(57)【要約】  新たな抗癌剤、抗癌剤の組み合わせによる新たな癌の治療方法及び新たな抗癌剤と放射線療法の組み合わせによる新たな癌の治療方法、並びに新たなＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を提供することを解決すべき課題とした。  ＧＥＭと組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧ、放射線療法と組み合わせて投与されるＭＧＤＧが癌細胞増殖抑制活性及び抗腫瘍活性を有することを確認し、さらに、リン酸化ＧＥＭと組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧがＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害を有することを確認して、本発明を完成した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗腫瘍剤であるゲムシタビン（ＧＥＭ）と、抗腫瘍効果を有するＤＮＡポリメラーゼ阻害剤であるリン酸化ＧＥＭと、抗腫瘍効果を有する放射線療法とのいずれかと組み合わせて併用投与されることを特徴とする、モノガラクトシルジアシルグリセロール（ＭＧＤＧ）又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含む医薬組成物又は食品組成物。
【請求項２】
ＧＥＭと組み合わせて併用投与されることを特徴とする、ＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含む請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
前記ＭＧＤＧは、ＧＥＭ投与前に、投与されることを特徴とする請求項２に記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
前記抗腫瘍剤は、膵臓癌又は大腸癌治療用抗腫瘍剤である請求項２又は３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
リン酸化ＧＥＭ又はＧＥＭと組み合わせて併用投与されることを特徴とする、ＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含む請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤。
【請求項６】
ＧＥＭ又はリン酸化ＧＥＭと組み合わせて併用投与されることを特徴とする、ＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含む請求項１に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項７】
放射線療法と組み合わせて投与されることを特徴とする、ＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含む請求項１に記載の膵臓癌治療用抗腫瘍剤。
【請求項８】
抗腫瘍剤であるＧＥＭ投与と、抗腫瘍効果を有するＤＮＡポリメラーゼ阻害剤であるリン酸化ＧＥＭ投与と、抗腫瘍効果を有する放射線療法とのいずれか１以上と組み合わせてＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を投与することを特徴とする、癌の治療方法。
【請求項９】
ＧＥＭとＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を併用投与することを特徴とする請求項８に記載の癌の治療方法。
【請求項１０】
前記ＭＧＤＧは、ＧＥＭ投与前に、投与されることを特徴とする請求項９に記載の癌の治療方法。
【請求項１１】
前記治療方法は、膵臓癌又は大腸癌治療方法であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１に記載の癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍剤であるゲムシタビン（ＧＥＭ）と、抗腫瘍効果を有するＤＮＡポリメラーゼ阻害剤であるリン酸化ＧＥＭと、抗腫瘍効果を有する放射線療法とのいずれかと組み合わせて併用投与されることを特徴とする、モノガラクトシルジアシルグリセロール（ＭＧＤＧ）を有効成分として含む医薬組成物又は食品組成物。
なお、本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本国特許出願の特願2012-157018からの優先権を請求する。
【背景技術】
【０００２】
（ＭＧＤＧ）
高等植物の葉緑体のチラコイド膜は、ＭＧＤＧ、ジガラクトシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）、スルホキノボシルジアシルグリセロール（ＳＱＤＧ）等の主要なグリセロ糖脂質を含んでいる。また、グリセロ糖脂質は、野菜、果実及び果物に含まれていることが知られている。本発明者らの１人は、野菜の中ではホウレン草（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）に多量のＭＧＤＧが含まれていることを確認している（非特許文献１）。
また、本発明者らの１人は、ＭＧＤＧを含む糖脂質には癌細胞増殖抑制活性を有することを確認している（特許文献１）。【０００３】
（ＧＥＭ）
シチジンアナログであるＧＥＭ（2',2'-ジフルオロデオキシシチジン）は、様々な癌の治療に広く使用されている。また、ＧＥＭは、膵臓癌の標準的な治療剤である。しかし、膵臓癌患者の１年後の生存率はわずか18％であり（非特許文献２）、ＧＥＭの単独での使用効果には限界がある。【０００４】
（抗癌剤の併用投与）
上記の低い生存率の改善のための抗癌剤の併用投与治療又は抗癌剤と放射線療法の組み合わせた併用治療は、単独抗癌剤の多量使用の限界を解消して、治療効果を上げるものである。特定の癌の治療剤又は治療法を組合せることにより、腫瘍細胞の死滅効果が大幅に上昇することが報告されている。【０００５】
以上により、新たな抗癌剤の組み合わせによる癌の治療方法及び新たな抗癌剤と放射線療法の組み合わせによる癌の治療方法の開発が望まれている。【０００６】
（ＤＮＡポリメラーゼ）
真核生物のＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）は、これまでα、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、ι、κ、λ、μ、σ、ＴｄＴ（ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ）及びＲｅｖ１の１５種類の分子種が知られている。
これらのＤＮＡポリメラーゼは、細胞の増殖、分裂、分化等に関与している。例えば、α型はＤＮＡ複製、β型、λ型及びＴｄＴは修復と組換え、δ型及びε型は複製と修復の双方、ζ〜κ型は修復を担っている。【０００７】
（ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害を有する化合物）
本発明者らの１人は、ＤＮＡ複製型のＤＮＡポリメラーゼα、δ、ε阻害剤には、ヒト由来癌細胞増殖抑制活性があることを報告している（参照：非特許文献３）。
また、本発明者らの１人は、ＤＮＡ修復・組換え型のＤＮＡポリメラーゼλ阻害活性と起炎剤ＴＰＡで誘導したマウス耳抗炎症活性やＬＰＳで炎症刺激を与えたマクロファージのＴＮＦ−α産生抑制活性には正の相関があることを報告している（参照：非特許文献４）。【０００８】
（ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤）
ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を阻害するＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、例えば、癌に対して癌細胞の増殖抑制活性を示し、エイズに対してＨＩＶ由来逆転写酵素に対する阻害活性を示し、また、免疫疾患に対して抗原に対する特異的抗体産生を抑制する免疫抑制活性を示すことが知られている。
ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性を有する糖脂質が、制癌剤、ＨＩＶ由来逆転写酵素阻害剤、免疫抑制剤として有用であることが報告されている（参照：特許文献２）。
現在、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤として、ジデオキシＴＴＰ（ｄｄＴＴＰ）、Ｎ-メチルマレイミド、ブチルフェニル-ｄＧＴＰなどが知られている。また植物由来の糖脂質であるスルホキノボシルアシルグリセリドにもＤＮＡポリメラーゼ阻害作用が見出されている（参照：特許文献２）。【０００９】
以上により、ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性を有する化合物は、癌、エイズ等のウイルス疾患、免疫疾患の予防・治療に期待されているので、新たなＤＮＡポリメラーゼ阻害剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】I. Kuriyama et al (2005) J. Nutr. Biochem. 16 594-601
【非特許文献２】M.J. Moore et al (2007) J. Clin. Oncol. 25 1960-1966
【非特許文献３】Y. Mizushina (2009) Biosci. Biotechnol. Biochem. 73, 1239-1251
【非特許文献４】Y. Mizushina (2011) 日本栄養・食糧学会誌. 64, 377-384
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】WO2005/027937
【特許文献２】特平１１−１０６３９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、新たな抗癌剤、抗癌剤の組み合わせによる新たな癌の治療方法及び新たな抗癌剤と放射線療法の組み合わせによる新たな癌の治療方法、新たなＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、並びにアポトーシス誘導剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、ＧＥＭと組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧ、放射線療法と組み合わせて投与されるＭＧＤＧが癌細胞増殖抑制活性及び抗腫瘍活性を有することを確認し、さらに、リン酸化ＧＥＭと組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧがＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害を有することを確認して、本発明を完成した。【００１４】
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．抗腫瘍剤であるゲムシタビン（ＧＥＭ）と、抗腫瘍効果を有するＤＮＡポリメラーゼ阻害剤であるリン酸化ＧＥＭと、抗腫瘍効果を有する放射線療法とのいずれかと組み合わせて併用投与されることを特徴とする、モノガラクトシルジアシルグリセロール（ＭＧＤＧ）又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含む医薬組成物又は食品組成物。
２．ＧＥＭと組み合わせて併用投与されることを特徴とする、ＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含む前項１に記載の抗腫瘍剤。
３．前記ＭＧＤＧは、ＧＥＭ投与前に、投与されることを特徴とする前項２に記載の抗腫瘍剤。
４．前記抗腫瘍剤は、膵臓癌又は大腸癌治療用抗腫瘍剤である前項２又は３に記載の抗腫瘍剤。
５．リン酸化ＧＥＭ又はＧＥＭと組み合わせて併用投与されることを特徴とする、ＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含む前項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤。
６．ＧＥＭ又はリン酸化ＧＥＭと組み合わせて併用投与されることを特徴とする、ＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含む前項１に記載のアポトーシス誘導剤。
７．放射線療法と組み合わせて投与されることを特徴とする、ＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含む前項１に記載の膵臓癌治療用抗腫瘍剤。
８．抗腫瘍剤であるＧＥＭ投与と、抗腫瘍効果を有するＤＮＡポリメラーゼ阻害剤であるリン酸化ＧＥＭ投与と、抗腫瘍効果を有する放射線療法とのいずれか１以上と組み合わせてＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を投与することを特徴とする、癌の治療方法。
９．ＧＥＭとＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を併用投与することを特徴とする前項８に記載の癌の治療方法。
１０．前記ＭＧＤＧは、ＧＥＭ投与前に、投与されることを特徴とする前項９に記載の癌の治療方法。
１１．前記治療方法は、膵臓癌又は大腸癌治療方法であることを特徴とする前項８〜１０のいずれか１に記載の癌の治療方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含む医薬組成物又は食品組成物は、癌細胞増殖抑制活性、ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害、及び／又は抗腫瘍活性を有することを確認した。より詳しくは、以下の通りである。
本発明のＧＥＭと組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧを有効成分として含む抗腫瘍剤は、癌細胞増殖抑制活性及び抗腫瘍活性を有することを確認した。
本発明のリン酸化ＧＥＭと組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧを有効成分として含むＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害を有することを確認した。
本発明の放射線療法と組み合わせて投与されるＭＧＤＧを有効成分として含む膵臓癌治療用抗腫瘍剤は、抗腫瘍活性を有することを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＭＧＤＧの化学構造を示す図。
【図２】ＭＧＤＧを高含有する糖脂質画分の精製方法。
【図３】リン酸化ＧＥＭによるＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害効果の確認。化合物を含まない場合のＤＮＡポリメラーゼ酵素活性を100％とした。データは、３回の独立実験による平均値±標準誤差により示した。
【図４】リン酸化ＧＥＭとの併用によるＭＧＤＧのＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害効果の確認。データは、３回の独立実験による平均値±標準誤差により示した。
【図５】ＧＥＭとの併用によるＭＧＤＧの癌細胞増殖抑制活性の確認。データは、３回の独立実験による平均値±標準誤差により示した。
【図６】ＧＥＭとの併用によるＭＧＤＧの癌細胞におけるアポトーシス誘導の確認。データは、３回の独立実験による平均値±標準誤差により示した。
【図７】ＭＧＤＧ投与及び放射線照射のタイムスケジュール。
【図８】放射線照射後の各マウスの腫瘍増殖曲線。
【図９】放射線照射１月後の各マウスの腫瘍。
【図１０】ＭＧＤＧ投与及びＧＥＭ投与のタイムスケジュール。
【図１１】ＭＧＤＧ投与及びＧＥＭ投与後の各マウスの腫瘍増殖曲線。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（ＭＧＤＧ）
ＭＧＤＧの化学構造を図１に記載する。図中、Ｒ１〜Ｒ２は互いに独立した脂肪酸であり、好ましくは炭素数１４〜２２の飽和脂肪酸または一価もしくは多価の不飽和脂肪酸である。飽和脂肪酸としては、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等を例示でき、不飽和脂肪酸としては、パルミトオレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸（ω３）、ジホモガンマリノレン酸、オクタデカテトラエン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等を例示できる。なお、各糖脂質におけるグリセロール骨格の１位と２位の構成脂肪酸の種類は特に限定されるものではなく、ジアシルグルセロールタイプの糖脂質においては、両脂肪酸は同じものであっても、異なるものであってもよい。
【００１８】
（ＭＧＤＧの薬学的に許容し得る塩）
本発明の「ＭＧＤＧの薬学的に許容し得る塩」は、フッ化水素酸塩、塩酸塩などのハロゲン化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、スルホン酸塩、有機酸塩、およびアミノ酸塩が挙げられ、好適には塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩を挙げることができる。
【００１９】
（ＭＧＤＧの抽出方法）
ＭＧＤＧの抽出方法の詳細は、WO2005/027937に記載の方法を参照することができる。
また、下記のＭＧＤＧの抽出方法は、一例であり特に限定されない。
例えば、以下の方法によりホウレン草から抽出・精製することができる。まず、原料には市販のホウレン草を使用し、図２に示すように、その乾燥物100ｇを細断した後、水溶性成分をできるだけ除去するために、60℃の温水1Ｌで２回洗浄する。次に、濾紙を使用して濾過後、水分を除去し、得られた固形物（残渣）に1Ｌのエタノールを加え、撹拌しながら60℃で還流抽出を２回行う。抽出液は濾過後、減圧下で濃縮を行うことで、ホウレン草のオイル状抽出物が得られる。
前記抽出物を70％エタノール溶液（エタノールと水の体積比が70：30の溶液。以下同様。）に溶解した後、逆相クロマトグラフィーにより糖脂質画分を精製し、本発明の第１の糖脂質含有組成物を得る。上記抽出物を70％エタノール溶液に溶解した後、これを疎水クロマトグラフィー用樹脂500ｇ（ダイヤイオンＨＰ−２０、三菱化学社製）に注入し、その後、70％エタノールで未吸着物質を洗浄・溶出した画分Ｉ（水溶性画分）、95％エタノールで溶出される画分ＩＩ（糖脂質画分すなわちＭＧＤＧ、ＤＧＤＧ、ＳＱＤＧを含む糖脂質含有組成物）、クロロホルムで溶出される画分ＩＩＩ｛クロロフィル（葉緑素）を含む色素画分｝の３つに分画する。
最後に、クロマトグラフィー等により上記画分ＩＩ（ＭＧＤＧ、ＤＧＤＧ、ＳＱＤＧを含む糖脂質含有組成物）からＭＧＤＧを抽出する。
【００２０】
（リン酸化ＧＥＭ）
本発明のリン酸化ＧＥＭとは、一リン酸化体（ＧＥＭ−ＭＰ）、二リン酸化体（ＧＥＭ−ＤＰ）、三リン酸化体（ＧＥＭ−ＴＰ）を含む。なお、リン酸化ＧＥＭは、公知の方法により、市販のＧＥＭをリン酸化することにより合成することができる。
【００２１】
（本発明の医薬組成物又は食品組成物）
本発明の医薬組成物又は食品組成物は、抗腫瘍剤であるＧＥＭと、抗腫瘍効果を有するＤＮＡポリメラーゼ阻害剤であるリン酸化ＧＥＭと、抗腫瘍効果を有する放射線療法とのいずれかと組み合わせて併用投与されることを特徴とする、ＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含む。
本発明の医薬組成物又は食品組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害効果、癌細胞増殖抑制活性、抗腫瘍活性といった有用な生理活性を有することから、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、抗腫瘍剤（抗癌剤、制癌剤）として利用可能であり、さらに、サプリメント、機能性食品、健康食品、健康補助食品、特定保健用食品、栄養機能食品等にも利用可能である。特に機能性食品に好適に用いることができ、例えば抗癌作用又は癌予防効果をもつ機能性食品として利用可能である。
さらに、本発明の医薬組成物又は食品組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害効果を有することから、抗腫瘍剤以外の医薬（医薬用組成物）への利用、機能性食品以外の食用組成物（食品または食品添加物）としての利用も可能であり、癌のほかエイズの発症、進行を予防する作用あるいは治療効果、また臓器移植時等の免疫抑制作用をねらいとして利用することができ、とりわけエイズ治療剤、抗ウイルス剤、免疫抑制剤、アポトーシス誘導剤等として利用可能である。
【００２２】
（本発明のＭＤＧＤを有効成分とする抗腫瘍剤又はＤＮＡポリメラーゼ阻害剤の組成）
本発明のＭＤＧＤを有効成分とする抗腫瘍剤又はＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、抽出したＭＧＤＧを必要に応じてさらに精製した後、そのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物となし、動物およびヒトに投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択すればよい。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。投与量は、通常、成人で糖脂質の重量として１日当たり20mg〜600mg以下を数回に分けて服用するのが適当である。
【００２３】
本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤としての経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中のＭＧＤＧの配合量は特に限定されるものではなく適宜設計できる。この種の製剤には、ＭＧＤＧ含有組成物の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。
【００２４】
非経口剤として本発明の所望の効果を発現するには、患者の年齢、体重、疾患の程度により異なるが、通常、成人で糖脂質の重量として１日当たり1〜60mgの静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射が適当である。この非経口投与剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。さらに必要に応じて、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤を加えてもよい。これら製剤中のＭＤＧＤの配合量は特に限定されるものではなく任意に設定できる。その他の非経口剤の例として、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、これらも常法に従って製造される。
【００２５】
（リン酸化ＧＥＭを有効成分として含むＤＮＡポリメラーゼ阻害剤の組成）
本発明のリン酸化ＧＥＭを有効成分とするＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、リン酸化した後に、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物となし、動物およびヒトに投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択すればよい。投与量は、通常、成人１日当たり10mg〜2500mgを点滴静注する。
【００２６】
（ＧＥＭの用法・容量）
ＧＥＭの一般的な投与方法は、以下の通りである。
（１）非小細胞肺癌、膵癌、胆道癌、尿路上皮癌、がん化学療法後に増悪した卵巣癌
通常、成人にはＧＥＭとして1回1000mg/m2を30分かけて点滴静注し、週1回投与を3週連続し、4週目は休薬する。これを1コースとして投与を繰り返す。なお、患者の状態により適宜減量する。
（２）手術不能又は再発乳癌の場合
通常、成人にはＧＥＭとして1回1250mg/m2を30分かけて点滴静注し、週1回投与を2週連続し、3週目は休薬する。これを1コースとして投与を繰り返す。なお、患者の状態により適宜減量する。
【００２７】
（放射線療法）
本発明の放射線療法とは、自体公知の方法を意味し、当業者に知られているプロトコルに従って実施することができる。X線が主たる線源であるが、その他にも陽子線や炭素イオン線等の荷電粒子線、小線源治療に用いられるイリジウム、ヨード、セシウム、又はコバルト照射などが前記の放射線療法に含まれる。
放射線療法は、全身照射（急性白血病、悪性リンパ腫）に用いられることもあるが、原則的には腫瘍そのものと、周囲の微小浸潤の範囲の局所的に照射するのが好ましい。一般的には、放射線療法に要する時間は１日2〜3分で、週５回、合計25〜30回（約5〜6週間）に分割して照射することが多い。
【００２８】
（ＧＥＭと組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧを有効成分として含む抗腫瘍剤）
本発明のＧＥＭと組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含む抗腫瘍剤の適用癌腫は特に限定されないが、好ましくは、膵臓癌、大腸癌であり、さらに好ましくは膵臓癌である。
また、該抗腫瘍剤とＧＥＭの併用投与方法は、特に限定されない。上記記載したＧＥＭの投与期間前、中、後のいずれの間に、ＭＧＤＧを含む抗腫瘍剤を経口又は非経口により患者に投与する。好ましくは、ＭＧＤＧは、ＧＥＭ投与前の数日、１日前、又は数時間前に、投与されることが好ましい。
【００２９】
（ＧＥＭと組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧを用いた癌の治療方法）
本発明では、ＧＥＭと組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧを用いた癌の治療方法も対象とする。併用投与方法は、特に限定されず、上記記載したＧＥＭの投与期間前、中、後のいずれの間に、ＭＧＤＧを経口又は非経口により患者に投与する。好ましくは、ＭＧＤＧは、ＧＥＭ投与前の数日、１日前、又は数時間前に、投与されることが好ましい。
【００３０】
（リン酸化ＧＥＭと組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧを有効成分として含むＤＮＡポリメラーゼ阻害剤）
本発明のリン酸化ＧＥＭと組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含むＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡポリメラーゼα、β、γ、κの酵素活性阻害を示す。
なお、ＤＮＡを合成する酵素であるＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ合成を伴う細胞増殖が活発な癌細胞や腫瘍組織では発現量が多く高活性である。よって、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡ合成を阻害して、癌細胞や腫瘍組織における細胞増殖を停止させる。従って、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は抗腫瘍剤になると考えられる。すなわち、本発明のリン酸化ＧＥＭと組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧを有効成分として含むＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、抗腫瘍剤でもある。
【００３１】
（リン酸化ＧＥＭと組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧを用いた癌の治療方法）
本発明では、リン酸化ＧＥＭと組み合わせて併用投与されるＤＮＡポリメラーゼ阻害活性を有するＭＧＤＧを用いた癌の治療方法も対象とする。併用投与方法は、特に限定されず、上記記載したＧＥＭと同様に、リン酸化ＧＥＭ投与期間前、中、後のいずれの間に、ＭＧＤＧを経口又は非経口により患者に投与する。好ましくは、ＭＧＤＧは、リン酸化ＧＥＭ投与前の数日、１日前、又は数時間前に、投与されることが好ましい。
【００３２】
（リン酸化ＧＥＭを有効成分として含むＤＮＡポリメラーゼ阻害剤）
本発明のリン酸化ＧＥＭ（ＧＥＭも含む）を有効成分として含むＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡポリメラーゼα、β、γ、κの酵素活性阻害だけでなく、ＤＮＡポリメラーゼδ、ε、λ、μ、η、ιの酵素活性阻害も有する。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害効果強度は、ＧＥＭ−ＴＰ、ＧＥＭ−ＤＰ、ＧＥＭ−ＭＰの順である。
また、前記同様に、本発明のリン酸化ＧＥＭを有効成分として含むＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、抗腫瘍剤でもある。
【００３３】
（リン酸化ＧＥＭを用いた癌の治療方法）
本発明では、ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性を有するリン酸化ＧＥＭを用いた癌の治療方法も対象とする。リン酸化ＧＥＭを用いた癌の治療方法は、特に限定されず、上記記載したＧＥＭの用法・容量を参考にして実施できる。
【００３４】
（放射線療法と組み合わせて投与されるＭＧＤＧを有効成分として含む膵臓癌治療用抗腫瘍剤）
本発明の放射線療法と組み合わせて投与されるＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含む膵臓癌治療用抗腫瘍剤と放射線療法の併用治療方法は、特に限定されず、上記記載した放射線療法期間前、中、後のいずれの間に、ＭＧＤＧを有効成分として含む膵臓癌治療用抗腫瘍剤を経口又は非経口により患者に投与する。
【００３５】
（放射線療法と組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧを用いた膵臓癌の治療方法）
本発明では、放射線療法と組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧを用いた膵臓癌の治療方法も対象とする。併用投与方法は、特に限定されず、上記記載した放射線療法の期間前、中、後のいずれの間に、ＭＧＤＧを経口又は非経口により膵臓癌患者に投与する。
【００３６】
（ＧＥＭと組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧを有効成分として含むアポトーシス誘導剤）
本発明のＧＥＭ（リン酸化ＧＥＭも含む）と組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含むアポトーシス誘導剤は、ＧＥＭ単独、ＭＧＤＧ単独と比較して、細胞、特に癌細胞のアポトーシスを非常に強く誘導する。
【００３７】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は該実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
リン酸化ＧＥＭによるＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害効果の確認、リン酸化ＧＥＭとの併用によるＭＧＤＧのＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害効果の確認、並びにＧＥＭとの併用によるＭＧＤＧの癌細胞増殖抑制活性の確認を本実施例で行った。詳細は、以下の通りである。【００３９】
（材料）
ＧＥＭは、日本イーライリリーから購入した。乾燥ホウレン草は、こだま食品株式会社から購入した。仔ウシ胸腺ＤＮＡは、Sigma Aldrichから購入した。４つの2'-デオキシヌクレオチド-5'-三リン酸であるdATP、dCTP、dGTP及びdTTPは、GE Healthcare Life Sciencesから購入した。放射性ヌクレオチド[3H]-dTTP (43 Ci/mmol)は、MP Biomedicals LLCから購入した。その他の試薬は、ナカライテスクから購入した。【００４０】
（リン酸化ＧＥＭの化学合成）
N4-benzoylgemcitabineは、リン酸トリエチル中の塩化ホスホリルによる選択的リン酸化、さらにphosphorimidazolidate method｛参照：Bull. Chem. Soc. Jpn. 42 (1969), p3505-3508｝を用いたリン酸化により、N4-benzoylgemcitabine 5'-diphosphate及びN4-benzoylgemcitabine 5'-triphosphateに変換した。ＧＥＭ−ＭＰ、ＧＥＭ−ＤＰ及びＧＥＭ−ＴＰは、それぞれ、１日間室温で、1M NH4OH中の対応するN4-benzoatesで処理することにより得た。
最後に、 ＧＥＭ−ＭＰ、ＧＥＭ−ＤＰ及びＧＥＭ−ＴＰの純度は、それぞれ、HPLC分析により、99％、96％及び98％であることを確認した。【００４１】
（ホウレン草よりＭＧＤＧの抽出）
乾燥ホウレン草をエタノールで抽出して、エタノール溶液を得た。該溶液は、70％エタノールで希釈し、そしてDiaion HP-20（Sigma-Aldrich）カラムクロマトグラフィーに通した。該カラムから溶出した95％エタノール（v/v）溶液を蒸発させて乾燥させた。乾燥物をクロロホルムに再溶解し、さらにシリカゲル（PSQ60B, Fuji Silysia）カラムクロマトグラフィーに通した。該カラムクロマトグラフィーは、クロロホルム／酢酸エチル（1/1、v/v）で洗浄し、さらに、酢酸エチルで溶出した。溶出した画分は、メタノールを用いたSep-Pak C18（Waters Corp., Tokyo, Japan）カラムクロマトグラフィーで精製した。
最後に、ＭＧＤＧを含む画分を蒸発させて乾燥させて、乾燥ＭＧＤＧを得た。なお、該ＭＧＤＧの純度が約98％であることを確認した。【００４２】
（ＤＮＡポリメラーゼアッセイ）
哺乳類由来の高活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、文献「J. Nat. Prod. 75 (2012) p135-141」に記載の方法に準じて精製した。ＤＮＡポリメラーゼα、βに対する標準ＤＮＡポリメラーゼ基質溶液は、文献「Biochim. Biophys. Acta 1308 (1996) p256-262」及び「Biochim. Biophys. Acta 1336 (1997) p509-521」に記載の方法に準じて作製した。ＤＮＡポリメラーゼγ、δに対する標準ＤＮＡポリメラーゼ基質溶液は、文献「Eur. J. Biochem. 267 (2000) p200-206」及び「Jpn. J. Cancer Res. 89 (1998) p1154-1159」に記載の方法に準じて作製した。ＤＮＡポリメラーゼη、ι及びκは、ＤＮＡポリメラーゼαと同じ方法により作製した。ＤＮＡポリメラーゼλは、ＤＮＡポリメラーゼβと同じ方法により作製した。
ＤＮＡポリメラーゼ反応に関し、活性化ＤＮＡ（例えば、ウシデオキシリボヌクレアーゼI処理済仔ウシ胸腺ＤＮＡ）及び４つのdNTPs（[3H]-dTTPを含む）は、それぞれ、ＤＮＡ鋳型プライマー基質及びヌクレオチド基質に使用した。
ＭＧＤＧは、様々な濃度のDMSOで溶解し、そして、30秒間超音波処理した。超音波処理後の4μLサンプルを、pH7.5の50mM Tris-HCl｛1mMジチオスレイトール、50%グリセロール（by vol）及び1mM EDTAを含む｝中の各酵素（0.05units）と混合し、0℃、10分間保存した。ＧＥＭ又はリン酸化ＧＥＭは、様々な濃度のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で溶解した。そして、ＭＧＤＧ溶液4μLをＤＮＡポリメラーゼ酵素液16μLと混合し、0℃、10分間保存した。本混合液（ＭＧＤＧ-酵素液）の各8μL量を、20μLのＧＥＭ-ＤＮＡポリメラーゼ反応液（ＤＮＡ鋳型プライマー基質及びヌクレオチド基質を含む）に添加し、37℃、60分間保温した。
阻害物質を含まない活性を100％に設定し、各阻害物質濃度による相対的な活性を測定した。ＤＮＡポリメラーゼ活性の１単位は、37℃、60分間及び通常の反応条件下｛参照文献：Biochim. Biophys. Acta 1308 (1996) p256-262、Biochim. Biophys. Acta 1336 (1997) p509-521｝において、1nmol dNTP（特に、dTTP）が合成ＤＮＡ鋳型プライマーに触媒作用により取り込まれる酵素の量として設定した。【００４３】
（細胞培養及び細胞生存率アッセイ）
ヒト膵臓癌細胞系であるBxPC-3、MIAPaCa2及びPANC-1は、American Type Culture Collectionから得た。これらの細胞は、RPMI1640培地｛10% FBS、penicillin (100 units/mL)、streptomycin (100μg/mL)及び1.6mg/mL NaHCO3を含む｝で培養した。ＧＥＭ、リン酸化ＧＥＭ及びＭＧＤＧの細胞毒性は、96穴マイクロタイタープレートに播種した細胞（〜1×103細胞／穴）に様々な濃度のこれらの化合物を含む溶液を添加することにより測定した。5%CO2/95%airの湿潤環境下で37℃、72〜96時間培養後において、MTT{3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide}溶液を最終濃度0.6mg/mLまで添加し、さらに該培地を破棄した後に、DMSOで該細胞を溶解した。各穴の吸光度（Ａ540）をマイクロプレートリーダーにより測定した。【００４４】
（アポトーシスを起こした細胞アッセイ）
アポトーシス誘導は、公知のキットであるAPO-DirectTM Assay Staining kit (BD Bioscience Pharmingen)を使用してＤＮＡフラグメントアッセイにより評価した。APO-DirectTM Assayは、アポトーシスを起こしている細胞の断片化ＤＮＡをFITC-dUTPにより標識し、さらに蛍光フローサイトメトリーで測定する方法である。
本実施例では、24時間、ＧＥＭ（50nM）で処理したMIAPaCa2、ＭＧＤＧ（70μM）で処理したMIAPaCa2及びＧＥＭ-ＭＧＤＧの両方で処理したMIAPaCa2を使用した。該処理済各細胞は、トリプシン処理を行い、さらにPBSで洗浄した。該洗浄済各細胞は、15分間の1％パラホルムアルデヒド、さらに、一晩の−20℃での70％エタノールによる固定処理を行った。該固定化した各細胞は、30分間、共役FITCを含むＤＮＡラベリング溶液に混合して染色した。該染色した各細胞はPBSで再懸濁させ、さらにCellQuest ソフトウエア（Becton-Dickinson）によりサイトメトリーデータを得た。なお、CellQuest ソフトウエアを使用して、全細胞中の染色されたものをアポトーシス誘導細胞として測定した。【００４５】
（リン酸化ＧＥＭによるＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害効果の確認）
哺乳類のＤＮＡポリメラーゼ分子種は１５種類が存在しており、アミノ酸配列の相同性や機能の類似性からＡ−、Ｂ−、Ｘ−、Ｙ−の４つのファミリーに分類されている。本実施例では、各ＤＮＡポリメラーゼファミリーを代表してＤＮＡ複製型の子牛ＤＮＡポリメラーゼα（Ｂ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼ）、ミトコンドリアＤＮＡ合成を担うヒトＤＮＡポリメラーゼγ（Ａ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡ修復型のヒトＤＮＡポリメラーゼκ（Ｙ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡ修復・組換え型のラットＤＮＡポリメラーゼβ（Ｘ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼ）を用いた。
図３に示すように、ＧＥＭ−ＴＰは、哺乳類のＤＮＡポリメラーゼ酵素活性を最も強力に阻害することを確認した。一方、ＧＥＭは、ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性を阻害しないことを確認した。ＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害強度は、ＧＥＭ−ＴＰ、ＧＥＭ−ＤＰ、ＧＥＭ−ＭＰの順であることも確認した。ＧＥＭ−ＴＰのＤＮＡポリメラーゼα及びγの酵素活性阻害は、ＤＮＡポリメラーゼβ及びκの酵素活性阻害よりも高かった。
下記表１の結果は、ＧＥＭ−ＴＰの哺乳類の１１種類のＤＮＡポリメラーゼに対する50％阻害濃度（IC50値）を示す。ＧＥＭ−ＴＰは、ＤＮＡポリメラーゼα、β、γ、κの酵素活性阻害だけでなく、ＤＮＡポリメラーゼδ、ε、λ、μ、η、ιの酵素活性阻害も有する。さらに、ＧＥＭ−ＴＰは、Ｘ及びＹファミリーのＤＮＡポリメラーゼに対する酵素活性阻害効果と比較して、ＢファミリーのＤＮＡポリメラーゼに対する酵素活性阻害効果は約４倍であることを確認した。
以上により、リン酸化ＧＥＭ、特にＧＥＭ−ＴＰは、ＤＮＡポリメラーゼα、δ、εのようなＤＮＡ複製型のＤＮＡポリメラーゼの酵素活性をより強力に阻害することを確認した。これにより、リン酸化ＧＥＭを有効成分として含むＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、優れたＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害効果を有する。【００４６】
【表１】
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【００４７】
（ＧＥＭ−ＴＰによるＤＮＡポリメラーゼαの阻害機構の確認）
ＧＥＭ−ＴＰによる選択的ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性阻害（特に、ＤＮＡポリメラーゼα、δ、εのようなＤＮＡ複製型の強力なＤＮＡポリメラーゼの酵素活性阻害）のメカニズムを確認した。同様に、ＭＧＤＧのＤＮＡポリメラーゼの酵素活性阻害に対する阻害メカニズムも確認した。詳細は、以下の通りである。なお、活性化ＤＮＡ及び4つのdNTPsは、それぞれ、酵素活性阻害の動態解析のために、ＤＮＡ鋳型プライマー基質及びヌクレオチド基質に使用した。
下記表２で示したデータは逆数プロットで示している。ＧＥＭ−ＴＰのＤＮＡポリメラーゼαの酵素活性阻害効果は、ＤＮＡ鋳型プライマー基質に対しては非拮抗阻害であることを確認した。なぜなら、Km値は7.80μMで一定であるが、一方、Vmax値はＧＥＭ−ＴＰ濃度上昇と共に減少している。また、ＧＥＭ−ＴＰのＤＮＡポリメラーゼαの酵素活性阻害効果は、ヌクレオチド基質に対しては拮抗阻害であることを確認した。なぜなら、Vmax値は29.2pmol/hで一定であるが、Km値はＧＥＭ−ＴＰ濃度上昇と共に上昇している。Dixonプロットから得られたＫi値は、ＤＮＡ鋳型プライマー基質では1.35μMであり、ヌクレオチド基質では0.67μMであった。すなわち、ヌクレオチド基質に対するＫi値は、ＤＮＡ鋳型プライマー基質に対するＫi値と比較して、約２倍低いことを確認した。これにより、ＧＥＭ−ＴＰは、ＤＮＡポリメラーゼαのＤＮＡ鋳型プライマー基質の結合部位よりもヌクレオチド基質の結合部位に対して強い親和性を示した。
ＭＧＤＧのＤＮＡポリメラーゼαの酵素活性阻害効果は、ＤＮＡ鋳型プライマー基質及びヌクレオチド基質の両方に対しては非拮抗阻害であることを確認した。また、ＭＧＤＧは、ヌクレオチド基質の結合部位よりもＤＮＡポリメラーゼαのＤＮＡ鋳型プライマー基質の結合部位に対して約1.3倍の強い親和性を示した。
以上により、dCTPアナログであるＧＥＭ−ＴＰは、dCTPと競合して、ＤＮＡポリメラーゼαのヌクレオチド基質の結合部位と作用し、一方、ＭＧＤＧはＤＮＡポリメラーゼαの他の部位に結合することを見出した。【００４８】
【表２】
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【００４９】
（リン酸化ＧＥＭとの併用によるＭＧＤＧのＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害効果の確認）
上記により、ＧＥＭ−ＴＰによるＤＮＡポリメラーゼαの阻害機構は、ＭＧＤＧによるＤＮＡポリメラーゼαの阻害機構とは異なることを確認した。そこで、ＧＥＭとの併用によるＭＧＤＧのＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害効果は、リン酸化ＧＥＭ単独又はＭＧＤＧ単独のＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害効果と比較して、高いことを確認した。詳細は、以下の通りである。
ＭＧＤＧ及びＧＥＭ−ＴＰを含む溶液は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素液及びＤＮＡ鋳型プライマー基質とヌクレオチド基質を含む標準ＤＮＡポリメラーゼ反応液と、それぞれ0℃、10分間前保温し、その後両者を混合して37℃、60分間保温してから、各ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を測定した。ＧＥＭ−ＴＰ及びＭＧＤＧの濃度は、それぞれ、各ＤＮＡポリメラーゼに対してIC50の半分及び20μMとした。
ＧＥＭ−ＴＰによる各哺乳類のＤＮＡポリメラーゼの酵素活性阻害効果であるIC50の半分を、ＤＮＡポリメラーゼ相対活性割合の１として、ＭＧＤＧ単独の相対活性割合、並びにＭＧＤＧ及びＧＥＭ−ＴＰ併用の相対活性割合を図４に示す。
ＭＧＤＧ及びＧＥＭ−ＴＰ併用によるＤＮＡポリメラーゼα、γの酵素活性阻害効果は、ＭＧＤＧ単独及びＧＥＭ−ＴＰ単独によるＤＮＡポリメラーゼα、γの酵素活性阻害効果と比較して、それぞれ、約３倍及び約２倍となった。これらの結果は、ＭＧＤＧ及びＧＥＭ−ＴＰ併用によるＤＮＡポリメラーゼα、γの酵素活性阻害効果は、ＭＧＤＧ及びＧＥＭ−ＴＰがそれぞれ異なるＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害機構を有することによる相乗効果であることを確認した。
以上により、リン酸化ＧＥＭとの併用によるＭＧＤＧは、非常に優れたＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害効果を有することを確認した。これにより、リン酸化ＧＥＭと併用投与されるＭＧＤＧを有効成分として含むＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、優れたＤＮＡポリメラーゼ酵素活性阻害効果を有する。【００５０】
（ＧＥＭとの併用によるＭＧＤＧの癌細胞増殖抑制活性の確認）
ＧＥＭとの併用によるＭＧＤＧの癌細胞増殖抑制活性の確認を行った。詳細は、以下の通りである。
３種類のヒト膵臓癌細胞系であるBxPC-3 cells、MIAPaCa2 cells及びPANC-1 cellsは、図５Ａに示す通りのＧＥＭ及びＭＧＤＧの投与スケジュールに従って処理し、さらに24時間培養し、最後にMTTアッセイにより細胞毒性を測定した。ＧＥＭ及びＭＧＤＧの濃度は、それぞれ、LD50の半分及び20μMにした。
ＧＥＭによる各細胞に対する毒性のIC50の半分を、１として、ＧＥＭ単独の相対活性割合、ＭＧＤＧ単独の相対活性割合、並びにＭＧＤＧ及びＧＥＭ併用の相対活性割合を図５Ｂに示す。
図５Ｂ（ｃ）の結果から明らかなように、ＭＧＤＧを、ＧＥＭ投与前に、投与することにより、非常に高い膵臓癌細胞の毒性を示すことを確認した。ＭＧＤＧ及びＧＥＭ併用による癌細胞増殖抑制活性は、ＭＧＤＧ単独及びＧＥＭ単独による癌細胞増殖抑制活性と比較して、少なくとも４倍以上の効果を示すことを見出した。
以上により、ＧＥＭと組み合わせて併用投与されるＭＧＤＧを有効成分として含む抗腫瘍剤は、優れた癌細胞増殖抑制活性を有する。【００５１】
（ＧＥＭとの併用によるＭＧＤＧの癌細胞アポトーシス誘導の確認）
ＧＥＭとの併用によるＭＧＤＧの癌細胞増殖抑制は、アポトーシス誘導しているかどうかをヒト膵臓癌細胞系であるMIAPaCa2 cellsを用いて確認した。詳細は、以下の通りである。
MIAPaCa2 cellsは、70μM ＭＧＤＧで処理し、続いて処理12時間後50nM ＧＥＭで処理して、さらに処理１２時間後に、アポトーシスの細胞をAPO-DirectTM Assay Staining kit及びフローサイトメトリーを使用して測定した。なお、未処理のMIAPaCa2 cellsのアポトーシス細胞の割合を１とした。
図６に示すように、ＭＧＤＧ及びＧＥＭ併用投与によるアポトーシス細胞数の割合は、ＭＧＤＧ単独及びＧＥＭ単独によるアポトーシス細胞数の割合と比較して、少なくとも３倍以上のアポトーシスを誘導していることを確認した。
以上により、ＭＧＤＧ及びＧＥＭ併用投与は、癌細胞のアポトーシスを非常に強く誘導していることを見出した。
【実施例２】
【００５２】
（放射線照射との併用によるＭＧＤＧの抗腫瘍活性の確認）
放射線照射との併用によるＭＧＤＧの抗腫瘍活性の確認を、ヒト膵臓癌細胞を移植したマウスを用いて確認した。詳細は、以下の通りである。【００５３】
（材料）
使用したマウスは、搬入時4週齢のBALB/cAJcl-nu/nuヌードマウスを使用した。
使用したＸ線照射装置は、MBR-1505R2（日立メディコ）X線照射装置を使用した。【００５４】
（ヒト膵臓癌細胞を移植したマウスの準備）
ヒト膵臓癌細胞であるMIAPaCa2を2×106cells/100mLになるようにMatrigel中に混合して、MIAPaCa2を含むMatrigelを作製した。
前記MIAPaCa2を含むMatrigel 100μLを、前記ヌードマウスの足の付け根に注入して、腫瘍が10mm大程度になるまで経過観測した。【００５５】
（放射線照射との併用によるＭＧＤＧの投与方法）
PBSに溶かしたＭＧＤＧ100μL（投与するＭＧＤＧは2mg/kg）を、図７に記載のタイムスケジュールに沿って、腫瘍が10mm大程度になったヌードマウスの腫瘍局所に２回投与した。さらに、２回目投与から24時間後に、該マウスの腫瘍部以外を鉛でカバーして、腫瘍部にのみ5Gy（0.7Gy/min, 150kV）照射して、経過観測した。【００５６】
（放射線照射との併用によるＭＧＤＧの抗腫瘍活性の確認結果）
放射線照射後の各マウスの腫瘍増殖曲線及び放射線照射後１月の各マウスの腫瘍の写真を、それぞれ、図８及び図９に示す。
図８に示す腫瘍増殖曲線結果から明らかなように、放射線照射との併用によるＭＧＤＧの抗腫瘍活性効果は、ＭＧＤＧ単独及び放射線照射単独の抗腫瘍活性効果と比較して、約2.5倍の効果があることを確認した。また、図９に示す各マウスの腫瘍の写真から明らかなように、放射線照射との併用によるＭＧＤＧの投与されたマウスの腫瘍の大きさは、他のマウスと比較して、非常に小さいことを確認した。
以上により、放射線照射との併用によるＭＧＤＧの投与は、優れた抗膵臓腫瘍活性効果を示す。よって、放射線療法と組み合わせて投与されるＭＧＤＧを有効成分として含む膵臓癌治療用抗腫瘍剤は優れた抗膵臓腫瘍活性効果を有する。
【実施例３】
【００５７】
（ＧＥＭとの併用によるＭＧＤＧの抗腫瘍活性の確認）
ＧＥＭとの併用によるＭＧＤＧの抗腫瘍活性の確認を、ヒト膵臓癌細胞を移植したマウスを用いて確認した。詳細は、以下の通りである。【００５８】
（材料）
使用したマウスは、搬入時4週齢のBALB/cAJcl-nu/nuヌードマウスを使用した。【００５９】
（ヒト膵臓癌細胞を移植したマウスの準備）
ヒト膵臓癌細胞であるMIAPaCa2を2×106cells/100mLになるようにMatrigel中に混合して、MIAPaCa2を含むMatrigelを作製した。
前記MIAPaCa2を含むMatrigel 100μLを、前記ヌードマウスの足の付け根に注入して、腫瘍が10mm大程度になるまで経過観測した。【００６０】
（ＧＥＭとの併用によるＭＧＤＧの投与方法）
PBSに溶かしたＭＧＤＧ100μL（投与するＭＧＤＧは2mg/kg）及びPBSに溶かしたＧＥＭ100μL（投与するＧＥＭは2ng/kg）を、図１０に記載のタイムスケジュールに沿って、腫瘍が10mm大程度になったヌードマウスの腫瘍局所に２回投与した。【００６１】
（ＧＥＭとの併用によるＭＧＤＧの抗腫瘍活性の確認結果）
ＧＥＭ及びＭＧＤＧの併用投与後の各マウスの腫瘍増殖曲線を図１１に示す。
図１１に示す腫瘍増殖曲線結果から明らかなように、ＧＥＭとの併用によるＭＧＤＧの抗腫瘍活性効果（特に、ＭＧＤＧ投与した後にＧＥＭを投与した場合）は、ＭＧＤＧ単独及び放射線照射単独の抗腫瘍活性効果と比較して、約6倍以上の効果があることを確認した。
以上により、ＧＥＭとの併用によるＭＧＤＧの投与は、優れた抗膵臓腫瘍活性効果を示す。よって、ＧＥＭと組み合わせて投与されるＭＧＤＧを有効成分として含む膵臓癌治療用抗腫瘍剤は優れた抗膵臓腫瘍活性効果を有する。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
新規なＭＧＤＧを有効成分として含む医薬組成物又は食品組成物を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年3月3日(2014.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
抗腫瘍剤であるゲムシタビン（ＧＥＭ）と組み合わせて併用投与されることを特徴とする、ＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含む抗腫瘍剤であって、前記ＭＧＤＧは、ＧＥＭ投与前に、投与されることを特徴とする抗腫瘍剤。
【請求項４】
前記抗腫瘍剤は、膵臓癌又は大腸癌治療用抗腫瘍剤である請求項３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
リン酸化ＧＥＭ又はＧＥＭと組み合わせて併用投与されることを特徴とする、ＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含むＤＮＡポリメラーゼ阻害剤。
【請求項６】
ＧＥＭ又はリン酸化ＧＥＭと組み合わせて併用投与されることを特徴とする、ＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含むアポトーシス誘導剤。
【請求項７】
放射線療法と組み合わせて投与されることを特徴とする、ＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含む膵臓癌治療用抗腫瘍剤。
【請求項８】
抗腫瘍剤であるＧＥＭ投与と、抗腫瘍効果を有するＤＮＡポリメラーゼ阻害剤であるリン酸化ＧＥＭ投与と、抗腫瘍効果を有する放射線療法とのいずれか１以上と組み合わせてＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を投与することを特徴とする、癌の治療方法。
【請求項９】
ＧＥＭとＭＧＤＧ又はその薬学的に許容し得る塩を併用投与することを特徴とする請求項８に記載の癌の治療方法。
【請求項１０】
前記ＭＧＤＧは、ＧＥＭ投与前に、投与されることを特徴とする請求項９に記載の癌の治療方法。
【請求項１１】
前記治療方法は、膵臓癌又は大腸癌治療方法であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１に記載の癌の治療方法。
【国際調査報告】
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