(57)【要約】  本発明は、ヒトＢＭＰ９（Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−９）に結合する、抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体又はその抗体断片、該抗体又は該抗体断片を産生するハイブリドーマ、該抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマ又は該形質転換体を用いる該抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とする治療薬を提供する。また本発明は、該抗体又は該抗体断片を有効成分として含有する、腎性貧血、がん性貧血などの貧血の治療に使用するための医薬組成物及びそれを用いた腎性貧血、がん性貧血などの貧血の治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｅ）から選ばれる１の抗体、もしくは該抗体と競合してヒトＢＭＰ９に結合し、かつ、ヒトＢＭＰ９への結合解離定数が１×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ以下であるモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（ａ）相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、以下ＣＤＲと記す）１〜３がそれぞれ配列番号５４〜５６で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５７〜５９で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含む抗体
（ｂ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６０〜６２で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６３〜６５で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含む抗体
（ｃ）配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域を含み、かつ配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域を含む抗体
（ｄ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域を含み、かつ配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域を含む抗体
（ｅ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域を含み、かつ配列番号１３２で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域を含む抗体
【請求項２】
前記（ａ）〜（ｅ）から選ばれる１の抗体が結合するエピトープに結合するモノクローナル抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
【請求項３】
遺伝子組換え抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
【請求項４】
ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、請求項３に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれる１のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（ａ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５４〜５６で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５７〜５９で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
（ｂ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６０〜６２で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６３〜６５で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
（ｃ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域を含み、かつ配列番号１３２で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域を含む抗体及び抗体断片
【請求項６】
配列番号６７で表されるヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列のうち、少なくとも、８７番目Ｌｙｓ、８９番目Ａｓｐ、９０番目Ｍｅｔ、及び９３番目Ｐｒｏに結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体及び該抗体断片。
【請求項７】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求項１〜６のいずれか1項に記載の抗体断片。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体又は該抗体断片を採取することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の製造方法。
【請求項１２】
ヒトＢＭＰ９に結合し、かつヒトＢＭＰ９とヒトＢＭＰＲＩＩとの結合を阻害するモノクローナル抗体又は該抗体断片を有効成分として含有する、ＢＭＰ９が関与する貧血を伴う疾患の治療剤。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いるヒトＢＭＰ９の免疫学的検出又は測定方法。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片と薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を投与することを含む、ヒトＢＭＰ９が関与する貧血の治療方法。
【請求項１６】
ヒトＢＭＰ９に結合し、かつヒトＢＭＰ９とヒトＢＭＰＲＩＩとの結合を阻害するモノクローナル抗体又は該抗体断片を投与することを含む、ＢＭＰ９が関与する貧血の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＢＭＰ９（Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−９）に結合する、抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体又はその抗体断片、該抗体又は該抗体断片を産生するハイブリドーマ、該抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマ又は該形質転換体を用いる該抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とする治療薬に関する。【０００２】
また本発明は、該抗体又は該抗体断片を有効成分として含有する、腎性貧血、がん性貧血などの貧血の治療に使用するための医薬組成物及びそれを用いた腎性貧血、がん性貧血などの貧血の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＢＭＰ９は、Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９の略で、別名ＧＤＦ２とも呼ばれる。ＢＭＰ９は約２０種類からなるＢＭＰ（骨形成タンパク質）ファミリー分子に属し、ヒトＢＭＰ９は４２９アミノ酸からなる分泌タンパク質である（非特許文献１）。【０００４】
ＢＭＰ９は、胎児期では脊髄または体節間膜で、成体期では肝臓で主に発現し（非特許文献２、３、４）、ヒトＢＭＰ９は血液中に２−１２ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する血中循環因子であることが知られている（非特許文献５）。【０００５】
生体内におけるＢＭＰ９の役割について、これまでＢＭＰ９欠損マウスまたは動物への抗ＢＭＰ９抗体投与に基づく報告は行われたことがないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの知見に基づく報告はいくつか行われている。例えば、肥大軟骨細胞の形成または間葉細胞から軟骨への分化に対する促進作用の発現（非特許文献６、７、８）、または血液前駆細胞の産生若しくはコロニー形成に対する促進作用の発現（非特許文献９）である。しかしながら、これらの報告から、抗ＢＭＰ９抗体が生体内における赤血球造血作用を有することを予想することは極めて困難であった。【０００６】
また、抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体として、Ｒ＆Ｄシステムズ社よりＢＭＰ９に対する中和活性を有するモノクローナル抗体（クローンＮｏ．３６０１０７）が市販されているが、その他の抗体は知られていなかった。【０００７】
貧血とは“単位容積血液中の赤血球数、ヘモグロビン濃度及びヘマトクリット値が正常より低下した状態”を指す（非特許文献１０）。赤血球産生調節には種々な因子が働くが、最も重要かつ特異的な因子はエリスロポエチン（以下、ＥＰＯと表記する）である。【０００８】
ＥＰＯは後期赤芽球コロニー形成細胞（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ：ＣＦＵ−Ｅ）の増殖・分化を促進し、結果的に生体内の赤血球を増加させる（非特許文献１０）。ＥＰＯは１６５アミノ酸からなる分子量３０ｋＤａの糖タンパク質ホルモンであり、主に腎臓から産生される（非特許文献１０）。【０００９】
腎疾患に伴う貧血（腎性貧血）は、ＥＰＯの産生組織である腎臓が障害を受けることによりＥＰＯの産生が低下し、赤血球数が低下する、慢性腎疾患（ＣＫＤ）患者に最も頻度の多い合併症である（非特許文献１１）。腎性貧血は、ＱＯＬに影響を与えるだけでなく、心血管病変の発症・進展・腎機能障害の進行にも影響を与えることが知られている（非特許文献１１、１２）。【００１０】
腎性貧血治療薬である遺伝子組換えヒトエリスロポエチンと、最近発売された血中半減期が長い持続型の第二世代ＥＰＯ製剤は、広くＥＳＡ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）と称される（非特許文献１３）。【００１１】
ＥＳＡは強力な赤血球造血作用を有するが、腎不全透析患者の１５−２０％にはＥＳＡを投与しても貧血改善効果が乏しい症例が存在する（これをＥＳＡ抵抗性貧血もしくはＥＳＡ低反応性貧血と呼ぶ）（非特許文献１３）。【００１２】
このようなＥＳＡ抵抗性を呈する患者へのＥＳＡの過剰投与は、生命予後の悪化を引き起こすことが大規模介入臨床試験（ＣＲＥＡＴＥ試験及びＣＨＯＩＲ試験）の結果より示されている（非特許文献１１、１２、１３）。このような背景から、ＥＳＡ抵抗性の克服は腎性貧血治療の大きな課題となっており、ＥＰＯとは異なる機序を有する新たな赤血球造血薬の開発が強く望まれている。【００１３】
一方、悪性腫瘍に伴う貧血（がん性貧血）は、種々のがんで認められる症状であり、その原因としては、失血を含む病状の進行に伴うものと、化学療法または放射線療法などに関連したものとの２つがある（非特許文献１４）。【００１４】
がん性貧血に対してもＥＳＡは有効であることが示されているが、ＥＳＡ投与によるがん増殖促進の可能性または血栓梗塞症の増加の懸念も指摘されており（非特許文献１４）、がん性貧血に対してもＥＰＯとは異なる機序を有する新たな赤血球造血薬の開発が望まれている。【００１５】
上述のように、腎性貧血、及びがん性貧血では、ＥＰＯとは異なる機序を有する赤血球造血薬が求められている。当然ながら、薬剤には薬効の強さも必要となる。具体的には、日本のＥＳＡの投与開始基準は、透析患者では、ヘモグロビン濃度が１０ｇ／ｄＬ未満とされ、薬剤にはヘモグロビン濃度を１０−１１ｇ／ｄＬの間にコントロールできる薬効が求められる。一方、保存期慢性腎臓病患者では、１１ｇ／ｄＬ未満となった時点とされ、ヘモグロビン濃度を１１−１３ｇ／ｄＬの間にコントロールできる薬効が求められる（非特許文献１５）。【００１６】
すなわち、新しい赤血球造血薬には、ＥＰＯ非依存性のほか、ヘモグロビン濃度を少なくとも１−２ｇ／ｄＬ上昇させられる程度の薬効という２つの特徴が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０，２６，２５１１１（２００５）
【非特許文献２】Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１，２９４（２００３）
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，２４，１７９３７（２０００）
【非特許文献４】Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｐａｒｉｓ，９６，５３（２００２）
【非特許文献５】Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，１０２，８，９１４（２００８）
【非特許文献６】Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１１，１７，１３１２（２００４）
【非特許文献７】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４，１，６４９（２００９）
【非特許文献８】Ｊ．Ｂｏｎｅｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，２６，６，１１６６（２０１１）
【非特許文献９】Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，２１，２，７１（２００３）
【非特許文献１０】標準血液病学（医学書院）（２０００）
【非特許文献１１】血液フロンティア，１８，２，１７（２００８）
【非特許文献１２】腎と透析，７１，２，２４７（２０１１）
【非特許文献１３】臨床透析，２６、２，５９（２０１０）
【非特許文献１４】臨床透析，２６，２，２７６（２０１０）
【非特許文献１５】日本透析医学会雑誌，４１，１０，６６１（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明が解決する課題は、抗ＢＭＰ９抗体を有効成分とする、治療剤を提供することにより、腎性貧血、がん性貧血などの貧血を改善することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、抗ＢＭＰ９抗体の生体内における作用を明らかにする目的で、ＢＭＰ９欠損マウスを用いて抗ＢＭＰ９抗体の取得を試みたところ、既存抗体に比して、著しくＢＭＰ９に対する結合性が向上した抗ＢＭＰ９抗体の取得に成功した。【００２０】
更に取得した抗体を用いて、抗ＢＭＰ９抗体の生体内における作用について鋭意検討した結果、驚くべきことに、それらの抗ＢＭＰ９抗体には、赤血球造血作用があること、更にその赤血球造血作用は、既存抗体の作用強度より優れていること、それらの抗体はヒトＢＭＰ９とヒトＢＭＰＲＩＩの結合を阻害することを見出した。【００２１】
またその作用機序解析から、取得抗体の赤血球造血作用は、血中ＥＰＯ濃度の上昇を介したものではないこと、すなわちＥＰＯとは異なった機序によるものであることを明らかにした。更に腎性貧血モデルである５／６腎摘ラットを用いた解析から、抗ＢＭＰ９抗体に、腎性貧血に対する改善作用があることも明らかにした。【００２２】
本発明者らはこれらの知見に基づき、抗ＢＭＰ９抗体を有効成分とする、腎性貧血、がん性貧血などの貧血に対する治療剤を提供できると考え、本発明を完成させるに至った。【００２３】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１６）に関する。
（１）以下の（ａ）〜（ｅ）から選ばれる１の抗体、もしくは該抗体と競合してヒトＢＭＰ９に結合し、かつ、ヒトＢＭＰ９への結合解離定数が１×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ以下であるモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（ａ）相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、以下ＣＤＲと記す）１〜３がそれぞれ配列番号５４〜５６で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５７〜５９で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含む抗体
（ｂ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６０〜６２で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６３〜６５で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含む抗体
（ｃ）配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域を含み、かつ配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域を含む抗体
（ｄ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域を含み、かつ配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域を含む抗体
（ｅ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域を含み、かつ配列番号１３２で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域を含む抗体
（２）前記（ａ）〜（ｅ）から選ばれる１の抗体が結合するエピトープに結合するモノクローナル抗体である、（１）に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（３）遺伝子組換え抗体である、（１）に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（４）ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、（３）に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（５）以下の（ａ）〜（ｃ）から選ばれる１のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（ａ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５４〜５６で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５７〜５９で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
（ｂ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６０〜６２で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６３〜６５で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
（ｃ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域を含み、かつ配列番号１３２で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域を含む抗体及び抗体断片
（６）配列番号６７で表されるヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列のうち、少なくとも、８７番目Ｌｙｓ、８９番目Ａｓｐ、９０番目Ｍｅｔ、及び９３番目Ｐｒｏに結合する、（１）〜（５）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体及び該抗体断片。
（７）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（１）〜（６）のいずれか１に記載の抗体断片。
（８）（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ。
（９）（８）に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（１０）（９）に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（１１）（１０）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体又は該抗体断片を採取することを特徴とする（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の製造方法。
（１２）ヒトＢＭＰ９に結合し、かつヒトＢＭＰ９とヒトＢＭＰＲＩＩとの結合を阻害するモノクローナル抗体又は該抗体断片を有効成分として含有する、ＢＭＰ９が関与する貧血を伴う疾患の治療剤。
（１３）（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いるヒトＢＭＰ９の免疫学的検出又は測定方法。
（１４）（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片と薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物。
（１５）（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を投与することを含む、ヒトＢＭＰ９が関与する貧血の治療方法。
（１６）ヒトＢＭＰ９に結合し、かつヒトＢＭＰ９とヒトＢＭＰＲＩＩとの結合を阻害するモノクローナル抗体又は該抗体断片を投与することを含む、ＢＭＰ９が関与する貧血の治療方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の抗体は、既存抗体に比して、著しくＢＭＰ９に対する結合性が向上した抗ＢＭＰ９抗体であり、既存抗体の作用強度より優れた赤血球造血作用を有し、ヒトＢＭＰ９とヒトＢＭＰＲＩＩの結合を阻害する。また、本発明の抗体の赤血球造血作用は、血中ＥＰＯ濃度の上昇を介したものではない。更に、本発明の抗体は、腎性貧血に対する改善作用を有する。このような特性を有する本発明の抗体を有効成分とすることにより、腎性貧血、がん性貧血などの貧血に対する治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、マウスＢＭＰ９  遺伝子ノックアウト用ベクターの構造を示す図である。マウス５’ゲノムは、ＢＭＰ９遺伝子ノックアウトベクター  ５’相同領域を、Ｎｅｏｒはネオマイシン耐性遺伝子を、マウス３’ゲノムはＢＭＰ９遺伝子ノックアウトベクター３’相同領域を、ＤＴ−ＡはジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子を、Ｔ３はＴ３プロモーターを、Ｔ７はＴ７プロモーターを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔはクローニングベクターをそれぞれ表す。
【図２】図２は、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体のヒトＢＭＰ９への結合特異性を酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した図である。縦軸は吸光度（４５０−５７０ｎｍ）を示す。固相化した抗原がヒトＢＭＰ９の場合を黒、ヒトＢＭＰ１０の場合を白で示す。
【図３】図３は、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体のヒトＢＭＰ９への結合性をＥＬＩＳＡによって測定した図である。横軸に抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、縦軸に各抗体濃度における吸光度（４５０−５７０ｎｍ）を示す。それぞれ、６Ｄ１０−１−１抗体は△、１０Ｄ５−２−３抗体は□、３Ｂ７−３−３抗体は■、Ｒ＆Ｄ抗体は●で示す。
【図４】図４は、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体のヒトＢＭＰ９と標識Ｒ＆Ｄ抗体の結合に対する阻害作用を示す図である。横軸に標識をしていない抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、縦軸に阻害活性（％）を示す。それぞれ、６Ｄ１０−１−１抗体は△、１０Ｄ５−２−３抗体は□、３Ｂ７−３−３抗体は■、Ｒ＆Ｄ抗体は●で示す。
【図５】図５は、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体のヒトＢＭＰ９とＢＭＰＲＩＩの結合に対する阻害作用を示す図である。縦軸は阻害活性（％）を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体の短期投与（２週間）による、マウス赤血球造血に対する作用を示す図である。図６Ａのグラフは赤血球数の変化を示す。グラフの横軸は抗体投与量（ｍｇ／ｋｇ）を、縦軸は赤血球数（×１０４／μＬ）を示す。６Ｄ１０−１−１抗体は△、１０Ｄ５−２−３抗体は□、Ｒ＆Ｄ抗体は●で示す。図内の０ｍｇ／ｋｇの値は媒体投与群のものを、エラーバーは標準誤差（ＳＥ、ｎ＝６）を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体の短期投与（２週間）による、マウス赤血球造血に対する作用を示す図である。図６Ｂのグラフはヘモグロビン濃度の変化を示す。グラフの横軸は抗体投与量（ｍｇ／ｋｇ）を、縦軸はヘモグロビン濃度（ｇ／ｄＬ）を示す。６Ｄ１０−１−１抗体は△、１０Ｄ５−２−３抗体は□、Ｒ＆Ｄ抗体は●で示す。図内の０ｍｇ／ｋｇの値は媒体投与群のものを、エラーバーは標準誤差（ＳＥ、ｎ＝６）を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体の長期投与（２ヶ月間）による、マウス赤血球造血に対する作用を示す図である。図７Ａのグラフは赤血球数の変化を示す。グラフの縦軸は赤血球数（×１０４／μＬ）を示す。図内のエラーバーは標準誤差（ＳＥ、ｎ＝８）を示す。媒体投与群に対する各種抗体投与群の測定値の統計学的有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて解析し、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体の長期投与（２ヶ月間）による、マウス赤血球造血に対する作用を示す図である。図７Ｂのグラフはヘモグロビン濃度の変化を示す。グラフの縦軸はヘモグロビン濃度（ｇ／ｄＬ）を示す。図内のエラーバーは標準誤差（ＳＥ、ｎ＝８）を示す。媒体投与群に対する各種抗体投与群の測定値の統計学的有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて解析し、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１を示す。
【図８】図８は、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体の長期投与による、血中マウスエリスロポエチン（ＥＰＯ）濃度に対する影響を示す図である。縦軸はマウスＥＰＯ濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。図内のエラーバーは標準誤差（ＳＥ、ｎ＝８）を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体の短期投与（２週間）による、ラット赤血球造血に対する作用を示す図である。図９Ａのグラフは赤血球数の変化を示す。グラフの縦軸は赤血球数（×１０４／μＬ）を示す。図内のエラーバーは標準誤差（ＳＥ、ｎ＝６）を示す。媒体投与群に対する各種抗体投与群の測定値の統計学的有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて解析し、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体の短期投与（２週間）による、ラット赤血球造血に対する作用を示す図である。図９Ｂのグラフはヘモグロビン濃度の変化を示す。グラフの縦軸はヘモグロビン濃度（ｇ／ｄＬ）を示す。図内のエラーバーは標準誤差（ＳＥ、ｎ＝６）を示す。媒体投与群に対する各種抗体投与群の測定値の統計学的有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて解析し、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体の投与による、腎性貧血ラットモデルに対する作用を示す図である。図１０Ａのグラフは赤血球数の変化を示す。グラフの横軸は抗体投与後の経過時間（週）を示し、グラフの縦軸は赤血球数（×１０４／μＬ）を示す。偽手術個体への媒体投与群は○、５／６腎摘手術個体への媒体投与群は●、５／６腎摘手術個体への６Ｄ１０−１−１抗体投与群は△、５／６腎摘手術個体への１０Ｄ５−２−３抗体投与群は□でそれぞれ示す。図内０ｍｇ／ｋｇの値は媒体群のものを、エラーバーは標準偏差（ＳＥ、媒体投与群ｎ＝５、それ以外の群ｎ＝８）を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体の投与による、腎性貧血ラットモデルに対する作用を示す図である。図１０Ｂのグラフはヘモグロビン濃度の変化を示す。グラフの横軸は抗体投与後の経過時間（週）を示し、グラフの縦軸はヘモグロビン濃度（ｇ／ｄＬ）を示す。偽手術個体への媒体投与群は○、５／６腎摘手術個体への媒体投与群は●、５／６腎摘手術個体への６Ｄ１０−１−１抗体投与群は△、５／６腎摘手術個体への１０Ｄ５−２−３抗体投与群は□でそれぞれ示す。図内０ｍｇ／ｋｇの値は媒体群のものを、エラーバーは標準偏差（ＳＥ、媒体投与群ｎ＝５、それ以外の群ｎ＝８）を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体とヒトＢＭＰ９との複合体のヒトＢＭＰ１０依存性ヒトＡＬＫ１由来シグナルに対する作用を示す図である。図１１Ａのグラフは６Ｄ１０−１−１抗体とヒトＢＭＰ９との複合体の結果を示す。グラフの横軸はヒトＢＭＰ１０の添加濃度を示し、縦軸は相対的なルシフェラーゼ発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｕｎｉｔ）を示す。抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体（３μｇ／ｍＬ）単独添加群を■、抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体（３μｇ／ｍＬ）と２ｎｇ／ｍＬ  ヒトＢＭＰ９との複合体添加群を△、抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体（３μｇ／ｍＬ）と１０ｎｇ／ｍＬ  ヒトＢＭＰ９との複合体添加群を○で示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体とヒトＢＭＰ９との複合体のヒトＢＭＰ１０依存性ヒトＡＬＫ１由来シグナルに対する作用を示す図である。図１１Ｂのグラフは１０Ｄ５−２−３抗体とヒトＢＭＰ９との複合体の結果を示す。グラフの横軸はヒトＢＭＰ１０の添加濃度を示し、縦軸は相対的なルシフェラーゼ発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｕｎｉｔ）を示す。抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体（３μｇ／ｍＬ）単独添加群を■、抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体（３μｇ／ｍＬ）と２ｎｇ／ｍＬ  ヒトＢＭＰ９との複合体添加群を△、抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体（３μｇ／ｍＬ）と１０ｎｇ／ｍＬ  ヒトＢＭＰ９との複合体添加群を○で示す。
【図１２】図１２は作製した１０Ｄ５−２−３抗体ヒト化抗体の重鎖可変領域を示す。
【図１３】図１３は作製した１０Ｄ５−２−３抗体ヒト化抗体の軽鎖可変領域を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合するモノクローナル抗体に関する。
【００２７】
本発明において、抗体と競合してヒトＢＭＰ９に結合する抗体とは、ヒトＢＭＰ９に本発明のモノクローナル抗体と同一又は部分的に同一のエピトープ（抗原決定基ともいう）を有し、該エピトープに結合する抗体をいう。
【００２８】
本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体とは、本発明のモノクローナル抗体が認識するヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列と同じ配列を認識し結合する抗体をいう。
【００２９】
ヒトＢＭＰ９は、配列番号６６で表されるアミノ酸配列を持つ、一本鎖の前駆体タンパク質（Ｐｒｅ−Ｐｒｏ体）として合成される。この一本鎖のＰｒｅ−Ｐｒｏ体は、配列番号６６で表されるアミノ酸配列のうち、ゴルジ体にて、１から２２番目までのシグナルペプチド領域が切断された後、３９２番目に存在するシステイン残基間によるジスルフィド結合を介し、２量体（Ｐｒｏ２量体）を形成する。
【００３０】
その後、ｆｕｒｉｎ様プロテアーゼにより、配列番号６６で表されるアミノ酸配列の３１９番目と３２０番目のアミノ酸残基間で切断がおこり、ジスルフィド結合を持たないＮ末側断片のプロペプチド領域（配列番号６６で表されるアミノ酸配列のうち、２３番目のアミノ酸から３１９番目のアミノ酸までを含むペプチド）と配列番号６７で表されるアミノ酸配列からなるＣ末側断片（ｍａｔｕｒｅ領域）に分割される。
【００３１】
前記ｍａｔｕｒｅ領域は、プロペプチド領域の切断後も、配列番号６７の７３番目に残るシステイン残基間によるジスルフィド結合を介し、２量体を形成する（以下、ｍａｔｕｒｅ２量体と表記する）。切断されたＮ末側のプロペプチド領域の２分子は、このｍａｔｕｒｅ２量体１分子と非共有結合を介し複合体を形成し、その複合体の形で細胞から分泌される［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０（２６），２５１１１（２００５）］。ｍａｔｕｒｅ２量体及びｍａｔｕｒｅ２量体にＮ末プロペプチド領域が結合した複合体のいずれも、ＢＭＰ９の機能を有している。
【００３２】
従って、本発明におけるヒトＢＭＰ９としては、配列番号６６又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８で示されるアミノ酸配列のうち、ｍａｔｕｒｅ領域に相当する３２０番目から４２９番目までのアミノ酸配列（配列番号６７）を含み、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチド、ｍａｔｕｒｅ領域に相当する３２０番目から４２９番目までのアミノ酸配列（配列番号６７）において、１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチド、及び配列番号６７で示されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチド、ならびに上述のｍａｔｕｒｅ２量体、及びｍａｔｕｒｅ２量体にＮ末プロペプチド領域が結合した複合体も包含される。
【００３３】
前述のＢＭＰ９の機能としては、ＢＭＰ９の細胞内のシグナル伝達への関与をいう。細胞内のシグナル伝達では、ＢＭＰ９がＴＧＦβスーパーファミリーに属するタイプＩ及びタイプＩＩの２つの受容体に結合することにより、当該受容体が活性化され、Ｓｍａｄ１／５／８がリン酸化され、さらにリン酸化により活性化されたＳｍａｄ１／５／８が、Ｓｍａｄ４と複合体を形成後、核内に移行し、転写因子として機能する。
【００３４】
タイプＩ受容体としては、ＡＬＫ１及びＡＬＫ２が挙げられる。また、タイプＩＩ受容体としてはＢＭＰタイプＩＩ受容体（ＢＭＰＲＩＩ）、ａｃｔｉｖｉｎタイプＩＩａ受容体（ＡｃｔＲＩＩａ）、及びａｃｔｉｖｉｎタイプＩＩｂ受容体（ＡｃｔＲＩＩｂ）が挙げられる。
【００３５】
配列番号６７で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得る方法としては、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ、３４、３１５（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４８８（１９８５）］などを用いて、例えば、配列番号６７で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子に部位特異的変異を導入する方法が挙げられる。
【００３６】
欠失、置換又は付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個〜数十個、例えば、１〜２０個、より好ましくは１個〜数個、例えば、１〜５個のアミノ酸である。
【００３７】
ヒトＢＭＰ９をコードする遺伝子としては、配列番号６８又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６２０４で示される塩基配列が挙げられる。そのうち、ｍａｔｕｒｅ領域に相当する配列番号６９で示される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、配列番号６９で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、ならびに配列番号６９で示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子なども、本発明のヒトＢＭＰ９をコードする遺伝子に包含される。
【００３８】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号６９で示される塩基配列を有するＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、又はＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味する。
【００３９】
具体的には、ハイブリダイズしたコロニーもしくはプラーク由来のＤＮＡ、又は該配列を有するＰＣＲ産物又はオリゴＤＮＡを固定化したフィルター又はスライドガラスを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、（１９９５）］を行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルター又はスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
【００４０】
前記ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号６９で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
【００４１】
真核生物の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明のＢＭＰ９をコードする遺伝子に包含される。
【００４２】
本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３（１９９０）］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５、３３８９（１９９７）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、７、６４９（１９９７）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌ］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
【００４３】
デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、−Ｅ（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、−ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈ）が−３、−ｒ（ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍａｔｃｈ）が１、−ｅ（ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）が１０、−Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、−ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒｂｌａｓｔ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ  ｉｎｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、−Ｘ（Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂｉｔｓ）が１５及びＺ（ｆｉｎａｌ  Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍｌ／ｂｌａｓｔｃｇｉｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）。
【００４４】
配列番号６６又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができ、例えば、配列番号６６で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。
【００４５】
また、上記の方法で作製されるポリペプチド又はＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号６６又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。
【００４６】
さらに、配列番号６６又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド、又は配列番号６６又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。
【００４７】
本発明のモノクローナル抗体（以下、本発明の抗体ともいう。）は、ヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列、又はその立体構造を認識し、かつ結合する抗体又はその抗体断片、もしくはヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列、又はその立体構造に結合し、ＢＭＰ９とＢＭＰＲＩＩとの結合を阻害し、ＢＭＰ９とＡＬＫ１との結合を阻害しない性質を有している。本発明のモノクローナル抗体としては、ヒトＢＭＰ９に結合し、さらに、ヒトＢＭＰ９への結合解離定数が１×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ以下であるモノクローナル抗体又は該抗体断片が挙げられる。
【００４８】
本発明の抗体としては、具体的には、配列番号６７で表されるヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列のうち、少なくとも、８４番目Ｖａｌ、９５番目Ｌｅｕ、９７番目Ｔｙｒ、及び９８番目Ｈｉｓに結合する抗体、又は、少なくとも、８７番目Ｌｙｓ、８９番目Ａｓｐ、９０番目Ｍｅｔ、及び９３番目Ｐｒｏに結合する抗体が挙げられる。より好ましくは、８７番目Ｌｙｓ、８９番目Ａｓｐ、９０番目Ｍｅｔ、及び９３番目Ｐｒｏに結合する抗体が挙げられる。
【００４９】
本発明におけるヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号６７で表されるヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列を２つ含み、７３番目のシステイン残基間がジスルフィド結合を形成しているものが挙げられる。
【００５０】
本発明におけるヒトＢＭＰ９の立体構造としては、配列番号６６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８又は配列番号６７で示されるアミノ酸配列を含むヒトＢＭＰ９が天然状態でとりうる構造と同等の構造を有していればいずれの構造でもよい。ヒトＢＭＰ９が天然状態でとりうる立体構造とは、ヒトＢＭＰ９の天然型の立体構造のことをいう。
【００５１】
本発明におけるＢＭＰＲＩＩとしては、配列番号７０又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１９５で示されるアミノ酸配列のうち、細胞外領域に相当する２７番目から１５０番目までのアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
【００５２】
本発明におけるＡＬＫ１としては、配列番号７１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ４２６３７で示されるアミノ酸配列のうち、細胞外領域に相当する２２番目から１１８番目までのアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
【００５３】
本発明の抗体の結合解離定数（Ｋｄ値）は、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて測定したセンサーグラムから、シングルサイクルカイネティクス算出法（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒ．３、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により解析することで、算出することができる。
【００５４】
前記抗体として、具体的には、以下の（ｉ）〜（ｉｉ）のモノクローナル抗体及びその抗体断片が挙げられる。
（ｉ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５４〜５６で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と記す）を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５７〜５９で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖（以下、Ｌ鎖と記す）を含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
（ｉｉ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６０〜６２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６３〜６５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
【００５５】
また、本発明のモノクローナル抗体としてより具体的には、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のモノクローナル抗体及びその抗体断片が挙げられる。
（ａ）配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨと記す）を含み、かつ配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（以下、ＶＬと記す）を含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
（ｂ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
（ｃ）配列番号１２８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号１３２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含む抗体及びその抗体断片
さらに、本発明のモノクローナル抗体としては、前記モノクローナル抗体が結合するヒトＢＭＰ９に存在するエピトープと、同じエピトープに結合するモノクローナル抗体及びその抗体断片を挙げることができる。
【００５６】
本発明の抗体又はその抗体断片が、ヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列、又はその立体構造に結合することは、固相抗原を用いた酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）など、ヒトＢＭＰ９またはヒトＢＭＰ９を発現した組織に対する公知の免疫学的検出法、特定の抗原と特定抗原に対する抗体の結合性を調べることができる方法などにより確認することができる。
【００５７】
例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）などを用いた表面プラズモン共鳴、ＩＴＣ（ＤＫＳＨ社製）などを用いた等温滴定カロリメトリーなどの方法が挙げられる。
【００５８】
抗原に対する抗体の結合解離定数（Ｋｄ値）は、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、等温滴定カロリメトリー、いずれの方法からも、スキャッチャード・プロット、または各装置の添付文書に従った解析を行うことで、求めることができる。
【００５９】
また、公知の免疫学的検出法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを組み合わせて確認することもできる。
【００６０】
ヒトＢＭＰ９を発現した組織としては、該ＢＭＰ９を発現していればいずれの組織でもよく、例えば血液、肝臓などが挙げられる。
【００６１】
本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、又は抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。
【００６２】
モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（１次構造）が均一であることが特徴である。
【００６３】
エピトープとしては、例えば、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、糖鎖が結合したアミノ酸配列及び糖鎖が結合したアミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。
【００６４】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列に結合することが好ましい。
【００６５】
本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープは、ヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列に含まれることが好ましい。
【００６６】
ハイブリドーマは、例えば、上記のヒトＢＭＰ９を抗原として調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性を有する抗体生産細胞を誘導し、さらに、該抗体生産細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより、調製することができる。該ハイブリドーマを培養するか、又は該ハイブリドーマ細胞を動物に投与して該動物を腹水がん化させ、該培養液又は腹水を分離、精製することにより抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体を取得することができる。
【００６７】
抗原を免疫する動物としては、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができるが、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、ニワトリ又はラビットなどが用いられる。また、このような動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫を施した後に、骨髄腫細胞と融合して作製したハイブリドーマが生産する抗体なども本発明の抗体に包含される。
【００６８】
本発明における遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、ヒト抗体又は抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。遺伝子組換え抗体は、例えば上記本発明のモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を用いて改変したものが挙げられる。
【００６９】
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬとヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨと記す）及び軽鎖定常領域（以下、ＣＬと記す）からなる抗体をいう。本発明のヒト型キメラ抗体は、前記のハイブリドーマより、ＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００７０】
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものが用いられ、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３又はｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラス又はλクラスのものを用いることができる。
【００７１】
本発明のヒト型キメラ抗体として具体的には、配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むキメラ抗体が挙げられる。また、配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むキメラ抗体が挙げられる。
【００７２】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト化抗体という場合もあり、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒトＢＭＰ９を特異的に認識し、かつヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列、又はその立体構造に結合するヒト以外の動物のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから産生されるヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を任意のヒト抗体のＶＨ及びＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）に移植した可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００７３】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものが用いられ、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３又はｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラス又はλクラスのものを用いることができる。
【００７４】
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体として具体的には、ＣＤＲ１〜３が配列番号５４〜５６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつＣＤＲ１〜３が配列番号５７〜５９で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むヒト化抗体が挙げられる。また、ＣＤＲ１〜３が配列番号６０〜６２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつＣＤＲ１〜３が配列番号６３〜６５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むヒト化抗体が挙げられる。
【００７５】
本発明のヒト化抗体として、具体的には、以下の（ａ）ＶＨ及び（ｂ）ＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体が挙げられる。
（ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列、又は配列番号１１６のアミノ酸配列の８番目のＧｌｙ、１８番目のＬｅｕ、４９番目のＧｌｙ、７９番目のＡｓｎ、８１番目のＬｅｕ、９４番目のＡｌａ、９５番目のＶａｌ、９９番目のＡｌａ、及び１００番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＨ
（ｂ）配列番号１１８のアミノ酸配列、又は配列番号１１８アミノ酸配列中の４番目のＭｅｔ、４０番目のＴｙｒ、８１番目のＳｅｒ、８２番目のＬｅｕ、８９番目のＶａｌ、及び９１番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＬ
【００７６】
更に、本発明のヒト化抗体に含まれるＶＨとしては、以下の（１）〜（６）が好ましい。
（１）配列番号１１６のアミノ酸配列中の８番目のＧｌｙ、１８番目のＬｅｕ、４９番目のＧｌｙ、７９番目のＡｓｎ、８１番目のＬｅｕ、９４番目のＡｌａ、９５番目のＶａｌ、９９番目のＡｌａ、及び１００番目のＡｒｇが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（２）配列番号１１６のアミノ酸配列中の８番目のＧｌｙ、１８番目のＬｅｕ、４９番目のＧｌｙ、８１番目のＬｅｕ、９４番目のＡｌａ、９９番目のＡｌａ、及び１００番目のＡｒｇが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（３）配列番号１１６のアミノ酸配列中の８番目のＧｌｙ、１８番目のＬｅｕ、４９番目のＧｌｙ、７９番目のＡｓｎ、９４番目のＡｌａ、９９番目のＡｌａ、及び１００番目のＡｒｇが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（４）配列番号１１６のアミノ酸配列中の４９番目のＧｌｙ、９５番目のＶａｌ、９９番目のＡｌａ、及び１００番目のＡｒｇが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（５）配列番号１１６のアミノ酸配列中の８番目のＧｌｙ、１８番目のＬｅｕ、７９番目のＡｓｎ、及び１００番目のＡｒｇが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（６）配列番号１１６のアミノ酸配列中の４９番目のＧｌｙ、９９番目のＡｌａ、及び１００番目のＡｒｇが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
【００７７】
前記ＶＨのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、７９番目のＡｓｎをＳｅｒに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９５番目のＶａｌをＩｌｅに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、又は１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。
【００７８】
９個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、７９番目のＡｓｎをＳｅｒに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９５番目のＶａｌをＩｌｅに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列が挙げられる。
【００７９】
８個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（９）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、７９番目のＡｓｎをＳｅｒに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９５番目のＶａｌをＩｌｅに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、７９番目のＡｓｎをＳｅｒに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９５番目のＶａｌをＩｌｅに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、７９番目のＡｓｎをＳｅｒに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９５番目のＶａｌをＩｌｅに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９５番目のＶａｌをＩｌｅに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、７９番目のＡｓｎをＳｅｒに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９５番目のＶａｌをＩｌｅに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、７９番目のＡｓｎをＳｅｒに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９５番目のＶａｌをＩｌｅに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号１１６アミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、７９番目のＡｓｎをＳｅｒに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号１１６アミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、７９番目のＡｓｎをＳｅｒに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９５番目のＶａｌをＩｌｅに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、７９番目のＡｓｎをＳｅｒに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９５番目のＶａｌをＩｌｅに、及び９９番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
【００８０】
７個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（８）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、７９番目のＡｓｎをＳｅｒに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、７９番目のＡｓｎをＳｅｒに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９５番目のＶａｌをＩｌｅに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、７９番目のＡｓｎをＳｅｒに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９５番目のＶａｌをＩｌｅに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、７９番目のＡｓｎをＳｅｒに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９５番目のＶａｌをＩｌｅに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
【００８１】
６個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（７）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、及び９９番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
【００８２】
５個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（６）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
【００８３】
４個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（７）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、７９番目のＡｓｎをＳｅｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、９５番目のＶａｌをＩｌｅに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、及び９９番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
【００８４】
３個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（６）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
【００８５】
２個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１２）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、及び４９番目のＧｌｙをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、及び４９番目のＧｌｙをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、及び８１番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、及び９４番目のＡｌａをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、及び９９番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、及び１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
【００８６】
１個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（９）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、４９番目のＧｌｙをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、７９番目のＡｓｎをＳｅｒに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８１番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、９４番目のＡｌａをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、９５番目のＶａｌをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、９９番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号１１６のアミノ酸配列中の、１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
【００８７】
また、本発明のヒト化抗体に含まれるＶＬとしては、以下の（１）〜（４）が好ましい。
（１）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４番目のＭｅｔ、４０番目のＴｙｒ、８１番目のＳｅｒ、８２番目のＬｅｕ、８９番目のＶａｌ、及び９１番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＬ
（２）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４番目のＭｅｔ、８１番目のＳｅｒ、８２番目のＬｅｕ、及び８９番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＬ
（３）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４０番目のＴｙｒ、８１番目のＳｅｒ、及び９１番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＬ
（４）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４０番目のＴｙｒ、及び９１番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＬ
【００８８】
前記ＶＬのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１１８のアミノ酸配列中の４番目のＭｅｔをＬｅｕに、４０番目のＴｙｒをＰｈｅに、８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、８９番目のＶａｌをＭｅｔに、又は９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。
【００８９】
６個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、配列番号１１８のアミノ酸配列中の４番目のＭｅｔをＬｅｕに、４０番目のＴｙｒをＰｈｅに、８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、８９番目のＶａｌをＭｅｔに、及び９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列が挙げられる。
【００９０】
５個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（６）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４０番目のＴｙｒをＰｈｅに、８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、８９番目のＶａｌをＭｅｔに、及び９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４番目のＭｅｔをＬｅｕに、８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、８９番目のＶａｌをＭｅｔに、及び９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４番目のＭｅｔをＬｅｕに、４０番目のＴｙｒをＰｈｅに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、８９番目のＶａｌをＭｅｔに、及び９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４番目のＭｅｔをＬｅｕに、４０番目のＴｙｒをＰｈｅに、８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、８９番目のＶａｌをＭｅｔに、及び９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４番目のＭｅｔをＬｅｕに、４０番目のＴｙｒをＰｈｅに、８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、及び９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４番目のＭｅｔをＬｅｕに、４０番目のＴｙｒをＰｈｅに、８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、及び８９番目のＶａｌをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
【００９１】
４個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（６）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４番目のＭｅｔをＬｅｕに、８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、及び８９番目のＶａｌをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１１８のアミノ酸配列中の８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、８９番目のＶａｌをＭｅｔに、及び９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４０番目のＴｙｒをＰｈｅに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、８９番目のＶａｌをＭｅｔに、及び９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４０番目のＴｙｒをＰｈｅに、８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、８９番目のＶａｌをＭｅｔに、及び９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４０番目のＴｙｒをＰｈｅに、８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、及び８９番目のＶａｌをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４番目のＭｅｔをＬｅｕに、８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、及び８９番目のＶａｌをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
【００９２】
３個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（６）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４０番目のＴｙｒをＰｈｅに、８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、及び９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４０番目のＴｙｒをＰｈｅに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、及び８９番目のＶａｌをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４０番目のＴｙｒをＰｈｅに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、及び９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１１８のアミノ酸配列中の８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、８９番目のＶａｌをＭｅｔに、及び９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１１８のアミノ酸配列中の８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、８９番目のＶａｌをＭｅｔに、及び９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１１８のアミノ酸配列中の８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、及び８９番目のＶａｌをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
【００９３】
２個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１０）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４０番目のＴｙｒをＰｈｅに、及び８１番目のＳｅｒをＰｒｏに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４０番目のＴｙｒをＰｈｅに、及び８２番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４０番目のＴｙｒをＰｈｅに、及び８９番目のＶａｌをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４０番目のＴｙｒをＰｈｅに、及び９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１１８のアミノ酸配列中の８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、及び８２番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１１８のアミノ酸配列中の８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、及び８９番目のＶａｌをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号１１８のアミノ酸配列中の８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、及び９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号１１８のアミノ酸配列中の８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、及び８９番目のＶａｌをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号１１８のアミノ酸配列中の８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、及び９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号１１８のアミノ酸配列中の８９番目のＶａｌをＭｅｔに、及び９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
【００９４】
１個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（６）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４番目のＭｅｔをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１１８のアミノ酸配列中の４０番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１１８のアミノ酸配列中の８１番目のＳｅｒをＰｒｏに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１１８のアミノ酸配列中の８２番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１１８のアミノ酸配列中の８９番目のＶａｌをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１１８のアミノ酸配列中の９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
【００９５】
また、本発明のヒト化抗体の具体例としては、抗体のＶＨが配列番号１１６及び／又は抗体のＶＬが配列番号１１８のアミノ酸配列を含むヒト化抗体、抗体のＶＨが配列番号１１６及び／又は抗体のＶＬが図１２で示されるいずれかのアミノ酸配列を含むヒト化抗体、又は、抗体のＶＨが図１１で示されるいずれかのアミノ酸配列及び／又は抗体のＶＬが配列番号１１８のアミノ酸配列を含むヒト化抗体などが挙げられる。
【００９６】
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリー及びヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
【００９７】
ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。
【００９８】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖及び２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
【００９９】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法を用い、ヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積させることにより作製できる。
【０１００】
上述の抗体又は抗体断片を構成するアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、付加、置換又は挿入され、かつ上述の抗体又はその抗体断片と同様な活性を有するモノクローナル抗体又はその抗体断片も、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片に包含される。
【０１０１】
欠失、置換、挿入及び／又は付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ、３４、３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３、４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４８８（１９８５）］などの周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数である。例えば、好ましくは１〜数十個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。
【０１０２】
上記の抗体のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、次のことを示す。即ち、同一配列中の任意、かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中において、１又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入又は付加があることを意味する。また、欠失、置換、挿入又は付加が同時に生じる場合もあり、置換、挿入又は付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある。
【０１０３】
天然型アミノ酸残基としては、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、又はＬ−システインなどが挙げられる。
【０１０４】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２、４−ジアミノブタン酸、２、３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【０１０５】
本発明において、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
【０１０６】
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素であるパパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【０１０７】
本発明のＦａｂは、本発明のモノクローナル抗体をパパインで処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することもできる。
【０１０８】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域のジスルフィド結合の下部を蛋白質分解酵素であるペプシンで分解して得られた、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約１０万の抗原結合活性を有する断片である。
【０１０９】
本発明のＦ（ａｂ’）２は、本発明のモノクローナル抗体をペプシンで処理して得ることができる。また、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合又はジスルフィド結合させ、作製することもできる。
【０１１０】
Ｆａｂ’は、前記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、本発明のＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することもできる。
【０１１１】
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
【０１１２】
本発明のｓｃＦｖは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【０１１３】
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
【０１１４】
本発明のｄｉａｂｏｄｙは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【０１１５】
ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は既知の方法［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
【０１１６】
本発明のｄｓＦｖは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【０１１７】
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
【０１１８】
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。
【０１１９】
本発明のモノクローナル抗体には、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的又は遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。抗体の誘導体を検出方法、定量方法、検出用試薬、又は定量用試薬として使用する場合には、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片に結合する薬剤として、通常の免疫学的検出又は測定法で用いられる標識体が挙げられる。
【０１２０】
本発明における、抗体の誘導体は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片のＨ鎖又はＬ鎖のＮ末端側又はＣ末端側、抗体又はその抗体断片中の適当な置換基又は側鎖、さらにはモノクローナル抗体又はその抗体断片中の糖鎖などに、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的手法［抗体工学入門、地人書館（１９９４）］により結合させることにより製造することができる。
【０１２１】
また、本発明における、抗体の誘導体は、本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させる遺伝子工学的手法より製造することができる。
【０１２２】
放射性同位元素としては、例えば、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、９９Ｔｃ、７７Ｌｕ、又は２１１Ａｔなどが挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）などが挙げられる。
【０１２３】
低分子の薬剤としては、例えば、アクリジニウムエステルもしくはロフィンなどの発光物質、又はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）もしくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質などが挙げられる。
【０１２４】
低分子の薬剤と抗体とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して薬剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法、又は水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などが挙げられる。
【０１２５】
高分子の薬剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、又はヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。これらの高分子化合物を抗体又は抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的又は生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失又は抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。例えば、ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などが挙げられる［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのｅ−アミノ基への修飾剤（日本国特開昭６１−１７８９２６号公報）、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシル基への修飾剤（日本国特開昭５６−２３５８７号公報）、又はアルギニンのグアニジノ基への修飾剤（日本国特開平２−１１７９２０号公報）などが挙げられる。
【０１２６】
蛋白質としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼもしくはルシフェラーゼなどの酵素が挙げられる。
【０１２７】
また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分として含有するＢＭＰ９が関与する貧血を伴う疾患の治療剤に関する。
【０１２８】
ＢＭＰ９が関与する貧血を伴う疾患としては、血液または造血機能自体に原因がある一次性貧血と、他の病気が原因でひき起こされる二次性貧血が挙げられる。一次性貧血には、鉄欠乏性貧血、巨大赤芽球性貧血、溶血性貧血、再生不良性貧血などがあり、二次性貧血には、腎疾患、感染症（結核、感染性心内膜炎、肝膿瘍など）、膠原病（慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、がんなどの悪性疾患、肝疾患、内分泌疾患などがある。
【０１２９】
がんとしては、例えば、血液がん、乳癌、子宮癌、大腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前立腺癌又は膵臓癌などが挙げられ、好ましくは血液がん、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌又は前立腺癌が挙げられる。
【０１３０】
血液がんとしては、例えば、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅｓ、ＭＤＳ）、多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＣＴＣＬ）、末梢Ｔ細胞性リンパ腫（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｔｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＰＴＣＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｌａｒｇｅｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＡＬＣＬ）、急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＬＬ）、その他リンパ性白血病、ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、又は、バーキットリンパ腫をはじめとする非ホジキンリンパ腫などが挙げられる。
【０１３１】
肝疾患としては、例えば、慢性肝炎、肝硬変、肝不全などが挙げられ、内分泌疾患としては、例えば、甲状腺機能低下症、副腎皮質機能低下症、下垂体機能低下症、副甲状腺機能亢進症などが挙げられる。
【０１３２】
本発明の治療剤としては、上述した本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を有効成分として含有する。
【０１３３】
本発明の抗体又は該抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
【０１３４】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内もしくは静脈内などの非経口投与が挙げられ、好ましくは静脈内投与もしくは皮下投与を挙げられる。
【０１３５】
投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。
【０１３６】
投与量又は投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、及び体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１３７】
さらに、本発明は、ＢＭＰ９のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分として含有する、ＢＭＰ９の免疫学的検出又は測定方法に関する。
【０１３８】
本発明においてＢＭＰ９の量を検出又は測定する方法としては、任意の公知の方法が挙げられる。例えば、免疫学的検出又は測定方法などが挙げられる。
【０１３９】
免疫学的検出又は測定方法とは、標識を施した抗原又は抗体を用いて、抗体量又は抗原量を検出又は測定する方法である。免疫学的検出又は測定方法としては、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット法又は物理化学的手法などが挙げられる。
【０１４０】
以下に、本発明の抗体の製造方法、疾患の治療方法、及び疾患の診断方法について、具体的に説明する。
１．モノクローナル抗体の製造方法
（１）抗原の調製
抗原となるＢＭＰ９又はＢＭＰ９を発現した組織は、ＢＭＰ９全長又はその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、ＢＭＰ９を多量に発現しているヒト組織からＢＭＰ９を精製し、得ることが出来る。また、該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によりＢＭＰ９の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
【０１４１】
本発明で用いられるＢＭＰ９は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、該ＢＭＰ９をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
【０１４２】
まず、ＢＭＰ９をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られた該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
【０１４３】
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製又は染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。
【０１４４】
宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
【０１４５】
大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ＢＭＰ９をコードする部分を含むＤＮＡ、及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
【０１４６】
該組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列ともいう）と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【０１４７】
また、該ＢＭＰ９をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするＢＭＰ９の生産率を向上させることができる。
【０１４８】
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８、６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５３、２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）より調製、日本国特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ６７９８）より調製、日本国特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４６８６１９１号明細書、米国特許第４９３９０９４号明細書、米国特許第５１６０７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２、２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、又はｐＭＥ１８ＳＦＬ３などが挙げられる。
【０１４９】
プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、又はＴ７プロモーターなどの、大腸菌又はファージなどに由来するプロモーターを挙げることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、又はｌｅｔ  Ｉプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。
【０１５０】
宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、又は大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。
【０１５１】
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９、２１１０（１９７２）、Ｇｅｎｅ、１７、１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６８、１１１（１９７９）］が挙げられる。
【０１５２】
動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３−２２９７９号公報；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、ｐｃＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ、３２９、８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡ  Ｉ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１０１、１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、又はｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）などが挙げられる。
【０１５３】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、又はモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーターもしくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【０１５４】
宿主細胞としては、例えば、ヒト白血病細胞Ｎａｍａｌｗａ細胞、サル細胞ＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０８、９４５（１９５８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６０、１２７５（１９６８）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、５５、５１３（１９６８）；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ、４１、１２９（１９７３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８、１１５（１９９６）；Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１４８、２６０（１９９７）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６（１９８０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６０、１２７５（１９６８）；Ｃｅｌｌ、６、１２１（１９７５）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｉ、ＩＩ（ｐｐ．８８３−９００））、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、Ｐｒｏ−３、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫ又はＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３−０００２９９号公報）、などが挙げられる。
【０１５５】
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、又はリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、７４１３（１９８７）］などが挙げられる。
【０１５６】
以上のようにして得られるＢＭＰ９をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、又は動物細胞などの由来の形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ＢＭＰ９を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ＢＭＰ９を製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【０１５７】
真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖又は糖鎖が付加されたＢＭＰ９を得ることができる。誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。
【０１５８】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９、５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２２、５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８、３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、７３、１（１９５０）］、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、又はこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン又はペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１５９】
ＢＭＰ９をコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産又は融合蛋白質発現などの方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］を用いることができる。
【０１６０】
ＢＭＰ９の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、又は宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞、又は生産させるＢＭＰ９の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
【０１６１】
ＢＭＰ９が宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４、１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．、４、１２８８（１９９０）］、日本国特開平０５−３３６９６３号公報、又は国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ＢＭＰ９を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【０１６２】
また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２−２２７０７５号公報）を利用してＢＭＰ９の生産量を上昇させることもできる。得られたＢＭＰ９は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。ＢＭＰ９が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、又はダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
【０１６３】
前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、又は等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独又は組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【０１６４】
ＢＭＰ９が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ＢＭＰ９の不溶体を回収する。回収した該ＢＭＰ９の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、該ＢＭＰ９を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
【０１６５】
ＢＭＰ９又はその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ＢＭＰ９又はその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【０１６６】
また、本発明において用いられるＢＭＰ９は、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル−ベガ社製、パーセプチブ社製、又は島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【０１６７】
（２）動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
３〜２０週令のマウス、ラット又はハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、ＢＭＰ９ノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。
【０１６８】
免疫は、動物の皮下、静脈内又は腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、又は水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、又はＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
【０１６９】
抗原の投与は、１回目の投与の後、１〜２週間おきに２〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を融合用抗体産生細胞の供給源とする。
【０１７０】
抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。
【０１７１】
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、８−アザグアニン耐性マウス（Ｂａｌｂ／Ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８、１（１９７８）］、Ｐ３−ＮＳ１／１Ａｇ４１（ＮＳ−１）［Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６、５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ、２７６、２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２３、１５４８（１９７９）］、又はＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５（１９７５）］などが用いられる。
【０１７２】
該骨髄腫細胞は、正常培地［グルタミン、２−メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、ＦＢＳ、及び８−アザグアニンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地］で継代し、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
【０１７３】
（４）細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地又はＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。
【０１７４】
沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）、ＭＥＭ培地及びジメチルスルホキシドの混液を３７℃で、攪拌しながら加える。さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、融合用抗体産生細胞にＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジン、及びアミノプテリンを加えた正常培地］中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
【０１７５】
培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のバインディングアッセイなどのハイブリドーマの選択方法により、ＢＭＰ９を含む抗原に反応し、ＢＭＰ９を含まない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目はＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。
【０１７６】
（５）精製モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８〜１０週令のマウス又はヌードマウスに、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０〜２１日でハイブリドーマは腹水がん化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラム又はゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ又はＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
【０１７７】
また、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ添加を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地に懸濁し、３〜７日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡ−カラム又はプロテインＧ−カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地には５％ダイゴＧＦ２１を添加することもできる。
【０１７８】
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法又は２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
【０１７９】
（６）モノクローナル抗体の選択
モノクローナル抗体の選択は以下に示す酵素免疫測定法によるバインディングアッセイ、及びＢｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析により行う。
（６−ａ）バインディングアッセイ
抗原としては、（１）で得られるＢＭＰ９をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入して得られた遺伝子導入細胞、リコンビナント蛋白質、又はヒト組織から得た精製ポリペプチド又は部分ペプチドなどを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ又はＫＬＨなどのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製して、これを用いても良い。
【０１８０】
抗原を９６ウェルプレートなどのプレートに分注し、固相化した後、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を分注し、反応させる。ＰＢＳ又はＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎなどで、よく洗浄した後、第２抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質又は放射線化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した後、第２抗体の標識物質に応じた反応を行ない、免疫原に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。
【０１８１】
また、本発明のモノクローナル抗体は、上述のバインディングアッセイ系に、被検抗体を添加して反応させることで取得できる。すなわち、被検抗体を加えた時にモノクローナル抗体の結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ＢＭＰ９のアミノ酸配列、又はその立体構造への結合について、取得したモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体を取得することができる。
【０１８２】
さらに、本発明のモノクローナル抗体が認識するエピトープと、同じエピトープに結合する抗体は、上述のバインティングアッセイ系で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの、部分的な合成ペプチド、又はエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで、取得することができる。
【０１８３】
（６−ｂ）Ｂｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用い、抗原と被験物の間の結合におけるｋｉｎｅｔｉｃｓを測定し、その結果を機器付属の解析ソフトウエアで解析をする。抗マウスＩｇＧ抗体をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリング法により固定した後、ハイブリドーマ培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を流し、適当量結合させ、さらに濃度既知の複数濃度の抗原を流し、結合、解離を測定する。
【０１８４】
得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、１：１バインディングモデルによりｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。又は、ヒトＢＭＰ９をセンサーチップ上に、例えばアミンカップリング法により固定した後、濃度既知の複数濃度の精製モノクローナル抗体を流し、結合、解離を測定する。得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、バイバレントバインディングモデルによりｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。
【０１８５】
２．遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製方法を示す。
【０１８６】
（１）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
【０１８７】
ヒト抗体の定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）は任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨ及びκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。
【０１８８】
動物細胞用発現ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３、１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０１、１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ、２７、２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８、１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ｂｄ２−４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４、１７３（１９９０）］、又はｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１−３［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１３、７９（１９９３）］などを用いる。
【０１８９】
動物細胞用発現ベクターのうちプロモーターとエンハンサーには、ＳＶ４０の初期プロモーター［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０１、１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１４９、９６０（１９８７）］、又は免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ、４１、４７９（１９８５）］とエンハンサー［Ｃｅｌｌ、３３、７１７（１９８３）］などを用いる。
【０１９０】
遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）の遺伝子組換え抗体発現用ベクター［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６７、２７１（１９９４）］を用いるが、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号公報）、ｐＥＥ１８［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１７、５５９（１９９８）］などを用いる。
【０１９１】
（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析
非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
【０１９２】
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ又はプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。
【０１９３】
前記ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分又はＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ又は組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ又は組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨ又はＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨ又はＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
【０１９４】
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物には、マウス、ラット、ハムスター、又はラビットなどを用いるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
【０１９５】
ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５４、３（１９８７）］、又はＲＮＡ  ｅａｓｙ  ｋｉｔ（キアゲン社製）などのキットなどを用いる。
【０１９６】
全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］、又はＯｌｉｇｏ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）、又はＱｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ファルマシア社製）などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。
【０１９７】
ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）］、又はＳｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）、又はＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などのキットなどを用いる。
【０１９８】
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターには、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  ＥｘＰｒｅｓｓ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、５、５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７、９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ、４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘ  Ｃｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３−１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３、２８０（１９８３）］、又はｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ、３３、１０３（１９８５）］などを用いる。
【０１９９】
ファージ又はプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ−１Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、５、８１（１９９２）］、Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３９、４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２、７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６６、１（１９８３）］、Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６、１１８（１９６６）］、又はＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ、３８、２７５（１９８５）］などを用いる。
【０２００】
ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープ又は蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、又はプラーク・ハイブリダイゼーション法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］などを用いる。
【０２０１】
また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、ＰＣＲ法と表記する、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）］を行うことよりＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
【０２０２】
選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、５４６３（１９７７）］などの反応を行った後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７００（ＰＥバイオシステムズ社製）又はＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などを用いる。
【０２０３】
決定した塩基配列からＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。
【０２０４】
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨ及びＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することによって見出すことができる。
【０２０５】
また、得られたＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ又はＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３（１９９０）］などの相同性検索を行い、ＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものかを確認できる。
【０２０６】
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
【０２０７】
非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを作製する。
【０２０８】
作製されたＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築する。
【０２０９】
また、非ヒト抗体ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
【０２１０】
（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。
【０２１１】
非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。
【０２１２】
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、又はヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。
【０２１３】
次に、選択したヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
【０２１４】
設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＨ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計する。
【０２１５】
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターに容易にヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。
【０２１６】
又は、設計したＤＮＡ配列に基づき、１本のＤＮＡとして合成された各Ｈ鎖、Ｌ鎖全長合成ＤＮＡを用いることで実施できる。
【０２１７】
ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
【０２１８】
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、９、２６６（１９９１）］。
【０２１９】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、及び抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。
【０２２０】
抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１２、５３５（１９７７）］又はコンピューターモデリング［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、１５０１（１９９４）］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築及び解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有する改変ヒト型ＣＤＲ移植抗体を取得できる。
【０２２１】
ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、改変させることができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
【０２２２】
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
【０２２３】
例えば、（４）及び（５）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
【０２２４】
（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
（３）及び（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、又はそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト型ＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
【０２２５】
発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えばＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６５１）を用いる［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２８３（１９９１）］。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、（１９９１）］、又はリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、７４１３（１９８７）］などを用いる。
【０２２６】
発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを用いて測定する。
【０２２７】
（８）遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
（３）及び（６）で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
【０２２８】
宿主細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法［日本国特開平２−２５７８９１号公報、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］などを用いる。遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
【０２２９】
例えば、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６（１９８０）］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Ｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２、５５（１９８６）］、α１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２）などを用いる。
【０２３０】
発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８硫酸塩などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２−２５７８９１号公報）。
【０２３１】
動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、又はこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。
【０２３２】
得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、形質転換株は、ＤＨＦＲ増幅系（日本国特開平２−２５７８９１号公報）などを利用して遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。
【０２３３】
遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡ−カラムを用いて精製する［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過などの蛋白質の精製で用いられる方法を組み合わすこともできる。
【０２３４】
精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０（１９７０）］、又はウェスタンブロッティング法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］など用いて測定することができる。
【０２３５】
３．精製モノクローナル抗体又はその抗体断片の活性評価
精製した本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。
【０２３６】
ＢＭＰ９及びＢＭＰ９発現組織に対する結合活性は、前述の１−（６−ａ）記載のバインディングアッセイ及び（６−ｂ）記載のＢｉａｃｏｒｅシステムなどを用いた表面プラズモン共鳴法を用いて測定する。また、蛍光抗体法［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３６、３７３（１９９３）］などを用いて測定できる。
【０２３７】
４．本発明の抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いた疾患の治療方法
本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、ＢＭＰ９が関与する貧血を伴う疾患の治療に用いることができる。
【０２３８】
本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。
【０２３９】
投与経路としては、例えば、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内もしくは静脈内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。
【０２４０】
経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、又は顆粒剤などでが挙げられる。
【０２４１】
乳剤又はシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトールもしくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコールもしくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油もしくは大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、又はストロベリーフレーバーもしくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。
【０２４２】
カプセル剤、錠剤、散剤又は顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖もしくはマンニトールなどの賦形剤、デンプンもしくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースもしくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤又はグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。
【０２４３】
非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、坐剤又は噴霧剤などが挙げられる。
【０２４４】
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、又はその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。
坐剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸などの担体を用いて製造する。
【０２４５】
噴霧剤は受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。担体としては、例えば乳糖又はグリセリンなどを用いる。また、エアロゾル又はドライパウダーとして製造することもできる。
【０２４６】
さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０２４７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。使用する試薬類は、特に記載がない限り、添付文書に従い使用するものとする。
【実施例】
【０２４８】
［実施例１］
マウスＢＭＰ９  遺伝子ノックアウト用ターゲティングベクターの構築
１−１）カセットベクターｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａの構築  
ノックアウト（ＫＯ）用ターゲティングベクターを作製するための基本ベクターとなるカセットベクターｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに制限酵素サイトを付加した後、ネオマイシン耐性マーカー遺伝子発現ユニットの両端にＬｏｘＰ配列を有するＬｏｘＰ−Ｎｅｏ及びジフテリア毒素Ａ鎖遺伝子（ＤＴ−Ａ）を挿入したベクターで、国際公開第２００６／０７８０７２号公報の実施例７で記載したベクターと同一である。以下に、当該ベクター作製の概略を記載する。【０２４９】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（東洋紡社製）ベクターに新たな制限酵素サイトを付加するため以下のオリゴＤＮＡ（ＬｉｎｋＡ１：配列番号１、ＬｉｎｋＡ２：配列番号２、ＬｉｎｋＢ１：配列番号３、及びＬｉｎｋＢ２：配列番号４）を合成した。【０２５０】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで処理し、反応液からプラスミド断片をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。このプラスミド断片に、新たな制限酵素サイト、ＮｒｕＩ、ＳｇｒＡＩ及びＡｓｃＩを付加するため、ＬｉｎｋＡ１及びＬｉｎｋＡ２からなるリンカーを挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりプラスミドｐＢｌｕｅＬＡを取得した。【０２５１】
ｐＢｌｕｅＬＡを制限酵素ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩで処理し、反応液からプラスミド断片をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。このプラスミド断片に新たな制限酵素サイト、ＰａｃＩ、ＦｓｅＩ及びＳａｌＩを付加するため、ＬｉｎｋＢ１及びＬｉｎｋＢ２からなるリンカーを挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりプラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢを取得した。【０２５２】
国際公開第００／１０３８３号に記載されたプラスミドｐＬｏｘＰ−ＳＴｎｅｏをＸｈｏＩで酵素消化し、両端にＬｏｘＰ配列を持つＮｅｏ耐性遺伝子（ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ）を取得した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いてＬｏｘＰ−Ｎｅｏの両末端を平滑化しＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−Ｂを取得した。【０２５３】
ｐＢｌｕｅＬＡＢをＥｃｏＲＶで酵素消化し、反応液からプラスミド断片をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。得られたプラスミド断片に、ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−Ｂを挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりプラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏを取得した。【０２５４】
ｐＭＣ１ＤＴ−Ａ（ライフテックオリエンタル社製）をＸｈｏＩ及びＳａｌＩで酵素消化後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＤＴ−Ａ遺伝子を含む断片を回収した。【０２５５】
ｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−ＮｅｏをＸｈｏＩで酵素消化し、反応液からプラスミド断片をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。得られたプラスミド断片に、ＤＴ−Ａ遺伝子を含む断片を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりカセットベクターｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａを取得した。【０２５６】
１−２）マウスＢＭＰ９遺伝子３’側ゲノム領域断片の取得
Ｅｎｓｅｍｂｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒより取得したマウスＢＭＰ９（ＧＤＦ２）遺伝子を含むゲノムＤＮＡ配列（アクセッション番号：ＥＮＳＭＵＳＧ００００００７２６２５）よりプライマー（配列番号５、６）を設計した。【０２５７】
大腸菌人工染色体［Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＢＡＣ）］のうちＣ５７ＢＬ／６ＪマウスＢＭＰ９遺伝子を含むクローンＲＰ２３−１８１Ｎ８由来のＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び６のプライマーを各１０ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を含む５０μＬの反応液を調製し、９４℃で３分間保温した後、９８℃で１０秒間、及び６８℃で５分間を１サイクルとして３５サイクルＰＣＲを行った。【０２５８】
得られたＰＣＲ増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて２．１ｋｂｐの断片を回収した。回収したＰＣＲ増幅断片をＣｌａＩ及びＡｓｃＩで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  を用いて酵素処理断片（ＣｌａＩ−ＡｓｃＩ断片）を回収した。【０２５９】
ｐＢｌｕｅＬＡＢをＣｌａＩ及びＡｓｃＩで酵素消化し、Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＳＡＰ）処理した後、このＣｌａＩ−ＡｓｃＩ断片をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。上記で回収したＣｌａＩ−ＡｓｃＩ断片を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。【０２６０】
得られた形質転換体より、ＰＣＲに起因する変異がない挿入遺伝子を有するクローンを選択した。このプラスミドＤＮＡをＣｌａＩ及びＡｓｃＩで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて２．１ｋｂｐのマウスＢＭＰ９遺伝子の３’側ゲノム配列を含む酵素処理断片を回収した。【０２６１】
１−３）マウスＢＭＰ９遺伝子５’側ゲノム領域断片の取得
Ｅｎｓｅｍｂｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒより取得したマウスＢＭＰ９遺伝子を含むゲノムＤＮＡ配列（アクセッション番号：ＥＮＳＭＵＳＧ００００００７２６２５）よりプライマー（配列番号７、８）を設計した。【０２６２】
ＢＡＣクローンＲＰ２３−１８１Ｎ８由来のＤＮＡを鋳型とし、配列番号７及び８のプライマーを各１０ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を含む５０μＬの反応液を調製し、９４℃で３分間保温した後、９８℃で１０秒間、及び６８℃で５分間を１サイクルとして３５サイクルＰＣＲを行った。【０２６３】
得られたＰＣＲ増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて５．１ｋｂｐの断片を回収した。回収したＰＣＲ増幅断片をＰａｃＩ及びＦｓｅＩで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて酵素処理断片（ＰａｃＩ−ＦｓｅＩ断片）を回収した。【０２６４】
ｐＢｌｕｅＬＡＢをＰａｃＩ及びＦｓｅＩで酵素消化し、ＳＡＰ処理した後、このＰａｃＩ−ＦｓｅＩ断片をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。上記で回収したＰａｃＩ−ＦｓｅＩ断片を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。【０２６５】
得られた形質転換体より、ＰＣＲに起因する変異がない挿入遺伝子を有するクローンを選択した。このプラスミドＤＮＡをＰａｃＩ及びＦｓｅＩで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて５．１ｋｂｐのマウスＢＭＰ９遺伝子の５’側ゲノム配列を含む酵素処理断片を回収した。【０２６６】
１−４）カセットベクターへのマウスＢＭＰ９遺伝子３’側ゲノム領域断片の挿入
実施例１−１で得られたｐＢｌｕｅＬＡＢ−Ｌｏｘ−Ｎｅｏ−ＤＴ−ＡをＣｌａＩ及びＡｓｃＩで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を回収した。回収した約７．６ｋｂｐのＤＮＡ断片に、実施例１−２で得られた酵素処理断片を挿入した後、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡ断片が挿入されているクローンを選択した。連結部分の塩基配列に問題がないことを確認した。【０２６７】
１−５）マウスＢＭＰ９遺伝子３’側ゲノム領域断片を持つカセットベクターへのマウスＢＭＰ９遺伝子５’側ゲノム領域断片の挿入
実施例１−４で得られたプラスミドをＰａｃＩ及びＦｓｅＩで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて酵素処理断片を回収した。回収した９．７ｋｂｐのＤＮＡ断片に、実施例１−３で作製した酵素処理断片を挿入した後、大腸菌ＤＨ５αに導入した。【０２６８】
得られた形質転換体よりＤＮＡ断片が挿入されているクローンを選択した。連結部分の塩基配列に問題がないことを確認し、マウスＢＭＰ９  遺伝子ノックアウト用のターゲティングベクターｐＢｌｕｅｍＢｍｐ９−Ｌｏｘ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯ（図１）を取得した。【０２６９】
［実施例２］
マウスＢＭＰ９遺伝子ターゲティングベクターの調製
実施例１−５で得られたｐＢｌｕｅｍＢｍｐ９−Ｌｏｘ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯ  ６０μｇを、終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにスペルミジン（シグマ社製）を添加し、ｐＨを７．０に調製した、制限酵素用Ｈバッファー（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）中で、ＮｏｔＩで酵素消化した。【０２７０】
反応液から、ベクター断片をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。ＤＮＡ濃度が０．５μｇ／μＬとなるよう、ｐＨ７．０５のＨＢＳ溶液［１リットルあたり、ＨＥＰＥＳ  ５ｇ、ＮａＣｌ  ８ｇ、ＫＣｌ  ０．３７ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．１２５ｇ、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ）１ｇを含む溶液］を加え、１時間室温で保存することによって、エレクトロポレーション用マウスＢＭＰ９遺伝子ターゲティング用ベクターｐＢｌｕｅｍＢｍｐ９−Ｌｏｘ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯ−ＮｏｔＩを調製した。【０２７１】
［実施例３］
ゲノムサザンブロット解析用プローブの調製
３−１）マウスＢＭＰ９遺伝子の５’側ゲノム確認用プローブの作製
ＢＡＣクローンＲＰ２３−１８１Ｎ８の塩基配列情報を基に、マウスＢＭＰ９遺伝子の５’側ゲノム領域約５００ｂｐを含むプローブを取得するため、プライマー（配列番号９、１０）を設計した。【０２７２】
ＢＡＣクローンＲＰ２３−１８１Ｎ８由来のＤＮＡを鋳型とし、配列番号９及び１０のプライマーを各１０ｐｍｏｌ、ＴａＫａＲａ  Ｚ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を含む５０μＬの反応液を調製し、９４℃で２分間保温した後、９４℃で３０秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で１分間を１サイクルとして２５サイクルＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて約５００ｂｐの５’側ゲノムサザンブロット用プローブ（５’ＫＯ−ｐｒｏｂｅ）を回収した。【０２７３】
３−２）マウスＢＭＰ９遺伝子の３’側ゲノム確認用プローブの作製
ＢＡＣクローンＲＰ２３−１８１Ｎ８の塩基配列情報を基に、マウスＢＭＰ９遺伝子の３’側ゲノム領域約５００ｂｐを含むプローブを取得するため、プライマー（配列番号１１、１２）を設計した。【０２７４】
ＢＡＣクローンＲＰ２３−１８１Ｎ８由来のＤＮＡを鋳型とし、配列番号１１及び１２のプライマーを各１０ｐｍｏｌ、ＴａＫａＲａ  Ｚ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を含む５０μＬの反応液を調製し、９４℃で２分間保温した後、９４℃で３０秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で１分間を１サイクルとして２５サイクルＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて約５００ｂｐの３’側ゲノムサザンブロット用プローブ（３’ＫＯ−ｐｒｏｂｅ）を回収した。【０２７５】
［実施例４］
マウスＢＭＰ９  ＫＯ  ＥＳ細胞株の取得
相同組換えを用いたマウスＢＭＰ９遺伝子ＫＯ  ＥＳ細胞の取得のため、確立されている方法（相沢慎一著、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、１９９５）に従って、実施例２において調製したｐＢｌｕｅｍＢｍｐ９−Ｌｏｘ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯ−ＮｏｔＩをマウスＥＳ細胞ＴＴ２（Ｙａｇｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１４：７０、１９９３）へ導入した。詳細な方法を以下に記載する。【０２７６】
栄養細胞としてマイトマイシンＣ（シグマ社製）で処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（インビトロジェン社製）を用いてＴＴ２細胞の培養増殖を３７℃、５％ｃＯ２の条件下に行った。ＴＴ２細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍＬとなるように実施例２に記載したＨＢＳ溶液で懸濁した。細胞懸濁液を０．５ｍＬと、ｐＢｌｕｅｍＢｍｐ９−Ｌｏｘ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯ−ＮｏｔＩを１０μｇ混和し、ジーンパルサーキュペット（電極距離：０．４ｃｍ、バイオラッド社製）に入れ、エレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２４０Ｖ、室温）。【０２７７】
エレクトロポレーションした細胞を、ＥＳ培地［１リットルあたり、牛胎仔血清（ＦＢＳ）１８０ｍＬ、Ｄ−グルコース３．５ｇ、ダルベッコ改変イーグル培地粉末（インビトロジェン社製）１０ｇ、非必須アミノ酸溶液（１００倍濃縮液；インビトロジェン社製）１０ｍＬ、炭酸水素ナトリウム１．９ｇを含む溶液］１０ｍＬに懸濁し、あらかじめ前述の栄養細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン社製）１枚に播種した。２４時間後、培地を２００μｇ／ｍＬのネオマイシン（シグマ社製）を含むＥＳ培地に置き換えた。７日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれ２４穴プレートに播種した。【０２７８】
コンフルーエントになるまで増殖させた後、３分の１の細胞を１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養することにより、１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社製）で調製した。これらネオマイシン耐性ＴＴ２細胞ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。次に、実施例３−２で得た３’ＫＯ−ｐｒｏｂｅを用いたサザンブロットを行った。野生型ＴＴ２細胞では、１本のバンド（約１５．５ｋｂｐ）が検出され、相同組換え体においては、２本のバンド（約１１．５ｋｂｐと約１５．５ｋｂｐ）が検出された。【０２７９】
更に、相同組換えが確認されたクローンのゲノムＤＮＡをＮｃｏＩで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。次に、実施例３−１で得た５’ＫＯ−ｐｒｏｂｅを用いたサザンブロットを行った。野生型ＴＴ２細胞では、１本のバンド（約１３．４ｋｂｐ）が検出され、相同組換え体においては、２本のバンド（約８．５ｋｂｐと約１３．４ｋｂｐ）が検出された。【０２８０】
以上の結果、マウスＢＭＰ９遺伝子を脱落したことが予想される相同組換え体は７株見出された。次に、相同組換体の核型解析を既報（相沢慎一著、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、１９９５）に従い行った結果、見出された７株のうち５株は正常核型を有するマウスＢＭＰ９遺伝子ＫＯ  ＥＳ細胞であることが確認された。【０２８１】
［実施例５］
ＢＭＰ９  ＫＯヘテロ接合型マウスの作製
実施例４において取得したＥＳ細胞は、毛色が濃茶色ＣＢＡ×Ｃ５７ＢＬ／６  Ｆ１マウス由来（Ｙａｇｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１４：７０−７６、１９９３）のＴＴ２細胞である。そこで、ＥＳ細胞由来の遺伝子を有するキメラマウスと、ＥＳ細胞由来の遺伝子を有さない宿主マウスを簡便に判別するため、宿主マウスには、毛色が白色のＩＣＲマウスを選択した。【０２８２】
まず、実施例４において正常核型を持つことが確認できたマウスＢＭＰ９遺伝子ＫＯ  ＥＳ細胞のうち４株を、ＩＣＲ系統の雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に、それぞれ胚１つあたり８〜１０個注入した。その後、ＥＳ培地を用いて一晩培養することで、インジェクション胚を胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＩＣＲマウス（日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約１０個の胚盤胞まで発生させたインジェクション胚を移植した。【０２８３】
胚盤胞まで発生させたインジェクション胚を計２６０個移植した結果、１０２匹の子キメラマウスが誕生した。誕生した１０２匹のうち毛色が濃茶色を含むマウス、すなわちＥＳ細胞の貢献が認められたキメラマウスは８９匹であった。これら８９匹のうち、毛色が全て濃茶色で白色部分を含まないマウス、すなわち、ＥＳ細胞由来のキメラ率の高いキメラマウスは４０匹であった。【０２８４】
次に、これらのキメラ率の高いオスのキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６のメスと交配させた結果、毛色が濃茶色の子マウスが誕生したことから、ＥＳ細胞ゲノムの生殖細胞系列への伝達が確認された。【０２８５】
ＢＭＰ９遺伝子がターゲティングされたヘテロ接合型マウスのスクリーニングは、尾部生検由来ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ解析により行った。そのために、実施例１にて作製したマウスＢＭＰ９遺伝子ノックアウト用ベクターｐＢｌｕｅｍＢｍｐ９−Ｌｏｘ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯ内のネオマイシン耐性遺伝子領域に特異的なプライマーであるｍＢＭＰ９＿ＦＷ５９１５（配列番号１３）及びｍＢＭＰ９＿ＲＶ１７１６５（配列番号１４）を作製した。【０２８６】
出生後３週以上を経たマウスから尻尾を取得し（勝木元也著、発生工学実験マニュアル、講談社サイエンティフィク、１９８７）、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３及び１４のプライマーを各１０ｐｍｏｌ、ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を含む５０μＬの反応液を調製し、９５℃で３０秒間、６０℃で１分間、及び７２℃で２分間を１サイクルとして３５サイクルＰＣＲを行った。【０２８７】
アガロースゲル電気泳動を行った結果、約１．３ｋｂｐの増幅産物が検出される個体が複数存在した。この結果は、内在性ＢＭＰ９遺伝子が相同組換えされ、ネオマイシン耐性遺伝子が挿入されたヘテロ接合型マウス［ＢＭＰ９ＫＯ（＋／−）］が複数得られたことを示している。【０２８８】
［実施例６］
ＢＭＰ９ＫＯホモ接合型マウスの作製
実施例５で作製されたＢＭＰ９ＫＯ（＋／−）の雌雄個体を交配させ、子マウスを得た。実施例５と同様に、マウスの尻尾からＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、実施例５と同様にＰＣＲを行った。さらに、アガロース電気泳動を行うことにより、ＢＭＰ９ＫＯへテロ接合型［ＢＭＰ９ＫＯ（＋／−）］とホモ接合型［ＢＭＰ９ＫＯ（−／−）］を選抜した。【０２８９】
選抜した個体のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５及び１６のプライマーを各１０ｐｍｏｌ、ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を含む５０μＬの反応液を調製し、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、及び７２℃で１分間を１サイクルとして３５サイクルＰＣＲを行った。アガロースゲル電気泳動を行った結果、約２００ｂｐの増幅産物が検出される個体、及び検出されない個体が存在することが明らかとなった。【０２９０】
野生型対立遺伝子をもつＢＭＰ９ＫＯ（＋／−）では約２００ｂｐの増幅産物が検出されるが、ＢＭＰ９ＫＯ（−／−）では検出されないことから、この結果は、ＢＭＰ９ＫＯ（−／−）が得られたことを示している。抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体取得には、得られた雌雄のホモ接合型［ＢＭＰ９ＫＯ（−／−）］のうち、雌マウスを１０匹用いた。【０２９１】
［実施例７］
抗ヒトＢＭＰ９モノクローナル抗体の作製
７−１）免疫原の調製
免疫原として用いたヒトＢＭＰ９組換えタンパク質は、国際公開第２０１０／１２６１６９号の実施例１２に記載された方法に従い調製した。【０２９２】
７−２）動物への免疫と抗体産生細胞の調製
アジュバントに、ＲＩＢＩアジュバント（Ｃｏｒｉｘａ社製）、又はＴｉｔｅｒ  Ｍａｘ  Ｇｏｌｄ（Ｔｉｔｅｒｍａｘ社製）を用いて、実施例７−１で調製したヒトＢＭＰ９組換えタンパク質を、実施例６で得られたＢＭＰ９  ＫＯ（−／−）マウスに免疫した。具体的には、ＲＩＢＩアジュバントの添付文書に従って、ヒトＢＭＰ９組換えタンパク質の懸濁液を調製した後、１匹あたり２５μｇのヒトＢＭＰ９組換えタンパク質が投与されるよう、該懸濁液をＫＯマウスの腹腔内に投与した。【０２９３】
Ｔｉｔｅｒ  Ｍａｘ  Ｇｏｌｄを用いる際も同様に、添付文書に従い、ヒトＢＭＰ９組換えタンパク質の懸濁液を調製した後、１匹あたり２５μｇのヒトＢＭＰ９組換えタンパク質が投与されるよう、該懸濁液をＫＯマウスの皮下に投与した。免疫は最終ブーストを含めていずれも計３回行った。脾臓は、最終投与の３日後に摘出した。【０２９４】
摘出した脾臓をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）中で細断した後、脾細胞を遠心分離（１５００ｒｐｍ、３分間）により回収した。得られた脾細胞画分は、赤血球を含むことから、ＲＥＤ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（シグマ社製）を添加し、氷上で処理することにより、赤血球を除去した。得られた脾細胞は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；インビトロジェン社製）培地で２回洗浄した後、細胞融合に供した。【０２９５】
７−３）マウス骨髄腫細胞の調製
マウス骨髄腫細胞株（Ｓｐ２／０，ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１５８１）を１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭにて培養し、細胞融合の親株として用いた。【０２９６】
７−４）ハイブリドーマの作製
実施例７―２で得られたマウス脾細胞と実施例７−３で得られた骨髄腫細胞を５：１になるよう混合し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、３分間）した。得られた沈殿画分（細胞群）に対して、ポリエチレングリコール−１５００（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）１ｍＬを、穏やかに揺らしながら、徐々に加えた。次に、該細胞液にＤＭＥＭ培地５ｍＬを穏やかに揺らしながら加え、更にＤＭＥＭ培地を１０ｍＬ添加した。次に、上記の該細胞液を含むチューブを３７℃で５分間インキュベートし、遠心分離（１５００ｒｐｍ、３分間）した。【０２９７】
得られた沈殿画分（細胞群）をコンプリート培地（ＦＣＳ  １０Ｖ／ｖ％、β―メルカプトエタノール  ５０μｍｏｌ／Ｌ、インシュリン  ５０μｇ／ｍＬ、及びＩＬ−６  １０ｎｇ／ｍＬを含むＤＭＥＭ培地］を用いて脾細胞数が１×１０６個／ｍＬになるように懸濁した後、９６ウェルプレートに１００μＬずつ播種した。【０２９８】
その１．５時間後、メーカーが推奨する終濃度の２倍のＨＡＴ  ｍｅｄｉａ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（シグマ社製、Ｃａｔ＃Ｈ０２６２−１０ＶＬ）を含むコンプリート培地を各ウェルに１００μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地交換は、ウェル内の細胞がスクリーニングに適した細胞数になるまで、メーカーが推奨する終濃度のＨＡＴ  ｍｅｄｉａ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むコンプリート培地を用いて週３回の頻度で行った。【０２９９】
７−５）ＡＬＫ１／ＢＭＰ９サンドイッチＥＬＩＳＡの構築
ＡＬＫ１／ＢＭＰ９サンドイッチＥＬＩＳＡは、抗ヒトＢＭＰ９マウスモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、クローンＮｏ．３６０１０７、以下Ｒ＆Ｄ抗体と記載）、及びヒトＢＭＰ９のタイプＩ受容体として知られているヒトＡＬＫ１細胞外領域ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域フュージョンタンパク質（ｈｓＡＬＫ１−Ｆｃ）を用いて、以下のように構築した。【０３００】
まず、９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３９４５４）に、国際公開第２０１０／１２６１６９号の実施例１に記載の方法に従い調製したｈｓＡＬＫ１−Ｆｃを、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９１−０１３０５）で０．０５μｇ／ｍＬに調製したものを１００μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置して吸着させた。【０３０１】
固相化液を取り除いた後、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、Ｃａｔ＃３７５３５）を２５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間静置してブロッキングし、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。【０３０２】
次に、ヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換えタンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製Ｃａｔ＃３２０９−ＢＰ）をＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋとＰＢＳ−Ｔを１：９の割合で混合した１０％  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔで１ｎｇ／ｍＬの濃度に調製したものを１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置し、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。【０３０３】
次に、ＳｕｒｅＬＩＮＫ  Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｉｃ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＫＰＬ社製）を用いてビオチン標識したＲ＆Ｄ抗体を１０％  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔで３０ｎｇ／ｍＬに調製した後、１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置した。このプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、１０％  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔで５００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｏｌｙＨＲＰ８０（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｃａｔ＃ＳＰ８０Ｄ５０）を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で３０分〜１時間静置した。【０３０４】
このプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＴＭＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ、Ｄａｋｏ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１５９９）を１００μＬ／ウェル添加して発色させ、適当な発色が得られたところで、１Ｎ  硫酸溶液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９２−０４７５５）を１００μＬ／ウェル添加し、ＡＲＶＯ（パーキンエルマー社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０３０５】
７−６）ＡＬＫ１／ＢＭＰ９サンドイッチＥＬＩＳＡを用いた抗ヒトＢＭＰ９抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
実施例７−５で構築したサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、ヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換えタンパク質の添加の際に、１ｎｇ／ｍＬ濃度のヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換えタンパク質、及び５０％濃度の実施例７−４で作製したハイブリドーマの培養上清を含むように調製した１０％  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔ溶液を、１００μＬ／ウェルで分注した。【０３０６】
陰性コントロールには、ハイブリドーマ用培地を用いた。ハイブリドーマ用培地を添加したウェルを基準として、発色が抑制されたウェルを陽性と判断し、ｈｓＡＬＫ１−Ｆｃとヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換えタンパク質、又は、ヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換えタンパク質とＲ＆Ｄ抗体の相互作用を阻害する抗体を産生するハイブリドーマ株を選抜した。【０３０７】
選抜したハイブリドーマについては、ＨＴ（シグマ社製、Ｃａｔ＃Ｈ０１３７−１０ＶＬ）を含むコンプリート培地にて限界希釈し、９６ウェルプレートに播種しクローン化を行った。クローン化は、１回目に陽性と判断したウェル由来のハイブリドーマに対して計３回行った。以上の操作により、６Ｄ１０−１−１抗体、１０Ｄ５−２−３抗体及び３Ｂ７−３−３抗体を産生するハイブリドーマ株を単離した。【０３０８】
７−７）ハイブリドーマのｅＲＤＦ培地への馴化
抗体を大量取得するため、ハイブリドーマの培地をコンプリート培地からｅＲＤＦ培地［Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）１ｖ／ｖ％、Ｔｒａｎｓｆｅｌｉｎ  ５μｇ／ｍＬ、インシュリン  ５μｇ／ｍＬ、エタノールアミン  １０μｍｏｌ／Ｌ、及びＳｏｄｉｕｍ  Ｓｅｌｅｎｉｔｅ  ２５ｎｍｏｌ／Ｌを含むｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬製）］に、段階的に置換し、ハイブリドーマ細胞のｅＲＤＦ培地への馴化を行った。【０３０９】
７−８）ハイブリドーマからの抗体の大量取得
実施例７−８で馴化したハイブリドーマを、細胞密度１〜２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬでローラーボトル（８５０ｃｍ２、ＢＤサイエンス社製）１００本に播種した。培地にはｅＲＤＦ培地を用いた。播種したローラーボトルをローラーボトル回転培養機で転回させながら、３７℃で６−８日間培養した後、細胞を含む培地を回収した。回収した培地を遠心分離し、得られた培養上清を０．２２μｍフィルターによりろ過した。【０３１０】
フィルターでろ過した培養上清から、Ｐｒｏｔｅｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を充填したオープンカラムを用いて、抗ヒトＢＭＰ９抗体を精製した。得られた抗体は、０．２２μｍフィルターを用いて滅菌した後、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験に供した。【０３１１】
［実施例８］
固相抗原を用いた酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）による取得抗体の特異性の評価
取得した抗体のヒトＢＭＰ９への特異性を確かめるため、ヒトＢＭＰ９及びヒトＢＭＰ９とホモロジーが最も高い分子であるヒトＢＭＰ１０への結合性を比較する実験を行った。まず、９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４４２４０４）に、ヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換えタンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃３２０９−ＢＰ）、又はヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ１０組換えタンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製Ｃａｔ＃２９２６−ＢＰ）を、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９１−０１３０５）で１００ｎｇ／ｍＬに調製したものを５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置して吸着させた。【０３１２】
固相化液を取り除いた後、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、Ｃａｔ＃３７５３５）を２００μＬ／ウェル加え、室温で１時間静置してブロッキングし、ＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｗｅｅｎ  ２０；ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ社製、ＳＣ−２４９５３）で３回洗浄した。【０３１３】
次に、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（コスモ・バイオ社製、Ｃａｔ＃ＬＫ０３）を用いてビオチン標識した６Ｄ１０−１−１抗体、１０Ｄ５−２−３抗体、３Ｂ７−３−３抗体、Ｒ＆Ｄ抗体、又は抗ＢＭＰ１０抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃ＭＡＢ２９２６）を、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋとＴＢＳＴを１：９の割合で混合した１０％  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ＴＢＳＴで１００ｎｇ／ｍＬに調製した後、一次抗体として５０μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置した。【０３１４】
このプレートをＴＢＳＴで３回洗浄した後、１０％  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ＴＢＳＴで５００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｏｌｙＨＲＰ８０（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｃａｔ＃ＳＰ８０Ｄ５０）を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置した。【０３１５】
このプレートをＴＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＢ基質液（ＴＭＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ、Ｄａｋｏ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１５９９）を５０μＬ／ウェル添加して発色させ、適当な発色が得られたところで、１Ｎ  硫酸溶液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９２−０４７５５）を５０μＬ／ウェル添加し、サンプル波長４５０ｎｍ、リファレンス波長５７０ｎｍにおける吸光度（４５０ｎｍ−５７０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。【０３１６】
結果を図２に記載する。図２に示すように、６Ｄ１０−１−１抗体、１０Ｄ５−２−３抗体及び３Ｂ７−３−３抗体は、Ｒ＆Ｄ抗体と同様に、ヒトＢＭＰ９に強く結合すること、またヒトＢＭＰ１０には結合しないことが示された。この結果は、６Ｄ１０−１−１抗体、１０Ｄ５−２−３抗体及び３Ｂ７−３−３抗体が、ヒトＢＭＰ９に特異的に結合する抗体であることを示している。【０３１７】
［実施例９］
取得抗体のヒトＢＭＰ９組換えタンパク質に対する結合性の評価
取得された抗ヒトＢＭＰ９抗体のヒトＢＭＰ９への結合活性を測定するために、以下の実験を行った。【０３１８】
まず、９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３９４５４）に、ヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換えタンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃３２０９−ＢＰ）を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３緩衝液で１００ｎｇ／ｍＬに調製したものを５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置して吸着させた。【０３１９】
固相化液を取り除いた後、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、Ｃａｔ＃３７５３５）を２００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間静置してブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗浄した。次に、ビオチン標識した６Ｄ１０−１−１抗体、１０Ｄ５−２−３抗体、３Ｂ７−３−３抗体又はＲ＆Ｄ抗体を、１０％  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ＴＢＳＴでそれぞれ１、５、２０、１００、３００ｎｇ／ｍＬになるように調製したものを、それぞれ５０μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置した。【０３２０】
このプレートをＴＢＳＴで３回洗浄した後、１０％  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ＴＢＳＴで５００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｏｌｙＨＲＰ８０を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置した。【０３２１】
このプレートをＴＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＢ基質液（ＴＭＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ、Ｄａｋｏ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１５９９）を５０μＬ／ウェル添加して発色させ、適当な発色が得られたところで１Ｎ  硫酸溶液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９２−０４７５５）を５０μＬ／ウェル添加し、サンプル波長４５０ｎｍ、リファレンス波長５７０ｎｍにおける吸光度（４５０ｎｍ−５７０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。【０３２２】
結果を図３に記載する。図３に示すように、６Ｄ１０−１−１抗体、１０Ｄ５−２−３抗体及び３Ｂ７−３−３抗体は、Ｒ＆Ｄ抗体と同様に、抗体濃度が高くなるに従ってヒトＢＭＰ９に結合した。さらに６Ｄ１０−１−１抗体及び１０Ｄ５−２−３抗体のヒトＢＭＰ９に対する結合活性はＲ＆Ｄ抗体に比して高いことが明らかとなった。【０３２３】
［実施例１０］
ヒトＢＭＰ９とＲ＆Ｄ抗体の結合に対する取得抗体の作用
実施例７で用いた系の特徴より、取得抗体はｈｓＡＬＫ１−Ｆｃとヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換えタンパク質の相互作用、もしくはヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換えタンパク質とＲ＆Ｄ抗体の相互作用のいずれかを阻害する抗体であると考えられる。そこで、まず、ヒトＢＭＰ９とＲ＆Ｄ抗体の結合アッセイ系を構築した。【０３２４】
９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３９４５４）に、実施例７−１で調製したヒトＢＭＰ９組換えタンパク質を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３緩衝液で１００ｎｇ／ｍＬに調製したものを１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置して吸着させた。固相化液を取り除いた後、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋを２５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間静置しブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。【０３２５】
次に、１０％  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔでそれぞれ１００〜３０００ｎｇ／ｍＬに調製した取得抗体及び５０ｎｇ／ｍＬのビオチン標識したＲ＆Ｄ抗体を含む溶液を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置した。このプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、１０％  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔで５００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｏｌｙＨＲＰ８０（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｃａｔ＃ＳＰ８０Ｄ５０）を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で３０分〜１時間静置した。【０３２６】
このプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＴＭＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ、Ｄａｋｏ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１５９９）を１００μＬ／ウェル添加して発色させ、適当な発色が得られたところで、１Ｎ硫酸溶液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９２−０４７５５）を１００μＬ／ウェル添加し、ＡＲＶＯ（パーキンエルマー社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図４に記載する。【０３２７】
図４に示すように、ヒトＢＭＰ９とビオチン標識Ｒ＆Ｄ抗体の結合は、非標識のＲ＆Ｄ抗体の添加で阻害され、１０Ｄ５−２−３抗体又は６Ｄ１０−１−１抗体の添加でも、阻害された。一方、３Ｂ７−３−３抗体では阻害は認められなかった。【０３２８】
この結果は、１０Ｄ５−２−３抗体及び６Ｄ１０−１−１抗体のヒトＢＭＰ９認識部位（エピトープ）は、Ｒ＆Ｄ抗体の認識部位と同じか、もしくはその近傍であり、３Ｂ７−３−３抗体のヒトＢＭＰ９認識部位（エピトープ）は、Ｒ＆Ｄ抗体の認識部位とは異なることを示唆している。【０３２９】
また阻害活性がＲ＆Ｄ抗体と比してより低濃度より認められたことより、１０Ｄ５−２−３抗体及び６Ｄ１０−１−１抗体のヒトＢＭＰ９に対する結合活性（アフィニティー）はＲ＆Ｄ抗体と比して高いことが明らかとなった。【０３３０】
［実施例１１］
ヒトＢＭＰ９とヒトＡＬＫ１の結合に対する取得抗体の作用
次に、ヒトＢＭＰ９とヒトＡＬＫ１の結合アッセイ系を構築した。
９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３９４５４）に、実施例７−１で調製したヒトＢＭＰ９組換えタンパク質を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３緩衝液で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したものを１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置して吸着させた。【０３３１】
固相化液を取り除いた後、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋを２５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間静置しブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次に、１０％  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔでそれぞれ１００、１０００又は１００００ｎｇ／ｍＬに調製した取得抗体もしくはＲ＆Ｄ抗体、及び１００ｎｇ／ｍＬのビオチン標識したｈｓＡＬＫ１−Ｆｃタンパク質を含む溶液を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置した。【０３３２】
このプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、１０％  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔで５００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｏｌｙＨＲＰ８０（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｃａｔ＃ＳＰ８０Ｄ５０）を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で３０分〜１時間静置した。【０３３３】
このプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＴＭＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ、Ｄａｋｏ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１５９９）を１００μＬ／ウェル添加して発色させ、適当な発色が得られたところで、１Ｎ硫酸溶液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９２−０４７５５）を１００μＬ／ウェル添加し、ＡＲＶＯ（パーキンエルマー社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０３３４】
１００、１０００又は１００００ｎｇ／ｍＬ濃度の３Ｂ７−３−３抗体は、ヒトＢＭＰ９とヒトＡＬＫ１との結合をそれぞれ１０．３％、２９．２％、６４％と阻害したのに対し、６Ｄ１０−１−１抗体、１０Ｄ５−２−３抗体及びＲ＆Ｄ抗体は、最高用量の１００００ｎｇ／ｍＬ濃度の添加においても、阻害しなかった。【０３３５】
以上の結果から、３Ｂ７−３−３抗体はヒトＢＭＰ９とヒトＡＬＫ１との結合を阻害する抗ＢＭＰ９抗体であるのに対し、６Ｄ１０−１−１抗体、１０Ｄ５−２−３抗体及びＲ＆Ｄ抗体は、ヒトＢＭＰ９とヒトＡＬＫ１との結合を阻害しない抗ＢＭＰ９抗体であることが明らかとなった。【０３３６】
［実施例１２］
ヒトＢＭＰ９とヒトＢＭＰＲＩＩの結合に対する取得抗体の作用
ＢＭＰ９の受容体はＢＭＰタイプＩ受容体とＢＭＰタイプＩＩ受容体から構成され、ＢＭＰ９はそれら両方のタイプの受容体に結合することが知られている。実施例１１から、１０Ｄ５−２−３抗体、６Ｄ１０−１−１抗体及びＲ＆Ｄ抗体は、ヒトＢＭＰ９とヒトＡＬＫ１の結合を阻害しないことが明らかとなり、これらの抗体は、ＢＭＰ９とＢＭＰタイプＩ受容体の結合を阻害しないことが示唆された。【０３３７】
次に、これらの抗体がＢＭＰ９とＢＭＰタイプＩＩ受容体の結合を阻害するか検討するため、ヒトＢＭＰ９とヒトＢＭＰ９タイプＩＩ受容体のひとつであることが知られているヒトＢＭＰＲＩＩとの結合アッセイ系を構築した。【０３３８】
９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３９４５４）に実施例７−１で調製したヒトＢＭＰ９組換えタンパク質を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３緩衝液で３μｇ／ｍＬに調製したものを、１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置して吸着させた。固相化液を取り除いた後、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋを２６０μＬ／ウェル加え、室温で１時間静置しブロッキングし、ＴＢＳＴで４回洗浄した。【０３３９】
次に、１０％  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ＴＢＳＴで１０００ｎｇ／ｍＬに調製した取得抗体、Ｒ＆Ｄ抗体もしくは陰性対照マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製、Ｘ０９３１）及び３μｇ／ｍＬに調製したＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ（ヒトＢＭＰＲＩＩの細胞外領域とヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域のフュージョン組換えタンパク質、Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を含む１０％  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ＴＢＳＴ溶液を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置した。【０３４０】
このプレートをＴＢＳＴで４回洗浄した後、１０％  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  ｉｎ  ＴＢＳＴで２００００倍希釈したＧｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で３０分〜１時間静置した。【０３４１】
このプレートをＴＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＴＭＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ、Ｄａｋｏ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１５９９）を１００μＬ／ウェル添加して発色させ、適当な発色が得られたところで、１Ｎ硫酸溶液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９２−０４７５５）を１００μＬ／ウェル添加し、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図５に記載する。【０３４２】
図５に示すように、ヒトＢＭＰ９とヒトＢＭＰＲＩＩの結合は、６Ｄ１０−１−１抗体、１０Ｄ５−２−３抗体及びＲ＆Ｄ抗体によって阻害されたことから、これらの抗体は、ＢＭＰ９とＢＭＰＲＩＩ受容体の結合を阻害する抗ヒトＢＭＰ９抗体であることが明らかとなった。【０３４３】
［実施例１３］
取得抗体のヒトＢＭＰ９組換えタンパク質に対する結合活性（ビアコア解析）
取得抗体のヒトＢＭＰ９組換えタンパク質に対する結合活性（アフィニティー）をＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて検討した。Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、抗マウスＩｇＧ抗体をセンサーチップＣＭ５上に固定化した後、抗ヒトＢＭＰ９抗体をＲＵ値として７００−１１００になるように結合させた。【０３４４】
その後、実施例７−１で調製したヒトＢＭＰ９組換えタンパク質をＨＢＳ−ＥＰ溶液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて０．１５２ｎｍｏｌ／Ｌ、０．４５７ｎｍｏｌ／Ｌ、１．３７ｎｍｏｌ／Ｌ、４．１ｎｍｏｌ／Ｌ、１２．３ｎｍｏｌ／Ｌ、３６．８９ｎｍｏｌ／Ｌ、１１０．６７ｎｍｏｌ／Ｌ、３２２ｎｍｏｌ／Ｌの濃度に調製したものをアナライトとして添加し、結合強度を測定した。【０３４５】
結合解離定数（Ｋｄ値）は、得られた値を基にシングルサイクルカイネティクス算出法（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒ．３、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にて算出した。結果を表１に記載する。【０３４６】
【表１】
2014007198.tif 000002
【０３４７】
表１に示すように、Ｒ＆Ｄ抗体のＫｄ値は、６．１６×１０−１０ｍｏｌ／Ｌであったのに対し、６Ｄ１０−１−１抗体、１０Ｄ５−２−３抗体のＫｄ値は、それぞれ２．９７×１０−１１ｍｏｌ／Ｌ、９．６９×１０−１２ｍｏｌ／Ｌを示し、６Ｄ１０−１−１抗体及び１０Ｄ５−２−３抗体のヒトＢＭＰ９への結合活性は、Ｒ＆Ｄ抗体に比して、２０．７倍、６３．６倍と著しく高いものであることが明らかとなった。また、以上の結果は、実施例９及び１０の結果と矛盾しないものであった。【０３４８】
［実施例１４］
正常Ｂａｌｂ／ｃマウスの赤血球造血に対する取得抗体の作用（短期投与）
実施例９で明らかとなったように、６Ｄ１０−１−１抗体及び１０Ｄ５−２−３抗体は、ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ２量体に結合する抗体である。配列番号６７で表される、ヒトＢＭＰ９のｍａｔｕｒｅ領域１１０アミノ酸のうち、マウスＢＭＰ９は１０６アミノ酸、ラットＢＭＰ９は１０４アミノ酸が完全一致することから、ＢＭＰ９は種間の保存性が非常に高いことが知られている。従って、これらの抗体は、げっ歯類のＢＭＰ９にヒトＢＭＰ９と同様に結合することが推測される。【０３４９】
そこで、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて６Ｄ１０−１−１抗体及び１０Ｄ５−２−３抗体の赤血球造血に対する作用を評価した。６週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー社製）を購入し、実験に供した。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料ＦＲ−２（フナバシファーム社製）を自由摂取で与えた。【０３５０】
予備飼育後、体重を指標にして、７群に群分けし（各群ｎ＝６）、６Ｄ１０−１−１抗体、１０Ｄ５−２−３抗体及びＲ＆Ｄ抗体を１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇの投与量になるように皮下投与した。具体的には、各々の抗体を生理食塩水にて０．１ｍｇ／ｍＬ又は０．３ｍｇ／ｍＬになるように調製したものを１０ｍＬ／ｋｇの用量にて投与した。媒体群には生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇの用量にて皮下投与した。【０３５１】
抗体又は媒体は、週１回の頻度で計２回投与した。初回投与から２週間後、イソフルラン麻酔下にて開腹後、後大静脈より採血を行い、ＥＤＴＡ入り採血管に加えて血液サンプルとした。【０３５２】
得られた血液サンプルについて、全自動血球計数器Ｃｅｌｌｔａｃ  α（日本光電社製）を用いて、血球数及びヘモグロビン濃度を測定した。結果を図６Ａと図６Ｂに記載する。【０３５３】
図６Ａおよび図６Ｂに示すように、赤血球数及びヘモグロビン濃度は、いずれの抗ヒトＢＭＰ９抗体の投与によっても増加し、抗ヒトＢＭＰ９抗体に赤血球造血作用があることが見出された。Ｒ＆Ｄ抗体は、投与量１ｍｇ／ｋｇと３ｍｇ／ｋｇともに、ほぼ同程度の赤血球数及びヘモグロビン濃度の増加を示したことから、Ｒ＆Ｄ抗体の最大活性は投与量１ｍｇ／ｋｇ以下であることが分かった。なお、最大活性を示す投与量１ｍｇ／ｋｇにおけるヘモグロビン濃度の増加は、約０．７ｇ／ｄＬであった。【０３５４】
一方、６Ｄ１０−１−１抗体、１０Ｄ５−２−３抗体は、Ｒ＆Ｄ抗体の約２倍の最大活性を示し、特にヘモグロビン濃度の増加は、約１．５−２ｇ／ｄＬ程度認められた。以上の結果より、６Ｄ１０−１−１抗体及び１０Ｄ５−２−３抗体は、ＢＭＰ９に対する結合活性だけでなく、赤血球造血作用においても、Ｒ＆Ｄ抗体を凌駕する抗体であることが示された。【０３５５】
［実施例１５］
正常ＢＡＬＢ／ｃマウス赤血球造血に対する取得抗体の作用（長期投与）
ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて、６Ｄ１０−１−１体及び１０Ｄ５−２−３抗体の赤血球造血に対する長期投与の効果を検討した。６週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー社製）を購入し、実験に供した。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料ＦＲ−２（フナバシファーム社製）を自由摂取で与えた。【０３５６】
予備飼育後、体重を指標にして、３群に群分けし（各群ｎ＝８）、高脂肪食（ＨＦＤ−３２；日本クレア社製）の自由摂取に切り替えた。次に、６Ｄ１０−１−１抗体及び１０Ｄ５−２−３抗体を、１ｍｇ／ｋｇの投与量になるように皮下投与した。具体的には、各々の抗体を生理食塩水にて０．１ｍｇ／ｍＬになるように調製したものを１０ｍＬ／ｋｇの用量にて投与した。媒体群には生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇの用量にて皮下投与した。【０３５７】
抗体又は媒体は、週１回の頻度で計８回投与した。初回投与から８週間後、イソフルラン麻酔下にて、開腹後、後大静脈より採血を行い、一部をＥＤＴＡ入り採血管に加えて血液サンプルとし、残りを血清サンプルとした。【０３５８】
得られた血液サンプルについて、全自動血球計数器Ｃｅｌｌｔａｃ  α（日本光電社製）を用いて、血球数及びヘモグロビン濃度を測定した。結果を図７Ａと図７Ｂに記載する。【０３５９】
図７Ａおよび図７Ｂに示すように、赤血球数及びヘモグロビン濃度は、６Ｄ１０−１−１抗体又は１０Ｄ５−２−３抗体の投与により有意に増加し、６Ｄ１０−１−１抗体及び１０Ｄ５−２−３抗体は、短期だけでなく、長期投与（２ヶ月間投与）によっても、持続的な赤血球造血作用を示すことが確認された。なお、体重に対する影響は、いずれの抗体ともに認められなかった。【０３６０】
次に、抗ヒトＢＭＰ９抗体の赤血球造血作用が、赤血球増加因子である血中エリスロポエチン（ＥＰＯ）を介したものであるか否かを確認するため、得られた血清サンプルを用いて血中ＥＰＯ濃度を測定した。測定にはＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｔｉｎ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を用いた。結果を図８に記載する。【０３６１】
図８に示すように、血中ＥＰＯ濃度は、抗ヒトＢＭＰ９抗体投与により減少傾向のみで有意な変化は観察されなかった。従って、抗ヒトＢＭＰ９抗体の赤血球造血作用はＥＰＯ産生上昇を介したものではない可能性が示された。【０３６２】
［実施例１６］
種々のマウス系統の赤血球造血に対する抗ヒトＢＭＰ９抗体の作用
ＢＡＬＢ／ｃ以外の系統のマウスを用いて、１０Ｄ５−２−３抗体の赤血球造血に対する作用を検討した。ＢＡＬＢ／ｃ以外の系統として、ＣＢＡ／Ｊ及びＩＣＲマウスを用いた。いずれも７週齢の雄性マウス（日本チャールズリバー社製）を購入し、実験に供した。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料ＦＲ−２（フナバシファーム社製）を自由摂取で与えた。【０３６３】
予備飼育後、体重を指標にして、２群に群分けし（各群ｎ＝６）、１０Ｄ５−２−３抗体を、１ｍｇ／ｋｇの投与量になるように皮下投与した。具体的には、生理食塩水にて０．１ｍｇ／ｍＬになるように調製した１０Ｄ５−２−３抗体を１０ｍＬ／ｋｇの用量にて投与した。媒体群には生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇの用量にて皮下投与した。【０３６４】
抗体又は媒体は、週１回の頻度で計２回投与した。初回投与から１４日後、イソフルラン麻酔下にて、開腹後、後大静脈より採血を行い、一部をＥＤＴＡ入り採血管に加えて血液サンプルとし、残りを血清サンプルとした。【０３６５】
得られた血液サンプルについて、全自動血球計数器Ｃｅｌｌｔａｃ  α（日本光電社製）を用いて、血球数及びヘモグロビン濃度を測定した。その結果、赤血球数（×１０４／μＬ）は、ＢＡＬＢ／ｃ、ＣＢＡ／Ｊ及びＩＣＲにおいて、媒体群はそれぞれ９５８±８．０、７８９±２５．３及び７１７±２２．９（平均値±標準誤差）であったのに対し、１０Ｄ５−２−３抗体投与群は、それぞれ１０２８±１８．１、８５３±８．１及び７７７±１３．２（平均値±標準誤差）であり、１０Ｄ５−２−３抗体投与により、それぞれ７０、６４及び６０増加した。【０３６６】
また、ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄＬ）は、ＢＡＬＢ／ｃ、ＣＢＡ／Ｊ及びＩＣＲにおいて、媒体群はそれぞれ１５．４±０．１６、１２．９±０．１３及び１３．１±０．５０（平均値±標準誤差）であったのに対し、１０Ｄ５−２−３抗体投与群ではそれぞれ１６．６±０．２６、１３．６±０．１３及び１３．７±０．２５（平均値±標準誤差）であり、１０Ｄ５−２−３抗体投与により、それぞれ１．２、０．７及び０．６増加した。【０３６７】
１０Ｄ５−２−３抗体の赤血球造血作用は、いずれの系統においても認められたことより、抗ヒトＢＭＰ９抗体の赤血球造血作用は系統を超えた作用であることが示唆された。【０３６８】
次に、１０Ｄ５−２−３抗体の赤血球造血作用が、ＥＰＯ増加を介したものかであるか否かを確認するため、得られた血清サンプルを用いて血中ＥＰＯ濃度を測定した。測定にはＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｔｉｎ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を用いた。【０３６９】
血中ＥＰＯ濃度（ｐｇ／ｍＬ）は、ＢＡＬＢ／ｃ、ＣＢＡ／Ｊ及びＩＣＲにおいて、媒体群はそれぞれ８８．５±８．７、１８１．２±２８．５及び２９１．５±１０６．４（平均値±標準誤差）であったのに対し、１０Ｄ５−２−３抗体投与群は、それぞれ７７．６±５．７、１２６．１±２０．１及び２３６．２±４６．１（平均値±標準誤差）であり、１０Ｄ５−２−３抗体投与により、それぞれ１０．９、５５．１及び５５．３減少した。【０３７０】
このことより、１０Ｄ５−２−３抗体の赤血球造血作用はＥＰＯ産生上昇を介したものではないことが、実施例１５同様に示唆された。【０３７１】
［実施例１７］
正常ラットの赤血球造血に対する取得抗体の作用
Ｗｉｓｔａｒラットを用いて、６Ｄ１０−１−１抗体及び１０Ｄ５−２−３抗体のラットの赤血球造血に対する作用を評価した。５週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒラット（日本クレア社製）を購入し、実験に供した。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料ＦＲ−２（フナバシファーム社製）を自由摂取で与えた。【０３７２】
予備飼育後、体重を指標にして、４群に群分けし（各群ｎ＝６）、６Ｄ１０−１−１抗体、１０Ｄ５−２−３抗体及びＲ＆Ｄ抗体を１ｍｇ／ｋｇの投与量になるように皮下投与した。具体的には、各々の抗体を生理食塩水にて０．５ｍｇ／ｍＬになるように調製したものを２ｍＬ／ｋｇの用量にて投与した。媒体群には生理食塩水を２ｍＬ／ｋｇの用量にて皮下投与した。【０３７３】
抗体又は媒体は、週１回の頻度で計２回投与した。初回投与から２週間後、イソフルラン麻酔下にて、開腹後、腹大動脈より採血を行い、一部をＥＤＴＡ入り採血管に加えて血液サンプルとし、残りを血清サンプルとした。【０３７４】
得られた血液サンプルについて、全自動血球計数器Ｃｅｌｌｔａｃ  α（日本光電社製）を用いて、血球数及びヘモグロビン濃度を測定した。結果を図９Ａと図９Ｂに示す。【０３７５】
図９Ａおよび図９Ｂに示すように、赤血球数及びヘモグロビン濃度は、いずれの抗ヒトＢＭＰ９抗体の投与によっても増加し、抗ヒトＢＭＰ９抗体の赤血球造血作用は、マウスだけでなく、ラットにおいても認められることが明らかとなった。また６Ｄ１０−１−１抗体及び１０Ｄ５−２−３抗体の赤血球造血作用は、マウスと同様、ラットでも、Ｒ＆Ｄ抗体と比して強い傾向が認められた。【０３７６】
［実施例１８］
腎不全ラットの貧血に対する抗ヒトＢＭＰ９抗体の作用
Ｗｉｓｔａｒラットに５／６腎摘手術を施した腎不全ラットを用いて、６Ｄ１０−１−１抗体及び１０Ｄ５−２−３抗体の腎性貧血に対する作用を検討した。５週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒラット（日本クレア社製）を購入し、実験に供した。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料ＦＲ−２（フナバシファーム社製）を自由摂取で与えた。【０３７７】
予備飼育後、まず、ペントバルビタール麻酔下にて左側背部を切開し、左腎臓を露出して腎臓の２／３を切除した。腎切除部からの出血がなくなったことを確認した後、切開部を縫合した。１週間後、同ラットをペントバルビタ−ル麻酔下にて、右側背部を切開し、右腎臓を結紮後、右腎臓を摘出することにより、５／６腎摘ラットを作製した。正常対照群として設定した偽手術ラットには、背部切開、縫合手術のみを施した。【０３７８】
５／６腎摘ラット作製２週間後、各ラットから無麻酔下で尾静脈より採血し、一部をＥＤＴＡ入り採血管に加えて血液サンプルとし、残りを血清サンプルとした。【０３７９】
得られた血液サンプルについて、全自動血球計数器Ｃｅｌｌｔａｃ  α（日本光電製）を用いて、血球数及びヘモグロビン濃度を測定した。【０３８０】
次に、得られた血清サンプルについて、日立自動分析装置７１７０（日立社製）を用いて、尿素窒素（ＢＵＮ）濃度及びクレアチニン濃度を測定した。【０３８１】
得られた赤血球値、ヘモグロビン濃度、ＢＵＮ濃度、クレアチニン濃度を基に、各群の平均値ができるだけ均等になるように、３群に群分けし（各群ｎ＝８）、６Ｄ１０−１−１抗体及び１０Ｄ５−２−３抗体を１ｍｇ／ｋｇの投与量になるように皮下投与した。【０３８２】
具体的には、各々の抗体を生理食塩水にて０．５ｍｇ／ｍＬになるように調製したものを、２ｍＬ／ｋｇの用量にて投与した。媒体群には生理食塩水を２ｍＬ／ｋｇの用量にて投与した。さらに、正常対照としての媒体投与偽手術ラット群（ｎ＝５）には生理食塩水を２ｍＬ／ｋｇの用量にて投与した。【０３８３】
抗体又は媒体は、週１回の頻度で投与した。初回投与から２週間、４週間、６週間及び８週間後に尾静脈より採血を行い、一部をＥＤＴＡ入り採血管に加えて血液サンプルとし、残りを血清サンプルとした。【０３８４】
得られた血液サンプルについて、全自動血球計数器Ｃｅｌｌｔａｃ  α（日本光電社製）を用いて、血球数及びヘモグロビン濃度を測定した。結果を図１０Ａと図１０Ｂに示す。また、５／６腎摘ラット媒体投与群に対する各種抗体投与群の測定値の統計学的有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて解析し、Ｐ＜０．０５を有意とした。【０３８５】
図１０Ａおよび図１０Ｂに示すように、媒体投与５／６腎摘群の赤血球数及びヘモグロビン濃度は、媒体投与偽手術ラット群に比して、０週から８週までの全ての実験期間において減少した。一方、６Ｄ１０−１−１抗体又は１０Ｄ５−２−３抗体を投与された５／６腎摘群の赤血球数及びヘモグロビン濃度は、抗体投与後２週以降８週まで、６１０Ｄ−１−１抗体の抗体投与後６週のサンプルを除き、媒体投与５／６腎摘群に比して有意に増加した。なお、いずれの抗体も体重に対して影響を与えなかった。【０３８６】
この結果より、６Ｄ１０−１−１抗体及び１０Ｄ５−２−３抗体に腎性貧血に対する改善作用があることが明らかになった。【０３８７】
［実施例１９］
抗ヒトＢＭＰ９モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子配列の単離
１９−１）抗ヒトＢＭＰ９モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞からの総ＲＮＡの調製
実施例７に記載の６Ｄ１０−１−１抗体、１０Ｄ５−２−３抗体及び３Ｂ７−３−３抗体を産生するハイブリドーマ  １×１０６個より、ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、Ｃａｔ＃７４１０４）及びＱＩＡ  ｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製、Ｃａｔ＃７９６５４）を用いて、総ＲＮＡを調製した。
１９−２）抗ヒトＢＭＰ９モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬの遺伝子クローニング【０３８８】
実施例１９−１で取得した各ハイブリドーマの総ＲＮＡ  １μｇから、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、Ｃａｔ＃６３４９２４）を用いて、ｃＤＮＡを作製した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、キット添付のユニバーサルプライマーＡ  ｍｉｘ（フォワードプライマーを含有する）と、マウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする特異的な異なる２種のリバースプライマーを組み合わせて使用することで、ＶＨのｃＤＮＡ配列決定を行った。【０３８９】
具体的には、マウスＩｇＧ１に特異的なプライマー（配列番号１７及び１８）、マウスＩｇＧ２ａに特異的なプライマー（配列番号１９及び２０）、マウスＩｇＧ２ｂに特異的なプライマー（配列番号２１及び２２）、マウスＩｇＧ２ｃに特異的なプライマー（配列番号２３）、又はマウスＩｇＧ３に特異的なプライマー（配列番号２４及び２５）を用いてそれぞれユニバーサルプライマーＡと組み合わせることでＰＣＲ反応を行い、各抗体のＶＨのｃＤＮＡ断片を増幅した。【０３９０】
また、マウスＩｇ（κ）特異的なプライマー（配列番号２６及び２７）又は、マウスＩｇ（λ）特異的なプライマー（配列番号２８及び２９）を同様に用いてそれぞれユニバーサルプライマーＡと組み合わせることでＰＣＲを行い、各抗体のＶＬのｃＤＮＡ断片を増幅した。【０３９１】
ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、７２℃で３分間からなる反応サイクルを５回、９４℃で３０秒間、７０℃で３０秒間、７２℃で３分間からなる反応サイクルを５回、９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で３分間からなる反応サイクルを２５回行った。【０３９２】
アガロースゲル電気泳動を行った結果、６Ｄ１０−１−１抗体、１０Ｄ５−２−３産生及び３Ｂ７−３−３抗体ハイブリドーマ由来のｃＤＮＡは、ＩｇＧ１重鎖定常領域をコードする特異的プライマーを用いたときにＰＣＲ増幅産物が得られた。【０３９３】
また、両ハイブリドーマ由来のｃＤＮＡは、マウスＩｇ（κ）特異的プライマーを用いたときにもＰＣＲ増幅産物が得られた。それぞれのＰＣＲ増幅産物をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＥＸ  ＩＩ、ＱＩＡＧＥＮ社製、Ｃａｔ＃２００２１）を用いて精製した。【０３９４】
得られた遺伝子断片を、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  ＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（インビトロジェン社製、Ｃａｔ＃Ｋ２８７５４０ＳＰ）を用い、ｐＣＲ４ベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。【０３９５】
得られたプラスミドを、大腸菌ＤＨ５α株に導入した。得られた形質転換体より自動プラスミド抽出機（クラボウ社製）を用いてプラスミドを抽出し、塩基配列を解析した。その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する完全長のＶＨ  ｃＤＮＡ、及びＶＬ  ｃＤＮＡが取得されたことを確認した。【０３９６】
１９−３）抗ヒトＢＭＰ９モノクローナル抗体Ｖ領域の遺伝子配列の解析
実施例１９−２で得られた６Ｄ１０−１−１抗体、１０Ｄ５−２−３抗体、３Ｂ７−３−３抗体のＶＨの全塩基配列を配列番号３０、３１、３２に、該配列から推定された、シグナル配列を含んだＶＨの全アミノ酸配列を配列番号３３、３４、３５に、ＶＬの全塩基配列を配列番号３６、３７、３８に、該配列から推定された、シグナル配列を含んだＶＬの全アミノ酸配列を配列番号３９、４０、４１にそれぞれ示す。【０３９７】
また、配列番号３０、３１、３２からシグナル配列を除いた塩基配列を配列番号４２、４３、４４に、配列番号３６、３７、３８からシグナル配列を除いた塩基配列を配列番号４５、４６、４７に、配列番号３３、３４、３５からシグナル配列を除いたアミノ酸配列を配列番号４８、４９、５０に、配列番号３９、４０、４１からシグナル配列を除いたアミノ酸配列を配列番号５１、５２、５３にそれぞれ示す。【０３９８】
既知のマウス抗体の配列データ［ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］との比較から、単離した各々のｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含む６Ｄ１０−１−１抗体、１０Ｄ５−２−３抗体、３Ｂ７−３−３抗体をコードする完全長ｃＤＮＡであることが確認できた。【０３９９】
各モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。６Ｄ１０−１−１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号５４、５５及び５６に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号５７、５８及び５９にそれぞれ示す。【０４００】
１０Ｄ５−２−３抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号６０、６１及び６２に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号６３、６４及び６５にそれぞれ示す。【０４０１】
［実施例２０］
取得抗体のエピトープ解析
２０−１）取得抗体の組換え発現
６Ｄ１０−１−１、１０Ｄ５−２−３抗体の軽鎖、重鎖可変領域（シグナル配列含む）の塩基配列を、それぞれマウス軽鎖（κ鎖）、重鎖（ＩｇＧ１）定常領域の塩基配列と結合させ、抗体発現用のベクターにサブクローニングした。ＢＭＰ９抗体の可変領域部分の塩基配列の増幅には、実施例１９にて作製したプラスミドを鋳型として、それぞれ配列番号７２〜７９で示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲを行った。【０４０２】
マウス軽鎖（κ鎖）、重鎖（ＩｇＧ１）定常領域部分の塩基配列の増幅は、それぞれ人工遺伝子合成（タカラバイオ社）によって作製された、配列番号８０、８１で示される塩基配列を鋳型として、配列番号８２〜８５で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。【０４０３】
いずれのＰＣＲも、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ（Ｐｒｅｍｉｘ）（タカラバイオ社製、Ｒ０４０Ａ）を用い、９６℃で２分間保温した後、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、及び７２℃で１〜２分間（増幅物のサイズによって調整した）を１サイクルとして３０サイクル反応を行った。得られたＰＣＲ増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、インサートとした。【０４０４】
Ｎ５ＫＧ１ベクター（Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ社）をＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩを用いて酵素処理し、上記と同様の手順にて精製し、インサート挿入用ベクターとした。【０４０５】
６Ｄ１０−１−１抗体の軽鎖可変領域およびマウス軽鎖定常領域のインサートをＩｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて酵素処理したＮ５ＫＧ１ベクターに組み込み、大腸菌に導入した。【０４０６】
得られた形質転換体より、正しい配列が挿入されたクローンを選択した。このプラスミドＤＮＡをＳａｌＩ、ＢａｍＨＩを用いて酵素消化し、上記と同様の手順によって精製した。６Ｄ１０−１−１抗体の重鎖可変領域およびマウス重鎖定常領域のインサートを、既に軽鎖が挿入された上記のベクターに組み込み、大腸菌に導入した。【０４０７】
得られた形質転換体より、正しい配列が挿入されたクローンを選択した。得られた６Ｄ１０−１−１抗体発現ベクターと同様の手順で、１０Ｄ５−２−３抗体の発現ベクターも作製した。軽鎖可変領域は制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＢｓｉＷＩ切断サイト間に、重鎖可変領域は制限酵素ＳａｌＩ、ＮｈｅＩ切断サイト間に挿入した。【０４０８】
作製した６Ｄ１０−１−１抗体または、１０Ｄ５−２−３抗体発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍａｘｉ（タカラバイオ社製）によってベクターを調製した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社製）を用いて一過性発現を行い、組換え抗体を発現させた。培養上清を、遠心分離と０．２２μｍフィルターを用いた濾過により培養液から取得した。【０４０９】
続いて、Ｐｒｏｔｅｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製した。ＮＡＰ−２５カラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いてバッファーをクエン酸バッファー（１０ｍＭ  クエン酸−ＮａＯＨ（ｐＨ  ６．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に置換した。２８０ｎｍの吸光度を測定して濃度を決定した。分子吸光係数として、１．４ｍＬ／（ｍｇ・ｃｍ）を使用した。【０４１０】
２０−２）ヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０キメラタンパク質の作製
ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域のうち、配列番号８６で表されるアミノ酸配列をヒトＢＭＰ９領域Ｃ、ヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域のうち、配列番号１３９で表されるアミノ酸配列をヒトＢＭＰ１０領域Ｃと定義する。【０４１１】
ヒトＢＭＰ９と最も相同性の高い分子はヒトＢＭＰ１０であるが、取得した６Ｄ１０−１−１抗体、１０Ｄ５−２−３抗体およびＲ＆Ｄ抗体はＢＭＰ１０に交差性を持たない。ヒトＢＭＰ９領域Ｃに含まれるアミノ酸残基のうち、ヒトＢＭＰ１０領域Ｃと異なるのは、配列番号６７で表されるヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域において、８０番目Ｓｅｒ、８４番目Ｖａｌ、８７番目Ｌｙｓ、８９番目Ａｓｐ、９０番目Ｍｅｔ、９３番目Ｐｒｏ、９５番目Ｌｅｕ、９７番目Ｔｙｒ、９８番目Ｈｉｓ、１０３番目Ｓｅｒ、１０５番目Ａｌａである。【０４１２】
この領域Ｃの違いに基づいて、ＢＭＰ９のアミノ酸残基を対応するＢＭＰ１０のアミノ酸残基に置換することで、ヒトＢＭＰ９／１０のキメラタンパク質１〜５を設計した。【０４１３】
キメラタンパク質１は、ヒトＢＭＰ９のうち、ｍａｔｕｒｅ領域の８７、８９、及び９３番目のアミノ酸残基を、それぞれ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｖａｌに置き換え、９０番目のアミノ酸残基を欠損させたものである。キメラタンパク質２は、ヒトＢＭＰ９のうち、ｍａｔｕｒｅ領域の８４、９５、９７及び９８番目のアミノ酸残基を、それぞれ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ及びＬｙｓに置き換えたものである。【０４１４】
キメラタンパク質３は、ヒトＢＭＰ９のうち、ｍａｔｕｒｅ領域の８０、１０３及び１０５番目のアミノ酸残基を、それぞれ、Ｇｌｕ、Ａｌａ及びＳｅｒに置き換えたものである。キメラタンパク質４は、ヒトＢＭＰ９のうち、ｍａｔｕｒｅ領域の８４、８７、８９、９３、９５、９７及び９８番目のアミノ酸残基を、それぞれ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ及びＬｙｓに置き換え、９０番目のアミノ酸残基を欠損させたものである。【０４１５】
キメラタンパク質５は、ヒトＢＭＰ９のうち、ｍａｔｕｒｅ領域の８０、８４、９５、９７、９８、１０３及び１０５番目のアミノ酸残基を、それぞれ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｌａ及びＳｅｒに置き換えたものである。キメラタンパク質１〜５における、ヒトＢＭＰ９領域Ｃ及びヒトＢＭＰ１０領域Ｃに相当するアミノ酸配列を配列番号７８〜９１に示す。【０４１６】
国際公開第２０１０／１２６１６９号の実施例１２及び図７に記載のＮ末Ｈｉｓ型ｈＢＭＰ９  ｃｏｍｐｌｅｘ組換え体発現ベクター（以下、ｐＬＮ１Ｖ５＿ヒトＢＭＰ９ベクターと記載）をＳｔｕＩおよびＸｈｏＩを用いて酵素処理し、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。【０４１７】
ヒトＢＭＰ９／１０領域Ｃのキメラタンパク質１〜５は、配列番号９２〜１０１に示すキメラタンパク質作製用プライマーの各Ｆｗｄ、Ｒｖを１／６、２／７、３／８、４／９、５／１０の組み合わせで混合してハイブリダイズさせたものを、精製したベクターにＩｎ−ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製、Ｚ９６４９Ｎ）を用いて挿入し、作製した。【０４１８】
また、ｐＬＮ１Ｖ５＿ヒトＢＭＰ１０ベクターは以下の手順で作製した。ｐＬＮ１Ｖ５＿ヒトＢＭＰ９ベクターをＮｈｅＩおよびＸｈｏＩを用いて酵素処理し、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。【０４１９】
Ｈｕｍａｎ  Ｈｅａｒｔ  ＰＣＲ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社、３３２６）をテンプレートとして、配列番号１０２〜１０５に示すＦｗｄ−１／Ｒｖ−１、Ｆｗｄ−２／Ｒｖ−２のプライマーの組み合わせでＰＣＲを行った。【０４２０】
ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ（Ｐｒｅｍｉｘ）（タカラバイオ社製、Ｒ０４０Ａ）を用い、９６℃で２分間保温した後、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、及び７２℃で２分間を１サイクルとして３２サイクル反応を行った。【０４２１】
得られた２つのＰＣＲ増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、インサートとした。Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、インサートを先に精製したｐＬＮ１Ｖ５ベクターに挿入してサブクローニングを行い、ｐＬＮ１Ｖ５＿ヒトＢＭＰ１０ベクターとした。【０４２２】
配列番号１０６〜１０９に、ヒトＢＭＰ１０とそのｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列および塩基配列を示す。配列番号１１０、１１１に、ｐＬＮ１Ｖ５＿ヒトＢＭＰ１０ベクターによって発現する、Ｎ末にＨｉｓタグを付与したＢＭＰ１０のアミノ酸配列および塩基配列を示す。【０４２３】
前項で作製したｐＬＮ１Ｖ５＿ヒトＢＭＰ１０ベクター、およびｐＬＮ１Ｖ５＿ヒトＢＭＰ９ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍａｘｉ（タカラバイオ社製）によってベクターを調製した。【０４２４】
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社製）を用いて一過性発現を行い、ヒトＢＭＰ９、ヒトＢＭＰ１０、およびヒトＢＭＰ９／１０領域Ｃのキメラタンパク質１〜５を発現させた。【０４２５】
培養上清を、遠心分離と０．２２μｍフィルターを用いた濾過により培養液から取得した。続いて、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて各タンパク質を精製した。Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒとして２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ  ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ４０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを用い、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒとして２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ  ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ２００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを用いた。ＮＡＰ−２５カラム（ＧＥヘルスケア社製、１７−０８５２−０２）を用いて、バッファーをＰＢＳに置換した。【０４２６】
２８０ｎｍの吸光度を測定して各タンパク質溶液の濃度を決定した。分子吸光係数として、ヒトＢＭＰ９、ヒトＢＭＰ１０はそれぞれ１．０５、０．９６ｍＬ／（ｍｇ・ｃｍ）、キメラ１〜５は１．０５５ｍＬ／（ｍｇ・ｃｍ）を使用した。【０４２７】
２０−３）取得抗体のキメラタンパク質に対する特異的結合性
キメラタンパク質を用いて、取得抗体の固相抗原ＥＬＩＳＡを行った。実施例２０−２で調製したヒトＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９／１０キメラ組換えタンパク質を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３緩衝液で３μｇ／ｍＬに調製し、９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４４２４０４）に５０μＬ／ウェル加えて４℃で一晩静置して吸着させた。【０４２８】
固相化液を取り除いた後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを２００μＬ／ウェル加え、室温で１時間静置してブロッキングし、ＰＢＳＴで５回洗浄した。次に、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００ｎｇ／ｍＬに調製した取得抗体（実施例２０−１で作製したもの）、Ｒ＆Ｄ抗体、ＢＭＰ１０抗体（Ｒ＆Ｄ社製、ＭＡＢ２９２６）、ＢＭＰ９ヤギポリクロ抗体（Ｒ＆Ｄ社製、ＡＦ３２０９）、陰性対照マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体（ＭＡＢ００２、ＭＡＢ００４（ともにＲ＆Ｄ社製））を５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間静置した。【０４２９】
このプレートをＰＢＳＴで５回洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２０００倍希釈したＧｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製、Ｐ０４４７）またはＲａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製、Ｐ０１６０）を５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間静置した。【０４３０】
プレートをＰＢＳＴで１０回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＴＭＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ、Ｄａｋｏ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１５９９）を５０μＬ／ウェル添加して発色させ、十分な発色が得られたところで、１Ｎ硫酸溶液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９２−０４７５５）を５０μＬ／ウェル添加し、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて４５０、５７０ｎｍの吸光度を測定した。【０４３１】
結果を表２に記載する。表内の＋および−は、吸光度の値が１以上であった場合を＋とし、１未満であった場合を−とした。
【表２】
2014007198.tif 000003
【０４３２】
表２に示すように、抗原が適当量固相化されていることを確認するために用いたＢＭＰ９ヤギポリクロ抗体については、ヒトＢＭＰ９およびキメラ１〜５のいずれのタンパク質に対しても結合を示し、プレート上に十分な抗原が固相化できていることを確認した。【０４３３】
一方、６Ｄ１０−１−１抗体とＲ＆Ｄ抗体はキメラタンパク質１、キメラタンパク質３に特異的に結合したのに対し、１０Ｄ５−２−３抗体はキメラタンパク質２、キメラタンパク質３、キメラタンパク質５に特異的に結合することが分かった。【０４３４】
これらの結果は、６Ｄ１０−１−１抗体とＲ＆Ｄ抗体はヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域の少なくとも８４番目Ｖａｌ、９５番目Ｌｅｕ、９７番目Ｔｙｒ、９８番目Ｈｉｓに結合すること、１０Ｄ５−２−３抗体はヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域の少なくとも８７番目Ｌｙｓ、８９番目Ａｓｐ、９０番目Ｍｅｔ、９３番目Ｐｒｏに結合することを示している。以上のことから、少なくとも、１０Ｄ５−２−３抗体は、既存のＲ＆Ｄ抗体とは異なるＢＭＰ９のエピトープを認識する抗体であることが明らかとなった。【０４３５】
［実施例２１］
ＢＭＰ９と取得複合体のＢＭＰ１０シグナル阻害作用
実施例１１、１２の結果より、１０Ｄ５−２−３抗体、６Ｄ１０−１−１抗体は、ともに、ヒトＢＭＰ９とヒトＡＬＫ１との結合は阻害せず、ヒトＢＭＰ９とヒトＢＭＰＲＩＩとの結合を特異的に阻害する抗体であることが判明した。【０４３６】
また実施例２０の結果からは、１０Ｄ５−２−３抗体、６Ｄ１０−１−１抗体のＢＭＰ９エピトープが異なることが明らかとなった。ＡＬＫ１レセプターのリガンドとしては、ＢＭＰ９の他、ＢＭＰ１０が知られている。６Ｄ１０−１−１抗体もしくは１０Ｄ５−２−３抗体が結合したＢＭＰ９はＡＬＫ１に結合することにより、ＢＭＰ１０のＡＬＫ１への結合を阻害し、ＢＭＰ１０によるＡＬＫ１シグナルを減弱させる可能性が想定された。【０４３７】
その可能性を検証するため、ヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞株を作製し、ＢＭＰ９と取得抗体複合体のヒトＢＭＰ１０依存性ヒトＡＬＫ１由来シグナルに対する阻害作用を評価した。また同時に両者の認識エピトープの違いによる抗体間での作用の違いについても検証した。【０４３８】
２１−１）ヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞株の作製
ヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞は、国際公開第２０１０／１２６１６９号の実施例２に記載のＢＭＰシグナル検出株［ｐ（ＧＣＣＧ）１２−Ｌｕｃ／ＨｅｐＧ２（３８．５）］に全長ヒトＡＬＫ１遺伝子を強制発現させることにより［ＡＬＫ１／ｐ（ＧＣＣＧ）１２−Ｌｕｃ／ＨｅｐＧ２（３８．５）］、作製した。【０４３９】
ヒトＡＬＫ１発現ベクターは、両端にＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限酵素サイトを持つヒトＡＬＫ１の全長ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化したものを、ｐＥＡＫ８発現ベクター（Ｅｄｇｅｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に組み込むことにより、作製した。ヒトＡＬＫ１の全長ｃＤＮＡ（ｃＤＮＡのＧｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号：ＢＣ０４２６３７．１、配列番号１１２、アミノ酸配列のＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号：ＡＡＨ４２６３７、配列番号７１）は、ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーとプライマー（配列番号１１３、１１４）を用いたＰＣＲにより作製した。【０４４０】
２１−２）ヒトＢＭＰ９と取得抗体からなる複合体のＢＭＰ１０依存性ＡＬＫ１由来シグナルに対する作用
上記の方法により作出したヒトＡＬＫ１レポーター細胞株［ＡＬＫ１／ｐ（ＧＣＣＧ）１２−Ｌｕｃ／ＨｅｐＧ２（３８．５）］を１μｇ／ｍＬのｈｓＡＬＫ１−Ｆｃを含むＤＭＥＭ増殖培地［ＦＣＳを１０％になるように添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］に懸濁し、１．５×１０４個／ウェルになるように９６ウェル白色プレート（パーキンエルマー社製）に播種した。【０４４１】
翌日、ウェル内を２００μＬの血清を含まないＤＭＥＭで洗浄した後、２ｎｇ／ｍＬもしくは１０ｎｇ／ｍＬのヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃３２０９−ＢＰ）および３μｇ／ｍＬの６Ｄ１０−１−１抗体または１０Ｄ５−２−３抗体を含む０．１％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）含有ＤＭＥＭ培地を、１００μＬずつ添加した。【０４４２】
その３０分後、終濃度で０．１，０．３，１．０，３．０，１０ｎｇ／ｍＬになるように０．１％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を用いて調整したヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ１０組換え蛋白質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃２９２６−ＢＰ−０２５５）を５μＬずつ添加し、６時間培養した。６時間後、化学発光試薬［Ｓｔｅａｄｙｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ、プロメガ社製］を５０μＬ添加し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定した。陰性対照ウェルには、０．１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ培地を添加した。結果を図１１に示す。【０４４３】
図１１に示すように、ヒトＢＭＰ９と６Ｄ１０−１−１抗体との複合体は、ＢＭＰ１０依存性ＡＬＫ１由来シグナルに対して抑制的に作用したのに対し、ヒトＢＭＰ９と１０Ｄ５−２−３抗体との複合体は抑制しないことが明らかとなった。ＢＭＰ１０は遺伝子欠損動物を用いた試験により心臓の発生に重要な分子であることが知られており［Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３１（９），２２１９（２００４）］、副作用の観点から、抗ＢＭＰ９抗体としては、心臓形成に重要なＢＭＰ１０シグナルには影響しない抗体であることが求められる。【０４４４】
従って、１０Ｄ５−２−３抗体は、６Ｄ１０−１−１抗体またはＲ＆Ｄ抗体より、副作用の観点において好ましい抗ＢＭＰ９抗体であることが示唆された。【０４４５】
［実施例２２］
１０Ｄ５−２−３キメラ抗体（ｃ１０Ｄ５−２−３抗体）及びヒト化抗体の作製
２２−１）１０Ｄ５−２−３ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の設計
１０Ｄ５−２−３ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。１０Ｄ５−２−３ＶＨのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列（配列番号６０、６１及び６２）の移植に適したヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を以下のようにして選択した。【０４４６】
まず、既知のヒト抗体重鎖可変領域配列はＴｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが提供するＩｇ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｇｅｎｅｓデータベースにより、１０Ｄ５−２−３抗体ＶＨのＦＲ配列と相同性の高いヒト抗体配列を検索した。その結果、ＩＧＶＨ３−７２が最も相同性の高いヒト抗体配列であったため、この抗体のＦＲを選択した。以上のようにして決定したヒト抗体ＦＲ配列の適切な位置に配列番号６０、６１及び６２で示す１０Ｄ５−２−３抗体ＶＨのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を移植することで、ＨＶ０（配列番号１１６）を設計した。【０４４７】
次に、１０Ｄ５−２−３抗体ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。１０Ｄ５−２−３抗体ＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列（配列番号６３、６４及び６５）を移植に適したヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を、以下のようにして選択した。【０４４８】
カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＬをそのアミノ酸配列の相同性からサブグループ（ＨＳＧＩ〜ＩＶ）に分類し、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ＵＳ  Ｄｅｐｔ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］。そこで、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩ〜ＩＶの共通配列のＦＲのアミノ酸配列と１０Ｄ５−２−３抗体ＶＬのＦＲのアミノ酸配列との相同性検索を実施した。【０４４９】
相同性を検索した結果、ＨＳＧＩ、ＨＳＧＩＩ、ＨＳＧＩＩＩ、およびＨＳＧＩＶの相同性はそれぞれ６７．１％、６７．１％、６８．４％、７５．９％であった。従って、１０Ｄ５−２−３抗体ＶＬのＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩＶと最も高い相同性を有していた。【０４５０】
以上の結果から、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩＶの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に、１０Ｄ５−２−３抗体ＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列（配列番号６３、６４及び６５）を移植した。しかし、１０Ｄ５−２−３抗体ＶＬのアミノ酸配列（配列番号５２）中の１０８番目のＬｅｕは、カバットらがあげるヒト抗体ＦＲのアミノ酸配列の相当する部位において、最も使用される頻度が高いアミノ酸残基ではないが、比較的高い頻度で使用されるアミノ酸残基であるため、上記の１０Ｄ５−２−３抗体ＶＬのアミノ酸配列で認められるアミノ酸残基を用いることとした。このようにして、１０Ｄ５−２−３抗体ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列である１０Ｄ５−２−３抗体ＬＶ０（配列番号１１８）を設計した。【０４５１】
上記で設計した１０Ｄ５−２−３抗体のＶＨのアミノ酸配列１０Ｄ５−２−３抗体ＨＶ０、およびＶＬのアミノ酸配列１０Ｄ５−２−３抗体ＬＶ０は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に、マウスモノクローナル抗体である１０Ｄ５−２−３抗体由来のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列である。【０４５２】
しかし、一般に、ヒト化抗体を作製する場合には、単にヒト抗体のＦＲへマウス抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を移植するのみでは、結合活性が低下してしまうことが多い。このような結合活性の低下を回避するため、ＣＤＲのアミノ酸配列の移植とともに、ヒト抗体とマウス抗体で異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基を改変することが行われている。そこで、本実施例においても、結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を以下のようにして同定し、改変することとした。【０４５３】
まず、上記で設計した１０Ｄ５−２−３抗体ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列１０Ｄ５−２−３抗体ＨＶ０、およびＶＬのアミノ酸配列１０Ｄ５−２−３抗体ＬＶ０より成る抗体Ｖ領域（以下、ＨＶ０ＬＶ０と表す）の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製および三次元構造の表示には、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ（アクセルリス社）を用いた。【０４５４】
また、１０Ｄ５−２−３抗体のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。更に、ＨＶ０ＬＶ０のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、１０Ｄ５−２−３抗体と異なっているアミノ酸残基を選択し、１０Ｄ５−２−３抗体のアミノ酸残基へ改変したアミノ酸配列を作製し、同様に三次元構造モデルを構築した。【０４５５】
これら作製した１０Ｄ５−２−３抗体、ＨＶ０ＬＶ０および改変体の各Ｖ領域の三次元構造を比較し、抗体の結合活性に影響を与えると予測されるアミノ酸残基を同定した。【０４５６】
その結果、ＨＶ０ＬＶ０のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基として、１０Ｄ５−２−３抗体ＨＶ０では、配列番号１１６のアミノ酸配列の８番目のＧｌｙ、１８番目のＬｅｕ、４９番目のＧｌｙ、７９番目のＡｓｎ、８１番目のＬｅｕ、９４番目のＡｌａ、９５番目のＶａｌ、９９番目のＡｌａ、及び１００番目のＡｒｇを、１０Ｄ５−２−３抗体ＬＶ０では、配列番号１１８のアミノ酸配列の４番目のＭｅｔ、４０番目のＴｙｒ、８１番目のＳｅｒ、８２番目のＬｅｕ、８９番目のＶａｌ、及び９１番目のＴｙｒを、それぞれ選択した。【０４５７】
これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸配列を１０Ｄ５−２−３抗体の同じ部位に存在するアミノ酸残基へ改変し、様々な改変を有するヒト化抗体のＶＨおよびＶＬを設計した。【０４５８】
具体的には、ＶＨについては、配列番号１１６のアミノ酸配列中の、８番目のＧｌｙをＡｒｇに、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、４９番目のＧｌｙをＡｌａに、７９番目のＡｓｎをＳｅｒに、８１番目のＬｅｕをＶａｌに、９４番目のＡｌａをＧｌｙに、９５番目のＶａｌをＩｌｅに、９９番目のＡｌａをＴｈｒに、又は１００番目のＡｒｇをＧｌｙに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。【０４５９】
また、ＶＬについては、配列番号１１８のアミノ酸配列中の、４番目のＭｅｔをＬｅｕに、４０番目のＴｙｒをＰｈｅに、８１番目のＳｅｒをＰｒｏに、８２番目のＬｅｕをＭｅｔに、８９番目のＶａｌをＭｅｔに、又は９１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。【０４６０】
ＨＶ０ＬＶ０のＦＲに存在する、少なくとも１つのアミノ酸残基を改変した１０Ｄ５−２−３抗体ヒト化抗体の抗体Ｖ領域として、ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ０ＬＶ２、ＨＶ０ＬＶ３、ＨＶ０ＬＶ４、ＨＶ０ＬＶ６、ＨＶ９ＬＶ０、ＨＶ９ＬＶ２、ＨＶ９ＬＶ３、ＨＶ９ＬＶ４、ＨＶ９ＬＶ６、ＨＶ３ＬＶ０、ＨＶ４ａＬＶ０、ＨＶ４ｂＬＶ０、ＨＶ７ａＬＶ０、ＨＶ３ＬＶ２、ＨＶ３ＬＶ３、ＨＶ３ＬＶ６、ＨＶ４ｂＬＶ２、ＨＶ４ｂＬＶ３、ＨＶ４ｂＬＶ６、ＨＶ７ａＬＶ２、およびＨＶ７ｂＬＶ２をそれぞれ設計した。【０４６１】
以降の記述においては、上述のＶ領域を含む１０Ｄ５−２−３抗体ヒト化抗体をそれぞれＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ０ＬＶ２、ＨＶ０ＬＶ３、ＨＶ０ＬＶ４、ＨＶ０ＬＶ６、ＨＶ９ＬＶ０、ＨＶ９ＬＶ２、ＨＶ９ＬＶ３、ＨＶ９ＬＶ４、ＨＶ９ＬＶ６、ＨＶ３ＬＶ０、ＨＶ４ａＬＶ０、ＨＶ４ｂＬＶ０、ＨＶ７ａＬＶ０、ＨＶ３ＬＶ２、ＨＶ３ＬＶ３、ＨＶ３ＬＶ６、ＨＶ４ｂＬＶ２、ＨＶ４ｂＬＶ３、ＨＶ４ｂＬＶ６、ＨＶ７ａＬＶ２、およびＨＶ７ｂＬＶ２と略記する。【０４６２】
Ｈ鎖可変領域ＨＶ３（配列番号１２０）、ＨＶ４ａ（配列番号１２２），ＨＶ４ｂ（配列番号１２４），ＨＶ７ａ（配列番号１２６）、ＨＶ７ｂ（配列番号１２８）、ＨＶ９（配列番号１３０）、およびＬ鎖可変領域ＬＶ２（配列番号１３２）、ＬＶ３（配列番号１３４）、ＬＶ４（配列番号１３６）、ＬＶ６（配列番号１３８）のアミノ酸配列をそれぞれ図１２および図１３に示す。【０４６３】
２２−２）１０Ｄ５−２−３抗体ヒト化抗体の可変領域遺伝子の設計
ヒト化抗体の可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、１０Ｄ５−２−３抗体ＶＨおよび１０Ｄ５−２−３抗体ＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（それぞれ配列番号３１、３７）で用いられているコドンを利用して設計し、アミノ酸改変を行う場合には、哺乳動物細胞で高頻度に使用されるコドンを用いて設計し、各々作製した。これらＤＮＡ配列を用いて、抗体発現ベクターの構築およびヒト化抗体の発現を行った。【０４６４】
２２−３）ｃ１０Ｄ５−２−３抗体、およびヒト化抗体のＶＨをコードするｃＤＮＡの構築
配列番号４９で示される１０Ｄ５−２−３抗体のＶＨ、および実施例２２−１）で設計した１０Ｄ５−２−３抗体ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０（配列番号１１６）、および実施例２２−１）の方法により設計したＨＶ３、ＨＶ４ａ、ＨＶ４ｂ、ＨＶ７ａ、ＨＶ７ｂ、ＨＶ９をコードするｃＤＮＡを全合成にて作成した。【０４６５】
２２−４）ｃ１０Ｄ５−２−３抗体、およびヒト化抗体のＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
配列番号５２で示される１０Ｄ５−２−３抗体のＶＬ、および実施例２２−１）で設計した１０Ｄ５−２−３抗体ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０（配列番号１１８）、および実施例２２−１）の方法により設計したＬＶ２、ＬＶ３、ＬＶ４、ＬＶ６をコードするｃＤＮＡを全合成にて作成した。【０４６６】
２２−５）ｃ１０Ｄ５−２−３抗体、およびヒト化抗体発現ベクターの構築
国際公開第９７／１０３５４号に記載のヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の適当な位置に１０Ｄ５−２−３抗体のＶＨ、実施例２２−３）で得られたＨＶ０、ＨＶ３、ＨＶ４ａ、ＨＶ４ｂ、ＨＶ７ａ、ＨＶ７ｂ、ＨＶ９のいずれかをコードするｃＤＮＡ、および１０Ｄ５−２−３抗体のＶＬ、実施例２２−４）で得られたＬＶ０、ＬＶ２、ＬＶ３、ＬＶ４、ＬＶ６のいずれかをコードするｃＤＮＡを挿入し、各種１０Ｄ５−２−３抗体ヒト化抗体発現ベクターを構築した。【０４６７】
２２−６）動物細胞を用いたｃ１０Ｄ５−２−３抗体、および１０Ｄ５−２−３抗体ヒト化抗体の発現
実施例２２−５）にて構築した動物細胞用の抗体発現ベクターの遺伝子導入は、ＣＨＯ−Ｓ細胞株（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。【０４６８】
ＣＨＯ−Ｓを宿主細胞とし、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の説明書に基づいて、一過性に導入した。３１２．５μＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、ＯｐｔｉＰｒｏＴＭ  ＳＦＭと混合して計５ｍＬとした。発現ベクタープラスミド溶液とＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ＭＡＸ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  溶液を混合し、室温で１０分間静置した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で培養したＣＨＯ−Ｓ  ２５０ｍＬに対して、全量を加えた後、３７℃、８％ＣＯ２、１３５ｒｐｍの設定条件下で、５日〜７日間培養した。【０４６９】
培養後、細胞懸濁液を回収し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で２０分間の遠心分離を行い、培養上清を回収した後、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を通して濾過滅菌した。【０４７０】
２２−７）精製ｃ１０Ｄ５−２−３抗体および１０Ｄ５−２−３抗体ヒト化抗体の取得
０．８ｃｍ径のカラムにＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）０．５ｍＬを充填し、精製水３．０ｍＬ、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ  ３．５）２．０ｍＬ、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．２Ｍホウ酸ナトリウム酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）１．５ｍＬを順次通塔し、担体の平衡化を行った。【０４７１】
次に、実施例２２−６）で回収した培養上清をカラムに通塔した後、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．２Ｍホウ酸ナトリウム酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）５．０ｍＬで洗浄した。洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ  ３．５）２．０ｍＬを用いて担体に吸着した抗体の溶出を行った。溶出は５００μＬずつ、４画分に分けて取得した。【０４７２】
次に、得られた精製画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行い、目的蛋白質の溶出が確認された画分をまとめ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  クエン酸Ｎａ溶液（ｐＨ  ６．０）を用いて、４℃で一昼夜透析を行った。【０４７３】
透析後、ｃ１０Ｄ５−２−３抗体、ヒト化抗体溶液を回収し、０．２２μｍ孔径ＭｉｌｌｅｘｇＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いて滅菌濾過した後に、２８０ｎｍの吸光度（ＯＤ２８０ｎｍ）を吸光光度計（ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ−１７００）を用いて測定し、各精製ｃ１０Ｄ５−２−３抗体、ヒト化抗体の濃度を算出した。【０４７４】
その結果、１０Ｄ５−２−３抗体のＶＨ、および１０Ｄ５−２−３抗体のＶＬからなる１種類のキメラ抗体ｃ１０Ｄ５−２−３抗体、および抗体のＶＨがＨＶ０、およびＶＬがＬＶ０、またはＬＶ２、またはＬＶ３、またはＬＶ４、またはＬＶ６からなるヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０、ＨＶ０ＬＶ２、ＨＶ０ＬＶ３、ＨＶ０ＬＶ４、ＨＶ０ＬＶ６、抗体のＶＨがＨＶ９、およびＶＬがＬＶ０、またはＬＶ２、またはＬＶ３、またはＬＶ４、またはＬＶ６からなるヒト化抗体ＨＶ９ＬＶ０、ＨＶ９ＬＶ２、ＨＶ９ＬＶ３、ＨＶ９ＬＶ４、ＨＶ９ＬＶ６、抗体のＶＨがＨＶ３、およびＶＬがＬＶ０、またはＬＶ２、またはＬＶ３、またはＬＶ６からなるヒト化抗体ＨＶ３ＬＶ０、ＨＶ３ＬＶ２、ＨＶ３ＬＶ３、ＨＶ３ＬＶ６、抗体のＶＨがＨＶ４ａ、およびＶＬがＬＶ０からなるヒト化抗体ＨＶ４ａＬＶ０、抗体のＶＨがＨＶ４ｂ、およびＶＬがＬＶ０、またはＬＶ２、またはＬＶ３、またはＬＶ６からなるヒト化抗体ＨＶ４ｂＬＶ０、ＨＶ４ｂＬＶ２、ＨＶ４ｂＬＶ３、ＨＶ４ｂＬＶ６、抗体のＶＨがＨＶ７ａ、およびＶＬがＬＶ０、またはＬＶ２からなるヒト化抗体ＨＶ７ａ  ＬＶ０、ＨＶ７ａ  ＬＶ２、抗体のＶＨがＨＶ７ｂ、およびＶＬがＬＶ２からなるヒト化抗体ＨＶ７ｂＬＶ２、の２２種類が作製されたことを確認した。【０４７５】
［実施例２３］
抗ＢＭＰ９ヒト化抗体の活性評価
２３−１）ビアコアによるｃ１０Ｄ５−２−３抗体およびヒト化抗体のヒトＢＭＰ９蛋白質への結合活性評価
実施例２２−７で得られたｃ１０Ｄ５−２−３抗体および２２種類の１０Ｄ５−２−３抗体ヒト化抗体のヒトＢＭＰ９に対する反応性を比較することを目的とし、ヒトＢＭＰ９組換え蛋白質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）に対する結合活性を、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）によるＢｉａｃｏｒｅＴ１００（ＧＥ  ヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて測定した。【０４７６】
Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙを、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて添付のプロトコルに従い、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に固定化した。Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙを固定化したフローセルに、０．４μｇ／ｍＬに調製したｃ１０Ｄ５−２−３抗体または各ヒト化抗体を１０μＬ／分の流速で２分間添加した。【０４７７】
次いで、１ｎｍより２倍希釈で段階的に５濃度調製したヒトＢＭＰ９組換え蛋白質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃３２０９−ＢＰ）を１０μＬ／分の流速で、結合反応を３分間、解離反応を３分間モニターした。取得したセンサーグラムは、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎＳｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて解析し、各抗体の速度論定数を算出した。【０４７８】
算出された各抗体の結合速度定数（ｋａ１）、解離速度定数（ｋｄ１）および解離定数［ｋｄ１／ｋａ１＝ＫＤ］を表３に記載した。その結果、１７種類の１０Ｄ５−２−３抗体ヒト化抗体は、ヒトＢＭＰ９蛋白質に対し、１０Ｅ−１１以下の特異的な反応性を有していることが確認された。
【表３】
2014007198.tif 000004
【０４７９】
［実施例２４］
正常ＢＡＬＢ／ｃマウスの赤血球造血に対する１０Ｄ５−２−３抗体ヒト化抗体の作用
次に１０Ｄ５−２−３抗体ヒト化抗体に実際に赤血球増加作用が保持されているか、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて４種類のヒト化抗体（ＨＶ９ＬＶ２，ＨＶ９ＬＶ３，ＨＶ７ａＬＶ２，ＨＶ７ｂＬＶ２）の赤血球造血に対する作用を評価した。７週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー社製）を購入し、実験に供した。飲水は滅菌水道水を、食餌は固形飼料ＦＲ−２（フナバシファーム社製）を自由摂取で与えた。【０４８０】
予備飼育後、体重を指標にして、７群に群分けし（各群ｎ＝６）、４種類のヒト化抗体（ＨＶ９ＬＶ２，ＨＶ９ＬＶ３，ＨＶ７ａＬＶ２，ＨＶ７ｂＬＶ２）に加え、ｃ１０Ｄ５−２−３抗体及び１０Ｄ５−２−３抗体を１ｍｇ／ｋｇの投与量になるように皮下投与した。【０４８１】
具体的には、各々の抗体を生理食塩水にて０．１ｍｇ／ｍＬになるように調製したものを１０ｍＬ／ｋｇの用量にて投与した。媒体群には生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇの用量にて皮下投与した。抗体投与から１週間後、イソフルラン麻酔下にて眼窩静脈より採血を行い、ＥＤＴＡ入り採血管に加えて血液サンプルとした。【０４８２】
得られた血液サンプルを生理食塩水にて２倍希釈し、自動血球計数装置  ＡＤＶＩＡ１２０（バイエルメディカル社製）を用いて、各種血球数を測定した。各群の赤血球数（×１０４／μＬ）は、ｓａｌｉｎｅ群が１０３６．３±１０．９であったのに対し、ＨＶ９ＬＶ２投与群、ＨＶ９ＬＶ３投与群、ＨＶ７ａＬＶ２投与群、ＨＶ７ｂＬＶ２投与群、ｃ１０Ｄ５−２−３抗体投与群、１０Ｄ５−２−３抗体投与群は、それぞれ、１１６８．０±１３．４、１１５７．３±８．７、１１４５．３±１２．８、１１４４．３±１４．４、１１２７．７±１０．９、１１０６．０±７．５（平均値±標準誤差）の値を示し、いずれのヒト化抗体にも有意な赤血球増加作用があることが確認された。【０４８３】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１２年７月２日付けで出願された米国仮出願（６１／６６６，９８１号）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【配列表フリーテキスト】
【０４８４】
配列番号１：ＬｉｎｋＡ１の塩基配列
配列番号２：ＬｉｎｋＡ２の塩基配列
配列番号３：ＬｉｎｋＢ１の塩基配列
配列番号４：ＬｉｎｋＢ２の塩基配列
配列番号５：Ｂｍｐ９ＫＯＣｌａＩ−３’Ｆｗの塩基配列
配列番号６：Ｂｍｐ９ＫＯＡｓｃＩ−３’Ｒｖの塩基配列
配列番号７：Ｂｍｐ９ＫＯＰａｃＩ−５’Ｆｗの塩基配列
配列番号８：Ｂｍｐ９ＫＯＦｓｅＩ−５’Ｒｖの塩基配列
配列番号９：Ｂｍｐ９ＫＯ５’ｐｒｏｂｅ  ＦＷ２の塩基配列
配列番号１０：Ｂｍｐ９ＫＯ５’ｐｒｏｂｅ  ＲＶ２の塩基配列
配列番号１１：Ｂｍｐ９ＫＯ３’ｐｒｏｂｅ  ＦＷ２の塩基配列
配列番号１２：Ｂｍｐ９ＫＯ３’ｐｒｏｂｅ  ＲＶ２の塩基配列
配列番号１３：ｍＢＭＰ９＿ＦＷ５９１５の塩基配列
配列番号１４：ｍＢＭＰ９＿ＲＶ１７１６５の塩基配列
配列番号１５：ｍＢＭＰ９＿ＦＷ１の塩基配列
配列番号１６：ｍＢＭＰ９＿ＲＶ１の塩基配列
配列番号１７：マウスＩｇＧ１に特異的なプライマーＲＶ１の塩基配列
配列番号１８：マウスＩｇＧ１に特異的なプライマーＲＶ２の塩基配列
配列番号１９：マウスＩｇＧ２ａに特異的なプライマーＲＶ１の塩基配列
配列番号２０：マウスＩｇＧ２ａに特異的なプライマーＲＶ２の塩基配列
配列番号２１：マウスＩｇＧ２ｂに特異的なプライマーＲＶ１の塩基配列
配列番号２２：マウスＩｇＧ２ｂに特異的なプライマーＲＶ２の塩基配列
配列番号２３：マウスＩｇＧ２ｃに特異的なプライマーＲＶの塩基配列
配列番号２４：マウスＩｇＧ３に特異的なプライマーＲＶ１の塩基配列
配列番号２５：マウスＩｇＧ３に特異的なプライマーＲＶ２の塩基配列
配列番号２６：マウスＩｇ（κ）特異的プライマーＲＶ１の塩基配列
配列番号２７：マウスＩｇ（κ）特異的プライマーＲＶ２の塩基配列
配列番号２８：マウスＩｇ（λ）特異的なプライマーＲＶ１の塩基配列
配列番号２９：マウスＩｇ（λ）特異的なプライマーＲＶ２の塩基配列
配列番号３０：６Ｄ１０−１−１抗体のＶＨ全塩基配列
配列番号３１：１０Ｄ５−２−３抗体のＶＨ全塩基配列
配列番号３２：３Ｂ７−３−３抗体のＶＨ全塩基配列
配列番号３３：６Ｄ１０−１−１抗体のＶＨ全アミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号３４：１０Ｄ５−２−３抗体のＶＨ全アミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号３５：３Ｂ７−３−３抗体のＶＨ全アミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号３６：６Ｄ１０−１−１抗体のＶＬ全塩基配列
配列番号３７：１０Ｄ５−２−３抗体のＶＬ全塩基配列
配列番号３８：３Ｂ７−３−３抗体のＶＬ全塩基配列
配列番号３９：６Ｄ１０−１−１抗体のＶＬ全アミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号４０：１０Ｄ５−２−３抗体のＶＬ全アミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号４１：３Ｂ７−３−３抗体のＶＬ全アミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号４２：６Ｄ１０−１−１抗体のＶＨ塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号４３：１０Ｄ５−２−３抗体のＶＨ塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号４４：３Ｂ７−３−３抗体のＶＨ塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号４５：６Ｄ１０−１−１抗体のＶＬ塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号４６：１０Ｄ５−２−３抗体のＶＬ塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号４７：３Ｂ７−３−３抗体のＶＬ塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号４８：６Ｄ１０−１−１抗体のＶＨアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号４９：１０Ｄ５−２−３抗体のＶＨアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号５０：３Ｂ７−３−３抗体のＶＨアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号５１：６Ｄ１０−１−１抗体のＶＬアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号５２：１０Ｄ５−２−３抗体のＶＬアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号５３：３Ｂ７−３−３抗体のＶＬアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号５４：６Ｄ１０−１−１抗体ＶＨのＣＤＲ１アミノ酸配列
配列番号５５：６Ｄ１０−１−１抗体ＶＨのＣＤＲ２アミノ酸配列
配列番号５６：６Ｄ１０−１−１抗体ＶＨのＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号５７：６Ｄ１０−１−１抗体ＶＬのＣＤＲ１アミノ酸配列
配列番号５８：６Ｄ１０−１−１抗体ＶＬのＣＤＲ２アミノ酸配列
配列番号５９：６Ｄ１０−１−１抗体ＶＬのＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号６０：１０Ｄ５−２−３抗体ＶＨのＣＤＲ１アミノ酸配列
配列番号６１：１０Ｄ５−２−３抗体ＶＨのＣＤＲ２アミノ酸配列
配列番号６２：１０Ｄ５−２−３抗体ＶＨのＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号６３：１０Ｄ５−２−３抗体ＶＬのＣＤＲ１アミノ酸配列
配列番号６４：１０Ｄ５−２−３抗体ＶＬのＣＤＲ２アミノ酸配列
配列番号６５：１０Ｄ５−２−３抗体ＶＬのＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号６６：ヒトＢＭＰ９蛋白質のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号６７：ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列
配列番号６８：ヒトＢＭＰ９蛋白質をコードする塩基配列（シグナル配列含む）
配列番号６９：ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域をコードする塩基配列
配列番号７０：ヒトＢＭＰＲＩＩのアミノ酸配列
配列番号７１：ヒトＡＬＫ１のアミノ酸配列
配列番号７２：６Ｄ１０−１−１抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーＦｗｄの塩基配列
配列番号７３：６Ｄ１０−１−１抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーＲｖの塩基配列
配列番号７４：６Ｄ１０−１−１抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーＦｗｄの塩基配列
配列番号７５：６Ｄ１０−１−１抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーＲｖの塩基配列
配列番号７６：１０Ｄ５−２−３抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーＦｗｄの塩基配列
配列番号７７：１０Ｄ５−２−３抗体の軽鎖の増幅に用いたプライマーＲｖの塩基配列
配列番号７８：１０Ｄ５−２−３抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーＦｗｄの塩基配列
配列番号７９：１０Ｄ５−２−３抗体の重鎖の増幅に用いたプライマーＲｖの塩基配列
配列番号８０：マウス軽鎖（κ鎖）定常領域の鋳型とした塩基配列
配列番号８１：マウス重鎖（ＩｇＧ１）定常領域の鋳型とした塩基配列
配列番号８２：マウス軽鎖（κ鎖）定常領域の増幅に用いたプライマーＦｗｄの塩基配列
配列番号８３：マウス軽鎖（κ鎖）定常領域の増幅に用いたプライマーＲｖの塩基配列
配列番号８４：マウス重鎖（ＩｇＧ１）定常領域の増幅に用いたプライマーＦｗｄの塩基配列
配列番号８５：マウス重鎖（ＩｇＧ１）定常領域の増幅に用いたプライマーＲｖの塩基配列
配列番号８６：ヒトＢＭＰ９領域Ｃのアミノ酸配列
配列番号８７：ヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０キメラタンパク質１の領域Ｃのアミノ酸配列
配列番号８８：ヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０キメラタンパク質２の領域Ｃのアミノ酸配列
配列番号８９：ヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０キメラタンパク質３の領域Ｃのアミノ酸配列
配列番号９０：ヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０キメラタンパク質４の領域Ｃのアミノ酸配列
配列番号９１：ヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０キメラタンパク質５の領域Ｃのアミノ酸配列
配列番号９２：キメラタンパク質作製用プライマー１の塩基配列
配列番号９３：キメラタンパク質作製用プライマー２の塩基配列
配列番号９４：キメラタンパク質作製用プライマー３の塩基配列
配列番号９５：キメラタンパク質作製用プライマー４の塩基配列
配列番号９６：キメラタンパク質作製用プライマー５の塩基配列
配列番号９７：キメラタンパク質作製用プライマー６の塩基配列
配列番号９８：キメラタンパク質作製用プライマー７の塩基配列
配列番号９９：キメラタンパク質作製用プライマー８の塩基配列
配列番号１００：キメラタンパク質作製用プライマー９の塩基配列
配列番号１０１：キメラタンパク質作製用プライマー１０の塩基配列
配列番号１０２：ヒトＢＭＰ１０クロニーニング用プライマーＦｗｄ−１の塩基配列
配列番号１０３：ヒトＢＭＰ１０クロニーニング用プライマーＲｖ−１の塩基配列
配列番号１０４：ヒトＢＭＰ１０クロニーニング用プライマーＦｗｄ−２の塩基配列
配列番号１０５：ヒトＢＭＰ１０クロニーニング用プライマーＲｖ−２の塩基配列
配列番号１０６：ヒトＢＭＰ１０蛋白質のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号１０７：ヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列
配列番号１０８：ヒトＢＭＰ１０蛋白質をコードする塩基配列（シグナル配列含む）
配列番号１０９：ヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域をコードする塩基配列
配列番号１１０：ｐＬＮ１Ｖ５＿ヒトＢＭＰ１０ベクターによって発現されるタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１１：ｐＬＮ１Ｖ５＿ヒトＢＭＰ１０ベクターにより発現されるアミノ酸をコードする塩基配列
配列番号１１２：ヒトＡＬＫ１の全長ｃＤＮＡ
配列番号１１３：ｈＡＬＫ１  ＦＰＮの塩基配列
配列番号１１４：ｈＡＬＫ１  ＲＰ配列番号１１５：ヒト化抗体改変体ＶＨ（ＨＶ０）の塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号１１６：ヒト化抗体改変体ＶＨ（ＨＶ０）のアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号１１７：ヒト化抗体改変体ＶＬ（ＬＶ０）の塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号１１８：ヒト化抗体改変体ＶＬ（ＬＶ０）のアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号１１９：ヒト化抗体改変体ＶＨ（ＨＶ３）の塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号１２０：ヒト化抗体改変体ＶＨ（ＨＶ３）のアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号１２１：ヒト化抗体改変体ＶＨ（ＨＶ４ａ）の塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号１２２：ヒト化抗体改変体ＶＨ（ＨＶ４ａ）のアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号１２３：ヒト化抗体改変体ＶＨ（ＨＶ４ｂ）の塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号１２４：ヒト化抗体改変体ＶＨ（ＨＶ４ｂ）のアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号１２５：ヒト化抗体改変体ＶＨ（ＨＶ７ａ）の塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号１２６：ヒト化抗体改変体ＶＨ（ＨＶ７ａ）のアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号１２７：ヒト化抗体改変体ＶＨ（ＨＶ７ｂ）の塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号１２８：ヒト化抗体改変体ＶＨ（ＨＶ７ｂ）のアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号１２９：ヒト化抗体改変体ＶＨ（ＨＶ９）の塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号１３０：ヒト化抗体改変体ＶＨ（ＨＶ９）のアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号１３１：ヒト化抗体改変体ＶＬ（ＬＶ２）の塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号１３２：ヒト化抗体改変体ＶＬ（ＬＶ２）のアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号１３３：ヒト化抗体改変体ＶＬ（ＬＶ３）の塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号１３４：ヒト化抗体改変体ＶＬ（ＬＶ３）のアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号１３５：ヒト化抗体改変体ＶＬ（ＬＶ４）の塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号１３６：ヒト化抗体改変体ＶＬ（ＬＶ４）のアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号１３７：ヒト化抗体改変体ＶＬ（ＬＶ６）の塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号１３８：ヒト化抗体改変体ＶＬ（ＬＶ６）のアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号１３９：ヒトＢＭＰ１０領域Ｃのアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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