(57)【要約】  ヒトやイヌ等のマウス以外の動物のアレルギー疾患の予防又は治療に用い得る、IgEペプチドワクチンの提供。(i)  配列番号２８で表されるアミノ酸配列、又は(ii)  配列番号２８で表されるアミノ酸配列中の連続した少なくとも１０アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチドであって、動物に投与した場合に該動物のIgE抗体のCH3領域に特異的に結合し、前記IgE抗体がIgE受容体に結合するのを阻止し得るペプチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)  配列番号２８で表されるアミノ酸配列、又は
(ii)  配列番号２８で表されるアミノ酸配列中の連続した少なくとも１０アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチドであって、動物に投与した場合に該動物のIgE抗体のCH3領域に特異的に結合し、前記IgE抗体がIgE受容体に結合するのを阻止し得るペプチド。
【請求項２】
(i)  配列番号２７で表されるアミノ酸配列、又は
(ii)  配列番号２７で表されるアミノ酸配列中の連続した少なくとも１０アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチドであって、動物に投与した場合に該動物のIgE抗体のCH3領域に特異的に結合し、前記IgE抗体がIgE受容体に結合するのを阻止し得る、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号２２、２３、２４、２５、及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号２９〜９２から選択されるアミノ酸配列からなる請求項２記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号２９、３１、３４、３８、４３、４９、５６、６４、７２、８２、３０、３３、３７、４２、４８、５５、６３、７１、８１及び９２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる請求項４記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号４５で表されるアミノ酸配列からなる請求項４記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチドのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、動物に投与した場合に該動物のIgE抗体のCH3領域に特異的に結合し、前記IgE抗体がIgE受容体に結合するのを阻止し得るペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドを含む、IgE介在性疾患用のワクチン又は治療剤。
【請求項９】
IgE介在性疾患が、アトピー性皮膚炎、花粉症、食物アレルギー、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アレルギー性結膜炎、ダニアレルギー疾患、蕁麻疹、アナフィラキシーショック、及びPIE（pulmonary infiltration with eosinophilia)症候群からなる群から選択される、請求項８記載のワクチン又は治療剤。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドを含む、IgE介在性疾患用のワクチン又は治療剤を、非ヒト動物に投与することを含む、IgE介在性疾患を予防又は治療する方法。
【請求項１１】
IgE介在性疾患が、アトピー性皮膚炎、花粉症、食物アレルギー、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アレルギー性結膜炎、ダニアレルギー疾患、蕁麻疹、アナフィラキシーショック、及びPIE（pulmonary infiltration with eosinophilia)症候群からなる群から選択される、請求項１０記載のIgE介在性疾患を予防又は治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー疾患の予防又は治療に用い得るマウスIgEの部分ペプチド及びそれを含むIgEペプチドワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドワクチン療法は、腫瘍等の抗原やそのエピトープ部分をアジュバントとともに投与することにより、前記腫瘍等の抗原に対する細胞性免疫と体液性免疫の両方を誘導するもので、臨床応用が進められている。【０００３】
IgEはアレルギー、特にI型アレルギーに関与している。近年、愛玩動物として飼育されているイヌにおいて、ヒトと同様にアレルギー疾患が増加している。【０００４】
I型アレルギーの治療の方法として、血清中のIgEと結合し、IgEがマスト細胞に結合するのを抑制する化合物の利用が考えられ、このようなものとして、IgEのFc領域に結合する抗体を用い得ることが示唆されていた（特許文献１を参照）。【０００５】
アレルギーの治療のために上記のペプチドワクチン療法を応用し、IgEのCH3領域から誘導される抗原性ペプチドをペプチドワクチンとして用いることについて報告があった（特許文献２を参照）。しかしながら、イヌのアレルギーの治療のためには、イヌのIgEに対する抗体を誘導するために、同種由来のIgEの抗原性ペプチドをワクチンとして用いていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2006-151880号公報
【特許文献２】特開2005-102701号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒトやイヌ等のマウス以外の動物のアレルギー疾患の予防又は治療に用い得る、IgEペプチドワクチンの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、イヌのアレルギーの治療方法について検討を行い、最初にラット抗イヌIgEモノクローナル抗体を作製し、イヌIgE、マウスIgE及びネコIgEを認識するモノクローナル抗体が存在することを見出した。このことは、例えばマウスIgEの特定のエピトープを認識する抗体が他の動物種のIgEをも認識し得ることを示唆する。この知見から、本発明者はマウスのIgEの部分ペプチドを他の動物種のIgEに対する抗体の誘導に用いることができないか、すなわち他の動物種に投与するためのアレルギー治療用ペプチドワクチンとして用いることができないか考え、鋭意検討を行った。【０００９】
その結果、イヌと必ずしも配列同一性の高くない部分ペプチドをイヌに投与した場合、これに対する抗体がイヌ体内で誘導され、該抗体はペプチドだけでなくIgEを認識し、さらにイヌ自身のIgEのFc領域に結合し、IgEがマスト細胞に結合するのを阻止することを見出した。【００１０】
この結果、マウスのIgEの部分ペプチドがIgE介在性のアレルギー治療のためのワクチンとして用い得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１１】
該ペプチドは、イヌばかりでなく、ヒトを含むマウス或いはマウスに近縁のげっ歯類を除く動物に対してペプチドワクチンとして利用できる。【００１２】
該ペプチドは、アジュバントを使用しなくともペプチドのみを皮下投与することでワクチンとしての利用が可能である。【００１３】
すなわち、本発明は以下のとおりである。【００１４】
[１]  (i)  配列番号２８で表されるアミノ酸配列、又は
(ii)  配列番号２８で表されるアミノ酸配列中の連続した少なくとも１０アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチドであって、動物に投与した場合に該動物のIgE抗体のCH3領域に特異的に結合し、前記IgE抗体がIgE受容体に結合するのを阻止し得るペプチド。【００１５】
[２]  (i)  配列番号２７で表されるアミノ酸配列、又は
(ii)  配列番号２７で表されるアミノ酸配列中の連続した少なくとも１０アミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチドであって、動物に投与した場合に該動物のIgE抗体のCH3領域に特異的に結合し、前記IgE抗体がIgE受容体に結合するのを阻止し得る、[１]のペプチド。【００１６】
[３]  配列番号２２、２３、２４、２５、及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、[１]のペプチド。【００１７】
[４]  配列番号２９〜９２から選択されるアミノ酸配列からなる[２]のペプチド。【００１８】
[５]  配列番号２９、３１、３４、３８、４３、４９、５６、６４、７２、８２、３０、３３、３７、４２、４８、５５、６３、７１、８１及び９２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる[４]のペプチド。【００１９】
[６]  配列番号４５で表されるアミノ酸配列からなる[４]のペプチド。【００２０】
[７]  [１]〜[６]のいずれかのペプチドのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、動物に投与した場合に該動物のIgE抗体のCH3領域に特異的に結合し、前記IgE抗体がIgE受容体に結合するのを阻止し得るペプチド。【００２１】
[８]  [１]〜[７]のいずれかのペプチドを含む、IgE介在性疾患用のワクチン又は治療剤。【００２２】
[９]  IgE介在性疾患が、アトピー性皮膚炎、花粉症、食物アレルギー、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アレルギー性結膜炎、ダニアレルギー疾患、蕁麻疹、アナフィラキシーショック、及びPIE（pulmonary infiltration with eosinophilia)症候群からなる群から選択される、[８]のワクチン又は治療剤。【００２３】
[１０]  [１]〜[７]のいずれかのペプチドを含む、IgE介在性疾患用のワクチン又は治療剤を、非ヒト動物に投与することを含む、IgE介在性疾患を予防又は治療する方法。【００２４】
[１１]  IgE介在性疾患が、アトピー性皮膚炎、花粉症、食物アレルギー、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アレルギー性結膜炎、ダニアレルギー疾患、蕁麻疹、アナフィラキシーショック、及びPIE（pulmonary infiltration with eosinophilia)症候群からなる群から選択される、[１０]のIgE介在性疾患を予防又は治療する方法。【００２５】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2012-136944号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のペプチドは、イヌ、ヒト等の他種哺乳類において、抗IgE抗体（IgG)の形成を誘導することができ、該抗IgE抗体は抗体が誘導された動物種のIgEに結合し、IgEがマスト細胞や好塩基球のIgE受容体に結合するのを阻止することができる。このため、本発明のマウスIgEのCH3領域の部分ペプチドは、IgEに対するIgG抗体を惹起するIgE介在性のアレルギー疾患等の疾患の予防又は治療のためのIgEペプチドワクチンとして用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１−１】イヌIgE CH3領域合成ペプチドマップを示す図である。
【図１−２】イヌIgE CH3領域及びマウスIgE CH3領域アミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図２】エピトープ解析結果を示す図である。
【図３−１】血清中ペプチド特異的IgG濃度の測定結果を示す図である。
【図３−２】血清中IgE特異的IgG濃度の測定結果を示す図である。
【図４】血清中Der f 2特異的IgE濃度の測定結果を示す図である。
【図５】血清中IgE濃度測定におけるペプチド非投与群と投与群のELISA反応系の反応様式を示す図である。
【図６−１】固相化抗原と検出抗原との非特異反応の有無を示す図である。
【図６−２】抗原（IgEペプチド及びヒトIgE）と抗イヌIgG抗体の反応性解析の結果を示す図である。
【図６−３】抗原（IgEペプチド、ヒトIgE及びイヌIgE）と抗イヌIgG1抗体の反応性解析の結果を示す図である。
【図６−４】抗原（IgEペプチド及びヒトIgE）と抗イヌIgG2抗体の反応性解析の結果を示す図である。
【図６−５】ペプチドを投与した後にDer f 2をアラムアジュバントとともに免疫（人工感作）した後の、Der f 2特異的IgEの反応性解析の結果を示す図である。
【図６−６】Der f 2をアラムアジュバントとともに免疫（人工感作）した後の、イヌ血清中のヒトIgE特異的イヌIgG、IgG1及びIgG2の値を示す図である。
【図７】Prausnitz-Kustner（P-K）試験における血清の投与方法を示す図である。図中、丸数字の１〜４は、それぞれ血清１〜血清４を示す。
【図８】Prausnitz-Kustner（P-K）試験における抗原液並びに陽性対照及び陰性対照の投与方法を示す図である。図中、丸数字の１〜４は、それぞれ血清１〜血清４を示す。
【図９】Prausnitz-Kustner（P-K）試験の結果の一例を示す図である。図中、丸数字の１〜４は、それぞれ血清１〜血清４を示す。
【図１０】Prausnitz-Kustner（P-K）試験において、同濃度のDer f 2特異的IgEを持つ血清１と血清２でスコアに差が生じた理由を示す図である。
【図１１−１】ペプチドで免疫（人工感作）したウサギ血清とイヌIgEとの反応性を示す図である。
【図１１−２】ペプチドで免疫（人工感作）したウサギ血清とイヌIgGとの反応性を示す図である。
【図１１−３】ペプチドで免疫（人工感作）したウサギ血清とマウスIgEとの反応性を示す図である。
【図１１−４】ペプチドで免疫（人工感作）したウサギ血清とヒトIgEとの反応性を示す図である。
【図１１−５】ペプチドで免疫（人工感作）したウサギ血清とネコリコンビナントCH3との反応性を示す図である。
【図１２−１】20種類のペプチドのラットに対するワクチン効果を示す図である。
【図１２−２】20種類のペプチドのうちのペプチドNo.1〜４のラットに対するワクチン効果を示す図である（血清を100倍希釈して測定）。
【図１２−３】20種類のペプチドのうちのペプチドNo.５〜８のラットに対するワクチン効果を示す図である（血清を100倍希釈して測定）。
【図１２−４】20種類のペプチドのうちのペプチドNo.９〜１２のラットに対するワクチン効果を示す図である（血清を100倍希釈して測定）。
【図１２−５】20種類のペプチドのうちのペプチドNo.1３〜１６のラットに対するワクチン効果を示す図である（血清を100倍希釈して測定）。
【図１２−６】20種類のペプチドのうちのペプチドNo.1７〜２０のラットに対するワクチン効果を示す図である（血清を100倍希釈して測定）。
【図１３】ラットを用いた静脈投与試験のプロトコールを示す図である。
【図１４】ペプチドをラットに静脈投与した場合の抗IgE抗体価の上昇を示す図である。
【図１５】ラットを用いた皮下投与試験のプロトコールを示す図である。
【図１６】予防実験のプロトコールを示す図である。
【図１７】ペプチドをラットに皮下投与した場合の抗IgE抗体価の上昇の推移と最終的な抗体価を示す図である。
【図１８】ペプチドをラットに皮下投与した場合の各個体ごとの抗IgE抗体価の上昇を示す図である。
【図１９】ペプチドをラットに皮下投与した場合のDer f 2特異的IgE測定の結果を示す図である。
【図２０】ペプチドをラットに皮下投与した場合の各個体ごとのDer f 2特異的IgE測定の結果を示す図である。
【図２１】犬を用いたペプチド投与試験（その１）のプロトコールを示す図である。
【図２２】ペプチドを犬に皮下投与した場合の抗IgE抗体価の上昇を示す図である。
【図２３】犬を用いたペプチド投与試験（その２）のプロトコールを示す図である。
【図２４】ペプチドを犬に皮下投与した場合の抗IgE抗体価の上昇を示す図である。
【図２５】コナヒョウダニ人工感作犬を用いた治療実験のプロトコールを示す図である。
【図２６】ペプチドをコナヒョウダニ人工感作犬に皮下投与した場合の抗IgE抗体価の上昇を示す図である。
【図２７】ペプチドをコナヒョウダニ人工感作犬に皮下投与した場合のコナヒョウヒダニ抗原特異的IgEの測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２９】
本発明のアレルギー疾患の治療用のペプチドワクチンに用いるペプチドは、マウスIgEの部分ペプチドである。具体的には、マウスIgEペプチドのCH3（Cε3）領域のNVTWNQEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSITSILPV（配列番号２８）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は該ペプチドの部分ペプチドであって、少なくとも６個、７個、８個若しくは９個、好ましくは少なくとも１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個若しくは２４個、さらに好ましくは少なくとも２５個の連続するアミノ酸配列からなる部分ペプチドである。このような部分ペプチドとして、例えば、配列番号２２（NVTWNQEKKTSVSAS）、２３（QEKKTSVSASQWYTK）、２４（SVSASQWYTKHHNNA）、２５（QWYTKHHNNATTSIT）、２６（HHNNATTSITSILPV）及び２７に表すアミノ酸配列からなる部分ペプチドが挙げられる。この中でも、QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号２７）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は該ペプチドの部分ペプチドであって、少なくとも６個、好ましくは少なくとも１０個の連続するアミノ酸配列からなる部分ペプチドが好ましく、このような部分ペプチドとして、配列番号２３、２４及び２５に表すアミノ酸配列からなる部分ペプチドが挙げられる。さらに、QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号２７）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの部分ペプチドであって、１５〜２４個の連続するアミノ酸配列からなる部分ペプチドも好適に用いることができる。QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号２７）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの部分ペプチドであって、１５〜２４個の連続するアミノ酸配列からなる部分ペプチドとして以下のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
【００３０】
QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSI（配列番号２９）、
EKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号３０）、
QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTS（配列番号３１）、
EKKTSVSASQWYTKHHNNATTSI（配列番号３２）、
KKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号３３）、
QEKKTSVSASQWYTKHHNNATT（配列番号３４）、
EKKTSVSASQWYTKHHNNATTS（配列番号３５）、
KKTSVSASQWYTKHHNNATTSI（配列番号３６）、
KTSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号３７）、
QEKKTSVSASQWYTKHHNNAT（配列番号３８）、
EKKTSVSASQWYTKHHNNATT（配列番号３９）、
KKTSVSASQWYTKHHNNATTS（配列番号４０）、
KTSVSASQWYTKHHNNATTSI（配列番号４１）、
TSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号４２）、
QEKKTSVSASQWYTKHHNNA（配列番号４３）、
EKKTSVSASQWYTKHHNNAT（配列番号４４）、
KKTSVSASQWYTKHHNNATT（配列番号４５）、
KTSVSASQWYTKHHNNATTS（配列番号４６）、
TSVSASQWYTKHHNNATTSI（配列番号４７）、
SVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号４８）、
QEKKTSVSASQWYTKHHNN（配列番号４９）、
EKKTSVSASQWYTKHHNNA（配列番号５０）、
KKTSVSASQWYTKHHNNAT（配列番号５１）、
KTSVSASQWYTKHHNNATT（配列番号５２）、
TSVSASQWYTKHHNNATTS（配列番号５３）、
SVSASQWYTKHHNNATTSI（配列番号５４）、
VSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号５５）、
QEKKTSVSASQWYTKHHN（配列番号５６）、
EKKTSVSASQWYTKHHNN（配列番号５７）、
KKTSVSASQWYTKHHNNA（配列番号５８）、
KTSVSASQWYTKHHNNAT（配列番号５９）、
TSVSASQWYTKHHNNATT（配列番号６０）、
SVSASQWYTKHHNNATTS（配列番号６１）、
VSASQWYTKHHNNATTSI（配列番号６２）、
SASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号６３）、
QEKKTSVSASQWYTKHH（配列番号６４）、
EKKTSVSASQWYTKHHN（配列番号６５）、
KKTSVSASQWYTKHHNN（配列番号６６）、
KTSVSASQWYTKHHNNA（配列番号６７）、
SVSASQWYTKHHNNATT（配列番号６８）、
VSASQWYTKHHNNATTS（配列番号６９）、
SASQWYTKHHNNATTSI（配列番号７０）、
ASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号７１）、
QEKKTSVSASQWYTKH（配列番号７２）、
EKKTSVSASQWYTKHH（配列番号７３）、
KKTSVSASQWYTKHHN（配列番号７４）、
KTSVSASQWYTKHHNN（配列番号７５）、
TSVSASQWYTKHHNNA（配列番号７６）、
SVSASQWYTKHHNNAT（配列番号７７）、
VSASQWYTKHHNNATT（配列番号７８）、
SASQWYTKHHNNATTS（配列番号７９）、
ASQWYTKHHNNATTSI（配列番号８０）、
SQWYTKHHNNATTSIT（配列番号８１）、
QEKKTSVSASQWYTK（配列番号８２）、
EKKTSVSASQWYTKH（配列番号８３）、
KKTSVSASQWYTKHH（配列番号８４）、
KTSVSASQWYTKHHN（配列番号８５）、
TSVSASQWYTKHHNN（配列番号８６）、
SVSASQWYTKHHNNA（配列番号８７）、
VSASQWYTKHHNNAT（配列番号８８）、
SASQWYTKHHNNATT（配列番号８９）、
ASQWYTKHHNNATTS（配列番号９０）、
SQWYTKHHNNATTSI（配列番号９１）、及び
QWYTKHHNNATTSIT（配列番号９２）。
【００３１】
上記の部分ペプチドは、IgEのエピトープを構成するアミノ酸配列を含む。
【００３２】
上記の部分ペプチドは、いずれもアレルギー疾患の治療用のペプチドワクチンとして用いることができるが、例えば、以下のペプチドが好ましい。
【００３３】
(1)  QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSI（配列番号２９）
(2)  QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTS（配列番号３１）
(3)  QEKKTSVSASQWYTKHHNNATT（配列番号３４）
(4)  QEKKTSVSASQWYTKHHNNAT（配列番号３８）
(5)  QEKKTSVSASQWYTKHHNNA（配列番号４３）
(6)  QEKKTSVSASQWYTKHHNN（配列番号４９）
(7)  QEKKTSVSASQWYTKHHN（配列番号５６）
(8)  QEKKTSVSASQWYTKHH（配列番号６４）
(9)  QEKKTSVSASQWYTKH（配列番号７２）
(10)  QEKKTSVSASQWYTK（配列番号８２）
(11)  EKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号３０）
(12)  KKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号３３）
(13)  KTSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号３７）
(14)  TSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号４２）
(15)  SVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号４８）
(16)  VSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号５５）
(17)  SASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号６３）
(18)  ASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号７１）
(19)  SQWYTKHHNNATTSIT（配列番号８１）
(20)  QWYTKHHNNATTSIT（配列番号９２）
さらに、以下のぺプチドがより好ましい。
【００３４】
(1)  QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSI（配列番号２９）
(2)  QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTS（配列番号３１）
(3)  QEKKTSVSASQWYTKHHNNATT（配列番号３４）
(4)  QEKKTSVSASQWYTKHHNNAT（配列番号３８）
(5)  QEKKTSVSASQWYTKHHNNA（配列番号４３）
(7)  QEKKTSVSASQWYTKHHN（配列番号５６）
(8)  QEKKTSVSASQWYTKHH（配列番号６４）
(10)  QEKKTSVSASQWYTK（配列番号８２）
(11)  EKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号３０）
(13)  KTSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号３７）
(14)  TSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号４２）
(15)  SVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号４８）
(16)  VSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号５５）
また、配列番号２７に表されるアミノ酸配列からなるペプチドから、１〜３個、例えば２個のN末端アミノ酸を除去し、あるいは、１〜３個、例えば３個のC末端アミノ酸を除去したアミノ酸配列からなるペプチドもペプチドワクチンとして好適に用いることができる。このようなペプチドとして、KKTSVSASQWYTKHHNNATT（配列番号４５）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
【００３５】
さらに、NVTWNQEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSITSILPV（配列番号２８）又はQEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号２７）で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の上記の部分アミノ酸配列であって、少なくとも６個、好ましくは少なくとも１０個の連続するアミノ酸配列において、１〜３個、好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなる部分ペプチドも含まれる。
【００３６】
上記のマウスIgEの部分ペプチドは、イヌやヒト等の他のアレルギー疾患に罹患する動物のIgEとのアミノ酸配列同一性は低いが、交差反応性を示す。すなわち、上記のマウスIgEの部分ペプチドに対する抗体は、イヌIgEやヒトIgEも認識し、結合する。
【００３７】
さらに、配列同一性が低いため、例えば上記のマウスのIgE部分ペプチドをイヌに投与した場合、自己抗原として認識されることはなく、イヌ体内でマウスIgEに対するIgE特異的IgG抗体が産生され、産生したIgG抗体はイヌ自身の体内のIgEのCH3領域に結合し、IgEがマスト細胞や好塩基球のIgE受容体に結合するのを阻止し、アレルギー症状が生じるのを防ぐ。従って、上記部分ペプチドをアレルギー疾患の予防又は治療用のIgEペプチドワクチンとして用いることができ、本発明は上記部分ペプチドを含むアレルギー疾患の予防又は治療用のIgEペプチドワクチンを包含する。該IgEペプチドは、上記のマウスIgEの部分ペプチドの１種のみを含んでいてもよいし、複数を含んでいてもよい。本発明のペプチドワクチンは、アジュバントを使用しなくともペプチドのみを皮下投与等により投与することによりワクチンとしての効果を発揮し得る。
【００３８】
配列番号１にイヌIgEのCH3領域のアミノ酸配列、配列番号２１にマウスIgEのCH3領域のアミノ酸配列を示す。上記の配列番号２７に表す配列は、配列番号２１に表されるアミノ酸配列の４５〜７０番目のアミノ酸配列に相当する。また、図１−２に両アミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００３９】
本発明のIgEペプチドワクチンは、イヌ、ネコ、ヒト等のマウス以外のアレルギー性疾患等のIgE介在性疾患に罹患し得る哺乳動物を対象として投与することができる。
【００４０】
アレルギー性疾患は、IgE介在性のものとそうでないものがあるが、IgE介在性のアレルギー疾患として、アレルギー性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、花粉症、食物アレルギー、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アレルギー性結膜炎、ダニ（ハウスダストマイト）アレルギー疾患、蕁麻疹、アナフィラキシーショック、PIE（pulmonary infiltration with eosinophilia)症候群等が挙げられる。ダニアレルギー疾患としては、例えばチリダニ科ヒョウダニ属のコナヒョウダニやヤケヒョウダニ等によるダニアレルギー疾患が挙げられる。
【００４１】
本発明のIgEペプチドワクチンの投与量は、投与する動物種により変えることができるが、１回数十ng〜数mgである。単回投与でもよいし、2日から8週間間隔で数回にわたって投与してもよい。
【００４２】
本発明のIgEペプチドワクチンは、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤、アジュバント等の医薬的に許容できる希釈剤、助剤、担体等を含んでいてもよい。ワクチンは、経口、経鼻、経粘膜、筋肉内又は皮下、鼻腔内、気管内、皮膚、経皮、皮内又は静脈等の各経路によって接種できる。この中でも経口接種、経鼻接種、経粘膜接種、皮下投与、静脈投与が好ましい。アジュバントとしては、フロイントの完全あるいは不完全アジュバントをはじめ、細菌及びその菌体成分、マイコバクテリウム、グラム陰性菌及び菌体成分、グラム陽性菌及び菌体成分、非細菌性物質、植物や真菌の多糖体、脂溶性ビタミン類、ミネラルオイル等、公知のアジュバントを用いることができる。非細菌性物質として、アラム（水酸化アルミニウム）アジュバント、リン酸カルシウムアジュバント、リン酸アルミニウムアジュバント、ミョウバン等が挙げられる。また、本発明のワクチンは飲料水や餌に含ませた状態でイヌ等の動物に摂取させてもよい。本発明は、ワクチンを含む飲料水及び餌も包含する。
【００４３】
さらに、本発明は、上記のIgEペプチドワクチンを動物、好ましくは非ヒト動物に投与して、該動物において、該動物のIgEに特異的に結合するIgG抗体を産生させ、IgEがマスト細胞又は好塩基球に結合するのを阻止することにより、該動物におけるIgE介在性アレルギー疾患を予防又は治療する方法を包含する。
【実施例】
【００４４】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００４５】
実施例１  IgEのCH3領域ペプチドの分析
イヌのIgE抗体に結合するマウスモノクローナル抗体と、イヌ及びマウスのIgE抗体に結合するラットモノクローナル抗体のエピトープ解析を行った。イヌのIgEのCH3（Cε3）領域遺伝子を用いて免疫したマウスから作製した、マウス抗イヌIgE抗体（クローン名：CCH3-4、CCH5-5、CCH3-12、CCH3-13、CCH3-14、CCH3-15）イヌ及びマウスIgEのCH3（Cε3）領域遺伝子を用いて免疫したラットから作製した、抗IgEモノクローナル抗体（クローン名：X-1、X-2、CCH3-21及びCCH3-22）をサンプルとし、図１−１に示す配列からなるイヌ及びマウスIgEペプチドのCH3（Cε3）領域の合成ペプチド（配列番号２〜２０及び２２〜２６）を合成し、ELISAによりエピトープ解析を行った。ラットを用いて作製したクローンX-1およびX-2は、マウスIgEおよびイヌのIgEの両方に反応することを確認した。各ペプチドをELISAプレートに100ng/ウェルずつ固相化し、マウス抗イヌIgEモノクローナル抗体（図2に示すCCH3-4、CCH5-5、CCH3-12、CCH3-13、CCH3-14、CCH3-15）、ラット抗イヌ・マウスIgEモノクローナル抗体（図2に示すX-1およびX-2）、およびラット抗イヌIgEモノクローナル抗体（図2に示すCCH3-21およびCCH3-22）を反応させ、２次抗体としてマウスを用いて作製した抗犬IgE抗体については抗マウスIgG HRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識抗体を、ラットを用いて作製した抗犬IgE抗体については抗ラットIgG HRP標識抗体を用いてペプチドに反応した抗イヌIgEモノクローナル抗体を検出した。【００４６】
図２にエピトープ解析の結果の例を示す。イヌIgEにおいては、図１−１の配列中、配列番号９〜１５の下線部を付した部位にエピトープが存在することがわかった。また、マウスIgEにおいては、図１−１の配列中、配列番号２２〜２６の下線部を付した部位にエピトープが存在することがわかった。【００４７】
この結果より、マウスIgEペプチドのCH3（Cε3）領域のQEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号２７）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドがエピトープが存在する領域ペプチドであることがわかった。【００４８】
実施例２  IgEペプチドワクチンのイヌにおける抗体応答
（１）ペプチド
ペプチドとして、MOUSE CH3-4-17-11（マウスのCH3領域アミノ酸配列）（配列番号２７）を用いた。該ペプチドの溶解液（濃度250μg/mL）を2mL（500μg）と完全アジュバント(DIFCO ADJUVANT COMPLETE FREUND、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社)2mLをマイクロチューブに分注し、高速振盪機で15分間振盪して乳化させた液体（1頭当たり4mL）をIgEペプチドワクチンとして使用した。【００４９】
（２）ワクチンの投与
用いた動物は、5〜7ヶ月齢のビーグル犬、雄1頭、雌7頭であり、投与群  4頭（08-33、08-42、08-43、08-44）及び非投与群  4頭（08-45、08-46、08-47、08-48）とした。【００５０】
1クール目として0日目（試験開始日）、14日目、28日目にペプチドの投与を実施し、更に2クール目として106日目、117日目に実施した。被験物質は投与群4頭の頚部皮下に投与した。非投与群は無処置とした。【００５１】
（３）ハウスダストマイト抗原（Der f 2）による人工感作
1クール目のペプチド投与4週間後（試験開始56日目、試験開始70日目）に全頭に対し人工感作を実施した。Der f 2（Lot No.3、1465μg/mL、薬剤研究チームで調製）を300μgとアラムアジュバント（SIGMA（登録商標）Aluminium hydrate IgEl、13mg/mL）50mgを混合した液体（1頭当たり4.0mL）を感作液とし、1回目は腹腔内、2回目は頚部皮下に投与した。【００５２】
（４）人工感作のブースト
2クール目のペプチド投与4週間後（試験開始145日目）に人工感作のブーストを実施した。Der f 2  （Lot No.3：1465μg/mLを0.205mL：300μg）を生理食塩水で1mLに調製した液を全頭に対し頚部皮下に投与した。【００５３】
（５）血清中IgG濃度の測定
以下の方法でペプチドを投与し、人工感作を行ったイヌ被験体の血清中IgG濃度を測定した。【００５４】
0、14、28、42、56、70、77、84、98、106、117、131、145、152日目(非投与群は0、14、28、42日目の4時点を除く)に各個体の頸静脈よりシリンジを用いて血液を採取し、血清を分離後、血清を用いて血清中のペプチド特異的IgG濃度及びIgE特異的IgG濃度の測定を実施した。【００５５】
ELISAプレートに抗原タンパク（ペプチド特異的IgG測定の場合はMOUSE  CH3-4-17-11、IgE特異的IgG測定の場合はヒトIgE）を固相化バッファー(0.05M炭酸Buffer pH9.6)にて1μg/mLになるように調製し、１ウェルあたり100μL添加し、４℃にて一晩放置して行った。固相化プレートをPBS-T(0.05%)にて１回洗浄し、ブロッキング液(４×Block Ace 雪印乳業社：UK-B80)を１ウェルあたり200μL添加し、37℃にて1.5時間インキュベートし、ブロッキングを行った。血清は、希釈液(PBS-T: Block Ace=9:1)により5000倍希釈して用いた。37℃にて1.5時間反応させ、PBS-T(0.05%)にて3回洗浄し、2次抗体として、抗イヌIgG抗体(BETHYL社:A40-118P)を希釈液で5000倍に希釈し、100μL添加した。37℃にて1.5時間反応させ、PBS-T(0.05%)にて3回洗浄し、基質液（クエン酸バッファーにTMBZ錠（Sigma社：T-3405）を１錠加え、使用直前に2μLの30％H2O2を加えたもの）を100μL/wellでプレートに添加し、10分間反応させ、2N硫酸を50μL/well加え、反応を停止させた。その後、プレートリーダー（BIO-RAD:model680）にて測定した（dual：測定450nm、対照570 nm）。【００５６】
なお、IgE特異的IgG濃度の測定には、ELISAの固相化抗体にイヌIgEを使用すると2次抗体のイヌIgG特異的ポリクローナル抗体が固相化抗体にも結合し、非特異的反応が生じてしまうことがあることから、固相化抗体としてヒトIgEを使用した。【００５７】
血清中Der f 2特異的IgE濃度の測定は、70、77、106、117、131、145、152日目の血清を用いて、血清中Der f 2特異的IgE濃度測定（動物アレルギー検査株式会社に依頼）を実施した。【００５８】
（６）結果
血清中ペプチド特異的IgG濃度の測定結果(O.D.値)を図３−１に示した。投与群の平均値は0日目から106日目までは0.16〜0.30の間で推移したが、2クール目にあたる117日目以降は08-44の1頭のみ1.0以上の値を示し、投与群の平均値は0.46〜0.66の間で推移した。非投与群の平均値は0.14〜0.23の間で推移した。77日目において投与群が非投与群に対し有意に高かった(p<0.05)。【００５９】
血清中IgE特異的IgG濃度の測定結果(O.D.値)を図３−２に示した。投与群の平均値は0.27〜0.46の間で推移した。非投与群の平均値は0.24〜0.34の間で推移した。77日目において投与群が非投与群に対し有意に高かった(p<0.05)。【００６０】
血清中Der f 2特異的IgE濃度の測定結果を図４に示した。1回目の感作から2週間後の70日目には投与群が1528.8±1823.6ng/mL(0が2頭)、非投与群が1486.3±1736.1ng/mL(0が2頭)であった。77日目、106日目は投与群、非投与群共に上昇し、106日目の投与群3091.8±1542.6ng/mL、非投与群2968.3±649.8ng/mLを最高濃度としてその後145日目まで低下した。ブースト7日後の152日目には投与群は3972.5±1216.5ng/mL、非投与群は4426.7±1015.7ng/mLと、再び上昇した。全ての時点において投与群と非投与群の間で有意差はなかった。【００６１】
血清中ペプチド特異的IgG濃度測定の結果、77日目における投与群のペプチド特異的IgG濃度が非投与群に比べて有意に高かったことから、IgEペプチドワクチンを投与したイヌでは血清中にペプチド特異的IgGが産生されることが確認された。2クール目において投与群の1頭(08-44)でペプチド特異的IgGが急激に上昇したことから、この1頭では2クール目の被験物質投与がブーストの効果を奏したと考えられた。【００６２】
また、血清中IgE特異的IgG濃度の測定においても投与群が非投与群に比べ高い傾向を示し、77日目において投与群が非投与群に比べて有意に高かったことから、投与群で産生されたペプチド特異的IgGはペプチドと類似構造を持つIgEのCH3領域を交差認識する抗体であると考えられた。【００６３】
血清中Der f 2特異的IgE濃度測定の結果、投与群と非投与群の間に有意差は認められなかった。投与群では血清中に抗ペプチドIgGが産生され、血清中IgEに結合したと考えられたものの、血清中Der f 2特異的IgEにおいて投与群と非投与群の間に有意差が認められなかった理由として、IgE 1個につきCH3領域は2箇所あるため、1箇所のCH3領域がIgGによってブロックされていても検出に使われた抗イヌIgE抗体(IgEのCH3領域を認識する抗体)の結合が可能であり、ELISAでの発色に差が認められなかった可能性が考えられた(図５)。【００６４】
本実施例の結果より、以下のことがわかった。【００６５】
1)マウスのCH3領域を鋳型にして作られたIgEペプチドワクチンの投与によって、抗ペプチド抗体（IgG）が産生された。【００６６】
2)この抗体は、イヌIgEのCH3領域を認識し、結合した。したがって、Der f 2の感作によって産生されたDer f 2特異的IgEにも結合すると考えられたが、IgE-IgG複合体は本試験で用いられたELISA系によって検出され、血清中Der f 2特異的IgE濃度に非投与群との群間差は認められなかった。【００６７】
3)このとき皮内反応試験による効果の確認を試みた場合、血清中Der f 2特異的IgEが上昇すると皮膚の肥満細胞表面にIgEが結合し、数ヶ月間は抗原に対する反応性を有すると考えられたため、この時点で皮内反応試験を実施したとしても群間差が生じない可能性が考えられた。【００６８】
4)供試犬の肥満細胞の状態とは無関係にIgEの定性的な評価が可能なPrausnitz-Kustner（P-K）試験(無感作犬を用いる)によって、IgE-IgG複合体の形成をin vivoで証明できる可能性があると考えられた。【００６９】
本試験の血清中Der f 2特異的IgE濃度は最高で5000ng/mL以上と高濃度であったが、血清中Der f 2特異的IgE濃度がアレルギー患畜と同程度（10〜1000ng/mL程度）の個体に被験物質を投与した場合、血清中のIgGがIgEに結合する割合がより高くなり、本試験で用いられたIgE検出系においても差が認められる可能性があると考えられた。【００７０】
次いで、固相化抗原（IgEペプチド及びIgE)と検出抗原（抗イヌIgG抗体、抗イヌIgG1抗体及び抗イヌIgG2抗体）との反応性を解析し、非特異反応がないもの（図６−１の○）と非特異反応があるもの（図６−１の×）を確認し、非特異反応が認められない組合せで反応性を確認した。【００７１】
さらに、図６−２、抗原（IgEペプチド及びヒトIgE）と抗イヌIgG抗体の反応性解析の結果を、図６−３に抗原（IgEペプチド、ヒトIgE及びイヌIgE）と抗イヌIgG1抗体の反応性解析の結果を、図６−４に抗原（IgEペプチド及びヒトIgE）と抗イヌIgG2抗体の反応性解析の結果を示す。さらに、図６−５に、ペプチドを投与した後にDer f 2をアラムアジュバントとともに免疫（人工感作）した後の、Der f 2特異的IgEの反応性解析の結果を示す。図６−６に、Der f 2をアラムアジュバントとともに免疫（人工感作）した後の、イヌ血清中のヒトIgE特異的イヌIgG、IgG1及びIgG2の値を示し、ペプチドワクチン投与群及び非投与群での結果の比較を示す。また、同時に全く処置をしていない健常イヌ血清の結果も示している。【００７２】
これらの結果より、ペプチドワクチンを投与することにより、犬においてペプチドに対するIgG抗体とともに、IgEに対するIgG抗体が上昇すること、さらに、その後、IgEが産生された場合、ペプチドワクチン投与において、IgEの産生が抑制されることが判明した。【００７３】
実施例３  IgEペプチドワクチンの効果の検討
IgE  実施例２では、ペプチドワクチン投与群で産生された血清中のIgEとの結合能を持つIgGが、感作によって産生されたDer f 2特異的IgEに結合したと考えられたものの、非投与群との間で血清中Der f 2特異的IgE濃度に有意差は認められなかった。その理由として、実施例２のELISA法ではIgGが結合したIgEも、結合していないIgEと同様に検出された可能性が考えられた。また、この時点で皮内反応試験を実施したとしても差が生じないものと考えられた。【００７４】
そこで、投与群で血清中Der f 2特異的IgEにIgGが結合したことを証明するためにPrausnitz-Kustner（P-K）試験を計画した。投与群の血清中ではIgEにIgGが結合しているために肥満細胞表面への結合が阻害され、P-K試験において発赤が生じにくい(脱顆粒が抑制される)可能性があると予測されたことから、本試験を実施した。【００７５】
（１）P-K試験の概要
P-K試験とは、被験血清中の抗原特異的IgEを定性的に評価する方法で、抗原に感作されていない別の個体を用いる。概要は次の通りである。【００７６】
1)P-K試験供試動物として、抗原に感作されていない動物を用意する。【００７７】
2)P-K試験供試動物に、被験血清及び健常動物(対照)の血清を皮内投与する。被験血清中に抗原特異的IgEが存在する場合、IgEは投与後48時間の間にP-K試験供試動物の皮膚の肥満細胞表面に結合する。【００７８】
3)血清投与の48時間後、同一の部位に抗原液を皮内投与する。被験血清中に抗原特異的IgEが存在した場合、肥満細胞表面に結合した抗原特異的IgEに抗原が結合し、IgEの架橋を形成する。これが引き金となって肥満細胞の脱顆粒が生じ、皮膚の発赤が確認される。【００７９】
（２）材料
本実施例のP-K試験では、77日目（2回目の感作から7日後）が投与群と非投与群の血清中Der f 2 特異的IgE濃度の差が最も大きく、被験物質の効果が最大の時点と判断したが、投与群の08-43は血清中Der f 2特異的IgE濃度が群平均の2倍以上と突出して高く、被験物質の効果が表れていないと判断したことから除外し、その他のプール血清を使用した。非投与群は、全頭のプール血清を使用した。また、IgEの機能を比較するため、非投与群の血清中Der f 2特異的IgEを投与群と同一濃度に調製したものを使用した。【００８０】
実施例１で採取した血清及び健常犬血清
血清１：非投与群77日目のプール血清（血清２におけるDer f 2特異的IgE濃度と等しくなるように生理食塩水で調製した）
血清１の調製は以下のように行った。投与群（08-43を除く3頭）の血清中Der f 2特異的IgE濃度の平均値は1352.3ng/mL、非投与群（4頭）の平均値は2879.3ng/mLであった。非投与群のプール血清を生理食塩水で希釈してDer f 2特異的IgE濃度が1352.3ng/mLになるよう調製した。【００８１】
血清２：投与群（08-43を除外）77日目のプール血清
血清３：非投与群77日目のプール血清
血清４：健常犬10頭のプール血清
上記の血清１〜血清４の血清を生理食塩水で5倍及び10倍希釈したものを、最適な条件を検討するための試薬として準備した。抗原液(原液)は、Der f 2  Lot.No.3  1465μg/mLを調製して用いた。【００８２】
（３）P-K試験供試犬
これまでにDer f 2関連の試験への供試歴がない5〜6歳齢のビーグル犬、雄2頭（02-97及び03-48）、雌1頭（04-14）を使用した。試験前に、皮内投与による非特異的反応が生じないことを確認するため、Der f 2を生理食塩水(「動物用生食V注射液」：日本全薬工業株式会社)で希釈し10μg/mLに調製した液0.05mLを皮内投与し、発赤が生じないことを確認した。【００８３】
（４）P-K試験の方法
(i)血清の投与
抗原液の投与の2日前に行った。P-K試験供試犬に塩酸メデトミジン（「ドミトール（登録商標）」：日本全薬工業株式会社、0.03mL/kg）とミダゾラム（「ドルミカム（登録商標）」：山之内製薬、0.06mL/kg）を混合したものを臀部筋肉内に投与し、鎮静処置を行った。腹部側面をバリカンで毛刈りし、油性マジックペンで投与部位に印をつけた。【００８４】
上記の血清１〜血清４の原液、5倍希釈及び10倍希釈の血清をB-Dディスポーザブル微量注射筒（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いて0.05mL×2箇所ずつ皮内投与した（図７）。【００８５】
投与の終了した個体は、塩酸アチパメゾール（「アンチセダン（登録商標）」：日本全薬工業株式会社、0.03mL/kg）を臀部に筋肉内投与し、覚醒させた。【００８６】
(ii)抗原液の投与及び判定
血清の投与から2日後に、血清を投与した同一部位への抗原液の皮内投与を実施した。鎮静及び覚醒処置は上記（i)と同様に行った。抗原液はDer f 2を生理食塩水で10μg/mL及び5μg/mLに調製したものを用い、(i)における血清の投与部位にそれぞれ皮内投与した。また、陽性対照としてヒスタミン溶液（0.0275mg/mL）、陰性対照として生理食塩水を、それぞれ別の部位に皮内投与した（図８）。【００８７】
抗原液の投与後、経時的に15分後まで数回にわたり発赤部分の直径を計測し、写真を撮影した。その中で肉眼的に最も明瞭な発赤が生じた時点での判定を行った。発赤は以下の基準によりスコアを付けた。【００８８】
発赤直径スコア基準
+++  … 陽性対照の発赤直径と同等又はそれ以上
++   … 陽性対照・陰性対照の平均と同等又はそれ以上
+     … 陽性対照・陰性対照の平均より小さく、陰性対照より大きい
−   … 陰性対照以下
(iii)最適条件の設定
投与群と非投与群の差を検討する最適条件を設定するため、血清の希釈倍率とDer f 2溶液の濃度を変えた以下の6通りの条件で行った。【００８９】
血清原液＋  Der f 2  10μg/mL
血清原液＋  Der f 2  5μg/mL
血清5倍希釈液＋Der f 2  10μg/mL
血清5倍希釈液＋Der f 2  5μg/mL
血清10倍希釈液＋Der f 2  10μg/mL
血清10倍希釈液＋Der f 2  5μg/mL
このうち、P-K試験供試犬3頭中2頭以上で次の基準を満たす条件を採用するものとした。【００９０】
1)健常犬の血清（血清４）の投与部位のスコアが−となる。【００９１】
2)非投与群の血清(血清１及び血清３)の投与部位のスコアが＋以上となる。【００９２】
（５）結果
結果を表１〜６に示した。【００９３】
また、撮影した写真のうち代表として03-48の結果を図９に示した。
【表１】
2013191166.tif 000002
【表２】
2013191166.tif 000003
【表３】
2013191166.tif 000004
【表４】
2013191166.tif 000005
【表５】
2013191166.tif 000006
【表６】
2013191166.tif 000007
【００９４】
表１〜６において、丸数字の１〜４は、それぞれ血清１〜血清４を示す。【００９５】
(i)最適条件の設定
6通りの条件による結果を、上記（４）の「(iii)最適条件の設定」で示した基準に照らし合わせた。【００９６】
1) 健常犬の血清（血清４）の投与部位のスコアが−となる。【００９７】
6条件の全てが該当した。【００９８】
2) 非投与群の血清(血清１及び血清３)の投与部位のスコアが＋以上となる。【００９９】
「血清原液＋Der f 2  10μg/mL」(表１)、「血清原液＋Der f 2  5μg/mL」(表２)、「血清5倍希釈液＋Der f 2  10μg/mL」(表３)の3条件が該当した。【０１００】
さらに、「血清原液＋10μg/mLのDer f 2」の条件ではP-K試験供試犬3頭全てで血清１と血清２のスコアに差がなかったため、原因は不明であるがこの条件は血清原液と抗原液（Der f 2 10μg/mL）の高濃度同士の組み合わせであり、非特異的に発赤が出ている可能性もあり、適切な評価ができない可能性があると判断したため、この条件も棄却した。【０１０１】
したがって、「血清原液＋Der f 2  5μg/mL」、「血清5倍希釈液＋Der f 2  10μg/mL」の2通りの条件について結果の考察を行った。【０１０２】
(ii)血清原液＋Der f 2  5μg/mLの結果(表２)
02-97及び03-48では、血清１及び血清３は＋以上のスコア、血清２及び血清４のスコアは−であった。04-14では、血清１〜血清４の全てのスコアが−であった。【０１０３】
(iii)血清5倍希釈液＋Der f 2  10μg/mLの結果(表３)
02-97及び03-48では、血清１及び血清３のスコアは＋＋、血清２及び血清４のスコアは−であった。04-14では、血清１のスコアは＋＋、血清２〜血清４のスコアは−であった。【０１０４】
（６）考察
「血清原液＋Der f 2  5μg/mL」の条件下ではP-K試験供試犬3頭中2頭で、また「血清5倍希釈液＋Der f 2  10μg/mL」の条件下では3頭全てで、血清１（非投与群の血清）投与部位のスコアが＋＋、血清２（投与群の血清）投与部位のスコアが−であった。同濃度のDer f 2特異的IgEを持つ血清１と血清２でスコアに差が生じた理由を図５に示す。血清１の投与部位ではP-K試験供試犬の皮膚に存在する肥満細胞に投与されたIgEが高頻度で結合したため、Der f 2によるIgEの架橋が成立し、肥満細胞の脱顆粒が生じたが、血清２の投与部位ではIgEのCH3領域にIgGが結合したことで肥満細胞への結合が妨害されたため、Der f 2によるIgEの架橋が成立しにくく、反応しなかった可能性があると考えられた（図１０）。【０１０５】
また、P-K試験供試犬のうち04-14は、「血清原液＋Der f 2  10μg/mL」の条件では血清３のみ、「血清5倍希釈液＋Der f 2  10μg/mL」の条件では血清１のみが発赤を示し、その他の4条件においては発赤が全く認められなかった。よって、04-14は他の個体に比べて皮膚の発赤反応が弱いことがわかった。【０１０６】
以上のことから、MOUSE CH3-4-17-11より構成されるIgEペプチドワクチンを投与されたイヌでは血清中にペプチド及びイヌIgEを交差認識するIgGが産生され、IgEの肥満細胞への結合を妨害することがわかった。【０１０７】
実施例４  
実施例２で用いた250μg/mLのペプチド２mL（トータル500μg）を等量の完全アジュバントと混合し（トータル４mL）、０日目、２週目、４週目、６週目、８週目にペプチド量500μgでウサギに皮下投与し免疫を行った。８週目の投与後５週後に採血し（０日目から１３週目）、さらに、０日目から１４週目にブースター免疫を行いその２週間後に採血した（０日目から１６週目）。採血した血液中の抗体価をELISAにより測定した。コントロールとしてペプチドを投与しないウサギ血清を用いた。【０１０８】
ELISAは以下の方法で行った。1000μg/mLのイヌIgE、ヒトIgE、マウスIgE、イヌIgG及びネコIgEのリコンビナントCH3の各溶液を100μL/ウェルで固相化した（100ng/ウェル）。一次抗体として上記の免疫したウサギから採血した血清を用い（×200〜×102400)、二次抗体としいて酵素標識抗ウサギIgG抗体（ZYMED社）を用いた。【０１０９】
図１１−１にイヌIgEの結果、図１１−２にイヌIgGの結果、図１１−３にマウスIgEの結果、図１１−４にヒトIgEの結果、図１１−５にネコCH3の結果を示す。【０１１０】
固相化抗原としてイヌIgGを用いた場合、ペプチド投与ウサギ血清、ペプチド非投与ウサギ血清いずれも反応しなかった。固相化抗原として、イヌIgE、ヒトIgE、マウスIgE及びネコIgEを用いた場合、ペプチド投与ウサギ血清とは反応したが、ペプチド非投与ウサギ血清とは反応しなかった。【０１１１】
本実施例の結果より、本発明のペプチドが広く種々の動物種に対してペプチドワクチンとして有用であることが判明した。【０１１２】
実施例５  各種ペプチドのワクチン効果の検討
実施例４までの試験において、ペプチド配列（QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT：配列番号27、M 4-17-11）が重要と考えられた。【０１１３】
さらに配列を絞る目的で、以下のペプチドを合成した。N末端およびC末端からペプチドを10残基削除させた20種類のペプチドである。これを、ラットに免疫し、犬IgEに対する抗体応答を評価した。【０１１４】
合成したペプチド（最初のかっこ内の数字はペプチド番号を示す）；
(1)  QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSI（配列番号２９）
(2)  QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTS（配列番号３１）
(3)  QEKKTSVSASQWYTKHHNNATT（配列番号３４）
(4)  QEKKTSVSASQWYTKHHNNAT（配列番号３８）
(5)  QEKKTSVSASQWYTKHHNNA（配列番号４３）
(6)  QEKKTSVSASQWYTKHHNN（配列番号４９）
(7)  QEKKTSVSASQWYTKHHN（配列番号５６）
(8)  QEKKTSVSASQWYTKHH（配列番号６４）
(9)  QEKKTSVSASQWYTKH（配列番号７２）
(10)  QEKKTSVSASQWYTK（配列番号８２）
(11)  EKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号３０）
(12)  KKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号３３）
(13)  KTSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号３７）
(14)  TSVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号４２）
(15)  SVSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号４８）
(16)  VSASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号５５）
(17)  SASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号６３）
(18)  ASQWYTKHHNNATTSIT（配列番号７１）
(19)  SQWYTKHHNNATTSIT（配列番号８１）
(20)  QWYTKHHNNATTSIT（配列番号９２）
供試動物；
ラット（wistar-ST/7w/♀）を用い、 40頭を2頭ずつ20群に分けた。【０１１５】
免疫；
合成したペプチド（KLHコンジュゲートのもの）200μg（500μg/mL）を等量の完全アジュバントと混合して、2週間隔で2回皮下投与した。【０１１６】
評価方法；
2回目の免疫から2週間後に、血清を採取し、ELISAにて、犬IgEに対するIgG抗体を評価した。【０１１７】
ELISAのプロトコールは以下の通りであった。【０１１８】
ELISAプレートに犬IgEタンパク質（BETHYL社；P115）、マウスIgEタンパク質（BD Bioscienses, San Jose, CA, USA）、ヒトIgEタンパク質（Athens Research And Technology社；16-16-090705-ML）を固相化バッファー(0.05M炭酸Buffer pH9.6)にて1μg/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.2ng/mL、15.6ng/mL、7.8ng/mL、3.9ng/mL、1.95ng/mL、0.97ng/mLになるように調製し、１ウェルあたり100μL添加し、４℃にて一晩放置して行った。固相化プレートをPBS-T(0.05%)にて１回洗浄し、ブロッキング液(４×Block Ace 雪印乳業社：UK-B80)を１ウェルあたり200μL添加し、37℃にて1.5時間インキュベートし、ブロッキングを行った。血清は、希釈液(PBS-T: Block Ace=9:1)により2000倍希釈して用いた。陰性コントロールとして、免疫していないラット血清を同じように希釈して使用した。37℃にて1.5時間反応させ、PBS-T(0.05%)にて3回洗浄し、2次抗体として、HRP標識抗ラットIgG抗体（invitrogen社619520）を希釈液で2000倍に希釈し、100μL添加した。37℃にて1.5時間反応させ、PBS-T(0.05%)にて3回洗浄し、基質液（クエン酸バッファーにTMBZ錠（Sigma社：T-3405）を１錠加え、使用直前に2μLの30％H2O2を加えたもの）を100μL/wellでプレートに添加し、10分間反応させ、2N硫酸を50μL/well加え、反応を停止させた。その後、プレートリーダー（BIO-RAD:model680）にて測定した（dual：測定450nm、対照570 nm）。【０１１９】
結果；
結果を図１２−１に示す。図１２−１Aは、上記の20種類のペプチドのうち、No.1〜10のペプチドの結果を示し、図１２−１BはNo.11〜20のペプチドの結果を示す。図１２-１A及びBの下に用いたペプチドの配列を示す。図１２−１A及びBの上のグラフの縦軸はOD値を示し、横軸は固相化したイヌIgEの量を示す。また、図１２−２〜１２−６は各ペプチドを免疫したラットの血清を100倍希釈した場合の反応性（配列番号27、免疫したペプチドそのもの、イヌIgE、マウスIgE、ヒトIgE）を示す。図１２−２はペプチド番号１〜４（図中、それぞれA〜D)、図１２−３はペプチド番号５〜８（図中、それぞれA〜D)、図１２−４はペプチド番号９〜１２（図中、それぞれA〜D)、図１２−５はペプチド番号１３〜１６（図中、それぞれA〜D)、図１２−６はペプチド番号１７〜２０（図中、それぞれA〜D)の結果を示す。100倍希釈の濃い濃度では、いずれのペプチドを免疫しても血清中にIgEに対するIgG抗体が産生されることを確認した。図１２−２〜１２−６中、CH3-4-17-11ペプチドは、配列番号２７に表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。【０１２０】
図１２−１〜１２−６に示すように、N末端を削除した場合、犬IgEに対する抗体応答が弱くなることから、N末端側に重要と考えられる配列が含まれていると考えられた。【０１２１】
実施例６  ラットを用いた静脈投与試験
実施例５の結果から、配列番号２７（QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT）のN末端側を2残基、C末端側を3残基削除した20残基のペプチドを合成した。【０１２２】
新規に合成したペプチド配列（ペプチド名：M4-7-11）は、KKTSVSASQWYTKHHNNATT（配列番号４５）であった。【０１２３】
これをラットにアジュバントなしで免疫し、犬IgEに対する抗体応答を評価した。【０１２４】
供試動物；
ラット（wistar-ST/7w/♀）を用い、20頭を4頭ずつ4群に分けた（図１３）。【０１２５】
免疫；
ペプチドM4-7-11（KKTSVSASQWYTKHHNNATT）（配列番号４５）（KLHコンジュゲートなし）を、1mg/mL、500μg/mL、100μg/mL、50μg/mLの濃度に生理食塩水にて調整し、各1mLずつ2週間隔で3回静脈投与した。【０１２６】
評価方法；
投与開始日から2週間ごとに採血を実施し、3回目の免疫から8週間後まで採血を実施した。血清を採取し、ELISAにて、犬IgEに対するIgG抗体を評価した（図１３）。【０１２７】
犬IgEに対するIgGの測定に用いたELISAの方法は、実施例６と同様であった。【０１２８】
ハウスダストマイトアレルゲンDer f 2に対するIgEの測定は以下の方法で行った。【０１２９】
ELISAプレートにDer f 2を固相化バッファー(0.05M炭酸Buffer pH9.6)にて1μg/mLになるように調製し、１ウェルあたり100μL添加し、４℃にて一晩放置して行った。固相化プレートをPBS-T(0.05%)にて１回洗浄し、ブロッキング液(４×Block Ace 雪印乳業社：UK-B80)を１ウェルあたり200μL添加し、37℃にて1.5時間インキュベートし、ブロッキングを行った。血清は、希釈液(PBS-T: Block Ace=9:1)により20倍希釈して用いた。37℃にて1.5時間反応させ、PBS-T(0.05%)にて3回洗浄し、2次抗体として、抗ラットIgE抗体(Rabbit anti-Rat IgE HRP ; invitrogen社 61-9520)を希釈液で1000倍に希釈し、100μL添加した。37℃にて1.5時間反応させ、PBS-T(0.05%)にて3回洗浄し、基質液（クエン酸バッファーにTMBZ錠（Sigma社：T-3405）を１錠加え、使用直前に2μLの30％H2O2を加えたもの）を100μL/wellでプレートに添加し、10分間反応させ、2N硫酸を50μL/well加え、反応を停止させた。その後、プレートリーダー（BIO-RAD:model680）にて測定した（dual：測定450nm、対照570 nm）。【０１３０】
結果；
結果を図１４に示す。図１４Aは、ラットIgG抗体の経時的な上昇を示し、図１４Bにおいて、注射器の図はその時点でペプチドを投与したことを示す。図１４Bは、IgE抗体価を示す。図１４に示すように、すべての群において犬のIgEに対するIgG抗体の上昇を確認した。【０１３１】
図１４Bは、最終日（3回目のワクチン投与日から8週間後）におけるラット血清中のイヌIgEに対するIgG抗体価を示す。すべての群において抗体価は3000倍まで上昇した。【０１３２】
実施例７  ラットを用いた皮下投与試験
実施例６において、50μgの3回投与で犬IgEに対する抗体の上昇を確認したこと、また、静脈投与であったため、投与しやすい皮下投与で抗体が上昇するか否かを確認するため、皮下投与試験を設定した。【０１３３】
免疫したペプチド配列（ペプチド名：M4-7-11）は、KKTSVSASQWYTKHHNNATT（配列番号４５）であった。【０１３４】
これをラットにアジュバントなしで免疫し、犬IgEに対する抗体応答を評価した。【０１３５】
供試動物；
ラット（wistar-ST/7w/♀）を用い、12頭を4頭ずつ3群に分けた（図１５）。【０１３６】
本実施例においては、予防実験を行った。予防実験とは、ワクチンを投与した後に、ハウスダストマイト抗原（Der f 2）をアラムアジュバントとともに免疫しIgEを上昇させIgEの上昇の阻害を評価する方法である（図１６）。【０１３７】
免疫；
ペプチドM4-7-11（KKTSVSASQWYTKHHNNATT（配列番号４５））（KLHコンジュゲートなし）を、50μg/mLの濃度に生理食塩水にて調整し、各1mLずつ2週間隔で3回静脈および皮下投与した。【０１３８】
評価方法；
投与開始日から2週間ごとに採血を実施し、3回目の免疫から4週間にハウスダストマイト抗原（Der f 2：50μg）をアラムアジュバント（2.5mg：SIGMA社）とともに1週間隔で4回腹腔投与した。4回目の感作から2週間後にDer f 2のみ50μg腹腔投与した。後まで採血を実施した。血清を採取し、ELISAにて、犬IgEに対するIgG抗体を評価した（図１６)。ELISAの方法は、実施例５と同様であった。【０１３９】
結果；
犬IgEに対するラットIgG抗体の上昇確認結果を図１７に示す。図１７Aは、ラットIgG抗体の経時的な上昇を示し、図１７Aにおいて、注射器の図はその時点でペプチドを投与したことを示す。図１７Bは、IgE抗体価を示す。図１７に示すように、ペプチドワクチン（M4-7-11）静脈および皮下投与により、犬IgEに対するラットIgG抗体の上昇を確認した。【０１４０】
また、各群の個体ごとのデータを図１８に示す。図１８A、B及びCは、それぞれ１群、２群及び３群の結果を示す。【０１４１】
さらに、Der f 2特異的IgE測定の結果（各群の平均値）を図１９に示し、個体ごとの結果を図２０に示す。図２０A、B及びCは、それぞれ１群、２群及び３群の結果を示す。図１９及び２０に示すように、ペプチドワクチン（M4-7-11）の静脈および皮下投与において、コントロール群（生理食塩水）に比較して、IgEの産生の抑制を確認した。IgEの産生抑制は、皮下投与群（2群）において顕著に確認された。【０１４２】
実施例８  犬を用いた試験（その１）
ラットを用いた皮下投与試験により、犬IgEに対するIgG抗体の上昇を確認したことから、犬を用いた試験を実施した。【０１４３】
ペプチド（M4-7-11）を生理食塩水にて2mg/mLの濃度に調整し、500μLずつ分注し、これをワクチンとした。ペプチドの純度は、98.1%で、合成を北海道システムバイオサイエンス社に依頼した。ワクチン中のエンドトキシンの混入がないことを確認した。ワクチンの投与方法は、1回あたり1mg皮下投与とし、これを2週間隔で5回とした。今回の試験で、ワクチンの投与回数の検討も実施することとした。【０１４４】
試験方法；
犬：健常ビーグル4頭（8カ月齢、オス2頭、メス2頭）を用いた。【０１４５】
ワクチン：M4-7-11ペプチドのみをコンジュゲートなしで用いた。【０１４６】
投与方法：1回あたり1mg（2mg/mLを500μL）を2週間隔で5回皮下投与した。【０１４７】
評価：血清を約1週間に一度採取し、ELISAにてヒトIgEに対するIgG抗体を測定した。抗犬IgG抗体に犬IgEが非特異的に反応するため、非特異的反応がないヒトIgEをELISAに使用した。【０１４８】
試験スケジュールを図２１に示した。【０１４９】
ELISA法は、以下の通りであった。【０１５０】
ELISAプレートにヒトIgE（Athens Research And Technology 社：IgE, human Myeloma Plasma）を固相化バッファー(0.05M炭酸Buffer pH9.6)にて1μg/mLになるように調製し、１ウェルあたり100μL添加し、４℃にて一晩放置して行った。固相化プレートをPBS-T(0.05%)にて１回洗浄し、ブロッキング液(４×Block Ace 雪印乳業社：UK-B80)を１ウェルあたり200μL添加し、37℃にて1.5時間インキュベートし、ブロッキングを行った。血清は、希釈液(PBS-T: Block Ace=9:1)により1000倍希釈して用いた。37℃にて1.5時間反応させ、PBS-T(0.05%)にて3回洗浄し、2次抗体として、抗イヌIgG抗体(Sheep anti-Dog IgG HRP、BETHYL社:A40-118P)を希釈液で2000倍に希釈し、100μL添加した。37℃にて1.5時間反応させ、PBS-T(0.05%)にて3回洗浄し、基質液（クエン酸バッファーにTMBZ錠（Sigma社：T-3405）を１錠加え、使用直前に2μLの30％H2O2を加えたもの）を100μL/wellでプレートに添加し、10分間反応させ、2N硫酸を50μL/well加え、反応を停止させた。その後、プレートリーダー（BIO-RAD:model680）にて測定した（dual：測定450nm、対照570 nm）。【０１５１】
なお、IgE特異的IgG濃度の測定には、ELISAの固相化抗体にイヌIgEを使用すると2次抗体のイヌIgG特異的ポリクローナル抗体が固相化抗体にも結合し、非特異的反応が生じてしまうことがあることから、固相化抗体としてヒトIgEを使用した。【０１５２】
結果；
ペプチドワクチン（M4-7-11）を犬に皮下投与した際の、IgEに対するIgG抗体の産生評価をELISAにて実施した結果を図２２に示した。図２２において、注射器の図はその時点でペプチドを投与したことを示す。図２２に示すように、ワクチン投与により、IgEに対するIgG抗体の上昇を犬で確認した。さらに、投与回数は、4回以下で充分であることが示唆された。【０１５３】
実施例９  犬を用いた試験（その２）
実施例８にて、4頭の犬にワクチン（M4-11-17）を投与し、IgEに対するIgG抗体の上昇を確認した。再現性を確認するため、コントロール群（生理食塩水）を含めた8頭の犬を用いた試験を実施した。また、今回使用した犬は、2歳以上の成犬とした。【０１５４】
試験方法は以下の通りであった。【０１５５】
犬：健常ビーグル8頭（24カ月齢、オス4頭、メス4頭）を用いた。【０１５６】
ワクチン：M4-7-11ペプチドのみをコンジュゲートなしで用いた。【０１５７】
投与方法：1回あたり1mg（2mg/mLを500μL）を2週間隔で5回皮下投与した。【０１５８】
評価：血清を約1週間に一度採取し、ELISAにてヒトIgEに対するIgG抗体を測定した。抗犬IgG抗体に犬IgEが非特異的に反応するため、非特異的反応がないヒトIgEをELISAに使用した。試験スケジュールを図２３に示した。ELISAの方法は、実施例８と同様であった。【０１５９】
結果；
ペプチドワクチン（M4-7-11）を犬に皮下投与した際の、IgEに対するIgG抗体の産生評価をELISAにて実施した結果を図２４に示した。図２４Aは、ペプチドをワクチンとして投与した群とコントロール群の平均の抗体価を示す。図２４B及び図２４Cは、それぞれワクチン投与群及びコントロール群（非投与群）の各個体の抗体価を示す。【０１６０】
図２４に示すように、ワクチン投与により、IgEに対するIgG抗体の上昇を犬で確認した。また、実施例８と同様に成犬でも確認した。さらに、投与回数は、4回以下で充分であることを再度確認した。【０１６１】
実施例１０  人工感作犬を用いた治療実験
実施例８及び９にて健常犬を用いてペプチドワクチン（M4-7-11）皮下投与によりIgEに対するIgG抗体の産生を確認したことから、コナヒョウヒダニ人工感作犬を用いて治療実験を行った。【０１６２】
試験方法は以下の通りであった。【０１６３】
試験方法；
犬：人工感作ビーグル8頭（1歳から8歳、オス4頭、メス4頭）を用いた。８頭の年齢及び番号は以下の通りであった。【０１６４】
8歳齢：04-78（投与群）、04-95（投与群）、04-60（対照群）
5歳齢：08-64（投与群）
4歳齢：09-63（対照群）
2歳齢：10-70（対照群）
1歳齢：11-12（投与群）、11-40（対照群）
人工感作：コナヒョウヒダニ抗原（GREER社）400μgとアラムアジュバント（LSL社）1mgを2週間隔で皮下投与し、コナヒョウヒダニ抗原に対するIgEをELISAで確認した。【０１６５】
群分け：ELISAのIgEの結果から、IgEの値が均等になるように、また、年齢が均等になるように2群になるように4頭ずつ群分けした。【０１６６】
ワクチン：M4-7-11 ペプチドのみをコンジュゲートなしで用いた。【０１６７】
投与方法：1回あたり1mg（2mg/mLを500μL）を2週間隔で5回皮下投与した。【０１６８】
評価：血清を採取し、ELISAにてヒトIgEに対するIgG抗体を測定した。抗犬IgG抗体に犬IgEが非特異的に反応するため、非特異的反応がないヒトIgEをELISAに使用した。また、コナヒョウヒダニに対するIgE抗体をELISAにて評価した。【０１６９】
試験スケジュールを図２５に示した。【０１７０】
ELISA法は、以下の通りであった。【０１７１】
IgEに対するIgG測定方法は、実施例８及び９と同様であった。【０１７２】
コナヒョウヒダニ抗原に対する犬IgEの測定方法は、以下の通りであった。【０１７３】
ELISAプレートにコナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）抗原を固相化バッファー(0.05M炭酸Buffer pH9.6)にて5μg/mLになるように調製し、１ウェルあたり100μL添加し、４℃にて一晩放置して行った。固相化プレートをPBS-T(0.05%)にて１回洗浄し、ブロッキング液(４×Block Ace 雪印乳業社：UK-B80)を１ウェルあたり200μL添加し、37℃にて1.5時間インキュベートし、ブロッキングを行った。血清は、希釈液(PBS-T: Block Ace=9:1)により20倍希釈して用いた。37℃にて1.5時間反応させ、PBS-T(0.05%)にて3回洗浄し、2次抗体として、抗犬IgE抗体(Goat anti-Dog IgE HRP、BETHYL社:A40-125P)を希釈液で2000倍に希釈し、100μL添加した。37℃にて1.5時間反応させ、PBS-T(0.05%)にて3回洗浄し、基質液（クエン酸バッファーにTMBZ錠（Sigma社：T-3405）を１錠加え、使用直前に2μLの30％H2O2を加えたもの）を100μL/wellでプレートに添加し、10分間反応させ、2N硫酸を50μL/well加え、反応を停止させた。その後、プレートリーダー（BIO-RAD:model680）にて測定した（dual：測定450nm、対照570 nm）。【０１７４】
結果：
ペプチドワクチン（M4-7-11）を犬に皮下投与した際の、IgEに対するIgG抗体の産生評価をELISAにて実施した結果を図２６に示した。図２６Aは、ペプチドをワクチンとして投与した群とコントロール群の平均の抗体価を示す。図２６B及び図２６Cは、それぞれワクチン投与群及びコントロール群（非投与群）の各個体の抗体価を示す。図２６に示すように、ワクチン投与により、IgEに対するIgG抗体の上昇を犬で、試験4および試験5と同様に成犬の人工感作犬において確認した。さらに、投与回数は、4回以下で充分であることをこれまで同様確認した。【０１７５】
コナヒョウヒダニ抗原特異的IgEのELISAでの測定結果を図２７に示す。図２７Aは、ペプチドをワクチンとして投与した群とコントロール群の平均の抗体価を示す。図２７B及び図２７Cは、それぞれワクチン投与群及びコントロール群（非投与群）の各個体の抗体価を示す。図２７に示すように、ワクチン（M4-7-11）投与群の1頭（04-95）において、血清中のIgEの減少を確認した。このことから、ワクチン（M4-7-11）投与により、血清中のIgEを減少させる可能性があると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１７６】
本発明のマウスIgEの部分ペプチドは、動物のIgE介在性アレルギー疾患を予防又は治療するための医薬として用いることができる。【０１７７】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１−１】
2013191166.tif 000008
【図１−２】
2013191166.tif 000009
【図２】
2013191166.tif 000010
【図３−１】
2013191166.tif 000011
【図３−２】
2013191166.tif 000012
【図４】
2013191166.tif 000013
【図５】
2013191166.tif 000014
【図６−１】
2013191166.tif 000015
【図６−２】
2013191166.tif 000016
【図６−３】
2013191166.tif 000017
【図６−４】
2013191166.tif 000018
【図６−５】
2013191166.tif 000019
【図６−６】
2013191166.tif 000020
【図７】
2013191166.tif 000021
【図８】
2013191166.tif 000022
【図９】
2013191166.tif 000023
【図１０】
2013191166.tif 000024
【図１１−１】
2013191166.tif 000025
【図１１−２】
2013191166.tif 000026
【図１１−３】
2013191166.tif 000027
【図１１−４】
2013191166.tif 000028
【図１１−５】
2013191166.tif 000029
【図１２−１】
2013191166.tif 000030
【図１２−２】
2013191166.tif 000031
【図１２−３】
2013191166.tif 000032
【図１２−４】
2013191166.tif 000033
【図１２−５】
2013191166.tif 000034
【図１２−６】
2013191166.tif 000035
【図１３】
2013191166.tif 000036
【図１４】
2013191166.tif 000037
【図１５】
2013191166.tif 000038
【図１６】
2013191166.tif 000039
【図１７】
2013191166.tif 000040
【図１８】
2013191166.tif 000041
【図１９】
2013191166.tif 000042
【図２０】
2013191166.tif 000043
【図２１】
2013191166.tif 000044
【図２２】
2013191166.tif 000045
【図２３】
2013191166.tif 000046
【図２４】
2013191166.tif 000047
【図２５】
2013191166.tif 000048
【図２６】
2013191166.tif 000049
【図２７】
2013191166.tif 000050
【配列表】
2013191166000001.app
【国際調査報告】
2013191166.tif 000051
2013191166.tif 000052
2013191166.tif 000053
2013191166.tif 000054
2013191166.tif 000055