(57)【要約】  筋緊張性ジストロフィー特に耐糖能異常又は糖尿病を随伴した筋緊張性ジストロフィーに対する治療剤，及び筋緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常又は糖尿病の治療剤が開示されている。当該治療剤は，式(I)【式１】2014030624.tif 000024 〔式中，Ａはヒドロキシル基を表し，ｍとｎは互いに独立して１〜３の整数であり，ヒドロキシル基の個数を表す。〕で示されるtrans−スチルベン誘導体又はその塩を有効成分として含有する，筋緊張性ジストロフィー治療剤である。
2014030624.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（Ｉ），
【化１】
2014030624.tif 000020
〔式中，Ａはヒドロキシル基を表し，ｍとｎは互いに独立して１〜３の整数であり，ヒドロキシル基の個数を表す。〕で示されるtrans−スチルベン誘導体又はその塩を有効成分として含有する，筋緊張性ジストロフィー治療剤。
【請求項２】
一般式（Ｉ）においてｍ＋ｎが３又は４である，請求項１の筋緊張性ジストロフィー治療剤。
【請求項３】
一般式（Ｉ）においてｍ＋ｎが３である，請求項１の筋緊張性ジストロフィー治療剤。
【請求項４】
該trans−スチルベン誘導体が，次式（II），
【化２】
2014030624.tif 000021
で示されるtrans−レスベラトロールである，請求項１の筋緊張性ジストロフィーの治療剤。
【請求項５】
該筋緊張性ジストロフィーが，耐糖能異常又は糖尿病を伴うものである，請求項１〜４の何れかの筋緊張性ジストロフィー治療剤。
【請求項６】
該耐糖能異常又は糖尿病が，インスリン受容体蛋白質の発現におけるＢ型スプライシング変異体の比率[IR-B]／([IR-A]+[IR-B]）の低下を伴うものである，請求項５の治療剤。
【請求項７】
次の一般式（Ｉ），
【化３】
2014030624.tif 000022
〔式中，Ａはヒドロキシル基を表し，ｍとｎは互いに独立して１〜３の整数であり，ヒドロキシル基の個数を表す。〕で示されるtrans−スチルベン誘導体又はその塩を有効成分として含有する，筋緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常又は糖尿病の治療剤。
【請求項８】
一般式（Ｉ）においてｍ＋ｎが３又は４である，請求項７の筋緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常又は糖尿病の治療剤。
【請求項９】
一般式（Ｉ）においてｍ＋ｎが３である，請求項７の筋緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常又は糖尿病の治療剤。
【請求項１０】
該trans−スチルベン誘導体が，式（II），
【化４】
2014030624.tif 000023
で示されるtrans−レスベラトロールである，請求項７の筋緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常又は糖尿病の治療剤。
【請求項１１】
該筋緊張性ジストロフィーがインスリン受容体蛋白質の発現におけるＢ型スプライシング変異体の比率[IR-B]／([IR-A]+[IR-B]）の低下を伴うものである，請求項７〜１０の何れかの筋緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常又は糖尿病の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，筋緊張性ジストロフィー又はその随伴疾患の治療剤に関し，詳しくは，trans−スチルベン誘導体，特にtrans−レスベラトロール又はその誘導体を有効成分として含有する，緊張性ジストロフィー治療剤，特に耐糖能異常又は糖尿病を伴う筋緊張性ジストロフィーの治療剤，及び緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常又は糖尿病の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
trans−スチルベン，【０００３】
【化１】
2014030624.tif 000003
【０００４】
の誘導体の一種であるtrans−レスベラトロール（３，５，４’−トリヒドロキシ−trans−スチルベン），【０００５】
【化２】
2014030624.tif 000004
【０００６】
は，天然に存在するポリフェノールである。trans−レスベラトロールは，ブドウの果皮の他，ピーナッツの皮，ラスベリー，クワの実，イタドリ等にも含まれており，食経験が豊富で安全性の高い物質である。グラス一杯の赤ワインには約６４０μｇの，一握りのピーナッツには約７３μｇのtrans−レスベラトロールが含まれている。trans−レスベラトロールは，植物体において，昆虫の忌避や病原菌の殺菌を引き起こすフィトアレキシンとして機能する物質であり，抗酸化物質でもある。【０００７】
trans−レスベラトロールはまた，抗変異原性及び抗炎症活性等の薬理学的活性を有し，また前骨髄性白血病細胞の分化を抑制し，発ガンの初発期（イニシエーション），促進期（プロモーション），悪性化（プログレッション）の３段階すべてを抑制する化学抗癌作用を有しており，その抗癌作用の濃度は，0.7〜5.7μｇ／ｍＬであることが報告されている（非特許文献１）。その他，trans−レスベラトロールは，一酸化窒素の産生促進を介した血管内皮機能改善及び血管拡張作用（特許文献１），低密度リポ蛋白質の酸化阻害作用等を介した抗動脈硬化作用（非特許文献２），ペルオキシソーム増殖応答性受容体（ＰＰＡＲ）の活性化を介した循環器系障害の進展の抑制作用（特許文献２），リポキシゲナーゼの活性阻害を介した血栓予防作用（特許文献３），脱アセチル化酵素（Sirt1）の活性化を介した脂肪細胞の蓄積を防止する作用（特許文献４），中性脂肪吸収阻害作用（特許文献５），肝細胞コレステロール合成阻害活性を介した高コレステロール血症の予防作用（特許文献６），ＡＭＰキナーゼの活性化等を介した脂肪代謝促進作用（特許文献７），サーチュイン活性の増強を介した視覚機能障害の改善作用（特許文献８），細胞内でのβ−アミロイドの分解促進等を介したアルツハイマー抑制作用（特許文献９，非特許文献３及び非特許文献４），サーチュイン活性の増強を介した酵母での延命効果（非特許文献５），骨芽細胞の増殖促進作用（非特許文献６）等，多くの生理活性，効果を示すことが知られている。【０００８】
更に，trans−レスベラトロールは，サーチュイン活性の増強を介した肥満及びインシュリン耐性障害抑制作用（特許文献１０），アディポネクチンの産生促進作用（特許文献１１），血糖値の低下作用（特許文献１２）等の生理活性を有することが知られており，２型糖尿病患者のインスリン感受性を改善する効果を有することも知られている（非特許文献７）。また，trans−レスベラトロールによるインスリン感受性の改善は，酸化ストレスの抑制及びAkt経路の活性化によるものであることが示唆されている（非特許文献７）。【０００９】
近年，trans−レスベラトロールは，survival motor neuron-2（SMN2）遺伝子を含む，種々の遺伝子のmRNAの選択的スプライシングのパターンに影響を与えることが報告されている。例えば，survival motor neuron-2 (SMN2)遺伝子の場合，エクソン７を欠くmRNAとエクソン７を有するmRNAの２種類のスプライシング変異体が存在するが，trans−レスベラトロールは，後者の比率を高める効果を有することが知られており（非特許文献８，非特許文献９），trans−レスベラトロールの，スプライシング異常を原因とする疾患の治療薬としての利用可能性が示唆されている（非特許文献８）。【００１０】
筋緊張性ジストロフィーは，進行性の筋萎縮と筋力低下を特徴とする常染色体優性遺伝を示す遺伝性ミオパチーであり，筋緊張現象を合併する症候群である。筋緊張性ジストロフィーの患者は，高頻度で耐糖能異常が認められ，糖尿病を併発する。時には，本疾患が見逃されて糖尿病と診断されることもある。発症年齢は乳児期から成人に至る広い範囲を示す。症状に個人差が大きく，「ぐにゃぐにゃ乳児」として出生する先天性筋緊張性ジストロフィーから一生発症に気づかず過ごす軽症者まである。乳児期に発症したものは精神遅延を伴う重症型が多い。重症型は母親が保因者の場合に生じやすい。【００１１】
筋緊張性ジストロフィーはＩ型とII型に分類される。Ｉ型の患者では，第19染色体に存在するミオトニンプロテインキナーゼ（DMPK）遺伝子に異常が見出される。DMPK遺伝子の3’側非翻訳領域には不安定CTG反復領域があり，健常者ではその反復回数が5〜37回程度であるのに対し，Ｉ型の患者では，通常100回以上である。一般にこの反復回数と重症度は正の相関が認められ，重症者あるいは先天性筋緊張性ジストロフィー患者では反復回数は1000回以上に達する。II型の患者では，第３染色体に存在するＺｎフィンガー蛋白質９（ZNF9）遺伝子に異常が見出される。ZNF9遺伝子のイントロン１には不安定CCTG反復領域があり，健常者ではその反復回数が4〜11回程度であるのに対し，II型の患者では通常75回以上であり，11,000回以上に達する場合もある。【００１２】
Ｉ型の患者では，DMPK遺伝子が転写されることにより生じるCUG反復回数が異常に増加したmRNAが，またII型の患者ではZNF9遺伝子が転写されることにより生じるCCUG反復回数が異常に増加したmRNAが，細胞質に移行せず細胞核内に留まることが知られている（非特許文献１０）。また，この細胞核内に滞留した異常なmRNAは，mRNAのスプライシングを制御する因子の一つであるCUG結合蛋白質（CUGBP1）と結合して存在することが知られている（非特許文献１１）。このようなCUGBP1の細胞核内での異常なmRNAとの結合は，mRNAのスプライシングの制御に影響を与えると考えられる。事実，本疾患の患者では，トロポニンＴ（非特許文献１２），筋特異性Ｃｌ−チャネル（非特許文献１３），微小管結合蛋白質タウ（非特許文献１４），ミオチュブラリン関連蛋白質1（非特許文献１５），インスリン受容体（非特許文献１６），BIN1（非特許文献１７）等で，スプライシング異常に起因する異常が生じることが知られている。特に，筋緊張性ジストロフィーの患者では，BIN1遺伝子が，スプライシング異常によりエクソン１１がスキップされたmRNAが蛋白質に翻訳され，これが患者の筋力低下の一因となっていると考えられている（非特許文献１７）。【００１３】
本疾患の患者で高頻度に認められる耐糖能異常及び糖尿病は，インスリン受容体蛋白質をコードするmRNAのスプライシング異常に起因すると考えられている（非特許文献１６）。インスリン受容体蛋白質をコードするmRNAには，エクソン（Exon）１１を欠くＡ型（IR-A型）とエクソン１１を有するＢ型（IR-B型）の２種類のスプライシング変異体が存在する（図１）。インスリン感受性はIR-BがIR-Aと比較して高い。本疾患の患者では健常人と比較して，インスリン感受性が高いIR-Bの発現量が特に骨格筋で低下しており，これによりインスリンに対する感受性が低下し，耐糖能異常となると考えられている（非特許文献１６）。健常人では，骨格筋においてこれら両変異体のうちIR-Bの発現比率〔[IR-B]/（[IR-A]+[IR-B]）×100%〕は60〜80%であるが，本疾患の患者では，この比率が4〜40%程度に低下する（非特許文献１６）。【００１４】
筋緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常及び糖尿病に対しては，メトフォルミンやチアゾリジン系のピオグリタゾン等の糖尿病治療薬が患者に投与されている（非特許文献１８，１９）。これらの薬剤は，ＡＭＰキナーゼ（AMPK）の活性化剤であり，また，筋緊張性ジストロフィー患者由来の細胞において，エクソン１１を有するIR-B型産物の比率を上昇若しくは変化させることが知られている（特許文献１３）。【００１５】
上記のように，筋緊張性ジストロフィーの発症メカニズムの解明は進んでいるが，本疾患に対する有効な治療法は存在せず，患者には食事療法等の対処療法が施されている現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２０１２−４１２９６
【特許文献２】特開２００３−３００９０４
【特許文献３】特開Ｓ６１−１７１４２７
【特許文献４】ＷＯ２００８／１３６１７３
【特許文献５】特開２０１１−１３２１４７
【特許文献６】特開２００１−７２５８３
【特許文献７】特開２００６−２７３８３４
【特許文献８】特表２００８−５３８２１５
【特許文献９】ＷＯ２００１／０３４１３８
【特許文献１０】特表２００７−５２７４１８
【特許文献１１】特開２００８−２５５０４０
【特許文献１２】特開２００７−１２６３９０
【特許文献１３】ＷＯ２０１１／１２１１０９
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Jang M. etal., Science. 275. 218-9 (2003)
【非特許文献２】Frankel EN. etal., Lancet. 341. 454-7 (1993)
【非特許文献３】Marambaud P.et al., J Biol Chem. 280. 37377-82 (2005)
【非特許文献４】Jang MH. etal., Biol Pharm Bull. 30. 1130-4 (2007)
【非特許文献５】Howitz KT.et al., Nature. 425. 191-6 (2003)
【非特許文献６】Mizutani K.et al., Biochem Biophys Res Commun. 253. 859-63, (1998)
【非特許文献７】Brasnyo P. et al., Br J Nutr. 106. 383-9 (2011)
【非特許文献８】Markus MA. et al., Pros One. 6. e28926 (2011)
【非特許文献９】Sakla MS. etal., Hum Genet. 122. 635-43 (2008)
【非特許文献１０】Timchenko NA. et al., J Biol Chem. 276. 7820-6 (2001)
【非特許文献１１】Wansink DG. et al., MolCell Biol. 23. 5489-501 (2003)
【非特許文献１２】Philips AV. et al., Science 280. 737-41 (1998)
【非特許文献１３】Charlet-BN. et al., Mol Cell. 10. 45-53 (2002)
【非特許文献１４】Sergeant N. et al., Hum Mol Genet. 10. 2143-55 (2001)
【非特許文献１５】Buj-Bello A. et al., Hum Mol Genet. 11. 2292-307 (2002)
【非特許文献１６】Savkur RS. et al., Nat Genet. 29. 40-7. (2001)
【非特許文献１７】Fugier C. etal., Nature Med. 17. 720-5 (2011)
【非特許文献１８】Kouki T. et al., Diabet Med. 22. 346-7 (2005)
【非特許文献１９】Abe H. etal., Endocr J. 56. 911-3 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上記背景の下で，本発明の目的は，筋緊張性ジストロフィーに対する治療剤を提供することであり，特に耐糖能異常又は糖尿病を随伴した筋緊張性ジストロフィーに対する治療剤，及び筋緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常又は糖尿病の治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記目的に向けた研究において，本発明者らは，trans−スチルベン誘導体の一種であるtrans−レスベラトロールが，インスリン受容体mRNAの選択的スプライシングに影響を与え，それによりエクソン１１を欠くＡ型（IR-A）とエクソン１１を有するＢ型（IR-B）の２種類のスプライシング変異体の比率を変化させ，インスリンに対する感受性がより高いIR-Bの発現比率を増加させることができることを見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を提供する。【００２０】
１．次の一般式（Ｉ），【００２１】
【化３】
2014030624.tif 000005
【００２２】
〔式中，Ａはヒドロキシル基を表し，ｍとｎは互いに独立して１〜３の整数であり，ヒドロキシル基の個数を表す。〕で示されるtrans−スチルベン誘導体又はその塩を有効成分として含有する，筋緊張性ジストロフィー治療剤。
２．一般式（Ｉ）において，ｍ＋ｎが３又は４である，上記１の筋緊張性ジストロフィー治療剤。
３．一般式（Ｉ）において，ｍ＋ｎが３である，上記１の筋緊張性ジストロフィー治療剤。
４．該trans−スチルベン誘導体が，次式（II），【００２３】
【化４】
2014030624.tif 000006
【００２４】
で示されるtrans−レスベラトロールである，上記１の筋緊張性ジストロフィーの治療剤。
５．該筋緊張性ジストロフィーが，耐糖能異常又は糖尿病を伴うものである，上記１〜４の何れかの筋緊張性ジストロフィー治療剤。
６．該耐糖能異常又は糖尿病が，インスリン受容体蛋白質をコードするmRNAにおけるＢ型スプライシング変異体の発現比率[IR-B]／([IR-A]+[IR-B]）の低下を伴うものである，上記５の治療剤。【００２５】
７．次の一般式（Ｉ），【００２６】
【化５】
2014030624.tif 000007
【００２７】
〔式中，Ａはヒドロキシル基を表し，ｍとｎは互いに独立して１〜３の整数であり，ヒドロキシル基の個数を表す。〕で示されるtrans−スチルベン誘導体又はその塩を有効成分として含有する，筋緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常又は糖尿病の治療剤。
８．一般式（Ｉ）において，ｍ＋ｎが３又は４である，上記７の筋緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常又は糖尿病の治療剤。
９．一般式（Ｉ）において，ｍ＋ｎが３である，上記７の筋緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常又は糖尿病の治療剤。
１０．該trans−スチルベン誘導体が，式（II），【００２８】
【化６】
2014030624.tif 000008
【００２９】
で示されるtrans−レスベラトロールである，上記７の筋緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常又は糖尿病の治療剤。
１１．該耐糖能異常又は糖尿病が，インスリン受容体蛋白質をコードするmRNAにおけるＢ型スプライシング変異体の発現比率[IR-B]／([IR-A]+[IR-B]）の低下を伴うものである，上記７〜１０の何れかの筋緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常又は糖尿病の治療剤。【００３０】
１２．筋緊張性ジストロフィーの治療のための式（Ｉ）【００３１】
【化７】
2014030624.tif 000009
【００３２】
〔式中，Ａはヒドロキシル基を表し，ｍとｎは互いに独立して１〜３の整数であり，ヒドロキシル基の個数を表す。〕で示されるtrans−スチルベン誘導体又はその塩の使用。【００３３】
１３．一般式（Ｉ）においてｍ＋ｎが３又は４である，上記１２の使用。
１４．一般式（Ｉ）においてｍ＋ｎが３である，上記１２の使用。
１５．該trans−スチルベン誘導体が，式（II），【００３４】
【化８】
2014030624.tif 000010
【００３５】
で示されるtrans−レスベラトロールである，上記１２の使用。
１６．該筋緊張性ジストロフィーが，耐糖能異常又は糖尿病を伴うものである，上記１２〜１５の何れかの使用。
１７．該耐糖能異常又は糖尿病が，インスリン受容体蛋白質をコードするmRNAにおけるＢ型スプライシング変異体の発現比率[IR-B]／([IR-A]+[IR-B]）の低下を伴うものである，上記１６の使用。【００３６】
１８．筋緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常又は糖尿病の治療のための，次の一般式（Ｉ），【００３７】
【化９】
2014030624.tif 000011
【００３８】
〔式中，Ａはヒドロキシル基を表し，ｍとｎは互いに独立して１〜３の整数であり，ヒドロキシル基の個数を表す。〕で示されるtrans−スチルベン誘導体又はその塩の使用。
１９．一般式（Ｉ）においてｍ＋ｎが３又は４である，上記１８の使用。
２０．一般式（Ｉ）においてｍ＋ｎが３である，上記１８の使用。
２１．該trans−スチルベン誘導体が，式（II），【００３９】
【化１０】
2014030624.tif 000012
【００４０】
で示されるtrans−レスベラトロールである，上記１８の使用。
２２．該耐糖能異常又は糖尿病が，インスリン受容体蛋白質をコードするmRNAにおけるＢ型スプライシング変異体の発現比率[IR-B]／([IR-A]+[IR-B]）の低下を伴うものである，上記１８〜２１の何れかの使用。【００４１】
２３．筋緊張性ジストロフィーの治療方法であって，次の一般式（Ｉ），【００４２】
【化１１】
2014030624.tif 000013
【００４３】
〔式中，Ａはヒドロキシル基を表し，ｍとｎは互いに独立して１〜３の整数であり，ヒドロキシル基の個数を表す。〕で示されるtrans−スチルベン誘導体又はその塩の有効量を筋緊張性ジストロフィーの患者に投与することを含んでなる方法。
２４．一般式（Ｉ）において，ｍ＋ｎが３又は４である，上記２３の治療方法。
２５．一般式（Ｉ）において，ｍ＋ｎが３である，上記２３の治療方法。
２６．該trans−スチルベン誘導体が，次式（II），【００４４】
【化１２】
2014030624.tif 000014
【００４５】
で示されるtrans−レスベラトロールである，上記２３の治療方法。
２７．該筋緊張性ジストロフィーが，耐糖能異常又は糖尿病を伴うものである，上記２３〜２６の治療方法。
２８．耐糖能異常又は糖尿病が，インスリン受容体蛋白質をコードするmRNAにおけるＢ型スプライシング変異体の発現比率[IR-B]／([IR-A]+[IR-B]）の低下を伴うものである，上記２６の治療方法。【００４６】
２９．筋緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常又は糖尿病の治療方法であって，次の一般式（Ｉ），【００４７】
【化１３】
2014030624.tif 000015
【００４８】
〔式中，Ａはヒドロキシル基を表し，ｍとｎは互いに独立して１〜３の整数であり，ヒドロキシル基の個数を表す。〕で示されるtrans−スチルベン誘導体又はその塩の有効量を筋緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常又は糖尿病の患者に投与することを含んでなる方法。
３０．一般式（Ｉ）においてｍ＋ｎが３又は４である，上記２９の治療方法。
３１．一般式（Ｉ）においてｍ＋ｎが３である，上記２９の治療方法。
３２．該trans−スチルベン誘導体が，式（II），【００４９】
【化１４】
2014030624.tif 000016
【００５０】
で示されるtrans−レスベラトロールである，上記２８の治療方法。
３３．該耐糖能異常又は糖尿病が，インスリン受容体蛋白質をコードするmRNAにおけるＢ型スプライシング変異体の発現比率[IR-B]／([IR-A]+[IR-B]）の低下を伴うものである，上記２９〜３２の何れかの治療方法。
【発明の効果】
【００５１】
本発明によれば，筋緊張性ジストロフィーの症状，特に筋力低下の改善又は防止，及び糖尿病を随伴した該筋緊張性ジストロフィーの症状の緩解，取り分け，筋緊張性ジストロフィーに随伴した糖尿病の症状を改善する治療剤を得ることができ，またそれによりそれら疾患を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は，インスリン受容体蛋白質をコードするmRNAのスプライシング変異を示す模式図である。
【図２】図２は，Hela細胞の全mRNAからPCRにより増幅させて得た，インスリン受容体蛋白質をコードするmRNAにおけるスプライシング変異体のDNA断片の解析結果を示す図面代用写真である。レーン１は通常培養のHela細胞から，レーン２はDMSOを添加して培養したHela細胞から，レーン３は100 μMtrans-レスベラトロールを含有する培地で培養したHela細胞から，それぞれ得た全mRNAの解析結果を示す。レーンＭは分子量マーカーを示す。（A）はIR-A，（B）はIR-Bに由来するDNA断片を，それぞれ示す。
【図３】図３は，Hela細胞におけるtrans-レスベラトロールの濃度とIR-Bに由来するDNA断片の比率〔IR-B/([IR-A]+[IR-B])×100(%)〕の相関を示す図である。縦軸はIR-Bに由来するDNA断片の比率（%）を，横軸はレスベラトロールの濃度（μM）を，それぞれ示す。
【図４】図４は，筋緊張性ジストロフィー患者由来の繊維芽細胞におけるtrans−レスベラトロールの濃度とIR-Bに由来するDNA断片の比率〔IR-B/([IR-A]+[IR-B])×100(%)〕の相関を示す図である。縦軸はIR-Bに由来するDNA断片の比率（%）を，横軸はレスベラトロールの濃度（μM）を，それぞれ示す。
【図５】図５は，筋緊張性ジストロフィー患者由来の繊維芽細胞におけるtrans−レスベラトロールの濃度とBIN1のエクソン11＋型変異体に由来するDNA断片の比率〔[エクソン11＋型産物]/([エクソン11＋型産物]+[エクソン11−型産物])×100(%)〕の相関を示す図である。縦軸はIR-Bに由来するDNA断片の比率（%）を，横軸はレスベラトロールの濃度（μM）を，それぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本明細書において，「筋緊張性ジストロフィー」の語は，ミオトニンプロテインキナーゼ（DMPK）遺伝子の不安定CTG反復領域の異常な増幅が認められるＩ型筋緊張性ジストロフィーと，Ｚｎフィンガー蛋白質９（ZNF9）遺伝子の不安定CCTG反復領域の異常な増幅が認められるII型筋緊張性ジストロフィーのいずれをも含み，これに限らず，筋緊張性ジストロフィーと診断される全ての症状を包含する。
【００５４】
本明細書において，「耐糖能異常」の語は，経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）において正常型と糖尿病型の中間に位置する前糖尿病群をいう。ここに，経口ブドウ糖負荷試験は，世界保健機関（ＷＨＯ）の推奨する基準に従い，成人につき８〜１２時間の絶食後の，及びこれに続く７５ｇのブドウ糖の経口投与の２時間後における，静脈血中のブドウ糖濃度の測定により行われ，次の表により，患者が正常，耐糖能異常，及び糖尿病の何れの群に属するかが判定される。
【００５５】
【表１】
2014030624.tif 000017
【００５６】
本発明において，trans−スチルベン誘導体は，次の一般式（I）
【００５７】
【化１５】
2014030624.tif 000018
【００５８】
〔式中，Ａはヒドロキシル基を表し，ｎとｍは互いに独立して１〜３の整数であり，ヒドロキシル基の個数を表す。〕で示され，塩の形態のものも包含する。
【００５９】
より好ましくは，ｍ＋ｎは３又は４であり，更に好ましくはｍ＋ｎは３であり，特に好ましくは，trans−スチルベン誘導体は，次式（II），
【００６０】
【化１６】
2014030624.tif 000019
【００６１】
で示されるtrans−レスベラトロール又はその塩である。
【００６２】
trans−スチルベン誘導体の塩の形態には特に限定はないが，例えば，元のtrans−スチルベン誘導体を含有する溶液を適当な塩基（例えば，水酸化ナトリウム）で中和して得られる塩が挙げられ，塩を形成したtrans−スチルベン誘導体と遊離trans−スチルベン誘導体との混合物であってよい。
【００６３】
本発明の治療剤は，該筋緊張性ジストロフィー患者に投与してその症状を緩解するために，特に，耐糖能異常又は糖尿病を伴う該筋緊張性ジストロフィー患者を治療するために用いることができ，また筋緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常又は糖尿病を有する患者の治療に用いることができる。本発明の治療剤は，インスリン受容体蛋白質をコードするmRNAにおけるエクソン１１を欠くＡ型（IR-A）とエクソン１１を有するＢ型（IR-B）の２種類のスプライシング変異体の総発現量に対するＢ型変異体（IR-B）の発現比率が正常に比べて減少している患者に投与することにより，IR-Bの発現比率[IR-B]／([IR-A]+[IR-B]）を増加させて正常に近づけることにより，耐糖能を改善させる。
【００６４】
筋緊張性ジストロフィー患者においては，BIN1（bridging integrator 1）遺伝子が，スプライシング異常によりエクソン１１がスキップされたmRNAが優勢に翻訳されており，これが患者の筋力低下の一因となっていると考えられている。本発明の治療剤は，BIN1をコードするmRNAにおいて，エクソン１１を欠く異常型ｍRNA（エクソン11−型変異体）の比率を減じ，エクソン１１を有する正常型ｍRNA（エクソン11＋型変異体）の比率を上昇させることができるので，耐糖能の改善のみならず，患者の筋力低下を防止することもできる。
【００６５】
本発明における治療剤は，有効成分であるtrans−レスベラトロール等のtrans−スチルベン誘導体を薬剤学的に許容される賦形剤その他の添加剤と共に，適宜の経口投与用剤又は坐剤の形態に製剤化して患者に投与することができる。また，注射剤等の静脈注射又は皮下注射等の非経口投与用剤とし，患者に投与してもよい。
【００６６】
本発明において，１日当たり投与される有効成分の量は，患者の症状により適宜調整される。経口投与溶剤又は坐剤の場合，一般的には１ｍｇ〜１ｇ／日の範囲とすればよく，注射剤の場合は，通常，０．１ｍｇ〜１００ｍｇ／日とすればよいが，これに限られず，適宜増減することができる。
【００６７】
経口投与用製剤の場合，錠剤，顆粒剤，カプセル剤，散剤等，任意の形態とすることができる。製剤の製造は，主薬であるポリフェノールに，製剤分野の当業者に知られている賦形剤，結合剤，滑沢剤，崩壊剤，湿潤剤その他から，採用する製剤の種類に応じて適宜選択して配合し，常法に従って行えばよい。
【００６８】
賦形剤としては，例えば乳糖，白糖，Ｄ−マンニトール，デンプン，結晶セルロース，軽質無水ケイ酸が挙げられ，結合剤としては，例えば，結晶セルロース，白糖，Ｄ−マンニトール，デキストリン，ヒドロキシプロピルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，ポリビニルピロリドン等の高分子化合物が挙げられ，滑沢剤としては，例えば，ステアリン酸マグネシウム，ステアリン酸カルシウム，タルク，及びコロイドシリカが挙げられ，崩壊剤としては，例えば，デンプン，カルボキシメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースカルシウム，クロスカルメロースナトリウム，及びカルボキシメチルスターチナトリウムが挙げられ，湿潤剤としては，例えば，グリセリン，ブチレングリコール，プロピレングリコール，ソルビトール，及びトリアセチンが挙げられるが，これらに限られない。
【００６９】
坐剤の場合，油脂性基剤（カカオ脂，ハードファット），水溶性基剤（マクロゴール，ソフトゼラチン）その他の適宜の基剤に，必要に応じ乳化剤，懸濁化剤などを加え，これに有効成分であるtrans−レスベラトロール等のtrans−スチルベン誘導体を加え，混和して均等にした後，溶解法，冷圧法又は手工法によって，適当な形状とすればよい。
【００７０】
注射剤の場合，有効成分を注射用水等の水性基剤又は注射用に許容される油性基剤に溶解又は分散させて，静脈注射用又は皮下注射用の注射剤とすればよい。必要に応じて，緩衝剤，ｐＨ調整剤，等張化剤，溶解補助剤，懸濁化剤，安定化剤等の添加剤を適宜加えることができる。
【００７１】
注射剤用の場合，水性基剤の例としては，注射用水及びリンゲル液等の輸液が挙げられ；油性基剤の例としては，プロピレングリコール，ポリエチレングリコール，ゴマ油，ダイズ油，トウモロコシ油，ラッカセイ油，綿実油，オリーブ油，プロピレングリコール脂肪酸エステル等が挙げられ；緩衝剤の例としては，リン酸塩，酢酸塩，炭酸塩，クエン酸塩，ホウ酸塩，グルタミン酸塩，イプシロンアミノカプロン酸塩，トリス緩衝液等の緩衝液等が挙げられ；ｐＨ調整剤の例としては，塩酸，リン酸，硫酸，炭酸等の無機酸，酢酸，酒石酸，乳酸，クエン酸，酒石酸，コハク酸等の有機酸；水酸化ナトリウム等の無機塩基；クエン酸ナトリウム，酒石酸ナトリウム等の有機塩基が挙げられ；等張化剤の例としては，塩化ナトリウム等の無機塩類；Ｄ−マンニトール，ソルビトール，キシリトール等の糖アルコール；フルクトース，グルコース，ガラストース，リボース，キシロース，マンノース，マルトトリオース，マルトテトラオース等の糖類；グリシン，アルギニン等のアミノ酸が挙げられ；溶解補助剤の例としては，ポリエチレングリコール，プロピレングリコール，Ｄ−マンニトール，安息香酸ベンジル，エタノール，トリスアミノメタン，コレステロール，トリエタノールアミン，炭酸ナトリウム，クエン酸ナトリウム，レシチンや，ポリソルベート８０等の非イオン界面活性剤が挙げられ；懸濁化剤の例としては，ステアリルトリエタノールアミン，ラウリル硫酸ナトリウム，ラウリルアミノプロピオン酸，レシチン，モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤や，ポリビニルアルコール，ポリビニルピロリドン，カルボキシメチルセルロースナトリウム，メチルセルロース，ヒドロキシメチルセルロース等が挙げられ，安定化剤の例としては，アルブミン，グロブリン，ゼラチン，ソルビトール，エチレングルコール又はプロピレングリコール，アスコルビン酸等が挙げられる。
【実施例】
【００７２】
以下，実施例をして本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。【００７３】
〔trans−レスベラトロールを含有する培地でのHeLa細胞の培養〕
12ウェルプレートの各ウェルに2.0×105
個のHeLa細胞を播種し，5% FBS（Gibco），及び1% ABAM （antibiotic-antimycotic
mixture，Invitrogen）を含むDMEM（D-MEM High Glucose; Wako）を用いて，37℃，5% CO2存在下で一晩培養した。trans−レスベラトロール（Wako）を200mMの濃度でDMSOに溶解させ，200mM trans−レスベラトロール溶液とした。これをDMSOで2段階希釈して，10〜200 mMの濃度のレスベラトロール溶液を作成した。【００７４】
培地を除去し，細胞をPBSで2回洗浄した後，5% FBS（Gibco）を含むDMEM培地（D-MEM
High Glucose, Wako）を各ウェルに1mLずつ加えた。次いで，10〜200mMの濃度のレスベラトロール溶液を，レスベラトロールの培養液中での終濃度が10〜200μMとなるように，1ウェル当たり1μL添加した。コントロールとして，DMSOを1ウェル当たり1μL添加したものを置いた。軽く振り混ぜた後，37℃，5% CO2存在下で細胞を24時間培養した。【００７５】
〔trans−レスベラトロールを含有する培地での筋緊張性ジストロフィー患者由来の繊維芽細胞の培養〕
6ウェルゼラチンコートプレート（Iwaki）の各ウェルに2.0×105 個の筋緊張性ジストロフィー患者由来の繊維芽細胞（GM04691, Criell Cell Repositories）を播種した。この細胞は，Ｉ型の筋緊張性ジストロフィーに罹患した４才女児[白色人種]から採取された繊維芽細胞である。細胞を，10% FBS（Gibco），及び1% ABAM （antibiotic-antimycotic
mixture，Invitrogen）を含むDMEM（D-MEM High Glucose; Wako）を用いて，37℃，5% CO2存在下で70%コンフルエントとなるまで培養した。【００７６】
培地を除去し，細胞をPBSで2回洗浄した後，5% FBS（Gibco）を含むDMEM培地（D-MEM
High Glucose, Wako）を各ウェルに1 mLずつ加えた。次いで，10〜100 mMの濃度のレスベラトロール溶液を，レスベラトロールの培養液中での終濃度が10〜100μMとなるように，1ウェル当たり1μL添加した。コントロールとして，DMSOを1ウェル当たり1μL添加したものを置いた。軽く振り混ぜた後，37℃，5% CO2存在下で細胞を24時間培養した。【００７７】
〔インスリン受容体蛋白質をコードするmRNAのスプライシング解析〕
各ウェルから細胞を回収し，常法により全RNAを精製した。500 ngの全RNAを純水で6μLの容量となるように溶解し，これに20×random hexamer primersを2μL，2.5 mM dNTP mixを5μL添加し，65℃で5分間加熱した後，25℃で10分間静置した。次いで，M-MLV
RT（Invitrogen）を1μL，RNase out（Invitrogen）を1μL，0.1 M DTTを1μL，5×First strand Bufferを4μL添加し，37℃で55分間反応させた後，70℃で15分間加熱し，cDNAを合成した。【００７８】
合成したcDNA 2μLに対し，10×Ex Taq Bufferを2μL，2.5 mM dNTP mixを1.62μL，10 pM プライマーIR C10F（配列番号１）溶液を1μL，10 pM プライマーIR C12R（配列番号２）溶液を1μL，Ex Taq ポリメラーゼを0.5 Unitを添加し，純水を加えて液量を20μLに調製した後，PCRに供し，インスリン受容体cDNAのエクソン10〜12にかけての領域を含むDNA断片を増幅した（図１）。PCRは，反応混合物を94℃で3分加熱後，（94℃30秒，60℃30秒，72℃90秒）の条件で28回反応させ，最後に72℃で3分加熱することにより行った。【００７９】
増幅したDNA断片をAgilent 2100 Bioanalyzer（Agilent technology），DNA1000 LabChip kit（Agilent technology），及び解析ソフトとして2100 Expet（Agilent technology）を用いて解析し，増幅したDNA断片中に含まれるIR-A由来のDNA断片（IR-A型産物）とIR-B由来のDNA断片（IR-B型産物）との比率を算出した。【００８０】
予め，通常に培養したHeLa細胞について，上記のインスリン受容体蛋白質をコードするmRNAにおけるスプライシング解析を行ったところ，エクソン１１を欠くＡ型（IR-A）とエクソン１１を有するＢ型（IR-B）の２種類のスプライシング変異体に由来するDNA断片がほぼ同等に増幅されることがわかった（図2レーン1）。この結果は，HeLa細胞がIR-AとIR-Bの２種のスプライシング変異体を発現していることを示す。なお，PCRにより増幅させた，IR-A型産物（129 bp，図１バンドＡ）及びIR-B型産物（165 bp，図１バンドＢ）については，それぞれDNAシークエンシングを行い，IR-A及びIR-B由来のDNA断片であることを確認した。IR-A型産物及びIR-B型産物の配列番号を，それぞれ配列番号３及び配列番号４で示した。【００８１】
上記の通常に培養したHeLa細胞におけるIR-Aに対するIR-B型産物の比率は，DMSOを添加した培地で培養したHeLa細胞では変化しなかった（図２，レーン２）。一方，trans−レスベラトロールを100 μMの濃度で含有する培地で培養したHeLa細胞では，IR-A型産物に対するIR-B型産物の比率が増加した（図２，レーン３）。また，IR-B型産物の比率（Ｂ型スプライシング変異体発現比率）を[IR-B]/([IR-A]+[IR-B])×100(%)で表わしたとき，IR-B型産物の比率は，培地中のtrans−レスベラトロールの濃度が0〜200 μMの範囲であるとき，その濃度に依存して増加した（図３）。培地がtrans−レスベラトロールを含まない場合，IR-B型産物の比率は約50%であったが，培地中のtrans−レスベラトロールの濃度が200 μMの場合，その比率は約75%となった（図３）。【００８２】
次いで，筋緊張性ジストロフィー患者由来の繊維芽細胞について，上記のインスリン受容体蛋白質をコードするmRNAにおけるスプライシング解析を行った。IR-B型産物の比率を[IR-B]/([IR-A]+[IR-B])×100(%)で表わしたとき，IR-B型産物の比率は，培地がtrans−レスベラトロールを含まない場合，約48％であった（図４）。IR-B型産物の比率は，培地中のtrans−レスベラトロールの濃度が0〜100
μMの範囲であるとき，その濃度に依存して増加し，培地中のtrans−レスベラトロールの濃度が100 μMの場合，その比率は約73%となった（図４）。【００８３】
以上の結果は，trans−レスベラトロールが，筋緊張性ジストロフィー患者の細胞内におけるインスリン受容体mRNAのスプライシングに影響を与え，インスリンへの感受性の高いＢ型スプライシング変異体の発現比率を高めることを示すものであり，trans−レスベラトロールが，筋緊張性ジストロフィー，特に耐糖能異常又は糖尿病を伴う筋緊張性ジストロフィーの治療剤，取り分け，緊張性ジストロフィーに随伴する耐糖能異常又は糖尿病を治療するための薬剤として使用できることを示している。【００８４】
〔BIN1をコードするmRNAのスプライシング解析〕
各ウェルから細胞を回収し，常法により全RNAを精製した。500 ngの全RNAを純水で6μLの容量となるように溶解し，これに20×random
hexamer primersを2μL，2.5 mM dNTP mixを5μL添加し，65℃で5分間加熱した後，25℃で10分間静置した。次いで，M-MLV RT（Invitrogen）を1μL，RNase out（Invitrogen）を1μL，0.1 M DTTを1μL，5×First strand Bufferを4μL添加し，37℃で55分間反応させた後，70℃で15分間加熱し，cDNAを合成した。【００８５】
合成したcDNA 2μLに対し，10×Ex Taq
Bufferを2μL，2.5 mM dNTP mixを1.62μL，10 pM プライマーBIN1exon10F（配列番号５）溶液を1μL，10 pM プライマーBIN1exon12R（配列番号６）溶液を1μL，Ex Taq ポリメラーゼを0.5 Unitを添加し，純水を加えて液量を20μLに調製した後，PCRに供し，BIN1 cDNAのエクソン10〜12にかけての領域を含むDNA断片を増幅した（図１）。PCRは，反応混合物を94℃で3分加熱後，（94℃30秒，60℃30秒，72℃90秒）の条件で28回反応させ，最後に72℃で3分加熱することにより行った。【００８６】
増幅したDNA断片をAgilent
2100 Bioanalyzer（Agilent technology），DNA1000 LabChip kit（Agilent Technology），及び解析ソフトとして2100 Expet（Agilent Technology）を用いて解析し，増幅したBIN1 cDNA断片中に含まれるエクソン11を有するDNA断片（エクソン11＋型変異体産物）とエクソン11を欠くDNA断片（エクソン11−型変異体産物）との比率を算出した。エクソン11＋型変異体の発現比率（エクソン11＋型変異体発現比率）を[エクソン11＋型産物]/([エクソン11＋型産物]+[エクソン11−型産物])×100(%)で表わしたとき，エクソン11＋型変異体発現比率は，培地がtrans−レスベラトロールを含まない場合，約2％であった（図５）。エクソン11＋型変異体発現比率は，培地中のtrans−レスベラトロールの濃度が0〜200 μMの範囲であるとき，その濃度に依存して増加し，培地中のtrans−レスベラトロールの濃度が100 μMの場合，その比率は約4%，その2濃度が200 μMの場合，その比率は約14%となった（図５）。【００８７】
以上の結果は，trans−レスベラトロールが，筋緊張性ジストロフィー患者の細胞内におけるBIN1をコードするmRNAのスプライシングに影響を与え，エクソン11を有する正常型のBIN1 mRNAであるエクソン11＋型変異体の発現比率を高めることを示すものであり，trans−レスベラトロールが，筋緊張性ジストロフィー患者における筋力低下を改善する効果を有することを示すものであり，筋緊張性ジストロフィーの治療剤として使用できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明によれば，有効な治療薬のない筋緊張性ジストロフィーに対し筋力低下を改善・防止する治療剤を，また，特に耐糖能異常又は糖尿病を伴う筋緊張性ジストロフィーにおいて当該耐糖能異常又は糖尿病に対する治療剤を提供することができる。
【図１】
2014030624.tif 000025
【図３】
2014030624.tif 000026
【図４】
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【図５】
2014030624.tif 000028
【図２】
2014030624.tif 000029
【配列表】
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【国際調査報告】
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2014030624.tif 000031
2014030624.tif 000032
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