(57)【要約】  抗体医薬の精製に好適に用いることができる陽イオン交換クロマトグラフィー用担体、特に抗体医薬の製造過程で生産される抗体単量体とその重合体の分離性能が良好な陽イオン交換クロマトグラフィー用担体の提供。多孔性粒子を含むベース担体に、下記式（１）または（２）で示される少なくとも１種の強カチオン性モノマー単位をモノマー全体の３０〜１００ｍｏｌ％の範囲で含む重合体が結合してなる抗体精製用陽イオン交換クロマトグラフィー担体であって、そのイオン交換容量が６０〜３００μｍｏｌ／ｍｌである陽イオン交換クロマトグラフィー担体。【化１】2014061411.tif 000016［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子またはメチルであり、Ａ１およびＡ２は、−Ｒ４−ＳＯ３Ｍであり、ここで、Ｒ４はＣ２〜Ｃ４のアルキレンであり、Ｍは、水素原子、ＮａまたはＫである。］
2014061411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔性粒子を含むベース担体に、式（１）または（２）：
【化１】
2014061411.tif 000013
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子またはメチルであり、Ａ１およびＡ２は、−Ｒ４−ＳＯ３Ｍであり、ここで、Ｒ４はＣ２〜Ｃ４のアルキレンであり、Ｍは、水素原子、ＮａまたはＫである。］
で示される少なくとも１種の強カチオン性モノマー単位をモノマー全体の３０〜１００ｍｏｌ％の範囲で含む重合体が結合してなる抗体精製用陽イオン交換クロマトグラフィー担体であって、そのイオン交換容量が６０〜３００μｍｏｌ／ｍｌである陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項２】
前記重合体が、式（３）：
【化２】
2014061411.tif 000014
［式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子またはメチルであり、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ４のアルキルまたはＣ１〜Ｃ４のアルコキシメチルである。］
で示される少なくとも１種の中性モノマー単位、または、式（４）：
【化３】
2014061411.tif 000015
［式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子またはメチルであり、Ａ３は、水素原子、ＮａまたはＫである。］
で示される少なくとも１種の弱カチオン性モノマー単位をさらに含む、請求項１記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項３】
前記重合体が、式（１）で示される少なくとも１種の強カチオン性モノマー単位と、式（３）で示される少なくとも１種の中性モノマー単位とを含む、請求項２記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項４】
前記重合体が、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸と、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとの重合体である、請求項３記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項５】
前記重合体に含まれる強カチオン性モノマー単位の割合が４０ｍｏｌ％以上、１００ｍｏｌ％未満であり、かつ、イオン交換容量が６０〜１５０μｍｏｌ／ｍｌである、請求項３または４記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項６】
前記重合体が、式（１）で示される少なくとも１種の強カチオン性モノマー単位と、式（４）で示される少なくとも１種の弱カチオン性モノマー単位とを含む、請求項２記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項７】
前記重合体が、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸と、アクリル酸との重合体である、請求項６記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項８】
前記重合体に含まれる強カチオン性モノマー単位の割合が５０ｍｏｌ％以上、１００ｍｏｌ％未満であり、かつ、イオン交換容量が９０〜２５０μｍｏｌ／ｍｌである、請求項６または７記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項９】
前記重合体が、式（１）で示される少なくとも１種の強カチオン性モノマー単位からなる重合体である、請求項１記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１０】
前記重合体が、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸の重合体である、請求項９記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１１】
イオン交換容量が７０〜２５０μｍｏｌ／ｍｌである、請求項９または１０記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１２】
前記多孔性粒子が架橋セルロース粒子である、請求項１〜１１のいずれか１項記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１３】
前記多孔性粒子が、重量平均分子量１．５×１０５Ｄａの標準ポリエチレンオキシドにおいて純水を移動相として使用したときのゲル分配係数Ｋａｖが０．３〜０．５であることを特徴とする多孔性粒子である、請求項１〜１２のいずれか１項記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１４】
抗体医薬製造過程で生産される抗体単量体とその重合体を分離するためのものである、請求項１〜１３のいずれか１項記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体を用いて、抗体医薬製造過程で生産される抗体単量体とその重合体を分離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体医薬の精製工程で用いられる陽イオン交換クロマトグラフィー担体および抗体医薬の製造過程で生産される抗体単量体とその重合体の分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィーを用いてバイオ医薬品の精製を行うことは広く知られており、種々の分子間相互作用を利用して目的物と不純物の分離が行われる。例としてイオン交換クロマトグラフィーの静電的相互作用を利用した分離方法、疎水クロマトグラフィーの疎水的相互作用を利用した分離方法およびプロテインＡクロマトグラフィーなどの抗体に対するアフィニティー相互作用を利用した分離方法などがある。【０００３】
抗体医薬の製造においては純度の高い製品を提供することが重要であり、その精製プロセスはプロテインＡクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーなどの組合せにおいて実施されている。中でも、不純物の一つである抗体重合体は培養または精製段階で生産され、抗原認識能の低下または副作用の原因になると考えられており、その除去は抗体医薬製造において重要な管理項目となっている。【０００４】
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０８、１４９４−１５０８、２０１１（非特許文献１）では、抗体重合体の生成機構および重合体除去の重要性などが報告されているが、抗体重合体はプロテインＡクロマトグラフィーによるアフィニティー精製工程では除去できないといった問題がある。それゆえ、プロテインＡクロマトグラフィーによる精製工程以降の工程において、抗体とその重合体を分離し、純度の高い抗体を取得することが抗体医薬メーカーにとって重要な課題となっている。【０００５】
このような目的のために、例えば非特許文献１ではミックスモード型リガンドを持つクロマトグラフィー担体による抗体とその重合体との分離が提案されている。また、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，１２１７、２１６−２２４、２０１０（非特許文献２）およびＪ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，１２１６、９０２−９０９、２００９（非特許文献３）では、疎水（フェニル）クロマトグラフィー担体による抗体とその重合体との分離が提案されている。しかしながら、これらの担体を使用した分離方法では、目的物となる抗体吸着容量が低かったり、高塩濃度での使用であったりなど実用的な課題が多い。【０００６】
陽イオン交換クロマトグラフィーは、抗体重合体の除去、宿主由来蛋白質の除去、プロテインＡリークの除去を目的に使用されており、安価で、多くのバイオ製剤の製造における使用実績が高いこともあり、プロテインＡクロマトグラフィー以降の精製工程において非常に重要な工程となっている。それゆえ、抗体医薬の製造過程において発生する抗体重合体や宿主由来のタンパク質などの不純物は陽イオン交換クロマトグラフィー処理でできるだけ削減することが望ましいとされている。【０００７】
抗体精製への陽イオン交換クロマトグラフィーの適応として、例えば、国際公開第２０１０／１２７０６９号パンフレット（特許文献１）には、ＩＧＦ１Ｒ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の精製が開示されており、抗体重合体などの不純物の除去に有効な陽イオン交換体の使用が開示されている。【０００８】
しかし、抗体医薬製造に用いる場合、陽イオン交換クロマトグラフィー担体には、不純物との分離性能だけでなく、生産性の観点から抗体の吸着量が高いこと、さらには圧縮せず高流速で処理できることも求められる。【０００９】
近年、高い吸着容量を有する蛋白質精製用陽イオン交換クロマトグラフィー担体として、Ｃａｐｔｏ（登録商標）  Ｓ（ＧＥヘルスケア社製）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）  ＧｉｇａＣａｐ  Ｓ（東ソー社製）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＥ  Ｈｉｃａｐ、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）  Ｓ（以上、メルク社製）、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（登録商標）  Ｓ（バイオ・ラッド社製）、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＸＳ（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社）などが開発、販売されている。【００１０】
例えば、特開平１−３１０７４４号公報（特許文献２）では、グラフトポリマーをリガンドとしてもつイオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法が開示されている。ここでは、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＳＫ  ＨＷ  ６５（Ｓ）またはＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標）ジオールをベース担体として用いた、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィー、さらには共重合ポリマーをリガンドとしてもつクロマトグラフィー担体の製造方法が記載されている。しかし、本報告例では、抗体とその重合体の分離については検討されていない。【００１１】
上記以外のグラフトポリマーをリガンドとしてもつ陽イオン交換クロマトグラフィー担体の例として、例えば、特表２０１１−５２９５０８号公報（特許文献３）では、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＳＫ  ＨＷ  ６５（Ｍ）にグラフト重合により共重合ポリマーをリガンドとして導入する方法が開示されている。該公報では、スルホン酸を含むモノマーと含まないモノマーを共重合させることで、スルホン酸を含むモノマーのみをグラフト重合させた場合と比べて、接触時間２分間で測定したポリクローナル抗体の動的結合容量が高くなることが示されている。しかし、該公報では共重合ポリマーの組成と動的結合容量の関係については明確に示されていない。また、該公報では共重合ポリマーの強カチオン基と中性基の組成が抗体とその重合体の分離に及ぼす影響の重要性について認識されておらず、その検討もされていない。【００１２】
特表２０１０−５２８２７１号公報（特許文献４）では、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＳＫ  ＨＷ  ６５（Ｍ）に、疎水的相互作用をもつモノマーを用いイオン交換基と疎水基の両方を有するグラフトポリマーをリガンドとして導入した陽イオン交換クロマトグラフィー担体が開示されている。該公報では、このクロマトグラフィー担体を用いることにより、ＮａＣｌが１５０ｍＭの濃度の条件下でもモノクローナル抗体で７６．１ｍｇ／ｍｌの動的結合容量を示すことが記されている（表３）。しかし、ここでも抗体とその重合体の分離については検討されていない。【００１３】
一方、国際公開第２００７／１２３２４２号パンフレット（特許文献５）には、メタクリル系ポリマーを原料とするベース担体にポリアクリル酸をリガンドとして結合させてなる担体が、ベース担体にカルボキシメチル基を直接結合させた担体に比べて、抗体の単量体とその重合体の分離に優れていることが示されている。しかし、上記担体を製造する場合、ポリアクリル酸を事前に合成する必要があり、抗体医薬メーカーが望む安価なクロマトグラフィー担体を提供するという課題に対応できない可能性がある。また、抗体結合容量などのその他の重要なクロマトグラフィー担体の特性に関する検討がされておらず、実用性の点で課題が残る。【００１４】
上記のとおり、抗体単量体とその重合体を効率的に分離でき、しかも吸着性の高いグラフトポリマーをリガンドとしてもつ陽イオン交換クロマトグラフィー担体は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１２７０６９号パンフレット
【特許文献２】特開平１−３１０７４４号公報
【特許文献３】特表２０１１−５２９５０８号公報
【特許文献４】特表２０１０−５２８２７１号公報
【特許文献５】国際公開第２００７／１２３２４２号パンフレット
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０８、１４９４−１５０８、２０１１
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，  １２１７、２１６−２２４、２０１０
【非特許文献３】Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，  １２１６、９０２−９０９、２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
このような状況において、抗体医薬の精製に好適に用いることができるイオン交換クロマトグラフィー担体、特に抗体医薬の製造過程で生産される抗体単量体とその重合体である抗体重合体との分離性能が良好であり、且つ、抗体吸着性が高く、抗体単量体を高純度で得ることができる陽イオン交換クロマトグラフィー担体の提供が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討した結果、多孔性粒子上に、スルホン基を少なくとも一つ含むモノマーを特定の組成で重合させてなる構造物をリガンドとして結合させることで、抗体単量体とその重合体を効率的に分離でき、しかも抗体吸着性の高い陽イオン交換クロマトグラフィー担体を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１９】
すなわち、本発明は、以下に示した抗体精製用陽イオン交換クロマトグラフィー担体および抗体単量体とその重合体の分離方法などに関するものである。【００２０】
［１］  多孔性粒子を含むベース担体に、式（１）または（２）：
【化１】
2014061411.tif 000003
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子またはメチルであり、Ａ１およびＡ２は、−Ｒ４−ＳＯ３Ｍであり、ここで、Ｒ４はＣ２〜Ｃ４のアルキレンであり、Ｍは、水素原子、ＮａまたはＫである。］
で示される少なくとも１種の強カチオン性モノマー単位をモノマー全体の３０〜１００ｍｏｌ％の範囲で含む重合体が結合してなる抗体精製用陽イオン交換クロマトグラフィー担体であって、そのイオン交換容量が６０〜３００μｍｏｌ／ｍｌである陽イオン交換クロマトグラフィー担体。【００２１】
［２］  前記重合体が、式（３）：
【化２】
2014061411.tif 000004
［式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子またはメチルであり、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ４のアルキルまたはＣ１〜Ｃ４のアルコキシメチルである。］
で示される少なくとも１種の中性モノマー単位、または、式（４）：
【化３】
2014061411.tif 000005
［式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子またはメチルであり、Ａ３は、水素原子、ＮａまたはＫである。］
で示される少なくとも１種の弱カチオン性モノマー単位をさらに含む、上記［１］記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。【００２２】
［３］  前記重合体が、式（１）で示される少なくとも１種の強カチオン性モノマー単位と、式（３）で示される少なくとも１種の中性モノマー単位とを含む、上記［２］記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。【００２３】
［４］  前記重合体が、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸と、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとの重合体である、上記［３］記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。【００２４】
［５］  前記重合体に含まれる強カチオン性モノマー単位の割合が４０ｍｏｌ％以上、１００ｍｏｌ％未満であり、かつ、イオン交換容量が６０〜１５０μｍｏｌ／ｍｌである、上記［３］または［４］記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。【００２５】
［６］  前記重合体が、式（１）で示される少なくとも１種の強カチオン性モノマー単位と、式（４）で示される少なくとも１種の弱カチオン性モノマー単位とを含む、上記［２］記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。【００２６】
［７］  前記重合体が、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸と、アクリル酸との重合体である、上記［６］記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。【００２７】
［８］  前記重合体に含まれる強カチオン性モノマー単位の割合が５０ｍｏｌ％以上、１００ｍｏｌ％未満であり、かつ、イオン交換容量が９０〜２５０μｍｏｌ／ｍｌである、上記［６］または［７］記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。【００２８】
［９］  前記重合体が、式（１）で示される少なくとも１種の強カチオン性モノマー単位からなる重合体である、上記［１］記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。【００２９】
［１０］  前記重合体が、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸の重合体である、上記［９］記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。【００３０】
［１１］  イオン交換容量が７０〜２５０μｍｏｌ／ｍｌである、上記［９］または［１０］記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。【００３１】
［１２］  前記多孔性粒子が架橋セルロース粒子である、上記［１］〜［１１］のいずれか１項記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。【００３２】
［１３］  前記多孔性粒子が、重量平均分子量１．５×１０５Ｄａの標準ポリエチレンオキシドにおいて純水を移動相として使用したときのゲル分配係数Ｋａｖが０．３〜０．５であることを特徴とする多孔性粒子である、上記［１］〜［１２］のいずれか１項記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体【００３３】
［１４］  抗体医薬製造過程で生産される抗体単量体とその重合体を分離するためのものである、上記［１］〜［１３］のいずれか１項記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体。【００３４】
［１５］  上記［１］〜［１４］のいずれか１項記載の陽イオン交換クロマトグラフィー担体を用いて、抗体医薬製造過程で生産される抗体単量体とその重合体を分離する方法。
【発明の効果】
【００３５】
本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー担体は、抗体医薬の精製に好適に用いることができる。本発明の好ましい態様によれば、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー担体を用いることで、抗体医薬の製造過程で生産される抗体単量体とその重合体を効率的に分離することができるため、抗体単量体を高純度で得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は実施例１のゲルによるモノクローナル抗体の分離度（ΔＣ）の測定結果を示したクロマトグラムである。
【図２】図２は実施例２のゲルによるモノクローナル抗体の分離度（ΔＣ）の測定結果を示したクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明の抗体精製用陽イオン交換クロマトグラフィー担体およびそれを用いた抗体単量体とその重合体の分離方法などについて詳しく説明する。
【００３８】
（１）抗体精製用陽イオン交換クロマトグラフィー担体
本発明の抗体精製用陽イオン交換クロマトグラフィー担体は、多孔性粒子を含むベース担体に、リガンドとして、式（１）または（２）：
【化４】
2014061411.tif 000006
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子またはメチルであり、Ａ１およびＡ２は、−Ｒ４−ＳＯ３Ｍであり、ここで、Ｒ４はＣ２〜Ｃ４のアルキレンであり、Ｍは、水素原子、ＮａまたはＫである。］
で示される少なくとも１種の強カチオン性モノマー単位をモノマー全体の３０〜１００ｍｏｌ％の範囲で含む重合体が結合した構造を有しており、そのイオン交換容量が６０〜３００μｍｏｌ／ｍｌであることを特徴としている。
【００３９】
（１．１）ベース担体である多孔性粒子
本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー担体において、ベース担体として用いる多孔性粒子としては、強カチオン性モノマー単位、ならびに必要に応じて、中性モノマー単位および弱カチオン性モノマー単位を導入するための官能基（例えば、水酸基またはカルバモイル基など）を有するものであれば特に制限されない。そのような多孔性粒子としては、上記のような官能基を有する、例えば、アガロース、デキストラン、でんぷん、セルロース、プルラン、キチン、キトサン、三酢酸セルロース、二酢酸セルロースなどの多糖類およびその誘導体；ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアルキルビニルエーテル、ポリビニルアルコールなどの有機重合体などが好ましく挙げられる。これらの多孔性粒子は、機械的強度を確保できることから、架橋構造を形成していることが好ましい。これらの中でも、本発明においては、架橋反応によってセルロース粒子の骨格が補強された架橋セルロース粒子を用いることが好ましい。
【００４０】
本発明に用いる架橋セルロース粒子としては、クロマトグラフィーのベース担体として通常使用されるものであれば特に制限されない。原料となるセルロースは、結晶セルロースであっても非結晶セルロースであってもよいが、強度が高いことから結晶セルロースが好ましい。
【００４１】
本発明において好適に使用できる架橋セルロース粒子としては、例えば、特開２００９−２４２７７０号公報に開示されている多孔性セルロースゲルが挙げられる。同公報に開示されている架橋方法、すなわち、未架橋セルロース粒子の懸濁液に、セルロースモノマーのモル数の６〜２０倍量の塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩およびホウ酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１種の無機塩の存在下、セルロースモノマーのモル数の４〜１２倍量の架橋剤と、架橋剤のモル数の０．１〜１．５倍量のアルカリとを３時間以上かけて連続滴下または分割添加して架橋する方法で得られた架橋セルロース粒子は、機械的強度が高く、高流速での使用が可能であり、生産性の高い陽イオン交換クロマトグラフィー担体を与えることができる。ここで、「セルロースモノマー」とは、セルロースの構成単位であるグルコースユニットを意味し、セルロースモノマーのモル数（すなわち、重合度）は、グルコース１ユニットから水分を引いた量、すなわち分子量１６２を１モルとして、セルロースの乾燥重量から計算する。
【００４２】
架橋セルロース粒子の形状は特に制限されないが、機械的強度が高く、ゲル沈降性に優れ、均一な充填床を作製できることから、球状のものが好ましい。この場合、架橋セルロース粒子の真球度は０．８〜１．０であることが好ましい。ここで「真球度」は、セルロース粒子の短径／長径を意味する。
【００４３】
球状セルロース粒子は、例えば、結晶セルロースまたは結晶領域と非結晶領域とからなるセルロースを溶解し再生することで容易に得ることができる。球状セルロースの製造方法としては、例えば、特公昭５５−３９５６５号公報、特公昭５５−４０６１８号公報などに記載される酢酸エステルを経由する方法、特公昭６３−６２２５２号公報などに記載されるチオシアン酸カルシウム塩を用いた溶液から造粒する方法、特開昭５９−３８２０３号公報などに記載されるパラホルムアルデヒド・ジメチルスルホキシド溶液から製造する方法、また、特許第３６６３６６６号公報に記載されるセルロースを塩化リチウム含有のアミドに溶解させたセルロース溶液から成形する方法などが挙げられる。また、球状の架橋セルロース粒子は、球状セルロース粒子を架橋することで得ることができる。
【００４４】
本発明に用いる多孔性粒子の粒子径は、１０〜５００μｍが好ましく、３０〜２００μｍがより好ましく、５０〜１５０μｍが特に好ましい。また、平均粒子径は、３０〜１０００μｍが好ましく、４０〜２００μｍがより好ましく、５０〜１００μｍがさらに好ましい。
【００４５】
なお、本明細書において、多孔性粒子の粒子径および平均粒子径は、粒子群にレーザ光を照射し、そこから発せられる回折・散乱光の強度分布パターンから計算によって粒度分布を求める方法を測定原理とするレーザ回折／散乱式の粒子径分布測定装置を用いて算出する。測定装置としては、株式会社堀場製作所のレーザ回折／散乱式の粒子径分布測定装置ＬＡ−９５０などを用いることができる。
【００４６】
あるいは、光学顕微鏡で撮影した画像の粒子径を、ノギスなどを用いて計測して、撮影倍率から元の粒子径を求めることができる。そして、光学顕微鏡写真から求めたそれぞれの粒子径の値から、下記の式によって平均粒子径を算出することができる。
体積平均粒子径（ＭＶ）＝Σ（ｎｄ４）／Σ（ｎｄ３）
［式中、ｎｄは光学顕微鏡写真から求めたそれぞれの粒子径の値を表し、ｎは測定した粒子の個数を表す。］
【００４７】
本発明においてベース担体として用いる多孔性粒子の多孔性は細孔サイズの特性をもって特徴づけることができる。細孔サイズ特性を示す指標の一つとして、ゲル分配係数Ｋａｖがある。細孔サイズは粒子の物理的強度や精製対象となる目的物質の粒子内の拡散性との関連から、担体の流速特性や動的吸着容量に影響を与える。そのため、目的に応じた最適な設計が必要となる。動的吸着容量の観点から、特に、本発明に用いる多孔性粒子の細孔サイズは、重量平均分子量１．５×１０５Ｄａの標準ポリエチレンオキシドにおいて純水を移動相として使用したときのゲル分配係数Ｋａｖが、０．１５〜０．６の範囲であるものが好ましく、より好ましくは、０．２〜０．５５であり、さらに好ましくは０．３〜０．５である。
【００４８】
ゲル分配係数Ｋａｖは、特定の分子量を有する標準物質（例えば、ポリエチレンオキシド）の溶出体積およびカラム体積の関係から次式により求めることができる。
Ｋａｖ＝（Ｖｅ−Ｖ０）／（Ｖｔ−Ｖ０）
［式中、Ｖｅはサンプルの保持容量（ｍＬ）、Ｖｔは空カラム体積（ｍＬ）、Ｖ０はブルーデキストラン保持容量（ｍＬ）を表す。］
【００４９】
ゲル分配係数Ｋａｖの測定方法は、例えば、Ｌ．Ｆｉｓｃｈｅｒ著生物化学実験法２「ゲルクロマトグラフィー」第１版（東京化学同人）などに記載されている。本発明に用いる架橋多孔質セルロース粒子のゲル分配係数Ｋａｖは、例えば、粒子形成時のセルロースの溶解濃度を制御することにより調整することができる。
【００５０】
本発明においてベース担体として用いる多孔性粒子には、本発明の目的および作用効果を損なわない範囲であれば、フェニル基やブチル基などの疎水基などの任意の置換基が導入されていても構わない。多孔性粒子に疎水基を導入する場合、アルカリ溶液中でフェニルグリシジルエーテルやブチルグリシジルエーテルなどを反応させることにより導入することができる。
【００５１】
（１．２）リガンドとしての重合体
本発明の抗体精製用陽イオン交換クロマトグラフィー担体においては、前記多孔性粒子に、リガンドとして、式（１）または（２）：
【化５】
2014061411.tif 000007
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子またはメチルであり、Ａ１およびＡ２は、−Ｒ４−ＳＯ３Ｍであり、ここで、Ｒ４はＣ２〜Ｃ４のアルキレンであり、Ｍは、水素原子、ＮａまたはＫである。］
で示される少なくとも１種の強カチオン性モノマー単位をモノマー全体の３０〜１００ｍｏｌ％の範囲で含む重合体が結合している。Ｒ４のＣ２〜Ｃ４のアルキレンとしては、特に制限されないが、エチレン、ｎ−プロピレン、ｉｓｏ−プロピレン、ｎ−ブチレン、ｉｓｏ−ブチレン、ｓｅｃ−ブチレンなどが好ましく挙げられる。
【００５２】
本発明において、前記重合体は、式（１）および／または（２）で示される強カチオン性モノマー単位のみからなるものであってもよく、式（１）および／または（２）で示される強カチオン性モノマー単位に加えて、中性モノマーまたは弱カチオン性モノマーなどの他の任意のモノマー単位をさらに含むものであってもよい。前記重合体に含まれる強カチオン性モノマー単位は、式（１）または（２）で示されるモノマー単位のいずれかのみであってもよいし、式（１）で示されるモノマー単位と式（２）で示されるモノマー単位の組み合わせであってもよい。式（１）または（２）で示されるモノマー単位は、それぞれ、１種でも２種以上で用いてもよい。また、前記重合体に任意に含まれる他のモノマー単位は、１種でも２種以上で用いてもよい。
【００５３】
前記重合体が、式（１）および／または（２）で示される強カチオン性モノマー単位のみからなり、他の任意のモノマー単位を含まない場合、得られる陽イオン交換クロマトグラフィー担体のイオン交換容量は、６０μｍｏｌ／ｍｌ以上であり、７０μｍｏｌ／ｍｌ以上がより好ましく、９０μｍｏｌ／ｍｌ以上がさらに好ましい。また、イオン交換容量は、３００μｍｏｌ／ｍｌ以下であり、２５０μｍｏｌ／ｍｌ以下がより好ましく、１５０μｍｏｌ／ｍｌ以下がさらに好ましい。この範囲である時、抗体単量体とその重合体との分離性能が良好となる。
【００５４】
なお、本明細書において、イオン交換容量は例えば、国際公開公報２００７／０２７１３９号パンフレットに記載されているような酸塩基滴定やＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，  １１４６，  ２０２−２１５に記載されているような逆滴定によって一般に求めることができる。
【００５５】
式（１）で示されるモノマーの具体例としては、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−アクリルアミドエタンスルホン酸、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−メタクリルアミドエタンスルホン酸などが挙げられる。中でも、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸が好ましい。
【００５６】
式（２）で示されるモノマーの具体例としては、３−スルホプロピルメタクリレート、２−スルホエチルメタクリレートなどが挙げられる。中でも、３−スルホプロピルメタクリレートが好ましい。
【００５７】
前記重合体が、式（１）または（２）で示される強カチオン性モノマー単位に加えて、さらに他の任意のモノマー単位を含む場合、他のモノマー単位は、本発明の目的を損なわないものであれば特に制限されない。他のモノマー単位としては、例えば、式（３）：
【化６】
2014061411.tif 000008
［式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子またはメチルであり、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１〜Ｃ４のアルキルまたはＣ１〜Ｃ４のアルコキシメチルである。］
で示される少なくとも１種の中性モノマー単位、または、式（４）：
【化７】
2014061411.tif 000009
［式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子またはメチルであり、Ａ３は、水素原子、ＮａまたはＫである。］
で示される弱カチオン性モノマー単位が好ましく挙げられる。
【００５８】
ここで、Ｃ１〜Ｃ４のアルキルとしては、特に制限されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−イソプロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどが好ましく挙げられる。Ｃ１〜Ｃ４のアルコキシメチルとしては、炭素数１〜４のアルキルを含むアルコキシメチルであれば特に制限されないが、メトキシメチル、エトキシメチル、ｎ−プロポキシメチル、ｉｓｏ−プロポキシメチル、ｎ−ブトキシメチル、ｉｓｏ−ブトキシメチル、ｓｅｃ−ブトキシメチル、ｔｅｒｔ−ブトキシメチルなどが好ましく挙げられる。
【００５９】
本発明の一実施態様では、前記重合体が中性モノマー単位および弱カチオン性モノマー単位の両方を含んでいてもよい。
【００６０】
式（３）で示される中性モノマーの具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｉｓｏ−プロピルアクリルアミド、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−（メトキシメチル）メタクリルアミド、Ｎ−（ｉｓｏ−ブトキシメチル）メタクリルアミドなどが挙げられる。
【００６１】
式（４）で示される弱カチオン性モノマーの具体例としては、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸ナトリウム、アクリル酸カリウム、メタクリル酸ナトリウム、メタクリル酸カリウムなどが挙げられる。
【００６２】
本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー担体においてリガンドとして用いる前記重合体が、中性モノマー単位および／または弱カチオン性モノマー単位を含むことで、さらに好ましい特性を付与することができる。
【００６３】
例えば、式（１）で示される強カチオン性モノマー単位と、式（３）で示される中性モノマー単位とを含む共重合体をリガンドとしてベース担体に結合させた陽イオン交換クロマトグラフィー担体は、吸着量、特に動的吸着容量の増加効果を期待できる。また、この陽イオン交換クロマトグラフィー担体は、抗体単量体とその重合体の分離性能が優れており、効率的に抗体単量体を分離精製することができるため好ましい。中でも、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸と、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとの共重合体をリガンドとして用いると分離性能が特に優れている。
【００６４】
また、式（１）で示される強カチオン性モノマー単位と、式（４）で示される弱カチオン性モノマー単位とを含む共重合体をリガンドとしてベース担体に結合させた陽イオン交換クロマトグラフィー担体は、吸着量、特に動的吸着容量の増加効果を期待できるだけでなく、抗体単量体とその重合体の分離性能が優れている。弱カチオン性のモノマーは、タンパク質の精製分野において一般に利用されている弱カチオン交換体のリガンドとしても機能することができ、弱カチオン基の効果により本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー担体には、宿主由来の不純物の除去効果なども期待できる。
【００６５】
前記重合体が、式（１）および／または（２）で示される強カチオン性モノマー単位と、式（３）で示される中性モノマー単位とを有する共重合体である場合、共重合体を構成するモノマー全体に対する強カチオン性モノマー単位の割合は、３０ｍｏｌ％以上であり、４０ｍｏｌ％以上が好ましく、５０ｍｏｌ％以上がより好ましい。また、強カチオン性モノマー単位の割合は１００ｍｏｌ％未満である。
さらに動的吸着容量を考慮すると、イオン交換容量は６０μｍｏｌ／ｍｌ以上であり、７０μｍｏｌ／ｍｌ以上が好ましく、９０μｍｏｌ／ｍｌ以上がより好ましく、１００μｍｏｌ／ｍｌ以上が特に好ましい。また、イオン交換容量は、３００μｍｏｌ／ｍｌ以下であり、２５０μｍｏｌ／ｍｌ以下が好ましく、２１０μｍｏｌ／ｍｌ以下がより好ましく、１５０μｍｏｌ／ｍｌ以下が特に好ましい。
最適な実施形態では、強カチオン性モノマー単位の割合は４０ｍｏｌ％以上、１００ｍｏｌ％未満であり、且つ、イオン交換容量は６０〜１５０μｍｏｌ／ｍｌである。
【００６６】
前記重合体が、式（１）および／または（２）で示される強カチオン性モノマー単位と、式（４）で示される弱カチオン性モノマー単位とを有する共重合体である場合、共重合体を構成するモノマー全体に対する強カチオン性モノマー単位の割合は、３０ｍｏｌ％以上であり、４０ｍｏｌ％以上が好ましく、５０ｍｏｌ％以上がより好ましい。また、強カチオン性モノマー単位の割合は１００ｍｏｌ％未満である。
さらに動的吸着容量を考慮すると、イオン交換容量は６０μｍｏｌ／ｍｌ以上であり、７０μｍｏｌ／ｍｌ以上が好ましく、９０μｍｏｌ／ｍｌ以上がより好ましい。また、イオン交換容量は、３００μｍｏｌ／ｍｌ以下であり、２５０μｍｏｌ／ｍｌ以下が好ましい。
最適な実施形態では、強カチオン性モノマー単位の割合は５０ｍｏｌ％以上、１００ｍｏｌ％未満であり、且つ、イオン交換容量は９０〜２５０μｍｏｌ／ｍｌである。
【００６７】
なお、本明細書において、強カチオン性モノマー単位の割合（Ｓ密度）とは、測定されたＳ含量、Ｎ含量またはＮａ含量を用いてモノマー単位に含まれるＮまたはＮａに対するＳのモル比を算出することで得ることができる。Ｓ含量、Ｎ含量またはＮａ含量は、例えば、発光分光分析法、元素分析法または原子吸光分析法などを用いて測定することができる。
【００６８】
（１．３）陽イオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法
次に、本発明の抗体精製用陽イオン交換クロマトグラフィー担体の製造方法について述べる。
【００６９】
本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー担体は、多孔性粒子を含むベース担体にグラフト重合反応により重合体を導入することにより製造される。本発明において、グラフト重合反応は水酸基に酸性条件下でＣｅ（ＩＶ）の作用で生成するラジカルを基点として進行させる。この基点となるラジカルが系中に存在するモノマーと反応することでベース担体上にグラフトポリマーを形成することができる。
【００７０】
具体的には、まず、反応容器に、純水と強カチオン性モノマーを加え、溶解させた後、水酸化ナトリウム溶液などのアルカリで中和する。この溶液に、必要に応じて追加のモノマーを加え、ベース担体を加えてスラリー状にする。この状態で、反応容器に窒素を吹き込みながら０．５〜４．０時間撹拌する。撹拌後、反応容器に、硫酸アンモニウムセリウムなどのＣｅ（ＩＶ）塩を希硝酸に溶解させた溶液をゆっくり滴下する。滴下後、反応溶液を１０〜７０℃の範囲、好ましくは３０℃〜５０℃の範囲に昇温し、６〜４０時間時間撹拌する。反応終了後は、得られた湿ゲルを純水で洗浄し、次いで、希硫酸で洗浄した後、純水で洗浄液が中性になるまで洗浄して、目的の陽イオン交換クロマトグラフィー担体を得ることができる。
【００７１】
反応は溶液のｐＨが０〜４の範囲で行うことが好ましい。
【００７２】
Ｃｅ（ＩＶ）塩は反応溶液中のモル濃度で０．０００１〜１ｍｏｌ／ｍｌの範囲であることが好ましく、０．０１〜０．１ｍｏｌ／ｍｌの範囲であればより好ましい。
【００７３】
反応に用いる強カチオン性モノマーと、中性モノマーおよび弱カチオン性モノマーなどの他のモノマーとの仕込み量のモル比は９９：１〜４０：６０の範囲であることが好ましく、より好ましくは７０：３０〜４５：５５の範囲である。
【００７４】
なお、Ｃｅ（ＩＶ）を使用したグラフト重合反応については、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９５８，Ｎｏ．１２２，２４２−２４３を参照することができる。
【００７５】
（２）分離方法
本発明の抗体精製用陽イオン交換クロマトグラフィー担体は、抗体医薬製造過程で生産される抗体単量体とその重合体との分離性能が優れているため、バイオ医薬品などの精製工程において好適に使用することができる。具体的にはカラムに本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー担体を充填し、そこへ目的物と不純物を含む液を流し目的物あるいは不純物のみを吸着させる目的や目的物と不純物を共に吸着させ溶出時の塩濃度を段階的あるいは連続的に増加させることでクロマトグラフィー担体への親和性の違いを利用して分離する目的に使用することができる。
【００７６】
本発明に用いる抗体としては、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が挙げられる。抗体の種類としては、例えば、マウス抗体、ラマ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはそれらのＦｃ領域などを改変した抗体などが挙げられ、分子型としては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆｃ−融合蛋白、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、Ｆａｂ’２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、ｓｃＤｂまたはｓｃＤｂＦｃなどが挙げられる。
【００７７】
また、本発明に用いる抗体としては、これらのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の一部を積極的に変性させた、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体も含まれる。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の変性方法としては、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、  ２０１１、  １００，２１０４−２１１９に記載の方法が挙げられる。
【００７８】
本発明において抗体単量体とは、１分子の前記抗体からなる分子である。抗体重合体とは、２分子以上の抗体の単量体が共有結合または非共有結合により重合した分子であり、例えば、二量体、三量体、多量体、凝集体または凝集塊などが挙げられる。
【００７９】
本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー担体を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことで、目的とする抗体単量体およびその重合体を分離することができる。
【００８０】
さらに、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー担体を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーは、抗体医薬製造過程で生産される抗体単量体と不純物の分離に用いても良い。不純物としては、例えば、培養細胞由来蛋白質、核酸、ウイルス、プロテインＡリーク、抗体の分解物、変性、糖鎖成分の除去、酸化または脱アミドなどを受けた目的とする抗体の修飾体などの培養過程または他のクロマトグラフィー処理工程などで生まれるものが挙げられる。
【００８１】
該陽イオン交換クロマトグラフィーに供される抗体含有水溶液としては、例えば、血漿、血清、乳若しくは尿など生体から得られた組成物、遺伝子組換え技術若しくは細胞融合技術を用いて得られた抗体を生産する細胞若しくは大腸菌などの菌類の培養液、またはトランスジェニック非ヒト動物、植物若しくは昆虫などから得られた組成物などが挙げられる。
【００８２】
抗体を生産する細胞としては、例えば、宿主細胞に所望の抗体をコードする遺伝子が組み込まれた形質転換細胞などが挙げられる。宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞または酵母細胞などの細胞株が挙げられる。具体的には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ラットミエローマ細胞であるＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞、胚性幹細胞、または受精卵細胞などが挙げられる。
【００８３】
抗体を生産する細胞を培養する培地としては、各々の細胞の培養に適した培地であればいずれも用いられるが、例えば、動物細胞を培養する培地としては、通常の動物細胞の培養に用いられる培地が用いられる。例えば、血清含有培地、血清アルブミン若しくは血清分画物などの動物由来成分を含まない培地、無血清培地、または無蛋白培地など、いずれの培地も用いられるが、好ましくは無血清培地または無蛋白培地が用いられる。また、必要に応じて抗体を生産する細胞の生育に必要な生理活性物質または栄養因子などを添加することができる。これらの添加物は、培養前に予め培地に含有させるか、培養中に添加培地または添加溶液として培養液へ適宜追加供給する。追加供給の方法は、１溶液または２種以上の混合溶液などいかなる形態でもよく、また、添加方法は連続または断続のいずれでもよい。
【００８４】
抗体を生産するトランスジェニック非ヒト動物、植物または昆虫としては、蛋白質をコードする遺伝子が細胞内に組み込まれた非ヒト動物、植物または昆虫が挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはサルなどが挙げられる。植物としては、例えば、タバコ、ポテト、トマト、ニンジン、ソイビーン、アブラナ、アルファルファ、コメ、小麦、大麦またはコーンなどが挙げられる。
【００８５】
また、本発明において、該陽イオン交換クロマトグラフィーに供される抗体含有水溶液としては、上述したような抗体を含有する血漿または尿など生体から得られるものの他、精製する工程で得られる抗体含有水溶液も含まれる。具体的には、例えば、細胞除去液、沈殿物除去液、アルコール分画液、塩析分画液、クロマトグラフィー溶出液などが挙げられる。さらに、抗体含有水溶液は、粒子などの不溶物が存在する場合には予めそれらを除去し、不溶物を除去した後に本発明の精製方法に供してもよい。粒子などの不溶物の除去方法としては、例えば、遠心分離法、クロスフローろ過法（タンジェンシャルフローろ過法）、デプスフィルターによるろ過法、メンブレンフィルターによるろ過法、透析法、またはこれらの方法を組み合わせた方法が挙げられる。
【００８６】
また、必要に応じて、例えば、限外ろ過膜を用いた限外ろ過法などを用いて、抗体含有水溶液のｐＨ、導電率、緩衝液、塩濃度、添加物、抗体濃度または陽イオン交換クロマトグラフィー担体の単位体積あたりの抗体負荷量などについて、好適な条件に調整した後に該陽イオン交換クロマトグラフィーに供される。
【００８７】
抗体含有水溶液のｐＨ、導電率、緩衝液、塩濃度、添加物、抗体濃度または陽イオン交換クロマトグラフィー担体の単位体積あたりの抗体負荷量などを調整する方法としては、例えば、限外ろ過膜を用いた限外ろ過法などが挙げられる。
【００８８】
該陽イオン交換クロマトグラフィーは、その目的に応じて吸着モードまたは非吸着モードで行われる。該陽イオン交換クロマトグラフィーにおける吸着モードとは、該陽イオン交換クロマトグラフィーに供する抗体含有水溶液を該担体に接触させ、目的の抗体を該担体に吸着させた後、必要に応じて洗浄を行い、その後、ｐＨ、電気伝導度、緩衝液成分、塩濃度または添加物などを変更した緩衝液で溶出させて吸着画分を回収することを意味する。該陽イオン交換クロマトグラフィーにおける非吸着モードとは、該陽イオン交換クロマトグラフィーに供する抗体含有水溶液を該担体と接触させ、該担体への非吸着画分を回収することを意味する。この際、適切な画分を回収することで、目的の抗体単量体と分離したい化合物を分離することができる。洗浄または溶出に使用する緩衝液は、ｐＨ、導電率、緩衝液成分、塩濃度または添加物などについて、それぞれ好適な条件を選定する。
【００８９】
クロマトグラフィーの条件を選定する場合、クロマトグラフィー担体に対する、目的の抗体単量体と分離したい化合物との親和性の違いを利用する。例えば、担体構造（リガンド種、リガンド密度、リガンド配行性、粒子径、細孔径、ベースマトリクス組成など）や、目的物と分離したい化合物の物理化学的性質（等電点、電荷、疎水性度、分子サイズまたは立体構造など）の違いを考慮して条件設定する。
吸着モードの溶出方法としては、目的の抗体単量体と担体との親和性が低下するような特定の塩濃度またはｐＨの緩衝液を通液して溶出させる一段階溶出法、段階的に塩濃度またはｐＨを変化させて目的の抗体単量体を溶出させるステップワイズ法または連続的に塩濃度またはｐＨを変化させて目的の抗体単量体を溶出させるグラジエント法が挙げられる。
【００９０】
抗体含有水溶液および洗浄または溶出に使用する緩衝液の成分としては、緩衝能を有するものであれば特に限定はされないが、例えば、１〜３００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳまたはＴｒｉｃｉｎｅなどが挙げられる。また上記の塩は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムのような他の塩と組み合わせて用いることもできる。さらに、緩衝液成分には、例えば、グリシン、アラニン、アルギニン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸若しくはヒスチジンなどのアミノ酸、グルコース、スクロース、ラクトース、シアル酸などの糖またはその誘導体などと組み合わせて用いることもできる。
【００９１】
抗体含有水溶液および洗浄または溶出に使用する緩衝液のｐＨとしては、好ましくは２〜９の範囲であり、より好ましくは３〜８の範囲である。
【００９２】
抗体含有水溶液および洗浄または溶出に使用する緩衝液の線速度としては、好ましくは５０〜１０００ｃｍ／ｈの範囲である。
【００９３】
陽イオン交換クロマトグラフィー担体の単位体積あたりの抗体負荷量としては、好ましくは１０〜２００ｇ／Lであり、より好ましくは６０〜１５０ｇ／Lの範囲である。
【００９４】
抗体医薬製造においては、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー担体を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーにさらに他の精製方法を組み合わせてもよい。該陽イオン交換クロマトグラフィーと組み合わせる精製方法としては、医薬品の製造に適した方法であればいずれも用いられるが、例えば、クロマトグラフィー、活性炭処理、アルコール分画、沈殿物除去、塩析、緩衝液交換、濃縮、希釈、ろ過、ウイルス不活性化、ウイルス除去などが挙げられる。該陽イオン交換クロマトグラフィーと組み合わせる精製方法は、複数の種類、数を組み合わせてもよい。また、これらの該陽イオン交換クロマトグラフィーと組み合わせる精製方法は、該陽イオン交換クロマトグラフィーの前後を問わず実施することができる。
【００９５】
該陽イオン交換クロマトグラフィーと組み合わせるクロマトグラフィーに用いられる担体または膜としては、ヘパリン担体またはプロテインＡ担体などのアフィニティー担体、陽イオン交換担体、陽イオン交換膜、陰イオン交換担体、陰イオン交換膜、ゲルろ過担体、疎水性相互作用担体、逆相担体、ヒドロキシアパタイト担体、フルオロアパタイト担体、硫酸化セルロース担体、硫酸化アガロース担体、混合モード(マルチモーダル)担体などが挙げられる。
【００９６】
本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー担体の特性において、抗体単量体とその重合体の分離特性を示す指標の一つとして、例えばモノクローナル抗体を用いた分離度ΔＣまたはポリクローナル抗体を用いた分離度ΔＣｐが挙げられる。
【００９７】
分離度ΔＣまたはΔＣｐは、重合体を含むモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む溶液を、陽イオン交換クロマトグラフィー担体を充填したカラムに添加し、溶出液の単量体または重合体のピークをモニターし、得られた単量体または重合体のピークトップに対応する電気伝導度値の差として求めることができる。ΔＣまたはΔＣｐの値が大きいほど抗体単量体とその重合体の分離能が高い。
【００９８】
また、吸着性を示す指標の一つとして、例えば１０％動的結合容量（ＤＢＣ）が挙げられる。１０％動的結合容量は、濃度既知の抗体を含む溶液を、陽イオン交換クロマトグラフィー担体を充填したカラムに添加し、溶出液の吸光度をモニターし、添加したサンプルの吸光度の１０％の漏出が見られた時点の添加タンパク質量から算出される。１０％動的結合容量の値が大きいほど抗体の吸着性が高い。
【実施例】
【００９９】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、実施例および比較例におけるイオン交換容量、ポリクローナル抗体の１０％動的結合容量、Ｓ含量、Ｎ含量、Ｎａ含量、分離度ΔＣおよびΔＣｐは測定法１〜７に記載の方法により測定した。【０１００】
＜参考例１＞
〔６％球状セルロース粒子（含水）の製造〕
（１）１００ｇのチオシアン酸カルシウム６０重量％水溶液に６．４ｇの結晶性セルロース（旭化成ケミカルズ株式会社製、商品名：セオラスＰＨ１０１）を加え、１１０〜１２０℃に加熱して溶解した。
（２）この溶液に界面活性剤としてソルビタンモノオレエート６ｇを添加し、１３０〜１４０℃に予め加熱したｏ−ジクロロベンゼン４８０ｍｌ中に滴下し、２００〜３００ｒｐｍにて攪拌分散した。
（３）次いで、上記分散液を４０℃以下まで冷却し、メタノール１９０ｍｌ中に注ぎ、粒子の懸濁液を得た。
（４）この懸濁液を濾過分別し、粒子をメタノール１９０ｍｌにて洗浄し、濾過分別した。この洗浄操作を数回行った。
（５）さらに大量の水で洗浄した後、球状セルロース粒子を得た。
（６）次いで、この球状セルロース粒子をＪＩＳ標準ふるい規格５３μｍ〜１２５μｍのふるいにかけて、所望の粒子径（実粒子サイズ間隔５０〜１５０μｍ、平均粒子径約１００μｍ）にし、目的の６％球状セルロース粒子（含水：セルロース溶解濃度６％）を得た。なお、ここでの平均粒子径は、光学顕微鏡で撮影した画像の粒子径を、ノギスなどを用いて計測して撮影倍率から元の粒子径を求め、それぞれの粒子径の値から、下記の式によって算出して求めた。
体積平均粒子径（ＭＶ）＝Σ（ｎｄ４）／Σ（ｎｄ３）
［式中、ｎｄは光学顕微鏡写真から求めたそれぞれの粒子径の値を表し、ｎは測定した粒子の個数を表す。］【０１０１】
〔架橋６％セルロース粒子の調製〕
（１）上記で得られた６％球状セルロース粒子（含水）１００ｇに１２１ｇの純水を加え、攪拌しながら加温した。３０℃に到達したところで４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．３ｇとＮａＢＨ４０．５ｇとを加え、撹拌した。初期アルカリ濃度は０．６９％（ｗ／ｗ）であった。
（２）３０分後、６０ｇのＮａ２ＳＯ４を反応液に加え、溶解させた。混合物の温度が５０℃に到達した時点で、２時間撹拌を継続した。
（３）５０℃で混合物の撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液４８ｇと、エピクロロヒドリン５０ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、この混合物を温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）この混合物を温度４０℃以下に冷却した後、酢酸２．６ｇを加え、中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の架橋６％セルロース粒子を得た。この時、株式会社堀場製作所のレーザ回折／散乱式の粒子径分布測定装置ＬＡ−９５０を用いて分析した平均粒子径は８５μｍであった。また、重量平均分子量１．５×１０５Ｄａの標準ポリエチレンオキシドにおいて純水を移動相として使用したときのゲル分配係数Ｋａｖは０．３８であった。【０１０２】
＜参考例２＞
〔１０％球状セルロース粒子（含水）の製造〕
（１）３１３ｇのチオシアン酸カルシウム６０重量％水溶液に３４．８ｇの結晶性セルロース（旭化成ケミカルズ株式会社製、商品名：セオラスＰＨ３０１）を加え、１１０〜１２０℃に加熱して溶解した。
（２）この溶液に界面活性剤としてソルビタンモノオレエート１．８３ｇを添加し、１３０〜１４０℃に予め加熱したｏ−ジクロロベンゼン４８０ｍｌ中に滴下し、２００〜３００ｒｐｍにて攪拌分散した。
（３）次いで、上記分散液を４０℃以下まで冷却し、メタノール５３３ｍｌ中に注ぎ、粒子の懸濁液を得た。
（４）この懸濁液を濾過分別し、粒子をメタノール６２０ｍｌにて洗浄し、濾過分別した。この洗浄操作を数回行った。
（５）さらに大量の水で洗浄した後、球状セルロース粒子を得た。
（６）次いで、この球状セルロース粒子をＪＩＳ標準ふるい規格５３μｍ〜１２５μｍのふるいにかけて、所望の粒子径（実粒子サイズ間隔５０〜１５０μｍ、平均粒子径約１００μｍ）にし、目的の１０％球状セルロース粒子（含水：セルロース溶解濃度１０％）を得た。ここでの平均粒子径は、参考例１の「６％球状セルロース粒子（含水）の製造」において述べた方法と同様の方法で求めた。【０１０３】
〔架橋１０％セルロース粒子の調製〕
（１）上記で得られた１０％球状セルロース粒子（含水）１００ｇに１９９ｇの純水を加え、攪拌しながら加温した。３０℃に到達したところで４５重量％のＮａＯＨ水溶液４．４６ｇとＮａＢＨ４０．７１ｇとを加え、撹拌した。初期アルカリ濃度は０．６９％（ｗ／ｗ）であった。
（２）３０分後、８１ｇのＮａ２ＳＯ４を反応液に加え、溶解させた。混合物の温度が５０℃に到達した時点で、２時間撹拌を継続した。
（３）５０℃で混合物の撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液６２ｇと、エピクロロヒドリン６４ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、この混合物を温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）この混合物を温度４０℃以下に冷却した後、酢酸３．３ｇを加え、中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の架橋１０％セルロース粒子を得た。この時、株式会社堀場製作所のレーザ回折／散乱式の粒子径分布測定装置ＬＡ−９５０を用いて分析した平均粒子径は９３μｍであった。また、重量平均分子量１．５×１０５Ｄａの標準ポリエチレンオキシドにおいて純水を移動相として使用したときのゲル分配係数Ｋａｖは０．２７であった。【０１０４】
＜実施例１＞
５００ｍｌセパラブルフラスコに純水６４．４ｇと２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸８．７ｇ加え溶解させた。次に４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液３．４ｇ加え中和した。次に参考例１の架橋６％セルロース粒子８０．０ｇを加えスラリーとした。この状態でセパラブルフラスコ内に窒素を吹き込みながら１時間攪拌した。１時間後、硝酸アンモニウムセリウム５．１９ｇを０．１７ｍｏｌ／ｍｌ硝酸１８．１ｍｌに溶解させた溶液を滴下ロートからゆっくりセパラブルフラスコ内に加えた。滴下終了後４０℃に昇温し、２２時間攪拌した。２２時間後攪拌を止めスラリーを吸引ろ過した。得られた湿ゲルを８０ｍｌの純水で５回洗浄した。次に１ｍｏｌ／Ｌ硫酸１２０ｍｌで１０回洗浄したあと純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。このときの湿ゲルの一部を取り出し別途イオン交換容量の測定に使用した。その後０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１６０ｍｌで洗浄した。最後に純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。得られた湿ゲルは余分な水分を取り除いた状態で保存した。このときのイオン交換容量は１１０μｍｏｌ／ｍｌ、ポリクローナル抗体の１０％動的結合容量は６１ｍｇ／ｍｌ、Ｓ含量は３．１％（ｗ／ｗ）、ΔＣは６．６ｍＳ／ｃｍ、ΔＣｐは２６ｍＳ／ｃｍであった。【０１０５】
＜実施例２＞
５００ｍｌセパラブルフラスコに純水６４．４ｇと２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸８．７ｇ加え溶解させた。次に４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液３．４ｇ加え中和した。次にＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド２．３ｇを加えた。次に参考例１の架橋６％セルロース粒子８０．０ｇを加えスラリーとした。この状態でセパラブルフラスコ内に窒素を吹き込みながら１時間攪拌した。１時間後、硝酸アンモニウムセリウム５．１９ｇを０．１７ｍｏｌ／ｍｌ硝酸に溶解させた溶液を滴下ロートからゆっくりセパラブルフラスコ内に加えた。滴下終了後４０℃に昇温し、２２時間攪拌した。２２時間後攪拌を止めスラリーを吸引ろ過した。得られた湿ゲルを８０ｍｌの純水で５回洗浄した。次に１ｍｏｌ／Ｌ硫酸１２０ｍｌで１０回洗浄したあと純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。このときの湿ゲルの一部を取り出し別途イオン交換容量の測定に使用した。その後０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１６０ｍｌで洗浄した。最後に純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。得られた湿ゲルは余分な水分を取り除いた状態で保存した。このときのイオン交換容量は１２６μｍｏｌ／ｍｌ、ポリクローナル抗体の１０％動的結合容量は１１４ｍｇ／ｍｌ、Ｓ含量は２．８％（ｗ／ｗ）、Ｎ含量は２．１％、ΔＣは６．１ｍＳ／ｃｍ、ΔＣｐは２２ｍＳ／ｃｍであった。【０１０６】
＜実施例３＞
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドの仕込み量を４．５ｇに変えたことを除いて実施例２と同様に湿ゲルを得た。このときのイオン交換容量は１３０μｍｏｌ／ｍｌ、ポリクローナル抗体の１０％動的結合容量は１１９ｍｇ／ｍｌ、Ｓ含量は２．６％（ｗ／ｗ）、Ｎ含量は２．９％（ｗ／ｗ）、ΔＣｐは１８ｍＳ／ｃｍであった。【０１０７】
＜実施例４＞
５００ｍｌセパラブルフラスコに純水５０．６ｇと２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸３．０ｇ加え溶解させた。次に４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液１．２ｇ加え中和した。次にＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド０．６２ｇを加えた。次に参考例１の架橋６％セルロース粒子６０．０ｇを加えスラリーとした。この状態でセパラブルフラスコ内に窒素を吹き込みながら１時間攪拌した。１時間後、硝酸アンモニウムセリウム３．７ｇを０．１７ｍｏｌ／ｍｌ硝酸１３．９ｍｌに溶解させた溶液を滴下ロートからゆっくりセパラブルフラスコ内に加えた。滴下終了後４０℃に昇温し、２２時間攪拌した。２２時間後攪拌を止めスラリーを吸引ろ過した。得られた湿ゲルを６０ｍｌの純水で５回洗浄した。次に１ｍｏｌ／Ｌ硫酸９０ｍｌで１０回洗浄したあと純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。このときの湿ゲルの一部を取り出し別途イオン交換容量の測定に使用した。その後０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１２０ｍｌで洗浄した。最後に純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。得られた湿ゲルは余分な水分を取り除いた状態で保存した。このときのイオン交換容量は６６μｍｏｌ／ｍｌ、ポリクローナル抗体の１０％動的結合容量は７３ｍｇ／ｍｌ、Ｓ含量は１．７％（ｗ／ｗ）、Ｎ含量は１．２％、ΔＣは６．８ｍＳ／ｃｍ、ΔＣｐは２２ｍＳ／ｃｍであった。【０１０８】
＜実施例５＞
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸の仕込み量を１２．２ｇに、４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液の仕込みを４．８５ｇに、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドの仕込み量を６．４ｇに変えたことを除いて実施例４と同様に湿ゲルを得た。このときのイオン交換容量は２１０μｍｏｌ／ｍｌ、ポリクローナル抗体の１０％動的結合容量は１０１ｍｇ／ｍｌ、Ｓ含量は３．８％（ｗ／ｗ）、Ｎ含量は４．２％（ｗ／ｗ）、ΔＣｐは１７ｍＳ／ｃｍであった。【０１０９】
＜実施例６＞
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸の仕込み量を１３．１ｇに、４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液の仕込みを５．２ｇに、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドの仕込み量を５．３０ｇに変えたことを除いて実施例２と同様に湿ゲルを得た。このときのイオン交換容量は１７２μｍｏｌ／ｍｌ、ポリクローナル抗体の１０％動的結合容量は９３ｍｇ／ｍｌ、Ｓ含量は３．２％（ｗ／ｗ）、Ｎ含量は３．５％（ｗ／ｗ）、ΔＣは５．８ｍＳ／ｃｍ、ΔＣｐは１８ｍＳ／ｃｍであった。【０１１０】
＜比較例Ａ＞
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドの仕込み量を１０．１ｇに変えたことを除いて実施例２と同様に湿ゲルを得た。このときのイオン交換容量は１３０μｍｏｌ／ｍｌ、ポリクローナル抗体の１０％動的結合容量は１２５ｍｇ／ｍｌ、Ｓ含量は２．３％（ｗ／ｗ）、Ｎ含量は４．１％（ｗ／ｗ）、ΔＣｐは１３ｍＳ／ｃｍであった。【０１１１】
＜比較例Ｂ＞
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸の仕込み量を１２．６ｇに、４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液の仕込みを５．０ｇに、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドの仕込み量を２３．２ｇに変えたことを除いて実施例２と同様に湿ゲルを得た。このときのイオン交換容量は１０２μｍｏｌ／ｍｌ、ポリクローナル抗体の１０％動的結合容量は５ｍｇ／ｍｌ、Ｓ含量は２．６％（ｗ／ｗ）、Ｎ含量は６．２％（ｗ／ｗ）であった。【０１１２】
＜比較例Ｃ＞
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸の仕込み量を１８．５ｇに、４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液の仕込みを７．３５ｇに、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドの仕込み量を８．４９ｇに変えたことを除いて実施例４と同様に湿ゲルを得た。このときのイオン交換容量は３１８μｍｏｌ／ｍｌ、ポリクローナル抗体の１０％動的結合容量は４４ｍｇ／ｍｌ、Ｓ含量は４．６％（ｗ／ｗ）、Ｎ含量は４．９％（ｗ／ｗ）、ΔＣｐは１９ｍＳ／ｃｍであった。【０１１３】
＜比較例Ｄ＞
５００ｍｌセパラブルフラスコに純水３３．３ｇと２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸１．２５ｇ加え溶解させた。次に４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液０．４９ｇ加え中和した。次にアクリル酸０．１４ｇを加えた。次に参考例１の架橋６％セルロース粒子４０．０ｇを加えスラリーとした。この状態でセパラブルフラスコ内に窒素を吹き込みながら１時間攪拌した。１時間後、硝酸アンモニウムセリウム２．４５ｇを０．１７ｍｏｌ／ｍｌ硝酸９．２ｍｌに溶解させた溶液を滴下ロートからゆっくりセパラブルフラスコ内に加えた。滴下終了後４０℃に昇温し、２２時間攪拌した。２２時間後攪拌を止めスラリーを吸引ろ過した。得られた湿ゲルを４０ｍｌの純水で５回洗浄した。次に１ｍｏｌ／Ｌ硫酸６０ｍｌで１０回洗浄したあと純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。このときの湿ゲルの一部を取り出し別途イオン交換容量の測定に使用した。その後０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液８０ｍｌで洗浄した。最後に純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。得られた湿ゲルは余分な水分を取り除いた状態で保存した。このときのイオン交換容量は４８μｍｏｌ／ｍｌ、ポリクローナル抗体の１０％動的結合容量は４５ｍｇ／ｍｌ、Ｓ含量は０．９５％（ｗ／ｗ）、Ｎａ含量は１．１％、ΔＣは６．６ｍＳ／ｃｍ、ΔＣｐは２３ｍＳ／ｃｍであった。【０１１４】
＜実施例７＞
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸の仕込み量を２．０２ｇに、４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液の仕込み量を０．８２ｇに、アクリル酸の仕込み量を０．３９ｇに変えたことを除いて比較例Ｄと同様に湿ゲルを得た。このときのイオン交換容量は９７μｍｏｌ／ｍｌ、ポリクローナル抗体の１０％動的結合容量は７７ｍｇ／ｍｌ、Ｓ含量は１．５％（ｗ／ｗ）、Ｎａ含量は２．０％（ｗ／ｗ）、ΔＣは６．５ｍＳ／ｃｍ、ΔＣｐは２２ｍＳ／ｃｍであった。【０１１５】
＜実施例８＞
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸の仕込み量を４．０７ｇに、４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液の仕込みを１．６２ｇに、アクリル酸の仕込み量を１．５６ｇに変えたことを除いて比較例Ｄと同様に湿ゲルを得た。このときのイオン交換容量は２４６μｍｏｌ／ｍｌ、ポリクローナル抗体の１０％動的結合容量は７０ｍｇ／ｍｌ、Ｓ含量は２．３％（ｗ／ｗ）、Ｎａ含量は４．８％（ｗ／ｗ）、ΔＣは４．７ｍＳ／ｃｍ、ΔＣｐは１９ｍＳ／ｃｍであった。【０１１６】
＜実施例９＞
５００ｍｌセパラブルフラスコに純水３２．７ｇと２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸２．１６ｇを加え溶解させた。次に４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液０．８６ｇ加え中和した。次に参考例１の架橋６％セルロース粒子４０．０ｇを加えスラリーとした。この状態でセパラブルフラスコ内に窒素を吹き込みながら１時間攪拌した。１時間後、硝酸アンモニウムセリウム２．６０ｇを０．１７ｍｏｌ／ｍｌ硝酸９．１ｍｌに溶解させた溶液を滴下ロートからゆっくりセパラブルフラスコ内に加えた。滴下終了後４０℃に昇温し、２２時間攪拌した。２２時間後攪拌を止めスラリーを吸引ろ過した。得られた湿ゲルを４０ｍｌの純水で５回洗浄した。次に１ｍｏｌ／Ｌ硫酸６０ｍｌで１０回洗浄したあと純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。このときの湿ゲルの一部を取り出し別途イオン交換容量の測定に使用した。その後０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液８０ｍｌで洗浄した。最後に純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。得られた湿ゲルは余分な水分を取り除いた状態で保存した。このときのイオン交換容量は６０μｍｏｌ／ｍｌ、ポリクローナル抗体の１０％動的結合容量は５３ｍｇ／ｍｌ、Ｓ含量は１．６％（ｗ／ｗ）、ΔＣは６．３ｍＳ／ｃｍ、ΔＣｐは２６ｍＳ／ｃｍであった。【０１１７】
＜実施例１０＞
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸の仕込み量を４．０７ｇに、４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液の仕込み量を１．６２ｇに変えたことを除いて実施例１と同様に湿ゲルを得た。このときのイオン交換容量は２４０μｍｏｌ／ｍｌ、ポリクローナル抗体の１０％動的結合容量は３８ｍｇ／ｍｌ、Ｓ含量は５．１％（ｗ／ｗ）、ΔＣｐは２５ｍＳ／ｃｍであった。【０１１８】
＜比較例Ｅ＞
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸の仕込み量を１９．４ｇに、４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液の仕込み量を７．７０ｇに変えたことを除いて実施例９と同様に湿ゲルを得た。このときのイオン交換容量は４０４μｍｏｌ／ｍｌ、ポリクローナル抗体の１０％動的結合容量は２６ｍｇ／ｍｌ、Ｓ含量は７．４％（ｗ／ｗ）、ΔＣは７．９ｍＳ／ｃｍ、ΔＣｐは２５ｍＳ／ｃｍであった。【０１１９】
＜実施例１１＞
５００ｍｌセパラブルフラスコに純水６６．４ｇと３−スルホプロピルメタクリレートカリウム塩７．０２ｇを加え溶解させた。次に参考例１の架橋６％セルロース粒子８０．０ｇを加えスラリーとした。この状態でセパラブルフラスコ内に窒素を吹き込みながら１時間攪拌した。１時間後、硝酸アンモニウムセリウム５．２０ｇを０．１７ｍｏｌ／ｍｌ硝酸１８．１ｍｌに溶解させた溶液を滴下ロートからゆっくりセパラブルフラスコ内に加えた。滴下終了後４０℃に昇温し、２２時間攪拌した。２２時間後攪拌を止めスラリーを吸引ろ過した。得られた湿ゲルを８０ｍｌの純水で５回洗浄した。次に１ｍｏｌ／Ｌ硫酸１２０ｍｌで１０回洗浄したあと純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。このときの湿ゲルの一部を取り出し別途イオン交換容量の測定に使用した。その後０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１６０ｍｌで洗浄した。最後に純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。得られた湿ゲルは余分な水分を取り除いた状態で保存した。このときのイオン交換容量は１２４μｍｏｌ／ｍｌ、ポリクローナル抗体の１０％動的結合容量は４５ｍｇ／ｍｌ、ΔＣｐは２８ｍＳ／ｃｍであった。【０１２０】
＜実施例１２＞
５００ｍｌセパラブルフラスコに純水９１．５ｇと２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸４．２０ｇを加え溶解させた。次に４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液１．６７ｇ加え中和した。次に参考例２の架橋１０％セルロース粒子５０．０ｇを加えスラリーとした。この状態でセパラブルフラスコ内に窒素を吹き込みながら１時間攪拌した。１時間後、硝酸アンモニウムセリウム５．０７ｇを０．１７ｍｏｌ／ｍｌ硝酸１７．７ｍｌに溶解させた溶液を滴下ロートからゆっくりセパラブルフラスコ内に加えた。滴下終了後４０℃に昇温し、２２時間攪拌した。２２時間後攪拌を止めスラリーを吸引ろ過した。得られた湿ゲルを５０ｍｌの純水で５回洗浄した。次に１ｍｏｌ／Ｌ硫酸７５ｍｌで１０回洗浄したあと純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。このときの湿ゲルの一部を取り出し別途イオン交換容量の測定に使用した。その後０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１００ｍｌで洗浄した。最後に純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。得られた湿ゲルは余分な水分を取り除いた状態で保存した。このときのイオン交換容量は１１１μｍｏｌ／ｍｌ、ポリクローナル抗体の１０％動的結合容量は３８ｍｇ／ｍｌ、Ｓ含量は１．５％（ｗ／ｗ）、ΔＣｐは２４ｍＳ／ｃｍであった。【０１２１】
［測定法１］
ポリクローナル抗体を用いた１０％動的結合容量（ＤＢＣ）の測定
（１）使用機器および試薬
ＬＣシステム      ：ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ（登録商標）
バッファー        ：酢酸バッファーｐＨ５．０、０．０５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ
ポリクローナル抗体：γ−グロブリン、人血清由来（和光純薬）
カラム            ：直径５ｍｍ、長さ５ｃｍ
（２）測定方法
まず抗体をバッファーに溶かし１ｍｇ／ｍｌの抗体溶液を作製した。そしてカラムにイオン交換基を付加したゲルを隙間のないよう充填した。次にカラムをシステムに接続しバッファーを用いて、カラム流出液のＵＶ（紫外線吸光度、２８０ｎｍ）と電気伝導度、ｐＨが一定になるまで流速１ｍＬ／分で平衡化した。その後、ベースラインのＵＶをゼロにした。次にカラムに抗体溶液を流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで流した。カラム流出液のＵＶをモニターし、カラム流出液のＵＶが、予め測定しておいた抗体溶液のＵＶの１０％に達した時点で抗体溶液を流すのを止めた。以下の式により１０％動的結合容量を求めた。なお、この分析は２５℃の部屋で行った。
｛抗体溶液濃度（ｍｇ／ｍｌ）×抗体溶液を流し始めてから終えるまでの時間（ｍｉｎ）×流速（ｍｌ／ｍｉｎ）−デッドボリューム｝／カラム体積＝１０％動的結合容量（ｍｇ／ｍｌ）
ここで、デッドボリュームは、システム配管体積とカラム空隙体積を足した体積（ｍｌ）である。【０１２２】
［測定法２］
重合体を含むモノクローナル抗体を用いた分離度（ΔＣ）の測定
（１）使用機器および試薬
ＬＣシステム  ：ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ（登録商標）
Ａバッファー  ：クエン酸バッファーｐＨ５．０
Ｂバッファー  ：クエン酸バッファーｐＨ５．０、０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ
カラム        ：直径５ｍｍ、長さ５ｃｍ
（２）分離度（ΔＣ）の測定
ゲルを充填したカラムをシステムに接続しＡバッファーを８０容量％、Ｂバッファーを２０容量％の混合溶液からなる平衡化緩衝液で平衡化した。１ｍｌのモノクローナル抗体溶液をカラムへアプライした。アプライ終了後、５カラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通液した。Ｂバッファーの割合を３０カラム容量かけて２０容量％から１００容量％まで増加させ、吸着したモノクローナル抗体を溶出した。流速はすべて０．６６ｍｌ／ｍｉｎで実施した。
（３）分離度（ΔＣ）の計算方法
（２）の分析によって単量体および重合体のピークが得られた。単量体のピークトップに対応する電気伝導度をＣ１（ｍＳ／ｃｍ）、重合体のピークトップに対応する電気伝導度をＣ２（ｍＳ／ｃｍ）とし、以下の式よりΔＣを求めた。
ΔＣ（ｍＳ／ｃｍ）＝Ｃ２（ｍＳ／ｃｍ）−Ｃ１（ｍＳ／ｃｍ）
（４）精製結果
本分離度（ΔＣ）の測定により得られた実施例１および実施例２のゲルを用いたモノクローナル抗体の分析結果（クロマトグラム）をそれぞれ図１および図２に示す。【０１２３】
［測定法３］
変性ポリクローナル抗体を用いた分離度（ΔＣｐ）の測定
（１）使用機器および試薬
ＬＣシステム          ：ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ（登録商標）
Ａバッファー          ：酢酸バッファーｐＨ５．０、０．０５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ
Ｂバッファー          ：酢酸バッファーｐＨ５．０、１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ
変性ポリクローナル抗体：（２）に記載
カラム                ：直径５ｍｍ、長さ５ｃｍ
（２）変性ポリクローナル抗体の作製方法
変性ポリクローナル抗体はＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、  ２０１１、  １００、２１０４−２１１９記載の方法に従って作製した。すなわち、２ｍｇのγ−グロブリン、人血清由来（和光純薬）を２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸／クエン酸バッファーｐＨ３．５、１ｍｌに溶かした。ブロックヒーターを用いて５５℃で１５分加熱した。その後、氷浴で冷やした。ＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア）を用い、酢酸バッファーｐＨ５．０、０．０５ＭのＮａＣｌにバッファー交換を行った。変性ポリクローナル抗体の生成の確認はゲルろ過クロマトグラフィーを用いて行った。使用するまでは冷蔵で保存した。
（３）分離度（ΔＣｐ）の測定
ゲルを充填したカラムをシステムに接続しＡバッファーで平衡化した。サンプルループを用いて１ｍｌの変性ポリクローナル抗体溶液をカラムへアプライした。未吸着部分を洗浄後、Ｂバッファーの割合を１２０分かけて０容量％から１００容量％まで増加させた。流速はすべて０．５ｍｌ／ｍｉｎで実施した。
（４）分離度（ΔＣｐ）の計算方法
（３）の分析によって二つのピークが得られた。前のピークのピークトップの溶出容量に対応する電気伝導度をＣ１（ｍＳ／ｃｍ）、後ろのピークのピークトップに対応する電気伝導度をＣ２（ｍＳ／ｃｍ）とし、以下の式よりΔＣｐを求めた。
ΔＣｐ（ｍＳ／ｃｍ）＝Ｃ２（ｍＳ／ｃｍ）−Ｃ１（ｍＳ／ｃｍ）【０１２４】
［測定法４］
イオン交換容量の測定
実施例１〜１２および比較例Ａ〜Ｄにおいては、硫酸洗浄後、純水洗浄したゲル１ｍｌをビーカーに加え、０．０１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液４０ｍｌとフェノールフタレイン溶液１滴を加えた。この溶液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を溶液の色が透明になるまで加えた。透明になるまで加えた塩酸量をＡｍｌとすると、各ゲル１ｍｌあたりのイオン交換容量（ＩＥＣ）は、次式：
（０．０１×４０/１０００−０．１×Ａ／１０００）×１００００００（μｍｏｌ／ｍｌ）
で求めることができる。
比較例Ｅにおいては、０．０１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液の量を４０ｍｌから６０ｍｌに変更し、その他は上記と同様にして溶液を調製した。比較例Ｅで得られたゲル１ｍｌのイオン交換容量は、次式：
（０．０１×６０/１０００−０．１×Ａ／１０００）×１００００００（μｍｏｌ／ｍｌ）
で求めることができる。【０１２５】
［測定法５］
Ｓ含量の測定
実施例１〜１０、１２、比較例Ａ〜Ｅのゲルを乾燥させＩＣＰ（ＩＮＤＵＣＴＩＶＥＬＹ  ＣＯＵＰＬＥＤ  ＰＬＡＳＭＡ）発光分光分析により乾燥重量あたりのＳ含量（重量％）を求めた。【０１２６】
［測定法６］
Ｎ含量の測定
実施例２〜６および比較例Ａ〜Ｃのゲルを乾燥させＣＨＮ（Ｃａｒｂｏｎ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ）元素分析により乾燥重量あたりのＮ含量（重量％）を求めた。【０１２７】
［測定法７］
Ｎａ含量の測定
実施例７、８および比較例Ｄのゲルを乾燥させ原子吸光分析により乾燥重量あたりのＮａ含量（重量％）を求めた。【０１２８】
［Ｓ密度の計算法］
（ｉ）実施例１〜６および比較例Ａ〜Ｃ
測定法４、測定法５で測定したＳ含量、Ｎ含量の値を使用し、以下の式から共重合ポリマー中の強カチオン性モノマー単位の割合（ｓ密度）を求めた。
｛（Ｓ含量／３２）／（Ｎ含量／１４）｝×１００（％）
（ｉｉ）実施例７、８および比較例Ｄ
測定法４、測定法７で測定したＳ含量、Ｎａ含量の値を使用し、以下の式から共重合ポリマー中の強カチオン性モノマー単位の割合（Ｓ密度）を求めた。
（Ｓ含量／３２）／（Ｎａ含量／２３）×１００（％）
なお、上記実施例では、強カチオン性モノマーとして式（１）で示されるモノマー単位を用いているため、便宜上、上式で示されるＳ密度を求めることで、共重合ポリマー中に含まれる強カチオン性モノマー単位の割合を概算することができる。【０１２９】
各実施例および比較例の結果を表１〜３に示す。
表１において、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー担体の動的吸着容量と分離特性に及ぼす中性モノマー導入の影響を示す。
【表１】
2014061411.tif 000010
【０１３０】
表２において、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー担体の動的吸着容量と分離特性に及ぼす弱カチオンモノマー導入の影響を示す。
【表２】
2014061411.tif 000011
【０１３１】
表３において、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィー担体の動的吸着容量と分離特性に及ぼす強カチオンモノマー導入量、強カチオンモノマーの構造の違いおよび架橋セルロース粒子のＫａｖの違いの影響を示す。
【表３】
2014061411.tif 000012
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明の抗体精製用陽イオン交換クロマトグラフィー担体は、抗体医薬の製造過程で生産される抗体単量体とその重合体を効率的に分離することができるため、バイオ医薬品の精製などにおいて好適に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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