(57)【要約】  合成ガス等からイソプレンを生産することができる一連の技術を提供することを目的とする。  非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能を有する宿主細胞に、イソプレン合成酵素をコードする核酸が導入されてなり、当該核酸が前記宿主細胞内で発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能である組換え細胞が提供される。宿主細胞としてClostridium属細菌又はMoorella属細菌が例示される。当該組換え細胞を用いたイソプレンの生産方法も提供される。
2014065271.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能を有する宿主細胞に、イソプレン合成酵素をコードする核酸が導入されてなり、当該核酸が前記宿主細胞内で発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能である組換え細胞。
【請求項２】
メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する宿主細胞に、イソプレン合成酵素をコードする核酸が導入されてなり、当該核酸が前記宿主細胞内で発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能である組換え細胞。
【請求項３】
一酸化炭素脱水素酵素を有するものである請求項１又は２に記載の組換え細胞。
【請求項４】
前記宿主細胞は、Clostridium属細菌又はMoorella属細菌である請求項１〜３のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項５】
メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする核酸がさらに導入され、メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能をさらに有する請求項１〜４のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項６】
前記メバロン酸経路は、酵母のメバロン酸経路である請求項５に記載の組換え細胞。
【請求項７】
前記メバロン酸経路は、原核生物のメバロン酸経路である請求項５に記載の組換え細胞。
【請求項８】
前記メバロン酸経路は、放線菌のメバロン酸経路である請求項５に記載の組換え細胞。
【請求項９】
非メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする核酸がさらに導入され、当該核酸が宿主細胞内で発現する請求項１〜８のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１０】
前記非メバロン酸経路は、宿主細胞以外の非メバロン酸経路である請求項９に記載の組換え細胞。
【請求項１１】
前記イソプレン合成酵素は、植物由来のものである請求項１〜１０のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１２】
前記イソプレン合成酵素をコードする核酸は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードするものである請求項１〜１１のいずれかに記載の組換え細胞。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質。
【請求項１３】
宿主細胞に導入された核酸は、コドンが改変されたものである請求項１〜１２のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１４】
宿主細胞に導入された核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれている請求項１〜１３のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１５】
宿主細胞に導入された核酸は、プラスミドに組み込まれている請求項１〜１３のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の組換え細胞を、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、当該組換え細胞にイソプレンを生産させるイソプレンの生産方法。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれかに記載の組換え細胞に、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物からイソプレンを生産させるイソプレンの生産方法。
【請求項１８】
一酸化炭素と水素とを主成分とするガス、あるいは二酸化炭素と水素とを主成分とするガスを、前記組換え細胞に提供する請求項１６又は１７に記載のイソプレンの生産方法。
【請求項１９】
組換え細胞はClostridium属細菌又はMoorella属細菌を宿主細胞とするものであり、組換え細胞の細胞外に放出されたイソプレンを回収する請求項１６〜１８のいずれかに記載のイソプレンの生産方法。
【請求項２０】
二酸化炭素に代えて、重炭酸塩を用いる請求項１６〜１９のいずれかに記載のイソプレンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一酸化炭素等の特定のＣ１化合物からイソプレンを生産可能な組換え細胞、及び当該組換え細胞を用いるイソプレンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソプレンは合成ポリイソプレンのモノマー原料であり、特にタイヤ業界において重要な素材である。近年、石油に依存した基幹化学品の生産プロセスから、植物資源等の再生可能資源からの生産プロセスへの転換技術の開発と実用化が、着実に進んでいる。イソプレンに関しても、例えば、糖を原料とした組換え大腸菌による生産技術が知られている（特許文献１，２）。【０００３】
再生可能資源からの生産プロセスについて、その従来技術のほとんどは、上記イソプレン生産技術を含めて、有機物、特に糖、グリセロールもしくは油成分等に依存した、微生物による生産法である。しかし、石油に由来する数多くの基幹化学品の世界的な生産量を賄うには、植物資源等に由来する現状使用可能な糖質、グリセリンや油成分の量では、微生物の炭素源として不足するのは必須である。すなわち、糖質や油成分に依存する微生物による基幹化学品の生産量は、将来に渡っても限定的である。また、このようなプロセスは、食との競合も懸念される。【０００４】
合成ガス（Synthesis gas, Syngas）は、廃棄物、天然ガス、及び石炭から高温・高圧下で金属触媒の作用によって効率よく得られる、一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素を主成分とする混合ガスである。合成ガスを起点とする金属触媒によるＣ１ケミストリーの分野では、メタノール、ギ酸、ホルムアルデヒド等の液状の化学品を安価かつ大量に生産するプロセスが開発されている。【０００５】
そして、一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素は、廃棄物由来の合成ガスや工場排ガス、天然ガス、または石炭由来の合成ガスに含まれており、ほぼ永久的に利用可能である。しかしながら、合成ガスをはじめとするＣ１炭素源とした、微生物による化学品生産の例は、極めて少ないのが現状である。現在のところ、開発が進んでいるのは、合成ガスからのエタノール、２，３−ブタンジオール等の生産のみである。特に、組換え体による合成ガス資化性物の利用に関する報告は少ない。特許文献３には、大腸菌の組換え体によるイソプロパノールの生産技術が開示されている。この技術では、大腸菌に複数のＣＯ代謝酵素遺伝子を導入して合成ガス資化能を付与し、合成ガスからイソプロパノールを生産している。ただし、この技術はイソプレンを生産するものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１１−５０５８４１号公報
【特許文献２】特表２０１１−５１８５６４号公報
【特許文献３】特表２０１１−５０９６９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記現状に鑑み、本発明は、合成ガス等からイソプレンを生産することができる一連の技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記した課題を解決するための本発明の１つの様相は、非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能を有する宿主細胞に、イソプレン合成酵素をコードする核酸が導入されてなり、当該核酸が前記宿主細胞内で発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能である組換え細胞である。【０００９】
本発明はイソプレンを生産可能な組換え細胞に係るものである。本発明の組換え細胞は、「非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能」を有する宿主細胞に、イソプレン合成酵素をコードする核酸が導入されてなるものであり、かつ当該核酸が宿主細胞内で発現する。そして、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から、イソプレンを生産可能なものである。本発明の組換え細胞によれば、前記したＣ１化合物からイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を合成し、さらに、合成されたＩＰＰをイソプレンに変換することができる。その結果、前記したＣ１化合物からイソプレンを生産することができる。本発明の組換え細胞を用いることにより、例えば、一酸化炭素や二酸化炭素を含む合成ガスからイソプレンを生産することができる。【００１０】
イソプレノイドの生合成経路はメバロン酸経路（ＭＶＡ経路ともいう）と非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路ともいう）に大別される。非メバロン酸経路は、グリセルアルデヒド３−リン酸とピルビン酸から、最終的にイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）又はジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生成する経路である。本発明で用いる宿主細胞は、非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能を有するものである。【００１１】
本発明の他の様相は、メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する宿主細胞に、イソプレン合成酵素をコードする核酸が導入されてなり、当該核酸が前記宿主細胞内で発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能である組換え細胞である。【００１２】
本発明の組換え細胞は、「メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能」を有する宿主細胞に、イソプレン合成酵素をコードする核酸が導入されてなるものであり、かつ当該核酸が宿主細胞内で発現する。そして、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から、イソプレンを生産可能なものである。本発明の組換え細胞によっても、前記したＣ１化合物からＩＰＰを合成し、さらに、合成されたＩＰＰをイソプレンに変換することができる。その結果、前記したＣ１化合物からイソプレンを生産することができる。本発明の組換え細胞を用いることにより、例えば、一酸化炭素や二酸化炭素を含む合成ガスからイソプレンを生産することができる。【００１３】
「メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能」を有する細胞としては、図１に示すアセチルＣｏＡ経路（Wood-Ljungdahl pathway）及びメタノール経路（Methanol pathway）を有する嫌気性微生物が例示される。【００１４】
好ましくは、一酸化炭素脱水素酵素を有するものである。【００１５】
一酸化炭素脱水素酵素（ＥＣ １．２．９９．２／１．２．７．４）（一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、CO dehydrogenase、ＣＯＤＨ）は、一酸化炭素と水から二酸化炭素とプロトンを生成させる作用、及びその逆反応である、二酸化炭素とプロトンから一酸化炭素と水を生成させる作用、を有する。一酸化炭素脱水素酵素は、アセチルＣｏＡ経路（図１）で作用する酵素の１つである。【００１６】
好ましくは、前記宿主細胞は、Clostridium属細菌又はMoorella属細菌である。【００１７】
好ましくは、メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする核酸がさらに導入され、メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能をさらに有する。【００１８】
かかる構成により、イソプレン合成酵素の基質となるＩＰＰが、メバロン酸経路と非メバロン酸経路の両方から合成され、ＩＰＰの供給が効率的に行われる。その結果、本発明の組換え細胞は、イソプレン生産能がさらに高いものとなる。【００１９】
好ましくは、前記メバロン酸経路は、酵母のメバロン酸経路である。【００２０】
好ましくは、前記メバロン酸経路は、原核生物のメバロン酸経路である。【００２１】
好ましくは、前記メバロン酸経路は、放線菌のメバロン酸経路である。【００２２】
好ましくは、非メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする核酸がさらに導入され、当該核酸が宿主細胞内で発現する。【００２３】
かかる構成により、非メバロン酸経路によるＩＰＰ合成能が増強される。その結果、本発明の組換え細胞は、イソプレン生産能がさらに高いものとなる。【００２４】
好ましくは、前記非メバロン酸経路は、宿主細胞以外の非メバロン酸経路である。【００２５】
好ましくは、前記イソプレン合成酵素は、植物由来のものである。【００２６】
好ましくは、前記イソプレン合成酵素をコードする核酸は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードするものである。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質。【００２７】
好ましくは、宿主細胞に導入された核酸は、コドンが改変されたものである。【００２８】
かかる構成により、導入された核酸（外来遺伝子）を宿主細胞内でより効率的に発現させることが可能となる。【００２９】
好ましくは、宿主細胞に導入された核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれている。【００３０】
好ましくは、宿主細胞に導入された核酸は、プラスミドに組み込まれている。【００３１】
本発明の他の様相は、上記の組換え細胞を、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、当該組換え細胞にイソプレンを生産させるイソプレンの生産方法である。【００３２】
本発明はイソプレンの生産方法に係るものである。本発明では、上記した組換え細胞を一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として培養することにより、当該組換え細胞にイソプレンを生産させる。本発明によれば、一酸化炭素や二酸化炭素を含む合成ガスや、ギ酸、メタノールからイソプレンを生産することができる。【００３３】
本発明の他の様相は、上記の組換え細胞に、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物からイソプレンを生産させるイソプレンの生産方法である。【００３４】
本発明では、上記した組換え細胞に、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該Ｃ１化合物からイソプレンを生産させる。本発明によっても、一酸化炭素や二酸化炭素を含む合成ガスや、ギ酸、メタノールからイソプレンを生産することができる。【００３５】
好ましくは、一酸化炭素と水素とを主成分とするガス、あるいは二酸化炭素と水素とを主成分とするガスを、前記組換え細胞に提供する。【００３６】
「組換え細胞にガスを提供する」とは、炭素源等としてガスを組換え細胞に与える、あるいは、組換え細胞にガスを接触させる、という意味である。【００３７】
好ましくは、組換え細胞はClostridium属細菌又はMoorella属細菌を宿主細胞とするものであり、組換え細胞の細胞外に放出されたイソプレンを回収する。【００３８】
二酸化炭素に代えて、重炭酸塩を用いてもよい。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の組換え細胞によれば、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、又はメタノールからイソプレンを生産することができる。例えば、一酸化炭素や二酸化炭素を含む合成ガスからイソプレンを生産することが可能となる。【００４０】
本発明のイソプレンの生産方法についても同様であり、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、又はメタノールからイソプレンを生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】アセチルＣｏＡ経路とメタノール経路を表す説明図である。
【図２】イソプレン標準品のガスクロマトグラムである。
【図３】コントロールベクターpSCi01プラスミドを保持するC. ljungdahliiの合成ガス発酵気相成分のガスクロマトグラムである。
【図４】pSCi::idi-ispSプラスミドを保持するC. ljungdahliiの合成ガス発酵気相成分のガスクロマトグラムである。
【図５】プラスミドpSCi::MVA-IspS-idiのイソプレン合成遺伝子クラスターの構成を表す説明図である。
【図６】プラスミドpSCi::MVA-IspS-idiを保持するC. ljungdahliiの合成ガス発酵気相成分のガスクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明の１つの様相に係る組換え細胞は、非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）合成能を有する宿主細胞に、イソプレン合成酵素をコードする核酸が導入されてなり、当該核酸が前記宿主細胞内で発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能なものである。
【００４３】
本様相の組換え細胞における宿主細胞は、「非メバロン酸経路によるＩＰＰ合成能」を有するものである。
上述したように、一般に、ＩＰＰの合成経路はメバロン酸経路（ＭＶＡ経路）と非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路）の２つに大別される。メバロン酸経路は真核生物が備えているものであり、アセチルＣｏＡを出発物質としている。メバロン酸経路で作用する酵素としては、上流から順に、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼが挙げられる。
【００４４】
一方、非メバロン酸経路は原核生物や葉緑体・色素体が備えているものであり、グリセルアルデヒド３−リン酸とピルビン酸を出発物質としている。非メバロン酸経路で作用する酵素としては、上流から順に、ＤＯＸＰシンターゼ、ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、４−ジホスホヂチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰシンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰレダクターゼ、が挙げられる。
【００４５】
また本発明の他の様相に係る組換え細胞は、メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有する宿主細胞に、イソプレン合成酵素をコードする核酸が導入されてなり、当該核酸が前記宿主細胞内で発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能なものである。
【００４６】
本発明の組換え細胞は、さらに、一酸化炭素脱水素酵素（ＣＯＤＨ）を有するものであることが好ましい。詳細には、主に一酸化炭素代謝、すなわち一酸化炭素脱水素酵素の働きにより、一酸化炭素と水から二酸化炭素とプロトンを発生する機能によって生育する細胞が好ましい。そのような細胞の例としては、図１に示すアセチルＣｏＡ経路（Wood-Ljungdahl pathway）とメタノール経路（Methanol pathway）を有する嫌気性微生物が挙げられる。
【００４７】
当該嫌気性微生物として、Clostridium ljungdahlii、Clostridium autoethanogenumn、Clostridium carboxidivorans、Clostridium ragsdalei（Kopke M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(15), 5467-5475）、Moorella thermoacetica（Clostridium thermoaceticumと同じ) (Pierce EG. Et al., Environ. Microbiol. 2008, 10, 2550-2573)等のClostridium属細菌又はMoorella属細菌が代表例として挙げられる。特に、Clostridium属細菌は、宿主−ベクター系や培養方法が確立しており、本発明における宿主細胞として好適である。
上記５種のClostridium属細菌又はMoorella属細菌は、合成ガス資化性微生物の代表例として知られている。
【００４８】
Clostridium属細菌、Moorella属細菌以外では、Carboxydocella sporoducens sp. Nov. (Slepova TV. et al., Inter. J. Sys. Evol. Microbiol. 2006, 56, 797-800)、Rhodopseudomonas gelatinosa(Uffen RL, J. Bacteriol. 1983, 155(3), 956-965)、Eubacterium limosum (Roh H. et al., J. Bacteriol. 2011, 193(1), 307-308)，Butyribacterium methylotrophicum (Lynd, LH. Et al., J. Bacteriol. 1983, 153(3), 1415-1423)等の細菌を宿主細胞として用いることができる。
【００４９】
なお、上記した細菌の増殖及びＣＯＤＨ活性は全て酸素感受性であるが、酸素非感受性のＣＯＤＨも知られている。例えば、Oligotropha carboxidovorans (Schubel, U. et al., J. Bacteriol., 1995, 2197-2203)、Bradyrhizobium japonicum (Lorite MJ. Et al., Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66(5), 1871-1876)を始め、その他のバクテリア種には酸素非感受性のＣＯＤＨが存在する（King GM et al., Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69 (12), 7257-7265）。好気性水素酸化細菌であるRalsotonia属菌にも酸素非感受性のＣＯＤＨが存在する (NCBI Gene ID: 4249199, 8019399)。
このように、ＣＯＤＨを有する細菌は広く存在しており、その中から本発明で用いる宿主細胞を適宜選択することができる。例えば、ＣＯ、ＣＯ／Ｈ2（ＣＯとＨ2を主成分とするガス）、もしくはＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2（ＣＯとＣＯ2とＨ2を主成分とするガス）を唯一の炭素源かつエネルギー源とした選択培地を用い、嫌気、微好気、もしくは好気的条件で、宿主細胞として利用できるＣＯＤＨを有する細菌を分離することができる。
【００５０】
イソプレン合成酵素としては、組換え細胞内でその酵素活性を発揮できるものであれば特に限定はない。イソプレン合成酵素をコードする核酸（遺伝子）についても同様であり、組換え細胞内で正常に転写・翻訳されるものであれば特に限定はない。また、イソプレン合成酵素をコードする核酸は、宿主細胞で転写されやすいコドンに改変したものであってもよい。例えば、宿主細胞がClostridium属細菌であれば、Clostridium属細菌のコドン使用頻度の情報を基に、導入する核酸のコドンを改変することができる。
【００５１】
イソプレン合成酵素は、多くの植物で見出されている。イソプレン合成酵素の具体例としては、ポプラ（Populus nigra）由来のもの（GenBank Accession No.: AM410988.1）が挙げられる。その他、Bacillus subtilis由来のもの（Sivy TL. et al., Biochem. Biophys. Res. Commu. 2002, 294(1), 71-5）が挙げられる。
配列番号１に上記ポプラ由来イソプレン合成酵素をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号２にアミノ酸配列のみを示す。配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡは、イソプレン合成酵素をコードする核酸の一例となる。
【００５２】
さらに、イソプレン合成酵素をコードする核酸には、少なくとも、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードする核酸が含まれる。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質。
なお（ｃ）におけるアミノ酸配列の相同性については、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【００５３】
本発明の組換え細胞においては、イソプレン合成酵素をコードする核酸に加えて、他の核酸がさらに導入されていてもよい。１つの実施形態では、メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする核酸がさらに導入され、メバロン酸経路によるＩＰＰ合成能をさらに有する。かかる構成によれば、メバロン酸経路と非メバロン酸経路の両方からＩＰＰが合成されるので、ＩＰＰ合成能が増強され、結果としてイソプレン生産がより効率的に行われる。
【００５４】
上述したように、メバロン酸経路で作用する酵素群としては、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼが挙げられる。このうち、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼからなる酵素群が宿主細胞内で発現するように、導入する核酸を選択すればよい。これらの核酸についても、宿主細胞で転写されやすいコドンに改変したものを採用することができる。
【００５５】
なお、メバロン酸経路は全ての真核生物が保有しているが、原核生物でも見出されている。原核生物でメバロン酸経路を有するものとしては、放線菌では、Streptomyces sp. Strain CL190 (Takagi M. et al., J. Bacteriol. 2000, 182 (15), 4153-7)、Streptomyces griseolosporeus MF730-N6 (Hamano Y. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001, 65(7), 1627-35）が挙げられる。
細菌では、Lactobacillus helvecticus (Smeds A et al., DNA seq. 2001, 12(3), 187-190)、Corynebacterium amycolatum、Mycobacterium marinum、Bacillus coagulans、Enterococcus faecalis、Streptococuss agalactiae、Myxococcus xanthus等が挙げられる（Lombard J. et al., Mol. Biol. Evol. 2010, 28(1), 87-99)。
アーキアでは、Aeropyrum属、Sulfolobus属、Desulfurococcus属、Thermoproteus属、Halobacterium属、Methanococcus属、Thermococcus属、Pyrococcus属、Methanopyrus属、Thermoplasma属等が挙げられる（Lombard J. et al., Mol. Biol. Evol. 2010, 28(1), 87-99）。
【００５６】
上記メバロン酸経路で作用する酵素群の由来としては特に限定はないが、酵母のメバロン酸経路で作用する酵素群が好ましい。その他、放線菌のメバロン酸経路で作用する酵素群も好ましく採用される。
【００５７】
別の実施形態では、非メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする核酸がさらに導入され、当該核酸が宿主細胞内で発現する。本実施形態においても、ＩＰＰ合成能が増強され、結果としてイソプレン生産がより効率的に行われる。導入される当該核酸は１種のみでもよいし、２種以上でもよい。
上述したように、非メバロン酸経路で作用する酵素としては、ＤＯＸＰシンターゼ、ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、４−ジホスホヂチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰシンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰレダクターゼ、が挙げられる。例えば、これらの酵素群から１又は２以上の酵素を選択し、当該酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入すればよい。
また、非メバロン酸経路で作用する酵素は、宿主細胞以外の由来であることが好ましい。かかる構成により、反応生成物による反応抑制を避けることができる。
これらの核酸についても、宿主細胞で転写されやすいコドンに改変したものを採用することができる。
【００５８】
メバロン酸経路あるいは非メバロン酸経路で作用するこれらの酵素については、天然に存在するものの他、各酵素の改変体でもよい。例えば、各酵素のアミノ酸置換変異体や、各酵素の部分断片であって同様の酵素活性を有するポリペプチドでもよい。
【００５９】
宿主細胞に核酸を導入する方法としては特に限定はなく、宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。例えば、宿主細胞に導入可能でかつ組み込まれた核酸を発現可能なベクターを用いることができる。
例えば、宿主細胞が細菌等の原核生物の場合には、当該ベクターとして、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、挿入された上記核酸（ＤＮＡ）を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記核酸（ＤＮＡ）、および転写終結配列からなる一連の構成を宿主細胞内で構築することが好ましい。
【００６０】
宿主細胞がClostridium属細菌（Moorella属細菌のような近縁種を含む）の場合について説明すると、Clostridium属細菌と大腸菌とのシャトルベクターpIMP1（Mermelstein LD et al., Bio/technology 1992, 10, 190-195）を用いることができる。本シャトルベクターは、pUC9 (ATCC 37252)とBacillus subtilisから分離されたpIM13 (Projan SJ et al., J. Bacteriol. 1987, 169 (11), 5131-5139)との融合ベクターであり、Clostridium属細菌内でも安定的に保持される。
【００６１】
なお、Clostridium属細菌への遺伝子導入には、通常、エレクトロポレーション法が使用されるが、遺伝子導入直後の導入された外来プラスミドは制限酵素Cac824I等による分解を受けやすく極めて不安定である。そのため、Bacillus subtilis ファージΦ3T1由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子が保持されたpAN1 (Mermelstein LD et al., Apply. Environ. Microbiol. 1993, 59(4), 1077-1081)を保有する大腸菌、例えばER2275株等で、pIMP1に由来するベクターを一旦増幅し、メチル化処理を行ってから、これを大腸菌から回収しエレクトロポレーションによる形質転換に使用することが好ましい。なお最近では、Cac824I遺伝子が欠損したClostridium acetobuthylicumが開発されており、メチル化処理されていないベクターも安定的に可能である(Dong H. et al., PLoS ONE 2010, 5 (2), e9038)。
【００６２】
Clostridium属細菌における異種遺伝子発現のプロモーターとしては、例えばthl (thiolase)プロモーター(Perret S et al., J. Bacteriol. 2004, 186(1), 253-257)、Dha (glycerol dehydratase)プロモーター(Raynaud C. et al., PNAS 2003, 100(9), 5010-5015)、ptb (phosphotransbutyrylase)プロモーター (Desai RP et al., Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65(3), 936-945)、adc (acetoacetate decarboxylase)プロモーター(Lee J et al., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78 (5), 1416-1423)等がある。ただし、本発明ではこれらに限定されることなく、宿主細胞等に見出される様々な代謝系のオペロンに使用されているプロモーター領域の配列が使用可能である。
【００６３】
また、ベクターを用いて複数種の核酸を宿主細胞に導入する場合、各核酸を１つのベクターに組み込んでもよいし、別々のベクターに組み込んでもよい。さらに１つのベクターに複数の核酸を組み込む場合には、各核酸を共通のプロモーターの下で発現させてもよいし、別々のプロモーターの下で発現させてもよい。複数種の核酸を導入する例としては、「イソプレン合成酵素をコードする核酸」に加えて、「メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする核酸」や「非メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする核酸」を導入する態様が挙げられる。
【００６４】
上記のような外来核酸導入に加え、突然変異やゲノムシャッフリングをさらに施すことで、イソプレンの生産性が格段向上した菌株を育種することも可能である。
【００６５】
すなわち、本発明においては、外来核酸を宿主細胞のゲノムに組み込んでもよいし、プラスミドに組み込んでもよい。
【００６６】
本発明のイソプレンの生産方法の１つの様相では、上記した組換え細胞を、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、当該組換え細胞にイソプレンを生産させる。炭素源として用いるこれらのＣ１化合物については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。また、これらのＣ１化合物は、主たる炭素源として用いることが好ましく、唯一の炭素源であることがより好ましい。
また、エネルギー源として水素（Ｈ2）を同時に提供することが好ましい。
【００６７】
本発明の組換え細胞を培養する方法としては特に限定はなく、宿主細胞の種類等に応じて適宜行うことができる。組換え細胞がClostridium属細菌（絶対嫌気性）の場合には、例えば、生育に必要な無機塩類及び、合成ガスからなる栄養条件で培養する。好ましくは０．２〜０．３ＭＰａ（絶対圧）程度の加圧状態で培養する。さらには、初期増殖及び到達細胞密度を良好にするためには、ビタミン、酵母エキス、コーンスティープリカー、バクトトリプトン等の有機物を少量加えてよい。
【００６８】
なお、組換え細胞が好気性や偏性嫌気性の場合には、例えば、液体培地を用いた通気・撹拌培養を行うことができる。
【００６９】
本発明のイソプレンの生産方法の別の様相では、上記した組換え細胞に、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物からイソプレンを生産させる。すなわち、細胞分裂（細胞増殖）を伴うか否かにかかわらず、組換え細胞に前記したＣ１化合物を接触させて、イソプレンを生産させることができる。例えば、固定化した組換え細胞に前記したＣ１化合物を連続的に供給し、イソプレンを連続的に生産させることができる。
本様相においても、これらのＣ１化合物については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。また、エネルギー源として水素（Ｈ2）を同時に接触させることが好ましい。
【００７０】
好ましい実施形態では、一酸化炭素と水素とを主成分とするガス、あるいは二酸化炭素と水素とを主成分とするガスを、前記組換え細胞に提供する。すなわち、これらのガスを炭素源として用いて組換え細胞を培養したり、あるいは、これらのガスを組換え細胞に接触させて、ガス中の一酸化炭素又は二酸化炭素からイソプレンを生産させる。この場合も、水素はエネルギー源として使用される。
【００７１】
ギ酸及び／又はメタノールを組換え細胞に提供し、ギ酸及び／又はメタノールからもイソプレンを生産することもできる。すなわち、一酸化炭素や二酸化炭素に加えて、もしくは単独で、ギ酸やメタノールを炭素源として用いて組換え細胞を培養したり、ギ酸やメタノールを組換え細胞に接触させることにより、ギ酸やメタノールからもイソプレンを生産することができる。
【００７２】
生産されたイソプレンは、細胞内に蓄積されるか、細胞外に放出される。例えば、上述したClostridium属細菌又はMoorella属細菌を宿主細胞とした組換え細胞を用い、細胞外に放出されたイソプレンを回収し、単離精製することにより、純化されたイソプレンを取得することができる。
【００７３】
なお、二酸化炭素に代えて重炭酸塩を用いることができる場合がある。すなわち、Clostridium属細菌及びその近縁種は、炭酸脱水素酵素（Carbonic anhydrase, ＣＡ）(ＥＣ ４．２．１．１： Ｈ2Ｏ＋ＣＯ2 ⇔ ＨＣＯ3-＋Ｈ+）を有することが知られており（Braus-Stromeyer SA et al., J. Bacteriol. 1997, 179(22), 7197-7200)、ＣＯ2源として、ＨＣＯ3-源となるＮａＨＣＯ3等の重炭酸塩を用いることができる。
【００７４】
ここで、宿主細胞がアセチルＣｏＡ経路とメタノール経路（図１）を有している場合において、組換え細胞に提供され得る一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールの組み合わせについて説明する。
【００７５】
アセチルＣｏＡ経路によるアセチルＣｏＡ合成では、メチルトランスフェラーゼ（Methyltransferase）、Corrinoid iron-sulfur protein (CoFeS-P)、アセチルＣｏＡシンターゼ（Acetyl-CoA synthase、ＡＣＳ）、及びＣＯＤＨの作用による、ＣｏＡ、メチルテトラヒドロ葉酸（methyltetrahydrofolate、［ＣＨ3］−ＴＨＦ)、及びＣＯからのアセチルＣｏＡの合成過程が必須である（Ragsdale SW et al., B.B.R.C. 2008, 1784(12), 1873-1898）。
【００７６】
一方、Butyribacterium methylotrophicumの培養において、炭素源としてＣＯやＣＯ2以外にギ酸やメタノールを添加することは、ＣＯ代謝すなわち、アセチルＣｏＡ経路のMethyl branchにおけるテトラヒドロ葉酸（tetrahydrofolate）含量、及び、ＣＯ代謝で必要とされるＣＯＤＨ、ギ酸デヒドロゲナーゼ（formate dehydrogenase、ＦＤＨ）及びヒドロゲナーゼ（hydrogenase）の活性を増大させることが知られている（Kerby R. et al., J. Bacteriol. 1987, 169(12), 5605-5609）。Eubacterium limosum等においても、嫌気条件下ＣＯ2及びメタノールを炭素源とした場合でも、高い増殖を得ることが示されている（Genthner BRS. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1987, 53(3), 471-476）。
【００７７】
これらのメタノールの合成ガス資化性微生物へ影響、及びMoorella thermoacetica（Clostridium thermoaceticum）及びClostridium ljungdahlii等のゲノム解析(Pierce E. et al., Environ. Microbiol. 2008, 10(10), 2550-2573; Durre P. et al., PNAS 2010, 107(29), 13087-13092)の結果から、これらの微生物種では、図１に示されるようなメタノール経路（methanol pathway）がアセチルＣｏＡ経路（Wood-Ljungdahl pathway）にメチル基のドナーとして関与することが説明できる。
【００７８】
また実際に、いくつかのClostridium属菌ではギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）(ＥＣ １．２．１．２／１．２．１．４３：Formate＋ＮＡＤ（Ｐ）+ ⇔ ＣＯ2＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）の正方向の活性（FormateからのＣＯ2形成）が確認されている（Liu CL et al., J. Bacteriol. 1984, 159(1), 375-380; Keamy JJ et al., J. Bacteriol. 1972, 109(1), 152-161)。このことから、これらの株ではＣＯ2やＣＯが欠乏状態にある場合、部分的にメタノール（ＣＨ3ＯＨ）やギ酸（ＨＣＯＯＨ）からＣＯ2の生成方向の反応が働くことができる（図１）。このことは、前述したＣＨ3ＯＨを加えることによる、ギ酸ヒドロゲナーゼ（formatede hydrogenase）活性、及びＣＯＤＨの活性増大の現象 (Kerby R et al., J. Bateriol. 1987, 169(12), 5605-5609)からも説明できる。すなわち、ギ酸（ＨＣＯＯＨ）もしくはメタノール（ＣＨ3ＯＨ）を唯一の炭素源としても増殖可能である。
【００７９】
宿主細胞が、元々、ギ酸デヒドロゲナーゼの正方向の活性を有しない株であっても、変異導入、外来遺伝子導入、もしくはゲノムシャッフリングのような遺伝子改変によって、正方向の活性を付与させればよい。
【００８０】
以上のことから、宿主細胞がアセチルＣｏＡ経路とメタノール経路を有している場合には、以下のガスや液体を用いて、イソプレンを生産することができる。
・ＣＯ
・ＣＯ2
・ＣＯ／Ｈ2
・ＣＯ2／Ｈ2
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2
・ＣＯ／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ2／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ2／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＨ3ＯＨ／Ｈ2
・ＨＣＯＯＨ／Ｈ2
・ＣＨ3ＯＨ
・ＨＣＯＯＨ
【００８１】
なお、本発明の組換え細胞について、イソプレン生産を目的とせず、専ら細胞を増やす目的で培養する場合には、一酸化炭素や二酸化炭素を炭素源として用いる必要はない。例えば糖類やグリセリンといった他の炭素源を用いて、組換え細胞を培養すればよい。
【００８２】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００８３】
（１）ポプラ由来イソプレン合成酵素遺伝子の単離と発現ベクターの構築
ポプラ（Populus nigra）の葉由来の全ＲＮＡを鋳型とし、配列番号３と配列番号４で表されるプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって、ポプラ由来イソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）をコードする核酸（ポプラ由来ＩｓｐＳ遺伝子、配列番号１、GenBank Accession No.: AM410988.1）を増幅した。得られた増幅ＤＮＡ断片をpT7-Blue T ベクター（タカラバイオ社）へクローニングし、ｐＴ７ＩＳを構築した。【００８４】
一方、Clostridium/E. coli シャトルベクターｐＩＭＰ１（Mermelstein LD et al., Bio/technology 1992, 10, 190-195）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位に、配列番号５及び配列番号６で表される合成ＤＮＡを導入し、クローニングサイトを改良し、ｐＩＭ１Ａを構築した。さらにｐＩＭ１ＡのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ部位に、配列番号７及び配列番号８で表される合成ＤＮＡを導入し、ｐＩＭ１Ｂを構築した。上記ｐＴ７ＩＳをＢａｍＨＩで切断することにより、ＩｓｐＳ遺伝子を回収し、これをｐＩＭ１ＢのＢａｍＨＩ部位へ導入することで、ポプラ由来ＩｓｐＳの発現ベクターｐＩＭＢＩＳを構築した。本発現ベクターは、pSOS95（Mingardon F et al., Appi. Environ. Microbiol. 2005, 71(3), 1215-1222）由来のプロモーター及びターミネーター領域をＩｓｐＳ遺伝子の前後に有する。【００８５】
（２）イソプレン生産能を有する組換え体の作製
上記（１）で作製したｐＩＭＢＩＳで、Bacillus subtilisファージφ3TI由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードするpAN1（Mermelstein  LD et al., Appl. Environ. Microbiol., 1993, 59(4), 1077-1081）が導入されたE. coli ER2275（ＮＥＢ社）を形質転換することで、in vivoメチル化を行った。形質転換されたE. coli ER2275からメチル化されたｐＩＭＢＩＳを回収した。「BIO/TECHNOLOGY 1992, VOL. 10, 190-195」記載の方法に従い、エレクトロポレーションによって、メチル化されたｐＩＭＢＩＳでClostridium ljungdahlii(DSM13528/ATCC55383)を形質転換し、組換え体を取得した。【００８６】
（３）組換え体によるイソプレン生産
上記（２）で取得したC. ljungdahliiの組換え体を、３７℃、嫌気条件下で培養した。培地として、５μｇ／ｍＬのClarithromycin及び２０μg／ｍＬのThiamphenicolを含有するATCC medium 1754 PETC培地（ただし、フルクトース及び酵母エキスを非含有）を用いた。１００ｍＬ容の密閉可能なガラス容器に１０ｍＬの培地を仕込み、酸素非含有ガスを２．５気圧（絶対圧）のガス圧で充填し、アルミキャップで密封した後、振とう培養した。酸素非含有ガスとして、（ａ）ＣＯ／Ｈ2＝５０／５０％、（ｂ）ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2＝３３／３３／３４％、（ｃ）ＣＯ2／Ｈ2＝５０／５０％（いずれも体積比）の３種の混合ガスを用いた。
コントロールとして、ｐＩＭＢＩＳに代えてｐＩＭＢ１が導入された組換え体を用いて、同様に培養した。
培養終了後の気相成分についてＧＣ／ＭＳで分析した。【００８７】
その結果、ｐＩＭＢＩＳが導入された組換え体では、いずれの混合ガスを用いた場合でも、イソプレンが検出された。一方、コントロールの組換え体では、いずれもイソプレンは検出されなかった。
以上より、ポプラ由来イソプレン合成酵素遺伝子が導入されたClostridium ljungdahliiの組換え体を培養することで、合成ガスからイソプレンを生産できることが示された。
【実施例２】
【００８８】
（１）メバロン酸経路酵素遺伝子とイソプレン合成酵素遺伝子が導入された発現ベクターの構築
Streptomyces griseolosporeus (Kitasatospora griseola)のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１０と配列番号１１で表されるプライマーを使用したＰＣＲによって、S. griseolosporeusのメバロン酸経路酵素をコードする核酸（配列番号９）を増幅した。この核酸には、Mevalonate kinase、Mevalonate diphosphate decarboxylase、Phosphomevalonate kinase、IPP isomerase、HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A) reductase (HMGR)、及びHMG-CoA synthaseをコードする遺伝子クラスターが含まれている。得られた増幅ＤＮＡ断片をpT7-Blue T ベクターへクローニングし、ｐＴ７ＳＭＶを構築した。【００８９】
一方、実施例１で作製したｐＴ７ＩＳを鋳型とし、配列番号３と配列番号１２で表されるプライマーを使用して、ポプラ由来ＩｓｐＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をpT7-Blue T ベクターへクローニングし、ｐＴ７ＩＳ２を構築した。【００９０】
実施例１で作製したｐＩＭ１ＢのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位に、配列番号１３と配列番号１４のオリゴＤＮＡで構成された二本鎖ＤＮＡを導入し、ｐＩＭ１Ｃを構築した。一方、ｐＴ７ＩＳ２をＢａｍＨＩとＫｐｎＩで切断してＩｓｐＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をｐＩＭ１ＣのＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ部位に導入し、ｐＩＭＣＩＳを構築した。
さらに、ｐＴ７ＳＭＶをＫｐｎＩで切断し、挿入ＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をｐＩＭＣＩＳのＫｐｎＩ部位に導入し、ｐＩＭＣＩＳＭＶを構築した。ｐＩＭＣＩＳＭＶは、ポプラ由来イソプレン合成酵素、及びStreptomyces由来の上記メバロン酸経路酵素群をコードする遺伝子を有し、当該遺伝子がpSOS95（Mingardon F et al., Appl. Envirion. Microbiol. 2005, 71(3), 1215-1222）由来のプロモーター及びターミネーターによる遺伝子発現制御を受ける。【００９１】
（２）イソプレン生産能を有する組換え体の作製
実施例１と同様にして、メチル化処理が施されたｐＩＭＣＩＳＭＶでClostridium ljungdahlii(DSM13528/ATCC55383)を形質転換し、組換え体を取得した。【００９２】
（３）組換え体によるイソプレン生産
実施例１と同様にして、３種の混合ガスを用いて、ｐＩＭＣＩＳＭＶで形質転換した上記組換え体を培養した。
コントロールとして、ｐＩＭＣＩＳＭＶに代えてｐＩＭ１Ｃが導入された組換え体、並びに、実施例１で作製したｐＩＭＢＩＳを有する組換え体を同様にして培養した。
培養終了後の気相成分についてＧＣ／ＭＳで分析した。【００９３】
その結果、ｐＩＭＣＩＳＭＶが導入された組換え体（本実施例）とｐＩＭＢＩＳが導入された組換え体（実施例１）では、いずれの混合ガスを用いた場合でもイソプレンが検出された。イソプレンの生産量に関しては、ｐＩＭＣＩＳＭＶが導入された組換え体（本実施例）の方が、ｐＩＭＢＩＳが導入された組換え体（実施例１）と比較して２〜４倍のイソプレンを生産していた。なお、ｐＩＭ１Ｃが導入された組換え体では、イソプレンは検出されなかった。
以上より、イソプレン合成酵素遺伝子に加えてメバロン酸経路酵素遺伝子を導入することにより、組換え体のイソプレンの生産量を増強できることが示された。
【実施例３】
【００９４】
（１）コドン改変されたイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（Isopentenyl diphosphate isomerase（ＩＤＩ））遺伝子及びイソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）遺伝子が導入された発現ベクターの構築
本実施例では、コドン改変された大腸菌由来イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）遺伝子及びポプラ由来イソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）遺伝子の両遺伝子が導入されたClostridium ljungdahliiによるイソプレンの生産を試みた。コドン改変にはClostridium kluyveri (DSM 555)のCodon Usage Table (http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/spsearch.cgi?species=clostridium&c=i)を参考にした。【００９５】
実施例１で作製したｐＩＭ１ＡのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ部位に、コドン改変されたＩＤＩ−ＩｓｐＳオペロン合成遺伝子（配列番号１５、センス鎖で表示）を導入し、発現ベクターpIMAIS1を構築した。同様の方法でコドン改変されていないＩＤＩ−ＩｓｐＳオペロン合成遺伝子が導入された発現ベクターpIMAIS2も構築した。
なお、配列番号１５において、塩基番号１６５〜７１３の部分がコドン改変された大腸菌由来ＩＤＩ遺伝子、塩基番号７８０〜２５６７の部分がコドン改変されたポプラ由来ＩｓｐＳ遺伝子に相当する。
コドン改変前の大腸菌由来ＩＤＩ遺伝子の塩基配列を配列番号１６に示す。コドン改変前のポプラ由来ＩｓｐＳ遺伝子の塩基配列は配列番号１に示したとおりである。【００９６】
（２）イソプレン生産能を有する組換え体の作製
実施例１と同様にして、メチル化処理が施されたpIMAIS1及びpIMAIS2でClostridium ljungdahlii(DSM13528)を形質転換し、組換え体ＩＳ１及びＩＳ２をそれぞれ取得した。【００９７】
（３）組換え体によるイソプレン生産
実施例１と同様にして、３種の混合ガスを用いて、組換え体ＩＳ１及びＩＳ２を培養した。培養終了後の気相成分についてＧＣ／ＭＳで分析した。【００９８】
その結果、ＩＳ１のイソプレン生産量は、いずれのガス組成においてもＩＳ２のそれの１．８〜３．０倍であった。このことから、大腸菌由来ＩＤＩ及びポプラ由来ＩｓｐＳの両酵素遺伝子のコドンを改変することで、C. ljungdahliiでのイソプレン生産性を向上させることが可能であることがわかった。
【実施例４】
【００９９】
Popilus alba由来イソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ)と酵母由来isopentenyl diphosphate isomerase （ＩＤＩ)を発現する組換えC. ljungdahliiの作製と、これによるイソプレンの生成【０１００】
C. acetobutylicumのコドン頻度パターンを用いて、Populus alba由来ＩｓｐＳ（Genbank accession no. Q50L36）及び酵母由来ＩＤＩの遺伝子配列が、コドン最適化された（配列番号１７)。Clostridium属における外来遺伝子発現のために、コドン最適化されたＩｓｐＳ（配列番号１７）とＩＤＩ遺伝子が、Escherichia coli/ClostridiumシャトルベクターpSCi01（配列番号１８)にクローニングされた。ＩｓｐＳ遺伝子及びＩＤＩ遺伝子は、誘導型のテトラサイクリンプロモーターとfdx転写ターミネーター（Nariya H. et al., Appl. Environ. Microbiol., 2011 (77), 1375）の間に挿入された。これにより、anhydrotetracyclineによってＩｓｐＳ及びＩＤＩの発現が誘導される発現ベクターpSCi::idi-isps（配列番号１９）が構築された。プラスミドは、大腸菌NEB Express（NEB社)を用いて増幅した。本宿主（DCM-, DAM+)で増幅することによって、プラスミドは正しいメチル化パターンを示し、これによってC. ljungdahliiで効率的に形質転換され得る。【０１０１】
C. ljungdahlii (DSMZ No. 13528)は、厳密な嫌気条件下でYTF培地（16 g tryptone, 10 g yeast extract, 4 g NaCl, 2 mM Cysteine and 5 g fructose / L, pH 5.9-6）にて培養された。エレクトロポレーションによるpSCi::idi-ispS ベクターのC. ljungdahliiへの導入のために、細胞は40 mM D,L-threonine が補充されたYTF培地にてOD600が0.2-0.3まで増殖された後、SMP緩衝液 （270 mM sucrose, 1 mM MgCl2, 7 mM sodium phosphate, pH 6) で洗浄され、１０％ ＤＭＳＯを含有する0.5mLのSMP緩衝液に再懸濁された。エレクトロポレーションには、3μgのpSCi::idi-ispS プラスミドDNAが使用された。BioRad MicropulserTM electroporator system（Bio-Rad Laboratory社）は、以下のようにセッテイングされた；キュベットサイズ 0.1 mm, 電圧 0.625 kV, 抵抗値 600 Ω, 電気容量 25 μF。１２時間の1 mLのYTF培地中での再生後、細胞は4 μg/mL clarithromycin 及び4 μg/mL thiamphenicolを含有する25 mLのYTF培地中に移植された。次のステップとして、5-10 mLの細胞懸濁液は、20 mLの融解状態のYTF寒天（1.5% 寒天)と混合し、コロニーが形成されるまで、3-5日間培養された。寒天プレートよりそれぞれのクローンは分離され、YTF培地（4 μg/mL clarithromycin and 4 μg/mL thiamphenicolを含む）にて液体培養された。【０１０２】
合成ガス発酵を行うために、細胞は、ATCC1754培地（4 μg/mL clarithromycin and 4 μg/mL thiamphenicolを含む）にて、合成ガス（60% CO, 10% CO2, 30% H2）を唯一の炭素源及びエネルギー減とする培地条件下で、200mLの密閉されたガラスボトル内で50 mLの培養液中で、合成ガス２気圧（絶対圧）下で行われた。イソプレン生成の分析は、Gerstel 社製のSPME (solid-phase-micro-extraction) 分析システムが装着されたGC/MS/MS-システムTQ8030（Shimazu社）が使用された。200 mLボトル培養からのサンプリングには、75 μm CAR/PDMS fiber （Supelco≡Sigma Aldrich社) が使用された。サンプリングは２２℃下で３０分間行った。KAS 6（Gerstel社）へのファイバーインジェクションの後、熱脱着は、200℃で３０秒間行われた。Phenomenex社製 A ZB-624 カラム （長さ30 m ; 内径0.25 mm I.D.；フィルム厚み1.4 μm）がガス成分の分離に使用された。GC/MS/MS の分析パラメーターは以下の様に設定された。【０１０３】
【表１】
2014065271.tif 000003
【０１０４】
熱脱着後、ファイバーは次の使用までに３００℃で３０分間処理された。質量分析器はMRM (multiple reaction monitoring)モードで作動された。イソプレンには68.1 m/z - 67.0 m/z 及び 67.1 m/z - 41.0 m/zの２種のトランジションが選択され、アルゴンがCID(collision induced dissociation)ガスとして使用された。イソプレン標準品としてイソプレン（Sigma Aldrich 社; cat no. 19551 :純度９９％)が使用された。【０１０５】
図２に示すように、イソプレン標準品は、２．７分のリテンションタイム、及び特徴的な68.1 m/z-67.0 m/z 及び 67.1 m/z-41.0 m/zのトランジションパターンを示した。合成ガス発酵開始４８時間後、ヘッドスペースは採取され、GC/MS/MSによって分析された。図３はpSCi01プラスミドを保持するC. ljungdahliiでのGC/MS/MS分析の結果を示す。図４はpSCi::idi-ispSプラスミドを保持するC. ljungdahliiでのGC/MS/MS分析の結果を示す。【０１０６】
以上の結果より、pSCi::idi-ispSを保持するC. ljungdahliiは、イソプレンを生成することがわかった。
【実施例５】
【０１０７】
Populus alba由来ＩｓｐＳ、Escherichia coli由来ＩＤＩ、及び微生物由来ＭＶＡ（mevalonate）経路遺伝子が導入された組換えC. ljungdahliiの作製と、これによるイソプレンの生成【０１０８】
プラスミドpSCi::MVA-IspS-idi のイソプレン合成遺伝子クラスターの設計を、図５及び配列番号２０に示した。コドン最適化された各遺伝子のaccession number、略語、及び由来生物は以下の表に示した。【０１０９】
【表２】
2014065271.tif 000004
【０１１０】
MVA-IspS-idi遺伝子クラスターは、誘導型テトラサイクリンプロモーター及びfdx転写ターミネーターの間に挿入されることにより、anhydrotetracyclineによる誘導発現系が構築された。構築された発現ベクターに由来する導入遺伝子の正しい発現は、標的されたプロテオミクスによって評価された。プラスミドは大腸菌株 NEB Express（NEB社)において増幅された。【０１１１】
C. ljungdahlii (DSMZ No. 13528)は、厳密な嫌気条件下でYTF培地（16 g tryptone, 10 g yeast extract, 4 g NaCl, 2 mM Cysteine and 5 g fructose / L, pH 5.9-6）にて培養された。エレクトロポレーションによるpSCi:: MVA-IspS-idi ベクターのC. ljungdahliiへの導入のために、細胞は40 mM D,L-threonine が補充されたYTF培地にてOD600が0.2-0.3まで増殖された後、SMP緩衝液 （270 mM sucrose, 1 mM MgCl2, 7 mM sodium phosphate, pH 6) で洗浄され、１０％のＤＭＳＯを含有する0.5mLのSMP緩衝液に再懸濁された。エレクトロポレーションには3 μgのpSCi:: MVA-IspS-idiプラスミドDNAが使用された。BioRad MicropulserTM electroporator system （Bio-Rad Laboratory社)は以下のようにセッテイングされた；キュベットサイズ 0.1 mm, 電圧 0.625 kV, 抵抗値 600 Ω, 電気容量 25 μF。１２時間の1 mLのYTF培地中での再生後、細胞は4 μg/mL clarithromycin 及び4 μg/mL thiamphenicolを含有する25 mLのYTF培地中に移植された。次のステップとして、5-10 mLの細胞懸濁液は、20 mLの融解状態のYTF寒天（1.5% 寒天)と混合し、コロニーが形成されるまで、3-5日間培養された。寒天プレートよりそれぞれのクローンは分離され、YTF培地（4 μg/mL clarithromycin and 4 μg/mL thiamphenicolを含む）にて液体培養された。【０１１２】
合成ガス発酵を行うために、細胞は、ATCC1754培地（4 μg/mL clarithromycin and 4 μg/mL thiamphenicolを含む）にて、合成ガス（60% CO, 10% CO2, 30% H2）を唯一の炭素源及びエネルギー源とする培地条件下で、200 mLの密閉されたガラスボトル内で50 mLの培養液中で、合成ガス２気圧（絶対圧）下で行われた。合成ガス発酵開始４８時間後、ヘッドスペースは実施例４と同様の方法で採取され、実施例４と同一条件下でGC/MS/MSによって分析された。【０１１３】
図６に示すように、pSCi::MVA-idi-ispS ベクターを保持するC. ljungdahliiがイソプレンを生成していることが示された。【０１１４】
ATCC medium: 1754 PETC培地の組成を以下に示す。
NH4Cl                                  1.0 g
KCl                                    0.1 g
MgSO4・7H2O                             0.2 g
NaCl                                   0.8 g
KH2PO4                                  0.1 g
CaCl2・2H2O                            20.0 mg
Yeast extract                          1.0 g
Trace Elements (下記参照)             10.0 mL
Wolfe's Vitamin Solution (下記参照)   10.0 mL
NaHCO3                                 2.0 g
Reducing Agent (下記参照)             10.0 mL
Distilled water                      980.0 mL
Final pH 5.9【０１１５】
（Trace Elements）
Nitrilotriacetic acid              2.0 g
MnSO4 H2O                           1.0 g
Fe(SO4)2(NH4)2・6H2O                 0.8 g
CoCl2・6H2O                         0.2 g
ZnSO4・7H2O                         0.2 mg
CuCl2・2H2O                        20.0 mg
NiCl2・ 6H2O                       20.0 mg
Na2MoO4・2H2O                      20.0 mg
Na2SeO4                           20.0 mg
Na2WO4                            20.0 mg
Distilled water                   1.0 L【０１１６】
（Wolfe's Vitamin Solution）
滅菌されたready-to-use溶液としてATCCより入手可能（Vitamin Supplement, catalog no. MD-VS）
Biotin                           2.0 mg
Folic acid                       2.0 mg
Pyridoxine hydrochloride        10.0 mg
Thiamine・HCl                    5.0 mg
Riboflavin                       5.0 mg
Nicotinic acid                   5.0 mg
Calcium D-(+)-pantothenate       5.0 mg
Vitamin B12                      0.1 mg
p-Aminobenzoic acid              5.0 mg
Thioctic acid                    5.0 mg
Distilled water                  1.0 L【０１１７】
（Reducing Agent）
NaOH                               0.9 g
L-Cysteine・HCl                    4.0 g
Na2S・9H2O                          4.0 g
Distilled water                  100.0 mL
【図１】
2014065271.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2014065271000001.app
【国際調査報告】
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2014065271.tif 000012
2014065271.tif 000013
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