(57)【要約】  本発明は、例えば血液などのような、様々な種類の細胞を大量に含む細胞懸濁液から希少細胞を検出する場合に、細胞懸濁液をマイクロチャンバーチップ表面上に展開したとき、細胞の回収率が高く、また金型による大量生産が可能なマイクロチャンバーチップを有する細胞展開用デバイスを提供することを目的とする。細胞を保持するためのマイクロチャンバー(6)を表面に有するマイクロチャンバーチップ(1)と、マイクロチャンバー(6)上に流路(5)が形成されるようにしてマイクロチャンバーチップ(1)と一体化して設けられた流路形成枠体(2)と、細胞懸濁液を流路(5)に流出入させるために流路形成枠体(2)に設けられた入口部(3)および出口部(4)とを少なくとも有する細胞展開用デバイス(10)であって、マイクロチャンバーチップ(1)の縦幅(20)に対する空隙(40)の割合である空隙率が、5％以下である。
2014007190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を格納、保持することができるマイクロチャンバー(6)を表面に有するマイクロチャンバーチップ(1)と、
マイクロチャンバー(6)上に流路(5)が形成されるようにしてマイクロチャンバーチップ(1)と一体化して設けられた流路形成枠体(2)と、
細胞懸濁液を流路(5)に流入させるために流路形成枠体(2)に設けられた入口部(3)と、
入口部(3)から流路(5)に流入された細胞懸濁液を流路(5)から流出させるために流路形成枠体(2)に設けられた出口部(4)とを少なくとも有する細胞展開用デバイス(10)であって、
マイクロチャンバー(6)の開口部をマイクロチャンバーチップ(1)の縦幅(20)に垂直に投影したとき、投影されたマイクロチャンバー(6)の開口部が該縦幅(20)に対して存在しない部分の長さである空隙(40)の総和の、該縦幅(20)に対する割合である空隙率が、5％以下である細胞展開用デバイス。
【請求項２】
上記空隙率が0％である、請求項1に記載の細胞展開用デバイス。
【請求項３】
上記マイクロチャンバー(6)のピッチ(50)が、該マイクロチャンバー(6)の直径の1.5倍以上である、請求項1または2に記載の細胞展開用デバイス。
【請求項４】
上記マイクロチャンバー(6)の直径が、20μｍ以上150μｍ以下である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞展開用デバイス。
【請求項５】
上記流路(5)の高さ(7)が、50μｍ以上500μｍ以下である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞展開用デバイス。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか一項に記載の細胞展開用デバイス(10)を用いて、細胞懸濁液から、細胞懸濁液に含有されている可能性のある希少細胞を検出する方法であって、
細胞展開用デバイス(10)の入口部(3)から細胞懸濁液を流路(5)に導入し、細胞をマイクロチャンバーチップ(1)表面上に展開する工程；および、
展開された細胞をマイクロチャンバー(6)内に格納する工程
を含む希少細胞の検出方法。
【請求項７】
上記細胞懸濁液に含まれる細胞の直径が、10μｍ以上100μｍ以下である、請求項6に記載の希少細胞の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を格納、保持することができるマイクロチャンバーを表面に有するマイクロチャンバーチップと、流路形成枠体と、流路形成枠体に設けられた細胞懸濁液の入口部および出口部とを有する細胞展開用デバイスおよび該デバイスを用いて細胞懸濁液から希少細胞を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
希少細胞を検出するためのアプリケーションとして代表的なＣＴＣ〔循環腫瘍細胞〕検出として、例えば、米国食品医薬品局〔ＦＤＡ〕により認可されたセルサーチ(登録商標)システムでは、血液7.5ｍＬ中に含まれる全細胞を検査し、乳癌および前立腺癌では5個以上、大腸癌では3個以上のＣＴＣの発見をもって、転移性の乳癌、大腸癌または前立腺癌が陽性であると判定されている。【０００３】
ＣＴＣはその血中濃度が極めて低いが故に、ＣＴＣを検出するには高い検出力が必要とされる。検出するための最初の段階として、ＣＴＣ等の希少細胞を、極めて高い確率で検出領域（例えば、顕微鏡の観察視野等）に出現させることが重要である。【０００４】
細胞を検出するための方法として、多数のマイクロチャンバー内に細胞を格納する技術が、いくつか知られている。例えば、特許文献1では、血中のマラリア細胞検出を目的として、大量の赤血球細胞を、ウェル構造を有するマイクロチャンバーを備えたチップ上に添加し、ウェルに格納された赤血球のみを検出対象としている。図7（特許文献1の図7）には、特定の内径および深さを有するマイクロチャンバーをそれぞれ備えた三種類のマイクロアレイチップＡ〜Ｃにおいて、マイクロチャンバーに赤血球細胞が格納されている様子が示されているが、それぞれのマイクロチャンバー同士の隙間はいずれも大きい。そのため、マイクロアレイチップ表面上に試料を単純に添加した場合、マイクロチャンバー外に大量の細胞が残存してしまうものと容易に推測できる。このようなマイクロアレイチップとしては他にも、特許文献2,3および非特許文献1にそれぞれ開示されている。【０００５】
例えば、乳癌を患っていると診断された被験者の血液から、特許文献1に記載のマイクロアレイチップを用いてその悪性度を判定しようとする場合、仮にその血液7.5ｍＬ中にＣＴＣが6個含まれており、特許文献1に記載のマイクロアレイチップ表面に添加した全細胞のうち80％に相当する細胞数の細胞がマイクロチャンバー内に格納できるとすると、マイクロチャンバー内に格納されるＣＴＣは4.8個すなわち5個未満となり、セルサーチ(登録商標)システムの判定（すなわち血液7.5ｍＬに含まれるＣＴＣが5個以上であると乳癌であると判定）に照らし合わせると「陰性」と判定され、「偽陰性」が発生してしまう。【０００６】
ところで、工業的量産性を鑑みてマイクロチャンバー型デバイスを生産する場合、金型を用いた成形（または生産）が一般的である。血液試料に含まれる全細胞数に対する、マイクロチャンバー内に格納された細胞数の割合、すなわち細胞の回収率を向上させる一つの方策として、マイクロチャンバー同士が密接した、すなわちマイクロチャンバー外の領域を最小限としたマイクロチャンバー型デバイスも考えられるが、金型生産時に金型からマイクロチャンバー型デバイスを"抜く"ことを想定すると現実的ではなく、マイクロチャンバー間にはある程度の隙間が必要となることは明らかである。【０００７】
このようなマイクロチャンバー型デバイスを、希少細胞の検出に応用するには、細胞の高い回収率と、金型生産できるという効率的な量産性とを考慮した細胞展開用のマイクロチャンバーデバイスを開発する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第2010/027003号
【特許文献２】特開第2004-212048号公報
【特許文献３】特開第2004-330038号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】High-Efficiency Single-Cell Entrapment and Fluorescence in Situ Hybridization Analysis Using a Poly(dimethylsiloxane) Microfluidic DeviceIntegrated with a Black Poly(ethylene terephthalate) Micromesh Anal. Chem., 2008, 80, 5139-5145
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、例えば血液などのような、様々な種類の細胞を大量に含む細胞懸濁液から希少細胞（例えばＣＴＣなど）を検出する場合に、細胞懸濁液をマイクロチャンバーチップ表面上に展開したとき、細胞懸濁液に含まれる全細胞数に対する、各マイクロチャンバーに保持することができる細胞数合計の割合（以下「細胞の回収率」ともいう。）が極めて高く、また金型による大量生産が可能なマイクロチャンバーチップを有する細胞展開用デバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、細胞懸濁液から希少細胞を検出するための細胞展開用デバイスについて検討した結果、特定の条件でマイクロチャンバーが配置されているマイクロチャンバーチップの表面上を細胞懸濁液が流下するようにすると、細胞の回収率が極めて高くなることを見出し、本発明の完成に至った。【００１２】
すなわち、上述した目的のうち、少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した、本発明に係る細胞展開用デバイスは、例えば図1(Ａ)によると、細胞を格納、保持することができるマイクロチャンバー(6)を表面に有するマイクロチャンバーチップ(1)と；マイクロチャンバー(6)上に流路(5)が形成されるようにしてマイクロチャンバーチップ(1)と一体化して設けられた流路形成枠体(2)と；細胞懸濁液を流路(5)に流入させるために流路形成枠体(2)に設けられた入口部(3)と；入口部(3)から流路(5)に流入された細胞懸濁液を流路(5)から流出させるために流路形成枠体(2)に設けられた出口部(4)と；を少なくとも有する細胞展開用デバイス(10)であって、マイクロチャンバー(6)の開口部をマイクロチャンバーチップ(1)の縦幅(20)に垂直に投影したとき、投影されたマイクロチャンバー(6)の開口部が該縦幅(20)に対して存在しない部分の長さである空隙(40)の総和の、該縦幅(20)に対する割合である空隙率が、5％以下である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る細胞展開用デバイスを用いると、例えば血液などの細胞懸濁液に含有される全細胞をマイクロチャンバーチップ上に展開する際、細胞展開用デバイスの出口部から細胞をほとんど流出させることなく、ほぼすべての細胞をマイクロチャンバー内に保持することができる。また、そのようなことを、マイクロチャンバー同士が一定の間隔を保った上で行うことができるので、マイクロチャンバーデバイスを金型生産する場合にも支障をきたさない。【００１４】
細胞を展開した後、希少細胞を検出するために、希少細胞を染色する工程やその後の洗浄工程などを実施する際に、マイクロチャンバーチップ表面のうちマイクロチャンバー以外の表面に残存していた細胞は、染色液や洗浄液とともに出口部から流出するおそれがあるが、マイクロチャンバー内に格納、保持された細胞は、染色工程や洗浄工程を実施しても、マイクロチャンバー内に保持されるため、出口部からほとんど流出することがない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1は、本発明に係る細胞展開用デバイス(10)の、流路(5)に細胞懸濁液を流した場合に細胞懸濁液が流れる方向に平行な断面図を模式的に示したものであり、図1(Ａ)は、流路(5)の底面がマイクロチャンバーチップ(1)の表面からなる態様を示し、図1(Ｂ)は、流路の底面がマイクロチャンバーチップ(1)の表面と流路形成枠体(2)の一部とからなる態様を示す。点線の矢印は、本発明に係る細胞展開用デバイス(10)に細胞懸濁液を流入させた場合、細胞懸濁液が流れる方向を示す。
【図２】図2は、本発明で用いるマイクロチャンバーチップ(1)の一態様の一部を真上から見た模式図であり、マイクロチャンバーチップ(1)の縦幅(20)と空隙(40)との関係を示す。なお、点線の矢印が示す方向は、図1で説明したとおりである。
【図３】図3は、本発明で用いるマイクロチャンバーチップ(1)の一態様を真上から見た模式図であり、ピッチ(50)は、隣接する二個のマイクロチャンバー(6)の中心間の距離を示す。図中の点は、マイクロチャンバー(6)と同様のマイクロチャンバーを表わす。なお、点線の矢印が示す方向は、図1で説明したとおりである。
【図４】図4は、本発明に係る細胞展開用デバイス(10)の具体的な態様を真上から俯瞰した模式図4(Ａ)および(Ａ)をＡ'の線で切った断面の模式図4(Ｂ)を示す。なお、点線の矢印が示す方向は、図1で説明したとおりであり、出口部(4)の上にリザーバー(60)（容量は例えば500μＬ）が配設されており、入口部(3)から流入された細胞懸濁液は出口部(4)から排出されリザーバー(60)に一時的に貯留される。また、流路形成枠体(2)の天井部および側面部が、それぞれ流路天板(2a)および流路シール(2b)から形成されている。
【図５】図5(Ａ)は、実施例1において、細胞懸濁液を細胞展開用デバイスの流路に導入し、5分間静置した後のマイクロチャンバーチップ表面の画像を示し、図5(Ｂ)は、実施例1において、間欠送液した後のマイクロチャンバーチップ表面の画像を示す。図5(Ｃ)は、特開2004-212048号公報（特許文献2）に記載の化学マイクロデバイスのプレート(100)の凹部(110a)（保持部(110)）の配置パターンを示し、図5(Ｄ)は、実施例1で用いたマイクロチャンバーチップ(1)のマイクロチャンバー(6)の配置パターンを示し、それぞれの矢印は細胞懸濁液に含有される細胞が移動する経路と方向を表わす。なお、図5(Ｃ)および(Ｄ)では、それぞれ凹部(110a)およびマイクロチャンバー(6)しか図示していないが、それらの上には流路が形成されており、矢印の末端と先端と結ぶ線の延長方向にはそれぞれ流路の入口部と出口部とが存在するため、細胞懸濁液が流入し排出する経路と方向は、図中の矢印が示す経路と方向に相当する。
【図６】図6は、特開2004-212048号公報（特許文献2）に記載の化学マイクロデバイスのプレート(100)の表面に、試料を保持させる保持部(110)として微細な凹部(110a)を多数形成した状態を示した概略平面図である（該公報の図1を参照、ただし符号は変更した）。
【図７】図7は、国際公開第2010/027003号（特許文献1）に記載された図7であり、内径および深さが異なるマイクロチャンバーを備えたマイクロアレイチップＡ〜Ｃそれぞれの上面画像において、マイクロチャンバーに赤血球細胞が格納されている様子を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について、詳細に説明する。
・細胞展開用デバイス
例えば図1(Ａ)に示されるように、本発明に係る「細胞展開用デバイス」(10)は、細胞を格納、保持することができる「マイクロチャンバー」(6)を表面に有する「マイクロチャンバーチップ」(1)と；マイクロチャンバー(6)上に「流路」(5)が形成されるようにしてマイクロチャンバーチップ(1)と一体化して設けられた「流路形成枠体」(2)と；細胞懸濁液を流路(5)に流入させるために流路形成枠体(2)に設けられた「入口部」(3)と；入口部(3)から流路(5)に流入された細胞懸濁液を流路(5)から流出させるために流路形成枠体(2)に設けられた「出口部」(4)と；を少なくとも有し、図2に示すように、マイクロチャンバー(6)の開口部を「マイクロチャンバーチップ(1)の縦幅」(20)に垂直に投影したとき、マイクロチャンバー(6)の開口部を、マイクロチャンバーチップ(1)の縦幅(20)（流路の縦幅ではない。）に垂直に投影したとき、投影されたマイクロチャンバー(6)の開口部が該縦幅(20)に対して存在しない部分の長さである空隙(40)の総和の、該縦幅(20)に対する割合である「空隙率」が5％以下、好ましくは0％である。
【００１７】
上記「マイクロチャンバーチップ(1)の縦幅」(20)は、図3に示すように、マイクロチャンバーチップ(1)の短手方向の幅として規定される。これに対して、マイクロチャンバーチップ(1)の長手方向の幅は横幅(30)として規定される。一般的には、流路中を細胞懸濁液が流れる方向（すなわち入口部(3)と出口部(4)とを結ぶ直線の方向）は、マイクロチャンバーチップの長手方向であり、マイクロチャンバーチップ(1)の縦幅(20)はそれに垂直な方向の幅となる。
【００１８】
本発明に係る細胞展開用デバイスを用いることによって、マイクロチャンバーチップ上への細胞懸濁液の展開、マイクロチャンバー内への細胞の格納および保持、特定の希少細胞の染色および検出という一連の工程を自動化することも可能である。
【００１９】
＜マイクロチャンバーチップ＞
本発明で用いるマイクロチャンバーチップ(1)は、その表面に、一個以上の細胞を格納し、保持することができるマイクロチャンバー(6)を一個以上有し、その上記空隙率が5％以下、好ましくは0％である。
【００２０】
本発明におけるマイクロチャンバーとは、一個以上の細胞を「格納」し、「保持」することができる凹状の微細穴（マイクロウェル）をいい、有底である（すなわち貫通した穴ではない）ことが好ましい。ここで、「格納」とは、本発明に係る細胞展開用マイクロチャンバーチップ表面に細胞懸濁液を添加した際に細胞がマイクロチャンバーに入る（収容）されることをいい、「保持」とは、マイクロチャンバーに格納された細胞が、細胞展開用マイクロチャンバーチップ表面に添加された染色液や洗浄液等によってマイクロチャンバー外に出ないことをいう。
【００２１】
例えば図5(Ｃ)は、従来使用されている典型的なプレート（特開2004-212048号公報（特許文献2）に記載の化学マイクロデバイスのプレート）(100)の凹部(11a)（保持部(110)）の配置パターンを示しており、細胞懸濁液に含有される細胞が矢印に示す経路に沿って移動する場合、凹部(110a)上を通過すると細胞は凹部(110a)に格納される（「○」で示す。）が、凹部(110a)上を一切通過しないと細胞はプレートを素通りしてしまう（「×」で示す）。なお、このプレートの空隙率は目測で50％程度である。
【００２２】
それに対して、例えば図5(Ｄ)は、本発明に係るマイクロチャンバー(6)の好ましい配置パターンを示しており、流路の横断方向に渡って、このような配置のマイクロチャンバーチップの空隙率は目測で0％である。図5(Ｄ)において、細胞懸濁液に含有される細胞が矢印に示す経路に沿って移動する場合、いずれの経路であっても細胞はマイクロチャンバー(6)上を追加するため、細胞がマイクロチャンバー(6)に格納される可能性は極めて高いことがわかる。
【００２３】
このように、本発明に係る細胞展開用デバイスが備えるマイクロチャンバーチップ上に細胞懸濁液を展開したとき、細胞懸濁液に含まれる全細胞数に対する、各マイクロチャンバーに保持することができる細胞数の合計の割合（細胞の回収率）が極めて高いことがわかる。
【００２４】
図3に示すように、マイクロチャンバー(6)のピッチ(50)は、該マイクロチャンバー(6)の直径の1.5倍以上であることが好ましい。理論上ピッチは該チャンバーの直径と限りなく同じ（すなわち、該チャンバー同士が接している）方が好ましいが、マイクロチャンバーチップ(1)は金型を用いて量産するため、金型から該チップが抜けられる最小限のピッチが好ましい。
【００２５】
また、マイクロチャンバー(6)の直径は、20〜150μｍであると好ましい。該チャンバーの直径が150μｍを超えると、該チャンバーの細胞保持力が弱まる傾向を示し、また該チャンバーの直径が20μｍ未満であると、細胞が該チャンバーに格納されない場合がある。
【００２６】
マイクロチャンバー(6)の深さは、マイクロチャンバー(6)の直径によって変動させることが好ましく、当業者であれば、該チャンバー1つあたり細胞を10〜15個程度格納できるように該チャンバーの深さを適宜決定することができる。典型的には、マイクロチャンバー(6)の深さは、20μｍ以上100μｍである。
【００２７】
マイクロチャンバー(6)の形状は、図1〜3では、底部が平坦な逆円錐形である（縦断面が台形を示している。）が、本発明ではこの態様に限定されず、例えば、円筒形、逆半球形、逆角錐形（逆四角形錐や逆六角形錐等の逆多角形錐）、直方体などが挙げられる。マイクロチャンバーの底部は、典型的には平坦であるが、曲面であってもよい。
【００２８】
マイクロチャンバーチップの材料としては、従来公知のマイクロプレート等と同じ材料を使用でき、かつ、金型を用いて成形できる材料であれば好ましく、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕、ポリメチルメタクリレート〔ＰＭＭＡ〕、環状オレフィンコポリマー〔ＣＯＣ〕などのポリマーが挙げられる。マイクロチャンバーチップは、成形されたポリマーに、金属、ガラス、石英ガラスなどからなる基板を張り合わせたような複数の材料を組み合わせたものであってもよい。
【００２９】
マイクロチャンバーチップ(1)の製造方法は、基板の表面にマイクロチャンバー(6)の形状に対応する凸部を有する金型を用いて成形する方法であってもよく、上記ポリマーや金属、ガラスなどからなる基板に直接加工（例えばリソグラフィーによる微細加工、掘削加工、ＬＩＧＡプロセスなど）を施しマイクロチャンバーを形成する方法であってもよいが、金型を用いて成形する製造方法が好ましい。
【００３０】
マイクロチャンバーチップ(1)は、必要に応じて、表面処理を施すことができる。表面処理としては、例えばプラズマ処理（酸素プラズマ処理など）やコロナ放電処理、または親水性ポリマーやタンパク質、脂質等でコーティングする処理などが挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。
【００３１】
＜流路＞
本発明に係る細胞展開用デバイス(10)の中に形成されている流路(5)は、例えば図1(Ａ)に示すように、マイクロチャンバーチップ(1)表面を底面とし、マイクロチャンバーチップ(1)と一体化して設けられた流路形成枠体(2)が側面部と天井部を形成しており、流路形成枠体(2)に設けられた入口部(3)から流入された細胞懸濁液を、点線の矢印が示す方向に流すためのものであり、その後、細胞懸濁液は流路形成枠体(2)に設けられた出口部(4)から流出される。
【００３２】
また、流路(5)は、例えば図1(Ｂ)に示すように、底面をマイクロチャンバーチップ(1)の表面とそれ以外の部材（図1(Ｂ)では流路形成枠体(2)）から形成される態様であってもよい。ただし、この場合、マイクロチャンバー(1)の備わっていない領域を流下することによる細胞の損失を防ぐため、マイクロチャンバーチップ(1)の短手方向には、マイクロチャンバーチップ(1)以外の部材が底面を形成しないようにすることが望ましい。
【００３３】
マイクロチャンバーチップ(1)と流路形成枠体(2)とは、それぞれが一体化した後であっても、互いに取り外すことは可能であり、さらに流路を形成した後、流路形成枠体(2)から側面部のみを残し、天井部（流路天板）だけ取り外すことも可能である。
【００３４】
流路(5)の高さ(7)、すなわち、マイクロチャンバーチップ(1)表面のうちマイクロチャンバー(6)の表面以外の表面から天井までの距離（以下「天井の高さ」ともいう。）は、50〜500μｍであると好ましい。天井の高さが上記範囲内であると、マイクロチャンバーチップ(1)表面のうちマイクロチャンバー(6)の表面以外の表面に付着した細胞を水流の力で動かすことが容易であり、細胞がマイクロチャンバーチップ(1)の表面に沈降するまでを時間を短縮することができ、また、流路内の細胞の目詰まり等が発生しにくいため、細胞が円滑に展開するので好ましい。
【００３５】
流路形成枠体(2)の材料としては、例えば、上記のようなマイクロチャンバーチップ(1)の材料と同じ材料が挙げられ、マイクロチャンバーチップ(1)と同じ材料を用いることが好ましい。また、上記のようなマイクロチャンバーチップ(1)と同様の表面処理を施してもよい。
【００３６】
また、流路(5)は、例えば図4(Ｂ)に示すように、流路天板(2a)とマイクロチャンバーチップ(1)との間に、両面に粘着性を有するシリコンシート、すなわち流路シール(2b)を挟持させることによって、流路形成枠体(2)を形成することもできる。
【００３７】
＜細胞懸濁液＞
細胞懸濁液は、希少細胞を含んでいる可能性がある、例えばヒトなどの血液、リンパ液、組織液、体腔液などであり、希釈液などで適宜希釈されていてもよい。また、細胞懸濁液は、生体由来のものに限定されず、試験・研究等のために人工的に細胞を懸濁させて調製した細胞の分散液であってもよい。
【００３８】
希少細胞としては、例えば癌細胞などが挙げられる。特に、細胞懸濁液が血液または血液由来検体である場合、希少細胞はＣＴＣ〔循環腫瘍細胞または循環癌細胞〕であってもよい。このような細胞懸濁液に含まれる種々の細胞の直径は、10〜100μｍであることが好ましい。
【００３９】
・希少細胞の検出方法
本発明に係る希少細胞の検出方法は、例えば図1(Ａ)によると、上記の細胞展開用デバイス(10)を用いて、細胞懸濁液から、細胞懸濁液に含有されている可能性のある希少細胞を検出する方法であって、細胞展開用デバイス(10)の入口部(3)から細胞懸濁液を流路(5)に導入し、細胞をマイクロチャンバーチップ(1)表面上に展開する工程；および、展開された細胞をマイクロチャンバー(6)内に格納する工程を少なくとも含み、典型的には、下記の工程を含む。
【００４０】
工程(a)：細胞展開用デバイス(10)の入口部(3)からＰＢＳ〔リン酸緩衝生理食塩水〕等の生理食塩水（好ましくは工程(b)で用いる細胞懸濁液と同じ溶媒）で流路(5)を満たす。
工程(b)：入口部(3)から細胞懸濁液を導入し、工程(a)で流路を満たしていた生理食塩水と置換するようにして、細胞懸濁液で流路(5)を満たす。入口部(3)から細胞懸濁液を導入するのと同時に、出口部(4)から生理食塩水が排出される。
【００４１】
工程(c)：1〜15分間（例えば5分間）静置させることによって、細胞懸濁液に含有される細胞を沈降させる。このとき、例えば図5(Ａ)に示されるように、マイクロチャンバー(6)内に格納される細胞もあるが、マイクロチャンバーチップ(1)表面のうちマイクロチャンバー(6)表面以外の表面に付着する細胞もある。
【００４２】
工程(d)：細胞懸濁液の体積の1/100〜1/2程度（例えば1/50）の生理食塩水（好ましくは工程(b)で用いる細胞懸濁液と同じ溶媒）を、流路の断面積が1〜1,000ｍｍ2である場合、1〜1,000μＬ/秒の流量（1秒間あたりの流量は、流速が1ｍｍ/秒か、またはそれより小さくなるように該流量を調整することが好ましい。）で、入口部(3)から送液し、1〜30秒間（例えば10秒間）静置させる。この工程を2回以上繰り返すことが好ましく、より好ましくは10回繰り返す。この工程において、送液と静置を繰り返す場合、この送液を本明細書では特に「間欠送液」という。
図5(Ｂ)に示されるように、間欠送液することによって、工程(c)の、マイクロチャンバー(6)内に格納されずにマイクロチャンバー(6)表面以外の表面に付着された細胞が、マイクロチャンバー(6)内に格納されやすくなる。
【００４３】
工程(e)：特定の希少細胞のみを染色することが可能な染色液（例えば、蛍光色素が標識された抗体の溶液）を入口部(3)から導入し、特定の条件で細胞と反応させた後、出口部(4)から排出する。さらに、細胞や流路(5)内を洗浄するために、洗浄液を入口部(3)から導入し出口部(4)から排出させるという洗浄工程を1回以上実施することが好ましい。
【００４４】
細胞はマイクロチャンバー(6)内に保持されているため、染色液や洗浄液とともに出口部(4)から排出されにくいのに対して、マイクロチャンバー(6)内に保持されずに、マイクロチャンバー(6)以外の表面に付着していた細胞は、染色液や洗浄液とともに出口部(4)から排出されやすい（このことを細胞が「ロス」（損失）するという）。
【００４５】
工程(f)：顕微鏡下で観察するなどして、染色された希少細胞を検出する。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明について実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
［実施例1］
マイクロチャンバー(6)が図5(Ｄ)に示すように配置されたマイクロチャンバーチップ（ポリスチレン製であり、所定の金型を用いて成形した。）を細胞展開用デバイスに用いた。このマイクロチャンバーチップのマイクロチャンバーの直径は100μｍ、マイクロチャンバーの深さは50μｍであり、マイクロチャンバーの形状は、底部が平坦な逆円錐形であった。隣接するマイクロチャンバー同士の中心間の距離を表わすピッチは200μｍであり、また、空隙率は0％であった。マイクロチャンバーチップの縦幅および横幅はそれぞれ25ｍｍおよび70ｍｍであって、また、細胞展開用デバイスの流路の高さは100μｍ、流路の幅は15ｍｍ、流路の長さは40ｍｍであった。すなわち、細胞展開用デバイスの流路の断面は1.5ｍｍ2であり、流路の容積は60ｍｍ3（＝0.06ｍＬ）となる。【００４７】
まず、細胞展開用デバイスの流路を、ウシ血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を3重量％含有するＰＢＳ（以下「3％ＢＳＡ含有ＰＢＳ」ともいう。）で満たした。次に、0.4％ホルムアルデヒドで細胞固定したＪｕｒｋａｔを3％ＢＳＡ含有ＰＢＳに溶解させた細胞懸濁液（細胞濃度は1×107cells/ｍＬ）70μＬ（約7×105cells）を、入口部から0.05ｍＬ/分（＝50μＬ/分）の流量条件で流路へ導入し、5分間静置させた。これによって、流路を満たしていたＰＢＳのほとんどは出口部から排出された。【００４８】
そのときのマイクロチャンバーチップ表面の拡大画像を図5(Ａ)に示す。細胞はマイクロチャンバー内外に分散して沈降していた。その後、間欠送液（0.1ｍＬ/分の流速で1μＬの3％ＢＳＡ含有ＰＢＳを送液後、5秒間静置する。）を10回実施した。【００４９】
このときのマイクロチャンバー表面の拡大画像を図5(Ｂ)に示す。間欠送液前にはマイクロチャンバー外に散らばっていた細胞のほとんどが、マイクロチャンバー内に格納できた。細胞展開用デバイスに流入させた全細胞数を100％とするとき、98％に相当する細胞数の細胞をマイクロチャンバー内に格納できた。すなわち、細胞の回収率は98％であった。【００５０】
［実施例2］
実施例1において、マイクロチャンバーチップの空隙率をそれぞれ1％および5％に変更した以外は実施例1と同様にして細胞の回収率を求めた。間欠送液をさらに10回（全20回）実施し、細胞の回収率を求めた。その結果を表1に示す。【００５１】
［比較例1］
実施例1において、マイクロチャンバーチップの空隙率を10％に変更した以外は実施例1と同様にして細胞の回収率を求めた。その結果を表1に示す。【００５２】
【表１】
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【００５３】
［比較例2］
実施例1において、空隙率が75％である図6に示すプレートを用いた以外は実施例1と同様にして細胞の回収率を求めた。その結果、間欠送液10回終了時の細胞の回収率は26％であった。
【符号の説明】
【００５４】
1 ・・・マイクロチャンバーチップ
2 ・・・流路形成枠体
2a・・・流路天板
2b・・・流路シール
3 ・・・入口部
4 ・・・出口部
5 ・・・流路
6 ・・・マイクロチャンバー
7 ・・・流路(5)の高さ
10 ・・・細胞展開用デバイス
20 ・・・マイクロチャンバーチップ(1)の縦幅
30 ・・・マイクロチャンバーチップ(1)の横幅（マイクロチャンバーチップ(1)の長手方向）
40 ・・・空隙（マイクロチャンバー(6)の開口部をマイクロチャンバーチップ(1)の縦幅(20)に垂直に投影したとき、該縦幅(20)から、投影されたマイクロチャンバー(6)の開口部に相当する幅を差し引いた長さ）
50 ・・・ピッチ
60 ・・・リザーバー
100 ・・・プレート
110 ・・・保持部
110a・・・凹部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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