(57)【要約】  生体分子を指標として認知症またはその前段階にある者を特定する検査方法、該検査方法に用いるキット、該キットに含有させる酵素、及び該酵素の製造方法を提供する。該検査方法は、被験者の自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）を定量する工程と、同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する工程とを含み、ＭＩ量が設定される閾値以上であり、ＰｌｓＥｔｎ量が設定される閾値以下である被験者を認知症患者またはその前段階にある者として分類する。
2014010667.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者を認知症患者またはその前段階にある者か否かを分類するための認知症検査方法であって、
被験者の自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）を定量する工程と、同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する工程とを含み、
健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の予め求められた閾値と、血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の予め求められた閾値のそれぞれに対して、前記被験者のミオイノシトール（ＭＩ）の定量値とエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の定量値を比較する工程を含む認知症検査方法。
【請求項２】
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する工程が、酵素を利用する反応により、最終的に過酸化水素が生成され、該エタノールアミン型プラスマローゲンの存在量に対応して発生する過酸化水素の量を検出して、血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ量を算出する工程を含む請求項１の方法。
【請求項３】
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、以下の（１）〜（３−４）（枝番号を付したものも全て含む。以下同様）の工程を含む請求項２に記載の方法。
（１）エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素を用いて、被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する工程：
（２）エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解でき、かつエーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できない加水分解酵素を用いて、前記（１）にて生成されたエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をグリセロ−３−ホフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解する工程：及び
（３−１）グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンを加水分解してエタノールアミンにせしめる酵素にて、工程（２）で得られたグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンを加水分解してエタノールアミンにする工程：
（３−２）エタノールアミンを酸化する酵素により、エタノールアミンから過酸化水素を発生せしめる工程：
（３−３）過酸化水素を過酸化水素定量手段により定量する工程：及び
（３−４）前記被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ量を算出する工程：
または前記（２）の加水分解酵素が、リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、前記（１）〜（３−４）の工程に先立つか、少なくとも前記（２）工程の前までに、下記（４）及び（５）を含む工程を行うことを特徴とする方法。
（４）ホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素を用いて、血清または血漿中に混在するホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する工程：及び
（５）リゾホスフォリパーゼ及び／又はモノグリセリドリパーゼを用いて、前記（４）工程により生成されるリゾホスファチジルエタノールアミンを分解し、実質的に消去する工程：
【請求項４】
前記工程（２）の加水分解酵素が、下記（ａ）または（ｂ）の酵素のいずれかである請求項３に記載の方法。
（ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列：
（ｂ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列：
からなる酵素であって、エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）を加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒する：
【請求項５】
前記工程（１）のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素が、下記（ｃ）または（ｄ）のいずれかの酵素である請求項３に記載の方法。
（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列：
（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であり、エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する作用を触媒する： 
【請求項６】
前記（２）の加水分解酵素が、リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、前記（１）〜（３−４）の工程に先立つか、少なくとも前記（２）工程の前までに、下記（４）及び（５）を含む工程を行うことを特徴とする請求項３に記載の方法。
（４）ホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素を用いて、血清または血漿中に混在するホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する工程：及び
（５）リゾホスフォリパーゼ及び／又はモノグリセリドリパーゼを用いて、前記（４）工程により生成されるリゾホスファチジルエタノールアミンを分解し、実質的に消去する工程：
【請求項７】
前記工程（４）のホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素としてホスフォリパーゼ（ＰＬ）を使用し、該ＰＬは、前記工程（１）のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素としての作用を兼ねさせて新たな該ＰＬを添加することなく前記工程（１）の工程を進行せしめ、前記工程（５）を実施と同時、または前記工程（５）の実施後に、前記工程（１）が完了し、以後前記工程（２）〜（３−４）を実施する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、以下の（１）〜（５）（枝番を付したもの、´を付したものも全て含む。以下同様）の工程を含む請求項２に記載の方法。
（１）エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素を用いて、被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する工程：
（２）´エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミンとプラズメニルホスファチジン酸に加水分解でき、かつエーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解でき、かつリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる加水分解酵素を用いて、前記（１）にて生成されたエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミンとプラズメニルホスファチジン酸に加水分解する工程： 
（３−１）´エタノールアミンを酸化する酵素により、工程（２）´で得られたエタノールアミンから過酸化水素を発生せしめる工程：
（３−２）´過酸化水素を過酸化水素定量手段により定量する工程：及び
（３−３）´前記被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ量を算出する工程：
【請求項９】
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、前記（１）〜（３−３）´の工程に先立つか、少なくとも前記（２）´工程の前までに、下記（４）及び（５）を含む工程を行うことを特徴とする請求項８に記載の方法。
（４）ホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素を用いて、血清または血漿中に混在するホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する工程：及び
（５）リゾホスフォリパーゼ及び／又はモノグリセリドリパーゼを用いて、前記（４）工程により生成されるリゾホスファチジルエタノールアミンを分解し、実質的に消去する工程：
【請求項１０】
前記工程（４）のホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素としてホスフォリパーゼ（ＰＬ）を使用し、該ＰＬは、前記工程（１）のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素としての作用を兼ねさせて新たな該ＰＬを添加することなく前記工程（１）の工程を進行せしめ、前記工程（５）を実施と同時、または前記工程（５）の実施後に、前記工程（１）が完了し、以後前記工程（２）〜（３−３）´を実施する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の予め求められた閾値が、２１．６〜６３．３ｍｇ／ｇＣｒの範囲から選択される値であり、血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の予め求められた閾値が、５０〜６４μＭの範囲から選択される値であって、被験者の自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の定量値が、前記ＭＩ閾値を越え、かつ被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の定量値が、前記ＰｌｓＥｔｎ閾値を下回った場合に、認知症患者またはその前段階にある者と区分する請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＩ閾値が３６．６ｍｇ／ｇＣｒである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）閾値が、５８μＭである請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の予め求められた閾値と、被験者の自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の定量値とを比較する工程と組み合わせることにより、被験者を認知症患者またはその前段階にある者か否かを分類する認知症検査に用いるものであって、
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する工程を含み、該工程中に、健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別するがことできる、血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の、予め求められた閾値に対して、被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の定量値を比較する工程を含む、エタノールアミン型プラスマローゲンの定量方法。
【請求項１５】
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する工程が、酵素を利用する反応により、最終的に過酸化水素が生成され、該エタノールアミン型プラスマローゲンの存在量に対応して発生する過酸化水素の量を検出して、血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ量を算出する工程を含む請求項１４の方法。
【請求項１６】
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、以下の（１）〜（３−４）の工程を含む請求項１５に記載の方法。
（１）エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素を用いて、被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する工程：
（２）エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解でき、かつエーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できない加水分解酵素を用いて、前記（１）にて生成されたエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をグリセロ−３−ホフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解する工程：及び
（３−１）グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンを加水分解してエタノールアミンにせしめる酵素にて、工程（２）で得られたグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンを加水分解してエタノールアミンにする工程：
（３−２）エタノールアミンを酸化する酵素により、エタノールアミンから過酸化水素を発生せしめる工程：
（３−３）過酸化水素を過酸化水素定量手段により定量する工程：及び
（３−４）前記被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ量を算出する工程：
または前記（２）の加水分解酵素が、リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、前記（１）〜（３−４）の工程に先立つか、少なくとも前記（２）工程の前までに、下記（４）及び（５）を含む工程を行うことを特徴とする方法。
（４）ホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素を用いて、血清または血漿中に混在するホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する工程：及び
（５）リゾホスフォリパーゼ及び／又はモノグリセリドリパーゼを用いて、前記（４）工程により生成されるリゾホスファチジルエタノールアミンを分解し、実質的に消去する工程：
【請求項１７】
前記工程（２）の加水分解酵素が、下記（ａ）または（ｂ）の酵素のいずれかである請求項１６に記載の方法。
（ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列：
（ｂ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列：
からなる酵素であって、エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）を加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒する：
【請求項１８】
前記工程（１）のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素が、下記（ｃ）または（ｄ）のいずれかの酵素である請求項１６に記載の方法。
（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列：
（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であり、エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する作用を触媒する：
【請求項１９】
前記（２）の加水分解酵素が、リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、前記（１）〜（３−４）の工程に先立つか、少なくとも前記（２）工程の前までに、下記（４）及び（５）を含む工程を行うことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
（４）ホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素を用いて、血清または血漿中に混在するホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する工程：及び
（５）リゾホスフォリパーゼ及び／又はモノグリセリドリパーゼを用いて、前記（４）工程により生成されるリゾホスファチジルエタノールアミンを分解し、実質的に消去する工程：
【請求項２０】
前記工程（４）のホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素としてホスフォリパーゼ（ＰＬ）を使用し、該ＰＬは、前記工程（１）のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素としての作用を兼ねさせて新たな該ＰＬを添加することなく前記工程（１）の工程を進行せしめ、前記工程（５）を実施と同時、または前記工程（５）の実施後に、前記工程（１）が完了し、以後前記工程（２）、（３−４）を実施する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、以下の（１）〜（３−３）´の工程を含む請求項１５に記載の方法。
（１）エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素を用いて、被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する工程：
（２）´エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミンとプラズメニルホスファチジン酸に加水分解でき、かつエーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解でき、かつリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる加水分解酵素を用いて、前記（１）にて生成されたエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミンとプラズメニルホスファチジン酸に加水分解する工程：及び
（３−１）´エタノールアミンを酸化する酵素により、工程（２）´で得られたエタノールアミンから過酸化水素を発生せしめる工程：
（３−２）´過酸化水素を過酸化水素定量手段により定量する工程：及び
（３−３）´前記被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ量を算出する工程：
【請求項２２】
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、前記（１）〜（３−３）´の工程に先立つか、少なくとも前記（２）工程の前までに、下記（４）及び（５）を含む工程を行うことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
（４）ホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素を用いて、血清または血漿中に混在するホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する工程：及び
（５）リゾホスフォリパーゼ及び／又はモノグリセリドリパーゼを用いて、前記（４）工程により生成されるリゾホスファチジルエタノールアミンを分解し、実質的に消去する工程：
【請求項２３】
前記工程（４）のホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素としてホスフォリパーゼ（ＰＬ）を使用し、該ＰＬは、前記工程（１）のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素としての作用を兼ねさせて新たな該ＰＬを添加することなく前記工程（１）の工程を進行せしめ、前記工程（５）を実施と同時、または前記工程（５）の実施後に、前記工程（１）が完了し、以後前記工程（２）〜（３−３）´を実施する請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別するがことできる、血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の予め求められた閾値と、被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の定量値とを比較する工程と組み合わせることにより、被験者を認知症患者またはその前段階にある者か否かを分類する認知症検査に用いるものであって、
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する工程を含み、該工程中に、健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別するがことできる、自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の、予め求められた閾値に対して、被験者の自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の定量値を比較する工程を含む、ミオイノシトール（ＭＩ）の定量方法。
【請求項２５】
被験者を認知症患者またはその前段階にある者か否かを分類するための認知症検査方法に用いられる手段であって、
被験者の自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）を定量する手段と、同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する手段とを含み、
健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の予め求められた閾値と、血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の予め求められた閾値のそれぞれに対して、前記被験者のミオイノシトール（ＭＩ）の定量値とエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の定量値を比較して用いる認知症検査手段。
【請求項２６】
前記手段が検査薬キットである請求項２５に記載の認知症検査手段。
【請求項２７】
健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の予め求められた閾値と、被験者の自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の定量値とを比較する工程と組み合わせることにより、被験者を認知症患者またはその前段階にある者か否かを分類する認知症検査に用いるものであって、
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する工程を含み、該工程中に、健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別するがことできる、血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の、予め求められた閾値に対して、被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の定量値を比較して用いる、エタノールアミン型プラスマローゲンの定量手段。
【請求項２８】
該エタノールアミン型プラスマローゲンの定量手段が試薬キットである請求項２７に記載の定量手段。
【請求項２９】
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する試薬キットが、以下の（１ａ）〜（３ａ）を含む請求項２８に記載の試薬キット。
（１ａ）エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素およびその酵素反応を進めることのできる添加物。
（２ａ）エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解でき、かつエーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できない加水分解酵素およびその酵素反応を進めることのできる添加物。
（３ａ）グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンをエタノールアミンとグリセロリン酸に変換する酵素、エタノールアミンをグリコールアルデヒド、アンモニア、及び過酸化水素に変換する酵素とその酵素反応を進めるにことのできる添加物、さらに必要により過酸化水素を定量するための過酸化水素定量手段。
または前記（２ａ）の加水分解酵素がリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、前記（１ａ）に、さらにリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解する酵素を含む試薬キット。
【請求項３０】
前記（２ａ）の加水分解酵素がリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、前記（１ａ）に、さらにリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解する酵素を含む請求項２９に記載の試薬キット。
【請求項３１】
前記（２ａ）の加水分解酵素が、下記（ａ）または（ｂ）の酵素のいずれかである請求項２９に記載の試薬キット。
（ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列：
（ｂ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列：
からなる酵素であって、エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）を加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒する：
【請求項３２】
前記（１ａ）のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素、が下記（ｃ）または（ｄ）のいずれかの酵素である請求項２９に記載の試薬キット。
（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列：
（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であり、エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する作用を触媒する：
【請求項３３】
健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の予め求められた閾値と、被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の定量値とを比較する工程と組み合わせることにより、被験者を認知症患者またはその前段階にある者か否かを分類する認知症検査に用いるものであって、
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する工程を含み、該工程中に、健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の、予め求められた閾値に対して、被験者の自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の定量値を比較して用いる、ミオイノシトール（ＭＩ）の定量手段。
【請求項３４】
前記手段が試薬キットである請求項３３に記載の定量手段。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子を指標として認知症またはその前段階にある者を特定する検査方法、とその測定方法、該検査方法に用いるキット、該キットに含有させる酵素、及び該酵素の製造方法に関する。【０００２】
【背景技術】
【０００３】
１．認知症
認知症は後天的な脳の器質的障害により、正常に発達した知能が低下した状態をいう。記憶、判断力などの障害により社会生活が困難となる。近年では高齢化に伴い老人性認知症者が増加しており、その数は約２００万人といわれ、さらに増加する傾向にある。【０００４】
認知症は症状が進行すると回復が困難になり、介護には多くの労力と金銭的負担が必要となるが、比較的軽度の段階で発見してリハビリ訓練等の治療を施すことにより発症予防やある程度の症状の回復が可能である。また抗認知症薬は症状の進行を抑制するための薬剤であることから、その処方は早ければ早いほど有効である。従って、認知症においては早期に治療対象者を特定することが重要となる。【０００５】
２．認知症検査
従来、認知症の判定には、ウェクスラー成人知能検査（ＷＡＩＳ−Ｒ）、改訂長谷川式簡易知能評価スケール（ＨＤＳ−Ｒ）、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳ、ＭＭＳＥ）、クリニカルデメンチアレーティング検査（ＣＤＲ）、モントリオールコグニティブアセスメント検査日本語版（ＭｏＣＡ−Ｊ）等の認知機能検査が利用されている。これらの検査は、専門の検査官が被験者と対面して行うため、大規模なスクリーニングには不向きである。また被験者の意識状態、気分、意欲などが成績に影響を及ぼすことや、うつ病やせん妄、あるいは難聴との識別も別途に必要となるなどの問題を有している。【０００６】
そこで、より客観的かつ簡便な認知症の検査方法として、生体分子（バイオマーカー）を指標とする方法が注目を集めている。例えば、代表的な認知症の一つであるアルツハイマー病の神経病理学的特徴は、アミロイドβ（Ａβ）の沈着により形成される老人班と、異常リン酸化タウ蛋白の出現に特徴付けられる神経原線維変化、そして大量の神経細胞脱落である。今日、アルツハイマー病の病態過程はＡβの産生により惹起されるというアミロイド仮説が提唱されている。これは、Ａβの産生に伴い神経細胞に酸化ストレスやカルシウム制御異常が誘導され、神経細胞死を引き起こす。また同時に、Ａβはタウ蛋白のリン酸化を誘導し、細胞骨格蛋白異常とそれに伴う細胞内輸送の障害を引き起こし、神経細胞を死に至らしめるというものである。Ａβはアミロイド前駆体蛋白から通常では作用しないβセクレターゼおよびγセクレターゼにより切断されて生成する。Ａβには主に４２個のアミノ酸から構成されるＡβ４２と４０個のアミノ酸から成るＡβ４０があり、前者が凝集能や神経毒性が高い点から、アルツハイマー病の発症により重要であると考えられている。脳脊髄液中のＡβ４２の減少（脳内でＡβ４２の沈着に起因）は、現状では最も信頼のできるアルツハイマー病診断指標の一つとされている。また、アルツハイマー病では脳脊髄液中のリン酸化タウ蛋白の増加も確認されており、病態と密接に関連した診断指標として位置づけられている。しかし、脳脊髄液は一般的な健康診断で扱う血液や尿とは異なり、その採取には特殊な技術を要し、また患者への負担も大きいことから、高齢者等のスクリーニング検査としては不向きである。【０００７】
その他にもさまざまな酸化ストレスマーカーや炎症マーカー、アポトーシス関連マーカーなどが認知症の検査指標として検討されている。酸化により糖化修飾されたｇｌｙｃａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎや核酸が酸化された８−ｈｙｄｒｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅはアルツハイマー病の脳脊髄液中で増加することが報告されており、不飽和脂肪酸の酸化生成物であるＦ２−ｉｓｏｐｒｏｓｔａｎｅは脳脊髄液、血液、尿中で増加すると報告されている。また、炎症マーカーではＩＬ−１βやＩＬ−６、ＴＧＦ−β１などが脳脊髄液中で増加、アポトーシスに関連するＴＲＡＩＬも脳脊髄液中での増加が報告されている。しかし、酸化ストレスや炎症、アポトーシスは、いずれもアルツハイマー病を含む認知症の病理・病態に深く関係する現象ではあるが、必ずしも特異的であるとは言えないことから、認知症のバイオマーカーとして好ましいものではない。【０００８】
３．エタノールアミン型プラスマローゲン（以下ＰｌｓＥｔｎと略す。）
プラスマローゲン（以下Ｐｌｓと略す。）はグリセロリン脂質のサブクラスの一つで、生体膜成分として人体を構成するリン脂質の約２割を占め、脳や心臓などに多く含まれている。このＰｌｓは、生活習慣病（動脈硬化症、高脂血症、糖尿病、高血圧症、中心性肥満症）のバイオマーカーとして検討されている（特許文献１、２）。また、特に脳内のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）は、神経髄鞘を成すミエリン膜の主要構成成分であり、また神経細胞間でのシナプス形成などに関わるとされる。ＰｌｓＥｔｎは膜モデュレーターとして機能し、細胞膜融合やエンドサイトーシス／エキソサイトーシスに関与するのに加え、膜結合酵素の活性調節などにも関わっている。また、Ｐｌｓはその構造上の特徴を成すビニルエーテル結合にラジカル消去能があることから、生体内で抗酸化物質として作用すると考えられている。【０００９】
ＰｌｓＥｔｎはアルツハイマー病やダウン症候群、脊髄損傷、多発性硬化症などで脳内レベルの特異的な減少が報告されている（非特許文献１）。特に、アルツハイマー病では酸化ストレスがその発症の初期段階で重要であることを支持する生化学的・臨床的証拠が集積していることから、ＰｌｓＥｔｎはアルツハイマー病の酸化ストレスマーカーとして注目されている（非特許文献２）。例えば、ＰｌｓＥｔｎの一分子種であるＰｌｓＥｔｎ２２：６の血清または血漿中濃度の低下がアルツハイマー病の早期発見マーカーとなり得ることが報告されている（非特許文献３）。ただし、ＰｌｓＥｔｎ２２：６の測定（定量）には液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）などの高価な分析機器が必要であり、また定量のための内部標準物質の調整等も煩雑であることから、通常の健康診断に付随させることのできる大規模スクリーニングには不向きである。一方、本発明者らは、特許文献１等に記載の簡便な方法で健康高齢者および認知障害者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ量（以下、「血清／血漿ＰｌｓＥｔｎ量」と記載することがある）を測定（定量）し、認知機能検査（ＣＤＲ）の結果別に比較したところ、ＰｌｓＥｔｎ量は認知機能の低下を良く反映することを見出している（非特許文献４）。【００１０】
ＰｌｓＥｔｎの測定方法としては、特許文献１に記載された放射性ヨウ素−高速液体クロマトグラフィー（１２５Ｉ−ＨＰＬＣ）法、ＬＣ−ＭＳ法（特許文献５）が公知である。【００１１】
４．ミオイノシトール（以下ＭＩと略す場合がある。）
ＭＩは９種類あるイノシトールの異性体の一つで、人体を含む天然に最も豊富に存在する。生体中のＭＩは食餌からの摂取に加え、体内でグルコースからも生合成される。ＭＩは細胞内情報伝達物質のソースとなるイノシトールリン脂質や、カルシウムイオンの恒常性維持に関わるイノシトールリン酸の合成材料として重要である。さらに、ＭＩ自身も脳内の有機性浸透圧調製物質として、また、おそらくミエリン形成への関与の可能性といった点から、中枢神経系の正常な機能維持に重要な役割をもつと考えられる。【００１２】
脳内ＭＩ濃度は血中レベルの２００倍程度もあり、うつ病などの感情障害やダウン症候群など様々な病態で脳内ＭＩの増加が報告されている。またアルツハイマー病患者においても脳内ＭＩ量の増加が報告されている。（非特許文献６）。脳内ＭＩの一部は、脳血液関門を通過して循環血液に入るが、ほとんどが腎臓で再吸収されるか分解され、尿に排泄されるＭＩ量（以下、「尿ＭＩ量」と記載することがある）はごくわずかである。再吸収過程が血糖と拮抗することから、高血糖状態ではそのレベルを反映して尿ＭＩ量が増加するため、糖負荷試験による境界型糖尿病の検出の際に血糖値に代替できる測定項目として注目されており（非特許文献５）、糖尿病予備群の検査（特許文献３）あるは軽症耐糖能異常やインスリン分泌不全の検出（特許文献４）のためのバイオマーカーとして使用されている。【００１３】
５．ＰｌｓとＭＩの関係
ＭＩは体内（特に脳内）でのＰｌｓ合成に於いて重要な役割を担うと考えられ、ＭＩの体外ロス（長期の持続的な尿中排泄の増加）はＰｌｓの体内（特に脳内）合成の低下を招くと推測される。ＭＩの尿中排泄はグルコースと拮抗することから、高血糖状態はＭＩの尿中排泄量を増加させる一因と思われる。したがって、特に、糖尿病などの高血糖状態を有する者では、高血糖状態  →  尿ＭＩ排泄の増加  →  脳内ＰｌｓＥｔｎの減少  →  認知症発症という仮説が提唱できる。また、高血糖に限らず、何らかの原因で尿ＭＩ排泄の増加がみられる場合も、脳内ＰｌｓＥｔｎの減少  →  認知症発症に至るリスクが高いと考えられる。ただし、尿ＭＩ量に関しては高齢健常者と認知症患者とで有意差は認められず、また認知機能検査の結果と尿ＭＩ量にも有意な相関が得られないことが報告されている（非特許文献７）。【００１４】
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開２００７−３３４１０号公報（特許第４１７６７４９号）
【特許文献２】特開２０１１−２５７１４８号公報
【特許文献３】特開２００１−１９０２９９号公報（特許第３９７５２７９号）
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００３／０８３１３３（特許第４４６６９１２号）
【特許文献５】特開２０１１−１３６９２６号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｌｅｂｉｇ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｐｌａｓｍａｌｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ：  Ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａｌｏｇｅｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １６：  ２０２１−４１，  ２００９
【非特許文献２】Ｈａｎ  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｐｌａｓｍａｌｏｇｅｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ：  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７７：１１６８−８０，  ２００１
【非特許文献３】Ｇｏｏｄｅｎｏｗｅ  ＤＢ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｐｌａｓｍａｌｏｇｅｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：  Ａ  ｌｏｇｉｃａｌ  ｃａｕｓａｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｄｅｍｅｎｔｉａ．  Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４８：  ２４８５−２４９８，  ２００７
【非特許文献４】前場良太他、血清プラスマローゲンの認知機能評価のバイオマーカーとしての有効性の検討  Ｄｅｍｅｎｔｉａ  Ｊａｐａｎ  Ｖｏｌ．２４  Ｎｏ．（３），  ｐ１４４  ４７，  ２０１１
【非特許文献５】Ｓａｒａｓｈｉｎａ  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ａｓ  ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ．  Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３４４：１８１−８，  ２００４
【非特許文献６】Ｚｈｕ  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｎ  ｆｒｏｎｔｏ−ｐａｒｉｅｔａｌ  ｂｒａｉｎ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｎｄ  ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ．  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｄｉｓ  Ａｓｓｏｃ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２０：  ７７−８５，  ２００６
【非特許文献７】前場良太他、自然排泄尿ミオイノシトールの臨床的意義に関する検討  第５８回日本臨床検査医学会学術集会抄録集  ｐ９５−О０２５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
前記のとおり、認知症を予防し、あるいはその進行を抑制するためには早期の発見が重要であり、客観的な指標であるバイオマーカーを用いた大規模なスクリーニングの実施が有効である。そしてバイオマーカーに求められることは、認知症患者またはその前段階にある者を的確に（すなわち他の疾患患者と混同することなく）特定できることであり、また通常の健康診断の範囲内で実施できるような簡便な測定（定量）と判定が可能なことである。【００１８】
このような観点から、血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量は認知症検査、特にその大規模スクリーニングのためのバイオマーカーとして有望視されている。しかしながら、血清／血漿ＰｌｓＥｔｎ量を単独指標とした場合の判定精度は必ずしも十分なものではない。たとえば後記の実施例に示したように、ＰｌｓＥｔｎ量がその平均的な値（５８μＭ）を下回った被験者のうち、認知機能検査で認知症と判定された者の割合は６０％未満である。【００１９】
本発明は、血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量をバイオマーカーとする認知症検査の精度をさらに向上させる手段を提供することを課題としている。【００２０】
また前記のとおり従来のＰｌｓＥｔｎ測定法の１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法は高額な装置や放射性ヨウ素を使用するので汎用性が劣る。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法は高額な装置を使用するので汎用性が劣る。以上のような背景のもと本発明は、汎用自動分析機に応用でき、利便性高いＰｌｓＥｔｎの測定方法を提供することを目的とする。【００２１】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、それ単独の定量では認知機能との関連性が存在しない尿ＭＩ量の定量値と血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎの定量値を組み合わせることで、認知症検査の精度が向上することを見出し、ＰｌｓＥｔｎに特異的に作用するリゾプラスマローゲナーゼ（Ｌｙｓｏｐｌａｓｍａｌｏｇｅｎａｓｅ、ｌｙＰｌｓ  ａｓｅと略す場合がある）とホスホリパーゼ（以下ＰＬと略す場合がある。）を新規に見出し、被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎを定量するためのｌｙＰｌｓ  ａｓｅとＰＬを含有する認知症検査試薬キットを創出して本発明を完成させた。【００２３】
すなわち、本出願は前記の課題を解決する発明として以下を提供する。【００２４】
［１］
被験者を認知症患者またはその前段階にある者か否かを分類するための認知症検査方法であって、
被験者の自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）を定量する工程と、同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する工程とを含み、
健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の予め求められた閾値と、血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の予め求められた閾値のそれぞれに対して、前記被験者のミオイノシトール（ＭＩ）の定量値とエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の定量値を比較する工程を含む認知症検査方法。【００２５】
［１−１］
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する工程が、酵素を利用する反応により、最終的に過酸化水素が生成され、該エタノールアミン型プラスマローゲンの存在量に対応して発生する過酸化水素の量を検出して、血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ量を算出する工程を含む［１］の方法。【００２６】
［１−２］
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、以下の（１）〜（３−４）の工程を含む［１］に記載の方法。
（１）エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素を用いて、被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する工程：
（２）エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解でき、かつエーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できない加水分解酵素を用いて、前記（１）にて生成されたエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をグリセロ−３−ホフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解する工程：及び
（３−１）グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンを加水分解してエタノールアミンにせしめる酵素にて、工程（２）で得られたグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンを加水分解してエタノールアミンにする工程：
（３−２）エタノールアミンを酸化する酵素により、エタノールアミンから過酸化水素を発生せしめる工程：
（３−３）過酸化水素を過酸化水素定量手段により定量する工程：及び
（３−４）前記被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ量を算出する工程：
または前記（２）の加水分解酵素が、リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、前記（１）〜（３−４）の工程に先立つか、少なくとも前記（２）工程の前までに、下記（４）及び（５）を含む工程を行うことを特徴とする方法。
（４）ホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素を用いて、血清または血漿中に混在するホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する工程：及び
（５）リゾホスフォリパーゼ及び／又はモノグリセリドリパーゼを用いて、前記（４）工程により生成されるリゾホスファチジルエタノールアミンを分解し、実質的に消去する工程。【００２７】
［１−３］
前記工程（２）の加水分解酵素が、下記（ａ）または（ｂ）の酵素のいずれかである［１−２］に記載の方法。
（ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列：
（ｂ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列：
からなる酵素であって、エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）を加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒する。【００２８】
［１−４］
前記工程（１）のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素、が下記（ｃ）または（ｄ）のいずれかの酵素である［１−２］に記載の方法。
（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列：
（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であり、エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する作用を触媒する。 【００２９】
［１−５］
前記（２）の加水分解酵素が、リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、前記（１）〜（３−４）の工程に先立つか、少なくとも前記（２）工程の前までに、下記（４）及び（５）を含む工程を行うことを特徴とする［１−１］〜［１−４］に記載の方法。
（４）ホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素を用いて、血清または血漿中に混在するホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する工程：及び
（５）リゾホスフォリパーゼ及び／又はモノグリセリドリパーゼを用いて、前記（４）工程により生成されるリゾホスファチジルエタノールアミンを分解し、実質的に消去する工程。【００３０】
［１−６］
前記工程（４）のホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素としてホスフォリパーゼ（ＰＬ）を使用し、該ＰＬは、前記工程（１）のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素としての作用を兼ねさせて新たな該ＰＬを添加することなく前記工程（１）の工程を進行せしめ、前記工程（５）を実施と同時、または前記工程（５）の実施後に、前記工程（１）が完了し、以後前記工程（２）〜（３−４）を実施する［１−５］に記載の方法。【００３１】
［１−７］
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、以下の（１）〜（３−３）´の工程を含む［１−１］に記載の方法。
（１）エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素を用いて、被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する工程：
（２）´エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミンとプラズメニルホスファチジン酸に加水分解でき、かつエーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解でき、かつリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる加水分解酵素を用いて、前記（１）にて生成されたエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミンとプラズメニルホスファチジン酸に加水分解する工程：及び
（３−１）´エタノールアミンを酸化する酵素により、工程（２）´で得られたエタノールアミンから過酸化水素を発生せしめる工程：
（３−２）´過酸化水素を過酸化水素定量手段により定量する工程：及び
（３−３）´前記被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ量を算出する工程。【００３２】
［１−８−１］
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、前記（１）〜（３−３）´の工程に先立つか、少なくとも前記（２）´工程の前までに、下記（４）及び（５）を含む工程を行うことを特徴とする［１−７］に記載の方法。
（４）ホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素を用いて、血清または血漿中に混在するホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する工程：及び
（５）リゾホスフォリパーゼ及び／又はモノグリセリドリパーゼを用いて、前記（４）工程により生成されるリゾホスファチジルエタノールアミンを分解し、実質的に消去する工程。【００３３】
［１−８−２］
前記工程（４）のホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素としてホスフォリパーゼ（ＰＬ）を使用し、該ＰＬは、前記工程（１）のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素としての作用を兼ねさせて新たな該ＰＬを添加することなく前記工程（１）の工程を進行せしめ、前記工程（５）を実施と同時、または前記工程（５）の実施後に、前記工程（１）が完了し、以後前記工程（２）〜（３−３）´を実施する［１−８−１］に記載の方法。【００３４】
［１−９］
自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の予め求められた閾値が、２１．６〜６３．３ｍｇ／ｇＣｒの範囲から選択される値であり、血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の予め求められた閾値が、５０〜６４μＭの範囲から選択される値であって、被験者の自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の定量値が、前記ＭＩ閾値を越え、かつ被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の定量値が、前記ＰｌｓＥｔｎ閾値を下回った場合に、認知症患者またはその前段階にある者と区分する［１］に記載の方法。【００３５】
［１−１０］ 
前記ＭＩ量の閾値が２５ｍｇ／ｇＣｒである［１−９］に記載の方法。【００３６】
［１−１１］
前記ＭＩ量の閾値が３３．２ｍｇ／ｇＣｒである［１−９］に記載の方法。【００３７】
［１−１２］ 
前記ＭＩ閾値が３６．６ｍｇ／ｇＣｒである［１−９］に記載の方法。【００３８】
［１−１３］
前記ＭＩ量の閾値が４４．８ｍｇ／ｇＣｒである［１−９］に記載の方法。【００３９】
［１−１４］
前記エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）閾値が、５８μＭである［１−９］に記載の方法。【００４０】
［１−１５］
前記エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）閾値が、６１μＭである［１−９］に記載の方法。【００４１】
［１−１６］
前記エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）閾値が、５６μＭである［１−９］に記載の方法。【００４２】
［１−１７］
前記被験者のＭＩ量が２１．６〜５５．１ｍｇ／ｇＣｒの範囲から設定される閾値以上であり、ＰｌｓＥｔｎ量が５０〜６４μＭの範囲から設定される閾値以下である［１−９］に記載の方法。【００４３】
［１−１８］
前記被験者のＭＩ量が２１．６〜５５．１ｍｇ／ｇＣｒの範囲から設定される閾値以上であり、ＰｌｓＥｔｎ量が５２〜６１μＭの範囲から設定される閾値以下である［１−９］に記載の方法。【００４４】
［１−１９］
前記被験者のＭＩ量が２９．８〜６３．３ｍｇ／ｇＣｒの範囲から設定される閾値以上であり、ＰｌｓＥｔｎ量が５０〜６４μＭの範囲から設定される閾値以下である［１―９］に記載の方法。【００４５】
［１−２０］
前記被験者のＭＩ量が２９．８〜６３．３ｍｇ／ｇＣｒの範囲から設定される閾値以上であり、ＰｌｓＥｔｎ量が５２〜６１μＭの範囲から設定される閾値以下である［１―９］に記載の方法。【００４６】
［１−２１］
前記ＭＩ量の閾値が３６．６ｍｇ／ｇＣｒであり、ＰｌｓＥｔｎ量の閾値が５８μＭである［１−９］記載の方法。【００４７】
［１−２２］
前記ＭＩ量の閾値が３６．６ｍｇ／ｇＣｒであり、ＰｌｓＥｔｎ量の閾値が５６μＭ又は６１μＭである［１−９］に記載の方法。【００４８】
［１−２３］
前記ＭＩを定量する尿が、特に被験者の空腹時随意尿である［１−９］に記載の方法。【００４９】
［２］
健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の予め求められた閾値と、被験者の自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の定量値とを比較する工程と組み合わせることにより、被験者を認知症患者またはその前段階にある者か否かを分類する認知症検査に用いるものであって、
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する工程を含み、該工程中に、健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の、予め求められた閾値に対して、被験者のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の定量値を比較する工程を含む、エタノールアミン型プラスマローゲンの定量方法。【００５０】
［２−１］
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する工程が、酵素を利用する反応により、最終的に過酸化水素が生成され、該エタノールアミン型プラスマローゲンの存在量に対応して発生する過酸化水素の量を検出して、血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ量を算出する工程を含む［２］の方法。【００５１】
［２−２］
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、以下の（１）〜（３−４）の工程を含む［２］に記載の方法。
（１）エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素を用いて、被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する工程：
（２）エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解でき、かつエーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できない加水分解酵素を用いて、前記（１）にて生成されたエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をグリセロ−３−ホフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解する工程：及び
（３−１）グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンを加水分解してエタノールアミンにせしめる酵素にて、工程（２）で得られたグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンを加水分解してエタノールアミンにする工程：
（３−２）エタノールアミンを酸化する酵素により、エタノールアミンから過酸化水素を発生せしめる工程：
（３−３）過酸化水素を過酸化水素定量手段により定量する工程：及び
（３−４）前記被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ量を算出する工程：
または前記（２）の加水分解酵素が、リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、前記（１）〜（３−４）の工程に先立つか、少なくとも前記（２）工程の前までに、下記（４）及び（５）を含む工程を行うことを特徴とする方法。
（４）ホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素を用いて、血清または血漿中に混在するホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する工程：及び
（５）リゾホスフォリパーゼ及び／又はモノグリセリドリパーゼを用いて、前記（４）工程により生成されるリゾホスファチジルエタノールアミンを分解し、実質的に消去する工程。【００５２】
［２−３］
前記工程（２）の加水分解酵素が、下記（ａ）または（ｂ）の酵素のいずれかである［２−２］に記載の方法。
（ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列：
（ｂ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列：
からなる酵素であって、エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）を加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒する。【００５３】
［２−４］
前記工程（１）のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素が、下記（ｃ）または（ｄ）のいずれかの酵素である［２−２］に記載の方法。
（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列：
（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であり、エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する作用を触媒する。 【００５４】
［２−５］
前記（２）の加水分解酵素が、リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、前記（１）〜（３−４）の工程に先立つか、少なくとも前記（２）工程の前までに、下記（４）及び（５）を含む工程を行うことを特徴とする［２−２］〜［２−４］に記載の方法。
（４）ホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素を用いて、血清または血漿中に混在するホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する工程：及び
（５）リゾホスフォリパーゼ及び／又はモノグリセリドリパーゼを用いて、前記（４）工程により生成されるリゾホスファチジルエタノールアミンを分解し、実質的に消去する工程。【００５５】
［２−６］
前記工程（４）のホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素としてホスフォリパーゼ（ＰＬ）を使用し、該ＰＬは、前記工程（１）のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素としての作用を兼ねさせて新たな該ＰＬを添加することなく前記工程（１）の工程を進行せしめ、前記工程（５）を実施と同時、または前記工程（５）の実施後に、前記工程（１）が完了し、以後前記工程（２）〜（３−４）を実施する［２−５］に記載の方法。【００５６】
［２−７］
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、以下の（１）〜（３−３）´の工程を含む［２−１］に記載の方法。
（１）エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素を用いて、被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する工程：
（２）´エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミンとプラズメニルホスファチジン酸に加水分解でき、かつエーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解でき、かつリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる加水分解酵素を用いて、前記（１）にて生成されたエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミンとプラズメニルホスファチジン酸に加水分解する工程：及び
（３−１）´エタノールアミンを酸化する酵素により、工程（２）´で得られたエタノールアミンから過酸化水素を発生せしめる工程：
（３−２）´過酸化水素を過酸化水素定量手段により定量する工程：及び
（３−３）´前記被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ量を算出する工程。【００５７】
［２−８］
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、前記（１）〜（３−３）´の工程に先立つか、少なくとも前記（２）工程の前までに、下記（４）及び（５）を含む工程を行うことを特徴とする［２−７］に記載の方法。
（４）ホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素を用いて、血清または血漿中に混在するホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する工程：及び
（５）リゾホスフォリパーゼ及び／又はモノグリセリドリパーゼを用いて、前記（４）工程により生成されるリゾホスファチジルエタノールアミンを分解し、実質的に消去する工程。【００５８】
［２−９］
前記工程（４）のホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素としてホスフォリパーゼ（ＰＬ）を使用し、該ＰＬは、前記工程（１）のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素としての作用を兼ねさせて新たな該ＰＬを添加することなく前記工程（１）の工程を進行せしめ、前記工程（５）を実施と同時、または前記工程（５）の実施後に、前記工程（１）が完了し、以後前記工程（２）〜（３−３）´を実施する［２−８］に記載の方法。【００５９】
［３］
健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の予め求められた閾値と、被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の定量値とを比較する工程と組み合わせることにより、被験者を認知症患者またはその前段階にある者か否かを分類する認知症検査に用いるものであって、
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する工程を含み、該工程中に、健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の、予め求められた閾値に対して、被験者の自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の定量値を比較する工程を含む、ミオイノシトール（ＭＩ）の定量方法。【００６０】
［３−１］
自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の予め求められた閾値が、２１．６〜６３．３ｍｇ／ｇＣｒの範囲から選択される値であり、血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の予め求められた閾値が、５０〜６４μＭの範囲から選択される値であって、被験者の自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の定量値が、前記ＭＩ閾値を越え、かつ被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の定量値が、前記ＰｌｓＥｔｎ閾値を下回った場合に、認知症患者またはその前段階にある者と区分する［３］に記載の方法。【００６１】
［３−２］ 
前記ＭＩ量の閾値が２５ｍｇ／ｇＣｒである［３−１］に記載の方法。【００６２】
［３−３］
前記ＭＩ量の閾値が３３．２ｍｇ／ｇＣｒである［３−１］ に記載の方法。【００６３】
［３−４］ 
前記ＭＩ閾値が３６．６ｍｇ／ｇＣｒである［３−１］ に記載の方法。【００６４】
［３−５］ 
前記ＭＩ量の閾値が４４．８ｍｇ／ｇＣｒである［３−１］ に記載の方法。【００６５】
［３−６］ 
前記エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）閾値が、５８μＭである［３−１］ に記載の方法。【００６６】
［３−７］
前記エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）閾値が、６１μＭである［３−１］ に記載の方法。【００６７】
［３−８］
前記エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）閾値が、５６μＭである［３−１］ に記載の方法。【００６８】
［３−９］
前記被験者のＭＩ量が２１．６〜５５．１ｍｇ／ｇＣｒの範囲から設定される閾値以上であり、ＰｌｓＥｔｎ量が５０〜６４μＭの範囲から設定される閾値以下である［３−１］に記載の方法。【００６９】
［３−１０］
前記被験者のＭＩ量が２１．６〜５５．１ｍｇ／ｇＣｒの範囲から設定される閾値以上であり、ＰｌｓＥｔｎ量が５２〜６１μＭの範囲から設定される閾値以下である［３−１］に記載の方法。【００７０】
［３−１１］
前記被験者のＭＩ量が２９．８〜６３．３ｍｇ／ｇＣｒの範囲から設定される閾値以上であり、ＰｌｓＥｔｎ量が５０〜６４μＭの範囲から設定される閾値以下である［３−１］に記載の方法。【００７１】
［３−１２］
前記被験者のＭＩ量が２９．８〜６３．３ｍｇ／ｇＣｒの範囲から設定される閾値以上であり、ＰｌｓＥｔｎ量が５２〜６１μＭの範囲から設定される閾値以下である［３−１］に記載の方法。【００７２】
［３−１３］
前記ＭＩ量の閾値が３６．６ｍｇ／ｇＣｒであり、ＰｌｓＥｔｎ量の閾値が５８μＭである［３−１］ 記載の方法。【００７３】
［３−１４］
前記ＭＩ量の閾値が３６．６ｍｇ／ｇＣｒであり、ＰｌｓＥｔｎ量の閾値が５６μＭ又は６１μＭである［３−１］ に記載の方法。【００７４】
［３−１５］
前記ＭＩを定量する尿が、特に被験者の空腹時随意尿である［３−１］ に記載の方法。【００７５】
［４］
被験者を認知症患者またはその前段階にある者か否かを分類するための認知症検査方法に用いられる手段であって、
被験者の自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）を定量する手段と、同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する手段とを含み、
健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の予め求められた閾値と、血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の予め求められた閾値のそれぞれに対して、前記被験者のミオイノシトール（ＭＩ）の定量値とエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の定量値を比較して用いる認知症検査手段。【００７６】
［４−１］
前記手段が試薬キットである［４］に記載の認知症検査手段。【００７７】
［４−２］
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する試薬キットが、以下の（１ａ）〜（３ａ）を含む［４−１］に記載の試薬キット。
（１ａ）エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素およびその酵素反応を進めることのできる添加物。
（２ａ）エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解でき、かつエーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できない加水分解酵素およびその酵素反応を進めることのできる添加物。
（３ａ）グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンをエタノールアミンとグリセロリン酸に変換する酵素、エタノールアミンをグリコールアルデヒド、アンモニア、及び過酸化水素に変換する酵素とその酵素反応を進めるにことのできる添加物、さらに必要により過酸化水素を定量するための過酸化水素定量手段。
または前記（２ａ）の加水分解酵素がリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、前記（１ａ）に、さらにリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解する酵素を含む［４−１］に記載の試薬キット。【００７８】
［４−２−１］
前記（２ａ）の加水分解酵素がリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、前記（１ａ）に、さらにリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解する酵素を含む［４−２］に記載の試薬キット。【００７９】
［４−３］
前記（２ａ）の加水分解酵素が、下記（ａ）または（ｂ）の酵素のいずれかである［４−２］または［４−２−１］に記載の試薬キット。
（ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列：
（ｂ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列：
からなる酵素であって、エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）を加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒する。【００８０】
［４−４］
前記（１）のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素、が下記（ｃ）または（ｄ）のいずれかの酵素である［４−２］または［４−２−１］に記載の試薬キット。
（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列：
（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であり、エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する作用を触媒する。 【００８１】
［５］
健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の予め求められた閾値と、被験者の自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の定量値とを比較する工程と組み合わせることにより、被験者を認知症患者またはその前段階にある者か否かを分類する認知症検査に用いるものであって、
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する工程を含み、該工程中に、健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の、予め求められた閾値に対して、被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の定量値を比較して用いる、エタノールアミン型プラスマローゲンの定量手段。【００８２】
［５−１］
前記手段が試薬キットである［５］に記載の定量手段。【００８３】
［５−２］
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する試薬キットが、以下の（１ａ）〜（３ａ）を含む［５−１］に記載の試薬キット。
（１ａ）エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素およびその酵素反応を進めることのできる添加物
（２ａ）エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解でき、かつエーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できない加水分解酵素およびその酵素反応を進めることのできる添加物
（３ａ）グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンをエタノールアミンとグリセロリン酸に変換し、エタノールアミンをグリコールアルデヒド、アンモニア、及び過酸化水素に変換する酵素とその酵素反応を進めるにことのできる添加物、さらに必要により過酸化水素を定量するための過酸化水素定量手段。
または前記（２ａ）の加水分解酵素がリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、前記（１ａ）に、さらにリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解する酵素を含む［５−１］記載の試薬キット。【００８４】
［５−２−１］
前記（２ａ）の加水分解酵素がリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、前記（１ａ）に、さらにリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解する酵素を含む［５−２］に記載の試薬キット。【００８５】
［５−３］
前記（２ａ）の加水分解酵素が、下記（ａ）または（ｂ）の酵素のいずれかである［５−２］または［５−２−１］に記載の試薬キット。
（ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列：
（ｂ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列：
からなる酵素であって、エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）を加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒する。【００８６】
［５−４］
前記（１ａ）のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素、が下記（ｃ）または（ｄ）のいずれかの酵素である［５−２］または［５−２−１］に記載の試薬キット。
（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列：
（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であり、エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する作用を触媒する。【００８７】
［６］
健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の予め求められた閾値と、被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）の定量値とを比較する工程と組み合わせることにより、被験者を認知症患者またはその前段階にある者か否かを分類する認知症検査に用いるものであって、
同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する工程を含み、該工程中に、健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の、予め求められた閾値に対して、被験者の自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）の定量値を比較して用いる、ミオイノシトール（ＭＩ）の定量手段。【００８８】
［６−１］
前記手段が試薬キットである［６］に記載の定量手段。【００８９】
なお、本発明の実施の形態における認知症とは、知能、記憶、見当識含む認知の障害を指し、加齢に伴う現象は含まず、病的に能力が低下する障害を指す。「認知症患者」とは、記憶、判断力などの障害により社会生活が困難な者（特に高齢者）をいう。具体的には、認知機能検査によって認知障害を有するレベルと判定される者（例えば、ＣＤＲスコアが１．０以上）である。また「認知症の前段階にある者」とは、例えば日常生活において記憶、判断力に衰えが観察される者などであり、ＷＡＩＳ−Ｒ、ＨＤＳ−Ｒ、ＭＭＳ、ＭＭＳＥ、ＣＤＲ、ＭｏＣＡ−Ｊ等の認知機能検査方法で検出できる最も軽度な段階を含み、例えばＣＤＲスコアが０．５以上、１．０未満のような者が好ましい。認知症の原因となる疾患は、例えば脳血管障害、アルツハイマー病、正常圧水頭症、代謝障害、栄養障害、甲状腺機能低下、鬱病などがあるが、一例としてアルツハイマー病が挙げられる。【００９０】
「手段」とは組成物、試薬、酵素あるいはそれらの組み合わせの総称を言う。組成物は組成物中の各成分を単一の組成物としてもよいが、２以上の組成物に分離する場合、このような２以上の組成物を合わせてキットという。
「定量」とは「測定」、「検出」等を含む概念をいう。
又本発明に関連する発明として以下が提示される。【００９１】
［７］
被験者の試料のＰｌｓＥｔｎを定量する方法であって、以下の（１）〜（３−４）の工程を含む方法。
（１）エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素を用いて、被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する工程：
（２）エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解でき、エーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できない加水分解酵素を用いて、前記（１）にて生成されたエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解する工程：及び
（３−１）グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンを加水分解してエタノールアミンにせしめる酵素にて、工程（２）で得られたグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンを加水分解してエタノールアミンにする工程：
（３−２）エタノールアミンを酸化する酵素により、エタノールアミンから過酸化水素を発生せしめる工程：
（３−３）過酸化水素を過酸化水素定量手段により定量する工程：及び
（３−４）前記被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ量を算出する工程：
または前記（２）の加水分解酵素が、リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、前記（１）〜（３−４）の工程に先立つか、少なくとも前記（２）工程の前までに、下記（４）及び（５）を含む工程を行うことを特徴とする方法。
（４）ホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素を用いて、血清または血漿中に混在するホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する工程：及び
（５）リゾホスフォリパーゼ及び／又はモノグリセリドリパーゼを用いて、前記（４）工程により生成されるリゾホスファチジルエタノールアミンを分解し、実質的に消去する工程。【００９２】
［８］
前記工程（２）の加水分解酵素が、下記（ａ）または（ｂ）の酵素のいずれかである［７］に記載の方法。
（ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列：
（ｂ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列：
からなる酵素であって、エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）を加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒する。【００９３】
［９］
前記工程（１）のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素、が下記（ｃ）または（ｄ）のいずれかの酵素である［７］に記載の方法。
（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列：
（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であり、エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する作用を触媒する。【００９４】
［１０］
前記（２）に加水分解酵素が、リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、被験者の試料のＰｌｓＥｔｎを定量する方法が、前記（１）〜（３−４）の工程に先立つか、少なくとも前記（２）工程の前までに、下記（４）及び（５）を含む工程を行うことを特徴とする［７］に記載の方法。
（４）ホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素を用いて、血清または血漿中に混在するホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する工程：及び
（５）リゾホスフォリパーゼ及び／又はモノグリセリドリパーゼを用いて、前記（４）工程により生成されるリゾホスファチジルエタノールアミンを分解し、実質的に消去する工程。【００９５】
［１１］
前記工程（４）のホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素としてホスフォリパーゼ（ＰＬ）を使用し、該ＰＬは、前記工程（１）のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素としての作用を兼ねさせて新たな該ＰＬを添加することなく前記工程（１）の工程を進行せしめ、前記工程（５）を実施と同時、または前記工程（５）の実施後に、前記工程（１）が完了し、以後前記工程を（２）〜（３−４）実施する［１０］に記載の方法。【００９６】
［１２］
被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する試薬キットであって、以下の（１ａ）〜（３ａ）を含む試薬キット。
（１ａ）エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素およびその酵素反応を進めることのできる添加物。
（２ａ）エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解でき、かつエーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できない加水分解酵素およびその酵素反応を進めることのできる添加物。
（３ａ）グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンをエタノールアミンとグリセロリン酸に変換する酵素、エタノールアミンをグリコールアルデヒド、アンモニア、及び過酸化水素に変換する酵素とその酵素反応を進めるにことのできる添加物、さらに必要により過酸化水素を定量するための過酸化水素定量手段。【００９７】
または前記（２ａ）の加水分解酵素がリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、前記（１ａ）に、さらにリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解する酵素を含む試薬キット。【００９８】
［１２−１］
前記（２ａ）の加水分解酵素がリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、前記（１ａ）に、さらにリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解する酵素を含む［１２］に記載の試薬キット。【００９９】
［１３］
前記（２ａ）の加水分解酵素が、下記（ａ）または（ｂ）の酵素のいずれかである［１２］または［１２−１］に記載の試薬キット。
（ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列：
（ｂ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列：
からなる酵素であって、エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）を加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒する。【０１００】
［１４］
前記（１ａ）のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素が、下記（ｃ）または（ｄ）のいずれかの酵素である［１２］または［１２−１］に記載の試薬キット。
（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列：
（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であり、エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する作用を触媒する。【０１０１】
［１５］
下記（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列を含む遺伝子。
（Ａ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなる酵素をコードする：  
（Ｂ）配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素であって、エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）を加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒する酵素をコードする。【０１０２】
［１６］
［１５］に記載の遺伝子を含む組換えベクター。【０１０３】
［１７］
［１６］に記載の組換えベクターを含む形質転換体。【０１０４】
［１８］
前記酵素の製造方法であって：
［１５］に記載の遺伝子をもつ微生物、または［１７］に記載の形質転換体を培地で培養する工程：
培養物中に［１３］に記載の酵素を生成蓄積させる工程：及び
該培養物から該蛋白質を採取する工程：
を含む方法。【０１０５】
［１９］
前記ＰｌｓＥｔｎを定量する試薬キットに含有させる下記（ｃ）または（ｄ）の酵素：
（ｃ）配列番号５に記載のアミノ酸配列：
（ｄ）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であり、エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する作用を触媒する。【０１０６】
【微生物の寄託】
【０１０７】
本発明に係る以下の微生物をブダペスト条約に基づき国際寄託している。
［ＮＡ２９７］
寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
住所：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
寄託日：２０１０年１２月7日
受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１４
［Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．］
寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
住所：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号
寄託日：２０１３年５月１７日
受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６２８
【発明の効果】
【０１０８】
検査の実施形態および被験者への負担を実施的に増大させることなく、血清及び／又は血漿中ＰｌｓＥｔｎ量の定量による認知検査の精度を向上させることが可能となる。【０１０９】
尿ＭＩ量の定量と血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量の定量を併用することで、認知機能の障害のレベルを高い確度で評価することもできる。従って、すでに認知症を発症している患者のみらならず、認知症の前段階にある者をも特定することが可能となる。【０１１０】
被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎを定量するためのｌｙＰｌｓ  ａｓｅとＰＬを含有する認知症検査試薬キットを提供することが可能となる。【０１１１】
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】実施例において定量した全被験者を群別した場合の尿ＭＩ量である。実測値は表５に示した。
【図２】実施例において、健常者群と「もの忘れ」群のそれぞれについて尿ＭＩ量およびＨｂＡ１ｃ量がＰｌｓＥｔｎ量に及ぼす影響を検討した結果である。
【図３】実施例において、全高齢者（健常＋「もの忘れ」群）を対象に血清ＰｌｓＥｔｎ（ＥＰ）量と尿ＭＩ量の全定量値の平均値を境に４群に分割して、各群での認知機能検査結果を比較した結果である。実測値は表６に示した。
【図４】血清ＰｌｓＥｔｎ量が５８μＭ未満、尿ＭＩ量が２５ｍｇ／ｇＣｒ以上をそれぞれの基準とした場合の認知症患者（ＣＤＲ≧０．５）の検出確度を検討した結果である。
【図５】全高齢者、尿ＭＩ量＞２５ｍｇ／ｇＣｒ高齢者群および尿ＭＩ量＞３６．６ｍｇ／ｇＣｒ高齢者群の３群について、血清ＰｌｓＥｔｎ量の認知機能正常（ＣＤＲ値：０）と認知機能非正常（ＣＤＲ値：０．５以上）を分別する精度について、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）解析によるＲＯＣ曲線下の面積（Ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ：ＡＵＣ）を求めることによって調べた結果である。
【図６】血清ＰｌｓＥｔｎ量の認知機能評価能と既存の認知機能検査法との相関性を、対象者を全高齢者、尿ＭＩ量＞２５ｍｇ／ｇＣｒ高齢者群および尿ＭＩ量＞３６．６ｍｇ／ｇＣｒ高齢者群の３群について検討した結果である。実測値は表７に示した。
【図７】本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を、ＰＬ及び加水分解酵素を用いて定量する方法の一例を示す概略図。
【図８】本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を、ＰＬ及び加水分解酵素を用いて定量する方法の、図７と別異な一例を示す概略図。
【図９】ホスファチジルエタノールアミンを実質的に消去する工程を示す概略図。
【図１０】被験の、３日分の随時尿中ＭＩ定量値と空腹時二番尿中ＭＩ定量値の平均値を比較した相関図。
【図１１】プール血清中ＰｌｓＥｔｎ（図中白丸）と０．９％食塩水中ＰｌｓＥｔｎ（図中黒丸）を、酵素を利用して定量した検量線。
【図１２】１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法とＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅを利用した血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎの定量値を比較した相関図。
【図１３】１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法とＴｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅを利用した血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎの定量値を比較した相関図。
【図１４】１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法とＰＬＤを利用した血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎの定量値を比較した相関図。
【図１５】Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ組換体酵素を示す（図中矢印）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図１６】粗蛋白質液中Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅ大腸菌組換体酵素を示す（図中矢印）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【０１１３】
【発明を実施するための形態】
【０１１４】
本発明は、被験者の自然排泄尿中のミオイノシトール（ＭＩ）を定量する工程と、同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する工程とを含み、被験者を認知症患者またはその前段階にある者か否かを分類するための認知症検査方法である。該認知症検査方法は、同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する工程を含むものであって、健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、ＭＩとＰｌｓＥｔｎとのそれぞれの、予め求められた閾値に対して、被験者のＭＩとＰｌｓＥｔｎの定量値を比較する工程を含む、前記の認知症検査方法に関する。
【０１１５】
被験者とは採尿及び／又は採血の対象となる健常人や患者を指し、年齢、性別、人種、基礎疾患などは限定せず、ヒト以外の実験動物なども含む。ヒトの場合、治験及び臨床試験に参加し治験薬の投与を受けるか又はその対象となる個人、すなわち治験モニター、医薬モニター、医薬ボランティア、創薬ボランティアなどの場合でも良く、ＷＡＩＳ−Ｒ、ＨＤＳ−Ｒ、ＭＭＳ、ＭＭＳＥ、ＣＤＲ、ＭｏＣＡ−Ｊ等の認知機能検査で認知症が疑われた患者又は健常人、認知症の自覚及び／又は他覚症状がある患者又は健常人でも良い。被験者には、食事制限などは設けなくても良いが、健康診断の場合は通常食事制限がある。
【０１１６】
本発明の実施の形態における尿は、薬剤等により強制的に排泄されたものではない自然排泄尿である。この自然排泄尿は、尿意を感じた際に排泄された随時尿であってもよいが、好ましくは平均的な生活サイクルにおいて朝食時前に排泄される早朝空腹時尿、さらに好ましくは早朝空腹時尿の後の空腹時に排泄される空腹時二番尿である。これらの尿は、連日あるいは適当な隔日（１ヶ月以内）の３日分を定量対象とする。３日分の採尿が困難な場合は、２日分あるいは１日分でもよいが、その場合の尿は空腹時二番尿であることが好ましい。また空腹時二番尿の採取が困難な場合は、早朝空腹時尿でよいが、その場合は３日分以上の尿の採取が好ましい。
【０１１７】
本発明は被験者の自然排泄尿中のＭＩを定量する工程を含む。本発明の実施の形態におけるＭＩは背景技術に記載した公知のＭＩを含む。ＭＩはＧＣ−ＭＡＳＳで定量する方法（Ｔｏｓｈｉｍｉｔｓｕ  Ｎｉｗａ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２２７（１９８３），２５−３９）、免疫測定法（特開平８−２１８３５号公報）、酵素法［Ｒｏｓｗｉｔｈａ  Ｄｏｌｈｏｆｅｒ，Ｏ．Ｈ．Ｗｉｅｌａｎｄ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５，７３３−７３６（１９８７）］、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）法やＨＰＬＣ法等の公知の方法で定量すれば良く、好ましくはミオイノシトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１８）を用いる方法（特許文献３、４）であり、さらに好ましくはミオイノシトール測定試薬ルシカＭＩ（旭化成ファーマ株式会社）を用いて定量する。
【０１１８】
本発明の実施の形態における尿は定量まで冷蔵保存することが好ましい（１年以上安定）。室温放置でも数日以内であれば問題はない。また、防腐剤として０．０５％アジ化ナトリウムあるいは０．１％プロクリンを添加しても定量に影響しない。
【０１１９】
ＭＩは定性反応によりＭＩの存在を検出する方法により行ってもよいが、定量することが好ましい。ＭＩを定量するとは、ＭＩが含まれている可能性のある被験者の尿と、ＭＩを既知の濃度で含む校正用の試料を、それぞれ単独にＭＩを公知の方法で検出し、ＭＩが含まれている可能性のある被験者の尿中のＭＩの濃度は、ＭＩが含まれている可能性のある被験者の尿についての検出量と、ＭＩを既知の濃度で含む校正用の試料についての検出量とを比較することにより算出することである。尿ＭＩ量は、同時に測定するクレアチニン１ｇ（ｇＣｒ）値で標準化した値（ｍｇ）として表示し、通常、複数検体の平均値として算出することが好ましく、３検体以上の定量値の中で他の定量値と大きく異なる値を示す検体がある場合は、これを除外することが好ましい。また、２検体しか定量されていない場合で、両者の定量値が大きく異なる場合は、再定量すれば良い。
【０１２０】
本発明はＭＩを定量する同一被験者の血清又は血漿中（血清及び／又は血漿）のＰｌｓＥｔｎを定量する工程を含む。ＭＩを定量する同一被験者にはＭＩを定量された被験者を含み、ＭＩとＰｌｓＥｔｎの定量の順序は任意である。被験者から血液を通常通り採血し、できるだけ早期に遠心分離し、採取した血清または血漿は速やかに冷蔵（４℃）あるいは凍結保存（−２０℃〜−８０℃）する。血液の状態で一時保管する場合は冷蔵保存し、少なくとも採血日当日に血清あるいは血漿分離までの処理を施すことが好ましい。血漿を取得する場合には、分離剤や抗プラスミン剤等の使用の有無は特に限定されず、ＥＤＴＡ、フッ化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム、モノヨード酢酸等の抗凝固剤や解糖阻止剤の使用の有無も特に限定されない。
【０１２１】
本発明の実施の形態における「検体」または「試料」はＰｌｓＥｔｎを含むと予想される試料であり、上記の被験者の尿、血清及び血漿を含み、ＰｌｓＥｔｎを添加した溶液、血清及び血漿でもよい。本発明の実施の形態における「検体」または「試料」はＰｌｓＥｔｎを含むと予想される試料であれば限定されないが、被験者の尿、血清、及び/または血漿であれば好ましい。その他の試料の例としては、実験動物由来の尿、血清、血漿や植物組織、海水、天然水、果汁、飲料、廃液等が挙げられる。
【０１２２】
本発明の実施の形態におけるＰｌｓＥｔｎは、グリセロリン脂質のＣ１（ｓｎ−１）位に脂肪酸がビニルエーテル結合したアルケニルアシル型グリセロリン脂質（アルケニルアシル型エーテルリン脂質）で塩基がエタノールアミンである、Ｊｏｕｒａｎａｌ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、１４巻、１号、２００７年、１２−１８頁やＪ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１０年、３５巻、１号、５９−６２頁等で開示された公知のＰｌｓＥｔｎであり、以下の式のＰｌｓＥｔｎである。：
【０１２３】
【化１】
2014010667.tif 000003
【０１２４】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、低級若しくは高級アルキル基又はアルケニル基である）
本発明の実施の形態におけるＰｌｓＥｔｎには以下の式のＰｌｓＥｔｎのリゾ体（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）を含む場合もある。
【０１２５】
【化２】
2014010667.tif 000004
【０１２６】
（式中、Ｒ３は、低級若しくは高級アルキル基又はアルケニル基である）
本発明は、被験者の自然排泄尿中のＭＩを定量する工程と、同一被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎを定量する工程とを含む、該被験者を認知症患者またはその前段階にある者か否かを分類するための認知症検査方法であって、健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、ＭＩとＰｌｓＥｔｎとのそれぞれの、予め求められた閾値に対して、被験者のＭＩとＰｌｓＥｔｎの定量値を比較する工程を含む、前記の認知症検査方法も含む。
【０１２７】
本発明の実施の形態において被験者を認知症またはその前段階にある者と分類する尿ＭＩ量の基準は、健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、ＭＩとＰｌｓＥｔｎとのそれぞれの、予め求められた閾値に対して、被験者のＭＩとＰｌｓＥｔｎの定量値を比較する。尿ＭＩの閾値は、健常成人の平均値±標準偏差の上限値から、健常高齢者の平均値±標準偏差の上限値までの範囲から設定すれば良い。
【０１２８】
一例として、尿ＭＩの閾値は、健常成人の平均値±標準偏差（１３．１±８．５ｍｇ／ｇＣｒ、ｎ＝４４４、平均年齢３９．６±１０．６歳）の上限値である２１．６ｍｇ／ｇＣｒから、健常高齢者の平均値±標準偏差（３３．０±２２．１ｍｇ／ｇＣｒ、ｎ＝７６、平均年齢７２．７±５．６歳）の上限値である５５．１ｍｇ／ｇＣｒまでの範囲から設定できる。
【０１２９】
従って、本発明の実施の形態において被験者を認知症またはその前段階にある者と分類する尿ＭＩ量の基準は、空腹時二番尿の場合、２１．６〜５５．１ｍｇ／ｇＣｒの範囲から設定される閾値以上としても良い。また、下記の実施例に示したとおり、２５ｍｇ／ｇＣｒを尿ＭＩ量の閾値とすることにより、血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量の定量との併用による認知症の検出確度が向上することから、尿ＭＩ量の閾値として２５ｍｇ／ｇＣｒを採用することも好ましい。さらに、下記の実施例に示したとおり、３６．６ｍｇ／ｇＣｒを尿ＭＩ量の閾値とすることにより、血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量の定量との併用による認知症の検出確度が向上することから、尿ＭＩ量の閾値として３６．６ｍｇ／ｇＣｒを採用することも好ましい。下記の実施例に示したとおり、随時尿ＭＩ量は平均的に空腹時二番尿より８．２ｍｇ／ｇＣｒ増加していることから、２９．８〜６３．３ｍｇ／ｇＣｒの範囲から設定される閾値以上としても良く、随時尿の場合３３．２又は４４．８ｍｇ／ｇＣｒを閾値として採用することも好ましい。
【０１３０】
被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎの閾値の下限値は、健常成人の平均値±標準偏差の下限値および健常高齢者の平均値±標準偏差の下限値より１〜２μＭ低く設定すれば良い。被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎの閾値の上限値は、全高齢者（健常＋認知障害）における尿ＭＩ量の平均値以上の高齢者を対象に作出されたＣＤＲとＰｌｓＥｔｎの相関近似曲線式に、ｙ＝０．５（ＣＤＲ、認知障害疑い）を代入して得られるｘとすれば良い。
【０１３１】
一例として、被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎを定量する工程が、後述する血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法を利用して定量したる場合の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量の閾値の下限値は、健常成人の平均値±標準偏差（７３．０±１９．５μＭ、ｎ＝４３９）の下限値は５３．５であり、健常高齢者の平均値±標準偏差（７３．３±２０．５μＭ、ｎ＝９７）の下限値は５２．８μＭなので、５２μＭとすることもできる。また、被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎを定量する工程が、後述する血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法を利用して定量したる場合の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量の閾値の上限値は、全高齢者（健常＋認知障害）における尿ＭＩ量の平均値である３６．６  ｍｇ／ｇＣｒ以上の高齢者を対象に作出されたＣＤＲとＰｌｓＥｔｎの相関近似曲線式（ｙ＝−０．０１９７ｘ＋１．６９０）に、ｙ＝０．５（ＣＤＲ、認知障害疑い）を代入して得られるｘ（ＰｌｓＥｔｎ）の値６０．４μＭと概算することもできる。
【０１３２】
従って、本発明の実施の形態において、被験者を認知症またはその前段階にある者と分類する血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量の基準は、被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎを定量する工程が、後述する血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法を利用した定量である場合、血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量が５２〜６１μＭの範囲から設定される閾値以下としても良い。
【０１３３】
被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎを定量する工程が、後述する酵素を利用した定量である場合、測定値の平均値は、１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法を利用した定量である場合の平均値−２μＭから＋３μＭの範囲である。したがって、本発明の実施の形態において、被験者を認知症またはその前段階にある者と分類する血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量の基準は、被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎを定量する工程が、後述する酵素を利用した定量である場合、血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量が５０〜６４μＭの範囲から設定される閾値以下としても良い。
【０１３４】
さらに、下記の実施例に示したとおり、空腹時二番尿ＭＩ量の閾値が３６．６ｍｇ／ｇＣｒ、随時尿中のであり、血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法により定量する場合、血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量の閾値が後述するように約５８μＭである場合に認知症検出の確度が最適となっており、これらの閾値を採用することが特に好ましい。また、被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎを定量する工程が、後述する酵素を利用した定量である場合、血漿ＰｌｓＥｔｎ量の閾値が約５６または６１μＭの閾値を採用することが特に好ましい。
【０１３５】
なお、実際の検査においては、尿ＭＩ量と血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量は全ての被験者について定量し、前記の基準に基づいて分類判定を行うことができる。あるいは、血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量が閾値以下の被験者について尿ＭＩ量を定量するか、または尿ＭＩ量が閾値以上の被験者について血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量してもよい。好ましくは、定量の手順がより簡便である尿ＭＩ量を全被験者について定量し、その結果に基づいて血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量の定量を行うことができるがこれに限定されない。
【０１３６】
本発明の実施の形態において血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量するとは、ＰｌｓＥｔｎが含まれている可能性のある被験者の血清又は血漿と、ＰｌｓＥｔｎを既知の濃度で含む校正用の試料を、それぞれ単独にＰｌｓＥｔｎを公知の方法及び/または本発明の方法で検出し、ＰｌｓＥｔｎが含まれている可能性のある被験者の血清又は血漿のＰｌｓＥｔｎの濃度は、ＰｌｓＥｔｎが含まれている可能性のある被験者の血清又は血漿についての検出量と、ＰｌｓＥｔｎを既知の濃度で含む校正用の試料についての検出量とを比較することにより算出することである。本発明の実施の形態においては、通常１モルのＰｌｓＥｔｎから1モルのグリセロ−３−ホスフォエタノールアミン又はエタノールアミンが生成物として得られるのでグリセロ−３−ホスフォエタノールアミン又はエタノールアミンを定量すればＰｌｓＥｔｎ量を算出できる。本発明の実施の形態においては、通常１モルのＰｌｓＥｔｎから1モルの過酸化水素が生成物として得られるので過酸化水素を定量すればＰｌｓＥｔｎ量を算出できる。
【０１３７】
本発明の実施の形態において血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量は、例えば特許文献１に記載された放射性ヨウ素−高速液体クロマトグラフィー（１２５Ｉ−ＨＰＬＣ）法により、定量できる。ＰｌｓＥｔｎを１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法で定量する場合、血清及び／又は血漿は冷蔵保存あるいは速やかに凍結融解した血清及び／又は血漿を一定量（通常、２００μＬ）使用し、脂質成分を規定の方法で抽出する。測定用試料（抽出脂質成分）は速やかにＰｌｓＥｔｎの定量に供することが好ましいが、測定まで一時的に保管する場合はメタノールやジエチルエーテル中は避け、クロロホルム中で冷凍保存（−２０℃〜−８０℃）することが好ましい。
【０１３８】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程は、酵素を利用した定量であっても良い。
【０１３９】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程は、以下の（１）〜（３−４）の工程のいずれかまたは複数を含んでもよく、また、さらに（１）〜（３−４）の全てを含んでもよい。
（１）エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解できる酵素を用いて、被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する工程：
（２）エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解でき、エーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できない加水分解酵素を用いて、前記（１）にて生成されたエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をグリセロ−３−ホフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解する工程：及び
（３−１）グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンを加水分解してエタノールアミンにせしめる酵素にて、工程（２）で得られたグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンを加水分解してエタノールアミンにする工程：
（３−２）エタノールアミンを酸化する酵素により、エタノールアミンから過酸化水素を発生せしめる工程：
（３−３）過酸化水素を過酸化水素定量手段により定量する工程：及び
（３−４）前記被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ量を算出する工程：
または前記（２）の加水分解酵素が、リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、同一被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）を定量する方法が、前記（１）〜（３−４）の工程に先立つか、少なくとも前記（２）工程の前までに、下記（４）及び（５）を含む工程を行うことを特徴とする方法。
【０１４０】
上記工程（１）〜（３−４）を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法の一例を概略して図７に示した。工程（１）はＰＬの作用で、ＰｌｓＥｔｎをｌｙＰｌｓＥｔｎに加水分解する工程である。さらに必要によりリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解する酵素、好ましくはリゾホスフォリパーゼ（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ、ＬＹＰＬと略す場合がある）を用いてリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解する工程を含む場合があるがこれに限定されない。工程（２）は加水分解酵素の作用で、ｌｙＰｌｓＥｔｎを加水分解する工程である。工程（３−１）は工程（２）で得られた生成物をＧｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ（ＧＰＣＰ）とエタノールアミンオキシダーゼ（ＥＡＯ）の作用で過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）とする工程である。工程（３−２）の過酸化水素は後述する公知の方法で定量すれば良い。
【０１４１】
図７に示した上記工程（１）の好適な例は、ＰＬの作用により、ＰｌｓＥｔｎをｌｙＰｌｓＥｔｎと脂肪酸に加水分解する工程である。図７に示した上記工程（２）の好適な例は、ｌｙＰｌｓ  ａｓｅの作用により、ｌｙＰｌｓＥｔｎをグリセロ−３−ホスフォエタノールアミン（ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）と対応するアルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅ）に加水分解する工程である。図７に示した上記工程（３−１）の好適な例は、工程（２）で得られたグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンをＧｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ（ＧＰＣＰ）の作用により、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンをエタノールアミン（ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）とグリセロリン酸（ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に加水分解し、エタノールアミンオキシダーゼの作用でエタノールアミンを過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、アンモニア（ＮＨ３、アンモニウム塩も含む）とグリコールアルデヒド（ｇｌｙｃｏｌａｌｄｅｈｙｄｅ）に酸化する工程である。
【０１４２】
上記工程（１）〜（３−４）を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法において、被験者の血清及び／又は血漿中にＰｌｓＥｔｎのみ、又はＰｌｓＥｔｎとｌｙＰｌｓＥｔｎが混在する場合は、後述する本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅ及びＰＬの作用を利用して血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量することが好ましいがこれに限定されない。被験者の血清及び／又は血漿中にｌｙＰｌｓＥｔｎのみが存在する場合は本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅの作用を利用して血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量することが好ましいがこれに限定されない。
【０１４３】
上記工程（１）〜（３−４）を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法において、工程（１）で用いるＰＬは、ＰｌｓＥｔｎをｌｙＰｌｓＥｔｎに加水分解する作用を触媒する酵素であれば限定されない。この様な酵素の好ましい例として配列番号５のアミノ酸配列を有するＰＬが挙げられる。また、配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＰｌｓをｌｙＰｌｓに加水分解する作用を触媒する酵素も挙げられ、その例は後述する本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅの場合と同様である。該ＰＬはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓに分類されるＮＡ２９７（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１４として寄託済み）を用いて国際公開番号：ＷＯ２０１２／１０５５６５  Ａ１に記載の製造方法で製造できる新規なホスホリパーゼＡ１である。
【０１４４】
上記工程（１）〜（３−４）を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法において、工程（１）で用いるその他のＰＬとしてはホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２、ＰＬＡ２と略す場合がある）、ホスホリパーゼＡ１（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ１、ＰＬＡ１と略す場合がある）、及びホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）が挙げられる。
【０１４５】
ＰＬＡ２は、ＥＣ  ３．１．１．４と分類される酵素を含む。ＰＬＡ２の好適な例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ由来ＰＬＡ２（ＰＬＡ２（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−３１））及びＰＬＡ２ナガセ（ナガセケムテックス（株）））、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来ＰＬＡ２（マキサパールＡ２及びケーキザイム（ともにディー・エス・エム  ジャパン（株）））、豚の膵臓由来ＰＬＡ２（リポモッド６９９Ｌ（ジェネンコア協和（株）））、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来ホスホリパーゼ（レシターゼ（ノボザイムズ  ジャパン（株））、ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ由来ＰＬＡ２（ＳＩＧＭＡ（Ｐ２２３））が挙げられる。
【０１４６】
ＰＬＡ１は、ＥＣ  ３．１．１．３２と分類される酵素を含む。ＰＬＡ１の好適な例としてはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来（三菱化学フーズ（株））が挙げられる。
【０１４７】
ＰＬＢはＰＬＡ１及びＰＬＡ２の作用を均等に又は不均等に併せ持つ。ＰＬＢの好適な例としては、特許第５０６０６６６号で開示された酵素、ＷＯ２００７−０１０８９２で開示された酵素、ＬＰＢＰ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−６３））及びＣＥＢＰ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−６６））が挙げられる。
【０１４８】
上記工程（１）〜（３−４）を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法において、工程（２）でｌｙＰｌｓＥｔｎを加水分解する酵素を用いる場合、該加水分解酵素はｌｙＰｌｓＥｔｎをグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンと対応するアルデヒド（単にアルデヒドと記載する場合がある）に加水分解する酵素を含む酵素であれば良いがこれに限定されない。
【０１４９】
また、工程（２）でｌｙＰｌｓＥｔｎを加水分解する酵素を用いる場合、該加水分解酵素は、少なくともエーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解しない酵素であればさらに好ましい。後述のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来、ラット由来、及びＴｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．由来のｌｙＰｌｓＥｔｎのｌｙＰｌｓＥｔｎをグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解する酵素はエーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解しない。
【０１５０】
上記工程（１）〜（３−４）を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法において、工程（２）で用いる加水分解酵素には、ＥＣ  ３．３．２．２またはＥＣ  ３．３．２．５と分類されるｌｙＰｌｓ  ａｓｅを含む。この様な酵素の例としてはＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＶＯＬ．２８６，ＮＯ．２８，ｐｐ．２４９１６−２４９３０で開示されたラット由来のｌｙＰｌｓ  ａｓｅが挙げられ、好ましくは後述する本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅである。
【０１５１】
上記工程（１）〜（３−４）を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法において、工程（３−１）では、グリセロホスホコリンホスホジエステラーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ、ＧＰＣＰと略す場合がある）を利用することができる。該ＧＰＣＰはＥＣ  ３．１．４．２と分類される酵素を含み、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンをエタノールアミンとグリセロリン酸加水分解する作用を触媒する酵素であれば限定されない。ＧＰＣＰの好適な例としてはＧｌｉｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ由来ＧＰＣＰ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−３３））が挙げられる。
【０１５２】
上記工程（１）〜（３−４）を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法において、工程（３−２）ではエタノールアミンオキシダーゼを利用することができる。該エタノールアミンオキシダーゼは、モノエタノールアミンオキシダーゼ（ＥＣ  １．４．３．８）、モノアミンオキシダーゼ（ＥＣ  １．４．３．４）、及び一級アミンオキシダーゼ（ＥＣ  １．４．３．２１）と分類される酵素を含み、エタノールアミンをＨ２Ｏ２、ＮＨ３とグリコールアルデヒドに酸化する作用を触媒する酵素であれば限定されない。エタノールアミンオキシダーゼの好適な例としてはＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属由来の酵素（Ｎａｒｒｏｄ  Ｓ．Ａ．及びＪａｋｏｂｙ  Ｗ．Ｂ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２３９巻、２１８９−２１９３頁、１９６４年）、Ｐｈｏｒｍｉａ  ｒｅｇｉｎａ由来の酵素（Ｋｕｌｋａｒｎｉ  Ａ．Ｐ．及びＨｏｄｇｓｏｎ  Ｅ．、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、Ｂ４４巻、４０７−４２２頁、１９７３年）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．（ＦＥＲＭ  Ｐ−０６２４０及びＢＰ−０４２１）由来の一級アミンオキシダーゼ（Ｏｔａ  Ｈ．ら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２巻、２７３２−２７３８頁、２００８年）が挙げられ、エタノールアミンに対する基質特異性が高いという観点からは特開２００５−５２０３４号公報で開示された分析方法に用いられるモノアミンオキシダーゼ（チラミンオキシダーゼ）が特に好ましい。
上記工程（１）〜（３−４）を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法は、前記（２）の加水分解酵素が、リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、上記（１）〜（３−４）の工程に先立つか、少なくとも前記（２）工程の前までに、下記（４）及び（５）を含む工程を行う方法であれば好ましいがこれに限定されない。工程（４）及び（５）は図９に概略して示した。
（４）ホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素を用いて、血清または血漿中に混在するホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する工程：及び
（５）リゾホスフォリパーゼ及び／又はモノグリセリドリパーゼを用いて、前記（４）工程により生成されるリゾホスファチジルエタノールアミンを分解し、実質的に消去する工程。
【０１５３】
ここで「前記（２）の加水分解酵素が、リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合」とは本実施の形態のＰｌｓＥｔｎの定量値において、被験者を認知症患者またはその前段階にある者か否かを分類する目的に影響を与える程度にリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解することを意味する。例えば、リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解する程度がｌｙＰｌｓＥｔｎに対して１５％以下、更には１２％以下であり、１０％以下の場合があるがこれに限定しない。
【０１５４】
例えば、後述のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来とラット由来のｌｙＰｌｓＥｔｎをグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解する酵素はリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解しない酵素である。また、後述のＴｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．由来のｌｙＰｌｓＥｔｎをグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解する酵素は、リゾホスファチジルエタノールアミンをｌｙＰｌｓＥｔｎに対して１２％加水分解するので、リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解する酵素である。
【０１５５】
上記工程（１）〜（３−４）を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法は、前記工程（４）のホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素としてＰＬを使用し、該ＰＬは、前記工程（１）のＰｌｓＥｔｎをｌｙＰｌｓＥｔｎに加水分解できる酵素としての作用を兼ねさせて新たな該ＰＬを添加することなく前記工程（１）の工程を進行せしめ、前記工程（５）を実施と同時、または前記工程（５）の実施後に、前記工程（１）が完了し、以後前記工程（２）〜（３−４）を実施する方法でも良い。
【０１５６】
上記工程（４）及び（５）は、被験者の血清または血漿中にホスファチジルエタノールアミン及び／又はリゾホスファチジルエタノールアミンが含まれない、または、前記工程（２）のｌｙＰｌｓＥｔｎをグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解する酵素がリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解しない場合には、実施しなくても良い場合があるが、被験者の血清または血漿中にホスファチジルエタノールアミン及び／又はリゾホスファチジルエタノールアミンが含まれ、かつ、前記工程（２）のｌｙＰｌｓＥｔｎをグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解する酵素がリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解する作用を有する場合には、実施することが好ましい。
【０１５７】
「実質的に消去する」の「消去する」とは消去対象を（例えば酵素の作用により）本実施の形態のＰｌｓＥｔｎの定量に関与しない物質へ分解（変換）することをいう。定量に関与しない物質は、用いる酵素の反応性や試薬等によっても異なるが、例えば上記工程（１）〜（３−４）を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法の場合、測定に関与しない物質の例としては、グリセロホスファチジン酸、グリコールアルデヒド、アンモニア、水、酸素などが挙げられる。例えば比色分析を用いた定量によって本実施の形態のＰｌｓＥｔｎの定量を行う場合には、消去対象を無色の物質に変換し、検出の対象外とすることも上記の「消去する」に含まれる。
【０１５８】
「実質的に消去する」とは、消去対象を、本実施の形態のＰｌｓＥｔｎの定量値において、被験者を認知症患者またはその前段階にある者か否かを分類する目的に影響を与えない程度に消去することを意味する。例えば、本実施の形態の測定方法を、後述する認知症検査方法として用いる場合、消去対象が、検査方法の正確性に影響を与えない程度まで消去されることを意味する。より具体的には、疾患によっても変動し得るが、消去対象が例えばホスファチジルエタノールアミン及び／又はリゾホスファチジルエタノールアミンの場合、これらを消去する工程を行った後のホスファチジルエタノールアミンの総量が、消去する工程を行う前の１０％以下となることが好ましく、更に好ましくは９％以下であり、最も好ましくは８％以下である。なお、上記の工程（４）及び（５）ではＰｌｓＥｔｎを含むエーテル型のエタノールアミン型リン脂質は消去しない。
【０１５９】
上記工程（４）で用いるＰＬは、上述の工程（１）の場合と同様であるが、上記の工程（４）及び（５）の「実質的に消去する」という観点からはＰＬＡ２が好ましく、反応性が早いという観点からＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ由来ＰＬＡ２がさらに好ましい。
【０１６０】
上記工程（５）で用いる酵素はリゾホスファチジルエタノールアミンをグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンと脂肪酸に加水分解する作用があれば限定されないが、リゾホスフォリパーゼ（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ、ＬＹＰＬと略す場合がある）、及び／又はモノグリセリドリパーゼ（ｍｏｎｏｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｌｐａｓｅ、ＭＧＬＰと略す場合がある）が好ましい。該ＬＹＰＬはＥＣ  ３．１．１．５と分類される酵素を含み、好適な例としてはＶｉｂｒｉｏ属由来ＬＹＰＬ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−３２））が挙げられる。該ＭＧＬＰはＥＣ  ３．１．１．２３と分類される酵素を含み、好適な例としてはＢａｃｉｌｌｕｓ属由来ＭＧＬＰ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−５９））が挙げられる。
【０１６１】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量である場合、過酸化水素の定量は、ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＥＣ  １．１１．１．７）の作用を利用して、例えばトリンダー試薬等の色原体とカップラーとの酸化縮合により色素を生成させて比色分析により行うことができる。トリンダー型試薬の色原体としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等が使用可能であり、具体例としてＮ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、２，４−ジクロロフェノール、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン（ＴＯＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−サクシニルアミノエチル）−ｍ−トルイジン（ＥＳＥＴ）等（以上株式会社同人化学研究所）が挙げられる。なかでもＴＯＯＳとＴＯＤＢは吸光係数が大きいため好ましい。また過酸化水素はＰＯＤの存在下、ロイコ型試薬を用いても発色させることができる。この試薬の具体例としては、Ｏ−ジアニシジン、Ｏ−トリジン、３，３−ジアミノベンジジン、３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（以上株式会社同人化学研究所）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＤＡ６７）等が挙げられる。ＤＡ−６４やＤＡ−６７など、不安定な試薬を用いる場合、公知の方法により、亜硫酸チオ硫酸を添加したり、紫外線や可視光線を吸収する効果のある色素を共存させたりすることで安定化させることができる。カップラーの例としては、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）が挙げられる。
【０１６２】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量である場合、過酸化水素の定量は、上記の方法のほか、吸光法、ＫＭｎＯ４等を利用する酸化還元法、蛍光法、発光法又は電極法等の公知の方法を用いて行うことができる。蛍光法には、酸化によって蛍光を発する化合物、例えばホモバニリン酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、チラミン、パラクレゾール、ジアセチルフルオレスシン誘導体等を用いることができる。発光法には、触媒としてルミノール、ルシゲニン、イソルミノール、ピロガロール等を用いることが出来る。電極法に用いる電極は、過酸化水素との間で電子を授受することの出来る材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金、銀等が挙げられ、電極測定方法としては、アンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー等の公知の方法を用いることが出来る。更にオキシダーゼ又は基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流又はその電気量を測定してもよい。電子伝達体としては、電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またオキシダーゼ反応により生成する過酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流又はその電気量を測定してもよい。
【０１６３】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程は、以下の（１）〜（３−３）´の工程のいずれかまたは複数を含んでもよく、さらに（１）〜（３−３）´の全てを含んでもよい。
（１）エタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解でき、かつリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素を用いて、被験者の血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に加水分解する工程：
（２）´エタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミンとプラズメニルホスファチジン酸に加水分解でき、かつエーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる加水分解酵素を用いて、前記（１）にて生成されたエタノールアミン型リゾプラスマローゲン（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）をエタノールアミンとプラズメニルホスファチジン酸に加水分解する工程： 
（３−１）´エタノールアミンを酸化する酵素により、工程（２）´で得られたエタノールアミンから過酸化水素を発生せしめる工程：
（３−２）´過酸化水素を過酸化水素定量手段により定量する工程：及び
（３−３）´前記被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ量を算出する工程。
【０１６４】
上記工程（１）〜（３−３）´を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法の別異な一例を概略して図８に示した。工程（１）はＰＬの作用で、ＰｌｓＥｔｎをｌｙＰｌｓＥｔｎに加水分解する工程である。工程（２）´は加水分解酵素の作用で、ｌｙＰｌｓＥｔｎを加水分解する工程である。工程（３−１）´は工程（２）´で得られた生成物であるエタノールアミンをＥＡＯの作用で過酸化水素とする工程である。過酸化水素は後述する公知の方法で定量すれば良い。
【０１６５】
上記工程（１）〜（３−３）´を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法において、工程（１）で用いるＰＬは、上述の工程（１）の場合と同様である。
【０１６６】
上記工程（１）〜（３−３）´を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法において、工程（２）´でｌｙＰｌｓＥｔｎを加水分解する酵素を用いる場合、該加水分解酵素はｌｙＰｌｓＥｔｎをプラズメニルホスファチジン酸とエタノールアミンに加水分解する酵素を含み、ホスホリパーゼＤ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｄ、ＰＬＤと略す場合がある）が好ましい。そのようなＰＬＤの例としてはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属由来（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−０７））、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ由来（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−３９））、キャベツ由来（ＳＩＧＭＡ（Ｐ８３９８））、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ属由来（名糖産業（株））ＰＬＤが挙げられる。ｌｙＰｌｓＥｔｎに対する基質特異性が高いという観点からは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ由来ＰＬＤが好ましい。
【０１６７】
上記工程（１）〜（３−３）´
を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法において、工程（３−１）´で用いるＥＡＯは、上述の工程（３−２）の場合と同様である。
【０１６８】
上記工程（１）〜（３−３）´を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法は、上記（１）〜（３−３）´の工程に先立つか、少なくとも前記（２）´工程の前までに、上記の（４）及び（５）を含む工程を行う方法であれば好ましいがこれに限定されない。
【０１６９】
上記工程（１）〜（３−３）´を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法は、前記工程（４）のホスファチジルエタノールアミンをリゾホスファチジルエタノールアミンと脂肪酸に分解する酵素としてＰＬを使用し、該ＰＬは、前記工程（１）のＰｌｓＥｔｎをｌｙＰｌｓＥｔｎに加水分解できる酵素としての作用を兼ねさせて新たな該ＰＬを添加することなく前記工程（１）の工程を進行せしめ、前記工程（５）を実施と同時、または前記工程（５）の実施後に、前記工程（１）が完了し、以後前記工程（２）´〜（３−３）´を実施する方法でも良い。
【０１７０】
上記工程（４）及び（５）は、被験者の血清または血漿中にホスファチジルエタノールアミン及び／又はリゾホスファチジルエタノールアミンが含まれない、または、前記工程（２）´のｌｙＰｌｓＥｔｎをエタノールアミンとプラズメニルホスファチジン酸に加水分解できる加水分解酵素がリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解しない場合には、実施しなくても良い場合があるが、被験者の血清または血漿中にホスファチジルエタノールアミン及び／又はリゾホスファチジルエタノールアミンが含まれ、かつ、前記工程（２）´のｌｙＰｌｓＥｔｎをエタノールアミンとプラズメニルホスファチジン酸に加水分解できる加水分解酵素がリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解する作用を有する場合には、実施することが好ましい。
【０１７１】
ここで、「実質的に消去する」の「消去する」とは上述と同様であり、定量に関与しない物質は、用いる酵素の反応性や試薬等によっても異なるが、例えば本実施の形態のＰｌｓＥｔｎの測定を、ＰＬＤで分解し、得られたエタノールアミンをさらに酸化して得られる過酸化水素を用いて定量する方法により行う場合、測定に関与しない物質の例としては、グリセロホスホエタノールアミン（ただし、用いるＰＬＤがグリセロホスホエタノールアミンに作用しない場合）、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、ホスホリルエタノールアミン、脂肪酸、セラミド、グリセロール−３−リン酸、アンモニア、グリコールアルデヒド、水、酸素などが挙げられる。例えば比色分析を用いた定量によって本実施の形態のＰｌｓＥｔｎの定量を行う場合には、消去対象を無色の物質に変換し、検出の対象外とすることも上記の「消去する」に含まれる。
【０１７２】
「実質的に消去する」とは、上述と同様であり、より具体的には、疾患によっても変動し得るが、消去対象が例えばホスファチジルエタノールアミン及び／又はリゾホスファチジルエタノールアミンの場合である場合、これらを消去する工程を行った後のホスファチジルエタノールアミン及び／又はリゾホスファチジルエタノールアミンの場合の総量が、消去する工程を行う前の１０％以下となることが好ましく、更に好ましくは９％以下であり、最も好ましくは８％以下である。
【０１７３】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量の酵素を利用した定量する工程は、特開２０１２−２１０１７９号に記載の方法でも良い。
【０１７４】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量で使用し得るいずれの酵素についても、所望の活性が維持される限り、その変異体も同様に各酵素の範囲に含まれる。例えば、各酵素のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有する酵素であっても、所望の活性が維持される限り、各酵素の範囲に含まれる。また、各酵素を塩基配列の翻訳によって得る場合にも、用いる塩基配列は、得られる酵素が所望の活性を有する限り特に限定されない。各酵素の二次構造、三次構造及び四次構造、性質、純度、由来、商品名並びに価格についても特に限定されない。
【０１７５】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量である場合、一態様において、試料中に含まれるアスコルビン酸を消去するためにアスコルビン酸オキシダーゼ（ａｓｃｏｒｂａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ、ＡＳＯＭと略す場合がある）を使用することができる。ＡＳＯＭは、アスコルビン酸を実質的に消去する作用を有するものが好ましく、ＥＣ  １．１０．３．３と分類される酵素がより好ましい。例えば、ウリ科植物由来のＡＳＯＭを使用することができる。好適な例としては、酵素の安定性が高いという観点からはＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属由来のアスコルビン酸オキシダーゼ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−５３））、アジ化ナトリウムによる阻害を受けないという観点からは天野エンザイム（株）社のアスコルビン酸オキシダーゼ（商品名ＡＳＯ−３）が挙げられる。
【０１７６】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量である場合、その量は下記のカタラーゼの量を除き、例えば、被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎの濃度が３００μＭ以下で、検体試薬比（試料の量：試薬の全量）が１：１０の場合、下限値が０．１Ｕ／ｍＬ以上、好ましくは１Ｕ／ｍＬ以上、更に好ましくは５Ｕ／ｍＬ以上であり、上限は特に設けないが、１００Ｕ／ｍＬ以下、好ましくは５０Ｕ／ｍＬ以下、更に好ましくは３０Ｕ／ｍＬ以下である。使用する酵素の量は、試薬の安定性という観点からは高い方が好ましく、経済性の観点からは低い方が好ましい。特にレートアッセイを行う場合には使用する酵素の量は低い方が好ましく、下限は０．０１Ｕ／ｍＬである。
【０１７７】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量である場合、一態様において、過酸化水素を消去するためにカタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）を使用する場合がある。カタラーゼは、過酸化水素を実質的に消去する作用を有するものが好ましく、ＥＣ  １．１１．１．６と分類される酵素がより好ましいがこれに限定されない。カタラーゼの使用量は限定されないが、通常１０〜５０００Ｕ／ｍＬの範囲で使用する。カタラーゼの好適な例としては、純度が高いという観点からはＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属由来（旭化成ファーマ株式会社）、安価で入手が容易である観点からは動物由来（ＳＩＧＭＡ（Ｃ１３４５等））のカタラーゼが挙げられる。
【０１７８】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量である場合、使用する酵素の反応性及び／又は安定性を維持及び／又は高めるという観点から、適宜ｐＨ緩衝剤を用いることが好ましい。ｐＨ緩衝剤は、目的のｐＨを保つことができれば限定されないが、グッドのｐＨ緩衝液（ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ等）、Ｔｒｉｓ緩衝液、ジエタノールアミン緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、硼酸緩衝液、リン酸緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、トリスエタノールアミン緩衝液、イミダゾール緩衝液等が例示できる。これらの緩衝液は、塩酸等の強酸やＮａＯＨ等の強アルカリを用いて、緩衝剤として使用可能なｐＨ範囲に調整して使用することができる。
【０１７９】
ｐＨは、用いる酵素によっても異なるが、弱アルカリ性のｐＨであることが好ましく、下限値としてｐＨ７．０以上、好ましくはｐＨ７．３以上、更に好ましくはｐＨ７．５以上が例示され、上限値としてはｐＨ９．０以下、好ましくはｐＨ８．４以下、更に好ましくはｐＨ８．０以下が例示される。例えば、ｌｙＰｌｓ  ａｓｅ、ＰＬ、ＬＹＰＬ、ＧＰＣＰを安定化及び／又は活性化するという観点からは、そのｐＨは、下限値としてｐＨ７．０以上が例示され、上限値としてはｐＨ９．５以下、好ましくはｐＨ９以下、更に好ましくはｐＨ８．５以下が例示される。
【０１８０】
ｐＨ緩衝剤の濃度は目的のｐＨを保つことができる限り特に限定されないが、下限値として３ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、更に好ましくは１０ｍＭ以上が例示され、上限値としては５００ｍＭ以下、好ましくは２００ｍＭ以下、更に好ましくは１００ｍＭ以下が例示される。
【０１８１】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量である場合、該工程には界面活性剤を存在させられる。界面活性剤の種類は限定されないが、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルホルムアルデヒド縮合物、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレンステロール類、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンラノリン類、ポリオキシエチレンアルキルアミン・脂肪酸アミド類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸・リン酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリグリセリン脂肪酸エステル類、グリセリン脂肪酸エステル類、プロピレングリコール脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、Ｎアシルアミノ酸塩類、アルキルエーテルカルボン酸塩類、アルキルリン酸塩、Ｎアシルタウリン酸塩、スルホン酸塩、アルキル硫酸、酢酸ベタイン型両性界面活性剤、イミダゾリン型両性界面活性剤、レシチン誘導体、ポリエチレングリコール類、ポリエチレングリコールラウリルエーテル、ポリエチレングリコールイソオクチルフェニルエーテル、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール等が例示される。好ましくは、非イオン性界面活性剤のエーテル型又はエステル型が挙げられ、更に好ましい例としては、ＨＬＢ値が１３以上１５以下のポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、及びポリオキシエチレンアルキルアミンからなる群から選択される非イオン界面活性剤が挙げられ、更に好ましくは、ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキル（１２−１４）エーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルが挙げられる。界面活性剤の溶解性の観点からは、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系非イオン性界面活性剤が好ましい。商品名としてはトリトンＸ−１００（ＴＸ−１００）、Ｔｗｅｅｎ２０、エマール２０Ｃ（花王株式会社）、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＴ−９（日光ケミカルズ株式会社）、ノニオンＨＳ−２０８、ＨＳ−２１０、ＨＳ−２０８、ＨＳ−２０８．５、ＮＳ２１０（日油株式会社）等が例示される。また、膜酵素安定化の観点からはｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ（ＤＤＭ）、ｎ−Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、ｎ−Ｎｏｎｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｍａｌｔｏｓｉｄｅ、ｎ−Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、３−Ｏｘａｔｒｉｄｅｃｙｌ−α−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｉｄｅのような親水部に糖鎖を持った非イオン性界面活性剤を使用する事もできる。界面活性剤は複数種混合して使用してもよい。
【０１８２】
極性をもつ界面活性剤は酵素などのタンパク質の変性作用を有することが知られているため、脂質を基質とする酵素を用いる場合、脂質を溶解するために中性（非極性）の界面活性剤存在下で実施することが好ましいがこれに限定されない。本実施の形態において、界面活性剤を用いる場合、その濃度は用いる酵素の所望の作用が得られる限り特に限定されない。例えば本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量であり、さらに該酵素が本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅ及び／またはＰＬである場合の界面活性剤の濃度は、上限値としては０．２５（ｗ／ｖ）％以下、好ましくは０．１（ｗ／ｖ）％以下、更に好ましくは０．０５（ｗ／ｖ）％以下が例示され、酵素の所望の作用が得られる限り、界面活性剤を用いなくてもよい。界面活性剤により酵素を安定化及び／又は活性化する、基質を分散させる、再現性等の酵素の作用を向上するという観点からは、通常、界面活性剤の濃度は、下限値としては０．００１（ｗ／ｖ）％以上、好ましくは０．００５（ｗ／ｖ）％以上、更に好ましくは０．０１（ｗ／ｖ）％以上が例示され、上限値としては１（ｗ／ｖ）％以下、好ましくは０．５（ｗ／ｖ）％以下が例示される。
【０１８３】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量である場合、該工程にはＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫安やＮＨ３Ｃｌ等の塩を存在させられ、その量は、下限値として０．１ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、更に好ましくは５０ｍＭ以上が例示され、上限値は特に制限されないが、好ましくは２００ｍＭ以下、更に好ましくは１５０ｍＭ以下、特に好ましくは１２０ｍＭ以下が例示される。これらの塩は後述する認知症検査試薬キットの酵素の安定化剤として機能し得る。
【０１８４】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量である場合、該工程には糖を存在させることができ、その濃度は溶解可能な範囲内であれば限定されない。例えばシュークロースを含有する場合、下限値は後述する認知症検査試薬キットの０．０５（ｗ／ｖ）％以上、好ましくは０．１（ｗ／ｖ）％以上、更に好ましくは０．３（ｗ／ｖ）％以上であり、上限値は３０（ｗ／ｖ）％以下、好ましくは１０（ｗ／ｖ）％以下、更に好ましくは５（ｗ／ｖ）％以下である。例えばマンニトールを含有する場合、下限値は０．０５（ｗ／ｖ）％以上、好ましくは０．１（ｗ／ｖ）％以上、更に好ましくは０．３（ｗ／ｖ）％以上であり、上限値は３（ｗ／ｖ）％以下、好ましくは２（ｗ／ｖ）％以下、更に好ましくは２（ｗ／ｖ）％以下である。その他の糖としてはトレハロースやシクロデキストリン等が挙げられる。これらの糖は、後述する認知症検査試薬キットの酵素やキット内容物自体の安定化剤として、また、キット内容物を凍結乾燥する場合は凍結乾燥賦型剤として機能し得る。
【０１８５】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量である場合、該工程には防腐剤を存在させられ、その種類や濃度は限定されない。例えばアジ化ナトリウムの場合、下限値は後述する認知症検査試薬キットの０．００５（ｗ／ｖ）％以上、好ましくは０．０１（ｗ／ｖ）％以上、更に好ましくは０．０３（ｗ／ｖ）％以上であり、上限値は１（ｗ／ｖ）％以下、好ましくは０．５（ｗ／ｖ）％以下、更に好ましくは０．１（ｗ／ｖ）％以下である。例えば抗生物質の場合、下限値は５μｇ／ｍＬ以上、好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは３０μｇ／ｍＬ以上であり、上限値は１００μｇ／ｍＬ以下、好ましくは７５μｇ／ｍＬ以下、更に好ましくは６０μｇ／ｍＬ以下である。
【０１８６】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量である場合、該工程にはＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＮＡＴ等のキレート剤を含有させられ、その種類や濃度は限定されない。例えばＥＤＴＡを含有する場合、通常は０．０５ｍＭ以上１０ｍＭ以下の範囲である。キレート剤は、金属を活性発現に利用するプロテアーゼがキット内容物中に混在する場合、該活性を阻害する作用により、キット中の酵素の安定化剤として機能し得る。
【０１８７】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量である場合、該工程には牛アルブミン、卵アルブミン、ヒトアルブミン、クリスタリン等の触媒作用をもたないタンパク質を存在させられ、その種類や濃度は限定されない。例えば牛アルブミンを含有する場合、通常その含有量は０．０１（ｗ／ｖ）％以上５（ｗ／ｖ）％以下の範囲である。これらのタンパク質はプロテアーゼの基質となるため、酵素の安定化剤となる場合がある。また、凍結乾燥に際しては凍結乾燥賦型剤となり得る。
【０１８８】
酵素反応を進めることのできる添加物とは、上記のような酵素の反応性及び／又は安定性を維持及び／又は高める目的の添加物を含み、その例としてはｐＨ緩衝剤、界面活性剤、塩、糖、防腐剤、キレート剤、触媒作用をもたないタンパク質等が挙げられる。
【０１８９】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量である場合、その反応時間は、血清及び／又は血漿中のＰｌｓＥｔｎ量を特異的に測定することができる限り限定されないが、例えば後述する本発明の実施の形態の認知症検査試薬キット内容物の各成分を単一の容器のキットとして用いる場合、反応時間の下限値は１５秒以上、好ましくは１分以上、更に好ましくは３分以上である。上限値は特に設けないが、好ましくは３０分以下、更に好ましくは１５分以下、特に好ましくは１０分以下である。例えば例えば後述する本発明の実施の形態の認知症検査試薬キット内容物の各成分を２以上の容器に分離して用いる場合、それぞれの容器の内容物を使用する反応時間の下限値は１５秒以上、好ましくは１分以上、更に好ましくは３分以上である。上限値は特に設けないが、好ましくは３０分以下、更に好ましくは１５分以下、特に好ましくは１０分以下である。それぞれの容器の内容物を使用する反応時間は同一でなくてもよい。一態様において、本発明の実施の形態のｌｙＰｌｓ  ａｓｅ及び／またはＰＬの作用を利用する血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法の反応時間は、好ましくは３０分以内、更に好ましくは１５分以内、特に好ましくは１０分以内に完了する。
【０１９０】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量である場合、各工程を実施する温度は、血清及び／又は血漿中のＰｌｓＥｔｎ量を特異的に測定することができる温度であれば限定されず、各工程の温度は同一でなくてもよい。各工程に酵素を用いる場合、用いる酵素の作用温度の範囲内で行うことが好ましい。例えば、下限値は１５℃以上、好ましくは２０℃以上、更に好ましくは２５℃以上であり、上限値は７０℃以下、好ましくは５０℃以下、更に好ましくは４０℃以下であり、好適には３７℃付近である。
【０１９１】
血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量は、例えば特許文献２に記載されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法によってＰｌｓＥｔｎを各分子種ごとに定量することもできる。
【０１９２】
本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法において、１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法は高額な装置や放射性ヨウ素を使用するので汎用性が劣るが、従来多くの測定実績があり比較対象データが多いので好ましい。本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量であり、さらに上記の（１）〜（３−４）の工程を含む酵素を利用する方法（図７）は、汎用自動分析機に応用でき、利便性が良いので好ましい。本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、さらに上記の（１）〜（３−３）´の工程を含む酵素を利用する方法（図８）は、（１）〜（３−４）の工程を含む酵素を利用する方法に比べて使用する酵素が多く経済性に劣るが、汎用自動分析機に応用でき、利便性が良いので好ましい。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法は高額な装置を使用するので汎用性が劣るが、各分子種ごとに定量できるので好ましい。すなわち本発明の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量の定量方法は、１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法、酵素法等に限定されず、例えば、測定感度、特異度、再現性、経済的な理由、安全性目的、適用法令等に応じて当業者であれば適宜変更し得る。
【０１９３】
本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅとしては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（ＫＴ２４４０）又はＴｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６２８）由来の配列番号１または２のアミノ酸配列を有するｌｙＰｌｓ  ａｓｅが挙げられる。また、水の存在下でｌｙＰｌｓＥｔｎを加水分解し、対応するアルデヒドとグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンを得る反応を触媒する本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅも挙げられる。
【０１９４】
本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅが天然の微生物由来である場合、該微生物は、ｌｙＰｌｓＥｔｎを加水分解し、対応するアルデヒドとグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンを得る反応を触媒する酵素を生産する微生物であれば特に限定されないが、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属又はＴｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ属に属する微生物であり、好ましくは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ又はＴｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．に属する微生物であり、最も好ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（ＫＴ２４４０）又はＴｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６２８）である。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（ＫＴ２４４０）はＤＳＭ  Ｎｏ．６１２５としてＬｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）で購入できる。
【０１９５】
土壌、湖沼、海、生物の表面や体腔内等から分離した菌株が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属又はＴｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ属に属する微生物であるかどうかは、例えば「Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  第２版（２００１年）」、「微生物の分類・同定実験法―分子遺伝学・分子生物学的手法を中心に（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ）シュプリンガー・フェアラーク東京、２００１年９月」等に記載の方法、市販の同定検査用製品（例えばＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ社）を使用する方法、「株式会社テクノスルガ・ラボ（静岡県静岡市）」等に委託する方法等により確認すればよい。さらにそれらの菌株が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ又はＴｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．であるかどうかは、「Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ  Ｅ．、Ｅｂｅｒｓ  Ｊ．：  Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ：  ｔａｒｎｉｓｈｅｄ  ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏｄａｙ，  ｎｏｖ，  １５２−１５５頁、２００６年」に記載の方法等により判断すればよい。すなわち、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションで７０％以上の相同性がある、又は１６ｓ  ｒＲＮＡが９８．５％以上同一であれば同属同種と判断できる。好ましくはＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションで７０％以上の相同性があれば同属同種と判断することができる。２８Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２及び／又はＩＴＳ−５．８Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列によりＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ又はＴｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．であるかどうかを判断する場合も同様である。
【０１９６】
天然の微生物の分離は、当業者に公知の手法を用いて行うことができ、例えば、日本生物工学会編生物工学実験書（２００２年改訂版、培風館）に記載の微生物分離方法を参考にして行うことができる。
【０１９７】
本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅとしては：配列番号１または２のアミノ酸配列を含み、ｌｙＰｌｓＥｔｎを加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒するｌｙＰｌｓ  ａｓｅ：配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、ｌｙＰｌｓＥｔｎを加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応の触媒作用に関与しない一部のアミノ酸を変異させたアミノ酸配列からなるｌｙＰｌｓ  ａｓｅ：及び配列番号１または２のアミノ酸配列に各種のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなり、ｌｙＰｌｓＥｔｎを加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒するｌｙＰｌｓ  ａｓｅが挙げられる。本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅのＮ末端側及び／又はＣ末端側にチオレドキシン蛋白質等機能性蛋白質やその他のアミノ酸配列からなる部分を付加する等により融合ｌｙＰｌｓ  ａｓｅとすることも好ましい。また、該付加する部分により精製や確認等をせしめることのできるタグと呼ばれる部分を融合させてもよく、場合によっては、融合後、そのタグ部分の全部又は一部を削除してよい。例えば、本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅを菌体外やペリプラズムへ輸送する為の約２０個のシグナルペプチドや、効率的な精製を行う為の５〜１０個のＨｉｓを付加してもよく、それらを直列して付加してもよい。それらのアミノ酸配列の間等に数個のプロテアーゼ認識アミノ酸配列を配置して付加してもよい。上述の付加の例と同様に、欠失、又は置換を行うことができ、例えば、配列番号１または２のアミノ酸配列において、ｌｙＰｌｓＥｔｎを加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒する作用とは無関係の、数個のアミノ酸からなるドメインや、複数個のアミノ酸からなるギャップが存在する場合、それらの欠失を組み合わせることもできる。欠失、置換又は付加を適宜組み合わせてもよい。具体的には配列番号２のアミノ酸配列において配列番号６の２７アミノ酸からなるシグナルペプチドを欠失しても本発明のｌｙＰｌｓＥｔｎである。配列番号５のアミノ酸配列において配列番号７の３３アミノ酸からなるシグナルペプチドを欠失しても本発明のＰＬである。また、Ｂｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．２０１１年、３３巻、７２７−７３１頁で開示された方法を参考に、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｃｌｌｕｍ  ｃiｎｎａｍｏｎｅｕｍ由来のｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｄのプロモーター、シグナルペプチド、ターミネーター配列も使用できる。
【０１９８】
本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅは、配列番号３または４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列と後述するストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる蛋白質であって、ｌｙＰｌｓＥｔｎを加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒するｌｙＰｌｓ  ａｓｅであってもよい。
【０１９９】
本発明は：配列番号１または２のアミノ酸配列からなるｌｙＰｌｓ  ａｓｅをコードする塩基配列を含む遺伝子：及び配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ｌｙＰｌｓＥｔｎを加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒する蛋白質をコードする塩基配列を含む遺伝子にも関する。
【０２００】
そのような遺伝子としては、特に限定されないが、例えば：配列番号３または４に記載の塩基配列を含む遺伝子：及び配列番号３または４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、ｌｙＰｌｓＥｔｎを加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒する蛋白質をコードする塩基配列が挙げられ、具体的には：配列番号３または４の塩基配列を大腸菌や放線菌等宿主のコドン使用頻度に合わせて変更した塩基配列を含む遺伝子：及び配列番号１または２のアミノ酸配列において、ｌｙＰｌｓＥｔｎを加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒する作用に関与しない１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子が例示される。
【０２０１】
本発明の遺伝子は、配列番号３または４に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、ｌｙＰｌｓＥｔｎを加水分解し、グリセロ−３−ホスフォタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒する蛋白質をコードする塩基配列を含む遺伝子であってもよい。
【０２０２】
上記のストリンジェントな条件は、通常、完全ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度であって、特異的なハイブリッドが形成される条件であり、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている条件が挙げられる。また、例えば、９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件であってもよい。具体的には、例えば、完全ハイブリッドのＴｍ〜（Ｔｍ−３０）℃、好ましくはＴｍ〜（Ｔｍ−２０）℃の温度範囲で、かつ１×ＳＳＣ（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、好ましくは０．１×ＳＳＣに相当する塩濃度でハイブリダイズを行う条件が挙げられる。
【０２０３】
本発明の遺伝子を組み込むベクターは特に限定されないが、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージ又はプラスミドのうち遺伝子組換用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、大腸菌に属する微生物を宿主とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ等が使用できる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴベクター、又はｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮ  Ｉ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋等、バチラス・サチリスを宿主とする場合にはｐＷＨ１５２０、ｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ等、放線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２等、酵母、特にサッカロマイセス・セレビジアエを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３等が使用できる。本発明の組換えベクターは、安全性が確認されているという観点から、遺伝子組換え生物等の第二種使用等のうち産業上の使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令（平成十六年財務省、厚生労働省、農林水産省、経済産業省、環境省令第一号）別表第一号の規定に基づき経済産業大臣が定めるＧＩＬＳＰ遺伝子組換え微生物の、別表第一に掲げられたベクターに、上記の本発明の遺伝子が挿入された組換えベクターが好ましい。プロモーターは宿主中で発現できるものであれば特に限定されない。本発明の組換えベクターは、例えば本発明の遺伝子及び上記のベクターを用いて、当業者に公知の手法で作成することができる。
【０２０４】
本発明の上記の組換えベクターを含む形質転換体は、上記組換えベクターで形質転換された形質転換体であれば限定されず、宿主としては、大腸菌、バチラス・サチリス、ストレプトマイセス属やロドコッカス属に属する放線菌、サッカロマイセス・セレビジアエ、ピキア・パストリス、麹カビ等が挙げられる。本発明の形質転換体は、安全性が確認されているという観点から、遺伝子組換え生物等の第二種使用等のうち産業上の使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令（平成十六年財務省、厚生労働省、農林水産省、経済産業省、環境省令第一号）別表第一号の規定に基づき経済産業大臣が定めるＧＩＬＳＰ遺伝子組換え微生物の、別表第一に掲げられた宿主に形質転換したものが好ましい。本発明の形質転換体は、例えば本発明の組換えベクター及び上記の宿主を用いて、当業者に公知の手法で作成することができる。
【０２０５】
本発明はまた、本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅを生成する微生物を培地で培養し、培養物中に本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅを生成蓄積させ、該培養物から本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅを採取することを特徴とする、本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅの製造方法にも関連する。
【０２０６】
微生物の培養工程及び生成蓄積工程における培養条件はその栄養生理的性質を考慮して適宜選択すればよく、通常液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利であり得る。培地の栄養源としては、ＬＢ、ＰＤＡ、ＭＡ、ＯＡ又はＬｃＡ培地等微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。培養温度は本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅが生成される範囲で適宜変更し得るが、天然の微生物の場合、下限が５℃以上、好ましくは１５℃以上、更に好ましくは２０℃以上、上限は、好熱性の古細菌やバクテリアの場合の約１００℃となるが、通常は５５℃以下、好ましくは４５℃以下、更に好ましくは４０℃以下である。特に真菌の場合は、下限が４℃以上、好ましくは１０℃以上、更に好ましくは２０℃以上、上限が５０℃以下、好ましくは４２℃以下、更に好ましくは３７℃以下である。培養時間は、培養条件によって変動し得るが、本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅの生成が最高量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常は下限が１７時間以上、好ましくは２０時間以上、更に好ましくは２４時間以上、上限が８０時間以下、好ましくは７２時間以下、更に好ましくは４８時間以下である。特に真菌の場合は、下限が１日以上、好ましくは２日以上、上限は約１０日、好ましくは４日以下、更に好ましくは３日以下である。培地ｐＨは微生物が発育し、本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅを生成する範囲で適宜変更し得るが、下限が好ましくはｐＨ４以上、更に好ましくはｐＨ５以上、上限が好ましくはｐＨ８．５以下、より好ましくはｐＨ７．５以下である。特に真菌の場合は、低いｐＨが好ましい。
【０２０７】
本発明はまた、上記の本発明の形質転換体を培地で培養し、培養物中に本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅを生成蓄積させ、該培養物から該ｌｙＰｌｓ  ａｓｅを採取することを特徴とする、本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅの製造方法にも関連する。
【０２０８】
形質転換体の培養工程及び生成蓄積工程における培養条件は、上記微生物の場合と同様であり、形質転換体の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、形質転換体が大腸菌の場合、培養温度は、下限が１０℃以上、好ましくは２０℃以上、更に好ましくは２５℃以上、上限が４５℃以下、好ましくは４２℃以下、更に好ましくは３７℃以下である。形質転換体が放線菌の場合、下限が４℃以上、好ましくは１０℃以上、更に好ましくは２０℃以上、上限が５０℃以下、好ましくは４２℃以下、更に好ましくは３７℃以下である。培養時間は、条件によって変動し得るが、本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅの生成が最高量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、形質転換体が大腸菌の場合、通常は下限が１０時間以上、好ましくは１２時間以上、更に好ましくは１７時間以上、上限が６０時間以下、好ましくは４８時間以下、更に好ましくは３０時間以下である。形質転換体が放線菌の場合、通常は下限が１７時間以上、好ましくは２０時間以上、更に好ましくは２４時間以上、上限が８０時間以下、好ましくは７２時間以下、更に好ましくは４８時間以下である。培地ｐＨは、形質転換体が発育し、本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅを生成する範囲で適宜変更し得るが、大腸菌や放線菌の場合、下限が好ましくはｐＨ５．８以上、更に好ましくはｐＨ６．２以上、上限が好ましくはｐＨ８．５以下、更に好ましくはｐＨ７．５以下である。
【０２０９】
上記の培養物中に生成蓄積された本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅを採取する方法は特に限定されないが、簡便には殺菌、非殺菌を問わず菌体を含む細胞等のまま本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅを採取してもよい。培養不純物や細胞破砕物等を軽く除き、不純物が残存したまま、本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅを採取することも好ましい。目的や用途等によっては実質的に不純物を包含しない本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅを採取することも好ましい。例えば５０％以上、７０％以上又は９５％以上の純度で本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅを採取することが例示される。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥやＨＰＬＣ等の公知の方法を用いて確認することができる。
【０２１０】
本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅを精製する方法を以下に説明する。本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅが、菌体内に形成される場合には、培養終了後、得られた培養物から、濾過又は遠心分離等の手段により菌体を採集する。次いで、この菌体を機械的方法又はリゾチーム等の酵素的方法で破壊し、必要に応じてＥＤＴＡ、及び／又は適当な界面活性剤等を添加して該ｌｙＰｌｓ  ａｓｅを濃縮し、アセトン、メタノール、エタノール等の有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウム、食塩等による塩析法等を適用して本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅを沈殿させ回収することができる。この沈殿物について、必要に応じて透析、等電点沈殿を行った後、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーや疎水的クロマトグラフィーにより処理して、精製された本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅを得ることができる。上記の方法は適宜組み合わせて行うことができる。また、本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅが培養液中に形成される場合には、培養物から濾過又は遠心分離等の手段により菌体を除去して培養液を得て、前記菌体内に形成される場合と同様の処理を行うことにより、精製された本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅを得ることができる。
【０２１１】
上記の本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅの製造方法によって得られるｌｙＰｌｓ  ａｓｅは、必要に応じて安定化剤として、各種の塩類、糖類、蛋白質、脂質、界面活性剤等を加え、限外濾過濃縮、凍結乾燥等の方法により、液状又は固形とすることができる。凍結乾燥を行う場合、安定化剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミン、硫安等を０．５〜１０％程度添加してもよい。
【０２１２】
本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅは、従来公知のｌｙＰｌｓ  ａｓｅとはアミノ酸配列において区別できる。例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列と相同性を有する公知のアミノ酸配列を、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ））でＰｒｏｔｅｉｎ  ＢＬＡＳＴ検索すると、平成２５年６月２９日時点で、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株由来のアミノ酸配列が検索できるものの、その定義（Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）はｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎであり、機能未知の蛋白質ででる。同様に配列番号２に記載のアミノ酸配列と相同性を有する公知のアミノ酸配列をＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴでＰｒｏｔｅｉｎ  ＢＬＡＳＴ検索すると、平成２５年６月２９日時点で、Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ  ｎａｓｓａｕｅｎｓｉｓ由来のアミノ酸配列が検索できるものの、その定義（Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）はｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｄｉｅｓｔｅｒ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅであり、全く異なることが明らかである。さらに従来公知のラット由来のｌｙＰｌｓ  ａｓｅを開示したＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＶＯＬ．２８６，ＮＯ．２８，の２４９２３頁右３行目には「Ｔｍｅｍ８６ｂ  （発明者註：ｌｙＰｌｓ  ａｓｅ遺伝子）  ｈａｓ  ｏｎｌｙ  ｂｅｅｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｉｎ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎｓ，ｍｉｃｅ，ｒａｔｓ，ｃｏｗｓ，ｄｏｇｓ，ａｎｄ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．」と記載されている。すなわち、従来、ヒト、マウス、ラット、ウシ、イヌ、及びゼブラフィッシュを含む脊椎動物のｌｙＰｌｓ  ａｓｅが公知であった。本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅは、上記のように微生物由来であり、本発明者らにより新規に発見された微生物由来のｌｙＰｌｓ  ａｓｅである。
【０２１３】
この様なｌｙＰｌｓ  ａｓｅは、本本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量であり、さらに該酵素が本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅ及び／またはＰＬである場合、ｌｙＰｌｓＥｔｎを加水分解し、グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドとを得る反応を触媒する酵素として利用できる。
【０２１４】
本発明はまた被験者の自然排泄尿中のＭＩの定量手段と、同一被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎの定量手段とを含む、該被験者を認知症患者またはその前段階にある者か否かを分類するための認知症検査手段であって、健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、ＭＩとＰｌｓＥｔｎとのそれぞれの、予め求められた閾値に対して、被験者のＭＩとＰｌｓＥｔｎの定量値を比較して用いる、前記の認知症検査手段に関わる。前記手段としては、組成物、検査試薬、酵素キット等が挙げられるがこれに限定されない。
【０２１５】
本発明はまた、被験者の自然排泄尿中のＭＩを定量する為の酵素と、同一被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎを定量する為の酵素とを含む、該被験者を認知症患者またはその前段階にある者か否かを分類するための認知症検査試薬キットであって、健常者と、認知症患者またはその前段階にある者とを区別することができる、ＭＩとＰｌｓＥｔｎとのそれぞれの、予め求められた閾値に対して、被験者のＭＩとＰｌｓＥｔｎの定量値を比較して用いる、前記の検査試薬キットに関わる。
【０２１６】
ＰｌｓＥｔｎを定量する試薬キットは、ＰｌｓＥｔｎを１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法で定量する方法、上記工程（１）〜（３−４）を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法により定量する方法などを実施するための試薬キットであり、本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅ及び／またはＰＬの作用を利用して定量するための試薬キットが好ましい。
【０２１７】
本実施の形態の認知症検査試薬キット（本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量であり、さらに該酵素が本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅ及び／またはＰＬである認知症検査試薬キット及び本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、さらに上記工程（１）〜（３−４）又は（１）〜（３−３）´を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法を利用した定量である認知症検査試薬キット）は、本明細書に記載の各種酵素、ＰＬ、ｌｙＰｌｓ  ａｓｅ、ＧＰＣＰ、エタノールアミンオキシダーゼ、ＰＬＡ１、ＰＬＡ２、ＰＬＢ、ＬＹＰＬ、ＭＧＬＰ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、ＡＳＯＭ等を、上述の認知症検査方法の記載を参照して、適宜組み合わせて１以上含むことができる。それらの好ましい例は上述の本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量である方法の場合と同様である。
【０２１８】
本実施の形態の認知症検査試薬キットは、測定の感度、正確性、再現性、キットの安定性等の品質を向上する目的等で、塩、糖、防腐剤、キレート剤、タンパク質、界面活性剤等他の成分を含有してもよい。含有される成分の種類及び量は、認知症検査試薬キットの使用目的や測定用途に応じて適宜変更することができ、例えば、測定感度、特異度、再現性、経済的な理由、安全性目的、適用法令等に応じて当業者であれば適宜変更し得る。それらの好ましい例は上述の本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程が、酵素を利用した定量である方法の場合と同様である。
【０２１９】
本発明は、被験者の自然排泄尿中のＭＩを定量する酵素と、同一被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎを定量する酵素とを含む酵素試薬キットであって、被験者を認知症患者またはその前段階にある者として分類することを特徴とする認知症検査試薬キットにも関する。被験者の自然排泄尿中のＭＩを定量する酵素を含む酵素試薬キットには少なくともミオイノシトールデヒドロゲナーゼを含むことが好ましい。
【０２２０】
本発明の実施の形態の認知症検査試薬キットは、自然排泄尿中のＭＩと血清及び／又は血漿中のＰｌｓＥｔｎ、それぞれの定量値に閾値を設定することによって被験者を認知症患者またはその前段階にある者として分類することも好ましく、そのような閾値は上述と同様である。また、本発明の実施の形態の認知症検査試薬キットで定量する被験者の自然排泄尿、血清及び／又は血漿中については上述と同様である。
【０２２１】
本発明の実施の形態の認知症検査試薬キットが、本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する工程を利用し、さらに上記工程（１）〜（３−４）又は（１）〜（３−３）´を含む本発明の実施の形態の血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量を定量する方法を利用したキットの場合、内容物の各成分を単一の容器のキットとしてもよいが、通常は２以上の容器に分離することが好ましい。一態様において、本実施の形態の認知症検査試薬キットは、被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ以外の物質を消去するための消去用容器１と、ＰｌｓＥｔｎを測定するための容器２とに分けられる。
【０２２２】
本発明の実施の形態の認知症検査試薬キットは、以下の（１ａ）〜（３ａ）を含み、（１ａ）〜（３ａ）は被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ以外の物質を消去するための消去用容器１と、ＰｌｓＥｔｎを測定するための容器２とに分けることができる。
【０２２３】
（１ａ）ＰｌｓＥｔｎをｌｙＰｌｓＥｔｎに加水分解できる酵素およびその酵素反応を進めることのできる添加物。
（２ａ）ｌｙＰｌｓＥｔｎをグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解でき、かつエーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できない加水分解酵素およびその酵素反応を進めることのできる添加物。
（３ａ）グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンをエタノールアミンとグリセロリン酸に変換する酵素、エタノールアミンをグリコールアルデヒド、アンモニア、及び過酸化水素に変換する酵素とその酵素反応を進めるにことのできる添加物、さらに必要により過酸化水素を定量するための過酸化水素定量手段。
または前記（２ａ）の加水分解酵素がリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる酵素である場合、前記（１ａ）に、さらにリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解する酵素を含む試薬キット。
【０２２４】
そのような試薬キットの好ましい例は、少なくとも上記（１ａ）及び（３ａ）を含有する容器１：並びに少なくとも（２ａ）を含有する容器２を含む、認知症検査試薬キットである。
【０２２５】
被験者の血清及び／又は血漿中にホスファチジルエタノールアミンが含まれ、かつ、ｌｙＰｌｓＥｔｎをグリセロ−３−ホスフォエタノールアミンとアルデヒドに加水分解する作用を触媒する酵素がリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解する作用を有する場合は、容器１にさらにリゾホスファチジルエタノールアミンを分解し、実質的に消去する作用を有する酵素を内容物として含有する容器１とすれば良い。
【０２２６】
本発明の実施の形態の認知症検査試薬キットは、以下の（１ａ）〜（３ａ）´を含み、（１ａ）〜（３ａ）´は被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎ以外の物質を消去するための消去用容器１と、ＰｌｓＥｔｎを測定するための容器２とに分けることができる。
【０２２７】
（１ａ）ＰｌｓＥｔｎをｌｙＰｌｓＥｔｎに加水分解できる酵素およびその酵素反応を進めることのできる添加物。
（２ａ）´ｌｙＰｌｓＥｔｎをプラズメニルホスファチジン酸とエタノールアミンに分解でき、かつエーテル型リゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解でき、かつリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解できる加水分解酵素およびその酵素反応を進めることのできる添加物。
（３ａ）´エタノールアミンをグリコールアルデヒド、アンモニア、及び過酸化水素に変換する酵素とその酵素反応を進めるにことのできる添加物、さらに必要により過酸化水素を定量するための過酸化水素定量手段。
【０２２８】
そのような試薬キットの好ましい例は、少なくとも上記（１ａ）及び（３ａ）´を含有する容器１：並びに少なくとも（２ａ）´を含有する容器２を含む、認知症検査試薬キットである。
【０２２９】
被験者の血清及び／又は血漿中にホスファチジルエタノールアミンが含まれ、かつ、ｌｙＰｌｓＥｔｎをプラズメニルホスファチジン酸とエタノールアミンに加水分解する作用を触媒する酵素がリゾホスファチジルエタノールアミンを加水分解する作用を有する場合は、容器１にさらにリゾホスファチジルエタノールアミンを分解し、実質的に消去する作用を有する酵素を内容物として含有する容器１とすれば良い。
【０２３０】
本実施の形態の認知症検査試薬キットは、少なくとも既知量のＰｌｓＥｔｎを含むキャリブレーション試薬とともに用いてもよい。上記のキャリブレーション試薬は、例えば、少なくとも既知量のＰｌｓＥｔｎ及び／又はｌｙＰｌｓを含む試薬であり、好ましくはｐＨ緩衝剤、アジ化ナトリウムや抗生物質等の防腐剤、糖等の安定化剤を含む。これらの種類や濃度等の条件等は上記認知症検査試薬キットに関して記載した条件を参照して当業者であれば適宜決定することができる。キャリブレーション方法は、一点検量の他、多点検量（折れ線やスプライン）や多点検量の直線回帰などが選択できる。
【０２３１】
キャリブレーション試薬中のＰｌｓＥｔｎの既知量は特に限定されず、被験者の血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎを正確に測定することができるよう、適宜選択すればよい。
【０２３２】
また、本実施の形態の認知症検査試薬キットのキャリブレーション試薬の場合、ＰｌｓＥｔｎの既知量の下限値は１０μＭ以上、好ましくは５０μＭ以上、更に好ましくは８０μＭ以上、上限値は５００μＭ以下、好ましくは３００μＭ以下、更に好ましくは２５０μＭ以下とすることができる。
【０２３３】
本実施の形態の認知症検査試薬キット及び上述のキャリブレーション試薬は、液状品、液状品の凍結物、液状品の凍結乾燥品又は液状品の乾燥品（加熱乾燥及び／又は風乾及び／又は減圧乾燥等による）等の形態で提供することができる。また、例えば、ポイントオブケア装置のキャピラリーへの使用又は酵素センサーとしての使用の場合、各成分の濃度は通常よりも高い濃度が好ましく、例えば、固定化したり、紙や膜に染み込ませたり、ゲル・ゾル状認知症検査試薬キットとしたりして使用することが好ましい。
【０２３４】
以下、本発明を参考例及び実施例（実施例等）に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の実施例等に限定して解釈されるものではない。
【０２３５】
本実施例等において、被験者は、東京都健康長寿医療センター「もの忘れ」外来来院者および高齢健常者「脳画像診断」ボランティアの中で、同センター倫理委員会の承認下、インフォームドコンセントが得て血液および尿を採取した。
【０２３６】
血清プラスマローゲン（コリン型プラスマローゲン：ＰｌｓＣｈｏ、エタノールアミン型プラスマローゲン：ＰｌｓＥｔｎ）以外の他のバイオマーカー（ＷＢＣ、ＲＢＣ、Ｈｂ、Ｈｔ、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ、ＰＬＴ、ＴＰ、Ａｌｂ、Ｔ−Ｂｉｌ、Ｃｒｅ、ＵＡ、β２−ｕｂ、ＡＭＹ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、Ｎａ、Ｃｌ、Ｋ、ＴＳＨ、ＦｒｅｅＴ３、ＦｒｅｅＴ４、Ｇｌｕ、ＨｂＡ１ｃ、ＣＲＰ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＴＧ、ＴＣ、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、ＰＬ、ＶＢ９、ＶＢ１２、α−Ｔｏｃ、β−Ｔｏｃ、γ−Ｔｏｃ、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２）は、株式会社エスアールエル（東京都新宿区西新宿２−１−１）にて測定した。
【０２３７】
自然排泄尿ＭＩ（尿ＭＩ）はミオイノシトール測定試薬（ルシカＭＩ、旭化成ファーマ株式会社、東京都千代田区神田神保町１丁目１０５）で測定し、１日あるいは３日分の平均値をＣｒｅで標準化した値（ｍｇ／ｇＣｒ）で示した。
【０２３８】
認知機能検査はＣＤＲ、ＨＤＳ−Ｒ、ＭＭＳＥおよびＭｏＣＡ−Ｊを行ない、うつ状態の検査として「老年期うつ病評価尺度（ＧＤＳ）」による検査を実施した。
【０２３９】
本実施例等で用いた試薬類としては、特に断らない限り、和光純薬工業株式会社、シグマアルドリッチ社等市販され容易に入手することができる任意のものを使用し、試薬メーカー、純度、価格等は特に限定されず、必要に応じて当業者であれば適宜選択して用いることができる。ヒトプール血清は、有限会社山久化成（東京都稲城市向陽台４−２−Ｃ−１００７）から購入したものを使用した。本実施例等に使用した技術は、例えば本明細書に記載の先行技術文献、マニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２年及び１９８９年）、蛋白質・酵素の基礎実験法（改訂第２版、堀尾武一、１９９４年南光堂参照）及び市販の各種酵素又はキット類に添付された手順に従って、当業者であれば実施することができるものである。
【０２４０】
ｌｙＰｌｓ  ａｓｅの酵素活性は以下の様にして測定した。
【０２４１】
石英製の１．０ｃｍキュベットに反応試薬混合液を１ｍＬとり、３７℃で５分間予備加温する。１２０ｍＭ  マンニトール及び７０ｍＭシュークロースを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で適当な濃度に希釈した本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅ  ２０μＬを反応試薬混合液に混和して反応を開始する。５４６ｎｍにおける吸光度を１０分間測定し、求められた吸光変化をＡｓ／ｍｉｎ、本発明の蛋白質溶液の代わりに精製水を用いた盲検をＡｂ／ｍｉｎとして、１分間に１μｍｏｌのＰｌｓＥｔｎを酸化する酵素量を１Ｕとし、酵素活性（Ｕ／ｍＬ）を下記［式］により算出する。
【０２４２】
酵素活性（Ｕ／ｍＬ）
＝｛（Ａｓ／ｍｉｎ−Ａｂ／ｍｉｎ）／１８｝×１．０２／０．０２×希釈倍数・・［式］
［反応試薬混合液］
５０ｍＭ      ＢＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液  ｐＨ７．５
５Ｕ／ｍＬ    ＧＰＣＰ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−３３）
５Ｕ／ｍＬ    ＰＯＤ  （ＳＩＧＭＡ（Ｐ８２５０）
０．０２％    ＴＯＤＢ（同仁化学研究所（ＯＣ２２））
０．０３％    ４−ＡＡ（０１２−１４４７１）
８ｍＭ        ｌｙＰｌｓＥｔｎ
（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（８５００９５））
本実施例等で用いた下記の［日立７０８０形自動分析機パラメーター］は、日立７０８０形自動分析機の取扱説明書等を参考にして、当業者であれば容易に設定し、該分析機を使用することができる。［日立７０８０形自動分析機パラメーター１］を例に、以下に簡単に分析機の使用方法を説明する。分析法（比色分析）は、１０分反応の２ポイントエンド法で、反応開始後約１０分後と５分後の吸光度の差を出力する（セルブランク、水ブランク、試薬量等の補正後に出力される）。測定波長は、主波長が６６０ｎｍであり、副波長は７５０ｎｍである。サンプル量（血清及び／又は血漿の量）は１２μＬ、最初の工程のための検査試薬キット１はＲ１として１６０μＬ使用し、次の工程のための検査試薬キット２はＲ３として４０μＬ使用する。なお、パラメーター中の空欄（［  ］）は、空欄にしておくという意味である。
【０２４３】
［日立７０８０形自動分析機パラメーター１］
分析法：              ［２ポイントエンド］［１０］［１６］［３１］［０］［０］
波長（副波長／主波長）：［７５０］／［６６０］
検体量：                種別１
標準：                ［１２．０］［０．０］［０］
試薬分注量
Ｒ１：              ［１６０］［０］［  ］［９９］
Ｒ２：              ［０］［０］［  ］［９９］
Ｒ３：              ［４０］［０］［  ］［９９］
Ｒ４：              ［０］［０］［  ］［９９］
［日立７０８０形自動分析機パラメーター２］
分析法：              ［２ポイントエンド］［１０］［１６］［３１］［０］［０］
波長（副波長／主波長）：［７５０］／［６６０］
検体量：                種別１
標準：                ［６．０］［０．０］［０］
試薬分注量
Ｒ１：              ［１６０］［０］［  ］［９９］
Ｒ２：              ［０］［０］［  ］［９９］
Ｒ３：              ［４０］［０］［  ］［９９］
Ｒ４：              ［０］［０］［  ］［９９］
以下に示した測定値等は、様々な条件、例えば、試薬の純度、測定の条件、使用機器の精度等、使用機器の置かれた温度や気圧等の雰囲気により変化し得るが、同条件で測定した場合には以下の実施例等で得られたものと同じ傾向を示す結果が得られることは当業者であれば理解できるであろう。
【０２４４】
【実施例】
【０２４５】
［実施例１：尿ＭＩ定量値と血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ定量値による認知症検査］
本実施例では、血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量は特許文献１に記載された放射性ヨウ素−高速液体クロマトグラフィー法（１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法）で測定した。本実施例では、空腹時二番尿中のＭＩを測定した。【０２４６】
１．血清ＰｌｓＥｔｎ量
全測定データ（表１−１、１−２）を基に、認知機能と相関性を示す項目を検索したところ、年齢、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、遊離トリヨードサイロニン（ＦｒｅｅＴ３）、アルブミン（Ａｌｂ）、グルコース（Ｇｌｕ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）に加えプラスマローゲン関連（ＰｌｓＥｔｎ、ＰｌｓＣｈｏ／ＰｌｓＥｔｎ比、全リン脂質中のＰｌｓＥｔｎ：ＰｌｓＥｔｎ／ＰＬ）項目で有意な相関を示すことが確認された（表２）。これらの項目についてＣＤＲ別に有意差検定を行なったところ、ＣＤＲ３群（０、０．５、１≦）すべてで有意差がみられた項目は認知機能検査（ＨＤＳ−Ｒ、ＭＭＳＥ、ＭｏＣＡ−Ｊ）を除いてはＰｌｓＥｔｎとＰｌｓＥｔｎ／ＰＬのみであった（表３）。以上の解析から、血清ＰｌｓＥｔｎは認知症を分類するバイオマーカーとして機能することが確認された。【０２４７】
【表１−１】
2014010667.tif 000005
【０２４８】
【表１−２】
2014010667.tif 000006
【０２４９】
【表２】
2014010667.tif 000007
【０２５０】
【表３】
2014010667.tif 000008
２．尿ＭＩ量
尿ＭＩ量の世代別・性別測定データを基に、群間での有意差検定を行なったところ、男女とも高齢者群で尿ＭＩ量が有意に増加することが確認された。高齢者群の尿ＭＩ量は、若年および中年者群と比べて個人差がきわめて大きかった。また、高齢者の中の健常者と認知症患者の間では尿ＭＩ量に有意差を認めなかった（図１、表４）。【０２５１】
【表４】
2014010667.tif 000009
全測定データ（表１）を基に、尿ＭＩ量と相関性を示す項目を検索したところ、「もの忘れ」群のみでプラスマローゲン関連（ＰｌｓＥｔｎ、ＰｌｓＣｈｏ＋ＰｌｓＥｔｎ、ＰｌｓＣｈｏ／ＰｌｓＥｔｎ比）項目とヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）で尿ＭＩと有意な相関を示すことが確認された（表５−１、５−２）。【０２５２】
【表５−１】
2014010667.tif 000010
【０２５３】
【表５−２】
2014010667.tif 000011
ＰｌｓＥｔｎ量、尿ＭＩ量およびＨｂＡ１ｃ量の３者の関係に注目して、尿ＭＩ量およびＨｂＡ１ｃ量がＰｌｓＥｔｎ量に及ぼす影響を検討した。健常者群と「もの忘れ」群ごとに、尿ＭＩ量およびＨｂＡ１ｃ量を全測定値の平均値を境に４群に分割して、各群でのＰｌｓＥｔｎ量を比較した。健常高齢者ではＰｌｓＥｔｎ量に４群間で有意差を認めなかった。一方、「もの忘れ」群では、高ＨｂＡ１ｃ者（＞５．５  ％）において高尿ＭＩ者（＞３６．６ｍｇ／ｇＣｒ）と低尿ＭＩ者間でＰｌｓＥｔｎ量に有意差を認めた。また、高尿ＭＩ者では健常者と「もの忘れ」群間でＰｌｓＥｔｎ量に有意差を認めた（図２）。以上の解析により、尿ＭＩ量を考慮する（高ＭＩ者を選択する）ことで、血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量の定量による認知症患者の検出確度（そして認知機能の評価能）が高まることが推測された。【０２５４】
３．尿ＭＩ量＋血清及び／又は血漿ＰｌｓＥｔｎ量
全高齢者（健常＋「もの忘れ」群）を対象に、血清ＰｌｓＥｔｎ（ＥＰ）量と尿ＭＩ量の全測定値の平均値を境に４群に分割して、各群での認知機能検査結果を比較した。認知機能検査（ＣＤＲ、ＨＤＳ−Ｒ、ＭＭＳＥ）の結果に対応させた場合、血清ＰｌｓＥｔｎ（ＥＰ）量（低レベル）かつ尿ＭＩ量（高レベル）群は他の３群と比較していずれも有意な認知機能低下を示した（図３、表６）。以上の解析から、血清ＰｌｓＥｔｎ量と尿ＭＩ量の測定を組み合わせることで、高精度で認知症患者を分類できることが確認された。【０２５５】
【表６】
2014010667.tif 000012
さらに、血清ＰｌｓＥｔｎ量が５８μＭ未満、尿ＭＩ量が２５ｍｇ／ｇＣｒ以上をそれぞれの基準とした場合の検出確度を調べたところ、７２．２％（８３／１１５）の確度で認知症患者を検出することができた（図４）。【０２５６】
また、全高齢者、尿ＭＩ量＞２５ｍｇ／ｇＣｒ高齢者群および尿ＭＩ量＞３６．６ｍｇ／ｇＣｒ高齢者群の３群について、血清ＰｌｓＥｔｎの認知機能正常（ＣＤＲ値：０）と認知機能非正常（ＣＤＲ値：０．５以上）を分別する精度について、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）解析によるＲＯＣ曲線下の面積（Ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ：ＡＵＣ）を求めることによって調べた。その結果、尿ＭＩ量が高レベルの高齢者を対象にするほど血清ＰｌｓＥｔｎの分別能が高くなることが示された。すなわち、尿ＭＩ量＞３６．６ｍｇ／ｇＣｒの高齢者を対象とした場合の血清ＰｌｓＥｔｎ量の分別能（ＡＵＣ）は０．８３８と、対面式認知機能検査（ＨＤＳ−Ｒ、ＭＭＳＥ、ＭｏＣＡ−Ｊ）のＡＵＣ（０．８７６〜０．８９４）に匹敵した（図５）。【０２５７】
さらに、血清ＰｌｓＥｔｎ量の認知機能評価能と対面式認知機能検査法との相関性を、対象者を全高齢者、尿ＭＩ量＞２５ｍｇ／ｇＣｒ高齢者群および尿ＭＩ量＞３６．６ｍｇ／ｇＣｒ高齢者群の３群について検討したところ、尿ＭＩ量が高レベルの高齢者を対象にするほど血清ＰｌｓＥｔｎ量と認知機能検査結果との相関性が高くなることが示された（図６、表７）。以上の結果から、血清ＰｌｓＥｔｎ量の測定と尿ＭＩ量の測定を組み合わせることで、高確度で認知症患者を分類できるようになり、さらには血清ＰｌｓＥｔｎ量を指標とした認知機能評価能が高まることが確認された。【０２５８】
【表７】
2014010667.tif 000013
［実施例２：随時尿中と空腹時二番尿中のＭＩ定量値の比較］
本実施例では、随時尿中と空腹時二番尿中のＭＩ定量値を比較し、本発明の実施の形態の認知症検査方法において随時尿が空腹時二番尿に代替できることを確認した。【０２５９】
５０人の被験者から、連日あるいは適当な隔日（１ヶ月以内）の３日分の随時尿を採尿してＭＩを定量し平均値を随時尿中のＭＩ定量値（ｙ軸）とした。被験者から、連日あるいは適当な隔日（１ヶ月以内）の３日分の空腹時二番尿を採尿してＭＩを定量し平均値を空腹時二番尿のＭＩ定量値（ｘ軸）とした。それぞれの定量値の相関図を図１０に示した。相関式はｙ  ＝１．０５ｘ＋６．６４、相関係数ｒ＝０．８４５と高い相関があったので、随時尿が空腹時二番尿に代替できることが確認できた。【０２６０】
また、本実施例に用いた５０人の被験者の随時尿中ＭＩ量と空腹時二番尿中ＭＩ量の平均はそれぞれ３２．３ｍｇ／ｇＣｒと４０．５ｍｇ／ｇＣｒであり、空腹時二番尿中ＭＩ量＋７．８＝随時尿中ＭＩ量の関係になる場合があることが分かった。【０２６１】
［実施例３：酵素を利用した血清、血漿等中のＰｌｓＥｔｎの定量］
［組成物１−１ａ］
２０ｍＭ      ＢＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液  ｐＨ７．５
０．０５ｍＭ  ＡＬＰＳ（同仁化学研究所（ＯＣ０４））
２ｍＭ        ＣａＣｌ２
７０ｍＭ      Ｓｕｃｒｏｓｅ
１２０ｍＭ    Ｍａｎｎｉｔｏｌ
５Ｕ／ｍＬ    ＧＰＣＰ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−３３））
４０Ｕ／ｍＬ  特開２００５−５２０３４号公報のＴＯＤ
５Ｕ／ｍＬ    国際公開番号：ＷＯ２０１２／１０５５６５  Ａ１のＰＬ
１０Ｕ／ｍＬ  ＰＯＤ  （ＳＩＧＭＡ（Ｐ８２５０））
５Ｕ／ｍＬ    ＡＳＯＭ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−５３））
［組成物２−１ａ］
２０ｍＭ      ＢＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液  ｐＨ７．５
１ｍＭ        Ｎａ２ＳＯ４
０．１２ｍＭ  ＤＡ−６７（和光純薬工業株式会社（０４６−２２３４１））
７０ｍＭ      Ｓｕｃｒｏｓｅ
１２０ｍＭ    Ｍａｎｎｉｔｏｌ
５Ｕ／ｍＬ    Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅ
２％          β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ
０．１％      ＤＤＭ（同仁化学研究所（Ｄ３８２））
上記の［組成物１−１ａ］と［組成物２−１ａ］を調製し、それぞれＲ１、Ｒ２として、［日立７０８０形自動分析機パラメーター１］で日立７０８０形自動分析機を用いて、０、２５、５０、・・・、１２５、１５０μＭの各濃度になるように、ＰｌｓＥｔｎ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．Ａｌａｂａｍａ、ＵＳＡ、８５２８０４Ｃ）をプール血清と０．９％食塩水に添加した検体を測定した。【０２６２】
結果を図１１に示した。図中白丸はＰｌｓＥｔｎをプール血清に添加した検体の定量値の検量線であり、ｙ＝２．１０ｘ＋１６４、相関係数ｒ＝０．９９７で酵素を利用した血清、血漿中のＰｌｓＥｔｎの定量ができた。黒丸はＰｌｓＥｔｎを０．９％食塩水に添加した検体の定量値の検量線であり、ｙ＝２．２８ｘ−５４、相関係数ｒ＝０．９９８で試料のＰｌｓＥｔｎの定量ができた。血清中ＰｌｓＥｔｎと０．９％食塩水中ＰｌｓＥｔｎの定量値の検量線の傾きが同じでかつ相関係数が１に近かった。【０２６３】
なお、血清中ＰｌｓＥｔｎの検量線の定量値の、切片は元々血清に含まれていたＰｌｓＥｔｎの影響であり、０．９％食塩水中ＰｌｓＥｔｎの定量値の検量線の切片は試薬ブランクの影響である。また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅの製造方法は後述する。【０２６４】
［組成物１−１ｂ］
５０ｍＭ             ＢＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．５
１０Ｕ／ｍＬ         Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
５０Ｕ／ｍＬ         Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ
５Ｕ／ｍＬ           ＧＰＣＰ
１Ｕ／ｍＬ           国際公開番号：ＷＯ２０１２／１０５５６５  Ａ１のＰＬ
［組成物１−１ｂ］
５０ｍＭ             ＢＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．５
４．２Ｕ／ｍＬ              ラット由来のｌｙＰｌｓ  ａｓｅ
１２μＭ             ＤＡ６７
ここで、ラット由来のｌｙＰｌｓ  ａｓｅはＴｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１１年、２８６巻、２４９１６〜２４９３０頁に記載の方法でラット由来のｌｙＰｌｓ  ａｓｅを大腸菌組換体として製造した。【０２６５】
１０％  ＤＤＭにＰｌｓＥｔｎを０〜２００μＭになるように添加して検体とした。検量線は相関式ｙ＝２．２７ｘ−５３で表され、相関係数ｒ＝０．９９８であった。なお、切片が−５３となった理由は、上記と同様である。【０２６６】
本実施例により酵素を利用した血清、血漿等中のＰｌｓＥｔｎが正確に定量できることが示された。【０２６７】
［実施例４：１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法と酵素を利用した血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎの定量値の比較１］
４７の血清検体を、次の２種類の方法で測定した：
（ｉ）１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法、
（ｉｉ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅを使用した酵素法（［組成物１−１ａ］と［組成物２−１ａ］）。【０２６８】
それぞれの検査試薬キットをＲ１、Ｒ２として、［日立７０８０形自動分析機パラメーター２］で日立７０８０形自動分析機を使用して測定した。【０２６９】
それぞれの定量値の相関図を図１２に示した。相関式はｙ  ＝０．５５ｘ＋２６．９、相関係数ｒ＝０．８８０と高い相関があり、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉ１ｄａ由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅを使用した酵素法で検体中のＰｌｓＥｔｎが測定できた。【０２７０】
［実施例５：１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法と酵素を利用した血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎの定量値の比較２］
４７の血清検体を、次の２種類の方法で測定した：
（ｉ）１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法、
（ｉｉｉ）Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．を使用した酵素法（［組成物１−２ｃ］と［組成物２−２ｃ］）。【０２７１】
それぞれの検査試薬キットをＲ１、Ｒ２として、［日立７０８０形自動分析機パラメーター２］で日立７０８０形自動分析機を使用して測定した。【０２７２】
［組成物１−２ｃ］
２０ｍＭ      ＢＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液  ｐＨ７．５
０．０５ｍＭ  ＡＬＰＳ（同仁化学研究所（ＯＣ０４））
２ｍＭ        ＣａＣｌ２
７０ｍＭ      Ｓｕｃｒｏｓｅ
１２０ｍＭ    Ｍａｎｎｉｔｏｌ
５Ｕ／ｍＬ    ＧＰＣＰ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−３３））
４０Ｕ／ｍＬ  特開２００５−５２０３４号公報のＴＯＤ
５Ｕ／ｍＬ    国際公開番号：ＷＯ２０１２／１０５５６５  Ａ１のＰＬ
１０Ｕ／ｍＬ  ＰＯＤ  （ＳＩＧＭＡ（Ｐ８２５０））
５Ｕ／ｍＬ    ＡＳＯＭ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−５３））
５Ｕ／ｍＬ    ＬＹＰＬ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−５９））
［組成物２−２ｃ］
２０ｍＭ      ＢＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液  ｐＨ７．５
１ｍＭ        Ｎａ２ＳＯ４
０．１２ｍＭ  ＤＡ−６７（和光純薬工業株式会社（０４６−２２３４１））
７０ｍＭ      Ｓｕｃｒｏｓｅ
１２０ｍＭ    Ｍａｎｎｉｔｏｌ
５Ｕ／ｍＬ    Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅ
２％          β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ
それぞれの定量値の相関図を図１３に示した。相関式はｙ  ＝０．７８ｘ＋１６．８、相関係数ｒ＝０．８５８と高い相関があり、Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅを使用した酵素法で検体中のＰｌｓＥｔｎが測定できた。【０２７３】
［実施例６：１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法と酵素を利用した血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎの定量値の比較３］
４７の血清検体を、次の２種類の方法で測定した：
（ｉ）１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法、
（ｉｖ）ＰＬＤを使用した酵素法（［組成物１−３］と［組成物キ２−３］）。【０２７４】
それぞれの検査試薬キットをＲ１、Ｒ２として、［日立７０８０形自動分析機パラメーター２］で日立７０８０形自動分析機を使用して測定した。【０２７５】
［組成物１−３］
２０ｍＭ      Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液  ｐＨ８．５
０．０５ｍＭ  ＡＬＰＳ（同仁化学研究所（ＯＣ０４））
２ｍＭ        ＣａＣｌ２
２ｍＭ        ＭｇＣｌ２
２Ｕ／ｍＬ    ＧＰＣＰ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−３３））
４０Ｕ／ｍＬ  ＴＯＤ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−２５））
５Ｕ／ｍＬ    ＰＬＡ２（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−３１））
３０Ｕ／ｍＬ  ＬＹＰＬ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−５９））
１０Ｕ／ｍＬ  ＰＯＤ  （ＳＩＧＭＡ（Ｐ８２５０））
５Ｕ／ｍＬ    ＡＳＯＭ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−５３））
０．１％      ＴＸ−１００
［組成物２−３］
２０ｍＭ      ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液  ｐＨ７．５
１０ｍＭ      ＣａＣｌ２
０．１２ｍＭ  ＤＡ−６７（和光純薬工業株式会社（０４６−２２３４１））
１０Ｕ／ｍＬ  ＰＬＤ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−３９））
２％          β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ
１％          ＴＸ−１００
それぞれの定量値の相関図を図１４に示した。相関式はｙ＝０．７４ｘ＋１９．８、相関係数ｒ＝０．８２５と高い相関があり、ＰＬＤを使用した酵素法で検体中のＰｌｓＥｔｎが測定できた。
［実施例７：１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法と酵素を利用した血清または血漿中のＰｌｓＥｔｎの定量値の比較４］
４７の血清検体を、次の４種類の方法で測定した：   
（ｉ）１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法、
（ｉｉ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅを使用した酵素法（［組成物１−１ａ］と［組成物２−１ａ］）、
（ｉｉｉ）Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．を使用した酵素法（［組成物１−２ｃ］と［組成物２−２ｃ］）、
（ｉｖ）ＰＬＤを使用した酵素法（［組成物１−３］と［組成物キ２−３］）。【０２７６】
それぞれの検査試薬キットをＲ１、Ｒ２として、［日立７０８０形自動分析機パラメーター２］で日立７０８０形自動分析機を使用して測定した。【０２７７】
各方法による測定値の平均値を表８に示した。【０２７８】
【表８】
2014010667.tif 000014
１２５Ｉ−ＨＰＬＣ法によるＰｌｓＥｔｎ定量値に比べて、（ｉｉ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅを使用した酵素法は約２μＭ低くなり、（ｉｉｉ）Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．を使用した酵素法と（ｉｖ）ＰＬＤを使用した酵素法は約３μＭ平均値が高くなる場合があることが分かった。【０２７９】
［実施例８：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅ組換体酵素の製造方法］
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（ＫＴ２４４０）の染色体ＤＮＡを、フェノール・クロロホルム法にて抽出した。染色体ＤＮＡをテンプレートにし、配列番号８に記載の塩基配列をセンスプライマー、配列番号９に記載の塩基配列をアンチセンスプライマーとして、ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡績株式会社、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＫＦＸ−１０１）を用いてＰＣＲし、ＰＣＲ産物１を得た。得られたＰＣＲ産物１をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号Ｋ２７００−２０）を用いてｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔにクローニングして、本発明の蛋白質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む組換えベクターＰＰ＿ｌｙＰｌａ  ａｓｅ／ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔを得た。ｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ  ６９７４０−３）をＮｄｅＩとＥｃｏＲ  Ｉで切断して約５．４ｋｂｐのＤＮＡを精製した。ＰＰ＿ｌｙＰｌａ  ａｓｅ／ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔを制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲ  Ｉで切断し、約０．７ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたそれぞれの精製ＤＮＡを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ株式会社、製品コード６０２２）でライゲーションして本発明の蛋白質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む組換えベクターＰＰ＿ｌｙＰｌａ  ａｓｅ／ｐＥＴ−２１ａ（＋）を得た。ＰＰ＿ｌｙＰｌａ  ａｓｅ／ｐＥＴ−２１ａ（＋）を、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号Ｃ６０００−０３）に形質転換して本発明の蛋白質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む組換えベクターを有する形質転換体ＰＰ＿ｌｙＰｌａ  ａｓｅ／ｐＥＴ−２１ａ（＋）／ＢＬ２１（ＤＥ３）を得た。ＰＰ＿ｌｙＰｌａ  ａｓｅ／ｐＥＴ−２１ａ（＋）／ＢＬ２１（ＤＥ３）を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む、１．６Ｌ（２Ｌジャー）のＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ  Ｍｅｄｉｕｍ（メルク、注文番号７１７５７−５）に植菌した。３４℃、ｐＨ６．８で３０時間培養して培養液を遠心分離して集菌し、７０ｍＭ  Ｓｕｃｒｏｓｅ、１２０ｍＭ  Ｍａｎｎｉｔｏｌ、及び１．２％  ＤＤＭを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で４℃１時間懸濁した。懸濁液を遠心分離し、上清の粗Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅを約１７０Ｕを得た。本実施例で得たＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅは、適宜濃縮して実施例３、４、７、１２で使用した。【０２８０】
［実施例９：Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅの製造方法］
Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６２８として独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センターに寄託）を２．４ＬのＩＰＳ２培地（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、カタログ番号２７７０１０）へ常法に従い植菌し、４５℃、１８０ｒｐｍで８４ｈ振とう培養した。培養上清のｌｙＰｌｓ  ａｓｅ活性は約０．０５８Ｕ／ｍＬ（総量１０４Ｕ）であった。遠心分離にて除菌して得た培養上清を０．４５μmのフィルターで濾過し、８５％飽和量硫安でタンパク質を濃縮した。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）に対して透析脱塩を行った濃縮液はＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣｕｐ Ｑ‐６５０Ｍ（ＴＯＳＯＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ）にて次の条件で部分精製した：１．０Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）と２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）を用いた２０ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ  ｖｏｌｕｍｅ）のリニアグラジェントによるカラムクロマトグラフィー。活性画分に１．５Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＰＰＧ‐６００Ｍ（ＴＯＳＯＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ）にて次の条件で部分精製した：１．５Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）と２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いた２０ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ  ｖｏｌｕｍｅ）のリニアグラジェントによるカラムクロマトグラフィー。活性画分はＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）にて次の条件で部分精製した：０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）と２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いた４０ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ  ｖｏｌｕｍｅ）のリニアグラジェントによるカラムクロマトグラフィー。活性画分に０．１５Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）でさらに部分精製した：２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）＋０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ。活性画分は１．６５  Ｍ  となるように硫酸アンモニウムを添加し、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｉｓｏ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）にて次の条件でさらに部分精製した：１．６５Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）と２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いた４０ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ  ｖｏｌｕｍｅ）のリニアグラジェントによるカラムクロマトグラフィー。活性画分はＭｏｎｏ  Ｑ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）にて次の条件でさらに部分精製した：０．４Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）と２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いた４０ＣＶのリニアグラジェントによるカラムクロマトグラフィー。活性画分は培養上清から約２８５倍精製した部分精製ｌｙＰｌｓ  ａｓｅを１．５５Ｕ（比活性５０．６Ｕ ｍｇ-１）得た。【０２８１】
［実施例１０：Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅ組換体酵素の製造方法１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ組み換え体）］
Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．の染色体ＤＮＡを、フェノール・クロロホルム法にて抽出した。配列番号１０に記載の塩基配列をセンスプライマー、配列番号１１に記載の塩基配列をアンチセンスプライマーとして、ＫＯＤ  ＦＸを用いてＰＣＲし、約９００ｂｐのＰＣＲ産物２を得た。ＰＣＲ産物２をＮｈｅＩとＢｇｌＩＩで消化し、発現ベクターである放線菌プラスミドのＮｈｅＩ−ＢｇｌＩＩ部位に挿入して、組換えプラスミドｌｙＰｌａ  ａｓｅ／Ｅｘを得た。ｌｙＰｌａ  ａｓｅ／Ｅｘを「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」に記載の方法に従い、プロトプラスト化された放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６を形質転換し、組換え放線菌ｌｙＰｌａ  ａｓｅ／Ｅｘ／Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓを得た。ｌｙＰｌａ  ａｓｅ／Ｅｘ／Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓを、５μｇ／ｍＬのチオストレプトン、１％  グルコース及び１％  トリプトンを含む０．８Ｌトリプチックソイ培地（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）で２８℃、１８０回転で４８時間培養した。培養後、遠心分離にて除菌して得た培養上清に、８５％飽和量となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。この沈殿を可溶化し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）で透析し、粗酵素液を得た。粗酵素液は透析で２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）にｂｕｆｆｅｒ交換し、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｑ−６５０Ｍ（ＴＯＳＯＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ）にて次の条件で部分精製した：１Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）と２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）を用いた１５ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ  ｖｏｌｕｍｅ）のリニアグラジェントによるカラムクロマトグラフィー。活性画分に１．５Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＰＰＧ−６００Ｍ（ＴＯＳＯＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ）にて次の条件で部分精製した：１．５Ｍ  硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）と２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いた１０ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ  ｖｏｌｕｍｅ）のリニアグラジェントによるカラムクロマトグラフィー。活性画分は透析で２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）にｂｕｆｆｅｒ交換し、Ｍｏｎｏ  Ｑ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）にて次の条件で精製した：０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）と２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）を用いた４０ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ  ｖｏｌｕｍｅ）のリニアグラジェントによるカラムクロマトグラフィー。活性画分は透析で２５ｍＭ  Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓ／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．３）にｂｕｆｆｅｒ交換し、Ｍｏｎｏ  Ｐ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）にて次の条件で精製した：開始ｂｕｆｆｅｒ２５ｍＭ  Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓ／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．３）、溶出Ｂｕｆｆｅｒ  ポリバッファー７４（１０倍希釈、ｐＨ４．０）。本実施例による精製結果を表９に���精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図中矢印）を図１５に示した。本実施例で得たＴｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅは、適宜濃縮して実施例５、７、１２で使用した。【０２８２】
【表９】
2014010667.tif 000015
［実施例１１：Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅ組換体酵素の製造方法２（大腸菌組換え体）］
Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．の染色体ＤＮＡを、フェノール・クロロホルム法にて抽出した。配列番号１２に記載の塩基配列をセンスプライマー、配列番号１３に記載の塩基配列をアンチセンスプライマーとして、ＫＯＤ  ＦＸを用いてＰＣＲし、約９００ｂｐのＰＣＲ産物３を得た。ＰＣＲ産物３をＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで消化し、発現ベクターであるｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクターのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入して、Ｔ＿ｌｙＰｌａ  ａｓｅ／ｐＥＴ−２１ａ（＋）を得た。Ｔ＿ｌｙＰｌａ  ａｓｅ／ｐＥＴ−２１ａ（＋）を、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換して本発明の蛋白質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む組換えベクターを有する形質転換体Ｔ＿ｌｙＰｌａ  ａｓｅ／ｐＥＴ−２１ａ（＋）／ＢＬ２１（ＤＥ３）を得た。Ｔ＿ｌｙＰｌａ  ａｓｅ／ｐＥＴ−２１ａ（＋）／ＢＬ２１（ＤＥ３）を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む、５０ｍＬ（５００ｍＬ三角フラスコ）のＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ  Ｍｅｄｉｕｍに植菌した。３７℃、ｐＨ６．８で２４時間振とう培養して培養液を遠心分離して集菌し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁し超音波破砕して、遠心分離し、得られた上清を粗蛋白質液とした。粗蛋白質液中のＴｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ  ｓｐ．由来ｌｙＰｌｓ  ａｓｅ組換体酵素は２０Ｕで、粗蛋白質液のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図１６に示した。ｌｙＰｌｓ  ａｓｅは矢印で示した。【０２８３】
［実施例１２：本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅの基質特異性］
表１０に、各種基質に対する本発明のｌｙＰｌｓ  ａｓｅの作用を、上記の活性測定法に準じて測定した結果を示す。【０２８４】
結果は、ｌｙＰｌｓＥｔｎを基質とした場合の測定値を１００として、相対活性で示した。【０２８５】
【表１０】
2014010667.tif 000016
表２から、本発明の蛋白質は、Ｌ−α−ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｐｌａｓｍａｌｏｇｅｎ（ｌｙＰｌｓＥｔｎ）に対して高い活性を有することが明らかになった。【０２８６】
【産業上の利用可能性】
【０２８７】
血清または血漿中のエタノールアミン型プラスマローゲン（ＰｌｓＥｔｎ）量をバイオマーカーとする、大規模スクリーニングに提起した認知症検査に利用できる。
【図７】
2014010667.tif 000017
【図８】
2014010667.tif 000018
【図９】
2014010667.tif 000019
【図１０】
2014010667.tif 000020
【図１１】
2014010667.tif 000021
【図１２】
2014010667.tif 000022
【図１３】
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【図１４】
2014010667.tif 000024
【図１】
2014010667.tif 000025
【図２】
2014010667.tif 000026
【図３】
2014010667.tif 000027
【図４】
2014010667.tif 000028
【図５】
2014010667.tif 000029
【図６】
2014010667.tif 000030
【図１５】
2014010667.tif 000031
【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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