(57)【要約】要約  遺伝的原因の大多数が未だ不明であるCIII欠乏症の確定診断に有用な新規な手段が開示されている。本発明のミトコンドリア複合体III欠乏症患者又は保因者の検出方法は、被検者から分離された試料を用いて、該被検者がUQCRC2遺伝子に変異を有するか否かを調べることを含む。該方法では、ホモ接合又は複合ヘテロ接合の前記変異が検出された場合に患者が検出され、ヘテロ接合の前記変異が検出された場合に保因者が検出される。UQCRC2遺伝子の変異は、例えば、UQCRC2タンパク質の第183番アミノ酸がTrpに置換する変異である。
2014027615.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者から分離された試料を用いて、該被検者がUQCRC2遺伝子に変異を有するか否かを調べることを含む、ミトコンドリア複合体III欠乏症患者又は保因者の検出方法であって、ホモ接合又は複合ヘテロ接合の前記変異が検出された場合に患者が検出され、ヘテロ接合の前記変異が検出された場合に保因者が検出される、方法。
【請求項２】
前記変異が病原性の変異である請求項１記載の方法。
【請求項３】
ゲノムDNA試料を用いてゲノム配列を調べることにより行なわれる請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ホモ接合の前記変異が検出された場合に患者が検出される請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
UQCRC2遺伝子の変異は、UQCRC2タンパク質の第183番アミノ酸がTrpに置換する変異である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記変異は、UQCRC2遺伝子コード領域の第547位（配列番号９における第353位）のCがTに置換する変異である請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリア複合体III欠乏症患者又は保因者の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリア呼吸鎖は、電子伝達鎖と酸化的リン酸化系により、アデノシン三リン酸（ATP）としてエネルギーを生成する。ミトコンドリア内膜に存在するミトコンドリア呼吸鎖は、複合体I〜Vの5種類の多量体タンパク質複合体で構成される。これらのうち、複合体III（CIII）（bc1複合体又はユビキノールシトクロームc還元酵素; EC1.10.2.2）モノマーは、11のタンパク質で構成される（非特許文献１）。１つのタンパク質はミトコンドリアDNA（MTCYB）にコードされ、残りの10タンパク質は核DNAにコードされる。後者は(1)コアタンパク質（UQCRC1遺伝子及びUQCRC2遺伝子がコード）、(2)呼吸系タンパク質（CYC1遺伝子及びUQCRFS1遺伝子がコード）、(3)低分子量タンパク質（UQCRH遺伝子, UQCRB遺伝子, UQCRQ遺伝子, UCRC遺伝子, UQCR11遺伝子, 及びUQCRFS1遺伝子がコード）の3群に分類される。天然の状態では、CIIIモノマーは触媒活性のホモダイマーに迅速に変換され、複合体I及びIVと共にスーパー複合体（respirasome）に組み込まれる。このスーパー複合体は単一の酵素として機能する（非特許文献２）。【０００３】
ミトコンドリア複合体III欠乏症（CIII欠乏症、MIM 124000）は、臨床的にも遺伝的にも不均質の比較的まれな疾患である。現在までに、常染色体劣性遺伝の複合体III欠乏症の責任遺伝子として、UQCRB (NM_006294), UQCRQ (NM_014402), BCS1L (NM_004328), 及びTTC19 (NM_017775)の４遺伝子が報告されている。UQCRB及びUQCRQは複合体III自体の構成成分をコードしており、BCS1L及びTTC19はミトコンドリアのアセンブリ因子をコードしている。CIII欠乏症の原因としては劣性のBCS1L変異が最も頻度が高い。興味深いことに、BCS1L変異は複数の異なる表現型を生じる: 感覚神経性難聴と捻転毛を特徴とするブヨルンスタッド症候群 (MIM 262000、非特許文献６); 胎児発育遅延、アミノ酸尿、胆汁うっ滞、鉄過剰、乳酸アシドーシス、及び早期死亡を呈するGRACILE症候群 (MIM 603358、非特許文献８); 並びにLeigh症候群 (MIM 256000、非特許文献４)。TTC19遺伝子のホモ接合変異は進行性の神経変性疾患を生じる（非特許文献９）。UQCRB遺伝子のホモ接合の4bp欠失は低血糖と乳酸アシドーシスを生じ（非特許文献１０）、UQCRQ遺伝子のホモ接合ミスセンス変異は重篤な精神運動遅滞、錐体外路徴候、及び認知症を生じる（非特許文献１１）。【０００４】
しかしながら、CIII欠乏症の遺伝的原因の大多数は未だ不明である（非特許文献３〜８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Iwata, et al., 1998, Science 281:64-71
【非特許文献２】Schagger and Pfeiffer, 2000, EMBO J 19:1777-1783
【非特許文献３】Benit, et al., 2009, Biochim Biophys Acta 1793:181-185
【非特許文献４】de Lonlay, et al., 2001, Nat Genet 29:57-60
【非特許文献５】DiMauro and Schon, 2003, N Engl J Med 348:2656-2668
【非特許文献６】Fernandez-Vizarra, et al., 2007, Hum Mol Genet 16:1241-1252
【非特許文献７】Hinson, et al., 2007, N Engl J Med 356:809-819
【非特許文献８】Visapaa, et al., 2002, Am J Hum Genet 71:863-876
【非特許文献９】Ghezzi, et al., 2011, Nat Genet 43:259-263
【非特許文献１０】Haut, et al., 2003, Hum Genet 113:118-122
【非特許文献１１】Barel, et al., 2008, Am J Hum Genet 82:1211-1216
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、遺伝的原因の大多数が未だ不明であるCIII欠乏症について、確定診断に有用な新規な手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、新生児期より繰り返し低血糖、高乳酸血症、ケトン性アシドーシス、高アンモニア血症を呈するCIII欠乏症の近親婚家系例を対象に鋭意に変異解析した結果、CIIIのコアタンパク質をコードするUQCRC2遺伝子がCIII欠乏症の原因遺伝子であることを同定し、本願発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、被検者から分離された試料を用いて、該被検者がUQCRC2遺伝子に変異を有するか否かを調べることを含む、ミトコンドリア複合体III欠乏症患者又は保因者の検出方法であって、ホモ接合又は複合ヘテロ接合の前記変異が検出された場合に患者が検出され、ヘテロ接合の前記変異が検出された場合に保因者が検出される、方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、CIII欠乏症の新規原因遺伝子が同定され、CIII欠乏症の確定診断に有用な新たな指標が提供された。これにより、該疾患への関与が既に知られている4遺伝子に変異が認められないCIII欠乏症例についても確定診断が可能になる。診断が確定することで予後等も推測可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】(A)  UQCRC2遺伝子に変異が同定されたCIII欠乏症患者１〜３の家系図である。矢印は発端者を示す。(B)  UQCRC2遺伝子のc.547C>T変異の配列解析の波形データである。患者3名（患者１、２及び３）は全てホモ接合で変異を有し、両親及び罹患していない患者１、２の姉はヘテロ接合で変異を有する保因者であった。矢印はc.547C>Tを示す。(C)  UQCRC2の第183番Argの進化的保存性を示す図である。rs4850 (chr 16: 21976762, G>A/G, p.Arg183Gln) は、dbSNP135データベースに登録されているcommon SNPである。
【図２】(A)  FoldXソフトウェアを用いて計算した、第183番残基におけるアミノ酸置換によるコアタンパク質ホモダイマーの相互作用エネルギー変化を示すグラフである。(B)  ウシミトコンドリアbcI（CIII）複合体（PDB_code 2A06）の結晶構造を示す図である。丸印はコアタンパク質の第183番残基である。(C-F) コアタンパク質ホモダイマー界面の詳細図である。Cは野生型（Arg）、Dは変異型（Trp）、EはSNP型（Gln）、Fはオルソログ型（Lys）の複合体構造である。
【図３】(A, B) 患者１及び対照被検者（n＝10）由来の初代線維芽細胞から調製したミトコンドリア画分を用いて測定した、ミトコンドリア呼吸鎖複合体の酵素活性である。各測定は３回反復して行なった。測定値は複合体II（A）又はクエン酸合成酵素（B）に対して正規化した。エラーバーはSEMを示す。(C, D) 0.5％DDMで可溶化したミトコンドリアを用いて各呼吸鎖複合体をイムノブロット検出した結果である。同量の対照被検者（n＝10）由来のプール化ミトコンドリアタンパク質をコントロールレーンにロードした。各呼吸鎖複合体のバンド強度はデンシトメトリーにより測定し、PDHC（グレー）又は複合体II（黒）のバンド強度に対して正規化した。これらのデータは２回の独立したアッセイにより取得した。(D)のエラーバーはSEMを示す。(E, F) 1％(w/v)ジギトニンで可溶化したミトコンドリアを用いて各呼吸鎖複合体をイムノブロット検出した結果である。同量の対照被検者（n＝10）由来のプール化ミトコンドリアタンパク質をコントロールレーンにロードした。スーパー複合体のバンド強度はデンシトメトリーにより測定し、複合体II（黒）のバンド強度に対して正規化した。これらのデータは３回の独立したアッセイにより取得した。(F)のエラーバーはSEMを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
UQCRC2遺伝子は、ミトコンドリア呼吸鎖複合体III（CIII）の構成成分のうちのコアタンパク質（ユビキノール−シトクロームc還元酵素コアタンパク質II、MIM 191329）をコードする核遺伝子である。UQCRC2遺伝子のmRNA配列はGenBankにNM_003366.2のアクセッション番号で登録されている。配列表の配列番号１及び２は、該遺伝子のcDNAのコード領域の塩基配列及びUQCRC2タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号３は、上記のアクセッション番号で登録されている該遺伝子のmRNA配列である。配列番号４〜１６には、各エクソン及びその近傍のイントロンの配列を表１の通りに示した。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
本願発明者らにより、UQCRC2遺伝子がミトコンドリア複合体III欠乏症（CIII欠乏症）の原因遺伝子であることが新たに同定された。UQCRC2遺伝子中に存在する病原性の変異は、CIII欠乏症の病因変異である。CIII欠乏症患者は、UQCRC2遺伝子中にそのような変異をホモ又は複合ヘテロで有し、CIII欠乏症保因者は該変異をヘテロで有する。複合ヘテロとは、UQCRC2遺伝子の両アリルにそれぞれ異なる変異を有することを意味する。UQCRC2遺伝子の異常により引き起こされるCIII欠乏症は、既報の4遺伝子（UQCRB, UQCRQ, BCS1L, TTC19）の異常で引き起こされるCIII欠乏症とは臨床的特徴がやや異なり、新生児期より繰り返し低血糖、高乳酸血症、ケトン性アシドーシス、高アンモニア血症を呈することを特徴とする。CIIIのコアタンパク質の異常としては、本願発明者らによる報告がヒトにおいて初めての報告である。
【００１４】
本発明において検出対象となるUQCRC2遺伝子の変異には、UQCRC2遺伝子がコードするUQCRC2タンパク質のごく少数のアミノ酸の変化のほか、該タンパク質の少なくとも一部の領域を欠失するような変化をもたらす塩基配列の変異が包含される。そのような塩基配列の変異は、例えば、エクソン又はイントロン領域内での塩基の置換、欠失、挿入、重複等によるミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異、アミノ酸欠失変異、スプライシング異常変異等であり得る。
【００１５】
配列表に示されたUQCRC2遺伝子のcDNA配列、ゲノム配列、及びUQCRC2タンパク質のアミノ酸配列は、正常なUQCRC2配列の典型例である。本発明では、変異の有無は、配列表に示されたUQCRC2遺伝子の配列を基準とし、この基準配列との対比により判断され得る。アミノ酸配列に変化を生じるUQCRC2遺伝子の変異であれば、CIII欠乏症を生じさせる病原性の変異である可能性があるが、中でも、進化的に保存性の高いアミノ酸を欠失させる遺伝子変異、又はこれを性質の異なるアミノ酸に変化（例えば、親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に変化）させる遺伝子変異は、正常に機能できないUQCRC2タンパク質、例えば、CIIIの酵素活性を大幅に低下させるUQCRC2タンパク質や、スーパー複合体を安定に形成できないUQCRC2タンパク質を生じる蓋然性が高く、CIII欠乏症の病因となる病原性変異の典型例である。種々の動物のUQCRC2タンパク質の配列が公知であり、GenBank等の各種データベースに登録されているので、当業者であれば容易に配列情報を入手して常法により各アミノ酸の進化的保存性を調べることができる。あるいはまた、検出された塩基の変異が、多数の健常者集団には認められない変異であったり、NCBIのdbSNPや1000 Genomes Project等の塩基配列の多様性に関する周知のデータベースに登録されていないまれな塩基変異である場合も、病原性変異である可能性が高い。
【００１６】
ある遺伝子中の変異が病原性の変異であるか否かを調べることができる各種の予測ツールが知られている。例えば、SIFT (http://sift.jcvi.org/)、PolyPhen (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/)、PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)、Mutation Taster (http://neurocore.charite.de/MutationTaster/index.html)、Align GVGD (http://agvgd.iarc.fr/agvgd_input.php)などが知られている。本発明の方法を実施し、UQCRC2遺伝子の変異が検出された場合において、その変異が病原性変異であるかどうかに疑義があるときは、このような公知の予測ツールを用いて病原性変異であるかどうかを判断することができる。SIFTでは、スコア0.05未満の場合、置換はintolerant（タンパク質機能変化に影響あり）と予測される。PolyPhenでは、スコア2.0を超えた場合、病原性と予測される。PolyPhen-2では、スコア0.000 (良性の可能性が最も大) 〜0.999 (有害の可能性が最も大)でスコア付けされ、スコアをもとにした判定がpossibly damaging又はprobably damagingであるときに、病原性変異が強く示唆される。Align GVGDでは、Class C0 (可能性小) 〜Class C65 (可能性大)の範囲でクラススコア評価され、クラススコアC55以上のUQCRC2変異であれば病原性変異が示唆される。
【００１７】
下記表２の変異は、実施例において近親婚家系から同定されたCIII欠乏症の病因変異であり、本発明で指標となるUQCRC2変異の具体例の１つである。このミスセンス変異は、dbSNP等の塩基配列の多様性に関するデータベースに登録されておらず、また健常者集団においてもほとんど認められないまれな変異であった。また、上記した各種予測ツールを用いた解析でも、病原性変異であることが強く示唆されており、さらに、変異タンパク質を用いた機能解析によりCIII複合体の酵素活性及びスーパー複合体形成に異常をきたすことも確認されている。もっとも、本発明で指標とするUQCRC2変異はこのような具体例にのみ限定されるものではなく、病原性が示唆されるUQCRC2変異が広く本発明の範囲に包含される。なお、第183番アミノ酸については、Glnに置換される非同義のヒトSNP［rs4850 (c.548G>A, p.Arg183Gln)］が知られているが、当該変異は病原性変異ではないことが、予測ツールによる解析、p.Arg183Gln型のUQCRC2タンパク質の機能解析等により確認されている。
【００１８】
【表２】
2014027615.tif 000004
【００１９】
UQCRC2遺伝子の変異は、ゲノムDNAやRNA等の核酸試料を用いて塩基配列を解析することで検出可能である。とりわけ、ゲノムDNA試料を用いてゲノム配列の解析を行なうことが最も確実で望ましい。ゲノムDNA等の核酸試料は、末梢血や口腔粘膜スワブ等から常法により容易に調製することができる。また、種々の出生前遺伝子検査法が公知であり、胎児にUQCRC2遺伝子変異が存在するかどうかを調べることも可能である。例えば、胎児から細胞を採取して検査する方法（羊水、絨毛、臍帯血を使用）、母体血中に混在している胎児細胞を用いて胎児の遺伝子変異を検査する非侵襲の検査方法、体外受精した受精卵の１細胞を用いる方法（着床前診断）など、種々の手法が公知である。上記非侵襲の検査方法では、胎児が「被検者」であり、母体血試料中に含まれる胎児細胞試料が「被検者から分離された試料」に該当する。あるいは、胎児を「対象生体」とし、母体を「生体」と表現することも可能であり、その場合、本発明の方法は、「生体から分離された試料を用いて、対象生体がUQCRC2遺伝子に変異を有するか否かを調べる」と表現することができる。
【００２０】
タンパク質のアミノ酸配列は、エクソン領域だけではなくイントロン領域における変異によっても影響され得るが、遺伝子検査では通常、エクソン及びその近傍数十〜数百塩基程度、例えば30〜50塩基程度のイントロン領域を含めて検査するのが一般的である。本発明でも、エクソン及びその近傍のイントロンを対象に配列解析を行えばよい。ゲノム配列の解析により変異を検出する場合には、本願配列表の配列番号４〜１６や公知のデータベースから入手可能なUQCRC2遺伝子のゲノム配列を参照して適宜プライマーを設計し、ゲノムDNA試料を用いて常法によりシークエンシングを行えばよい。対象生体ゲノムDNA上のUQCRC2遺伝子の塩基配列を決定し、これを野生型配列と比較することにより、変異を詳細に同定できる。決定した塩基配列は、例えばSeqScape (登録商標) 等の公知のソフトウェアを用いて解析することにより、変異の検出やプロファイリングを容易に行うことができる。
【００２１】
変異がホモかヘテロかは、シークエンスの波形データから確認できる。ヘテロ変異がある場合、同一部位に2種類のシグナルが重なることになる。ヘテロ変異が２箇所以上ある場合、変異が複合ヘテロであるかどうか（すなわち、変異が異なる染色体上に存在するかどうか）は、患者の両親の検査を行ない、２つの変異がそれぞれ父親と母親由来であることを調べることで確認できる。
【００２２】
ヘテロ二本鎖の検出により、UQCRC2遺伝子の変異のスクリーニングを行なうことも有効である。ヘテロや複合ヘテロの変異が存在する場合、ゲノムDNA試料を熱変性後に再会合させることにより、正常型DNAと変異DNAとがハイブリダイズしたヘテロ二本鎖が生じる。ヘテロ二本鎖は、(1)非変性ポリアクリルアミドゲル中で異なる移動度を示す、(2)ミスマッチ部分の塩基は化学物質や酵素による切断を受けやすい、(3)変性の際に異なる変性温度を示す、といった特性を有する。これらの特性を利用してヘテロ二本鎖を検出する方法がこの分野において公知であり、変異の検査方法として実用化もされている。具体的には、例えば、変性高速液体クロマトグラフィー（dHPLC）を用いてヘテロ二本鎖を検出する方法や、High Resolution Melt法が知られている。
【００２３】
High Resolution Melt法とは、二本鎖DNAに高密度で結合する蛍光色素（SYTO(登録商標)9, LC Green(登録商標), EvaGreen(商標)等）を用いて、二本鎖DNAの融解（熱変性）の過程を蛍光強度の変化としてとらえ、ヘテロ二本鎖を検出する方法である。すなわち、二本鎖DNAに高密度で結合する蛍光色素を用いて二本鎖DNAを染色すると、該二本鎖DNAを融解（熱変性）させたとき、二本鎖が解離した部位から蛍光色素が脱落するため、二本鎖DNAからの蛍光シグナルの量が減少する。従って、そのような蛍光色素を用いることで、二本鎖DNAの熱変性の過程を蛍光強度の変化として視覚的にとらえることができる。温度−蛍光のデータを高密度で取得し解析することで、ヘテロ二本鎖の検出を迅速に高感度で行うことができる。市販の機器類及びキット等を用いて容易に実施可能である。変異がホモである場合、High resolution melt法の検出感度は低くなると想定されるが（検出できないわけではない）、常染色体劣性遺伝病では、患者両親の血族婚がない場合ではまず複合ヘテロ変異が想定されるため、High Resolution Melt法等のヘテロ二本鎖検出は本発明でも有効な検査方法となり得る。
【００２４】
本発明では、UQCRC2のエクソン＋近傍イントロン領域を全て対象として塩基配列を決定し、変異の有無を調べてもよい。また、例えば、ヘテロ二本鎖の検出により塩基配列を決定すべき領域を絞り込み、その後に対象領域の塩基配列を決定することで、検査をより効率的に実施することができる。所望により、既報の４つの原因遺伝子（UQCRB, UQCRQ, BCS1L, TTC19）についても変異の有無を調べてよい。
【００２５】
被検試料の塩基配列を同定した後、これを野生型配列と対比する。上述した通り、アミノ酸配列の変化を生じるような変異、特に、進化的に保存性の高いアミノ酸を性質の異なる他のアミノ酸に変化させる変異であれば、CIII欠乏症の病因変異と判断し得る。適宜、NCBIのdbSNPや1000 Genomes Project等の塩基配列多様性に関するデータベースを参照し、登録のないまれな変異であるかどうかを確認してもよいし、上記した公知の予測ツールで病原性変異であるかどうかを調べてもよい。
【００２６】
低血糖、高乳酸血症、ケトン性アシドーシス及び高アンモニア血症を呈する患者は、UQCRC2遺伝子異常によるCIII欠乏症が疑われる。そのようなCIII欠乏症の疑いのある患者について本発明の方法を実施し、UQCRC2遺伝子の病原性変異が検出されれば、該患者をCIII欠乏症と確定診断することができる（CIII欠乏症患者の検出）。また、健常者について本発明の方法を実施することで、CIII欠乏症の病因変異であるUQCRC2遺伝子変異を有する保因者であるかどうかを調べることができる（保因者の検出）。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００２８】
１．材料及び方法
(1)  DNAの調製
家族員のDNA及び患者の線維芽細胞は、インフォームドコンセントを得た後に採取した。DNAは、常法により末梢血白血球より抽出した。コントロールサンプルとして、メキシコ人コントロール８０名のDNAをCoriell Institute for Medical Research（米国ニュージャージー州キャムデン）より購入した。実験プロトコールは横浜市立大学の治験審査委員会に承認された。【００２９】
(2)  連鎖解析
SNPタイピングは、Affymetrix Human Mapping SNP 10K Xba I 142 2.0 array（アフィメトリックス社、米国カリフォルニア州サンタクララ）を製造者の指示書に従い用いて行なった。多点連鎖解析はAllegro version 2.0（Gudbjartsson et al., 2005, Nat Genet 37:1015-1016）を用いて行なった。完全浸透率を持つ常染色体劣性遺伝形式及び疾患アレル頻度0.005を用いた。【００３０】
(3)  エキソームシークエンス
3μgのゲノムDNAを断片化し、NimbleGen SeqCap EZ Exome library SR (Roche NimbleGen社, 米国ウィスコンシン州マディソン)を製造者の指示書に従い用いてキャプチャーした。キャプチャーされたサンプルは、次世代シーケンサーGAIIx（イルミナ社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）にてリード長76bpのペアエンドを用いて配列決定した。画像解析及びベースコーリングはsequence control software (SCS) real time analysis（イルミナ社）及びCASAVA software v1.7（イルミナ社）により実施した。Mapping and Assembly with Qualities (MAQ, http://maq.sourceforge.net/) 及びNextGENe software v2.00 (SoftGenetics社, 米国ペンシルベニア州ステートカレッジ)を用いて、クオリティコントロール済みの（パスフィルター済みの）リードをヒトゲノムリファレンスhg19にマップした。MAQで得られた変異は、SeattleSeq annotation 131 (http://snp.gs.washington.edu/SeattleSeqAnnotation131) を用いてアノテートした。変異の優先順位付けは既報の通りに行なった（Tsurusaki et al., 2011, J Med Genet 48:606-609）。【００３１】
(4)  発現ベクターの調製
哺乳動物発現コンストラクトのため、多組織cDNA（MTC）パネル（クローンテック社、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）由来のcDNAライブラリーからKOD-plus DNAポリメラーゼ（東洋紡社、日本国大阪）を用いて全長UQCRC2を増幅した。PCR産物をGatewayシステム（インビトロジェン社、米国カリフォルニア州カールズバッド）のエントリーベクター（pDONR（商品名）221）にクローニングした。２つのミスセンス変異は、Quick change II XL Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社、米国カリフォルニア州ラホーヤ）を用いてそれぞれ別個にエントリークローンに導入した。LR組換え反応により各インサートをpcDNA-DEST40 (C-末端V5及び6xHisタグ) にクローニングした。全てのクローンについて、ダイレクトシークエンシングによる検証を行なった。【００３２】
(5)  細胞内局在
各哺乳動物発現コンストラクト（200 ng）は、FuGENE6 (ロシュ・ダイアグノスティックス社, 米国インディアナ州インディアナポリス)を用いてCOS-1細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後にMito tracker Red CMXRos (インビトロジェン社) を添加し、30分間インキュベートした。次いで細胞を4％パラホルムアルデヒドで室温にて20分間固定した。0.1％トリトン／1×PBSで10分間透過処理を行なった後、マウス抗V5抗体（1:1000）（インビトロジェン社）及び二次抗体としてAlexa Fluor-488ヤギ抗マウスIgG抗体（1:1000）（モレキュラープローブ社、米国カリフォルニア州カールズバッド）を用いてC末端V5-6xHisタグされたUQCRC2タンパク質を染色した。FLUOVIEW FV1000-D顕微鏡（オリンパス社、日本国東京）を用いて共焦点顕微鏡像を取得した。【００３３】
(6)  ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロッティングにより、ミトコンドリア酵素活性及びスーパー複合体形成を解析した。ミトコンドリア呼吸鎖複合体の酵素活性は、患者１及びコントロール（n=10）に由来する初代線維芽細胞から調製したミトコンドリア画分を用いて測定した。各測定は3回反復して行なった。測定値は複合体II又はクエン酸シンターゼに対して正規化した。各呼吸鎖複合体の免疫ブロット検出は、0.5％DDMで可溶化したミトコンドリアを用いて実施した。コントロールとして、対照被検者（n=10）由来のミトコンドリアタンパク質をプールしたものを同量用いた。１次抗体として下記のものを用いた：2μg/mL 抗NDUFA9 (複合体I; インビトロジェン), 0.02μg/mL 抗SDHA (複合体II; インビトロジェン), 2μg/mL 抗UQCRC1 (CIII; アブカム, 米国マサチューセッツ州ケンブリッジ), 0.2μg/mL 抗MTCO1 (複合体IV; インビトロジェン), 及び2μg/mL 抗ATP5B (複合体V; インビトロジェン)。呼吸鎖スーパー複合体の免疫ブロット検出は、1％(w/v)ジギトニンで可溶化したミトコンドリアを用いて実施した。コントロールとして、対照被検者（n=10）由来のミトコンドリアタンパク質をプールしたものを同量用いた。１次抗体として下記のものを用いた：0.02μg/mL 抗SDHA (複合体II; インビトロジェン) 及び2μg/mL 抗UQCRC1 (CIII; アブカム)。スーパー複合体のバンド強度はデンシトメトリーにより測定し、複合体IIのバンド強度に対して正規化した。これらのデータは３回の独立したアッセイにより得られた。【００３４】
２．結果
(1)  患者１
患者1（図1AのV:2）は、またいとこの関係にある26歳の健常女性（G2P2Ab0）及び28歳の健常男性の子として生まれたラテンアメリカ系の女児である。37週齢の時点で胎児心拍陣痛図の異常により帝王切開にて分娩。出生時の体重は2,329グラム(5〜10パーセンタイル) 、身長は46 cm (5〜10パーセンタイル)、頭囲は34 cm (25〜50パーセンタイル)。アプガースコアは、1分後8点、5分後9点、10分後9点。一日以内に重篤な代謝性アシドーシス（pH7.1、過剰塩基-24.6 mEq/L）を呈し、新生児集中治療室に入院となった。血中乳酸値及びピルビン酸値はそれぞれ25.5 mM (基準域: < 2.2 mM)及び0.436 mM (基準域＜0.16 mM) であった(乳酸/ピルビン酸比＝58.48)。診察の結果、頻呼吸（47回／分）、頻脈（181拍／分）、軽度の肋骨下の陥没呼吸、Levine II/VIの収縮期心雑音、臓器肥大なし、及び吸啜反射の不良を認めた。血中アンモニア値は126μM (新生児基準域＜80μM)であった。該女児患者は対症療法に迅速に応答し、グルコース静注10 mg/kg/分及び炭酸水素ナトリウム点滴で24時間以内に血中乳酸レベルが12.7 mMまで低下した。さらに、3日以内に乳酸レベルは3.1 mMまで、ピルビン酸レベルは0.125 mMまで改善した。入院時の尿有機酸分析で認めた異常は、大量の乳酸性及びピルビン酸性の酸性尿、並びにケトン尿であった。血漿アミノ酸は、アラニンレベルが特に高かった（1,519μM; 基準域200〜600μM）。脳の磁気共鳴像断層撮影（MRI）により、右頭頂部及び側頭部に小さい梗塞を認めた。【００３５】
女児は後遺症なく回復し、１月半の入院の後、高炭水化物・低脂肪の調合乳（カロリーの60％が炭水化物由来、30％が脂肪由来）で完全経口栄養となり退院した。また、女児は心房中隔欠損症及び尿細管性アシドーシスと診断された。発熱、嘔吐、下痢を含む併発疾患により惹起される乳酸アシドーシス（最高値は3歳10か月時の10.8 mM）、高アンモニア血症（最高値は3歳3か月時の346μM）、ケトーシス、及び低血糖を伴う突発性の代謝代償不全のために、最初の入院の後、女児は10回以上入退院を繰り返した。【００３６】
患者1は現在5歳齢であり、発育は正常、知的障害の兆候はない。併発疾患の間の代謝代償不全を予防するために女児は依然として緊急のグルコース静注処置を必要とするが、入院の頻度は低下した。【００３７】
(2)  患者２
患者2（図1AのV:3）は患者1の弟である。該男児は妊娠39週で帝王切開により出生した。出生時の体重は2,658 g (5〜10thパーセンタイル)、身長は49 cm (25〜50パーセンタイル)、頭囲は34.3 cm (25パーセンタイル)。アプガースコアは、1分後8点、5分後9点。高乳酸血症により、患者2は1日以内に頻呼吸、呻吟、哺乳力不良を進展した。初回のキャピラリー血液ガス分析の結果、pHは7.05、pCO2は25 mmHg、炭酸水素は5.8 mmol/L、過剰塩基は-22 mEq/Lであった。代謝性アシドーシスを補正するため、患者2は2日間挿管され、グルコース静注と炭酸水素点滴の処置が行なわれた。高炭水化物・低脂肪の調合乳の摂食が10日以内に開始された。患者2の最初の入院期間は1か月であり、その間に先天性の乳酸血症及び原因不明の持続性低血糖と診断された。患者2は副腎機能不全のため、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）刺激テストで正常な結果が得られるようになるまでの4か月間、副腎皮質ステロイド投与を受けた。8か月齢時、2日間の軽度の上気道感染に関連する食欲低下に起因して、6時間の絶食後に反応性の低下が認められた。緊急治療室において、代謝性アシドーシス（pH＝7.23）、低血糖（3 mg/dL, 基準域＞60 mg/dL）、高アンモニア血症（463μM）及びケトーシス（血液及び尿）が認められた。該患者はこのエピソードに関連した全身発作のエピソードが5回記録されているが、レベチラセタムによる治療後、発作はなくなった。8か月齢時の脳MRI所見では特段の異常を認めず。該患者は1か月間入院し、後遺症なく退院した。併発疾患により惹起される乳酸アシドーシス、低血糖、高アンモニア血症、及びケトーシスという同様のエピソードにより、該患者は10回以上入退院を繰り返した。発育遅延は4か月齢時に1回指摘され、理学及び言語療法を受けたところ、3歳齢時には発育が正常と評価された。【００３８】
患者2は現在4歳齢であり、発育は正常、知的障害の兆候はない。理学的検査の結果、外表奇形や異常な局所神経学的兆候も認められなかった。該患者は低脂肪・高炭水化物食の摂取と空腹対策を続けている。併発疾患の間の代謝代償不全を予防するために該患者は依然として緊急のグルコース静注処置を必要とし続けているが、入院の頻度は低下した。16か月齢時に生じた重篤な急性代謝代償不全の際の臨床検査では、下記の点で異常を認めた：キャピラリー血液ガスpH 7.19、グルコース11 mg/dL、血中アンモニア348μM、血中乳酸6.8mM。尿有機酸分析によると、重篤なケトーシスを意味する3-ヒドロキシ酪酸及びアセト酢酸の顕著な上昇、乳酸アシドーシスを意味する酪酸及びピルビン酸の顕著な上昇、亢進した脂肪酸のβ酸化を意味するジカルボン酸の顕著な上昇（アジピン酸1,194 mmol/mol Cr [基準域＜15 mmol/mol Cr]、スベリン酸122 mmol/mol Cr [基準域＜7 mmol/mol Cr],セバシン酸288 mmol/mol Cr [基準域＜2 mmol/mol Cr]）、並びにリンゴ酸、フマル酸及び2-オキソグルタル酸を含むトリカルボン酸（TCA）回路中間体の中等度の上昇が認められた。血漿アミノ酸は、アラニンが440μMに上昇していた（基準域は23〜410μM）。軽度の代償不全であった19か月齢時のアシルカルニチンプロファイルでは、C2の顕著な上昇（48 nmol/mL[基準域2.6〜15.5 nmol/mL]）及び3-ヒドロキシアシルカルニチン（C12〜C18）の中等度の上昇を認めた。【００３９】
(3)  患者３
患者3（図1AのVI:1）は、患者1及び2と同じ家系内の分家に属する近親婚の両親の間に生まれた女児である。胎児期には妊娠月齢に比して小さく、在胎満期で23歳齢の母親より経膣分娩で出生した。出生時体重は2,200 g。軽度の呼吸促迫があり、通常よりも１日多く監視下に置かれた。嘔吐、脱水症状及び低血糖のため、18か月齢までに4回の入院を経験した。18か月齢時の最初の血液検査では、血糖値が17 mg/dL、重炭酸値が8 mmol/L、アニオンギャップが30 mmol/Lであった。血中乳酸レベル及びピルビン酸レベルはそれぞれ26.3 mg/dL（基準域＜16.0mg/dL）及び1.5 mg/dL（基準域＜1.5 mg/dL）であった。デキストロース静注に迅速に応答し、低血糖及び代謝性アシドーシスが補正された。発達遅延と小頭症（2パーセンタイル）を認めたため脳MRI検査を行なったが、結果は正常であった。18か月時、患者3は2語しか喋らなかったが、二語文には従うことができた。15か月齢で歩行。14か月齢で作業療法を開始する前までは低体重であった。外表奇形は認めず。健康時は筋力及び筋緊張は正常であり、年齢相応のやり方でよじ登り、片足跳び、跳躍の動作が可能であった。【００４０】
(4)  遺伝子変異の同定
当該家族の血縁関係を考慮し、我々は該疾患を常染色体劣性様式で遺伝するとの仮説を立てた。患者2名（患者１、２）及び罹患していない家族員3名（IV:1, IV:2, 及びV:1）を用いた連鎖解析により、LODスコア≧2.0（Allegro version 2 (Gudbjartsson, et al., 2005)で算出）で2名の患者に共通している合計36Mbのホモ接合領域が同定された。【００４１】
次いで、患者１由来のDNAの全エキソーム配列決定を行なった。上記36Mbホモ接合領域内にUQCRC2遺伝子（NM_003366、配列番号１及び２）中のc.547C>T変異（p.Arg183Trp）及びTNRC6A遺伝子（NM_014494）中のc.1675A>G変異（p.Met559Val）という2つのホモ変異が同定された。サンガー法による配列決定により、患者１に当該2変異があることを確認した。Polyphen-2プログラム(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) による予測の結果、UQCRC2におけるp.Arg183Trp変異は有害の可能性大（probably damaging）（表３）、TNRC6Aにおけるp.Met559Val変異は良性（benign）であった。TNRC6Aについては、患者3においてヘテロ接合性の変異が確認されたため、候補から除外した。【００４２】
【表３】
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【００４３】
UQCRC2遺伝子は、CIIIのコアタンパク質であるユビキノール−シトクロームc還元酵素コアタンパク質II (UQCRC2;MIM 191329、配列番号２)をコードしている。3名の患者は全てUQCRC2中にホモ接合のp.Arg183Trp変異を有していたが、父親（IV-2）、母親（IV-1）及び姉（V-1）（全て非罹患者）ではヘテロ接合であった（図1B）。当該変異は、80例のメキシコ人コントロールアレルにも750例の日本人コントロールアレルにも観察されなかった。【００４４】
(5)  変異タンパク質の機能解析
当該ミスセンス変異（c.547C>T, p.Arg183Trp）がCIIIの構造的安定性に与える影響を予測するため、FoldXソフトウェア（version 3.0）（Guerois, et al., 2002; Khan and Vihinen, 2010）を用いて、UQCRC2遺伝子にコードされるコアタンパク質モノマーの変異体と非変異体との間で相互作用の自由エネルギー変化を計算した。ヒトのUQCRC2については結晶構造が利用不能であったため、この計算ではウシCIII（PDB code 2A06）の結晶構造を構造モデルとして用いた。UQCRC2の第183番アミノ酸は、ゼブラフィッシュからヒトまでの種間で高度に保存された塩基性アミノ酸であり（例えば、ヒト及びウシではArg、マウスではLysである。図1C参照）、当該アミノ酸がGlnに置換される非同義のヒトSNP［rs4850 (c.548G>A, p.Arg183Gln)］が報告されている（図1C）。そこで、患者で発見されたTrpへの置換に加えて、Arg183のLys又はGlnへの置換による相互作用エネルギーの変化も計算した。その結果、Arg183のTrpへの置換によって生じる相互作用エネルギー変化は10 kcal/molと算出され、Lys又はGlnへの置換によって生じる変化は2 kcal/mol以下であった（図2A, 表３）。なお、Arg183のGlnへの置換及びLysへの置換は、Polyphen-2ソフトウェアの予測によるといずれも良性（benign）であった。【００４５】
野生型のコアタンパク質ホモダイマーの分子構造は、Arg183側鎖のメチレン部分がホモダイマー界面にある他のサブユニットのHis254及びPhe449の側鎖と疎水性コアを形成していることを示していた（図2B、C）。コアタンパク質のArg183がTrpで置換されると、立体障害のためにTrp183側鎖が本来の側鎖の位置から外方向に反転した（図2D）。対照的に、Arg183がLys又はGlnで置換されると、側鎖は本来の位置を占めてLys又はGlnのメチレン部分が疎水性コアを維持していた（図2E、F）。このことは、UQCRC2におけるArg183Trp変異がUQCRC2を含む複合体の界面で形成される疎水性コアを破壊し、CIIIを不安定化させることを示している。【００４６】
当該変異がミトコンドリア内膜におけるUQCRC2の局在化に変化を与えるか否かを調べるため、UQCRC2全長野生型、変異体、及びSNP（rs4850）の哺乳類発現ベクターを作出し、それらをCOS1細胞内で一過的に過剰発現させ、顕微鏡下で各タンパク質の局在化を観察した。その結果、変異タンパク質は、野生型及びSNPタンパク質と同様にミトコンドリアに共存していた。このことは、p.Arg183Trp変異が細胞内局在化には変化を与えないであろうことを示している。【００４７】
インビトロでミトコンドリアの機能を評価するため、患者１から分離した初代線維芽細胞より調製したミトコンドリア画分を用いてミトコンドリア呼吸鎖複合体の酵素活性を測定した。複合体IIの活性に対して正規化すると、患者１のCIII活性はコントロール（n＝10）のCIII活性の50％まで低下していたが、複合体Iの活性はコントロールの3倍に上昇し、複合体IVの活性はコントロールと同レベルを維持していた（図3A）。クエン酸合成酵素活性に対して正規化した場合にも同様の結果が得られた（図3B）。【００４８】
さらに、酵素活性の測定に用いたのと同じミトコンドリア画分を用いたブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN-PAGE）により、呼吸鎖複合体の定常状態レベルについても検討した。各個の複合体の分析には、ミトコンドリアを0.5% (w/v) n-ドデシル-β-D-マルトシド(DDM) で可溶化して使用し、スーパー複合体（複合体I, III, 及びIV）の分析には、ミトコンドリアを1% (w/v)ジギトニンで可溶化して使用した。BN-PAGE後、呼吸鎖複合体に対する特異抗体を用いてイムノブロッティングを行なった（図3C〜F）。その結果、患者の線維芽細胞中では、CIIIアセンブリがプールされたコントロールサンプルにおけるレベルの18〜20％まで（図3C、D）、スーパー複合体アセンブリは4％まで（図3E、F）低下していた。電子伝達系の機能的補償を示唆しているかもしれないが、複合体Iの量が減少していたにもかかわらず何故複合体Iの活性が上昇していたのかは不明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月5日(2014.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者から分離された試料を用いて、該被検者がＵＱＣＲＣ２遺伝子の変異を有するか否かを調べることを含む、新生児期より繰り返し低血糖、高乳酸血症、ケトン性アシドーシス及び高アンモニア血症を呈するミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠乏症の病因変異の検出方法であって、前記ＵＱＣＲＣ２遺伝子の変異には、ＵＱＣＲＣ２タンパク質の第１８３番アミノ酸がＴｒｐに置換する変異が包含される、方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
ゲノムＤＮＡ試料を用いてゲノム配列を調べることにより行なわれる請求項１記載の方法。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
前記第１８３番アミノ酸がＴｒｐに置換する変異は、ＵＱＣＲＣ２遺伝子コード領域の第５４７位（配列番号９における第３５３位）のＣがＴに置換する変異である請求項１又は３記載の方法。
【国際調査報告】
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2014027615.tif 000011
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