(57)【要約】生理活性物質のキャリアになりうる、弱酸性環境に応答して膜破壊機能促進効果を発現するｐＨ感受性担体およびその製造方法、並びに該担体を含むｐＨ感受性医薬、ｐＨ感受性医薬組成物、およびこれを用いた培養方法を提供する。  デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、を含む、膜破壊機能促進効果を発現する、ｐＨ感受性担体。
2013180253.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、
炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、
を含む、膜破壊機能促進効果を発現する、ｐＨ感受性担体。
【請求項２】
前記ｐＨ感受性化合物と前記両親媒性物質とが、ミセル状の粒子を形成する、請求項１に記載のｐＨ感受性担体。
【請求項３】
粒子径が１０〜２００ｎｍである、請求項２に記載のｐＨ感受性担体。
【請求項４】
前記ｐＨ感受性化合物が、前記両親媒性物質１００モルに対して１０モル以上の割合で含有される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｐＨ感受性担体。
【請求項５】
溶出性試験におけるｐＨ感受性化合物単独の溶出率をＬａ、両親媒性物質単独の溶出率をＬｂ、ｐＨ感受性担体の溶出率をＬｃとし、
ｐＨ７．４の溶出率を、それぞれ、Ｌｃ７．４、Ｌａ７．４、Ｌｂ７．４と表し、ｐＨ５．０または４．５の溶出率を、それぞれ、Ｌｃｘ、Ｌａｘ、Ｌｂｘと表した場合に、下記式（１）で表されるΔが５以上であり、下記式（２）で表されるΔ’が５以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のｐＨ感受性担体。
【数１】
2013180253.tif 000016
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のｐＨ感受性担体が生理活性物質を担持してなる、ｐＨ感受性医薬。
【請求項７】
前記生理活性物質がタンパク質またはペプチドである請求項６に記載のｐＨ感受性医薬。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のｐＨ感受性担体および生理活性物質を含む、ｐＨ感受性医薬組成物。
【請求項９】
前記生理活性物質がタンパク質またはペプチドである請求項８に記載のｐＨ感受性医薬組成物。
【請求項１０】
デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、
炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、
を会合させる工程を含む、膜破壊機能促進効果を発現する、ｐＨ感受性担体の製造方法。
【請求項１１】
細胞を、請求項６または７に記載のｐＨ感受性医薬および／または請求項８または９に記載のｐＨ感受性医薬組成物を含む培地で培養する工程を含む、培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐＨ感受性担体およびその製造方法、並びに該担体を含むｐＨ感受性医薬、ｐＨ感受性医薬組成物およびこれを用いた培養方法に関する。より詳しくは、本発明はＤＤＳ（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）として有用な、弱酸性環境に応答して膜破壊機能促進効果を発現するｐＨ感受性担体およびその製造方法、並びに該担体を含むｐＨ感受性医薬、ｐＨ感受性医薬組成物およびこれを用いた培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生理活性物質を必要な部位に必要な量を送達するためのＤＤＳキャリア（担体）の研究が盛んに行われている。刺激応答性のキャリアは集積性の向上や送達部位の選択の観点から注目されており、熱や磁気などの外部刺激や、分子認識、ｐＨ変化、酵素反応などの生体内の刺激を利用する検討など、数多くの報告がある。なかでも、弱酸性のｐＨに感受性をもつキャリアは古くから注目されている。【０００３】
例えば、弱酸性環境に応答するｐＨ感受性担体として、ＰＥ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）を含むリポソームに、ＰＨＣ（Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ  Ｈｏｍｏｃｙｓｅｉｎｅ）やオレイン酸、ＣＨＥＭＳ（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  Ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ）など、種々のｐＨ感受性素子を加えたｐＨ感受性リポソームがよく知られている（Ｓ．Ｓｉｍｏｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉ．Ｒｅｖ．２００４  ５６  ９４７−９６５など）。最近では、機能を高めることを目的にＰＥＡＡ（Ｐｏｌｙ（２−ｅｔｈｙｌａｃｒｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ））やＳｕｃＰＧ（Ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｐｏｌｙ（ｇｌｙｃｉｄｏｌ））など新規の合成材料や、ＧＡＬＡやｐＨＬＩＰ（ｐＨ  Ｌｏｗ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）などの合成ペプチド、ＰＬＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ））など生分解性の材料、ｐＨ感受性のウイルスの成分を用いたＶＬＰ（Ｖｉｒｕｓ  Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ）やＶｉｒｏｓｏｍｅなどの検討が報告されている。【０００４】
また、ｐＨ感受性のキャリアは、腫瘍や炎症など生体内においてｐＨが低下している部位への効率の良い生理活性物質の送達（Ｒｅｓｈｅｔｎｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＣ  ２００７  ｖｏｌ，１０４，１９，７８９３−７８９８）や、細胞に取り込まれた後の小胞の酸性化を利用した細胞質基質への送達などについても期待されている。【０００５】
小胞の酸性化を利用した細胞質基質への送達としては、エンドソームに送達された際にキャリアの膜融合を促進させることで、薬物の細胞質基質への移行が促進されることを見出し、ｐＨに応答して構造を変化させるｐＨ感受性部位と、膜融合する部位と、膜貫通部位と、を有するペプチド誘導体のＤＤＳキャリアが報告されている（特開２００６−３４２１１号公報）。【０００６】
このような細胞質基質への生理活性物質の送達は、種々の分野に活用可能であることから、実現の要望が極めて高い技術である。例えば、ＲＮＡやＤＮＡの細胞質基質への送達は遺伝子治療を可能にし、抗原を細胞質基質に送達することでＣＴＬ（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）を誘導するものと期待されている。また、低分子抗癌剤の細胞質基質送達は活性を向上させる効果があると報告されており、細胞内をドラッグターゲットとした新規薬剤への適用も検討されている。生理活性物質の細胞質基質への送達はこれらの分野の主要な課題であり、実現に向けた鍵となる技術である。【０００７】
そして、ｐＨ６以下に感受性を有するｐＨＬＩＰによるａｃｉｄｏｓｉｓ部位への送達の成功事例（Ｒｅｓｈｅｔｎｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＣ  ２００７  ｖｏｌ，１０４，１９，７８９３−７８９８）や、エンドソーム内の到達ｐＨが４付近である（Ｓ．Ｓｉｍｏｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉ．Ｒｅｖ．２００４  ５６  ９４７−９６５）ことから、ｐＨ感受性の担体は中性からｐＨ４までの間に高い感受性をもつことが求められている。このことは多くの文献において指摘されているとおりである。また、安全な材料からなることも実用を考慮した場合、重要である。
【発明の概要】
【０００８】
多くのｐＨ感受性リポソームや一部の生分解性材料などは、比較的低いｐＨにおいて感受性を有することや、不十分な機能しかもたないことが問題となっている。また、ｐＨ感受性物質を直接修飾する方法は、生理活性物質の活性の低下が懸念される。また、新規の合成材料や、ウイルスの成分を用いることは安全性の観点から懸念が存在している。
【０００９】
したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、生理活性物質のキャリアになりうる、弱酸性環境に応答して膜破壊機能促進効果を発現するｐＨ感受性担体およびその製造方法、並びに該担体を含むｐＨ感受性医薬、ｐＨ感受性医薬組成物およびこれを用いた培養方法を提供することを目的とする。
【００１０】
上記目的を達成するための本発明は、（１）デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、を含む、膜破壊機能促進効果を発現する、ｐＨ感受性担体である。
【００１１】
また、上記目的を達成するための本発明は、（２）前記ｐＨ感受性化合物と前記両親媒性物質とが、ミセル状の粒子を形成する、上記（１）に記載のｐＨ感受性担体である。
【００１２】
さらに、上記目的を達成するための本発明は、（３）粒子径が１０〜２００ｎｍである、上記（２）に記載のｐＨ感受性担体である。
【００１３】
また、上記目的を達成するための本発明は、（４）前記ｐＨ感受性化合物が、前記両親媒性化合物１００モルに対して１０モル以上の割合で含有される、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のｐＨ感受性担体である。
【００１４】
さらに、上記目的を達成するための本発明は、（５）溶出性試験におけるｐＨ感受性化合物単独の溶出率をＬａ、両親媒性物質単独の溶出率をＬｂ、ｐＨ感受性担体の溶出率をＬｃとし、ｐＨ７．４の溶出率を、それぞれ、Ｌｃ７．４、Ｌａ７．４、Ｌｂ７．４と表し、ｐＨ５．０または４．５の溶出率を、それぞれ、Ｌｃｘ、Ｌａｘ、Ｌｂｘと表した場合に、下記式（１）で表されるΔが５以上であり、下記式（２）で表されるΔ’が５以上である、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のｐＨ感受性担体である。
【００１５】
【数１】
2013180253.tif 000003
【００１６】
また、上記目的を達成するための本発明は、（６）上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載のｐＨ感受性担体が生理活性物質を担持してなる、ｐＨ感受性医薬である。
【００１７】
さらに、上記目的を達成するための本発明は、（７）前記生理活性物質がタンパク質またはペプチドである上記（６）に記載のｐＨ感受性医薬である。
【００１８】
また、上記目的を達成するための本発明は、（８）上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載のｐＨ感受性担体および生理活性物質を含む、ｐＨ感受性医薬組成物である。
【００１９】
さらに、上記目的を達成するための本発明は、（９）前記生理活性物質がタンパク質またはペプチドである上記（８）に記載のｐＨ感受性医薬組成物である。
【００２０】
また、上記目的を達成するための本発明は、（１０）デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、を会合させる工程を含む、膜破壊機能促進効果を発現する、ｐＨ感受性担体の製造方法である。
【００２１】
さらに、上記目的を達成するための本発明は、（１１）細胞を、上記（６）または（７）に記載のｐＨ感受性医薬および／または上記（８）または（９）に記載のｐＨ感受性医薬組成物を含む培地で培養する工程を含む、培養方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明のｐＨ感受性担体および該担体に生理活性物質が担持されてなる医薬の模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｐＨ感受性医薬を用いた場合において、ｐＨ感受性担体が膜破壊機能促進作用を発現することにより、ｐＨ感受性担体に担持された生理活性物質を細胞質基質にデリバリーする模式図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ｐＨ感受性医薬組成物を用いた場合において、ｐＨ感受性担体が膜破壊機能促進作用を発現することにより、ｐＨ感受性担体と混合された生理活性物質を細胞質基質にデリバリーする模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、種々の濃度でデオキシコール酸を含む、ＥＹＰＣ（Ｅｇｇ  Ｙｏｌｋ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）とデオキシコール酸とを含む分散液の写真である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、種々の濃度でデオキシコール酸を含む、ＤＬＰＣ（Ｄｉｌａｕｒｏｙｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）とデオキシコール酸とを含む分散液の写真である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＥＹＰＣとデオキシコール酸とを含む分散液の透過度を示すグラフである。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＤＬＰＣとデオキシコール酸とを含む分散液の透過度を示すグラフである。
【図３】図３は、デオキシコール酸量に対する、ＥＹＰＣとデオキシコール酸とを含む分散液のゼータポテンシャルを示すグラフである。
【図４】図４は、種々のｐＨにおけるＥＹＰＣ単独、ＤＬＰＣ単独、デオキシコール酸単独、ＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体およびＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の溶出率を示すグラフである。
【図５】図５（Ａ）は、二重蛍光標識したリポソームとインキュベーションした場合における、種々のｐＨでのＥＹＰＣ単独、ＤＬＰＣ単独、デオキシコール酸単独、ＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体およびＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の蛍光強度比を示すグラフであり、図５（Ｂ）はデオキシコール酸単独、ＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体およびＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の融合率を示すグラフである。
【図６】図６は、種々のｐＨに対する、ＤＯＰＥ（Ｄｉｏｌｅｏｙｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔａｎｏｌａｍｉｎｅ）−Ｃｈｅｍｓリポソーム、ＤＯＰＥ−オレイン酸リポソーム、およびＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の溶出率を示すグラフである。
【図７】図７（Ａ）および（Ｂ）は、デオキシコール酸量に対する、デオキシコール酸単独、ＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体およびＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の融合率を示すグラフである。
【図８】図８（Ａ）は、デオキシコール酸単独、ＤＳＰＣ（Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）−デオキシコール酸複合体、ＤＰＰＣ（Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）−デオキシコール酸複合体、ＤＭＰＣ（Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）−デオキシコール酸複合体、ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体、およびＤＤＰＣ（Ｄｉｄｅｃａｎｏｙｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）−デオキシコール酸複合体の融合率を示す図である。図８（Ｂ）は、デオキシコール酸単独、ＨＳＰＣ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｅｔｅｄ  Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）−デオキシコール酸複合体、ＤＯＰＣ（Ｄｉｏｌｅｏｙｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）−デオキシコール酸複合体およびＰＯＰＣ（１−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ  ２−Ｏｌｅｏｙｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）−デオキシコール酸複合体の融合率を示すグラフである。
【図９】図９（Ａ）は、デオキシコール酸単独、ＤＬＰＥ（Ｄｉｌａｕｒｏｙｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔａｎｏｌａｍｉｎｅ）単独、ＤＭＰＥ（Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔａｎｏｌａｍｉｎｅ）単独、ＤＳＰＥ（Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔａｎｏｌａｍｉｎｅ）単独、およびＤＯＰＥ単独の溶出率を示すグラフである。図９（Ｂ）は、デオキシコール酸単独、ＤＬＰＥ−デオキシコール酸複合体、ＤＭＰＥ−デオキシコール酸複合体、ＤＳＰＥ−デオキシコール酸複合体、およびＤＯＰＥ−デオキシコール酸複合体の溶出率を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ｐＨ５．０におけるデオキシコール酸と高分子材料との複合体の溶出率を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ＥＹＰＣとデオキシコール酸とＤＬＰＣまたはＳＰＡＮ８５との複合体の（Ａ）ｐＨ７．４、（Ｂ）ｐＨ５．０における溶出率を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ＤＬＰＣと種々の候補化合物との複合体の（Ａ）ｐＨ７．４、（Ｂ）ｐＨ５．０における溶出率を示すグラフである。
【図１３】図１３は、種々のｐＨにおけるＤＬＰＣと種々の候補化合物との複合体の溶出率を示すグラフである。
【図１４】図１４は、（Ａ）種々のｐＨ感受性化合物単独、（Ｂ）ＤＬＰＣと種々のｐＨ感受性化合物との複合体の融合率を示すグラフである。
【図１５】図１５は、蛍光標識したＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体とＨｅＬａ細胞とを、（Ａ）ｐＨ７．４、（Ｂ）ｐＨ５．３のメディウム中にてインキュベーションした場合の顕微鏡写真である。また、（Ｃ）はフローサイトメーターを用いて評価した細胞の蛍光強度である。
【図１６】図１６は、ｐＨ７．４およびｐＨ５．０における（Ａ）ペプチド、（Ｂ）タンパク質を組み込んだ担体の溶出率を示すグラフである。
【図１７】図１７は、ｐＨ７．４およびｐＨ５．０におけるペプチドおよびタンパク質を組み込んだ（Ａ）ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体、（Ｂ）ＤＬＰＣ−ウルソデオキシコール酸複合体の融合率を示すグラフである。
【図１８】図１８は、（Ａ）蛍光標識ペプチド単独の溶液、（Ｂ）蛍光標識ペプチド含有ＤＬＰＣ単独の溶液、（Ｃ）蛍光標識ペプチド含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の溶液、および（Ｄ）蛍光標識ペプチド含有ＤＬＰＣ−ウルソデオキシコール酸複合体の溶液の写真である。
【図１９】図１９は、（Ａ）蛍光標識ペプチド単独、（Ｂ）蛍光標識ペプチド含有ＤＬＰＣ単独、（Ｃ）蛍光標識ペプチド含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体を取り込ませた細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図２０】図２０は、蛍光標識ペプチド含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体を取り込ませた細胞の（Ａ）顕微鏡写真および（Ｂ）蛍光顕微鏡写真、ならびに蛍光標識ペプチド含有ＤＬＰＣ−ウルソデオキシコール酸複合体を取り込ませた細胞の（Ｃ）顕微鏡写真および（Ｄ）蛍光顕微鏡写真である。
【図２１】図２１は、β−ｇａｌの細胞質基質へのデリバリーを評価した結果であり、（Ａ）β−ｇａｌ単独、（Ｂ）β−ｇａｌ含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体、および（Ｃ）β−ｇａｌ含有ＤＬＰＣ−ウルソデオキシコール酸複合体の評価結果である。
【図２２Ａ】図２２Ａは、ｐＨ感受性担体および生理活性物質をそれぞれ独立に使用した場合の細胞質基質へのデリバリーを検討した結果であり、（Ａ）蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣ単独、（Ｂ）蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣ単独、（Ｃ）蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣおよびＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体の併用、（Ｄ）蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣおよびＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体の併用、（Ｅ）蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣおよびＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の併用、（Ｆ）蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣおよびＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の併用、（Ｇ）蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣおよびＳＰＡＮ８０−デオキシコール酸複合体の併用、（Ｈ）蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣおよびＳＰＡＮ８０−デオキシコール酸複合体の併用、（Ｉ）蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣおよびＤＤＰＣ−デオキシコール酸複合体の併用、（Ｊ）蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣおよびＤＤＰＣ−デオキシコール酸複合体の併用の細胞培養環境にて得られた、顕微鏡写真と、蛍光顕微鏡写真とを重ね合わせた画像である。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、ｐＨ感受性担体および生理活性物質をそれぞれ独立に使用した場合の細胞質基質へのデリバリーを検討した結果であり、（Ｋ）蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣおよびＰＥＧ１０ヒマシ油−デオキシコール酸複合体の併用、（Ｌ）蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣおよびＰＥＧ１０ヒマシ油−デオキシコール酸複合体の併用、（Ｍ）蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣおよびＴｗｅｅｎ２０−デオキシコール酸複合体の併用、（Ｎ）蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣおよびＴｗｅｅｎ２０−デオキシコール酸複合体の併用、（Ｏ）蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣおよびＴｗｅｅｎ８０−デオキシコール酸複合体の併用、（Ｐ）蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣおよびＴｗｅｅｎ８０−デオキシコール酸複合体の併用、（Ｑ）蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣおよびα−トコフェロール−デオキシコール酸複合体の併用、（Ｒ）蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣおよびα−トコフェロール−デオキシコール酸複合体の併用、（Ｓ）蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣおよびＤＬＰＣ−ウルソデオキシコール酸複合体の併用、（Ｔ）蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣおよびＤＬＰＣ−ウルソデオキシコール酸複合体の併用の細胞培養環境にて得られた、顕微鏡写真と、蛍光顕微鏡写真とを重ね合わせた画像である。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、ｐＨ感受性担体および生理活性物質をそれぞれ独立に使用した場合の細胞質基質へのデリバリーを検討した結果であり、（Ｕ）蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣおよびＤＬＰＣ−グリチルリチン酸複合体の併用、（Ｖ）蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣおよびＤＬＰＣ−グリチルリチン酸複合体の併用、（Ｗ）蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣおよびＤＬＰＣ−ケノデオキシコール酸複合体の併用、（Ｘ）蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣおよびＤＬＰＣ−ケノデオキシコール酸複合体の併用、（Ｙ）蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣおよびＤＬＰＣ−ヒオデオキシコール酸複合体の併用、（Ｚ）蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣおよびＤＬＰＣ−ヒオデオキシコール酸複合体の併用、（ＡＡ）蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣおよびＤＬＰＣ−グリコデオキシコール酸複合体の併用、並びに（ＡＢ）蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣおよびＤＬＰＣ−グリコデオキシコール酸複合体の併用の細胞培養環境にて得られた、顕微鏡写真と、蛍光顕微鏡写真とを重ね合わせた画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、を含む、膜破壊機能促進効果を発現する、ｐＨ感受性担体に関する。以下、ｐＨ感受性担体を、単に「担体」、「会合体」、または「複合体」とも称する。なお、本明細書において、両親媒性物質における「炭素数」とは、両親媒性物質の疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。
【００２４】
本発明によれば、安全性の高い、ｐＨに対する高い感受性を有するｐＨ感受性担体が提供される。
【００２５】
なお、本発明において、「膜破壊機能」とは、溶出性試験において溶出を起こす機能を意味する。ここで、本明細書における溶出性試験とは、消光物質と蛍光物質とを含む水溶液を内包したリポソーム（分散液）と、ｐＨ感受性担体、あるいはｐＨ感受性化合物単独、両親媒性化合物単独などの評価サンプル分散液とを、所定のｐＨに調製した水溶液に添加し、当該水溶液を３７℃で９０分間あるいは３０分間インキュベーションした後、当該水溶液の蛍光を測定する試験である。当該方法により、リポソームから溶出した蛍光物質量が測定することができ、ｐＨ感受性担体のリポソームの膜破壊機能を確認することができる。なお、溶出性試験については、後述する実施例で詳細に説明する。
【００２６】
また、「膜破壊機能促進効果を発現する」とは、（１）溶出性試験において、生理的ｐＨにおける溶出率よりも生理的ｐＨ未満の所定のｐＨにおける溶出率が上昇し、なおかつその上昇幅がｐＨ感受性化合物単独で実験した場合の上昇幅よりも大きいこと、および、（２）当該生理的ｐＨ未満の所定のｐＨでの溶出性試験において、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質が複合体（ｐＨ感受性担体）を形成したときの溶出率が、ｐＨ感受性化合物単独の溶出率と両親媒性物質単独の溶出率の和より大きいこと、の両者を満たすことを意味する。より具体的には、膜破壊機能促進効果を発現するとは、ｐＨ７．４とｐＨ５．０またはｐＨ４．５との溶出性試験において、ｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との複合体）の溶出率Ｌｃが、ｐＨ感受性化合物単独の溶出率Ｌａと両親媒性物質単独の溶出率Ｌｂと、下記の関係を双方満たすものをいう。すなわち、上記（１）が、下記式（１）で表され、上記（２）が下記式（２）で表される。なお、下記式中、ｐＨ７．４の溶出率を、それぞれ、Ｌｃ７．４、Ｌａ７．４、Ｌｂ７．４と表し、ｐＨ５．０または４．５の溶出率を、それぞれ、Ｌｃｘ、Ｌａｘ、Ｌｂｘと表す。
【００２７】
【数２】
2013180253.tif 000004
【００２８】
上記式（１）において、Δは、０を超えていればよいが、５以上であるのが好ましく、１０以上であるのがより好ましく、３０以上であるのがさらに好ましい。また、上記式（２）において、Δ’は、０を超えていればよいが、５以上であるのが好ましく、１０以上であるのがより好ましく、１５以上であるのがさらに好ましい。
【００２９】
上記式（１）及び上記式（２）においてΔ及びΔ’はそれぞれ５以上であるｐＨ感受性担体であって、該担体は胆汁酸と脂質を含むものが好ましい。また、上記式（１）及び上記式（２）においてΔ及びΔ’はそれぞれ５以上であるｐＨ感受性担体であって、グリチルリチン酸又はグリチルレチン酸と脂質とを含むｐＨ感受性担体であるのが好ましい。
【００３０】
本明細書中、「生理的ｐＨ」とは、正常組織や正常体液におけるｐＨを意味する。生理的ｐＨは、通常、７．４であるが、正常組織や正常体液によって若干（±０．１）異なる。また、「生理的ｐＨ未満の所定のｐＨ」とは、ｐＨ７．４未満であればよく、好ましくはｐＨ３．０以上、ｐＨ７．４未満、より好ましくはｐＨ４．０以上、ｐＨ７．３未満、さらに好ましくはｐＨ４．５以上、ｐＨ７．０未満である。
【００３１】
本発明のｐＨ感受性担体が膜破壊機能促進効果を発現するメカニズムは明らかではないが、下記のように推測される。なお、本発明は、下記推測によって限定されるものではない。
【００３２】
本発明のｐＨ感受性担体は、水性溶液中で、生理的ｐＨ以上において、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが会合して形成されているものと考えられる。
【００３３】
図１Ａに、本発明のｐＨ感受性担体および該ｐＨ感受性担体が、生理活性物質を担持してなるｐＨ感受性医薬の模式図を示す。図１Ａに示されるように、本発明のｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物が、両親媒性物質の構成する疎水性部分に会合して形成されているものと考えられる。また、本発明のｐＨ感受性担体は、担体の内部に生理活性物質を内包することができる。なお、ｐＨ感受性担体の当該会合形式は推測であり、本発明のｐＨ感受性担体は、当該会合形式には限定されない。また、ｐＨ感受性担体の当該担持形式も推測であり、本発明のｐＨ感受性担体は、当該担持形式には限定されない。
【００３４】
ｐＨ感受性担体は、周辺環境が生理的ｐＨ未満となった場合には、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との会合形態が変化し、その結果、膜破壊機能促進効果を有するものと考える。例えば、ｐＨ感受性担体と、生体膜（例えば、細胞膜、小胞膜など）とが存在している系で、ｐＨが生理的ｐＨ未満となった場合、ｐＨ感受性担体の会合形態が変化し、生体膜と接触した後、当該変化に誘起されて、生体膜の膜構造変化も生じるものと推測される。すなわち、ｐＨ感受性担体が生体膜の膜構造変化を誘起する。これは、ｐＨが弱酸性に変化することで、ｐＨ感受性担体中のｐＨ感受性化合物が該担体の構造中で不安定化し、その結果、ｐＨ感受性担体が、系内に存在する生体膜と再配列し、膜破壊機能促進効果が発現すると考えられる。また、換言すれば、ｐＨ感受性化合物は、ｐＨが弱酸性に変化すると、プロトン化により疎水的な会合への溶解性を変化させる分子であると考えられる。つまり、ｐＨ感受性化合物を含む疎水的な会合は、弱酸性環境に応答し、機能を発現することが可能であるといえる。なお、「膜破壊」とは、このような膜構造の変化を称するものであり、膜構成成分が全て分離または分解しなくてもよい。このような「膜破壊」が生じることにより、生体膜（例えば、エンドソーム）の膜内部に含有されうる成分が生体膜の外部（例えば、細胞質基質）に溶出等する。
【００３５】
本発明のｐＨ感受性担体は、溶出性試験における溶出率がｐＨ７．４で２０％未満であり、かつｐＨ４．０で２０％より大きいものであるのが好ましい。また、溶出性試験における溶出率がｐＨ６．５で２０％未満であり、かつｐＨ４．０で２０％より大きいものであるのがより好ましい。また、上記においてｐＨ７．４またはｐＨ６．５での溶出率が、１５％以下であるのがより好ましく、１０％以下であるのがさらに好ましい。また、ｐＨ４．０での溶出率が、４０％以上であるのがより好ましく、５０％以上であるのがさらに好ましい。ｐＨ感受性担体の溶出率が、上記のようになることで、弱酸性ｐＨにおける膜破壊機能促進効果の発現がより発揮される。
【００３６】
また、本発明のｐＨ感受性担体は、膜破壊機能促進効果とともに、膜融合機能促進効果を発現しうる。
【００３７】
本発明において、「膜融合機能」とは、膜融合試験において膜融合を起こす機能を意味する。ここで、本明細書における膜融合試験とは、２種類の蛍光物質を二分子膜に組み込んだリポソーム（分散液）と、ｐＨ感受性担体、あるいはｐＨ感受性化合物単独、両親媒性化合物単独などの評価サンプル分散液とを、所定のｐＨに調製した水溶液に添加し、当該水溶液を３７℃で６０分間インキュベーションした後、当該水溶液の蛍光を測定する試験である。当該方法により、リポソーム中に組み込まれた２種類の蛍光物質のエネルギー共鳴移動の変化を測定することができ、ｐＨ感受性担体の膜融合機能を確認することができる。なお、膜融合試験については、後述する実施例で詳細に説明する。
【００３８】
また、「膜融合機能促進効果を発現する」とは、膜融合試験において、生理的ｐＨにおける融合率よりも生理的ｐＨ未満の所定のｐＨにおける融合率が上昇し、なおかつその上昇幅がｐＨ感受性化合物単独で実験した場合の上昇幅よりも大きいこと、を満たすことを意味する。より具体的には、膜融合機能促進効果を発現するとは、ｐＨ７．４とｐＨ５．０との膜融合試験において、ｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との複合体）の融合率Ｒｃ（％）が、ｐＨ感受性化合物単独の融合率Ｒａ（％）と、下記式（３）の関係を満たすものをいう。なお、下記式中、ｐＨ７．４の融合率を、それぞれ、Ｒｃ７．４、Ｒａ７．４、と表し、ｐＨ５．０の融合率を、それぞれ、Ｒｃｘ、Ｒａｘ、と表す。
【００３９】
【数３】
2013180253.tif 000005
【００４０】
上記式（３）においてΔＲは、０を超えていればよいが、２以上であるのが好ましく、５以上であるのがより好ましく、１０以上であるのがさらに好ましい。
【００４１】
上記式（３）においてΔＲが２以上であるｐＨ感受性担体であって、該担体は胆汁酸と脂質を含むものが好ましい。
【００４２】
本発明のｐＨ感受性担体は、弱酸性ｐＨ（生理的ｐＨ未満の所定のｐＨ）において、膜融合機能促進効果を発現するが、これらのメカニズムは明らかではないが、上記の膜破壊機能促進効果と同様のメカニズムであると考えられる。なお、本発明は、当該推測によって限定されるものではない。
【００４３】
すなわち、本発明のｐＨ感受性担体は、周辺環境が生理的ｐＨ未満となった場合、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との会合形態が変化し、系内に存在する生体膜と再配列することで、膜融合するものと推測される。この際、膜融合は互いに親和性のある成分どうしで再配列するため、生体膜と親和性がない、または低い成分（例えば、生理活性物質）は、再配列される膜から排除、放出される。
【００４４】
通常、細胞外分子は生体膜の一種であるエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）に取り囲まれ、細胞に取り込まれる。その後、プロトンポンプの作用によってエンドソーム内部のｐＨが低下する。さらに、エンドソームは、加水分解酵素を含むリソソームと融合して、細胞外分子は分解される。このため、ほとんどの細胞外分子は細胞質基質内にデリバリーされない。
【００４５】
これに対して、本発明では、図１Ｂ、図１Ｃに示されるように、ｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性医薬またはｐＨ感受性医薬組成物）がエンドソームに取り囲まれ、細胞に取り込まれると、同様にして、ｐＨの低下した環境に導かれる。そして、ｐＨの低下（酸性化）に伴い、ｐＨ感受性化合物がｐＨ感受性担体を不安定化させ、エンドソームとｐＨ感受性担体との間で膜の再配列が起こる。その結果、ｐＨ感受性担体による膜破壊機能（場合によっては膜融合機能とともに発現する膜破壊機能）が生じる。
【００４６】
図１Ｂ、図１Ｃにおいて例示したように、本発明に係るｐＨ感受性担体を利用することにより生理活性物質等を細胞質基質内にデリバリーすることができる。具体的には、ｐＨ感受性医薬を用いた場合において、ｐＨ感受性担体内部に内包される生理活性物質（図１Ｂ）またはｐＨ感受性医薬組成物を用いた場合において、ｐＨ感受性担体とともに使用される生理活性物質（図１Ｃ）は、ｐＨ感受性担体と共にエンドソームに取り囲まれ、細胞に取り込まれる。エンドソーム内部のｐＨが低下すると、ｐＨ感受性化合物がｐＨ感受性担体を不安定化させ、エンドソームとｐＨ感受性担体との間で膜の再配列が起こる。その結果、ｐＨ感受性担体によるエンドソームの膜破壊が生じる。これにより、生理活性物質が細胞質基質に放出される。すなわち、生理活性物質を分解させることなく、細胞質基質内にデリバリーすることができる。
【００４７】
また、本発明のｐＨ感受性担体は、好ましくは、水性媒体中で、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを含む複合体を形成する。これらの複合体の形態は特に制限されず、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが膜を形成してもよいし、両親媒性物質が形成する構造にｐＨ感受性化合物の一部分もしくは全体が会合などにより埋め込まれていてもよい。また、本発明のｐＨ感受性担体においては、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とがミセル状の粒子を形成するのが好ましいがリポソームなどの粒子状の担体を形成していても良い。また、ＥＰＲ効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  Ｅｆｆｅｃｔ）やエンドサイトーシスによる細胞の取り込みを考慮した場合、ミセル状の粒子は、粒子径が１０〜２００ｎｍであるのが好ましい。より好ましくは１０〜１００ｎｍである。なお、本明細書中、ミセル状の粒子とは、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが疎水性相互作用により粒状に会合した粒子を言い、典型的には単分子膜構造の粒子であって、脂質二分子膜構造（例えば、リポソーム）を形成するものは含まない。また、本明細書中、ｐＨ感受性担体の粒子径は、動的光散乱法（ＭＡＬＶＥＲＮ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、ＮａｎｏＺＳ９０）により測定することができる。
【００４８】
なお、本発明のｐＨ感受体担体を含む水性溶液中、ｐＨ感受性化合物または両親媒性物質が、会合体を形成せず、遊離の状態で存在していても、ｐＨ感受性担体が存在していればよい。
【００４９】
以下、本発明のｐＨ感受性担体を構成する各成分について述べる。
【００５０】
＜ｐＨ感受性担体の構成成分＞
（ｐＨ感受性化合物）
本発明で用いられるｐＨ感受性化合物としては、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種である。ｐＨ感受性化合物の塩としては、特に制限されないが、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、などが挙げられる。これらのｐＨ感受性化合物は、単独で用いても、２種以上を併用して用いてもよい。
【００５１】
ｐＨ感受性化合物としては、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、グリチルレチン酸またはそれらの塩が好ましく、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、グリチルレチン酸またはそれらの塩がより好ましい。
【００５２】
本発明で好ましく用いられるデオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸およびグリコデオキシコール酸は、胆汁酸と総称される。胆汁酸は、代表的なステロイド誘導体として１９２０年代以前から知られており、細菌学の分野において利用されている。胆汁酸はヒトの生体内においてコレステロールや脂質、脂溶性ビタミンと複合体を形成し、その吸収を補助する働きを有している。また、物理化学的な性質から脂質やタンパク質、疎水的な材料との複合体を形成することができるため、タンパク質の分離精製や可溶化剤、乳化剤として古くから利用されている。最近ではワクチンの製造工程の用途、胆汁酸トランスポーターを介在させることによる薬剤の吸収促進剤としても注目されている。特に、デオキシコール酸ナトリウム（別名デスオキシコール酸ナトリウム）とウルソデオキシコール酸（別名ウルソデスオキシコール酸）はヒトへの注射が可能な医薬品添加物として実績を有しており、優れた安全性が認められている。そのため、本発明のｐＨ感受性化合物として、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸またはその塩（例えば、ナトリウム塩）を用いることがさらに好ましい。
【００５３】
ｐＨ感受性化合物は、両親媒性物質１００モルに対して１０モル以上の割合で含有されるのが好ましい。より好ましくは、両親媒性物質１００モルに対して１０〜６４０モル、さらに好ましくは２０〜３２０モル、特に好ましくは２０〜１６０モルである。
【００５４】
（両親媒性物質）
本発明で用いられる両親媒性物質としては、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種である。これらの両親媒性物質は、単独で用いても、２種以上を併用して用いてもよい。なお、本明細書において、両親媒性物質における「炭素数」とは、両親媒性物質の疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。
【００５５】
炭素数１０〜１２のホスファチジルコリンとしては、飽和のアシル基を有するジアシルホスファチジルコリンが好ましく、例えば、ジデカノイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ；１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）が挙げられる。ホスファチジルコリンとしては、天然由来または公知の方法で合成したものでもよく、また市販のものを用いることができる。
【００５６】
炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルとしては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、ポリオキシエチレンソルビタンミリスチン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノミリステート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンパルミテート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）等が挙げられる。ポリオキシエチレンの重合度としては、特に制限されないが、ソルビタンに付加したポリオキシエチレン鎖の合計した重合度が、１０〜２００が好ましく、１５〜１００がより好ましく、２０〜５０がさらに好ましい。ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルは、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルの市販品としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ６０（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル）として販売されているものを好ましく用いることができる。これらのなかでも、炭素数１６〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０）が好ましい。
【００５７】
炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステルとしては、ソルビタンモノパルミチン酸エステル（ソルビタンモノパルミテート）、ソルビタンモノステアリン酸エステル（ソルビタンモノステアレート）、ソルビタンモノオレイン酸エステル（ソルビタンモノオレート）等のソルビタンモノ脂肪酸エステル、ソルビタントリパルミチン酸エステル（ソルビタントリパルミテート）、ソルビタントリステアリン酸エステル（ソルビタントリステアレート）、ソルビタントリオレイン酸エステル（ソルビタントリオレート）等のソルビタントリ脂肪酸エステル等が挙げられる。ソルビタン脂肪酸エステルは、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。ソルビタン脂肪酸エステルの市販品としては、例えば、ＳＰＡＮ４０（ソルビタンパルミチン酸エステル）、ＳＰＡＮ６０（ソルビタンステアリン酸エステル）、ＳＰＡＮ８０（ソルビタンオレイン酸エステル）、ＳＰＡＮ６５（ソルビタントリステアリン酸エステル）、ＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレイン酸エステル）として販売されているものを好ましく用いることができる。これらのなかでも、ＳＰＡＮ８０，ＳＰＡＮ６５、ＳＰＡＮ８５が好ましい。
【００５８】
本発明で用いられるモノオレイン酸グリセロール（モノオレイン酸グリセリル）、ジラウリン酸グリセロール（ジラウリン酸グリセリル）、ジステアリン酸グリセロール（ジステアリン酸グリセリル）、ジオレイン酸グリセロール（ジオレイン酸グリセリル）としては、グリセリンに１または２分子の脂肪酸がエステル結合したアシルグリセロールであり、脂肪酸が結合する部位は特に制限されない。例えば、モノアシルグリセロールであるモノオレイン酸グリセロールであれば、グリセリンのＣ１位またはＣ２位に脂肪酸がエステル結合していてよい。また、ジアシルグリセロールであるジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールであれば、グリセリンのＣ１位およびＣ２位、またはＣ１位およびＣ３位に脂肪酸がエステル結合していればよい。例えば、ジラウリン酸グリセロールとしては、Ｃ１位およびＣ３位が置換された、α、α’−ジラウリンが好ましい。ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールとしては、Ｃ１位およびＣ２位が置換されたジアシルグリセロールが好ましい。これらのグリセロール誘導体としては、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。
【００５９】
ポリオキシエチレンヒマシ油としては、ヒマシ油にポリオキシエチレンが付加したものである。ポリオキシエチレンの重合度としては、特に制限されないが、３〜２００が好ましく、５〜１００がより好ましく、１０〜５０がさらに好ましい。ポリオキシエチレンヒマシ油は、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。
【００６０】
α−トコフェロールとしては、天然由来または公知の方法で合成したものでもよく、また市販のものを用いることができる。
【００６１】
これら両親媒性物質としては、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリンが好ましい。なかでも、炭素数１２のジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）が特に好ましい。
【００６２】
（ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質の組み合わせ）
本発明のｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、所望のｐＨにおいて、膜破壊機能促進効果を発現させることができる。この際、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果を発現し始めるｐＨは異なる。これはｐＨ感受性化合物によってｐＫａが異なること、さらには両親媒性物質との会合形成の様式が、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより異なることに由来するものと考えられる。したがって、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせを適宜変更することによって、機能を発現するｐＨを選択することが可能であり、生体内のデリバリー、および細胞内のデリバリーを詳細に設定することが可能であるといえる。
【００６３】
本発明のｐＨ感受性担体において、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせとしては、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、デオキシコール酸およびα−トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジステアリン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’−ジラウリン）、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ウルソデオキシコール酸およびＤＤＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、ウルソデオキシコール酸およびα−トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジステアリン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジオレイン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’−ジラウリン）、ウルソデオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、グリチルリチン酸およびＤＤＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ２０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ４０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ６０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ４０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６５、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８５、グリチルリチン酸およびα−トコフェロール、グリチルリチン酸およびモノオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジステアリン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’−ジラウリン）、グリチルリチン酸およびポリオキシエチレンヒマシ油が好ましい。
【００６４】
より好ましくは、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、デオキシコール酸およびα‐トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ウルソデオキシコール酸およびＤＤＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、ウルソデオキシコール酸およびα‐トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびモノオレイン、ウルソデオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、グリチルリチン酸およびＤＤＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ４０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ６０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ４０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６５、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８５、グリチルリチン酸およびα−トコフェロール、グリチルリチン酸およびモノオレイン、グリチルリチン酸およびポリオキシエチレンヒマシ油である。
【００６５】
（水性溶媒）
本発明のｐＨ感受性担体は、水性溶液中に含有されていてもよい。なお、ｐＨ感受性担体を含む水溶液を、以下、「担体分散液」とも称する。
【００６６】
本発明のｐＨ感受性担体を含む水性溶液の溶媒としては、緩衝剤、ＮａＣｌ、グルコース、ショ糖などの糖類を含む水溶液であるのが好ましい。
【００６７】
緩衝剤としては、ｐＨ感受性担体を含む水性溶液のｐＨを生理的ｐＨ以上に維持するものであれば公知の緩衝剤が適宜使用でき、特に限定されるものではない。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸−リン酸緩衝剤、トリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ緩衝剤（トリス塩酸緩衝剤）、ＭＥＳ緩衝剤（２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝剤）、ＴＥＳ緩衝剤（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤）、酢酸緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤（３−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝剤）、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝剤）、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝剤などのＧＯＯＤ緩衝剤、グリシン−塩酸緩衝剤、グリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝剤などのアミノ酸系緩衝剤、トリス−ホウ酸緩衝剤、ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝剤、ホウ酸緩衝剤などのホウ酸系緩衝剤、またはイミダゾール緩衝剤などが用いられる。これらのうち、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸−リン酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、ＭＥＳ緩衝剤、酢酸緩衝剤、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝剤が好ましい。緩衝剤の濃度としては、特に制限されず、０．１〜２００ｍＭであるのが好ましく、１〜１００ｍＭであるのがより好ましい。なお、本発明において緩衝剤の濃度とは、水性溶液中に含まれる緩衝剤の濃度（ｍＭ）をいう。
【００６８】
ＮａＣｌ、グルコース、ショ糖などの糖類の濃度としては、特に制限されず、０．１〜２００ｍＭであるのが好ましく、１〜１５０ｍＭであるのがより好ましい。
【００６９】
水性溶液中のｐＨ感受性担体の濃度としては、特に制限されないが、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との合計モル濃度が、好ましくは０．７３μｍｏｌ／Ｌ〜７．４ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは７．３μｍｏｌ／Ｌ〜６．５ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは８．０μｍｏｌ／Ｌ〜４．２ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００７０】
（他の成分）
本発明のｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性担体中またはｐＨ感受性担体を含む水性溶液中に、安定化剤等の他の成分を含んでいてもよい。これらの成分の含有量としては、ｐＨ感受性担体を破壊しなければ特に制限されないが、両親媒性物質１００モルに対して、１５０モル以下であるのが好ましく、６６．４モル以下であるのがより好ましい。
【００７１】
安定化剤としては、ｐＨ感受性担体を破壊しなければ特に制限されず、例えば、１−オクタノール、１−ドデカノール、１−ヘキサドデカノール、１−エイコサノール等の飽和および不飽和の炭素数４〜２０のアルコール；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の飽和および不飽和の炭素数１２〜１８の脂肪酸；カプリル酸メチル（オクタン酸メチル）、カプリル酸メチル（オクタン酸エチル）、ラウリン酸メチル、ラウリン酸エチル、ミリスチン酸エチル、パルミチン酸エチル、ステアリン酸エチル、オレイン酸メチル、オレイン酸エチル等の飽和および不飽和の炭素数８〜１８の脂肪酸アルキルエステル（炭素数１〜３のアルキル）；Ｄ（Ｌ）−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニルアラニン等のＤ（Ｌ）−アミノ酸；トリカプロイン、トリカプリリン等のアミノ酸トリグリセライド；ポリオキシエチレンソルビタントリパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタントリオレイン酸エステル等の炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタントリ脂肪酸エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ６５、Ｔｗｅｅｎ８５）；ポリオキシエチレンラウリン酸エステル、ポリオキシエチレンミリスチン酸エステル、ポリオキシエチレンパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンステアリン酸エステル等の炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンアルキルエステル（例えば、ＰＥＧ２０ステアリルエーテル、ＰＥＧ２３ラウリルエーテル）；ポリオキシアルキレン硬化ヒマシ油（例えば、ＰＥＧ１０硬化ヒマシ油、ＰＥＧ４０硬化ヒマシ油、ＰＥＧ６０硬化ヒマシ油）；カプリリン（オクタン酸グリセロール）、モノカプリン酸グリセロール、モノラウリン酸グリセロール、モノミリスチン酸グリセロール、モノパルミチン酸グリセロール、モノステアリン酸グリセロール、モノオレイン酸グリセロール等の飽和および不飽和の炭素数８〜１８のモノ脂肪酸グリセロールエステル；ジオクタン酸グリセロール、ジカプリン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジミリスチン酸グリセロールエステル、ジパルミチン酸グリセロール等の炭素数８〜１６のジ脂肪酸グリセロール；α−トコフェロール酢酸エステル、ヒマシ油、大豆油、コレステロール、スクアレン、スクアラン、ラクトース、パルミチン酸アスコルビル、安息香酸ベンジル、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、等の公知の安定化剤が用いられうる。なお、「炭素数」とは疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。
【００７２】
＜ｐＨ感受性担体の製造方法＞
本発明によれば、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、を会合させる工程を含む、膜破壊機能促進効果を発現する、ｐＨ感受性担体の製造方法も提供される。
【００７３】
ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを会合させる方法としては、ｐＨ感受性化合物と、両親媒性物質とが、水性溶液中で接触すればよい。よって、本発明のｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物と、両親媒性物質とを、水性溶液中で接触させることにより製造することができる。具体的には、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを含む水性溶液を作製し、当該溶液を、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて強く攪拌し分散することで、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが会合したｐＨ感受性担体を得ることができる。
【００７４】
ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを含む水性溶液を調製する方法としては、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが会合体を形成すれば特に制限されない。例えば、（１）ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液と、両親媒性物質を含む水性溶液とを別々に調製し、それら水性溶液を混合し、当該溶液を、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて強く攪拌し分散させてｐＨ感受性担体を得る方法；（２）リポソームの製造法として公知であるバンガム法にて調製する方法；が挙げられる。バンガム法としては、具体的には、ガラス容器中で、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質等のｐＨ感受性担体の構成成分を有機溶媒（例えば、メタノール、クロロホルム）に溶解し、ロータリーエバポレーターなどによって有機溶媒を除去して、ガラス容器の壁に薄膜を形成させる。次いで、水性溶液を、薄膜を形成したガラス容器に加えて、常温（５〜３５℃）で薄膜を膨潤させた後、常温（５〜３５℃）でガラス容器を振盪する。この際、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波を用いて強く攪拌し、薄膜を十分に水性溶液中に分散させることができる。また、上記の（１）製造方法において、両親媒性物質を含む水性溶液に、ｐＨ感受性化合物を混合させてもよい。なお、水性溶液の溶媒としては、上述した水性溶液の溶媒を使用することができる。
【００７５】
なお、バンガム法の方法の詳細は、公知のリポソームの製造方法を参考にすることができ、「リポソーム」（野島庄七、砂本順三、井上圭三編、南江堂）および「ライフサイエンスにおけるリポソーム」（寺田弘、吉村哲郎編、シュプリンガー・フェアラーク東京）に記載されている。
【００７６】
また、ｐＨ感受性担体中またはｐＨ感受性担体を含む水性溶液中に含有してもよい、安定化剤等の他の成分の添加方法としては、特に制限されない。例えば、ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液、または両親媒性物質を含む水性溶液に添加していてもよいし、薄膜を調製する際に、ｐＨ感受性担体の構成成分と一緒に溶解させて、これらの成分を含む薄膜を用いて、ｐＨ感受性担体を含む水性溶液を得てもよい。
【００７７】
以上のようにして得られたｐＨ感受性担体は、上述のような膜破壊機能促進効果を発現することができ、ＤＤＳに好適に使用できる。
【００７８】
＜ｐＨ感受性医薬およびｐＨ感受性医薬組成物＞
本発明の一実施形態によれば、ｐＨ感受性担体が少なくとも１種の生理活性物質を担持してなる、ｐＨ感受性医薬も提供される。
【００７９】
なお、本発明において、担持とは、生理活性物質が、担体に内包される形態、担体の膜内に挿入される形態、または担体の表面に直接または媒体を介して結合する形態をいう。ここで、結合とは、共有結合やイオン結合等の化学的結合、ファンデルワールス結合や疎水結合等の物理的結合のどちらであってもよい。生理活性物質は、親水性物質および疎水性物質のいずれであってもよい。生理活性物質が疎水性物質である場合は、ｐＨ感受性担体に内包またはｐＨ感受性担体の膜内に挿入される形態で担持されることが好ましく、生理活性物質が親水性物質である場合は、担体の表面に直接または媒体を介して結合する形態で担持されることが好ましい。
【００８０】
本発明のｐＨ感受性担体は、生理活性物質を担持することができ、生理的ｐＨ未満の環境下において、ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果が発現することで、担持した生理活性物質を所望の部位に送達することができる。これらのメカニズムは明らかではないが、下記のように推測される（図１Ｂを参照）。なお、本発明は、下記推測によって限定されるものではない。
【００８１】
本発明のｐＨ感受性担体が生理活性物質を担持したｐＨ感受性医薬は、細胞がエンドサイトーシスすることにより、細胞内に取り込まれ、ｐＨ感受性医薬を含むエンドソームを形成する。その後、エンドソーム内は酸性環境へ導かれる。この際、本発明のｐＨ感受性医薬は、周囲環境が生理的ｐＨ未満（例えば、ｐＨ６．５）に達した際に、ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果を発現する。すなわち、ｐＨ感受性担体の構成成分と、エンドソームを構成する膜構成成分とが、再配列を引き起こし、エンドソーム内部に存在する、ｐＨ感受性担体が担持している生理活性物質が、細胞質基質内へと移行する。これにより、生理活性物質を所望の細胞質基質へと直接送達することができるため、薬理作用の高い効果が発揮されると考えられる。
【００８２】
本発明の別の一実施形態によれば、ｐＨ感受性担体および少なくとも１種の生理活性物質を含む、ｐＨ感受性医薬組成物が提供される。この際、前記生理活性物質は、上記実施形態に係るｐＨ感受性医薬とは異なり、ｐＨ感受性担体の外部に（別に）存在しており、かつ、生理活性物質とｐＨ感受性担体とは直接または媒介を介して結合していない。すなわち、本実施形態に係るｐＨ感受性医薬組成物は、ｐＨ感受性担体および生理活性物質がそれぞれ独立に混合されてなる。
【００８３】
本発明のｐＨ感受性担体および生理活性物質がそれぞれ独立に混合されたｐＨ感受性医薬組成物もまた、生理的ｐＨ未満の環境下において、ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果が発現することで、生理活性物質を所望の部位に送達することができる。これらのメカニズムは明らかではないが、上述のｐＨ感受性担体が生理活性物質を担持したｐＨ感受性医薬と同様のメカニズムによると推測される（図１Ｃを参照）。なお、本発明は、下記推測によって限定されるものではない。
【００８４】
すなわち、本実施形態に係るｐＨ感受性医薬組成物は、細胞がｐＨ感受性担体をエンドサイトーシスすることにより、細胞内に取り込まれる。この際、ｐＨ感受性担体とともに、生理活性物質についてもエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。その結果、同一のエンドソーム内にｐＨ感受性担体および生理活性物質をそれぞれ独立に含むエンドソームが形成される。その後、エンドソーム内は酸性環境へ導かれ、周囲環境が生理的ｐＨ未満（例えば、ｐＨ６．５）に達した際に、ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果を発現する。そうすると、エンドソーム内部に存在する生理活性物質が細胞質基質内へと移行する。これにより、生理活性物質を所望の細胞質基質へと直接送達することができる。
【００８５】
また、本発明のｐＨ感受性医薬およびｐＨ感受性医薬組成物は、腫瘍や炎症など生体内においてｐＨが低下している部位への効率の良い生理活性物質の送達も可能である。すなわち、本発明のｐＨ感受性医薬およびｐＨ感受性医薬組成物は、ｐＨの低下した部位で、膜破壊機能促進効果を発現するため、炎症等の治療部位に、生理活性物質を選択的に送達することができる。
【００８６】
ｐＨ感受性医薬およびｐＨ感受性医薬組成物に用いられる生理活性物質の種類は特に限定されない。たとえば、生理活性物質としては、核酸、低分子化合物、タンパク質、ペプチドが挙げられる。
【００８７】
前記核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）、ＤＮＡ等の治療効果を有する核酸が挙げられる。
【００８８】
前記低分子化合物としては、マイトマイシン、ドセタキセル、メトトレキサート等の細胞毒性剤；５−アミノレブリン酸、プロトポルフィリンＩＸ等のプロドラッグ；ガンシクロビル、デキサメタゾン、リバビリン、ビダラビン等の抗炎剤；ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｔｅｔｒａｄｅｃａｎｅ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ＤＴＰＡ（１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｅｃａｎｅ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）等の造影剤；エダラボン等の神経保護剤が挙げられる。
【００８９】
前記タンパク質としては、ＳＯＤ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、インドフェノールオキシダーゼ等の酸化還元酵素；ＩＬ−１０等のサイトカイン、ｂ−ＦＧＦ等の増殖因子、ｔ−ＰＡ等の血栓溶解薬、エリスロポエチン等のホルモン、ＰＳＤ（Ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）やＦＮＫ（Ａｎｔｉ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）等の細胞死抑制タンパク質；Ｆａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、ＩｇＧ、ＩｇＥ等の抗体が挙げられる。
【００９０】
前記ペプチドとしては、シクロスポリンＡ、ＪＩＰ−１（ＪＮＫ−ｉｎｔｅｒｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）等のペプチド医薬が挙げられる。
【００９１】
このような知見は出願時の技術常識を適宜参照することができる。
【００９２】
また、生理活性物質の量は特に限定されず、生理活性物質の種類などにより適宜選択することができる。
【００９３】
ｐＨ感受性担体に生理活性物質を担持させる方法としては、生理活性物質の種類に応じて公知の方法を用いることができる。該方法としては限定されないが、例えば、担体に内包される形態および担体内に挿入される形態を得る方法としては、上記のｐＨ感受性担体の製造方法に従ってｐＨ感受性担体を形成させた後に、生理活性物質を含む溶液に該ｐＨ感受性担体を浸漬させて生理活性物質をｐＨ感受性担体の内部に取り込ませる方法、上記のｐＨ感受性担体の製造方法において薄膜が形成された容器内に、生理活性物質を含む溶液を投入した後に会合体を形成させて生理活性物質を内部に封入する方法などが挙げられる。また、担体の表面に直接または媒体を介して結合する形態を得る方法としては、担体の構成成分であるｐＨ感受性化合物または両親媒性物質に、所望の生理活性物質と反応しうる官能基を導入し、その後、生理活性物質と反応させることで、生理活性物質が結合したｐＨ感受性担体を得る方法等が挙げられる。なお、これらの生理活性物質との結合は、ｐＨ感受性担体を調製する前であっても、調製した後であってもよい。
【００９４】
また、ｐＨ感受性担体および生理活性物質を混合する方法としては、生理活性物質の種類に応じて公知の方法を用いることができる。該方法としては特に制限されないが、例えば、担体および生理活性物質を、水性溶媒、賦形剤等の媒体に混合する方法等が挙げられる。
【００９５】
本発明のｐＨ感受性医薬およびｐＨ感受性医薬組成物は、他の医薬添加剤を含んでいてもよい。ｐＨ感受性医薬およびｐＨ感受性医薬組成物は、錠剤、粉末、カプセルなどの固形製剤の形態であってもよいが、注射製剤のような液体製剤の形態が好ましい。該液体製剤は、用時に水または他の適切な賦形剤で再生する乾燥製品として提供してもよい。
【００９６】
上記の錠剤およびカプセルは、通常の方法により腸溶コーティングを施すことが望ましい。腸溶コーティングとしては、当該分野において通常用いられるものを利用できる。また、カプセルは粉末又は液体のいずれを含有することもできる。
【００９７】
上記のｐＨ感受性医薬およびｐＨ感受性医薬組成物が液体製剤である場合、医薬添加剤は、溶媒（例えば生理食塩水、滅菌水、緩衝液など）、膜安定剤（例えばコレステロールなど）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム、グルコース、グリセリンなど）、抗酸化剤（例えばトコフェロール、アスコルビン酸、グルタチオンなど）、防腐剤（例えばクロルブタノール、パラベンなど）などを含み得る。上記の溶媒は、ｐＨ感受性医薬およびｐＨ感受性医薬組成物を製造する際に用いる溶媒であってもよい。
【００９８】
ｐＨ感受性医薬およびｐＨ感受性医薬組成物が固形製剤である場合、医薬添加剤は、賦形剤（例えば乳糖、ショ糖のような糖類、トウモロコシデンプンのようなデンプン類、結晶セルロースのようなセルロース類、アラビアゴム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸カルシウムなど）、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールなど）、結合剤（例えばマンニトール、ショ糖のような糖類、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉のようなデンプン類、カルボキシメチルセルロースのようなセルロース類、架橋ポリビニルピロリドンなど）、着色剤、矯味矯臭剤などを含み得る。
【００９９】
ｐＨ感受性医薬およびｐＨ感受性医薬組成物は、そのまま、または凍結乾燥させて、上記の医薬添加剤と混合することにより製造することができる。ｐＨ感受性医薬およびｐＨ感受性医薬組成物を凍結乾燥する場合、凍結乾燥する前に適当な賦形剤を添加しておくのがよい。
【０１００】
本発明のｐＨ感受性医薬およびｐＨ感受性医薬組成物を対象者の治療に用いる場合の投与形態は特に制限されず、例えば、経口投与、および静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、経皮投与または経皮的吸収等の非経口的投与等が挙げられる。例えば、生理活性物質としてペプチドおよびタンパク質を用いる場合は、非経口経路、特に皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、静脈注射による投与が好ましい。なお、ｐＨ感受性担体および生理活性物質がそれぞれ独立に混合されてなるｐＨ感受性医薬組成物については、局所投与、具体的には、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与の形態で投与することが好ましい。
【０１０１】
本発明のｐＨ感受性医薬およびｐＨ感受性医薬組成物は、対象者に投与して、ｐＨ感受性医薬およびｐＨ感受性医薬組成物の外部環境が生理的ｐＨ未満（例えば、ｐＨ６．５）となったときに、膜破壊機能促進効果、または膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果を発現し、生理活性物質を特異的に効率よく放出させることが可能になる。
【０１０２】
よって、本発明により、治療または予防を必要とする対象者に、上記のｐＨ感受性医薬およびｐＨ感受性医薬組成物の有効量を経口または非経口的に投与することを含む、疾患の治療または予防方法が提供される。
【０１０３】
上記の対象者は、哺乳動物が好ましく、特に好ましくはヒトである。
【０１０４】
上記疾患としては、例えば、前立腺癌、肺癌、大腸癌、腎臓癌、胃癌、脳腫瘍、乳癌等の癌；ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎等の感染症疾患；アルツハイマー病、パーキンソン病等の中枢神経疾患が挙げられる。
【０１０５】
すなわち、本発明の好ましい一実施形態によれば、疾患の治療または予防方法が提供される。このような知見は出願時の技術常識を適宜参照することができる。
【０１０６】
また、本発明の一実施形態において、ｐＨ感受性医薬およびｐＨ感受性医薬組成物は、培養により、細胞に直接生理活性物質を輸送することもできる。すなわち、本発明の一形態によれば、細胞に生理活性物質に輸送するための培養方法が提供される。
【０１０７】
前記培養方法は、細胞を、ｐＨ感受性医薬および／またはｐＨ感受性医薬組成物を含む培地で培養する工程を含む。
【０１０８】
前記ｐＨ感受性医薬およびｐＨ感受性医薬組成物としては、上述したもの、すなわち、ｐＨ感受性担体が少なくとも１種の生理活性物質を担持してなるｐＨ感受性医薬、ｐＨ感受性担体および少なくとも１種の生理活性物質をそれぞれ独立に含むｐＨ感受性医薬組成物が挙げられる。これらは単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１０９】
前記培地としては、特に制限されず、公知のものを使用することができる。具体的には、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ等が挙げられる。
【０１１０】
前記培地へのｐＨ感受性医薬、ｐＨ感受性医薬組成物の添加量としては、特に制限されないが、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との合計モル濃度が、０．７３μｍｏｌ／Ｌ〜７．４ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、７．３μｍｏｌ／Ｌ〜６．５ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、８．０μｍｏｌ／Ｌ〜４．２ｍｍｏｌ／Ｌであることがさらに好ましい。
【０１１１】
また、前記培地のｐＨは、７．０以上であることが好ましく、７．２〜７．８であることがより好ましい。培地のｐＨが７．０以上であると、培地中でのｐＨ感受性担体を構成するｐＨ感受性化合物の不安定化を防止できることから好ましい。
【０１１２】
前記細胞としては、特に制限されないが、対象者から採取された細胞、株化された培養細胞等が挙げられる。
【０１１３】
この際、前記対象者から採取された細胞または株化された培養細胞の具体例としては、樹状細胞、ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ）細胞、Ｔリンパ細胞、Ｂリンパ球細胞、リンパ球細胞等が挙げられる。
【０１１４】
上記細胞のうち、対象者から採取された細胞を用いることが好ましく、対象者から採取された樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、リンパ細胞等を用いることがより好ましい。
【０１１５】
対象者から採取された細胞を用いる場合には、対象者を採血、生検等により当該細胞を採取することができる。すなわち、一実施形態において、前記培養方法は、対象者から細胞を採取する工程を含みうる。
【０１１６】
なお、培養した細胞は、対象者に投与してもよい。これにより、対象者の疾患の治療または予防をすることができる。すなわち、本発明の一実施形態において、疾患の治療または予防方法が提供される。
【０１１７】
好ましい一実施形態において、前記治療または予防方法は、対象者から細胞を採取する工程と、ｐＨ感受性医薬および／またはｐＨ感受性医薬組成物を含む培地で前記採取した細胞を培養する工程と、前記培養した細胞を前記対象者に投与する工程と、を含む。
【０１１８】
これにより、疾患の治療または予防をすることができる。なお、前記疾患は上述のとおりである。
【実施例】
【０１１９】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。【０１２０】
＜原料＞
実施例では、下記の化合物を用いた。試薬名と製品名が同一の場合は製品名を省略した。
・ＥＹＰＣ（未水添卵黄ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＮＣ−５０）
・ＨＳＰＣ（ソイビーン−ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＮＣ−２１）
・ＤＤＰＣ（１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−１０１０）
・ＤＬＰＣ（１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−１２１２）
・ＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−４０４０）
・ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−６０６０）
・ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−８０８０）
・ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ８１８１）
・ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ６０８１）
・ＤＬＰＥ（１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＥ−２０２０）
・ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＥ４０４０）
・ＤＳＰＥ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＥ８０８０）
・ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＥ−８１８１）
・Ｃｈｅｍｓ（コレステリルヘミサクシネート：ナカライテスク社製）
・ＮＢＤ−ＰＥ（１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ（７−ｎｉｔｒｏ−２−１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）ａｍｍｏｎｉｕｍ：Ａｖａｎｔｉ  ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄｓ社製）
・Ｒｈ−ＰＥ（１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ）ａｍｍｏｎｉｕｍ：Ａｖａｎｔｉ  ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄｓ社製）
・デオキシコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）
・コール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）
・ウルソデオキシコール酸ナトリウム（東京化成工業社製）
・ケノデオキシコール酸（東京化成工業社製）
・ヒオデオキシコール酸（東京化成工業社製）
・コール酸メチル（東京化成工業社製）
・デヒドロコール酸ナトリウム（東京化成工業社製）
・リトコール酸（ナカライテスク社製）
・グリココール酸ナトリウム（東京化成工業社製）
・タウロコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）
・グリコデオキシコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）
・タウロデオキシコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）
・グリコウルソデオキシコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）
・タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）
・高級胆汁酸（３α，７α，１２α−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ：Ａｖａｎｔｉ  ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄｓ社製）
・５β−コラン酸（シグマ−アルドリッチ社製）
・グリチルリチン酸モノアンモニウム（東京化成工業社製）
・グリチルレチン酸（長良サイエンス社製）
・サッカリンナトリウム（和光純薬工業社製）
・メタノール（ナカライテスク社製）
・クロロホルム（和光純薬工業社製）
・酢酸（和光純薬工業社製）
・酢酸ナトリウム（関東化学社製）
・ＭＥＳ−Ｎａ（メルク社製）
・Ｈｅｐｅｓ−Ｎａ（ナカライテスク社製）
・塩化ナトリウム（関東化学社製）
・Ｐｙｒａｎｉｎｅ（東京化成工業社製）
・ＤＰＸ（ｐ−ｘｙｌｅｎｅ−ｂｉｓ−ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社製）
・ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｔｓ：タカラバイオ社製、ＰＢＳ  Ｔａｂｌｅｔｓ）
・ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０、４０、６０、８０、６５、８５：東京化成工業社製）
・ＰＥＧ２０−ｓｔｅａｒｙｌ  ｅｔｈｅｒ（ポリオキシエチレン２０−ステアリルエーテル：和光純薬工業社製）
・ＰＥＧ２３−Ｌａｕｒｙｌ  ｅｔｈｅｒ（ポリオキシエチレン２３−ラウリルエーテル：和光純薬工業社製）
・ソルビタン脂肪酸エステル（ＳＰＡＮ２０：ナカライテスク社製−ソルビタンモノラウレート、ＳＰＡＮ４０、６０：東京化成工業社製、ＳＰＡＮ８０：ナカライテスク社製−ソルビタンモノオレエート、６５：和光純薬工業社製、ソルビタントリステアレート、ＳＰＡＮ８５：東京化成工業社製）
・モノカプリン酸グリセロール（東京化成工業社製、モノカプリン）
・モノカプリリン酸グリセロール（東京化成工業社製、モノカプリリン）
・モノラウリン酸グリセロール（東京化成工業社製、モノラウリン）
・モノミリスチン酸グリセロール（東京化成工業社製、モノミリスチン）
・モノパルミチン酸グリセロール（東京化成工業社製、モノパルミチン）
・モノステアリン酸グリセロール（東京化成工業社製、モノステアリン）
・モノオレイン酸グリセロール（東京化成工業社製、モノオレイン）
・ジラウリン酸グリセロール（東京化成工業社製、ααジラウリン）
・ジステアリン酸グリセロール（和光純薬工業社製）
・ジオレイン酸グリセロール（和光純薬工業社製）
・ポリオキシエチレンヒマシ油（和光純薬工業社製、ポリオキシエチレン１０ヒマシ油）
・ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（１０：和光純薬工業社製、ポリオキシエチレン１０硬化ヒマシ油、４０：日油社製、ユニオックスＨＣ−４０、６０：日油社製、ユニオックスＨＣ−６０）
・１−ブタノール（ナカライテスク社製）
・１−オクタノール（ナカライテスク社製）
・１−ドデカノール（東京化成工業社製）
・１−ヘキサデカノール（ナカライテスク社製）
・１−エイコサノール（東京化成工業社製）
・ラウリン酸（ナカライテスク社製）
・オレイン酸ナトリウム（ナカライテスク社製）
・オクタン酸エチル（ナカライテスク社製）
・ラウリン酸エチル（東京化成工業社製）
・オレイン酸エチル（ナカライテスク社製）
・ラクトース（ナカライテスク社製）
・Ｌ−ロイシン（ナカライテスク社製）
・Ｌ−ヒスチジン（ナカライテスク社製）
・ダイズ油（ナカライテスク社製、大豆油）
・スクアラン（ナカライテスク社製）
・スクアレン（ナカライテスク社製）
・α−トコフェロール（ナカライテスク社製、ＤＬ−α−トコフェロール）
・酢酸トコフェロール（ナカライテスク社製、酢酸ＤＬ−α−トコフェロール）
・安息香酸ベンジル（ナカライテスク社製）
・パラオキシ安息香酸ベンジル（東京化成工業社製）
・パルミチン酸アスコルビル（ＬＫＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）
・アラビアゴム（ナカライテスク社製、アラビアゴム粉末）
・ゼラチン（ナカライテスク社製、ゼラチン精製粉末）
・シクロデキストリン（ナカライテスク社製）
・メチルセルロース（ナカライテスク社製）
・ミネラルオイル（ナカライテスク社製）
・パラフィン（ナカライテスク社製）
・水酸化ナトリウム水溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ：ナカライテスク社製）
・塩酸（０．１ｍｏｌ／Ｌ、１ｍｏｌ／Ｌ：ナカライテスク社製）
・Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（和光純薬工業社製、トリトンＸ１００）
・モデルペプチド：ＯＶＡ２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ，ピーエイチジャパン委託合成）
・蛍光標識ペプチド：ＯＶＡ２５７−２６４−Ｒｈ（ピーエイチジャパン委託合成）
・モデルタンパク質：ＯＶＡ（シグマ−アルドリッチ社製）
・トリプシン（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
・ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸：ナカライテスク社製）
・β−ｇａｌ（和光純薬工業社製、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）
・ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：国産化学社製）
・ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ：ナカライテスク社製、ＭＥＭ培地アール塩，Ｌ‐グルタミン含有  液体）
・ＤＭＥＭ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ（ナカライテスク社製、ダルベッコ変法イーグル培地４．５ｇ／ｌ  グルコース  Ｌ−グルタミンピルビン酸フェノールレッド不含  液体）
・ＤＭＥＭ（ナカライテスク社製、ダルベッコ変法イーグル培地）
・クロロキン二リン酸（ナカライテスク社製）
・ＩｓｏＦｌｏｗ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）
＜試料の作製＞
（ｐＨ感受性担体の調製）
メタノール（またはクロロホルム）に溶解した１０００ｎｍｏｌ両親媒性物質と、メタノール（またはクロロホルム）に溶解したｐＨ感受性化合物または候補化合物と、を１０ｍＬナスフラスコで混合し、ロータリーエバポレーター（ＢｕＣＨＩ）により薄膜とした。なお、両親媒性物質とｐＨ感受性化合物または候補化合物との比率は、所望の比率（モル比１００：１０、１００：２０、１００：６４０等）となるよう調整した。また、複数の両親媒性物質を使用する場合は、両親媒性物質の総量が、所望のモル数（１０００ｎｍｏｌ）となるように調整した。【０１２１】
作製した薄膜にＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳ：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭ  ｐＨ７．４）１ｍＬを添加し、超音波照射装置（ＵＳＣ−Ｊ）を用いて常温で１分間超音波を照射して分散させ、目的とするｐＨ感受性担体を含む水性溶液（担体の分散液）を得た。【０１２２】
（比較例の担体の調製）
（ＥＹＰＣ単独およびＤＬＰＣ単独）
クロロホルムに溶解した１０００ｎｍｏｌのＥＹＰＣまたはＤＬＰＣを１０ｍＬナスフラスコに入れ、ロータリーエバポレーター（ＢｕＣＨＩ）により薄膜とした。【０１２３】
作製した薄膜にＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳ：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭ  ｐＨ７．４）１ｍＬを添加し、超音波照射装置（ＵＳＣ−Ｊ）を用いて常温で１分間超音波を照射して分散させ、ＥＹＰＣ単独またはＤＬＰＣ単独の分散液を得た。【０１２４】
（高分子材料を含む担体）
ｐＨ感受性担体の調製法と同様にして、ｐＨ感受性化合物と高分子材料の薄膜を調製し、担体を調製した。アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、ミネラルオイル、またはパラフィンの高分子材料は、１６００ｎｍｏｌのｐＨ感受性化合物の１／５倍、１倍、５倍の質量を用いた。【０１２５】
（ｐＨ感受性リポソーム）
ｐＨ感受性担体の調製法と同様にして、ＤＯＰＥとＣｈｅｍｓまたはオレイン酸の薄膜を調製し、リポソームを調製した。なお、ｐＨ感受性リポソームであるＤＯＰＥ−Ｃｈｅｍｓ（ＤＯＰＥ：Ｃｈｅｍｓ＝３：２（モル比））、およびＤＯＰＥ−オレイン酸（ＤＯＰＥ：オレイン酸＝７：３（モル比））は、１０００ｎｍｏｌのＤＯＰＥと、所望の量のＣｈｅｍｓまたはオレイン酸と１ｍＬのＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳ：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭ  ｐＨ７．４）を用いて調製した。【０１２６】
（ペプチド含有担体およびタンパク質含有担体の調製）
両親媒性物質１０００ｎｍｏｌに対して、モデルペプチドのＯＶＡ２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）、またはモデルタンパク質のＯＶＡを、０〜１５３６μｇとなるように量り取り、ＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳ：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭ  ｐＨ７．４）１ｍＬに溶解させた。これらの溶液を用いて担体を調製することにより、ペプチドまたはタンパク質を含有した担体の分散液を得た。【０１２７】
蛍光標識ペプチドのＯＶＡ２５７−２６４−Ｒｈを用いる場合は、両親媒性物質１０００ｎｍｏｌに対して、１４０μｇ／ｍＬの蛍光標識ペプチドを用いて調製し、β−ｇａｌを用いる場合は両親媒性物質１０００ｎｍｏｌに対して１．４ｍｇのβ−ｇａｌを用いて調製した。【０１２８】
＜測定方法＞
（透過度の測定）
ＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳ：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭ  ｐＨ７．４）２５０μＬに担体の分散液２５０μＬを加え、測定溶液とした。ＵＶ−２４５０を用いて、５００ｎｍにおける透過度を常温にて測定した。【０１２９】
（ゼータポテンシャルおよび粒子径の測定）
ゼータポテンシャルの測定はｐＨ７．４に調整した１．０ｍＬのＨｅｐｅｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｈｅｐｅｓ：１．０ｍＭ）に、担体の分散液２０〜５０μＬを加え、測定溶液とした。測定はＮａｎｏＺＳ９０を用いて複数回実施し、得られたゼータポテンシャルの値を平均し、担体粒子のゼータポテンシャルとした。【０１３０】
（粒子径および多分散指数の測定）
粒子径および多分散指数（ＰＤＩ：Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ）の測定はＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳ：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭ  ｐＨ７．４）に適当量の担体の分散液を加え、測定溶液とした。測定はＮａｎｏＺＳ９０を用いて複数回実施し、動的光散乱測定にて得られるＺ−ａｖｅｒａｇｅ（半径）の値を平均し、その２倍の値をＤｉａｍｅｔｅｒ（直径、粒子径）とした。ＰＤＩの値は複数の測定により得られたＰＤＩの値を平均して求めた。【０１３１】
（溶出性試験：Ｌｅａｋａｇｅ（溶出率）の測定）
Ｌｅａｋａｇｅ（溶出率）は、Ｋ．Ｋｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００８  １９  １０４０−１０４８に記載の方法に従い、蛍光物質であるＰｙｒａｎｉｎｅと消光剤であるＤＰＸとを内包したＥＹＰＣリポソームを用いて評価した。【０１３２】
クロロホルムに溶解させた３０００ｎｍｏｌのＥＹＰＣを１０ｍＬナスフラスコに測り入れ、ロータリーエバポレーター（ＢｕＣＨＩ）を用いて薄膜とした。Ｐｙｒａｎｉｎｅ溶液（Ｐｙｒａｉｎｅ：３５ｍＭ、ＤＰＸ：５０ｍＭ、ＭＥＳ：２５ｍＭ、ｐＨ７．４）５００μＬを加え、超音波照射装置（ＵＳＣ−Ｊ）を用いて分散させた後、エクストルーダーを用いて孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を通し、粒子径を揃えた。ＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳ：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭ  ｐＨ７．４）とＧ１００カラムを用いて外水層の置換を行い、蛍光物質を内包したＥＹＰＣリポソーム分散液を得た。リン脂質Ｃ−テストワコーを用いてリン脂質コリン基の濃度を求め、リン脂質が１．０ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳ：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭ  ｐＨ７．４）を用いて濃度を調整した。【０１３３】
濃度を調整したＥＹＰＣリポソーム分散液２０μＬと、担体、あるいはｐＨ感受性化合物単独、両親媒性化合物単独などの評価サンプル分散液２０μＬを、種々のｐＨに調整したＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳ：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭ）２９６０μＬ中に投与し、３７℃にて９０あるいは３０分間インキュベーションした後（実施例において、特別な記載のない限り、９０分間の結果である）、分光光度計ＦＰ−６５００を用いてＥｘ４１６、Ｅｍ５１２ｎｍの蛍光を観察することにより、Ｌｅａｋａｇｅをモニターした。ＤＯＰＥ−Ｃｈｅｍｓ、およびＤＯＰＥ−オレイン酸は、酢酸ｂｕｆｆｅｒ（酢酸：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭ）中にて測定した。また、その他のサンプルにおいても、ｐＨ４．０〜ｐＨ３．０の測定は酢酸ｂｕｆｆｅｒを用いて実施した。【０１３４】
なお、ＥＹＰＣリポソーム分散液のみの場合を０％とし、１０倍希釈したＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を３０μＬ加えた場合の値を１００％として、溶出率を算出した。【０１３５】
具体的には、溶出率は、下記式に従って計算した。なお、下記式中において、測定した蛍光強度をＬとし、蛍光物質を内包したＥＹＰＣリポソーム分散液のみの蛍光強度をＬ０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加えた場合の蛍光強度をＬ１００と表す。【０１３６】
【数４】
2013180253.tif 000006
【０１３７】
（膜融合試験：Ｆｕｓｉｏｎ（膜融合）の測定）
Ｆｕｓｉｏｎ（膜融合）は、Ｋ．Ｋｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００８  ２９  ４０２９−４０３６に記載の方法に従い、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）を利用して評価した。蛍光標識は、ＮＢＤ−ＰＥ、Ｒｈ−ＰＥを用いた。【０１３８】
ＥＹＰＣに対して０．６ｍｏｌ％のＮＢＤ−ＰＥ、およびＲｈ−ＰＥを含むＥＹＰＣ（ＥＹＰＣ１０００ｎｍｏｌ）の薄膜を作製し、１ｍＬのＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳ：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭ  ｐＨ７．４）を加え、超音波照射装置（ＵＳＣ−Ｊ）を用いて分散させた後、エクストルーダーを用いて孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を通し、二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液を得た。二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液２０μＬと、担体、あるいはｐＨ感受性化合物単独、両親媒性化合物単独などの評価サンプル分散液２０μＬを、種々のｐＨに調製したＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳ：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭ）２９６０μＬ中に投与し、３７℃にて６０分間インキュベーションした後、分光光度計（ＦＰ−６５００）を用いて４５０ｎｍの励起光による５００ｎｍ〜６２０ｎｍの蛍光スペクトルを測定し、５２０ｎｍと５８０ｎｍとの蛍光強度比を求めた。【０１３９】
融合率は、上記で得られた二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と両親媒性物質とをインキュベーションした場合の蛍光強度比を０％とし、二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と、ｐＨ感受性担体あるいは両親媒性物質の分散液と、をメタノール処理したものを１００％として算出した。メタノール処理は二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液とｐＨ感受性担体あるいはｐＨ感受性化合物単独、両親媒性化合物単独などの評価サンプル分散液との両者をメタノールに溶解させた後、ロータリーエバポレーター（ＢｕＣＨＩ）を用いて薄膜とし、３．０ｍＬのＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ：ＭＥＳ、１２５ｍＭ：ＮａＣｌ）と超音波照射装置（ＵＳＣ−Ｊ）を用いて分散させて実施した。【０１４０】
具体的には、融合率は、下記式に従って計算した。なお、下記式中において、測定して得られた蛍光強度比をＲとし、二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と両親媒性物質とをインキュベーションした場合の蛍光強度比をＲ０、二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソーム分散液と担体あるいはｐＨ感受性化合物単独、両親媒性化合物単独などの評価サンプル分散液をメタノール処理して得られた蛍光強度比をＲ１００と表す。【０１４１】
【数５】
2013180253.tif 000007
【０１４２】
（細胞膜に対する膜融合の確認）
ｐＨ感受担体が実際の細胞膜に対しても膜融合を誘起することを、ＨｅＬａ細胞を用いて確認した。【０１４３】
ｐＨ感受性担体を投与する前日にＨｅＬａ細胞を松浪ガラスボトムディッシュに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭにて培養した。この際、培養は５％ＣＯ２、３７℃に設定したインキュベーター（ＭＣＯ２０ＡＩＣ）を用いて実施した。インキュベート後、細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて洗浄した。次いで、水酸化ナトリウム水溶液または塩酸を用いてｐＨを７．４に調整した２５ｍＭのＨｅｐｅｓおよび５０μＭのクロロキン二リン酸含有ＤＭＥＭ２．０ｍＬを細胞に添加し、１時間プレ−インキュベーションを行った。【０１４４】
なお、ｐＨ５．３で実験する場合には、水酸化ナトリウム水溶液または塩酸を用いてｐＨを５．３に調整した２５ｍＭのＭＥＳおよび５０μＭのクロロキン二リン酸含有ＤＭＥＭ２．０ｍＬを細胞に添加し、１時間プレ−インキュベーション行った。【０１４５】
プレ−インキュベーション後、所定ｐＨのメディウムに、両親媒性物質に対して０．６ｍｏｌ％のＲｈ−ＰＥで蛍光標識したｐＨ感受性担体の分散液を１００μＬ添加し、２時間インキュベーションを行った。細胞をフェノールレッド非添加ＤＭＥＭで少なくとも３回洗浄した後、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ−  ソフト：Ａｘｉｏ  ｖｉｓｉｏｎ  ３．０−  光源：Ｆｌｕｏ  Ａｒｃ）を用いて観察した。なお、細胞の蛍光強度は、洗浄した細胞を０．０２５ｗｔ％のトリプシンおよび０．０１ｗｔ％のＥＤＴＡ含有ＰＢＳを用いて細胞を剥離し、フローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００，ソフト：ＣＸＰ  ｖｅｒ２）を用いて評価した。【０１４６】
（蛍光標識ペプチドを用いた細胞質基質デリバリーの評価）
モデルペプチドとしてＯＶＡ２５７−２６４−Ｒｈを選択した。０．２２μｍのフィルターを通したＰＢＳを用いて１４０μｇ／ｍＬの蛍光標識ペプチド溶液を調製し、担体の調製に用いた。細胞はＲＡＷ細胞を使用し、培養は５％ＣＯ２、３７℃に設定したインキュベーター（ＭＣＯ２０ＡＩＣ）を用いて実施した。担体を投与する前日にＲＡＷ細胞を松浪ガラスボトムディッシュに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭメディウムにて培養した。細胞をＰＢＳにて洗浄した後、新たな１９００μＬの１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭメディウムに置換し、それぞれ１００μＬのサンプルを投与した。１６〜２０時間インキュベーションを行い、細胞をＰＢＳにて少なくとも３回洗浄した。その後、新たな１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭメディウム２ｍＬを添加し、３時間ポスト−インキュベーションを行った。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄメディウムに置換した後、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ−  ソフト：Ａｘｉｏ  ｖｉｓｉｏｎ  ３．０−  光源：Ｆｌｕｏ  Ａｒｃ）を用いて細胞を観察した。【０１４７】
（β−ｇａｌの細胞質基質デリバリー）
０．２２μｍのフィルターを通したＰＢＳを用いて、１．４ｍｇ／ｍＬのβ−ｇａｌ溶液を調製した。１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸またはウルソデオキシコール酸とからなる混合薄膜に、調製したβ−ｇａｌ溶液を用いて分散させ、β−ｇａｌ含有担体を調製した。投与前日にＲＡＷ細胞を松浪ガラスボトムディッシュに播種して培養し、投与直前に細胞をＰＢＳで洗浄した。培養は５％ＣＯ２、３７℃に設定したインキュベーター（ＭＣＯ２０ＡＩＣ）、および１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭメディウムを用いて実施した。新たな１９００μＬの１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭメディウムに置換し、それぞれ１００μＬのサンプルを投与し、１６〜２０ｈインキュベーションを行った。細胞をＰＢＳにて少なくとも３回洗浄した後、新たな１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭメディウム２ｍＬを添加し、３時間ポスト−インキュベーションを行った。細胞をＰＢＳで洗浄し、β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオより購入）を用いて細胞を染色し、顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ−  ソフト：Ａｘｉｏ  ｖｉｓｉｏｎ  ３．０）を用いて細胞を観察した。染色はｋｉｔの推奨に従い実施した。【０１４８】
（ｐＨ感受性担体および生理活性物質をそれぞれ独立に使用した場合の細胞質基質へのデリバリー評価）
ＲＡＷ細胞を前日に松浪ガラスボトムディッシュに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭにて培養した。ＰＢＳにて洗浄後、ＭＥＭを添加し、１時間インキュベーションを行った。蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣ、あるいは蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣを３０μｇ／ｍＬの濃度で含む１９００μＬのＭＥＭを調製し、培養メディウムと置換した。さらに、１００μＬのｐＨ感受性担体の調製溶液を添加し、培養メディウム中にて両者の混合した状態にて１６〜２０時間インキュベーションを行った。蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣおよび蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣは、ｐＨ感受性担体を含む溶液との混合状態において、ｐＨ感受性担体に担持されないことを確認している。ＰＢＳにて洗浄し、２ｍＬの新たなＭＥＭにて３時間のポスト−インキュベーションを行った後、細胞をＰＢＳで洗浄し、フェノールレッド非添加ＤＭＥＭに置換し、蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察した。培養は５％ＣＯ２、３７℃に設定したインキュベーター（ＭＣＯ２０ＡＩＣ）を用いて実施し、細胞の観察は蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ−  ソフト：Ａｘｉｏ  ｖｉｓｉｏｎ  ３．０−  光源：Ｆｌｕｏ  Ａｒｃ）を用いて実施した。【０１４９】
（１）デオキシコール酸の複合化について
まず、デオキシコール酸と両親媒性物質との複合化を評価した。【０１５０】
上記ｐＨ感受性担体の調製にしたがって、１０００ｎｍｏｌのＥＹＰＣまたはＤＬＰＣと種々の量（０〜６４００ｎｍｏｌ）のデオキシコール酸との混合薄膜を作製し、１ｍＬのｐＨ７．４  ＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒを加えて超音波を照射し、デオキシコール酸が複合化した分散液をそれぞれ調製した。種々の濃度でデオキシコール酸を含む、ＥＹＰＣとデオキシコール酸とを含む分散液の写真を図２Ａに、種々の濃度でデオキシコール酸を含む、ＤＬＰＣとデオキシコール酸とを含む分散液の写真を図２Ｂに示す。なお、図２Ａ、図２Ｂは、左から順に、０ｎｍｏｌ、５０ｎｍｏｌ、１００ｎｍｏｌ、２００ｎｍｏｌ、４００ｎｍｏｌ、８００ｎｍｏｌ、１６００ｎｍｏｌ、３２００ｎｍｏｌ、６４００ｎｍｏｌのデオキシコール酸を含む、脂質１０００ｎｍｏｌの分散液である。ＥＹＰＣ、ＤＬＰＣのいずれの脂質も、脂質のみの分散液は白濁しているのに対し、デオキシコール酸を複合化したものは複合化量に依存して澄んだ溶液となった。【０１５１】
また、それぞれの分散液の５００ｎｍにおける透過度を測定したところ目視と同様の傾向が得られた。図２Ｃは、ＥＹＰＣとデオキシコール酸とを含む分散液の透過度を、図２Ｄは、ＤＬＰＣとデオキシコール酸とを含む分散液の透過度を測定した結果である。これらは、デオキシコール酸と脂質とが複合体（会合体）を形成していることを示唆している。以下、デオキシコール酸と脂質との複合体を「脂質−デオキシコール酸複合体」とも称する。【０１５２】
次に、これら分散液のゼータポテンシャルを調べた。図３は、デオキシコール酸量に対する、ＥＹＰＣとデオキシコール酸とを含む分散液（図中、ＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体）、およびＤＬＰＣとデオキシコール酸とを含む分散液（図中、ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体）のゼータポテンシャルの測定結果である。なお、図３の結果は、異なる５回の測定の平均値であり、±はＳＤである。【０１５３】
両分散液はデオキシコール酸の複合化に伴い、値を負に低下させた。これは負電荷を有するデオキシコール酸が脂質と複合化していることを意味するものであり、デオキシコール酸と脂質とが混在する複合体を形成していることを示している。いずれの脂質を用いた場合も、デオキシコール酸が１６００ｎｍｏｌの複合化量において、ゼータポテンシャルは約−３０ｍＶの値を示し、それ以上の複合化量においてゼータポテンシャルの値は大きく低下しなかった。したがって、この複合化量において、デオキシコール酸が、形成する複合体の表面を十分に覆って複合化しているものと考えられる。【０１５４】
（２）複合体の構造について
上記ｐＨ感受性担体の調製にしたがって、１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣに対して１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸で調製した複合体の蛍光物質保持実験（Ｐｙｒａｎｉｎｅ溶液を用いて薄膜を分散させる実験）を行ったところ、該複合体には蛍光物質が保持されていなかった。複合体が蛍光物質を保持できなかったことから、当該複合体は、中空構造ではなく、ミセルの形状であることが示唆された（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。【０１５５】
次に、上記ｐＨ感受性担体の調製にしたがって得られた種々の複合体の粒子径を測定した。動的光散乱測定による粒子径測定の結果、ＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体（ＥＹＰＣ：デオキシコール酸＝１０００ｎｍｏｌ：１６００ｎｍｏｌ）の粒子径（Ｄｉａｍｅｔｅｒ）は約７３ｎｍ、ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体（ＤＬＰＣ：デオキシコール酸＝１０００ｎｍｏｌ：１６００ｎｍｏｌ）の粒子径（Ｄｉａｍｅｔｅｒ）は約４３ｎｍの大きさの粒子であることがわかった（表１）。また、これらの多分散指数（ＰＤＩ）は０．２６と０．０７と小さな値であり、デオキシコール酸と脂質の複合体は小さく、均一な粒子であることが判明した。【０１５６】
【表１】
2013180253.tif 000008
【０１５７】
（３）ｐＨ感受性について
（溶出性試験）
ＥＹＰＣ単独、ＤＬＰＣ単独、ＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体およびＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体のｐＨ感受性を調べた。なお、実験は、上記の担体の調製方法にしたがって、１０００ｎｍｏｌの脂質（ＥＹＰＣまたはＤＬＰＣ）と１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸とを用いて複合体を調製し、上記の溶出性試験の方法にしたがって、生体膜モデルのリポソーム（ＥＹＰＣリポソーム）とインキュベーションすることにより調べた（以降、特別な記載のない限り、溶出性試験は９０分間のインキュベーションを実施した結果である）。図４は、ｐＨ７．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、ｐＨ５．５、ｐＨ５．０およびｐＨ４．５におけるＥＹＰＣ単独、ＤＬＰＣ単独、デオキシコール酸単独、ＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体およびＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の溶出性試験の結果である。また、図４のプロットは異なる３回の測定の平均であり、±はＳＤである。【０１５８】
ＥＹＰＣ単独、ＤＬＰＣ単独、およびＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体は、ｐＨ７．４からｐＨ４．５のいずれのｐＨにおいても蛍光物質の溶出を引き起こさず、ｐＨ感受性を示さなかったのに対し、ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体はｐＨ６．５以下においてデオキシコール酸単独よりも大きな溶出を引き起こした。ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体は、ｐＨ感受性の膜破壊機能促進効果を発現することが明らかとなった。【０１５９】
当該実験より、デオキシコール酸と適切な両親媒性物質の組み合わせにより、弱酸性環境に応答して機能を発現する複合体が得られると判明した。効果発現のｐＨは６．５以下であり、実用に適したｐＨ帯であった。また、生理的環境のｐＨでは全く溶出を引き起こさなかったことから、機能のｏｎ−ｏｆｆが良く制御されたｐＨ感受性であった。【０１６０】
（膜融合試験）
生理活性物質を細胞質基質に送達するためには弱酸性環境における膜融合の機能を有していることが望ましい。そこで、上記の膜融合試験の方法にしたがって、二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソームと、１０００ｎｍｏｌの脂質（ＥＹＰＣまたはＤＬＰＣ）および１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸を用いて調製した担体（複合体）とを、種々のｐＨにおいて、３７℃にて６０分間インキュベーションし、両者の融合を調べた。図５（Ａ）は、ｐＨ７．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、ｐＨ５．５、ｐＨ５．０およびｐＨ４．５におけるＥＹＰＣ単独、ＤＬＰＣ単独、デオキシコール酸単独、ＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体およびＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の蛍光強度比を示すグラフである。図５（Ｂ）は、上記と同様のｐＨにおける、デオキシコール酸単独、ＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体、ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の融合率を示すグラフである。融合率の０％は二重蛍光標識リポソームに、ＤＬＰＣ単独、またはＥＹＰＣ単独を添加した場合の蛍光強度比であり、１００％はそれぞれのサンプルをメタノール処理した値である。デオキシコール酸単独の値は、二重蛍光標識リポソーム単独を０％に、ＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体のメタノール処理をした値を１００％に用いて算出した。なお、図５（Ａ）および（Ｂ）のプロットは異なる３回の測定の平均であり、±はＳＤである。【０１６１】
図５（Ａ）の結果より、ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体は、ｐＨの低下に伴い蛍光強度比を増大させ、二重蛍光標識したＥＹＰＣリポソームとの融合を引き起こした。また、それらの融合率を評価したところ、ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体は弱酸性環境において膜融合機能促進効果を発現することが明らかとなった（図５（Ｂ））。ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体は膜破壊機能促進効果と膜融合機能促進効果の両者を発現した。このことから両者の効果は同一の現象に由来しており、膜破壊機能促進効果を発現する担体は膜融合機能促進効果も併せて発現する可能性があると考えられる。【０１６２】
なお、ｐＨ５．０の蛍光強度比は、メタノール処理のサンプルと比較して８割程の値であった（図５（Ａ））。メタノール処理をしたサンプルは、二重蛍光標識リポソームと担体が完全に融合した状態を意味するものであり、この結果は生体膜モデルのＥＹＰＣリポソームと作製した担体が高い効率で融合していること示している。生理活性物質の効率の良いデリバリーが期待される。【０１６３】
（４）一般的なｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅリポソームとの比較
ｐＨに対する感受性、および溶出の強さを確認するため、ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅリポソームとして良く知られているＤＯＰＥ−Ｃｈｅｍｓリポソーム（ＤＯＰＥ：Ｃｈｅｍｓ＝３：２（モル比））、およびＤＯＰＥ−オレイン酸リポソーム（ＤＯＰＥ：オレイン酸＝７：３（モル比））との比較を溶出性試験により実施した。測定は、２０ｎｍｏｌのＤＯＰＥに相当するＤＯＰＥ−ＣｈｅｍｓリポソームまたはＤＯＰＥ−オレイン酸リポソームを含む分散液を用いて、実施した。図６は、種々のｐＨに対する、ＤＯＰＥ−Ｃｈｅｍｓリポソーム、ＤＯＰＥ−オレイン酸リポソーム、およびＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の溶出率を示すグラフである。図６のプロットは異なる３回の測定の平均であり、±はＳＤである。【０１６４】
ＤＯＰＥ−Ｃｈｅｍｓリポソーム、ＤＯＰＥ−オレイン酸リポソームは、ｐＨ６．０以下のｐＨにおいて溶出し始め、ｐＨ３．５において最大値である２０〜３０％の溶出を示した。一方、ｐＨ感受性担体（ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体）はｐＨ６．５から溶出を誘起し始め、最大で６０％強の溶出となった。【０１６５】
従来のｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅリポソームと比較して、ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体は高い溶出率であったことから、本発明のｐＨ感受性担体（ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体）は、膜を不安定化、破壊する強い効果を有していることが示された。また、効果の発現するｐＨは一般的なｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅリポソームのそれよりも中性に近く、弱酸性環境に対して高い感受性であることも示された。【０１６６】
（５）デオキシコール酸の複合化量の検討
効果の発現に必要なデオキシコール酸の複合化量を調べるために、種々の量のデオキシコール酸を用いてｐＨ感受性担体を作製し、膜融合試験による膜融合機能促進効果の発現を評価した。測定は３回行い、平均値とＳＤを算出した。デオキシコール酸単独の値はＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体のメタノール処理をした値を用いて算出した。【０１６７】
図７（Ａ）および（Ｂ）は、デオキシコール酸量に対する、デオキシコール酸単独、ＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体およびＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の融合率である。【０１６８】
図７（Ａ）および（Ｂ）より、作製した担体は１００ｎｍｏｌ以上の複合化量においてデオキシコール酸単独よりも大きな値となり、膜融合機能促進効果を発現することが示された。よって、１０００ｎｍｏｌの脂質に対して１００〜６４００ｎｍｏｌのデオキシコール酸を複合化することにより、膜融合機能促進効果の発現を得られることが明らかとなった。【０１６９】
なお、ＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体の融合率は、デオキシコール酸単独とほぼ一致した値であり、ＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体はｐＨ感受性化合物の複合化による膜融合機能促進効果の獲得が、全くできていないことを示している。【０１７０】
（６）脂質構造の影響
以上の検討から、デオキシコール酸と適切な脂質（両親媒性物質）との組み合わせにより、弱酸性環境に応答して膜破壊機能促進効果、および膜融合機能促進効果を発現する担体を得られることが明らかとなった。これらの性質を与える脂質の解明を目的に、種々の構造の脂質を用いて担体を作製し、溶出性試験または膜融合試験を実施した。【０１７１】
脂質構造として、（Ａ）ジアシルホスファチジルコリンのアシル基の長さの影響（炭素数１０〜１８）、（Ｂ）ジアシルホスファチジルコリンのアシル基の不飽和結合の影響を調べた。それぞれの担体は、脂質１０００ｎｍｏｌとデオキシコール酸１６００ｎｍｏｌを使用して調製した。測定は３回行い、平均値とＳＤを算出した。なお、「炭素数」とは疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。【０１７２】
図８（Ａ）は、デオキシコール酸単独、ＤＳＰＣ−デオキシコール酸複合体、ＤＰＰＣ−デオキシコール酸複合体、ＤＭＰＣ−デオキシコール酸複合体、ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体、およびＤＤＰＣ−デオキシコール酸複合体の融合率である。図８（Ｂ）は、デオキシコール酸単独、ＨＳＰＣ−デオキシコール酸複合体、ＤＯＰＣ−デオキシコール酸複合体、およびＰＯＰＣ−デオキシコール酸複合体の融合率である。【０１７３】
図８（Ａ）より、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣを用いた担体は、デオキシコール酸単独と同等の値であり、効果を示さなかったのに対し、ＤＬＰＣ、ＤＤＰＣは効果を示した。使用する脂質の炭素長が影響しており、短い炭素鎖の脂質によって、効果の発現を得られると考えられる。炭素鎖の短い脂質は膜中における分子の反転運動であるｆｌｉｐ  ｆｌｏｐを発生しやすく、その性質が影響していると考えられる。【０１７４】
また、不飽和結合の影響に関して、炭素数１８に不飽和を１つもつＰＯＰＣや不飽和を２つもつＤＯＰＣの担体は効果を発現しなかった（図８（Ｂ））。不飽和結合は効果の発現に大きな影響を与えないことを示している。【０１７５】
次に、効果の発現に及ぼす脂質のヘッド構造の影響を調べた。それぞれ、脂質１０００ｎｍｏｌとデオキシコール酸１６００ｎｍｏｌを使用して担体を調製した。測定は３回行い、平均値とＳＤを算出した。【０１７６】
図９（Ａ）は、デオキシコール酸単独、ＤＬＰＥ単独、ＤＭＰＥ単独、ＤＳＰＥ単独およびＤＯＰＥ単独の溶出率を示すグラフであり、図９（Ｂ）は、デオキシコール酸単独、ＤＬＰＥ−デオキシコール酸複合体、ＤＭＰＥ−デオキシコール酸複合体、ＤＳＰＥ−デオキシコール酸複合体およびＤＯＰＥ−デオキシコール酸複合体の溶出率を示すグラフである。【０１７７】
ＰＥを有する脂質はいずれも効果発現に至らず、ヘッド構造はコリン基が望ましいことが示された（図９（Ａ）および（Ｂ））。【０１７８】
以上の結果より、効果の発現を与える両親媒性物質としては、コリン基をヘッド構造にもち、炭素鎖１０〜１２の不飽和脂質および飽和脂質が望ましいと判明した。【０１７９】
（７）その他の両親媒性物質の検討
脂質以外の材料も生理活性物質のデリバリーに利用されている。さらに、デオキシコール酸は脂質以外の疎水性材料とも複合体を形成することが知られており、様々な物質において機能を有する担体を得られる可能性がある。そこで、種々の物質とデオキシコール酸とを複合化させて担体を作製し、溶出性試験にて評価を行った。デオキシコール酸単独でも、界面活性作用により溶出率の増大を招くため、（１）溶出性試験において、生理的ｐＨにおける溶出率よりも生理的ｐＨ未満の所定のｐＨにおける溶出率が上昇し、なおかつその上昇幅がｐＨ感受性化合物単独で実験した場合の上昇幅よりも大きいこと、および、（２）当該生理的ｐＨ未満の所定のｐＨでの溶出性試験において、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質が複合体（ｐＨ感受性担体）を形成したときの溶出率が、ｐＨ感受性化合物単独の溶出率と両親媒性物質単独の溶出率の和より大きいこと、の両者を満たす場合を、効果の発現を与える物質であると規定し、スクリーニングを行った。【０１８０】
なお、上記（１）および（２）とは、溶出性試験において、ｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との複合体）の溶出率Ｌｃが、ｐＨ感受性化合物単体の溶出率Ｌａと両親媒性物質単体の溶出率Ｌｂと、下記の関係を双方満たすものをいう。すなわち、上記（１）が、下記式（１）で表され、上記（２）が下記式（２）で表される。なお、下記式中、ｐＨ７．４の溶出率を、それぞれ、Ｌｃ７．４、Ｌａ７．４、Ｌｂ７．４と表し、ｐＨ５．０または４．５の溶出率を、それぞれ、Ｌｃｘ、Ｌａｘ、Ｌｂｘと表す。【０１８１】
【数６】
2013180253.tif 000009
【０１８２】
結果を表２〜７に示す。なお、表２〜７のそれぞれの値は異なる３回の測定の平均値であり、±はＳＤである。【０１８３】
また、デオキシコール酸１６００ｎｍｏｌ（６６３μｇ）に対して種々の質量の高分子材料を用いて粒子を調整し、ｐＨ５．０における溶出の発生を評価した。図１０に、ｐＨ５．０におけるデオキシコール酸と高分子材料との複合体の溶出性の結果を示す。なお、図１０の値は、１回の測定の値である。【０１８４】
【表２】
2013180253.tif 000010
【０１８５】
【表３】
2013180253.tif 000011
【０１８６】
【表４】
2013180253.tif 000012
【０１８７】
検討の結果、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルであるＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０およびＴｗｅｅｎ８０；炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステルであるＳＰＡＮ４０、ＳＰＡＮ６０、ＳＰＡＮ８０、ＳＰＡＮ６５およびＳＰＡＮ８５；グリセロール誘導体であるモノオレイン酸グリコール（表中、モノオレイン）、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールおよびジラウリン酸グリセロール（ααジラウリン）；ポリオキシエチレンヒマシ油であるＰＥＧ１０−ヒマシ油；α−トコフェロール；が、適切な物質であることが示された。なお、両親媒性物質における「炭素数」とは、両親媒性物質の疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。【０１８８】
（８）両親媒性物質の割合検討
上記（７）の検討により、効果発現をもたらす両親媒性物質と、そうではない物質とが明らかとなった。そこで、効果発現をもたらす物質がどの程度の割合で含まれれば、効果発現に至るのかを調べた。効果発現をもたらさない物質としてＥＹＰＣを選択し、ＥＹＰＣに種々の割合でＤＬＰＣ、あるいはＳＰＡＮ８５を、合計して１０００ｎｍｏｌとなるように混合し、複数の両親媒性物質からなる担体を調製した。【０１８９】
ＥＹＰＣに、ＤＬＰＣあるいはＳＰＡＮ８５を合計して１０００ｎｍｏｌとなるように種々の割合で混合し、さらに１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸を複合化させ担体を調製した。それぞれの担体のｐＨ７．４、ｐＨ５．０における溶出性試験を行い、効果発現について調べた。【０１９０】
図１１は、ＥＹＰＣとデオキシコール酸とＤＬＰＣまたはＳＰＡＮ８５との複合体の（Ａ）ｐＨ７．４、（Ｂ）ｐＨ５．０における溶出率である。図１１（Ａ）および（Ｂ）のそれぞれの値は異なる３回の測定の平均値であり、±はＳＤである。【０１９１】
ＤＬＰＣあるいはＳＰＡＮ８５：ＥＹＰＣ（ｍｏｌ：ｍｏｌ）の割合が１００：１５０〜１００：０の範囲においてｐＨ感受性の溶出を確認した（図１１（Ａ）および（Ｂ））。デオキシコール酸との複合化による、弱酸性環境に応答して、効果を発現するｐＨ感受性担体を得るためには、適切な両親媒性物質の割合が、前記の範囲で必要であることが明らかとなった。【０１９２】
（９）デオキシコール酸以外のｐＨ感受性化合物の探索
以上の結果より、デオキシコール酸が弱酸性環境において疎水的な会合の状態に影響を及ぼしうることがわかった。デオキシコール酸と類似の構造をもつ分子は同様にｐＨ感受性担体を与えることが期待される。そこで、デオキシコール酸の類似分子として、種々の胆汁酸、グリチルリチン酸、およびグリチルレチン酸を選定し、該酸とＤＬＰＣとの複合体の溶出性試験および膜融合試験を行い、ｐＨ感受性化合物として利用可能かを調べた。【０１９３】
１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６００ｎｍｏｌの種々の酸（以下、候補化合物）とを用いて担体を調製した。【０１９４】
図１２は、ＤＬＰＣと種々の候補化合物との複合体の（Ａ）ｐＨ７．４、（Ｂ）ｐＨ５．０における溶出率である。図１２のそれぞれの値は異なる３回の測定の平均値であり、±はＳＤである。【０１９５】
また、図１３には、種々のｐＨにおけるＤＬＰＣと種々の候補化合物との複合体の溶出率のグラフを示す。図１３のそれぞれの値は異なる３回の測定の平均値であり、±はＳＤである。【０１９６】
図１４は、（Ａ）種々のｐＨ感受性化合物単独、（Ｂ）ＤＬＰＣと種々のｐＨ感受性化合物との複合体のｐＨ７．４およびｐＨ５．０における融合率である。それぞれの値は異なる３回の測定の平均値であり、±はＳＤである。【０１９７】
ｐＨ７．４ではいずれの候補化合物を用いて調製した担体も溶出を引き起こさなかったのに対し、ｐＨ５．０ではデオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸（トリハイドロコレスタノニック・アシッド）、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸を用いて調製した担体は、候補化合物単独を添加した場合に比べて有意に大きな溶出を引き起こし、膜破壊機能促進効果を示した（図１２（Ａ）および（Ｂ））。これらの担体はｐＨ感受性の膜融合機能促進効果を有していることも併せて確認した（図１４（Ａ）および（Ｂ））。図５（Ａ）および（Ｂ）における結果に引き続き、本実施例に係るｐＨ感受性担体は、膜破壊機能促進効果とともに膜融合機能促進効果も併せて発現した。【０１９８】
また、これら担体のｐＨ−ｐｒｏｆｉｌｅを調べたところ、溶出を引き起こし始めるｐＨは用いる分子によって異なった（図１３）。これは分子によってｐＫａが異なること、および両親媒性物質との会合形成の様式が異なることに由来するものと考えられる。この結果は効果を発現するｐＨを詳細に選択することが可能であることを示しており、生体内のデリバリー、および細胞内のデリバリーを詳細に設定することが可能であると期待される。本実験により、これらのｐＨ感受性担体はｐＨ７〜３において効果を有することが明らかとなった。【０１９９】
（１０）ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質の組み合わせの検討
図１２（Ａ）および（Ｂ）、図１３、図１４（Ａ）および（Ｂ）において、デオキシコール酸と類似の構造をもち効果の発現を与えることが判明した化合物（ｐＨ感受性化合物）と、表２〜７および図１０のスクリーニングにおいて効果の発現をもたらすと判明した両親媒性物質との種々の組み合わせについて、効果発現の有無を確認検討した。【０２００】
１０００ｎｍｏｌの両親媒性物質と、１００ｎｍｏｌのｐＨ感受性化合物、あるいは１０００ｎｍｏｌの両親媒性物質と、６４００ｎｍｏｌのｐＨ感受性化合物とを用いて担体を調製した。表８および９に、種々のｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との複合体の溶出試験の結果を示す。【０２０１】
【表５】
2013180253.tif 000013
【０２０２】
【表６】
2013180253.tif 000014
【０２０３】
表８および表９より、いずれの組み合わせにおいても、効果を有すると判断する指標であるΔとΔ’はプラスの値を示しており、表８および表９の組み合わせによって得られた担体はｐＨ感受性の機能を有することが判明した。【０２０４】
（１１）細胞膜に対する膜融合の確認
ｐＨ感受性担体は、上記（３）、（５）、（６）、（９）等の結果から、弱酸性環境に応答して膜破壊機能促進効果、および膜融合機能促進効果を発現することが示された。そこで、実際にｐＨ感受性担体と細胞膜との膜融合を確認した。より詳細には、ｐＨ７．４とｐＨ５．３に調整したメディウム中において、蛍光標識したｐＨ感受性担体とＨｅＬａ細胞を短時間インキュベートし、細胞表面の膜に対する染色を調べ、ｐＨ感受性担体と細胞膜との膜融合を確認した。【０２０５】
その結果、ｐＨ７．４において蛍光は起点状であるか、核近くの領域に観察された（図１５（Ａ））。これは、ｐＨ感受性担体が、細胞に取り込まれ、エンドソームやリソソームに存在していることを示している。なお、同様の画像は、蛍光標識した両親媒性物質単独においても観察された（Ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。【０２０６】
一方、ｐＨ５．３においては、視野内全てにおいて蛍光の形状と細胞の形状が一致した像が観察された（図１５（Ｂ））。蛍光標識されたｐＨ感受性担体が、細胞の表面において細胞膜と膜融合したために、細胞の形状に蛍光が広がったと考えられる。【０２０７】
以上の結果から、ｐＨ感受性担体は、メディウム中の弱酸性環境に応答して膜融合機能促進効果を発現し、細胞表面の細胞膜と膜融合したことが明らかとなった。【０２０８】
また、フローサイトメーターを用いて細胞の蛍光強度を評価したところ、ｐＨ５．３でインキュベートした細胞は大きな蛍光強度を示した（図１５（Ｃ））。この結果は、蛍光標識したｐＨ感受性担体が多量に膜融合したことによるものであると考えられる。よって、ｐＨ感受性担体は、実際の細胞膜とも効率良く膜融合が可能であることが示された。【０２０９】
（１２）ペプチドおよびタンパク質の組み込みが効果発現に与える影響
生理活性を有するペプチドまたはタンパク質を疎水的な会合に組み込み、ＤＤＳに使用することは良く検討されている。これは、本担体の有望な利用方法である。そこで、モデルペプチドとしてＯＶＡ２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ、ピーエイチジャパンより購入）、モデルタンパク質としてＯＶＡ（シグマ−アルドリッチより購入）を用いて、生理活性物質の組み込みが担体の効果発現に及ぼす影響について調べた。【０２１０】
まず、生理活性物質の組み込みを評価するために、ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体（１０００ｎｍｏｌ：１６００ｎｍｏｌ）に、ペプチドまたはタンパク質（１９２μｇ）を組み込んだ担体の粒子径および多分散指数（ＰＤＩ）を測定した（表１０）。【０２１１】
次に、ＤＬＰＣ１０００ｎｍｏｌおよびデオキシコール酸１６００ｎｍｏｌに対して、種々の量のペプチド（Ａ）またはタンパク質（Ｂ）を組込んだ担体の溶出性を調べた。図１６に、ｐＨ７．４およびｐＨ５．０における（Ａ）ペプチド、（Ｂ）タンパク質含有担体の溶出率の結果を示す。図１６の値は異なる３回の測定の平均であり±はＳＤである。【０２１２】
さらに、ＤＬＰＣ１０００ｎｍｏｌおよびデオキシコール酸（Ａ）またはウルソデオキシコール酸（Ｂ）１６００ｎｍｏｌに対して、７６８μｇのペプチドまたはタンパク質を組込んだ担体の融合率を調べた。図１７に、ｐＨ７．４およびｐＨ５．０における（Ａ）デオキシコール酸、（Ｂ）ウルソデオキシコール酸含有担体の融合率の結果を示す。図１７（Ａ）および（Ｂ）の値は異なる３回の測定の平均であり±はＳＤである。【０２１３】
【表７】
2013180253.tif 000015
【０２１４】
担体がペプチドまたはタンパク質を組み込むことにより、担体の粒子径はやや大きくなる傾向となった（表１０）。これらの物質が担体に組込まれたことを示唆している。一方、引き起こされる溶出は、ペプチドまたはタンパク質のいずれの量においても組込まなかった場合と同一の値となった（図１６（Ａ）および（Ｂ））。ペプチドまたはタンパク質の担体への組み込みは効果の低下を引き起こさないことが示された。【０２１５】
また、融合性試験の結果においても同様の結果が得られた（図１７（Ａ）および（Ｂ））。これらの結果より、生理活性物質を組込むことは担体の効果発現に大きな影響を及ぼさないことが明らかとなった。【０２１６】
（１３）細胞質基質へのデリバリー１
弱酸性環境において膜融合および膜破壊を促進する性質を有した担体はエンドソームを経由し、内包あるいは組込んだ物質を細胞質基質までデリバリーすることが多数報告されている。構築したｐＨ感受性担体を用いて生理活性物質の細胞質基質へのデリバリーを試みた。【０２１７】
ＤＬＰＣ１０００ｎｍｏｌとデオキシコール酸またはウルソデオキシコール酸１６００ｎｍｏｌとに対して、１４０μｇ／ｍＬの蛍光標識ペプチド溶液を用いて担体を調製した。また、コントロールとして、ＤＬＰＣ１０００ｎｍｏｌに対して、１４０μｇ／ｍＬの蛍光標識ペプチドを用いて担体を調製した。【０２１８】
図１８に、（Ａ）蛍光標識ペプチド単独の溶液、（Ｂ）蛍光標識ペプチド含有ＤＬＰＣ単独の溶液、（Ｃ）蛍光標識ペプチド含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の溶液、および（Ｄ）蛍光標識ペプチド含有ＤＬＰＣ−ウルソデオキシコール酸複合体の溶液の写真を示す。【０２１９】
蛍光標識ペプチド単独の溶液（Ａ）に比べて、蛍光標識ペプチド含有ＤＬＰＣ単独の溶液（Ｂ）、蛍光標識ペプチド含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の溶液（Ｃ）、および蛍光標識ペプチド含有ＤＬＰＣ−ウルソデオキシコール酸複合体の溶液（Ｄ）は弱い蛍光となった。これは蛍光標識ペプチドが担体の疎水的なドメインに固定されたためと考えられ、蛍光標識ペプチドが担体に組込まれていることを示唆している。【０２２０】
次に、蛍光標識ペプチドの細胞質基質へのデリバリーを試みた。具体的には、１９００μＬの１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭメディウムにて培養しているＲＡＷ細胞に、上記（Ａ）〜（Ｄ）の蛍光標識ペプチド含有サンプルを１００μＬ（１４μｇ蛍光標識ペプチド／ｗｅｌｌ）投与し、１晩取り込ませた。細胞を洗浄し、ポストインキュベーションを３時間行い、蛍光顕微鏡にて細胞を観察した。【０２２１】
図１９に、（Ａ）蛍光標識ペプチド単独、（Ｂ）蛍光標識ペプチド含有ＤＬＰＣ単独、および（Ｃ）蛍光標識ペプチド含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の蛍光顕微鏡写真を示す。また、図２０に、蛍光標識ペプチド含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体の（Ａ）顕微鏡写真および（Ｂ）蛍光顕微鏡写真、ならびに蛍光標識ペプチド含有ＤＬＰＣ−ウルソデオキシコール酸複合体の（Ｃ）顕微鏡写真および（Ｄ）蛍光顕微鏡写真を示す。【０２２２】
蛍光標識ペプチド単独（Ａ）、あるいは蛍光標識ペプチド含有ＤＬＰＣ単独（Ｂ）の場合、蛍光の多くは起点状に見え、蛍光標識ペプチドはエンドソーム内に留まっていることを示している（図１９（Ａ）および（Ｂ））。【０２２３】
一方、蛍光標識ペプチドを組込んだＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体（Ｃ）は、ほぼ全ての細胞において細胞質基質全体に蛍光が確認され、蛍光標識ペプチドはエンドソームから脱出し、細胞質基質に移行していることが示された（図１９（Ｃ））。担体が負に帯電していること、およびポスト−インキュベーションを３時間実施していることから、この蛍光は担体が細胞表面全体に吸着することによって得られた像であるとは考え難く、蛍光標識ペプチドがエンドソームを経由して、細胞質基質にデリバリーされたと考えられる。【０２２４】
また、ウルソデオキシコール酸を用いて調製した担体においてもデオキシコール酸の場合と同様に、細胞質基質全体に蛍光が観察され、効率の良い細胞質基質デリバリーが確認された（図２０（Ｃ）および（Ｄ））。【０２２５】
以上より、本発明のｐＨ感受性担体によって、生理活性物質の効率の良い細胞質基質デリバリーが可能であることが示された。【０２２６】
（１４）細胞質基質へのデリバリー２
続いて、タンパク質の細胞質基質へのデリバリーを試みた。モデルタンパク質としてβ−ｇａｌを選択し、ｐＨ感受性担体に組込んだ。細胞質基質へのデリバリーは、ＲＡＷ細胞にアプライした後の酵素活性を可視化し、その様子を比較することにより評価した。【０２２７】
ＤＬＰＣ１０００ｎｍｏｌとデオキシコール酸またはウルソデオキシコール酸１６００ｎｍｏｌとに対して、１．４ｍｇ／ｍＬのβ−ｇａｌ溶液を用いて担体を調製した。【０２２８】
図２１に、（Ａ）β−ｇａｌ単独、（Ｂ）β−ｇａｌ含有ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体、および（Ｃ）β−ｇａｌ含有ＤＬＰＣ−ウルソデオキシコール酸複合体の顕微鏡写真を示す。【０２２９】
β−ｇａｌ単独を添加した細胞は染色されなかった（図２１（Ａ））。これはβ−ｇａｌがエンドソームにおいて分解されているためであり、細胞質基質に移行していないことを示している。一方、ｐＨ感受性担体に組込んだ場合はβ−ｇａｌによる青色の染色が確認された（図２１（Ｂ）および（Ｃ））。β−ｇａｌがエンドソームから脱出し、酵素活性を維持した状態で細胞質基質に移行したことを示している。Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｍ．Ｒｏｔｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０  １３２（８）２６４２−２６４５において、β−ｇａｌの細胞質基質へのデリバリーを目的とした同様の実験が実施されており、その文献と同様の結果を得られていることから、前記の考察を支持している。【０２３０】
（１５）細胞質基質へのデリバリー３
上記（１３）および（１４）においては、生理活性物質をｐＨ感受性担体に担持させて細胞質基質へのデリバリーを確認した。そこで、次に、ｐＨ感受性担体および生理活性物質をそれぞれ独立に使用した場合の細胞質基質へのデリバリーを試みた。ｐＨ感受性担体および生理活性物質が同一のエンドソーム内に取り込まれる場合、ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果によりエンドソームの膜破壊が生じ、この際、エンドソーム内に混在する生理活性物質がエンドソームから溶出することで、細胞質基質に生理活性物質をデリバリーすることができると考えられる。【０２３１】
まず、蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣをＲＡＷ細胞に添加した場合、および蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣをＲＡＷ細胞に添加した場合、ともに細胞内における蛍光は起点状に確認され、蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣおよび蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣはエンドソーム内に留まっていることが示された（図２２Ａ（Ａ）および（Ｂ））。【０２３２】
次に、上記（３）および（５）により膜破壊促進機能および膜融合促進機能が観察されなかったＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体を蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣまたは蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣとともに併用した。具体的には、蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣを含むＲＡＷ細胞の培養溶液にＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体をさらに添加した。また、蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣを含むＲＡＷ細胞の培養溶液にＥＹＰＣ−デオキシコール酸複合体をさらに添加した。これらの場合においても上記と同様、細胞内における蛍光は起点状に確認され、蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣおよび蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣはエンドソーム内に留まっていることが示された（図２２Ａ（Ｃ）および（Ｄ））。【０２３３】
そして、ｐＨ感受性担体を、蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣまたは蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣとともに併用した。具体的には、蛍光標識ペプチド−ＦＩＴＣを含むＲＡＷ細胞の培養溶液に膜破壊機能促進効果を有するｐＨ感受性担体の調製溶液をさらに添加した。また、蛍光標識ＯＶＡ−ＦＩＴＣを含むＲＡＷ細胞の培養溶液に膜破壊機能促進効果を有するｐＨ感受性担体の調製溶液をさらに添加した。なお、前記ｐＨ感受性担体としては、ＤＬＰＣ−デオキシコール酸複合体、ＳＰＡＮ８０−デオキシコール酸複合体、ＤＤＰＣ−デオキシコール酸複合体、ポリオキシエチレンヒマシ油（ＰＥＧ１０ヒマシ油）−デオキシコール酸複合体、Ｔｗｅｅｎ２０−デオキシコール酸複合体、Ｔｗｅｅｎ８０−デオキシコール酸複合体、α−トコフェロール−デオキシコール酸複合体、ＤＬＰＣ−ウルソデオキシコール酸複合体、ＤＬＰＣ−グリチルリチン酸複合体、ＤＬＰＣ−ケノデオキシコール酸複合体、ＤＬＰＣ−ヒオデオキシコール酸複合体、およびＤＬＰＣ−グリコデオキシコール酸複合体を用いた。この際、ｐＨ感受性担体は、１６０ｎｍｏｌのｐＨ感受性化合物と１００ｎｍｏｌ両親媒性物質とを用いて調製した。これらの場合においては、細胞質基質全体に蛍光が確認された（図２２Ａ（Ｅ）〜（Ｊ）、図２２Ｂ（Ｋ）〜（Ｔ）、図２２Ｃ（Ｕ）〜（ＡＢ））。したがって、生理活性物質は、膜破壊機能促進効果を有するｐＨ感受性担体と独立に使用された場合（担持されていない場合）であっても、細胞質基質にデリバリーをすることができることが示された。
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１７】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【国際調査報告】
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