(57)【要約】  がんの罹患危険度を試験するための新たながんマーカーを提供する。  本発明のがんマーカーは、プロレニン受容体である。本発明のがんの罹患危険度の試験方法は、被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現を測定する方法であり、例えば、さらに、前記被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を、基準値と比較することにより、前記被検者のがんの罹患危険度を試験する工程を含む。前記基準値は、健常者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量またはがん患者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量であり、前記被検者の発現量が、前記健常者の発現量よりも高い場合、前記がん患者の発現量と同じ場合、前記がん患者の発現量よりも高い場合、前記被検者は、がんに罹患する危険性があると評価できる。
2014042148.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロレニン受容体であることを特徴とするがんマーカー。
【請求項２】
消化器がんマーカーまたは脳腫瘍マーカーである、請求項１記載のがんマーカー。
【請求項３】
前記消化器がんマーカーが、膵臓がんマーカー、胃がんマーカー、大腸がんマーカーおよび肝臓がんマーカーからなる群から選択された少なくとも１つのがんマーカーである、請求項２記載のがんマーカー。
【請求項４】
前記脳腫瘍マーカーが、グリオーママーカー、アストロサイトーママーカー、中枢神経系原発悪性リンパ腫マーカーおよび海綿上血管腫マーカーからなる群から選択された少なくとも１つのがんマーカーである、請求項２記載のがんマーカー。
【請求項５】
被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする、がんの罹患危険度を試験する方法。
【請求項６】
前記がんが、消化器がんまたは脳腫瘍である、請求項５記載の試験方法。
【請求項７】
前記消化器がんが、膵臓がん、胃がん、大腸がんおよび肝臓がんからなる群から選択された少なくとも１つである、請求項６記載の試験方法。
【請求項８】
前記脳腫瘍が、グリオーマ、アストロサイトーマ、中枢神経系原発悪性リンパ腫および海綿上血管腫からなる群から選択された少なくとも１つである、請求項６記載の試験方法。
【請求項９】
さらに、前記被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を、基準値と比較することにより、前記被検者のがんの罹患危険度を試験する工程を含み、前記基準値が、健常者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量またはがん患者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量である、請求項５から８のいずれか一項に記載の試験方法。
【請求項１０】
前記試験工程において、前記被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量が、前記健常者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量よりも高い場合、前記がん患者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量と同じ場合または、前記がん患者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量よりも高い場合に、前記被検者は、がんに罹患する危険性があるとする、請求項９記載の試験方法。
【請求項１１】
前記生体試料が、血液である、請求項５から１０いずれか一項に記載の試験方法。
【請求項１２】
前記生体試料が、消化器または脳由来の試料である、請求項５から１０のいずれか一項に記載の試験方法。
【請求項１３】
前記消化器が、膵臓、胃、大腸および肝臓からなる群から選択された少なくとも１つである、請求項１２記載の試験方法。
【請求項１４】
前記脳が、大脳、側頭葉、後頭葉、小脳、大脳基底核および間葉組織からなる群から選択された少なくとも１つである、請求項１２記載の試験方法。
【請求項１５】
プロレニン受容体の発現量が、そのｍＲＮＡの発現量およびタンパク質の発現量の少なくとも一方である、請求項５から１４のいずれか一項に記載の試験方法。
【請求項１６】
請求項５から１５のいずれか一項に記載のがんの罹患危険度の試験方法に使用する試験試薬であって、プロレニン受容体の発現測定試薬を含むことを特徴とする試験試薬。
【請求項１７】
前記発現測定試薬が、プロレニン受容体タンパク質に結合する物質、およびプロレニン受容体と前記結合物質との結合を検出する検出試薬を含む、請求項１６記載の試験試薬。
【請求項１８】
前記発現測定試薬が、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡを逆転写により増幅する試薬である、請求項１６記載の試験試薬。
【請求項１９】
プロレニン受容体に結合する結合物質およびプロレニン受容体の発現を抑制する発現抑制物質の少なくとも一方を含むことを特徴とするがん治療薬。
【請求項２０】
前記結合物質が、プロレニン受容体に対する抗体である、請求項１９記載のがん治療薬。
【請求項２１】
前記発現抑制物質が、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現を抑制する物質、発現したｍＲＮＡを切断する物質および発現したｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を抑制する物質からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１９記載のがん治療薬。
【請求項２２】
請求項１９から２１のいずれか一項に記載のがん治療薬を、患者に投与する工程を含むことを特徴とするがんの治療方法。
【請求項２３】
がんの治療用候補物質のスクリーニング方法であって、被検物質から、プロレニン受容体に結合する結合物質またはプロレニン受容体の発現を抑制する発現抑制物質を、前記治療用候補物質として選択することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２４】
プロレニン受容体に前記被検物質を接触させる工程、プロレニン受容体と前記被検物質との結合を検出する工程、およびプロレニン受容体に結合した前記被検物質を、前記治療用候補物質として選択する工程を含む、請求項２３記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
プロレニン受容体の発現系に前記被検物質を共存させて、プロレニン受容体を発現させる工程、前記発現系におけるプロレニン受容体の発現を検出する工程、およびプロレニン受容体の発現量が、前記被検物質を共存させていないコントロールの発現系よりも低い前記被検物質を、前記治療用候補物質として選択する工程とを含む、請求項２３記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
前記被検物質が、低分子化合物、ペプチド、タンパク質および核酸からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項２３から２５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんマーカー、それを用いたがんの罹患危険度の試験方法、および試験試薬に関し、さらに、がん治療薬およびそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、がんは、日本人の死因のトップであり、他の国においても、死因の上位を占めるに致っている。がんの発生および進展には、遺伝的要因、環境的要因等の様々な因子が関連しているが、決定的な診断方法および治療法は、未だ確立されていない。【０００３】
がんの中でも、例えば、膵臓がんは、進行が早いため早期発見が難しく、発見時には、周囲のリンパ節および臓器等に転移していることが多い。このように、治療の段階において、がんが進行しているため、例えば、治療が困難であり、外科的手術を行った場合でも予後が悪いとの問題もある。このため、膵臓がんをはじめとする各種がんについて、早期発見を可能とするためのがんマーカーの開発が望まれている（非特許文献１および２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｄｕｆｆｙ  ＭＪ、他７名、「Ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ：  ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ  （ＥＧＴＭ）  ｓｔａｔｕｓ  ｒｅｐｏｒｔ」、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１０年３月、第２１巻、第３号、ｐ．４４１−４４７
【非特許文献２】渡邊  弘之、他３名、「特集  膵癌の診断と治療．膵癌の早期診断は可能か？  腫瘍マーカー」  外科治療、株式会社  永井書店、２００７年９月、第９７巻、ｐ．２５０−２５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、がんの罹患危険度を試験するための新たながんマーカーの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のがんマーカーは、プロレニン受容体であることを特徴とする。【０００７】
本発明のがんの罹患危険度の試験方法は、被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする。【０００８】
本発明の試験試薬は、前記本発明のがんの罹患危険度の試験方法に使用する試験試薬であって、プロレニン受容体の発現測定試薬を含むことを特徴とする。【０００９】
本発明のがん治療薬は、プロレニン受容体に結合する結合物質およびプロレニン受容体の発現を抑制する発現抑制物質の少なくとも一方を含むことを特徴とする。本発明のがんの治療方法は、前記本発明のがん治療薬を、患者に投与する工程を含むことを特徴とする。【００１０】
本発明のスクリーニング方法は、がんの治療用候補物質のスクリーニング方法であって、被検物質から、プロレニン受容体に結合する結合物質またはプロレニン受容体の発現を抑制する発現抑制物質を、前記治療用候補物質として選択することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明者は、鋭意研究の結果、生体におけるプロレニン受容体の発現が、がんの発症と相関を示すことを見出し、本発明を確立するに至った。本発明によれば、プロレニン受容体の発現量を測定することによって、被検者のがんの罹患危険度を試験できる。また、本発明において、プロレニン受容体は、がんのターゲットとなることから、前記ターゲットを用いたスクリーニングにより、がんの治療用候補物質を得ることもできる。このため、本発明は、臨床分野および生化学分野において極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例１における血漿中のプロレニン受容体タンパク質の濃度を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例２における経時的な細胞数の変化を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例３におけるプロレニン受容体タンパク質の発現を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例３におけるプロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例４におけるプロレニン受容体タンパク質の発現を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例４におけるプロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例５におけるプロレニン受容体タンパク質の発現を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例５におけるプロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現を示すグラフである。
【図９】図９は、実施例６におけるプロレニン受容体タンパク質の発現を示す組織染色図である。
【図１０】図１０は、実施例７におけるがんの容積を示すグラフである。
【図１１】図１１は、実施例７におけるマウスの写真である。
【図１２】図１２は、実施例７におけるプロレニン受容体タンパク質の発現を示すグラフである。
【図１３】図１３は、実施例８におけるがんの容積を示すグラフである。
【図１４】図１４は、実施例９におけるプロレニン受容体タンパク質の発現を示す写真である。
【図１５】図１５は、実施例１０におけるプロレニン受容体タンパク質の発現を示す写真である。
【図１６】図１６は、実施例１０におけるリン酸化ＬＲＰタンパク質の発現を示すグラフである。
【図１７】図１７は、実施例１０における活性型β−カテニンタンパク質およびＣｙｌｌｉｎ  Ｄ１タンパク質の発現を示すグラフである。
【図１８】図１８は、実施例１１における細胞の増殖能力を示すグラフである。
【図１９】図１９は、実施例１２におけるアポトーシス細胞の割合を示すドットプロットである。
【図２０】図２０は、実施例１２におけるアポトーシス細胞の割合を示すヒストグラムである。
【図２１】図２１は、実施例１２における各細胞周期の細胞の割合を示すグラフである。
【図２２】図２２は、実施例１２におけるカスパーゼ３の活性を示すグラフである。
【図２３】図２３は、実施例１３における血漿中のプロレニン受容体タンパク質の濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（がんマーカー）
本発明のがんマーカーは、前述のように、プロレニン受容体であることを特徴とする。本発明のがんマーカーによれば、例えば、被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を測定することで、前記被検者のがんの罹患危険度を試験できる。
【００１４】
プロレニン受容体の由来は、特に制限されず、例えば、被検者の種類によって適宜設定できる。前記由来は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物等があげられ、前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ等の哺乳類があげられる。各種動物由来のプロレニン受容体は、例えば、既存のデータベースに登録されている情報を参照できる。具体例として、ヒト由来プロレニン受容体は、ｃＤＮＡとして、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５７６５で登録されている下記の塩基配列（配列番号５）における１０３−１１５５番目の領域（終始コドン含む）、タンパク質として、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００５７５６で登録されている下記のアミノ酸配列（配列番号６）があげられる。配列番号５の塩基配列は、配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列である。
【００１５】
ヒトプロレニン受容体ｃＤＮＡ（配列番号５）
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【００１６】
ヒトプロレニン受容体タンパク質（配列番号６）
MAVFVVLLALVAGVLGNEFSILKSPGSVVFRNGNWPIPGERIPDVAALSMGFSVKEDLSWPGLAVGNLFHRPRATVMVMVKGVNKLALPPGSVISYPLENAVPFSLDSVANSIHSLFSEETPVVLQLAPSEERVYMVGKANSVFEDLSVTLRQLRKRLFQENSVLSSLPLNSHSRNNEVDLLFLSELQVLHDISSLLSRHKHLAKDHSPDLYSLELAGLDEIGKRYGEDSEQFRDASKILVDALQKFADDMYSLYGGNAVVELVTVKSFDTSLIRKTRTILEAKQAKNPASPYNLAYKYNFEYSVVFNMVLWIMIALALAVIITSYNIWNMDPGYDSIIYRMTNQKIRMD
【００１７】
前記プロレニン受容体は、がんマーカーとして使用でき、具体的には、例えば、消化器がんおよび脳腫瘍のがんマーカーとして使用できる。前記消化器がんは、例えば、消化管がんおよび消化腺がんがあげられ、前記消化管がんは、例えば、胃がんおよび大腸がん等があげられ、前記消化腺がんは、例えば、膵臓がんおよび肝臓がん等があげられる。前記脳腫瘍は、例えば、グリオーマ、アストロサイトーマ、中枢神経系原発悪性リンパ腫および海綿上血管腫があげられる。本発明のがんマーカーは、この他に、例えば、腹膜がんのがんマーカーにもなる。また、本発明によれば、例えば、原発巣のがんおよび転移がんのいずれであっても試験できる。
【００１８】
本発明のマーカーは、例えば、プロレニン受容体タンパク質でもよいし、プロレニン受容体遺伝子から転写されたｍＲＮＡでもよい。
【００１９】
（がんの罹患危険度の試験方法）
本発明のがんの罹患危険度の試験方法は、前述のように、被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする。
【００２０】
本発明は、がんマーカーとして、プロレニン受容体の発現量を測定することが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限がない。
【００２１】
本発明の試験方法によれば、例えば、がんの発症の可能性、がんの発症の有無（がん化しているか否か）、がんの進行度および予後の状態等を評価できる。対象となるがんは、前述のように、例えば、消化器がんおよび脳腫瘍があげられる。前記消化器がんは、例えば、消化管がんおよび消化腺がんがあげられ、消化管がんは、例えば、胃がんおよび大腸がん等があげられ、消化腺がんは、例えば、膵臓がんおよび肝臓がんがあげられる。前記脳腫瘍は、例えば、グリオーマ、アストロサイトーマ、中枢神経系原発悪性リンパ腫および海綿上血管腫があげられる。本発明の試験方法によれば、この他に、例えば、腹膜がんのがんも評価できる。また、本発明によれば、例えば、原発巣のがん、転移がんのいずれであっても試験できる。
【００２２】
本発明の試験方法において、前記被検者は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物等があげられ、前記非ヒト動物は、前述のように、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ等の哺乳類があげられる。
【００２３】
本発明の試験方法において、前記生体試料の種類は、特に制限はされず、例えば、生体から分離した、体液、体液由来細胞、器官、組織または細胞等があげられる。前記体液は、例えば、血液があげられ、具体例として、例えば、全血、血清、血漿等があげられる。前記体液由来細胞は、例えば、血液由来細胞があげられ、具体的には、血球、白血球、リンパ球等の血球細胞があげられる。前記生体試料は、例えば、試験対象のがんの種類に応じて、適宜決定できる。前記生体試料は、例えば、試験対象のがんが発生しうる器官由来である。前記器官は、例えば、胃、膵臓、大腸、肝臓等の前記消化器、脳または、腹膜等である。前記脳は、例えば、大脳、側頭葉、後頭葉、小脳、大脳基底核および間葉組織等である。具体例として、前記試験対象が膵臓がんの場合、膵臓由来の組織または細胞が好ましい。前記試験対象が脳腫瘍の場合、脳由来の組織または細胞が好ましい。また、本発明のがんマーカーによれば、例えば、膵臓等の前記消化器および大脳等の前記脳におけるがんを、血液中のプロレニン受容体の発現量によって試験できる。このため、例えば、患者や医師の負担を軽減できることから、前記生体試料は、全血、血清、または血漿が好ましく、より好ましくは、血清または血漿である。
【００２４】
測定対象であるプロレニン受容体の発現は、例えば、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡおよびプロレニン受容体タンパク質の発現があげられる。前記発現は、例えば、前記生体試料について、前記ｍＲＮＡまたは前記タンパク質のいずれか一方のみを測定してもよいし、両方を測定してもよい。これらの測定方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。具体例として、前記ｍＲＮＡ発現の測定方法は、例えば、逆転写（Reverse  transcription：ＲＴ）−ＰＣＲ法等の逆転写反応を利用した遺伝子増幅法等があげられる。具体的には、例えば、ｍＲＮＡから逆転写反応でｃＤＮＡを合成し、前記ｃＤＮＡを鋳型として遺伝子増幅する方法である。また、前記タンパク質発現の測定方法は、例えば、免疫抗体法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロット法等があげられる。
【００２５】
本発明の試験方法は、例えば、さらに、前記被検者の生体試料（以下、被検生体試料ともいう）におけるプロレニン受容体の発現量を、基準値と比較することにより、前記被検者のがんの罹患危険度を試験する工程を含む。前記基準値は、特に制限されず、例えば、健常者、がん患者および進行ステージごとのがん患者のプロレニン受容体の発現量があげられる。予後の評価の場合、前記基準値は、例えば、同じ被検者の治療後（例えば、治療直後）のプロレニン受容体の発現量であってもよい。
【００２６】
前記基準値は、例えば、前述のような、健常者および／またはがん患者から単離した生体試料（以下、基準生体試料ともいう）を用いて、得ることができる。また、予後の評価の場合、例えば、同じ被検者から治療後に単離した基準生体試料を用いてもよい。前記基準値は、例えば、前記被検者の被検生体試料と同時に測定してもよいし、予め測定してもよい。後者の場合、例えば、前記被検者の被検生体試料を測定する度に、基準値を得ることが不要となるため、好ましい。前記被検者の被検生体試料と前記基準生体試料は、例えば、同じ条件で採取し、同じ条件でプロレニン受容体の測定を行うことが好ましい。
【００２７】
前記比較工程において、被検者のがんの罹患危険度の評価方法は、特に制限されず、前記基準値の種類によって適宜決定できる。具体例として、前記被検者の被検生体試料におけるプロレニン受容体の発現量が、前記健常者の基準生体試料におけるプロレニン受容体の発現量よりも有意に高い場合、前記がん患者の基準生体試料におけるプロレニン受容体の発現量と同じ場合（有意差がない場合）、および／または、前記がん患者の基準生体試料におけるプロレニン受容体の発現量よりも有意に高い場合、前記被検者は、がんに罹患する危険性があるまたは危険性が高いと評価できる。また、前記被検者の被検生体試料におけるプロレニン受容体の発現量が、前記健常者の基準生体試料におけるプロレニン受容体の発現量と同じ場合（有意差が無い場合）、前記健常者の基準生体試料におけるプロレニン受容体の発現量よりも有意に低い場合、および／または、前記がん患者の基準生体試料におけるプロレニン受容体の発現量よりも有意に低い場合、前記被検者は、がんに罹患する危険性が無いまたは危険性が低いと評価できる。また、前記比較工程において、前記被検者の被検生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を、前記進行ステージごとのがん患者の基準生体試料におけるプロレニン受容体の発現量と比較することで、がんの進行度を評価できる。具体的には、前記被検者の被検生体試料が、例えば、いずれかの進行ステージの前記基準生体試料と同程度の発現量の場合（有意差がない場合）、前記被検者は、前記進行ステージの可能性があると評価できる。
【００２８】
前記比較工程において、予後の状態を評価する場合、例えば、前述と同様に評価判断してもよいし、基準値として、同じ被検者の治療後の基準生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を使用して評価することもできる。具体例として、前記被検者の被検生体試料におけるプロレニン受容体の発現量が、前記基準値よりも有意に高い場合、前記被検者は、前記治療後、再発または悪化の危険性があると評価できる。また、前記被検者の被検生体試料におけるプロレニン受容体の発現量が、前記基準値と同じ場合（有意差がない場合）、および／または、前記基準値よりも有意に低い場合、前記被検者は、前記治療後、再発の危険性が無いもしくは危険性が低いと評価できる。
【００２９】
本発明においては、例えば、同じ被検者の生体試料を経時的に採取し、前記生体試料におけるプロレニン受容体発現量を比較してもよい。これによって、例えば、経時的に発現量が増加すれば、罹患の可能性が高くなった等の判断が可能であり、経時的に発現量が低下すれば、罹患の可能性が低くなったまたは治癒してきた等の判断が可能である。
【００３０】
（試験試薬）
本発明の試験試薬は、前記本発明のがんの罹患危険度の試験方法に使用する試験試薬であって、プロレニン受容体の発現測定試薬を含むことを特徴とする。本発明の試験試薬によれば、前記本発明のがんの罹患危険度の試験方法を簡便に行える。本発明は、がんの罹患危険度の試験をプロレニン受容体の発現の測定に基づいて行うことが特徴であり、プロレニン受容体の発現が測定できればよく、前記発現測定試薬の種類は、特に制限されない。前記プロレニン受容体の発現測定試薬は、例えば、プロレニン受容体タンパク質の発現測定試薬でもよく、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現測定試薬でもよい。
【００３１】
前者は、例えば、プロレニン受容体タンパク質に結合する結合物質があげられ、具体例として、抗体があげられる。この場合、本発明の試験試薬は、例えば、さらに、プロレニン受容体タンパク質と前記抗体との結合を検出する検出物質を含むことが好ましい。前記検出物質は、例えば、前記抗体に対する検出可能な標識化抗体と、前記標識に対する基質等の組合せがあげられる。
【００３２】
後者は、例えば、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡを逆転写により増幅する試薬があげられ、具体例として、プライマーがあげられる。前記プライマーは、例えば、プロレニン受容体の遺伝子配列に基づいて適宜設計できる。
【００３３】
（がんの診断方法および診断試薬）
本発明のがんの診断方法は、被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする。また、本発明のがんの診断試薬は、プロレニン受容体の発現測定試薬を含むことを特徴とする。なお、本発明は、前記本発明の試験方法および試験試薬の説明を援用できる。
【００３４】
（がん治療薬およびがん治療方法）
本発明のがんターゲットは、プロレニン受容体であることを特徴とする。本発明は、プロレニン受容体を前記がんターゲットとし、例えば、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡまたはプロレニン受容体タンパク質の発現を抑制すること、または、プロレニン受容体タンパク質の機能を阻害もしくは中和すること等により、がんを治療できる。
【００３５】
本発明のがん治療薬は、前述のように、プロレニン受容体に結合する結合物質およびプロレニン受容体の発現を抑制する発現抑制物質の少なくとも一方を含むことを特徴とする。本発明の治療方法は、がんの治療方法であって、患者に前記本発明のがん治療薬を投与する工程を含むことを特徴とする。
【００３６】
本発明は、プロレニン受容体タンパク質への結合物質の結合またはプロレニン受容体の発現抑制によって、がんを治療することが特徴であり、前記結合物質および前記発現抑制物質の種類は、特に制限されない。本発明は、例えば、前記結合物質および前記発現抑制物質の一方を使用してもよいし、両者を併用してもよい。
【００３７】
前記結合物質は、例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、核酸等があげられ、好ましくは、抗体またはその抗原結合断片である。前記結合物質は、アンタゴニストが好ましい。
【００３８】
前記抗体は、特に制限されず、一般的な抗体の製造方法により得ることができる。具体例として、例えば、プロレニン受容体タンパク質またはその断片を抗原とし、動物に免疫した後、前記免疫された動物から血清を回収することにより、プロレニン受容体タンパク質に対する抗体を得ることができる。前記抗体は、例えば、モノクローナル抗体でもよいし、ポリクローナル抗体でもよい。
【００３９】
前記抗原は、例えば、前述のように、プロレニン受容体の全長アミノ酸配列でもよいし、部分配列でもよい。前記部分配列は、例えば、前記ヒトプロレニン受容体タンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）において、２００−２１３番目のアミノ酸領域（HKHLAKDHSPDLYS：配列番号７）があげられる。
【００４０】
前記プロレニン受容体タンパク質において、前記プロレニン受容体タンパク質と前記プロレニン受容体タンパク質に対する抗体との結合位置は、特に制限されない。前記プロレニン受容体タンパク質が、ヒトプロレニン受容体タンパク質である場合、前記結合位置は、例えば、前記ヒトプロレニン受容体タンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）において、２００−２１３番目のアミノ酸領域（HKHLAKDHSPDLYS：配列番号７）があげられる。
【００４１】
前記発現抑制物質は、例えば、プロレニン受容体遺伝子からのｍＲＮＡの転写を抑制する物質、転写されたｍＲＮＡを切断する物質およびｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を抑制する物質等があげられる。具体例としては、例えば、ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡ干渉剤、アンチセンス、リボザイム等があげられ、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００４２】
本発明のがん治療薬の投与条件は、特に制限されず、例えば、対象となるがん疾患の種類、進行度、患者の年齢等に応じて、投与形態、投与時期、投与量等を適宜設定できる。投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物等があげられ、前記非ヒト動物は、前述のように、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ等の哺乳類があげられる。
【００４３】
（スクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、がん治療薬候補物質のスクリーニング方法であって、被検物質から、プロレニン受容体に結合する結合物質またはプロレニン受容体の発現を抑制する発現抑制物質を、前記治療用候補物質として選択することを特徴とする。本発明は、がん治療薬候補物質のターゲットがプロレニン受容体であることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。
【００４４】
前記結合物質は、例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、核酸等があげられ、好ましくは、抗体もしくはその抗原結合断片である。
【００４５】
前記発現抑制物質は、例えば、プロレニン受容体遺伝子からのｍＲＮＡの転写を抑制する物質、転写されたｍＲＮＡを切断する物質およびｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を抑制する物質等があげられる。具体例としては、例えば、ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡ干渉剤、アンチセンス、リボザイム等があげられる。
【００４６】
本発明の前記結合物質のスクリーニング方法は、例えば、プロレニン受容体に前記被検物質を接触させる工程と、プロレニン受容体と前記被検物質との結合を検出する工程と、プロレニン受容体に結合した前記被検物質を、前記治療薬候補物質として選択する工程とを含む。前記検出工程において、プロレニン受容体と前記被検物質との結合の検出方法は、特に制限されず、例えば、前記被検物質の種類に応じて、適宜決定できる。
【００４７】
本発明の前記発現抑制物質のスクリーニング方法は、例えば、プロレニン受容体の発現系に前記被検物質を共存させて、プロレニン受容体を発現させる工程と、前記発現系におけるプロレニン受容体の発現を検出する工程と、プロレニン受容体の発現量が、前記被検物質を共存させていないコントロールの発現系よりも低い前記被検物質を、前記治療用候補物質として選択する工程とを含む。前記検出工程において、検出対象の前記発現は、例えば、プロレニン受容体タンパク質の発現でもよいし、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの転写でもよい。前記タンパク質の発現およびｍＲＮＡの発現の検出方法は、特に制限されず、公知の方法が適用できる。
【実施例】
【００４８】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。【００４９】
［実施例１］
膵臓がん患者の血漿中のプロレニン受容体の濃度上昇を確認した。【００５０】
血漿中のプロレニン受容体の測定は、Ｈｕｍａｎ  ｓｏｌｕｂｌｅ  （Ｐｒｏ）ｒｅｎｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（株式会社  免疫生物研究所）を用いて、そのプロトコルに従って行った。まず、健常者男性（ｎ＝９）、健常者女性（ｎ＝３）、膵臓がん患者男性（ｎ＝９）および膵臓がん患者女性（ｎ＝８）の血液から血漿を回収した。これらを、前記キットの希釈液（１％  ＢＳＡおよび５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有リン酸緩衝液）で２倍希釈し、得られた希釈血漿を被検サンプルとした。前記被検サンプル１００μＬを、捕獲抗体（抗Ｈｕｍａｎ  ｒｅｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒポリクローナルラビットＩｇＧ抗体）が結合したプレートに添加し、４℃で一晩反応させた。前記被検サンプルを除き、前記プレートを前記リン酸緩衝液で４回洗浄した。つぎに、前記プレートに、標識抗体（ＨＲＰ標識抗Ｈｕｍａｎ  ｒｅｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒポリクローナルマウスＩｇＧ抗体）を１００μＬ添加し、４℃で６０分反応させた。前記標識抗体を除き、前記プレートを前記リン酸緩衝液で５回洗浄した。さらに、前記プレートにＴｅｔｒａ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ含有基質液を１００μＬ添加して発色させた後、０．５ｍｏｌ／Ｌ（１Ｎ）  Ｈ２ＳＯ４で、発色反応を停止した。停止後、プレートリーダーで、前記プレート内の反応液について４５０ｎｍでの吸光度を測定した。他方、前記キットの標準物質（Ｈｕｍａｎ  ｓｏｌｕｂｌｅ  （Ｐｒｏ）ｒｅｎｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を段階希釈し、得られた希釈標準サンプルを用いて、同様に吸光度を測定し、検量線を作成した。そして、前記被検サンプルの吸光度から、前記検量線に基づき、前記血漿中のプロレニン受容体の濃度を測定した。【００５１】
また、健常者（ｎ＝２０）、膵臓がんを原発巣とし且つ転移のない膵臓がん患者（転移なし、ｎ＝１１）、および膵臓がんを原発巣とし且つ他臓器への転移がある膵臓がん患者（転移あり、ｎ＝９）から血漿を回収し、同様にして前記血漿中のプロレニン受容体の濃度を測定した。【００５２】
この結果を図１（Ａ）および（Ｂ）に示す。図１（Ａ）および（Ｂ）は、血漿中のプロレニン受容体の濃度を示すグラフである。図１（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、前記被検サンプルの種類を、縦軸は、プロレニン受容体の濃度を示す。図１（Ａ）に示すように、男性および女性共に、膵臓がん患者（ＰＤＡＣ）は、健常者（Ｎｏｒｍａｌ）と比較して、血漿中のプロレニン受容体の濃度が有意に上昇した。また、図１（Ｂ）に示すように、膵臓がんの転移無しの患者および膵臓がんの転移ありの患者は、いずれも、健常者と比較して、血漿中のプロレニン受容体濃度が有意に上昇した。これらの結果から、転移の有無および性別に関わらず膵臓がんの発症と血漿中のプロレニン受容体濃度上昇との間に相関関係があり、血漿中のプロレニン受容体が、膵臓がんのマーカーとなることがわかった。【００５３】
［実施例２］
膵臓がん細胞株のプロレニン受容体の発現を抑制し、前記細胞株の増殖能力を確認した。【００５４】
４０％コンフルエントのヒト膵臓がん細胞株ＰＫ−１を、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で２４時間、ディッシュ上の無血清培地中で培養した。次に、前記ＰＫ−１に、プロレニン受容体遺伝子をノックダウンさせる下記のｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはネガティブコントロールであるｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｉＲＮＡ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）  ＲＮＡｉＭＡＸ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、そのプロトコルに従って導入した。そして、ｓｉＲＮＡを導入したＰＫ−１を、同条件下で４８時間培養した。培養後、０．２５％トリプシンおよび１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、前記ディッシュからＰＫ−１を剥離し、新たな前記無血清培地を添加した。そして、ＰＫ−１を含む前記培地から、遠心分離によってＰＫ−１を含むペレットを回収した。前記ペレットをリン酸緩衝液１ｍＬに懸濁し、この懸濁液と２０μＬのトリパンブルー液とを混合後、血球計算板に注入し、１ｍＬあたりの細胞数を算出した。生細胞の数が５×１０５細胞／１０ｃｍ径ディッシュとなるように播種し、細胞増殖を誘導するヒトＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１５０ｎｇ／ｍＬで加えた。０、２４、４８、７２時間の培養後、ＰＫ−１を回収し、同様に生細胞の数を算出した。また、コントロールとして、ｓｉＲＮＡ処理を行わない以外は、同様にして培養および生細胞数の測定を行った。【００５５】
ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ
センス鎖（配列番号８）
５’−UAUAGGGACUUGCUGGGUUCUUCGC−３’
アンチセンス鎖（配列番号９）
５’−GCGAAGAACCCAGCAAGUCCCUAUA−３’【００５６】
この結果を図２に示す。図２は、ＲＮＡｉによりプロレニン受容体の発現を抑制したときの、前記膵臓がん細胞株の細胞数を示すグラフである。図２において、コントロール（○）は、ｓｉＲＮＡ無処理のコントロール群、スクランブル（△）は、スクランブルｓｉＲＮＡで処理したスクランブル群、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ（□）は、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲで処理したｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群の結果である。図２の横軸は、Ｗｎｔ３ａで刺激した時間を、縦軸は、細胞数を示す。図２に示すように、コントロール群およびスクランブル群は、各処理時間で同等の細胞増殖を示した。これに対して、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群は、前記両群に比べて、各処理時間のいずれにおいても、前記膵臓がん細胞株の細胞増殖が抑制された。さらに、コントロール群およびスクランブル群は、７２時間まで増殖し続けたのに対して、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群は、４８時間をピークに細胞数が減少した。この結果から、プロレニン受容体の発現を抑制することで、膵臓がん細胞株の増殖を抑制できること、つまり、プロレニン受容体が、膵臓がんのターゲットとなることがわかった。【００５７】
［実施例３］
転移がん組織におけるプロレニン受容体タンパク質およびｍＲＮＡの発現上昇を確認した。【００５８】
（１）プロレニン受容体タンパク質の発現
原発巣が膵臓であるがん患者から、肝臓の正常組織（コントロール）、肝臓の転移がん組織および腹膜の転移がん組織を採取した。各組織２ｇにＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  １ｍＬを添加し、４，０００ｒｐｍで５分間、ホモジェナイズを行い、被検サンプルを作製した。試薬（商品名  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、前記被検サンプル中のタンパク質量を測定した。【００５９】
前記被検サンプル（総タンパク量２０μｇ）を、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動に供し、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオライド）メンブレンに転写した。前記転写後の前記メンブレンを、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてブロッキングした。前記ブロッキング後の前記メンブレンを、１０００倍希釈した抗ラビット（Ｐ）ＲＲポリクローナル抗体と室温で１時間反応させ、続いて２０００倍希釈したＩＲＤｙｅ（登録商標）標識抗ラビットＩｇＧ抗体（Ｌｉ−Ｃｏｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）と、同条件下で反応させた。前記反応後のメンブレンについて、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、前記被検サンプル中のプロレニン受容体タンパク質の発現量を測定した。コントロールである肝臓の正常組織の発現量を１として、肝臓および腹膜の転移がん組織の発現量の相対値を求めた。【００６０】
各組織におけるプロレニン受容体タンパク質の発現の結果を、図３に示す。図３は、各組織におけるプロレニン受容体タンパク質の発現量を示したグラフである。横軸は、被検サンプルの種類を、縦軸は、プロレニン受容体タンパク質の相対的発現量を示す。図３に示すように、肝臓および腹膜の転移がん組織は、正常な肝臓組織よりプロレニン受容体タンパク質の発現が、有意に上昇した。これらの結果から、転移がん組織と、プロレニン受容体タンパク質の発現上昇との間に相関があること、つまり、プロレニン受容体タンパク質が、転移がんのマーカーとなることがわかった。【００６１】
（２）プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現
前記（１）で採取した肝臓の正常組織（コントロール）、肝臓の転移がん組織および腹膜の転移がん組織を使用した。各組織２ｇにＩＳＯＧＥＮ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）  １ｍＬを添加し、４，０００ｒｐｍで５分間、ホモジェナイズを行い、被検サンプルを作製した。前記被検サンプルにエタノールを加え、ＲＮＡを沈殿させた後、前記ＲＮＡをＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒに溶解し、ＲＮＡ溶液を作製した。分光光度計により、前記ＲＮＡ溶液の濃度およびＯＤ２６０／ＯＤ２８０（純度）を計測した。そして、ＲＮＡ濃度３００ｎｇ／μＬ、純度１．８以上の前記ＲＮＡ溶液を、以下の定量的リアルタイム（ｑＲＴ）−ＰＣＲに使用した。【００６２】
逆転写酵素およびランダムプライマーを用い、常法により、前記ＲＮＡ溶液からｃＤＮＡを合成後、ＲＮａｓｅＨを用いてＲＮＡを分解した。得られた前記ｃＤＮＡを鋳型として、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、添付のプロトコルに従ってｑＲＴ−ＰＣＲを行い、前記被検サンプル中のプロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡ発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した。プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、前記β−アクチン遺伝子のｍＲＮＡ発現量に対する比として算出した。前記ｑＲＴ−ＰＣＲにおいて、プロレニン受容体遺伝子および前記β−アクチン遺伝子の増幅には、それぞれ以下のプライマーセットを使用した。【００６３】
プロレニン受容体遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号１）5’-GGCGTTGGTGGCGGGTGTTT-3’
（配列番号２）5’-AGCCCATGGACAATGCAGCCAC-3’
β−アクチン遺伝子増幅用プライマーセット
（配列番号３）5’-CACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATC-3’
（配列番号４）5’-ACGAGCGCGGCGATATCATCATC-3’【００６４】
各組織のプロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現量の結果を、図４に示す。横軸は、被検サンプルの種類を、縦軸は、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡのβ−アクチン遺伝子のｍＲＮＡに対する相対的発現量を示す。図４に示すように、肝臓および腹膜の転移がん組織は、正常な肝臓組織と比較して、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現が上昇した。この結果から、転移がん組織と、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現上昇との間に相関があること、つまり、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡが、転移がんのマーカーとなることがわかった。【００６５】
［実施例４］
胃がん組織におけるプロレニン受容体タンパク質およびｍＲＮＡの発現上昇を確認した。【００６６】
（１）プロレニン受容体タンパク質の発現
胃がん患者４名から、それぞれ胃の正常組織（ｎ＝４）およびがん組織（ｎ＝４）を採取し、前記実施例３（１）と同様にして、プロレニン受容体タンパク質の発現量を測定した。そして、患者４名の正常組織およびがん組織について、それぞれ発現量の平均を求めた。【００６７】
胃がん組織におけるプロレニン受容体タンパク質の発現の結果を、図５に示す。図５は、プロレニン受容体タンパク質の発現量を示したグラフである。横軸は、被検サンプルの種類を、縦軸は、プロレニン受容体タンパク質の相対的発現量を示す。図５に示すように、胃がん組織（ｎ＝４）では、正常な胃組織（ｎ＝４）と比較して、プロレニン受容体タンパク質の発現が、有意に上昇した。これらの結果から、胃がんの発症と、プロレニン受容体タンパク質の発現上昇との間に相関があること、つまり、胃組織におけるプロレニン受容体タンパク質が、胃がんのマーカーとなることがわかった。【００６８】
（２）プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現
前記（１）で採取した胃の正常組織およびがん組織を使用し、前記実施例３（２）と同様にして、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。そして、患者４名の正常組織およびがん組織について、それぞれ発現量の平均を求めた。【００６９】
胃がん組織のプロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現量の結果を、図６に示す。横軸は、被検サンプルの種類を、縦軸は、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡのβ−アクチン遺伝子のｍＲＮＡに対する相対的発現量を示す。図６に示すように、胃がん組織（ｎ＝４）では、正常な胃組織（ｎ＝４）と比較して、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現が、上昇した。この結果から、胃がん発症と、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現上昇との間に相関があること、つまり、胃組織におけるプロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡが、胃がんのマーカーとなることがわかった。【００７０】
［実施例５］
大腸がん組織におけるプロレニン受容体タンパク質およびｍＲＮＡの発現上昇を確認した。【００７１】
（１）プロレニン受容体タンパク質の発現
大腸がん患者４名から、大腸の正常組織（ｎ＝４）およびがん組織（ｎ＝４）を採取し、前記実施例３（１）と同様にして、プロレニン受容体タンパク質の発現量を測定した。そして、患者４名の正常組織およびがん組織について、それぞれ発現量の平均を求めた。【００７２】
大腸がん組織におけるプロレニン受容体タンパク質の発現の結果を、図７に示す。図７は、プロレニン受容体タンパク質の発現量を示したグラフである。横軸は、被検サンプルの種類を、縦軸は、プロレニン受容体タンパク質の相対的発現量を示す。図７に示すように、大腸がん組織（ｎ＝４）では、正常な大腸組織（ｎ＝４）と比較して、プロレニン受容体タンパク質の発現が、有意に上昇した。これらの結果から、大腸がんの発症と、プロレニン受容体タンパク質の発現上昇との間に相関があること、つまり、大腸組織におけるプロレニン受容体タンパク質が、大腸がんのマーカーとなることがわかった。【００７３】
（２）プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現
前記（１）で採取した大腸の正常組織およびがん組織について、前記実施例３（２）と同様にして、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。そして、患者４名の正常組織およびがん組織について、それぞれ発現量の平均を求めた。【００７４】
大腸がん組織におけるプロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現量の結果を、図８に示す。横軸は、被検サンプルの種類を、縦軸は、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡのβ−アクチン遺伝子のｍＲＮＡに対する相対的発現量を示す。図８に示すように、大腸がん組織（ｎ＝４）では、正常な大腸組織（ｎ＝４）と比較して、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現が、有意に上昇した。この結果から、大腸がん発症と、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現上昇との間に相関があること、つまり、大腸組織におけるプロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡが、大腸がんのマーカーとなることがわかった。【００７５】
［実施例６］
膵臓がん組織におけるプロレニン受容体タンパク質の発現上昇を免疫組織化学染色により確認した。【００７６】
膵臓がん患者２２名から、膵管の正常上皮組織、膵臓のがん組織および前がん病変部位（ＰａｎＩＮ）を含む膵管の上皮組織を採取した。これらを被検サンプルとして、パラフィン切片を作製し、１００％キシレンおよび９９．５％エタノールを用いて、脱パラフィン操作を行った。そして、前記被検サンプルについて、１００％エタノールおよび３０％過酸化水素水を用い、内在性ペルオキシダーゼを不活性化した。つぎに、前記被検サンプルの切片領域を、リキッドブロッカー（撥水性物質）で囲った後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。続いて、前記被検サンプルを、１０％ヤギ正常血清（商品名  ヒストフィンＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キット、ニチレイバイオサイエンス）を用い、室温で１５分間、ブロッキングした。【００７７】
前記ブロッキング後、前記被検サンプルを、４０００倍希釈した抗ラビット（Ｐ）ＲＲポリクローナル抗体と、室温で１時間反応させ、前記ＰＢＳで洗浄した。つぎに、前記被検サンプルを、ＨＲＰ標識二次抗体であるヒストファイン  シンプルステインＭＡＸ−ＰＲＯ（ＭＵＬＴＩ）（ニチレイバイオサイエンス）と、室温で３０分間反応させた。続いて、前記被検サンプルを前記ＰＢＳで洗浄し、ＨＲＰの発色基質であるＤＡＢ（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）で発色させた。そして、前記被検サンプルを流水で洗浄し、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）で染色した。前記染色後の前記被検サンプルを流水で洗浄し、９９．５％エタノールおよび１００％キシレンで脱水し、固定した。前記固定した前記被検サンプルをマリノールで封入し、ＤＡＢにより茶色に染色されるプロレニン受容体の発現領域を、光学顕微鏡を用いて観察した。【００７８】
膵臓組織におけるプロレニン受容体タンパク質の発現の結果を、図９に示す。図９は、膵臓組織における、プロレニン受容体タンパク質の発現を示す組織染色図である。図９において、（Ａ）は、膵臓がん組織の染色図であり、（Ｂ）は、膵管の正常上皮組織の染色図であり、（Ｃ）は、中期のＰａｎＩＮであるＰａｎＩＮ−２を含む膵管上皮組織の染色図であり、（Ｄ）は、後期のＰａｎＩＮであるＰａｎＩＮ−３を含む膵管上皮組織の染色図である。また、（Ａ）−（Ｄ）におけるスケールバーは、１００μｍとし、染色された領域は、実線で囲んで示した（例えば、矢印Ｘ、ＹおよびＺの領域）。【００７９】
図９（Ｂ）に示すように、膵管上皮組織（正常）は、茶色の染色がほとんど確認されなかった。一方、図９（Ａ）に示すように、膵臓ガン組織は、実線（Ｘ）で囲んだ領域が茶色に染色された。さらに、図９（Ｃ）および（Ｄ）に示すように、ＰａｎＩＮ−２およびＰａｎＩＮ−３は、それぞれ実線（Ｙ）または実線（Ｚ）で囲んだ領域が茶色に染色された。つまり、膵臓がん組織およびＰａｎＩＮは、正常な膵管上皮組織と比較して、プロレニン受容体タンパク質の発現が上昇した。なお、図９は、１名の膵臓がん患者由来の組織の染色図を示すが、その他の膵臓がん患者由来の組織においても同様に、膵臓がん組織およびＰａｎＩＮにおいて、プロレニン受容体タンパク質の発現が上昇していた。これらの結果から、ＰａｎＩＮの形成および膵臓がん発症と、プロレニン受容体タンパク質の発現上昇との間に相関があること、つまり、膵臓組織におけるプロレニン受容体タンパク質が、膵臓がんの高い発症可能性を示すマーカー、および膵臓がんのマーカーとなることがわかった。【００８０】
［実施例７］
ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲで処理したヒト膵臓がん細胞株をヌードマウスに移植し、ヌードマウスにおける前記膵臓がん細胞株の成長の抑制および血漿中の可溶性プロレニン受容体タンパク質の発現量の低下を確認した。【００８１】
（１）膵臓がん細胞株の成長
ＰＫ−１に代えて、ヒト膵臓がん細胞株であるＰＡＮＣ−１を用いた以外は前記実施例２と同様にして、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲを導入し、ｓｉＲＮＡを導入したＰＡＮＣ−１（ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群）を回収した。つぎに、５×１０５細胞のＰＡＮＣ−１を、５週齢雄ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎ＝７）（日本クレア社製）の右上側腹部に皮下移植した。そして、前記移植後２５および４０日に、前記右上側腹部におけるＰＡＮＣ−１由来のがんの長径および短径を、電気ノギス（アズワン社製）を用いて測定した。前記がんの容積は、下記式から算出した。コントロールは、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲに代えて、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｉＲＮＡを導入したＰＡＮＣ−１（スクランブル群）用いた以外は同様にして、がんの容積を測定した。
［式１］
ガン容積（ｍｍ３）＝長径×（短径）２×０．５【００８２】
図１０に、前記がんの容積を示し、図１１に、前記移植後２５日目の前記マウスの写真を示す。図１０において、（Ａ）は、前記移植後２５日の前記がんの容積を示すグラフであり、（Ｂ）は、前記移植後４０日の前記がんの容積を示すグラフである。図１０（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、処理したｓｉＲＮＡを示し、縦軸は、がんの容積を示す。図１０（Ａ）および（Ｂ）に示すように、前記移植後２５および４０日において、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群由来のがんの容積は、スクランブル群由来のがんの容積に対して、顕著に低下した。【００８３】
図１１において、（Ａ）は、スクランブル群の移植後２５日目の前記マウスの写真であり、（Ｂ）は、ｓｉ（Ｐ）ＲＲ群の移植後２５日目の前記マウスの写真である。図１１に示すように、前記移植後２５日において、スクランブル群は、実線（Ｔ）で囲んだ領域にがんの形成が確認された。これに対し、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群は、がんの形成が確認されなかった。これらの結果から、プロレニン受容体の発現を抑制することで、生体内におけるがんの成長を抑制できることがわかった。【００８４】
（２）プロレニン受容体タンパク質の発現量
前記移植後２５日の前記ヌードマウスの血液から血漿を採取した。前記血漿中のプロレニン受容体タンパク質の発現量の測定は、前記実施例３（１）と同様にして測定した。つぎに、コントロールの血漿のプロレニン受容体の発現量を１として、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲを導入したＰＡＮＣ−１を移植した前記ヌードマウスの血漿のプロレニン受容体の発現量の相対値を求めた。【００８５】
これらの結果を図１２に示す。図１２は、前記移植後２５日の血漿におけるプロレニン受容体の発現量の相対値を示すグラフである。図１２において、横軸は、処理したｓｉＲＮＡを示し、縦軸は、プロレニン受容体の相対的発現量を示す。図１２に示すように、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群を移植した前記ヌードマウスの血漿のプロレニン受容体の相対的発現量は、スクランブル群を移植した前記ヌードマウスの血漿のプロレニン受容体の相対的発現量に対して、有意に低下した。これらの結果から、生体内において、がんのプロレニン受容体の発現を抑制することで、血漿中のプロレニン受容体の発現量を抑制できることがわかった。【００８６】
［実施例８］
膵臓がんを移植したヌードマウスに抗プロレニン受容体抗体を投与することで、がんの成長を抑制できることを確認した。【００８７】
（１）抗プロレニン受容体抗体の作製
前記ヒトプロレニン受容体タンパク質（配列番号６）の２００−２１３番目のポリペプチド（配列番号７）を、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合し、抗原タンパク質とした。１５０−２００μｇの前記抗原タンパク質を、２週間毎に７−１０回ウサギ皮内の数十箇所に免疫した（６００−８００μｇ／体重１ｋｇ）。前記免疫は、初回は、完全アジュバントと混合した前記抗原タンパク質を用いて行い、２回目以降は、不完全アジュバントと混合した前記抗原タンパク質を用いて行った。つぎに、前記ポリペプチドに対する抗体価の上昇を確認した後、前記ウサギより全血を採取し、さらに、血清を回収し、これを抗血清とした。前記抗血清におけるポリクローナル抗ヒトプロレニン受容体抗体（クローン名：ＰＲＲ１）の濃度は、０．６μｇ／μＬであった。なお、前記抗原タンパク質に用いたヒトプロレニン受容体タンパク質の全アミノ酸配列とマウスプロレニン受容体タンパク質の全アミノ酸配列（配列番号１０）との相同性（異種間のアライメントスコア）は、９２．２９％であった。このことから、前記抗血清に含まれる前記ヒトプロレニン受容体抗体は、マウスプロレニン受容体にも結合するといえる。【００８８】
マウスプロレニン受容体タンパク質（配列番号１０）
MAVLVVLLFFLVAGALGNEFSILRSPGSVVFRNGNWPIPGDRIPDVAALSMGFSVKEDLSWPGLAVGNLFHRPRATIMVMVKGVDKLALPAGSVISYPLENAVPFSLDSVANSIHSLFSEETPVVLQLAPSEERVYMVGKANSVFEDLSVTLRQLRNRLFQENSLLNSLPLNSLSRNNEVDLLFLSELQVLHDISSLLSRHKHLAKDHSPDLYSLELAGLDELGKRYGEDSEQFRDASKILVDALQKFADDMYSLYGGNAVVELVTVKSFDTSLVRKSRTILEAKQENTQSPYNLAYKYNLEYSVVFNLVLWIMIGLALAVIITSYNIWNMDPGYDSIIYRMTNQKIRID【００８９】
（２）生体内におけるがん細胞の成長抑制
１×１０６細胞のＰＫ−１またはＰＡＮＣ−１、３０μｌの前記抗血清（前記抗体０．６μｇ／μｌ）および１７０μｌのＰＢＳを混合した。この混合液（全量）を、ヌードマウス（ｎ＝１０）の右上側腹部に移植した。この際、前記マウスの体重１ｋｇあたりの移植量は、前記細胞が５０×１０６細胞であり、前記抗体０．９ｍｇである。つぎに、前記移植後から３日毎に、１０μｌの前記抗血清（前記抗体０．６μｇ／μｌ）を、ＰＫ−１またはＰＡＮＣ−１由来のがん内に投与した、この際、１回の投与における、前記マウスの体重１ｋｇあたりの前記抗体の投与量は、０．３ｍｇである。そして、前記移植後１５、１８、２１、２４および２７日に、前記右上側腹部におけるＰＫ−１またはＰＡＮＣ−１由来のがんの容積を、前記実施例７と同様に測定した。コントロールは、前記抗プロレニン受容体抗体に代えて、マウスの体重１ｋｇあたり１ｍｇとなるように、ヒトＩｇＧ１抗体（ＷＡＫＯ社製）を投与した以外は同様にして、がんの容積を測定した。【００９０】
これらの結果を図１３に示す。図１３において、（Ａ）は、ＰＫ−１を移植した際の前記がんの容積を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＰＡＮＣ−１を移植した際の前記がんの容積を示すグラフである。図１３（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、移植後の日数を示し、縦軸は、がんの容積を示し、図中の黒抜きバーは、抗プロレニン受容体投与群を示し、白抜きバーは、ヒトＩｇＧ１抗体投与群を示す。図１３（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ＰＫ−１およびＰＡＮＣ−１のいずれを移植した前記ヌードマウスにおいても、前記移植後１５、１８、２１、２４および２７日において、抗プロレニン受容体投与群のがんの容積は、ヒトＩｇＧ１抗体投与群のがんの容積に対して低下した。これらの結果から、抗プロレニン受容体抗体を用いることで、生体内におけるがんの成長を抑制できることがわかった。【００９１】
［実施例９］
ヒト膵管上皮細胞株およびヒト膵臓がん細胞株におけるプロレニン受容体タンパク質の発現およびこれらの細胞株の培養上清におけるプロレニン受容体タンパク質の発現を確認した。【００９２】
ヒト膵管上皮細胞株として、ＨＰＤＥを、ヒト膵臓がん細胞株として、ＰＫ−８、ＰＣＩ−３５、ＢｘＰＣ−３、ＰＫ−１、ＰＡＮＣ−１およびＭＩＡＰａＣａ−２を用いた。前記細胞株を、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で２４時間、無血清培地中で培養した。前記無血清培地は、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。前記培養後、培養上清を回収した。つぎに、１ｍＬ前記培養上清を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ  ｗｉｔｈ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて濃縮し、２０μｇの総タンパク質を含む濃縮液を得た。前記濃縮液を培養上清サンプルとした。【００９３】
また、前記培養上清回収後の前記細胞株は、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで溶解した。前記細胞溶解液を１２，５００ｒｐｍで１０分遠心後、上清を取得し、細胞溶解サンプルとした。そして、前記培養上清サンプルおよび前記細胞溶解サンプルにおけるプロレニン受容体タンパク質およびβ−アクチンタンパク質の発現を、前記実施例３（１）と同様にして確認した。【００９４】
これらの結果を図１４（Ａ）および（Ｂ）に示す。図１４において、（Ａ）は、前記細胞株の前記細胞溶解サンプルにおけるプロレニン受容体タンパク質の発現を示すウエスタンブロットの写真であり、（Ｂ）は、前記細胞株の前記培養上清サンプルにおけるプロレニン受容体タンパク質の発現を示すウエスタンブロットの写真である。図１４（Ａ）および（Ｂ）において、写真の上側は、細胞株を示し、写真の左側は、検出したタンパク質を示す。図１４（Ａ）に示すように、いずれの前記細胞株の前記細胞溶解サンプルにおいても、プロレニン受容体タンパク質の発現が確認された。また、図１４（Ｂ）に示すように、いずれの前記細胞株の前記培養上清サンプルにおいても、プロレニン受容体タンパク質の発現が確認された。これらの結果から、前記ヒト膵管上皮細胞株および前記ヒト膵臓がん細胞株およびこれらの細胞株の培養上清において、プロレニン受容体タンパク質が、発現していることが確認された。【００９５】
［実施例１０］
プロレニン受容体の発現を抑制することで、Ｗｎｔシグナルが抑制されることを確認した。【００９６】
（１）リン酸化ＬＲＰ６の発現
前記実施例２と同様にして、ＰＫ−１にｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲを導入した（ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群）。前記導入後、１５０ｎｇ／ｍＬとなるように組換えヒトＷｎｔ３ａを加えた。前記添加後１０分に、ＰＫ−１を回収し、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒで溶解し、被検サンプルを調製した。つぎに、実施例３（１）と同様にして、プロレニン受容体タンパク質とβ−アクチンタンパク質の発現を確認した。【００９７】
また、前記被検サンプルについて、前記抗プロレニン受容体抗体に代えて、抗リン酸化ＬＲＰ６抗体（Ｓｅｒ  １４９０、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）または抗ＬＲＰ６抗体（クローン名：Ｃ４７Ｅ１２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた以外は、前記実施例３（１）と同様にして、リン酸化ＬＲＰ６タンパク質またはＬＲＰ６タンパク質の発現量を測定した。ネガティブコントロールは、ｓｉＲＮＡを導入せず、またＷｎｔ３ａを加えなかった以外は同様にして、コントロール１は、ｓｉＲＮＡを導入しなかった以外は同様にして、コントロール２は、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲに代えて、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｉＲＮＡを導入した以外は同様にして、リン酸化ＬＲＰ６タンパク質およびＬＲＰ６タンパク質の発現量を測定した。【００９８】
さらに、各サンプルについて、ＬＲＰ６タンパク質の発現量に対するリン酸化ＬＲＰ６タンパク質の発現量の比（リン酸化ＬＲＰ６発現量比）を求めた。そして、ネガティブコントロールにおけるリン酸化ＬＲＰ６発現量比を１として、各サンプルにおけるリン酸化ＬＲＰ６発現量比の相対値を算出した。【００９９】
図１５に、プロレニン受容体タンパク質およびβ−アクチンタンパク質の発現を示し、図１６に、リン酸化ＬＲＰ６発現量比の相対値を示す。図１５は、プロレニン受容体タンパク質およびβ−アクチンタンパク質の発現を示すウエスタンブロットの写真である。図１５において、写真の下側は、処理したｓｉＲＮＡおよびＷｎｔ３ａ刺激の有無を示し、写真の左側は、検出したタンパク質を示す。図１５に示すように、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群では、ネガティブコントロール、コントロール１および２に対して、プロレニン受容体タンパク質の発現が低下した。【０１００】
図１６は、リン酸化ＬＲＰ６発現量比の相対値を示すグラフである。図１６において、横軸は、処理したｓｉＲＮＡおよびＷｎｔ３ａ刺激の有無を示し、縦軸は、リン酸化ＬＲＰ６発現量比の相対値を示す。図１６に示すように、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群では、ネガティブコントロール、コントロール１および２に対して、Ｗｎｔ３ａ刺激後のリン酸化ＬＲＰ６発現量比の相対値が低下した。これらの結果から、プロレニン受容体タンパク質の発現を抑制することで、Ｗｎｔシグナルが抑制されることが確認された。【０１０１】
（２）活性型β−カテニンおよびＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１の発現
前記（１）と同様にして、被検サンプルを調製した。つぎに、前記被検サンプルについて、抗プロレニン受容体抗体に代えて、抗活性型β−カテニン抗体（ａｎｔｉ−ＡＢＣ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）または抗Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１抗体を用いた以外は、前記実施例３（１）と同様にして、活性型β−カテニンタンパク質およびＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１タンパク質の発現量を求めた。ネガティブコントロールは、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲに代えて、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｉＲＮＡを導入し、Ｗｎｔ３ａを加えなかった以外は、コントロールは、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲに代えて、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｉＲＮＡを導入した以外は同様にして、活性型β−カテニンタンパク質およびＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１タンパク質の発現量を求めた。そして、前記ネガティブコントロールにおける活性型β−カテニンタンパク質およびＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１タンパク質の発現量を１として、各サンプルにおける活性型β−カテニンタンパク質およびＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１タンパク質の発現量の相対値を求めた。【０１０２】
また、ＢｘＰＣ−３およびＰＡＮＣ−１についても同様にして、活性型β−カテニンタンパク質およびＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１タンパク質の発現量の相対値を求めた。【０１０３】
これらの結果を図１７（Ａ）−（Ｃ）に示す。図１７において、（Ａ）−（Ｃ）は、活性型β−カテニンタンパク質およびＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１タンパク質の発現量の相対値を示すグラフであり、（Ａ）は、ＰＫ−１を用いた結果であり、（Ｂ）は、ＢｘＰＣ−３を用いた結果であり、（Ｃ）は、ＰＡＮＣ−１を用いた結果である。図１７（Ａ）−（Ｃ）において、横軸は、処理したｓｉＲＮＡおよびＷｎｔ３ａ刺激の有無を示し、縦軸は、相対的発現量を示し、図中の黒抜きバーは、活性型β−カテニンタンパク質の相対的発現量を示し、白抜きバーは、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１タンパク質の相対的発現量を示す。【０１０４】
図１７（Ａ）−（Ｃ）に示すようにｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群は、コントロールに対して、活性型β−カテニンタンパク質およびＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１タンパク質の相対的発現量が有意に低下し、ネガティブコントロールと同程度またはネガティブコントロール未満の相対的発現量となった。活性型β−カテニンタンパク質およびＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１タンパク質は、Ｗｎｔシグナルによって誘導されるタンパク質である。このため、これらの結果から、プロレニン受容体タンパク質の発現を抑制することで、Ｗｎｔシグナルが抑制されることが確認された。【０１０５】
［実施例１１］
５×１０４細胞／ウェルとなるよう６ウェルプレートにＰＫ−１を播種した。つぎに、前記実施例２と同様にして、ＰＫ−１にｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲを導入した（ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群）。前記導入後、１５０ｎｇ／ｍＬとなるように組換えヒトＷｎｔ３ａを加え、４８時間培養した。前記培養後、さらに、１００μＬの水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）試薬を各ウェルに添加し、２時間インキュベートした。そして、各ウェルについて、プレートリーダーを用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、増殖能力を測定した。ネガティブコントロールは、ｓｉＲＮＡを導入せず、またＷｎｔ３ａを加えなかった以外は同様にして、コントロール１は、ｓｉＲＮＡを導入しなかった以外は同様にして、コントロール２は、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲに代えて、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｉＲＮＡを導入した以外は同様にして、増殖能力を測定した。【０１０６】
さらに、ネガティブコントロールにおける増殖能力を１として、各サンプルにおける増殖能力の相対値を求めた。また、ＢｘＰＣ−３およびＰＡＮＣ−１についても同様にして、増殖能力の相対値を求めた。【０１０７】
これらの結果を図１８に示す。図１８において、（Ａ）−（Ｃ）は、増殖能力の相対値を示すグラフであり、（Ａ）は、ＰＫ−１を用いた結果であり、（Ｂ）は、ＢｘＰＣ−３を用いた結果であり、（Ｃ）は、ＰＡＮＣ−１を用いた結果である。図１８（Ａ）−（Ｃ）において、横軸は、処理したｓｉＲＮＡおよびＷｎｔ３ａ刺激の有無を示し、縦軸は、相対的増殖能力を示す。【０１０８】
図１８（Ａ）−（Ｃ）に示すように、いずれのヒト膵臓がん細胞株においても、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群では、ネガティブコントロール、コントロール１および２に対して、相対的増殖能力が低下した。これらの結果から、プロレニン受容体タンパク質の発現を抑制することで、ヒト膵臓がん細胞株の増殖が抑制されることが確認された。【０１０９】
［実施例１２］
プロレニン受容体の発現を抑制することで、アポトーシスが誘導されることを確認した。【０１１０】
（１）アポトーシス細胞の測定
前記実施例２と同様にして、ＰＫ−１にｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲを導入した（ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群）。前記導入後、１５０ｎｇ／ｍＬとなるように組換えヒトＷｎｔ３ａを加え、４８時間培養した。つぎに、培養後のＰＫ−１を遠心して回収し、０．５ｍＬの氷冷７０％エタノールに懸濁し、−２０℃で２４時間保存した。前記保存後のＰＫ−１をＰＢＳで洗浄後、１０ｍｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ  Ａ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社製）含有ＰＢＳに懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。そして、１ｍｇ／ｍＬ  ＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）含有ＰＢＳを用いて、３７℃で３０分間、染色した。【０１１１】
前記染色後のＰＫ−１をＰＢＳで洗浄後、再度ＰＢＳで懸濁し、ＤＮＡフローサイトメーター（ベックマン  コールター社製）を用いて、前方散乱光（ＦＳ）、側方散乱光（ＳＳ）およびＤＮＡ含有量を測定した。また、前記ＤＮＡ含有量に基づき、各細胞周期の細胞の割合を算出した。コントロールは、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲに代えて、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｉＲＮＡを導入した以外は同様にして、前方散乱光（ＦＳ）、側方散乱光（ＳＳ）およびＤＮＡ含有量を測定し、各細胞周期の細胞の割合を算出した。また、ＰＡＮＣ−１についても同様にして、各細胞周期の細胞の割合を算出した。【０１１２】
図１９に、ＦＳおよびＳＳのドットプロットを示し、図２０に、ＤＮＡ含有量のヒストグラムを示し、図２１に、各細胞周期の細胞の割合のグラフを示す。図１９は、アポトーシス細胞の割合を示すドットプロットである。図１９において、横軸は、ＳＳを示し、縦軸は、ＦＳを示し、図中の数字は、アポトーシス細胞の割合を示す。図１９に示すように、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群では、コントロール対して、アポトーシス細胞を示す４分割のドットプロットの右上画分を占める細胞の割合が増加した。【０１１３】
図２０は、ＤＮＡ含有量を示すヒストグラムである。図２０において、横軸は、ＰＩの蛍光強度を示し、縦軸は、カウント数を示し、図中の黒抜きヒストグラムは、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群を示し、白抜きヒストグラムは、コントロールを示す。図２０に示すように、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群では、図中の矢印で示すＤＮＡ含有量の低下したアポトーシス細胞が観察された。これに対し、コントロールでは、アポトーシス細胞が観察されなかった。【０１１４】
図２１（Ａ）および（Ｂ）は、各細胞周期の細胞の割合を示すグラフである。図２１において、（Ａ）は、ＰＫ−１を用いた結果であり、（Ｂ）は、ＰＡＮＣ−１を用いた結果である。図２１（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、処理したｓｉＲＮＡを示し、縦軸は、各細胞周期の細胞の割合を示す。【０１１５】
図２１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、いずれのヒト膵臓がん細胞株においても、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群では、コントロールに対して、アポトーシス細胞であるＳｕｂＧ１基の細胞の割合が増加した。これらの結果から、プロレニン受容体タンパク質の発現を抑制することで、ヒト膵臓がん細胞株のアポトーシスが誘導されることが確認された。【０１１６】
（２）カスパーゼ３の活性化の測定
前記（１）と同様にして、ＰＫ−１を培養し、回収した。カスパーゼ３の活性の測定は、ＡＰＯＰＣＹＴＥ（Ｋｉｔ名：Ｃａｓｐａｓｅ−３  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｍｅｄｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用い、そのプロトコルに従って行った。コントロールは、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲに代えて、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｉＲＮＡを導入した以外は同様にして、カスパーゼ３の活性を測定した。また、ＢｘＰＣ−３およびＰＡＮＣ−１についても同様にして、カスパーゼ３の活性を測定した。【０１１７】
これらの結果を図２２（Ａ）−（Ｃ）に示す。図２２において、（Ａ）−（Ｃ）は、カスパーゼ３の活性を示すグラフであり、（Ａ）は、ＰＫ−１を用いた結果であり、（Ｂ）は、ＢｘＰＣ−３を用いた結果であり、（Ｃ）は、ＰＡＮＣ−１を用いた結果である。図２２（Ａ）−（Ｃ）において、横軸は、処理したｓｉＲＮＡを示し、縦軸は、カスパーゼ３の活性を示す。図２２（Ａ）−（Ｃ）に示すように、いずれのヒト膵臓がん細胞株においても、ｓｉＲＮＡ（Ｐ）ＲＲ群では、コントロールに対して、アポトーシスを誘導するカスパーゼ３の活性が上昇した。これらの結果から、プロレニン受容体タンパク質の発現を抑制することで、アポトーシスを誘導するカスパーゼ３が活性化することが確認された。【０１１８】
［実施例１３］
脳腫瘍患者の血漿中のプロレニン受容体の濃度上昇を確認した。【０１１９】
健常者男性（ｎ＝４）、健常者女性（ｎ＝２）、脳腫瘍患者男性（ｎ＝５）および脳腫瘍患者女性（ｎ＝１０）の血液から血漿を回収した。これらを、前記実施例１と同様にして、前記血漿中のプロレニン受容体の濃度を測定した。【０１２０】
この結果を図２３に示す。図２３は、血漿中のプロレニン受容体の濃度を示すグラフである。図２３において、横軸は、前記被検サンプルの種類を、縦軸は、プロレニン受容体の濃度を示す。図２３に示すように、男性および女性共に、脳腫瘍患者（Ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ）は、健常者（Ｎｏｒｍａｌ）と比較して、血漿中のプロレニン受容体の濃度が有意に上昇した。これらの結果から、性別に関わらず脳腫瘍の発症と血漿中のプロレニン受容体濃度上昇との間に相関関係があり、血漿中のプロレニン受容体が、脳腫瘍のマーカーとなることがわかった。【０１２１】
以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。【０１２２】
この出願は、２０１２年９月１１日に出願された日本出願特願２０１２−１９９５０８を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
以上のように、本発明によれば、プロレニン受容体の発現量を測定することによって、がんの罹患危険度を試験できる。また、プロレニン受容体は、がんのターゲットとなることから、本発明のスクリーニング方法によれば、プロレニン受容体をターゲットとした、がん治療用候補物質を得ることができる。このため、本発明のがんマーカーは、臨床分野、生化学分野において、極めて有用なマーカーとなる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図１】
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【図９】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年7月7日(2014.7.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を測定する工程を含み、
前記生体試料が、血液試料であり、
試験対象のがんが、膵臓がんおよび脳腫瘍の少なくとも一方であることを特徴とする、がんの罹患危険度を試験する方法。
【請求項２】
前記がんが、膵臓がんである、請求項１記載の試験方法。
【請求項３】
前記脳腫瘍が、グリオーマ、アストロサイトーマ、中枢神経系原発悪性リンパ腫および海綿上血管腫からなる群から選択された少なくとも１つである、請求項１記載の試験方法。
【請求項４】
さらに、前記被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量を、基準値と比較することにより、前記被検者のがんの罹患危険度を試験する工程を含み、前記基準値が、健常者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量またはがん患者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量である、請求項１から３のいずれか一項に記載の試験方法。
【請求項５】
前記試験工程において、前記被検者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量が、前記健常者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量よりも高い場合、前記がん患者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量と同じ場合または、前記がん患者の生体試料におけるプロレニン受容体の発現量よりも高い場合に、前記被検者は、がんに罹患する危険性があるとする、請求項４記載の試験方法。
【請求項６】
プロレニン受容体の発現量が、そのｍＲＮＡの発現量およびタンパク質の発現量の少なくとも一方である、請求項１から５のいずれか一項に記載の試験方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のがんの罹患危険度の試験方法に使用する試験試薬であって、プロレニン受容体の発現測定試薬を含むことを特徴とする試験試薬。
【請求項８】
前記発現測定試薬が、プロレニン受容体タンパク質に結合する物質、およびプロレニン受容体と前記結合物質との結合を検出する検出試薬を含む、請求項７記載の試験試薬。
【請求項９】
前記発現測定試薬が、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡを逆転写により増幅する試薬である、請求項７記載の試験試薬。
【請求項１０】
プロレニン受容体に結合する結合物質およびプロレニン受容体の発現を抑制する発現抑制物質の少なくとも一方を含むことを特徴とするがん治療薬。
【請求項１１】
前記結合物質が、プロレニン受容体に対する抗体である、請求項１０記載のがん治療薬。
【請求項１２】
前記発現抑制物質が、プロレニン受容体遺伝子のｍＲＮＡの発現を抑制する物質、発現したｍＲＮＡを切断する物質および発現したｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を抑制する物質からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１０記載のがん治療薬。
【請求項１３】
請求項１０から１２のいずれか一項に記載のがん治療薬を、患者に投与する工程を含むことを特徴とするがんの治療方法。
【請求項１４】
がんの治療用候補物質のスクリーニング方法であって、被検物質から、プロレニン受容体に結合する結合物質またはプロレニン受容体の発現を抑制する発現抑制物質を、前記治療用候補物質として選択することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１５】
プロレニン受容体に前記被検物質を接触させる工程、プロレニン受容体と前記被検物質との結合を検出する工程、およびプロレニン受容体に結合した前記被検物質を、前記治療用候補物質として選択する工程を含む、請求項１４記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
プロレニン受容体の発現系に前記被検物質を共存させて、プロレニン受容体を発現させる工程、前記発現系におけるプロレニン受容体の発現を検出する工程、およびプロレニン受容体の発現量が、前記被検物質を共存させていないコントロールの発現系よりも低い前記被検物質を、前記治療用候補物質として選択する工程とを含む、請求項１４記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記被検物質が、低分子化合物、ペプチド、タンパク質および核酸からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１４から１６のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【国際調査報告】
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