(57)【要約】  ヘテロ原子を含む官能基で表面が修飾されておりＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子が提供される。このナノダイヤモンド粒子は化学修飾することにより生体内で利用できる蛍光分子プローブとすることができる。またこの蛍光分子プローブに含まれるＮＶセンターの回転運動を追跡することによりタンパク質の構造変化をリアルタイムで解析することができる。ヘテロ原子を含む官能基は、ヒドロキシル基およびヒドロキシアルキル基の少なくともいずれかの官能基、またはカルボキシル基とすることができる。
2014058012.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘテロ原子を含む官能基で表面が修飾されている、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
【請求項２】
前記ヘテロ原子を含む官能基は、電子供与性官能基である、請求項１に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
【請求項３】
前記ヘテロ原子を含む官能基は、ヒドロキシル基およびヒドロキシアルキル基の少なくともいずれかである、請求項１または請求項２に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
【請求項４】
前記ヘテロ原子を含む官能基は、カルボキシル基である、請求項１に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
【請求項５】
前記ナノダイヤモンド粒子は、平均粒径が１ｎｍ以上５０ｎｍ以下である、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
【請求項６】
前記ＯＤＭＲ強度は、１〜５ＧＨｚの高周波磁場を照射したときの、励起光による蛍光発光量の減少率である、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
【請求項７】
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子からなる粉末状試薬、または前記ナノダイヤモンド粒子を液体に分散させた試薬。
【請求項８】
ナノダイヤモンド粒子を準備する工程と、
前記ナノダイヤモンド粒子の表面に存在する官能基のうち１種以上のヘテロ原子を含む官能基の修飾率を選択的に高める処理を行なう工程と、を含む、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造方法。
【請求項９】
前記ヘテロ原子を含む官能基はヒドロキシル基およびヒドロキシアルキル基の少なくともいずれかであり、かつ前記処理を行なう工程は還元処理を行なう工程である、請求項８に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造方法。
【請求項１０】
前記ヘテロ原子を含む官能基はカルボキシル基であり、かつ前記処理を行なう工程は酸化処理を行なう工程である、請求項８に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を化学修飾した、蛍光分子プローブ。
【請求項１２】
請求項１１に記載の蛍光分子プローブからなる粉末試薬、または前記蛍光分子プローブを液体に分散させた試薬。
【請求項１３】
請求項１１に記載の蛍光分子プローブで標的タンパク質を標識する工程と、
標識された前記標的タンパク質に励起光および１〜５ＧＨｚの高周波磁場を照射して、蛍光発光量が減少するピーク磁場周波数を検知することによって前記標的タンパク質の構造変化を検知する工程と、を備える、タンパク質の構造解析方法。
【請求項１４】
前記検知する工程において、前記ピーク磁場周波数は静的な外部磁場の下で分裂しており、
前記検知する工程は、前記ピーク磁場周波数の分裂幅の大きさから、前記蛍光分子プローブに含まれるＮＶセンターの回転運動を検知する工程を含む、請求項１３に記載のタンパク質の構造解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノダイヤモンド粒子およびその製造方法ならびに蛍光分子プローブおよびタンパク質の構造解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の構造やタンパク質等生体分子の構造解析や機能解析に使用される蛍光分子プローブとしては、種々のものが知られている。たとえば、第一級アミンと特異的に反応して蛍光性を示すフルオレスカミン等を挙げることができる。そして、蛍光分子プローブで標的タンパク質を標識し蛍光顕微鏡等を用いて観測することによって、標的タンパク質の運動や配向等といった分子構造に関する各種情報を収集できる。そして、昨今、このような蛍光分子プローブに使用される蛍光物質としてナノダイヤモンド粒子が注目されている（たとえば、特開２０１１−１８０５７０号公報（特許文献１））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１１−１８０５７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
生体内において、タンパク質は生命現象に深く関与している。そして、タンパク質の生体内における構造変化を追跡することは、タンパク質の機能を明らかにし、ひいては病気の発現や進行のメカニズムを明らかにする上で極めて重要である。従来、タンパク質の構造解析は、専ら「ｉｎ−ｖｉｔｒｏ」すなわち試験管内で行なわれてきた。しかし、実際にタンパク質が機能している生体内「ｉｎ−ｖｉｖｏ」と試験管内とでは、タンパク質を取り巻く環境が大きく異なることから試験管内で観測された結果がそのまま生体内での構造や機能に適用できる場面は限られており、生体内におけるタンパク質の構造解析方法の早期確立が望まれている。【０００５】
従来、タンパク質の構造解析には核磁気共鳴による分子構造解析法〔以下「ＮＭＲ（Nuclear Magnetic Resonance）法」とも記す〕や蛍光顕微鏡を用いた蛍光分子観察法等が主に用いられてきた。【０００６】
ＮＭＲ法は、非侵襲的な計測が可能であるとともに原子レベルでの高い空間分解能を有するため、立体構造に関する多くの情報を収集できる。しかしその反面、感度が低く、時間分解能も低いためリアルタイムでの観測は困難であった。【０００７】
蛍光分子観察法は、一分子計測が可能であるとともにリアルタイム観察・計測が可能である。しかしその反面、空間分解能が低く、いわゆる構造の揺らぎや構造変化を計測することが極めて困難であった。さらには蛍光分子プローブに用いられる蛍光物質に毒性がある場合も多く非侵襲的な計測に適していなかった。【０００８】
このように既存の方法によっては、生体内で非侵襲的に、かつタンパク質１分子の構造変化をリアルタイムで観測することは不可能であった。【０００９】
ところで、光検出磁気共鳴法〔以下「ＯＤＭＲ（Optically-Detected Magnetic Resonance）法」とも記す〕は、試料体の磁気共鳴を高感度に検出できる手段として知られている。ＯＤＭＲ法では、試料体に励起光および高周波磁場を同時に照射して蛍光発光量の変化を検知することにより磁気共鳴を高感度に検出する。これ以降、本明細書では、このような計測手段をＯＤＭＲ計測とも記す。【００１０】
近年、たとえば、特許文献１に記載された蛍光顕微鏡装置のように、磁気共鳴法と蛍光分子観察法とを融合させたＯＤＭＲ法を生体内におけるタンパク質の構造解析に応用する研究が進められている。そしてその中でナノダイヤモンド粒子の蛍光分子プローブとしての可能性が示されている。【００１１】
ダイヤモンド結晶中の窒素原子と空孔からなる複合欠陥（以下「ＮＶセンター」とも記す）を含むナノダイヤモンド粒子は、ＮＶセンターにおいて蛍光発光し、かつ磁気共鳴によって蛍光発光量を変化させることが知られている。ここで、ＮＶセンターとは、図１に示すように、ダイヤモンド結晶中の炭素原子１を置換した窒素原子２（Ｎ；Nitrogen）と、窒素原子２と隣接する空孔３（Ｖ；Vacancy）とからなる複合欠陥を示す。【００１２】
ＮＶセンターにおける蛍光には、蛍光の褪色やブリンキングが少なく、蛍光分析への適応性が高い。さらに、ナノダイヤモンド粒子は炭素原子からなる物質であるため、生体への毒性が極めて低いと考えられ、また標的タンパク質を標識するための粒子表面の化学修飾が容易であるため生体内で使用する蛍光分子プローブとして有望視されている。【００１３】
上記のようなＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子のＯＤＭＲ計測を行ない、蛍光発光量を縦軸、磁場周波数を横軸とした２次元座標に表示した場合、特定の高周波磁場において蛍光発光の減少ピークが観測される。ここで、本明細書では上記の２次元座標に表示されたスペクトルを「ＯＤＭＲスペクトル」とも記し、上記の減少ピークを「ＯＤＭＲシグナル」とも記す。【００１４】
そして、ＯＤＭＲ計測において、高周波磁場を照射したときの発光量をＬ（ＯＮ）とし、磁場を照射しないときの発光量Ｌ（ＯＦＦ）としたとき、下記式（Ｉ）によって算出される蛍光発光量の減少率を「ＯＤＭＲ強度」と定義する。【００１５】
（ＯＤＭＲ強度）＝１−｛Ｌ（ＯＮ）／Ｌ（ＯＦＦ）｝・・・（Ｉ）
上記の減少ピーク（ＯＤＭＲシグナル）は静的な外部磁場に置かれたＮＶセンターでは分裂し、ピークの分裂幅はＮＶセンターの回転運動とともに変化するため、ＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を蛍光分子プローブとして使用し、該蛍光分子プローブによって標的タンパク質を標識するとともにＯＤＭＲスペクトルを計測することにより、上記した既存の方法では実現できなかった生体内におけるタンパク質の精細かつリアルタイムの構造解析が実現できる可能性がある。【００１６】
ここで、上記のような生体内におけるタンパク質の構造解析方法が実現されるためには、極めて高いＯＤＭＲ強度を有するＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子が必要とされる。【００１７】
しかしながら、現状において、ＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子のＯＤＭＲ強度は生体内での計測を安定的に行なうには十分ではなく、未だ上記のようなタンパク質の構造解析方法は確立されていない。そして、現在まで、ＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子のＯＤＭＲ強度を高める方法が報告された例はない。【００１８】
本発明はこのような現状に鑑みてなされたものであって、その目的とするところはＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を提供し、該ナノダイヤモンド粒子を化学修飾した蛍光分子プローブを用いて新規なタンパク質の構造解析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明のナノダイヤモンド粒子は、粒子表面が特定の官能基で修飾されることによって、粒子内部に存在するＮＶセンターのＯＤＭＲ強度が高められている。【００２０】
すなわち、本発明のナノダイヤモンド粒子は、ヘテロ原子を含む官能基で表面が修飾されており、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むことを特徴とする。【００２１】
ここで、上記ヘテロ原子を含む官能基は電子供与性官能基であることが好ましい。また、上記ヘテロ原子を含む官能基はヒドロキシル基およびヒドロキシアルキル基の少なくともいずれかであることが好ましい。また上記ヘテロ原子を含む官能基はカルボキシル基であってもよい。【００２２】
また、上記ナノダイヤモンド粒子は、平均粒径が１ｎｍ以上５０ｎｍ以下であることが好ましい。【００２３】
そして、上記ＯＤＭＲ強度とは、１〜５ＧＨｚの高周波磁場を照射したときの励起光による蛍光発光量の減少率を示す。【００２４】
本発明のナノダイヤモンド粒子の具体的な利用形態としては、たとえばナノダイヤモンド粒子からなる粉末状試薬やナノダイヤモンド粒子を液体に分散させた試薬等を挙げることができる。【００２５】
さらに、本発明は上記のナノダイヤモンド粒子の製造方法にも係わり、該製造方法は、ナノダイヤモンド粒子を準備する工程と、該ナノダイヤモンド粒子表面に存在する官能基のうち１種以上のヘテロ原子を含む官能基の修飾率を選択的に高める処理を行なう工程と、を含む、ＯＤＭＲ強度が高められたナノダイヤモンド粒子の製造方法である。【００２６】
ここで、上記１種以上のヘテロ原子を含む官能基はヒドロキシル基および／またはヒドロキシアルキル基（ヒドロキシル基およびヒドロキシアルキル基の少なくともいずれか）であり、かつ上記処理を行なう工程は還元処理を行なう工程であることが好ましい。【００２７】
また、上記１種以上のヘテロ原子を含む官能基はカルボキシル基であり、かつ上記処理を行なう工程は酸化処理を行なう工程であってもよい。【００２８】
また、本発明は上記のナノダイヤモンド粒子を用いた蛍光分子プローブにも係わり、該蛍光分子プローブは、上記のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を化学修飾したものであることを特徴とする。この蛍光分子プローブは、たとえば粉末状の試薬や液体に分散させた試薬として利用することができる。【００２９】
さらに、本発明はタンパク質の構造解析方法にも係わり、該構造解析方法は、上記の蛍光分子プローブで標識した標的タンパク質に、励起光および１〜５ＧＨｚの高周波磁場を照射して、蛍光発光量が減少するピーク磁場周波数を検知することで、該標的タンパク質の構造変化を検知するタンパク質の構造解析方法である。すなわち、該構造解析方法は蛍光分子プローブで標的タンパク質を標識する工程と、標識された標的タンパク質に励起光および１〜５ＧＨｚの高周波磁場を照射して、蛍光発光量が減少するピーク磁場周波数を検知することによって標的タンパク質の構造変化を検知する工程と、を備える。【００３０】
ここで、上記ピーク磁場周波数は静的な外部磁場の下で分裂しており、その分裂幅の大きさから、蛍光分子プローブに含まれるＮＶセンターの回転運動を検知することができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のナノダイヤモンド粒子は、極めて高いＯＤＭＲ強度を示す。したがって、生体内における蛍光分子プローブとして利用可能であり、これを用いることによって生体内におけるタンパク質の精細かつリアルタイムの構造解析が実現できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ダイヤモンド結晶中におけるＮＶセンターの概略概念図である。
【図２】ダイヤモンド結晶中における窒素原子と空孔の配置の一例を示す概略概念図である。
【図３】ＮＶセンターのエネルギー準位の一例を示す概念図である。
【図４】ダイヤモンド結晶中におけるＮＶ（−）を示す概略概念図である。
【図５】ダイヤモンド結晶中におけるＮＶ（０）を示す概略概念図である。
【図６】ＮＶ（−）のエネルギー準位の一例を示す概略概念図である。
【図７】ＮＶ（−）が蛍光発光する際のエネルギー準位の一例を示す概略概念図である。
【図８】本発明の実施形態に係わるＯＤＭＲスペクトルの一例を示す図である。
【図９】本発明の実施形態に係るタンパク質の構造解析方法におけるＯＤＭＲスペクトルの一例を示す図である。
【図１０】本発明の実施形態に係わるナノダイヤモンド粒子のＩＲスペクトルの一例を示す図である。
【図１１】本発明の実施形態に係わるＯＤＭＲ強度の評価に用いる蛍光顕微鏡装置の一例を示す概略概念図である。
【図１２】本発明の実施形態に係るＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造方法を示すフローチャートである。
【図１３】本発明の実施形態のタンパク質の構造解析方法に係わる解析装置を示す概略概念図である。
【図１４】本発明の実施形態に係わるナノダイヤモンド粒子のＯＤＭＲ強度の測定例を示すグラフである。
【図１５】本発明の実施形態に係わるナノダイヤモンド粒子のＯＤＭＲ強度の測定例を示すグラフである。
【図１６】本発明の実施形態に係る蛍光分子プローブの合成スキームの一例を示す図である。
【図１７】ナノダイヤモンド粒子を添加した細胞株の観察結果の一例を示す図である。
【図１８】水溶液中のタンパク質の濃度とナノダイヤモンド粒子に吸着したタンパク質濃度との関係の一例を示すグラフである。
【図１９】図１９（Ａ）は本発明の実施形態に係るナノダイヤモンド粒子の蛍光像を示す図であり、図１９（Ｂ）は本発明の実施形態に係るナノダイヤモンド粒子のＯＤＭＲ像を示す図である。
【図２０】図２０（Ａ）は従来のナノダイヤモンド粒子の蛍光像を示す図であり、図２０（Ｂ）は従来のナノダイヤモンド粒子のＯＤＭＲ像を示す図である。
【図２１】本発明の実施形態に係るタンパク質の構造解析方法の概略を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
［実施形態１］
以下、本発明の実施形態（以下「本実施形態」とも記す）についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
＜ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子＞
以下、本実施形態のナノダイヤモンド粒子について説明する。本実施形態のナノダイヤモンド粒子はヘテロ原子を含む官能基で表面が修飾されており、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含んでいる。
【００３５】
≪ナノダイヤモンド粉末≫
原料となるナノダイヤモンド粉末の製造方法は特に制限されず、いかなる方法で製造されてもよい。ナノダイヤモンド粉末の製造方法としては、たとえばＣＶＤ法（化学蒸着法）、爆発法（爆轟法）、高温高圧法（ＨＰＨＴ法）等を挙げることができる。
【００３６】
本実施形態のナノダイヤモンド粒子は、生体内におけるタンパク質の構造解析方法への利用を目的のひとつとしている。一般に、ＣＶＤ法、ＨＰＨＴ法によって得られたナノダイヤモンド粉末は幅広い粒度分布を有するため、適宜分級を行なって粒度分布を調整することが好ましい。ここで分級方法としては、たとえば超遠心法、サイズ排斥クロマトグラフィー等を好適に用いることができる。他方、爆轟法によって得られたナノダイヤモンド粉末であれば分級操作を行なわずそのまま用いることができる。爆轟法ではその製法原理上、大粒子が生成されず、粒子径が４〜５ｎｍ程度でありかつ粒子径の揃った粉末が得られるからである。
【００３７】
生体内での使用を考慮するとナノダイヤモンド粒子の平均粒径は小さいほど好ましく、好ましくは５０ｎｍ以下であり、より好ましくは４０ｎｍ以下であり、最も好ましくは３０ｎｍ以下である。平均粒径が５０ｎｍを超過すると分散性が低下する傾向があり好ましくない。また、上記のように平均粒径は小さいほど好ましいが、ＮＶセンターを有しかつ高い結晶性を確保するという観点から１ｎｍ以上であることが好ましい。前述のように爆轟法によって得られたナノダイヤモンド粉末は４〜５ｎｍ程度の粒子径範囲を有することができる。そのため爆轟法によって得られたナノダイヤモンド粉末は本実施形態のナノダイヤモンド粒子の原料として特に好適である。なお「平均粒径」は、たとえば動的光散乱法、レーザー回折法等によって測定することができる。
【００３８】
≪ＮＶセンター≫
本実施形態のナノダイヤモンド粒子は、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含んでいる。ここで、ＮＶセンターとは図１に示すように、ダイヤモンド結晶中の炭素原子１を置換した窒素原子２と窒素原子２と隣接する空孔３とからなる複合欠陥を示す。
【００３９】
≪ＮＶセンターの生成≫
一般的に、上記のような方法でナノダイヤモンド粉末を製造した場合、ダイヤモンド結晶中には不純物として窒素原子が混入しており、同時に炭素原子が欠落した空孔も存在している。しかし、このままでは、たとえば図２に示すように窒素原子２と空孔３とが隣接した一対をなしておらずＮＶセンターとはなっていない。
【００４０】
≪真空熱処理≫
そこで、ナノダイヤモンド粉末を真空中７００℃〜１０００℃の高温で熱処理することによって、窒素原子２と空孔３とを結合させることができる。これによりダイヤモンド結晶中に図１に示されるＮＶセンターが生成される。
【００４１】
≪空気熱処理≫
しかし、上記のように高温で真空熱処理した場合、粒子表面のダイヤモンド構造の一部がグラファイト化してしまう。このように、表面がグラファイトで覆われてしまうと、結晶内部にＮＶセンターを有していても、ナノダイヤモンド粒子は良好な蛍光発光を示さない。
【００４２】
そこで、良好な蛍光発光を示すナノダイヤモンド粒子を得るためには、真空熱処理の後、さらに空気中４００℃〜６００℃で熱処理して表面を酸化することを要する。
【００４３】
≪ＮＶ（−）およびＮＶ（０）≫
上記のようにして、ダイヤモンド結晶内部にＮＶセンターが生成されたナノダイヤモンド粒子は励起光を照射すると蛍光発光する。そして、励起光および高周波磁場を該ダイヤモンド粒子に同時照射して、電子スピン磁気共鳴〔以下「ＥＳＲ（Electron Spin Resonance）」とも記す〕を発生させると、蛍光発光量が減少する場合がある。
【００４４】
この現象は、ＮＶセンターのうち、ＥＳＲ発生時に蛍光発光しないスピン状態を形成するＮＶ（−）の存在によって引き起こされる。以下、図３〜８を用いて該現象を説明する。
【００４５】
図３に示すように、ＮＶセンターの基底状態はスピン三重項（3Ａ）であり、励起状態はスピン三重項（3Ｅ）である。そして（3Ａ）と（3Ｅ）との間には波長６３７ｎｍに相当するエネルギーギャップが存在する。また（3Ａ）と（3Ｅ）との間にはスピン一重項（1Ａ1）が存在する。
【００４６】
図４に示すように、ＮＶ（−）は、窒素原子２と隣接する空孔３に余分な電子５を獲得している。この電子の存在によって不対電子６が２個となり、Ｓ＝１のスピン状態を形成することができる。
【００４７】
そのため、図６に示すように、ＮＶ（−）では、基底状態は静磁場を印加しない状態でも約２．８７ＧＨｚに相当するエネルギーギャップをもつＭｚ＝０の基底状態（Ａ1）とＭｚ＝±１の準基底状態（Ｅ）とに分裂している。したがって、約２．８７ＧＨｚの高周波磁場を照射するとゼロ磁場環境下でもＥＳＲを発生する。
【００４８】
ここで、ＮＶ（−）にＥＳＲが発生した状態で、励起光を照射した際の緩和過程を図７に示す。励起光によってＭｚ＝±１の準基底状態（Ｅ）から励起された電子の一部は項間交差し、図７中の一点鎖線で示すようにスピン一重項（1Ａ1）を経て蛍光発光しない無輻射過程をたどる。すなわち、これが図８に示すような蛍光発光量の減少（ＯＤＭＲシグナル）として観測される。そして、無輻射過程をたどる電子が多いほどＯＤＭＲシグナルは大きくなる（換言すればＯＤＭＲ強度は高められる。）。
【００４９】
他方、ＮＶ（０）には、図５に示すようにＮＶセンターに余分な電子５が存在しないためＳ＝１／２のスピン状態となる。そのため、ＮＶ（０）では、励起光を照射しても図３に示す（3Ａ）と（3Ｅ）との間の遷移しか起こらず無輻射過程をたどることはない。すなわちＯＤＭＲシグナルを示さない（ＯＤＭＲ不活性）。
【００５０】
以上の説明から分かるように、ＮＶセンターのうちＮＶ（−）の存在率を増加させることができれば、ＯＤＭＲ強度を高めることができる。
【００５１】
本発明者らは、ＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子において、ＮＶ（−）の存在率を高める方法について鋭意研究を重ねた結果、ナノダイヤモンド粒子の表面を特定の官能基で修飾することによって、ＮＶ（−）の存在率を増加させることができるとともに、ＯＤＭＲ強度が飛躍的に高められることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００５２】
すなわち、本実施形態のナノダイヤモンド粒子は、ヘテロ原子を含む官能基で表面が修飾されることによって、ＮＶセンターのＯＤＭＲ強度が高められたナノダイヤモンド粒子である。
【００５３】
≪ヘテロ原子を含む官能基≫
本明細書において、ヘテロ原子とは、炭素（Ｃ）、水素（Ｈ）以外の原子であり、かつ官能基中において該原子上に非共有電子対を有する原子を示す。このようなヘテロ原子としては、たとえば、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）等を挙げることができる。そして、ヘテロ原子を含む官能基としては、たとえば、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、ヒドロキシアルキル基（−ＣＨ２ＯＨ、−ＲＯＨ：Ｒはアルキル基を示す。）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ２）、アルキルアミノ基（−ＮＨＲ、−ＮＲ２：Ｒはアルキル基を示す。）、チオール基（−ＳＨ）等を挙げることができる。
【００５４】
≪電子供与性≫
上記のヘテロ原子を含む官能基は電子供与性官能基であることが好ましい。ここで、本明細書において「電子供与性」とは、該ヘテロ原子上の非共有電子対によって引き起こされる共鳴効果による電子供与性を示す。
【００５５】
電子供与性のヘテロ原子を含む官能基によって、ナノダイヤモンド粒子の表面を修飾することにより、ＮＶ（−）の発生を促進させることができる。
【００５６】
そして、上記したヘテロ原子を含む官能基のうち、ヒドロキシル基、ヒドロキシアルキル基およびカルボキシル基は、本発明の効果が得られやすく、修飾官能基として好ましい。なお、カルボキシル基は電子吸引性を有する官能基であるが、本発明者の研究によればカルボキシル基でナノダイヤモンド粒子を修飾した場合であってもＮＶ（−）の存在率が高められることが明らかとなっている。
【００５７】
≪表面修飾処理≫
一般に、ナノダイヤモンド粒子の表面には多種多様な官能基が存在している。そのような官能基としては、たとえば、アルキル基、カルボキシル基、ケトン基、ヒドロキシル基、ビニル基、ラクトン基等の存在が知られている。
【００５８】
本実施形態のナノダイヤモンド粒子は、このような官能基のうち１種以上のヘテロ原子を含む官能基の修飾率を選択的に高める処理を行なうことにより製造することができる。
【００５９】
ここで、ヘテロ原子を含む官能基は、ヒドロキシル基、ヒドロキシアルキル基およびカルボキシル基からなる群より選ばれた１種以上の官能基であることが好ましい。
【００６０】
また、上記のような処理としては、たとえば、ナノダイヤモンド粒子表面に存在する官能基を、還元処理および／または酸化処理する方法を好適に用いることができる。
【００６１】
ここで、上記の処理が還元処理である場合には、ヒドロキシル基および／またはヒドロキシアルキル基（ヒドロキシル基およびヒドロキシアルキル基の少なくともいずれか）によるナノダイヤモンド粒子表面の修飾率を選択的に高めることができる。還元処理の方法としては、従来公知のいかなる還元反応も採用することができる。たとえば、還元剤として、ボラン−テトラヒドロフラン混合溶液、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム、フェントン試薬等を用いて還元処理を行なってもよい。
【００６２】
また、上記処理は酸化処理であってもよい。酸化処理である場合には、カルボキシル基によるナノダイヤモンド粒子表面の修飾率を選択的に高めることができる。酸化処理の方法としては、従来公知のいかなる酸化反応も採用することができる。たとえば、酸化剤として、濃硫酸と濃硝酸の混合溶液、ピランハ溶液、硫酸、硝酸、過塩素酸混合溶液等を用いて酸化処理を行なってもよい。
【００６３】
≪表面修飾官能基の定性≫
上記のように、表面修飾処理を行なった後に、ナノダイヤモンド粒子の表面に存在する官能基の定性を行なうことが好ましい。官能基の定性は、たとえば赤外分光スペクトル（以下「ＩＲスペクトル」とも記す）を測定することによって行なうことができる。たとえば、ナノダイヤモンド粒子を従来公知の錠剤法によって錠剤に成形して、ＩＲスペクトルを測定することができる。
【００６４】
≪ＯＤＭＲ強度の評価≫
ＯＤＭＲ強度の評価は、ナノダイヤモンド粒子に励起光を照射しながらＥＳＲを発生する高周波磁場を照射して蛍光発光量を計測するとともに、上記式（Ｉ）によってＯＤＭＲ強度を算出して行なうことができる。
【００６５】
≪ＮＶ（−）の存在率の評価≫
ＮＶ（−）の存在率の評価は、同条件で処理された一定数のナノダイヤモンド粒子について、個々の粒子について上記したＯＤＭＲ強度を求め、それらの相加平均を算出することによって行なうこともできる。ここで、信頼性の高い結果を得るためには、上記一定数は、たとえば５０〜２００個程度とすることが好ましい。
【００６６】
≪その他≫
上記のように本実施形態のナノダイヤモンド粒子は高いＯＤＭＲ強度を有する。ここでＯＤＭＲ強度をさらに高めるとの観点から、ナノダイヤモンド粒子は結晶内部に希土類金属（たとえば、イッテルビウム（Ｙｂ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）等）を含まないことが好ましい。結晶中に希土類金属が導入されるとダイヤモンド結晶格子に歪みが生じ、ＯＤＭＲ強度が減退することがあるからである。またダイヤモンド結晶中に磁性元素（たとえば、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、ニッケル（Ｎｉ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）等）も含まないことが好ましい。これらの磁性元素が生起する磁場がＯＤＮＲ強度の測定に悪影響を及ぼすことがあるからである。
【００６７】
なお、本実施形態においてダイヤモンド結晶を構成する炭素には、自然界に存在するものを特に限定なく用いることができる。たとえば、天然に存在する炭素の安定な同位体として12Ｃおよび13Ｃがあるが、ダイヤモンド結晶中におけるこれらの存在比率も特に限定されるものではない。
【００６８】
［実施形態２］
このような本実施形態のナノダイヤモンド粒子は、以下のような製造方法によって製造される。換言すれば、以下のような製造方法によって製造されるナノダイヤモンド粒子は上記のような特性を示す。したがって、本実施形態のナノダイヤモンド粒子は極めて高いＯＤＭＲ強度を示すという優れた効果を有する。以下、本実施形態のナノダイヤモンド粒子の製造方法について説明する。
【００６９】
＜ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造方法＞
図１２に本実施形態のナノダイヤモンド粒子の製造方法のフローチャートを示す。当該製造方法は、ナノダイヤモンド粒子を準備する工程Ｓ１と、ナノダイヤモンド粒子の表面に存在する官能基のうち１種以上のヘテロ原子を含む官能基の修飾率を選択的に高める処理を行なう工程Ｓ２と、を含む。以下、各工程について説明する。
【００７０】
≪ナノダイヤモンド粒子を準備する工程Ｓ１≫
まず、工程Ｓ１では、ナノダイヤモンド粉末を分級する工程Ｓ１１と、ナノダイヤモンド粒子を真空中で熱処理する工程Ｓ１２と、ナノダイヤモンド粒子を空気中で熱処理する工程Ｓ１３と、を実施する。工程Ｓ１１を実施することによって、ナノダイヤモンド粒子は生体内での使用に好適な粒度分布に調整され、工程Ｓ１２を実施することによってナノダイヤモンド粒子の内部にＮＶセンターが生成される。さらに、工程Ｓ１３を実施することによって、ナノダイヤモンド粒子表面のグラファイト層を酸化し、蛍光性を示すＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を製造することができる。なお、前述のように爆轟法によって得られたダイヤモンド粉末を用いる場合は、分級する工程を省略することができる。
【００７１】
≪ヘテロ原子を含む官能基の修飾率を選択的に高める処理を行なう工程Ｓ２≫
次いで、工程Ｓ２では、上記工程Ｓ１で得られたナノダイヤモンド粒子に、粒子の表面に存在する官能基のうち１種以上のヘテロ原子を含む官能基の修飾率を選択的に高める処理を行なう工程として、還元処理を行なう工程Ｓ２１および／または酸化処理を行なう工程Ｓ２２を実施することによって、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を製造することができる。
【００７２】
なお、本実施形態のナノダイヤモンド粒子の製造方法は、上記の工程Ｓ１（工程Ｓ１１〜工程Ｓ１３）と工程Ｓ２（工程Ｓ２１および工程Ｓ２２の少なくともいずれか）とを含む限り、他の工程を含んでいてもよく、工程Ｓ１と工程Ｓ２とを含む限り本発明の効果は示される。
【００７３】
ここで、他の工程としては、たとえば工程Ｓ２の後にナノダイヤモンド粒子を乾燥する工程を含むことができる。ただし、表面修飾がなされたナノダイヤモンド粒子を乾燥する場合は凍結乾燥を行なうことが望ましい。凍結乾燥によればナノダイヤモンド粒子が凝集してクラスターとなることを防止できるからである。これに対して、たとえば減圧乾燥を行なうとナノダイヤモンド粒子が凝集してクラスターとなるため好ましくない。
【００７４】
本実施形態のナノダイヤモンド粒子は生体分子の構造解析に用いるため、前述のようにその粒子径は小さいことが好ましい。そして、本実施形態のナノダイヤモンド粒子は凝集体ではなく単一粒子であることが特に好ましい。その理由は次の通りである。
【００７５】
後述するように本実施形態のタンパク質の構造解析方法では、ナノダイヤモンド粒子中のＮ−Ｖ軸ベクトルと外部磁場（静磁場）ベクトルとのなす角度を追跡することにより、Ｎ−Ｖ軸の回転運動を追跡する。ここでダイヤモンド結晶中のＮＶセンターは４つのＮ−Ｖ軸を有している。したがって、ナノダイヤモンド粒子の凝集体を蛍光分子プローブとして用いた場合は、凝集体の中で複数のナノダイヤモンド粒子が様々な方向（角度）で近距離に存在するため、複数のＮ−Ｖ軸も様々に配向することとなり、ＯＤＭＲシグナルの分解能が低下する。したがって、本実施形態のナノダイヤモンド粒子は単一粒子であることが好ましく、その製造方法には凝集体が発生しないプロセスを採用することが好ましい。
【００７６】
［実施形態３］
以下、上記に説明した本実施形態のナノダイヤモンド粒子の生体計測への具体的な適用例である蛍光分子プローブについて説明する。
【００７７】
＜蛍光分子プローブ＞
本実施形態の蛍光分子プローブは、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を化学修飾することによって得られる。
【００７８】
ここで生体内での計測を考慮すると、蛍光分子プローブに使用されるナノダイヤモンド粒子としては、本実施形態のナノダイヤモンド粒子のうち粒径が１〜１０ｎｍのものが好ましい。
【００７９】
また、ＯＤＭＲ計測において十分なＳ／Ｎ比を確保し高い時間分解能を得るためには、本実施形態のナノダイヤモンド粒子のうちＯＤＭＲ強度が０．０２以上のナノダイヤモンド粒子が好ましく、ＯＤＭＲ強度が０．０５以上のナノダイヤモンド粒子がより好ましく、ＯＤＭＲ強度が０．１０以上のナノダイヤモンド粒子が特に好ましい。
【００８０】
≪化学修飾≫
ここで、化学修飾とは、標的タンパク質と特異的に結合する分子鎖をナノダイヤモンドに化学結合させることを示す。該分子鎖は、ダイヤモンド結晶をなす炭素原子と直接結合されていてもよく、ナノダイヤモンド粒子表面上の官能基と結合していてもよい。また該分子鎖は、標的タンパク質（目的タンパク質ともいう）に合わせて適宜選択することが好ましい。たとえば、後述する代謝型グルタミン酸受容体を標的とする場合、アンピシリン（Ampicillin、以下「Ａｍｐ」と略記することもある）等を用いることができる。
【００８１】
≪非特異的な吸着の阻害方法≫
上記の化学修飾は、標的タンパク質以外の生体高分子への非特異的な吸着を阻害する分子鎖を含むことが好ましい。そのような分子鎖の一例としては、たとえば高分岐ポリグリセロール（ＨＰＧ：Hyper branched Poly-Glycerol）を挙げることができる。化学修飾が非特異的な吸着を阻害する分子鎖を含むことにより、高選択的に標的タンパク質を標識することができる。
【００８２】
図１６は、本実施形態の蛍光分子プローブの合成スキームの一例を示している。図１６に示すように、本実施形態の蛍光分子プローブは、次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の手順に従って合成することができる。すなわち、本実施形態の蛍光分子プローブ１０１は、（ｉ）ナノダイヤモンド粒子１００の表面をたとえばヒドロキシル基によって修飾してＯＤＭＲ強度を高め、（ｉｉ）非特異的な吸着を阻害する分子鎖をヒドロキシル基等に結合させ、（ｉｉｉ）さらに標的タンパク質と特異的に結合する分子鎖で修飾することにより合成することができる。なお図１６では、非特異的な吸着を阻害する分子鎖としてＨＰＧを、標的タンパク質と特異的に結合する分子鎖としてＡｍｐを採用した例を示している。
【００８３】
（実験例）
ここで非特異的な吸着の阻害に成功した具体例を、実験例を用いて説明する。まず（ｉ）ナノダイヤモンド粒子をヒドロキシル基によって修飾しＯＤＭＲ強度の増強を行なった。次いで（ｉｉ）このナノダイヤモンド粒子に次の［ａ］〜［ｃ］に示す分子鎖を結合させ（すなわち該分子鎖で表面修飾して）、表面修飾ナノダイヤモンド粒子を得た。
【００８４】
［ａ］カルボキシル基
［ｂ］ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：polyethylene glycol）
［ｃ］ＨＰＧ
以下のこの実験例での説明においては、上記符号［ａ］〜［ｃ］に従い、カルボキシル基で表面修飾されたナノダイヤモンド粒子を「ＮＤ［ａ］」と記し、ＰＥＧで表面修飾されたナノダイヤモンド粒子を「ＮＤ［ｂ］」と記し、ＨＰＧで表面修飾されたナノダイヤモンド粒子を「ＮＤ［ｃ］」と記す。
【００８５】
（実験例１）
実験例１ではナノダイヤモンド粒子の細胞表面への非特異的な吸着を評価した。
【００８６】
ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modi ed Eagle's Medium）培地中で培養されたＡ４３１（ヒト上皮様細胞癌由来細胞株）に対して、上記で得られたＮＤ［ａ］〜［ｃ］を１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加して、試験細胞株［ａ］〜［ｃ］を作製した。ここで、たとえば試験細胞株［ａ］とはＮＤ［ａ］を１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加した試験細胞株を示している。
【００８７】
またこのとき、比較実験例としてＮＤ［ｃ］を１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加したもの（試験細胞株［ｄ］）も合わせて作製した。
【００８８】
上記の各試験細胞株を２時間培養した後、生理食塩水で洗浄した。そして、各試験細胞株に含まれる細胞に吸着したナノダイヤモンド粒子を明視野顕微鏡で観察して、細胞膜へのナノダイヤモンド粒子の非特異的な吸着の有無を確認した。その結果を図１７に示す。
【００８９】
図１７は、明視野顕微鏡を用いて１０倍の倍率で各試験細胞株を観察した観察視野画像、および４０倍の倍率で各試験細胞株を観察した観察視野画像である。図１７中、「ａ．ＮＤ−ＣＯＯＨ」は試験細胞株［ａ］を示し、「ｂ．ＮＤ−ＰＥＧ」は試験細胞株［ｂ］を示し、「ｃ．ＮＤ−ＨＰＧ」は試験細胞株［ｃ］を示し、「ｄ．ＮＤ−ＨＰＧ」は試験細胞株［ｄ］をそれぞれ示している。また「ｅ．ｃｏｎｔｒｏｌ」はコントロール細胞、すなわちナノダイヤモンド粒子が添加されていない細胞株を示している。
【００９０】
図１７に示すように、「ａ．ＮＤ−ＣＯＯＨ」および「ｂ．ＮＤ−ＰＥＧ」では視野中に黒点が存在しており、細胞膜へのナノダイヤモンド粒子の非特異的な吸着が起こっていることが分かる。これに対して「ｃ．ＮＤ−ＨＰＧ」および「ｄ．ＮＤ−ＨＰＧ」では、このような非特異的な吸着は確認できず、「ｅ．ｃｏｎｔｒｏｌ」（コントロール細胞）と比較しても殆ど差異が確認できなかった。すなわち、ＨＰＧでナノダイヤモンド粒子を表面修飾することにより、ナノダイヤモンド粒子による細胞表面への非特異的な吸着を阻害できることが確認された。
【００９１】
（実験例２）
実験例２ではタンパク質のナノダイヤモンド粒子への非特異的な吸着を評価した。
【００９２】
まずリゾチーム水溶液に上記ＮＤ［ａ］〜［ｃ］を２ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加し、試験水溶液［ａ］〜［ｃ］を作製した。ここで、たとえば試験水溶液［ａ］とはＮＤ［ａ］が２ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加されたリゾチーム水溶液を示している。
【００９３】
次いで、各水溶液においてナノダイヤモンド粒子の表面に吸着したタンパク質（リゾチーム）の量を波長２８０ｎｍにおける吸光度を計測することにより算出した。その結果を図１８に示す。
【００９４】
図１８は、実験例２において、水溶液中に存在するリゾチームの濃度と、ナノダイヤモンド粒子の表面に非特異的に吸着したリゾチームの濃度の関係を示すグラフである。図１８中、横軸はナノダイヤモンド粒子を添加する前の初期リゾチーム濃度を示し、縦軸はナノダイヤモンド粒子の表面に吸着したリゾチーム濃度を示している。また、図１８中、丸型の凡例はＮＤ［ａ］での結果を、三角型の凡例はＮＤ［ｂ］での結果を、四角型の凡例はＮＤ［ｃ］での結果をそれぞれ示している。なお各濃度に対して測定は複数回行なっており、結果の標準偏差をエラーバーとして表示している。また図１８中の曲線は結果を分かりやすく表示するため補助的に付している。
【００９５】
図１８から明らかなように、ＮＤ［ａ］およびＮＤ［ｂ］では初期リゾチーム濃度が増加するに従い、ナノダイヤモンド粒子の表面へのリゾチームの非特異的な吸着が多くなる傾向が確認された。これに対して、ＮＤ［ｃ］（ＨＰＧで表面修飾されたナノダイヤモンド粒子）では、初期リゾチーム濃度が増加してもナノダイヤモンド粒子の表面に吸着したリゾチーム量はゼロ（０）近傍で推移していた。すなわち、ＨＰＧでナノダイヤモンド粒子を表面修飾することにより、標的タンパク質以外のタンパク質（この例ではリゾチーム）のナノダイヤモンド粒子への非特異的な吸着が阻害できることが確認された。
【００９６】
≪標的タンパク質≫
本実施形態において観測対象となる標的タンパク質としては、たとえば代謝型グルタミン酸受容体（以下「ｍＧｌｕＲ」とも記す）等を挙げることができる。これまでの構造生物学における知見から、ｍＧｌｕＲは細胞内においてシグナルを伝達する際、２量体のコンフォメーションを変化させていると予想されている。しかしこれまでに、この構造変化を実際に観測した例は報告されていない。本実施形態の蛍光分子プローブおよび後述する本実施形態のタンパク質の構造解析方法によれば、上記の構造変化を初めて観測できる可能性が高い。
【００９７】
［実施形態４］
以下、上記の蛍光分子プローブを用いた本実施形態のタンパク質の構造解析方法について説明する。
【００９８】
＜タンパク質の構造解析方法＞
図２１は本実施形態のタンパク質の構造解析方法の概略を示すフローチャートである。図２１に示すように、本実施形態のタンパク質の構造解析方法は、本実施形態の蛍光分子プローブで標識した標的タンパク質に励起光および１〜５ＧＨｚの高周波磁場を照射して、蛍光スペクトルが減少するピーク磁場周波数を検知することによって標的タンパク質の構造変化を検知するタンパク質の構造解析方法である。すなわち、本実施形態のタンパク質の構造解析方法は、蛍光分子プローブで標的タンパク質を標識する工程Ｓ１０１と、標識された標的タンパク質に励起光および１〜５ＧＨｚの高周波磁場を照射して、蛍光発光量が減少するピーク磁場周波数を検知することによって標的タンパク質の構造変化を検知する工程Ｓ１０２と、を備える。
【００９９】
そして、図９に示すように、上記ピーク磁場周波数は静的な外部磁場のもとで分裂しており、その分裂幅の大きさから、上記蛍光分子プローブに含まれるＮＶセンターの回転運動を検知することができ、標的タンパク質の構造変化を追跡することができる。
【０１００】
≪蛍光分子プローブで標的タンパク質の標識する工程Ｓ１０１≫
蛍光分子プローブによって、標的タンパク質を標識するためには、まず標的タンパク質とタグとなるタンパク質（以下、「タグ−タンパク質」とも記す）を融合する。たとえば、上記に例示したｍＧｌｕＲを標的とする場合、バクテリア由来β−ラクタマーゼの変異体（以下「ＢＬタグ」とも記す）をタグ−タンパク質として採用することができる。
【０１０１】
たとえば、ｍＧｌｕＲおよびＢＬタグの塩基配列をコードしたＤＮＡをリポフェクション法により、ＨｅＬａ細胞内にトランスフェクションすることによって、ＨｅＬａ細胞内に、ｍＧｌｕＲおよびＢＬタグが融合したタンパク質を発現させることができる。
【０１０２】
このとき、蛍光分子プローブとしては、ＢＬタグと特異的に反応するＡｍｐを化学修飾したナノダイヤモンド粒子を用いることができる。そして、ＢＬタグとナノダイヤモンド粒子とをＡｍｐを介して結合させることによって、ｍＧｌｕＲをナノダイヤモンド粒子で標識することができる。
【０１０３】
≪標的タンパク質の構造変化を検知する工程Ｓ１０２≫
上記のようにして、標識された標的タンパク質の構造解析は、ＯＤＭＲ計測によって、蛍光分子プローブに含まれるダイヤモンド結晶内のＮ−Ｖ軸の回転運動を検出することにより行なうことができる。
【０１０４】
（Ｎ−Ｖ軸）
ここで、Ｎ−Ｖ軸とは、ダイヤモンド結晶内のＮＶセンターにおいて、窒素原子（Ｎ）と隣接する空孔（Ｖ）とを結ぶ直線軸を示す。ＮＶセンターは、該Ｎ−Ｖ軸上に磁気モーメントμNVを有している。
【０１０５】
（回転運動の検出）
図９に示すＯＤＭＲスペクトルのように、ナノダイヤモンド粒子に含まれるＮＶ（−）のＯＤＭＲシグナルはゼーマン効果により静的な外部磁場の下で２つに分裂している。分裂した２つのＯＤＭＲシグナルは約２．８７ＧＨｚを中心として対称となる。これは、縮退していたＭｚ＝±１のエネルギー準位がゼーマン効果によりＭｚ＝＋１とＭｚ＝−１の２つのエネルギー準位に分裂していることを示している。このとき、ＯＤＭＲシグナルの分裂幅をΔωとすると、ΔωはＮ−Ｖ軸と静磁場とのなす角θに対応して変化する。
【０１０６】
したがって、たとえば図９に示すＯＤＭＲスペクトルにおけるピークの分裂幅Δωから、Ｎ−Ｖ軸と静磁場とのなす角θを下記式（ＩＩ）によって算出することができる。
【０１０７】
θ＝ｃｏｓ-1（ｈΔω／μNVＢ0）・・・（ＩＩ）
式（ＩＩ）は、Ｎ−Ｖ軸ベクトルと静磁場ベクトルとの内積を示し、式（ＩＩ）中、θはＮ−Ｖ軸と静磁場とのなす角を示し、ｈは換算プランク定数を示し、ΔωはＯＤＭＲスペクトルのピークの分裂幅を示し、μNVはＮＶセンターの磁気モーメントを示し、Ｂ0は静磁場強度を示す。
【０１０８】
なおここで、ピークの分裂幅Δωは、ＯＤＭＲスペクトルにおける２つの蛍光発光量の減少ピークの各ピーク頂点の周波数を、ω1、ω2(ω1とω2は、ω1＞ω2の関係を満たす)とすると、Δω＝ω1−ω2により算出される。
【０１０９】
したがって、Δωの経時変化を追跡することで、Ｎ−Ｖ軸の回転運動を追跡可能である。これにより、たとえば、ＮＶ（−）を含むナノダイヤモンド粒子を用いた蛍光分子プローブでタンパク質の特定部位を標識した場合、該部位の回転運動を追跡可能であり、ひいては該タンパク質の構造変化が追跡可能となる。
【０１１０】
たとえば、上記したようにｍＧｌｕＲを本実施形態の蛍光分子プローブで標識すれば、ｍＧｌｕＲの２量体のコンフォメーションをリアルタイムに計測できる。
【０１１１】
≪解析装置≫
上記に説明したタンパク質の構造解析は次のような解析装置によって行なうことができる。図１３は本実施形態のタンパク質の構造解析方法に係わる解析装置の一例を示す概略概念図である。この解析装置を機能毎に大別すると、光検出部と、磁気共鳴部と、コンソール部とに分けることができる。
【０１１２】
光検出部は、一分子蛍光計測が可能な蛍光顕微鏡から構成される。たとえば、図１３に示すように光学顕微鏡１０および蛍光検出が可能な検出部６０から構成することができる。ここで検出部６０には、蛍光検出器としては超高感度であり定量性の高いアバランシュフォトダイオードまたは電子増倍型冷却ＣＣＤカメラを用いることが望ましい。
【０１１３】
磁気共鳴部（高周波磁場発生部２０）は主に電磁石（図示せず）、発振器２１、高周波コイル２３および静磁場コイル２４から構成される。電磁石は５０ガウス以下のもので構わないが、磁場方位の制御が可能であることが望ましい。発振器２１はナノ秒レベルで発振を制御できる高周波発振器である必要がある。また高周波コイル２３は試料にＥＳＲを生起させるためのものであり、静磁場コイル２４は静磁場を任意の方向に変更するためものである。
【０１１４】
コンソール部はワークステーション、変換回路３１および変調部３０から構成される。ワークステーションには、たとえば処理部４０、入力装置５０および出力装置５１を備えるものを用いることができる。また変換回路３１は具体的にはＤＡＣ（Digital to Analog Converter）であり、変調部３０は具体的にはパルス／ディレイジェネレータである。
【０１１５】
この解析装置において、光検出部と磁気共鳴部とは、ＤＡＣおよびパルス／ディレイジェネレータを用いてピコ秒〜ナノ秒の精度で同期される必要がある。ワークステーションは光検出部と磁気共鳴部とのセッティング、ならびにＤＡＣおよびパルス／ディレイジェネレータの制御を行なう。またワークステーションは、光検出部で検出された蛍光信号をリアルタイムで取り込み再帰的な装置制御を行なうとともに、計測データの解析を行なうものである。
【０１１６】
計測データの解析方法は特に制限されないが、たとえばスピンハミルトニアンのエネルギー固有値からシミュレートされる高周波数領域スペクトルと実際に得られた計測結果との間でフィッティングによる方位解析を行なう方法、あるいはＯＤＭＲ強度の時間領域信号の周波数解析を行なう方法等を用いることができる。
【実施例】
【０１１７】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【０１１８】
［実施例１］
以下に示す実施例１、実施例２および比較例１ではＨＰＨＴ法によって得られたナノダイヤモンド粉末を用いてＯＤＭＲ強度の評価を行なった。【０１１９】
＜ＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造＞
≪ナノダイヤモンド粒子を準備する工程Ｓ１≫
まず、出発原料として、ＨＰＨＴ法によって得られたナノダイヤモンド粉末（製品名「Ｍｉｃｒｏｎ＋ＭＤＡ、０−０．０１０μｍ」、エレメントシックス社製）を準備した。【０１２０】
（分級する工程Ｓ１１）
このナノダイヤモンド粉末を水中に分散させ、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心してダイヤモンド粒子の分級を行なった。このようにして得られたナノダイヤモンド粒子の平均粒径を、レーザー回折・散乱式粒度分布計（製品名「Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ  ＩＩ」、日機装株式会社製）を用いて動的光散乱法によって求めた。このとき平均粒径は２７．３ｎｍであり、粒度分布の標準偏差は７．３ｎｍであった。【０１２１】
（真空中で熱処理する工程Ｓ１２）
次いで、分級処理によって得たナノダイヤモンド粒子を真空中８００℃で熱処理してダイヤモンド結晶内にＮＶセンターを生成した。【０１２２】
（空気中で熱処理する工程Ｓ１３）
次いで、空気中５５０℃で熱処理して表面を酸化した。【０１２３】
≪ヘテロ原子を含む官能基の修飾率を選択的に高める処理を行なう工程Ｓ２≫
（還元処理を行なう工程Ｓ２１）
上記のようにして得たナノダイヤモンド粒子１０ｍｇと、ボラン−テトラヒドロフランコンプレックス（製品名、ＡＬＤＲＩＣＨ社製）３００μｌとを、ガラス製反応器に入れ、さらにテトラヒドロフラン５ｍｌを加え、アルゴン雰囲気下で、７０℃で還流して、２４時間攪拌した。次いで、上澄み液を除去し、アセトン、超純水で洗浄した後、乾燥してＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を得た。【０１２４】
［実施例２］
実施例１のＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造において、還元処理を実施せず、以下の酸化処理を実施した以外は、実施例１と同様にして、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を得た。【０１２５】
≪酸化処理を行なう工程Ｓ２２≫
空気熱処理を経たナノダイヤモンド粉末１１ｍｇと、濃硫酸と濃硝酸を体積比９：１で混合した溶液５ｍｌとを、ガラス製反応器に入れ７５℃で７２時間攪拌した。次いで、上澄み液を除去し超純水で洗浄した後、乾燥してナノダイヤモンド粒子を得た。【０１２６】
［比較例１］
実施例１のＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造において、還元処理を実施しなかった以外は、実施例１と同様にしてＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を得た。【０１２７】
＜ＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の評価＞
≪修飾官能基の定性≫
上記のようにして得られた実施例１、実施例２および比較例１のナノダイヤモンド粒子の表面に存在する官能基の定性（ＩＲスペクトルの測定）を以下のようにして行なった。ここで、実施例１または実施例２については、還元処理後または酸化処理後のナノダイヤモンド粒子を試料とした。一方、比較例１のナノダイヤモンド粒子については、真空熱処理後、空気熱処理前のナノダイヤモンド粒子を試料とした。これは、空気熱処理後にＩＲ測定を行なうと、グラファイトの酸化によって生じた夾雑物質により測定の精度が低下するためである。【０１２８】
まず、臭化カリウムの粉末に、極少量のナノダイヤモンド粒子からなる粉末を加え、混合して均一な粉末とした後、該混合粉末を成形型に入れ、プレスしてディスク状の測定試料とした。次いで、フーリエ変換型赤外分光測定装置（型番「ＦＴ／ＩＲ−４２００」、日本分光社製）を用いて、各測定試料のＩＲスペクトルを測定した。その結果を図１０に示す。【０１２９】
図１０中、「Ｎ．Ｄ−ＣＨ２ＯＨ」は実施例１のナノダイヤモンド粒子のＩＲスペクトルを示し、「Ｎ．Ｄ−ＣＯＯＨ」は実施例２のナノダイヤモンド粒子のＩＲスペクトルを示し、「Ｎ．Ｄ」は比較例１のナノダイヤモンド粒子のＩＲスペクトルを示す。【０１３０】
図１０に示すとおり、比較例１のナノダイヤモンド粒子では、アルキル基、ケトン基、エーテル基、ヒドロキシル基、ビニル基、ラクトン基等の多様な官能基に由来するピークが観測された。これに対して、実施例１（還元処理）のナノダイヤモンド粒子は、ヒドロキシアルキル基由来のピーク（１２５８ｃｍ-1、２９５６−２９２７ｃｍ-1）が観測でき、その他の官能基に由来するピークは比較例１（未処理）に比べ相対的に減少していた。また、実施例２（酸化処理）のナノダイヤモンド粒子は、カルボキシル基に由来するピーク（１７７８ｃｍ-1）が明りょうに観測でき、その他の官能基に由来するピークは比較例１（未処理）に比べ相対的に減少していた。すなわち、実施例１のナノダイヤモンド粒子は表面がヒドロキシル基および／またはヒドロキシアルキル基で修飾されており、実施例２のナノダイヤモンド粒子は表面がカルボキシル基で修飾されていることが確認できた。【０１３１】
≪ＯＤＭＲ強度およびＮＶ（−）存在率の評価≫
次に、実施例１、実施例２および比較例１のＯＤＭＲ強度を以下のようにして評価した。【０１３２】
まず、図１１を用いてＯＤＭＲ強度の評価に用いる蛍光顕微鏡装置を説明する。該蛍光顕微鏡装置は、光学顕微鏡１０と、高周波磁場発生部２０と、変調部３０と、処理部４０と、入力装置５０と、出力装置５１と、を備えている。さらに、光学顕微鏡１０は、光源１１と、励起フィルタ１２と、ダイクロイックミラー１３と、バンドフィルタ１４と、対物レンズ１５と、を備えている。またさらに、高周波磁場発生部２０は、発振器２１と、増幅部２２と、高周波コイル２３と、を備えている。なお、この装置に変換回路３１と静磁場を任意の方向に変更するための静磁場コイル２４を設けると、先に説明したタンパク質の構造解析に用いる解析装置（図１３参照）と同様のものとなる。【０１３３】
光源１１から出た光は励起フィルタ１２を通過し励起光となる。励起光はダイクロイックミラー１３によって反射され対物レンズ１５を通して試料台７０に照射される。励起光によって励起された試料７１から発生した蛍光は、ダイクロイックミラー１３によって反射されず、直進して検出部６０へと向かい蛍光発光量が計測される。また、試料７１には高周波磁場発生部２０より高周波磁場が照射される。高周波磁場を照射することにより試料７１にＥＳＲが発生し、その際の蛍光発光量の変化を検出部６０で計測することで、処理部４０にて上記式（Ｉ）によりＯＤＭＲ強度を算出できるようになっている。【０１３４】
まず、上記した蛍光顕微鏡装置の試料台に、実施例１のナノダイヤモンド粒子からなる粉末試料を水に懸濁しスライドガラスに塗布した。該試料に励起光を照射して出力装置５１の画面上にナノダイヤモンド粒子の蛍光発光による輝点を確認した。次いで、高周波磁場を照射し蛍光発光量を減少させＯＤＭＲ強度を計測した。同様の計測を粒子１００個について行なった。【０１３５】
上記と同様にして、実施例２および比較例１のナノダイヤモンド粒子についても、粒子１００個のＯＤＭＲ強度を測定した。その結果を表１ならびに図１４および図１５に示す。【０１３６】
【表１】
2014058012.tif 000003
【０１３７】
表１の測定結果の欄に示す各数値は、粒子１００個中ＯＤＭＲ強度が一定値以上（０．０１以上、０．０２以上、０．０５以上）である粒子の累積度数（％）と、粒子１００個についてのＯＤＭＲ強度の相加平均値とを示している。【０１３８】
また図１４は、粒子１００個についてのＯＤＭＲ強度の測定結果を示すグラフであり、ＯＤＭＲ強度が高いものから粒子を降順に並べて結果を表示したものである。図１４中、実線は実施例１の結果を示し、一点鎖線は実施例２の結果を示し、点線は比較例１の結果を示している。【０１３９】
また図１５は、ＯＤＭＲ強度と粒子の存在確率との関係を示すグラフであり、横軸に示すＯＤＭＲ強度の数値以上のＯＤＭＲ強度を有する粒子の存在確率を縦軸に表示している。図１５中、丸型の凡例および実線は実施例１の結果を示し、三角型の凡例および一点鎖線は実施例２の結果を示し、四角型の凡例および点線は比較例１の結果を示している。なお図１５の横軸の数値は１００倍にして表示している。【０１４０】
表１ならびに図１４および図１５から明らかなように、未処理である比較例１のナノダイヤモンド粒子に比較して、実施例１および実施例２のナノダイヤモンド粒子では高いＯＤＭＲ強度を有する粒子が数多く含まれていた。特に実施例１のナノダイヤモンド粒子は、比較例のナノダイヤモンド粒子では全く存在しなかったＯＤＭＲ強度が０．０５以上という極めて高いＯＤＭＲ強度を有する粒子を含むものであった。【０１４１】
以上の結果より、実施例のナノダイヤモンド粒子はＮＶセンターを含み、ヘテロ原子を含む官能基で表面が修飾されていることを以って、ＮＶ（−）の存在率が増加しＯＤＭＲ強度が高められていることが確認できた。【０１４２】
［実施例３］
以下に示す実施例３および比較例２では、爆轟法によって得られたナノダイヤモンド粉末を用いてＯＤＭＲ強度の評価を行なった。【０１４３】
まず、爆轟法によって得られたナノダイヤモンド粉末（「NanoAmand（登録商標） Aqueous colloid (Dispersed 5nm-Bucky Diamond)」、NanoCarbon Research Institute, Ltd.製）を準備した。このナノダイヤモンド粉末に含まれる粒子は単一粒子であり、その粒子径の範囲は４ｎｍ〜５ｎｍ程度である。【０１４４】
次に、ナノダイヤモンド粉末を分級する工程Ｓ１１を行なわないことを除いては実施例１と同様にして実施例３に係るナノダイヤモンド粒子を得た。【０１４５】
［比較例２］
上記の爆轟法によって得られたナノダイヤモンド粉末を真空中８００℃で熱処理し、続いて空気中５５０℃で熱処理することにより比較例２に係るナノダイヤモンド粒子を得た。すなわち、比較例２に係るナノダイヤモンド粒子は還元処理を行なわない以外は実施例３と同様にして得られたものである。【０１４６】
≪ＯＤＭＲ強度の評価≫
以上のようにして得られた実施例３および比較例２に係るナノダイヤモンド粒子のＯＤＭＲ強度を前述した蛍光顕微鏡（図１１参照）を用いて評価した。結果を図１９および図２０ならびに表２に示す。【０１４７】
【表２】
2014058012.tif 000004
【０１４８】
表２中の蛍光発光量およびＯＤＭＲ強度の欄に示す数値は、図１９（実施例３）および図２０（比較例２）に示す視野画像中における蛍光発光量およびＯＤＭＲ強度である。図１９（Ａ）に示す画像は実施例３に係るナノダイヤモンド粒子の蛍光像を示している。図１９（Ａ）に示すように、この視野画像にはナノダイヤモンド粒子の蛍光発光による輝点が３点確認できる。また図１９（Ｂ）は同視野におけるＯＤＭＲ像を示している。図１９（Ｂ）には、図１９（Ａ）の輝点に対応して３点の輝点が明りょうに確認できる。したがって実施例３に係るナノダイヤモンド粒子はＯＤＭＲ活性である。【０１４９】
他方、図２０（Ａ）は比較例２に係るナノダイヤモンド粒子の蛍光像であり、図２０（Ｂ）は同ナノダイヤモンド粒子のＯＤＭＲ像である。図２０（Ａ）にはナノダイヤモンド粒子の蛍光発光による輝点が確認できるが、図２０（Ｂ）には輝点が確認できない。したがって比較例２に係るナノダイヤモンド粒子はＯＤＭＲ不活性である。【０１５０】
以上の結果から、爆轟法によって得られたダイヤモンド粒子であっても、ヘテロ原子を含む官能基で表面を修飾することによって、ＮＶ（−）の存在率が増加しＯＤＭＲ強度が高められていることが確認できた。【０１５１】
以上のように本発明の実施形態および実施例について説明を行なったが、上述の各実施形態および実施例の構成を適宜組み合わせることも当初から予定している。【０１５２】
今回開示された実施形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【符号の説明】
【０１５３】
１  炭素原子、２  窒素原子、３  空孔、４  窒素原子の非共有電子、５  余分な電子、６  炭素原子の不対電子、１０  光学顕微鏡、１１  光源、１２  励起フィルタ、１３  ダイクロイックミラー、１４  バンドフィルタ、１５  対物レンズ、２０  高周波磁場発生部、２１  発振器、２２  増幅部、２３  高周波コイル、２４  静磁場コイル、３０  変調部、３１  変換回路、４０  処理部、５０  入力装置、５１  出力装置、６０  検出部、７０  試料台、７１  試料、１００  ナノダイヤモンド粒子、１０１  蛍光分子プローブ。
【図１】
2014058012.tif 000005
【図２】
2014058012.tif 000006
【図３】
2014058012.tif 000007
【図４】
2014058012.tif 000008
【図５】
2014058012.tif 000009
【図６】
2014058012.tif 000010
【図７】
2014058012.tif 000011
【図８】
2014058012.tif 000012
【図９】
2014058012.tif 000013
【図１０】
2014058012.tif 000014
【図１１】
2014058012.tif 000015
【図１２】
2014058012.tif 000016
【図１３】
2014058012.tif 000017
【図１４】
2014058012.tif 000018
【図１５】
2014058012.tif 000019
【図１８】
2014058012.tif 000020
【図２１】
2014058012.tif 000021
【図１６】
2014058012.tif 000022
【図１７】
2014058012.tif 000023
【図１９】
2014058012.tif 000024
【図２０】
2014058012.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成26年3月5日(2014.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシル基およびヒドロキシアルキル基の少なくともいずれかで表面が修飾されている、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
前記ナノダイヤモンド粒子は、平均粒径が１ｎｍ以上５０ｎｍ以下である、請求項１に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
【請求項６】
前記ＯＤＭＲ強度は、１〜５ＧＨｚの高周波磁場を照射したときの、励起光による蛍光発光量の減少率である、請求項１または請求項５に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
【請求項７】
請求項１、請求項５および請求項６のいずれか１項に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子からなる粉末状試薬、または前記ナノダイヤモンド粒子を液体に分散させた試薬。
【請求項８】
ナノダイヤモンド粒子を準備する工程と、
前記ナノダイヤモンド粒子の表面に存在する官能基のうち１種以上のヘテロ原子を含む官能基の修飾率を選択的に高める処理を行なう工程と、を含み、
前記ヘテロ原子を含む官能基はヒドロキシル基およびヒドロキシアルキル基の少なくともいずれかであり、かつ前記処理を行なう工程は還元処理を行なう工程である、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造方法。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
請求項１、請求項５および請求項６のいずれか１項に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を化学修飾した、蛍光分子プローブ。
【請求項１２】
請求項１１に記載の蛍光分子プローブからなる粉末試薬、または前記蛍光分子プローブを液体に分散させた試薬。
【請求項１３】
請求項１１に記載の蛍光分子プローブで標的タンパク質を標識する工程と、
標識された前記標的タンパク質に励起光および１〜５ＧＨｚの高周波磁場を照射して、蛍光発光量が減少するピーク磁場周波数を検知することによって前記標的タンパク質の構造変化を検知する工程と、を備える、タンパク質の構造解析方法。
【請求項１４】
前記検知する工程において、前記ピーク磁場周波数は静的な外部磁場の下で分裂しており、
前記検知する工程は、前記ピーク磁場周波数の分裂幅の大きさから、前記蛍光分子プローブに含まれるＮＶセンターの回転運動を検知する工程を含む、請求項１３に記載のタンパク質の構造解析方法。
【請求項１５】
前記蛍光発光量の減少率は、０．０１以上である、請求項６に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
【請求項１６】
高分岐ポリグリセロールで化学修飾されている、請求項１１に記載の蛍光分子プローブ。
【手続補正書】
【提出日】平成27年5月22日(2015.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子供与性官能基で表面が修飾されている、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
【請求項２】
前記電子供与性官能基は、ヒドロキシル基およびヒドロキシアルキル基の少なくともいずれかである、請求項１に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
【請求項３】
前記ナノダイヤモンド粒子は、平均粒径が１ｎｍ以上５０ｎｍ以下である、請求項１または２に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
【請求項４】
前記ＯＤＭＲ強度は、１〜５ＧＨｚの高周波磁場を照射したときの、励起光による蛍光発光量の減少率である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
【請求項５】
前記蛍光発光量の減少率は、０．０１以上である、請求項４に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子からなる粉末状試薬、または前記ナノダイヤモンド粒子を液体に分散させた試薬。
【請求項７】
ナノダイヤモンド粒子を準備する工程と、
前記ナノダイヤモンド粒子の表面に存在する官能基のうち１種以上の電子供与性官能基の修飾率を選択的に高める処理を行なう工程と、を含む、ＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造方法。
【請求項８】
前記電子供与性官能基はヒドロキシル基およびヒドロキシアルキル基の少なくともいずれかであり、かつ前記処理を行なう工程は還元処理を行なう工程である、請求項７に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のＯＤＭＲ強度が高められたＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子を化学修飾した、蛍光分子プローブ。
【請求項１０】
高分岐ポリグリセロールで化学修飾されている、請求項９に記載の蛍光分子プローブ。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の蛍光分子プローブからなる粉末試薬、または前記蛍光分子プローブを液体に分散させた試薬。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載の蛍光分子プローブで標的タンパク質を標識する工程と、
標識された前記標的タンパク質に励起光および１〜５ＧＨｚの高周波磁場を照射して、蛍光発光量が減少するピーク磁場周波数を検知することによって前記標的タンパク質の構造変化を検知する工程と、を備える、タンパク質の構造解析方法。
【請求項１３】
前記検知する工程において、前記ピーク磁場周波数は静的な外部磁場の下で分裂しており、
前記検知する工程は、前記ピーク磁場周波数の分裂幅の大きさから、前記蛍光分子プローブに含まれるＮＶセンターの回転運動を検知する工程を含む、請求項１２に記載のタンパク質の構造解析方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
≪その他≫
上記のように本実施形態のナノダイヤモンド粒子は高いＯＤＭＲ強度を有する。ここでＯＤＭＲ強度をさらに高めるとの観点から、ナノダイヤモンド粒子は結晶内部に希土類金属（たとえば、イッテルビウム（Ｙｂ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）等）を含まないことが好ましい。結晶中に希土類金属が導入されるとダイヤモンド結晶格子に歪みが生じ、ＯＤＭＲ強度が減退することがあるからである。またダイヤモンド結晶中に磁性元素（たとえば、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、ニッケル（Ｎｉ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）等）も含まないことが好ましい。これらの磁性元素が生起する磁場がＯＤＭＲ強度の測定に悪影響を及ぼすことがあるからである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）培地中で培養されたＡ４３１（ヒト上皮様細胞癌由来細胞株）に対して、上記で得られたＮＤ［ａ］〜［ｃ］を１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加して、試験細胞株［ａ］〜［ｃ］を作製した。ここで、たとえば試験細胞株［ａ］とはＮＤ［ａ］を１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加した試験細胞株を示している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
＜ＮＶセンターを含むナノダイヤモンド粒子の製造＞
≪ナノダイヤモンド粒子を準備する工程Ｓ１≫
まず、出発原料として、ＨＰＨＴ法によって得られたナノダイヤモンド粉末（製品名「Ｍｉｃｒｏｎ＋ＭＤＡ、０−０．１０μｍ」、エレメントシックス社製）を準備した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
まず、爆轟法によって得られたナノダイヤモンド粉末（「NanoAmando（登録商標） Aqueous colloid (Dispersed 5nm-Bucky Diamond)」、NanoCarbon Research Institute, Ltd.製）を準備した。このナノダイヤモンド粉末に含まれる粒子は単一粒子であり、その粒子径の範囲は４ｎｍ〜５ｎｍ程度である。
【国際調査報告】
2014058012.tif 000026
2014058012.tif 000027
2014058012.tif 000028
2014058012.tif 000029