(57)【要約】  デリバリー機能を有する標的遺伝子の発現を抑制可能な一本鎖核酸を提供する。  ５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）、内部領域（Ｚ）、リンカー領域（Ｌｙ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含み、５’末端、３’末端、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）からなる群から選択された少なくとも１つに、生体関連物質が結合していることを特徴とする分子とする。
2013180038.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）、内部領域（Ｚ）、リンカー領域（Ｌｙ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、
前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、
前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含み、
５’末端、３’末端、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）からなる群から選択された少なくとも１つに、生体関連物質が結合していることを特徴とする、デリバリー機能を有する標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子。
【請求項２】
前記生体関連物質が、脂質である、請求項１記載の一本鎖核酸分子。
【請求項３】
前記生体関連物質が、単純脂質、複合脂質、誘導脂質、一本鎖脂質、二本鎖脂質、糖脂質、脂溶性ビタミン、ステロイドである、請求項２記載の一本鎖核酸分子。
【請求項４】
前記脂質が、パルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸からなる群から選択される少なくとも一つである請求項２記載の一本鎖核酸分子。
【請求項５】
前記生体関連物質が、抗体タンパク、そのペプチドおよび膜透過性ペプチドからなる群から選択された少なくとも１つである、請求項１記載の一本鎖核酸分子。
【請求項６】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、下記式（１）および（２）の条件を満たす、請求項１から５のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
Ｚ＝Ｘ＋Ｙ      ・・・（１）
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ  ・・・（２）
【請求項７】
少なくとも１つの修飾された残基を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項８】
安定同位体を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項９】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および／または前記リンカー領域（Ｌｙ）が、
ヌクレオチド残基および非ヌクレオチド残基の少なくとも一つから構成される、請求項１から８のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド残基が、非修飾ヌクレオチド残基および／または修飾ヌクレオチド残基である、請求項９記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１１】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および／または前記リンカー領域（Ｌｙ）が、下記（１）〜（７）のいずれかの残基で構成される、請求項９または１０記載の一本鎖核酸分子。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【請求項１２】
前記遺伝子の発現抑制が、ＲＮＡ干渉による発現抑制である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１３】
前記一本鎖核酸分子の塩基配列が、配列番号５、６、１１、１２、１３、１４、１５または１６の塩基配列である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１４】
標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
請求項１から１３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする、発現抑制用組成物。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項１６】
炎症治療用である、請求項１５記載の薬学組成物。
【請求項１７】
標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
請求項１から１３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする発現抑制方法。
【請求項１８】
前記一本鎖核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項１７記載の発現抑制方法。
【請求項１９】
前記一本鎖核酸分子を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで投与する、請求項１８記載の発現抑制方法。
【請求項２０】
前記遺伝子の発現抑制が、ＲＮＡ干渉による発現抑制である、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の発現抑制方法。
【請求項２１】
標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であって、
請求項１から１３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする発現誘導方法。
【請求項２２】
疾患の治療方法であって、
請求項１から１３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を、患者に投与する工程を含み、
前記一本鎖核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする治療方法。
【請求項２３】
標的遺伝子の発現抑制のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子の使用。
【請求項２４】
ＲＮＡ干渉の誘導のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子の使用。
【請求項２５】
疾患の治療に使用するための核酸分子であって、
前記核酸分子は、請求項１から１３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子であり、
前記一本鎖核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デリバリー機能を有する遺伝子発現抑制用の一本鎖核酸分子、それを含む組成物およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現を抑制する技術として、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が知られている（非特許文献１）。ＲＮＡ干渉による遺伝子の発現抑制は、例えば、短い二本鎖のＲＮＡ分子を、細胞等に投与することによって、実施されるのが一般的である。前記二本鎖のＲＮＡ分子は、通常、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）と呼ばれる。この他に、環状のＲＮＡ分子であり、分子内アニールにより、部分的に二重鎖を形成したＲＮＡ分子によっても、遺伝子の発現が抑制できることが報告されている（特許文献１）。しかしながら、これらの手法では、遺伝子の発現抑制を誘導するＲＮＡ分子は、以下のような問題がある。【０００３】
まず、前記ｓｉＲＮＡを製造する場合、センス鎖およびアンチセンス鎖を別々に合成した上で、最後にこれらの鎖をハイブリダイズする工程が必要である。このため、製造効率が悪いという問題がある。また、前記ｓｉＲＮＡを細胞に投与する際、一本鎖ＲＮＡへの解離を抑制した状態で、細胞に投与する必要があるため、その取り扱い条件の設定にも労力を要する。つぎに、環状のＲＮＡ分子の場合、その合成が困難という問題がある。これに対して、本発明者らは、このような問題を解消する、自己アニーリングによる２つのループ構造を有する新たな一本鎖核酸分子を構築するに至った（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２７８７８４
【特許文献２】国際公報ＷＯ２０１２／００５３６８号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ファイアら（Ｆｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ  第３９１巻、ｐ．８０６−８１１、１９９８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そして、このような新たな一本鎖核酸分子について、さらに、ターゲットに対する優れたデリバリー機能の実現が求められている。【０００７】
そこで、本発明は、デリバリー機能を有する標的遺伝子の発現を抑制可能な一本鎖核酸の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の一本鎖核酸分子は、５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）、内部領域（Ｚ）、リンカー領域（Ｌｙ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、
前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、
前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含み、
５’末端、３’末端、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）からなる群から選択された少なくとも１つに、生体関連物質が結合していることを特徴とする、デリバリー機能を有する標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の一本鎖核酸分子によれば、例えば、デリバリー用のキャリアを必須とすることなく、ターゲットへの優れたデリバリー能を実現できる。このため、例えば、キャリアの毒性を考慮する必要がなく、核酸分子とキャリアとの複合体との形成に関する様々な条件設定の検討を回避できる。このため、例えば、製造面および使用面における労力やコストを低減可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の一本鎖核酸分子の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の一本鎖核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明の実施例におけるホタルルシフェラーゼ安定発現乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐＧＬ３  Ｌｕｃ）が保持するホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果（ルシフェラーゼの相対活性）を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例におけるホタルルシフェラーゼ安定発現乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐＧＬ３  Ｌｕｃ）が保持するホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果（ルシフェラーゼの相対活性）を示す別のグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例におけるホタルルシフェラーゼ安定発現乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐＧＬ３  Ｌｕｃ）が保持するホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果（ルシフェラーゼの相対活性）を示すさらに別のグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例におけるホタルルシフェラーゼ安定発現乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐＧＬ３  Ｌｕｃ）が保持するホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果（ルシフェラーゼの相対活性）を示すさらに別のグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例におけるホタルルシフェラーゼ安定発現乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐＧＬ３  Ｌｕｃ）が保持するホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果（ルシフェラーゼの相対活性）を示すさらに別のグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例におけるホタルルシフェラーゼ安定発現乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐＧＬ３  Ｌｕｃ）が保持するホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果（ルシフェラーゼの相対活性）を示すさらに別のグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施例におけるホタルルシフェラーゼ安定発現乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐＧＬ３  Ｌｕｃ）が保持するホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果（ルシフェラーゼの相対活性）を示すさらに別のグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例における、マウスを用いたホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制の測定結果を示す写真である。図１０（ａ）は、本発明の一本鎖核酸で処理したマウスの測定結果を示す写真である。図１０（ｂ）は、未処理マウスの測定結果を示す写真である。
【図１１】図１１は、図１０の写真における、全身のルシフェラーゼ活性（ホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制）の測定結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、図１０の写真における、脳のルシフェラーゼ活性（ホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制）の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
【００１２】
１．ｓｓＮｃ分子
本発明の一本鎖核酸分子は、前述のように、デリバリー機能を有する標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子であって、５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）、内部領域（Ｚ）、リンカー領域（Ｌｙ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、
前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、
前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含み、
５’末端、３’末端、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）からなる群から選択された少なくとも１つに、生体関連物質が結合していることを特徴とする。
【００１３】
本発明において、「標的遺伝子の発現抑制」は、例えば、前記標的遺伝子の発現を阻害することを意味する。前記抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ダウンレギュレーションまたはサイレンシングでもよい。前記標的遺伝子の発現抑制は、例えば、前記標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物の活性の減少、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。前記タンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質があげられる。
【００１４】
本発明の一本鎖核酸分子は、以下、本発明の「ｓｓＮｃ分子」ともいう。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、標的遺伝子の発現抑制に使用できることから、「標的遺伝子の発現抑制用ｓｓＮｃ分子」または「標的遺伝子の発現抑制剤」ともいう。また、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、ＲＮＡ干渉により、前記標的遺伝子の発現を抑制できることから、「ＲＮＡ干渉用ｓｓＮｃ分子」、「ＲＮＡ干渉誘導分子」、「ＲＮＡ干渉剤」または「ＲＮＡ干渉誘導剤」ともいう。また、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、インターフェロン誘導等の副作用を抑制できる。
【００１５】
本発明のｓｓＮｃ分子は、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記内部領域（Ｚ）において、前記内部５’領域（Ｘ）と前記内部３’領域（Ｙ）が、直接的に連結されている。
【００１６】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）は、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、前記３’側領域（Ｙｃ）は、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的である。このため、５’側において、前記領域（Ｘｃ）が前記領域（Ｘ）に向かって折り返し、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能であり、また、３’側において、前記領域（Ｙｃ）が前記領域（Ｙ）に向かって折り返し、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能である。
【００１７】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記発現抑制配列は、例えば、本発明のｓｓＮｃ分子が、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞内に導入された場合に、前記標的遺伝子の発現を抑制する活性を示す配列である。前記発現抑制配列は、特に制限されず、目的の標的遺伝子の種類に応じて、適宜設定できる。前記発現抑制配列は、例えば、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉に関与する配列を適宜適用できる。ＲＮＡ干渉は、一般に、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、細胞内において、Ｄｉｃｅｒにより、３’末端が突出した１９〜２１塩基対程度の二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）に切断され、その一方の一本鎖ＲＮＡが標的ｍＲＮＡに結合して、前記ｍＲＮＡを分解することにより、前記ｍＲＮＡの翻訳を抑制する現象である。前記標的ｍＲＮＡに結合する前記ｓｉＲＮＡにおける一本鎖ＲＮＡの配列は、例えば、標的遺伝子の種類に応じて様々な種類が報告されている。本発明は、例えば、前記ｓｉＲＮＡの一本鎖ＲＮＡの配列を、前記発現抑制配列として使用できる。本発明においては、例えば、出願時において公知となっている前記ｓｉＲＮＡの一本鎖ＲＮＡ配列の他、将来的に明らかとなる配列に関しても、前記発現抑制配列として利用できる。
【００１８】
前記発現抑制配列は、例えば、前記標的遺伝子の所定領域に対して、９０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９５％であり、さらに好ましくは９８％であり、特に好ましくは１００％である。このような相補性を満たすことにより、例えば、オフターゲットを十分に軽減できる。
【００１９】
本発明のｓｓＮｃ分子による前記標的遺伝子の発現の抑制は、例えば、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つに前記発現抑制配列を配置した構造をとることで、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡ干渉に類似する現象（ＲＮＡ干渉様の現象）が生じることによると推測される。なお、本発明は、このメカニズムにより限定されない。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、いわゆるｓｉＲＮＡのように、二本鎖の一本鎖ＲＮＡからなるｄｓＲＮＡとして、細胞等へ導入するものではなく、また、細胞内において、前記発現抑制配列の切り出しは、必ずしも必須ではない。このため、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、ＲＮＡ干渉様の機能を有するということもできる。
【００２０】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記発現抑制配列は、前述のように、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つに含まれる。本発明のｓｓＮｃ分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。
【００２１】
後者の場合、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、同じ標的遺伝子に対する同じ発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、同じ標的遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、異なる標的遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよい。本発明のｓｓＮｃ分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）のいずれか一領域でもよいし、異なる領域であってもよい。本発明のｓｓＮｃ分子が、異なる標的遺伝子に対する前記発現抑制配列を２つ以上有する場合、例えば、本発明のｓｓＮｃ分子によって、２種類以上の異なる標的遺伝子の発現を抑制可能である。
【００２２】
前記内部領域（Ｚ）は、前述のように、前記内部５’領域（Ｘ）と前記内部３’領域（Ｙ）が連結されている。前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）は、例えば、直接的に連結され、その間に介在配列を有していない。前記内部領域（Ｚ）は、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｘｃ）との配列関係を示すために、「前記内部５’側領域（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成される」と表わすものであって、前記内部領域（Ｚ）において、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記３’側領域（Ｙｃ）とが、例えば、前記ｓｓＮｃ分子の使用において、別個の独立した領域であることを限定するものではない。すなわち、例えば、前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列が配置されてもよい。
【００２３】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）は、前記内部５’側領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、具体的には、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。本発明のｓｓＮｃ分子において、前記３’側領域（Ｙｃ）は、前記内部３’側領域（Ｙ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を有していればよく、具体的には、例えば、前記領域（Ｙ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基または２塩基である。
【００２４】
本発明のｓｓＮｃ分子は、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に、リンカー領域（Ｌｘ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｘ）を介して、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが連結している。
【００２５】
本発明のｓｓＮｃ分子は、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが連結している。
【００２６】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、それぞれ、それ自体の領域内部において、自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。
【００２７】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記生体関連物質は、生体への親和性を示す物質であり、生体親和性物質ということもできる。前記生体関連物質は、例えば、生体由来成分に含まれる物質、またはそれと同一もしくは類似の構造を有する物質があげられる。前記生体関連物質は、生体への親和性を示す物質であれば、特に制限されないが、例えば、ビタミン、ホルモン等の各種機能性物質があげられる。より具体的には、例えば、以下のとおりである。
【００２８】
前記生体関連物質は、第１形態として、例えば、脂質があげられる。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、脂質を有することによって、細胞内への導入効率および／または耐酵素分解性を向上できる。これは、例えば、以下のようなメカニズムによると推測される。すなわち、本発明のｓｓＮｃ分子は、前記脂質領域と、その他の核酸領域とにより、全体としてミセル構造を形成することで、細胞膜の透過性および耐酵素分解性が向上すると解される。また、本発明のｓｓＮｃ分子は、前記脂質領域と、その他の核酸領域とにより、全体として、エクソソーム様複合体を形成することにより、生体内の移動性がより向上すると解される。なお、本発明は、これらのメカニズムには、制限されない。
【００２９】
前記脂質の具体例は、例えば、単純脂質、複合脂質、誘導脂質、脂溶性ビタミン等があげられる。前記単純脂質は、脂肪酸とアルコールとのエステルである１本鎖脂質があげられる。前記複合脂質は、２本鎖のリン脂質、糖脂質等があげられる。前記誘導脂質は、例えば、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂肪酸、コレステロール，ステロイドホルモン等のステロイド等があげられる。前記脂溶性ビタミンは、例えば、レチノール、トコフェロール、カルシフェロール等があげられる。また、この他に、前記脂質は、例えば、油脂、スクアレン等の炭化水素、高級アルコール等があげられる。
【００３０】
前記１本鎖脂質は例えば、ＲＣＯＯ−で表すことができる。前記２本鎖脂質は、例えば、下記式で表すことができる。Ｒは、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸等の飽和脂肪酸、オレイン酸等の不飽和脂肪酸等があげられる。
【化１】
2013180038.tif 000003
【００３１】
前記生体関連物質は、第２形態として、例えば、ペプチドがあげられる。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記ペプチドを有することによって、細胞内への導入効率および／または耐酵素分解性を向上できる。
【００３２】
前記ペプチドは、特に制限されず、例えば、ターゲット細胞の膜タンパク質に結合可能なタンパク質またはそのペプチド；ターゲット部位に選択的に取り込まれるタンパク質もしくはそのペプチド、特定の受容体に作用する生体内分子もしくはそのペプチド、細胞表面に発現する抗原と反応する抗体タンパクもしくはそのペプチド等があげられる。前記膜タンパク質に結合可能なタンパク質は、例えば、膜透過性タンパク質等があげられ、そのペプチドは、例えば、アルギニンペプチド等があげられる。前記抗体タンパク質のペプチドは、例えば、Ｆａｂドメイン等があげられる。
【００３３】
前記生体関連物質は、その他の形態として、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアミン、蛍光分子、ビオチン、インターカレーター分子、糖、水溶性ビタミン、金属キレート剤、クロスリンク剤等もあげられる。
【００３４】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記生体関連物質の数は、特に制限されず、例えば、１個〜４個、好ましくは、１〜３個、より好ましくは、１個または２個である。前記生体関連物質の結合箇所は、前述のように、前記核酸分子における５’末端、３’末端、前記リンカー領域（Ｌｘ）、および／または前記リンカー領域（Ｌｙ）である。
【００３５】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記生体関連物質は、例えば、前記核酸分子に直接結合してもよいし、間接的に結合してもよく、好ましくは後者である。前記後者の場合、例えば、結合用リンカーを介して、結合することが好ましい。前記結合用リンカーの構造は、特に制限されず、例えば、下記式の構造が例示できる。下記式において、ｎは正の整数であり、Ｙは、例えば、ＮＨ、Ｓ、Ｏ、ＣＯ等があげられる。また、本発明のｓｓＮｃ分子において、前記生体関連物質がシステイン等のアミノ酸を有する場合は、例えば、前記核酸分子に対して、ジスルフィド結合により前記生体関連物質を結合させてもよい。
【化２】
2013180038.tif 000004
【００３６】
本発明のｓｓＮｃ分子について、核酸構造の一例を、図１の模式図に示す。図１（Ａ）は、前記ｓｓＮｃ分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図１（Ｂ）は、前記ｓｓＮｃ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図１（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＮｃ分子は、前記５’側領域（Ｘｃ）が折り返し、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間で二重鎖が形成され、前記３’側領域（Ｙｃ）が折り返し、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間で二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域および前記Ｌｙ領域が、ループ構造をとる。図１はあくまでも、各領域の連結順番および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ等は、これに制限されない。
【００３７】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記生体関連物質は、前述のように、例えば、図１における前記５’側領域（Ｘｃ）のフリーの末端、前記３’側領域（Ｙｃ）のフリーの末端、リンカー領域（Ｌｘ）、リンカー領域（Ｌｙ）のいずれに結合してもよい。
【００３８】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）、前記内部５’側領域（Ｘ）、前記内部３’側領域（Ｙ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、特に制限されず、例えば、以下の通りである。本発明において、「塩基数」は、例えば、「長さ」を意味し、「塩基長」ということもできる。
【００３９】
前記５’側領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｘ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的であることが好ましい。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【００４０】
また、前記５’側領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的であることが好ましい。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、５’末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域（セグメント）であることが好ましい。
【００４１】
前記３’側領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｙ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補であることが好ましい。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【００４２】
また、前記３’側領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｙ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補であることが好ましい。前記領域（Ｙ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｙ）における、３’末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域（セグメント）であることが好ましい。
【００４３】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）との関係、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）との関係は、例えば、下記式（１）および（２）の条件を満たす。
Ｚ＝Ｘ＋Ｙ  ・・・（１）
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ  ・・・（２）
【００４４】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）の長さの関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれの条件を満たしてもよい。
Ｘ＝Ｙ  ・・・（１９）
Ｘ＜Ｙ  ・・・（２０）
Ｘ＞Ｙ  ・・・（２１）
【００４５】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の関係は、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの条件を満たす。
（ａ）下記式（３）および（４）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（４）
（ｂ）下記式（５）および（６）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（６）
（ｃ）下記式（７）および（８）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（７）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（８）
（ｄ）下記式（９）および（１０）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（９）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（１０）
【００４６】
前記（ａ）〜（ｄ）において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差は、例えば、下記条件を満たすことが好ましい。
（ａ）下記式（１１）および（１２）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３  ・・・（１１）
Ｙ−Ｙｃ＝０  ・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）および（１４）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０  ・・・（１３）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３  ・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）および（１６）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２または３、
より好ましくは１または２  ・・・（１５）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２または３、
より好ましくは１または２  ・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）および（１８）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０  ・・・（１７）
Ｙ−Ｙｃ＝０  ・・・（１８）
【００４７】
前記（ａ）〜（ｄ）のｓｓＮｃ分子について、それぞれの構造の一例を、図２の模式図に示す。図２は、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）を含むｓｓＮｃであり、（Ａ）は、前記（ａ）のｓｓＮｃ分子、（Ｂ）は、前記（ｂ）のｓｓＮｃ分子、（Ｃ）は、前記（ｃ）のｓｓＮｃ分子、（Ｄ）は、前記（ｄ）のｓｓＮｃ分子の例である。図２において、点線は、自己アニーリングにより二重鎖を形成している状態を示す。図２のｓｓＮｃ分子は、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）を、前記式（２０）の「Ｘ＜Ｙ」として表わすが、これには制限されず、前述のように、前記式（１９）の「Ｘ＝Ｙ」でも、前記式（２１）の「Ｘ＞Ｙ」でもよい。また、図２は、あくまでも、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）との関係、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）との関係を示す模式図であり、例えば、各領域の長さ、形状等は、これには制限されず、また、リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）の有無も、これには制限されない。
【００４８】
前記（ａ）〜（ｃ）のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）、および、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）が、それぞれ二重鎖を形成することによって、前記内部領域（Ｚ）において、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）のいずれともアライメントできない塩基を有する構造であり、二重鎖を形成しない塩基を有する構造ともいえる。前記内部領域（Ｚ）において、前記アライメントできない塩基（二重鎖を形成しない塩基ともいう）を、以下、「フリー塩基」という。図２において、前記フリー塩基の領域を、「Ｆ」で示す。前記領域（Ｆ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）は、例えば、前記（ａ）のｓｓＮｃ分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数であり、前記（ｂ）のｓｓＮｃ分子の場合、「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数であり、前記（ｃ）のｓｓＮｃ分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数と「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数との合計数である。
【００４９】
他方、前記(ｄ)のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の全領域が、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）とアライメントする構造であり、前記内部領域（Ｚ）の全領域が二重鎖を形成する構造ともいえる。なお、前記（ｄ）のｓｓＮｃ分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）の５’末端と前記３’側領域（Ｙｃ）の３’末端は、未連結である。
【００５０】
本発明のｓｓＮｃ分子について、各領域の長さを以下に例示するが、本発明は、これには制限されない。本発明において、例えば、塩基数の数値範囲は、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、例えば、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００５１】
前記５’側領域（Ｘｃ）、前記３’側領域（Ｙｃ）、および前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基（Ｆ）の塩基数の合計は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の塩基数となる。このため、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の長さは、例えば、前記内部領域（Ｚ）の長さ、前記フリー塩基の数（Ｆ）およびその位置に応じて、適宜決定できる。
【００５２】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数は、例えば、１９塩基以上である。前記塩基数の下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。前記塩基数の上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）の塩基数の具体例は、例えば、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または、３０塩基である。
【００５３】
前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記内部領域（Ｚ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１９〜３０塩基であり、好ましくは、１９、２０または２１塩基である。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基であり、さらに好ましくは、１〜７塩基である。
【００５４】
前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、より好ましくは１〜７塩基であり、さらに好ましくは１〜４塩基であり、特に好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記３’側領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【００５５】
前記５’側領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記５’側領域（Ｘｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記５’側領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【００５６】
前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、より好ましくは１〜７塩基であり、さらに好ましくは１〜４塩基であり、特に好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記５’側領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【００５７】
前記３’側領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記３’側領域（Ｙｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記３’側領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【００５８】
前述のように、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、前記式（２）の「Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ」で表わすことができる。具体例として、「Ｘｃ＋Ｙｃ」の塩基数は、例えば、前記内部領域（Ｚ）と同じ、または、前記内部領域（Ｚ）より小さい。後者の場合、「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、１〜１０塩基、好ましくは１〜４塩基、より好ましくは１塩基、２塩基または３塩基である。前記「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基の領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）に相当する。
【００５９】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましく、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位が塩基を含む場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）のそれぞれの塩基数は、同じであっても異なってもよく、また、その塩基配列も、同じであっても異なってもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。前記各リンカー領域の塩基数は、具体例として、例えば、１〜５０塩基、１〜３０塩基、１〜２０塩基、１〜１０塩基、１〜７塩基、１〜４塩基等が例示できるが、これには制限されない。
【００６０】
本発明のｓｓＮｃ分子の全長は、特に制限されない。本発明のｓｓＮｃ分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。本発明のｓｓＮｃ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【００６１】
本発明のｓｓＮｃ分子の構成単位は、特に制限されず、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基があげられる。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。前記ヌクレオチド残基および前記非ヌクレオチド残基の詳細は、後述する。
【００６２】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の構成単位は、それぞれ、前記ヌクレオチド残基が好ましい。前記各領域は、例えば、下記（１）〜（３）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【００６３】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位は、特に制限されず、例えば、前記ヌクレオチド残基および前記非ヌクレオチド残基があげられる。前記リンカー領域は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記ヌクレオチド残基と前記非ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域は、例えば、下記（１）〜（７）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【００６４】
本発明のｓｓＮｃ分子が、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の両方を有する場合、例えば、両方の構成単位が同じでもよいし、異なってもよい。具体例として、例えば、両方のリンカー領域の構成単位が前記ヌクレオチド残基である形態、両方のリンカー領域の構成単位が前記非ヌクレオチド残基である形態、一方の領域の構成単位が前記ヌクレオチド残基であり、他方のリンカー領域の構成単位が非ヌクレオチド残基である形態等があげられる。
【００６５】
本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記ヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。本発明のｓｓＮｃ分子において、前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾ヌクレオチド残基および前記修飾ヌクレオチド残基の両方であってもよい。前記ｓｓＮｃ分子が、前記非修飾ヌクレオチド残基と前記修飾ヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。本発明のｓｓＮｃ分子が、前記非ヌクレオチド残基を含む場合、前記非ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜８個、１〜６個、１〜４個、１、２または３個である。
【００６６】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。この場合、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、「ＲＮＡ分子」または「ｓｓＲＮＡ分子」ともいう。前記ｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記リボヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記リボヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子があげられる。前記ｓｓＲＮＡ分子において、前記リボヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾リボヌクレオチド残基および前記修飾リボヌクレオチド残基の両方を含んでもよい。
【００６７】
前記ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基であってもよい。前記ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【００６８】
本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。前記安定同位体は、例えば、被ばくの危険性が少なく、専用の施設も不要であることから取り扱い性に優れ、また、コストも低減できる。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓがあげられる。
【００６９】
本発明のｓｓＮｃ分子は、前述のように、前記標的遺伝子の発現抑制ができる。このため、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、遺伝子が原因となる疾患の治療剤として使用できる。本発明のｓｓＮｃ分子が、例えば、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を含む場合、例えば、前記標的遺伝子の発現抑制により、前記疾患を治療できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【００７０】
本発明のｓｓＮｃ分子の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記ｓｓＮｃ分子を投与すればよい。
【００７１】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【００７２】
本発明において、発現抑制の対象となる前記標的遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を設定できる。そして、前述のように、前記標的遺伝子の種類に応じて、前記発現抑制配列を適宜設計すればよい。
【００７３】
本発明のｓｓＮｃ分子の使用に関しては、後述する本発明の組成物、発現抑制方法および治療方法等の記載を参照できる。
【００７４】
本発明のｓｓＮｃ分子は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農薬、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
【００７５】
２．ヌクレオチド残基
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびＵ（ウラシル）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を有する。
【００７６】
前記ヌクレオチド残基は、未修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基があげられる。前記未修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、好ましくは、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
【００７７】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基を修飾したヌクレオチド残基である。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」は、例えば、前記構成要素の置換、付加および／または欠失、前記構成要素における原子および／または官能基の置換、付加および／または欠失であり、「改変」ということができる。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。前記天然由来の修飾ヌクレオチド残基は、例えば、リンバックら（Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３〜２１９６）を参照できる。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい。
【００７８】
前記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、リボース−リン酸骨格（以下、リボリン酸骨格）の修飾があげられる。
【００７９】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水酸基を、水素またはフルオロ等のハロゲンに置換できる。前記２’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
【００８０】
前記リボリン酸骨格は、例えば、非リボース残基および／または非リン酸を有する非リボリン酸骨格に置換してもよい。前記非リボリン酸骨格は、例えば、前記リボリン酸骨格の非荷電体があげられる。前記非リボリン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチドの代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等があげられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸モノマー残基があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等があげられ、好ましくはＰＮＡである。
【００８１】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。前記リボリン酸骨格において、糖残基に最も隣接するリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。前記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の２つの酸素原子にわたって、均一に分布している。前記αリン酸基における４つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である２つの酸素原子は、以下、「非結合（ｎｏｎ−ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」ともいう。他方、前記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している２つの酸素原子は、以下、「結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」という。前記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、または、前記非結合酸素における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
【００８２】
前記リン酸基は、例えば、前記非結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｅ（セレン）、Ｂ（ホウ素）、Ｃ（炭素）、Ｈ（水素）、Ｎ（窒素）およびＯＲ（Ｒは、アルキル基またはアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Ｓで置換される。前記非結合酸素は、例えば、片方がＳで置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がＳで置換される。前記修飾リン酸基は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステル等があげられ、中でも、前記２つの非結合酸素が両方ともＳで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
【００８３】
前記リン酸基は、例えば、前記結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｃ（炭素）およびＮ（窒素）のいずれかの原子で置換でき。前記修飾リン酸基は、例えば、Ｎで置換した架橋ホスホロアミデート、Ｓで置換した架橋ホスホロチオエート、およびＣで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。前記結合酸素の置換は、例えば、本発明のｓｓＮｃ分子の５’末端ヌクレオチド残基および３’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行うことが好ましく、５’側の場合、Ｃによる置換が好ましく、３’側の場合、Ｎによる置換が好ましい。
【００８４】
前記リン酸基は、例えば、前記リン非含有のリンカーに置換してもよい。前記リンカーは、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ等を含み、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基を含む。
【００８５】
本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、３’末端および５’末端の少なくとも一方のヌクレオチド残基が修飾されてもよい。前記修飾は、例えば、３’末端および５’末端のいずれか一方でもよいし、両方でもよい。前記修飾は、例えば、前述の通りであり、好ましくは、末端のリン酸基に行うことが好ましい。前記リン酸基は、例えば、全体を修飾してもよいし、前記リン酸基における１つ以上の原子を修飾してもよい。前者の場合、例えば、リン酸基全体の置換でもよいし、欠失でもよい。
【００８６】
前記末端のヌクレオチド残基の修飾は、例えば、他の分子の付加があげられる。前記他の分子は、例えば、前述のような標識物質、保護基等の機能性分子があげられる。前記保護基は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｂ（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。前記標識物質等の機能性分子は、例えば、本発明のｓｓＮｃ分子の検出等に利用できる。
【００８７】
前記他の分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、前記リン酸基または前記糖残基に付加してもよい。前記スペーサーの末端原子は、例えば、前記リン酸基の前記結合酸素、または、糖残基のＯ、Ｎ、ＳもしくはＣに、付加または置換できる。前記糖残基の結合部位は、例えば、３’位のＣもしくは５’位のＣ、またはこれらに結合する原子が好ましい。前記スペーサーは、例えば、前記ＰＮＡ等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加または置換することもできる。
【００８８】
前記スペーサーは、特に制限されず、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、およびモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬およびフルオレセイン試薬等を含んでもよい。前記式において、ｎは、正の整数であり、ｎ＝３または６が好ましい。
【００８９】
前記末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）等があげられる。
【００９０】
本発明のｓｓＮｃ分子は、前記５’末端が、例えば、リン酸基またはリン酸基アナログで修飾されてもよい。前記リン酸基は、例えば、５’一リン酸（(HO)2(O)P-O-5’）、５’二リン酸（(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’三リン酸（(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)PO-P(HO)(O)-O-5’）、５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’一チオリン酸（ホスホロチオエート：(HO)2(S)P-O-5’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：(HO)(HS)(S)P-O-5’）、５’−ホスホロチオール酸（(HO)2(O)P-S-5’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸および三リン酸（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸等）、５’−ホスホルアミデート（(HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’）、５’−アルキルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、Ｒはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、５’−アルキルエーテルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、Ｒはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
【００９１】
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
【００９２】
前記塩基は、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基があげられる。前記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等があげられる。前記塩基は、例えば、２−アミノアデニン、６−メチル化プリン等のアルキル誘導体；２−プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の８−置換プリン；５−トリフルオロメチル化および他の５−置換ピリミジン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；Ｏ−アルキル化塩基等があげられる。また、プリンおよびピリミジンは、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツジェーアイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ  Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
【００９３】
前記修飾ヌクレオチド残基は、これらの他に、例えば、塩基を欠失する残基、すなわち、無塩基のリボリン酸骨格を含んでもよい。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、米国仮出願第６０／４６５，６６５号（出願日：２００３年４月２５日）、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（出願日：２００４年３月８日）に記載される残基が使用でき、本発明は、これらの文献を援用できる。
【００９４】
３．非ヌクレオチド残基
前記非ヌクレオチド残基は、特に制限されない。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記非ヌクレオチド残基として、アミノ酸残基またはペプチド残基を含む非ヌクレオチド構造を有してもよい。前記アミノ酸残基またはペプチド残基を構成するアミノ酸としては、例えば、塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸等があげられる。前記塩基性アミノ酸としては、例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン等があげられる。前記酸性アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等があげられる。前記非ヌクレオチド残基は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の少なくとも一方に有することが好ましい。前記非ヌクレオチド残基は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）に有してもよいし、前記リンカー領域（Ｌｙ）に有してもよいし、両方の前記リンカー領域に有してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、同じでもよいし、異なってもよい。
【００９５】
本発明の一本鎖核酸分子において、５’末端、３’末端、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）を前記生体関連物質で修飾する方法は、特に制限されない。
【００９６】
修飾方法の第１形態として、例えば、前記核酸分子の５’末端の修飾方法は、例えば、下記スキーム１に例示できる。
【化Ｓ１】
2013180038.tif 000005
【００９７】
修飾方法の第２形態として、例えば、アミノ酸残基またはペプチド残基を有するリンカー領域の修飾方法を、以下に例示する。
【００９８】
まず、下記スキーム２の合成方法により、アミダイトを合成する。ただし、下記スキーム２は例示であり、これに限定されない。例えば、Ｌｙｓ側鎖のアミノ基の保護基として、下記スキーム２ではＦｍｏｃを用いているが、例えば、後述の実施例におけるスキーム６のようにＴｆａを用いてもよいし、その他の保護基を用いてもよい。
【化Ｓ２】
2013180038.tif 000006
【００９９】
そして、前記結合用リンカーを有する前記アミダイトを用いて、下記スキーム３の方法により、核酸分子を合成し、前記核酸分子における前記結合用リンカーに前記生体関連物質を連結させる。
【化Ｓ３】
2013180038.tif 000007
【０１００】
また、前記結合用リンカーとして、チオールリンカーを導入する場合は、下記スキーム４の合成方法により、前記核酸分子を合成する。
【化Ｓ４】
2013180038.tif 000008
【０１０１】
そして、下記スキーム５のように、前記核酸分子における前記チオールリンカーに、Ｓ−Ｓ結合により、前記生体関連物質を連結する。
【化Ｓ５】
2013180038.tif 000009
【０１０２】
なお、これらの方法は、例示であって、本発明は、これらの形態に何ら制限されない。例えば、前記スキーム２および３は、前記アミノ酸残基がリシン残基である場合の合成方法の一例であるが、前記アミノ酸残基または前記ペプチド残基が、他のアミノ酸に由来する構造である場合も、同様にして合成できる。
【０１０３】
４．組成物
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であり、前記本発明のｓｓＮｃ分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のｓｓＮｃ分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
【０１０４】
本発明によれば、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に投与することで、前記標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。
【０１０５】
また、本発明の薬学的組成物は、前述のように、前記本発明のｓｓＮｃ分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のｓｓＮｃ分子を含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。
【０１０６】
本発明によれば、例えば、遺伝子が原因となる疾患の患者に投与することで、前記遺伝子の発現を抑制し、前記疾患を治療することができる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０１０７】
本発明において、治療の対象となる疾患は、特に制限されず、例えば、遺伝子の発現が原因となる疾患があげられる。前記疾患の種類に応じて、その疾患の原因となる遺伝子を前記標的遺伝子に設定し、さらに、前記標的遺伝子に応じて、前記発現抑制配列を適宜設定すればよい。
【０１０８】
具体例として、前記標的遺伝子を前記ＴＧＦ−β１遺伝子に設定し、前記遺伝子に対する発現抑制配列を前記ｓｓＮｃ分子に配置すれば、例えば、炎症性疾患、具体的には、急性肺傷害等の治療に使用できる。
【０１０９】
本発明の発現抑制用組成物および薬学的組成物（以下、組成物という）は、その使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記ｓｓＮｃ分子を投与すればよい。
【０１１０】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【０１１１】
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。
【０１１２】
本発明の組成物は、例えば、本発明のｓｓＮｃ分子のみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【０１１３】
５．発現抑制方法
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明のｓｓＮｃ分子を使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明のｓｓＮｃ分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【０１１４】
本発明の発現抑制方法において、前記遺伝子の発現抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡ干渉様の現象による発現抑制があげられる。ここで、本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であり、前記本発明のｓｓＮｃ分子を使用することを特徴とする発現誘導方法ともいえる。
【０１１５】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に、前記ｓｓＮｃ分子を投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記ｓｓＮｃ分子を接触させる。前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。
【０１１６】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記ｓｓＮｃ分子を単独で投与してもよいし、前記ｓｓＮｃ分子を含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【０１１７】
６．治療方法
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明のｓｓＮｃ分子を、患者に投与する工程を含み、前記ｓｓＮｃ分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明のｓｓＮｃ分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【０１１８】
本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の発現抑制方法等を援用できる。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与および非経口投与のいずれでもよい。
【０１１９】
７．ｓｓＮｃ分子の使用
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明のｓｓＮｃ分子の使用である。また、本発明の使用は、ＲＮＡ干渉の誘導のための、前記本発明のｓｓＮｃ分子の使用である。
【０１２０】
本発明の核酸分子は、疾患の治療に使用するための核酸分子であって、前記核酸分子は、前記本発明のｓｓＮｃ分子であり、前記ｓｓＮｃ分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。
【実施例】
【０１２１】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に限定されない。【０１２２】
（Lysアミダイトの合成）
下記スキーム６に従い、リシン（Lys）アミダイトであるDMTr-Lysアミダイト（７）を合成した。なお、下記スキーム６中、「Ｔｆａ」は、トリフルオロアセチル基を表す。
【化Ｓ６】
2013180038.tif 000010
【０１２３】
（１）化合物２の合成
6-ヒドロキシヘキサン酸(6g,  15.1mmol)のピリジン溶液(124mL)に4,4’-ジメトキシトリチルクロリド(20g,  1.3eq.)およびジメチルアミノピリジン(0.5g,  0.1eq.)を加え、室温にて20時間撹拌した。反応終了後メタノール(10mL)を加えて10分間撹拌し、溶媒留去した。反応液を酢酸エチルで希釈し、TEAA緩衝液(pH  8-9)で3回洗浄、飽和食塩水で1回洗浄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下溶媒留去した。このようにして、薄黄色油状物質である化合物２を31g(ピリジン含有)得た。【０１２４】
（２）化合物４の合成
化合物３(2.7g,  7.9mmol)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.9g,  1.2eq.)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(2.6g,  2.4eq.)のアセトニトリル溶液(45mL)に、4-アミノ-1-ブタノール(0.86g,  1.2eq.)のアセトニトリル溶液(5mL)を加えて室温で16時間撹拌した。反応終了後沈殿物を濾取し、濾液をエバポレーターにて溶媒留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、酢酸緩衝液(pH4)で3回、飽和重曹水で3回洗浄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下溶媒留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒：ジクロロメタン/メタノール=10/1)により精製し、白色固体である化合物４を2.8g(収率85%)得た。以下に、化合物（４）の機器分析値を示す。【０１２５】
化合物４；
1H-NMR(400MHz,  CDCl3)    δ:  7.07(br,  1H),  6.72(t,  J=5.6Hz,  1H),  4.03(m,  1H),  3.66(d,  J=4.9Hz,  2H),  3.37(dd,  J=12.9,  6.3Hz,  2H),  3.29(dd,  J=12.4,  6.3Hz,  2H),  1.83(s,  2H),  1.66-1.60(m,  6H),  1.44(s,  9H),  1.41-1.37(m,  2H)【０１２６】
（３）化合物５の合成
化合物４(2.5g,  6.1mmol)を塩酸/テトラヒドロフラン溶液(4M,  45mL)中で室温にて2時間撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をエタノールに溶かし、トルエンを加えて共沸した。溶媒留去後、白色固体である化合物５を1.9g得た。以下に、化合物５の機器分析値を示す。【０１２７】
化合物５；
1H-NMR(400MHz,  CD3OD)    δ:  3.85-3.81(m,  1H),  3.59-3.56(m,  2H),  3.32-3.20(m,  2H),  1.94-1.80(m,  2H),  1.66-1.58(m,  6H),  1.46-1.40(m,  2H)【０１２８】
（４）化合物６の合成
化合物２(ピリジン含有,  24g,  35.5mmol)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(8.8g,  1.2eq.)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(7.2g,  1.5eq.)の溶液(150mL)にトリエチルアミン(4.5mL,  0.9eq.)を加え、さらに化合物5(10g,  0.9eq.)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(30mL)を加えて室温で20時間撹拌した。反応終了後沈殿物を濾取し、濾液をエバポレーターにて溶媒留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和重曹水で3回洗浄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下溶媒留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒：ジクロロメタン/メタノール=20/1+0.05%ピリジン)により精製し、薄黄色固体である化合部部６を16g(収率70%)得た。以下に、化合物６の機器分析値を示す。【０１２９】
化合物６；
1H-NMR(400MHz,  CDCl3)    δ:  7.43-7.40(m,  2H),  7.32-7.26(m,  6H),  7.21-7.17(m,  1H),  6.81(d,  J=8.8Hz,  4H),  4.39-4.37(m,  1H),  3.78(s,  6H),  3.64-3.61(m,  2H),  3.33-3.22(m,  4H),  3.03(t,  J=6.6Hz,  2H),  2.19(t,  J=7.6Hz,  2H),  1.79-1.54(m,  12H),  1.40-1.34(m,  4H)【０１３０】
（５）化合物７の合成
アセトニトリルにて共沸乾燥した出発物質(1.26g,  1.73mmol)の無水アセトニトリル溶液(3.5mL)に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(394mg,  1.3eq.)、2-シアノエトキシ-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(700mg,  1.3eq.)を加え、室温にて2.5時間撹拌した。ジクロロメタンを加えて飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウム乾燥後、溶媒留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製(アミノシリカ、展開溶媒：n-ヘキサン/酢酸エチル=2/3)し、白色固体である化合物７を1.3g(収率78%)得た。以下に、化合物７の機器分析値を示す。【０１３１】
化合物７；
1H-NMR(400MHz,  CDCl3)    δ:  7.43-7.41(m,  2H),  7.32-7.17(m,  7H),  6.81(dt,  J=9.3,  2.9Hz,  4H),  4.42-4.37(m,  1H),  3.78(s,  6H),  3.88-3.54(m,  6H),  3.32-3.20(m,  4H),  3.03(t,  J=6.3Hz,  2H),  2.19(t,  J=7.6Hz,  2H),  1.83-1.53(m,  12H),  1.42-1.31(m,  4H),  1.28-1.24(m,  2H),  1.18-1.16(m,  12H)
31P-NMR(162MHz,  CDCl3)    δ:  146.9【０１３２】
（Ｇｌｙアミダイトの合成）
下記スキーム７に従い、グリシン（Gly）アミダイトであるDMTr-Glyアミダイト（化合物１２）を合成した。
【化Ｓ７】
2013180038.tif 000011
【０１３３】
（１）N-(4-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-グリシンアミド（化合物８）
Ｆｍｏｃ−グリシン（４．００ｇ，  １３．４５ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（３．３３ｇ，  １６．１５ｍｍｏｌ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（４．９４ｇ，  ３２．２９ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１００ｍＬ）に４−アミノブタノール（１．４４ｇ，  １６．１５ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（３０ｍＬ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下で濃縮した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄した。更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）に付し、N-(4-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-グリシンアミド（８）（４．３０ｇ，  ８７％）を得た。以下に、N-(4-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-グリシンアミド（８）の機器分析値を示す。【０１３４】
N-(4-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-グリシンアミド（８）；
１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz,  ＣＤＣｌ３）：δ＝７．７８−７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．６５−７．６３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．４２−７．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．３４−７．３０（２Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７．６，１．１Ｈｚ），４．４２−４．４０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），４．２５−４．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．８３（２Ｈ，ｓ），３．６０−３．５５（２Ｈ，ｍ），３．３０−３．２５（２Ｈ，ｍ），１．６１−１．５５（４Ｈ，ｍ）．【０１３５】
（２）N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-グリシンアミド（化合物９）
化合物８（４．２０ｇ，  １１．４０ｍｍｏｌ）に対し無水ピリジンを用いて３回共沸乾燥した。その共沸残渣に４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（５．８０ｇ，  １７．１０ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（８０ｍＬ）を加え、室温下で終夜撹拌した。得られた反応混合物にメタノール（２０ｍＬ）を加え室温で３０分撹拌した後、減圧下で溶媒を留去した。その後、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。未精製のN-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-グリシンアミド（９）（１１．４０ｇ）を得た。【０１３６】
（３）N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-グリシンアミド（化合物１０）
未精製の化合物９（１１．４０ｇ，  １６．９９ｍｍｏｌ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４５ｍＬ）及びピペリジン（１１．７ｍＬ）を室温で加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミド（３）（４．９０ｇ，  ９６％、  ２ｓｔｅｐｓ）を得た。以下に、N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-グリシンアミド（１０）の機器分析値を示す。【０１３７】
N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-グリシンアミド（１０）；
１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz,ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４４−７．４２（２Ｈ，ｍ），７．３３−７．２６（６Ｈ，ｍ），７．２１−７．２０（１Ｈ，ｍ），６．８３−６．８０（４Ｈ，ｍ），３．７９（６Ｈ，ｓ），  ３．４９（２Ｈ，ｓ），３．３０−３．２８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．０９−３．０６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），１．６１−１．５５（４Ｈ，ｍ）．【０１３８】
（４）N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-ヒドロキシヘキサノイル)-グリシンアミド（化合物１１）
化合物１０（４．８０ｇ，  １０．７０ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥後、アルゴン雰囲気下で６−ヒドロキシヘキサン酸（１．７０ｇ，  １２．８４ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２．４６ｇ，  １２．８４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（３．９３ｇ，  ２５．６９ｍｍｏｌ）、及び無水ジクロロメタン（６０ｍＬ）を室温で加え、１０分間撹拌した。このようにして得た混合物にトリエチルアミン（３．９０ｇ，  ３８．５３ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え飽和重曹水で３回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-ヒドロキシヘキサノイル)-グリシンアミド（１１）（４．８０ｇ，  ８０％）を得た。以下に、N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-ヒドロキシヘキサノイル)-グリシンアミド（１１）の機器分析値を示す。【０１３９】
N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-ヒドロキシヘキサノイル)-グリシンアミド（１１）；
１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz,ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４３−７．４０（２Ｈ，ｍ），７．３３−７．２６（６Ｈ，ｍ），７．２２−７．２０（１Ｈ，ｍ），６．８３−６．８０（４Ｈ，ｍ），３．８５（２Ｈ，ｓ），３．７８（６Ｈ，ｓ），３．６３−３．６０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．２６−３．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．０７−３．０５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．２６−２．２２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．６８−１．５２（８Ｈ，ｍ），１．４１−１．３６（２Ｈ，ｍ）．【０１４０】
（５）N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスフィチル)-ヒドロキシヘキサノイル)-グリシンアミド（化合物１２）
化合物１１（４．７０ｇ，  ８．３５ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥した。つぎに、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（１．７２ｇ，  １０．０２ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気してアルゴンガスを充填し、無水アセトニトリル（５ｍＬ）を加えた。さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（３．０２ｇ，  １０．０２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリルジクロロメタン混合溶液（１：１）（４ｍＬ）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加え、飽和重曹水で２回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。アミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ｎ−ヘキサン−アセトン（３：２）＋０．１％トリエチルアミン）に残渣を付し、ヒドロキシヘキサン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミドホスホロアミダイト（１２）（４．５０ｇ，  ７１％，  ＨＰＬＣ９８．２％）を得た。以下に、N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスフィチル)-ヒドロキシヘキサノイル)-グリシンアミド（１２）の機器分析値を示す。【０１４１】
N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスフィチル)-ヒドロキシヘキサノイル)-グリシンアミド（１２）；
１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz,ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４３−７．４０（２Ｈ，ｍ），７．３３−７．２６（６Ｈ，ｍ），７．２２−７．２０（１Ｈ，ｍ），６．８３−６．８０（４Ｈ，ｍ），３．８５−３．８１（４Ｈ，ｓ），３．７８（６Ｈ，ｓ），３．６３−３．６１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．２６−３．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．０５−２．９７（４Ｈ，ｍ），２．６４−２．６２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），２．２５−２．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．６８−１．５２（８Ｈ，ｍ），１．４０−１．３８（２Ｈ，ｍ），１．１３−１．２０（１２Ｈ，ｍ）．
３１Ｐ−ＮＭＲ（162MHz,ＣＤＣｌ３）：  δ＝１４６．５７．【０１４２】
（プロリンアミダイトの合成）
下記スキーム８に従い、プロリン骨格を含むアミダイトである化合物１７を製造した。【０１４３】
【化Ｓ８】
2013180038.tif 000012
【０１４４】
（１）N-(4-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-L-プロリンアミド（化合物１４）
化合物１３（Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリン）を出発原料とした。前記化合物１３（１０．００ｇ、２９．６４ｍｍｏｌ）、４−アミノ−１−ブタノール（３．１８ｇ、３５.５６ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１０．９０ｇ、７０．７２ｍｍｏｌ）を混合し、前記混合物に対し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に、無水アセトニトリル（１４０ｍＬ）を室温で加え、さらに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（７．３４ｇ、３５.５６ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７０ｍＬ）を添加した後、アルゴン雰囲気下、室温で１５時間撹拌した。反応終了後、生成した沈殿をろ別し、回収したろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水（２００ｍＬ）で洗浄した。そして、有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、その残渣にジエチルエーテル（２００ｍＬ）を加え、粉末化した。生じた粉末を濾取することにより、無色粉末状の化合物１４（１０．３４ｇ、収率８４％）を得た。以下に、前記化合物１４の機器分析値を示す。【０１４５】
化合物１４：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．７６−７．８３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．５０−７．６３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．３８−７．４３  （ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２８−７．３３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ），４．４０−４．４６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），４．１５−４．３１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．６７−３．７３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．３５−３．５２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．１８−３．３０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．２０−２．５０（ｍ，４Ｈ）、１．８１−２．０３（ｍ，３Ｈ）、１．４７−１．５４（ｍ，２Ｈ）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ４０９（Ｍ＋Ｈ＋）．【０１４６】
（２）N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-L-プロリンアミド（化合物１５）
Ｆｍｏｃ−ヒドロキシアミド−Ｌ−プロリン（化合物１４）（７．８０ｇ、１９．０９ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５ｍＬ）と混合し、室温で２回共沸乾燥した。得られた残留物に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（８．２０ｇ、２４．２０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（３９ｍＬ）を加えた。この混合物を、室温で１時間撹拌した後、メタノール（７．８ｍＬ）を加え、室温で３０分撹拌した。この混合物を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、飽和重曹水（１５０ｍＬ）で洗浄後、有機層を分離した。前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた未精製の残渣に、無水ジメチルホルムアミド（３９ｍＬ）およびピペリジン（１８．７ｍＬ、１８９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応終了後、前記混合液について、減圧下、室温で、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（商品名Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−３００、展開溶媒  ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９：１、０．０５％ピリジン含有に供し、淡黄色油状の化合物１５（９．１１ｇ、収率９８％）を得た。以下に、前記化合物１５の機器分析値を示す。【０１４７】
化合物１５：
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ７．３９−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．３０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７，２１（ｔｔ，１Ｈ，４．９，１．３Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ）、６．８１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．７１（ｄｄ，Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，５．４Ｈｚ，ＣＨ）、３．２１（２Ｈ，１２．９，６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．０５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．８５−２．９１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０８−２．１７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．８５−２．００（ｍ，３Ｈ）、１．５５−１．６５（ｍ，５Ｈ）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）；  ｍ／ｚ  ４８９（Ｍ＋Ｈ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．【０１４８】
（３）N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-ヒドロキシヘキサノイル)-L-プロリンアミド（化合物１６）
得られた前記ＤＭＴｒ−アミド−Ｌ−プロリン（化合物１５）（６．０１ｇ、１２．２８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２．８３ｇ、１４．７４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．９８ｇ、２９．４７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．４７ｇ、４４．２１ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１２０ｍＬ）を混合した。この混合液に、さらに、アルゴン雰囲気下、室温で、６−ヒドロキシヘキサン酸（１．９５ｇ、１４．４７ｍｍｏｌ）を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で、１時間撹拌した。前記混合液をジクロロメタン（６００ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水（８００ｍＬ）で３回洗浄した。有機層を回収し、前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。これにより、淡黄色泡状の前記化合物１６（６．２９ｇ、収率８５％）を得た。以下に、前記化合物１６の機器分析値を示す。【０１４９】
化合物１６：
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ７．４１−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２７−７．３１（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１９−７．２６（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．７９−６．８２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．５１−４．５３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ＣＨ２）、３．５０−３．５５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．３６−３．４３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），３．１５−３．２４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．０４（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．３８−２．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３１（ｔ，６．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０５−２．２０（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．９２−２．００（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７５−１．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．４８−１．７１（ｍ，８Ｈ）、１．３５−１．４４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ６０２（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．【０１５０】
（４）N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスフィチル)-ヒドロキシヘキサノイル)-L-プロリンアミド（化合物１７）
得られた前記ＤＭＴｒ−ヒドロキシジアミド−Ｌ−プロリン（化合物１６）（８．５５ｇ、１４．１８ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルと混合し、室温で３回共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２．９１ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル（１０ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（５.１３ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で２時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水（２００ｍＬ）で３回洗浄した後、飽和食塩水（２００ｍＬ）で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られた前記ろ液について、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ヘキサン：酢酸エチル＝１：３、０．０５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物１７（１０.２５ｇ、純度９２％、収率８３％）を得た。以下に、前記化合物１７の機器分析値を示す。【０１５１】
化合物１７：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．４２（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２９−７．３１（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２５−７．２７（ｍ，２Ｈ，  Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８０−６．８２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．５１−４．５３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．７５−３．９３（ｍ，４Ｈ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．４５−３．６０（ｍ，４Ｈ）、３．３５−３．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．２０−３．２９（ｍ，１Ｈ）、３．０４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．６２（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．４０−２．４４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３１（ｔ，７．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０３−２．１９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．９２−２．０２（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７０−１．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．５１−１．７１（ｍ，８Ｈ）、１．３５−１．４４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、１．１８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３）、１．１６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３）；
３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ１４７．１７；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ８０２（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋），２０１（Ｃ８Ｈ１９Ｎ２ＯＰ＋）．【０１５２】
（脂肪酸活性エステル体の合成）
下記スキーム９に従い、ミリスチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C14-NHS）、パルミチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C16-NHS）またはステアリン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C18-NHS）を、それぞれ合成した。また、下記スキーム１０に従い、オレイン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C18:1-NHS）を合成した。
【化Ｓ９】
2013180038.tif 000013
【化Ｓ１０】
2013180038.tif 000014
【０１５３】
ミリスチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C14-NHS）の合成
ミリスチン酸(1.5g,  6.6mmol)をジクロロメタン(30mL)に溶解させ撹拌した。この溶液にN-ヒドロキシコハク酸イミド(0.91g,  1.2eq.)と1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC）(1.5g,  1.2eq.)を加え、一晩撹拌した。水で2回洗浄後、飽和食塩水で1回洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン=1/3)により精製し、目的物を1.4g(収率67%)得た。以下に、得られたミリスチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C14-NHS）のNMR測定結果を示す。【０１５４】
ミリスチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C14-NHS）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ：  ２．８３（４Ｈ，  ｓ），  ２．６０（２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝７．６Ｈｚ），  １．７４（２Ｈ，  ｑ，  Ｊ＝７．６Ｈｚ），  １．４４（２Ｈ，  ｑ，  Ｊ＝６．９Ｈｚ），  １．４８−１．２２（１８Ｈ，  ｍ），  ０．８８（３Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝６．８Ｈｚ）．【０１５５】
パルミチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C16-NHS）の合成
パルミチン酸(6.0g,  23mmol)をジクロロメタン(110mL)に溶解させ撹拌した。この溶液にN-ヒドロキシコハク酸イミド(3.2g,  1.2eq.)と1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC）(5.4g,  1.2eq.)を加え、一晩撹拌した。水で2回洗浄後、飽和食塩水で1回洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン=1/2)により精製し、目的物を7.8g(収率94%)得た。以下に、得られたパルミチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C16-NHS）のNMR測定結果を示す。【０１５６】
パルミチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C16-NHS）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ：  ２．８４（４Ｈ，  ｓ），  ２．６０（２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝７．６Ｈｚ），  １．７４（２Ｈ，  ｑ，  Ｊ＝７．６Ｈｚ），  １．３８（２Ｈ，  ｑ，  Ｊ＝６．９Ｈｚ），  １．４３−１．２０（ｍ，  ２２Ｈ），  ０．８８（３Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝６．８Ｈｚ）．【０１５７】
ステアリン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C18-NHS）の合成
ステアリン酸(3.0g,  11mmol)をジクロロメタン(100mL)に溶解させ撹拌した。この溶液にN-ヒドロキシコハク酸イミド(1.5g,  1.2eq.)と1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC）(2.4g,  1.2eq.)を加え、2日間撹拌した。水で2回洗浄後、飽和食塩水で1回洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン=1/3)により精製し、目的物を2.8g(収率70%)得た。以下に、得られたステアリン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C18-NHS）のNMR測定結果を示す。
ステアリン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C18-NHS）：【０１５８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ：  ２．８４（４Ｈ，  ｍ），  ２．６０（２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝７．６Ｈｚ），  １．７４（２Ｈ，  ｑ，  Ｊ＝７．６Ｈｚ），  １．３８（２Ｈ，  ｑ，  Ｊ＝６．９Ｈｚ），  １．４３−１．２０（ｍ，  ２６Ｈ），  ０．８８（３Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝６．８Ｈｚ）．【０１５９】
オレイン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C18:1-NHS）の合成
オレイン酸(4.0g,  14mmol)をジクロロメタン(70mL)に溶解させ撹拌した。この溶液にN-ヒドロキシコハク酸イミド(2.0g,  1.2eq.)と1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC）(3.3g,  1.2eq.)を加え、一晩撹拌した。水で2回洗浄後、飽和食塩水で1回洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン=1/3)により精製し、目的物を5.2g(収率97%)得た。以下に、得られたオレイン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C18:1-NHS）のNMR測定結果を示す。【０１６０】
オレイン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C18:1-NHS）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．３５（２Ｈ，  ｍ），  ２．８３（４Ｈ，  ｓ），  ２．６０（２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝７．６Ｈｚ），  ２．０１（４Ｈ，  ｍ），  １．７５（２Ｈ，  ｑ，  Ｊ＝７．６Ｈｚ），  １．４１−１．２７（２０Ｈ，  ｍ），  ０．８８（３Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝６．８Ｈｚ）．【０１６１】
（実施例Ａ１：５’末端脂質コンジュゲート核酸の合成）
５’末端に脂質が結合している５’末端脂質コンジュゲート核酸（「５’末端脂質コンジュゲート体」、「５’末端脂質修飾核酸」、または単に「脂質修飾核酸」ともいう。）を合成した。以下に、合成した５’末端脂質コンジュゲート核酸の構造を模式的に示す。下記５’末端脂質コンジュゲート核酸のうち「Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ」は、後述する標的配列（ホタルルシフェラーゼ安定発現乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐＧＬ３  Ｌｕｃ）が保持するホタルルシフェラーゼ遺伝子の配列）に相補的でない配列を有し、参考例に該当する。「Ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」は、前記標的配列に相補的な配列を有する核酸である。「Ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」のうちｓｉＲＮＡ型（ｓｉＲＮＡ  ｔｙｐｅ）は、二本鎖核酸の一方の５’末端に脂質が結合している核酸であり、参考例に該当する。「Ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」のうちｎｋＲＮＡ（登録商標）型およびＰｎｋＲＮＡ（商品名）型は、一本鎖核酸の５’末端に脂質が結合している核酸であり、実施例に該当する。
【化ｓｉｎｋＰｎｋ】
2013180038.tif 000015
【０１６２】
前記５’末端脂質コンジュゲート核酸のうち、ｓｉＲＮＡ型（ｓｉＲＮＡ  ｔｙｐｅ）であるＮＩ−００８９−Ｃ１６、ＮＩ−００８９−ＤＰＰＥおよびそれらの合成原料であるＮＩ−００８９ｓ−ａｍｉｎｏの具体的な配列および構造を、５’末端に結合した脂質の構造を含めて以下に示す。
【化ｓｉ】
2013180038.tif 000016
【０１６３】
ＮＩ−００８９−Ｃ１６およびＮＩ−００８９−ＤＰＰＥの上側の配列は下記配列番号１で、下側の配列は下記配列番号２で、それぞれ表される。配列番号１の５’末端の「Ｂ」は、生体関連物質（脂質）を表す。ＮＩ−００８９ｓ−ａｍｉｎｏの配列も、下記配列番号１で表される。
5’-B-CUUACGCUGAGUACUUCGATT-3’（配列番号１）
5’-UCGAAGUACUCAGCGUAAGTT-3’（配列番号２）【０１６４】
また、前記５’末端脂質コンジュゲート核酸のうち、ｎｋＲＮＡ型（ｎｋＲＮＡ  ｔｙｐｅ）であるＮＫ−０１３９−Ｃ１６、ＮＫ−０１３９−ＤＰＰＥおよびそれらの合成原料であるＮＫ−０１３９−ａｍｉｎｏの具体的な配列および構造を、５’末端に結合した脂質の構造を含めて以下に示す。
【化ｎｋ】
2013180038.tif 000017
【０１６５】
ＮＫ−０１３９−Ｃ１６、ＮＫ−０１３９−ＤＰＰＥおよびＮＫ−０１３９−ａｍｉｎｏの配列のうち、領域Ｘｃの配列は下記配列番号３で表され、領域Ｘの配列は下記配列番号４で表され、全体の配列は、下記配列番号５で表される。配列番号５の５’末端の「Ｂ」は、生体関連物質（脂質）を表す。
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-3’（配列番号３）
5’-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-3’（配列番号４）
【化ｓｅｑ０５】
2013180038.tif 000018
【０１６６】
また、前記５’末端脂質コンジュゲート核酸のうち、ＰｎｋＲＮＡ型（ＰｎｋＲＮＡ  ｔｙｐｅ）であるＰＫ−００７１−Ｃ１６、ＰＫ−００７１−ＤＰＰＥおよびそれらの合成原料であるＰＫ−００７１−ａｍｉｎｏの具体的な配列および構造を、５’末端に結合した脂質の構造を含めて以下に示す。
【化Ｐｎｋ】
2013180038.tif 000019
【０１６７】
ＰＫ−００７１−Ｃ１６、ＰＫ−００７１−ＤＰＰＥおよびＰＫ−００７１−ａｍｉｎｏの配列は、下記配列番号６で表される。下記配列番号６の配列は、リンカー領域ＬｘおよびＬｙが、核酸配列に代えてプロリン残基Ｌｐに置き換わっていること以外は、配列番号５と同じである。また、Ｌｐの具体的な構造は、下記式で表される。
5’-B-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-Lｐ-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-Lｐ-G-3（配列番号６）
【化Ｌｐ】
2013180038.tif 000020
【０１６８】
さらに、前記５’末端脂質コンジュゲート核酸のうち、ネガティブコントロール配列を有するＮＩ−００００の具体的な配列および構造を、以下に示す。
【化ＮＩ００００】
2013180038.tif 000021
【０１６９】
ＮＩ−００００の上側の配列は、下記配列番号７で、下側の配列は、下記配列番号８で、それぞれ表される。
5’-UACUAUUCGACACGCGAAGTT-3’（配列番号７）
5’-CUUCGCGUGUCGAAUAGUATT-3’（配列番号８）【０１７０】
ＮＩ−００００−Ｃ１６およびＮＩ−００００−ＤＰＰＥの配列は、上側の配列が下記配列番号７に代えて下記配列番号９に置き換わっていること以外は、ＮＩ−００００と同じである。下記配列番号９は、５’側に生体関連物質（脂質）Ｂが結合していること以外は、配列番号７と同じであり、Ｂの構造は、前記ｓｉ型またはｎｋ型ＲＮＡと同じである。ＮＩ−００００−Ｃ１６およびＮＩ−００００−ＤＰＰＥの合成原料であるＮＩ−００００ｓ−ａｍｉｎｏの配列も、下記配列番号９で表され、この場合、前記Ｂの構造は、  NH2-(CH2)6-O-PO(OH)-O-  で表される。
5’-B-UACUAUUCGACACGCGAAGTT-3’（配列番号９）【０１７１】
前記各ＲＮＡ（５’末端脂質コンジュゲート核酸）は、以下のようにして合成した。【０１７２】
NI-0089s-aminoの合成
NI-0089s-aminoは、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（登録商標）  ８９０９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ）により、３’側から５’側に向かって合成した。前記合成には、ＲＮＡアミダイトとして、ＲＮＡ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、ST  Pharma）を用いた（以下、同様）。また、５’末端へのアミノ基の導入は、５’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６−ＴＦＡアミダイトを用いた（以下、同様）。前記アミダイトの脱保護は、定法に従い、合成したＲＮＡは、ＨＰＬＣにより精製した。また、以下の実施例において、ＲＮＡの合成（核酸配列の形成）は、特に示さない限り、同様に行った。【０１７３】
＜5’末端修飾＞
NI-0089-C16の合成
NI-0089s-amino(1.5mM)60μL、10mM  C16-NHS/DMF溶液356μL、5%ジイソプロピルアミン水溶液5μL、DMF  150μLを混合し、室温にて終夜撹拌した。反応液をエタノール沈殿し、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた後HPLCにて精製(Develosil  C8-UG-5,  2.5mm,  10x50  mm,  4.7mL/min,  260nm,  35℃,  Buffer  A:  50mM  TEAA,  5%  CH3CN;  Buffer  B:  CH3CN;  B  conc.  0-100%/20min)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV  260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。このようにして、純度97.64%のNI-0089s-amino-C16（NI-0089-C16のセンス鎖、前記配列番号１）を1.16mg得た。質量分析値は7024.17（計算値：7024.37）であった。得られたNI-0089s-amino-C16とNI-0089のアンチセンス鎖を混合してアニーリング操作を行い、NI-0089-C16を得た。【０１７４】
NI-0000-C16の合成
NI-0089s-aminoと同様の核酸合成法でNI-0000s-aminoを合成し、さらに、NI-0089s-aminoに代えてNI-0000s-aminoを用いる以外はNI-0089-C16と同様の方法でNI-0000-C16の合成を行った。【０１７５】
NK-0139-C16の合成
NI-0089s-aminoと同様の核酸合成法でNK-0139-aminoを合成した。つぎに、NK-0139-amino(687μM)50μL、10mM  C16-NHS/DMF溶液172μL、5%ジイソプロピルアミン水溶液5μL、DMF  75μLを混合し、室温にて終夜撹拌した。反応液をエタノール沈殿し、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた後HPLCにて精製(Develosil  C8-UG-5,  2.5mm,  10x50mm,  4.7mL/min,  260nm,  35℃,  Buffer  A:  50mM  TEAA,  5%  CH3CN;  Buffer  B:  CH3CN;  B  conc.  0-100%/20min)、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV  260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。このようにして、純度95.67%のNK-0139-C16を1.33mg得た。質量分析値は20173.23（計算値：20173.11）であった。【０１７６】
PK-0071-aminoの合成
PK-0071-aminoの合成は、前述と同様のホスホロアミダイト法により行った。具体的には、まず、グアノシンの５’側に、前記化合物１７を連結し、プロリン残基を導入した。つぎに、前記グアノシンの５’側に、前記プロリン残基を介して、前記配列番号４で表されるＲＮＡを連結した。さらに、その５’側に、前記化合物１７を連結し、プロリン残基を導入した。さらに、その５’側に、前記プロリン残基を介して、下記配列番号１０で表されるＲＮＡを連結した。なお、下記配列番号１０は、５’末端にＢが連結していること以外は前記配列番号３と同じである。また、PK-0071-aminoの場合は、前記Ｂの構造は、  NH2-(CH2)6-O-PO(OH)-O-  で表される。
5’-B-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-3’（配列番号１０）【０１７７】
PK-0071-C16の合成
PK-0071-amino(739μM)100μL、10mM  C16-NHS/DMF溶液296μL、5%ジイソプロピルアミン水溶液3μL、DMF  250μLを混合し、室温にて終夜撹拌した。反応液をエタノール沈殿し、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた後HPLCにて精製(Develosil  C8-UG-5,  2.5mm,  10x50mm,  4.7mL/min,  260nm,  35℃,  Buffer  A:  50mM  TEAA,  5%  CH3CN;  Buffer  B:  CH3CN;  B  conc.  0-100%/20min)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV  260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。このようにして、純度94.59%のPK-0071-C16を0.57mg得た。質量分析値は17450.88（計算値：17450.78）であった。【０１７８】
NI-0089-DPPEの合成
NI-0089s-amino(1.5mM)  60μL、10mM  DPPE-NHSエタノール溶液445μL、5%トリエチルアミン水溶液15μL、エタノール130μL、注射用蒸留水220μLを混合し、室温にて終夜撹拌した。反応液をエタノール沈殿し、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた後HPLCにて精製(Develosil  C8-UG-5,  2.5mm,  10x50mm,  4.7mL/min,  260nm,  35℃,  Buffer  A:  50mM  TEAA,  5%  CH3CN;  Buffer  B:  CH3CN;  B  conc.  0-100%/20min)、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV  260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度92.41%のNI-0089s-amino-DPPE（NI-0089-DPPEのセンス鎖、前記配列番号１）を1.53mg得た。質量分析値は7573.71（計算値：7573.67）であった。得られたNI-0089s-amino-DPPEとNI-0089のアンチセンス鎖を混合してアニーリング操作を行い、NI-0089-DPPEを得た。【０１７９】
NK-0139-DPPEの合成
NK-0139-amino(687μM)100μL、10mM  DPPE-NHSエタノール溶液343μL、5%トリエチルアミン水溶液15μL、エタノール50μL、注射用蒸留水150μLを混合し、室温にて終夜撹拌した。反応液をエタノール沈殿し、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた後HPLCにて精製(Develosil  C8-UG-5,  2.5mm,  10x50mm,  4.7mL/min,  260nm,  35℃,  Buffer  A:  50mM  TEAA,  5%  CH3CN;  Buffer  B:  CH3CN;  B  conc.  0-100%/20min)、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV  260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度95.79%のNK-0139-DPPEを1.42mg得た。質量分析値は20722.75（計算値：20722.41）であった。【０１８０】
PK-0071-DPPEの合成
PK-0071-amino(739μM)100μL、10mM  DPPE-NHSエタノール溶液369μL、5%トリエチルアミン水溶液10μL、エタノール110μL、注射用蒸留水120μLを混合し、室温にて終夜撹拌した。反応液をエタノール沈殿し、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた後HPLCにて精製(Develosil  C8-UG-5,  2.5mm,  10x50mm,  4.7mL/min,  260nm,  35℃,  Buffer  A:  50mM  TEAA,  5%  CH3CN;  Buffer  B:  CH3CN;  B  conc.  0-100%/20min)、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV  260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。このようにして、純度97.67%のPK-0071-DPPEを2.18mg得た。質量分析値は18000.50（計算値：18000.08）であった。【０１８１】
（実施例Ｂ１）５’末端脂質コンジュゲート核酸によるホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果
前記５’末端脂質コンジュゲート核酸を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制を確認した。【０１８２】
（１）材料および方法
前記各ＲＮＡを、所望の濃度（２０μｍｏｌ／Ｌ）となるように、注射用蒸留水（大塚製薬、以下同様）に溶解し、ＲＮＡ溶液を調製した。【０１８３】
細胞は、ホタルルシフェラーゼ安定発現乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐＧＬ３  Ｌｕｃ）を使用し、培地は、１０％  ＦＢＳを含む  ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、培養条件は、３７℃、５％  ＣＯ２下とした。【０１８４】
ホタルルシフェラーゼ安定発現乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐＧＬ３  Ｌｕｃ）の培養は、より具体的には、以下のようにして行った。
[1]  前記細胞を培地中で培養し、その培養液を９６穴プレートに５０μＬずつ１×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。
[2]  つぎに、ウェル中の前記細胞に対し、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付プロトコールに従ってＲＮＡサンプルをトランスフェクションした。具体的には、ウェルあたり前記ＲＮＡサンプルと前記トランスフェクション試薬との複合体５０μＬを添加し、全量を１００μＬ、前記ＲＮＡサンプルの最終濃度を０．１、１、または１０ｎｍｏｌ／Ｌとした。コントロール１として、前記ＲＮＡサンプルおよび前記トランスフェクション試薬を添加していない細胞（−）、コントロール２として、トランスフェクションにおいて前記ＲＮＡサンプルを未添加とし、前記トランスフェクション試薬のみを添加した細胞（ｍｏｃｋ）を用意した。
[3]  さらに、前記トランスフェクション後、４８時間培養した。【０１８５】
ルシフェラーゼ活性測定は、以下のようにして行った。このルシフェラーゼ活性測定は、すなわち、ホタルルシフェラーゼ安定発現乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐＧＬ３  Ｌｕｃ）が保持するホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果の測定である。
[1]  まず、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、添付のプロトコールに従ってホタルルシフェラーゼの活性を測定した。具体的には、前記ウェルあたり、基質溶液１００μＬを添加し、マルチラベルリーダーであるＡＲＶＯ  Ｘ２（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてルシフェラーゼ発光量を測定した。
[2]  前記[1]のルシフェラーゼ活性測定結果は、ＲＮＡサンプルおよびトランスフェクション試薬を添加していない細胞（−）（前記コントロール１、非添加細胞群）を１とした相対活性で表した。【０１８６】
（２）結果
これらの結果を、図３〜５に示す。図３〜５は、ルシフェラーゼ活性の相対値を示すグラフである。【０１８７】
図３に示すとおり、ｓｉＲＮＡ型（二本鎖ＲＮＡ）である参考例Ｂ１−１（ＮＩ−００８９）、参考例Ｂ１−２（ＮＩ−００８９−Ｃ１６）、参考例Ｂ１−３（ＮＩ−００８９−ＤＰＰＥ）においては、それぞれ、ルシフェラーゼ発光抑制の抑制が見られた。なお、ネガティブコントロール配列を有するｓｉＲＮＡ型（二本鎖ＲＮＡ）である参考例Ｂ１−４（ＮＩ−００００）、参考例Ｂ１−５（ＮＩ−００００−Ｃ１６）、参考例Ｂ１−６（ＮＩ−００００−ＤＰＰＥ）においては、ルシフェラーゼ発光抑制の抑制が見られなかった。【０１８８】
また、図４に示すとおり、ｎｋＲＮＡ型であるＮＫ−０１３９（参考例Ｂ１−７）、ＮＫ−０１３９−Ｃ１６（実施例Ｂ１−１）およびＮＫ−０１３９−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ１−２）においては、それぞれ、ルシフェラーゼ発光抑制の抑制が見られた。５’末端に脂質を結合した（修飾した）ＮＫ−０１３９−Ｃ１６（実施例Ｂ１−１）およびＮＫ−０１３９−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ１−２）は、それぞれ、脂質を結合していない（無修飾の）ＮＫ−０１３９（参考例Ｂ１−７）と遜色ないルシフェラーゼ活性抑制効果を示した。さらに、脂質（生体関連物質）を結合したことで、例えば、デリバリー用のキャリアを必須とすることなく、ターゲットへの優れたデリバリー能を実現できる。さらに、ＮＫ−０１３９−Ｃ１６（実施例Ｂ１−１）およびＮＫ−０１３９−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ１−２）は、ｓｉＲＮＡ型（二本鎖ＲＮＡ）である参考例Ｂ１−１〜Ｂ１−３と比較しても遜色ないルシフェラーゼ活性抑制効果を示した。さらに、ＮＫ−０１３９−Ｃ１６（実施例Ｂ１−１）およびＮＫ−０１３９−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ１−２）は、一本鎖核酸であることで、ｓｉＲＮＡ型（二本鎖ＲＮＡ）と比較して合成および取扱いが容易である。【０１８９】
また、図５に示すとおり、ＰｎｋＲＮＡ型であるＰＫ−００７１（参考例Ｂ１−１１）、ＰＫ−００７１−Ｃ１６（実施例Ｂ１−３）およびＰＫ−００７１−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ１−４）においては、それぞれ、ルシフェラーゼ発光抑制の抑制が見られた。５’末端に脂質を結合した（修飾した）ＰＫ−００７１−Ｃ１６（実施例Ｂ１−３）およびＰＫ−００７１−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ１−４）は、それぞれ、脂質を結合していない（無修飾の）ＰＫ−００７１（参考例Ｂ１−８）と遜色ないルシフェラーゼ活性抑制効果を示した。さらに、脂質（生体関連物質）を結合したことで、例えば、デリバリー用のキャリアを必須とすることなく、ターゲットへの優れたデリバリー能を実現できる。さらに、ＰＫ−００７１−Ｃ１６（実施例Ｂ１−３）およびＰＫ−００７１−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ１−４）は、ｓｉＲＮＡ型（二本鎖ＲＮＡ）である参考例Ｂ１−１〜Ｂ１−３と比較しても遜色ないルシフェラーゼ活性抑制効果を示した。さらに、ＰＫ−００７１−Ｃ１６（実施例Ｂ１−３）およびＰＫ−００７１−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ１−４）は、一本鎖核酸であることで、ｓｉＲＮＡ型（二本鎖ＲＮＡ）と比較して合成および取扱いが容易である。【０１９０】
（実施例Ａ２：内部脂質コンジュゲート核酸の合成）
核酸の末端以外の内部に脂質が結合している内部脂質コンジュゲート核酸（「内部脂質コンジュゲート体」、「内部脂質修飾核酸」、または単に「脂質修飾核酸」ともいう。）を合成した。以下に、合成した内部脂質コンジュゲート核酸の構造を模式的に示す。核酸を示す符号（「Ｋ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１６」等）中、「Ｋ」は、後述するリシン（Lysine）残基を示し、「Ｇ」は、後述するグリシン（Glycine）残基を示す。「Ｒ」は、下図において右側のリンカー領域（リンカー領域Ｌｘ）が前記リシン残基または前記グリシン残基であることを表す。「Ｌ」は、下図において左側のリンカー領域（リンカー領域Ｌｙ）が前記リシン残基または前記グリシン残基であることを表す。「ＬＲ」は、下図において左右のリンカー領域（リンカー領域ＬｘおよびＬｙ）が前記リシン残基または前記グリシン残基であることを表す。「Ｃ１６」は、前記リシン残基に、実施例Ａ１およびＢ１と同様の一本鎖脂質が結合していることを表す。「ＤＰＰＥ」は、前記リシン残基に、実施例Ａ１およびＢ１と同様の二本鎖脂質が結合していることを表す。
【化ＲＬＬＲ】
2013180038.tif 000022
【０１９１】
上記内部脂質コンジュゲート核酸のうち「Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ」は、標的配列（ホタルルシフェラーゼ安定発現乳癌細胞株ＭＣＦ−７（ｐＧＬ３  Ｌｕｃ）が保持するホタルルシフェラーゼ遺伝子の配列）に相補的でない配列を有し、参考例に該当する。「Ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」は、前記標的配列に相補的な配列を有する核酸である。「Ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」のうちＧ（Ｒ）−０１０１、Ｇ（Ｌ）−０１０２、およびＧ（ＬＲ）−０１００は、後述する通り、生体関連物質（脂質）が結合されておらず、参考例に該当する。「Ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」のうちＫ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１６、Ｋ（Ｒ）−０１０１−ＤＰＰＥ、Ｋ（Ｌ）−０１０１−Ｃ１６、Ｋ（Ｌ）−０１０１−ＤＰＰＥ、Ｋ（ＬＲ）−０１０１−Ｃ１６、Ｋ（ＬＲ）−０１０１−ＤＰＰＥは、後述するように、一本鎖核酸の末端以外の内部に脂質が結合している核酸であり、実施例に該当する。【０１９２】
前記内部脂質コンジュゲート核酸のうち、Ｒ型（Ｒ  ｔｙｐｅ）であるＫ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１６、Ｋ（Ｒ）−０１０１−ＤＰＰＥ、Ｇ（Ｒ）−０１０１の具体的な配列および構造は、下記のとおりである。下記構造式において、「Ｌｙｓ」は、リンカー領域のリシン残基を表し、「Ｇｌｙ」は、リンカー領域のグリシン残基を表す。
【化Ｒ】
2013180038.tif 000023
【０１９３】
Ｋ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１６およびＧ（Ｒ）−０１０１において、Ｌｙｓ（リシン残基）およびＧｌｙ（グリシン残基）までも含めた具体的な構造は、下記のとおりである。なお、Ｋ（Ｒ）−０１０１−ＤＰＰＥにおけるリシン残基Ｌｙｓの構造は、Ｋ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１６と同じであり、Ｌｙｓには、一本鎖脂質（Ｃ１６）に代えて前記二本鎖脂質（ＤＰＰＥ）が結合している。
【化Ｒｓ】
2013180038.tif 000024
【０１９４】
Ｋ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１６およびＫ（Ｒ）−０１０１−ＤＰＰＥの配列は、下記配列番号１１で表される。下記配列番号１１において、Ｌｌは、リンカー領域Ｌｘである前記リシン残基Ｌｙｓを表す。なお、前述のとおり、Ｋ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１６およびＫ（Ｒ）−０１０１−ＤＰＰＥにおいて、Ｌｙｓには脂質が結合している。また、Ｇ（Ｒ）−０１０１の配列は、下記配列番号１２で表される。下記配列番号１２において、Ｌｇは、リンカー領域Ｌｘである前記グリシン残基Ｇｌｙを表す。
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-Ll-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUCUUCGG-3’（配列番号１１）
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-Lg-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUCUUCGG-3’（配列番号１２）【０１９５】
前記内部脂質コンジュゲート核酸のうち、Ｌ型（Ｌ  ｔｙｐｅ）であるＫ（Ｌ）−０１０２−Ｃ１６、Ｋ（Ｌ）−０１０２−ＤＰＰＥ、Ｇ（Ｌ）−０１０２の具体的な配列および構造は、下記のとおりである。下記構造式において、「Ｌｙｓ」は、リンカー領域のリシン残基を表し、「Ｇｌｙ」は、リンカー領域のグリシン残基を表す。ＬｙｓおよびＧｌｙの構造は、前記Ｒ型と同じである。
【化Ｌ】
2013180038.tif 000025
【０１９６】
Ｋ（Ｌ）−０１０２−Ｃ１６およびＫ（Ｌ）−０１０２−ＤＰＰＥの配列は、下記配列番号１３で表される。下記配列番号１３において、Ｌｌは、リンカー領域Ｌｙである前記リシン残基Ｌｙｓを表す。なお、前述のとおり、Ｋ（Ｌ）−０１０２−Ｃ１６およびＫ（Ｌ）−０１０２−ＤＰＰＥにおいて、Ｌｙｓには脂質が結合している。また、Ｇ（Ｌ）−０１０２の配列は、下記配列番号１４で表される。下記配列番号１４において、Ｌｇは、リンカー領域Ｌｙである前記グリシン残基Ｇｌｙを表す。
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCCCCACACCGGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-Ll-G-3’（配列番号１３）
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCCCCACACCGGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-Lg-G-3’（配列番号１４）【０１９７】
前記内部脂質コンジュゲート核酸のうち、ＬＲ型（ＬＲ  ｔｙｐｅ）であるＫ（ＬＲ）−０１００−Ｃ１６、Ｋ（ＬＲ）−０１００−ＤＰＰＥ、Ｇ（ＬＲ）−０１００の具体的な配列および構造は、下記のとおりである。下記構造式において、「Ｌｙｓ」は、リンカー領域のリシン残基を表し、「Ｇｌｙ」は、リンカー領域のグリシン残基を表す。ＬｙｓおよびＧｌｙの構造は、前記Ｒ型および前記Ｌ型と同じである。
【化ＬＲ】
2013180038.tif 000026
【０１９８】
Ｋ（ＬＲ）−０１００−Ｃ１６およびＫ（ＬＲ）−０１００−ＤＰＰＥの配列は、下記配列番号１５で表される。下記配列番号１５において、Ｌｌは、リンカー領域Ｌｙである前記リシン残基Ｌｙｓを表す。なお、前述のとおり、Ｋ（ＬＲ）−０１００−Ｃ１６およびＫ（ＬＲ）−０１００−ＤＰＰＥにおいて、Ｌｙｓには脂質が結合している。また、Ｇ（ＬＲ）−０１００の配列は、下記配列番号１６で表される。下記配列番号１６において、Ｌｇは、リンカー領域Ｌｙである前記グリシン残基Ｇｌｙを表す。
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-Ll-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-Ll-G-3’（配列番号１５）
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-Lg-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-Lg-G-3’（配列番号１６）【０１９９】
前記各ＲＮＡ（内部脂質コンジュゲート核酸）は、以下のようにして合成した。【０２００】
K(R)-0101の合成
前述と同様のホスホロアミダイト法により、Ｌｙｓに脂質が結合していないこと以外はK(R)-0101-C16およびK(R)-0101-DPPEと同じ構造（前記配列番号１１）を有するK(R)-0101を合成した。具体的には、まず、下記配列番号１７で表される核酸の５’側に、前記化合物７を連結し、リシン残基を導入した。つぎに、前記配列番号１７で表される核酸の５’側に、前記リシン残基を介して、前記配列番号３で表されるＲＮＡを連結し、K(R)-0101を合成した。
5’-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUCUUCGG-3’（配列番号１７）【０２０１】
K(R)-0101-C16の合成
K(R)-0101(500μM)  80μL、50mM  C16-NHS/DMF溶液32μL、イソプロパノール128μL、pH  9.2の炭酸緩衝液160μL(最終濃度100mM)  を混合し、40℃にて3時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製(Develosil  C8-UG-5,  2.5mm,  10x50mm,  4.7mL/min,  260nm,  35℃,  Buffer  A:  50mM  TEAA,  5%  CH3CN;  Buffer  B:  CH3CN;  B  conc.  0-100%/20min)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV  260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。このようにして、純度99.50%のK(R)-0101-C16を405μg得た。質量分析値は、18203.18(計算値：18203.41)であった。【０２０２】
K(L)-0102-C16の合成
前記配列番号１７をグアノシンに変えたことと、前記配列番号３を下記配列番号１８に変えたこと以外はK(R)-0101-C16と同様の方法で合成を行い、純度96.69%のK(L)-0102-C16を316μg得た。質量分析値は、19124.88(計算値：19125.01)であった。
5’-ACUUACGCUGAGUACUUCGAUUCCCCACACCGGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-3’（配列番号１８）【０２０３】
K(LR)-0100の合成
前述と同様のホスホロアミダイト法により、Ｌｙｓに脂質が結合していないこと以外はK(LR)-0100-C16およびK(LR)-0100-DPPEと同じ構造（前記配列番号１１）を有するK(LR)-0100を合成した。具体的には、まず、グアノシンで表される核酸の５’側に、前記化合物７を連結し、リシン残基を導入した。つぎに、前記グアノシンの５’側に、前記リシン残基を介して、下記配列番号１９で表される核酸を導入した。さらに、前記配列番号１９で表される核酸の５’側に、前記化合物７を連結し、リシン残基を導入した。さらに、前記配列番号１９で表される核酸の５’側に、前記リシン残基を介して、前記配列番号３で表されるＲＮＡを連結し、K(LR)-0100を合成した。
5’-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUUC-3’（配列番号１９）【０２０４】
K(LR)-0100-C16の合成
K(R)-0101に代えてK(LR)-0100を用いること以外はK(R)-0101-C16と同様の方法で合成を行い、純度98.07%のK(LR)-0100-C16を317μg得た。質量分析値は、17572.21(計算値：17572.52)であった。【０２０５】
K(R)-0101-DPPEの合成
K(R)-0101(500μM)160μL、10mM  DPPE-NHSエタノール溶液320μL、1%トリエチルアミン水溶液80μL、エタノール160μL、注射用蒸留水80μLを混合し、40℃にて24時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製(Develosil  C8-UG-5,  2.5mm,  10x50mm,  4.7mL/min,  260nm,  35℃,  Buffer  A:  50mM  TEAA,  5%  CH3CN;  Buffer  B:  CH3CN;  B  conc.  0-100%/20min)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV  260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。このようにして、純度99.55%のK(R)-0101-DPPEを0.98mg得た。質量分析値は、18752.70(計算値：18753.04)であった。【０２０６】
K(L)-0102-DPPEの合成
前記配列番号１７をグアノシンに変えたことと、前記配列番号３を前記配列番号１８に変えたこと以外はK(R)-0101-DPPEと同様の方法で合成を行い、純度99.10%のK(L)-0102-DPPEを1.05mg得た。質量分析値は、19674.36(計算値：19674.64)であった。【０２０７】
K(LR)-0100-DPPEの合成
K(LR)-0100(500μM)  120μL、10mM  DPPE-NHSエタノール溶液360μL、1%トリエチルアミン水溶液90μL、注射用蒸留水30μLを混合し、40℃にて24時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製(Develosil  C8-UG-5,  2.5mm,  10x50mm,  4.7mL/min,  260nm,  35℃,  Buffer  A:  50mM  TEAA,  5%  CH3CN;  Buffer  B:  CH3CN;  B  conc.  0-100%/20min)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV  260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。このようにして、純度99.14%のK(LR)-0100-DPPEを0.54mg得た。質量分析値は、18670.42(計算値：18671.78)であった。【０２０８】
（実施例Ｂ２）内部脂質コンジュゲート核酸によるホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果
前記５’末端脂質コンジュゲート核酸に代えて、前記内部脂質コンジュゲート核酸を用いること以外は、実施例Ｂ１と同様にして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制を確認した。これらの結果を、図６〜８に示す。図６〜８は、ルシフェラーゼ活性の相対値を示すグラフである。【０２０９】
図６〜８に示すとおり、Ｇ（Ｒ）−０１０１（参考例Ｂ２−１）、Ｋ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１６（実施例Ｂ２−１）、Ｋ（Ｒ）−０１０１−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ２−２）、Ｇ（Ｌ）−０１０２（参考例Ｂ２−２）、Ｋ（Ｌ）−０１０２−Ｃ１６（実施例Ｂ２−３）、Ｋ（Ｌ）−０１０２−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ２−４）、Ｇ（ＬＲ）−０１００（参考例Ｂ２−３）、Ｋ（ＬＲ）−０１００−Ｃ１６（実施例Ｂ２−５）、Ｋ（ＬＲ）−０１００−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ２−６）では、それぞれ、ルシフェラーゼ発光抑制の抑制が見られた。【０２１０】
また、図６〜８に示す通り、末端以外の内部に脂質を結合した（修飾した）Ｋ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１６（実施例Ｂ２−１）、Ｋ（Ｒ）−０１０１−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ２−２）、Ｋ（Ｌ）−０１０２−Ｃ１６（実施例Ｂ２−３）、Ｋ（Ｌ）−０１０２−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ２−４）、Ｋ（ＬＲ）−０１００−Ｃ１６（実施例Ｂ２−５）、Ｋ（ＬＲ）−０１００−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ２−６）は、それぞれ、脂質を結合していない（無修飾の）Ｇ（Ｒ）−０１０１（参考例Ｂ２−１）、Ｇ（Ｌ）−０１０２（参考例Ｂ２−２）、Ｇ（ＬＲ）−０１００（参考例Ｂ２−３）と遜色ないルシフェラーゼ活性抑制効果を示した。さらに、脂質（生体関連物質）を結合したことで、例えば、デリバリー用のキャリアを必須とすることなく、ターゲットへの優れたデリバリー能を実現できる。また、前記実施例Ｂ２−１〜Ｂ２−６の核酸は、ｓｉＲＮＡ型（二本鎖ＲＮＡ）である参考例Ｂ１−１〜Ｂ１−３と比較しても遜色ないルシフェラーゼ活性抑制効果を示し、さらに、一本鎖核酸であることで、ｓｉＲＮＡ型（二本鎖ＲＮＡ）と比較して合成および取扱いが容易である。【０２１１】
（実施例Ａ３：脂質の構造を変化させた内部脂質コンジュゲート核酸の合成）
前記実施例Ａ２のＲ型（Ｒ  ｔｙｐｅ）核酸であるＫ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１６において、脂質の構造をＣ１６（パルミチン酸）からＣ１４（ミリスチン酸）、Ｃ１８（ステアリン酸）または不飽和結合を１つ有するＣ１８（オレイン酸）に変えたＫ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１４、Ｋ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１８、およびＫ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１８：１を合成した。それぞれの構造は、下記のとおりである。
【化ＲＦＡ】
2013180038.tif 000027
【０２１２】
K(R)-0101-C14の合成
K(R)-0101(500μM)  40μL、50mM  C14-NHS/DMF溶液16μL、イソプロパノール64μL、pH9.2の炭酸緩衝液80μL(最終濃度100mM)を混合し、40℃にて3時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製(Develosil  C8-UG-5,  2.5mm,  10x50mm,  4.7mL/min,  260nm,  35℃,  Buffer  A:  50mM  TEAA,  5%  CH3CN;  Buffer  B:  CH3CN;  B  conc.  0-100%/20min)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV  260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。このようにして、純度94.43%のK(R)-0101-C14を193μg得た。質量分析値は、18175.91(計算値：18175.36)であった。【０２１３】
K(R)-0101-C18の合成
K(R)-0101(500μM)  40μL、50mM  C18-NHS/DMF溶液16μL、イソプロパノール64μL、pH  9.2の炭酸緩衝液80μL(最終濃度100mM)を混合し、40℃にて3時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製(Develosil  C8-UG-5,  2.5mm,  10x50mm,  4.7mL/min,  260nm,  35℃,  Buffer  A:  50mM  TEAA,  5%  CH3CN;  Buffer  B:  CH3CN;  B  conc.  0-100%/20min)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV  260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。このようにして、純度95.97%のK(R)-0101-C18を188μg得た。質量分析値は、18231.08(計算値：18231.46)であった。【０２１４】
K(R)-0101-C18:1の合成
K(R)-0101(500μM)  40μL、50mM  C18:1-NHS/DMF溶液16μL、イソプロパノール64μL、pH  9.2の炭酸緩衝液80μL(最終濃度100mM)を混合し、40℃にて3時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製(Develosil  C8-UG-5,  2.5mm,  10x50mm,  4.7mL/min,  260nm,  35℃,  Buffer  A:  50mM  TEAA,  5%  CH3CN;  Buffer  B:  CH3CN;  B  conc.  0-100%/20min)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV  260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。このようにして、純度96.22%のK(R)-0101-C18:1を192μg得た。質量分析値は、18230.49(計算値：18229.45)であった。【０２１５】
（実施例Ｂ３）脂質の構造を変化させた内部脂質コンジュゲート核酸によるホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果
Ｋ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１６に代えてＫ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１４、Ｋ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１８、およびＫ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１８：１を用いること以外は、実施例Ｂ２と同様にして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制を確認した（実施例Ｂ３−２〜実施例Ｂ３−４）。また、Ｇ（Ｒ）−０１０１（参考例Ｂ３−１）およびＫ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１６（実施例Ｂ３−１）についても、同様にして発現抑制を確認した。これらの結果を、図９に示す。図９は、ルシフェラーゼ活性の相対値を示すグラフである。図示のとおり、ルシフェラーゼ活性の抑制効果は、おおむね、C14修飾＜C18:1修飾＜C16修飾＜C18:0修飾の順であったが、大差はなかった。すなわち、実施例Ｂ３−２〜実施例Ｂ３−４のいずれも、実施例Ｂ３−１と遜色ないルシフェラーゼ活性抑制効果が得られたことから、脂質の構造を変化させても本発明の効果が得られることが確認された。また、実施例Ｂ３−１〜Ｂ３−４は、脂質を結合させていない参考例Ｂ３−１に対しても遜色ないルシフェラーゼ活性抑制効果を示した。【０２１６】
（実施例Ｃ４）
K(R)-0101-C16のin vivoにおける効果について，ホタルルシフェラーゼ遺伝子を恒常的に発現しているマウス（Luciferase  transgenic  マウス）を用いて以下のように調査した。すなわち、まず、Luciferase  transgenic  マウス(C57Blac/J)  (♀４週齢)を5匹ずつ２群準備した。１つの群には、尾静脈より、K(R)0101-C16を200μg/100μL/headの割合で投与した。もう１つの群には、何も投与しなかった（未処理）。投与から4日後にD-Luciferin（Promega）を3mg/headを腹腔内投与し、エーテル麻酔下で解剖し、各臓器を摘出してIVIS  Imaging  System(Caliper  Co.,)で15分間化学発光強度の測定を行い、解析をした。【０２１７】
図１０の写真に、前記ＩＶＩＳアッセイによる、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制の測定結果を示す。図１０（ａ）は、本発明の一本鎖核酸（K(R)0101-C16）で処理したマウスの測定結果を示す写真である。図１０（ｂ）は、未処理マウスの測定結果を示す写真である。【０２１８】
図１１は、図１０の写真における、全身のルシフェラーゼ活性（ホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制）の測定結果を示すグラフである。図１２は、図１０の写真における、脳のルシフェラーゼ活性（ホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制）の測定結果を示すグラフである。図１１および１２において、縦軸は、ルシフェラーゼ活性を示し、「Ｎｏｎｔｒｅａｔ」は、未処理マウスの測定結果を示し、「Ｋ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１６」は、Ｋ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１６で処理したマウスの測定結果を示す。図示のとおり、Ｋ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１６で処理したマウスにおいては、未処理マウスと比較して明らかにルシフェラーゼ活性が低下しており、ルシフェラーゼ活性抑制効果が見られた。また、図１２に示すとおり、Ｋ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１６で処理したマウスにおいては脳におけるルシフェラーゼ活性が低下していることから、本発明の核酸は血液脳関門を通過して脳内で遺伝子発現を抑制することが可能である。さらに、脂質（生体関連物質）を結合したことで、例えば、デリバリー用のキャリアを必須とすることなく、ターゲットへの優れたデリバリー能を実現できる。【０２１９】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
【産業上の利用可能性】
【０２２０】
本発明の一本鎖核酸分子によれば、例えば、デリバリー用のキャリアを必須とすることなく、ターゲットへの優れたデリバリー能を実現できる。このため、例えば、キャリアの毒性を考慮する必要がなく、核酸分子とキャリアとの複合体との形成に関する様々な条件設定の検討を回避できる。このため、例えば、製造面および使用面における労力やコストを低減可能である。
【図１】
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【図２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年11月10日(2014.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）、内部領域（Ｚ）、リンカー領域（Ｌｙ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、
前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、
前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、
前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的であり、
前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含み、
５’末端、３’末端、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）からなる群から選択された少なくとも１つに、生体関連物質が結合していることを特徴とする、デリバリー機能を有する標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子。
【請求項２】
前記生体関連物質が、脂質である、請求項１記載の一本鎖核酸分子。
【請求項３】
前記生体関連物質が、単純脂質、複合脂質、誘導脂質、一本鎖脂質、二本鎖脂質、糖脂質、脂溶性ビタミン、ステロイドである、請求項２記載の一本鎖核酸分子。
【請求項４】
前記脂質が、パルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸からなる群から選択される少なくとも一つである請求項２記載の一本鎖核酸分子。
【請求項５】
前記生体関連物質が、抗体タンパク、そのペプチドおよび膜透過性ペプチドからなる群から選択された少なくとも１つである、請求項１記載の一本鎖核酸分子。
【請求項６】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、下記式（１）および（２）の条件を満たす、請求項１から５のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
Ｚ＝Ｘ＋Ｙ      ・・・（１）
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ  ・・・（２）
【請求項７】
少なくとも１つの修飾された残基を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項８】
安定同位体を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項９】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および／または前記リンカー領域（Ｌｙ）が、
ヌクレオチド残基および非ヌクレオチド残基の少なくとも一つから構成される、請求項１から８のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド残基が、非修飾ヌクレオチド残基および／または修飾ヌクレオチド残基である、請求項９記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１１】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および／または前記リンカー領域（Ｌｙ）が、下記（１）〜（７）のいずれかの残基で構成される、請求項９または１０記載の一本鎖核酸分子。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【請求項１２】
前記遺伝子の発現抑制が、ＲＮＡ干渉による発現抑制である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１３】
前記一本鎖核酸分子の塩基配列が、配列番号５、６、１１、１２、１３、１４、１５または１６の塩基配列である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１４】
標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
請求項１から１３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする、発現抑制用組成物。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項１６】
標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導するための組成物であって、
請求項１から１３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項１７】
ＲＮＡ干渉の誘導のための組成物であって、請求項１から１３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項１８】
疾患の治療に使用するための核酸分子であって、
前記核酸分子は、請求項１から１３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子であり、
前記一本鎖核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする核酸分子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
図３に示すとおり、ｓｉＲＮＡ型（二本鎖ＲＮＡ）である参考例Ｂ１−１（ＮＩ−００８９）、参考例Ｂ１−２（ＮＩ−００８９−Ｃ１６）、参考例Ｂ１−３（ＮＩ−００８９−ＤＰＰＥ）においては、それぞれ、ルシフェラーゼ発光の抑制が見られた。なお、ネガティブコントロール配列を有するｓｉＲＮＡ型（二本鎖ＲＮＡ）である参考例Ｂ１−４（ＮＩ−００００）、参考例Ｂ１−５（ＮＩ−００００−Ｃ１６）、参考例Ｂ１−６（ＮＩ−００００−ＤＰＰＥ）においては、ルシフェラーゼ発光の抑制が見られなかった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８８】
また、図４に示すとおり、ｎｋＲＮＡ型であるＮＫ−０１３９（参考例Ｂ１−７）、ＮＫ−０１３９−Ｃ１６（実施例Ｂ１−１）およびＮＫ−０１３９−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ１−２）においては、それぞれ、ルシフェラーゼ発光の抑制が見られた。５’末端に脂質を結合した（修飾した）ＮＫ−０１３９−Ｃ１６（実施例Ｂ１−１）およびＮＫ−０１３９−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ１−２）は、それぞれ、脂質を結合していない（無修飾の）ＮＫ−０１３９（参考例Ｂ１−７）と遜色ないルシフェラーゼ活性抑制効果を示した。さらに、脂質（生体関連物質）を結合したことで、例えば、デリバリー用のキャリアを必須とすることなく、ターゲットへの優れたデリバリー能を実現できる。さらに、ＮＫ−０１３９−Ｃ１６（実施例Ｂ１−１）およびＮＫ−０１３９−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ１−２）は、ｓｉＲＮＡ型（二本鎖ＲＮＡ）である参考例Ｂ１−１〜Ｂ１−３と比較しても遜色ないルシフェラーゼ活性抑制効果を示した。さらに、ＮＫ−０１３９−Ｃ１６（実施例Ｂ１−１）およびＮＫ−０１３９−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ１−２）は、一本鎖核酸であることで、ｓｉＲＮＡ型（二本鎖ＲＮＡ）と比較して合成および取扱いが容易である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８９】
また、図５に示すとおり、ＰｎｋＲＮＡ型であるＰＫ−００７１（参考例Ｂ１−１１）、ＰＫ−００７１−Ｃ１６（実施例Ｂ１−３）およびＰＫ−００７１−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ１−４）においては、それぞれ、ルシフェラーゼ発光の抑制が見られた。５’末端に脂質を結合した（修飾した）ＰＫ−００７１−Ｃ１６（実施例Ｂ１−３）およびＰＫ−００７１−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ１−４）は、それぞれ、脂質を結合していない（無修飾の）ＰＫ−００７１（参考例Ｂ１−８）と遜色ないルシフェラーゼ活性抑制効果を示した。さらに、脂質（生体関連物質）を結合したことで、例えば、デリバリー用のキャリアを必須とすることなく、ターゲットへの優れたデリバリー能を実現できる。さらに、ＰＫ−００７１−Ｃ１６（実施例Ｂ１−３）およびＰＫ−００７１−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ１−４）は、ｓｉＲＮＡ型（二本鎖ＲＮＡ）である参考例Ｂ１−１〜Ｂ１−３と比較しても遜色ないルシフェラーゼ活性抑制効果を示した。さらに、ＰＫ−００７１−Ｃ１６（実施例Ｂ１−３）およびＰＫ−００７１−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ１−４）は、一本鎖核酸であることで、ｓｉＲＮＡ型（二本鎖ＲＮＡ）と比較して合成および取扱いが容易である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０９】
図６〜８に示すとおり、Ｇ（Ｒ）−０１０１（参考例Ｂ２−１）、Ｋ（Ｒ）−０１０１−Ｃ１６（実施例Ｂ２−１）、Ｋ（Ｒ）−０１０１−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ２−２）、Ｇ（Ｌ）−０１０２（参考例Ｂ２−２）、Ｋ（Ｌ）−０１０２−Ｃ１６（実施例Ｂ２−３）、Ｋ（Ｌ）−０１０２−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ２−４）、Ｇ（ＬＲ）−０１００（参考例Ｂ２−３）、Ｋ（ＬＲ）−０１００−Ｃ１６（実施例Ｂ２−５）、Ｋ（ＬＲ）−０１００−ＤＰＰＥ（実施例Ｂ２−６）では、それぞれ、ルシフェラーゼ発光の抑制が見られた。
【国際調査報告】
2013180038.tif 000040
2013180038.tif 000041
2013180038.tif 000042
2013180038.tif 000043
2013180038.tif 000044
2013180038.tif 000045