(57)【要約】【課題】グルコースセンサにおいてＦＡＤ依存型ＧＤＨがグルコースと反応して生じる応答シグナルを増大させる。【解決手段】フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼ、電子受容体、および、ポリグルタミン酸を含むことを特徴とする、グルコース測定用組成物。【選択図】  図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）の成分を含むことを特徴とする、グルコース測定用組成物。
（１）フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼ、
（２）電子受容体、および、
（３）ポリグルタミン酸
【請求項２】
請求項１に記載のグルコース測定用組成物を含むグルコース測定用センサであって、前記グルコース測定用組成物がグルコースセンサ上の反応層中に存在する、グルコース測定用センサ。
【請求項３】
フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼを用いてグルコースを測定する過程において、以下の（１）〜（３）の成分を共存させることを特徴とする、グルコース測定方法。
（１）フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼ、
（２）電子受容体、および、
（３）ポリグルタミン酸
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコース測定用組成物、該グルコース測定用組成物を含むグルコース測定用センサ、および、グルコース測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中グルコース濃度の測定は、糖尿病患者が適当な血糖コントロールを行うにあたって必要不可欠である。日常的に血糖値をチェックするために使われるのは簡易型自己血糖測定キットであり、グルコースオキシダーゼ（以下ＧＯＤとも記載）もしくはグルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨとも記載）を利用したものが知られている。ＧＯＤは血糖測定用酵素として古くから用いられているが、溶存酸素が測定値に影響を与えることから、近年ではＧＤＨを用いたものが主流となってきている。ＧＤＨを原料としたグルコースセンサは、ＧＤＨの以下の反応を利用して血液中のグルコース濃度を測定するものである。（特許文献１）
Ｄ−グルコース  ＋  電子受容体（酸化型）  →
Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン  ＋  電子受容体（還元型）
すなわち、グルコースを酸化することによって生じる電子の流れを測定することにより、グルコースの定量を可能にしている。これまでに血糖測定に用いられているＧＤＨとしては、反応に要する補酵素の違いから、ニコチンアミド依存型、ピロロキノリンキノン（以下ＰＱＱとも記載）依存型、フラビンアデニンジヌクレオチド（以下ＦＡＤとも記載）依存型の３種類が知られている。ニコチンアミド依存型としてはバチルス属由来のものが市販されているが、補酵素を含んだホロ酵素の状態で精製することができないため、センサを作製するにあたって補酵素となるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤとも記載）などを加えなければならない。この煩雑さ及び補酵素となるＮＡＤ等が高価であることが問題点として挙げられる。一方、ＰＱＱ依存型ＧＤＨはホロ酵素での提供が可能であり、また比活性が高くグルコースに対する十分な応答シグナルを得られるという利点がある一方で、基質特異性の厳密さに欠け、マルトース等のグルコース以外の糖類にも反応してしまう点が問題視されている。これらの問題点をクリアしうるものとして、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）依存型ＧＤＨが浸透しつつある。【０００３】
血糖センサの特性としてグルコース以外の糖類に反応しない高い基質特異性を持たせることは、正確な血糖値を得るために重要な事柄であるが、血糖測定の感度もまたセンサの開発にあたって重視される事柄である。グルコースセンサ上のＦＡＤ依存型ＧＤＨの単位量あたりの応答シグナルの強度を増大させることができれば、グルコースセンサにおいて検出可能な濃度範囲の下限値を高めることが可能である。また別の観点からは、応答シグナル強度の増大を実現することにより、グルコース定量におけるＦＡＤ依存型ＧＤＨの必要量を低減してセンサ作製のコストを低減するという優位さを生み出すことにもつながる。さらに別の観点からは、応答シグナルを積算してグルコース濃度の定量を行う場合にあっては、濃度の算出に必要な応答シグナル値を積算に要する時間を低減でき、それによってグルコース定量に要する時間を低減するという優位さを生み出すことにもつながる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−５０３００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明の目的は、グルコースセンサにおいてＦＡＤ依存型ＧＤＨがグルコースと反応して生じる応答シグナルを増大させることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、センサ上のＧＤＨおよび電子受容体を含む組成物中に促進剤を加えることでＧＤＨがグルコースと反応して電子を電子受容体へ供与するまでの過程を促進し、結果として血糖センサにおける血糖値算出までの時間を短縮可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００７】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［項１］
以下の（１）〜（３）の成分を含むことを特徴とする、グルコース測定用組成物。
（１）フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼ、
（２）電子受容体、および、
（３）ポリグルタミン酸
［項２］
前記グルコース測定用組成物を含むグルコース測定用センサであって、前記グルコース測定用組成物がグルコースセンサ上の反応層中に存在する、グルコース測定用センサ。
［項３］
フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼを用いてグルコースを測定する過程において、以下の（１）〜（３）の成分を共存させることを特徴とする、グルコース測定方法。
（１）フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼ、
（２）電子受容体、および、
（３）ポリグルタミン酸
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ＦＡＤ依存型ＧＤＨを用いたグルコースセンサ上においてグルコースを酸化して電子受容体へ電子を供与する過程を促進することができ、結果としてグルコースに応答して得られるシグナル強度を高め、グルコース濃度算出に要するシグナルを短時間に得ることができる。すなわちＦＡＤ依存型ＧＤＨを用いたグルコースセンサにおける血糖値算出までの所要時間を短縮し、使用者の煩労を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】センサチップを作製する際のＬ−ポリグルタミン酸濃度と、それぞれのセンサチップにグルコース溶液を添加し、電圧を印加した際の電流値の挙動との関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（グルコース測定用組成物）
本発明の実施形態の一つは、以下の（１）〜（３）の成分を含むことを特徴とする、グルコース測定用組成物である。
（１）フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼ、
（２）電子受容体、および、
（３）ポリグルタミン酸
【００１１】
本発明に用いるＦＡＤ依存型ＧＤＨとしては、ＦＡＤを補酵素とし、かつグルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する酵素であれば特に限定しない。このようなＦＡＤ依存型ＧＤＨの例としては、アスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・オリゼに代表されるアスペルギルス属由来、ペニシリウム・リラシノエキヌラタム、ペニシリウム・イタリカムに代表されるペニシリウム属由来の他、ムコール・ヒエマリスに代表されるムコール属由来等のＧＤＨが例示される。さらに該ＧＤＨは由来する微生物を培養して得られた酵素であってもよく、また該ＧＤＨをコードする遺伝子を宿主細胞に形質転換し、組換え発現させて得られた酵素であってもよい。さらに、該ＧＤＨをコードする遺伝子に遺伝子工学的に変異を導入した上で発現させることによって得られる変異型ＧＤＨであってもよい。
好ましくはアスペルギルス属由来であり、さらに好ましくは、アスペルギルス・オリゼ由来のＦＡＤ依存型ＧＤＨである。
【００１２】
本発明に用いる電子受容体としては、ＧＤＨの補酵素であるＦＡＤから電子を受け取り、場合によっては発色物質や電極に電子を供与しうるものが挙げられ、たとえばフェリシアン化物塩、フェナジンエトサルフェート、フェナジンメトサルフェート、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン、１−メトキシ−フェナジンメトサルフェート、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、２，５−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，５−ジクロロ−１，４−ベンゾキノン、ニトロソアニリン、９，１０−フェナントレンキノン、フェロセン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体等が例示されるが、これらに限定されない。
好ましくは、フェリシアン化物塩由来であり、さらに好ましくは、フェリシアン化カリウム塩である。
【００１３】
本発明に用いるポリグルタミン酸（ポリ−γ−グルタミン酸ともいう）とは、グルタミン酸のα−アミノ基とγ−カルボキシル基とがアミド結合したポリアミノ酸である。ポリグルタミン酸は納豆のネバネバの主成分としても知られており、様々な生物により合成される高分子化合物で、生分解性に優れている。ポリグルタミン酸は、Ｌ−グルタミン酸のみからなるもの、Ｄ−グルタミン酸のみからなるもの、両方を含むもの（ＤＬ−グルタミン酸）があるが、何れも用いることができる。Ｄ−グルタミン酸もしくはＬ−グルタミン酸からなるポリグルタミン酸のほうが、光学活性が均一であり、分子毎の性質も均一である。一般的にＤ−グルタミン酸やＤＬ−グルタミン酸からなるポリグルタミン酸の分子質量は１０−１０００ｋＤａであるが、Ｌ−グルタミン酸からなるポリグルタミン酸は分子質量が１０００ｋＤａ以上のものが見出されている。分子量の高いポリグルタミン酸は高い保水性を示す。したがって、Ｌ−グルタミン酸からなるポリグルタミン酸がより好ましく用いられる。
【００１４】
ポリグルタミン酸は、市販されているものがあればそれを用いてもよいし、別途製造してもよい。但し、通常の条件でグルタミン酸を重合するとポリ−α−グルタミン酸が得られるので、微生物を使って生合成させることが好ましい。ポリグルタミン酸を生産する微生物としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（納豆菌）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（戦国醤菌）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｎａｔｒｉａｌｂａ  ａｅｇｙｐｔｉａｃａ、Ｈｙｄｒａなどがある。分子サイズの大きいポリグルタミン酸を製造できる微生物としては、枯草菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓや超好塩古細菌であるＮａｔｒｉａｌｂａ  ａｅｇｙｐｔｉａｃａがある。この中でも、Ｌ−グルタミン酸のみからなるポリグルタミン酸を生産する微生物である、Ｎａｔｒｉａｌｂａ  ａｅｇｙｔｉａｃａによって生産されたポリグルタミン酸を用いるのが好ましい。市販品としては、東洋紡製「アミノピジェール」（登録商標）、一丸ファルコス製「バイオＰＧＡＮａパウダー」（商標）「バイオＰＧＡ溶液」（商標）、Ｚｙｔｅｘ製「Ａｑｕａ  Ｄｉｐ」、味の素製「カルテイク」（登録商標）、明治フードマテリア製「明治ポリグルタミン酸」（商標）、ヤクルト薬品工業製「ＰＧＡ「フード」」（商標）「ＰＧＡ「コスメ」」（商標）「ＰＧＡ「エコ」」（商標）「ＰＧＡ「架橋型」」（商標）などが例示出来る。
【００１５】
本発明に係るポリグルタミン酸は、グルタミン酸の分子同士を架橋させ架橋体を用いても良い。ポリグルタミン酸の架橋体は、溶媒に溶解させてＬ−ＰＧＡの溶液を作製した上で、架橋反応に供すればよい。ポリグルタミン酸を溶解させる溶媒としては、例えば、水、アルコ−ル、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル等が挙げられ、溶液に架橋反応を施すと、当該溶液中でポリグルタミン酸の架橋体が形成される。Ｌ−ＰＧＡの架橋反応の方法は、Ｌ−ＰＧＡの分子同士を架橋させることができる限り限定されるものではなく、従来公知の方法で行なえばよい。例えば、架橋剤を用いてもよく、放射線を用いてもよいが、例えば放射線を使用する場合、α線、β線、γ線、電子線、中性子線、Ｘ線等を用いればよく、中でも、γ線が好ましい。照射する放射線の照射線量は、０．５ｋＧｙ以上２０ｋＧｙ以下が好ましく、さらに好ましくは２ｋＧｙ以上１０ｋＧｙ以下であり、特に好ましくは３ｋＧｙ以上７ｋＧｙ以下であるが、製造するＬ−ＰＧＡ架橋体の用途等に応じて適宜設定すればよい。
【００１６】
ポリグルタミン酸がＦＡD依存型ＧＤＨおよび電子受容体を少なくとも含む組成物中に存在することで感度が上昇する理由としては次のようなことが考えられる。すなわち、センサ上のグルコース定量用組成物にグルコースを含む試料溶液が加えられるとき、高い感度を得るためにはグルコース溶液が組成物中にすばやく浸透しＧＤＨと反応することが望ましい。また特に電極状のセンサにあっては、組成中にグルコース溶液が浸透した状態においてＧＤＨが容易に拡散せずに電極表面近傍に保持されることが、電極表面における電子の授受を迅速になすために望ましい。ポリグルタミン酸は、ＧＤＨ表面に存在する正電荷を有するアミノ酸残基、すなわちリジン、アルギニンなどと電気的親和性により吸着されるものと推察される。この親和性は、一般的にグルコースセンサ等に添加されるカルボキシメチルセルロースやポリビニルピロリドンのような非イオン性のポリマーよりも強いと考えられる。この際、ポリグルタミン酸はそれ自身が親水性ポリマーであるがゆえにグルコース溶液が組成中に浸透する速度を速め、結果として酵素と基質であるグルコースの接触を促進するものと考える。さらに、その際に長鎖ポリマーであるポリグルタミン酸が網のようにＧＤＨを保持して拡散を抑える働きをするため、特に電極上においてグルコースの酸化により発生する電子の電極への受け渡しを早めているものと推察される。このため、本発明に述べるポリグルタミン酸によるグルコースセンサの感度上昇効果は、ＧＤＨの由来や電子受容体の種類によらず達成しえるものと考えられる。
【００１７】
組成中へのポリグルタミン酸の添加量は、ＧＤＨがグルコースを酸化して得られる電子を電子受容体に供与する反応を促進する効果が得られる範囲であれば特に限定しないが、液状での濃度として好ましくは０．１％以上であり、より好ましくは０．２％以上である。また、好ましくは１％以下である。また、加温または凍結乾燥等を経ることによる固体状の組成においては、好ましい添加量は３％以上であり、より好ましくは６％以上である。また、好ましくは３０％以下である。本発明の反応促進剤はセンサ作製時に組成中に混合してもよく、また血糖測定時に添加してもよい。あるいは、測定対象となる血液中に添加するかもしくは血液を希釈する場合においては希釈溶液中に含有させてもよい。
【００１８】
上記のＦＡＤ依存型ＧＤＨ、電子受容体、およびポリグルタミン酸を含む組成物の中には、さらに緩衝剤成分、界面活性剤、タンパク質安定化剤、親水性ポリマー等を含んでいてもよく、あるいはＧＤＨを保持するための担体を含んでもよい。該担体にはＧＤＨを吸着させるための官能基および該官能基と該担体とを繋ぐスペーサーを有していてもよい。
【００１９】
上記の組成物に緩衝能を持たせる場合においては、バッファー成分を使用してもよい。バッファー成分としてはリン酸塩、ホウ酸塩、酢酸や各種ジカルボン酸等の有機酸塩、アミノ酸、トリス塩酸塩、ＧＯＯＤのバッファー等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２０】
また、上記の組成物は、酵素安定化剤として糖アルコール、アミノ酸、グリセロール、ウシ血清アルブミンに代表されるタンパク質等を含んでもよい。あるいはプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどに代表される親水性ポリマーを賦形剤および／または増粘剤として含んでもよく、あるいはＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸ナトリウム、エマルゲン４３０等に代表される界面活性剤をさらに含んでもよい。
【００２１】
（グルコース測定用センサ）
本発明の別の実施形態は、以下の（１）〜（３）の成分を含む上記のグルコース測定用組成物がグルコースセンサ上の反応層中に存在する、グルコース測定用センサである。
（１）フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコースデヒドロゲナーゼ、
（２）電子受容体、および、
（３）ポリグルタミン酸
【００２２】
本発明のグルコース測定用センサは、比色式であってもよく、また電気化学式であってもよい。また該グルコース測定用センサにはグルコースに応答して得られたシグナル強度から血糖値を算出するための演算装置並びに算出された血糖値を表示するためのディスプレイを具備していてもよい。さらに該グルコース測定用センサは、反応層上に検体となる血液もしくは血液の希釈液を滴下するタイプであってもよいが、被検者の皮膚を窄孔し血液を採取するための針及び／または血液を移送させる流路を具備するかまたは装着可能であってもよい。比色式センサの場合はさらに吸光度を測定するための光源ランプおよび光度計を具備していてもよい。電気化学式センサの場合は作用極と対極を有しているかこれら電極上にＧＤＨおよび電子受容体を保持したチップを装着できるタイプであってもよい。電極としては、カーボン電極、金電極、銀電極、白金電極などを用い、この電極上にＧＤＨを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、電子受容体とともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いてＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００２３】
（グルコース測定方法）
本発明の方法によるグルコース濃度の測定は、比色式グルコースセンサの場合にあっては例えば以下のようにして行うことができる。グルコースセンサ上の反応層にはＦＡＤ依存型ＧＤＨ、電子受容体、そして反応促進剤としてポリグルタミン酸を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてｐＨ緩衝剤、発色試薬を添加する。ここにグルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、還元により退色する電子受容体もしくは電子受容体より電子を受け取ることで重合し生成する色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化より、あらかじめ標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブを元に試料中のグルコース濃度を算出することができる。この方法において使用できるメディエーター及び発色試薬としては、たとえば２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）を電子受容体として添加し、６００ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を、さらに発色試薬としてニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）を加え、５７０ｎｍ吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。いうまでもなく使用する電子受容体および発色試薬はこれらに限定されない。
【００２４】
また、本発明の方法によるグルコース濃度の測定は、電気化学式センサの場合にあっては以下のようにして行うことができる。グルコースセンサ上の電極に接続された反応層にはＦＡＤ依存型ＧＤＨ、電子受容体、そして反応促進剤としてポリグルタミン酸を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。この組成物にはさらにｐＨ緩衝剤等を含んでいてもよい。ここにグルコースを含む試料を加えて反応させ、さらに電極に一定の電圧を印加する。電流をモニタリングし、電圧印加開始から一定時間に蓄積される電流を積算するかあるいは電圧印加開始から一定時間を経過したある時点での電流値を測定する。この値を元に、標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００２５】
本発明のグルコース測定用組成物またはセンサにおいて、ＦＡＤ依存型ＧＤＨおよび電子受容体を含む組成に、さらにポリグルタミン酸を含有させることにより、これらの組成物またはセンサを用いてグルコースを測定する過程において、グルコースに応答して発生する応答シグナル強度が、ポリグルタミン酸を含まない場合と比較して増大する。
【００２６】
本発明に述べる応答シグナルとは、ＧＤＨがグルコースを酸化させることにより発生する電子の量に比例して発生する計測可能な発色・退色もしくは電流のことを示し、これらを数値化することでグルコースの定量が可能となる。すなわちシグナル強度の増大とは、これら発色・退色もしくは電流の発生する度合いが増大することを意味する。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を具体的に実施例として示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００２８】
＜実施例＞
電気化学式センサにおける応答シグナルの増大
まず、グルコース測定用試薬として、以下の組成からなる溶液（ｐＨ＝７．０）を作製した。
１ｍＭ  クエン酸
５０ｍＭ  フェリシアン化カリウム
３２００Ｕ／ｍｌ  ＦＡＤ依存型ＧＤＨ（東洋紡製ＧＬＤ−３５１）
０．１％  カルボキシメチルセルロース
０〜１％  Ｌ−ポリグルタミン酸（東洋紡製ＰＧＡ−３０１）
上記溶液５μＬを、３電極を具備するディスポーサブルチップ（ＤＥＰ−ＣＨＩＰ、バイオデバイステクノロジーズ社製）の作用極・対極・参照極上に滴下し、５０℃１０分の加温処理を行うことでセンサチップとした。このセンサチップを専用ソケットを介してポテンショ／ガルバノスタットに接続し、電極上の組成物に１０ｍＭの標準グルコース溶液５μＬを添加して＋０．３Ｖの電圧を印加して電流値をモニタリングした。なお、上記組成におけるＬ−ポリグルタミン酸濃度条件は、０％、０．２％、１．０％の３条件で行った。結果を表１および図１に示す。【００２９】
【表１】
2014054531.tif 000002
【００３０】
Ｌ−ポリグルタミン酸を含まない場合の応答電流に対し、Ｌ−ポリグルタミン酸を加えて作製したセンサチップでは約２５％の応答電流の上昇がみられた。すなわち、ポリグルタミン酸の添加によって、電気化学センサにおける応答シグナルを増大させる効果があることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明は、血糖値測定用試薬、血糖センサ並びにグルコース濃度定量キットとしての供給が可能であり、また血液その他の試料中のグルコースの定量において有効な方法である。
【図１】
2014054531.tif 000003
【国際調査報告】
2014054531.tif 000004
2014054531.tif 000005