(57)【要約】カルスを安定的に植物に再生できる植物の再生方法、及び天候や季節等に影響されずに安定的に植物を増殖できる植物の増殖方法を提供する。本発明は、カルスから不定胚を誘導する工程を含む植物の再生方法、及びカルスから不定胚を誘導する工程を含む植物の増殖方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルスから不定胚を誘導する工程を含む植物の再生方法。
【請求項２】
不定胚を誘導した後に、シュートを形成させる請求項１記載の植物の再生方法。
【請求項３】
植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる再生誘導工程と、シュートを発根培地で培養することにより発根させる発根工程とを含む請求項１記載の植物の再生方法。
【請求項４】
植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる再生誘導工程と、形成されたシュートを伸長培地で培養することにより伸長させる伸長工程と、伸長させたシュートを発根培地で培養することにより発根させる発根工程とを含む請求項１記載の植物の再生方法。
【請求項５】
前記伸長培地及び前記発根培地が、植物生長ホルモンを含まない培地である請求項４記載の植物の再生方法。
【請求項６】
前記植物がイソプレノイド産生植物である請求項１〜５のいずれかに記載の植物の再生方法。
【請求項７】
前記植物がキク科に属する植物又はトウダイグサ科に属する植物である請求項１〜６のいずれかに記載の植物の再生方法。
【請求項８】
前記植物がＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物又はＨｅｖｅａ属に属する植物である請求項１〜６のいずれかに記載の植物の再生方法。
【請求項９】
前記植物がノゲシ又はパラゴムノキである請求項１〜６のいずれかに記載の植物の再生方法。
【請求項１０】
カルスから不定胚を誘導する工程を含む植物の増殖方法。
【請求項１１】
植物の組織片からカルスを誘導する工程を含む請求項１０記載の植物の増殖方法。
【請求項１２】
不定胚を誘導した後に、シュートを形成させる請求項１０又は１１記載の植物の増殖方法。
【請求項１３】
植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する誘導工程と、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる再生誘導工程と、シュートを発根培地で培養することにより発根させる発根工程とを含む請求項１０記載の植物の増殖方法。
【請求項１４】
植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する誘導工程と、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる再生誘導工程と、形成されたシュートを伸長培地で培養することにより伸長させる伸長工程と、伸長させたシュートを発根培地で培養することにより発根させる発根工程とを含む請求項１０記載の植物の増殖方法。
【請求項１５】
前記植物がイソプレノイド産生植物である請求項１０〜１４のいずれかに記載の植物の増殖方法。
【請求項１６】
前記植物がキク科に属する植物又はトウダイグサ科に属する植物である請求項１０〜１５のいずれかに記載の植物の増殖方法。
【請求項１７】
前記植物がＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物又はＨｅｖｅａ属に属する植物である請求項１０〜１６のいずれかに記載の植物の増殖方法。
【請求項１８】
前記植物がノゲシ又はパラゴムノキである請求項１０〜１７のいずれかに記載の植物の増殖方法。
【請求項１９】
植物生長ホルモン及び炭素源を含む培地中でカルスを培養することにより不定胚を誘導する不定胚誘導方法。
【請求項２０】
培地中の固形化剤の濃度が０．１〜２質量％、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌ、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであり、培養温度が０〜４０℃である請求項１９記載の不定胚誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の不定胚誘導方法、植物の再生方法、及び植物の増殖方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴム（ポリイソプレノイドの１種）は、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）や桑科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）などのゴム産生植物を栽培し、その植物体が有する乳管細胞で天然ゴムを生合成させ、該天然ゴムを植物から手作業により採取することにより得られる。【０００３】
現状、工業用天然ゴムは、パラゴムノキをほぼ唯一の採取源としている。またゴム製品の主原料として、様々な用途において幅広くかつ大量に用いられている。しかしながら、パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でのみ生育可能な植物である。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、採取出来る季節が限られる場合もある。また、成木から天然ゴムを採取できる期間は２０〜３０年に限られる。【０００４】
今後、開発途上国を中心に天然ゴムの需要の増大が見込まれており、上述の理由によりパラゴムノキによる天然ゴムの大幅な増産は困難である。そのため、天然ゴム資源の枯渇が懸念されており、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴムの供給源や、パラゴムノキでの収率の向上が望まれている。【０００５】
このような状況下、パラゴムノキ以外の天然ゴムの供給源の探索が盛んに行われている。パラゴムノキ以外にもイソプレノイドを生産している植物が２０００種以上存在することが知られており、特にグアユーレやロシアンタンポポなどが新たな天然ゴムの供給源として検討されている。また、キク科に属する植物のなかでもイソプレノイドを生産する植物が存在することが知られており、日本に広く自生するノゲシもその一つである。【０００６】
新たな天然ゴムの供給源として、これらの植物を利用する場合、多量の天然ゴムを生産するためには、当該植物を大量に増殖させる必要が生じることが予想される。植物を大量に増殖させる方法としては、種子から植物を栽培する方法、挿し木により植物を増殖させる方法等が挙げられるが、これらの方法では、天候や季節等に影響されやすいため、安定的に植物を増殖できないおそれがある。【０００７】
一方で、パラゴムノキによる天然ゴムの増産を図る動きも見られる。パラゴムノキは、播種により実生苗を育成させ成長させた後台木とし、クリーン苗から得た芽を台木に継ぎ芽する事で苗を増殖させる。クローン苗から得られる芽には限りがあるため、優良品種を普及させるには、優良品種のクリーン苗を大量増殖させる必要がある。【０００８】
また従来のクリーン増殖技術である接ぎ木は、元の木がもつ病気を一緒に継いでしまう可能性があり、罹病した苗を増殖させる可能性がある。従って、安定的に植物を増殖できる方法が望まれている。【０００９】
一方、植物におけるイソプレノイドの生産量を増大させるためには、例えば、耐ストレス性の向上や、植物中に蓄積されるイソプレノイド量の増大を目的として、植物を改良する方法が考えられる。植物の改良方法としては、人工交配や突然変異を利用する方法も考えられるが、所望する性質を効率的に付与することが難しく、その実現性は低いものと考えられる。そのため、植物の改良には、植物細胞に標的遺伝子を導入し、所望する性質を付与するという細胞工学的手法が利用されることになると考えられる。【００１０】
細胞工学的手法を利用する場合、標的遺伝子を導入した植物細胞を植物体へ再分化させる必要がある。すなわち、植物細胞（例えば、カルス）から植物を再生する必要がある。しかしながら、従来から、植物において、種々の組織培養の検討が行われているものの、イソプレノイドを生産する植物のカルスから植物を再生する方法を検討した例はほとんどなく、カルスを安定的に植物に再生することは困難であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、前記課題を解決し、カルスを安定的に植物に再生できる植物の再生方法、及び天候や季節等に影響されずに安定的に植物を増殖できる植物の増殖方法を提供することを目的とする。また、植物の不定胚誘導方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、鋭意検討した結果、カルスから不定胚を誘導することにより、その後、安定的にシュートが形成され、形成されたシュートが伸長し、発根させることができることを見出した。すなわち、カルスから不定胚を誘導することにより、カルスを安定的に植物に再生できること、更には、安定的に植物の増殖が可能であることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、カルスから不定胚を誘導する工程を含む植物の再生方法に関する。【００１３】
上記再生方法においては、不定胚を誘導した後に、シュートを形成させることが好ましい。【００１４】
上記再生方法が、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる再生誘導工程と、シュートを発根培地で培養することにより発根させる発根工程とを含むことが好ましい。【００１５】
上記再生方法が、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる再生誘導工程と、形成されたシュートを伸長培地で培養することにより伸長させる伸長工程と、伸長させたシュートを発根培地で培養することにより発根させる発根工程とを含むことが好ましい。【００１６】
上記再生方法において、特に、キク科に属する植物（好ましくはＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシ）の場合には、上記伸長培地及び上記発根培地が、植物生長ホルモンを含まない培地であることも好ましい一形態である。【００１７】
上記再生方法において、上記植物がイソプレノイド産生植物であることが好ましく、キク科に属する植物又はトウダイグサ科に属する植物であることがより好ましく、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物又はＨｅｖｅａ属に属する植物であることが更に好ましく、ノゲシ又はパラゴムノキであることが特に好ましい。【００１８】
本発明は、カルスから不定胚を誘導する工程を含む植物の増殖方法に関する。【００１９】
上記増殖方法が、植物の組織片からカルスを誘導する工程を含むことが好ましい。【００２０】
上記増殖方法においては、不定胚を誘導した後に、シュートを形成させることが好ましい。【００２１】
上記増殖方法が、植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する誘導工程と、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる再生誘導工程と、シュートを発根培地で培養することにより発根させる発根工程とを含むことが好ましい。【００２２】
上記増殖方法が、植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する誘導工程と、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる再生誘導工程と、形成されたシュートを伸長培地で培養することにより伸長させる伸長工程と、伸長させたシュートを発根培地で培養することにより発根させる発根工程とを含むことが好ましい。【００２３】
上記増殖方法において、特に、キク科に属する植物（好ましくはＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシ）の場合には、上記伸長培地及び上記発根培地が、植物生長ホルモンを含まない培地でも好ましい一形態である。【００２４】
上記増殖方法において、上記植物がイソプレノイド産生植物であることが好ましく、キク科に属する植物又はトウダイグサ科に属する植物であることがより好ましく、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物又はＨｅｖｅａ属に属する植物であることが更に好ましく、ノゲシ又はパラゴムノキであることが特に好ましい。【００２５】
本発明は、植物生長ホルモン及び炭素源を含む培地中でカルスを培養することにより不定胚を誘導する不定胚誘導方法に関する。【００２６】
上記不定胚誘導方法においては、培地中の固形化剤の濃度が０．１〜２質量％、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌ、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌ、スクロースの濃度が１〜５質量％であり、培養温度が０〜４０℃であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の植物の再生方法は、カルスから不定胚を誘導する工程を含む植物の再生方法であるので、カルスを安定的に植物に再生できる。また、本発明の植物の増殖方法は、カルスから不定胚を誘導する工程を含む植物の増殖方法であるので、制御された環境下で組織培養を行うことにより、天候や季節等に影響されずに安定的に植物を増殖できる。また、本発明の不定胚誘導方法は、植物生長ホルモン及び炭素源を含む培地中でカルスを培養することにより不定胚を誘導する方法であるので、好適に不定胚を誘導できる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ノゲシにおける不定胚の形成、シュートの形成、シュートの伸長、及び発根の様子を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の不定胚誘導方法は、植物生長ホルモン及び炭素源を含む培地中でカルスを培養することにより不定胚を誘導する方法であり、該方法によりカルスから不定胚を誘導できる（図１（ａ）参照）。
【００３０】
本発明の植物の再生方法は、カルスから不定胚を誘導する工程を含む植物の再生方法である。上述のように、カルスから不定胚を誘導し（図１（ａ）参照）、不定胚を培養することにより、安定的にシュートが形成され（図１（ｂ）参照）、形成されたシュートが伸長し（図１（ｃ）参照）、発根させる（図１（ｄ）参照）ことができ、カルスを安定的に植物に再生できる。
【００３１】
また、本発明の植物の増殖方法は、カルスから不定胚を誘導する工程を含む植物の増殖方法である。本発明の植物の増殖方法は、上述の本発明の植物の再生方法を利用した植物の増殖方法であるので、安定的に植物の増殖が可能であり、制御された環境下で組織培養を行うことにより、天候や季節等に影響されずに安定的に植物を増殖できる。具体的には、植物の葉や茎など大量に入手可能な植物の組織片からカルスを誘導し、本発明の植物の再生方法を利用してカルスを植物に再生することにより、安定的かつ大量に植物を増殖させることが可能である。
【００３２】
また、再生された植物は、カルスの状態で維持（継代培養）する場合よりも変異が起こりにくく、安定的に植物を供給することができる。また、再生された植物は、土壌中で生育させることができるため、カルス等の植物細胞と異なり、細胞を維持するために高価な植物成長調整物質を必要としないため、コストを抑制できる。
【００３３】
本発明において、カルスとは、分化していない状態の植物細胞又は分化していない状態の植物細胞塊を意味する。また、本発明において、不定胚とは、カルスから誘導された胚様の組織を意味する。また、本発明において、シュートとは、葉や幼植物を意味する。
【００３４】
本発明の方法（植物の再生方法、植物の増殖方法）が適用できる植物は、特に限定されないが、天然ゴムの供給源となり得るという理由から、イソプレノイド産生植物が好ましい。
【００３５】
イソプレノイド産生植物としては、イソプレノイドを産生可能な植物であれば特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）、タイワンハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ａｒｖｅｎｓｉｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ  ｆ．  ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｇｉｇａｎｔｅａ  Ａｉｔ．  ｖａｒ．  ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ  Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｖｅｎｕｓｔｕｍ  Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ  Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ  Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ  Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ  ｐｕｍｉｌａ  Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｒｅｃｔａ  Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ａｍｐｅｌａｓ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｉｒｉｓａｎａ  Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ  Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｓｅｐｔｉｃａ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓｅｒｒｉｏｌａ）等が挙げられる。なかでも、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物等のキク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）に属する植物、Ｈｅｖｅａ属に属する植物等のトウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）に属��る植物であることが好ましく、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、Ｈｅｖｅａ属に属する植物であることがより好ましく、ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）であることが更に好ましい。
【００３６】
パラゴムノキはその生育可能な地域が東南アジアや南米に限定されるが、ノゲシはヨーロッパ諸国や日本などのアジアなど、世界各地で自生しており、生産地域を限定することなく、広範囲での栽培が可能である。さらに、パラゴムノキは植樹からゴムの採取まで約７年を要するが、ノゲシは一年草であることから、生育もより早い点で有利である。
【００３７】
以下において、本発明の植物の増殖方法について具体的に説明する。なお、本発明の植物の増殖方法は、基本的に本発明の不定胚誘導方法、本発明の植物の再生方法を利用した植物の増殖方法であるので、本発明の植物の増殖方法を説明することにより、本発明の不定胚誘導方法、本発明の植物の再生方法についても説明したこととなる。
【００３８】
本発明の植物の増殖方法は、カルスから不定胚を誘導する工程を含む植物の増殖方法である。具体的には、カルスから不定胚を誘導し、該不定胚を培養することにより、カルスを植物に再生し、植物の増殖を行えばよい。更に具体的には、カルスから不定胚を誘導し、該不定胚を培養することにより、シュートを形成させ、該シュートを培養することにより、カルスを植物に再生し、植物の増殖を行えばよい。
【００３９】
カルスとしては、安定的にカルスを得ることができるという理由から、植物の組織片からカルスを誘導し、誘導したカルスを使用することが好ましい。すなわち、本発明の植物の増殖方法は、植物の組織片からカルスを誘導する工程と、カルスから不定胚を誘導する工程とを含むことが好ましい。
【００４０】
具体的には、本発明の植物の増殖方法は、植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する誘導工程と、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる再生誘導工程と、シュートを発根培地で培養することにより発根させる発根工程とを含むことが好ましく、植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する誘導工程と、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる再生誘導工程と、形成されたシュートを伸長培地で培養することにより伸長させる伸長工程と、伸長させたシュートを発根培地で培養することにより発根させる発根工程とを含むことがより好ましい。すなわち、本発明の植物の再生方法としては、上記再生誘導工程と、上記発根工程とを含むことが好ましく、上記再生誘導工程と、上記伸長工程と、上記発根工程とを含むことがより好ましい。
【００４１】
以下において、上記各工程について説明する。
【００４２】
（誘導工程）
誘導工程では、例えば、植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する。
【００４３】
組織片としては、特に限定されないが、具体的には、葉、茎、根、芽、花弁、子葉、胚軸、葯、及び種子からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。なかでも、葉、茎が好ましい。
また、乳液の含有量が少ない組織、具体的には、花弁、葯、種子を使用することも好ましい。
【００４４】
誘導工程では、まず、植物の組織片の表面を洗浄する。組織片として植物の内部にある組織を利用する場合は、例えば、磨き粉で洗浄しても良いが、界面活性剤を約０．１％含む水で洗浄してもよい。葉などを利用する場合は、軟らかいスポンジで表面を洗浄することが好ましい。
【００４５】
次に、組織片を殺菌又は滅菌する。殺菌又は滅菌は、周知の殺菌剤、滅菌剤を用いて行うことができるが、エタノール、塩化ベンザルコニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液が好ましい。
【００４６】
次に、殺菌又は滅菌した組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することにより、カルスの誘導を行う。なお、誘導培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、カルス化しやすいため、固体培養が好ましい。また、誘導培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【００４７】
植物生長ホルモンとしては、例えば、オーキシン系植物ホルモン及び／又はサイトカイニン系植物ホルモンが挙げられる。
【００４８】
オーキシン系植物ホルモンとしては、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸、インドール酢酸、インドールプロピオン酸、クロロフェノキシ酢酸、ナフトキシ酢酸、フェニル酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、パラクロロフェノキシ酢酸、２−メチル−４−クロロフェノキシ酢酸、４−フルオロフェノキシ酢酸、２−メトキシ−３，６−ジクロロ安息香酸、２−フェニル酸、ピクロラム、ピコリン酸等が挙げられる。なかでも、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸が好ましく、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸がより好ましく、キク科に属する植物（好ましくはＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシ）の場合にはナフタレン酢酸が更に好ましく、トウダイグサ科に属する植物（好ましくはＨｅｖｅａ属に属する植物、特に、パラゴムノキ）の場合には２，４−ジクロロフェノキシ酢酸が更に好ましい。
【００４９】
サイトカイニン系植物ホルモンとしては、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチン、ベンジルアミノプリン、イソペンチニルアミノプリン、チジアズロン、イソペンテニルアデニン、ゼアチンリポシド、ジヒドロゼアチン等が挙げられる。なかでも、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンが好ましく、ベンジルアデニン、カイネチンがより好ましく、キク科に属する植物（好ましくはＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシ）の場合にはベンジルアデニンが更に好ましく、トウダイグサ科に属する植物（好ましくはＨｅｖｅａ属に属する植物、特に、パラゴムノキ）の場合にはカイネチンが更に好ましい。
【００５０】
炭素源としては、特に限定されず、スクロース、グルコース、トレハロース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アロース、タロース、グロース、アルトロース、マンノース、イドース、アラビノース、アピオース、マルトース等の糖類が挙げられる。なかでも、スクロース、グルコースが好ましく、スクロースがより好ましい。
【００５１】
誘導培地としては、Ｗｈｉｔｅの培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、Ｈｅｌｌｅｒの培地（Ｈｅｌｌｅｒ  Ｒ，  Ｂｏｔ．Ｂｉｏｌ．Ｖｅｇ．Ｐａｒｉｓ  １４  １−２２３（１９５３））、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、ＭＢ培地、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましい。また、カルスの維持および細胞分裂の促進に適しているという理由から、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを含むことが好ましい。
【００５２】
誘導培地を固体培地とする場合、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。固形化剤としては、特に限定されず、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、ゼラチン、シリカゲル、アガー、フィタゲル等が挙げられる。
【００５３】
好適な誘導培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、キク科に属する植物（好ましくはＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシ）、トウダイグサ科に属する植物（好ましくはＨｅｖｅａ属に属する植物、特に、パラゴムノキ）の場合は）以下の組成である。
【００５４】
誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。なお、本明細書において、炭素源の濃度とは、糖類の濃度を意味する。
【００５５】
誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．０５ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上である。植物が、トウダイグサ科に属する植物（好ましくはＨｅｖｅａ属に属する植物、特に、パラゴムノキ）の場合、最も好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２．５ｍｇ／ｌ以下である。
【００５６】
誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．１ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上である。植物が、トウダイグサ科に属する植物（好ましくはＨｅｖｅａ属に属する植物、特に、パラゴムノキ）の場合、最も好ましくは０．８ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは３ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以下、最も好ましくは１．２ｍｇ／ｌ以下である。
【００５７】
誘導培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましく、５．７〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜３０℃がより好ましい。植物が、キク科に属する植物（好ましくはＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシ）の場合、培養温度は２０〜２６℃であることが更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、２０００〜２５０００ｌｘがより好ましい。培養時間は、特に限定されないが、１〜１０週間培養することが好ましい。
なお、本明細書において、固体培地のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。また、本明細書において、暗所とは、照度が０〜０．１ｌｘであることを意味し、明所とは、照度が０．１ｌｘを超えていることを意味する。
【００５８】
固体培地の場合、誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．６質量％以下である。
【００５９】
上述の条件のなかでも、特に、植物が、キク科に属する植物（好ましくはＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシ）の場合、オーキシン系植物ホルモンがナフタレン酢酸で、その濃度が０．５〜２．５ｍｇ／ｌで、サイトカイニン系植物ホルモンがベンジルアデニンで、培養温度が２０〜２６℃であることが特に好ましい。
【００６０】
上述の条件のなかでも、特に、植物が、トウダイグサ科に属する植物（好ましくはＨｅｖｅａ属に属する植物、特に、パラゴムノキ）の場合、オーキシン系植物ホルモンが２，４−ジクロロフェノキシ酢酸で、その濃度が１．５〜２．５ｍｇ／ｌで、サイトカイニン系植物ホルモンがカイネチンで、その濃度が０．８〜１．２ｍｇ／ｌであることが特に好ましい。
【００６１】
以上のように、殺菌又は滅菌した組織片を上記誘導培地中で培養することにより、カルスの誘導を行うことが可能である。
【００６２】
本発明では、誘導されたカルスの遺伝子を組み換えてもよい。組み換え遺伝子の導入方法は一般的に用いられているものを、通常知られた条件で使用すればよく、例えば、プロトプラスト法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法（以上「生物化学実験法４１植物細胞工学入門」１９９８年９月１日、学会出版センター、第２５５頁〜３２６頁，「植物バイオテクノロジー」２００９年５月２５日、幸書房、第１３０頁〜１３６頁）などがあるが、これらに限らない。
【００６３】
誘導したカルスをそのまま再生誘導工程に用いてもよいが、より多量の植物を増殖できるという理由から、誘導したカルスをまず増殖させ、増殖させたカルスを再生誘導工程に用いることが好ましい。カルスの増殖は、カルスが増殖可能な条件でカルスを培養すればよく、例えば、誘導工程と同様の培地組成、培養条件でカルスの培養を行うことにより、カルスの増殖が可能である。
【００６４】
（再生誘導工程）
再生誘導工程では、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中でカルスを培養することにより不定胚及びシュートを形成させる。カルスから不定胚を誘導（形成）し、不定胚を培養することにより、安定的にシュートの形成を行うことができるため、再生誘導工程の培養条件は、カルスから不定胚を誘導できる条件であれば、特に限定されない。
【００６５】
再生誘導工程では、例えば、誘導工程により誘導されたカルス（上述の方法等により遺伝子が組み換えられていてもよく、また、誘導工程により誘導されたカルスを増殖させたものであってもよい）を再生誘導培地中で培養して不定胚を誘導する。なお、再生誘導培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、不定胚を誘導しやすいため、固体培養が好ましい。また、再生誘導培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【００６６】
再生誘導培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましく、ＭＳ培地に植物生長ホルモンを加えたものがより好ましい。植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。また、不定胚の誘導に適しているという理由から、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを含むことが好ましく、ナフタレン酢酸及びベンジルアデニンを含むことがより好ましい。
【００６７】
再生誘導培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【００６８】
好適な再生誘導培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、キク科に属する植物（好ましくはＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシ）、トウダイグサ科に属する植物（好ましくはＨｅｖｅａ属に属する植物、特に、パラゴムノキ）の場合は）以下の組成である。
【００６９】
再生誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上、更に好ましくは２質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは５質量％以下である。キク科に属する植物（好ましくはＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシ）の場合、特に好ましくは４質量％以下である。
【００７０】
再生誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは５×１０−３ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．０１ｍｇ／ｌ以上であり、トウダイグサ科に属する植物（好ましくはＨｅｖｅａ属に属する植物、特に、パラゴムノキ）の場合、最も好ましくは０．０３ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは８ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは５ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは１ｍｇ／ｌ以下、最も好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以下、より最も好ましくは０．１ｍｇ／ｌ以下、キク科に属する植物（好ましくはＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシ）の場合、更に最も好ましくは０．０３ｍｇ／ｌ以下である。
【００７１】
再生誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．０１ｍｇ／ｌ以上、特に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上、最も好ましくは０．８ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは５ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは２ｍｇ／ｌ以下、最も好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以下、より最も好ましくは１．２ｍｇ／ｌ以下である。サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が上記範囲内の場合に、特に、不定胚を好適に誘導でき、好適にシュートを形成できる。
【００７２】
再生誘導培地には、組織の成長阻害物質蓄積の防止のため、ＦｅＮａＥＤＴＡを培地中に添加してもよい。また、不定胚形成促進のために、ジベレリンを添加してもよい。
【００７３】
再生誘導培地のｐＨは、特に限定されないが、４．０〜１０．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜３６℃がより好ましく、２３〜３２℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、２４時間中１０〜１６時間明所で培養を行うことが好ましく、明所の照度は、２０００〜２５０００ｌｘが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、５〜４８週間培養することが好ましく、５〜２４週間培養することがより好ましく、キク科に属する植物（好ましくはＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシ）の場合、５〜１０週間培養することが更に好ましい。また、トウダイグサ科に属する植物（好ましくはＨｅｖｅａ属に属する植物、特に、パラゴムノキ）の場合、１６〜４８週間培養することが特に好ましい。
【００７４】
固体培地の場合、再生誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．１５質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．６質量％以下、特に好ましくは０．３質量％以下である。
【００７５】
キク科に属する植物（好ましくはＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシ）の場合、再生誘導培地は、ベースとなる培地としてＭＳ培地を使用し、再生誘導培地中のスクロースの濃度が２〜４質量％、ナフタレン酢酸の濃度が１×１０−３〜０．０３ｍｇ／ｌ、ベンジルアデニンの濃度が０．８〜１．２ｍｇ／ｌ、固形化剤（ゲランガム）の濃度が０．１〜０．３質量％であることが好ましい。
【００７６】
トウダイグサ科に属する植物（好ましくはＨｅｖｅａ属に属する植物、特に、パラゴムノキ）の場合、再生誘導培地は、ベースとなる培地としてＭＳ培地を使用し、再生誘導培地中のナフタレン酢酸の濃度が０．０３〜０．５ｍｇ／ｌ、ベンジルアデニンの濃度が０．０１〜１．２ｍｇ／ｌ、固形化剤（ゲランガム）の濃度が０．１〜０．６質量％であることが好ましい。
【００７７】
以上のように、再生誘導工程では、カルスを上記再生誘導培地中で培養することにより、不定胚及びシュートを形成させることが可能である。この再生誘導工程により形成されたシュートは、次の伸長工程に使用される。次の伸長工程に移るタイミングとしては、シュートが視認され、その後安定して成長していることが確認できた後が好ましい。なお、次の伸長工程を省略して、再生誘導工程により形成されたシュートを直接発根工程に使用してもよい。また、再生誘導工程は、本発明の不定胚誘導方法に該当する。
【００７８】
（伸長工程）
伸長工程では、形成されたシュートを伸長培地で培養することによりシュートを伸長させる。
【００７９】
伸長工程では、例えば、再生誘導工程により形成されたシュートを伸長培地中で培養してシュートを伸長させる。なお、伸長培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、シュートを伸長させやすいため、固体培養が好ましい。また、伸長培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【００８０】
伸長培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等を使用すればよいが、シュートを好適に伸長できるという理由から、植物が、特に、キク科に属する植物（好ましくはＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシ）の場合には、伸長培地が、植物生長ホルモンを含まない培地であることが好ましく、植物生長ホルモンを含まないＭＳ培地であることがより好ましい。なお、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。
【００８１】
伸長培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【００８２】
伸長工程における好適な培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、キク科に属する植物（好ましくはＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシ）、トウダイグサ科に属する植物（好ましくはＨｅｖｅａ属に属する植物、特に、パラゴムノキ）の場合は）以下の条件である。
【００８３】
伸長培地のｐＨは、特に限定されないが、４．０〜１０．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜３６℃がより好ましく、２０〜３０℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、２４時間中１０〜１６時間明所で培養を行うことが好ましく、明所の照度は、２０００〜２５０００ｌｘが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、５〜１０週間培養することが好ましい。
【００８４】
固体培地の場合、伸長培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．６質量％以下である。
【００８５】
以上のように、伸長工程では、形成されたシュートを上記伸長培地中で培養することにより、シュートを伸長させることが可能である。また、この伸長工程では、シュートが伸長するだけではなく、新たなシュートも形成される。この伸長工程により伸長させたシュートは、次の発根工程に使用される。次の発根工程に移るタイミングとしては、シュートが２〜３ｃｍ程度の大きさに伸長した後が好ましい。
【００８６】
（発根工程）
発根工程では、シュートを発根培地で培養することにより発根させる。ここで、シュートとしては、伸長工程により伸長させたシュートを使用してもよく、再生誘導工程により形成されたシュートを直接使用してもよい。
【００８７】
発根工程では、例えば、伸長工程により伸長させたシュート又は再生誘導工程により形成されたシュートを発根培地中で培養して発根させる。なお、発根培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、発根させやすいため、固体培養が好ましい。また、発根培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【００８８】
発根培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等を使用すればよいが、好適に発根できるという理由から、発根培地が、植物生長ホルモンを含まない培地であることが好ましく、キク科に属する植物（好ましくはＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシ）の場合、植物生長ホルモンを含まないＢ５培地がより好ましく、トウダイグサ科に属する植物（好ましくはＨｅｖｅａ属に属する植物、特に、パラゴムノキ）の場合、１／２ＭＳ培地がより好ましい。なお、該１／２ＭＳ培地は、植物生長ホルモンを含んでいてもよく、含まなくてもよい。また、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。なお、伸長培地と発根培地の組成が同一であってもよい。また、伸長工程において既に発根している場合には、この発根工程を省略してもよい。
【００８９】
発根培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【００９０】
発根工程における好適な培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、キク科に属する植物（好ましくはＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシ）、トウダイグサ科に属する植物（好ましくはＨｅｖｅａ属に属する植物、特に、パラゴムノキ）の場合は）以下の条件である。
【００９１】
発根培地のｐＨは、特に限定されないが、４．０〜１０．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３６℃がより好ましく、２０〜３０℃が更に好ましく、キク科に属する植物（好ましくはＳｏｎｃｈｕｓ属に属する植物、特に、ノゲシ）の場合、２０〜２５℃が特に好ましい。また、トウダイグサ科に属する植物（好ましくはＨｅｖｅａ属に属する植物、特に、パラゴムノキ）の場合、２５〜３２℃が特に好ましい。
培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、２４時間中１０〜１６時間明所で培養を行うことが好ましく、明所の照度は、２０００〜２５０００ｌｘが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、４〜１０週間培養することが好ましい。
【００９２】
固体培地の場合、発根培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上、更に好ましくは０．３質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．６質量％以下である。
【００９３】
以上のように、発根工程では、伸長したシュートを上記発根培地中で培養することにより、発根させることが可能であり、発根させたシュート（幼植物）が得られる。この幼植物は、直接土壌に移植してもよいが、バーキュライト等の人工土壌に移して馴化してから土壌に移植することが好ましい。
【００９４】
以上の説明の通り、本発明では、カルスから不定胚を誘導し、不定胚を培養することにより、安定的にシュートを形成させ、形成させたシュートを伸長させ、発根させることができ、カルスを安定的に植物に再生できる。また、制御された環境下で組織培養を行うことにより、天候や季節等に影響されずに安定的に植物を増殖できる。
【実施例】
【００９５】
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。【００９６】
以下、ノゲシを用いた実施例で使用した各種薬品について、まとめて説明する。
ＮＡＡ：ナフタレン酢酸
ＢＡ：ベンジルアデニン
ノゲシ：神戸市灘区で自生しているノゲシの種子から、無菌的に発芽させた植物体を使用した【００９７】
（カルスの誘導（誘導工程））
ノゲシから葉及び茎を採取した。次に、採取した葉及び茎の表面を流水で洗浄し、さらに７０％エタノールで洗浄した後、約５〜１０％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、再度流水で洗浄した。【００９８】
次に、滅菌した葉及び茎の組織を誘導培地（固体培地）に差込み、培養を行った（誘導工程）。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）に、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、ベンジルアデニン（ＢＡ）、スクロースをそれぞれ１．０ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、３質量％となるように添加し、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した後、ゲランガムを０．２質量％となるように添加し、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。【００９９】
ノゲシの組織片を誘導培地（固体培地）に差込み、培養温度２３℃、明所（１００００ｌｘ）で４週間培養し、ノゲシの組織片からカルス（未分化細胞）を誘導した。【０１００】
（不定胚及びシュート形成のための培地検討（再生誘導工程））
次に、誘導されたカルスを用いて、カルスから不定胚及びシュートを形成させるための培地（再生誘導培地）条件の検討を基本培地であるＭＳ培地を用いて行った。具体的には、ＭＳ培地に、オーキシン系植物ホルモンであるＮＡＡ、サイトカイニン系植物ホルモンであるＢＡ、糖類であるスクロースを種々の濃度となるように添加した培地を用いて検討を行った（表１参照）。また、ｐＨは、５．７〜５．８に調整した。なお、固形化剤であるゲランガムは０．２質量％となるように培地に添加した。そして、調製した各固体培地（滅菌済み）を用いて、誘導工程により誘導されたカルスを培養温度２３℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間培養した。８週間培養した後の不定胚の形成率を表１に示す。不定胚が形成された培地では、不定胚の形成後にシュートの形成も観察された。一方、不定胚が形成されなかった培地では、シュートも形成されなかった。このことから、カルスから不定胚を誘導することにより、安定的にシュートが形成されることが分かった。
なお、不定胚の形成率は、不定胚を形成したカルスの個数を、再生誘導培地に移植したカルスの個数で割ることにより算出した。【０１０１】
（シュート伸長（伸長工程））
次に、シュート伸長のために、形成されたシュートを、植物生長ホルモンを含まないＭＳ培地に移植した。該培地のｐＨは、５．７に調整した。０．４％のゲランガムを含む固体培地（滅菌済み）を用い、培養温度２３℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間培養した。植物生長ホルモンを含まない培地で培養することにより、良好にシュート伸長が観察された。結果を表１に示す。【０１０２】
（発根（発根工程））
次に、発根のために、３ｃｍ程度に成長したシュートを、植物成長ホルモンを含まないＢ５培地に移植した。該培地のｐＨは、５．８に調整した。０．４％のゲランガムを含む固体培地（滅菌済み）を用い、培養温度２３℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間培養した。植物生長ホルモンを含まない培地で培養することにより、良好に発根が観察された。結果を表１に示す。
なお、表１において、以下の基準でシュートの伸長、発根を評価した。
○：１０％以上でシュートの伸長・発根が見られる
△：１０％未満でシュートの伸長・発根が見られる
×：シュート伸長なし【０１０３】
【表１】
2014038564.tif 000002
【０１０４】
表１の結果より、再生誘導工程において、不定胚の形成率が高い場合に、その後のシュート形成、伸長、発根が安定的に進行することが分かった。このことから、カルスから不定胚を誘導することにより、その後、安定的にシュートが形成され、形成されたシュートが伸長し、発根させることができ、カルスを安定的に植物に再生でき、更には、安定的に植物の増殖が可能であることが分かった。【０１０５】
以下、パラゴムノキを用いた実施例で使用した各種薬品について、まとめて説明する。
ＮＡＡ：ナフタレン酢酸
２，４−Ｄ：２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
ＩＢＡ：インドール酪酸
ＢＡ：ベンジルアデニン
ＫＩ：カイネチン
ゲル化剤：ゲルライト、ゲランガム
パラゴムノキ：東京大学大学院農学生命科学研究科附属  科学の森教育研究センター  樹芸研究所より入手【０１０６】
（カルスの誘導（誘導工程））
パラゴムノキから葉を採取した。次に、採取した葉の表面を流水で洗浄し、さらに７０％エタノールで洗浄した後、約５〜１０％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、再度流水で洗浄した。【０１０７】
次に、滅菌した葉の組織を誘導培地（固体培地）に差込み、培養を行った（誘導工程）。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）に、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、カイネチン（ＫＩ）、スクロースをそれぞれ２．０ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、３質量％となるように添加し、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した後、ゲランガムを０．２質量％となるように添加し、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。【０１０８】
パラゴムノキの組織片を誘導培地（固体培地）に差込み、培養温度２５℃、暗所で８週間培養し、パラゴムノキの組織片からカルス（未分化細胞）を誘導した。【０１０９】
（不定胚及びシュート形成のための培地検討（再生誘導工程））
次に、誘導されたカルスを用いて、カルスから不定胚及びシュートを形成させるための培地（再生誘導培地）条件の検討を基本培地であるＭＳ培地を用いて行った。具体的には、ＭＳ培地に、オーキシン系植物ホルモンであるＮＡＡ、サイトカイニン系植物ホルモンであるＢＡ、糖類であるスクロースを種々の濃度となるように添加し、必要に応じてＦｅＮａＥＤＴＡ、ジベレリンも添加した培地を用いて検討を行った（表２参照）。また、ｐＨは、５．７〜５．８に調整した。なお、固形化剤であるゲランガムは０．４質量％となるように培地に添加した。そして、調製した各固体培地（滅菌済み）を用いて、誘導工程により誘導されたカルスを培養温度２５℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で３〜６ヶ月培養した。なお、１ヶ月培養する毎に培地を交換した。３〜６ヶ月間培養した後の不定胚の形成率を表２に示す。不定胚が形成された培地では、不定胚の形成後にシュートの形成も観察された。一方、不定胚が形成されなかった培地では、シュートも形成されなかった。このことから、カルスから不定胚を誘導することにより、安定的にシュートが形成されることが分かった。
なお、不定胚の形成率は、不定胚を形成したカルスの個数を、再生誘導培地に移植したカルスの個数で割ることにより算出した。【０１１０】
（シュート伸長（伸長工程））
次に、シュート伸長のために、形成されたシュートを、再生誘導培地と同様の組成の培地で継代培養した。培養温度２５℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間培養した。良好にシュート伸長が観察された。結果を表２に示す。【０１１１】
（発根（発根工程））
次に、発根のために、３ｃｍ程度に成長したシュートを、植物成長ホルモンを含まない１／２ＭＳ培地又は植物成長ホルモンを含む１／２ＭＳ培地に移植した。該培地のｐＨは、５．７に調整した。０．４％のゲランガムを含む固体培地（滅菌済み）を用い、培養温度２５℃、２４時間中１２時間の照明下（１００００ｌｘ）で８週間培養した。上記培地で培養することにより、良好に発根が観察された。結果を表２に示す。
なお、表２において、以下の基準でシュートの伸長、発根を評価した。
○：１０％以上でシュートの伸長・発根が見られる
△：１０％未満でシュートの伸長・発根が見られる
×：シュート伸長なし【０１１２】
【表２】
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【０１１３】
表２の結果より、再生誘導工程において、不定胚の形成率が高い場合に、その後のシュート形成、伸長、発根が安定的に進行することが分かった。このことから、カルスから不定胚を誘導することにより、その後、安定的にシュートが形成され、形成されたシュートが伸長し、発根させることができ、カルスを安定的に植物に再生でき、更には、安定的に植物の増殖が可能であることが分かった。
【図１】
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【国際調査報告】
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