(57)【要約】  本発明は、Dnmt-1の発現を抑制する物質又はDnmt-1の機能を阻害する物質を有効成分として含有する、肝前駆細胞から肝細胞への分化促進剤、及び肝前駆細胞から肝細胞（好ましくは成熟度の高い肝細胞）を製造する方法を提供する。
2014025046.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Dnmt-1の発現を抑制する物質又はDnmt-1の機能を阻害する物質を有効成分として含有する、肝前駆細胞から肝細胞への分化促進剤。
【請求項２】
Dnmt-1の発現を抑制する物質が、Dnmt-1の発現を抑制する核酸又はその前駆体である、請求項１に記載の分化促進剤。
【請求項３】
Dnmt-1の発現を抑制する核酸又はその前駆体が、Dnmt-1遺伝子のmRNAに対するmiRNA若しくはその前駆体、又はDnmt-1遺伝子のmRNAに対するsiRNA若しくはその前駆体である、請求項２に記載の分化促進剤。
【請求項４】
Dnmt-1の発現を抑制する核酸又はその前駆体が、miR-148a若しくはその前駆体である、請求項３に記載の分化促進剤。
【請求項５】
Dnmt-1の機能を阻害する物質が、Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質である、請求項１に記載の分化促進剤。
【請求項６】
Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質が、シチジン類縁体、又は、その塩、溶媒和物、水和物、前駆体若しくは誘導体である、請求項５に記載の分化促進剤。
【請求項７】
Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質が、Dnmt-1標的配列をマスキングする、請求項５に記載の分化促進剤。
【請求項８】
Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質が、Dnmt-1の活性部位をブロッキングする、請求項５に記載の分化促進剤。
【請求項９】
肝前駆細胞が、初代培養細胞、又は幹細胞より分化誘導した細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分化促進剤。
【請求項１０】
肝前駆細胞が、初代培養細胞である、請求項９に記載の分化促進剤。
【請求項１１】
肝前駆細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞又は間葉系幹細胞より分化誘導した細胞である、請求項９に記載の分化促進剤。
【請求項１２】
以下の工程を含むことを特徴とする、肝前駆細胞から肝細胞を製造する方法：
（１）肝前駆細胞を請求項１〜９のいずれか一項に記載のDnmt-1の発現を抑制する物質又はDnmt-1の機能を阻害する物質と接触させることにより、該肝前駆細胞においてDnmt-1の発現を抑制するか又はDnmt-1の機能を阻害する工程；及び
（２）前記工程（１）で得られたDnmt-1の発現が抑制されたか又はDnmt-1の機能が阻害された肝前駆細胞を培養することにより肝細胞へと分化誘導する工程。
【請求項１３】
肝前駆細胞が、初代培養細胞、又は幹細胞より分化誘導した細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
肝前駆細胞が、初代培養細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
肝前駆細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞又は間葉系幹細胞より分化誘導した細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法により製造された肝細胞。
【請求項１７】
以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、被検化合物の代謝を評価する方法：
（ａ）請求項１６に記載の肝細胞に被検化合物を接触させる工程；及び
（ｂ）前記工程（ａ）で肝細胞に接触させた被検化合物の代謝を測定する工程。
【請求項１８】
以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、被検化合物の肝毒性を評価する方法：
（ａ）請求項１６に記載の肝細胞に被検化合物を接触させる工程；及び
（ｂ）前記工程（ａ）で被検化合物を接触させた肝細胞の障害の程度を測定する工程。
【請求項１９】
Dnmt-1の発現を抑制する物質又はDnmt-1の機能を阻害する物質を有効成分として含有する、肝芽細胞腫から肝細胞への分化促進剤。
【請求項２０】
以下の工程を含むことを特徴とする、肝芽細胞腫から肝細胞を製造する方法：
（１）肝芽細胞腫を請求項１〜９のいずれか一項に記載のDnmt-1の発現を抑制する物質又はDnmt-1の機能を阻害する物質と接触させることにより、該肝芽細胞腫においてDnmt-1の発現を抑制するか又はDnmt-1の機能を阻害する工程；及び
（２）前記工程（１）で得られたDnmt-1の発現が抑制されたか又はDnmt-1の機能が阻害された肝芽細胞腫を７日以上培養することにより肝細胞へと分化誘導する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝前駆細胞又は肝芽細胞腫から肝細胞への分化促進剤、肝前駆細胞又は肝芽細胞腫から肝細胞を製造する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
新薬開発過程においては、肝毒性又は肝代謝物を予測するために肝細胞を利用した試験が行なわれている。肝細胞としては、一般にヒト初代培養肝細胞が使用されているが、ヒト初代培養肝細胞は、（１）海外からの輸入に依存しているため、日本国内においては良好なロットの入手が困難である、（２）増殖しない初代細胞であるため、同一ロットのサンプル数が限られている、等の問題を抱えており、安定供給及び継続的な使用に支障をきたしている。そのため、増殖性に優れた幹細胞（人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性幹細胞（ES細胞）、間葉系幹細胞）を分化誘導し、肝細胞を得る方法が求められている。【０００３】
幹細胞から肝細胞を分化誘導する方法に関しては、iPS細胞に複数の遺伝子を段階的に導入する方法（非特許文献１)や、間葉系幹細胞を特殊な分化誘導培地で培養する方法（非特許文献２）等が知られている。しかしながら、従来知られている方法により幹細胞から分化誘導して作製した肝細胞は、ヒト初代培養肝細胞と比べて薬物代謝酵素活性（CYP活性）等が低く、成熟が不十分であり、成熟度の高い肝細胞は未だ得られていない。【０００４】
現在、RNA干渉（RNA interference：RNAi）技術は、生命科学研究に頻繁に利用され、その有用性は広く確認されている。RNAiとは、二本鎖RNAによって、その配列特異的にmRNAが分解され、その結果遺伝子の発現が抑制される現象をいう。2001年に21塩基の低分子二本鎖RNAが哺乳動物細胞内でRNAiを媒介できることが報告されてから（非特許文献３）、siRNA（small interference RNA）は、標的遺伝子の発現抑制方法として頻用されている。siRNAは、医薬品への応用や、がんを含む種々の難治性疾患の治療への応用が期待されている。【０００５】
マイクロRNA（miRNA）は、1993年に線虫で発見された約22塩基対からなる短鎖RNA分子であり、標的遺伝子のメッセンジャーRNAの3’非翻訳領域中の相補的配列に結合することでその翻訳を抑制し、様々な生命現象を調節することが知られている。これまでにヒトでは1921種類、マウスでは1157種類のマイクロRNAが存在することが報告されている(http://www.mirbase.org/）。興味深いことに、１つのマイクロRNAに対して標的遺伝子は複数存在し、しかもそれらは同じ生理機能、同じ情報伝達経路に関与する遺伝子である場合が多い。そのため、たった１種類のマイクロRNAの発現変動が、ダイナミックな生理作用変化を引き起こすことが可能となる。【０００６】
これまでに肝細胞の分化においてマイクロRNAが重要な働きを担っていることが示唆されている。非特許文献４には、HepG2（ヒト肝癌由来細胞株であるが、未成熟／未分化の肝芽細胞に似ているため使用された）にmiR-122を安定的に過剰発現させると細胞増殖が抑制され、miR-122のコピー数を更に増やすと細胞増殖の抑制に加えて細胞の形態の変化が見られ、成熟肝細胞で発現するcytochrome P450ファミリー遺伝子の発現が増加することが開示されており、miR-122が肝臓の発達における肝細胞の分化に重要な役割を担っていることが示唆されている。非特許文献５には、bipotent murine embryonic liver（BMEL）細胞にmiR-122 mimicsをトランスフェクトすると肝細胞特異的遺伝子の発現が増加すること、またmiR-122の発現を増加させたトランスジェニックマウスでは肝細胞の分化が促進されることが開示されており、miR-122が肝細胞への分化を正に制御することが示されている。非特許文献６には、肝細胞に分化したresident liver stem cell（RLSC-derived hepatocyte）にmiRs-200a、b又はcのインヒビターをトランスフェクトすると、間葉様の形態に変化し、間葉マーカーの発現が増加し、幹細胞マーカーを発現する細胞の増加が見られることが開示されており、これらのマイクロRNAが肝細胞への分化に関与していることが示唆されている。非特許文献７には、ヒト胚性幹細胞（hESCs）を公知の方法によりdefinitive endoderm（DE）細胞を経て肝細胞へ分化させ、その際のmiRNAの発現パターンを解析した結果が開示されており、hESCsから肝細胞への分化の過程で、様々なmiRNAが細胞系列特異的に機能していることが示唆されている。【０００７】
miR-148aは、いくつかの癌の増殖に関与することが示唆されているが、肝細胞への分化に関与するか否かはこれまで全く知られていない。【０００８】
これまでに、Dnmt-1によるDNAのメチル化を阻害する5-アザ-2-デオキシシチジンで、HepG2細胞を2日間処理することでCYP遺伝子のmRNAレベルが上昇することは知られている（非特許文献８）が、タンパクレベルでのCYP発現の上昇は報告されていない。一方、HepG2細胞を用いた検討により、miR-148aはCYP3A4の遺伝子転写を促進するPXRの翻訳を抑制することが知られている（非特許文献９）。さらに、Dnmt-1によるDNAのメチル化を阻害する物質により、miR-148aの発現が上昇することが報告されている（非特許文献１０）。従って、Dnmt-1によるDNAのメチル化を阻害することによってmiR-148aの発現が上昇した結果、PXRの発現が抑制され、CYP遺伝子のmRNA発現量の上昇がタンパク質レベルの上昇に反映されない可能性が考えられている（非特許文献１１）。
また、Dnmt-1によるDNAのメチル化を阻害する5-アザ-2-デオキシシチジンは、細胞毒性が高く、かつアポトーシスを誘導することが報告されている（非特許文献１２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Molecular Therapy, Vol.20(1), p.127-137 (2012).
【非特許文献２】Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol.328(1), p.258-264(2005).
【非特許文献３】Nature, Vol.411, p.494-8 (2001).
【非特許文献４】HEPATOLOGY, Vol.52(4), p.1431-1442 (2010).
【非特許文献５】GASTROENTEROLOGY, Vol.142(1), p.119-129 (2012).
【非特許文献６】Cell Death Differ, Vol.19(6), p.937-946 (2012)(doi: 10.1038/cdd.2011.175. Epub 2011 Dec 2, 1-10).
【非特許文献７】Hepatology Research, Vol.41, p.170-183 (2011).
【非特許文献８】BMC Genomics. 2006,7;181.
【非特許文献９】Journal of Biological Chemistry, Vol. 283, p.9674-9680 (2008).
【非特許文献１０】Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 105, p.13556-13561 (2008).
【非特許文献１１】DNAメチル化による薬物動態関連遺伝子発現制御に関する研究DNAメチル化による薬物動態関連遺伝子発現制御に関する研究，宮嶋篤志，千葉大学大学院薬学研究院，医薬博甲第薬93号.
【非特許文献１２】Cancer Res, Vol.66(5), p.2794-2800(2006).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来知られている方法により幹細胞から分化誘導して作製した肝細胞は、ヒト初代培養肝細胞と比べて薬物代謝酵素活性（CYP活性）等が低く、成熟が不十分であるという問題があった。本発明の目的は、肝前駆細胞から肝細胞への分化を促進することにより、肝細胞（好ましくは成熟度の高い肝細胞）を短期間で作製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、胎児マウス肝組織、新生マウス肝組織及びマウス肝癌由来細胞株（Hepa1-6）と比較して、成体マウス肝組織においてmiR-148aが高発現していること、またヒト肝癌由来細胞株（Huh-7、HepG2及びHep3B）と比較して、ヒト正常肝組織においてmiR-148aが高発現していることを見出した。肝前駆細胞にmiR-148a前駆体を導入し、分化誘導用培地中で培養することにより肝細胞への分化を誘導したところ、miR-148a前駆体を導入しない場合と比較して、肝機能発現の指標であるアルブミン、グルコース-6-ホスファターゼ（G6pc）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（Tat）、cytochrome P450（Cyp）及びmiR-122の発現レベルが短期間で顕著に増大した。更に、DNAメチルトランスフェラーゼであるDnmt-1の発現レベルが肝前駆細胞から肝細胞への分化誘導後に低下すること、即ちmiR-148a発現レベルと逆相関の関係にあること、またmiR-148a前駆体を導入した肝前駆細胞ではDnmt-1の発現レベルが更に低下することを見出した。これらの知見はmiR-148aを利用してDnmt-1の発現を抑制することができ、それにより肝細胞マーカーの発現が増大した成熟度の高い肝細胞が短期間で得られることを示す。実際、Dnmt-1の発現を抑制するsiRNA（siDnmt-1）を導入した肝前駆細胞を肝細胞へと分化誘導した場合にも、Dnmt-1の発現を抑制しないコントロールsiRNAを導入した場合と比較してアルブミン、G6pc、Tat及びCypの発現レベルが顕著に増大した。本発明者らは、以上の知見からDnmt-1の発現を抑制することにより肝細胞への分化を促進できることを見出し、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。【００１２】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］Dnmt-1の発現を抑制する物質又はDnmt-1の機能を阻害する物質を有効成分として含有する、肝前駆細胞から肝細胞への分化促進剤。
［２］Dnmt-1の発現を抑制する物質が、Dnmt-1の発現を抑制する核酸又はその前駆体である、［１］に記載の分化促進剤。
［３］Dnmt-1の発現を抑制する核酸又はその前駆体が、Dnmt-1遺伝子のmRNAに対するmiRNA若しくはその前駆体、又はDnmt-1遺伝子のmRNAに対するsiRNA若しくはその前駆体である、［２］に記載の分化促進剤。
［４］Dnmt-1の発現を抑制する核酸又はその前駆体が、miR-148a若しくはその前駆体である、［３］に記載の分化促進剤。
［５］Dnmt-1の機能を阻害する物質が、Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質である、［１］に記載の分化促進剤。
［６］Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質が、シチジン類縁体、又は、その塩、溶媒和物、水和物、前駆体若しくは誘導体である、［５］に記載の分化促進剤。
［７］Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質が、Dnmt-1標的配列をマスキングする、［５］に記載の分化促進剤。
［８］Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質が、Dnmt-1の活性部位をブロッキングする、［５］に記載の分化促進剤。
［９］肝前駆細胞が、初代培養細胞、又は幹細胞より分化誘導した細胞である、［１］〜［８］のいずれかに記載の分化促進剤。
［１０］肝前駆細胞が、初代培養細胞である、［９］に記載の分化促進剤。
［１１］肝前駆細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞又は間葉系幹細胞より分化誘導した細胞である、［９］に記載の分化促進剤。
［１２］以下の工程を含むことを特徴とする、肝前駆細胞から肝細胞を製造する方法：
（１）肝前駆細胞を［１］〜［９］のいずれかに記載のDnmt-1の発現を抑制する物質又はDnmt-1の機能を阻害する物質と接触させることにより、該肝前駆細胞においてDnmt-1の発現を抑制するか又はDnmt-1の機能を阻害する工程；及び
（２）前記工程（１）で得られたDnmt-1の発現が抑制されたか又はDnmt-1の機能が阻害された肝前駆細胞を培養することにより肝細胞へと分化誘導する工程。
［１３］肝前駆細胞が、初代培養細胞、又は幹細胞より分化誘導した細胞である、［１２］に記載の方法。
［１４］肝前駆細胞が、初代培養細胞である、［１３］に記載の方法。
［１５］肝前駆細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞又は間葉系幹細胞より分化誘導した細胞である、［１３］に記載の方法。
［１６］［１２］〜［１５］のいずれかに記載の方法により製造された肝細胞。
［１７］以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、被検化合物の代謝を評価する方法：
（ａ）［１６］に記載の肝細胞に被検化合物を接触させる工程；及び
（ｂ）前記工程（ａ）で肝細胞に接触させた被検化合物の代謝を測定する工程。
［１８］以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む、被検化合物の肝毒性を評価する方法：
（ａ）［１６］に記載の肝細胞に被検化合物を接触させる工程；及び
（ｂ）前記工程（ａ）で被検化合物を接触させた肝細胞の障害の程度を測定する工程。
［１９］Dnmt-1の発現を抑制する物質又はDnmt-1の機能を阻害する物質を有効成分として含有する、肝芽細胞腫から肝細胞への分化促進剤。
［２０］以下の工程を含むことを特徴とする、肝芽細胞腫から肝細胞を製造する方法：
（１）肝芽細胞腫を［１］〜［９］のいずれかに記載のDnmt-1の発現を抑制する物質又はDnmt-1の機能を阻害する物質と接触させることにより、該肝芽細胞腫においてDnmt-1の発現を抑制するか又はDnmt-1の機能を阻害する工程；及び
（２）前記工程（１）で得られたDnmt-1の発現が抑制されたか又はDnmt-1の機能が阻害された肝芽細胞腫を７日以上培養することにより肝細胞へと分化誘導する工程。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、肝前駆細胞又は肝芽細胞腫から肝細胞への分化を促進することができる。そのため、従来知られている方法により幹細胞から分化誘導して作製した肝細胞よりも成熟度の高い肝細胞を短期間で提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】分化誘導後の肝前駆細胞の形態変化を示す図である。培養細胞は、培養3日後にコンフルエントとなり、細胞の形態は立方形であった（ａ）。培養5日後にオーバル細胞の形態となった（ｂ）。培養12日後に成熟した肝細胞の形態となった（ｃ及びｄ）。スケールバー：200μm(a, c)、50μm(b, d)。
【図２】ヒト（右パネル）及びマウス（左パネル）の肝組織又は肝癌由来細胞株におけるmiR-148aの発現レベルを示す図である。平均値±SEM（n=10）。
【図３】肝前駆細胞における、分化誘導後のmiR-148a発現レベルの変化を示す図である。平均値±SEM（n=3）。
【図４】miR-148a前駆体を導入した肝前駆細胞における、分化誘導後のmiR-148a発現レベルの変化を示す図である。黒色バーはmiR-148a前駆体を導入していない肝前駆細胞、灰色バーはmiR-148a前駆体を導入した肝前駆細胞の発現レベルを示す。平均値±SEM（n=3）。
【図５】miR-148a前駆体を導入した肝前駆細胞における、分化誘導後のアルブミン、G6pc、Tat、Cyp17a1及びmiR-122の発現レベルの変化を示す図である。左側のバーはmiR-148aを導入していない肝前駆細胞、右側のバーはmiR-148a前駆体を導入した肝前駆細胞の発現レベルを示す。平均値±SEM（n=3）。
【図６】肝前駆細胞における、分化誘導後のDnmt-1発現レベルの変化を示す図である。平均値±SEM（n=3）。
【図７】miR-148a前駆体を導入した肝前駆細胞における、培養開始後4日目（D4）及び5日目（D5）のDnmt-1発現レベルを示す図である。左側のバーはmiR-148aを導入していない肝前駆細胞、右側のバーはmiR-148a前駆体を導入した肝前駆細胞の発現レベルを示す。平均値±SEM（n=3）。
【図８】Dnmt-1の発現を抑制するsiRNA（siDnmt-1）を導入した肝前駆細胞における、培養開始後6日目のDnmt-1、アルブミン、G6pc、Tat及びCyp17a1の発現レベルの変化を示す図である。「siCtrl」はDnmt-1の発現を抑制しないsiRNA（siCtrl）を導入した肝前駆細胞、「siDnmt-1」はsiDnmt-1を導入した肝前駆細胞の発現レベルを示す（aとbはDnmt-1を標的遺伝子とする、塩基配列の異なる2種類のsiRNA(siDnmt-1)を示す）。平均値±SEM（n=3）。
【図９】Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質を添加した培地で培養した肝前駆細胞における、分化誘導後のmiR-148a発現レベルの変化を示す図である。平均値±SEM（n=3）。
【図１０】Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質を添加した培地で培養した肝前駆細胞における、分化誘導後の肝細胞マーカーの発現レベルの変化を示す図である。平均値±SEM（n=3）。
【図１１】培地のみで培養したヒト肝前駆細胞（コントロール）、miR-148a前駆体を導入したヒト肝前駆細胞（miR-148a）、機能を持たないmiRNAを導入したヒト肝前駆細胞（miCtrl）における、分化誘導後の(A)アルブミン（ALB）及び(B)Cyp3a4の発現レベルを示す図である。左側のバーはコントロールを、真ん中のバーはmiCtrlを、右側のバーはmiR-148aを導入した細胞での発現レベルを示す。
【図１２】miR-148a前駆体を導入したヒト肝前駆細胞を、光学顕微鏡下で観察した図である。成熟肝細胞に特有の、多核かつ細胞の境界が明瞭である形態を有する細胞を、図中丸で囲って示す。スケールバー：50μm。
【図１３】HepG2細胞を、Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質である5-アザ-2'-デオキシシチジン（2.5μM）で処理した後の細胞の形態を示す図である。5-アザ-2'-デオキシシチジンで処理していないこと以外は同条件で培養した細胞をコントロールとする。
【図１４】HepG2細胞を、5-アザ-2'-デオキシシチジン（2.5μM）で処理した後のPAS染色の結果を示す図である。5-アザ-2'-デオキシシチジンで処理していないこと以外は同条件で培養した細胞をコントロールとする。
【図１５】HepG2細胞を、5-アザ-2'-デオキシシチジン（5-アザ）（2.5μM）で処理した後の肝細胞マーカーの発現レベルの変化を示す図である。5-アザ-2'-デオキシシチジンで処理していないこと以外は同条件で培養した細胞をコントロールとする。
【図１６】HepG2細胞を、Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質（5-アザ-2'-デオキシシチジン（5-アザ）若しくはRG108）、又はDnmt-1の阻害性核酸（miR-148a若しくはsiDnmt1）で処理した後のCYP酵素の活性を測定した図である。該阻害物質及び阻害性核酸で処理していないこと以外は同条件で培養した細胞をコントロールとする。
【図１７】HepG2細胞を、5-アザ-2'-デオキシシチジン（5-アザ）（2.5μM）で処理した後、デキサメタゾン（25μM）で酵素誘導した後のCYP酵素（CYP1A2又はCYP3A4）の活性を測定した図である。5-アザ-2'-デオキシシチジンで処理していないこと以外は同条件で培養した細胞をコントロールとする。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．肝前駆細胞又は肝芽細胞腫から肝細胞への分化促進剤
本発明は、Dnmt-1の発現を抑制する物質、又はDnmt-1の機能を阻害する物質を有効成分として含有する、肝前駆細胞から肝細胞への分化促進剤を提供する。更なる局面において、本発明は、Dnmt-1の発現を抑制する物質、又はDnmt-1の機能を阻害する物質を有効成分として含有する、肝芽細胞腫から肝細胞への分化促進剤を提供する。以上、肝前駆細胞から肝細胞への分化促進剤、及び肝芽細胞腫から肝細胞への分化促進剤をあわせて本発明の剤という。Dnmt-1は、哺乳動物のDNAメチルトランスフェラーゼの一つである。本発明は、肝前駆細胞又は肝芽細胞腫から肝細胞への分化誘導の際に、Dnmt-1の発現を抑制するか、又はDnmt-1の機能を阻害することにより、肝細胞マーカーの発現が促進されることを見出したことに基づく。
【００１６】
本発明の剤は、細胞内に取り込まれると、Dnmt-1の発現を抑制する活性、又はDnmt-1の機能を阻害する活性を有する。Dnmt-1発現抑制活性は、Dnmt-1遺伝子を導入した形質転換体、生体内や生体外のDnmt-1遺伝子発現系、Dnmt-1生体内や生体外のDnmt-1翻訳系を用いて調べることができる。また、Dnmt-1の機能阻害活性は、in vivo又はin vitroの自体公知のDnmt-1のDNAメチルトランスフェラーゼ活性測定系を用いて調べることができる。例えば、Dnmt-1を発現する細胞を本発明の剤の存在下で培養し、親細胞DNAと娘細胞DNAのメチル化状態を調べ、親細胞DNAのメチル化状態が娘細胞DNAに伝達されなければ、本発明の剤がDnmt-1の機能阻害活性を有すると判定することができる。
【００１７】
本発明の剤は、肝前駆細胞又は肝芽細胞腫に導入され、肝細胞への分化を促進する。本発明において「肝細胞」とは、肝細胞マーカー（例えば、アルブミン、グルコース-6-ホスファターゼ（G6pc）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（Tat）、cytochrome P450（Cyp）、miR-122等）の少なくとも1種（好ましくは、アルブミン、G6pc、Tat及びCypの4種、より好ましくは、アルブミン、G6pc、Tat、Cyp及びmiR-122の5種）を発現している細胞をいう。また「肝細胞への分化を促進する」とは、分化誘導開始から所定の日数（例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日等）経過後に、本発明の剤を導入していない肝前駆細胞又は肝芽細胞腫を分化誘導した場合と比較して、肝細胞マーカー（例えば、アルブミン、グルコース-6-ホスファターゼ（G6pc）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（Tat）、cytochrome P450（Cyp）、miR-122等）の少なくとも1種（好ましくは、アルブミン、G6pc、Tat及びCypの4種、より好ましくは、アルブミン、G6pc、Tat、Cyp及びmiR-122の5種）の発現レベルを増大させることを意味する。この場合、分化誘導は、William's E培地（インビトロジェン社）に2 mM L-グルタミン液（インビトロジェン社）、50 U/mLペニシリン-50μg/mLストレプトマイシン液（インビトロジェン社）、10%ウシ胎児血清（サーモサイエンティフィック社）、5μg/mLインスリン（シグマアルドリッチ社）、25 ng/mL上皮成長因子（EGF）（シグマアルドリッチ社）、25 ng/mL肝細胞増殖因子（HGF）（ぺプロテック社）、12.5 ng/mLオンコスタチンM（シグマアルドリッチ社）、5×10-7Mヒドロコルチゾン 21-ヘミコハク酸ナトリウム塩（シグマアルドリッチ社）、10-7 Mデキサメタゾン（シグマアルドリッチ社）を添加した培地で細胞を48時間培養し、その後上皮成長因子（EGF）とウシ胎児血清を除いた培地で培養することにより行なう。或いは、更なる局面において、肝芽細胞種の分化誘導は、例えば、DMEM培地（インビトロジェン社）に2 mM L-グルタミン液（インビトロジェン社）、50 U/mLペニシリン-50μg/mLストレプトマイシン液（インビトロジェン社）、10%ウシ胎児血清（サーモサイエンティフィック社）を添加した培地で継続的に培養することで行うことができる。肝細胞マーカーの発現レベルは、自体公知の方法により測定することができ、例えば細胞からトータルRNAを抽出し、リアルタイムPCR法等の公知の手法により肝細胞マーカーのmRNAレベル又はmiRNAレベルを定量すればよい。
【００１８】
本発明において、肝前駆細胞とは、増殖能と肝細胞・胆管上皮細胞への二方向の分化能を持つ細胞であって、表面抗原マーカーとしてE-カドヘリンが同定されている細胞を意味する。肝前駆細胞には、肝幹細胞及び肝芽細胞（hepatoblast）も含まれる。
【００１９】
本発明において用いられる肝前駆細胞は、上記特性を有していれば特に限定されないが、好ましくは非腫瘍細胞である。
【００２０】
本発明において用いられる肝前駆細胞は、通常、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル、ヒト、好ましくはヒト）の細胞である。
【００２１】
本発明の剤は、肝前駆細胞であれば、その取得方法に関わらず、肝細胞への分化を促進することができる。肝前駆細胞は、自体公知の方法により取得することができ、例えば生体から採取した初代培養細胞、幹細胞（胚性幹細胞（ES細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）及び間葉系幹細胞等）より分化誘導した細胞等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２２】
一態様において、肝前駆細胞は初代培養細胞である。例えば、肝前駆細胞は、生体より摘出した肝臓（好ましくは、胎生期の肝臓）に含まれる肝細胞群からE-カドヘリン陽性細胞をソーティングすることで単離することができる。より具体的には、以下の手順により肝前駆細胞を単離することができるがこれに限定されない：胎児から肝組織を採取し、外科用ハサミ等で細かく切り刻んだ後、プロテアーゼ（例えば、リベラーゼ（Roche Applied Science製）等）を含む酵素液で処理する。分散した細胞を培地（例えば、肝細胞用基礎培地）で洗浄し、肝実質細胞を得る。得られた肝実質細胞をビオチン標識した抗E-カドヘリン抗体（例えば、イーバイオサイエンス製）と接触させ、EasySep Mouse Biotin Positive Selection Kit（STEMCELL Technologies製）等を用いてビオチン標識抗体で標識された細胞を回収する。回収された細胞が肝前駆細胞である。
【００２３】
また別の態様において、肝前駆細胞は幹細胞より分化誘導した細胞である。幹細胞には、胚性幹細胞（ES細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）及び間葉系幹細胞が包含される。
【００２４】
ES細胞としては、例えば、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等の胚性幹細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞、及びこれらの染色体上の遺伝子を公知の遺伝子工学の手法を用いて改変した胚性幹細胞が挙げられる。
【００２５】
具体的には、胚性幹細胞としては、初期胚を構成する内部細胞塊や単一割球等より樹立された胚性幹細胞、始原生殖細胞から樹立されたEG細胞、着床以前の初期胚の多分化能を有する細胞集団（例えば、原始外胚葉）から単離した細胞、あるいはその細胞を培養することによって得られる細胞等が挙げられる。また、これらの胚性幹細胞は、公知の方法を用いて、分化マーカーをコードする遺伝子に標識遺伝子（例えばＧＦＰ等の蛍光タンパク質）をインフレームにノックインすることにより、標識遺伝子の発現を指標として対応する分化段階に達したことを識別可能とした細胞であってもよい。
【００２６】
胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるKhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。
【００２７】
ES細胞と体細胞の細胞融合によって得られる融合ES細胞も、本発明の方法に用いられる胚性幹細胞に含まれる。
【００２８】
人工多能性幹細胞（iPS細胞）は、リプログラム因子の導入により体細胞（例えば線維芽細胞、皮膚細胞等）をリプログラムして得られた細胞である。人工多能性幹細胞は、体細胞（例えば線維芽細胞、皮膚細胞等）にOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycからなるリプログラミング因子を導入する方法で初めて見出された（Cell, 126: p. 663-676, 2006）。その後、多くの研究者により、リプログラム因子の組み合わせや因子の導入法について様々な改良が進められており、多様な人工多能性幹細胞の製造法が報告されている。本発明における人工多能性幹細胞には、このような方法で製造された細胞も含まれる。
【００２９】
間葉系幹細胞は、間葉に由来する体性幹細胞であり、間葉系に属する細胞への分化能を持つ。また、外胚葉由来細胞、内胚葉由来細胞など、中胚葉性でない組織にまで分化できる可塑性を持っていることが示されている。間葉系幹細胞には、例えば、骨髄間葉系細胞及び臍帯血由来幹細胞が含まれる。間葉系幹細胞は間葉系組織のある全ての組織に存在すると考えられているが、間葉系組織の中でも骨髄間葉系幹細胞は、骨髄穿刺で容易に採取でき、培養技術も確立されている。骨髄間葉系幹細胞は骨髄間質細胞の中に含まれており、骨髄間質細胞は骨髄の中で主体となる造血細胞を支える細胞の一種である。一方、臍帯血とは、胎児と母体を繋ぐ胎児側の組織であるへその緒（臍帯）の中に含まれる血液をいう。臍帯血の中には、臍帯血由来幹細胞（造血幹細胞）が多量に含まれていることが知られていたが、造血幹細胞以外の体性幹細胞である間葉系幹細胞（臍帯血由来の間葉性幹細胞）が存在することも明らかとなっている。
【００３０】
幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導は、例えば、アクチビンAを添加した培養液で培養した後に、骨形成タンパク質（BMP）や線維芽細胞増殖因子（FGF）を添加した培養液で培養することなどにより行なうことができる。
【００３１】
肝芽細胞腫は、未熟な肝芽細胞から発生する悪性腫瘍である。肝芽細胞腫は、株化されていてもよく、そのような株化細胞として、例えばHepG2が挙げられる。
【００３２】
Dnmt-1は、既に公知の分子であり、DNAメチルトランスフェラーゼ活性を有することが知られている。従来より、肝臓癌細胞におけるDnmt-1発現レベルと、肝臓癌の悪性度との関連性が示唆されていたが（International Journal of Cancer, Volume 105, Issue 4, pages 527-532, 1 July 2003）、Dnmt-1と肝細胞分化との関連性については全く知られていなかった。
Dnmt-1のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は数種の動物において公表されている。例えば、ヒトDnmt-1の塩基配列及びアミノ酸配列は、それぞれNCBIアクセション番号NM_001130823.1（2012年6月17日更新）（配列番号１）及びNP_001124295.1（2012年6月17日更新）（配列番号２）として公開されており、またマウスDnmt-1の塩基配列及びアミノ酸配列は、それぞれNCBIアクセション番号NM_010066.4（2012年5月5日更新）（配列番号３）及びNP_034196.5（2012年5月5日更新）（配列番号４）として公開されている。その他の哺乳動物のDnmt-1オルソログや、天然に見出されている変異体については、当該技術分野で周知の公共のデータベース（例えば、HomoloGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/）やUniProtKB/Swiss-Protデータベース等）からその配列情報を取得することができる。
Dnmt-1の機能としては、DNAメチルトランスフェラーゼ活性により、DNAの複製過程で、元のDNA（親鎖：Parent Strand）のメチル化状態を新しいDNA（娘鎖：Daughter strand）に導入することが知られている。
【００３３】
本発明において「Dnmt-1の発現を抑制する物質」は、Dnmt-1をコードするDnmt-1遺伝子の転写レベル、転写後調節のレベル、Dnmt-1への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル等のいかなる段階で作用するものであってもよい。従って、Dnmt-1の発現を抑制する物質としては、例えば、Dnmt-1遺伝子の転写を阻害する物質（例、アンチジーン）、初期転写産物からmRNAへのプロセッシングを阻害する物質、mRNAの細胞質への輸送を阻害する物質、mRNAからDnmt-1への翻訳を阻害するか（例、アンチセンス核酸、miRNA）あるいはmRNAを分解する（例、siRNA、リボザイム、miRNA）物質、初期翻訳産物の翻訳後修飾を阻害する物質等が含まれる。いずれの段階で作用するものであっても好ましく用いることができるが、mRNAに相補的に結合してDnmt-1への翻訳を阻害するかあるいはmRNAを分解する物質が好ましい。
【００３４】
Dnmt-1遺伝子のmRNAからDnmt-1への翻訳を特異的に阻害する（あるいはmRNAを分解する）物質としては、好ましくは、該mRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸が挙げられる。
【００３５】
本発明において核酸は、RNA、RNAとDNAのキメラ核酸（以下、キメラ核酸と称する）又はハイブリッド核酸である。ここにおいて、キメラ核酸とは、一本鎖又は二本鎖の核酸において一本の核酸の中にRNAとDNAを含むことをいい、ハイブリッド核酸とは、二本鎖において、一方の鎖がRNA又はキメラ核酸でもう一方の鎖がDNA又はキメラ核酸である核酸をいう。
【００３６】
本発明において核酸は、一本鎖又は二本鎖である。二本鎖の態様には、二本鎖RNA、二本鎖キメラ核酸、RNA／DNAハイブリッド、RNA／キメラ核酸ハイブリッド、キメラ核酸／キメラ核酸ハイブリッド及びキメラ核酸／DNAハイブリッドが含まれる。本発明において核酸は、好ましくは一本鎖RNA、一本鎖キメラ核酸、二本鎖RNA、二本鎖キメラ核酸、RNA／DNAハイブリッド、RNA／キメラ核酸ハイブリッド、キメラ核酸／キメラ核酸ハイブリッド又はキメラ核酸／DNAハイブリッドであり、より好ましくは一本鎖RNA、一本鎖キメラ核酸、二本鎖RNA、二本鎖キメラ核酸、RNA／DNAハイブリッド、キメラ核酸／キメラ核酸ハイブリッド又はRNA／キメラ核酸ハイブリッドである。
【００３７】
「Dnmt-1遺伝子のmRNAの塩基配列と実質的に相補的な塩基配列」とは、哺乳動物の生理的条件下において、該mRNAの標的配列に結合してその翻訳を阻害し得る（あるいは該標的配列を切断する）程度の相補性を有する塩基配列を意味し、具体的には、例えば、該mRNAの塩基配列と完全相補的な塩基配列（すなわち、mRNAの相補鎖の塩基配列）と、オーバーラップする領域に関して、約80％以上、好ましくは約90％以上、より好ましくは約95％以上、特に好ましくは約97％以上の相同性を有する塩基配列である。
本発明における「塩基配列の相同性」は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。
【００３８】
「Dnmt-1遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列の一部」とは、Dnmt-1遺伝子のmRNAに特異的に結合することができ、且つ該mRNAからのタンパク質の翻訳を阻害（あるいは該mRNAを分解）し得るものであれば、その長さや位置に特に制限はない。
【００３９】
具体的には、Dnmt-1遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸として、以下の(a)又は(b)が好ましく例示される。
(a) Dnmt-1遺伝子のmRNAに対するmiRNA又はその前駆体
(b) Dnmt-1遺伝子のmRNAに対するsiRNA又はその前駆体
【００４０】
(a) Dnmt-1遺伝子のmRNAに対するmiRNA又はその前駆体
本発明において、miRNAとは、17〜28塩基長からなる一本鎖RNAであって、標的mRNAに相補的に結合して該mRNAの翻訳を阻害（あるいは該mRNAを分解）することで遺伝子発現の転写後制御を行うものをいう。Dnmt-1遺伝子のmRNAに対するmiRNAとしては、Dnmt-1の発現を抑制する限り任意のmiRNAであってよい。miRNAがその標的遺伝子のmRNAの翻訳を抑制するメカニズムとして、miRNAの5’末端側2〜8番目の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するmRNAが、miRNA標的遺伝子としてmiRNAにより認識されることが知られている（Current Biology, 15, R458-R460 (2005)）。このメカニズムにより、該mRNAの発現がmiRNAによって抑制される。従って、Dnmt-1遺伝子のmRNAに対するmiRNAは、その5’末端側2〜8番目の塩基配列に、Dnmt-1遺伝子のmRNA中（好ましくはmRNAの3'UTR中）の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有することが好ましく、そのようなmiRNAとしては、例えばmiR-148aが挙げられる。
【００４１】
miR-148aは、既に公知の分子であり、代表的には、成熟型miRNAと呼ばれているものを意味する。ここで、miR-148aには、任意の生物種由来のものが含まれ、例えば、ヒト（has-miR-148a（has-miR-148a-3pとも呼ばれる）：配列番号５で表される塩基配列であり、miRBaseにAccession No. MIMAT0000243として登録されている）、マウス（mmu-miR-148a（mmu-miR-148a-3pとも呼ばれる）：配列番号６で表される塩基配列であり、miRBaseにAccession No. MIMAT0000516として登録されている）等由来のものが挙げられる。本発明においては、miR-148aは、本発明の剤を適用する細胞においてDnmt-1の発現を抑制する限り、本発明の剤を適用する細胞が由来する生物種と同じ生物種由来のmiR-148aであっても異なる生物種由来のmiR-148aであってもよい。本発明において、核酸について「生物Ｘ由来」とは、該核酸の塩基配列が、生物Ｘにおいて天然に存在している該核酸の塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を有することを意味する。「実質的に同一」とは、着目した塩基配列が、生物Ｘにおいて天然に存在している核酸の塩基配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上）の同一性を有しており、且つ当該核酸の機能が維持されていることを意味する。
【００４２】
miRNAは、成熟型miRNAとして細胞に導入してもよいし、その前駆体として細胞に導入してもよい。miRNAの前駆体とは、細胞内のプロセシングや、２本鎖核酸の開裂の結果、細胞内において成熟型miRNAを生じ得る核酸を意味する。該前駆体としては、pri-miRNAやpre-miRNA等を挙げることができる。pri-miRNAはmiRNA遺伝子の一次転写産物（１本鎖RNA）であり、通常数百〜数千塩基程度の長さを有する。pre-miRNAは、pri-miRNAが核内プロセシングを受けることにより生じるヘアピン構造を有する１本鎖ＲＮＡであり、通常９０〜１１０塩基の長さを有する。これらのmiRNAの前駆体は天然物なので、大量に導入しても排除されたり、インターフェロン応答等の細胞応答を生じる可能性は低いと考えられる。Dnmt-1遺伝子のmRNAに対するmiRNAの前駆体としては、例えば、has-miR-148aの前駆体（配列番号７で表される塩基配列であり、miRBaseにAccession No. MI0000253として登録されている）、mmu-miR-148aの前駆体（配列番号８で表される塩基配列であり、miRBaseにAccession No. MI0000550として登録されている）等が挙げられる。
【００４３】
また、好ましい別の態様としては、成熟型miRNAと同様の活性（即ちDnmt-1の発現を抑制する活性）を有するヌクレオチドを含む核酸、例えば、内在性の成熟型miRNAを模倣するように合成されたmiRNA模倣物等をmiRNAとして使用することができる。市販のものを利用することもできる。
【００４４】
miRNAは、安定性（化学的及び／又は対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、miRNAを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2’位の水酸基を、OR［R=CH3（2’-O-Me）、F（2'-F）、CH2CH2OCH3（2’-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等］に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換等が挙げられる。
【００４５】
核酸の糖部のコンフォーメーションはC2’-endo（S型）とC3’-endo（N型）の２つが支配的であり、一本鎖核酸ではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとN型に固定される。したがって、標的RNAに対して強い結合能を付与するために、2’酸素と4’炭素をメチレン残基を介して架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定した核酸誘導体であるLNA（Imanishi, T. et al., Chem. Commun., 1653-9, 2002;Jepsen, J.S. et al., Oligonucleotides, 14, 130-46, 2004）や2’酸素と4’炭素をエチレン残基を介して架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定した核酸誘導体であるENA（Morita, K. et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22, 1619-21, 2003）もまた、好ましく用いられ得る。
【００４６】
miRNAは、例えばmiRBaseデータベース等から目的のmiRNAの塩基配列情報を取得し、これに基づいて市販のDNA/RNA自動合成機（アプライドバイオシステムズ社、ベックマン社等）で合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むmiRNAも、自体公知の手法により、化学的に合成することができる。またhas-miR-148a-3p（ライフテクノロジーズ社）等の市販のmiRNAを利用することもできる。
【００４７】
(b) Dnmt-1遺伝子のmRNAに対するsiRNA又はその前駆体
本明細書においては、Dnmt-1遺伝子のmRNAに相補的なオリゴRNAとその相補鎖とからなる二本鎖RNA、いわゆるsiRNAもまた、Dnmt-1遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAに相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉（RNAi）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として汎用されている。
【００４８】
Dnmt-1遺伝子のmRNAに対するsiRNAは、Dnmt-1遺伝子のmRNAに対してRNAi活性を有する限り特に限定されず、標的遺伝子のcDNA配列情報に基づいて、例えば、Elbashirら（Genes Dev., 15, 188-200 (2001)）の提唱する規則に従って設計することができる。siRNAの標的配列としては、例えばAA+(N)19、AA+(N)21又はNA+(N)21（Nは任意の塩基）等が挙げられるが、それらに限定されない。標的配列の位置も特に制限されない。選択された標的配列の候補群について、標的以外のmRNAにおいて16-17塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）等のホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認する。例えば、AA+(N)19、AA+(N)21又はNA+(N)21（Nは任意の塩基）を標的配列とする場合、特異性の確認された標的配列について、AA（又はNA）以降の19-21塩基にTT又はUUの3’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該19-21塩基に相補的な配列及びTT又はUUの3’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる二本鎖RNAをsiRNAとして設計してもよい。また、siRNAの前駆体であるショートヘアピンRNA（shRNA）は、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、5-25塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。
【００４９】
siRNA及び／又はshRNAの配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、Ambionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）及びpSilencerTM Expression Vector用インサートデザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc /psilencer_converter.html）、RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
Dnmt-1遺伝子のmRNAに対するsiRNAとしては、例えば、配列番号９で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号１０で表されるアンチセンス鎖とからなる二本鎖RNA（図８中、siDnmt-1a）（ライフテクノロジーズ社）、配列番号１１で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号１２で表されるアンチセンス鎖とからなる二本鎖RNA（図８中、siDnmt-1b）（ライフテクノロジーズ社）等の市販のsiRNAが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
siRNAは、安定性、比活性等を向上させるために、上記のmiRNAの場合と同様の修飾を受けていてもよい。
【００５２】
siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるshRNAを合成し、これをダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。
【００５３】
siRNAは、生体内でDnmt-1遺伝子のmRNAに対するsiRNAを生成し得るようにデザインされた前駆体として細胞に導入することもできる。siRNAの前駆体としてはshRNAが挙げられる。shRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ（例えば5〜25塩基程度）のスペーサー配列を間に挿入して連結した塩基配列を含むオリゴRNAをデザインし、これをDNA/RNA自動合成機で合成することにより調製することができる。
【００５４】
上記の「Dnmt-1遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸」（以下、本発明の核酸ともいう）は、発現ベクターの形態をとるようにベクターに組み込まれていてもよい。本発明の核酸を発現するベクターとしては、細胞内に導入して転写されることによりmiRNA等の本発明の核酸が生合成されるように設計されたベクターであればいかなるものであってもよい。例えば、siRNA又はshRNAを発現するベクターには、タンデムタイプとステムループ（ヘアピン）タイプとがある。前者はsiRNAのセンス鎖の発現カセットとアンチセンス鎖の発現カセットをタンデムに連結したもので、細胞内で各鎖が発現してアニーリングすることにより二本鎖のsiRNA（dsRNA）を形成する。一方、後者はshRNAの発現カセットをベクターに挿入したもので、細胞内でshRNAが発現しdicerによるプロセシングを受けてdsRNAを形成する。
【００５５】
このような発現ベクターのためのプロモーターとしては、polII系プロモーター（例えば、CMV前初期プロモーター）を使用することもできるが、短いRNAの転写を正確に行わせるために、polIII系プロモーターを使用するのが一般的である。polIII系プロモーターとしては、マウス及びヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーター等が挙げられる。また、転写終結シグナルとして4個以上Tが連続した配列が用いられる。細胞内でmiRNA等の本発明の核酸を発現することができるベクターとしては、具体的には、pCDNA6.2-GW/miR（Invitrogen社製）、pSilencer4.1-CMV（Ambion社製）、pSINsi-hH1 DNA（タカラバイオ社製）、pSINsi-hU6 DNA（タカラバイオ社製）、pENTR/U6（Invitrogen社製）等を挙げることができる。
【００５６】
以上のようなDnmt-1の発現を抑制する物質（好ましくは、本発明の核酸）を細胞に導入する場合、導入方法としては、リポフェクション法、リポソーム法、ポリアミン法、エレクトロポレーション法、ビーズ法等を用いることができる。カチオン性脂質との脂質複合体を形成させて細胞に導入する方法が最も一般的で、導入効率も高い。例えば、0.1〜100μM、好ましくは1〜10μMの核酸を市販の核酸導入試薬を用いて哺乳動物細胞に導入することができる。導入試薬としては、TransFectin（バイオラッド社）、Lipofectamine RNAiMAX（インビトロジェン社）、HiPerFect Transfection Kit（キアゲン社）、DharmaFECT試薬キット（Thermo Fisher Scientific社）等を用いることができる。
【００５７】
また本発明の核酸を発現するベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、ドミナントネガティブ変異体をコードする核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Plat-E細胞）や相補細胞株（例、293細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。非ウイルスベクターであるプラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法等を用いて該ベクターを細胞に導入することができる。
【００５８】
本発明において「Dnmt-1の機能を阻害する物質」は、機能的に産生されたDnmt-1が、DNAメチルトランスフェラーゼ活性によりDNAの複製過程で親鎖のメチル化状態を娘鎖に導入するのを抑制する限り、いかなるものでもよい。Dnmt-1の機能を阻害するか否かは、上述のようなin vivo又はin vitroの自体公知のDnmt-1のDNAメチルトランスフェラーゼ活性測定系を用いて確認することができる。Dnmt-1の機能を阻害する物質としては、例えば、Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質が挙げられる。Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質としては、ヌクレオチドのアナログとしてDNA合成時に取り込まれてメチル化を阻害する物質が好ましく例示され、例えば、5-アザシチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジン（デシタビン）、1β-D-リボフラノシル-2(1H)-ピリミジノン（ゼブラリン）等のシチジン類縁体、又はそれらの塩、溶媒和物（例えば、エタノール溶媒和物等）、水和物、前駆体若しくは誘導体（例えば、エステル化誘導体等）が挙げられる。また、Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質としては、非ヌクレオチド系化合物も知られており、それらとしてはDnmt-1標的配列をマスキングすることによりDNAメチル化を阻害する物質（例えば、プロカイン、プロカインアミド等）、又はDnmt-1の活性部位をブロッキングすることによりDNAメチル化を阻害する物質（例えば、（（−）−エピガロカテキン−３−ガレート（EGCG）、RG108等）が好ましく例示される。以上のようなDNAメチル化を阻害する物質の中でも、肝細胞への分化を促進する効果が高いことから、RG108が好ましい。
【００５９】
またDnmt-1の機能を阻害する物質は、Dnmt-1に直接、間接的に作用し、可逆、不可逆を問わず、Dnmt-1の細胞内での機能を阻害する物質であってもよい。このような物質としては、例えば、Dnmt-1と他のタンパク質（例えば、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）等）との複合体形成を阻害することによりDnmt-1の細胞内での機能を阻害する物質、Dnmt-1の分解を促進する物質（例えば、プロテアソームを介したDnmt-1の分解を促進する物質（例えば、5-アザ-2'-デオキシシチジン等））等が挙げられる。
【００６０】
具体的には、Dnmt-1の機能を阻害する物質として、例えば、Dnmt-1に対する中和抗体（即ち、Dnmt-1と結合することによってDnmt-1の機能を阻害する抗体（例えば、Dnmt-1とHDACとの結合を阻害する抗体））が挙げられる。該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体は、自体公知の抗体又は抗血清の製造法に従って製造した抗Dnmt-1抗体の中から、Dnmt-1の機能を阻害するか否かについてスクリーニングを行なうことにより選択することができる。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgM又はIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab')2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、或いはポリエチレングリコール（PEG）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体等であってもよい。
【００６１】
「Dnmt-1の機能を阻害する物質」がポリペプチドである場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて、当該ポリペプチドの細胞への導入を実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（PTD）若しくは細胞透過性ペプチド（CPP）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６２】
２．肝前駆細胞又は肝芽細胞腫から肝細胞を製造する方法
本発明は、以下の工程を含むことを特徴とする、肝前駆細胞又は肝芽細胞腫から肝細胞を製造する方法（以下、本発明の方法ともいう）を提供する：
（１）肝前駆細胞又は肝芽細胞腫を本発明の剤（即ち、Dnmt-1の発現を抑制する物質又はDnmt-1の機能を阻害する物質）と接触させることにより、該肝前駆細胞又は肝芽細胞腫においてDnmt-1の発現を抑制するか又はDnmt-1の機能を阻害する工程；及び
（２）前記工程（１）で得られたDnmt-1の発現が抑制されたか又はDnmt-1の機能が阻害された肝前駆細胞又は肝芽細胞腫を培養することにより肝細胞へと分化誘導する工程。
【００６３】
本発明の方法は、本発明の剤が肝前駆細胞又は肝芽細胞腫から肝細胞への分化を促進することに基づいており、肝細胞を効率よく製造することができる。肝細胞とは、上記１に記載した通りの細胞である。また好ましい態様において、本発明の方法により製造される肝細胞は、成熟度の高い肝細胞である。本発明において、「成熟度の高い肝細胞」とは、本発明の剤を導入していない肝前駆細胞又は肝芽細胞腫を用いること以外は本発明の方法と同様の方法により作製した肝細胞と比較して、肝細胞マーカー（例えば、アルブミン、グルコース-6-ホスファターゼ（G6pc）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（Tat）、cytochrome P450（Cyp）、miR-122等）の少なくとも1種（好ましくは、アルブミン、G6pc、Tat及びCypの4種、より好ましくは、アルブミン、G6pc、Tat、Cyp及びmiR-122の5種）の発現レベルが高い肝細胞を意味する。好ましくは、肝細胞マーカーの発現レベルは、初代培養肝細胞と同じかそれ以上である。肝細胞マーカーの発現レベルは、上記１に記載したように自体公知の方法により測定することができる。
【００６４】
工程（１）における肝前駆細胞又は肝芽細胞腫は、上記１に記載した通りである。本発明において用いられる肝前駆細胞又は肝芽細胞腫は、通常、単離されている。本発明において「単離された」とは、天然に存在する状態とは異なる状態に人為的に置かれることをいう。例えば、生体から採取した初代培養細胞及び幹細胞より分化誘導した細胞は、単離された細胞である。
【００６５】
工程（１）における肝前駆細胞又は肝芽細胞腫と本発明の剤（即ち、Dnmt-1の発現を抑制する物質又はDnmt-1の機能を阻害する物質）との接触は、上記１に記載したように当該物質を肝前駆細胞又は肝芽細胞腫に導入することにより行なうことができる。当該物質が核酸である場合には、細胞への導入効率の観点から、カチオン性脂質との脂質複合体を形成させて肝前駆細胞又は肝芽細胞腫に導入することが好ましく、例えば以下の方法により行なうことができる：市販の核酸導入試薬（例えば、TransFectin（バイオラッド社）等）を用いて、添付の使用説明書の記載に従って本発明の剤とカチオン性脂質との脂質複合体を形成させる。肝前駆細胞又は肝芽細胞腫を所定の時間（例えば1日間、2日間、3日間、4日間程度）培養した後、該複合体を培地に添加して当該肝前駆細胞又は肝芽細胞腫と接触させ、更に所定の時間（例えば5時間程度）培養することにより本発明の剤を肝前駆細胞又は肝芽細胞腫に導入する。肝前駆細胞又は肝芽細胞腫の培養には、広く動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として利用することができる。市販されている基礎培地を利用してもよく、それらとしては、例えば、（最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、William's E培地）等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができるが、これらに特に限定されない。培地への添加剤としては、例えば、各種アミノ酸（例えば、L-グルタミン等）、各種無機塩、各種ビタミン、各種抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等）、緩衝剤等が挙げられる。通常、miRNA、siRNA等の核酸の細胞への導入は、細胞が対数増殖期にある状態（例えば、細胞が培養容器底面を80%程度覆った状態（80%コンフルエント））で実施することから、培地には、肝前駆細胞の増殖を促すため血清（例えば、ウシ胎児血清等）を添加することが好ましい。また通常、増殖因子、サイトカイン、ホルモン等の因子も添加され、これらの因子としては、例えば上皮成長因子（EGF）（25 ng/mL程度）、インスリン（5μg/mL程度）、肝細胞増殖因子（HGF）（25 ng/mL程度）、オンコスタチンM（12.5 ng/mL程度）、ヒドロコルチゾン 21-ヘミコハク酸又はその塩（5×10-7 M程度）及びデキサメタゾン（10-7 M程度）が挙げられる。特にEGFは、肝前駆細胞の増殖を促すため、培地に添加することが好ましい。更なる局面において、肝芽細胞腫の増殖のための培地には、肝芽細胞腫の増殖を促すため血清（例えば、ウシ胎児血清等）を添加することが好ましい。
肝前駆細胞又は肝芽細胞腫と本発明の剤とを接触させる際には、細胞への導入効率の観点から、以上のような肝前駆細胞又は肝芽細胞腫の増殖に適した培地（本明細書中、肝前駆細胞又は肝芽細胞腫用培地とも言う）を、OptiMEM（インビトロジェン社）等の遺伝子導入に用いられる特殊培地（遺伝子導入用培地とも言う）に交換することが好ましい。
また肝前駆細胞又は肝芽細胞腫がコンフルエントに達した後に肝細胞への分化誘導を行なうことで効率よく肝細胞を得ることができることから、前記遺伝子導入用培地中で培養した後に細胞数が少ない場合には、更に肝前駆細胞又は肝芽細胞腫用培地中で培養してもよい。肝前駆細胞又は肝芽細胞腫用培地中でのかかる追加の培養は、細胞がコンフルエントに達するまで行なえばよく、通常、本発明の剤との接触前の肝前駆細胞又は肝芽細胞腫用培地中での培養時間も含めた、肝前駆細胞又は肝芽細胞腫用培地中での合計培養時間が3日間以上（4日間程度）となるように培養すればよい。
【００６６】
また肝前駆細胞又は肝芽細胞腫と本発明の剤（即ち、Dnmt-1の発現を抑制する物質又はDnmt-1の機能を阻害する物質）との接触は、本発明の剤の存在下で肝前駆細胞又は肝芽細胞腫を培養することにより行なうことができる。培地としては、例えば、上記の本発明の剤の肝前駆細胞又は肝芽細胞腫への導入に用いられる培地や、肝前駆細胞又は肝芽細胞腫用培地が挙げられる。接触条件は適宜決定されるが、例えば、pHは約6〜約8であり、温度は通常約30〜約40℃である。接触時間及び接触時の本発明の剤の濃度は、該肝前駆細胞又は肝芽細胞腫においてDnmt-1の発現を抑制するか又はDnmt-1の機能を阻害する限り特に限定されず、本発明の剤の有効成分に応じて適宜設定することができる。例えば、本発明の剤として5-アザ-2'-デオキシシチジン（デシタビン）を用いる場合、肝前駆細胞を肝前駆細胞用培地で培養し、培養2日目から細胞がコンフルエントに達するまで本発明の剤を0.2〜1.0μM程度の濃度で接触させればよい。更なる局面において、5-アザ-2'-デオキシシチジン（デシタビン）を2.5-20μMの濃度で添加した肝芽細胞腫用培地で、培養0日目から細胞がコンフルエントに達するまで肝芽細胞腫と接触させてもよい。また例えば、本発明の剤としてRG108を用いる場合、肝前駆細胞を肝前駆細胞用培地で培養し、培養2日目から細胞がコンフルエントに達するまで本発明の剤を20〜100μM程度の濃度で接触させればよい。更なる局面において、RG108を20-100μM程度の濃度で添加した肝芽細胞腫用培地で、培養0日目から細胞がコンフルエントに達するまで肝芽細胞腫と接触させてもよい。また本発明の剤の存在下で肝前駆細胞又は肝芽細胞腫を培養することにより肝前駆細胞又は肝芽細胞腫と本発明の剤とを接触させる場合には、より効率よく肝細胞への分化を促進するために、後述の工程（２）における培養も本発明の剤の存在下で行うことが好ましい。この場合、本発明の剤の濃度は、工程（１）における濃度と同程度であればよい。
【００６７】
工程（２）における培養は、肝前駆細胞から肝細胞へ分化誘導可能である限り、任意の方法で行なうことができ、肝細胞への分化誘導法として公知の方法を用いることができる。公知の方法としては、例えば、オンコスタチンM、デキサメタゾン、肝細胞増殖因子（HGF）等を添加した培養液で培養する方法（Journal of Cellular Physiology, Vol.227(5), p.2051-2058 (2012); Hepatology, Vol.45(5), p.1229-1239 (2007)）等が挙げられる。また、肝芽細胞腫から肝細胞への分化誘導法としては培養液で継続的に培養する方法等が挙げられる。
【００６８】
工程（２）における培養には、広く動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地（本明細書中、肝細胞用基礎培地ともいう）として利用することができる。市販されている基礎培地を利用してもよく、それらとしては、例えば、（最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、William's E培地）等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができるが、これらに特に限定されない。培地への添加剤としては、例えば、各種アミノ酸（例えば、L-グルタミン等）、各種無機塩、各種ビタミン、各種抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等）、緩衝剤等が挙げられる。
【００６９】
肝前駆細胞から肝細胞への分化誘導のためには、通常、上記肝細胞用基礎培地に更に増殖因子、サイトカイン、ホルモン等の因子を添加する。これらの因子を添加した肝細胞用基礎培地（本明細書中、分化誘導用培地ともいう）が肝前駆細胞から肝細胞へ分化誘導可能である限り、添加する因子は特に限定されない。例えば、後述の実施例に記載されるように、これらの因子としてインスリン（5μg/mL程度）、肝細胞増殖因子（HGF）（25 ng/mL程度）、オンコスタチンM（12.5 ng/mL程度）、ヒドロコルチゾン 21-ヘミコハク酸又はその塩（5×10-7 M程度）及びデキサメタゾン（10-7 M程度）が添加された培地を使用すれば、肝前駆細胞から肝細胞への分化誘導を行なうことができる。また例えば特開2000-287680に開示されているように、上記因子のうちオンコスタチンM及びデキサメタゾンを用いて未成熟肝細胞から肝細胞への分化誘導を行なうことも可能である。尚、肝前駆細胞を増殖させるためにはEGF及び血清（例えば、ウシ胎児血清等）が添加された培地を使用するが、分化誘導のためにはこれらが添加されていない培地を使用することが好ましい。
肝芽細胞腫から肝細胞への分化誘導のためには、通常、上記基礎培地に更に血清（例えば、ウシ胎児血清等）を添加する。これらの因子を添加した肝芽細胞腫用培地（本明細書中、肝芽細胞腫用培地ともいう）が肝芽細胞腫から肝細胞へ分化誘導可能である限り、添加する因子は特に限定されない。
【００７０】
一実施形態において、上記の肝細胞用基礎培地（分化誘導用培地）中のEGF及び血清に関し、EGFが添加されず且つ血清の濃度が低減された培地を使用することもできる。該低減させた血清の量は、0.5〜2%（w/w）、好ましくは1%（w/w）であり得る。
【００７１】
工程（１）で得られたDnmt-1の発現が抑制されたか又はDnmt-1の機能が阻害された肝前駆細胞又は肝芽細胞腫を分化誘導用培地中もしくは肝芽細胞用培地中で培養することにより分化誘導することができる。培養条件は、肝前駆細胞又は肝芽細胞腫から肝細胞への分化が誘導される限り特に限定されず適宜決定されるが、例えば、培地のpHは約6〜約8であり、培養温度は通常約30〜約40℃である。培養時間も特に限定されず、肝細胞への分化誘導方法に応じて適宜設定することができる。
【００７２】
上記工程（１）及び（２）により、肝前駆細胞又は肝芽細胞腫から肝細胞への分化が促進されて肝細胞を効率よく製造することができる。肝細胞が製造されたことは、肝細胞マーカーの発現を指標に確認することができる。肝細胞マーカーの発現レベルは、上記１に記載したように自体公知の方法により測定することができる。また肝細胞は通常、グルコース産生能、アンモニア代謝能、アルブミン生産能、尿素合成能等の機能を有するため、肝細胞が製造されたことをこれらの機能の有無を指標に確認することもできる。グルコース生産能は、グルコースオキシダーゼ法によって培養上清中のグルコースレベルを分析することで確認できる。アンモニア代謝能は、改変インドフェノール法（Horn DB & Squire CR, Clin. Chim. Acta. 14(2): p.185-94 (1966)）によって、培養培地中のアンモニアレベルを分析することで確認できる。アルブミン生産能は、血清アルブミン濃度を測定する方法により、培養液中のアルブミン濃度を分析することで確認できる。また、尿素合成能は、例えばColorimetric assay（シグマ社）を使用して確認できる。また本発明の好ましい態様において、成熟度の高い肝細胞が製造されたことは、肝細胞マーカーの発現レベルを測定し、コントロール（本発明の剤を導入していない肝前駆細胞又は肝芽細胞腫を同様に分化誘導した場合の発現レベル）と比較することにより確認することができる。
【００７３】
本発明の方法によれば、肝毒性や肝代謝物の予測等に使用される肝細胞を安定供給することができる。また本発明の好ましい態様においては、従来の方法により製造された肝細胞と比較して成熟度が高い肝細胞が製造されるため、肝毒性や肝代謝物の予測等により好適に使用される肝細胞を安定供給することが可能となる。従って、本発明の方法は例えば医薬品や食品等の開発の分野において有用である。
【００７４】
肝細胞の分化誘導のために、Dnmt-1の発現を抑制する活性、又はDnmt-1の機能を阻害する活性を有する物質を培地に添加する場合、該物質は細胞毒性を示し得る。従って、本発明の剤を用いて肝細胞の分化を誘導する際に、細胞の密度を高くして播種することで、該細胞毒性を低減することができる。好ましい細胞密度として、例えば、４×１０４〜２×１０５cells/cm2で播種することが挙げられる。
特に長期間の分化誘導を行う場合、Dnmt-1の発現を抑制する活性、又はDnmt-1の機能を阻害する活性を有する物質の細胞毒性を抑えるために、上記細胞密度で播種することが好ましい。
【００７５】
本発明の好ましい態様において、上記工程（２）の培養は長期間行われる。長期間の分化誘導を行うことで、成熟のより進んだ肝細胞を得ることができ、そのような細胞では、肝細胞マーカーの発現上昇がmRNAレベルのみならず、タンパク質レベルでも誘導される。長期間分化誘導の好ましい期間としては、肝細胞マーカーのタンパク質レベルでの発現が誘導されれば、特に限定されないが、例えば、７日間以上、１０日間以上、１３日間以上などが挙げられる。
成熟のより進んだ肝細胞における肝細胞マーカーのタンパク質レベルでの発現誘導を確認するには、上記の肝細胞マーカーのタンパク量をウェスタンブロッティング等の自体公知の方法で定量することができ、又は例えば、CYP酵素（例えば、CYP1A2及びCYP3A4等）の活性を測定することもできる。
或いは、成熟のより進んだ肝細胞は、多核及び顕微鏡下で細胞の境界が明瞭等の特有の形態を有し得、及び／又はグリコーゲン貯蔵能の亢進も示す。細胞が多核であるか否かは、光学顕微鏡で確認する方法、公知の核染色剤（例えばDAPI、Hoechst33342等）を使用して核を染色する方法などにより決定でき、細胞の境界の明瞭さは、光学顕微鏡により確認することができる。また、グリコーゲン貯蔵能は、PAS染色等の当業者に公知の方法を用いて確認できる。好ましい態様において、長期間培養により誘導される成熟の進んだ肝細胞は、CYP1A2及びCYP3A4タンパク質を発現し、多核であり、且つPAS染色陽性である。
【００７６】
本発明はまた、本発明の方法により製造された肝細胞を提供する。本発明の方法により製造された肝細胞は、例えば、被検化合物の代謝や肝毒性の評価等に利用できる。
【００７７】
被検化合物の代謝や肝毒性の評価には、従来、動物モデル等が用いられていたが、一度に評価できる被検化合物の数に制限があり、また動物モデル等で得られた評価を、そのままヒトに適用できないという問題があった。そのため、ヒト肝癌細胞株や初代正常ヒト培養肝細胞を用いる評価方法が採用されている。しかしながら、ヒト肝癌細胞株は癌細胞であるため、ヒト肝癌細胞株で得られた評価が、ヒト正常肝細胞に適用できないという可能性が残る。また、初代正常ヒト培養肝細胞は安定供給やコストの面での問題がある。また、初代正常ヒト培養肝細胞を不死化した細胞株は、不死化していない場合と比較して、CYP3A4の活性が低下していることが示されている（International Journal of Molecular Medicine 14: 663-668, 2004, Akiyama I. et al.）。本発明の方法により製造された肝細胞を利用することで、このような問題を解決し得る。
【００７８】
従って本発明は更に、被検化合物の代謝を評価する方法を提供する。該方法では、本発明の方法により製造された肝細胞に被検化合物を接触させる。次いで、肝細胞に接触させた被検化合物の代謝を測定する。
【００７９】
本発明で用いる被検化合物としては、特に制限はない。例えば、生体異物、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられるが、これらに限定されない。
生体異物としては、例えば薬剤や食品の候補化合物、既存の薬剤や食品が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、生体にとって異物である限り、本発明の生体異物に含まれる。より具体的には、Rifampin、Dexamethasone、Phenobarbital、Ciglirazone、Phenytoin、Efavirenz、Simvastatin、β-Naphthoflavone、Omeprazoie、Clotrimazole、3-Methylcholanthrene等が例示できる。
【００８０】
本発明における「接触」は、通常、培地や培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。
【００８１】
被検化合物の代謝は、当業者に周知の方法で測定することが可能である。例えば被検化合物の代謝産物が検出された場合に、被検化合物が代謝されたと判定される。また、被検化合物の接触により、CYP（チトクロムp450）、MDR、MPR等の酵素遺伝子の発現が誘導された場合や、これら酵素の活性が上昇した場合に、被検化合物が代謝されたと判定される。
【００８２】
また本発明は、被検化合物の肝毒性を評価する方法を提供する。該方法では、本発明の方法により製造された肝細胞に被検化合物を接触させる。次いで、被検化合物を接触させた肝細胞の障害の程度を測定する。障害の程度は、例えば肝細胞の生存率やGOTやGPT等の肝障害マーカーを指標に測定できる。
【００８３】
例えば、肝細胞の培養液に被検化合物を添加することにより、肝細胞の生存率が低下する場合、該被検化合物は肝毒性を有すると判定され、生存率に有意な変化がない場合、該被検化合物は肝毒性を有さないと判定される。また、例えば、肝細胞の培養液に被検化合物を添加後、培養液中のGOTやGPTが上昇する場合、該被検化合物は肝毒性を有すると判定され、GOTやGPTに有意な変化がない場合、該被検化合物は肝毒性を有さないと判定される。
なお、すでに肝毒性の有無が判明している化合物を対照として用いることで、より正確に、被検化合物が肝毒性を有するか否かを評価することができる。
【実施例】
【００８４】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例になんら限定されるものではない。【００８５】
材料と方法
(1)肝組織の回収
(i)ヘペス緩衝液の調製
オートクレーブ滅菌済み蒸留水750 mLに8 g塩化ナトリウム（シグマアルドリッチ社）、0.2 g塩化カリウム（シグマアルドリッチ社）、0.1 gリン酸水素ナトリウム十二水和物（和光純薬）、10 mL HEPES溶液（2.38 g/10 mL、インビトロジェン社）を加えた後、攪拌しながら容量を1 Lに調整した。得られたHEPES緩衝液100 mLに、56.25 mg塩化カルシウム二水和物（シグマアルドリッチ社）を加え、ヘペス緩衝液（カルシウム含）100 mLを調製した。
(ii)マウス胎児由来肝組織の回収
2匹の妊娠マウス（E14.5）に麻酔を施した後、頚椎脱臼により屠殺した。外科用ハサミで腹腔を開いた後、胎児を含む子宮を注意深く取り出し、氷冷したPBS溶液（シグマアルドリッチ社：D8537）に移した。ピンセットで胎児を取り出し、ヘペス緩衝液を含む10 cmペトリ皿に移した。双眼実体顕微鏡を用いて、胎児を解剖し、肝組織を回収した。回収した肝組織を冷やしたヘペス緩衝液を含むペトリ皿に移した後、慎重に肝臓被膜を剥がし、肝組織を得、これを肝実質細胞の採取に用いた。【００８６】
(2)肝実質細胞の採取
(i)酵素液の調製
5 mg凍結乾燥リベラーゼ（ロシュ社）に2 mL蒸留水を加え、氷中に30分間静置した後、完全に溶解するまで2-3分間おきに攪拌し、13 U/mLリベラーゼ溶液を調製した。13 U/mLリベラーゼ溶液をストック溶液とし、-20℃で保存した。使用時に、10 mLヘペス緩衝液（カルシウム含）に100μLリベラーゼ溶液（13 U/mL）を加えて、酵素液を調製した。
(ii)肝細胞用基礎培地の調製
William's E培地（インビトロジェン社）に、2 mM L-グルタミン液（インビトロジェン社）、50 U/mLペニシリン-50μg/mLストレプトマイシン液（インビトロジェン社）、10%ウシ胎児血清（サーモサイエンティフィック社）を添加し調製した。
(iii)胎児肝組織由来肝実質細胞の採取
回収した肝組織を1.5 mLチューブに移し、外科用ハサミで徹底的に細かく切り刻んだ。酵素処理は以下の手順で行った。50 mLチューブに切り刻んだ組織を入れ、37℃に温めた10 mL酵素液で懸濁し、37℃で5分間インキュベートした。その間、2-3分おきにチューブを攪拌した。その後、2 mLプラスチックピペットに25 mL肝細胞用基礎培地を加えて、酵素液を希釈することで酵素反応を止めた。細胞を含む希釈した酵素液を60μmナイロンフィルターでろ過し、細胞懸濁液を得た。続いて、肝細胞用基礎培地でフィルターを洗浄し、細胞懸濁液と同じ容器に回収した。この時、細胞懸濁液がおよそ100 mLとなるよう調整した。細胞懸濁液を三角フラスコに移し、15分間室温で静置した。静置後、上層（全容量の4分の3）を25 mLプラスチックピペットで取り除いた。残りの細胞懸濁液に、25 mL肝細胞用基礎培地を加えて再懸濁した。懸濁液を、25 mLプラスチックピペットを用いて、2本の50 mL丸底チューブに分け、それぞれのチューブに肝細胞用基礎培地を加え、容量を40 mLに調整した。4℃で1000rpm（22×g）、2分間遠心した後、上清を取り除き、肝実質細胞を得た。【００８７】
(3)肝前駆細胞の単離
(i)肝前駆細胞用培地の調製
肝細胞用基礎培地に、5μg/mLインスリン（シグマアルドリッチ社）、25 ng/mL上皮成長因子（EGF）（シグマアルドリッチ社）、25 ng/mL肝細胞増殖因子（HGF）（ぺプロテック社）、12.5 ng/mLオンコスタチンM（シグマアルドリッチ社）、5×10-7 Mヒドロコルチゾン 21-ヘミコハク酸 ナトリウム塩（シグマアルドリッチ社）、10-7Mデキサメタゾン（シグマアルドリッチ社）を添加し調製した。
(ii)肝前駆細胞の単離
2%ウシ胎児血清を添加したヘペス緩衝液で肝実質細胞を希釈し、107個/100μLの細胞懸濁液を調製し、5 mL丸底チューブに移した。EasySep Mouse Biotin Positive Selection Kit（ステムセルテクノロジーズ社）中の、マウスFcRブロッキング抗体を細胞107個あたり1μL加え、チューブをタッピングし混和した。ビオチン標識した抗E-カドヘリン抗体（イーバイオサイエンス社）を、細胞107個あたり2-4μL加えた後、2-3分おきにチューブを攪拌させながら室温に15分間置いた。EasySep Mouse Biotin Positive Selection Kit中のBiotin Selection Cocktailを細胞107個あたり10μL加え、時々攪拌しながら、室温に15分間置いた。EasySep Mouse Biotin Positive Selection Kit中の磁気粒子を細胞107個あたり5μL加え、攪拌し、室温に10分間置いた。細胞懸濁液に細胞単離用培地を加え、容量を2.5 mLに調整した。2 mLプラスチックピペットで懸濁し、チューブを専用磁石（ステムセルテクノロジーズ社）に入れ、室温に10分間置いた。チューブを入れた状態で専用磁石を3秒間反転させ、非肝前駆細胞画分を取り除いた（純化操作：1回目）。チューブを専用磁石から取り出し、2.5 mL細胞単離用培地を加えて、再度純化操作を行った（純化操作：2回目）。さらに2.5 mL細胞単離用培地を加えて、3回目の純化操作を行った（純化操作：3回目）。チューブ内に残った細胞が肝前駆細胞である。【００８８】
(4)肝癌細胞株の培養
マウス肝癌由来細胞株（Hepa1-6）及びヒト肝癌由来細胞株（Huh-7、HepG2、Hep3B）は、DMEM（インビトロジェン社）に、50 U/mLペニシリン-50μg/mLストレプトマイシン液（インビトロジェン社）、10%ウシ胎児血清（サーモサイエンティフィック社)を添加した培地で培養した。【００８９】
(5)トータルRNAの抽出
培養細胞、肝癌細胞株、マウス及びヒト正常肝組織からのトータルRNAの抽出は、miRNeasy Mini Kit（キアゲン社）を用いて行った。トータルRNAの定量は、NanoDrop 1000 spectrophotometer（サーモサイエンティフィック社）で実施した。マウスから回収した肝組織は、RNAの抽出前に、氷冷したリン酸緩衝液に入れ破砕した。また、赤血球はRed Blood Cell Lysis Buffer（シグマアルドリッチ社）で溶解させた。【００９０】
(6)リアルタイムPCR法による定量
RNAは、7300リアルタイムPCRシステム（アプライドバイオシステムズ社）及びTaqMan MicroRNA Assays（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、リアルタイムPCR法で定量した。6NU6BレベルでmiRNA発現を標準化した。メッセンジャーRNAの定量のために、トータルRNAサンプルをDNアーゼ（TURBO DNA-free kit：アンビオン社）で処理した後、1μgのトータルRNAから逆転写酵素（SuperScript III Reverse Transcriptase：アンビオン社）を用いてcDNAを合成した。定量はSYBR Green（PlatinumSYBR Green定量PCRスーパーミックス  UDG：インビトロジェン社）を用いた。リアルタイムPCRの反応は、95℃・2分、40サイクル（95℃・15秒、60℃・30秒）で行った。GAPDHでcDNA発現レベルを標準化した。【００９１】
(7)miRNA前駆体又はsiRNAの細胞への導入
肝癌細胞株へのmiRNA前駆体の導入は、細胞を35 mm細胞培養用ディッシュに4×105個播種し、培養24時間後に1 mL OptiMEM（インビトロジェン社）に、100 nMのmiRNA前駆体と、5μLトランスフェクチン試薬（バイオラッド社）を加えて実施した。肝前駆細胞へのmiRNA前駆体の導入は、肝癌細胞株へのmiRNA前駆体の際と同様の方法で、培養4日目に実施した。肝前駆細胞へのsiRNAの導入は、肝癌細胞株へのmiRNA前駆体の際と同様の方法で、100 nMのsiRNA（2種類）を用い、培養2日目に実施した。【００９２】
(8)ヒト肝前駆細胞の培養
ヒト肝前駆細胞（Cell Systems Corporation社）は、DMEM（インビトロジェン社）に、10%ウシ胎児血清（MPバイオ社)を添加した培地で培養した。【００９３】
(9)トータルRNAの抽出
ヒト肝前駆細胞からのトータルRNAの抽出は、miRNeasy Mini Kit（キアゲン社）を用いて行った。トータルRNAの定量は、Synergy H1−Take3プレート（バイオテック社）で実施した。【００９４】
(10)リアルタイムPCR法による定量
RNAは、StepOne リアルタイムPCRシステム（アプライドバイオシステムズ社）及びTaqMan Gene Expression Assays（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、リアルタイムPCR法で定量した。メッセンジャーRNAの定量のために、1μgのトータルRNAから逆転写酵素（ReverTra Ace qPCR RT Master Mix：東洋紡社）を用いてcDNAを合成した。定量はTaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG（インビトロジェン社）を用いた。リアルタイムPCRの反応は、50℃・2分、95℃・10分、40サイクル（95℃・15秒、60℃・1分）で行った。18SリボソームRNAでcDNA発現レベルを標準化した。【００９５】
(11)miRNA前駆体のヒト肝前駆細胞への導入
ヒト肝前駆細胞へのmiRNA前駆体の導入は、細胞を6ウェルプレートに2×104個/cm2で播種し、80%コンフルエント時に1.25 mL OptiMEM（インビトロジェン社）に、20nMのmiRNA前駆体と、3.7μLトランスフェクチン試薬（バイオラッド社）を加えて実施した。【００９６】
実施例１  肝前駆細胞の分化、成熟化
マウス肝前駆細胞をI型コラーゲンでコートした35 mm細胞培養ディッシュに2×106個/cm2で播種し、肝前駆細胞用培地で培養した。コンフルエント以降は、上皮成長因子（EGF）とウシ胎児血清を除いた肝前駆細胞用培地で培養した。培地は毎日交換した。
細胞の形態変化を図１に示す。培養3日後にコンフルエントとなり、細胞の形態は立方形であった（図１ａ）。培養5日後にオーバル細胞の形態となった（図１ｂ）。培養12日後に成熟した肝細胞の形態となった（図１ｃ及びｄ）。【００９７】
実施例２  ヒト及びマウスの肝組織又は肝癌由来細胞におけるmiR-148aの定量
マウス肝癌由来細胞株Hepa1-6（American Type Culture Collection：ATCC）、ヒト肝癌由来細胞株HepG2、Hep3B（American Type Culture Collection：ATCC）、ヒト肝癌由来細胞株Huh-7（理研細胞バンク）、マウス（胎児マウス、新生マウス、成体マウス）肝組織（上記(1)及び(2)と同様の方法で採取）及びヒト正常肝組織（国立がん研究センターより入手）に発現するmiR-148aをリアルタイムPCR法で定量した。図２に示すように、miR-148aは、成体マウス肝組織及びヒト正常肝組織でのみ高発現していた。【００９８】
実施例３  肝前駆細胞における、分化誘導後のmiR-148a発現レベルの変化
マウス肝前駆細胞をI型コラーゲンでコートした35 mm細胞培養ディッシュに4×104個/cm2で播種し、肝前駆細胞用培地で培養した。コンフルエント以降（培養4日目以降）は、上皮成長因子（EGF）とウシ胎児血清を除いた肝前駆細胞用培地で培養した。培地は毎日交換した。miRNAを含むトータルRNAを抽出し、miR-148aをリアルタイムPCR法で定量した。
図３に示すように、miR-148a発現レベルは、分化誘導後、肝前駆細胞の成熟化に伴い増加した。【００９９】
実施例４  miR-148a前駆体を導入した肝前駆細胞における、分化誘導後のmiR-148a発現レベルの変化
マウス肝前駆細胞をI型コラーゲンでコートした35 mm細胞培養ディッシュに4×104個/cm2で播種し、肝前駆細胞用培地で培養した。培養したマウス肝前駆細胞にmiR-148a前駆体を導入し、コンフルエント以降（培養4日目以降）は、上皮成長因子（EGF）とウシ胎児血清を除いた肝前駆細胞用培地で培養した。培地は毎日交換した。miRNAを含むトータルRNAを抽出し、miR-148aをリアルタイムPCR法で定量した。尚、miR-148a前駆体を導入しない場合は培養2日目から、miR-148a前駆体を導入した場合はmiRNA導入後の培養5日目から測定を開始した。
図４に示すように、miRNA導入後の培養5日目からmiR-148aは過剰発現していた。【０１００】
実施例５  分化誘導後の肝細胞マーカーの発現レベルの変化
マウス肝前駆細胞をI型コラーゲンでコートした35 mm細胞培養ディッシュに4×104個/cm2で播種し、肝前駆細胞用培地で培養した。培養したマウス肝前駆細胞にmiR-148a前駆体を導入し、コンフルエント以降（培養4日目以降）は、上皮成長因子（EGF）とウシ胎児血清を除いた肝前駆細胞用培地で培養した。トータルRNAを抽出し、肝細胞のマーカーであるアルブミン、肝細胞に存在するグルコース-6-ホスファターゼ（G6pc）、チロシンアミノ基転移酵素（Tat）、薬物代謝酵素（Cyp17a1）の遺伝子、並びに肝特異的に発現するmiR-122の発現レベルをリアルタイムPCR法で定量した。尚、miR-148a前駆体を導入しない場合は培養2日目から、miR-148a前駆体を導入した場合はmiRNA導入後の培養5日目から測定を開始した。
図５に示すように、アルブミン、G6pc、Tat、Cyp17a1及びmiR-122の発現レベルはいずれも、分化誘導後に増大した。miR-148a前駆体を導入した場合には、培養5日目以降、miR-148a前駆体を導入していない場合と比較していずれも高い発現レベルを示した。【０１０１】
実施例６  分化誘導後のDnmt-1の発現レベルの変化
マウス肝前駆細胞をI型コラーゲンでコートした35 mm細胞培養ディッシュに4×104個/cm2で播種し、肝前駆細胞用培地で培養した。コンフルエント以降（培養4日目以降）は、上皮成長因子（EGF）とウシ胎児血清を除いた肝前駆細胞用培地で培養した。培地は毎日交換した。トータルRNAを抽出し、Dnmt-1をリアルタイムPCR法で定量した。
図６に示すように、miR-148a発現レベルとは逆に、Dnmt-1発現レベルは分化誘導後に低下した。【０１０２】
実施例７  miR-148aを導入した肝前駆細胞における、分化誘導後のDnmt-1発現レベルの変化
マウス肝前駆細胞をI型コラーゲンでコートした35 mm細胞培養ディッシュに4×104個/cm2で播種し、肝前駆細胞用培地で培養した。培養したマウス肝前駆細胞にmiR-148a前駆体を導入し、コンフルエント以降（培養4日目以降）は、上皮成長因子（EGF）とウシ胎児血清を除いた肝前駆細胞用培地で培養した。培地は毎日交換した。トータルRNAを抽出し、Dnmt-1をリアルタイムPCR法で定量した。
図７に示すように、培養4日目及び5日目のDnmt-1発現レベルは、miR-148a前駆体を導入した場合には、miR-148a前駆体を導入していない場合と比較して更に低下していた。この結果は、miR-148aの導入により、肝細胞への分化誘導時のDnmt-1の発現をより低レベルに抑制することができることを示す。【０１０３】
実施例８  Dnmt-1発現の阻害による、分化誘導後の肝細胞マーカーの発現レベルの変化
マウス肝前駆細胞をI型コラーゲンでコートした35 mm細胞培養ディッシュに4×104個/cm2で播種し、肝前駆細胞用培地で培養した。培養したマウス肝前駆細胞にDnmt-1の発現を抑制するsiRNA（下記siDnmt-1a又はb）を導入し、コンフルエント以降（培養4日目以降）は、上皮成長因子（EGF）とウシ胎児血清を除いた肝前駆細胞用培地で培養した。培養6日目にトータルRNAを抽出した。Dnmt-1の発現レベルや、肝細胞のマーカーであるアルブミン、肝細胞に存在するグルコース-6-ホスファターゼ（G6pc）、チロシンアミノ基転移酵素（Tat）、薬物代謝酵素（Cyp17a1）の遺伝子の発現レベルをリアルタイムPCR法で定量した。肝細胞のマーカーであるアルブミン並びに肝細胞に存在するグルコース-6-ホスファターゼや薬物代謝酵素の遺伝子（G6pc、Tat及びCyp）の発現レベルをリアルタイムPCR法で定量した。
siDnmt-1a：
センス鎖：GGUAGAGAGUUACGACGAAtt（配列番号９）
アンチセンス鎖：UUCGUCGUAACUCUCUACCtg（配列番号１０）
siDnmt-1b：
センス鎖：CAACGGAUCCUAUCACACUtt（配列番号１１）
アンチセンス鎖：AGUGUGAUAGGAUCCGUUGta（配列番号１２）
図８に示すように、siDnmt-1a又はbを導入した場合には、いずれの遺伝子もDnmt-1の発現を抑制しないコントロールsiRNA（siCtrl）を導入した場合と比較して高い発現レベルを示した。また、Dnmt-1の発現はコントロールsiRNA（siCtrl）を導入した場合と比較して、抑制された。【０１０４】
実施例９  Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質による、分化誘導後のmiR-148a発現レベルの変化
マウス肝前駆細胞をI型コラーゲンでコートした35 mm細胞培養ディッシュに1×105個/cm2で播種し、肝前駆細胞用培地で培養した。培養2日目に培地をDnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質（5-アザ-2'-デオキシシチジン（デシタビン）：0.2μM若しくは1.0μM、又はRG108：20μM若しくは100μM）を含有する肝前駆細胞用培地に交換し、マウス肝前駆細胞をコンフルエントまで培養した。コンフルエント以降は、上皮成長因子（EGF）とウシ胎児血清を除いた肝前駆細胞用培地にDNAメチル化を阻害する物質（5-アザ-2'-デオキシシチジン（デシタビン）：0.2μM（5-aza 0.2）若しくは1.0μM（5-aza 1.0）、又はRG108：20μM(RG 20)若しくは100μM(RG 100)）を添加した培地で培養し分化誘導した。培地は毎日交換した。培養7日目にトータルRNAを抽出し、miR-148a発現レベルをリアルタイムPCR法で定量した。
図９に示すように、miR-148a発現レベルは、Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質を含有する培地で分化誘導した場合に、Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質を添加していない培地で分化誘導した場合（コントロール）と比較し、高い発現レベルを示した。【０１０５】
実施例１０  Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質による、分化誘導後の肝細胞マーカーの発現レベルの変化
マウス肝前駆細胞をI型コラーゲンでコートした35 mm細胞培養ディッシュに1×105個/cm2で播種し、肝前駆細胞用培地で培養した。培養2日目に、培地をDnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質（5-アザ-2'-デオキシシチジン（デシタビン）：0.2μM若しくは1.0μM又はRG108：20μM若しくは100μM）を含有する肝前駆細胞用培地に交換し、マウス肝前駆細胞をコンフルエントまで培養した。コンフルエント以降は、上皮成長因子（EGF）とウシ胎児血清を除いた肝前駆細胞用培地にDNAメチル化を阻害する物質（5-アザ-2'-デオキシシチジン（デシタビン）：0.2μM若しくは1.0μM又はRG108：20μM若しくは100μM）を添加した培地で培養し分化誘導した。培地は毎日交換した。培養7日目にトータルRNAを抽出し、肝細胞のマーカーであるアルブミン、薬物代謝酵素（Cyp3a4）、及び肝特異的に発現するmiR-122の発現レベルをリアルタイムPCR法で定量した。
図１０Ｂ及びＣに示すように、Cyp3a4及びmiR-122の発現レベルはいずれも、Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質を含有する培地で分化誘導した場合に、Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質を添加していない培地で分化誘導した場合（コントロール）と比較し、高い発現レベルを示した。また図１０Ａに示すように、アルブミンの発現レベルは、RG108を含有する培地で分化誘導した場合に、コントロールと比較し、高い発現レベルを示した。これらの結果は、Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質を含有する培地で分化誘導すると、肝細胞への分化が促進されることを示す。【０１０６】
実施例１１  miR-148a前駆体を導入したヒト肝前駆細胞における、分化誘導後の肝細胞マーカーの発現レベルの変化
ヒト肝前駆細胞（Cell System Corporation社）をマトリゲル（ベクトンディッキンソン社）でコートした6ウェルプレートに2×104個/cm2で播種し培養した。培養したヒト肝前駆細胞にmiR-148a前駆体を導入し、コンフルエント以降は、ウシ胎児血清を1%に下げた肝前駆細胞用培地で培養した。培地は毎日交換した。miR-148a前駆体導入後5日目、7日目、9日目にトータルRNAを抽出した。肝細胞のマーカーであるアルブミン、薬物代謝酵素（Cyp3A4）の遺伝子の発現レベルをリアルタイムPCR法で定量した。
図１１に示すように、アルブミン、Cyp3A4の発現レベルは、miR-148a前駆体を導入した場合には、機能を持たないmiRNA(miCtrl)を導入した場合や、培地のみで培養した場合（コントロール）と比較していずれも高い発現レベルを示した。【０１０７】
実施例１２  miR-148a前駆体を導入したヒト肝前駆細胞の形態
ヒト肝前駆細胞（Cell System Corporation社）をマトリゲル（ベクトンディッキンソン社）でコートした6ウェルプレートに2×104個/cm2で播種し培養した。培養したヒト肝前駆細胞にmiR-148a前駆体を導入し、コンフルエント以降は、ウシ胎児血清を1%に下げた肝前駆細胞用培地で培養した。培地は毎日交換した。培養14日目の形態を図１２に示す。成熟肝細胞に特有の形態（多核、細胞の境界が明瞭）を有する細胞が認められた。【０１０８】
以上の結果より、miR-148aはDnmt-1の発現を抑制して肝前駆細胞の分化を促進し、より成熟度の高い肝細胞へと分化させることが示された。【０１０９】
実施例１３  Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質を添加した培地で培養したHepG2細胞の形態
肝芽細胞腫であるHepG2細胞（American Type Culture Collection: ATCC）を35 mm細胞培養ディッシュに7×105個播種し、DMEM（インビトロジェン社）に、100IU/mLペニシリン-100μg/mLストレプトマイシン液（インビトロジェン社）、10%ウシ胎児血清（サーモサイエンティフィック社）、DNAメチル化を阻害する物質（5-アザ-2'-デオキシシチジン：5-アザ（デシタビン）：2.5μM）を添加した培地で培養した。培地は毎日交換した。14日間培養した際の細胞の形態を図１３に示す。DNAメチル化阻害剤を添加した培地で培養したHepG2細胞は成熟肝細胞に特有の形態（多核、細胞の境界が明瞭）を有していた。【０１１０】
実施例１４  Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質を添加した培地で培養したHepG2細胞のPAS染色
HepG2細胞（ATCC）を35 mm細胞培養ディッシュに7×105個播種し、DMEM（インビトロジェン社）に、100IU/mLペニシリン-100μg/mLストレプトマイシン液（インビトロジェン社）、10%ウシ胎児血清（サーモサイエンティフィック社）、DNAメチル化を阻害する物質（5-アザ-2'-デオキシシチジン：5-アザ（デシタビン）：2.5μM）を添加した培地で培養した。培地は毎日交換した。14日間培養した後に、成熟肝細胞で見られるグリコーゲンの貯蔵能を確認するためにPAS染色を行った（図１４）。DNAメチル化阻害剤を添加した細胞では、該阻害剤無添加のコントロールと比較して、グリコーゲン貯蔵能が高かった。【０１１１】
実施例１５  HepG2における、Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質による肝細胞マーカーの発現レベルの変化
HepG2細胞からのトータルRNAの抽出は、miRNeasy Mini Kit（キアゲン社）を用いて行った。トータルRNAの定量は、NanoDrop 1000 spectrophotometer（サーモサイエンティフィック社）で実施した。
トータルRNAサンプルをDNアーゼ（TURBO DNA-free kit：アンビオン社）で処理した後、1μgのトータルRNAから逆転写酵素（SuperScript III Reverse Transcriptase：アンビオン社）を用いてcDNAを合成した。定量はSYBR Green（PlatinumSYBR Green定量PCRスーパーミックス  UDG：インビトロジェン社）を用いた。リアルタイムPCRの反応は、95℃・2分、40サイクル（95℃・15秒、60℃・30秒）で行った。GAPDHでcDNA発現レベルを標準化した。
HepG2細胞を35 mm細胞培養ディッシュに4×105個播種し、DMEM（インビトロジェン社）に、100IU/mLペニシリン-100μg/mLストレプトマイシン液（インビトロジェン社）、10%ウシ胎児血清（サーモサイエンティフィック社）、DNAメチル化を阻害する物質（5-アザ-2'-デオキシシチジン：5-アザ（デシタビン）：2.5μM）を添加した培地で培養した。培地は毎日交換した。10日間培養した後、上記方法でトータルRNAを抽出し、肝細胞のマーカーであるアルブミン、グルコース-6-ホスファターゼ（G6pc）、チロシンアミノ基転移酵素（Tat）、薬物代謝酵素（Cyp17a1、Cyp2C19、CYP3A4、及びCYP1A2）の遺伝子の発現レベルをリアルタイムPCR法で定量した。
図１５に示すように、肝細胞マーカーの発現レベルはいずれも、DNAメチル化阻害剤を含有する培地で分化誘導した場合に、該阻害剤を添加していない培地で分化誘導した場合（コントロール）と比較し、高い発現レベルを示した。【０１１２】
実施例１６  Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質及びDnmt-1阻害核酸による肝細胞が有するCYP酵素活性の変化
HepG2細胞を12ウェル細胞培養プレートに3×105個播種し、DMEM（インビトロジェン社）に、100IU/mLペニシリン-100μg/mLストレプトマイシン液（インビトロジェン社）、10%ウシ胎児血清（サーモサイエンティフィック社）、DNAメチル化を阻害する物質（5-アザ-2'-デオキシシチジン：5-アザ（デシタビン）：2.5μM、5μM、7.5μM、10μM、若しくは20μM、又はRG108：20μM若しくは100μM）を添加した培地で培養した。培地は毎日交換した。培養13日目にP450-Glo CYP450 Assay System（プロメガ社）を用いてCYP活性を評価した。Dnmt-1の発現を抑制するsiRNA（siDnmt-1）若しくはmiR-148a前駆体は、培養72時間後に1 mL OptiMEM（インビトロジェン社）に、20 nMのsiRNA若しくはmiR-148a前駆体と、5μLトランスフェクチン試薬（バイオラッド社）を加えて実施した。
CYP活性測定後、DMEM（インビトロジェン社）に、100IU/mLペニシリン-100μg/mLストレプトマイシン液（インビトロジェン社）、10%ウシ胎児血清（サーモサイエンティフィック社）に培地を交換し、Cell Counting Kit-8（同仁化学研究所）を添加した。2時間後に吸光度（450nm）を測定し、CYP活性を細胞数で補正した。
Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質、又はDnmt-1阻害核酸で処理した細胞では、当該処理をしていない細胞（コントロール）と比較し、高いCYPの酵素活性を示した（図１６）。【０１１３】
実施例１７  Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質で処理した肝細胞のCYP酵素誘導能
HepG2細胞を35 mm細胞培養ディッシュに1×106個播種し、DMEM（インビトロジェン社）に、100IU/mLペニシリン-100μg/mLストレプトマイシン液（インビトロジェン社）、10%ウシ胎児血清（サーモサイエンティフィック社）、DNAメチル化を阻害する物質（5-アザ-2'-デオキシシチジン：5-アザ（デシタビン）：2.5μM）を添加した培地で培養した。培地は毎日交換した。培養1週間後にデキサメタゾンを25μM添加した。72時間培養後にP450-Glo CYP450 Assay System（プロメガ社）を用いてCYP活性誘導能を評価した（図１７）。
Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質を含有する培地で処理した肝細胞にデキサメタゾンを添加し、酵素誘導した場合、該阻害剤を添加していない培地で分化誘導した場合（コントロール）と比較し、高いCYP1A2及びCYP3A4の酵素誘導能を示した。【０１１４】
以上の結果より、Dnmt-1によるDNAメチル化を阻害する物質、又はDnmt-1阻害核酸で処理した肝芽細胞腫は、より成熟度の高い肝細胞へと分化することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明によれば、肝細胞（好ましくは成熟度の高い肝細胞）を短期間で提供することができるため、肝毒性・肝代謝物予測のための試験等に用いることのできる肝細胞を安定供給することが可能となる。また本発明の方法において、増殖性に優れた幹細胞から誘導された肝前駆細胞を用いれば、初代培養肝細胞よりもロットによるばらつきが少ない肝細胞を安定して作製できるため、薬物スクリーニング等における継続的な使用に適した肝細胞を提供することが可能となる。【０１１６】
本願は日本で出願された特願2012-177171（出願日：2012年8月9日）及び特願2013-003365（出願日：2013年1月11日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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