(57)【要約】  本発明は、細胞質雄性不稔性を有する新規なユーストマ及びその育種方法に関する。さらに詳しくは、雄ずい又は、花粉の形成が不十分であるため、実質的に授粉機能を欠失することを特徴とする、新規な細胞質雄性不稔性を有するユーストマ及びその育種方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞質雄性不稔性を有するEustoma属植物、またはその後代。
【請求項２】
配列番号１もしくは配列番号２に記載した塩基配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のEustoma属植物、またはその後代。
【請求項３】
前記Eustoma属植物またはその後代が、配列番号１もしくは配列番号２に記載した塩基配列を有するEustoma属植物を種子親、任意のEustoma属植物を花粉親とした交雑後代から作出された細胞質雄性不稔植物であることを特徴とする、請求項１または２に記載のEustoma属植物、またはその後代。
【請求項４】
前記Eustoma属植物またはその後代が、配列番号１もしくは配列番号２に記載した塩基配列を有するEustoma属植物を種子親、E. grandiflorumを花粉親とした交雑後代から作出された細胞質雄性不稔植物であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のEustoma属植物、またはその後代。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のEustoma属植物またはその後代の植物体の一部。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のEustoma属植物またはその後代の種子。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のEustoma属植物またはその後代の細胞を含むカルス。
【請求項８】
請求項７に記載のカルスから誘導され、組織培養により無性繁殖されるEustoma属植物、またはその後代。
【請求項９】
請求項８に記載のEustoma属植物またはその後代の植物体の一部。
【請求項１０】
請求項７に記載のカルスから誘導され、組織培養により無性繁殖されるEustoma属植物を作製する方法。
【請求項１１】
請求項１〜４および８のいずれか１項に記載のEustoma属植物もしくはその後代、請求項５および９に記載の植物体の一部、請求項６に記載の種子、または請求項７に記載のカルスに含まれる細胞質。
【請求項１２】
請求項１〜４および８のいずれか１項に記載のEustoma属植物もしくはその後代、請求項５および９に記載の植物体の一部、請求項６に記載の種子、または請求項７に記載のカルスに含まれるミトコンドリア。
【請求項１３】
受託番号FERM BP-11506で特定される、細胞質雄性不稔性を有するEustoma属植物、またはその後代。
【請求項１４】
請求項１３に記載のEustoma属植物またはその後代の植物体の一部。
【請求項１５】
請求項１３に記載のEustoma属植物またはその後代の種子。
【請求項１６】
請求項１３に記載のEustoma属植物もしくはその後代、請求項１４に記載の植物体の一部、または請求項１５に記載の種子に含まれる細胞質。
【請求項１７】
請求項１３に記載のEustoma属植物もしくはその後代、請求項１４に記載の植物体の一部、または請求項１５に記載の種子に含まれるミトコンドリア。
【請求項１８】
受託番号FERM BP-11507で特定される、細胞質雄性不稔性を有するEustoma属植物のカルス。
【請求項１９】
請求項１８に記載のカルスから誘導され、組織培養により無性繁殖されるEustoma属植物、またはその後代。
【請求項２０】
請求項１９に記載のEustoma属植物またはその後代の植物体の一部。
【請求項２１】
請求項１８に記載のカルスから誘導され、組織培養により無性繁殖されるEustoma属植物を作製する方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載のカルス、請求項１９に記載のEustoma属植物もしくはその後代、または請求項２０に記載の植物体の一部に含まれる細胞質。
【請求項２３】
請求項１８に記載のカルス、請求項１９に記載のEustoma属植物もしくはその後代、または請求項２０に記載の植物体の一部に含まれるミトコンドリア。
【請求項２４】
請求項１〜４および８のいずれか１項に記載のEustoma属植物またはその後代を種子親とし、該植物と交配可能なEustoma属植物を花粉親として交配し、交配後の種子親から雑種第一代種子を採種することを含む、雑種第一代種子の作出方法。
【請求項２５】
請求項１３に記載のEustoma属植物またはその後代を種子親とし、該植物と交配可能なEustoma属植物を花粉親として交配し、交配後の種子親から雑種第一代種子を採種することを含む、雑種第一代種子の作出方法。
【請求項２６】
請求項１８に記載のカルスより再生させたEustoma属植物またはその後代を種子親とし、該植物と交配可能なEustoma属植物を花粉親として交配し、交配後の種子親から雑種第一代種子を採種することを含む、雑種第一代種子の作出方法。
【請求項２７】
請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法により作出された雑種第一代種子。
【請求項２８】
請求項２７に記載の雑種第一代種子から生育させた雑種第一代植物。
【請求項２９】
配列番号１もしくは配列番号２に記載した塩基配列を細胞質に有するEustoma属植物と、有用形質を有するEustoma属植物を連続戻し交雑することにより、前記有用形質を有し、細胞質雄性不稔性を発現させることを特徴とするEustoma属植物の作出方法。
【請求項３０】
受託番号FERM BP-11506で特定される、細胞質雄性不稔性を有するEustoma属植物またはその後代と、有用形質を有するEustoma属植物を連続戻し交雑することにより、前記有用形質を有し、細胞質雄性不稔性を発現させることを特徴とするEustoma属植物の作出方法。
【請求項３１】
受託番号FERM BP-11507で特定される、細胞質雄性不稔性を有するEustoma属植物のカルスから誘導され、組織培養により無性繁殖されるEustoma属植物またはその後代と、有用形質を有するEustoma属植物を連続戻し交雑することにより、前記有用形質を有し、細胞質雄性不稔性を発現させることを特徴とするEustoma属植物の作出方法。
【請求項３２】
有用形質を有するEustoma属植物がE.  grandiflorumに由来するものである、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の作出方法。
【請求項３３】
請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法により作出されたEustoma属植物、またはその後代。
【請求項３４】
請求項３３に記載のEustoma属植物またはその後代の植物体の一部。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞質雄性不稔性を有する新規なユーストマ及びその育種方法に関する。さらに詳しくは、雄ずい又は、花粉の形成が不十分であるため、実質的に授粉機能を欠失することを特徴とする、新規な細胞質雄性不稔性を有するユーストマ及びその育種方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユーストマは北アメリカ南部から中央アメリカ北部に自生するリンドウ科ユーストマ（Eustoma）属の自殖性種子繁殖植物で、（1）Eustoma  grandiflorum（英名Prairie  gentian,  旧学名E.  russellianum（Hook）G.Don  ex  Sweet,  Lisianth（i）us  russellianus  Hook.）、及び（2）Eustoma  exaltatum（英名Seaside  gentian,  Catchfly  gentian,  旧学名E.  selenifolium  Salisb.）の2種が存在する。別名トルコギキョウ、またはリシアンサス（Lisianthus）として親しまれている。1835年に自生種がスコットランドにもたらされ、Lisianthus  russellianus  Hook.と命名された。日本には、1930年代に導入され、以降主に切花用、鉢物用として品種改良が盛んに行われている。品種改良には、Eustoma  grandiflorumが主に使用されている。
ユーストマは観賞価値および市場価値が高い花卉植物として知られており、特に切花用品種においては多種多様な形質を有する品種が作出されており、切花の主要品目の一つに数えられる（非特許文献1参照）。【０００３】
一般的に、主要園芸作物においては、雑種強勢を利用した、両親よりも優れた形質を有する雑種第一代交配（F1）植物の利用が行われている。
切花としての需要が高いユーストマの栽培品種においても、耐病性や高品質性を持たせるため、雑種第一代交配品種が主流である。
また、生産における播種作業を効率化するため、育成者には純度の高い種子の供給が求められている。
雑種第一代交配品種の採種は、まず人手による種子親の除雄後、花粉親の花粉を、除雄した種子親の柱頭へ授粉させることにより行われる。
通常、種子親を除雄できる期間は開花直前期に限定され、かつ天候に左右されやすいため、除雄には、除雄可能な期間の予測がつき難いという作業性の問題がある。また、この作業は人手により行われるため、除雄しきれずに残存した花粉が原因となって意図せぬ自家受粉種子が発生する場合があり、自家受粉種子の混入による種子の品質の低下が問題となっていた。
上記の理由から、ユーストマでは、人手による種子親の除雄が不要である、雄性不稔性を利用した採種方法の開発が望まれている。【０００４】
アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）によりrolC遺伝子を導入し、形質転換した矮性トルコギキョウが知られているが（非特許文献2）、花が小型化し、花粉稔性がなくなり頂芽優勢の消失（rolシンドローム）も同時に起こることが報告されている。
非特許文献2の技術を応用し、不定芽再生により維持されている雄性不稔のトルコギキョウによるF1品種を作出する方法が開示されている（特許文献1）。しかし当該方法に従い作出されたF1品種は目的としない形質を伴うため、当該方法には商品性がある草姿や草丈を要求される切花品種の育種に利用することができないという問題がある。【０００５】
雄性不稔性の１つである細胞質雄性不稔性は、細胞質遺伝するため、細胞質雄性不稔系統と雄性可稔系統とを交配した場合、後代植物は雄性不稔性を有するため、純度の高い種子の供給が可能となる。また、細胞質雄性不稔系統は、当該系統と核ゲノムが同一であって細胞質が正常である維持系統との交配により、系統の維持および増殖が容易である。従って、細胞質雄性不稔性を利用した雑種第一代交配品種の採種方法は、実用性が極めて高く、多くの主要園芸作物において利用されている。しかしながら、ユーストマにおいては、雄性不稔性を利用した採種方法の開発が望まれていたにもかかわらず、細胞質雄性不稔ユーストマの作出方法は報告されていない。よって、ユーストマF1品種の種子生産において、実用的な雄性不稔系統を用いた採種体系が存在しないため、除雄作業を要する採種が行われている。【０００６】
一方、花弁の老化を遅らせることによって、花の観賞期間を延長する花持ちの良さが求められている。花弁の老化の原因として、受粉、または雌ずいの柱頭や花柱が傷害を受けることによるエチレン生成などが挙げられる（非特許文献3）。
ユーストマでは、花持ちの良い品種として、柱頭の部分が閉じたままであることにより、受粉することを妨げ花の老化を遅くする変形雌ずいを有するユーストマが知られている（特許文献2）。
花持ちを良くするためには、雄ずいの花糸が短い系統を育成するか、又は前述の変形雌ずいのように物理的に柱頭に受粉しないよう植物の器官の構造を変えた系統を利用することが必要であった。【０００７】
さらに、市場価値の高い花卉植物の条件の１つとして、花粉の飛散を防止することが求められている。しかし、現在のユーストマ品種では、いずれの品種においても雄ずいは花粉を有するため、花粉の飛散による花弁または衣服の汚損などの課題があった。【０００８】
雄性不稔性を利用することにより、有用形質に変化を及ぼすことなく、花持ち性等の課題を解決することが可能となるが、そのような実用的な雄性不稔性を有するユーストマは作出されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平9-107829号公報
【特許文献２】特許4133011号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】農業技術体系花卉編８巻追録６号387-395 2004年  社団法人農山漁村文化協会発行
【非特許文献２】組織培養Vol.19No.2  p50-551993年  ニューサイエンス社
【非特許文献３】実践花き園芸技術トルコギキョウ栽培管理と開花調節  2003年  株式会社誠文堂新光社発行
【非特許文献４】E. S. Mousavi , M. Behbahani , E. Hadavi, S.M. Miri (2012) CALLUS INDUCTION AND PLANT REGENERATION IN LISIANTHUS (EUSTOMAGRANDIFLORIUM), ANNIVERSARY EDITION TRAKIA JOURNAL OF SCIENCES Vol. 10, No 1,pp 22-25
【非特許文献５】J.Duminil, M.-H.PEMONGE and R.J.PETIT(2002)Molecular Ecology Notes vol.2 p428-430 “A set of 35consensus primer pairs amplifying genes and introns of plant mitochondrial DNA”
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上述のような従来のユーストマ品種におけるF1種子生産時の煩雑な除雄作業等の問題点、種子品質低下の問題点、更には花持ち性や花粉飛散の課題に鑑みて、細胞質雄性不稔性を有する新規なユーストマ及びその作出方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、細胞質雄性不稔性を有する新規なユーストマ個体を作出し、その細胞質雄性不稔性を有するユーストマ品種を育成し、その細胞質雄性不稔性ユーストマを用いて雑種第一代交配品種を得る育成方法を完成した。【００１３】
即ち、本発明は、細胞質雄性不稔性を有する新規なユーストマ及びその育種方法に関し、さらに好ましくは、雄ずい又は、花粉の形成が不十分であるため、実質的に授粉機能を欠失することを特徴とする、新規な細胞質雄性不稔性を有するユーストマ及びその育種方法に関する。【００１４】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（３４）を提供する。
（１）細胞質雄性不稔性を有するEustoma属植物、またはその後代。
（２）配列番号１もしくは配列番号２に記載した塩基配列を有することを特徴とする、（１）に記載のEustoma属植物、またはその後代。
（３）前記Eustoma属植物またはその後代が、配列番号１もしくは配列番号２に記載した塩基配列を有するEustoma属植物を種子親、任意のEustoma属植物を花粉親とした交雑後代から作出された細胞質雄性不稔植物であることを特徴とする、（１）または（２）に記載のEustoma属植物、またはその後代。
（４）前記Eustoma属植物またはその後代が、配列番号１もしくは配列番号２に記載した塩基配列を有するEustoma属植物を種子親、E. grandiflorumを花粉親とした交雑後代から作出された細胞質雄性不稔植物であることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載のEustoma属植物、またはその後代。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載のEustoma属植物またはその後代の植物体の一部。
（６）（１）〜（４）のいずれかに記載のEustoma属植物またはその後代の種子。
（７）（１）〜（４）のいずれかに記載のEustoma属植物またはその後代の細胞を含むカルス。
（８）（７）に記載のカルスから誘導され、組織培養により無性繁殖されるEustoma属植物、またはその後代。
（９）（８）に記載のEustoma属植物またはその後代の植物体の一部。
（１０）（７）に記載のカルスから誘導され、組織培養により無性繁殖されるEustoma属植物を作製する方法。
（１１）（１）〜（４）および（８）のいずれかに記載のEustoma属植物もしくはその後代、（５）および（９）に記載の植物体の一部、（６）に記載の種子、または（７）に記載のカルスに含まれる細胞質。
（１２）（１）〜（４）および（８）のいずれかに記載のEustoma属植物もしくはその後代、（５）および（９）に記載の植物体の一部、（６）に記載の種子、または（７）に記載のカルスに含まれるミトコンドリア。
（１３）受託番号FERM BP-11506で特定される、細胞質雄性不稔性を有するEustoma属植物、またはその後代。
（１４）（１３）に記載のEustoma属植物またはその後代の植物体の一部。
（１５）（１３）に記載のEustoma属植物またはその後代の種子。
（１６）（１３）に記載のEustoma属植物もしくはその後代、（１４）に記載の植物体の一部、または（１５）に記載の種子に含まれる細胞質。
（１７）（１３）に記載のEustoma属植物もしくはその後代、（１４）に記載の植物体の一部、または（１５）に記載の種子に含まれるミトコンドリア。
（１８）受託番号FERM BP-11507で特定される、細胞質雄性不稔性を有するEustoma属植物のカルス。
（１９）（１８）に記載のカルスから誘導され、組織培養により無性繁殖されるEustoma属植物、またはその後代。
（２０）（１９）に記載のEustoma属植物またはその後代の植物体の一部。
（２１）（１８）に記載のカルスから誘導され、組織培養により無性繁殖されるEustoma属植物を作製する方法。
（２２）（１８）に記載のカルス、（１９）に記載のEustoma属植物もしくはその後代、または（２０）に記載の植物体の一部に含まれる細胞質。
（２３）（１８）に記載のカルス、（１９）に記載のEustoma属植物もしくはその後代、または（２０）に記載の植物体の一部に含まれるミトコンドリア。
（２４）（１）〜（４）および（８）のいずれかに記載のEustoma属植物またはその後代を種子親とし、該植物と交配可能なEustoma属植物を花粉親として交配し、交配後の種子親から雑種第一代種子を採種することを含む、雑種第一代種子の作出方法。
（２５）（１３）に記載のEustoma属植物またはその後代を種子親とし、該植物と交配可能なEustoma属植物を花粉親として交配し、交配後の種子親から雑種第一代種子を採種することを含む、雑種第一代種子の作出方法。
（２６）（１８）に記載のカルスより再生させたEustoma属植物またはその後代を種子親とし、該植物と交配可能なEustoma属植物を花粉親として交配し、交配後の種子親から雑種第一代種子を採種することを含む、雑種第一代種子の作出方法。
（２７）（２４）〜（２６）のいずれかに記載の方法により作出された雑種第一代種子。
（２８）（２７）に記載の雑種第一代種子から生育させた雑種第一代植物。
（２９）配列番号１もしくは配列番号２に記載した塩基配列を細胞質に有するEustoma属植物と、有用形質を有するEustoma属植物を連続戻し交雑することにより、前記有用形質を有し、細胞質雄性不稔性を発現させることを特徴とするEustoma属植物の作出方法。
（３０）受託番号FERM BP-11506で特定される、細胞質雄性不稔性を有するEustoma属植物またはその後代と、有用形質を有するEustoma属植物を連続戻し交雑することにより、前記有用形質を有し、細胞質雄性不稔性を発現させることを特徴とするEustoma属植物の作出方法。
（３１）受託番号FERM BP-11507で特定される、細胞質雄性不稔性を有するEustoma属植物のカルスから誘導され、組織培養により無性繁殖されるEustoma属植物またはその後代と、有用形質を有するEustoma属植物を連続戻し交雑することにより、前記有用形質を有し、細胞質雄性不稔性を発現させることを特徴とするEustoma属植物の作出方法。
（３２）有用形質を有するEustoma属植物がE.  grandiflorumに由来するものである、（２９）〜（３１）のいずれかに記載の作出方法。
（３３）（２９）〜（３２）のいずれかに記載の方法により作出されたEustoma属植物、またはその後代。
（３４）（３３）に記載のEustoma属植物またはその後代の植物体の一部。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により提供される新規な細胞質雄性不稔性を有するユーストマを利用することにより、採種性、花持ち性、および／または鑑賞性に優れたユーストマとそのF１品種を育成し、その高品質種子の採種を行うことを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の細胞質雄性不稔ユーストマと、雄性可稔のユーストマの写真である（(A)は雄性可稔系統、(B)及び(C)は雄ずいの発達が不完全な細胞質雄性不稔系統、(D)は雄ずいが全く存在しない細胞質雄性不稔系統）。
【図２】図２は、細胞質雄性不稔ユーストマ系統（SSE-CMS細胞質：レーン1）、株式会社サカタのタネが保有しているユーストマ属野生種（レーン2-8）、および株式会社サカタのタネが育成したユーストマ属栽培種（レーン9-15）のトータルDNAを鋳型としてPCRを実施し、電気泳動を行った結果を示す。Mは分子量マーカー。(A) Marker1：SSE-CMSユーストマ系統に特異的なマーカー、(B) Marker2：SSE-CMSユーストマ系統に特異的なマーカー、(C) nad5/4-5：全てのユーストマ属植物に共通のマーカー。
【図３】図３は、Marker１およびMarker２の塩基配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．細胞質雄性不稔ユーストマ
本発明の雄性不稔性を有するユーストマの育成方法は、ユーストマ属植物の雑種から細胞質雄性不稔性を有するユーストマを選抜することを特徴とする。
本発明に係る「ユーストマ属植物」または「ユーストマ」とは、リンドウ科ユーストマ（Eustoma）属の植物であって、日本ではトルコギキョウの名前で親しまれている園芸作物である。
【００１８】
ユーストマをはじめ、通常花にはがく片と花弁（花びら）があり、その内側に雄ずい（雄しべ）と雌ずい（雌しべ）がある。典型的な雄ずいは、花粉を含む葯と花糸とからなる。本発明にかかる、「雄性不稔」とは、雄ずいの発達が不完全なため、花粉を充分に産出できない状態を示す。限定するものではないが、例えば、雄ずいが全く存在しない状態や、雄ずいの発達が不完全な状態のユーストマは、雄性不稔性を示す（図1参照）。また、「細胞質雄性不稔」とは、細胞質の器官由来の遺伝子によって母性遺伝する雄性不稔形質のことをいう。
【００１９】
本発明において「細胞質雄性不稔性を有するユーストマ属植物の後代」とは、細胞質雄性不稔性を有するユーストマ属植物を雌親（種子親）とし、該植物に交配可能なユーストマ属植物を雄親（花粉親）として交配することによって得られる、母性遺伝により雄性不稔性を引き継ぐ次世代及び次世代以降のユーストマ属植物を意味する。また、本発明において「植物体の一部」とは、当該植物体の１個以上の細胞または１個以上の細胞からの細胞質を含むものであり、具体的には花、葉、茎、根等の器官または組織、或いは、これらの器官または組織からの細胞（細胞から調製されたプロトプラストを含む）もしくは細胞質、或いは前記細胞もしくは細胞質の集合体を意味する。
【００２０】
本明細書において、「受託番号FERM BP-11506で特定されるユーストマ属植物」には、細胞質雄性不稔性の形質を有する、該植物と実質的に等価な植物もその範囲に含まれる。すなわち、細胞質雄性不稔性を維持している限り、例えば、受託番号FERM BP-11506で特定されるユーストマ属植物の突然変異体や遺伝子組換え体等もその範囲に含まれる。
【００２１】
本明細書において、「受託番号FERM BP-11507で特定されるユーストマ属植物のカルス」には、当該カルスから再生された植物が細胞質雄性不稔性の形質を有する、当該カルスと実質的に等価なカルスもその範囲に含まれる。すなわち、再生される植物が細胞質雄性不稔性を維持している限り、例えば、受託番号FERM BP-11507で特定されるユーストマ属植物のカルスに由来する突然変異体や遺伝子組換え体、ならびに細胞質雄性不稔性を維持している受託番号FERM BP-11506で特定されるユーストマ属植物の突然変異体や遺伝子組換え体等由来のカルスもその範囲に含まれる。
【００２２】
本発明に係る細胞質雄性不稔ユーストマは、次のような特徴を有する。
（１）雑種第一代交配品種を作出する際に種子親の除雄が不要であるため、手間がかからず、経済的な採種ができる。
（２）雄性可稔系統と交配した場合、後代は雄性不稔性を有するため、純度の高い種子を供給することができる。
（３）当該系統と核ゲノムが同一であって細胞質が正常である維持系統との交配により、系統の維持および増殖が容易である。
（４）自家受粉しないため、受粉による花の老化を抑制することができ、その結果、花持ちがよい。
（５）花粉を有さないため、花粉の飛散によって花弁や衣服を汚損することがない。
【００２３】
２．細胞質雄性不稔ユーストマの作出方法
本発明に係る雄性不稔ユーストマの作出方法においては、雌親としてEustoma属植物の野生種、雄親としてEustoma grandiflorumとを交配し、これらの交雑後代の中から雄性不稔性を示す個体を選抜して育成する。雄性不稔性を示す個体としては、雄ずいが全く存在しない、又は雄ずいの発達が不完全な状態の個体を選抜する。更に、雄性不稔性が細胞質遺伝する形質であることを確認するため、雄性可稔系統であるユーストマを戻し交配し、後代植物が雄性不稔性を示すことを確認する。
【００２４】
３．雑種第一代種子の作出方法
本発明の方法で作出した細胞質雄性不稔ユーストマに、優良な形質を有するユーストマ属植物を連続戻し交配することにより、後代として、細胞質雄性不稔性を有する優良系統を得ることができる。この細胞質雄性不稔性を有する優良系統は、雑種第一代種子（Ｆ１種子）を得るための種子親として使用することができる。
【００２５】
４．花持ち試験
本発明に係る細胞質雄性不稔ユーストマの花持ちの評価は、以下のようにして実施することができる。なお、本明細書中において「花持ち」とは、「開花した花の維持」を意味し、よって、「花持ちが良い」とは、「開花始めから開花終わりまでの開花期間が相対的に長いこと」を意味する。ユーストマの開花期間が相対的に長いかどうかは、通常の雄性可稔ユーストマと細胞質雄性不稔ユーストマを、同一環境条件下で複数個体を栽培して比較評価することにより判断される。
【００２６】
花持ち試験の一例として、切花後の花持ちを評価する方法について説明する。この方法では、まず試験材料として、同一条件で栽培したユーストマのうち、通常の雄性可稔個体と雄性不稔個体をそれぞれ適当数用意する。各ユーストマは開花日（花弁の開きが認められた日）当日ほぼ同時に、花柄をつけた状態で採花し、花柄部分を一定の長さ（例えば、4〜6cm程度）に調整する。次いで、調整した試験材料は、茎の断面が水に浸たる状態にして、一定温度（好ましくは、18〜22℃）、一定湿度（好ましくは、55〜65％）、かつ明暗が12時間周期で切り替わる恒温室内に静置し、花の外観変化を観察する。
【００２７】
「開花始め」を花弁が開いたときと定義し、また「開花終わり」は花弁の外観（花弁のしわや萎れ）から判断・決定し、花の開花期間（花の開花始めから開花終わりまでの期間）を測定する。通常の雄性可稔個体と雄性不稔個体のそれぞれについて、測定された開花期間の平均値を求めて比較すれば、本発明の雄性不稔ユーストマの花持ちを評価することができる。
【００２８】
５．分子マーカーによる標識因子の作製
本発明により作製した細胞質雄性不稔ユーストマ系統と、従来知られたユーストマ属植物の間でミトコンドリアゲノムの配列を比較し、細胞質雄性不稔ユーストマ系統に特異的な領域を同定することで、標識因子となる分子マーカーを作製することができる。分子マーカーの検出は、ＰＣＲ法等、当業者に周知の方法に従って行うことができる。分子マーカーを使用することにより、本発明による細胞質雄性不稔ユーストマ系統が、形態的特徴のみならず、分子生物学的特徴によっても、従来知られたユーストマ属植物とは明確に異なる系統であることを証明することができる。
【００２９】
本発明の細胞質雄性不稔ユーストマ系統を識別するための分子マーカーとして、配列番号１および配列番号２に示した塩基配列を使用することができる。また、配列番号１または配列番号２に記載された塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列を有するユーストマ系統も、当該塩基配列が配列番号１または配列番号２の塩基配列と同様に増幅され、検出される限り、本発明の細胞質雄性不稔ユーストマ系統と実質的に同一な系統とみなすことができる。例えば、細胞質雄性不稔ユーストマ系統を識別するための分子マーカーとして、配列番号１または配列番号２に記載した塩基配列と80％、好ましくは90％、より好ましくは95％以上の相同性を有する塩基配列を使用することができる。
【００３０】
６．細胞質雄性不稔ユーストマ系統のカルス誘導、増殖、及び再分化
本発明により作製した細胞質雄性不稔ユーストマ系統は、組織培養法により無性繁殖させることが可能である。例えば、非特許文献4に開示されている、カルスを誘導し、再分化させる方法により、無性繁殖させることができる。
【００３１】
具体的には、温室で育成した細胞質雄性不稔ユーストマ系統の葉片を表面殺菌し、カルス誘導培地に置床して培養することにより、カルス誘導を行う。その後、形成されたカルスを再分化培地に移して培養することにより、シュートを誘導する。次いで、形成されたシュートを発根培地に移して、発根を誘導し植物体を再生させる。カルス誘導、増殖、および再分化のための培養条件は、当業者であれば、公知技術に従って適宜設定することができる。
【００３２】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て参照として本明細書に組み込まれる。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願2012-213296号（2012年9月27日出願）の明細書および図面に記載の内容は全て参照として本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００３３】
下記の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。【００３４】
実施例１  新規な雄性不稔性を有するユーストマ個体の作出
本発明の雄性不稔性を有するユーストマは、アメリカ合衆国から導入した種名が特定されていない野生のEustoma属植物と、Eustoma grandiflorumとの雑種から選抜され、株式会社サカタのタネ三郷試験場において作出された。【００３５】
本発明におけるユーストマ個体の育成過程
これまで、株式会社サカタのタネ保有の種名が特定されていない野生のEustoma属植物10数系統と、同じく株式会社サカタのタネ保有の由来の異なる親系統（E.grandiflorum）との間で合計60組程度の雑種を作製しF1種子を得た。それらF1種子を播種し、表現型を確認した上でF1集団より適当な2、3個体を選抜し、それらを集団交配した後代（以下、「F2世代」という）種子を得た。【００３６】
そのF2世代種子を播種し50から100個体程度栽培し、F2集団に含まれる表現形質を確認した。その結果、ほとんどのF2集団から花径の大小、花色や花型、早晩性の分離が見られたが、その中で、株式会社サカタのタネ保有の種名が特定されていない野生のEustoma属植物の内E-1を雌親、親系統の内G-1（E.grandiflorum）を雄親として交配したF1種子(以下組Aと記す)由来のF2集団の中から、予期せぬことにこれまでEustoma属植物では知られていなかった雄性不稔形質を示す個体が複数出現した。その中から、1個体を選抜し、株式会社サカタのタネ保有の親系統4系統G-2、G-3、G-4、G-5を花粉親として交配した後代種子（F2BC1世代、それぞれ組B,C,D,Eと記す）を得た。なお、世代の表記については、混乱を避けるために、E.grandiflorumをCMS系統に戻し交配した回数を基準としてBC1、BC2、・・・と記載した。【００３７】
それらの後代種子(F2BC1世代)を播種し、各系統12個体の形質を確認したところ、すべての系統および個体において、雄ずいが全く存在しない、又は雄ずいの発達が不完全な状態の雄性不稔形質を示した。組C由来のF2BC1世代の4個体(以下ms-1と記す)、組D由来のF2BC1世代の2個体(以下ms-2と記す)、組E由来のF2BC1世代の3個体(以下ms-3と記す)および4個体(以下ms-4と記す)を選抜し、ms-1に親系統G-3および親系統G-6、ms-2に親系統G-4および親系統G-7、ms-3に親系統G-5および親系統G-8、ms-4に親系統G-5および親系統G-9を花粉親として交配し、それぞれ後代種子(F2BC2世代)を得た。【００３８】
後代種子(F2BC2世代)を播種し、後代の表現形質を確認したところ、ms-1にG-3およびG-6を交配した系統の後代集団の一部に雄ずいの発達が不完全な状態の雄性不稔個体が見られたが、それ以外の組み合わせは、雄ずいがまったくない雄性不稔形質を示した。それらの雄性不稔個体に、約100系統の親系統を交配し、後代種子(F2BC3世代)を得た。【００３９】
後代種子(F2BC3世代)を播種し、後代の表現形質を調査したところ、雄性不稔形質を確認することができた。このことから、安定的な母系遺伝を示す細胞質雄性不稔系統の作出に成功したことが実証されたため、この細胞質をSSE-CMS細胞質と命名した。なお、安定した細胞質雄性不稔を示す上記F2BC1種子は、2012年7月20日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託されている（寄託者が付した識別のための表示08P-81S、受託番号FERM BP-11506）。【００４０】
実施例２  雄性不稔性の再現性の確認
雄性不稔形質の安定的な出現を確認するため、前述のEustoma属植物E-1を雌親、親系統G-10（E.grandiflorum）を雄親として交配し、F1種子(以下組Fと記載)を採種した。前述の組Aおよび組Fを播種し、それぞれ6個体を選抜し、集団交配を行ったところ、組A由来個体は56莢で0.22g、組F由来個体は59莢で0.47gの収量でF2世代種子を得た。それぞれのF2世代種子を播種し、雄性不稔個体の出現率を調査したところ、組A由来のF2世代は92個体中19個体、組F由来のF2世代は88個体中14個体において雄性不稔形質を示した。
以上の結果により、雄性不稔形質は、安定的に出現することが示された。【００４１】
実施例３  雄性不稔性を有するユーストマ品種の花持ち試験
雄性不稔系統と可稔系統の花持ち試験を実施した。
（1）試験材料
試験材料として用いたユーストマは、通常の雄性可稔ユーストマのF1個体と細胞質雄性不稔ユーストマのF1個体の2種類を使用した。上記2種類のユーストマは、ユーストマ栽培圃場より当日開花したと思われるユーストマの花を、花柄をつけた状態で採花し、花柄部分を4cmの長さに調整した。雄性可稔ユーストマは、輸送を想定し、柱頭に花粉を強制授粉させた。また、細胞質雄性不稔ユーストマは、雄性可稔系統の花粉を強制授粉させた個体と、授粉させなかった個体をそれぞれ試験に供試した。【００４２】
（2）試験方法
花持ち試験は、水道水を満たした試験管に試験材料を挿し、温度20℃、湿度60％（±5％）で、一般の蛍光灯（アイライン白色ラピッド40W）のオン・オフが12時間周期で切り替わる恒温室内で行なった。なお、試験中、特に水の汚れなどは認められなかったので、水の交換は行なわなかった。【００４３】
（3）評価・判定
「開花始め」は、花弁が開いたときと定義し、また「開花終わり」は花弁の外観から育種している技術者が花のしわや萎れを見て判断し、決定した。【００４４】
（4）試験結果
細胞質雄性不稔のユーストマに可稔系統の花粉を強制授粉させた場合は、雄性可稔のユーストマに比較して、花持ち性にはあまり差がなかった。そのため、使用した系統の遺伝的バックグラウンドの花持ち性への影響は認められない条件下であることが証明された。また、細胞質雄性不稔のユーストマは、花粉が産出されないため、花持ち性は雄性可稔系統と比較して平均で7日も優れることが判明した(表1)。【００４５】
【表１】
2014050116.tif 000002
【００４６】
実施例４    SSE-CMSユーストマ系統を識別するためのマーカー作製
本発明により作製したSSE-CMSユーストマ系統は、従来の栽培種や野生種には存在しなかった表現型特性を示した。一方で、分子生物学的な側面からも、従来知られたユーストマ属植物とは異なる系統であることを証明するため、SSE-CMSユーストマ系統を識別するための分子マーカーを作製することとした。【００４７】
非特許文献5に記載されたミトコンドリアのコンセンサスプライマーを用い、SSE-CMSユーストマ系統と既存のユーストマ系統を鋳型としてPCR分析を実施したところ、増幅したDNA断片のサイズが異なるマーカーを見出すことができた。このように多型を示したマーカーの中から、nad4L/orf25及びnad7/4-5の2種類を選び、増幅断片の塩基配列を解析したところ、SSE-CMSユーストマ系統に特異的な領域を同定することができた。これらの領域を標識因子とするため、表2に示すようなプライマーを設計し、PCR分析（熱変性94℃1分、アニーリング65℃1分、伸長反応72℃1分を30サイクル繰り返した）を実施したところ、SSE-CMSユーストマ系統のみからDNA断片を増幅させる2種類の分子マーカー”Marker1”及び”Marker2”を作製することに成功した。Marker1は、プライマーorf25-F及びorf25-Rを用い、配列番号1に記載した323bp のDNA断片を増幅させるマーカーである（図３）。Marker2はプライマーnad7-F及びnad7-Rを用い、配列番号2に記載した492bpの DNA断片を増幅させるマーカーである（図３）。【００４８】
上記手法により作製したマーカーを用い、株式会社サカタのタネが育成した既存のユーストマ系統（E.grandiflorum）190系統、及び、株式会社サカタのタネが保有しているユーストマ属野生種34系統を鋳型としてPCR試験を実施したところ、これら2種類の塩基配列を保有している系統は、SSE-CMSユーストマ系統以外に存在しないことを確認した。その試験結果の一部を図2に示す。図2（A)〜(C)は、以下の条件で実験を行った。
(A) Marker1：SSE-CMSユーストマ系統に特異的なマーカー
orf25-F及びorf25-Rのプライマーを用いてPCR（熱変性94℃1分、アニーリング65℃1分、伸長反応72℃1分を30サイクル）を行い、配列番号1で示した塩基配列（323bp）を増幅した。
(B) Marker2：SSE-CMSユーストマ系統に特異的なマーカー
nad7-F及びnad7-Rのプライマーを用いてPCR（熱変性94℃1分、アニーリング65℃1分、伸長反応72℃1分を30サイクル）を行い、配列番号2で示した塩基配列（492bp）を増幅した。
(C) nad5/4-5：全てのユーストマ属植物に共通のマーカー
nad5/4及びnad5/5のプライマーを用いてPCR（熱変性94℃1分、アニーリング60℃1分、伸長反応72℃1分を30サイクル）を行い、全ての系統から約1.5ｋｂのDNA断片を増幅した。
すなわち、本発明により作製した  SSE-CMSユーストマ系統が、従来知られたユーストマ属植物とは異なる系統であることが明らかとなった。【００４９】
【表２】
2014050116.tif 000003
【００５０】
実施例５   SSE-CMSユーストマ系統のカルス誘導、増殖、及び再分化
本発明により作製したSSE-CMSユーストマ系統を、組織培養法により無性繁殖させるため、温室で育成したSSE-CMSユーストマ系統の葉片を採取した。葉片を1%次亜塩素酸ナトリウム溶液で10分間表面殺菌を行ない、滅菌水ですすぎを行なった。滅菌した葉片を1.5mg/l NAAを添加したMS培地へ置床しカルスを誘導した。カルスを0.5mg/l GA3、1.5mg/l BAを添加したB5培地へ移しシュートを誘導した。形成されたシュートは植物ホルモンを含まないB5培地へ移して発根させ、植物体を再生し、雄性不稔であることを確認した。【００５１】
上記方法によって作製したカルスは、2012年7月26日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6）に国際寄託されている（寄託者が付した識別のための表示12S-134C、受託番号FERM BP-11507）。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明により提供される新規な細胞質雄性不稔性を有するユーストマを利用することにより、採種性、花持ち性、鑑賞性に優れたユーストマとそのF１品種を育成し、その高品質種子の採種を行うことを可能とする。
【図１】
2014050116.tif 000004
【図２】
2014050116.tif 000005
【図３】
2014050116.tif 000006
【配列表】
2014050116000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年8月7日(2015.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号FERM BP-11506で特定される細胞質を有する、細胞質雄性不稔ユーストマ属植物、またはその後代。
【請求項２】
受託番号FERM BP-11506で特定される、細胞質雄性不稔ユーストマ属植物、またはその後代。
【請求項３】
請求項１または２に記載のユーストマ属植物またはその後代の植物体の一部。
【請求項４】
請求項１または２に記載のユーストマ属植物またはその後代の種子。
【請求項５】
請求項１または２に記載のユーストマ属植物もしくはその後代、請求項３に記載の植物体の一部、または請求項４に記載の種子に含まれる細胞質。
【請求項６】
請求項１または２に記載のユーストマ属植物もしくはその後代、請求項３に記載の植物体の一部、または請求項４に記載の種子に含まれるミトコンドリア。
【請求項７】
受託番号FERM BP-11507で特定される細胞質を有する、細胞質雄性不稔ユーストマ属植物のカルス。
【請求項８】
受託番号FERM BP-11507で特定される、細胞質雄性不稔ユーストマ属植物のカルス。
【請求項９】
請求項７または８に記載のカルスに含まれる細胞質。
【請求項１０】
請求項７または８に記載のカルスに含まれるミトコンドリア。
【請求項１１】
請求項１または２に記載のユーストマ属植物またはその後代を種子親とし、該植物と交配可能なユーストマ属植物を花粉親として交配し、交配後の種子親から雑種第一代種子を採種することを含む、雑種第一代種子の作出方法。
【請求項１２】
花粉親が、ユーストマ・グランディフロラム（E. grandiflorum）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１または２に記載のユーストマ属植物またはその後代と、有用形質を有するユーストマ属植物を連続戻し交雑することを含む、前記有用形質を有し、細胞質雄性不稔性を発現するユーストマ属植物の作出方法。
【請求項１４】
受託番号FERM BP-11507で特定される細胞質を有する細胞質雄性不稔ユーストマ属植物のカルスから誘導し、組織培養により無性繁殖してユーストマ属植物またはその後代を得ることと、得られたユーストマ属植物またはその後代と、有用形質を有するユーストマ属植物を連続戻し交雑することにより、前記有用形質を有し、細胞質雄性不稔性を発現させることを特徴とするユーストマ属植物の作出方法。
【請求項１５】
有用形質を有するユーストマ属植物がユーストマ・グランディフロラム（E. grandiflorum）に由来するものである、請求項１３または１４に記載の作出方法。
【請求項１６】
請求項６に記載のミトコンドリアに含まれるミトコンドリアゲノム。
【請求項１７】
請求項１０に記載のミトコンドリアに含まれるミトコンドリアゲノム。
【国際調査報告】
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2014050116.tif 000008
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