(57)【要約】  本発明に係るＢＬＶ検出用のプライマーセットにおいてフォワードプライマーは、（１）配列番号１に示す塩基配列における１６番目のＣを含んだ１５個以上の連続する塩基を含むポリヌクレオチドからなる第一のプライマーと、（２）配列番号２に示す塩基配列における少なくとも１〜１５番目の塩基を含む複数種のポリヌクレオチドからなる第二のプライマーとの混合物であって、第二のプライマーに含まれるＭ、Ｎ、Ｙ、Ｋ、Ｄのうちの２つ以上は２種以上の塩基を指定する縮重塩基であり、当該第二のプライマーは、配列番号３〜１２に示す各塩基配列における少なくとも１〜１５番目の塩基を含む１０種のポリヌクレオチドを少なくとも含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ白血病ウイルスに由来するＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なフォワードプライマー及びリバースプライマーの組合せからなるプライマーセットであって、
上記フォワードプライマーは、（１）配列番号１に示す塩基配列における１６番目のシトシンを含んだ１５個以上の連続する塩基を含むポリヌクレオチドからなる第一のプライマーと、（２）配列番号２に示す塩基配列における少なくとも１〜１５番目の塩基を含む複数種のポリヌクレオチドからなる第二のプライマーとの混合物であって、
配列番号２中における塩基ＭはＡ又はＣを示し、塩基ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを示し、塩基ＹはＣ又はＴを示し、塩基ＫはＧ又はＴを示し、塩基ＤはＡ、Ｇ又はＴを示し、
上記第二のプライマーに含まれる塩基Ｍ、塩基Ｎ、塩基Ｙ、塩基Ｋ、及び塩基Ｄのうちの２つ以上は２種以上の塩基を指定する縮重塩基であるとともに、当該第二のプライマーは、配列番号３〜１２に示す各塩基配列における少なくとも１〜１５番目の塩基を含む１０種のポリヌクレオチドを少なくとも含んでいる、
プライマーセット。
【請求項２】
上記第二のプライマーに含まれる塩基Ｍ、塩基Ｎ、塩基Ｙ、塩基Ｋ、及び塩基Ｄは全て、取り得る全種の塩基を指定する縮重塩基である、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
上記第二のプライマーは配列番号２に示す塩基配列における少なくとも１〜１８番目の塩基を含む複数種のポリヌクレオチドからなる、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか一項に記載のプライマーセットを備えるウシ白血病ウイルスの検出キット。
【請求項５】
以下の工程：
（ａ）対象サンプルからＤＮＡを含有する試料を調製する工程、
（ｂ）上記試料に対して、請求項１〜３の何れか一項に記載のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
（ｃ）上記（ｂ）の工程で得られる増幅断片を検出する工程、
を含む、ウシ白血病ウイルスの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）検出用プライマーセット、ＢＬＶ検出キット、及び検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）と最も近縁のレトロウイルスで、Ｂリンパ腫である地方病性牛白血病（Ｅｎｚｏｏｔｉｃ   ｂｏｖｉｎｅ  ｌｕｅｋｏｓｉｓ：ＥＢＬ）を誘発する。近年、ＢＬＶ感染牛の数が増加し、比例して発症牛の数も急増傾向である。【０００３】
ＢＬＶは変異体が多数存在し、ＢＬＶの感染の有無を判別するに際して、これらの変異体を包括的に検出できるツールが求められている。例えば、非特許文献１には、ＢＬＶの主要な変異体及び未知の変異体を検出可能なＢＬＶ検出用の縮重プライマーが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Jimba, M., S. N. Takeshima, K. Matoba, D. Endoh, and Y. Aida. 2010. BLV-CoCoMo-qPCR: Quantitation of bovine leukemia virus proviral load using the CoCoMo algorithm. Retrovirology 7:91.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、非特許文献１に記載の縮重プライマーはその縮重度が非常に高く、品質よく製造するためには高度な技術を要する。【０００６】
本願発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、製造が容易で、かつ、ＢＬＶの主要な変異体及び未知の変異体を検出可能なＢＬＶ検出用プライマーセット、ＢＬＶ検出キット、及び検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。【０００８】
ウシ白血病ウイルスに由来するＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なフォワードプライマー及びリバースプライマーの組合せからなるプライマーセットであって、上記フォワードプライマーは、（１）配列番号１に示す塩基配列における１６番目のシトシンを含んだ１５個以上の連続する塩基を含むポリヌクレオチドからなる第一のプライマーと、（２）配列番号２に示す塩基配列における少なくとも１〜１５番目の塩基を含む複数種のポリヌクレオチドからなる第二のプライマーとの混合物であって、配列番号２中における塩基ＭはＡ又はＣを示し、塩基ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを示し、塩基ＹはＣ又はＴを示し、塩基ＫはＧ又はＴを示し、塩基ＤはＡ、Ｇ又はＴを示し、上記第二のプライマーに含まれる塩基Ｍ、塩基Ｎ、塩基Ｙ、塩基Ｋ、及び塩基Ｄのうちの２つ以上は２種以上の塩基を指定する縮重塩基であるとともに、当該第二のプライマーは、配列番号３〜１２に示す各塩基配列における少なくとも１〜１５番目の塩基を含む１０種のポリヌクレオチドを少なくとも含んでいる、プライマーセット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、製造が容易なＢＬＶ検出用プライマーセット等を提供することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】参考例１におけるamplification plotの一例を示した図である。
【図２】参考例１におけるamplification plotの他の例を示した図である。
【図３】実施例１におけるamplification plotを示した図である。
【図４】実施例３におけるamplification plotを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００１２】
〔１：プライマーセット〕
本発明に係るプライマーセットは、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）に由来するＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能なものである。すなわち、本発明に係るプライマーセットは、ＢＬＶ由来のＤＮＡ又は当該ＤＮＡの断片にハイブリダイズして、ＰＣＲにより所定サイズの上記ＤＮＡ断片を増幅させる。
【００１３】
上記プライマーセットは、好ましくは、ＢＬＶに由来するＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって選択的に増幅可能という特性を有する。ここで、「選択的に増幅可能」とは、所定のサンプルに対して当該プライマーセットを用いたＰＣＲを行った場合に、ＢＬＶ由来のＤＮＡ断片が専ら増幅産物として得られるが、他の多くの生物（特にＢＬＶの宿主生物、例えばウシ）由来のＤＮＡ断片は増幅産物として実質的に得られないことを指す。
【００１４】
なお、本発明に係るプライマーセットが適用されるＢＬＶは、宿主のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡの形態をとるものであってもよく、プロウイルスの転写産物に対応したｃＤＮＡであってもよい。これらの中でより好ましいのは、宿主のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡの形態である。
【００１５】
本発明に係るプライマーセットは、具体的には以下に示すものである。
ウシ白血病ウイルスに由来するＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅可能なフォワードプライマー及びリバースプライマーの組合せからなるプライマーセットであって、上記フォワードプライマーは、（１）配列番号１に示す塩基配列における１６番目のシトシンを含んだ１５個以上の連続する塩基を含むポリヌクレオチドからなる第一のプライマーと、（２）配列番号２に示す塩基配列における少なくとも１〜１５番目の塩基を含む複数種のポリヌクレオチドからなる第二のプライマーとの混合物であって、配列番号２中における塩基ＭはＡ（アデニン）又はＣ（シトシン）を示し、塩基ＮはＡ、Ｃ、Ｇ（グアニン）又はＴ（チミン）を示し、塩基ＹはＣ又はＴを示し、塩基ＫはＧ又はＴを示し、塩基ＤはＡ、Ｇ又はＴを示し、上記第二のプライマーに含まれる塩基Ｍ、塩基Ｎ、塩基Ｙ、塩基Ｋ、及び塩基Ｄのうちの２つ以上は２種以上の塩基を指定する縮重塩基であるとともに、当該第二のプライマーは、配列番号３〜１２に示す各塩基配列における少なくとも１〜１５番目の塩基を含む１０種のポリヌクレオチドを少なくとも含んでいる、プライマーセット。なお、本明細書において「塩基」とは特に断りの無い限り核酸塩基を指す。
【００１６】
上記第一のプライマー及び第二のプライマーの長さは何れも１５塩基長以上であればよく、好ましくは１５塩基長以上で５０塩基長以下の範囲内であり、より好ましくは１８塩基長以上で３５塩基長以下の範囲内であり、さらに好ましくは２０塩基長以上で３５塩基長以下の範囲内であり、特に好ましくは２３塩基長以上で３０塩基長以下の範囲内である。なお、配列番号１〜１２は何れも２５塩基の配列のみを示したが、これらは既知のＢＬＶの塩基配列に基づきデザインしたものであるから、当該２５塩基の前後に繋がる塩基配列が必要な場合には、既知のＢＬＶの塩基配列に基づき、当該ＢＬＶ由来の配列にハイブリダイズするようにデザインすればよい。
【００１７】
上記第二のプライマーは、１８塩基長以上の場合においては、配列番号２に示す塩基配列における少なくとも１〜１８番目の塩基を含む複数種のポリヌクレオチドからなることが好ましい。また、上記第二のプライマーは、１９塩基長以上の場合においては、配列番号２に示す塩基配列における少なくとも１〜１９番目の塩基を含む複数種のポリヌクレオチドからなることが好ましい。
【００１８】
複数のプライマーの混合物である上記第二のプライマーにおいて、「塩基Ｍ、塩基Ｎ、塩基Ｙ、塩基Ｋ、及び塩基Ｄが含まれている」とは、例えば、塩基Ｍについて説明すると、第二のプライマーを構成する或るプライマーにおいて、塩基Ｍに対応する塩基がＡであり、第二のプライマーを構成する他のプライマーでは塩基Ｍに対応する塩基がＣとなっているが、塩基Ｍに対応する塩基としてＴやＧは出現しないというように、第二のプライマー全体としてみると塩基Ｍに対応する塩基がＡ又はＣとなっている状態を指す。これは、他の塩基Ｎ、塩基Ｙ、塩基Ｋ、及び塩基Ｄについても同様である。なお、塩基Ｍ、塩基Ｎ、塩基Ｙ、塩基Ｋ、及び塩基Ｄは、後述するように、縮重塩基として含まれる場合と、個別の塩基として含まれる場合とがある。
【００１９】
第二のプライマーにおいて、「塩基Ｍ、塩基Ｎ、塩基Ｙ、塩基Ｋ、及び塩基Ｄのうちの２つ以上が２種以上の塩基を指定する縮重塩基である」とは、縮重塩基である２つ以上の塩基の間で取り得る全ての塩基種の組合せが第二のプライマーの中に出現することを指す。具体的な例では、配列番号２に示す塩基配列における１番目の塩基Ｍと２番目の塩基Ｎとが縮重塩基であり、塩基Ｍが縮重塩基としてＡ及びＣを指定し、かつ塩基Ｎが縮重塩基としてやはりＡ及びＣを指定するときは、ＡＡ、ＡＣ、ＣＡ及びＣＣの全ての縮重パターンが含まれるように（すなわち、１番目の塩基と２番目の塩基が関与する縮重プライマーを含むように）第二のプライマーが構成される。なお、２番目の塩基ＮはＧ及びＴも取る必要があるが、これらは縮重塩基ではなく個別の塩基として第二のプライマー中に出現する。個別の塩基として出現するとは、取り得る全ての組合せが出現するのではなく、一部の組合せのみ（例えば1番目の塩基と２番目の塩基の組合せがＡＧとＡＴのみ）が出現することを指す。同様に、配列番号２に示す塩基配列における1番目の塩基Ｍと２番目の塩基Ｎとが縮重塩基であり、塩基Ｍが縮重塩基としてＡ及びＣを指定し、かつ塩基Ｎが縮重塩基としてＡ、Ｃ及びＧを指定するときは、２×３＝６通りの縮重パターンが含まれるように（すなわち、１番目の塩基と２番目の塩基が関与する縮重プライマーを含むように）、かつ２番目の塩基ＮがＴのものが個別の塩基として出現するように第二のプライマーが構成される。この考え方は３つ以上の塩基が縮重塩基である場合や、隣り合わない塩基（例えば、配列番号２中の1番目の塩基Ｍと３番目の塩基Ｍ）が縮重塩基である場合にも同様である。より具体的には実施例に示すセット５では、配列番号２中の１番目及び３番目の塩基Ｍが個別の塩基として縮重化されずに第二のプライマーに現れ、２番目の塩基Ｎ（Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴを表す）が縮重塩基Ｂ（Ｃ、Ｇ及びＴを表す）と個別の塩基Ａとして第二のプライマーに現れ、４番目の塩基Ｙが縮重塩基Ｙとして第二のプライマーに現れるというように構成されている（５番目以降の塩基も同様に設計されているため、詳細な説明は省略する）。
【００２０】
第二のプライマーの特に好ましい形態では、第二のプライマーに含まれる塩基Ｍ、塩基Ｎ、塩基Ｙ、塩基Ｋ、及び塩基Ｄは全て、取り得る全種の塩基を指定する縮重塩基である。すなわち、取り得る全種の塩基を指定するべく、塩基ＭはＡ及びＣを指定する縮重塩基として、塩基ＮはＡ、Ｃ、Ｇ及びＴを指定する縮重塩基として、塩基ＹはＣ及びＴを指定する縮重塩基として、塩基ＫはＧ及びＴを指定する縮重塩基として、塩基ＤはＡ、Ｇ及びＴを指定する縮重塩基として、第二のプライマー（混合物）中に出現する。より具体的には実施例に示すセット６やセット７の形態に相当する。
【００２１】
フォワードプライマーは複数種のポリヌクレオチド（プライマー）の混合物である。これら複数種のポリヌクレオチドの混合比は特に限定されないが、好ましくは各ポリヌクレオチドの実質的等量混合物である。実質的等量混合物とは、最も含量が少ないポリヌクレオチドと最も含量が多いポリヌクレオチドとの数量比(モル比と実質同義)が１：１〜１：１．３の範囲内、好ましくは１：１〜１：１．１５の範囲内に収まっていることを指す。
【００２２】
上記の通り、フォワードプライマーは、第一のプライマーと、配列番号３〜１２に示す各塩基配列における少なくとも１〜１５番目の塩基を含む１０種のポリヌクレオチドを必ず含む第二のプライマーとから構成されている。これら１１種のポリヌクレオチドは、主要な１１種類の既知のＢＬＶの配列を増幅する。また、上述の通り、第二のプライマーは上記縮重塩基で規定される縮重プライマーをさらに備えて、上記１１種類以外の既知のＢＬＶ及び未知のＢＬＶの配列を増幅可能となっている。また、縮重度は最大でも１５３６（２×４×２×２×２×２×３×２×２）であり、非特許文献１に記載の縮重プライマー（縮重度：３９３２１６）と比較して製造が大幅に容易となった。
【００２３】
なお、リバースプライマーは、複数種のＢＬＶの共通配列を参照して設計したり、非特許文献１に記載のＢＬＶ増幅用のリバースプライマーを適宜用いることができる。その長さはフォワードプライマーと同様に１５塩基長以上であればよく、好ましくは１５塩基長以上で５０塩基長以下の範囲内であり、より好ましくは１８塩基長以上で３５塩基長以下の範囲内であり、さらに好ましくは２０塩基長以上で３５塩基長以下の範囲内であり、特に好ましくは２３塩基長以上で３５塩基長以下の範囲内である。リバースプライマーは、ＰＣＲの結果得られるＰＣＲ増幅断片の大きさが凡そ１００ｂｐ〜５００ｂｐ程度となるように設計することが好ましい場合がある。リバースプライマーの好ましい一例は、配列番号１４に示す塩基配列における７番目〜１４番目の塩基部分を少なくとも含み、１５塩基長以上で５０塩基長未満の長さのポリヌクレオチドである。
【００２４】
プライマーセットに含まれるフォワードプライマーとリバースプライマーとの数量比(モル比と実質同義)は特に限定されないが、好ましくはフォワードプライマーの濃度がリバースプライマーの濃度の５倍〜１５倍の範囲内であることが好ましく、８倍〜１２倍の範囲内であることがより好ましい。
【００２５】
また、各プライマーを構成するヌクレオチドにはＰＮＡ（ペプチド核酸）が含まれていてもよい。
【００２６】
本発明に係るプライマーセットは常法に従って合成することができる。また、本発明に係るプライマーセットを用いたＰＣＲの反応条件は特に限定されない。２ステップＰＣＲを用いる場合の一例では、変性ステップの温度は例えば９３℃〜９６℃の範囲内、好ましくは９４℃〜９５℃の範囲内に設定される。アニーリング及び伸長ステップの温度は例えば５８℃〜６９℃の範囲内、好ましくは５９℃〜６３℃の範囲内に設定される。変性ステップの反応時間は、例えば１４秒〜２５秒の範囲内、好ましくは１４秒〜２０秒の範囲内に設定される。アニーリング及び伸長ステップの反応時間は例えば２５秒〜１分の範囲内、好ましくは２８秒〜３５秒の範囲内に設定される。また、サイクル数は例えば２０〜１００サイクルの範囲内、好ましくは５５〜８５サイクルの範囲内、より好ましくは５５〜６５サイクルの範囲内に設定される。
【００２７】
〔２：ＢＬＶの検出キット〕
本発明に係るＢＬＶの検出キットは、上記説明した本発明に係るプライマーセットを備える。この検出キットは、ＢＬＶの有無の判別を含む検出に用いる。さらに、必要に応じて、１）ＰＣＲに用いる各種試薬及び器具（ポリメラーゼ、ＰＣＲバッファー、各ｄＮＴＰ、ピペット等）、２）ＰＣＲに供するＤＮＡを含有する試料を調製するための各種試薬及び器具（試験管、バッファー等）、３）ＰＣＲ増幅断片を解析するための各種試薬及び器具（電気泳動ゲル材料、ピペット等）、４）さらなる詳細解析のため、特定のＢＬＶのみを増幅可能なＰＣＲプライマーセット、５）検出キットの使用説明書、等の少なくとも１つを備えていてもよい。
【００２８】
〔３：ＢＬＶの検出方法〕
本発明に係るＢＬＶの検出方法は、以下の工程：
（ａ）対象サンプルからＤＮＡを含有する試料を調製する工程、
（ｂ）上記試料に対して、本発明に係るプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程、
（ｃ）上記（ｂ）の工程で得られる増幅断片を検出する工程、を含む。
【００２９】
以下、各工程を説明する。
【００３０】
（１）工程（ａ）
工程（ａ）は、対象サンプルからＤＮＡを含有する試料を調製する工程である。ここで、「対象サンプル」とは、ＢＬＶの検出をしようとするサンプルを意味する。対象サンプルは、ＢＬＶを含む可能性のあるものであればよい。例えば、哺乳動物由来の試料が挙げられ、より具体的にはウシ、スイギュウ、ヒツジ、ヤギ等のＢＬＶの感染が成立するウシ科の哺乳動物の体液（特に血液又は乳汁）由来又は組織由来の試料が挙げられる。或いは、試験管内でＢＬＶの感染が成立するウシ、ヒツジ、ネコ、コウモリ、ヒト等の多くの哺乳動物由来の培養細胞が挙げられる。ＤＮＡを含有する試料は、対象サンプルの種類に応じて常法に従って調製することができる。例えば、ＢＬＶのプロウイルスＤＮＡを検出対象とする場合、対象サンプルから常法に従ってゲノムＤＮＡを抽出すればよいし、当該プロウイルスＤＮＡの転写産物（ＲＮＡ）を検出対象とする場合は、対象サンプルから常法に従ってトータルＲＮＡを抽出し、これを常法に従って逆転写してｃＤＮＡとすることで当該試料を得るようにしてもよい。
【００３１】
（２）工程（ｂ）
工程（ｂ）は、工程（ａ）で得た試料に対して、上記した本発明に係るプライマーセットを用いたＰＣＲを行う工程である。工程（ｂ）におけるＰＣＲは、常法に従って行うことができる。工程（ｂ）により、試料中にＢＬＶが含まれている場合には、使用したプライマーの塩基配列を両端に有するＢＬＶ由来のＰＣＲ増幅断片が得られる。
【００３２】
（３）工程（ｃ）
工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得られるＰＣＲ増幅断片の有無を検出する工程である。ＰＣＲ増幅断片（アンプリコン）の有無の確認は、常法に従って行うことができる。例えば、電気泳動によりＰＣＲ増幅断片の有無及びサイズを確認することができる。また、必要に応じて定量的にＰＣＲ増幅断片を検出してもよい。なお、工程（ｂ）〜（ｃ）をリアルタイムＰＣＲでワンステップで行うことがより好ましい。
【００３３】
ＰＣＲ増幅断片の有無の確認の結果、ＰＣＲ増幅断片が存在する場合には、対象サンプルにＢＬＶが存在すると判別することができる。また、ＰＣＲ増幅断片の有無の確認の結果、ＰＣＲ増幅断片が存在しない場合には、対象サンプルにＢＬＶが存在していないと判別することができる。
【００３４】
〔４：フォワードプライマーの設計法〕
本発明に係るプライマーセットに含まれるフォワードプライマーは、例えば、次のように設計される。実施例に示す１１種類の主要なＢＬＶを検出可能とするために、第一のプライマーは配列番号１に記載の塩基配列に基づいて、他のプライマーとは独立に設計する。配列番号１に記載の塩基配列は、DQ287255なるＢＬＶ（参考文献・出典等は以下を参照）の変異部位を含んだ塩基配列である。
【００３５】
第二のプライマーは、残る１０種のＢＬＶであるEF600696、DQ287261、D00647、DQ287257、AF257515、DQ287260、DQ288220、M38278、DQ287259、及びDQ288193（参考文献・出典等は以下を参照）の変異部位を含んだ１０種の塩基配列（順に、配列番号３〜１２に対応）から、以下のようにして設計される。まず、１０種の塩基配列を１以上のグループに分類する。グループ分けに際しては、各グループに必ず複数種の塩基配列が含まれるようにする。例えば、グループを一つのみ作る場合には、上記１０種の塩基配列全てが同一のグループに含まれる。また、グループを二つ作る場合には、上記１０種の塩基配列が２個と８個、３個と７個、４個と６個、或いは５個と５個に分かれるようにする。そして、同一のグループに入った塩基配列同士で配列の比較（ｎ番目（ｎ＝１〜２５の整数）の塩基の異同を判定する）を行い、配列間で異なる塩基のみを縮重塩基とする縮重プライマーを設計する。すなわち、グループを一つのみ作る場合は一つの縮重プライマーが、グループを二つ作る場合は二つの縮重プライマーが第二のプライマーを構成することになる。
【００３６】
以上のように構成したフォワードプライマーは、配列番号１、及び配列番号３〜１２に由来するヌクレオチドを含むため、１１種類の主要なＢＬＶを検出可能である。また、第二のプライマーは縮重プライマーであるから、１１種類の主要なＢＬＶ以外のＢＬＶも検出できる。また、DQ287255なるＢＬＶ用のプライマーを縮重プライマーではない形で設計したために、縮重度が大幅に抑えられた。縮重度が大幅に抑えられたということはすなわち、安定した品質での製造が非常に容易となることを意味する。
【００３７】
（ＢＬＶの配列情報に係る参考文献・出典等）
DQ287255：  Hirsch,C., Barbosa-Stancioli,E.F., Camargos,M.F., Reis,J.K.P. and  Leite,R.C., Bovine Leukemia Virus LTR: Genetic Variability and Phylogeny of  Brazilian Samples, Direct Submission  Submitted (10-NOV-2005)(出典Ａ)
EF600696:   Rovnak,J., Boyd,A.L., Casey,J.W., Gonda,M.A., Jensen,W.A. and Cockerell,G.L. 1993, Pathogenicity of molecularly cloned bovine leukemia virus.  J. Virol. 67, 7096-7105(出典Ｂ)
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D00647：  Coulston,J., Naif,H., Brandon,R., Kumar,S., Khan,S., Daniel,R.C. and Lavin,M.F., Molecular cloning and sequencing of an Australian isolate of proviral bovine leukaemia virus DNA: comparison with other isolates. 1990, J. Gen. Virol. 71, 1737-1746(出典Ｃ)
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AF257515：Dube,S., Dolcini,G., Abbott,L., Mehta,S., Dube,D., Gutierrez,S., Ceriani,C., Esteban,E., Ferrer,J. and Poiesz,B., The complete genomic sequence of a BLV strain from a Holstein cow  from Argentina. 2000, Virology 277, 379-386(出典Ｄ)
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DQ287259：  (出典Ａ)
DQ288193：  (出典Ｅ)。
【００３８】
本出願は、２０１２年８月１４日付で日本国特許庁に出願された特願２０１２−１７９９７２（基礎出願）に基づく優先権の利益を主張するものである。当該基礎出願の内容、及び、本明細書で言及されているすべての文献の内容は、本明細書の一部を構成するものとして、本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００３９】
以下、参考例及び実施例に基づき本発明をより詳細に説明する。【００４０】
〔参考例１〕
非特許文献１の記載を参照して、ＢＬＶ検出用のフォワードプライマーとして配列番号１３に示すもの（塩基配列：ＭＮＭＹＣＹＫＤＲＳＹＫＳＹＫＳＡＹＹＴＣＡＣＣＴ）を、リバースプライマーとして配列番号１４に示すもの（塩基配列：ＴＡＣＣＴＧＭＣＳＳＣＴＫＳＣＧＧＡＴＡＧＣＣＧＡ）を用いて、以下の条件にてリアルタイムＰＣＲ反応によるＢＬＶの遺伝子断片の増幅を行った。なお、配列番号１３及び１４においてＭはＡ及びＣを、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ及びＴを、ＹはＣ及びＴを、ＫはＧ及びＴを、ＤはＡ、Ｇ及びＴを、ＲはＡ及びＧを、ＳはＧ及びＣを表す何れも縮重塩基であって、フォワードプライマーの縮重度は３９３２１６である。なお、フォワードプライマーは異なる三社（Ａ〜Ｃ社）が製造した液体品（液体納品）又は乾燥品（乾燥納品）を用い、リバースプライマーは液体品を用いた。なお、参考例及び実施例において、液体品とは所定の液体（１０ｍＭ Tris-HCL、１ｍＭ EDTA(pH8.0)）に溶解した水溶液状態で納品されたオリゴＤＮＡを指し、乾燥品とは乾燥状態で納品されたオリゴＤＮＡを指す。【００４１】
＜リアルタイムＰＣＲ用の試料の調製＞
ウシＢ細胞白血病細胞株で、白血病ウイルスをつくらないが、１×１０４copy／μＬ程度のＢＬＶが検出される細胞株ＫＵ−１を培養し、１×１０7個の細胞を回収した。得られた培養細胞から、Wizard（登録商標） Genomic DNA Purification Kit（Promega）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、ＴＥバッファーに溶解して５０ｎｇ／μＬ、１００μｇ程度のゲノムＤＮＡ溶液を回収し、リアルタイムＰＣＲ用の高濃度試料（ＨＡ）サンプルとして使用した。【００４２】
検量線は、非特許文献１にて作製したBoLA-DRA遺伝子／pBluescript+IIおよびBLV-LTR遺伝子／pBluescript+IIをQUIAGEN Plasmid Maxi Kitを用いて精製後、制限酵素XhoIを用いて直鎖状とした。その後、O.D値の測定およびQuant-iTTM PicoGreen（登録商標） dsDNA Reagent and Kits(Life Technologies社)を用いて、ＤＮＡ定量を行い、モル数を計算した。得られた濃度既知の1 cut検量線プラスミドを１ｍｏｌ／μＬ(１ copy)〜１×１０７ｍｏｌ／μＬ(１０７ copy)の範囲で希釈して定量ＰＣＲの検量線として用いた。【００４３】
＜リアルタイムＰＣＲの反応条件、データ解析条件＞
リアルタイムＰＣＲにおいて用いたTaqManプローブの配列は、ＤＲＡ検出用のＶＩＣ‐ＤＲＡが(５’‐ＶＩＣ‐ＴＧＴＧＴＧＣＣＣＴＧＧＧＣ‐ＮＦＱ‐ＭＧＢ‐３’：配列番号１５)であり、ＢＬＶ検出用のＦＡＭ‐ＢＬＶが(５’‐ＦＡＭ‐ＣＴＣＡＧＣＴＣＴＣＧＧＴＣＣ‐ＮＦＱ‐ＭＧＢ‐３’：配列番号１６)である。また、リアルタイムＰＣＲは、Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイムPCRシステムを用いて、以下のＰＣＲ反応条件下で行った。
・ＰＣＲ用の反応液組成：
（１）ＤＲＡ用反応液（２０μＬ中）
ＤＲＡ検出用フォワードプライマー及びＤＲＡ検出用リバースプライマー  各８５ｎＭ
（ＤＲＡ検出用フォワードプライマーの配列（配列番号２０）：ＣＣＣＡＧＡＧＡＣＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣ）
（ＤＲＡ検出用リバースプライマーの配列（配列番号２１）：ＣＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＡＡＴＣＡ）
２×TaqMan Gene Expression Master mix  １０μＬ
ウシ由来ゲノムＤＮＡ  １５０μｇ
（２）ＢＬＶ用反応液（２０μＬ中）
ＢＬＶ検出用のフォワードプライマー  ８５０ｎＭ
ＢＬＶ検出用のリバースプライマー    ８５ｎＭ
２×TaqMan Gene Expression Master mix  １０μＬ
ウシ由来ゲノムＤＮＡ  １５０μｇ
・ＰＣＲの反応条件（ＤＲＡの検出とＢＬＶの検出とで共通）：
５０℃で２分、続いて９５℃で１０分反応した後に、９５℃で１５秒の反応と６０℃で１分の反応とを１サイクルとして、８５サイクルの反応を行った。【００４４】
＜結果＞
図１〜図２は、リアルタイムＰＣＲのサイクル数（横軸）とデルタＲｎ（縦軸）との関係（いわゆるamplification plot）を示す。図１から分かるように、異なる会社が製造した液体品間、及び乾燥品間の何れでも品質のバラつきが観察された。また、図２は、図１中で最も優れた品質を示すＡ社の液体品（「Ａ社  液体納品」と記載）を、Ａ社の異なるロットＡ〜Ｃ（液体品及び乾燥品）と比較したものである。図２に示す通り、同一製品でもロットが異なれば品質のバラつきが観察された。【００４５】
〔実施例１〕
まず、ＢＬＶ検出用のフォワードプライマーとして下記の表１に示すＮｏ．５−１〜５−３の混合物（セット５と称する）を、リバースプライマーとして配列番号１４に示すもの（参考例１と同じ配列）を用いて、以下の条件にてリアルタイムＰＣＲ反応によるＢＬＶの遺伝子断片の増幅を行った。なお、フォワードプライマーにおいてＢはＡ、Ｃ及びＧを、ＹはＣ及びＴを、ＫはＧ及びＴを、ＲはＡ及びＧを表す何れも縮重塩基であって、フォワードプライマーの縮重度は６４である（表１中のＮｏ．５−２の配列では３×２×２×２×２＝４８、Ｎｏ．５−３の配列では２×２×２×２＝１６）。なお、フォワードプライマーは液体品を用い、リバースプライマーは液体品を用いた。【００４６】
【表１】
2014027663.tif 000002
【００４７】
さらに、ＢＬＶ検出用のフォワードプライマーとして下記の表２に示すＮｏ．６−１〜６−２の混合物（セット６と称する）を、リバースプライマーとして配列番号１４に示すもの（参考例１と同じ）を用いて、以下の条件にてリアルタイムＰＣＲ反応によるＢＬＶの遺伝子断片の増幅を行った。なお、フォワードプライマーにおいて塩基ＭはＡ及びＣを、塩基ＮはＡ、Ｃ、Ｇ及びＴを、塩基ＹはＣ及びＴを、塩基ＫはＧ及びＴを、塩基ＤはＡ、Ｇ及びＴを表す何れも縮重塩基であって、フォワードプライマーの縮重度は１５３６である。なお、フォワードプライマーは液体品を用い、リバースプライマーは液体品を用いた。【００４８】
【表２】
2014027663.tif 000003
【００４９】
＜リアルタイムＰＣＲ用の試料の調製＞
参考例１で調製した濃度既知の1 cut検量線プラスミド１×１０7ｍｏｌ／μＬ（１０７ copy）のストックを１００倍〜１００万倍に希釈した試料（１×１０１ｍｏｌ／μＬ（10 copy）〜１×１０５ｍｏｌ／μＬ（１０５ copy））、及び、リアルタイムＰＣＲ用の高濃度試料（ＨＡ）と、当該ＨＡをＢＬＶが検出されないウシゲノムＤＮＡを使用し、１０倍〜１０００倍に希釈し、５０ｎｇ／μＬに調製した試料も準備した。【００５０】
＜リアルタイムＰＣＲの反応条件、データ解析条件＞
リアルタイムＰＣＲの反応試薬として表３に示す組成のものを用いた点以外は、参考例１と同様の反応条件、及びデータ解析条件に従った。【００５１】
【表３】
2014027663.tif 000004
【００５２】
＜結果＞
図３は、リアルタイムＰＣＲのサイクル数（横軸）とデルタＲｎ（縦軸）との関係（amplification plot）を示す。図３は、参考例１で最も優れた品質を示すＡ社の液体品（図中で「Ａ社  液体納品」と記載）を、上述のセット５及び６と比較したものである。【００５３】
また、Ｃｔ（Threshold cycle）値の測定結果は下記の表４〜５に示す。【００５４】
【表４】
2014027663.tif 000005
【００５５】
【表５】
2014027663.tif 000006
【００５６】
※ＭＡはＨＡ(高濃度試料)の１０倍希釈、ＬＡはＨＡの１００倍希釈、ＬＬＡはＨＡの１０００倍希釈
図３及び表４〜５に示す通り、セット５及び６は何れもＡ社の液体品より高品質であった。【００５７】
〔実施例２〕
ＢＬＶ検出用のフォワードプライマーとして上記の表２に示すＮｏ．６−１〜６−２の混合物（セット６）を、リバースプライマーとして配列番号１４に示すものを用いて、以下の条件にてリアルタイムＰＣＲ反応によるＢＬＶの遺伝子断片の増幅を行った。なお、セット６は実施例１で用いたものを含めて４ロットを準備した。【００５８】
＜リアルタイムＰＣＲ用の試料の調製＞
実施例１と同様に、濃度既知の1 cut検量線プラスミド１×１０7ｍｏｌ／μＬ（１０７ copy）のストックを１００倍〜１００万倍に希釈した試料（１×１０１ｍｏｌ／μＬ（10 copy）〜１×１０５ｍｏｌ／μＬ（１０５ copy））を用意した。【００５９】
＜リアルタイムＰＣＲの反応条件、データ解析条件＞
リアルタイムＰＣＲの反応試薬として、上記の表３に示す組成を用い、５０℃で２分、９５℃で１０分反応させた後、９５℃で１５秒、６０℃で１分の反応を１サイクルとして８５サイクルのＰＣＲ反応を行った。この点以外は、参考例１と同様の反応条件、及びデータ解析条件に従った。【００６０】
＜結果＞
Ｃｔ値の測定結果は下記の表６に示す。【００６１】
【表６】
2014027663.tif 000007
【００６２】
表６に示す通り、セット６はロット間での品質のぶれがほとんどなかった。【００６３】
〔実施例３〕
ＢＬＶ検出用のフォワードプライマーとして以下のＮｏ．７−１〜７−２の混合物（セット７：配列番号１７及び１８）を、リバースプライマーとして配列番号１９（ＴＴＧＣＣＴＴＡＣＣＴＧＭＣＳＳＣＴＫＳＣＧＧＡＴＡＧＣＣＧＡ）に示すものを用いて、以下の条件にてリアルタイムＰＣＲ反応によるＢＬＶの遺伝子断片の増幅を行った。また、フォワードプライマーとして実施例１及び２で示したセット６を用いた以外は同じ条件でＢＬＶの遺伝子断片の増幅を行った。なお、セット７中に含まれるプライマーの混合比は表７に示すように調製した。
Ｎｏ．７−１：（配列番号１７）
５‘‐ＡＡＴＣＣＭＮＭＹＣＹＫＤＡＧＣＴＧＣＴＧＡＹＹＴＣＡＣＣＴ‐３’
Ｎｏ．７−２：（配列番号１８）
５‘‐ＡＴＣＣＡＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＣＡＣＣＴ‐３’
＜リアルタイムＰＣＲ用の試料の調製＞
実施例１と同様に、濃度既知の1 cut検量線プラスミド１×１０7ｍｏｌ／μＬ（１０７ copy）のストックを１００倍〜１００万倍に希釈した試料（１×１０１ｍｏｌ／μＬ（10 copy）〜１×１０５ｍｏｌ／μＬ（１０５ copy））を用意した。また、リアルタイムＰＣＲ用の高濃度試料（ＨＡ）を１００倍に希釈した試料（ＬＡ）も準備した。【００６４】
＜リアルタイムＰＣＲの反応条件、データ解析条件＞
リアルタイムＰＣＲの反応試薬として、上記の表３に示す組成を用い、５０℃で２分、９５℃で１０分反応させた後、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒の反応を１サイクルとして６０サイクルのＰＣＲ反応を行った。この点以外は、参考例１と同様の反応条件、及びデータ解析条件に従った。【００６５】
＜結果＞
図４は、リアルタイムＰＣＲのサイクル数（横軸）とデルタＲｎ（縦軸）との関係（amplification plot）を示す。また、Ｃｔ値の測定結果は下記の表７に示す。【００６６】
【表７】
2014027663.tif 000008
【００６７】
図４及び表７に示すように、セット７の方がセット６よりＣｔ値がさらに低いという点で優れており、かつプライマーの混合比率を大きく変化させてもＣｔ値にさほど影響を与えないことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明はＢＬＶの検出に利用することができる。
【図１】
2014027663.tif 000009
【図２】
2014027663.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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