(57)【要約】  本発明は、タンパク質より構成される毛髪、皮膚等の損傷を抑制しながら効果的に毛髪、皮膚等の浸水性を増大（膨潤）し得るタンパク質の親水性向上化剤を提供することを課題とする。  本発明は、プロテイングルタミナーゼを含有するタンパク質の親水性向上化剤、並びにプロテイングルタミナーゼ及びトランスグルタミナーゼの両方を含有するタンパク質の親水性向上化剤を提供することによって課題を解決する。
2014061728.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテイングルタミナーゼを含有する、化粧料組成物。
【請求項２】
プロテイングルタミナーゼの分子量が１０〜４０ｋＤａである、請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項３】
プロテイングルタミナーゼの含有量が０．００００１〜１０質量％である、請求項１または２に記載の化粧料組成物。
【請求項４】
プロテイングルタミナーゼが、Chryseobacterium属に属する細菌に由来するものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化粧料組成物。
【請求項５】
トランスグルタミナーゼをさらに含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化粧料組成物。
【請求項６】
トランスグルタミナーゼの含有量が０．００１〜２質量％である、請求項５に記載の化粧料組成物。
【請求項７】
プロテイングルタミナーゼ及びトランスグルタミナーゼの配合比（プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ（質量：質量））が、１：１〜１：１００００である、請求項５または６に記載の化粧料組成物。
【請求項８】
アミノ酸、アシルアミノ酸、アシルアミノ酸エステル、アシルアミノ酸アミド、ペプチド、アシルペプチドまたはそれらの塩をさらに含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化粧料組成物。
【請求項９】
アミノ酸、アシルアミノ酸、アシルアミノ酸エステル、アシルアミノ酸アミド、ペプチド、アシルペプチドまたはそれらの塩の含有量が、０．００５〜５０質量％である、請求項８に記載の化粧料組成物。
【請求項１０】
アルコールをさらに含有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化粧料組成物。
【請求項１１】
アルコールの含有量が０．００５〜５０質量％である、請求項１０に記載の化粧料組成物。
【請求項１２】
アルコールが、飽和または不飽和の一価のＣ１−６アルコールあるいは多価アルコールである、請求項１０または１１に記載の化粧料組成物。
【請求項１３】
皮膚化粧料である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化粧料組成物。
【請求項１４】
毛髪化粧料である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化粧料組成物。
【請求項１５】
毛髪化粧料がパーマ剤またはカラー剤である、請求項１４に記載の化粧料組成物。
【請求項１６】
プロテイングルタミナーゼを含有する、タンパク質の親水性向上化剤。
【請求項１７】
タンパク質の親水性を向上させるための、プロテイングルタミナーゼの使用。
【請求項１８】
プロテイングルタミナーゼを含有する、浸透促進剤。
【請求項１９】
有効成分の浸透を促進させるための、プロテイングルタミナーゼの使用。
【請求項２０】
有効成分がトランスグルタミナーゼである、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
有効成分がアミノ酸、アシルアミノ酸、アシルアミノ酸エステル、アシルアミノ酸アミド、ペプチド、アシルペプチドまたはそれらの塩である、請求項１９記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテイングルタミナーゼを含有する化粧料組成物に関する。また、本発明は、プロテイングルタミナーゼを含有する、タンパク質の親水性向上化剤および浸透促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーマやカラーリング等の毛髪処理を行うに際して、薬液の毛髪への浸透を促進するためには、毛髪を構成するタンパク質の親水性を向上させること、即ち、毛髪を膨潤させることが重要である。かくして、パーマ剤やカラーリング剤等の薬剤が浸透し易くなる。毛髪の膨潤処理は、多くの場合、アンモニアやモノエタノールアミン等のアルカリ性物質を用いて行われる（例えば、特許文献１を参照のこと）。これは、毛髪にアルカリ性物質を作用させることにより毛髪中タンパク質の極性基をイオン化させ、構造変化を誘発させるためである。しかしながら、このようなアルカリ性物質を用いた毛髪処理は、同時に毛髪中のタンパク質の加水分解や脂質の損失などの副作用も招き、結果として毛髪の損傷を引き起こしたり、皮膚刺激性を誘発したりすることになる。【０００３】
一方、化粧料または皮膚外用剤に含まれる有効成分を毛髪や皮膚に浸透させるとともに、その浸透を促進させることは、有効成分の効果を高めるために重要である。そのため、従来から種々の浸透促進剤が用いられている。このような浸透促進剤としては、例えばジメチルスルホキシド、オレイン酸、ベンジルアルコール等が知られている（例えば、特許文献２を参照のこと）。しかしながら、これらの浸透促進剤は皮膚刺激性等の問題を同時に有しており、安全性の面で十分なものではない。また、その使用感も良好なものではない。従って、従来の浸透促進剤は使用者にとって十分に満足できるものとはいえない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表平１−５０３０６４号公報
【特許文献２】特表平８−５００３６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、毛髪の損傷および皮膚刺激を抑制しながら、優れたタンパク質の親水性向上効果および浸透促進効果を有する化粧料組成物を提供することを課題とする。また、本発明は、優れたタンパク質の親水性向上効果および浸透促進効果を有する剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討を行った結果、プロテイングルタミナーゼが組織中のタンパク質に対して親水性を向上させること、特に毛髪、皮膚等を膨潤させることができ、加えて毛髪、皮膚等の損傷を生起しにくいことを見出した。さらに、本発明者らは、プロテイングルタミナーゼが、化粧料または皮膚外用剤に含まれる有効成分の毛髪および皮膚への浸透を効果的に促進することを見出した。これら知見に基づき、本発明者らは、さらに研究を重ねることによって本発明を完成するに至った。【０００７】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］  プロテイングルタミナーゼを含有する、化粧料組成物。
［２］  プロテイングルタミナーゼの分子量が１０〜４０ｋＤａである、［１］に記載の化粧料組成物。
［３］  プロテイングルタミナーゼの含有量が０．００００１〜１０質量％である、［１］または［２］に記載の化粧料組成物。
［４］  プロテイングルタミナーゼが、Chryseobacterium属に属する細菌に由来するものである、［１］〜［３］のいずれかに記載の化粧料組成物。
［５］  トランスグルタミナーゼをさらに含有する、［１］〜［４］のいずれかに記載の化粧料組成物。
［６］  トランスグルタミナーゼの含有量が０．００１〜２質量％である、［５］に記載の化粧料組成物。
［７］  プロテイングルタミナーゼ及びトランスグルタミナーゼの配合比（プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ（質量：質量））が、１：１〜１：１００００である、［５］または［６］に記載の化粧料組成物。
［８］  アミノ酸、アシルアミノ酸、アシルアミノ酸エステル、アシルアミノ酸アミド、ペプチド、アシルペプチドまたはそれらの塩をさらに含有する、［１］〜［７］のいずれかに記載の化粧料組成物。
［９］  アミノ酸、アシルアミノ酸、アシルアミノ酸エステル、アシルアミノ酸アミド、ペプチド、アシルペプチドまたはそれらの塩の含有量が、０．００５〜５０質量％である、［８］に記載の化粧料組成物。
［１０］  アルコールをさらに含有する、［１］〜［９］のいずれかに記載の化粧料組成物。
［１１］  アルコールの含有量が０．００５〜５０質量％である、［１０］に記載の化粧料組成物。
［１２］  アルコールが、飽和または不飽和の一価のＣ１−６アルコールあるいは多価アルコールである、［１０］または［１１］に記載の化粧料組成物。
［１３］  皮膚化粧料である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の化粧料組成物。
［１４］  毛髪化粧料である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の化粧料組成物。
［１５］  毛髪化粧料がパーマ剤またはカラー剤である、［１４］に記載の化粧料組成物。
［１６］  プロテイングルタミナーゼを含有する、タンパク質の親水性向上化剤。
［１７］  タンパク質の親水性を向上させるための、プロテイングルタミナーゼの使用。
［１８］  プロテイングルタミナーゼを含有する、浸透促進剤。
［１９］  有効成分の浸透を促進させるための、プロテイングルタミナーゼの使用。
［２０］  有効成分がトランスグルタミナーゼである、［１９］記載の使用。
［２１］  有効成分がアミノ酸、アシルアミノ酸、アシルアミノ酸エステル、アシルアミノ酸アミド、ペプチド、アシルペプチドまたはそれらの塩である、［１９］記載の使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、毛髪、皮膚等におけるタンパク質の分子内の静電的反発が増加することによってこれらが膨潤し、その結果、化粧料または皮膚外用剤に含まれる有効成分の毛髪、皮膚等への浸透性が改善される。しかも、毛髪、皮膚等の損傷、皮膚刺激を引き起こすことなくタンパク質の親水性を向上し、効果的に毛髪、皮膚等を膨潤させることができる。【０００９】
また、本発明によれば、組織（例えば、毛髪、皮膚等）におけるタンパク質の親水性を向上させる剤が提供される。さらに、化粧料または皮膚外用剤に含まれる有効成分の組織（例えば、毛髪、皮膚等）への浸透を促進させる剤が提供される。いずれの剤も、化粧料のみならず、皮膚外用剤や経皮吸収剤等のような医薬にも利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、各種試料で処理したときの毛髪の膨潤度を示すグラフである。グラフの縦軸は毛髪の膨潤度（％）を示し、横軸は試料の種類及び処理時間（３分及び５分）を示す。
【図２】図２は、各種試料で３分間処理したときの毛髪の状態を示す顕微鏡画像（倍率４００倍）である。「ＰＧ」はプロテイングルタミナーゼを示す。
【図３】図３は、各種試料で処理したときのアンモニア生成量を示すグラフである。グラフの縦軸はアンモニア生成量（μｇ／ｍＬ）を示し、横軸は試料の種類を示す。
【図４】図４は、培養皮膚を透過した有効成分の量を示すグラフである。グラフの縦軸はフルオレセイン標識された有効成分の蛍光強度を示し、横軸は有効成分の培養皮膚への添加後の時間（時間）を示す。また、「GGG-FITC(-PG)」はプロテイングルタミナーゼを用いなかった場合の蛍光強度を示し、「GGG-FITC(+PG)」はプロテイングルタミナーゼを用いた場合の蛍光強度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明におけるプロテイングルタミナーゼは、特に限定されないが、例えばＥＣ番号（Enzyme Commission No.）がＥＣ３．５．１（またはＥＣ３．５．１．Ｘ（Ｘは任意の数字、例えば４４等））で表されるものを用いることができる。また、特に限定されないが、本発明におけるプロテイングルタミナーゼは微生物由来のものを用いることができる。当該微生物としては、例えばChryseobacterium属に属する細菌等が挙げられ、その中でもChryseobacterium proteolyticum、Chryseobacterium gleumと命名される細菌が好ましい。Chryseobacterium proteolyticumの菌株としては、本発明の効果を奏するものであれば種々の菌株を用いることができるが、例えば９６７０株等を挙げることができる。これら微生物は寄託機関等から容易に入手可能である。例えば、Chryseobacterium proteolyticum 9670株は、特開２００５−５２１５８号公報に記載の通り、受託番号FERM BP-7351として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東１丁目１番３号中央第６）に寄託されている。
【００１２】
Chryseobacterium proteolyticum 9670株由来のプロテイングルタミナーゼは、全長３２０アミノ酸の１本鎖ポリペプチドであり、そのアミノ酸配列はGenbank Accession No. BAB21508として登録されている（配列番号２）。また、当該ポリペプチドをコードする塩基配列は、Genbank Accession No. AB046594として登録されている（配列番号１）。
【００１３】
上記ポリペプチドはプレプロ体としてコードされており、Ｎ末端側の１３５残基がプレプロ領域で、残りの１８５残基が成熟体に対応する。当該成熟体のアミノ酸配列は配列番号４で表され、またそれをコードする塩基配列は配列番号３で表される。そのため、本発明においてプロテイングルタミナーゼは、例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドということができる。尚、上記プレプロ領域１３５残基のうちＮ末端側の２１残基が、シグナル配列の特徴を有していることからプレ領域と推定されており、残りの１１４残基がプロ領域と推定されている。
【００１４】
配列番号４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号４で表されるアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、更により好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。ここで「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメントにおける、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸の割合（％）を意味する。
【００１５】
配列番号４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１または２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１または２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１または２個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１または２個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）それらを組み合わせたアミノ酸配列等が挙げられる。
【００１６】
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失、付加または置換されている場合、その挿入、欠失、付加または置換の位置は、かかるアミノ酸配列を有するポリペプチドが、本発明の効果を奏する限り特に限定されない。
【００１７】
プロテイングルタミナーゼの長さは、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、調製の容易さ及びポリペプチドの安定性の観点から、例えば４００アミノ酸以下、好ましくは３００アミノ酸以下、より好ましくは２００アミノ酸以下である。
【００１８】
プロテイングルタミナーゼの製造方法としては、特に限定されず、公知の方法を用いて製造することができる。例えば、Chryseobacterium属の細菌（例えば、Chryseobacterium proteolyticum 9670株）を液体培養し（例えば、ＬＢ培地を用いて２５℃で４０時間）、得られた培養液を除菌ろ過したものについて、限外ろ過により脱塩及び濃縮を行い、イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製することにより得ることができる。ろ過やイオン交換クロマトグラフィーの方法及び条件は、自体公知の技術を用いて適宜選択することができる。また、上記のほかにも、プロテイングルタミナーゼをコードする遺伝子（例えば、配列番号１または３で表されるポリヌクレオチド配列）を用いて、E.coliおよびCorynebacterium等の宿主に導入して、宿主内でプロテイングルタミナーゼを発現させ、これを単離及び精製する方法を利用することもできる。なお、遺伝子を利用する方法は、例えば、Y. Kikuchi et al., Applied microbiology and biotechnology 78, 67-74(2008)、およびS. Yamaguchi et al., Eur. J. Biochem. 268, 1410-1421 (2001)に記載の方法に準じて行うことができる。また、プロテイングルタミナーゼは市販品を用いることもできる。
【００１９】
本発明におけるプロテイングルタミナーゼの分子量は、その分子がプロテイングルタミナーゼの活性を有している限り特に限定されないが、１〜２００ｋＤａが好ましく、５〜１００ｋＤａがより好ましく、１０〜６０ｋＤａがさらに好ましく、１０〜４０ｋＤａがさらにより好ましい。当該分子量は、アミノ酸配列から計算することができ、またはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法等を用いて測定することもできる。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、自体公知の方法を用いて行うことができる。尚、プロテイングルタミナーゼの活性は、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミル−グリシン（N-carbobenzoxy-L-glutamyl-glycine）（CBZ-Gln-Gly）を基質として用い、プロテイングルタミナーゼとの反応により生成されたアンモニアの量を調べることにより測定することができる（例えば、S. Yamaguchi et al. Appl. Environ. Microbiol. 66, 3337-3343 (2000)を参照）。基質に用いられるCBZ-Gln-Glyは、自体公知の方法を用いて製造してもよく、市販品を用いてもよく、または外注先等への委託製造を利用してもよい。
【００２０】
本発明において、上記プロテイングルタミナーゼは化粧料組成物に含有される。本発明の化粧料組成物におけるプロテイングルタミナーゼの含有量は、その製剤の形態、使用頻度、処理時間、プロテイングルタミナーゼの力価等によって異なるが、好ましくは０．００００１質量％以上であり、より好ましくは０．００００５質量％以上であり、さらに好ましくは０．０００１質量％以上である。また、当該含有量は、好ましくは１０質量％以下であり、より好ましくは５質量％以下であり、さらに好ましくは２質量％以下である。
【００２１】
本発明の化粧料組成物は、例えば有効成分として、トランスグルタミナーゼをさらに含有することが好ましい。トランスグルタミナーゼはタンパク質修飾酵素の一つであり、タンパク質またはペプチド中のグルタミン残基のγ−カルボキシルアミド基と、リジン残基のε−アミノ基との間の反応を触媒し、ε−（γ−グルタミル）リジン結合を介する架橋形成反応を触媒する作用を有する。トランスグルタミナーゼ自体は、例えば毛髪においては、主に毛髪最外層に存在する遊離のグルタミン残基とリジン残基との反応を上記の通り触媒し、ε−（γ−グルタミル）リジン結合からなる架橋を形成することにより、毛髪の表面構造を緻密化し、損傷毛の改善、水分保持機能の亢進、毛髪の保湿性の改善を行い、更に毛髪に光沢性、柔軟性、弾力性を与える損傷毛髪改善効果を発揮する。本発明では、さらに上記プロテイングルタミナーゼを組み合わせることにより、例えば毛髪に関しては、毛髪を本質的に改善させて、毛髪の強度（特に、引張強度）を効果的に高めることができる。
【００２２】
本発明におけるトランスグルタミナーゼは、特に限定されないが、例えばＥＣ番号（Enzyme Commission No.）がＥＣ２．３．２．１３で表されるものを用いることができる。トランスグルタミナーゼは、主に動物の諸組織や血液細胞に存在している。そのため、本発明において用いられるトランスグルタミナーゼは、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ等の哺乳動物の肝臓、血清、血小板、表皮等から自体公知の方法を用いて単離・精製することができる。また、本発明においては、動物由来だけでなく、その起源にかかわらず、例えばStreptomyces mobaraensis等の微生物由来や植物由来のトランスグルタミナーゼを用いることもできる。トランスグルタミナーゼは、好適には市販品を用いることができ、例えば食品分野等において広く市販されているので容易に入手することができる。本発明に用いるトランスグルタミナーゼは遺伝子組み換え法で生産したものでも構わない。
【００２３】
トランスグルタミナーゼは、その反応において通常カルシウムイオンを必要とするが、種類によってはカルシウムイオン非依存性のトランスグルタミナーゼも存在している（例えば、特開平１−２７４７１号等）。そのため本発明の組成物には、必須ではないが、必要に応じてカルシウムイオンを添加させることができる。本発明においてカルシウムイオンを供給し得る化合物としては、例えば、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、および臭化カルシウム等が挙げられる。これらのうち、好ましくは塩化カルシウムである。その添加量としては、通常、カルシウム濃度として１〜２０ｍＭであり、好ましくは３〜１０ｍＭである。
【００２４】
また、本発明におけるトランスグルタミナーゼの分子量は、その分子がトランスグルタミナーゼの活性を有している限り特に限定されないが、１〜２００ｋＤａが好ましく、５〜１００ｋＤａがより好ましく、１０〜８０ｋＤａがさらに好ましく、３０〜６０ｋＤａがさらにより好ましい。当該分子量は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて測定することができる。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、自体公知の方法を用いて行うことができる。尚、トランスグルタミナーゼの活性は、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニルグリシンとヒドロキシルアミンとを基質として、カルシウムイオンを必要とする場合は必要量のカルシウムイオンを添加して反応を行い、生成したヒドロキサム酸をトリクロロ酢酸存在下で鉄錯体を形成させ、５２５ｎｍの吸光度を測定し、ヒドロキサム酸の量を検量線より求めて算出することにより測定することができる。
【００２５】
本発明の化粧料組成物におけるトランスグルタミナーゼの含有量は、その製剤の形態、使用頻度、処理時間、トランスグルタミナーゼの力価等によって異なるが、好ましくは０．００１質量％以上であり、より好ましくは０．０１質量％以上であり、さらに好ましくは０．０２質量％以上である。また、当該含有量は、好ましくは２質量％以下であり、より好ましくは１質量％以下であり、さらに好ましくは０．５質量％以下である。上記範囲内においてトランスグルタミナーゼが含有されることにより、プロテイングルタミナーゼと協同して毛髪の強度を効果的に向上させることができる。
【００２６】
本発明の化粧料組成物において、プロテイングルタミナーゼ及びトランスグルタミナーゼの配合比（プロテイングルタミナーゼ：トランスグルタミナーゼ（質量：質量））は、両酵素の力価等によって必ずしも制限されるわけではないが、好ましくは１：１〜１：１００００であり、より好ましくは１：２〜１：１０００であり、さらに好ましくは１：１０〜１：１００である。両酵素の配合比が上記範囲内であることにより、プロテイングルタミナーゼ及びトランスグルタミナーゼの併用効果がさらに高くなり、顕著な毛髪強度の向上に寄与することができる。
【００２７】
別の態様として、本発明の化粧料組成物は、例えば有効成分として、アミノ酸またはその塩、アシルアミノ酸、そのエステルもしくはアミドまたはそれらの塩、ペプチドまたはその塩、アシルペプチドまたはその塩をさらに含有することが好ましい。これらは１種のみを用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２８】
アミノ酸としては、例えば、アルギニン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、グリシン、アラニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、スレオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン、シスチン、ピロリドンカルボン酸、メチオニンが挙げられる。
【００２９】
アシルアミノ酸としては、特に限定されないが、上記に例示したアミノ酸と同じアミノ酸がアシル化されたものが挙げられる。アシルアミノ酸およびアシルペプチドのアシル基としては、炭素原子数２〜２３の飽和または不飽和脂肪酸より誘導されるアシル基が挙げられ、その具体例としては、アセチル基、プロパノイル基、イソプロパノイル基、ブタノイル基、イソブタノイル基、ｓｅｃ−ブタノイル基、ｔｅｒｔ−ブタノイル基、ペンタノイル基、イソペンタノイル基、ｓｅｃ−ペンタノイル基、ｔｅｒｔ−ペンタノイル基、ヘキサノイル基、ヘプタノイル基、オクタノイル基、ｔｅｒｔ−オクタノイル基、２−エチルヘキサノイル基、ノナノイル基、イソノナノイル基、デカノイル基、イソデカノイル基、ウンデカノイル基、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、ベヘノイル基、ウンデシレノイル基およびオレオイル基等が挙げられる。単一組成の酸より誘導されるアシル基のほか、ヤシ油脂肪酸、ヒマシ油脂肪酸、オリーブ油脂肪酸、パーム油脂肪酸等の天然より得られる混合脂肪酸あるいは合成により得られる脂肪酸（分岐脂肪酸を含む）より誘導されるアシル基であっても良い。これらのうち１種類を使用しても良いし、２種以上を混合して使用しても構わない。炭素原子数２〜１８の飽和または不飽和脂肪酸より誘導されるアシル基であることが好ましく、炭素原子数２〜１２の飽和または不飽和脂肪酸より誘導されるアシル基であることがより好ましく、炭素原子数２〜６の飽和または不飽和脂肪酸より誘導されるアシル基であることがさらに好ましい。なお、飽和脂肪酸より誘導されるアシル基が不飽和脂肪酸より誘導されるアシル基よりも好ましい。
【００３０】
アシルアミノ酸エステルのエステル基としてはアルキルエステルまたはアラルキルエステルが挙げられ、たとえば、Ｃ１−２４アルキル基またはＣ１−２４アルケニル基を有するエステルが挙げられる。Ｃ１−６アルキル基を有するアルキルエステルが好ましい。
Ｃ１−２４アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、ヘプチル、ｓｅｃ−ヘプチル、オクチル、２−エチルヘキシル、ｓｅｃ−オクチル、ノニル、ｓｅｃ−ノニル、デシル、ｓｅｃ−デシル、ウンデシル、ｓｅｃ−ウンデシル、ドデシル、ｓｅｃ−ドデシル、トリデシル、イソトリデシル、ｓｅｃ−トリデシル、テトラデシル、ｓｅｃ−テトラデシル、ヘキサデシル、ｓｅｃ−ヘキサデシル、ステアリル、モノメチル分枝−イソステアリル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、トリアコンチル、２−ブチルオクチル、２−ヘキシルオクチル、２−ブチルデシル、２−ヘキシルデシル、２−オクチルデシル、２−ヘキシルドデシル、２−オクチルドデシル、２−デシルドデシル、２−オクチルテトラデシル、２−デシルテトラデシル、２−ドデシルテトラデシル、２−デシルヘキサデシル、２−ドデシルヘキサデシル、２−テトラデシルヘキサデシル、２−ドデシルオクタデシル、２−テトラデシルオクタデシル、２−ヘキサデシルオクタデシル、２−テトラデシルイコシル、２−ヘキサデシルイコシル、および２−オクタデシルイコシル等が挙げられる。
特に、Ｃ１−６アルキル基としては、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、イソペンチル、およびヘキシルが挙げられる。
Ｃ１−２４アルケニル基としては例えば、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、ペンテニル、イソペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、テトラデセニル、オレイル、およびリノレイル等が挙げられる。
【００３１】
アシルアミノ酸アミドのアミド基としては、アルキルアミドまたはアラルキルアミドが挙げられ、たとえば、Ｃ１−２４アルキル基またはＣ１−２４アルケニル基を有するアミド挙げられる。Ｃ１−６アルキル基を有するアルキルアミドが好ましい。
【００３２】
ペプチドとしては、上記に例示したアミノ酸の１種以上から構成されるジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドが好ましい。本発明において、より好ましくはトリペプチドであり、特に好ましくはグリシルグリシルグリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）である。
【００３３】
本発明の化粧料組成物における上記アミノ酸またはその塩、アシルアミノ酸、そのエステルもしくはアミドまたはそれらの塩、ペプチドまたはその塩、アシルペプチドまたはその塩の含有量は、その製剤の形態、使用頻度、処理時間、種類等によって異なるが、好ましくは０．００５質量％以上であり、より好ましくは０．０１質量％以上であり、さらに好ましくは０．１質量％以上である。また、当該含有量は、好ましくは５０質量％以下であり、より好ましくは３０質量％以下であり、さらに好ましくは２０質量％以下である。
【００３４】
本発明の化粧料組成物は、上記の各種成分に加えて、さらにアルコールを含有することが好ましい。アルコールが含有されることにより、酵素の透過性が増し、より効果的に酵素反応が進行する。これにより、例えば、損傷毛の改善、水分保持機能の亢進、毛髪の保湿性の改善、更に毛髪に光沢性、柔軟性、弾力性を与える損傷毛髪改善効果の向上が期待できる。
【００３５】
本発明の化粧料組成物に含有されるアルコールとしては、特に限定されず、例えば、飽和または不飽和の一価のＣ１−６アルコール、飽和または不飽和の一価のＣ８−３８アルコール、多価アルコールが挙げられる。
【００３６】
飽和または不飽和の一価のＣ１−６アルコールとしては、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどが挙げられる。
【００３７】
飽和または不飽和の一価のＣ８−３８アルコールとしては、カプリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、アラギジニルアルコール、ベヘニルアルコール等の直鎖飽和アルコール；２−ヘキシルデシルアルコール、２−オクチルドデシルアルコール、イソステアリルアルコール、デシルテトラデシルアルコール等の分岐鎖飽和アルコール；オレイルアルコール、リノレイルアルコール等の直鎖不飽和アルコール；等が挙げられる。
【００３８】
多価アルコールとしてはエチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、１，２−ブチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、テトラメチレングリコール、２，３−ブチレングリコール、ペンタメチレングリコール、２−ブテン−１，４−ジオール、１，２−ヘキサンジオール、ヘキシレングリコール、オクチレングリコール等の２価のアルコール；グリセリン、トリメチロールプロパン、１，２，６−ヘキサントリオール等の３価のアルコール；ペンタエリスリトール等の４価のアルコール；キシリトール等の５価のアルコール；ソルビトール、マンニトール等の６価のアルコール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、トリグリセリン、テトラグリセリン、ポリグリセリン等の多価アルコール共重合体；エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールノモブチルエーテル、エチレングリコールモノフェニルエーテル、エチレングリコールモノヘキシルエーテル、エチレングリコールモノ−２−メチルヘキシルエーテル、エチレングリコールイソアミルエーテル、エチレングリコールベンジルエーテル、エチレングリコールイソプロピルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル等の２価のアルコールアルキルエーテル類；ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコール、ジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジブチルエーテル、ジエチレングリコールメチルエチルエーテル、トリエチレングリコールモノメチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノイソプロピルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、ジプロピレングリコールエチルエーテル、ジプロピレングリコールブチルエーテル等の２価のアルコールアルキルエーテル類；エチレングリコールモノメチルエーテルアセテート、エチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、エチレングリコールモノブチルエーテルアセテート、エチレングリコールモノフェニルエーテルアセテート、エチレングリコールジアジペート、エチレングリコールジサクシネート、エチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、ジエチレングリコールモノブチルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノエチルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノプロピルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノフェニルエーテルアセテート等の２価のアルコールエーテルエステル類；キシルアルコール、セラキルアルコール、バチルアルコール等のグリセリンモノアルキルエーテル；ソルビトール、マルチトール、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、デンプン分解糖還元アルコール等の糖アルコール；グリソリッド、テトラハイドロフルフリルアルコール、ＰＯＥテトラハイドロフルフリルアルコール、ＰＯＰブチルエーテル、ＰＯＰ・ＰＯＥブチルエーテル、チルポリオキシプロピレングリセリンエーテル、ＰＯＰグリセリンエーテル、ＰＯＰグリセリンエーテルリン酸、ＰＯＰ・ＰＯＥペンタエリスルトールエーテル等が挙げられる。
【００３９】
上記に例示されたアルコールは１種単独でまたは２種以上を組み合わせて用いることができる。例示されたアルコールのうち、本発明の効果の観点から、好ましくは飽和または不飽和の一価のＣ１−６アルコールまたは多価アルコールであり、より好ましくはエタノール、プロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，２−ブチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、および１，２−ヘキサンジオールであり、より好ましくは、エタノール、１，２−ヘキサンジオールである。
【００４０】
本発明の化粧料組成物におけるアルコールの含有量は、その製剤の形態、使用頻度、処理時間、使用するアルコールの種類等によって異なるが、好ましくは０．００５質量％以上であり、より好ましくは０．０１質量％以上であり、さらに好ましくは０．１質量％以上である。また、当該含有量は、好ましくは５０質量％以下であり、より好ましくは３０質量％以下であり、さらに好ましくは２０質量％以下である。上記範囲内においてアルコールが含有されることにより、酵素の透過性が増し、より効果的に酵素反応が進行し、損傷毛の改善、水分保持機能の亢進、毛髪の保湿性の改善、更に毛髪に光沢性、柔軟性、弾力性を与える損傷毛髪改善効果の向上が期待できる。
【００４１】
本発明の化粧料組成物のｐＨは、本発明の効果を阻害しない範囲であれば特に限定されない。本発明の化粧料組成物のｐＨは、好ましくはｐＨ２．５〜１０．０であり、好ましくはｐＨ３．０〜９．０であり、より好ましくはｐＨ４．０〜７．５である。
【００４２】
本発明の化粧料組成物は、上記の成分に加え、例えば化粧料に一般に使用され得る薬効成分をさらに含有することができる。当該薬効成分としては、特に限定されないが、美白剤や、育毛剤およびコンディショニング剤など毛髪の健全性を保持し得る成分または発毛を促進し得る成分等が好ましい。
【００４３】
たとえば、美白剤としてはハイドロキノン、アルブチン等のハイドロキノンおよびその誘導体；アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸硫酸ナトリウム、アスコルビン酸リン酸マグネシウム塩、アスコルビン酸リン酸ナトリウム塩、アスコルビン酸グルコシド、ビタミンＣエチル等のアスコルビン酸およびその誘導体；植物抽出物；エラグ酸、没食子酸、ペンタガロイルグルコース、レスベラトロールのポリフェノール等が挙げられる。
育毛剤としては、パントテン酸およびその誘導体、アラントイン、ビオチン、モノニトログアヤコール、アデノシン、ペンタデカン酸グリセリド、ジアルキルモノアミン誘導体、コレウスエキス、クロロフィル、感光素、エストラジオール、エチニルエストラジオール、塩酸ピリドキシン、チオキソロン、硫黄、有機硫黄物質等が挙げられる。本発明の化粧料組成物における各種薬効成分の含有量は、薬効成分の種類等に応じて本発明の効果を阻害しない範囲で適宜設定することができる。
【００４４】
また、本発明の化粧料組成物は、その他、油分、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、酸化防止剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、色素等の成分をさらに含有することができる。これらの成分の具体的な種類及び含有量は、その目的等に応じて本発明の効果を阻害しない範囲で適宜設定することができる。
【００４５】
本発明の化粧料組成物は、常法に従って製造することができ、例えば毛髪、皮膚等に適用可能な任意の形態の製剤とすることができる。特に限定されないが、例えば、液状、クリーム状、ゲル状、ペースト状等の形態とすることができる。また、液状形態のものは、必要に応じて、例えば炭酸ガス、酸素ガス、ＬＰＧ等と併用して耐圧容器に充填し、噴射剤として用いることもできる。本発明のタンパク質の親水性向上化剤の外観も特に制限されず、透明、白濁、パール状等、任意の外観を適宜選択することができる。
【００４６】
本発明の化粧料組成物は、特に限定されないが、具体例として、パーマ剤、カラー剤、養毛剤、育毛剤、ヘアクリーム、ヘアローション、毛髪用化粧水、毛髪用乳液、毛髪用軟膏、ヘアトリートメント、ヘアコンディショナー、シャンプー、リンス等の毛髪化粧料、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、美容液、パック、マスク、石鹸、ボディシャンプー、白粉、ファンデーション、口紅、チーク、アイライナー、マスカラ、アイシャドー、眉墨等の皮膚化粧料等が挙げられる。
【００４７】
以上の通り説明した本発明の化粧料組成物の効果は、組織（例えば、毛髪、皮膚等）に対してダメージを与えることなく当該組織におけるタンパク質の親水性を向上させるというプロテイングルタミナーゼの特有の作用によるものである。これは、おそらくプロテイングルタミナーゼがタンパク質またはペプチド中のグルタミン残基をグルタミン酸残基に変換する作用を有するとともに、かかるアミノ酸の変換が、当該タンパク質またはペプチドのペプチド結合が切断されることなく行われるためと考えられる。このように、プロテイングルタミナーゼは組織中のタンパク質の親水性を向上させるという点において有用である。従って、本発明はさらに、プロテイングルタミナーゼを含有するタンパク質の親水性向上化剤を提供する。尚、本発明の「タンパク質の親水性向上化剤」におけるタンパク質とは、ヒトの毛髪、皮膚、爪等を構成しているタンパク質を意味する。
またタンパク質の親水性向上効果により、組成物に含まれる有効成分の組織（例えば、毛髪、皮膚等）への浸透を促進させることができる。従って、本発明はさらに、プロテイングルタミナーゼを含有する（有効成分の）浸透促進剤を提供する。上記タンパク質の親水性向上化剤および浸透促進剤を併せて、以下、「本発明の剤」と称する。
【００４８】
本発明の剤は、化粧料のみならず医薬としても有用であり、その適用対象としては、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）が挙げられる。本発明の剤の適用対象は、好ましくはヒトである。尚、ヒト以外の哺乳動物に適応する場合、本発明の剤の投与量は、動物の体重若しくは大きさに応じて適宜加減すればよい。
【００４９】
本発明の剤を医薬として用いる場合の投与方法は、特に限定されないが、その効果の観点から非経口投与とすることが好ましく、経皮投与とすることが特に好ましい。
【００５０】
本発明の剤の剤形は、好適には外用剤（例、外用固形剤（外用散剤等）、外用液剤（リニメント剤、ローション剤等）、スプレー剤（外用エアゾール剤、ポンプスプレー剤等）、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤（テープ剤、パップ剤等）等）であるが、特にこれに限定されない。本発明の剤は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。
【００５１】
本発明の剤は、上記プロテイングルタミナーゼそのままであってもよく、或いは、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体を配合して製剤化されていてもよい。薬学的に許容される担体としては、特に限定されないが、例えば、水性担体、乳状担体、ゲル状担体、クリーム基剤及び軟膏基剤等が挙げられ、具体的には、動植物性油脂類、ロウ類、脂肪酸、脂肪族アルコール、エステル油類、炭化水素油類、シリコーン油類等の油性成分；非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤等の界面活性剤；エタノール等の低級アルコール類；グリセリン、１，３−ブタンジオール等の多価アルコール類；カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシセルロース等の増粘剤類；乳酸及びその塩、クエン酸及びその塩等のｐＨ調整剤；水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、Ｌ−アルギニン等の塩基類；トコフェロール及びその誘導体等の抗酸化剤；紫外線防止剤、防菌防黴剤、香料、色素、顔料等、医薬分野において通常に使用される成分等が挙げられる。
【００５２】
担体を用いて製剤化された場合の本発明の剤におけるプロテイングルタミナーゼの含有量は、特に限定されるものではなく、本発明の効果を奏するのに必要な量を含有するように適宜調整することができる。プロテイングルタミナーゼの含有量は、剤形の種類や使用される担体の種類によっても異なるが、例えば、０．１〜３０質量％であり、好ましくは０．５〜２０質量％、より好ましくは１〜２０質量％、さらに好ましくは１〜１０質量％である。
【００５３】
本発明の剤の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法等によって異なるが、ヒトに対して非経口的に投与する場合は、例えば、体重６０ｋｇの成人において、プロテイングルタミナーゼの質量として、一日につき約０．０１〜１０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜５ｍｇ程度、より好ましくは１〜４ｍｇ程度である。投与対象がヒト以外の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。あるいは投与対象にあわせて、適切な投与量を設定してもよい。本発明においては、上記の一日量を、１回、または必要に応じて２〜４回、好ましくは２〜３回に分割して適宜の間隔をあけて投与することができる。
【００５４】
本発明の剤は、例えば、上述したトランスグルタミナーゼ、アミノ酸またはその塩、アシルアミノ酸、そのエステルもしくはアミドまたはそれらの塩、ペプチドまたはその塩、アシルペプチドまたはその塩、アルコール、および化粧料に一般に使用され得る薬効成分等と併用することができる。また、本発明の剤は、その効果の観点から外用剤に通常用いられる有効成分と併用することもできる。
【００５５】
本明細書において「併用」とは、上記各種成分の投与の前、同時、または後における本発明の剤の使用を意味し、また、両者を混合させた配合剤としての使用も含むことを意味する。本発明の剤及び上記各種成分の両方を使用し、且つ、上記各種成分の効果が増強される限り、それらの投与形態は限定されない。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００５７】
１．プロテイングルタミナーゼ溶液、トランスグルタミナーゼ溶液の調製
プロテイングルタミナーゼ溶液の調製は、Y. Kikuchi et al., Applied microbiology and biotechnology 78, 67-74(2008)に記載の方法に準じて行った。すなわち、Chryseobacterium proteolyticumのプロテイングルタミナーゼをコードする遺伝子（配列番号３で表されるポリヌクレオチド配列）を用いて発現プラスミドを作成し、Corynebacterium glutamicumに導入して、プロプロテイングルタミナーゼを分泌発現させ、プロテアーゼによる活性化後、これを精製し、リン酸緩衝液に溶解した。
トランスグルタミナーゼ溶液は、Streptomyces mobaraenseの培養上清から得られたトランスグルタミナーゼを、K.Yokoyama et al., Protein Expression and Purification 26 329-335(2002)に記載の方法に準じて精製し、リン酸緩衝液に溶解することにより、調製した。【００５８】
２．膨潤度の測定
凹部深さが２００μｍの生化学カウント用スライドグラス（日本ジェネティクス社製）の凹部に毛髪を固定し、凹部を被覆するようにカバーグラスをスライドグラス上に乗せて毛髪の直径を１０〜１４回測定し、その平均値を求めた（Ｄ０）。その後カバーグラスとスライドグラスとの隙間から試料を注入し、３分または５分間静置し、毛髪の直径を１０〜１４回測定し、その平均値を求めた（Ｄ1）。
試料としては、イオン交換水、リン酸緩衝液（ｐＨ６．２）、プロテイングルタミナーゼ溶液（６．２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．２）及び１％アンモニア水（ｐＨ１１．８）を使用した。  測定した毛髪の直径（Ｄ０およびＤ1）より、膨潤度を下記式により求めた。
膨潤度（％）＝（Ｄ１−Ｄ０）／Ｄ０×１００【００５９】
結果を表１および図１に示した。【００６０】
【表１】
2014061728.tif 000003
【００６１】
表１および図１の結果より、実施例１（プロテイングルタミナーゼ溶液）の毛髪の膨潤度は、３分後及び５分後の両方において、比較例１（イオン交換水）および比較例２（リン酸緩衝液）よりも高く、毛髪の膨潤剤として一般に使用されているアンモニア水と同程度であることが示された。【００６２】
３．毛髪損傷の観察
上記１の試験において、イオン交換水、プロテイングルタミナーゼ溶液または１％アンモニア水を注入してから３分後における毛髪の状態を観察した。各種試料に供した毛髪の顕微鏡画像（倍率：４００倍）を図２に示した。
その結果、アンモニア水を用いた場合（比較例３）は毛髪表面のキューティクルが毛羽立っていることが確認されたが、プロテイングルタミナーゼを用いた場合（実施例１）は、イオン交換水を用いた場合（比較例１）と同等に毛髪表面は全く損傷していないことが示された。
上記１及び２の結果より、プロテイングルタミナーゼは毛髪の損傷を引き起こすことなく、毛髪を効果的に膨潤させることが明らかとなった。【００６３】
４．パーマ処理毛に対するプロテイングルタミナーゼの反応性評価
＜１＞パーマ処理毛髪の調製
２０代の日本人女性の毛髪にパーマ処理を行い、その毛髪を実験試料とした。パーマ処理は、１）毛髪を３３℃のパーマ１液中に１５分間漬け、３５〜４０℃の水道水で１液を洗い流し、２）３３℃のパーマ２液中に１５分間漬け、３５〜４０℃の水道水で十分に洗い流すことで実施した。この１）、２）の連続操作を４回繰り返し、１５％ラウレス硫酸ナトリウム（エマールＥ２７Ｃ；花王株式会社）で毛髪を洗浄した後、３５〜４０℃の水道水で十分にすすいだ。緩衝液に漬け、時々攪拌しながら室温で１０分間処理した。櫛で毛髪の流れを整え、毛髪が重なり合わないようにつり下げて恒温恒湿室（２３℃・４０％Ｒ．Ｈ．）で乾燥させた。
使用したパーマ１液、パーマ２液、および緩衝液は以下の通りである。【００６４】
【表２】
2014061728.tif 000004
【００６５】
【表３】
2014061728.tif 000005
【００６６】
緩衝液：
40mMリン酸・40mM酢酸・40mMホウ酸・水酸化ナトリウム、pH4.5【００６７】
＜２＞生成する遊離アンモニア量の定量
アンモニアテストキット（和光純薬工業社製）を用いて、プロテイングルタミナーゼが上記パーマ処理毛髪に反応することにより生成する遊離アンモニア量を定量した。
０．２５ｇの上記パーマ処理毛髪の束に、表４記載の濃度のプロテイングルタミナーゼ溶液２ｍｌを添加し、３７℃で１時間反応させたサンプルのアンモニア量を測定した。結果を表４および図３に示す。アンモニア生成量は、プロテイングルタミナーゼ無添加の場合（比較例４）のアンモニア量を差し引いた値で示した。【００６８】
【表４】
2014061728.tif 000006
【００６９】
表４より、プロテイングルタミナーゼ溶液が０．０１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度であるとき、パーマ処理毛髪に対してプロテイングルタミナーゼが反応していることが示された。【００７０】
５．プロテイングルタミナーゼによる毛髪への有効成分（トランスグルタミナーゼ）浸透性向上評価
５ｇの上記パーマ処理毛髪の束に、表５記載のＡ液２ｍｌを添加し、サランラップ（登録商標）（旭化成社製）で包み、３７℃で３０分間反応させた。反応後、超純水で振り洗いを２回（各３０秒）行った後、表５記載のＢ液２ｍｌを添加し、サランラップで包み、３７℃で３０分間反応させた。反応後、超純水で振り洗いを２回（各３０秒）行った後、自然乾燥した。なお、Ａ液、Ｂ液として使用したプロテイングルタミナーゼ溶液およびトランスグルタミナーゼ溶液は、リン酸緩衝液でｐＨ６．０に調整した。
反応後の各毛束から毛髪を１０本ずつ採取し、レーザー寸法測定器（ＬＳ−７０１０ＭＲ：キーエンス社製）で各々の毛髪の長径および短径を測定した。その後、引張試験機（ＫＥＳ−Ｇ１：カトーテック社製）を用い、純水中で毛髪の引っ張り強度を測定した（測定長４０ｍｍ）。短径、長径および引っ張り強度の測定値より、長径、短径ともに８０μｍの毛髪１本あたりの強度を求め、１０本の毛髪の測定結果の平均値を比較した。結果を表５に示す。【００７１】
【表５】
2014061728.tif 000007
【００７２】
比較例５および比較例６を見ると、トランスグルタミナーゼの適用により、パーマ処理毛髪の引っ張り強度が１３．２（gf/p）から、１５．８（gf/p）へ上昇した。この結果は、トランスグルタミナーゼが毛髪に浸透、反応し、強度が上昇したことを示している。予めプロテイングルタミナーゼで処理した実施例６および７と比較例６とを比較すると、引っ張り強度が１５．８（gf/p）から、１８．２、１８．４（gf/p）へ上昇した。プロテイングルタミナーゼによってトランスグルタミナーゼの浸透度が向上し、トランスグルタミナーゼの反応性が向上することで強度が上昇した結果である。
この結果から、プロテイングルタミナーゼが、毛髪強度に対する有効成分であるトランスグルタミナーゼの毛髪への浸透性を向上させることが確認できた。【００７３】
６．プロテイングルタミナーゼによる毛髪への有効成分（ヘアコンディショナー）の浸透性向上評価
１ｇの毛髪（２０代の日本人女性の毛髪（通常毛）および上記パーマ処理毛髪）を５０ｍｌのリン酸緩衝液で、５分間３回洗浄した。その後、実施例８および実施例９については、各毛髪を４ｍｌのプロテイングルタミナーゼ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）に浸し、比較例７および比較例８は、各毛髪を４ｍｌのリン酸緩衝液に浸し、それぞれ３７℃、３０分間反応させた。反応後の各毛髪は、５０ｍｌのリン酸緩衝液で、５分間３回洗浄した後、水洗し自然乾燥した。
各毛髪１ｇあたり０．５ｇのヘアコンディショナー（「Ｐｒｏｐｏｌｉｎｅ」ヘアコンディショナー  カモミール＆ハニー、ＡＰＩＶＩＴＡ社製）を３０秒間塗布し、４０℃の水道水（流水）で３０秒間すすいだのち、恒温恒湿室（２５℃・４０％Ｒ．Ｈ．）で自然乾燥させた。
乾燥後の毛髪のしっとり感、なめらかさ、毛先のぱさつき感のなさ、毛先のまとまりについて、下記の評点で、男女５人のパネルによる官能評価を行った。
＜しっとり感＞
２点：強いしっとり感がある
１点：しっとり感がある
０点：しっとり感を感じない
−１点：乾いて感じられる
＜なめらかさ＞
２点：非常になめらか
１点：なめらか
０点：なめらかさを感じない
−１点：粗さを感じる
＜毛先のぱさつき感のなさ＞
２点：毛先が全くぱさつかない
１点：毛先がぱさつかない
０点：やや毛先のぱさつきがある
−１点：毛先が非常にぱさつく
＜毛先のまとまり＞
２点：毛先が非常によくまとまっている
１点：毛先がまとまっている
０点：やや毛先のまとまりに欠ける
−１点：毛先のまとまりが全くない
評価は、５人のパネルの評点を合計し、かかる合計点が１０〜８点の場合を◎とし、７〜５点の場合を○とし、４〜０点の場合を△とし、−１〜―５点の場合を×とした。結果を表６に示す。【００７４】
【表６】
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【００７５】
表６に示されるように、プロテイングルタミナーゼ溶液で処理した毛髪（実施例８および実施例９）は、プロテイングルタミナーゼ溶液で処理していない毛髪（比較例７および比較例８）に比較して、乾燥後の毛髪のしっとり感、なめらかさ、毛先のまとまりに優れ、ぱさつき感がなかった。これはプロテイングルタミナーゼ溶液で処理することにより、毛髪表面の親水性が向上し、コンディショニング成分（ステアラミドプロピルジメチルアミン、ベヘントリモニウムクロリド、クオタニウム−８０）の吸着が増加するとともに、ヘアコンディショナーの有効成分（パンテノール）が毛髪へより浸透した結果である。【００７６】
なお、使用したヘアコンディショナー（「Ｐｒｏｐｏｌｉｎｅ」ヘアコンディショナー  カモミール＆ハニー、ＡＰＩＶＩＴＡ社製）の成分は、以下の通りである。
水、セタノール、ステアラミドプロピルジメチルアミン、ベヘントリモニウムクロリド、セチルエステルズ、クオタニウム−８０、香料、クエン酸、ＢＧ、セテアレスー１２、ベンジルアルコール、フェノキシエタノール、パンテノール、グリセリン、ソルビン酸Ｋ、加水分解カラスムギ、酢酸トコフェロール、トコフェロール、ハチミスエキス、カミツレ花エキス、シロバナワタエキス、ローズマリー葉エキス、ブチルフェニルメチルプロパナール、セージ葉エキス、セイヨウオトギリソウ花/葉/茎エキス、クマリン、α−グルカンオリゴサッカリド、オニサルビア油、オレンジ果皮油【００７７】
７．プロテイングルタミナーゼによる皮膚への有効成分（ペプチド）の浸透性向上評価
皮膚への浸透性を評価するペプチドとしてグリシルグリシルグリシン（以下、「Gly-Gly-Gly」と表記する）（ペプチド研究所社製）を用いて、市販の人工培養皮膚（3次元培養ヒト皮膚モデル：TESTSKIN  LSE-high、東洋紡社製）に対するGly-Gly-Glyの浸透性評価を実施した。Gly-Gly-Glyは、高感度検出を可能とするためフルオレセインイソチオシアネート（FITC-I、同仁化学社製）を用いてフルオレセイン標識を行った。
培養皮膚はトランスウェル底部のポリカーボネート膜上に培養されており、６穴のアッセイプレート上にセットされる。アッセイプレートには培養皮膚の下部（真皮側）が浸るようにリン酸緩衝液(-)1.2mlを添加した。培養皮膚の上部（角質層側）にはアッセイリングを装着して、FITCラベル化Gly-Gly-Glyサンプルを添加し、一定時間インキュベートした後、培養皮膚を透過してリン酸緩衝液(-)に移動したFITCラベル化Gly-Gly-Glyの量を測定することにより透過性を評価した。
まずプロテイングルタミナーゼ溶液（4mg/ml）100μlを培養皮膚の上部に添加して30分間37℃でインキュベートし、その後、FITCラベル化Gly-Gly-Glyサンプル100μlを培養皮膚の上部に添加して、2、5、および20時間後に、培養皮膚を透過してリン酸緩衝液(-)に移動したFITCラベル化Gly-Gly-Glyの量を測定した。その比較対象として、プロテイングルタミナーゼ溶液の代わりにリン酸緩衝液(-)を培養皮膚の上部に添加した。蛍光強度は、励起波長492nm及び蛍光波長520nmの条件で測定した。蛍光強度の測定は、プレートリーダーSpectraMaxM2（モレキュラーデバイス社製）を用いて行った。これらの結果を図４に示した。【００７８】
図４に示されるように、プロテイングルタミナーゼで培養皮膚を処理した場合の方が、処理をしなかった培養皮膚を用いた場合よりもペプチドの透過性が向上することが明らかとなった。この結果により、ヒトの皮膚に対してプロテイングルタミナーゼを作用させることにより角質層の親水性が高まり、アミノ酸やペプチド等の親水性物質の皮膚への浸透性が向上することが示唆された。また、アミノ酸やペプチド等（上述したアシルアミノ酸、アシルペプチド及びそれらの誘導体を含む）はその種類に応じて皮膚や毛髪に対する有効成分となり得ることから、これらをプロテイングルタミナーゼと組み合わせて使用することは皮膚や毛髪に対して極めて有用であると考えられた。【００７９】
８．処方例１〜５
下記の表に示す処方で常法に従って調製されるパーマ前処理剤（処方例１）、パーマネントウェーブ用剤還元剤（処方例２）、酸化染毛剤（処方例３）、カラーリンス（処方例４）及びジェル状美白美容液（処方例５）は、いずれも毛髪、皮膚等に含まれるタンパク質の親水性向上に有用なものである。なお、各表に記載の各成分の配合量（表中の数値）は、処方全体を１００としたときの質量分率（％）である。【００８０】
【表７】
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【００８１】
【表８】
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【００８２】
【表９】
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【００８３】
【表１０】
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【００８４】
【表１１】
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【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明によれば、毛髪、皮膚等に含まれるタンパク質の親水性向上に有用な化粧料を提供することができる。特に、本発明によれば、毛髪の損傷を引き起こすことなく毛髪を効果的に膨潤させることができ、さらに毛髪の強度を効果的に向上させ得ることから、例えばパーマ剤やカラー剤等に有用な毛髪化粧料を提供することができる。また、本発明によれば、効果的にタンパク質の親水性を向上させる剤を提供することができ、加えて有効成分の組織への浸透を促進する剤も提供することができる。これらの剤は、化粧料のみならず医薬の分野においても有用である。【００８６】
本出願は、日本で出願された特願2012-229590（出願日：2012年10月17日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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