(57)【要約】  細胞が発現する標的タンパク質の量が減少又は増加した場合に、その原因を判断可能なスクリーニング方法の提供。  一又は複数の実施形態において、アッセイ細胞をテスト物質と接触させることを含む培養を行い内部標準に対する標的タンパク質の相対量（Ａ）を測定すること、アッセイ細胞をテスト物質と接触させることなく培養し内部標準に対する相対量（Ｂ）を測定すること、前記相対量（Ａ）と前記相対量（Ｂ）とを比較すること、及び、前記比較に基づいて標的タンパク質の不安定性及び／又は安定性を誘導する候補物質を選択することを含む。アッセイ細胞は、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうる細胞、又は、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうる手段を有する細胞である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質の不安定性及び／又は安定性を誘導する物質のスクリーニング方法であって、
アッセイ細胞をテスト物質と接触させることを含む培養を行い前記アッセイ細胞が発現する内部標準タンパク質に対する前記アッセイ細胞が発現する標的タンパク質の相対量（Ａ）を測定すること、
アッセイ細胞をテスト物質と接触させることなく培養し前記アッセイ細胞が発現する前記アッセイ細胞が発現する内部標準タンパク質に対する標的タンパク質の相対量（Ｂ）を測定すること、
前記相対量（Ａ）と前記相対量（Ｂ）とを比較すること、及び、
前記比較に基づいて標的タンパク質の不安定性及び／又は安定性を誘導する候補物質を選択することを含み、
アッセイ細胞は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうる細胞、又は、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうる手段を有する細胞である、方法。
【請求項２】
候補物質の選択が、前記相対量（Ａ）が前記相対量（Ｂ）よりも減少していれば、前記テスト物質を標的タンパク質の不安定性を誘導する候補物質として選択すること、及び／又は、前記相対量（Ａ）が前記相対量（Ｂ）よりも増加していれば、前記テスト物質を標的タンパク質の安定性を誘導する候補物質として選択することを含む、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
アッセイ細胞が、標的タンパク質と内部標準タンパク質とを同一のプロモーターで発現しうる細胞である、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
アッセイ細胞が、標的タンパク質と内部標準タンパク質とをポリシストロニック遺伝子発現系により発現しうる細胞である、請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記ポリシストロニック遺伝子発現系が、標的タンパク質遺伝子と内部標準タンパク質遺伝子とが内部リボゾーム結合配列又は自己開裂ペプチドをコードする遺伝子配列を介して連結された構成を含む、請求項４記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
標的タンパク質又は内部標準タンパク質の少なくとも一方が、タグと融合した形態でアッセイ細胞において発現される、請求項１から５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
標的タンパク質及び内部標準タンパク質が、蛍光を発光可能な形態でアッセイ細胞において発現される、請求項１から６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載のスクリーニング方法を行うためのキットであって、
標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうるアッセイ細胞、若しくは、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうる手段を有するアッセイ細胞、又は、
任意の標的タンパク質の遺伝子を組み込むことができ、かつ、内部標準タンパク質が予め組み込まれ、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとが同一の発現制御下で発現されうるように構成及び適合された遺伝子発現ベクターを含むキット。
【請求項９】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩。
【化１】
2013183718.tif 000050
［式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｒ２は、-Ｒ３、-Ｃ≡Ｃ-Ｒ３、-ＣＨ=ＣＨ-Ｒ３、及び-Ｏ-(ＣＨ２)ｎ-Ｒ３からなる群から選択され、ｎは１〜６であり、Ｒ３は、水素原子、水酸基、Ｃ１−８アルキル基、-Ｓｉ(Ｒ５)３、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、Ｒ１とＲ２は結合して環を形成し、-Ｒ１-Ｒ２-が、-(ＣＨ２)ｍ-ＣＨ２-、-ＣＨ=ＣＨ-、-(ＣＨ２)ｍ-Ｏ-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、ｍは１〜６であり、Ｒ４は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である。Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、-Ｓｉ(Ｒ５)３中の３つのＲ５はそれぞれ異なっていてもよい。］
【請求項１０】
【化２】
2013183718.tif 000051
で表される化合物又はその製薬上許容される塩。
【請求項１１】
生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための組成物であって、請求項９又は１０に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩を含む組成物。
【請求項１２】
生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための請求項９又は１０に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩。
【請求項１３】
生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる組成物を製造するための請求項９又は１０に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩の使用。
【請求項１４】
生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法であって、
下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法。
【化３】
2013183718.tif 000052
［式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｒ２は、-Ｒ３、-Ｃ≡Ｃ-Ｒ３、-ＣＨ=ＣＨ-Ｒ３、及び-Ｏ-(ＣＨ２)ｎ-Ｒ３からなる群から選択され、ｎは１〜６であり、Ｒ３は、水素原子、水酸基、Ｃ１−８アルキル基、-Ｓｉ(Ｒ５)３、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、Ｒ１とＲ２は結合して環を形成し、-Ｒ１-Ｒ２-が、-(ＣＨ２)ｍ-ＣＨ２-、-ＣＨ=ＣＨ-、-(ＣＨ２)ｍ-Ｏ-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、ｍは１〜６であり、Ｒ４は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である。Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、-Ｓｉ(Ｒ５)３中の３つのＲ５はそれぞれ異なっていてもよい。］
【請求項１５】
生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法であって、
【化４】
2013183718.tif 000053
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物であって、請求項９又は１０に記載の化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、医薬組成物。
【請求項１７】
アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための請求項９又は１０に記載の化合物又はその製薬上許容される塩。
【請求項１８】
アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物を製造するための請求項９又は１０に記載の化合物又はその製薬上許容される塩の使用。
【請求項１９】
アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む、方法。
【化５】
2013183718.tif 000054
［式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｒ２は、-Ｒ３、-Ｃ≡Ｃ-Ｒ３、-ＣＨ=ＣＨ-Ｒ３、及び-Ｏ-(ＣＨ２)ｎ-Ｒ３からなる群から選択され、ｎは１〜６であり、Ｒ３は、水素原子、水酸基、Ｃ１−８アルキル基、-Ｓｉ(Ｒ５)３、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、Ｒ１とＲ２は結合して環を形成し、-Ｒ１-Ｒ２-が、-(ＣＨ２)ｍ-ＣＨ２-、-ＣＨ=ＣＨ-、-(ＣＨ２)ｍ-Ｏ-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、ｍは１〜６であり、Ｒ４は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である。Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、-Ｓｉ(Ｒ５)３中の３つのＲ５はそれぞれ異なっていてもよい。］
【請求項２０】
アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、
【化６】
2013183718.tif 000055
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む、方法。
【請求項２１】
アルツハイマー病が、ダウン症候群において発症しうるアルツハイマー病である、請求項１６から２０のいずれかに記載の医薬組成物、塩、使用、又は方法。
【請求項２２】
生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させるための組成物であって、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を含む組成物。
【化７】
2013183718.tif 000056
［式（ＩＩ）において、Ｒ１１は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、Ｒ１３は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｑは、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｃ=Ｃ-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-ＣＨ２-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、及び、-ＳＯ２-Ｒ１４からなる群から選択される基であり、Ｒ１４は、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。］
【請求項２３】
生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させるための化合物、又はその製薬上許容される塩であって、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩。
【化８】
2013183718.tif 000057
［式（ＩＩ）において、Ｒ１１は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、Ｒ１３は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｑは、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｃ=Ｃ-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-ＣＨ２-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、及び、-ＳＯ２-Ｒ１４からなる群から選択される基であり、Ｒ１４は、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。］
【請求項２４】
生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させる組成物を製造するための請求項２２又は２３に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩であって、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩の使用。
【化９】
2013183718.tif 000058
［式（ＩＩ）において、Ｒ１１は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、Ｒ１３は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｑは、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｃ=Ｃ-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-ＣＨ２-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、及び、-ＳＯ２-Ｒ１４からなる群から選択される基であり、Ｒ１４は、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。］
【請求項２５】
生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させる方法であって、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法。
【化１０】
2013183718.tif 000059
［式（ＩＩ）において、Ｒ１１は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、Ｒ１３は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｑは、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｃ=Ｃ-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-ＣＨ２-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、及び、-ＳＯ２-Ｒ１４からなる群から選択される基であり、Ｒ１４は、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。］
【請求項２６】
生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させる方法であって、
【化１１】
2013183718.tif 000060
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法。
【請求項２７】
アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物であって、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、医薬組成物。
【化１２】
2013183718.tif 000061
［式（ＩＩ）において、Ｒ１１は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、Ｒ１３は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｑは、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｃ=Ｃ-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-ＣＨ２-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、及び、-ＳＯ２-Ｒ１４からなる群から選択される基であり、Ｒ１４は、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。］
【請求項２８】
アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための下記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩。
【化１３】
2013183718.tif 000062
［式（ＩＩ）において、Ｒ１１は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、Ｒ１３は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｑは、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｃ=Ｃ-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-ＣＨ２-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、及び、-ＳＯ２-Ｒ１４からなる群から選択される基であり、Ｒ１４は、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。］
【請求項２９】
アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物を製造するための下記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩の使用。
【化１４】
2013183718.tif 000063
［式（ＩＩ）において、Ｒ１１は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、Ｒ１３は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｑは、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｃ=Ｃ-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-ＣＨ２-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、及び、-ＳＯ２-Ｒ１４からなる群から選択される基であり、Ｒ１４は、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。］
【請求項３０】
アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む、方法。
【化１５】
2013183718.tif 000064
［式（ＩＩ）において、Ｒ１１は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、Ｒ１３は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｑは、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｃ=Ｃ-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-ＣＨ２-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、及び、-ＳＯ２-Ｒ１４からなる群から選択される基であり、Ｒ１４は、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。］
【請求項３１】
アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、
【化１６】
2013183718.tif 000065
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法。
【請求項３２】
生体内でのDYRK1Aタンパク質活性の指標としての血中ホモシステイン濃度の使用。
【請求項３３】
個体内でのDYRK1Aタンパク質の活性を評価する方法であって、
個体の血中ホモシステイン濃度をモニタリングすること、及び、
血中ホモシステイン濃度が下降した場合にDYRK1Aタンパク質活性が亢進したと分類し、血中ホモシステイン濃度が上昇した場合にDYRK1Aタンパク質活性が抑制されたと分類する基準と比較することにより前記個体内でのDYRK1Aタンパク質活性を評価することを含む、方法。
【請求項３４】
DYRK1A活性の阻害化合物又はその候補化合物を含む組成物の投与効果を評価する方法であって、
個体の血中ホモシステイン濃度をモニタリングすること、
前記個体にDYRK1A活性の阻害化合物又はその候補化合物を含む組成物を投与すること、及び、
投与後に血中ホモシステイン濃度が上昇した場合に前記組成物の投与によりDYRK1Aタンパク質の活性が抑制されたと評価することを含む、方法。
【請求項３５】
アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、
生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる組成物を投与すること、及び、
請求項３３又は３４に記載の評価方法を行うことを含む、方法。
【請求項３６】
アルツハイマー病が、ダウン症候群において発症しうるアルツハイマー病である、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩。
【化１７】
2013183718.tif 000066
［式（ＩＩＩ）において、R２１及びR２３は、それぞれ独立して、水素原子、C１−６直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基であり、R２２は、-R２６、-C≡C-R２６、-CH=CH-R２６、及び-O-(CH２)n-R２６からなる群から選択され、nは１〜６であり、R２６は、水素原子、水酸基、C１−８アルキル基、-Si(R２７)３、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R２１とR２２は結合して環を形成し、-R２１-R２２-が、-(CH２)m-CH２-、-CH=CH-、-(CH２)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは１〜６であり、R２７は水素原子、C１―６アルキル基、トリハロメチル基、又は水酸基であり、-Si(R２７)３中の３つのR２７はそれぞれ異なっていてもよい。R２４、R２５は、水素原子又はC１―６アルキル基である。］
【請求項３８】
【化１８】
2013183718.tif 000067
で表される化合物又はその製薬上許容される塩。
【請求項３９】
生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための組成物であって、請求項３７又は３８に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩を含む組成物。
【請求項４０】
生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための請求項３７又は３８に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩。
【請求項４１】
生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる組成物を製造するための請求項３７又は３８に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩の使用。
【請求項４２】
生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法であって、
下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法。
【化１９】
2013183718.tif 000068
［式（ＩＩＩ）において、R２１及びR２３は、それぞれ独立して、水素原子、C１−６直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基であり、R２２は、-R２６、-C≡C-R２６、-CH=CH-R２６、及び-O-(CH２)n-R２６からなる群から選択され、nは１〜６であり、R２６は、水素原子、水酸基、C１−８アルキル基、-Si(R２７)３、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R２１とR２２は結合して環を形成し、-R２１-R２２-が、-(CH２)m-CH２-、-CH=CH-、-(CH２)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは１〜６であり、R２７は水素原子、C１―６アルキル基、トリハロメチル基、又は水酸基であり、-Si(R２７)３中の３つのR２７はそれぞれ異なっていてもよい。R２４、R２５は、水素原子又はC１―６アルキル基である。］
【請求項４３】
生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法であって、
【化２０】
2013183718.tif 000069
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法。
【請求項４４】
アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物であって、請求項３７又は３８に記載の化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、医薬組成物。
【請求項４５】
アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための請求項３７又は３８に記載の化合物又はその製薬上許容される塩。
【請求項４６】
アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物を製造するための請求項３７又は３８に記載の化合物又はその製薬上許容される塩の使用。
【請求項４７】
アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む、方法。
【化２１】
2013183718.tif 000070
［式（ＩＩＩ）において、R２１及びR２３は、それぞれ独立して、水素原子、C１−６直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基であり、R２２は、-R２６、-C≡C-R２６、-CH=CH-R２６、及び-O-(CH２)n-R２６からなる群から選択され、nは１〜６であり、R２６は、水素原子、水酸基、C１−８アルキル基、-Si(R２７)３、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R２１とR２２は結合して環を形成し、-R２１-R２２-が、-(CH２)m-CH２-、-CH=CH-、-(CH２)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは１〜６であり、R２７は水素原子、C１―６アルキル基、トリハロメチル基、又は水酸基であり、-Si(R２７)３中の３つのR２７はそれぞれ異なっていてもよい。R２４、R２５は、水素原子又はC１―６アルキル基である。］
【請求項４８】
アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、
【化２２】
2013183718.tif 000071
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む、方法。
【請求項４９】
アルツハイマー病が、ダウン症候群において発症しうるアルツハイマー病である、請求項４４から４８のいずれかに記載の医薬組成物、塩、使用、又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、タンパク質の不安定性及び／又は安定性を誘導する物質のスクリーニング方法、タンパク質の不安定性及び／又は安定性を誘導する化合物、その製薬上許容される塩、組成物、それらの使用、それらを用いたタンパク質の不安定性及び／又は安定性の誘導方法、それらを用いたアルツハイマー病等の予防、改善、進行抑制及び／又は治療方法、及び、タンパク質の活性評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の発現解析は、免疫アッセイ、酵素アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等により行われる。加えて、細胞イメージング技術の向上に伴い、ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）と呼ばれる高度に自動化された蛍光顕微鏡、マルチパラメータの定量、及び、画像解析を組み合わせた細胞分析技術が、タンパク質発現解析にも応用されている（非特許文献１から１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Brodin P, Christophe T. 1370397491407_0 Curr Opin Chem Biol. 2011 Aug;15(4):534-9.
【非特許文献２】Jain S, Heutink P. 1370397491407_1 Neuron. 2010 Oct 21;68(2):207-17.
【非特許文献３】Daub A, Sharma P, Finkbeiner S. 1370397491407_2 Curr Opin Neurobiol. 2009 Oct;19(5):537-43.
【非特許文献４】Bullen A. 1370397491407_3 Nat Rev Drug Discov. 2008 Jan;7(1):54-67.
【非特許文献５】Korn K, Krausz E. 1370397491407_4 Curr Opin Chem Biol. 2007 Oct;11(5):503-10.
【非特許文献６】Nicholson RL, Welch M, Ladlow M, Spring DR. 1370397491407_5 ACS Chem Biol. 2007 Jan 23;2(1):24-30.
【非特許文献７】Szymczak AL, Workman CJ, Wang Y, Vignali KM, Dilioglou S, Vanin EF, Vignali DA. 1370397491407_6Nat Biotechnol. 2004 May;22(5):589-94.
【非特許文献８】de Felipe P. 1370397491407_7 Curr Gene Ther. 2002 Sep;2(3):355-78.
【非特許文献９】Martinez-Salas E. 1370397491407_8Curr Opin Biotechnol. 1999 Oct;10(5):458-64.
【非特許文献１０】Houdebine LM, Attal J. 1370397491407_9 Transgenic Res. 1999 Jun;8(3):157-77.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
様々なタンパク質の過剰発現又は過剰活性化と疾患との関連性が指摘されている。例えば、このような疾患に関与するタンパク質を低減させることは、これらの疾患に対する治療法となり得ることが期待される。【０００５】
細胞内ではタンパク質は様々な外的要因にその安定性が影響を受ける。例えば、リン酸化又はアセチル化などの翻訳後修飾は、外的要因の１つと考えられる。翻訳後修飾は、タンパク質の安定性に重要であり、タンパク質の機能発現に必要不可欠な場合がある。ヒトの疾患の中には、これらの外的要因が異常になることによる疾患関連タンパク質の過剰発現や過剰活性化が原因であるものも少なくない。【０００６】
一般に医薬の有効成分の候補化合物のスクリーニングは、試験管内で解析されることが多い。一方で、明らかになっていない未知の分子メカニズムを標的とする場合、細胞を用いた化合物スクリーニングが有利となる。しかし、細胞を用いた化合物スクリーニングの場合、標的タンパク質の量が低減したとしても、該タンパク質が不安定化したのか、或いは、該タンパク質の遺伝子発現が抑制されたのかをスクリーニングの段階で区別することが難しいという問題がある。【０００７】
本開示は、一又は複数の実施形態において、細胞が発現する標的タンパク質の量が増加又は減少した場合に、その理由が遺伝子発現の亢進又は抑制であるのか、或いは、タンパク質自体の安定性の変化であるのかを区別可能なスクリーニング方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質の不安定性及び／又は安定性を誘導する物質のスクリーニング方法に関する。前記スクリーニング方法は、一又は複数の実施形態において、アッセイ細胞をテスト物質と接触させることを含む培養を行い前記アッセイ細胞が発現する内部標準タンパク質に対する前記アッセイ細胞が発現する標的タンパク質の相対量（Ａ）を測定すること、アッセイ細胞をテスト物質と接触させることなく培養し前記アッセイ細胞が発現する前記アッセイ細胞が発現する内部標準タンパク質に対する標的タンパク質の相対量（Ｂ）を測定すること、前記相対量（Ａ）と前記相対量（Ｂ）とを比較すること、及び、前記比較に基づいて標的タンパク質の不安定性及び／又は安定性を誘導する候補物質を選択することを含む。ここで、アッセイ細胞は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうる細胞、又は、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうる手段を有する細胞である。【０００９】
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示にかかるスクリーニング方法を行うためのキットであって、アッセイ細胞又は遺伝子発現ベクターを含むキットに関する。前記アッセイ細胞は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうる細胞、又は、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうる手段を有する細胞である。前記遺伝子発現ベクターは、一又は複数の実施形態において、任意の標的タンパク質の遺伝子を組み込むことができ、かつ、内部標準タンパク質が予め組み込まれ、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとが同一の発現制御下で発現されうるように構成及び適合された遺伝子発現ベクターである。【００１０】
本開示は、一又は複数の実施形態において、下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩に関する。
【化１】
2013183718.tif 000002
［式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｒ２は、-Ｒ３、-Ｃ≡Ｃ-Ｒ３、-ＣＨ=ＣＨ-Ｒ３、及び-Ｏ-(ＣＨ２)ｎ-Ｒ３からなる群から選択され、ｎは１〜６であり、Ｒ３は、水素原子、水酸基、Ｃ１−８アルキル基、-Ｓｉ(Ｒ５)３、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、Ｒ１とＲ２は結合して環を形成し、-Ｒ１-Ｒ２-が、-(ＣＨ２)ｍ-ＣＨ２-、-ＣＨ=ＣＨ-、-(ＣＨ２)ｍ-Ｏ-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、ｍは１〜６であり、Ｒ４は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である。Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、-Ｓｉ(Ｒ５)３中の３つのＲ５はそれぞれ異なっていてもよい。］【００１１】
本開示は、一又は複数の実施形態において、下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩に関する。
【化２】
2013183718.tif 000003
［式（ＩＩＩ）において、R２１及びR２３は、それぞれ独立して、水素原子、C１−６直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基であり、R２２は、-R２６、-C≡C-R２６、-CH=CH-R２６、及び-O-(CH２)n-R２６からなる群から選択され、nは１〜６であり、R２６は、水素原子、水酸基、C１−８アルキル基、-Si(R２７)３、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R２１とR２２は結合して環を形成し、-R２１-R２２-が、-(CH２)m-CH２-、-CH=CH-、-(CH２)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは１〜６であり、R２７は水素原子、C１―６アルキル基、トリハロメチル基、又は水酸基であり、-Si(R２７)３中の３つのR２７はそれぞれ異なっていてもよい。R２４、R２５は、水素原子又はC１―６アルキル基である。］【００１２】
本開示は、一又は複数の実施形態において、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための化合物、その製薬上許容される塩、又はそれらを含む組成物に関する。本開示は、一又は複数の実施形態において、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法に関する。【００１３】
本開示は、一又は複数の実施形態において、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための化合物、その製薬上許容される塩、又はそれらを含む組成物を用いたアルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法に関する。【００１４】
本開示は、一又は複数の実施形態において、生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させるための下記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩、又はそれらを含む組成物に関する。本開示は、一又は複数の実施形態において、生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させる方法に関する。
【化３】
2013183718.tif 000004
［式（ＩＩ）において、Ｒ１１は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、Ｒ１３は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｑは、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｃ=Ｃ-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-ＣＨ２-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、及び、-ＳＯ２-Ｒ１４からなる群から選択される基であり、Ｒ１４は、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。］【００１５】
本開示は、一又は複数の実施形態において、生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させるための下記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩、又はそれらを含む組成物を用いたアルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法に関する。
【化４】
2013183718.tif 000005
［式（ＩＩ）において、Ｒ１１は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、Ｒ１３は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｑは、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｃ=Ｃ-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-ＣＨ２-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、及び、-ＳＯ２-Ｒ１４からなる群から選択される基であり、Ｒ１４は、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。］【００１６】
本開示は、一又は複数の実施形態において、生体内でのDYRK1Aタンパク質活性の指標としての血中ホモシステイン濃度の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、FLAGタグ付きDYRK1AとEGFPの同時発現系（FLAG-DYRK1A-2A-EGFP）の一実施形態のモデル図である。
【図２】図２は、FLAG-DYRK1AとEGFPがドキシサイクリンにより発現誘導がされることを示すウエスタンブロット解析の一例である。
【図３】図３は、テスト化合物（化合物１）が、内部標準のEGFPタンパク質量には影響を与えず、細胞内でFLAG-DYRK1Aのタンパク質量のみを低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。
【図４】図４は、化合物１を０、４、及び８μＭで添加した時の様々なリン酸化酵素のタンパク量をウエスタンブロット解析した結果の一例を示す図である。
【図５】図５は、FLAGタグ付きDYRK1AとEGFPの同時発現系（FLAG-DYRK1A-2A-EGFP）の一実施形態のモデル図である。
【図６】図６は、テスト化合物（化合物２）が、内部標準のmCherryタンパク質量には影響を与えず、細胞内でEGFP-TAUタンパク質量のみを低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。
【図７】図７は、DYRK1A阻害剤Harmineをラットへの経口投与した場合における血中ホモシステイン濃度を測定した結果の一例である。
【図８】図８は、化合物３、４又は５を０、及び４μＭで添加した時のDYRK1Aタンパク質量をウエスタンブロット解析した結果の一例を示す図である。
【図９】図９は、テスト化合物（化合物６）が、細胞内でFLAG-DYRK1Aのタンパク質量を低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。
【図１０】図１０の左図は、テスト化合物（化合物７）が、内部標準のEGFPタンパク質量には影響を与えず、細胞内でFLAG-DYRK1Aのタンパク質量のみを低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。図１０の右図は、テスト化合物（化合物８）が、内部標準のEGFPタンパク質量には影響を与えず、細胞内でFLAG-DYRK1Aのタンパク質量のみを増加させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。
【図１１】図１１は、テスト化合物（化合物９）が、内部標準のEGFPタンパク質量には影響を与えず、細胞内でFLAG-DYRK1Aのタンパク質量のみを低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。
【図１２】図１２は、テスト化合物（化合物１０）が、細胞内でFLAG-DYRK1Aのタンパク質量を低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
［スクリーニング方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質の不安定性及び／又は安定性を誘導する物質のスクリーニング方法に関する。前記スクリーニング方法は、一又は複数の実施形態において、アッセイ細胞をテスト物質と接触させることを含む培養を行い前記アッセイ細胞が発現する内部標準タンパク質に対する前記アッセイ細胞が発現する標的タンパク質の相対量（Ａ）を測定すること、アッセイ細胞をテスト物質と接触させることなく培養し前記アッセイ細胞が発現する前記アッセイ細胞が発現する内部標準タンパク質に対する標的タンパク質の相対量（Ｂ）を測定すること、前記相対量（Ａ）と前記相対量（Ｂ）とを比較すること、及び、前記比較に基づいて標的タンパク質の不安定性及び／又は安定性を誘導する候補物質を選択することを含む。
【００１９】
本開示にかかるスクリーニング方法は、一又は複数の実施形態において、生きた細胞、又は、組織、器官、若しくは生体で行うことができる。本実施形態においては、試験管内での解析では見出だすことが困難な分子メカニズムを標的にできる点で利点がある。例えば、疾患関連タンパク質の安定性を担保する分子メカニズムの多くは、未だ明らかとはなっていないため、そのような未知の分子メカニズムを標的とするために、生きた細胞等を基盤としたスクリーニング法は利点がある。
【００２０】
〔アッセイ細胞〕
本開示にかかるスクリーニング方法におけるアッセイ細胞は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質と内部標準タンパク質とを発現する。例えば、生きた細胞等を基盤としたスクリーニング法において標的タンパク質の量が低減したとしても、不安定化したのか、遺伝子発現を抑制したのかをスクリーニングの段階で明確に区別することは困難な場合がある。アッセイ細胞が内部標準タンパク質を発現すれば、アッセイ細胞が発現する標的タンパク質の量が増加又は減少した場合に、その理由が遺伝子発現の亢進又は抑制であるのか、或いは、タンパク質自体の安定性の変化であるのかを区別可能な点で有利である。
【００２１】
本開示にかかるスクリーニング方法におけるアッセイ細胞は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうる細胞である。標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現させることにより、アッセイ細胞が発現する標的タンパク質の量が増加又は減少した場合に、その理由が遺伝子発現の亢進又は抑制であるのか、或いは、タンパク質自体の安定性の変化であるのかをより明確に区別可能となる点で有利である。或いは、標的タンパク質の不安定化が細胞ダメージ等による二次的影響である可能性を排除しうる。標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうる細胞は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質と内部標準タンパク質とを同一のプロモーターで発現しうる細胞である。標的タンパク質と内部標準タンパク質とを同一のプロモーターで発現しうる細胞は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質と内部標準タンパク質とをポリシストロニック遺伝子発現系により発現しうる細胞である。ポリシストロニック遺伝子発現系は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質遺伝子と内部標準タンパク質遺伝子とが内部リボゾーム結合配列又は自己開裂ペプチドをコードする遺伝子配列を介して連結された構成を含む遺伝子発現系である。
【００２２】
本開示にかかるスクリーニング方法におけるアッセイ細胞は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうる手段を有する細胞である。標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうる手段により、アッセイ細胞が発現する標的タンパク質の量が増加又は減少した場合に、その理由が遺伝子発現の亢進又は抑制であるのか、或いは、タンパク質自体の安定性の変化であるのかをより明確に区別可能となる点で有利である。或いは、標的タンパク質の不安定化が細胞ダメージ等による二次的影響である可能性を排除しうる。標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうる手段は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質と内部標準タンパク質とを同一のプロモーターで発現する発現系である。標的タンパク質と内部標準タンパク質とを同一のプロモーターで発現する発現系は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質と内部標準タンパク質とが同一ｍＲＮＡで発現されうるポリシストロニック遺伝子発現系である。ポリシストロニック遺伝子発現系は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質遺伝子と内部標準タンパク質遺伝子とが内部リボゾーム結合配列又は自己開裂ペプチドをコードする遺伝子配列を介して連結された構成を含む遺伝子発現系である。
【００２３】
本開示において「プロモーター」は、アッセイ細胞内でタンパク質の発現を誘導できる、従前知られた又は今後開発されるプロモーターを使用できる。例えば、ＣＭＶプロモーター（但し、これに限定されない）のように構成的な発現が可能なプロモーターであってもよく、例えば、テトラサイクリン発現誘導システム（但し、これに限定されない）のように発現のＯＮ／ＯＦＦの制御が可能なプロモーターであってもよい。
【００２４】
本開示において「ポリシストロニック遺伝子発現系」で同一ｍＲＮＡとして発現される遺伝子の数は、特に限定されないが、一又は複数の実施形態において、２、３、又は４個である。本開示において「内部リボゾーム結合配列」（Internal Ribosome Entry Site: IRES sequence）は、キャップ構造非依存的にリボソームをｍＲＮＡ上にリクルートし、翻訳を開始させることができる配列であって、従前知られた又は今後開発されるIRES配列を使用できる。本開示において「自己開裂ペプチド」は、一又は複数の実施形態において、口蹄疫ウイルス２Ａ遺伝子由来のものであるが、これに限定されず、従前知られた又は今後開発される自己開裂ペプチドが使用できる。
【００２５】
アッセイ細胞は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとが同一の発現制御下で発現されうるように構成及び適合された遺伝子発現ベクターを細胞に導入することで作製できる。アッセイ細胞の作製に使用する、すなわち、前記ベクターの導入対象となる細胞は、特に制限されず、一又は複数の実施形態において、哺乳類細胞である。哺乳類細胞は、一又は複数の実施形態において、ヒト、ウシ、ネコ、サル、イヌ、ゾウ、ハムスター、ミンク、マウス、ブタ、ウサギ、ラットの細胞である。細胞の種類は、特に制限されないが、一又は複数の実施形態において、神経細胞又はその培養細胞、血球系細胞又はその培養細胞、骨髄細胞又はその培養細胞、上皮細胞又はその培養細胞、結合組織細胞又はその培養細胞、胚性細胞又はその培養細胞、腎臓由来細胞又はその培養細胞、肝臓由来細胞又はその培養細胞、肺由来細胞又はその培養細胞、脳由来細胞又はその培養細胞、乳腺由来細胞又はその培養細胞、骨由来細胞又はその培養細胞、胃由来細胞又はその培養細胞等が挙げられる。前記ベクターは、一過性発現を行うタイプであってもよく、安定発現を行うタイプであってもよい。
【００２６】
〔テスト物質〕
本開示にかかるスクリーニング方法におけるテスト物質は、特に限定されない。本開示において「物質」は、一又は複数の実施形態において、化合物、組成物、混合物、抽出物、天然物、又は合成物であってよい。テスト物質は、一又は複数の実施形態において、スクリーニングライブラリーを利用してもよく、特に限定されないが、化合物若しくはその塩、組成物、混合物、抽出物、天然物、又は合成物のライブラリーが利用できる。
【００２７】
アッセイ細胞とテスト物質との接触は、一又は複数の実施形態において、テスト物質の存在下でアッセイ細胞を培養することに行えるが、この方法に限定されない。また、アッセイ細胞の培養条件は、一又は複数の実施形態において、アッセイ細胞の種類に応じて適宜選択できるが、この方法に限定されない。アッセイ細胞とテスト物質との接触における、接触時間、及びテスト物質の濃度は、特に限定されず、適宜設定され得る。
【００２８】
〔相対量〕
本開示にかかるスクリーニング方法における相対量は、一又は複数の実施形態において、内部標準タンパク質のタンパク質量に対する標的タンパク質のタンパク質量である。相対量の測定は、特に限定されず、従前知られた又は今後開発されるタンパク質量の測定方法で測定できる。相対量の測定は、一又は複数の実施形態において、光学イメージングにより行われる。光学イメージングが採用されることにより、スクリーニングの高速化、ハイスループット化が可能となる利点がある。光学イメージングによる相対量の測定は、一又は複数の実施形態において、アッセイ細胞を顕微鏡で観察し、標的タンパク質からの蛍光又は発光、及び、内部標準タンパク質からの蛍光又は発光を測定することで行われる。アッセイ細胞からの蛍光又は発光を測定する手段は、一又は複数の実施形態において、顕微鏡を搭載した蛍光又は発光イメージング装置であり、前記装置は、一又は複数の実施形態において、さらに解析ソフト又は解析装置を含む。標的タンパク質から蛍光又は発光を得る手段は、一又は複数の実施形態において、蛍光又は発光するように免疫学的に標的タンパク質を標識することであり、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質をタグと融合させることである。内部標準タンパク質から蛍光又は発光を得る手段は、一又は複数の実施形態において、内部標準タンパク質として蛍光タンパク質を使用することであり、一又は複数の実施形態において、蛍光又は発光するように免疫学的に内部標準タンパク質を標識することであり、一又は複数の実施形態において、内部標準タンパク質をタグと融合させることである。
【００２９】
本開示において「蛍光するように免疫学的に標識すること」は、一又は複数の実施形態において、蛍光タンパク質と結合した抗体を用いる蛍光細胞染色検出法があげられる。本開示において「発光するように免疫学的に標識すること」は、一又は複数の実施形態において、例えば、アルカリホスファターゼ標識抗体を用いるような（但し、これに限定されない）、化学発光検出法があげられる。本開示において「タグ」は、タンパク質の測定に使用できる従前知られた又は今後開発されるタグが使用でき、一又は複数の実施形態において、蛍光タンパク質であり、一又は複数の実施形態において、例えば、FLAGタグやHAタグなどの（但し、これに限定されない）エピトープタグである。
【００３０】
本開示にかかるスクリーニング方法の一又は複数の実施形態において、標的タンパク質及び内部標準タンパク質は、蛍光を発光可能な形態でアッセイ細胞において発現される。これにより、生きた細胞内で標的タンパク質の相対量を観察できるという利点がある。
【００３１】
〔標的タンパク質〕
本開示にかかるスクリーニング方法において「標的タンパク質」は、特に制限されない。標的タンパク質は、一又は複数の実施形態において、例えば、DARK1AやTAUなどの（但し、これに限定されない）疾患に関与するタンパク質、又は、疾患に関与すると考えられるタンパク質が挙げられる。リン酸化酵素DYRK1Aは、ダウン症候群にて過剰産生が示され、この過剰産生がダウン症候群にて高確率に発症するアルツハイマー病の原因と考えられている。また、微小管結合タンパク質TAUは、過剰リン酸化を受けることで不溶化・集積し、この過剰リン酸化タウの蓄積が神経変性疾患の発症原因と考えられている。遺伝子欠損マウスを用いた過去の解析により、TAU遺伝子を欠損させることでアルツハイマー病の発症を抑制出来ることが示されている。この結果は、TAU遺伝子産物（TAUタンパク質）を低減させれば、アルツハイマー病の発症を抑制出来ることを示唆している。
【００３２】
標的タンパク質は、一又は複数の実施形態において、タグと融合した形態でアッセイ細胞において発現され、或いは、蛍光を発光可能な形態でアッセイ細胞において発現される。これらの形態は、上述のとおり、光学イメージングにより標的タンパク質の相対量を測定する点で利点がある。
【００３３】
〔内部標準タンパク質〕
本開示にかかるスクリーニング方法において「内部標準タンパク質」は、特に制限されない。内部標準タンパク質は、一又は複数の実施形態において、例えば、GFPやEGFPなどのような（但し、これに限定されない）蛍光タンパク質である。この形態は、上述のとおり、光学イメージングにより標的タンパク質の相対量を測定する点で利点がある。
【００３４】
〔相対量（Ａ）と（Ｂ）の比較と候補物質の選択〕
本開示にかかるスクリーニング方法は、アッセイ細胞をテスト物質と接触させることを含む培養を行い前記アッセイ細胞が発現する内部標準タンパク質に対する前記アッセイ細胞が発現する標的タンパク質の相対量（Ａ）と、アッセイ細胞をテスト物質と接触させることなく培養し前記アッセイ細胞が発現する前記アッセイ細胞が発現する内部標準タンパク質に対する標的タンパク質の相対量（Ｂ）とを比較し、標的タンパク質の不安定性及び／又は安定性を誘導する候補物質を選択することを含む。本開示にかかるスクリーニング方法における候補物質の選択の方法は特に制限されない。候補物質の選択は、一又は複数の実施形態において、前記相対量（Ａ）が前記相対量（Ｂ）よりも減少していれば、前記テスト物質を標的タンパク質の不安定性を誘導する候補物質として選択すること、及び／又は、前記相対量（Ａ）が前記相対量（Ｂ）よりも増加していれば、前記テスト物質を標的タンパク質の安定性を誘導する候補物質として選択することを含む。選択された候補物質は、一又は複数の実施形態において、さらなる検討を行って、標的タンパク質の不安定性及び／又は安定性を誘導する物質と判断してもよく、一又は複数の実施形態において、選択された候補物質そのものを標的タンパク質の不安定性及び／又は安定性を誘導する物質と判断してもよい。
【００３５】
［キット］
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示にかかるスクリーニング方法を行うためのキットに関する。本開示にかかるキットは、本開示かかるスクリーニング方法に使用するアッセイ細胞、又は、アッセイ細胞を作製するための遺伝子発現ベクターを含む。本開示にかかるキットは、一又は複数の実施形態において、アッセイ細胞の培養に必要な培地及び試薬、アッセイ細胞を作製するために必要な試薬、ポリヌクレオチド、並びにアッセイ細胞又は遺伝子発現ベクターについての取扱説明書から選択される少なくとも１つを含みうる。
【００３６】
〔遺伝子発現ベクター〕
本開示にかかるキットに含まれる遺伝子発現ベクターは、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとが同一の発現制御下で発現されうるように構成及び適合された遺伝子発現ベクターである。前記ベクターは、アッセイ細胞の作製のために使用される。前記ベクターは、一又は複数の実施形態において、アッセイ細胞の種類に応じて発現制御機構が適宜選択されうる。前記ベクターは、一又は複数の実施形態において、一過性発現を行うタイプであってもよく、安定発現を行うタイプであってもよい。本開示にかかるキットに含まれる遺伝子発現ベクターは、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質と内部標準タンパク質とを同一のプロモーターで発現しうる遺伝子発現ベクターである。標的タンパク質と内部標準タンパク質とを同一のプロモーターで発現しうる遺伝子発現ベクターは、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質と内部標準タンパク質とをポリシストロニック遺伝子発現系により発現しうる遺伝子発現ベクターである。ポリシストロニック遺伝子発現系は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質遺伝子と内部標準タンパク質遺伝子とが内部リボゾーム結合配列又は自己開裂ペプチドをコードする遺伝子配列を介して連結された構成を含む遺伝子発現系である。
【００３７】
すなわち、本開示は以下の一又は複数の実施形態に関しうる；
［Ｓ１］  標的タンパク質の不安定性及び／又は安定性を誘導する物質のスクリーニング方法であって、アッセイ細胞をテスト物質と接触させることを含む培養を行い前記アッセイ細胞が発現する内部標準タンパク質に対する前記アッセイ細胞が発現する標的タンパク質の相対量（Ａ）を測定すること、アッセイ細胞をテスト物質と接触させることなく培養し前記アッセイ細胞が発現する前記アッセイ細胞が発現する内部標準タンパク質に対する標的タンパク質の相対量（Ｂ）を測定すること、前記相対量（Ａ）と前記相対量（Ｂ）とを比較すること、及び、前記比較に基づいて標的タンパク質の不安定性及び／又は安定性を誘導する候補物質を選択することを含み、アッセイ細胞は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうる細胞、又は、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうる手段を有する細胞である方法；
［Ｓ２］  候補物質の選択が、前記相対量（Ａ）が前記相対量（Ｂ）よりも減少していれば、前記テスト物質を標的タンパク質の不安定性を誘導する候補物質として選択すること、及び／又は、前記相対量（Ａ）が前記相対量（Ｂ）よりも増加していれば、前記テスト物質を標的タンパク質の安定性を誘導する候補物質として選択することを含む［Ｓ１］記載のスクリーニング方法；
［Ｓ３］  アッセイ細胞が、標的タンパク質と内部標準タンパク質とを同一のプロモーターで発現しうる細胞である［Ｓ１］又は［Ｓ２］に記載のスクリーニング方法；
［Ｓ４］  アッセイ細胞が、標的タンパク質と内部標準タンパク質とをポリシストロニック遺伝子発現系により発現しうる細胞である［Ｓ３］記載のスクリーニング方法；
［Ｓ５］  前記ポリシストロニック遺伝子発現系が、標的タンパク質遺伝子と内部標準タンパク質遺伝子とが内部リボゾーム結合配列又は自己開裂ペプチドをコードする遺伝子配列を介して連結された構成を含む［Ｓ４］記載のスクリーニング方法；
［Ｓ６］  標的タンパク質又は内部標準タンパク質の少なくとも一方が、タグと融合した形態でアッセイ細胞において発現される［Ｓ１］から［Ｓ５］のいずれかに記載のスクリーニング方法；
［Ｓ７］  標的タンパク質及び内部標準タンパク質が、蛍光を発光可能な形態でアッセイ細胞において発現される［Ｓ１］から［Ｓ６］のいずれかに記載のスクリーニング方法；
［Ｓ８］  ［Ｓ１］から［Ｓ７］のいずれかに記載のスクリーニング方法を行うためのキットであって、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうるアッセイ細胞、若しくは、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとを同一の発現制御下で発現しうる手段を有するアッセイ細胞、又は、任意の標的タンパク質の遺伝子を組み込むことができ、かつ、内部標準タンパク質が予め組み込まれ、標的タンパク質のｍＲＮＡと内部標準タンパク質のｍＲＮＡとが同一の発現制御下で発現されうるように構成及び適合された遺伝子発現ベクターを含むキット。
【００３８】
［DYRK1Aの不安定化又は安定化に関する物質］
本開示は、一又は複数の実施形態において、下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩に関する。
【化５】
2013183718.tif 000006
［式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｒ２は、-Ｒ３、-Ｃ≡Ｃ-Ｒ３、-ＣＨ=ＣＨ-Ｒ３、及び-Ｏ-(ＣＨ２)ｎ-Ｒ３からなる群から選択され、ｎは１〜６であり、Ｒ３は、水素原子、水酸基、Ｃ１−８アルキル基、-Ｓｉ(Ｒ５)３、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、Ｒ１とＲ２は結合して環を形成し、-Ｒ１-Ｒ２-が、-(ＣＨ２)ｍ-ＣＨ２-、-ＣＨ=ＣＨ-、-(ＣＨ２)ｍ-Ｏ-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、ｍは１〜６であり、Ｒ４は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である。Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、-Ｓｉ(Ｒ５)３中の３つのＲ５はそれぞれ異なっていてもよい。］
【００３９】
本開示は、一又は複数の実施形態において、下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩に関する。
【化６】
2013183718.tif 000007
［式（ＩＩＩ）において、R２１及びR２３は、それぞれ独立して、水素原子、C１−６直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基であり、R２２は、-R２６、-C≡C-R２６、-CH=CH-R２６、及び-O-(CH２)n-R２６からなる群から選択され、nは１〜６であり、R２６は、水素原子、水酸基、C１−８アルキル基、-Si(R２７)３、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R２１とR２２は結合して環を形成し、-R２１-R２２-が、-(CH２)m-CH２-、-CH=CH-、-(CH２)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは１〜６であり、R２７は水素原子、C１―６アルキル基、トリハロメチル基、又は水酸基であり、-Si(R２７)３中の３つのR２７はそれぞれ異なっていてもよい。R２４、R２５は、水素原子又はC１―６アルキル基である。］
【００４０】
式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）において「Ｃ１−６アルキル基」とは、一又は複数の実施形態において、炭素数１〜６個の直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基である。炭素数１〜６の直鎖又は分枝のアルキル基としては、一又は複数の実施形態において、メチル基、エチル基、１−プロピル基、２−プロピル基、２−メチル−１−プロピル基、２−メチル−２−プロピル基、１−ブチル基、２−ブチル基、１−ペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、２−メチル−１−ブチル基、３−メチル−１−ブチル基、２−メチル−２−ブチル基、３−メチル−２−ブチル基、２，２−ジメチル−１−プロピル基、１−へキシル基、２−へキシル基、３−へキシル基、２−メチル−１−ペンチル基、３−メチル−１−ペンチル基、４−メチル−１−ペンチル基、２−メチル−２−ペンチル基、３−メチル−２−ペンチル基、４−メチル−２−ペンチル基、２−メチル−３−ペンチル基、３−メチル−３−ペンチル基、２，３−ジメチル−１−ブチル基、３，３−ジメチル−１−ブチル基、２，２−ジメチル−１−ブチル基、２−エチル−１−ブチル基、３，３−ジメチル−２−ブチル基、２，３−ジメチル−２−ブチル基等が挙げられる。また、炭素数１―６の環状アルキル基としては、一又は複数の実施形態において、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。
【００４１】
式（Ｉ）において「Ｃ１−３アルキル基」とは、炭素数１〜３個の脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される一価の基である、炭素数１〜３個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を意味し、具体的には例えば、メチル基、エチル基、１−プロピル基、２−プロピル基等が挙げられる。
【００４２】
式（Ｉ）において「Ｃ１−６アルコキシ基」とは前記定義の「Ｃ１−６アルキル基」が結合したオキシ基であることを意味し、具体的には例えば、メトキシ基、エトキシ基、１−プロピルオキシ基、２−プロピルオキシ基、２−メチル−１−プロピルオキシ基、２−メチル−２−プロピルオキシ基、１−ブチルオキシ基、２−ブチルオキシ基、１−ペンチルオキシ基、２−ペンチルオキシ基、３−ペンチルオキシ基、２−メチル−１−ブチルオキシ基、３−メチル−１−ブチルオキシ基、２−メチル−２−ブチルオキシ基、３−メチル−２−ブチルオキシ基、２，２−ジメチル−１−プロピルオキシ基、１−へキシルオキシ基、２−へキシルオキシ基、３−へキシルオキシ基、２−メチル−１−ペンチルオキシ基、３−メチル−１−ペンチルオキシ基、４−メチル−１−ペンチルオキシ基、２−メチル−２−ペンチルオキシ基、３−メチル−２−ペンチルオキシ基、４−メチル−２−ペンチルオキシ基、２−メチル−３−ペンチルオキシ基、３−メチル−３−ペンチルオキシ基、２，３−ジメチル−１−ブチルオキシ基、３，３−ジメチル−１−ブチルオキシ基、２，２−ジメチル−１−ブチルオキシ基、２−エチル−１−ブチルオキシ基、３，３−ジメチル−２−ブチルオキシ基、２，３−ジメチル−２−ブチルオキシ基等が挙げられる。
【００４３】
式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）において「複素環」とは、環を構成する原子中に１〜２個のヘテロ原子を含有し、環中に二重結合を含んでいてもよく、非芳香族性の環又は芳香族性の環を意味する。本開示において「複素芳香環」とは、芳香族性の複素環を意味する。本開示において「ヘテロ原子」とは、硫黄原子、酸素原子又は窒素原子を意味する。また、本開示において「含窒素複素環」とは、環を構成する原子中に１〜２個の窒素原子を含有し、環中に二重結合を含んでいてもよく、非芳香族性の環又は芳香族性の環を意味する。
【００４４】
式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）において「環状脂肪族基」とは、環状構造を有する脂肪族基を意味する。環状脂肪族基としては、例えば、炭素数３〜１０個の環状脂肪族基が挙げられ、複数の環から構成される縮環構造を有する環状脂肪族基であってもよい。具体的には例えば、炭素数３〜１０のシクロアルキル基、環状エーテル基、デカヒドロナフチル基及びアダマンチル基等が挙げられる。炭素数３〜１０個の環状脂肪族基の具体例としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が挙げられる。
【００４５】
式（ＩＩＩ）において、ヘテロアリール（ヘテロアリールメチル基におけるヘテロアリールを含む）としては、一又は複数の実施形態において、窒素原子を１〜２個含む５〜６員単環式の基、窒素原子を１〜２個と酸素原子を１個若しくは硫黄原子を１個とを含む５〜６員単環式の基、酸素原子を１個若しくは硫黄原子を１個含む５員単環式の基、窒素原子１〜４個を含み、６員環と５又は６員環が縮合した二環式の基などが挙げられる。また、そのたの一又は複数の実施形態において、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−チエニル、３−チエニル、３−オキサジアゾリル、２−イミダゾリル、２−チアゾリル、３−イソチアゾリル、２−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、２−フリル、３−フリル、３−ピロリル、２−キノリル、８−キノリル、２−キナゾリニル、８−プリニルが挙げられる。アリール基としては、フェニル基、ナフチル基等の炭素原子数１０個以下のアリール基が挙げられる。
【００４６】
式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）において、フェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基、並びに、アリール基及びヘテロアリール（ヘテロアリールメチル基におけるヘテロアリールを含む）基の置換基としては、一個又は同一若しくは異なって複数個あってもよく、一又は複数の実施形態において、ハロゲン原子、シアノ基、トリフルオロメチル基、ニトロ基、水酸基、メチレンジオキシ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ベンジルオキシ基、低級アルカノイルオキシ基、アミノ基、モノ低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、カルバモイル基、低級アルキルアミノカルボニル基、ジ低級アルキルアミノカルボニル基、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルキルチオ基、低級アルキルスルフィニル基、低級アルキルスルホニル基、低級アルカノイルアミノ基、又は低級アルキルスルホンアミド基が挙げられる。ハロゲン原子は、一又は複数の実施形態において、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素の原子が挙げられる。低級アルキルは、一又は複数の実施形態において、前記定義の「Ｃ１−６アルキル基」が挙げられる。
【００４７】
本開示において「製薬上許容される塩」とは、薬理上及び／又は医薬上許容される塩を含有し、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性又は塩基性アミノ酸塩などが挙げられる。
【００４８】
前記無機酸塩の好ましい例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などが挙げられ、有機酸塩の好ましい例としては、例えば酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。
【００４９】
前記無機塩基塩の好ましい例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。前記有機塩基塩の好ましい例としては、例えばジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩などが挙げられる。
【００５０】
前記酸性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられる。前記塩基性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩などが挙げられる。
【００５１】
本開示において「化合物の塩」には、化合物が大気中に放置されることにより、水分を吸収して形成されうる水和物が包含され得る。また、本開示において「化合物の塩」には、化合物が他のある種の溶媒を吸収して形成されうる溶媒和物も包含され得る。
【００５２】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ１は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である。一又は複数の実施形態において、Ｒ１は、水素原子、メチル基、エチル基である。前記一般式（Ｉ）中、Ｒ２は、-Ｒ３、-Ｃ≡Ｃ-Ｒ３、-ＣＨ=ＣＨ-Ｒ３、及び-Ｏ-(ＣＨ２)ｎ-Ｒ３からなる群から選択され、ｎは１〜６である。一又は複数の実施形態において、Ｒ２は、-Ｒ３、又は-Ｃ≡Ｃ-Ｒ３である。前記一般式（Ｉ）中、Ｒ３は、水素原子、水酸基、Ｃ１−８アルキル基、-Ｓｉ(Ｒ５)３、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、Ｒ１とＲ２は結合して環を形成し、-Ｒ１-Ｒ２-が、-(ＣＨ２)ｍ-ＣＨ２-、-ＣＨ=ＣＨ-、-(ＣＨ２)ｍ-Ｏ-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、ｍは１〜６である。一又は複数の実施形態において、Ｒ３は、-Ｓｉ(Ｒ５)３、及び、置換若しくは無置換のフェニル基又は環状脂肪族基からなる群から選択される。一又は複数の実施形態において、Ｒ３は、-Ｓｉ(Ｒ５)３、アマダンチル基、及び、一若しくは複数のメチル基、トリフルオロメチル基又は水酸基で置換されていてもよいフェニル基又はシクロヘキシル基からなる群から選択される。前記一般式（Ｉ）中、Ｒ４は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である。一又は複数の実施形態において、Ｒ４は、水素原子である。一又は複数の実施形態において、前記一般式（Ｉ）中、Ｒ１は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ２は、-Ｒ３、-Ｃ≡Ｃ-Ｒ３であり、Ｒ３は、-Ｓｉ(ＣＨ３)３、アマダンチル基、及び、メチル基又は水酸基で置換されていてもよいフェニル基又はシクロヘキシル基からなる群から選択され、Ｒ４は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である。Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、-Ｓｉ(Ｒ５)３中の３つのＲ５はそれぞれ異なっていてもよい。
【００５３】
前記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩は、一又は複数の実施形態において、
【化７】
2013183718.tif 000008
で表される化合物又はその製薬上許容される塩である。
【００５４】
前記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩は、一又は複数の実施形態において、
【化８】
2013183718.tif 000009
で表される化合物又はその製薬上許容される塩である。
【００５５】
前記一般式（ＩＩＩ）中、R２１は、一又は複数の実施形態において、水素原子、Ｃ１−３アルキル基である。R２２は、一又は複数の実施形態において、-R２６又は-C≡C-R２６であり、R２６は、一又は複数の実施形態において、-Si(R２７)３、或いは、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、R２７は、一又は複数の実施形態においてＣ１−３アルキル基である。R２３は、一又は複数の実施形態において、水素原子、Ｃ１−６アルキル基である。R２４及びR２５、一又は複数の実施形態において、水素原子、Ｃ１−３アルキル基である。
【００５６】
また、式（ＩＩＩ）で表される化合物は、一又は複数の実施形態において、Harmineを含まず、また、一又は複数の実施形態において、式（ＩＩＩ）におけるＲ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５がHarmineとなる組み合わせ（Ｒ２１がメチル基、Ｒ２２及びＲ２３が水素原子、Ｒ２４がメチル基、かつ、Ｒ２５が水素原子の組み合わせ）ではない。
【００５７】
前記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩は、一又は複数の実施形態において、
【化９】
2013183718.tif 000010
で表される化合物又はその製薬上許容される塩である。
【００５８】
前記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩は、一又は複数の実施形態において、
【化１０】
2013183718.tif 000011
で表される化合物又はその製薬上許容される塩である。
【００５９】
前記一般式（Ｉ）及び（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩は、一又は複数の実施形態において、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導すること、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させることが可能である。
【００６０】
本開示において「細胞内」とは、一又は複数の実施形態において、in vivo、in vitro、又は、ex vivoの細胞の内部であることを意味しうる。
【００６１】
したがって、本開示は、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための組成物であって、前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を含む組成物に関する。また、本開示は、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩に関する。さらにまた、本開示は、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる組成物を製造するための前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩の使用に関する。
【００６２】
［DYRK1Aの不安定化に関する方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法であって、前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む方法に関する。前記生体又は細胞は、一又は複数の実施形態において、DYRK1Aタンパク質を発現する生体又は細胞である。
【００６３】
［アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療］
リン酸化酵素DYRK1Aは、ダウン症候群にて過剰産生が示され、この過剰産生がダウン症候群にて高確率に発症するアルツハイマー病の原因と考えられている。したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための化合物、その製薬上許容される塩、又はそれらを含む組成物を用いたアルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法に関する。前記アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法は、一又は複数の実施形態において、ダウン症候群において発症しうるアルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法である。
【００６４】
本開示は、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物であって、前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物（以下、「本開示にかかる医薬組成物D」ともいう。）に関する。また、本開示は、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩に関する。さらにまた、本開示は、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物を製造するための前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩の使用に関する。
【００６５】
本開示において「医薬組成物」は、一又は複数の実施形態において、周知の製剤技術を適用し、投与形態に適した剤形とすることができる。その投与形態としては、これらに限定されないが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、シロップ剤、液剤等の剤形による経口投与が挙げられる。或いは、注射剤、液剤、エアゾール剤、座剤、貼布剤、パップ剤、ローション剤、リニメント剤、軟膏剤、点眼剤等の剤形による非経口投与を挙げることができる。これらの製剤は、これらに限定されないが、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定化剤、矯味矯臭剤、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造されうる。
【００６６】
前記賦形剤としては、これらに限定されないがデンプン、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン等のデンプン、乳糖、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。前記コーティング剤としては、これらに限定されないが、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セラック、タルク、カルナウバロウ、パラフィン等を挙げることができる。前記結合剤としては、これらに限定されないが、ポリビニルピロリドン、マクロゴール及び前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。前記崩壊剤としては、これらに限定されないが、前記賦形剤と同様の化合物及びクロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。前記安定化剤としては、これらに限定されないが、メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェエノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及びソルビン酸を挙げることができる。前記矯味矯臭剤としては、これらに限定されないが、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。
【００６７】
また、液剤の製造には、溶媒として、これらに限定されないが、エタノール、フェノール、クロロクレゾール、精製水、蒸留水等を使用することができ、必要に応じて界面活性剤又は乳化剤等も使用できる。前記界面活性剤又は乳化剤としては、これらに限定されないが、ポリソルベート８０、ステアリン酸ポリオキシル４０、ラウロマクロゴール等を挙げることができる。
【００６８】
本開示にかかる医薬組成物Dの使用方法は、症状、年齢、投与方法等により異なりうる。使用方法は、これらに限定されないが、有効成分である前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）で表される化合物の体内濃度が１００ｎＭ〜１ｍＭの間のいずれかになるように、間欠的若しくは持続的に、経口、経皮、粘膜下、皮下、筋肉内、血管内、脳内、又は腹腔内に投与することができる。限定されない実施形態として、経口投与の場合、対象（ヒトであれば成人）に対して１日あたり、前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）で表される化合物に換算して、下限として０．０１ｍｇ（好ましくは０．１ｍｇ）、上限として、２０００ｍｇ（好ましくは５００ｍｇ、より好ましくは１００ｍｇ）を１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが挙げられる。限定されない実施形態として、静脈内投与の場合には、対象（ヒトであれば成人）に対して１日当たり、下限として０．００１ｍｇ（好ましくは０．０１ｍｇ）、上限として、５００ｍｇ（好ましくは５０ｍｇ）を１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが挙げられる。
【００６９】
本開示は、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む方法に関する。前記一般式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩の投与は、一又は複数の実施形態において、前述の医薬組成物Dの使用方法に準じることができる。対象としては、ヒト、ヒト以外の動物が挙げられる。前記動物としては、DYRK1Aタンパク質を発現する動物が挙げられる。
【００７０】
すなわち、本開示は以下の一又は複数の実施形態に関しうる；
［Ｄ１］  下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩；
【化１１】
2013183718.tif 000012
［式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｒ２は、-Ｒ３、-Ｃ≡Ｃ-Ｒ３、-ＣＨ=ＣＨ-Ｒ３、及び-Ｏ-(ＣＨ２)ｎ-Ｒ３からなる群から選択され、ｎは１〜６であり、Ｒ３は、水素原子、水酸基、Ｃ１−８アルキル基、-Ｓｉ(Ｒ５)３、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、Ｒ１とＲ２は結合して環を形成し、-Ｒ１-Ｒ２-が、-(ＣＨ２)ｍ-ＣＨ２-、-ＣＨ=ＣＨ-、-(ＣＨ２)ｍ-Ｏ-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、ｍは１〜６であり、Ｒ４は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である。Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、-Ｓｉ(Ｒ５)３中の３つのＲ５はそれぞれ異なっていてもよい。］
［Ｄ２］
【化１２】
2013183718.tif 000013
で表される化合物又はその製薬上許容される塩；
［Ｄ３］  生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための組成物であって、［Ｄ１］又は［Ｄ２］に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩を含む組成物；
［Ｄ４］  生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための［Ｄ１］又は［Ｄ２］に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩；
［Ｄ５］  生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる組成物を製造するための［Ｄ１］又は［Ｄ２］に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩の使用；
［Ｄ６］  生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法であって、
下記一般式（Ｉ）表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法；
【化１３】
2013183718.tif 000014
［式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｒ２は、-Ｒ３、-Ｃ≡Ｃ-Ｒ３、-ＣＨ=ＣＨ-Ｒ３、及び-Ｏ-(ＣＨ２)ｎ-Ｒ３からなる群から選択され、ｎは１〜６であり、Ｒ３は、水素原子、水酸基、Ｃ１−８アルキル基、-Ｓｉ(Ｒ５)３、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、Ｒ１とＲ２は結合して環を形成し、-Ｒ１-Ｒ２-が、-(ＣＨ２)ｍ-ＣＨ２-、-ＣＨ=ＣＨ-、-(ＣＨ２)ｍ-Ｏ-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、ｍは１〜６であり、Ｒ４は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である。Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、-Ｓｉ(Ｒ５)３中の３つのＲ５はそれぞれ異なっていてもよい。］
［Ｄ７］  生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法であって、
【化１４】
2013183718.tif 000015
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法；
［Ｄ８］  アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物であって、［Ｄ１］又は［Ｄ２］に記載の化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、医薬組成物；
［Ｄ９］  アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための［Ｄ１］又は［Ｄ２］に記載の化合物又はその製薬上許容される塩；
［Ｄ１０］  アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物を製造するための［Ｄ１］又は［Ｄ２］に記載の化合物又はその製薬上許容される塩の使用；
［Ｄ１１］  アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む方法；
【化１５】
2013183718.tif 000016
［式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｒ２は、-Ｒ３、-Ｃ≡Ｃ-Ｒ３、-ＣＨ=ＣＨ-Ｒ３、及び-Ｏ-(ＣＨ２)ｎ-Ｒ３からなる群から選択され、ｎは１〜６であり、Ｒ３は、水素原子、水酸基、Ｃ１−８アルキル基、-Ｓｉ(Ｒ５)３、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、Ｒ１とＲ２は結合して環を形成し、-Ｒ１-Ｒ２-が、-(ＣＨ２)ｍ-ＣＨ２-、-ＣＨ=ＣＨ-、-(ＣＨ２)ｍ-Ｏ-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、ｍは１〜６であり、Ｒ４は、水素原子又はＣ１−６アルキル基である。Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、-Ｓｉ(Ｒ５)３中の３つのＲ５はそれぞれ異なっていてもよい。］
［Ｄ１２］  アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、
【化１６】
2013183718.tif 000017
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む方法；
［Ｄ１３］  アルツハイマー病が、ダウン症候群において発症しうるアルツハイマー病である、［Ｄ８］から［Ｄ１２］のいずれかに記載の医薬組成物、塩、使用、又は方法。
【００７１】
また、本開示は以下の一又は複数の実施形態に関しうる；
［Ｄ’１］  下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩；
【化１７】
2013183718.tif 000018
［式（ＩＩＩ）において、R２１及びR２３は、それぞれ独立して、水素原子、C１−６直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基であり、R２２は、-R２６、-C≡C-R２６、-CH=CH-R２６、及び-O-(CH２)n-R２６からなる群から選択され、nは１〜６であり、R２６は、水素原子、水酸基、C１−８アルキル基、-Si(R２７)３、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R２１とR２２は結合して環を形成し、-R２１-R２２-が、-(CH２)m-CH２-、-CH=CH-、-(CH２)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは１〜６であり、R２７は水素原子、C１―６アルキル基、トリハロメチル基、又は水酸基であり、-Si(R２７)３中の３つのR２７はそれぞれ異なっていてもよい。R２４、R２５は、水素原子又はC１―６アルキル基である。］
［Ｄ’２］
【化１８】
2013183718.tif 000019
で表される化合物又はその製薬上許容される塩；
［Ｄ’３］  生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための組成物であって、［Ｄ’１］又は［Ｄ’２］に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩を含む組成物；
［Ｄ’４］  生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための［Ｄ’１］又は［Ｄ’２］に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩；
［Ｄ’５］  生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる組成物を製造するための［Ｄ’１］又は［Ｄ’２］に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩の使用；
［Ｄ’６］  生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法であって、
下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法；
【化１９】
2013183718.tif 000020
［式（ＩＩＩ）において、R２１及びR２３は、それぞれ独立して、水素原子、C１−６直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基であり、R２２は、-R２６、-C≡C-R２６、-CH=CH-R２６、及び-O-(CH２)n-R２６からなる群から選択され、nは１〜６であり、R２６は、水素原子、水酸基、C１−８アルキル基、-Si(R２７)３、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R２１とR２２は結合して環を形成し、-R２１-R２２-が、-(CH２)m-CH２-、-CH=CH-、-(CH２)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは１〜６であり、R２７は水素原子、C１―６アルキル基、トリハロメチル基、又は水酸基であり、-Si(R２７)３中の３つのR２７はそれぞれ異なっていてもよい。R２４、R２５は、水素原子又はC１―６アルキル基である。］
［Ｄ’７］  生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法であって、
【化２０】
2013183718.tif 000021
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法；
［Ｄ’８］  アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物であって、［Ｄ’１］又は［Ｄ’２］に記載の化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、医薬組成物；
［Ｄ’９］  アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための［Ｄ’１］又は［Ｄ’２］に記載の化合物又はその製薬上許容される塩；
［Ｄ’１０］  アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物を製造するための［Ｄ’１］又は［Ｄ’２］に記載の化合物又はその製薬上許容される塩の使用；
［Ｄ’１１］  アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、下記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む方法；
【化２１】
2013183718.tif 000022
［式（ＩＩＩ）において、R２１及びR２３は、それぞれ独立して、水素原子、C１−６直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基であり、R２２は、-R２６、-C≡C-R２６、-CH=CH-R２６、及び-O-(CH２)n-R２６からなる群から選択され、nは１〜６であり、R２６は、水素原子、水酸基、C１−８アルキル基、-Si(R２７)３、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R２１とR２２は結合して環を形成し、-R２１-R２２-が、-(CH２)m-CH２-、-CH=CH-、-(CH２)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは１〜６であり、R２７は水素原子、C１―６アルキル基、トリハロメチル基、又は水酸基であり、-Si(R２７)３中の３つのR２７はそれぞれ異なっていてもよい。R２４、R２５は、水素原子又はC１―６アルキル基である。］
［Ｄ’１２］  アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、
【化２２】
2013183718.tif 000023
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む方法；
［Ｄ’１３］  アルツハイマー病が、ダウン症候群において発症しうるアルツハイマー病である、［Ｄ’８］から［Ｄ’１２］のいずれかに記載の医薬組成物、塩、使用、又は方法。
【００７２】
［TAUの不安定化に関する物質］
本開示は、一又は複数の実施形態において、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩に関する。
【化２３】
2013183718.tif 000024
［式（ＩＩ）において、Ｒ１１は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、Ｒ１３は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｑは、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｃ=Ｃ-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-ＣＨ２-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、及び、-ＳＯ２-Ｒ１４からなる群から選択される基であり、Ｒ１４は、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基又は単環式複素芳香環基である。］
【００７３】
前記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩は、一又は複数の実施形態において、
【化２４】
2013183718.tif 000025
で表される化合物又はその製薬上許容される塩である。
【００７４】
前記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩は、一又は複数の実施形態において、生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導すること、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させることが可能である。
【００７５】
したがって、本開示は、生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させるための組成物であって、前記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を含む組成物に関する。また、本開示は、生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させるための前記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩に関する。さらにまた、本開示は、生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させる組成物を製造するための前記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩の使用に関する。
【００７６】
［TAUの不安定化に関する方法］
本開示は、一又は複数の実施形態において、生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させる方法であって、前記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む方法に関する。前記生体又は細胞は、一又は複数の実施形態において、TAUタンパク質を発現する生体又は細胞である。
【００７７】
［アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び又は、治療］
微小管結合タンパク質TAUは、過剰リン酸化を受けることで不溶化・集積し、この過剰リン酸化タウの蓄積が神経変性疾患の発症原因と考えられている。遺伝子欠損マウスを用いた過去の解析により、TAU遺伝子を欠損させることでアルツハイマー病の発症を抑制出来ることが示されている。この結果は、TAU遺伝子産物（TAUタンパク質）を低減させれば、アルツハイマー病の発症を抑制出来ることを示唆している。また、TAUタンパク質の蓄積は、認知症の１つであるタウオパチーの原因とされている。したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させるための化合物、その製薬上許容される塩、又はそれらを含む組成物を用いたアルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法に関する。
【００７８】
本開示は、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物であって、前記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物（以下、「本開示にかかる医薬組成物T」ともいう。）に関する。また、本開示は、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための前記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩に関する。さらにまた、本開示は、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物を製造するための前記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩の使用に関する。
【００７９】
本開示にかかる医薬組成物Tの使用方法は、症状、年齢、投与方法等により異なりうる。使用方法は、これらに限定されないが、有効成分である前記一般式（ＩＩ）で表される化合物の体内濃度が１００ｎＭ〜１ｍＭの間のいずれかになるように、間欠的若しくは持続的に、経口、経皮、粘膜下、皮下、筋肉内、血管内、脳内、又は腹腔内に投与することができる。限定されない実施形態として、経口投与の場合、対象（ヒトであれば成人）に対して１日あたり、前記一般式（ＩＩ）で表される化合物に換算して、下限として０．０１ｍｇ（好ましくは０．１ｍｇ）、上限として、２０００ｍｇ（好ましくは５００ｍｇ、より好ましくは１００ｍｇ）を１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが挙げられる。限定されない実施形態として、静脈内投与の場合には、対象（ヒトであれば成人）に対して１日当たり、下限として０．００１ｍｇ（好ましくは０．０１ｍｇ）、上限として、５００ｍｇ（好ましくは５０ｍｇ）を１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが挙げられる。
【００８０】
本開示は、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、前記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む方法に関する。前記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩の投与は、一又は複数の実施形態において、前述の医薬組成物Tの使用方法に準じることができる。対象としては、ヒト、ヒト以外の動物が挙げられる。前記動物としては、TAUタンパク質を発現する動物が挙げられる。
【００８１】
すなわち、本開示は以下の一又は複数の実施形態に関しうる；
［Ｔ１］  下記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩；
【化２５】
2013183718.tif 000026
［式（ＩＩ）において、Ｒ１１は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、Ｒ１３は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｑは、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｃ=Ｃ-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-ＣＨ２-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、及び、-ＳＯ２-Ｒ１４からなる群から選択される基であり、Ｒ１４は、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基又は単環式複素芳香環基である。］
［Ｔ２］
【化２６】
2013183718.tif 000027
で表される化合物又はその製薬上許容される塩；
［Ｔ３］  生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させるための組成物であって、［Ｔ１］又は［Ｔ２］に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩を含む組成物；
［Ｔ４］  生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させるための［Ｔ１］又は［Ｔ２］に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩；
［Ｔ５］  生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させる組成物を製造するための［Ｔ１］又は［Ｔ２］に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩の使用；
［Ｔ６］  生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させる方法であって、
下記一般式（ＩＩ）表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法；
【化２７】
2013183718.tif 000028
［式（ＩＩ）において、Ｒ１１は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、Ｒ１３は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｑは、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｃ=Ｃ-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-ＣＨ２-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、及び、-ＳＯ２-Ｒ１４からなる群から選択される基であり、Ｒ１４は、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基又は単環式複素芳香環基である。］
［Ｔ７］  生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させる方法であって、
【化２８】
2013183718.tif 000029
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法；
［Ｔ８］  アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物であって、［Ｔ１］又は［Ｔ２］に記載の化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、医薬組成物；
［Ｔ９］  アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための［Ｔ１］又は［Ｔ２］に記載の化合物又はその製薬上許容される塩；
［Ｔ１０］  アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療のための医薬組成物を製造するための［Ｔ１］又は［Ｔ２］に記載の化合物又はその製薬上許容される塩の使用；
［Ｔ１１］  アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む方法；
【化２９】
2013183718.tif 000030
［式（ＩＩ）において、Ｒ１１は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基であり、Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、Ｒ１３は、水素原子又はＣ１−６アルキル基であり、Ｑは、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｃ=Ｃ-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-ＣＨ２-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-ＮＨ-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、-Ｃ(Ｏ/Ｓ)-Ｒ１４、及び、-ＳＯ２-Ｒ１４からなる群から選択される基であり、Ｒ１４は、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基又は単環式複素芳香環基である。］
［Ｔ１２］  アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、
【化３０】
2013183718.tif 000031
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む方法。
【００８２】
［DYRK1Aの指標］
DYRK1Aの過剰発現が認められるダウン症患者及びモデルマウスでは血中ホモシステイン濃度が劇的に低下するが、この血中ホモシステイン濃度の低下は肝臓におけるDYRK1A過剰発現が原因であることが知られている（Noll et al, PLoS One. 2009）。また、DYRK1Aの阻害剤を生体（ラット）に投与すると、血中ホモシステイン濃度が向上するという知見が本発明者らによって得られた。したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、生体内でのDYRK1Aタンパク質活性の指標としての血中ホモシステイン濃度の使用に関する。また、本開示は、一又は複数の実施形態において、血中ホモシステイン濃度を使用した生体内でのDYRK1Aタンパク質活性のモニタリング方法に関する。本開示にかかる血中ホモシステイン濃度の使用、及び、本開示にかかるモニタリング方法によれば、例えば、血中ホモシステイン濃度を指標に、生きたまま生体内のDYRK1A活性阻害を同一個体でモニターすることが可能になる。また、本開示にかかる血中ホモシステイン濃度の使用、及び、本開示にかかるモニタリング方法は、一又は複数の実施形態において、DYRK1A活性阻害に関する開発候補化合物の投与量及び又は投与スケジュールを、モデル動物を生かしたまま検討することを可能とする。さらに、本開示にかかる血中ホモシステイン濃度の使用、及び、本開示にかかるモニタリング方法は、一又は複数の実施形態において、ヒトでの体内DYRK1A活性を間接的に測定することを可能とする。
【００８３】
DYRK1Aの過剰産生がダウン症候群にて高確率に発症するアルツハイマー病の原因と考えられている。よって、本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示にかかる血中ホモシステイン濃度の使用、及び、本開示にかかるモニタリング方法を含む、アルツハイマー病の生化学的スコア化若しくは病態の生化学的評価に関する。前記アルツハイマー病は、一又は複数の実施形態において、ダウン症候群において発症しうるアルツハイマー病である。
【００８４】
本開示は、一又は複数の実施形態において、個体内でのDYRK1Aタンパク質の活性を評価する方法であって、個体の血中ホモシステイン濃度をモニタリングすること、及び、血中ホモシステイン濃度が下降した場合にDYRK1Aタンパク質活性が亢進したと分類し、血中ホモシステイン濃度が上昇した場合にDYRK1Aタンパク質活性が抑制されたと分類する基準と比較することにより前記個体内でのDYRK1Aタンパク質活性を評価することを含む方法に関する。前記個体は、生体であって、一又は複数の実施形態において、ヒト、マウス、ラット、その他のDYRK1Aタンパク質を発現する動物が挙げられる。
【００８５】
本開示は、一又は複数の実施形態において、DYRK1A活性の阻害化合物又はその候補化合物を含む組成物の投与効果を評価する方法であって、個体の血中ホモシステイン濃度をモニタリングすること、前記個体にDYRK1A活性の阻害化合物又はその候補化合物を含む組成物を投与すること、及び、投与後に血中ホモシステイン濃度が上昇した場合に前記組成物の投与によりDYRK1Aタンパク質の活性が抑制されたと評価することを含む方法に関する。前記個体は、生体であって、一又は複数の実施形態において、ヒト、マウス、ラット、その他のDYRK1Aタンパク質を発現する動物が挙げられる。
【００８６】
本開示は、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び／又は、治療の方法であって、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる組成物を投与すること、及び、本開示にかかる個体内でのDYRK1Aタンパク質の活性を評価する方法又はDYRK1A活性の阻害化合物又はその候補化合物を含む組成物の投与効果を評価する方法を行うことを含む方法に関する。
【実施例】
【００８７】
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本開示中に引用された文献は、すべて本開示の一部として組み入れられる。【００８８】
［リン酸化酵素DYRK1Aタンパク質を低減させる化合物のスクリーニングシステム］
〔標的タンパク質と内部標準タンパク質の同時発現系を持つアッセイ細胞の作成〕
図１のモデル図に示すような、FLAGタグ付きDYRK1AとEGFPの同時発現系（FLAG-DYRK1A-2A-EGFP）を持つアッセイ細胞を作製した。具体的には以下のように作製した。DYRK1AにはFLAGタグを融合させ（FLAG-DYRK1A）、さらに緑色蛍光タンパク質をコードするEGFP遺伝子と2Aペプチドを用いてin-frameに連結させた（FLAG-DYRK1A-2A-EGFP）。2Aペプチドは、バイシストロニック遺伝子発現を可能にするアミノ酸配列である。これによりFLAG-DYRK1A-2A-EGFPは一つのmRNA上から同時に翻訳される。前記遺伝子（FLAG-DYRK1A-2A-EGFP）を発現するベクターは以下のように作製した。すなわち、ベクターを構成する各DNA要素は、それぞれ別々のベクターからPCR法によりDNA断片として単離した。各断片をオーバーラップ伸長PCR法およびDNAライゲーション法を用いて順次繋ぎ合わせ、目的のベクターを構築した。ヒト胎児腎細胞由来HEK293細胞への導入には、リポフェクション法を用いた。また目的のベクターにはハイグロマイシン耐性遺伝子を組み込んでおり、ベクターの導入された細胞をハイグロマイシン存在下にて培養することにより、ベクターが染色体に安定に組み込まれた細胞のみを選択した。【００８９】
作製されたアッセイ細胞内では、ドキシサイクリン（Dox）を添加することにより、Tet-onシステムで制御されたFLAGタグ付きDYRK1AとEGFPが発現誘導された。その結果を図２に示す。図２は、FLAG-DYRK1AとEGFPがドキシサイクリンにより発現誘導がされることを示すウエスタンブロットの一例である。【００９０】
〔アッセイ細胞を用いた化合物スクリーニング〕
FLAG-DYRK1A-2A-EGFPを発現させた培養細胞株（アッセイ細胞）をプレート上に培養し、培養液にテスト化合物を一定濃度にて加え、培養した。培養後、細胞を固定後、抗FLAGタグ抗体及び抗EGFP抗体を用いて蛍光細胞染色を行った。この染色を行った細胞サンプルを蛍光顕微鏡を搭載した解析装置により、抗FLAGタグ抗体の量と抗EGFP抗体の量をそれぞれ定量解析し、その比率を解析した。解析データの中から、テスト化合物非存在下と比較して比率を変動させるテスト化合物を候補化合物として選択した。その一例を図３に示す。図３は、テスト化合物（下記化合物１）が、内部標準のEGFPタンパク質量には影響を与えず、細胞内でFLAG-DYRK1Aのタンパク質量のみを低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。【００９１】
得られた候補化合物群を用いて、それぞれの濃度依存性や特異性を検討した結果、下記化合物１を得た。
【化３１】
2013183718.tif 000032
【００９２】
化合物１は、DYRK1Aの転写や翻訳には全く影響を与えず、DYRK1Aタンパク質を不安定化し、分解へと導く活性を有していた。また、化合物１は、類縁リン酸化酵素であるDYRK1B、DYRK2、DYRK4を含む様々なリン酸化酵素に対しては不安定化する効果（すなわち、タンパク質の量を低減させる効果）を示さず、DYRK1Aに対する高い特異性を示した。その一例を図４に示す。図４は、化合物１を0、4、及び8μMで添加した時の様々なリン酸化酵素のタンパク量をウエスタンブロット解析した結果の一例を示す図である。また、化合物１は、リン酸化活性に対する阻害効果においても、DYRK1Aに高い特異性を示した。【００９３】
製造例１：化合物１の製造
前記化合物１を以下のように製造した。
【化３２】
2013183718.tif 000033
【００９４】
〔化合物Ａの合成〕
アルゴン雰囲気下、3-ブロモ-4-メトキシベンズアルデヒド（3-bromo-4-methoxybenzaldehyde）（5.00 g、23.3 mmol、商用品）、ジクロロビストリフェニルホスフィンパラジウム（(Ph3P)2PdCl2）（816 mg、1.16 mmol、商用品）、ヨウ化銅（CuI）（133 mg、 0.70 mmol、商用品）のトリエチルアミン（Et3N）（100 mL）溶液に、トリメチルシリルアセチレン（trimethylsilylacetylene）（5.5 mL、40 mmol、商用品）を室温にて添加し、混合物を3時間加熱還流した。これに水を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した（×3）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（n-ヘキサン／酢酸エチル = 5/1）にて精製し、4-メトキシ-3-[2-(トリメチルシリル)エチニル]ベンズアルデヒド （4-methoxy-3-[2-(trimethylsilyl)ethynyl]benzaldehyde）（化合物Ａ）（4.24 g、18.2 mmol、78.1%）を薄黄色の固体として得た。
TLC Rf 0.30 (n-hexane/ethyl acetate = 5/1)
mp 55-56 ℃
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 0.27 (s, 9H, Si(CH3)3), 3.96 (s, 3H, OCH3), 6.98 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.82 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.97 (s, 1H aromatic), 9.85 (s, 1H, CHO)
13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ −0.1, 56.3, 99.5, 100.1, 110.7, 113.3, 129.4, 131.8, 136.1, 164.7, 190.1
IR (cm-1) 762, 849, 1125, 1263, 1499, 1591, 1690, 2155, 2965【００９５】
〔化合物１の合成〕
アルゴン雰囲気下、化合物Ａ（2.01 g、8.62 mmol）、酢酸アンモニウム（NH4OAc）（331 mg、4.30 mmol、商用品）、ロダニン（rhodanine）（1.15 g、8.62 mmol、商用品）のアセトニトリル（MeCN）（50 mL）溶液に、酢酸（AcOH）(0.5 mL、8.62 mmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を３時間加熱還流した。室温まで放冷した後、これに水（H2O）（10 mL）を添加し、析出した固体を桐山ロートで濾過後、ロート上で水（×3）、ジエチルエーテル（×2）で順次洗浄し、(Z)-5-(4-メトキシ-3-((トリメチルシリル)エチニル)ベンジリデン)-2-チオキソチアゾリジン-4-オン（(Z)-5-(4-methoxy-3-((trimethylsilyl)ethynyl)benzylidene)-2-thioxothiazolidin-4-one）（化合物１）（2.64 g、7.60 mmol、88.2%）を黄色の固体として得た。
mp 215−216 ℃
1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 0.24 (s, 9H, Si(CH3)3), 3.90 (s, 3H, OCH3), 7.24 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.59-7.64 (m, 3H, aromatic and olefinic), 13.81 (brs, 1H, NH) 
13C NMR (DMSO-d6, 126 MHz) δ−0.1, 56.3, 99.3, 100.4, 112.3, 112.5, 123.5, 125.5, 130.8, 132.7, 136.1, 161.6, 169.4, 195.3
IR (cm-1) 849, 1275, 1433, 1499, 1586, 1692, 2839, 2895, 2943, 2970, 3038, 3057, 3152【００９６】
［神経変性疾患関連タンパク質TAUを低減させる化合物スクリーニングシステム］
〔標的タンパク質と内部標準タンパク質の同時発現系を持つアッセイ細胞の作成〕
図５のモデル図に示すような、EGFP融合TAUとmCherryの同時発現系（mCherry-2A-EGFP-TAU）を持つアッセイ細胞を作製した。具体的には以下のように作製した。TAUにはEGFPを融合させ（EGFP-TAU）、さらに赤色蛍光タンパク質をコードするmCherry遺伝子と2Aペプチドを用いてin-frameに連結させた（mCherry-2A-EGFP-TAU）。2Aペプチドは、バイシストロニック遺伝子発現を可能にするアミノ酸配列である。これによりmCherry-2A-EGFP-TAUは一つのmRNA上から同時に翻訳される。前記遺伝子（mCherry-2A-EGFP-TAU）を発現するベクターは以下のように作製した。すなわち、ベクターを構成する各DNA要素は、それぞれ別々のベクターからPCR法によりDNA断片として単離した。各断片をオーバーラップ伸長PCR法およびDNAライゲーション法を用いて順次繋ぎ合わせ、目的のベクターを構築した。ヒト胎児腎細胞由来HEK293細胞への導入には、リポフェクション法を用いた。また目的のベクターにはハイグロマイシン耐性遺伝子を組み込んでおり、ベクターの導入された細胞をハイグロマイシン存在下にて培養することにより、ベクターが染色体に安定に組み込まれた細胞のみを選択した。【００９７】
〔アッセイ細胞を用いた化合物スクリーニング〕
mCherry-2A-EGFP-TAUを発現させた培養細胞株（アッセイ細胞）をプレート上に培養し、培養液にテスト化合物を一定濃度にて加え、培養した。培養後、細胞を蛍光顕微鏡を搭載した解析装置により、EGFP量とmCherry量をそれぞれ定量解析し、その比率を解析した。解析データの中から、テスト化合物非存在下と比較して比率を変動させるテスト化合物を候補化合物として選択した。その一例を図６に示す。図６は、テスト化合物（下記化合物２）が、内部標準のmCherryタンパク質量には影響を与えず、細胞内でEGFP-TAUタンパク質のみを低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。【００９８】
得られた候補化合物群を用いて、それぞれの濃度依存性や特異性を検討した結果、下記化合物２を得た。化合物２は、TAUの転写や翻訳には全く影響を与えず、TAUタンパク質を不安定化し、分解へと導く活性を有していた。
【化３３】
2013183718.tif 000034
【００９９】
製造例２：化合物２の製造
前記化合物２を以下のように製造した。
【化３４】
2013183718.tif 000035
【０１００】
〔化合物Ｂの合成〕
1,4-ジフルオロ-2-ニトロベンゼン（1,4-difluoro-2-nitrobenzene）（2.00 g、12.6 mmol、商用品）のN,N-ジメチルホルムアミド（DMF）（20 mL）溶液に、1-フェニルピペラジン（1-phenylpiperazine）（6.11 g、37.7 mmol、商用品）を室温にて添加し、混合物を１３時間撹拌した。これに水を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した（×3）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（n-ヘキサン／酢酸エチル = 7/1）にて精製し、1-(4-フルオロ-2-ニトロフェニル)-4-フェニルピペラジン（1-(4-fluoro-2-nitrophenyl)-4-phenylpiperazine）（化合物Ｂ）（3.82 g、12.6 mmol、quant.）をオレンジ色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.30 (n-hexane/ethyl acetate = 7/1)。【０１０１】
〔化合物Ｃの合成〕
化合物Ｂ（3.82 g、12.6 mmol）のエタノール（40mL）溶液に、濃塩酸（6.86 mL、82.4 mmol）及び無水二塩化スズ（7.21 g、38.0 mmol）を0℃にて順次添加し、混合物を室温に戻し、2時間撹拌した。これに炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液を添加し、混合物を酢酸エチル（×3）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル= 19/1）にて精製し、2-(4-フェニル-1-ピペラジニル)-5-フルオロアニリン（2-(4-phenyl-1-piperazinyl)-5-fluoroaniline）（化合物Ｃ）（<3.69 g、<13.6 mmol、quant.）を無色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.33 (n-hexane/ethyl acetate = 5/1)
mp 161-163 ℃
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ3.02 (t, J = 4.5 Hz, 4H, 2CH2), 3.20-3.45 (br, 4H, 2CH2), 4.16 (s, 2H, NH2), 6.42 (dd, J = 2.5, 8.5 Hz, 1H, aromatic), 6.45 (dd, J = 2.5, 10.5 Hz, 1H, aromatic), 6.89 (t, J = 7.5 Hz, 1H, aromatic), 6.96-7.02 (m, 3H, aromatic), 7.28-7.32 (m, 2H, aromatic)
13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ50.3, 51.8, 101.0 (d, J = 26.5 Hz), 104.5 (d, J = 22.7 Hz), 116.5 (d, J = 31.5 Hz), 120.1, 121.2 (d, J = 10.1 Hz), 129.4 (d, J = 3.8 Hz), 135.2 (d, J = 2.5 Hz), 143.4 (d, J = 11.3 Hz), 151.5, 160.7 (d, J = 241 Hz)
19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ-113.5 − -113.4 (m)
IR (cm-1) 546, 698, 768, 802, 837, 935, 972, 1142, 1159, 1175, 1207, 1229, 1260, 1290, 1310, 1377, 1450, 1493, 1504, 1576, 1599, 1612, 2835, 3354, 3453【０１０２】
〔化合物Ｄの合成〕
化合物Ｃ（500 mg、1.84 mmol）のジクロロメタン（15 mL）溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（980 mg、5.52 mmol、商用品）及びトリエチルアミン（1.15 mL、8.29 mmol）を0℃にて順次添加し、混合物を室温に戻し、13時間撹拌した。これに水を添加し、混合物を酢酸エチル（×3）で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝2/1）にて精製し、N-[5-フルオロ-2-(4-フェニル-1-ピペラジニル)フェニル]イソニコチン酸アミド（N-[5-fluoro-2-(4-phenyl-1-piperazinyl)phenyl]isonicotinamide）（化合物Ｄ）（556 mg、1.48 mmol、80.4％）を無色の固体として得た。
TLC Rf 0.47 (n-hexane/ethyl acetate = 1/1)
mp 203-204 ℃
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ3.08 (t, J = 4.5 Hz, 4H, 2CH2), 3.20-3.54 (br, 4H, 2CH2), 6.86 (ddd, J = 3.0, 8.5, 8.5 Hz, 1H, aromatic), 6.94 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 7.01 (dd, J = 1.0, 9.0 Hz, 2H, aromatic), 7.27 (dd, J = 5.5, 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.31-7.36 (m, 2H, aromatic), 7.74 (AA’BB’, 2H, aromatic), 8.39 (dd, 1H, J = 3.0, 10.5 Hz, 1H, aromatic), 8.83 (AA’BB’, 2H, aromatic), 9.76 (s, 1H, NH)
13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ50.6, 53.1, 107.3 (d, J = 29.0 Hz), 111.1 (d, J = 22.7 Hz), 116.5, 120.7, 120.8, 122.5 (d, J = 10.1 Hz), 129.5, 134.7 (d, J = 12.6 Hz), 137.3 (d, J = 3.8 Hz), 141.8, 151.1, 151.2 160.6 (d, J = 244 Hz), 162.9
19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ-118.2 − -118.1 (m)
IR (cm-1) 692, 748, 768, 939, 1140, 1159, 1231, 1269, 1377, 1445, 1495, 1533, 1557, 1605, 1678, 2828, 3273【０１０３】
〔化合物２の合成〕
化合物Ｄ（183 mg、0.486 mmol）のトルエン（30 mL）溶液に、Lawesson’s試薬（294 mg、0.729 mmol、商用品）を添加し、混合物を130℃にて20時間還流攪拌した。室温に戻した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝2/1）にて精製し、N-[5-フルオロ-2-(4-フェニル-1-ピペラジニル)フェニル]イソニコチン酸チオアミド（N-[5-fluoro-2-(4-phenyl-1-piperazinyl)phenyl]isonicotinthioamide）（化合物２）（122 mg、0.311 mmol、64.0%）を黄色の固体として得た。
TLC Rf 0.50 (n-hexane/ethyl acetate = 1/1)
mp 183-186 ℃
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ3.08 (t, J = 4.5 Hz, 4H, 2CH2), 3.20-3.40 (br, 4H, 2CH2), 6.91-7.03 (m, 4H, aromatic), 7.27-7.34 (m, 3H, aromatic), 7.71 (d, J = 5.5 Hz, 2H, aromatic), 8.73 (d, J = 5.5 Hz, 2H, aromatic), 9.28 (d, 11.5 Hz, 1H, aromatic), 11.0 (s, 1H, NH)
13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ50.3, 53.0, 107.5 (d, J = 30.2 Hz), 112.9 (d, J = 22.7 Hz), 116.4, 120.1, 120.7, 122.3 (d, J = 8.8 Hz), 129.3, 135.7 (d, J = 11.3 Hz), 138.8 (d, J = 2.5 Hz), 149.3, 150.6, 150.7, 159.6 (d, J = 244 Hz), 192.2
19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ-112.4 − -112.6 (m)
IR (cm-1) 733, 760, 818, 937, 1155, 1229, 1263, 1314, 1364, 1377, 1410, 1449, 1495, 1518, 1599, 2826【０１０４】
［血中ホモシステインを指標としたDYRK1Aの活性阻害のモニタリング］
DYRK1A阻害剤Harmineをラットへ経口投与し、投与後の血中ホモシステイン濃度を測定した。具体的な条件は以下のとおりとし、その結果を図７に示す。【０１０５】
DYRK1A阻害剤Harmineは、投与溶媒0.9% NaClに溶解後、一個体当たり約１ｍｌ(最終投与濃度18mg/kg）を経口投与した。投与後の各時間において、尾静脈より採血を行い、血漿を分離し、EDTA-2Na存在下にて保存した。血漿中のホモシステイン濃度の解析は、株式会社エスアールエルに委託して行った。具体的には、血漿よりホモシステインを含む画分を抽出後、抽出液に含まれるホモシステインの量をHPLCにより分析することで測定した（参考文献：Araki A et al:Journal of Chromatography 422, 43-52 1987、荒木 厚:現代医療 22, 10, 2544-2549 1990）。【０１０６】
図７に示すとおり、Harmineを経口投与後２時間で血中ホモシステインは急激に上昇し、５時間後までコントロールよりも高い数値を示した。したがって、血中ホモシステインは、DYRK1A阻害剤の生体内での阻害活性、或いは、体内でのDYRK1Aの活性を示す指標となり得る。【０１０７】
［DYRK1Aタンパク質を低減させる化合物のスクリーニングシステム２］
〔アッセイ細胞を用いた化合物スクリーニング〕
FLAGx3-DYRK1A-2A-HAx3-EGFPを発現させた培養細胞株（アッセイ細胞）をプレート上に培養し、培養液にテスト化合物を一定濃度にて加え、培養した。培養後、ウエスタンブロット法により、FLAGx3-DYRK1A量とHAx3-EGFP量、GAPDH量をそれぞれ定量解析し、その比率を解析した。解析データの中から、テスト化合物非存在下と比較して比率を変動させるテスト化合物を候補化合物として選択した。その一例を図８に示す。図８は、テスト化合物（化合物３、４及び５）が、細胞内でFLAGx3-DYRK1Aタンパク質を低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。図８に示すように、化合物３、４及び５は、4μMの濃度で細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減できうることがわかった。【０１０８】
製造例３：化合物３の製造
下記化合物３を以下のように製造した。
【化３５】
2013183718.tif 000036
【化３６】
2013183718.tif 000037
【０１０９】
〔化合物Ｅの合成〕
アルゴン雰囲気下、3-ブロモ-4-メトキシベンズアルデヒド（3-bromo-4-methoxybenzaldehyde）（215 mg、1.00 mmol、商用品）、ジクロロビストリフェニルホスフィンパラジウム（(Ph3P)2PdCl2）（35.1 mg、50.0 μmol、商用品）、ヨウ化銅（CuI）（5.7 mg、30.0 μmol、商用品）のトリエチルアミン（Et3N）（2 mL）溶液に、シクロヘキシルアセチレン（cyclohexylacetylene）（260 μL、2.00 mmol、商用品）を室温にて添加し、混合物を8時間加熱還流した。これに水を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した（×3）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（n-ヘキサン／酢酸エチル = 5/1）にて精製し、3-(シクロヘキシルエチニル)-4-メトキシベンズアルデヒド （3-(cyclohexylethynyl)-4-methoxybenzaldehyde）（化合物Ｅ）（211 mg、870 μmol、87.0%）を茶色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.25 (n-hexane/ethyl acetate = 5/1)
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 1.32−1.41 (m, 3H, cyclohexyl), 1.50−1.62 (m, 3H, cyclohexyl), 1.73−1.80 (m, 2H, cyclohexyl), 1.89−1.91 (m, 2H, cyclohexyl), 2.63−2.68 (m, 1H, CH), 3.95 (s, 3H, OCH3), 6.96 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.77 (dd, J = 2.5, 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.90 (d, J = 2.5 Hz, 1H, aromatic), 9.84 (s, 1H, CHO)
13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ 24.8, 25.9, 29.9, 32.6, 56.2, 75.3, 100.1, 110.5, 114.3, 129.5, 130.9, 135.5, 164.4, 190.4
IR (cm-1) 768, 816, 1020, 1593, 1697, 2228, 2853, 2930, 3503【０１１０】
〔化合物３の合成〕
アルゴン雰囲気下、化合物Ｅ（242 mg、1.00 mmol）、酢酸アンモニウム（NH4OAc）（38.5 mg、500 μmol、商用品）、ロダニン（rhodanine）（133 mg、1.00 mmol、商用品）のアセトニトリル（MeCN）（2 mL）溶液に、酢酸（AcOH）(57 μL、1.00 mmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を２時間加熱還流した。室温まで放冷した後、これに水（H2O）（1 mL）を添加し、析出した固体を桐山ロートで濾過後、ロート上で水（×3）、ジエチルエーテル（×2）で順次洗浄し、(Z)-5-(3-(シクロヘキシルエチニル)-4-メトキシベンジリデン)-2-チオキソチアゾリジン-4-オン（(Z)-5-(3-(cyclohexylethynyl)-4-methoxybenzylidene)-2-thioxothiazolidin-4-one）（化合物３）（207 mg、579 μmol、57.9%）を黄色の固体として得た。
mp 185-186 ℃
1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 1.34−1.36 (m, 3H, cyclohexyl), 1.46−1.50 (m, 3H, cyclohexyl), 1.68−1.71 (m, 2H, cyclohexyl), 1.79−1.81 (m, 2H, cyclohexyl), 2.65−2.69 (m, 1H, CH), 3.87 (s, 3H, OCH3), 7.20 (d, J = 9.5 Hz, 1H, aromatic), 7.53−7.58 (m, 3H, aromatic and olefinic), 13.79 (brs, 1H, NH)
13C NMR (DMSO-d6, 126 MHz) δ 24.6, 25.8, 29.4, 32.5, 56.6, 76.4, 99.8, 112.7, 113.9, 123.5, 125.8, 131.5, 132.3, 135.8, 161.7, 169.8, 195.8
IR (cm-1), 675, 1148, 1586, 1695, 2849, 2899, 2926, 3036, 3050, 3146【０１１１】
製造例４：化合物４の製造
下記化合物４を以下のように製造した。
【化３７】
2013183718.tif 000038
【化３８】
2013183718.tif 000039
【０１１２】
〔化合物Ｆの合成〕
アルゴン雰囲気下、3-ヨード-4-メトキシベンズアルデヒド（3-iodo-4-methoxybenzaldehyde）（262 mg、1.00 mmol、商用品）、ジクロロビストリフェニルホスフィンパラジウム（(Ph3P)2PdCl2）（35.1 mg、50.0 μmol、商用品）、ヨウ化銅（CuI）（5.7 mg、30 μmol、商用品）のトリエチルアミン（Et3N）（2 mL）溶液に、1-エチニルアダマンタン（1-ethynyladamantane）（192 mg、1.20 mmol、商用品）を室温にて添加し、混合物を10時間加熱還流した。これに水を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した（×3）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（n-ヘキサン／酢酸エチル = 5/1）にて精製し、3-(1-アダマンチルエチニル)-4-メトキシベンズアルデヒド （3-(1-adamantylethynyl)-4-methoxybenzaldehyde）（化合物Ｆ）（172 mg、584 μmol、58.4%）を茶色の固体として得た。
mp 86−87 ℃
TLC Rf 0.35 (n-hexane/ethyl acetate = 5/1)
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 1.72 (brs, 6H, adamantyl), 1.98 (brs, 9H, adamantyl), 3.93 (s, 3H, OCH3), 6.93 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.75 (dd, J = 2.0, 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.88 (d, J = 2.0 Hz, 1H, aromatic), 9.83 (s, 1H, CHO)
13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ 27.9, 30.3, 36.3, 42.7, 56.2, 74.0, 104.0, 110.5, 114.2, 129.4, 130.8, 135.5, 164.3, 190.4
IR (cm-1) 814, 1138, 1271, 1501, 1684, 2359, 2849, 2903【０１１３】
〔化合物４の合成〕
アルゴン雰囲気下、化合物Ｆ（172 mg、580 μmol）、酢酸アンモニウム（NH4OAc）（22.4 mg、290 μmol、商用品）、ロダニン（rhodanine）（77.3 mg、580 μmol、商用品）のアセトニトリル（MeCN）（2 mL）溶液に、酢酸（AcOH）(33 μL、580 μmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を3時間加熱還流した。室温まで放冷した後、これに水（H2O）（1 mL）を添加し、析出した固体を桐山ロートで濾過後、ロート上で水（×3）、ジエチルエーテル（×2）で順次洗浄し、(Z)-5-(3-(2-アダマンチルエチニル)-4-メトキシベンジリデン)-2-チオキソチアゾリジン-4-オン（(Z)-5-(3-(2-adamantylethynyl)-4-methoxybenzylidene)-2-thioxothiazolidin-4-one）（化合物４）（148 mg、361 μmol、62.2%）を黄色の固体として得た。
mp 266-267 ℃
1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 1.68 (brs, 6H, adamantyl), 1.90 (brs, 6H, adamantyl), 1.95 (brs, 3H, adamantyl), 3.86 (s, 3H, OCH3), 7.18 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.50 (s, 1H, aromatic), 7.53 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.57 (s, 1H, olefinic), 13.78 (brs, 1H, CHO)
13C NMR (DMSO-d6, 126 MHz) δ 27.3, 29.9, 35.7, 42.3, 56.2, 74.6, 103.1, 112.3, 113.4, 123.0, 125.4, 131.1, 131.8, 135.4, 161.1, 169.3, 195.3
IR (cm-1) 667, 801, 1190, 1425, 1501, 1589, 1703, 2847, 2903, 2928, 3061, 3069, 3154【０１１４】
製造例５：化合物５の製造
下記化合物５を以下のように製造した。
【化３９】
2013183718.tif 000040
【化４０】
2013183718.tif 000041
【０１１５】
〔化合物Ｇの合成〕
アルゴン雰囲気下、3-ブロモ-4-メトキシベンズアルデヒド（3-bromo-4-methoxybenzaldehyde）（215 mg、1.00 mmol、商用品）、m-methylphenyl boronic acid（163 mg、1.20 mmol）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（Pd(PPh3)4）（57.8 mg、50.0 μmol、商用品）、炭酸ナトリウム一水和物（Na2CO3・H2O）（248 mg、2.00 mmol、商用品）の1,4-ジオキサン（1,4-dioxane）（15 mL）溶液に、水（H2O）（2 mL）を室温にて添加し、混合物を7.5時間加熱還流した。これに水を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した（×3）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（n-ヘキサン／酢酸エチル = 5/1）にて精製し、3-(3’-メチルフェニル)-4-メトキシベンズアルデヒド （3-(3’-methylphenyl)-4-methoxybenzaldehyde）（化合物Ｇ）（224 mg、990 μmol、99.0%）を薄黄色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.30 (n-hexane/ethyl acetate = 5/1)
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 2.43 (s, 3H, CH3), 3.91 (s, 3H, OCH3), 7.10 (d, J = 9.0 Hz, 1H, aromatic), 7.19−7.21 (m, 1H, aromatic), 7.34−7.52 (m, 3H, aromatic), 7.86−7.89 (m, 2H, aromatic), 9.94 (s, 1H, CHO)
13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ 21.4, 55.8, 110.9, 126.5, 127.9, 128.3, 129.7, 130.0, 131.2, 131.4, 132.2, 136.9, 137.7, 161.4, 190.9
IR (cm-1) 702, 791, 1022, 1202, 1370, 1499, 1595, 1686, 2837, 2943【０１１６】
〔化合物５の合成〕
アルゴン雰囲気下、化合物G（226 mg、1.00 mmol）、酢酸アンモニウム（NH4OAc）（38.5 mg、500 μmol、商用品）、ロダニン（rhodanine）（133 mg、1.00 mmol、商用品）のアセトニトリル（MeCN）（2 mL）溶液に、酢酸（AcOH）(57 μL、1.0 mmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を3時間加熱還流した。室温まで放冷した後、これに水（H2O）（1 mL）を添加し、析出した固体を桐山ロートで濾過後、ロート上で水（×3）、ジエチルエーテル（×2）で順次洗浄し、(Z)-5-(3-(3’-メチルフェニル))-4-メトキシベンジリデン)-2-チオキソチアゾリジン-4-オン((Z)-5-(3-(3’-methylphenyl))-4-methoxybenzylidene)-2-thioxothiazolidin-4-one)（化合物５）（311 mg、911 μmol、91.1%）を橙色の固体として得た。
mp 204−205 ℃
1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 2.33 (s, 3H, CH3), 3.93 (s, 3H, OCH3), 7.23−7.27 (m, 3H, aromatic), 7.43 (s, 1H, aromatic), 7.44 (s, 1H, aromatic), 7.57−7.69 (m, 2H, aromatic), 7.70 (s, 1H, olefinic), 13.80 (brs, 1H, NH)
13C NMR (DMSO-d6, 126 MHz) δ 21.1, 56.3, 84.3, 94.1, 99.5, 112.4, 112.6, 119.2, 125.8, 129.4 (2C), 131.3 (2C), 132.5, 135.2, 138.7, 161.0, 196.1
IR (cm-1) 679, 1018, 1200, 1582, 1701, 2839, 2909, 2943, 2963, 3017, 3036, 3050, 3148【０１１７】
［DYRK1Aタンパク質を低減又は増減させる化合物のスクリーニングシステム３］
〔アッセイ細胞を用いた化合物スクリーニング〕
FLAGx3-DYRK1A-2A-HAx3-EGFPを発現させた培養細胞株（アッセイ細胞）をプレート上に培養し、培養液にテスト化合物を一定濃度にて加え、培養した。培養後、ウエスタンブロット法により、FLAGx3-DYRK1A量とHAx3-EGFP量、GAPDH量をそれぞれ定量解析し、その比率を解析した。解析データの中から、テスト化合物非存在下と比較して比率を変動させるテスト化合物を候補化合物として選択した。その一例を図９及び図１０に示す。図９は、テスト化合物（化合物６）が、細胞内でFLAGx3-DYRK1Aタンパク質を低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。また、図１０左図は、テスト化合物（化合物７）が、内部標準のEGFPタンパク質量には影響を与えず、細胞内でFLAGx3-DYRK1Aタンパク質のみを低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。図１０右図は、テスト化合物（化合物８）が、内部標準のEGFPタンパク質量には影響を与えず、細胞内でFLAGx3-DYRK1Aタンパク質のみを増加させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。【０１１８】
製造例６：化合物６の製造
下記化合物６を以下のように製造した。
【化４１】
2013183718.tif 000042
【化４２】
2013183718.tif 000043
【０１１９】
〔化合物Ｈの合成〕
アルゴン雰囲気下、3-ブロモ-4-メトキシベンズアルデヒド（3-bromo-4-methoxybenzaldehyde）（215 mg、1.00 mmol、商用品）、3,5-ビス（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸（3,5-bis(trifluoromethyl)phenylboronic acid）（310 mg、1.20 mmol、商用品）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（Pd(PPh3)4）（57.8 mg、50.0 μmol、商用品）、炭酸ナトリウム一水和物（Na2CO3?H2O）（248 mg、2.00 mmol、商用品）の1,4-ジオキサン（1,4-dioxane）（15 mL）溶液に、水（H2O）（2 mL）を室温にて添加し、混合物を２２時間加熱還流した。これに水を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した（×３）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮し、3,5-ビス（トリフルオロメチル）フェニル)-4-メトキシベンズアルデヒド(3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl-4-methoxybenzaldehyde)（化合物H）を茶色の油状物質として得た。これを未精製のまま、次の反応に用いた。【０１２０】
〔化合物６の合成〕
アルゴン雰囲気下、化合物H（3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl-4-methoxybenzaldehyde）（<1 mmol）、酢酸アンモニウム（NH4OAc）（38.5 mg、0.500 mmol、商用品）、ロダニン（rhodanine）（133 mg、1.00 mmol、商用品）のアセトニトリル（MeCN）（2 mL）溶液に、酢酸（AcOH）(57 μL、1.0 mmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を３時間加熱還流した。室温まで放冷した後、これに水（H2O）（10 mL）を添加し、析出した結晶を桐山ロートで濾過、水（×3）、ジエチルエーテル（×2）で洗浄し、(Z)-5-(3,5-ビス（トリフルオロメチル）-4-メトキシベンジリデン)-2-チオキソチアゾリジン-4-オン（(Z)-5-(3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl-4-methoxybenzylidene)-2-thioxothiazolidin-4-one）（化合物６）（236 mg、0.509 mmol、50.9%）を黄色の固体として得た。
mp 244-245 ℃
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 3.92 (s, 3H, OCH3), 7.14 (d, J = 8.8 Hz, 1H, aromatic), 7.44 (d, J = 2.4 Hz, 1H, olefinic), 7.56 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H, aromatic), 7.66 (s, 1H, aromatic), 7.89 (s, 1H, aromatic), 7.95 (s, 2H, aromatic), 9.41 (brs, 1H, NH)
IR (cm-1) 686, 808, 1154, 1436, 1594, 1699, 3191, 3445【０１２１】
製造例７：化合物７の製造
下記化合物７を以下のように製造した。
【化４３】
2013183718.tif 000044
【化４４】
2013183718.tif 000045
【０１２２】
〔化合物Ｉの合成〕
アルゴン雰囲気下、3-ブロモ-4-メトキシベンズアルデヒド（3-bromo-4-methoxybenzaldehyde）（215 mg、1.00 mmol、商用品）、3-（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸（3-(trifluoromethyl)phenylboronic acid）（228 mg、1.20 mmol、商用品）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（Pd(PPh3)4）（57.8 mg、50.0 μmol、商用品）、炭酸ナトリウム一水和物（Na2CO3?H2O）（248 mg、2.00 mmol、商用品）の1,4-ジオキサン（1,4-dioxane）（15 mL）溶液に、水（H2O）（2 mL）を室温にて添加し、混合物を２２時間加熱還流した。これに水を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した（×３）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮し、（3-(トリフルオロメチル）フェニル）-4-メトキシベンズアルデヒド (3-(trifluoromethyl)phenyl-4-methoxybenzaldehyde)（化合物I）を黄色の油状物質として得た。これを未精製のまま、次の反応に用いた。【０１２３】
〔化合物７の合成〕
アルゴン雰囲気下、化合物I（3-(trifluoromethyl)phenyl-4-methoxybenzaldehyde）（<1 mmol）、酢酸アンモニウム（NH4OAc）（38.5 mg、0.500 mmol、商用品）、ロダニン（rhodanine）（133 mg、1.00 mmol、商用品）のアセトニトリル（MeCN）（2 mL）溶液に、酢酸（AcOH）(57 μL、1.0 mmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を３時間加熱還流した。室温まで放冷した後、これに水（H2O）（10 mL）を添加し、析出した結晶を桐山ロートで濾過、水（×3）、ジエチルエーテル（×2）で洗浄し、(Z)-5-(3-（トリフルオロメチル）-4-メトキシベンジリデン)-2-チオキソチアゾリジン-4-オン（(Z)-5-(3-(trifluoromethyl)phenyl-4-methoxybenzylidene)-2-thioxothiazolidin-4-one）（化合物７）（127 mg、0.321 mmol、32.1%）を黄色の固体として得た。
mp 209−210 ℃
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 3.91 (s, 3H, OCH3), 7.11 (d, J = 8.4 Hz, 1H, aromatic), 7.44 (d, J = 2.0 Hz, 1H, olefinic), 7.52 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H, aromatic), 7.58 (d, J = 7.6 Hz, 1H, aromatic), 7.69-7.63 (m, 3H, aromatic), 7.78 (s, 2H, aromatic), 9.22 (brs, 1H, NH)
IR (cm-1) 555, 696, 806, 1023, 1272, 1339, 1570, 1689, 3049, 3153【０１２４】
製造例８：化合物８の製造
下記化合物８を以下のように製造した。
【化４５】
2013183718.tif 000046
【化４６】
2013183718.tif 000047
【０１２５】
〔化合物Ｊの合成〕
アルゴン雰囲気下、3-ブロモ-4-メトキシベンズアルデヒド（3-bromo-4-methoxybenzaldehyde）（215 mg、1.00 mmol、商用品）、3,5-ジメチルフェニルボロン酸（3,5-dimethylphenylboronic acid）（228 mg、1.20 mmol、商用品）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（Pd(PPh3)4）（57.8 mg、50.0 μmol、商用品）、炭酸ナトリウム一水和物（Na2CO3・H2O）（248 mg、2.00 mmol、商用品）の1,4-ジオキサン（1,4-dioxane）（15 mL）溶液に、水（H2O）（2 mL）を室温にて添加し、混合物を２２時間加熱還流した。これに水を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した（×３）。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮し、3,5-ジメチルフェニル)-4-メトキシベンズアルデヒド(3-(trifluoromethyl)phenyl-4-methoxybenzaldehyde)（化合物J）を黄色の油状物質として得た。これを未精製のまま、次の反応に用いた。【０１２６】
〔化合物８の合成〕
アルゴン雰囲気下、化合物J（3,5-dimethylphenyl-4-methoxybenzaldehyde）（<1 mmol）、酢酸アンモニウム（NH4OAc）（38.5 mg、0.500 mmol、商用品）、ロダニン（rhodanine）（133 mg、1.00 mmol、商用品）のアセトニトリル（MeCN）（2 mL）溶液に、酢酸（AcOH）(57 μL、1.0 mmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を３時間加熱還流した。室温まで放冷した後、これに水（H2O）（10 mL）を添加し、析出した結晶を桐山ロートで濾過、水（×3）、ジエチルエーテル（×2）で洗浄し、(Z)-5-(3-（トリフルオロメチル）-4-メトキシベンジリデン)-2-チオキソチアゾリジン-4-オン（(Z)-5-(3,5-dimethylphenyl-4-methoxybenzylidene)-2-thioxothiazolidin-4-one）（化合物８）（309 mg、0.870 mmol、87.0%）を黄色の固体として得た。
mp 238−239 ℃
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ2.38 (s, 6H, CH3), 3.89 (s, 3H, OCH3), 7.03 (s, 1H, aromatic), 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 1H, aromatic), 7.10 (s, 1H, aromatic), 7.42 (d, J = 2.4 Hz, 1H, olefinic), 7.47 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H, aromatic), 7.67 (s, 1H, aromatic), 9.30 (brs, 1H, NH)
IR (cm−1) 701, 801, 849, 1025, 1286, 1397, 1568, 1686, 2870, 3047, 3143【０１２７】
［DYRK1Aタンパク質を低減させる化合物のスクリーニングシステム４］
〔アッセイ細胞を用いた化合物スクリーニング〕
FLAGx3-DYRK1A-2A-HAx3-EGFPを発現させた培養細胞株（アッセイ細胞）をプレート上に培養し、培養液にテスト化合物を一定濃度にて加え、培養した。培養後、ウエスタンブロット法により、FLAGx3-DYRK1A量とHAx3-EGFP量、GAPDH量をそれぞれ定量解析し、その比率を解析した。解析データの中から、テスト化合物非存在下と比較して比率を変動させるテスト化合物を候補化合物として選択した。その一例を図１１及び図１２に示す。図１１は、テスト化合物（化合物９）が、内部標準のEGFPタンパク質量には影響を与えず、細胞内でFLAGx3-DYRK1Aタンパク質のみを低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。図１２は、テスト化合物（化合物１０）が、細胞内でFLAGx3-DYRK1Aタンパク質を低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。【０１２８】
製造例９：化合物９の製造
下記化合物９を以下のように製造した。
【化４７】
2013183718.tif 000048
【０１２９】
〔化合物９の合成〕
アルゴン雰囲気下、8-ヨードハルミン（8-iodoharmine）（67.6 mg、0.200 mmol、合成品（US2007027199A1））、ジクロロビストリフェニルホスフィンパラジウム（(PPh3)2PdCl2）（7.0 mg、10 μmol、商用品）、ヨウ化銅（CuI）（3.8 mg、20 μmol、商用品）、トリフェニルホスフィン（PPh3）（5.2 mg、20 μmol、商用品）のトルエン（toluene）（脱水、2.0 mL）、トリエチルアミン（Et3N）（2.0 mL）溶液に、トリメチルシリルアセチレン（trimethylsilylacetylene）（55 μL、0.40 mmol、商用品）を室温にて添加し、混合物を６０℃で４時間加熱撹拌した。室温まで放冷した後、これに飽和塩化アンモニウム水溶液を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した（×３）。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）にて精製し、(8-[2-(トリメチルシリル)エチニル]ハルミン (8-[2-(trimethylsilyl)ethynyl]harmine)（化合物９）（35.8 mg、0.116 mmol、58.0%）を無色の固体として得た。
TLC Rf 0.40 (ethyl acetate)。
mp 185−186 ℃
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ0.37 (s, 9H, Si(CH3)3), 2.83 (s, 3H, CH3), 4.02 (s, 3H, OCH3), 6.87 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.70 (d, J = 5.0 Hz, 1H, aromatic), 7.98 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 8.12 (brs, 1H, NH), 8.35 (brs, 1H, aromatic)
13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ0.3(3C), 20.2, 56.6, 94.8, 96.9, 104.3, 104.7, 112.4,  115.8, 123.2, 128.9, 134.4, 139.5, 141.3, 142.9, 161.0
IR (cm-1) 775, 945, 1099, 1339, 1450, 1614, 2146, 2767, 2861, 2977【０１３０】
製造例１０：化合物１０の製造
下記化合物１０を以下のように製造した。
【化４８】
2013183718.tif 000049
【０１３１】
〔化合物１０の合成〕
アルゴン雰囲気下、8-ヨードハルミン（8-iodoharmine）（33.8 mg、0.100 mmol、合成品（US2007027199A1））、ジクロロビストリフェニルホスフィンパラジウム（(PPh3)2PdCl2）（3.5 mg、5.0 μmol、商用品）、ヨウ化銅（CuI）（1.9 mg、10 μmol、商用品）、トリフェニルホスフィン（PPh3）（2.6 mg、10 μmol、商用品）のトルエン（toluene）（脱水、1.0 mL）、トリエチルアミン（Et3N）（1.0 mL）溶液に、シクロヘキシルアセチレン（cyclohexylacetylene）（26 μL、0.20 mmol、商用品）を室温にて添加し、混合物を６０℃で１１時間加熱撹拌した。室温まで放冷した後、これに飽和塩化アンモニウム水溶液を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した（×３）。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）にて精製し、(8-[2-(シクロヘキシル)エチニル]ハルミン (8-[2-(cyclohexyl)ethynyl]harmine)（化合物１０）（30.3 mg、95.2 μmol、95.2%）を無色の固体として得た。
TLC Rf 0.30 (ethyl acetate)。
mp 198−199 ℃
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ1.68 (brs, 4H, -CH2-×2), 1.44 (brs, 2H, -CH2-), 1.84 (brs, 2H, -CH2-), 2.00 (brs, 2H, -CH2-), 2.85-2.80 (m, 1H, -CH-), 2.82 (s, 3H, CH3), 4.00 (s, 3H, OCH3), 6.88 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.70 (d, J = 5.0 Hz, 1H, aromatic), 7.93 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 8.12 (brs, 1H, NH), 8.33 (d, J = 5.0 Hz, 1H, aromatic)
13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ20.2(2C), 24.9, 25.9, 30.3, 32.9(2C), 56.7, 72.3, 95.6, 104.0, 105.0, 112.4, 115.7, 121.9, 129.0, 134.4, 139.3, 141.2, 142.7, 160.4
IR (cm-1) 792, 1088, 1230, 1245, 1288, 1423, 1448, 1616, 2851, 2930
【図５】
2013183718.tif 000072
【図７】
2013183718.tif 000073
【図１】
2013183718.tif 000074
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
2013183718.tif 000079
【図９】
2013183718.tif 000080
【図１０】
2013183718.tif 000081
【図１１】
2013183718.tif 000082
【図１２】
2013183718.tif 000083
【国際調査報告】
2013183718.tif 000084
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