さらに、半導体デバイスの界面や電池の電極−電解液界面などの物理情報の計測・評価に用いることができる。
【符号の説明】
【００４５】
１  探針
２  振動子
３  試料
４  配線
５  探針用電源
１１  試料ホルダ
１２  培養液注入口
１３  培養液回収口
１４  培養液（水、溶媒）
１５  培養液イン
１６  培養液アウト
１７  培養液供給排出機構
１８  培養液供給容器
１９  培養液排出容器
２１  プリズム
２２  第一のパルス発振レーザー光
２３  第二のパルス発振レーザー光
２４  出力光
２５  フィルター付検出器
２６  制御装置 
２７，２８  レーザー発振器
３１  走査機構
３２  細胞培養装置または半導体検査装置等
３３  窓
３５  探針振動のフィードバックオフ
３６  振動と同期して発振されるパルス発振レーザー
３７  探針振動のフィードバックオン
４１  探針が光を遮らない幾何学的条件による出力光極大
４２  探針増強効果による出力光極大
５１  バイポテンショスタット 
５２  探針電極 
５３  試料電極 
５４  作用電極 
５５  参照電極 
５６  電荷注入電極 
【図１】
2014033844.tif 000003
【図２】
2014033844.tif 000004
【図３Ａ】
2014033844.tif 000005
【図３Ｂ】
2014033844.tif 000006
【図３Ｃ】
2014033844.tif 000007
【図４】
2014033844.tif 000008
【図５】
2014033844.tif 000009
【図６】
2014033844.tif 000010
【図７】
2014033844.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成27年11月10日(2015.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を周期的に変位させる振動子と、前記試料において前記探針により計測される領域に光を入射するパルス発振型レーザーの光源と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測する検出器と、前記試料ホルダを移動する走査機構と、制御装置とを備える走査プローブ顕微鏡において、
前記制御装置は、前記探針と前記試料との相対距離を制御し、前記探針と前記試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、前記探針によりレーザー光が遮られることによる前記出力光の極小に重畳する探針増強効果による出力光の極大を計測することにより探針増強検出効率を最適化することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項２】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記制御装置は、前記振動子による前記探針位置の周期的変位の振幅を減少させるとともに、前記探針と前記試料との相対距離を短縮し、前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、探針増強検出効率を最適化することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項３】
請求項２記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記制御装置は、前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させるために、探針振動のフィードバックをオフにし、強制的に前記探針を前記試料に近づけ、前記探針の振幅が小さくなった時点で前記パルス発振レーザー光が照射されるようにすることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項４】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料表面に生じた近接場光中に前記探針を配置して、試料表面近傍の光の電場強度を増幅することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項５】
請求項４記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料に対して、前記探針側からパルスレーザー光を入射させ、反射したパルスレーザー光を前記探針側で検出するようにしたことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項６】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記パルスレーザー光は、第一のパルスレーザー光と第二の波長可変パルスレーザー光であり、前記出力光は和周波光であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項７】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記出力光は前記パルスレーザー光の第二高調波であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項８】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記出力光は前記パルスレーザー光のラマン散乱光であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項９】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記パルスレーザー光は、第一のパルスレーザー光と第二の波長可変パルスレーザー光であり、前記出力光はコヒーレントアンチストークスラマン散乱光であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１０】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料ホルダは、培養液を保持・循環させる機能を有することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１１】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
少なくとも前記探針、前記振動子、前記試料ホルダおよび前記走査機構は、培養装置または検査装置内に設けられていることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１２】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料は、前記培養液中で培養される生体分子・生体細胞・生体組織などの生体材料であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１３】
探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を周期的に変位させる振動子と、前記試料において前記探針により計測される領域に光を入射するパルス発振型レーザーの光源と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測する検出器と、前記試料ホルダと前記探針の相対位置を制御する走査機構と、制御装置とを備える走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法において、
前記振動子による前記探針位置の周期的変位の振幅を減少させるとともに、前記探針と前記試料との相対距離を短縮し、前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、前記探針によりレーザー光が遮られることによる前記出力光の極小に重畳する探針増強効果による出力光の極大を計測することにより探針増強検出効率を最適化することを特徴とする走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法。
【請求項１４】
請求項１４記載の走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法において、
前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させるために、探針振動のフィードバックをオフにするステップと、強制的に前記探針を前記試料に近づけるステップと、前記探針の振幅が小さくなった時点で前記パルス発振レーザー光を照射するステップを有することを特徴とする走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明の走査プローブ顕微鏡は、探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を周期的に変位させる振動子と、前記試料において前記探針により計測される領域に光を入射するパルス発振型レーザーの光源と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測する検出器と、前記試料ホルダを移動する走査機構と、制御装置とを備える走査プローブ顕微鏡において、前記制御装置は、前記探針と前記試料との相対距離を制御し、前記探針と前記試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、前記探針によりレーザー光が遮られることによる前記出力光の極小に重畳する探針増強効果による出力光の極大を計測することにより探針増強検出効率を最適化することを特徴とするものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
また、本発明の走査プローブ顕微鏡を用いた計測方法は、探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を周期的に変位させる振動子と、前記試料において前記探針により計測される領域に光を入射するパルス発振型レーザーの光源と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測する検出器と、前記試料ホルダと前記探針の相対位置を制御する走査機構と、制御装置とを備える走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法において、前記振動子による前記探針位置の周期的変位の振幅を減少させるとともに、前記探針と前記試料との相対距離を短縮し、前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、前記探針によりレーザー光が遮られることによる前記出力光の極小に重畳する探針増強効果による出力光の極大を計測することにより探針増強検出効率を最適化することを特徴とするものである。
【手続補正書】
【提出日】平成28年1月20日(2016.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を周期的に変位させる振動子と、前記試料において前記探針により計測される領域に光を入射するパルス発振型レーザーの光源と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測する検出器と、前記試料ホルダを移動する走査機構と、制御装置とを備える走査プローブ顕微鏡において、
前記制御装置は、前記探針と前記試料との相対距離を制御し、前記探針と前記試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、前記探針によりレーザー光が遮られることによる前記出力光の極小に重畳する探針増強効果による出力光の極大を計測することにより探針増強検出効率を最適化することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項２】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記制御装置は、前記振動子による前記探針位置の周期的変位の振幅を減少させるとともに、前記探針と前記試料との相対距離を短縮し、前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、探針増強検出効率を最適化することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項３】
請求項２記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記制御装置は、前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させるために、探針振動のフィードバックをオフにし、強制的に前記探針を前記試料に近づけ、前記探針の振幅が小さくなった時点で前記パルス発振レーザー光が照射されるようにすることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項４】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料表面に生じた近接場光中に前記探針を配置して、試料表面近傍の光の電場強度を増幅することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項５】
請求項４記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料に対して、前記探針側からパルスレーザー光を入射させ、反射したパルスレーザー光を前記探針側で検出するようにしたことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項６】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記パルスレーザー光は、第一のパルスレーザー光と第二の波長可変パルスレーザー光であり、前記出力光は和周波光であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項７】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記出力光は前記パルスレーザー光の第二高調波であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項８】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記出力光は前記パルスレーザー光のラマン散乱光であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項９】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記パルスレーザー光は、第一のパルスレーザー光と第二の波長可変パルスレーザー光であり、前記出力光はコヒーレントアンチストークスラマン散乱光であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１０】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料ホルダは、培養液を保持・循環させる機能を有することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１１】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
少なくとも前記探針、前記振動子、前記試料ホルダおよび前記走査機構は、培養装置または検査装置内に設けられていることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１２】
請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
前記試料は、前記培養液中で培養される生体分子・生体細胞・生体組織などの生体材料であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
【請求項１３】
探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を周期的に変位させる振動子と、前記試料において前記探針により計測される領域に光を入射するパルス発振型レーザーの光源と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測する検出器と、前記試料ホルダと前記探針の相対位置を制御する走査機構と、制御装置とを備える走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法において、
前記振動子による前記探針位置の周期的変位の振幅を減少させるとともに、前記探針と前記試料との相対距離を短縮し、前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、前記探針によりレーザー光が遮られることによる前記出力光の極小に重畳する探針増強効果による出力光の極大を計測することにより探針増強検出効率を最適化することを特徴とする走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法において、
前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させるために、探針振動のフィードバックをオフにするステップと、強制的に前記探針を前記試料に近づけるステップと、前記探針の振幅が小さくなった時点で前記パルス発振レーザー光を照射するステップを有することを特徴とする走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法。
【国際調査報告】
2014033844.tif 000012
2014033844.tif 000013
2014033844.tif 000014
2014033844.tif 000015
2014033844.tif 000016
2014033844.tif 000017