(57)【要約】【課題】癌の治療剤、特に癌の細胞増殖抑制剤、癌の転移抑制又は予防剤、前記剤を利用した医薬、癌治療の効果を判定する方法、癌治療の予後を予測する方法、癌の増殖抑制作用を有する物質のスクリーニング方法、及び癌の転移阻害作用を有する物質のスクリーニング方法の提供。【解決手段】少なくとも配列番号１又は２と７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る核酸であって、タンパク質発現抑制活性を示す核酸を含有する医薬。【選択図】図３【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも以下の：
（１）配列番号１又は配列番号２で示されるヌクレオチド配列から成る核酸；
（２）配列番号１又は配列番号２と７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る核酸であって、タンパク質発現抑制活性を示す核酸；又は
（３）上記（１）又は（２）のヌクレオチド配列及び当該ヌクレオチド配列と相補的な配列を含み、それにより鎖中の全部又は一部に二本鎖構造を形成する一本鎖又は二本鎖の核酸、
を含有することを特徴とする、癌治療のための医薬。
【請求項２】
前記核酸が、二本鎖の核酸である、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
核酸が配列番号１で示されるヌクレオチド配列又はその部分配列から成る、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
核酸が配列番号２で示されるヌクレオチド配列又はその部分配列から成る、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項５】
核酸がｍｉＲ５８２のヌクレオチド配列を含み、且つタンパク質発現抑制活性を示す、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項６】
核酸がｍｉＲ５８２及びその前駆体からなる群より選ばれる少なくとも一つの核酸である、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項７】
核酸がｍｉＲ５８２である、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項８】
核酸が修飾された核酸である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項９】
癌が、ｍｉＲ５８２の発現が減少している癌である請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１０】
癌が、膀胱癌である請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１１】
癌が、グレード２以上の膀胱癌である請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸を含有する、癌の転移を抑制又は予防するための医薬。
【請求項１３】
経尿道的に哺乳動物に投与される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬の治療効果を予測する方法であって、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬投与前に癌における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度を測定する工程を含む方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬の治療効果を予測する方法であって、癌におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数を測定する工程を含む方法。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬の治療効果を判定する方法であって、癌における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度を測定する工程を含む方法。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬の治療効果を判定する方法であって、癌におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数を測定する工程を含む方法。
【請求項１８】
癌治療の予後を判定する方法であって、癌における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度を測定する工程を含む方法。
【請求項１９】
癌治療の予後を判定する方法であって、癌におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数を測定する工程を含む方法
【請求項２０】
癌が膀胱癌である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項２１】
癌が膀胱癌である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２２】
癌が膀胱癌である、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号１又は配列番号２に記載の核酸を特異的に検出し得る核酸プローブを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬の効果を判定するための組成物。
【請求項２４】
以下の（１）〜（３）の工程を含む、癌の増殖を抑制し得る物質を探索する方法；
（１）被検物質と配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被検物質を接触させた細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現量と比較する工程、及び
（３）上記（２）の比較結果に基づいて、配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現量を上昇制御する被検物質を、癌の増殖を阻害し得る物質として選択する工程。
【請求項２５】
以下の（１）〜（３）の工程を含む、癌の転移又は癌細胞の浸潤能を阻害し得る物質を探索する方法；
（１）被検物質と配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現を測定可能な細胞とを接触させる工程；
（２）被検物質を接触させた細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸発現量と比較する工程、及び
（３）上記（２）の比較結果に基づいて、配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現量を上昇制御する被検物質を、癌の転移又は癌細胞の浸潤能を阻害し得る物質として選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療剤、特に癌の細胞増殖抑制剤、癌の転移抑制又は予防剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）技術は、生命科学研究に頻繁に利用され、その有用性は広く確認されてきている。ＲＮＡｉとは、二本鎖ＲＮＡによって配列特異的にｍＲＮＡが分解され、その結果遺伝子の発現が抑制される現象をいう。２００１年に２１塩基の低分子二本鎖ＲＮＡが哺乳動物細胞内でＲＮＡｉを媒介できることが報告されてから（非特許文献１）、ｓｉＲＮＡ  （ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）  は、標的遺伝子の発現抑制方法として頻用されている。また、ｓｉＲＮＡは、医薬品への応用や、癌を含む種々の難治性疾患の治療への応用が期待されている。【０００３】
ｍｉＲＮＡ
ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）は、ゲノム上にコードされた内在性の２０〜２５塩基程度の非コード（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ上のｍｉＲＮＡ遺伝子から、まず数百〜数千塩基程度の長さの一次転写物（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｉＲＮＡ：以下、「Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」と呼ぶことがある。）として転写され、次にプロセッシングを受けて約６０〜７０塩基程度のヘアピン構造を有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｓｏｒ  ｍｉＲＮＡ）となる。その後、核から細胞質内ヘ移動し、さらにプロセッシングを受けて２０〜２５塩基程度の二本鎖成熟ｍｉＲＮＡとなる。二本鎖成熟ｍｉＲＮＡは、そのうちの一本鎖がＲＩＳＣ（ＲＮＡ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれるタンパク質との複合体を形成し、標的遺伝子のｍＲＮＡに作用することで、標的遺伝子の翻訳を阻害する働きをすることが知られている（非特許文献１）。ｍｉＲＮＡは、ヒトやマウスなどで１０００種類以上が知られており、それぞれが複数の標的遺伝子の発現を調節し、細胞の増殖や分化など、様々な生命現象に関与することが示唆されている。例えば、造血細胞や神経細胞の分化などに関与するｍｉＲＮＡについての報告がある（非特許文献２）。また、癌細胞の増殖に関与するｍｉＲＮＡについても報告があり、ｍｉＲＮＡの発現パターンを癌の臨床診断に利用することや、ｍｉＲＮＡの発現を抑制することで癌細胞の増殖を抑制する癌の治療法について、提案がなされている（特許文献１、２）。  ｍｉｒ５８２はｍｉＲＮＡの一つとして知られている。（非特許文献３）【０００４】
膀胱癌
膀胱の癌は前癌性の病変として一般に生じ、浸潤性癌へと変化し得る。一部は転移して増殖することもある。最も一般的な膀胱癌は、上皮起源の移行上皮癌であり、全ての膀胱癌の９０％を占めている。表在性膀胱悪性腫瘍の患者は外科的に除去することができるが再発の傾向が大きい。また、下部筋肉組織へ深く浸潤する膀胱悪性腫瘍の場合は、５年生存率が約５０％まで減じる。【０００５】
いずれにせよ、外科手術がこれら膀胱癌の主要な治療法である。手術の範囲は疾患の病期により決定されるが、早期疾患は、一般に膀胱内化学療法及び経尿道的切除により治療可能である。膀胱壁と同じ部位又は他の部位での癌の発現及び再発の重症度を減じるために、外科手術は化学療法薬又は免疫療法薬の補助的膀胱内注入と組み合されることが多い。外科手術に適さない膀胱癌患者のためには一般に決定的（根治的）放射線療法が用いられる。表面的、低悪性度の疾患の場合には化学療法を膀胱内に直接施して腫瘍部位に薬物を集積させ、切除後の任意の残存腫瘍塊を除去する。進行性の膀胱癌に対応するためには、全身的化学療法も使用される。【０００６】
ドキソルビシン及びエピルビシンのようなアントラサイクリンは膀胱癌を治療することが分かっている。アントラサイクリンの投与は術後の再発のリスクを低下すると考えられているが、これらの化合物は全身毒性を有する。この毒性は、薬物を膀胱へ直接注入することにより低下させることができるが、膀胱が手術により何らかの損傷を受けている場合には薬物が他の器官系に侵入し得る。さらにこれらの化合物は、投与経路とは無関係に、潜在的に発癌性であると考えられている。従って侵襲性疾患の進行を予防する、より安全な治療方法の開発が重要である。また、膀胱癌は外科的手術、化学療法を行っても比較的再発率が高いことが特徴である。このため、再発率を下げるような治療法の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−８６２０１公報
【特許文献２】特開２００６−５０６４６９公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−４９８（２００１）
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３：８３−８６（２００４）
【非特許文献３】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０３：３６８７−３６９２（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、より効果的な癌の治療法を提供することにある。例えば、癌の治療剤、特に、癌の細胞増殖抑制剤や癌の転移抑制又は予防剤、前記各剤を利用した医薬、癌治療の効果を判定する方法、癌治療の予後を予測する方法、癌の増殖を抑制する作用を有する物質のスクリーニング方法、又は癌の転移を阻害する作用を有する物質のスクリーニング方法の少なくとも一つが意図される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
これまで「ｍｉｒ５８２」と癌細胞の増殖や転移との関連性は全く知られていなかった。本発明者らは、驚くべきことに膀胱癌細胞において、ｍｉＲＮＡの一種である「ｍｉＲ５８２」の発現が顕著に減少していることを初めて見出した。さらに重要なことに、膀胱癌細胞にｍｉＲ５８２を恒常発現させると、当該癌細胞の増殖が抑制されること及び癌細胞の浸潤性が抑制されることを初めて見出した。加えて、ｍｉＲ５８２を導入した癌細胞では、ＫＣＮＣ１、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１、ＲＡＢ２７Ａ等の特定のＲＮＡの発現が抑制されていることも見出した。【００１１】
発現が抑制された上記のＲＮＡのうち、ＫＣＮＣ１を除く４遺伝子は、いずれも癌や細胞増殖との関連性が示唆されている。つまり、ＰＧＧＴ１Ｂは癌の浸潤に関与することが報告されている（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．，３４：８１５−８２６（２０１０））。ＬＲＲＫ２は細胞の増殖に関与するＡｋｔなどのタンパク質をリン酸化することが報告されている（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５８５：２１６５−２１７０（２０１１））。また、ＤＩＸＤＣ１も細胞の増殖に関与することが報告されており（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，１００：１８０１−１８０８（２００９））、ＲＡＢ２７Ａについては、増殖因子の分泌に関与することが報告されている（Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．，６：３７２−３８２（２００８））。理論に拘束されることは好まないが、それらのＲＮＡの機能が抑制されることにより癌細胞の増殖や浸潤性が影響されているのかもしれない。【００１２】
さらに、本発明者らは、ヒト膀胱癌の臨床検体を用いた解析から、膀胱癌の悪性度（グレード）に伴ってｍｉＲ５８２の発現が低下している患者の割合が増加していることも見出した。【００１３】
従って、本発明は以下のものを包含する：
〔１〕  少なくとも以下の：
（１）配列番号１又は配列番号２で示されるヌクレオチド配列から成る核酸；
（２）配列番号１又は配列番号２と７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る核酸であって、タンパク質発現抑制活性を示す核酸、又は
（３）上記（１）又は（２）のヌクレオチド配列及び当該ヌクレオチド配列と相補的な配列を含み、それにより鎖中の全部又は一部に二本鎖構造を形成する一本鎖又は二本鎖の核酸、
を含有することを特徴とする、癌治療のための医薬。
〔１−２〕  前記核酸が、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１、及びＲＡＢ２７Ａからなる群から選択される少なくとも一つのＲＮＡとハイブリッドを形成し得る核酸である、前記〔１〕に記載の医薬。
〔１−３〕  前記核酸が、ＫＣＮＣ１、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１、及びＲＡＢ２７Ａからなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質の発現を抑制し得る核酸である、前記〔１〕に記載の医薬。
〔２〕  前記核酸が、二本鎖の核酸である、前記〔１〕に記載の医薬。
なお、上記のように〔１〕を引用する項は、〔１〕の枝番として表した〔１−２〕等が存在する場合、当該項も同時に引用する。以下、同じである。
〔３〕  核酸が配列番号１で示されるヌクレオチド配列又はその部分配列から成る、前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載の医薬。
〔３−２〕  核酸が配列番号１で示されるヌクレオチド配列から成る、前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載の医薬。
〔４〕  核酸が配列番号２で示されるヌクレオチド配列又はその部分配列から成る、前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載の医薬。
〔４−２〕  核酸が配列番号２で示されるヌクレオチド配列から成る、前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載の医薬。
〔５〕  核酸がｍｉＲ５８２のヌクレオチド配列を含み、且つタンパク質発現抑制活性を示す、前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載の医薬。
〔６〕  核酸がｍｉＲ５８２及びその前駆体からなる群より選ばれる少なくとも一つの核酸である、前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載の医薬。
〔６−２〕  ｍｉＲ５８の前駆体がｐｒｉ−ｍｉＲ５８２又はｐｒｅ−ｍｉＲ５８２である、前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載の医薬。
〔７〕  核酸がｍｉＲ５８２である、前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載の医薬。
〔８〕  核酸が修飾された核酸である、前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の医薬。
〔９〕  癌が、ｍｉＲ５８２の発現が減少している癌である前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の医薬。
〔１０〕  癌が、膀胱癌である前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の医薬。
〔１１〕  癌が、グレード２以上の膀胱癌である前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の医薬。
〔１２〕  前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の核酸を含有する、癌の転移を抑制又は予防するための医薬。
〔１３〕  経尿道的に哺乳動物に投与される、前記〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の医薬。【００１４】
〔１４〕  前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬の治療効果を予測する方法又は当該予測を補助するための方法であって、癌における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度を測定する工程を含む方法。
〔１４−２〕  以下の（１）〜（３）の工程を含む、前記〔１４〕に記載の方法；
（１）前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された正常組織又は正常細胞及び前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された癌組織又は癌細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度を測定する工程、
（２）正常組織又は正常細胞と癌組織又は癌細胞との間で配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度を比較する工程、及び
（３）癌組織又は癌細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度が、正常組織又は正常細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度よりも低い場合に、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬が治療効果があると予測する工程。
〔１５〕  前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬の治療効果を予測する方法又は当該予測を補助するための方法であって、癌におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数を測定する工程を含む方法。
〔１５−２〕  以下の（１）〜（３）の工程を含む、前記〔１５〕に記載の方法；
（１）前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された正常組織又は正常細胞及び前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された癌組織又は癌細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数を測定する工程、
（２）正常組織又は正常細胞と癌組織又は癌細胞との間でｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数を比較する工程、及び
（３）癌組織又は癌細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数が、正常組織又は正常細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数よりも低い場合に、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬が治療効果があると予測する工程。
〔１６〕  前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬の治療効果を判定する方法又は当該判定を補助するための方法であって、癌における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度を測定する工程を含む方法。
〔１６−２〕  以下の（１）〜（３）の工程を含む、前記〔１６〕に記載の方法；
（１）前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された癌組織又は癌細胞及び前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬投与後に患者から摘出された癌組織又は癌細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度を測定する工程、
（２）前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された癌組織又は癌細胞と前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬投与後に患者から摘出された癌組織又は癌細胞との間で配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度を比較する工程、及び
（３）前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬投与後に患者から摘出された癌組織又は癌細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度が、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された癌組織又は癌細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度よりも高い場合に、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬が治療効果があると判定する工程。
〔１７〕  前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬の治療効果を判定する方法又は当該判定を補助するための方法であって、癌におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数を測定する工程を含む方法。
〔１７−２〕以下の（１）〜（３）の工程を含む、前記〔１７〕に記載の方法；
（１）前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された癌組織又は癌細胞及び前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬投与後に患者から摘出された癌組織又は癌細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数を測定する工程、
（２）前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された癌組織又は癌細胞と前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬投与後に患者から摘出された癌組織又は癌細胞との間でｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数を比較する工程、及び
（３）前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬投与後に患者から摘出された癌組織又は癌細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数が、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された癌組織又は癌細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数よりも高い場合に、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬が治療効果があると判定する工程。
〔１８〕  癌治療の予後を判定する方法又は当該判定を補助するための方法であって、癌における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度を測定する工程を含む方法。
〔１８−２〕  以下の（１）〜（３）の工程を含む、前記〔１８〕に記載の方法；
（１）患者から摘出された正常組織又は正常細胞及び患者から摘出された癌組織又は癌細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度を測定する工程、
（２）正常組織又は正常細胞と癌組織又は癌細胞との間で配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度を比較する工程、及び
（３）癌組織又は癌細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度が、正常組織又は正常細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度よりも低い場合に、癌治療の予後が悪いと判定する工程。
〔１９〕  癌治療の予後を判定する方法又は当該判定を補助するための方法であって、癌におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数を測定する工程を含む方法。
〔１９−２〕  以下の（１）〜（３）の工程を含む、前記〔１９〕に記載の方法；
（１）患者から摘出された正常組織又は正常細胞及び患者から摘出された癌組織又は癌細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数を測定する工程、
（２）正常組織又は正常細胞と癌組織又は癌細胞との間でｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数を比較する工程、及び
（３）癌組織又は癌細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数が、正常組織又は正常細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数よりも低い場合に、癌治療の予後が悪いと判定する工程。
〔２０〕  癌が膀胱癌である、前記〔１４〕〜〔１９〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕  配列番号１又は配列番号２に記載の核酸を特異的に検出し得る核酸プローブを含む、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の医薬の効果を判定するための組成物。
〔２２〕  以下の（１）〜（３）の工程を含む、癌の増殖を抑制し得る物質を探索する方法；
（１）被検物質と配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被検物質を接触させた細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現量と比較する工程、及び
（３）上記（２）の比較結果に基づいて、配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現量を上昇制御する被検物質を、癌の増殖を阻害し得る物質として選択する工程。
〔２３〕  以下の（１）〜（３）の工程を含む、癌の転移又は癌細胞の浸潤能を阻害し得る物質を探索する方法；
（１）被検物質と配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現を測定可能な細胞とを接触させる工程；
（２）被検物質を接触させた細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸発現量と比較する工程、及び
（３）上記（２）の比較結果に基づいて、配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現量を上昇制御する被検物質を、癌の転移又は癌細胞の浸潤能を阻害し得る物質として選択する工程。
〔２４〕  少なくとも以下の：
（１）配列番号１又は配列番号２で示されるヌクレオチド配列から成る核酸；
（２）配列番号１又は配列番号２と７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る核酸であって、ＫＣＮＣ１、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１、及びＲＡＢ２７Ａからなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質の発現抑制活性を示す核酸、又は
（３）上記（１）又は（２）のヌクレオチド配列及び当該ヌクレオチド配列と相補的な配列を含み、それにより鎖中の全部又は一部に二本鎖構造を形成する一本鎖又は二本鎖の核酸、
を含有することを特徴とする、ＫＣＮＣ１、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１、及びＲＡＢ２７Ａからなる群から選択される少なくとも一つのタンパク質の発現抑制剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、癌の治療剤、特に膀胱癌の治療剤、癌の転移を抑制又は予防する剤、又は前記剤を利用した医薬の少なくとも一つを提供することができる。また本発明により、癌の治療効果を判定する方法、癌治療の予後を予測する方法、癌の増殖を抑制する作用を有する物質のスクリーニング方法、又は癌の転移を阻害する作用を有する物質のスクリーニング方法の少なくとも一つを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】各種膀胱癌細胞におけるｍｉＲ５８２の発現量を示す図である。図中、「Ｎｏｒｍａｌ」は正常細胞を示し、縦軸の値は、Ｎｏｒｍａｌに対する比として表している。
【図２】各種膀胱癌細胞におけるｍｉＲ５８２の染色体領域のコピー数を示す図である。縦軸の値は、ＨＴ１３７６細胞に対する比として表している。
【図３】ｍｉＲ５８２によるヒト膀胱癌細胞株の増殖抑制を示す図である。図中、「ＮＣ」は陰性対照を示し、縦軸の値は、ＮＣに対する比として表している。
【図４】ｍｉＲ５８２によるヒト膀胱癌細胞株の浸潤能の抑制を示す図である。図中、「ＮＣ」は陰性対照を示し、縦軸の値は、ＮＣに対する比として表している。
【図５】マウス膀胱癌モデルでのｍｉＲ５８２投与による治療効果を示す図である。図中、Ｓｃｒａｍｂｌｅは陰性対照である。
【図６】マウス膀胱癌モデルでのｍｉＲ５８２投与による癌転移抑制効果を示す図である。図中、Ｓｃｒａｍｂｌｅは陰性対照である。
【図７】ｍｉＲ５８２によりＫＣＮＣ１、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１、ＲＡＢ２７Ａの遺伝子発現が抑制されることを示す図である。図中、「ＮＣ」は陰性対照を示し、縦軸の値は、ＮＣに対する比として表している。
【図８】ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１、ＲＡＢ２７ＡがｍｉＲ５８２の直接的な標的分子であり、ＫＣＮＣ１が間接的な標的分子であることを示す図である。図中、「ＮＣ」は陰性対照を示し、縦軸の値は、ＮＣに対する比として表している。
【図９】ｍｉＲ５８２によるＫＣＮＣ１、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１、ＲＡＢ２７Ａの蛋白質発現抑制を示す図である。図中、「ＮＣ」は陰性対照を示す。
【図１０】ｍｉＲ５８２の上記標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入することにより、ヒト膀胱癌細胞株の増殖抑制を示す図である。図中、「ＮＣ」は陰性対照を示し、縦軸の値は、ＮＣに対する比として表している。
【図１１】ｍｉＲ５８２の上記標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入することにより、ヒト膀胱癌細胞株の浸潤抑制を示す図である。図中、「ＮＣ」は陰性対照を示し、縦軸の値は、ＮＣに対する比として表している。
【図１２】膀胱癌のヒト臨床検体におけるｍｉＲ５８２の発現量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を、好ましい実施態様（以下、「本実施の形態」と略すことがある。）に基づいて具体的に説明するが、本発明の範囲は下記に説明する特定の態様に限定されない。また、本明細書及び配列表において、ヌクレオチド配列を便宜的にＲＮＡの配列を用いて記載したが、これは、該配列ないし対応する配列番号により特定された核酸がＲＮＡのみを示すことを意味するものではなく、適宜Ｕ（ウラシル）をＴ（チミン）と読み替えることにより、ＤＮＡやキメラ核酸のヌクレオチド配列をも示すものであることが理解されるべきである。
【００１８】
本発明は、後記の実施例で示すとおり、「ｍｉＲ５８２」が、（１）癌細胞、特に膀胱癌細胞の増殖を抑制する機能を有すること、（２）癌細胞、特に膀胱癌細胞の浸潤又は転移を抑制する機能を有すること、（３）ヒト膀胱癌患者の癌組織で発現が低下していることの発見及び実証に基づいて、「ｍｉＲ５８２」及びその機能的類似物を、癌治療剤の有効成分として利用することを意図する。
１．有効成分
ａ．配列番号１又は２で示される核酸及び機能的類似物
有効成分に関する本実施の形態としては、まず、配列番号１（以下、「ｍｉＲ５８２−５ｐ」と呼ぶことがある。）又は配列番号２（以下、「ｍｉＲ５８２−３ｐ」と呼ぶことがある。）で表されるヌクレオチド配列から成る核酸が挙げられる。それらの核酸は、本発明の最も典型的な有効成分である。加えて、当該核酸の機能的類似物もまた、本発明の有効成分として使用可能である。
【００１９】
つまり、本明細書において、「機能的類似物」の用語は、ヌクレオチド配列、高次構造、又は化学構造のいずれか又はその組合せにおいて天然型配列とは完全に一致しないが、以下で説明する本発明の所望の生理活性の少なくともいずれか一つを示し得る核酸を指す。例えば、本実施の態様における機能的類似物は、前記配列番号１又は２のいずれかと７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る核酸を含む。
【００２０】
なお、ヌクレオチド配列の「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのヌクレオチド配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全ヌクレオチド残基に対する、同一ヌクレオチド残基の割合（％）を意味する。例えば、ヌクレオチド配列の同一性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ−２  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、（ギャップオープン＝５ペナルティ；ギャップエクステンション＝２ペナルティ；ｘ＿ドロップオフ＝５０；期待値＝１０；フィルタリング＝ＯＮ）の条件にて２つのヌクレオチド配列をアラインすることにより計算することができる。
【００２１】
本実施の態様における別の好適な機能的類似物は、配列番号１又は配列番号２で表されるヌクレオチド配列に対して１もしくは複数のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加されたヌクレオチド配列から成り得る。そのようなヌクレオチド配列としては、例えば、
（１）配列番号１又は配列番号２で表されるヌクレオチド配列中の１〜６個（好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個）のヌクレオチドが欠失したヌクレオチド配列、
（２）配列番号１又は配列番号２で表されるヌクレオチド配列に１〜６個（好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個）のヌクレオチドが付加されたヌクレオチド配列、
（３）配列番号１又は配列番号２で表されるヌクレオチド配列に１〜６個（好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個）のヌクレオチドが挿入されたヌクレオチド酸配列、
（４）配列番号１又は配列番号２で表されるヌクレオチド配列中の１〜６個（好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個）のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換されたヌクレオチド配列、又は
（５）上記（１）〜（４）の変異が組み合わされたヌクレオチド配列（この場合、変異したヌクレオチドの総和が、１〜６個（好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個））
が挙げられる。
【００２２】
ｂ．部分配列
本実施の態様における機能的類似物はまた、配列番号１又は配列番号２の「部分配列」から成ることが好ましい。本実施の形態に関連する「部分配列」とは、ｍｉＲＮＡが標的遺伝子を認識するのに必要な最小限のヌクレオチド配列を含む核酸を意味する。この最小限のヌクレオチド配列はシード配列としてその存在がよく知られている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０４：１９２９１−６（２００７））。つまり、ｍｉＲＮＡにおいてはシード配列と呼ばれる５’末端から２〜８番目の塩基配列が非常に重要で、ｍｉＲＮＡの標的となるｍＲＮＡの多くはその３’非翻訳領域にこのシード配列と相補的な配列を持っている。これにより、ｍｉＲＮＡはそのシード配列と相補的な配列を持っている特定のｍＲＮＡを認識しその機能を抑制する。また、シード配列は７塩基という短い配列で構成されているため、１つのｍｉＲＮＡがシード配列と相補的な配列を持っている複数のｍＲＮＡを標的にして、本来のｍｉＲＮＡ活性を発揮することが可能となる。例えば、配列番号１のシード配列としては、５’−ＵＧＡＣＡＵＵ−３’が挙げられる。また、配列番号２のシード配列としては、５’−ＧＧＵＣＡＡＵ−３’が挙げられる。従って、本実施の形態における有効成分は、配列番号１又は２の上記シード配列から成るか、或いは当該シード配列を含む連続する１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上、よりいっそう好ましくは１９塩基以上、最も好ましくは２０塩基を有してよい。
【００２３】
ｃ．核酸の長さ及び構造
一方、本実施の形態における核酸及び機能的類似物（以下、当該核酸と機能的類似物をまとめて「本発明の核酸」または「本実施の形態における核酸」等ということがある。）は、後述する本発明の所望の活性のうちの少なくとも一つ以上を示す限り、その長さに上限はない。しかし、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、本実施の形態における核酸の長さは、上限としては、例えば２００塩基以下、好ましくは１３０塩基以下、より好ましくは５０塩基以下であり、最も好ましくは３０塩基以下である。下限としては、例えば７塩基以上、典型的には１５塩基以上、好ましくは、１７塩基以上である。なお、本明細書において、核酸がヘアピンループ型の構造をとることにより部分的に２本鎖構造を形成する場合であっても、その核酸の長さは一本鎖の長さとして計算するものとする。
【００２４】
つまり、本実施の形態における核酸は１本鎖核酸に限定されず、２本鎖の形態であってよい。２本鎖の態様には、２本鎖ＲＮＡ、２本鎖キメラ核酸、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、ＲＮＡ／キメラ核酸ハイブリッド、キメラ核酸／キメラ核酸ハイブリッド及びキメラ核酸／ＤＮＡハイブリッドが含まれる。なお、キメラ核酸とは、１本鎖又は２本鎖の核酸において一本の核酸の中にＲＮＡとＤＮＡを含むことをいい、ハイブリッド核酸とは、二本鎖において、一方の鎖がＲＮＡ又はキメラ核酸でもう一方の鎖がＤＮＡ又はキメラ核酸である核酸をいう。総じて、本実施の形態における核酸は、好ましくは１本鎖ＲＮＡ、１本鎖キメラ核酸、２本鎖ＲＮＡ、２本鎖キメラ核酸、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、ＲＮＡ／キメラ核酸ハイブリッド、キメラ核酸／キメラ核酸ハイブリッド又はキメラ核酸／ＤＮＡハイブリッドであり、より好ましくは１本鎖ＲＮＡ、１本鎖キメラ核酸、２本鎖ＲＮＡ、２本鎖キメラ核酸、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、キメラ核酸／キメラ核酸ハイブリッド又はＲＮＡ／キメラ核酸ハイブリッドであり、さらに好ましくは２本鎖ＲＮＡ、２本鎖キメラ核酸、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、ＲＮＡ／キメラ核酸ハイブリッド、キメラ核酸／キメラ核酸ハイブリッド又はキメラ核酸／ＤＮＡハイブリッドであり、特に好ましくは２本鎖ＲＮＡである。
【００２５】
ｄ．「ｍｉＲ５８２」分子
上記配列番号１で表されるヌクレオチド配列から成る核酸と配列番号２で表されるヌクレオチド配列から成る核酸により構成される２本鎖形態のＲＮＡ（式（Ｉ））は、「成熟型ｍｉＲ５８２」として公知である（非特許文献３）。
【化１】
2014030602.tif 000002
したがって、本実施の形態の有効成分は、上記成熟型ｍｉＲ５８２であってよい。
【００２６】
ｅ．「ｍｉＲ５８２」の前駆体
本実施の形態の有効成分は、ｍｉＲ５８２の前駆体でもあり得る。ｍｉＲ５８２の前駆体とは、細胞内のプロセシングや２本鎖核酸の開裂の結果として、細胞内において成熟型ｍｉＲ５８２を生じ得る核酸を意味する。具体的には、ｍｉＲ５８２のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡやｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ等を挙げることができる。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡ遺伝子の一次転写産物（１本鎖ＲＮＡ）であり、通常数百〜数千塩基程度の長さを有する。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡが細胞内プロセシングを受けることにより生じるヘアピン構造を有する１本鎖ＲＮＡであり、通常９０〜１１０塩基の長さを有する。ｍｉＲ５８２のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡやｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは公知の分子であり、例えばサンガー研究所が作成しているｍｉＲＢａｓｅデータベース：ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／等に開示されている。ｍｉＲ５８２の好適なｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとしては、「ＭＩ０００３５８９」として知られるヌクレオチド配列からなる１本鎖ＲＮＡを挙げることが出来る。
【００２７】
また、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと類似の構造をとるものとして、例えば、配列番号１又は配列番号２で表されるヌクレオチド配列（第１の配列）とその相補配列（第２の配列）とが連結された一本鎖核酸がヘアピンループ型の構造をとることにより、第１の配列が第２の配列と２本鎖構造状の形状を有する核酸も本実施の形態における核酸の好ましい態様の１つである。上記「ＭＩ０００３５８９」を例にとって説明すると、本実施の形態における好ましい核酸は、下記の式（ＩＩ）（配列番号３）で表される構造をとってよい。
【化２】
2014030602.tif 000003
【００２８】
本実施の形態における核酸は、従来公知の手法を用いて、哺乳動物細胞（ヒト細胞等）から単離することにより、又は化学的に合成することにより、又は遺伝子組み換え技術を用いて産生することにより得ることができる。さらに適宜市販されている核酸を用いることも可能である。そのような市販品の一つは、「Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｍｉｍｉｃ」（製品名、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）として入手可能である。
【００２９】
ｆ．修飾された核酸
天然型の核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によって容易に分解される場合がある。従って、本実施の形態における核酸には、各種分解酵素に対して抵抗性となるように修飾された核酸（以下、「修飾体」と呼ぶことがある。）も含まれる（例えば、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，６：９１３−２５（２００６）及びＭｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，６：８６２−７０（２０１０）参照。）。具体的には、前記の核酸のいずれかを、後述する本発明の所望の生理活性の全てが損なわれることのないように修飾したものが本実施の形態における核酸に含まれる。当該修飾体の例としては、糖鎖部分が修飾されているもの（例えば、２’−０メチル化）、塩基部分が修飾されているもの、リン酸部分やヒドロキシル部分が修飾されているもの（例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等）を挙げることができるが、これに限定されない。また、核酸自体を修飾してもよい。核酸自体を修飾するとは、例えば、その５’端又は３’端にコレステロール、ビタミン等の脂質性物質や蛍光物質の付加を施すことが挙げられる。また、例えば、ｍｉＲ５８２と同ーの領域と、その配列と６０％〜１００％未満相補的である相補領域とを含む合成核酸であってもよい。或いは、国際公開第Ｗ０２００６／６２７１７１号パンフレットに記載のような合成ＲＮＡ分子としてもよい。
【００３０】
また、本実施の形態における核酸は、５’又は３’末端に付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは通常５塩基以下である。該付加的塩基は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばｕｇ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’、ｇｇｇ−３’、ｇｕｕｕ−３’、ｇｔｔｔ−３’、ｔｔｔｔｔ−３’、ｕｕｕｕｕ−３’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
本実施の形態における核酸の好ましい態様としては、配列番号１又は配列番号２からなる核酸、成熟型ｍｉＲ５８２、その前駆体等の核酸を挙げることができる。本実施の形態における核酸の好ましい別の態様としては、成熟型ｍｉＲ５８２活性を有するヌクレオチドを含む核酸、例えば、内在性の成熟型ｍｉＲ５８２を模倣するように合成された、「ｍｉＲ５８２  ｍｉｍｉｃＨｕｍａｎ  ｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｍｉｍｉｃ」（製品名、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）などを使用することができる。また、その他の例として、Ｐｒｅ−ｍｉＲＴＭ  ｍｉＲＮＡ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）が挙げられる。
【００３２】
ｇ．核酸の活性
本実施の形態における核酸は、癌細胞内ヘ取り込まれると、癌細胞の浸潤増殖抑制活性、癌細胞の転移を抑制する作用を示し得る。また、当該作用は、本実施の形態における核酸がタンパク質発現抑制活性を有することに起因するものと考えられる。従って、本実施の形態における核酸は、少なくともタンパク質発現抑制活性を有する必要がある。タンパク質発現抑制には、標的ｍＲＮＡの発現を抑制すること（この作用をＲＮＡ発現抑制活性と呼ぶことがある）、及び標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害することが含まれる。前記標的ｍＲＮＡの発現を抑制することには、転写されて生成した標的ｍＲＮＡを分解し、結果として標的ｍＲＮＡの発現量を減少させることが含まれる。より特定的には、本実施の形態において、「ｍｉＲ５８２活性を有する核酸」を本実施の形態における医薬に使用することが好ましい。ここで、「ｍｉＲ５８２活性」とは、いずれかの天然型「ｍｉＲ５８２」分子の標的となり得るｍＲＮＡに関連するタンパク質のうちの少なくとも一つの発現を抑制する活性であり、典型的な例としては当該ｍＲＮＡのうちの少なくとも一つの発現を抑制する活性を言う。しかして、本実施の形態の「ｍｉＲ５８２活性を有する核酸」は、天然型「ｍｉＲ５８２」分子の標的ｍＲＮＡに関連するタンパク質のうちの少なくとも一つの発現を抑制するか、或いは当該ｍＲＮＡのうちの少なくとも一つの発現を抑制する核酸であればよい。天然型「ｍｉＲ５８２」が発現を抑制する標的ｍＲＮＡとしては、例えばＰＧＧＴ１Ｂ（Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ５２２９）、ＬＲＲＫ２（Ｇｅｎｅ  ＩＤ  １２０８９２）、ＤＩＸＤＣ１（Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ８５４５８）、ＲＡＢ２７Ａ（Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ５８７３）、ＫＣＮＣ１（Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ３７４６）、ＴＥＸ１９（Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ４００６２９）、又はＡＳＧＲ１（Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ４３２）が挙げられる。
【００３３】
従って、本実施の形態における「ｍｉＲ５８２活性を有する核酸」の具体例は、ＫＣＮＣ１、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１やＲＡＢ２７Ａ等を標的ｍＲＮＡとし、その発現を抑制する核酸であり得る。当該「ｍｉＲ５８２活性を有する核酸」が、ＬＲＲＫ２の発現を抑制することが好ましく、ＬＲＲＫ２及びＤＩＸＤＣ１の発現を抑制することがより好ましく、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１、及びＲＡＢ２７Ａの発現を抑制することがさらに好ましく、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１、ＲＡＢ２７Ａ及びＰＧＧＴ１Ｂの発現を抑制することがさらに好ましく、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１、ＲＡＢ２７Ａ、ＰＧＧＴ１Ｂ及びＫＣＮＣ１の発現を抑制することが最も好ましい。
【００３４】
より特定の態様に言及すれば、本実施の形態では、核酸がｍｉＲ５８２であり、それによりＰＧＧＴ１Ｂの発現を抑制することが好ましい。また、ｍｉＲ５８２を用いてＰＧＧＴ１Ｂ及びＬＲＲＫ２の発現を抑制することがより好ましく、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、及びＤＩＸＤＣ１の発現を抑制することがさらに好ましく、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１、及びＲＡＢ２７Ａの発現を抑制することがさらにいっそう好ましく、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１、ＲＡＢ２７Ａ、ＫＣＮＣ１の発現を抑制することが最も好ましい。また、別の特定の態様では、核酸としてｍｉＲ５８２−５ｐを用いて、ＬＲＲＫ２の発現を抑制することが好ましく、ＬＲＲＫ２及びＤＩＸＤＣ１の発現を抑制することがより好ましく、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１、及びＲＡＢ２７Ａの発現を抑制することがさらに好ましく、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１、ＲＡＢ２７Ａ、及びＫＣＮＣ１の発現を抑制することが特に好ましい。さらに別の特定の態様では、核酸としてｍｉＲ５８２−３ｐを用いて、ＬＲＲＫ２の発現を抑制することが好ましく、ＬＲＲＫ２及びＤＩＸＤＣ１の発現を抑制することがより好ましく、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１、及びＫＣＮＣ１の発現を抑制することが最も好ましい。
【００３５】
なお、本実施の形態における「ｍｉＲ５８２活性を有する核酸」が、ｍｉＲ５８２の標的ｍＲＮＡに関連するタンパク質のうちの少なくとも１つの発現を抑制する機序としては、標的ｍＲＮＡの発現を抑制すること、標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制することのほかに、ｍｉＲ５８２の標的タンパクの機能を抑制することであってもよい。要は、本実施の形態における核酸が、ｍｉＲ５８２の標的ｍＲＮＡに関連するタンパク質又は当該ｍＲＮＡの発現等を実質的に抑制すればよい。例えば、本実施の形態における核酸が、標的ｍＲＮＡに関連するタンパク質又は当該ｍＲＮＡの発現を少なくとも１０％以上抑制すれば、当該核酸が標的ｍＲＮＡに関連するタンパク質又は当該ｍＲＮＡの発現を実質的に抑制したと見做し得る。本実施の形態における核酸がｍｉＲ５８２の標的ｍＲＮＡに関連するタンパク質又は当該ｍＲＮＡの発現を２０％以上抑制することが好ましく、３０％以上抑制することがより好ましく、４０％以上抑制することがさらに好ましく、５０％以上抑制することが特に好ましく、６０％以上抑制することが最も好ましい。発現抑制能は、例えば本明細書の実施例７乃至９のいずれかに記載の方法により確認することができる。
【００３６】
一方で、本実施の形態における「ｍｉＲ５８２活性を有する核酸」が、天然型ｍｉＲ５８２の標的ｍＲＮＡのうちの少なくとも一つと実質的にハイブリッドを形成することが必要十分条件とも言い得る。例えば、本実施の形態における「ｍｉＲ５８２活性を有する核酸」が、その標的ｍＲＮＡのうちの少なくとも一つと、０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、２５℃の条件下でハイブリッドを形成し得るならば、当該核酸はその標的ｍＲＮＡのうちの少なくとも一つと実質的にハイブリッドを形成したと見做し得る。天然型ｍｉＲ５８２がハイブリッドを形成する標的ｍＲＮＡとしては、例えばＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１やＲＡＢ２７Ａが挙げられる。
【００３７】
従って、本実施の形態における「ｍｉＲ５８２活性を有する核酸」が、ＰＧＧＴ１Ｂとハイブリッドを形成することが好ましく、ＰＧＧＴ１Ｂ及びＤＩＸＤＣ１とハイブリッドを形成することがより好ましく、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＤＩＸＤＣ１、及びＬＲＲＫ２とハイブリッドを形成することがさらに好ましく、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＤＩＸＤＣ１、ＬＲＲＫ２、及びＲＡＢ２７Ａとハイブリッドを形成することが最も好ましい。
【００３８】
より特定の態様に言及すれば、本実施の形態では、核酸がｍｉＲ５８２−５ｐ又はｍｉＲ５８２であり、それらがＰＧＧＴ１Ｂとハイブリッドを形成することが好ましく、ＰＧＧＴ１Ｂ及びＤＩＸＤＣ１とハイブリッドを形成することがより好ましく、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＤＩＸＤＣ１、及びＬＲＲＫ２とハイブリッドを形成することがさらに好ましく、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＤＩＸＤＣ１、ＬＲＲＫ２、及びＲＡＢ２７Ａとハイブリッドを形成することが特に好ましい。また、別の特定の態様では、核酸がｍｉＲ５８２−３ｐであり、それがＰＧＧＴ１Ｂとハイブリッドを形成することが好ましく、ＰＧＧＴ１Ｂ及びＤＩＸＤＣ１とハイブリッドを形成することがより好ましく、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＤＩＸＤＣ１、及びＬＲＲＫ２とハイブリッドを形成することがさらに好ましい。なお、ハイブリッド形成能は、例えば本明細書の実施例６乃至８に記載の方法により確認することができる。
【００３９】
ｈ．治療／予防対象
本実施の形態における治療対象の癌細胞は、通常、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブ夕、ウシ、サル、ヒト、好ましくはヒト）の癌細胞である。そのような癌の種類は、ｍｉＲ５８２の発現が減少している癌であれば特に限定されないが、例えば、膀胱癌、乳癌、肺癌、肺臓癌、前立腺癌、骨肉腫、食道癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、脳腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、腎癌、卵巣癌、子宮頚癌、甲状腺癌、睾丸腫瘍、カポジ肉腫、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、筋肉腫、皮膚癌などの固形癌、骨髄腫、又は白血病等が例示される。治療の対象となる癌としては、膀胱癌が好ましく、転移性の膀胱癌がより好ましい。また、治療の対象となる膀胱癌としては、グレード２又はグレード３の膀胱癌であることが好ましく、グレード２の膀胱癌であることがより好ましい。また、一態様として、グレード３の膀胱癌を好適に治療し得る。
【００４０】
より特定の態様について言及すれば、本実施の形態における医薬が癌の細胞増殖を阻害する活性を有するか否かは、上記治療／予防対象の癌細胞株を用いることにより確認してもよい。特に、本実施の形態における医薬が膀胱癌の細胞増殖を阻害する活性を有するか否かは、本明細書の実施例３や実施例５に記載の、ＵＭ−ＵＣ−３細胞のような膀胱癌細胞株を用いることにより確認してもよい。さらに、本実施の形態における医薬が癌細胞の浸潤能を阻害する活性を有するか否かについても、本明細書の実施例４や実施例５に記載のＵＭ−ＵＣ−３細胞のような浸潤性の高い膀胱癌細胞株を用いることにより確認してもよい。
【００４１】
ｉ．医薬
本実施の形態における医薬は、有効量の本実施の形態における核酸に加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含むことができ、医薬組成物の形態で医薬として適用される。
【００４２】
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００４３】
本実施の形態における核酸の癌細胞内への導入を促進するために、本実施の形態における医薬は更に核酸導入用試薬を含むことができる。該核酸導入用試薬としては、アテロコラーゲン、リボソーム、ナノパーティクル、リポフェクチン、リプフェクタミン、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、或いはポリエチレンイミン等の陽イオン性脂質等を用いることが出来る。
【００４４】
本実施の形態における医薬をアテロコラーゲンに含ませることにより、標的となる癌細胞に本実施の形態における核酸を効率よく送達し、当該細胞に効率よく取り込ませることができる。
【００４５】
本実施の形態における医薬は、経口的に又は非経口的に、哺乳動物に対して投与することが可能であるが、非経口的に投与するのが望ましい。
【００４６】
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量或いは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。非経口的な投与に好適な別の製剤としては、噴霧剤等を挙げることが出来る。また、膀胱癌の治療に用いるための製剤は、経尿道的に投与される局所注入剤とすることも好ましい。
【００４７】
本実施の形態における医薬組成物中の核酸の含有量は、例えば、医薬組成物全体の約０．１ないし１００重量％が例示される。
【００４８】
本実施の形態における医薬の投与量は、投与の目的、投与方法、癌の種類、大きさ、投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）によって異なるが、成人に注射により局所投与する場合、通常、核酸の量としてｌｐｍｏｌ／ｋｇ以上１０ｎｍｏｌ／ｋｇ以下、全身投与では２ｎｍｏｌ／ｋｇ以上２００ｎｍｏｌ／ｋｇ以下が望ましい。かかる投与量を１〜１０回、より好ましくは５〜１０回投与することが望ましい。
【００４９】
本実施の形態における医薬は、その有効成分である本実施の形態における核酸が癌組織（癌細胞）に送達されるように、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブ夕、ウシ、サル、ヒト）に対して安全に投与される。
【００５０】
本実施の形態における核酸は、癌の細胞増殖を抑制する活性を有する。本実施の形態における医薬を、癌の患者等に対して投与することにより、癌疾患を治療することが出来る。また、本実施の形態における核酸が、癌細胞の浸潤能を阻害する活性を有することも好ましい。本実施の形態における医薬を、癌患者や、転移リスクを有する癌の治療後の患者等に対して投与することにより、癌の浸潤、転移を抑制し、癌の浸潤、転移に起因する疾患を治療又は予防することが出来る。従って、本実施の形態における医薬は、癌の治療剤として極めて有用である。
【００５１】
なお、本明細書にいう「転移抑制」とは、癌細胞が原発巣から異なる部位ヘ到達し、該部位において癌を二次的に生じることを抑制することを意味する。
【００５２】
前記のとおり、本実施の形態における医薬が適用し得る癌としては、ｍｉＲ５８２の発現が減少している癌であれば特に限定されないが、例えば、乳癌、肺癌、肺臓癌、前立腺癌、骨肉腫、食道癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、脳腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、腎癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頚癌、甲状腺癌、睾丸腫瘍、カポジ肉腫、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、筋肉腫、皮膚癌、網膜芽腫などの固形癌、骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫、骨髄腫、悪性黒色腫、血管腫、真性多血症、神経芽腫等が例示できる。膀胱癌や転移性の癌に対して本実施の形態における医薬を適用することが好ましい例として挙げられる。
【００５３】
転移性癌としては、例えば、乳癌、肺癌、肺臓癌、前立腺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、腺癌、白血病及びリンパ腫を含む血液細胞悪性腫瘍、頭頚部癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、肝癌を含む消化管癌、卵巣癌、子宮内膜癌及び子宮頚癌を含む女性生殖管の悪性腫瘍、膀胱癌、神経芽細胞腫を含む脳腫瘍、肉腫、骨肉腫及び悪性黒色腫、並びに扁平上皮癌を含む皮膚癌などの転移性癌が例示できる。膀胱癌の転移性癌に対して本実施の形態における医薬を適用することが好ましい例として挙げられる。また、癌の転移に起因する疾患としては、例えば、転移性癌、癌の増大や癌性胸膜炎による呼吸不全等が挙げられる。
【００５４】
本実施の形態における医薬は、他の抗癌剤と併用することができる。他の抗癌剤としては、例えば、タキサン類等の微小管作用剤だけでなく、代謝拮抗剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ結合剤（白金製剤）、抗癌性抗生物質などが挙げられる。具体的には、塩酸アムルビシン、塩酸イリノテカン、イホスファミド、エトポシドラステット、ゲフィニチブ、シクロホスファミド、シスプラチン、トラスツズマブ、フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、メシル酸イマニチブ、メソトレキサート、リツキサン、アドリアマイシンなどが挙げられる。
【００５５】
２．  本実施の形態における医薬の治療効果を予測する方法
本実施の形態としては、癌におけるｍｉＲ５８２の発現レベルを測定すること、及び当該発現レベルが癌では正常組織と比較して低下することに基づき、本実施の形態における医薬の治療効果を予測する方法ないし医師が当該予測を行うことを補助する方法（以下、それらの両方法をまとめて「予測方法」等と略すことがある。）が挙げられる。
【００５６】
本実施の形態における予測方法においては、本実施の形態における医薬投与前に測定対象患者から摘出された癌組織もしくは癌細胞におけるｍｉＲ５８２の発現レベルが測定される。また、本明細書の実施例２にあるようにｍｉＲ５８２の染色体領域のコピー数を測定することにより、ｍｉＲ５８２の発現レベルを推定することも可能である。本実施の形態における予測方法を適用することの出来る癌の種類としては、上記「ｈ．治療／予防対象」の項において詳述されている癌を挙げることが出来る。本実施の形態における予測方法は、好ましくは膀胱癌に対して適用できる。
【００５７】
本実施の形態における予測方法において発現レベルが測定されるｍｉＲ５８２には、配列番号１又は配列番号２で表されるヌクレオチド配列、成熟型ｍｉＲ５８２、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが含まれるが、好ましくは、これら全ての型の発現レベルの合計又は配列番号１又は配列番号２で表されるヌクレオチド配列又は成熟型の発現レベル、より好ましくは配列番号１又は配列番号２で表されるヌクレオチド配列の発現レベルが測定される。
【００５８】
例えば、ｍｉＲ５８２の発現レベルは、該ｍｉＲＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブを用いて、自体公知の方法により測定することが出来る。該測定方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション、核酸アレイ等を挙げることができる。又は、市販のキット（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴ  Ｋｉｔ）によっても測定できる。
【００５９】
ｍｉＲ５８２を特異的に検出し得る核酸プローブとしては、配列番号１又は配列番号２で表されるヌクレオチド配列に含まれる、１５塩基以上、好ましくは１８塩基以上、より好ましくは約２０塩基以上、最も好ましくはその全長の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドを挙げることが出来る。同じく、ｍｉＲ５８２活性を有する核酸を検出し得る核酸プローブとしても、配列番号１、配列番号２又はそれらと相補的な配列で表されるヌクレオチド配列に含まれる、１５塩基以上、好ましくは１８塩基以上、より好ましくは約２０塩基以上、最も好ましくはその全長の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドを挙げることが出来る。
【００６０】
核酸プローブは、特異的検出に支障を生じない範囲で付加的配列（検出対象のポリヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド配列）を含んでいてもよい。また、核酸プローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ等）、酵素（例：βーガラクトシダーゼ、βーグルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）などで標識されていてもよい。或いは、蛍光物質（例：ＦＡＭ、ＶＩＣ等）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
【００６１】
核酸プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ核酸のいずれであってもよく、また、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。核酸プローブ又はプライマーは、例えば、配列番号１、配列番号２又はそれらと相補的な配列で表されるヌクレオチド配列の情報に基づいて、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。
【００６２】
上記のようにして測定されたｍｉＲ５８２の発現レベルに基づいて、癌の治療効果が予測される。後述の実施例に示すように、膀胱癌では正常膀胱組織と比較してｍｉＲ５８２の発現レベルが低下する。従って、上記予測は膀胱癌と正常組織におけるｍｉＲ５８２の発現レベルの違いに基づき行われる。
【００６３】
例えば、本実施の形態における予測は、膀胱癌患者から抗癌治療を行う前に癌組織を摘出し（又は癌細胞を得て）、癌組織周辺の癌ではない組織と癌組織におけるｍｉＲ５８２の発現レベルを比較することで行い得る。発現レベルの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。そして、ｍｉＲ５８２の発現レベルの比較結果より、癌組織におけるｍｉＲ５８２の発現レベルが相対的に低い場合は、ｍｉＲ５８２又はｍｉＲ５８２活性を有する核酸を抗癌剤として用いる癌治療或いはｍｉＲ５８２の発現レベルを上昇させる抗癌治療が有効であると予測することができる。逆に、測定対象のｍｉＲ５８２の発現レベルが相対的に高い場合にはｍｉＲ５８２又はｍｉＲ５８２活性を有する核酸を抗癌剤として用いる癌治療、或いはｍｉＲ５８２の発現レベルを上昇させる抗癌治療が有効ではないと予測することができる。
【００６４】
本実施の形態における医薬の治療対象としては、癌組織（又は癌細胞）におけるｍｉＲ５８２の発現レベルが低下している膀胱癌の患者が望ましいため、本実施の形態における予測方法は、本実施の形態における医薬による治療効果が期待できる患者、特に当該膀胱癌患者の選別に有用である。具体的には、本実施の形態における予測方法で選別される患者としては、その患者の癌組織（又は癌細胞）におけるｍｉＲ５８２の発現レベルが、正常細胞におけるｍｉＲ５８２の発現レベルに比して、７５％以下であることが例示され、５０％以下であることが好ましく、２５％以下であることがより好ましい。
【００６５】
また、同様に、膀胱癌患者から摘出された癌組織及びその周辺の癌ではない正常組織及びにおけるｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数を比較し、ｍｉＲ５８２の発現レベルを推定することで、本実施の形態における予測方法を実施し得る。ｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。そして、ｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数の比較結果より、測定対象のｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数が、正常組織に対して、癌組織において相対的に少なくなる場合には、治療効果が高い癌組織であると予測することができる。逆に、測定対象のｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数が、癌組織においても正常組織と同等以上である場合には、治療効果の低い癌組織であると予測することができる。
【００６６】
具体的には、本実施の形態における医薬の治療対象としては、癌組織（又は癌細胞）におけるｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数が、正常細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数に比して、７５％以下であることが例示され、５０％以下であることが好ましく、２５％以下であることがより好ましい。
【００６７】
上記の説明から明らかなように本実施の形態は、上述のｍｉＲ５８２又はｍｉＲ５８２活性を有する核酸を特異的に検出し得る核酸プローブを含む、本実施の形態における医薬の治療効果を予測するための組成物（以下、「本実施の形態における組成物」と呼ぶことがある。）を提供するものである。本実施の形態における組成物は、抗癌剤の治療効果を予測するためのキットであり得る。本実施の形態における組成物を用いることにより、上述の予測方法により容易に本実施の形態における医薬の治療効果について予測することができる。
【００６８】
核酸プローブは、通常、水もしくは適当な緩衝液（例：ＴＥバッファー、ＰＢＳなど）中に適当な濃度となるように溶解された水溶液の態様で、或いは該核酸プローブが固相担体上に固定された核酸アレイの態様で、本実施の形態における組成物に含まれる。
【００６９】
本実施の形態における組成物はまた、ｍｉＲ５８２又はｍｉＲ５８２活性を有する核酸の測定方法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。例えば、ノザンブロッティングや核酸アレイを測定に用いる場合には、本実施の形態における組成物は、ブロッティング緩衝液、標識化試薬、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションを測定に用いる場合には、本実施の形態における組成物は、標識化試薬、発色基質等をさらに含むことができる。
【００７０】
３．  本実施の形態における医薬の治療効果を判定する方法
本実施の形態としては、癌におけるｍｉＲ５８２の発現レベルを測定すること、及び当該発現レベルが癌では正常組織と比較して低下することに基づき、本実施の形態における医薬の治療効果を判定する方法ないし医師が当該判定を行うことを補助する方法（以下、それらの両方法をまとめて「判定方法」等と略すことがある。）が挙げられる。
【００７１】
本実施の形態における判定方法においては、測定対象患者から摘出された癌の癌組織もしくは癌細胞におけるｍｉＲ５８２の発現レベルが測定される。また、後記実施例２にあるようにｍｉＲ５８２の染色体領域のコピー数を測定することによりｍｉＲ５８２の発現レベルを推定することも可能である。本実施の形態における判定方法を適用することの出来る癌の種類としては、「ｈ．治療／予防対象」の項において詳述されている癌を挙げることが出来る。本実施の形態における判定方法は、好ましくは膀胱癌に対して適用できる。
【００７２】
本実施の形態における判定方法において発現レベルが測定されるｍｉＲ５８２には、配列番号１又は配列番号２で表されるヌクレオチド配列、成熟型ｍｉＲ５８２、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが含まれるが、好ましくは、これら全ての型の発現レベルの合計又は配列番号１又は配列番号２で表されるヌクレオチド配列又は成熟型の発現レベル、より好ましくは配列番号１又は配列番号２で表されるヌクレオチド配列の発現レベルが測定される。
【００７３】
例えば、ｍｉＲ５８２の発現レベルは、該ｍｉＲＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブを用いて、自体公知の方法により測定することが出来る。該測定方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション、核酸アレイ等を挙げることができる。又は、市販のキット（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴ  Ｋｉｔ）によっても測定できる。
【００７４】
ｍｉＲ５８２を特異的に検出し得る核酸プローブとしては、配列番号１、配列番号２で表されるヌクレオチド配列に含まれる、１５塩基以上、好ましくは１８塩基以上、より好ましくは約２０塩基以上、最も好ましくはその全長の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドを挙げることが出来る。同じく、ｍｉＲ５８２活性を有する核酸を検出し得る核酸プローブとしても、配列番号１、配列番号２又はそれらと相補的な配列で表されるヌクレオチド配列に含まれる、１５塩基以上、好ましくは１８塩基以上、より好ましくは約２０塩基以上、最も好ましくはその全長の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドを挙げることが出来る。
【００７５】
核酸プローブは、特異的検出に支障を生じない範囲で付加的配列（検出対象のポリヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド配列）を含んでいてもよい。また、核酸プローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ等）、酵素（例：βーガラクトシダーゼ、βーグルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）などで標識されていてもよい。或いは、蛍光物質（例：ＦＡＭ、ＶＩＣ等）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
【００７６】
核酸プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ核酸のいずれであってもよく、また、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。核酸プローブ又はプライマーは、例えば、配列番号１、配列番号２又はそれらと相補的な配列で表されるヌクレオチド配列の情報に基づいて、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。
【００７７】
上記のようにして測定されたｍｉＲ５８２の発現レベルに基づいて、抗癌剤の治療効果が判定される。後述の実施例に示すように、膀胱癌では正常膀胱組織と比較してｍｉＲ５８２の発現レベルが低下する。従って、上記判定は膀胱癌と正常組織におけるｍｉＲ５８２の発現レベルの違いに基づき行われる。
【００７８】
例えば、膀胱癌患者から抗癌治療を行う前に癌組織を摘出し（又は癌細胞を得て）、癌組織周辺の癌ではない組織（ネガティブコントロール）及び、癌組織（ポジティブコントロール）と、同一患者の抗癌治療を行った後に摘出した癌組織におけるｍｉＲ５８２の発現レベルを比較することで本実施の形態における判定方法を行い得る。発現レベルの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。そして、ｍｉＲ５８２の発現レベルの比較結果より、測定対象のｍｉＲ５８２の発現レベルが治療を行うことにより、治療前と比較して相対的に高くなっていた場合には、行われている抗癌治療が有効であると判定することができる。逆に、測定対象のｍｉＲ５８２の発現レベルが相対的に低くなる場合には、行われている抗癌治療が有効ではないと判定することができる。
【００７９】
具体的には、行われている抗癌治療が有効であると判定する場合、抗癌治療前の癌組織（又は癌細胞）におけるｍｉＲ５８２の発現レベルが、正常細胞におけるｍｉＲ５８２の発現レベルに比して、７５％以下であることが例示され、５０％以下であることが好ましく、２５％以下であることがより好ましい。また、癌治療後の癌組織（又は癌細胞）におけるｍｉＲ５８２の発現レベルが、癌治療前の癌組織（又は癌細胞）におけるｍｉＲ５８２の発現レベルに比して、１２５％以上であることが例示され、１５０％以上であることが好ましく、２００％以上であることがより好ましい。
【００８０】
また、同様に、膀胱癌患者から摘出された抗癌治療を行う前の癌組織及び抗癌治療を行った後の癌組織におけるｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数を比較し、発現レベルを推定することで、本実施の形態における予測方法を実施し得る。ｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。そして、ｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数の比較結果より、測定対象のｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数が抗癌治療を行う前の癌組織に対して抗癌治療を行なった後の癌組織において相対的に少なくなる場合には、治療効果が低い癌組織であると判定することができる。逆に、測定対象のｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数が、抗癌治療を行う前の癌組織に対して抗癌治療を行なった後の癌組織において同等以上である場合には、治療効果が高い癌組織であると判定することができる。
【００８１】
具体的には、行われている抗癌治療が有効であると判定する場合、抗癌治療前の癌組織（又は癌細胞）におけるｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数が、正常細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数に比して、７５％以下であることが例示され、５０％以下であることが好ましく、２５％以下であることがより好ましい。また、癌治療後の癌組織（又は癌細胞）におけるｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数が、癌治療前の癌組織（又は癌細胞）におけるゲノム領域のコピー数に比して、１２５％以上であることが例示され、１５０％以上であることが好ましく、２００％以上であることがより好ましい。
【００８２】
また、ｍｉＲ５８２又はｍｉＲ５８２活性を有する核酸が抗癌剤として投与された場合、投与された癌組織において同様にｍｉＲ５８２又はｍｉＲ５８２活性を有する核酸の量を測定し、投与前の癌組織におけるｍｉＲ５８２の発現と比較して治療効果を判定することが可能である。即ち、ｍｉＲ５８２又はｍｉＲ５８２活性を有する核酸の投与後、癌組織において、ｍｉＲ５８２又はｍｉＲ５８２活性を有する核酸の量の増加が認められた場合、行われている抗癌治療が有効であると判定することができる。
【００８３】
本実施の形態における医薬の治療対象としては、癌組織（又は癌細胞）におけるｍｉＲ５８２の発現レベルが低下している膀胱癌の患者が望ましいため、本実施の形態における判定方法は、本実施の形態における医薬による治療効果が得られた患者、特に当該膀胱癌患者の判断に有用である。
【００８４】
上記の説明から明らかなように、本実施の形態は、上述のｍｉＲ５８２又はｍｉＲ５８２活性を有する核酸を特異的に検出し得る核酸プローブを含む、抗癌剤の治療効果を判定するための組成物（以下、「本実施の形態における組成物」と呼ぶことがある。）を提供するものである。本実施の形態における組成物は、本実施の形態における医薬の治療効果を判定するためのキットであり得る。本実施の形態における組成物を用いることにより、上述の判定方法により容易に本実施の形態における医薬の治療効果について判定することができる。
【００８５】
核酸プローブは、通常、水もしくは適当な緩衝液（例：ＴＥバッファー、ＰＢＳなど）中に適当な濃度となるように溶解された水溶液の態様で、或いは該核酸プローブが固相担体上に固定された核酸アレイの態様で、本実施の形態における組成物に含まれる。
【００８６】
本実施の形態における組成物は、ｍｉＲ５８２又はｍｉＲ５８２活性を有する核酸の測定方法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。例えば、ノザンブロッティングや核酸アレイを測定に用いる場合には、本実施の形態における組成物は、ブロッティング緩衝液、標識化試薬、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションを測定に用いる場合には、本実施の形態における組成物は、標識化試薬、発色基質等をさらに含むことができる。
【００８７】
４．  癌治療の予後を判定する方法
本実施の形態としては、癌におけるｍｉＲ５８２の発現レベルを測定すること、及び当該発現レベルが癌では正常組織と比較して低下すること、或いはｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数を測定し、ｍｉＲ５８２の発現量を予測することに基づき、癌治療の予後を判定する方法ないし医師が当該予後の判定を行うことを補助する方法（以下、それらの両方法をまとめて「予後判定方法」等と略すことがある。）が挙げられる。
【００８８】
本実施の形態における予後判定方法においては、測定対象患者から摘出された癌の癌組織もしくは癌細胞におけるｍｉＲ５８２の発現レベルが測定される。また、ｍｉＲ５８２の染色体領域のコピー数を測定することによりｍｉＲ５８２の発現レベルを推定することも可能である。本実施の形態における予後判定方法を適用することの出来る癌の種類としては、上記「ｈ．治療／予防対象」の項において詳述されている癌を挙げることが出来る。本実施の形態における予後判定方法は、好ましくは膀胱癌に対して適用できる。
【００８９】
本実施の形態における予後判定方法において発現レベルが測定されるｍｉＲ５８２には、配列番号１又は配列番号２で表されるヌクレオチド配列、成熟型ｍｉＲ５８２、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが含まれるが、好ましくは、これら全ての型の発現レベルの合計又は配列番号１又は配列番号２で表されるヌクレオチド配列又は成熟型の発現レベル、より好ましくは配列番号１又は配列番号２で表されるヌクレオチド配列の発現レベルが測定される。
【００９０】
例えば、ｍｉＲ５８２の発現レベルは、該ｍｉＲＮＡを特異的に検出し得る核酸プローブを用いて、自体公知の方法により測定することが出来る。該測定方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション、核酸アレイ等を挙げることができる。又は、市販のキット（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴ  Ｋｉｔ）によっても測定できる。
【００９１】
ｍｉＲ５８２を特異的に検出し得る核酸プローブとしては、配列番号１又は配列番号２で表されるヌクレオチド配列に含まれる、１５塩基以上、好ましくは１８塩基以上、より好ましくは約２０塩基以上、最も好ましくはその全長の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドを挙げることが出来る。
【００９２】
また、ｍｉＲ５８２の発現レベルは該ｍｉＲＮＡがコードされるゲノム領域のコピー数を測定することにより推定することが可能である。
【００９３】
ｍｉＲ５８２がコードされるゲノム領域を特異的に検出し、コピー数を測定し得る核酸プローブとしては、例として、後記の配列番号４又は配列番号５で表されるヌクレオチド配列に含まれる、１５塩基以上、好ましくは１８塩基以上、より好ましくは約２０塩基以上、最も好ましくはその全長の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドを挙げることが出来る。
【００９４】
核酸プローブは、特異的検出に支障を生じない範囲で付加的配列（検出対象のポリヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド配列）を含んでいてもよい。また、核酸プローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ等）、酵素（例：βーガラクトシダーゼ、βーグルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）などで標識されていてもよい。或いは、蛍光物質（例：ＦＡＭ、ＶＩＣ等）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
【００９５】
核酸プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ核酸のいずれであってもよく、また、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。核酸プローブ又はプライマーは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号４又は配列番号５で表されるヌクレオチド配列の情報に基づいて、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。
【００９６】
上記のようにして測定されたｍｉＲ５８２の発現レベルに基づいて、癌治療の予後が判定される。後述の実施例に示すように、膀胱癌では正常膀胱組織と比較してｍｉＲ５８２の発現レベルが低下する。従って、上記予測は膀胱癌と正常組織におけるｍｉＲ５８２の発現レベルの違い、或いはｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数を測定し、ｍｉＲ５８２の発現量を推定することに基づき行われる。
【００９７】
例えば、膀胱癌患者から癌組織を摘出し（又は癌細胞を得て）、癌組織周辺の癌ではない正常組織及び、癌組織におけるｍｉＲ５８２の発現レベルを比較することで本実施の形態における予後判定方法を行い得る。発現レベルの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。そして、ｍｉＲ５８２の発現レベルの比較結果より、測定対象のｍｉＲ５８２の発現レベルが、正常組織に対して、癌組織において相対的に高くなる場合には、予後の良い癌組織であると判定することができる。逆に、測定対象のｍｉＲ５８２の発現レベルが相対的に低くなる場合には、予後の悪い癌組織であると判定することができる。
【００９８】
具体的には、予後が悪いと判定する癌組織（又は癌細胞）におけるｍｉＲ５８２の発現レベルが、正常細胞におけるｍｉＲ５８２の発現レベルに比して、７５％以下であることが例示され、５０％以下であることが好ましく、２５％以下であることがより好ましい。
【００９９】
また、同様に、膀胱癌患者から摘出された癌組織及びその周辺の癌ではない正常組織及びにおけるｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数を比較し発現レベルを推定することで、本実施の形態における予後判定方法を実施し得る。ｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。そして、ｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数の比較結果より、測定対象のｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数が、正常組織に対して、癌組織において相対的に少なくなる場合には、低いｍｉＲ５８２の発現レベルが予測され、予後の悪い癌組織であると判定することができる。逆に、測定対象のｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数が正常組織と同等以上である場合には、高いｍｉＲ５８２の発現レベルが予測され、予後の良い癌組織であると判定することができる。
【０１００】
具体的には、予後が悪いと判定する癌組織（又は癌細胞）におけるｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数が、正常細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数に比して、７５％以下であることが例示され、５０％以下であることが好ましく、２５％以下であることがより好ましい。
【０１０１】
本実施の形態における医薬の治療対象としては、癌組織（又は癌細胞）におけるｍｉＲ５８２の発現レベルが低下している膀胱癌の患者が望ましいため、本実施の形態における予後判定方法は、本実施の形態における医薬による治療の予後が良好な患者、特に当該膀胱癌患者の判定に有用である。
【０１０２】
上記の説明から明らかなように、本実施の形態は、上述のｍｉＲ５８２を特異的に検出し得る核酸プローブ、或いはｍｉＲ５８２のゲノム領域を特異的に検出しそのコピー数を測定し得る核酸プローブを含む、癌治療の予後を判定するための組成物（以下、「本実施の形態における組成物」と呼ぶことがある。）を提供するものである。本実施の形態における組成物は、癌治療の予後を判定するためのキットであり得る。本実施の形態における組成物を用いることにより、上述の判定方法により容易に癌治療の予後について判定することができる。
【０１０３】
核酸プローブは、通常、水もしくは適当な緩衝液（例：ＴＥバッファー、ＰＢＳなど）中に適当な濃度となるように溶解された水溶液の態様で、或いは該核酸プローブが固相担体上に固定された核酸アレイの態様で、本実施の形態における組成物に含まれる。
【０１０４】
本実施の形態における組成物は、ｍｉＲ５８２の測定方法、或いはｍｉＲ５８２のゲノム領域のコピー数の測定方法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。例えば、ノザンブロッティングや核酸アレイを測定に用いる場合には、本実施の形態における組成物は、ブロッティング緩衝液、標識化試薬、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションを測定に用いる場合には、本実施の形態における組成物は、標識化試薬、発色基質等をさらに含むことができる。
【０１０５】
５．  膀胱癌の増殖を抑制し得る物質、癌の転移又は癌細胞の浸潤能を阻害し得る物質等を探索する方法
本実施の形態としては、被検物質がｍｉＲ５８２の発現を増強するか否かを評価することを含む、癌の増殖を抑制する物質を探索する方法、癌の転移又は癌細胞の浸潤能を阻害し得る物質を探索する方法、並びに当該方法により得られうる物質が挙げられる。本実施の形態における探索方法においては、ｍｉＲ５８２の発現を上方制御する物質が、癌の増殖を抑制し得る物質、癌の転移又は癌細胞の浸潤能を阻害し得る物質として選択される。
【０１０６】
本実施の形態における探索方法に供される被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、ランダムペプチドライブラリー、或いは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【０１０７】
本実施の形態における、癌の増殖を抑制し得る物質を探索する方法は、以下の（１）〜（３）の工程を含む：
（１）被検物質と配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被検物質を接触させた細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現量と比較する工程、及び
（３）上記（２）の比較結果に基づいて、配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現量を上昇制御する被検物質を、癌の増殖を阻害し得る物質として選択する工程。
【０１０８】
また、本実施の形態における、癌の転移又は癌細胞の浸潤能を阻害し得る物質を探索する方法は、以下の（１）〜（３）の工程を含む：
（１）被検物質と配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現を測定可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被検物質を接触させた細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現量と比較する工程、及び
（３）上記（２）の比較結果に基づいて、配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現量を上昇制御する被検物質を、癌の転移又は癌細胞の浸潤能を阻害し得る物質として選択する工程。
【０１０９】
本実施の形態における探索方法において、発現レベルが測定される配列番号１又は配列番号２に記載の核酸には、成熟型ｍｉＲ５８２、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが含まれるが、好ましくは、これら全ての型の発現レベルの合計又は成熟型の発現レベル、より好ましくは成熟型の発現レベルが測定される。
【０１１０】
「発現を測定可能な細胞」とは、測定対象のｍｉＲＮＡの発現レベルを評価可能な細胞をいう。該細胞としては、測定対象のｍｉＲＮＡを天然で発現可能な細胞が挙げられる。
【０１１１】
測定対象、即ちｍｉＲ５８２を天然で発現可能な細胞は、ｍｉＲ５８２を潜在的に発現するものである限り特に限定されず、当該細胞として、哺乳動物（例えばヒト、マウス等）の初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株などを用いることができる。ｍｉＲ５８２を天然で発現可能な細胞としては、例えば上記「ｈ．治療／予防対象」の項において詳述されている癌の細胞を挙げることができる。好ましくは、膀胱癌細胞であり、より好ましくは、転移性又は浸潤能の高い膀胱癌細胞である。
【０１１２】
被検物質とｍｉＲ５８２の発現を測定可能な細胞との接触は、培養培地中で行われる。培養培地は、ｍｉＲ５８２の発現を測定可能な細胞に応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）などである。培養条件も同様に適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
【０１１３】
ｍｉＲ５８２の発現量の測定は、「２．本実施の形態における医薬の治療効果を予測する方法」の項で述べた方法に従い行うことができる。
【０１１４】
発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被検物質を接触させない対照細胞におけるｍｉＲ５８２の発現量は、被検物質を接触させた細胞におけるｍｉＲ５８２の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【０１１５】
そして、比較の結果得られた、ｍｉＲ５８２の発現量を上方制御する物質が、癌細胞の増殖を抑制し得る物質、癌の転移又は癌細胞の浸潤能を阻害し得る物質として選択される。
【０１１６】
本実施の形態における探索方法で得られる化合物は、新たな癌の治療剤の開発のための候補物質として有用である。
【実施例】
【０１１７】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において、特に断りのない限りヌクレオチド配列は５’から３’方向に向けて記載される。また、以下の実施例においては、配列番号１と配列番号２とが二本鎖を形成したＲＮＡ（式（■）参照）を「ｍｉＲ５８２」と略記する。また、配列番号１とその相補鎖とで二本鎖を形成し、さらに両鎖の３’末端に塩基「ａａ」が付加した二本鎖のＲＮＡを「ｍｉＲ５８２−５ｐ」と略記する。さらに、配列番号２とその相補鎖とで二本鎖を形成し、さらに両鎖の３’末端に塩基「ａａ」が付加した二本鎖のＲＮＡを「ｍｉＲ５８２−３ｐ」と略記する。【０１１８】
〔実施例１〕膀胱癌細胞におけるｍｉＲ５８２の発現
ヒト膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３、５６３７、Ｔ２４及びＨＴ１３７６、並びにヒト膀胱移行上皮性乳頭腫細胞株ＲＴ４及びマウス膀胱癌細胞ＭＢＴ２細胞から、ＲＮＡを、ＱＩＡｚｏｌ（製品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（製品名、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製品に添付のプロトコールに従って精製した。ヒト膀胱癌細胞のＲＮＡはＡｍｂｉｏｎ社のＨｕｍａｎ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いた。ｍｉＲ５８２−５ｐとｍｉＲ５８２−３ｐの発現はＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（製品名、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量した。定量ＰＣＲ反応はＡＢＩ７３００（製品名、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、内部標準にはヒトＲＮＵ６Ｂ（４３７３３８１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）或いはｈａｓ−ｍｉＲ−１０３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。ヒト膀胱移行上皮性乳頭腫細胞株ＲＴ４及び正常膀胱細胞では、ｍｉＲ５８２−５ｐ及びｍｉＲ５８２−３ｐの発現は高かった。膀胱癌細胞ＵＭ−ＵＣ−３、５６３７、ＨＴ１３７６及びＭＢＴ２では、全体的にｍｉＲ５８２−５ｐ及びｍｉＲ５８２−３ｐの発現は低下しており、浸潤能の高い膀胱癌細胞株であるＵＭ−ＵＣ−３、ＨＴ１３７６及びＭＢＴ２では明らかに発現が低下していた（図１）。Ｔ２４は浸潤能の高い膀胱癌細胞株であるが、この細胞株ではｍｉＲ５８２−５ｐ及びｍｉＲ５８２−３ｐの発現の著しい低下は認められなかった。【０１１９】
以上の結果から、膀胱癌細胞では、ｍｉＲ５８２−５ｐ及びｍｉＲ５８２−３ｐの発現が低下している割合が高い可能性が示唆された。【０１２０】
〔実施例２〕ｍｉＲ５８２の染色体領域のコピー数の検討
ヒト膀胱癌細胞ＵＭ−ＵＣ−３、Ｔ２４及びＨＴ１３７６からゲノムＤＮＡを、ＧｅｎＥｌｕｔｅ  哺乳動物用ゲノムＤＮＡミニプレップキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて、製品に添付のプロトコールに従って抽出した。染色体５ｑ１２上のｍｉＲ５８２領域の定量ＰＣＲは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（製品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行った。定量ＰＣＲに用いたプライマー配列を配列番号４と配列番号５に示す。【０１２１】
【化３】
2014030602.tif 000004
【０１２２】
内部標準にはＲＮａｓｅ  Ｐを用いて、ＴａｑＭａｎ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ａｓｓａｙ  ＲＮａｓｅ  Ｐ（４４０３３２６、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）とＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（製品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で定量を行い、先のｍｉＲ５８２領域の定量ＰＣＲデータの補正を行った。定量を行った結果、Ｔ２４及びＨＴ１３７６と比較して、転移能及び浸潤能の高い膀胱癌細胞であるＵＭ−ＵＣ−３では、ｍｉＲ５８２の染色体領域のコピー数は約半分に減少していた（図２）。以上の結果から、ｍｉＲ５８２の発現低下にはｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数が関与している可能性が示唆された。【０１２３】
〔実施例３〕ｍｉＲ５８２によるヒト膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３の増殖抑制活性
ヒト膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３の増殖抑制活性の確認には、ｍｉＲ５８２、ｍｉＲ５８２−５ｐ及びｍｉＲ５８２−３ｐを用いた。それらは、いずれもＢＯＮＡＣ社より購入した。ネガティブコントロールにはＡｌｌｓｔａｒｓ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。ＵＭ−ＵＣ−３細胞株に上記の各ｍｉＲＮＡを、各々２５ｎＭの濃度で、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を用いて、製品に添付のプロトコールに従って導入した。その細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間培養後、３，０００細胞／ｗｅｌｌで９６穴プレートに播種し直した。さらに３日間培養後、生細胞数を、Ｔｅｔｒａ  Ｃｏｌｏｒ  Ｏｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（製品名、生化学工業社）を用いて、製品に添付のプロトコールに従って４５０ｎｍの吸光度をＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定することで評価した。【０１２４】
その結果、ネガティブコントロールに比べ、ｍｉＲ５８２、ｍｉＲ５８２−５ｐ及びｍｉＲ５８２−３ｐを導入したＵＭ−ＵＣ−３細胞株では、その細胞増殖が有意に抑制された（図３、ｐ＜０．０１）。この結果から、ｍｉＲ５８２等は、膀胱癌細胞の増殖を抑制する活性を有することが明らかになった。【０１２５】
〔実施例４〕ｍｉＲ５８２によるヒト膀胱癌細胞株ＵＭ−ＵＣ−３の浸潤抑制活性
ＵＭ−ＵＣ−３細胞株に、実施例３で用いたものと同様の、ｍｉＲ５８２、ｍｉＲ５８２−５ｐ及びｍｉＲ５８２−３ｐ、或いはＡｌｌｓｔａｒｓ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を、各々２５ｎＭの濃度で、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を用いて、製品に添付のプロトコールに従って導入した。その細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間培養後、細胞浸潤アッセイに供した。当該アッセイは、２４−ｗｅｌｌ  Ｂｉｏｃｏａｔ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｃｈａｍｂｅｒ  （８μｍ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて、製品に添付のプロトコールに従って行った。詳細には、細胞を１００，０００細胞／ｗｅｌｌで２４穴プレートのアッパーチャンバーに播種し、ロアーチャンバーの培養液には終濃度１０％で  ＦＢＳを添加した。３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間培養後、透過膜のアッパーチャンバー側に付着した細胞をふき取り、ロアーチャンバー側に浸潤した細胞をディフ・クイック（シスメックス社）で固定、染色した。顕微鏡下でランダムな３視野における浸潤した細胞数をカウントし、各実験群における浸潤細胞数を求めた。【０１２６】
その結果、コントロールに比べ、ｍｉＲ５８２、ｍｉＲ５８２−５ｐ及びｍｉＲ５８２−３ｐを導入したＵＭ−ＵＣ−３細胞株では、その細胞浸潤が有意に抑制された（図４、ｐ＜０．０１）。この結果から、ｍｉＲ５８２等は、膀胱癌細胞の浸潤を抑制する活性を有することが明らかになった。【０１２７】
〔実施例５〕ｍｉＲ５８２によるマウス膀胱癌モデルの治療効果
マウスに対して、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するＵＭ−ＵＣ−３細胞（ＵＭ−ＵＣ−３−ＬＵＣ）の５，０００，０００細胞個を膀胱内投与して癌移植を行った。癌の増殖と転移は週に１回の頻度で、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇにより観察した。すなわち、Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１５０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与し１０分間放置した後、癌組織における生物発光をＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ社）を用いて、製品に添付の方法に従ってフォトンカウントで検出し、癌の増殖を測定した。データ解析はＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ２．５、Ｘｅｎｏｇｅｎ社）で行った。癌移植後４日目に移植した癌の大きさを生物発光で測定し、群間で発光量が揃うようにマウスを２群に分けた。【０１２８】
実施例３で用いたものと同様のｍｉＲ−５８２、或いはｍｉＲ５８２−ｓｃｒａｍｂｌｅコントロール（配列番号６と配列番号７）とＬＩＣ１０１（日本新薬）とを１：１６（ｗ／ｗ）の比で用いて複合体形成させた。当該複合体を、癌移植後、５、７、９、１１、１３、１５日目に、経尿道的に１０μｇ（核酸量）／７０μｌで投与した。生物発光観察は、癌移植後１、２、３、４週間目に行い、癌の大きさを測定した。【０１２９】
【化４】
2014030602.tif 000005
【０１３０】
その結果、３週目からｍｉＲ−５８２投与群で癌組織の増殖抑制が観察され、４週目にはｓｃｒａｍｂｌｅコントロール投与群と比較して有意な癌の増殖抑制が観察された（図５、ｐ＜０．０５）。また、癌移植後２８日目にマウスを屠殺し、肺に転移したＵＭ−ＵＣ−３−ＬＵＣの検出を、生物発光を指標に行った。その結果、Ｓｃｒａｍｂｌｅコントロール投与群では８匹中５匹のマウスで転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）を認めたが、ｍｉＲ５８２投与群では１０匹中１匹のマウスでしか転移が認められなかった（表１）。【０１３１】
【表１】
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【０１３２】
また、肺に転移したＵＭ−ＵＣ−３−ＬＵＣの定量を、生物発光を指標に行った結果、ｓｃｒａｍｂｌｅコントロール投与群と比較してｍｉＲ５８２投与群で有意な発光低下を観察した（図６、ｐ＜０．０５）。【０１３３】
以上の結果から、ｍｉＲ５８２は動物モデルにおいても膀胱癌細胞の増殖と転移を抑制する活性を有することが明らかになった。【０１３４】
〔実施例６〕ｍｉＲ５８２の標的遺伝子の予測
ｍｉＲ５８２の標的遺伝子を同定するため、以下の実験を行い、各実験において標的候補遺伝子を抽出した。
１）  下記の実験に用いる安定発現細胞を以下のように樹立した。ｐＨＡ−ｈＡＧＯ２−Ｐｕｒｏ（ＲＡ７０３Ａ−１、ＳＢＩ）はＶｉｒａＰｏｗｅｒ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ｋ４９７５−００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に、製品に添付のプロトコールに従ってＬ２９３Ｔ細胞へトランスフェクトした。その細胞を３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間培養後、培養上清を回収しウイルス溶液とした。製品に添付のプロトコールに従ってウイルスをＵＭ−ＵＣ−３細胞に感染させ、２μｇ／ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎ存在下で、３７℃、５％  ＣＯ２で２週間培養し、ＨＡ−ＡＧＯ２を安定的に発現するＵＭ−ＵＣ−３／ＨＡ−ＡＧＯ２を得た。Ｐｒｅ−ｍｉＲ５８２配列は配列番号８と配列番号９をプライマーに用いて、ＨＴ１３７６細胞株のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させ、ｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ＧｒｅｅｎＰｕｒｏ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（ＣＤ５１３Ｂ−１、ＳＢＩ）のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩサイトにクローニングした。【０１３５】
【化５】
2014030602.tif 000007
【０１３６】
このプラスミドをＶｉｒａＰｏｗｅｒ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ｋ４９７５−００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に、製品に添付のプロトコールに従ってＬ２９３Ｔ細胞へトランスフェクトした。その細胞を３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間培養後、培養上清を回収しウイルス溶液とした。製品に添付のプロトコールに従ってウイルスをＵＭ−ＵＣ−３細胞に感染させ、２μｇ／ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎ存在下で、３７℃、５％  ＣＯ２で２週間培養し、ｍｉＲ５８２を安定的に発現するＵＭ−ＵＣ−３／ｍｉＲ５８２を得た。Ｌｅｎｔｉ−ｓｃｒａｍｂｌｅ  ｓｈＲＮＡ（ＭＺＩＰ０００ＰＡ−１、ＳＢＩ）はＶｉｒａＰｏｗｅｒ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ｋ４９７５−００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に、製品に添付のプロトコールに従ってＬ２９３Ｔ細胞へトランスフェクトした。その細胞を３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間培養後、培養上清を回収しウイルス溶液とした。製品に添付のプロトコールに従ってウイルスをＵＭ−ＵＣ−３細胞に感染させ、２μｇ／ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎ存在下で、３７℃、５％  ＣＯ２で２週間培養し、ｓｃｒａｍｂｌｅコントロールのｓｈＲＮＡを安定的に発現するＵＭ−ＵＣ−３／ｓｈＮＣを得た。【０１３７】
２）  ＨＡ−ＡＧＯ２を発現するＵＭ−ＵＣ−３細胞にｍｉＲ５８２或いはコントロールｓｉＲＮＡ（Ａｌｌｓｔａｒｓ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ、Ｑｉａｇｅｎ）を、各々２５ｎＭの濃度で、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を用いて、製品に添付のプロトコールに従って導入し、３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間培養した。その後にＲＩＰ−ａｓｓａｙ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ＭＢＬ社）と抗ＨＡアガロースビーズ（和光純薬社）を用いてＲＮＡ−結合タンパク質免疫沈降（ＲＩＰ）を行った。ＡＧＯ２に結合したＲＮＡをＨＡペプチド（和光純薬社）で溶出し、ＱＩＡｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製品に添付のプロトコールに従って抽出、精製した。得られたＲＮＡはＬｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ，  ｏｎｅ  ｃｏｌｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて、製品に添付のプロトコールに従いＣｙ３で標識し、ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ＧＥ  マイクロアレイキット  ８ｘ６０Ｋ（製品名、Ａｇｉｌｅｎｔ社）にハイブリダイズさせ、マイクロアレイデータを取得した。得られたマイクロアレイデータはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ１１．５（トミーデジタル）で解析を行った。その結果、ＡＧＯ２とｍｉＲ５８２と複合体を形成したｍｉＲ５８２の標的候補遺伝子を９，２６６遺伝子同定した。【０１３８】
３）  ＵＭ−ＵＣ−３細胞にｍｉＲ５８２、或いはＡｌｌｓｔａｒｓ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡを、各々２５ｎＭの濃度で、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を用いて、製品に添付のプロトコールに従って導入した。その細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間培養後、各々の細胞からＲＮＡを、ＱＩＡｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製品に添付のプロトコールに従って抽出、精製した。得られたＲＮＡは、製品に添付のプロトコールに従い、Ｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ，  ｏｎｅ  ｃｏｌｏｒ（製品名、Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いてＣｙ３で標識し、ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ＧＥ  マイクロアレイキット  ８ｘ６０Ｋ（製品名、Ａｇｉｌｅｎｔ社）にハイブリダイズさせ、マイクロアレイデータを取得した。得られたマイクロアレイデータはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ１１．５（トミーデジタル）で解析を行った。ｍｉＲ５８２をトランスフェクトしたＵＭ−ＵＣ−３細胞とＡｌｌｓｔａｒｓ  ｓｉＲＮＡ  をトランスフェクトしたＵＭ−ＵＣ−３  細胞の発現データを比較し、ｍｉＲ５８２を導入したＵＭ−ＵＣ−３細胞で発現低下している遺伝子をｍｉＲ５８２の標的候補遺伝子として７，３９９遺伝子を同定した。【０１３９】
４）  ＵＭ−ＵＣ−３／ｍｉＲ５８２とＵＭ−ＵＣ−３／ｓｈＮＣの各々からＲＮＡを、ＱＩＡｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製品に添付のプロトコールに従って抽出、精製した。得られたＲＮＡは、製品に添付のプロトコールに従い、Ｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ，  ｏｎｅ  ｃｏｌｏｒ（製品名、Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてＣｙ３で標識し、ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ＧＥ  マイクロアレイキット  ８ｘ６０Ｋ（製品名、Ａｇｉｌｅｎｔ）にハイブリダイズさせ、マイクロアレイデータを取得した。得られたマイクロアレイデータはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ１１．５（トミーデジタル）で解析を行った。ＵＭ−ＵＣ−３  ｍｉＲ５８２細胞とＵＭ−ＵＣ−３  ｓｈＮＣ細胞の発現データを比較し、ＵＭ−ＵＣ−３  ｍｉＲ５８２細胞で発現低下している遺伝子をｍｉＲ５８２の標的候補遺伝子として１０，２０３遺伝子を同定した。【０１４０】
５）  ｍｉＲ５８２の直接の標的となる候補遺伝子群として、上記２、３）と４）の群間で重複した２５９遺伝子（直接標的候補遺伝子群Ｉ）を抽出した。その中で癌との関連性が文献等で示唆されている遺伝子は３８遺伝子存在し、さらに癌の増殖、浸潤、転移との関連性が文献等で示唆されている遺伝子を１９遺伝子抽出した。【０１４１】
６）  ｍｉＲ５８２の間接的な標的となる候補遺伝子群として、上記３）と４）の群間で重複し、かつ上記２）とは重複しない遺伝子を１，５５９遺伝子抽出した（間接標的候補遺伝子群Ｉ）。さらに上記３）の実験で発現変動量が２倍以上でＰ  ｖａｌｕｅ＜０．０５、かつ、上記４）の実験で発現変動量が１．７倍以上でｐ  ｖａｌｕｅ＜０．０５であった遺伝子を７遺伝子抽出した。【０１４２】
７）  ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／）を行い、ｍｉＲ５８２−５ｐの予想標的遺伝子、スコア上位５０遺伝子とｍｉＲ５８２−３ｐの予想標的遺伝子、スコア上位５０遺伝子、計１００遺伝子を抽出し、癌の増殖、浸潤、転移との関連性が文献等で示唆されている遺伝子を３５遺伝子抽出し、上記５）の直接標的遺伝子群Ｉ或いは６）の関節標的遺伝子群Ｉと重複する遺伝子を２０遺伝子抽出した。【０１４３】
８）  上記、５）、６）、７）で最終的に抽出された４６遺伝子をｍｉＲ５８２の標的遺伝子と予測した。【０１４４】
〔実施例７〕ｍｉＲ５８２の標的遺伝子の同定
実施例６でｍｉＲ５８２の標的遺伝子と予測した４６遺伝子のうち、ＫＣＮＣ１、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１及びＲＡＢ２７Ａ遺伝子の５種について、その遺伝子発現をｍｉＲ５８２が導入されたＵＭ−ＵＣ−３細胞で検討した。実施例３で用いたものと同様のｍｉＲ５８２、ｍｉＲ５８２−５ｐ及びｍｉＲ５８２−３ｐ、或いはコントロールｓｉＲＮＡ（Ａｌｌｓｔａｒｓ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ、Ｑｉａｇｅｎ）を、各々２５ｎＭの濃度で、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を用いて、製品に添付のプロトコールに従って導入した。その後、３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間培養したＵＭ−ＵＣ−３細胞からＲＮＡを、ＱＩＡｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製品に添付のプロトコールに従って抽出、精製した。得られたＲＮＡから、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（製品名、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、添付のプロトコールに従ってｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡについて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（前出）を用いて定量ＰＣＲを行って各遺伝子の定量を行った。内部標準にはβアクチンを用いて、各遺伝子の発現データの標準化を行った。定量ＰＣＲに用いた各プライマー配列は、ＫＣＮＣ１については配列番号１０と配列番号１１、ＰＧＧＴ１Ｂについては配列番号１２と配列番号１３、ＬＲＲＫ２については配列番号１４と配列番号１５、ＲＡＢ２７Ａについては配列番号１６と配列番号１７、ＤＩＸＤＣ１については配列番号１８と配列番号１９、そしてβアクチンについては配列番号２０と配列番号２１に示す。【０１４５】
【化６】
2014030602.tif 000008
2014030602.tif 000009
【０１４６】
その結果、ＫＣＮＣ１、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１は、ｍｉＲ５８２、ｍｉＲ５８２−５ｐ及びｍｉＲ５８２−３ｐをＵＭ−ＵＣ−３細胞にトランスフェクトすることによりその発現が有意に減少した（図７、ｐ＜０．０１）。ＲＡＢ２７ＡはｍｉＲ５８２及びｍｉＲ５８２−５ｐをＵＭ−ＵＣ−３細胞にトランスフェクトすることによりその発現が有意に減少した（ｐ＜０．０１）（図７）。ＰＧＧＴ１Ｂは、ｍｉＲ５８２をＵＭ−ＵＣ−３細胞にトランスフェクトすることによりその発現が有意に減少した（図８、ｐ＜０．０１）。また、ｍｉＲ５８２−５ｐでは発現を抑制する傾向にあった（図７）。【０１４７】
以上の結果から、ＫＣＮＣ１、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１は、ｍｉＲ５８２を構成するｍｉＲ５８２−５ｐ及びｍｉＲ５８２−３ｐの両配列の標的遺伝子であるが、ＲＡＢ２７ＡはｍｉＲ５８２を構成するｍｉＲ５８２−５ｐの標的遺伝子であることが示された。ＰＧＧＴ１ＢはｍｉＲ５８２を構成するｍｉＲ５８２−５ｐの標的遺伝子である可能性が示された。【０１４８】
〔実施例８〕ｍｉＲ５８２の標的遺伝子の発現抑制機構の解析
ＫＣＮＣ１、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１及びＲＡＢ２７Ａ遺伝子の３’−ＵＴＲ領域を、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅し、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＮｏｔＩとＸｈｏＩサイトにクローニングした。ＫＣＮＣ１の３’−ＵＴＲ領域（ＫＣＮＣ１−＃１；ＫＣＮＣ１  ｍＲＮＡ内の位置、３，９５５−５，４５０ｂｐ）の増幅に用いたＰＣＲプライマーは配列番号２２と配列番号２３に、ＫＣＮＣ１の３’−ＵＴＲ領域（ＫＣＮＣ１−＃２；ＫＣＮＣ１  ｍＲＮＡ内の位置、５，７１２−６，６９８ｂｐ）の増幅に用いたＰＣＲプライマーは配列番号２４と配列番号２５に示す。ＰＧＧＴ１Ｂの３’−ＵＴＲ領域（ＰＧＧＴ１Ｂ  ｍＲＮＡ内の位置、１，１７８−２，７１３ｂｐ）の増幅に用いたＰＣＲプライマーは配列番号２６と配列番号２７に、ＬＲＲＫ２の３’−ＵＴＲ領域（ＬＲＲＫ２  ｍＲＮＡ内の位置、７，７７７−９，１３０ｂｐ）の増幅に用いた配列番号２８と配列番号２９に、ＲＡＢ２７Ａの３’−ＵＴＲ領域（ＲＡＢ２７Ａ  ｍＲＮＡ内の位置、１，９８８−２，５３３ｂｐ）の増幅に用いた配列番号３０と配列番号３１に示す。ＤＩＸＤＣ１の３’−ＵＴＲ領域（ＤＩＸＤＣ１−＃１；ＤＩＸＤＣ１  ｍＲＮＡ内の位置、２，９０８−４，４２０ｂｐ）の増幅に用いたＰＣＲプライマーは配列番号３２と配列番号３３に、ＤＩＸＤＣ１の３’−ＵＴＲ領域（ＤＩＸＤＣ１−＃２；ＤＩＸＤＣ１  ｍＲＮＡ内の位置、５，４６５−５，８９０ｂｐ）の増幅に用いたＰＣＲプライマーは配列番号３４と配列番号３５に示す。【０１４９】
【化７】
2014030602.tif 000010
【０１５０】
これらレポータープラスミド１００ｎｇと、各２５ｎＭの、実施例３で用いたものと同様のｍｉＲ５８２、ｍｉＲ５８２−５ｐ及びｍｉＲ５８２−３ｐ、或いはコントロールｓｉＲＮＡ（Ａｌｌｓｔａｒｓ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ、Ｑｉａｇｅｎ）をＵＭ−ＵＣ−３細胞に、ＤｈａｒｍＦＥＣＴ  Ｄｕｏ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、９６穴プレート上でトランスフェクトした。細胞を３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間培養後、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製品に添付のプロトコールに従ってデュアルルシフェラーゼアッセイを行った。レニラルシフェラーゼの値をホタルルシフェラーゼの値で補正し、レポーター活性を求めた。【０１５１】
その結果、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２及びＤＩＸＤＣ１−＃１は、ｍｉＲ５８２、ｍｉＲ５８２−５ｐ及びｍｉＲ５８２−３ｐで有意にルシフェラーゼ活性が減少した（図８、ｐ＜０．０１）。ＲＡＢ２７Ａは、ｍｉＲ５８２及びｍｉＲ５８２−５ｐで有意にルシフェラーゼ活性が減少した（図８、ｐ＜０．０１）。また、ＫＣＮＣ１−＃１とＫＣＮＣ１−＃２は、いずれのｍｉＲＮＡ配列を用いてもルシフェラーゼ活性の減少は認められなかった。【０１５２】
以上の結果から、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２及びＤＩＸＤＣ１の３’−ＵＴＲには、ｍｉＲ５８２、ｍｉＲ５８２−５ｐ及びｍｉＲ５８２−３ｐのターゲット配列が存在することが明らかになった。ＲＡＢ２７Ａの３’−ＵＴＲには、ｍｉＲ５８２−５ｐのターゲット配列が存在することが明らかになった。また、ＫＣＮＣ１の３’−ＵＴＲには、いずれのｍｉＲＮＡのターゲット配列も存在せず、この遺伝子は間接的にｍｉＲ５８２で発現抑制を受けることが明らかになった。ＤＩＸＤＣ１＃２には、ｍｉＲ５８２−３ｐのターゲット配列の存在が予測されていたが、この配列は機能していないことが明らかになった。【０１５３】
〔実施例９〕ｍｉＲ５８２による標的遺伝子の蛋白発現抑制
ＵＭ−ＵＣ−３細胞に、ｍｉＲ５８２、或いはコントロールｓｉＲＮＡ（Ａｌｌｓｔａｒｓ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ、Ｑｉａｇｅｎ）を、各々２５ｎＭの濃度でＤｈａｒｍＦＥＣＴ１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトランスフェクションした。３７℃、５％  ＣＯ２で４８時間培養後、細胞を回収し、Ｍ−ＰＥＲ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（製品名、Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて細胞ライセートを調製した。ライセート中の細胞タンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、定法に従ってＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。ブロッキング（Ｂｌｏｋｉｎｇ  ＯＮＥ、０３９５３−９５、ナカライテスク社）を行った後、抗ＫＣＮＣ１抗体（１：５００希釈、ａｂ８４８２３、Ａｂｃａｍ）、抗ＰＧＧＴ１Ｂ抗体（１：５００希釈、ａｂ５５６１５、Ａｂｃａｍ）、抗ＬＲＲＫ２抗体（１：５００希釈、ａｂ５７３２９、Ａｂｃａｍ）、抗ＤＩＸＤＣ１抗体（１：５００希釈、ａｂ６７７６３、Ａｂｃａｍ）及び抗ＲＡＢ２７Ａ抗体（１：２００希釈、ａｂ５５６６７、Ａｂｃａｍ）を１次抗体に使用した。ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＮＡ９３１Ｖ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は１：５０００の希釈で２次抗体に用いた。目的蛋白質の検出はＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（製品名、ＧＥヘルスケア社）を用いて、ＬｕｍｉｎｏＩｍａｇｅｒ（ＬＡＳ−３０００、富士写真フィルム社）で行った。その結果、ｍｉＲ５８２をトランスフェクトしたＵＭ−ＵＣ−３細胞では、コントロールと比較してＫＣＮＣ１、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１及びＲＡＢ２７Ａの蛋白量の減少が認められた（図９）。【０１５４】
以上のことから、ｍｉＲ５８２は、ＫＣＮＣ１、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１及びＲＡＢ２７Ａを標的遺伝子とし、それら蛋白質の発現を抑制する活性があることが明らかになった。【０１５５】
〔実施例１０〕ｍｉＲ５８２標的遺伝子のノックダウンと膀胱癌細胞の増殖の抑制効果
下記、試験に用いたＫＣＮＣ１のｓｉＲＮＡの配列を配列番号３６と配列番号３７に、ＰＧＧＴ１ＢのｓｉＲＮＡ配列を配列番号３８と配列番号３９に、ＬＲＲＫ２のｓｉＲＮＡ配列を配列番号４０と配列番号４１に、ＲＡＢ２７ＡのｓｉＲＮＡ配列を配列番号４２と配列番号４３に、ＤＩＸＤＣ１のｓｉＲＮＡ配列を配列番号４４と配列番号４５に示す。【０１５６】
【化８】
2014030602.tif 000011
【０１５７】
ＵＭ−ＵＣ−３細胞株に、各ｓｉＲＮＡ或いはＡｌｌｓｔａｒｓ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を２５ｎＭの濃度で、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を用いて、製品に添付のプロトコールに従って導入した。３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間培養後、細胞を３，０００細胞／ｗｅｌｌで９６穴プレートに播種し直した。その細胞をさらに３日間培養後、生細胞数を、Ｔｅｔｒａ  Ｃｏｌｏｒ  Ｏｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（生化学工業社）を用いて、製品に添付のプロトコールに従って４５０ｎｍの吸光度をＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定することで評価した。その結果、コントロールに比べ、ＫＣＮＣ１、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１或いはＲＡＢ２７ＡのｓｉＲＮＡを導入したＵＭ−ＵＣ−３細胞株では、いずれもその細胞増殖が有意に抑制された（図１０、ｐ＜０．０１）。この結果から、ｍｉＲ５８２の標的遺伝子であるＫＣＮＣ１、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１及びＲＡＢ２７Ａには、膀胱癌細胞の増殖を誘導する活性があることが明らかになった。【０１５８】
〔実施例１１〕ｍｉＲ５８２標的遺伝子のノックダウンと膀胱癌細胞の浸潤抑制効果
ＵＭ−ＵＣ−３細胞株に、ＫＣＮＣ１のｓｉＲＮＡ（配列番号３６と配列番号３７）、ＰＧＧＴ１ＢのｓｉＲＮＡ（配列番号３８と配列番号３９）、ＬＲＲＫ２のｓｉＲＮＡ（配列番号４０と配列番号４１）、ＲＡＢ２７ＡのｓｉＲＮＡ（配列番号４２と配列番号４３）、ＤＩＸＤＣ１のｓｉＲＮＡ（配列番号４４と配列番号４５）或いはＡｌｌｓｔａｒｓ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を２５ｎＭの濃度で、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を用いて、製品に添付のプロトコールに従って導入した。その細胞を３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間培養し後、細胞浸潤アッセイを行った。当該アッセイは、２４−ｗｅｌｌ  Ｂｉｏｃｏａｔ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｃｈａｍｂｅｒ  （８μｍ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて、製品に添付のプロトコールに従って行った。詳細には、細胞を１００，０００細胞／ｗｅｌｌで２４穴プレートのアッパーチャンバーに播種した。ロアーチャンバーの培養液には終濃度１０％で  ＦＢＳを添加した。３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間培養後、透過膜のアッパーチャンバー側に付着した細胞をふき取り、ロアーチャンバー側に浸潤した細胞をディフ・クイック（シスメックス社）で固定、染色した。顕微鏡下でランダムな３視野における浸潤した細胞数をカウントし、各実験群における浸潤細胞数を求めた。【０１５９】
その結果、コントロールに比べ、ＫＣＮＣ１、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１或いはＲＡＢ２７ＡのｓｉＲＮＡを導入したＵＭ−ＵＣ−３細胞株ではいずれにおいてもその細胞浸潤が有意に抑制された（図１１、ｐ＜０．０１）。この結果から、ｍｉＲ５８２の標的遺伝子であるＫＣＮＣ１、ＰＧＧＴ１Ｂ、ＬＲＲＫ２、ＤＩＸＤＣ１及びＲＡＢ２７Ａは、膀胱癌細胞の浸潤を誘導する活性があることが明らかになった。【０１６０】
〔実施例１２〕ヒト膀胱癌検体におけるｍｉＲ５８２の発現
２９人の膀胱癌患者から経尿道的切除、或いは根治的膀胱切除術によってヒト膀胱組織を摘出し、検体とした。癌組織と正常上皮組織はホルマリンで固定し、パラフィン包埋後、組織切片を作成し、顕微鏡観察を行い、レーザー・キャプチャー・ダイセクションで目的とする細胞を得た。得られた細胞からＲＮＡを、ＱＩＡｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製品に添付のプロトコールに従って精製した。ｍｉＲ５８２−５ｐとｍｉＲ５８２−３ｐの発現は、ｍｉＲＮＡ  ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量した。定量ＰＣＲ反応はＡＢＩ７３００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、内部標準にはａｓ−ｍｉＲ−１０３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。その結果、同一患者の非癌細胞と癌細胞でｍｉＲ５８２−５ｐとｍｉＲ５８２−３ｐの発現を比較すると、いずれも癌細胞では有意にそれらの発現が低下していた（図１２中のグラフＡ、ｍｉＲ５８２−５ｐはｐ＜０．０００１、ｍｉＲ５８２−３ｐはｐ＝０．０００３）。また、ｍｉＲ５８２−５ｐ或いはｍｉＲ５８２−３ｐの癌細胞での発現低下が２．５倍以上の患者数を膀胱癌のグレード別に区分すると、いずれについても癌のグレードに伴い、発現が低下する患者の数が増えていく傾向にあることが判明した（図１２中のグラフＢ、表２）。【０１６１】
【表２】
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【０１６２】
以上の結果から、ヒト膀胱癌組織において、ｍｉＲ５８２−５ｐとｍｉＲ５８２−３ｐは正常組織と比較してその発現が低下することが明らかになった。また、癌の進行とこれらのｍｉＲＮＡの発現が負の相関している傾向にあることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１６３】
本発明の癌治療のための医薬は、癌、癌の転移に起因する疾患に対する治療や予防に有用である。本発明の方法により、癌や膀胱癌又はそれら癌の浸潤能又は転移能を判定することができ、癌や膀胱癌の治療効果や予後を判定するための剤、及び癌の増殖を抑制する作用を有する物質や、癌の転移を阻害する作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年11月5日(2015.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも以下の：
（１）配列番号１又は配列番号２で示されるヌクレオチド配列から成る核酸；
（２）部分配列５’−ＵＵＡＣＡＧＵ−３’又は５’−ＵＡＡＣＵＧＧ−３’を含み、配列番号１又は配列番号２と７０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成る核酸であって、タンパク質発現抑制活性を示す核酸；又は
（３）上記（１）又は（２）のヌクレオチド配列及び当該ヌクレオチド配列と相補的な配列を含み、それにより鎖中の全部又は一部に二本鎖構造を形成する一本鎖又は二本鎖の核酸、
を含有することを特徴とする、膀胱癌治療のための医薬。
【請求項２】
前記核酸が、二本鎖の核酸である、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
核酸が配列番号１で示されるヌクレオチド配列から成る、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
核酸が配列番号２で示されるヌクレオチド配列から成る、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項５】
核酸がｍｉＲ５８２のヌクレオチド配列を含み、且つタンパク質発現抑制活性を示す、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項６】
核酸がｍｉＲ５８２及びその前駆体からなる群より選ばれる少なくとも一つの核酸であり、前記前駆体がｐｒｉ−ｍｉＲ５８２又はｐｒｅ−ｍｉＲ５８２である、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項７】
核酸がｍｉＲ５８２である、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項８】
核酸が修飾された核酸である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項９】
膀胱癌が、ｍｉＲ５８２の発現が減少している膀胱癌である請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１０】
膀胱癌が、グレード２以上の膀胱癌である請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸を含有する、膀胱癌の転移を抑制又は予防するための医薬。
【請求項１２】
経尿道的に哺乳動物に投与される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬の膀胱癌治療効果を予測する方法であって、以下の；
（１）請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された正常組織又は正常細胞及び請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された癌組織又は癌細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度を測定する工程、
（２）正常組織又は正常細胞と癌組織又は癌細胞との間で配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度を比較する工程、及び
（３）癌組織又は癌細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度が、正常組織又は正常細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度よりも低い場合に、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬が治療効果があると予測する工程、
を含む方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬の膀胱癌治療効果を予測する方法であって、以下の；
（１）請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された正常組織又は正常細胞及び請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された癌組織又は癌細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数を測定する工程、
（２）正常組織又は正常細胞と癌組織又は癌細胞との間でｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数を比較する工程、及び
（３）癌組織又は癌細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数が、正常組織又は正常細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数よりも低い場合に、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬が治療効果があると予測する工程、
を含む方法。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬の膀胱癌治療効果を判定する方法であって、以下の；
（１）請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された癌組織又は癌細胞及び請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬投与後に患者から摘出された癌組織又は癌細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度を測定する工程、
（２）請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された癌組織又は癌細胞と請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬投与後に患者から摘出された癌組織又は癌細胞との間で配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度を比較する工程、及び
（３）請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬投与後に患者から摘出された癌組織又は癌細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度が、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された癌組織又は癌細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度よりも高い場合に、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬が治療効果があると判定する工程
を含む方法。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬の膀胱癌治療効果を判定する方法であって、以下の；
（１）請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された癌組織又は癌細胞及び請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬投与後に患者から摘出された癌組織又は癌細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数を測定する工程、
（２）請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された癌組織又は癌細胞と請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬投与後に患者から摘出された癌組織又は癌細胞との間でｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数を比較する工程、及び
（３）請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬投与後に患者から摘出された癌組織又は癌細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数が、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬投与前に患者から摘出された癌組織又は癌細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数よりも高い場合に、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬が治療効果があると判定する工程
を含む方法。
【請求項１７】
膀胱癌治療の予後を判定する方法であって、以下の；
（１）患者から摘出された正常組織又は正常細胞及び患者から摘出された癌組織又は癌細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度を測定する工程、
（２）正常組織又は正常細胞と癌組織又は癌細胞との間で配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度を比較する工程、及び
（３）癌組織又は癌細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度が、正常組織又は正常細胞における配列番号１又は配列番号２に記載の核酸の発現レベル又は濃度よりも低い場合に、癌治療の予後が悪いと判定する工程
を含む方法。
【請求項１８】
膀胱癌治療の予後を判定する方法であって、以下の；
（１）患者から摘出された正常組織又は正常細胞及び患者から摘出された癌組織又は癌細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数を測定する工程、
（２）正常組織又は正常細胞と癌組織又は癌細胞との間でｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数を比較する工程、及び
（３）癌組織又は癌細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数が、正常組織又は正常細胞におけるｍｉＲ５８２のゲノムのコピー数よりも低い場合に、癌治療の予後が悪いと判定する工程
を含む方法。
【請求項１９】
配列番号１又は配列番号２に記載の核酸を特異的に検出し得る核酸プローブを含み、該核酸プローブが、配列番号１又は配列番号２で表されるヌクレオチド配列に含まれる１５塩基以上の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬の効果を判定するための組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
ｂ．部分配列
本実施の態様における機能的類似物はまた、配列番号１又は配列番号２の「部分配列」から成ることが好ましい。本実施の形態に関連する「部分配列」とは、ｍｉＲＮＡが標的遺伝子を認識するのに必要な最小限のヌクレオチド配列を含む核酸を意味する。この最小限のヌクレオチド配列はシード配列としてその存在がよく知られている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０４：１９２９１−６（２００７））。つまり、ｍｉＲＮＡにおいてはシード配列と呼ばれる５’末端から２〜８番目の塩基配列が非常に重要で、ｍｉＲＮＡの標的となるｍＲＮＡの多くはその３’非翻訳領域にこのシード配列と相補的な配列を持っている。これにより、ｍｉＲＮＡはそのシード配列と相補的な配列を持っている特定のｍＲＮＡを認識しその機能を抑制する。また、シード配列は７塩基という短い配列で構成されているため、１つのｍｉＲＮＡがシード配列と相補的な配列を持っている複数のｍＲＮＡを標的にして、本来のｍｉＲＮＡ活性を発揮することが可能となる。例えば、配列番号１のシード配列としては、３’−ＵＧＡＣＡＵＵ−５’が挙げられる。また、配列番号２のシード配列としては、３’−ＧＧＵＣＡＡＵ−５’が挙げられる。従って、本実施の形態における有効成分は、配列番号１又は２の上記シード配列から成るか、或いは当該シード配列を含む連続する１５塩基以上、より好ましくは１７塩基以上、よりいっそう好ましくは１９塩基以上、最も好ましくは２０塩基を有してよい。
【国際調査報告】
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