(57)【要約】  銀化合物を使用することなく、目的環状マクロライド系化合物と同様に二重結合を有する化合物が混在していても分離できる方法の提供。  環状マクロライド系化合物及び１種以上のその類縁化合物を含有する混合物を、不斉識別剤固定化シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付すことを特徴とする該混合物から環状マクロライド系化合物の分離方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状マクロライド系化合物及び１種以上のその類縁化合物を含有する混合物を、不斉識別剤固定化シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付すことを特徴とする該混合物から環状マクロライド系化合物の分離方法。
【請求項２】
環状マクロライド系化合物が、タクロリムスである請求項１記載の分離方法。
【請求項３】
環状マクロライド系化合物がタクロリムスであり、その類縁化合物がアスコマイシン、ＦＲ−９０１１５６及びＦＲ−９００５２５から選ばれる１種又は２種以上である請求項１又は２記載の分離方法。
【請求項４】
不斉識別剤固定化シリカゲルが、カルバメート修飾多糖類固定化シリカゲル又はエナンチオマー修飾合成高分子固定化シリカゲルである請求項１〜３のいずれか１項記載の分離方法。
【請求項５】
環状マクロライド系化合物及び１種以上のその類縁化合物を含有する混合物を、不斉識別剤固定化シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付すことを特徴とする、前記類縁化合物の合計量が０．２７％未満である環状マクロライド系化合物の製造方法。
【請求項６】
環状マクロライド系化合物が、タクロリムスである請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
環状マクロライド系化合物がタクロリムスであり、その類縁化合物がアスコマイシン、ＦＲ−９０１１５６及びＦＲ−９００５２５から選ばれる１種又は２種以上である請求項５又は６記載の製造方法。
【請求項８】
不斉識別剤固定化シリカゲルが、カルバメート修飾多糖類固定化シリカゲル又はエナンチオマー修飾合成高分子固定化シリカゲルである請求項５〜７のいずれか１項記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品等として有用な環状マクロライド系化合物の分離精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環状マクロライド系化合物の中には、エリスロマイシン等の抗生物質、タクロリムス等の免疫抑制剤などのように医薬品として有用な物質が数多く存在する。当該環状マクロライド系化合物は、微生物の培養物から採取されるものが多い。そのような培養物中には目的とする環状マクロライド系化合物以外に多くの類縁物質が含まれていることから、目的とする化合物のみを分離する技術が種々報告されている。【０００３】
例えば、天然化合物の古典的な精製方法として、銀を担持させたシリカゲルカラムクロマトグラフィーに被検液を付し、骨格に二重結合を有する化合物と有しない化合物を分離する手法がある（非特許文献１、２等）。
タクロリムス及びその類縁物質は側鎖骨格中に二重結合を有する成分と有しない成分がある。そのため、強酸性イオン交換樹脂に銀を担持させ、タクロリムス及びその類縁物質の混合物を通液し、タクロリムスと類縁物質を分離する技術が報告されている（特許文献１）。また、非イオン性吸着樹脂へ混合物を吸着させ、銀イオン含有含水溶媒等でタクロリムスと類縁物質を分離する技術が報告されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３７５０５２７号公報
【特許文献２】特許第３９２５１９８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】物質の単離と生成，大竹他  ｐ７０（東京大学出版会，１９７６）
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ．６９，２０７（１９７２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記特許文献記載の技術は、側鎖に二重結合を有する化合物と有しない化合物の分離には有効であるが、タクロリムスと同様に側鎖に二重結合を有する化合物とタクロリムスとの分離には有効ではない。実際にタクロリムス含有培養物中には、タクロリムスと同様に側鎖に二重結合を有する化合物が含まれていることが知られている。また、銀化合物を使用することから、後処理の工程で銀を完全に除去する操作を行う必要がある。廃液処理などの環境面でも配慮が必要である。
従って、本発明は、銀化合物を使用することなく、目的環状マクロライド系化合物と同様に二重結合を有する化合物が混在していても分離できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、タクロリムス等の環状マクロライド系化合物及びその類縁化合物を含有する混合物を対象として、種々の分離精製手段を検討してきたところ、不斉識別剤固定化シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いれば、意外にも光学異性体ではないタクロリムスとその複数の類縁体が効率良く分離でき、高純度のタクロリムスが製造できることを見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔８〕を提供するものである。【０００９】
〔１〕環状マクロライド系化合物及び１種以上のその類縁化合物を含有する混合物を、不斉識別剤固定化シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付すことを特徴とする該混合物から環状マクロライド系化合物の分離方法。
〔２〕環状マクロライド系化合物が、タクロリムスである〔１〕記載の分離方法。
〔３〕環状マクロライド系化合物がタクロリムスであり、その類縁化合物がアスコマイシン、ＦＲ−９０１１５６及びＦＲ−９００５２５から選ばれる１種又は２種以上である〔１〕又は〔２〕記載の分離方法。
〔４〕不斉識別剤固定化シリカゲルが、カルバメート修飾多糖類固定化シリカゲル又はエナンチオマー修飾合成高分子固定化シリカゲルである〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の分離方法。
〔５〕環状マクロライド系化合物及び１種以上のその類縁化合物を含有する混合物を、不斉識別剤固定化シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付すことを特徴とする、前記類縁化合物の合計量が０．２７％未満である環状マクロライド系化合物の製造方法。
〔６〕環状マクロライド系化合物が、タクロリムスである〔５〕記載の製造方法。
〔７〕環状マクロライド系化合物がタクロリムスであり、その類縁化合物がアスコマイシン、ＦＲ−９０１１５６及びＦＲ−９００５２５から選ばれる１種又は２種以上である〔５〕又は〔６〕記載の製造方法。
〔８〕不斉識別剤固定化シリカゲルが、カルバメート修飾多糖類固定化シリカゲル又はエナンチオマー修飾合成高分子固定化シリカゲルである〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の分離方法によれば、目的環状マクロライド系化合物との相違点が側鎖に二重結合を有するか否か、さらに炭素数が１又は２個多いか少ないか等の相違である類縁化合物を収率良く分離することができる。用いるカラムが本来不斉識別剤を有するカラムであるにもかかわらず、炭素数のわずかに相違する類縁化合物が分離できることは全く予想外である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１の分離方法による分離状況を示す図である。
【図２】比較例１の分離方法による分離状況を示す図である。
【図３】比較例２の分離方法による分離状況を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、不斉識別剤固定化シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、環状マクロライド系化合物及び１種以上のその類縁化合物を含有する混合物から、目的の環状マクロライド系化合物を分離精製する方法である。
【００１３】
環状マクロライド系化合物としては、タクロリムス、エリスロマイシン類、アジスロマイシン、ジョサマイシン、キタサマイシン、ラパマイシン類が挙げられるが、ラパマイシン及びタクロリムスが好ましく、タクロリムスが特に好ましい。
【００１４】
環状マクロライド系化合物の類縁化合物としては、培養技術により当該環状マクロライド系化合物を製造する際に培養物中に含まれる類縁化合物が挙げられる。例えば、環状マクロライド系化合物との構造上の相違点が、側鎖に二重結合を有するか否か、構造中の炭素数が１〜２個の相違等の化合物が挙げられる。タクロリムスの類縁化合物としては、アスコマイシン（ＦＫ５２０）、ＦＲ−９０１１５６、ＦＲ−９００５２５等が挙げられる。以下に、タクロリムス、アスコマイシン、ＦＲ−９０１１５６及びＦＲ−９００５２５の構造を示す。
【００１５】
【化１】
2014007362.tif 000002
【００１６】
本発明に使用される環状マクロライド系化合物及び１種以上のその類縁化合物を含有する混合物としては、タクロリムスと、アスコマイシン、ＦＲ−９０１１５６及びＦＲ−９００５２５から選ばれる１種又は２種以上とを含有する混合物がさらに好ましい。より具体的には、これらの混合物を含む培養液の粗精製物である。
【００１７】
当該混合物は、タクロリムスを６０質量％（以下、単に％という）以上含有するのが好ましく、７０％以上含有するのがより好ましく、８０％以上含有するのがさらに好ましい。またタクロリムスの含有量の上限は９８％以下、さらに９５％以下、さらに９０％以下が好ましい。該混合物中のタクロリムスの具体的な含有量としては、６０〜９０％が好ましく、７０〜９５％がより好ましく、８０〜９８％がさらに好ましい。また、前記類縁化合物は混合物中に合計で２％以上、さらに４％以上、さらに５％以上含有するのが好ましい。前記類縁化合物は混合物中に２〜１０％、さらに４〜１０％、さらに５〜１０％含有するのが好ましい。
【００１８】
当該混合物としては、例えばタクロリムス生産菌の培養物の粗精製物が挙げられる。タクロリムス生産菌としては、例えば特公平３−３８２７６号公報記載の菌、例えばストレプトミセス属に属するタクロリムス生産菌、ストレプトミセス・ツクバエンシスに属するタクロリムスツクバエンシスに属するタクロリムス生産菌、ストレプトミセス・ツクバエンシスＮｏ．９９９３が挙げられる。粗精製物としては当該公報記載の粗精製物が挙げられる。
【００１９】
本発明は、分離用カラムとして不斉識別剤固定化シリカゲルカラムを使用する。タクロリムスとその類縁化合物は、光学異性体ではなく、構造的に相違する化合物である。それにもかかわらず、タクロリムスとその類縁化合物とが効率良く分離できることは予想外である。
【００２０】
不斉識別剤固定化シリカゲルとしては、カルバメート修飾多糖類固定化剤シリカゲル、エナンチオマー固定化シリカゲル、エナンチオマー修飾合成高分子固定化シリカゲル、包接多糖類固定化シリカゲル、蛋白固定化シリカゲル、クラウンエーテル固定化シリカゲル、光学活性ポリマレイミド固定化シリカゲル等が挙げられる。カルバメート修飾多糖類としては、カルバメート修飾セルロース、カルバメート修飾アミロース、カルバメート修飾アガロース、カルバメート修飾アミロペクチン、カルバメート修飾シクロデキストリン類等が挙げられる。より具体的には、下記式（１）
【００２１】
【化２】
2014007362.tif 000003
【００２２】
（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、同一又は異なって水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アリール基又はアルカノイル基を示す）
で表されるフェニルカルバメート修飾多糖類が挙げられる。ここで、アルキル基としては炭素数１〜６のアルキル基が好ましく、アルケニル基及びアルキニル基としては、炭素数２〜６のアルケニル基、アルキニル基が好ましい。アルコキシ基としては炭素数１〜６のアルコキシ基が好ましい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アルカノイル基としては炭素数２〜６のアルカノイル基が好ましい。
【００２３】
エナンチオマー修飾合成高分子としては、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸等のアミノ酸類；（Ｒ）又は（Ｓ）ナフチルエチルアミン、（Ｒ）又は（Ｓ）フェニルエチルアミン等の光学活性アミン類；Ｌ−酒石酸等の光学活性有機酸などのエナンチオマーが修飾されたポリ（メタ）アクリレート及び、その固定化シリカゲル等が挙げられる。
【００２４】
本発明の分離方法は、カラムとして前記不斉識別剤固定化シリカゲルカラムを使用する以外は、通常のシリカゲルカラムクロマトグラフィーと同様に行うことができる。例えば、環状マクロライド系化合物及びその類縁化合物を含有する混合物を不斉識別剤固定化シリカゲルカラムに通液し、次いでその化合物の溶離に有用な溶離液で溶離させればよい。タクロリムスの場合、溶離液として、ヘキサン等飽和炭化水素、アルコール及び／またはエーテル類の混液、アセトニトリル、アルコール、エーテル類、水等の混液を用いるのが好ましい。
【００２５】
本発明方法により得られるタクロリムスの純度は、９９．０％以上が好ましく、９９．５％以上がより好ましく、９９．７％以上がさらに好ましい。また、化合物Ｉ及び化合物IIの各々の含有量は０．１％以下が好ましく、アスコマイシン、化合物Ｉ及び化合物IIの類縁化合物の合計量は、０．２７％未満が好ましい。
【実施例】
【００２６】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。【００２７】
参考例１
グリセリン（１％）、コーンスターチ（１％）、グルコース（０．５％）、綿実粉（１％）、コーンスチープリカー（０．５％）、乾燥酵母（０．５％）、炭酸カルシウム（０．２％）を含む培地（１５０ｍＬ、ｐＨ６．５）を１２０℃で３０分間滅菌する。Streptomyces tsukubaensis Ｎｏ．９９９３株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−９２７）の斜面培養物から１白金耳を滅菌済みの培地に接種し３０℃で４日間振盪培養する。可溶性デンプン（４．５％）、コーンスチープリカー（１．０％）、乾燥酵母（１％）、炭酸カルシウム（０．１％）、アデカノール（０．１％）を含む培地（１５Ｌ、ｐＨ６．８）に前培養物を接種し、３０℃で４日間培養する。
得られた培養ブロスに活性炭及び珪藻土を加え、ろ過する。菌糸体混合物をアセトン８Lで抽出し、抽出液を濃縮する。濃縮物に塩化ナトリウム１７０ｇ、酢酸エチル１．７Ｌを加え、撹拌後水層を除去する。有機層を塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、酢酸エチル層を濃縮する。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル：ｎ−ヘキサンの混液（１：１）及び（４：１）で溶出するタクロリムスの画分を濃縮し、タクロリムス、アスコマイシン、１７−プロピル−１，１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザトリシクロ［２２．３．１．０4,9］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン（以下、化合物Ｉと略す）、１６−アリル−１，１３−ジヒドロキシ−１１−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２２，２４−ジメトキシ−１２，１８，２０，２６−テトラメチル−１０，２７−ジオキサ−４−アザトリシクロ［２１．３．１．０4,8］ヘプタコス−１７−エン−２，３，９，１５−テトラオン（以下、化合物IIと略す）を含む混合物を得る。その組成比は、タクロリムス９０．５％、アスコマイシン６．４％、化合物Ｉ２．６％、化合物II０．４％である。
分離した活性画分に含まれるアスコマイシン、化合物Ｉ及び化合物IIの濃度の和は低いほど好ましく、０．２７％未満であることが実用上必要である。【００２８】
実施例１
キラルパック（登録商標）ＩＣを使用するカラムクロマトグラフィーによる分離
参考例１で示した方法で得られたタクロリムス、アスコマイシン、化合物Ｉ、化合物IIを含む混合物４ｍｇを、不斉識別剤であるトリス（３，５−ジクロロフェニルカルバメート）セルロースを化学結合させたシリカゲルである、キラルパック（登録商標）ＩＣ  ４ｍＬのカラムクロマトグラフィーに付し、溶離液としてｎ−ヘキサン：２−プロパノール：メチルｔ−ブチルエーテルの混液（７０：１５：１５）を用い、溶出させた。
その結果を図１に示した。分離した活性画分の純度をＨＰＬＣ分析にて測定した。溶出画分組成中、タクロリムス９９．８８％、アスコマイシン０．０８％、化合物Ｉは０．０４％、化合物IIは未検出であった。【００２９】
実施例２
キラルパック（登録商標）ＩＥを使用するカラムクロマトグラフィーによる分離
実施例１と同様にタクロリムス、アスコマイシン、化合物Ｉ、化合物IIの混合物４ｍｇを、不斉識別剤であるトリス（３，５−ジクロロフェニルカルバメート）アミロースを化学結合させたシリカゲルである、キラルパック（登録商標）ＩＥ  ４ｍＬのカラムクロマトグラフィーに付し、溶離液としてｎ−ヘキサン：２−プロパノール：メチル−ｔ−ブチルエーテルの混液（４５：１５：４０）を用い、溶出させた。
分離した活性画分の純度をＨＰＬＣ分析にて測定した。溶出画分組成中、タクロリムス１００．００％、アスコマイシン、化合物Ｉ、化合物IIは何れも未検出であった。【００３０】
比較例１
ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳ及び硝酸銀含有溶離液を使用するカラムクロマトグラフィーによる分離
実施例１と同様にタクロリムス、アスコマイシン、化合物Ｉ、化合物IIの混合物２００ｍｇを、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０ＳＳ  ２０ｍＬのカラムクロマトグラフィーに付し、溶離液として０．２９４ｍｏｌ／Ｌ硝酸銀含有５０％アセトン水溶液、次いで６０％アセトン水溶液を用い、溶出させた。その結果を図２に示した。分離した活性画分の純度をＨＰＬＣ分析にて測定した。溶出画分組成中、タクロリムス９９．７３％、アスコマイシン及び化合物Ｉは未検出、化合物IIは０．２７％であった。【００３１】
比較例２
ダイヤイオン（登録商標）ＲＣＰ１６０Ｍイオン交換樹脂の銀塩を使用するカラムクロマトグラフィーによる分離
ダイヤイオン（登録商標）ＲＣＰ１６０Ｍイオン交換樹脂１５．６ｍＬに硝酸銀溶液により銀イオンを吸着させた後、実施例１と同様にタクロリムス、アスコマイシン、化合物Ｉ、化合物IIの混合物２００ｍｇを付し、溶離液として酢酸エチル：メタノールの混液（１：１）を用い、溶出させた。その結果を図３に示した。分離した活性画分の純度をＨＰＬＣ分析にて測定した。溶出画分組成中、タクロリムス９９．３５％、アスコマイシン０．２％、化合物Ｉ０．０６％、化合物II０．４％であった。【００３２】
実施例３
ＹＭＣ  キラルＮＥＡ（登録商標）（Ｒ）を使用するカラムクロマトグラフィーによる分離
実施例１と同様にタクロリムス、アスコマイシン、化合物Ｉ、化合物IIの混合物１ｍｇを、不斉識別剤である（Ｒ）−１−（α−ナフチル）エチルアミンを結合させたメタクリレートポリマーを固定化したシリカゲルである、キラルＮＥＡ（登録商標）（Ｒ）２．５ｍＬのカラムクロマトグラフィーに付し、溶離液として３５％アセトニトニトリルを用い、溶出させた。分離した活性画分の純度をＨＰＬＣ分析にて測定した。溶出画分組成中、タクロリムス９９．９４％、アスコマイシン０．０２％、化合物Ｉは未検出、化合物IIは０．０４％であった。
【図１】
2014007362.tif 000004
【図２】
2014007362.tif 000005
【図３】
2014007362.tif 000006
【国際調査報告】
2014007362.tif 000007
2014007362.tif 000008
2014007362.tif 000009
2014007362.tif 000010