(57)【要約】  培養容器であって、第一容器と、前記第一容器内に収納し保持される複数の第二容器と、前記第一容器及び前記第二容器の各々を封止する容器蓋部材と、前記第一容器及び前記第二容器の各々と、該培養容器に前記細胞及び培地を供給する流路回路とを接続する接続ポートとを備えており、前記第一容器及び前記第二容器は、各々、培地及び細胞を、または培地のみを収容するための容器であり、前記接続ポートとして、前記第一容器には、前記培地の供給と、前記気体の供給及び排出をするための第二供給ポートと、前記培地を排出するための第二排出ポートとが接続され、前記第二容器の各々には、前記培地の供給と、気体の供給及び排出をするための第一供給ポートと、前記培地を排出するための第一排出ポートとが接続され、前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートは、前記培地を前記培養容器に対して常に一方向へ流す流路として機能する。
2013183121.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を保持、培養するための培養容器であって、
第一容器と、
前記第一容器内に収納し保持される複数の第二容器と、
前記第一容器及び前記第二容器の各々を封止する容器蓋部材と、
前記第一容器及び前記第二容器の各々と、該培養容器に前記細胞及び培地を供給する流路回路とを接続する接続ポートとを備えており、
前記第一容器及び前記第二容器は、各々、培地及び細胞を、または培地のみを収容するための容器であり、前記第一容器及び前記第二容器の各々間の隔壁の一部は、液体及び気体が相互に移動可能に構成されており、
前記第一容器及び前記第二容器の各々との間には、相互に気体の流通を可能にするギャップが存在しており、
前記接続ポートとして、
前記第一容器には、前記培地の供給と、前記気体の供給及び排出をするための第二供給ポートと、前記培地を排出するための第二排出ポートとが接続され、
前記第二容器の各々には、前記培地の供給と、前記気体の供給及び排出をするための第一供給ポートと、前記培地を排出するための第一排出ポートとが接続され、
前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートは、前記培地を前記培養容器に対して常に一方向へ流す流路として機能する
ことを特徴とする培養容器。
【請求項２】
請求項１において、
前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートは、前記培地を前記培養容器の外側から内側への方向のみに流す流路、及び、前記気体を双方的に流す流路として機能し、
前記第一排出ポート及び前記第二排出ポートは、前記培地を前記培養容器の内側から外側への方向のみに流す流路として機能する
ことを特徴とする培養容器。
【請求項３】
請求項２において、
前記第一容器は函体状の容器であり、該容器に複数個設けられた開口部を有し、
前記容器蓋部材は前記第一供給ポート及び前記第一排出ポートを有し、
前記第二容器は、各々、前記開口部を介して前記第一容器の内部に収納され、該第二容器の各々に対応して前記容器蓋部材が、前記開口部を塞ぐようにして前記第一容器に各々固定され、これにより、前記培養容器内に、前記容器蓋部材と前記第一容器により囲まれた閉鎖空間が形成され、各前記第二容器が該閉鎖空間内に保持される
ことを特徴とする培養容器。
【請求項４】
請求項３において、
前記容器蓋部材と前記第一容器の間に接続され、かつ、その内部に前記第二容器を収容可能な隔離膜を有し、
該隔離膜は、前記容器蓋部材が前記開口部から取り外された状態でも、前記閉鎖空間を維持する機能を有する
ことを特徴とする培養容器。
【請求項５】
請求項４において、
前記隔離膜は、培養時において、前記容器蓋部材と前記第一容器の内部に収容することが可能であり、
該隔離膜は、前記第二容器を取り出す時において、前記容器蓋部材と前記第一容器の間に伸長可能である
ことを特徴とする培養容器。
【請求項６】
請求項４において、
前記隔離膜は、該隔離膜を溶着させさらに切断させることにより、当該第一容器を当該隔離膜及び当該容器蓋部材により封止した状態で当該第二容器から分離可能であり、
当該第一容器を当該第二容器から分離させた後の当該第一容器は、当該隔離膜により封止され前記閉鎖空間を維持する状態となる
ことを特徴とする培養容器。
【請求項７】
請求項４において、
前記隔離膜は、培養時において、前記容器蓋部材と前記第一容器の外部に収容することが可能であり、
該隔離膜は、前記第二容器を取り出す時において、前記容器蓋部材と前記第一容器の間に伸長可能である
ことを特徴とする培養容器。
【請求項８】
請求項７において、
前記容器蓋部材と前記第二容器の間を、当該容器蓋部材の上面若しくは側面と当該第二容器への溶着により接続した
ことを特徴とする培養容器。
【請求項９】
請求項３において、
前記容器蓋部材は、各々、螺合、係合、嵌合のいずれかの固定手段で前記第一容器に固定される
ことを特徴とする培養容器。
【請求項１０】
請求項９において、
前記容器蓋部材は、ねじにより前記第一容器に固定され、
前記第二容器を取り出す時において、前記容器蓋部材を回転させ前記隔離膜を捻じることにより生ずる捻じれ構造部分を溶着、切断することにより、前記第二容器を前記第一容器から単離させせる
ことを特徴とする培養容器。
【請求項１１】
細胞を保持、培養するための培養容器であって、
第一容器と、
前記第一容器内に収納し保持される複数の第二容器と、
前記第一容器及び前記第二容器の各々を封止する容器蓋部材と、
検査用第一容器と、
前記検査用第一容器内に収納し保持される検査用第二容器と、
検査用容器蓋部材と、
前記第一容器及び前記検査用第一容器と、前記第二容器の各々及び前記検査用第二容器と、該培養容器に前記細胞及び培地を供給する流路回路とを接続する接続ポートとを備えており、
前記第一容器、前記第二容器、前記検査用第一容器、及び前記検査用第二容器は、各々、培地及び細胞を、または培地のみを収容するための容器であり、
前記第一容器と前記第二容器の各々、及び、前記検査用第一容器と前記検査用第二容器は、液体及び気体が相互に移動可能に構成されており、
前記第一容器と前記第二容器の各々、及び、前記検査用第一容器と前記検査用第二容器との間には、相互に気体の流通を可能にするギャップが存在しており、
前記接続ポートとして、
前記第二容器の各々及び前記検査用第二容器には、前記培地の供給と、前記気体の供給及び排出をするための第一供給ポートと、前記培地を排出するための第一排出ポートとが接続され、
前記第一容器及び前記検査用第一容器には、各々、前記培地の供給と、前記気体の供給及び排出をするための第二供給ポートと、前記培地を排出するための第二排出ポートとが接続され、
前記流路回路には、前記検査用第一容器及び前記検査用第二容器をバイパスする迂回流路チューブが設けられ、
前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートは、前記培地を前記培養容器に対して常に一方向へ流す流路として機能する
ことを特徴とする培養容器。
【請求項１２】
培養容器内への細胞播種と培地交換を行い、前記培養容器内において細胞を培養する自動培養装置であって、
少なくとも１つの閉鎖系培養容器と、
前記閉鎖系培養容器の供給側に１つの細胞バッグ、培地バッグ、第一のフィルタ、及び排液回収バッグを接続する第一の流路回路と、
前記閉鎖系培養容器の供給側に他の細胞バッグ、培地バッグ、第二のフィルタ及び排液回収バッグを接続する第二の流路回路と、
前記第一の流路回路及び前記第二の流路回路に設けられた流体移動制御機構部及び電磁弁と、
制御装置とを備え、
前記閉鎖系培養容器は、
第一容器と、
前記第一容器内に収納し保持される複数の第二容器と、
前記第一容器及び前記第二容器の各々を封止する容器蓋部材と、
前記第一容器及び前記第二容器の各々と、該培養容器に前記細胞及び培地を供給する流路回路とを接続する接続ポートとを備えており、
前記第一容器及び前記第二容器は、各々、培地及び細胞を、または培地のみを収容するための容器であり、前記第一容器及び前記第二容器の各々間の隔壁の一部は、液体及び気体が相互に移動可能に構成されており、
前記第一容器及び前記第二容器の各々との間には、相互に気体の流通を可能にするギャップが存在しており、
前記第一容器には、前記培地の供給と、前記気体の供給及び排出をするための第二供給ポートと、前記培地を排出するための第二排出ポートとに、前記第二の流路回路が接続され、
前記第二容器には、前記培地の供給と、前記気体の供給及び排出をするための第一供給ポートと、前記培地を排出するための第一排出ポートとに、前記第一の流路回路が接続され、
前記培地が、前記第一の流路回路、前記第二の流路回路、前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートを介して、前記培養容器に対して常に一方向に供給される
ことを特徴とする自動培養装置。
【請求項１３】
請求項１２において、
前記制御装置は、前記第一の流路回路内の培地の先端を一時的に前記第一供給ポート近傍に維持し待機状態とする機能、及び前記第二の流路回路の培地の先端を一時的に前記第二供給ポート近傍に維持し待機状態とする機能を有する
ことを特徴とする自動培養装置。
【請求項１４】
請求項１３において、
前記容器蓋部材と前記第一容器の間に接続され、かつ、その内部に前記第二容器を収容可能な隔離膜を有し、
該隔離膜は、前記容器蓋部材が前記開口部から取り外された状態でも、前記培養容器内に、前記容器蓋部材と前記第一容器により囲まれた閉鎖空間を維持する機能を有する
ことを特徴とする自動培養装置。
【請求項１５】
請求項１４において、
前記隔離膜は、培養時において、前記容器蓋部材と前記第一容器の内部若しくは外部に収容することが可能であり、
該隔離膜は、前記第二容器を取り出す時において、前記容器蓋部材と前記第一容器の間に伸長することが可能である
ことを特徴とする自動培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞又は組織を自動操作により培養する培養容器、及び自動培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療治療に用いる再生組織の製造は、医薬品等の製造管理及び品質管理の基準であるＧＭＰ（Good Manufacturing Practice；適正製造基準）に基づく。一般に、再生組織は清潔な製造環境を提供するCPC（Cell Processing Center；細胞処理施設）において、専門の細胞培養技術を有した製造従事者により、SOP（Standard Operational Procedure；標準手順書）に従い製造される。そのため、多大な人件費、労力、運用コストが発生する。また、全ての製造工程は人手でなされるため、再生組織の製造量には限界がある。よって製造コストは高くなり、結果として再生医療治療の普及の妨げとなっている。【０００３】
このような現状を打破するため、培養工程の一部ないし全てを自動化する自動培養装置の導入が求められている。培養工程を人手ではなく自動培養装置により実施することで、省力化とコストダウンを実現し、大量生産が可能となる。加えて、自動培養装置による操作は一定であるため、製造後に得られる再生組織の品質一定化への寄与も期待される。【０００４】
ここで、自動培養装置は人手による作業の代替として細胞を培養するが、人手による作業内容に対するＧＭＰに準拠していることが必要である。また、自動培養装置に特化したＧＭＰは現在のところ規定されていないが、臨床用途の自動培養装置に関する開発ガイドライン（再生医療分野（ヒト細胞培養加工装置についての設計ガイドライン［改訂］、２００９）が経済産業省より提示されており、この開発ガイドラインへの準拠も必要である。以上より、自動培養装置は、手作業に対するＧＭＰ及び自動培養装置の開発ガイドラインを鑑みて、科学的根拠に基づき、清浄な環境を維持した状態で高品質の再生組織を再現性良く製造可能であることが求められる。これらの課題を解決する手段として、例えば特許文献１、２に示すような培養工程を自動化する装置が開発されている。培地交換等の操作を自動で実施することにより、生物学的汚染リスクの低減と生産効率の向上が達成される。【０００５】
再生医療治療の対象臓器が角膜上皮、食道粘膜、表皮等である場合、培養する細胞種は、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、表皮細胞といった上皮系細胞となる。この場合、培養容器の構造は２層構造が望ましい。上皮系細胞は、マウス由来３Ｔ３−Ｊ２細胞等のフィーダー細胞と共培養し、フィーダー細胞が産出する成長因子により生育するが、上皮系細胞とフィーダー細胞を同一培養平面上で培養した場合、製造後の再生組織にフィーダー細胞が混入する。一方、２層構造の培養容器を用いて培養した場合、２種類の細胞を異なる培養表面上で培養するため、ヒトとは異種であるマウス由来細胞等の再生組織への混入を回避することができる。これは、ヒトに対する再生医療治療においてより好ましい。自動培養装置を用いて上皮系細胞を培養する場合においても、同様に２層構造が望ましい。２層構造の閉鎖系培養容器は、特許文献１に示されているように、既に開発が進められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−１４８６０２号公報
【特許文献２】特開２００７−３１２６６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
自動培養装置は、前述の通り、製造後の再生組織の品質を一定にするため、全量の培地を交換する場合の培地交換工程において、古い培地を排出し新しい培地を供給する際、新しい培地に古い培地が混入しないことが必要である。また、培地交換時の排液である古い培地を用いた培地成分分析によるモニタリングを実施する場合、正確に培地成分分析を行うには、排液である古い培地の中に、新しい培地が混入することは回避する必要がある。【０００８】
また、自動培養装置は前述の通り、手作業において要求されるＧＭＰ及び自動培養装置に関する開発ガイドラインを満たすことが要求されるが、その中の一つの要求として、製造した再生組織の品質を一定にする必要がある。品質を一定にする条件は複数存在するが、その中の一つとして、多くの場合で採用されている全量の培地を交換する培地交換工程において、古い培地を排出し新しい培地を供給する際、新しい培地に古い培地が混入しないことが必要である。古い培地は細胞が生育するために使用した培地であり、例えばグルコースが消費され、代わりに乳酸が排出されている。古い培地が新しい培地に混入した場合、培地交換後のグルコース量等は新しい培地の濃度と異なり、結果として培養工程の再現性は失われる。同様に、古い培地に含まれる乳酸は培地のＰＨを変化させるため、培地交換後の古い培地に由来する乳酸の混入も、培養工程の再現性に影響を与える。以上より、培養工程の再現性を向上させるには、培地交換工程において古い培地と新しい培地が混入しないことが必要である。また、培養工程において培養状況を把握するため、排液である古い培地を用いた培地成分分析によるモニタリング機能の搭載が望ましいとされる。正確に培地成分分析を行うには、排液である古い培地の中に、新しい培地が混入することを回避する必要がある。前述の通り、古い培地と新しい培地は成分組成が異なるため、培地成分分析に使用する古い培地に新しい培地が混入すると、培地成分分析の結果が異なるためである。以上より、培養工程において、古い培地と新しい培地の混入を制御する技術も必要である。【０００９】
最後に、自動培養装置で培養する場合、培養に必要な培地等の送液及び５％二酸化炭素等を含む気体の送気を、培養容器に取り付けた流路チューブにより実施する必要がある。前述の食道粘膜再生のように培養容器を１０枚培養する場合、送液及び送気のために閉鎖系培養容器へ取り付ける流路チューブの総長は多大となる。また、１個の培養容器あたりに取り付ける流路チューブの本数は、少なければ少ない程、流路回路が簡潔となり好ましい。流路回路が複雑化した場合、自動培養装置の故障原因やコスト上昇の原因となるためである。【００１０】
加えて、自動培養装置は、手作業において要求されるＧＭＰ及び自動培養装置に関する開発ガイドラインを満たすことが要求される。特に、再生医療を安全に実施するため、再生組織を治療に用いる前日等に、無菌的に再生組織を取り出し検査を実施し、残りの再生組織の品質が良好であることを確認する必要がある。また、検査用に再生組織を取り出した後、残りの再生組織は、治療を行う時まで無菌性を維持した培養を継続可能である必要がある。【００１１】
また、再生医療治療に必要な再生組織の数量は対象臓器毎に異なる。例えば食道粘膜再生の場合、３−５層程度に重層化した直径２４ｍｍの口腔粘膜シートである再生組織を、約８枚使用することによる再生医療治療の臨床研究が既に進められている。治療を行う前日には、製造した再生組織が良好な品質を有しているか検査する必要があり、検査用の再生組織がさらに必要となる。食道粘膜再生の場合、必要な再生組織は合計約１０枚となる。検査用に用いる再生組織は移植前日に取り出すため、取り出した後も移植用の再生組織は無菌性を維持した培養が可能である必要がある。よって再生医療用途の自動培養装置は、移植用と検査用とで少なくとも複数枚の再生組織が製造可能であり、前日に検査用の再生組織を取り出した後も、無菌性を維持した培養が可能でなければならない。【００１２】
特許文献１の発明では、培地交換時、培養容器内に古い培地が存在した状態で新しい培地を供給し、培養容器内部で新しい培地と古い培地とが混在した状態を経て、過剰な分の液体が排出される連続的な培地交換方法をとる。排出される液体には古い培地の占める割合が多いが、低濃度であるものの古い培地が新しい培地に混入する。古い培地の組成は、細胞の生育段階（細胞数、分化度）により異なるため、本方法による培地交換後の培地の各成分濃度も、細胞生育段階により異なることになる。また、この方法で得られた古い培地を用いて培地成分分析を行う場合、回収した古い培地には新しい培地が混入しているため、モニタリング結果は正確ではなくなるという問題がある。【００１３】
また、特許文献１の発明では、複数個の２層構造である培養容器を用いて自動培養を行う。培養容器と、その内部へ送液を行う流路チューブは、着脱式である。培養時は分離状態で、送液時は結合状態となる。よって流路回路は閉鎖系でなく開放系であり、培養容器の着脱部より、菌等の侵入による生物学的汚染の危険性を有している。同時培養している複数個の培養容器から、検査用として１個のみを取り出すことは可能であるが、そもそも培養容器の着脱部からの生物学的汚染の危険性を有しているため、無菌的な取り出しは実現できていない。【００１４】
特許文献２の発明では、１個の１層構造である閉鎖系培養容器を用いて自動培養を行う。閉鎖系培養容器と流路チューブは常時接続しており、よって閉鎖系の流路回路となる。これにより、菌等の侵入による生物学的汚染の危険性を排除している。しかし１層構造であるため、この培養容器を用いて上皮系細胞を培養する場合、製造後の再生組織へ、共培養するフィーダー細胞が混入する。フィーダー細胞には、ヒト由来ではない動物由来の細胞を使用することがあるため、フィーダー細胞の混入は、再生医療治療に対する安全性の低下につながる。【００１５】
加えて、特許文献２の装置は、培地等の液体を送液及び排出する流路チューブに加え、培養容器内の圧力を調整する空気のみを送気する流路チューブを必要とする。仮に本方法を２層構造の閉鎖系培養容器に適用する場合、１個の閉鎖系培養容器に必要な流路チューブは、上層及び下層それぞれの層に対し送液及び排出を担う流路チューブに加え、送気を担う流路チューブが必要となり、合計５本が必要となる。特許文献２の方法では１個の閉鎖系培養容器を自動で培養するが、例えば食道粘膜再生に対する再生医療治療用途のとして１０個の閉鎖系培養容器を培養する場合、流路チューブの合計本数は５０本となり、かなり多くなる。結果として、流路回路は複雑なものとなる。【００１６】
また、１回の培養において閉鎖系培養容器を１個のみ培養するため、再生医療治療を実施する前日等に、検査等の目的のため無菌的に一部の再生組織を取り出すことはできない。再生医療治療用と検査用の再生組織を区別して取り出すことはできず、全てを取り出すことになる。その場合、検査と治療を同時に実施するか、検査後から治療時まで、再生組織は培養状態と異なる環境下に置くことになる。前者の場合、検査の結果を再生医療治療のスケジュールに反映させることが困難である。後者の場合、再生組織の品質が変化する危険性がある。【００１７】
以上を踏まえ、本発明の目的は、簡潔な流路回路により、古い培地と新しい培地が混じり合わないよう、培地が一方向に流れ、培地交換時に古い培地を全量排出後に新しい培地が供給されることを可能とする培養容器及び自動培養装置を提供することにある。【００１８】
本発明の他の目的は、複数個を同時培養している細胞容器の中から、無菌的に１個の再生組織を取り出すことができる培養容器及び自動培養装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の代表的なもの一例を示すと次の通りである。細胞を保持、培養するための培養容器であって、第一容器と、前記第一容器内に収納し保持される複数の第二容器と、前記第一容器及び前記第二容器の各々を封止する容器蓋部材と、前記第一容器及び前記第二容器の各々と、該培養容器に前記細胞及び培地を供給する流路回路とを接続する接続ポートとを備えており、前記第一容器及び前記第二容器は、各々、培地及び細胞を、または培地のみを収容するための容器であり、前記第一容器及び前記第二容器の各々間の隔壁の一部は、液体及び気体が相互に移動可能に構成されており、前記第一容器及び前記第二容器の各々との間には、相互に気体の流通を可能にするギャップが存在しており、前記接続ポートとして、前記第一容器には、前記培地の供給と、前記気体の供給及び排出をするための第二供給ポートと、前記培地を排出するための第二排出ポートとが接続され、前記第二容器の各々には、前記培地の供給と、前記気体の供給及び排出をするための第一供給ポートと、前記培地を排出するための第一排出ポートとが接続され、前記第一供給ポート及び前記第二供給ポートは、前記培地を前記培養容器に対して常に一方向へ流す流路として機能する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、細胞播種工程及び培地交換工程において、培地は常に一方向に流れる。全量を交換する培地交換において、古い培地が新しい培地に混入しないようにするため、培養の再現性が向上する。回収した古い培地を用いた培地成分分析の分析精度が向上する。閉鎖系培養容器に取り付けた流路チューブは、送液と送気の機能を兼ねるため、流路回路は簡潔となる。
また、本発明によれば、複数個を同時培養している細胞容器の中から、無菌的に１個の再生組織を取り出すことが可能である。残りの培養容器に対しては、継続して無菌的な培養が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】本発明の第１の実施例に係る、複数の上層用培養容器ユニットを下層一体型の培養容器函体内に収容した、図１ＢのＡ−Ａ‘断面に相当する、培養容器の平面図である。
【図１Ｂ】第１の実施例における、図１ＡのＢ−Ｂ‘断面に相当する、培養容器の縦断面図である。
【図２Ａ】第１の実施例において、１個の上層用培養容器ユニットを、下層一体型の培養容器函体に収容した状態を示す縦断面図である。
【図２Ｂ】第１の実施例において、１個の上層用培養容器ユニットを、下層一体型の培養容器函体から分離した状態を示す縦断面図である。
【図３Ａ】第１の実施例に係る自動培養装置において、１０個の再生組織を培養する時の全体流路回路図である。
【図３Ｂ】第１の実施例において、１個の上層用培養容器ユニットに対し、図３Ａの全体流路回路図から関連する流路回路を抽出して示した図である。
【図４】第１の実施例に係る培養容器を有する自動培養装置の制御機構を示した図である。
【図５】第１の実施例において、本実施例の自動培養装置を用いて細胞の培養を実施する一連のプロトコルを示した図である。
【図６】第１の実施例において、自動培養装置により細胞播種の制御を行うためのテーブルの一例を示した図である。
【図７Ａ】第１の実施例において、１個の上層用培養容器ユニットに対し、全体流路回路図から関連する部分を抽出した流路回路により、細胞播種時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図７Ｂ】第１の実施例において、下層用培養容器に対する、細胞播種時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図８】第１の実施例において、自動培養装置により、培地交換の制御を行うためのテーブルの一例を示した図である。
【図９Ａ】第１の実施例において、１個の上層用培養容器ユニットに対し、流路回路により、上層の培地交換時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図９Ｂ】上層の培地交換時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図９Ｃ】上層の培地交換時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図９Ｄ】上層の培地交換時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図１０Ａ】第１の実施例に係る、１個の上層用培養容器ユニットに対し、全体流路回路図から関連する部分を抽出した流路回路により、下層の培地交換時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図１０Ｂ】下層の培地交換時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図１０Ｃ】下層の培地交換時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図１０Ｄ】下層の培地交換時の培地及び空気の流れを示した図である。
【図１１】本発明の第２の実施例に係る、下層用培養容器本体と別に検査用培養容器を並行して培養する、培養容器の平面図である。
【図１２Ａ】本発明の第３の実施例に係る、各上層用培養容器ユニットと下層用培養容器本体の間に蛇腹型の隔離膜を具備した培養容器の一部を示す縦断面図である。
【図１２Ｂ】第３の実施例において、培養容器から１個の上層用培養容器ユニットを無菌的に取り出す一連のプロトコルを示した図である。
【図１２Ｃ】第３の実施例において、培養容器から１個の上層用培養容器ユニットを無菌的に取り出す一連のプロトコルを示した図である。
【図１２Ｄ】第３の実施例において、培養容器から１個の上層用培養容器ユニットを無菌的に取り出す一連のプロトコルを示した図である。
【図１３】本発明の第４の実施例に係る、各上層用培養容器ユニットと下層用培養容器本体の間に蛇腹型の隔離膜を具備した培養容器の製造方法の一例を示す縦断面図である。
【図１４Ａ】本発明の第５の実施例に係る、各上層用培養容器ユニットと下層用培養容器本体の間に蛇腹型の隔離膜を具備した培養容器の一例を示す縦断面図である。
【図１４Ｂ】第５の実施例における、下層用培養容器本体に対する上層用培養容器ユニットの収容状態を説明するである。
【図１４Ｃ】第５の実施例における、下層用培養容器本体に対する上層用培養容器ユニットの収容方法の一例を示す縦断面図である。
【図１５】本発明の第６の実施例に係る、各上層用培養容器ユニットと下層用培養容器本体の間に蛇腹型の隔離膜を具備した培養容器の一例を示す縦断面図である。
【図１６Ａ】本発明の第７の実施例に係る、各上層用培養容器ユニットと下層用培養容器本体の間に蛇腹型の隔離膜を具備した培養容器の一例を示す縦断面図である。
【図１６Ｂ】第７の実施例における、培養容器から１個の上層用培養容器ユニットを無菌的に取り出す状態を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の代表的な実施形態においては、培養容器は、内部に培養空間を有し、第一容器及び第二容器及びそれらの蓋部材を有した２層構造の閉鎖系培養容器であって、第一容器内には複数の第二容器を収容可能であり、第一容器には、培地の供給と、気体の供給及び排出をするための第二供給ポートと、培地を排出するための第二排出ポートとが接続される。また、第二容器の各々には、培地の供給と、気体の供給及び排出をするための第一供給ポートと、培地を排出するための第一排出ポートとが接続される。第一供給ポート及び第二供給ポートは、培地を培養容器に対して常に一方向へ流す流路として機能する。
【００２３】
本発明の他の実施形態においては、内部に培養空間を有し、第一容器及び第二容器を有した２層構造の閉鎖系培養容器であって、第一容器内には複数の第二容器を収容可能であり、第一容器及び第二容器それぞれへ、細胞懸濁液または培地の供給と、空気の供給及び排出を行う第一の供給ポート及び第二の供給ポートを有し、さらに、第一容器及び第二容器それぞれから培地の排出と、空気の排出を行う第一の排出ポート及び第二の排出ポートを有する。そして、容器蓋部材と第一容器の間を接続し、その内部に当該第二容器を収容可能である伸長部材（隔離膜）を有した構成の培養容器を提供する。
【００２４】
また、上記の目的を達成するため、本発明の他の実施形態においては、上記第一容器及び第二容器を備えた２層構造の閉鎖系培養容器を用いた自動培養装置おいて、培地が常に一方向に流れるように構成可能な流路回路と、この流路回路を制御する制御プロトコルとを採用している。すなわち、内部に培養空間を有する閉鎖系培養容器を用いる自動培養装置であって、細胞懸濁液が収容される細胞バッグと、培地が収容される培地バックと、培地を冷蔵保存する冷蔵庫と培地交換時に事前に培地を３７℃に温めるヒーターと、細胞を培養する培養容器と、細胞懸濁液及び培地及び空気を送液/送気する流体移動制御機構部と、二酸化炭素等を供給源となるガスタンク及びガス濃度を調節するガス濃度調節部及び外界との気圧調整を行うフィルタと、流路の開閉を行う二方弁及び三方弁から成る。培養容器、細胞バッグ、培地バッグ、流体移動制御機構部等から構成される流路回路は恒温機の中に設置され、流路回路全体の温度が制御される。培養容器の培養環境は、制御装置により制御する。また、装置内には温度センサを設置し、内部温度をモニタリングする。加えて顕微鏡も設置し、細胞の生育状態を光学的に適宜モニタリングする。
【００２５】
すなわち、上述した目的を達成する本発明の好適な態様の、内部に培養空間を有する閉鎖系培養容器を用いた自動培養装置おいて、培養容器内の第一容器への細胞播種時は、流体移動制御機構部により細胞懸濁液を細胞バッグから第一供給ポートを経由して第一容器へ供給しつつ、第二供給ポートから培養容器内の空気を外部へ排出する。培養容器内の第二容器への細胞播種時は、第一供給及び第二供給ポートの切り替え後、流体移動制御機構部により細胞懸濁液を細胞バッグから第二供給ポートを経由して第一容器へ供給しつつ、第一供給ポートから培養容器内の空気を外部へ排出する。尚、第一容器及び第二容器へ細胞播種を行う順番は任意である。
【００２６】
培養容器内の第一容器の培地交換時は、流体移動制御機構部により培地を培地バッグから第一供給ポートまで送液しつつ、第二供給ポートから培養容器内の空気を外部へ排出する。第一供給ポートまで達した培地は、保存時に４℃にて冷蔵状態であったが３７℃まで温めるヒーターを経由しており、よってこの時点で温度は３７℃である。第一供給ポートまで達している培地は、常に３７℃に維持されている恒温槽内で、一時的に待機するため、培地の温度も３７℃に維持される。次に、流体移動制御機構部により第一容器の古い培地を第一排出ポートから排出しつつ、第二供給ポートから培養容器内の空気を内部へ供給する。続いて、流体移動制御機構部により第一供給ポートにて待機している培地を第一容器内へ供給しつつ、第二供給ポートから培養容器内の空気を外部へ排出する。この操作は、第一排出ポートから排出した古い培地が第一容器から全量排出された直後より、開始する。第一排出ポートから排出した古い培地が排液バッグ等まで完全に送液することを完了させる必要はない。最後に、流路チューブ内にある第一排出ポートから排出した古い培地に対し、一部を排液回収バッグより回収し、残りを排液バッグへ排出する。以上により、第一容器内において、古い培地は新しい培地と混じることなく、排出することが可能となる。培地交換後の第一容器内の培地は、培地交換時に供給した新しい培地のみとなる。
【００２７】
培養容器内の第二容器の培地交換時は、第一容器の培地交換時に比べ、第一供給ポートと第二供給ポートの役割が入れ替わる。また、排出口は、第一容器では第一排出ポートであったのに対し、第二容器では第二排出ポートとなる。最初に、流体移動制御機構部により培地を培地バッグから第二供給ポートまで送液しつつ、第一ポートから培養容器内の空気を外部へ排出する。第二ポートまで達した培地の温度は、第一容器の時と同様に、一時的に待機するため、この時点で３７℃を維持している。次に、流体移動制御機構部により第二容器の古い培地を第二排出ポートから排出しつつ、第一供給ポートから培養容器内の空気を内部へ供給する。続いて、流体移動制御機構部により第二供給ポートにて待機している培地を第二容器内へ供給しつつ、第一供給ポートから培養容器内の空気を外部へ排出する。この操作は、第二排出ポートから排出した古い培地が第一容器から全量排出された直後より、開始する。第二排出ポートから排出した古い培地が排液バッグ等まで完全に送液することを完了させる必要はない。最後に、流路チューブ内にある第二排出ポートから排出した古い培地に対し、一部を排液回収バッグより回収し、残りを排液バッグへ排出する。以上により、第一容器内と同様に、第二容器においても古い培地は新しい培地と混じることなく、排出することが可能となる。培地交換後の第二容器内の培地は、培地交換時に供給した新しい培地のみとなる。尚、第一容器及び第二容器に愛し培地交換を行う順番は任意である。
【００２８】
また培養途中において、例えば検査を目的として、培養容器に設置した伸長部材を用いることにより、第二容器を１個のみ無菌的な取り出しを可能とする。加えて１個のみを無菌的に取り出した後は、残された第一容器及び第二容器は、無菌性を維持した状態での培養を継続することが可能である。
【００２９】
以上の構成及びプロトコルにより、流路回路において培地は一方向に流れることになる。古い培地と新しい培地は混じり合わない。結果として、回収した古い培地に対する培地成分分析の精度も向上する。また、前述したとおり第一供給ポート及び第二供給ポートは、培地の送液及び気体の送気の機能を併せ持つ。よって、気体送気用の流路チューブを独立に設けた場合に比較し、閉鎖系培養容器に取り付けることになる流路チューブの数は経ることになる。そのため流路回路はより簡潔となる。さらに、培養途中において、無菌的に一部の培養容器を取り出すことが可能である。取り出した後の残りの培養容器も無菌性を維持するため、培養の継続が可能となる。
【００３０】
本発明に係る閉鎖系培養容器を用いた培養容器及び自動培養装置によれば、複数個を同時培養している細胞容器の中から、無菌的に１個の再生組織を取りだすことが可能である。残りの培養容器に対しては、継続して無菌的な培養が可能である。加えて、細胞播種工程及び培地交換工程において、培地は常に一方向に流れる。全量を交換する培地交換において、古い培地が新しい培地に混入しないようにするため、培養の再現性が向上する。回収した古い培地を用いた培地成分分析の分析精度が向上する。閉鎖系培養容器に取り付けた流路チューブは、送液と送気の機能を兼ねるため、流路回路は簡潔となる。  
以下、本発明に係る自動培養装置の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【実施例１】
【００３１】
以下、本発明の第１の実施例に係る、複数の上層用培養容器ユニットを１つの下層用培養容器に収容した自動培養装置について、図面を参照して詳細に説明する。なお、本明細書において、自動培養装置の流路を流れる気体、液体、気体及び液体を総称して流体と呼ぶ場合がある。  
図１Ａは、図１ＢのＡ−Ａ‘断面に相当する、培養容器の平面図であり、図１Ｂは、図１ＡのＢ−Ｂ‘断面に相当する、培養容器の縦断面図である。
本実施例の培養容器１００は、再生組織を培養するための複数の上層用培養容器ユニット１０１（ここではａ〜ｊの１０個）が、フィーダー細胞を培養するための１個の下層一体型の培養容器函体１０２内に収容可能となっている。各上層用培養容器ユニット１０１は、逆円錐台の形状となっている。各上層用培養容器ユニット１０１は函型の培養容器函体１０２の上面の所定の複数の位置に設けられた開口部１１５を介して培養容器函体１０２の内部に収納され、各上層用培養容器ユニット１０１に対応する複数（ここでは１０個）の容器蓋部材１０３が、各開口部１１５を塞ぐようにして下層用培養容器本体１０４の上面に各々ねじ等で固定されている。これによって、培養容器１００に、容器蓋部材１０３と下層用培養容器本体（第二容器）１０４により囲まれた閉鎖空間１１０が形成され、各上層用培養容器ユニット（第一容器）１０１は、この閉鎖空間１１０内に保持される。なお、上層用培養容器ユニット１０１はフック構造等により容器蓋部材１０３へ設置し、必要に応じ簡便に取り出すことが可能になっている。また、図１Ａの例では、複数の開口部１１５は、培養容器函体１０２の上面に平行に並んで設けられているが、千鳥状等、他の配列法でも良い。【００３２】
次に、下層一体型の培養容器１００の基本的な構成要素を詳細に説明する。下層一体型の培養容器函体１０２の素材はポリカーボネイト、ポリスチレン、ポリプロピレン等の可塑性と共に剛性を有するプラスチックである。本例では、下層一体型の培養容器函体の底面の形状が正方形である場合を示している。また、１０個の上層用培養容器ユニット１０１を、縦に２個、横に５個並べた状態で、１つの培養容器函体１０２内に収容した例を示している。尚、上層用培養容器ユニット１０１の配置は、これに限定されるものではない。培養容器函体１０２を構成する容器蓋部材１０３、下層用培養容器本体１０４は、射出成形、切削加工等により形成される。【００３３】
培養容器函体１０２の内部には上層用培養容器ユニット１０１を収容するが、この上層用培養容器ユニットとして例えば、一般に細胞培養に使用されるセルカルチャーインサート容器を使用する。セルカルチャーインサート容器は市販のものでよく、ＢＤ社製、コーニング社製、グライナー社製等があり、使用可能な製品は限定されない。また、セルシード社製の温度応答性セルカルチャーインサート容器への適用も可能である。セルカルチャーインサート容器等である上層用培養容器ユニット１０１の底面１２０は多孔性膜であり、例えば直径０．４μｍ程度の孔を多数有する。これにより、上層及び下層間にて、培地及び液性因子の移動が可能となる。孔の径は細胞よりも十分に小さいため、上層の細胞が、孔を通り下層へ移動することはない。また、その程度の大きさの孔であるため、培地及び液性因子が、例えば数分程度の短時間で急激に移動することはない。よって、上層用培養容器ユニット１０１内に培地等が入った状態で、上層用培養容器ユニットを持ち上げても、例えば数分以内であれば、内部の培地は保持される。なお、上層用培養容器ユニット１０１の上縁部と、培養容器函体１０２の上面に設けられた下層用培養容器本体１０４の開口部１１５との間には、相互に気体の流通を可能にするギャップ１２２が存在する。【００３４】
セルカルチャーインサート容器等である上層用培養容器ユニット１０１では、細胞は上層用培養容器ユニット１０１の底面上にて播種、培養する。培養容器函体１０２では、細胞は下層用培養容器本体１０４の底面上にて播種、培養する。容器蓋部材１０３或いは下層用培養容器本体１０４には、Ｏリング等の弾性部材１０５が設けられる。これにより、細胞の培養容器１００の外部から、気体や菌等を含む粒子は内部に混入しない。よって培養中において、培養容器１００の内部は無菌性の維持が可能である。容器蓋部材１０３の下層用培養容器本体１０４への接続は、容器蓋部材１０３及び下層用培養容器本体１０４に設けられたねじ同士を螺合させることにより固定する。この場合、容器蓋部材１０３を下層用培養容器本体１０４から取り外す際には、容器蓋部材１０３を回転させて取り外す。或いは、容器蓋部材１０３は、容器蓋部材１０３及び下層用培養容器本体１０４に設けられた係合もしくは嵌合用の噛合部にて固定する。この場合、容器蓋部材１０３は回転させずに軸方向に持ち上げて取り外す。尚、容器蓋部材１０３の下層用培養容器本体１０４への固定方法は、これらの方法に限定されるものではない。【００３５】
下層用培養容器本体１０４には、培地供給と、空気/水蒸気の供給及び排出をするための、下層供給用接続突起構造（第二供給ポート）１０６をその一端に有する下層供給用流路１０７と、培地排出と、空気/水蒸気の排出をするための、下層排出用接続突起構造（第二排出ポート）１０８をその一端に有する下層排出用流路１０９を有する。下層供給用流路１０６の下層用培養容器本体１０４における位置は、導入する培地１５０の量により変えるべきであるが、導入された培地液面よりも上部であればよい。下層排出用流路１０９の下層用培養容器本体１０４における位置は、下層用培養容器本体１０４からの培地の排出に使用するため、下層用培養容器本体１０４の底面と下層排出用流路１０９の最下部が、同じ高さとなるよう設置することが望ましい。そうすることで、培地の排出効率の向上が可能となる。後述する図３Ａに示した、本培養容器を回転させる回転機構により、培養容器を適宜傾けつつ培地を排出することで排出効率はより向上する。【００３６】
各容器蓋部材１０３には、各上層用培養容器ユニット１０１に対し、培地供給と、空気/水蒸気の供給及び排出をするための、上層供給用接続突起構造（第一供給ポート）１１１をその一端に有する上層供給用流路１１２と、培地を排出するための、上層排出用接続突起構造（第一排出ポート）１１３をその一端に有する上層排出用流路１１４が設けられている。なお、図１ＡのＢ−Ｂ‘断面に相当する図１Ｂにおいて、上層供給用流路１１２と上層排出用流路１１４は前後に重なって表示されるべきものであるが、ここでは構成を分かり易くするために、上層供給用流路１１２と上層排出用流路１１４を左右に離して表示している（以下の図でも同じ）。【００３７】
上層供給用流路１１１の容器蓋部材１０３における位置は、容器内に導入する培地の量によって変えるべきであるが、導入された培地液面よりも上部であればよい。上層排出用流路１１４の上層用培養容器ユニット１０１の底面における位置は、上層用培養容器ユニット１０１から培地の排出に使用するため、上層用培養容器ユニット１０１の底面と上層排出用流路１１４が、近接していることが望ましい。但し近接しすぎると、再生組織の製造において、細胞の増殖に従い上層排出用流路１１４が接触し、細胞の増殖に支障を及ぼす。口腔粘膜上皮細胞の場合、再生組織まで培養すると約数百μｍの高さまで細胞は増殖する。よって、上層排出用流路１１４はそれよりも十分に高い位置まで、例えば約５００μｍまで、上層用培養容器ユニット１０１の底面への近接が可能である。近接が可能となる距離は、培養対象となる細胞の種類に合わせ決定する。培養液の排出時は、下層の培地交換時と同様に、図３Ａにおける回転機構により適宜傾けつつ培地を排出することで、排出効率を向上させることが可能である。【００３８】
各容器蓋部材１０３に設置した上層供給用流路１１２及び上層排出用流路１１４は、細胞観察に可能な限り支障がないように配置する。細胞観察に支障がないとは、例えば細胞培養容器内を顕微鏡観察する際に、顕微鏡光軸を阻害しない形状を備え、また顕微鏡光軸を阻害しない位置に配置することを意味する。下層供給用流路１０７、下層排出用流路１０９、上層供給用流路１１２、上層排出用流路１１４は、流路の突起構造サイズに適合した内径を有する、シリコン等の弾性体からなる流路チューブが接続可能である。これにより、自動培養装置が有する流路回路に接続することができる。【００３９】
培養時においては、上層用培養容器ユニット１０１には上皮系細胞を播種し、下層用培養容器本体１０４にはフィーダー細胞を播種する。但し、用途においては別の細胞を播種したり、細胞を播種しないまま培養したりすることもある。細胞を播種しないまま培養する例として、上層用培養容器ユニット１０１に上皮系細胞を播種し、下層用培養容器本体１０４には細胞を播種せず培地のみとすることで、フィーダー細胞なしに培養可能であることが報告されている。【００４０】
図２Ａ、図２Ｂにより、１個の上層用培養容器ユニットに着目して、細胞培養容器の構成を説明する。図２Ａは、１個の上層用培養容器ユニットを、培養容器函体１０２内に収容した状態を拡大して示しており、図２Ｂは、１個の上層用培養容器ユニットを培養容器函体から分離した状態を示している。なお、上層用培養容器ユニット１０１はその上端に外周縁部１０１０を有し、この外周縁部１０１０が容器蓋部材１０３の内方向突出部１０３０上に保持されている。この内方向突出部１０３０は、下層用培養容器本体１０４の開口部１１５の周囲に設けられた環状突出部１０４０上に保持されている。各容器蓋部材１０３の外周部と下層用培養容器本体１０４の環状突出部１０４０の外周部には、ねじ構造１０５０Ａ，１０５０Ｂが設けられており、このねじ構造により容器蓋部材１０３が下層用培養容器本体１０４に固定される。なお、固定方法は、螺合に限定されるものではなく、係合、嵌合、その他いずれの手段でもよい。【００４１】
このように、細胞を保持、培養するための培養容器１００は、培地及び細胞、または培地のみを収容する上層用培養容器ユニット１０１と、この上層用培養容器ユニットを収容し培地及び細胞、または培地のみを収容する一体型の下層用培養容器本体１０４と、各上層用培養容器ユニット及び下層用培養容器を封止する容器蓋部材１０３を有しており、この培養容器の外面に流路回路と接続可能な上層供給用流路１１２、下層供給用流路１０７、上層排出用流路１１４、及び、下層排出用流路１０９を備え、この各上層用培養容器ユニットへの培地の排出または供給、あるいは下層用培養容器に対する排出または供給を行う場合に、送液を制御する手段により連通状態が切り替えられる。後で述べるように、上層供給用流路１１２及び下層供給用流路１０７は、細胞懸濁液/培地は培養容器１００に対して常に一方向へ流れ、気体は双方向に流れる。【００４２】
次に、図３Ａは、１０個の再生組織を培養する時の全体流路回路図である。図３Ｂは、１個の上層用培養容器ユニットに対し、全体流路回路図から関連する流路回路を抽出して示したものである。【００４３】
図３Ａを用いて、１０枚の上層用培養容器ユニット１０１を収容する下層一体型の培養容器１００を培養する時の全体流路を説明する。培養対象は、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、表皮細胞等の上皮系細胞である。下層一体型の培養容器１００は、図１Ａ、図１Ｂで説明した通り、上皮系細胞を培養する層と、上皮系細胞のための成長因子を産出するフィーダー細胞を培養する層から成る、２層構造である。２種類の細胞を用いるため、細胞バッグ２０３、２０４は２種類となる。また、細胞播種時において２種類の細胞が混じらないようにするため、播種するための流路回路は分ける。本図では、細胞バッグ２０２に対し上皮系細胞を入れ、破線で示された第一流路回路（１）２０５を通過し、１０枚の上層用培養容器ユニット１０１（Ａ〜Ｊ）へ順次播種する。細胞バッグ２０３に対しては、フィーダー細胞を入れ、実線で示された第二流路回路２０４を通過し、下層一体型の培養容器函体１０２へ播種する。細胞播種時は、細胞バッグ２０２、２０３から、それぞれの細胞懸濁液を培養容器１００まで送液する。【００４４】
即ち、細胞バッグ２０２及び培地バッグ２１１が、第一の流路回路２０５、電磁弁２０６Ｂ、２０６Ｄ、流体移動制御機構部（チューブポンプ）２０８Ａ、第一の流路回路２２１、第一の電磁弁３０７（二方弁Ａ〜Ｊ）を介して上層用培養容器ユニット１０１（Ａ〜Ｊ）の流路（第一供給ポート）１１１に接続されている。第一の流路回路２０５は、多分岐部２０９Ａにより１０個の上層用培養容器ユニットに対応する第一の流路回路２２１に分岐している。細胞バッグ２０３及び培地バッグ２１１が、第二の流路回路２０４、電磁弁２０６Ｃ、２０６Ｅ、流体移動制御機構部（チューブポンプ）２０８Ｂ、第二の流路回路２２）を介して培養容器函体１０２の流路（第二供給ポート）１０６に接続されている。一方、各上層用培養容器ユニット１０１の流路（第一排出ポート）１１３は、第一の流路回路２２３、流体移動制御機構部２０８Ｃ、三方弁２０７Ａを介して排液バッグ２１３、排液回収バッグ２１４Ａに接続されている。第一の流路回路を構成する１０個の分岐路（２２３）が多分岐部２０９Ｂで１つにまとめられている。また、培養容器函体１０２の流路（第二排出ポート）１０８は、第二の流路回路２２４、流体移動制御機構部２０８Ｄ、三方弁２０７Ｂを介して排液バッグ２１３、排液回収バッグ２１４Ｂに接続されている。なお、２１２はヒーター、２１５Ａ，２１５Ｂはガス供給部、２１６はガス濃度調整部、２１７はフィルタである。【００４５】
このように、第一の流路回路（２０５、２２１、２２３）及び第二の流路回路（２０４、２２２、２２４）において、各二方弁２０６、３０７、各流体移動制御機構部２０８、各三方弁２０７は、予め与えられた制御プロトコルにより、所定のシーケンスに基づいて制御される。これにより、培養容器１００に対して培地が常に一方向に流れ、かつ、古い培地を排出後に新しい培地を供給するように、流路回路が制御される。【００４６】
図３Ｂは、図３Ａに示した培養容器１００において、１個の上層用培養容器ユニットと下層用培養容器本体に関連する部分を抽出したものである。【００４７】
本図を用い、細胞播種及び培地交換のプロトコルについて説明する。図３Ａでは、多分岐部２０９Ａにより、１０個の上層用培養容器ユニットへ流路は分岐している。図３Ｂでは、多分岐部２０９Ａから１個の上層用培養容器ユニット１０１へ流路がつながった場合を示している。また、図３Ｂでは細胞懸濁液/培地と空気の流れる向きを示している。上層供給用流路２２１及び下層供給用流路２２２において、細胞懸濁液/培地は、培養容器１００（１０１、１０４）の外側から内側への方向のみに流れる。一方、空気は双方的に流れる。それに対し上層排出用流路１１４及び下層排出用流路１０９においては、細胞懸濁液/培地、空気は共に、培養容器１００の内側から外側への方向のみに流れる。【００４８】
送液時は、事前に所定の二方弁（２０６、３０７）、三方弁（２０７）の開閉を行う。そして流体移動制御機構部２０８を作動させ、流量、送液時間を制御しつつ送液する。送液された細胞懸濁液は、上皮系細胞の場合、多分岐部２０９Ａにおいて、細胞播種を行う上層用培養容器ユニット１０１へ分岐する。事前に、送液対象となる上層用培養容器ユニットに連結する流路回路に設置された二方弁、三方弁は開いて送液可能な状態にする。一方、送液対象ではない培養容器に連結する流路回路に設置された二方弁、三方弁は閉じて送液不可能な状態にする。細胞播種は、１０個の上層用培養容器ユニット１０１及び下層一体型の培養容器函体１０２に対し、順次実施する。全てに対し播種終了後、下層一体型の培養容器函体１０２の下部に取り付けた回転機構３１１を作動させる。細胞播種時及び細胞培養時において培養容器は水平状態を保持しているが、細胞播種直後、培地交換時は、培養容器を傾ける。細胞播種時は連続的に揺動させることにより、播種後の細胞の分布を一様化する。その後、培養容器を水平状態に戻し、その状態で培養を行う。【００４９】
培養期間中、培地交換時を所定の日時に実施する。上皮系細胞の場合、１−３日程度に１回の頻度で一般に実施する。細胞播種、培地交換時以外の培養中は、流路回路が設置されている恒温機内の温度を３７℃に維持する。これにより、培養容器内の温度も３７℃に維持する。また、必要に応じＣＯ２等をガス供給部２１５から供給する。濃度はガス濃度調整部にて行う。例えば、培養容器内部へ、ＣＯ２が５％含まれた気体を適宜送気する。培養対象の細胞種、使用している培地の種類に応じて気体組成と送気スケジュールは決定する。加えて、流路回路外部から気体を取り込んだり、流路回路内部の気圧を調整したりする場合は、フィルタを介して行う。フィルタは、例えば０．２２μｍ以上の粒子を通さない品質のものを使用する。【００５０】
流路回路において上層用培養容器ユニット１０１の前後には、無菌脱着部１１０３を取り付ける。培養中は、流路チューブと同様に送液が可能である。前日検査等で培養容器を１個のみ取り外し、残りの培養容器は無菌性を維持したまま培養を継続する際、無菌脱着部１１０３を使用し、上層用培養容器ユニットを流路回路から切り離す。続いて、前述した方法により、下層用培養容器本体から上層用培養容器ユニットを無菌的に取り出す。無菌脱着部により取り外した後の流路回路は、培養容器が取り外した場所に残された無菌脱着部１１０３により、流路チューブは閉じた状態を維持する。これにより、前日検査のため培養容器を取り外しても、残された培養容器に対して培養を継続可能となる。【００５１】
図４は、閉鎖系の培養容器１００を有する自動培養装置の制御機構を示したブロック図である。制御装置１４０２により制御される各構成要素が、恒温機１４０３の内部に配置された培養容器１４０１に接続されている。なお、恒温槽１４０３中に配置されるものは、各実施例で説明する閉鎖系培養容器１０１、１０４等の培養容器、或いは自動培養装置内に設置された当該培養容器であることは言うまでもない。【００５２】
図４において、制御装置１４０２には、恒温機１４０３の温度を制御するための温度調節部１４０４と、温度センサ１４０６と、ガス供給部１４０５を有し培養容器内のガス濃度を制御するためのガス濃度調節部１４１１と、培養容器内の培養液を自動で交換するための、各流路回路構成要素に接続された流路チューブを有する流体移動制御１４０７と、それぞれの構成要素の動作を制御することを目的とした細胞観察用の顕微鏡１４０８と、ＣＯ２・Ｏ２センサ（図示略）とが接続されている。【００５３】
制御装置１４０２、表示画面１４１０及びデータベース１４１２は、ＣＰＵ（CentrＡl Processing Unit；中央処理部）から成る処理部、記憶部や、ディスプレイ装置、キーボードから成る入出力部等を備えた通常のコンピュータの、処理部および記憶部とディスプレイ装置の表示部にそれぞれ対応している。制御装置１４０２２は、記憶部で記憶された各種プログラムを、処理部としてのＣＰＵ上で動作させる。これにより、温度調整部１４０４、ガス供給部１４０５、流体移動制御機構部１４０７、顕微鏡１４０８、ＣＯ２・Ｏ２センサ、ガス濃度調整部１４１１、細胞・培地・排液・排液回収バッグ１４０９により、恒温機１４０３中の培養環境を制御し、培養容器１４０１中での所定の培養工程の実施を可能とする。【００５４】
ガス濃度調節部１４１１は、培養容器１４０１に直接接続されている必要はない。温度調節部１４０４、ガス濃度調節部１４１１と、ＣＯ２・Ｏ２センサが恒温機１４０３に接続された構成でも構わない。この構成の場合、細胞培養容器１４０１へは容器外から気体を供給する必要があるため、細胞培養容器１４０１の蓋部の一部に、ポリカーボネイトやポリスチレン、ポリメチルペンテン等のガス透過性を有した透明な薄膜を溶着し、細胞培養容器１４０１内部のガス交換を可能とすることで、細胞培養を可能とすることができる。【００５５】
以上の構成を有する本実施例の自動培養装置を用い、細胞を培養する時の一連の培養手順について説明する。図５は、自動培養装置の動作を説明するためのフローチャートである。以下、自動培養装置の動作を説明する。尚、使用する培養容器の数を増やす場合は、流路の多分岐部において、並列に培養容器を並べればよい。またその場合の培養手順は、以下に示す操作を各培養容器に対して順々に実施すればよい。【００５６】
まず、自動培養装置を起動させ（ステップＳ１）、スケジュール決定する（ステップＳ２）。さらに、適切な二方弁及び三方弁の開閉を行った後、流体移動制御機構部を作動させ、培養容器へ播種を行い（ステップＳ３）、培養容器で細胞の培養（ステップＳ４）、及び、顕微鏡による観察を行う（ステップＳ５）。細胞か正常な状態か判定し（ステップＳ６）、正常であれば培養容器の培地交換を行う（ステップＳ７）。その後、移植直前の培養及び培地交換を行う（ステップＳ８〜Ｓ１０）を行う。さらに、移植用組織の回収（ステップＳ１１）を行い、一連の処理を終了する（ステップＳ１２）。【００５７】
次に、培養容器で細胞の培養（ステップＳ４）、培地交換（ステップＳ７）、及び、移植直前の培養及び培地交換（ステップＳ１０）に関し、自動培養装置の制御プロトコルを説明する。なお、検査用組織の回収（ステップＳ９）は実施例２以下で述べる培養容器で実施されるのが望ましいので、ここでは説明を省略する。【００５８】
まず、閉鎖系培養容器１００への播種について説明する。
図６は、データベース１４１２に保持された、培養容器１００への播種時制御用のテーブル６００の一例を示す図である。図中、黒丸印が電磁弁２０６、２０７、３０７の開（オン）及びポンプ２０８の動作状態、×印が電磁弁の閉（オフ）及びポンプの停止状態を示している（以下、同じ）。  
まず、１０個の上層用培養容器ユニット１０１（１０１Ａ〜１０１Ｊ）の各々への播種のために、二方弁（電磁弁）２０６、３０７、三方弁（電磁弁）２０７、流体移動制御機構部（チューブポンプ）２０８等が、テーブル６００で与えられる所定のシーケンスに従い、制御される。例えば、各上層用培養容器の容量が２ｍｌであった場合、上層用培養容器１０１Ａに対する播種のために、３０秒かけて各弁やポンプを制御し、それに続いて、上層用培養容器１０１Ｂに対する播種のために、３０秒かけて一連の処理がなされ、以下、同様にして、上層用培養容器１０１Ｊまで、播種のための処理がなされる。【００５９】
最後に、下層すなわち一体型の培養容器函体１０２への播種のために、二方弁（電磁弁）２０６、３０７、三方弁（電磁弁）２０７、流体移動制御機構部（チューブポンプ）２０８等が、テーブル６００で与えられる所定のシーケンスに従い、制御される。一例として、下層用培養容器本体１０４の容量が３０ｍｌであった場合は４５０秒かけて、一連の処理がなされ、５０ｍｌであった場合は７５０秒かけて、一連の処理がなされる。【００６０】
図７Ａにより、上層へ細胞播種するプロトコルを示す。図に示すように、細胞バッグ２０２から上層供給用流路２２１を経由して１つの上層用培養容器１０１内へ送液する。この時、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁はあらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部２０８Ａ及び２０８Ｂを作動させ、送液及び送気を実施する。すなわち、細胞バッグ２０２が、第一の流路回路（２０５）、電磁弁２０６Ｂ、流体移動制御機構部２０８Ａ、第一の流路回路（２２１）、第二の電磁弁３０７を介して上層用培養容器１０１の流路（第一供給ポート）１１１に接続され、上層用培養容器１０１に対して細胞播種が実施される。この時同時に、下層供給用流路１０７より下層用培養容器本体１０４内の空気を培養容器外へ排出する。空気は、最終的にフィルタ２１７Ａより流路外へ排出する。すなわち、下層用培養容器本体１０４は、その流路（第二供給ポート）１０６が第二の流路回路（２２２）、流体移動制御機構部２０８Ｂ、第二の流路回路（２０４）、電磁弁２０６Ａを介してフィルタ２１７Ａに接続される。上層用培養容器１０１と下層用培養容器本体１０４との間には、相互に気体の流通を可能にするギャップが存在するので、上層用培養容器内の気体は第二の流路回路及びフィルタ２１７Ａを介して排気される。所定量を送液し終えたら終了する。他の上層用培養容器１０１に対しても、同様にして、細胞播種を実施する。なお、ここでは、細胞播種を上層、下層の順に実施しているが、その順番は任意である。【００６１】
続いて、下層用培養容器本体１０４へ細胞播種するプロトコルを示す。事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁は、図６に示すように、あらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部２０９Ａ及び２０９Ｂを作動させ、送液及び送気を実施する。すなわち、図７Ｂに示すように、細胞バッグ２０３から、第二の流路回路（２０４）、電磁弁２０６Ｃ、流体移動制御機構部２０８Ｂ、第二の流路回路（２２２）を介して、第二供給ポート１０６から下層用培養容器本体１０４へ送液する。この時同時に、培養容器内の空気を、上層用培養容器１０１の供給用流路（第一供給ポート）１１１から第一の流路回路（２２１）、流体移動制御機構部２０８Ａ、電磁弁２０６Ｆを介して培養容器外へ排出する。空気は、最終的にフィルタ２１７Ｂより流路外へ排出する。所宇量を送液し終えたら終了する。このようにして、細胞バッグから培養容器に対する細胞播種は、スムーズに実行される。【００６２】
次に、培地交換について説明する。
培地交換は、１０個の上層用培養容器ユニット１０１及び１つの下層一体型の培養容器函体１０２に対し、順次実施する。  
図８は、閉鎖系培養容器の培地交換制御用のテーブル８００の一例を示す図である。このテーブル８００により、培地交換のために、二方弁（電磁弁）２０６、３０７、三方弁（電磁弁）２０７、流体移動制御機構部（チューブポンプ）２０８等が、テーブル８００で与えられる所定のシーケンスに従い、制御される。【００６３】
図９Ａ〜９Ｄにより、上層用培養容器１０１の培地を交換するプロトコルを説明する。図９Ａ〜図９Ｄは、１個の上層用培養容器１０１に対し、テーブル８００に従い形成される流路回路と、それによる上層の培地交換時の培地及び空気の流れを示したものである。【００６４】
まず、図９Ａに示すように、培地バッグ２０２から第一の流路回路（２２１）を経て上層用培養容器ユニットの第一供給ポート１１１まで培地送液し、ここで待機状態とする。この時同時に、流路（第二供給ポート）１０６より培養容器内の空気を、第二の流路回路（２２２）を介して、培養容器１００の外へ排出する。空気は、最終的にフィルタ２１７Ａより流路外へ排出する。この時、テーブル８００に従い、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁はあらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部２０８Ａ及び２０８Ｂを作動させ、送液及び送気を実施する。また、培地バッグ２１１は４℃の冷蔵庫内に設置するため、培地バッグ２１１から送液した直後の培地は４℃であるが、ヒーター２１２により３７℃まで加温し、培養容器等が設置された恒温機内にて３７℃にて維持する。【００６５】
このように、図９Ａの状態では、第一の流路回路内の培地の先端は第一供給ポート１１１若しくはその近傍に維持される。なお、この停止位置は、用途によって、適宜変更すれば良い。【００６６】
次に、図９Ｂに示すように、第一の流路回路（２２１）での新しい培地の待機状態を維持したまま、上層用培養容器ユニット１０１内の培養に用いた古い培地を、上層排出用流路１１４から排出する。すなわち、培養容器内の培地を、第一排出ポート１１３、第一の流路回路（２２３）を介して、流体移動制御機構部２０８Ｃにより、排液バッグ２１３へ排出する。その時、培地成分分析に必要な排液の一部は、排液回収バッグ２１４Ａにおいて回収する。培養容器から古い培地を排出する際には、回転機構３１１により培養容器を傾け、培養容器内の排出口側から古い培地が排出されやすくなるようにする。この時同時に、下層供給用流路すなわち第二の流路回路（２２２）を介して、流体移動制御機構部２０８Ａにより、空気を第二供給ポート１０６から培養容器内１００へ供給する。空気は、最終的にフィルタ２１７Ａから流路内へ供給する。この時、テーブル８００に従い、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁及び三方弁はあらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部２０８Ａ、２０８Ｂ及び２０８Ｃを作動させ、排液及び送気を実施する。古い培地は、最終的に排液バッグ２１３または排液回収バッグ２１４Ａへ排出される。排液は、上層にある古い培地の全量が、上層から排出された時点で終了する。但し、この時点では全量に対し完了する必要はない。【００６７】
続いて、図９Ｃに示すように、培地バッグ２１１から第一の流路回路（２２１）を介して上層用培養容器ユニット１０１の第一供給ポート１１１若しくはその近傍まで送液し、先端がこの部分で３７℃にて待機させていた新しい培地を、上層用培養容器ユニット１０１内へ供給する。この時同時に、培養容器１００内の空気を、第二供給ポート１０６、下層供給用流路（第二の流路回路２２２）を介して、培養容器の外へ排出する。空気は、最終的にフィルタ２１７Ａより流路外へ排出する。この時、テーブル８００に従い、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁はあらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部２０８Ａ、２０８Ｂを作動させ、送液及び送気を実施する。【００６８】
最後に、図９Ｄに示すように、上層排出用流路１１４と排液バッグ２１３または排液回収バッグ２１４Ａの間の第一の流路回路（２２３）等に残存している古い培地を、排液バッグ２１３または排液回収バッグ２１４Ａへ排出する。この時同時に、下層供給用流路すなわち第二の流路回路（２２２）を介して、空気を第二供給ポート１０６から培養容器１００内へ供給する。空気は、最終的にフィルタ２１７Ａから流路内へ供給する。この時、テーブル８００に従い、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁及び三方弁はあらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部２０８Ｂ及び２０８Ｃを作動させ、排液及び送気を実施する。排液は、上層にある古い培地が全量、排液バッグ２１３または排液回収バッグ２１４Ａへ排出された時点で終了する。【００６９】
次に、下層一体型の培養容器函体１０２への培地交換のプロトコルについて説明する。  
図１０Ａ〜図１０Ｄは、下層の培養容器函体１０２に対し、テーブル８００に従い形成される流路回路と、それによる下層の培地交換時の培地及び空気の流れを示したものである。【００７０】
まず、図１０Ａに示すように、培地バッグ２１１から、下層供給用流路すなわち第二の流路回路（２２２）を介して、培養容器１００の第二供給ポート１０６若しくはその近傍まで培地を送液し、ここで待機状態とする。この時同時に、培養容器１００内の空気を第一供給ポート１１１より第一の流路回路（２２１）を経て培養容器外へ排出する。空気は、最終的にフィルタ２１７Ｂより流路外へ排出する。この時、テーブル８００に従い、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁はあらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部２０８Ａ及び２０８Ｂを作動させ、送液及び送気を実施する。また、培地バッグ２１１は冷蔵庫内に設置するため、培地バッグ２１１から送液した直後の培地は４℃であるが、ヒーター２１２により３７℃まで加温し、培養容器等が設置された恒温機１４０３内にて３７℃にて維持する。【００７１】
次に、図１０Ｂに示すように、第二供給ポート１０６における新しい培地の待機状態を維持したまま、下層一体型の培養容器函体１０２内の培養に用いた古い培地を、下層排出用流路１０９から第二の流路回路（２２４）を介して排出する。この時同時に、第一の流路回路（２２１）を経て空気を第一供給ポート１１１から培養容器１００内へ供給する。空気は、最終的にフィルタ２１７Ｂから流路内へ供給する。この時、テーブル８００に従い、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁及び三方弁はあらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部２０８Ａ及び２０８Ｄを作動させ、排液及び送気を実施する。排液は、下層にある古い培地の全量が、下層から排出された時点で終了する。なお、古い培地は最終的に排液バッグ２１３または排液回収バッグ２１４Ｂへ排出されるが、この時点では、全量に対し完了する必要はない。【００７２】
続いて、図１０Ｃに示すように、培地バッグ２１１から第二の流路回路（２２４）を介して下層一体型の培養容器函体１０２の第二供給ポート１０６若しくはその近傍まで送液し、３７℃にて待機させていた新しい培地を、下層の培養容器函体１０２内へ供給する。この時同時に、第一の流路回路（２２１）を介して、第一供給ポート１１１より培養容器１００内の空気を培養容器外へ排出する。空気は、最終的にフィルタ２１７Ｂより流路外へ排出する。この時、テーブル８００に従い、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁はあらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部２０８Ａ及び２０８Ｂを作動させ、送液及び送気を実施する。【００７３】
最後に、図１０Ｄに示すように、下層排出用流路１０９と排液バッグ２１３または排液回収バッグ２１４Ｂの間の第二の流路回路（２２４）等に残存している古い培地を、排液バッグ２１３または排液回収バッグ２１４Ｂへ排出する。この時同時に、第一の流路回路（２２１）を介して、第一供給ポート１１１より空気を培養容器１００内へ供給する。空気は、最終的にフィルタ２１７Ｂから流路内へ供給する。この時、テーブル８００に従い、事前に培地及び空気が流れる流路上の二方弁及び三方弁はあらかじめ開いた状態にする。それ以外のものは閉じた状態にする。その状態で、流体移動制御機構部２０８Ａ及び２０８Ｄを作動させ、排液及び送気を実施する。排液は、下層にある古い培地が全量、排液バッグ２１３または排液回収バッグ２１４Ｂへ排出された時点で終了する。【００７４】
本実施例によれば、閉鎖系培養容器に取り付けた流路チューブの一部は、送液と送気の機能を兼ねるため、全体流路回路が簡潔となる。例えば、１０個の上層用培養容器ユニット１０１（１０１Ａ〜１０１Ｊ）の各々に、下層用培養容器本体１０４を個別に設けた場合、第一供給ポート、第一排出ポート、第二供給ポート、第二排出ポートの各々に流路チューブを接続する必要が有るので、合計４０本の流路チューブが必要になる。一方、本実施例によれば、下層用培養容器本体１０４には全体で２本の流路チューブを接続するのみなので、合計２２本の流路チューブで足りる。また、流路を制御する電磁弁も少なくなる。さらに、下層用培養容器本体への播種は１回のみなので、処理時間が短縮され、速やかに培養へ移行できる。【００７５】
以上述べた本実施例の自動培養装置おける一連の処理の詳細を、図５の制御フローを参照しながら、まとめて説明する。尚、使用する培養容器の数を増やす場合は、流路の多分岐部において、並列に培養容器を並べればよい。またその場合の培養手順は、以下に示すＳ１〜Ｓ８、Ｓ１０〜Ｓ１２の操作を各培養容器に対して順々に実施すればよい。【００７６】
＜ステップＳ１：スタート＞
まず、図５に示すように、自動培養装置を起動させる。操作者が制御装置にある操作部のスタートスイッチを押すことにより起動する。尚、この時点で流路回路等は事前に自動培養装置へ設置されている。制御部のディスプレイの操作画面において、自動培養装置の内部環境として適切な値であることを確認する。例えば、恒温機の温度が３７℃であることを確認する。これらの数値は限定的なものでなく、例えば温度は、０℃から４５℃の範囲より選択可能である。また装置の内部は、事前の適切な操作により、滅菌ガスによる滅菌或いはエタノールによる消毒が施され、清浄な状態となっている。また、培養に用いる流路部に対しても事前に滅菌を施してある。【００７７】
＜ステップＳ２：スケジュール決定＞
培養する細胞の種類と量に合わせ、自動培養装置により実施する自動培養スケジュールを決定する。細胞播種、培地交換、顕微鏡観察、排液回収、検査用組織回収、移植用組織回収等の操作を行う日時、頻度、液量等の条件を、制御部の操作部より入力する。【００７８】
＜ステップＳ３：細胞播種＞
適切な二方弁及び三方弁の開閉を行った後、流体移動制御機構部を作動させ、細胞バッグより細胞懸濁液を吸引する。細胞懸濁液は、食道粘膜再生の例では口腔粘膜上皮細胞を培養するため、ＫＣＭ培地（keratinocyte culture medium）に懸濁した口腔粘膜上皮細胞と、同じくＫＣＭ培地に懸濁した３Ｔ３−Ｊ２細胞である。流体移動制御機構部を駆動させることにより、エアフィルタを介して流路外へ流路内の空気を排出しつつ、細胞懸濁液を吸引する。そして培養容器へ播種する。細胞播種は、各培養容器のそれぞれの上層及び下層へ、順次実施する。播種後、回転機構により培養容器を複数回揺動させることにより、培養表面上の細胞分布が均一となるようにする。【００７９】
＜ステップＳ４：細胞の培養＞
培養容器を水平に静置した状態で所定時間、培養する。例として口腔粘膜上皮細胞の場合、静置期間は播種後５日間程度とする。培養中は、恒温機により培養容器の周囲環境を３７℃に維持する。また、必要に応じ培養容器の内部へ所定成分の気体を送気する。口腔粘膜上皮細胞の培養の場合、ＣＯ２濃度は５％、湿度は１００％に維持する。自動培養装置内部の空気はファンにより常に攪拌し、温度分布が常に一様となるようにする。【００８０】
＜ステップＳ５：顕微鏡による観察＞
自動培養装置内に設置した顕微鏡を用い、細胞画像を取得する。自動培養装置内に設置した光源を適宜発光させ、顕微鏡により細胞に焦点を合わせ、撮像する。必要に応じ、培養表面に定点を任意に定め、撮影する。取得した細胞画像はデータベースに保存し、自動培養装置の外部に設置したディスプレイ上で必要に応じ閲覧できるようにする。【００８１】
＜ステップＳ６：細胞の状態判定＞
顕微鏡観察により得た細胞の生育状態に関する情報から判断し、培地交換の頻度、時期の調整を行う。例えば細胞の接着が不十分な場合、次のステップの培地交換は実施せず、ステップＳ４の細胞の培養を継続する。【００８２】
＜ステップＳ７：培地交換＞
培地交換は、一般に数日に一度の頻度で実施する。細胞の生育状況に応じ、頻度は調整を行う。適切な電磁弁の開閉を行った後、流体移動制御機構部を作動させ、流体移動制御機構部を駆動させることにより培地バッグより培地を吸引する。同時に、フィルタを介して流路外へ流路内の空気を排出する。培地バッグから送液された直後の培地は４℃であるが、ヒーター及び恒温機内の気相により、培地の温度は３７℃を維持した状態で次の工程に進む。【００８３】
続いて、培養容器から古い培地を排出する。この時、回転機構により培養容器を傾け、古い培地の全量が排出されるようにする。排出後、速やかに、３７℃に維持されている新しい培地を培養容器内へ供給する。これにより、培養表面上の細胞の乾燥と、培養表面の温度低下を回避する。【００８４】
培養容器から排出した古い培地は、一部を排液回収バッグへ、残りを排液バッグへ送液する。回収した古い培地は、別途用意する培地成分分析装置により培地成分分析を用い、細胞の生育状況を評価する。例えば、細胞が生育時に用いるグルコースと排出する乳酸の量を測定し、細胞の生育状態を把握する。また、マイコプラズマ試験等を実施し、培地が汚染されていないか判定する。汚染があった場合には培養を直ちに終了し、自動培養装置の設置場所が汚染されないよう、細胞を適切な操作により無菌的に破棄する。【００８５】
＜ステップＳ８：移植直前の判定＞
移植を実施するに適しているか否かの判定を行う。【００８６】
＜ステップＳ１０：移植直前の培養及び培地交換＞
移植を実施する直前に、ステップＳ４〜Ｓ７と同じ操作による培地交換を行う。【００８７】
＜ステップＳ１１：移植用組織の回収＞
ステップＳ７による評価の結果、移植に適した再生組織が培養できていると判断がついた場合、移植用として組織を回収して再生医療治療に用いる。培養容器を取り外し、その後、再生医療治療を行う手術室へ、無菌性と生物学的な質を維持した状態で搬送し、治療に用いる。【００８８】
＜ステップＳ１２：終了＞
培養に用いた流路部を取り外す。続いて、装置の内部へ適切な操作により、滅菌ガスによる滅菌或いはエタノールによる消毒を施し、清浄な状態にする。自動培養装置の各種ソフトを終了させ、自動培養装置の作動を終了させる。【００８９】
以上、本発明の実施の形態の一例を図面に従い説明したが、本発明はこれら実施例に限定されるものでないこと明らかである。例えば実施例において、流体を移動させる流体移動制御機構部としてペリスタルティック・ポンプを想定しているが、シリンジ・ポンプ等の他の駆動機構を用いても良いことは言うまでもない。【００９０】
以上のように構成された自動培養装置の好適な実施形態によれば、検査用等の再生組織を、無菌性を維持した状態で事前に取り出すことが可能である。取り出した後の残りの再生組織は、同様に無菌性を維持するため、培養の継続が可能である。また、細胞播種工程及び培地交換工程において、培地は常に一方向に流れる。全量を交換する培地交換において、古い培地が新しい培地に混入しないようにするため、培養の再現性が向上する。回収した古い培地を用いた培地成分分析の分析精度が向上する。古い培地を回収後は、速やかに事前に３７℃へ温めた新しい培地を供給する。閉鎖系培養容器に取り付けた流路チューブの一部は、送液と送気の機能を兼ねるため、全体流路回路は簡潔となる。【００９１】
以上、本発明の実施の形態の一例を図面に従い説明したが、本発明はこれら実施例に限定されるものでないこと明らかである。例えば実施例において、流体を移動させる流体移動制御機構部としてペリスクルティック・ポンプを想定しているが、シリンジ・ポンプ等の他の駆動機構を用いても良いことは言うまでもない。【００９２】
以上、本発明の実施の形態の一例を図面に従い説明したが、本発明はこれら実施例に限定されるものでないこと明らかである。例えば実施例において、流体を移動させる流体移動制御機構部としてペリスタルティック・ポンプを想定しているが、シリンジ・ポンプ等の他の駆動機構を用いても良いことは言うまでもない。【００９３】
本実施例によれば、細胞播種工程及び培地交換工程において、培地は常に一方方向に流れるので古い培地が新しい培地に混入せず、培養の再現性が向上する。培地交換時に古い培地を全て排出した後に新しい培地が速やかに供給される。【００９４】
しかも、閉鎖系培養容器に取り付けた流路チューブの一部は、送液と送気の機能を兼ねるため、全体流路回路は簡潔となる。特に、下層は一体型の培養容器函体としているので、下層用培養容器本体には全体で２本の流路チューブを接続するのみで良く、流路回路は簡潔となり、流路を制御する電磁弁も少なくなる。
【実施例２】
【００９５】
培養容器内の再生組織は、再生医療治療を行うに際して、再生医療治療に適した質を有するかが評価される。そのために、同じ環境で複数個を同時培養している細胞容器の中から、その１つを、事前に無菌的に取り出して、検査用としたいというニーズがある。すなわち、図５の検査用組織の回収（ステップＳ９）を実施したい場合がある。【００９６】
本実施例は、このようなニーズに応える培養容器１００を提供するものである。【００９７】
図１１に示した実施例２の培養容器１００は、上層用培養容器ユニット１０１及び下層一体型の培養容器函体１０２と並行して、細胞バッグ、培地バッグ、排液バッグ、排液回収バッグ等に接続された、検査用上層用培養容器ユニット１１０１及び検査用培養容器函体１１０２を具備している。検査用上層用培養容器ユニット１１０１及び検査用培養容器函体１１０２は、実施例１の培養容器１００と同じ環境で同時培養される。
すなわち、検査用上層用培養容器ユニット１１０１は、上層供給用接続突起構造１１１及び上層排出用接続突起構造１１３に対応する上層供給用接続突起構造１１１１及び上層排出用接続突起構造１１１３を有する。検査用培養容器函体１１０２は、実施例１の下層用培養容器本体１０４に対応する培養容器本体と、下層供給用接続突起構造１０６に対応する下層供給用接続突起構造１１０６と、下層排出用接続突起構造１０８に対応する下層排出用接続突起構造１１０８と、開口部１１５対応する開口部を有している。本例では、下層一体型の培養容器函体１０２を、流路チューブ２２２を含む第二の流路回路で、検査用培養容器函体１１０２に接続した状態を示している。なお、検査用上層用培養容器ユニット１１０１の接続関係については、図には記載していないが、実施例１と同様の構成の複数の上層用培養容器ユニット１０１と並行して、１個の検査用上層用培養容器ユニット１１０１を検査用培養容器函体１１０２の上に設置し、流路チューブを含む第一の流路回路で、細胞バッグ、培地バッグ、排液バッグ、排液回収バッグ等に接続すればよい。【００９８】
検査用培養容器函体１１０２の前後の第二の流路回路には、無菌脱着部１１０３を設置する。無菌脱着部１１０３は、流路チューブと同様に送液及び送気が可能であり、流路の切断も可能である。切断後の流路は、無菌性を維持する。また無菌脱着部１１０３により検査用培養容器函体１１０２を取り外した後も、下層一体型の培養容器函体１０２の培養を継続するため、第二の流路回路には、三分岐部１１０４により、検査用培養容器函体１１０２をバイパスする、迂回流路チューブ１１０５を事前に取り付けておく。第一の流路回路にも、同様に三分岐部により、検査用上層用培養容器ユニット１１０１をバイパスする、迂回流路チューブを事前に取り付けておく。【００９９】
検査用培養容器函体１１０２を取り外した後は、迂回流路チューブ１１０５により下層一体型の培養容器函体１０２へ送液及び送気を実施する。同様に、検査用上層用培養容器ユニット１１０１を取り外した際も、迂回流路チューブ１１０５により各上層用培養容器ユニット１０１へ送液及び送気を実施する。【０１００】
本実施例によれば、以下のようにして、図５の検査用組織の回収（ステップＳ９）を含む処理を行うことができる（実施例１と同じ処理に関しては、説明を省略する）。【０１０１】
＜ステップＳ９：検査用組織の回収＞
移植予定日の前日に、培養中の培養容器のうち１枚を検査用に回収する。まず、自動培養装置の扉を開ける。装置内の温度低下を回避するため、流路のみを取り出し、装置の扉を閉めても良い。続いて、検査用培養容器函体１１０２及び検査用上層用培養容器ユニット１１０１の流路チューブを、無菌脱着部１１０３により取り外す。次に、検査用上層用培養容器ユニット１１０１を、検査用培養容器函体１１０２から取り外す。取り外した上層用培養容器ユニットに対しては、速やかに検査を実施する。検査用の上層用培養容器ユニットを取り外した後の流路は同じく速やかに装置内へ戻し、装置の扉を閉める。【０１０２】
この時点までの作業中に流路は室温に晒され温度が低下しているため、培養温度である３７℃まで迅速に温度が戻るよう、装置内の空調及びヒーターを制御し調整する。【０１０３】
検査用に取り出した上層用培養容器ユニット１１０１内の再生組織は、再生医療治療に適した質を有するか評価する。例えば口腔粘膜上皮細胞による再生組織の場合、組織学的評価により３層程度の重層化した構造を有するか、免疫組織化学染色評価により口腔粘膜幹細胞が再生組織の基底層に存在するか、口腔粘膜上皮細胞特異的タンパク質を発現しているか等の評価を行う。【０１０４】
以上のように構成された実施例２の培養容器によれば、検査用等の再生組織を、無菌性を維持した状態で事前に取り出すことが可能である。取り出した後の残りの再生組織は、同様に無菌性を維持するため、培養の継続が可能である。また、細胞播種工程及び培地交換工程において、培地は常に一方向に流れる。全量を交換する培地交換において、古い培地が新しい培地に混入しないようにするため、培養の再現性が向上する。回収した古い培地を用いた培地成分分析の分析精度が向上する。古い培地を回収後は、速やかに事前に３７℃へ温めた新しい培地を供給する。閉鎖系培養容器に取り付けた流路チューブの一部は、送液と送気の機能を兼ねるため、全体流路は簡潔となる。
【実施例３】
【０１０５】
本実施例は、同じ環境で複数個を同時培養している細胞容器の中から、その１つを、事前に無菌的に取り出して、検査用したいというニーズに応える培養容器１００の他の例を提供するものである。【０１０６】
図１２Ａ〜図１２Ｄを用いて、実施例３を説明する。本実施例の培養容器１００は、例えば実施例１と同様に、再生組織を培養するための１０個の上層用培養容器ユニット１０１（Ａ〜Ｊ）が、フィーダー細胞を培養するための下層一体型の培養容器函体１０２内に収容可能となっている。【０１０７】
この例では、下層一体型の培養容器函体１０２から、１個の上層用培養容器ユニット１０１を無菌的に取り出すための隔離膜４０３を備えている。すなわち、図２Ａ、図２Ｂに示したねじ構造に代えて、各容器蓋部材１０３と下層用培養容器本体１０４の開口部１１５の周囲との間に、隔離膜４０３が設けられている。【０１０８】
図１２Ａ〜図１２Ｄに示した隔離膜４０３は蛇腹形状であり、容器蓋部材１０３と下層一体型の培養容器函体１０２とに溶着されている。その位置は、容器蓋部材１０３、或いは下層一体型の培養容器函体１０２に設置するＯリング１０５よりも内側となる。なお、隔離膜４０３の構成には複数の形態が考えられる。溶着方法として、製造時に高熱を付与する熱溶着により隔離膜を固定するが、この方法に限定されるものではない。隔離膜の他の溶着方法として、機械的圧力、超音波溶着、接着材、光硬化樹脂を用いた光照射等が挙げられる。溶着された隔離膜４０３により、隔離膜４０３の内側と外側は、隔離される。少なくとも、生物学的汚染の原因となりうる菌等の移動を不可能とする。素材は、例えば高圧蒸気滅菌において使用する才一トクレーブバック等に用いるフィルム、或いは流路チューブ等に用いられるシリコン素材等の弾性部材が挙げられるが、これらの素材に限定されるものではない。溶着が可能であり、菌等の移動を不可能とし、後述するように、上層用培養容器ユニットの取り出し時に迅速な溶着及び切断が可能な素材であればよい。【０１０９】
図１２Ａは、容器蓋部材１０３と下層一体型の培養容器函体１０２を一体化させた、培養状態を示している。上層用培養容器ユニット１０１及び下層用の一体型の培養容器函体１０２の内部には、培地１５０が入っている。隔離膜４０３は、容器蓋部材１０３及び下層用培養容器本体１０４の間、及び容器蓋部材１０３の外周近傍に収容されている。この隔離膜４０３の中間部分は、例えば、容器蓋部材１０３の外周のすぐ横において下層用培養容器本体１０４上に、折り畳み、あるいは、まるめた状態とし、接着材などでその状態が固定される。【０１１０】
一方、図１２Ｂは、蛇腹型隔離膜４０３を伸長させ、容器蓋部材１０３と下層一体型の培養容器函体１０２を分離させた状態を示している。すなわち、上層用培養容器ユニット１０１及び容器蓋部材１０３を持ち上げた状態を示している。上層用培養容器ユニット１０１の底面部は、多孔性膜であるため、例えば数分程度の短時間であれば、上層用培養容器ユニット内に培地１５０を保持することが可能である。隔離膜４０３は、事前に容器蓋部材１０３及び下層用培養容器本体１０４に溶着されているため、隔離膜４０３の内側は無菌性を維持している。【０１１１】
容器蓋部材１０３と下層一体型の培養容器函体１０２を結合する手段として、容器蓋部材１０３の底面には、円周方向に沿って等間隔に複数の係止片１２３が設けられ、この係止片１２３が下層用培養容器本体１０４の環状突出部１０４０の外側に設けられた係止穴１２４に係止するように構成されている。両者を一体化させた時、隔離膜４０３は、容器蓋部材１０３及び下層一体型の培養容器函体１０２の間に収容されている。【０１１２】
次に、図１２Ａに示した、培養状態にある１０個の上層用培養容器ユニット１０１（Ａ〜Ｊ）の中から任意の１個の上層用培養容器ユニット１０１を、下層一体型の培養容器函体１０２から無菌的に取り出す一連のプロトコルを説明する。【０１１３】
まず、図１２Ｂのように、取り出すべき上層用培養容器ユニット１０１の容器蓋部材１０３と下層一体型の培養容器函体１０２を分離させる。次に、図１２Ｃに示したように、切断治具４０７により、隔離膜４０３の中間部分を絞り、隔離膜４０３を圧着させる。この状態において、切断治具４０７に挟まれている部分の隔離膜４０３を溶着させる。尚、切断治具３０７に挟まれている部分の隔離膜３０４の溶着方法には、例として熱溶着が挙げられるが、超音波溶着、機械的高圧力による溶着等の方法もあり、熱溶着に限定されるものではない。【０１１４】
隔離膜３０４の溶着後、溶着部分を切断する。図１２Ｄは、溶着された隔離膜４０３を切断した後の状態である。すなわち、図１２Ｄに示したように、溶着・切断により、容器蓋部材１０３、下層用培養容器本体１０４、隔離膜４０３により囲まれていた１つの閉鎖空間１１０は、取り出す上層用培養容器ユニット１０１の容器蓋部材１０３と上層側隔離膜４０３１に囲まれた１つの閉鎖空間と、下層用培養容器本体１０４と下層側隔離膜４０３２及び残りの９個の上層用培養容器ユニット１０１の容器蓋部材１０３とに囲まれた他の閉鎖空間に、分離される。取り出した上層用培養容器ユニット１０１と、取り出し後の下層用培養容器本体１０４は、それぞれ上層側隔離膜４０３１と下層側隔離膜４０３２に囲まれているため、各閉鎖空間は共に閉鎖性を維持し、結果として、各々、内部の無菌性を維持している。【０１１５】
本実施例によれば、以下のようにして、図５の検査用組織の回収（ステップＳ９）を含む処理を行うことができる。（実施例１と同じ処理に関しては、説明を省略する）。【０１１６】
＜ステップＳ９：検査用組織の回収＞
移植予定日の前日に、培養中の培養容器のうち１枚を検査用に回収する。検査に用いる任意の上層用培養容器ユニット１０１の流路チューブを、無菌脱着部１１０３により取り外す。次に、この上層用培養容器ユニットを、下層用培養容器本体１０４から取り外す。上層用培養容器ユニットと下層用培養容器本体の間に設置している隔離膜４０３は、上層用培養容器ユニットを、下層用培養容器本体から取り外す。取り外した上層用培養容器ユニットに対しては、速やかに検査を実施する。検査用の上層用培養容器ユニットを取り外した後の培養容器１００の流路は同じく速やかに装置内へ戻し、装置の扉を閉める。この時点までの作業中に培養容器１００の流路は室温に晒され温度が低下しているため、培養温度である３７℃まで迅速に温度が戻るよう、装置内の空調及びヒーターを制御し調整する。検査用に取り出した上層用培養容器ユニット内の再生組織は、再生医療治療に適した質を有するか評価する。例えば口腔粘膜上皮細胞による再生組織の場合、組織学的評価により３層程度の重層化した構造を有するか、免疫組織化学染色評価により口腔粘膜幹細胞が再生組織の基底層に存在するか、口腔粘膜上皮細胞特異的タンパク質を発現しているか等の評価を行う。【０１１７】
＜ステップＳ１１：移植用組織の回収＞
評価の結果、移植に適した再生組織が培養できていると判断がついた場合、移植用として組織を回収して再生医療治療に用いる。まず、培養容器を取り外し、その後、再生医療治療を行う手術室へ、無菌性と生物学的な質を維持した状態で搬送し、治療に用いる。【０１１８】
隔離膜に収容されている状態であれば再生組織は無菌性を維持するため、再生医療治療の進行に合わせ、隔離膜からの再生組織を取り出すタイミングを制御する。例えば、隔離膜に収容した状態での手術室内での待機、搬送等が可能である。【０１１９】
このように、本実施例によれば、複数個を同時培養している細胞容器の中から、無菌的に任意の１個の再生組織を取り出すことが可能である。残りの培養容器に対しては、継続して無菌的な培養が可能である。
【実施例４】
【０１２０】
次に、実施例４として、実施例３の隔離膜４０３の形成方法を述べる。すなわち、実施例４では、図１３を参照しながら、上層用培養容器ユニット１０１を保持した各容器蓋部材１０３と下層用培養容器本体１０４の開口部１１５の周囲との間に、隔離膜４０３を設ける製造方法について説明する。【０１２１】
最初に、図１３に示したように、上層用培養容器ユニット１０１を、フック構造等により容器蓋部材１０３へ設置する。次に、容器蓋部材１０３の内方向突出部１０３０の下面に蛇腹型の隔離膜４０３の上端面４０３３を、熱溶着等の手段により溶着する。尚、溶着方法は他の方法を選択することも可能であり、熱溶着に限定されるものではない。続いて、隔離膜４０３の他端４０３４を下層用の培養容器本体１０４の開口部１１５の周囲へ熱溶着等の手段により溶着する。尚、溶着方法は熱溶着に限定されるものではない。【０１２２】
最後に、容器蓋部材１０３を下層用培養容器本体１０４へ設置する。【０１２３】
下層一体型培養容器の製造後、滅菌を行う。γ線滅菌が適用可能な素材のみを使用している場合、流路チューブ等を連結させた閉鎖系流路全体を滅菌バッグに入れた状態で、γ線滅菌を実施する。使用時、滅菌バッグより流路を取り出し自動培養装置に設置し、自動培養を行う。γ線滅菌を適用不可能な素材を使用している場合、適用可能な素材のみに対しγ線滅菌を実施し、残りについてはγ線滅菌以外の方法、例えばガス滅菌を実施する。両素材は、安全キャビネット等において一体化させる。
【実施例５】
【０１２４】
隔離膜４０３は、実施例３で述べた蛇腹型以外の構成であっても良い。  
実施例５として、図１４Ａ〜図１４Ｃを参照しながら、層用培養容器から１個の上層用培養容器ユニットを無菌的に取り出すための、平坦型の隔離膜と、その製造方法について説明する。
実施例３で説明した蛇腹型の隔離膜と同様、隔離膜４０３はその上端面及び下端面が各々容器蓋部材１０３及び下層用培養容器本体１０４に溶着されている。図１２で説明した隔離膜と異なり、実施例５に示したものは、隔離膜を容器蓋部材１０３及び下層用培養容器本体１０４の外部に収容する
図１４Ａは、上層用培養容器ユニット１０１を保持した容器蓋部材１０３を、下層用培養容器本体１０４から取り外した状態を示している。隔離膜４０３は、その上端及び下端が各々、容器蓋部材１０３及び下層用培養容器本体１０４に溶着された状態となっている。【０１２５】
図１４Ｂは、上層用培養容器ユニット１０１を保持した容器蓋部材１０３が、下層用培養容器本体１０４内に保持された状態を示している。この状態において、隔離膜４０３は、その中間部分が折り曲げられ、上層用容器蓋部材１０１及び下層培養容器本体１０４の外側に延びた状態で位置している。【０１２６】
この隔離膜４０３の外側に延びた部分は、例えば、容器蓋部材１０３の外周のすぐ横に丸めて設置される。あるいは、外側に延びた部分を折り畳んだ状態にしても良い。【０１２７】
図１４Ｃは、容器蓋部材１０３及び下層用培養容器本体１０４の外側に延びた部分の有る隔離膜４０３を、折り畳んだ状態で収容する方法を示したものである。隔離膜４０３の中間部分、すなわち外側に延びた部分は、同心円状の位置固定治具８０１，８０２の間に保持され、上から圧縮治具８０３で加圧されることにより、折り曲げられる。このようにして、隔離膜４０３は、容器蓋部材１０３の外周横に折り畳んでコンパクトに設置される。【０１２８】
図１２（１２Ａ〜１２Ｄ）の隔離膜と図１４（１４Ａ〜１４Ｃ）の隔離膜を比較すると、図１２で示した隔離膜の収容方法では、容器蓋部材１０３及び下層用培養容器本体１０４の内部に隔離膜４０３を設置したため、折りたたんで収容した隔離膜の厚みが大きくなり、鉛直方向に下層用培養容器本体１０４は大きくなる。培養中において、下層用培養容器本体内で培養する細胞を顕微鏡により観察する必要が有るが、鉛直方向に下層用培養容器本体が大きくなると、顕微鏡観察に必要な光が減衰したり、鮮明な細胞画像を得るための焦点深度の調整が困難となったりする可能性がある。一方、容器蓋部材の外側横に隔離膜を収容していないため、下層用培養容器本体内において各上層用培養容器ユニット１０１を近接させることができるので、培養容器１００により多くの上層用培養容器ユニット１０１を配置することが可能となる。【０１２９】
これに対し、図１４で示した隔離膜の収容方法では、容器蓋部材の外側横部に隔離膜を収容するため、その分、下層用培養容器本体内において各上層用培養容器ユニットを離して配置する必要があり、培養容器１００に配置できる上層用培養容器ユニットの数に制約がある。一方、容器蓋部材及び下層用培養容器本体の内部に折りたたんだ隔離膜を収容していないため、鉛直方向に下層用培養容器本体が大きくなることはない。よって、顕微鏡観察に影響を生じることはない。
【実施例６】
【０１３０】
隔離膜４０３の他の構成例を、実施例６で説明する。  
図１５は、下層用培養容器本体から１個の上層用培養容器ユニットを無菌的に取り出すための、蓋上面設置型の隔離膜の例を示したものである。【０１３１】
実施例６では、下層用培養容器本体から１個の上層用培養容器ユニットを取り出すための隔離膜４０３が、容器蓋部材１０３及び下層用培養容器本体１０４の外周部に設置されている。実施例３、実施例５で説明した隔離膜と異なり、隔離膜４０３は容器蓋部材１０３及び下層用培養容器本体１０４の外周部に溶着されている。隔離膜４０３は、その上端面が容器蓋部材１０３の外周上端面において、容器蓋部材接着部５０４にて容器蓋部材１０３に溶着されている。また、隔離膜４０３は、その下端面が下層用蓋部接着部５０５にて下層用培養容器本体１０４の上面に溶着されている。実施例６では、実施例５と同様に、隔離膜を容器蓋部材１０３及び下層用培養容器本体１０４の外部に隔離膜４０３を収容する。隔離膜４０３の上端面を容器蓋部材１０３の外周側面において、容器蓋部材接着部５０４にて容器蓋部材１０３に溶着してもよい。【０１３２】
この隔離膜の収容方法によれば、実施例５と同様に、容器蓋部材の外側横に隔離膜を収容するため、培養容器１００に配置できる上層用培養容器ユニットの数に制約がある。一方、容器蓋部材及び下層用培養容器本体の内部に隔離膜を収容していないため、顕微鏡観察に影響を生じることはない。【０１３３】
なお、実施例３で述べた、切断治具３０７により隔離膜４０３を切断する方法は、実施例５、実施例６の隔離膜を切断するのにも適用できる。
【実施例７】
【０１３４】
前記各実施例で述べた隔離膜４０３は、実施例１で述べたような、容器蓋部材と下層用培養容器本体とを、ねじ等の回転操作を必要とする固定方式により、固定している場合にも適用できる。これを実施例７として説明する。
図１６Ａは、上層用培養容器ユニットを保持した容器蓋部材１０３と下層用培養容器本体１０４とのに、蓋上面設置型の隔離膜４０３が設置された培養容器１００において、容器蓋部材１０３と下層用培養容器本体１０４とをねじ１０５（Ａ，Ｂ）の螺合により固定する方式を採用している。【０１３５】
しかし、実施例３で述べた、切断治具３０７による隔離膜４０３の切断方法は、容器蓋部材と下層用培養容器本体をねじ等の回転操作を必要とする固定方式を採用している場合には、適用できない。【０１３６】
このような回転操作を必要とする固定方式を採用している場合の、容器蓋部材を取り外す方法を、図１６Ｂで説明する。【０１３７】
図１６Ｂは、前記各実施例の隔離膜を用いる場合において、容器蓋部材１０３と下層用培養容器本体１０４をねじ１０５（Ａ，Ｂ）により固定する方式を使用する場合について、上層用培養容器ユニット１０１を取り外した状態を示している。ねじ１０５（Ａ，Ｂ）により容器蓋部材１０３は下層用培養容器本体１０４に固定されているため、下層用培養容器本体１０４から取り外す際には、容器蓋部材１０３を回転させつつ取り外すことになる。よって隔離膜４０３は捻じられることになり、捻じれ構造１００４が生じる。【０１３８】
本実施例では、この捻じれ構造部分を溶着、切断することにより、上層用培養容器ユニット１０１を無菌的に単離させせる。これにより、容器蓋部材１０３と下層用培養容器本体１０４の固定を、ねじにより行う場合は、容器蓋部材１０１を回転させつつ取り外した段階で、隔離膜４０３に絞り込みに相当する捻じれ構造１００４が得られる。すなわち、捻じれ構造１００４で上下に分離することにより、容器蓋部材１０３、下層用培養容器本体１０４、隔離膜４０３により囲まれていた１つの閉鎖空間１１０は、取り出す上層用培養容器ユニット１０１の容器蓋部材１０３と上層側隔離膜に囲まれた１つの閉鎖空間と、下層用培養容器本体１０４と下層側隔離膜及び残りの上層用培養容器ユニット１０１の容器蓋部材１０３とに囲まれた他の閉鎖空間に、分離される。取り出した上層用培養容器ユニット１０１と、取り出し後の下層用培養容器本体１０４は、それぞれ上層側隔離膜と下層側隔離膜に囲まれているため、各閉鎖空間は共に閉鎖性を維持し、結果として、各々、内部の無菌性を維持している。  
本実施例の場合、取り外しプロトコルを少なくすることが可能となる。【０１３９】
以上述べたように、本発明は、培養容器を用いて細胞又は組織を自動操作により培養する自動培養装置、特に再生医療に使用可能な再生組織を製造することのできる自動培養装置として有用である。
【符号の説明】
【０１４０】
１００…培養容器
１０１…上層用培養容器ユニット
１０２…下層一体型の培養容器函体
１０３…容器蓋部材
１０４…下層用培養容器本体
１０５…弾性部材（Ｏリング）
１０６…下層供給用接続突起構造（第二供給ポート）
１０７…下層供給用流路
１０８…下層排出用接続突起構造（第二排出ポート）
１０９…下層排出用流路
１１０…閉鎖空間
１１１…上層供給用接続突起構造（第一供給ポート）
１１２…上層供給用流路
１１３…上層排出用接続突起構造（第一排出ポート）
１１４…上層排出用流路
１１５…開口部
１２０…養容器ユニットの底面
１２２…ギャップ
１５０…培池
１０１０…外周縁部
１０３０…内方向突出部
１０４０…環状突出部
１０５０Ａ，１０５０Ｂ…ねじ構造
２０２…細胞バッグ
２０３…細胞バッグ
２０４…第二の流路回路
２０５…第一流路回路
２０６…二方弁（電磁弁）
２０７…三方弁（電磁弁）
２０８…流体移動制御機構部
２０９…多分岐部
２１１…培地バッグ
２１２…ヒーター
２１３…排液バッグ
２１４…排液回収バッグ
２１７…フィルタ
２２１…第一の流路回路
２２２…第二の流路回路
２２３…第一の流路回路
２２４…第二の流路回路
３０７…二方弁（電磁弁）
３１１…回転機構
３１９…無菌脱着部
４０３…隔離膜
４０７…切断治具
６００…テーブル
８００…テーブル
８０１…位置固定治具
８０２…位置固定治具
８０３…圧縮治具
１００４…捻じれ構造
１１０２…検査用培養容器
１１０４…三分岐部
１１０５…迂回流路チューブ
１４０１…培養容器
１４０２…制御装置
１４０３…恒温機
１４０４…温度調節部
１４０５…ガス供給部
１４０６…温度センサ
１４０７…流体移動制御機構部
１４０８…顕微鏡
１４１０…表示画面
１４１１…ガス濃度調整部
１４１２…データベース。
【図１Ａ】
2013183121.tif 000003
【図１Ｂ】
2013183121.tif 000004
【図２Ａ】
2013183121.tif 000005
【図２Ｂ】
2013183121.tif 000006
【図３Ａ】
2013183121.tif 000007
【図３Ｂ】
2013183121.tif 000008
【図４】
2013183121.tif 000009
【図５】
2013183121.tif 000010
【図６】
2013183121.tif 000011
【図７Ａ】
2013183121.tif 000012
【図７Ｂ】
2013183121.tif 000013
【図８】
2013183121.tif 000014
【図９Ａ】
2013183121.tif 000015
【図９Ｂ】
2013183121.tif 000016
【図９Ｃ】
2013183121.tif 000017
【図９Ｄ】
2013183121.tif 000018
【図１０Ａ】
2013183121.tif 000019
【図１０Ｂ】
2013183121.tif 000020
【図１０Ｃ】
2013183121.tif 000021
【図１０Ｄ】
2013183121.tif 000022
【図１１】
2013183121.tif 000023
【図１２Ａ】
2013183121.tif 000024
【図１２Ｂ】
2013183121.tif 000025
【図１２Ｃ】
2013183121.tif 000026
【図１２Ｄ】
2013183121.tif 000027
【図１３】
2013183121.tif 000028
【図１４Ａ】
2013183121.tif 000029
【図１４Ｂ】
2013183121.tif 000030
【図１４Ｃ】
2013183121.tif 000031
【図１５】
2013183121.tif 000032
【図１６Ａ】
2013183121.tif 000033
【図１６Ｂ】
2013183121.tif 000034
【国際調査報告】
2013183121.tif 000035
2013183121.tif 000036