(57)【要約】真核細胞を三次元培養する際に有効に用いられる添加剤を提供する事を目的とする。微生物由来のセラミックスを有効成分とする、真核細胞の三次元培養用添加剤の提供によって、斯かる目的が達成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物由来のセラミックスを有効成分とする、真核細胞の三次元培養用添加剤。
【請求項２】
微生物由来のセラミックスが、酸化鉄及び／又はシリカを含む、請求項１に記載の三次元培養用添加剤。
【請求項３】
微生物由来のセラミックスが、更にリンを含む、項１又は２に記載の三次元培養用添加剤。
【請求項４】
微生物由来のセラミックスの形状が、中空チューブ状、中空繊維状鞘状、螺旋状、枝分かれしたチューブ状、枝分かれした糸状、ハープ状、扇状、短幹状、カプセル状、及び球状からなる群より選択される何れかである、請求項１〜３の何れか１項に記載の添加剤
【請求項５】
微生物由来のセラミックスの形状が、中空チューブ状又は螺旋状である、請求項１〜４の何れか１項に記載の添加剤。
【請求項６】
微生物由来のセラミックスの長さが、０．１〜３０００μｍである、請求項１〜５の何れか１項に記載の添加剤。
【請求項７】
微生物由来のセラミックスが、磁性体である、請求項１〜６の何れか一項に記載の添加剤。
【請求項８】
酸化鉄が、α−Ｆｅ２Ｏ３、β−Ｆｅ２Ｏ３、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、α−ＦｅＯＯＨ、β−ＦｅＯＯＨ、γ−ＦｅＯＯＨ、及びフェリハイドライトからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２〜７の何れか１項に記載の添加剤。
【請求項９】
真核細胞が、哺乳類細胞及び／又は昆虫細胞である、請求項１〜８の何れか1項に記載の添加剤。
【請求項１０】
真核細胞が、幹細胞及び／又は肝細胞である、請求項１〜９の何れか１項に記載の添加剤。
【請求項１１】
微生物が、トキソシリックス属菌、レプトスリックス属菌、クレノシリックス属菌、クロノシリックス属菌、ガリオネラ属菌、シデロカプサ属菌、シデロコッカス属菌、シデロモナス属菌、及びプランクトミセス属菌からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１〜１０の何れか１項に記載の添加剤。
【請求項１２】
微生物が、レプトスリックス属菌及び／又はガリオネラ属菌である、請求項１〜１１の何れか1項に記載の添加剤。
【請求項１３】
スフェロイド又は又は細胞塊形成用である、請求項１〜１２の何れか1項に記載の添加剤。
【請求項１４】
三次元培養が、フィーダー細胞を使用しない、請求項１〜１３の何れか1項に記載の添加剤。
【請求項１５】
真核細胞の三次元培養方法であって、培地に真核細胞及び微生物由来のセラミックスを添加する工程を含む方法。
【請求項１６】
微生物由来のセラミックスが、酸化鉄及び／又はシリカを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
微生物由来のセラミックスと、其れに担持された真核細胞とを含むスフェロイド又は又は細胞塊。
【請求項１８】
請求項１５又は１６に記載の方法によって得られる、請求項１７に記載のスフェロイド又は又は細胞塊。
【請求項１９】
タンパク質又はペプチドの製造用である、請求項１７又は１８に記載のスフェロイド又は又は細胞塊。
【請求項２０】
薬剤又は脂質のスクリーニング用である、請求項１７又は１８に記載のスフェロイド又は又は細胞塊。
【請求項２１】
疾病の悪性度鑑別用である、請求項１７又は１８に記載のスフェロイド又は又は細胞塊。
【請求項２２】
再生医療用である、請求項１７又は１８に記載のスフェロイド又は又は細胞塊。
【請求項２３】
真核細胞の三次元培養用添加剤としての使用のための、微生物由来のセラミックス。
【請求項２４】
微生物由来のセラミックスが、酸化鉄及び／又はシリカを含む、請求項２３に記載の微生物由来のセラミックス。
【請求項２５】
真核細胞の三次元培養用添加剤を製造するための、微生物由来のセラミックスの使用。
【請求項２６】
微生物由来のセラミックスが、酸化鉄及び／又はシリカを含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
タンパク質又はペプチドの製造方法であって、培地に真核細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、及び前記細胞を三次元培養する工程を含む、製造方法。
【請求項２８】
微生物由来のセラミックスが、酸化鉄及び／又はシリカを含む、請求項２７に記載の製造方法。
【請求項２９】
薬剤又は脂質のスクリーニング方法であって、培地に真核細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、前記細胞を三次元培養する工程、及び前記三次元培養で得られたスフェロイド又は又は細胞塊と、薬剤又は脂質の候補物質を接触させる工程を含むスクリーニング方法。
【請求項３０】
微生物由来のセラミックスが、酸化鉄及び／又はシリカを含む、請求項２８に記載のスクリーニング方法。
【請求項３１】
疾病の悪性度の鑑別方法であって、培地に生体から採取した組織片又は腫瘍片に由来する細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、前記細胞を三次元培養する工程、及び前記三次元培養で得られたスフェロイド又は細胞塊を評価する工程を含む鑑別方法。
【請求項３２】
微生物由来のセラミックスが、酸化鉄及び／又はシリカを含む、請求項３１に記載の鑑別方法。
【請求項３３】
人工組織の製造方法であって、培地に生体から採取した細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、前記細胞を三次元培養する工程、及び前記三次元培養で得られたスフェロイド又は細胞塊を、患者又は治療を要する動物に直接的又は間接的に注入する工程を含む製造方法。
【請求項３４】
微生物由来のセラミックスが、酸化鉄及び／又はシリカを含む、請求項３３に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞と微生物が生成した酸化鉄とを含む細胞培養物、及び細胞培養物を用いたタンパク質又はペプチドの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフェロイド形成を促進する技術として、特許文献１及び特許文献２には、特定のパターンを有する培養基材上で細胞を培養する方法が開示されている。特許文献３及び特許文献４には、マイクロ流路あるいはナノスケールの流路を用いて細胞を培養する方法が開示されている。培養液を取り込むようにスフェロイドを形成させる方法として、特許文献５では培養液中にガドリウム化合物を用いており、特許文献６では培養液中に粘膜質の体表皮を有する魚類の体液を用いている。また、特許文献６の背景技術には、中空糸膜上で単層培養する方法、糖鎖高分子を用いる方法、及び動物肝臓由来のプロテオグリカンを利用する方法が記載されている。【０００３】
一方、有用タンパク質の生産技術として、特許文献７−１０には、大腸菌又は酵母、特にピキア属酵母及びサッカロマイセス属酵母の組換え体を用いたヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ，ＨＳＡ）の生産方法が記載されている。また、遺伝子組換え体を用いない方法として、特許文献７の背景技術に記載されているように、ＨＳＡは血液の分画産物として製造されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−２３３５３８公報
【特許文献２】特開２０１０−２２３６６公報
【特許文献３】特開２０１１−１７２５３３公報
【特許文献４】特開２００９−２４２４９５公報
【特許文献５】特開２０１２−６５５５５公報
【特許文献６】特開２０１１−０６２１２９公報
【特許文献７】特開２００５−３１２４６３公報
【特許文献８】特開２００９−２９８７８３公報
【特許文献９】特開２００４−２４２６７８公報
【特許文献１０】特開２００３−１５３６９７公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の特許文献１−６では、形成されるスフェロイドはマイクロメートルスケールであり、大きく成長したスフェロイドは内部で壊死を起こすためにスフェロイドが崩壊、分裂する可能性が高いという問題があった。また、培養細胞を用いたタンパク質の生産においては特許文献５及び特許文献６のようにヒト以外の生物由来タンパク質や糖鎖が混入するとヒトの体内で抗原となり、アレルギー反応やアナフィラキシーショックを生じる危険性がある。特許文献７−１０についても、組換え体を用いることで内毒素又はパイロジェン等の外因性物質の混入の危険性があり、また莫大なＧＭＰ設備投資が必要である。特許文献７の血液を原料に製造する方法は、原料の安定した供給が困難である上、ウイルス混入等の問題がある。【０００６】
従って、本発明の一つの目的は、巨大なスフェロイドを提供することにある。
本発明の別の目的は、生産量が上昇されたタンパク質又はペプチドの生産方法を提供することにある。【０００７】
更に本発明は、真核細胞を三次元培養する際に有効に用いられる添加剤を提供する事を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討し、真核細胞を微生物が生成した酸化鉄、すなわち微生物由来のセラミックスと共に培養すると、三次元培養が可能となることを見出した。本発明は斯かる知見に基づいて完成されたものであり、下記に示す広い態様の発明を包含する。【０００９】
項１  微生物由来のセラミックスを有効成分とする、真核細胞の三次元培養用添加剤。【００１０】
項２  微生物由来のセラミックスが、酸化鉄及び／又はシリカを含む、項１に記載の三次元培養用添加剤。【００１１】
項３  微生物由来のセラミックスが、更にリンを含む、項１又は２に記載の三次元培養用添加剤。【００１２】
項４  微生物由来のセラミックスの形状が、中空チューブ状、中空繊維状鞘状、螺旋状、枝分かれしたチューブ状、枝分かれした糸状、ハープ状、扇状、短幹状、カプセル状、及び球状からなる群より選択される何れかである、項１〜項３の何れか１項に記載の添加剤。【００１３】
項５  微生物由来のセラミックスの形状が、中空チューブ状又は螺旋状である、項１〜項４の何れか１項に記載の添加剤。【００１４】
項６  微生物由来のセラミックスの長さが、０．１〜３０００μｍである、項１〜項５の何れか１項に記載の添加剤。【００１５】
項７  微生物由来のセラミックスが、磁性体である、項１〜項６の何れか一項に記載の添加剤。【００１６】
項８  酸化鉄が、α−Ｆｅ２Ｏ３、β−Ｆｅ２Ｏ３、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、α−ＦｅＯＯＨ、β−ＦｅＯＯＨ、γ−ＦｅＯＯＨ、及びフェリハイドライトからなる群より選択される少なくとも１種である、項２〜項７の何れか１項に記載の添加剤。【００１７】
項９  真核細胞が、哺乳類細胞及び／又は昆虫細胞である、項１〜項８の何れか1項に記載の添加剤。【００１８】
項１０  真核細胞が、幹細胞及び／又は肝細胞である、項１〜項９の何れか１項に記載の添加剤。【００１９】
項１１  微生物が、トキソシリックス属菌、レプトスリックス属菌、クレノシリックス属菌、クロノシリックス属菌、ガリオネラ属菌、シデロカプサ属菌、シデロコッカス属菌、シデロモナス属菌、及びプランクトミセス属菌からなる群より選択される少なくとも一種である、項１〜項１０の何れか１項に記載の添加剤。【００２０】
項１２  微生物が、レプトスリックス属菌及び／又はガリオネラ属菌である、項１〜項１１の何れか1項に記載の添加剤。【００２１】
項１３  スフェロイド又は細胞塊形成用である、項１〜１２の何れか1項に記載の添加剤。【００２２】
項１４  三次元培養が、フィーダー細胞を使用しない、項１〜項１３の何れか1項に記載の添加剤。【００２３】
項１５  真核細胞の三次元培養方法であって、培地に真核細胞及び微生物由来のセラミックスを添加する工程を含む方法。【００２４】
項１６  微生物由来のセラミックスが、酸化鉄及び／又はシリカを含む、項１５に記載の方法。【００２５】
項１７  微生物由来のセラミックスと、其れに担持された真核細胞とを含むスフェロイド又は細胞塊。【００２６】
項１８  項１５又は項１６に記載の方法によって得られる、項１７に記載のスフェロイド又は細胞塊。【００２７】
項１９  タンパク質又はペプチドの製造用である、項１７又は項１８に記載のスフェロイド又は細胞塊。【００２８】
項２０  薬剤又は脂質のスクリーニング用である、項１７又は項１８に記載のスフェロイド又は細胞塊。【００２９】
項２１  疾病の悪性度鑑別用である、項１７又は項１８に記載のスフェロイド又は細胞塊。【００３０】
項２２  再生医療用である、項１７又は項１８に記載のスフェロイド又は細胞塊。【００３１】
項２３  真核細胞の三次元培養用添加剤としての使用のための、微生物由来のセラミックス。【００３２】
項２４  微生物由来のセラミックスが、酸化鉄及び／又はシリカを含む、項２３に記載の微生物由来のセラミックス。【００３３】
項２５  真核細胞の三次元培養用添加剤を製造するための、微生物由来のセラミックスの、使用。【００３４】
項２６  微生物由来のセラミックスが、酸化鉄及び／又はシリカを含む、項２５に記載の使用。【００３５】
項２７  タンパク質又はペプチドの製造方法であって、培地に真核細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、及び前記細胞を三次元培養する工程を含む、製造方法。【００３６】
項２８  微生物由来のセラミックスが、酸化鉄及び／又はシリカを含む、項２７に記載の製造方法。【００３７】
項２９  薬剤又は脂質のスクリーニング方法であって、培地に真核細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、前記細胞を三次元培養する工程、及び前記三次元培養で得られたスフェロイド又は細胞塊と、薬剤又は脂質の候補物質を接触させる工程を含むスクリーニング方法。【００３８】
項３０  微生物由来のセラミックスが、酸化鉄及び／又はシリカを含む、項２８に記載のスクリーニング方法。【００３９】
項３１  疾病の悪性度の鑑別方法であって、培地に生体から採取した組織片又は腫瘍片に由来する細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、前記細胞を三次元培養する工程、及び前記三次元培養で得られたスフェロイド又は細胞塊を評価する工程を含む鑑別方法。【００４０】
項３２  微生物由来のセラミックスが、酸化鉄及び／又はシリカを含む、項３１に記載の鑑別方法。【００４１】
項３３  人工組織の製造方法であって、培地に生体から採取した細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、前記細胞を三次元培養する工程、及び前記三次元培養で得られたスフェロイド又は細胞塊を、患者又は治療を要する動物に直接的又は間接的に注入する工程を含む製造方法。【００４２】
項３４  微生物由来のセラミックスが、酸化鉄及び／又はシリカを含む、項３３に記載の製造方法。【００４３】
更に本発明には以下に示す態様の発明も包含される。
項Ａ１．細胞と、微生物が生成した酸化鉄とを含む細胞培養物。
項Ａ２．前記細胞が初代肝細胞、肝細胞由来細胞株、初代癌細胞、又は癌細胞由来細胞株
である項Ａ１に記載の細胞培養物。
項Ａ３．前記細胞が幹細胞である項Ａ１に記載の細胞培養物。
項Ａ４．前記細胞がスフェロイドである項Ａ１〜項Ａ３のいずれか一項に記載の細胞培養物。
項Ａ５．前記微生物が生成した酸化鉄が、レプトスリックス属又はガリオネラ属が生産する酸化鉄である、項Ａ１〜項Ａ４のいずれか一項に記載の細胞培養物。
項Ａ６．前記微生物が生成した酸化鉄が、中空チューブ状の酸化鉄である、項Ａ１〜項Ａ５のいずれか一項に記載の細胞培養物。
項Ａ７．項Ａ１〜項Ａ６のいずれか一項に記載の細胞培養物を用いた、タンパク質又はペプチドの生産方法。
項Ａ８．前記タンパク質又はペプチドは血清タンパク質、ホルモン、酵素、免疫調節因子、リンホカイン、モノカイン、サイトカイン、糖タンパク質、ワクチン抗原、抗体、成長因子、増殖因子、又は液性因子である項Ａ７に記載の方法。
項Ａ９．前記タンパク質又はペプチドはアルブミンである項Ａ７に記載の方法。
項Ａ１０．微生物が生成した酸化鉄を用いて細胞を培養することからなる、スフェロイドの製造方法。
項Ａ１１．前記スフェロイドが初代肝細胞、肝細胞由来細胞株、初代癌細胞、又は癌細胞由来細胞株から培養されたスフェロイドである項Ａ１０に記載の方法。
項Ａ１２．前記細胞が幹細胞である項Ａ１０に記載の方法。
項Ａ１３．前記微生物が生成した酸化鉄が、レプトスリックス属又はガリオネラ属が生産する酸化鉄である、項Ａ１０〜項Ａ１２のいずれか一項に記載の方法。
項Ａ１４．前記微生物が生成した酸化鉄が、中空チューブ状の酸化鉄である、項Ａ１０〜項Ａ１３のいずれか一項に記載の方法。
項Ａ１５．前記培養することは、細胞非接着性の内底面を有する培養皿に、細胞と微生物が生成した酸化鉄とを含む培地を入れることにより細胞を培養することからなる、項Ａ１０〜項Ａ１４のいずれか一項に記載の方法。
項Ａ１６．項Ａ１０〜項Ａ１５のいずれか一項に記載の方法により得られたスフェロイドの、薬剤又は脂質のスクリーニングのための使用。
項Ａ１７．微生物が生成した酸化鉄の、スフェロイド形成のための使用。
【発明の効果】
【００４４】
本発明により、細胞と、微生物が生成した酸化鉄とを含む細胞培養物が提供される。かかる細胞培養物により、巨大なスフェロイドの形成が促進されると共に、かかる細胞培養物はアルブミンを初めとするタンパク質又はペプチドの生産、及び薬剤又は脂質のスクリーニングに使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】Ｌ−ＢＩＯＸに接着及び凝集する細胞。図１Ａ−１Ｃはヒト乳癌由来ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の接着の走査型電子顕微鏡写真を示し、図１Ｄ−１Ｆはヒト肝臓癌由来ＨｅｐＧ２細胞の接着の走査型電子顕微鏡写真を示す。
【図２】Ｌ−ＢＩＯＸの存在下又は不在下で培養されたＨｅｐＧ２細胞のスフェロイドの光学顕微鏡写真。図２Ａ−ＣはＬ−ＢＩＯＸ上で形成される培養６日目、９日目、及び１０日目のＨｅｐＧ２細胞のスフェロイド、図２Ｄ−ＥはＬ−ＢＩＯＸがない場合の培養４日目及び１４日目のＨｅｐＧ２細胞のスフェロイドを示す。細胞は倒立型光学顕微鏡で観察し、顕微鏡用デジタルカメラ（ＤＰ７１、オリンパス株式会社製）を用いてＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．７．３．０モレキュラーデバイスジャパン株式会社製）で画像を取り込み、スフェロイド直径を測定した。以下、図３−１０も同様に倒立型光学顕微鏡で観察し、スフェロイド直径を測定した。
【図３】培養１ヶ月目の、磁性Ｌ−ＢＩＯＸ上でスフェロイド形成したＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の光学顕微鏡写真（対物４０倍）。
【図４】Ｌ−ＢＩＯＸ上で培養したｍｉＰＳ−ＬＬＣｃｍ細胞のスフェロイド直径。
【図５】Ｌ−ＢＩＯＸ上で７日間培養したｍｉＰＳ−ＬＬＣｃｍの明視野観察（ＢＦ）（図５Ａ）、蛍光（ＧＦＰ）観察（図５Ｂ）及びＭｅｒｇｅ写真（図５Ｃ）。
【図６】Ｌ−ＢＩＯＸ上で形成されたｍｉＰＳ細胞塊（図６Ａ−Ｃ）と非接着性培養皿で培養したｍｉＰＳ細胞（図６Ｄ−Ｆ）。
【図７】Ｌ−ＢＩＯＸ及びＧ−ＢＩＯＸがＨｅｐＧ２細胞のスフェロイド形成に与える効果を示すグラフ。図７ＡはＬ−ＢＩＯＸに関するグラフ、図７ＢはＧ−ＢＩＯＸに関するグラフ。
【図８】Ｌ−ＢＩＯＸの存在（■）又は不在下（▲）で培養されたＨｅｐＧ２細胞のスフェロイド径を示すグラフ。
【図９】ＨｅｐＧ２細胞のスフェロイド形成における培養５日目のＬ−ＢＩＯＸと他の担体粒子との比較。図９Ａ：Ｌ−ＢＩＯＸ、図９Ｂ：担体なし、図９Ｃ：Ａｅｒｏｓｉｌ  ３００、図９Ｄ：市販の酸化鉄。
【図１０】ＨｅｐＧ２細胞のスフェロイド形成におけるＬ−ＢＩＯＸとマイクロキャリアビーズとの比較。図１０Ａ，Ｂ：Ｌ−ＢＩＯＸ、図１０Ｃ，Ｄ：マイクロキャリアビーズ。
【図１１】ＨｅｐＧ２細胞によるヒト血清アルブミン生産。図１１Ａはウェスタンブロッティングにおけるアルブミンの発現を示す。図１１Ｂは図１１Ａの発現量をシグナル強度で示したグラフ。
【図１２】Ｌ−ＢＩＯＸの形状の影響を検討した実験結果。（Ａ）はチューブ状のＬ−ＢＩＯＸを用いてｍｉＰＳ細胞を三次元培養した結果を示す顕微鏡写真像。バーは１００μｍを示す。（Ｂ）はチューブ状のＬ−ＢＩＯＸ粉末状に粉砕したものを用いてｍｉＰＳ細胞を三次元培養した結果を示す顕微鏡写真像。バーは１００μｍを示す。（Ｃ）は（Ａ）拡大像。バーは２０μｍを示す。（Ｄ）は（Ａ）を三次元再構成した像。
【図１３】Ｌ−ＢＩＯＸを用いて三次元培養したｍｉＰＳ細胞における遺伝子の発現量を検討した結果を示す図。（Ａ）は内在性発現遺伝子、（Ｂ）は総発現遺伝子を示す。グラフの縦軸は、接着ディッシュ上でフィーダレス培養したｍｉＰＳ細胞での発現量を基準（値を１）とした相対発現量を示す。
【図１４】Ｌ−ＢＩＯＸを用いて三次元培養したガン幹細胞モデル細胞（ｍｉＰＳ−ＬＬＣｃｍ）細胞における遺伝子の発現量を検討した結果を示す図。グラフの縦軸は三次元培養で得られた細胞塊の直径（μｍ）を示し、横軸は培養日数を示す。グラフ中の四角は、Ｌ−ＢＩＯＸ及びＰｕｒｉｍｙｃｉｎを添加したもの、グラフ中の丸は、Ｌ−ＢＩＯＸを添加せず、Ｐｕｒｉｍｙｃｉｎを添加したものを示す。また、横軸の矢印はＰｕｒｉｍｙｃｉｎを添加した日を示し、グラフ中の写真像は、それぞれ三次元培養した際の細胞塊の写真像を示すものである。バーは５００μｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕
本発明の真核細胞の三次元培養用添加剤は、微生物由来のセラミックスを有効成分とする。すなわち、本発明における微生物由来セラミックスは、真核細胞の三次元培養用添加剤に使用することができる。そして、前記微生物由来のセラミックスは、真核細胞の三次元培養用添加剤の製造に使用される。
【００４７】
上述の微生物由来のセラミックスとは、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明する「微生物が生成した酸化鉄」に該当する。より具体的には、
（ｉ）微生物が生成した酸化鉄に加熱処理を施すことにより磁性セラミックスとしたもの、
（ｉｉ）微生物が生成した酸化鉄を酸処理しＦｅ成分を溶解除去することにより多孔質アモルファスシリカとしたもの、及び
（ｉｉｉ）微生物が生成した酸化鉄、磁性セラミックス、又は多孔質アモルファスシリカの有機基で化学修飾し得る部分（例えば、Ｆｅ原子及び／又はＳｉ原子に結合した酸素原子）の少なくとも一部を有機基で化学修飾して得られた有機・無機材料
が、本発明の微生物由来のセラミックスに包含される。
【００４８】
本発明の三次元培養用添加剤に有効成分として含有される微生物由来のセラミックスには、酸化鉄及び／又はシリカを含有される。さらに、リンを含有することもできる。そして、後述する本発明の微生物をコバルト、ニッケル、マンガン等の遷移金属元素やネオジウム等の希土類元素等が存在する環境化で培養することにより、微生物由来のセラミックスにこれらの元素を含有させ得る。これらの元素を含有させれば、鉄以外の物質に由来する磁性を本発明の磁性セラミックスに付与できる。また、ナトリウム、マグネシウム、アルミニウムのような軽元素も含有させることもできる。
【００４９】
また、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明する国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号に記載のように、上述のセラミックスの構成成分として、鉄、シリカ、及びリンの元素比率は原子数％（ａｔ％）で、通常は、６６〜８７：２〜２７：１〜３２程度である。
【００５０】
上述の酸化鉄とは、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明の詳細な説明、及びこれを説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号に記載の「酸化鉄」であることができる。
【００５１】
なお、上記「酸化鉄」にて示されるフェリハイドライトとは、低結晶性の酸化鉄を意味し、Ｘ線回折パターンに現れるピークの数によって２−ｌｉｎｅ  ｆｅｒｒｉｈｙｄｒｉｔｅや６−ｌｉｎｅ  ｆｅｒｒｉｈｙｄｒｉｔｅ等と呼ばれている。２−ｌｉｎｅ  ｆｅｒｒｉｈｙｄｒｉｔｅの組成はＦｅ４（Ｏ，ＯＨ，Ｈ２Ｏ）で、６−ｌｉｎｅ  ｆｅｒｒｉｈｙｄｒｉｔｅの組成はＦｅ４．６（Ｏ，ＯＨ，Ｈ２Ｏ）１２とされている（Ｒ．Ａ．Ｅｇｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｗ．Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，“Ｎｅｗ  ｄａｔａ  ａｎｄ  ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒｆｅｒｒｉｈｙｄｒｉｔｅ”，Ｃｌａｙｓ  ａｎｄ  Ｃｌａｙ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．２，ｐｐ１１１−１２４，１９８８）。
【００５２】
また、上記「酸化鉄」にて示されるレピドクロサイトとは、結晶系は斜方晶系、空間群はＢｂｍｍ、格子定数はａ＝０．３０７１，ｂ＝１．２５２０，ｃ＝０．３８７３Å，α＝β＝γ＝９０°であり、化学式がγ−ＦｅＯＯＨで表される結晶性の酸化鉄である。
【００５３】
上述のセラミックスの形状は、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明の詳細な説明、及びこれを説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号に記載のように、中空チューブ状、中空繊維状鞘状、鞘状、らせん状、枝分かれしたチューブ状、糸状（糸状が集まって構成されたハープのような形状、扇状等も含む）、短幹状、カプセル状、球状、マイクロチューブ状、ナノチューブ状、中空ひも状、カプセル状、ひも状と球状の凝集体、ひも状、ロッド状等とすることができる。前記セラミックスの形状は、一次粒子径が、通常は、３〜５ｎｍ程度の微粒子が集合して形成される。
【００５４】
上述の微生物由来のセラミックスの長さは、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明の詳細な説明、及びこれを説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号に記載のように、通常は、０．１〜３０００μｍ程度である。
【００５５】
好ましくは、上述のような微生物由来のセラミックスが鞘状、らせん状、枝分かれしたチューブ状、糸状、及び短幹状であれば、通常は、直径０．１〜５μｍ程度、長さ５〜３０００μｍ程度；カプセル状であれば、通常は、長さ１．２〜２４μｍ程度；球状であれば、通常は、直径０．１〜１μｍ程度；マイクロチューブ状であれば、通常は、直径０．３〜４μｍ程度、長さ５〜２００μｍ程度；ナノチューブ状であれば、通常は、直径３００〜４５０ｎｍ程度、長さ５〜２００μｍ程度；中空ひも状であれば、通常は、長さ３〜１０μｍ程度；カプセル状であれば、通常は、長径１．５〜７μｍ程度、短径０．５〜３μｍ程度；ひも状であれば、通常は、長さ０．５〜５μｍ程度；ロッド状であれば、通常は、長さ５〜３０μｍ程度である。
【００５６】
上述の微生物とは、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明の詳細な説明にて「鉄酸化細菌」と説明される微生物であることができる。好ましくは、レプトスリックス属菌又はガリオネラ属菌である。
【００５７】
上述の微生物由来のセラミックスは、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明する「微生物が生成した酸化鉄」に包含される（ｉ）に示すように、磁性体であることができる。この様な磁性体（以後、本明細書において磁性セラミックスともいう。）は、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号にて記載されるように、例えば、Ｆｅ３Ｏ４及びγ−Ｆｅ２Ｏ３からなる群から選ばれる少なくとも１種の磁性酸化鉄を含有する。
【００５８】
また、本発明の磁性セラミックスの形状は、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号にて記載されるように、通常は、原料である上述の微生物由来のセラミックスの形状とほぼ同じとすることができる。
【００５９】
具体的には、本発明の磁性セラミックスの形状は、鞘状、らせん状、枝分かれしたチューブ状、糸状（糸状が集まって構成されたハープのような形状、扇状等も含む）、短幹状、カプセル状、球状、マイクロチューブ状、ナノチューブ状、中空ひも状、カプセル状、ひも状と球状の凝集体、ひも状、ロッド状等が挙げられる。
【００６０】
また、本発明の磁性セラミックスの大きさは、通常は、０．１〜３０００μｍ程度である。より具体的には、例えば、鞘状、らせん状、枝分かれしたチューブ状、糸状、短幹状であれば、通常は、直径０．１〜５μｍ程度、長さ５〜３０００μｍ程度、好ましくは直径０．３〜３μｍ程度、長さ５〜１０００μｍ程度、より好ましくは直径０．５〜２μｍ程度、長さ５〜２００μｍ程度である。また、カプセル状であれば、通常は、長さ１．２〜２４μｍ程度；球状であれば、通常は、直径０．１〜１μｍ程度；マイクロチューブ状であれば、通常は、直径０．３〜４μｍ程度、長さ５〜２００μｍ程度；ナノチューブ状であれば、直径３００〜４５０ｎｍ程度、長さ５〜２００μｍ程度；中空ひも状であれば、通常は、長さ３〜１０μｍ程度；カプセル状であれば、通常は、長径１．５〜７μｍ、短径０．５〜３μｍ程度；ひも状であれば、通常は、長さ０．５〜５μｍ程度；ロッド状であれば、通常は、長さ５〜３０μｍ程度である。
【００６１】
さらに、本発明の磁性セラミックスがＦｅ３Ｏ４を含有する場合と、γ−Ｆｅ２Ｏ３を含有する場合とは、表面形状にはほとんど差がない。また、本発明の磁性セラミックスは、望ましくは超高分解能ＳＥＭ像による表面の形状が微細凹凸構造である。
【００６２】
本発明の磁性セラミックスにおいて、前記微生物由来のセラミックスに、鉄原子に加えて、ケイ素及びリンが含有される場合、その組成比は、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号にて記載されるように、原料である前記微生物由来のセラミックスの組成とほぼ同じとすることができる。すなわち、本発明の磁性セラミックスに鉄、ケイ素、及びリンが含有される場合、鉄、ケイ素、及びリンの元素比率は原子数％（ａｔ％）で、それぞれ、通常は、６６〜８７：２〜２７：１〜３２程度、好ましくは７０〜７７：１６〜２７：１〜９程度である。
【００６３】
なお、本発明の磁性セラミックスの構成成分は、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号にて記載されるように、原料となる前記微生物由来のセラミックスの構成成分によって変化する。上述の通り、例えば、微生物由来のセラミックスを生成する微生物をコバルト、ニッケル、マンガン等の遷移金属元素やネオジウム等の希土類元素等が存在する環境化で培養することにより、微生物由来のセラミックスにこれらの元素を含有させることができる。これらの元素を含有させることで、鉄以外の物質に由来する磁性を本発明の磁性セラミックスに付与できる。また、ナトリウム、マグネシウム、アルミニウム等のような軽元素を含有させてもよい。
【００６４】
また、本発明の磁性セラミックスが鉄に加えて、ケイ素及びリンを含有する場合、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号にて記載されるように、通常、磁性セラミックスに含有されるＦｅ３Ｏ４及びγ−Ｆｅ２Ｏ３と、ケイ素及びリンとは固溶しておらず、鉄、ケイ素及びリンはそれぞれ相分離したものとすることができる。なお、ケイ素及びリンを含む場合、本発明の磁性セラミックスのＸ線回折（ＸＲＤ）パターンにケイ素及びリンに起因する明瞭なピークが確認されないことから、ケイ素及びリンはアモルファス構造の酸化物を形成したものとすることができる。この様なアモルファス相の主成分は、アモルファスシリカであることが好ましい。
【００６５】
本発明の磁性セラミックスの結晶子サイズは、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号にて記載されるように、通常は、５〜１００ｎｍ程度である。
【００６６】
また、本発明の磁性セラミックスに含有される酸化鉄がＦｅ３Ｏ４の単一相である場合、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号にて記載されるように、磁性セラミックスに含有される鉄の、通常は、約６割程度がＦｅ３Ｏ４であり、約４割程度が常磁性のＦｅ２＋及びＦｅ３＋である。一方、本発明の磁性セラミックスに含有される酸化鉄がγ−Ｆｅ２Ｏ３の単一相である場合、磁性セラミックスに含まれる鉄の、通常は、約７割程度がγ−Ｆｅ２Ｏ３であり、約３割程度が常磁性のＦｅ２＋及びＦｅ３＋である。
【００６７】
なお、常磁性のＦｅ２＋及びＦｅ３＋が、前記のアモルファス相を構成するＦｅ成分であると仮定して、メスバウアー分光法（Ｍｏｓｓｂａｕｅｒ分光法）の結果と原料である前記微生物由来のセラミックス中の鉄、ケイ素、及びリンの組成比から、アモルファス相の組成を計算することができる。
【００６８】
微生物由来のセラミックス中の鉄、ケイ素、及びリンの組成比が、上記のＦｅ：Ｓｉ：Ｐ＝６６〜８７：２〜２７：１〜３２である場合であって、本発明の磁性セラミックスに含有される酸化鉄がＦｅ３Ｏ４の単一相である場合、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号にて記載されるように、アモルファス相の組成（ａｔ％）は、通常は、およそＦｅ：Ｓｉ：Ｐ＝３６〜６６：５〜５５：２〜６０程度である。また、本発明の磁性セラミックスに含有される酸化鉄がγ−Ｆｅ２Ｏ３の単一相である場合、アモルファス相の組成（ａｔ％）は、通常は、およそＦｅ：Ｓｉ：Ｐ＝３９〜６９：４〜５１：２〜５６程度である。
【００６９】
本発明の磁性セラミックスがＦｅ３Ｏ４を含有する場合には、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号にて記載されるように、磁性セラミックスの飽和磁化は、通常は、１〜５０ｅｍｕ／ｇ程度、好ましくは３０〜５０ｅｍｕ／ｇ程度、より好ましくは４０〜５０ｅｍｕ／ｇ程度である。また、保磁力は、通常は、０〜２５０Ｏｅ程度である。さらに、残留磁化は、通常は、０〜２０ｅｍｕ／ｇ程度でる。なお、本発明の磁性セラミックスに含有される酸化鉄がＦｅ３Ｏ４の単一相である場合には、磁性セラミックスの飽和磁化は、通常は、５０ｅｍｕ／ｇ程度である。
【００７０】
一方、本発明の磁性セラミックスに含有される酸化鉄がγ−Ｆｅ２Ｏ３を含有する場合、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号にて記載されるように、磁性セラミックスの飽和磁化は、通常は、１〜４０ｅｍｕ／ｇ程度、好ましくは２５〜４０ｅｍｕ／ｇ程度、より好ましくは３０〜４０ｅｍｕ／ｇ程度である。また、保磁力は、通常は、０〜６０Ｏｅ程度である。さらに、残留磁化は、通常は、０〜２０ｅｍｕ／ｇ程度である。なお、本発明の磁性セラミックスに含有される酸化鉄がγ−Ｆｅ２Ｏ３の単一相である場合、磁性セラミックスの飽和磁化は、通常は、４０ｅｍｕ／ｇ程度である。
【００７１】
また、純粋なＦｅ３Ｏ４及びγ−Ｆｅ２Ｏ３は、それぞれ９８ｅｍｕ／ｇ及び８１ｅｍｕ／ｇであることから、本発明の磁性セラミックス中に含有される１〜５０質量％程度の化合物が、Ｆｅ３Ｏ４又はγ−Ｆｅ２Ｏ３の磁性酸化鉄微粒子となる。
【００７２】
また、本発明の磁性セラミックス中の、Ｆｅ３Ｏ４及びγ−Ｆｅ２Ｏ３からなる群から選ばれる少なくとも一種の磁性酸化鉄の含有量は、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号にて記載されるように、通常は、３０〜５０質量％程度、好ましくは４０〜５０質量％程度である。また、本発明の磁性セラミックス中のアモルファス相の含有量は、通常は、７０〜５０質量％程度、好ましくは６０〜５０質量％程度である。
【００７３】
本発明の磁性セラミックスがケイ素及びリンの酸化物を含有する場合、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号にて記載されるように、磁性セラミックス中のケイ素酸化物の含有量は、通常は、１０〜３０質量％程度、好ましくは１５〜２５質量％程度である。また、磁性セラミックス中のリン酸化物の含有量は、通常は、１〜２０質量％程度、好ましくは１〜１０質量％程度である。
【００７４】
本発明の微生物由来のセラミックスの多孔度は、特に限定はされないがＢｅｔの比表面積に換算して、通常は２００〜３５０ｍ2／ｇ程度、より好ましくは、２６０〜３００ｍ2／ｇ程度である。
【００７５】
本発明の微生物由来のセラミックスに該当する「微生物が生成した酸化鉄」包含される、上記（ｉｉｉ）の、微生物が生成した酸化鉄の酸処理しＦｅ成分を溶解除去することにより多孔質アモルファスシリカとしたものは、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明の詳細な説明にて説明される通りとすることができる。斯かる多孔質アモルファスシリカの多孔度は、特に限定はされないがＢｅｔの比表面積に換算して、通常は３００ｍ2／ｇ程度以上、好ましくは４００ｍ2／ｇ程度以上、より好ましくは５００ｍ2／ｇ程度以上である。
【００７６】
本発明の微生物由来のセラミックスに該当する「微生物が生成した酸化鉄」包含される、上記（ｉｉｉ）の、微生物が生成した酸化鉄、磁性セラミックス、又は多孔質アモルファスシリカの有機基で化学修飾し得る部分（例えば、Ｆｅ原子及び／又はＳｉ原子に結合した酸素原子）の少なくとも一部を有機基で化学修飾して得られた有機・無機材料は後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明の詳細な説明にて説明される通りとすることができる。
【００７７】
上記有機基とは、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号にて記載されるように、カルボキシル基、カルボン酸エステル基、アミド基、イミド基、シアノ基、イソシアノ基、アルデヒド基、ケトン基、イミノ基、アミノ基、アジド基、ニトロ基、ヒドロキシ基、エーテル基、エポキシ基、イソシアナト基、イソチオシアナト基、アルキル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基、チオール基、スルフィド基、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホキシド基、複素環、ハロゲン原子、ケイ素原子、チタン原子及びリン原子等の官能基を有する基が挙げられる。
【００７８】
上述の微生物が生成した酸化鉄、磁性セラミックス、又は多孔質アモルファスシリカの有機基で化学修飾し得る部分と前記有機基を修飾する方法は、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号に記載の方法で作製することが可能である。
【００７９】
本発明の三次元培養用添加剤における上述の微生物由来のセラミックスの含有量は、特に限定することはないが、三次元培養用剤１００重量部当たり、通常は０．００１〜１００重量部程度である。すなわち、上述の微生物由来のセラミックスそのものを、本発明の三次元培養用添加剤であることができる。
【００８０】
上述の真核細胞は、特に限定はされないが、例えば哺乳類細胞、昆虫細胞等が挙げられる。
【００８１】
例えば、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明する細胞であることができ、中でも、幹細胞又は肝細胞が好ましい。
【００８２】
本発明の三次元培養用添加剤は、スフェロイド又は細胞塊の形成用の添加剤であることができる。
【００８３】
なお、三次元培養とは、平面的に単層で細胞を増殖させるものとは異なり、細胞同士を接着させながら増殖させ、立体的な細胞塊又はスフェロイドを形成させるものである。
【００８４】
本発明の三次元培養用添加剤の使用量は、特に限定はされないが、適当な培地に対して、上述の微生物由来のセラミックスの量に換算した最終濃度が０．１〜５ｍｇ／ｍｌ程度、好ましくは、０．５〜３ｍｇ／ｍＬ程度、より好ましくは１．０〜２．０ｍｇ／ｍＬ程度である。
【００８５】
本発明の三次元培養用添加剤は、フィーダー細胞を用いることなく使用することが可能である。
【００８６】
〔真核細胞の三次元培養方法〕
本発明の真核細胞の三次元培養方法は、培地に微生物由来のセラミックスを添加する工程を含む。
【００８７】
真核細胞とは、上述の〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕に関する説明と同様であることができる。
【００８８】
微生物由来のセラミックスとは上述の〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕に関する説明と同様であることができる。
【００８９】
培地とは、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明と同様であることができる。
【００９０】
培養条件、培養環境等に関する具体的な培養方法は、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明と同様であることができる。
【００９１】
〔スフェロイド又は細胞塊〕
本発明のスフェロイド又は細胞塊は、微生物由来のセラミックスと、これに担持された真核細胞を含む。そして、本発明のスフェロイド又は細胞塊は、微生物由来のセラミックスに担持されている。すなわち、微生物由来のセラミックスは、真核細胞のスキャフォールドとしての機能を発揮する。
【００９２】
微生物由来のセラミックスとは、上述の〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕に関する説明と同様であることができる。
【００９３】
真核細胞とは、上述の〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕に関する説明と同様であることができる。
【００９４】
本発明のスフェロイド又は細胞塊は、タンパク質又はペプチドの製造に関する分野に好適に用いることができる。本発明のスフェロイド又は細胞塊を用いた具体的な製造方法は、例えば〔本発明のタンパク質又はペプチドの製造方法〕にて後述する方法を採用すればよいが、これに限定はされない。
【００９５】
本発明のスフェロイド又は細胞塊は、薬剤又は脂質のスクリーニングに関する技術分野に好適に用いることができる。本発明のスフェロイド又は細胞塊を用いた具体的なスクリーニング方法は、例えば〔本発明の薬剤又は脂質のスクリーニング方法〕にて後述する方法を採用すればよいが、これに限定はされない。
【００９６】
本発明のスフェロイド又は細胞塊は、疾病の悪性度鑑別に関する技術分野に好適に用いることができる。本発明のスフェロイド又は細胞塊を用いた具体的な悪性度の鑑別方法は、例えば〔本発明の疾病の悪性度の鑑別方法〕にて後述する方法を採用すればよいが、これに限定はされない。
【００９７】
本発明のスフェロイド又は細胞塊は、再生医療に関する技術分野に好適に用いることができる。具体的な再生医療分野での方法に関しては、例えば〔本発明の人工組織の製造方法〕にて後述する方法等にて製造される人工組織の使用方法を採用すればよいが、これに限定はされない。
【００９８】
〔タンパク質又はペプチドの製造方法〕
本発明のタンパク質又はペプチドの製造方法は、培地に真核細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、及び前記細胞を三次元培養する工程を含む。
【００９９】
タンパク質又はペプチドは後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明と同様であることができる。
【０１００】
培地は、上述の〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕に関する説明と同様であることができる。
【０１０１】
真核細胞は、上述の〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕に関する説明と同様であることができる。
【０１０２】
微生物に由来するセラミックス並びにその添加量は、上述の〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕及び〔真核細胞の三次元培養方法〕に関する説明と同様であることができる。
【０１０３】
具体的な三次元培養の方法は、上述の〔真核細胞の三次元培養方法〕に関する説明と同様であることができる。
【０１０４】
また、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明に記載される各種のタンパク質又はペプチドの製造技術を適宜採用してもよい。この様なタンパク質ペプチド又は、予め前記タンパク質又はペプチドをコードする遺伝子が導入され、これらを発現する真核細胞から得られるリコンビナントタンパク質又はペプチドであることができ、真核細胞に起源的に発現している内在性のタンパク質又はペプチドであることもできる。
【０１０５】
〔薬剤又は脂質のスクリーニング方法〕
本発明の薬剤又は脂質のスクリーニング方法は、培地に真核細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、前記細胞を三次元培養する工程、及び前記三次元培養で得られたスフェロイド又は細胞塊と、薬剤又は脂質の候補物質を接触させる工程を含む。
【０１０６】
薬剤又は脂質とは、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明と同様であることができる。
【０１０７】
培地、真核細胞、及び微生物に由来するセラミックスとは、上述の〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕及び〔真核細胞の三次元培養方法〕に関する説明と同様であることができる。
【０１０８】
具体的な三次元培養の方法は、上述の〔真核細胞の三次元培養方法〕に関する説明と同様であることができる。
【０１０９】
スクリーニング方法では、上述の薬剤又は脂質の候補物質と三次元培養で得られたスフェロイド又は細胞塊を接触させたのち、斯かる三次元培養でスフェロイド又は細胞塊における生体反応を指標として、薬剤又は脂質をスクリーニングすればよい。
【０１１０】
生体反応の指標とは、スクリーニングを所望する薬剤又は脂質が、スフェロイド又は細胞塊において発揮する作用を基に選択すればよく、特に限定はされない。
【０１１１】
また、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明に記載される各種のスクリーニング技術を適宜採用してもよい。
【０１１２】
本発明の薬剤又は脂質のスクリーニング方法として、例えば、がん治療薬の薬剤スクリーニングであれば、上述のスフェロイド又は細胞塊に候補となるガン治療薬を曝露して培養した後に、ＭＴＴアッセイ等による増殖抑制効果を測定してＩＣ５０を算出し、その数値が設定した基準値よりも低い結果を示すスフェロイド又は細胞塊に曝露したがん治療薬を所望のガン治療薬として選択する工程；上述の曝露後のスフェロイド又は細胞塊を染色して固定した後に、公知の方法を用いて生死判定を行い、死んだスフェロイド又は細胞塊に曝露させたガン治療薬を所望のがん治療薬として選択する工程；上記固定後のスフェロイド又は細胞塊にＴＵＮＥＬ染色法等によるアポトーシスの検出を行って、アポトーシスを引き起こしているスフェロイド又は細胞塊に曝露したガン治療薬を、所望のがん治療薬として選択する工程等を挙げることができる。
【０１１３】
また、脂質のスクリーニングでは、候補脂質をスフェロイド又は細胞塊に曝露して培養した後に、培養上清、スフェロイド、又は細胞塊から脂質代謝産物を測定し、測定した量が多い場合に所望の脂質として選択する工程を含む方法、蛍光ラベルした候補脂質のスフェロイド又は細胞塊内への取込みやスフェロイド又は細胞塊内での移行を評価し、所望の動態を示す脂質を選択する工程を含む方法等が挙げられる。
【０１１４】
〔疾病の悪性度の鑑別方法〕
本発明の疾病の悪性度の鑑別方法は、培地に生体から採取した組織片又は腫瘍片に由来する細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、前記細胞を三次元培養する工程、及び前記三次元培養で得られたスフェロイド又は又は細胞塊を評価する工程を含む。
【０１１５】
疾病とは、特に限定はされないが、例えばガン等が挙げられる。悪性度とは、例えば疾病の進行度合いを示すものであり、特に限定はされない。
【０１１６】
生体から採取した組織片又は腫瘍片とは、特に限定はされないが、疾病の悪性度を検討する上において、有用な部位から採取すればよい。また、生体とは特に限定はされないが、例えば後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明における哺乳類等を参照することができる。
【０１１７】
培地及び微生物に由来するセラミックスとは、上述の〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕及び〔真核細胞の三次元培養方法〕に関する説明と同様とすることができる。
【０１１８】
具体的な三次元培養の方法は、上述の〔真核細胞の三次元培養方法〕に関する説明と同様とすることができる。
【０１１９】
鑑別方法では、三次元培養によって得られたスフェロイド又は細胞塊を公知の方法にて解析又は観察することによって、公知の診断技術を採用し、疾患の悪性度を鑑別とすることができるが、特に限定はされない。
【０１２０】
また、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明に記載される各種の鑑別技術を適宜採用することができる。
【０１２１】
本発明の疾病の悪性度の鑑別方法として、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＣＤ４４タンパク質が高発現で、且つＣＤ２４タンパク質が低発現の上記スフェロイド又は細胞塊、又はＣＤ１３３タンパク質が高発現するスフェロイド又は細胞塊の割合をフローサイトメトリーで測定する工程を含む方法；これらの遺伝子およびタンパク質のスフェロイド又は細胞塊における発現量を、qPCR法、ウエスタンブロッティング法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、免疫染色法等を用いて検出する工程を含む方法等が挙げられる。
【０１２２】
また、上記スフェロイド又は細胞塊をＷｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ法、トランスウェル等に供し、遊走能を評価する工程、マトリゲルを用いて浸潤能を評価する工程を含む悪性度の鑑別方法が挙げられる。
【０１２３】
更に、マウスに上記スフェロイド又は細胞塊を移植して担癌マウスを作製した後に、がん組織を摘出し、病理組織学的診断を行う工程を含む方法が挙げられる。この場合、さらに移植部位以外に転移が観察できれば悪性度は高い判断することもできる。
【０１２４】
〔本発明の人工組織の製造方法〕
本発明の本発明の人工組織の製造方法は、培地に生体から採取した細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、前記細胞を三次元培養する工程、及び前記三次元培養で得られたスフェロイド又は又は細胞塊を、患者又は治療を要する動物に直接的又は間接的に注入する工程を含む。
【０１２５】
生体から採取する細胞又は組織とは、特に限定はされないが、疾病の悪性度を検討する上において、有用な部位から採取することができる。また、生体とは特に限定はされないが、例えば後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明における哺乳類等を参照することができる。
【０１２６】
患者又は治療を要する動物とは特に限定はされないが、例えば後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明における哺乳類等を参照することができる。
【０１２７】
直接的又は間接的に注入する工程とは、特に限定はされないが、再生医療分野にて用いられる公知の注入方法を適宜採用することができる。
【０１２８】
培地及び微生物に由来するセラミックスとは、上述の〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕及び〔真核細胞の三次元培養方法〕に関する説明と同様であることができる。
【０１２９】
具体的な三次元培養の方法は、上述の〔真核細胞の三次元培養方法〕に関する説明と同様であることができる。
【０１３０】
また、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明に記載される各種の再生医療に用いられる技術を適宜採用することができる。
【０１３１】
本発明の人工組織の製造方法として、例えば骨芽細胞作製を目的とした場合であれば、特開２００６−１２９７３４号公報、ＰｌｏｓＯｎｅ，２０１３，Ｖｏｌ．８（１）ｅ５３７７１に記載の様に、上記スフェロイド又は細胞塊（特に、骨芽細胞を含むもの）に対してデキサメタゾン及びβグリセロフォスフェートなどを添加して培養する工程を含む方法が挙げられ、これによって人工組織（特に骨組織、軟骨組織等）を提供することができる。
また、三次元培養後して上記スフェロイド又は細胞塊を作成した後に、公知の方法を用いて酸化鉄を除去する工程に供した後に、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１２，Ｖｏｌ．２（５），１４４８−１４６０、特願２００２−２９４０７１号公報等に記載の方法が挙げられ、これによって人工組織（心筋）を提供することができる。
【０１３２】
以下に、上述した項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明する。ただし、本発明が以下に説明される発明に限定されないのは言うまでもない。
【０１３３】
本明細書において、複数の細胞が凝集して三次元の球状細胞塊になったものを「スフェロイド」という。スフェロイドを形成及び／又は維持することは、スフェロイドの生理機能が生体組織により近いことを示す。
【０１３４】
本発明の細胞培養物は、細胞と、微生物が生成した酸化鉄とを含む。微生物が生成した酸化鉄は、細胞を増殖させるための担体又は支持体として機能し、細胞培養物中の細胞は、微生物が生成した酸化鉄を細胞間に取り込みながら細胞間で接着して増殖する。
【０１３５】
細胞
細胞は、培地中で増殖させることができる細胞であれば特に限定されず、動物細胞であることが好ましく、その中でもほ乳類由来の細胞であることがより好ましい。ほ乳類として、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、モルモット、ラット、及びマウスなどが例示されるが、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ラット、及びマウスがスフェロイドの形成容易性の面から好ましく、ヒトが特に好ましい。
【０１３６】
ほ乳類由来の細胞を用いる場合の、細胞が由来する組織・臓器については、組織を形成する細胞に増殖能を有する細胞が存在しているか、或いは人為的に増殖能を付加することができる組織・臓器である限りに於いて特に限定されない。かかる組織・臓器としては、例えば、肝臓、角膜、皮膚、軟骨、大腸、小腸、膵臓、胃、筋組織、心臓、肺臓、食道、骨髄、腎臓、脾臓、精巣、卵巣、脂肪組織等の正常な組織・臓器の他、これらの細胞が癌化又は腫瘍化したものが例示される。その中でも、特に肝臓又は腫瘍由来の細胞若しくは癌細胞であることがスフェロイド形成のために好ましい。好ましい細胞の例は、初代肝細胞（ヘパトサイト）、肝細胞由来細胞株、初代癌細胞、及び癌細胞由来細胞株である。癌細胞由来細胞株には、例えば、ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２、ヒト肝癌細胞株ＨｕＨ−７、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ヒト神経膠腫由来細胞株Ａ１７２、Ｕ２５１ＭＧ、マウスＬｅｗｉｓ肺癌（ＬＬＣ）細胞、マウス胚性腫瘍Ｐ１９細胞、及びマウス骨芽様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１等が挙げられる。
【０１３７】
また、細胞は幹細胞であってもよい。幹細胞には、成体幹細胞（組織幹細胞、体性幹細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が含まれる。さらには細胞には、幹細胞から分化された細胞又はｉＰＳ細胞から誘導された幹細胞も含まれる。かかる細胞をスフェロイド培養することによって、再生医療への応用も期待できる。幹細胞の例には、例えば癌幹細胞（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，ＣＳＣ）及びｉＰＳ細胞から作製した癌幹細胞が挙げられる。ｉＰＳ細胞から癌幹細胞を作製する方法は、例えば本願発明者らのＣｈｅｎ  Ｌ，Ｋａｓａｉ  Ｔ，Ｌｉ  Ｙ，Ｓｕｇｉｉ  Ｙ，Ｊｉｎ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（４）：ｅ３３５４４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３３５４４に記載されており、当該文献はその全体を本明細書に援用する。例えば、マウスｉＰＳ（ｍｉＰＳ）細胞から作製されるがん幹細胞モデル細胞は、フィーダー細胞なし又は有りで、ｍｉＰＳ培地とマウス癌細胞株から得られた条件培地との混合物中でｍｉＰＳを約４週間培養することにより得られる。
【０１３８】
さらに、細胞は非組み換え細胞であっても、組み換え細胞であってもよい。非組み換え細胞を用いた場合には、細胞により生産されたタンパク質又はペプチドを応用する対象における内毒素又はパイロジェン等の外因性物質の混入が防止される。組み換え細胞を用いた場合には、タンパク質又はペプチドのより高効率な生産が可能となる。また、組み換え細胞を用いた場合には、必ずしも巨大スフェロイドを形成せずとも、細胞を浮遊培養系で培養し得る。
【０１３９】
細胞の培養方法、培養条件は、各細胞の種類に応じて一般的な培養方法、条件が採用できる。培地は、任意の細胞培養用の培地を用いることができ、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、グラスゴーＭＥＭ（ＧＭＥＭ）、ＥＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ−１６４０、ハムＦ−１２、ＭＣＤＢ培地等が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、これらの培地には血清又は、各種の増殖因子もしくは分化誘導因子等が添加されてもよい。
【０１４０】
微生物が生成した酸化鉄
微生物が生成した酸化鉄及びその製造方法は、ＷＯ２０１０／１１０４３５及びＷＯ２０１１／０７４５８７に記載されており、これらの文献全体を本明細書に援用する。微生物が生成した酸化鉄は、様々な微生物が菌体外に生産する酸化鉄であり、種々の形状のものが知られている。微生物が生成した酸化鉄は、「バイオジナス酸化鉄」とも称される。
【０１４１】
本明細書において、「酸化鉄」とはα−Ｆｅ２Ｏ３、β−Ｆｅ２Ｏ３、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４などに例示される狭義の酸化鉄、α−ＦｅＯＯＨ、β−ＦｅＯＯＨ、γ−ＦｅＯＯＨなどに例示されるオキシ水酸化鉄、フェリハイドライト（Ｆｅｒｒｉｈｙｄｒｉｔｅ）に代表される非晶質に近い構造の水酸化鉄を含む、鉄と酸素とを主成分とする化合物の総称である。
【０１４２】
上記鉄酸化細菌としては、Ｆｅ３Ｏ４、α−ＦｅＯＯＨ、又はγ−ＦｅＯＯＨ（レピドクロサイト）等を含む上記酸化鉄を形成するものであれば良く、特に限定されるものではない。上記バイオジナス酸化鉄を生成する鉄酸化細菌としては、たとえば、トキソシリックス属菌（Ｔｏｘｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ．）、レプトスリックス属菌（Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ．）、クレノシリックス属菌（Ｃｒｅｎｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ．）、クロノシリックス属菌（Ｃｌｏｎｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ．）、ガリオネラ属菌（Ｇａｌｌｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、シデロカプサ属菌（Ｓｉｄｅｒｏｃａｐｓａ  ｓｐ．）、シデロコッカス属菌（Ｓｉｄｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、シデロモナス属菌（Ｓｉｄｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、及びプランクトミセス属菌（Ｐｌａｎｋｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）などを挙げることができる。
【０１４３】
レプトスリックス属細菌の一例としては、レプトスリックス・コロディニ  ＯＵＭＳ１株が挙げられる。当該レプトスリックス・コロディニＯＵＭＳ１株は、２００９年１２月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８））に、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−８６０として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はＮＩＴＥ  ＢＰ−８６０である。
【０１４４】
微生物が生成した酸化鉄は種々の形状を取り、レプトスリックス・オクラセア（Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ  ｏｃｈｒａｃｅａ）が生産する酸化鉄は、中空繊維状鞘状構造をしており、ガリオネラ・フェルギネア（Ｇａｌｌｉｏｎｅｌｌａ  ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ）を初めとするガリオネラ属は螺旋状、スフェロチルス属及びクロノスリックス属は枝分かれしたチューブ状又は糸状、トクソスリックス属は糸状（ハープのような形状、扇状）、シデロモナス属は短幹状、シデロカプサ属はカプセル状、シデロコッカス属は球状の酸化鉄を生産する。微生物が生成した酸化鉄の大きさは、その種類によって様々であるが、通常０．１〜３０００μｍ程度である。これらの酸化鉄は、例えば、浄水場の自然ろ過施設に溜まった堆積物中等に存在し、該堆積物に遠心分離、減圧乾燥等を施すことより、精製することができる。
【０１４５】
微生物が生成した酸化鉄は、鉄、酸素以外に微量のケイ素、リンを含むが、同一の微生物が作り出す酸化鉄であっても、酸化鉄に含まれる鉄、ケイ素、リン等の構成成分の種類や構成比は、微生物の存在する環境によって変化する。微生物が生成した酸化鉄は天然物由来であるため、かかる酸化鉄を担体として用いた培養上清から抗原成分が混入する可能性は非常に低い。
【０１４６】
本発明の微生物が生成した酸化鉄は、特定の実施形態に限定されないが、レプトスリックス・オクラセアが生成する酸化鉄は中空チューブ状であるため、スフェロイド内部にまで養分や酸素等の供給、培養液の交換がより効果的になされる点で好ましい。レプトスリックス・オクラセアが生成する酸化鉄を用いると、スフェロイドは大きく成長しても状態をより良好に維持することができる。
【０１４７】
さらに、本発明の“微生物が生成した酸化鉄”は広義に解され、微生物由来のセラミックスとすることができ、前記酸化鉄の他に
（ｉ）かかる酸化鉄に加熱処理を施すことにより磁性セラミックスとしたもの、
（ｉｉ）かかる酸化鉄の酸処理しＦｅ成分を溶解除去することにより多孔質アモルファスシリカとしたもの、ならびに
（ｉｉｉ）微生物が生成した酸化鉄、磁性セラミックス、又は多孔質アモルファスシリカの有機基で化学修飾し得る部分（例えば、Ｆｅ原子及び／又はＳｉ原子に結合した酸素原子）の少なくとも一部を有機基で化学修飾して得られた有機・無機材料
も含まれる。
【０１４８】
磁性セラミックス及びその製造方法についてはＷＯ２０１１／０７４５８７に記載されており、この文献全体を本明細書に援用する。上記酸処理は、バイオジナス酸化鉄を酸処理することによりＦｅ成分を溶解除去し、結果として多孔質アモルファスシリカが得られるもので、酸処理に使用する酸としては、例えば、塩酸及び硫酸が挙げられる。酸処理の時間は、通常１時間〜６日、特に２〜４日である。酸処理工程の前に、微生物が生成した酸化鉄を乾燥する工程を有していても良く、酸処理工程の後に、酸処理工程で得られた多孔質アモルファスシリカを洗浄及び乾燥する工程を有していても良い。有機・無機材料及びその製造方法についてはＷＯ２０１０／１１０４３５に記載されている。
【０１４９】
スフェロイド及びその培養
本発明の細胞は、担体である微生物が生成した酸化鉄と共に培養されると、微生物が生成した酸化鉄を細胞が取り込んで増殖することにより、スフェロイドを形成することができる。当業者には使用する細胞に合わせて好ましい培地を適宜選択して使用することが可能である。
【０１５０】
培養容器は、スフェロイド培養に適したフラスコ、シャーレ、ペトリディッシュ、プレート、組織培養用チューブ、トレイ、培養バッグ、ローラーボトル、又はホローファイバー等の任意の培養容器又は培養皿であってよい。１実施形態において、培養容器は細胞非接着性の内底面を有する培養容器である。ここで、細胞非接着性とは、培養細胞が全く接着しないという趣旨ではなく、本発明が目的とするスフェロイドの形成を阻害しない程度に、培養細胞が接着しないという趣旨である。
【０１５１】
細胞非接着性の内底面を有する培養容器は、任意の公知の又は市販の細胞非接着性の培養容器であってよく、例えば、ポリスチレン等の汎用プラスチックを射出成型した、特別な表面処理を行わない培養容器、不織布又は多孔性フィルムの足場を備えた培養容器、微細な凹凸面を備えたプラスチック成型の培養容器、ポリエチレングリコールやポリヒドロキシエチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体などの親水性の高い物質から形成された培養容器、容器の表面を、界面活性剤やリン脂質などの表面性能を親水性にし得る物質でコーティングした培養容器、プラズマ処理などの表面処理によって親水性を付与した培養容器が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１５２】
培養細胞の数は培養容器の容量、細胞の種類、最終的なスフェロイドの大きさ等を考慮して適宜決定されるが、例えば、培地１ｍＬ辺り１０４個〜１０７個、好ましくは１０４個〜１０６個の終濃度で培養容器に播種される。培養日数は特に限定されないが、通常、数時間〜数ヶ月、好ましくは１日以上〜約１ヶ月である。
【０１５３】
細胞は、細胞と微生物が生成した酸化鉄とを含む液体培地を、培養容器に入れることにより培養され得るが、細胞、微生物が生成した酸化鉄及び液体培地は、同じタイミングで培養容器に入れられてもよいし、別のタイミングで培養容器に入れられてもよい。
【０１５４】
スフェロイドの大きさは特に限定されず、直径が１０μｍ以上あれば良いが、好ましくは１００μｍ以上、より好ましくは２００μｍを超える。従来技術の培養基材及び担体ではスフェロイドが成長すると内部で壊死が生じて大きさに限界があったが、微生物が生成した酸化鉄を用いることで、直径２００μｍをも超えるより大きなスフェロイドの形成が可能となる。一般に、スフェロイドの直径が大きいと、スフェロイドの状態が生体内での状態と近くなり、タンパク質又はペプチドの生産が増大する。
【０１５５】
本発明のスフェロイド及び細胞培養物は、創薬等の段階に於いて薬剤となる物質のスクリーニング又は代謝における脂質のスクリーニングに使用することができる。すなわち、細胞培養基材又は細胞培養容器に固着したスフェロイドに対して、化学物質、薬剤等を添加し、スフェロイドを形成する細胞に対して何らかの効果を有するものをスクリーニングすることができる。
また、本発明のスフェロイドは、疾病の悪性度鑑別のために使用することもできる。すなわち、生体から採取した組織片や腫瘍片を、細胞毎に分散させた後、本発明のスフェロイドとする過程において増殖能の評価を行ったり、或いはかかるスフェロイドからの遊離細胞の有無を評価することにより癌転移能の評価をすることができる。
【０１５６】
また、本発明のスフェロイドは、再生医療のために使用することもできる。すなわち、健常な組織より採取した細胞より本発明のスフェロイドを調製し、かかるスフェロイドを患者や治療を要する動物の該当組織に直接的又は間接的に注入することで、該当組織の機能の維持・再生に使用することができる。
【０１５７】
培養細胞を用いたタンパク質又はペプチドの生産
上記のようにして製造されたスフェロイド及び細胞培養物により、糖又は糖鎖を含んでも含まなくてもよい有用なタンパク質又はペプチドを生産することができる。そのようなタンパク質又はペプチドとしては血清タンパク質、ホルモン、酵素、免疫調節因子、リンホカイン、モノカイン、サイトカイン、糖タンパク質、ワクチン抗原、抗体、成長因子、増殖因子、又は液性因子等が挙げられる。さらに具体的なタンパク質又はペプチドには、血清アルブミン、インスリン、アレルギー抑制因子、サプレッサー因子、細胞障害性糖タンパク質、細胞障害因子、腫瘍細胞由来因子、リンホトキシン類、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α、−β等）、カケクチン、形質転換増殖因子（ＴＧＦ−α、−β）、あるいは造血因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及びマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）等が挙げられる。かかるタンパク質又はペプチドの発現量は、タンパク質又はペプチドに対する特異的結合対（抗体、レセプター、及びレクチンなど当業者であれば適宜選択して使用することができる）を利用した免疫染色又はウェスタンブロッティング等で確認することができる。
【０１５８】
培養細胞株と、それにより分泌されるタンパク質との組み合わせの例としては、任意の公知のものが含まれる。例えば、ヒト肝臓癌由来ＨｅｐＧ２細胞のスフェロイド培養により、血清アルブミンが生産される（特開２００８−０５４５２１）、マウスの乳腺上皮細胞では、細胞が三次元の肺胞様球状構造を形成し、培養に伴い乳清酸性タンパク質遺伝子の発現量が上昇し、同タンパク質が分泌される（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１，４５−５４，１９８９）。ヒト脳腫瘍の癌幹細胞のスフェロイド培養では、がん幹細胞マーカーのＣＤ１３３発現量が上昇している（Ｓｈｅｉｌａ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００３，６３  ：  ５８２１−５８２８，  ２００３）。ヒト小児血管腫細胞のスフェロイド培養によりＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）の発現レベルが増大する（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０１１，４：５４）。いずれの場合も細胞のスフェロイド培養によりタンパク質の生産量が上昇している。よって、かかる培養細胞株を用いることにより、内毒素又はパイロジェン等の外因性物質の混入が防止され、酵母組換え体や血液の精製によらずとも、低コストで安全なタンパク質又はペプチドの生産が可能となる。
【０１５９】
本明細書中に引用されているすべての特許、特許出願及び文献の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【実施例】
【０１６０】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。【０１６１】
１．材料
非接着性培養皿としては、ＢＤ  ＦａｌｃｏｎＴＭペトリディッシュ（カタログ番号３５１００７，６０ｍｍ×１５ｍｍ）又はアズノール滅菌シャーレ（アズワン製、品番１−７４８４−０１、９０ｍｍ×１５ｍｍ）を使用した。接着性培養皿としては、ＴＰＰ組織培養皿ＴＰＰ９３０６０又はＴＰＰ９３１００（いずれもＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用した。【０１６２】
ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞及びＨｅｐＧ２細胞はいずれも独立行政法人理化学研究所筑波研究所バイオリソースセンター（筑波、日本）から得た（それぞれＲＣＢ１１９２及びＲＢＣ１８８６）。マウスｉＰＳ細胞（ｍｉＰＳ；ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−２０Ｄ−１７）は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（筑波、日本）から購入し、それぞれ終濃度が０．１ｍＭのＮＥＡＡ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノールと５０Ｕ／ｍｌペニシリン、及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンとなるように含むＤＭＥＭ培地中にて維持した。マウスＬｅｗｉｓ肺癌（ＬＬＣ）細胞はＡＴＣＣ（アメリカ合衆国）から購入し、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地中に維持した。【０１６３】
２．バイオジナス酸化鉄の調製
（２−１．Ｌ−ＢＩＯＸの調製）
京都府城陽市の公共施設である文化パルク城陽に設置した鉄酸化細菌の培養槽から、微生物が生成した酸化鉄を含んだ地下水スラリーを回収した。この培養槽の優先種は鉄酸化細菌レプトスリックス・オクラセアであり、得られるバイオジナス酸化鉄は直径１μｍ程度の中空チューブ状である。このスラリーに２８％ＮＨ３水溶液を加えてｐＨ１０．５に調整し１０分撹拌し、撹拌をとめて４０分静置した。デカンテーションにより上澄みのみフィルタろ過し、４倍量の蒸留水で洗浄した。得られた含水ケーキをエタノールに分散し、１５分撹拌した。懸濁液をフィルタろ過し、１００℃で乾燥し、これをＬ−ＢＩＯＸと命名した。  Ｌ−ＢＩＯＸの直径は１μｍ程度、全体が多孔質、表面は粒子状であり、表面積が広く（２８０ｍ２／ｇ程度、市販の酸化鉄は通常７０ｍ２／ｇ）、表面に水酸基（−ＯＨ）が多かった。【０１６４】
（２−２．Ｇ−ＢＩＯＸの調製）
岡山大学農学部に設置した鉄酸化細菌の培養槽から、微生物が生成した酸化鉄を含んだ地下水スラリーを回収した。この培養槽の優先種はガリオネラ・フォルギネアであり、得られるバイオジナス酸化鉄は螺旋状である。スラリーを上述と同様に処理し、得られたバイオジナス酸化鉄をＧ−ＢＩＯＸと命名した。【０１６５】
（２−３．磁性Ｌ−ＢＩＯＸの調製）
レプトスリックス・オクラセア由来の上記Ｌ−ＢＩＯＸを、ＷＯ２０１１／０７４５８７の［０１１３］の実施例１の手順（Ｉ）−（ＩＩＩ）で加熱処理して、磁性Ｌ−ＢＩＯＸとした。【０１６６】
具体的な手順（Ｉ）−（ＩＩＩ）は以下の通りである。
手順（Ｉ）：原料セラミックスの乾燥粉末をアドバンテック社製の電気マッフル炉ＯＰＭ−２８Ｄを用いて、大気下、８００℃で２時間焼成した。この操作は急熱急冷で行った。
手順（ＩＩ）：Ｈ２３％−Ａｒガス（１気圧）の存在下、手順（Ｉ）で得られた焼成後のセラミックスを電気炉（光洋リンドバーグ（株）社製のチューブ炉）で、５５０℃、２時間の条件下に水素還元した。電気炉のＨ２３％−Ａｒガス（０．１ＭＰａ）流入口の直前に酸除去カラム（ジーエルサイエンス（株）社製の大型オキシゲントラップ）を、原料セラミックスが入った電気炉の前後にＰ２Ｏ５を設置することによって、ガス中の微量酸素、反応で発生する水分を除去しながら還元処理を行った。還元処理前に炉内を真空排気した後に、Ｈ２３％−Ａｒガスで満たした。反応中のガス流量は１００ｃｃｍとした。昇温速度は１０℃／ｍｉｎで冷却は急冷とした。
手順（ＩＩＩ）：実施例１の手順（ＩＩ）で得られたサンプルを大気下、２５０℃で２時間、アドバンテック社製の電気マッフル炉ＯＰＭ−２８Ｄを用いて加熱した。この操作は急熱急冷で行った。【０１６７】
３．スフェロイド形成
（３−１．ＨｅｐＧ２細胞におけるスフェロイド形成）
１０％−ＦＢＳ，ＤＭＥＭ培地中にＬ−ＢＩＯＸを１ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁し、非接着性培養皿に注入後、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞及びＨｅｐＧ２細胞をそれぞれ１×１０４個／ｍｌの終濃度で播種して５％のＣＯ２，３７℃で４日間培養するとＬ−ＢＩＯＸ上に細胞が接着して形成したスフェロイドが観察された（図１）。培地上清の交換は培養開始から２日後に行った。【０１６８】
Ｌ−ＢＩＯＸの存在下で形成されたＨｅｐＧ２細胞のスフェロイドは、培養１０日後には１ｍｍを超える大きさに成長した（図２Ａ−Ｃ）。ＨｅｐＧ２細胞はＬ−ＢＩＯＸ上に凝集して周囲のＬ−ＢＩＯＸを取り込みながら成長する様子が観察された。このように、Ｌ−ＢＩＯＸを用いて細胞をスフェロイド培養することで巨大なスフェロイドの作製に成功した。【０１６９】
一方、Ｌ−ＢＩＯＸ無しで非接着性培養皿上に同濃度のＨｅｐＧ２細胞を播種した場合はスフェロイドの直径が大きくても約２００μｍであった（図２Ｄ−Ｅ）。培地上清の交換は培養開始から２日〜３日毎に行い、培養７日目からは毎日行った。【０１７０】
（３−２．ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞及びマウスＬｅｗｉｓ肺癌（ＬＬＣ）細胞におけるスフェロイド形成）
ＨｅｐＧ２細胞以外にも、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞及びマウスＬｅｗｉｓ肺癌（ＬＬＣ）細胞でもＬ−ＢＩＯＸ上での巨大なスフェロイドの作製が確認された（図示せず）。また、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞は、磁性Ｌ−ＢＩＯＸ上でも巨大スフェロイドが形成された（図３）。【０１７１】
（３−３．癌幹細胞におけるスフェロイド形成）
０．１ｍＭのＮＥＡＡ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及びＩＴＳサプリメントを含むＤＭＥＭ培地中にＬ−ＢＩＯＸを１ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁し、非接着性培養容器に注入後、マウスｉＰＳ（ｍｉＰＳ；ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−２０Ｄ−１７）より作製したがん幹細胞モデル細胞であるｍｉＰＳ−ＬＬＣｃｍ細胞（前掲のＣｈｅｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．の論文に記載）を１×１０５個／ｍｌの終濃度で播種して５％のＣＯ２，３７℃で７日間培養するとＬ−ＢＩＯＸ上に細胞が接着して形成したスフェロイドが観察された（図４）。培地上清の交換は行わなかった。【０１７２】
図４に示す結果から、Ｌ−ＢＩＯＸを添加した場合、２０００μｍ近くの大きさスフェロイドが形成されるのに対し、Ｌ−ＢＩＯＸを添加しない場合には２００μｍ程度の大きさにまでしか成長しなかった。また、培養開始から１８日目の結果からは、Ｌ−ＢＩＯＸを添加した場合に得られるスフェロイドが、無添加の場合と比較して８倍程度もの大きさにまで成長することが明らかとなった。【０１７３】
スフェロイドを前記の倒立型光学顕微鏡を用いて、水銀ランプとミラーユニットＷＩＢ（Ｕ−ＭＷＩＢ３（励起フィルタ：ＢＰ４６０−４９５、吸収フィルタＢＡ５１０ＩＦ、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）で蛍光観察した結果からスフェロイドでＧＦＰ蛍光が一様に認められ（図５Ｂ）、Ｎａｎｏｇの発現すなわち幹細胞としての性質が維持されていることが確認できた。【０１７４】
（３−４．ｉＰＳ細胞におけるスフェロイド形成）
０．１ｍＭのＮＥＡＡ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及びＩＴＳサプリメントを含むＤＭＥＭ培地中にＬ−ＢＩＯＸを１ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁し、ｍｉＰＳ（ｍｉＰＳ；ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−２０Ｄ−１７）を１×１０４個／ｍｌの終濃度で播種して５％のＣＯ２，３７℃で７日間培養すると、Ｌ−ＢＩＯＸ上では細胞塊が形成され、ＧＦＰの蛍光が非常に強く観察された（図６Ｂ）が、Ｌ−ＢＩＯＸなしではＧＦＰの蛍光が観察されなかった（図６Ｅ）。培地は２日毎に交換した。Ｌ−ＢＩＯＸ上で培養を行うと、フィーダー細胞なしで多分化能を維持した培養が出来る可能性がある。【０１７５】
４．バイオジナス酸化鉄の量がスフェロイド形成に与える効果
１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中に添加するＬ−ＢＩＯＸ又はＧ−ＢＩＯＸの量がスフェロイド形成に与える効果を評価する目的で、非接着性培養皿上にＢＩＯＸを０，０．１，０．５，１及び２ｍｇ／ｍｌの最終濃度となるように濃度で懸濁した後、１×１０４個／ｍｌの終濃度でＨｅｐＧ２細胞を播種し、５％のＣＯ２，３７℃で培養を行い、培養２日後及び４日後にそれぞれ１０個以上のスフェロイドを無作為に選択し、その直径を測定した（図７Ａ−Ｂ）。それぞれの平均の値をグラフにした。培地上清の交換は培養開始から２日後に行った。Ｌ−ＢＩＯＸを添加して培養すると、Ｌ−ＢＩＯＸを添加しない非接着性培養皿上での培養に比べていずれの濃度でもスフェロイド形成が促進される傾向にあったが、特に１ｍｇ／ｍｌの濃度でスフェロイド形成促進効果が顕著であった（図７Ａ）。レプトスリックス・オクラセアが生成する酸化鉄は中空であるため、Ｌ−ＢＩＯＸによりスフェロイド内部にまで養分や酸素等の供給、培養液の交換がより効果的になされ、Ｇ−ＢＩＯＸの場合（図７Ｂ）に比べてスフェロイドの状態をより良好に維持できたと考えられる。【０１７６】
５．培養日数とスフェロイド径の関係
１ｍｇ／ｍｌの終濃度のＬ−ＢＩＯＸを１０％−ＦＢＳ，ＤＭＥＭ培地中に添加してＨｅｐＧ２細胞を１×１０４個／ｍｌの終濃度で播種し、５％のＣＯ２，３７℃で培養を１０日間継続すると、Ｌ−ＢＩＯＸを添加しない非接着性培養皿上での培養と比較してスフェロイドの直径が６倍以上になった（図８）。培地上清の交換は２日〜３日毎に行い、培養７日目からは毎日行った。【０１７７】
６．バイオジナス酸化鉄と他の担体粒子との比較
Ｌ−ＢＩＯＸ、市販のアモルファスシリカ粒子（Ａｅｒｏｓｉｌ  ３００、東新化成株式会社）、市販の酸化鉄粒子（αＦｅ２Ｏ３）をそれぞれ終濃度１ｍｇ／ｍｌで１０％−ＦＢＳ，ＤＭＥＭ培地中に懸濁してＨｅｐＧ２細胞を１×１０４個／ｍｌの終濃度で播種し、５％のＣＯ２，３７℃で培養を５日間培養した。培地上清の交換は培養開始後２日目に行った。Ｌ−ＢＩＯＸ上のスフェロイドは直径が２００μｍを超える大きさに成長したのに対し、Ａｅｒｏｓｉｌ、酸化鉄及び担体を添加しない非接着性培養皿上では大きいスフェロイドでも直径は２００μｍ以下であった（図９Ａ−Ｄ）。【０１７８】
また、マイクロキャリアビーズ（ＨｙＱ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ，  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１ｍｇ／ｍｌの終濃度で１０％−ＦＢＳ，ＤＭＥＭ培地に添加してＨｅｐＧ２細胞を１×１０４個／ｍｌの終濃度で播種し、５％のＣＯ２，３７℃で２週間培養した場合、ビーズ表面上に細胞が付着して増殖する様子が観察されたが、スフェロイドは形成されなかった（図１０Ａ−Ｄ）。【０１７９】
７．ＨｅｐＧ２細胞によるヒト血清アルブミン生産
ＨｅｐＧ２は細胞分化の指標としてアルブミンタンパク質を分泌する。０及び１ｍｇ／ｍｌの終濃度のＬ−ＢＩＯＸを１０％−ＦＢＳ，ＤＭＥＭ培地中に添加してＨｅｐＧ２細胞を１×１０４個／ｍｌの終濃度で播種し、５％のＣＯ２，３７℃で培養を１０日間培養した。培地上清の交換は２日〜３日毎に行い、培養７日目からは毎日行った。培養１０日後にＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地に交換して２日間、５％のＣＯ２，３７℃でインキュベートした後、培地上清を回収した。また、接着性培養皿で１０％−ＦＢＳ，ＤＭＥＭ培地、５％ＣＯ２，３７℃で２日間培養したＨｅｐＧ２細胞の培地からＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地に交換して更に２日間、同様に培養して培地上清を回収した。回収した上清のそれぞれ１０μｌずつをウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）解析に供した。【０１８０】
ウェスタンブロッティングは以下のように行った。つまり、培養上清各１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してセミドライ式ブロッティング装置を用いてＰＶＤＦ膜にブロッティングした後、１０％スキムミルクＴＢＳＴでブロッキングを行い、ＴＢＳＴで洗浄後、一次抗体の抗ヒト血清アルブミン抗体（ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，ＣＳＴジャパン製、＃４９２９）を４℃で一晩反応させ、ＴＢＳＴで洗浄後、二次抗体のＨＲＰ標識抗ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ抗体（ｇｏａｔ，  ＣＳＴジャパン製、＃７０７１）を室温で３０分反応させ、洗浄後、ＨＲＰ基質Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｐｌｕｓ−ＥＣＬ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅａｇｅｎｔ  （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を添加し、Ｌｉｇｈｔ−Ｃａｐｔｕｒｅ  ＩＩ  ｃｏｏｌｅｄ  ＣＣＤ  ｃａｍｅｒａ  ｓｙｓｔｅｍ（ＡＴＴＯ社製）で撮影した。バンドの強度を画像解析ソフトＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊで定量した。【０１８１】
接着性培養皿で培養した場合と比較して、Ｌ−ＢＩＯＸを添加した培養物ではアルブミンの分泌量が約３倍に増加していることが分かった（図１１Ａ−Ｂ）。ウェスタンブロッティングによるバンド強度の比較から約１４０ｍｇ／Ｌのアルブミンが培地中に分泌されていた。このように、肝臓癌由来細胞をＬ−ＢＩＯＸを用いてスフェロイド培養することにより、アルブミンタンパク質の生産量が著しく上昇した。アルブミンの分泌量が著しく上昇したことから、ＨｅｐＧ２細胞において分化シグナルが促進されていると考えられ、従来技術よりも生体内に近い細胞を培養することができたと考えられる。【０１８２】
８．スピナーフラスコでのＨｅｐＧ２細胞の培養及びヒト血清アルブミン生産
Ｌ−ＢＩＯＸとＨｅｐＧ２細胞をそれぞれ１０倍の濃度にして、すなわち１０ｍｇ／ｍｌの終濃度のＬ−ＢＩＯＸを１０％−ＦＢＳ，ＤＭＥＭ培地中に添加してＨｅｐＧ２細胞を１×１０５個／ｍｌの終濃度で播種した。２０ｍｌ容のスピナーフラスコ内で撹拌しながら５％のＣＯ２，３７℃で１０日間培養した。培地上清の交換は２日〜３日毎に行い、培養上清はそれぞれ回収した。培養１０日後にＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地に交換して２日間、５％のＣＯ２，３７℃でインキュベートした後、培地上清を回収した。培養期間内に回収した上清に含まれるヒト血清アルブミン量をイライザ法によって定量した。イライザ法は、市販のＡｌｂｕｍｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＩＮＣ社製）を用いて製造業者のプロトコルに従って行い、９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅとしてＥＩＡプレート（６５５０６１、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ社製）を用いた。【０１８３】
その結果、１Ｌスケールの培養当り合計約２００ｍｇのヒト血清アルブミンが分泌されていることが判った。【０１８４】
９．バイオジナス酸化鉄の形状の検討
上記３−４「ｉＰＳ細胞におけるスフェロイド形成」の項で説明した条件と同様にして、チューブ状のＬ−ＢＩＯＸを終濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように培地に添加してｍｉＰＳを培養した。培養から３日目の蛍光顕微鏡による観察結果を図１２Ａに示す。すると、直径３００μｍ程度の細胞塊が形成されることが確認された。【０１８５】
一方で、上述のチューブ状のＬ−ＢＩＯＸに代えて、これをボールミルで粉砕して粉末状にしたもの用いて培養した場合には、細胞塊の形成を確認することはできなかった（図１２Ｂ）。【０１８６】
次いで、チューブ状のＬ−ＢＩＯＸを用いて培養して得られた細胞を、共焦点蛍光顕微鏡を用いてそれが発現するＧＦＰを検出することにより観察した。得られた細胞の内部においても、ＧＦＰの発現が確認された（図１２Ｃ）。また、これを三次元再構成した結果（図１２Ｄ）から、より明確に細胞塊全体においてＧＦＰの発現が確認された。ＧＦＰはＮａｎｏｇプロモーターの下流に配置されている。従って、ＧＦＰが著量発現していることから得られたｍｉＰＳ細胞の細胞塊が未分化な状態維持していることが明らかとなった。【０１８７】
チューブ状のＬ−ＢＩＯＸを用いて培養して得られたｍｉＰＳ細胞の細胞塊のｍＲＮＡを抽出し、内在性遺伝子の発現（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｉｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｅｆｔｙ−１、及びＬｅｆｔｙ−２）及び総遺伝子の発現（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）の量を測定した。結果を図１３Ａ−Ｂに示す。【０１８８】
この結果、各遺伝子の発現量において、内在性遺伝子と総遺伝子との間の発現量には大きな変化は認められず、ｍｉＰＳ細胞が未分化な状態を維持していることが明らかであった。また、Ｋｌｆ４、Ｌｅｆｔｙ１、及びＬｅｆｔｙ２の内在性遺伝子の発現量が僅かに増加していることから、活性型のガン抑制遺伝子の生産にも利用できる可能性を示唆している。【０１８９】
１０．ガン幹細胞モデルでの検討
上記３−４「癌幹細胞におけるスフェロイド形成」の項で説明した条件と同様にして、ガン幹細胞モデル細胞であるｍｉＰＳ−ＬＬＣｃｍ細胞を培養した。なお、この細胞は、未分化マーカーであるＮａｎｏｇプロモーターの下流にＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子が組み込まれているために、細胞が未分化状態を維持していれば、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ存在下でも生存維持効果を発揮する。
そこで、培養開始７日目から毎日、培地にＰｕｒｏｍｙｃｉｎを最終濃度が１μｇ／ｍＬとなるように添加して、そのまま１２日間培養を続けた。その結果を図１４に示す。この結果、Ｌ−ＢＩＯＸを添加なかった場合、ｍｉＰＳ−ＬＬＣｃｍ細胞の細胞塊は培養から１日目に崩壊してしまい１００μｍ程度の大きさとなってしまった。
一方で、Ｌ−ＢＩＯＸを添加した場合、ｍｉＰＳ−ＬＬＣｃｍ細胞の細胞塊は、その大きさを維持していることが明らかとなった。そして、大きさが維持された細胞塊は、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ存在下で培養しても死滅することが無かったため、Ｎａｎｏｇ遺伝子を発現し、未分化な状態を維持していることも明らかとなった。これによって、均一な状態のがん幹細胞を一度に大量に培養できることが示唆される。これによって、生体内でがん幹細胞からがん細胞に分化する過程の解析やがん化誘導因子の解析、標的分子の解析に有効となることが考えられる。
【図１】
2014030641.tif 000002
【図２】
2014030641.tif 000003
【図３】
2014030641.tif 000004
【図４】
2014030641.tif 000005
【図５】
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【図６】
2014030641.tif 000007
【図７】
2014030641.tif 000008
【図８】
2014030641.tif 000009
【図９】
2014030641.tif 000010
【図１０】
2014030641.tif 000011
【図１１】
2014030641.tif 000012
【図１２】
2014030641.tif 000013
【図１３】
2014030641.tif 000014
【図１４】
2014030641.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成25年12月26日(2013.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物由来のセラミックスを有効成分とする、真核細胞の三次元培養用添加剤。
【請求項２】
微生物由来のセラミックスが、酸化鉄を含む、請求項１に記載の三次元培養用添加剤。
【請求項３】
微生物由来のセラミックスが、更にリンを含む、項１又は２に記載の三次元培養用添加剤。
【請求項４】
微生物由来のセラミックスの形状が、中空チューブ状、中空繊維状鞘状、螺旋状、枝分かれしたチューブ状、枝分かれした糸状、ハープ状、扇状、短幹状、カプセル状、及び球状からなる群より選択される何れかである、請求項１〜３の何れか１項に記載の添加剤
【請求項５】
微生物由来のセラミックスの形状が、中空チューブ状である、請求項１〜４の何れか１項に記載の添加剤。
【請求項６】
微生物由来のセラミックスの長さが、０．１〜３０００μｍである、請求項１〜５の何れか１項に記載の添加剤。
【請求項７】
微生物由来のセラミックスが、磁性体である、請求項１〜６の何れか一項に記載の添加剤。
【請求項８】
酸化鉄が、α−Ｆｅ２Ｏ３、β−Ｆｅ２Ｏ３、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、α−ＦｅＯＯＨ、β−ＦｅＯＯＨ、γ−ＦｅＯＯＨ、及びフェリハイドライトからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２〜７の何れか１項に記載の添加剤。
【請求項９】
真核細胞が、哺乳類細胞及び／又は昆虫細胞である、請求項１〜８の何れか１項に記載の添加剤。
【請求項１０】
真核細胞が、幹細胞及び／又は肝細胞である、請求項１〜９の何れか１項に記載の添加剤。
【請求項１１】
微生物が、トキソシリックス属菌、レプトスリックス属菌、クレノシリックス属菌、クロノシリックス属菌、ガリオネラ属菌、シデロカプサ属菌、シデロコッカス属菌、シデロモナス属菌、及びプランクトミセス属菌からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１〜１０の何れか１項に記載の添加剤。
【請求項１２】
微生物が、レプトスリックス属菌である、請求項１〜１１の何れか１項に記載の添加剤。
【請求項１３】
スフェロイド又は細胞塊形成用である、請求項１〜１２の何れか１項に記載の添加剤。
【請求項１４】
三次元培養が、フィーダー細胞を使用しない、請求項１〜１３の何れか１項に記載の添加剤。
【請求項１５】
真核細胞の三次元培養方法であって、培地に真核細胞及び微生物由来のセラミックスを添加する工程を含む方法。
【請求項１６】
微生物由来のセラミックスが、酸化鉄を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
微生物由来のセラミックスと、其れに担持された真核細胞とを含むスフェロイド又は細胞塊。
【請求項１８】
請求項１５又は１６に記載の方法によって得られる、請求項１７に記載のスフェロイド又は細胞塊。
【請求項１９】
タンパク質又はペプチドの製造用である、請求項１７又は１８に記載のスフェロイド又は細胞塊。
【請求項２０】
薬剤又は脂質のスクリーニング用である、請求項１７又は１８に記載のスフェロイド又は細胞塊。
【請求項２１】
疾病の悪性度鑑別用である、請求項１７又は１８に記載のスフェロイド又は細胞塊。
【請求項２２】
再生医療用である、請求項１７又は１８に記載のスフェロイド又は細胞塊。
【請求項２３】
真核細胞の三次元培養用添加剤としての使用のための、微生物由来のセラミックス。
【請求項２４】
微生物由来のセラミックスが、酸化鉄を含む、請求項２３に記載の微生物由来のセラミックス。
【請求項２５】
真核細胞の三次元培養用添加剤を製造するための、微生物由来のセラミックスの使用。
【請求項２６】
微生物由来のセラミックスが、酸化鉄を含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
タンパク質又はペプチドの製造方法であって、培地に真核細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、及び前記細胞を三次元培養する工程を含む、製造方法。
【請求項２８】
微生物由来のセラミックスが、酸化鉄を含む、請求項２７に記載の製造方法。
【請求項２９】
薬剤又は脂質のスクリーニング方法であって、培地に真核細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、前記細胞を三次元培養する工程、及び前記三次元培養で得られたスフェロイド又は細胞塊と、薬剤又は脂質の候補物質を接触させる工程を含むスクリーニング方法。
【請求項３０】
微生物由来のセラミックスが、酸化鉄を含む、請求項２９に記載のスクリーニング方法。
【請求項３１】
疾病の悪性度の鑑別方法であって、培地に生体から採取した組織片又は腫瘍片に由来する細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、前記細胞を三次元培養する工程、及び前記三次元培養で得られたスフェロイド又は細胞塊を評価する工程を含む鑑別方法。
【請求項３２】
微生物由来のセラミックスが、酸化鉄を含む、請求項３１に記載の鑑別方法。
【請求項３３】
人工組織の製造方法であって、培地に生体から採取した細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、前記細胞を三次元培養する工程、及び前記三次元培養で得られたスフェロイド又は細胞塊を、患者又は治療を要する動物に直接的又は間接的に注入する工程を含む製造方法。
【請求項３４】
微生物由来のセラミックスが、酸化鉄を含む、請求項３３に記載の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
真像。バーは１００μｍを示す。（Ｃ）は（Ａ）拡大像。バーは２０μｍを示す。（Ｄ）は（Ａ）を三次元再構成した像。
［図１３］Ｌ−ＢＩＯＸを用いて三次元培養したｍｉＰＳ細胞における遺伝子の発現量を検討した結果を示す図。（Ａ）は内在性発現遺伝子、（Ｂ）は総発現遺伝子を示す。グラフの縦軸は、接着ディッシュ上でフィーダレス培養したｍｉＰＳ細胞での発現量を基準（値を１）とした相対発現量を示す。
［図１４］Ｌ−ＢＩＯＸを用いて三次元培養したガン幹細胞モデル細胞（ｍｉＰＳ−ＬＬＣｃｍ）細胞における遺伝子の発現量を検討した結果を示す図。グラフの縦軸は三次元培養で得られた細胞塊の直径（μｍ）を示し、横軸は培養日数を示す。グラフ中の四角は、Ｌ−ＢＩＯＸ及びＰｕｒｉｍｙｃｉｎを添加したもの、グラフ中の丸は、Ｌ−ＢＩＯＸを添加せず、Ｐｕｒｉｍｙｃｉｎを添加したものを示す。また、横軸の矢印はＰｕｒｉｍｙｃｉｎを添加した日を示し、グラフ中の写真像は、それぞれ三次元培養した際の細胞塊の写真像を示すものである。バーは５００μｍを示す。
発明を実施するための形態
［００４６］
〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕
本発明の真核細胞の三次元培養用添加剤は、微生物由来のセラミックスを有効成分とする。すなわち、本発明における微生物由来セラミックスは、真核細胞の三次元培養用添加剤に使用することができる。そして、前記微生物由来のセラミックスは、真核細胞の三次元培養用添加剤の製造に使用される。
［００４７］
上述の微生物由来のセラミックスとは、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明する「微生物が生成した酸化鉄」に該当する。より具体的には上記酸化鉄の他に、
（ｉ）微生物が生成した酸化鉄に加熱処理を施すことにより磁性セラミックスとしたもの、
（ｉｉ）微生物が生成した酸化鉄を酸処理しＦｅ成分を溶解除去することにより多孔質アモルファスシリカとしたもの、及び
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
（ｉｉｉ）微生物が生成した酸化鉄、磁性セラミックス、又は多孔質アモルファスシリカの有機基で化学修飾し得る部分（例えば、Ｆｅ原子及び／又はＳｉ原子に結合した酸素原子）の少なくとも一部を有機基で化学修飾して得られた有機・無機材料
が、本発明の微生物由来のセラミックスに包含される。
［００４８］
本発明の三次元培養用添加剤に有効成分として含有される微生物由来のセラミックスには、酸化鉄及び／又はシリカが含有される。さらに、リンを含有することもできる。そして、後述する本発明の微生物をコバルト、ニッケル、マンガン等の遷移金属元素やネオジウム等の希土類元素等が存在する環境下で培養することにより、微生物由来のセラミックスにこれらの元素を含有させ得る。これらの元素を含有させれば、鉄以外の物質に由来する磁性を本発明の磁性セラミックスに付与できる。また、ナトリウム、マグネシウム、アルミニウムのような軽元素も含有させることもできる。
［００４９］
また、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明する国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号に記載のように、上述のセラミックスの構成成分として、鉄、シリカ、及びリンの元素比率は原子数％（ａｔ％）で、通常は、６６〜８７：２〜２７：１〜３２程度である。
［００５０］
上述の酸化鉄とは、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明の詳細な説明、及びこれを説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号に記載の「酸化鉄」であることができる。
［００５１］
なお、上記「酸化鉄」にて示されるフェリハイドライトとは、低結晶性の酸化鉄を意味し、Ｘ線回折パターンに現れるピークの数によって２−ｌｉｎｅ  ｆｅｒｒｉｈｙｄｒｉｔｅや６−ｌｉｎｅ  ｆｅｒｒｉｈｙｄｒｉｔｅ等と呼ばれている。２−ｌｉｎｅ  ｆｅｒｒｉｈｙｄｒｉｔｅの組成はＦｅ４（Ｏ，ＯＨ，Ｈ２Ｏ）で、６−ｌｉｎｅ  ｆｅｒｒｉｈｙｄｒｉｔｅの組成はＦｅ４．６（Ｏ，ＯＨ，Ｈ２Ｏ）１２とされている（Ｒ．Ａ．Ｅｇｇｌｅｔｏｎ
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
る環境下で培養することにより、微生物由来のセラミックスにこれらの元素を含有させることができる。これらの元素を含有させることで、鉄以外の物質に由来する磁性を本発明の磁性セラミックスに付与できる。また、ナトリウム、マグネシウム、アルミニウム等のような軽元素を含有させてもよい。
［００６４］
また、本発明の磁性セラミックスが鉄に加えて、ケイ素及びリンを含有する場合、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号にて記載されるように、通常、磁性セラミックスに含有されるＦｅ３Ｏ４及びγ−Ｆｅ２Ｏ３と、ケイ素及びリンとは固溶しておらず、鉄、ケイ素及びリンはそれぞれ相分離したものとすることができる。なお、ケイ素及びリンを含む場合、本発明の磁性セラミックスのＸ線回折（ＸＲＤ）パターンにケイ素及びリンに起因する明瞭なピークが確認されないことから、ケイ素及びリンはアモルファス構造の酸化物を形成したものとすることができる。この様なアモルファス相の主成分は、アモルファスシリカであることが好ましい。
［００６５］
本発明の磁性セラミックスの結晶子サイズは、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号にて記載されるように、通常は、５〜１００ｎｍ程度である。
［００６６］
また、本発明の磁性セラミックスに含有される酸化鉄がＦｅ３Ｏ４の単一相である場合、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明している国際公開第２０１０／１１０４３５号及び国際公開第２０１１／０７４５８７号にて記載されるように、磁性セラミックスに含有される鉄の、通常は、約６割程度がＦｅ３Ｏ４であり、約４割程度が常磁性のＦｅ２＋及びＦｅ３＋である。一方、本発明の磁性セラミックスに含有される酸化鉄がγ−Ｆｅ２Ｏ３の単一相である場合、磁性セラミックスに含まれる鉄の、通常は、約７割程度がγ−Ｆｅ２Ｏ３であり、約３割程度が常磁性のＦｅ２＋及びＦｅ３＋である。
［００６７］
なお、常磁性のＦｅ２＋及びＦｅ３＋が、前記のアモルファス相を構成するＦ
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
来のセラミックスそのものを、本発明の三次元培養用添加剤であることができる。
［００８０］
上述の真核細胞は、特に限定はされないが、例えば哺乳類細胞、昆虫細胞等が挙げられる。
［００８１］
例えば、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明する細胞であることができ、中でも、幹細胞又は肝細胞が好ましい。
［００８２］
本発明の三次元培養用添加剤は、スフェロイド又は細胞塊の形成用の添加剤であることができる。
［００８３］
なお、三次元培養とは、平面的に単層で細胞を増殖させるものとは異なり、細胞同士を接着させながら増殖させ、立体的な細胞塊又はスフェロイドを形成させるものである。
［００８４］
本発明の三次元培養用添加剤の使用量は、特に限定はされないが、適当な培地に対して、上述の微生物由来のセラミックスの量に換算した最終濃度が０．１〜５ｍｇ／ｍｌ程度、好ましくは、０．５〜３ｍｇ／ｍＬ程度、より好ましくは１．０〜２．０ｍｇ／ｍＬ程度である。
［００８５］
本発明の三次元培養用添加剤は、フィーダー細胞を用いることなく使用することが可能である。
［００８６］
〔真核細胞の三次元培養方法〕
本発明の真核細胞の三次元培養方法は、培地に微生物由来のセラミックスを添加する工程を含む。
［００８７］
真核細胞とは、上述の〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕に関する説明と同様であることができる。
［００８８］
微生物由来のセラミックスとは上述の〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕に関する説明と同様であることができる。
［００８９］
培地とは、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明の詳細な説明と同様であることができる。
［００９０］
培養条件、培養環境等に関する具体的な培養方法は、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明の詳細な説明と同様であることができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
物に由来するセラミックスを添加する工程、及び前記細胞を三次元培養する工程を含む。
［００９９］
タンパク質又はペプチドは後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明の詳細な説明と同様であることができる。
［０１００］
培地は、上述の〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕に関する説明と同様であることができる。
［０１０１］
真核細胞は、上述の〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕に関する説明と同様であることができる。
［０１０２］
微生物に由来するセラミックス並びにその添加量は、上述の〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕及び〔真核細胞の三次元培養方法〕に関する説明と同様であることができる。
［０１０３］
具体的な三次元培養の方法は、上述の〔真核細胞の三次元培養方法〕に関する説明と同様であることができる。
［０１０４］
また、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明の詳細な説明に記載される各種のタンパク質又はペプチドの製造技術を適宜採用してもよい。この様なタンパク質ペプチド又は、予め前記タンパク質又はペプチドをコードする遺伝子が導入され、これらを発現する真核細胞から得られるリコンビナントタンパク質又はペプチドであることができ、真核細胞に起源的に発現している内在性のタンパク質又はペプチドであることもできる。
［０１０５］
〔薬剤又は脂質のスクリーニング方法〕
本発明の薬剤又は脂質のスクリーニング方法は、培地に真核細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、前記細胞を三次元培養する工程、及び前記三次元培養で得られたスフェロイド又は細胞塊と、薬剤又は脂質の候補物質を接触させる工程を含む。
［０１０６］
薬剤又は脂質とは、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明の詳細な説明と同様であることができる。
［０１０７］
培地、真核細胞、及び微生物に由来するセラミックスとは、上述の〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕及び〔真核細胞の三次元培養方法〕に関する説
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
明と同様であることができる。
［０１０８］
具体的な三次元培養の方法は、上述の〔真核細胞の三次元培養方法〕に関する説明と同様であることができる。
［０１０９］
スクリーニング方法では、上述の薬剤又は脂質の候補物質と三次元培養で得られたスフェロイド又は細胞塊を接触させたのち、斯かる三次元培養でスフェロイド又は細胞塊における生体反応を指標として、薬剤又は脂質をスクリーニングすればよい。
［０１１０］
生体反応の指標とは、スクリーニングを所望する薬剤又は脂質が、スフェロイド又は細胞塊において発揮する作用を基に選択すればよく、特に限定はされない。
［０１１１］
また、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明の詳細な説明に記載される各種のスクリーニング技術を適宜採用してもよい。
［０１１２］
本発明の薬剤又は脂質のスクリーニング方法として、例えば、がん治療薬の薬剤スクリーニングであれば、上述のスフェロイド又は細胞塊に候補となるガン治療薬を曝露して培養した後に、ＭＴＴアッセイ等による増殖抑制効果を測定してＩＣ５０を算出し、その数値が設定した基準値よりも低い結果を示すスフェロイド又は細胞塊に曝露したがん治療薬を所望のガン治療薬として選択する工程；上述の曝露後のスフェロイド又は細胞塊を染色して固定した後に、公知の方法を用いて生死判定を行い、死んだスフェロイド又は細胞塊に曝露させたガン治療薬を所望のがん治療薬として選択する工程；上記固定後のスフェロイド又は細胞塊にＴＵＮＥＬ染色法等によるアポトーシスの検出を行って、アポトーシスを引き起こしているスフェロイド又は細胞塊に曝露したガン治療薬を、所望のがん治療薬として選択する工程等を挙げることができる。
［０１１３］
また、脂質のスクリーニングでは、候補脂質をスフェロイド又は細胞塊に曝露して培養した後に、培養上清、スフェロイド、又は細胞塊から脂質代謝産物を測定し、測定した量が多い場合に所望の脂質として選択する工程を含む方法、蛍光ラベルした候補脂質のスフェロイド又は細胞塊内への取込みや
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
スフェロイド又は細胞塊内での移行を評価し、所望の動態を示す脂質を選択する工程を含む方法等が挙げられる。
［０１１４］
〔疾病の悪性度の鑑別方法〕
本発明の疾病の悪性度の鑑別方法は、培地に生体から採取した組織片又は腫瘍片に由来する細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、前記細胞を三次元培養する工程、及び前記三次元培養で得られたスフェロイド又は細胞塊を評価する工程を含む。
［０１１５］
疾病とは、特に限定はされないが、例えばガン等が挙げられる。悪性度とは、例えば疾病の進行度合いを示すものであり、特に限定はされない。
［０１１６］
生体から採取した組織片又は腫瘍片とは、特に限定はされないが、疾病の悪性度を検討する上において、有用な部位から採取すればよい。また、生体とは特に限定はされないが、例えば後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明の詳細な説明における哺乳類等を参照することができる。
［０１１７］
培地及び微生物に由来するセラミックスとは、上述の〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕及び〔真核細胞の三次元培養方法〕に関する説明と同様とすることができる。
［０１１８］
具体的な三次元培養の方法は、上述の〔真核細胞の三次元培養方法〕に関する説明と同様とすることができる。
［０１１９］
鑑別方法では、三次元培養によって得られたスフェロイド又は細胞塊を公知の方法にて解析又は観察することによって、公知の診断技術を採用し、疾患の悪性度を鑑別とすることができるが、特に限定はされない。
［０１２０］
また、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明の詳細な説明に記載される各種の鑑別技術を適宜採用することができる。
［０１２１］
本発明の疾病の悪性度の鑑別方法として、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＣＤ４４タンパク質が高発現で、且つＣＤ２４タンパク質が低発現の上記スフェロイド又は細胞塊、又はＣＤ１３３タンパク質が高発現するスフェロイド又は細胞塊の割合をフローサイトメトリーで測定する工程を含む方法；これらの遺伝子およびタンパク質のスフェロイド又は細胞塊における発現量
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
を、ｑＰＣＲ法、ウエスタンブロッティング法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、免疫染色法等を用いて検出する工程を含む方法等が挙げられる。
［０１２２］
また、上記スフェロイド又は細胞塊をＷｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ法、トランスウェル等に供し、遊走能を評価する工程、マトリゲルを用いて浸潤能を評価する工程を含む悪性度の鑑別方法が挙げられる。
［０１２３］
更に、マウスに上記スフェロイド又は細胞塊を移植して担癌マウスを作製した後に、がん組織を摘出し、病理組織学的診断を行う工程を含む方法が挙げられる。この場合、さらに移植部位以外に転移が観察できれば悪性度は高い判断することもできる。
［０１２４］］
〔本発明の人工組織の製造方法〕
本発明の人工組織の製造方法は、培地に生体から採取した細胞及び微生物に由来するセラミックスを添加する工程、前記細胞を三次元培養する工程、及び前記三次元培養で得られたスフェロイド又は細胞塊を、患者又は治療を要する動物に直接的又は間接的に注入する工程を含む。
［０１２５］
生体から採取する細胞又は組織とは、特に限定はされないが、疾病の悪性度を検討する上において、有用な部位から採取することができる。また、生体とは特に限定はされないが、例えば後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明の詳細な説明における哺乳類等を参照することができる。
［０１２６］
患者又は治療を要する動物とは特に限定はされないが、例えば後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明の詳細な説明における哺乳類等を参照することができる。
［０１２７］
直接的又は間接的に注入する工程とは、特に限定はされないが、再生医療分野にて用いられる公知の注入方法を適宜採用することができる。
［０１２８］
培地及び微生物に由来するセラミックスとは、上述の〔真核細胞の三次元培養用添加剤〕及び〔真核細胞の三次元培養方法〕に関する説明と同様であることができる。
［０１２９］
具体的な三次元培養の方法は、上述の〔真核細胞の三次元培養方法〕に関
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
する説明と同様であることができる。
［０１３０］
また、後出の前記項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明の詳細な説明に記載される各種の再生医療に用いられる技術を適宜採用することができる。
［０１３１］
本発明の人工組織の製造方法として、例えば骨芽細胞作製を目的とした場合であれば、特開２００６−１２９７３４号公報、ＰｌｏｓＯｎｅ，２０１３，Ｖｏｌ．８（１）ｅ５３７７１に記載の様に、上記スフェロイド又は細胞塊（特に、骨芽細胞を含むもの）に対してデキサメタゾン及びβグリセロフォスフェートなどを添加して培養する工程を含む方法が挙げられ、これによって人工組織（特に骨組織、軟骨組織等）を提供することができる。
また、三次元培養後して上記スフェロイド又は細胞塊を作成した後に、公知の方法を用いて酸化鉄を除去する工程に供した後に、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１２，Ｖｏｌ．２（５），１４４８−１４６０、特願２００２−２９４０７１号公報等に記載の方法が挙げられ、これによって人工組織（心筋）を提供することができる。
［０１３２］
以下に、上述した項Ａ１〜Ａ１７に示す態様の発明を詳細に説明する。ただし、本発明が以下に説明される発明に限定されないのは言うまでもない。
［０１３３］
本明細書において、複数の細胞が凝集して三次元の球状細胞塊になったものを「スフェロイド」という。スフェロイドを形成及び／又は維持することは、スフェロイドの生理機能が生体組織により近いことを示す。
［０１３４］
本発明の細胞培養物は、細胞と、微生物が生成した酸化鉄とを含む。微生物が生成した酸化鉄は、細胞を増殖させるための担体又は支持体として機能し、細胞培養物中の細胞は、微生物が生成した酸化鉄を細胞間に取り込みながら細胞間で接着して増殖する。
［０１３５］
細胞
細胞は、培地中で増殖させることができる細胞であれば特に限定されず、動物細胞であることが好ましく、その中でもほ乳類由来の細胞であることがより好ましい。ほ乳類として、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、モルモット、ラット、及びマウスなどが例示
【国際調査報告】
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