(57)【要約】  DNAシーケンサは塩基配列を解析するための装置であるので、微量に存在する多型の検出は想定されていない。またDNA標識に用いる蛍光物質の波長が持つクロストークは同一座標上の低い信号取得の妨げである。そのため、体細胞変異等の存在比が小さい遺伝子変異の検出が困難であった。  遺伝子分析装置に、塩基種毎に標識化された核酸試料を、塩基種毎にそれぞれ対応する複数の流路と、複数の流路のそれぞれにおける核酸試料毎に、塩基種毎の標識信号を検出して検出強度の波形データを生成する波形データ生成部と、塩基種毎に波形データのピーク値の検出を行うピーク検出部と、複数の波形データについて統合処理を行うデータ統合部と、を備える。
2014061146.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基種毎に標識化された核酸試料を、前記塩基種毎にそれぞれ個別に電気泳動する複数の流路と、
前記複数の流路のそれぞれで前記電気泳動される前記核酸試料毎に、前記塩基種毎の標識信号を検出して検出強度の波形データを生成する波形データ生成部と、
前記塩基種毎に前記波形データのピーク値の検出を行うピーク検出部と、
前記ピーク値の検出を行った複数の前記波形データについて統合処理を行うデータ統合部と、
前記統合処理を行ったデータを表示する表示部と、を備える、
ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子分析装置であって、
前記データ統合部は、
前記流路間における前記電気泳動での前記試料の移動度の差を補正して前記統合を行う、
ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子分析装置であって、
前記統合処理の後に、前記複数の流路のそれぞれで計測された前記ピーク値を比較し、同一塩基配列上の座標位置の遺伝子多型の存在比を算出する多型解析部を更に備え、
前記表示部は、前記多型解析部の前記算出結果を表示する、
ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子分析装置であって、
前記多型解析部は、
前記遺伝子多型の存在比と、既知の参照塩基配列情報と、の比較に基づいて、前記核酸試料より得られた塩基配列情報と、前記参照塩基配列情報と、の間の一致度を算出する、
ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項５】
請求項１に記載の遺伝子分析装置であって、
前記ピーク検出部は、
前記塩基種毎に前記波形データから所定の閾値以上の信号強度を前記ピーク値として抽出する、
ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項６】
塩基種毎に標識化された核酸試料を、前記塩基種毎にそれぞれ個別の流路で電気泳動し、
前記複数の流路のそれぞれで前記電気泳動される前記核酸試料毎に、前記塩基種毎の標識信号を検出して検出強度の波形データを生成し、
前記塩基種毎に前記波形データのピーク値の検出を行い、
前記ピーク値の検出を行った複数の前記波形データについて統合処理を行い、
前記統合処理を行ったデータを表示する、
ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項７】
請求項１に記載の遺伝子分析方法であって、
前記流路間における前記電気泳動での前記試料の移動度の差を補正して前記統合を行う、
ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項８】
請求項１に記載の遺伝子分析方法であって、
前記統合処理の後に、更に、前記複数の流路のそれぞれで計測された前記ピーク値を比較し、同一塩基配列上の座標位置の遺伝子多型の存在比を算出し、
前記多型解析部の前記算出結果を前記表示する、
ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項９】
請求項８に記載の遺伝子分析方法であって、
前記遺伝子多型の存在比と、既知の参照塩基配列情報と、の比較に基づいて、前記核酸試料より得られた塩基配列情報と、前記参照塩基配列情報と、の間の一致度を算出する、
ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の遺伝子分析方法であって、
前記塩基種毎に前記波形データから所定の閾値以上の信号強度を前記ピーク値として抽出する、
ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項１１】
核酸試料を塩基種毎に標識化し、
前記塩基種毎にそれぞれ個別の流路で電気泳動し、
前記複数の流路のそれぞれで前記電気泳動される前記核酸試料毎に、前記塩基種毎の標識信号から得られる波形データに基づいて遺伝子変異を検出する、
4種の塩基種を独立に標識する遺伝子変異検出用の試薬を備える遺伝子分析キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の分析方法、分析用キット及び遺伝子の分析装置に関する。特に、標的遺伝子領域内に存在する遺伝子多型を検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAは生物の遺伝情報を担う高分子であり、その塩基配列を分析する手法としてサンガー法が開発されてよりDNAシーケンシング技術は生命科学に不可欠な技術として大きく発展してきた。サンガーらが開発した技術“ジデオキシ法”はDNA合成反応液中に、低濃度の鎖停止ヌクレオチドとしてジデオキシヌクレオチド (ddATP・ddGTP・ddCTP・ddTTP) を加えることにより、ジデオキシヌクレオチドの取込み位置で合成反応が停止する反応を利用した塩基配列決定方法である。【０００３】
当初のDNAシーケンス技術は4種のジデオキシヌクレオチドを放射性同位元素で標識し、それぞれの放射性標識ジデオキシヌクレオチドを含む4種の容器にて独立にDNA合成反応を行い、各反応産物をアクリルアミドゲル電気泳動の個別のレーンを用いてDNA断片長に応じて分離し、オートラジオグラフィーによって放射性同位元素の存在位置を検出することにより塩基配列の決定を行っていた。【０００４】
その後4種のジデオキシヌクレオチドに対応する4色の蛍光色素を用いた塩基識別法が開発されたことにより4種の塩基を混合して検出することが可能となり、アクリルアミドゲルの1レーンでDNAの塩基配列解析が可能となった。また、アクリルアミドゲルに変わる電気泳動技術としてキャピラリー電気泳動法が開発された。キャピラリー電気泳動法を用いたDNAシーケンサは、サンガー法を利用して4色の蛍光標識によって標識したDNA1試料を1本のキャピラリーで分析する装置である。キャピラリー電気泳動法を用いたDNAシーケンサは連続自動分析に対応し、高速に多数の試料を並行して分析処理を行うことが可能であり、2003年に終了報告が行われたヒトゲノム計画等の大規模な遺伝子配列決定に大きく寄与し、現在でも最も広く普及しているDNAシーケンサである。【０００５】
DNAシーケンサは測定対象とする試料の遺伝子配列を決定する装置であり、その決定原理は電気泳動によるDNA鎖長の分離とその分離位置における蛍光標識分子の検出からなっている。得られた蛍光信号強度からの塩基推定は信号強度の強さ、または信号波形の面積によって各ピーク座標位置において多数決的に決定される。【０００６】
最も重要な遺伝子配列解析対象であるヒトを含め多くの生物のゲノムは2倍体で構成されており、またそれらのゲノム配列中には1塩基遺伝子多型と呼ばれる塩基変異が存在することが知られている。これらの遺伝子多型は生殖細胞系列多型と呼ばれ、親から子へ遺伝する性質を持ち、個体や細胞中では1体1の比で存在している。これら塩基多型が存在する領域をDNAシーケンサによって分析を行った場合、塩基多型位置では2種の蛍光信号ピークが同時に検出される。【０００７】
先に記したように生殖細胞系列多型は1体1の比で存在しているため、基本的には生殖細胞系列多型位置で検出される2種の蛍光信号も1対1となる。しかし、ある塩基位置での信号の強さは蛍光物質の発光効率の差や多型位置での蛍光物質の取り込み効率の違い等により1体1を示さない場合があり、通常のDNAシーケンス技術では検出困難な例が見出された。【０００８】
それらの多型の検出方法として得られた蛍光信号の特別な分析方法が開発されている（特許文献1）。また、蛍光物質の違いが泳動度に影響する場合は波形のピーク位置にずれが生じる場合があり、それらピーク位置がずれた多型の判定方法も開発されている（特許文献2）。【０００９】
特許文献1、特許文献2は分析対象とする遺伝子領域の既存の波形データを参照することにより多型の判定精度と検出力を高める方法であり、既存のDNAシーケンサのデータを高精度に分析することにより生殖細胞系列多型を含む遺伝子配列を決定する方法として有効である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開2002-055080号公報
【特許文献２】特開2003-270206号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
近年のゲノム解析技術の発展により全ヒトゲノム配列が2003年に報告され、遺伝子情報を活用した医薬品開発が行われている。特にがんは遺伝子異常がその発症要因であり、すでに一部の治療薬の選択や処方量の決定に患者個人の遺伝子検査が保険適用されている。【００１２】
がん等の疾患に由来する遺伝子破壊は先に記載した生殖細胞系列多型に対し、体細胞系列多型と呼ばれている。体細胞系列多型は後天的に発生する遺伝子変異であり、親から子への遺伝性がないこと、ゲノム上での変異発生位置が予測できないこと、また、体内や組織内における存在比率が予測できないことが特徴である。体細胞系列多型の検出においてはその存在比率が予測できないことが大きな問題である。例としてがん患者から切除したがん組織にはがん化細胞と正常細胞を含み、さらにがん細胞間においても遺伝子異常に多様性が存在するために検出対象とする遺伝子領域に多型を有する細胞の組織中存在比率は低い。このため、体細胞系列多型の検出は生殖細胞系列多型より困難である。【００１３】
現在、体細胞系列多型の検出装置として定量PCR装置やDNAシーケンサが用いられている。定量PCR装置は高い検出力を有していることが大きな利点である。ただし、その検出原理として標的とする多型毎に特異的な検出用プローブを用意し、各プローブ単位で検出反応を実施する必要がある。特にがんでは遺伝子異常の発生位置や変化の種類がいまだ予測不可能であることから、事前に検出対象多型に合わせたプローブ設計が必要な定量PCR装置は体細胞系列多型の網羅的検出には不向きである。また、仮に想定されうる様々な組み合わせの検出プローブを用意したとしても、それら全プローブを用いた検出を実施することは検査コストや検体試料量の制限から実現が困難である。【００１４】
一方、現在最も普及しているキャピラリー電気泳動型DNAシーケンサは500bp〜700bpの塩基配列決定能力がある。そのため定量PCR装置に対してi)1回の検出で大きな領域を検出対象とできること、ii)上記塩基決定範囲内に出現する新規な体細胞系列多型が決定可能であること、が利点である。加えて定量PCR装置は検出対象多型信号値の大小のみで判定を行うのに対し、DNAシーケンサは多型情報を内包した標的遺伝子配列が得られるため、その標的遺伝子配列情報を用いて検出された遺伝子多型が真に目的とする遺伝子に由来することが確認できるため、得られた結果の信頼性は定量PCRより高い。計測結果の信頼性が高いことは正確な判定が要求される医療診断において重要な特徴である。ただし、DNAシーケンサは遺伝子配列を決定するための装置であるため微量に存在する体細胞系列遺伝子多型の検出力が不十分であることが大きな課題であった。【００１５】
キャピラリー型DNAシーケンサは4種の蛍光標識物質を4種の塩基に対応させることによって塩基の判定を行っている。一般に蛍光物質は単一の波長ではなく広い波長領域に渡って発光する。図2は塩基配列解析に用いられている一般的な4種の蛍光物質の波長域である。4種の蛍光物質はそのピーク波長（2a〜2d）が異なるものの、図2に明らかなようにそれぞれクロストークが存在する。DNAシーケンサは電気泳動によってDNA鎖長に応じて標識DNAを分離してピーク波長域の信号強度を計測することにより主要な蛍光信号を判定し塩基配列を決定する装置であり、この目的においては上記クロストークの存在は大きな問題とならなかった。しかし、体細胞変異の様に存在比が1対1を下回るDNA分子の検出を目的とする場合には、本クロストークの存在が同一DNA鎖長位置に微量に存在するDNA分子に由来する信号検出の妨げとなるため、遺伝子変異検出感度低下の原因となる。先に記載の特許文献1及び特許文献2はいずれも既存のシーケンサより出力された信号値を入力情報として利用しており、これらクロストークの存在による検出感度低下を改善できないため、体細胞系列多型の遺伝子変異を十分に検出できなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上述した課題の少なくとも一の課題を解決するための本発明の一態様として、核酸試料を塩基種毎に標識化し、前記塩基種毎にそれぞれ個別の流路で電気泳動し、前記複数の流路のそれぞれで前記電気泳動される前記核酸試料毎に、前記塩基種毎の標識信号から得られる波形データに基づいて遺伝子変異を検出する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、標的とする遺伝子領域に存在する体細胞系列多型が高感度に検出可能となる。上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施例の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明における独立した流路を用いた計測装置の一例を示す構成図。
【図２】一般的に用いられているDNAシーケンス用の4種の蛍光色素の波長図。
【図３】本発明におけるピーク検出、及び移動度の補正と流路の統合処理の処理フローの一例を示すフロー図。
【図４】本発明におけるピーク検出、及び移動度の補正と流路の統合処理の処理フローの他の一例を示すフロー図。
【図５】本発明におけるピーク検出、及び移動度の補正と流路の統合処理の処理フローの他の一例を示すフロー図。
【図６】本発明におけるピーク検出、及び移動度の補正と流路の統合処理の処理フローの他の一例を示すフロー図。
【図７】本発明による統合波形データと検出多型情報の表示例を示す図。
【図８】本発明におけるシステム全体の構成の一例を示す構成図。
【図９】データ解析装置が備える機能の一例を示す機能ブロック構成図。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態の一例について、図面を参照して説明する。ただし、本実施形態は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明を限定するものではないことに注意すべきである。
【００２０】
まず、図1を用いて、本実施形態におけるＤＮＡ検出の概要について説明する。初めに分析対象とするＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）1aを用意する。一般的には解析対象とする遺伝子領域を特異的に増幅するポリメラーゼ連鎖増幅反応（ＰＣＲ）法により鋳型DNAは調製されるが、本実施形態は鋳型調製の方法をPCR法に限定するものではない。
【００２１】
鋳型DNA（1a）を含む溶液に、鋳型ＤＮＡの一部に相補的な配列を持つプライマーとDNA合成酵素、反応基質としてdNTP及びddNTPを加えることによってサンガー法による標識反応を行う。本実施形態では標識対象の塩基種（A,G,C,T）をそれぞれ独立した流路内（1f〜1i）で電気泳動と計測を行うため、標識反応は1つの鋳型DNAとプライマーの組み合わせに対し塩基種（A,G,C,T）に対応した4つの反応液（1b〜1e）を用いて標識を行う。
【００２２】
ここで、合成DNAの標識方法として、i)プライマーに標識を行うダイプライマー法と、ii)ddNTPに標識を行うダイターミネーター法、があるがそのどちらであっても本実施形態に利用可能である。また、標識物質としては蛍光色素、化学発光物質、放射性同位元素のいずれも利用可能である。現在市販されているDNAシーケンス用キットは4種のddNTPを異なる蛍光物質で標識しているが、本実施形態では4種のddNTPを異なる蛍光物質で標識した標識DNAに適用可能である。また、電気泳動によって物理的に隔離した流路で分析を行うため、ダイプライマー法、ダイターミネーター法のいずれの標識方法であっても4種のddNTPを単一の蛍光物質で標識したものを分析することが可能である。
【００２３】
特にダイターミネーター法においてはddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTPが異なる蛍光物質で標識されている場合に、それら蛍光物質の構造の違いが標識反応時の取込み効率に影響することから4種の塩基を同一の蛍光色素で標識することは正確な存在比の検出に有効である。また蛍光物質の違いは電気泳動におけるDNA断片の移動度にも影響するため、単一の蛍光物質による標識はDNA断片の移動度補正においても有利である。
【００２４】
次に標識を行ったDNAを塩基種毎に独立した流路（1f〜1i）を用いて電気泳動し、DNA分子量で分離する。電気泳動では短いDNAが先に移動するため、検出部（1j）にて経時的に信号強度を計測装置（1k）を用いて測定する事によって分析対象試料中の塩基配列に従って塩基の存在に該当する信号を計測可能である。標識DNAの電気泳動と検出に用いる流路としてはキャピラリー型に加えて、一般にMEMS（Micro-Electro-Mechanical Systems）と呼ばれる技術によって作製された微小流路も適用できる。
【００２５】
図1では4つの流路を用いた標的DNA分析例を示したが、分析精度を高めるために、1つの鋳型に対し2種のプライマーを用いて各塩基単位の標識反応を8つの反応液を用いて行い、反応産物である標識DNAを個別に8つの電気泳動分離と検出を行うことも有効である。
【００２６】
また、例えば図４で後述するような他の用途に応じて適宜流路を追加することも可能である。
【００２７】
次に、図８を用いて本実施形態におけるシステム全体の構成の一例について説明する。図1を用いて上述したDNA検出により信号値の計測を行う計測装置（8a）と、それら計測装置から得られた信号値の補正とデータの解析結果の表示を行うデータ解析装置（8c）と、が主要な構成要素である。さらに、計測装置（8a）に接続した制御装置（8b）と、検出対象とする遺伝子の塩基配列情報が記録されている参照遺伝子データベース（8d）及び外部ネットワーク（8e）と連結したデータ解析装置（8c）と、が通信回路（8h）によって接続する例を示しているが、DNA検出機能と信号値の補正機能、結果表示機能を一体化したシステムであっても構わない。また、計測装置によって得られた信号値を外部ネットワーク（8e）を介して接続する外部計算機に伝達することによって信号値補正機能を外部計算機によって行うことも可能である。なお、制御線や情報線は説明上必要と考えられるものを示しており、製品上必ずしも全ての制御線や情報線を示しているとは限らない。実際には殆ど全ての構成が相互に接続されていると考えてもよい。
【００２８】
次に、図９を用いて、図８で示したデータ解析装置が備える機能部について説明する。図９に示すデータ解析装置8cの各機能部は、それぞれの機能を実現するメモリ9fに格納されたプログラムをプロセッサ9eが解釈して実行することによりソフトウェアで実現することができる。また、データ解析装置8cはインタフェース9c, 9dを介して外部装置やデータベース、ネットワークとの間で情報の送受信を行う。さらに、上記の各構成、機能部、処理部、処理手段等は、それらの一部又は全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現してもよい。各機能を実現するプログラム、ファイル、データベース等の情報は、メモリや、ハードディスク、ＳＳＤ（Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｄｒｉｖｅ）等の記録装置、または、ＩＣカード、ＳＤカード、ＤＶＤ等の記録媒体に置くことができる。
【００２９】
まず、計測装置（8a, 8f）が、制御装置（8b, 8g）から受信する分離計測条件に基づいて、DNA鎖長分離部（9a）で図1に示した塩基種毎に独立した流路を用いて電気泳動によってDNAを分子量で分離し、標識DNA計測部（9b）で標識したDNA分子を検出して計測を行う。
【００３０】
次に、計測装置（8a）によって計測された信号値はデータ解析装置（8c）に送られる。計測信号を受け取ったデータ解析装置（8c）は、受け取った信号値を計測信号値記憶部（9j）に記録する。次に、図３、図４、図５、図６を用いて後述する方法に従って、ピーク検出部（9k）が、計測信号値記憶部（9j）に記録された信号値よりピークを検出し、移動度補正及び流路統合部（9l）が、対象試料に対応した複数の流路に由来する計測結果の間の移動度の補正と流路の統合処理を行う。次に、統合処理結果記憶部（9m）が統合処理結果の記録を行う。次に、主要・変異ピーク検出部（9o）が、ピーク検出論理記憶部（9n）に記録されたピーク検出の手順と、判定依頼入力部（9h）から受け取る依頼者の指定する任意の閾値の入力等のユーザからの判定依頼と、に基づいて主要ピーク及び変異ピークの検出を行う。この際、統合処理結果記憶部（9m）に収めた信号値より、各塩基の信号強度について閾値以上の信号値を示す塩基の種類とその塩基配列上の座標の抽出を行うことにより、分析対象領域内に存在する多型を網羅的に検出する。
【００３１】
次に、結果出力部（9i）が主要・変異ピーク検出部（9o）が検出したデータを受信して、配列・検出変異記憶部（9g）に当該データを記録するとともに、表示部（9f）に当該データを出力する。そして、表示部（9f）は、図７を用いて後述するように、塩基配列と変異情報の表示及び波形の表示を行う。配列・検出変異記憶部（9g）は計測結果の記録を行うことによって過去に計測した結果との比較解析を可能とするとともに、また検出対象とする遺伝子の参照塩基配列を記録することによって検出結果と参照配列との比較解析が可能となる。図9に示したブロック図は一例であり、制御装置の機能をデータ解析装置の機能と統合し1台の計算機上で実行することが可能である。また、図8に示したように1台のデータ解析装置に複数の計測装置を連結することによって複数の計測装置から得られた計測結果を1台のデータ解析装置上に集約して解析することが可能である。
【００３２】
次に、図３、図４、図５、図６を用いて、図９にて上述したピーク検出部（9k）のピーク検出、及び移動度補正及び流路統合部（9l）が行う移動度の補正と流路の統合処理の内容について説明する。本実施形態では4つの塩基種を独立した流路で分析するため、各流路で検出された信号値（1l〜1o）はそれぞれ標識された1種の塩基に由来する信号のみであり、各流路の信号のみでは鋳型DNAの遺伝子配列を決定することが不可能である。そこで対象鋳型DNAの計測結果を算出するためには対象試料に対応した複数の流路に由来する計測結果の統合（1p）が必要になる。ただし、独立した流路での電気泳動はその移動度に差異が発生するため、統合対象とする計測結果の移動度を補正して統合する機能が必要である。
【００３３】
計測装置（8a, 8b）により各流路について計測された信号値を入力情報とし、移動を補正する手段として、i)分析対象領域の既知塩基配列情報、または既知参照波形情報より各塩基種の出現位置を各塩基種の計測結果にて閾値以上の信号が計測された位置情報と参照することにより補正する図３に示す方法、ii）上記塩基種別の計測に加え、分析対象試料より通常のDNAシーケンス法と同様に4塩基種を単一流路にて電気泳動と分析を行うことによって、分析対象試料の参照波形情報または参照塩基配列情報を取得してその少なくとも一方を参照情報として移動度の補正を行う図４に示す方法、iii）塩基別に標識したDNA試料おのおのにあらかじめDNAマーカーとして分子量既知の標識DNAを混合して電気泳動と計測を行い、DNAマーカーの計測位置を参照情報として移動度の補正を行う図５に示す方法、iv）各流路から得られた塩基種毎の信号強度より閾値以上の信号強度が存在する位置を算出し、DNA鎖は塩基が連続する高分子物質であることから各流路の閾値以上の信号値の出現が連続性を持つ性質を指標として移動度を補正する図６に示す方法、v)前記i)〜iv）の2つ以上の組み合わせを行う方法、がある。以下、各方法について説明する。
【００３４】
図３に示すi)の方法では、計測装置（8a, 8b）により各流路について計測された信号値3aから各塩基種についてのピークを検出し（3b）、配列・検出変異記憶部（9g）に格納された分析対象領域の既知塩基配列情報、または既知参照波形情報より各塩基種の出現位置を各塩基種の計測結果にて閾値以上の信号が計測された位置情報と参照してフィッティングを行い（3c）、フィッティング結果に基づいて移動度の補正を行い（3d）、各流路のデータを統合する（3e）。
【００３５】
また、図４に示すii）の方法では、計測装置（8a, 8b）により、塩基種別の計測に加え、分析対象試料より通常のDNAシーケンス法と同様に4塩基種を単一流路にて電気泳動と分析を行い（4a）、塩基種別の計測を行った各流路について計測された信号値4aから各塩基種についてのピーク検出、さらに4塩基種を単一流路にて分析した流路についての全塩基についてのピーク検出を行い（4b）、4塩基種を単一流路にて分析した流路についての全塩基についてのピーク検出結果に基づいて分析対象試料の参照波形情報または参照塩基配列情報を取得して、その少なくとも一方を参照情報としてフィッティングを行い（4c,4d）、フィッティング結果に基づいて移動度の補正を行い（4e）、各流路のデータを統合する（4f）。
【００３６】
また、図５に示すiii）の方法では、計測装置（8a, 8b）により、塩基別に標識したDNA試料おのおのにあらかじめDNAマーカーとして分子量既知の標識DNAを混合して電気泳動と計測を行い（5a）、各流路について計測された信号値5aから各塩基種についてのピークを検出し（5b）、DNAマーカーの計測位置を参照情報としてフィッティングを行い（5c）、フィッティング結果に基づいて移動度の補正を行い（5d）、各流路のデータを統合する（5e）。
【００３７】
また、図６に示すiv)の方法では、計測装置（8a, 8b）により各流路について計測された信号値6aから各塩基種についてのピークを検出し（6b）、それらのピーク位置とピーク間隔を相互に比較し、検出した4種のピーク位置の重なりが最少でありピーク間隔が平準化されるフィッティング条件を算出し（6c）、フィッティング結果に基づいて移動度の補正を行い（6d）、各流路のデータを統合する（6e）。
【００３８】
以上のように分析対象試料の計測信号値の移動度を補正して統合したのち、図９で上述した処理によって、各塩基の信号強度について閾値以上の信号値を示す塩基の種類とその塩基配列上の座標の抽出を行うことにより、分析対象領域内に存在する多型を網羅的に検出する。本実施形態では、各塩基の電気泳動分離と検出が物理的に隔離されている独立した流路で行われているため、検出された信号値には従来のDNAシーケンサにおける問題であった蛍光色素のクロストークが存在しないために、従来のDNAシーケンサより高感度に多型の存在を検出可能である。
【００３９】
また、各座標位置にて計測された最も大きな信号値と検出されたより小さな信号値を用いて検出された多型の存在比率の指標を算出することが可能である。加えて、分析対象試料から得られた信号強度より各座標において閾値以上で最も大きな信号強度を示した塩基種を判定し、分析対象領域の既知参照塩基配列情報と比較することによって、分析対象試料より得られた塩基配列情報と参照塩基配列情報の一致度を算出することができる。
【００４０】
次に、図７を用いて本実施形態にて得られる分析結果表示の例について説明する。7aは移動度を補正した各流路の統合情報の例であり、各塩基を検出した位置情報と検出信号強度情報を含む（7b〜７e）。各流路の移動度補正の結果として横軸座標が一致する位置にて閾値以上の値で検出された微量信号はその塩基位置に多型が存在することを示す。多型の存在が検出された座標位置の例を7f〜7hに示した。
【００４１】
流路を統合して得られた計測結果（7a）より、分析領域中に存在する多型情報を網羅的に検出した結果を一覧として表示した例を7iに示した。7iでは参照塩基配列情報（7j）を横座標、各塩基を縦座標（7j〜7n）とし、各塩基位置で閾値を超えて算出された4種の塩基の存在比率を一覧として表示している。統合した波形情報（7a）の7f〜7hのように同一横軸座標にて検出された信号はその塩基位置に多型が存在することを示し、存在する多型の塩基の種類に加えて同一座標位置の信号強度を比較することによって多型の存在比率を算出してその算出比率を表示することが可能である（7o〜7q）。  
加えて、分析対象試料から得られた信号強度より各座標において閾値以上で最も大きな信号強度を示した塩基種を判定し、分析対象領域の既知参照塩基配列情報と比較することによって、分析対象試料より得られた塩基配列情報と参照塩基配列情報の一致度を算出することができる（7r）。参照塩基配列情報に対する一致度は計測を行ったDNA領域が計画した計測対象領域に合致していることを判定する指標として重要である。
【００４２】
7iの計測結果表示に加えてi）多型が検出された位置のみを抽出または強調して表示する構成、ii）疾患と関連する既知多型位置を抽出または強調して表示する構成、iii）試験者が指定した特定座標位置を抽出または強調して表示する構成、とすることもできる。得られた分析対象領域の網羅的多型情報は既存のDNAシーケンサや定量PCR装置では取得し得ない詳細な体細胞変異の存在を示す情報であり、体細胞変異と疾患の相関解析やその疾患治療に有効な情報である。
【００４３】
さらに標的とした遺伝子領域内の特定座標の塩基多型の存在やその存在比率が薬剤投与または治療方法の指標となる場合は、上記網羅的多型検出結果より直接的にそれら薬剤投与の可否、投薬量、治療方法について指針を提示することは医療用途の分析機において有効な結果の表示方法である。また、網羅的多型検出結果を他の臨床情報及び治療実績と比較参照することにより、さらに有効な治療投薬計画の策定が可能となる。
【００４４】
また、核酸試料を塩基種毎に標識化し、塩基種毎にそれぞれ個別の流路で電気泳動し、複数の流路のそれぞれで電気泳動される核酸試料毎に、塩基種毎の標識信号から得られる波形データに基づいて遺伝子変異を検出する、4種の塩基種を独立に標識する遺伝子変異検出用の試薬を備える遺伝子分析キットを用いることで、上記の装置を用いて多型検出を行うことができる。
【００４５】
以上、本実施形態によって、塩基種を独立した流路を用いて電気泳動と検出を行うことにより、標的とする遺伝子領域に存在する体細胞系列多型が高感度に検出可能となる。さらに検出した信号強度の比較により、体細胞遺伝子変異の存在比率の分析が可能となる。得られた分析対象領域の網羅的多型情報は既存のDNAシーケンサや定量PCR装置では取得し得ない詳細な体細胞変異の存在を示す情報であり、体細胞変異と疾患の相関解析やその疾患治療に有効な情報である。さらには得られた体細胞系列多型情報を既存の体細胞系列多型情報、臨床情報及び治療実績と比較参照することによって有効な治療投薬計画の策定が可能となる。
【符号の説明】
【００４６】
1a…分析対象試料、1b,1c,1d,1e…塩基種毎に標識を行った標識DNA試料、1f,1g,1h,1i…独立した流路、1l,1m,1n,1o…各流路にて計測された信号値情報、7a…1試料分析結果の波形表示の例、7f,7g,7h…同一座標位置に微量の信号が検出される検出位置、8a,8f…計測装置、8c…データ解析装置、9a…DNA鎖長 分離部、9b…標識DNA計測部 、9c, 9d…インタフェース、9f…表示部、9e…プロセッサ、9l…移動度補正及び流路統合部、9o…主要・変異ピーク検出部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年2月25日(2013.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基種毎に標識化された核酸試料を、前記塩基種毎にそれぞれ個別に電気泳動する複数の流路と、
前記複数の流路のそれぞれで前記電気泳動される前記核酸試料毎に、前記塩基種毎の標識信号を検出して検出強度の波形データを生成する波形データ生成部と、
前記塩基種毎に前記波形データのピーク値の検出を行うピーク検出部と、
前記ピーク値の検出を行った複数の前記波形データについて統合処理を行うデータ統合部と、
前記統合処理を行ったデータを表示する表示部と、を備える、
ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子分析装置であって、
前記データ統合部は、
前記流路間における前記電気泳動での前記試料の移動度の差を補正して前記統合を行う、
ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子分析装置であって、
前記統合処理の後に、前記複数の流路のそれぞれで計測された前記ピーク値を比較し、同一塩基配列上の座標位置の遺伝子多型の存在比を算出する多型解析部を更に備え、
前記表示部は、前記多型解析部の前記算出結果を表示する、
ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子分析装置であって、
前記多型解析部は、
前記遺伝子多型の存在比と、既知の参照塩基配列情報と、の比較に基づいて、前記核酸試料より得られた塩基配列情報と、前記参照塩基配列情報と、の間の一致度を算出する、
ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項５】
請求項１に記載の遺伝子分析装置であって、
前記ピーク検出部は、
前記塩基種毎に前記波形データから所定の閾値以上の信号強度を前記ピーク値として抽出する、
ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項６】
塩基種毎に標識化された核酸試料を、前記塩基種毎にそれぞれ個別の流路で電気泳動し、
前記複数の流路のそれぞれで前記電気泳動される前記核酸試料毎に、前記塩基種毎の標識信号を検出して検出強度の波形データを生成し、
前記塩基種毎に前記波形データのピーク値の検出を行い、
前記ピーク値の検出を行った複数の前記波形データについて統合処理を行い、
前記統合処理を行ったデータを表示する、
ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項７】
請求項６に記載の遺伝子分析方法であって、
前記流路間における前記電気泳動での前記試料の移動度の差を補正して前記統合を行う、
ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項８】
請求項６に記載の遺伝子分析方法であって、
前記統合処理の後に、更に、前記複数の流路のそれぞれで計測された前記ピーク値を比較し、同一塩基配列上の座標位置の遺伝子多型の存在比を算出し、
前記多型解析部の前記算出結果を前記表示する、
ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項９】
請求項８に記載の遺伝子分析方法であって、
前記遺伝子多型の存在比と、既知の参照塩基配列情報と、の比較に基づいて、前記核酸試料より得られた塩基配列情報と、前記参照塩基配列情報と、の間の一致度を算出する、
ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の遺伝子分析方法であって、
前記塩基種毎に前記波形データから所定の閾値以上の信号強度を前記ピーク値として抽出する、
ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項１１】
核酸試料を塩基種毎に標識化し、
前記塩基種毎にそれぞれ個別の流路で電気泳動し、
前記複数の流路のそれぞれで前記電気泳動される前記核酸試料毎に、前記塩基種毎の標識信号から得られる波形データに基づいて遺伝子変異を検出する、
４種の塩基種を独立に標識する遺伝子変異検出用の試薬を備える遺伝子分析キット。
【手続補正書】
【提出日】平成27年2月9日(2015.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基種毎に標識化された核酸試料を、前記塩基種毎にそれぞれ個別に電気泳動する複数の流路と、
前記複数の流路のそれぞれで前記電気泳動される前記核酸試料毎に、前記塩基種毎の標識信号を検出して検出強度の波形データを生成する波形データ生成部と、
前記塩基種毎に前記波形データのピーク値の検出を行うピーク検出部と、
前記ピーク値の検出を行った複数の前記波形データについて統合処理を行うデータ統合部と、
前記統合処理の後に、前記複数の流路のそれぞれで計測された前記ピーク値を比較し、同一塩基配列上の座標位置の遺伝子多型の存在比を算出する多型解析部と、
前記多型解析部の前記算出結果を表示する表示部と、を備える、
ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子分析装置であって、
前記データ統合部は、
前記流路間における前記電気泳動での前記試料の移動度の差を補正して前記統合を行う、ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子分析装置であって、
前記多型解析部は、
前記遺伝子多型の存在比と、既知の参照塩基配列情報と、の比較に基づいて、前記核酸試料より得られた塩基配列情報と、前記参照塩基配列情報と、の間の一致度を算出する、ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項４】
請求項１に記載の遺伝子分析装置であって、
前記ピーク検出部は、
前記塩基種毎に前記波形データから所定の閾値以上の信号強度を前記ピーク値として抽出する、ことを特徴とする遺伝子分析装置。
【請求項５】
塩基種毎に標識化された核酸試料を、前記塩基種毎にそれぞれ個別の流路で電気泳動し、
前記複数の流路のそれぞれで前記電気泳動される前記核酸試料毎に、前記塩基種毎の標識信号を検出して検出強度の波形データを生成し、
前記塩基種毎に前記波形データのピーク値の検出を行い、
前記ピーク値の検出を行った複数の前記波形データについて統合処理を行い、
前記統合処理の後に、前記複数の流路のそれぞれで計測された前記ピーク値を比較し、同一塩基配列上の座標位置の遺伝子多型の存在比を算出し、
前記遺伝子多型の存在比を表示する、
ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項６】
請求項５に記載の遺伝子分析方法であって、
前記流路間における前記電気泳動での前記試料の移動度の差を補正して前記統合を行う、ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項７】
請求項５に記載の遺伝子分析方法であって、
前記遺伝子多型の存在比と、既知の参照塩基配列情報と、の比較に基づいて、前記核酸試料より得られた塩基配列情報と、前記参照塩基配列情報と、の間の一致度を算出する、ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【請求項８】
請求項５に記載の遺伝子分析方法であって、
前記塩基種毎に前記波形データから所定の閾値以上の信号強度を前記ピーク値として抽出する、ことを特徴とする遺伝子分析方法。
【国際調査報告】
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