(57)【要約】  本発明は、被験者の糖代謝能を測定する方法、および当該方法に好適に使用される組成物を提供する。本発明の糖代謝能測定方法は、下記の通りである：生体内で標識炭酸ガスに変換されて呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコースを有効成分とする、糖代謝能を測定するための組成物を用いて、下記（a）及び（b）の工程を実施する、被験者の糖代謝能の測定方法：（a）上記組成物を被験者に投与して呼気を採取する工程、および（b）非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合を求める工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）及び（ｂ）の工程を有する、被験者の糖代謝能の測定方法：
（ａ）生体内で標識炭酸ガスに変換されて呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコースを有効成分とする組成物を被験者に投与して呼気を採取する工程、および
（ｂ）非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合を求める工程。
【請求項２】
さらに下記（ｃ）の工程を有する請求項１に記載する糖代謝能測定方法：
（ｃ）（ｂ）工程で得られる被験者の「非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（被験者）を、健常者について得られる「非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（対照値）と比較し、被験値が対照値よりも低い場合を被験者について糖代謝能が低下していると決定し、被験者が対照値よりも高い場合を被験者について糖代謝能が亢進していると決定する工程。
【請求項３】
糖負荷状態にある被験者を（ａ）工程に供することを特徴とする請求項１または２に記載する糖代謝能測定方法。
【請求項４】
糖負荷状態にある被験者が（ａ）工程前に、糖質、または糖質を含む飲食品若しくは代謝されて糖質になるものを含む飲食品を摂取した被験者である請求項３に記載する糖代謝能測定方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載する糖代謝能測定方法により得られる被験者の糖代謝能を指標として、被験者について糖尿病発症の前段階または／および糖尿病発症後の病態ステージを検出する方法。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれかに記載する糖代謝能測定方法において糖代謝能が亢進していると決定された被験者を、糖尿病発症の前段階にあると決定する工程を有する、請求項５に記載する糖尿病病態ステージの検出方法。
【請求項７】
請求項１乃至４のいずれかに記載する糖代謝能測定方法により得られる被験者の糖代謝能の指標として、「△13Ｃ（％）−呼気採取時間ｔまでの曲線下面積（△13Ｃ（‰）ＡＵＣｔ）」または被験試料投与後の少なくとも１つの時点（ｔ）における△13Ｃ（‰）値（△13Ｃ（‰）ＡＵＣｔ／インスリン）または「△13Ｃ（‰）ｔ／インスリン」）と血糖値との相関関係から、被験者について糖尿病発症の前段階または／および糖尿病発症後の病態ステージを検出する請求項５または６に記載する方法。
【請求項８】
被験者について得られる「△13Ｃ（‰）ＡＵＣｔ／インスリン」または「△13Ｃ（‰）ｔ／インスリン」が、健常者についても得られる「△13Ｃ（‰）ＡＵＣｔ／インスリン」または「△13Ｃ（‰）ｔ／インスリン」よりも低値である場合、当該被験者について糖尿病発症前の前段階若しくは／及び糖尿病発症後の病態ステージであると決定する工程を有する請求項５乃至７のいずれかに記載する方法。
【請求項９】
請求項１乃至４のいずれかに記載する糖代謝能測定方法により得られる糖尿病患者の糖代謝能を指標として、糖尿病患者に対する糖尿病治療効果を検出する方法。
【請求項１０】
被験者について糖尿病治療前に測定した糖代謝能と糖尿病治療後に測定した糖代謝能とを対比し、糖尿病治療前に測定した糖代謝能と比較して糖尿病治療後の糖代謝能が増加していることを指標として、当該被験者に対して糖尿病治療効果があると決定する工程を有する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
生体内で標識炭酸ガスに変換されて呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコースを有効成分とする、糖代謝能を測定するための組成物。
【請求項１２】
生体内で標識炭酸ガスに変換されて呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコースを有効成分とする組成物の、糖代謝能を測定するための呼気試験における使用。
【請求項１３】
生体内で標識炭酸ガスに変換されて呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコースを有効成分とする組成物の、糖尿病発症の前段階または／および糖尿病発症後の病態ステージを測定するための呼気試験における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者の糖代謝能を測定する方法、および当該方法に好適に使用される組成物に関する。具体的には、本発明は、被験者の糖代謝能を、13Ｃ等の標識C-呼気試験を用いて測定し、またモニタリングする方法、および当該方法に好適に使用される組成物に関する。また、本発明は、標識Ｃ-呼気試験を用いて被験者の糖代謝能を測定することにより、糖尿病発症後の病態ステージまたは／および糖尿病発症の前段階を判定する方法に関する（以下、本明細書では、糖尿病発症後の病態ステージ及び糖尿病発症の前段階を総称して「糖尿病病態ステージ」ともいう。）。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病診断は、まず尿糖検査、または空腹時血糖値検査による一次スクリーニングが行われ、これらの検査で陽性の場合に、グルコース負荷試験を行い、確定診断に至るのが一般的である。最近では、グルコースを用いた糖負荷試験の前に、血中のＨｂＡｌＣやフルクトサミンを検査する場合もある。【０００３】
しかし、尿糖検査、空腹時血糖値検査等の従来の方法では、多くの糖尿病患者で尿糖が陰性となり、血糖値が正常値を示すため、糖尿病患者を見逃してしまうことも多く、その感度の低さが問題となっている。このため、従来の方法では、糖尿病は発症していないものの糖尿病の前段階の状態までは判定できないため。予防医学の点からは十分ではない。また、グルコースを用いた糖負荷試験は優れた検査法であるが、大量のグルコースを摂取することによる副作用の問題が指摘されているとともに、被験者を数時間にわたり拘束し、また度重なる採血が必要であるため、被験者の身体的負担が大きく現実には限られた対象者にしか実施できない。また、ＨｂＡｌＣやフルクトサミンの結果は次の来院時まで知ることができず、迅速性に欠けるという欠点がある。【０００４】
また、糖尿病の病型診断（インスリン依存型、非依存型）、治療方針決定、及び糖尿病治療の効果を調べるための検査として、従来は、主に血中インスリン濃度の測定、血中または尿中Ｃ−ペプチドの測定、グルコースを用いた糖負荷試験における血糖値、血中インスリン濃度の経時変化の測定により行われている。しかし、グルコースを用いた糖負荷試験は上記のように被験者の身体的負担が大きいため実際にはなかなか行われず、血中インスリン濃度、血中または尿中Ｃ−ペプチドの結果は次の来院時まで知ることができず、迅速性に欠ける。【０００５】
一方、糖尿病の診断に、13Ｃで標識したグルコースを投与し、呼気中に二酸化炭素として排出される13CO2を測定する、いわゆる標識Ｃ-呼気試験を応用することが提案されている（特許文献１〜３参照）。具体的には、特許文献１には、特定位の炭素を13Ｃで置換したグルコースを用いて呼気試験を行い、呼気中に排泄される13CO2濃度の増加率を測定することにより、糖尿病の有無及びその病型（１型糖尿病、２型糖尿病）の別を診断する方法が記載されている。また、特許文献２及び３には、特許文献１と同様に13Ｃで標識したグルコースを用いて呼気試験を行い、呼気中に排泄される13CO2濃度から算出した呼気中の13Ｃと12Ｃとの比（13C/12C）が、健常者のそれよりも低値であることを指標として、糖尿病患者、インスリン抵抗患者または耐糖能障害患者を診断することができることが記載されている。【０００６】
しかし、いずれの文献にも、グルコースを用いた標識Ｃ-呼気試験により、被験者の糖代謝能を精度高く検出すること、その結果、糖尿病を発症した患者の病態ステージのみならず、糖尿病を発症する前段階の状態を測定し、モニタリングすることができることは記載も示唆もされていない。【０００７】
また、特許文献４には、2Ｈで標識したグルコースを被験者に投与し、当該被験者における重水素水（2H2O）の総量を測定し、当該重水素水（2H2O）の総量をインスリン量またはインスリン濃度下面積（インスリンAUC）で除した値を指標として、被験者におけるインスリン抵抗性を決定する方法が、また特許文献５には、検査用食品を投与後に測定した血糖値及びインスリン濃度から、インスリン濃度下面積（インスリンAUC）とグルコース濃度下面積（グルコースAUC）の積（「インスリンAUC×グルコースAUC」）を求め、この値を指標として被験者におけるインスリン抵抗性を決定する方法が記載されている。【０００８】
このように、これらの文献には、被験者のインスリン抵抗性の評価にインスリン濃度下面積（インスリンAUC）を考慮することが記載されているものの、いずれの文献にも、グルコースを用いた標識Ｃ-呼気試験により、被験者の糖代謝能を精度高く検出できること、その結果、糖尿病を発症した患者の病態ステージのみならず、糖尿病を発症する前段階の状態を測定し、モニタリングすることができることは記載も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平１０−６７６８９号公報
【特許文献２】特表２００２−５１３９１１号公報
【特許文献３】特開２００８−２９２５０６号公報
【特許文献４】特表２００８−５４３７８７号公報
【特許文献５】特開２０１０−４４０９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、同位体標識されたグルコースを用いた標識Ｃ-呼気試験により、被験者の糖代謝能を精度高く、且つ迅速に検出する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、糖尿病を発症した患者の病態ステージのみならず、糖尿病を発症する前段階の状態を測定し、モニタリングするための方法を提供することを目的とする。【００１１】
また本発明は、上記方法に使用するために糖代謝能測定用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、同位元素で標識したグルコースを投与した後、呼気に排泄される同位体標識炭酸ガス（ＣＯ２）の量、およびそれから算出される呼気に含まれる炭酸ガスの存在比（非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合)の挙動から、被験者の糖代謝能を精度高く、しかも迅速に測定することができることを見出した。また、本発明者らは、かくして測定した被験者の糖代謝能を指標とすることで、糖尿病を発症した患者の病態ステージのみならず、糖尿病を発症する前段階の状態をも測定し、またそれを経時的にモニタリングできることを見出した。さらに、本発明者らは、上記被験者の糖代謝能を指標とすることで、糖尿病患者に対する薬物（糖尿病治療薬）の治療効果が判定できること、またそれを経時的にモニタリングすることもできることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。【００１３】
すなわち、本発明は下記の態様を有する：
（１）糖代謝能の測定方法
（1-1）下記（a）及び（b）の工程を有する、被験者の糖代謝能の測定方法：
（a）生体内で標識炭酸ガスに変換されて呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコースを有効成分とする組成物を被験者に投与して呼気を採取する工程、および
（b）呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合を求める工程。【００１４】
なお、当該（b）の工程は、後述するように、例えばΔ％13Ｃ（13Ｃ濃度変化量：atom％）またはΔ13Ｃ値（δ13Ｃ値変化量：‰）を求めることによって行うことができる。
（1-2）さらに下記（c）の工程を有する、（1-1）に記載する糖代謝能測定方法：
（c）（b）工程で得られる被験者の「呼気に含まれる非標識ＣＯ２量または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ2量の割合」（被験値）を、健常者について得られる「呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（対照値）と比較し、被験値が対照値よりも低い場合を被験者について糖代謝能が低下していると決定し、被験値が対照値よりも高い場合を被験者について糖代謝能が亢進していると決定する工程。
（1-3）上記同位元素が13Ｃである、（1-1）または（1-2）に記載する糖代謝測定方法。【００１５】
（1-4）上記組成物の投与形態が経口投与形態または注射投与形態である、(1-1)乃至（1-3）のいずれかに記載する糖代謝測定方法。【００１６】
（1-5）糖負荷状態にある被験者を（a）工程に供することを特徴とする(1-1)乃至（1-4）のいずれかに記載する糖代謝測定方法。【００１７】
（1-6）糖負荷状態にある被験者が、（a）工程前に、糖質、または糖若しくは代謝されて糖になるものを含む飲食品を摂取した被験者である、（1-5）に記載する糖代謝測定方法。【００１８】
（1-7）上記飲食品が、糖若しくは代謝されて糖になる成分に加えて、タンパク質(半消化態タンパク質を含む）、アミノ酸、脂肪、電解質、微量元素類およびビタミン類からなる群から選択される少なくとも１種を含む液状、半液状、または固体状の飲食品である、（1-6）に記載する糖代謝測定方法。【００１９】
（２）糖尿病発症後の病態ステージ及び糖尿病発症の前段階を検出する方法
（2-1）（1-1）乃至（1-7）のいずれかに記載する糖代謝能測定方法により得られる被験者の糖代謝能を指標として、被験者について糖尿病発症の前段階または／および糖尿病発症後の病態ステージを検出する方法。【００２０】
以下、本明細書において「糖尿病発症の前段階または／および糖尿病発症後の病態ステージ」を総称して、「糖尿病病態ステージ」ともいう。【００２１】
（2-2）（1-2）乃至（1-7）のいずれかに記載する糖代謝能測定方法において糖代謝能が亢進していると決定された被験者を、糖尿病発症の前段階にあると決定する工程を有する（2-1）に記載する糖尿病病態ステージを検出する方法。【００２２】
当該本発明の方法は、具体的には下記［2-a］〜［2-g］のように言い換えることができる。【００２３】
［2-a］  下記（a）〜（ｃ’）の工程を有する、被験者について糖尿病病態ステージを検出する方法：
(a)  生体内で標識炭酸ガスに変換されて呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコース（標識Ｃ-グルコース）を有効成分とする組成物を被験者に投与して呼気を採取する工程、
(b)  呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合を求める工程、及び
(c’)  上記（b）工程で得られる被験者の「呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（Δ%13Ｃ（atom％）またはΔ13Ｃ値（‰））（被験値）を、健常者について得られる対応する「呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（Δ%13Ｃ（atom％）若しくはΔ13Ｃ値（‰））（対照値）と比較し、被験値が対照値よりも低い場合、当該被験者を糖尿病を発症していると決定し、被験値が対照値よりも高い場合、当該被験者を糖尿病発症の前段階にあると決定する工程。【００２４】
［2-b］上記同位元素が13Ｃである、［2-a］に記載する検出方法。【００２５】
［2-c］上記組成物の投与形態が経口投与形態または注射投与形態である、［2-a］または［2-b］に記載する検出方法。【００２６】
［2-d］糖負荷状態にある被験者を上記（a）工程に供することを特徴とする［2-a］乃至［2-c］のいずれかに記載する検出方法。【００２７】
［2-f］糖負荷状態にある被験者が、（a）工程前に、糖質、または糖若しくは代謝されて糖になるものを含む飲食品を摂取した被験者である、［2-d］に記載する検出方法。【００２８】
［2-g］上記飲食品が、糖若しくは代謝されて糖になる成分に加えて、タンパク質(半消化態タンパク質を含む）、アミノ酸、脂肪、電解質、微量元素類およびビタミン類からなる群から選択される少なくとも１種を含む液状、半液状、または固体状の飲食品である、［2-f］に記載する検出方法。【００２９】
また本発明の糖尿病病態ステージの検出方法は、上記方法のほか、下記（2-3）〜（2-6）に記載する方法で実施することもできる。【００３０】
（2-3）（1-1）乃至（1-6）のいずれかに記載する糖代謝能測定方法により得られる被験者の糖代謝能の指標として［Δ13Ｃ（‰）- 呼気採取時間ｔまでの曲線下面積（△13Ｃ（‰）AUCｔ）］または被験試料投与後の少なくとも１の時点（t）における△13Ｃ（‰）値（Δ13Ｃ（‰）ｔ）」を用い、これらのいずれか一方を被験者のインスリン濃度で除した値（「Δ13Ｃ（‰）AUCｔ/インスリン」または「Δ13Ｃ（‰）ｔ/インスリン」）と血糖値との相関関係から、被験者について糖尿病発症の前段階または／および糖尿病発症後の病態ステージを検出する（2-1）に記載する方法。【００３１】
（2-4）上記被験試料投与後の少なくとも１の時点（t）が、被験試料投与から120分以内の少なくとも１の時点である（2-3）に記載する方法。【００３２】
（2-5）上記被験試料投与後の少なくとも１の時点（t）が、被験試料投与から10分以上経過後の少なくとも１の時点である（2-3）または（2-4）に記載する方法。【００３３】
（2-6）被験者について得られる「Δ13Ｃ（‰）AUCt/インスリン」または「Δ13Ｃ（‰）t/インスリン」が、健常者について得られる「Δ13Ｃ（‰）AUCt/インスリン」または「Δ13Ｃ（‰）t/インスリン」よりも低値である場合、当該被験者を糖尿病発症の前段階または糖尿病発症後の病態ステージにあると決定する工程を有する（2-3）乃至（2-5）のいずれかに記載する方法。【００３４】
（３）糖尿病患者に対する糖尿病治療効果を検出する方法
（3-1）（1-1）乃至（1-6）のいずれかに記載する糖代謝能測定方法により得られる糖尿病患者の糖代謝能を指標として、糖尿病治療を受けた糖尿病患者に対する当該糖尿病治療の治療効果を検出する方法。【００３５】
（3-2）被験者について糖尿病治療前に測定した糖代謝能と糖尿病治療後に測定した糖代謝能とを対比し、糖尿病治療後の糖代謝能が糖尿病治療前と比べて増加していることを指標として、当該被験者に対して糖尿病治療効果があると決定する工程を有する（3-1）記載の方法。【００３６】
当該本発明の方法は、具体的には下記［3-a］〜［3-g］のように言い換えることができる。
［3-a］下記（a’）、（b）及び（ｄ）の工程を有する、糖尿病患者に対する糖尿病治療の検出方法：
(a’)生体内で標識炭酸ガスに変換されて呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコース（標識Ｃ-グルコース）を有効成分とする組成物を、糖尿病治療の前後で被験者に投与して呼気を採取する工程、
（b)糖尿病治療の前後の呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合を求める工程、及び
(d)（b）工程で、糖尿病治療処置後の被験者について得られる「呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（Δ%13Ｃ（atom％）またはΔ13Ｃ値（‰））を、糖尿病治療処置前の被験者について得られる対応する「呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（Δ%13Ｃ（atom％）またはΔ13Ｃ値（‰））（対照値）と比較し、被験値が対照値よりも高い場合の当該被験者については糖尿病治療効果があると決定し、被験値が対照値と同じ若しくはそれよりも低い場合の当該被験者については糖尿病治療効果がないと決定する工程。【００３７】
［3-b］上記同位元素が13Ｃである、［3-a］に記載する検出方法。【００３８】
［3-c］上記組成物の投与形態が経口投与形態または注射投与形態である、［3-a］または［3-b］に記載する検出方法。【００３９】
［3-d］糖負荷状態にある被験者を上記（a’）工程に供することを特徴とする［3-a］乃至［3-c］のいずれかに記載する検出方法。【００４０】
［3-f］糖負荷状態にある被験者が、（a’）工程前に、糖質、または糖若しくは代謝されて糖になるものを含む飲食品を摂取した被験者である、［3-d］に記載する検出方法。【００４１】
［3-g］上記飲食品が、糖若しくは代謝されて糖になる成分に加えて、タンパク質(半消化態タンパク質を含む）、アミノ酸、脂肪、電解質、微量元素類およびビタミン類からなる群から選択される少なくとも１種を含む液状、半液状、または固体状の飲食品である、［3-f］に記載する検出方法。【００４２】
（４）糖代謝能を測定するための組成物
（4-1）生体内で標識炭酸ガスに変換されて呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコースを有効成分とする、糖代謝能を測定するための組成物。【００４３】
（4-2）上記同位元素が13Ｃである、（4-1）に記載する糖代謝能測定用組成物。【００４４】
（4-3）上記組成物の投与形態が経口投与形態または注射投与形態である、(4-1)または（4-2）に記載する糖代謝能測定用組成物。【００４５】
（５）標識Ｃ-グルコースの使用
（5-1）生体内で標識炭酸ガスに変換されて呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコースの、呼気試験によって糖代謝能を測定するための組成物（糖代謝能測定用組成物）の製造のための使用。【００４６】
（5-2）上記糖代謝能の測定が（1-6）乃至（1-7）のいずれかに記載する方法によって行われるものである、（5-1）に記載する使用。【００４７】
（5-3）生体内で標識炭酸ガスに変換されて呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコースの、呼気試験によって糖尿病発症の前段階または／及び糖尿病発症後の病態ステージを測定するための組成物（糖尿病病態ステージ測定用組成物）の製造のための使用。【００４８】
（5-4）上記糖尿病発症の前段階または／及び糖尿病発症後の病態ステージの測定が、（2-1）乃至（2-6）及び（2-a）乃至（2-g）のいずれかに記載する方法によって行われるものである（5-3）に記載する使用。【００４９】
（5-5）生体内で標識炭酸ガスに変換されて呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコースの、呼気試験によって糖尿病患者に対する糖尿病治療効果を検出するための組成物（糖尿病治療効果検出用組成物）の製造のための使用。【００５０】
（5-6）上記糖尿病治療効果の検出が、（3-1）、（3-2）及び（3-a）乃至（3-g）のいずれかに記載する方法によって行われるものである（5-5）に記載する使用。【００５１】
（６）標識Ｃ-グルコースまたはそれを含む組成物の用途
（6-1）呼気試験によって糖代謝能を測定するために使用される、生体内で標識炭酸ガスに変換されて呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコース、またはそれを有効成分とする組成物。【００５２】
（6-2）上記糖代謝能の測定が（1-6）乃至（1-7）のいずれかに記載する方法によって行われるものである、（6-1）に記載するグルコースまたは組成物。【００５３】
（6-3）呼気試験によって糖尿病発症の前段階または／及び糖尿病発症後の病態ステージを測定するために使用される、生体内で標識炭酸ガスに変換されて呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコース、またはそれを有効成分とする組成物。【００５４】
（6-4）上記糖尿病発症の前段階または／及び糖尿病発症後の病態ステージの測定が、（2-1）乃至（2-6）及び（2-a）乃至（2-g）のいずれかに記載する方法によって行われるものである（6-3）に記載するグルコースまたは組成物。【００５５】
（6-5）呼気試験によって糖尿病患者に対する糖尿病治療効果を検出するために使用される、生体内で標識炭酸ガスに変換されて呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコース、またはそれを有効成分とする組成物。【００５６】
（6-6）上記糖尿病治療効果の検出が、（3-1）、（3-2）及び（3-a）乃至（3-g）のいずれかに記載する方法によって行われるものである（6-5）に記載するグルコースまたは組成物。
【発明の効果】
【００５７】
本発明の方法によれば、被験者の糖代謝能を、精度高くかつ迅速に測定し評価することができる。精度及び迅速性は、本発明の方法を糖負荷条件下にある被験者を対象として行うことにより、および／または被験物質である標識Ｃ-グルコースの投与形態を経口投与ではなく静脈投与とすることで、より一層向上させることができる。【００５８】
また、本発明の方法によれば、かくして測定した被験者の糖代謝能を指標とすることで、糖尿病を発症した患者の病態ステージのみならず、糖尿病を発症する前段階であるか否かをも決定することができ、また経時的にその状態（糖尿病の発症前の状態を含む糖尿病の病態）をモニタリングできる。特に、かかる糖尿病病態ステージは、好ましくは試験開始（同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコースを有効成分とする組成物の投与）から６０分以内、より好ましくは３０分以内の短時間で測定し、評価することができる。このため、本発明の方法によれば、被験者を長時間拘束する必要がなく、身体的また精神的負担を軽減することができる。【００５９】
さらに、本発明の方法によれば、上記被験者の糖代謝能を指標とすることで、糖尿病の治療を受けた糖尿病患者に対する当該糖尿病治療の治療効果を判定し、また糖尿病の治療効果を経時的にモニタリングすることができる。当該判定も、本発明によれば、好ましくは試験開始（同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコースを有効成分とする組成物の投与）から１２０分以内、より好ましくは６０分以内、さらに好ましくは３０分以内といった短時間で測定し評価することができる。このため、本発明の方法によれば、糖尿病治療の効果判定に際して、被験者を長時間拘束する必要がなく、身体的また精神的負担を軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】実験例１の結果を示す。ラット４群（1-13C-Glc投与群、2-13C-Glc投与群、3-13C-Glc 投与群、及びU-13C-Glc投与群）にそれぞれ各13Ｃ-グルコース溶液を投与した後に測定した呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移を示す。図中、縦軸は呼気中Δ13Ｃ（‰）、横軸は各13Ｃ-グルコース溶液投与後の呼気採取時間（t）（分）を示す。
【図２】実験例２の結果を示す。ラット４群（Ａ群：健常群、Ｂ群：糖尿病重度発症群、Ｃ群：糖尿病中度発症群、Ｄ群：糖尿病発症前段階群、以下、図３及び４においても同じ。）に、それぞれU-13C-グルコース経口投与液を投与した後、測定した呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移を示す。図中、縦軸は呼気中Δ13Ｃ（‰）、横軸はU-13C-グルコース経口投与液投与後の呼気採取時間（t）（分）を示す。以下、図５〜１３においても同じ。
【図３】実験例２の結果を示す。ラット４群の「血糖値（mg/dL）」（横軸）と、［Δ13Ｃ（‰）-呼気採取時間（120分）曲線下面積（AUC）］を各群のインスリン濃度（ng/mL）で除した値「AUC120/インスリン（‰・min・mL/ng）」（縦軸）との相関関係を示す。
【図４】実験例２の結果を示す。ラット４群の「血糖値（mg/dL）」（横軸）と、Δ13Ｃ（‰）（10分）を各群のインスリン濃度（ng/mL）で除した値「Δ13Ｃ（‰）（10分）/インスリン（‰・min・mL/ng）」（縦軸）との相関関係を示す。
【図５】実験例３の結果を示す。ラット（ZDF Fatty、ZDF lean）の各週齢時にU-13C-グルコース経口投与液を投与した後に測定した呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移を示す。
【図６】実験例４（2-1）の結果を示す。絶食下の第１群（対照群）及び第２群（糖尿病群）に、それぞれU-13C-グルコース水溶液（50μmol/4mL/kg）を経口投与した後に測定した呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移を示す。
【図７】実験例４（2-2-1）の結果を示す。第１群（対照群）及び第２群（糖尿病群）に、それぞれグルコース水溶液（450mg/4mL/kg）とU-13C-グルコース水溶液（50μmol/4mL/kg）を同時に経口投与した後に測定した呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移を示す。
【図８】実験例４（2-2-2）の結果を示す。第１群（対照群）及び第２群（糖尿病群）に、それぞれグルコース水溶液（450mg/4mL/kg）経口投与30分後にU-13C-グルコース水溶液（50μmo/4mL/kg）を経口投与した後に測定した呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移を示す。
【図９】実験例４（2-2-3）の結果を示す。第１群（対照群）及び第２群（糖尿病群）に、それぞれグルコース水溶液（450mg/4mL/kg）経口投与30分後にU-13C-グルコース水溶液（50μmo/4mL/kg）を静脈投与した後に測定した呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移を示す。
【図１０】実験例４（2-2-4）の結果を示す。第１群（対照群）及び第２群（糖尿病群）に、それぞれグルコース水溶液（2g/4mL/kg）経口投与30分後にU-13C-グルコース水溶液（50μmo/4mL/kg）を静脈投与した後に測定した呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移を示す。
【図１１】実験例４（2-2-5）の結果を示す。第１群（対照群）及び第２群（糖尿病群）に、それぞれ経腸栄養剤（たん白アミノ酸製剤：商品名「ラコール（登録商標）配合経腸用液」）を4mL/kg経口投与30分後にU-13C-グルコース水溶液（50μmo/4mL/kg）を静脈投与した後に測定した呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移を示す。
【図１２】実験例５の結果を示す。３群のラット（Ａ群：健常群、Ｂ群：糖尿病重度発症群、Ｃ群：糖尿病中度発症群）について、糖尿病治療薬投与前（無処置）のΔ13Ｃ（‰）の推移と糖尿病治療薬（メトモルミン）投与後のΔ13Ｃ（‰）の推移を示す。
【図１３】実験例６の結果を示す。各群のラット（対照群：―■―、１型糖尿病群：―□―、インスリン投与4h−糖尿病群：―△―、インスリン投与24h−糖尿病群：―●―）の呼気パターン（Δ13Ｃ（‰）の推移）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
（Ｉ）標識C-呼気試験に関連する用語および解析方法の説明
本発明の糖代謝能測定方法は、13Ｃ-呼気試験などの標識Ｃ-呼気試験を用いることを基礎とするものである。よって、本発明の説明に先だって、標識Ｃ-呼気試験に関連する用語およびその解析方法について説明する（「13Ｃ-呼気試験の実際 基礎と実践的応用 第8項：13Ｃ-呼気試験データ解析法」、松林恒夫、松山渉、13Ｃ医学応用研究会、pp.102-111）。
【００６２】
なお、ここでは本発明で用いる「同位元素Ｃ又はＯの少なくとも一方」の一例として、13Ｃを挙げて説明する。
【００６３】
(1) δ13Ｃ値（‰）
同位体の存在比を表す場合、同一元素の中で最も組成比の高い元素を分母にした同位体比（Ｒ）を用いる。従って炭素13（13Ｃ）のＲ値は、炭素12（12Ｃ）を分母とした次式で表される。
【００６４】
【数１】
2014030650.tif 000002
【００６５】
Ｒは非常に小さい数値であるため、直接測定することは困難である。より正確に定量するため、質量分析計を用いる場合には、常に標準物質との比較が行われ、測定結果は、次式で定義されるδ値で表される。
【００６６】
【数２】
2014030650.tif 000003
【００６７】
なお、標準ガスとして、石灰石由来の炭酸ガス（PDB）を使用する場合、ＲSTDは、ＲPDB＝0.0112372となる。
【００６８】
(2) Δ13Ｃ値（‰）
「Δ13Ｃ値（‰）」は、下式で示すように、試薬投与前のδ13Ｃ値（すなわち天然に存在する13Ｃのδ値）をback groundとして、試薬投与後のδ13Ｃ値から差し引いた値（Δ13Ｃ）を意味する。
【００６９】
【数３】
2014030650.tif 000004
【００７０】
(3) 呼気中の13Ｃ濃度（%13C：atom%）
呼気中の13Ｃ濃度（%13C：atom%）は下式で定義される。
【００７１】
【数４】
2014030650.tif 000005
【００７２】
(1)で定義した相対値δ13Ｃ値を、一般的な濃度の概念である総炭素中の13Ｃ含量(％)の形に変換するには、下記の方法を用いることができる。
【００７３】
まず、上記式の右辺の分母子を12Ｃで割り、（式１）に基づいてＲに変換すると、下記の通りになる。
【００７４】
【数５】
2014030650.tif 000006
【００７５】
このＲに、（式２）で求めたＲSAMを代入して整理すると、次式となり、δ13Ｃ値を用いて13Ｃ濃度（%13C）を表すことができる。
【００７６】
【数６】
2014030650.tif 000007
【００７７】
(4) 13Ｃ濃度の変化量（Δ%13C）
呼気中の13Ｃ濃度（%13C）の変化量（Δ%13C）は、次式で定義されるように、投与ｔ時間後の13Ｃ濃度〔(%13C)t〕から投与前０時間の13Ｃ濃度〔(%13C)0〕を差し引いて求められる。
【００７８】
【数７】
2014030650.tif 000008
【００７９】
(5) Δ13Ｃ値（‰）と13Ｃ濃度変化量（Δ%13C）との関係
13Ｃの天然存在比（Ｒ）は約0.011であり、標識試薬を投与した場合でも呼気中への増加量はわずかに＋0.001〜0.002程度である。そこで、天然存在比Ｒ→０とみなすことができ、％13CをＲで表した（式４）は、次式で近似することができる。
【００８０】
【数８】
2014030650.tif 000009
【００８１】
この近似式を用いて、まずδ13Ｃの定義である（式２）よりＲSAMを求めて上記式のＲに代入して整理すると、13Ｃ濃度を求める近似（式７）が得られる。
【００８２】
【数９】
2014030650.tif 000010
【００８３】
これを（式６）に代入すると、下式（式８）に示すように、Δ13ＣからΔ％13Ｃを算出することができる。
【００８４】
【数１０】
2014030650.tif 000011
【００８５】
（II）糖代謝能測定用組成物
本発明の糖代謝能測定用組成物は、生体内で標識ＣＯ２ガスに変換して呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一種で標識されてなるグルコースを有効成分とするものである。本発明で用いられる標識Ｃ-グルコースは、被験者に投与された後、体内の糖代謝能に応じて糖代謝され、被験者の糖代謝能の大きさを反映した標識Ｃを含む炭酸ガスとして呼気に排出される特性を有する。
【００８６】
グルコースを構成する炭素原子の標識に用いられる同位元素としては、特に制限はされないが、具体的には13Ｃ、及び14Ｃを挙げることができる。かかる同位元素は放射性及び非放射性の別を問わないが、安全性の観点から好ましく非放射性同位元素である。かかる同位元素としては好適に13Ｃを挙げることができる。
【００８７】
同位体元素−標識グルコースは、これから糖代謝経路を経て生成されるＣＯ２の少なくとも一部が同位元素で標識されてなるように、標識されてなるものである。例えば、このようなグルコースとしては、グルコースの１位或いは６位、２位或いは５位、及び３位或いは４位のいずれか少なくとも１つの炭素原子が同位元素で標識されてなる化合物、具体的には、１-13Ｃ標識グルコース、２-13Ｃ標識グルコース、３-13Ｃ標識グルコースを例示することができる。またグルコースの１位、２位、３位、４位、５位及び６位の全ての炭素原子が同位元素で標識されてなるものであってもよい。後述する実験例１に示すように「Δ13Ｃ（‰）」の立ち上がりの速さ、言い換えると13Ｃ標識グルコース投与後、呼気中に13ＣＯ2として排泄される速さから、好ましくは３位または４位の炭素原子が同位元素で標識されてなるグルコース（例えば、３-13Ｃ標識グルコース、４−13Ｃ標識グルコース）、並びに１位、２位、３位、４位、５位及び６位の全ての炭素原子が同位元素で標識されてなるグルコースである。
【００８８】
グルコース等の化合物を13Ｃ、14Ｃ並びに18Ｏなどの同位体で標識する方法は、特に制限されず、通常使用される方法が広く採用される（佐々木、「５．１安定同位体の臨床診断への応用」：化学の領域107「安定同位体の医・薬学、生物学への応用」pp.149-163（1975）南江堂；梶原、RADIOISOTOPES，41，45-48（1992）等）。これらの同位体標識化合物、特に実施例に示す13Ｃ標識−グルコースはいずれも商業的に入手することができ、簡便にはかかる市販品を使用することもできる。
【００８９】
本発明の組成物は、基本的には、投与後、標識Ｃ-グルコースが体内に吸収され、また代謝された後に、標識炭酸ガスとして呼気に排出されるのであるものであればよく、それを満たすものである限り、その形態、標識Ｃ-グルコース以外の成分、各成分の配合割合、組成物の調製方法等を特に制限するものではない。
【００９０】
例えば形態としては、経口投与形態を有するものであっても、また静脈投与形態を有するものであってもよい。前者の場合、液剤（シロップ剤を含む）、懸濁剤および乳剤などの液状形態；錠剤（裸剤、被覆剤を含む）、チュアブル錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤（粉末剤）、細粒剤および顆粒剤などの固形形態など、任意の経口投与形態を採用することができる。後者の場合、例えば注射剤や点滴剤の投与形態（液状、懸濁状または乳液状）を採用することができる。好ましくは非侵襲的測定方法である経口投与形態であり、さらに好ましくは、実験例４に示すように、高い測定精度が得られるという点で、静脈投与形態である。
【００９１】
また本発明の組成物は、製剤形態を有するものに限らず、上記標識Ｃ-グルコースを含み、本発明の作用効果を妨げないものであればよく、上記標識Ｃ-グルコースを任意の食品素材と組み合わせて、固形食、流動食または液状食の形態を有するものであってもよい。
【００９２】
本発明の組成物は、実質上、有効成分である上記標識Ｃ-グルコースだけからなるものであってもよいが、本発明の作用及び効果を損なわない限り、他の成分として、各製剤形態（投与形態）に応じて、通常当業界において用いられる薬学上許容される任意の担体及び添加物を配合した形態であってもよい。
【００９３】
この場合、有効成分として配合する標識Ｃ-グルコースの量としては、特に制限されることなく、組成物１００重量％中１〜９５重量％を挙げることができ、かかる範囲で適宜調整することができる。
【００９４】
本発明の組成物を、例えば点滴または注射剤などの液体、懸濁液または乳液の形態に調製するに際しては、各種形態に応じて、精製水または注射用蒸留水のほか、各種の担体または添加剤を用いることができる。例えば、添加剤としては、等張化剤（例えば塩化ナトリウムなど）、ｐＨ調整剤（例えば塩酸、水酸化ナトリウムなど）、緩衝剤（例えばホウ酸、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど）、保存剤（例えば塩化ベンザルコニウムなど）、増粘剤（例えばカルボキシビニルポリマーなど）のような通常用いられる添加剤を用いることができる。
【００９５】
また本発明の組成物を、例えば錠剤、チュアブル錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤（粉末剤）、細粒剤、および顆粒剤などの固形形態に成形するに際しては、各種形態に応じて各種の担体または添加剤を用いることができる。
【００９６】
担体または添加剤として、例えば乳糖、白糖、デキストリン、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、リン酸二水素カルシウム、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、デキストリン、プルラン等の結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖、カルメロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスポピドン等の崩壊剤；白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；ポリソルベート８０、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、デンプン等の保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール、コロイド状ケイ酸、ショ糖脂肪酸類、硬化油等の滑沢剤；クエン酸、無水クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム二水和物、無水リン酸一水素ナトリウム、無水リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等のｐＨ調整剤；酸化鉄、βカロテン、酸化チタン、食用色素、銅クロロフィル、リボフラビン等の着色剤；およびアスコルビン酸、塩化ナトリウム、各種甘味料等の矯味剤等を使用できる。
【００９７】
錠剤は必要に応じて通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることができる。またカプセル剤は常法に従い、有効成分である同位体標識グルコースを上記で例示した各種の担体と混合して硬化ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。
【００９８】
本発明の組成物は、後述する測定方法において被験者への投与試料（被験試料）として使用される。具体的には、被験者における糖代謝能の測定のために投与される被験試料として使用される。また、本発明の組成物は、被験者について糖尿病発症の前段階または／および糖尿病発症後の病態ステージを測定し、決定するために投与される被験試料として使用される。さらに、本発明の組成物は、糖尿病患者について糖尿病治療の効果を判定し、モニタリングするために投与される被験試料として使用される。
【００９９】
これらの測定方法は、いずれも、本発明の組成物を被験者（ヒトおよび動物を含む）に投与した後、呼気を採取して呼気に含まれる炭酸ガスの存在比（非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合）を測定することによって、当該存在比を指標として測定することができる。その詳細は、下記(III)にて説明する。
【０１００】
本発明の糖代謝能測定用組成物が経口投与形態または静脈投与形態（注射剤または点滴剤）を有する場合、当該組成物に配合される標識Ｃ-グルコース（有効成分）の量としては、ケースに応じて適宜調節設定することができる。いずれの場合も、１回あたりの投与量が標識Ｃ-グルコース（有効成分）の量に換算して、5 mg／body〜50 g／body、好ましくは10 mg／body〜25 g／bodyの範囲となるように調製することができる。
【０１０１】
（III）糖代謝能の測定方法
前述する本発明の糖代謝能測定用組成物を用いることによって、被験者（ヒトまたはヒト以外の哺乳動物）の糖代謝能を測定することができる。
【０１０２】
当該糖代謝能の測定は、基本的には、下記に示すように、標識Ｃ-グルコースを有効成分とする上記組成物を、ヒトを始めとする哺乳動物（被験者）に投与し、呼気を採取し［本発明方法の（a）工程］、当該呼気に含まれる炭酸ガスの存在比（非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合）を測定する工程［本発明方法の（b）工程］を経て行うことができる。
【０１０３】
［(a)工程］  生体内で標識炭酸ガスに変換されて呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコース（標識Ｃ-グルコース）を有効成分とする組成物を被験者に投与して呼気を採取する工程、および
［(b)工程］  呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合を求める工程。
【０１０４】
本発明で用いる標識Ｃ-グルコースは、前述するように、いずれも被験者に経口または静脈投与された後、被験者の糖代謝能に応じて糖代謝され、当該糖代謝能の大きさを反映した量の「標識Ｃを含む炭酸ガス」として呼気に排出される特性を有している。
【０１０５】
なお、ここで標識Ｃ-グルコースを有効成分とする本発明の組成物の投与方法は、特に制限されず、経口投与及び静脈内投与のいずれでもよい。非侵襲的方法である点では経口投与が好ましく、実験例４に示すように精度の高さという点からは静脈内投与が好ましい。
【０１０６】
本発明の糖代謝能測定用組成物に配合される標識Ｃ-グルコース（有効成分）の量としては、ケースに応じて適宜調節設定することができる。糖代謝能測定用組成物が経口投与または静脈内投与形態を有するいずれも場合も、１回あたりの投与量が、標識Ｃ-グルコース（有効成分）の量に換算して、5 mg／body〜50 g／body、好ましくは10 mg／body〜25 g／bodyの範囲となるように調製することができる。
【０１０７】
本発明が対象とする被験者は、前述するようにヒトまたはヒト以外の哺乳動物である。ヒト以外の哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ブタ、牛、及び馬などが挙げられるが、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等の実験動物である。
【０１０８】
かかる被験者は、(a)工程に供する前、絶食状態であってもまた非絶食状態であってもよい。後述する実験例４で示すように、絶食状態にある被験者よりも糖負荷状態にある被験者を（a）工程に供することで、短時間で精度高く糖代謝能を測定することができることから、非絶食状態、特に糖負荷状態にあることが好ましい。より詳細には、(a)工程に供する前の少なくとも１２０分前、より好ましくは少なくとも６０分前に、絶食状態にあった被験者に糖質（例えば、グルコース）、または糖質を含む飲食品若しくは代謝されて糖質になるものを含む飲食品を摂取させて、糖負荷状態にすることが好ましい。これらの糖質または飲食品の投与量は、体内に投与されるグルコース或いは体内で代謝されて生成するグルコースの量が450mg〜２g/kg程度になるような割合を挙げることができる。
【０１０９】
ここで糖質を含む飲食品若しくは代謝されて糖質になるものを含む飲食品としては、制限はされないが、糖質若しくは代謝されて糖質になる成分のほか、タンパク質(半消化態タンパク質を含む）、アミノ酸、脂肪、電解質、微量元素類およびビタミン類からなる群から選択される少なくとも１種を含む液状、半液状、または固体状の飲食品を挙げることができる。ここで糖質としては、グルコース、ショ糖（白糖）、麦芽糖、ソルビトール、オリゴ糖、炭水化物など、制限なく挙げることができる。好ましくはグルコースおよびマルトデキストリンである。
【０１１０】
かかる糖負荷試験に使用するための飲食品として、制限はされないものの、具体的には、後述する実験例で使用する「ラコール（登録商標）配合経腸用液」のように、糖質（マルトデキストリン、精製白糖）を含む経腸栄養剤を用いることができる。
【０１１１】
（a）工程で採取した呼気を用い、これに含まれる炭酸ガスの存在比（非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合）から、被験者の糖代謝能を測定する方法の一例を、13Ｃ-標識グルコースを有効成分とする組成物を用いる場合（即ち、測定する標識ＣＯ２が13ＣＯ２の場合）を例として説明すれば、下記の通りである。
【０１１２】
（1）採取した呼気に含まれる炭酸ガスの存在比（総ＣＯ２量に対する13ＣＯ２量の割合）を、下記に記載する方法に従って、13Ｃ-標識グルコース投与前の13Ｃ含量（atom％）〔（%13C)0〕を差し引いた13Ｃ濃度の変化量（Δ％13Ｃ）として算出する。
【０１１３】
具体的には、試薬投与からｔ時間後に採取した呼気に含まれる総炭素中の13Ｃ含量（atom ％）〔呼気中の13Ｃ濃度（%13C）〕〔（%13C)ｔ〕を求め、さらに式６に従って、13Ｃ-標識化合物投与前の13Ｃ濃度（atom ％）〔（%13C)0〕を差し引いて、13Ｃ濃度の変化量（Δ％13Ｃ）を求める。
【０１１４】
【数１１】
2014030650.tif 000012
【０１１５】
【数１２】
2014030650.tif 000013
【０１１６】
(2) なお、必要に応じて、上記13Ｃ濃度の変化量（Δ％13Ｃ）は、式５および式３に基づいて、Δ13Ｃ値（‰）〔δ13Ｃ値変化量（‰）またはDOB（‰）〕に換算してもよい。
【０１１７】
【数１３】
2014030650.tif 000014
【０１１８】
【数１４】
2014030650.tif 000015
【０１１９】
標識Ｃ-グルコースを有効成分とする糖代謝能測定用組成物を投与した後に呼気中に排出される標識Ｃ含量、またはこれに対応するΔ%13Ｃ（atom％）若しくはΔ13Ｃ値（‰）は、後述する実験例に示すように、被験者の糖代謝能を反映しており、当該組成物を用いた本発明の方法によれば、当該被験者の糖代謝能を精度良く、且つ迅速に測定することができる。
【０１２０】
なお、呼気試料中に含まれる標識炭酸ガスの測定・分析は、使用する同位元素が放射性か非放射性かによって異なるが、通常、液体シンチレーションカウンター法、質量分析法、赤外分光分析法、発光分析法、磁気共鳴スペクトル法等といった一般に使用される分析手法を用いて行うことができる。好ましくは測定精度の点から赤外分光分析法及び質量分析法である。
【０１２１】
上記（b）の工程で得られる「呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（Δ%13Ｃ（atom％）またはΔ13Ｃ値（‰））を指標として、下記の方法により、被験者の糖代謝能を決定することができる。
【０１２２】
（c-1）（b）工程で得られる被験者の「呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（Δ%13Ｃ（atom％）またはΔ13Ｃ値（‰））（被験値）を、健常者について得られる対応する「呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（Δ%13Ｃ（atom％）若しくはΔ13Ｃ値（‰））（対照値）と比較する。
【０１２３】
（c-2）比較した結果、被験値が対照値よりも低い場合を被験者について糖代謝能が低下していると決定し、被験値が対照値よりも高い場合を被験者について糖代謝能が亢進していると決定する。
【０１２４】
なお、ここで健常者とは、糖尿病に関して健常であること、つまり糖尿病を発症しておらず、且つ糖尿病を発症する前状態にもない被験者（非糖尿病者）を意味する。
【０１２５】
実験例２（図２）に示すように、糖尿病を発症している患者は、健常者の糖代謝能よりも糖代謝能が低下しており、糖尿病の症状が進行し重篤度が高いほど、糖代謝能の低下が著しいことがわかる。一方、糖尿病は発症していないもの、糖尿病発症の前段階にある被験者は、健常者の糖代謝能よりも糖代謝能が亢進していることがわかる。従って、下記（IV）において詳述するように、本発明の方法により、被験者の糖代謝能を測定することで、糖尿病発症の病態ステージを評価、決定することができるだけでなく、糖尿病発症の前段階にある被験者を検出することができる。具体的には、本発明の方法において糖代謝能が健常者の糖代謝能よりも低い被験者は糖尿病を発症していると決定され、また本発明の方法において糖代謝能が健常者の糖代謝能よりも高い被験者は糖尿病発症の前段階にあると決定される。つまり、本発明の糖代謝能測定方法によれば、被験者について糖尿病発症の前段階にあることを検出することができるため、糖尿病発症のリスクを判定することができ、糖尿病発症の予防に資することができる。
【０１２６】
また、上記するように、既に糖尿病を発症した糖尿病患者の糖代謝能を測定することで、糖尿病患者の病態ステージ（重篤度）を判定し、またモニタリングすることができるが、同様に、実験例５及び６(図１２及び１３)に示すように、糖尿病治療を受けている糖尿病患者の糖代謝能を測定することで、当該糖尿病患者に対する糖尿病治療による治療効果を判定し、またモニタリングすることもできる。これについても、下記（V）において詳述する。
【０１２７】
なお、これらの方法は、呼気試験を利用した本発明の方法と並行して、当業界において公知または慣用の糖尿病の診断方法（血糖値の測定、インスリン抵抗性試験、ヘモグロビンA1cなど）を測定することによっても行うことができる。
【０１２８】
（IV）糖尿病発症の前段階、または／および糖尿病発症後の病態ステージを測定する方法
前述するように、前述する本発明の糖代謝能測定方法によって得られた被験者の糖代謝能を指標とすることで、当該被験者について糖尿病発症の前段階または／および糖尿病発症後の病態ステージを測定することができる。
【０１２９】
具体的には、下記（a）〜（c）工程において（c）工程で得られる結果を元に、健常者の糖代謝能と比較して、糖代謝能が低下していると決定された被験者を糖尿病患者（糖尿病発症患者）、糖代謝能が亢進（上昇）していると決定された被験者を糖尿病発症の前段階にある患者（糖尿病前段階患者）であるとして、糖尿病の病態ステージを判定することができる。
【０１３０】
［(a)工程］生体内で標識炭酸ガスに変換されて呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコース（標識Ｃ-グルコース）を有効成分とする組成物を被験者に投与して呼気を採取する工程、
［(b)工程］呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合を求める工程、及び
［(c)工程］（b）工程で得られる被験者の「呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（Δ%13Ｃ（atom％）またはΔ13Ｃ値（‰））（被験値）を、健常者について得られる対応する「呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（Δ%13Ｃ（atom％）若しくはΔ13Ｃ値（‰））（対照値）と比較し、被験値が対照値よりも低い場合、当該被験者について糖代謝能が低下していると決定し、被験値が対照値よりも高い場合、当該被験者について糖代謝能が亢進していると決定する工程。
【０１３１】
なお、上記［(c)工程］は、本発明の「糖尿病発症の前段階、または／および糖尿病発症後の病態ステージを測定する方法」においては、下記のように言い換えることができる。
【０１３２】
［(c’)工程］（b）工程で得られる被験者の「呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（Δ%13Ｃ（atom％）またはΔ13Ｃ値（‰））（被験値）を、健常者について得られる対応する「呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（Δ%13Ｃ（atom％）若しくはΔ13Ｃ値（‰））（対照値）と比較し、被験値が対照値よりも低い場合、当該被験者を糖尿病を発症していると決定し、被験値が対照値よりも高い場合、当該被験者を糖尿病発症の前段階にあると決定する工程。
【０１３３】
特に、本発明の方法は、従来の方法では判定が難しかった糖尿病発症の前段階にある患者（糖尿病前段階患者）を、健常者と識別することができるという点で有用である。また、実施例２（図２）に示すように、糖代謝能の低下度合が大きいと糖尿病の進行度合（重篤度）が大きく、糖代謝能の低下度合と糖尿病の進行度合（重篤度）との間に相対的な関係があるため、本発明の方法によれば、糖代謝能の低下の程度から糖尿病の進行の程度（重篤度）を測定評価し、またモニタリングすることができる。
【０１３４】
糖尿病の病態ステージ（糖尿病発症の前段階または／および糖尿病発症後の病態ステージ）の測定は、下記の方法によっても行うことができる。当該方法によれば、糖尿病患者のみならず、糖尿病発症の前段階にある患者も、健常者とより明確に且つ精度高く、識別することができる。
【０１３５】
（1）被験者に標識Ｃ-グルコースを投与した後、好ましくは標識Ｃ-グルコース投与から１２０分以内における少なくとも１の時点での「呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（Δ%13Ｃ（atom％）またはΔ13Ｃ値（‰））を、当該被験者の絶食下での血中インスリン濃度（ng/mL）で除したパラメータ〔例えば［Δ13Ｃ（‰）（t分）/インスリン（mL/ng）］（‰・mL/ng）〕と、当該被験者の絶食下での[血糖値]（mg/dl）との相関関係を求める方法。
【０１３６】
具体的には、実験例２（3-3）（図４）に示すように、上記パラメータ（例えば［Δ13Ｃ（‰）（t）/インスリン］（‰・mL/ng）（t=10分）を縦軸に、また上記[血糖値]（mg/dl）を横軸にした図面に、上記パラメータと血糖値をスポットして両者の相関関係を調べることで、糖尿病患者および糖尿病発症の前段階にある患者を、健常者と識別することができる。
【０１３７】
図４に示すように、横軸で示す血糖値を例えば１５０mg/dlにて分割し、また縦軸で示す［Δ13Ｃ（‰）（t）/インスリン］（t=10分）を例えば９０‰・mL/ngにて分割した場合、健常者群は、左上欄（血糖値１５０mg/dl以下、［Δ13Ｃ（‰）（t）/インスリン］９０‰・mL/ng以上）に集中するのに対して、糖尿病患者と糖尿病発症の前段階にある患者は、［Δ13Ｃ（‰）（t）/インスリン］９０‰・mL/ng以下の、特に低値に集中する。なかでも、糖尿病発症の前段階にある患者は、［Δ13Ｃ（‰）（t）/インスリン］９０‰・mL/ng以下で且つ血糖値１５０mg/dl以下の領域に集中しており、さらに糖尿病を発症し、その程度が進行すると（重篤度が高くなると）、その程度に応じて図の右側（血糖値１５０mg/dlより高い領域）にシフトする傾向がある。
【０１３８】
（2）被験者に標識Ｃ-グルコース投与後、１２０分以内の「呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（Δ%13Ｃ（atom％）若しくはΔ13Ｃ値（‰））の曲線下面積を、当該被験者の絶食下での血中インスリン濃度（ng/mL）で除したパラメータ〔例えば［Δ13Ｃ（‰）AUC（t分）/インスリン（mL/ng）］（‰・min・mL/ng）〕と、当該被験者の絶食下での[血糖値]（mg/dl）との相関関係を求める方法。
【０１３９】
具体的には、実験例２（3-2）（図３）に示すように、上記パラメータ（例えば［Δ13Ｃ（‰）AUCt /インスリン］（‰・min・mL/ng）、ｔ=120分）を縦軸に、また上記[血糖値]（mg/dl）を横軸にした図面に、上記パラメータと血糖値をスポットして両者の相関関係を調べることで、糖尿病患者および糖尿病発症の前段階にある患者を、健常者と識別することができる。
【０１４０】
図３に示すように、横軸で示す血糖値を例えば１５０mg/dlにて分割し、また縦軸で示す［Δ13Ｃ（‰）AUCt/インスリン］（t=120分）を例えば２３０００‰・min・mL/ngにて分割した場合、健常者群は、左上欄（血糖値１５０mg/dl以下、［Δ13Ｃ（‰）AUCt/インスリン］２３０００‰・min・mL/ng以上）に集中するのに対して、糖尿病患者と糖尿病発症の前段階にある患者は、［Δ13Ｃ（‰）AUCt/インスリン］２３０００‰・min・mL/ng以下の特に低値に集中する。なかでも、糖尿病発症の前段階にある患者は、［Δ13Ｃ（‰）AUCt/インスリン］２３０００‰・min・mL/ng以下で且つ血糖値１５０mg/dl以下の領域に集中しており、さらに糖尿病を発症し、その程度が進行すると（重篤度が高くなると）、その程度に応じて図の右側（血糖値１５０mg/dlより高い領域）にシフトする傾向がある。
【０１４１】
このように本発明の方法によれば、短時間の試験によって、糖尿病発症の前段階にある被験者を健常者及び糖尿病患者と区別して検出することができるため、この結果を被験者にフィードバックし、適切な処置をとることで糖尿病発症の抑制または予防に期することができる。また、被験者を経時的にモニタリングすることで、糖尿病発症の進展有無や程度、糖尿病患者の重篤度を経時的に管理・監視することも可能である。
【０１４２】
（Ｖ）糖尿病患者に対する糖尿病治療効果を検出する方法
前述するように、本発明の糖代謝能測定方法によって得られた被験者の糖代謝能を指標とすることで、糖尿病の治療を受けている被験者（糖尿病患者）に対する糖尿病治療の治療効果を検出し評価することができる。
【０１４３】
具体的には、被験者について、下記（a’）〜（b）工程を、糖尿病治療の前後で行い、糖尿病治療の前後で得られる「呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（Δ%13Ｃ（atom％）またはΔ13Ｃ値（‰））を対比し、糖尿病治療後の値が糖尿病治療前の値よりも高い場合に、糖尿病に対する治療効果があると決定することができる。
【０１４４】
［(a’)工程］生体内で標識炭酸ガスに変換されて呼気中に排出される同位元素Ｃの少なくとも一つで標識されてなるグルコース（標識Ｃ-グルコース）を有効成分とする組成物を、糖尿病治療の前後で被験者に投与して呼気を採取する工程、
［(b)工程］糖尿病治療の前後の呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合を求める工程、及び
［(d)工程］（b）工程で、糖尿病治療処置後の被験者について得られる「呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（Δ%13Ｃ（atom％）またはΔ13Ｃ値（‰））を、糖尿病治療処置前の被験者について得られる対応する「呼気に含まれる非標識ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合、または総ＣＯ２量に対する標識ＣＯ２量の割合」（Δ%13Ｃ（atom％）またはΔ13Ｃ値（‰））（対照値）と比較し、被験値が対照値よりも高い場合の当該被験者については糖尿病治療効果があると決定し、被験値が対照値と同じ若しくはそれよりも低い場合の当該被験者については糖尿病治療効果がないと決定する工程。
【０１４５】
かかる本発明の方法によれば、糖尿病の治療を受けた糖尿病患者について、糖代謝能の上昇を指標として当該糖尿病治療の治療効果を測定評価し、またモニタリングすることができる。
【実施例】
【０１４６】
以下に実施例並びに実験例を掲げて、本発明をより一層明らかにする。ただし、本発明はこれらの実施例等によって何ら制限されるものではない。【０１４７】
実験例１    グルコースの13Ｃ標識部位の差
（１）13Ｃ-グルコース溶液の調製
（a）1-13Ｃ-グルコース（1位の炭素原子を13Ｃに置換したグルコース。MW：181，Cambridge Isotope Laboratory製）を生理食塩水で300μmol/mLになるように調製した。
（b）2-13Ｃ-グルコース（2位の炭素原子を13Ｃに置換したグルコース。MW：181，Cambridge Isotope Laboratory製）を生理食塩水で300μmol/mLになるように調製した。
（c）3-13Ｃ-グルコース（3位の炭素原子を13Ｃに置換したグルコース。MW：181，Cambridge Isotope Laboratory製）を生理食塩水で300μmol/mLになるように調製した。
（d）U-13Ｃ-グルコース（全ての炭素原子を13Ｃに置換したグルコース。MW：186，Cambridge Isotope Laboratory製）を生理食塩水で50μmol/mLになるように調製した。【０１４８】
（２）実験方法
被験動物として絶食させたラット（雄，SD系ラット）を４群にわけ（１群あたりn=4）、各群（1-13Ｃ-Glc投与群、2-13Ｃ-Glc投与群、3-13Ｃ-Glc投与群、及びU-13Ｃ-Glc投与群）のラットに、それぞれ上記で調製した各13Ｃ-グルコース溶液を1mL/kgずつ静脈内投与した。次いで、各13Ｃ-グルコース溶液の投与前（0分）と投与後の各時点（10，20，30，40，50，60，80，100，120分）で呼気を採取し、呼気中に排出された13ＣＯ２濃度からΔ13Ｃ（‰）を、呼気分析用質量分析計（ABCA:SerCon社製）を用いて求めた。【０１４９】
なお、Δ13Ｃ（‰）は、13Ｃ-グルコース溶液投与前（0分）と投与後の各呼気採取ポイント（t分）における呼気中13ＣＯ２/12ＣＯ２濃度比（δ13Ｃ値）をそれぞれ測定し、各採取ポイント（t）におけるδ13Ｃ値（δ13Ｃt）と投与前のδ13Ｃ値（δ13Ｃ0）の差（δ13Ｃt−δ13Ｃ0）から算出した（以下の実験例でも同じ）。【０１５０】
（３）実験結果
ラット４群にそれぞれ各13Ｃ-グルコース溶液を投与した後に測定した呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移を図1に示す。図中、縦軸は呼気中Δ13Ｃ（‰）である。また横軸は各13Ｃ-グルコース溶液投与後の呼気採取時間（分）（t分）を示す。【０１５１】
図1に示すように、グルコース溶液投与後30分までのΔ13Ｃ（‰）値が高いのは、3-13Ｃ-Glc投与群（―▲―）、次いでU-13Ｃ-Glc投与群（―×―）であった。この結果から、1-13Ｃ-グルコース、2-13Ｃ-グルコース、3-13Ｃ-グルコース及びU-13Ｃ-グルコースのうち、体内への投与後、より早期に13ＣＯ2として呼気に排泄され、Δ13Ｃ（‰）値に反映する13Ｃ-グルコースは、3-13Ｃ-グルコース、次いでU-13Ｃ-グルコースであることが判明した。つまり、Δ13Ｃ（‰）値の測定が、短時間で可能な13Ｃ-グルコースは、好ましくは、3-13Ｃ−グルコース、及びU-13Ｃ-グルコースである。【０１５２】
実験例２  呼気試験による糖尿病病態ステージのモニター（その１）
（１）U-13Ｃ-グルコース経口投与液の調製
U-13Ｃ-グルコース（MW：186，Cambridge Isotope Laboratory製）を生理食塩水に溶解して50μmol/4mL濃度のU-13Ｃ-グルコース経口投与液を調製した。【０１５３】
（２）病態ステージモニターの実験
被験動物として、表１に記載するＡ〜Ｄの計４群のラット（雄，ZDFラット（LeanまたはFatty）、１群あたり、n＝4〜6）を用い、各群のラットを絶食させた後、上記で調製したU-13Ｃ-グルコース経口投与液を強制的に4mL/kgずつ経口投与した。【０１５４】
【表１】
2014030650.tif 000016
【０１５５】
次いでU-13Ｃ-グルコース経口投与液の投与前（0分）と投与後（10，20，30，40，50，60，80，100，120分）の各時点で呼気を採取し、呼気中に排出された13ＣＯ２濃度からΔ13Ｃ（‰）を、呼気分析用質量分析計（ABCA:SerCon社製）を用いて求めた。【０１５６】
（３）実験結果
（3-1）  上記ラット４群に、それぞれU-13Ｃ-グルコース経口投与液を投与した後、測定した呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移を図２に示す。図中、縦軸は呼気中Δ13Ｃ（‰）である。また横軸は、U-13Ｃ-グルコース経口投与液投与後の呼気採取時間（分）を示す。【０１５７】
図２に示すように，健常群（Ａ群：―▲―）に比して、糖尿病中度発症群（Ｃ群：―■―）および糖尿病重度発症群（Ｂ群：―◆―）はΔ13Ｃ（‰）値が低かった。一方、糖尿病発症前段階群（Ｄ群：―×―）は、健常群，糖尿病発症群（糖尿病中度発症群、糖尿病重度発症群）のいずれよりも、Δ13Ｃ（‰）値が高かった。【０１５８】
このことから、糖尿病発症前段階では糖代謝能が健常時よりも亢進しており、U-13Ｃ-グルコースがより速く代謝されて呼気中に13ＣＯ２として排出されることが判明した。また、一旦糖尿病を発症すると、糖代謝能が低下し、糖代謝が抑制される結果、13Ｃ-グルコースが代謝されて呼気中に13ＣＯ２として排出される量が低下すること、さらにその糖代謝能の低下（13ＣＯ２排出量の低下）は糖尿病の重篤度に相関することが判明した。【０１５９】
この結果から、13Ｃ-グルコースを被験物質として、呼気試験を用いて糖代謝能を測定することで、糖尿病発症後の病態ステージの判定が可能であるだけでなく、糖尿病発症の前段階の判定が可能になることがわかる。【０１６０】
（3-2）ラット４群の［Δ13Ｃ（‰）- 呼気採取時間（120分）曲線下面積（AUC）］を各群のインスリン濃度（ng/mL）で除した値（「AUC120/インスリン（‰・min・mL/ng）」）と各群の「血糖値（mg/dL）」との相関関係を図３に示す。図中縦軸はAUC120/インスリン濃度（‰・min・mL/ng）、横軸は血糖値（mg/dL）を示す。【０１６１】
図３からわかるように、インスリン濃度当たりのAUC（120分）［AUC120/インスリン（‰・min・mL/ng）］は、糖尿病発症前段階群（Ｄ群：―×―）、並びに糖尿病中度発症群（Ｃ群：―■―）及び糖尿病重度発症群（Ｂ群：―◆―）の糖尿病発症群で有意に低値を示し、いずれも健常群（Ａ群：―▲―）の値とは明らかに相違した。更に糖尿病病態ステージの進行に従って、血糖値の上昇と共に図の右側にシフトしていくことが示された。このことから、上記のパラメータ［AUC120/インスリン（‰・min・mL/ng）］と[血糖値（mg/dL）]との相関関係を求めることで、健常状態と糖尿病発症前段階及び糖尿病とを識別することができるとともに、糖尿病発症前段階及び糖尿病の病態ステージ（これらを総称して「糖尿病病態ステージ」という）を判定し、またモニタリングすることができることが確認された。このパラメータを用いた糖尿病病態ステージ判定は、従来の方法では判別することが難しい、特に糖尿病発症前段階の診断に有用である。【０１６２】
（3-3）ラット４群のU-13Ｃ-グルコース経口投与後10分時点でのΔ13Ｃ（‰）をそれぞれのインスリン濃度（ng/mL）で除した値「Δ13Ｃ（‰）（10分）/インスリン（‰・mL/ng）」と各群の「血糖値（mg/dL）」との相関関係を図４に示す。図中、縦軸は「Δ13Ｃ（‰）（10分）/インスリン濃度」（‰・mL/ng）、横軸は血糖値（mg/dL）を示す。【０１６３】
この結果から、前述する図３において、縦軸を「AUC120/インスリン（‰・min・mL/ng）」から「Δ13Ｃ（‰）（10分）/インスリン（‰・mL/ng）」に代えても、健常状態と糖尿病発症前段階及び糖尿病とを識別することができるとともに、糖尿病病態ステージを判定し、またモニタリングすることができることが確認された。つまり、13Ｃ-グルコース投与後のある時点（投与後ｔ分）でのΔ13Ｃ（‰）（Δ13Ｃ（‰）（t分））をインスリン濃度で除したパラメータ［Δ13Ｃ（‰）（t分）/インスリン］（‰・mL/ng）と[血糖値]（mg/dL）との相関関係を求めることで、健常状態と糖尿病発症前段階及び糖尿病とを識別することができるとともに、糖尿病発症前段階及び糖尿病の病態ステージ（糖尿病病態ステージ）を判定し、またモニタリングすることができる。なお、上記の測定時点（ｔ分）は、13Ｃ-グルコース投与後であればよいが、短時間で上記のことが実行できるという本発明の長所を生かす意味では、13Ｃ-グルコース投与後１２０分以内、好ましくは６０分以内、より好ましくは３０分以内である。また、制限されないが、13Ｃ-グルコース投与後、少なくとも１０分以上経過した後であることが好ましい。【０１６４】
このパラメータを用いた糖尿病病態ステージ判定は、従来の方法では短時間で判別することが難しい、特に糖尿病発症前段階の診断に有用である。【０１６５】
実験例３  呼気試験による糖尿病病態ステージのモニター（その２）
（１）U-13Ｃ-グルコース経口投与液の調製
U-13Ｃ-グルコース（MW：186，Cambridge Isotope Laboratory製）を生理食塩水に溶解して50μmol/4mL濃度のU-13Ｃ-グルコース経口投与液を調製した。【０１６６】
（２）週齢変化における病態ステージモニターの実験
被験動物として、絶食させたZDF Laenラット（非糖尿病ラット：健常群）（雄，n=4）とZDF Fattyラット（雄， n=4）を用い、ZDF Fattyラットについては9，10，13，及び23週齢の各時点で、またZDF Laenラットについては13週齢の各時点で、上記で調製した投与液を強制的に4mL/kg経口投与した。次いで、各群について、U-13Ｃ-グルコース経口投与液投与前（0分）と投与後の各時点(10,20,30,40，50，60，80，100，120分）で呼気を採取し、呼気中に排出された13ＣＯ2濃度からΔ13Ｃ（‰）を、呼気分析用質量分析計（ABCA：SerCon社製）を用いて測定した。【０１６７】
（３）実験結果
各週齢時（ZDF Fatty：9W，10W，13W，23W、ZDF Laen：13W）にU-13Ｃ-グルコース経口投与液を投与した後に測定した呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移を図５に示す。図中、縦軸は呼気中Δ13Ｃ（‰）、また横軸はU-13Ｃ-グルコース経口投与液投与後の呼気採取時間（分）を示す。【０１６８】
図５に示すように、ZDF Fattyラット9週齢（―○―）では、健常群（ZDF Leanラット13週齢、―■―）と同様な呼気パターン（呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移）を示した。一方、ZDF Fattyラット10週齢群（―□―）及び13週齢群（―×―）では糖代謝が亢進しており、その呼気パターン（呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移）は健常群（―■―）の呼気パターンに比して高値を示した。更にZDF Fattyラット23週齢（―△―）では糖尿病を発症しており、その呼気パターンは健常群（―■―）の呼気パターンに比して低値を示した。このことから、13Ｃ-グルコースを用いた呼気試験により、呼気中Δ13Ｃ（‰）の指標とすることで、健常状態、糖尿病発症前段階、及び糖尿病の別をそれぞれ識別することができるとともに、糖尿病発症前段階及び糖尿病の病態ステージ（糖尿病病態ステージ）を経時的推移をモニタリングすることが可能であることが判明した。【０１６９】
実験例４  糖負荷条件下での呼気試験
（１）被験動物
被験動物として、糖尿病モデル動物であるOLETFラットとそのコントロールとしてLETOラットを用いた。具体的には、第１群（対照群：LETOラット，雄，n=5）と第２群（糖尿病群：OLETFラット，雄，n=6）を20時間絶食した後、下記の試験に供した。【０１７０】
（２）実験方法と結果
(2-1) 絶食下での呼気パターン（呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移）
絶食下の第１群（対照群）及び第２群（糖尿病群）に、それぞれU-13Ｃ-グルコース水溶液（50μmol/4mL/kg）を経口投与した。各群について、U-13Ｃ-グルコース投与前（0分）と投与後の各時点（10，20，30，40，50，60，80，100，120分）で呼気を採取し、呼気中に排出された13ＣＯ2濃度からΔ13Ｃ（‰）を呼気分析用質量分析計（ABCA：SerCon社製）を用いて測定した。図６に、その呼気パターン（呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移）を示す。【０１７１】
(2-2) グルコース450mg/4mL/kg投与下（糖負荷条件下）での呼気パターン（呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移）
（2-2-1）（１）の被験動物、第１群（対照群）及び第２群（糖尿病群）に、それぞれグルコース水溶液（450mg/4mL/kg）とU-13Ｃ-グルコース水溶液（50μmol/4mL/kg）を同時に経口投与した。
（2-1）と同様に、各群についてU-13Ｃ-グルコース投与前（0分）と投与後の各時点（10，20，30，40，50，60，80，100，120分）で呼気を採取し、呼気中に排出された13ＣＯ2濃度からΔ13Ｃ（‰）を測定した。図７にその呼気パターン（呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移）を示す。【０１７２】
（2-2-2）また、（１）の被験動物、第１群（対照群）及び第２群（糖尿病群）に、それぞれグルコース水溶液（450mg/4mL/kg）経口投与30分後にU-13Ｃ-グルコース水溶液（50μmo/4mL/kg）を経口投与した。（2-1）と同様に、各群についてU-13Ｃ-グルコース投与前（0分）と投与後の各時点（10，20，30，40，50，60，80，100，120分）で呼気を採取し、呼気中に排出された13ＣＯ2濃度からΔ13Ｃ（‰）を測定した。図８にその呼気パターン（呼気中Δ13Ｃ‰）の推移）を示す。【０１７３】
（2-2-3）（１）の被験動物、第１群（対照群）及び第２群（糖尿病群）に、それぞれグルコース水溶液（450mg/4mL/kg）経口投与30分後にU-13Ｃ-グルコース水溶液（50μmol/mL/kg）を静脈内投与した。（2-1）と同様に、各群についてU-13Ｃ-グルコース投与前（0分）と投与後の各時点（10，20，30，40，50，60，80，100，120分）で呼気を採取し、呼気中に排出された13ＣＯ2濃度からΔ13Ｃ（‰）を測定した。図９にその呼気パターン（呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移）を示す。【０１７４】
（2-2-4）（１）の被験動物、第１群（対照群）及び第２群（糖尿病群）に、それぞれグルコース水溶液（2g/4mL/kg）経口投与30分後にU-13Ｃ-グルコース水溶液（50μmol/mL/kg）を静脈内投与した。（2-1）と同様に、各群についてU-13Ｃ-グルコース投与前（0分）と投与後の各時点（10，20，30，40，50，60，80，100，120分）で呼気を採取し、呼気中に排出された13ＣＯ2濃度からΔ13Ｃ（‰）を測定した。図１０にその呼気パターン（呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移）を示す。【０１７５】
（2-2-5）（１）の被験動物、第１群（対照群）及び第２群（糖尿病群）に、それぞれ経腸栄養剤（たん白アミノ酸製剤：商品名「ラコール（登録商標）配合経腸用液」、イーエヌ大塚製薬株式会社）を4mL/kg経口投与し、30分後にU-13Ｃ-グルコース水溶液（50μmol/mL/kg）を静脈内投与した。（2-1）と同様に、各群についてU-13Ｃ-グルコース投与前（0分）と投与後の各時点（10，20，30，40，50，60，80，100，120分）で呼気を採取し、呼気中に排出された13ＣＯ2濃度からΔ13Ｃ（‰）を測定した。図１１にその呼気パターン（呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移）を示す。【０１７６】
各図（図６〜１１）中、縦軸はΔ13Ｃ（‰）であり、横軸はU-13Ｃ-グルコース投与後の呼気採取時間（分）を示す。また、―□―及び―■―は、それぞれ第１群（対照群）及び第２群（糖尿病群）を測定した呼気中Δ13Ｃ（‰）の経時的推移である。【０１７７】
（３）考察
図６に示すように、絶食下では第１群（対照群）と第２群（糖尿病群）のΔ13Ｃ（‰）値の差は小さかった。一方、図７〜１１に示すように、糖負荷条件下では第１群（対照群）の呼気パターン（呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移）は第２群（糖尿病群）の呼気パターン（呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移）に比して有意に高いことが判明した。つまり、絶食下では、健常者群（対照群）と糖尿病群との呼気反応（呼気パターン、呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移）の間に差はあるものの、その程度は小さいのに対して、糖負荷条件下での測定により、両者の呼気反応（呼気パターン、呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移）の差が増大する。このことから、糖負荷条件下で測定することにより、糖尿病群が健常者群（対照群）と区別されてより判別しやすくなることが確認された。【０１７８】
また、図７に示すように、糖負荷用の糖質と13Ｃ-グルコースとを同時に投与すると、第１群（対照群）と第２群（糖尿病群）の初期（特に投与後10分以内）の呼気反応に重なりが認められたが、図８に示すように、被験物質である13Ｃ-グルコースの投与前に、糖質を事前に投与（糖負荷）することで、上記初期の呼気反応の重なりが解消した。更に、図８と図９及び１０との対比からわかるように、13Ｃ-グルコースの投与形態を、経口投与（図８）から静脈内投与（図９および１０）に替えることで、第１群（対照群）と第２群（糖尿病群）における呼気反応の差、特に初期（例えば投与後10分以内）における呼気反応の差が一層広がった。【０１７９】
以上のことからわかるように、糖負荷条件下での13Ｃ-グルコースを用いた呼気試験、好ましくは事前に糖質を投与して糖負荷した条件下での13Ｃ-グルコースを用いた呼気試験、より好ましくは13Ｃ-グルコースを静脈投与して行う呼気試験により、糖尿病病態ステージの測定精度を高めることができる。【０１８０】
さらにまた、図１１に示すように、糖負荷に使用する糖質（グルコース）に替えて、たん白質、脂肪、糖類及び各種のミネラル成分を含む経腸溶液（ラコール[登録商標]配合経腸用液）を用いても、同様の結果が得られることが確認された。従来から、糖尿病患者においてOGTT（糖負荷試験）による高血糖の危険性が危惧されていることから、たん白質、脂肪、糖類及び各種のミネラル成分を含む飲食品は、従来のOGTTで使用される糖質（グルコース）に代わる試験食になり得ると考えられる。【０１８１】
実験例５  糖尿病治療薬の治療効果の評価
（１）実験方法
被験動物として３群のZDFラット（Ａ群：健常群（n=4）、Ｂ群：糖尿病重度発症群（n=6）、Ｃ群：糖尿病中度発症群（n=6））を用いた。なお、実験中、これらのZDFラットには、水及び餌料（糖質、脂質及び蛋白質含有）（ＭＦ：オリエンタル酵母社）を自由摂取させた。つまり、下記の実験は非絶食条件下で行った。【０１８２】
これら各群のラットに対してビグアナイド系糖尿病治療薬（総称名メルビン）の有効成分であるメトホルミン（和光株式会社）300mg/kgを毎朝３日間経口投与した。３日目の投与から３時間後に実験例1の（１）に記載する方法で調製したU-13Ｃ-グルコース溶液を静脈内投与した。【０１８３】
次いで各群のラットを対象として、U-13Ｃ-グルコース投与前（0分）と投与後の各時点（10，20，30，40，50，60，80，100，120分）で呼気を採取し、呼気中に排出された13ＣＯ2濃度からΔ13Ｃ（‰）を、呼気分析用質量分析計（ABCA：SerCon社製）を用いて測定した。【０１８４】
（２）実験結果
各３群（Ａ群：健常群、Ｂ群：糖尿病重度発症群、Ｃ群：糖尿病中度発症群）の糖尿病治療薬投与前（無処置）のΔ13Ｃ（‰）の推移（Ａ群：―◆―、Ｂ群：―■―、Ｃ群：―▲―）と糖尿病治療薬投与後のΔ13Ｃ（‰）の推移（Ｂ群：―□―、Ｃ群：―△―）を図１２に示す。図中、縦軸はΔ13Ｃ（‰），横軸はU-13Ｃ-グルコース投与後の呼気採取時間（分）を示す。【０１８５】
図１２からわかるように、２つの糖尿病発症群（Ｂ及びＣ群）はいずれも、糖尿病治療薬を投与することにより、糖尿病治療薬投与前よりも、呼気パターン（呼気中Δ13Ｃ（‰）の推移）が高くなり、糖代謝能が亢進することが判明した。つまり、糖尿病治療薬による治療効果が本発明の呼気試験を用いて評価判定出来ることが判明した。【０１８６】
また、この実験により、13Ｃ-グルコースを用いた呼気試験、特に13Ｃ-グルコースを静脈投与して行う呼気試験を用いることで、糖尿病治療薬による治療効果を３日以内という短期間で確認出来ることが判明した（通常、薬物による治療効果の判定には、薬物治療開始から約1ヶ月後のHbA1c測定値が指標として使用されている）。【０１８７】
実験例６  インスリン投与後の治療効果の評価
被験動物として、対照群（Wistarラット，雄，n=3），及び１型糖尿病群（STZラット，雄，n=3）を用いた。なお、実験中、これらのラットには、水及び餌料（糖質、脂質及び蛋白質含有）（ＭＦ：オリエンタル酵母社）を自由摂取させた。つまり、下記の実験は非絶食条件下で行った。【０１８８】
1型糖尿病群（STZラット）として、STZ（streptozocin：SIGNA）65mg/mL/kg を静脈内投与して1週間経過したラットを使用した。【０１８９】
１型糖尿病群にインスリン（SIGMA）30U/bodyを皮下投与し、インスリン投与前、投与から４時間後または投与から２４時間後に、実験例１（１）に記載する方法で調製した1-13Ｃ-グルコース溶液を静脈内投与した（但し、健常群である対照群のラットには、インスリン投与は実施しなかった）。次いで，各群のラット（対照群、１型糖尿病群、インスリン投与4h−糖尿病群、インスリン投与24h−糖尿病群）について、1-13Ｃ-グルコース投与前（0分）と投与後の各時点（10,20，30，40，50，60，80，100，120分）で呼気を採取し、呼気中に排出された13ＣＯ2濃度からΔ13Ｃ（‰）を呼気分析用質量分析計（ABCA：SerCon社製）を用いて測定した。【０１９０】
図１３に、各群のラット（対照群：―■―、１型糖尿病群：―□―、インスリン投与4h−糖尿病群：―△―、インスリン投与24h−糖尿病群：―●―）の呼気パターン（Δ13Ｃ（‰）の推移）を示す。図中、縦軸はΔ13Ｃ（‰）、横軸は1-13Ｃ-グルコース投与後の呼気採取時間（分）を示す。図１３のインスリン投与4h−糖尿病群（―△―）の結果からわかるように、インスリンの効果が持続している間のΔ13Ｃ（‰）は対照群とほぼ同様の値を示した。また、インスリン投与24h−糖尿病群（―●―）の結果からわかるように、インスリンの効果が消失することで呼気パターン（Δ13Ｃ（‰）の推移）が低値を示した。【０１９１】
以上の実験結果は、本発明の13Ｃ-グルコースを用いた呼気試験を用いることで、糖尿病患者に対するインスリンの効果を確認することができることを示している。
【図１】
2014030650.tif 000017
【図２】
2014030650.tif 000018
【図３】
2014030650.tif 000019
【図４】
2014030650.tif 000020
【図５】
2014030650.tif 000021
【図６】
2014030650.tif 000022
【図７】
2014030650.tif 000023
【図８】
2014030650.tif 000024
【図９】
2014030650.tif 000025
【図１０】
2014030650.tif 000026
【図１１】
2014030650.tif 000027
【図１２】
2014030650.tif 000028
【図１３】
2014030650.tif 000029
【国際調査報告】
2014030650.tif 000030
2014030650.tif 000031
2014030650.tif 000032
2014030650.tif 000033
2014030650.tif 000034
2014030650.tif 000035