(57)【要約】  コア遺伝子に関する情報に依存せず、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタを高精度に予測する。  少なくとも一対のゲノム塩基配列情報を用いた相同性検索の結果に基づいて他のゲノム塩基配列情報との間で遺伝子の並びが保存されている領域を遺伝子クラスタとして特定する工程と、上記工程で特定された遺伝子クラスタのうちシンテニー様領域が占める割合に基づいて、当該遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する工程とを備える。
2014046284.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一対のゲノム塩基配列情報に含まれる遺伝子に関して相互に相同性検索し、これらゲノム塩基配列情報間で相同遺伝子の組み合わせ、相同遺伝子の組み合わせのなかでオーソログ遺伝子の組み合わせを同定する工程と、
上記相同性検索の結果に基づいて他のゲノム塩基配列情報との間で遺伝子の並びが保存されている領域を遺伝子クラスタとして特定する工程と、
上記工程で特定された遺伝子クラスタのうち、上記相同性検索の結果のうちオーソログ遺伝子の存在に基づいてシンテニー様領域を特定し、当該シンテニー様領域が占める割合に基づいて、当該遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する工程と
を含む二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタの予測方法。
【請求項２】
上記シンテニー様領域に含まれる遺伝子数が上記遺伝子クラスタ全体に含まれる遺伝子数に対して、所定の割合以下である場合に当該遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであると判定することを特徴とする請求項１記載の予測方法。
【請求項３】
上記所定の割合を２５％とすることを特徴とする請求項２記載の予測方法。
【請求項４】
上記シンテニー様領域は、少なくとも２以上のオーソログ遺伝子を含み、隣接するオーソログ遺伝子の距離が上記ゲノム塩基配列情報及び上記他のゲノム塩基配列情報のそれぞれにおいて所定の距離以内にある領域とすることを特徴とする請求項１記載の予測方法。
【請求項５】
上記所定の距離は、１０〜３０ｋｂとすることを特徴とする請求項４記載の予測方法。
【請求項６】
上記シンテニー様領域は、比較に用いる少なくとも一対のゲノム塩基配列情報のうちの１種のゲノム塩基配列情報と、これら一対のゲノム塩基配列情報とは異なる第３のゲノム塩基配列情報とを用いてシンテニー領域／非シンテニー領域をあらかじめ決定し、このシンテニー領域をシンテニー様領域とすることを特徴とする請求項１記載の予測方法。
【請求項７】
上記遺伝子クラスタを特定する工程の後、特定した遺伝子クラスタに含まれる相同遺伝子の数及び/又は特定した遺伝子クラスタに含まれる全遺伝子の数を予め定めた基準値を比較し、相同遺伝子の数が基準値以上である遺伝子クラスタ、及び/又は全遺伝子の数が基準値未満の遺伝子クラスタについて、当該遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する上記工程を行うことを特徴とする請求項１記載の予測方法。
【請求項８】
相同遺伝子の数に関する上記基準値を３個とし、全遺伝子の数に関する上記基準値を３５個とすることを特徴とする請求項７記載の予測方法。
【請求項９】
上記遺伝子クラスタを特定する工程の後、特定した遺伝子クラスタに含まれる全遺伝子の数を予め定めた基準値を比較するか、特定した遺伝子クラスタの長さを予め定めた基準値と比較し、全遺伝子の数又は長さが基準値未満の遺伝子クラスタについて、遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する工程を行い、
遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する工程では、判定対象の遺伝子クラスタに含まれる遺伝子の数が上記基準値の個数となるように、当該遺伝子クラスタに隣接する遺伝子を追加して当該遺伝子クラスタを修正し、当該基準値の個数の遺伝子からなる修正された遺伝子クラスタについてシンテニー様領域を特定することを特徴とする請求項１記載の予測方法。
【請求項１０】
全遺伝子の数に関する上記基準値を３５個とすることを特徴とする請求項９記載の予測方法。
【請求項１１】
上記遺伝子クラスタを特定する工程の後、特定した遺伝子クラスタに含まれる全遺伝子の数を予め定めた基準値を比較するか、特定した遺伝子クラスタの長さを予め定めた基準値と比較し、全遺伝子の数又は長さが基準値未満の遺伝子クラスタについて、遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する工程を行い、
遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する工程では、判定対象の遺伝子クラスタに対して、所定の数の遺伝子又は所定の長さの領域を追加して当該遺伝子クラスタを修正し、修正された遺伝子クラスタについてシンテニー様領域を特定することを特徴とする請求項１記載の予測方法。
【請求項１２】
上記遺伝子クラスタを特定する工程では、Smith-Watermanアルゴリズムで作成されるSmith-Watermanマトリックスにおいて、最大のスコアを示すセルからトレースバックすることで遺伝子クラスタを特定することを特徴とする請求項１記載の予測方法。
【請求項１３】
上記遺伝子クラスタを特定する工程では、上記特定された遺伝子クラスタに含まれるセルのスコアに0を代入し、このSmith-Watermanマトリックスについてトレースバックすることで他の遺伝子の並びが保存されている領域を特定し、特定された領域について再度Smith-Watermanアルゴリズムにて遺伝子の並びが保存された領域を特定し、これを遺伝子クラスタとして特定することを特徴とする請求項１２記載の予測方法。
【請求項１４】
上記遺伝子クラスタを特定する工程の後、特定した遺伝子クラスタに含まれる全遺伝子の数を予め定めた基準値を比較するか、特定した遺伝子クラスタの長さを予め定めた基準値と比較し、遺伝子クラスタに対して所定の数の遺伝子又は所定の長さの領域を追加して当該遺伝子クラスタが当該基準値となるように拡張し、
拡張した遺伝子クラスタを構成する各遺伝子について、他のゲノム塩基配列情報における比較対象の遺伝子クラスタを構成する遺伝子との間で相同性がある場合にはプラスのスコア、相同性がない場合にはマイナスのスコアを与え、
遺伝子クラスタの中心に位置する遺伝子から端に向かって順にスコアの合計値を算出し、スコアの合計値が極大値となる遺伝子を遺伝子クラスタの境界として特定し、
境界として特定された遺伝子により挟み込まれる領域を遺伝子クラスタとすることを特徴とする請求項１記載の予測方法。
【請求項１５】
全遺伝子の数を予め定めた上記基準値を１５〜６５個とすることを特徴とする請求項１４記載の予測方法。
【請求項１６】
入力手段、中央演算処理手段及び記憶手段を備えるコンピュータに対して、
上記中央演算処理手段が少なくとも一対のゲノム塩基配列情報に含まれる遺伝子に関して相互に相同性検索し、これらゲノム塩基配列情報間で相同遺伝子の組み合わせ、相同遺伝子の組み合わせのなかでオーソログ遺伝子の組み合わせを同定する工程と、
上記中央演算処理手段が上記相同性検索の結果に基づいて他のゲノム塩基配列情報との間で遺伝子の並びが保存されている領域を遺伝子クラスタとして特定する工程と、
上記中央演算処理手段が上記工程で特定された遺伝子クラスタのうち、上記相同性検索の結果のうちオーソログ遺伝子の存在に基づいてシンテニー様領域を特定し、当該シンテニー様領域が占める割合に基づいて、当該遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する工程と
を実行させる、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタの予測プログラム。
【請求項１７】
上記中央演算処理手段は、上記シンテニー様領域に含まれる遺伝子数が上記遺伝子クラスタ全体に含まれる遺伝子数に対して、所定の割合以下である場合に当該遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであると判定することを特徴とする請求項１６記載の予測プログラム。
【請求項１８】
上記所定の割合を２５％とすることを特徴とする請求項１７記載の予測プログラム。
【請求項１９】
上記シンテニー様領域は、少なくとも２以上のオーソログ遺伝子を含み、隣接するオーソログ遺伝子の距離が上記ゲノム塩基配列情報及び上記他のゲノム塩基配列情報のそれぞれにおいて所定の距離以内にある領域とすることを特徴とする請求項１６記載の予測プログラム。
【請求項２０】
上記所定の距離は、１０〜３０ｋｂとすることを特徴とする請求項１９記載の予測プログラム。
【請求項２１】
上記シンテニー様領域は、比較に用いる少なくとも一対のゲノム塩基配列情報のうちの１種のゲノム塩基配列情報と、これら一対のゲノム塩基配列情報とは異なる第３のゲノム塩基配列情報とを用いてシンテニー領域／非シンテニー領域をあらかじめ決定し、このシンテニー領域をシンテニー様領域とすることを特徴とする請求項１６記載の予測プログラム。
【請求項２２】
上記遺伝子クラスタを特定する工程の後、上記中央演算処理手段は、特定した遺伝子クラスタに含まれる相同遺伝子の数及び/又は特定した遺伝子クラスタに含まれる全遺伝子の数を予め定めた基準値を比較し、相同遺伝子の数が基準値以上である遺伝子クラスタ、及び/又は全遺伝子の数が基準値未満の遺伝子クラスタについて、当該遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する上記工程を行うことを特徴とする請求項１６記載の予測プログラム。
【請求項２３】
相同遺伝子の数に関する上記基準値を３個とし、全遺伝子の数に関する上記基準値を３５個とすることを特徴とする請求項２２記載の予測プログラム。
【請求項２４】
上記遺伝子クラスタを特定する工程の後、上記中央演算処理手段は、特定した遺伝子クラスタに含まれる全遺伝子の数を予め定めた基準値を比較するか、特定した遺伝子クラスタの長さを予め定めた基準値と比較し、全遺伝子の数又は長さが基準値未満の遺伝子クラスタについて、遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する工程を行い、
遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する工程では、判定対象の遺伝子クラスタに含まれる遺伝子の数が上記基準値の個数となるように、当該遺伝子クラスタに隣接する遺伝子を追加して当該遺伝子クラスタを修正し、当該基準値の個数の遺伝子からなる修正された遺伝子クラスタについてシンテニー様領域を特定することを特徴とする請求項１６記載の予測プログラム。
【請求項２５】
全遺伝子の数に関する上記基準値を３５個とすることを特徴とする請求項２４記載の予測プログラム。
【請求項２６】
上記遺伝子クラスタを特定する工程の後、上記中央演算処理手段は、特定した遺伝子クラスタに含まれる全遺伝子の数を予め定めた基準値を比較するか、特定した遺伝子クラスタの長さを予め定めた基準値と比較し、全遺伝子の数又は長さが基準値未満の遺伝子クラスタについて、遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する工程を行い、
遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する工程では、判定対象の遺伝子クラスタに対して、所定の数の遺伝子又は所定の長さの領域を追加して当該遺伝子クラスタを修正し、修正された遺伝子クラスタについてシンテニー様領域を特定することを特徴とする請求項１６記載の予測プログラム。
【請求項２７】
上記遺伝子クラスタを特定する工程では、Smith-Watermanアルゴリズムで作成されるSmith-Watermanマトリックスにおいて、最大のスコアを示すセルからトレースバックすることで遺伝子クラスタを特定することを特徴とする請求項１６記載の予測プログラム。
【請求項２８】
上記遺伝子クラスタを特定する工程では、上記特定された遺伝子クラスタに含まれるセルのスコアに0を代入し、このSmith-Watermanマトリックスについてトレースバックすることで他の遺伝子の並びが保存されている領域を特定し、特定された領域について再度Smith-Watermanアルゴリズムにて遺伝子の並びが保存された領域を特定し、これを遺伝子クラスタとして特定することを特徴とする請求項２７記載の予測プログラム。
【請求項２９】
上記遺伝子クラスタを特定する工程の後、上記中央演算処理手段は、特定した遺伝子クラスタに含まれる全遺伝子の数を予め定めた基準値を比較するか、特定した遺伝子クラスタの長さを予め定めた基準値と比較し、遺伝子クラスタに対して所定の数の遺伝子又は所定の長さの領域を追加して当該遺伝子クラスタが当該基準値となるように拡張し、
拡張した遺伝子クラスタを構成する各遺伝子について、他のゲノム塩基配列情報における比較対象の遺伝子クラスタを構成する遺伝子との間で相同性がある場合にはプラスのスコア、相同性がない場合にはマイナスのスコアを与え、
遺伝子クラスタの中心に位置する遺伝子から端に向かって順にスコアの合計値を算出し、スコアの合計値が極大値となる遺伝子を遺伝子クラスタの境界として特定し、
境界として特定された遺伝子により挟み込まれる領域を遺伝子クラスタとすることを特徴とする請求項１６記載の予測プログラム。
【請求項３０】
全遺伝子の数を予め定めた上記基準値を１５〜６５個とすることを特徴とする請求項２９記載の予測プログラム。
【請求項３１】
入力手段、中央演算処理手段及び記憶手段を備え、
上記中央演算処理手段が少なくとも一対のゲノム塩基配列情報に含まれる遺伝子に関して相互に相同性検索し、これらゲノム塩基配列情報間で相同遺伝子の組み合わせ、相同遺伝子の組み合わせのなかでオーソログ遺伝子の組み合わせを同定する相同性検索手段と、
上記中央演算処理手段が上記相同性検索手段の結果に基づいて他のゲノム塩基配列情報との間で遺伝子の並びが保存されている領域を遺伝子クラスタとして特定する遺伝子クラスタ特定手段と、
上記中央演算処理手段が上記遺伝子クラスタ特定手段で特定された遺伝子クラスタのうち、上記相同性検索手段の結果のうちオーソログ遺伝子の存在に基づいてシンテニー様領域を特定し、当該シンテニー様領域が占める割合に基づいて、当該遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する判定手段と
から構成される、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタの予測装置。
【請求項３２】
上記中央演算処理手段は、上記シンテニー様領域に含まれる遺伝子数が上記遺伝子クラスタ全体に含まれる遺伝子数に対して、所定の割合以下である場合に当該遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであると判定することを特徴とする請求項３１記載の予測装置。
【請求項３３】
上記所定の割合を２５％とすることを特徴とする請求項３２記載の予測装置。
【請求項３４】
上記シンテニー様領域は、少なくとも２以上のオーソログ遺伝子を含み、隣接するオーソログ遺伝子の距離が上記ゲノム塩基配列情報及び上記他のゲノム塩基配列情報のそれぞれにおいて所定の距離以内にある領域とすることを特徴とする請求項３１記載の予測装置。
【請求項３５】
上記所定の距離は、１０〜３０ｋｂとすることを特徴とする請求項３４記載の予測装置。
【請求項３６】
上記シンテニー様領域は、比較に用いる少なくとも一対のゲノム塩基配列情報のうちの１種のゲノム塩基配列情報と、これら一対のゲノム塩基配列情報とは異なる第３のゲノム塩基配列情報とを用いてシンテニー領域／非シンテニー領域をあらかじめ決定し、このシンテニー領域をシンテニー様領域とすることを特徴とする請求項３１記載の予測装置。
【請求項３７】
上記遺伝子クラスタ特定手段による処理の後、上記中央演算処理手段は、特定した遺伝子クラスタに含まれる相同遺伝子の数及び/又は特定した遺伝子クラスタに含まれる全遺伝子の数を予め定めた基準値を比較し、相同遺伝子の数が基準値以上である遺伝子クラスタ、及び/又は全遺伝子の数が基準値未満の遺伝子クラスタについて、当該遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する上記判定手段の処理を行うことを特徴とする請求項３１記載の予測装置。
【請求項３８】
相同遺伝子の数に関する上記基準値を３個とし、全遺伝子の数に関する上記基準値を３５個とすることを特徴とする請求項３７記載の予測装置。
【請求項３９】
上記遺伝子クラスタ特定手段による処理の後、上記中央演算処理手段は、特定した遺伝子クラスタに含まれる全遺伝子の数を予め定めた基準値を比較するか、特定した遺伝子クラスタの長さを予め定めた基準値と比較し、全遺伝子の数又は長さが基準値未満の遺伝子クラスタについて、遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する上記判定手段の処理を行い、
遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する上記判定手段は、判定対象の遺伝子クラスタに含まれる遺伝子の数が上記基準値の個数となるように、当該遺伝子クラスタに隣接する遺伝子を追加して当該遺伝子クラスタを修正し、当該基準値の個数の遺伝子からなる修正された遺伝子クラスタについてシンテニー様領域を特定することを特徴とする請求項３１記載の予測装置。
【請求項４０】
全遺伝子の数に関する上記基準値を３５個とすることを特徴とする請求項３９記載の予測装置。
【請求項４１】
上記遺伝子クラスタ特定手段による処理の後、上記中央演算処理手段は、特定した遺伝子クラスタに含まれる全遺伝子の数を予め定めた基準値を比較するか、特定した遺伝子クラスタの長さを予め定めた基準値と比較し、全遺伝子の数又は長さが基準値未満の遺伝子クラスタについて、遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する上記判定手段の処理を行い、
遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する上記判定手段では、判定対象の遺伝子クラスタに対して、所定の数の遺伝子又は所定の長さの領域を追加して当該遺伝子クラスタを修正し、修正された遺伝子クラスタについてシンテニー様領域を特定することを特徴とする請求項３１記載の予測装置。
【請求項４２】
上記遺伝子クラスタ特定手段では、Smith-Watermanアルゴリズムで作成されるSmith-Watermanマトリックスにおいて、最大のスコアを示すセルからトレースバックすることで遺伝子クラスタを特定することを特徴とする請求項３１記載の予測装置。
【請求項４３】
上記遺伝子クラスタ特定手段では、上記特定された遺伝子クラスタに含まれるセルのスコアに0を代入し、このSmith-Watermanマトリックスについてトレースバックすることで他の遺伝子の並びが保存されている領域を特定し、特定された領域について再度Smith-Watermanアルゴリズムにて遺伝子の並びが保存された領域を特定し、これを遺伝子クラスタとして特定することを特徴とする請求項４２記載の予測装置。
【請求項４４】
上記遺伝子クラスタを特定する工程の後、上記中央演算処理手段は、特定した遺伝子クラスタに含まれる全遺伝子の数を予め定めた基準値を比較するか、特定した遺伝子クラスタの長さを予め定めた基準値と比較し、遺伝子クラスタに対して所定の数の遺伝子又は所定の長さの領域を追加して当該遺伝子クラスタが当該基準値となるように拡張し、
拡張した遺伝子クラスタを構成する各遺伝子について、他のゲノム塩基配列情報における比較対象の遺伝子クラスタを構成する遺伝子との間で相同性がある場合にはプラスのスコア、相同性がない場合にはマイナスのスコアを与え、
遺伝子クラスタの中心に位置する遺伝子から端に向かって順にスコアの合計値を算出し、スコアの合計値が極大値となる遺伝子を遺伝子クラスタの境界として特定し、
境界として特定された遺伝子により挟み込まれる領域を遺伝子クラスタとすることを特徴とる請求項３１記載の予測装置。
【請求項４５】
全遺伝子の数を予め定めた上記基準値を１５〜６５個とすることを特徴とする請求項４４記載の予測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の遺伝子から構成される遺伝子クラスタのうち二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタを予測する方法、予測プログラム及び予測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
二次代謝物質は、生理活性を有する可能性が高く、医薬のリード化合物として極めて有用である。二次代謝物質は多様で、放線菌、真菌、植物などの様々な生物種から発見されているが、発現する条件が特殊で知られていないことが多く、有用な性質を持つ多数の二次代謝物質が発見されないままに眠っていると考えられている。また発見されたとしても、安定で十分な量の生産が困難であることが利用の際の問題である。【０００３】
一方、近年、ＤＮＡシークエンス技術の革新的な発展により、様々な生物種、特に微生物のゲノム情報の蓄積は加速度的に増加しており、数年後には数千種以上の微生物のゲノム塩基配列が明らかになることは確実である。また、ＤＮＡシークエンス技術によれば、ゲノム情報が未知の生物についても迅速、且つ低コストにゲノム情報を取得することができる。このようなゲノム情報の蓄積、ゲノム情報の簡便な解析により、ホールゲノム解析、シンテニー解析といった比較ゲノム解析を広範な生物種に対して行うことができる。【０００４】
このような状況であれば、詳細かつ膨大なゲノム情報を収集して構築されたデータベースを利用し、更に二次代謝物質の構造、多様性、生物界での分布などに関する情報を利用することによって、有用な未知の二次代謝物質の発見及び二次代謝物質の生合成に関与する遺伝子（二次代謝系遺伝子）を同定できると期待される。しかし、二次代謝系遺伝子は、現状の比較ゲノム解析方法を利用して高精度に同定することが困難であった。これは、二次代謝系遺伝子は、属・種の進化系統樹と矛盾することが多い上、機能が全く解明されていない未知の遺伝子が多数存在するためである。【０００５】
従来、二次代謝系遺伝子を解析する手法として、ポリケチドシンターゼ遺伝子（PKS遺伝子）やノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ遺伝子（NRPS遺伝子）等、既知の配列相同性が高い遺伝子（コア遺伝子）の検出を基盤として、これに付随する遺伝子を含めたクラスタとして予測する方法であった。具体的には、非特許文献１に記載されたSMURF、非特許文献２に記載されたantiSMASH、非特許文献３に記載されたCLUSEAN及び非特許文献４に記載されたClustScanを挙げることができる。【０００６】
しかし、これら方法で検出されるクラスタは、コア遺伝子を有する二次代謝系遺伝子クラスタに限定され、二次代謝系遺伝子を含むクラスタ全体の一部でしかない。換言すると、これらの方法では、全体の半数以上を占めると予想されるコア遺伝子を含まない二次代謝系遺伝子クラスタを予測することは不可能であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Khaldi Nora; Seifuddin Fayaz T.; Turner Geoff; et al. SMURF: Genomic mapping of fungal secondary metabolite clusters. FUNGAL GENETICS AND BIOLOGY. 47, 9, 736-741 (2010)
【非特許文献２】Medema Marnix H.; Blin Kai; Cimermancic Peter; et al. antiSMASH: rapid identification, annotation and analysis of secondary metabolite biosynthesis gene clusters in bacterial and fungal genome sequences. NUCLEIC ACIDS RESEARCH. 39, 339-346 (2011)
【非特許文献３】Weber T.; Rausch C.; Lopez P.; et al. CLUSEAN: A computer-based framework for the automated analysis of bacterial secondary metabolite biosynthetic gene clusters.  JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY. 140, 1-2, 13-17 (2009)
【非特許文献４】Starcevic Antonio; Zucko Jurica; Simunkovic Jurica; et al. ClustScan: an integrated program package for the semi-automatic annotation of modular biosynthetic gene clusters and in silico prediction of novel chemical structures. NUCLEIC ACIDS RESEARCH. 36, 21, 6882-6892 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述したような実情に鑑み、コア遺伝子に関する情報に依存せず、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタを高精度に予測することができる方法、予測プログラム及び予測装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。【００１０】
（１）少なくとも一対のゲノム塩基配列情報に含まれる遺伝子に関して相互に相同性検索し、これらゲノム塩基配列情報間で相同遺伝子の組み合わせ、相同遺伝子の組み合わせのなかでオーソログ遺伝子の組み合わせを同定する工程と、上記相同性検索の結果に基づいて他のゲノム塩基配列情報との間で遺伝子の並びが保存されている領域を遺伝子クラスタとして特定する工程と、上記工程で特定された遺伝子クラスタのうち、上記相同性検索の結果のうちオーソログ遺伝子の存在に基づいてシンテニー様領域を特定し、当該シンテニー様領域が占める割合に基づいて、当該遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する工程とを含む二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタの予測方法。【００１１】
（２）上記シンテニー様領域に含まれる遺伝子数が上記遺伝子クラスタ全体に含まれる遺伝子数に対して、所定の割合以下である場合に当該遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであると判定することを特徴とする（１）記載の予測方法。【００１２】
（３）上記所定の割合を２５％とすることを特徴とする（２）記載の予測方法。【００１３】
（４）上記シンテニー様領域は、少なくとも２以上のオーソログ遺伝子を含み、隣接するオーソログ遺伝子の距離が上記ゲノム塩基配列情報及び上記他のゲノム塩基配列情報のそれぞれにおいて所定の距離以内にある領域とすることを特徴とする（１）記載の予測方法。【００１４】
（５）上記所定の距離は、１０〜３０ｋｂとすることを特徴とする（４）記載の予測方法。【００１５】
（６）上記シンテニー様領域は、比較に用いる少なくとも一対のゲノム塩基配列情報のうちの１種のゲノム塩基配列情報と、これら一対のゲノム塩基配列情報とは異なる第３のゲノム塩基配列情報とを用いてシンテニー領域／非シンテニー領域をあらかじめ決定し、このシンテニー領域をシンテニー様領域とすることを特徴とする（１）記載の予測方法。【００１６】
（７）上記遺伝子クラスタを特定する工程の後、特定した遺伝子クラスタに含まれる相同遺伝子の数及び/又は特定した遺伝子クラスタに含まれる全遺伝子の数を予め定めた基準値を比較し、相同遺伝子の数が基準値以上である遺伝子クラスタ、及び/又は全遺伝子の数が基準値未満の遺伝子クラスタについて、当該遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する上記工程を行うことを特徴とする（１）記載の予測方法。【００１７】
（８）相同遺伝子の数に関する上記基準値を３個とし、全遺伝子の数に関する上記基準値を３５個とすることを特徴とする（７）記載の予測方法。【００１８】
（９）上記遺伝子クラスタを特定する工程の後、特定した遺伝子クラスタに含まれる全遺伝子の数を予め定めた基準値を比較するか、特定した遺伝子クラスタの長さを予め定めた基準値と比較し、全遺伝子の数又は長さが基準値未満の遺伝子クラスタについて、遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する工程を行い、遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する工程では、判定対象の遺伝子クラスタに含まれる遺伝子の数が上記基準値の個数となるように、当該遺伝子クラスタに隣接する遺伝子を追加して当該遺伝子クラスタを修正し、当該基準値の個数の遺伝子からなる修正された遺伝子クラスタについてシンテニー様領域を特定することを特徴とする（１）記載の予測方法。【００１９】
（１０）全遺伝子の数に関する上記基準値を３５個とすることを特徴とする（９）記載の予測方法。【００２０】
（１１）上記遺伝子クラスタを特定する工程の後、特定した遺伝子クラスタに含まれる全遺伝子の数を予め定めた基準値を比較するか、特定した遺伝子クラスタの長さを予め定めた基準値と比較し、全遺伝子の数又は長さが基準値未満の遺伝子クラスタについて、遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する工程を行い、遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定する工程では、判定対象の遺伝子クラスタに対して、所定の数の遺伝子又は所定の長さの領域を追加して当該遺伝子クラスタを修正し、修正された遺伝子クラスタについてシンテニー様領域を特定することを特徴とする（１）記載の予測方法。【００２１】
（１２）上記遺伝子クラスタを特定する工程では、Smith-Watermanアルゴリズムで作成されるSmith-Watermanマトリックスにおいて、最大のスコアを示すセルからトレースバックすることで遺伝子クラスタを特定することを特徴とする（１）記載の予測方法。【００２２】
（１３）上記遺伝子クラスタを特定する工程では、上記特定された遺伝子クラスタに含まれるセルのスコアに0を代入し、このSmith-Watermanマトリックスについてトレースバックすることで他の遺伝子の並びが保存されている領域を特定し、特定された領域について再度Smith-Watermanアルゴリズムにて遺伝子の並びが保存された領域を特定し、これを遺伝子クラスタとして特定することを特徴とする請求項（１２）記載の予測方法。【００２３】
（１４）上記遺伝子クラスタを特定する工程の後、特定した遺伝子クラスタに含まれる全遺伝子の数を予め定めた基準値を比較するか、特定した遺伝子クラスタの長さを予め定めた基準値と比較し、遺伝子クラスタに対して所定の数の遺伝子又は所定の長さの領域を追加して当該遺伝子クラスタが当該基準値となるように拡張し、
拡張した遺伝子クラスタを構成する各遺伝子について、他のゲノム塩基配列情報における比較対象の遺伝子クラスタを構成する遺伝子との間で相同性がある場合にはプラスのスコア、相同性がない場合にはマイナスのスコアを与え、
遺伝子クラスタの中心に位置する遺伝子から端に向かって順にスコアの合計値を算出し、スコアの合計値が極大値となる遺伝子を遺伝子クラスタの境界として特定し、
境界として特定された遺伝子により挟み込まれる領域を遺伝子クラスタとすることを特徴とする（１）記載の予測方法。【００２４】
（１５）全遺伝子の数を予め定めた上記基準値を１５〜６５個とすることを特徴とする（１４）記載の予測方法。【００２５】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2012-210044号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明では、比較ゲノム科学的手法を用い、遺伝子の並びを配列と見立てて塩基配列を比較する技術を応用すること、および、単純なシンテニーと区別することにより、コア遺伝子を含むか否かに拘わらず、全く新規な二次代謝系遺伝子クラスタを予測することを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明に係る二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタの予測方法に関するフローチャートである。
【図２】本発明に係る予測方法において、遺伝子クラスタを特定する際のSmith-Watermanアルゴリズムにおいて作成されるマトリックスの概念図である。
【図３】本発明に係る予測方法において、遺伝子クラスタを特定し、特定した遺伝子クラスタにオーソログチェックを行い、最終的に二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタを特定するまでの工程を示すフローチャートである。
【図４】本発明に係る予測方法を適用してオーソログチェックを行うステップを説明するための模式図である。
【図５】本発明に係る予測方法を適用してオーソログチェックを行うステップを説明するための模式図である。
【図６】本発明に係る予測方法を適用してオーソログチェックを行うステップを説明するための模式図である。
【図７】本発明に係る予測方法において、遺伝子クラスタの境界を修正するステップを説明するための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明を図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２９】
本発明に係る二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタの予測方法は、少なくとも一対のゲノムに含まれる遺伝子に関して相同性検索した結果を利用し、比較したゲノムの遺伝子の並びに基づいて遺伝子クラスタを特定する工程と、特定した遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるかを判定する工程と含んでいる（図１）。
【００３０】
ここで、二次代謝系遺伝子とは、二次代謝産物の生合成に関与する遺伝子を意味する。二次代謝産物とは、生物の生命活動に直接関与しない代謝産物である。なお、生物が合成する物質を代謝産物と総称する場合、代謝産物は一次代謝産物と二次代謝産物とから構成されることとなる。この場合、二次代謝産物とは、一次代謝産物を除く代謝産物ということができる。なお、一次代謝産物とは、生物の生命活動に直接関与する物質であり、例えば糖、アミノ酸、脂質及び核酸を意味する。よって、二次代謝産物とは、代謝産物のうち糖、アミノ酸、脂質及び核酸以外の物質と定義しても良い。二次代謝産物としては、例えば、抗生物質、アルカロイド、テルペノイド、フラボノイド、ポリケチド、フェノール類、配糖体、タンパク質を構成しない特殊なアミノ酸等を挙げることができる。
【００３１】
また、二次代謝産物の生合成に関与する遺伝子とは、二次代謝物質の同化反応又は異化反応に関与する酵素をコードする遺伝子、二次代謝物質の転流・蓄積に関与するタンパク質をコードする遺伝子、及びこれら遺伝子の発現制御に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。
【００３２】
より具体的に、二次代謝系遺伝子としては、ポリケチド、非リボソームペプチド、アルカロイド、テルペノイド、フラボノイド、その他の一次代謝に属さない化合物の生合成に関わる遺伝子を挙げることができる。なお、本発明に係る予測方法によって予測される遺伝子クラスタは、これら具体的に例示した二次代謝系遺伝子を含むとは限らず、他の二次代謝系遺伝子を含むこともある。
【００３３】
<遺伝子クラスタの特定>
本方法においては、先ず、遺伝子クラスタを特定する。ここで、遺伝子クラスタとは、所定の連続した領域に含まれる複数の遺伝子からなる群であって、複数のゲノム間（例えば、一対のゲノム間）で並びが保存された複数の遺伝子の群を意味する。連続した領域とは、染色体、ミトコンドリアといった核酸から構成されるゲノム全体或いはゲノムの一部に含まれる領域を意味する。すなわち、遺伝子クラスタとは、ゲノム全体或いはゲノムの一部に含まれる連続した領域において、並びが保存された複数の遺伝子の群を意味する。
【００３４】
遺伝子クラスタを特定するには、少なくとも一対のゲノム塩基配列情報を準備する。ゲノム塩基配列情報とは、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンからなる４種類のヌクレオチドをそれぞれA、G、C及びGとして表記したテキストデータである。なお、ゲノム塩基配列情報は、5'末端から3'末端の方向で表記される。ここで、一対のゲノム塩基配列情報のうち一方又は両方は、各種のゲノム塩基配列情報等が格納されたデータベースから取得したデータを使用しても良いし、DNAシーケンス技術を適用して未知或いは公知の生物から取得したデータを使用しても良い。DNAシーケンス技術としては、例えばMolecular Cloning, A Laboratory Manual, Fourth Edition (Cold Spring Harbor Laboratoty Press)のChapter 11に記載される全ての方法を適用することができる。
【００３５】
また、ゲノム塩基配列情報としては、如何なる生物種由来のデータを使用しても良い。言い換えると、本発明に係る予測方法では、生物種には何ら限定されず、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタを予測することができる。具体的に、生物種としては、例えば、植物、細菌、放線菌、真菌、糸状菌、キノコ等を挙げることができる。さらに、ゲノム塩基配列情報としては、由来する生物種が明らかになっていないデータであっても良い。例えば、土壌や汚泥、湖水、海水等の環境から培養を経ずに直接抽出されたDNA、いわゆる環境DNAについて塩基配列を決定し、これをゲノム塩基配列情報として利用することもできる。すなわち、本発明に係る予測方法では、環境DNAに存在する、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタを予測することができる。
【００３６】
少なくとも一対のゲノム塩基配列情報から遺伝子クラスタを特定するには、先ず、ゲノム塩基配列情報に基づいて、一対のゲノム塩基配列情報に存在する複数の遺伝子の配置を比較し、遺伝子の並びが保存された領域を特定する。
【００３７】
遺伝子の配置を比較するには、対象となる一対のゲノム塩基配列情報に含まれる遺伝子に関して相互に相同性検索し、これらゲノム塩基配列情報間で相同遺伝子の組み合わせ、相同遺伝子の組み合わせのなかでオーソログ遺伝子の組み合わせを同定する。これには先ず、対象となる一対のゲノム塩基配列情報に含まれる複数の遺伝子について、これら遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を推定する。アミノ酸配列の推定には、いわゆるOpen Reading Frame解析ソフトウェアを使用することができる。この解析ソフトウェアによれば、5'末端から3'末端の方向で表記されたゲノム塩基配列情報及びその相補鎖について、それぞれ３つのフレームのORFを特定することができる。このとき一方のゲノム塩基配列情報にある遺伝子をxi（i=1, 2,…, I）とし、他方のゲノム塩基配列情報上にある遺伝子をyj（j=1, 2,…, J）とする。
【００３８】
次に、一方のゲノム塩基配列情報に含まれる全ての遺伝子について、それぞれアミノ酸配列を問い合わせ配列（クエリー配列）とし、他方のゲノム塩基配列情報に含まれる遺伝子に関するアミノ酸配列をデータベース配列として相同性を検索する。相同性の検索には、Blastp、FASTA及びClustalといった従来公知の相同性解析ソフトウェアを使用することができる。また、問い合わせ配列としたゲノム塩基配列情報と、データベース配列としたゲノム塩基配列情報とを入れ替えて同様に相同性検索を実施する。
【００３９】
この相同性検索によれば、一対のゲノム塩基配列情報の間で、配列類似性の高い遺伝子を相互に特定することができる。例えば、配列類似性を示す値に対して閾値を設定し、当該閾値を超える遺伝子の組み合わせを相同遺伝子として特定することができる。さらに、相同遺伝子として特定された遺伝子の組み合わせのなかで、所定の基準をクリアした組み合わせをオーソログ遺伝子として特定することができる。なお、オーソログ遺伝子とは、共通の起源をもつ単一の遺伝子から種の分化によってできた相同性を持つ遺伝子と定義される。
【００４０】
ここで、配列類似性を示す値としては、Blast検索におけるE値（e-value）、bits値（bits）、アミノ酸一致度（Identities）といった値を挙げることができる。よって、これらのうち１又は複数の値について閾値を設定することで、相同遺伝子として遺伝子の組み合わせを特定することができる。例えば具体的には、問い合わせ配列とデータベース配列との間の相同性検索及びこれら問い合わせ配列とデータベース配列とを入れ替えて実施する相同性検索（これらをまとめて「一組の相同性検索」と称す）において、閾値としてE値（E-value）を、例えば1.0e-20、好ましくは1.0e-15、特に好ましくは1.0e-10を設定することができる。そして、一組の相同性検索において、それぞれE値の値が閾値以下となっている遺伝子の組み合わせを、両方のゲノム塩基配列情報における相同遺伝子として特定することができる。
【００４１】
また、このように特定された相同遺伝子のなかからオーソログ遺伝子を特定するには、上述したオーソログ遺伝子の定義に合致する組み合わせを選択できるように基準を設定する。具体的には、上述した一組の相同性検索の結果として、配列類似性の高い順（E値の低い順）で作成される一組の遺伝子リストにおいて、互いに上位５番目以内、好ましくは上位３位以内、特に好ましくは上記１位にリストされるときにオーソログ遺伝子の組み合わせと定義することができる。また、一組の相同性検索にて特定された相同性遺伝子の組み合わせのなかからオーソログ遺伝子の組み合わせを特定するには、上述した方法に限定されるものではない。
【００４２】
次に、上述した相同性検索の結果を用いて、一対のゲノム塩基配列情報における遺伝子の配置を比較し、遺伝子の並びが保存されている領域を特定する。このとき、「一対のゲノム塩基配列情報における遺伝子の配置を比較」するには、遺伝子を文字に見立てることでゲノム塩基配列情報に存在する複数の遺伝子を文字列とみなし、文字列の検索や文字列の類似性を比較するアルゴリズムを適用することができる。
【００４３】
本工程で使用できるアルゴリズムとしては、文字列検索アルゴリズムであるSmith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunsch アルゴリズム、ｋ−タプル法等を挙げることができる。特に、Smith-Watermanアルゴリズムを適用することが好ましい。これは高感度に局所アライメントが得られるためである。
【００４４】
Smith-Watermanアルゴリズムを適用することで、具体的には以下のようにして一対のゲノム塩基配列情報における遺伝子の配置を比較することができる。一方のゲノム塩基配列情報にある遺伝子をxi（i=1, 2,…, I）とし、他方のゲノム塩基配列情報上にある遺伝子をyj（j=1, 2,…, J）とする。Smith-Watermanアルゴリズムでは、一方のゲノム塩基配列情報の遺伝子xi（i=1, 2,…, I）と他方のゲノム塩基配列情報上にある遺伝子をyj（j=1, 2,…, J）とについて、(J+1)×(I+1)のマトリックス（二次元）を作成する（図２）。
【００４５】
そして、マトリックスの各セルには、以下の手順に従って計算されるスコアが記入される。すなわち、各セルについて、xiとｙjに相同性があるとき
【数１】
2014046284.tif 000003
【００４６】
とし、相同性がないとき
【数２】
2014046284.tif 000004
【００４７】
とする。マトリックスの全てのセルに対して以上のスコア計算を行った後、最大のスコアを持つセルからスコアが0になっているセルまでトレースバックを行う。この時に通過したセルのうち、xiとｙjに相同性が高いセルの座標の集合をR0とする。ここで、gapとmismatchはペナルティスコアであり、-0.4〜-0.1程度の範囲で設定されるが、好ましくは、いずれも-0.2である。
【数３】
2014046284.tif 000005
【００４８】
ここで、R0は遺伝子の並びが保存されている領域内にあり、かつ相同性の高い遺伝子ペアの座標の集合になる。すなわち、このR0が遺伝子クラスタ、すなわち、一対のゲノム塩基配列情報において並びが保存された複数の遺伝子の群となる。なお、(J+1)×(I+1)のマトリックスにおいて、最大のスコアを持つセルが複数ある場合には、上述した工程において複数の遺伝子クラスタが特定されることとなる。
【００４９】
本発明に係る予測方法では、上述のように特定された遺伝子クラスタR0について、詳細を後述するように、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるかを判定することができる。しかしながら、本発明に係る予測方法では、上述のように特定された遺伝子クラスタR0に限定されず、以下の手順により、更に異なる遺伝子クラスタR'0を特定し、これら遺伝子クラスタR'0について二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるかを判定することもできる（図３）。
【００５０】
遺伝子クラスタR'0とは、上述したR0以外であって、xi（i=1, 2,…, I）とyj（j=1, 2,…, J）との対応関係で遺伝子の並びが保存されている領域として特定された遺伝子クラスタRm（m=1, 2, 3, …）を再度アライメント解析（図３中、アライメント_2と表記）した結果として導き出される遺伝子クラスタである。
【００５１】
二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタは、当該クラスタを構成する各遺伝子についても多様性が高く、遺伝子クラスタ同士を比較する場合には遺伝子単位での挿入や欠失により大きなギャップが予想される。そこで、ギャップを多く含む領域も遺伝子クラスタとして検出できるように、上述した計算の際に得た(J+1)×(I+1)のマトリックス及びスコアを利用して遺伝子クラスタ（Rm、m=1, 2, 3, …）を特定する。この遺伝子クラスタ（Rm、m=1, 2, 3, …）を特定する手法としては、特に限定されないが、以下の手順を適用することができる。
【００５２】
まず、ひとつ前の操作で得た集合（最初はR0）に含まれる座標が示すセルすべてに0を代入する。すなわち、
【数４】
2014046284.tif 000006
【００５３】
次に、R0の各セルに０が代入された(J+1)×(I+1)のマトリックスの中でスコアが1よりも大きく、かつ最大であるセルからスコアが0になっているセルまで再度トレースバックを行う。なお、スコアが1よりも大きく、かつ最大であるセルとは
【数５】
2014046284.tif 000007
【００５４】
となる。これを条件※1と称する。
【００５５】
条件※1を満たすセルからスコアが0になっているセルまでトレースバックすることで、xiとｙjに相同性が高いセルの座標の集合Rmを特定することができる。なお、R0の各セルに０が代入された(J+1)×(I+1)のマトリックスにおいて、条件※1を満たすセルが複数ある場合には、上述した工程において複数の遺伝子クラスタRm（m=1, 2, 3, …）が特定されることとなる。
【００５６】
また、以上のように特定された複数の遺伝子クラスタRm（m=1, 2, 3, …）については、既に特定されている遺伝子クラスタR0を十分に近接していると、R0含まれるセルのスコアに影響を受けたものとなる。よって、以上のように複数の遺伝子クラスタRm（m=1, 2, 3, …）を特定した後、R0含まれるセルのスコアに影響を排除するため、特定した遺伝子クラスタRmに対して、Smith-Watermanアルゴリズム等の文字列検索アルゴリズムによって再度、保存されている遺伝子の並びを特定し直すことが好ましい。
【００５７】
具体的には、集合Rm（m=1, 2, 3, …）のうちn(Rm)≧3を満たすものについて、
【数６】
2014046284.tif 000008
【００５８】
を満たす領域を取り出し、上述と同様にマトリックス（二次元）を作成するとともに再度スコアを計算する。これにより、上述のように特定したRm（m=1, 2, 3, …）から、新たに構築した遺伝子クラスタR'0を導き出すことができる。
【００５９】
以上の処理を上記条件※1を満たすセルからスコアが0になっているセルまでトレースバックすることができなくなるまで繰り返すことで、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるかを判定する対象となる、遺伝子クラスタ（R0、R'0、R''0…）を特定することができる。
【００６０】
<二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタの判定>
以上のようにして特定された、R0で示す遺伝子クラスタ又はR0、R'0、R''0…で示す遺伝子クラスタ群について、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるかを判定する（図３における「オーソログチェック」）。
【００６１】
本予測方法では、二次代謝系遺伝子は多様性が高く、異なる種間でオーソロガスな遺伝子をほとんど含まないという特徴を考慮することで、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるかの判定を行う。この特徴は、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであればシンテニー様領域の割合が低いことと同義である。したがって、特定された遺伝子クラスタについて、シンテニー様領域を特定し、当該シンテニー様領域が遺伝子クラスタに占める割合に基づいて、当該遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであるか判定することができる。
【００６２】
より具体的には、特定された遺伝子クラスタにおけるシンテニー様領域は、当該遺伝子クラスタに含まれるオーソログ遺伝子の数と距離を用いて評価することができる。このとき、遺伝子クラスタの大きさや当該遺伝子クラスタに含まれる相同性遺伝子の数によって、評価対象の遺伝子クラスタを限定することが好ましい。具体的には、R0で示す遺伝子クラスタ又はR0、R'0、R''0…で示す遺伝子クラスタ群について、相同遺伝子の組み合わせが例えば２個以上、好ましくは３個以上含まれており、且つ、全体の遺伝子の数が例えば５０以内、好ましくは４０以内、より好ましくは３５以内であるか確認する。これら両条件を満たす遺伝子クラスタについて、シンテニー様領域を特定するためのオーソログチェックを実施することが好ましい。これら条件の少なくとも一方を満たさない遺伝子クラスタについては以後の処理を行わず、二次代謝系遺伝子を含まない遺伝子クラスタとして棄却する。例えば、この段階で、相同遺伝子の組み合わせの数を３個とし、且つ、全体の遺伝子の数を35個という基準を設けた場合、この段階では下記条件（※2）で遺伝子クラスタを絞り込むこととなる。
【数７】
2014046284.tif 000009
【００６３】
n:遺伝子クラスタ内での遺伝子の位置
in：ゲノム中での遺伝子の位置
次に、上述の条件（例えば条件※２）を満たす遺伝子クラスタについてオーソログチェックを行う。オーソログチェックを実施する前に、遺伝子クラスタに含まれる遺伝子の数が上記条件における全体の遺伝子数（例えば条件※２の場合には35遺伝子）となるように遺伝子クラスタを修正する（図４）。具体的には、上記工程で特定された遺伝子クラスタに対して、例えば合計35遺伝子になるように、遺伝子クラスタの近傍に存在する遺伝子を追加する。例えば、上記工程で特定された遺伝子クラスタの両端から、同じ数の遺伝子を加えることで例えば合計35遺伝子からなる遺伝子クラスタに修正することができる。なお、拡充する遺伝子の数が奇数である場合、特に限定されないが、遺伝子クラスタの3'末端に１つ多い数又は少ない数の遺伝子を加えればよい。このように、合計の遺伝子の数を例えば35遺伝子とすることで、上記工程で特定された遺伝子クラスタの境界における誤差を考慮することができ、近傍の領域におけるオーソロガス遺伝子ペアの分布も平均化して評価することができる。なお、図４は、簡単のために遺伝子数を一部省略している。
【００６４】
xi（i=1, 2,…, I）とyj（j=1, 2,…, J）について、遺伝子クラスタに含まれる遺伝子の数を35遺伝子としたときの、全遺伝子の集合をそれぞれX及びYとする。
【数８】
2014046284.tif 000010
【００６５】
そして、X及びYに含まれる遺伝子の間でオーソログ遺伝子の組み合わせが存在しているか、上述した相同性検索の結果に基づいて判断する（図４の破線矢印）。X及びYに含まれる遺伝子の間でオーソログ遺伝子の組み合わせが二つ以上ある場合には、シンテニー様領域を特定する。ここでシンテニー様領域とは、複数のオーソログ遺伝子を含む領域であって隣接するオーソログ遺伝子（間に他の遺伝子を含んでいても良い）の距離が基準値以下の領域を意味する。ここで、基準値としては、例えば10〜30kbとすることができ、10〜20bkとすることができ、10kbとすることができる。例えば、図５の吹き出しにおいて、Aとa、1と2の二つのペアは1〜A <10kbかつ2〜a<10kbを満たしているため、1〜A、2〜aの領域をシンテニー様領域とすることができる。X及びYに含まれるオーソログ遺伝子の組み合わせ全てについて同様にシンテニー様領域であるか確認する。なお、複数のシンテニー様領域が存在することもある。
【００６６】
X及びYにおいて特定されたシンテニー様領域を、それぞれX及びYの部分集合xSB, ySBで表す。これらの部分集合の要素の数がともにX及びY全体の要素の数に対して所定の割合以下である場合に、xiからなる遺伝子クラスタ及びyjからなる遺伝子クラスタが二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタであると判定する。ここで、所定の割合としては、特に限定されないが、30%、25%或いは20%とすることができる。例えば、所定の割合を25%としたとき（条件※3）に、
【数９】
2014046284.tif 000011
【００６７】
を二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタとして予測することができる。
【数１０】
2014046284.tif 000012
【００６８】
具体的に、図６においてシンテニー様領域に該当しなかった領域を破線枠で囲った。そして、シンテニー様領域（図６中、実線枠）内の遺伝子が双方ともに8遺伝子以下（全体35遺伝子に対する25%未満）であれば、最初に検出されたA〜G、a〜hを、それぞれ二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタとして予測する。
【００６９】
二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタの予測方法としては、上記手順に従って特定したシンテニー様領域を利用する方法に限定されず、他の方法により特定されたシンテニー様領域を利用しても良い。シンテニー様領域を特定する方法としては、例えば、異なる種のゲノム塩基配列情報とアノテーション情報などを用いて、シンテニー領域と非シンテニー領域を予め決定しておく方法が挙げられる。
【００７０】
予め決定したシンテニー領域を、本方法におけるシンテニー様領域として利用することで、上述した方法と同様にして二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタを予測することができる。すなわち、このようにシンテニー領域からシンテニー様領域を特定する方法であっても、図５にて説明したように、シンテニー様領域の決定と同様の方法を適用することができる。即ち、あらかじめ2種のゲノム上に予測された遺伝子についてオーソログ遺伝子を決定しておき、上述したように定義されたシンテニー領域を特定し、ゲノム塩基配列情報におけるシンテニー領域以外の領域を非シンテニー領域として定義する。そして、上記により特定された、R0で示す遺伝子クラスタ又はR0、R'0、R''0…で示す遺伝子クラスタ群について、上記と同様の方法によってクラスタ長を延長し（例えば３５遺伝子）、シンテニー領域（上述した方法におけるシンテニー様領域）が全体の25％未満となる場合に、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタとして予測することができる。
【００７１】
この方法では、上述したように遺伝子クラスタを検出してからシンテニー様領域を特定する方法と比較して、より高精度に二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタを予測できる場合がある。例えば、A. flavusとA. oryzaeの様に近縁度が高い種間の比較においては、A. oryzaeの一部の株にアフラトキシン生合成クラスタと相同性の高い遺伝子クラスタが存在する場合があり、かつA. flavusあるいはA.oryzaeの他の株には同遺伝子クラスタと相同性が高い第２の遺伝子クラスタが存在しないため、A. flavusに存在するアフラトキシン生合成クラスタが検出されないことが考えられる。この場合に、実際に比較する生物種２種のゲノムの一方について、第３の種のゲノムを用いてシンテニー領域を予め決定しておくことにより、予測の可能性を向上させることができる。この方法では、シンテニー領域はAspergillus属などの比較的近縁種間で共通に存在する遺伝子の領域として定義される。
【００７２】
一方、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタの予測方法としては、上述したように、遺伝子クラスタに含まれる遺伝子の数に基づいて、評価対象の遺伝子クラスタを限定していた。しかしながら、本発明に係る予測方法では、遺伝子クラスタの長さに基づいて評価対象の遺伝子クラスタを限定してもよい。すなわち、遺伝子クラスタな長さを所定の基準値と比較し、当該基準値未満の長さの遺伝子クラスタについてオーソログチェックを実施することもできる。ここで、基準値としては、特に限定されないが、例えば125kb（50個の遺伝子程度に相当）、好ましくは100kb（40個の遺伝子程度に相当）、より好ましくは87.5kb（35個の遺伝子程度に相当）とすることができる。
【００７３】
また、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタの予測方法としては、上述したように、オーソログチェックを実施する前に、遺伝子クラスタに含まれる遺伝子の数が所定の数（例えば35個）となるように遺伝子クラスタを修正していた。しかしながら、本発明に係る予測方法では、オーソログチェックを行う前に、遺伝子クラスタに対して所定の数の遺伝子又は所定の長さの領域を追加して当該遺伝子クラスタを修正し、修正された遺伝子クラスタについてオーソログチェックを行うようにしても良い。
【００７４】
遺伝子クラスタを修正する方法としては、例えば、以下に説明するように、遺伝子クラスタの境界を修正する方法が挙げられる。すなわち、特定されたR0、R'0、R''0…で示す遺伝子クラスタについて、その遺伝子クラスタの境界を修正する方法である。遺伝子クラスタの境界を修正するとは、上述した<遺伝子クラスタの特定>の欄に記載の方法で特定された遺伝子クラスタに対して、当該遺伝子クラスタの外側に存在する遺伝子を含ませるか判断することと同義である。
【００７５】
具体的には、図７（ａ）に示すように、先ず、R0、R'0、R''0…で示す遺伝子クラスタについて、上述のように、遺伝子クラスタに含まれる遺伝子の数が15〜65遺伝子、より具体的に好ましくは35遺伝子（35遺伝子には限定されない）となるように遺伝子クラスタを拡張する。次に、拡張した遺伝子クラスタを構成する各遺伝子について、比較する遺伝子クラスタ内に相同性が高い遺伝子が存在する場合にはプラスのスコアを与え、相同性が高い遺伝子が存在しない場合にはマイナスのスコアを与える。次に、図７（ｂ）に示すように、拡張した遺伝子クラスタの中心に位置する遺伝子から順に両端に向かって遺伝子に与えられたスコアを合計し、各遺伝子にスコアの合計値を与える。そして、拡張した遺伝子クラスタに含まれる各遺伝子に与えられたスコアの合計値が極大値となる遺伝子を特定し、特定した遺伝子を遺伝子クラスタの境界とする。なお、この処理により、遺伝子クラスタの境界となる遺伝子が修正されずオリジナルの遺伝子クラスタのままとなる場合もある。
【００７６】
より具体的に、例えばxi（i=1, 2,…, I）とyj（j=1, 2,…, J）について、遺伝子クラスタに含まれる遺伝子の数を35遺伝子に拡張したときの、全遺伝子の集合をそれぞれX及びYとする。
【数１１】
2014046284.tif 000013
【００７７】
そして、遺伝子クラスタの境界を修正するため、n(X)個の要素からなる一次元配列SCを作製した。この配列の各要素には、例えば以下の式に従って計算されたスコアを入れることができる。xiがyc, yc-1, … yd-1, ydの少なくとも一つに相同性があるとき
【数１２】
2014046284.tif 000014
【００７８】
xiがyc, yc-1, … yd-1, ydのいずれとも相同性がないとき
【数１３】
2014046284.tif 000015
【００７９】
とした。そして、配列の全ての要素に対して以上のスコア計算を行った後、(1)及び(2)それぞれの範囲で最大のスコアを持つ要素の要素番号をistart及びistopとする。同様の操作を集合Yに対しても行う。
【００８０】
このようにして特定されたistart及びistopを遺伝子クラスタの境界とする。すなわち、境界が修正された遺伝子クラスタは、それぞれ、
【数１４】
2014046284.tif 000016
【００８１】
となる。なお、xiがyc, yc-1, … yd-1, ydのいずれとも相同性がないときのスコアSC(j)において、negativeの値は例えば-0.1、-0.2、-0.3、-0.4、-0.5或いは-1とすることができる。
【００８２】
以上のようにして、R0、R'0、R''0…で示す遺伝子クラスタの境界を修正することで、上述したオーソログチェックを経て予測される二次代謝系遺伝子の遺伝子クラスタの正確性を向上させることができる。なお、上述のように、遺伝子クラスタの境界を修正する処理は、上述したオーソログチェックの前でも良いし、オーソログチェックの後でも良い。
【００８３】
<予測装置及び予測プログラム>
以上で説明した本発明に係る二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタの予測方法は、マウスやキーボード等の入力手段、中央演算処理手段（CPU）、揮発性及び/又は不揮発性メモリを含む記憶手段及びディスプレイ等の出力手段を備えるコンピュータにて実行することができる。このとき、コンピュータは、外部のデータベース等の記憶装置や外部のコンピュータシステム等に対してインターネットやイントラネット等の通信回線網を介して接続されていることが好ましい。すなわち、本発明に係る予測方法は、上記構成のコンピュータ装置を用いて二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタを予測することができる予測プログラムとして提供することができる。また、この予測プログラムをインストールしたコンピュータは、言い換えると、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタの予測装置となる。
【００８４】
上述した予測方法をコンピュータにて実現するには、一対のゲノム塩基配列情報を外部の記憶手段やコンピュータシステムから上記通信回線網を介してコンピュータに入力しても良いし、DNAシーケンサーとインターフェイスを介して接続されてコンピュータに入力されても良い。或いは、DVDやCD等の記憶媒体を利用して一対のゲノム塩基配列情報をコンピュータに読み込んでも良い。
【００８５】
また、コンピュータによれば、中央演算装置により一対のゲノム塩基配列情報について相同性検索を実行することができ、相同性検索の結果を記憶装置に格納することができる。また、コンピュータによれば、上述した<遺伝子クラスタの特定>手順及び<二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタの判定>については、Smith-Watermanアルゴリズム等の文字列検索アルゴリズムを実装したソフトウェアにより実現することができる。
【実施例】
【００８６】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。【００８７】
〔実施例１〕
本実施例では、８種類のゲノムのデータセットを使用した。このうち、Aspergillus oryzaeのデータはGenBankに登録したもの(AP007150-AP007177)と同等のものを使用した。Aspergillus flavusのデータはGenBankよりgenbank形式のファイルをダウンロードして使用した。(genbank accession EQ963472〜EQ963493)。Aspergillus fumigatas、Aspergillus nidulans、Aspergillus terreus、Magnaporthe grisea、Fusarium graminearum及びChaetomium globosumのデータはBROAD INSTITUTE よりダウンロードして使用した。【００８８】
本実施例では、相同性検索においてE値（E-value）が1.0e-10以下のものを相同遺伝子とした。また、本実施例では、相同性検索の結果として配列類似性の高い順（E値の低い順）で作成される一組の遺伝子リストにおいて互いに１位にリストされるときにオーソログ遺伝子の組み合わせとした。【００８９】
また、本実施例では、Smith-Watermanアルゴリズムにより遺伝子の並びの保存性を検証し、遺伝子クラスタR0、R'0、R''0…を特定した。また、本実施例では、シンテニー様領域を特定するため、特定した遺伝子クラスタに含まれる相同遺伝子の組み合わせの数を３個以上とし、且つ、全体の遺伝子の数を35個未満という基準を設けた。また、本実施例において、シンテニー様領域とは、複数のオーソログ遺伝子を含む領域であって隣接するオーソログ遺伝子（間に他の遺伝子を含んでいても良い）の距離が10bk以下、20kb以下或いは30kb以下の領域として定義した。【００９０】
さらに、本実施例では、シンテニー様領域（X及びYの部分集合xSB,及びySB）に含まれる遺伝子の数（部分集合の要素の数）が35遺伝子中の25%未満（8個以下）のときに、もとの遺伝子クラスタを二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタとして予測した。【００９１】
上記に記載の方法を用いて、A. flavus、A. oryzaeなどのゲノム解析が完了した糸状菌の10個のゲノム塩基配列を用いて予測された二次代謝遺伝子を含む遺伝子クラスタの数を表１に示した。なお、表１−１は、シンテニー様領域を隣接するオーソログ遺伝子の距離が10bk以下と定義した場合の結果であり、表１−２は同距離を20kb以下とした場合の結果であり、表１−３は同距離を30kb以下とした場合の結果を示している。この結果より、シンテニー様領域を隣接するオーソログ遺伝子の距離が10〜30bk以下と定義すれば結果について特に大きな変動がないことが明らかとなった。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【００９２】
また、本実施例で二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタとして予測されたもののなかでQ遺伝子が含まれているものの割合を計算した結果を表２に示す。なお、Q遺伝子とは、COG（Cluster of Orthologous Group）の機能分類において、二次代謝系と考えられる遺伝子分類である。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【００９３】
表２に示す結果から、本実施例によって、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタと予測されたものは、非常に高い確率でQ遺伝子を含んでいることが明らかとなった。この結果から、本実施例に示した方法によれば、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタを高精度に予測することができ、従来の方法論では見つけられなかった二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタを見つけられる可能性が非常に高いことが判った。【００９４】
〔実施例２〕
本実施例では、実施例１と同様にして、Smith-Watermanアルゴリズムにより遺伝子の並びの保存性を検証し、遺伝子クラスタR0、R'0、R''0…を特定した。また、本実施例では、特定した遺伝子クラスタの境界を修正する工程として、３５遺伝子となるように拡張した遺伝子クラスタに含まれる各遺伝子について、相同遺伝子がある場合には＋１を与え、相同遺伝子がない場合には−０．３を与え、拡張した遺伝子クラスタの中心からスコアの合計値を算出し、合計値の極大値を取る遺伝子を遺伝子クラスタの境界とした以外は、実施例１と同様にして、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタを予測した。【００９５】
本実施例で予測した二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタの一部を表３に示す。また、実施例１と同様に、遺伝子クラスタの境界を修正することなく予測した二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタを表４に示す。
【表３】
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【表４】
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【００９６】
なお、表３及び４において、エラーの欄は、実際の二次代謝系遺伝子の遺伝子クラスタに対して、予測した遺伝子クラスタが上流方向（５’側）及び下流方向（３’側）にどの程度誤っているかを遺伝子の個数として示している。【００９７】
表４から判るように、遺伝子クラスタの境界を修正しない場合には、エラーとして９４個の遺伝子がカウントされた。これは、表４に示した２１個の遺伝子クラスタに平均４．５個のエラーが含まれることになる。これに対して、遺伝子クラスタの境界を修正した場合には、エラーとして８２個の遺伝子がカウントされ、２１個の遺伝子クラスタに平均３．９個のエラーとなった。このように遺伝子クラスタの境界を修正することによって、二次代謝系遺伝子を含む遺伝子クラスタをより正確に検出することができる。【００９８】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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