(57)【要約】  微小粒子の流路内の通流位置のばらつきによって生じる測定誤差を効果的に補正して、蛍光及び散乱光の強度及びスペクトルを高精度に測定することが可能な技術の提供。  流路を通流する微小粒子に光を照射して該微小粒子から発生する光を検出可能で、該光の強度情報を取得する強度検出手順と、前記微小粒子の位置情報を取得可能な位置検出手順と、前記位置情報に基づいて前記強度情報を補正する補正手順と、を含む、微小粒子測定装置におけるデータ補正方法を提供する。このデータ補正方法では、前記位置検出手順において、前記微小粒子から発生する散乱光から分離され、非点収差を与えられたＳ偏光成分を検出器により受光し、該検出器における前記Ｓ偏光成分の受光位置を前記位置情報として取得する。
2013183345.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路を通流する微小粒子に光を照射して該微小粒子から発生する光を検出可能で、該光の強度情報を取得する強度検出手順と、
前記微小粒子の位置情報を取得可能な位置検出手順と、
前記位置情報に基づいて前記強度情報を補正する補正手順と、を含む、
微小粒子測定装置におけるデータ補正方法。
【請求項２】
前記位置検出手順において、前記位置情報として、前記微小粒子に対する光の照射方向であるＸ軸方向における前記微小粒子の位置情報、及び／又は、前記微小粒子の通流方向であるＹ軸方向と前記Ｘ軸方向とに垂直なＺ軸方向における前記微小粒子の位置情報、を取得する請求項１記載のデータ補正方法。
【請求項３】
前記位置検出手順において、前記微小粒子から発生する散乱光から分離され、非点収差を与えられたＳ偏光成分を検出器により受光し、該検出器における前記Ｓ偏光成分の受光位置を前記位置情報として取得する請求項２記載のデータ補正方法。
【請求項４】
前記位置検出手順において、前記検出器として、受光面が複数領域に分割された検出器を用いる請求項３記載のデータ補正方法。
【請求項５】
前記検出器として、受光面が領域Ａ、領域Ｂ、領域Ｃ、領域Ｄの４つの領域に格子状に分割された検出器を用い、
前記領域Ａと、前記領域Ａに隣接しない前記領域Ｃと、の検出値の差分Δ１（Ａ−Ｃ）から、前記Ｚ軸方向における前記微小粒子の前記位置情報を取得する請求項４記載のデータ補正方法。
【請求項６】
前記位置検出手順において、前記領域Ａと前記領域Ｃの検出値の和（Ａ＋Ｃ）と、前記領域Ｂと前記領域Ｄの検出値の和（Ｂ＋Ｄ）と、の差分Δ２（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））から、前記Ｘ軸方向における前記微小粒子の前記位置情報を取得する請求項５記載のデータ補正方法。
【請求項７】
前記補正手順において、前記差分Δ１及び／又は前記差分Δ２に基づいて前記強度情報を補正する請求項６記載のデータ補正方法。
【請求項８】
前記補正手順において、前記差分Δ１及び／又は前記差分Δ２が所定範囲内である前記微小粒子の前記強度情報のみを抽出する請求項６記載のデータ補正方法。
【請求項９】
前記検出器として、４分割フォトダイオードを用いる請求項７記載のデータ補正方法。
【請求項１０】
流路を通流する微小粒子に光を照射する光照射部と、
前記微小粒子から発生する光を検出する光検出部と、
前記微小粒子の位置情報を取得する位置検出部と、
前記光検出部により取得された前記微小粒子から発生する光の強度情報を、前記位置情報に基づいて補正する演算部と、を備える微小粒子測定装置。
【請求項１１】
前記位置検出部は、
前記微小粒子から発生する散乱光をＳ偏光成分とＰ偏光成分とに分離する第一分光素子と、
前記Ｓ偏光成分を受光するＳ偏光検出器と、
前記第一分光素子と前記Ｓ偏光検出器との間に配設され、前記Ｓ偏光成分に非点収差を与える非点収差素子と、を有し、
前記Ｓ偏光検出器における前記Ｓ偏光成分の受光位置を前記位置情報として取得する請求項１０記載の微小粒子測定装置。
【請求項１２】
前記Ｓ偏光検出器の受光面が複数領域に分割されている請求項１１記載の微小粒子測定装置。
【請求項１３】
前記Ｓ偏光検出器の受光面が領域Ａ、領域Ｂ、領域Ｃ、領域Ｄの４つの領域に格子状に分割されている請求項１２記載の微小粒子測定装置。
【請求項１４】
前記演算部は、前記領域Ａと、前記領域Ａに隣接しない前記領域Ｃと、の検出値の差分Δ１（Ａ−Ｃ）、及び／又は、
前記領域Ａと前記領域Ｃの検出値の和（Ａ＋Ｃ）と、前記領域Ｂと前記領域Ｄの検出値の和（Ｂ＋Ｄ）と、の差分Δ２（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））、
に基づいて前記強度情報を補正する請求項１３記載の微小粒子測定装置。
【請求項１５】
前記演算部は、前記領域Ａと、前記領域Ａに隣接しない前記領域Ｃと、の検出値の差分Δ１（Ａ−Ｃ）、及び／又は、
前記領域Ａと前記領域Ｃの検出値の和（Ａ＋Ｃ）と、前記領域Ｂと前記領域Ｄの検出値の和（Ｂ＋Ｄ）と、の差分Δ２（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））、
が所定範囲内である前記微小粒子の前記強度情報のみを抽出する請求項１３記載の微小粒子測定装置。
【請求項１６】
前記Ｓ偏光検出器が４分割フォトダイオードである請求項１４記載の微小粒子測定装置。
【請求項１７】
前記非点収差素子がシリンドリカルレンズである請求項１６記載の微小粒子測定装置。
【請求項１８】
前記微小粒子から発生する前記光を前記散乱光と蛍光に分離する第二分光素子を備え、
前記光検出部に、前記Ｐ偏光成分を検出するＰ偏光検出器と、前記蛍光を検出する蛍光検出器と、を有する請求項１７記載の微小粒子測定装置。
【請求項１９】
前記光検出部に、前記蛍光を分光する第三分光素子を有し、
前記蛍光検出器には、前記第三分光素子により分光された前記蛍光を検出する、複数の独立した受光素子が配列されている請求項１８記載の微小粒子測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、微小粒子測定装置におけるデータ補正方法及び微小粒子測定装置に関する。より詳しくは、微小粒子測定装置において、フローセル及びマイクロチップなどに形成された流路内における微小粒子の通流位置のばらつきに起因して生じる測定誤差を補正するデータ補正方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
フローセル及びマイクロチップなどに形成された流路内に微小粒子を含むラミナーフロー（シースフローとも称される）を形成し、ラミナーフロー中の微小粒子に光を照射して微小粒子から発生する蛍光及び散乱光を検出する微小粒子測定装置が知られている。例えばフローサイトメータでは、検出される蛍光又は散乱光の強度又はスペクトルに基づいて細胞及びビーズなどの微小粒子の光学特性を測定し、分析できる。【０００３】
微小粒子測定装置では、流路の概ね中央に微小粒子が通流するようにラミナーフローを形成しているものの、個々の微小粒子の流路内の通流位置にはばらつきがあるため、このばらつきに起因した測定誤差が問題となる。流路内における微小粒子の通流位置のばらつき及びこれに起因した測定誤差は、測定時間を短縮化するため、ラミナーフロー中において微小粒子を含むサンプル液層流の流量をシース液層流の流量に対して増やす場合、特に大きくなる。【０００４】
流路内の通流位置が微小粒子間でばらつくと、微小粒子と、微小粒子への光の照射系及び微小粒子から発生する蛍光及び散乱光の検出系と、の光学的な位置関係が微小粒子間でずれてしまう。その結果、各微小粒子で検出される蛍光及び散乱光の強度及びスペクトルに、光学位置のずれに起因した測定誤差が発生する。【０００５】
特許文献１及び特許文献２には、このような微小粒子の通流位置のばらつきによる測定誤差を抑制するための技術が開示されている。特許文献１に記載の流動粒子分析装置では、前方散乱光、側方散乱光又は後方散乱光から光分割器を介して取りだした検出光（散乱光）を、４分割フォトダイオード及びエリアＣＣＤなどによって検出している。そして、その検出位置から、励起光の中心とシースフローの中心との位置ずれを検出し、この位置ずれが所定の範囲内に入るようにフローセルの位置を調節している。また、特許文献２には、微小粒子から発生する散乱光に生じる偏向角変化を利用して微小粒子の位置情報を検出し、フローセルの位置又は励起光の焦点位置を調整する技術が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平９−１６６５４１号公報
【特許文献２】特開２０１１−１４９８２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
微小粒子の通流位置のばらつきによる測定誤差は、微小粒子から発生する蛍光をスペクトルとして測定する場合にも問題となる。微小粒子から発生する蛍光を、プリズム及びグレーティングミラーなどの分光素子を用いて分光する。そして、分光された蛍光を、ＰＭＴ及びフォトダイオードなどが一次元に配列された受光素子アレイ、あるいはＣＣＤ及びＣＭＯＳなどの二次元受光素子などによって検出する。このとき、微小粒子の通流位置にばらつきが存すると、受光素子アレイ又は二次元受光素子に配された独立した複数の検出チャネルのうちの一つに入射する蛍光の波長範囲が、微小粒子間でずれてしまう場合がある。【０００８】
具体的には、検出チャネルｎに対して、微小粒子ｋから投影される蛍光の波長範囲がλｋ〜λｋ＋１である場合に、流路内の通流位置が微小粒子ｋと異なる微小粒子ｌから投影される蛍光の波長範囲がλｌ〜λｌ＋１となり、（λｋ、λｋ＋１）及び（λｌ、λｌ＋１）の値が異なってしまう場合がある。その結果、各微小粒子で検出される蛍光スペクトルに、検出チャネルｎに入射する蛍光の波長範囲のずれに起因した測定誤差が発生する。【０００９】
本技術は、微小粒子の流路内の通流位置のばらつきによって生じる測定誤差を効果的に補正して、蛍光及び散乱光の強度及びスペクトルを高精度に測定することが可能な技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題解決のため、本技術は、流路を通流する微小粒子に光を照射して該微小粒子から発生する光を検出可能で、該光の強度情報を取得する強度検出手順と、前記微小粒子の位置情報を取得可能な位置検出手順と、前記位置情報に基づいて前記強度情報を補正する補正手順と、を含む、微小粒子測定装置におけるデータ補正方法を提供する。
このデータ補正方法では、前記位置検出手順において、前記位置情報として、前記微小粒子に対する光の照射方向であるＸ軸方向における前記微小粒子の位置情報、及び／又は、前記微小粒子の通流方向であるＹ軸方向と前記Ｘ軸方向とに垂直なＺ軸方向における前記微小粒子の位置情報、を取得してもよい。
このデータ補正方法では、前記位置検出手順において、前記微小粒子から発生する散乱光から分離され、非点収差を与えられたＳ偏光成分を検出器により受光し、該検出器における前記Ｓ偏光成分の受光位置を前記位置情報として取得してもよい。
このデータ補正方法では、前記位置検出手順において、前記検出器として、受光面が複数領域に分割された検出器を用いてもよい。より具体的には、前記検出器として、受光面が領域Ａ、領域Ｂ、領域Ｃ、領域Ｄの４つの領域に格子状に分割された検出器を用いる。そして、前記領域Ａと、前記領域Ａに隣接しない前記領域Ｃと、の検出値の差分Δ１（Ａ−Ｃ）から、前記Ｚ軸方向における前記微小粒子の前記位置情報を取得してもよい。また、前記領域Ａと前記領域Ｃの検出値の和（Ａ＋Ｃ）と、前記領域Ｂと前記領域Ｄの検出値の和（Ｂ＋Ｄ）と、の差分Δ２（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））から、前記Ｘ軸方向における前記微小粒子の前記位置情報を取得してもよい。
このデータ補正方法では、前記補正手順において、前記差分Δ１及び／又は前記差分Δ２に基づいて前記強度情報を補正してもよい。あるいは、前記補正手順において、前記差分Δ１及び／又は前記差分Δ２が所定範囲内である前記微小粒子の前記強度情報のみを抽出してもよい。
このデータ補正方法の前記強度検出手順において、前記微小粒子から発生する前記光を複数の異なる波長域において検出し、前記強度情報を前記光のスペクトル情報として取得する場合には、前記補正手順では、このスペクトル情報を前記位置情報に基づいて補正することもできる。【００１１】
また、本技術は、流路を通流する微小粒子に光を照射する光照射部と、前記微小粒子から発生する光を検出する光検出部と、前記微小粒子の位置情報を取得する位置検出部と、前記光検出部により取得された前記微小粒子から発生する光の強度情報を、前記位置情報に基づいて補正する演算部と、を備える微小粒子測定装置を提供する。
この微小粒子測定装置において、前記位置検出部は、前記微小粒子から発生する散乱光をＳ偏光成分とＰ偏光成分とに分離する第一分光素子と、前記Ｓ偏光成分を受光するＳ偏光検出器と、前記第一分光素子と前記Ｓ偏光検出器との間に配設され、前記Ｓ偏光成分に非点収差を与える非点収差素子と、を有し、前記Ｓ偏光検出器における前記Ｓ偏光成分の受光位置を前記位置情報として取得してもよい。
この微小粒子測定装置において、前記Ｓ偏光検出器は、受光面が複数領域に分割されており、領域Ａ、領域Ｂ、領域Ｃ、領域Ｄの４つの領域に格子状に分割されていてもよい。
この微小粒子測定装置において、前記演算部は、前記領域Ａと、前記領域Ａに隣接しない前記領域Ｃと、の検出値の差分Δ１（Ａ−Ｃ）、及び／又は、前記領域Ａと前記領域Ｃの検出値の和（Ａ＋Ｃ）と、前記領域Ｂと前記領域Ｄの検出値の和（Ｂ＋Ｄ）と、の差分Δ２（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））、に基づいて前記強度情報を補正してもよい。あるいは、前記演算部は、前記領域Ａと、前記領域Ａに隣接しない前記領域Ｃと、の検出値の差分Δ１（Ａ−Ｃ）、及び／又は、前記領域Ａと前記領域Ｃの検出値の和（Ａ＋Ｃ）と、前記領域Ｂと前記領域Ｄの検出値の和（Ｂ＋Ｄ）と、の差分Δ２（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））、が所定範囲内である前記微小粒子の前記強度情報のみを抽出してもよい。
この微小粒子測定装置は、前記微小粒子から発生する前記光を前記散乱光と蛍光に分離する第二分光素子を備え、前記光検出部に、前記Ｐ偏光成分を検出するＰ偏光検出器と、前記蛍光を検出する蛍光検出器と、を有していてもよい。
また、微小粒子測定装置は、前記光検出部に、前記蛍光を分光する第三分光素子を有し、前記蛍光検出器には、前記第三分光素子により分光された前記蛍光を検出する、複数の独立した受光素子が配列されていてもよい。【００１２】
本技術において、「強度情報」には、ある微小粒子から検出される蛍光の波長域、及び該波長域内における蛍光の強度に関する情報が含まれる。より具体的には、「強度情報」には、ある微小粒子から発生する蛍光を受光素子へ導光して検出する場合に、当該受光素子に入射する蛍光の波長域、及び該波長域内における蛍光の強度に関する情報が含まれる。従って、「強度情報の補正」とは、具体的には、ある微小粒子について、受光素子への入射蛍光波長域、及び／又は該波長域内における蛍光強度を、当該微小粒子の位置情報に基づいて補正することを意味する。【００１３】
また、本技術において、「微小粒子」には、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれるものとする。【００１４】
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれる。細胞には、動物細胞(血球系細胞など)および植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。さらに、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。また、工業用粒子は、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。これら微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
【発明の効果】
【００１５】
本技術により、微小粒子の流路内の通流位置のばらつきによって生じる測定誤差を効果的に補正して、蛍光及び散乱光の強度及びスペクトルを高精度に測定することが可能な技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本技術に係る微小粒子測定装置の測定部の構成を説明するための図である。
【図２】Ｓ偏光検出器５１の受光面の構成を説明するための図である。
【図３】流路Ｃを通流するラミナーフローＬと、ラミナーフローＬ中の微小粒子Ｐに照射される励起光１のレーザスポットＳを説明するための図である。
【図４】微小粒子Ｐの通流位置をＺ軸方向に移動させた場合に、蛍光検出器３２の検出結果を元に算出した蛍光３のピーク波長（Ａ）及びピーク強度（Ｂ）の変化を例示するグラフである。
【図５Ａ】微小粒子Ｐの通流位置をＺ軸方向に移動させた場合に蛍光検出器３２により検出される蛍光スペクトルの変化を例示するグラフである。
【図５Ｂ】微小粒子Ｐの通流位置をＺ軸方向に移動させた場合に蛍光検出器３２により検出される蛍光スペクトルの平均値（平均スペクトル）を例示するグラフである。
【図６】微小粒子Ｐの通流位置をＺ軸方向に移動させたときの差分Δ１及び差分Δ２の変化を例示するグラフである。
【図７】微小粒子Ｐの通流位置をＺ軸方向に移動させたときの差分Δ１と蛍光検出器３２の検出結果を元に算出した蛍光３のピーク波長（Ａ）及びピーク強度（Ｂ）との関係を例示するグラフである。
【図８】微小粒子Ｐの通流位置をＸ軸方向に移動させた場合に、蛍光検出器３２の検出結果を元に算出した蛍光３のピーク波長（Ａ）及びピーク強度（Ｂ）の変化を例示するグラフである。
【図９】微小粒子Ｐの通流位置をＸ軸方向に移動させたときの差分Δ１及び差分Δ２の変化を例示するグラフである。
【図１０】微小粒子Ｐの通流位置をＸ軸方向に移動させたときの差分Δ２と蛍光検出器３２の検出結果を元に算出した蛍光３のピーク波長（Ａ）及びピーク強度（Ｂ）との関係を例示するグラフである。
【図１１】補正前の蛍光スペクトル（Ａ）及び補正後の蛍光スペクトル（Ｂ）を例示するグラフである。
【図１２】差分Δ１及び差分Δ２を軸として、微小粒子Ｐの集団をプロットした分布図の一例である。
【図１３】光検出部の変形例の構成を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．微小粒子測定装置の構成
（１）測定部
（１−１）光照射部
（１−２）光検出部
（１−３）位置検出部
（２）演算部
２．微小粒子測定装置におけるデータ補正処理
（１）補正対象
（２）補正処理
３．変形例
（１）光検出部
（２）位置検出部
４．データ補正方法及びデータ補正プログラム
【００１８】
１．微小粒子測定装置の構成
（１）測定部
図１は、本技術に係る微小粒子測定装置の測定部の構成を説明する図である。本技術に係る微小粒子測定装置は、大略、図に示される測定部と、不図示の演算部とから構成されている。測定部は、流路Ｃを通流する微小粒子Ｐに励起光１を照射する光照射部と、微小粒子Ｐから発生する散乱光２及び蛍光３を検出する光検出部と、微小粒子Ｐの位置情報を取得する位置検出部と、を含む。
【００１９】
（１−１）光照射部
光照射部は、励起光１を出射する光源１１と、フローセル及びマイクロチップなどに形成された流路Ｃを通流する微小粒子Ｐに対して励起光１を集光する対物レンズ１２とを含んで構成されている。光源１１は、測定の目的に応じてレーザダイオード、ＳＨＧ（Second Harmonic Generation）レーザ、固体レーザ、ガスレーザ及び高輝度ＬＥＤ（Light Emitting Diode:発光ダイオード）などから適宜選択される。光照射部には、必要に応じて、光源１１及び対物レンズ１２以外の光学素子が配されていてもよい。
【００２０】
（１−２）光検出部
光検出部は、集光レンズ２１、分光素子２２、分光素子３１、蛍光検出器３２とＰ偏光検出器４１とを含んで構成されている。
【００２１】
集光レンズ１１は、励起光１を照射された微小粒子Ｐから発生する散乱光２及び蛍光３を集光する。散乱光２は、前方散乱光、側方散乱光、レイリー散乱及びミー散乱などの各種散乱光であってよい。また、蛍光３は、微小粒子Ｐそのものから発生する蛍光又は微小粒子Ｐに標識された蛍光物質から発生する蛍光であってよい。
【００２２】
分光素子２２は、集光レンズ１１により集光された散乱光２と蛍光３とを分離する。分光素子２２には、特定波長の光のみを反射し、それ以外の波長成分を透過するダイクロックミラーが用いられ、本実施形態に係る微小粒子測定装置では、散乱光２を反射し、蛍光３を透過するものが使用されている。
【００２３】
分光素子３１は、プリズム及びグレーティングミラーなどとされ、分光素子２２により分離された蛍光３をさらに分光して蛍光検出器３２に投影する。蛍光検出器３２は、分光素子２２により分光された蛍光３を検出する。蛍光検出器３２には、複数の独立した受光素子が配列されており、各受光素子が蛍光３のうち分光素子３１から分光されて投影されてくる波長域の光を検出する。本実施形態に係る微小粒子測定装置では、蛍光検出器３２として、受光素子として３２チャネルのＰＭＴ（photo multiplier tube）を一次元に配列したＰＭＴアレイを用いている。蛍光検出器３２は、検出された蛍光３の強度情報を電気信号に変換して演算部に出力する。なお、蛍光検出器３２として、フォトダイオードアレイや、ＣＣＤ及びＣＭＯＳなどの２次元受光素子を用いてもよい。
【００２４】
分光素子３１と組み合わせて、受光素子アレイ又は２次元受光素子を蛍光検出器３２に用いることにより、微小粒子Ｐから発生する蛍光３をスペクトル（後述の図１１参照）として取得することができる。
【００２５】
Ｐ偏光検出器４１は、分光素子２２により分離された散乱光２に含まれるＰ偏光成分４を検出する。Ｐ偏光検出器４１には、例えばＰＤ（Photo diode）、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）又はＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube）などを使用することができる。Ｐ偏光検出器４１は、検出されたＰ偏光成分４の強度情報を電気信号に変換して演算部に出力する。Ｐ偏光成分４の強度情報からは、微小粒子Ｐの大きさ、内部構造等に関する分析を行うことができる。
【００２６】
（１−３）位置検出部
位置検出部は、分光素子２３、Ｓ偏光検出器５１と非点収差素子５２とを含んで構成されている。
【００２７】
分光素子２３は、入射する非偏光を、振動方向が直交する２つの偏光に分離するものであり、分光素子２２により分離された散乱光２をＰ偏光成分４とＳ偏光成分５とに分離する。具体的には、分光素子２３は、入射した散乱光２のうちＰ偏光成分４を透過し、Ｓ偏光成分５を反射する。
【００２８】
Ｓ偏光検出器５１は、分光素子２３により分離されたＳ偏光成分５を検出するものであり、その受光面が複数の領域に分割されている。本実施形態に係る微小粒子測定装置では、図２に示すように、受光面が領域Ａ、領域Ｂ、領域Ｃ、領域Ｄの４つの領域に格子状に分割された４分割フォトダイオードを用いている。
【００２９】
非点収差素子５２は、分光素子２３とＳ偏光検出器５１との間に配設されたシリンドリカルレンズであり、Ｓ偏光検出器５１へ向かって透過するＳ偏光成分５に非点収差を与える。位置検出部は、非点収差を生じたＳ偏光成分５の偏光検出器５１の受光面における受光位置（結像パターン）を、微小粒子Ｐの位置情報として取得して演算部に出力する。Ｓ偏光成分５の偏光検出器５１の受光面における受光位置（結像パターン）については詳しく後述する。
【００３０】
（２）演算部
演算部は、光検出部の蛍光検出器３２及びＰ偏光検出器４１から入力される蛍光３及びＰ偏光成分４の強度情報を、位置検出部から入力される微小粒子Ｐの位置情報に基づいて補正する処理を行う。演算部は、この処理を実行するためのプログラムとＯＳが格納されたハードディスク、ＣＰＵ及びメモリなどにより構成される。
【００３１】
２．微小粒子測定装置におけるデータ補正処理
次に、演算部による蛍光３及びＰ偏光成分４の強度情報の補正処理について詳細に説明する。
【００３２】
（１）補正対象
図３Ａに、流路Ｃを通流するラミナーフローＬと、ラミナーフローＬ中の微小粒子Ｐに照射される励起光１のレーザスポットＳを示す。図中、微小粒子Ｐに対する励起光１の照射方向をＸ軸方向、ラミナーフローＬの送液方向をＹ軸方向、Ｘ軸方向及びＹ軸方向に垂直な方向をＺ軸方向とする。
【００３３】
ラミナーフローＬは流路Ｃの概ね中央を微小粒子Ｐが通流するように形成されているが、微小粒子Ｐの通流位置にはＺ軸方向にばらつきがある。レーザスポットＳの強度は、図３Ｂ、Ｃに示すようなガウスシアンの分布（Ｂ）又はトップフラットの分布（Ｃ）をとり、Ｚ軸方向において中心で最も高く周辺で低い。いずれの場合でも、微小粒子ＰがレーザスポットＳの中心位置を通流し、励起光１の焦点位置が微小粒子Ｐの通流位置に一致するとき、励起光１による微小粒子Ｐの照射強度が最も高くなる。一方、微小粒子ＰがレーザスポットＳの中心を外れた周辺位置を通流し、励起光１の焦点位置が微小粒子Ｐの通流位置に不一致の場合には、励起光１による微小粒子Ｐの照射強度がより低くなる。従って、微小粒子Ｐ間で励起光１の照射強度が異なることとなり、微小粒子Ｐから発生する散乱光２及び蛍光３の強度にも差が生じ、測定誤差の原因となる。ただし、図３Ｃのトップフラット光学系は、ラミナ―フローＬの中央付近では位置ずれによる照射強度変化が小さくなるように設計されているため、図３Ｂのガウシアン光学系に比較して影響は小さい。同様の測定誤差は、Ｘ軸方向における微小粒子Ｐの通流位置のばらつきに起因しても生じる。
【００３４】
微小粒子Ｐの通流位置のばらつきによる微小粒子Ｐと光照射部との光学位置のずれは、蛍光検出器３２のＰＭＴ１〜３２のそれぞれに入射する蛍光３の波長範囲が微小粒子Ｐ間でずれる要因ともなる。具体的には、検出チャネルｋに対して、微小粒子Ｐｋから投影される蛍光３の波長範囲がλｋ〜λｋ＋１である場合に、流路Ｃ内の通流位置が微小粒子Ｐｋと異なる微小粒子Ｐｌから投影される蛍光３の波長範囲がλｌ〜λｌ＋１となり、（λｋ、λｋ＋１）及び（λｌ、λｌ＋１）の値が異なってしまう場合がある。その結果、各微小粒子Ｐで検出される蛍光スペクトルに、検出チャネルｋに入射する蛍光３の波長範囲のずれに起因した測定誤差が発生する（後述図５参照）。
【００３５】
（２）補正処理
演算部は、微小粒子Ｐの通流位置がばらつくことによって生じる蛍光３の強度のばらつき及び蛍光検出器３２の各ＰＭＴに入射する蛍光３の波長範囲のばらつきに起因した測定誤差を、微小粒子Ｐの位置情報に基づいて補正する処理を行う。
【００３６】
演算部は、まず、Ｓ偏光検出器５１の受光面に設けられた複数の領域間で検出値の差分をとる。具体的には、図２に示した４分割フォトダイオードの領域Ａ、領域Ｂ、領域Ｃ及び領域Ｄにおける検出値について、差分Δ１（Ａ−Ｃ）及び差分Δ２（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））をとる。
【００３７】
非点収差素子５２により非点収差を与えられたＳ偏光成分５のＳ偏光検出器５１の受光面における結像パターン（受光位置）は、微小粒子Ｐが図３ＡのレーザスポットＳの中心位置を通流し、励起光１の焦点位置が微小粒子Ｐの通流位置に一致するとき、図２中点線で示す像となる。一方、微小粒子ＰがレーザスポットＳの中心を外れた周辺位置を通流し、励起光１の焦点位置が微小粒子Ｐの通流位置に不一致の場合には、結像パターンは、図２中実線で示す像となる。すなわち、微小粒子Ｐの通流位置に対応してＳ偏光成分５の結像パターンは変化し、Ｓ偏光成分５のうち領域Ａ〜Ｄに投影される割合が微小粒子Ｐの通流位置に対応して変化する。このため、領域Ａ〜ＤにおけるＳ偏光成分５の検出値のパターンは、微小粒子Ｐの通流位置を直接反映する。
【００３８】
本発明者らは、上記差分Δ１（Ａ−Ｃ）から、図３ＡのＺ軸方向における微小粒子Ｐの位置情報を取得でき、上記差分Δ２（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））から図３ＡのＸ軸方向における微小粒子Ｐの位置情報を取得できることを見出している。
【００３９】
微小粒子Ｐが通流する流路Ｃが形成されたフローセルをステッピングモータによりＺ軸方向に移動させた場合、光学位置のずれに伴って、図５Ａに示すように移動量が大きくなるほど微小粒子Ｐの蛍光３は強度が低下して分散が大きくなり、蛍光スペクトルの形状も変化する。なお、図では、横軸に波長、縦軸に強度（波長あたりの蛍光強度）を示し、色スケールによって頻度を示す。グラフ上部の数字はステッピングモータの移動量をパルス数によって示したものである。
【００４０】
この蛍光スペクトルの変化を定量化するために、図５Ｂに示すように計測された蛍光スペクトルについて平均スペクトルを計算し、カーネル平滑化法によってスムージングを行い、その結果の曲線について最大値および最大値での波長を取得した。これをステッピングモータの各移動量に対して行うことにより、パルス移動量と蛍光ピーク波長との関係をプロットしたものが図４Ａ、パルス移動量と蛍光ピーク強度との関係をプロットしたのが図４Ｂである。いずれのグラフも横軸はパルス移動量を示し、縦軸は図４Ａでは蛍光ピーク波長、図４Ｂでは蛍光強度を示している。ここでの結果から、微小粒子ＰのＺ軸方向の位置ずれによって検出される蛍光スペクトルのピーク波長及び強度が変化することが確認できる。
【００４１】
微小粒子Ｐが通流するフローセルをステッピングモータによりＺ軸方向に移動させたときの差分Δ１（Ａ−Ｃ）及び差分Δ２（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））の変化を図６に示す。図に示されるように、移動量に相関して差分Δ１のみが変化する。このことから、差分Δ１（Ａ−Ｃ）から微小粒子ＰのＺ軸方向における位置情報が得られることが分かる。さらに、図６の結果と図４の結果を合わせることで、差分Δ１（Ａ−Ｃ）と、検出された蛍光スペクトルのピーク波長及びピーク強度との関係を得ることができる（図７）。従って、微小粒子ＰのＺ軸方向における位置情報として差分Δ１（Ａ−Ｃ）を用いることで、Ｚ軸方向における位置ずれにより生じるＰＭＴに入射する蛍光３の波長及び強度の歪みを補正することが可能である。
【００４２】
また、微小粒子Ｐが通流するフローセルをステッピングモータによりＸ軸方向に移動させた場合についても、上述のＺ軸方向への移動と同様に解析を行った。図８は、フローセルをＸ軸方向に移動させたときの蛍光スペクトルの解析を図４と同様の方法で行った結果であり、図８ＡはフローセルをステッピングモータでＸ軸方向に移動させた際の移動量と蛍光ピーク波長との関係を、図８Ｂは移動量と蛍光ピーク強度との関係を示したものである。なお、図８横軸は、ステッピングモータの移動量をパルス数によって示す。図から、フローセルのＸ方向の移動に対しては、Ｚ軸方向と比較すると蛍光ピーク波長の変化は小さいが、蛍光ピーク強度は大きく変化している様子が分かる。
【００４３】
微小粒子Ｐが通流するフローセルをステッピングモータによりＸ軸方向に移動させたときの差分Δ１（Ａ−Ｃ）及び差分Δ２（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））の変化を図９に示す。図に示されるように、移動量に相関して差分Δ２のみが変化する。このことから、差分Δ２（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））から微小粒子ＰのＸ軸方向における位置情報が得られることが分かる。さらに、図９の結果と図８の結果を合わせることで、差分Δ２（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））と、検出された蛍光スペクトルのピーク波長及びピーク強度との関係を得ることができる（図１０）。従って、微小粒子ＰのＸ軸方向における位置情報としてΔ２（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））を用いることで、Ｘ軸方向における位置ずれにより生じるＰＭＴに入射する蛍光の波長及び強度の歪みを補正することが可能である。
【００４４】
次に、演算部は、上述した差分Δ１（Ａ−Ｃ）及び差分Δ２（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））を微小粒子Ｐの位置情報をして用い、蛍光３及びＰ偏光成分４の強度情報の補正処理を行う。補正処理は、図７及び図１０に示される関係から回帰曲線を作成し、当該回帰曲線を表すキャリブレーション計算式を利用して強度情報を差分Δ１及びΔ２の値に応じて補正することによって行われる。
【００４５】
具体的には、微小粒子Ｐの全てについて、蛍光３の強度情報とともに、位置情報として差分Δ１及びΔ２を取得する。そして、各微小粒子Ｐについて、上記キャリブレーション計算式を用いて、差分Δ１及びΔ２の値から微小粒子Ｐの通流位置のずれによって生じている蛍光波長及び蛍光強度の歪み量を算出し、当該歪み量を補正する。
【００４６】
蛍光波長の補正は、差分Δ１及びΔ２の値から、蛍光検出器３２の各ＰＭＴに入射する蛍光３の波長範囲の歪み量（変化量）を算出し、算出された歪み量だけ各ＰＭＴの検出波長範囲をずらすことによって行う。また、蛍光強度の補正は、差分Δ１及びΔ２の値から、各ＰＭＴに入射する蛍光３の強度値の歪み率（変化率）を算出し、算出された歪み率によって各ＰＭＴの強度値を除すことによって行う。なお、ここでは、蛍光３の強度情報の補正について説明したが、Ｐ偏光成分４の強度情報についても同様にして補正できる。
【００４７】
図１１に、補正前後の蛍光スペクトルの一例を示す。図１１Ａは補正前のスペクトルチャートを示し、横軸が波長、縦軸が蛍光強度、色スケールが頻度を示す。このデータに対して、差分Δ１を用いて位置ずれによる波長ずれの効果を補正した結果が図１１Ｂである。例えば、蛍光検出器３２の検出チャネル１０番（ＰＭＴ１０）が波長540.0nm〜546.0nmの蛍光を検出するように設計されているとする。この場合に、ある微小粒子Ｐについての差分Δ１の値から、検出チャネル１０番の検出波長範囲に1.5nmの波長ずれが発生していることが想定されたとする。この場合において、上記補正は、当該微小粒子Ｐについては、検出チャネル１０番の計測結果を波長域541.5nm〜547.5nmにおける計測結果として取り扱うものである。補正前のＡでは、微小粒子Ｐの通流位置のばらつきによって生じる測定誤差により分散が大きく歪な形状のスペクトルとなっている。補正後のＢでは、分散が小さく滑らかな形状のスペクトルとなっている。
【００４８】
上述の回帰曲線及びキャリブレーション計算式は、キャリブレーション用のマイクロビーズを用いて、試料とする微小粒子Ｐの測定前に取得しておくことが好ましい。回帰曲線及びキャリブレーション計算式は、より簡便には以下のようにして得ることもできる。
【００４９】
すなわち、まず、フローセルの位置を固定した状態で、キャリブレーション用のマイクロビーズについて、蛍光３の強度情報と、位置情報としての差分Δ１及びΔ２を取得する。そして、差分Δ１及びΔ２が異なる２以上のビーズあるいは２以上のビーズの集団を抽出する。差分Δ１及びΔ２が異なる２つのビーズ集団として、図１２に、Ｇａｔｅ１及びＧａｔｅ２で囲われたビーズ集団を例示する。
【００５０】
次に、抽出されたビーズあるいはその集団について蛍光スペクトルの特徴量を算出し、差分Δ１及びΔ２の値と当該特徴量とを関係付ける回帰曲線及びキャリブレーション計算式を得る。特徴量としては、蛍光検出器３２の各ＰＭＴに入射する蛍光のピーク波長及びピーク強度などを用いることができる。
【００５１】
さらに、上述の回帰曲線及びキャリブレーション計算式を用いることなく、微小粒子Ｐの位置ずれに起因した測定誤差を排除する方法として、図１２に示したＧａｔｅ１及びＧａｔｅ２のように差分Δ１及び／又は前記差分Δ２が所定範囲内である微小粒子Ｐの強度情報のみを抽出して測定結果とする方法も挙げられる。
【００５２】
以上のように本技術に係る微小粒子測定装置によれば、微小粒子Ｐの一つ一つの位置情報を取得して、微小粒子Ｐの散乱光２及び蛍光３の強度情報を補正することにより、微小粒子Ｐの位置ずれに起因した測定誤差を補償して、散乱光２及び蛍光３の強度及びスペクトルの測定を正確に行うことができる。また、本技術に係る微小粒子測定装置によれば、分散が小さく滑らかな形状の蛍光スペクトルを得ることができるため、試料とする微小粒子Ｐの蛍光スペクトルをより直感的に認識でき、蛍光分光光度計などを用いて得られる蛍光スペクトルとのデータ比較を容易に行うことができる。
【００５３】
３．変形例
（１）光検出部
上述の実施形態に係る微小粒子測定装置では、分光素子３１と、受光素子アレイ又は２次元受光素子とした蛍光検出器３２とを組み合わせて光検出部を構成し、微小粒子Ｐから発生する蛍光３をスペクトルとして取得する例を説明した。本技術に係る微小粒子測定装置において、光検出部は、図１３に示すように、複数の波長選択素子（ここでは符号３１ａ、３１ｂ、３１ｃの３つ）を用いて、蛍光３から所望の波長域のみを選択して蛍光検出器（ここでは符号３２ａ、３２ｂ、３２ｃの３つ）によって検出する構成であってもよい。波長選択素子３１ａ、３１ｂ、３１ｃには、特定の波長域の光のみを反射し、それ以外の光を透過するダイクロイックミラー等を使用すればよい。また、蛍光検出器３２ａ、３２ｂ、３２ｃには、ＰＤ（Photo diode）、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）又はＰＭＴ（Photo-Multiplier Tube）などを使用することができる。なお、波長選択素子及び蛍光検出器の組み合わせはここで示した３つに限られず、１又は２以上とできる。
【００５４】
（２）位置検出部
上述の実施形態に係る微小粒子測定装置では、位置検出部として４分割フォトダイオードを用い、非点収差を生じたＳ偏光成分５の偏光検出器５１の受光面における結像パターン（受光位置）を微小粒子Ｐの位置情報として取得する例を説明した。本技術に係る微小粒子測定装置では、位置検出部に高速カメラを用いて、流路Ｃを通流する微小粒子Ｐを直接撮影し、画像処理によって微小粒子Ｐの位置情報を取得することも考えられる。
【００５５】
４．データ補正方法及びデータ補正プログラム
本技術に係るデータ補正方法は、上述の微小粒子測定装置の演算部によって実行される補正処理に対応するものである。また、微小粒子測定装置の演算部には、このデータ補正を実行するためのデータ補正プログラムが格納されている。
【００５６】
プログラムは、ハードディスクに格納・保持され、ＣＰＵおよびＯＳの制御の下でメモリに読み込まれて、上述の補正処理を実行する。プログラムは、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されたものとできる。記録媒体としては、コンピュータ読み取り可能な記録媒体であれば特に制限はないが、具体的には、例えば、フレキシブルディスクやＣＤ−ＲＯＭ等の円盤形記録媒体が用いられる。また、磁気テープ等のテープ型記録媒体を用いてもよい。
【００５７】
本技術に係る微小粒子測定装置におけるデータ補正方法は以下のような構成をとることもできる。
（１）流路を通流する微小粒子に光を照射して該微小粒子から発生する光を検出可能で、該光の強度情報を取得する強度検出手順と、前記微小粒子の位置情報を取得可能な位置検出手順と、前記位置情報に基づいて前記強度情報を補正する補正手順と、を含む、微小粒子測定装置におけるデータ補正方法。
（２）前記位置検出手順において、前記位置情報として、前記微小粒子に対する光の照射方向であるＸ軸方向における前記微小粒子の位置情報、及び／又は、前記微小粒子の通流方向であるＹ軸方向と前記Ｘ軸方向とに垂直なＺ軸方向における前記微小粒子の位置情報、を取得する上記（１）記載のデータ補正方法。
（３）前記位置検出手順において、前記微小粒子から発生する散乱光から分離され、非点収差を与えられたＳ偏光成分を検出器により受光し、該検出器における前記Ｓ偏光成分の受光位置を前記位置情報として取得する上記（１）又は（２）記載のデータ補正方法。
（４）前記位置検出手順において、前記検出器として、受光面が複数領域に分割された検出器を用いる上記（３）記載のデータ補正方法。
（５）前記検出器として、受光面が領域Ａ、領域Ｂ、領域Ｃ、領域Ｄの４つの領域に格子状に分割された検出器を用い、前記領域Ａと、前記領域Ａに隣接しない前記領域Ｃと、の検出値の差分Δ１（Ａ−Ｃ）から、前記Ｚ軸方向における前記微小粒子の前記位置情報を取得する上記（４）記載のデータ補正方法。
（６）前記位置検出手順において、前記領域Ａと前記領域Ｃの検出値の和（Ａ＋Ｃ）と、前記領域Ｂと前記領域Ｄの検出値の和（Ｂ＋Ｄ）と、の差分Δ２（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））から、前記Ｘ軸方向における前記微小粒子の前記位置情報を取得する上記（５）記載のデータ補正方法。
（７）前記補正手順において、前記差分Δ１及び／又は前記差分Δ２に基づいて前記強度情報を補正する上記（６）記載のデータ補正方法。
（８）前記補正手順において、前記差分Δ１及び／又は前記差分Δ２が所定範囲内である前記微小粒子の前記強度情報のみを抽出する上記（６）記載のデータ補正方法。
（９）前記検出器として、４分割フォトダイオードを用いる上記（４）〜（７）のいずれかに記載のデータ補正方法。
【００５８】
また、本技術に係る微小粒子測定装置は以下のような構成をとることもできる。
（１）流路を通流する微小粒子に光を照射する光照射部と、前記微小粒子から発生する光を検出する光検出部と、前記微小粒子の位置情報を取得する位置検出部と、前記光検出部により取得された前記微小粒子から発生する光の強度情報を、前記位置情報に基づいて補正する演算部と、を備える微小粒子測定装置。
（２）前記位置検出部は、前記微小粒子から発生する散乱光をＳ偏光成分とＰ偏光成分とに分離する第一分光素子と、前記Ｓ偏光成分を受光するＳ偏光検出器と、前記第一分光素子と前記Ｓ偏光検出器との間に配設され、前記Ｓ偏光成分に非点収差を与える非点収差素子と、を有し、前記Ｓ偏光検出器における前記Ｓ偏光成分の受光位置を前記位置情報として取得する上記（１）記載の微小粒子測定装置。
（３）前記Ｓ偏光検出器の受光面が複数領域に分割されている上記（２）記載の微小粒子測定装置。
（４）前記Ｓ偏光検出器の受光面が領域Ａ、領域Ｂ、領域Ｃ、領域Ｄの４つの領域に格子状に分割されている上記（３）記載の微小粒子測定装置。
（５）前記演算部は、前記領域Ａと、前記領域Ａに隣接しない前記領域Ｃと、の検出値の差分Δ１（Ａ−Ｃ）、及び／又は、前記領域Ａと前記領域Ｃの検出値の和（Ａ＋Ｃ）と、前記領域Ｂと前記領域Ｄの検出値の和（Ｂ＋Ｄ）と、の差分Δ２（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））、に基づいて前記強度情報を補正する上記（４）記載の微小粒子測定装置。
（６）前記演算部は、前記領域Ａと、前記領域Ａに隣接しない前記領域Ｃと、の検出値の差分Δ１（Ａ−Ｃ）、及び／又は、前記領域Ａと前記領域Ｃの検出値の和（Ａ＋Ｃ）と、前記領域Ｂと前記領域Ｄの検出値の和（Ｂ＋Ｄ）と、の差分Δ２（（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ））、が所定範囲内である前記微小粒子の前記強度情報のみを抽出する上記（４）記載の微小粒子測定装置。
（７）前記Ｓ偏光検出器が４分割フォトダイオードである上記（３）〜（６）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（８）前記非点収差素子がシリンドリカルレンズである上記（２）〜（７）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（９）前記微小粒子から発生する前記光を前記散乱光と蛍光に分離する第二分光素子を備え、前記光検出部に、前記Ｐ偏光成分を検出するＰ偏光検出器と、前記蛍光を検出する蛍光検出器と、を有する上記（２）〜（７）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
（１０）前記光検出部に、前記蛍光を分光する第三分光素子を有し、前記蛍光検出器には、前記第三分光素子により分光された前記蛍光を検出する、複数の独立した受光素子が配列されている上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の微小粒子測定装置。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本技術によれば、微小粒子の流路内の通流位置のばらつきによって生じる測定誤差を効果的に補正して、蛍光及び散乱光の強度及びスペクトルを高精度に測定することできる。従って、本技術は、細胞等の微小粒子の光学特性をより詳細に解析するための微小粒子測定装置に好適に適用されるものであり、特にはスペクトル型フローサイトメータに好適に適用できる。
【符号の説明】
【００６０】
１：励起光、１１：光源、１２：対物レンズ、２：散乱光、２１：集光レンズ、２２：分光素子、２３：分光素子、３：蛍光、３１：分光素子、３１ａ，３１ｂ，３１ｃ：波長選択素子、３２，３２ａ，３２ｂ，３２ｃ：蛍光検出器、４：Ｐ偏光成分、４１：Ｐ偏光検出器、５：Ｓ偏光成分、５１：Ｓ偏光検出器、５２：非点収差素子、Ｃ：流路、Ｌ：ラミナーフロー、Ｐ：微小粒子、Ｓ：レーザスポット
【図１】
2013183345.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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2013183345.tif 000018
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