(57)【要約】  本発明の課題は、中間代謝物である化合物Ｐから代謝物Ｍへの転換量を減少させ、しかも代謝物Ｍまたは代謝物Ｍから生成する最終産物を添加しない培地中で化合物Ｐを効率よく蓄積できる菌株を提供することである。本発明によれば、炭素源から生育に必須な代謝物Ｍを生成する生合成経路において中間代謝物である化合物Ｐを代謝物Ｍに転換する酵素Ｘの発現量を調節することにより化合物Ｐを蓄積させるために、本明細書に規定する（ａ）から（ｄ）に記載の性質をすべて有する原核生物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素源から生育に必須な代謝物Ｍを生成する生合成経路において中間代謝物である化合物Ｐを代謝物Ｍに転換する酵素Ｘの発現量を調節することにより化合物Ｐを蓄積させるために、以下の（ａ）から（ｄ）に記載の性質をすべて有する原核生物。
（ａ）該原核生物が利用できる炭素源から化合物Ｐに至る生合成に関わる酵素群のうち、いずれか１つ以上の酵素の活性が該原核生物の野生株と比べて増強している。
（ｂ）酵素Ｘのタンパク質をコードする野生型遺伝子ｘの翻訳領域、該遺伝子の翻訳調節領域または遺伝子ｘの転写を促すプロモーター領域の中に１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異を有することにより、酵素Ｘの活性が欠損または低下している。
（ｃ）前記遺伝子ｘの転写を促す本来のプロモーターとは異なっており、かつリプレッサーＲのタンパク質により転写が抑制されるプロモーターＡにより、活性型酵素ＸをコードするDNAの転写が制御される。
（ｄ）リプレッサーＲのタンパク質をコードする遺伝子ｚを１コピー以上有し、該遺伝子の転写が該遺伝子の本来のプロモーターおよび／または該プロモーターとは異なる誘導プロモーターＢにより制御される。
【請求項２】
性質（ｂ）に記載の遺伝子ｘの転写を促すプロモーター領域の中の置換変異が、該プロモーターの全域または一部の領域を、性質（ｃ）に記載のプロモーターＡのDNAと置換する変異であることを特徴とする、請求項１に記載の原核生物。
【請求項３】
前記原核生物が有する化合物Ｐを代謝する酵素のうち、酵素Ｘ以外のいずれか１つ以上の代謝酵素の活性が欠損または低下していることを特徴とする、請求項１または２に記載の原核生物。
【請求項４】
前記プロモーターＢが、フェルラ酸、バニリン酸、バニリン、安息香酸、３−ヒドロキシ安息香酸、レゾルシノール、４−ヒドロキシ安息香酸、２，４−ジヒドロキシ安息香酸、フラクトースおよびスクロースからなる群から選ばれる化合物の添加により誘導されるプロモーターであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の原核生物。
【請求項５】
前記リプレッサーＲのタンパク質をコードする遺伝子ｚが、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のvanR（cg2615）遺伝子、pcaR（cg2624）遺伝子、またはrhcR（cg1308）遺伝子であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の原核生物。
【請求項６】
前記プロモーターＡが、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のvanA（cg2616）遺伝子のプロモーター、pobA（cg1226）遺伝子のプロモーター、pcaH（cg2631）遺伝子のプロモーター、またはrhcH（cg1309）遺伝子のプロモーターであることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の原核生物。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の原核生物をプロモーターＡの転写を抑制した状態で炭素源の存在下で培養することを特徴とする、化合物Ｐの製造方法。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項に記載の原核生物をプロモーターＡの転写を抑制した状態で炭素源の存在下で培養した後、プロモーターＢの転写を誘導する処理を加えることによりリプレッサーＲのタンパク質の発現量を増加させることにより、代謝物Ｍの生成量を減少させることを特徴とする、化合物Ｐの製造方法。
【請求項９】
請求項１から６のいずれか一項に記載の原核生物をプロモーターＡの転写抑制を解除した状態で炭素源の存在下で培養した後、プロモーターＢの転写を誘導する処理を加えることによりリプレッサーＲのタンパク質の発現量を増加させることにより、代謝物Ｍの生成量を減少させることを特徴とする、化合物Ｐの製造方法。
【請求項１０】
前記化合物Ｐおよび前記代謝物Ｍの組み合わせが、以下（ｆ）から（ｉ）のいずれかであることを特徴とする、請求項７から９のいずれか一項に記載の化合物Ｐの製造方法。
（ｆ）化合物Ｐが３−デヒドロシキミ酸であり、代謝物Ｍがシキミ酸である。
（ｇ）化合物Ｐがグルタミン酸であり、代謝物ＭがＮ−アセチルグルタミン酸またはγーグルタミルリン酸である。
（ｈ）化合物Ｐがアスパラギン酸であり、代謝物Ｍがβ−アルパルチルリン酸である。
（ｉ）化合物Ｐがセリンであり、代謝物Ｍがグリシンである。
【請求項１１】
蓄積する化合物Ｐを酵素Ｙにより化合物Ｑに転換するために、（ａ）から（ｄ）に記載の性質に加えて下記の性質（ｅ）を有することを特徴する、請求項１から６のいずれか一項に記載の原核生物。
（ｅ）酵素Ｙのタンパク質をコードする遺伝子ｙの翻訳領域、該遺伝子の翻訳調節領域または遺伝子ｙの転写を促すプロモーター領域の中に１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異を有することにより、化合物Ｐから化合物Ｑへの転換能が増強している、もしくは遺伝子ｙの発現が野生型とは異なる制御を受けている。
【請求項１２】
前記原核生物が有する化合物Ｑを代謝する酵素のうち、いずれか１つ以上の代謝酵素の活性が欠損または低下していることを特徴とする、請求項１１に記載の原核生物。
【請求項１３】
性質（ｅ）に記載の遺伝子ｙの転写を促すプロモーター領域の中の置換変異が、該プロモーターの全域または一部の領域を、該遺伝子の転写を促す本来のプロモーターおよびプロモーターＡとは異なるプロモーターＣのDNAと置換する変異であることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の原核生物。
【請求項１４】
前記プロモーターＣがプロモーターＢと同一である、または前記プロモーターＣがプロモーターＢの転写を制御するタンパク質による転写制御を受けることを特徴とする、請求項１３に記載の原核生物。
【請求項１５】
前記プロモーターＣが誘導プロモーターであることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の原核生物。
【請求項１６】
前記プロモーターＣが、フェルラ酸、バニリン酸、バニリン、安息香酸、３−ヒドロキシ安息香酸、レゾルシノール、４−ヒドロキシ安息香酸、２，４−ジヒドロキシ安息香酸、フラクトースおよびスクロースからなる群から選ばれる化合物の添加により誘導されるプロモーターであることを特徴とする、請求項１５に記載の原核生物。
【請求項１７】
請求項１１から１６のいずれか一項に記載の原核生物をプロモーターＡの転写を抑制した状態で炭素源の存在下で培養することを特徴とする、化合物Ｑの製造方法。
【請求項１８】
請求項１１から１６のいずれか一項に記載の原核生物をプロモーターＡの転写を抑制した状態で炭素源の存在下で培養した後、プロモーターＢの転写を誘導する処理を加えることによりリプレッサーＲのタンパク質の発現量を増加させることにより、代謝物Ｍの生成量を減少させ、化合物Ｑの生成量を増加させることを特徴とする、化合物Ｑの製造方法。
【請求項１９】
請求項１１から１６のいずれか一項に記載の原核生物をプロモーターＡの転写抑制を解除した状態で炭素源の存在下で培養した後、プロモーターＢの転写を誘導する処理を加えることによりリプレッサーＲのタンパク質の発現量を増加させることにより、代謝物Ｍの生成量を減少させ、化合物Ｑの生成量を増加させることを特徴とする、化合物Ｑの製造方法。
【請求項２０】
請求項１１から１６のいずれか一項に記載の原核生物を炭素源の存在下で培養した後、前記プロモーターＣの転写を誘導する処理を加えることにより前記酵素Ｙの発現量を増加させることにより、化合物Ｑの生成量を増加させることを特徴とする、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の化合物Ｑの製造方法。
【請求項２１】
前記化合物Ｐ、前記化合物Ｑおよび前記代謝物Ｍの組み合わせが、以下（ｊ）から（ｗ）のいずれかであることを特徴とする、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の化合物Ｑの製造方法。
（ｊ）化合物Ｐが３−デヒドロシキミ酸であり、化合物Ｑがプロトカテク酸であり、代謝物Ｍがシキミ酸である。
（ｋ）化合物Ｐがコリスミン酸であり、化合物Ｑがアントラニル酸であり、代謝物Ｍがプレフェン酸である。
（ｌ）化合物Ｐがプレフェン酸であり、化合物Ｑが４−ヒドロキシフェニルピルビン酸であり、代謝物Ｍがフェニルピルビン酸である。
（ｍ）化合物Ｐがプレフェン酸であり、化合物Ｑがアロゲン酸であり、代謝物Ｍがフェニルピルビン酸である。
（ｎ）化合物Ｐがプレフェン酸であり、化合物Ｑがフェニルピルビン酸であり、代謝物Ｍが４−ヒドロキシフェニルピルビン酸またはアロゲン酸である。
（ｏ）化合物Ｐが２−オキソイソ吉草酸であり、化合物Ｑが２−イソプロピルリンゴ酸であ、代謝物Ｍがバリンである。
（ｐ）化合物Ｐが２−オキソイソ吉草酸であり、化合物Ｑがバリンであり、代謝物Ｍが２−イソプロピルリンゴ酸である。
（ｑ）化合物Ｐがグルタミン酸であり、化合物Ｑがγーグルタミルリン酸であり、代謝物ＭがＮ−アセチルグルタミン酸である。
（ｒ）化合物Ｐがグルタミン酸であり、化合物ＱがＮ−アセチルグルタミン酸であり、代謝物Ｍがγーグルタミルリン酸である。
（ｓ）化合物Ｐがアスパラギン酸であり、化合物Ｑがアスパラギンであり、代謝物Ｍがβ−アルパルチルリン酸である。
（ｔ）化合物Ｐがアスパラギン酸β−セミアルデヒドあり、化合物Ｑが２，３−ジヒドロジピコリン酸であり、代謝物Ｍがホモセリンである。
（ｕ）化合物Ｐがホモセリンあり、化合物ＱがＯ−アセチルホモセリンであり、代謝物Ｍがホモセリンリン酸である。
（ｖ）化合物Ｐがホモセリンであり、化合物Ｑがホモセリンリン酸であり、代謝物ＭがＯ−アセチルホモセリンである。
（ｗ）化合物Ｐがセリンであり、化合物ＱがＯ−アセチルセリンであり、代謝物Ｍがグリシンである。
【請求項２２】
前記酵素Ｘがシキミ酸脱水素酵素であり、かつ前記酵素Ｙが３−デヒドロシキミ酸脱水酵素であることを特徴とする、請求項２１の（ｊ）に記載のプロトカテク酸の製造方法。
【請求項２３】
プロトカテク酸２，３−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子、プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子およびプロトカテク酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子について、該遺伝子の翻訳領域またはその転写・翻訳調節領域の中に、１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異を導入することにより、プロトカテク酸の代謝活性が欠損または低下している性質であることを特徴とする、請求項２２に記載のプロトカテク酸の製造方法。
【請求項２４】
コリネバクテリウム・グルタミカムまたはエッシェリヒア・コリである、請求項１から６のいずれか一項または請求項１１から１６のいずれか一項に記載の原核生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機酸やアミノ酸などの有用物質を効率よく製造するための微生物および該微生物を用いた有用物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
栄養要求変異や代謝調節変異の導入、または組換えDNA技術などを用いて、有機酸、アミノ酸、核酸、ビタミンなどの有用化合物を効率よく製造する微生物を取得する方法が開発されている。図１に示すように、炭素源から中間代謝物である化合物Ｐを経由して生育に必須な代謝物Ｍを生成する生合成経路または代謝経路において、化合物Ｐを効率よく生産させるためには、化合物Ｐを代謝物Ｍに転換する酵素Ｘの活性を欠損させた栄養要求変異株を取得する方法がよく用いられてきた。しかしながら、該変異株を用いて目的の化合物Ｐを生産する場合、代謝物Ｍまたは代謝物Ｍから生成する最終産物を培地に添加する必要があり、製造コストが高くなるという問題点があった。【０００３】
たとえば、図２に示すシキミ酸経路の中間代謝物であるシキミ酸を、シキミ酸キナーゼ活性を欠損させたエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）を用いて効率よく生産できることが報告されている（特許文献１、非特許文献１）。ただし、該微生物を用いた場合、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンの要求性に加えて、パラヒドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸および２，３−ジヒドロキシ安息香酸の要求性が生じるために、これら６種類の化合物を培地に添加する必要があるという問題点があった。また、シキミ酸経路の中間代謝物である３−デヒドロシキミ酸を、シキミ酸脱水素活性を欠損させたエシェリヒア・コリを用いて効率よく生産できることが報告されているが、該微生物も上記６種類の化合物の要求性が生じるという問題点があった（特許文献２、非特許文献２）。【０００４】
Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンやエチルメタンスルフォン酸などの変異剤を用いた処理やＵＶや放射線の照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによって変異を導入することによって、化合物Ｐから代謝物Ｍに転換する酵素Ｘの量を減少させる変異を導入して代謝物Ｍの生成量が減少させることにより、化合物Ｐの量を増加させることも可能である。この場合、酵素Ｘの活性が残存することにより化合物Ｐの一部が常に代謝物Ｍに転換するために、化合物Ｐの生産量を最大化する条件を見出すことは容易でない。【０００５】
本発明では、酵素Ｘをコードする遺伝子ｘの転写を人為的にリプレッサーの制御下に置いて代謝物Ｍの生成量を制御することにより、代謝物Ｍまたは代謝物Ｍから生成する最終産物を培地に添加せずに、化合物Ｐを効率よく生産する方法を開示するが、遺伝子ｘの本来のプロモーターではなく、リプレッサーにより転写抑制がかかる別のプロモーターを利用して遺伝子ｘの転写量を制御することにより化合物Ｐの生産量を向上させた事例は報告されていない。【０００６】
微生物を用いて有用化合物を製造する場合、炭素源から中間代謝物である化合物Ｐを経由して生育に必須な代謝物Ｍを生成する生合成経路または代謝経路において、該経路上の化合物Ｐから分岐する経路により該有用化合物を生産させる方法が用いられることも多い。この方法を用いる場合にも、上記酵素Ｘの活性を欠損させた栄養要求変異株を取得する方法がよく用いられてきたが、代謝物Ｍまたは代謝物Ｍから生成する最終産物を培地に添加する必要があり、製造コストが高くなるという問題点があった。【０００７】
多数の分岐経路を持つシキミ酸経路（図２）を用いる目的物質の生産に関しては、たとえば、トリプトファン生産菌株の多くは、中間代謝物であるコリスミン酸がチロシンやフェニルアラニンの合成経路に流れないようにするために、チロシンおよびフェニルアラニンの要求性を有することが知られている（特許文献３、非特許文献３と４）。また、フェニルアラニン生産菌はチロシンの要求性を有することが知られている（特許文献４と５、非特許文献５）。したがって、目的の芳香族アミノ酸を製造するときには、別の芳香族アミノ酸を培地に添加する必要がある。【０００８】
３−デヒドロシキミ酸（以下、ＤＨＳと略す）からシキミ酸（代謝物Ｍ）に転換する酵素を欠損させ、しかもシキミ酸経路の出発物質である３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸（以下、ＤＡＨＰと略す）の生成量を増加させた変異株を造成することにより、約40 g/Lのプロトカテク酸を生産できることも報告されている（非特許文献６）。ただし、該変異株を用いた場合、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンの要求性に加えて、パラヒドロキシ安息香酸、パラアミノ安息香酸および２，３−ジヒドロキシ安息香酸の要求性が生じるために、これら６種類の化合物を培地に添加する必要があるという問題点があった。また、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌（特許文献６）またはブレビバクテリウム（Brevibacterium）属細菌（特許文献７と８）に変異を導入することにより、プロトカク酸生産菌も取得されているが、これら変異株はプロトカテク酸の生産に対してチロシンなどの栄養源が必要である。さらに、これら変異株のプロトカテク酸の生産量の最高値は約13 g/Lであり、上述の芳香族アミノ酸栄養要求変異株の生産量よりも低い（特許文献８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】United States Patent 6,472,169
【特許文献２】United States Patent 5,821,266
【特許文献３】特許第４，３０５，１８４号公報
【特許文献４】特開平５−４９４８９号公報
【特許文献５】特開平５−３０４９７１号公報
【特許文献６】特公昭４５−３９０３６号公報
【特許文献７】特開昭５０−８９５９２号公報
【特許文献８】特開昭６０−９８９８９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Biotechnol. Prog. 19, 808 (2003)
【非特許文献２】Biotechol. Bioeng. 64, 61 (1999)
【非特許文献３】Agric. Biol. Chem. 39, 343 (1975)
【非特許文献４】Appl Environ Microbiol. 65, 2497 (1999)
【非特許文献５】Agric. Biol. Chem. 37, 2013 (1973)
【非特許文献６】J. Am. Chem. Soc. 127, 2874 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、炭素源から中間代謝物である化合物Ｐを介して生育に必須な代謝物Ｍを生成する生合成経路または代謝経路を有する微生物を用いて化合物Ｐを生産する際に、化合物Ｐから代謝物Ｍへの転換量を減少させ、しかも代謝物Ｍまたは代謝物Ｍから生成する最終産物を添加しない培地中で化合物Ｐを効率よく蓄積できる菌株を取得する方法（図１）を提供することであり、さらに、蓄積した化合物Ｐをもとに酵素Ｙにより化合物Ｑを生産する方法（図３）を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032株（以下、ATCC13032株と略記する）を用いて目的物質であるＤＨＳを効率よく生産する菌株を造成する研究において、上記課題を解決することを試みた。まず、グルコースからＤＨＳ（化合物Ｐ）に至る生合成経路に関わる複数の酵素の発現を増強し、さらにＤＨＳからプロトカテク酸への転換を促すＤＨＳ脱水酵素（酵素Ｙ）をコードする遺伝子qsuB（cg0502）遺伝子の転写をtuf（cg0587）遺伝子のプロモーター（以下、Tuプロモーターと略す）の制御下に置いたNSH株をもとに、ＤＨＳからシキミ酸（代謝物Ｍ）への転換を促すシキミ酸脱水素酵素（酵素Ｘ）をコードするaroE3（cg1835）遺伝子に欠失変異を導入したNSHΔaroE3株を造成したところ、NSHΔaroE3株の増殖は、３種類の芳香族アミノ酸（トリプトファン、フェニルアラニンおよびチロシン）を添加しないと極端に遅くなることを確認した。このNSHΔaroE3株は3種類の芳香族アミノ酸とシキミ酸を添加した培地中で培養することにより、0.5 g/Lのプロトカテク酸を生産することを確認した。次に、このNSHΔaroE3株をもとに、活性型シキミ酸脱水素酵素遺伝子（aroE3遺伝子）の発現をvanR（cg2615）遺伝子がコードするリプレッサー（以下、VanRリプレッサーと略す）により制御するために、aroE3遺伝子をvanA（cg2616）遺伝子のプロモーター（以下、vanAプロモーターと略す）に連結したDNAを染色体に組み込んだNSHΔaroE3＿vanE3株を造成した。このNSHΔaroE3＿vanE3株は、３種類の芳香族アミノ酸とシキミ酸を添加しない合成培地中で生育できる上、16.6 g/Lのプロトカテク酸が生産することを見出し、本発明の課題を解決するに至った。また、このNSHΔaroE3株をもとに、aroE3遺伝子の発現をrhcR（cg1308）遺伝子がコードするリプレッサー（以下、RhcRリプレッサーと略す）により制御する菌株を造成したところ、11.2 g/Lののプロトカテク酸の生産性が確認され、VanRリプレッサー以外のリプレッサーを利用することによっても優れているプロトカテク酸の生産性が得られることを見出した。【００１３】
次に、NSHΔaroE3株のaroE3遺伝子欠失変異に加えて、ＤＨＳからシキミ酸（代謝物Ｍ）への転換を促すシキミ酸脱水素酵素をコードするqsuD（cg0504）遺伝子とＤＨＳ脱水酵素をコードするqsuB遺伝子にも欠失変異を導入したNSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD株を造成したところ、NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD株は３種類の芳香族アミノ酸とビタミンＫ２とパラアミノ安息香酸を添加しないと増殖できないことを確認した。このNSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD株はこれらの添加物を加えた培地中で培養することにより、7.7 g/LのＤＨＳを生産することを確認した。NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD株の構築と同様の手順で、NSHΔaroE3＿vanE3株をもとに、qsuD遺伝子とqsuB遺伝子に欠失変異を導入したNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuBΔqsuD株を造成した。このNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuBΔqsuD株をもとに、benA（cg2637）遺伝子のプロモーターとVanRリプレッサーをコードするvanR遺伝子を連結したDNAを染色体に組み込んだPben-vanR株を造成したところ、Pben-vanR株は、これら添加物を含まない合成培地中で生育できる上、15.4 g/LのＤＨＳを生産できることを見出し、本発明の課題を解決するに至った。【００１４】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（２４）に関する。
（１）炭素源から生育に必須な代謝物Ｍを生成する生合成経路において中間代謝物である化合物Ｐを代謝物Ｍに転換する酵素Ｘの発現量を調節することにより化合物Ｐを蓄積させるために、以下の（ａ）から（ｄ）に記載の性質をすべて有する原核生物。
（ａ）該原核生物が利用できる炭素源から化合物Ｐに至る生合成に関わる酵素群のうち、いずれか１つ以上の酵素の活性が該原核生物の野生株と比べて増強している。
（ｂ）酵素Ｘのタンパク質をコードする野生型遺伝子ｘの翻訳領域、該遺伝子の翻訳調節領域または遺伝子ｘの転写を促すプロモーター領域の中に１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異を有することにより、酵素Ｘの活性が欠損または低下している。
（ｃ）前記遺伝子ｘの転写を促す本来のプロモーターとは異なっており、かつリプレッサーＲのタンパク質により転写が抑制されるプロモーターＡにより、活性型酵素ＸをコードするDNAの転写が制御される。
（ｄ）リプレッサーＲのタンパク質をコードする遺伝子ｚを１コピー以上有し、該遺伝子の転写が該遺伝子の本来のプロモーターおよび／または該プロモーターとは異なる誘導プロモーターＢにより制御される。【００１５】
（２）性質（ｂ）に記載の遺伝子ｘの転写を促すプロモーター領域の中の置換変異が、該プロモーターの全域または一部の領域を、性質（ｃ）に記載のプロモーターＡのDNAと置換する変異であることを特徴とする、（１）に記載の原核生物。
（３）前記原核生物が有する化合物Ｐを代謝する酵素のうち、酵素Ｘ以外のいずれか１つ以上の代謝酵素の活性が欠損または低下していることを特徴とする、（１）または（２）に記載の原核生物。
（４）前記プロモーターＢが、フェルラ酸、バニリン酸、バニリン、安息香酸、３−ヒドロキシ安息香酸、レゾルシノール、４−ヒドロキシ安息香酸、２，４−ジヒドロキシ安息香酸、フラクトースおよびスクロースからなる群から選ばれる化合物の添加により誘導されるプロモーターであることを特徴とする、（１）から（３）のいずれか一項に記載の原核生物。【００１６】
（５）前記リプレッサーＲのタンパク質をコードする遺伝子ｚが、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のvanR（cg2615）遺伝子、pcaR（cg2624）遺伝子、またはrhcR（cg1308）遺伝子であることを特徴とする、（１）から（４）のいずれか一項に記載の原核生物。
（６）前記プロモーターＡが、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のvanA（cg2616）遺伝子のプロモーター、pobA（cg1226）遺伝子のプロモーター、pcaH（cg2631）遺伝子のプロモーター、またはrhcH（cg1309）遺伝子のプロモーターであることを特徴とする、（１）から（５）のいずれか一項に記載の原核生物。【００１７】
（７）（１）から（６）のいずれか一項に記載の原核生物をプロモーターＡの転写を抑制した状態で炭素源の存在下で培養することを特徴とする、化合物Ｐの製造方法。
（８）（１）から（６）のいずれか一項に記載の原核生物をプロモーターＡの転写を抑制した状態で炭素源の存在下で培養した後、プロモーターＢの転写を誘導する処理を加えることによりリプレッサーＲのタンパク質の発現量を増加させることにより、代謝物Ｍの生成量を減少させることを特徴とする、化合物Ｐの製造方法。
（９）（１）から（６）のいずれか一項に記載の原核生物をプロモーターＡの転写抑制を解除した状態で炭素源の存在下で培養した後、プロモーターＢの転写を誘導する処理を加えることによりリプレッサーＲのタンパク質の発現量を増加させることにより、代謝物Ｍの生成量を減少させることを特徴とする、化合物Ｐの製造方法。【００１８】
（１０）前記化合物Ｐおよび前記代謝物Ｍの組み合わせが、以下（ｆ）から（ｉ）のいずれかであることを特徴とする、（７）から（９）のいずれか一項に記載の化合物Ｐの製造方法。
（ｆ）化合物Ｐが３−デヒドロシキミ酸であり、代謝物Ｍがシキミ酸である。
（ｇ）化合物Ｐがグルタミン酸であり、代謝物ＭがＮ−アセチルグルタミン酸またはγーグルタミルリン酸である。
（ｈ）化合物Ｐがアスパラギン酸であり、代謝物Ｍがβ−アルパルチルリン酸である。
（ｉ）化合物Ｐがセリンであり、代謝物Ｍがグリシンである。【００１９】
（１１）蓄積する化合物Ｐを酵素Ｙにより化合物Ｑに転換するために、（ａ）から（ｄ）に記載の性質に加えて下記の性質（ｅ）を有することを特徴する、（１）から（６）のいずれか一項に記載の原核生物。
（ｅ）酵素Ｙのタンパク質をコードする遺伝子ｙの翻訳領域、該遺伝子の翻訳調節領域または遺伝子ｙの転写を促すプロモーター領域の中に１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異を有することにより、化合物Ｐから化合物Ｑへの転換能が増強している、もしくは遺伝子ｙの発現が野生型とは異なる制御を受けている。【００２０】
（１２）前記原核生物が有する化合物Ｑを代謝する酵素のうち、いずれか１つ以上の代謝酵素の活性が欠損または低下していることを特徴とする、（１１）に記載の原核生物。
（１３）性質（ｅ）に記載の遺伝子ｙの転写を促すプロモーター領域の中の置換変異が、該プロモーターの全域または一部の領域を、該遺伝子の転写を促す本来のプロモーターおよびプロモーターＡとは異なるプロモーターＣのDNAと置換する変異であることを特徴とする、（１１）または（１２）に記載の原核生物。【００２１】
（１４）前記プロモーターＣがプロモーターＢと同一である、または前記プロモーターＣがプロモーターＢの転写を制御するタンパク質による転写制御を受けることを特徴とする、（１３）に記載の原核生物。
（１５）前記プロモーターＣが誘導プロモーターであることを特徴とする、（１３）または（１４）に記載の原核生物。
（１６）前記プロモーターＣが、フェルラ酸、バニリン酸、バニリン、安息香酸、３−ヒドロキシ安息香酸、レゾルシノール、４−ヒドロキシ安息香酸、２，４−ジヒドロキシ安息香酸、フラクトースおよびスクロースからなる群から選ばれる化合物の添加により誘導されるプロモーターであることを特徴とする、（１５）に記載の原核生物。【００２２】
（１７）（１１）から（１６）のいずれか一項に記載の原核生物をプロモーターＡの転写を抑制した状態で炭素源の存在下で培養することを特徴とする、化合物Ｑの製造方法。
（１８）（１１）から（１６）のいずれか一項に記載の原核生物をプロモーターＡの転写を抑制した状態で炭素源の存在下で培養した後、プロモーターＢの転写を誘導する処理を加えることによりリプレッサーＲのタンパク質の発現量を増加させることにより、代謝物Ｍの生成量を減少させ、化合物Ｑの生成量を増加させることを特徴とする、化合物Ｑの製造方法。【００２３】
（１９）（１１）から（１６）のいずれか一項に記載の原核生物をプロモーターＡの転写抑制を解除した状態で炭素源の存在下で培養した後、プロモーターＢの転写を誘導する処理を加えることによりリプレッサーＲのタンパク質の発現量を増加させることにより、代謝物Ｍの生成量を減少させ、化合物Ｑの生成量を増加させることを特徴とする、化合物Ｑの製造方法。
（２０）（１１）から（１６）のいずれか一項に記載の原核生物を炭素源の存在下で培養した後、前記プロモーターＣの転写を誘導する処理を加えることにより前記酵素Ｙの発現量を増加させることにより、化合物Ｑの生成量を増加させることを特徴とする、（１７）から（１９）のいずれか一項に記載の化合物Ｑの製造方法。【００２４】
（２１）前記化合物Ｐ、前記化合物Ｑおよび前記代謝物Ｍの組み合わせが、以下（ｊ）から（ｗ）のいずれかであることを特徴とする、（１７）から（２０）のいずれか一項に記載の化合物Ｑの製造方法。
（ｊ）化合物Ｐが３−デヒドロシキミ酸であり、化合物Ｑがプロトカテク酸であり、代謝物Ｍがシキミ酸である。
（ｋ）化合物Ｐがコリスミン酸であり、化合物Ｑがアントラニル酸であり、代謝物Ｍがプレフェン酸である。
（ｌ）化合物Ｐがプレフェン酸であり、化合物Ｑが４−ヒドロキシフェニルピルビン酸であり、代謝物Ｍがフェニルピルビン酸である。
（ｍ）化合物Ｐがプレフェン酸であり、化合物Ｑがアロゲン酸であり、代謝物Ｍがフェニルピルビン酸である。
（ｎ）化合物Ｐがプレフェン酸であり、化合物Ｑがフェニルピルビン酸であり、代謝物Ｍが４−ヒドロキシフェニルピルビン酸またはアロゲン酸である。
（ｏ）化合物Ｐが２−オキソイソ吉草酸であり、化合物Ｑが２−イソプロピルリンゴ酸であ、代謝物Ｍがバリンである。
（ｐ）化合物Ｐが２−オキソイソ吉草酸であり、化合物Ｑがバリンであり、代謝物Ｍが２−イソプロピルリンゴ酸である。
（ｑ）化合物Ｐがグルタミン酸であり、化合物Ｑがγーグルタミルリン酸であり、代謝物ＭがＮ−アセチルグルタミン酸である。
（ｒ）化合物Ｐがグルタミン酸であり、化合物ＱがＮ−アセチルグルタミン酸であり、代謝物Ｍがγーグルタミルリン酸である。
（ｓ）化合物Ｐがアスパラギン酸であり、化合物Ｑがアスパラギンであり、代謝物Ｍがβ−アルパルチルリン酸である。
（ｔ）化合物Ｐがアスパラギン酸β−セミアルデヒドあり、化合物Ｑが２，３−ジヒドロジピコリン酸であり、代謝物Ｍがホモセリンである。
（ｕ）化合物Ｐがホモセリンあり、化合物ＱがＯ−アセチルホモセリンであり、代謝物Ｍがホモセリンリン酸である。
（ｖ）化合物Ｐがホモセリンであり、化合物Ｑがホモセリンリン酸であり、代謝物ＭがＯ−アセチルホモセリンである。
（ｗ）化合物Ｐがセリンであり、化合物ＱがＯ−アセチルセリンであり、代謝物Ｍがグリシンである。【００２５】
（２２）前記酵素Ｘがシキミ酸脱水素酵素であり、かつ前記酵素Ｙが３−デヒドロシキミ酸脱水酵素であることを特徴とする、（２１）の（ｊ）に記載のプロトカテク酸の製造方法。
（２３）プロトカテク酸２，３−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子、プロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子およびプロトカテク酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子について、該遺伝子の翻訳領域またはその転写・翻訳調節領域の中に、１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異を導入することにより、プロトカテク酸の代謝活性が欠損または低下している性質であることを特徴とする、（２２）に記載のプロトカテク酸の製造方法。
（２４）コリネバクテリウム・グルタミカムまたはエッシェリヒア・コリである、（１）から（６）のいずれか一項または（１１）から（１６）のいずれか一項に記載の原核生物。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、グルコースなどの炭素源をもとに、ＤＨＳやプロトカテク酸などの有用有機化合物を効率よく生産する微生物を取得することができる。また、本発明の微生物を用いれば、芳香族アミノ酸を含まない培地を用いてＤＨＳやプロトカテク酸などを効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】遺伝子ｚの産物であるリプレッサーＲによって酵素Ｘ（化合物Ｐから代謝物Ｍへの転換を司る酵素）の発現を制御することにより、炭素源から生育に必須な代謝物Ｍに至る生合成経路上の中間代謝物である目的の化合物Ｐを製造する方法を示す図。
【図２】炭素源からの芳香族アミノ酸の生合成に関わるシキミ酸経路を示す図。
【図３】遺伝子ｚの産物であるリプレッサーＲによって酵素の発現を制御することにより、炭素源から生育に必須な代謝物Ｍに至る生合成経路上の目的の化合物Ｐを製造するとともに、化合物Ｐから化合物Ｑへの転換を司る酵素Ｙを発現させることにより目的の化合物Ｑを製造する方法を示す図。
【図４】リプレッサーＲによるプロモーターＡの転写抑制により酵素Ｘの発現が低く維持し、代謝物Ｍの生産量を制限することにより、化合物Ｐを効率よく生産できることを示す図。
【図５】培養前期は、リプレッサーＲによるプロモーターＡの転写抑制が解除されることにより酵素Ｘが正常に生産されるが、培養後期は、リプレッサーＲによるプロモーターＡの転写抑制が回復することにより、酵素Ｘの発現量が大きく減少し、化合物Ｐが蓄積することを示す図。
【図６】培養前期は、リプレッサーＲの量が少ないためにプロモーターＡの転写により酵素Ｘが正常に生産されるが、培養後期は、リプレッサーＲの量が増えるために酵素Ｘの発現量が大きく減少し化合物Ｐが蓄積することを示す図。
【図７】プロモーターＢの制御下にある遺伝子ｚがコードするリプレッサーＲによりプロモーターの転写が抑制されるために、酵素Ｘの発現量が大きく減少し、化合物Ｐが蓄積し、さらに化合物Ｐを遺伝子ｚの産物である酵素Ｙの作用により化合物Ｑに転換することを示す図。
【図８】培養前期は、リプレッサーＲによるプロモーターＡの転写抑制が解除されることにより酵素Ｘが正常に生産されるが、培養後期は、リプレッサーＲによるプロモーターＡの転写抑制が回復することにより酵素Ｘの発現量が大きく減少し蓄積する化合物Ｐが、酵素Ｙの作用により化合物Ｑに転換することを示す図。
【図９】培養前期は、リプレッサーＲの量が少ないためにプロモーターＡの転写により酵素Ｘが正常に生産されるが、培養後期は、リプレッサーＲの量が増えるために酵素Ｘの発現量が大きく減少し蓄積する化合物Ｐが、酵素Ｙの作用により化合物Ｑに転換することを示す図。
【図１０】培養前期は、リプレッサーＲによるプロモーターＡの転写抑制により酵素Ｘの発現が低く維持し、代謝物Ｍの生産量を制限することにより、微生物を増殖させながら少量の化合物Ｐを生産できるが、培養後期は、化合物Ｐを化合物Ｑに転換する酵素Ｙを誘導発現させて酵素Ｙの発現量を増加させることにより、化合物Ｑの生産量を増加させることを示す図。
【図１１】培養前期は、リプレッサーＲによるプロモーターＡの転写抑制により酵素Ｘの発現が低く維持し、代謝物Ｍの生産量を制限することにより、微生物を増殖させながら少量の化合物Ｐを生産できるが、培養後期は、リプレッサーＲを誘導発現させて化合物Ｐの蓄積量を増加させるとともに、蓄積した化合物Ｐを化合物Ｑに転換する酵素Ｙを誘導発現させて酵素Ｙの発現量を増加させることにより、化合物Ｑの生産量を増加させることを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下に、図１と図３を用いながら、本発明を詳細に説明する。
本発明の微生物は、炭素源から生育に必須な代謝物Ｍに至る生合成経路上の中間代謝物である目的の化合物Ｐを効率よく製造するために用いる微生物であり、以下に示す４つの性質（ａ）〜（ｄ）を有する。該微生物は、遺伝子発現制御のためにリプレッサーＲによる転写抑制系が発達している原核生物であることが好ましい。
（ａ）該微生物が利用できる炭素源から化合物Ｐに至る生合成に関わる酵素群のうち、いずれか１つ以上の酵素の活性が該原核生物の野生株と比べて増強している。
（ｂ）化合物Ｐを代謝物Ｍに転換する酵素Ｘのタンパク質をコードする野生型遺伝子ｘの翻訳領域、該遺伝子の翻訳調節領域または遺伝子ｘの転写を促すプロモーター領域の中に１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異を有することにより、酵素Ｘの活性が欠損または低下している。
（ｃ）前記遺伝子ｘの転写を促す本来のプロモーターとは異なっており、かつリプレッサーＲのタンパク質により転写が抑制されるプロモーターＡにより、活性型酵素ＸをコードするDNAの転写が制御される。
（ｄ）リプレッサーＲのタンパク質をコードする遺伝子ｚを１コピー以上有し、該遺伝子の転写が該遺伝子の本来のプロモーターおよび／または該プロモーターとは異なる誘導プロモーターＢにより制御される。
【００２９】
グルコースなどの炭素源から化合物Ｐまでの生合成経路に関わる酵素群のいずれか１つ以上の酵素について、以下のようにして酵素活性の増強および／または酵素タンパク質の量の増加を行うことにより、本発明で利用する微生物に性質（ａ）を付与することができる。すなわち、該酵素タンパク質をコードする遺伝子の翻訳開始領域への変異導入、該遺伝子のプロモーター領域への変異導入、該プロモーターの他の強いプロモーターへの置換、マルチコピープラスミドへのクローニングなどによる該遺伝子の増幅、該遺伝子の転写を正に制御するタンパク質の発現増加、および／または該遺伝子の転写を負に制御するタンパク質の発現減少・欠損などの方法により、該酵素活性の増強および／または該酵素タンパク質の量の増加を行うことにより化合物Ｐの生成量を増加させることができる。もしくは、下流の代謝物によりフィードバック阻害を受ける酵素の場合には、そのフィードバック阻害を解除するアミノ酸の変異を酵素タンパク質に導入することによっても化合物Ｐの生成量を増加させることができる。これらのDNAまたはタンパク質への変異導入については、変異誘起処理などによって行うこともできるが、組換えDNA技術や相同組換え技術を用いても行うことができる。
【００３０】
性質（ｂ）の付与については、変異誘起処理や組換えDNA技術などを用いて酵素Ｘの活性を欠損させることができるが、好ましくは、相同組換え技術を用いて野生型遺伝子ｘの翻訳領域内に欠失変異を導入する。この場合、翻訳領域全部を欠失させると、極性効果により下流の遺伝子発現を阻害することがあるので、翻訳領域の５’側部分と３’側部分を残してインフレームで翻訳領域内に欠失変異を導入することが望ましい。また、遺伝子ｘの翻訳開始領域周辺または遺伝子ｘの転写を促すプロモーター領域の中に、１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異を導入することによっても、酵素Ｘの活性を欠損させることができる。また、遺伝子ｘの転写を促す本来のプロモーター領域を性質（ｃ）に記載のプロモーターＡのDNAと置換することによって、性質（ｂ）と性質（ｃ）を同時に付与してもよい。
【００３１】
性質（ｃ）は、リプレッサーＲにより転写が抑制されるプロモーターＡの制御下に活性型酵素Ｘのタンパク質をコードするDNAを置くことにより付与できる。プロモーターＡは、前記遺伝子ｘの転写を促す本来のプロモーターとは異なるプロモーターであり、かつリプレッサーＲにより転写が抑制されるならば、いかなるプロモーターであってよい。好ましくは、エシェリヒア・コリK-12株内でリプレッサーＲにより抑制されるプロモーターＡとしては、λファージのcI857遺伝子産物により転写抑制を受けるpLプロモーターまたはpRプロモーター、lacI遺伝子産物により転写抑制を受けるlacプロモーター、もしくはgalR遺伝子産物により転写抑制を受けるgalオペロンのプロモーターが挙げられる。また、ATCC13032株内でリプレッサーＲにより抑制されるプロモーターＡとしては、vanR（cg2615）遺伝子（以下、vanR遺伝子という）の産物（以下、VanRリプレッサーと略す）により転写抑制を受けるvanAプロモーター、rhcR（cg1308）遺伝子（以下、rhcR遺伝子という）の産物（以下、RhcRリプレッサーと略す）により転写抑制を受けるrhcH（cg1309）遺伝子（以下、rhcH遺伝子という）のプロモーター（以下、rhcHプロモーターと略す）、もしくはpcaR（cg2624）遺伝子（以下、pcaR遺伝子という）の産物（以下、PcaRリプレッサーと略す）により転写抑制を受けるpcaI（cg2623）遺伝子（以下、pcaI遺伝子という）のプロモーター（以下、pcaIプロモーターと略す）が挙げられる。なお、遺伝子ｘは、本発明の微生物由来の遺伝子を用いてもよいし、本発明の微生物とは異なる原核生物または真核生物由来の遺伝子を用いてもよい。
【００３２】
本発明の微生物は、性質（ｂ）と性質（ｃ）の付与により、通常の状態では酵素Ｘの発現量は低い。しかしながら、該微生物は、性質（ａ）の付与により、化合物Ｐの量を増加させる変異を有しているために、生育に必要な量の代謝物Ｍを生産できる。化合物Ｐの生成量が極端に低く、生育が悪い場合には、リプレッサーＲによる転写抑制を解除し、酵素Ｘの発現量を上昇させることにより該微生物の生育を良くすることができる。
【００３３】
性質（ｄ）は、リプレッサーＲのタンパク質をコードする遺伝子ｚの野生型発現ユニットだけでなく、遺伝子ｚを該遺伝子のプロモーターとは異なる誘導プロモーターＢの制御下に置いた遺伝子ｚの発現ユニットを造成することによっても付与することができる。本発明の微生物に対して、遺伝子ｚの野生型発現ユニットに加えて、誘導プロモーターＢの制御下に置いた遺伝子ｚの発現ユニットを組み込んでもよい。リプレッサーＲについては、原核生物由来のリプレッサーであれば、いかなるリプレッサーを用いることができるが、誘導物質の添加や温度変化などにより抑制を解除できるリプレッサーの利用が好ましい。具体的には、本発明の微生物としてエシェリヒア・コリK-12株を用いる場合には、たとえば、38℃以上の培養により誘導がかかるλファージのcI857遺伝子、ラクトースの添加により誘導がかかるlacI遺伝子、ガラクトースの添加により誘導がかかるgalR遺伝子、もしくはテトラサイクリンの添加により誘導がかかるtetR遺伝子がコードするリプレッサーなどを用いることができる。本発明の微生物としてATCC13032株を用いる場合には、たとえば、フェルラ酸、バニリン酸またはバニリンの添加により抑制が解除されるVanRリプレッサー、レゾルシノールまたは２，４−ジヒドロキシ安息香酸の添加により抑制が解除されるRhcRリプレッサー、もしくは４−ジヒドロキシ安息香酸の添加により抑制が解除されるPcaRリプレッサーを用いることができる。
【００３４】
プロモーターＢとしては、原核生物由来の誘導プロモーターであれば、いかなるプロモーターを用いることができる。具体的には、エシェリヒア・コリK-12株で遺伝子ｚを発現させる場合には、λファージのpLプロモーターまたはpRプロモーター、lacプロモーター、galオペロンのプロモーター、trpオペロンのプロモーター、もしくはaraBAD プロモーターなどを用いることができる。また、ATCC13032株で遺伝子ｚを発現させるときには、フェルラ酸、バニリン酸またはバニリンの添加により誘導がかかるvanAプロモーター、レゾルシノールまたは２，４−ジヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるrhcHプロモーター、４−ヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるpcaIプロモーター、３−ヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるnagI（cg3351）遺伝子（以下、nadI遺伝子という）のプロモーター（以下、nagIプロモーターと略す）、安息香酸の添加により誘導がかかるbenA（cg2637）遺伝子（以下、benA遺伝子という）のプロモーター（以下、benAプロモーターと略す）、もしくはフラクトースまたはスクロースのいずれかの添加により誘導がかかるcg2118遺伝子のプロモーターまたはptsS（cg2925）遺伝子（以下、ptsS遺伝子という）のプロモーターを用いることができる。
【００３５】
本発明の微生物が酵素Ｘ以外に化合物Ｐを代謝する酵素活性を有しており、化合物Ｐの製造において該化合物の蓄積量が減少する可能性がある場合には、変異誘起処理または組換えDNA技術により、該微生物が有する化合物Ｐの代謝酵素のうち、いずれか１つ以上の代謝酵素の活性を欠損または低下させることが好ましい。
【００３６】
本発明の微生物は、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属、ノカルディオイダセアエ（Nocardioidaceae）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、アミコカクトプシス（Amycolatopsis）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、キネオコッカス（Kineococcus）属、アシネトバクター（Acinetobactor）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、パントアエ（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属およびエシェリヒア（Escherichia）属のいずれかに属する原核生物であることが好ましい。さらに好ましくは、本発明の微生物は、アミノ酸の発酵生産でよく用いられるコリネバクテリウム・グルタミカムまたは性状が詳しく解析されているエッシェリヒア・コリである。
【００３７】
本発明の微生物を用いた化合物Ｐの製造方法は、たとえば、炭素源を含む培地中でプロモーターＡの転写を抑制した状態で培養することにより、目的の化合物Ｐを製造する方法が挙げられる。本発明の微生物では、酵素Ｘの発現を制御しているプロモーターＡの転写量がリプレッサーＲにより低く抑えられているために、代謝物Ｍの生産量が制限され、化合物Ｐを効率よく生産することができる（図４）。
【００３８】
本発明の製造方法において、酵素Ｘの発現を制御しているプロモーターＡの転写量が低いために該微生物の生育が遅い場合には、化合物Ｐの製造工程を培養前期と培養後期と２期に分けることにより目的の化合物Ｐを製造することも可能である。すなわち、炭素源を含む培地に該微生物を接種した後、リプレッサーＲの性質に応じて誘導物質の添加もしくは培養温度の上昇または低下などにより転写抑制を解除することにより、酵素Ｘの発現量を増やして培養を続ける。その後、適切な時期にリプレッサーＲによる抑制を回復させて、酵素Ｘの発現を抑制することにより、化合物Ｐの生産量を増加させることができる（図５）。誘導物質の添加により誘導されるプロモーターＡを用いた場合には、該誘導物質の添加量を調節して培養後期に該誘導物質を枯渇させることにより、リプレッサーＲによる抑制を回復させることができる。培養温度の上昇または低下により誘導がかかるプロモーターＡを用いた場合には、リプレッサーＲによる抑制が起こる温度に培養温度を戻すことにより、リプレッサーＲによる抑制を回復させることができる。
【００３９】
好ましくは、リプレッサーＲの発現を誘導プロモーターＢの制御下に置いた本発明の微生物を用いて、化合物Ｐの製造工程を培養前期と培養後期の２期に分けることにより目的の化合物Ｐを製造する。すなわち、炭素源を含む培地に該微生物を接種し、菌体を増殖させた後に、誘導プロモーターＢの性質に応じて誘導物質の添加もしくは培養温度の上昇または低下により誘導プロモーターＢを活性化してリプレッサーＲの生成量を増加させることにより、代謝物Ｍの生産を抑制し、化合物Ｐの生産量を増加させる（図６）。
【００４０】
以上のように、本発明の微生物による製造方法を用いると、該微生物の増殖の状態または化合物Ｐが該微生物に与える影響に応じて、同一の微生物を用いて培養方法を変えることによって容易に化合物Ｐの生産量を最大化することができる。
【００４１】
炭素源としては、本発明の微生物が利用できる炭素源であれば、いかなる炭素源も用いることができる。たとえば、グルコース、スクロース、フラクトース等の糖類、エタノール、メタノール等のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸類、グリセロール、廃糖蜜等が用いることができる。
【００４２】
化合物Ｐは、炭素源から生育に必須な代謝物を生成する生合成経路上の代謝物であれば、いかなる有機化合物であってもよい。たとえば、ＤＨＳ、グルタミン酸、アルパラギン酸およびセリンなどが挙げられる。
【００４３】
ＤＨＳは、シキミ酸（代謝物Ｍ）を生成するシキミ酸脱水素酵素（酵素Ｘ）の発現を制御することにより生産できる。ＤＨＳは、抗酸化剤として有用であるほか（United States Patent 5,821,266）、微生物を用いてプロトカテク酸やシキミ酸などを製造するときの原料として利用できる。
【００４４】
有用なアミノ酸であるグルタミン酸は、Ｎ−アセチルグルタミン酸（代謝物Ｍ）を生成するミノ酸−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（酵素Ｘ）またはγーグルタミルリン酸（代謝物Ｍ）を生成するγ−グルタミルキナーゼ（酵素Ｘ）の発現を制御することにより生産できる。
【００４５】
有用なアミノ酸であるアスパラギン酸は、β−アルパルチルリン酸（代謝物Ｍ）を生成するアスパルトキナーゼ（酵素Ｘ）またはアスパラギン（代謝物Ｍ）を生成するアスパラギン合成酵素（酵素Ｘ）の発現を制御することにより生産できる。
【００４６】
有用なアミノ酸であるセリンは、グリシン（代謝物Ｍ）を生成するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（酵素Ｘ）またはＯ−アセチルセリン（代謝物Ｍ）を生成するセリントランスフェラーゼ（酵素Ｘ）の発現を制御することにより生産できる。
【００４７】
ここで、より具体的な例として、ＤＨＳを効率よく生産するATCC13032株由来の菌株について詳しく述べる。なお、ATCC13032株のゲノム配列については、ナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー・インフォメーション（以下、ＮＣＢＩと略記する）のジェンバンク（GenBank；以下、ＧＢと略記する）データベースから、ＧＢアクセッション番号BX927147として得ることができる。また、これとほぼ同じゲノム配列は、ＧＢアクセッション番号NC＿003450としても得ることができるが、本明細書ではＧＢアクセッション番号BX927147の塩基番号および遺伝子名に従って塩基の位置と遺伝子名を記載する。
【００４８】
ＤＨＳを生産するATCC13032株由来の菌株とは、下記の性質（ａａ）〜（ｄｄ）を持つ微生物である。
（ａａ）該菌株が利用できる炭素源からＤＨＳ（化合物Ｐ）に至る生合成に関わる酵素群のうち、いずれか１つ以上の酵素の活性が野生株と比べて増強している。
（ｂｂ）ＤＨＳをシキミ酸（代謝物Ｍ）に転換するシキミ酸脱水素酵素（酵素Ｘ）のタンパク質をコードする野生型遺伝子（遺伝子ｘ）の翻訳領域または翻訳調節領域、もしくは該遺伝子の転写を促すプロモーター領域の中に、１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異を有することにより、ＤＨＳからシキミ酸への転換能が欠損または低下している。ATCC13032株は、活性型シキミ酸脱水素酵素をコードする遺伝子として、aroE3（cg1835）遺伝子（相補鎖塩基番号1,726,078〜1,726,908のDNA領域）、aroE1（cg1283）遺伝子（相補鎖塩基番号1,182,337〜1,183,143のDNA領域）およびqsuD（cg0504）遺伝子（塩基番号446,537〜447,388のDNA領域）の３種類を有しているが、ＤＨＳからシキミ酸への変換に主要な役割を果たしているaroE3遺伝子に変異を導入し、該遺伝子の活性型シキミ酸脱水素酵素の発現が欠損あるいは低下することによっても性質ｂｂを付与することができる。さらに、aroE3遺伝子の変異に加えて、qsuD遺伝子および／またはaroE1遺伝子についても該遺伝子の活性型シキミ酸脱水素酵素の発現が欠損あるいは低下する変異を導入することにより、性質ｂｂを付与してもよい。
（ｃｃ）前記遺伝子ｘの転写を促す本来のプロモーターとは異なっており、かつリプレッサーＲのタンパク質により転写が抑制されるプロモーターＡにより、活性型酵素ＸをコードするDNAの転写が制御される。
（ｄｄ）リプレッサーＲのタンパク質をコードする遺伝子ｚを１コピー以上有し、該遺伝子の転写が該遺伝子の本来のプロモーターおよび／または該プロモーターとは異なる誘導プロモーターＢにより制御される。
【００４９】
リプレッサーＲとしては、上述したように、フェルラ酸、バニリン酸またはバニリンの添加により抑制が解除されるVanRリプレッサー、レゾルシノールまたは２，４−ジヒドロキシ安息香酸の添加により抑制が解除されるRhcRリプレッサー、もしくは４−ジヒドロキシ安息香酸の添加により抑制が解除されるPcaRリプレッサーを用いることができる。
【００５０】
プロモーターＡとしては、ATCC13032株内でリプレッサーＲにより抑制されるプロモーターＡとしては、VanRリプレッサーにより転写抑制を受けるvanAプロモーター、RhcRリプレッサーにより転写抑制を受けるrhcHプロモーター、もしくはPcaRリプレッサーにより転写抑制を受けるpcaI遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【００５１】
プロモーターＢとしては、フェルラ酸、バニリン酸またはバニリンの添加により誘導がかかるvanAプロモーター、レゾルシノールまたは２，４−ジヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるrhcHプロモーター、４−ヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるpcaIプロモーター、３−ヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるnagIプロモーター、安息香酸の添加により誘導がかかるbenAプロモーター、もしくはフラクトースまたはスクロースのいずれかの添加により誘導がかかるcg2118遺伝子のプロモーターまたはptsSプロモーターを用いることができる。
【００５２】
シキミ酸脱水素酵素（酵素Ｘ）のタンパク質をコードするaroE3遺伝子（遺伝子ｘ）の転写を促す本来のプロモーター領域を性質（ｃｃ）に記載のプロモーターＡのDNAと置換することによって、性質（ｂｂ）と性質（ｃｃ）を同時に付与してもよい。
【００５３】
上記性質（ａａ）の付与については、公知の知見に基づいて、ＤＡＨＰからＤＨＳを生成する経路を強化させる変異、またはＤＡＨＰの生成量を増加させる変異を導入すればよい。
【００５４】
ＤＡＨＰは、３−デヒドロキナ酸合成酵素により３−デヒドロキナ酸（以下、ＤＨＱと略記する）に転換され、さらにＤＨＱはＤＨＱ脱水酵素によりＤＨＳに転換される。したがって、ＤＨＱ合成酵素をコードする遺伝子aroB（cg1827）遺伝子（以下、aroB遺伝子という）および／またはＤＨＱ脱水酵素をコードするaroD（cg0503）遺伝子（以下、aroD遺伝子という）の転写・翻訳調節領域に変異を導入することにより、ＤＨＱ合成酵素および／またはＤＨＱ脱水酵素の発現量を増強させ、ＤＨＳ量を増加させることができる。たとえば、aroB遺伝子および／またはaroD遺伝子の転写を促す本来のプロモーターを、プロモーター活性が強いTuプロモーターと置換することにより、ＤＨＳ量を増加させることができる。
【００５５】
また、ＤＡＨＰ量を増加させることによっても、ＤＨＳ量を増加させることができる。ＤＡＨＰ量を増加させる方法としては、ＤＡＨＰ合成酵素に対する芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害の解除、ＤＡＨＰ合成酵素の発現量の増強、もしくはＤＡＨＰ合成酵素の基質であるエリスロース４−リン酸（以下、Ｅ４Ｐと略記する）またはホスホエノールピルビン酸（以下、ＰＥＰと略記する）の量を増加させる方法があげられる。
【００５６】
ＤＡＨＰ合成酵素は、トリプトファン、チロシンまたはフェニルアラニンによってフィードバック阻害を受けることが多い。ＤＡＨＰ合成酵素にアミノ置換変異などを導入することによりフィードバック阻害が解除できることが知られているので、aroF（cg1129）遺伝子（以下、aroF遺伝子という）およびaroG（cg2391）遺伝子（以下、aroG遺伝子という）などのＤＡＨＰ合成酵素遺伝子に変異を導入してＤＡＨＰ量を増加させることができる。
【００５７】
ＤＡＨＰ合成酵素の発現量を増強する方法としては、ＤＡＨＰ合成酵素をコードする遺伝子の転写・翻訳調節領域に変異を導入する方法があげられる。たとえば、ＤＡＨＰ合成酵素をコードする遺伝子の転写を促す本来のプロモーターを、Tuプロモーターと置換することにより、ＤＡＨＰ量を増加させることができる。
【００５８】
ＤＡＨＰ合成酵素の基質であるＥ４Ｐの量を増加させる方法としては、トランスケトラーゼをコードするtkt（cg1774）遺伝子（以下、tkt遺伝子という）、トランスアルドラーゼをコードするtal（cg1776）遺伝子（以下、cg1776遺伝子という）、またはグルコース−６−リン酸１−脱水素酵素をコードするzwf（cg1778）遺伝子などのペントースリン酸経路に関わる酵素遺伝子の転写・翻訳調節領域に変異を導入して該遺伝子の発現を増強する方法があげられる。
【００５９】
また、ＤＡＨＰ合成酵素の基質であるＰＥＰの量を増加させる方法としては、ＰＥＰ合成酵素をコードするpps（cg0644）遺伝子またはＰＥＰカルボキシキナーゼをコードするpck（cg3169）遺伝子の転写・翻訳調節領域に変異を導入して該遺伝子の発現を増強する方法があげられる。
【００６０】
さらに、ピルビン酸キナーゼをコードするpyk（cg2291）遺伝子、ＰＥＰカルボキシラーゼをコードするppc（cg1787）遺伝子、またはグルコースなどの糖の取り込みに関与するホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子群（cg2117遺伝子など）のいずれかの遺伝子の翻訳領域または該遺伝子の転写・翻訳調節領域に変異を導入し、ＰＥＰの変換を抑制することにより、ＰＥＰの量を増加させることができる。
【００６１】
上記性質（ａａ）を付与するために単独の遺伝子に変異を導入してもよいが、ＤＨＳの生成量をより一層向上させるために、上記遺伝子のうち複数の遺伝子に変異を入れる方が好ましい。
【００６２】
上述の性質（ａａ）〜（ｄｄ）を有するATCC13032株由来の菌株は、グルコースなどの炭素源をもとにＤＨＳを生産できる。ＤＨＱ脱水酵素をコードするaroD遺伝子がＤＨＳをプロトカテク酸に転換するＤＨＳ脱水酵素をコードするqsuB（cg0502）遺伝子（以下、qsuB遺伝子という）とオペロンを形成しているので、性質（ａａ）を付与するために、プロモーター置換によりaroD遺伝子の発現を増加させると、qsuB遺伝子の発現も増加することにより、蓄積したＤＨＳの一部がプロトカテク酸に転換してしまう。プロトカテク酸への転換を抑制するには、qsuB遺伝子の翻訳領域または該遺伝子の転写・翻訳調節領域に変異を導入することが望ましい。
【００６３】
本発明の微生物が、上記の４つの性質（ａ）〜（ｄ）に加えて、以下の性質（ｅ）を有すると、該微生物を用いることにより、炭素源から生育に必須な代謝物Ｍに至る生合成経路上の化合物Ｐを化合物Ｑに転換することにより、目的の化合物Ｑを効率よく製造することができる。
（ｅ）化合物Ｐから化合物Ｑに転換する酵素Ｙのタンパク質をコードする遺伝子ｙの翻訳領域、該遺伝子の翻訳調節領域または遺伝子ｙの転写を促すプロモーター領域の中に１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異を有することにより、化合物Ｐから化合物Ｑへの転換能が増強している、もしくは遺伝子ｙの発現が野生型とは異なる制御を受けている。
【００６４】
性質（ｅ）については、酵素Ｙの発現量が野生型の状態では十分でないことが多いので、該遺伝子ｙの翻訳調節領域または遺伝子ｙの転写を促すプロモーター領域の中に１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異を導入することにより、酵素Ｙの発現量を増強させる、または遺伝子ｙの転写を野生型プロモーターの制御とは異なる制御下に置くことによって、性質（ｅ）を付与することができる。また、分岐経路の最初の酵素は最終産物によるフィードバック阻害を受けることも多いので、遺伝子ｙの翻訳領域内に変異を導入することにより該フィードバック阻害を解除することにより、酵素Ｙの活性を増強することによっても性質（ｅ）を付与することができる。
【００６５】
好ましくは、遺伝子ｙの転写を促すプロモーターの全域または一部の領域を、該遺伝子の転写を促す本来のプロモーターおよびプロモーターＡとは異なるプロモーターＣのDNAと置換することによって性質（ｅ）を付与することができる。
【００６６】
プロモーターＣとしては、遺伝子ｙの本来のプロモーターとは異なり、かつプロモーターＡとも異なるプロモーターを用いることができる。プロモーターＣとしては構成的発現プロモーターを用いることもできるが、誘導プロモーターを用いることが好ましい。誘導プロモーターとしては、上述の性質（ｄ）の付与で用いられるプロモーターＢの例として挙げたプロモーターのいずれかを用いることもできる。
【００６７】
即ち、プロモーターＣとしては、λファージのpLプロモーターまたはpRプロモーター、lacプロモーター、galオペロンのプロモーター、trpオペロンのプロモーター、もしくはaraBAD プロモーターなど、あるいはフェルラ酸、バニリン酸またはバニリンの添加により誘導がかかるvanAプロモーター、レゾルシノールまたは２，４−ジヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるrhcHプロモーター、４−ヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるpcaIプロモーター、３−ヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるnagIプロモーター、安息香酸の添加により誘導がかかるbenAプロモーター、もしくはフラクトースまたはスクロースのいずれかの添加により誘導がかかるcg2118遺伝子のプロモーターまたはptsSプロモーターを用いることができる。
【００６８】
性質（ｅ）の付与で用いられるプロモーターＣは、性質（ｄ）の付与で用いられるプロモーターＢと同一であってもよい。また、該プロモーターＣは、該プロモーターＢの転写を制御するタンパク質による転写制御を受けるプロモーターであってもよい。
【００６９】
本発明の微生物が化合物Ｑを代謝する酵素活性を有しているために、化合物Ｐの製造において該化合物の蓄積量が減少する可能性がある場合には、変異誘起処理または組換えDNA技術により、該微生物が有する化合物Ｐの代謝酵素のうち、いずれか１つ以上の代謝酵素の活性を欠損または低下させることが好ましい。
【００７０】
本発明の微生物を用いた化合物Ｑの製造方法は、たとえば、炭素源を含む培地中でプロモーターＡの転写を抑制した状態で培養することにより、化合物Ｑを製造する方法が挙げられる。本発明の微生物では、酵素Ｘの発現を制御しているプロモーターＡの転写量がリプレッサーＲにより低く抑えられているために、代謝物Ｍの生産量が制限され、化合物Ｐから化合物Ｑを効率よく生産することができる（図７）。
【００７１】
本発明の製造方法において、酵素Ｘの発現を制御しているプロモーターＡの転写量が低いために該微生物の生育が遅い場合には、化合物Ｑの製造工程を培養前期と培養後期と２期に分けることにより化合物Ｑを製造することが好ましい。すなわち、該微生物を炭素源を含む培地に接種した後、リプレッサーＲの性質に応じて誘導物質の添加もしくは培養温度の上昇または低下などにより転写抑制を解除することにより、酵素Ｘの発現量を増やして培養を続ける。その後、適切な時期にリプレッサーＲによる抑制を回復させて、酵素Ｘの発現を抑制することにより、化合物Ｐからの化合物Ｑの生成量を増加させることができる（図８）。誘導物質の添加により誘導されるプロモーターＡを用いた場合には、該誘導物質の添加量を調節して培養後期に該誘導物質を枯渇させることにより、リプレッサーＲによる抑制を回復させることができる。培養温度の上昇または低下により誘導がかかるプロモーターＡを用いた場合には、リプレッサーＲによる抑制が起こる温度に培養温度を戻すことにより、リプレッサーＲによる抑制を回復させることができる。
【００７２】
好ましくは、リプレッサーＲの発現を誘導プロモーターＢの制御下に置いた本発明の微生物を用いて、化合物Ｑの製造工程を培養前期と培養後期の２期に分けることにより化合物Ｑを製造する。すなわち、該微生物を炭素源を含む培地に接種し、菌体を増殖させた後に、誘導プロモーターＢの性質に応じて誘導物質の添加もしくは培養温度の上昇または低下により誘導プロモーターＢを活性化してリプレッサーＲの生成量を増加させることにより、代謝物Ｍの生産を抑制し、化合物Ｐからの化合物Ｑの生成量を増加させることができる（図９）。
【００７３】
本発明の製造方法において、化合物Ｑが本発明の微生物の増殖に影響を与える場合には、酵素Ｙの発現を誘導プロモーターＣの制御下に置いた微生物を用いて、化合物Ｑの製造工程を培養前期と培養後期の２期に分けることにより化合物Ｑを製造することが好ましい。すなわち、該微生物を炭素源を含む培地に接種し、菌体を増殖させた後に、誘導プロモーターＣの性質に応じて、誘導物質の添加もしくは培養温度の上昇または低下により誘導プロモーターＣの転写を活性化して酵素Ｙの生成量を増加させることにより、化合物Ｐからの化合物Ｑの生成量を増加させることができる（図１０）。さらに、培養後期に誘導プロモーターＣの転写を活性化して酵素Ｙの生成量を増加させるとともに、誘導プロモーターＢを活性化してリプレッサーＲの生成量を増加させることにより、代謝物Ｍの生産を抑制し、化合物Ｐからの化合物Ｑの生成量を増加させてもよい（図１１）。
【００７４】
この場合、プロモーターＣとプロモーターＢを同一のプロモーターにすることにより、プロモーターＣの誘導をプロモーターＢの誘導と同じ時期に行うことができる。また、プロモーターＣとプロモーターＢを同一の制御タンパク質により転写制御を受けるプロモーター群の中から選ぶ場合には、ぞれぞれが異なるプロモーターであっても、プロモーターＣの誘導をプロモーターＢの誘導と同じ時期に行うことができる。
【００７５】
以上のように、本発明の微生物による製造方法を用いると、該微生物の増殖の状態または化合物Ｑが該微生物に与える影響に応じて、同一の微生物を用いて培養方法を変えることによって容易に化合物Ｑの生産量を最大化することができる。
【００７６】
本発明の微生物を用いて製造できる化合物Ｑに関しては、炭素源から化合物Ｐを経由して生育に必須な代謝物Ｍを生成する生合成経路または代謝経路において、化合物Ｐから分岐した経路により化合物Ｑを生成できれば、いかなる化合物も製造することができる。
【００７７】
化合物Ｐは、炭素源から生育に必須な代謝物を生成する生合成経路上の代謝物であれば、いかなる有機化合物であってもよい。たとえば、ＤＨＳ、コリスミン酸、プレフェン酸、２−オキソイソ吉草酸、グルタミン酸、アルパラギン酸、アスパラギン酸β−セミアルデヒド、ホモセリンおよびセリンなどが挙げられる。化合物Ｑは、化合物Ｐを酵素Ｙにより転換することにより得られる物質であれば、いかなる有機化合物であってもよい。たとえば、プロトカテク酸、アントラニル酸、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、アロゲン酸、フェニルピルビン酸、２−イソプロピルリンゴ酸、バリン、γーグルタミルリン酸、Ｎ−アセチルグルタミン酸、アスパラギン、２，３−ジヒドロジピコリン酸およびＯ−アセチルホモセリンなどが挙げられる。
【００７８】
化合物ＰがＤＨＳである場合、シキミ酸脱水素酵素（酵素Ｘ）によりシキミ酸（代謝物Ｍ）が生成するが、ＤＨＳ脱水酵素（酵素Ｙ）によりプロトカテク酸（化合物Ｐ）を生産することができる。プロトカテク酸は、医薬、農薬、香料等の原料になるほか、新しいプラスチックの原料として期待されている２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を微生物を用いて製造するときの原料として利用できる。
【００７９】
化合物Ｐがコリスミン酸である場合、コリスミン酸ムターゼ（酵素Ｘ）によりプレフェン酸（代謝物Ｍ）が生成するが、アントラニル酸合成酵素（酵素Ｙ）によりアントラニル酸（化合物Ｐ）を生産することができる。アントラニル酸は芳香族アミノ酸であるトリプトファンなどの合成原料となり、該微生物がトリプトファンの生合成経路を持っていれば、トリプトファンを直接生産することもできる。
【００８０】
化合物Ｐがプレフェン酸である場合、プレフェン酸脱水酵素（酵素Ｘ）によりフェニルピルビン酸（代謝物Ｍ）が生成するが、本発明の微生物がエシェリヒア・コリK-12株などではプレフェン酸脱水素酵素（酵素Ｙ）により４−ヒドロキシフェニルピルビン酸（化合物Ｑ）を生産することができる。４−ヒドロキシフェニルピルビン酸は芳香族アミノ酸であるチロシンの合成原料となり、該微生物が４−ヒドロキシフェニルピルビン酸からのチロシンの生合成経路を持っていれば、チロシンを直接生産することもできる。
【００８１】
化合物Ｐがプレフェン酸である場合、プレフェン酸脱水酵素（酵素Ｘ）によりフェニルピルビン酸（代謝物Ｍ）が生成するが、本発明の微生物がコリネバクテリウム・グルタミカクなどではプレフェン酸アミノトランスフェレラーゼ（酵素Ｙ）によりアロゲン酸（化合物Ｑ）を生産することができる。アロゲン酸は芳香族アミノ酸であるチロシンの合成原料となり、該微生物がアロゲン酸からのチロシンの生合成経路を持っていれば、チロシンを直接生産することもできる。
【００８２】
化合物Ｐがプレフェン酸である場合、本発明の微生物がエシェリヒア・コリK-12株などではプレフェン酸脱水素酵素（酵素Ｘ）により４−ヒドロキシフェニルピルビン酸（代謝物Ｍ）が生成し、本発明の微生物がコリネバクテリウム・グルタミカクなどではプレフェン酸脱水素酵素（酵素Ｘ）によりアロゲン酸（代謝物Ｍ）が生成するが、プレフェン酸脱水酵素（酵素Ｙ）によりフェニルピルビン酸（化合物Ｑ）を生産することができる。フェニルピルビン酸は芳香族アミノ酸であるフェニルアラニンの合成原料となり、該微生物がフェニルアラニンの生合成経路を持っていれば、フェニルアラニンを直接生産することもできる。
【００８３】
化合物Ｐが２−オキソイソ吉草酸である場合、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（酵素Ｘ）によりバリン（代謝物Ｍ）が生成するが、２−イソプロピルリンゴ酸合成酵素（酵素Ｙ）により２−イソプロピルリンゴ酸（化合物Ｑ）を生産することができる。２−イソプロピルリンゴ酸はロイシンの合成原料となり、該微生物がロイシンの生合成経路を持っていれば、ロイシンを直接生産することもできる。
【００８４】
化合物Ｐが２−オキソイソ吉草酸である場合、２−イソプロピルリンゴ酸合成酵素（酵素Ｘ）により２−イソプロピルリンゴ酸（代謝物Ｍ）が生成するが、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（酵素Ｙ）によりバリン（化合物Ｑ）を生産することができる。
【００８５】
化合物Ｐがグルタミン酸である場合、アミノ酸−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（酵素Ｘ）によりＮ−アセチルグルタミン酸（代謝物Ｍ）が生成するが、γ−グルタミルキナーゼ（酵素Ｙ）によりγーグルタミルリン酸（化合物Ｑ）を生産することができる。γーグルタミルリン酸はプロリンの合成原料となり、該微生物がプロリンの生合成経路を持っていれば、プロリンを直接生産することもできる。
【００８６】
化合物Ｐがグルタミン酸である場合、γ−グルタミルキナーゼ（酵素Ｘ）によりγーグルタミルリン酸（代謝物Ｍ）が生成するが、アミノ酸−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（酵素Ｙ）によりＮ−アセチルグルタミン酸（化合物Ｑ）を生産することができる。Ｎ−アセチルグルタミン酸はアルギニンの合成原料となり、該微生物がアルギニンの生合成経路を持っていれば、アルギニンを直接生産することもできる。
【００８７】
化合物Ｐがアスパラギン酸である場合、アスパルトキナーゼ（酵素Ｘ）によりβ−アルパルチルリン酸（代謝物Ｍ）が生成するが、アスパラギン合成酵素（酵素Ｙ）によりアスパラギン（化合物Ｑ）を生産することができる。
【００８８】
化合物Ｐがアスパラギン酸β−セミアルデヒドである場合、ホモセリン脱水素酵素（酵素Ｘ）によりホモセリン（代謝物Ｍ）が生成するが、ジヒドロキシピロリン酸合成酵素（酵素Ｙ）により２，３−ジヒドロジピコリン酸（化合物Ｑ）を生産することができる。２，３−ジヒドロジピコリン酸はリジンの合成原料となり、該微生物が２，３−ジヒドロジピコリン酸からリジンを合成する生合成経路を持っていれば、リジンを直接生産することもできる。
【００８９】
化合物Ｐがホモセリンである場合、ホモセリンキナーゼ（酵素Ｘ）によりホモセリンリン酸（代謝物Ｍ）が生成するが、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（酵素Ｙ）によりＯ−アセチルホモセリン（化合物Ｑ）を生産することができる。Ｏ−アセチルホモセリンはメチオニンの合成原料となり、該微生物がメチオニンの生合成経路を持っていれば、メチオニンを直接生産することもできる。
【００９０】
化合物Ｐがホモセリンである場合、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（酵素Ｘ）によりＯ−アセチルホモセリン（代謝物Ｍ）を生成するが、ホモセリンキナーゼ（酵素Ｘ）によりホモセリンリン酸（化合物Ｑ）を生産することができる。ホモセリンリン酸はトレオニンやイソロイシンの合成原料となり、該微生物がイソロイシンの生合成経路を持っていれば、トレオニンやイソロイシンを直接生産することもできる。
【００９１】
化合物Ｐがセリンである場合、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（酵素Ｘ）によりグリシン（代謝物Ｍ）が生成するが、セリントランスフェラーゼ（酵素Ｙ）によりＯ−アセチルセリン（化合物Ｑ）を生産することができる。Ｏ−アセチルセリンはシステインの合成原料となり、該微生物がシステインの生合成経路を持っていれば、システインを直接生産することもできる。
【００９２】
上記の化合物Ｑの生産に関わる酵素Ｙをコードする遺伝子は、本発明の微生物由来の遺伝子を用いてもよいし、本発明の微生物とは異なる原核生物または真核生物由来の遺伝子を用いてもよい。たとえば、本発明の微生物を用いてプロトカテク酸を製造するときには、ATCC13032株はＤＨＳ脱水酵素遺伝子を持っているので、該遺伝子産物をプロトカテク酸の生産に用いればよいが、エシェリヒア・コリK-12株はＤＨＳ脱水酵素遺伝子を持っていないので、他の微生物由来のＤＨＳ脱水酵素遺伝子を用いる必要がある。
【００９３】
ここで、より具体的な例として、上述のATCC13032株由来のＤＨＳ生産菌株に性質（ｅｅ）を付与することにより造成できるプロトカテク酸を効率よく生産する菌株について詳しく述べる。
【００９４】
プロトカテク酸を生産するATCC13032株由来の菌株とは、上述の性質（ａａ）〜（ｄｄ）に加えて、下記の性質（ｅｅ）を有する微生物である。
（ｅｅ）ＤＨＳからプロトカテク酸に転換するＤＨＳ脱水酵素（酵素Ｙ）のタンパク質をコードするqsuB遺伝子（遺伝子ｙ；塩基番号444,184〜446,040）の転写を促す本来のプロモーターとは異なり、かつプロモーターＡとも異なるプロモーターＣによりqsuB遺伝子の転写が制御される。
【００９５】
上述の性質（ａａ）〜（ｅｅ）を有するATCC13032株由来の菌株は、グルコースなどの炭素源をもとにプロトカテク酸を生産できるが、該菌株はプロトカテク酸ジオキシゲナーゼを有しているので、生成したプロトカテク酸を分解してプロトカテク酸の量が減少させる可能性がある。したがって、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼ・アルファサブユニット・タンパク質をコードするpcaG（cg2630）遺伝子（相補鎖塩基番号2,511,382〜2,511,996)）および／またはプロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼ・ベータサブユニット・タンパク質をコードするpcaH（cg2631）遺伝子（相補鎖塩基番号2,512,008〜2,512,700）の翻訳領域または該遺伝子の転写・翻訳調節領域の中に、１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異を導入することにより、該酵素が有する分解活性を欠損または低下させることが好ましい。
【００９６】
また、該菌株は、プロトカテク酸の５位を水酸化し、没食子酸への変換を触媒するパラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼを有しているので、生成したプロトカテク酸の一部を没食子酸に転換する可能性がある。したがって、パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ・タンパク質をコードするpobB（cg1226）遺伝子（相補鎖塩基番号1,126,301〜1,127,488)の翻訳領域または該遺伝子の転写・翻訳調節領域の中に、１個以上の塩基の置換、欠失または付加による変異を導入することにより、該パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼが有する水酸化活性を欠損または低下させることが好ましい。
【００９７】
以下に、本発明の微生物の造成にあたり、DNAクローニングと変異導入株造成の方法について述べる。なお、上述のように、本発明の微生物は、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、アルスロバクター属、ノカルディオイダセアエ属、ミクロバクテリウム属、ストレプトマイセス属、アミコカクトプシス属、ロドコッカス属、キネオコッカス属、アシネトバクター属、シュードモナス属、パントアエ属、クレブシエラ属およびエシェリヒアに属する微生物であるなら、いずれの微生物も用いることができるが、ATCC13032株について変異導入の方法について詳しく説明する。なお、DNAクローニングと変異を導入するために用いる宿主菌としては、主にエシェリヒア・コリK-12株を用いる。
【００９８】
上記のエシェリヒア・コリK-12株とATCC13032株は、それぞれエシェリヒア・コリとコリネバクテリウム属細菌の培養に通常用いられる公知の方法により培養する。培養後、公知の方法（例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法）により、該微生物の染色体DNAを単離・精製する。制限酵素消化法、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（PCR）法、または合成DNAを用いたハイブリダイゼイション法などにより、該染色体DNAから上記プロモーターまたは代謝酵素などをコードするDNAを含む断片を取得することができる。
【００９９】
DNAクローニングや変異導入のためにDNAを連結するためのエシェリヒア・コリ用ベクターとしては、エシェリヒア・コリK-12株などにおいて自立複製可能なベクターであればプラスミドベクター、ファージベクター等いずれも使用可能であるが、具体的には、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pUC18、pBR322等を用いることができる。
【０１００】
上記ベクターの宿主として用いるエシェリヒア・コリは、エシェリヒア・コリに属する微生物であればいずれでも用いることができるが、具体的には、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） XL1-Blue MRF’〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 81 (1992)〕、エシェリヒア・コリJM109、エシェリヒア・コリBL21等をあげることができる。
【０１０１】
コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、アルスロバクター属、ノカルディオイダセアエ属、ミクロバクテリウム属、ストレプトマイセス属、アミコカクトプシス属、ロドコッカス属、キネオコッカス属、アシネトバクター属、シュードモナス属、パントアエ属、クレブシエラ属およびエシェリヒア属に属する微生物の中に、上記DNAを導入するときは、これら微生物の中で自立複製可能なベクターを用いる。好ましくは、該微生物のいずれかとエシェリヒア・コリK-12株の両方の微生物の中で自立複製可能なシャトル・ベクターを用いて、組換えDNAを宿主となる該微生物に導入することができる。
【０１０２】
コリネバクテリウム属細菌で自立複製可能なシャトル・ベクターとしては、pAM330（特開昭58-67699号公報参照）、pHM1519（特開昭58-77895号公報参照）等が挙げられる。また、これらのベクターからコリネバクテリウム内でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つDNA断片を取り出し、エシェリヒア・コリ−コリネバクテリウム用シャトル・ベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリおよびコリネバクテリウムの両方で自律複製可能なベクターとして使用することができる。たとえば、エシェリヒア・コリ用ベクターであるpHSG298（タカラバイオ社製）に、コリネバクテリウム属株でプラスミドを複製させるための複製領域として、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13058株が有するプラスミドpHM1519の複製領域を挿入することにより、当該シャトル・ベクターを構築することができる。当該シャトル・ベクターを保持できる。ATCC13032株とコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13058株は、独立行政法人・製品評価技術基盤機構・生物遺伝資源部門（以下、ＮＩＴＥと略記する）より入手することができる。
【０１０３】
DNAの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕等をあげることができる。コリネバクテリウム・グルタミカムへのDNAの導入は、van der Restらの方法〔Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541 (1999)〕によっても行うことができる。
【０１０４】
上記のようにして得られた形質転換体からDNAを抽出し、該DNAに含まれる本発明のDNAの塩基配列を決定することができる。塩基配列の決定には、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕または3730xl型DNAアナライザー（アプライド・バイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いることができる。
【０１０５】
また、上記において決定されたDNAの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成装置等を用いて化学合成することによっても目的とするDNAを調製することもできる。
【０１０６】
目的のフェノタイプを有する菌株は、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンやエチルメタンスルフォン酸などの変異剤を用いた処理やＵＶや放射線の照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによって変異を導入することによって得られる。あるいは、該菌株は、変異を導入する領域のDNAをクローニングして、試験管内（イン・ビトロ）でDNAに変異を導入する。大きな置換変異を導入する場合には、該菌株内で複製可能なベクターに置換すべきDNAを乗せたプラスミドを構築した後に、該プラスミドを該菌株に導入する、または該プラスミドと染色体DNAとの間の相同組換えにより、置換変異を導入することもできる。導入する変異の種類については、目的のフェノタイプが現れるならば、塩基置換変異、欠失変異、挿入変異または大きなDNA断片との置換変異のいずれでもよく、かつ変異の大きさについても、１塩基以上であれば、いかなる大きさの変異であってもよい。以下、変異の導入方法は特記しない限り、上記の方法を用いる。
【０１０７】
本発明の微生物において、プロモーターや転写制御タンパク質以外で遺伝子の発現量を調節する必要があるときには、リボソーム結合配列と翻訳開始コドンの間の距離の調整、翻訳開始コドンの周囲の配列の改変、または翻訳領域内の塩基配列の改変などにより該遺伝子の翻訳開始効率を調節することができる。
【０１０８】
このようにして得られる変異を導入するためのDNAは、通常エシェリヒア・コリ内で複製可能なプラスミドに挿入した後、上述したDNAの導入法を用いて宿主菌であるコリネバクテリウム・グルタミカムに導入する。該プラスミドが温度感受性ベクターである場合には高温培養選択により、また宿主菌内で発現しうるカナマイシン耐性など抗生物質耐性マーカーを有する場合には、該抗生物質耐性選択により、１回交差型相同組換え体を選別する。該DNA断片と相同な染色体の領域において２回交差型相同組換えによって該DNAが置換された変異株を得るには、通常W Jagerら〔J. Bacteriol. 174, 5462 (1992)〕が開発したバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）168株のレバンスクラーゼ遺伝子（sacB遺伝子）を用いる方法を用いることができる。スクロース耐性選択を用いる。本方法を用いると、バチルス・サブチリス168株のsacB遺伝子を発現させたコリネバクテリウム・グルタミカムはスクロースを含む培地では致死的になるので、２回交差型相同組換えによってレバンスクラーゼ遺伝子を失った変異株をスクロース耐性選択によって得ることができる。
【０１０９】
本発明の微生物の培養は、炭素源、窒素源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ糖、果糖等の糖類、エタノール、メタノール等のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸類、グリセロール、廃糖蜜等が用いられる。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独または混合して用いられる。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。
【０１１０】
培養は、通常、通気攪拌、振とう等の好気条件下で行う。培養温度は、本発明の微生物が生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、培養途中のpHについても本発明の微生物が生育し得るpHであれば特に制限はない。培養中のpH調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。
【０１１１】
培養終了後の培養液中の目的の有機化合物は、必要に応じて遠心分離等により該培養液から菌体等の不溶成分を除いた後、例えば、酢酸エチル等の有機溶媒による抽出法、活性炭を用いる方法、イオン交換樹脂を用いる方法、晶析法、塩析などの沈殿法、蒸留法等の方法を単独でまたは組み合わせることによって目的の有機化合物を採取することができる。
【実施例】
【０１１２】
以下に、本発明の微生物として、化合物ＰとしてＤＨＳを効率よく生産するATCC13032株の菌株の造成と該微生物によるＤＨＳの製造法について実施例により具体的に述べる。また、本発明の微生物として、化合物Ｑとしてプロトカテク酸を効率よく生産するATCC13032株の菌株の造成と該微生物によるプロトカテク酸の製造法について実施例により具体的に述べる。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【０１１３】
実施例１．Pben-vanR株とNSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD株のＤＨＳ生産性の比較
以下のようにして、qsuB遺伝子のインフレーム欠失変異によりＤＨＳからプロトカテク酸への転換能を失い、benAプロモーターの制御下にあるvanR遺伝子がコードするVanRリプレッサーによりaroE3遺伝子の発現が抑制されるPben-vanR株（参考例１１）、およびqsuB遺伝子とqsuD遺伝子とaroE3遺伝子のインフレーム欠失変異により、ＤＨＳからシキミ酸への転換能とＤＨＳからプロトカテク酸への転換能を失ったNSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD株（参考例１０）を3 Lジャーファーメンターで培養し、ＤＨＳの生産性試験を行った。なお、これらの菌株は、ＤＡＨＰからＤＨＳの合成に関わる４種類の遺伝子（aroF、aroG、aroBおよびaroD遺伝子）の転写がTuプロモーターによって制御されるために、野生株と比べてＤＨＳ生成量が向上している。【０１１４】
これら菌株の前々培養および前培養用の培地としては、CGXII培地（硫酸アンモニウム 20 g/L、尿素 5 g/L、リン酸二水素カリウム 1 g/L、リン酸水素二カリウム 1 g/L、硫酸マグネシウム・７水和物0.25 g/L、塩化カルシウム 10 mg/L、硫酸第一鉄・７水和物 10 mg/L、硫酸マンガン・５水和物10 mg/L、硫酸亜鉛・７水和物1 mg/L、硫酸銅 0.2 mg/L、塩化ニッケル・６水和物 0.02 mg/L、ビオチン 0.2 mg/L、グルコース 20 g/L、プロトカテク酸 30  mg/L、pH7.0）を用いた。これら菌株の前々培養液1％を前培養液に接種した後、30℃で24時間培養した。前培養液を吸光度600nmが3.0になるようにCGXII培地で希釈した後、3 Lジャーファーメンター（エイブル株式会社製BMS-03NP2）内の本培養用培地（0.9 L）に1％だけ摂取した。本培養用培地としては、2.1 g/Lの無水クエン酸と1.0 g/Lの硫酸鉄・7H2Oを含むCGXII培地であるCGCF培地を用いた。以下、ＤＨＳならびにプロトカテク酸の生産実験は特記しない限りこの方法を用いて行った。【０１１５】
なお、NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD株は、CGXII培地とCGCF培地では極めて生育が悪いために、0.5 g/Lのトリプトファン、0.4 g/Lのフェニルアラニン、0.45 g/Lのチロシン、17 mg/Lのシキミ酸、45 mg/LのビタミンK2 および14 mg/L のパラアミノ安息香酸をこれらの培地に添加して培養した。本培養開始後に適時培養液を採取して、5％アセトニトリル水溶液で1000倍に希釈し、高速液体クロマトグラフィー（Waters社、LCT Premier XE）を用いて表１の分離条件で分析した後に、濃度既知のＤＨＳ水溶液（ＤＨＳはSigma社から購入）を対照としたＤＨＳピークの面積の比をもとに算出した。以下、ＤＨＳの定量はこの方法を用いて測定した。【０１１６】
Pben-vanR株については、本培養開始時に終濃度5 mMの安息香酸を添加し、38時間後にグルコースを4.0 g/時間の割合で添加し、さらに48時間培養した。一方、NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD株は、本培養開始後45.5時間の時点でグルコースを6.0 g/時間の割合で添加し、さらに16.5時間培養した。Pben-vanR株とNSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD株のＤＨＳの生産量はそれぞれ培養開始後86時間目と62 時間目に最大化し、これら菌株のＤＨＳの最大生産量はそれぞれ15.4g/Lと7.7 g/Lであった。この結果より、aroE遺伝子の発現をVanRリプレッサーで人為的に制御できるPben-vanR株は、芳香族アミノ酸などを含む培地中で培養したNSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD株と比較して、芳香族アミノ酸などを含まない培地中で培養してもＤＨＳの生産性が優れていることは明らかになった。【０１１７】
【表１】
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【０１１８】
実施例２．NSHΔaroE3株およびNSHΔaroE3＿vanE3株を用いたプロトカテク酸の生産
以下のようにして、aroE3遺伝子にインフレーム欠失変異を有するNSHΔaroE3株（参考例７参照）、ならびに該菌株をもとにVanRリプレッサーの制御下でaroE3遺伝子を発現するように改変したNSHΔaroE3＿vanE3株（参考例８参照）を、3 Lジャーファーメンターで培養してプロトカテク酸の生産量を比較した。【０１１９】
これら菌株をCGXII培地で培養した培養液を、吸光度600nmが3.0になるようにCGXII培地で希釈した後、3 Lジャーファーメンター内のCGCF培地（0.9 L）に1％だけ接種した。なお、NSHΔaroE3株は、aroE3遺伝子の欠失変異によりCGXII培地とCGCF培地では極めて生育が悪いために、50 mg/Lのトリプトファン、50 mg/Lのフェニルアラニン、50 mg/Lのチロシンおよび17 mg/Lのシキミ酸をこれら培地に添加して培養した。本培養開始後24時間の時点でグルコースを2.0 g/時間の割合で添加し、さらに62.5時間培養した。本培養開始後に適時培養液を採取して、培養液を5％アセトニトリル水溶液で1000倍に希釈し、高速液体クロマトグラフィー（Water社、LCT Premier XE）を用いて表１の分離条件で分析した後に、濃度既知のプロトカテク酸水溶液（プロトカテク酸は和光純薬工業株式会社から購入）を対照としたプロトカテク酸ピークの面積の比をもとに算出した。以下、プロカテク酸の定量はこの方法を用いて測定した。その結果、NSHΔaroE3株とNSHΔaroE3＿vanE3株のプロトカテク酸の生産量はそれぞれ培養開始後48時間目と62.5時間目に最大化し、これら菌株のプロトカテク酸の最大生産量はそれぞれ0.5 g/Lと16.6 g/Lであった。この結果より、aroE遺伝子の発現をVanRリプレッサーで制御する菌株を芳香族アミノ酸とシキミ酸を含まない培地中で培養すると、芳香族アミノ酸とシキミ酸を含む培地中で培養したNSHΔaroE3株のプロトカテク酸の生産量と比較して、約33倍のプロトカテク酸を生産することが明らかになった。【０１２０】
実施例３．NSHΔaroE3＿vanE3株とNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB株およびNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB-vanR株を用いたプロトカテク酸の生産
以下のようにして、上述のNSHΔaroE3＿vanE3株（参考例８）、qsuB遺伝子の発現を安息香酸の添加により誘導できるように育種したNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB株（参考例１２）、ならびにqsuB遺伝子およびvanR遺伝子の発現を安息香酸の添加により誘導できるように育種したNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB-vanR株（参考例１３）を、それぞれ3 Lジャーファーメンターを用いて培養することによりプロトカテク酸の生産量を比較した。NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB株については本培養開始後14.5時間の時点で安息香酸を終濃度5 mM添加することによりqsuB遺伝子を誘導し、またNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB-vanR株については本培養開始後15.5時間の時点で安息香酸を終濃度5 mM添加することによりqsuB遺伝子とvanR遺伝子を誘導した。NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB株、NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB-vanR株、およびNSHΔaroE3＿vanE3株については、それぞれ本培養開始後14.5時間、15.5時間および18.5時間の時点でグルコースを3.5 g/時間の割合で添加し、本培養開始より62時間後に培養を終了した。その結果、NSHΔaroE3＿vanE3株、NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB株およびNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB-vanR株のプロトカテク酸の生産量はそれぞれ培養開始後43.8時間目と43.8時間目と38.5時間目に最大化し、これら菌株のプロトカテク酸の最大生産量はそれぞれ8.5 g/L、8.6 g/L、15.2 g/Lであった。この結果から、VanRリプレッサーの制御下でaroE3遺伝子を発現する菌株は著量のプロトカテク酸を蓄積できるとともに、VanRリプレッサー量を増加させてaroE3遺伝子の発現抑制を強化した方が、プロトカテク酸の生産性が高いことが明らかになった。【０１２１】
実施例４．NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB-vanR株とtkt株を用いたプロトカテク酸の生産
以下のようにして、上述のNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB-vanR株（参考例１３）および該菌株のトランスケトラーゼ発現を強化したtkt株（参考例１４）をそれぞれ3 Lジャーファーメンターを用いて培養することによりプロトカテク酸の生産量を比較した。それぞれの菌株ともに、本培養開始後17時間の時点で安息香酸を終濃度5 mM添加し、また本培養開始後24時間の時点でグルコースを4.5 g/時間の割合で添加し、培養開始から64時間後に培養を終了した。その結果、NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB-vanR株とtkt株のプロトカテク酸の生産量はそれぞれ培養開始後40時間目と45時間目に最大化し、これら菌株のプロトカテク酸の最大生産量はそれぞれ14.8 g/L、20.0 g/Lであった。この結果から、VanRリプレッサーによるaroE遺伝子の発現制御に加えて、トランスケトラーゼ発現を増強すると、プロトカテク酸の生産性が向上することが明らかになった。【０１２２】
実施例５．RhcRリプレッサーによる制御系を利用したプロトカテク酸の生産
上述の実施例はすべてVanRリプレッサーによりaroE3遺伝子の発現を制御した生産実験であったが、VanRリプレッサーの代わりにRhcRリプレッサーによりaroE3遺伝子の発現を制御し、かつnagIプロモーターの制御下でqsuB遺伝子とrhcR遺伝子を発現するPnag-qsuB-rhcR株（参考例１７）を用いて、nagIプロモーターの転写誘導の有無によるプロトカテク酸の生産性の差を、以下のようにして調べた。Pnag-qsuB-rhcR株のnagIプロモーターの転写を誘導する場合には、本培養開始後16.5時間の時点で3−ヒドロキシ安息香酸を5 mMになるように添加し、20.5時間の時点でグルコースを4.9 g/時間の割合で添加し、培養開始から62.5時間後に培養を終了した。Pnag-qsuB-rhcR株のnagIプロモーターの転写を誘導しない場合には、3−ヒドロキシ安息香酸を添加せずに、培養開始から62.5時間後に培養を終了した。その結果、。その結果、nagIプロモーターの転写誘導を行ったPnag-qsuB-rhcR株のnagIプロモーターの転写誘導を行わないPnag-qsuB-rhcR株のプロトカテク酸の生産量はそれぞれ培養開始後47.5時間目と43.5時間目に最大化し、それぞれのプロトカテク酸の最大生産量は11.2 g/L、8.4 g/Lであった。この結果より、RhcRリプレッサーによってaroE3遺伝子とqsuB遺伝子の発現を制御した場合でも著量のプロトカテク酸が生産できるとともに、培養後期にRhcRリプレッサーの量を増強した方がプロトカテク酸の生産性が高くなることが明らかになった。【０１２３】
参考例１．大腸菌−コリネバクテリウム属細菌用シャトル・ベクターpHCG298の構築
プラスミドpHM1519を保持するコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13058株は、ＮＩＴＥより入手し、プラスミドpHM1519を常法により単離した。続いて、ATCC13032株中で機能するカナマイシン耐性遺伝子を保持する大腸菌用ベクターpHSG298（タカラバイオ株式会社製）に制限酵素BglII部位とNcoI部位を付加するために２種類のDNA（配列番号１と２）を合成した。これらDNAをpHSG298のKpnI部位とPstI部位の間に挿入し、プラスミドpHSG298BNを構築した。続いて、プラスミドpHM1519から、プラスミド複製領域を含む約3.1 kbのBglII断片をBglII消化により切り出し、pHSG298BNのBglII部位に挿入することにより、プラスミドpHCG100を構築した。このpHCG100を制限酵素BglIIとNcoIによって消化した後、Blunting Highキット（東洋紡績株式会社製）を用いて制限酵素切断末端を平滑末端に変えた。pHCG100由来の約1.9 kbのBglII（平滑末端）−NcoI（平滑末端）断片を精製した後、pHSG298のStuI部位に挿入することにより、大腸菌−コリネバクテリウム用シャトル・ベクターpHCG298を構築した。【０１２４】
参考例２．レバンスクラーゼ構成的発現プラスミドpHKPsacB1の構築
コリネバクテリウム属細菌において２回交差型相同組換えにより目的DNA領域を染色体の特定領域に組み込むときに用いるレバンスクラーゼ遺伝子を構成的に発現するプラスミドpHKPsacB1を以下のようにして構築した。【０１２５】
１．レバンスクラーゼ遺伝子のクローニング
２回交差型相同組換えにより目的DNA領域が染色体の特定領域に組み込まれた株を選別するため、宿主細胞に対して致死的に機能するレバンスクラ−ゼをコードするバチルス・サブチリス168株のsacB遺伝子を選別マーカーとして用いることにした。バチルス・サブチリス168株は、理化学研究所微生物系統保存施設よりIAM2118株として入手した。また、バチルス・サブチリス168株のゲノム配列情報（ＧＢアクセッション番号：NC＿000964）をＮＣＢＩよりインターネット経由で取得した。バチルス・サブチリス168株の染色体DNAを染色体DNA 抽出キット（RBC Bioscience社製）を用いて精製した。この染色体DNA（100 ng）を鋳型として、２種類のDNAプライマー（配列番号３と４）を用いてPCR反応を行うことにより、sacB遺伝子を含む増幅DNA断片を得た。続いて、Taq DNAポリメラーゼを用いて増幅DNA断片の３’末端へＡ残基を付加した。増幅DNA断片をゲル電気泳動後に回収し、精製した後、pT7Blue-Tベクターに組み込むことにより、sacB遺伝子を保持するプラスミドpTBSACB1を構築した。【０１２６】
２．プラスミドpHKPsacB1の構築
配列番号５〜１２で表わされる8本の合成DNAを合成した後に、これら合成DNAをpT7Blue-Tベクターに組み込むことにより、sacB遺伝子を構成的に発現するプラスミドpTRKD2を構築した。続いて、上記１で取得したプラスミドpTBSACB1上のsacB遺伝子領域を制限酵素HindIIIとKpnIならびに制限酵素KpnIとXbaIを用いて消化することより、sacB遺伝子領域から由来する1.0 kbのHindIII−KpnI断片と0.4 kbのKpnI−XbaI断片を得た。これら２つのDNA断片を、上で取得したｐTRKD2由来の0.2 kbのHindIII−SphI断片ともに、大腸菌用クローニングベクターpHSG298（タカラバイオ社製）のSphI部位とXbaI部位の間に挿入することにより、sacB遺伝子構成的発現プラスミドpHKPsacB1を構築した。
プラスミドpHKPsacB1は、コリネバクテリウム属細菌の染色体DNAと相同性が高いDNAを運ぶときには、染色体DNAとプラスミドの間で相同組換えを起こり、プラスミド全体が染色体上に取り込まれる。そのために得られた菌株がカナマイシン耐性かつスクロース感受性の表現型を示す。その後、２回交差型相同組換えが起こると、プラスミド由来DNA領域が染色体上から排除される。その結果、当該細菌はカナマイシン感受性かつスクロース耐性の表現型を示す。【０１２７】
参考例３．ATCC13032株の修飾・制限酵素遺伝子を破壊したHT23株の作製
１．DNA修飾・制限酵素遺伝子破壊用プラスミドの構築
以下のようにして、ATCC13032株をもとに、DNA修飾・制限酵素遺伝子を破壊したHT23株を造成した。ATCC13032株は、ＮＩＴＥよりNBRC12168株として入手した。また、下記の実施例で示す塩基番号は、ATCC13032株のゲノム配列の塩基番号であり、該ゲノム配列情報については、ＮＣＢＩのＧＢデータベースから、アクセッション番号NC＿006958としてインターネット経由で取得した。また、ATCC13032株を含むコリネバクテリウム属細菌の培養は、特記しない限り、CGYE培地（硫酸アンモニウム 20 g/L、尿素 5 g/L、KH2PO4 1 g/L、K2HPO4 1 g/L、MgSO4・7H20 0.25 g/L、酵母エキス 1 g/L、CaCl2 10 mg/L、FeSO4・7H2O 10 mg/L、MnSO4・5H2O 10 mg/L、ZnSO4・7H2O 1 mg/L、CuSO4 0.2 mg/L、NiCl2・6H2O 0.02 mg/L、ビオチン 0.2 mg/L、グルコース 20 g/L、pH7）を用いて行った。【０１２８】
ATCC13032株が保有するDNA修飾酵素をコードするcglIM（cg1996）遺伝子（塩基番号1,879,784〜1,880,875）、ならびに２つの制限酵素をコードするcglIR（cg1997）遺伝子（塩基番号1,880,884〜1,881,960）およびcglIIR（cg1998）遺伝子（塩基番号1,881,962〜1,883,860）はゲノム上に連続して存在している。これら３遺伝子の発現を欠損させるために、該菌株の染色体DNAの一部（塩基番号1,879,784〜1,883,860）を以下の手順で欠失させた。【０１２９】
DNA修飾・制限酵素遺伝子の５’フランキング領域（塩基番号1,878,625〜1,879,745）を増幅させるために２種類のプライマー（配列番号１３と１４）を合成した。ATCC13032株の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法により該５’フランキング領域を増幅した。Taq DNAポリメラーゼによって増幅DNA断片の３’末端にＡ残基を付加した後、増幅DNA断片をゲル電気泳動法により精製し、pT7Blue-Tベクターに組み込むことにより、該５’フランキング領域を保持するプラスミドpTUSR1Fを構築した。次に、DNA修飾・制限酵素遺伝子領域の３’フランキング領域（塩基番号1,883,891〜1,885,298）を増幅させるために、２種類のプライマー（配列番号１５と１６）を合成した。ATCC13032株の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法により該３’フランキング領域を増幅した。Taq DNAポリメラーゼによって増幅DNA断片の３’末端にＡ残基を付加した後、増幅DNA断片をゲル電気泳動法により精製し、pT7Blue-Tベクターに組み込むことにより、該３’フランキング領域を保持するプラスミドpTDSR1Rを構築した。続いて、プラスミドpTUSR1Fから上記５’フランキング領域を含む約1.1 kbのBamHI−XhoI断片を調製した。また、プラスミドpTUSR1Rから上記３’フランキング領域を含む約1.4 kbのXbaI−XhoI断片を調製した。さらにプラスミドpHKPsacB1（参考例２の２）からsacB遺伝子構成的発現領域を含む約1.6 kbのBamHI−SphI断片を調製した。これら３断片を大腸菌用クローニングベクターpHSG298のBamHI部位とXbaI部位の間に挿入し、DNA修飾・制限酵素遺伝子破壊用プラスミドpHKSD0977-9を構築した。【０１３０】
２．DNA修飾・制限酵素遺伝子破壊株の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドpHKSD0977-9をATCC13032株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、SCR株を取得した。配列番号１３と１６のプライマーならびにsacB遺伝子確認用プライマー（配列番号３と４）を用いるPCR法によりSCR株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、SCR株はプラスミドpHKSD0977-9 がDNA修飾・制限酵素遺伝子領域に導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１３１】
SCR株を1 mLのLB液体培地（10 g/l トリプトン、5 g/l 酵母エキス、10 g/l 塩化ナトリウム）の中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養することにより、HT23株を得た。配列番号１３と１４のプライマーを用いるPCR法により、HT23株が予想通りDNA修飾・制限酵素遺伝子を欠損している２回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１３２】
参考例４．pcaH・pcaG遺伝子の破壊株の造成
以下のようにして、参考例３で造成したHT23株をもとに、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼをコードするpcaH・pcaG遺伝子を欠損させるために、ATCC13032株の染色体DNAの一部（相補鎖塩基番号2,511,382〜2,512,700）を欠失したDRHG株を造成した。【０１３３】
１．pcaH・pcaG遺伝子破壊用プラスミドの構築
HT23株のpcaH・pcaG遺伝子の５’フランキング領域（塩基番号2,512,743〜2,513,990）を増幅するための２種類のプライマー（配列番号１７と１８）を合成した。HT23株の染色体DNA（100 ng）を鋳型として、これらのプライマーを用いるPCR法により該５’フランキング領域を増幅した。続いて、Taq DNAポリメラーゼによって増幅DNA断片の３’末端にＡ残基を付加した後、増幅DNA断片をゲル電気泳動法により精製し、pT7Blue-Tベクター（ノバジェン社製）に組み込むことにより、該５’フランキング領域を持つプラスミドpTPCAUSR1Fを構築した。同様にして、HT23株の３’フランキング領域（相補鎖塩基番号2,510,015〜2,511,377）を増幅するための２種類のプライマー（配列番号１９と２０）を合成し、HT23株の精製染色体DNAを鋳型としてこれらのプライマーを用いるPCR法により該３’フランキング領域を増幅した。Taq DNAポリメラーゼによって増幅DNA断片の３’末端にA残基を付加した後、増幅DNA断片をゲル電気泳動法により精製し、pT7Blue-Tベクターに組み込むことにより、該３’フランキング領域を持つプラスミドpTPCADSR1Rを構築した。制限酵素消化によりpTPCAUSR1Fから上記５’フランキング領域を含む約1.3 kbのEcoRI−MluI断片を調製した。また、制限酵素消化によりpTPCADSR1Rから上記３’フランキング領域を含む約1.4 kbのMluI−BamHI断片を調製した。さらに、制限酵素消化によりプラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）からsacB遺伝子領域を含む約1.6 kbのBamHI−SphI断片を調製した後、これら３つの断片を大腸菌用クローニングベクターpHSG298のEcoRI部位とSphI部位の間に挿入し、遺伝子破壊用プラスミドpHKSDPHG1を構築した。【０１３４】
２． DRHG株の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドpHKSDPHG1をHT23株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、SCRHG株を取得した。配列番号２１と２２のプライマーならびにsacB遺伝子確認用プライマー（配列番号３と４）を用いるPCR法によりSCRHG株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、SCRHG株はプラスミドpHKSDPHG1がpcaH・pcaG遺伝子領域に導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１３５】
SCRHG株を1 mLのLB液体培地中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養することにより、DRHG株を得た。配列番号２３と２４のプライマーセットを用いるPCR法により、DRHG株が予想通りpcaH・pcaG遺伝子を欠損している２回交差型相同組換え体であることを確認した。なお、配列番号２５と２６のプライマーを用いたPCR反応を行ったところ、増幅DNA断片が得られなかったことから、DRHG株はsacB遺伝子を欠損していることも確認できた。【０１３６】
参考例５．pobB遺伝子の破壊株の造成
パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシゲナーゼをコードするpobB遺伝子を破壊し、プロトカテク酸から没食子酸の生成を抑制するために、参考例４で造成したDRHG株をもとに、染色体DNAの一部（相補鎖塩基番号1,126,301〜1,127,488b）を欠失したDRHG145株を以下のようにして造成した。【０１３７】
１．pobB遺伝子破壊用プラスミドの構築
pobB遺伝子の３’フランキング領域を（塩基番号1,125,101〜1,126,300）を増幅するとともに、増幅断片の両端に制限酵素SphI部位とXbaI部位を付加するために、２種類のDNAプライマー（配列番号２７と２８）を合成した。DRHG株の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法によりpobB遺伝子の３’フランキング領域を増幅した。次に、pobB遺伝子の５’フランキング領域（塩基番号1,127,505〜1,128,687）を増幅するとともに、増幅断片の両端に制限酵素XbaI部位とSalI部位を付加するために２種類のDNAプライマー（配列番号２９と３０）を合成した。DRHG株の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法によりpobB遺伝子の５’フランキング領域を増幅した。３’フランキング領域の増幅DNA断片を制限酵素SphIとXbaIで消化し、また５’フランキング領域の増幅DNA断片を制限酵素XbaIとSalIで消化した後、これらのDNA断片をプラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）のマルチクローニングサイト内にあるSphI部位とSalI部位の間に導入し、プラスミドpHKPsacBΔpobBを得た。【０１３８】
２．pobB遺伝子破壊株の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドpHKPsacBΔpobBをDRHG株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、DRHG＿Km株を取得した。配列番号２７と３０のプライマーならびにsacB遺伝子確認用プライマー（配列番号３と４）を用いるPCR法によりDRHG＿Km株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、これら菌株はプラスミドpHKPsacBΔpobBがpobB遺伝子領域に導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１３９】
DRHG＿Km株を1 mLのLB液体培地中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養することにより、DRHG145株を得た。配列番号２７と３０のプライマーを用いるPCR法により、DRHG145株が予想通りpobB遺伝子を欠損している２回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１４０】
参考例６．aroF遺伝子、aroG遺伝子、aroB遺伝子およびaroD遺伝子の転写をTuプロモーターの制御下に置いたNSH株の造成
以下の４段階で、ＤＡＨＰからＤＨＳの合成に関わる４種類の遺伝子（aroF、aroG、aroBおよびaroD遺伝子）の転写を、ATCC13032株のTuプロモーター（塩基番号526,013〜526,374）の制御下に置くことにより、ＤＨＳ生成量を増強したNSH株を造成した。【０１４１】
１．qsuB遺伝子、aroD遺伝子およびqsuD遺伝子のプロモーターをTuプロモーターと置換したNUA株の作製
ATCC13032株のqsuB遺伝子、aroD遺伝子、qsuD遺伝子はオペロン構造を形成しており（以下、aroオペロンという）、同一の制御因子（cg0500遺伝子産物）により、発現量が調節されている。参考例５で造成したDRHG145株をもとに、このaroオペロンのプロモーター領域（塩基番号441,597〜442,756）を転写活性が強いTuプロモーターと置換したNUA株を以下にようにして造成した。【０１４２】
（１）cg0500遺伝子とaroプロモーターの領域をTuプロモーターと置換するためのプラスミドの構築
cg0500遺伝子の５’フランキング領域（塩基番号440,437〜441,596）を増幅するともに、増幅断片の両端に制限酵素SphI部位とRsrII部位を付加するために２種類のプライマー（配列番号３１と３２）を合成した。aroプロモーターの３’フランキング領域（塩基番号442,757〜443,916）を増幅するともに、増幅断片の両端に制限酵素PfoI部位とSbfI部位を付加するために２種類のプライマー（配列番号３３と３４）を合成した。また、Tuプロモーター領域を増幅するともに、増幅断片の両端に制限酵素RsrII部位とPfoI部位を付加するために２種類のプライマー（配列番号３５と３６）を合成した。DRHG株の染色体DNAを鋳型にして、これら３組のプライマーセットを用いるPCR法によりcg0500遺伝子の５’フランキング領域、aroオペロンのプロモーター領域の３’フランキング領域、およびTuプロモーターを増幅した。【０１４３】
cg0500遺伝子の５’フランキング領域の増幅DNA断片を制限酵素SphIとRsrIIで消化し、またaroオペロンのプロモーター領域の３’フランキング領域の増幅DNA断片を制限酵素PfoIとSbfIで消化し、またTuプロモーターの増幅DNA断片を制限酵素RsrIIとPfoIで消化した後、これらの制限酵素によって得られた３種類のDNA断片をプラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）のマルチクローニングサイト内にあるSbfI部位とSphI部位の間に導入し、プラスミドpHKPsacB＿ aro-Ntuを得た。【０１４４】
（２）プラスミドpHKPsacB＿ aro-Ntuを用いた相同組換え体の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、pHKPsacB＿Ntu-aroをDRHG145株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、DRHG145＿Km株を取得した。配列番号３１と３４のプライマーならびにsacB遺伝子確認用プライマー（配列番号３と４）を用いるPCR法によりDRHG145＿Km株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、DRHG145＿Km株はプラスミドpHKPsacB＿Ntu-aroがcg0500遺伝子領域に導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１４５】
DRHG145＿Km株を1 mLのLB液体培地中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養することにより、NUA株を得た。配列番号３７のプライマーを合成し、これと配列番号３６のプライマーと、配列番号３１と３４のプライマーを用いるPCR法により、DRHG145株が予想通りcg0500遺伝子とaroプロモーターがTuプロモーターと置換されている株２回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１４６】
２．aroG遺伝子のプロモーターをTuプロモーターと置換したNDSGU株の造成
ＤＡＨＰ合成酵素をコードするaroG遺伝子のプロモーター領域をTuプロモーター領域と置換したNDSGU株を以下のようにしてNUA株をもとに造成した。
（１）aroGプロモーター置換用プラスミドの構築
aroG遺伝子のプロモーターの５’フランキング領域（相補鎖塩基番号2,280,842〜2,282,206）を増幅するとともに、増幅断片の両端に制限酵素SphI部位とRsrII部位を付加するために２種類のプライマー（配列番号３８と３９）を合成した。aroG遺伝子のプロモーターの３’フランキング領域（相補鎖塩基番号2,279,366〜2,280,754）を増幅するとともに、増幅断片の両端に制限酵素PfoI部位とSbfI部位を付加するために２種類のプライマー（配列番号４０と４１）を合成した。また、DRHG株の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法によりaroG遺伝子のプロモーターの５’フランキング領域と３’フランキング領域をそれぞれ増幅した。これとは別に、DRHG株の染色体DNAを鋳型にして配列番号３５と３６のプライマーを用いるPCR法によりTuプロモーターを増幅した。【０１４７】
aroG遺伝子のプロモーターの５’フランキング領域の増幅DNA断片を制限酵素SphIとRsrIIで消化し、またaroG遺伝子のプロモーターの３’フランキング領域の増幅DNA断片を制限酵素PfoIとSbfIで消化し、またTuプロモーターの増幅DNA断片を制限酵素RsrIIとPfoIで消化した後、これらの制限酵素によって得られた３種類のDNA断片をプラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）のマルチクローニングサイト内にあるSbfI部位とSphI部位の間に導入し、プラスミドpHKPsacB＿aroG-Ntuを得た。【０１４８】
（２）プラスミドpHKPsacB＿aroG-Ntuを用いた相同組換え体の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、プラスミドpHKPsacB＿aroG-NtuをNUA株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、NUA＿Km株を取得した。配列番号３８と４１のプライマーならびにsacB遺伝子確認用プライマー（配列番号３と４）を用いるPCR法によりNUA＿Km株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、NUA＿Km株はプラスミドpHKPsacB＿aroG-NtuがaroG遺伝子領域に導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１４９】
NUA＿Km株を1 mLのLB液体培地中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養することにより、NDSGU株を得た。配列番号３８と４１のプライマーならびに配列番号３５と３６のプライマーを用いるPCR法により、NDSGU株が予想通りaroGプロモーター領域がTu プロモーターに置換されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。さらに、aroG遺伝子の５’フランキング領域の外側のDNAプライマー（配列番号４２）および３’フランキング領域の外側のDNAプライマー（配列番号４３）を合成し、これらプライマーを用いるPCR法によってもaroGプロモーター領域がTu プロモーターと置換されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１５０】
３．aroB遺伝子のプロモーターをTuプロモーターと置換したNSU株の造成
ＤＨＱ合成酵素をコードするaroB遺伝子のプロモーター領域をTuプロモーター領域と置換したNSU株を以下のようにしてNDSGU株をもとに造成した。
（１）aroBプロモーター置換用プラスミドの構築
aroB遺伝子のプロモーターの５’フランキング領域（相補鎖塩基番号1,720,573〜1,721,670）を増幅するとともに、増幅断片の両端に制限酵素SphI部位とRsrII部位を付加するために２種類のプライマー（配列番号４４と４５）を合成した。aroB遺伝子のプロモーターの３’フランキング領域（相補鎖塩基番号1,719,404〜1,720,501）を増幅するとともに、増幅断片の両端に制限酵素PfoI部位とSbfI部位を付加するために２種類のプライマー（配列番号４６と４７）を合成した。また、DRHG株の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用い、PCR法によりaroB遺伝子のプロモーターの５’フランキング領域と３’フランキング領域をそれぞれ増幅した。これとは別に、DRHG株の染色体DNAを鋳型にして配列番号３５と１６のプライマーを用いるPCR法によりTuプロモーターを増幅した。【０１５１】
aroB遺伝子のプロモーターの５’フランキング領域の増幅DNA断片を制限酵素SphIとRsrIIで消化し、またaroB遺伝子のプロモーターの３’フランキング領域の増幅DNA断片を制限酵素PfoIとSbfIで消化し、またTuプロモーターの増幅DNA断片を制限酵素RsrIIとPfoIで消化した後、これらの制限酵素によって得られた３種類のDNA断片をプラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）のマルチクローニングサイト内にあるSbfI部位とSphI部位の間に導入し、プラスミドpHKPsacB＿aroB-Ntuを得た。【０１５２】
（２）プラスミドpHKPsacB＿aroB-Ntuを用いた相同組換え体の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドpHKPsacB＿aroB-NtuをNDSGU株に導入して、カナマイシン耐性で選択することにより、NDSGU＿Km株を取得した。得られたNDSGU＿Km株が目的の1回交差型相同組換え体であることを確認するために、aroB遺伝子のプロモーターの５’フランキング領域の上流の一部と３’フランキング領域の下流の一部に基づく２種類のプライマー（配列番号４８と４９）を合成した。NDSGU＿Km株の染色体DNAを鋳型として、配列番号４８と４９のプライマー、配列番号３５と３６のプライマーならびにsacB遺伝子確認用プライマー（配列番号３と４）を用いるPCR法によりNDSGU＿Km株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、NDSGU＿Km株はプラスミドpHKPsacB＿aroB-NtuがaroB遺伝子領域に導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１５３】
NDSGU＿Km株を1 mLのLB液体培地中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養することにより、NSU株を得た。配列番号４４と４７のプライマー、配列番号４８と４９のプライマー、ならびに配列番号３５と３６のプライマーを用いるPCR法により、NSU株が予想通りaroBプロモーター領域がTu プロモーターに置換されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１５４】
４．aroF遺伝子のプロモーターをTuプロモーターと置換したNSH株の造成
ＤＨＱ脱水酵素をコードするaroF遺伝子のプロモーター領域をTuプロモーター領域と置換したNSH株を、以下のようにしてNSU株をもとに造成した。
（１）aroFプロモーター置換用プラスミドの構築
aroF遺伝子のプロモーターの５’フランキング領域（相補鎖塩基番号1,046,619〜1,047,863）を増幅するとともに、増幅断片の両端に制限酵素SphI部位とRsrII部位を付加するために２種類のプライマー（配列番号５０と５１）を合成した。aroB遺伝子のプロモーターの３’フランキング領域（相補鎖塩基番号1,046,619〜1,047,863）を増幅するとともに、増幅断片の両端に制限酵素PfoI部位とSbfI部位を付加するために２種類のプライマー（配列番号５２と５３）を合成した。また、DRHG株の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法によりaroF遺伝子のプロモーターの５’フランキング領域と３’フランキング領域をそれぞれ増幅した。これとは別に、DRHG株の染色体DNAを鋳型にして配列番号３５と３６のプライマーを用いるPCR法によりTuプロモーターを増幅した。【０１５５】
aroF遺伝子のプロモーターの５’フランキング領域の増幅DNA断片を制限酵素SphIとRsrIIで消化し、またaroF遺伝子のプロモーターの３’フランキング領域の増幅DNA断片を制限酵素PfoIとSbfIで消化し、またTuプロモーターの増幅DNA断片を制限酵素RsrIIとPfoIで消化した後、これらの制限酵素によって得られた３種類のDNA断片をプラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）のマルチクローニングサイト内にあるSbfI部位とSphI部位の間に導入し、プラスミドpHKPsacB＿aroF-Ntuを得た。【０１５６】
（２）プラスミドpHKPsacB＿aroF-Ntuを用いた相同組換え体の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドpHKPsacB＿aroF-NtuをNSU株に導入して、カナマイシン耐性で選択することにより、NSU＿Km株を取得した。得られたNSU＿Km株が目的の1回交差型相同組換え体であることを確認するために、aroF遺伝子のプロモーターの５’フランキング領域の上流の一部と３’フランキング領域の下流の一部に基づく２種類のプライマー（配列番号５４と５５）を合成した。NSU＿Km株の染色体DNAを鋳型として、配列番号５４と５５のプライマー、配列番号３５と３６のプライマーならびにsacB遺伝子確認用プライマー（配列番号３と４）を用いるPCR法によりNSU＿Km株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、NSU＿Km株はプラスミドpHKPsacB＿aroF-NtuがaroF遺伝子領域に導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１５７】
NSU＿Km株を1 mLのLB液体培地中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養することにより、NSH株を得た。配列番号５０と５３のプライマー、配列番号５４と５５のプライマー、ならびに配列番号３５と３６のプライマーを用いるPCR法により、NSU株が予想通りaroBプロモーター領域がTu プロモーターと置換されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１５８】
参考例７．シキミ酸脱水素酵素をコードするaroE1遺伝子およびaroE3遺伝子のインフレーム破壊株の造成
ATCC13032株が保有する３種類のシキミ酸脱水素酵素のうち、生育に影響を与える可能性があるaroE1遺伝子とaroE3遺伝子にインフレーム欠失変異を導入した菌株（インフレーム欠失変異を導入した菌株（以下、必要に応じて、インフレーム破壊株とも呼ぶ）を以下のようにして造成した。なお、インフレーム欠失変異、すなわちインフレーム破壊とは、翻訳領域内に３塩基の倍数の長さの欠失を導入した変異のことをいう。【０１５９】
１．aroE1遺伝子のインフレーム破壊用プラスミドの構築
aroE1遺伝子の５’フランキング領域を（塩基番号1,183,128〜1,184,160）を増幅させるために２種類のDNAプライマー（配列番号５６と５７）を合成した。なお、配列番号５６のプライマーには制限酵素SphI部位を導入した。DRHG株の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法によりaroE1遺伝子の５’フランキング領域を増幅した。次に、aroE1遺伝子の３’フランキング領域（塩基番号1,181,390〜1,182,365）を増幅させるために２種類のDNAプライマー（配列番号５８と５９）を合成した。なお、配列番号５９のプライマーには制限酵素SbfI部位を導入した。【０１６０】
このようにして得られたaroE1遺伝子の５’フランキング領域の増幅DNAと３’フランキング領域の増幅DNAの混合物を鋳型としてDNAプライマー（配列番号５６と５９）を用いてオーバーラップPCR法による増幅反応を行った後、制限酵素SphIとSbfIで消化反応を行った。生じたDNA断片をプラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）のマルチクローニングサイト内の制限酵素部位SbfI - SphI間に導入し、プラスミドpHKPsacBΔaroE1を得た。なお、プラスミドpHKPsacBΔaroE1は、aroE1遺伝子領域のうち、相補鎖塩基番号1,181,390〜1,184,160の領域が欠失している構造を有する。【０１６１】
２．aroE1遺伝子のインフレーム破壊株の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドpHKPsacBΔaroE1をNSH株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、NSH＿Km株を取得した。得られたNSH＿Km株が目的の1回交差型相同組換え体であることを確認するために、aroE1遺伝子５’フランキング領域の上流の一部と３’フランキング領域の下流の一部に基づく２種類のプライマー（配列番号６０と６１）を合成した。配列番号５６と５９のプライマーならびにsacB遺伝子確認用プライマー（配列番号３と４）を用いるPCR法によりNSH＿Km株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、NSH＿Km株はプラスミドpHKPsacBΔaroE1がaroE1遺伝子領域に導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１６２】
NSH＿Km株を1 mLのLB液体培地中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養することにより、NSHΔaroE1株を得た。配列番号６０と６１のプライマーを用いるPCR法により、NSHΔaroE1株が予想通りaroE1遺伝子を欠損している２回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１６３】
３．aroE3遺伝子のインフレーム破壊用プラスミドの構築
aroE3遺伝子の５’フランキング領域を（塩基番号1,726,887〜1,727,845）を増幅させるために２種類のDNAプライマー（配列番号６２と６３）を合成した。なお、配列番号６２のプライマーには制限酵素SphI部位を導入した。DRHG株の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法によりaroE3遺伝子の５’フランキング領域を増幅した。次に、aroE3遺伝子の３’フランキング領域（塩基番号1,725,101〜1,726,094）を増幅させるために２種類のDNAプライマー（配列番号６４と６５）を合成した。なお、配列番号６５のプライマーには制限酵素SbfI部位を導入した。このようにして得られたaroE3遺伝子の５’フランキング領域の増幅DNAと３’フランキング領域の増幅DNAの混合物を鋳型として、配列番号６２と６５のプライマーを用いるオーバーラップPCR法により増幅反応を行った後、制限酵素SphIとSbfIによる消化反応を行った。生じたDNA断片をプラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）のマルチクローニングサイト内の制限酵素SbfI 部位とSphI部位の間に導入し、プラスミドpHKPsacBΔaroE3を得た。なお、プラスミドpHKPsacBΔaroE3は、aroE3遺伝子領域のうち、相補鎖塩基番号1,726,095〜1,726,886の領域が欠失している構造を有する。【０１６４】
４．aroE3遺伝子のインフレーム破壊株の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドpHKPsacBΔaroE3をNSH株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、NSH＿Km2株を取得した。得られたNSH＿Km2株が目的の1回交差型相同組換え体であることを確認するために、aroE3遺伝子５’フランキング領域の上流の一部と３’フランキング領域の下流の一部に基づく２種類のプライマー（配列番号６６と６７）を合成した。配列番号６２と６５のプライマー、配列番号６６と６７のプライマー、ならびにsacB遺伝子確認用プライマー（配列番号３と４）を用いるPCR法によりNSH＿Km株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、NSH＿Km2株はプラスミドpHKPsacBΔaroE3がaroE3遺伝子領域に導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１６５】
NSH＿Km2株を1 mLのLB液体培地中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養することにより、NSHΔaroE3株を得た。配列番号６６と６７のプライマーを用いるPCR法により、NSHΔaroE3株が予想通りaroE3遺伝子を欠損している２回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１６６】
５．aroE1遺伝子とaroE3遺伝子の２重破壊株の造成
NSHΔaroE1菌をもとに、上述の「aroE3遺伝子のインフレーム破壊株の造成」と同じ手法で、aroE3遺伝子もインフレームで破壊した２重破壊株（NSHΔaroE1ΔaroE3株と命名）を造成した。【０１６７】
６．NSHΔaroE1株、NSHΔaroE3株およびにNSHΔaroE1ΔaroE3株の芳香族アミノ酸の要求性試験
上述のようにして造成したNSH株、NSHΔaroE1株、NSHΔaroE3株およびにNSHΔaroE1ΔaroE3株の４株について、以下のようにして芳香族アミノ酸の要求性試験を行った。【０１６８】
各菌株を前培養培地のLB培地に植菌し、30℃で終夜培養した後、CGXII培地に2 %を植えついだ。また、CGXII培地にシキミ酸、トリプトファン、ファニルアラニン、チロシンをそれぞれ終濃度50 mg/Lずつ添加した培養実験も並行して行った。その結果、NSH株、NSHΔaroE1株はCGXII培地で正常に生育するが、NSHΔaroE3株とNSHΔaroE1ΔaroE3株は生育しないことを確認した。また、NSHΔaroE3株とNSHΔaroE1ΔaroE3株はCGXII培地にシキミ酸、トリプトファン、ファニルアラニンおよびチロシンを添加すると生育が回復することを見出し、シキミ酸脱水素酵素をコードする主たる遺伝子がaroE3遺伝子であることを確認した。【０１６９】
参考例８．vanAプロモーターの制御下でaroE3遺伝子を発現するプロトカテク酸生産菌株NSHΔaroE3＿vanE3の造成
ATCC13032株のバニリン酸脱メチル酵素をコードする遺伝子はcg2616（以下vanA遺伝子と略す。塩基番号2,496,775〜2,497,905 bp：大きさ1,131 bp）とcg2617(以下vanB遺伝子と略す。塩基番号2,497,909〜2,498,886 bp：大きさ978 bp)である。また2,496,775〜2,498,886 bpをvanAB遺伝子領域と略す。またvanA遺伝子とvanB遺伝子を制御しているリプレッサーはcg2615 (以下vanR遺伝子と略す。相補鎖塩基番号2,496,013〜2,496,591 bp：大きさ579 bp)が既知である。vanR遺伝子により、aroE3遺伝子をvanA遺伝子とvanB遺伝子領域に導入し、aroE3遺伝子をvanR遺伝子制御下に置換した。親株は、上記参考例７に示すNSHΔaroE3株を用いた。【０１７０】
１．vanAB遺伝子領域とaroE3遺伝子の置換用ベクターの構築
ATCC13032株のvanAB遺伝子領域をaroE3遺伝子に置換するために以下の手順で置換用ベクターを構築した。まず、ATCC13032株のゲノム配列をもとに、vanAB遺伝子領域の５’フランキング領域（塩基番号2,495,799〜2,496,774 bp：大きさ976kp）を増幅させるために２種類のDNAプライマー（配列番号６８と配列番号６９）を合成し、vanAB遺伝子領域の３’フランキング領域（塩基番号2,498,887〜2,499,870 bp：大きさ984kp）を増幅するために２種類のDNAプライマー（配列番号７０と配列番号７１）を合成した。これらのプライマーを用いて菌株NSHの染色体DNAを鋳型にしてPCR法によりvanAB遺伝子の５’フランキング領域、vanAB遺伝子の３’フランキング領域を増幅した。vanAB遺伝子の５’フランキング領域を増幅するとともに配列番号６８のDNAプライマーに制限酵素サイトSphIを導入し、vanAB遺伝子の３’フランキング領域を増幅するとともに配列番号７１のDNAプライマーに制限酵素サイトSbfIを導入した。またaroE3遺伝子を増幅するために2種類のDNAプライマー（配列番号７２と配列番号７３）を合成した。aroE3遺伝子を増幅するとともに、配列番号７２のDNAプライマーにvanAB遺伝子領域の５’フランキング領域の3´末端の15 bpを付加し、配列番号７３のDNAプライマーにvanAB遺伝子領域の３’フランキング領域の5´末端の15 bpを付加し増幅した。増幅した５’フランキング領域、aroE3遺伝子を混合したDNA断片を鋳型として、DNAプライマー(配列番号６８と配列番号７３)を用い、また増幅した３’フランキング領域、aroE3遺伝子を混合したDNA断片を鋳型として、DNAプライマー(配列番号７２と配列番号７１)を用い、オーバーラップPCR法で増幅した。それぞれ増幅したDNA断片を制限酵素SphIとaroE3遺伝子内部制限酵素サイトAscIおよびSbfIとaroE3遺伝子内部制限酵素サイトAscIで消化し、プラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）のマルチクローニングサイト内の制限酵素部位SbfI - SphI間に導入し、プラスミドpHKPsacB＿vanR＿Pvan-aroE3を得た。【０１７１】
２．vanAB遺伝子領域とaroE3遺伝子の置換株の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドpHKPsacB＿vanR＿Pvan-aroE3を菌株NSHΔaroE3に導入して、カナマイシン耐性株NSHΔaroE3を取得した。得られたカナマイシン耐性株の染色体DNA上（塩基番号2,495,799〜2,499,870 bp：大きさ4,071 bp）領域のうち塩基番号2,496,775〜2,498,886 bpがaroE3遺伝子に置換していることを確認するために以下の実験を行った。vanAB遺伝子の５’フランキング領域の112 bp外側と３’フランキング領域の106 bp外側にDNAプライマー（配列番号７４と配列番号７５）を作製し、vanAB遺伝子の５’フランキング領域と３’フランキング領域を増幅する際に使用したDNAプライマー(配列番号６８と配列番号７１)を用いて菌株NSHΔaroE3のカナマイシン耐性株のコロニーを直接鋳型としたPCRを行った。
菌株NSHΔaroE3のカナマイシン耐性株の染色体DNAを鋳型にし、配列番号７４と配列番号７１のDNAプライマーで増幅したPCRによって取得される増幅DNA断片が4,194 bp、配列番号６８と配列番号７５のDNAプライマーで増幅したPCRによって取得される増幅DNA断片は2,905 bpであった。もしくは配列番号７４と配列番号７１のDNAプライマーで増幅したPCRによって取得される増幅DNA断片が2,913bp、配列番号６８と配列番号７５のDNAプライマーで増幅したPCRによって取得される増幅DNA断片は4,186 bpであった。またsacB遺伝子領域が、PCR法による解析などによって確認されたことから、菌株NSHΔaroE3は1回交差型相同組換え体であることがわかった。【０１７２】
菌株NSHΔaroE3の1回交差型相同組換え体をLB液体培地1 mLで24時間培養した後、少量を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養した。増殖した菌株NSHΔaroE3が保持する染色体DNAはsacB遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、vanAB遺伝子領域がaroE3遺伝子と置換していると予想されNSHΔaroE3＿vanE3株と命名した。この菌株NSHΔaroE3＿vanE3について、２種類のDNAプライマー（配列番号７４と配列番号７５）を用いたPCR法により、vanAB遺伝子領域がaroE3遺伝子に置換しており予想通り２回交差型相同組換え体であった。【０１７３】
３．菌株NSHΔaroE3＿vanE3の生育確認
17.5 mg/Lのシキミ酸、50  mg/Lのトリプトファン、50  mg/Lのファニルアラニン、50  mg/Lのチロシン、10  mg/Lのパラヒドロキシ安息香酸および10 mg/Lのパラアミノ安息香酸（以下、６種類の添加物という）を加えたCGXII培地および６種類の添加物を加えないCGXII培地を用いて、菌株NSHΔaroE3＿vanE3とNSHΔaroE3の生育性試験を行った。その結果、菌株NSHΔaroE3＿vanE3は前者の培地では正常に増殖したが、後者の培地では培養中期までの生育速度が遅かった。一方、菌株NSHΔaroE3は前者の培地では増殖したが、後者の培地では増殖しなかった。また、６種類の添加物を加えないCGXII培地にフェルラ酸またはバニリン酸またはバニリンを50 μM以上添加して、菌株NSHΔaroE3＿vanE3を培養したときには、正常に増殖することがわかった。【０１７４】
参考例９．ＤＨＳ脱水酵素遺伝子のインフレーム破壊株の作製
参考例６、７および８に示すNSH株、NSHΔaroE3株およびNSHΔaroE3＿vanE3株を親株として、qsuB遺伝子にインフレーム欠失変異を導入することにより、ＤＨＳからプロトカテク酸への転換を遮断した菌株を以下のようにして造成した。【０１７５】
１．qsuB遺伝子破壊用プラスミドの構築
qsuB遺伝子の５’フランキング領域（塩基番号443,184〜444,207）を増幅するとともに、増幅断片の両端に制限酵素SbfI部位とXbaI部位を付加するために２種類のDNAプライマー（配列番号７６と７７）を合成した。また、qsuB遺伝子の３’フランキング領域（塩基番号446,032〜447,053）を増幅するともに、増幅断片の両端に制限酵素XbaI部位とSalI部位を付加するために２種類のDNAプライマー（配列番号７８と７９）を合成した。NSH株の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法によりqsuB遺伝子の５’フランキング領域と３’フランキング領域を増幅した。５’フランキング領域増幅物を制限酵素SbfIおよびXbaIで消化し、また３’フランキング領域増幅物を制限酵素XbaIおよびSalIで消化した後、これらのDNA断片をプラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）のマルチクローニングサイト内にあるSbfI 部位とSalI部位の間に導入し、qsuB遺伝子破壊用プラスミドであるpHKPsacBΔqsuBを得た。【０１７６】
２．qsuB遺伝子破壊株の造成
上述のプラスミドpHKPsacBΔqsuBをNSH株、NSHΔaroE3株およびNSHΔaroE3＿vanE3株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、それぞれの菌株からNSH＿qsuB＿Km株、NSHΔaroE3＿qsuB＿Km株およびNSHΔaroE3＿vanE3＿qsuB＿Km株を取得した。取得した菌株をPCR法により解析するために、qsuB遺伝子の５’フランキング領域の上流の配列に一致するDNAプライマー（配列番号８０）と３’フランキング領域の下流の配列に一致するDNAプライマー（配列番号８１）を合成し、配列番号７９と８０のプライマー、配列番号７６と８１のプライマーを用いるPCR法によって解析した。いずれのプライマーセットを用いたPCR法による解析でも予想通りの結果が得られたことから、これら菌株はプラスミドpHKPsacBΔqsuB がqsuB遺伝子領域に導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１７７】
NSHΔqsuB＿Km株、NSHΔaroE3ΔqsuB＿Km株、およびNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Km株をそれぞれ1 mLのLB液体培地中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養することにより、それぞれの菌株からNSHΔqsuB株、NSHΔaroE3ΔqsuB株、およびNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB株を得た。配列番号８０と８１のプライマーならびにsacB遺伝子確認用プライマー（配列番号３と４）を用いるPCR法により、これら菌株がqsuB遺伝子内の領域（塩基番号444,208〜446,031）を欠失している２回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１７８】
参考例１０．シキミ酸脱水酵素遺伝子のインフレーム破壊株の造成
NSHΔaroE3ΔqsuB株およびNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB株をもとに、残存するシキミ酸脱水酵素活性を低減するために、シキミ酸脱水酵素をコードするqsuD遺伝子にインフレーム欠失変異を導入した菌株を以下のようにして造成した。【０１７９】
１．qsuD遺伝子のインフレーム破壊用プラスミドの構築
qsuD遺伝子の５’フランキング領域を（塩基番号443,644〜446,553、ただし444,199〜446,031の領域はqsuBのインフレーム破壊領域である）を増幅させるために２種類のDNAプライマー（配列番号８２と８３）を合成した。なお、配列番号８２のプライマーには制限酵素SbfI部位を導入した。NSHΔqsuB株の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法によりqsuD遺伝子の５’フランキング領域を増幅した。次に、qsuD遺伝子の３’フランキング領域（塩基番号447,385〜448,441）を増幅させるために２種類のDNAプライマー（配列番号８４と８５）を合成した。なお、配列番号８５のプライマーには制限酵素XhoI部位を導入した。このようにして得られたaroE遺伝子の５’フランキング領域の増幅DNAと３’フランキング領域の増幅DNAの混合物を鋳型としてDNAプライマー（配列番号８２と８５）を用いてオーバーラップPCR法による増幅反応を行った後、制限酵素SbfIとXhoIで消化反応を行った。生じたDNA断片をプラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）のマルチクローニングサイト内の制限酵素部位SbfI - SalI間に導入し、プラスミドpHKPsacBΔqsuDを得た。なお、プラスミドpHKPsacBΔqsuDは、qsuD遺伝子領域のうち、塩基番号446,554〜447,384の領域が欠失している構造を有する。【０１８０】
２．qsuD遺伝子のインフレーム破壊株の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドpHKPsacBΔqsuDをNSHΔaroE3ΔqsuB株、およびNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、NSHΔaroE3ΔqsuB＿Km株、およびNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿km株を取得した。得られたNSHΔaroE3ΔqsuB＿Km株、およびNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿km株が目的の1回交差型相同組換え体であることを確認するために、qsuD遺伝子５’フランキング領域の上流の一部と３’フランキング領域の下流の一部に基づく２種類のプライマー（配列番号８６と８７）を合成した。配列番号８６と８５のプライマー、配列番号８２と８７ならびにsacB遺伝子確認用プライマー（配列番号３と４）を用いるPCR法によりNSHΔaroE3ΔqsuB＿Km株、およびNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿km株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、NSHΔaroE3ΔqsuB＿Km株、およびNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿km株はプラスミドpHKPsacBΔqsuDがqsuD遺伝子領域に導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１８１】
NSHΔaroE3ΔqsuB＿Km株、およびNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿km株を1 mLのLB液体培地中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養することにより、NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD株、およびNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuBΔqsuD株を得た。配列番号８６と８７のプライマーを用いるPCR法により、NSHΔaroE3ΔqsuBΔaroE株、およびNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuBΔqsuD株が予想通りaroE遺伝子を欠損している２回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１８２】
３．NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD株の芳香族アミノ酸の要求性試験
上述のようにして造成したNSH株、NSHΔaroE3株、NSHΔaroE3ΔqsuB株、NSHΔaroE3ΔqsuBΔaroE1株、NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB株、NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD株の６株について、以下のようにして芳香族アミノ酸の要求性試験を行った。【０１８３】
17.5 mg/Lのシキミ酸、50 mg/Lのトリプトファン、50 mg/Lのファニルアラニン、50 mg/Lのチロシンを添加した前培養培地のCGXII培地に各菌株を植菌し、30℃で終夜培養した後、2回洗浄し、本培養培地CGXII培地にOD600が約0.05になるように植えついだ。本培養培地であるCGXII培地に17.5 mg/Lのシキミ酸、50 mg/Lのトリプトファン、50 mg/Lのファニルアラニン、50 mg/Lのチロシンを添加した培養実験も並行して行った。その結果、NSH株、NSHΔaroE3株、NSHΔaroE3ΔqsuB株、NSHΔaroE3ΔqsuBΔaroE1株、NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB株、NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD株の６株のうちNSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD株のみがシキミ酸、トリプトファン、ファニルアラニン、チロシンを添加したときにのみ生育したことから、qsuD遺伝子の欠失により残存するシキミ酸脱水酵素の活性がほとんど消失したことがわかった。【０１８４】
参考例１１．VanRリプレッサーの誘導発現によってaroE3遺伝子の発現を制御できるＤＨＳ生産菌株の造成
参考例１０で造成したNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuBΔqsuD株のbenABCD遺伝子領域をvanR遺伝子と置換することにより、benAプロモーターの制御下でvanR遺伝子を発現する菌株を造成した。【０１８５】
１．benABCD遺伝子領域をvanR遺伝子と置換するためのプラスミドの構築
benABCD遺伝子領域の５’フランキング領域（塩基番号2,515,963〜2,516,969）を増幅させるために２種類のDNAプライマー（配列番号８８と８９）を合成し、またbenABCD遺伝子領域の３’フランキング領域（塩基番号2,521,372〜2,522,498）を増幅するために２種類のDNAプライマー（配列番号９０と９１）を合成した。なお、配列番号８８と９１のプライマーはそれぞれ制限酵素SalI部位とSbfI部位を持つ。HT23株（参考例３）の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法によりbenABCD遺伝子の５’フランキング領域と３’フランキング領域を増幅した。また、vanR遺伝子を増幅するために２種類のDNAプライマー（配列番号９２と９３）を合成した。HT23株の染色体DNAを鋳型にして配列番号９２と９３のプライマーを用いるPCR法によりvanR遺伝子領域を増幅した。このようにして得られたbenABCD遺伝子の５’フランキング領域の増幅DNAとqsuB遺伝子領域の増幅DNAの混合物を鋳型として、配列番号８８と９３のプライマーを用いるオーバーラップPCR法により増幅反応を行った後、制限酵素SalIとNarIによる消化により、配列番号８８のプライマー内のSalI部位とvanR遺伝子内部のNarI部位で切断されたDNA断片を得た。また、vanR遺伝子領域の増幅DNAとbenABCD遺伝子の３’フランキング領域の増幅DNAの混合物を鋳型として、配列番号９１と９２のプライマーを用いたオーバーラップPCR法により増幅反応を行った後、制限酵素NarIとSbfIによる消化により、vanR遺伝子内部のNarI部位と配列番号９１のプライマー内のSbfI部位で切断されたDNA断片を得た。これら２種類のDNA断片をプラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）のマルチクローニングサイト内にあるSalI部位とSbfI部位の間に導入し、プラスミドpHKPsacB＿Pben-vanRを得た。【０１８６】
２．benABCD遺伝子領域をvanR遺伝子に置換した菌株の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドpHKPsacB＿Pben-vanRをNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuBΔqsuD株に導入してカナマイシン耐性となったNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuBΔqsuD株＿Km株を取得した。続いて、NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuBΔqsuD株＿Km株をPCR法により解析するために、vanR遺伝子の５’フランキング領域の上流の配列に一致するプライマー（配列番号９４）と３’フランキング領域の下流の配列に一致するプライマー（配列番号９５）を合成した後、配列番号９４と９１のプライマーならびに配列番号８８と９５のプライマーを用いるPCR法によって解析した。いずれのプライマーセットを用いたPCR法による解析でも、予想通りの結果が得られたことから、NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuBΔqsuD株＿Km株はプラスミドpHKPsacB＿Pben-vanR がbenABCD遺伝子領域に導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１８７】
NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuBΔqsuD株＿Km株を1 mLのLB液体培地中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養することにより、Pben-vanR株を得た。配列番号９４と９５のプライマーを用いるPCR法により、Pben-vanR株はbenABCD遺伝子領域がvanR遺伝子に置換した２回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１８８】
参考例１２．benAプロモーターの制御下でqsuB遺伝子を発現するプロトカテク酸生産菌NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB株の造成
以下のようにして、参考例９で造成したNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB株のbenABCD遺伝子オペロン領域をqsuB遺伝子と置換することにより、benAプロモーターの制御下でqsuB遺伝子を発現する菌株を造成した。【０１８９】
１．benABCD遺伝子領域をqsuB遺伝子と置換するためのプラスミドの構築
benABCD遺伝子領域の５’フランキング領域を増幅させるために２種類のDNAプライマー（配列番号８８と８９）を利用し、またbenABCD遺伝子領域の３’フランキング領域を増幅するために２種類のDNAプライマー（配列番号９０と９１）を利用した。HT23株（参考例３）の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法によりbenABCD遺伝子の５’フランキング領域と３’フランキング領域を増幅した。また、qsuB遺伝子を増幅するために２種類のDNAプライマー（配列番号９６と９７）を合成し、HT23株の染色体DNAを鋳型にしてこれらプライマーを用いるPCR法によりqsuB遺伝子領域を増幅した。このようにして得られたbenABCD遺伝子の５’フランキング領域の増幅DNAとqsuB遺伝子領域の増幅DNAの混合物を鋳型として、配列番号８８と９７のプライマーを用いるオーバーラップPCR法により増幅反応を行った後、制限酵素SalIとNarIによる消化により、配列番号８８のプライマー内のSalI部位とqsuB遺伝子内部のNarI部位で切断されたDNA断片を得た。また、qsuB遺伝子領域の増幅DNA とbenABCD遺伝子の３’フランキング領域の増幅DNAの混合物を鋳型として、配列番号９１と９６のプライマーを用いたオーバーラップPCR法により増幅反応を行った後、制限酵素NarIとSbfIによる消化により、qsuB遺伝子内部のNarI部位と配列番号９１のプライマー内のSbfI部位で切断されたDNA断片を得た。これら２種類のDNA断片をプラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）のマルチクローニングサイト内にあるSalI部位とSbfI部位の間に導入し、プラスミドpHKPsacB＿Pben-qsuBを得た。【０１９０】
２．benABCD遺伝子領域をqsuB遺伝子に置換した菌株の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドpHKPsacB＿Pben-qsuBをNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB株に導入してカナマイシン耐性となったNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Km株を取得した。続いて、NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Km株をPCR法により解析するために、qsuB遺伝子の５’フランキング領域の上流の配列に一致するプライマー（配列番号９８）と３’フランキング領域の下流の配列に一致するプライマー（配列番号９９）を合成した後、配列番号８８と９９のプライマーならびに配列番号９１と９８のプライマーを用いるPCR法によって解析した。いずれのプライマーセットを用いたPCR法による解析でも、予想通りの結果が得られたことから、NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Km株はプラスミドpHKPsacB＿Pben-qsuB がbenABCD遺伝子領域に導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１９１】
NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Km株を1 mLのLB液体培地中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養することにより、NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB株を得た。配列番号８８と９９のプライマーならびに配列番号９１と９８のプライマーを用いるPCR法により、benABCD遺伝子領域がqsuB遺伝子に置換した２回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１９２】
参考例１３．benAプロモーターの制御下でqsuB遺伝子とvanR遺伝子を発現するプロトカテク酸生産菌NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB-vanR株の造成
参考例１２で造成したNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB株をもとに、qsuB遺伝子とオペロン構造を保持する形でvanR遺伝子を導入した。qsuB遺伝子とオペロン構造を保持することにより、benAプロモーターの制御下でqsuB遺伝子とvanR遺伝子を発現する菌株を以下のようにして造成した。【０１９３】
１．vanR遺伝子をqsuB遺伝子の下流に挿入するためのプラスミドの構築
vanR遺伝子挿入領域の５’フランキング領域（塩基番号2,520,333〜2,521,374）を増幅させるために２種類のDNAプライマー（配列番号１００と１０１）を合成し、またvanR遺伝子挿入領域の３’フランキング領域（塩基番号2,521,372〜2,522,498）を増幅するために２種類のDNAプライマー（配列番号１０２と１０３）を合成した。なお、配列番号１００と１０３のプライマーはそれぞれ制限酵素SalI部位とSbfI部位を持つ。NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB株の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法によりvanR遺伝子挿入領域の５’フランキング領域と３’フランキング領域を増幅した。また、vanR遺伝子を増幅するために２種類のDNAプライマー（配列番号１０４と１０５）を合成し、HT23株(参考例３)の染色体DNAを鋳型にしてこれらプライマーを用いるPCR法によりvanR遺伝子領域を増幅した。このようにして得られたvanR遺伝子挿入領域の５’フランキング領域の増幅DNAとvanR遺伝子領域の増幅DNAの混合物を鋳型として、配列番号１００と１０５のプライマーを用いるオーバーラップPCR法により増幅反応を行った後、制限酵素SalIとBamHIによる消化により、配列番号１００のプライマー内のSalI部位とvanR遺伝子内部のBamHI部位で切断されたDNA断片を得た。また、vanR遺伝子領域の増幅DNAとvanR遺伝子挿入領域の３’フランキング領域の増幅DNAの混合物を鋳型として、配列番号１０４と１０３のプライマーを用いたオーバーラップPCR法により増幅反応を行った後、制限酵素BamHIとSbfIによる消化により、vanR遺伝子内部のBamHI部位と配列番号１０３のプライマー内のSbfI部位で切断されたDNA断片を得た。これら２種類のDNA断片をプラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）のマルチクローニングサイト内にあるSalI部位とSbfI部位の間に導入し、プラスミドpHKPsacB＿Pben-qsuB-vanRを得た。【０１９４】
２．vanR遺伝子をqsuB遺伝子の下流に挿入した菌株の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドpHKPsacB＿Pben-qsuB-vanRをNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB株に導入してカナマイシン耐性となったNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB株＿Km株を取得した。続いて、NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB株＿Km株をPCR法により解析するために、vanR遺伝子導入領域の５’フランキング領域の上流の配列に一致するプライマー（配列番号１０６）と３’フランキング領域の下流の配列に一致するプライマー（配列番号１０７）を合成した後、配列番号１００と１０３のプライマーを用いるPCR法によって解析した。いずれのプライマーセットを用いたPCR法による解析でも、予想通りの結果が得られたことから、NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB株＿Km株はプラスミドpHKPsacB＿Pben-qsuB-vanRがvanR遺伝子挿入領域に導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１９５】
NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB株＿Km株を1 mLのLB液体培地中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養することにより、NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB-vanR株を得た。配列番号１０６と１０７のプライマーを用いるPCR法により、benABCD遺伝子領域のqsuB遺伝子下流にvanR遺伝子を挿入された２回交差型相同組換え体であることを確認した。【０１９６】
参考例１４．tkt遺伝子を構成的に発現するプロトカテク酸生産菌tkt株の造成
参考例１３で造成したNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB-vanR株を親株として、エリトロース-4-リン酸の合成に関わるtkt遺伝子をTuプロモーター（参考例６）に連結した転写ユニット（以下、Ptu-tkt転写ユニットと略す）をDNA修飾・制限酵素遺伝子の破壊部位に挿入したtkt株を以下のようにして造成した。【０１９７】
１．Ptu-tkt転写ユニットを構築するためのプラスミドの構築
DNA修飾・制限酵素遺伝子の破壊部位の５’フランキング領域（塩基番号1,885,120〜1,883,861）を増幅させるために２種類のDNAプライマー（配列番号１０８と１０９）を合成し、DNA修飾・制限酵素遺伝子の破壊部位の３’フランキング領域（塩基番号1,879,744〜1,878,664）を増幅するために２種類のDNAプライマー（配列番号１１０と１１１）を合成した。またTuプロモーターを増幅させるためにDNAプライマー（配列番号１１２と３６）を、tkt遺伝子を増幅させるために２種類のDNAプライマー（配列番号１１３と１１４）合成した。なお、配列番号１０８と１１１のプライマーはそれぞれ制限酵素SbfI部位とSalI部位を持つ。【０１９８】
参考例HT23株（参考例３）の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法によりDNA修飾・制限酵素遺伝子の破壊部位の５’フランキング領域と３’フランキング領域を増幅した。得られた５’フランキング領域の増幅DNAとtkt遺伝子の増幅DNAの混合物を鋳型として、配列番号１０８と１１３のプライマーを用いるオーバーラップPCR法により増幅反応を行った後、制限酵素SbfIとPfoIによる消化により、配列番号１０８のプライマー内のSbfI部位と、配列番号１１３のプライマー内のPfoI部位で切断されたDNA断片を得た。また、Tuプロモーターの増幅DNA と３’フランキング領域の増幅DNAの混合物を鋳型として、配列番号３６と１１１のプライマーを用いたオーバーラップPCR法により増幅反応を行った後、制限酵素PfoとSalIによる消化により、配列番号３６のプライマー内のPfoI部位と、配列番号１１１のプライマー内のSalI部位で切断されたDNA断片を得た。これら２種類のDNA断片をプラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）のマルチクローニングサイト内にあるSbfI部位とSalI部位の間に導入し、プラスミドpHKPsacB＿Ptu-tktを得た。【０１９９】
２．Ptu-tkt転写ユニットを組み込んだ菌株の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドpHKPsacB＿Ptu-tktをNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB-vanR株に導入してカナマイシン耐性となったNSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB-vanR株＿Km株を取得した。続いて、NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB-vanR株＿Km株をPCR法により解析するために、５’フランキング領域の上流の配列に一致するプライマー（配列番号１１５）と３’フランキング領域の下流の配列に一致するプライマー（配列番号１１６）を合成した後、配列番号１１５と１１６のプライマーならびに配列番号１０８と１１１のプライマーを用いるPCR法によって解析した。いずれのプライマーセットを用いたPCR法による解析でも、予想通りの結果が得られたことから、NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB-vanR株＿Km株はプラスミドpHKPsacB＿Ptu-tktが導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０２００】
NSHΔaroE3＿vanE3ΔqsuB＿Pben-qsuB-vanR株＿Km株を1 mLのLB液体培地中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養することにより、tkt株を得た。配列番号１１５と１１６のプライマーならびに配列番号１０８と１１１のプライマーを用いる用いるPCR法と、増幅断片の制限酵素消化により、Ptu-tkt転写ユニットがDNA修飾・制限酵素遺伝子の破壊部位に組み込まれた２回交差型相同組換え体であることを確認した。【０２０１】
参考例１５．rhcHプロモーターの制御下でaroE3遺伝子を発現する菌株の造成
cg1309遺伝子からcg1311遺伝子までの領域（以下、rhcHMD遺伝子領域と略す）をaroE3遺伝子で置換した菌株を以下のように造成した。【０２０２】
１．genH遺伝子破壊用プラスミドの構築
３−ヒドロキシ安息香酸６−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子であるcg3354遺伝子（以下、genH遺伝子という）の５’フランキング領域を（塩基番号3,201,424〜3,202,403）を増幅するとともに、増幅断片の両端に制限酵素KpnI部位とSbfI部位を付加するために、２種類のDNAプライマー（配列番号１１７と１１８）を合成した。DRHG株の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法によりgenH遺伝子の５’フランキング領域を増幅した。次に、genH遺伝子の３’フランキング領域（塩基番号3,203,894〜3,204,901）を増幅するとともに、増幅断片の両端に制限酵素SbfI部位とSalI部位を付加するために２種類のDNAプライマー（配列番号１１９と１２０）を合成した。DRHG株の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法によりgenH遺伝子の３’フランキング領域を増幅した。５’フランキング領域の増幅DNA断片を制限酵素KpnIとSbfIで消化し、また３’フランキング領域の増幅DNA断片を制限酵素SbfIとSalIで消化した後、これらのDNA断片をプラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）のマルチクローニングサイト内にあるKpnI部位とSalI部位の間に導入し、プラスミドpHKPsacBΔgenHを得た。【０２０３】
２．genH遺伝子破壊株の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドpHKPsacBΔgenHをNSHΔaroE3株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、NSHΔaroE3＿Km株を取得した。配列番号１１７と１２０のプライマーならびにsacB遺伝子確認用プライマー（配列番号３と４）を用いるPCR法によりNSHΔaroE3＿Km株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、これら菌株はプラスミドpHKPsacBΔgenHがgenH遺伝子領域に導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０２０４】
NSHΔaroE3＿Km株を1 mLのLB液体培地中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、NSHΔaroE3ΔgenH株を得た。配列番号１１７と１２０のプライマーを用いるPCR法により、NSHΔaroE3ΔgenH株が予想通りgenH遺伝子を欠損している２回交差型相同組換え体であることを確認した。【０２０５】
３．rhcHMD遺伝子領域とaroE3遺伝子の置換用ベクターの構築
rhcHMD遺伝子領域の５’フランキング領域（塩基番号1,213,341〜1,214,736）を増幅させるために２種類のDNAプライマー（配列番号１２１と配列番号１２２）を合成した。なお、配列番号１２１のプライマーには制限酵素SbfI部位を導入した。NSH株の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法によりrhcHMD遺伝子領域の５’フランキング領域を増幅した。次に、rhcHMD遺伝子の３’フランキング領域（塩基番号1,218,296〜1,219,545）を増幅させるために２種類のDNAプライマー（配列番号１２３と配列番号１２４）を合成した。なお、配列番号１２４のプライマーには制限酵素SalI部位を導入した。【０２０６】
またaroE3遺伝子を増幅するために配列番号１２５と配列番号１２６のDNAプライマーを合成した。rhcHMD遺伝子領域の５’フランキング領域、aroE3遺伝子を増幅したDNA断片を鋳型として、DNAプライマー(配列番号１２１と配列番号１２６)を用い、オーバーラップPCR法による増幅反応を行った。また３’フランキング領域、aroE3遺伝子を増幅したDNA断片を鋳型として、DNAプライマー(配列番号１２５と配列番号１２４)を用い、オーバーラップPCR法で増幅した。それぞれ増幅したDNA断片をSbfIとAvrIIおよびAvrIIとSalIで消化し、プラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）のマルチクローニングサイト内の制限酵素部位SbfI-SalI間に導入し、プラスミドpHKPsacB＿rhcR＿Prhc-rhcE3を得た。【０２０７】
４．rhcHMD遺伝子領域とaroE3遺伝子の置換株の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドpHKPsacB＿rhcR＿Prhc-rhcE3を上述の菌株NSHΔaroE3ΔgenH株に導入し、カナマイシン耐性で選択することによりNSHΔaroE3ΔgenH＿Km株を取得した。
配列番号１２７と配列番号１２８のDNAプライマーと、配列番号１２１と配列番号１２４のプライマーとsacB遺伝子確認用プライマー（配列番号３と４）を用いるPCR法によりNSHΔaroE3ΔgenH＿Km株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、NSHΔaroE3ΔgenH＿Km株はプラスミドpHKPsacB＿rhcR＿Prhc-rhcE3がrhcHMD遺伝子領域に導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０２０８】
NSHΔaroE3ΔgenH株の1回交差型相同組換え体を1 mLのLB液体培地中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養することにより、NSHΔaroE3ΔgenH＿rhcE3株を得た。配列番号１２７と１２８のプライマーを用いるPCR法により、NSHΔaroE3ΔgenH＿rhcE3株のrhcHMD遺伝子領域がaroE3遺伝子に置換しており、予想通り２回交差型相同組換え体であることを確認した。【０２０９】
５．NSHΔaroE3＿vanE3株とNSHΔaroE3ΔgenH＿rhcE3株のアミノ酸の要求性試験
造成したNSH株、NSHΔaroE3株、NSHΔaroE3＿vanE3株、NSHΔaroE3ΔgenH＿rhcE3株について、以下のようにして芳香族アミノ酸の要求性試験を行った。【０２１０】
各菌株を前培養培地のCGXII培地に植菌し、30℃で終夜培養した後、２回洗浄し、本培養培地CGXII培地に吸光度600nmが約0.1になるように植えついだ。また、CGXII培地にシキミ酸（17.5 mg/L）、トリプトファン（50 mg/L）、ファニルアラニン（50 mg/L）およびチロシン（50 mg/L）を添加した培養実験も並行して行った。その結果、NSH株はCGXII培地では正常に生育したが、NSHΔaroE3株は極めて生育が遅かったことが明らかになった。またNSHΔaroE3＿vanE3株とNSHΔaroE3ΔgenH＿rhcE3株は培養初期から中期にかけて生育が遅れ、培養終期に生育が回復することを確認した。また、NSHΔaroE3＿vanE3株もしくはNSHΔaroE3ΔgenH＿rhcE3株はCGXII培地にシキミ酸、トリプトファン、ファニルアラニンおよびチロシンを添加すると生育が回復することを確認した。これらの結果から、VanRリプレッサーとRhcRリプレッサーはともにaroE3遺伝子の発現を制御できることを見出した。【０２１１】
参考例１６．nagIプロモーターの制御下でrhcR遺伝子を発現する菌株の造成
rhcR遺伝子がコードするRhcRリプレッサーによりaroE3遺伝子の転写を制御する系を構築ために、nagIプロモーターの制御下でrhcR遺伝子を発現する菌株を以下のようにして造成した。【０２１２】
１．nagIKL遺伝子オペロン領域とrhcR遺伝子の置換用ベクターの構築
以下のようにして、上記で造成したNSHΔaroE3ΔgenH株のnagIKL遺伝子オペロン領域をrhcR遺伝子と置換することにより、nagIプロモーターの制御下でrhcR遺伝子を発現する菌株を造成した。【０２１３】
nagIKL遺伝子オペロン領域の５’フランキング領域（相補鎖塩基番号3,199,996〜3,200,904）を増幅させるために２種類のDNAプライマー（配列番号１２９と配列番号１３０）を合成した。なお、配列番号１２９のプライマーには制限酵素SbfI部位を導入した。NSH株の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法によりnagIKL遺伝子オペロン領域の５’フランキング領域を増幅した。次に、nagIKL遺伝子オペロン領域の３’フランキング領域（相補鎖塩基番号3,196,321〜3,197,306）を増幅させるために２種類のDNAプライマー（配列番号１３１と配列番号１３２）を合成した。なお、配列番号１３２のプライマーには制限酵素SalI部位を導入した。【０２１４】
またrhcR遺伝子を増幅するために配列番号１３３と配列番号１３４のDNAプライマーを合成した。nagIKL遺伝子オペロン領域の５’フランキング領域、rhcR遺伝子を増幅したDNA断片を鋳型として、DNAプライマー(配列番号１３３と配列番号１３４)を用い、オーバーラップPCR法による増幅反応を行った。また３’フランキング領域、rhcR遺伝子を増幅したDNA断片を鋳型として、DNAプライマー(配列番号１３２と配列番号１３３)を用い、オーバーラップPCR法で増幅した。それぞれ増幅したDNA断片をSbfIとAvrIIおよびAvrII とSalIで消化し、プラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）のマルチクローニングサイト内の制限酵素部位SbfI-SalI間に導入し、プラスミドpHKPsacB＿Pnag-rhcRを得た。【０２１５】
２．nagIプロモーターの制御下でrhcR遺伝子を発現する菌株の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドpHKPsacB＿Pnag-rhcRを菌株NSHΔaroE3ΔgenH＿rhcE3に導入し、カナマイシン耐性で選択することによりNSHΔaroE3ΔgenH＿rhcE3＿Km株を取得した。配列番号１３５と配列番号１３６のDNAプライマーと、配列番号１２９と配列番号１３２のプライマーとsacB遺伝子確認用プライマー（配列番号３と４）を用いるPCR法によりNSHΔaroE3ΔgenH＿rhcE3＿Km株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、NSHΔaroE3ΔgenH＿rhcE3＿Km株はプラスミドpHKPsacB＿Pnag-rhcRがnagIKL遺伝子オペロン領域に導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０２１６】
NSHΔaroE3ΔgenH＿rhcE3株の1回交差型相同組換え体を1 mLのLB液体培地中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養することにより、Pnag-rhcR株を得た。配列番号１３５と配列番号１３６のプライマーを用いるPCR法により、Pnag-rhcR株のnagIKL遺伝子領域がrhcR遺伝子に置換しており、予想通り２回交差型相同組換え体であることを確認した。【０２１７】
参考例１７．nagIプロモーターの制御下でqsuB遺伝子とrhcR遺伝子を発現するプロトカテク酸生産菌Pnag-qsuB-rhcR株の造成
qsuB遺伝子をPnag-rhcR株のnagIプロモーター制御下に導入した菌株を以下のようにして造成した。【０２１８】
１．qsuB遺伝子をnagIプロモーターの下流に導入するためのプラスミドの構築
qsuB遺伝子導入領域の５’フランキング領域（塩基番号3,199,996〜3,200,904）を増幅させるために２種類のDNAプライマー（配列番号１３７と１３８）を合成し、またqsuB遺伝子導入領域の３’フランキング領域（塩基番号3,198,925〜3,199,995 この領域はrhcR遺伝子に置換されている）を増幅するために２種類のDNAプライマー（配列番号１３９と１４０）を合成した。なお、配列番号１３７と１４０のプライマーはそれぞれ制限酵素SbfI部位とSphI部位を持つ。Pnag-rhcR株（参考例１６）の染色体DNAを鋳型にして、これらのプライマーを用いるPCR法によりqsuB遺伝子導入領域の５’フランキング領域と３’フランキング領域を増幅した。また、qsuB遺伝子を増幅するために２種類のDNAプライマー（配列番号１４１と１４２）を合成し、HT23株(参考例３)の染色体DNAを鋳型にしてこれらプライマーを用いるPCR法によりqsuB遺伝子領域を増幅した。このようにして得られたqsuB遺伝子導入領域の５’フランキング領域の増幅DNAとqsuB遺伝子領域の増幅DNAの混合物を鋳型として、配列番号１３７と１４２のプライマーを用いるオーバーラップPCR法により増幅反応を行った後、制限酵素 SbfIとXhoIによる消化により、配列番号１３７のプライマー内のSbfI部位とqsuB遺伝子内部のXhoI部位で切断されたDNA断片を得た。また、qsuB遺伝子領域の増幅DNA とqsuB遺伝子導入領域の３’フランキング領域の増幅DNAの混合物を鋳型として、配列番号１４０と１４１のプライマーを用いたオーバーラップPCR法により増幅反応を行った後、制限酵素XhoIとSphIによる消化により、qsuB遺伝子内部のXhoI部位と配列番号１４０のプライマー内のSphI部位で切断されたDNA断片を得た。これら２種類のDNA断片をプラスミドpHKPsacB1（参考例２参照）のマルチクローニングサイト内にあるSbfI部位とSphI部位の間に導入し、プラスミドpHKPsacB＿Pnag-qsuB-rhcRを得た。【０２１９】
２． nagIプロモーターの制御下でqsuB遺伝子とrhcR遺伝子を発現する菌株の造成
エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドpHKPsacB＿Pnag-qsuB-rhcRをPnag-rhcR株に導入してカナマイシン耐性となったPnag-rhcR株＿Km株を取得した。続いて、Pnag-rhcR株＿Km株をPCR法により解析するために、qsuB遺伝子導入領域の５’フランキング領域の上流の配列に一致するプライマー（配列番号１４３）と３’フランキング領域の下流の配列に一致するプライマー（配列番号１４４）を合成した後、配列番号１３７と１４０のプライマーを用いるPCR法によって解析した。いずれのプライマーセットを用いたPCR法による解析でも、予想通りの結果が得られたことから、Pnag-rhcR株＿Km株はプラスミドpHKPsacB＿Pnag-qsuB-rhcRがnagIプロモーターの下流に導入された1回交差型相同組換え体であることを確認した。【０２２０】
Pnag-rhcR株＿Km株を1 mLのLB液体培地中で24時間培養し、培養液の一部を10％スクロース含有LB寒天培地上で塗抹培養することにより、Pnag-qsuB-rhcR株を得た。配列番号１４３と１４４のプライマーを用いるPCR法により、qsuB遺伝子がnagIプロモーターの下流に導入された２回交差型相同組換え体であることを確認した。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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