(57)【要約】本発明は、レニン・アンジオテンシン系（ＲＡＳ）における新たな構成要素を見出し、これを循環器疾患または腎臓疾患の新たなバイオマーカーとして提供することを課題とする。  本発明によれば、配列番号１に示すアミノ酸配列または配列番号１に示すアミノ酸配列において１４位のアスパラギン残基を除く１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列の１４位のアスパラギン残基にＮ−結合型糖鎖が付加されていることを特徴とする、レニン・アンジオテンシン系に関与する新規ペプチドが提供される。本ペプチドをバイオマーカーとすることにより、腎臓疾患または循環器疾患を被験者に負担をかけることなく、早期かつ簡便に診断できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列または配列番号１に示すアミノ酸配列において１４位のアスパラギン残基を除く１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列の１４位のアスパラギン残基にＮ−結合型糖鎖が付加されていることを特徴とする、ペプチド。
【請求項２】
Ｎ−結合型糖鎖が非還元末端にシアル酸が結合していてもよい糖鎖であって、該糖鎖を構成する糖としてガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびマンノースを含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｎ−結合型糖鎖が下記式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）のいずれかに示される構造を有する、請求項１または２に記載のペプチド。
2014073708.tif 000006
（上記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）中、Ｇａｌはガラクトース、Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を示す。）
【請求項４】
配列番号１に示すアミノ酸配列または配列番号１に示すアミノ酸配列において１４位のアスパラギン残基を除く１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列の１８位のシステイン残基にジスルフィド結合を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項５】
腎臓疾患または循環器疾患の診断用マーカーである、請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド。
【請求項６】
キマーゼの基質となる、請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７】
被験体より採取した生体試料における請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドの量を測定することを含む、腎臓疾患または循環器疾患の診断のための検査方法。
【請求項８】
治療前後に被験体から採取した生体試料における請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドの量の変化を調べることを特徴とする、腎臓疾患または循環器疾患の治療効果の判定方法。
【請求項９】
生体試料が尿である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
被験物質を哺乳動物由来の糸球体上皮細胞に接触させるか、または、被験物質を非ヒト哺乳動物に投与し、前記細胞または尿における請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドの量を測定し、その変化を調べることを特徴とする、腎臓疾患または循環器疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１１】
ペプチドの量の測定が、該ペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫学的測定法により行われる、請求項７〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体を含有する、腎臓疾患または循環器疾患の診断薬。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体を含有する、腎臓疾患または循環器疾患の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レニン・アンジオテンシン系に関与する新規なペプチド、ならびに該ペプチドの腎臓疾患または循環器疾患の診断などの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
レニン・アンジオテンシン系（Ｒｅｎｉｎ−Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：ＲＡＳ）は、血圧および体液バランスにおいて重要な役割を果たしており、腎臓疾患または循環器疾患の発症や進展に深く関与している。高齢化社会を迎え、これらの疾患の患者数は年々増加している。そのためＲＡＳを抑制する薬剤（アンジオテンシン受容体拮抗薬、アンジオテンシン変換酵素阻害薬等）や生化学検査によるＲＡＳの評価は、現在の腎臓疾患または循環器疾患の治療・診断に欠かせないものとなっている。
循環血中のＲＡＳの機序は次の通りである。まず、主に肝臓で合成される４５２個のアミノ酸からなるアンジオテンシノーゲンが、腎臓から分泌されるレニンによって、アンジオテンシノーゲンのＮ末端に存在する１０個のアミノ酸からなるアンジオテンシンＩ（ＡｎｇＩ）に変換される。続いて、アンジオテンシンＩ（ＡｎｇＩ）は肺毛細血管に存在するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によってアンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）に変換される。このアンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）は、その受容体であるアンジオテンシンＩＩ受容体に結合することによって血管の収縮、アルドテスロンの分泌、ナトリウムの再吸収を促し、血圧上昇を惹起する。
ＲＡＳは、これまで上記のような昇圧システムとして血中での作用が着目されてきたが、近年では、局所組織で生成される組織ＲＡＳの存在が指摘され、レニン非依存的なアンジオテンシン産生経路も示唆されている。組織ＲＡＳは、血中ＲＡＳとは独立して、血圧調節だけではなく、各種臓器障害に関与することがわかってきている。このように、生体内のアンジオテンシン産生経路に関しては諸説あり、その生成機構や役割に関しては未だに不明な点が多いのが現状である。よって、非レニン依存性のアンジオテンシンＩＩ産生経路が明確になれば新たな医薬品開発の可能性が期待される。
発明者らは、これまでに、ラットの組織（小腸）からプロアンジオテンシン−１２を発見した。プロアンジオテンシン−１２は、アンジオテンシンＩよりもＣ末側に２アミノ酸長い１２アミノ酸（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ）からなり、ラットのアンジオテンシノーゲン（１−１２）に相当するペプチドである。また、ヒトのアンジオテンシノーゲン（１−１２）に相当するポリペプチドがヒトの組織（胎盤）にも存在することを証明している（特許文献１）。また、最近では、アンジオテンシンＩＩ由来のペプチドであるアンジオテンシン（１−７）、アンジオテンシンＩＩＩ、アンジオテンシンＩＶの報告もある（非特許文献１、２）。
これまで、上記のＲＡＳが関わる生体内における作用に基づき、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ、レニン等のＲＡＳの構成要素やアンジオテンシンＩＩで産生が促進されるアルドステロンなどが、循環器疾患や高血圧による臓器障害のバイオマーカーとして用いられている。ＲＡＳの新たな構成要素が発見されれば、上記疾患や障害の新たなバイオマーカーとなることが強く期待できる。一方、腎障害のバイオマーカーとしては、尿中のアルブミンがよく使用されている。また近年、尿中のアンジオテンシノーゲンが、腎症や高血圧、食塩負荷などで上昇することが報告されており、腎障害における新しいバイオマーカーとして期待されている。しかしながら、アルブミンの分子量は６６，０００、アンジオテンシノーゲンの分子量は約５０，０００と大きく、尿中に排泄される場合は、糸球体障害がかなり亢進しており、腎障害の早期発見のバイオマーカーが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−００７４８２
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８４（１９７４）９９４−９９６
【非特許文献２】Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６８（１９９５）Ｌ３０２−３０８
【発明の概要】
【０００５】
上記のように腎臓疾患または循環器疾患の発症に関連するレニン・アンジオテンシン系（ＲＡＳ）の新たな構成要素またはアンジオテンシンの新たな産生経路が発見されれば、新たな医薬品開発の可能性が大きく広がる。
従って、本発明は、ＲＡＳにおける新たな構成要素を見出し、これを腎臓疾患または循環器疾患の新たなバイオマーカーとして提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために、アンジオテンシノーゲンのＮ末端付近を特異的に認識するラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を利用して生体内のＲＡＳにおける新たな構成要素を探索したところ、ヒト尿中に新規なペプチドが存在していることを見出した。この新規ペプチドは、Ｎ末側にアンジオテンシンＩＩを有し、Ｎ型糖鎖とシステイン（Ｃｙｓ）が付加した２５個のアミノ酸からなる特徴的な構造をもつこと、また、糸球体上皮細胞（ポドサイト）に特異的に局在していること、糖尿病に伴う腎障害患者の尿においてその濃度が上昇していること、尿中当該ペプチドのクレアチニンに対する比が尿蛋白や糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）と正の相関があることを明らかにした。この新規ペプチドは、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩに関連するペプチドであると考えられたため、ビッグアンジオテンシン−２５（Ｂｉｇ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−２５（ＢＡｎｇ−２５））と命名した。
本発明者らはまた、ＢＡｎｇ−２５に付加している糖鎖の有無・種類を変化させ、レニンまたはキマーゼに対する作用を調べたところ、ＢＡｎｇ−２５は、レニンの基質にはならず、キマーゼの特異的な基質となることが確認され、ＢＡｎｇ−２５は非レニン依存性のアンジオテンシンＩＩ産生経路に関与する新規物質であるという知見を得た。さらに、ＢＡｎｇ−２５は腎臓のみならず、心臓、血管、神経・内分泌組織、生殖組織にも高濃度に存在することを確認し、腎臓・循環器疾患、神経・内分泌疾患、生殖疾患の新たな標的分子になりうるという知見を得た。
本発明はかかる知見により完成されたものである。
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列または配列番号１に示すアミノ酸配列において１４位のアスパラギン残基を除く１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列の１４位のアスパラギン残基にＮ−結合型糖鎖が付加されていることを特徴とする、ペプチド。
（２）Ｎ−結合型糖鎖が非還元末端にシアル酸が結合していてもよい糖鎖であって、該糖鎖を構成する糖としてガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびマンノースを含む、（１）に記載のペプチド。
（３）Ｎ−結合型糖鎖が下記式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）のいずれかに示される構造を有する、（１）または（２）に記載のペプチド。
2014073708.tif 000002
（上記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）中、Ｇａｌはガラクトース、Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を示す。）
（４）配列番号１に示すアミノ酸配列または配列番号１に示すアミノ酸配列において１４位のアスパラギン残基を除く１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列の１８位のシステイン残基にジスルフィド結合を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチド。
（５）腎臓疾患または循環器疾患の診断用マーカーである、（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド。
（６）キマーゼの基質となる、（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド。
（７）被験体より採取した生体試料における（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドの量を測定することを含む、腎臓疾患または循環器疾患の診断のための検査方法。
（８）治療前後に被験体から採取した生体試料における（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドの量の変化を調べることを特徴とする、腎臓疾患または循環器疾患の治療効果の判定方法。
（９）生体試料が尿である、（７）または（８）に記載の方法。
（１０）被験物質を哺乳動物由来の糸球体上皮細胞に接触させるか、または、被験物質を非ヒト哺乳動物に投与し、前記細胞または尿における（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドの量を測定し、その変化を調べることを特徴とする、腎臓疾患または循環器疾患の治療薬のスクリーニング方法。
（１１）ペプチドの量の測定が、該ペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫学的測定法により行われる、（７）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
（１３）（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体を含有する、腎臓疾患または循環器疾患の診断薬。
（１４）（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体を含有する、腎臓疾患または循環器疾患の診断用キット。
本願は、２０１２年１１月６日に出願された日本国特許出願２０１２−２４４７５２号、および２０１３年２月２２日に出願された日本国特許出願２０１３−０３３６５１号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。
発明の効果
本発明によれば、非レニン依存性のアンジオテンシンＩＩ産生経路に関与する新規なペプチドであるビッグアンジオテンシン−２５（ＢＡｎｇ−２５）が提供される。ＢＡｎｇ−２５は、腎組織（特に、ポドサイト）に局在しており、また、蛋白尿を伴う糖尿病患者の尿中濃度が有意に上昇していることから、腎障害や糖尿病性腎症のバイオマーカーとして有用である。従って、ＢＡｎｇ−２５を利用することにより、被験者に負担をかけることなく、腎臓疾患や循環器疾患を早期かつ簡便に診断することが可能であり、また、前記疾患患者の治療効果の確認や経過観察、新たな治療薬のスクリーニングにも利用できる。また、ＢＡｎｇ−２５は腎臓・心臓などの臓器に加え、副腎髄質や膵臓のランゲルハンス氏島、腸管の神経叢などの神経・内分泌組織、胎盤や精巣などの生殖組織にも高濃度存在することから、腎臓疾患や心臓等循環器の疾患以外にも、神経・内分泌・生殖疾患の新たな標的分子になる可能性がある。
さらに、ＢＡｎｇ−２５に付加した糖鎖構造はレニン抵抗性およびキマーゼとの反応性を有し、アンジオテンシン産生を制御することができることから、糖鎖修飾は、アンジオテンシンの産生を調整する新たな手段となる。また、近年アンジオテンシンやアンジオテンシン受容体に対するワクチン療法も試みられていることから、ＢＡｎｇ−２５をＲＡＳワクチンとして利用することにより腎保護や降圧効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１Ａは、ヒト尿をゲル濾過し、各画分の免疫活性Ｎ−末端ＡｎｇＩＩをラジオイムノアッセイで測定した結果を示す（矢印：免疫活性Ｎ−末端ＡｎｇＩＩ含有画分を示す）。図１Ｂは、免疫活性画分のＲＰ−ＨＰＬＣによる最終精製を示す。図１Ｃは、四重極飛行時間型質量分析装置による精製ペプチドの構造解析を示す。図１Ｄは、プロテインシーケンサーによる精製ペプチドのアミノ酸解析を示す。
図２Ａは、精製ペプチドに含まれるＮ型糖鎖の一次構造解析を示す。図２Ｂは、精製ペプチドに含まれるＮ型糖鎖の二次構造解析を示す。図２Ｃは、精製ペプチド（ビッグアンジオテンシン−２５）の構造を示す（２５個のアミノ酸からなり、１４番目のＡｓｎにＮ型糖鎖、１８番目のアミノ酸にＣｙｓが付加している）。
図３は、ビッグアンジオテンシン−２５（糖鎖あり；ＢＡｎｇ−２５）、ビッグアンジオテンシン−２５（糖鎖なし；Ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｃｈａｉｎ  ＢＡｎｇ−２５）、ビッグアンジオテンシン−２５（ＧｌｃＮＡｃ置換；ＢＡｎｇ−２５＋ＧｌｃＮＡｃ）の構造を示す。
図４Ａ、Ｂは、ビッグアンジオテンシン−２５（糖鎖あり；ＢＡｎｇ−２５）に対するレニンの反応性をＨＰＬＣで解析した結果を示す（図４Ａ：レニンなし、図４Ｂ：１００Ｕレニン）。図４Ｃ、Ｄは、ビッグアンジオテンシン−２５（糖鎖なし；Ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｃｈａｉｎ  ＢＡｎｇ−２５）に対するレニンの反応性をＨＰＬＣで解析した結果を示す（図４Ｃ：レニンなし、図４Ｄ：１００Ｕレニン）。図４Ｅ、Ｆは、ビッグアンジオテンシン−２５（ＧｌｃＮＡｃ置換；ＢＡｎｇ−２５＋ＧｌｃＮＡｃ）に対するレニンの反応性をＨＰＬＣで解析した結果を示す（図４Ｅ：レニンなし、図４Ｆ：１００Ｕレニン）。
図５は、ビッグアンジオテンシン−２５（糖鎖なし；Ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｃｈａｉｎ  ＢＡｎｇ−２５）とビッグアンジオテンシン−２５（糖鎖あり；ＢＡｎｇ−２５）をレニン２０Ｕで２４時間反応後のＡｎｇＩ生成量を示す（黒丸：Ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｃｈａｉｎ  ＢＡｎｇ−２５、白丸：ＢＡｎｇ−２５）。
図６Ａ、Ｂは、ビッグアンジオテンシン−２５（糖鎖あり；ＢＡｎｇ−２５）に対するキマーゼの反応性をＨＰＬＣで解析した結果を示す（図６Ａ：キマーゼなし、図６Ｂ：４３．４ｍＵキマーゼ）。図６Ｃ、Ｄは、ビッグアンジオテンシン−２５（糖鎖なし；Ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｃｈａｉｎ  ＢＡｎｇ−２５）に対するキマーゼの反応性をＨＰＬＣで解析した結果を示す（図６Ｃ：キマーゼなし、図６Ｄ：４３．４ｍＵキマーゼ）。図６Ｅ、Ｆは、ビッグアンジオテンシン−２５（ＧｌｃＮＡｃ置換；ＢＡｎｇ−２５＋ＧｌｃＮＡｃ）に対するキマーゼの反応性をＨＰＬＣで解析した結果を示す（図６Ｅ：キマーゼなし、図６Ｆ：４３．４ｍＵキマーゼ）。
図７は、ビッグアンジオテンシン−２５（糖鎖あり；ＢＡｎｇ−２５）、ビッグアンジオテンシン−２５（糖鎖なし；Ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｃｈａｉｎ  ＢＡｎｇ−２５）、ビッグアンジオテンシン−２５（ＧｌｃＮＡｃ置換；ＢＡｎｇ−２５＋ＧｌｃＮＡｃ）をキマーゼ２０Ｕで２４時間反応後のＡｎｇＩＩ生成量を示す（菱形：ＢＡｎｇ−２５、四角：Ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｃｈａｉｎ  ＢＡｎｇ−２５、三角：ＢＡｎｇ−２５＋ＧｌｃＮＡｃ）。
図８Ａは腎におけるビッグアンジオテンシン−２５の免疫染色を示す（左：バー１００μｍ、右：バー５０μｍ）。図８Ｂは、ビッグアンジオテンシン−２５／尿中クレアチニン比（ＢＡｎｇ−２５／ＵＣｒｅ）と糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）の関係を示す。図８Ｃは、ビッグアンジオテンシン−２５／尿中クレアチニン比（ＢＡｎｇ−２５／ＵＣｒｅ）と糖尿病患者の蛋白尿との関係を示す（Ｕｐｒｏ（−）：蛋白尿陰性、Ｕｐｒｏ（＋）：蛋白尿陽性）。図８Ｄは、ビッグアンジオテンシン−２５／尿中クレアチニン比（ＢＡｎｇ−２５／ＵＣｒｅ）と尿蛋白（クレアチニン補正）の相関関係を示す。
図９は心臓（左心室）におけるビッグアンジオテンシン−２５の免疫染色を示す。
図１０は食道の重層扁平上皮（上のパネル）、食道の平滑筋細胞（下のパネル）におけるビッグアンジオテンシン−２５の免疫染色を示す。
図１１は副腎（上のパネル）、副腎髄質（下のパネル）におけるビッグアンジオテンシン−２５の免疫染色を示す。
図１２は膵臓ランゲルハンス氏島におけるビッグアンジオテンシン−２５の免疫染色を示す。
図１３は胃の胃腸内分泌細胞（上のパネル）、胃の粘膜下層神経線維（左下のパネル）、胃のアウエルバッハ神経叢（右下のパネル）におけるビッグアンジオテンシン−２５の免疫染色を示す。
図１４は大腸の胃腸内分泌細胞におけるビッグアンジオテンシン−２５の免疫染色を示す。
図１５は胎盤の絨毛膜（上のパネル）、胎盤の脱落膜（下のパネル）におけるビッグアンジオテンシン−２５の免疫染色を示す。
図１６は卵管におけるビッグアンジオテンシン−２５の免疫染色を示す。
図１７は精巣におけるビッグアンジオテンシン−２５の免疫染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
１．ビッグアンジオテンシン−２５（ＢＡｎｇ−２５）
本発明のレニン・アンジオテンシン系に関与する新規なペプチドであるビッグアンジオテンシン−２５（以下、単に「ＢＡｎｇ−２５」と記載する場合がある）は、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｎのアミノ酸配列（配列番号１）からなり、該アミノ酸配列の１４位のアスパラギン残基にＮ−結合型糖鎖が付加された特徴的な構造を有する。
本発明のＢＡｎｇ−２５は、配列番号１のアミノ酸配列の１８位のシステイン残基にジスルフィド結合を有していてもよい。典型的には、当該システイン残基に、システインがジスルフィド結合により付加される。このとき、配列番号１のアミノ酸配列の１８位はシスチン（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）である。
血中ではアンジオテンシノーゲンは速やかにレニンによりアンジオテンシンＩに変換される。これに対し、ＢＡｎｇ−２５（配列番号１に示すアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列の１４位のアスパラギン残基にＮ−結合型糖鎖が付加されたペプチド）は、後記実施例に示されるように、Ｎ−結合型糖鎖が付加しているとレニンが作用せず、アンジオテンシンＩが生成されないが、Ｎ−結合型糖鎖が付加されていないＢＡｎｇ−２５にはレニンが作用して速やかにアンジオテンシンＩが生成されるという興味深いレニンに対する酵素反応性を有する。また、ＢＡｎｇ−２５は、糖鎖の有無にかかわらず、キマーゼが作用し、アンジオテンシンＩＩが生成される。すなわち、ＢＡｎｇ−２５は、レニンの基質にはならず、キマーゼの特異的な基質となる。
従って、本発明のＢＡｎｇ−２５は、レニン抵抗性およびキマーゼとの反応性を有する限り、その改変ペプチドであってもよく、改変ペプチドとしては、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列において１４位のアスパラギン残基を除く１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。ここで、「１〜数個」の範囲は、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個（配列番号１に示すアミノ酸配列との相同性が少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上）をいう。本発明において「レニン抵抗性」とは、レニンとの反応性が全くないか、あるいは反応性に乏しいことをいう。すなわち、レニンにより対象物質（基質）からのアンジオテンシンＩ生成反応が全くないか、あるいはアンジオテンシンＩ生成反応速度が遅く生成反応が進行しにくいことを意味する。レニンと基質の反応速度は、酵素反応速度論のＫｍ値により評価することができ、Ｋｍ値が大きいほど反応性に乏しい。レニンの代表的な基質であるアンジオテンシノーゲンと対象物質のＫｍ値を比較し、対象物質のＫｍ値が５０倍以上、好ましくは８０倍程度以上大きければ、レニンとの反応性に乏しいとすることができる。
アミノ酸の欠失とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の中から、１４位のアスパラギンを除く任意のアミノ酸を選択して欠失させることをいう。また、アミノ酸の付加とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端側に、１〜数個のアミノを付加させることをいう。アミノ酸の置換としては、例えば保存的アミノ酸置換が挙げられる。保存的アミノ酸置換は、例えば構造的、電気的、極性もしくは疎水性などの性質が類似したアミノ酸間の置換を意味する。このような性質は、例えばアミノ酸側鎖の類似性で分類することも可能である。塩基性側鎖を有するアミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジンからなり、酸性側鎖を有するアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸からなり、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システインなどを含み、疎水性側鎖を有するアミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンなどを含み、分岐側鎖を有するアミノ酸はトレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシンからなり、ならびに、芳香族側鎖を有するアミノ酸は、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジンからなる。
本発明のペプチドにおけるＮ−結合型糖鎖は、非還元末端にシアル酸が結合していてもよい糖鎖であって、該糖鎖を構成する糖としてガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、およびマンノース（Ｍａｎ）を含み、その糖鎖修飾により配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチドにレニン抵抗性を付与する活性を有する限り、グルコース（Ｇｌｃ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、イズロン酸（ＩｄｏＡ）、キシロース（Ｘｙｌ）、ガラクツロン酸（ＧｌｃＡ）を含んでいてもよい。糖鎖が分岐する場合、分岐数は、典型的には二本であるが、三本以上であってもよい。
上記Ｎ−結合型糖鎖の好ましい例としては、下記式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）のいずれかに示されるＮ−結合型糖鎖が挙げられる。
2014073708.tif 000003
（上記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）中、Ｇａｌはガラクトース、Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を示す。）
本発明の上記Ｎ−結合型糖鎖が付加したペプチドの製造は、例えば、Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ法、Ｓｔｅｐｗｉｓｅ法、化学酵素−合成法（Ｃｈｅｍｏ−ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）などの公知の方法により行うことができる。Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ法は、糖鎖部分とペプチド部分をそれぞれ合成しておき、それらを縮合させて糖ペプチドを合成する方法である。Ｓｔｅｐｗｉｓｅ法は、糖アミノ酸（例えば、アスパラギンにＮ−アセチルグルコサミンが結合したグリコシルアスパラギン）を用いてペプチド固相合成を行い伸長させて糖ペプチドを合成する方法である。また、化学酵素−合成法（Ｃｈｅｍｏ−ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）は、Ｎ−アセチルグルコサミンを有する糖ペプチドを合成し、これを糖鎖受容体とし、天然の様々なＮ−結合型糖タンパク質を糖鎖供与体として用い、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅｎｄｏ−Ｍなど）によって糖鎖供与体から糖鎖転移反応により糖鎖を糖鎖受容体に転移付加し、糖ペプチドを合成する方法である。
さらに、本発明のＢＡｎｇ−２５は、必要に応じて塩の形態、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩の形態であってもよい。そのような塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）の塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）の塩等が挙げられる。
２．ビッグアンジオテンシン−２５（ＢＡｎｇ−２５）の診断用途
ビッグアンジオテンシン−２５（ＢＡｎｇ−２５）は、後記実施例に示すように、糸球体上皮細胞（ポドサイト）に特異的に局在し、蛋白尿を伴う糖尿病患者や重度腎障害者において尿中ＢＡｎｇ−２５濃度、尿中ＢＡｎｇ−２５／クレアチニン比が有意に上昇し、尿中ＢＡｎｇ−２５／クレアチニン比が尿蛋白や糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）と正の相関がある。従って、ＢＡｎｇ−２５は糖尿病性腎症などの腎臓疾患の診断用マーカーとして利用できる。また、ＢＡｎｇ−２５は、ＲＡＳ関連ペプチドであるから、アンジオテンシンＩ（ＡｎｇＩ）、アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）などの他のＲＡＳ関連ペプチドと同様に、高血圧症に起因する循環器疾患の診断用マーカーとなりうる。
よって、本発明によれば、被験体より採取した生体試料におけるＢＡｎｇ−２５の量を測定することを含む、腎臓疾患または循環器疾患の診断のための検査方法が提供される。
本発明において「被験体」は哺乳動物であれば限定されないが、ヒトが特に好ましい。ヒト以外の被験体としては、例えば、サル、チンパンジー等の非ヒト霊長類や、イヌ、ウシ、マウス、ラット、モルモット等の他の哺乳動物が挙げられる。
「生体試料」としては、前記ＢＡｎｇ−２５が存在する体液または組織であれば特に限定はされない。例えば、体液として尿、血液、汗、唾液、髄液、腹水、リンパ液等が、組織として腎臓、心臓、血管、脳、副腎、膵臓、卵巣、胎盤、精巣等に由来する組織、胃腸内分泌細胞、脂肪細胞が挙げられる。このうち、尿、血液、腎組織が好ましい。尿や血液は、被験体に負荷が少なく、生体試料として通常頻繁に用いられているため、尿や血液を用いることが特に好ましい。非侵襲的に生体試料を採取できる点において尿がさらに好ましい。
本発明の方法において「診断のための検査」とは、ＢＡｎｇ−２５の量の測定および必要により対照との比較すること、診断のためのデータを取得することをいう。ＢＡｎｇ−２５の量の測定は、標準サンプルとの比較などにより絶対量を測定してもよいが、必ずしもＢＡｎｇ−２５の絶対的な量を測定する必要はなく、対照サンプルにおけるＢＡｎｇ−２５の量との相対的な関係が明らかになれば十分である。
本発明において「診断」とは、典型的には、被験体が腎臓疾患や循環器疾患に罹患しているか否かの判定（狭義の診断）を意味するが、これには限定されず、該疾患の重症度の判定、該疾患に対する治療効果の判定、および治療後に該疾患を再発する危険性が存在するか否かの判定をも包含する概念（広義の診断）である。
本発明の方法により診断できる腎臓疾患としては、例えば、糖尿病性腎症、良性腎硬化症、巣状性糸球体硬化症、膜性腎症、微小変化型ネフローゼ症候群、膜性増殖性糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性腎炎、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎、急性腎炎、慢性腎炎（慢性糸球体腎炎）、急性腎不全、慢性腎不全、血尿、蛋白尿、電解質異常、悪性高血圧などが挙げられる。また、循環器疾患としては、高血圧症によって引き起こされる動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、不整脈、弁膜症、心不全、脳卒中などが挙げられる。
ＢＡｎｇ−２５の測定は、免疫学的測定方法、質量分析方法（ＬＣ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ等）などの公知の測定方法により行うことができる。
免疫学的測定方法により行う場合は、ＢＡｎｇ−２５に特異的に結合し得る抗体を用いて行う。ＢＡｎｇ−２５に特異的に結合する抗体は、ＢＡｎｇ−２５、又はＢＡｎｇ−２５の部分配列からなるペプチドを抗原として用い、常法により作成された抗体を好適に使用できる。ＢＡｎｇ−２５とＡｎｇ  Ｉ及びＡｎｇ  ＩＩとはＮ末端が共通していることから、ＢＡｎｇ−２５を抗原として誘導された抗体が、Ａｎｇ  Ｉ及びＡｎｇ  ＩＩにも結合性を示す可能性がある。その場合は、ＢＡｎｇ−２５のＣ末端を含む部分配列からなるペプチド（例えばＢＡｎｇ−２５の１８番目〜２５番目までのペプチド）を用いたアフィニティカラムによりＢＡｎｇ−２５特異的抗体を精製することが好ましい。また、ＢＡｎｇ−２５のＣ末端端を含む上記部分配列からなるペプチドを抗原として用いることにより、ＢＡｎｇ−２５特異的抗体を調製することもできる。
抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。また抗体はＢＡｎｇ−２５に特異的に結合し得る限り断片として使用することもできる。抗体の断片としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）等が挙げられる。
モノクローナル抗体は例えば次の手順で作製することができる。
上記の抗原を、動物に対して、抗原の投与により抗体産生が可能な部位に、それ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。用いられる動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどの哺乳動物が挙げられるが、マウスが好ましい。抗血清中の抗体価の測定は常法により行うことができる。
抗原を免疫された動物から抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。融合操作は既知の方法、例えば、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）記載の方法に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが挙げられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様の、例えば塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡまたはプロテインＧなどを用いた特異的精製法による免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
一方、ポリクローナル抗体は例えば次の手順で作製することができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、抗原とキャリアとの複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物からＢＡｎｇ−２５に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。ポリクローナル抗体の作製に使用する抗原はモノクローナル抗体の作製におけるのと同様である。抗原とキャリアとの複合体を形成する際に、キャリアの種類および抗原とキャリアとの混合比は、キャリアに架橋させた抗原に対して抗体が効率よくできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよい。キャリアとしては、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等が用いられる。また、抗原とキャリアのカップリングには、種々の縮合剤を用いることができ、具体的にはグルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
抗原とキャリアとの複合体は、免疫される動物に対して、抗体産生が可能な部位に、それ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。用いられる動物としては、モノクローナル抗体作製の場合と同様の哺乳動物が挙げられる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の手順で行なうことができる。
本発明の抗体は検出のために適宜標識していてもよい。標識物質は、酵素、放射性同位体、蛍光色素を使用することができる。また、抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインＡやプロテインＧを標識して間接的に検出することもできる。
本発明の抗体を用いるＢＡｎｇ−２５の量の免疫学的測定法としては、特に制限はなく、従来公知の方法、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、ラテックス凝集法、免疫クロマトグラフィー法、ウエスタンブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、抗原抗体複合体形成に伴う濁度を測定する比濁法、抗体固相膜電極を利用し抗原との結合による電位変化を検出する酵素センサー電極法、免疫電気泳動法などを採用することができる。これらの中でもＥＩＡ法またはウエスタンブロット法が好ましい。なお、ＥＩＡ法には、競合的酵素免疫測定法や、サンドイッチ酵素結合免疫固相測定法（サンドイッチＥＬＩＳＡ法）等が包含される。
例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法の場合は、上記のＢＡｎｇ−２５に特異的に結合する抗体を固相に結合させ、これに被験体から採取した生体試料、好ましくは尿を加えて反応させ、固相を洗浄した後、アルカリホスファターゼやパーオキシダーゼなどの酵素で標識されたヒト免疫グロブリンに対する二次抗体を加えて反応させ、前記酵素に応じた基質（発色剤）を添加し、生じた発色を、分光光度計、蛍光光度計などを用いて反応液の吸光度を測定することにより生体試料中のＢＡｎｇ−２５を定量することができる。固相としては、例えばポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、フッ素樹脂、ガラス、金属などが使用できる。担体の形状としては、プレート、ビーズ、セル、試験管などが挙げられる。好ましくは、エンザイムイムノアッセイ用のマイクロタイタープレート（９６穴マイクロタイタープレート）などの市販の固相を使用すればよい。
上記のような方法にて測定したＢＡｎｇ−２５の量を用いて被験体の腎臓疾患または循環器疾患の診断を行う場合、基準値との比較により行うことが好ましい。例えば、疾患の有無の判定を行なう場合は、健常体から採取した生体試料におけるＢＡｎｇ−２５の量を基準値とすることができる。また、治療の効果の判定の際には、治療前の被験体から採取した生体試料におけるＢＡｎｇ−２５の量を基準値とすることもできる。本発明では、比較対象となるこれらの検体を「対照」と称する。
対照との比較において診断する場合、被験体から採取した生体試料におけるＢＡｎｇ−２５の量が、対照のＢＡｎｇ−２５量と比較して有意に多いときに、被験体が腎臓疾患や循環器疾患に罹患している、あるいは対照と比較してより重度の腎臓疾患や循環器疾患であると判断される。
より典型的な例では、尿を用いて被験体が腎臓疾患または循環器疾患に罹患しているか否かを判定する場合は、被験体から採取した尿サンプル中のＢＡｎｇ−２５の量を測定し、当該量と、対照として健常体から採取した尿サンプル中のＢＡｎｇ−２５の量とを対比し、前者が後者より有意に多いときに、該被験体が腎臓疾患または循環器疾患に罹患している可能性が高いと診断することができる。また、腎臓疾患または循環器疾患に対する治療効果を判定する場合は、対照として治療前の被験体から採取した尿サンプルを用い、治療後の当該被験体から採取した尿サンプル中のＢＡｎｇ−２５の量が対照（すなわち、治療前）よりも有意に減少していれば、治療効果があったと判定することができる。この場合、対照の尿サンプル中のＢＡｎｇ−２５の量の測定は、被験体の尿サンプル中のＢＡｎｇ−２５の測定と同様の手順で行うことができる。対照の尿サンプル中のＢＡｎｇ−２５の量は、被験体の尿の測定のたびに測定してもよいし、事前に測定しておいてもよい。また、診断または判定に際しては、尿サンプル中のＢＡｎｇ−２５量と尿クレアチニン量との比を指標としてもよい。血液等を生体試料とする場合にも、上記の尿の場合と同様の手法によることができる。
３．腎臓疾患または循環器疾患の治療薬のスクリーニング方法
本発明はまた、腎臓疾患または循環器疾患の治療薬をスクリーニングする方法に関する。
本発明のスクリーニング方法は、被験物質を哺乳動物由来の糸球体上皮細胞に接触させるか、または、被験物質を非ヒト哺乳動物に投与し、前記細胞、尿または血液におけるＢＡｎｇ−２５の量を測定し、その変化を調べることにより行なう。被験物質が、ＢＡｎｇ−２５の量を減少させる場合には当該被験物質は腎臓疾患または循環器疾患の治療薬の候補となりうる。
被験物質を接触させる細胞は、糸球体上皮細胞のほか、心筋細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、メサンギウム細胞、近位尿細管上皮細胞、線維芽細胞、免疫細胞、間質細胞等の腎臓、心臓、血管に由来する細胞を使用することが望ましい。このほかにも、アンジオテンシノーゲンを産生する臓器である、脳、副腎、卵巣等に由来する細胞や脂肪細胞を用いることも可能である。細胞は、ヒト、非ヒト哺乳動物のいずれに由来するものであってもよい。
被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する場合、腎障害または高血圧症のモデル動物（例えば、ポドサイト障害誘発モデルマウス（ＮＥＰ２５マウス）、ＨＩＧＡマウス、高血圧自然発症（ＳＨＲ）ラット、Ｄａｈ１食塩感受性ラット、ＳＨＲＳＰ脳卒中易発症ラット、つくば高血圧マウス、遺伝性ネフローゼＩＣＧＮマウス等を使用することが好ましい。
本発明のスクリーニング方法の対象となる被験物質の種類は特に限定されない。例えば、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品；天然に生じる分子（例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、ステロイド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど）；あるいは天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体（例えば、ペプチド擬態物など）；及び天然に生じない分子（例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作成した低分子有機化合物）；ならびにそれらの混合物などを挙げることができる。また、被験物質としては単一の被験物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験物質を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー、ペプチドライブラリーなどが挙げられる。
４．腎臓疾患または循環器疾患の診断薬および診断用キット
本発明はまた、ＢＡｎｇ−２５に特異的に結合する抗体を含有する、腎臓疾患または循環器疾患の診断薬に関する。
本発明の診断薬は、必要な試薬とともにキット化することもできる。例えばキットには、前記のＢＡｎｇ−２５に特異的に結合する抗体、標識化された二次抗体、検出のための試薬等の必要な構成要素が含まれ得る。キットにはさらに、標準試料、緩衝液、溶解液、洗浄液、反応停止液、使用説明書が含まれていてもよい。
また、ＢＡｎｇ−２５に特異的に結合する抗体はチップ上に高密度に貼り付けてプロテインチップとしてよく、このようなプロテインチップも本発明の診断薬に包含される。
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものでない。
【実施例１】
【０００８】
１．実験方法
（１）精製方法
３名の健常者から５．５Ｌの尿を採取した。次にこの尿をＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジにアプライし、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有６０％アセトニトリルで溶出した。溶出サンプルを、０．１Ｍ  ＮＨ４ＣＯＯＨ（ｐＨ４．０）で溶出したＣＭ  ５２カラムにアプライし、そしてＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−５０を用いたゲルろ過に供した。ペプチド抽出物を、ジフェニルカラムを使用した逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、および、抗−Ｎ末端Ａｎｇ  ＩＩ抗血清を用いて調製したアフィニティカラム（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  １０  Ａｃｔｉｖｅ  Ｅｓｔｅｒ  Ａｇａｒｏｓｅ；Ｂｉｏ  Ｒａｄ製）に供した。最後に、精製したペプチドをＯＤＳ−１２０Ａカラムを用いるＲＰ−ＨＰＬＣに供した（溶出グラジエント：０．１％トリフルオロ酢酸に溶解した１０％〜６０％のアセトニトリルの直線勾配を１ｍｌ／ｍｉｎの流出速度で６０分間）。
これらの精製ステップは既報（Ｓ．Ｎａｇａｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−１２，ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｎｉｎ−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３５０（２００６）１０２６−１０３１．）に記載のとおり、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて免疫反応性Ｎ末端Ａｎｇ  ＩＩをモニタリングしながら行なった。
（２）構造決定
精製したペプチドのアミノ酸配列及び分子量を決定するために、タンデム質量分析を、ＱＳＴＡＲ  Ｅｌｉｔｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ，米国）を用いるポジティブエレクトロスプレーイオン化法およびＰｒｏｃｉｓｅ  ４９４  ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，米国）を用いて実施した。試料を０．１％ギ酸含有５０％アセトリニリル溶液に溶解した。糖鎖を決定するための酵素的除去、蛍光標識、Ｎ−グリカンの分離および構造同定のための条件は、既報（Ｈ．Ｎａｋａｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌ  ａｎｄ  ｓｉａｌｙｌ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｒｅｅ  ｋｉｎｄｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２６（１９９５）１３０−１３８．；Ｈ．Ｙａｇｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｕｌｆａｔｅｄ  Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５（２００５）１０５１−１０６０．）に従った。すなわち、脱脂した抽出物をペプシンとグリコアミダーゼＡを用いてタンパク分解し、得られたペプチドをさらにプロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）で処理してアミノ酸にした。Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２クロマトグラフィーによる精製後、脱離したＮ−グリカンの還元末端を蛍光２−アミノピリジンで標識化した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５クロマトグラフィーによって過剰な試薬を除去した後、ピリミジルアミノ（ＰＡ）−グリカンをＴＳＫ−ｇｅｌ  ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ（ＤＥＡＥ）−５ＰＷカラム（東ソー；東京、日本）を用いて電荷に基づいて分離した。各分離画分をさらに疎水性に基づいて分離するためのＳｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＨＲＣ  ｏｃｔａｄｅｃｙｌ  ｓｉｌｉｃａ（ＯＤＳ）ｃｏｌｕｍｎ（島津製作所；京都、日本）にアプライし、各ピークの溶出時間を糖単位（ＧＵ）値と表した。各ＰＡ−グリカン画分の分子量はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって解析した。２種のグリカンを含む画分をＴＳＫ−ｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０  ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｏｓｏｈ）によって分子量サイズに従ってさらにサブフラクション化し、そして溶出位置をＧＵ値において算出した。ＰＡ−グリカン試料をそれらのＧＵおよび分子量値に基づいてマッピングし、そして、それらの座標をＧＡＬＡＸＹデータベース上の参照ＰＡ−グリカンのそれらと比較した。
（３）ビッグアンジオテンシン−２５の変換
（３−１）レニン（Ｒｅｎｉｎ）反応性の検討
（２）で構造決定したペプチドに相当するビッグアンジオテンシン−２５（ＢＡｎｇ−２５）、ビッグアンジオテンシン−２５からＮ−型糖鎖を除いたビッグアンジオテンシン−２５（Ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｃｈａｉｎ  ＢＡｎｇ−２５）、およびビッグアンジオテンシン−２５のＮ−型糖鎖をＧｌｕｃＮＡｃに置換したビッグアンジオテンシン−２５（ＢＡｎｇ−２５＋ＧｌｃＮＡｃ）の３種のペプチドを合成した。
上記３種のペプチドの各々１０μｇを、組換えヒトレニン（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｉｎｃ．，米国）（１００Ｕ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした。インキュベーションは１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２００μＬ中で、３７℃にて１時間行なった。各反応産物の半量（５μｇ）を前述したグラジエントを用いるＲＰ−ＨＰＬＣに供した。
（３−２）キマーゼ（Ｃｈｙｍａｓｅ）反応性の検討
上記３種のペプチドの各々１０μｇを、ヒト皮膚マストセル由来キマーゼ（ＥＬＡＳＴＩＮ  ＰＲＯＤＵＴＳ  ＣＯＭＰＡＮＹ，ＩＮＣ．，米国）４３．４ｍＵとｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした。インキュベーションは３Ｍ  ＮａＣｌを含む６００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２００μＬ中で、２５℃にて１時間行なった。各反応産物の半量（５μｇ）をＲＰ−ＨＰＬＣに供した。
・条件
カラム：ＯＤＳ
Ｂｕｆｆｅｒ：  Ａ  水：アセトニトリル：１０％ＴＡＦ＝９０：１０：１
Ｂ  水：アセトニトリル：１０％ＴＡＦ＝４０：６０：１
Ａ−Ｂｕｆｆｅｒ  １００％から１時間でＢ−Ｂｕｆｆｅｒ  １００％へグラジエントをかける。
（４）ヒトビッグアンジオテンシン−２５の免疫染色
ヒトビッグアンジオテンシン−２５を特異的に検出するために、該ペプチドのＣ末端部分に対する抗血清を用いた。抗体を用いる免疫染色はＳｃｒｕｍ  Ｉｎｃ．（東京、日本）のビッグアンジオテンシン−２５の（１８−２５）を用いて調製した。常套的にホルマリン固定し、パラフィン包埋した組織ブロックを４μｍの切片にカットし、抗−ウサギポリクローナル抗体（ＰＢＳで１００倍希釈）を用いて免疫組織学的に染色した。陰性コントロールは、非免疫ウサギ血清（Ｄａｋｏ  Ｊａｐａｎ  Ｉｎｃ．）を用いた。切片をＥｎＶｉｓｉｏｎ＋（Ｄａｋｏ  Ｊａｐａｎ  Ｉｎｃ．）で染色した。ホースラディッシュパーオキシダーゼ活性を、過酸化水素を含む３，３−ジアミノベンジジンで可視化し、該切片をマイヤーのヘマトキシリンで対比染色した。
（５）尿試料採取およびビッグアンジオテンシン−２５の測定
５１８被験者を宮崎県宮崎市内の医療機関から募った。尿試料をＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジにアプライし、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有６０％アセトニトリルで溶出し、各試料の免疫活性Ｎ−末端ビッグアンジオテンシン−２５をＲＩＡで測定した。尿蛋白、尿中クレアチニン、および血清クレアチニンはＳＲＬ，Ｉｎｃ．（東京、日本）で測定した。推定される糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）は下記式を用いて算出した。
ｅＧＦＲ（ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）＝１９４×年齢（才）−０．２８７×血清クレアチニン（ｍｇ／ｄＬ）−１．０９４
（女性の場合は×０．７３９）
（６）統計学的分析
蛋白尿陽性（＋）群および蛋白尿陰性（−）群間でのデータ比較を独立ｔ−検定（ｕｎｐａｉｒｅｄｔ−ｔｅｓｔ）を用いて行なった。ｅＧＦＲデータの比較は分散分析（ＡＮＯＶＡ）により行い、次いでＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ検定を行うことにより行なった。数値は平均値±Ｓ．Ｅ．で示す。統計的な有意差はＰ＜０．０５に設定した。
２．結果
（１）ビッグアンジオテンシン−２５の構造解析
ヒト尿をゲル濾過後、アンジオテンシノーゲンＮ末端に特異的なラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で各画分の免疫活性を測定した結果、分子量が約５，０００のところに高い活性を持つ画分があった（図１Ａ）。すなわち、この画分中に、尿中に存在するアンジオテンシンに関連するペプチドのうち、最も主要なペプチドが存在することが明らかとなった。次に、高い免疫活性が見られた画分をイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ精製法、および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で精製を繰り返し（溶出グラジエント：０．１％トリフルオロ酢酸に溶解した１０％〜６０％のアセトニトリルの直線勾配を１ｍｌ／ｍｉｎの流出速度で６０分間）、最終的に単一のピークを得た（図１Ｂ）。
この精製ペプチドサンプルを質量分析に供したところ、６価イオン（７８０．２ｍ／ｚ）、５価イオン（９３６．０ｍ／ｚ）、４価イオン（１１６９．８ｍ／ｚ）のピークが検出された（図１Ｃ）。これらのデータから分子量が４６７５．１であることが判明したが、構造解析には至らず、糖鎖の付加を示すピークが検出された。さらに、精製ペプチドのこの糖鎖をＮ−グルコシダーゼによって切断し、質量分析に供したところ、５価イオン（６１１．７１ｍ／ｚ）および４価イオン（７６４．３９ｍ／ｚ）が検出された（データは示さず）。
精製ペプチドのアミノ酸配列をプロテインシーケンサーにより解析したところ、２５個のアミノ酸が検出され、１８位にはＣｙｓのデヒドロ体が検出された。この配列は、アンジオテンシノーゲンのＮ末端に相当しており、１４位のアミノ酸はＡｓｎであることと質量分析で糖鎖の存在が確認されたことから、１４位のアミノ酸にＮ型糖鎖が付加していると考えられた（図１Ｄ）。また、１８位のアミノ酸は質量分析の結果、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（シスチン）であることが明らかとなった（図１Ｄ）。
精製ペプチドに含まれるＮ型糖鎖（Ｎ−グリカン）の一次解析の結果、１種類の中性糖（分子量１７２０Ｄａ、糖組成（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）４（ＰＡ）１）が検出された（図２Ａ）。このＮ型糖鎖をさらにアミドカラムによって分画し、その糖鎖構造をＨＰＬＣ溶出位置（ＯＤＳカラムの溶出位置：９．８、アミドカラムの溶出位置：６．９）とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳデータに基づきマッピング法によって同定した結果、Ｎ型糖鎖の座標はＧＡＬＡＸＹの公知の参照Ｎ型糖鎖（ｃｏｄｅ  ｎｏ．２００．４）のそれらと一致した。この候補糖鎖と精製糖鎖の共クロマトグラフィー（ｃｏ−ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行なったところ、ピークが一致した（図２Ｂ）。
上記の精製ペプチドをビッグアンジオテンシン−２５と命名した。ビッグアンジオテンシン−２５は２５個のアミノ酸からなり（配列番号１）、１４位のアミノ酸にＮ−型糖鎖が付加されており、さらに、１８位のアミノ酸にシステインが付加した特異的な構造を有していた（図２Ｃ）。
（２）ビッグアンジオテンシン−２５のアンジオテンシンＩ（ＡｎｇＩ）、アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）への変換
（２−１）レニン（Ｒｅｎｉｎ）反応性
ビッグアンジオテンシン−２５（糖鎖あり；ＢＡｎｇ−２５）、ビッグアンジオテンシン−２５（糖鎖なし；Ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｃｈａｉｎ  ＢＡｎｇ−２５）、ビッグアンジオテンシン−２５（ＧｌｃＮＡｃ置換；ＢＡｎｇ−２５＋ＧｌｃＮＡｃ）の３種のペプチド（図３）をレニンとインキュベートした結果を図４に示す。ＢＡｎｇ−２５はレニンによって切断されず、ＡｎｇＩが生成しなかったが（図４Ｂ）、Ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｃｈａｉｎ  ＢＡｎｇ−２５（図４Ｄ）とＢｉｇＡｎｇ−２５＋ＧｌｃＮＡｃ（図４Ｆ）はレニンによって切断されＡｎｇ  Ｉが生成された。
図５はビッグアンジオテンシン−２５（糖鎖なし；Ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｃｈａｉｎ  ＢＡｎｇ−２５）およびビッグアンジオテンシン−２５（糖鎖あり；ＢＡｎｇ−２５）をレニン２０Ｕで２４時間反応した結果を示す。糖鎖なしの場合は速やかにＡｎｇ  Ｉが生成されているのに対し、糖鎖がある場合は２４時間たってもＡｎｇ  Ｉが生成されなかった。これらの結果は、糖鎖が付加されているＢＡｎｇ−２５はレニン抵抗性を有することを示している。このように、糖鎖の有無はレニンの酵素特異性に深く関わっていると考えられた。
（２−２）キマーゼ（Ｃｈｙｍａｓｅ）反応性
ビッグアンジオテンシン−２５（糖鎖あり；ＢＡｎｇ−２５）、ビッグアンジオテンシン−２５（糖鎖なし；Ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｃｈａｉｎ  ＢＡｎｇ−２５）、ビッグアンジオテンシン−２５（ＧｌｃＮＡｃ置換；ＢＡｎｇ−２５＋ＧｌｃＮＡｃ）の３種のペプチドをキマーゼとインキュベートした結果を図６に示す。ＢＡｎｇ−２５（図６Ｂ）とＮｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｃｈａｉｎ  ＢＡｎｇ−２５（図６Ｅ）はキマーゼによって切断され、ＡｎｇＩＩが生成したが、ＢＡｎｇ−２５＋ＧｌｃＮＡｃ（図６Ｆ）はキマーゼによって切断されず、ＡｎｇＩＩが生成されなかった。ＢＡｎｇ−２５がキマーゼとの反応でＡｎｇＩＩが生成されたことは、非レニン依存性のＡｎｇＩＩ産生経路の存在を示唆するものである。
図７は、ビッグアンジオテンシン−２５（糖鎖あり；ＢＡｎｇ−２５）、ビッグアンジオテンシン−２５（糖鎖なし；Ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｃｈａｉｎ  ＢＡｎｇ−２５）、ビッグアンジオテンシン−２５（ＧｌｃＮＡｃ置換；ＢＡｎｇ−２５＋ＧｌｃＮＡｃ）の３種のペプチド（各１０μｇ）を緩衝液（０．６Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．３Ｍ  ＮａＣｌ：１９０μｌ）中でキマーゼ（０．４μｌ）と２５℃にて２４時間反応させた結果を示す。ＢＡｎｇ−２５とＮｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｃｈａｉｎ  ＢＡｎｇ−２５は速やかにＡｎｇ  ＩＩが生成されているのに対し、ＢＡｎｇ−２５＋ＧｌｃＮＡｃは２４時間たってもＡｎｇＩＩが生成されなかった。
以上のビッグアンジオテンシン−２５と酵素反応性の結果をまとめると次のようになる。
ビッグアンジオテンシン−２５は、アンジオテンシノーゲンやＮ−結合型糖鎖を有
しないＢＡｎｇ−２５ペプチドに比較してレニン抵抗性を有するが、キマーゼには反応性を有する。糖鎖無しの場合には、レニンにもキマーゼにも反応性を有する。ＧｌｃＮＡｃ置換の場合には、レニンとの反応性を有するが、キマーゼとは反応しない。
このように、糖鎖の有無や種類によってレニン、キマーゼの作用が異なることがわかった。
（３）ヒトビッグアンジオテンシン−２５の腎臓における発現
組織染色を外科手術標本の腎臓内で可視化したところ、糸球体上皮細胞（ポドサイト）が特異的に染色されていた（図８Ａ）。
（４）尿中ビッグアンジオテンシン−２５との相関関係
図８Ｂは、３群（ｅＧＦＲ（ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）：＞９０、９０−３０、＜３０）における尿中ビッグアンジオテンシン−２５／クレアチニン比を示す。尿中ビッグアンジオテンシン−２５／クレアチニン比は、ｅＧＦＲ＜３０（重度腎障害）の群では他の２群に比べて顕著に高かった。また、糖尿病患者で尿蛋白が陽性の場合（Ｕｐｒｏ（＋））と陰性の場合（Ｕｐｒｏ（−））と比較すると、尿中ビッグアンジオテンシン−２５／クレアチニン比は尿蛋白が陽性の場合（Ｕｐｒｏ（＋））は陰性の場合（Ｕｐｒｏ（−））と比べて有意に高かった（図８Ｃ）。また、ビッグアンジオテンシン−２５／尿中クレアチニン比と尿蛋白（クレアチニン補正）とは正の相関があった（図８Ｄ）。
（５）ヒトビッグアンジオテンシン−２５の他の組織における発現
外科手術標本から作成した各臓器（心臓、食道、副腎、膵臓、胃、大腸、胎盤、卵管、精巣）の組織ブロックの免疫染色を可視化した（図９〜１７）。その結果、心筋細胞、膵臓のランゲルハンス氏島、副腎髄質、精巣のセルトリ細胞、卵管の平滑筋細胞（ＳＭＣ）、胎盤の絨毛外栄養膜細胞において強く染色された細胞が観察された（表１）。
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明は、腎臓疾患または循環器疾患の治療薬の診断薬またはキットの製造分野において利用できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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