【手続補正書】
【提出日】平成27年1月19日(2015.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応領域と、検出領域と、が設けられ、
前記検出領域に銅が収容されている核酸解析用マイクロチップ。
【請求項２】
前記銅が固形銅である請求項１記載の核酸解析用マイクロチップ。
【請求項３】
前記検出領域に塩が収容されている請求項１又は２記載の核酸解析用マイクロチップ。
【請求項４】
前記塩の収容量が、核酸を含むサンプル液を前記検出領域へ導入した後の終濃度で５０ｍＭ以上に設定されている請求項３記載の核酸解析用マイクロチップ。
【請求項５】
前記固形銅が、前記検出領域内にスパッタリング、蒸着又は塗布されている請求項２〜４のいずれかに記載の核酸解析用マイクロチップ。
【請求項６】
前記塩が、塩化ナトリウム又は塩化カリウムである請求項３又は４記載の核酸解析用マイクロチップ。
【請求項７】
前記反応領域が、前記核酸の増幅反応、電気泳動、ハイブリダイゼーション反応又はバイサルファイト反応の反応場である請求項１〜６のいずれかに記載の核酸解析用マイクロチップ。
【請求項８】
前記反応領域への前記サンプル液の導入部と、前記反応領域と前記検出領域とを接続する流路と、を有する請求項７記載の核酸解析用マイクロチップ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
上記課題解決のため、本技術は、反応領域と、検出領域と、が設けられ、前記検出領域に銅が収容されている核酸解析用マイクロチップを提供する。
この核酸解析用マイクロチップにおいて、前記銅は、固形銅であってよく、前記検出領域内にスパッタリング、蒸着又は塗布されているものとできる。
この核酸解析用マイクロチップでは、銅と接触して複合体を形成した核酸から発生する蛍光を検出することによって核酸を光学的に分析できる。
この核酸解析用マイクロチップにおいて、前記検出領域には、必要に応じて塩化ナトリウム及び塩化カリウムなどの塩が収容される。前記塩の収容量は、核酸を含むサンプル液を前記検出領域へ導入した後の終濃度で５０ｍＭ以上に設定されることが好ましい。
この核酸解析用マイクロチップにおいて、前記反応領域は、前記核酸の増幅反応、電気泳動、ハイブリダイゼーション反応又はバイサルファイト反応の反応場であってよい。また、この核酸解析用マイクロチップは、前記反応領域への前記サンプル液の導入部と、前記反応領域と前記検出領域とを接続する流路と、を有するものとできる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
以下、本技術を実施するための好適な形態について詳細に説明する。以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．本技術の第一実施形態に係る核酸解析用マイクロチップ
（１）全体構成
（２）反応領域
（３）検出領域
［銅］
［塩］
（４）核酸解析方法
［増幅反応後の核酸解析］
［電気泳動後の核酸解析］
［ハイブリダイゼーション反応後の核酸解析］
［バイサルファイト反応後の核酸解析］
２．本技術の第二実施形態に係る核酸解析用マイクロチップ
（１）全体構成
（２）核酸解析方法
３．本技術の第三実施形態に係る核酸解析用マイクロチップ
４．本技術の第四実施形態に係る核酸解析用マイクロチップ
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
（２）反応領域
反応領域３は、核酸の増幅反応、電気泳動、ハイブリダイゼーション反応又はバイサルファイト反応等の核酸反応の反応場である。解析対象とする核酸を含むサンプル液は、導入部２から導入され、流路５１を送液されて反応領域３に導入される。導入部２は、例えばマイクロチップ１ａの上面に設けられた開口であってよい。また、導入部２は、例えばマイクロチップ１ａを構成する基板層に注射針等を穿通させ、注射針が取り付けられたシリンジからチップ内へサンプル液を注入するための穿刺部位であってもよい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
サンプル液を反応領域３に導入した後、所定の核酸反応を行う。核酸反応は、核酸の増幅反応、電気泳動、ハイブリダイゼーション反応又はバイサルファイト反応等であってよい。これらの核酸反応は従来公知の手法によって行うことが可能である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
［バイサルファイト反応後の核酸解析］
反応領域３において核酸のバイサルファイト反応を行った後、検出領域４において核酸の蛍光を検出することで、核酸の塩基配列中のシトシン（C）のメチル化の有無を解析できる。ＤＮＡ分子のうちシトシン（C）は、細胞内のゲノム中においてメチル化されることが知られている。シトシン（C）のメチル化の有無は、バイサルファイト反応においてウラシル（U）に置換されるかどうかで検出することが可能である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
反応領域３において適切な条件下で核酸のバイサルファイト（亜硫酸水素塩）処理を行う。これにより、メチル化されていないシトシン（C）のみを選択的にウラシル（U）に変換できる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
核酸と銅との複合体に由来する蛍光は、ウラシルとチミンで強度が高く、シトシン及びメチル化シトシンでは検出されない（実施例参照）。従って、バイサルファイト処理によってサンプルに含まれる核酸中の非メチル化シトシンを選択的にウラシルに変換した後、検出領域４においてサンプルから検出される蛍光の強度及び／又はスペクトルの変化量を調べることで、核酸中のシトシンのメチル化あるいは脱メチル化の有無及び量を解析できる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
メチル化解析は、バイサルファイト処理前のサンプル及び処理後のサンプルから検出される蛍光の強度及び／又はスペクトルを比較することによって行う。メチル化されていないシトシンの量が多いほど、バイサルファイト処理によって生じるウラシルの量が多くなるため、バイサルフェート処理前後のサンプルの蛍光を比較することにより、核酸中のシトシンのメチル化あるいは脱メチル化の有無及び量についての情報を得ることができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
合流部３３と合流部３４の間の泳動チャネル３２には、電気泳動のためのゲルが充填される。あるいは泳動チャネル３２の同部位には、ゲルの代替として電気泳動のためのナノピラー構造を設けるとともに、電気泳動用の緩衝液を満たしてもよい。ゲル及び緩衝液は、銅（II）イオンを安定化するキレート剤などの成分（例えば、EDTAやTrisなど）を含まないものを用いることが好ましい。緩衝液には、例えばHEPPSO, EPPS, POPSO, TAPS, PIPES, TAPS, CAPSなどのバッファーを用いることができる。なお、合流部３４と電極３２２との間にもゲルもしくはバッファーを充填してもよい。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
本技術に係る核酸解析用マイクロチップは以下のような構成をとることもできる。
（１）反応領域と、検出領域と、が設けられ、前記検出領域に銅が収容されている核酸解析用マイクロチップ。
（２）前記銅が固形銅である上記（１）記載の核酸解析用マイクロチップ。
（３）前記検出領域に塩が収容されている上記（１）又は（２）記載の核酸解析用マイクロチップ。
（４）前記塩の収容量が、核酸を含むサンプル液を前記検出領域へ導入した後の終濃度で５０ｍＭ以上となるように設定されている上記（３）記載の核酸解析用マイクロチップ。
（５）前記固形銅が、前記検出領域内にスパッタリング、蒸着又は塗布されている上記（２）〜（４）のいずれかに記載の核酸解析用マイクロチップ。
（６）前記塩が、塩化ナトリウム又は塩化カリウムである上記（３）又は（４）記載の核酸解析用マイクロチップ。
（７）前記反応領域が、前記核酸の増幅反応、電気泳動、ハイブリダイゼーション反応又はバイサルファイト反応の反応場である上記（１）〜（６）のいずれかに記載の核酸解析用マイクロチップ。
（８）前記反応領域への前記サンプル液の導入部と、前記反応領域と前記検出領域とを接続する流路と、を有する上記（７）記載の核酸解析用マイクロチップ。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
＜結果＞
ssDNAについて、S.A.濃度50mMの条件下でCuSO4の濃度を変化させて取得された蛍光スペクトル及びRFU値を、図５及び図６にそれぞれ示す。（Ａ）は蛍光スペクトルを示し、（Ｂ）はピークRFU値を示す。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
これらの結果から、銅を用いた蛍光の検出によって、ウラシルを、シトシン及びメチル化シトシンから識別可能であることが示された。このことは、本発明に係る核酸検出方法によれば、バイサルファイト反応によるシトシン（C）のウラシル（U）への置換を検出し、ＤＮＡ分子のメチル化の解析を行うことが可能であることが示唆された。