(57)【要約】  がんにおいて薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる遺伝子を同定し、当該遺伝子を標的として薬剤による治療の有効性を予測する新規な方法を提供することを目的として、びまん型胃がんのトランスクリプトームシークエンシングにより、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子とのインフレーム融合転写産物を同定した。また、当該遺伝子融合は、ＲＥＴタンパク質の活性化をもたらし、細胞をがん化させることも見出した。さらに、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によって、前記遺伝子融合によるＲＥＴタンパク質の活性化及びがん化を抑制できることも実証し、前記遺伝子融合が検出される患者に対しては、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤による治療が有効であることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＥＰ５５タンパク質又はその一部と、ＲＥＴタンパク質又はその一部とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
【請求項３】
試料中における請求項１に記載のポリヌクレオチド又は請求項２に記載のポリペプチドの存在又は非存在を検出する方法であって、
（ａ）試料中における該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在又は非存在を特異的に検出するための薬剤と試料とを接触させる工程、及び
（ｂ）該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在又は非存在を検出する工程、
を含む方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法により、試料中における請求項１に記載のポリヌクレオチド又は請求項２に記載のポリペプチドの存在又は非存在を検出するための薬剤であって、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチド、又は、下記（ｄ）に記載の抗体を含む薬剤。
（ａ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
（ｃ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
（ｄ）ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴタンパク質とが融合しているポリペプチドに結合する抗体。
【請求項５】
ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法であって、患者から単離した試料における請求項１に記載のポリヌクレオチド又は請求項２に記載のポリペプチドの存在又は非存在を検出する工程を含み、前記ポリヌクレオチド又は前記ポリペプチドの存在が検出されれば、前記患者における前記ＲＥＴ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定される方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法によりＲＥＴ阻害剤によるがん治療の有効性を判定するための薬剤であって、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチド、又は、下記（ｄ）に記載の抗体を含む薬剤
（ａ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
（ｃ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
（ｄ）ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴタンパク質とが融合しているポリペプチドに結合する抗体。
【請求項７】
がんを治療する方法であって、請求項５に記載の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に、前記ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程を含む方法。
【請求項８】
ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とするがんの治療剤であって、請求項５に記載の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に投与される治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子に関し、より詳しくは、ＣＥＰ５５タンパク質又はその一部と、ＲＥＴタンパク質又はその一部との融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、及び、該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドを検出する方法に関する。また、本発明は、該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドを標的としたＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法に関する。さらに、本発明は、この有効性の判定を利用したがんの治療方法に関する。また、本発明は、これらの方法に用いるための薬剤にも関する。
【背景技術】
【０００２】
胃がんは世界で２番目に死亡者数の多いがんであり、東アジアにおいて患者の多いがんの一つである。内視鏡を始めとする早期診断技術の進歩により、とりわけ日本においてその予後は改善しているが、進行がんや再発症例の治療は依然として難しく、欧米を含む多くの国において、５年生存率は３０％以下である。【０００３】
胃がんは、病理組織学的に大きく腸型（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ−ｔｙｐｅ）とびまん型（ｄｉｆｆｕｓｅ−ｔｙｐｅ）との２つに分類される（Ｌａｕｒｅｎ分類）。後者は、若年者に多く、腹膜播種やリンパ節転移を起こし易く、予後不良のがんである。また、胃がんの治療法として、基本的に外科手術が採用されているが、腹膜播種や他臓器等への転移が生じ易く、再発率の高いびまん型胃がんに対しては、外科手術にて対応することが難しい。さらに、びまん型含め、胃がんに対しては、有効な抗がん剤が開発されておらず、胃がん、特にびまん型胃がんに対しては有効な治療法が確立していないのが現状である。【０００４】
また、胃がんにおいては、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ２、ＭＥＴ、ＥＲＢＢ２、ＭＹＣ遺伝子の増幅やＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＨ１遺伝子の突然変異等が報告されている。そして、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ２、ＥＲＢＢ２等を対象として、現在胃がんに対する様々な分子標的治療の検討が進められている。このように、胃がんを含め、がんにおいて、これらの発生に関与する変異遺伝子（変異タンパク質）や融合遺伝子（融合タンパク質）等のがん遺伝子を同定することは、これら遺伝子を標的とした新規ながん治療方法やがん検査方法の開発に大きく寄与するため、強く望まれている。【０００５】
また、他のがんに関し、ＲＥＴ遺伝子の活性型変異は、家族性及び孤発性の甲状腺がん、一部の大腸がん、褐色細胞腫において生じていることが報告されている。さらに、ＲＥＴ遺伝子は、多発性内分泌腫瘍症候群（ＭＥＮ２Ａ、ＭＥＮ２Ｂ）の原因遺伝子であることも明らかになっている（非特許文献１）。また、甲状腺がんに特徴的なゲノム異常として、ＰＴＣ−ＲＥＴ融合遺伝子が報告されており（非特許文献２）、最近肺がんにおいてもその存在が確認されている（非特許文献３）。さらにまた、肺腺がんにおけるゲノム異常として、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子の存在も明らかになっている（非特許文献３〜５）。【０００６】
また、ＲＥＴに対する低分子阻害剤には、ｖａｎｄａｔｉｎｉｂ、ｍｏｔｅｓａｎｉｂ、ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ、ＸＬ−１８４といったものが知られており、現在そのいくつかについては、抗がん剤としての臨床開発研究が進められている。【０００７】
さらに、かかる阻害剤のがんに対する治療効果を予測するために、前述の変異遺伝子や融合遺伝子を指標として用いることが検討されている。例えば、ＥＧＦＲやＡＬＫタンパク質を標的としたチロシンキナーゼ阻害剤はＥＧＦＲ変異やＡＬＫ融合を持つ肺腺がんの治療に特に有効であることが明らかになっている。さらに、肺がんの４〜５％に存在するＡＬＫチロシンキナーゼ遺伝子の融合を検出する手法がＡＬＫタンパク質のチロシンキナーゼに対する阻害薬適応例の選出法として開発され、臨床試験が進行している。【０００８】
一方、ＣＥＰ５５遺伝子は微小管結合分子であり、細胞分裂において重要な役割を果たすことが明らかになっている（非特許文献６）。また、このタンパク質は、Ｎ末を含め複数のコイルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌ）領域を有し、二量体を形成しうることが推測されている。さらに、ＣＥＰ５５タンパク質は、広くがん細胞で高発現しているが、他方正常組織では発現が低く、精巣のみで高発現している。このように、ＣＥＰ５５タンパク質は、いわゆるｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎとして知られ、がんワクチン療法の標的として検討されている（非特許文献７）。【０００９】
しかしながら、胃がんを含めたがんにおける融合遺伝子等の解明はいまだ十分とはいえず、新規ながん治療方法やがん検査方法の開発に大きく寄与し、さらには薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる融合遺伝子等の同定が望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｋｏｕｖａｒａｋｉ  ＭＡ.ら、Ｔｈｙｒｏｉｄ。２００５年、１５巻、５３１〜５４４ページ
【非特許文献２】Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ  ＹＥ.ら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、２０１１年、７巻、５６９〜５８０ページ
【非特許文献３】Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｋ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．、２０１２年、１８巻、３７８〜３８１ページ
【非特許文献４】Ｋｏｈｎｏ  Ｔ.ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．、２０１２年、１８巻、３７５〜３７７ページ
【非特許文献５】Ｌｉｐｓｏｎ  Ｄ.ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．、２０１２年、１８巻、３８２〜３８４ページ
【非特許文献６】Ｚｈａｏ  ＷＭ.ら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．、２００６年、１７巻、３８８１〜３８９６ページ
【非特許文献７】Ｉｎｏｄａ  Ｓ.ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２００９年、３２巻、４７４〜４８５ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、胃がん等において薬剤による治療の有効性を予測する指標となりうる遺伝子を同定することにある。また、当該遺伝子やその発現産物を標的として薬剤による治療の有効性を予測する新規な方法を提供することにある。さらに、本発明は、当該遺伝子やその発現産物を標的とした薬剤による治療の有効性の予測に基づいて、胃がん等を治療する方法を提供することを目的とする。さらなる本発明の目的は、これら方法において当該遺伝子やその発現産物の検出に用いるための薬剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、１３症例のびまん型胃がんのトランスクリプトームシークエンシングにより、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子とのインフレーム（Ｉｎ−ｆｌａｍｅ）融合転写産物を同定した。したがって、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子（ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合遺伝子）は、ヒト第１０番染色体間の相互転座又はヒト第１０番染色体内の切断及び再結合によって生じることが考えられる。実際、ゲノム融合部位の塩基配列を確認したところ、ヒト第１０番染色体内の切断及び再結合によって生じた融合例が見出された。【００１３】
そこで、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合遺伝子を正常細胞に導入したところ、この細胞は足場非依存性のコロニー形成能を獲得し、すなわちがん化することが確認された。また、かかる細胞においては、ＲＥＴタンパク質キナーゼの活性化が認められ、さらにはその下流シグナルであるＡＫＴ等のリン酸化も亢進していることが明らかになった。【００１４】
また、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合遺伝子を発現している細胞をヌードマウスの皮下に移植したところ、該細胞はｉｎ−ｖｉｖｏにおける造腫瘍能を有していることが確認された。【００１５】
一方、かかるＲＥＴタンパク質キナーゼの活性化、ＡＫＴ等のリン酸化、足場非依存性のコロニー形成能、ｉｎ−ｖｉｖｏにおける造腫瘍能は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤により、若しくはＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドのキナーゼドメインの不活化により顕著に抑制されることも確認された。【００１６】
以上の点に基づき、本発明者らは、びまん型胃がん等において、当該遺伝子融合を標的として薬剤による治療の有効性を予測することが可能であり、さらに、この予測において薬剤による治療が有効であると判定された患者に当該薬剤を投与すれば、効率的に治療を行うことが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１７】
従って、本発明は、ＣＥＰ５５タンパク質又はその一部とＲＥＴタンパク質又はその一部との融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、このポリヌクレオチドやポリペプチドの検出方法、当該ポリヌクレオチドや当該ポリペプチドの存在を指標としたＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法、この有効性の判定を利用したがんの治療方法、並びに、これらの方法に用いるための薬剤に関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
[１]  ＣＥＰ５５タンパク質又はその一部と、ＲＥＴタンパク質又はその一部とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[２]  [１]に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
[３]  試料中における[１]に記載のポリヌクレオチド又は[２]に記載のポリペプチドの存在又は非存在を検出する方法であって、
（ａ）試料中における該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在又は非存在を特異的に検出するための薬剤と試料とを接触させる工程、及び
（ｂ）該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在又は非存在を検出する工程、
を含む方法。
[４]  [３]に記載の方法により、試料中における[１]に記載のポリヌクレオチド又は[２]に記載のポリペプチドの存在又は非存在を検出するための薬剤であって、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチド、又は、下記（ｄ）に記載の抗体を含む薬剤。
（ａ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
（ｃ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
（ｄ）ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴタンパク質とが融合しているポリペプチドに結合する抗体。
[５]  ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法であって、患者から単離した試料における[１]に記載のポリヌクレオチド又は[２]に記載のポリペプチドの存在又は非存在を検出する工程を含み、前記ポリヌクレオチド又は前記ポリペプチドの存在が検出されれば、前記患者における前記ＲＥＴ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定される方法。
[６]  [５]に記載の方法によりＲＥＴ阻害剤によるがん治療の有効性を判定するための薬剤であって、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチド、又は、下記（ｄ）に記載の抗体を含む薬剤
（ａ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
（ｃ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
（ｄ）ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴタンパク質とが融合しているポリペプチドに結合する抗体。
[７]  がんを治療する方法であって、[５]に記載の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に、前記ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程を含む方法。
[８]  ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とするがんの治療剤であって、[５]に記載の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に投与される治療剤。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子やその発現産物を効率的に検出することが可能となる。また、本発明によれば、当該融合遺伝子やその発現産物の検出により、がんに対する治療の有効性を予測すること、特にＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を予測することが可能となる。そして、これにより、薬剤を投与することが有効ではないと考えられるがん患者への薬剤の投与を回避することができるため、効率的ながん治療を実現することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合の態様を示す概略図である。図中左側は、ヒト第１０番染色体間の相互転座によって生じるＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合例を示し、図中右側は、ヒト第１０番染色体内の切断及び再結合によって生じる融合例を示す。
【図２】ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合を示す概略図である。すなわち、ＣＥＰ５５タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含むＣ末端部分とが融合していることを示す概略図である。また、ＣＥＰ５５遺伝子のエクソン２と、ＲＥＴ遺伝子のエクソン１４とに、ハイブリダイズするＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーを利用することにより、ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出することができることを示す概略図である。
【図３】ＩＳＨ法により本発明の融合遺伝子を検出する方法を示す概略図である。すなわち、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合遺伝子については、ＣＥＰ５５遺伝子５’側及びＲＥＴ遺伝子の３’側にそれぞれＩＳＨ用プローブを設計することで、ヒト第１０番染色体間の相互転座によって生じるＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合遺伝子の存在を検出できることを示す概略図である。図中、黒丸は、ＣＥＰ５５遺伝子５’側にハイブリダイズするプローブを示し、白丸は、ＲＥＴ遺伝子の３’側にハイブリダイズするプローブを示す（プローブの表記に関し、図４においても同じ）。
【図４】ＩＳＨ法により本発明の融合遺伝子を検出する方法を示す概略図である。すなわち、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合遺伝子については、ＣＥＰ５５遺伝子５’側及びＲＥＴ遺伝子の３’側にそれぞれＩＳＨ用プローブを設計することで、ヒト第１０番染色体内の切断及び再結合によって生じるＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合遺伝子の存在を検出できることを示す概略図である。
【図５】野性型又は変異型のＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現するマウス正常繊維芽細胞株をソフトアガー培地に播種し、これら細胞株の足場非依存性コロニー形成を顕微鏡下にて観察した結果を示す写真である。図中、「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ」は野生型のＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示し、「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ−ＫＤ」は変異型のＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示し、「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ」は野生型のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示し、「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ−ＫＤ」は変異型のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示す。また、各バーは１００μｍであることを示す。
【図６】ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤（Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ又はＸＬ１８４）を添加したソフトアガー培地に、野性型のＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現するマウス正常繊維芽細胞株を播種し、これら細胞株の足場非依存性コロニー形成能を解析した結果を示すグラフである。図中、「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ」は野生型のＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示し、「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ」は野生型のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示す。「ＶＤ」はＶａｎｄｅｔａｎｉｂ存在下（培地中のＶａｎｄｅｔａｎｉｂの濃度：０．２μＭ）におけるコロニー形成の結果を示し、「ＸＬ」はＸＬ１８４存在下（培地中のＸＬ１８４の濃度：０．２μＭ）におけるコロニー形成の結果を示し、「非添加」はＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤非存在下におけるコロニー形成の結果を示す。また縦軸は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤非存在下において、野性型の各ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株が形成したコロニーの数を１００とした際の相対値を示す。
【図７】ＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現するマウス正常繊維芽細胞株に血清飢餓処理を各々施した後、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤（Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ又はＸＬ１８４）の存在下にて培養し、これら細胞における各種タンパク質のリン酸化を、ウエスタンブロッティングにより解析した結果を示す写真である。図中、「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ」はＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示し、「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ」はＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株の結果を示す。「Ｗ」が付記されているレーンは、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤非存在下における野生型ＲＥＴ融合ポリペプチド発現細胞株の培養の結果を示し、「Ｖ」が付記されているレーンは、Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ存在下（培地中のＶａｎｄｅｔａｎｉｂの濃度：１μＭ）における野生型ＲＥＴ融合ポリペプチド発現細胞株の培養の結果を示し、「Ｘ」が付記されているレーンは、ＸＬ１８４存在下（培地中のＸＬ１８４の濃度：１μＭ）における野生型ＲＥＴ融合ポリペプチド発現細胞株の培養の結果を示し、「ＫＤ」が付記されているレーンは、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤非存在下における変異型ＲＥＴ融合ポリペプチド発現細胞株の培養の結果を示す。また、各融合ポリペプチドはＦＬＡＧタグを更に結合させ、細胞内にて発現させているため、図中「ＦＬＡＧ  ｔａｇ」は、該タグを通して各融合ポリペプチドを検出した結果を示す。「ｐ−ＲＥＴ（Ｙ１０６２）」は、リン酸化されたＲＥＴを検出した結果を示す。「ＳＴＡＴ３」及び「ｐ−ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）」は、ＳＴＡＴ３及びリン酸化ＳＴＡＴ３を検出した結果を各々示す。「ＡＫＴ」及び「ｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）」は、ＡＫＴ及びリン酸化ＡＫＴを検出した結果を各々示す。「ＭＡＰＫ」及び「ｐ−ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）」は、ＭＡＰＫ及びリン酸化ＭＡＰＫを検出した結果を各々示す。「β−ａｃｔｉｎ」は、内部標準として各レーンにおけるタンパク質量が揃っていることを示す。
【図８】ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現しているマウス正常繊維芽細胞株を、免疫不全マウスの皮下に移植した結果を示す写真である。図中、「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ」は、野生型のＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株を免疫不全マウスの皮下に移植し、その１８日後の該マウスを観察した写真である。「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ」は、野生型のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株を免疫不全マウスの皮下に移植し、その１８日後の該マウスを観察した写真である。三角は形成された腫瘍を示し、「８／８」は当該細胞を４匹のマウスに２箇所ずつ計８箇所に移植し、その８箇所全てにおいて腫瘍の形成が認められたことを示す。「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ−ＫＤ」は、変異型のＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現している細胞株を免疫不全マウスの皮下に移植し、その１８日後の該マウスを観察した写真である。「０／６」は当該細胞を３匹のマウスに２箇所ずつ計６箇所に移植し、その６箇所全ておいて腫瘍の形成が認められなかったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
＜ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド＞
後述の実施例において示す通り、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合例が本発明において初めて明らかになった。したがって、本発明は、ＣＥＰ５５タンパク質又はその一部と、ＲＥＴタンパク質又はその一部との融合ポリペプチド（以下、「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチド」とも称する）をコードするポリヌクレオチド（以下、「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド」とも称する）を提供する。
【００２１】
本発明の「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチド」とは、ＣＥＰ５５タンパク質の全長又はその一部と、ＲＥＴタンパク質の全長又はその一部とが融合しているポリペプチドを意味する。また、本発明の「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド」とは、ＣＥＰ５５タンパク質の全長又はその一部をコードするポリヌクレオチドと、ＲＥＴタンパク質の全長又はその一部をコードするポリヌクレオチドとが融合しているポリヌクレオチドを意味する。
【００２２】
本発明にかかる「ＣＥＰ５５タンパク質（中心体タンパク質５５ＫＤａ）」は、ヒトにおいては１０番染色体長腕部（１０ｑ２３．３）に座乗している遺伝子にコードされているタンパク質である。本発明において、「ＣＥＰ５５タンパク質」は、ヒト由来のものであれば、典型的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。また、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、典型的には配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２３】
本発明にかかる「ＲＥＴ（トランスフェクション中の再構成、ＲＥＡＲＲＡＮＧＥＤ  ＤＵＲＩＮＧ  ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＯＮ）タンパク質」は、ＲＥＴチロシンキナーゼタンパク質又はＲＥＴ受容体型チロシンキナーゼタンパク質とも称され、ヒトにおいて１０ｑ１１．２に座乗している遺伝子にコードされているタンパク質である。本発明において、「ＲＥＴタンパク質」は、ヒト由来のものであれば、典型的には、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＲＥＴ５１、ＲＥＴアイソフォームａ）及び配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＲＥＴ９、ＲＥＴアイソフォームｃ）が挙げられる。また、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、典型的には各々、配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＲＥＴ転写産物変異体２）及び配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＲＥＴ転写産物変異体４）である。なお、図２に示す通り、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＲＥＴ５１）と配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＲＥＴ９）とは、１位のメチオニン残基から１０６３位のグリシン残基まではアミノ酸配列が一致しているが、Ｃ末端部分の配列及び長さが相違する。
【００２４】
ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドは、典型的には、ＣＥＰ５５タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００２５】
本発明において、「ＣＥＰ５５タンパク質のＮ末端部分」とは、典型的には、前記ＣＥＰ５５タンパク質の１位のメチオニン残基〜１５３位のグルタミン残基からなる領域を含むものである。また、「ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分」とは、典型的には、前記ＲＥＴタンパク質のチロシンキナーゼドメインを含むものである（図２参照）。
【００２６】
本発明の「ＣＥＰ５５タンパク質のＮ末端部分と、ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」としては、典型的には、図１〜４において示す通り、ヒト第１０番染色体間の相互転座又は１０番染色体内の切断及び再結合によって生じるものである。より具体的には、前記ＣＥＰ５５タンパク質のうち、エクソン１〜３によりコードされるポリペプチド領域と前記ＲＥＴタンパク質のうち、エクソン１２〜１９ｂ又はエクソン１２〜２０によりコードされるポリペプチド領域とが融合しているポリペプチド（例えば、配列番号：８又は１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドは、例えば、配列番号：７又は９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２７】
本発明にかかる「ＣＥＰ５５タンパク質」及び「ＲＥＴタンパク質」のアミノ酸配列、並びにこれらタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。従って、「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチド」のアミノ酸配列及び「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド」の塩基配列も、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。また、これらアミノ酸配列や塩基配列は、人工的に改変することもできる。本発明には、このような変異体も含まれる。
【００２８】
ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドの変異体の一態様としては、配列番号：８又は１０に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００２９】
ここで「複数」とは、通常５０アミノ酸以内、好ましくは３０アミノ酸以内、より好ましくは１０アミノ酸以内、特に好ましくは数個のアミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
【００３０】
ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドの変異体の他の態様としては、配列番号：７又は９に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードするポリペプチドが挙げられる。
【００３１】
ここで高ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、０．２ｘＳＳＣ、６５℃という条件が挙げられ、低ストリンジェンシーなハイブリダイズの条件として、例えば、２．０ｘＳＳＣ、５０℃という条件が挙げられる。
【００３２】
ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドの変異体のさらなる他の態様としては、配列番号：８に記載のアミノ酸配列と８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
【００３３】
ここで配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＸ又はＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４−２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【００３４】
ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの変異体としては、上記ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチド及びアミノ酸の変異を伴なわない縮重変異体をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３５】
本発明の「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド」の形態には、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等が含まれる。「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド」は、当業者であれば、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子を保持するびまん型胃がん等から調製したｃＤＮＡのライブラリー又はゲノムＤＮＡのライブラリーから、公知のハイブリダイゼーション技術を利用して単離することができる。また、前記びまん型胃がん等から調製したｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを鋳型として公知の遺伝子増幅技術（ＰＣＲ)を利用することにより増幅し、調製することもできる。
【００３６】
さらに、このようにして調製したポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを無細胞タンパク質合成系（例えば、網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液）に導入してインキュベーションすることにより、また該ベクターを適当な細胞（例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞）に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドを調製することができる。
【００３７】
なお、上記の通り、本発明の「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチド」及び「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド」は、広義には、天然型の配列を有するもの（自然界において変異が生じたものも含む）及び人工的に配列が改変されたものの双方を含む。しかしながら、、特に、後述する検出の対象としての「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチド」及び「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド」を指す場合には、主として、天然型の配列を有するもの（自然界において変異が生じたものも含む）を意味することに留意されたい。
【００３８】
＜ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチド又はＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在又は非存在の検出方法＞
本発明は、また、試料中におけるＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド又はＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドの存在又は非存在を検出する方法を提供する。本発明の検出方法は、（ａ）試料中における該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在又は非存在を特異的に検出するための薬剤と試料とを接触させる工程、及び（ｂ）該ポリヌクレオチド又は該ポリペプチドの存在又は非存在を検出する工程、を含む。
【００３９】
本発明において「試料」とは、生体試料（例えば、細胞、組織、臓器、体液（血液、リンパ液等）、消化液、喀痰、肺胞・気管支洗浄液、尿、便）のみならず、これらの生体試料から得られる核酸抽出物（ゲノムＤＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物から調製されたｃＤＮＡ調製物やｃＲＮＡ調製物等）やタンパク質抽出物も含む。また、前記試料は、ホルマリン固定処理、アルコール固定処理、凍結処理又はパラフィン包埋処理が施してあるものでもよい。
【００４０】
さらに、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はタンパク質は、当業者であれば、前記試料の種類及び状態等を考慮し、それに適した公知の手法を選択して調製することが可能である。
【００４１】
本発明において「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド又はＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドの存在又は非存在の検出」は、前記融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ、前記ゲノムＤＮＡからの転写産物、前記転写産物からの翻訳産物を対象として行うことができる。
【００４２】
また、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡは、ヒト第１０番染色体間の相互転座又は１０番染色体内の切断及び再結合によって形成されるものであるから、「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在又は非存在の検出」においては、この相互転座という現象を検出してもよい（図１及び３参照のこと）。かかる相互転座の検出においては、例えば、ＣＥＰ５５遺伝子のエクソン３のコード領域及び該コード領域よりも５’側の上流領域と、ＣＥＰ５５遺伝子のエクソン４のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域との分離を検出してもよく、また、ＲＥＴ遺伝子のエクソン１１のコード領域及び該コード領域よりも５’側の上流領域と、ＲＥＴ遺伝子のエクソン１２のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域との分離を検出してもよい。
【００４３】
本発明における「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在又は非存在の検出」には、公知の手法を用いることができる。「前記融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ」を対象とする場合においては、例えば、蛍光等を用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ゲノムＰＣＲ法、ダイレクトシークエンシング、サザンブロッティング、ゲノムマイクロアレイ解析を用いることができる。また、「前記ゲノムＤＮＡからの転写産物」を対象とする場合においては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ダイレクトシークエンシング、ノーザンブロッティング、ドットブロット法、ｃＤＮＡマイクロアレイ解析を用いることができる。
【００４４】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいては、前記生体試料に、少なくとも１５塩基の鎖長を有する下記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを接触させることにより、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出することができる。
（ａ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド。
【００４５】
ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの検出において、本発明にかかるＣＥＰ５５−ＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヒト由来のものであれば、典型的にはＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＣ＿００００１０．１０で特定されるゲノムの配列のうち９５２５６３６９〜９５２８８８４９番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子（ＣＥＰ５５遺伝子）である。
【００４６】
また、本発明にかかるＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヒト由来のものであれば、典型的にはＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＣ＿００００１０．１０で特定されるゲノムの配列のうち４３５７２５１７〜４３６２５７９９番目のＤＮＡ配列からなる遺伝子（ＲＥＴ遺伝子）である。
【００４７】
しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異等により、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。従って、このような天然の変異体も本発明の対象になりうる（以下、同様）。
【００４８】
本発明の（ａ）に記載のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、前記生体試料におけるＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出できるものであればよいが、好ましくは、下記（ａ１）〜（ａ３）に記載のポリヌクレオチドである。
（ａ１）  ＣＥＰ５５遺伝子のエクソン３のコード領域及び該コード領域よりも５’側の上流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「５’ＣＥＰ５５プローブ」とも称する）と、ＲＥＴ遺伝子のエクソン１２のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「３’ＲＥＴプローブ」とも称する）との組み合わせ
（ａ２）  ５’ＣＥＰ５５プローブと、ＣＥＰ５５遺伝子のエクソン４のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「３’ＣＥＰ５５プローブ」とも称する）との組み合わせ
（ａ３）  ＲＥＴ遺伝子のエクソン１１のコード領域及び該コード領域よりも５’側の上流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「５’ＲＥＴプローブ」とも称する）と、３’ＲＥＴプローブとの組み合わせ。
【００４９】
本発明において、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ１）に記載のポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域（標的塩基配列）としては、標的塩基配列に対する特異性及び検出の感度の観点から、ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点から１００００００塩基以内の領域であることが好ましく、また、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ２）又は（ａ３）に記載のポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域としては、同観点から、ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチド又はＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおける切断点から１００００００塩基以内の領域であることが好ましい。
【００５０】
また、本発明において、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる前記（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの標的塩基配列である、ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズすることにより、前記生体試料におけるＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの存在を検出できるものであればよいが、典型例としては、配列番号：７又は９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドをコードするゲノムＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチド、例えば、ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
【００５１】
また、本発明において、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、標的塩基配列に対する特異性及び検出の感度をより向上させるという観点から、前記標的塩基配列全体をカバーすることのできる、複数種のポリヌクレオチドからなる集団であることが好ましい。かかる場合、該集団を構成するポリヌクレオチドの長さは少なくとも１５塩基であるが、１００〜１０００塩基であることが好ましい。
【００５２】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いられる前記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドは、検出のため、蛍光色素等によって標識されていることが好ましい。かかる蛍光色素としては、例えば、ＤＥＡＣ、ＦＩＴＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５が挙げられるが、これらに制限されない。また、蛍光色素以外にＤＡＢ等の色素（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）や酵素的金属沈着に基づく銀等によって、前記ポリヌクレオチドを標識してもよい。
【００５３】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するプローブとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するプローブとは互いに異なる色素にて標識されていることが好ましい。異なる色素にて標識した上記（ａ１）のプローブの組み合わせを用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、各プローブの標識が発するシグナルの重なりが観察された場合、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出できたと判定することができる（図３及び４  参照）。一方、異なる色素にて標識した上記（ａ２）及び（ａ３）のいずれかのプローブの組み合わせを用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、各プローブの標識が発するシグナルの分離が観察された場合、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出できたと判定することができる。
【００５４】
なお、ポリヌクレオチドの標識は、公知の手法により行うことができる。例えば、ニックトランスレーション法やランダムプライム法により、蛍光色素等によって標識された基質塩基をポリヌクレオチドに取り込ませ、該ポリヌクレオチドを標識することができる。
【００５５】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、前記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドと前記生体試料とを接触させる際の条件は、当該ポリヌクレオチドの長さ等の諸要因により変動し得るが、高ストリンジェンシーな条件として、例えば、０．２ｘＳＳＣ、６５℃という条件が挙げられ、低ストリンジェンシーな条件として、例えば、２．０ｘＳＳＣ、５０℃という条件が挙げられる。なお、当業者であれば、塩濃度（ＳＳＣの希釈率等）と温度の他、例えば、界面活性剤（ＮＰ−４０等）の濃度、ホルムアミドの濃度、ｐＨ等の諸条件を適宜選択することで、前記条件と同様のストリンジェントな条件を実現することができる。
【００５６】
前記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを用いて、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出する方法としては、前記ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション以外に、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング及びドットブロッティングが挙げられる。これら方法においては、前記生体試料から得られる核酸抽出物を転写したメンブレンに、前記（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、前記融合遺伝子を検出する。前記（ａ）のポリヌクレオチドを用いた場合、ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドとが、メンブレンにおいて展開された同一のバンドを認識した場合に、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出することができたと判定することができる。
【００５７】
前記（ｂ）のポリヌクレオチドを用いてＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡを検出する方法としては、さらに、ゲノムマイクロアレイ解析やＤＮＡマイクロアレイ解析が挙げられる。これら方法においては、前記（ｂ）のポリヌクレオチドを基板に固定したアレイを作製し、当該アレイ上のポリヌクレオチドに前記生体試料を接触させることにより、当該ゲノムＤＮＡを検出する。
【００５８】
ＰＣＲやシークエンシングにおいては、前記生体試料から調製したＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）やＲＮＡを鋳型としてＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの一部又は全部を特異的に増幅するために、下記（ｃ）のポリヌクレオチドを用いることができる。
（ｃ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド。
【００５９】
「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」は、標的となる前記融合ポリヌクレオチド等において、片方のプライマーがＣＥＰ５５遺伝子領域にハイブリダイズし、他方のプライマーがＲＥＴ遺伝子領域にハイブリダイズするプライマーセットである。これらポリヌクレオチドの長さは、通常１５〜１００塩基であり、好ましくは１７〜３０塩基である。
【００６０】
また、本発明の（ｃ）に記載のポリヌクレオチドは、ＰＣＲ法による検出の精度や感度の観点から、ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点から５０００塩基内の前記融合ポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な配列であることが好ましい。
【００６１】
「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」は、標的となるＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド等の塩基配列に基づき、公知の手法により適宜設計することができる。公知の手法としては、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ソフトウェア（登録商標、ＡＢＩ社製）を利用する方法が挙げられる。
【００６２】
「一対のプライマーであるポリヌクレオチド」の好適な例としては、好ましくは、下記（ｃ１）に記載のポリヌクレオチドである。
（ｃ１）  ＣＥＰ５５遺伝子のエクソン３のコード領域及び該コード領域よりも５’側の上流領域にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「５’ＣＥＰ５５プライマー」とも称する）と、ＲＥＴ遺伝子のエクソン１２のコード領域及び該コード領域よりも３’側の下流領域の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「３’ＲＥＴプライマー」とも称する）との組み合わせ。
【００６３】
例えば、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの検出においては、ＣＥＰ５５遺伝子の開始コドンを含むエクソン２、ＲＥＴ遺伝子のキナーゼ領域内にあるエクソン１４に対してプライマーを設計することで、ＲＥＴタンパク質のチロシンキナーゼ領域を含む全てのバリアントと、ＣＥＰ５５遺伝子との融合遺伝子が検出できる（図２参照）。
【００６４】
本発明において、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの翻訳産物を検出する方法としては、例えば、免疫染色法、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法、免疫沈降法、抗体アレイ解析が挙げられる。これら方法においては、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドに結合する抗体が用いられる。かかる抗体としては、例えば、ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴタンパク質との融合点を含むポリペプチドに特異的な抗体（以下、「融合点特異的抗体」とも称する）、ＣＥＰ５５タンパク質の前記融合点よりＮ末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体（以下、「ＣＥＰ５５−Ｎ末抗体」とも称する）、ＲＥＴタンパク質の前記融合点よりＣ末端側の領域からなるポリペプチドに結合する抗体（以下、「ＲＥＴタンパク質−Ｃ末抗体」とも称する）が挙げられる。ここで、「融合点特異的抗体」とは、前記融合点を含むポリペプチドに特異的に結合するが、野生型（正常型）のＣＥＰ５５タンパク質及び野生型（正常型）のＲＥＴタンパク質のいずれにも結合しない抗体を意味する。
【００６５】
ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドは、前記融合点特異的抗体により、また、前記ＣＥＰ５５−Ｎ末抗体と前記ＲＥＴタンパク質−Ｃ末抗体との組み合わせにより検出することができる。
【００６６】
「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドに結合する抗体」は、当業者であれば適宜公知の手法を選択して調製することができる。かかる公知の手法としては、前記ＲＥＴタンパク質のＣ末端部分からなるポリペプチド、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチド、前記ＣＥＰ５５タンパク質のＮ末端部分からなるポリペプチド等を免疫動物に接種し、該動物の免疫系を活性化させた後、該動物の血清（ポリクローナル抗体）を回収する方法や、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法等のモノクローナル抗体の作製方法が挙げられる。標識物質を結合させた抗体を用いれば、当該標識を検出することにより、標的蛋白質を直接検出することが可能である。標識物質としては、抗体に結合することができ、検出可能なものであれば特に制限されることはなく、例えば、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、アルカリホスファターゼ、ビオチン及び放射性物質が挙げられる。さらに、標識物質を結合させた抗体を用いて標的蛋白質を直接検出する方法以外に、標識物質を結合させた二次抗体、プロテインＧ又はプロテインＡ等を用いて標的蛋白質を間接的に検出する方法を利用することもできる。
【００６７】
＜ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法＞
後述の実施例において示す通り、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合は、ＲＥＴタンパク質の活性化をもたらし、がんの悪性化等に寄与してと考えられる。そのため、このような融合が検出されるがん患者においては、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤による治療が有効である蓋然性が高い。
【００６８】
従って、本発明は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定する方法であって、患者から単離した試料におけるＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド又はＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドの存在又は非存在を検出する工程を含み、前記ポリヌクレオチド又は前記ポリペプチドの存在が検出されれば、前記患者における前記ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定される方法を提供する。
【００６９】
本発明において「患者」とは、がんに罹患しているヒトのみならず、がんに罹患していると疑いのあるヒトであってもよい。本発明の方法を適用する対象となる「がん」としては、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合遺伝子の発現が認められるがんであれば特に制限はない。好ましくはびまん型胃がんである。患者からの生体試料の採取は、生体試料の種類に応じて公知の手法により行うことができる。
【００７０】
本発明においてがん治療の有効性を評価する対象となる「ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤」としては、ＲＥＴタンパク質の機能を直接的に又は間接的に抑制できる物質であれば特に制限はない。本発明に適用し得る公知のＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤としては、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（一般名：バンデタニブ（Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ）；ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ及びＲＥＴを標的とする化合物）、４−［４−［３−［４−クロロ‐３−（トリフルオロメチル）フェニル］ウレイド］フェノキシ］−Ｎ−メチルピリジン−２−カルボアミド（一般名：ソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）；ＢＲＡＦ及びＲＥＴ等を標的とする化合物）、Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−５−［（Ｚ）−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボキシアミド  モノ［（２Ｓ）−２−ヒドロキシサクシネート］（一般名：スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）；ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＲＥＴ等を標的とする化合物）、Ｎ−（３，３−ジメチルインドリン−６−イル）−２−（ピリジン−４−イルメチルアミノ）ニコチンアミド（一般名：モテサニブ（Ｍｏｔｅｓａｎｉｂ）；ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＲＥＴ等を標的とする化合物）、Ｎ−（４−（６，７−ジメトキシキノリン−４−イルオキシ）フェニル）−Ｎ−（４−フルオロフェニル）シクロプロパン−１，１−ジカルボキシアミド（一般名；ＸＬ１８４／カボザンチニブ（Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）；ＭＥＴ、ＲＥＴ等を標的とする化合物）が挙げられる。
【００７１】
「試料」の定義、試料からのＤＮＡやＲＮＡ等の抽出方法、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド及びＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドの存在又は非存在の検出の手法等は、上記の通りである。
【００７２】
本発明の方法により、患者から単離した試料において、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド又はＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドの存在が検出された場合、当該患者は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定され、一方、当該ポリヌクレオチド又は当該ポリペプチドの存在が検出されなかった場合は、当該患者は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が低いと判定される。
【００７３】
＜ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド又はＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドの存在又は非存在を検出するための薬剤、並びにＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を判定するための薬剤＞
上記の通り、少なくとも１５塩基の鎖長を有する、下記（ａ）〜（ｃ）に記載のいずれかであるポリヌクレオチドは、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの存在又は非存在の検出に好適に用いることができる。従って、また、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性の判定にも好適に用いることができる。
（ａ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及びＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブからなる群から選択される少なくとも一つのプローブであるポリヌクレオチド
（ｂ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点にハイブリダイズするプローブであるポリヌクレオチド
（ｃ）ＣＥＰ５５タンパク質をコードするポリヌクレオチドとＲＥＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合点を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド。
【００７４】
これらポリヌクレオチドは、標的遺伝子の特定の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。ここで「相補的」とは、ハイブリダイズする限り、完全に相補的でなくともよい。これらポリヌクレオチドは、該特定の塩基配列に対して、通常、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは１００％の相同性を有する。
【００７５】
なお、（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、またその一部又は全部において、ＰＮＡ（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ペプチド核酸）、ＬＮＡ（登録商標、ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ、架橋化核酸）、ＥＮＡ（登録商標、２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ＧＮＡ（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、グリセロール核酸）、ＴＮＡ（Ｔｈｒｅｏｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、トレオ―ス核酸）等の人工核酸によって、ヌクレオチドが置換されているものであってもよい。
【００７６】
また、上記の通り、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドに結合する抗体は、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドの翻訳産物（ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチド）の検出に好適に用いることができる。
【００７７】
本発明の薬剤においては、有効成分としての前記物質（ポリヌクレオチド、抗体）に加え、薬理学上許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、防腐剤、生理食塩等が挙げられる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
【００７８】
また、ポリヌクレオチドや抗体を含む標品に加えて、ポリヌクレオチドや抗体に付加した標識の検出に必要な基質、陽性対照（例えば、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチド、又はこれらを保持する細胞等）や陰性対照、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等において用いられる対比染色用試薬（ＤＡＰＩ等）、抗体の検出に必要な分子（例えば、二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡ）、試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等の標品を組み合わせ、本発明の方法に用いるためのキットとすることもできる。当該キットには、当該キットの使用説明書を含めることができる。本発明は、上記本発明の方法に用いるためのキットをも提供するものである。
【００７９】
＜がんを治療する方法、がんの治療剤＞
上記の通り、本発明の方法によりＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチド又はＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドの存在を検出された患者は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと考えられる。このため、がん患者のうち、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合遺伝子を保持する患者に選択的に、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を投与することにより、効率的にがんの治療を行うことが可能である。従って、本発明は、がんを治療する方法であって、上記本発明の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に、前記ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を投与する工程を含む方法を提供するものである。
【００８０】
また、本発明は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とするがんの治療剤であって、上記本発明の方法によりＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性が高いと判定された患者に投与される治療剤を提供するものである。
【００８１】
「ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤」としては、上記の通り、ＲＥＴタンパク質の機能を直接的に又は間接的に抑制できる物質であれば特に制限はない。本発明に適用し得る公知のＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤の例としては、前述の通りである。
【００８２】
患者へのＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤の投与方法は、当該阻害剤の種類やがんの種類等に応じて適宜選択されるが、例えば、経口、静脈内、腹腔内、経皮、筋肉内、気管内（エアゾール）、直腸内、膣内等の投与形態を採用することができる。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない
＜実験材料＞
びまん型胃がん手術切除凍結標本１３症例を研究対象とした。また、陰性対照として、正常胃粘膜組織を用いた。【００８４】
＜ＲＮＡ抽出＞
液体窒素内にて凍結保存されていた腫瘍組織を、クライオプレップ（製品名：ＣＰ０２、コバリス社製）にて粉砕した。次いで、粉砕された腫瘍組織から、トータルＲＮＡ精製用キット（製品名：ＲＮＡｅａｓｙ、キアゲン社製）を用いて、トータルＲＮＡを抽出した。【００８５】
＜ＲＮＡシークエンス＞
前記にて調製したトータルＲＮＡ２μｇを用いて、ｍＲＮＡｓｅｑサンプル調製キット（イルミナ社製）により、ライブラリーの合成を行なった。すなわち、先ず２μｇのトータルＲＮＡを９４℃にて５分間処理し、断片化した後、ｃＤＮＡ合成を行なった。次いで、得られたｃＤＮＡの両端にシークエンス用のアダプターを結合し、その後アガロースゲルに泳動、精製した。そして、精製したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、３００塩基長のライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡライブラリーを高速シークエンサー（ＧＡ２Ｘ、イルミナ社製）を用いて、その両端５０ｂｐをシークエンス解読した。【００８６】
＜シークエンス情報の解析＞
得られた配列情報からＰＣＲによる重複クローンを除外した後、Ｂｏｗｔｉｅソフトを用いて既知のデータベース（Ｒｅｆｓｅｑ及びＥｎｓｅｍｂｌｅ）にマッピングし、両端の配列が、異なる遺伝子由来の配列であるものを抽出した（非特許文献４  参照）。【００８７】
＜ＲＴ−ＰＣＲ及びサンガー法による確認＞
ＲＮＡシークエンスに用いた同じトータルＲＮＡから、新たに逆転写酵素（スーパースクリプトIIIファースト（１ｓｔ）−ストランド合成システム、インビトロゲン社製）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。得られた配列を元にＰＣＲプライマーを合成し、ＥｘＴａｑ  ＨＳ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＰＣＲを行い、その後、電気泳動にてＰＣＲ産物を確認した。さらに、ＰＣＲ産物をアガロースゲルから抽出し、同プライマー、ビッグダイターミネーターｖ３．１サイクルシークエンシングキット（アプライドバイオシステム社製）及びＡＢＩ  ３７３０シークエンサーを用いて、サンガー法によりシークエンシング解析を行った。そして、得られた結果から、融合遺伝子の融合点と読み枠とを確認した。【００８８】
転写反応及びＰＣＲ反応の条件は以下の通りである。【００８９】
＜逆転写反応＞
先ず、前記トータルＲＮＡ５μｇ（８μＬ）に、ランダムヘキサマーズプライマー（５０ｎｇ／μＬ）１μＬと、１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス１μＬとを混ぜ、６５℃にて５分間反応し、氷上にて急冷した。次いで、１０×ＲＴバッファー２μＬと、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２４μＬと、０．１Ｍ  ＤＴＴ２μＬと，ＲＮａｓｅＯＵＴ（４０Ｕ／μＬ）１μＬと、スーパースクリプトIIIＲＴ（２００Ｕ／μＬ）１μＬとを順番に添加した。そして、２５℃にて１０分間、５０℃にて５０分間、８５℃にて５分間、４℃にて５分間という条件にて、逆転写反応を行った。次いで、得られた逆転写産物に、ＲＮａｓｅＨ  １μＬを添加し、３７℃にて２０分間かけ、トータルＲＮＡを消化した後、使用するまで、−２０℃にて保存した。【００９０】
＜ＰＣＲ反応＞
前記にて調製した１ｓｔストランドｃＤＮＡ２μＬと、１０×ＥｘＴａｑバッファー１μＬと、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ１．２μＬと、Ｈ２Ｏ４．７μＬと、ＥｘＴａｑ  ＨＳ  ０．１μＬと、２μＭ  ＣＦ／ＣＲミックスプライマー  １μＬとを混合し、先ず、９５℃にて３分間、次いで、９４℃にて３０秒間、５８℃にて３０秒間及び７２℃にて３０秒間という反応サイクルを３５サイクル繰り返した後、７２℃にて５分間反応した。【００９１】
（実施例１）
［ＲＮＡシークエンスによる新規キナーゼ融合遺伝子の同定］
１３症例のびまん型胃がん臨床検体から、ＰＣＲによる重複クローンを除外した上で、各々８．０ｘ１０７以上のペア塩基配列が得られた。それらを既存の遺伝子データベースに参照した結果、図２に示す通り、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子候補（ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴ９タンパク質とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴ５１タンパク質とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、以下「ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合遺伝子」とも称する）を１例において検出した。【００９２】
［ＲＴ−ＰＣＲ及びサンガーシークエンスによる確認］
次に、同一検体を用いてＲＴ−ＰＣＲとサンガーシークエンスによる融合遺伝子の検証を行なった。その結果、ＲＴ−ＰＣＲにて、前記融合遺伝子について、症例特異的な増幅、すなわち、びまん型胃がんのみにおいて前記融合遺伝子が発現しており、正常胃粘膜組織においては、前記融合遺伝子が発現していないことが明らかになった。【００９３】
さらに、得られたＰＣＲ産物をシークエンス解析することによって、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子においては、図２及び配列番号：７及び９に示す通り、ＣＥＰ５５のエクソン３（配列番号：１、７又は９の４８８〜７６３位に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド）と、ＲＥＴ遺伝子のエクソン１２（配列番号：３又は５の２３２７〜２４７４位に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド）とが直接結合することにより、これら遺伝子の読み枠にずれが生じることなく融合していることが明らかになった。【００９４】
従って、以上の結果から、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子とは、同じ１０番染色体に同じ方向で存在することから、びまん型胃がん等のがん細胞特異的に、１０番染色体間の相互転座（図１左側  参照）又は１０番染色体内の切断及び再結合（図１右側  参照）により、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合が生じていることが示唆された。実際、未分化胃がん患者由来のがん組織より得たゲノムＤＮＡの融合部位の塩基配列解析より、該患者がん組織においては１０番染色体内の切断及び再結合により、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合が生じていることが見出された。【００９５】
（実施例２）
［ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドの機能、並びに該ポリペプチドを発現しているがん細胞に対するＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤の有効性についての解析］
前述の遺伝子融合は、ＲＥＴタンパク質の活性化をもたらすものと考えられ、さらには該活性化によりその下流のシグナルも活性化され、細胞ががん化することが考えられる。したがって、このような活性化が生じている患者に対し、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤が治療において有効性を示すものと考えられる。そこで、これらの点について確認すべく、以下に示す通り、適宜定法に従い、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合遺伝子について解析を行った。【００９６】
先ず、未分化胃がん患者由来のがん組織より得たＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合遺伝子（ＣＥＰ５５タンパク質とＲＥＴ５１タンパク質とが融合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）のｃＤＮＡの５’側に、ＦＬＡＧエピトープタグをコードするｃＤＮＡを翻訳の読み枠を合わせて連結し、ｐＭＸｓレトロウイルスベクターにクローニングした。【００９７】
また、このベクターに部位特異的な変異を導入し、ＲＥＴキナーゼ部位内の１アミノ酸を置換したキナーゼ活性変異体（ＫＤ変異型ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチド：Ｋ７５８Ｍ）をコードするベクターも作製した。【００９８】
次に、このように調製して得られたレトロウイルスベクターを、マウス正常繊維芽細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３細胞に各々感染させ、野性型又は変異型のＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現する細胞株を得た。【００９９】
また、肺腺がんにおいて検出されるＲＥＴ融合遺伝子（ＫＩＦ５Ｂ遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合遺伝子、以下「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子」とも称する）についても、前記同様に該遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを作製した。さらに、前記同様にＲＥＴキナーゼ部位内のリジンをメチオニンに置換したキナーゼ活性変異体をコードするレトロウイルスベクターも作製した。さらに、これらレトロウイルスベクターをＮＩＨ−３Ｔ３細胞に各々感染させ、野性型又は変異型のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現する細胞株を調製した。そして、この細胞株を対照群として以下に示す実験に供した。【０１００】
なお、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子については、Ｋｏｈｎｏ  Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１２年２月１２日オンライン公開、１８巻、３号、３７５〜３７７ページ  参照。また、本実施例において対照として用いたＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子は、該文献に記載の「ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ  ｆｕｓｉｏｎ  ｖａｒｉａｎｔ  １」である。【０１０１】
また、本明細書において、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合遺伝子及びＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合遺伝子（又はＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチド及びＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチド）を「ＲＥＴ融合遺伝子（又はＲＥＴ融合ポリペプチド）」とも総称する。【０１０２】
野性型又は変異型のＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現する前記細胞株をソフトアガー培地（培地中のアガーの濃度：４ｍｇ／ｍＬ、以下同じ）に播種し、これら細胞株の足場非依存性コロニー形成能を評価することによって、ＲＥＴ融合ポリペプチドの形質転換能を調べた。得られた結果を図５に示す。【０１０３】
また、低分子ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤（Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ又はＸＬ１８４）を添加したソフトアガー培地に、野性型のＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現する前記細胞株を各々播種し、これら細胞株の足場非依存性コロニー形成能を評価することによって、ＲＥＴ融合ポリペプチドによる形質転換に対するＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤の効果を調べた。得られた結果を図６に示す。【０１０４】
さらに、野性型又は変異型のＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現する前記細胞株を液体培地にて各々培養し、血清飢餓処理を施した後に、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤（Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ又はＸＬ１８４）を添加した液体培地に交換して培養した。そして、このようにして得られた各細胞株から、タンパク質を抽出し、各種リン酸化タンパク質又は非リン酸化タンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロット解析を行うことにより、ＲＥＴ融合にポリペプチドの下流のシグナルについて解析を行った。得られた結果を図７に示す。【０１０５】
また、野性型若しくは変異型のＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現する前記細胞株又は野生型のＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリペプチドを安定的に発現する前記細胞株を免疫不全マウス（ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ）の皮下に、１箇所につき細胞１ｘ１０６個を移植し、これらＲＥＴ融合ポリペプチドを発現する細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける造腫瘍能を調べた。得られた結果を図８に示す。【０１０６】
図５に示した結果から明らかなように、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドの発現によって、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は足場非依存性のコロニー形成を示した。一方、ＲＥＴタンパク質のキナーゼ活性を不活性化することによって、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドによる足場非依存性コロニー形成能は顕著に抑制されることが明らかになった。【０１０７】
さらに、図６に示す通り、かかるＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドによる足場非依存性コロニー形成能は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によって著しく阻害されることも明らかになった。【０１０８】
また、図７に示した結果から明らかなように、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドの発現によって、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞ではＲＥＴキナーゼドメインの強いリン酸化が認められた（図７の「ｐ−ＲＥＴ（Ｙ１０６２）」において「Ｗ」が付記されているレーン  参照）。さらに、このリン酸化はＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤処理又はＲＥＴタンパク質におけるキナーゼ活性の不活性化によって顕著に抑制されることも明らかになった（図７の「ｐ−ＲＥＴ（Ｙ１０６２）」において「Ｖ」及び「Ｘ」、又は「ＫＤ」が付記されているレーン  参照）。【０１０９】
また、図７に示す通り、ＡＫＴのリン酸化は、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドによって強く引き起こされた（図７の「ｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）」において「Ｗ」が付記されているレーン  参照）。さらに、ＳＴＡＴ３及びＭＡＰＫのリン酸化も該融合ペプチドによって亢進されることも明らかになった（図７の「ｐ−ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）」及び「ｐ−ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４７０５）」において「Ｗ」が付記されているレーン  参照）。しかし、これらのリン酸化もＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤処理又はＲＥＴタンパク質におけるキナーゼ活性の不活性化によって顕著に抑制されることも明らかになった（図７の「ｐ−ＲＥＴ（Ｙ１０６２）」、「ｐ−ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）」及び「ｐ−ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４７０５）」において「Ｖ」及び「Ｘ」、又は「ＫＤ」が付記されているレーン  参照）。【０１１０】
また、図８に示す通り、野生型のＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現しているＮＩＨ−３Ｔ３細胞を免疫不全マウスの皮下に移植した結果、その移植後１４日以内に腫瘍形成が観察された。一方、変異型のＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドを発現しているＮＩＨ−３Ｔ３細胞を免疫不全マウスの皮下に移植しても、その移植後３０日迄の観察において、腫瘍形成を全く確認することができなかった。【０１１１】
したがって、ＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合遺伝子は形質転換能を有してがん遺伝子として働いること、さらには該形質転換にはＲＥＴキナーゼ活性の活性化が必要であることが明らかになった。【０１１２】
また、かかるＣＥＰ５５−ＲＥＴ融合ポリペプチドによる形質転換能は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によって、該融合ポリペプチドにおけるＲＥＴチロシンキナーゼの活性化やその下流のシグナルであるＡＫＴ等の活性化が阻害されることにより、抑制されることも明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
以上説明したように、本発明によれば、ＣＥＰ５５タンパク質又はその一部と、ＲＥＴタンパク質又はその一部との融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドやその発現産物を検出することが可能となり、さらに、この検出により、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の有効性を予測することが可能となる。この融合はＲＥＴタンパク質の活性化をもたらし、ひいては細胞をがん化してしまう。さらに、上記にて実証している通り、かかるＲＥＴの活性化及びがん化は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤により顕著に抑制することができる。従って、ＣＥＰ５５遺伝子とＲＥＴ遺伝子との融合は、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤の標的となりうるため、本発明は、がん治療の効率を高める上で、極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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