(57)【要約】  簡便かつ極めて感度及び特異性高く、腎細胞癌の予後不良リスクを検出するための方法を提供することを目的とし、正常腎組織、腎細胞癌患者由来の非癌組織及び腎細胞癌についてメチローム解析を行った。その結果、ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６−２遺伝子の少なくとも一のＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを検出することによって、腎細胞癌の予後不良リスクを検出できることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、腎細胞癌の予後不良リスクを検出する方法
（ａ）被験体の腎臓組織由来のゲノムＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡについて、ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６−２からなる遺伝子群から選択される遺伝子の少なくとも一のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で検出したＤＮＡメチル化レベルから、前記被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定する工程、
を含む方法。
【請求項２】
工程（ｂ）が、工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡをバイサルファイト処理し、前記ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出する工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法に用いるための、少なくとも１２塩基の鎖長を有する、下記（ａ）〜（ｂ）に記載のいずれかであるオリゴヌクレオチド
（ａ）前記遺伝子群から選択される遺伝子の少なくとも一のＣｐＧサイトを挟み込むように設計された一対のプライマーであるオリゴヌクレオチド
（ｂ）前記遺伝子群から選択される遺伝子の少なくとも一のＣｐＧサイトを含むヌクレオチドにハイブリダイズするプライマー又はプローブであるオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡメチル化レベルを検出することを含む、腎細胞癌の予後不良リスクを検出するための方法に関する。また、本発明は、前記方法に用いられるオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
腎細胞癌（ＲＣＣ）は、労働人口に属する壮年期にもしばしば発生し、腎摘除術で根治する症例群が大勢をなす反面、急速に遠隔転移を来す症例群も明らかに存在し、両者の臨床経過には大きな差違がある。さらに、転移しても免疫療法・分子標的治療薬等が奏功する症例が知られている。再発の可能性が高い症例は密に経過観察して再発を早期に診断し、後療法を追加すれば予後が改善できる可能性がある。しかし、病理組織学的に低異型度で最もありふれた組織型である淡明細胞型ＲＣＣに属しながら急速に遠隔転移を来す症例が経験され、既存の臨床病理学的因子等による予後予測は困難である。【０００３】
淡明細胞型ＲＣＣは、ＶＨＬ腫瘍抑制遺伝子の不活性化を特徴とすることがよく知られている。また、ＲＣＣの体系的なリシークエンシング及びエクソン解析が、癌ゲノムアトラス計画、癌ゲノムプロジェクト及び他の国際的取り組みにおいて、実施されている。そして、このような取り組みによって、腎細胞癌発生には、ヒストンＨ３リジン３６メチルトランスフェラーゼであるＳＥＴＤ２、ヒストンＨ３リジン４デメチラーゼであるＪＡＲＩＤ１Ｃ（ＫＤＭ５Ｃ）、ヒストンＨ３リジン２７デメチラーゼであるＵＴＸ（ＫＤＭ６Ａ）、ＳＷＩ／ＳＮＦクロマチンリモデリング因子であるＰＢＲＭ１等のヒストン修飾遺伝子の不活性化が寄与していることが明らかになっている（非特許文献１〜３）。さらに、ＲＣＣにおいて、ＮＦ２遺伝子の非同義変異及びＭＬＬ２遺伝子の欠失型変異も報告されている（非特許文献１）。しかしながら、このような遺伝子変異は、前述のＲＣＣにおける臨床経過の差異等（臨床病理学的な多様性）を完全に説明できるものではない。【０００４】
癌の発生過程において、ジェネティックな事象のみならず、エピジェネティックな事象が認められており、これら双方の事象が、様々な組織において互いに関連しながら臨床病理学的な多様性を招いている。また、ＤＮＡメチル化の変化は、ヒト癌における主要なエピジェネティック変化の一つであると考えられている。【０００５】
実際、ＲＣＣに関し、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、ＣＯＢＲＡ（バイサルファイトと制限酵素との併用による解析）及び細菌人工染色体（ＢＡＣ）アレイに基づくメチル化ＣｐＧアイランド増幅法（ＢＡＭＣＡ法）による解析によって、本発明者らは、ＲＣＣ患者から得た非癌腎皮質組織は、ＤＮＡメチル化状態の変化に関連した前癌段階に既にあることを示している（特許文献１及び非特許文献４〜７）。さらに、ＢＡＭＣＡ法によるゲノムワイドな解析によって、前癌段階にある非癌腎皮質組織のＤＮＡメチル化の変化は、同一患者の対応するＲＣＣに受け継がれていることも明らかにし、ＲＣＣ症例の予後を予測する方法を開発することに成功している（特許文献１及び非特許文献６）。【０００６】
しかしながら、ＢＡＭＣＡ法によるＤＮＡメチル化状態の評価手技は煩雑であり、さらには、かかるＢＡＭＣＡ法によるＲＣＣ症例の予後予測においては、発明当時ＢＡＣクローンでカバーできる染色体領域が極めて限られていたので、真に診断能力の高いメチル化ＣｐＧサイトが同定されていなかった。【０００７】
また、癌におけるＤＮＡメチル化に関し、大腸癌及び胃癌等において、症例の臨床病理学的因子と相関するＣｐＧアイランドのＤＮＡメチル化亢進が蓄積する癌の形質（ＣＩＭＰ）の存在が明らかになっている（非特許文献８〜１１）。【０００８】
しかしながら、腎細胞癌においては、ＣＩＭＰ陽性形質と腎細胞癌との関連は未だ明らかになっていないと考えられている（非特許文献１２）。実際、個々の腫瘍におけるメチル化ＣｐＧの数が、期待されるポアソン分布とは異なる分布を示すという知見に基づき、腎細胞癌の一部はＣＩＭＰを示す可能性が推定されていたものの、腎臓において、ＣＩＭＰ陽性腎細胞がんの存在は確定しておらず、特徴となる明確なＣｐＧサイトは同定されていない（非特許文献１３）。【０００９】
かかる状況から、腎細胞癌においても、ＲＣＣの臨床病理学的因子と強く相関しＣｐＧアイランドにおけるＤＮＡメチル化が蓄積する形質（ＣＩＭＰ）の存在を示し、ＣＩＭＰのマーカーとなるＣｐＧ部位を同定して、簡便かつ極めて感度及び特異性高くＲＣＣの予後を予測することのできる方法が希求されてはいるものの、実用化されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１０−６３４１３号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｄａｌｇｌｉｅｓｈ，Ｇ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０年、４６３巻、３６０〜３６３ページ
【非特許文献２】ｖａｎ  Ｈａａｆｔｅｎ，Ｇ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２００９年、４１巻、５２１〜５２３ページ
【非特許文献３】Ｖａｒｅｌａ，Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１１年、４６９巻、５３９〜５４２ページ
【非特許文献４】Ａｒａｉ，Ｅ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００８年、１４巻、５５３１〜５５３９ページ
【非特許文献５】Ａｒａｉ，Ｅ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２００６年、１１９巻、２８８〜２９６ページ
【非特許文献６】Ａｒａｉ，Ｅ．ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２００９年、３０巻、２１４〜２２１ページ
【非特許文献７】Ａｒａｉ，Ｅ．ら、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１１年、７８巻、１〜９ページ
【非特許文献８】Ｉｓｓａ，Ｊ．Ｐ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，、２００４年、４巻、９８８〜９９３ページ
【非特許文献９】Ｔｏｙｏｔａ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９９年、９６巻、８６８１〜８６８６ページ
【非特許文献１０】Ｓｈｅｎ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００７年、１０４巻、１８６５４〜１８６５９ページ
【非特許文献１１】Ｔｏｙｏｔａ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９９年、５９巻、５４３８〜５４４２ページ
【非特許文献１２】Ｍｏｒｒｉｓ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ．、２０１０年、２（９）：５９
【非特許文献１３】ＭｃＲｏｎａｌｄ，Ｆ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ、２００９年、８：３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
簡便かつ極めて感度及び特異性高く、腎細胞癌の予後不良リスクを決定するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、１ＣｐＧ解像度インフィニウムアレイを用い、２９の正常腎皮質組織（Ｃ）サンプル、淡明細胞型腎細胞癌（ｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ＲＣＣ）の患者より得られた１０７の非癌腎皮質組織（Ｎ）サンプル及び１０９の癌組織（Ｔ）サンプルについて、メチローム解析を行った。その結果、ＮサンプルのＤＮＡメチル化レベルは、Ｃサンプルと比較して、４８３０ＣｐＧサイトにおいて既に変化していることが明らかになった。さらに、ＮサンプルにおいてＤＮＡメチル化の変化が生じており、それらの変化がＴサンプルに引き継がれ亢進しているサイト、８０１ＣｐＧサイトを同定し、この８０１ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルに基づき、教師なし階層的クラスタリング解析を行った。その結果、腎細胞癌はクラスターＡ（ｎ＝９０）とクラスターＢ（ｎ＝１４）とに分けられることを見出した。そして、このクラスターＢには、臨床病理学的に悪性度の高い腫瘍が集積しており、またこのクラスターＢに属する患者の無癌生存率（無再発生存率）及び全体的な生存率（全生存率）は、クラスターＡに属する患者のそれらよりも有意に低いことも見出した。すなわち、クラスターＢに属する腎細胞癌は、ＣｐＧアイランドにおけるＤＮＡ高メチル化の蓄積によって特徴付けられ、ＣｐＧアイランドメチル化形質（ＣＩＭＰ）陽性癌であることを明らかにした。【００１４】
さらに、ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６−２遺伝子のＣｐＧサイトにおけるＤＮＡ高メチル化は、腎細胞癌におけるＣＩＭＰの特徴であることも初めて見出した。【００１５】
なお、特許文献１及び非特許文献６に示す、ＤＮＡメチル化の有無を調べることによって、腎細胞癌の予後予測に有効であると同定された腎細胞癌関連領域（７０のＢＡＣクローン）には、今回同定された１７遺伝子のＣｐＧサイトは一つも含まれていなかった。【００１６】
また、これら１７遺伝子のＣｐＧサイトにおける高メチル化状態は、インフィニウムアレイを用いた解析以外の方法（パイロシークエンシング法及び質量分析計を用いたＤＮＡメチル化解析法）においても検出できることも確認し、本発明を完成するに至った。本発明は、より詳しくは、以下のものである。
＜１＞  下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、腎細胞癌の予後不良リスクを検出する方法
（ａ）被験体の腎臓組織由来のゲノムＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡについて、ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６−２からなる遺伝子群から選択される遺伝子の少なくとも一のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で検出したＤＮＡメチル化レベルから、前記被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定する工程、
を含む方法。
＜２＞  工程（ｂ）が、工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡをバイサルファイト処理し、前記ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出する工程である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞  ＜１＞又は＜２＞に記載の方法に用いるための、少なくとも１２塩基の鎖長を有する、下記（ａ）〜（ｂ）に記載のいずれかであるオリゴヌクレオチド
（ａ）前記遺伝子群から選択される遺伝子の少なくとも一のＣｐＧサイトを挟み込むように設計された一対のプライマーであるオリゴヌクレオチド
（ｂ）前記遺伝子群から選択される遺伝子の少なくとも一のＣｐＧサイトを含むヌクレオチドにハイブリダイズするプライマー又はプローブであるオリゴヌクレオチド。
【発明の効果】
【００１７】
腎細胞癌の予後不良リスクを、簡便かつ極めて感度及び特異性高く決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】淡明細胞型腎細胞癌患者に由来する、非癌腎皮質組織（Ｎ）と腫瘍性組織（Ｔ）との組織学的差異を示す顕微鏡写真である。すなわち、Ｎは主に近位尿細管からなる。一方、Ｔには胞状構造が認められ、また、腫瘍細胞の細胞質は脂質及びグリコーゲンにて充満されており、はっきりとした細胞膜にて囲まれている。さらに、腫瘍細胞の核は、円形状をとる傾向にあり、細かい顆粒状の均一に分散されたクロマチンを伴っていることを示す顕微鏡写真である。
【図２】ＺＦＰ４２遺伝子のＣｐＧサイトに関し、インフィニウムアッセイによって検出されたＤＮＡメチル化レベル（β値）と、パイロシークエンシングによって検出されたＤＮＡメチル化レベルとの相関を示すグラフである。
【図３】ＺＦＰ１５４遺伝子のＣｐＧサイトに関し、インフィニウムアッセイによって検出されたＤＮＡメチル化レベル（β値）と、パイロシークエンシングによって検出されたＤＮＡメチル化レベルとの相関を示すグラフである。
【図４】ＺＦＦ５４０遺伝子のＣｐＧサイトに関し、インフィニウムアッセイによって検出されたＤＮＡメチル化レベル（β値）と、パイロシークエンシングによって検出されたＤＮＡメチル化レベルとの相関を示すグラフである。
【図５】淡明細胞型腎細胞癌の患者１０４人の８０１プローブ（ＣｐＧサイト）における癌組織（Ｔ）と非癌組織（Ｎ）とのＤＮＡメチル化レベルの差（ΔβＴ−Ｎ）を、教師なし階層的クラスタリングすることによって、クラスターＡ（ｎ＝９０）及びクラスターＢ（ｎ＝１４）にサブクラスター化できたことを示す図である。なお、前記８０１プローブにおけるＤＮＡメチル化は、前癌段階にて変化が生じており、引き続き腎細胞の癌化に寄与していることが考えられる。
【図６】淡明細胞型腎細胞癌の患者（クラスターＡに属する患者及びクラスターＢに属する患者）に関し、術後の無再発生存率の経時的変化を示すグラフである。
【図７】淡明細胞型腎細胞癌の患者（クラスターＡに属する患者及びクラスターＢに属する患者）に関し、術後の全生存率の経時的変化を示すグラフである。
【図８】インフィニウムアッセイの検出対象とした２６４５４個の全てのプローブに対し、淡明細胞型腎細胞癌患者の非癌組織（Ｎサンプル）と該患者の癌組織（Ｔサンプル）とでＤＮＡメチル化レベルの差（ΔβＴ−Ｎの絶対値）が０．１以上認められたプローブの割合を示すグラフである。図中、「全症例」は解析した淡明細胞型腎細胞癌患者全ての結果を示し、「Ａ」は解析した淡明細胞型腎細胞癌患者の内、クラスターＡに属する淡明細胞型腎細胞癌患者を示し、「Ｂ」は解析した淡明細胞型腎細胞癌患者の内、クラスターＢに属する淡明細胞型腎細胞癌患者を示す。バーはＳＤ（標準偏差）を示し、「ＮＳ」は有意差が認められないことを示す（図９〜１２において同じ）。
【図９】インフィニウムアッセイの検出対象とした２６４５４個の全てのプローブに対し、ＮサンプルとＴサンプルとでＤＮＡメチル化レベルの差（ΔβＴ−Ｎの絶対値）が０．２以上認められたプローブの割合を示すグラフである。
【図１０】インフィニウムアッセイの検出対象とした２６４５４個の全てのプローブに対し、ＮサンプルとＴサンプルとでＤＮＡメチル化レベルの差（ΔβＴ−Ｎの絶対値）が０．３以上認められたプローブの割合を示すグラフである。
【図１１】インフィニウムアッセイの検出対象とした２６４５４個の全てのプローブに対し、ＮサンプルとＴサンプルとでＤＮＡメチル化レベルの差（ΔβＴ−Ｎの絶対値）が０．４以上認められたプローブの割合を示すグラフである。
【図１２】インフィニウムアッセイの検出対象とした２６４５４個の全てのプローブに対し、ＮサンプルとＴサンプルとでＤＮＡメチル化レベルの差（ΔβＴ−Ｎの絶対値）が０．５以上認められたプローブの割合を示すグラフである。
【図１３】クラスターＡに属する代表的な淡明細胞型腎細胞癌患者（ケース１〜４）に関し、腎細胞癌組織（Ｔサンプル）におけるＤＮＡメチル化レベル（β値）と、非癌腎組織（Ｎサンプル）のそれらとの対応付けを行った結果を示す、散布図である。
【図１４】クラスターＢに属する代表的な淡明細胞型腎細胞癌患者（ケース５〜８）に関し、腎細胞癌組織（Ｔサンプル）におけるＤＮＡメチル化レベル（β値）と、非癌腎組織（Ｎサンプル）のそれらとの対応付けを行った結果を示す、散布図である。図中の丸で囲んでいる部分は、ＤＮＡメチル化レベルがＮサンプルにおいて低く、ＤＮＡ高メチル化の程度が対応するＮサンプルと比較してＴサンプルの方が顕著であるプローブの分布を示す。
【図１５】表１４に示す、ＣｐＧアイランドメチル化形質（ＣＩＭＰ）の特徴となる１６プローブ（１６ＣｐＧサイト）のＤＮＡメチル化レベルと、前記クラスターＡ又はクラスターＢに属する淡明細胞型腎細胞癌患者との対応を示す図である。図中、黒く塗りつぶされた箇所は、ΔβＴ−Ｎが０，４を超えていることを示す。
【図１６】クラスターＡとクラスターＢとの間で顕著にＤＮＡメチル化レベル（ΔβＴ−Ｎ）が異なっていた８６９プローブ（ＦＤＲ［ｑ＝０．０１］）を用い、ランダムフォレスト解析を行った結果を示すグラフである。図中、折れ線は上から順に、スパム（３）、アウトオブバッグ（ＯＯＢ）、ノンスパム（１）を示す。横軸は木（ｔｒｅｅ）の数を示し、縦軸は推測誤差（Ｅｒｒｏｒ）を示す。
【図１７】クラスターＡとクラスターＢとの間で顕著にＤＮＡメチル化レベル（ΔβＴ−Ｎ）が異なっていた８６９プローブ（ＦＤＲ［ｑ＝０．０１］）を用い、ランダムフォレスト解析を行った結果を示すプロット図である。図中、横軸はＧｉｎｉ係数の平均値（ＭｅａｎＤｅｃｒｅａｓｅＧｉｎｉ）を示し、縦軸はインフィニウムアッセイに用いたプローブ（ＣｐＧサイト）を示す。
【図１８】クラスターＡ又はクラスターＢに属する淡明細胞型腎細胞癌患者におけるＳＬＣ１３Ａ５遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるＤＮＡメチル化レベルを、ＭａｓｓＡＲＲＡＹによって解析した結果を示すグラフである。なお図中、ＳＬＣ１３Ａ５＿１０「ＣｐＧ＿４０」は、インフィニウムアッセイによってもクラスターＢにおいて高いＤＮＡメチル化レベルが検出されたＣｐＧサイト（プローブＩＤ：ｃｇ２２０４０６２７、ＮＣＢＩデータベース  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｕｉｌｄ  ３７上の位置：１７番染色体６６１７０３０）である。
【図１９】クラスターＡ又はクラスターＢに属する淡明細胞型腎細胞癌患者におけるＲＩＭＳ４遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるＤＮＡメチル化レベルを、ＭａｓｓＡＲＲＡＹによって解析した結果を示すグラフである。
【図２０】クラスターＡ又はクラスターＢに属する淡明細胞型腎細胞癌患者におけるＰＣＤＨＡＣ１遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるＤＮＡメチル化レベルを、ＭａｓｓＡＲＲＡＹによって解析した結果を示すグラフである。
【図２１】クラスターＡ又はクラスターＢに属する淡明細胞型腎細胞癌患者におけるＺＮＦ５４０遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるＤＮＡメチル化レベルを、ＭａｓｓＡＲＲＡＹによって解析した結果を示すグラフである。
【図２２】クラスターＡ又はクラスターＢに属する淡明細胞型腎細胞癌患者におけるＴＲＨ遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるＤＮＡメチル化レベルを、ＭａｓｓＡＲＲＡＹによって解析した結果を示すグラフである。
【図２３】クラスターＡ又はクラスターＢに属する淡明細胞型腎細胞癌患者におけるＰＲＡＣ遺伝子のＣｐＧアイランドにおけるＤＮＡメチル化レベルを、ＭａｓｓＡＲＲＡＹによって解析した結果を示すグラフである。
【図２４】カットオフ値（診断閾値）を満たすＣｐＧサイトの数によって、クラスターＡ又はクラスターＢに淡明細胞型腎細胞癌患者を分別した結果を示すグラフである。カットオフ値については表１９〜２７を参照のこと。また、この分別において指標としたＣｐＧサイトは、表１９〜２７に記載のＡＵＣが０．９５より大きいＣｐＧサイト２３箇所（３２のＣｐＧサイト）である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、腎細胞癌の予後不良リスクを検出する方法を提供する。
（ａ）被験体の腎臓組織由来のゲノムＤＮＡを調製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡについて、ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６−２からなる遺伝子群から選択される遺伝子の少なくとも一のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で検出したＤＮＡメチル化レベルから、前記被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定する工程、
を含む方法。
【００２０】
本発明において「腎細胞癌」とは、腎臓の尿細管上皮細胞が癌化したものであり、その病理学的特徴から、淡明細胞型、顆粒細胞型、色素嫌性型、紡錘型、嚢胞随伴型、嚢胞由来型、嚢胞性型、乳頭状型に分類される癌である。また、本発明にかかる「被験体」としては、例えば、腎摘出術等によって腎細胞癌の治療が施された患者が挙げられる。
【００２１】
本発明にかかる「腎細胞癌の予後不良リスク」とは、例えば、被験体の予後（腎摘出術等）の生存率が低いことが挙げられ、より具体的には、後述の図６に示すように、術後５００日経過後の無再発生存率（無癌生存率）が５０％以下となることが挙げられ、後述の図７に示すように術後１５００日経過後の全生存率（全体的な生存率）が７０％以下となることが挙げられる。
【００２２】
本発明において「ＣｐＧサイト」とは、シトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との間がホスホジエステル結合（ｐ）している部位のことを意味し、「ＤＮＡメチル化」とは前記ＣｐＧサイトにおいて、シトシンの５位の炭素がメチル化されている状態のことを意味する。「ＤＮＡメチル化レベル」とは、検出の対象とする特定のＣｐＧサイトにおいてメチル化されている割合を意味し、例えば、検出の対象とする特定のＣｐＧサイトにおける、全シトシン数（メチル化シトシン及び非メチル化シトシン）に対するメチル化シトシン数の比率にて表わすことができる。
【００２３】
本発明にかかる「腎臓組織由来のゲノムＤＮＡの調製」は特に制限はなく、フェノールクロロホルム処理法等の公知の手法を適宜選択して用いることより、行うことができる。
【００２４】
かかる方法によりゲノムＤＮＡが調製される腎臓組織としては、例えば、腎摘出術等において採取したそのままの腎臓組織、腎摘出術等において採取した後凍結した腎臓組織、腎摘出術等に際して採取した後ホルマリン固定及びパラフィン包埋を施した腎臓組織が挙げられる。これらの腎臓組織においては、本発明の検出方法に供するまで、腎臓組織中のゲノムＤＮＡの分解等を抑制し、また後述のＤＮＡメチル化レベルを検出する工程において、より効率良くバイサルファイト処理、ＰＣＲ等を行えるという観点から、凍結した腎臓組織を用いることが望ましい。
【００２５】
また、後述の実施例において示す通り、本発明者らは、インフィニウムアッセイにより、１７遺伝子（ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６−２）の１８ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを検出することによって、予後不良の腎細胞癌（ＣＩＭＰ陽性腎細胞癌）と比較的良好な腎細胞癌とを明確に判別できることを明らかにしている。さらに、質量分析計を用いたＤＮＡメチル化解析法によって、かかるＣｐＧサイトを含むＣｐＧアイランド全域においても、予後不良の腎細胞癌において高メチル化状態が続いていることを明らかにしている。
【００２６】
従って、本発明にかかる「ＣｐＧサイト」とは、他の遺伝子よりも、前記１７遺伝子群の少なくとも１の遺伝子に近い位置に存在するＣｐＧサイトを意味し、好ましくは、他の遺伝子よりも前記遺伝子に近い位置に存在するＣｐＧアイランド中の少なくとも１のＣｐＧサイトであり、より好ましくは、前記１７遺伝子群のプロモーター領域に位置する少なくとも１のＣｐＧサイトであり、特に好ましくは、基準ヒトゲノム配列である、ＮＣＢＩデータベース  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｕｉｌｄ  ３７上の位置が、表１〜４に記載の染色体番号及び染色体上の位置である少なくとも１のＣｐＧサイトである。
【００２７】
【表１】
2013168644.tif 000002
【００２８】
【表２】
2013168644.tif 000003
【００２９】
【表３】
2013168644.tif 000004
【００３０】
【表４】
2013168644.tif 000005
【００３１】
また、本発明において典型的には、ＦＡＭ１５０ＡはＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿９９７２９６で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＧＲＭ６はＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿０００８３４で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＺＮＦ５４０はＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿６８９８１９で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＺＦＰ４２はＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿７７７５６０で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＺＮＦ１５４はＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００１０７８８５３で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＲＩＭＳ４はＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿８９２０１５で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＰＣＤＨＡＣ１はＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿０６１７２１で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＫＨＤＲＢＳ２はＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿６８９９０１で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＡＳＣＬ２はＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００５１６１で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＫＣＮＱ１はＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿０００２０９で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＰＲＡＣはＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿１１５７６７で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＷＮＴ３ＡはＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿１４９１２２で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＴＲＨはＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００９０４８で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＦＡＭ７８ＡはＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿２０３７４５で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＺＮＦ６７１はＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿０７９１０９で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＳＬＣ１３Ａ５はＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿８０８２１８で特定されるタンパク質をコードする遺伝子であり、ＮＫＸ６−２はＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿７９６３７４で特定されるタンパク質をコードする遺伝子である。
【００３２】
本発明における、「ＤＮＡメチル化レベルを検出する方法」としては、特定のＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを定量できる方法であればよく、公知の方法を適宜選択して行うことができる。かかる公知の方法としては、例えば以下に示す第一〜第七の方法が挙げられる。
【００３３】
第一の方法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡに重亜硫酸塩（バイサルファイト）処理を施す。なお、このバイサルファイト処理によって、非メチル化シトシン残基はウラシルに変換されるが、メチル化シトシン残基は変換されない（Ｃｌａｒｋ  ＳＪら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１９９４年、２２巻、２９９０〜７ページ  参照）。次いで、このようにバイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型として、全ゲノム増幅を行い、酵素による断片化（通常３００〜６００ｂｐ程度の断片化）を行い、一本鎖に解離させる。
【００３４】
また第一の方法において、バイサルファイト処理によって変換されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズするプローブであって、該プローブの３’末端の塩基は、前記ＣｐＧサイトのシトシンに相補的な塩基となっているプローブを調製する。すなわち、該ＣｐＧサイトがメチル化されている場合には、プローブの３’末端の塩基はグアニンとなり、該ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合には、プローブの３’末端の塩基はアデニンとなる。
【００３５】
そして、このような前記ＣｐＧサイトに相補的な３’末端の塩基のみ異なる２種類のプローブと、前記断片化ゲノムＤＮＡとをハイブリダイズさせ、蛍光標識した塩基存在下、１塩基伸長反応を行う。その結果、前記ＣｐＧサイトがメチル化されている場合には、３’末端の塩基がグアニンであるプローブ（メチル化検出用プローブ）に蛍光標識した塩基が取り込まれることになり、一方、前記ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合には、３’末端の塩基がアデニンであるプローブ（非メチル化検出用プローブ）に蛍光標識した塩基が取り込まれることになるため、メチル化検出用プローブ及び／又は非メチル化検出用プローブが発する蛍光の強度からＤＮＡメチル化レベルを算出することができる。
【００３６】
また、かかる第一の方法においては別の態様として、前記メチル化検出用プローブ及び非メチル化検出用プローブの代わりに、バイサルファイト処理によって変換されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズするプローブであって、該プローブの３’末端の塩基は前記ＣｐＧサイトのグアニンに相補的な塩基となっているプローブを用いてもよい。そして、かかるプローブと、前記断片化ゲノムＤＮＡとをハイブリダイズさせ、蛍光物質にて標識したグアニン及び／又は該蛍光物質とは異なる蛍光色素にて標識したアデニンの存在下、１塩基伸長反応を行う。その結果、前記ＣｐＧサイトがメチル化されている場合には、当該プローブに蛍光標識したグアニンが取り込まれることになり、一方、前記ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合には、当該プローブに蛍光標識したアデニンが取り込まれることになるため、前記プローブに取り込まれた各蛍光物質が発する蛍光の強度からＤＮＡメチル化レベルを算出することができる。
【００３７】
第一の方法としては、例えば、ビーズアレイ法（例えば、インフィニウム（登録商標）アッセイ）が挙げられる。
【００３８】
また、かかる第一の方法において、ＤＮＡメチル化レベルの検出対象とする前記ＣｐＧサイトとしては、好ましくは、基準ヒトゲノム配列であるＮＣＢＩデータベース  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｕｉｌｄ  ３７上の位置が、第８染色体５３，４７８，４５４位、第５染色体１７８，４２２，２４４位、第１９染色体３８，０４２，４７２位、第４染色体１８８，９１６，８６７位、第１９染色体５８，２２０，６６２位、第２０染色体４３，４３８，８６５位、第５染色体１４０，３０６，４５８位、第６染色体６２，９９５，９６３位、第１１染色体２，２９２，００４位、第１１染色体２，４６６，４０９位、第１７染色体４６，７９９，６４０位、第１９染色体５８，２２０，４９４位、第１染色体２２８，１９４，４４８位、第３染色体１２９，６９３，６１３位、第９染色体１３４，１５２，５３１位、第１９染色体５８，２３８，９２８位、第１７染色体６，６１７，０３０位及び第１０染色体１３４，５９９，８６０位からなる群から選択される少なくとも１のＣｐＧサイトである。また、本発明にかかる第一の方法においては、前記１８ＣｐＧサイトのうち少なくとも一のサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを検出することが好ましいが、予後不良リスクの検出における、感度又は特異性をより向上させることができるという観点から、複数のＣｐＧサイト（例えば、２サイト、５サイト、１０サイト、１５サイト）をＤＮＡメチル化レベルの検出対象とすることがより好ましく、前記１８ＣｐＧサイト全てをＤＮＡメチル化レベルの検出対象とすることが特に好ましい。
【００３９】
第二の方法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いで、バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記ＣｐＧサイトを少なくとも一つ含むＤＮＡを、Ｔ７プロモーターを付加したプライマーで増幅する。次いで、ＲＮＡに転写し、ＲＮａｓｅにより塩基特異的な切断反応を行う。そして、かかる切断反応産物を質量分析計にかけ、質量測定を行う。
【００４０】
そして、質量測定によって得られたメチル化シトシン残基由来の質量（シトシンの質量）と、非メチル化シトシン残基由来の質量（ウラシルの質量）とを比較し、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。
【００４１】
第二の方法としては、例えば、質量分析計を用いたＤＮＡメチル化解析法（例えば、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）、Ｊｕｒｉｎｋｅ  Ｃら、Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ、２００５年、５７３巻、８３〜９５ページ  参照）が挙げられる。
【００４２】
また、かかる第二の方法において、ＤＮＡメチル化レベルの検出対象とする前記ＣｐＧサイトとして、好ましくは、配列番号：１〜１６に記載の塩基配列に含まれる少なくとも１のＣｐＧサイトであり、予後不良リスクの検出における、感度又は特異性をより向上させることができるという観点から、より好ましくは、後述のＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）が０．９０より大きい、下記表５〜８に記載のＣｐＧサイト群のうちの少なくとも１のＣｐＧサイトであり、さらに好ましくは、下記表５〜８に記載のＡＵＣが０．９５より大きいＣｐＧサイト群のうちの少なくとも１のＣｐＧサイトであり、当該ＡＵＣが０．９５より大きいＣｐＧサイト群全てをＤＮＡメチル化レベルの検出対象とすることが特に好ましい。
【００４３】
【表５】
2013168644.tif 000006
【００４４】
【表６】
2013168644.tif 000007
【００４５】
【表７】
2013168644.tif 000008
【００４６】
【表８】
2013168644.tif 000009
【００４７】
なお、表５〜８に記載の「染色体番号」及び「染色体上の位置」は、基準ヒトゲノム配列である、ＮＣＢＩデータベース  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｕｉｌｄ  ３７上の位置を示す。「標的遺伝子名_プライマーセット名_ＣｐＧサイト」は、後述の質量分析計を用いたＤＮＡメチル化解析（実施例５）にて、表１７及び１８に記載のプライマーセットを用いて増幅したＰＣＲ産物中のＣｐＧサイトの順番を示す。「ＡＵＣ値」、「カットオフ値」、「特異度」、「感度」及び「１−特異度」については、後述の実施例５参照のこと。
【００４８】
第三の方法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。なお、このバイサルファイト処理によって、非メチル化シトシン残基はウラシルに変換されるが、下記伸長反応（シークエンス反応）においてはウラシルはチミンとして示される。次いで、このようにバイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記ＣｐＧサイトを少なくとも一つ含むＤＮＡを増幅する。そして、増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する。そして、前記ＣｐＧサイトの塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する。このようにして得られたメチル化シトシン残基由来の発光の強度（シトシンの発光強度）と、非メチル化シトシン残基由来の発光の強度（チミンの発光強度）とを比較し、例えば、下記式によって前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベル（％）を算出する。
ＤＮＡメチル化レベル（％）＝シトシンの発光強度×１００／（シトシンの発光強度＋チミンの発光強度）。
【００４９】
第三の方法としては、例えば、パイロシークエンシング法（登録商標、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （２０００）１０：１０３−１１０  参照）等が挙げられる。
【００５０】
第四の方法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次に、ＤＮＡ二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーターを含む反応系において、前記バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記ＣｐＧサイトを少なくとも１つ含むヌクレオチドを増幅する。次いで、前記反応系の温度を変化させ、前記インターカレーターが発する蛍光の強度の変動を検出する。前記ＣｐＧサイトを少なくとも１つ含むヌクレオチドの融解曲線を、メチル化・非メチル化対照検体を鋳型とする増幅産物の融解曲線と比較し、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。
【００５１】
第四の方法としては、例えば、メチル化感受性高解像能融解曲線分析（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ：ＭＳ−ＨＲＭ、Ｗｏｊｄａｃｚ  ＴＫら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．、２００８年、３巻、１９０３〜８ページ  参照）が挙げられる。
【００５２】
第五の方法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次に、前記ＣｐＧサイトがメチル化されている場合に増幅可能なプライマーセット、及び前記ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合に増幅可能なプライマーセットを調製する。そして、前記バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記ＣｐＧサイトを少なくとも１つ含むヌクレオチドを、これらのプライマーセットを用いて各々増幅する。そして、得られた増幅産物の量、すなわちメチル化ＣｐＧサイト特異的な増幅産物の量、及び非メチル化ＣｐＧサイト特異的な増幅産物の量を比較することにより、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。
【００５３】
さらに、かかる第五の方法においては別の態様として、先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次に、前記ＣｐＧサイトがメチル化されている場合にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドを有し、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。また、前記ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドを有し、前記レポーター蛍光色素とは異なるレポーター蛍光色、及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。そして、バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡに前記オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、さらに前記オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズしたゲノムＤＮＡを鋳型として前記ＣｐＧサイトを含むヌクレオチドを増幅する。そして、前記増幅に伴うオリゴヌクレオチドプローブの分解により、前記レポーター蛍光色素が発する蛍光を検出する。このようにして検出されたメチル化シトシンＣｐＧサイト特異的なレポーター蛍光色素が発する蛍光の強度と、非メチル化シトシンＣｐＧサイト特異的なレポーター蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較することによって、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。
【００５４】
第五の方法としては、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）を用いたＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ法等のメチル化特異的定量ＰＣＲ法（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＭＳ−ＰＣＲ）  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ）が挙げられる。
【００５５】
第六の方法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いで、バイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイトを含むヌクレオチドを鋳型として、直接シークエンシング反応を行う。そして、決定された塩基配列に基づく蛍光強度、すなわちメチル化シトシン残基由来の蛍光強度（シトシンの蛍光強度）と、非メチル化シトシン残基由来の蛍光強度（チミンの蛍光強度）とを比較することによって、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。
【００５６】
さらに、かかる第六の方法においては別の態様として、先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いで、バイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイトを含むヌクレオチドをＰＣＲ反応等によってクローンニングする。そして、得られた複数のクローンニング産物の塩基配列を各々決定し、メチル化シトシンＣｐＧサイト特異的な塩基配列を有するクローニング産物の個数と、非メチル化シトシンＣｐＧサイト特異的な塩基配列を有するクローニング産物の個数とを比較することによって、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを算出する。
【００５７】
第六の方法としては、例えば、バイサルファイト直接シークエンシング（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、バイサルファイトクローニングシークエンシング（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）が挙げられる（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＬＳら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、２００９年、５５巻、１４７１〜８３ページ  参照）。
【００５８】
第七の方法は、次の原理に基づく方法である。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いで、バイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイトを含むヌクレオチドを鋳型として、前記ＣｐＧサイトを含む領域をＰＣＲにて増幅する。次いで、増幅したＤＮＡ断片を、該ＣｐＧサイトがメチル化されている場合とされていない場合とで配列が異なる箇所を認識する制限酵素で処理する。そして、電気泳動することによって分画された、メチル化ＣｐＧサイトに由来する制限酵素断片と非メチル化ＣｐＧサイトに由来する制限酵素断片とのバンドの濃さを定量的に解析することにより、該ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを算出することができる。
【００５９】
第七の方法としては、例えば、ＣＯＢＲＡ（バイサルファイトと制限酵素との併用による解析）が挙げられる。
【００６０】
以上、本発明の「ＤＮＡメチル化レベルを検出する方法」として好適に用いることのできる方法を例示したが、本発明はこれに限定されるものではない。また上述の通り、ＤＮＡメチル化レベルを検出するに際し、被験体から調製されたゲノムＤＮＡは、さらにバイサルファイト処理に供される。従って、本発明の腎細胞癌の予後不良リスクを検出する方法として、前記工程（ｂ）が、前記工程（ａ）で調製したゲノムＤＮＡをバイサルファイト処理し、前記ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出する工程である方法もとり得る。
【００６１】
本発明において、工程（ｂ）で検出したＤＮＡメチル化レベルから、前記被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するための指標は、当業者であれば適宜ＤＮＡメチル化レベルを検出する方法に合わせて設定することができる。例えば後述の実施例に示すような、各ＣｐＧサイトに対し、受信者操作特性（ＲＯＣ）解析を行い、感度（陽性率）及び特異度を求め、さらに感度及び特異度の和が最大となるＤＮＡメチル化レベルを前記指標（カットオフ値、診断閾値）として設定することができ、検出したＤＮＡメチル化レベルが該カットオフ値より高ければ、その被験体を予後不良群に分類することができる。
【００６２】
また本発明においては、腎細胞癌の予後不良リスクの検出における、感度又は特異性をより向上させることができるという観点から、ＤＮＡメチル化レベルのみならず、前記カットオフ値より高値を示すＣｐＧサイトの数を、前記被験体が予後不良群に分類されるか否かを決定するための指標としてもよい。例えば、後述の実施例において示すように、本発明にかかるＣｐＧサイト２３箇所において、前記カットオフ値を満たす箇所が１５以上である場合にその被験体を予後不良群に分類することができる（後述の図２４  参照）。
【００６３】
このように、本発明によれば、組織学的観察等の既存の分類基準では検知し得ない、腎摘除術後の腎細胞癌の予後不良リスクを判定することができる。腎細胞癌の治療方法としては腎摘除術が第一選択であるが、転移・再発を早期に発見できれば、それらに対して免疫療法や分子標的治療薬等の奏効が期待できる。
【００６４】
従って、本発明は、本発明の方法により予後不良群に分類された被験体に、分子標的治療薬を投与する工程及び／又は免疫療法を施す工程を含む、腎細胞癌の治療方法を提供することもできる。
【００６５】
また、本発明により腎摘除術の対象となる大多数の腎細胞癌症例において、予後不良群に分類された患者にはより精密な転移・再発スクリーニングを行い、その場合には早期発見により治療成績を向上させ得ると期待され、一方で、予後不良群には分類されなかった患者では転移・再発スクリーニングの負担を軽減させることができる。
【００６６】
本発明は、腎細胞癌の予後不良リスクを検出する方法に用いるための、少なくとも１２塩基の鎖長を有する、下記（ａ）〜（ｂ）に記載のいずれかであるオリゴヌクレオチドを提供する
（ａ）前記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトを挟み込むように設計された一対のプライマーであるオリゴヌクレオチド
（ｂ）前記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトを含むヌクレオチドにハイブリダイズするプライマー又はプローブであるオリゴヌクレオチド。
【００６７】
かかる（ａ）前記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトを挟み込むように設計された一対のプライマーとしては、例えば、バイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトを含むＤＮＡを増幅することができるプライマー（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー（フォワードプライマー及びリバースプライマー））が挙げられる。当該プライマーは、前記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトの両側のバイサルファイト変換された各ヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーである。
【００６８】
また、（ｂ）前記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトを含むヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーとしては、例えばバイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイトの塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行うことができるプライマー（シークエンシングプライマー）が挙げられる。さらに、（ｂ）前記ＣｐＧサイト群から選択される少なくとも１つのサイトを含むヌクレオチドにハイブリダイズするプローブとしては、例えばバイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイトを含むヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ（いわゆるＴａｑＭａｎプローブ）が挙げられる。
【００６９】
また、本発明のオリゴヌクレオチドの鎖長は少なくとも１２塩基であるが、好ましくは少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも２０塩基である。
【００７０】
特定のヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、当該特定のヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するが、ハイブリダイズする限り完全に相補的でなくともよい。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、バイサルファイト変換された又はされていない前記ＣｐＧサイトを含む塩基配列に基づき、当業者であれば公知の手法により、例えば、後述の実施例に示すように、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法プライマーデザインソフトウエア  ＥｐｉＤｅｓｉｇｎｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｃｏｍ、ＳＥＱＵＥＮＯＭ社製）、パイロシークエンシングアッセイデザインソフトウェアｖｅｒ．１．０（ＱＩＡＧＥＮ社製）等を用いて、適宜設計することができる。また、本発明にかかる「ＣｐＧサイトを含む」とは、ＣｐＧサイト全部、すなわちシトシン及びグアニン両方を含むことのみならず、その一部（シトシン、グアニン、又は非メチル化シトシンがバイサルファイト変換された後のウラシル若しくはチミン）を含むものであってもよい。
【００７１】
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、後述の実施例に示すように、質量分析計を用いたＤＮＡメチル化解析法においては、配列番号：１７〜４８に記載の塩基配列からなる群より選択されるプライマーが好ましい（表１７及び表１８  参照）。また、後述の実施例に示すように、パイロシークエンシングにおいて、本発明のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号：４９〜５７に記載の塩基配列からなる群より選択されるプライマーが好ましい（表９  参照）。
【００７２】
さらに、本発明は、前記オリゴヌクレオチドを含む、腎細胞癌の予後不良リスクを検出する方法に用いるためのキットも提供することができる。
【００７３】
前記オリゴヌクレオチドの標品において、前記オリゴヌクレオチドは、必要に応じて固定化されていてもよい。例えば、インフィニウムアッセイによって検出する場合は、ビーズに固定されたプローブを用いることができる。また前記オリゴヌクレオチドは、必要に応じて標識されていてもよい。例えば、パイロシークエンシング法によって検出する場合は、ビオチン標識したプライマーを用いることができ、ＴａｑＭａｎプローブ法によって検出する場合は、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素を標識したプローブを用いることができる。
【００７４】
本発明のキットにおいては、前記オリゴヌクレオチドの標品以外の標品を含むことができる。このような標品としては、バイサルファイト変換に必要な試薬（例えば、亜硫酸水素ナトリウム溶液等）、ＰＣＲ反応に必要な試薬（例えば、デオキシリボヌクレオチドや耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等）、インフィニウムアッセイに必要な試薬（例えば、蛍光物質にて標識されたヌクレオチド）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹに必要な試薬（例えば、塩基特異的な切断反応を行うためのＲＮａｓｅ）、パイロシークエンシングに必要な試薬（例えば、ピロリン酸の検出のためのＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン−５’−ホスホ硫酸、ルシフェラーゼ、及びルシフェリンや、一本鎖ＤＮＡを分離するためのストレプトアビジン等）、ＭＳ−ＨＲＭ法に必要な試薬（例えば、ＤＮＡ二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーター等）が挙げられる。また、前記標識の検出に必要な試薬（例えば、基質や酵素、陽性対照や陰性対照、あるいは試料（被験体の腎臓臓組織由来のゲノムＤＮＡ等）の希釈や洗浄に用いる緩衝液等）が挙げられる。また、キットには、その使用説明書を含めることができる。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、実施例において用いた試料及び方法は下記に示す通りである。【００７６】
＜患者及び組織サンプル＞
１０９の癌組織（Ｔ）サンプル及び対応する１０７の非癌腎皮質組織（Ｎ）サンプルは、原発性の淡明細胞型腎明細癌を罹患している１１０人の患者から手術によって摘出された試料から得たものであり、Ｎサンプルには顕著な組織学的変化は認められていない。【００７７】
なお、これら患者は、術前の治療は受けておらず、国立がん研究センター病院にて腎摘出術を受けた患者である。７９名の男性と３１名の女性とからなり、平均年齢は６２．８±１０．３歳（平均±標準偏差、３６〜８５歳）である。【００７８】
また、サンプルの組織学的診断は、ＷＨＯの分類に従って行った（Ｅｂｌｅ，Ｊ．Ｎ．ら、「腎細胞癌  腫瘍ＷＨＯ分類  病理学及び遺伝学  男性生殖器及び泌尿系の腫瘍」、２００４年、ＩＡＲＣ出版、Ｌｙｏｎ、１０〜４３ページ、図１  参照）。【００７９】
さらに、全ての腫瘍の組織学的異型度は「Ｆｕｈｒｍａｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９８２年、６巻、６５５〜６６３ページ」に記載の基準に従って評価し、ＴＮＭ分類は「Ｓｏｂｉｎ，Ｌ．Ｈ．ら、国際対がん連合（ＵＩＣＣ）、ＴＮＭ悪性腫瘍の分類、第６版、２００２年、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９３〜１９５ページ」に従って分類した。【００８０】
また、腎細胞癌の肉眼分類の基準として、肝細胞癌（ＨＣＣ）において確立された基準を採用した（非特許文献４〜６  参照）。なお、タイプ３（多結節癒合型）ＨＣＣは、タイプ１（単結節型）及びタイプ２（単結節周囲増殖型）のＨＣＣよりも、組織学的分化度は低く、肝内転移の発生率は高い（Ｋａｎａｉ，Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ、１９８７年、６０巻、８１０〜８１９ページ  参照）。【００８１】
血管侵襲の有無は、へマトキシリン−エオジン及びエラスチカ・ワン・ギーソン染色を施したスライドを顕微鏡にて観察することによって調べた。【００８２】
腎静脈の本幹における腫瘍血栓の有無は肉眼的観察によって調べた。なお、腎細胞癌は通常線維性被膜に囲まれ、その境界が明瞭となっている。また、腎細胞癌の癌細胞間に線維性間質は殆ど含まれていない。そのため、非癌上皮細胞や間質細胞を混在させることなく、外科試料から癌細胞を得ることができた。【００８３】
また、前記ＲＣＣ患者と比較するため、原発性腎腫瘍を罹患していない患者２９人から手術によって摘出された試料から、正常腎皮質組織（Ｃ１〜Ｃ２９）２９サンプルを得た。サンプルを得た原発性腎腫瘍を罹患していない患者は、１８名の男性と１１名の女性とからなり、平均年齢は６１．４±１０．８歳（平均±標準偏差、３１〜８１歳）である。また、これら患者のうち２２人は、腎盂における尿路上皮癌のため腎摘出術を受けた患者であり、６人は腎臓周囲の後腹膜肉腫の切除と共に腎摘出術を受けた患者である。残り１名は、転移性胚細胞腫瘍のため大動脈周囲リンパ節摘出術を受けた患者であり、腎動脈を維持することが難しかったため、同時に腎摘出術も施された。【００８４】
今回の研究対象である全ての患者からは、書面によるインフォームドコンセントを得ている。また、本研究は、国立がん研究センターの倫理委員会の承認を受けて実施されたものである。【００８５】
＜インフィニウムアッセイ＞
前記患者から得た新鮮凍結組織サンプルを、フェノール−クロロホルムにて処理し、次いで透析を施すことによって、高分子量ＤＮＡを抽出した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、モレキュラークローニング：実験マニュアル  第３版、コールドスプリングハーバー出版、ＮＹ、６．１４〜６．１５ページ  参照）。【００８６】
そして、ＤＮＡ５００ｎｇを、ＥＺ  ＤＮＡメチレーション−ゴールド（ＴＭ）キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、バイサルファイト変換処理に供した。【００８７】
次いで、２７５７８ＣｐＧ部位におけるＤＮＡメチル化状態を、インフィニウムヒトメチレーション２７ビーズアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用い、１ＣｐＧサイトの解像度にて解析した。このアレイには、ＮＣＢＩデータベースに登録されている１４４７５遺伝子（コンセンサスコーディング配列）の転写開始部位における近位プロモーター領域内に位置するＣｐＧサイトが含まれている。また、平均して、１遺伝子あたり２つのサイトが選択され、さらに２００以上の癌関連遺伝子及びインプリンティング遺伝子については１遺伝子あたり３〜２０のＣｐＧサイトが選択され、このアレイには搭載されている。また、各アレイには４０のコントロールプローブが搭載されている。このコントロールプローブには、染色、ハイブリダイゼーション、伸長及びバイサルファイト変換のコントロール並びにネガティブコントロールが含まれている。【００８８】
なお、前記バイサルファイト変換したＤＮＡを自動的に処理するため、Ｅｖｏロボット（Ｔｅｃａｎ社製）を用いた。また、インフィニウムアッセイキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、全ゲノム増幅処理を行った（Ｂｉｂｉｋｏｖａ，Ｍ．ら、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ、２００９年、１巻、１７７〜２００ページ  参照）。【００８９】
そして、このようにして増幅したＤＮＡ断片と、前記アレイ上のプローブとをハイブリダイズした後、特異的にハイブリダイズしたＤＮＡを１塩基伸長反応にて蛍光標識した。次いで、製造会社のプロトコールに従って、ビーズスキャンリーダー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用い、当該ＤＮＡを検出した。得られたデータは、ゲノムスタジオメチレーションソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、解析した。【００９０】
なお、各ＣｐＧサイトにおいて、蛍光シグナルの比率は、メチル化プローブ及び非メチル化プローブの合計に対するメチル化プローブの相対比を用い測定した。すなわち、所謂β値（範囲：０．００〜１．００）はＣｐＧサイト個々におけるメチル化レベルを反映するものである。【００９１】
＜統計解析＞
前記インフィニウムアッセイにおいて、解析した組織サンプル全てに対し、コール率（ｃａｌｌ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ、バックグランド以上のシグナルの検出におけるＰ値＜０．０１）が９０％以下であったプローブは３２個あった。このような低いコール率はプロープのＣｐＧサイトにおける多型に起因しているかもしれないため、本アッセイにおいてはこれら３２プローブを除外した。さらに、性特異的なメチル化のバイアスを回避するために、Ｘ染色体及びＹ染色体における全てのＣｐＧサイトは除外した。その結果、常染色体上のＣｐＧサイト２６４５４が最終的な解析対象として残った。【００９２】
ロジスティックモデルにより、２９のＣサンプルと１０７のＮサンプルとの間で、ＤＮＡメチル化レベルの有意な差を示すインフィニウムプローブを同定した。【００９３】
累積ロジットモデルにより、２９のＣサンプル、１０７のＮサンプル及び１０９のＴサンプルにおいて、Ｃサンプル、Ｎサンプル、Ｔサンプルと、ＤＮＡメチル化レベルが段階的に変化する（Ｏｒｄｅｒｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）プローブを同定した。【００９４】
１の患者由来の、Ｎサンプルと対応するＴサンプルとの１０４のペアにおけるＤＮＡメチル化状態の差を、ウィルコクソンの符号付順位和検定により調べた。【００９５】
ｑ＝０．０１の誤検出率（ＦＤＲ）を有意と見なした。【００９６】
ＤＮＡメチル化レベル（ΔβＴ−Ｎ）に基づき、淡明細胞型腎細胞癌の患者について教師なし階層的クラスタリング（ユークリッド距離、ウォード法）を行った。【００９７】
患者のクラスターと臨床病理学的因子との相関は、ウィルコクソンの順位和検定及びフィッシャーの直接確率検定により調べた。【００９８】
各クラスターに属する患者の生存率曲線は、カプラン・マイヤー法により算出した。そして、ログランク検定により差を比較した。【００９９】
各クラスターにおいてＤＮＡ高メチル化又はＤＮＡ低メチル化を示すインフィニウムアッセイプローブの数と、各クラスターにおける平均ＤＮＡメチル化レベル（ΔβＴ−Ｎ）とを、Ｐ＜０．０５を有意水準とするウィルコクソンの順位和検定によって調べた。【０１００】
クラスターを識別できるＣｐＧサイトを、フィッシャーの直接確率検定及びランダムフォレスト法により同定した（Ｂｒｅｉｍａｎ，Ｌ．、Ｍａｃｈ．Ｌｅａｒｎ．、２００１年、４５巻、５〜３２ページ  参照）。【０１０１】
（実施例１）
＜腎細胞癌発生におけるＤＮＡメチル化の変化＞
先ず、前記インフィニウムアッセイによって見出された代表的なＣｐＧサイトについて、表９に示す条件にてパイロシークエンシング法を行うことにより確認した。その結果、図２〜４に示す通り、各ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルに関し、定量性の高いパイロシークエンシング法による解析結果（図２〜４の縦軸）と、インフィニウムアッセイによる解析結果（図２〜４の横軸）との間には強い相関があった。【０１０２】
【表９】
2013168644.tif 000010
【０１０３】
このように、今回のインフィニウムアッセイのデータは信頼性の高いものであることが確認された。【０１０４】
腎臓の前癌状態については、今まで殆ど論じられていない。しかしながら、本発明者らによって、非癌組織は、組織学的な顕著な変化は認められず、慢性炎症及びウィルスや病原性微生物の持続感染との関連も認められないものの、ＤＮＡメチル化が変化しているという観点から既に前癌段階にあるということが示唆されている（特許文献１及び非特許文献４〜７）。【０１０５】
この点に関し、今回のインフィニウムアッセイの結果を、ロジスティックモデルによって解析した結果、４８３０のプローブにおいて、ＮサンプルのＤＮＡメチル化レベルは、Ｃサンプルのそれらと比較して既に変化していることが明らかになった（ＦＤＲ  ｑ＝０．０１，表１０の（ａ）  参照）。【０１０６】
さらに、ＤＮＡメチル化の変化が腎細胞癌自体に受け継がれていることを明らかにするため、累積ロジットモデルにより、Ｃサンプル、Ｎサンプル、Ｔサンプルと、ＤＮＡメチル化レベルが段階的に変化するプローブを同定した。その結果、このようにＤＮＡメチル化レベルが段階的に変化するプローブは１１０８９個あった（ＦＤＲ  ｑ＝０．０１，表１０の（ｂ）  参照）。【０１０７】
また、癌化に強く寄与するＤＮＡメチル化の変化を明らかにするため、ＮサンプルとＴサンプルとの１０４のペアを、ウィルコクソンの符号付順位和検定により調べた。その結果、Ｎサンプルと、対応する腎細胞癌との間で有意差が認められたプローブは１０８７０個あった（ＦＤＲ  ｑ＝０．０１，表１０の（ｃ）  参照）。【０１０８】
【表１０】
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【０１０９】
以上の結果から、癌に至る過程にてＤＮＡ低メチル化も観察されたものの、腎細胞癌発生のきわめて初期の段階において、ＤＮＡ高メチル化はしばし生じていることが明らかになった。【０１１０】
また、表１０の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に記載の基準全てを満たす、すなわち、ＤＮＡメチル化が既に非癌段階にて明らかに変化しており、さらにそれらの変化が腎細胞癌に引き継がれ亢進しているプローブを８０１個同定した。【０１１１】
（実施例２）
＜腎細胞癌のエピジェネティッククラスタリング＞
前記８０１プローブにおけるＤＮＡメチル化レベル（ΔβＴ−Ｎ）を用い、教師なし階層的クラスタリングをした結果、淡明細胞型腎細胞癌の患者１０４人を、クラスターＡ（ｎ＝９０）及びクラスターＢ（ｎ＝１４）にサブクラスター化できることが明らかになった（図５  参照）。なお、前述の通り、前記８０１プローブにおけるＤＮＡメチル化は、前癌段階にて変化が生じており、引き続き腎細胞の癌化に寄与していることが考えられる。【０１１２】
次に、これらクラスターＡ及びＢに属する淡明細胞型腎細胞癌における臨床病理学的因子及びＴＮＭステージについて調べた。得られた結果を表１１に示す。【０１１３】
【表１１】
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【０１１４】
なお、表１１の「Ｐ値」において、下線が付してあるものは「Ｐ＜０．０５」であり、（ｂ）が付してある数値は、ウィルコクソンの順位和検定によるものであり、（ｃ）が付してある数値は、フィッシャーの直接確率検定によるものである。また、（ｄ）が付してある臨床病理学的因子については、腫瘍が不均一である場合に、面積的に優勢な領域における所見が示してあり、（ｅ）が付してある臨床病理学的因子については、腫瘍が不均一である場合に、腫瘍において最も侵襲性の高い特徴が示してある。【０１１５】
また、これらクラスターＡ及びＢに属する患者の生存率についても調べた。生存率を分析した期間は４２〜４０２４日間（平均１８２１日間）である。得られた結果（カプラン・マイヤー生存率曲線）を図６及び７に示す。【０１１６】
表１１に示した結果から明らかなように、淡明細胞型腎細胞癌の直径、前述の肉眼分類による、単結節周囲増殖型（タイプ２）又は多結節癒合型（タイプ３）の出現頻度、血管侵襲の頻度、腎静脈における腫瘍血栓形成の頻度、浸潤性増殖の頻度、腫瘍壊死及び腎盂への浸潤の頻度、組織学的異型度並びにＴＮＭ分類による病期、これらの点において、クラスターＢはクラスターＡよりも大きかった（又は高かった）。なお表１１に示す通り、腎細胞癌のエピジェネティッククラスタリングは、患者の性別、年齢によるものではないことは明白である。【０１１７】
また、図６及び７に示した結果から明らかなように、クラスターＢに属する患者の無再発生存率（無癌生存率）及び全生存率（全体的な生存率）は、クラスターＡに属する患者のそれらよりも有意に低かった（無癌生存率のＰ値は４．１６×１０−６であり、全体的な生存率のＰ値は１．３２×１０−２である）。【０１１８】
（実施例３）
＜腎細胞癌のＤＮＡメチル化プロファイル＞
次に、２６４５４個の全てのプローブに対し、対応するＮサンプルよりもＴサンプルにおいてＤＮＡ高メチル化が認められたプローブの割合を、そのＤＮＡ高メチル化の差の程度（ΔβＴ−Ｎ＞０．１、０．２、０．３、０．４又は０．５）毎に分析した。また、２６４５４個の全てのプローブに対し、対応するＴサンプルよりもＮサンプルにおいてＤＮＡ低メチル化が認められたプローブの割合を、そのＤＮＡ低メチル化の差の程度（ΔβＴ−Ｎ＜−０．１、−０．２、−０．３、−０．４又は−０．５）毎に分析した。得られた結果を図８〜１２に示す。【０１１９】
図８〜１２に示した結果から明らかなように、際立ったＤＮＡ低メチル化（ΔβＴ−Ｎ＜−０．５）を示したプローブは、クラスターＡよりもクラスターＢの方が僅かに集積していた。しかしながら、クラスターＡ及びクラスターＢにおいて、ＤＮＡ低メチル化の発生頻度に統計的な有意な差は認められなかった（ΔβＴ−Ｎ＜−０．１、−０．２、−０．３又は−０．４）。一方、ＤＮＡ高メチル化を示したプローブは、ＤＮＡ高メチル化の差の程度に関係なく、クラスターＡよりもクラスターＢの方に顕著に集積していた（ΔβＴ−Ｎ＞０．１、０．２、０．３、０．４又は０．５）。【０１２０】
従って、クラスターＢに属する腎細胞癌はＤＮＡ高メチル化の蓄積によって特徴付けられることが明らかになった。【０１２１】
また、クラスターＡ及びクラスターＢに関し、これらの間でＤＮＡメチル化レベルにおいて顕著な差があった上位６１のプローブを表１２及び１３に示す。なお、表１２及び１３の「ターゲットＩＤ」は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社によって、インフィニウムヒトメチレーション２７ビーズアレイの全プローブに付与された番号を示し、「染色体番号」及び「染色体上の位置」は、基準ヒトゲノム配列である、ＮＣＢＩデータベース  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｕｉｌｄ  ３７上の位置を示す（以下、プローブに関する表に関する標記において同じ）。「ＣｐＧアイランド」の「Ｙ」はそのプローブがＣｐＧアイランドに位置していることを示し、「Ｎ」はそのプローブがＣｐＧアイランドに位置していないことを示す（表１４及び１５においても同じ）。さらに「遺伝子領域」は、そのプローブがエクソン（Ｅｘｏｎ）、イントロン（Ｉｎｔｒｏｎ）又は転写開始部位の上流（ＴＳＳ）に位置していることを示す。さらに、「Ｐ値」はウィルコクソンの順位和検定により算出された値を示す。【０１２２】
【表１２】
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【０１２３】
【表１３】
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【０１２４】
全２６４５４個のプローブの内、ＣｐＧアイランドに位置していたプローブは１９２４６個、７２．８％であったにも関わらず、前記６１個のプローブの内、クラスターＢに属する腎細胞癌においてＤＮＡ高メチル化を示すＣｐＧアイランドに位置するプローブは６０個、９８．４％もあった（ΔβＴ−Ｎ＞０．０９７、表１２及び１３）。なお、前記６１個プローブの内、残り１個のプローブは非ＣｐＧアイランドに位置し、ＤＮＡ低メチル化を示すものであった（クラスターＢにおいて、ΔβＴ−Ｎ＞−０．４２５±０．０９６）。【０１２５】
実施例２及び３に示した結果から、クラスターＢは臨床病理学的形質とよく相関しており、ＣｐＧアイランドにおける高頻度のＤＮＡ高メチル化によって特徴付けられることが明らかになった。【０１２６】
なお、クラスターＢに属する腎細胞癌のかかる特徴は、よく研究されている他の臓器（例えば、大腸及び胃）のＣｐＧアイランドメチル化形質（ＣＩＭＰ）陽性の癌のそれと似ている（非特許文献８〜１１）。すなわち、本１ＣｐＧ解像メチローム解析によって、ＣＩＭＰ陽性の腎細胞癌がクラスターＢとして初めて同定された。【０１２７】
（実施例４）
＜ＣＩＭＰ陽性腎細胞癌を特徴付けるＣｐＧサイトの同定＞
クラスターＡ及びＢに各々属する代表的な腎細胞癌患者に関し、腎細胞癌組織（Ｔサンプル）におけるＤＮＡメチル化レベル（β値）と、非癌腎組織（Ｎサンプル）のそれらとの対応付けを行った。得られた結果を散布図として図１３及び１４に示す。なお、図１３に示すＣａｓｅ：１〜４はクラスターＡに属する代表的な腎細胞癌患者の例であり、図１４に示すＣａｓｅ：５〜８はクラスターＢに属する代表的な腎細胞癌患者の例である。【０１２８】
図１３及び１４に示した結果から明らかなように、ＤＮＡメチル化レベルがＮサンプルにおいて低く、ＤＮＡ高メチル化の程度が対応するＮサンプルと比較してＴサンプルの方が顕著であるプローブは、クラスターＢのみにはっきりと存在しており、クラスターＡにおいては認められなかった。【０１２９】
この結果に基づき、クラスターＢに属する腎細胞癌とクラスターＡに属するそれらとを区別するため、全てのＮサンプルにおける平均β値が０．２未満であり、０．４を超えるΔβＴ−Ｎの出現頻度がクラスターＡと比してクラスターＢの方か顕著に高い（Ｐ＜１．９８×１０−６、フィッシャーの直接確率検定）プローブに着目した。【０１３０】
そして、このようなプローブにおいて、１６プローブ（１５遺伝子：ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ及びＺＮＦ６７１）は、クラスターＢに属する１４の腎細胞癌の内６以上（４２．８％以上）の腎細胞癌において、０．４を超えるΔβＴ−Ｎを示した。一方、クラスターＡに属する９０の腎細胞癌の内、前記１６プローブが０．４を超えるΔβＴ−Ｎを示した腎細胞癌は２個以下（２．２％以下）であった（表１４  参照）。【０１３１】
【表１４】
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【０１３２】
また、図１５に示した結果から明らかなように、クラスターＡとクラスターＢとの間で前記１６ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベル（ΔβＴ−Ｎ）は完全に異なっていた。【０１３３】
さらに、クラスターＡとクラスターＢとの間で顕著にＤＮＡメチル化レベル（ΔβＴ−Ｎ）が異なっていた８６９プローブ（ＦＤＲ［ｑ＝０．０１］）を用い、ランダムフォレスト解析を行った（図１６及び１７  参照）。その結果、クラスターＡとクラスターＢとを識別することのできる上位４プローブをさらに同定した（表１５  参照）。【０１３４】
【表１５】
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【０１３５】
なお、前記１５遺伝子と、ランダムフォレスト解析によって見出されたクラスターＡとクラスターＢとを識別することのできる上位４遺伝子とは、２遺伝子（ＦＡＭ１５０Ａ及びＧＲＭ６）は重複していた。【０１３６】
従って、これら１７遺伝子（ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６−２）におけるＣｐＧサイトは、ＣＩＭＰ陽性腎細胞癌、例えばクラスターＢに属する腎細胞癌の特徴とみなすことができる。すなわち、前記１７遺伝子のＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを検出することによって、腎細胞癌患者の予後不良リスクを検出できることが明らかになった。【０１３７】
また、これら遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲによって解析した結果、ＤＮＡ高メチル化によりこれら遺伝子の発現が抑制されていることが明らかになった（表１６  参照）。【０１３８】
【表１６】
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【０１３９】
従って、前癌段階において生じているＤＮＡメチル化の変化は、遺伝子発現レベルの変化を介して、腎細胞癌の悪性度及び患者の予後を決定していることが示された。【０１４０】
（実施例５）
＜質量分析計による、腎細胞癌におけるＤＮＡメチル化レベルの検出＞
前記インフィニウムアッセイとは異なるメチル化ＤＮＡ検出方法、マスアレイ法（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法）にて、前記１７遺伝子のＣｐＧサイトについてのＤＮＡメチル化レベル検出の有効性を確認した。【０１４１】
ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法は、バイサルファイト処理後のＤＮＡを増幅し、ＲＮＡに転写し、さらにＲＮＡａｓｅにより塩基特異的に切断した後、質量分析計によって、メチル化ＤＮＡ断片と非メチル化ＤＮＡ断片との分子量の差を検出する方法である。【０１４２】
先ず、インフィニウムアレイのプローブ部位である前記ＣｐＧサイトを含むＣｐＧアイランドに対し、ＥｐｉＤｅｓｉｇｎｅｒ（ＳＥＱＵＥＮＯＭ社製、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ用プライマー設計ソフト）を用いてＭａｓｓＡＲＲＡＹのプライマー設計を行った。【０１４３】
なお、ＭａｓｓＡＲＲＡＹにおけるＰＣＲ標的配列は１００〜５００ｂｐ程度とやや長いので、前記ＣｐＧサイト周辺の多数のＣｐＧ部位のＤＮＡメチル化レベルを合わせて評価することができる。【０１４４】
また、ＰＣＲにおけるバイアスの影響を排除するため、１プライマーセット当たり、ＤＮＡポリメラーゼ３種とアニール温度４段階程度の条件との組み合わせを平均して試行し、定量性の良好な至適ＰＣＲ条件を決定した。【０１４５】
そして、ＰＣＲ標的配列に含まれ解析対象となる全てのＣｐＧ部位について、採用したＰＣＲ条件で定量性が良好であることを確認し、ＣＩＭＰ陰性腎細胞癌８８検体とＣＩＭＰ陽性腎細胞癌１４検体とにおいて、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ解析を実施した。【０１４６】
すなわち先ず、前述のインフィニウムアッセイ同様に、各サンプルからゲノムＤＮＡを抽出し、バイサルファイト変換した後、ＰＣＲにて増幅して、インビトロ転写反応を行った。次いで、得られたＲＮＡをＲＮａｓｅＡによりウラシルの部位で特異的に切断し、各サンプルのゲノムＤＮＡのメチル化の有無に応じた長さの異なる断片を生成した。そして、得られたＲＮＡ断片を、一塩基の質量の差異を検出できるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳ（ＳＥＱＵＥＮＯＭ社製、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ４）にかけ、質量分析を行った。得られた質量分析結果を、解析ソフトウェア（ＥｐｉＴＹＰＥＲ、ＳＥＱＵＥＮＯＭ社製）を用いて、リファレンス配列にアラインメントし、メチル化ＤＮＡに由来するＲＮＡ断片と非メチル化ＤＮＡに由来するＲＮＡ断片との質量の比から、メチル化レベルを算出した。【０１４７】
本解析に用いたプライマーの配列と該プライマーのセットを用いて増幅されたＰＣＲ産物の配列を、表１７及び１８並びに配列表に示す。得られた結果の一部について図１８〜２３に示す。【０１４８】
【表１７】
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【０１４９】
【表１８】
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【０１５０】
図１８〜２３に示した結果から明らかなように、ＭａｓｓＡＲＲＡＹの解析対象とした全ての領域に関し、先のインフィニウムアレイを用いた解析結果同様に、前記ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出することによってクラスターＢに属する予後不良の腎細胞癌（ＣＩＭＰ陽性群）と、クラスターＡに属する予後が良好である腎細胞癌（ＣＩＭＰ陰性群）とを判別できることが確認された。さらに、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ解析によって、１ＣｐＧサイトのみならず、それを含むＣｐＧアイランド全域（例えば、インフィニウムプローブ部位であるＣｐＧサイトの前後１５００ｂｐに亘る領域）においても、ＣＩＭＰ陽性群において高メチル化状態が続いていることが明らかになった。【０１５１】
従って、プロモーター全域の高メチル化状態により強固なサイレンシングの起こっている領域の１ＣｐＧサイトが、実施例４において同定されていたことが明らかになった、すなわち、前記１８ＣｐＧサイトに限らず、前記１７遺伝子のＣｐＧアイランドに位置する少なくとも１のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルを検出すれば、腎細胞癌の予後不良リスクを検出できることが明らかになった。【０１５２】
また、かかるＭａｓｓＡＲＲＡＹ法により、前述のインフィニウムアッセイにて既にＣＩＭＰ陽性群に分類されている１４症例とＣＩＭＰ陰性例８８症例において、１４遺伝子の３１２ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを定量した。そして、その結果に基づき、受信者操作特性（ＲＯＣ）解析を行い、各ＣｐＧサイト単独でＣＩＭＰ陽性群をＣＩＭＰ陰性群から見分けるときの「感度（陽性率）」、「特異度」及び「１−特異度（偽陽性率）」を求めた。さらに、得られたこれらの値からＲＯＣ曲線を作製し、ＡＵＣ（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ、ＲＯＣ曲線下面積）を算出した。また、各ＣｐＧサイトに対しては、「感度＋特異度」が最大となるようにカットオフ値（診断閾値）を設定した。前記ＭａｓｓＡＲＲＡＹ解析において定量的に解析を行うことができたＣｐＧサイトについて得られた結果を表１９〜２７に示す。なお、表１９〜２７において、近接しており且つＭａｓｓＡＲＲＡＹ法の特性によりまとめてＤＮＡメチル化レベルが測定される複数のＣｐＧサイトについては１箇所としてまとめて記載している。また、これら表の「標的遺伝子名_プライマーセット名_ＣｐＧサイト」は、表１７及び１８に記載のプライマーセットを用いて増幅したＰＣＲ産物中のＣｐＧサイトの順番を示す。なお、表２３の記載において、ＳＬＣ１３Ａ５＿１０＿ＣｐＧ＿４４とＳＬＣ１３Ａ５＿１３＿ＣｐＧ＿１とは、異なるプライマーセットによって増幅された領域における４４番目のＣｐＧサイトと１番目のＣｐＧサイトとを各々示すが、ゲノム上の位置（ＮＣＢＩデータベース  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｕｉｌｄ  ３７上の位置）は１７番染色体の６６１７０７７とする、同一のＣｐＧサイトである。【０１５３】
【表１９】
2013168644.tif 000020
【０１５４】
【表２０】
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【０１５５】
【表２１】
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【０１５６】
【表２２】
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【０１５７】
【表２３】
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【０１５８】
【表２４】
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【０１５９】
【表２５】
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【０１６０】
【表２６】
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【０１６１】
【表２７】
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【０１６２】
表１９〜２７に示した結果から明らかなように、診断能力の大きなＣｐＧサイトが、インフィニウムプローブ部位である前記ＣｐＧサイトに加えて、各ＣｐＧアイランドに多数存在することがわかった。すなわち、ＡＵＣ＞０．９であるＣｐＧサイト数は１４１サイトあり、ＡＵＣ＞０．９５であるＣｐＧサイト数は３２サイトあった。【０１６３】
また、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法においては、例えば「ＦＡＭ１５０Ａ＿１４＿ＣｐＧ＿１３．１４．１５」のようにＣＧＣＧＣＧと連続するＣｐＧサイトでは全体で１個の計測値が与えられるので、前記ＡＵＣ＞０．９である１４１サイトは、ＡＵＣ算出の根拠になる計測値としては９０個に相当する。また同様に、前記ＡＵＣ＞０．９５である３２サイトは、ＡＵＣ算出の根拠になる計測値としては２３計測値に相当する。【０１６４】
また、図２４に示した結果から明らかなように、ＡＵＣが０．９５より大きいＣｐＧサイト２３箇所（２３計測値）を指標として用いることによって、ＣＩＭＰ陽性群とＣＩＭＰ陰性群とを明確に区別することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１６５】
以上説明したように、本発明によれば、前記１７遺伝子（ＦＡＭ１５０Ａ、ＧＲＭ６、ＺＮＦ５４０、ＺＦＰ４２、ＺＮＦ１５４、ＲＩＭＳ４、ＰＣＤＨＡＣ１、ＫＨＤＲＢＳ２、ＡＳＣＬ２、ＫＣＮＱ１、ＰＲＡＣ、ＷＮＴ３Ａ、ＴＲＨ、ＦＡＭ７８Ａ、ＺＮＦ６７１、ＳＬＣ１３Ａ５及びＮＫＸ６−２）の少なくとも一のＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化レベルを検出することによって、予後不良の腎細胞癌（ＣＩＭＰ陽性腎細胞癌）と比較的良好な腎細胞癌とを明確に分類することが可能となる。【０１６６】
かかるＤＮＡメチル化レベルの、予後不良群と良好群との差違は大きいので、病院の検査室等ですでに普及しているＰＣＲ法等（例えば、メチル化特異的定量ＰＣＲ法、ＣＯＢＲＡ法）でも容易に検出できる。また、腎細胞癌手術検体から、患者に余分な侵襲を加えることなく、予後診断用のゲノムＤＮＡを豊富に抽出できる。従って、本発明の腎細胞癌の予後不良リスクを検出する方法は、治療成績の向上を目指した方法として、臨床分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１６７】
配列番号：１７
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＳＬＣ１３Ａ５＿ＭＡ＿１０フォワードプライマー）
配列番号：１８
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＳＬＣ１３Ａ５＿ＭＡ＿１０リバースプライマー）
配列番号：１９
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＳＬＣ１３Ａ５＿ＭＡ＿１３フォワードプライマー）
配列番号：２０
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＳＬＣ１３Ａ５＿ＭＡ＿１３リバースプライマー）
配列番号：２１
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＳＬＣ１３Ａ５＿ＭＡ＿１５フォワードプライマー）
配列番号：２２
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＳＬＣ１３Ａ５＿ＭＡ＿１５リバースプライマー）
配列番号：２３
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＦＡＭ１５０Ａ＿ＭＡ＿１４フォワードプライマー）
配列番号：２４
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＦＡＭ１５０Ａ＿ＭＡ＿１４リバースプライマー）
配列番号：２５
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＧＲＭ６＿ＭＡ＿８フォワードプライマー）
配列番号：２６
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＧＲＭ６＿ＭＡ＿８リバースプライマー）
配列番号：２７
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＺＦＰ４２＿ＭＡ＿２フォワードプライマー）
配列番号：２８
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＺＦＰ４２＿ＭＡ＿２リバースプライマー）
配列番号：２９
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＺＦＰ４２＿ＭＡ＿５フォワードプライマー）
配列番号：３０
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＺＦＰ４２＿ＭＡ＿５リバースプライマー）
配列番号：３１
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＲＩＭＳ４＿ＭＡ＿９フォワードプライマー）
配列番号：３２
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＲＩＭＳ４＿ＭＡ＿９リバースプライマー）
配列番号：３３
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＴＲＨ＿ＭＡ＿８フォワードプライマー）
配列番号：３４
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＴＲＨ＿ＭＡ＿８リバースプライマー）
配列番号：３５
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＺＮＦ５４０＿ＭＡ＿１７フォワードプライマー）
配列番号：３６
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＺＮＦ５４０＿ＭＡ＿１７リバースプライマー）
配列番号：３７
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＰＣＤＨＡＣ１＿ＭＡ＿５フォワードプライマー）
配列番号：３８
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＰＣＤＨＡＣ１＿ＭＡ＿５リバースプライマー）
配列番号：３９
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＰＲＡＣ＿ＭＡ＿２フォワードプライマー）
配列番号：４０
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＰＲＡＣ＿ＭＡ＿２リバースプライマー）
配列番号：４１
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＺＮＦ６７１＿ＭＡ＿８フォワードプライマー）
配列番号：４２
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＺＮＦ６７１＿ＭＡ＿８リバースプライマー）
配列番号：４３
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＷＮＴ３Ａ＿ＭＡ＿９フォワードプライマー）
配列番号：４４
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＷＮＴ３Ａ＿ＭＡ＿９リバースプライマー）
配列番号：４５
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＫＨＤＲＢＳ２＿ＭＡ＿１９（ｒｅｖ）フォワードプライマー）
配列番号：４６
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＫＨＤＲＢＳ２＿ＭＡ＿１９（ｒｅｖ）リバースプライマー）
配列番号：４７
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＡＳＣＬ２＿ＭＡ＿８フォワードプライマー）
配列番号：４８
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（ＭａｓｓＡＲＲＡＹアッセイに用いたＡＳＣＬ２＿ＭＡ＿８リバースプライマー）
配列番号：４９
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（パイロシークエンシング用ＺＦＰ４２フォワードプライマー）
配列番号：５０
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（パイロシークエンシング用いたＺＦＰ４２リバースプライマー）
配列番号：５１
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（パイロシークエンシング用いたＺＦＰ４２シークエンシングプライマー）
配列番号：５２
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（パイロシークエンシング用ＺＦＰ１５４フォワードプライマー）
配列番号：５３
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（パイロシークエンシング用いたＺＦＰ１５４リバースプライマー）
配列番号：５４
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（パイロシークエンシング用いたＺＦＰ１５４シークエンシングプライマー）
配列番号：５５
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（パイロシークエンシング用ＺＦＰ５４０フォワードプライマー）
配列番号：５６
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（パイロシークエンシング用いたＺＦＰ５４０リバースプライマー）
配列番号：５７
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列（パイロシークエンシング用いたＺＦＰ５４０シークエンシングプライマー）
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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