(57)【要約】  本発明は、配列番号：１２３に示されるアミノ酸配列を有するＷＴ１ヘルパーペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＴＣＲのα鎖遺伝子およびβ鎖遺伝子のＣＤＲ３をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明は、これらのポリヌクレオチドによりコードされるペプチドにも関する。さらに本発明は、これらのポリヌクレオチドを含むＴＣＲ遺伝子を導入したＣＤ４＋Ｔ細胞、それを用いるＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導、ならびに癌の治療などにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、３、５、８、１０、１１、１３、１４、１６、１８、２０、２２、２３、２５、２７、２８、３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５６、５８からなる群より選択される塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、配列番号：１２３に示されるアミノ酸配列またはその変異配列を有するＷＴ１ヘルパーペプチド（ＷＴ１３３２ペプチドという）に特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＴＣＲのα鎖のＣＤＲ３をコードするポリヌクレオチド（αＣＤＲ３ポリヌクレオチドという）。
【請求項２】
配列番号：２、４，６、７、９、１２、１５、１７、１９、２１，２４、２６、２９、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５７、５９からなる群より選択される塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、ＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＴＣＲのβ鎖のＣＤＲ３をコードするポリヌクレオチド（βＣＤＲ３ポリヌクレオチドという）。
【請求項３】
請求項１に記載のαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよび請求項２記載のβＣＤＲ３ポリヌクレオチドの組であって、各ポリヌクレオチドが下記の塩基配列を有するものであるポリヌクレオチドの組：
αＣＤＲ３ポリヌクレオチド          βＣＤＲ３ポリヌクレオチド
配列番号：１                        配列番号：２      
配列番号：３                        配列番号：４      
配列番号：５                        配列番号：６      
配列番号：３                        配列番号：７      
配列番号：８                        配列番号：９      
配列番号：１０                      配列番号：１２      
配列番号：１１                      配列番号：１２      
配列番号：１３                      配列番号：１５      
配列番号：１４                      配列番号：１５      
配列番号：１６                      配列番号：１７      
配列番号：１８                      配列番号：１９      
配列番号：２０                      配列番号：２１      
配列番号：２２                      配列番号：２４      
配列番号：２３                      配列番号：２４      
配列番号：２５                      配列番号：２６      
配列番号：２７                      配列番号：４      
配列番号：２８                      配列番号：２９      
配列番号：３０                      配列番号：３２      
配列番号：３１                      配列番号：３２      
配列番号：３３                      配列番号：３４      
配列番号：３５                      配列番号：３６      
配列番号：３７                      配列番号：３８      
配列番号：３９                      配列番号：４０      
配列番号：４１                      配列番号：４２      
配列番号：４３                      配列番号：４４      
配列番号：４５                      配列番号：４６      
配列番号：４７                      配列番号：４８      
配列番号：４９                      配列番号：５０      
配列番号：５１                      配列番号：５２      
配列番号：５３                      配列番号：５４      
配列番号：５５                      配列番号：５７      
配列番号：５６                      配列番号：５７      
配列番号：５８                      配列番号：５９      
ただし、上記配列はその相補配列または縮重配列であってもよい。
【請求項４】
請求項３に記載したいずれかの組のαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドを含むＴＣＲ遺伝子。
【請求項５】
ＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞から得られる請求項４に記載したＴＣＲ遺伝子。
【請求項６】
請求項４または５に記載したＴＣＲ遺伝子をＣＤ４＋Ｔ細胞に導入することを特徴とする、ＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパー細胞の製造方法。
【請求項７】
請求項６に記載した方法により得られるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞。
【請求項８】
請求項３に記載したいずれかのポリヌクレオチドの組のαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチド含むＴＣＲ遺伝子を含むベクター。
【請求項９】
該導入が請求項８に記載のベクターを用いて行われる請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
請求項７に記載したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞と末梢血単核細胞を共培養することを特徴とする、ＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導増強方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載した方法により得られるＷＴ１特異的ＣＴＬ。
【請求項１２】
請求項７に記載したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を対象に導入することを特徴とする、対象における癌の治療または予防方法。
【請求項１３】
請求項７に記載したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を含有する、癌の治療または予防のための医薬組成物。
【請求項１４】
癌の治療または予防のための医薬の製造のための、請求項７に記載したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の使用。
【請求項１５】
請求項１に記載したαＣＤＲ３ポリヌクレオチド、請求項２に記載したβＣＤＲ３ポリヌクレオチド、あるいは請求項１に記載したαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよび請求項２に記載したβＣＤＲ３ポリヌクレオチドの両方を含むＤＮＡチップ。
【請求項１６】
請求項１５に記載のＤＮＡチップを用いることを特徴とする、検体中のＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の頻度測定方法。
【請求項１７】
請求項１に記載されたいずれかのαＣＤＲ３ポリヌクレオチドによりコードされるαＣＤＲ３ペプチド。
【請求項１８】
請求項２に記載されたいずれかのβＣＤＲ３ポリヌクレオチドによりコードされるβＣＤＲ３ペプチド。
【請求項１９】
請求項３に記載されたポリヌクレオチドのいずれかの組によりコードされるペプチドの組。
【請求項２０】
請求項１７もしくは請求項１８に記載のペプチドまたは請求項１９に記載のペプチドの組を含むチップ。
【請求項２１】
請求項１７〜１９のいずれかに記載のペプチドに対する抗体。
【請求項２２】
請求項２１に記載の抗体を用いることを特徴とする、検体中のＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の頻度測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌抗原特異的ヘルパーＴ細胞のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）遺伝子に含まれるポリヌクレオチドに関する。詳細には、配列番号：１２３に示されるアミノ酸配列を有するＷＴ１ヘルパーペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＴＣＲのα鎖およびβ鎖の各  相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明は、これらのポリヌクレオチドによりコードされるペプチドにも関する。さらに本発明は、これらのポリヌクレオチドを含むＴＣＲ遺伝子を導入したＣＤ４＋Ｔ細胞、それを用いるＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＷＴ１特異的ＣＴＬ）の誘導増強、ならびに癌の治療などにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＷＴ１遺伝子（Wilms' tumor 1 gene）は、小児の腎癌であるウイルムス腫瘍の責任遺伝子として同定された遺伝子であり（非特許文献１および２）、ジンクフィンガー構造を有する転写因子である。当初、ＷＴ１遺伝子は癌抑制遺伝子であるとされたが、その後の研究（非特許文献３、４、５および６）により、造血器腫瘍や固形癌においてはむしろ癌遺伝子として働くことが示された。【０００３】
ＷＴ１ペプチドを用いて末梢血単核球をインビトロで刺激することにより、ペプチド特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が誘導され、これらのＣＴＬは、内因性にＷＴ１を発現する造血器腫瘍や固形癌の癌細胞を傷害することが示された。ＣＴＬはＷＴ１ペプチドをＭＨＣクラスＩ分子に結合した複合体の形で認識するので、かかるＷＴ１ペプチドはＭＨＣクラスＩのサブタイプにより異なる（特許文献１、非特許文献７、特許文献２、３および４）。【０００４】
ＣＴＬが有効に誘導されるためには、癌抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の存在が重要である（非特許文献８）。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子と抗原ペプチドとの複合体を認識して誘導・活性化される。活性化されたヘルパーＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、あるいはインターフェロンなどのサイトカインを産生し、Ｂ細胞の増殖、分化、成熟を助ける。また、活性化ヘルパーＴ細胞は、Ｔ細胞の他のサブセット（Ｔｃ細胞など）の増殖、分化、成熟を促進する機能を有する。このように、活性化ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞の増殖・活性化を促進することにより免疫系を活性化する機能を有することから、癌免疫療法においてＭＨＣクラスＩＩ結合性の抗原ペプチド（ヘルパーペプチド）を介してヘルパーＴ細胞の機能を増強し、癌ワクチンの効果を増強することが有用であると考えられている（非特許文献９）。【０００５】
ＷＴ１に関して現在分かっているヘルパーペプチドとしては、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１分子に結合するもの（非特許文献１０）、ならびにＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０５分子に結合するものおよびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０２分子に結合するもの（特許文献５）、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０５分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９：０１分子およびＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１分子に結合するもの（特許文献６）が挙げられる。【０００６】
しかしながら、ヘルパーペプチドを認識する抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）遺伝子の配列は全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００３／１０６６８２号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００５／０９５５９８号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００７／０９７３５８号公報
【特許文献４】国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０７４１４６
【特許文献５】国際公開ＷＯ２００５／０４５０２７号公報
【特許文献６】国際公開ＷＯ２００８１０５４６２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Daniel A. Haber et al., Cell. 1990 Jun 29;61(7):1257-69.
【非特許文献２】Call KM et al., Cell. 1990 Feb 9;60(3):509-20.
【非特許文献３】Menke AL et al., Int Rev Cytol. 1998;181:151-212. Review.
【非特許文献４】Yamagami T et al., Blood. 1996 Apr 1;87(7):2878-84.
【非特許文献５】Inoue K et al., Blood. 1998 Apr 15;91(8):2969-76.
【非特許文献６】Tsuboi A et al., Leuk Res. 1999 May;23(5):499-505.
【非特許文献７】Oka Y et al., Immunogenetics. 2000 Feb;51(2):99-107.
【非特許文献８】Gao FG et al., Cancer Res. 2002 Nov 15;62(22):6438-41.
【非特許文献９】Zeng G, J Immunother. 2001 May;24(3):195-204
【非特許文献１０】Knights AJ et al., Cancer Immunol Immunother. 2002 Jul;51(5):271-81.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＷＴ１ヘルパーペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＴＣＲ遺伝子の配列を決定すること、これらのＴＣＲ遺伝子を導入したＣＤ４＋Ｔ細胞を得ること、かかる細胞を用いてＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導を増強すること、ならびにかかる細胞を用いて癌の治療または予防を行うことなどが、本発明の解決課題であった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、ＷＴ１ヘルパーペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＴＣＲのα鎖遺伝子およびβ鎖遺伝子を単離し、それぞれのＣＤＲ３の配列を決定することに成功した。さらに本発明者らは、かくして配列決定された配列を含むＴＣＲ遺伝子をＣＤ４＋Ｔ細胞に導入し、これを用いてＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導を増強すること、ならびにＷＴ１発現癌細胞を傷害することにも成功した。かくして本発明者らは本発明を完成させるに至った。【００１１】
すなわち本発明は、以下のものを提供する。
（１）配列番号：１、３、５、８、１０、１１、１３、１４、１６、１８、２０、２２、２３、２５、２７、２８、３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５６、５８からなる群より選択される塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、配列番号：１２３に示されるアミノ酸配列またはその変異配列を有するＷＴ１ヘルパーペプチド（ＷＴ１３３２ペプチド）に特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＴＣＲのα鎖のＣＤＲ３をコードするポリヌクレオチド（αＣＤＲ３ポリヌクレオチドという）。
（２）配列番号：２、４，６、７、９、１２、１５、１７、１９、２１，２４、２６、２９、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５７、５９からなる群より選択される塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、ＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＴＣＲのβ鎖のＣＤＲ３をコードするポリヌクレオチド（βＣＤＲ３ポリヌクレオチドという）。
（３）αＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドの組であって、各ポリヌクレオチドが下記の塩基配列を有するものであるポリヌクレオチドの組：
αＣＤＲ３ポリヌクレオチド          βＣＤＲ３ポリヌクレオチド
配列番号：１                        配列番号：２      
配列番号：３                        配列番号：４      
配列番号：５                        配列番号：６      
配列番号：３                        配列番号：７      
配列番号：８                        配列番号：９      
配列番号：１０                      配列番号：１２      
配列番号：１１                      配列番号：１２      
配列番号：１３                      配列番号：１５      
配列番号：１４                      配列番号：１５      
配列番号：１６                      配列番号：１７      
配列番号：１８                      配列番号：１９      
配列番号：２０                      配列番号：２１      
配列番号：２２                      配列番号：２４      
配列番号：２３                      配列番号：２４      
配列番号：２５                      配列番号：２６      
配列番号：２７                      配列番号：４      
配列番号：２８                      配列番号：２９      
配列番号：３０                      配列番号：３２      
配列番号：３１                      配列番号：３２      
配列番号：３３                      配列番号：３４      
配列番号：３５                      配列番号：３６      
配列番号：３７                      配列番号：３８      
配列番号：３９                      配列番号：４０      
配列番号：４１                      配列番号：４２      
配列番号：４３                      配列番号：４４      
配列番号：４５                      配列番号：４６      
配列番号：４７                      配列番号：４８      
配列番号：４９                      配列番号：５０      
配列番号：５１                      配列番号：５２      
配列番号：５３                      配列番号：５４      
配列番号：５５                      配列番号：５７      
配列番号：５６                      配列番号：５７      
配列番号：５８                      配列番号：５９      
ただし、上記配列はその相補配列または縮重配列であってもよい。
（４）（３）に記載したいずれかの組のαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドを含むＴＣＲ遺伝子。
（５）ＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞から得られる（４）に記載したＴＣＲ遺伝子。
（６）（４）に記載したＴＣＲ遺伝子をＣＤ４＋Ｔ細胞に導入することを特徴とする、ＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパー細胞の製造方法。
（７）（５）に記載した方法により得られるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞。
（８）（３）に記載したいずれかのポリヌクレオチドの組のαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチド含むＴＣＲ遺伝子を含むベクター。
（９）該導入が（８）に記載のベクターを用いて行われる（６）記載の方法。
（１０）（７）に記載したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞と末梢血単核細胞を共培養することを特徴とする、ＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導増強方法。
（１１）（１０）に記載した方法により得られるＷＴ１特異的ＣＴＬ。
（１２）（７）に記載したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を対象に導入することを特徴とする、対象における癌の治療または予防方法。
（１３）（７）に記載したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を含有する、癌の治療または予防のための医薬組成物。
（１４）癌の治療または予防のための医薬の製造のための、（７）に記載したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の使用。
（１５）（１）に記載したαＣＤＲ３ポリヌクレオチド、（２）に記載したβＣＤＲ３ポリヌクレオチド、あるいは（１）に記載したαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよび（２）に記載したβＣＤＲ３ポリヌクレオチドの両方を含むＤＮＡチップ。
（１６）（１５）に記載のＤＮＡチップを用いることを特徴とする、検体中のＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の頻度測定方法。
（１７）（１）に記載されたいずれかのαＣＤＲ３ポリヌクレオチドによりコードされるαＣＤＲ３ペプチド。
（１８）（２）に記載されたいずれかのβＣＤＲ３ポリヌクレオチドによりコードされるβＣＤＲ３ペプチド。
（１９）（３）に記載されたポリヌクレオチドのいずれかの組によりコードされるペプチドの組。
（２０）（１７）もしくは（１８）に記載のペプチドまたは（１９）に記載のペプチドの組を含むチップ。
（２１）（１７）〜（１９）のいずれかに記載のペプチドに対する抗体。
（２２）（２１）に記載の抗体を用いることを特徴とする、検体中のＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の頻度測定方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、本発明により決定されたＣＤＲ３塩基配列を有するＴＣＲ遺伝子を導入されたＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が得られ、これを用いてＷＴ１特異的ＣＴＬを誘導することができ、効果的に癌を治療または予防することができる。さらに、これらのＴＣＲ配列を用いてＤＮＡチップを作成し、検体中のＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の頻度を測定することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明により得られたＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＴＣＲのα鎖およびβ鎖のＣＤＲ３の塩基配列およびそれによりコードされるＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。各配列の右端の括弧内の数は配列表の配列番号を示す。これらの配列をクローンごとに示す。Ｖ−ＧＥＮＥ、Ｊ−ＧＥＮＥ、Ｄ−ＧＥＮＥはそれぞれ、各遺伝子のＶ領域、Ｊ領域、Ｄ領域がどのようなものかを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明により得られたＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＴＣＲのα鎖およびβ鎖のＣＤＲ３の塩基配列およびそれによりコードされるＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。各配列の右端の括弧内の数は配列表の配列番号を示す。これらの配列をクローンごとに示す。Ｖ−ＧＥＮＥ、Ｊ−ＧＥＮＥ、Ｄ−ＧＥＮＥはそれぞれ、各遺伝子のＶ領域、Ｊ領域、Ｄ領域がどのようなものかを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、表３に示すＴＣＲ遺伝子を導入されたＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のインターフェロンγ産生を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、表３に示すＴＣＲ遺伝子を導入されたＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＩＬ−２産生を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＷＴ１３３２ペプチド濃度に対するＴＣＲ遺伝子を導入されたＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＴＮＦ−α産生応答を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、各種物質添加系でのＴＣＲ遺伝子を導入されたＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の増殖能を示す。ＷＴ１３３２はＷＴ１３３２ペプチド存在下、α−ＤＰは抗−ＨＬＡ−ＤＰ抗体存在下、α−ＤＱは抗−ＨＬＡ−ＤＱ抗体存在下、α−ＤＲは抗−ＨＬＡ−ＤＲ抗体存在下、ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉは抗−ＨＬＡクラスＩ抗体存在下、ＨＩＶはＨＩＶペプチド（ＦＲＫＱＮＰＤＩＶＩＹＱＹＭＤＤＬＹＶＧ）（配列番号：１２４）存在下での培養を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、各種物質をパルスしたＰＢＭＣ存在下でのＴＣＲ遺伝子を導入されたＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の増殖を示す。ＷＴ１３３２はＷＴ１３３２ペプチドをパルスした自己のＰＢＭＣ、ＨＷＴ１は全長のＷＴ１蛋白をパルスした自己のＰＢＭＣ、ＨＷＴ３は短縮されたＷＴ１蛋白（ＷＴ１３３２配列を含まない）をパルスした自己のＰＢＭＣ、ＰＨＡ−ｂｌａｓｔはＰＨＡ−ｂｌａｓｔの溶解物をパルスしたＰＢＭＣ、ＴＦ１はＷＴ１を発現する白血病細胞株ＴＦ−１の溶解物をパルスしたＰＢＭＣ、Ｋ５６２はＷＴ１を発現する白血病細胞株Ｋ５６２の溶解物をパルスしたＰＢＭＣにて刺激したことを示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、各種物質をパルスしたＰＢＭＣ存在下でのＴＣＲ遺伝子を導入されたＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＩＦＮ−γ産生を示す。ＷＴ１３３２はＷＴ１３３２ペプチドをパルスした自己のＰＢＭＣ、ＨＷＴ１は全長のＷＴ１蛋白をパルスした自己のＰＢＭＣ、ＨＷＴ３は短縮されたＷＴ１蛋白（ＷＴ１３３２配列を含まない）をパルスした自己のＰＢＭＣ、ＰＨＡ−ｂｌａｓｔはＰＨＡ−ｂｌａｓｔの溶解物をパルスしたＰＢＭＣ、ＴＦ１はＷＴ１を発現する白血病細胞株ＴＦ−１の溶解物をパルスしたＰＢＭＣ、Ｋ５６２はＷＴ１を発現する白血病細胞株Ｋ５６２の溶解物をパルスしたＰＢＭＣにて刺激したことを示す。
【図２Ｇ】図２Ｇは、３人の健常人（ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性）に由来する、ＴＣＲ遺伝子を導入されたＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞株のＷＴ１３３２ペプチドに応答した各種サイトカイン産生の平均値を示す。黒棒はＷＴ１３３２ペプチドでの刺激あり、白棒は刺激なしを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＰＢＭＣとＴＣＲ遺伝子を導入されたＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を図に示した割合で共培養したときのＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＰＢＭＣとＴＣＲ遺伝子を導入されたＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を図に示した割合で共培養したときの改変型ＷＴ１２３５／ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２テトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＰＢＭＣとＴＣＲ遺伝子を導入されたＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を図に示した割合で共培養したときのＷＴ１特異的ＣＴＬの細胞数を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＰＢＭＣとＴＣＲ遺伝子を導入されたＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を図に示した割合で共培養したときの、改変型ＷＴ１２３５の刺激によってインターフェロンγを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、図に示したＥ：Ｔ比における、ＴＣＲ遺伝子を導入されたＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によるＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性ＷＴ１発現白血病細胞株ＴＦ−１およびＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陰性ＷＴ１発現白血病細胞株ＴＦ−１の傷害を溶解率（％）で表す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図に示したＥ：Ｔ比における、ＴＣＲ遺伝子を導入されたＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によるＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性でＷＴ１を強制発現させたＢ−ＬＣＬ細胞およびＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性でＷＴ１を発現しないＢ−ＬＣＬ細胞の傷害を溶解率（％）で表す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、図に示したＥ：Ｔ比における、ＴＣＲ遺伝子を導入されたＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によるＫ５６２細胞株およびＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性でＷＴ１を発現する白血病細胞株Ｃ２Ｆ８の傷害を溶解率（％）で表す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＴＣＲ遺伝子を導入されたＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞におけるグランザイムＢ（左）およびパーフォリン（右）の発現をフローサイトメトリーにて検出した結果を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、実施例４に記載された方法で培養されたＴＣＲ遺伝子を導入されたＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＣＤ１０７ａ産生細胞およびＩＦＮ−γ産生細胞の割合を調べたフローサイトメトリーの結果である。
【図４Ｆ】図４Ｆは、Ａｃ−ＩＥＴＤ−Ｃｈｏにて前処理されたＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性ＴＦ−１細胞に対するＴＣＲ遺伝子を導入されたＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の細胞傷害活性と、ＤＭＳＯにて前処理されたＴＦ−１細胞に対するＴＣＲ遺伝子を導入されたＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の細胞傷害活性を比較した結果を示す棒グラフである。棒の高さは平均値を示し、標準偏差のバーを添えてある。アステリスクはｐ＜０．０５であることを示す。
【図５】図５は、ＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞由来ＴＣＲ遺伝子を導入されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるＮＯＧ（登録商標）マウスでの抗腫瘍効果を示す生存曲線である。実線は、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１拘束性ＷＴ１３３２特異的ＴＣＲを導入したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を移入したマウスの生存曲線を示す。破線は、コントロールベクターを導入したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を移入したマウスの生存曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ＷＴ１ヘルパーペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞クローンのＴＣＲのＣＤＲ３を含むα鎖をコードするポリヌクレオチド（αＣＤＲ３ポリヌクレオチドという）の塩基配列およびＣＤＲ３を含むβ鎖をコードするポリヌクレオチド（βＣＤＲ３ポリヌクレオチドという）の塩基配列を決定したことに基づく。したがって、本発明は、１つの態様において、図１に示す塩基配列（配列番号：１、３、５、８、１０、１１、１３、１４、１６、１８、２０、２２、２３、２５、２７、２８、３０、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５６、５８からなる群より選択される塩基配列）を有するαＣＤＲ３ポリヌクレオチド、ならびに図１に示す塩基配列（配列番号：２、４，６、７、９、１２、１５、１７、１９、２１，２４、２６、２９、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５７、５９からなる群より選択される塩基配列）を有するβＣＤＲ３ポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
好ましくは、図１に示すように、各クローンに含まれるαＣＤＲ３ポリヌクレオチドとβＣＤＲ３ポリヌクレオチドとが１つのＴＣＲに含まれることが、受容体機能発現の観点から好ましい。すなわち、図１に示すように、各クローンに対応したαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドが組をなすことが好ましい。したがって、本発明は、さらなる態様において、αＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドの組であって、組を構成する各ポリヌクレオチドが図１に示す塩基配列を有するものである組を提供する。αＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドの組合せはクローンによって異なる。各クローン中のαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドの組の塩基配列は図１に示すとおりである。
【００１６】
αＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドに対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドも、αＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドに包含される。また、図１に示すペプチドをコードする限り、αＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチド配列の縮重配列も、αＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドに包含される。
【００１７】
αＣＤＲ３ポリヌクレオチドの塩基配列に対して、７０％以上、例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上または９０％以上、例えば９２％、９４％、９６％または９８％以上の同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドも、αＣＤＲ３ポリヌクレオチドに包含される。βＣＤＲ３ポリヌクレオチドの塩基配列に対して、７０％以上、例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上または９０％以上、例えば９２％、９４％、９６％または９８％以上の同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドも、βＣＤＲ３ポリヌクレオチドに包含される。
【００１８】
αＣＤＲ３ポリヌクレオチドの塩基配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする塩基配列を有するポリヌクレオチドも、αＣＤＲ３ポリヌクレオチドに包含される。βＣＤＲ３ポリヌクレオチドの塩基配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする塩基配列を有するポリヌクレオチドも、βＣＤＲ３ポリヌクレオチドに包含される。
【００１９】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、５ｘＳＳＣ、７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ  変性サケ精子ＤＮＡおよび５ｘデンハルト溶液を含む溶液中で、４８〜５２℃にてハイブリダイゼーションを行い、０．１ｘＳＳＣ、０．５ｘＳＳＣ、１ｘＳＳＣまたは２ｘＳＳＣ中で、４８〜６８℃にて１時間洗浄する条件、あるいは２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、１％  ＳＤＳ、５０％ホルムアミドおよび２００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃にてハイブリダイゼーションを行い、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  クエン酸三ナトリウムおよび０．１％  ＳＤＳを含む溶液中で洗浄を行う条件が挙げられる。
【００２０】
本発明は、もう１つの態様において、上記のαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドによりコードされるペプチド（それぞれ、αＣＤＲ３ペプチド、βＣＤＲ３ペプチドという）を提供する。これらのペプチドは図１に示すアミノ酸配列を有する。好ましくは、これらのペプチドは、図１に示すように、各クローンに対応したαＣＤＲ３ペプチドおよびβＣＤＲ３ペプチドの組をなす。
【００２１】
本明細書において、ペプチドのアミノ酸配列の表記は慣用的な１文字法または３文字法にて行う。
【００２２】
上で説明したαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドの変異体によりコードされるペプチドもαＣＤＲ３ペプチド、βＣＤＲ３ペプチドに包含される。αＣＤＲ３ペプチドのアミノ酸配列に対して、７０％以上、例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上または９０％以上、例えば９２％または９４％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドも、αＣＤＲ３ペプチドに包含される。βＣＤＲ３ペプチドのアミノ酸配列に対して、７０％以上、例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上または９０％以上、例えば９２％または９４％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドも、βＣＤＲ３ペプチドに包含される。さらに、αＣＤＲ３ペプチドのアミノ酸配列において、１個〜数個（例えば、１個、２個、３個、４個または５個）のアミノ酸が置換、欠失、付加されたアミノ酸配列を有するペプチドも、αＣＤＲ３ペプチドに包含される。βＣＤＲ３ペプチドのアミノ酸配列において、１個〜数個（例えば、１個、２個、３個、４個または５個）のアミノ酸が置換、欠失、付加されたアミノ酸配列を有するペプチドも、βＣＤＲ３ペプチドに包含される。ただし、これらの変異ペプチドは元のαＣＤＲ３ペプチドまたはβＣＤＲ３ペプチドと同様の特性を有するものである。
【００２３】
これらのポリヌクレオチドおよびペプチドは、当業者に公知の化学的方法および／または生物学的方法を用いて合成することができる。
【００２４】
本発明において、ＷＴ１ヘルパーペプチドは配列番号：１２３に示すアミノ酸配列（Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｈｉｓ）またはその変異配列を有するペプチドである（これらのペプチドをＷＴ１３３２ペプチドと称する）。ＷＴ１３３２ペプチドはＷＴ１ポリペプチドの部分配列またはその変異配列であってもよい。その一例として、配列番号：１２３に示すアミノ酸配列またはその変異配列からなるペプチドが挙げられる。
【００２５】
ＷＴ１３３２ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９：０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０５分子またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０２分子に対する結合能を有していることが知られている。
【００２６】
上記の配列番号：１２３に示すアミノ酸配列の変異配列とは、配列番号：１２３に示すアミノ酸配列において、１個〜数個（例えば、１個、２個、３個、４個または５個）のアミノ酸が置換、欠失、付加されたアミノ酸配列をいう。あるいは上記の配列番号：１２３に示すアミノ酸配列の変異配列とは、配列番号：１２３に示すアミノ酸配列に対して７０％以上、例えば７５％以上、８０％以上、８５％以上または９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をいう。配列番号：１２３に示すアミノ酸配列またはその変異配列を有するペプチドは、好ましくは２５アミノ酸またはそれ未満の長さを有するものである。配列番号：１２３に示すアミノ酸配列の変異配列を有するペプチドは、配列番号：１２３に示すアミノ酸配列を有するペプチドと同様の特性を有するものである。
【００２７】
本発明は、さらなる態様において、図１に示すいずれかの組に属するαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドを含むＴＣＲ遺伝子に関する。かかるＴＣＲ遺伝子は、ＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞から単離してもよく、公知の遺伝子操作技術を用いて調製してもよい。
【００２８】
本発明は、さらなる態様において、図１に示すいずれかの組に属するαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドを含むＴＣＲ遺伝子をＣＤ４＋Ｔ細胞に導入することにより得られるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（ＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞という）に関する。ＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、ＷＴ１３３２特異的かつＨＬＡクラスＩＩ拘束性に増殖反応およびサイトカイン産生を示す。
【００２９】
図１に示す１つの組に属するαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドを含むＴＣＲ遺伝子をＣＤ４＋Ｔ細胞に導入することは、当業者が容易に行いうることである。例えば、各種ベクター、エレクトロポレーション、あるいは遺伝子銃などを用いることにより、ＴＣＲ遺伝子を導入することができる。導入されるＴＣＲ遺伝子は、ＴＣＲ発現効率の向上などを目的として、改変が加えられていてもよい。
【００３０】
したがって、本発明は、さらなる態様において、図１に示すいずれかの組のαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドを含むＴＣＲ遺伝子を含むベクターを提供する。
【００３１】
ＴＣＲ遺伝子の導入は、αＣＤＲ３ポリヌクレオチドを含むＴＣＲのα鎖遺伝子と、βＣＤＲ３ポリヌクレオチドを含むＴＣＲのβ鎖遺伝子を別々のベクターに挿入し、これらのベクターをＣＤ４＋Ｔ細胞に導入することにより行ってもよい。
【００３２】
αＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドを含むＴＣＲ遺伝子を導入されるＣＤ４＋Ｔ細胞としては、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９：０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０５陽性またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０２陽性の対象に由来するものが例示されるが、これらに限定されない。また、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、癌にかかっている対象および癌にかかっていない対象（健常人を含む）のいずれに由来するものであってもよく、あるいは骨髄移植のドナーに由来するものであってもよい。
【００３３】
本発明は、さらなる態様において、図１に示すいずれかの組に属するαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドを含むＴＣＲ遺伝子を含む、ＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞にも関する。
【００３４】
ＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を用いて、ＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導を増強することができる。具体的には、ＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞と末梢血単核細胞を共培養することにより、ＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導を増強することができる。したがって、本発明は、さらなる態様において、ＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞と末梢血単核細胞を共培養することを特徴とする、ＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導増強方法を提供する。もう１つの態様において、本発明は、上記方法により得られるＷＴ１特異的ＣＴＬに関する。
【００３５】
ＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞と末梢血単核細胞との共培養の方法および条件は公知である。当方法は、インビボあるいはインビトロいずれにおいても行うことができる。ＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導を増強する際に用いるＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は１種類であってもよいが、２種類以上のＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を用いることが好ましい。
【００３６】
本発明のＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導増強方法において用いられる末梢血単核細胞としては、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９：０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０５陽性またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０２陽性の対象に由来するものが例示されるが、これらに限定されない。好ましくは、末梢血単核細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞は、癌を治療または予防すべき対象から得られたものである。
【００３７】
共培養の際に、ＷＴ１３３２ペプチドおよび／または他のＷＴ１ペプチドが共存していることは好ましい。他のＷＴ１ペプチドとして、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９：０１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１分子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０５分子またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０２分子に対する結合能を有するものが例示されるが、これらに限定されない。
【００３８】
上記方法により誘導されたＷＴ１特異的ＣＴＬを、必要に応じてさらに培養して細胞数を増加させ、対象に投与することにより、対象における癌の治療または予防に資することができる。このような癌の治療または予防において、ＷＴ１３３２ペプチドおよび／または他のＷＴ１ペプチドを共投与することは好ましい。ＷＴ１特異的ＣＴＬの作用により、他の癌抗原に対して特異的なＣＴＬも誘導されうる。
【００３９】
ＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、ＷＴ１を発現する癌細胞に傷害を与えることができる。したがって、本発明は、さらなる態様において、ＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を対象に導入することを特徴とする、対象における癌の治療または予防方法を提供する。
【００４０】
本発明は、さらなる態様において、ＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を含有する、癌の治療または予防のための医薬組成物、癌の治療または予防のための医薬の製造のためのＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の使用、ならびに癌の治療または予防のためのＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の使用を提供する。
【００４１】
なお、本明細書において、癌の「治療」とは、癌の進行を抑制すること、癌を縮小させること、癌を消失させる等の癌の処置だけでなく、癌の再発を防止することも含む。
【００４２】
癌を治療または予防される対象としては、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０９：０１陽性、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０５陽性またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０２陽性の対象が例示されるが、これらに限定されない。上記対象は、癌患者に限られず、癌にかかっていない人（健常人を含む）であってもよく、骨髄移植のドナーであってもよい。
【００４３】
上記治療または予防方法、医薬組成物および使用の具体例の１つを以下に説明するが、この例に限定されるものではない。まず、治療を要する癌患者の末梢血からＣＤ４＋Ｔ細胞を採取し、これにαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドを含むＴＣＲ遺伝子を導入して、ＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を得る。かくして得られたＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を当癌患者に投与するのであるが、その前に、適当な条件下でＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を培養して増殖させて、十分な数の細胞を得てから、当癌患者に投与することができる。
【００４４】
投与されるＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は１種類であってもよいが、２種類以上のＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を対象に投与するほうが、治療または予防効果の向上の点から好ましい。
【００４５】
ＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を対象に投与する場合、投与細胞数、投与回数、投与間隔などの条件は医師が適宜決定することができる。例えばＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を１回だけ投与してもよく、複数回に分けて投与してもよい。典型的には、成人対象の場合、１回に投与されるＴＣＲ遺伝子導入ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞数は約１０９個〜約１０１１個であるが、これらの量に限定されない。
【００４６】
上記治療または予防方法、医薬組成物および使用において、ＷＴ１３３２ペプチドおよび／または他のＷＴ１ペプチドを共投することは好ましい。ＷＴ１３３２ペプチドおよび／または他のＷＴ１ペプチドの投与量および投与回数は、医師が適宜決定することができる。また、他の抗癌治療または予防を併用してもよい。
【００４７】
上記治療または予防方法、医薬組成物および使用は、固形癌、血液癌を問わず広範囲の種類の癌に適用することができ、例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、同種造血幹細胞移植後再発などの血液悪性疾患；舌癌、歯肉癌、口腔底癌、咽頭癌、喉頭癌、唾液腺癌、甲状腺癌などの固形癌；乳癌、肺癌、胸腺癌などの胸部の癌；大腸癌、小腸癌、胃癌、膵臓癌、肝癌、胆管癌、消化器内分泌腫瘍、消化管カルチノイドなどの消化器の癌；腎癌、尿路上皮癌、胚細胞腫、ウイルムス腫瘍、前立腺癌、子宮体癌、子宮頚癌、子宮肉腫、卵巣悪性腫瘍などの尿路生殖器系の癌；骨原発性悪性腫瘍（骨肉種、Ewing肉腫など）、軟部肉腫などの筋・骨格系の悪性腫瘍；その他皮膚癌、神経芽細胞腫、悪性神経膠腫（グリオブラストーマ）、中枢神経原発悪性リンパ腫、髄芽腫・ＰＮＥＴなどに適用できるが、これらの癌や腫瘍に限定されない。
【００４８】
ＣＤＲ３は最も多様性に富む領域であり、抗原認識の特異性に最も強く関与する部分である。それゆえ、本発明のαＣＤＲ３ポリヌクレオチド、βＣＤＲ３ポリヌクレオチド、αＣＤＲ３ペプチド、βＣＤＲ３ペプチドの配列は、ＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞に特有の配列であると考えられる。したがって、あるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＴＣＲのα鎖およびβ鎖のＣＤＲ３領域をコードするポリヌクレオチドまたはそのＣＤＲ３領域のペプチドが本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のペプチドの配列を有していれば、そのＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞はＷＴ１３３２ペプチドに特異的であると考えられる。
【００４９】
例えば、（ｉ）１種またはそれ以上のαＣＤＲ３ポリヌクレオチドを含むＤＮＡチップ、（ｉｉ）１種またはそれ以上のβＣＤＲ３ポリヌクレオチドを含むＤＮＡチップ、あるいは（ｉｉｉ）１種またはそれ以上のαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよびβＣＤＲ３ポリヌクレオチドの両方を含むＤＮＡチップを用いて、検体中のＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の頻度を測定することができる。具体的には、対象から得られた検体中の細胞を公知の方法により溶解させ、核酸を抽出することにより調製した試料をＤＮＡチップに接触させる。
【００５０】
例えば、（ｉ）のチップに試料を接触させて、いずれかの位置にハイブリダイゼーションが見られたならば、（ｉｉ）のチップに同じ試料を接触させて、ハイブリダイゼーションが見られるかどうか確認する。そして、（ｉ）のチップおよび（ｉｉ）のチップにおけるハイブリダイゼーションが、図１に示すいずれかの組を構成するαＣＤＲ３ポリヌクレオチドとβＣＤＲ３ポリヌクレオチドとの間で生じたならば、試料中に機能的なＴＣＲを有するＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が存在すると判断することができる。（ｉｉｉ）のチップを用いれば、上記操作を１工程で行うことが可能である。
【００５１】
ＤＮＡチップはマイクロチップ、マイクロアレイなどの形態であってもよい。これらのチップは公知の方法により作製することができ、例えば、ガラス基盤上にαＣＤＲ３ポリヌクレオチドおよび／またはβＣＤＲ３ポリヌクレオチドを公知の方法で固定することができる。試料中のＤＮＡあるいはチップ上のＤＮＡ配列に、ハイブリダイゼーションの有無およびハイブリダイゼーション量を示すことのできる標識を付しておくことが好ましい。
【００５２】
ＤＮＡチップ以外にも、サザンブロット、ノーザンブロット、コロニーハイブリダイゼーションなどの手法を用いて、検体中のＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の頻度を測定することができる。
【００５３】
さらに、αＣＤＲ３ペプチドおよびβＣＤＲ３ペプチドを用いて、ＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞に対する抗体を得ることもできる。かかる抗体を用いて、検体中のＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を検出することができる。かかる抗体を用いて、ＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の受容体を刺激することもできる。かかる刺激はインビボ、インビトロいずれにおいても行うことができる。
【００５４】
αＣＤＲ３ペプチドを含むチップあるいはβＣＤＲ３ペプチドを含むチップ、あるいはαＣＤＲ３ペプチドおよびβＣＤＲ３ペプチドの両方を含むチップを用いて、ＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞に対する抗体を検出することもできる。
【００５５】
これらのペプチドを含むチップは、公知の方法にて作製することができる。試料中のペプチドあるいはチップ上のペプチドに、特異的結合の有無を判別できる標識を付しておくことが好ましい。
【００５６】
αＣＤＲ３ペプチドおよび／またはβＣＤＲ３ペプチドに対する抗体を含むチップを用いて、試料中のαＣＤＲ３ペプチドおよび／またはβＣＤＲ３ペプチドの種類や量を調べることもでき、あるいは試料中のＷＴ１３３２ペプチドに特異的なＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の種類や量を調べることができる。
【００５７】
これらの抗体を固定したチップは、公知の方法にて作製することができる。試料中のペプチドあるいはチップ上の抗体に、特異的結合の有無を判別できる標識を付しておくことが好ましい。
【００５８】
配列の説明
配列番号：１−５９は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞クローンのＴＣＲに含まれるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：６０−１１８は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞クローンのＴＣＲに含まれるＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
配列番号：１１９は、ＴＣＲα鎖増幅用のリバースプライマーである。
配列番号：１２０は、ＴＣＲβ鎖増幅用のリバースプライマーである。
配列番号：１２１は、ＴＣＲβ鎖増幅用のリバースプライマーである。
配列番号：１２２は、ＣＤＲ３ヌクレオチド配列決定用のプライマーである。
配列番号：１２３は、ＷＴ１３３２ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：１２４は、ＨＩＶペプチドのアミノ鎖配列である。
配列番号：１２５は、天然ＷＴ１ペプチドの変異体のアミノ酸配列である。
【００５９】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００６０】
実施例１  ＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンの樹立とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子の単離および配列決定
実験手順は以下のとおりであった。【００６１】
（１）ＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンの樹立法
（ｉ）健常人由来末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を採取し、２４穴プレートに３×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播く。メディウムは１０％  ＡＢ  ｓｅｒｕｍ、４０ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２添加Ｘ−ＶＩＶＯ  １５メディウムを用いる。
（ｉｉ）上記ｉにＷＴ１３３２ペプチドを終濃度２０μｇ／ｍｌで添加し７日間培養する。
（ｉｉｉ）７日後、細胞を回収し１０％  ＡＢ  ｓｅｒｕｍ添加Ｘ−ＶＩＶＯ  １５メディウムで１×１０７  ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調製し、それを１００μｌずつ丸底９６穴プレートに播く。
（ｉｖ）１０％  ＡＢ  ｓｅｒｕｍ添加Ｘ−ＶＩＶＯ  １５メディウムにＷＴ１３３２ペプチド、ＢＤ  ＧｏｌｇｉＳｔｏｐＴＭ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＣＤ２８／ＣＤ４９ｄ  Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をそれぞれ終濃度４０μｇ／ｍｌ、終濃度４μｇ／ｍｌおよび終濃度４μｇ／ｍｌになるように添加する。
（ｖ）上記ｉｖを１００μｌずつ上記ｉｉｉに加える。
（ｖｉ）上記ｖに抗−ヒトＣＤ１５４−ＡＰＣ標識抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を１０μｌずつ加えて、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターで６時間インキュベーションする。
（ｖｉｉ）インキュベーション後、細胞を回収し、抗−ヒトＣＤ４−ＡＰＣ−Ｈ７標識抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ヒトＣＤ３−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ標識抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および死細胞を除くために７−ＡＡＤ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色する。
（ｖｉｉｉ）３人の健常人からＰＢＭＣを採取・混合し、３０Ｇｙのγ線を照射し終濃度１０％  ＡＢ  ｓｅｒｕｍ、終濃度１００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２、終濃度３μｇ／ｍｌ  ＰＨＡ添加Ｘ−ＶＩＶＯ  １５メディウムで１×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調製する。これを１００μｌずつ丸底９６穴プレートに播く。
（ｉｘ）ＦＡＣＳＡｒｉａ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒを用いて７−ＡＡＤ−ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１５４＋細胞分画、つまりＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が含まれる細胞分画を上記ｖｉｉｉの各ウェルにシングルセルソーティングする。
（ｘ）１０〜１４日間の培養後、増殖してきた各ウェルの細胞を独立したＣＤ４＋Ｔ細胞クローンとする。【００６２】
（２）ＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンのスクリーニング
（ｉ）上記（１）−ｘの各ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを３×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１％  ＡＢ  ｓｅｒｕｍ添加Ｘ−ＶＩＶＯ  １５メディウム中に調製する。
（ｉｉ）ＷＴ１３３２をパルスした、もしくはペプチドを何もパルスしていない自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）ＰＢＭＣに３０Ｇｙのγ線を照射し、１×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１％  ＡＢ  ｓｅｒｕｍ添加Ｘ−ＶＩＶＯ  １５メディウム中に調製する。
（ｉｉｉ）上記（２）−ｉおよびｉｉを１００μｌずつ丸底９６穴プレートに播く。
（ｉｖ）２日間の培養後、各ウェルに３Ｈ−チミジンを１μＣｉ／ｗｅｌｌになるように添加する。
（ｖ）１８時間後に各ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンに取り込まれた３Ｈ−チミジンを測定し、ＷＴ１３３２特異的な増殖反応を示すＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを選び出す。これをＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンとする。
（ｖｉ）ＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンの培養は１〜２週間に一度くらいの頻度でＷＴ１３３２をパルスした自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）ＰＢＭＣに３０Ｇｙのγ線を照射したものと共培養することで、ＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを刺激し行う。【００６３】
（３）５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄ）法を用いたＴＣＲ遺伝子の単離
（ｉ）ＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを最後の刺激から１０日間以上培養する。これは刺激に用いる自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）ＰＢＭＣに含まれるＴ細胞の混入を防ぐためである。
（ｉｉ）ＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンをペレットにし、そこにＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて、そのマニュアルに従ってＲＮＡを抽出する。
（ｉｉｉ）上記（３）−ｉｉで抽出したＲＮＡをクロンテック社ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてｃＤＮＡを合成する。
（ｉｖ）上記（３）−ｉｉｉで合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＴＣＲ  α鎖およびβ鎖遺伝子を増幅する。用いるプライマーはＳＭＡＲＴｅｒTM  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属のＵＰＭプライマーをフォワードプライマーとし、以下のＴＣＲ特異的プライマーをリバースプライマーとした：
Cα3’UTR-primer: 5’-CAC AGG CTG TCT TAC AAT CTT GCA GAT C-3’  （配列番号：１１９）
Cβ1-3’UTR-primer: 5’-CTC CAC TTC CAG GGC TGC CTT CA-3’  （配列番号：１２０）
Cβ2-3’UTR-primer: 5’-TGA CCT GGG ATG GTT TTG GAG CTA-3’  （配列番号：１２１）。
（ｖ）ＴＣＲ遺伝子の増幅にはＴｏＹｏＢｏ社のＫＯＤ  ＦＸを用いて、９４℃、３ｍｉｎ→（９８℃、１０ｓｅｃ→６８℃、１ｍｉｎ）×３５サイクル、の条件で行った。
（ｖｉ）ＰＣＲ産物の大きさをアガロースゲル電気泳動を用いて確認し１ｋｂｐ付近のバンドをゲルから切り出して精製する。
（ｖｉｉ）上記（３）−ｖｉの精製済みＰＣＲ産物にアデニンをＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて付加した後、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションする。
（ｖｉｉｉ）上記（３）−ｖｉｉをコンピテントセルＨＳＴ０２に形質転換し、シングルコロニーからプラスミドを精製したのち、シークエンスを行う。
（ｉｘ）シークエンスの解析はＴｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=humanTcR）を用いて行い各ＴＣＲ遺伝子を同定する。【００６４】
上記（３）「５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄ）法を用いたＴＣＲ遺伝子の単離」について、詳細な実験手順を以下に示す。【００６５】
（３−１）ＲＮＡ抽出
Ｔ細胞クローンからのＲＮＡ抽出はＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行った。用いるＴ細胞クローンはフィーダー細胞の混入を防ぐ目的で、３週間以上ＩＬ−２存在下で抗原刺激を加えないで培養したものを準備した。抽出されたＲＮＡはＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒに溶かし、−８０℃で保存した。【００６６】
（３−２）５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）法を用いた完全長ＴＣＲ（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ｃＤＮＡのクローニング
ＴＣＲ  α／βのクローニングにはＳＭＡＲＴｅｒＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いた。まず最初に、そのマニュアルに従い５’−ＲＡＣＥ反応を行い１ｓｔストランドｃＤＮＡを合成した。その後、完全長ＴＣＲ  α鎖およびβ鎖ｃＤＮＡを得るために、それぞれの３’ＵＴＲ  （Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎ）に特異的なリバースプライマーとキットに付属のユニバーサルプライマー（ＵＰＭ）を用い、合成された１ｓｔストランドｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。使用したリバースプライマーは以下の通りである。
Cα 3’UTR-RACE-primer: CACAGGCTGTCTTACAATCTTGCAGATC  （配列番号：１１９）
Cβ1 3’UTR-RACE-primer: CTCCACTTCCAGGGCTGCCTTCA  （配列番号：１２０）
Cβ2 3’UTR-RACE-primer: TGACCTGGGATGGTTTTGGAGCTA  （配列番号：１２１）
また、ＰＣＲ反応はＫＯＤ  ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて以下の反応液組成で行った。
2ページ前のプライマー、つまり、Cα3’UTR-primer、Cβ1-3’UTR-primerおよびCβ2-3’UTR-primerと同じものなので、名前をどちらかに統一したほうがいいかと思いますが、いかがでしょう。
【表１】
2014042226.tif 000002
【００６７】
ＰＣＲ反応後に１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、９００〜１０００ｂｐ付近のシングルバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＰＣＲ生成物を５０μｌの蒸留水で精製した。ＰＣＲ生成物をＴＡクローニングするためには、ＰＣＲ生成物の両末端にアデニンを付加する必要がある。アデニンの付加にはＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、以下のように行った。【００６８】
（１）下表に示す２×反応液を作製する。
【表２】
2014042226.tif 000003
（２）２×反応液を９５℃，５分でインキュベーションする
（３）精製したＰＣＲ生成物を５０μｌ加える。
（４）７２℃，１０分インキュベーションする。【００６９】
アデニンを付加したＰＣＲ生成物は、エタノール沈殿により精製・濃縮後、ｐＣＲ２．１ベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ社）を用いて挿入された。ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔを含むｐＣＲ２．１ベクターはＨＳＴ０２コンピテント細胞に形質転換により導入・クローニングされた。【００７０】
（３−３）完全長ＴＣＲ  α鎖およびβ鎖ｃＤＮＡを含んだプラスミドの精製
形質転換されたＨＳＴ０２コンピテント細胞は、アンピシリン／ＬＢプレートに播種され、３７℃でインキュベーションされた。その後、シングルコロニーをアンピシリン／ＬＢ液体培地に取り、３７℃，２００ｒｐｍで撹拌しつつインキュベーションした。その後、大腸菌液からプラスミドをＡＵＴＯＭＡＴＩＣ  ＤＮＡ  ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭ  ＰＩ−５０（ＫＵＲＡＢＯ社）を用いて精製した。【００７１】
（３−４）シークエンスによるＴＣＲのＣＤＲ３配列の決定
精製したプラスミドのシークエンスにはＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。またプライマーにはＭ１３リバースプライマー：
caggaaacagctatgac  （配列番号：１２２）
を使用した。ＴＣＲおよびＣＤＲ３の解析には、ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/）を利用した。【００７２】
決定されたＣＤＲ３の塩基配列およびアミノ酸配列を図１に示す。いくつかのクローンにおいては、２種のα鎖が存在し、２種類のＣＤＲ３配列が存在した。
【実施例２】
【００７３】
実施例２  ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞へのＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞由来Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子の導入
ＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞由来Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子を導入されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞はＷＴ１３３２特異的かつＨＬＡクラスＩＩ拘束性に増殖反応およびサイトカイン産生を示すことを確認した。【００７４】
ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１拘束性にＷＴ１３３２を特異的に認識するＣＤ４＋Ｔ細胞クローンであるクローン９から表３に示すＴＣＲ遺伝子を単離した。このＴＣＲ遺伝子をレンチウイルスベクターを用いて、健常人末梢血由来ＣＤ４＋Ｔ細胞に導入し、ＷＴ１３３２に対する反応をサイトカイン（インターフェロンγおよびＩＬ−２）の産生を指標に検討した（図２Ａ、Ｂ）。また、コントロールとしてＴＣＲ遺伝子を持たないレンチウイルスベクター（ｍｏｃｋと標記）を導入したＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた。ＷＴ１３３２特異的ＴＣＲ遺伝子を導入したＣＤ４＋Ｔ細胞（実施例セクションにおいて「ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞」という）はＷＴ１３３２にのみ反応して、つまりＷＴ１３３２特異的にＩＦＮ−ｇおよびＩＬ−２を産生した。一方、ｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞はＷＴ１３３２特異的サイトカイン産生を示さなかった。
ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカイン発現に及ぼすＷＴ１３３２ペプチド濃度の影響を調べた。ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞を各種濃度のＷＴ１３３２ペプチドにて４時間刺激し、細胞内サイトカイン染色アッセイを行って、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＴＮＦ−α産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を調べた。結果を図２Ｃに示す。サイトカイン産生はＷＴ１３３２ペプチド濃度依存的であり、ＥＤ５０は４．８５μＭであった。
ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖能を調べると、ＷＴ１３３２特異的に強い増殖能が認められ、その増殖反応はａｎｔｉ−ＨＬＡ−ＤＰ抗体で顕著に抑制された（図２Ｄ）。
次に、ＷＴ１３３２ペプチドをパルスした自己のＰＢＭＣ、全長のＷＴ１蛋白をパルスした自己のＰＢＭＣ、短縮されたＷＴ１蛋白（ＷＴ１３３２配列を含まない）をパルスした自己のＰＢＭＣ、ＰＨＡ−ｂｌａｓｔの溶解物をパルスしたＰＢＭＣ、ＷＴ１を発現する白血病細胞株ＴＦ−１の溶解物をパルスしたＰＢＭＣ、ＷＴ１を発現する白血病細胞株Ｋ５６２の溶解物をパルスしたＰＢＭＣに対するＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答およびＩＦＮ−γ産生を調べた。細胞増殖は［３Ｈ］−チミジン取り込みにより測定し、ＩＦＮ−γはＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図２Ｅおよび図２Ｆにそれぞれ示す。ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖およびＩＦＮ−γ産生は、ＷＴ１を発現する白血病細胞株（ＴＦ−１およびＫ５６２）の溶解物をパルスしたＰＢＭＣにより顕著に刺激され、ＷＴ１３３２ペプチドをパルスした自己のＰＢＭＣおよび全長のＷＴ１蛋白をパルスした自己のＰＢＭＣによっても刺激されることがわかった。
さらに、３人の健常人（ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性）ドナーに由来する、実施例２と同様に調製されたＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞株（つまり３種類）のＷＴ１３３２ペプチドに応答した各種サイトカイン産生についても調べた。３種類の細胞株のサイトカイン産生能の平均値を図２Ｇに示す。ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦといったＴｈ１タイプのサイトカインの産生が多かった。
【表３】
2014042226.tif 000004
【実施例３】
【００７５】
実施例３  ＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞由来ＴＣＲ遺伝子を導入されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導増強
一般に、ＣＤ４＋Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞として働き、がん細胞を攻撃する主要なエフェクター細胞であるＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導やその維持に重要である事が知られている。そこで、ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞がＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導を増強するか検討した。【００７６】
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性健常人のＰＢＭＣに同一の健常人から作製したＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞を１０：１および５：１の割合（図３では１：０．１および１：０．２と表記）で混合し、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２拘束性ＷＴ１由来ＣＴＬエピトープである改変型ＷＴ１２３５ペプチド（ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２分子に結合する天然型ＷＴ１ペプチドの２番目のアミノ酸ＭをＹに改変したもの（ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ）（配列番号：１２５）とＷＴ１３３２の存在下で一週間培養した。その後、再び改変型ＷＴ１２３５ペプチドで、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２分子への結合能を増強させたもの）で刺激して、さらに一週間培養した。一連の培養は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のｈｅｌｐ  ａｃｔｉｖｉｔｙを正しく評価するためにＩＬ−２は一切加えなかった。計２週間の培養後にＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度、改変型ＷＴ１２３５／  ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２テトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度および改変型ＷＴ１２３５特異的インターフェロンγ（ＩＦＮ−ｇ）発現ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を指標に、ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞によってＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導が増強されたか評価した。その結果、コントロールであるｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞を加えて培養したものと比べ、ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養したものでＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が有意に高かった（図３Ａ）。さらにＷＴ１特異的ＣＴＬである改変型ＷＴ１２３５／ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２テトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞はＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養したもので明らかな陽性集団が確認できたが、コントロールでは確認できなかった（図３Ｂ）。これらの結果から１０００００個のリンパ球に存在するＷＴ１特異的ＣＴＬの細胞数を算出すると、その細胞数はコントロールと比較してＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養したもので約２８倍高かった（図３Ｃ）。同様に、改変型ＷＴ１２３５の刺激によってＩＦＮ−ｇを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度も、ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養したもので有意に高かった（図３Ｄ）。以上よりＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞はＷＴ１特異的ＣＴＬの誘導を増強することが明らかになった。
【実施例４】
【００７７】
実施例４  ＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞由来ＴＣＲ遺伝子を導入されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるＷＴ１発現白血病細胞のＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１拘束性傷害
次に、ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞傷害活性、つまりｋｉｌｌｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙを評価した。【００７８】
まず、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１遺伝子を単離しＷＴ１を発現する白血病細胞株ＴＦ−１に遺伝子導入しＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性ＴＦ−１細胞を作製した。図４Ａに示すように、ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞はＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性ＴＦ−１細胞を強く傷害したが、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陰性ＴＦ−１細胞に対しては細胞傷害活性を示さなかった。そこで、この細胞傷害活性がＷＴ１特異的なものか確認するためにＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性で、ＷＴ１を発現しないＢ−ＬＣＬ細胞（Ｂ−ＬＣＬ（−）と標記）にＷＴ１遺伝子を強制発現させたＢ−ＬＣＬ（＋）を作製し、これらを標的細胞としてＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を評価した。図４Ｂに示すようにＢ−ＬＣＬ（＋）はＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞によって強く傷害されたが、Ｂ−ＬＣＬ（−）は傷害されなかった。これらの結果より、ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞はＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１拘束性かつＷＴ１特異的に細胞傷害活性を有することが明らかとなった。さらに、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性でＷＴ１を発現する白血病細胞株Ｃ２Ｆ８を用いて、このＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を確認した（図４Ｃ）。
次に、ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞が、グランザイムＢ（granzyme B）およびパーフォリン（perforin）経路により細胞傷害活性を発揮するかどうかについて調べた。ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞において、グランザイムＢおよびパーフォリンの高発現がみられた（図４Ｄ）。
ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞および空のベクターで同様に処理されたＣＤ４＋Ｔ細胞（ｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞）を、ＷＴ１３３２ペプチドをパルスしたＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性ＴＦ−１細胞またはＷＴ１３３２ペプチドをパルスしていないＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性ＴＦ−１細胞とともに、抗−ＣＤ１０７ａ−ＡＰＣモノクローナル抗体の存在下で５時間培養した。その後ＩＦＮ−γ染色を行ってフローサイトメトリーに供した。ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞をＷＴ１３３２ペプチドをパルスしたＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性ＴＦ−１細胞とともにインキュベーションした場合にのみ、ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＩＦＮ−γおよびＣＤ１０７ａの同時発現がみられた（図４Ｅ）。このことは、ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞において脱顆粒が起こっていることを示す。
ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞傷害活性がグランザイムＢ／パーフォリン経路に依存するものであるかどうかを確認するために、１００μＭのグランザイム阻害剤Ａｃ−ＩＥＴＤ−Ｃｈｏにて前処理されたＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性ＴＦ−１細胞を標的細胞として用いた。ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性ＴＦ−１細胞を１００μＭのＡｃ−ＩＥＴＤ−ＣｈｏまたはＤＭＳＯ（コントロール）にて２時間前処理し、その後５１Ｃｒにて標識し、ＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞とともにインキュベーションし、５１Ｃｒ放出アッセイを行った。Ａｃ−ＩＥＴＤ−Ｃｈｏにて前処理されたＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性ＴＦ−１細胞に対するＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞傷害活性は、ＤＭＳＯにて前処理されたＴＦ−１細胞に対する細胞傷害活性と比較して著しく低かった（図４Ｆ）。
これらの結果を総合すると、本発明で得られたＷＴ１３３２−ＴＣＲ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＷＴ１を発現する、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性白血病細胞を直接認識し、グランザイムＢ／パーフォリン経路によりそれらに傷害を与えることが確認された。
【実施例５】
【００７９】
実施例５  ＷＴ１３３２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞由来ＴＣＲ遺伝子を導入されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるＮＯＧ（登録商標）マウスでの抗腫瘍効果
ＷＴ１発現ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１陽性ヒト白血病細胞Ｃ２Ｆ８（５×１０４個）をＮＯＧ（登録商標）マウス（７匹）に尾静脈より移入した。翌日、実験系として、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１拘束性ＷＴ１３３２特異的ＴＣＲ（配列番号１４と１５）を導入したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（５×１０６  個）および抗原提示細胞としてＴ細胞を除去した同一人のヒト末梢血単核球（２×１０６  個）を上記ＮＯＧ（登録商標）マウス（３匹）の尾静脈より移入した。コントロールとして、コントロールベクターを導入したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（５×１０６  個）および抗原提示細胞としてＴ細胞を除去した同一人のヒト末梢血単核球（２×１０６  個）を上記ＮＯＧ（登録商標）マウス（４匹）の尾静脈より移入した。
１週間後および２週間後に、実験系のマウスにはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１拘束性ＷＴ１３３２特異的ＴＣＲを導入したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（５×１０６  個）を尾静脈より移入した。コントロールのマウスにはコントロールベクターを導入したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（５×１０６  個）を尾静脈より移入した。その後、マウスの生存を調べた。
結果を図５に示す。実験系のマウスの生存率はコントロールのマウスの生存率を上回ったことから、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１拘束性ＷＴ１３３２特異的ＴＣＲ導入ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、インビボで抗腫瘍効果を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明は、癌の治療または予防のための医薬品の分野、癌の研究用試薬の分野、癌の検査試薬やキットの分野などにおいて利用可能である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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