(57)【要約】  ＴＥＴ１タンパク質のアミノ末端から２番目のアミノ酸を異なるアミノ酸に置換等することにより、ＴＥＴ１タンパク質をヒト分化多能性幹細胞において従来より安定に発現させることができた。そして、かかる変異型ＴＥＴ１タンパク質を分化多能性幹細胞に導入することにより、分化誘導の抑制因子であるＮＡＮＯＧ等の発現を速やかに消失させ、分化誘導に関わる因子の発現を促進させることができた。分化能を向上させた分化多能性幹細胞の製造方法、並びに当該製造方法に有用な物質を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化多能性幹細胞の製造方法であって、
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの分子を、分化多能性幹細胞又は該細胞に誘導するための体細胞に導入する工程を含む方法
（ａ）ＴＥＴ１タンパク質
（ｂ）ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸
（ｃ）ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクター。
【請求項２】
前記ＴＥＴ１タンパク質は、変異型ＴＥＴ１タンパク質であって、正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上しているタンパク質である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、そのアミノ末端から２番目のアミノ酸残基が正常型ＴＥＴ１タンパク質のアミノ末端から２番目のアミノ酸残基とは異なるＴＥＴ１タンパク質である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、さらにジオキシゲナーゼ領域を欠失しているＴＥＴ１タンパク質である、請求項２又は３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記ＴＥＴ１タンパク質は、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
変異型ＴＥＴ１タンパク質であって、正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上しているタンパク質。
【請求項７】
アミノ末端から２番目のアミノ酸残基が正常型ＴＥＴ１タンパク質のアミノ末端から２番目のアミノ酸残基とは異なる、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
さらにジオキシゲナーゼ領域が欠失している、請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
配列番号：４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１０】
請求項６〜９のうちのいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸が挿入されているベクター。
【請求項１２】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの分子が導入されている、分化多能性幹細胞又は該細胞に誘導するための体細胞
（ａ）ＴＥＴ１タンパク質
（ｂ）ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸
（ｃ）ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分化多能性幹細胞の製造方法に関し、より詳しくは、分化能を向上させた分化多能性幹細胞の製造方法に関する。また、本発明は、当該製造方法に利用されるタンパク質にも関する。
【背景技術】
【０００２】
分化多能性幹細胞は、自己とは異なる複数系統の種類の細胞に変化することができる能力（分化多能性）と、細胞分裂を経ても自己と同じ能力を有する細胞を娘細胞として創出できる能力（自己複製能）とを備えている細胞であると定義されており、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等がこの定義に該当する細胞であると考えられている。そして、かかる能力を有しているが故に、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等は、再生医療や創薬開発の分野において重要な役割を果たすことが強く期待されている。【０００３】
しかしながら、最近、マウス分化多能性幹細胞とヒト分化多能性幹細胞とは、基本性質が異なっており、こと分化能に関しては、ヒト分化多能性幹細胞がマウス分化多能性幹細胞より劣っているということが報告されている。【０００４】
マウス分化多能性幹細胞に関しては、実験的に分化多能性を比較的正確に評価することができる。例えば、マウスＥＳ細胞を胚盤胞の腔内に注入すると、内部細胞塊と細胞同士とが混ざり合い、ＥＳ細胞由来の細胞が胚内で正常な発生を呈する場合があり、これをキメラ形成と呼んでいる。マウスＥＳ細胞にとって、このように発生時期が同等の内部細胞塊と発生の進行を同期できるかどうかは、分化多能性の良き指標になる。この場合、更に発生が進むと、これらＥＳ細胞の一部が生殖細胞系列に動員されることも知られている。この生殖細胞移行（ｇｅｒｍ  ｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）が起こることは、ＥＳ細胞由来の遺伝情報が次世代に渡されることを意味しており、この意味においてより広い意味での正常細胞としての適合性を示すことが可能である。またさらに“究極”とも言える分化多能性の証明方法が存在する。マウス受精卵の細胞分裂を一時的に阻害した後にこれを培養皿で培養すると、４倍体（ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ）の胚盤胞が形成される。この４倍体胚盤胞に含まれる内部細胞塊は、一見性質は正常に見えるが、その後の胚発生が進行することはない。このため、この４倍体胚盤胞をそのまま偽妊娠させた母親マウスの子宮に戻しても個体は得られない。しかし、この４倍体胚盤胞に対して、分化多能性を持った幹細胞を注入し、前述のキメラ形成を行わせると、この場合は注入した細胞のみが正常な核型を持ち、発生に貢献できる。こうすることで、単一世代で、注入した分化多能性幹細胞に完全に由来する個体が発生する。この方法は一般には４倍体補完（ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）アッセイと呼ばれ、その際生まれたマウスを、注入した由来細胞にちなんでａｌｌ−ｉＰＳＣマウスと呼ぶ。このように、マウスにおいては、分化多能性を幾重にも検証することが可能であり、これまでに多くの証左によって、マウスｉＰＳ細胞も厳密な意味で分化多能であることが示されている。【０００５】
一方、ヒト分化多能性幹細胞に関しては、当然のことながら、倫理的な観点から上述の検証法はヒトでは用いる事ができない。その代用法としてよく用いられるのはテラトーマ形成である。ヌードマウスの皮下に幹細胞を移植すると、宿主となるマウスの血行に支えられて移植した細胞が“ランダム”に分化して組織化する。この腫瘍片を生長させ、その病理標本から外・中・内胚葉を探し出すことで、一応の分化多能性が示される。しかし、テラトーマ形成法によって分化多能性を評価する上で大きな問題が存在する。それは、本法においては、例え元の幹細胞の分化効率が悪くても、三胚葉への組織が確認された段階で分化多能性ありと判断される点である。これでは、腫瘍内に発生の全く進んでいない未分化な細胞が残留していても多くの場合これを無視して分化多能性を評価してしまうことになる。テラトーマ形成では、元の幹細胞集団に真の分化多能性細胞が数個存在すれば、他の細胞は全く何でもよくなり、評価方法としては全く定量性がない。例えば、マウスｉＰＳ細胞でもｃ−Ｍｙｃを用いて作製されたものは、テラトーマ形成では三胚葉分化能が認められるものの、キメラ形成を行うと、ほとんどの場合、ｉＰＳ細胞に由来する自然発生的な腫瘍を形成してしまう。次善の策として、実際に三胚葉に個別に分化誘導し、それを評価する方法も考えられる。これは、分化プロトコールに左右され、やはり定量的な実験は難しいことが予想される。【０００６】
さらに、ヒト分化多能性幹細胞に関しては、もっと根源的な問題点がある。それは、全ての細胞系譜に均等に分化する潜在能力を有する理想的なヒト分化多能性幹細胞が存在しないことである。長船らの報告によると、ヒトＥＳ細胞は遺伝子発現レベルでどれ２つとして同一のものは存在せず、それを受けて個々のＥＳ細胞株は、どれか特定の胚葉への分化誘導性に偏っていること、ひいては、ヒトＥＳ細胞は、定量的な点において、十分な“分化多能性”を持っていないことが示唆されている（非特許文献１）。【０００７】
また、マウスのＥＳ細胞が樹立されてから、ヒトのＥＳ細胞が樹立されるまで１７年という時間がかかっている。これは、マウスＥＳ細胞の樹立方法ではヒトＥＳ細胞が樹立出来なかったために他ならない。マウスＥＳ細胞の自己複製培養には白血病抑制因子（以下「ＬＩＦ」とも称する）が必要であるが、ヒトＥＳ細胞はＬＩＦ添加培地では自己複製させることができない。ＴｈｏｍｓｏｎらがヒトＥＳ細胞の維持に必要だと見出したのは、ＦＧＦとアクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）／Ｎｏｄａｌとであった（非特許文献２）。さらに、マウスＥＳ細胞はＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナルを介するのに対し、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞ではＳＭＡＤ２／３シグナルを介するという双方で異なるシグナル系を介してそれぞれの分化多能性幹細胞が自己複製することが明らかになっている。また、ヒト分化多能性幹細胞において、ＳＭＡＤ２／３を介した細胞内シグナルは、ＮＡＮＯＧの発現上昇に関わるとの見方が優勢である。一方で、ＳＭＡＤ２／３シグナルは、哺乳類の発生では中内胚葉分化に必要なシグナル伝達経路であり、実際、これらの細胞系譜を目指して分化誘導を施すためには高濃度のＡｃｔｉｖｉｎＡを用いる。よって目的は異なるが、現状で多く用いられているヒト分化多能性幹細胞の自己複製シグナルは、同細胞の中内胚葉系への分化シグナルと重なっている。【０００８】
ヒトＥＳ細胞もマウスＥＳ細胞も、胚盤胞から樹立する点は共通している。しかしながら、前述の培養条件の違いからか、それらの性質は異なる。これまでの知見を総合すると、マウスＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊の遺伝子発現プロファイルを踏襲していることが判明しているが、ヒトＥＳ細胞は、胚盤胞が少し発達して形成されるエピブラスト内の原始外胚葉に最も性質が似ているということである。その後、マウスエピブラストから直接エピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）がヒトＥＳ細胞と同様の培養条件にて樹立されたことを受けて（非特許文献３及び４）、分化多能性を大きく２つに分けて考えるようになった。１つはマウスＥＳ細胞やマウスｉＰＳ細胞に代表される胚盤胞型の分化多能性を持つ幹細胞であり、もう１つはヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウスＥｐｉＳＣ等のエピブラスト型幹細胞であり、前者の性質はナイーブ（ｎａｉｖｅ）と、後者の性質はプライム（ｐｒｉｍｅｄ）と称されるようになった（非特許文献５）。【０００９】
以上の通り、ナイーブ型の分化多能性幹細胞もプライム型の分化多能性幹細胞も共に三胚葉への分化能を有し、ヌードマウスに移植すればテラトーマが形成される点においては共通している。しかしながら、ナイーブ型の分化多能性幹細胞は、発生段階において受精卵に近い初期状態（胚盤胞）の性質を反映しているため、樹立等が容易であり、さらには、この細胞に完全に由来する個体を発生させることができる程の完全な分化多能性を有している。一方、プライム型の分化多能性幹細胞は、胚盤胞より発生の段階が進んでいるエピブラストの性質を反映していることもあり、樹立等が容易ではない。また、この細胞においては、前述の通り、分化多能性に偏りがあることも明らかになっている（非特許文献１）。さらに、プライム型の分化多能性幹細胞は、生殖細胞移行能やキメラ形成能を有しておらず、分化多能性を含め分化能の点において、プライム型の性質を有するヒト分化多能性幹細胞等は、ナイーブ型の性質を有するマウス分化多能性幹細胞より劣っていることが明らかになっている。【００１０】
再生医療の実用化や創薬開発において、多種多様な細胞、組織、臓器等を提供し得る程の高い分化能を備えることが、ことヒト分化多能性幹細胞には求められている。そのため、プライム型の性質を有するヒト分化多能性幹細胞等の分化能を向上させる方法が強く求められているが、かかる方法は未だ開発されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｏｓａｆｕｎｅ，Ｋ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００８年、２６巻３号、３１３〜３１５ページ
【非特許文献２】Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、２８２巻、５３９１号、１１４５〜７ページ
【非特許文献３】Ｂｒｏｎｓ，Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、４４８巻、７１５０号、１９１〜１９５ページ
【非特許文献４】Ｔｅｓａｒ，Ｐ．Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、４４８巻、７１５０号、１９６〜１９９ページ
【非特許文献５】Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、２００９年、４巻、６号、４８７〜４９２ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、分化能を向上させた分化多能性幹細胞の製造方法、並びに当該製造方法に有用な物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、マウス分化多能性幹細胞とヒト分化多能性幹細胞との性質の差異について鋭意研究を進めた。【００１４】
マウス分化多能性幹細胞は、着床前の胚盤胞の内部細胞塊に近い性質を有している。一方、ヒト分化多能性幹細胞は、着床後のエピブラスト内の原始外胚葉に最も性質が似ている。そして、この発生段階の差により、分化多能性の点において、ヒト分化多能性幹細胞はマウス分化多能性幹細胞よりも劣っていることが想定される。【００１５】
また、発生過程において、初期化には２種類あると考えられている。受精直後から着床初期に生じる「初期胚における初期化」と、着床後に生殖細胞の形成過程で生じる「生殖系列における初期化」とである。この点を鑑み、本発明者らは、着床前の胚盤胞から着床後のエピブラストまでの記憶を消去すべく、「生殖系列における初期化」において発現している多種の因子を精査し、その中でＴＥＴ１に着目した。【００１６】
ＴＥＴ１タンパク質は、５−メチル化シトシンのメチル基をヒドロキシル化し、５−ヒドロキシメチルシトシンに変換する作用を有する酵素であることが明らかになっている。また、近年、このタンパク質に関しては、前記５−ヒドロキシメチルシトシンから更にシトシンが生成される、すなわち脱メチル化が生じることが推測されている。さらに、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ等のＤＮＡメチル化酵素とＤＮＡメチル化部位との結合を、ＴＥＴ１タンパク質が競合的に阻害することにより、ＤＮＡの低メチル化状態が維持されていることも想定されている。故に、ＴＥＴ１タンパク質はＤＮＡの脱メチル化又は低メチル化状態維持の機構に関与していることが強く示唆されている。さらに、ＴＥＴ１タンパク質に関しては、マウスにおいて、受精卵から胚盤胞までの初期胚の発生過程や、始原生殖細胞、胚盤胞から樹立されるＥＳ細胞等において、その発現が認められている。したがって、前記ＤＮＡの脱メチル化等と併せ、ＴＥＴ１タンパク質は、細胞の「初期化」に関与していることも強く示唆されている。しかしながら、ヒトにおけるＴＥＴ１タンパク質の発現は解析されていなかった。【００１７】
そこで、ヒトｉＰＳ細胞におけるＴＥＴ１の発現を転写レベル及び翻訳レベルにて調べた。その結果、ヒトｉＰＳ細胞においてもマウスＥＳ細胞等同様にＴＥＴ１ｍＲＮＡは豊富に発現していることが確認された。また、その際ヒトｉＰＳ細胞において検出された２種類のＴＥＴ１ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の配列は、いずれも従前知られていたものとは一部のエクソンの有無の点において異なっていたため、新たなＴＥＴ１のスプライシングバリアントを見出すことにも本発明者らは成功した。【００１８】
しかしながら、その一方で驚くべきことに、ヒトｉＰＳ細胞においてＴＥＴ１タンパク質の発現を検出することは、マウスＥＳ細胞等とは異なり出来なかった。そして、このＴＥＴ１タンパク質の発現の有無が、マウス分化多能性幹細胞とヒト分化多能性幹細胞との分化能の差異を生じさせていると想定し、このＴＥＴ１タンパク質をヒト分化多能性幹細胞において発現させる方法について鋭意検討した。その結果、天然型のＴＥＴ１タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）にペプチドタグを付加することによって、当該タンパク質をヒト分化多能性幹細胞において安定的に発現させることを見出した。さらに、驚くべきことに、Ｎ末端から２番目のアミノ酸を異なるアミノ酸に置換するだけでも、当該タンパク質の発現が安定化することも明らかになった。【００１９】
次に、このようなヒト分化多能性幹細胞において安定的に発現することのできる変異型ＴＥＴ１タンパク質（改変ＴＥＴ１タンパク質）をヒトｉＰＳ細胞において発現させたところ、従前のヒト分化多能性幹細胞においては発現が認められた、中内胚葉への分化傾向を示すＴ、ＳＯＸ１７の発現は消失していることが見出された。したがって、改変ＴＥＴ１タンパク質によりヒトｉＰＳ細胞におけるこのような分化誘導の偏り（分化誘導の偏向性）が解消できることが明らかになった。【００２０】
また、改変ＴＥＴ１タンパク質を導入したヒトｉＰＳ細胞を神経系（外胚葉）に分化誘導したところ、分化誘導の抑制因子であるＯＣＴ３／４及びＮＡＮＯＧの発現は速やかに消失することが明らかになった。特にＮＡＮＯＧの発現は、殆どの細胞種への分化誘導の阻害要因となっていることが知られているため、改変ＴＥＴ１タンパク質の導入により、分化多能性幹細胞におけるこの因子による分化誘導に対する抵抗性が解消され、該細胞の分化多能性を確実に発揮させることができることも明らかになった。一方、改変ＴＥＴ１タンパク質の導入により、神経発生の必須因子であるＳＯＸ２や、ＳＯＸ１等の神経マーカーの発現は、神経系への分化誘導過程において亢進されることも明らかになった。特にＳＯＸ１の発現量は、ＴＥＴ１タンパク質が導入されず作製された従前のｉＰＳ細胞の分化誘導過程と比べて約６０倍に上昇していたため、当該タンパク質の導入により、分化多能性幹細胞における神経系への分化能も約６０倍向上していることが想定される。【００２１】
そして、これら転写因子の増減を反映しているかのように、従来のＴＥＴ１タンパク質が発現していないヒトｉＰＳ細胞では神経細胞への分化が僅かにしか認められなかった分化誘導の条件下においても、改変ＴＥＴ１タンパク質を導入したヒトｉＰＳ細胞においては、ほぼ１００％の細胞が神経細胞に分化できることも見出した。また、かかる外胚葉系への分化のみならず、改変ＴＥＴ１タンパク質の導入により、分化多能性幹細胞の内胚葉系への分化能も向上されることも確認した。【００２２】
さらに、驚くべきことに、このような分化能の向上は、Ｎ末端から２番目のアミノ酸を異なるアミノ酸に置換し、さらにジオキシゲナーゼ領域を欠失させた改変ＴＥＴ１タンパク質によっても達成されることが明らかになった。すなわち、かかる分化能の向上においては、ジオキシゲナーゼ領域が担う脱メチル化活性は必要ではなく、ＴＥＴ１タンパク質のＤＮＡ結合能が維持されていれば十分であることが示された。【００２３】
また、前述の改変ＴＥＴ１タンパク質を、所謂リプログラミング因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ）と共に体細胞に導入することによって、得られるｉＰＳ細胞の分化能の向上のみならず、該ｉＰＳ細胞の誘導効率（製造効率）も高めることができることも明らかになった。【００２４】
さらに、ＴＥＴ１タンパク質が導入されず作製された従前のｉＰＳ細胞においては、癌関連マーカー（ＧＰＣ４、ＧＡＧＥ２Ｂ及びＧＡＧＥ７）が高発現している一方で、ＴＥＴ１タンパク質を導入して作製されたｉＰＳ細胞においては、これら癌関連マーカーの発現は抑制されていることを見出し、ＴＥＴ１タンパク質を導入することによって得られるｉＰＳ細胞は、分化能及び該ｉＰＳ細胞の誘導効率（製造効率）の向上のみならず、その安全性を高めることができることも明らかにした。【００２５】
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものであり、分化能を向上させた分化多能性幹細胞の製造方法を提供するものである。また、本発明は、当該製造方法において有用な変異型ＴＥＴ１タンパク質及び該変異型タンパク質の材料となる新規ＴＥＴ１タンパク質、並びにこれらタンパク質をコードする核酸を提供するものである。より詳しくは、本発明は以下を提供するものである。
＜１＞  分化多能性幹細胞の製造方法であって、
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの分子を、分化多能性幹細胞又は該細胞に誘導するための体細胞に導入する工程を含む方法
（ａ）ＴＥＴ１タンパク質
（ｂ）ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸
（ｃ）ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクター。
＜２＞  前記ＴＥＴ１タンパク質は、変異型ＴＥＴ１タンパク質であって、正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上しているタンパク質である、＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞  前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、そのアミノ末端から２番目のアミノ酸残基が正常型ＴＥＴ１タンパク質のアミノ末端から２番目のアミノ酸残基とは異なるＴＥＴ１タンパク質である、＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞  前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、さらにジオキシゲナーゼ領域を欠失しているＴＥＴ１タンパク質である、＜２＞又は＜３＞に記載の製造方法。
＜５＞  前記ＴＥＴ１タンパク質は、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、＜１＞に記載の製造方法。
＜６＞  変異型ＴＥＴ１タンパク質であって、正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上しているタンパク質。
＜７＞  アミノ末端から２番目のアミノ酸残基が正常型ＴＥＴ１タンパク質のアミノ末端から２番目のアミノ酸残基とは異なる、＜６＞に記載のタンパク質。
＜８＞  さらにジオキシゲナーゼ領域が欠失している、＜７＞に記載のタンパク質。
＜９＞  配列番号：４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
＜１０＞  ＜６＞〜＜９＞のうちのいずれか一に記載のタンパク質をコードする核酸。
＜１１＞  ＜１０＞に記載の核酸が挿入されているベクター。
＜１２＞  下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの分子が導入されている、分化多能性幹細胞又は該細胞に誘導するための体細胞
（ａ）ＴＥＴ１タンパク質
（ｂ）ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸
（ｃ）ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクター。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、分化多能性幹細胞の分化能を向上させることが可能となる。さらには、ｉＰＳ細胞を効率良く製造することも可能となる。また、腫瘍形成能が抑制された、安全性の高い分化多能性幹細胞を製造することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】プロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２）存在下又は非存在下において、ヒトｉＰＳ細胞株（＃５８、＃２３７及び＃１０５）におけるＴＥＴ１タンパク質の発現量を、ウェスタンブロット法により分析した結果を示す写真である。
【図２】ＭＧ１３２存在下又は非存在下において、ヒトｉＰＳ細胞株（＃５８、＃２３７及び＃１０５）におけるＴＥＴ１ｍＲＮＡの発現量を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により分析した結果を示すグラフである。なお、図中縦軸は、同一サンプルに対して３つの反応を行い、その平均値を求め、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内部標準として標準化した相対的な値を示す。また、それぞれのカラムにおける誤差バーは標準誤差を示している（図５、８〜２３において同じ）。
【図３】ヒトｉＰＳ細胞において発現している３種類のＴＥＴ１遺伝子産物の構造を示す概略図である。上段に、Ｒｅｆｓｅｑとして既に公知となっているＴＥＴ１遺伝子のコーディング領域（ＣＤＳ）及び該ＣＤＳがコードするタンパク質の構造を示す。中段及び下段に、本発明者らが今回新たに見出した２種のＴＥＴ１遺伝子スプライスバリアントのＣＤＳ及び該ＣＤＳがコードするタンパク質の構造を示す。
【図４】Ｎ末にＦＬＡＧタグを配したＴＥＴ１を強制発現したヒトｉＰＳ細胞株（ＮＦＬＡＧ  ＴＥＴ１ＯＥ）と、Ｃ末にＦＬＡＧタグを配したＴＥＴ１を強制発現した株（ＣＦＬＡＧ  ＴＥＴ１ＯＥ）と、ベクターのみを発現したコントロールヒトｉＰＳ細胞株（ｐＣＡＧ−ＩＰ）とにおけるＴＥＴ１タンパク質の発現量を、ウェスタンブロット法により分析した結果を示す写真である。
【図５】ＮＦＬＡＧ  ＴＥＴ１ＯＥと、ＣＦＬＡＧ  ＴＥＴ１ＯＥと、ｐＣＡＧ−ＩＰとにおけるＴＥＴ１ｍＲＮＡの発現量を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により分析した結果を示すグラフである。
【図６】改変ＴＥＴ１タンパク質の改変部位と安定性との相関を分析するために用いた、改変ＴＥＴ１タンパク質の構造を示す概略図である。図中、上から一段目はヒトＴＥＴ１遺伝子（バリアント２）のＣＤＳ及び該ＣＤＳがコードするタンパク質の構造を示す。上から二段目はヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質（♯９３）の構造を示す。上から三段目は、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質（♯９４）の構造を示す。上から四段目は、Ｎ末にＦＬＡＧタグを付加したヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質（♯９５）の構造を示す。
【図７】図６に示した構造を有するＧＦＰ融合ＴＥＴ１タンパク質（♯９３、♯９４及び♯９５）を各々導入したヒトｉＰＳ細胞をＦＡＣＳにて分析した結果を示すヒストグラムである。なお、図中「ヒトｉＰＳ細胞」で示されるヒストグラムは、ネガティブコントロールとしてＧＦＰを発現しないｉＰＳ細胞を分析した結果を示す。
【図８】ヒトｉＰＳ細胞（図中「ｈｉＰＳＣ」）と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞（図中「ＴＥＴ１ｏ／ｅ−ｈｉＰＳＣ」）とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＴＥＴ１  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。図中の縦軸は、神経細胞への分化誘導を開始してからの日数を示す（図９〜２３において同様）。
【図９】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＤＮＭＴ３Ａ  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１０】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＤＮＭＴ３Ｂ  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１１】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＮＡＮＯＧ  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１２】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＯＣＴ３／４  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１３】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＳＯＸ２  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１４】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＳＯＸ１  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１５】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＮＥＵＲＯＧＥＮＩＮ１  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１６】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＮＥＵＲＯＧＥＮＩＮ２  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１７】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＮＥＵＲＯＤ１  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１８】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＡＳＣＬ１  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１９】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＰＡＸ６  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図２０】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＺＮＦ５２１  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図２１】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＯＴＸ２  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図２２】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、Ｔ  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図２３】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＳＯＸ１７  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図２４】ヒトｉＰＳ細胞を１２日間かけ神経細胞に分化誘導した後、ラミニンをコートした培養皿に播種し直し、更に１４日間培養した細胞を観察した結果を示す顕微鏡写真である。図中の矢印は、神経細胞の細胞体の塊が認められた箇所を示す。
【図２５】Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞を、１２日間かけ神経細胞に分化誘導した後、ラミニンをコートした培養皿に播種し直し、更に１４日間培養した細胞を観察した結果を示す顕微鏡写真である。
【図２６】ヒトｉＰＳ細胞（図中「ｈｉＰＳＣ」）と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞（図中「ＴＥＴ１ｏ／ｅ−ｈｉＰＳＣ」）とを、内胚葉系に分化誘導した際の、ＮＡＮＯＧ  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。図中の縦軸は、ヒトｉＰＳ細胞での分化誘導前の状態における発現量を１とした場合の相対量を示し、横軸は、内胚葉系への分化誘導を開始してからの日数を示す（図２７〜２９において同様）。
【図２７】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、内胚葉系に分化誘導した際の、ＳＯＸ１７  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図２８】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、内胚葉系に分化誘導した際の、ＨＮＦ４Ａ  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図２９】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、内胚葉系に分化誘導した際の、ＦＯＸＡ２  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図３０】空ベクターを導入したヒトｉＰＳ細胞（図中「ｐＣＡＧ−ＩＰ」）、ヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞（図中「♯９３」）、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞（図中「♯９４」）、及び、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質（全長）を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞（図中「ＴＥＴ１ｏ／ｅ」）を、各々神経細胞に分化誘導した際の、ＮＡＮＯＧ  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。図中の縦軸は、ｐＣＡＧＩＰの分化前の値を１とした相対値を示す（図３２において同様）。図中の横軸は、神経細胞への分化誘導を開始してからの日数を示す（図３１及び３２において同様）。
【図３１】空ベクターを導入したヒトｉＰＳ細胞、ヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞、及び、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質（全長）を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞を、各々神経細胞に分化誘導した際の、ＳＯＸ１  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。図中の縦軸は、空ベクターを導入したヒトｉＰＳ細胞（ｐＣＡＧＩＰ）の分化前の値が測定感度以下であったため、任意の相対値を示す。
【図３２】空ベクターを導入したヒトｉＰＳ細胞、ヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞、及び、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質（全長）を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞を、各々神経細胞に分化誘導した際の、ＯＴＸ２  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図３３】質の良いｉＰＳ細胞から構成されるコロニー（図中「Ｆｒｃｓ」）及び質の悪いｉＰＳ細胞から構成されるコロニー（図中「Ｐｒｃｓ」）の外観の例を示す顕微鏡写真である。
【図３４】モックベクターが導入されたヒトｉＰＳ細胞（「ｍｖ−ｉＰＳＣ」とも称する、図３５及び３６においても同じ）と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞（「ＴＥＴ１−ｉＰＳＣ」とも称する、図３５及び３６においても同じ）との細胞増殖曲線を示すグラフである。図中、横軸は日数を示す。
【図３５】ｍｖ−ｉＰＳＣ及びＴＥＴ１−ｉＰＳＣの細胞周期についてＦＡＣＳにて解析した結果を示すヒストグラムである。図中、各ヒストグラムの下にＧ１、Ｓ及びＧ２期における細胞数の割合も併記する。
【図３６】ＤＮＡマイクロアレイ解析において、ＴＥＴ１−ｉＰＳＣと比較してｍｖ−ｉＰＳＣにおいて発現の異なる遺伝子を示す、散布図である。ＤＮＡマイクロアレイ解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ社製  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ＧＥ  ８ｘ６０Ｋ  ｖ２  １カラープラットフォームを用い、７５パーセンタイルシフト方法にて行った。
【図３７】マウスＥＳ細胞のナイーブ段階からプライム段階への移行過程を示す、概略図である。すなわち、ナイーブ段階のおいては、白血病阻止因子（ＬＩＦ）及びナイーブ段階への移行を促進するその他の物質を除外した培地にてマウスＥＳ細胞を維持し、該細胞をＦＧＦ２及びアクチビンＡ（ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナル伝達のアゴニスト）を添加した培地に移すことでプライム段階への移行を誘導させたことを示す、概略図である。
【図３８】ｑＰＣＲによる解析結果において、ナイーブ段階からプライム段階への移行過程において、エピブラストマーカーの発現が亢進していることを示す、グラフである。図中、各マーカーの発現を示す棒グラフにおいては、左から順に、プライム段階への移行の誘導を開始してから０時間、２４時間、４８時間後の結果を示す（時間に関する表記については、図４０〜５４において同様）。
【図３９】Ｔｅｔ１ノックダウン（Ｔｅｔ１−ＫＤ）マウスＥＳ細胞からエピブラスト様幹細胞（ＥｐｉＬＣ）に至る過程を示す概略図である。Ｔｅｔ１−ＫＤマウスＥＳ細胞は、Ｔｅｔ１  ｓｈＲＮＡを導入し、ピューロマイシン耐性を指標として選択することにより、樹立した（Ｋ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７３，３４３（Ｍａｙ  １９，２０１１）  参照）。
【図４０】マウスＥＳ細胞のナイーブ段階からプライム段階への移行過程における、Ｔｅｔ１ノックダウンによる影響を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示すグラフである。図中、「Ｔｅｔ１ＫＤ」は、Ｔｅｔ１をノックダウンさせたマウスＥＳ細胞の結果を示す。「ＧＦＰＫＤ」は、Ｔｅｔ１ＫＤ細胞のコントロールとして、ＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡを導入したマウスＥＳ細胞の結果を示す。「ＩＣＭ」はＩＣＭ／ナイーブ型マーカーの転写レベルを解析した結果であることを示す。
【図４１】ナイーブ段階からプライム段階への移行過程において、Ｔｅｔ１−ＫＤマウスＥＳ細胞（Ｔｅｔ１ＫＤ）及びそのコントロール（ＧＦＰ−ＫＤ）における、Ｔｅｔ１、エピブラストマーカー（Ｅｐｉ）及び原始内胚葉マーカー（ＰＥ）についての転写レベルをｑＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。
【図４２】Ｔｅｔ１−ＫＤマウスＥＳ細胞（Ｔｅｔ１ＫＤ）及びＧＦＰ−ＫＤマウスＥＳ細胞（ＧＦＰ−ＫＤ）における、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２、ＩＣＭマーカー及びエピブラストマーカーのタンパク質発現レベルを、ウェスタンブロットにより解析した結果を示す、写真である。なお、ナイーブ型因子（特に、Ｎａｎｏｇ、Ｅｓｒｒｂ、Ｔｂｘ３及びＳｔａｔ３）のタンパク質レベルの発現は、Ｔｅｔ１−ＫＤ  ＥｐｉＬＣにおいて維持されていた。
【図４３】ＪＡＫ阻害剤の存在下（ＪＡＫｉ  ＋）又は非存在下（ＪＡＫｉ  −）において、ナイーブ段階からプライム段階への移行過程におけるＳｔａｔ３、Ｄｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ３ｂについてのタンパク質発現レベルを、ウェスタンブロットにより解析した結果を示す写真である。ＪＡＫ阻害剤としてＪＡＫインヒビターＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、培地への添加濃度：１μＭ）を用いた。また、Ｄｎｍｔ３ａに関しては、ウェスタンブロッティングにより２つのバリアント（ｖ１及びｖ２）を検出した。
【図４４】ＪＡＫ阻害剤の存在下（ＪＡＫｉ  ＋）又は非存在下（ＪＡＫｉ  −）において、ナイーブ段階からプライム段階への移行過程におけるＧａｔａ６転写レベルをｑＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。
【図４５】ＭＧ１３２存在下（ＭＧ１３２＋）又は非存在下（ＭＧ１３２−）において、ナイーブ段階からプライム段階への移行過程におけるマウスＥＳ細胞のＴｅｔ１  ｍＲＮＡの発現レベルを示す、グラフである。
【図４６】ＭＧ１３２存在下（ＭＧ１３２  ＋）又は非存在下（ＭＧ１３２  −）において、ナイーブ段階からプライム段階への移行過程におけるマウスＥＳ細胞のＴｅｔ１タンパク質の発現レベルを、ウェスタンブロットにより解析した結果を示す、写真である。図中の数値は、アクチンの発現量を基準に補正した、Ｔｅｔ１タンパク質の発現量を示す。
【図４７】ナイーブ段階からプライム段階への移行過程におけるＴｃｌ１のメチル化可変領域（ＤＭＲ）をバイサルファイトシークエンシングにより解析した結果を示す図である。図中、黒丸はメチル化（ヒドロキシメチル化）されたＣｐＧ部位を示し、白丸は非メチル化ＣｐＧ部位を示す。バイサルファイトシークエンシングは、Ｈ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７３，３８９（Ｍａｙ１９，２０１１）に記載を参照して行った。
【図４８】Ｔｅｔ１／Ｐｒｄｍ１４ダブルノックダウンマウスＥＳ細胞の、ナイーブ段階からプライム段階への移行過程に至る過程を示す概略図である。
【図４９】ナイーブ段階からプライム段階への移行過程における、Ｔｅｔ１／Ｐｒｄｍ１４ダブルノックダウンマウスＥＳ細胞のＯｔｘ２  ｍＲＮＡ発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。「ＧＦＰＫＤ  ＧＦＰＫＤ」は、ＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡを導入して樹立した細胞株（コントロール）の結果を示し、「ＧＦＰＫＤ  Ｐ１４ＫＤ♯１〜３」は、ＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡ及びＰｒｄｍ１４を標的とするｓｈＲＮＡを導入して樹立した各細胞株における結果を示し、「Ｔｅｔ１ＫＤ  ＧＦＰＫＤ」は、ＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡ及びＴｅｔ１を標的とするｓｈＲＮＡを導入して樹立した細胞株における結果を示し、「Ｔｅｔ１ＫＤ  Ｐ１４ＫＤ♯１〜３」は、Ｔｅｔ１を標的とするｓｈＲＮＡ及びＰｒｄｍ１４を標的とするｓｈＲＮＡを導入して樹立した各細胞株における結果を示す（図中の細胞株表記については、図５０〜５２においても同様）。
【図５０】ナイーブ段階からプライム段階への移行過程における、Ｔｅｔ１／Ｐｒｄｍ１４ダブルノックダウンマウスＥＳ細胞のＤｎｍｔ３ａ  ｍＲＮＡ発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。
【図５１】ナイーブ段階からプライム段階への移行過程における、Ｔｅｔ１／Ｐｒｄｍ１４ダブルノックダウンマウスＥＳ細胞のＤｎｍｔ３ｂ  ｍＲＮＡ発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。
【図５２】ナイーブ段階からプライム段階への移行過程における、Ｔｅｔ１／Ｐｒｄｍ１４ダブルノックダウンマウスＥＳ細胞のＧａｔａ６  ｍＲＮＡ発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。
【図５３】ナイーブ段階からプライム段階への移行過程における、Ｄｎｍｔ３ａ１過剰発現マウスＥＳ細胞（３ａ１ＯＥ）、Ｄｎｍｔ３ａ２過剰発現マウスＥＳ細胞（３ａ２ＯＥ）及びＤｎｍｔ３ｂ過剰発現マウスＥＳ細胞（３ｂＯＥ）のＯｔｘ２  ｍＲＮＡ発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。「ＧＦＰＫＤ  ｐＣＡＧ−ＩＨ」は、モックベクター（ｐＣＡＧ−ＩＨ）及びＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡを導入して樹立した細胞株（コントロール）の結果を示し、「ＧＦＰＫＤ  ３ａ１ＯＥ」は、ＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡとＤｎｍｔ３ａ１をコードするｐＣＡＧ−ＩＨベクターとを導入して樹立した各細胞株における結果を示し、「ＧＦＰＫＤ  ３ａ２ＯＥ」は、ＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡとＤｎｍｔ３ａ２をコードするｐＣＡＧ−ＩＨベクターとを導入して樹立した各細胞株における結果を示し、「ＧＦＰＫＤ  ３ｂＯＥ」は、ＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡとＤｎｍｔ３ｂをコードするｐＣＡＧ−ＩＨベクターとを導入して樹立した各細胞株における結果を示す。また、「Ｔｅｔ１ＫＤ  ｐＣＡＧ−ＩＨ」は、モックベクター及びＴｅｔ１を標的とするｓｈＲＮＡを導入して樹立した細胞株（コントロール）の結果を示し、「Ｔｅｔ１ＫＤ  ３ａ１ＯＥ」は、Ｔｅｔ１を標的とするｓｈＲＮＡとＤｎｍｔ３ａ１をコードするｐＣＡＧ−ＩＨベクターとを導入して樹立した各細胞株における結果を示し、「Ｔｅｔ１ＫＤ  ３ａ２ＯＥ」は、Ｔｅｔ１を標的とするｓｈＲＮＡとＤｎｍｔ３ａ２をコードするｐＣＡＧ−ＩＨベクターとを導入して樹立した各細胞株における結果を示し、「Ｔｅｔ１ＫＤ  ３ｂＯＥ」は、Ｔｅｔ１を標的とするｓｈＲＮＡとＤｎｍｔ３ｂをコードするｐＣＡＧ−ＩＨベクターとを導入して樹立した各細胞株における結果を示す（図中の細胞株表記については、図５４においても同様）
【図５４】ナイーブ段階からプライム段階への移行過程における、Ｄｎｍｔ３ａ１過剰発現マウスＥＳ細胞（３ａ１ＯＥ）、Ｄｎｍｔ３ａ２過剰発現マウスＥＳ細胞（３ａ２ＯＥ）及びＤｎｍｔ３ｂ過剰発現マウスＥＳ細胞（３ｂＯＥ）のＧａｔａ６  ｍＲＮＡ発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
＜本発明の分化多能性幹細胞の製造方法＞
本発明は、分化多能性幹細胞の製造方法であって、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの分子を、分化多能性幹細胞又は該細胞に誘導するための体細胞に導入する工程を含む方法を提供するものである
（ａ）ＴＥＴ１タンパク質
（ｂ）ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸
（ｃ）ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクター。
【００２９】
そして、該製造方法によれば、分化能を向上させた分化多能性幹細胞を製造することができる。また、前記製造方法によれば、ＴＥＴ１タンパク質等を前記体細胞に導入することにより、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を効率良く製造することもできる。さらに、前記製造方法によれば、腫瘍形成能が抑制された、安全性の高い分化多能性幹細胞を製造することも可能となる。
【００３０】
本発明において、「分化多能性幹細胞」とは、自己とは異なる複数系統の種類の細胞に変化することができる能力（分化多能性）と、細胞分裂を経ても自己と同じ能力を有する細胞を娘細胞として創出できる能力（自己複製能）とを備えている細胞を意味する。
【００３１】
本発明において、「分化能」とは、自己とは異なる種類の細胞に変化することができる能力を意味する。また「分化能の向上」とは、異なる種類の細胞への分化を誘導する因子（例えば、神経細胞への誘導におけるＳＯＸ２）や異なる種類の細胞の分化マーカー（例えば、神経細胞における、ＳＯＸ１、ＮＥＵＲＯＧＥＮＩＮ１、ＮＥＵＲＯＧＥＮＩＮ２、ＮＥＵＲＯＤ１、ＡＳＣＬ１、ＰＡＸ６、ＺＮＦ５２１及びＯＴＸ２）の発現亢進といった単なる分化誘導の促進のみならず、分化誘導に偏りをもたらす因子（例えば、外胚葉系への分化誘導時におけるＴ及びＳＯＸ１７）の減衰（分化偏向性の解消）や、ＮＡＮＯＧ等の分化誘導を阻害する因子の減衰（分化抵抗性の解消）も含む意である。後述の実施例において示す通り、分化多能性幹細胞においては通常、分化偏向性や分化抵抗性によって、その分化多能性が抑制されている。これに対し、本発明によれば、かかる分化偏向性及び分化抵抗性を解消することにより、当該細胞の分化多能性を確実に発揮させることができる。したがって、本発明における「分化能の向上」には分化多能性の改善も含まれる。
【００３２】
本発明によって分化能が向上される「分化多能性幹細胞」としては、例えば、ＥＳ細胞、エピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、多能性生殖細胞（ｍＧＳ細胞）、ＭＵＳＥ細胞（Ｋｕｒｏｄａ  Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０１０年、１０７巻、１９号、８６３９〜８６４３ページ  参照）等の生体から採取され得る細胞が挙げられる。さらに、当該細胞にはｉＰＳ細胞等のように、生体から採取された体細胞から人工的に分化多能性等を持たせるよう誘導された細胞も含まれる。
【００３３】
また、これら細胞の由来となる生体については特に制限はなく、ヒト及び非ヒト動物（マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリ等）の体が挙げられる。
【００３４】
また、分化多能性幹細胞は、発生段階において受精卵に近い初期状態（胚盤胞）の性質を反映しているナイーブ型の分化多能性幹細胞と、胚盤胞より発生の段階が進んでいるエピブラストの性質を反映しているプライム型の分化多能性幹細胞とに分けることができ、前者より後者の方が分化能の点において劣っていることが明らかになっている。したがって、本発明の製造方法は、プライム型の分化多能性幹細胞に対してより有効であり、かかるプライム型の性質を有する分化多能性幹細胞としては、例えば、ヒト、サル、ブタ、ヒツジ、イヌ又はウシに由来するＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞、並びにヒト及び前記非ヒト動物細胞に由来するエピブラスト幹細胞が挙げられる。
【００３５】
本発明の製造方法において、このような分化多能性幹細胞又は後述の分化多能性幹細胞に誘導するための体細胞に導入される、「ＴＥＴ１タンパク質」としては、変異型ＴＥＴ１タンパク質が好ましい。
【００３６】
本発明において「変異型ＴＥＴ１タンパク質」は、分化多能性幹細胞に導入されることにより、該細胞の分化能を向上させる機能を有する限り、後述の正常型ＴＥＴ１タンパク質に人工的に変異が導入されているタンパク質であってもよく、自然界において（すなわち、非人工的に）後述の正常型ＴＥＴ１タンパク質に変異が生じたタンパク質であってもよい。分化能を向上させる機能を有しているか否かは、後述の通り、例えば、ＴＥＴ１タンパク質等を分化多能性幹細胞等に導入し、当該細胞から異なる細胞への分化誘導過程において、異なる種類の細胞への分化を誘導する因子、分化マーカー、分化誘導に偏りをもたらす因子、分化誘導を阻害する因子の発現量を測定することによって判断することができる。
【００３７】
変異型ＴＥＴ１タンパク質としては、プライム型の分化多能性幹細胞において、正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上しているタンパク質であることが好ましい。タンパク質が正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上しているか否かは、後述の実施例において示すように、当業者であればウェスタンブロット等の公知のタンパク質の検出法を用いて評価することができる。
【００３８】
「正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上している変異型タンパク質」の好適な例としては、そのアミノ末端から２番目のアミノ酸残基が正常型ＴＥＴ１タンパク質のアミノ末端から２番目のアミノ酸残基とは異なるＴＥＴ１タンパク質が挙げられる。
【００３９】
Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から２番目のアミノ酸残基とは異なるＴＥＴ１タンパク質は、以下のように、正常型ＴＥＴ１タンパク質において、人工的に変異を導入することにより得ることができる。また、同様な変異が自然界において生じた変異タンパク質として得ることもできる。
【００４０】
ＴＥＴ１タンパク質のアミノ酸置換体に関しては、例えば、正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から２番目のアミノ酸残基（ヒト由来のＴＥＴ１タンパク質であればセリン残基）を異なるアミノ酸（例えば、グリシン残基）に置換したＴＥＴ１タンパク質が挙げられる。正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から２番目のアミノ酸残基を置換する方法としては特に制限はないが、例えば、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．＆Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９８７，１５４，３５０．）が挙げられる。
【００４１】
ＴＥＴ１タンパク質のアミノ酸挿入体及びアミノ酸付加体に関しては、正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から１番目と２番目とのアミノ酸残基間に１又は複数のアミノ酸が挿入されているＴＥＴ１タンパク質や、正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端に直接１又は複数のアミノ酸が付加されているＴＥＴ１タンパク質が挙げられる。かかる場合において、複数のアミノ酸としては特に制限はなく、例えば、２〜１００個のアミノ酸（好ましくは、２〜５０個のアミノ酸、２〜１０個のアミノ酸）が挙げられる。かかるアミノ酸の挿入、付加を行う方法としては特に制限はなく、例えば、後述の実施例において示すように、挿入又は付加するアミノ酸又はポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含むプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。
【００４２】
ＴＥＴ１タンパク質のアミノ酸欠失体に関しては、正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分において、１又は複数のアミノ酸が欠失しているＴＥＴ１タンパク質が挙げられる。かかる場合において、前記ＤＮＡ結合ドメインを損なうことなく、ＴＥＴ１タンパク質の機能が維持されるという観点から、正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から１〜５８４番目の領域において１又は複数のアミノ酸が欠失していることが好ましい。また、ＴＥＴ１タンパク質のアミノ酸欠失体における複数のアミノ酸としては特に制限はなく、例えば、２〜１００個のアミノ酸（好ましくは、２〜５０個のアミノ酸、２〜１０個のアミノ酸）が挙げられる。かかるアミノ酸の欠失を行う方法としては特に制限はなく、例えば、かかる欠失領域のＴＥＴ１タンパク質をコードするＤＮＡをＰＣＲによって増幅する方法が挙げられる。
【００４３】
また、後述の実施例９において示す通り、ＴＥＴ１タンパク質において、脱メチル化酵素活性は必要ではなく、ＤＮＡ結合能が維持されていれば、分化多能性幹細胞の分化能を向上させることができる。そのため、変異型ＴＥＴ１タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン（ＣＸＸＣドメイン）よりカルボキシル末端側（Ｃ末端側）の領域が欠失しているものであってもよく、例えば、ジオキシゲナーゼ領域が欠失している変異型ＴＥＴ１タンパク質、システインリッチ領域及びジオキシゲナーゼ領域が欠失している変異型ＴＥＴ１タンパク質が挙げられる。
【００４４】
本発明において、ＴＥＴ１タンパク質のＤＮＡ結合ドメインとしては、例えば、ヒトＴＥＴ１タンパク質（配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）においては、５８５番目のリシンから６１３番目のリシンまでのアミノ酸配列からなるドメインである。ジオキシゲナーゼ領域としては、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列においては、１６１１〜２０７４番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列においては、１６４０〜２１０３番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号：６に記載のアミノ酸配列においては、８０９〜１２７２番目のアミノ酸からなる領域である。また、システインリッチ領域としては、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列においては、１４１８〜１６１０番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列においては、１４１８〜１６０８番目のアミノ酸及び１６３８〜１６３９番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号：６に記載のアミノ酸配列においては、６５７〜７７７番目のアミノ酸及び８０７〜８０８番目のアミノ酸からなる領域である。
【００４５】
以上、本発明の変異型タンパク質の好適な例について説明したが、分化多能性幹細胞に導入されることにより、該細胞の分化能を向上させる機能を有する限り、正常型ＴＥＴ１タンパク質に他の変異が導入されているＴＥＴ１タンパク質であってもよい。例えば、ＴＥＴ１タンパク質とＴＥＴ２タンパク質又はＴＥＴ３タンパク質とにおいて、酵素活性部位（ジオキシゲナーゼ領域）はその酵素活性の点において同等であるという観点から、ＴＥＴ１タンパク質のジオキシゲナーゼ領域の代わりに、ＴＥＴ２タンパク質又はＴＥＴ３タンパク質のジオキシゲナーゼ領域が導入されているタンパク質、ＴＥＴ１タンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質とＴＥＴ２タンパク質又はＴＥＴ３タンパク質のジオキシゲナーゼ領域とが間接的又は直接的に結合してなるタンパク質が挙げられる。
【００４６】
本発明の製造方法において、分化多能性幹細胞等に導入されるＴＥＴ１タンパク質として、正常型ＴＥＴ１タンパク質を利用することも考えられる。「正常型ＴＥＴ１タンパク質」とは、典型的には、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は該タンパク質の天然のホモログであり、かつプライム型の分化多能性幹細胞において分解されるタンパク質を意味する。正常型ＴＥＴ１タンパク質を利用する場合には、分化多能性幹細胞等におけるタンパク質分解能を越える程の過剰な量を当該細胞に導入することが好ましい。また、分化多能性幹細胞等においてこれらタンパク質の分解を抑制するという観点から、ＴＥＴ１タンパク質のデコイをさらにに導入してもよい。デコイとしては、例えば、正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端部分のポリペプチドが挙げられる。
【００４７】
後述の実施例において示す通り、分化多能性幹細胞の分化能を向上させるためには、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの機能が維持されていることが必要である。したがって、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の天然のホモログとしては、当該タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＣＸＸＣモチーフ）のアミノ酸配列において７０％以上（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の相同性を有する天然のタンパク質が好ましい。かかる天然のタンパク質としては、ＸＰ＿００３３５９２７０、ＸＰ＿００４７７７９０１、ＸＰ＿００５６０２６３５、ＸＰ＿００２８０５７５６、ＸＰ＿００３９２８８２８、ＸＰ＿００２７３５０４４、ＸＰ＿００５１６８６７３、ＣＧ４３４４４等のアクセッション番号にて特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００４８】
本発明における「アミノ酸配列の相同性」は、比較するアミノ酸配列間において、完全に一致したアミノ酸、及び、塩基性・酸性等の物理化学的性質の点で一致したアミノ酸（類似アミノ酸）の割合（％）を意味し、ＢＬＡＳＴＰのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，１９９０）等を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４−２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７，１９９３）に基づいている。より具体的には、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴホモロジー検索ページ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において、「タンパク質ｂｌａｓｔ」又は「ｂｌａｓｔｘ」等のプログラムを、これらのデフォルトパラメーターを用いて解析することによって、相同性を決定することができる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【００４９】
なお、本発明の変異型ＴＥＴ１タンパク質が、プライム型の分化多能性幹細胞において分解されるタンパク質である場合においても、正常型ＴＥＴ１タンパク質同様に、過剰な量を導入することによって、又は、デコイをさらに導入することによって、本発明の製造方法に利用することができる。
【００５０】
変異型ＴＥＴ１タンパク質の調製方法に関し、上述においては、正常型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸を改変する方法を挙げた。そして、当業者であれば、例えば、前記変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸を、バキュロウィルスを介して、Ｓｆ９細胞等の昆虫細胞に導入することにより、本発明の変異型ＴＥＴ１タンパク質を調製することができる。また、かかる遺伝子レベルでの改変以外に、本発明の変異型ＴＥＴ１タンパク質は、そのアミノ酸配列に基づき、市販のポリペプチド合成機によって化学的に合成することもできる。
【００５１】
また、正常型ＴＥＴ１タンパク質の調製方法に関しては、当業者であれば、ＴＥＴ１タンパク質を発現しているヒト又はヒト以外の動物の組織等から調製したｃＤＮＡのライブラリー又はゲノムＤＮＡのライブラリーから、公知のハイブリダイゼーション技術を利用して、正常型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸を単離し、そして、前述の変異型ＴＥＴ１タンパク質の調製と同様にして、単離した核酸を昆虫細胞に導入等することにより、調製することができる。また、配列番号：２に記載のアミノ酸配列等の情報に基づき、市販のポリペプチド合成機によって化学的に合成することによって、正常型ＴＥＴ１タンパク質を調製することもできる。
【００５２】
前記ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸を、分化多能性幹細胞又は後述の分化多能性幹細胞に誘導するための体細胞に導入する方法としては特に制限はなく、例えば、ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）を、各細胞にて機能するプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを感染、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法にて細胞に導入することができる。
【００５３】
このような発現ベクターとしては、例えば、レンチウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルペスウィルス、センダイウィルス等のウィルスベクター、エピソーマルベクター、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクター等の動物細胞発現プラスミドが挙げられる。これらの中では、ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸が導入された細胞のゲノムに挿入されないという観点から、エピソーマルベクター又はセンダイウィルスを用いることが好ましい。また、前記核酸が前記ゲノムに一旦は挿入されるものの、トランスポナーゼによって当該核酸を当該ゲノムより除去できるという観点から、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを用いることが好ましい。
【００５４】
かかる発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばＣＡＧプロモータ−、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等が挙げられる。また、かかるプロモーターは薬剤（例えば、テトラサイクリン）の有無等によって、該プロモーターの下流に挿入された遺伝子の発現を制御できるものであってもよい。発現ベクターは、さらに、プロモーターの他に、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子（例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）、ＳＶ４０複製起点等を含有していてもよい。
【００５５】
また、上述の方法にて分化多能性幹細胞等に導入された核酸がコードするＴＥＴ１タンパク質の発現としては、一過性の発現であってもよく、誘導的な発現であってもよく、恒常的な発現であってもよいが、分化誘導の抑制因子であるＮＡＮＯＧ等の発現を消失させ、また本発明の方法によって製造された分化多能性幹細胞から他の細胞に分化している過程において、ＴＥＴ１タンパク質による所謂初期化のシグナルが残存していると、当該分化の妨げとなるという観点から、一過性又は誘導的な発現であることが好ましい。かかる発現の期間としては、本発明の方法によって製造された分化多能性幹細胞を他の細胞への分化誘導開始の１日前から当該分化誘導を開始してから４日以内の期間であることが好ましい。
【００５６】
ＴＥＴ１タンパク質を各細胞に導入する場合においては、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）を当該改変タンパク質に付加した融合タンパク質を用いる方法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法が挙げられる。
【００５７】
また、ＴＥＴ１タンパク質、該タンパク質をコードする核酸又は該核酸が挿入されているベクターを細胞に導入する際、またはその後の培養条件としては特に制限はなく、当業者であれば核酸等を導入する細胞に合わせ、培地の組成、培養温度、培養湿度、二酸化炭素及び酸素等の濃度を適宜設定することができる。また、ＴＥＴ１タンパク質によるヒドロキシル化反応を効率良く行うという観点から、鉄、α−ケトグルタル酸塩又はアスコルビン酸（ビタミンＣ）が培地に含まれていてもよい。
【００５８】
本発明の製造方法において、ＴＥＴ１タンパク質等が導入される「分化多能性幹細胞に誘導するための体細胞」としては特に制限はなく、例えば、線維芽細胞、上皮細胞、血球系細胞、動物検体由来の任意の細胞が挙げられる。また、かかる体細胞から分化多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）への誘導は、通常、体細胞の細胞記憶を消去することのできる「リプログラミング因子」を体細胞に導入することにより行うことができる。
【００５９】
かかる「リプログラミング因子」としては、体細胞に導入されることにより、単独で、又は他のリプログラミング因子と協働して該体細胞に分化多能性を付与できる因子であれば特に制限されることはないが、ＯＣＴ３／４、ｃ−ＭＹＣ、Ｌ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ＫＬＦ２、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、ＦＢＸ１５、ＥＲＡＳ、ＥＣＡＴ７、ＥＣＡＴ８、ＧＤＦ３、ＳＯＸ１５、ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、Ｆｔｈｌ１７、ＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ４、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＴＣＬ１、ＳＴＥＬＬＡ、β−カテニン、ＥＳＲＲＢ、ＰＲＤＭ１４、ＴＢＸ３、ＳＴＡＴ３、ＧＡＴＡ３及びＧＲＢ２等のタンパク質、並びにｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５（ｍｉＲ−２９０クラスター）及びｍｉＲ−３０２クラスター等のマイクロＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一種の因子であるであることが好ましい。さらにこれらの因子の中では、少ない因子で効率良くｉＰＳ細胞を樹立できるという観点から、ＯＣＴ３／４、ｃ−ＭＹＣ、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４（所謂山中４因子）を体細胞に導入することがより好ましい。また、得られる分化多能性幹細胞の癌化のリスクを抑えるという観点からは、前記４因子においてｃ−ＭＹＣの代わりにＬ−ＭＹＣを体細胞に導入すること又は、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４（３因子）を体細胞に導入することが望ましい。さらに、分化多能性幹細胞の誘導効率の点から、ＯＣＴ３／４、Ｌ−ＭＹＣ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＬＩＮ２８、さらに後述のｐ５３の機能を阻害する化合物若しくは核酸又はｐ２１の機能を阻害する化合物若しくは核酸を体細胞に導入することが望ましい。また、「リプログラミング因子」としては、前述のタンパク質等ではなくともよく、これらの機能を代替する、またはこれらの発現を誘導する低分子化合物であってもよい。かかる低分子化合物としては、例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）等のヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＣＨＩＲ９９０２１等のＧＳＫ−３β阻害剤、６１６４５２等のＴＧＦ−β１型受容体阻害剤、トラニルシプロミン（Ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ）等のヒストン脱メチル化酵素阻害剤、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）等のｃＡＭＰ産生促進剤、３−デアザネプラノシ（ＤＺＮｅｐ）等のヒストンメチル化酵素阻害剤、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６０】
本発明において、リプログラミング因子を体細胞に導入する方法としては特に制限はなく、前記ＴＥＴ１タンパク質等と同様に、公知の手法を適宜選択し、タンパク質であればタンパク質の形態又は該タンパク質をコードする核酸の形態にて体細胞に導入することができ、またマイクロＲＮＡであれば核酸の形態にて体細胞に導入することができるが、リプログラミング因子が作製した分化多能性幹細胞において残存してしまうと、当該細胞は他の細胞への分化誘導に対して抵抗性を示し、新たな細胞記憶の定着が困難となるという観点から、リプログラミング因子をコードする核酸をエピソーマルベクター、センダイウィルス、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを用いて体細胞に導入する方法が好ましい。
【００６１】
かかるリプログラミング因子の導入は、ＴＥＴ１タンパク質又は該タンパク質をコードする核酸の導入前であってもよく、導入と同時であってもよく、導入後であってもよい。
【００６２】
また、リプログラミング因子を導入してからの体細胞の培養方法としては特に制限はなく、当業者であれば公知の培養方法を適宜選択して利用することができる。かかる公知の培養方法としては、例えば、フィーダー細胞上にて、当初は体細胞の培養に適した培地にて培養し、徐々に分化多能性幹細胞に適した培地に交換していく培養方法が挙げられる。
【００６３】
「フィーダー細胞」としては、分化多能性幹細胞の増殖や維持に用いることができる細胞であればよく、例えば、ＭＥＦ（マウス胎児線維芽細胞）、ＯＰ−９細胞、ＰＡ６細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｍ１５細胞、１０Ｔ／２細胞、ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞が挙げられる。また、これらの細胞においては抗生物質処理（マイトマイシンＣ等による処理）、放射線処理等により、細胞増殖が抑制されていることが望ましい。
【００６４】
「体細胞の培養に適した培地」としては、当業者であれば公知の情報に基づき、体細胞の種類に合わせて適宜調製することができる。例えば、基礎培地としては、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地、最小必須培地（α−ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２培地が挙げられ、この基礎培地に、ヒト血清、サイトカイン、培養に必要なアミノ酸（例えば、Ｌ−グルタミン）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ピューロマイシン）を適宜添加することにより、「体細胞の培養に適した培地」を調製することができる。
【００６５】
「分化多能性幹細胞に適した培地」としては、由来とする動物の種類に合わせて、公知の培地から適宜選択して用いればよく、例えば、ヒト由来の分化多能性幹細胞の培養に適した培地としては、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノール、ＦＧＦ２等を含有する、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地が挙げられる。
【００６６】
以上のような、フィーダー細胞との共培養による分化多能性幹細胞への誘導並びにその後の維持培養法は、未分化状態を維持し易いという観点からは好適である。しかしながら、分化多能性幹細胞を神経系等の外胚葉系に分化誘導する効率を高めるという観点から、さらに分化誘導を行う上で必要な細胞密度の制御をし易くするという観点から、フィーダー細胞を用いない分散培養法が、本発明にかかる分化多能性幹細胞においては好適である。かかるフィーダー細胞を用いない分散培養は、例えば、以下に示す方法にて行うことができる。
【００６７】
先ず、リプログラミング因子を導入した体細胞は、ＴｈｏｍｓｏｎらによるＥ８培地（Ｃｈｅｎ，Ｇ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１１年、８巻、５号、４２４〜４２９ページ）にて培養する。そして、この培養においてコロニーの形成が認められた段階で、ＫＳＲ、ＦＧＦ２、アクチビンＡ、ＲＯＣＫ阻害剤及びフィブロネクチンを含む培地に当該コロニーの分化多能性幹細胞を分散させた後、コラーゲンタイプＩコート培養皿に播種し直すことにより、フィーダー細胞を用いない分散培養を行うことができる。
【００６８】
かかる分散培養に用いられる培地において、ＫＳＲ、ＦＧＦ２及びアクチビンＡ等が添加される基礎培地としては、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＣＤＭ培地が挙げられる。また、かかる基礎培地に添加するＫＳＲ、ＦＧＦ２及びアクチビンＡの濃度として、各々、好ましくは１５〜２５％、４〜１００ｎｇ／ｍｌ及び０．０１〜２０ｎｇ／ｍｌであり、特に好ましくは２０％、１５ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌである。また、これらＫＳＲ等以外に、他の成分、例えば、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ピューロマイシン）を適宜添加してもよい。
【００６９】
また、分化多能性幹細胞への誘導効率をより高めるために、フィーダー細胞を用いる、用いないに関わらず、上述の培養方法においては、ＨＤＡＣの機能を阻害する化合物（ＶＰＡ、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤等）、Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼの機能を阻害する化合物（ＢＩＸ−０１２９４等の低分子阻害剤等）、ｐ５３の機能を阻害する化合物（Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−α（ＰＦＴ−α）等の低分子阻害剤等）を、ｐ２１の機能を阻害する化合物を、ｌｅｔ−７クラスター、ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−１０６ａ−３６３又はｍｉＲ−１０６ｂ−２５といったマイクロＲＮＡの機能を阻害する化合物を、体細胞にリプログラミング因子を導入する際、又はその後において、培地に添加しておくことが好ましい。また、各因子の機能を阻害することにより、分化多能性幹細胞への誘導効率をより高めるという前記同様の観点から、ＨＤＡＣ、Ｇ９ａ、ｐ５３、ｐ２１又はｌｅｔ−７クラスター等のマイクロＲＮＡの機能を阻害する核酸（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、アプタマー等）を公知の遺伝子導入手法により、前記体細胞に導入してもよい。
【００７０】
さらに、上述の培養方法において、その他の培養条件（培養温度、酸素及び二酸化炭素の濃度等）について、当業者であれば適宜設定することができるが、分化多能性幹細胞への誘導効率を向上させるという観点から、低酸素（酸素濃度：５％）条件下での培養が好ましい。
【００７１】
以上、本発明の分化多能性幹細胞の製造方法について説明したが、かかる製法によって作製された分化多能性幹細胞が、ＴＥＴ１タンパク質が導入されていない分化多能性幹細胞と比較して、その分化能が向上しているか否かは、後述の実施例７に記載の通り、所望の細胞への分化誘導の効率（例えば、分化誘導後の所望の細胞数／分化誘導前の分化多能性幹細胞）を指標として判断することができる。また、例えば、後述の実施例５及び６に記載の通り、所望の細胞への分化誘導過程における、分化マーカー（例えば、神経細胞における、ＳＯＸ１、ＮＥＵＲＯＧＥＮＩＮ１、ＮＥＵＲＯＧＥＮＩＮ２、ＮＥＵＲＯＤ１、ＡＳＣＬ１、ＰＡＸ６、ＺＮＦ５２１及びＯＴＸ２）、異なる種類の細胞への分化を誘導する因子（例えば、神経細胞への誘導におけるＳＯＸ２）、分化誘導に偏りをもたらす因子（例えば、外胚葉系への分化誘導時におけるＴ及びＳＯＸ１７）、分化誘導を阻害する因子（例えば、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ３／４）の発現量を測定し、得られた発現量を、前記分化能の向上の可否の１指標として用いることができる。さらに、後述の実施例１１において示す通り、ＴＥＴ１タンパク質が導入されていない従前のヒトｉＰＳ細胞において、ＦＯＸＡ２、ＬＨＸ１、ＬＩＭ２、ＳＯＸ１７、ＥＯＭＥＳ及びＴ等の分化マーカー、並びにＧＰＣ４、ＧＡＧＥ２Ｂ及びＧＡＧＥ７等の未分化マーカーも高発現している。したがって、これらマーカーの発現量も、前記分化能の向上の可否の１指標として用いることができる。
【００７２】
なお、これらマーカーの内、ＧＰＣ４、ＧＡＧＥ２Ｂ及びＧＡＧＥ７は癌関連マーカーとしても知られているため、本発明は、ＧＰＣ４、ＧＡＧＥ２Ｂ及びＧＡＧＥ７から選択される少なくとも１の癌関連マーカーの発現を指標として、分化多能性幹細胞の安全性（腫瘍形成能の有無）を評価する方法をも提供することができる。
【００７３】
＜本発明のタンパク質、核酸、ベクター及び細胞＞
上述の通り、本発明の分化多能性幹細胞の製造方法においては、プライム型の分化多能性幹細胞において分解されないＴＥＴ１タンパク質が有用である。したがって、本発明は、変異型ＴＥＴ１タンパク質であって、正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上しているタンパク質を提供するものであり、好ましくは変異型ＴＥＴ１タンパク質であって、そのアミノ末端から２番目のアミノ酸残基が正常型ＴＥＴ１タンパク質のアミノ末端から２番目のアミノ酸残基とは異なるＴＥＴ１タンパク質も提供するものである。
【００７４】
また、配列番号：４又は６に記載のアミノ酸配列からなるＴＥＴ１タンパク質は、本発明者らによって初めて見出されたＴＥＴ１タンパク質であり、正常型ＴＥＴ１タンパク質として本発明の製造方法において利用する上でも、また前述の変異型ＴＥＴ１タンパク質の調製においても有用である。然るに、本発明はこれらＴＥＴ１タンパク質も提供するものである。
【００７５】
さらに、前述の通り、変異型ＴＥＴ１タンパク質であって、正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上しているＴＥＴ１タンパク質を分化多能性幹細胞において発現させるために、当該タンパク質をコードする核酸は有用である。また、当該変異型ＴＥＴ１タンパク質及び該タンパク質をコードする核酸を調製する点においても、さらには正常型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸として本発明の製造方法において利用する上でも、配列番号：４又は６に記載のアミノ酸配列からなるＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸は有用である。したがって、本発明はこれら核酸も提供するものである。
【００７６】
また、前述の通り、核酸を体細胞等に導入する上で、当該核酸はベクターに挿入されていることが好ましい。したがって、本発明は、正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上している変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸又は配列番号：４又は６に記載のアミノ酸配列からなるＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクターも提供するものである。
【００７７】
さらに、本発明の製造方法によれば、前述の通り、分化能が向上している分化多能性幹細胞を得ることができる。したがって、本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの分子が導入されている、分化多能性幹細胞又は該細胞に誘導するための体細胞も提供するものである
（ａ）ＴＥＴ１タンパク質
（ｂ）ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸
（ｃ）ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクター。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本実施例において用いた実験方法は以下の通りである。【００７９】
＜エピゾーマルＤＮＡベクターを用いたヒトｉＰＳ細胞の作製＞
本実施例において用いたヒトｉＰＳ細胞は、「Ｏｋｉｔａ，Ｋ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１１年、８巻、５号、４０９〜４１２ページ」に記載の方法に沿って作製した。すなわち、ｐ５３に対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｐ５３）及びＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ３／４）、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４、Ｌ−ＭＹＣ及びＬＩＮ２８、これら３種の組み合わせにて、ｓｈＲＮＡ又は各タンパク質をコードするＤＮＡをエピソーマルベクター  ｐＣＸＬＥに挿入し、３種類のベクターＤＮＡを調製した。【００８０】
なお、かかるｉＰＳ細胞の作製過程において、通常、体細胞の細胞記憶を消去する「リプログラミング」には、所謂  山中４因子（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ−Ｍｙｃ）を強制的に体細胞に発現させることによって行われる。本実施例においては、これらリプログラミング因子において、ｉＰＳ細胞の腫瘍化を抑制するという観点から、ｃ−ＭＹＣの代わりに腫瘍原性の低いリプログラミング因子であるＬ−ＭＹＣを利用した。また、これら因子の他、ヒトｉＰＳ細胞の誘導効率を向上させる因子として知られているＬＩＮ２８も体細胞に導入した。さらに、ｐ５３はリプログラミングに対して抑制的に働くため、ｓｈｐ５３によるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を体細胞内において生じさせ、ｐ５３の発現を抑制することにより、ヒトｉＰＳ細胞の誘導効率を向上させた。【００８１】
また、かかるｉＰＳ細胞の作製過程において、リプログラミング因子の発現が作製したｉＰＳ細胞において残存してしまうと、当該ｉＰＳ細胞は神経細胞等の他の細胞への分化誘導に対して抵抗性（分化抵抗性）を示し、新たな細胞記憶の定着が困難となることが懸念される。そのため、本実施例においては、リプログラミング因子が細胞のゲノムＤＮＡに挿入され、ｉＰＳ細胞への誘導終了後もリプログラミング因子が発現し続けることにない、エピソーマルベクターを用いた遺伝子導入法を本実施例において選択した。【００８２】
次に、前記３種のベクターＤＮＡ各１μｇずつを、遺伝子導入試薬（ヒト皮膚線維芽細胞用ヌクレオフェクターキット）及び遺伝子導入装置（ヌクレオフェクター：登録商標）（共にＬｏｎｚａ社製）を用いて、１．０ｘ１０５個のヒト新生児由来線維芽細胞細胞に導入した。次いで、フィーダー細胞を用いずにｉＰＳ細胞への誘導が可能であることが示されているＴｈｏｍｓｏｎらによるＥ８培地（Ｃｈｅｎ，Ｇ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１１年、８巻、５号、４２４〜４２９ページ）にて、前記ベクターＤＮＡ導入後の細胞を培養した。この際、前記ベクターＤＮＡを導入してから５〜１０日は、線維芽細胞の増殖促進のためヒドロコルチゾンを１００ｎＭの濃度で添加し、以降はヒドロコルチゾンを加えず、さらにＴＧＦβも除いたＥ８培地にてｉＰＳ細胞への誘導を行った。また、培地交換は１〜２日に一回行い、さらに、この誘導には低酸素培養装置を用い、酸素濃度５％、二酸化炭素濃度５％にて細胞の培養を行った。【００８３】
そして、かかる培養により、前記ベクターＤＮＡを導入してから２５〜３０日程度に、複数のｉＰＳ細胞のコロニーの出現が確認された。次いで、後述の通り、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、アクチビンＡ、ＲＯＣＫ阻害剤及びフィブロネクチン等を添加した培地を用いて、コラーゲンタイプＩコート培養皿に個別に播種、培養することにより、ｉＰＳ細胞株を取得した。具体的には、ＹＭｈｉＰＳＣ０５８、ＹＭｈｉＰＳＣ１０５及びＹＭｈｉＰＳＣ２３７等と各々名を付けた、安定して培養することができるヒトｉＰＳ細胞株が取得できた。【００８４】
さらに、これら細胞株よりサブクローンを取得し、それらの分化能を指標に評価を加えたところ、図には示さないが、これらｉＰＳサブクローンはそれぞれ性質が異なることが見出され、前述のような方法にて樹立されたｉＰＳ細胞株は、少なくとも分化能の点において「均質性」を維持できていないことが明らかになった。本実施例においては、取得した細胞株の内、現時点で最も分化能に偏りがないと判断したＹＭｈｉＰＳＣ０５８ｓｂｃ６亜株について解析した結果を提示する。【００８５】
＜フィーダー細胞を用いない、ヒトｉＰＳ細胞の分散培養方法＞
本実施例において、ヒトｉＰＳ細胞の培養は、２０％ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１５ｎｇ／ｍｌ  ヒトＦＧＦ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、１０ｎｇ／ｍｌ  アクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、１ｎｇ／ｍｌ  ヘパリン硫酸（ＳＩＧＭＡ社製）、０．０３％  Ｌ−グルタミン（ＭＰ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）、１ｘ  非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１ｘペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及び１ｘストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（コージンバイオ社製）（以下、この組成の培地を「ＫＦＡ培地」とも称する）を用い、フィーダー細胞を用いずに行った。【００８６】
また、継代時には、０．０１％  トリプシン／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡにて、ヒトｉＰＳ細胞を単一細胞にまで解離させ、２μＭ  ＲＯＣＫ阻害剤（チアゾゾビン、ＷＡＫＯ社製）及び５μｇ／ｍｌ  ヒトフィブロネクチン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を更に添加したＫＦＡ培地に分散させた後、コラーゲンタイプＩコート培養皿に播種した。【００８７】
なお、かかるヒトｉＰＳ細胞の非フィーダー細胞・分散培養系は、本発明者らによって今回初めて確立されたものである。すなわち、本発明者らは、本実施例に先立ち、先ず、かかる非フィーダー細胞・分散培養系におけるヒトｉＰＳ細胞の適正条件の検討を行った。かかる検討を行った理由は、現在もっとも広く用いられているヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞の培養方法であるマウスフィーダー細胞を用いた培養法では、未分化な状態を維持するのは比較的容易である。しかしながら、その後の分化、特に神経外胚葉系への分化が抑制されることを本発明者らは独自に見出していたからである。また現在難しいとされる継代時の分散操作は、正確に分化誘導を行う上で必要な細胞密度の制御に欠かせない手技となるからである。【００８８】
そして、ヒト皮膚線維芽細胞にレトロウイルスにてリプログラミング因子（ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣ）を強制発現して作製したヒトｉＰＳ細胞株（ｒｖｈｉＰＳＣ０８）を用い、以下の２項目について主に検討した
（１）  培養液に加える増殖因子の種類とその濃度、
（２）  トリプシンを用いて継代する際に用いたシグナル阻害剤や細胞外基質の組み合わせ。【００８９】
それまでの標準的なヒト分化多能性幹細胞（ＰＳＣ）の培養方法としては、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）上に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＫＳＲを主な添加物とした基礎培地にヒトＦＧＦ２を４〜５ｎｇ／ｍｌ添加したもので培養することが多かった。この際、様々な文献や独自の研究成果（未発表データ）より鑑みて、ＭＥＦの果たす役割として、まずは細胞外基質を提供し、ＰＳＣの定着を促進すると共に、一部、生体内におけるＦＧＦ２及びＮＯＤＡＬの活性を補填していることが考えられた。そこで本発明者らは、培養液に加える添加物をＫＳＲに加えて、ＦＧＦ２と、ＮＯＤＡＬ様活性を持つアクチビンＡとに絞って検討した。その際、ヒトｉＰＳ細胞の未分化状態を示すＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２やＮＡＮＯＧの発現量に加え、分化細胞にて認められる中内胚葉系の遺伝子マーカーであるＴ（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ）や、神経外胚葉のマーカーであるＳＯＸ１等を指標にＦＧＦ２とアクチビンＡとの濃度を検定した。その結果、かかる培養系ではＦＧＦ２は終濃度１５ｎｇ／ｍｌ、アクチビンＡは終濃度１０ｎｇ／ｍｌ辺りがもっとも安定して細胞が増殖することを見出し、本発明者らは、前述のＫＦＡ培地を用いて、簡便に、フィーダー細胞なしで、ヒトｉＰＳ細胞を培養することに成功した。【００９０】
次に、ヒトｉＰＳ細胞は、通常コロニーを軽く酵素処理にてはがし、物理的に数十個程度の細胞塊として継代されているところ、上述の観点から、単一細胞に分散して培養することを試みた。かかる分散倍培養に関しては、ヒトＥＳ細胞がＲＯＣＫ阻害剤を用いることで分散培養が可能となる報告が存在している（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００７年、２５巻、６号、６８１〜６８６ページ、Ｌｉｎ，Ｔ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００９年、６巻、１１号、８０５〜８０８ページ）。ただし、これら文献等において開示されている培養方法においては、培養皿をＭａｔｒｉＧｅｌ等の人工的細胞外基質でコーティングすることが要求されており、必ずしも利用勝手の良いものではなかった。そこで、別の知見にて、細胞外基質の１つであるフィブロネクチンを培養液中に添加して継代すると、ＲＯＣＫ阻害剤による分散培養が助けられるとした報告（Ｋｉｔａｊｉｍａ，Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２０１０年、３９６巻、４号、９３３〜９３８ページ）を見出した。そして、これら知見を合わせることにより、継代時にＫＦＡ＋ＲＯＣＫ阻害剤＋フィブロネクチン培地に、トリプシン分散した細胞を懸濁し、コラーゲンタイプＩコート培養皿に播種することで、良好なヒトｉＰＳ細胞の非フィーダー細胞・分散培養系が確立できた。【００９１】
＜定量的ＲＴ−ＰＣＲ法＞
ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡ抽出を行った。ゲノムＤＮＡの混入を防ぐため、ＲＮａｓｅ−フリーＤＮａｓｅセット（ＱＩＡＧＥＮ社製）にてＤＮａｓｅ処理も行った。抽出した全ＲＮＡ  １μｇを鋳型とし、オリゴｄＴプライマー（ＴＯＹＯＢＯ社製）及びＲｅｖｅｒｔｒａ  Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて逆転写（ＲＴ）反応を行い、ｃＤＮＡを調製した。このように調製したｃＤＮＡを２０倍に希釈し、ＡＢＩ機器、ファストＳＹＢＲグリーンマスターミックス（ＡＢＩ社製）及び表１に記載のプライマーを用いてｑＰＣＲを行った。また、同一サンプルに対して３つの反応を行い、その平均値を求め、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内部標準としてそれぞれ標準化した値をグラフ化した（図２、５、８〜２３  参照）。【００９２】
【表１】
2014069479.tif 000002
【００９３】
＜ウェスタンブロット法＞
ＴＥＴ１タンパク質を再現性よくウェスタンブロッティングで検出するために、まずはその抽出方法の予備検討を行った。その結果、Ｔｅｔ１分子はＤＮＡに強固に結合していることを突き止め、核を分画し、ＮＥＲ溶液（ＰＩＥＲＣＥ社製）にて溶出することにより、定量的にＴＥＴ１タンパク質を検出できるようになった。なお、ＴＥＴ１タンパク質はＤＮＡに強固に結合していることが知られており、このような特別な抽出方法が必要であったと考えられる。【００９４】
ウェスタンブロット法においては、先ず、このようにして抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分画し、さらにゲル中の分画されたタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写した。また、抗ヒトＴＥＴ１抗体（ＳＩＧＭＡ社製）及び抗ヒトβ−アクチン抗体（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ社製）を、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、３％ＢＳＡ及び１％正常ヒツジ血清を添加したＰＢＳ（−）（抗体希釈液）にて１０００倍希釈した。次いで、このようにして得られたメンブレンと前記１次抗体とを４℃で一晩反応させ、洗浄した後、当該メンブレンとＨＲＰ標識２次抗体とを室温にて１時間反応させた。そして、洗浄した後、当該メンブレン上のＨＲＰとＥＣＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）とを反応させることにより、発色させ、フィルム現像を行った。【００９５】
＜ヒトｉＰＳ細胞の神経分化誘導法＞
ヒトｉＰＳ細胞から神経細胞への分化誘導は、本発明者らが以前に見出した、マウスＥＳ細胞から効率良く神経細胞を分化誘導するプロトコール（Ｂｏｕｈｏｎ，Ｉ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ、２００５年、６８巻（１−２）、６２〜７５ページ）に改良を施して行った。具体的には以下の通りである。【００９６】
（１）  適応培養
先ず、ＫＦＡ培地にてフィーダー細胞を用いずに培養したヒトｉＰＳ細胞を、分化誘導に供する直前に一度、ＣＤＭ培地を基調とした培地にて同様に継代し、適応培養を行った。この適応培養に用いたＣＦＡ培地は、ＣＤＭ培地を基調に、４０ｎｇ／ｍｌのヒトリコンビナントＦＧＦ２及び２ｎｇ／ｍｌのヒトリコンビナントアクチビンＡを含む新規培地であり、本発明者らによって、ヒト分化多能性幹細胞を維持培養から神経細胞への分化誘導に切り替えるために開発された培地である。ＣＤＭ培地の組成については、Ｂｏｕｈｏｎ，Ｉ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ、２００５年、６８巻（１−２）、６２〜７５ページ参照のこと。また、このＣＦＡ培地での培養において、細胞は空気中に含まれる酸素による酸化ストレスに十分に耐えられないため、この適応培養は低酸素ＣＯ２インキュベーター内で行った（低酸素培養：酸素濃度５％）。【００９７】
（２）  ヒトｉＰＳ細胞から神経前駆体細胞への分化誘導
このＣＦＡ培地での培養にてコンフルエントになったヒトｉＰＳ細胞を、前記同様にトリプシン処理にて細胞を解離させ、ＣＤＭ培地に再懸濁した後に、５ｘ１０４細胞／ｍｌとなるよう、１０μＭ  Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）を添加したＣＤＭ培地に希釈し、低接着培養皿（バクテリア培養用のペトリ皿）に播種した。【００９８】
播種して４日後に、細胞同士が接着して形成した細胞塊（以下「スフェア」とも称する）を回収し、これをアキュターゼ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により、再度細胞同士を解離させた。次いで、このようにして解離した細胞を、神経誘導培地（１０μＭ  ＳＢ４３１５４２、３０ｎＭ  ＩＷＲ−１ｅｎｄｏ及び１０μＭ  Ｙ２７６３２を添加したＣＤＭ培地）に再懸濁し、前記同様にぺトリ皿に播種した。そして、その４日後、同様の懸濁操作を施し、１０μＭ  ＳＢ４３１５４２及び１０μＭ  Ｙ２７６３２を添加したＣＤＭ培地に播き込んだ。【００９９】
なお、ＳＢ４３１５４２及びＩＷＲ−１ｅｎｄｏは、マウスＥＳ細胞とヒト分化多能性幹細胞との分化多能性の差異を考慮し、ＣＤＭ培地に添加して、ヒトｉＰＳ細胞の培養を行った。すなわち、ｎａｉｖｅと評されるマウスＥＳ細胞から、原始内胚葉細胞が誘導可能であり、本発明者らの以前の報告でも、この原始内胚葉が神経誘導過程で一過性に「登場」することで、神経誘導を阻害するＴＧＦβ／ＮｏｄａｌやＷＮＴ等のシグナル伝達に拮抗する阻害因子が発現していることが明らかになっている。一方、ヒト分化多能性幹細胞には、この原始内胚葉への分化能が通常存在しないため、マウスＥＳ細胞のプロトコールをそのままヒト分化多能性幹細胞に適用しても神経への分化誘導は起こらないことが想定された。そこで、本実施例において、ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナル伝達を阻害することが知られている低分子化合物  ＳＢ４３１５４２、ＷＮＴシグナル伝達を阻害することが知られている低分子化合物であるＩＷＲ−１ｅｎｄｏをＣＤＭ培地に添加して、ヒトｉＰＳ細胞の培養を行った。【０１００】
そして、ＳＢ４３１５４２及びＹ２７６３２を添加したＣＤＭ培地における培養以降は、同様な間隔にて、１０μＭ  Ｙ２７６３２を添加したＣＤＭ培地に継代するか、次に示す神経細胞の成熟プロトコールに供した。なお、ＣＤＭ培地における継代培養において、神経細胞は成熟せず、殆どが増殖可能な神経前駆体細胞として継代される。【０１０１】
（３）  神経細胞の成熟
神経細胞は、もはや細胞分裂しない分裂終了（ｐｏｓｔ−ｍｉｔｏｔｉｃ）細胞である。前述の神経分化誘導プロトコールでは、ヒト分化多能性幹細胞から神経前駆体細胞までが誘導された。その状態から更に神経突起を持ち、機能を発揮するｐｏｓｔ−ｍｉｔｏｔｉｃな神経細胞を誘導するためには、前述のようなスフェア状態から、個々の細胞が培養皿の底面等の基質に接着して維持される必要がある（この培養皿内で人工的に神経細胞を誘導する過程を「神経細胞成熟培養」とも称する）。【０１０２】
神経細胞成熟培養において、具体的には、神経細胞が接着しやすいように、播種する培養皿を前述のぺトリ皿から、コラーゲンタイプIV（ＩＷＡＫＩ社製）にてコートしたものに変更した。そして、培養には、この培養皿の底面をさらにポリオルニチン（Ｓｉｇｍａ社製）及びリコンビナントラミニン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にて一定時間コーティングしたものを用いた。また、播種する際のスフェアからの細胞の解離は、前述のようにアキュターゼにより行った。さらに、この成熟培養は、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１、１０μＭ  ＤＡＰＴ及び１０μＭ  ｆｏｒｓｋｏｌｉｎを添加したＣＤＭ培地にて行った。そして、この培養条件にて、２日に一度の培地交換を継続することにより、約一週間で明瞭な神経突起を有する神経細胞の出現が観察された。【０１０３】
（実施例１）
＜ヒト分化多能性幹細胞における内因性ＴＥＴ１の動態＞
マウス分化多能性幹細胞は、着床前の胚盤胞の内部細胞塊に近い性質を有している。一方、ヒト分化多能性幹細胞は、着床後のエピブラスト内の原始外胚葉に最も性質が似ている。そして、この発生段階の差により、分化多能性の点において、ヒト分化多能性幹細胞はマウス分化多能性幹細胞よりも劣っていることが想定される。そこで、本発明者らは、ヒト分化多能性幹細胞の分化多能性を向上させるために、当該細胞をエピブラスト（プライム）の状態から胚盤胞（ナイーブ）の状態に脱分化（初期化）することを試みた。【０１０４】
発生過程において、初期化には２種類あると考えられている。受精直後から着床初期に生じる「初期胚における初期化」と、着床後に生殖細胞の形成過程で生じる「生殖系列における初期化」とである。この点を鑑み、本発明者らは、着床前の胚盤胞から着床後のエピブラストまでの記憶を消去すべく、「生殖系列における初期化」において発現している多種の因子を精査し、その中でＴＥＴ１に着目した。【０１０５】
哺乳類動物におけるＴｅｔ１／ＴＥＴ１の発現様式に関しては、マウスに関してのみ報告されている。それによると、マウスＴｅｔ１は、初期発生においては受精卵から胚盤胞まで細胞核に存在していることが知られている（Ｉｔｏ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０年、４６６巻、７３１０号、１１２９〜１１３３ページ）。また別の報告では、生殖細胞が規定される始原生殖細胞に限定して本因子の発現が認められている（Ｈａｊｋｏｖａ，Ｐ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０年、３２９巻、５９８７号、７８〜８２ページ）。さらに、Ｔｅｔ１の発現が認められる胚盤胞より樹立されるマウスＥＳ細胞においても、このタンパク質の豊富な発現が確認されている。しかしながら、これまではヒトのＴＥＴ１の発現動態に関しては一切知られていなかった。【０１０６】
そこで、本発明者らは、ヒトｉＰＳ細胞におけるＴＥＴ１ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を調べた。特に、Ｔｅｔ１タンパク質の発現に関しては、マウスＥＳ細胞を用いた予備実験の結果、前述の通り、ＴＥＴ１タンパク質はＤＮＡに強固に結合していることを突き止め、独自に工夫を施したタンパク質抽出方法を駆使することにより、ウェスタンブロット法により定量的に検出することに初めて成功した。得られた結果を図１及び２に示す。【０１０７】
図１及び２に示した結果から明らかなように、ＴＥＴ１はヒトｉＰＳ細胞において十分に転写されているにも関わらず、通常ではそのタンパク質は検出できず、マウスＥＳ細胞における状況と異なっていることが明らかになった。【０１０８】
そこで、タンパク質分解の主要経路であるプロテアソームの機能を、プロテアソーム阻害剤（低分子化合物：ＭＧ１３２）にて一時的に阻害してやり、ウェスタンブロット法にて検出を試みた。すなわち、ＫＦＡ培地にて培養した各ヒトｉＰＳ細胞株（＃５８、＃２３７及び＃１０５）を定法で培養した後、回収の７時間前に０．１％ＤＭＳＯに溶解したＭＧ１３２を５μＭ添加し、回収した核抽出物をウェスタンブロッティングした。また、コントロールとして、０．１％ＤＭＳＯのみを添加して回収した核抽出物についてもウェスタンブロッティングを行った。【０１０９】
その結果、図１及び２に示す通り、ＴＥＴ１は、ヒトｉＰＳ細胞において積極的に転写されるものの、そのタンパク質は速やかにプロテアソーム系によって分解されていることが判明した。なお、ＭＧ１３２を添加すると、若干ＴＥＴ１の転写レベルも上昇するが、明らかに図１において示されるタンパク質レベルでの上昇を裏付けるものではなかった。このように通常条件で維持されるヒト分化多能性幹細胞にはＴＥＴ１はタンパク質レベルでは存在していないか、その存在がウェスタンブロット法における検出感度以下であることが明らかになった。【０１１０】
（実施例２）
＜ヒトＴＥＴ１遺伝子構造の決定＞
実施例１において明らかになった通り、ヒト分化多能性幹細胞においてはＴＥＴ１タンパク質が安定して存在しないことが判明した。さらに、ヒトのｉＰＳ細胞誘導を考えると、ＴＥＴ１が安定的に発現しうる胚盤胞や生殖系列に似た環境内で十分時間経過したことは考えにくく、結果としてその生成過程において十分にＴＥＴ１の活性がゲノムに作用していないことが想像される。さらに、このＴＥＴ１タンパク質のゲノムへの作用の有無によって、ナイーブ型の性質を有するマウス分化多能性幹細胞とプライム型の性質を有するヒト分化多能性幹細胞との分化能における差異が生じていることが想定される。【０１１１】
そこで、ヒト分化多能性幹細胞において、ＴＥＴ１タンパク質を強制的に発現させるべく、コード領域の全長をＲＴ−ＰＣＲにて増幅することにより、ヒトＴＥＴ１のｃＤＮＡ配列の取得を試みた。すなわち、ヒトｉＰＳ細胞株（ｒｖｈｉＰＳＣ０８）から、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いたＲＴ−ＰＣＲ法により、ＴＥＴ１ｃＤＮＡを増幅した。この際、報告されているＴＥＴ１ｃＤＮＡの配列（Ｒｅｆｓｅｑ：ＮＭ＿０３０６２５）に基づき、Ｎ末又はＣ末にＦＬＡＧタグが付加された形でＴＥＴ１タンパク質が発現できるように、以下に示す配列を有するプライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲに用いた。
（Ｎ末ＦＬＡＧタグプライマー）
ＸｈｏＩ−Ｆｌａｇ−ｈＴｅｔ１−Ｓ：
ＧＣＡＡＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＴＣＴＣＧＡＴＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＡＡＧ（配列番号：７）
ＸｈｏＩ−ｈＴｅｔ１−ＡＳ：
ＧＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＴＧＧＴＴＡＴＡＧＧＧＣＣ（配列番号：８）
（Ｃ末ＦＬＡＧタグプライマー）
ＸｈｏＩ−ｈＴｅｔ１−Ｓ：
ＧＣＡＡＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＣＧＡＴＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣ（配列番号：９）
ＸｈｏＩ−ｈＴｅｔ１−Ｆｌａｇ−ＡＳ：
ＧＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＴＴＡＣＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＧＡＣＣＣＡＡＴＧＧ（配列番号：１０）。【０１１２】
その結果、図３に示す通り、２つのＰＣＲ産物が得られ、ともにＴＥＴ１のバリアントであったが、Ｒｅｆｓｅｑの配列（ヒトＴＥＴ１，バリアント１）とは異なるものであり、分化多能性幹細胞において初めて明らかになったバリアントであった。【０１１３】
長い方のバリアント（ヒトＴＥＴ１，バリアント２）は、Ｒｅｆｓｅｑに登録されている配列に比べると、第７エクソンと第８エクソンの間にさらに８７塩基対の配列を持つものであり、該配列は、ゲノムとの比較により、単一のエクソンに相当することが明らかになった。また、この部位は、結晶構造解析から予想される本分子の活性部位（ジオキシゲナーゼ）のＮ末側に位置する領域である。興味深いことに、マウスのＴｅｔ１配列では、このエクソンに相当する配列が認められる。【０１１４】
もう一つの短い方のバリアント（ヒトＴＥＴ１、バリアント３）に関しては、興味深いことに第３エクソン〜第５エクソンを欠失するものであった。第３〜５エクソンは２４９３塩基対で構成されているため、この欠失はインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）欠失であることが想定される。このバリアント３で欠失している部分には、バリアント１及び２では核移行シグナルが２つ存在することが知られている。【０１１５】
また、図には示さないが、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、これらバリアントについて、ヒトｉＰＳ細胞における転写レベルを評価したところ、バリアント２の豊富な発現が確認された一方で、バリアント１については若干ではあるが、その発現が確認された。また、バリアント３の発現量が低いことが明らかになった。さらに、図には示していないが、マウスにおいても、これら３つのバリアントに相当するｍＲＮＡの発現を確認している。【０１１６】
なお、配列表において、ヒトＴＥＴ１のバリアント１の塩基配列を配列番号：１に示し、当該バリアントがコードするアミノ酸配列を配列番号：２に示す。ヒトＴＥＴ１のバリアント２の塩基配列は配列番号：３に示し、当該バリアントがコードするアミノ酸配列は配列番号：４に示す。ヒトＴＥＴ１のバリアント３の塩基配列は配列番号：５に示し、当該バリアントがコードするアミノ酸配列は配列番号：６に示す。【０１１７】
（実施例３）
＜改変ＴＥＴ１タンパク質の発現１＞
実施例２にて増幅したヒトＴＥＴ１（バリアント２）を、以下に示す方法にて、ヒト分化多能性幹細胞に導入し、該細胞内におけるＴＥＴ１タンパク質の発現を試みた。【０１１８】
先ず、前述の通り、Ｎ末又はＣ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質をコードするｃＤＮＡを、ヒトｉＰＳ細胞のｃＤＮＡを鋳型とし、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。そして、このように調製した２種類の改変型ＴＥＴ１ｃＤＮＡを、哺乳類細胞発現ベクター（ｐＣＡＧ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ、理研ＣＤＢ  丹羽研究室より受領）のＸｈｏＩにイン−フュージョンＨＤクローニングキット（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて各々挿入した。【０１１９】
次に、ヌクレオフェクターを用い、これらベクターを前記ヒトｉＰＳ細胞株（ＹＭｈｉＰＳＣ０５８ｓｂｃ６亜株）に各々トランスフェクションした。このトランスフェクションにおいては、ｉＰＳ細胞を、ヒト幹細胞ヌクレオフェクターキット１（Ｌｏｎｚａ社製）にて懸濁し、ヒトｉＰＳ細胞に対して最も高い遺伝子導入効率を示したヌクレオフェクターのプログラム：Ｂ−０１６にて電気パルスをかけた。【０１２０】
このようにして前記ベクターを導入したヒトｉＰＳ細胞を、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）にてセレクションをかけながら培養することにより、Ｎ末−、Ｃ末−ＦＬＡＧタグＴＥＴ１を強制発現した安定株を各々数クローン取得した。そして、これら改変ＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞株における、ＴＥＴ１ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を調べた。得られた結果を図４及び５に示す。【０１２１】
図４及び５に示した結果から明らかなように、いずれの末端にタグを配した強制発現株においても、ＴＥＴ１の転写量は有意に上昇していた（図５）。しかし、大変興味深いことに、Ｎ末にＦＬＡＧを配したＴＥＴ１安定発現株のみで、ウェスタンブロットにて明瞭にＴＥＴ１タンパク質の発現が認められた（図４）。したがって、ＴＥＴ１タンパク質の場合、Ｎ末部分の配列に、本タンパク質を不安定にする配列が存在することが示唆された。【０１２２】
（実施例４）
＜改変ＴＥＴ１タンパク質の発現２＞
実施例３に示した結果に基づき、ＴＥＴ１タンパク質を不安定にする配列を同定すべく、以下に示す方法にて、改変ＴＥＴ１タンパク質の安定性について評価した。【０１２３】
先ず、ＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸）のＣ末側に、ＧＦＰタンパク質を融合させた改変ＴＥＴ１タンパク質を調製し、ヒトｉＰＳ細胞において、前記同様に、ヌクレオフェクターを用いて強制的に発現させた。なお、ここで用いたＧＦＰタンパク質（Ｔａｇ−ＧＦＰ、ｅｖｒｏｇｅｎ社製）は、通常のＧＦＰタンパク質と比較して、翻訳から発色までの時間が短縮されており、融合させた目的のタンパク質の発現及び消失をリアルタイムに観測することができる。【０１２４】
具体的には、図６に示す通り、野生型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分にＴａｇ−ＧＦＰを融合させたもの（＃９３）、試験的にＮ末端から２番目のアミノ酸（Ｓ：セリン）をＧ：グリシンに置換したＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分にＴａｇ−ＧＦＰを融合させたもの（＃９４）、実施例３に記載の通りＴＥＴ１タンパク質を安定的に発現させることのできる、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを付加したＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分にＴａｇ−ＧＦＰを融合させたもの（＃９５）を個別に作製し、別々にｉＰＳ細胞において発現させた。なお、これら細胞において、導入された各改変ＴＥＴ１タンパク質とＴａｇ−ＧＦＰとからなる融合タンパク質が発する蛍光は細胞の核内に限局していることは確認している。そして、この蛍光シグナルを個々の細胞レベルで、かつ、定量的に解析する目的で、各改変ＴＥＴ１タンパク質を強制発現しているヒトｉＰＳ細胞をＦＡＣＳ解析した。得られた結果を図７に示す。【０１２５】
図７に示した結果から明らかなように、ネガティブコントロールとしてＧＦＰを発現しないｉＰＳ細胞にて自家蛍光のシグナル値を測定したところ、その相乗平均値は７．２であった。また、野生型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分にＧＦＰタグを融合させたもの（＃９３）が導入されているｉＰＳ細胞を解析したところ、その値は２６．３であった。これに対し、興味深いことに、２番目のアミノ酸をセリンからグリシンに変換しただけで、蛍光強度が有意に上昇した（蛍光強度：３１．６、図６の♯９４参照）。さらには、実施例３の結果から予想されるように、ＴＥＴ１タンパク質の第１メチオニンを欠失させ、そのＮ末端側にＦＬＡＧタグを付加した場合にも、有意に値が上昇した（蛍光強度：３７．７、図６の♯９５参照）。【０１２６】
したがって、ＴＥＴ１タンパク質のアミノ末端から２番目のアミノ酸：セリンが、このタンパク質の安定性を規定する上で必須であることが明らかになった。また、この結果に基づき、実施例３及び４において示された、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを付加したＴＥＴ１タンパク質の安定性は、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がセリンから、ＦＬＡＧタグのＮ末端から２番目のアミノ酸であるアスパラギン酸に変更されたことにより、得られたことが明らかになった（ＦＬＡＧタグのアミノ酸配列を示す配列番号：４６  参照）。【０１２７】
（実施例５）
＜改変ＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞株（ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣ）の未分化状態における検討＞
実施例１に示す通り、いわゆるエピブラストに相当する状態を保つとされるヒトの分化多能性幹細胞には、通常ＴＥＴ１タンパク質はほとんど存在していなかった。したがって、実施例３にて作製した、改変ＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞株（ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣ）は、おそらくは発生過程では存在しない細胞状態であることが考えられる。【０１２８】
しかし奇妙なことに、図には示さないが、ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣはＫＦＡ培地を用いて未分化な状態で維持している間は、その形態や増殖速度等、通常の改変ＴＥＴ１タンパク質が発現していないヒトｉＰＳ細胞と一切見分けが付かない。そこで、ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣに関し、一般に分化多能性幹細胞の性質に強く関わるとされる所定の転写因子のｍＲＮＡレベルでの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにて評価した。得られた結果を図８〜２３の日数：０に示す。【０１２９】
図８に示した結果から明らかなように、分化誘導前（日数：０）のＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣにおけるＴＥＴ１ｍＲＮＡの発現は、コントロールとして用いたｐＣＡＧ−ＩＰベクターのみを発現したｈｉＰＳＣに比べると、約４倍強となっており、通常状態の約３倍の発現が強制発現分であることが判った。それを踏まえた上で、未分化状態で分化多能性幹細胞の自己複製能に関わる諸因子、ＯＣＴ３／４、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ２のｍＲＮＡ発現レベルは、ＴＥＴ１強制発現の有無で大差が無いことが判った（図１１〜１３の日数：０  参照）。【０１３０】
エピブラストに相当するプライム型の性質を有する分化多能性幹細胞は、その後外胚葉か中内胚様へと分化する能力を備えていることが知られている。この点に関し、興味深いことに、外胚葉への分化傾向を示すマーカー（神経細胞のマーカー：ＳＯＸ１、ＮＥＵＲＯＧＥＮＩＮ１、ＮＥＵＲＯＧＥＮＩＮ２、ＮＥＵＲＯＤ１、ＡＳＣＬ１、ＰＡＸ６、ＺＮＦ５２１及びＯＴＸ２）に関しては、ＴＥＴ１強制発現の影響が殆ど無いことが明らかになった（図１４〜２１の日数：０  参照）。【０１３１】
さらに、中内胚葉への分化傾向を示すマーカー：Ｔ及びＳＯＸ１７に関しては、発現の様相がＴＥＴ１強制発現の有無で大きく異なっていた。すなわち、改変ＴＥＴ１タンパク質を強制的に発現していないｈｉＰＳＣにおいては、これらマーカーの発現が認められたのに対し、同一の培地で培養維持しているにも関わらず、ＴＥＴ１−ｉＰＳＣではこれらマーカーの発現は低く抑えられていた（図２２及び２３の日数：０  参照）。【０１３２】
一般にＴやＳＯＸ１７は、すでに分化したことを示すマーカーとされており、原則として未分化な幹細胞では発現していないはずである。このことは、定法に従って作製された従前のヒトｉＰＳ細胞が、培地中に含まれている、中内胚葉への誘導に必要なＮＯＤＡＬと同じ機序で働くアクチビンＡに過剰に反応し、未分化な状態を通り越して、中内胚葉へ分化していたことを示唆している。換言すれば、従前のヒト分化多能性幹細胞は、中内胚葉へ多少分化した細胞であり、厳密な意味で“未分化”でなかった可能性がある。【０１３３】
（実施例６）
＜ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣの神経分化誘導性の検証１＞
脊椎動物の初期発生で広く保存されている現象に、デフォルトとして神経系の細胞に分化誘導すること（ｄｅｆａｕｌｔ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）が知られている（Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｊ．ら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、２００７年、３０８巻、２号、２４７〜２５６ページ）。すなわち、初期胚の細胞を単離すると、他の誘導刺激が入らない場合、その細胞は神経系に分化するというものである。これまでにマウスＥＳ細胞もこのｄｅｆａｕｌｔ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓに従うことが報告されてきた（Ｓｍｕｋｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００６年、１７２巻、１号、７９〜９０ページ）。また、本発明者らが以前にマウスＥＳ細胞から神経細胞を誘導しうるプロトコールを提案した際も、このデフォルトな経路にＥＳ細胞を“乗せる”ことを主眼においてきた（Ｂｏｕｈｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ、２００５年、６８（１−２）、６２〜７５ページ）。しかしこれまで、ヒトの分化多能性幹細胞を用いた場合のデフォルトが何であるのかに関しては報告がない。【０１３４】
そこで、ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣの分化能を検証する一例として、マウスＥＳ細胞でｄｅｆａｕｌｔ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓが起こる状況に似せて、ヒトｉＰＳ細胞のデフォルトな分化を観察した。すなわち、前述の通り、ＫＦＡで維持培養したＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣ又はｈｉＰＳＣを、発生分化に中性なＣＤＭ培地で４日維持し、後は神経誘導に有利な条件であるアクチビンＡ／Ｎｏｄａｌを阻害した状況に供した。そして、かかる神経系へのデフォルトな分化誘導を開始してから１２日間、４日間おきにこれらヒトｉＰＳ細胞における転写因子のｍＲＮＡ発現を分析した。得られた結果を図８〜２３に示す。【０１３５】
神経が誘導される際には、ＯＣＴ３／４とＮＡＮＯＧは速やかにそれらの発現が減弱することが必要であることが明らかになっている（Ｚｈｅｎｇ  Ｗｎａｇら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、２０１２年、１０巻、４４０〜４５４ページ）。この点に関し、図１１及び１２に示した結果から明らかなように、分化誘導を開始してから最初の４日間で既に、ＯＣＴ３／４及びＮＡＮＯＧの発現に対してＴＥＴ１強制発現の影響が強く発揮されていた。特にＮＡＮＯＧの発現性に関し、ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣでは、４日間でその発現が１００分の１以下に減少していた。これに対し、従来のヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳＣ）では、デフォルトな状態ではこれら因子の発現が減少するどころか、上昇していることが確認された。さらに、図には示さないが、これら従来のヒトｉＰＳ細胞においては、ＯＣＴ３／４及びＮＡＮＯＧの発現はこの後約１ヶ月をかけてようやく初期値の１０分の１ぐらいになるのみであった。【０１３６】
また、図１３に示す通り、ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣにおけるＳＯＸ２の発現は、分化誘導を開始してから経時的に上昇していくことが明らかになった。ＳＯＸ２は未分化な分化多能性幹細胞で発現する転写因子の１つであるが、同時に神経の発生に必須の因子であることが知られている。そのため、ＴＥＴ１−ｉＰＳＣを神経系に分化させた時に、ＳＯＸ２の発現が減少しないのが、後で示す効率良い神経分化に向かわせた一因であると考えられる。一方、従来のヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳＣ）では、ＳＯＸ２の転写量は逆に減少する傾向を示していた。【０１３７】
また、図１４〜２１に示した結果から明らかなように、神経分化マーカー（ＳＯＸ１、ＮＥＵＲＯＧＥＮＩＮ１、ＮＥＵＲＯＧＥＮＩＮ２、ＮＥＵＲＯＤ１、ＡＳＣＬ１、ＰＡＸ６、ＺＮＦ５２１及びＯＴＸ２）に関しては、これらマーカーの顕著な発現誘導がＴＥＴ１−ｉＰＳＣにおいて認められた。一方、従来のヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳＣ）では、これら神経分化マーカーの殆どにて発現は誘導されなかった。また特に、分化誘導開始後１２日目のＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣにおけるＳＯＸ１の発現量は、ＴＥＴ１タンパク質を発現していないヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳＣ）におけるそれの約６０倍であった。これから類推するに、ＴＥＴ１タンパク質の強制発現により、ヒトｉＰＳ細胞は６０倍も神経細胞に分化しやすくなったことが示された。【０１３８】
また、ｄｅｆａｕｌｔ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓにおいて誘導される神経細胞は、前脳（ｆｏｒｅｂｒａｉｎ）の性質を持つことが知られている。この点に関し、図２１に示す通り、前脳のマーカーであるＯＴＸ２が、ＴＥＴ１タンパク質の強制発現により、著明に発現誘導されることが明らかになった。したがって、ＴＥＴ１タンパク質を導入することにより、デフォルトで前脳型の神経細胞に誘導可能であることが示された。【０１３９】
さらに、前述の通り、ＴＥＴ１タンパク質の強制発現によって、ＮＡＮＯＧの発現は速やかに消失することが明らかになった。ＮＡＮＯＧの抑制は、前述の神経系への分化に限らず、殆どの細胞種に分化させる場合に抑制されることが必要であることが知られている。したがって、実施例６においては神経系（外胚葉系）への分化誘導を例にＴＥＴ１タンパク質の有効性を明らかにしたが、後述の実施例８においても示す通り、本発明の方法又はタンパク質によって得られる効果は、外胚葉系の分化に限定されるわけではない。すなわち、ＴＥＴ１タンパク質の強制発現によって、ＮＡＮＯＧの発現の速やかな消失が生じ、分化誘導の抑制要因が解消されることにより、万能性幹細胞の分化多能性は向上される。【０１４０】
（実施例７）
＜ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣの神経分化誘導性の検証２＞
実施例６にて分化誘導して得られた神経前駆体細胞を、前述の通り、ラミニンコートした培養皿に播種し直し、神経突起形成等の成熟過程を観察した。得られた結果を図２４及び２５に示す。【０１４１】
図２５に示した結果から明らかなように、ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣからの分化誘導においては、神経細胞以外の細胞は一切認められず、ほぼ１００％のＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣが神経細胞に分化していることが認められた。これに対し、従来のヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳＣ）からは、図２４中に矢印で示した箇所に神経細胞の細胞体の塊が認められたが、それ以外は全て増殖性の非神経細胞であり、神経細胞の占める割合は極めて限定的であった（図２４  参照）。【０１４２】
（実施例８）
＜ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣの内胚葉系への分化誘導性の検証＞
哺乳類の初期発生は、単純化すると、神経系や皮膚等の外胚葉系の細胞系譜に分化するか、それとも、その他の中胚葉（血液、筋、骨格系）や内胚葉（肺、消化器系臓器）等の共通の祖先細胞系譜である中内胚葉系の細胞系譜に分化するかの二者択一である。そこで、前述において実証されたＴＥＴ１タンパク質による外胚葉系への分化誘導性の向上に加え、ＴＥＴ１タンパク質によって内胚葉系への分化誘導性も向上されることを以下に示す方法にて確認した。【０１４３】
＜ヒトｉＰＳ細胞の内胚葉系分化誘導法＞
内胚葉系の臓器には、糖尿病発症と関わる膵臓や、代謝・解毒の中枢臓器である肝臓があるため、これらの細胞系譜への分化誘導プロトコールの開発は比較的進んでいる。そのため今回は、膵臓のインスリン産生細胞であるβ細胞への分化プロトコールを改変し、すなわち、Ｋｅｖｉｎ  Ａ  Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２００６年、２４巻、１３９２〜１４０１ページに記載のプロトコールを改変し、内胚葉までの分化決定を実施した。【０１４４】
なおプロトコールの改変部分は、該論文に記載のプロトコールに用いられている基本培地ＲＰＭＩを、本発明者らが神経誘導等に用いている前記ＣＤＭ培地に置換した点と、誘導物質としてＷｎｔ３ａタンパク質を用いるのではなく、細胞に対して同様の活性を有する、すなわち同じシグナル伝達機構に働く低分子化合物ＣＨＩＲ９９０２１を用いた点と、内胚葉系細胞の内、特に膵臓細胞を誘導する場合に用いるＣｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達の阻害剤）を用いなかった点とにある。また、かかる改変により、ヒトｉＰＳ細胞は、肝臓に近い細胞種へと分化することが想定される。【０１４５】
以下に、本分化誘導方法をステージ別に説明する。【０１４６】
ステージ１：内胚葉系細胞への決定（４日間）
ＫＦＡ培地等にて未分化状態に維持したヒトｉＰＳ細胞（実施例３にて作製した、改変ＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞株（ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣ）又はＹＭｈｉＰＳＣ０５８ｓｂｃ６亜株）を定法に従いトリプシン溶液にて解離する。すなわち、十分時間トリプシンを作用させた後に、トリプシン阻害剤にてその酵素反応を停止させる。その後、ＣＤＭ培地にＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）及びＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２；１０μＭ）を加えた分化培地に懸濁し、低接着の培養皿に播種することで、平均約２０００個の細胞塊を形成させる。４８時間後、形成された細胞塊を回収し、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加したＣＤＭ培地に再度細胞塊を浮遊させる。さらに４８時間培養することにより、細胞は内胚葉系への決定がなされ、ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ（胚体内胚葉、マーカー：ＳＯＸ１７）が形成されることが想定される。【０１４７】
ステージ２：原始腸管形成（４日間）
前記方法にて、一度内胚葉に細胞運命が固定した細胞を、次に消化器系臓器の原始形態である腸管を目指した分化培養に供する。すなわち、ステージ１から回収した細胞塊を、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＣＤＭ培地に置換し、そのまま４日間分化を継続させる。その結果、細胞は原始腸管と呼ばれる細胞（マーカー：ＨＮＦ４Ａ）に分化することが想定される。【０１４８】
ステージ３：前腸形成（４日間）
原始腸管の細胞は、頭に近い位置では甲状腺や肺等の臓器、より後部では消化器系臓器へと分化する。この内、消化器系臓器の共通の祖先細胞が前腸である。
ステージ２より回収した細胞塊を、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）及びオ―ルトランス・レチノイン酸（２μＭ）を添加したＣＤＭ培地に置換し、そのまま４日間分化を継続させる。その結果、細胞は前腸細胞（マーカー：ＦＯＸＡ２）の性質を呈することが想定される。【０１４９】
以上に記載の分化誘導方法に、従来のヒトｉＰＳ細胞と、ＴＥＴ１−ｉＰＳＣとを供し、各細胞由来のサンプルを４日おきに採取し、ＲＮＡを抽出した。そして、そのＲＮＡを鋳型としてｑＰＣＲを行い、各分化ステージを表す前記マーカー遺伝子の発現量を定量した。また、ＮＡＮＯＧの発現量を細胞の未分化性を表す指標として定量した。得られた結果を図２６〜２９に示す。【０１５０】
定法に従って作製された従来のヒトｉＰＳ細胞は、図２６〜２９に示すように、ＴＥＴ１を導入せずとも、この細胞株においてもある程度の内胚葉分化誘導が確認された。一方、ＴＥＴ１タンパク質を導入したヒトｉＰＳ細胞株においては、ＮＡＮＯＧの発現抑制と共に、内胚葉系分化マーカー遺伝子（ＳＯＸ１７、ＨＮＦ４Ａ及びＦＯＸＡ２）の顕著な発現誘導が認められた。すなわち、これらマーカー遺伝子の発現量から、ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣは、従来のｉＰＳ細胞株と比して、全ステージを通し、内胚葉系への誘導効率が約３倍に亢進していることが示された。したがって、前述の外胚葉系への分化能同様に、ＴＥＴ１タンパク質の導入により、分化多能性幹細胞の内胚葉系への分化能も亢進されることが確認された。【０１５１】
（実施例９）
＜改変ＴＥＴ１タンパク質についての検証＞
上述の通り、本発明の変異型ＴＥＴ１タンパク質として、ＴＥＴ１タンパク質（全長）のＮ末にＦＬＡＧタグを付加したタンパク質を用い、その効果について検証してきた。そこで、本発明の変異型ＴＥＴ１タンパク質の別の態様（図６に示す、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質（♯９４））についても、分化多能性幹細胞の分化能を向上させることが可能となることを、以下に示す方法にて確認した。【０１５２】
先ず、下記４種のヒトｉＰＳ細胞を調製した。
ＴＥＴ１ｏ／ｅ：Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質（全長）を、強制発現させたＹＭｈｉＰＳＣ０５８ｓｂｃ６亜株（実施例３にて作製した、改変ＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞株）、
♯９３：図６に示すヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質を、強制発現させたＹＭｈｉＰＳＣ０５８ｓｂｃ６亜株、
♯９４：図６に示すＮ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）を、強制発現させたＹＭｈｉＰＳＣ０５８ｓｂｃ６亜株、及び
ｐＣＡＧ−ＩＰ：ｐＣＡＧ−ＩＰ（空ベクター）を導入し、薬剤耐性のみを持たせたＹＭｈｉＰＳＣ０５８ｓｂｃ６亜株（コントロール細胞株）。【０１５３】
なお、♯９３、♯９４又はｐＣＡＧ−ＩＰは、実施例３に記載の方法と同様の方法にて、各改変ＴＥＴ１タンパク質をコードするｐＣＡＧ−ＩＰベクター又はｐＣＡＧ−ＩＰ（空ベクター）を作製し、そして、得られたベクターをヌクレオフェクターによりＹＭｈｉＰＳＣ０５８ｓｂｃ６亜株に導入し、薬剤耐性によるセレクションをかけて培養することにより調製した。【０１５４】
次に、これらヒトｉＰＳ細胞を前述の神経分化誘導に供し、この分化誘導過程（８日間）における各マーカー遺伝子の発現量を前述の方法に沿って解析した。得られた結果を、図３０〜３２に示す。【０１５５】
図３０〜３２に示した結果から明らかな通り、ＴＥＴ１タンパク質（全長）のＮ末にＦＬＡＧタグを付加したタンパク質（ＴＥＴ１ｏ／ｅ）同様に、本発明の変異型タンパク質の別の態様である、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質（♯９４）を導入することによっても、ヒトｉＰＳ細胞の神経分化誘導能を向上できることが確認された。したがって、ＴＥＴ１タンパク質導入による分化多能性幹細胞の分化能の向上においては、ＴＥＴ１タンパク質のＣ末端部分のジオキゲナーゼが担う脱メチル化活性は必要ではなく、ＤＮＡ結合ドメインを含むＴＥＴ１タンパク質のＮ末端部分が担うＤＮＡ結合能が維持されていれば十分であることが示された。【０１５６】
（実施例１０）
＜改変ＴＥＴ１タンパク質によるｉＰＳ細胞の生産効率向上についての検証＞
ｉＰＳ細胞への誘導、特にヒトｉＰＳ細胞への誘導は極めて効率の悪いプロセスである。そのため、質の良いｉＰＳ細胞、すなわち、顕微鏡下にて辺縁がシャープであるコロニーを形成するｉＰＳ細胞を入手することが難しい。なお、このような形態の良いコロニーを形成するｉＰＳ細胞は、分化多能性を担う転写因子（ＯＣＴ３／４やＳＯＸ２）の発現が高いこと、並びにその後の増殖においても細胞の性質が安定していることが経験上知られている。【０１５７】
そこで、所謂リプログラミング因子をｉＰＳ細胞に誘導するための体細胞に導入する際に、併せて本発明の変異型ＴＥＴ１タンパク質を導入することにより、ｉＰＳ細胞の生産効率が向上するか否かを以下に示す方法にて解析した。【０１５８】
すなわち、沖田らの開発したエピゾーマルベクター系を用いた以外は、前記同様に６因子（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びｓｈｐ５３）を導入してｉＰＳ誘導を行った。その際、Ｎ末にＦｌａｇタグを配した全長ＴＥＴ１を同じベクターに挿入したものを別個に作製し、この有無にて、ｉＰＳ細胞を誘導した。【０１５９】
そして、得られたｉＰＳ細胞コロニーを観察し、それらの数を計測した。得られた結果を表２に示す。表２に記載の「６因子」は前記６因子導入によるｉＰＳ細胞誘導の結果を示し、「６因子＋Ｆｌａｇ−ＴＥＴ１」は前記６因子と本発明の変異型ＴＥＴ１タンパク質との導入によるｉＰＳ細胞誘導の結果を示す。「Ｆｒｃｓ」は質の良いｉＰＳ細胞から構成されるコロニーの数を示し、「Ｐｒｃｓ」は質の悪いｉＰＳ細胞から構成されるコロニーの数を示す。「Ｆｒｃｓ」及び「Ｐｒｃｓ」の外観の例を図３３に示す。【０１６０】
【表２】
2014069479.tif 000003
【０１６１】
表２に示す通り、従来のＴＥＴ１タンパク質を導入しないｉＰＳ細胞誘導法と比較し、本発明のＴＥＴ１タンパク質を導入するｉＰＳ細胞誘導法によって、ｉＰＳ細胞コロニーの出現率を向上させること（コロニー数を２２個から４７個に向上させること）ができることが明らかになった。さらには、従来のｉＰＳ細胞誘導法ではＦｒｃｓもＰｒｃｓもほぼ同程度出来ていたのが、本発明のｉＰＳ細胞誘導法によって、Ｆｒｃｓの出現率も向上させることができること（Ｆｒｃｓの出現率が１０／２２から４０／４７に向上すること）も明らかになった。【０１６２】
したがって、本発明のＴＥＴ１タンパク質を導入する分化多能性幹細胞の製造方法によれば、得られる分化多能性幹細胞の分化能を向上させることのみならず、該分化多能性幹細胞も効率良く製造できることが明らかになった。【０１６３】
（実施例１１）
＜改変ＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞株（ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣ）の未分化状態における検討２＞
実施例３にて作製した、改変ＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞株（ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣ）の未分化状態の性状に関し、増殖性、網羅的な遺伝子発現の観点から、さらに解析した。【０１６４】
ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣの増殖性に関し、図には示さないが、樹立後２０回継代することができ、当該細胞は安定していることが明らかになった。また、モックベクター発現系統（ｍｖ−ｉＰＳＣ）と比較して、増殖速度は遅いことも明らかになった（図３４）。さらに、細胞周期に関し、ｍｖ−ｉＰＳＣと比較したところ、ＴＥＴ１−ｉＰＳ細胞はＧ２期における時間は短く、Ｓ期における時間が長くなっていた（図３５）。このように、ＴＥＴ１−ｉＰＳ細胞の細胞周期は、Ｓ期における細胞存在比率が高く、Ｇ１／Ｇ２／Ｍにおいては低いという、典型的な幹細胞様の細胞周期を連想させるものであった。【０１６５】
また、ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣのトランスクリプトームに関し、マイクロアレイを用いたグローバルな解析を行った結果、当該細胞の転写プロフィールはナイ―ブ型よりもプライム型であることが示された（図３６）。例えば、ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣにおいて、ナイ―ブ型の因子の発現は亢進していないものの、プライム型を決定する因子であるＤＮＭＴ３Ｂ及びＯＴＸ２の発現が亢進していた。また、ＳＯＸ２の発現亢進及びＮＡＮＯＧの僅かな発現低下を除外すれば、多能性に関する遺伝子の発現は大きく変化していなかった。さらに、図には示さないが、ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣをＬＩＦによって処理しても、ナイーブ段階に復帰することはなかった。【０１６６】
また、全体的にみると、ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣにおける遺伝子のグローバルな発現プロファイルは、コントロールであるｍｖ−ｉＰＳＣにおけるそれよりも、未分化であることが明らかになった。すなわち、ＴＥＴ１の発現により、ＮＯＤＡＬ、その直接的な制御対象（ＬＥＦＴＹ１及びＬＥＦＴＹ２）、並びに中内胚葉マーカー（Ｔ、ＳＯＸ１７、ＭＩＸＬ１、ＥＯＭＥＳ、ＬＨＸ１、ＬＩＭ２及びＦＯＸＡ２）の発現は、顕著に低下していた。また、ＴＥＴ１導入によってＮＯＤＡＬの発現は劇的に４５分の１程度に低下しており、上述の通り、ＴＥＴ１が導入されていない従前のヒトｉＰＳ細胞は、中内胚葉系統への分化傾向を示していることが確認された。なお、図には示さないが、ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣにおけるＤＮＭＴ３Ｂの発現亢進及び中内胚葉マーカーの有意な低発現は、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより確認した。また、ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣと比較して、癌関連マーカー（ＧＰＣ４、ＧＡＧＥ２Ｂ及びＧＡＧＥ７）は、ｍｖ−ｉＰＳＣにおいて高発現しており、ＴＥＴ１タンパク質が導入されていない従前のヒトｉＰＳ細胞は、腫瘍形成能を有していることが示唆された（図３６）。また、ＴＥＴ１−ｈｉＰＳＣ及びｍｖ−ｉＰＳＣの双方において、神経外胚葉マーカーであるＳＯＸ１は発現していなかったが、ＴＥＴ１−ｉＰＳＣにおいて、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＳＯＸ２及びＯＴＸ２の発現が亢進しており、該細胞の神経分化能が増強していることが示唆された。【０１６７】
（実施例１２）
＜Ｔｅｔ１ノックダウンマウスＥＳ細胞のプライム段階への移行性についての検証＞
上述の通り、ＴＥＴ１タンパク質を導入することによって、ヒトｉＰＳ細胞の分化能を向上させることができた。そこで、ＴＥＴ１のこの機能について、マウスにおけるナイーブ型多能性段階からプライム型多能性段階へのインビトロ移行モデルを用いて解析した。すなわち、「Ｋ．Ｈａｙａｓｈｉ，Ｈ．Ｏｈｔａ，Ｋ．Ｋｕｒｉｍｏｔｏ，Ｓ．Ａｒａｍａｋｉ，Ｍ．Ｓａｉｔｏｕ，Ｃｅｌｌ  １４６，５１９（Ａｕｇ１９，２０１１）」及び「Ｇ．Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３６，１０６３（Ａｐｒ，２００９）」の記載に沿って、培養条件を切り替えることにより、４８時間以内に、ナイーブ型の多能性段階にあるマウスＥＳ細胞を、プライム型の多能性段階にあるエピブラスト様細胞（ＥｐｉＬＣｓ）に誘導できるインビトロモデルを用いた（図３７）。実際、このように誘導して得られたＥｐｉＬＣｓは、Ｆｇｆ５、Ｄｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ３ｂの発現が亢進しているという原始外胚葉細胞の特性を示し（図３８）、一連のナイーブ型因子の発現は消失していた（図４０）。【０１６８】
そして、多能性の確立におけるＴｅｔ１の役割を探るため、全てのＴｅｔ１転写産物を対象とするショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を用い、前記インビトロモデル系において、Ｔｅｔ１の発現を低減させた（図３９、Ｋ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７３，３４３（Ｍａｙ  １９，２０１１）  参照）。【０１６９】
Ｔｅｔ１ノックダウン（ＫＤ）マウスＥＳ細胞において、図には示さないが、多能性マーカーであるＯｃｔ３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）、Ｓｏｘ２及びＮａｎｏｇの発現レベルは変わっていなかった。また、細胞周期に関しても、上記同様に典型的な幹細胞様の細胞周期を示し、従前からの報告の通り、Ｔｅｔ１はマウスＥＳ細胞の自己複製においては重要でないということが確認できた（Ｋ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７３，３４３（Ｍａｙ  １９，２０１１）、Ｋ．Ｐ．Ｋｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ８，２００（Ｆｅｂ  ４，２０１１）、Ｇ．Ｆｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７３，３９８（Ｍａｙ  １９，２０１１）、Ｍ．Ｍ．Ｄａｗｌａｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ９，１６６（Ａｕｇ  ５，２０１１）及びＭ．Ｍ．Ｄａｗｌａｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ２４，３１０（Ｆｅｂ  １１，２０１３）  参照）。【０１７０】
しかしながら、Ｔｅｔ１−ＫＤマウスＥＳ細胞は、未処理の細胞同様に、プライム型の多能性段階にあるＥｐｉＬＣｓに変化することはなかった。代わりに、エピブラスト段階において高発現していることが知られている遺伝子、特にｄｅ  ｎｏｖｏ  ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（Ｄｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ３ｂ）の発現レベルは、Ｔｅｔ１−ＫＤ  ＥｐｉＬＣｓにおいてかなり低くなっていた（図４１〜４３）。【０１７１】
さらに、ナイーブ型因子（Ｎａｎｏｇ、Ｐｒｄｍ１４、Ｅｓｒｒｂ、Ｒｅｘ１／Ｚｆｐ４２、Ｔｃｌ１、Ｔｂｘ３、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４及びＳｔａｔ３）の発現は、Ｔｅｔ１−ＫＤ  ＥｐｉＬＣｓにおいて維持されていた（図４２及び図４０）。【０１７２】
概して、プロテオーム及びトランスクリプトームにおけるＴｅｔ１−ＫＤ  ＥｐｉＬＣｓは、初期の多能性段階の発現プロファイルを示しており、また、マウスＥＳ細胞は、Ｔｅｔ１が発現していないと、４８時間以内にプライム型の多能性段階に達することができないということが明らかになった。【０１７３】
さらに、Ｔｅｔ１−ＫＤ  ＥｐｉＬＣｓにおいて、原始内胚葉細胞における典型的な転写因子シグナル（Ｇａｔａ６及びＳｏｘ１７の発現）が確認された。このシグナルは、着床前の胚盤胞ＩＣＭのナイーブ型の細胞に由来する原始内胚葉において確認されるものである。また、ナイーブ段階での状態維持に関与するＪＡＫシグナルを阻害し、Ｔｅｔ１−ＫＤ  ＥｐｉＬＣｓをより積極的にエピブラスト（プライム段階）に誘導することを試みても、その誘導をかけてから４８時間後のＴｅｔ１−ＫＤ  ＥｐｉＬＣｓにおいて、（エピブラスト型）原始外胚葉への分化能は損なわれたままであった（図４４）。【０１７４】
（実施例１３）
＜プライム型の多能性におけるＴＥＴ１の分解＞
ナイーブ型からプライム型の移行過程におけるＴｅｔ１の発現プロファイルを解析した結果、「Ｓ．Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６６，１１２９（Ａｕｇ２６，２０１０）」にて報告されている通り、Ｔｅｔ１は未分化のマウスＥＳ細胞において高発現していた（図４５、図４６及び図４１）。しかし、プライム段階への移行に際して、Ｔｅｔ１のｍＲＮＡレベルが維持されているにも関わらず、それらのタンパク質レベルは有意に下がっていた（図４５、図４６、図４１及び図４２）。一方、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２によってＥｐｉＬＣｓにおけるタンパク質分解を阻害することによって、Ｔｅｔ１タンパク質の発現レベルを回復させることができた（図４６）。一方、ナイーブ型の未分化ＥＳ細胞において、Ｔｅｔ１のタンパク質レベルに関し、このようなプロテアソーム阻害処理による影響は見られなかった。【０１７５】
なお、上述の通り、ＴＥＴ１タンパク質はヒトｉＰＳ細胞において殆ど検出されず、表現型上、プライム型にあるマウスＥｐｉＬＣｓ内と同様のタンパク質動態制御下にあると考えられた。また、ヒトｉＰＳ細胞におけるＴＥＴ１タンパク質の発現レベルは、ＭＧ１３２処理によって顕著に亢進した（図１）。【０１７６】
したがって、ナイーブ型の分化多能性幹細胞と同程度に、プライム型の分化多能性幹細胞はＴＥＴ１タンパク質を安定化することができないことが明らかになった。また、インビトロモデルにおけるナイーブ段階からプライム段階への移行においてＴｅｔ１タンパク質の発現が低下することは、胚盤胞からエピブラストへのインビボ移行段階において、Ｔｅｔ１タンパク質の発現が発生的に低下するように制御されていることを反映していることが示唆される。【０１７７】
（実施例１４）
＜Ｔｅｔ１によるＤｎｍｔ３の発現制御についての検証＞
Ｔｅｔ１は脱メチル化を促進するため、Ｔｅｔ１−ＫＤマウスＥＳ細胞又はＥｐｉＬＣのゲノムは高メチル化状態にあることが予測される。【０１７８】
しかしながら、ナイーブ型の因子であるＴｃｌ１のメチル化可変領域（ＤＭＲ）について解析した結果、Ｔｅｔ１の喪失は、マウスＥＳ細胞におけるＴｃｌ１のＤＭＲのメチル化状態に影響を与えることはなかった。なお、Ｔｃｌ１のＤＭＲは、着床後の胚盤胞からエピブラストへの移行過程におけるゲノムワイドなメチル化の一環として、ｄｅ  ｎｏｖｏのメチル化が有意に導入される領域として報告されている（Ｊ．Ｂｏｒｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４２，１０９３（Ｄｅｃ，２０１０）  参照）。また、コントロールのＴｃｌ１  ＤＭＲは、ＥｐｉＬＣｓへの移行の過程においてメチル化され始めるものの、Ｔｅｔ１−ＫＤ  ＥｐｉＬＣｓにおいては、低メチル化のまま維持されていた（図４７）。【０１７９】
したがって、Ｔｅｔ１は、脱メチル化活性によってＴｃｌ１  ＤＭＲのメチル化に直接影響は与えていないものの、Ｔｅｔ１がまだ高発現しているナイーブ段階において、ゲノムのグローバルな再メチル化において重要であることが知られている、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（Ｄｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ３ｂ）の発現を制御することによって間接的に影響を与えていることが考えられる。実際、図４１に示す通り、Ｔｅｔ１−ＫＤ  ＥｐｉＬＣｓにおいて、これらＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現レベルは、きわめて低い。【０１８０】
そこで、次に、Ｔｅｔ１−ＫＤ  ＥｐｉＬＣｓにおいて見られる、グローバルな低メチル化状態及びＤｎｍｔ３ａ／ｂの調節異常は、Ｄｎｍｔ３ｂプロモータ−における異常なメチル化状態によって説明できるかどうかを調べた。すなわち、バイサルファイトシークエンシングにより、Ｄｎｍｔ３ｂの全ての推定上ＤＭＲのメチル化状態を解析した結果、図には示さないが、転写開始部位から−８６６〜−５７６の間に位置する一つの領域に関し、Ｔｅｔ１−ＫＤマウスＥＳ細胞において高メチル化していることが明らかとなり、この高メチル化状態は、Ｔｅｔ１の脱メチル化活性の喪失と一致しているように思われる。【０１８１】
しかしながら、このメチル化状態の差異はささやかなものであったため、Ｄｎｍｔ３ａ／ｂの異常調節を説明するための、デオキシゲナーゼ非依存的な分子機構について調べた。【０１８２】
ナイーブ型因子であるＰｒｄｍ１４は、Ｄｎｍｔ３ｂの発現を抑制することによって、マウスＥＳ細胞における多能性の確保に部分的に関与していることが知られている（Ｚ．Ｍａ，Ｔ．Ｓｗｉｇｕｔ，Ａ．Ｖａｌｏｕｅｖ，Ａ．Ｒａｄａ−Ｉｇｌｅｓｉａｓ，Ｊ．Ｗｙｓｏｃｋａ，ＮａｔＳｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １８，１２０（Ｆｅｂ，２０１１）及びＭ．Ｙａｍａｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １２，３６８（Ｍａｒ  ７，２０１３）  参照）。そこで、このＰｒｄｍ１４のナイーブ段階からプライム段階への移行過程における発現を解析した。【０１８３】
その結果、ナイーブ段階からプライム段階への移行過程において、Ｐｒｄｍ１４  ｍＲＮＡの発現レベルは、マウスＥＳ細胞において高いが、ＥｐｉＬＣｓにおいて低くなっていた。しかしながら、Ｔｅｔ１をノックダウンすることによって、ＥｐｉＬＣにおけるＰｒｄｍ１４発現抑制は解除されることが明らかになった（図４０）。このように、Ｔｅｔ１はＰｒｄｍ１４の発現抑制を担っており、結果として、マウスＥＳ細胞からＥｐｉＬＣに分化する際のＤｎｍｔ３ａ／ｂの発現亢進に寄与することが示唆され、さらには、この発現抑制は、Ｔｅｔ１−ＫＤ  ＥｐｉＬＣにおけるＤｎｍｔ３ａ／ｂの発現抑制とも一致する。【０１８４】
次に、Ｐｒｄｍ１４及びＴｅｔ１を共にノックダウン（Ｔｅｔ１／Ｐｒｄｍ１４−ｄｏｕｂｌｅ  ＫＤ）することにより、Ｔｅｔ１喪失によるＥｐｉＬＣにおけるＤｎｍｔ３ｂの発現低下が無効となるかどうか調べた（図４８）。【０１８５】
Ｔｅｔ１−ＫＤと比較して、Ｔｅｔ１／Ｐｒｄｍ１４−ｄｏｕｂｌｅ  ＫＤ  ＥｐｉＬＣにおいて、プライム段階を決定する因子Ｏｔｘ２、Ｄｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ３ｂの発現は増強され、（胚体外）原始内胚葉マ―カーであるＧａｔａ６の発現は抑制されていた（図４９〜５２）。【０１８６】
以上の通り、Ｔｅｔ１−ＫＤのナイーブ段階からプライム段階への移行過程におけるＤｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ３ｂの発現低下の誘導、並びにＴｅｔ１−ＫＤ  ＥｐｉＬＣにおける低メチル化状態の維持には、Ｔｅｔ１デオキシゲナーゼ依存的な機構のみならず、非依存的な機構が関与していることが示唆される。【０１８７】
次に、ナイーブ段階からプライム段階への移行において、Ｄｎｍｔ３アイソフォームの役割を個別に解析するため、Ｔｅｔ１−ＫＤ細胞にＤｎｍｔ３の様々なアイソフォームを個々に導入した。【０１８８】
その結果、Ｔｅｔ１−ＫＤにおけるＯｔｘ２の発現は、Ｄｎｍｔ３ａ２の異所発現によって野生型のそれと同レベルにまで回復した（図５３）。一方、Ｔｅｔ１−ＫＤにおけるＧａｔａ６の発現亢進は、Ｄｎｍｔ３ｂの異所発現によって無効となった（図５４）。【０１８９】
したがって、Ｔｅｔ１は、Ｄｎｍｔ３ａ／ｂを制御することによって、積極的にマウスＥＳ細胞をナイーブ段階からプライム型の多能性段階へと導くことが示唆された。【０１９０】
以上、実施例１〜９及び１１において示した通り、アミノ末端から２番目の位置において、天然のＴＥＴ１タンパク質のアミノ末端から２番目のアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有する変異型ＴＥＴ１タンパク質をヒト分化多能性幹細胞に導入することにより、その分化能を顕著に向上できることが明らかになった。ひいては、通常ＴＥＴ１タンパク質が積極的に分解されているヒト分化多能性幹細胞等において、当該タンパク質を発現させることができれば、該細胞の分化能を顕著に向上できることが明らかになった。さらに、かかる分化能の向上によって、従来のヒトｉＰＳ細胞において認められた分化誘導の偏り（例えば、実施例５において認められた中内胚葉への多少の分化）を解消できることも明らかになった。さらにまた、かかる分化能の向上は、Ｎ末端から２番目のアミノ酸を異なるアミノ酸に置換し、ジオキシゲナーゼ領域を欠失させた変異型ＴＥＴ１タンパク質によっても達成されることが明らかになった。すなわち、分化能の向上においては、ジオキシゲナーゼ領域が担う脱メチル化活性は必要ではなく、ＴＥＴ１タンパク質のＤＮＡ結合能が維持されていれば十分であることが示された。【０１９１】
また、実施例１０において示した通り、本発明によれば、得られる分化多能性幹細胞の分化能の向上のみならず、ｉＰＳ細胞の誘導効率（製造効率）も高めることができることも明らかになった。【０１９２】
また、前述の通り、ＴＥＴ１タンパク質は、受精卵から胚盤胞までのナイーブな状態にて発現していることが知られている。このことと、本実施例において明らかになった、ヒト分化多能性幹細胞（プライムな状態）においてＴＥＴ１タンパク質が発現していないこと、並びにＴＥＴ１タンパク質導入による分化能の向上とを併せ考えるに、初期発生においては、胚盤胞（ナイーブ）からエピブラスト（プライム）、さらには各胚葉への分化をスムーズに起こすために、ＴＥＴ１タンパク質は機能していることが考えられる。実際、実施例１２〜１４において示した通り、ＴＥＴ１タンパク質は、Ｄｎｍｔ３ａ／ｂの発現を制御することによって、積極的にマウスＥＳ細胞をナイーブ段階からプライム型の多能性段階に導くことが、本発明において明らかになった。【０１９３】
したがって、かかる各細胞種への分化誘導を速やかに行わせるための潤滑油としての作用、換言すれば、発生進行における頑強性（ロバストネス）を付与する機能を有しているのがＴＥＴ１タンパク質であり、本実施例において明らかになったＴＥＴ１タンパク質による分化多能性幹細胞における分化能の向上は、この分化誘導におけるロバストネスが増強されたことにより生じたものであると強く示唆される。
【産業上の利用可能性】
【０１９４】
以上説明したように、本発明によれば、通常ＴＥＴ１タンパク質が積極的に分解されているヒト分化多能性幹細胞等において、当該タンパク質を安定的に発現させることによって、分化誘導の抑制因子であるＮＡＮＯＧ等の発現を速やかに消失させる。また、その一方で、分化誘導に関わる因子の発現を促進させることにより、分化多能性幹細胞の分化能を向上させることが可能となる。【０１９５】
したがって、本発明のＴＥＴ１タンパク質等及び該タンパク質等を利用する分化多能性幹細胞の製造方法は、該細胞における、ＮＡＮＯＧ等の発現による分化誘導に対する抵抗や、中内胚葉マーカーであるＴ及びＳＯＸ１７等の発現による分化誘導の偏りを解消でき、ひいては目的とする細胞のみを極めて高い効率にて得ることができるという点において優れている。そのため、本発明は、多種多様な細胞、組織、臓器等の提供が強く求められている再生医療や創薬開発、並びに生殖医療等において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１９６】
配列番号：７〜４４
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号：４５及び４６
＜２２３＞  ＦＬＡＧタグの配列
【図１】
2014069479.tif 000004
【図２】
2014069479.tif 000005
【図３】
2014069479.tif 000006
【図４】
2014069479.tif 000007
【図５】
2014069479.tif 000008
【図６】
2014069479.tif 000009
【図７】
2014069479.tif 000010
【図８】
2014069479.tif 000011
【図９】
2014069479.tif 000012
【図１０】
2014069479.tif 000013
【図１１】
2014069479.tif 000014
【図１２】
2014069479.tif 000015
【図１３】
2014069479.tif 000016
【図１４】
2014069479.tif 000017
【図１５】
2014069479.tif 000018
【図１６】
2014069479.tif 000019
【図１７】
2014069479.tif 000020
【図１８】
2014069479.tif 000021
【図１９】
2014069479.tif 000022
【図２０】
2014069479.tif 000023
【図２１】
2014069479.tif 000024
【図２２】
2014069479.tif 000025
【図２３】
2014069479.tif 000026
【図２４】
2014069479.tif 000027
【図２５】
2014069479.tif 000028
【図２６】
2014069479.tif 000029
【図２７】
2014069479.tif 000030
【図２８】
2014069479.tif 000031
【図２９】
2014069479.tif 000032
【図３０】
2014069479.tif 000033
【図３１】
2014069479.tif 000034
【図３２】
2014069479.tif 000035
【図３３】
2014069479.tif 000036
【図３４】
2014069479.tif 000037
【図３５】
2014069479.tif 000038
【図３６】
2014069479.tif 000039
【図３７】
2014069479.tif 000040
【図３８】
2014069479.tif 000041
【図３９】
2014069479.tif 000042
【図４０】
2014069479.tif 000043
【図４１】
2014069479.tif 000044
【図４２】
2014069479.tif 000045
【図４３】
2014069479.tif 000046
【図４４】
2014069479.tif 000047
【図４５】
2014069479.tif 000048
【図４６】
2014069479.tif 000049
【図４７】
2014069479.tif 000050
【図４８】
2014069479.tif 000051
【図４９】
2014069479.tif 000052
【図５０】
2014069479.tif 000053
【図５１】
2014069479.tif 000054
【図５２】
2014069479.tif 000055
【図５３】
2014069479.tif 000056
【図５４】
2014069479.tif 000057
【配列表】
2014069479000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年5月27日(2015.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化能を向上させた分化多能性幹細胞の製造方法であって、
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの分子を、分化多能性幹細胞又は該細胞に誘導するための体細胞に導入する工程を含む方法
（ａ）ＴＥＴ１タンパク質
（ｂ）ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸
（ｃ）ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクター。
【請求項２】
前記ＴＥＴ１タンパク質は、変異型ＴＥＴ１タンパク質であって、正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上しているタンパク質である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、そのアミノ末端から２番目のアミノ酸残基が正常型ＴＥＴ１タンパク質のアミノ末端から２番目のアミノ酸残基とは異なるＴＥＴ１タンパク質である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、さらにジオキシゲナーゼ領域を欠失しているＴＥＴ１タンパク質である、請求項２又は３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記ＴＥＴ１タンパク質は、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
変異型ＴＥＴ１タンパク質であって、正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上しているタンパク質。
【請求項７】
アミノ末端から２番目のアミノ酸残基が正常型ＴＥＴ１タンパク質のアミノ末端から２番目のアミノ酸残基とは異なる、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
さらにジオキシゲナーゼ領域が欠失している、請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
配列番号：４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１０】
請求項６〜９のうちのいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸が挿入されているベクター。
【請求項１２】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの分子が導入されている、分化多能性幹細胞又は該細胞に誘導するための体細胞
（ａ）ＴＥＴ１タンパク質
（ｂ）ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸
（ｃ）ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクター。
【請求項１３】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記ジオキシゲナーゼ領域は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列においては、１６１１〜２０７４番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列においては、１６４０〜２１０３番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号：６に記載のアミノ酸配列においては、８０９〜１２７２番目のアミノ酸からなる領域である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から１番目と２番目とのアミノ酸残基間に１又は複数のアミノ酸が挿入されているＴＥＴ１タンパク質、または正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端に直接１又は複数のアミノ酸が付加されているＴＥＴ１タンパク質である、請求項２に記載の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
【図１】プロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２）存在下又は非存在下において、ヒトｉＰＳ細胞株（＃５８、＃２３７及び＃１０５）におけるＴＥＴ１タンパク質の発現量を、ウェスタンブロット法により分析した結果を示す写真である。
【図２】ＭＧ１３２存在下又は非存在下において、ヒトｉＰＳ細胞株（＃５８、＃２３７及び＃１０５）におけるＴＥＴ１ｍＲＮＡの発現量を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により分析した結果を示すグラフである。なお、図中縦軸は、同一サンプルに対して３つの反応を行い、その平均値を求め、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内部標準として標準化した相対的な値を示す。また、それぞれのカラムにおける誤差バーは標準誤差を示している（図５、８〜２３において同じ）。
【図３】ヒトｉＰＳ細胞において発現している３種類のＴＥＴ１遺伝子産物の構造を示す概略図である。上段に、Ｒｅｆｓｅｑとして既に公知となっているＴＥＴ１遺伝子のコーディング領域（ＣＤＳ）及び該ＣＤＳがコードするタンパク質の構造を示す。中段及び下段に、本発明者らが今回新たに見出した２種のＴＥＴ１遺伝子スプライスバリアントのＣＤＳ及び該ＣＤＳがコードするタンパク質の構造を示す。
【図４】Ｎ末にＦＬＡＧタグを配したＴＥＴ１を強制発現したヒトｉＰＳ細胞株（ＮＦＬＡＧ  ＴＥＴ１ＯＥ）と、Ｃ末にＦＬＡＧタグを配したＴＥＴ１を強制発現した株（ＣＦＬＡＧ  ＴＥＴ１ＯＥ）と、ベクターのみを発現したコントロールヒトｉＰＳ細胞株（ｐＣＡＧ−ＩＰ）とにおけるＴＥＴ１タンパク質の発現量を、ウェスタンブロット法により分析した結果を示す写真である。
【図５】ＮＦＬＡＧ  ＴＥＴ１ＯＥと、ＣＦＬＡＧ  ＴＥＴ１ＯＥと、ｐＣＡＧ−ＩＰとにおけるＴＥＴ１ｍＲＮＡの発現量を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により分析した結果を示すグラフである。
【図６】改変ＴＥＴ１タンパク質の改変部位と安定性との相関を分析するために用いた、改変ＴＥＴ１タンパク質の構造を示す概略図である。図中、上から一段目はヒトＴＥＴ１遺伝子（バリアント２）のＣＤＳ及び該ＣＤＳがコードするタンパク質の構造を示す。上から二段目はヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質（♯９３）の構造を示す。上から三段目は、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質（♯９４）の構造を示す。上から四段目は、Ｎ末にＦＬＡＧタグを付加したヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質（♯９５）の構造を示す。
【図７】図６に示した構造を有するＧＦＰ融合ＴＥＴ１タンパク質（♯９３、♯９４及び♯９５）を各々導入したヒトｉＰＳ細胞をＦＡＣＳにて分析した結果を示すヒストグラムである。なお、図中「ヒトｉＰＳ細胞」で示されるヒストグラムは、ネガティブコントロールとしてＧＦＰを発現しないｉＰＳ細胞を分析した結果を示す。
【図８】ヒトｉＰＳ細胞（図中「ｈｉＰＳＣ」）と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞（図中「ＴＥＴ１ｏ／ｅ−ｈｉＰＳＣ」）とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＴＥＴ１  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。図中の横軸は、神経細胞への分化誘導を開始してからの日数を示す（図９〜２３において同様）。
【図９】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＤＮＭＴ３Ａ  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１０】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＤＮＭＴ３Ｂ  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１１】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＮＡＮＯＧ  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１２】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＯＣＴ３／４  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１３】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＳＯＸ２  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１４】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＳＯＸ１  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１５】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＮＥＵＲＯＧＥＮＩＮ１  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１６】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＮＥＵＲＯＧＥＮＩＮ２  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１７】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＮＥＵＲＯＤ１  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１８】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＡＳＣＬ１  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図１９】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＰＡＸ６  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図２０】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＺＮＦ５２１  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図２１】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＯＴＸ２  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図２２】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、Ｔ  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図２３】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、神経細胞に分化誘導した際の、ＳＯＸ１７  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図２４】ヒトｉＰＳ細胞を１２日間かけ神経細胞に分化誘導した後、ラミニンをコートした培養皿に播種し直し、更に１４日間培養した細胞を観察した結果を示す顕微鏡写真である。図中の矢印は、神経細胞の細胞体の塊が認められた箇所を示す。
【図２５】Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞を、１２日間かけ神経細胞に分化誘導した後、ラミニンをコートした培養皿に播種し直し、更に１４日間培養した細胞を観察した結果を示す顕微鏡写真である。
【図２６】ヒトｉＰＳ細胞（図中「ｈｉＰＳＣ」）と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞（図中「ＴＥＴ１ｏ／ｅ−ｈｉＰＳＣ」）とを、内胚葉系に分化誘導した際の、ＮＡＮＯＧ  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。図中の縦軸は、ヒトｉＰＳ細胞での分化誘導前の状態における発現量を１とした場合の相対量を示し、横軸は、内胚葉系への分化誘導を開始してからの日数を示す（図２７〜２９において同様）。
【図２７】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、内胚葉系に分化誘導した際の、ＳＯＸ１７  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図２８】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、内胚葉系に分化誘導した際の、ＨＮＦ４Ａ  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図２９】ヒトｉＰＳ細胞と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞とを、内胚葉系に分化誘導した際の、ＦＯＸＡ２  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図３０】空ベクターを導入したヒトｉＰＳ細胞（図中「ｐＣＡＧ−ＩＰ」）、ヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞（図中「♯９３」）、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞（図中「♯９４」）、及び、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質（全長）を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞（図中「ＴＥＴ１ｏ／ｅ」）を、各々神経細胞に分化誘導した際の、ＮＡＮＯＧ  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。図中の縦軸は、ｐＣＡＧＩＰの分化前の値を１とした相対値を示す（図３２において同様）。図中の横軸は、神経細胞への分化誘導を開始してからの日数を示す（図３１及び３２において同様）。
【図３１】空ベクターを導入したヒトｉＰＳ細胞、ヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞、及び、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質（全長）を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞を、各々神経細胞に分化誘導した際の、ＳＯＸ１  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。図中の縦軸は、空ベクターを導入したヒトｉＰＳ細胞（ｐＣＡＧＩＰ）の分化前の値が測定感度以下であったため、任意の相対値を示す。
【図３２】空ベクターを導入したヒトｉＰＳ細胞、ヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質のＮ末部分（６７０アミノ酸からなるタンパク質）とＧＦＰタグとを融合させたタンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞、及び、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質（全長）を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞を、各々神経細胞に分化誘導した際の、ＯＴＸ２  ｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示すグラフである。
【図３３】質の良いｉＰＳ細胞から構成されるコロニー（図中「Ｆｒｃｓ」）及び質の悪いｉＰＳ細胞から構成されるコロニー（図中「Ｐｒｃｓ」）の外観の例を示す顕微鏡写真である。
【図３４】モックベクターが導入されたヒトｉＰＳ細胞（「ｍｖ−ｉＰＳＣ」とも称する、図３５及び３６においても同じ）と、Ｎ末にＦＬＡＧタグが付加されたＴＥＴ１タンパク質を強制発現させたヒトｉＰＳ細胞（「ＴＥＴ１−ｉＰＳＣ」とも称する、図３５及び３６においても同じ）との細胞増殖曲線を示すグラフである。図中、横軸は日数を示す。
【図３５】ｍｖ−ｉＰＳＣ及びＴＥＴ１−ｉＰＳＣの細胞周期についてＦＡＣＳにて解析した結果を示すヒストグラムである。図中、各ヒストグラムの下にＧ１、Ｓ及びＧ２期における細胞数の割合も併記する。
【図３６】ＤＮＡマイクロアレイ解析において、ＴＥＴ１−ｉＰＳＣと比較してｍｖ−ｉＰＳＣにおいて発現の異なる遺伝子を示す、散布図である。ＤＮＡマイクロアレイ解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ社製  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ＧＥ  ８ｘ６０Ｋ  ｖ２  １カラープラットフォームを用い、７５パーセンタイルシフト方法にて行った。
【図３７】マウスＥＳ細胞のナイーブ段階からプライム段階への移行過程を示す、概略図である。すなわち、ナイーブ段階のおいては、白血病阻止因子（ＬＩＦ）及びナイーブ段階への移行を促進するその他の物質を除外した培地にてマウスＥＳ細胞を維持し、該細胞をＦＧＦ２及びアクチビンＡ（ＴＧＦβ／Ｎｏｄａｌシグナル伝達のアゴニスト）を添加した培地に移すことでプライム段階への移行を誘導させたことを示す、概略図である。
【図３８】ｑＰＣＲによる解析結果において、ナイーブ段階からプライム段階への移行過程において、エピブラストマーカーの発現が亢進していることを示す、グラフである。図中、各マーカーの発現を示す棒グラフにおいては、左から順に、プライム段階への移行の誘導を開始してから０時間、２４時間、４８時間後の結果を示す（時間に関する表記については、図４０〜５４において同様）。
【図３９】Ｔｅｔ１ノックダウン（Ｔｅｔ１−ＫＤ）マウスＥＳ細胞からエピブラスト様幹細胞（ＥｐｉＬＣ）に至る過程を示す概略図である。Ｔｅｔ１−ＫＤマウスＥＳ細胞は、Ｔｅｔ１  ｓｈＲＮＡを導入し、ピューロマイシン耐性を指標として選択することにより、樹立した（Ｋ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７３，３４３（Ｍａｙ  １９，２０１１）  参照）。
【図４０】マウスＥＳ細胞のナイーブ段階からプライム段階への移行過程における、Ｔｅｔ１ノックダウンによる影響を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示すグラフである。図中、「Ｔｅｔ１ＫＤ」は、Ｔｅｔ１をノックダウンさせたマウスＥＳ細胞の結果を示す。「ＧＦＰＫＤ」は、Ｔｅｔ１ＫＤ細胞のコントロールとして、ＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡを導入したマウスＥＳ細胞の結果を示す。「ＩＣＭ」はＩＣＭ／ナイーブ型マーカーの転写レベルを解析した結果であることを示す。
【図４１】ナイーブ段階からプライム段階への移行過程において、Ｔｅｔ１−ＫＤマウスＥＳ細胞（Ｔｅｔ１ＫＤ）及びそのコントロール（ＧＦＰ−ＫＤ）における、Ｔｅｔ１、エピブラストマーカー（Ｅｐｉ）及び原始内胚葉マーカー（ＰＥ）についての転写レベルをｑＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。
【図４２】Ｔｅｔ１−ＫＤマウスＥＳ細胞（Ｔｅｔ１ＫＤ）及びＧＦＰ−ＫＤマウスＥＳ細胞（ＧＦＰ−ＫＤ）における、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２、ＩＣＭマーカー及びエピブラストマーカーのタンパク質発現レベルを、ウェスタンブロットにより解析した結果を示す、写真である。なお、ナイーブ型因子（特に、Ｎａｎｏｇ、Ｅｓｒｒｂ、Ｔｂｘ３及びＳｔａｔ３）のタンパク質レベルの発現は、Ｔｅｔ１−ＫＤ  ＥｐｉＬＣにおいて維持されていた。
【図４３】ＪＡＫ阻害剤の存在下（ＪＡＫｉ  ＋）又は非存在下（ＪＡＫｉ  −）において、ナイーブ段階からプライム段階への移行過程におけるＳｔａｔ３、Ｄｎｍｔ３ａ及びＤｎｍｔ３ｂについてのタンパク質発現レベルを、ウェスタンブロットにより解析した結果を示す写真である。ＪＡＫ阻害剤としてＪＡＫインヒビターＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、培地への添加濃度：１μＭ）を用いた。また、Ｄｎｍｔ３ａに関しては、ウェスタンブロッティングにより２つのバリアント（ｖ１及びｖ２）を検出した。
【図４４】ＪＡＫ阻害剤の存在下（ＪＡＫｉ  ＋）又は非存在下（ＪＡＫｉ  −）において、ナイーブ段階からプライム段階への移行過程におけるＧａｔａ６転写レベルをｑＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。
【図４５】ＭＧ１３２存在下（ＭＧ１３２＋）又は非存在下（ＭＧ１３２−）において、ナイーブ段階からプライム段階への移行過程におけるマウスＥＳ細胞のＴｅｔ１  ｍＲＮＡの発現レベルを示す、グラフである。
【図４６】ＭＧ１３２存在下（ＭＧ１３２  ＋）又は非存在下（ＭＧ１３２  −）において、ナイーブ段階からプライム段階への移行過程におけるマウスＥＳ細胞のＴｅｔ１タンパク質の発現レベルを、ウェスタンブロットにより解析した結果を示す、写真である。図中の数値は、アクチンの発現量を基準に補正した、Ｔｅｔ１タンパク質の発現量を示す。
【図４７】ナイーブ段階からプライム段階への移行過程におけるＴｃｌ１のメチル化可変領域（ＤＭＲ）をバイサルファイトシークエンシングにより解析した結果を示す図である。図中、黒丸はメチル化（ヒドロキシメチル化）されたＣｐＧ部位を示し、白丸は非メチル化ＣｐＧ部位を示す。バイサルファイトシークエンシングは、Ｈ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７３，３８９（Ｍａｙ１９，２０１１）に記載を参照して行った。
【図４８】Ｔｅｔ１／Ｐｒｄｍ１４ダブルノックダウンマウスＥＳ細胞の、ナイーブ段階からプライム段階への移行過程に至る過程を示す概略図である。
【図４９】ナイーブ段階からプライム段階への移行過程における、Ｔｅｔ１／Ｐｒｄｍ１４ダブルノックダウンマウスＥＳ細胞のＯｔｘ２  ｍＲＮＡ発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。「ＧＦＰＫＤ  ＧＦＰＫＤ」は、ＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡを導入して樹立した細胞株（コントロール）の結果を示し、「ＧＦＰＫＤ  Ｐ１４ＫＤ♯１〜３」は、ＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡ及びＰｒｄｍ１４を標的とするｓｈＲＮＡを導入して樹立した各細胞株における結果を示し、「Ｔｅｔ１ＫＤ  ＧＦＰＫＤ」は、ＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡ及びＴｅｔ１を標的とするｓｈＲＮＡを導入して樹立した細胞株における結果を示し、「Ｔｅｔ１ＫＤ  Ｐ１４ＫＤ♯１〜３」は、Ｔｅｔ１を標的とするｓｈＲＮＡ及びＰｒｄｍ１４を標的とするｓｈＲＮＡを導入して樹立した各細胞株における結果を示す（図中の細胞株表記については、図５０〜５２においても同様）。
【図５０】ナイーブ段階からプライム段階への移行過程における、Ｔｅｔ１／Ｐｒｄｍ１４ダブルノックダウンマウスＥＳ細胞のＤｎｍｔ３ａ  ｍＲＮＡ発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。
【図５１】ナイーブ段階からプライム段階への移行過程における、Ｔｅｔ１／Ｐｒｄｍ１４ダブルノックダウンマウスＥＳ細胞のＤｎｍｔ３ｂ  ｍＲＮＡ発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。
【図５２】ナイーブ段階からプライム段階への移行過程における、Ｔｅｔ１／Ｐｒｄｍ１４ダブルノックダウンマウスＥＳ細胞のＧａｔａ６  ｍＲＮＡ発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。
【図５３】ナイーブ段階からプライム段階への移行過程における、Ｄｎｍｔ３ａ１過剰発現マウスＥＳ細胞（３ａ１ＯＥ）、Ｄｎｍｔ３ａ２過剰発現マウスＥＳ細胞（３ａ２ＯＥ）及びＤｎｍｔ３ｂ過剰発現マウスＥＳ細胞（３ｂＯＥ）のＯｔｘ２  ｍＲＮＡ発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。「ＧＦＰＫＤ  ｐＣＡＧ−ＩＨ」は、モックベクター（ｐＣＡＧ−ＩＨ）及びＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡを導入して樹立した細胞株（コントロール）の結果を示し、「ＧＦＰＫＤ  ３ａ１ＯＥ」は、ＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡとＤｎｍｔ３ａ１をコードするｐＣＡＧ−ＩＨベクターとを導入して樹立した各細胞株における結果を示し、「ＧＦＰＫＤ  ３ａ２ＯＥ」は、ＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡとＤｎｍｔ３ａ２をコードするｐＣＡＧ−ＩＨベクターとを導入して樹立した各細胞株における結果を示し、「ＧＦＰＫＤ  ３ｂＯＥ」は、ＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡとＤｎｍｔ３ｂをコードするｐＣＡＧ−ＩＨベクターとを導入して樹立した各細胞株における結果を示す。また、「Ｔｅｔ１ＫＤ  ｐＣＡＧ−ＩＨ」は、モックベクター及びＴｅｔ１を標的とするｓｈＲＮＡを導入して樹立した細胞株（コントロール）の結果を示し、「Ｔｅｔ１ＫＤ  ３ａ１ＯＥ」は、Ｔｅｔ１を標的とするｓｈＲＮＡとＤｎｍｔ３ａ１をコードするｐＣＡＧ−ＩＨベクターとを導入して樹立した各細胞株における結果を示し、「Ｔｅｔ１ＫＤ  ３ａ２ＯＥ」は、Ｔｅｔ１を標的とするｓｈＲＮＡとＤｎｍｔ３ａ２をコードするｐＣＡＧ−ＩＨベクターとを導入して樹立した各細胞株における結果を示し、「Ｔｅｔ１ＫＤ  ３ｂＯＥ」は、Ｔｅｔ１を標的とするｓｈＲＮＡとＤｎｍｔ３ｂをコードするｐＣＡＧ−ＩＨベクターとを導入して樹立した各細胞株における結果を示す（図中の細胞株表記については、図５４においても同様）
【図５４】ナイーブ段階からプライム段階への移行過程における、Ｄｎｍｔ３ａ１過剰発現マウスＥＳ細胞（３ａ１ＯＥ）、Ｄｎｍｔ３ａ２過剰発現マウスＥＳ細胞（３ａ２ＯＥ）及びＤｎｍｔ３ｂ過剰発現マウスＥＳ細胞（３ｂＯＥ）のＧａｔａ６  ｍＲＮＡ発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。
【手続補正書】
【提出日】平成27年12月3日(2015.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化能が向上した分化多能性幹細胞の製造方法であって、
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの分子を、分化多能性幹細胞又は該細胞に誘導するための体細胞に導入する工程を含む、分化能が向上した分化多能性幹細胞の製造方法
（ａ）そのＮ末端から２番目のアミノ酸残基が正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から２番目のアミノ酸残基とは異なるＴＥＴ１タンパク質である、変異型ＴＥＴ１タンパク質
（ｂ）前記変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸
（ｃ）前記変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクター。
【請求項２】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質である、請求項１に記載の分化能が向上した分化多能性幹細胞の製造方法。
【請求項３】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から１番目と２番目とのアミノ酸残基間に１又は複数のアミノ酸が挿入されているＴＥＴ１タンパク質、または正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端に直接１又は複数のアミノ酸が付加されているＴＥＴ１タンパク質である、請求項１に記載の分化能が向上した分化多能性幹細胞の製造方法。
【請求項４】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、さらにジオキシゲナーゼ領域を欠失しているＴＥＴ１タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分化能が向上した分化多能性幹細胞の製造方法。
【請求項５】
前記ジオキシゲナーゼ領域は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列においては、１６１１〜２０７４番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列においては、１６４０〜２１０３番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号：６に記載のアミノ酸配列においては、８０９〜１２７２番目のアミノ酸からなる領域である、請求項４に記載の分化能が向上した分化多能性幹細胞の製造方法。
【請求項６】
前記正常型ＴＥＴ１タンパク質は、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分化能が向上した分化多能
性幹細胞の製造方法。
【請求項７】
変異型ＴＥＴ１タンパク質であって、そのＮ末端から２番目のアミノ酸残基が正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から２番目のアミノ酸残基とは異なり、正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上している、変異型ＴＥＴ１タンパク質。
【請求項８】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質である、請求項７に記載の変異型ＴＥＴ１タンパク質。
【請求項９】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から１番目と２番目とのアミノ酸残基間に１又は複数のアミノ酸が挿入されているＴＥＴ１タンパク質、または正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端に直接１又は複数のアミノ酸が付加されているＴＥＴ１タンパク質である、請求項７に記載の変異型ＴＥＴ１タンパク質。
【請求項１０】
さらにジオキシゲナーゼ領域が欠失している、請求項７〜９のいずれか一項に記載の変異型ＴＥＴ１タンパク質。
【請求項１１】
前記ジオキシゲナーゼ領域は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列においては、１６１１〜２０７４番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列においては、１６４０〜２１０３番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号：６に記載のアミノ酸配列においては、８０９〜１２７２番目のアミノ酸からなる領域である、請求項１０に記載の変異型ＴＥＴ１タンパク質。
【請求項１２】
前記正常型ＴＥＴ１タンパク質は、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の変異型ＴＥＴ１タンパク質。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれか一項に記載の変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸が挿入されているベクター。
【請求項１５】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの分子が導入されている、分化多能性幹細胞又は該細胞に誘導するための体細胞
（ａ）請求項７〜１２のいずれか一項に記載の変異型ＴＥＴ１タンパク質
（ｂ）前記変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸
（ｃ）前記変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクター。 
【手続補正書】
【提出日】平成28年4月8日(2016.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化能が向上したヒト分化多能性幹細胞の製造方法であって、
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの分子を、ヒト分化多能性幹細胞に導入する工程を含む、分化能が向上したヒト分化多能性幹細胞の製造方法
（ａ）そのＮ末端から２番目のアミノ酸残基が、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から２番目のアミノ酸残基とは異なるＴＥＴ１タンパク質であって、前記正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上した、変異型ＴＥＴ１タンパク質
（ｂ）前記変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸
（ｃ）前記変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクター。
【請求項２】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基またはアスパラギン酸残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質である、請求項１に記載の分化能が向上したヒト分化多能性幹細胞の製造方法。
【請求項３】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から１番目と２番目とのアミノ酸残基間に１〜５０個のアミノ酸が挿入されているＴＥＴ１タンパク質、または正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端に直接１〜５０個のアミノ酸が付加されているＴＥＴ１タンパク質である、請求項１に記載の分化能が向上したヒト分化多能性幹細胞の製造方法。
【請求項４】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、さらに、配列番号：２に記載のアミノ酸配列においては、１６１１〜２０７４番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列においては、１６４０〜２１０３番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号：６に記載のアミノ酸配列においては、８０９〜１２７２番目のアミノ酸からなる領域である、ジオキシゲナーゼ領域を欠失しているＴＥＴ１タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分化能が向上したヒト分化多能性幹細胞の製造方法。
【請求項５】
ヒト分化多能性幹細胞の製造方法であって、
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの分子を、ヒト分化多能性幹細胞に誘導するためのヒト体細胞に導入する工程を含む、ヒト分化多能性幹細胞の製
造方法
（ａ）そのＮ末端から２番目のアミノ酸残基が、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から２番目のアミノ酸残基とは異なるＴＥＴ１タンパク質であって、前記正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上した、変異型ＴＥＴ１タンパク質
（ｂ）前記変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸
（ｃ）前記変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクター。
【請求項６】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基またはアスパラギン酸残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質である、請求項５に記載のヒト分化多能性幹細胞の製造方法。
【請求項７】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から１番目と２番目とのアミノ酸残基間に１〜５０個のアミノ酸が挿入されているＴＥＴ１タンパク質、または正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端に直接１〜５０個のアミノ酸が付加されているＴＥＴ１タンパク質である、請求項５に記載のヒト分化多能性幹細胞の製造方法。
【請求項８】
変異型ＴＥＴ１タンパク質であって、そのＮ末端から２番目のアミノ酸残基が、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から２番目のアミノ酸残基とは異なり、前記正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上している、変異型ＴＥＴ１タンパク質。
【請求項９】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基またはアスパラギン酸残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質である、請求項８に記載の変異型ＴＥＴ１タンパク質。
【請求項１０】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から１番目と２番目とのアミノ酸残基間に１〜５０個のアミノ酸が挿入されているＴＥＴ１タンパク質、または正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端に直接１〜５０個のアミノ酸が付加されているＴＥＴ１タンパク質である、請求項８に記載の変異型ＴＥＴ１タンパク質。
【請求項１１】
さらに、配列番号：２に記載のアミノ酸配列においては、１６１１〜２０７４番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列においては、１６４０〜２１０３番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号：６に記載のアミノ酸配列においては、８０９〜１２７２番目のアミノ酸からなる領域である、ジオキシゲナーゼ領域が欠失している、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の変異型ＴＥＴ１タンパク質。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載の変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸が挿入されているベクター。
【請求項１４】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの分子が導入されている、ヒト分化多能性幹細胞又は該細胞に誘導するためのヒト体細胞
（ａ）請求項８〜１０のいずれか一項に記載の変異型ＴＥＴ１タンパク質
（ｂ）前記変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸
（ｃ）前記変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクター。
【手続補正書】
【提出日】平成28年6月17日(2016.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化能が向上したヒト分化多能性幹細胞の製造方法であって、
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの分子を、ヒト分化多能性幹細胞に導入する工程を含む、分化能が向上したヒト分化多能性幹細胞の製造方法
（ａ）そのＮ末端から２番目のアミノ酸残基が、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から２番目のアミノ酸残基とは異なるＴＥＴ１タンパク質であって、ｉ）正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から２番目のセリン残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するＴＥＴ１タンパク質、およびii）正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から１番目と２番目のアミノ酸残基間に１〜５０個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を有するＴＥＴ１タンパク質からなる群より選択され、前記正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上した、変異型ＴＥＴ１タンパク質
（ｂ）前記変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸
（ｃ）前記変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクター。
【請求項２】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基またはアスパラギン酸残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質である、請求項１に記載の分化能が向上したヒト分化多能性幹細胞の製造方法。
【請求項３】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、さらに、配列番号：２に記載のアミノ酸配列においては、１６１１〜２０７４番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列においては、１６４０〜２１０３番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号：６に記載のアミノ酸配列においては、８０９〜１２７２番目のアミノ酸からなる領域である、ジオキシゲナーゼ領域を欠失しているＴＥＴ１タンパク質である、請求項１または２に記載の分化能が向上したヒト分化多能性幹細胞の製造方法。
【請求項４】
ヒト分化多能性幹細胞の製造方法であって、
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの分子を、ヒト分化多能性幹細胞に誘導するためのヒト体細胞に導入する工程を含む、ヒト分化多能性幹細胞の製造方法
（ａ）そのＮ末端から２番目のアミノ酸残基が、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ
酸配列からなるタンパク質である正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から２番目のアミノ酸残基とは異なるＴＥＴ１タンパク質であって、ｉ）正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から２番目のセリン残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するＴＥＴ１タンパク質、およびii）正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から１番目と２番目のアミノ酸残基間に１〜５０個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を有するＴＥＴ１タンパク質からなる群より選択され、前記正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上した、変異型ＴＥＴ１タンパク質
（ｂ）前記変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸
（ｃ）前記変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクター。
【請求項５】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基またはアスパラギン酸残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質である、請求項４に記載のヒト分化多能性幹細胞の製造方法。
【請求項６】
変異型ＴＥＴ１タンパク質であって、そのＮ末端から２番目のアミノ酸残基が、配列番号：２、４又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から２番目のアミノ酸残基とは異なり、ｉ）正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から２番目のセリン残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するＴＥＴ１タンパク質、およびii）正常型ＴＥＴ１タンパク質のＮ末端から１番目と２番目のアミノ酸残基間に１〜５０個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を有するＴＥＴ１タンパク質からなる群より選択され、前記正常型ＴＥＴ１タンパク質と比較して安定性が向上している、変異型ＴＥＴ１タンパク質。
【請求項７】
前記変異型ＴＥＴ１タンパク質は、Ｎ末端から２番目の位置においてセリン残基をグリシン残基またはアスパラギン酸残基に置換したヒトＴＥＴ１タンパク質である、請求項６に記載の変異型ＴＥＴ１タンパク質。
【請求項８】
さらに、配列番号：２に記載のアミノ酸配列においては、１６１１〜２０７４番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列においては、１６４０〜２１０３番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号：６に記載のアミノ酸配列においては、８０９〜１２７２番目のアミノ酸からなる領域である、ジオキシゲナーゼ領域が欠失している、請求項６または７に記載の変異型ＴＥＴ１タンパク質。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸が挿入されているベクター。
【請求項１１】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの分子が導入されている、ヒト分化多能性幹細胞又は該細胞に誘導するためのヒト体細胞
（ａ）請求項６〜８のいずれか一項に記載の変異型ＴＥＴ１タンパク質
（ｂ）前記変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸
（ｃ）前記変異型ＴＥＴ１タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクター。
【国際調査報告】
2014069479.tif 000058
2014069479.tif 000059
2014069479.tif 000060
2014069479.tif 000061