(57)【要約】  この発明は、生体試料において、配列表の配列番号２〜３０の偶数の配列番号に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有するポリペプチドの発現を測定することを含む癌の検出方法、ＣＡＰＲＩＮ−１を標的とする治療薬の癌患者への投与を決定するために、癌患者試料中のＣＡＰＲＩＮ−１の存在及びその量を決定する癌の検出方法、ならびに、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を含む癌診断薬、キットを提供する。
2014014082.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して免疫学的反応性を有する抗体又はその抗原結合性断片を用いて、抗原抗体反応により、生体試料中のＣＡＰＲＩＮ−１の発現量を測定することを含む、癌の検出方法。
【請求項２】
測定すべき前記ＣＡＰＲＩＮ−１が
（ａ）配列表の配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
（ｂ）前記ポリペプチドと８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド
である、請求項１に記載の癌の検出方法。
【請求項３】
前記生体試料が、ヒト、イヌ又はネコ由来である、請求項１又は２に記載の癌の検出方法。
【請求項４】
前記生体試料がイヌ由来であり、測定すべき前記ＣＡＰＲＩＮ−１は配列番号６、８、１０、１２又は１４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の癌の検出方法。
【請求項５】
前記生体試料がヒト由来であり、測定すべき前記ＣＡＰＲＩＮ−１は配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の癌の検出方法。
【請求項６】
測定されたＣＡＰＲＩＮ−１発現量が健常個体と比較して有意に高い場合に、癌治療薬としての前記抗体の標的となる癌の存在が示される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の癌の検出方法。
【請求項７】
前記ＣＡＰＲＩＮ−１の発現量の測定は、免疫学的アッセイ法を用いて行う、請求項１〜６のいずれか１項に記載の癌の検出方法。
【請求項８】
前記免疫学的アッセイ法が、ＥＬＩＳＡ及び/又は免疫組織化学染色法である、請求項７に記載の癌の検出方法。
【請求項９】
前記生体試料が体液、組織又は細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の癌の検出方法。
【請求項１０】
前記癌が、乳癌、脳腫瘍、食道癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、甲状腺癌、脾臓癌、膵臓癌、大腸癌、皮膚癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、精巣癌、骨肉腫及び線維肉腫からなる群より選ばれる少なくとも１つの癌である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の癌の検出方法。
【請求項１１】
前記抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号７０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び７１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の癌の検出方法。
【請求項１２】
配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと免疫学的反応性を有する抗体又はその抗原結合性断片を含むことを特徴とする、癌診断薬又はキット。
【請求項１３】
前記抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号７０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び７１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である、請求項１２に記載の癌診断薬又はキット。
【請求項１４】
配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して免疫学的反応性を有する抗体又はその抗原結合性断片を用いて生体試料中のＣＡＰＲＩＮ−１の発現量を測定し、その発現量が健常個体と比較して統計学的に有意に高い場合に、ＣＡＰＲＩＮ−１標的薬を該生体試料が由来する個体に投与するのに適した癌治療薬として選択することを決定する、個体別癌治療薬の選択方法。
【請求項１５】
前記ＣＡＰＲＩＮ−１標的薬が、ＣＡＰＲＩＮ−１と免疫学的反応性を有する抗体又はその抗原結合性断片であることを特徴とする、請求項１４に記載の個体別癌治療薬の選択方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＡＰＲＩＮ−１を腫瘍マーカーとする癌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。これまでの医療技術の進歩により、癌種によっては早期発見できれば治せる可能性の高い疾患となってきている。そのため、癌患者の体力的、経済的負担のない、簡便に検査できる癌の検出方法が求められている。【０００３】
最近では、腫瘍マーカー等の腫瘍生産物を測定する方法が普及してきた。腫瘍生産物とは、腫瘍に関連する抗原、酵素、特定のタンパク質、代謝産物、腫瘍遺伝子、腫瘍遺伝子生産物及び腫瘍抑制遺伝子等を指し、癌胎児性抗原ＣＥＡ、糖タンパク質ＣＡ１９−９、前立腺特異抗原ＰＳＡ、甲状腺で産生されるペプチドホルモンであるカルシトニン等が一部の癌で腫瘍マーカーとして癌診断に活用されている。しかし、他の多くの癌種においては、癌診断に有用な腫瘍マーカーは存在しない。また、現在知られている腫瘍マーカーの大部分は、体液中にごく微量（ｐｇ／ｍＬオーダー程度）にしか存在しないため、それらを検出するためには、高感度な測定法や特殊な技術が必要とされる。このような現状の中で、各種癌を簡便な操作で高感度に検出できる新規な癌検査手段が提供できれば、各種癌に対する診断用途が開かれると期待される。【０００４】
一方、近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、多くの癌では効果的な癌診断技術が確立されていない。それ故、癌を早期に発見することができず、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。【０００５】
近年、分子生物学や癌免疫学の進歩によって、癌に特異的に反応する抗体や、癌化や癌の増悪に関連する癌抗原に対する分子標的薬等、癌抗原類をターゲットにした特異的癌治療法への期待が高まっている。中でも、癌細胞上の抗原タンパク質を標的にした、癌を治療するための抗体医薬が複数上市され、癌治療に用いられている。抗体医薬は、癌特異的治療薬として一定の薬効が得られていることから注目されているが、標的となる抗原タンパク質の大部分は正常細胞にも発現するものであり、抗体投与の結果、癌細胞だけでなく、抗原が発現する正常細胞も障害されてしまい、その結果生じる副作用が問題になっている。また、癌患者によって病因は様々であるため癌治療の効果は個人差が極めて大きい。例えば、手術、化学療法あるいは放射線療法において、癌の進行段階によりその治療及び予後は大きく左右される。個体の多様性により、同じ癌治療薬に対しても個々人で異なる感受性をもつことが知られており、ある患者で有効な薬が他の患者でも有効であるとは限らない。【０００６】
そこで、予め患者の疾患関連遺伝子やタンパク質の発現を測定し、ある特定の薬物が特定の遺伝子又はタンパク質を発現している癌患者に対して有効であるかどうか評価した上で、その癌患者への治療薬の投与の決定がなされている。具体的には、ある種の癌に対する疾患関連遺伝子やタンパク質を測定する検出法を用いて、臨床現場で癌患者由来の試料、例えば血清や組織中に癌抗原が存在するか否かを検査した後に癌抗原特異的な治療薬の投与の決定がなされている。例えば、大腸癌患者の癌組織を、免疫組織化学染色ＥＧＦＲ検出法「ＥＧＦＲｐｈａｒｍ（ＤＡＫＯ社）」により評価し、大腸癌におけるアービタックスの有効性を予測した後に、アービタックスの投与を決定している。また、乳癌患者の癌組織を、免疫組織化学染色Ｈｅｒ２検出法「ハーセプテスト」により評価し、乳癌におけるハーセプチンの有効性を予測した後に、ハーセプチンの適用を決定している。【０００７】
ところで、コンパニオンアニマルは家族の一員として飼育され、飼い主と同様の生活習慣を持っていることが多い。そのため、コンパニオンアニマルの癌罹患により、飼い主が将来癌を発症する危険性が高いことを予測することができると言われている。【０００８】
代表的なコンパニオンアニマルであるイヌは、ヒトと比べ７倍早く年を取ることが知られている。現在、イヌの飼育数は、日本では約６７０万頭、また米国では約１７６４万頭ともいわれている。狂犬病予防接種のほかに５種、７種、８種等の混合ワクチンが一般に普及し、イヌパルボウィルス感染症、イヌジステンパーウィルス感染症、イヌパラインフルエンザ（ケンネルコフ）、イヌアデノウィルス２型感染症（ケンネルコフ）、イヌ伝染性肝炎、イヌコロナウィルス感染症、及びレプトスピラ病といった致死率の高い感染症が減少した。そのため、イヌの平均寿命は延び、７歳以上の高齢犬は全飼育数の３５．５％を占めている。死亡原因もヒトと同じく癌や高血圧、心臓病等が増加の一途をたどっている。米国では１年間に約４００万頭のイヌが癌と診断されており、日本においても潜在的に約１６０万頭に何らかの腫瘍があるといわれている。しかしながら、コンパニオンアニマルは、ヒトのように健康診断が普及していないため発見が遅れ、腫瘍が大きくなって初めて飼い主が気づき、来院することが多い。その大きくなってしまった腫瘍が悪性である場合、手術等の外科的療法や抗癌剤等の投薬を行ったとしても、すでに手遅れとなる場合がほとんどである。そのため、獣医が悪性と判断した場合には手術せずに抗癌剤治療を行うのが一般的である。手術を行う場合にも、マージン確保の大きさや手術中の血液、細胞飛散対策といった手術中の対策も厳重に施す必要がある。手術後すぐに抗癌剤治療を開始し、経過観察も短い間隔で行うことが望ましい。したがって、癌に罹ったコンパニオンアニマルにおいても癌治療薬の投薬は必須であり、ある種の癌に対する疾患関連遺伝子やタンパク質を測定する検出法が存在すれば、これまでよりも効果的な治療が可能になり、飼い主にとっても獣医にとってもメリットが大きい。【０００９】
Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ−ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＣＡＰＲＩＮ−１）は、休止期の正常細胞が活性化や細胞分裂を起こす際に発現し、また細胞内でＲＮＡと細胞内ストレス顆粒を形成してｍＲＮＡの輸送、翻訳の制御に関与すること等が知られている細胞内タンパク質である。一方で、本発明者らは、乳癌細胞の膜表面にＣＡＰＲＩＮ−１が高発現していること、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体が乳癌細胞に対して強い抗腫瘍効果を発揮することを明かにした（特許文献１）。また、細胞表面に発現しているＣＡＰＲＩＮ−１に結合する抗体を用いて、患者に由来する試料中のＣＡＰＲＩＮ−１の発現を測定することにより、癌の検出ならびに癌の悪性度を評価できることが報告されている（特許文献２）。すなわち、細胞膜タンパク質の１つであるＣＡＰＲＩＮ−１は癌治療等のターゲットとなりうることが記載されている。一方、上述したように、癌患者の多様性から、ＣＡＰＲＩＮ−１を標的とした治療薬、例えば抗体の投与を決定するためには、予め癌患者由来試料中のＣＡＰＲＩＮ−１の発現を検証する必要がある。しかし、このように特異的な治療薬を適用するためのＣＡＰＲＩＮ−１の検出方法に関する報告はなく、また癌患者試料を用いた癌を検出する試薬は存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／０１６５２６
【特許文献２】ＷＯ２０１０／０１６５２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、癌の診断に有用な癌の検出手段を提供することである。また、癌患者に対するＣＡＰＲＩＮ−１を標的とする治療薬の投与を決定するために、癌患者試料中のＣＡＰＲＩＮ−１を検出し、その発現量を決定する癌の検出方法、癌診断薬及びキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、鋭意研究の結果、イヌ精巣由来ｃＤＮＡライブラリーと担癌犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体が結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを取得した。そのｃＤＮＡを基にして、配列番号６、８、１０、１２及び１４で示されるアミノ酸配列を有するイヌＣＡＰＲＩＮ−１を作製した。また、取得した遺伝子のヒト相同性遺伝子を基にして、配列番号２及び４で示されるアミノ酸配列を有するヒトＣＡＰＲＩＮ−１を作製した。そして、ＣＡＰＲＩＮ−１をコードする遺伝子が、イヌ及びヒトの精巣ならびに悪性の癌細胞において特異的に発現すること（後述の実施例１を参照）、ＣＡＰＲＩＮ−１のアミノ酸配列を基に作製された組換えポリペプチドを抗原として作製したモノクローナル抗体が様々な癌組織中のＣＡＰＲＩＮ−１と結合すること、及びＣＡＰＲＩＮ−１をその表面に有する癌細胞を障害しうることを見出し、その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１が癌治療標的になるという知見を得た。さらに、上述したモノクローナル抗体を利用して、癌患者由来試料から特異的にＣＡＰＲＩＮ−１を検出できることを見出した。すなわち、本発明は、生体試料に対して行う癌の検出方法であり、ＣＡＰＲＩＮ−１の発現を測定することを含む方法を提供する。また、上述のモノクローナル抗体を用いた免疫学的アッセイ法、すなわち癌患者由来血清によるＥＬＩＳＡ法及び癌組織による免疫組織化学染色法等により、癌患者由来試料中のＣＡＰＲＩＮ−１を検出し、その発現量を評価する方法を確立した。また、その方法を適用して癌由来試料を評価し、その結果からＣＡＰＲＩＮ−１を発現し、かつその量が高い患者に対しては、ＣＡＰＲＩＮ−１を標的とする治療薬の適用が可能になることを見出し、本願発明を完成した。【００１３】
本発明は、生体試料に対して行なう方法であって、該試料中のＣＡＰＲＩＮ−１を検出し、その発現量を測定する癌の検出方法を提供する。また、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する治療薬を癌患者に投与する前に、組織中のＣＡＰＲＩＮ−１の発現量を測定することによって、ＣＡＰＲＩＮ−１を標的とする治療薬、例えば抗体等をその癌患者に適用できるか、その有効性を予測することによって、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する治療薬の適用性を明らかにする診断方法を提供する。さらに、本発明は、ＣＡＰＲＩＮ−１と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む癌診断薬又はキットを提供する。【００１４】
具体的には、本発明は以下の特徴を有する。【００１５】
（１）配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して免疫学的反応性を有する抗体を用いて、抗原抗体反応により、生体試料中のＣＡＰＲＩＮ−１発現量を測定することを含む、癌の検出方法。【００１６】
（２）測定すべき前記ＣＡＰＲＩＮ−１が（ａ）配列表の配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は（ｂ）該ＣＡＰＲＩＮ−１と８５％以上の配列同一性を有するポリペプチドである、上記（１）に記載の癌の検出方法。【００１７】
（３）前記生体試料が、ヒト、イヌ又はネコ由来である、上記（１）又は（２）に記載の癌の検出方法。【００１８】
（４）前記生体試料がイヌ由来であり、測定すべき前記ＣＡＰＲＩＮ−１は配列番号６、８、１０、１２又は１４に示されるアミノ酸配列を有する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の癌の検出方法。【００１９】
（５）前記生体試料がヒト由来であり、測定すべき前記ＣＡＰＲＩＮ−１は配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を有する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の癌の検出方法。【００２０】
（６）測定されたＣＡＰＲＩＮ−１発現量が健常個体と比較して有意に高い場合に、癌治療薬としての前記抗体の標的となる癌の存在が示される、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の癌の検出方法。【００２１】
（７）前記ＣＡＰＲＩＮ−１の発現の測定は、免疫学的アッセイ法を利用する上記（１）〜（６）のいずれかに記載の癌の検出方法。【００２２】
（８）前記免疫学的アッセイ法が、ＥＬＩＳＡ及び/又は免疫組織化学染色法である、上記（７）に記載の癌の検出方法。【００２３】
（９）前記試料が体液、組織又は細胞である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の癌の検出方法。【００２４】
（１０）前記癌が、乳癌、脳腫瘍、食道癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、甲状腺癌、脾臓癌、膵臓癌、大腸癌、皮膚癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、精巣癌、骨肉腫、及び線維肉腫からなる群より選ばれる少なくとも一の癌である、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の癌の検出方法。【００２５】
（１１）前記抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号７０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び７１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の癌の検出方法。【００２６】
（１２）配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと免疫学的反応性を有する抗体又はその抗原結合性断片を含むことを特徴とする癌診断薬又はキット。【００２７】
（１３）前記抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号７０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び７１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である上記（１２）に記載の癌診断薬又はキット。【００２８】
（１４）配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して免疫学的反応性を有する抗体又はその抗原結合性断片を用いて生体試料中のＣＡＰＲＩＮ−１の発現量を測定し、その発現量が健常個体と比較して統計学的に有意に高い場合に、ＣＡＰＲＩＮ−１標的薬を該生体試料が由来する個体に投与するのに適した癌治療薬として選択することを決定する、個体別癌治療薬の選択方法。【００２９】
（１５）前記ＣＡＰＲＩＮ−１標的薬が、ＣＡＰＲＩＮ−１と免疫学的反応性を有する抗体又はその抗原結合性断片であることを特徴とする、上記（１４）に記載の個体別癌治療薬の選択方法。【００３０】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2012-160751号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００３１】
本発明により、癌患者から分離された試料中のＣＡＰＲＩＮ−１の発現量を測定することのできる新規な癌の検出方法が提供される。後述の実施例において具体的に示されるように、ＣＡＰＲＩＮ−１（又はＣａｐｒｉｎ−１ともいう）のアミノ酸配列を基に作製した組換えポリペプチドを抗原として作製した抗体は、癌患者の血清や組織中のＣＡＰＲＩＮ−１と特異的に反応する。また、下記実施例に記載される通り、様々な癌組織において、ＣＡＰＲＩＮ−１自体が特異的に高発現していることから、癌患者から分離した試料中のＣＡＰＲＩＮ−１を検出し、その発現量を測定することによって、癌の検出が可能になる。また、ＣＡＰＲＩＮ−１を標的とした治療薬、例えば抗体医薬に対して感受性があるか否かを予め判定することにより、本治療薬を適用可能な患者の選抜が可能になる。すなわち、本発明を癌患者に適用し、ＣＡＰＲＩＮ−１を検出し、その発現量を予め測定することによって、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を用いたより効率的な治療の提供が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＣＡＰＲＩＮ−１をコードする遺伝子の、正常組織及び腫瘍細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号１；ＣＡＰＲＩＮ−１タンパクをコードする遺伝子の発現パターン、参照番号２；ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現パターンを示す。最上段のパネルはイヌ正常組織、左中段のパネルはイヌ乳癌組織、右中段のパネルはヒト乳癌細胞株、最下段のパネルは各種のヒト癌細胞株についての結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の癌の検出方法では、生体試料中のＣＡＰＲＩＮ−１を検出し、その発現量を測定する。癌患者試料中のＣＡＰＲＩＮ−１の発現量を測定する方法としては、例えば、抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を用いた免疫学的アッセイ法により解析することができる。このような方法は、その多くが当該技術分野で公知であり、例えば、免疫組織化学的解析、ウエスタンブロット解析、免疫沈降、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、生化学的酵素活性アッセイ等、抗体を使用する免疫学的アッセイ法が適用可能である。なお、本明細書における「発現量」は、細胞内におけるタンパク質の蓄積量及び存在量を含む。
【００３４】
試料中のＣＡＰＲＩＮ−１の発現は、実施例に示すスコア値に分類することにより区別することができる。そのスコア値が高ければ高い程、癌患者の癌組織や癌血清中に測定対象になっているＣＡＰＲＩＮ−１が多く含まれていることを示す。なお、本発明において、「測定」という用語には、検出、定性、定量及び半定量のいずれもが包含される。
【００３５】
配列番号６、８、１０、１２又は１４に示されるアミノ酸配列は、イヌのＣＡＰＲＩＮ−１のアミノ酸配列である。該アミノ酸配列を有するイヌＣＡＰＲＩＮ−１は、イヌ精巣由来ｃＤＮＡライブラリーと担癌犬由来の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチドとして同定されたものである（実施例１参照）。上記の方法によりイヌの組織中の抗原たる配列番号６、８、１０、１２又は１４のＣＡＰＲＩＮ−１自体を測定することで、ＣＡＰＲＩＮ−１を標的とする治療薬に対する患者の感受性の有無を診断することができる（実施例参照）。なお、本明細書で使用する「アミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸残基がそのような順序で配列しているという意味である。したがって、例えば、「配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、配列番号２に示されるＭｅｔ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｌａ・・（中略）・・Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ａｓｎのアミノ酸配列がその順序で連結してなる、７０９アミノ酸残基のサイズのポリペプチドを意味する。本明細書では、「配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」を「配列番号２のポリペプチド」と略記することがある。「塩基配列を有する」という表現についても同様である。この場合、「有する」という用語は、「からなる」という表現で置き換えてもよい。
【００３６】
また、本明細書中で使用する「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が多いポリペプチド分子のみならず、アミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）や、全長タンパク質も包含される。本発明では配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号に示すアミノ酸配列を有するＣＡＰＲＩＮ−１の全長タンパク質もポリペプチドに包含される。
【００３７】
本発明の方法では、配列番号６、８、１０、１２又は１４で示されるイヌＣＡＰＲＩＮ−１以外の、その他の哺乳動物のＣＡＰＲＩＮ−１も測定対象となる。本明細書では、以下、その他の哺乳動物のＣＡＰＲＩＮ−１をイヌＣＡＰＲＩＮ−１に対する「相同因子」（又は「ホモログ」）ということがある。また、単に「ＣＡＰＲＩＮ−１」という場合には、イヌに限らず、他の哺乳動物由来のＣＡＰＲＩＮ−１も包含する。本発明の方法で測定対象となるその他の哺乳動物のＣＡＰＲＩＮ−１としては、例えば、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１、ネコＣＡＰＲＩＮ−１等が挙げられるが、これらに限定されない。下記実施例に具体的に記載される通り、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｍＲＮＡは、配列番号６、８、１０、１２又は１４で示されるイヌＣＡＰＲＩＮ−１同様、ヒトの精巣と癌細胞で有意に高発現しているが、健常ヒト体内では該抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１抗体が検出されない。また、抗ネコＣＡＰＲＩＮ−１抗体は、健常ネコ体内では検出されず、担癌ネコでのみ検出される。したがって、イヌ以外の哺乳動物におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現量を測定した場合であっても、該哺乳動物へのＣＡＰＲＩＮ−１を標的とする治療薬の適否を判定することができる。
【００３８】
なお、ヒトＣＡＰＲＩＮ−１をコードする塩基配列、及びそのアミノ酸配列は、配列表の配列番号１及び３、及び２及び４にそれぞれ示される通りである。ヒトＣＡＰＲＩＮ−１のイヌＣＡＰＲＩＮ−１に対する配列同一性は塩基配列で９４％、アミノ酸配列で９８％である。イヌとヒトのように遺伝的に遠縁な哺乳動物間であっても、それぞれのＣＡＰＲＩＮ−１のアミノ酸配列の配列同一性は９８％と非常に高いことから、ヒト以外の哺乳動物のＣＡＰＲＩＮ−１とイヌＣＡＰＲＩＮ−１との間でも８５％程度以上の高い配列同一性を有するものと考えられる。すなわち、本発明の方法において測定対象となるＣＡＰＲＩＮ−１は、特に限定されないが、配列番号６、８、１０、１２又は１４に示されるイヌＣＡＰＲＩＮ−１のアミノ酸配列と好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有する。
【００３９】
通常、タンパク質等のような、複雑な構造をとる分子量の大きい抗原物質の場合、分子上に構造の異なる複数のエピトープが存在している。したがって、生体内では、そのような抗原物質に対し、複数のエピトープをそれぞれ認識して結合する複数種類の抗体が生産される。すなわち、生体内でタンパク質等の抗原物質に対して生産される抗体は、複数種類の抗体の混合物であるポリクローナル抗体である。本願発明者らが見出した、担癌に罹患した生体由来の血清中に特異的に存在し、組換えＣＡＰＲＩＮ−１と抗原抗体反応により特異的に結合する抗体もまた、ポリクローナル抗体である。なお、本発明において「ポリクローナル抗体」といった場合には、抗原物質を体内に含む生体由来の血清中に存在する抗体であって、該抗原物質に対して該生体内で誘導された抗体を指す。
【００４０】
抗原として用いるペプチドの好ましい具体例としては、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号のポリペプチド又はその断片が挙げられる。
【００４１】
なお、配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号（すなわち、配列番号２，４，６・・・２８，３０）のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列はそれぞれ、配列番号１〜２９のうち奇数の配列番号（すなわち、配列番号１，３，５・・・２７，２９）に示されている。
【００４２】
一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換され、欠失され、付加され、又は挿入された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。したがって、ＣＡＰＲＩＮ−１のアミノ酸配列のうち少数の（好ましくは、１個もしくは数個の）アミノ酸残基が置換され、欠失され、及び／又は挿入された配列を有するポリペプチドであって、元の配列と８０％以上、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、かつ、ＣＡＰＲＩＮ−１に対するポリクローナル抗体と抗原抗体反応により特異的に結合するポリペプチド（以下、便宜的に「特異反応性修飾ポリペプチド」ということがある）も、上記配列番号２〜３０のうち偶数の配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同様に癌の検出に用いることができる。好ましい特異反応性修飾ポリペプチドは、ＣＡＰＲＩＮ−１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が置換され、欠失され、付加され、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有する。本明細書中の「数個」とは、２〜１０の整数、好ましくは２〜６の整数、さらに好ましくは２〜４の整数を表す。
【００４３】
本明細書中で使用する、アミノ酸配列の「配列同一性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を全アミノ酸残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ等の周知のプログラムを用いて行なうことができる（Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８７：２２６４−２２６８，  １９９３；  Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２５：３３８９−３４０２，  １９９７）。
【００４４】
なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Ｇｌｙ，  Ｉｌｅ，  Ｖａｌ，  Ｌｅｕ，  Ａｌａ，  Ｍｅｔ，  Ｐｒｏ）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Ａｓｎ，  Ｇｌｎ，  Ｔｈｒ，  Ｓｅｒ，  Ｔｙｒ，  Ｃｙｓ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ，  Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ，  Ｌｙｓ，  Ｈｉｓ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，  Ｔｙｒ，  Ｔｒｐ，  Ｈｉｓ）のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換、すなわち保存的置換、であればポリペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。したがって、ＣＡＰＲＩＮ−１のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、対応抗体との結合性を維持できる可能性が高くなる。しかしながら、本発明では、上記改変体は、未改変体と同等もしくはほとんど同等の免疫誘導活性を付与する限り、非保存的置換を有していてもよい。
【００４５】
本発明で用いられる上記ポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる（日本生化学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、化学修飾とペプチド合成、東京化学同人（日本）、１９８１年）。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。あるいは、公知の遺伝子工学的手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  第２版，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌら，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第３版，  Ａ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９５），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ等）を用いて容易に調製することができる。例えば、配列番号２のヒトＣＡＰＲＩＮ−１又はその相同因子をコードする遺伝子を発現している組織から抽出したＲＮＡから、該遺伝子のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより調製し、該ｃＤＮＡの全長又は所望の一部を発現ベクターに組み込んで、宿主細胞中に導入し、目的とするポリペプチドを得ることができる。配列番号６、８、１０、１２及び１４のイヌＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｃＤＮＡの塩基配列はそれぞれ配列番号５、７、９、１１及び１３に、そして、そのヒト相同因子である配列番号２及び４のヒトＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｃＤＮＡの塩基配列はそれぞれ配列番号１及び３に示されているため、ＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーはこれらの塩基配列を参照して容易に設計できる。また、後述するとおり、ヒト以外の哺乳動物のＣＡＰＲＩＮ−１をコードする遺伝子は、配列番号５〜２９のうち奇数の配列番号の塩基配列を参照して設計したプライマーにより増幅し得るため、例えばネコＣＡＰＲＩＮ−１をコードするｃＤＮＡも上記と同様の手法により容易に調製し得る。ＲＮＡの抽出、ＲＴ−ＰＣＲ、ベクターへのｃＤＮＡの組み込み、ベクターの宿主細胞への導入は、例えば以下に記載するとおり、周知の方法により行なうことができる。また、用いるベクターや宿主細胞も周知であり、種々のものが市販されている。
【００４６】
上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌等、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞ＣＯＳ１、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ、ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３、マウス胎仔皮膚細胞株ＮＩＨ３Ｔ３等の哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞等が挙げられる。
【００４７】
宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、マルチクローニングサイト、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム等が例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換した後、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。なお、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば上記したようにＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡを調製して得ることができ、また後述するように市販の核酸合成機を用いて常法により合成することもできる。なお、配列番号２及び４のＣＡＰＲＩＮ−１をコードする遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号１及び３に示されている。
【００４８】
宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、本発明で用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換した後、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ（例えば（Ｈｉｓ）6〜（Ｈｉｓ）10）、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰ等の各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。
【００４９】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション、ウイルス感染、リポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、等の周知の方法を用いることができる。
【００５０】
宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素等の変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられる。
【００５１】
以上の方法によって得られるポリペプチドには、他の任意のタンパク質との融合タンパク質の形態にあるものも含まれる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やＨｉｓタグとの融合タンパク質等が例示できる。さらに、形質転換細胞で発現されたポリペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。このような翻訳後修飾されたポリペプチドも、ＣＡＰＲＩＮ−１に対するポリクローナル抗体との結合性を有する限り使用可能である。このような翻訳修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化等が例示できる。
【００５２】
本発明の方法では、生体試料中に含まれ得るＣＡＰＲＩＮ−１が測定される。上述した通り、癌細胞において抗原であるＣＡＰＲＩＮ−１の発現量が有意に高いことが判っている。癌細胞や癌組織中のＣＡＰＲＩＮ−１自体を測定することによって、ＣＡＰＲＩＮ−１の発現量が高い患者に対して、ＣＡＰＲＩＮ−１を標的とする治療薬の適用できるということは、下記実施例に具体的に記載されている通りである。
【００５３】
試料中のポリペプチドの測定は、周知の免疫学的アッセイ法により容易に行なうことができる。具体的には、例えば、ＣＡＰＲＩＮ−１と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を作製し、これを用いて免疫測定を行うことにより、試料中に存在し得るＣＡＰＲＩＮ−１を測定することができる。また、抗体には交叉反応性があるため、例えば、配列番号６のイヌＣＡＰＲＩＮ−１と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を用いて、配列番号６のイヌＣＡＰＲＩＮ−１のみならず、その他の哺乳動物におけるその相同因子、例えば配列番号２又は４のヒトＣＡＰＲＩＮ−１やネコＣＡＰＲＩＮ−１等も測定することができる。
【００５４】
免疫測定方法自体は、上述した通り周知の常法である。ＣＡＰＲＩＮ−１を認識する抗体は、当業者に周知の方法での免疫組織化学により、外科手術の間に患者から得た組織や、自然に又はトランスフェクション後にＣＡＰＲＩＮ−１を発現する細胞系を接種した異種移植組織を担持する動物から得た組織から、パラホルムアルデヒド又はアセトン固定した凍結切片、又はパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した組織切片を使用して、ＣＡＰＲＩＮ−１との反応性に関して試験することができる。
【００５５】
免疫組織化学染色を行った後、試料中のＣＡＰＲＩＮ−１の発現量の定量化は、染色状態を反映させたスコア値を割り出して数値化すればよい。スコア値の設定は２段階以上が好ましく、最も好ましい態様では４段階で分類である。例えば、癌細胞の細胞表面に発現するＣＡＰＲＩＮ−１を通常の免疫組織化学染色法で染色し、その染色状態を反映させたスコア値を４段階に分類した場合の各スコアは以下のように設定される。
【００５６】
・スコア０（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現なし）：細胞膜に陽性染色なし、又は細胞膜の陽性染色がある癌細胞が１０％未満。
【００５７】
・スコア１（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現なし）：ほとんど識別できないほどのかすかな細胞膜の染色がある癌細胞が１０％以上であり、癌細胞は細胞膜のみが部分的に染色されている。
【００５８】
・スコア２（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現あり）：弱〜中程度の完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞が１０％以上、又は強い完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞が１０％以上３０％以下である。
【００５９】
・スコア３（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現あり）：強い完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞が３０％以上である。
【００６０】
このようなスコア値の設定は、米国American Society of Clinical Oncologyにおいて定められたものであり、国内においては日本病理学会が認定している。また、癌抗原の１つであるＨｅｒ２の患者試料中の存在量を定量する「ハーセプテスト」にも適用され、Ｈｅｒ２の定量についてはＡＳＣＯ／ＣＡＰ  Ｈｅｒ２検査ガイドラインに定められている。国内においてもトラスツマブ病理部会が本スコアの設定を含めたＨｅｒ２検査ガイドを定めている。
【００６１】
各スコア値に記載している、免疫組織化学染色後の癌細胞が染色される割合は、光学顕微鏡の感度を４倍、１０倍又は２０倍に上げて、視野に入っている細胞を最低５００数え、各スコア値に記載の細胞膜に染色像を示す細胞を計測して、以下の式を利用して試算することができる。
【００６２】
陽性細胞数／全細胞数（約５００前後）×１００
免疫組織化学染色のため、ＣＡＰＲＩＮ−１に対して反応性のある抗体を、様々な方法で染色させることができる。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヤギ抗マウス抗体やヤギ抗ニワトリ抗体を反応させることにより、可視化することができる。
【００６３】
ＣＡＰＲＩＮ−１自体を免疫測定する際に用いられる、ＣＡＰＲＩＮ−１と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片も、癌診断薬又はキットとして提供することができる。この場合の癌診断薬又はキットも、上記抗体又は抗原結合性断片のみから成るものであってもよく、また、該抗体又は抗原結合性断片の安定化等に有用な各種添加剤等を含んでいてもよい。また、該抗体又は抗原結合性断片は、マンガンや鉄等の金属を結合させたものであってもよい。そのような金属結合抗体又は抗原結合性断片を体内に投与すると、抗原タンパク質が存在する部位に該抗体又は抗原結合性断片がより多く集積するので、ＭＲＩ等によって金属を測定すれば、抗原タンパク質を産生する癌細胞の存在を検出することができる。
【００６４】
なお、ＣＡＰＲＩＮ−１は、癌細胞の表面に発現する細胞膜タンパクであることが判明した。癌患者の体内には多くのタンパク質分解酵素が含まれていることから、ＣＡＰＲＩＮ−１配列中の癌細胞の細胞外領域が分解を受けて癌細胞から分離するため、ＣＡＰＲＩＮ−１配列中の癌細胞の細胞内領域よりも血液中に多く存在する。したがって、本測定に用いられる抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体又はその抗原結合性断片として、ＣＡＰＲＩＮ−１の細胞外領域により強く結合するものを用いれば、スライドに固定された癌組織のみならず、癌患者の血清中に存在するＣＡＰＲＩＮ−１を検出することができる。また、本方法は、ＣＡＰＲＩＮ−１の細胞外領域に結合する抗体を用いる検出であるため、ＣＡＰＲＩＮ−１を標的とした治療薬、特に抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体医薬を投与して治療効果が期待できる癌患者の正確な特定が可能になり、より効果的な癌治療を提供することができる。したがって、本発明では、ＣＡＰＲＩＮ−１のうち、癌細胞の細胞外領域に結合する抗体が好ましく用いられる。このような抗体が認識するエピトープを含むＣＡＰＲＩＮ−１タンパク質の部分ペプチドとしては、配列表の配列番号２〜３０のうち配列番号６及び配列番号１８を除く偶数番号で表されるアミノ酸配列において細胞外領域に相当するペプチドが挙げられる。具体的には、配列番号２において５０位〜９８位又は２３３位〜３４４位の領域内の連続する７個以上のアミノ酸配列、又は配列番号４〜３０のうち配列番号６及び配列番号１８を除く偶数番号で表されるアミノ酸配列において前記アミノ酸位置に相同する領域内の連続する７個以上のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。より具体的には、例えば、配列番号４３又は配列番号６１に示されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号６１に示されるアミノ酸配列中、配列番号６２に示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。本発明で用いられる抗体は、これらペプチドに結合する全ての抗体が含まれる。具体的には、配列番号６３に結合する抗体又はその抗原結合性断片、配列番号７０と７１のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が挙げられる。
【００６５】
本明細書中で使用する「抗原結合性断片」とは、抗体分子中に含まれるＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）2断片のような、抗原との結合能を有する抗体断片を意味する。抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、免疫測定等のためには、再現性が高いモノクローナル抗体が好ましい。ペプチドを免疫原とするポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の調製方法は周知であり、常法により容易に行うことが出来る。例えば、ＣＡＰＲＩＮ−１をキーホールリンペットヘモシアン（ＫＬＨ）、カゼイン、血清アルブミン等のキャリアタンパク質に結合させたものを免疫原とし、アジュバントと共に動物に免疫することにより、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する抗体を誘起することができる。免疫した動物から採取した脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製した後、ＣＡＰＲＩＮ−１と結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これを増殖させて、培養上清からＣＡＰＲＩＮ−１を対応抗原とするモノクローナル抗体を得ることができる。なお、上記の方法は周知の常法である。
【００６６】
本発明の対象となる癌としては、ＣＡＰＲＩＮ−１を過剰発現している癌であり、乳癌、脳腫瘍、食道癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、甲状腺癌、脾臓癌、膵臓癌、大腸癌、皮膚癌、卵巣癌、子宮癌（子宮頸癌及び子宮体癌）、前立腺癌、膀胱癌、精巣癌、骨肉腫が挙げられる。その他、頭、首の扁平上皮癌、メラノーマ、各種腺癌、肝細胞癌、基底細胞癌、勅細胞腫様歯肉腫、口腔内腫瘤、肛門周囲腺癌、肛門嚢腫瘤、肛門嚢アポクリン腺癌、セルトリ細胞腫、膣前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮腫、脂腺腺腫、汗腺癌、鼻腔内腺癌、鼻腺癌、気管支腺癌、腺管癌、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、線維肉腫、血管周皮腫、軟骨肉腫、軟部組織肉腫、組織球肉腫、粘液肉腫、未分化肉腫、肥満細胞腫、皮膚平滑筋腫、腹腔内平滑筋腫、平滑筋腫、リンパ腫、慢性型リンパ球性白血病、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫、副腎髄質腫瘍、顆粒膜細胞腫、褐色細胞腫等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６７】
また、本発明の方法の対象となる生体試料は哺乳動物由来であり、ヒトやイヌ、ネコ由来が好ましい。
【００６８】
本発明の方法に供する試料としては、体液、組織又は細胞が挙げられる。本明細書で「体液」とは、液体状の生体試料をいう。例えば、血液（血清、血漿及び間質液を含む）、リンパ液、腹水、胸水、髄液、痰、涙液、鼻汁、唾液、尿、膣液、精液等が挙げられる。生理食塩水を用いた腹腔洗浄液等を含んでいてもよい。好ましくは血清、血漿、腹水、又は胸水である。
【００６９】
本発明の方法では、測定された生体試料中のＣＡＰＲＩＮ−１発現量が健常個体と比較して高い（好ましくは統計学的に有意に高い）場合、その生体試料が由来する生体（個体）中に、その測定に用いた抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体が特異的に結合可能な癌（すなわち、癌治療薬としての該抗体の標的）が存在することが示される。これを利用して、癌患者由来の生体試料について、本発明の方法によりＣＡＰＲＩＮ−１の発現量を測定し、その発現量を健常個体と比較することにより、患者の癌が、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する治療薬を適用できる（例えば、癌治療薬としての該抗体の標的となる）癌であるか否かを判定することができる。
【００７０】
したがって本発明に基づけば、ＣＡＰＲＩＮ−１を標的とした抗体をはじめとする治療薬の投与により治療効果が期待できる癌患者の特定が可能になり、より効果的な癌治療を提供することができる。
【００７１】
一実施形態では、本発明は、配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して免疫学的反応性を有する抗体を用いて、生体試料中のＣＡＰＲＩＮ−１の発現量を測定し、その発現量が健常個体と比較して高い場合（好ましくは統計学的に有意に高い場合）に、ＣＡＰＲＩＮ−１標的薬を、好ましくはＣＡＰＲＩＮ−１に対して免疫学的反応性を有する抗体又はその抗原結合性断片を、該生体試料が由来する個体に投与するのに適したＣＡＰＲＩＮ−１標的癌治療薬として選択することを含む、個体別癌治療薬の選択方法に関する。個体別癌治療薬の選択により、患者個人に最適な癌治療法を適用するいわゆるオーダーメード医療が可能になる。
【００７２】
本明細書において「統計学的に有意」とは、二者間の量的差異を統計学的に処理したときに有意差があることをいう。具体的には、例えば、危険率（有意水準）が５％、１％又は０．１％より小さい場合が挙げられる。検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の方法であれば、特に限定しない。例えば、スチューデントｔ検定法、多重比較検定法を用いることができる。
【実施例】
【００７３】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって制限されないものとする。【００７４】
＜実施例１  各組織でのＣＡＰＲＩＮ−１発現解析＞
ＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子のイヌ及びヒトの正常組織及び各種癌組織又は癌細胞株における発現をＷＯ２０１０／０１６５２６の実施例１（４）に従ってＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。その結果を図１に示す。健常なイヌ正常組織では精巣で強い発現が見られ、またイヌ乳癌で発現が見られた。さらに、ヒト組織での発現を併せて確認したところ、イヌＣＡＰＲＩＮ−１遺伝子と同様、正常組織で発現が確認できたのは精巣のみだったが、癌細胞ではヒト乳癌細胞株８種（ＺＲ７５−１、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＢＴ−２０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖ、ＭＲＫ−ｎｕ−１）及び脳腫瘍細胞株４種、白血病由来細胞株３種、肺癌細胞株１種、食道癌細胞株２種等、多種類の癌細胞株で発現が検出された。この結果から、ＣＡＰＲＩＮ−１は精巣以外の正常組織では発現が見られず、一方、乳癌細胞株をはじめとする多くの癌細胞株に発現していることが確認された。【００７５】
＜実施例２：抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体の作製＞
（１）マウス抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体の作製
ＷＯ２０１０／０１６５２６の実施例３で調製した配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＣＡＰＲＩＮ−１  １００μｇを等量のＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント（シグマ社製）と混合し、これをマウス１匹当たりの抗原溶液とした。前記抗原溶液を６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社製）の腹腔内に投与後、１週間毎にさらに３回投与を行った。最後の免疫から３日後に摘出した脾臓を滅菌した２枚のスライドガラスに挟んで擦り潰し、ＰＢＳ（−）（日水社製）を用いて洗浄した後、１５００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を除去する操作を３回繰り返して脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞とマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣから購入）とを１０：１の比率にて混和し、そこに３７℃に加温した１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地２００μＬとＰＥＧ１５００（ベーリンガー社製）８００μＬを混和して調製したＰＥＧ溶液を加えて５分間静置して細胞融合を行った。１７００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去後、ギブコ社製のＨＡＴ溶液を２％当量加えた１５％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＨＡＴ選択培地）１５０ｍＬで細胞を懸濁し、９６穴プレート（ヌンク社製）の１ウェル当たり１００μＬずつ、プレート１５枚に播種した。７日間、３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養することで、脾臓細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを得た。【００７６】
作製したハイブリドーマを、それが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ−１に対する結合親和性を指標にして選抜した。上記ＣＡＰＲＩＮ−１溶液１μｇ／ｍＬを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μＬ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、０．５％  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）溶液（シグマ社製）を１ウェル当たり４００μＬ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μＬのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μＬ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を１ウェル当たり１００μＬ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μＬ添加して１５〜３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μＬ添加して反応を停止させ、吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、吸光度値が高かった抗体を産生するハイブリドーマを目的のハイブリドーマの候補株として複数個選抜した。【００７７】
選抜したハイブリドーマを９６穴プレート１ウェル当たりに０．５個となるようにプレートに添加し培養した。１週間後、ウェル中に単一のコロニーを形成しているハイブリドーマが観察された。それらウェルの細胞をさらに培養して、クローニングされたハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ−１に対する結合親和性を指標に、上記と同様の方法により選抜し、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに反応性を示すモノクローナル抗体を産生する複数のハイブリドーマ株を得た。ハイブリドーマの培養上清を、プロテインＧ担体を用いて精製し、ＣＡＰＲＩＮ−１に結合するモノクローナル抗体１５０個を得た。【００７８】
次に上記モノクローナル抗体からＣＡＰＲＩＮ−１が発現する乳癌細胞の細胞表面に反応性を示すものを選抜した。具体的には、１０６個のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖを１．５ｍＬ容のミクロ遠心チューブにて遠心分離し、これに上記各ハイブリドーマの上清１００μＬを添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％牛胎児血清を含むＰＢＳで５００倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、抗体の代わりに培地を添加したものをコントロールとした。その結果、コントロールに比べて蛍光強度が強い、すなわち、乳癌細胞の細胞表面に反応するモノクローナル抗体１０個（＃１〜＃１０）を選抜した。これらモノクローナル抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域それぞれのアミノ酸配列を配列番号４４〜６０に示す。上記モノクローナル抗体＃１は配列番号４４の重鎖可変領域と配列番号４５の軽鎖可変領域を含み、＃２は配列番号４４の重鎖可変領域と配列番号４６の軽鎖可変領域を含み、＃３は配列番号４４の重鎖可変領域と配列番号４７の軽鎖可変領域を含み、＃４は配列番号４４の重鎖可変領域と配列番号４８の軽鎖可変領域を含み、＃５は配列番号４９の重鎖可変領域と配列番号５０の軽鎖可変領域を含み、＃６は配列番号５１の重鎖可変領域と配列番号５２の軽鎖可変領域を含み、＃７は配列番号５３の重鎖可変領域と配列番号５４の軽鎖可変領域を含み、＃８は配列番号５５の重鎖可変領域と配列番号５６の軽鎖可変領域を含み、＃９は配列番号５７の重鎖可変領域と配列番号５８の軽鎖可変領域を含み、＃１０は配列番号５９の重鎖可変領域と配列番号６０の軽鎖可変領域を含む。【００７９】
（２）癌細胞の細胞表面に反応するマウス抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１抗体が結合するＣＡＰＲＩＮ−１中のペプチドの同定
上記で取得した、癌細胞の細胞表面に反応する＃１〜＃１０のマウス抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体を用いて、それらの抗体が認識するＣＡＰＲＩＮ−１中の部分配列の同定を行った。【００８０】
まず、ＰＢＳで１μｇ／μＬの濃度に溶解した組換えＣＡＰＲＩＮ−１溶液１００μＬに、終濃度が１０ｍＭになるようにＤＴＴ（Ｆｌｕｋａ社製）を添加し、９５℃、５分間反応させてＣＡＰＲＩＮ−１内のジスルフィド結合の還元を行い、次に終濃度２０ｍＭのヨードアセトアミド（和光純薬社製）を添加し、３７℃、遮光条件下にて３０分間チオール基のアルキル化反応を行った。得られた還元アルキル化ＣＡＰＲＩＮ−１４０μｇに、＃１〜＃１０のマウス抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体をそれぞれ５０μｇ添加し、２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬにメスアップして撹拌混合しながら４℃で一晩反応させた。【００８１】
次に、トリプシン（プロメガ社製）を終濃度０．２μｇとなるように添加し、３７℃で１時間、２時間、４時間、及び１２時間反応させた後、予め１％  ＢＳＡ（シグマ社製）を含むＰＢＳでブロッキングし、ＰＢＳで洗浄したプロテインＡ−ガラスビーズ（ＧＥ社製）と１ｍＭ炭酸カルシウム、ＮＰ−４０緩衝液（２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０）中で混合し、それぞれ３０分間反応させた。【００８２】
反応液を２５ｍＭ炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、０．１％  ギ酸１００μＬを用いて抗原抗体複合体を溶出し、溶出液についてＱ−ＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｗａｔｅｒｓ−ＭｉｃｒｏＭａｓｓ社製）を用いてＬＣ−ＭＳ解析を行った。解析は機器に付属のプロトコールに従った。【００８３】
その結果、＃１〜＃１０の全てのマウス抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体が認識するＣＡＰＲＩＮ−１の部分アミノ酸配列として、配列番号６１のポリペプチドが同定された。さらに、モノクローナル抗体＃１〜＃４、＃５〜＃７及び＃９が認識する、上記配列番号６１のポリペプチド中の部分配列として配列番号６２のペプチドが同定され、さらにモノクローナル抗体＃１０が配列番号６３のペプチドを認識することが判った。【００８４】
（３）ニワトリ抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体の作製
ＷＯ２０１０／０１６５２６の実施例３で調製した配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＣＡＰＲＩＮ−１  ３００μｇを等量のフロイントの完全アジュバントと混合し、これをニワトリ１羽当たりの抗原溶液とした。抗原溶液を７週齢のニワトリの腹腔内に投与後、４週間毎に７回投与を行い、免疫を完了した。最後の免疫から４日後に摘出したそれぞれの脾臓を滅菌した２枚のスライドガラスに挟んで擦り潰し、ＰＢＳ（−）（日水社製）を用いて洗浄し１５００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を除去する操作を３回繰り返して脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞と鳥類細網内皮症ウイルスを用いてニワトリから形質転換法により樹立した、軽鎖が欠損しているニワトリミエローマ細胞とを５：１の比率にて混和し、そこに３７℃に加温した１０％  ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地２００μＬとＰＥＧ１５００（ベーリンガー社製）８００μＬを混和して調製したＰＥＧ溶液を加えて５分間静置して細胞融合を行った。１７００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去後、Ｇｉｂｃｏ社製のＨＡＴ溶液を２％当量加えた１０％  ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地（ＨＡＴ選択培地）３００ｍＬで細胞を懸濁し、９６穴プレート（ヌンク社製）の１ウェル当たり１００μＬずつ、プレート３０枚に播種した。７日間、３７℃、５％  ＣＯ2の条件で培養することで、脾臓細胞とニワトリミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを得た。【００８５】
作製したハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ−１に対する結合親和性を指標にしてハイブリドーマを選抜した。ＣＡＰＲＩＮ−１溶液１μｇ／ｍＬを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μＬ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、０．５％  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）溶液（シグマ社製）を１ウェル当たり４００μＬ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μＬのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μＬ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ニワトリＩｇＹ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を１ウェル当たり１００μＬ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μＬ添加して１５〜３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μＬ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、吸光度値が高かった抗体を産生するハイブリドーマを目的のハイブリドーマの候補株として複数個選抜した。【００８６】
選抜したハイブリドーマを９６穴プレート１ウェル当たりに０．５個となるようにプレートに添加し培養した。１週間後、ウェル中に単一のコロニーを形成しているハイブリドーマが観察された。それらウェルの細胞をさらに培養して、クローニングされたハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ−１に対する結合親和性を指標に、上記と同様の方法により選抜し、ＣＡＰＲＩＮ−１タンパクに反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株を複数個得た。【００８７】
次にそれらモノクローナル抗体のうち、ＣＡＰＲＩＮ−１が発現する乳癌細胞の細胞表面に反応性を示すものを選抜した。具体的には、５×１０５個のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖを１．５ｍＬ容のミクロ遠心チューブにて遠心分離し、これに上記各ハイブリドーマの培養上清１００μＬを添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％  ＦＢＳを含むＰＢＳで３０倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、ハイブリドーマ培養用培地を用いて行い、コントロールのサンプルとした。その結果、コントロールに比べて蛍光強度が強い、すなわち、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する乳癌細胞の細胞表面に反応するモノクローナル抗体１個（ニワトリ抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃１１）を選抜した。【００８８】
（４）マウス−ニワトリキメラ組換え抗体の作製
上記（３）で得られた、配列番号６４で示されるニワトリ抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃１１の重鎖可変領域の遺伝子増幅断片の両端を制限酵素処理した後、精製し、ニワトリ抗体由来のリーダー配列とマウスＩｇＧ１のＨ鎖定常領域を既に挿入済みのｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）ベクターへ常法に従って挿入した。また、配列番号６５で示されるニワトリ抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃１１の軽鎖可変領域の遺伝子増幅断片の両端を制限酵素処理した後精製し、ニワトリ抗体由来のリーダー配列とマウスＩｇＧ１のＬ鎖定常領域を既に挿入済みのｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）ベクターへ常法に従って挿入した。【００８９】
次に、ニワトリ抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃１１の重鎖可変領域が挿入された上記組換えベクターと、ニワトリ抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃１１の軽鎖可変領域が挿入された上記組換えベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞（理研セルバンクより入手）に導入した。具体的には、１２穴培養プレートの１ウェル当たりに１ｍＬの１０％ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で培養された２×１０５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞をＰＢＳ（−）で洗浄したのちに、１ウェル当たり１ｍＬの１０％ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地を新たに加えたウェルに３０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に溶解した上記各ベクター２５０ｎｇとＰｏｌｙｆｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）３０μＬとを混合したものを添加した。上記組換えベクターを導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞を、２００μｇ／ｍＬゼオシン（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）ならびに２００μｇ／ｍＬジェネチシン（ロシュ社製）を添加した１０％ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地で培養した後、９６ウェルプレートの１ウェル当たりに０．５個となるように上記組換えベクターを導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞を播種して、ニワトリモノクローナル抗体＃１１の可変領域とマウスＩｇＧ１の定常領域を有するマウス−ニワトリキメラ抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃１２を安定的に産生する細胞株を作製した。作製した細胞株を１５０ｃｍ２フラスコを用いて５×１０５個／ｍＬで血清を含まないＯｐｔｉＣＨＯ培地（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）３０ｍＬを用いて５日間培養し、＃１２を含む培養上清を得た。【００９０】
（５）マウス−ニワトリキメラ抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃１２が認識するＣＡＰＲＩＮ−１エピトープの同定
（４）で取得した、癌細胞の細胞表面に反応するマウス−ニワトリキメラ抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃１２を用いて、認識するＣＡＰＲＩＮ−１エピトープ領域の同定を行った。ＣＡＰＲＩＮ−１組換えタンパク質１００μgをタンパク質阻害剤を含まない溶解バッファーに溶解し、モノクローナル抗体＃１２と反応させた。その溶液に、トリプシン又はキモトリプシン消化酵素を加え、適正温度にて消化反応を行った。反応後プロテインＧセファロース担体を加えて反応させ、遠心操作により担体を沈殿させた。上清を除去した後、溶解バッファーとＰＢＳで洗浄して０．１％の蟻酸に溶解させ、その上清を回収した。回収した上清サンプルを逆相カラム（ＨＬＢ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（ＯＡＳＩＳ社））にかけて、抗体を除去したサンプル溶液を得た。得られたサンプルを逆相液体クロマトグラフィー（クロマトグラフィーナノシステム（ＫＹＡ社））を用いてペプチドのみが含まれた溶液を回収し、タンデム型質量分析計ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−ＴＯＦ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社）に導入してＭＳ／ＭＳ解析を行い、サンプル内に含まれるペプチドを検出した。その結果、マウス−ニワトリキメラ抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃１２が認識するＣＡＰＲＩＮ−１の部分配列として、配列番号６６のアミノ酸配列からなるペプチドが同定された。また、このペプチドは、抗体＃１２の可変領域を構成するニワトリ抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃１１が認識するＣＡＰＲＩＮ−１の部分配列でもあることを意味する。【００９１】
（６）ヒト−ニワトリキメラ抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１抗体の作製
上記（３）で得られた、配列番号６４で示されるニワトリ抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃１１の重鎖可変領域の遺伝子増幅断片の両端を制限酵素処理した後精製し、配列番号６７を含むニワトリ抗体由来のリーダー配列と配列番号６８を含むヒトＩｇＧ１のＨ鎖定常領域を既に挿入済みのｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）ベクターへ常法に従って挿入した。また、配列番号６５で示されるニワトリ抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃１１の軽鎖可変領域の遺伝子増幅断片の両端を制限酵素処理した後精製し、配列番号６８を含むニワトリ抗体由来のリーダー配列と配列番号６９を含むヒトＩｇＧ１のＬ鎖定常領域を既に挿入済みのｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）ベクターへ常法に従って挿入した。【００９２】
次に、上記抗体＃１１の重鎖可変領域が挿入された上記組換えベクターと、上記抗体＃１１の軽鎖可変領域が挿入された上記組換えベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞（理研セルバンクより入手）に導入した。具体的には、１２穴培養プレートの１ウェル当たりに１ｍＬの１０％ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で培養された２×１０５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞をＰＢＳ（−）で洗浄したのちに、１ウェル当たり１ｍＬの１０％ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地を新たに加えたウェルに３０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に溶解した上記各ベクター２５０ｎｇとＰｏｌｙｆｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）３０μＬとを混合したものを添加した。上記組換えベクターを導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞を、２００μｇ／ｍＬゼオシン（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）ならびに２００μｇ／ｍＬジェネチシン（ロシュ社製）を添加した１０％ＦＢＳを含むＨａｍ’ｓＦ１２培地で培養した後、９６ウェルプレートの１ウェル当たりに０．５個となるように上記組換えベクターを導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞を播種して、ニワトリ抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃１１の可変領域とヒトＩｇＧ１の定常領域を有するヒト−ニワトリキメラ抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１３を安定的に産生する細胞株を作製した。作製した細胞株を、１５０ｃｍ２フラスコを用いて、５×１０５個／ｍＬで血清を含まないＯｐｔｉＣＨＯ培地（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）３０ｍＬで５日間培養し、上記抗体＃１３を含む培養上清を得た。【００９３】
（７）マウス抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃１４の作製
（１）と同様の方法で、（２）で同定した配列番号６３のアミノ酸配列とキャリアタンパク質のＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）との融合タンパク質を免疫原として、等量のアジュバント剤ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（登録商標）（ＣｙｔＲｘ社）と混合して７日間隔でマウスの皮下に１回あたり２０μg投与した。合計４回の投与を行った後、最終免疫から３日後のマウスから脾臓細胞を得て、上記（１）と同様の方法にてマウスミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製した。その後、作製したハイブリドーマの培養上清中に含まれる各抗体とＷＯ２０１０／０１６５２６の実施例３で調製したＣＡＰＲＩＮ−１溶液１μｇ／ｍＬ又は免疫原として用いた配列番号６３のアミノ酸配列とキャリアタンパク質のＫＬＨとの融合タンパク質との反応性を指標に抗体を選抜した。ＷＯ２０１０／０１６５２６の実施例３で調製したＣＡＰＲＩＮ−１溶液１μｇ／ｍＬと配列番号６３のアミノ酸配列とキャリアタンパク質のＢＳＡとの融合タンパク質３０μg／ｍＬをそれぞれ９６穴プレート１ウェル当たりに１００μＬ添加して４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル社）溶液を１ウェル当たり４００μＬ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、ＰＢＳ−Ｔでウェルを洗浄後、上記で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μＬ添加し、室温で２時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを洗浄した後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を１ウェル当たり１００μＬ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μＬ添加して５〜３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μＬ添加して反応を停止させ、吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、吸光度値が高かった抗体を産生するハイブリドーマを選抜した。【００９４】
選抜したハイブリドーマを９６穴プレート１ウェル当たりに０．３個となるようにプレートに添加し培養した。１週間後、ウェル中に単一のコロニーを形成しているハイブリドーマが観察された。それらウェルの細胞をさらに培養して、クローニングされたハイブリドーマが産生する抗体のＣＡＰＲＩＮ−１の部分配列である配列番号６３のアミノ酸配列に対する結合親和性を指標に上記と同様の方法を用いて、配列番号６３のアミノ酸に対する抗体を産生するハイブリドーマを得た。【００９５】
得られたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のうち、ＣＡＰＲＩＮ−１を発現する乳癌細胞の細胞表面に反応性を示すものを選抜した。具体的には、１０６個のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｖを１．５ｍＬ容のミクロ遠心チューブにて遠心分離し、これに上記各ハイブリドーマの培養上清１００μＬを添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１％ＦＢＳを含むＰＢＳで５００倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、抗体の代わりに何も処理していない６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの血清をハイブリドーマ培養用培地で５００倍希釈したものを用いたサンプル、及び二次抗体のみを反応させたサンプルを陰性コントロールとして行った。その結果、陰性コントロールに比べて蛍光強度が強い、すなわち、乳癌細胞の細胞表面に反応するマウス抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃１４を得た。上記抗体＃１４は配列番号７０の重鎖可変領域と配列番号７１の軽鎖可変領域から成る。【００９６】
得られたマウス抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃１４が免疫原であるＣＡＰＲＩＮ−１の部分配列である配列番号６３のアミノ酸配列に特異的に反応することを調べた。０．１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液で３０μg／ｍＬに調製した配列番号６３のアミノ酸配列を含む溶液及び配列番号６３のアミノ酸配列を含まないＣＡＰＲＩＮ−１の部分配列をそれぞれＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートイモビライザーアミノ（ヌンク社）に１００μg／ｍＬずつ添加して、４℃にて一昼夜反応させてペプチドをウェルに結合させた。ペプチドが結合したウェルに１０ｍＭエタノールアミンを含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を添加して室温で１時間静置した。ウェル内の溶液を除去後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄したのち、ブロックエース溶液を１ウェル当たり４００μＬ添加して室温にて３時間静置した。ウェル内の溶液を除去し、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、マウスモノクローナル抗体＃１４を含む培養上清を１ウェルあたりに５０μＬ添加して、室温にて１時間反応させた。その後ＰＢＳ−Ｔで洗浄して、ブロックエース溶液で５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を１ウェル当たり５０μＬ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを十分に洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μＬ添加して５〜３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μＬ添加して反応を停止させ、吸光度計を用いて４５０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度値を測定したところ、配列番号６３のアミノ酸配列を含まないＣＡＰＲＩＮ−１の部分配列には全く反応せず、配列番号６３のアミノ酸のみにマウスモノクローナル抗体＃１４は特異的に反応した。したがって、配列番号６３のポリペプチドが抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１４のエピトープ領域を含んでいることが確認された。【００９７】
＜実施例３：ＣＡＰＲＩＮ−１検出に最適な抗体の選抜＞
（１）ヒト乳癌組織を用いた抗体の選抜
パラフィン包埋されたヒト乳癌組織アレイ（ＭＢＬ社製）の乳癌組織３１検体を用いて免疫組織化学染色を行った。ヒト乳癌組織アレイを６０℃で３時間処理後、キシレンを満たした染色瓶に入れて５分ごとにキシレンを入れ替える操作を３回行った。続いて、エタノール及びＰＢＳ−Ｔを用いて前記キシレンと同様の操作を行った。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を満たした染色瓶にヒト乳癌組織アレイを入れ、１２５℃で５分間処理後、室温で４０分以上静置した。切片周囲の余分な水分をキムワイプでふき取り、ＤＡＫＯＰＥＮ（ＤＡＫＯ社製）で囲み、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ（ＤＡＫＯ社製）を適量滴下した。室温で５分間静置後、ＰＢＳ−Ｔを満たした染色瓶に入れて５分ごとにＰＢＳ−Ｔを入れ替える操作を３回行った。ブロッキング液として、１０％  ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ溶液を載せ、モイストチャンバー内にて室温で１時間静置した。次に実施例２で作製したマウス抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃８又は＃１４をそれぞれ５％  ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ溶液で１０μｇ／ｍＬに調製した溶液を載せ、モイストチャンバー内にて４℃で一晩静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＤＡＫＯ社製）適量滴下し、モイストチャンバー内で室温にて３０分間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ＤＡＢ発色液（ＤＡＫＯ社製）を載せ、室温で１０分程度静置した後、発色液を捨て、ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った。蒸留水でリンスした後、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の各エタノール溶液に順番に１分間ずつ入れ、最後にキシレン中で一晩静置した。スライドガラスを取り出し、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社製）で封入後、観察を行った。組織におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現量は、以下の基準に従って判定した。陽性所見を示すスライドを選択し、ＣＡＰＲＩＮ−１染色像を確認した。まず、光学顕微鏡の４倍対物レンズを使用して、組織内の癌細胞のＣＡＰＲＩＮ−１染色像、陽性染色の強度、陽性細胞率を観察した。次に、対物レンズを１０倍又は２０倍に切り替え、陽性所見が細胞膜か細胞質に局在しているかを検索した。以上の方法により検出結果を判定し、スコア０〜３に分類した。スコアの詳細は以下の通りである。【００９８】
・スコア０（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現なし）：細胞膜に陽性染色なし、又は細胞膜の陽性染色がある癌細胞が１０％未満である。【００９９】
・スコア１（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現なし）：ほとんど識別できないほどのかすかな細胞膜の染色がある癌細胞が１０％以上であり、癌細胞は細胞膜のみが部分的に染色されている。【０１００】
・スコア２（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現あり）：弱〜中程度の完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞が１０％以上、又は強い完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞が１０％以上３０％以下である。【０１０１】
・スコア３（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現あり）：強い完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞が３０％以上である。【０１０２】
検出結果がスコア２及び３であった場合にＣＡＰＲＩＮ−１陽性の癌組織と判定する。【０１０３】
その結果、いずれの抗体を用いても乳癌組織中にＣＡＰＲＩＮ−１の発現を確認することができた。抗体＃８を用いた免疫組織化学染色の結果では、スコア２が１４検体、スコア３が１検体であり、ＣＡＰＲＩＮ−１陽性の検体数が１５検体であったのに対して、抗体＃１４を用いた免疫組織化学染色の結果では、スコア２が１２検体、スコア３が８検体でありＣＡＰＲＩＮ−１陽性の検体数は２０検体であった。したがって、ヒト癌組織を用いたＣＡＰＲＩＮ−１の検出には、より感度の高い抗体＃１４を選択した。【０１０４】
（２）抗体＃１４を用いた免疫組織化学染色法によるヒト各種正常組織上のＣＡＰＲＩＮ−１の検出
ヒト正常組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）（脳、甲状腺、肺、脾臓、腎臓、食道、胃、大腸、膵臓、筋肉、皮膚、唾液腺、卵巣、子宮、乳腺、胎盤、骨髄、精巣、前立腺子宮、前立腺の組織を含む）を用いて、免疫組織化学染色を行った。切片周囲の余分な水分をキムワイプでふき取り、ＤＡＫＯＰＥＮ（ＤＡＫＯ社製）で囲み、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ（ＤＡＫＯ社製）を適量滴下した。室温で５分間静置後、ＰＢＳ−Ｔを満たした染色瓶に入れて５分ごとにＰＢＳ−Ｔを入れ替える操作を３回行った。ブロッキング液として、１０％  ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ溶液を載せ、モイストチャンバー内にて室温で１時間静置した。次に実施例２で作製したマウス抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃１４を５％  ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ溶液で１０μｇ／ｍＬに調製した溶液を載せ、モイストチャンバー内にて４℃で一晩静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＤＡＫＯ社製）適量滴下し、モイストチャンバー内にて室温で３０分間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ＤＡＢ発色液（ＤＡＫＯ社製）を載せ、室温で１０分程度静置した後、発色液を捨て、ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った。蒸留水でリンスした後、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の各エタノール溶液に順番に１分間ずつ入れ、最後にキシレン中で一晩静置した。スライドガラスを取り出し、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社製）で封入後、観察を行った。【０１０５】
組織におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現量は、以下の基準に従って判定した。陽性所見を示すスライドを選択し、ＣＡＰＲＩＮ−１染色像を確認した。まず、光学顕微鏡の４倍対物レンズを使用して、組織内の癌細胞のＣＡＰＲＩＮ−１染色像、陽性染色の強度、陽性細胞率を観察した。次に、対物レンズを１０倍又は２０倍に切り替え、陽性所見が細胞膜か細胞質に局在しているかを検索した。以上の方法により検出結果を判定し、スコア０〜３に分類した。スコアの詳細は以下の通りである。【０１０６】
・スコア０（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現なし）：細胞膜に陽性染色なし、あるいは細胞膜の陽性染色がある癌細胞が１０％未満である。【０１０７】
・スコア１（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現なし）：ほとんど識別できないほどのかすかな細胞膜の染色がある癌細胞が１０％以上であり、癌細胞は細胞膜のみが部分的に染色されている。【０１０８】
・スコア２（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現あり）：弱〜中程度の完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞が１０％以上、又は強い完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞が１０％以上３０％以下である。【０１０９】
・スコア３（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現あり）：強い完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞が３０％以上である。【０１１０】
検出結果がスコア２及び３であった場合にＣＡＰＲＩＮ−１陽性の癌組織と判定する。【０１１１】
子宮及び前立腺では、スコア１であったが、それ以外の組織では、全てスコア０であった。したがって、ヒト正常組織にＣＡＰＲＩＮ−１の発現は認められなかった。【０１１２】
（３）マウス抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１４を用いた免疫組織化学染色法によるヒト各種癌組織上のＣＡＰＲＩＮ−１の検出
パラフィン包埋されたヒト癌組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の各種癌組織を用いて、免疫組織化学染色を行った。ヒト癌組織アレイを６０℃で３時間処理後、キシレンを満たした染色瓶に入れて５分ごとにキシレンを入れ替える操作を３回行った。続いて、エタノール及びＰＢＳ−Ｔで前記キシレンと同様の操作を行った。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を満たした染色瓶にヒト癌組織アレイを入れ、１２５℃で５分間処理後、室温で４０分以上静置した。切片周囲の余分な水分をキムワイプでふき取り、ＤＡＫＯＰＥＮ（ＤＡＫＯ社製）で囲み、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ（ＤＡＫＯ社製）を適量滴下した。室温で５分間静置後、ＰＢＳ−Ｔを満たした染色瓶に入れて５分ごとにＰＢＳ−Ｔを入れ替える操作を３回行った。ブロッキング液として、１０％  ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ溶液を載せ、モイストチャンバー内にて室温で１時間静置した。次に実施例２で作製したモノクローナル抗体＃１４を５％  ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ溶液で１０μｇ／ｍＬに調製した溶液を載せ、モイストチャンバー内にて４℃で一晩静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＤＡＫＯ社製）適量滴下し、モイストチャンバー内にて室温で３０分間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ＤＡＢ発色液（ＤＡＫＯ社製）を載せ、室温で１０分程度静置した後、発色液を捨て、ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った。蒸留水でリンスした後、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の各エタノール溶液に順番に１分間ずつ入れ、最後にキシレン中で一晩静置した。スライドガラスを取り出し、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社製）で封入後、観察を行った。【０１１３】
組織におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現量は、以下の基準に従って判定した。陽性所見を示すスライドを選択し、ＣＡＰＲＩＮ−１染色像を確認した。まず、光学顕微鏡の４倍対物レンズを使用して、組織内の癌細胞のＣＡＰＲＩＮ−１染色像、陽性染色の強度、陽性細胞率を観察した。次に、対物レンズを１０倍又は２０倍に切り替え、陽性所見が細胞膜か細胞質に局在しているかを検索した。以上の方法により検出結果を判定し、スコア０〜３に分類した。スコアの詳細は以下の通りである。【０１１４】
・スコア０（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現なし）：細胞膜に陽性染色なし、あるいは細胞膜の陽性染色がある癌細胞が１０％未満である。【０１１５】
・スコア１（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現なし）：ほとんど識別できないほどのかすかな細胞膜の染色がある癌細胞が１０％以上であり、癌細胞は細胞膜のみが部分的に染色されている。【０１１６】
・スコア２（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現あり）：弱〜中程度の完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞が１０％以上、又は強い完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞が１０％以上３０％以下である。【０１１７】
・スコア３（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現あり）：強い完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞が３０％以上である。【０１１８】
検出結果がスコア２及び３であった場合にＣＡＰＲＩＮ−１陽性の癌組織と判定する。【０１１９】
その結果、ＣＡＰＲＩＮ−１は、脳腫瘍組織２２検体の内１６検体（６４％）で、肺癌組織３２検体の内１９検体（５９％）で、子宮癌組織２１検体の内１８検体（８６％）で、食道癌組織１６検体の内１０検体（６３％）で、腎臓癌組織３０検体の内２７検体（９０％）で、肝臓癌組織１７検体の内１４検体（８２％）で、甲状腺癌組織１５検体の内１１検体（７３％）で、胃癌組織１４検体の内１０検体（７１％）で、膵臓癌組織１９検体の内１７検体（８９％）で、前立腺癌組織１３検体中１３検体（１００％）で、膀胱癌組織１４検体中１２検体（８６％）で、大腸癌組織１４検体の内１１検体（７９％）で、皮膚癌組織３０検体の内２４検体（８０％）及び乳癌組織２１検体の内１６検体（７６％）でそれぞれ陽性であることが認められた。【０１２０】
（４）マウス抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１４を用いた免疫組織化学染色法によるイヌ乳癌組織上のＣＡＰＲＩＮ−１の検出
病理診断で悪性乳癌と診断されたイヌの凍結された乳癌組織１００検体を用いて、免疫組織化学染色を行った。凍結イヌ乳癌組織をクライオスタット（ＬＥＩＣＡ社製）を用いて１０〜２０μｍに薄切し、スライドガラスに載せ、スライドガラスごとヘアードライアーで３０分間風乾し、薄切組織が載ったスライドガラス作製した。次にＰＢＳ−Ｔ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）を満たした染色瓶に入れて５分ごとにＰＢＳ−Ｔを入れ替える操作を３回行った。切片周囲の余分な水分をキムワイプでふき取り、ＤＡＫＯＰＥＮ（ＤＡＫＯ社製）で囲んだ後、ブロッキング液として、１０％牛胎児血清を含むＰＢＳ−Ｔ溶液を載せ、モイストチャンバー内にて室温で１時間静置した。次に実施例２で作製したマウス抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃８又は＃１４をそれぞれブロッキング液で１０μｇ／ｍＬに調製した溶液を載せ、モイストチャンバー内にて４℃下で一晩静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ブロッキング液で２５０倍に希釈したＭＯＭビオチン標識抗ＩｇＧ抗体（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）を載せ、モイストチャンバー内にて室温で１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、アビジンービオチンＡＢＣ試薬（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）を載せ、モイストチャンバー内にて室温で５分間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ＤＡＢ発色液（ＤＡＢ  １０ｍｇ＋３０％  Ｈ2Ｏ2１０μＬ／０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５０ｍＬ）を載せ、モイストチャンバー内にて室温で３０分間静置した。蒸留水でリンスし、ヘマトキシリン試薬（ＤＡＫＯ社製）を載せて室温で１分間静置後、蒸留水でリンスした。７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の各エタノール溶液に順番に１分間ずつ入れた後、最後にキシレン中で一晩静置した。スライドガラスを取り出し、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社製）で封入後、観察を行った。組織におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現量は、以下の基準に従って判定した。陽性所見を示すスライドを選択し、ＣＡＰＲＩＮ−１染色像を確認した。まず、光学顕微鏡の４倍対物レンズを使用して、組織内の癌細胞のＣＡＰＲＩＮ−１染色像、陽性染色の強度、陽性細胞率を観察した。次に、対物レンズを１０倍又は２０倍に切り替え、陽性所見が細胞膜か細胞質に局在しているかを検索した。以上の方法により検出結果を判定し、スコア０〜３に分類した。スコアの詳細は以下の通りである。【０１２１】
・スコア０（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現なし）：細胞膜に陽性染色なし、あるいは細胞膜の陽性染色がある癌細胞が１０％未満である。【０１２２】
・スコア１（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現なし）：ほとんど識別できないほどのかすかな細胞膜の染色がある癌細胞が１０％以上であり、癌細胞は細胞膜のみが部分的に染色されている。【０１２３】
・スコア２（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現あり）：弱〜中程度の完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞が１０％以上、又は強い完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞が１０％以上３０％以下である。【０１２４】
・スコア３（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現あり）：強い完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞が３０％以上である。【０１２５】
検出結果がスコア２及び３であった場合に陽性とし、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する治療薬投与による有効な治療効果の得られる担癌犬組織と判定した。【０１２６】
その結果、いずれの抗体を用いてもイヌ乳癌組織中にＣＡＰＲＩＮ−１の発現を確認することができた。具体的には、抗体＃８を用いた免疫組織化学染色の結果では、スコア２が６９検体、スコア３が１１検体でありＣＡＰＲＩＮ−１陽性の検体数は８０検体（８０％）であったのに対して、抗体＃１４を用いた免疫組織化学染色の結果では、スコア２が５０検体、スコア３が３２検体でありＣＡＰＲＩＮ−１陽性の検体数は８２検体（８２％）であった。【０１２７】
（５）マウス抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃１４を用いた免疫組織化学染色法によるネコ乳癌組織上のＣＡＰＲＩＮ−１の検出
病理診断で悪性乳癌と診断されたネコの凍結された乳癌組織３０検体を用いて、免疫組織化学染色を行った。凍結ネコ癌組織をクライオスタット（ＬＥＩＣＡ社製）を用いて１０〜２０μｍに薄切し、スライドガラスに載せ、スライドガラスごとヘアードライアーで３０分間風乾し、薄切組織がのったスライドガラス作製した。次にＰＢＳ−Ｔ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）を満たした染色瓶に入れて５分ごとにＰＢＳ−Ｔを入れ替える操作を３回行った。切片周囲の余分な水分をキムワイプでふき取り、ＤＡＫＯＰＥＮ（ＤＡＫＯ社製）で囲んだ後、ブロッキング液として、１０％牛胎児血清を含むＰＢＳ−Ｔ溶液を載せ、モイストチャンバー内にて室温で１時間静置した。次に実施例２で作製したマウス抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃８又は＃１４をそれぞれブロッキング液で１０μｇ／ｍｌに調製した溶液を載せ、モイストチャンバー内にて４℃下で一晩静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ブロッキング液で２５０倍に希釈したＭＯＭビオチン標識抗ＩｇＧ抗体（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）を載せ、モイストチャンバー内にて室温で１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、アビジンービオチンＡＢＣ試薬（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）を載せ、モイストチャンバー内にて室温で５分間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ＤＡＢ発色液（ＤＡＢ  １０ｍｇ＋３０％  Ｈ2Ｏ2１０μｌ／０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５０ｍｌ）を載せ、モイストチャンバー内にて室温で３０分間静置した。蒸留水でリンスし、ヘマトキシリン試薬（ＤＡＫＯ社製）を載せて室温で１分間静置後、蒸留水でリンスした。７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の各エタノール溶液に順番に１分間ずつ入れた後、最後にキシレン中で一晩静置した。スライドガラスを取り出し、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社製）で封入後、観察を行った。組織におけるＣＡＰＲＩＮ−１の発現量は、以下の基準に従って判定した。陽性所見を示すスライドを選択し、ＣＡＰＲＩＮ−１染色像を確認した。まず、光学顕微鏡の４倍対物レンズを使用して、組織内の癌細胞のＣＡＰＲＩＮ−１染色像、陽性染色の強度、陽性細胞率を観察した。次に、対物レンズを１０倍又は２０倍に切り替え、陽性所見が細胞膜か細胞質に局在しているかを検索した。以上の方法により検出結果を判定し、スコア０〜３に分類した。スコアの詳細は以下の通りである。【０１２８】
・スコア０（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現なし）：細胞膜に陽性染色なし、あるいは細胞膜の陽性染色がある癌細胞が１０％未満である。【０１２９】
・スコア１（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現なし）：ほとんど識別できないほどのかすかな細胞膜の染色がある癌細胞が１０％以上であり、癌細胞は細胞膜のみが部分的に染色されている。【０１３０】
・スコア２（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現あり）：弱〜中程度の完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞が１０％以上、又は強い完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞が１０％以上３０％以下である。【０１３１】
・スコア３（ＣＡＰＲＩＮ−１過剰発現あり）：強い完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞が３０％以上である。【０１３２】
検出結果がスコア２及び３であった場合に陽性とし、ＣＡＰＲＩＮ−１に対する治療薬投与による有効な治療効果の得られる担癌猫組織と判定した。【０１３３】
その結果、いずれの抗体を用いてもネコ乳癌組織中にＣＡＰＲＩＮ−１の発現を確認することができた。具体的には、抗体＃８を用いた免疫組織化学染色の結果では、スコア２が２０検体、スコア３が４検体でありＣＡＰＲＩＮ−１陽性の検体数は２４検体（８０％）であるのに対して、抗体＃１４を用いた免疫組織化学染色の結果では、スコア２が２１検体、スコア３が６検体でありＣＡＰＲＩＮ−１陽性の検体数は２７検体（９０％）であった。【０１３４】
＜実施例４：癌の試料を用いたＣＡＰＲＩＮ−１の発現評価と抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体による抗腫瘍効果の相関性＞
（１）免疫組織化学染色法によるマウス癌細胞を移植した担癌マウス由来癌組織を用いたＣＡＰＲＩＮ−１の検出
２６匹のＢａｌｂ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社製）の背部皮下に、マウス由来の癌細胞２種（Ｂ１６Ｆ１０，ＥＭＴ−６）をそれぞれ５匹ずつ移植し、腫瘍が直径７ｍｍ程度の大きさになるまで成長させた。癌細胞２種を移植したマウスの２つの群から各３匹ずつ選抜し、腫瘍塊を切り出して、ＰＢＳ中で腫瘍塊を切り開き、４％  ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰＦＡ）を含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で一晩還流固定した。還流液を捨て、ＰＢＳで各臓器の組織表面をすすぎ、１０％ショ糖を含むＰＢＳ溶液を５０ｍＬ容の遠心チューブに入れ、その中に癌組織を入れて４℃で２時間ローターを用いて振とうした。２０％ショ糖を含むＰＢＳ溶液に入れ替え、４℃で癌組織が沈むまで静置後、３０％ショ糖を含むＰＢＳ溶液に入れ替え、再び４℃で癌組織が沈むまで静置した。癌組織を取り出し、必要な部分を手術用メスで切り出した。次に、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ社製）をかけて組織表面になじませた後、クライオモルドに組織を配置した。ドライアイスの上にクライオモルドを置いて急速凍結させた後、クライオスタット（ＬＥＩＣＡ社製）を用いて１０〜２０μｍに薄切し、スライドガラスごとヘアードライアーで３０分間風乾し、薄切組織がのったスライドガラス作製した。翌日、ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。ブロッキング液として、５％  ヤギ血清を含むＰＢＳ（−）を載せ、モイストチャンバー内にて室温で１時間静置した。次に実施例２で作製したマウス抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１モノクローナル抗体＃８又は＃１４を含むＰＢＳ（−）溶液で１０μｇ／ｍＬに調製した溶液を載せ、モイストチャンバー内にて４℃で一晩静置した。ＰＢＳ（−）で５分間５回洗浄を行った後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＤＡＫＯ社製）適量滴下し、モイストチャンバー内にて室温で３０分間静置した。ＰＢＳ−Ｔで５分間６回洗浄を行った後、ＤＡＢ発色液（ＤＡＫＯ社製）を載せ、室温で１０分程度静置した後、発色液を捨てた。ＰＢＳ（−）で５分間３回洗浄を行った後、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社製）で封入後、観察を行った。実施例３に記載の通り、スコア分類したところ、抗体＃８を用いた免疫組織化学染色の結果、メラノーマ由来癌細胞Ｂ１６Ｆ１０及び乳癌由来細胞ＥＭＴ−６は、共にスコア１であり、ＣＡＰＲＩＮ−１発現は検出されなかった。一方、抗体＃１４を用いた結果では、癌細胞Ｂ１６Ｆ１０に対しては、抗体＃８と同じくスコア１であったが、癌細胞ＥＭＴ−６に対してはスコア３であった。【０１３５】
（２）抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体による抗腫瘍効果
ヒト−ニワトリキメラ抗ヒトＣＡＰＲＩＮ−１抗体＃１３を用いて、上記（１）で作製した担癌マウスを用いた抗腫瘍効果を検討した。Ｂ１６Ｆ１０及びＥＭＴ−６の各癌細胞を移植した担癌マウス１０匹のうち、各５匹に対して、抗体＃１３を１匹あたり２００μｇ（２００μＬ）ずつ腹腔内投与した。その後、２日間計３回、同量の抗体を腹腔に投与し、これを検討群として、毎日腫瘍の大きさを計測し、＃１３抗体による抗腫瘍効果を観察した。一方、各担癌マウスの残り５匹に対しては、抗体の代わりにＰＢＳ（−）を投与し、これをコントロール群とした。【０１３６】
抗腫瘍効果の観察の結果、抗体＃１３を投与したＢ１６Ｆ１０移植検討群では、腫瘍体積が抗体投与開始時を１００％とした場合に、４日目、６日目、８日目、１１日目で、それぞれ、約１５０％、２００％、３７０％、６３０％に増大した。一方、抗体＃１３を投与したＥＭＴ−６移植検討群では、腫瘍体積が抗体投与開始時を１００％とした場合に、４日目には５１％にまで退縮し、６日目には３１％程度、８日目には９％％にまで腫瘍が退縮し、１０〜１４日目までには腫瘍はほぼ完全に退縮した。なお、ＰＢＳ（−）を投与したコントロール群では、Ｂ１６Ｆ１０移植検討群及びＥＭＴ−６移植検討群のいずれも４日目、６日目、８日目、１１日目にはそれぞれ、約２３０％、２９０％、４７０％、８００％にまで腫瘍が増大した。【０１３７】
以上の結果から、抗体＃８を用いた場合、ＣＡＰＲＩＮ−１の検出結果と、当該抗体の抗腫瘍活性による癌治療効果には相関が見られなかったが、抗体＃１４を用いた場合には、ＣＡＰＲＩＮ−１の検出結果と、当該抗体の抗腫瘍活性による癌治療効果には相関性が見られた。すなわち、ＥＭＴ−６を移植した癌組織での抗体＃１４によるＣＡＰＲＩＮ−１の検出結果はスコア３であったことからＣＡＰＲＩＮ−１の過剰発現が認められ、かつ当該抗体の投与による抗腫瘍活性に基づく薬理効果も確認された。【０１３８】
一方、Ｂ１６Ｆ１０を移植した癌組織での抗体＃１４によるＣＡＰＲＩＮ−１の発現の検出結果はスコア１で、ＣＡＰＲＩＮ−１の発現が検出されず、また抗腫瘍活性を有する抗体＃１３を、Ｂ１６Ｆ１０を移植した担癌マウスに投与しても薬理効果は得られなかった。【０１３９】
以上の結果から、本発明のＣＡＰＲＩＮ−１に特異的に結合する抗体である＃１４を用いて癌組織中のＣＡＰＲＩＮ−１を検出し、その発現量が高いと判定された癌又は個体に抗腫瘍効果を有する抗ＣＡＰＲＩＮ−１抗体を投与すれば、高い治療効果が得られることが予測可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明は、癌の診断のために産業上有用である。【０１４１】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【０１４２】
配列番号３１〜３６、３８〜４２：プライマー
【図１】
2014014082.tif 000003
【配列表】
2014014082000001.app
【国際調査報告】
2014014082.tif 000004
2014014082.tif 000005
2014014082.tif 000006
2014014082.tif 000007
2014014082.tif 000008