(57)【要約】本願発明の課題は、機能を有するタンパク質集合体を作製すること。及びそれを作製するために有効なビオチン化合物を提供することであり、その解決出手段は、下記式（１）[化１]2013084526.tif 000029（式中、  ｎは、１又は２であり、  Ｘは、Ｏ又はＮＨであり、前記ｎが２である場合のＸは、同一であっても異なっていてもよく、  Ｒ１は、直接結合またはアミノ酸残基であり、前記ｎが２である場合のＲ１のアミノ酸残基は、同一であっても異なっていてもよく  Ｒ２は、ｎが１の場合、直接結合であり、前記ｎが２の場合のＲ２のアミノ酸残基は、側鎖の末端のアミノ基から１つの水素原子が除かれたアミノ残基を有し、且つ該アミノ残基とＲ１のカルボン酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基であり、  Ｒ３は、直接結合又はアミノ酸残基であり、  Ｒ１又はＲ３のアミノ酸残基は、それぞれ１個のアミノ酸残基であるか、又は２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基である。）で表わされるビオチン化合物を提供することである。
2013084526.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
2013084526.tif 000023
（式中、
ｎは、１又は２であり、
Ｘは、Ｏ又はＮＨであり、前記ｎが２である場合のＸは、同一であっても異なっていてもよく、
Ｒ１は、直接結合またはアミノ酸残基であり、前記ｎが２である場合のＲ１のアミノ酸残基は、同一であっても異なっていてもよく
Ｒ２は、ｎが１の場合、直接結合であり、前記ｎが２の場合のＲ２のアミノ酸残基は、側鎖の末端のアミノ基から１つの水素原子が除かれたアミノ残基を有し、且つ該アミノ残基とＲ１のカルボン酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基であり、
Ｒ３は、直接結合又はアミノ酸残基であり、
Ｒ１又はＲ３のアミノ酸残基は、それぞれ１個のアミノ酸残基であるか、又は２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基である。）
で表わされるビオチン化合物。
【請求項２】
前記Ｒ１又はＲ３のアミノ酸残基が、グリシン残基及びロイシン残基からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１に記載のビオチン化合物。
【請求項３】
前記Ｒ２のアミノ酸残基が、リジン残基である請求項１又は２に記載のビオチン化合物。
【請求項４】
前記Ｒ１のアミノ酸残基が、６個以下のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基、又はＲ３のアミノ酸残基が、６個以下のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基である、請求項１〜３の何れか１項に記載のビオチン化合物。
【請求項５】
下記式（２）
【化２】
2013084526.tif 000024
（式中、
ｎは、１又は２であり、
Ｘは、Ｏ又はＮＨであり、前記ｎが２である場合のＸは、同一であっても異なっていてもよく、
Ｒ１は、直接結合またはアミノ酸残基であり、前記ｎが２である場合のＲ１のアミノ酸残基は、同一であっても異なっていてもよく
Ｒ２は、前記ｎが１の場合、直接結合であり、前記ｎが２の場合のＲ２のアミノ酸残基は、側鎖の末端のアミノ基から１つの水素原子が除かれたアミノ残基を有し、且つ該アミノ残基とＲ１のカルボン酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基であり、
Ｒ４は、直接結合又はアミノ酸残基であり、
Ｒ１又はＲ４のアミノ酸残基は、それぞれ１個のアミノ酸残基であるか、又は２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基である。）で表わされる請求項１〜４の何れか１項に記載のビオチン化合物。
【請求項６】
前記Ｒ１又はＲ４のアミノ酸残基が、グリシン残基を少なくとも１つ含む、請求項５に記載のビオチン化合物。
【請求項７】
前記Ｒ２のアミノ酸残基が、リジン残基である請求項５又は６に記載のビオチン化合物。
【請求項８】
前記Ｒ１のアミノ酸残基が、６個以下のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基、又はＲ４のアミノ酸残基が、５個以下のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基である、請求項５〜７の何れか１項に記載のビオチン化合物。
【請求項９】
下記式（３）
【化３】
2013084526.tif 000025
（式中、
Ｘは同一又は異なってＯ又はＮＨであり、
Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、それぞれ、同一又は異なって直接結合又はアミノ酸残基であり、
Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７のアミノ酸残基は、それぞれ１個、又は２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合したアミノ酸残基である。）
で表わされる請求項１〜８の何れか１項に記載のビオチン化合物。
【請求項１０】
前記Ｒ５、Ｒ６、又はＲ７のアミノ酸残基がグリシン残基を少なくとも１つ含む、請求項９に記載のビオチン化合物。
【請求項１１】
前記Ｒ５のアミノ酸残基が、６個以下のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基、Ｒ６のアミノ酸残基が、６個以下のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基、又はＲ７のアミノ酸残基が、５個以下のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基である、請求項９又は１０に記載のビオチン化合物。
【請求項１２】
下記式（４）
【化４】
2013084526.tif 000026
で表わされる、請求項１に記載のビオチン化合物。
【請求項１３】
下記式（５）
【化５】
2013084526.tif 000027
で表わされる請求項５に記載のビオチン化合物。
【請求項１４】
下記式（６）
【化６】
2013084526.tif 000028
で表わされる請求項９に記載のビオチン化合物。
【請求項１５】
請求項１〜１４の何れか１項に記載のビオチン化合物を含む、タンパク質又はペプチドに対するビオチン標識化剤。
【請求項１６】
前記タンパク質又はペプチドが、配列番号１〜４の何れかに示されるアミノ酸配列を１つ以上含む、請求項１５に記載のビオチン標識化剤。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載のビオチン標識化剤と、トランスグルタミナーゼを含む、タンパク質又はペプチドのビオチン標識化キット。
【請求項１８】
前記トランスグルタミナーゼが微生物由来トランスグルタミナーゼである、請求項１７に記載のビオチン標識化キット。
【請求項１９】
以下の工程１〜３を含む、タンパク質又はペプチドのビオチン標識化方法；
（１）請求項１〜１４の何れか１項に記載のビオチン化合物と前記タンパク質又はペプチドを、トランスグルタミナーゼの存在下で混合する工程１、
（２）工程１の混合物を、トランスグルタミナーゼの至適活性条件下におく工程２、
（３）工程２の後、前記混合物からビオチン標識化タンパク質又はビオチン標識化ペプチドを回収する工程３。
【請求項２０】
前記タンパク質又はペプチドが、配列番号１〜４の何れかに示されるアミノ酸配列を１つ以上含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記トランスグルタミナーゼが微生物由来トランスグルタミナーゼである、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
配列番号１〜４の何れかに示されるアミノ酸配列の１つ以上が挿入又は置換されたタンパク質又はペプチド集合体。
【請求項２３】
配列番号８〜１３の何れかに示されるアミノ酸配列を含む請求項２２に記載のタンパク質又はペプチド集合体。
【請求項２４】
以下の、工程１〜３を含む、タンパク質又はペプチド集合体の製造方法；
（１）請求項２２又は２３に示すタンパク質又はペプチド変異体、請求項１〜１４の何れか１項に記載のビオチン化合物、アビジン化合物、及びトランスグルタミナーゼを混合する工程１、
（２）工程１の混合物を、前記トランスグルタミナーゼの至適活性条件下におく工程２、
（３）工程２の後、前記混合物からタンパク質又はペプチド集合体を回収する工程３。
【請求項２５】
前記トランスグルタミナーゼが、微生物由来トランスグルタミナーゼである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２４又は２５に記載の方法によって得られるタンパク質又はペプチド集合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビオチン化化合物、ビオチン標識化剤、及びタンパク質集合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の自己集合は例えばウィルス、微小管、鞭毛、アクチンファイバーの形成などといった例に代表されるように、自然界において重要な役割を担っている（非特許文献１）。このような自己集合のシステムを解明・確立することは、これまでにない機能を有するバイオ材料の設計への知見を与えるため、バイオテクノロジーの分野においても、ナノテクノロジーの分野において特に注目を浴びている（非特許文献２）。【０００３】
タンパク質を構成要素（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ）として用いる、新規の自己集合構造体の設計というのは未だにチャレンジングな分野ではあるものの、近年の数多くの研究によって、その一端が明らかとなってきている（非特許文献３）。タンパク質の自己集合の分野において、単に集合体化させるだけでなく、酵素や抗体のように構成要素それ自体が機能を持ち、またその機能を発現する事が出来る集合体の構築である（非特許文献４）。機能性集合体の意義としては、例えば局所濃度の上昇、タンパク質固定化の際の固定化量の増加、検出系に用いた時の検出感度の上昇などが挙げられる。異なる機能を有するタンパク質の組み合わせについては、例えば異種酵素の組み合わせにおいて、片方の酵素の生成物がもう片方の酵素の基質になる共役反応に応用できれば、高効率な複合酵素系の構築が可能になる。従って、もし機能性自己集合体の設計が合理的に行えるようになれば、その有用性は計り知れないものになる。【０００４】
架橋酵素である微生物由来のトランスグルタミナーゼ（以下、本明細書においてＭＴＧと呼ぶ。）は、部位特異的なリガンドラベリング技術に用いられている。ＭＴＧはグルタミン（Ｑ）と、リジン（Ｋ）又は一級アミンのアシル転移反応を触媒する架橋酵素の一種であり、タンパク質の翻訳後修飾を行う際には極めて有用なツールである。このようなＭＴＧを用いた架橋反応は、タンパク質中のＭＴＧ認識配列に対して特異的に進行するため、タンパク質本来の機能を損なう事無く容易に修飾を行う事が出来る。【０００５】
アルカリホスファターゼ（以下、本明細書でＡＰと称することがある）は、アルカリ性条件下でリン酸エステルを加水分解する脱リン酸化酵素であり、ＤＮＡの末端塩基の脱リン酸化；ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング等の抗体免疫反応等の標識酵素として汎用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃ．  Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｔｏｏｚｅ，  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｎｅｗ      Ｙｏｒｋ，  １９９９．
【非特許文献２】Ｔ．  Ｏ．  Ｙｅａｓｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｅ．  Ｐａｄｉｌｌａ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ２００２，  １２，４６４．
【非特許文献３】Ｃ．  Ｍ．  Ｎｉｅｍｅｙｅｒ，  Ｍ．  Ａｄｌｅｒ，  Ｓ．  Ｇａｏ  ａｎｄ  Ｌ．  Ｃｈｉ，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．，  ２０００，  ３９，  ３０５６．
【非特許文献４】Ｔ．  Ｆ．  Ｃｈｏｕ，  Ｃ．  Ｓｏ，  Ｂ．  Ｒ．  Ｗｈｉｔｅ，  Ｊ．  Ｃ．  Ｔ．  Ｃａｒｌｓｏｎ，  Ｍ．  Ｓａｒｉｋａｙａ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｒ．  Ｗａｇｎｅｒ，  ＡＳＣ  Ｎａｎｏ，  ２００８，  ２，  ２５１９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
タンパク質を自己集合体化させるにあたり最初の問題となるのが、集合体化の為の駆動力の選択である。自己集合には例えばπ−πスタッキングや、水素結合や、ファンデルワールス力といった非共有性の結合が用いられるが、その汎用性、応用性等の高さから、あるレセプターと、それに対するリガンドを用いた自己集合の設計が重用視されている。特に、リガンドをタンパク質にラベリングするプロセスに問題が生じている。なぜなら、タンパク質の狙った部位にリガンドを導入することは一般的に困難なためである。
最も簡易的なラベリングの方法としては化学修飾法が挙げられるが、タンパク質表面の反応点を狙って修飾を行う為、機能の低下は免れず、更に反応の制御も困難でラベルされる場所もランダムな為、制御された自己集合に用いるには適さない。【０００８】
以上のことから、タンパク質本来の立体構造を損なう事無くリガンドを修飾することは、制御可能な自己集合系の構築には必要不可欠である。【０００９】
また、このような修飾に適した修飾化剤の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明者は鋭意研究を重ねた結果、特定のビオチン化合物が、特定のアミノ酸配列を認識するトランスグルタミナーゼと共に用いることによって、タンパク質又はペプチドをビオチン化することを見出した。また、ビオチン化されたタンパク質又はペプチドは、効率よく集合体とすることができ、斯かる集合体はそのタンパク質又はペプチドが発揮する機能と比べて飛躍的に向上した機能を発揮することを見出した。【００１１】
本発明は係る知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す態様の発明を広く包含するものである。【００１２】
項１
下記式（１）
【化１】
2013084526.tif 000003
（式中、
ｎは、１又は２であり、
Ｘは、Ｏ又はＮＨであり、前記ｎが２である場合のＸは、同一であっても異なっていてもよく、
Ｒ１は、直接結合またはアミノ酸残基であり、前記ｎが２である場合のＲ１のアミノ酸残基は、同一であっても異なっていてもよく
Ｒ２は、ｎが１の場合、直接結合であり、前記ｎが２の場合のＲ２のアミノ酸残基は、側鎖の末端のアミノ基から１つの水素原子が除かれたアミノ残基を有し、且つ該アミノ残基とＲ１のカルボン酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基であり、
Ｒ３は、直接結合又はアミノ酸残基であり、
Ｒ１又はＲ３のアミノ酸残基は、それぞれ１個のアミノ酸残基であるか、又は２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基である。）
で表わされるビオチン化合物。【００１３】
項２
前記Ｒ１又はＲ３のアミノ酸残基が、グリシン残基及びロイシン残基からなる群より選択される少なくとも１つを含む、項１に記載のビオチン化合物。【００１４】
項３
前記Ｒ２のアミノ酸残基が、リジン残基である項１又は２に記載のビオチン化合物。【００１５】
項４
前記Ｒ１のアミノ酸残基が、６個以下のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基、又はＲ３のアミノ酸残基が、６個以下のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基である、項１〜３の何れか１項に記載のビオチン化合物。【００１６】
項５
下記式（２）
【化２】
2013084526.tif 000004
（式中、
ｎは、１又は２であり、
Ｘは、Ｏ又はＮＨであり、前記ｎが２である場合のＸは、同一であっても異なっていてもよく、
Ｒ１は、直接結合またはアミノ酸残基であり、前記ｎが２である場合のＲ１のアミノ酸残基は、同一であっても異なっていてもよく
Ｒ２は、前記ｎが１の場合、直接結合であり、前記ｎが２の場合のＲ２のアミノ酸残基は、側鎖の末端のアミノ基から１つの水素原子が除かれたアミノ残基を有し、且つ該アミノ残基とＲ１のカルボン酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基であり、
Ｒ４は、直接結合又はアミノ酸残基であり、
Ｒ１又はＲ４のアミノ酸残基は、それぞれ１個のアミノ酸残基であるか、又は２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基である。）で表わされる項１〜４の何れか１項に記載のビオチン化合物。【００１７】
項６
前記Ｒ１又はＲ４のアミノ酸残基が、グリシン残基を少なくとも１つ含む、項５に記載のビオチン化合物。【００１８】
項７
前記Ｒ２のアミノ酸残基が、リジン残基である項５又は６に記載のビオチン化合物。【００１９】
項８
前記Ｒ１のアミノ酸残基が、６個以下のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基、又はＲ４のアミノ酸残基が、５個以下のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基である、項５〜７の何れか１項に記載のビオチン化合物。【００２０】
項９
下記式（３）
【化３】
2013084526.tif 000005
（式中、
Ｘは同一又は異なってＯ又はＮＨであり、
Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、それぞれ、同一又は異なって直接結合又はアミノ酸残基であり、
Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７のアミノ酸残基は、それぞれ１個、又は２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合したアミノ酸残基である。）
で表わされる項１〜８の何れか１項に記載のビオチン化合物。【００２１】
項１０
前記Ｒ５、Ｒ６、又はＲ７のアミノ酸残基がグリシン残基を少なくとも１つ含む、項９に記載のビオチン化合物。【００２２】
項１１
前記Ｒ５のアミノ酸残基が、６個以下のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基、Ｒ６のアミノ酸残基が、６個以下のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基、又はＲ７のアミノ酸残基が、５個以下のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基である、項９又は１０に記載のビオチン化合物。【００２３】
項１２
下記式（４）
【化４】
2013084526.tif 000006
で表わされる、項１に記載のビオチン化合物。【００２４】
項１３
下記式（５）
【化５】
2013084526.tif 000007
で表わされる項５に記載のビオチン化合物。【００２５】
項１４
下記式（６）
【化６】
2013084526.tif 000008
で表わされる項９に記載のビオチン化合物。【００２６】
項１５
項１〜１４の何れか１項に記載のビオチン化合物を含む、タンパク質又はペプチドに対するビオチン標識化剤。【００２７】
項１６
前記タンパク質又はペプチドが、配列番号１〜４の何れかに示されるアミノ酸配列を１つ以上含む、項１５に記載のビオチン標識化剤。【００２８】
項１７
項１５又は１６に記載のビオチン標識化剤と、トランスグルタミナーゼを含む、タンパク質又はペプチドのビオチン標識化キット。【００２９】
項１８
前記トランスグルタミナーゼが微生物由来トランスグルタミナーゼである、項１７に記載のビオチン標識化キット。【００３０】
項１９
以下の工程１〜３を含む、タンパク質又はペプチドのビオチン標識化方法；
（１）項１〜１４の何れか１項に記載のビオチン化合物と前記タンパク質又はペプチドを、トランスグルタミナーゼの存在下で混合する工程１、
（２）工程１の混合物を、トランスグルタミナーゼの至適活性条件下におく工程２、
（３）工程２の後、前記混合物からビオチン標識化タンパク質又はビオチン標識化ペプチドを回収する工程３。【００３１】
項２０
前記タンパク質又はペプチドが、配列番号１〜４の何れかに１つに示されるアミノ酸配列を１つ以上含むことを特徴とする、項１９に記載の方法。【００３２】
項２１
前記トランスグルタミナーゼが微生物由来トランスグルタミナーゼである、項１９又は２０に記載の方法。【００３３】
項２２
配列番号１〜４の何れか１つに示されるアミノ酸配列の１つ以上が挿入又は置換されたタンパク質又はペプチド変異体。【００３４】
項２３
配列番号８〜１３の何れかに示されるアミノ酸配列を含む項２２に記載のタンパク質又はペプチド変異体。【００３５】
項２４
以下の、工程１〜３を含む、タンパク質又はペプチド集合体の製造方法；
（１）項２２又は２３に示すタンパク質又はペプチド変異体、項１〜１４の何れか１項に記載のビオチン化合物、アビジン化合物、及びトランスグルタミナーゼを混合する工程１、
（２）工程１の混合物を、前記トランスグルタミナーゼの至適活性条件下におく工程２、
（３）工程２の後、前記混合物からタンパク質又はペプチド集合体を回収する工程３。【００３６】
項２５
前記トランスグルタミナーゼが、微生物由来トランスグルタミナーゼである、項２４に記載の方法。【００３７】
項２６
項２４又は２５に記載の方法によって得られるタンパク質又はペプチド集合体。【００３８】
以下に、本発明をより詳細に説明する。
本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学及び分子生物学的技術であれば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，．ＮＹ等の文献を参照すればよい。【００３９】
ビオチン化合物
本発明のビオチン化合物は、式（１）にて表される。
【化７】
2013084526.tif 000009
【００４０】
式（１）において、ｎは１又は２である。【００４１】
式（１）において、ＸはＯ又はＮＨであり。また、ｎが２である場合のＸは、同一であっても異なっていてもよい。【００４２】
式（１）において、Ｒ１は直接結合またはアミノ酸残基である。また、ｎが２である場合、Ｒ１のアミノ酸残基は同一であっても異なっていてもよい。【００４３】
式（１）において、Ｒ３は、直接結合又はアミノ酸残基である。【００４４】
式（１）において、Ｒ１又はＲ３のアミノ酸残基はそれぞれ１個、又は２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合したアミノ酸残基である。【００４５】
式（１）において、アミノ酸残基とは、アミノ酸のアミド基から１つの水素原子が取り除かれ（本明細書において、このような基をアミノ残基と称する。）、カルボキシル基から１つのＯＨが取り除かれたものである（本明細書において、このような基をカルボキシ残基と称する。）。ここで、アミノ酸とは、生体内に存在するアミノ酸に限定はされず、アミド基及びカルボキシル基を有する化合物である。【００４６】
なお、上述のアミノ酸には、プロリンも含まれる。すなわち、アミノ酸残基がプロリン残基である場合は、上述したアミノ基から１つの水素原子が取り除かれたアミノ残基を有するのではなく、ピロリジン環構造中のイミノ基から１つの水素原子が取り除かれたものを有する。【００４７】
また、２個以上のアミノ酸がペプチド結合したアミノ酸残基とは、上述のアミノ酸残基がペプチド結合しているタンパク質又はペプチドの主鎖のＮ末端のアミド基から１つの水素原子が取り除かれ、Ｃ末端のカルボキシル基から１つのＯＨが取り除かれたものである。これらの基も、本明細書においてそれぞれアミノ残基及びカルボキシ残基と称する。【００４８】
式（１）において、Ｒ１がアミノ酸残基である場合、該アミノ酸残基のアミノ残基と、Ｒ１に隣接する（Ｃ＝Ｏ）基とがペプチド結合している。【００４９】
式（１）において、ｎが１の場合において、Ｒ２は直接結合である。このとき、Ｒ１がアミノ酸残基である場合で、且つ、Ｒ３がアミノ酸残基である場合は、Ｒ１のアミノ酸残基のカルボン酸残基と、Ｒ３のアミノ残基のカルボン酸残基がペプチド結合している。また、Ｒ３が直接結合である場合は、Ｒ１のアミノ酸残基のカルボン酸残基と、Ｒ３に隣接している（ＮＨ）基がペプチド結合している。【００５０】
式（１）において、ｎが１の場合であって、Ｒ１が直接結合であり、且つＲ３がアミノ酸残基である場合は、Ｒ１に隣接する（Ｃ＝Ｏ）基と、Ｒ３のアミノ残基のアミノ残基がペプチド結合している。【００５１】
式（１）において、ｎが２の場合のＲ２は、側鎖の末端のアミノ基から１つの水素原子が除かれたアミノ残基を有するアミノ酸残基である。【００５２】
ここで、Ｒ１がアミノ酸残基である場合、上述の側鎖の末端のアミノ基から１つの水素原子が除かれたアミノ残基と、Ｒ１のアミノ酸残基のカルボン酸残基がペプチド結合している。このようなペプチド結合の他に、Ｒ１のアミノ酸残基におけるカルボン酸残基と、Ｒ２が有するアミノ酸残基にて定義したアミノ残基とペプチド結合している。【００５３】
なお、Ｒ１が直接結合である場合には、上述の側鎖の末端のアミノ基から１つの水素原子が除かれたアミノ残基も、Ｒ２が有するアミノ酸残基にて定義したアミノ残基も、Ｒ１に隣接する（Ｃ＝Ｏ）基と結合している。【００５４】
すなわち、上記式（１）において、ｎが２である場合、Ｒ２は、Ｒ１と２箇所でペプチド結合している。【００５５】
式（１）において、ｎが２である場合、Ｒ２のカルボン酸残基は、Ｒ３のアミノ酸残基のアミノ残基とペプチド結合している。Ｒ３が直接結合である場合は、Ｒ２のカルボン酸残基と、Ｒ３に隣接する（ＮＨ）基がペプチド結合している。【００５６】
式（１）において、上記ｎが２である場合の上記Ｒ２としては、特に限定はされないが、好ましくはリジン残基である。【００５７】
式（１）において、Ｒ１又はＲ３のアミノ酸残基は、特に限定はされないが、例えば、グリシン残基又はロイシン残基からなる群より選択される少なくとも１つを含むアミノ酸残基が挙げられる。【００５８】
Ｒ１が２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基である場合、その個数についての上限値は限定的ではないが、例えば６個以下のアミノ酸残基がペプチド結合したアミノ酸残基とすればよい。より好ましくは５個以下、更に好ましくは４個以下、最も好ましくは３個以下である。【００５９】
Ｒ３が２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基である場合、その個数についての上限値は限定的ではないが、例えば６個以下のアミノ酸残基がペプチド結合したアミノ酸残基とすればよい。より好ましくは５個以下、更に好ましくは４個以下、最も好ましくは３個以下である。【００６０】
式（１）にて示されるビオチン化合物の中でも、最も好ましいビオチン化合物の１つとして、式（４）にて表されるビオチン化合物が挙げられる。式（４）にて表されるビオチン化合物は、式（１）において、ｎが１であり、且つＲ１及びＲ３が直接結合であるビオチン化合物である。以後、本明細書において、式（４）にて表されるビオチン化合物を、ｂｉｏｔｉｎ−ＱＧと称することがある。【００６１】
【化８】
2013084526.tif 000010
【００６２】
式（１）にて表されるビオチン化合物の別の態様として、式（２）にて示すビオチン化合物が挙げられる。
【化９】
2013084526.tif 000011
【００６３】
式（２）は、式（１）において、Ｒ３が２以上のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基であって、該アミノ酸残基のカルボキシ末端側にロイシン残基を含むビオチン化合物である。【００６４】
式（２）において、ｎは１又は２である。【００６５】
式（２）において、ＸはＯ又はＮＨであり。また、ｎが２である場合のＸは、同一であっても異なっていてもよい。【００６６】
式（２）において、Ｒ１は直接結合またはアミノ酸残基である。また、ｎが２である場合、Ｒ１のアミノ酸残基は同一であっても異なっていてもよい。【００６７】
式（２）において、Ｒ４は、直接結合又はアミノ酸残基である。【００６８】
式（２）において、Ｒ１又はＲ４のアミノ酸残基はそれぞれ１個、又は２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合したアミノ酸残基である。【００６９】
式（２）におけるアミノ酸残基及び２個以上のアミノ酸がペプチド結合したアミノ酸残基とは、式（１）と同様に説明されるものである。【００７０】
式（２）において、Ｒ１がアミノ酸残基である場合、該アミノ酸残基のアミノ残基と、Ｒ１に隣接する（Ｃ＝Ｏ）基とがペプチド結合している。【００７１】
式（２）において、ｎが１の場合において、Ｒ２は直接結合である。このとき、Ｒ１がアミノ酸残基である場合で、且つ、Ｒ４がアミノ酸残基である場合は、Ｒ１のアミノ酸残基のカルボン酸残基と、Ｒ４のアミノ残基のカルボン酸残基がペプチド結合している。また、Ｒ４が直接結合である場合は、Ｒ１のアミノ酸残基のカルボン酸残基と、Ｒ４に隣接している（ＮＨ）基がペプチド結合している。【００７２】
式（２）において、ｎが１の場合であって、Ｒ１が直接結合であり、且つＲ４がアミノ酸残基である場合は、Ｒ１に隣接する（Ｃ＝Ｏ）基と、Ｒ４のアミノ残基のアミノ残基がペプチド結合している。【００７３】
式（２）において、ｎが２の場合のＲ２は、側鎖の末端のアミノ基から１つの水素原子が除かれたアミノ残基を有するアミノ酸残基である。【００７４】
ここで、Ｒ１がアミノ酸残基である場合、上述の側鎖の末端のアミノ基から１つの水素原子が除かれたアミノ残基と、Ｒ１のアミノ酸残基のカルボン酸残基がペプチド結合している。このようなペプチド結合の他に、Ｒ１のアミノ酸残基におけるカルボン酸残基と、Ｒ２が有するアミノ酸残基にて定義したアミノ残基とペプチド結合している。【００７５】
なお、Ｒ１が直接結合である場合には、上述の側鎖の末端のアミノ基から１つの水素原子が除かれたアミノ残基も、Ｒ２が有するアミノ酸残基にて定義したアミノ残基も、Ｒ１に隣接する（Ｃ＝Ｏ）基と結合している。【００７６】
すなわち、上記式（２）において、ｎが２である場合、Ｒ２は、Ｒ１と２箇所でペプチド結合している。【００７７】
式（２）において、ｎが２である場合、Ｒ２のカルボン酸残基は、Ｒ４のアミノ酸残基のアミノ残基とペプチド結合している。Ｒ４が直接結合である場合は、上記Ｒ２のカルボン酸残基と、Ｒ４に隣接する（ＮＨ）基がペプチド結合している。【００７８】
式（２）において、ｎが２である場合の上記Ｒ２としては、特に限定はされないが、好ましくはリジン残基である。【００７９】
式（２）において、Ｒ１又はＲ４のアミノ酸残基は、特に限定はされないが、例えば、少なくとも１つのグリシン残基を含むアミノ酸残基が挙げられる。【００８０】
Ｒ１が２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基である場合、その個数についての上限値は限定的ではないが、例えば６個以下のアミノ酸残基がペプチド結合したアミノ酸残基とすればよい。より好ましくは５個以下、更に好ましくは４個以下、最も好ましくは３個以下である。【００８１】
Ｒ４が２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基である場合、その個数についての上限値は限定的ではないが、例えば５個以下のアミノ酸残基がペプチド結合したアミノ酸残基とすればよい。より好ましくは４個以下、最も好ましくは３個以下である。【００８２】
式（２）にて示されるビオチン化合物の中でも、最も好ましいビオチン化合物の１つとして、式（５）にて表されるビオチン化合物が挙げられる。式（５）にて表されるビオチン化合物は、式（２）において、ｎが１であり、且つ、Ｒ４が６個のグリシン残基がペプチド結合しているアミノ酸残基である、ビオチン化合物である。以後、本明細書において、式（５）にて表されるビオチン化合物を、ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ−ＧＧＬＱＧと称することがある。
【化１０】
2013084526.tif 000012
【００８３】
式（１）にて表されるビオチン化合物の別の態様として、式（３）にて示すビオチン化合物が挙げられる。
【化１１】
2013084526.tif 000013
【００８４】
式（３）は、式（１）において、ｎが２であり、Ｒ１が、それぞれＲ５及びＲ６に対応し、Ｒ２がリジン残基であり、且つ、Ｒ３が２以上のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基であって、該アミノ酸残基のカルボキシ末端側にロイシン残基を含むビオチン化合物である。【００８５】
また、リジン残基の側鎖のε位末端のアミノ基から１つの水素原子が除かれたアミノ残基が、式（３）にてＲ５に対応する、式（１）のＲ１のカルボン酸残基とペプチド結合しており、且つリジン残基のアミノ残基と式（３）にてＲ６に対応する、Ｒ１のカルボン酸残基とペプチド結合している。【００８６】
なお、Ｒ５又はＲ６が直接結合である場合は、それぞれ式（１）のＲ１に隣接する、（Ｃ＝Ｏ）基とペプチド結合している。【００８７】
式（３）において、ＸはＯ又はＮＨであり、これらは同一であっても異なっていてもよい。【００８８】
式（３）において、Ｒ５、Ｒ６、又はＲ７は、直接結合又はアミノ酸残基である。【００８９】
式（３）において、Ｒ５、Ｒ６、又はＲ７のアミノ酸残基はそれぞれ１個、又は２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合したアミノ酸残基である。【００９０】
式（３）におけるアミノ酸残基及び２個以上のアミノ酸がペプチド結合したアミノ酸残基とは、上記式（１）或いは上記式（２）と同様に説明されるものである。【００９１】
式（３）において、Ｒ５がアミノ酸残基である場合、該アミノ酸残基のアミノ残基と、Ｒ５に隣接する（Ｃ＝Ｏ）基がペプチド結合しており、該アミノ酸残基のカルボン酸残基と、上記リジン残基の側鎖のε末端のアミノ基から１つの水素原子が除かれたアミノ残基とペプチド結合している。【００９２】
式（３）において、Ｒ５が直接結合である場合、Ｒ５に隣接する（Ｃ＝Ｏ）基と、上記リジン残基の側鎖のε末端のアミノ基から１つの水素原子が除かれたアミノ残基がペプチド結合している。【００９３】
式（３）において、上記Ｒ６がアミノ酸残基である場合、該アミノ酸残基のアミノ残基と、Ｒ６に隣接する（Ｃ＝Ｏ）基がペプチド結合しており、該アミノ酸残基のカルボン酸残基と、上記リジン残基アミノ残基とペプチド結合している。【００９４】
式（３）において、Ｒ６が直接結合である場合、Ｒ６に隣接する（Ｃ＝Ｏ）基と、上記リジン残基のアミノ残基がペプチド結合している。【００９５】
式（３）において、上記Ｒ７がアミノ酸残基である場合、該アミノ酸残基のアミノ残基と、上記リジン残基のカルボン酸残基がペプチド結合しており、該アミノ酸残基のカルボン酸残基と、Ｒ７に隣接する（ＮＨ）基とペプチド結合している。【００９６】
上記Ｒ７が直接結合である場合、上記リジン残基のアミノ残基と、Ｒ７に隣接する（Ｃ＝Ｏ）基と、がペプチド結合している。【００９７】
Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７におけるアミノ酸残基は、特に限定はされないが、例えば、少なくとも１つのグリシン残基を含むアミノ酸残基が挙げられる。【００９８】
Ｒ５又はＲ６が、２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基である場合、その個数についての上限値は限定的ではないが、例えば６個以下のアミノ酸残基がペプチド結合したアミノ酸残基とすればよい。より好ましくは５個以下、更に好ましくは４個以下、最も好ましくは３個以下である。【００９９】
Ｒ７が、２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合しているアミノ酸残基である場合、その個数についての上限値は限定的ではないが、例えば５個以下のアミノ酸残基がペプチド結合したアミノ酸残基とすればよい。より好ましくは４個以下、更に好ましくは３個以下である。【０１００】
式（３）にて示されるビオチン化合物の中でも、最も好ましいビオチン化合物として、式（６）にて表されるビオチン化合物が挙げられる。式（６）にて表されるビオチン化合物は、式（３）において、Ｒ５及びＲ６が３個のグリシン残基がペプチド結合しているアミノ酸残基であり、且つ、Ｒ７が１個のグリシン残基である、ビオチン化合物である。以後、本明細書において、式（６）にて表されるビオチン化合物を、ｂｉｓ−（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧと称することがある。
【化１２】
2013084526.tif 000014
【０１０１】
本発明のビオチン化合物は、ビオチン、各種構成アミノ酸残基に基づくアミノ酸を原料にし、例えば固相合成法のような一般的なＦｍｏｃペプチド合成方法を採用すれば製造すればよい。具体的なペプチド合成方法として、以下の手順による方法が挙げられる。【０１０２】
１）ＰＤ−１０カラムを組み立て、その中に０．１ｍｍｏｌ分のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｌｋｏｒｅｓｉｎを添加する。【０１０３】
２）３ｍＬのＤＭＦで一晩震盪し、樹脂の膨潤を行う。【０１０４】
３）３ｍＬのＤＭＦで３回洗浄し、安定剤の除去を行う。【０１０５】
４）３ｍＬの２０％ＰＰＤ／ＤＭＦで１回洗浄し、Ｆｍｏｃの脱保護を行う。【０１０６】
５）３ｍＬの２０％ＰＰＤ／ＤＭＦで１５分震盪し、Ｆｍｏｃの脱保護を行う。【０１０７】
６）３ｍＬのＤＭＦで３回洗浄する。【０１０８】
７）０．５ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−各種アミノ酸及び０．４５ＭのＨＢＴＵ，２．１ｍＬのＨＯＢｔ／ＤＭＦ溶液、０．７ｍＬの０．９Ｍ  ＤＩＥＡ／ＤＭＦ溶液を加え、適当な時間で震盪する。【０１０９】
８）３ｍＬのＤＭＦで３回洗浄する。なお、ここでＫａｉｓｅｒテストによって未反応樹脂の確認を行ってもよい。テスト結果が陽性の場合、上記の７）に戻りアミノ酸を再伸長させてもよい。テスト結果が陰性の場合、以下の操作を先に進めればよい。【０１１０】
９）３ｍＬのＤＣＭで３回洗浄する。【０１１１】
１０）３ｍＬのＤＭＦで３回洗浄する。【０１１２】
１１）３ｍＬの２０％ＰＰＤ／ＤＭＦで１回洗浄し、Ｆｍｏｃの脱保護を行う。【０１１３】
１２）３ｍＬの２０％ＰＰＤ／ＤＭＦで１５分震盪し、Ｆｍｏｃの脱保護を行う。【０１１４】
１３）３ｍＬのＤＭＦで３回洗浄する。【０１１５】
１４）上記７）から１３）までを繰り返し、目的のビオチン化合物となるようにそれを構成するアミノ酸を伸長させる。例えば、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ等の化合物を、適宜採用して伸長させる。【０１１６】
１５）アミノ酸を伸長させた樹脂に、ビオチン又はイミノビオチン、及び０．４５ＭのＨＢＴＵ、２．１ｍＬのＨＯＢｔ／ＤＭＦ溶液、０．７ｍＬの０．９Ｍ  ＤＩＥＡ／ＤＭＦ溶液を加え、適当な時間で震盪する。【０１１７】
１６）３ｍＬのＤＣＭで５回、３ｍＬのＤＣＭで５回、３ｍＬのメタノールで５回洗浄後、一晩真空乾燥する。【０１１８】
１７）ＴＦＡ、ＴＩＳ、及び脱イオン水をそれぞれ９５：２．５：２．５で混合した２．５ｍＬのカクテルを添加して１時間攪拌し、樹脂からの切り出しを行う。【０１１９】
１８）全ての伸長操作の後切り出した溶液に対して、４０ｍＬのジエチルエーテルを添加して析出させ、凍結乾燥により粗ペプチドが得られる。【０１２０】
１９）得られた粗ペプチドを下記の条件でペプチド由来の２３０ｎｍの吸収を追跡する事でＨＰＬＣによって精製し、生成物に相当するフラクションを回収し、凍結乾燥させる。ＨＰＬＣの条件について、表１に示す。【０１２１】
【表１】
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【０１２２】
上記式（４）、（５）、及び（６）にて示すビオチン化合物のＭＳスペクトルによる解析結果の一例を表２に示す。【０１２３】
【表２】
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【０１２４】
ビオチン標識化剤
本発明のビオチン化合物は、他の試薬又はそのままで、アミノ酸又はタンパク質をビオチン化する際に特に有用である。従って、本発明では、上述のビオチン化合物を含む、タンパク質又はペプチドに対するビオチン標識化剤が提供される。【０１２５】
また、本発明のビオチン化合物の他に、Ｎ−ＢＩＯＴＩＮＹＬ−３，  ６，  ９−ＴＲＩＯＸＡＵＮＤＥＣＡＮＥ−１，  １１−ＤＩＡＭＩＮＥ、ｂｉｏｔｉｎ  ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ等のビオチン化合物も本発明のビオチン標識化剤として有用である。これらは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社等より入手することが可能である。【０１２６】
本発明のビオチン標識化剤は、上述の本発明のビオチン化合物の他に、アミノ酸又はタンパク質へのビオチン化を妨げない範囲において、通常、試薬に含有させる公知の物質を含んでいてもよい。このようなビオチン化標識剤において、上述のビオチン化合物は、０．００１重量部〜９９．９重量部含まれていればよい。【０１２７】
本発明のビオチン標識化剤の対象とするタンパク質又はペプチドは、特に限定はされないが、例えば
配列番号１〜４に示されるアミノ酸配列の何れか１つ以上を含むものであることが好ましい。これらのアミノ酸配列の中でも、プロリン残基及びリジン残基の存在及びその位置については重要であり、より好ましくは、配列番号５〜７に示されるアミノ酸配列の何れか１つ以上である。【０１２８】
このようなアミノ酸配列は、タンパク質又はペプチドのＮ末端又はＣ末端に含まれていても、それ以外の部位に含まれていてもよい。また、タンパク質又はペプチドの立体構造において、その内部ではなく外側に近い位置の部位に、アミノ酸配列が、含まれていることが好ましい。【０１２９】
例えば、タンパク質がアルカリホスファターゼである場合、９１番目のリジン残基と９３番目のスレオニン残基の間の部位に代えて挿入されて含まれる場合、２１９番目のリジン残基と２２１番目のグルタミン残基の間の部位に代えて挿入されて含まれる場合などが挙げられる。【０１３０】
また、タンパク質がＥＧＦＰである場合にはC末端に挿入されて含まれる場合等が挙げられる。【０１３１】
本発明のタンパク質又はペプチドに対するビオチン修飾化剤は、転移酵素の一種であるトランスグルタミナーゼと共に用いることが好ましい。トランスグルタミナーゼは、グルタミンと、リジン又は一級アミン基を有する化合物との間でのアシル転移反応を触媒する酵素であれば特に限定はされないが、例えば微生物由来のトランスグルタミナーゼが好ましい。より具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ由来のトランスグルタミナーゼであり、ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｑ８ＫＲＪ２Ｐ８１４５３に示されるアミノ酸配列を有するトランスグルタミナーゼである。【０１３２】
本発明では、上述のタンパク質又はペプチドに対するビオチン修飾化剤と上述のトランスグルタミナーゼを含むビオチン標識化キットも提供する。【０１３３】
本発明のビオチン標識化キットには、更に公知の構成物品、試薬等が含まれていてもよい。【０１３４】
本発明のタンパク質又はペプチド変異体
本発明の変異体は、配列番号１〜４の何れかに示されるアミノ酸配列の１つ以上が挿入又は置換されたタンパク質又はペプチド変異体である。【０１３５】
挿入とは、タンパク質又はペプチドのＮ末端、Ｃ末端、或いはそれ以外の部位に挿入されていてもよい。【０１３６】
置換とは、タンパク質又はペプチドのＮ末端、Ｃ末端、或いはそれ以外の部位のアミノ酸配列と置換されていてもよい【０１３７】
例えば、タンパク質又はペプチドがアルカリホスファターゼであれば、９１番目のリジン残基と９３番目のスレオニン残基の間の部位に代えて挿入又は置換される場合、２１９番目のリジン残基と２２１番目のグルタミン残基の間の部位に代えて挿入又は置換される場合等が挙げられる。【０１３８】
また、タンパク質又はペプチドがＥＧＦＰであれば、Ｃ末端の５アミノ酸の部位に代えて挿入又は置換される場合などが挙げられる【０１３９】
本発明のタンパク質又はペプチド変異体として、例えば、
配列番号８〜１３に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質変異体又はペプチドが挙げられる。【０１４０】
本発明のタンパク質又はペプチド変異体の製造方法は、特に限定はされず、公知の生化学的手法を用いればよい。例えば、本発明のタンパク質変異体又はペプチドをコードする核酸を製造し、これを用いて適当な宿主を形質転換し、斯かる宿主を培養することで生合成させて、最後に得られた培養後の宿主からタンパク質変異体又はペプチドを、回収、必要に応じて精製すればよい。【０１４１】
このようなタンパク質又はペプチド変異体には、それらが有する機能を損なわない範囲において、さらに変異が導入されていてもよい。このような変異体と、本発明の変異体との相同性は、８５％程度、より好ましくは９０％程度、更に好ましくは、９５％程度、最も好ましくは９９％程度である。相同性とは同一性ともよばれる。【０１４２】
アミノ酸配列の同一性とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列又は塩基配列の、お互いに対する同一のアミノ酸配列又は塩基配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列又は塩基配列の同一性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。アミノ酸配列又は塩基配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメーターを用いて決定される。【０１４３】
若しくは、アミノ酸配列を解析する場合はＢＬＡＳＴＸを用いればよく、パラメーターとしては、例えば、ｓｃｏｒｅ＝  ５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝  ３とすればよい。【０１４４】
ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いればよい。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）
を参照すればよい。【０１４５】
また、本発明に係るタンパク質又はペプチド変異体には、後述する本発明の効果を損なわない範囲において、公知のタグ配列を有していてもよい。タグ配列は、例えば、タンパク質又はペプチド変異体のアミノ酸配列の内部、Ｎ末端、又はＣ末端のいずれに有していてもよい。【０１４６】
本発明に係るタンパク質又はペプチド変異体は、アミノ酸配列を基にそれをコードする塩基配列を含む核酸を作製し、斯かる核酸を大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞等といったタンパク質合成に適した宿主細胞へ導入して製造することができる。具体的な方法は、特に限定されず、公知の方法を用いればよい。【０１４７】
本発明に係るタンパク質又はペプチド変異体は、適宜、精製工程を経て製造してもよい。具体的な製造方法は特に限定はされないが、例えばカラムクロマトグラフィー、アセトン沈殿法、硫酸アンモニウム沈殿法等の公知の手段を用いて精製すればよい。【０１４８】
具体的なカラムクロマトグラフィーとしては、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティカラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられ、これらのうちの１種又は２種以上を組み合わせて採用すればよい。【０１４９】
本発明のビオチン標識化方法
本発明のビオチン標識化方法は、タンパク質又はペプチドのビオチン標識化方法、すなわちタンパク質又はペプチドに対するビオチン化する方法であり、以下の工程１〜３を含むものである。【０１５０】
＜工程１＞
上述の本発明のビオチン化合物とタンパク質又はペプチドを、トランスグルタミナーゼの存在下で混合する工程１。【０１５１】
＜工程２＞
工程１の混合物を、トランスグルタミナーゼの至適活性条件下におく工程２。【０１５２】
＜工程３＞
工程２の後、前記混合物からビオチン標識化タンパク質又はビオチン標識化ペプチドを回収する工程３。【０１５３】
工程１について
本発明のタンパク質又はペプチドのビオチン標識化方法における工程１は、上述の本発明のビオチン化合物と、タンパク質又はペプチドを、トランスグルタミナーゼの存在下で混合する工程である。【０１５４】
工程１は適当な溶媒中にて混合すればよく、その種類は特に限定はされないが、例えば生化学実験にて多用される周知の緩衝液を用いればよく、例えば２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）等が挙げられる。【０１５５】
タンパク質又はペプチドは、上述した本発明のビオチン標識化剤の対象とするアミノ酸又はタンパク質と同様とすればよい。このようなタンパク質又はペプチドは、上述した本発明のタンパク質又はペプチド変異体の製造方法等によって得られる。【０１５６】
トランスグルタミナーゼは、特に限定されることは無いが、例えば上述した本発明のタンパク質又はペプチドに対するビオチン修飾化剤と共に用いられるトランスグルタミナーゼを採用すればよい。【０１５７】
トランスグルタミナーゼの使用量は、混合物中の最終濃度が、通常０．０１〜１Ｕ／ｍｌ程度となる量とすればよい。【０１５８】
また、ビオチン化合物とタンパク質又はペプチドは、モル比で通常１：１〜１：２０程度となる量で混合すればよい。【０１５９】
工程２について
本発明のタンパク質又はペプチドのビオチン標識化方法における工程２は、工程１の混合物を、トランスグルタミナーゼの至適活性条件下におく工程である。【０１６０】
上述のように工程１にて用いるトランスグルタミナーゼは、アシル転移反応を触媒する酵素であるため、工程２における条件とは、斯かる反応が首尾よく進行する条件とすることである。【０１６１】
具体的には、４〜５０℃程度の温度及び５〜９程度のｐＨとすればよい。反応時間は、特に限定はされないが５分〜２４時間程度とすればよい。この反応時間が、工程２での「至適活性条件下におく」時間となる。【０１６２】
工程３について
本発明のタンパク質又はペプチドのビオチン標識化方法における工程３は、工程２の後、前記混合物からビオチン標識化タンパク質又はビオチン標識化ペプチドを回収する工程である。この工程において、必要に応じてビオチン標識化タンパク質又はビオチン標識化ペプチドを精製する工程が含まれていてもよい。【０１６３】
具体的な製造方法は、特に限定はされず、工程２にて得られた混合物中から、本発明のビオチン化合物、及び未修飾のタンパク質或いはペプチドを除去するための手段であればよい。例えば、上述の本発明のタンパク質又はペプチド変異体の製造において採用する精製方法か、これを適宜改変した方法が挙げられる。【０１６４】
タンパク質又はペプチド集合体
本発明に係るタンパク質又はペプチド集合体は、以下に示す工程１〜工程３を含む方法によって製造する。【０１６５】
≪工程１≫
タンパク質又はペプチド変異体、ビオチン化合物、アビジン化合物及びトランスグルタミナーゼを混合する工程１、【０１６６】
≪工程２≫
上記工程１の混合物を、前記トランスグルタミナーゼの至適活性条件下におく工程２。【０１６７】
≪工程３≫
上記工程３の後、アルカリホスファターゼ集合体を回収する工程３。【０１６８】
工程１について
本発明のタンパク質又はペプチド集合体の製造方法における工程１は、タンパク質又はペプチド、ビオチン化合物、アビジン化合物、及びトランスグルタミナーゼを混合する工程である。【０１６９】
工程１にて用いるタンパク質又はペプチドは、上記の本発明のビオチン標識化方法の工程１にて用いるものと同様にすればよい。【０１７０】
工程１にて使用するビオチン化合物は、上述の本発明のビオチン標識化方法と同様のものを採用すればよい。【０１７１】
工程１にて用いるアビジン化合物は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンなどが挙げられ、特に限定はされないが、対象タンパク質との相互作用、等電点の違いによる静電的相互作用等の観点からストレプトアビジンを用いることが好ましい。【０１７２】
工程１にて用いるトランスグルタミナーゼは、上記の本発明のビオチン標識化方法の工程１にて用いるものと同様にすればよい。【０１７３】
具体的な精製方法は、特に限定はされないが混合物中から、ビオチン化合物、トランスグルタミナーゼ、ビオチン化合物、並びに未修飾のタンパク質又はペプチドを除去するための手段であれば、特に限定されることは無く、上述した本発明に係るタンパク質又はペプチド変異体の製造方法と同様にすればよい。【０１７４】
また、予めタンパク質又はペプチド、ビオチン化合物、及びトランスグルタミナーゼを混合する場合には、混合後にトランスグルタミナーゼの至適活性条件下に置くことが好ましい。具体的な条件については、工程２に記載の条件と同様にすればよい。【０１７５】
工程１におけるタンパク質又はペプチド、ビオチン化合物、及びアビジン化合物の混合量は、通常モル比でタンパク質又はペプチド：ビオチン化合物＝１：１〜１：２０程度とすればよい。【０１７６】
また、工程１が複合体の形成までを含むと仮定したときにはビオチン化合物：アビジン化合物＝１：０．１〜１：１程度とすればよい。【０１７７】
さらに、ビオチン化合物が、２つのビオチニル基を有する場合、ビオチン化合物：アビジン化合物＝１：０．１〜１：２程度とすればよい。【０１７８】
工程１におけるトランスグルタミナーゼの混合量は、特に限定はされないが、混合物中の最終濃度が０．０１〜１Ｕ／ｍｌ程度となるようにすればよい。【０１７９】
工程１において、タンパク質又はペプチド、ビオチン化合物、アビジン化合物、及びトランスグルタミナーゼは、適当な溶媒中にて混合すればよい。具体的な溶媒は特に限定されないが、生化学的実験にて用いられる周知の緩衝液を用いればよい。【０１８０】
工程２について
工程２では、工程１にて示される混合物を、上記トランスグルタミナーゼの至適活性条件下におく工程である。上述のように工程１にて用いるトランスグルタミナーゼは、アシル転移反応を触媒する酵素であるため、工程２における条件とは、斯かる反応が首尾よく進行する条件とすることである。【０１８１】
具体的には、４〜５０℃程度の温度及び５〜９程度のｐＨとすればよい。反応時間は、特に限定はされないが５分〜２４時間程度とすればよい。この反応時間が、工程２での「至適活性条件下におく」時間となる。【０１８２】
工程３について
工程３は、工程２の後にタンパク質又はペプチド集合体を回収する工程である。この工程において、回収とは、精製する工程が含まれていても良い。【０１８３】
具体的な精製方法は、特に限定はされず、工程２にて得られた混合物中から、タンパク質又はペプチド変異体、ビオチン化合物、トランスグルタミナーゼ、並びに、ビオチン化合物を除去するための手段であれば、特に限定されることは無く、上述した本発明に係るタンパク質又はペプチド変異体の製造方法と同様にすればよい。【０１８４】
以下、本発明のタンパク質又はペプチドが、アルカリホスファターゼ集合体である場合について詳述する。【０１８５】
アルカリホスファターゼ集合体は、４量体以上を形成する。そして、集合体形成する原料である、アルカリホスファターゼが２量体を形成していることから、アルカリホスファターゼ集合体は、４量体、６量体、８量体等のように、偶数の単量体によって形成されることが好ましい。【０１８６】
アルカリホスファターゼ集合体の分子径は、特に限定はされないが、通常１３ｎｍ以上が好ましい。また、分子量も特に限定はされないが、通常は、通常２００ｋＤａ以上が好ましい。
【発明の効果】
【０１８７】
以下に、本発明のビオチン化合物が有する効果について列挙する。なお、本発明のビオチン化合物は、以下の全ての効果を有するものに限定されないのは言うまでもない。【０１８８】
本発明のビオチン化合物は、トランスグルタミナーゼと共に用いることによって、特定のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドに対して、特異的に結合することができる。従って、本発明のビオチン化合物は、ビオチン修飾化剤として好適である【０１８９】
以下に、本発明のタンパク質又はペプチド変異体が有する効果について列挙する。なお、本発明に係るタンパク質又はペプチド変異体は、以下の全ての効果を有するものに限定されないのは言うまでもない。【０１９０】
本発明に係るタンパク質又はペプチド変異体は、トランスグルタミナーゼによって認識される配列を有しており、このような配列付近のアミノ酸を特異的に修飾することができる。【０１９１】
上述のような修飾が施されたタンパク質又はペプチド変異体の酵素活性は、野生型のタンパク質又はペプチドと比較して顕著に低下するものではなく、修飾の目的を達成しながら酵素活性をも発揮することができるので、多機能分子とすることができる。【０１９２】
本発明のタンパク質又はペプチド変異体は、野生型の立体構造に影響を与えないように修飾を施すことができるので、集合体化することが可能であり、このような集合体化したタンパク質又はペプチドは、顕著に優れた機能を有する集合体とすることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１−１】各種アルカリホスファターゼ変異体のＦＩＴＣ修飾実験結果を示す図。（Ａ）ＦＩＴＣ修飾した各種アルカリホスファターゼ変異体の実験条件。（Ｂ）ＦＩＴＣ修飾した各種アルカリホスファターゼ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＣＢＢ染色した像。（Ｃ）ＦＩＴＣ修飾した各種アルカリホスファターゼ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の蛍光写真像。
【図１−２】各種アルカリホスファターゼ変異体のＦＩＴＣ修飾実験結果を示す図。（Ａ）ＦＩＴＣ修飾した各種アルカリホスファターゼ変異体の実験条件。（Ｂ）ＦＩＴＣ修飾した各種アルカリホスファターゼ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＣＢＢ染色した像。（Ｃ）ＦＩＴＣ修飾した各種アルカリホスファターゼ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の蛍光写真像。
【図１−３】各種アルカリホスファターゼ変異体のＦＩＴＣ修飾実験結果を示す図。（Ａ）ＦＩＴＣ修飾した各種アルカリホスファターゼ変異体の実験条件。（Ｂ）ＦＩＴＣ修飾した各種アルカリホスファターゼ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＣＢＢ染色した像。（Ｃ）ＦＩＴＣ修飾した各種アルカリホスファターゼ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の蛍光写真像。
【図２−１】ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体のビオチン修飾実験結果を示す図。（Ａ）ｂｉｏｔｉｎ−ＱＣを用いた場合のＣＢＢ染色像。（Ｂ）ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ−ＧＧＬＱＧを用いた場合のＣＢＢ染色像。（Ｃ）ｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧを用いた場合のＣＢＢ染色像。
【図２−２】ＡＰ（２１９−２２１）−Ｑ変異体のビオチン修飾実験結果を示す図。（Ａ）実験条件。（Ｂ）ＣＢＢ染色像。
【図３−１】ビオチン修飾アルカリホスファターゼ変異体（ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２）の複合体のＤＬＳ実験結果を示す図。（Ａ）ｂｉｏｔｉｎ−ＱＧによって修飾したアルカリホスファターゼを用いた場合。（Ｂ）ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ−ＧＧＬＱＧによって修飾したアルカリホスファターゼを用いた場合。（Ｃ）ｂｉｓ  （ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧによって修飾したアルカリホスファターゼを用いた場合。
【図３−２】ビオチン修飾アルカリホスファターゼ変異体（ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２）の集合体の分子排斥クロマトグラフィー実験結果を示す図。（Ａ）ｂｉｏｔｉｎ−ＱＧによって修飾したアルカリホスファターゼを用いた場合。（Ｂ）ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ−ＧＧＬＱＧによって修飾したアルカリホスファターゼを用いた場合。（Ｃ）ｂｉｓ  （ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧによって修飾したアルカリホスファターゼを用いた場合。
【図４】アルカリホスファターゼ集合体（２１９−２２１）−Ｑの複合体形成実験結果を示す図。（Ａ）ＤＬＳ実験結果を示す図。（Ｂ）分子排斥クロマトグラフィー実験結果を示す図。
【図５】アルカリホスファターゼ集合体の形状を示す模式図。
【図６】アルカリホスファターゼ複合体の機能を間接ＥＬＩＳＡによって確認した実験結果。（Ａ）ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体を用いた場合。（Ｂ）ＡＰ（２１９−２２１）−Ｑ変異体を用いた場合。（Ｃ）化学修飾ビオチン化ＡＰを用いた場合。
【図７】ストレプトアビジン被覆プレート上でのアルカリホスファターゼ集合体の形成実験結果を示す図。
【図８】ＥＧＦＰ集合体の形成実験結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【０１９４】
以下に本発明をより詳細に説明するための実施例を記載する。なお、本発明が以下に示す実施例に記載の内容に限定されないのは言うまでもない。
【０１９５】
＜実施例＞
実験例１：アルカリホスファターゼ変異体の作製
下記の表３に示すアルカリホスファターゼ変異体を作製した。具体的には、角変異体のＮ末端に、ＭＤＩＧＩＮＳＤＰＨＨＨＨＨＨ（ＮＨｉｓ−ＡＰ：配列番号１４）からなるアミノ酸配列を付加した各種アルカリホスファターゼ変異体をコードする塩基配列を、大腸菌発現用のベクター（ｐＥＴ２２ｂ（＋））に組み込んだアルカリホスファターゼ変異体発現ベクターを作製した。斯かるベクターで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
【０１９６】
この形質転換体を適当な培地で培養した後に回収し、次いで破砕工程に供して形質転換体の細胞溶解液を得た。その後、常法に従って細胞溶解液から各種アルカリホスファターゼ変異体を単離及び精製した。なお、精製工程においてＮｉ−ＮＴＡカラムを用いた。
【０１９７】
【表３】
2013084526.tif 000017
【０１９８】
実験例２：各種アルカリホスファターゼ変異体の活性測定
実験例１にて作製した各種アルカリホスファターゼの活性を測定した。変異を施すことによって活性に影響があるかどうかを確認するためである。アルカリホスファターゼの基質として、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐ−ＮＰＰ）を用いた。活性測定は２５°Ｃで行い、１０μｌの各種アルカリホスファターゼ溶液（濃度２μＭ）を、９９０μｌの１ｍＭ  ｐ−ＮＰＰ／１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液に加え、４１０ｎｍの吸収を追跡することにより求めた。結果を表４に示す。
【０１９９】
【表４】
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【０２００】
表４から明らかなように、実験例１にて作製した各種アルカリホスファターゼ変異体の活性は、野生型と殆ど変わらないことが明らかとなった。従って、上記変異導入は、アルカリホスファターゼそのものが有する活性に殆ど影響しないことが言える。
【０２０１】
実験例３：各種アルカリホスファターゼ変異体のＦＩＴＣ修飾
上記実験例１にて作製した各種アルカリホスファターゼ変異体のうち、Ｅ２１９Ｋ、Ｗ２２０Ｋ、Ｑ２２１Ｋ、ＡＰ（９１−９３）−Ｋ１、ＡＰ（９１−９３）−Ｋ２、ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ１、及びＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２をＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ（Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７，３４０７−３４１２参照）にて修飾した。これは、Ａｌａ−Ｇｌｎ−ＧｌｙのトリペプチドのＮ末端にＦＩＴＣが共有結合した化合物であり、トランスグルタミナーゼの基質として知られる。
【０２０２】
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌのＴＢＳバッファー中に、最終濃度がそれぞれ２００μＭ、０．５ｍｇ／ｍｌ（１０μＭ）、及び０．５Ｕ／ｍｌとなるようにＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＱＧ、上記３種類のアルカリホスファターゼ変異体、及びＭＴＧ（Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７，３４０７−３４１２参照）を加えて良く攪拌し、２５°Ｃで３時間静置させることで行った。また、ＭＴＧを加えない比較実験も行った。
【０２０３】
その後、反応開始後０、６０、１８０分後のサンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後のゲルについて蛍光イメージャーを用いて、ＦＩＴＣ由来の蛍光を観察した。
さらに、観察後にＣＢＢ染色も行った。そして比較実験として、上記６種類のアルカリホスファターゼ変異体に代えて、配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＮＨｉｓ）を用いた。これらの結果を図１−１及び図１−２に示す。
【０２０４】
また、上記実験例１にて作製したアルカリホスファターゼ変異体であるＡＰ（２１９−２２１）−Ｑは、一級アミンであるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ（［５−（（５−Ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅｉｄｙｌ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ］：ＡｎａＳｐｅｃ社）にて修飾した。これは、トランスグルタミナーゼの基質として知られる。
【０２０５】
２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌのＴＢＳバッファー中に、最終濃度がそれぞれ２００μＭ、０．５ｍｇ／ｍｌ（１０μＭ）、及び０．５Ｕ／ｍｌとなるようにＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ、ＡＰ（２１９−２２１）−Ｑ、及びＭＴＧを加えて良く攪拌し、２５°Ｃで３時間静置させることで行った。また、ＭＴＧを加えない比較実験も行った。
【０２０６】
その後、反応開始後０、１０、３０、６０、１２０、及び１８０分後のサンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後のゲルについて蛍光イメージャーを用いて、ＦＩＴＣ由来の蛍光を観察した。さらに、観察後にＣＢＢ染色も行った。これらの結果を図１−３に示す。
【０２０７】
さらに、上記７種類のＦＩＴＣ修飾が施されたアルカリホスファターゼ変異体の活性測定を行った。ＦＩＴＣによる修飾を完追させるため、上記の全ての変異体に対する反応の時間を２４時間として得られたＦＩＴＣ化アルカリホスファターゼ変異体を活性測定実験に供した。具体的なアルカリホスファターゼ活性測定は、上記実験例２と同の方法にて行った。この結果は表５にて示す。
【０２０８】
【表５】
2013084526.tif 000019
【０２０９】
図１−１及び図１−２から、約５０ｋＤａに各種アルカリホスファターゼ変異体が、そして約３８ｋＤａにＭＴＧのバンドが観察された。
【０２１０】
特に、図１−１からは、Ｗ２２０Ｋ、つまりアルカリホスファターゼの２２０番目のトリプトファン残基をリジンに変異させた変異体で、且つＭＴＧが存在するもののみについて、若干のバンドの上昇が見られた。また、ＣＢＢによる染色位置と同じ位置にＦＩＴＣに由来する蛍光が観察された。これより、一残基変異を行うだけでも、ＭＴＧによって認識されうるという事が分かった。
【０２１１】
しかしながら、反応性がかなり低く殆ど未反応のアルカリホスファターゼが残っており、同じように一残基変異を行ったＥ２１９Ｋ、Ｑ２２１ＫについてはＭＴＧに認識されず、バンドの上昇並びにＦＩＴＣ由来の蛍光を観察する事は出来なかった。
【０２１２】
この結果から、Ｗ２２０ＫがＭＴＧによって上手く認識されたが、本来ＭＴＧの認識にはリジン残基前後のアミノ酸残基の性質に依存するため、一残基変異によって新たなＭＴＧ認識サイトを構築するというのは、タンパク質本来の機能活性の低下は少ないが、認識されるか否かはやってみないと分からないといった、博打的要素が含まれるため、汎用性の観点から好ましくない。
【０２１３】
また、図１−２からは、１３アミノ酸残基からなるＫ−ｌｏｏｐを挿入した各種アルカリホスファターゼ変異体において、ＭＴＧが存在する場合において若干のバンドシフトと、ＦＩＴＣ由来の蛍光が観察された。
【０２１４】
また斯かる反応はアルカリホスファターゼに対して、基質２０等量で反応時間６０は６０分程度でほぼ反応が飽和していると予測された。これより、挿入したＫ−ｌｏｏｐが狙い通りＭＴＧによって認識されることを確認した。また、ＦＩＴＣ由来の蛍光のバンド強度から考えて、Ｋ−ｌｏｏｐのＫＲ（ＩＲＩＮＫＧＰＧＲＡＦＶＴ）よりもＲＫ（ＩＲＩＮＲＧＰＧＫＡＦＶＴ）の配列が、そして挿入部位は９１−９３番目よりも２１９−２２１番目の方が、反応性が高いことも明らかである。
【０２１５】
前者についてはＭＴＧ認識においてリジン残基前後の配列が、ＲＫ配列の方が適していたからであると考える。挿入部位については、９１−９３番目の位置よりも２１９−２２１番目の位置の方が、立体障害が低く、ＭＴＧが接近し易いためであると考える。
【０２１６】
以上の２点から、今回調製した各種アルカリホスファターゼ変異体の中でも、ＲＫの並びのＫ−ｌｏｏｐを２１９−２２１番目の位置に挿入したＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２が最もＭＴＧに対する反応性が高いと言える。
【０２１７】
この結果から考えて、今までＭＴＧに対して認識される配列の挿入はタンパク質のＮ又はＣ末端への挿入が主であったが、上記ＲＫ並びのＫ−ｌｏｏｐを使えば、ＭＴＧに対して認識される配列の導入部位の選択肢が大きく広がったと言える。
【０２１８】
また図１−３から、上記Ｋ−ｌｏｏｐを挿入した変異体と同様に、アミノ酸番号２１９−２２１に挿入したＱ−ｌｏｏｐ挿入ＡＰ変異体であるＡＰ（２１９−２２１）−Ｑも、ＭＴＧによって高効率にラベル化されることも明らかである。
【０２１９】
そして、表５に記載の結果から、ＡＰ（９１−９３）−Ｋ１及びＡＰ（９１−９３）−Ｋ２の活性が著しく低下していることが明らかである。これはＡＰ（９１−９３）−Ｋ１及びＡＰ（９１−９３）−Ｋ２に対するＦＩＴＣの修飾位置がアルカリホスファターゼの活性中心近傍に存在していた為であると予想される。一方で、ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ１、ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２、及びＡＰ（２１９−２２１）−ＲはＦＩＴＣによる修飾後も高い活性を維持していたため、２１９−２２１はアルカリホスファターゼ活性中心から遠隔に位置するといえる。
【０２２０】
実験例４：各種アルカリホスファターゼ変異体のビオチン修飾
〔ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体について〕
ＭＴＧのビオチン化基質であるｂｉｏｔｉｎ−ＱＧ、ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ−ＧＧＬＱＧ並びにｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧを用いて、ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２のビオチン化を行った。
【０２２１】
酵素反応はＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ中に、最終濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ（１０μＭ）、２００μＭ、０．５Ｕ／ｍｌとなるようにＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２、ビオチン化基質、及びＭＴＧを加え、それらを良く攪拌し、２５°Ｃで静置させることで行った。
【０２２２】
その後、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いたＨｉｓ−ｔａｇ精製により、過剰の未反応のビオチン化基質とビオチン化アルカリホスファターゼ変異体を単離し反応を終了させた。反応後のサンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色した。
【０２２３】
また、ビオチン化の程度を確認するために、ＨＡＢＡアッセイを行った。２４．２ｍｇの４−ｈｙｄｒｏｘｙ−ａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ−２’−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＡＢＡ）を９．９ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶かし、個々に１００ｍｌの１Ｎ  ＮａＯＨを入れて激しく攪拌した。２０ｍｌの卵白由来アビジン溶液（１０ｍｇ）をメスフラスコにいれ、次いでＨＡＢＡ溶液を６００ｍｌ入れた後、ＰＢＳでメスアップしてＨＡＢＡ−Ａｖｉｄｉｎ溶液を調整した。
【０２２４】
１ｍｌセルに上記ＨＡＢＡ−Ａｖｉｄｉｎ溶液を９００μｌとり、５００ｎｍの吸光度を測定し、この値をＡｂｓ．Ａとした。次いで、セルの中に上記１０μＭのビオチン化アルカリホスファターゼ変異体を１００μｌ入れ、よくピペッティングし、吸光度が安定したら値を測定し、この値をＡｂｓ．Ｂとした。吸光度を下記の式１に当てはめ、サンプル中のビオチン濃度をからビオチンのラベル化率を算出した。
【０２２５】
［ビオチン化率］＝１０−３×（０．９×Ａｂｓ．Ａ−Ａｂｓ．Ｂ）／３４
（式１）
【０２２６】
最後に、上記ビオチン化アルカリホスファターゼの測定を２種類の方法にて実施した。
【０２２７】
（活性測定Ａ）…上記実験例１〜３と同様の方法。
【０２２８】
（活性測定Ｂ）…０．１μＭの上記ビオチン化アルカリホスファターゼ変異体を２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で調製し、予め９６穴マイクロプレート固層化されたストレプトアビジンにそれぞれ１００μＬ／ｗｅｌｌずつとなるように添加し、４°Ｃで一時間固定化させた。その後各ウェルを、ＴＢＳＴ（２５ｍＭ  ＴＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）により洗浄した。固定化されたアルカリホスファターゼ変異体の活性測定は、各ウェルに上記のｐ−ＮＰＰ溶液を添加し、同様の反応条件で反応させた後、同様の方法にて測定した。これらの結果を図２−１及び表６に示す。
【０２２９】
【表６】
2013084526.tif 000020
【０２３０】
ｂｉｏｔｉｎ−ＱＧ、ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ−ＧＧＬＱＧ、ｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧにてビオチン化した全てのアルカリホスファターゼ変異体において、１時間の反応時間の後、高分子量側へのわずかなバンドシフトが見られた。修飾前後のバンドが重なって見えるために正確ではないが、かなり高効率にビオチン化されていることが分かる。このようなビオチン化は、ＨＡＢＡアッセイを用いて測定されるビオチン化率にて定量的な評価ができる。
【０２３１】
ｂｉｏｔｉｎ−ＱＧ、ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ−ＧＧＬＱＧは１００％の反応率でビオチン化率１．００、ｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧはビオチン化率２．００となる。測定の結果、全てのビオチン化アルカリホスファターゼ変異体において、ほぼ定量的なビオチン化反応を達成した。よって今回の新規合成ビオチン化基質は確かにＭＴＧによって認識され、かつ定量的なビオチン化反応が可能な基質であることが確認された。
【０２３２】
また、ビオチン化アルカリホスファターゼ変異体の活性測定（活性測定Ａ）の結果から、ビオチン修飾によるアルカリホスファターゼ変異体の活性の低下はほぼ見られなかった。
【０２３３】
最後に、アルカリホスファターゼ変異体に修飾したビオチン基がストレプトアビジンとの結合能を維持しているかを確認するために、アビジンコートプレート上に添加し固定化し、更にその場合の活性測定も行った（活性測定Ｂ）。
【０２３４】
その結果、プレート上でアルカリホスファターゼの活性が確かに見られたことからアルカリホスファターゼに修飾されたビオチンのストレプトアビジンへの結合能を確認し、同時にストレプトアビジンに結合した場合でもアルカリホスファターゼ変異体は活性を維持していることを確認した。
【０２３５】
〔ＡＰ（２１９−２２１）−Ｒ変異体について〕
ビオチン化基質としてｂｉｏｔｉｎ−（ＰＥＯ）４−ａｍｉｎｅを用いて、ＡＰ（２１９−２２１）−ＱのＭＴＧによるビオチン化を行った。酵素反応はＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ中に、最終濃度がそれぞれ、０．５ｍｇ／ｍｌ（１０μＭ）、２００μＭ、及び０．５Ｕ／ｍｌとなるようにＡＰ（２１９−２２１）−Ｑ、ｂｉｏｔｉｎ−（ＰＥＯ）４−ａｍｉｎｅ、及びＭＴＧを加え、それらを良く攪拌し、２５°Ｃで静置させることで行った。
【０２３６】
次いで、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いたＨｉｓ−ｔａｇ精製により、過剰の未反応のビオチン化基質とビオチン化アルカリホスファターゼ変異体を単離し、反応を終了させた。反応後のサンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色した。また、ビオチン化率測定と活性測定は〔ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体について〕に記載の方法と同様にして行った。結果を図２−２に示す。
【０２３７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＣＢＢ染色の結果から、ＭＴＧとｂｉｏｔｉｎ−（ＰＥＯ）４−ａｍｉｎｅ存在化のサンプルにおいて僅かにバンドの上昇が確認された。活性測定の結果から、ビオチン化前のＡＰ（２１９−２２１）−Ｑの酵素活性を１．００とした場合、ビオチン化ＡＰ（２１９−２２１）−Ｑの比活性は０．９６±０．０１であり、ほぼ元の活性を維持したままのビオチン化に成功した。
【０２３８】
また、ＨＡＢＡアッセイを用いたビオチン化率の測定結果からＡＰ（２１９−２２１）−Ｑのビオチン化率は０．９７±０．０４であり、ほぼ定量的なビオチン化が達成されたと言える。また、ＡＰ（２１９−２２１）−Ｑのストレプトアビジンプレート上への固定化を試みた結果（活性測定Ｂ）から、プレート上でも問題なくアルカリホスファターゼの活性が維持されていることが明らかとなった。
【０２３９】
実験例５：ビオチン修飾各種アルカリホスファターゼ変異体の複合体形成
各種ビオチン化アルカリホスファターゼ変異体を０．２μｍのフィルター濾過処理後のＴＢＳにより２μＭに調製した。ストレプトアビジン溶液を（ストレプトアビジンのビオチン結合サイト）／（ＡＰのｂｉｏｔｉｎ基）（以下、［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］と表記する。）［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１／４、１／２、１となるように加え、３０分間静置した後、動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて酵素集合体の粒子径測定を行った。
【０２４０】
使用したストレプトアビジンの最終濃度を、ｂｉｏｔｉｎ−ＱＧ並びにｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ−ＧＧＬＱＧにてビオチン化したＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２及びｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ４−ａｍｉｎｅにてビオチン化したＡＰ（２１９−２２１）−Ｑの場合は２μＭとし、ｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧにてビオチン化したＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２の場合は４μＭとした。
【０２４１】
ＤＬＳ測定後の溶液を、サイズ排除カラムクロマトグラフィー（ＳＥＣ）にて分画し、ストレプトアビジンとアルカリホスファターゼ変異体の比による、形成された集合体形成の挙動を行った。ＳＥＣは２０ｍＭ  ＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎにて分析を行った。
【０２４２】
各種ビオチン修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体について結果を図３−１、図３−２、及び表７に示す。
【０２４３】
【表７】
2013084526.tif 000021
【０２４４】
〔ｂｉｏｔｉｎ−ＱＧ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２について〕
ｂｉｏｔｉｎ−ＱＧは今回調製したビオチン化基質の中で一番短いため立体障害が大きく、これにより集合体の自己環化反応を防ぎ、集合体の成長が期待された。ＤＬＳの測定の結果、ストレプトアビジンの添加に伴い粒子径が増大し、［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１の時点で直径５０．３ｎｍの集合体が観察された。図５（Ａ）の模式図にて示されるような、集合体の成長が起きたことが期待される。
【０２４５】
以前調製した両末端のＮＱ−ＡＰ−ＣＱの場合、直径が最大３１．９ｎｍであったの（Ｙ．Ｍｏｒｉ，Ｋ．Ｍｉｎａｍｉｈａｔａ，Ｈ．Ａｂｅ，Ｍ．Ｇｏｔｏ，Ｎ．Ｋａｍｉｙａ，２０１１，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，９，５６４１．）で、今
回はそれを上回る大きさの集合体の形成に成功した。
【０２４６】
よって（ｉ）アルカリホスファターゼの対角線上に架橋点であるビオチン基を調製すること、更に（ｉｉ）短いリンカー長により自己環化反応を抑えたことの二点によって、大きな集合体の形成に成功した。
【０２４７】
次にＤＬＳ測定後のサンプルについてＳＥＣにより検討したところ、溶出体積１２．３  ｍＬでｂｉｏｔｉｎ−ＱＧ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体由来のピークが見られた。このピークはストレプトアビジンの添加に伴って減少し、代わりにそれ以上の分子量の集合体を形成した。
【０２４８】
溶出体積９．８ｍＬのピークは分子量が４４０ｋＤａと見積もられ、系中に存在するｂｉｏｔｉｎ−ＱＧ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体とストレプトアビジンの比から、ストレプトアビジンの４つの結合サイトに対して、ｂｉｏｔｉｎ−ＱＧ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体がそれぞれ結合したものと思われる。
【０２４９】
更に高分子両側の８．４ｍＬのピークは先ほどの集合体に更にストレプトアビジン１つとｂｉｏｔｉｎ−ＱＧ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体３つが結合したものが考えられた。また、［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１においては今回用いたカラムのサイズ排除体積で出るほどの大きな集合体を形成しており、ＤＬＳで測定した通り、今回巨大な集合体の形成に成功している。
【０２５０】
これより、立体障害／モノマーの剛直性により、集合体の粒子径は大きいが、フレキシビリティが乏しく、密に詰まることが出来ず、密度が低くなっているのではないかと予想された。
【０２５１】
〔ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ−ＧＧＬＱＧ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体〕
次にビオチン化基質として検討したｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ−ＧＧＬＱＧはｂｉｏｔｉｎ−ＱＧと同じく直鎖型ビオチン化基質であるが、リンカー長がｂｉｏｔｉｎ−ＱＧの約２倍である。リンカーが長くなることによって、自己環化反応がｂｉｏｔｉｎ−ＱＧに比べて起こり易くなることが予想された。ＤＬＳで粒子径を測定した所、ストレプトアビジンの添加によって粒子径は増大したものの、［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１／２と１の粒子径はほとんど変わらず、直径２９．２ｎｍ程度の集合体が形成されるに留まった。
【０２５２】
即ち、ｂｉｏｔｉｎ−ＱＧ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体の結果と比較して、リンカー長の増加によって集合体の粒子径の減少が見られた。
【０２５３】
次にＳＥＣによる分析を行った所、［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１／２まではほとんどｂｉｏｔｉｎ−ＱＧ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体と同じ挙動を示し、形成する集合体も溶出体積が同じことから、同じ集合体を形成していることが示唆された。しかし、［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１において見られた大きい集合体の形成は確認されず、先述の二つの集合体が比を変えて存在しているだけであった。これよりＳＥＣによる解析においても、リンカー長によって自己環化反応が促進される挙動を確認した。
【０２５４】
〔ｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体〕
最後にｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体とストレプトアビジンを組み合せることで集合体を形成した。集合体の粒子径は、ストレプトアビジンの添加によって段階的に増加し、最終的に直径３４．８ｎｍの集合体となった。ストレプトアビジンの添加による粒子径の増加の様子が明らかに前者２つと異なり、段階的に成長している様子が予想された。これは二股構造を有するビオチン基質のため、ストレプトアビジンのペアになっているビオチン結合部位を２つ同時に捕まえている為に、ワイヤー状にストレプトアビジン−ｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体の集合体が成長していることが考えられた。
【０２５５】
［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１において、ＤＬＳ測定結果は粒子径大方向にブロードしたようなものが得られたので、ピークが伸びた部分はワイヤー状集合体の形成を示唆している。
【０２５６】
ＳＥＣにより更なる分析を行った所、明らかに前者２つとは異なる集合体を形成していた。まず、［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１／２の時点で溶出体積１０．５ｍＬと１１．１ｍＬに新たなピークが見られた。これらはそれぞれ分子量２６０ｋＤａと３２０ｋＤａであり、例えば、図５（Ｂ）の模式図にて示されるような、ｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体−ストレプトアビジン−ｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体の集合体（ＡＰ−ＳＡ−ＡＰ集合体）と、リング状に自己環化した（ｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体−ストレプトアビジン）２集合体（（ＡＰ−ＳＡ）２集合体）と予想された。
【０２５７】
［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１においては、上記のＡＰ−ＳＡ−ＡＰ集合体がメインとして形成され、上記の（ＡＰ−ＳＡ）２集合体に加え新たに溶出体積９．７ｍＬ、推定分子量４１９ｋＤａのピークが確認された。分子量から考えると、（ＡＰ−ＳＡ）２集合体に更にｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体を含む集合体であると思われた。
【０２５８】
最後に、［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝２においては、溶出時間９．７ｍＬと１１．１ｍＬのものに加え、新たに８．２ｍＬにピークが観察された。推定分子量は６９１ｋＤａであり、（ＡＰ−ＳＡ）４−ＡＰ集合体と予想された。以上の結果より、推定分子量から考えるとワイヤー状の集合体の形成が示唆される結果となった。
【０２５９】
次に、ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ４−ａｍｉｎｅ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｑ変異体について結果を図４及び表８に示す
【０２６０】
【表８】
2013084526.tif 000022
【０２６１】
ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ４−ａｍｉｎｅ  修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｑ変異体に対して、［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１／４、１／２並びに１となるように加え、ストレプトアビジン−  ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ４−ａｍｉｎｅ  修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｑ変異体の集合体を形成した。その結果、ストレプトアビジンの添加によって確かに粒子径の増大が観察された。
【０２６２】
しかし集合体の粒子径は、［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１／２で３４．９ｎｍと最大となり、更にストレプトアビジンを添加して［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１の条件では、２６．０ｎｍと粒子径は減少してしまった。
【０２６３】
ストレプトアビジンの添加による粒子径の減少挙動についてより深い検討を行う為に、ＤＬＳ測定後のサンプルをＳＥＣで流し、ストレプトアビジンとｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ４−ａｍｉｎｅ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｑ変異体の比による集合体の形成挙動を追跡した。
【０２６４】
得られたチャートより、溶出体積１４．２ｍＬと１６．２ｍＬにそれぞれｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ４−ａｍｉｎｅ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｑ変異体とストレプトアビジンのピークが観察された。ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ４−ａｍｉｎｅ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｑ変異体に対してストレプトアビジンを添加するに伴い、ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ４−ａｍｉｎｅ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｑ変異体のピークが減少し、より溶出時間の早い＝分子量の大きな集合体の形成が確認された。［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１／２の時点で集合体のほぼ全てが排除体積で溶出される様な大きな集合体が観察されたが、［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１の条件においては集合体一個当りの分子量が減少し、ＤＬＳの測定結果を補完する形となった。
【０２６５】
［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１／４から１／２の順に１で粒子径が増加、減少、増加という挙動より、ストレプトアビジンとｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ４−ａｍｉｎｅ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｑ変異体を用いた集合体の形成は、ストレプトアビジンの添加によって際限なく成長していくのではなく、ある安定化状態（安定な直径・分子量の粒子）が存在するのではないかと考察された。ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体における結果と合わせて、ビオチン化基質のリンカー長による立体障害が粒子径に大きく影響しているこが推察された。
【０２６６】
実験例６：各種アルカリホスファターゼ変異体の複合体の機能解析
上記実験例５にて作製したｂｉｏｔｉｎ−ＱＧ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体並びにｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ４−ａｍｉｎｅ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｑ変異体と、ストレプトアビジンとの複合体の機能解析を行った。
【０２６７】
両変異体とストレプトアビジンとの混合量を、それぞれ上述したような［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１／４、１／２並びに１として得られた複合体について機能解析を行った。コントロールとして、ストレプトアビジンを含まない、単にｂｉｏｔｉｎ−ＱＧ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体並びにｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ４−ａｍｉｎｅ修飾ＡＰ（２１９−２２１）−Ｑ変異体を用いた。
【０２６８】
また、更なる比較実験として、アルカリホスファターゼに対してビオチンを化学的に修飾した化学修飾アルカリホスファターゼを用いた。具体的な製造方法は以下の通りである。
【０２６９】
５μＭのアルカリホスファターゼに対し、ｂｉｏｔｉｎ−（ＡＣ）２−ＯＳｕをそれぞれ５００若しくは５０μＭ（１００ｍＭのホウ酸緩衝液  ｐＨ９．０）になるように調製し、２５°Ｃで５時間、化学修飾ビオチン化反応を行った。反応後のサンプルを１０ｋＤａのフィルターを用いて、遠心ろ過並びにＴＢＳ緩衝液の添加を繰り返し、未反応の試薬を取り除くと共に反応を終了させた。
【０２７０】
次に、ＥＬＩＳＡ測定用のプレートを作製した。０、０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００、１０００μｇ／ｍｌとなるように調製した抗原であるオブアルブミン（ＯＶＡ）を１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように各ウェルに加え、４°Ｃで１２時間静置することで固相化を行った。次いで、ＴＢＳＴで５回洗浄後、２％ＢＳＡ／ＴＢＳを２００μｌ／ｗｅｌｌ加え、３７°Ｃで２時間静置することでブロッキングを行った。洗浄後、一次抗体である抗ＯＶＡ  ｍｏｕｓｅ抗体の１００００倍希釈溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、３７°Ｃで２時間静置した。洗浄後、二次抗体であるビオチン化した抗ｍｏｕｓｅＩｇＧ  ｒａｂｂｉｔ抗体の１００００倍希釈溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、３７°Ｃで２時間静置した。洗浄後、上述した各種アルカリホスファターゼ集合体、並びに化学修飾アルカリホスファターゼ溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、３７°Ｃで２時間静置した。
【０２７１】
最後に、上記作成したプレートを洗浄後、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐ−ＮＰＰ）を基質として用いた活性測定を行った。活性測定は、５ｍＭのｐ−ＮＰＰを含む１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）の条件下、３７°Ｃで行い、４１０ｎｍの吸収を追跡する上述の方法に従って活性測定を行った。なお、本実験では、ストレプトアビジンなしの条件の吸光度をＮｏｉｓｅとし、各吸光度からＳ／Ｎ比を算出している。結果を図６に示す。
【０２７２】
先ず、２つのビオチン修飾化アルカリホスファターゼ変異体を用いた場合について、［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１／４においてはシグナルが見られなかったが、これらはアルカリホスファターゼ集合体を形成する溶液中にビオチン基が過剰に存在するサンプルであるからである。ストレプトアビジンのビオチン結合サイトが全て占有されていたため、ビオチン化抗体と結合出来なかったものと予想された。
【０２７３】
しかしながら［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１／２ではどちらにおいてもシグナルが観察され、サンプル条件的には先ほどと同様ビオチン基過剰であるにも関わらず結合していることになる。ここでもう一度［ＳＡ］／［ＡＰ］＝１／４のＳ／Ｎ比を見ると、２には至らないものの、確かに［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝０μｇ／ｍｌと比較してシグナル強度の増強が見て取れた。
【０２７４】
よって、アルカリホスファターゼ集合体はアビジン―ビオチン間の平衡反応によって抗ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ抗体と結合するのではないかと推察された。［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１／４のシグナルが弱いのは、系中に存在するビオチンと相互作用可能な集合体量が少ないことが示唆される。
【０２７５】
一方、［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１においては強いシグナルが観察され、確かにビオチン化抗体へのＡＰ集合体の結合を確認した。以上の結果は、上記表に示した［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］の比を変えることによる集合体の成長と相関していると考えられる。即ち、より大きな集合体の形成が、ＥＬＩＳＡにおけるシグナル強度の増大に寄与していることが示唆された。
【０２７６】
また、［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝２のシグナルが弱いのは、今度は逆に系中にストレプトアビジンが
過剰に存在しているため、フリーなストレプアビジンの結合が増えた為と思われる。また粒子径にはある最適な値が存在し、それ以上のストレプトアビジンを添加すると集合体１つ当りの粒子径が減少するという仮説が正しいとすれば、ストレプトアビジン過剰によりＯＶＡ１つ当りに結合しているアルカリホスファターゼの量が減ってしまったことも原因であると考えられた。
【０２７７】
ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ（ｂ）とＡＰ（２１９−２２１）−Ｑ（ｂ）で［ｍＳＡ］／［ｍＡＰ］＝１／２，１間のシグナル強度の傾向が違うのもそれが要因となっていると考えられた。
【０２７８】
化学修飾アルカリホスファターゼについては全ての場合において微弱なシグナルの上昇が観測されるだけであった。これは化学修飾のためにビオチン化率が高くなってしまい、系中に酵素修飾ビオチン化アルカリホスファターゼと比べてビオチン基が過剰量存在したためであると考えられる。また、化学修飾によるアルカリホスファターゼの活性自体の低下も懸念された。
【０２７９】
実験例７：各種アルカリホスファターゼ変異体の複合体形成能について
上記実験例４にて作製したビオチン修飾されたアルカリホスファターゼの集合体形成能について実験した。具体的には、ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体に対して、ｂｉｏｔｉｎ−ＱＧ、ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ−ＧＧＬＱＧ並びにｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧを用い、更にＭＴＧを用いてビオチン化したものである。
【０２８０】
これらのビオチン化アルカリホスファターゼを、ストレプトアビジンで被覆されたプレート上に添加し、これらのビオチン化アルカリホスファターゼのプレート上への固定化を試みた。
【０２８１】
固定化は、ストレプトアビジンによってコーティングされたプレートに、１μＭに調製した各ビオチン化アルカリホスファターゼを１００μＬずつプレートに添加し、４℃で３０分静置した後、２００μｌのＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒにて洗浄した。次いで、アルカリホスファターゼの活性測定を上述の方法で行った。その結果を図７に示す。
【０２８２】
図７中、ビオチン化基質としてｂｉｏｔｉｎ−ＱＧを用いたものを（１）、ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ−ＧＧＬＱＧを用いたものを（２）、そしてｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧを用いたものを（３）とする。また、図７中のＷＴとは、ＡＰ（２１９−２２１）−Ｋ２変異体に代えて野生型のアルカリホスファターゼを用いたものである。
【０２８３】
以上より先ほどと同様に、今回合成した新規のビオチン化基質はＭＴＧによって認識され、またアルカリホスファターゼがビオチン化された状態でもストレプトアビジンとの結合能を維持していることが明らかとなった。
【０２８４】
従って、プレート上にてアルカリホスファターゼ集合体が形成していることも明らかとなった。
【０２８５】
実験例８：ＥＧＦＰ変異体の複合体形成能について
配列番号１５に示すアミノ酸配列（ＭＨＨＨＨＨＨ）のＨｉｓタグをＮ末端に有する、配列番号１３に示すＥＧＦＰ変異体を作製した。具体的な作製方法は、上述のアルカリホスファターゼ変異体と同様にして行った。配列番号１３に示すＥＧＦＰ変異体は、そのＣ末端に配列番号４に示すアミノ酸配列が含まれている。
【０２８６】
次いで、ビオチン化合物としてｂｉｓ（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧ）−ＫＧＬＱＧを用い、ＥＧＦＰ変異体をビオチン化した。ビオチン化の条件としては、１０μＭのＥＧＦＰ変異体、２００μＭのビオチン化合物、０．５Ｕ／ｍＬのＭＴＧをＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ中で混合して２５℃で１時間反応させた。反応後にゲル濾過カラム（Ｇ−２５）を用いてビオチン化ＥＧＦＰ変異体を精製した。
【０２８７】
得られたビオチン化ＥＧＦＰを、ストレプトアビジンで被覆されたプレート上に添加し、これらのビオチン化アルカリホスファターゼのプレート上への固定化を試みた。
【０２８８】
固定化は、上述の実施例７のアルカリホスファターゼのストレプトアビジンによってコーティングされたプレートへの固定化と同様にして行った。固定化の後、蛍光イメージング装置を用いてプレートを観察した。その結果を図８に示す。
【０２８９】
図８（Ａ）はイメージング像、（Ｂ）はイメージング像から得られた蛍光強度を算出したグラフである。図中のＫ ｔａｇ  ＥＧＦＰが変異体を示し、ＷＴがＥＧＦＰ変異体に代えて野生型を用いたものである。
【０２９０】
図８の結果から、アルカリホスファターゼ変異体と同様に、今回合成した新規のビオチン化基質はＭＴＧによって認識され、またＥＧＦＰ変異体に対してビオチン化できることが明らかとなった。ＥＧＦＰはビオチン化された状態でもストレプトアビジンとの結合能を維持していることが明らかとなった。
【０２９１】
従って、プレート上にてＥＧＦＰ集合体が形成していることも明らかとなった。
【図１−１】
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【図１−２】
2013084526.tif 000031
【図１−３】
2013084526.tif 000032
【図２−１】
2013084526.tif 000033
【図２−２】
2013084526.tif 000034
【図３−１】
2013084526.tif 000035
【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2013084526.tif 000040
【図８】
2013084526.tif 000041
【配列表】
2013084526000001.app
【国際調査報告】
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2013084526.tif 000043
2013084526.tif 000044
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