(57)【要約】  西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼポリペプチドをコードする野生型の塩基配列と少なくとも１個のコドンにおいて異なる塩基配列を有する、修飾されたポリヌクレオチドであって、修飾されたコドンの使用頻度がフミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ３種の糸状菌のコドン使用頻度であり、糸状菌において、コードするポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼポリペプチドをコードする野生型の塩基配列と少なくとも１個のコドンにおいて異なる塩基配列を有する、修飾されたポリヌクレオチドであって、コドンの使用頻度が下記百分率であり、糸状菌において、コードするポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチド
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアラニンである場合、ＧＣＣの使用頻度が８０％、ＧＣＴの使用頻度が２０％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアルギニンである場合、ＣＧＣの使用頻度が９０％、ＣＧＴの使用頻度が１０％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギンである場合、ＡＡＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギン酸である場合、ＧＡＣの使用頻度が９５％、ＧＡＴの使用頻度が５％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がシステインである場合、ＴＧＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミンである場合、ＣＡＧの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミン酸である場合、ＧＡＧの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグリシンである場合、ＧＧＣの使用頻度が７５％、ＧＧＴの使用頻度が２５％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がヒスチジンである場合、ＣＡＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がイソロイシンである場合、ＡＴＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がロイシンである場合、ＣＴＣの使用頻度が８０％、ＣＴＧの使用頻度が２０％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がリジンである場合、ＡＡＧの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がフェニルアラニンである場合、ＴＴＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がプロリンである場合、ＣＣＣの使用頻度が８０％、ＣＣＴの使用頻度が２０％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がセリンである場合、ＡＧＣの使用頻度が１５％、ＴＣＣの使用頻度が８５％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がスレオニンである場合、ＡＣＣの使用頻度が８５％、ＡＣＧの使用頻度が１５％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がチロシンである場合、ＴＡＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がバリンである場合、ＧＴＣの使用頻度が８５％、ＧＴＧの使用頻度が５％、ＧＴＴの使用頻度が１０％。
【請求項２】
少なくとも２個のコドンが修飾されている請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
少なくとも１０％のコドンが修飾されている請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼＣ１ａポリペプチドをコードし、下記（ｉ）〜（ii）からなる群から選択される少なくとも１の特徴を有する請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド
（ｉ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含む
（ii）配列番号：１に記載の９１〜１０１７位からなる塩基配列と９５％以上の相同性を有する。
【請求項５】
西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼＣ１ａポリペプチドをコードし、下記（ｉ）〜（ii）からなる群から選択される少なくとも１の特徴を有する請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド
（ｉ）配列番号：２６に記載の塩基配列のコード領域を含む
（ii）配列番号：２６に記載の９１〜１０１７位からなる塩基配列と９５％以上の相同性を有する。
【請求項６】
請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドに、さらに所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターを糸状菌に導入してなる形質転換体。
【請求項９】
前記糸状菌が、トリコデルマ属菌又はアスペルギルス属菌である請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
前記糸状菌が、トリコデルマ・ビリデ又はアスペルギルス・ニガーである請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１１】
前記糸状菌が、トリコデルマ・ビリデである請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項８〜１１のうちのいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、培養された形質転換体及び/又は該形質転換体の培養物から、発現させたポリペプチドを採取する工程を含む、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの製造方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法によって製造されたポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法によって製造され、糖鎖が除去されたポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法によって製造されたポリペプチドを含む調製物。
【請求項１６】
標的分子を検出するための方法であって、請求項１２に記載の方法によって製造されたポリペプチドを前記標的分子に結合させることを特徴とする方法。
【請求項１７】
色素の脱色方法であって、該色素に請求項１２に記載の方法によって製造されたポリペプチドを過酸化水素存在下で作用させることを特徴とする方法。
【請求項１８】
フェノール性化合物の除去方法であって、該フェノール性化合物に請求項１２に記載の方法によって製造されたポリペプチドを過酸化水素存在下で作用させることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌を用いた西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ組換えタンパク質の製造方法に関する。詳しくは、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼポリペプチドをコードし、該ポリペプチドを糸状菌において発現させることができるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、該発現ベクターを糸状菌に導入してなる形質転換体、該形質転換体を用いた西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ組換えタンパク質の製造方法、該製造方法によって製造された西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ組換えタンパク質、及びそれを含む調製物、並びにそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼは、酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、免疫組織染色法、サザンブロッティング法、ウエスタンブロッティング法等の各種試験における検出用酵素のひとつとして、広く使用されている。また、近年では臨床検査キット用酵素としても広く用いられている。【０００３】
ペルオキシダーゼはダイコン、サツマイモ、小麦、日本ワサビ、西洋ワサビ等一般に植物界に広く存在しているが、西洋ワサビのペルオキシダーゼ含量が高い等の理由により、工業生産には、西洋ワサビが好んで用いられている。【０００４】
しかしながら、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼは、酸性、中性、及び塩基性アイソザイム等の複数の酵素から成り立っている。さらに、ペルオキシダーゼ含量及びこれらアイソザイム組成比は、栽培した土壌の性質、与えた肥料の種類と量、天候、採取時期等により著しく変動することに加え、植物を破壊し、多種多様な夾雑成分の中からペルオキシダーゼを精製するという方法で製造されるため、西洋ワサビから精製されたペルオキシダーゼの品質は必ずしも一定ではない。つまり、現在広く用いられている西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ製品の多くは、多くのアイソザイムの混合物である場合がほとんどであり、その割合はロットごとに異なっていることがほとんどである。このような西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ製品を用いた各種測定、例えばＥＬＩＳＡを行なった場合、製造ロットごとにばらつきが生じ、安定した測定結果を得ることが困難になるという重大な問題がある。【０００５】
また、原料となる西洋ワサビの栽培は長期間を要するため、天候により収量が変動する上に、近年では、栽培効率の悪さや、需要の大きいバイオエタノール用穀物への転作等を理由に、西洋ワサビの供給不安が生じつつある状況が懸念されており、安定供給が可能な西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼに対する潜在的なニーズは大きい。【０００６】
前記のような西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼが有する問題を克服する方法として、遺伝子組換え技術を用いた微生物による大量生産が考えられる。微生物を用いることにより、短期間で大量培養が可能であるだけでなく、天候等による影響を受けずに安定供給が可能となる。また、遺伝子組換え技術を利用すれば、目的とするペルオキシダーゼのみを多量に発現させることができるため、アイソザイムの夾雑という問題も回避が可能である。【０００７】
西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼにおいて主要アイソザイムの一つであるペルオキシダーゼＣ１ａは、そのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列が明らかとなっている（非特許文献１参照）。また、ペルオキシダーゼＣ１ａをコードする遺伝子を用い、大腸菌、酵母及びタバコ植物細胞において発現検討がなされている。しかしながら、その発現量は大腸菌で０．１１ｍｇ／Ｌ（非特許文献２参照）、酵母で５．３ｍｇ／Ｌ（非特許文献３参照）、タバコ植物細胞で３ｍｇ／Ｌ（非特許文献４参照）と微量であり、生産は極めて低く実用的ではない。以上のことから、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼの大量生産が可能な組換え生物、及びそれを用いた西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ製造方法の開発が所望されていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｆｕｊｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９８８年、１７３巻、６８１〜６８７ページ
【非特許文献２】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、１９９９年、１５巻、４６７〜４７１ページ
【非特許文献３】Ｍｏｒａｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０００年、１３巻、３７７〜３８４ページ
【非特許文献４】Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．、２００６年、１０２巻、１０２〜１０９ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼポリペプチドを大量に効率良く製造することを可能にするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、先ず、野生型の西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）  Ｃ１ａをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを糸状菌に導入し、得られた形質転換体におけるＨＲＰペプチドの産生量を調べた。しかしながら、かかる形質転換体からのＨＲＰペプチドの産生を確認することができず、野生型ＨＲＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いても、糸状菌にＨＲＰポリペプチドを産生させることができないということが明らかになった。【００１１】
そこで、本発明者らは、ＨＲＰポリペプチドを糸状菌において高発現させるべく鋭意検討を行い、先ず、フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマの糸状菌３種におけるコドン使用頻度を勘案した。次に、得られたコドン使用頻度に、ＨＲＰポリヌクレオチドにおけるコドンの出現頻度を適合させたコドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドを調製した。そして、このコドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドを用いて、フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマを形質転換したところ、フミコーラでは発現が確認できなかったものの、アスペルギルス及びトリコデルマにおいてＨＲＰの発現を確認できた。特に、トリコデルマを用いた場合、これまでの１００倍以上の濃度にてＨＲＰを生産させることに成功した。【００１２】
そこで、本発明者らは、ＨＲＰをトリコデルマにおいてより高発現させるべく、トリコデルマのコドン使用頻度のみに適合させたＨＲＰポリヌクレオチドを用い、トリコデルマを形質転換した。その結果、かかる形質転換体においてもＨＲＰの発現を確認することはできた。しかしながら、驚くべきことに予想に反して、フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマの糸状菌３種におけるコドン使用頻度を勘案して修飾したポリヌクレオチドを用いて形質転換した場合の方が、宿主細胞であるトリコデルマのみのコドン使用頻度に適合させたポリヌクレオチドを用いて形質転換した場合よりも、ＨＲＰの生産性は顕著に高いものであった。【００１３】
本発明者らは、フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ３種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案することの有効性をさらに検証するために、当該３種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案して修飾した別のポリヌクレオチドを調製し、トリコデルマに形質転換して、ＨＲＰの発現を評価した。その結果、前記同様に、形質転換したトリコデルマにおいて、ＨＲＰが高発現していることが確認された。さらに、かかるコドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドを利用することによって、トリコデルマ由来ＣＢＨ１ポリペプチド又はＨｉｓタグポリペプチドを融合させたＨＲＰポリペプチドをも、糸状菌において発現させることができることを明らかにした。さらに、これらＨＲＰに融合させたポリペプチドによって、簡便にＨＲＰを単離精製できることも見出した。また、コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドにより形質転換された糸状菌が産生するＨＲＰポリペプチドは過酸化水素存在下にて、アナトー色素を脱色できることも見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、より詳しくは以下を提供するものである。
（１）  西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼポリペプチドをコードする野生型の塩基配列と少なくとも１個のコドンにおいて異なる塩基配列を有する、修飾されたポリヌクレオチドであって、コドンの使用頻度が下記百分率であり、糸状菌において、コードするポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチド
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアラニンである場合、ＧＣＣの使用頻度が８０％、ＧＣＴの使用頻度が２０％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアルギニンである場合、ＣＧＣの使用頻度が９０％、ＣＧＴの使用頻度が１０％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギンである場合、ＡＡＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギン酸である場合、ＧＡＣの使用頻度が９５％、ＧＡＴの使用頻度が５％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がシステインである場合、ＴＧＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミンである場合、ＣＡＧの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミン酸である場合、ＧＡＧの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグリシンである場合、ＧＧＣの使用頻度が７５％、ＧＧＴの使用頻度が２５％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がヒスチジンである場合、ＣＡＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がイソロイシンである場合、ＡＴＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がロイシンである場合、ＣＴＣの使用頻度が８０％、ＣＴＧの使用頻度が２０％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がリジンである場合、ＡＡＧの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がフェニルアラニンである場合、ＴＴＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がプロリンである場合、ＣＣＣの使用頻度が８０％、ＣＣＴの使用頻度が２０％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がセリンである場合、ＡＧＣの使用頻度が１５％、ＴＣＣの使用頻度が８５％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がスレオニンである場合、ＡＣＣの使用頻度が８５％、ＡＣＧの使用頻度が１５％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がチロシンである場合、ＴＡＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がバリンである場合、ＧＴＣの使用頻度が８５％、ＧＴＧの使用頻度が５％、ＧＴＴの使用頻度が１０％。
（２）  少なくとも２個のコドンが修飾されている（１）に記載のポリヌクレオチド。
（３）  少なくとも１０％のコドンが修飾されている（１）又は（２）に記載のポリヌクレオチド。
（４）  西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼＣ１ａポリペプチドをコードし、下記（ｉ）〜（ii）からなる群から選択される少なくとも１の特徴を有する（１）〜（３）のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチド
（ｉ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含む
（ii）配列番号：１に記載の９１〜１０１７位からなる塩基配列と９５％以上の相同性を有する。
（５）  西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼＣ１ａポリペプチドをコードし、下記（ｉ）〜（ii）からなる群から選択される少なくとも１の特徴を有する（１）〜（３）のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチド
（ｉ）配列番号：２６に記載の塩基配列のコード領域を含む
（ii）配列番号：２６に記載の９１〜１０１７位からなる塩基配列と９５％以上の相同性を有する。
（６）  （１）〜（５）のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチドに、さらに所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド。
（７）  （１）〜（６）のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（８）  （７）に記載の発現ベクターを糸状菌に導入してなる形質転換体。
（９）  前記糸状菌が、トリコデルマ属菌又はアスペルギルス属菌である（８）に記載の形質転換体。
（１０）  前記糸状菌が、トリコデルマ・ビリデ又はアスペルギルス・ニガーである（８）に記載の形質転換体。
（１１）  前記糸状菌が、トリコデルマ・ビリデである（８）に記載の形質転換体。
（１２）  （８）〜（１１）のうちのいずれか一に記載の形質転換体を培養し、培養された形質転換体及び/又は該形質転換体の培養物から、発現させたポリペプチドを採取する工程を含む、（１）〜（６）のうちのいずれか一に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの製造方法。
（１３）  （１２）に記載の方法によって製造されたポリペプチド。
（１４）  （１２）に記載の方法によって製造され、糖鎖が除去されたポリペプチド。
（１５）  （１２）に記載の方法によって製造されたポリペプチドを含む調製物。
（１６）  標的分子を検出するための方法であって、（１２）に記載の方法によって製造されたポリペプチドを前記標的分子に結合させることを特徴とする方法。
（１７）  色素の脱色方法であって、該色素に（１２）に記載の方法によって製造されたポリペプチドを過酸化水素存在下で作用させることを特徴とする方法。
（１８）  フェノール性化合物の除去方法であって、該フェノール性化合物に（１２）に記載の方法によって製造されたポリペプチドを過酸化水素存在下で作用させることを特徴とする方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする糸状菌の発現に最適化されたコドンを含むポリヌクレオチドが提供された。さらに、前記ポリヌクレオチドを形質転換したトリコデルマ・ビリデ又はアスペルギルス・ニガーを用いた西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ組換えタンパク質の製造が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】野生型の西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）Ｃ１ａをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（ｐＣＢ１−ＨＲＰ＿Ｎａｔｉｖｅ）により、糸状菌（トリコデルマ）を形質転換し、得られた形質転換体の培養上清を、抗ＨＲＰ抗体を用いたウェスタンブロットにより分析した結果を示す写真である。図中、１のレーンは分子量マーカーを展開した結果を示し、２のレーンは形質転換体の培養上清を展開した結果を示す。
【図２】野生型ＨＲＰポリヌクレオチドと、本発明のポリヌクレオチド（コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチド）とを、塩基配列（１〜５４０位）において比較した結果を示す図である。図中、上の配列が野生型ＨＲＰポリヌクレオチドの塩基配列（配列番号：３に記載の塩基配列）を示し、下の配列が本発明のポリヌクレオチド（配列番号：１に記載の塩基配列）を示す。
【図３】野生型ＨＲＰポリヌクレオチドと、本発明のポリヌクレオチド（コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチド）とを、塩基配列（５４１〜１０１４位）において比較した結果を示す図である。図中、上の配列が野生型ＨＲＰポリヌクレオチドの塩基配列（配列番号：３に記載の塩基配列）を示し、下の配列が本発明のポリヌクレオチド（配列番号：１に記載の塩基配列）を示す。
【図４】本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター（ｐＮＣＥ２−ＨＲＰ−ｈｕｍｉｃｏｌａ）により、フミコーラを形質転換し、得られた形質転換体の培養上清を、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロットにより分析した結果を示す写真である。図中、１のレーンは分子量マーカーを展開した結果を示し、２のレーンは形質転換体の培養上清を展開した結果を示す。
【図５】本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター（ｐＡｍｙＢ−ｐｙｒ−ＨＲＰ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）により、アスペルギルスを形質転換し、得られた形質転換体の培養上清を、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロットにより分析した結果を示す写真である。図中、１のレーンは分子量マーカーを展開した結果を示し、２のレーンは形質転換体の培養上清を展開した結果を示す。
【図６】本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター（ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏにより、トリコデルマを形質転換し、得られた形質転換体の培養上清を、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロットにより分析した結果を示す写真である。図中、１のレーンは分子量マーカーを展開した結果を示し、２のレーンは形質転換体の培養上清を展開した結果を示す。
【図７】本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター（ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ）により、トリコデルマを形質転換し、得られた形質転換体の培養上清を、抗ＨＲＰ抗体を用いたウェスタンブロットにより分析した結果を示す写真である。図中、１のレーンは分子量マーカーを展開した結果を示し、２のレーンは形質転換体の培養上清を展開した結果を示す。
【図８】本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター（ｐＣＢ１−ＫＲ−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ）により、トリコデルマを形質転換し、得られた形質転換体の培養上清を、抗ＨＲＰ抗体を用いたウェスタンブロットにより分析した結果を示す写真である。図中、１のレーンは分子量マーカーを展開した結果を示し、２のレーンは形質転換体の培養上清を展開した結果を示す。
【図９】トリコデルマのコドン使用頻度のみに適合させたＨＲＰポリヌクレオチドを含む発現ベクター（ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−２）により、トリコデルマを形質転換し、得られた形質転換体の培養上清を、抗ＨＲＰ抗体を用いたウェスタンブロットにより分析した結果を示す写真である。図中、１のレーンは分子量マーカーを展開した結果を示し、２のレーンは形質転換体の培養上清を展開した結果を示す。
【図１０】野生型ＨＲＰポリヌクレオチドと、本発明のポリヌクレオチド（コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチド）とを、塩基配列（１〜５４０位）において比較した結果を示す図である。図中、上の配列が野生型ＨＲＰポリヌクレオチドの塩基配列（配列番号：３に記載の塩基配列）を示し、下の配列が本発明のポリヌクレオチド（配列番号：２６に記載の塩基配列）を示す。
【図１１】野生型ＨＲＰポリヌクレオチドと、本発明のポリヌクレオチド（コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチド）とを、塩基配列（５４１〜１０１４位）において比較した結果を示す図である。図中、上の配列が野生型ＨＲＰポリヌクレオチドの塩基配列（配列番号：３に記載の塩基配列）を示し、下の配列が本発明のポリヌクレオチド（配列番号：２６に記載の塩基配列）を示す。
【図１２】本発明のポリヌクレオチドどうしを塩基配列（１〜５４０位）において比較した結果を示す図である。図中、上の配列が配列番号：１に記載の塩基配列を示し、下の配列が配列番号：２６に記載の塩基配列を示す。
【図１３】本発明のポリヌクレオチドどうしを塩基配列（５４１〜１０１７位）において比較した結果を示す図である。図中、上の配列が配列番号：１に記載の塩基配列を示し、下の配列が配列番号：２６に記載の塩基配列を示す。
【図１４】本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター（ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−３）により、トリコデルマを形質転換し、得られた形質転換体の培養上清を、抗ＨＲＰ抗体を用いたウェスタンブロットにより分析した結果を示す写真である。図中、１のレーンは分子量マーカーを展開した結果を示し、２のレーンは形質転換体の培養上清を展開した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜ポリヌクレオチド＞
後述の実施例に示す通り、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼポリペプチド（ＨＲＰ）をコードする野生型の塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いては、糸状菌において、ウェスタンブロット分析により、ＨＲＰポリペプチドの発現を検出できなかったが、前記野生型の塩基配列とコドンにおいて異なる塩基配列を有する、修飾されたポリヌクレオチドを用いたところ、かかる糸状菌において、ＨＲＰポリペプチドの発現を検出することができた。
【００１７】
従って、本発明は下記ポリヌクレオチドを提供するものである。
西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼポリペプチドをコードする野生型の塩基配列と少なくとも１個のコドンにおいて異なる塩基配列を有する、修飾されたポリヌクレオチドであって、コドンの使用頻度が下記百分率であり、糸状菌において、コードするポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチド
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアラニンである場合、ＧＣＣの使用頻度が８０％、ＧＣＴの使用頻度が２０％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアルギニンである場合、ＣＧＣの使用頻度が９０％、ＣＧＴの使用頻度が１０％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギンである場合、ＡＡＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギン酸である場合、ＧＡＣの使用頻度が９５％、ＧＡＴの使用頻度が５％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がシステインである場合、ＴＧＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミンである場合、ＣＡＧの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミン酸である場合、ＧＡＧの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグリシンである場合、ＧＧＣの使用頻度が７５％、ＧＧＴの使用頻度が２５％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がヒスチジンである場合、ＣＡＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がイソロイシンである場合、ＡＴＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がロイシンである場合、ＣＴＣの使用頻度が８０％、ＣＴＧの使用頻度が２０％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がリジンである場合、ＡＡＧの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がフェニルアラニンである場合、ＴＴＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がプロリンである場合、ＣＣＣの使用頻度が８０％、ＣＣＴの使用頻度が２０％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がセリンである場合、ＡＧＣの使用頻度が１５％、ＴＣＣの使用頻度が８５％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がスレオニンである場合、ＡＣＣの使用頻度が８５％、ＡＣＧの使用頻度が１５％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がチロシンである場合、ＴＡＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がバリンである場合、ＧＴＣの使用頻度が８５％、ＧＴＧの使用頻度が５％、ＧＴＴの使用頻度が１０％。
【００１８】
本発明において、ＨＲＰポリペプチドとは、西洋ワサビから抽出される、ペルオキシド構造を酸化的に切断して２つのヒドロキシル基に分解する活性を有する酵素のことを意味し、例えば、ＨＲＰ  Ｃ１ａ、ＨＲＰ  Ｃ１ｂ、ＨＲＰ  Ｃ１ｃ、ＨＲＰ  Ｃ２、ＨＲＰ  Ｃ３のアイソザイムが挙げられるが、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼにおいて、最も含有率が高いアイソザイムであるため、西洋ワサビから抽出され、試薬等として汎用されているペルオキシダーゼ混合物の性質に、その性質が最も強く反映されているという観点から、ＨＲＰ  Ｃ１ａポリペプチドであることが好ましい。
【００１９】
また、ＨＲＰ  Ｃ１ａポリペプチドとして、典型的には、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのことである。さらに、自然界においても、アミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。従って、ＨＲＰポリペプチドには、前記活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれる。
【００２０】
なお、ＨＲＰ  Ｃ１ａポリペプチドにおいて、Ｎ末端のメチオニン残基から数えて３０番目のアラニン残基までからなるポリペプチドは、ＨＲＰのシグナルペプチドとして機能することが知られている。また、本発明において、ポリペプチドとは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した分子を意味する。従って、完全長のタンパク質のみならず、いわゆるオリゴペプチドをも含む概念である。ポリペプチドには、アミノ酸配列の変異以外に、例えば、グリコシル化、リン酸化、パルミトイル化、プレニル化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ヒドロキシル化、アミド化等の修飾がなされていてもよい。
【００２１】
本発明において、「ＨＲＰポリペプチドをコードする野生型の塩基配列」とは、典型的には、配列番号３に記載の塩基配列である。「コドン」とは、アミノ酸をコードするヌクレオチド３個の塩基の組み合わせのことを意味する。
【００２２】
本発明において、前記野生型の塩基配列と異なる塩基配列を有する少なくとも１個のコドンとしては、糸状菌において翻訳効率を向上させるコドンであることが好ましい。このコドンは、好ましくは、アミノ酸配列の変化を伴わない「縮重変異」が導入されたコドンである。
【００２３】
前記野生型の塩基配列を有するポリヌクレオチドを糸状菌に導入することによって産生されるＨＲＰポリペプチドの量よりも、前記野生型の塩基配列と少なくとも１個のコドンにおいて異なる塩基配列を有する修飾されたポリヌクレオチドを糸状菌に導入することによって産生されるＨＲＰポリペプチドの量が多い場合、当該コドンは「糸状菌において翻訳効率を向上させるコドン」と判定することができる。ＨＲＰポリペプチドの量の比較は、後述の実施例に示すように、例えば、ウェスタンブロッティング、テトラメチルベンヂジンによる発色の検出（波長４５０ｎｍにおける吸光度の測定）、グアヤコール酸化活性の測定等の公知の手法を用いて行うことができる。
【００２４】
また、修飾されるコドンの数は、好ましくは少なくとも２個（例えば、３個以上、５個以上）、より好ましくは１０個以上（例えば、２０個以上、３０個以上、５０個以上）、さらに好ましくは１００個以上（例えば、１２０個以上、１５０個以上、１８０個以上）、特に好ましくは２００個以上（例えば、２１０個以上、２２０個以上、２３０個以上、２４０個以上）である。また、本発明において、前記野生型の塩基配列を有するポリヌクレオチド中の全コドンにおける、修飾されたコドンの割合は、好ましくは少なくとも１０％であり、より好ましくは３０％以上、特に好ましくは６０％以上（例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％）である。なお、配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域においては、３３８のコドンのうち２４６のコドン（７２．８％）に修飾（縮重変異の導入）がされている。また、配列番号：２６に記載の塩基配列のコード領域においては、３３８のコドンのうち２４５のコドン（７２．５％）に修飾（縮重変異の導入）がされている。
【００２５】
本発明において、糸状菌とは、菌糸から構成される真菌のことを意味し、例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属菌、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属菌、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属菌、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｔｈｏｒａ）属菌、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属菌、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属菌、リゾムコル（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属菌、テルモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属菌、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属菌、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）属菌が挙げられる。
【００２６】
さらに、より具体的には、トリコデルマ属菌として、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）が挙げられる。また、アスペルギルス属菌として、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フェチヅス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニヅランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）が挙げられる。これらの中で、トリコデルマ属菌及びアスペルギルス属菌であることが好ましく、トリコデルマ・ビリデ及びアスペルギルス・ニガーであることがより好ましい。
【００２７】
本発明において、かかる糸状菌において、「コードするポリペプチドを発現させることができる」とは、ＨＲＰポリペプチドをコードする野生型の塩基配列と少なくとも１個のコドンにおいて異なる塩基配列を有する修飾されたポリヌクレオチドを導入することにより形質転換された糸状菌を培養し、該形質転換体の濃度が９×１０８ＣＦＵ／ｍＬとなるよう希釈された培養上清中に産生されているＨＲＰの濃度が０．００１ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは１０ｍｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは１００ｍｇ／Ｌ以上、特に好ましくは３００ｍｇ／Ｌ以上となることを意味する。
【００２８】
後述の実施例に示す通り、フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ３種におけるコドン使用頻度を勘案し、後に示す表１に記載のコドン使用頻度を算出した。そして、得られたコドン使用頻度に、野生型ＨＲＰポリヌクレオチドにおけるコドンの出現頻度を適合させ、野生型ＨＲＰポリヌクレオチドの塩基配列（配列番号：３に記載の塩基配列）を、配列番号：１に記載の塩基配列又は配列番号：２６に記載の塩基配列に変更した。そして、このようにして調製したコドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドを用いて、糸状菌を形質転換したところ、野生型ＨＲＰポリヌクレオチドを用いては、発現が確認できなかったＨＲＰポリペプチドについて、その発現を検出することができた。
【００２９】
従って、本発明のポリヌクレオチドは、コドンの使用頻度が下記百分率となるよう修飾された、ＨＲＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアラニンである場合、ＧＣＣの使用頻度が８０％、ＧＣＴの使用頻度が２０％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアルギニンである場合、ＣＧＣの使用頻度が９０％、ＣＧＴの使用頻度が１０％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギンである場合、ＡＡＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がアスパラギン酸である場合、ＧＡＣの使用頻度が９５％、ＧＡＴの使用頻度が５％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がシステインである場合、ＴＧＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミンである場合、ＣＡＧの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグルタミン酸である場合、ＧＡＧの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がグリシンである場合、ＧＧＣの使用頻度が７５％、ＧＧＴの使用頻度が２５％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がヒスチジンである場合、ＣＡＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がイソロイシンである場合、ＡＴＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がロイシンである場合、ＣＴＣの使用頻度が８０％、ＣＴＧの使用頻度が２０％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がリジンである場合、ＡＡＧの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がフェニルアラニンである場合、ＴＴＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がプロリンである場合、ＣＣＣの使用頻度が８０％、ＣＣＴの使用頻度が２０％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がセリンである場合、ＡＧＣの使用頻度が１５％、ＴＣＣの使用頻度が８５％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がスレオニンである場合、ＡＣＣの使用頻度が８５％、ＡＣＧの使用頻度が１５％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がチロシンである場合、ＴＡＣの使用頻度が１００％；
修飾されたコドンがコードするアミノ酸がバリンである場合、ＧＴＣの使用頻度が８５％、ＧＴＧの使用頻度が５％、ＧＴＴの使用頻度が１０％。
【００３０】
本発明において、「野生型ＨＲＰの塩基配列を、コドンの使用頻度が前記百分率となるよう修飾する」とは、前記百分率の値そのものに合致させることのみならず、前記百分率の値に２．５％の幅をもって適合させることも含む意である。例えば、修飾されたコドンがコードするアミノ酸がセリンである場合には、ＡＧＣの使用頻度が１２．５〜１７．５％、ＴＣＣの使用頻度が８２．５〜８７．５％になるよう適合させるべく、ＨＲＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列における、セリンをコードするコドンの使用頻度が修正されることを意味する。また、本発明のポリヌクレオチドにおいて、コドンの使用頻度が前記百分率となるアミノ酸は少なくとも１種あればよいが、好ましくは少なくとも２種（例えば、３種以上、５種以上、７種以上）、より好ましくは１０個以上（例えば、１２種以上、１５種以上、１７種以上）、特に好ましくは前記１８種全てある。
【００３１】
前述の通り、コドン使用頻度が前記百分率となるよう修飾された塩基配列（配列番号：１に記載の塩基配列又は配列番号：２６に記載の塩基配列）を有するポリヌクレオチドを用い、糸状菌を形質転換したところ、ＨＲＰポリペプチドの顕著に高い発現を検出することができた。
【００３２】
従って、本発明は、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）Ｃ１ａポリペプチドをコードし、下記（ｉ）〜（ii）からなる群から選択される少なくとも１の特徴を有するポリヌクレオチドを提供するものである
（ｉ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含む
（ii）配列番号：１に記載の９１〜１０１７位からなる塩基配列と９５％以上の相同性を有する。
【００３３】
また、本発明は、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）Ｃ１ａポリペプチドをコードし、下記（ｉ）〜（ii）からなる群から選択される少なくとも１の特徴を有するポリヌクレオチドを提供するものである。
（ｉ）配列番号：２６に記載の塩基配列のコード領域を含む
（ii）配列番号：２６に記載の９１〜１０１７位からなる塩基配列と９５％以上の相同性を有する。
【００３４】
本発明において、「配列番号：１に記載の９１〜１０１７位からなる塩基配列」及び「配列番号：２６に記載の９１〜１０１７位からなる塩基配列」とは、すなわち、コドン使用頻度が前記百分率となるよう修飾され、更にシグナル配列をコードする塩基配列が除外された、ＨＲＰ  Ｃ１ａポリペプチドをコードする塩基配列を意味する。
【００３５】
また、塩基配列についての「相同性」は、比較される配列間において、各々の配列を構成する塩基の一致の程度の意味で用いられる。本明細書において示した「相同性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ等においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、容易に算出することができる。
【００３６】
また、ＨＲＰ  Ｃ１ａポリペプチドがその活性を発揮するためには、シグナル配列を要さないので、本発明のポリヌクレオチドとしては、ＨＲＰポリヌクレオチドから、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号：１に記載の１〜９０位に相当する塩基配列）が除外されているものであってもよい。
【００３７】
本発明のポリヌクレオチドは、当業者であれば、適宜公知の手法を用いることにより、調製することができる。例えば、後述の実施例に示すように、ＨＲＰポリペプチドをコードする野生型の塩基配列と少なくとも１個のコドンにおいて異なる塩基配列を設計し、この塩基配列情報に基づき、市販のＤＮＡ合成機を用いて、本発明のポリヌクレオチドを化学的に合成することができる。また、野生型ＨＲＰポリヌクレオチドに、公知の部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法等により、変異（塩基の置換）を導入することによっても、本発明のポリヌクレオチドを調製することができる。
【００３８】
後述の実施例において示す通り、前記コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドを利用することによって、トリコデルマ由来ＣＢＨ１（セロビオハイドロレース１）ポリペプチド又はＨｉｓタグポリペプチドを融合させたＨＲＰポリペプチドをも、糸状菌において発現させることができることも明らかになった。
【００３９】
従って、本発明は、前記コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドに、さらに所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチドを提供するものである。
【００４０】
本発明において、所望のポリペプチドとしては特に制限はなく、例えば、ＨＲＰポリペプチドを検出用のタグとして付加することにより、当該所望のポリペプチドを検出し易くすることができる。
【００４１】
一方、本発明においては、所望のポリペプチドを、ＨＲＰポリペプチドを精製するために、当該ＨＲＰポリペプチドに付加してもよい。かかるＨＲＰポリペプチドを精製するために用いられるポリペプチドとしては、例えば、基質吸着能を有しているポリペプチドが挙げられ、より具体的には、セロビオハイドロレース（ＣＢＨ）、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルブミン、抗体、Ｆａｂ抗体、ｓｃＦＶ抗体、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、ＴＡＰタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｖ５タグ、Ｔ７タグが挙げられる。
【００４２】
前記コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドと、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの付加の様式としては、付加することにより、これらポリペプチドの読み取り枠（Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）がずれることがなく、一続きの融合ポリペプチドとして翻訳されるものであればよく、コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドの５’側及び３’側のいずれか片方又は両方に、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが付加されていてもよい。また、かかる付加は直接的なものであっても間接的なものであってもよい。間接的な付加としては、例えば、前記コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドと所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの間に、リンカーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挿入されている様式が挙げられる。かかるリンカーポリペプチドの長さとしては、通常、１〜１００アミノ酸、好ましくは１〜５０アミノ酸、より好ましくは１〜３０アミノ酸、特に好ましくは１２〜１８アミノ酸（例えば１５アミノ酸）である。
【００４３】
＜発現ベクター、形質転換体＞
本発明は、前記本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターも提供する。本発明の発現ベクターとしては、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発現ベクターは、宿主である糸状菌に導入されたとき、その糸状菌のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
【００４４】
本発明の発現ベクターは、糸状菌に導入してＨＲＰ等を発現させるために、前記本発明のポリヌクレオチドの他に、その発現を制御するポリヌクレオチドや形質転換体を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいることが望ましい。
【００４５】
かかる発現を制御するポリヌクレオチドとしては、プロモーター、リーダー配列及びターミネーター等が挙げられる。プロモーターは糸状菌において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主とする糸状菌と同種若しくは異種又は同属若しくは異属のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子の発現を制御するポリヌクレオチドとして得ることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、α−アミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、グリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターが挙げられる。ターミネーターは、転写を終結するために糸状菌によって認識される配列であればよく、例えば、ＴＡＫＡアミラーゼ、グルコアミラーゼ、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、アントラニル酸シンターゼ、α−グルコシダーゼ、ｔｒｐＣ遺伝子、トリプシン様プロテアーゼ遺伝子のターミネーターが挙げられる。リーダー配列は、糸状菌による翻訳効率を向上させることのできるｍＲＮＡの非翻訳領域であればよく、例えば、ＴＡＫＡアミラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ｇｌａＡ遺伝子のリーダー配列が挙げられる。
【００４６】
また、形質転換体を選択するための遺伝子マーカーとしては、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができ、例えば、ウラシル生合成遺伝子（ｐｙｒ４）、硝酸資化遺伝子（ｎｉａＤ）、アルギニン生合成遺伝子（ａｒｇＢ）、アセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子（ａｒｇＢ）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｂａｒ）、フレオマイシン結合性遺伝子（ｂｌｅＡ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｙｇＢ）、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｒＧ）、硫酸アデニルトランスフェラーゼ遺伝子（ｓＣ）、アントラニル酸シンターゼ遺伝子（ｔｒｐＣ）、デストマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、オーレオバシジン耐性遺伝子が挙げられる。
【００４７】
かかるベクターの設計及び調製は、当業者であれば公知の遺伝子組み換え技術等を用いることにより適宜行うことができる。
【００４８】
また、このような本発明のベクターを導入することにより、ＨＲＰポリペプチド等を糸状菌において産生させることができる。従って、前記発現ベクターを糸状菌に導入してなる形質転換体を、本発明は提供するものである。
【００４９】
かかる糸状菌としては、前述の通りだが、ＨＲＰポリペプチド等の産生量がより多いという観点から、トリコデルマ属菌（特に、トリコデルマ・ビリデ）、アスペルギルス属菌（特に、アスペルギルス・ニガー）が好ましく、トリコデルマ属菌がより好ましく、トリコデルマ・ビリデが特に好ましい。
【００５０】
本発明のベクターを導入する方法としては、特に限定されず、公知の手法を用いて行うことができる。かかる公知の手法としては、例えば、プロトプラスト法、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、コンピテント法、ヒートショック法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法が挙げられる。また、後述の実施例において示すように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、前記遺伝子マーカーとを含むベクターとを同時に導入する、所謂コートランスフォーメーション法であってもよい。
【００５１】
＜ＨＲＰポリペプチド等の製造方法、ＨＲＰポリペプチド等、ＨＲＰポリペプチド等を含む調製物＞
本発明においては、前記形質転換体を培養し、培養された形質転換体及び/又は該形質転換体の培養物から、発現させたＨＲＰポリペプチド等を採取することによって、本発明のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを製造することができる。本発明による形質転換体の培養は、常法に従って、培地、培養条件等を適宜選択することにより行うことができる。
【００５２】
本発明において「培養物」とは、前記形質転換体を、糸状菌に対して適当な培地で培養することによって得られる、増殖した形質転換体、該形質転換体の分泌産物及び該形質転換体の代謝産物等を含有する培地のことであり、それらの希釈物、濃縮物を含む。
【００５３】
かかる培地としては、糸状菌が資化し得るものが含有されていればよく、炭素源、窒素源、硫黄源、無機塩類、金属、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、カゼイン加水分解物、血清等が含有物として挙げられる。また、かかる培地には、例えば、本発明の発現ベクターがコードし得る薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質や、本発明の発現ベクターがコードし得る栄養要求性を相補する遺伝子に対応する栄養物を添加してもよい。
【００５４】
本発明にかかる培養の条件としては、本発明の形質転換体が前記培地中にＨＲＰポリペプチド等を分泌産生できる条件であればよく、当業者であれば、糸状菌の種類、用いる培地等に合わせて、温度、空気の添加の有無、酸素の濃度、二酸化炭素の濃度、培地のｐＨ、培養温度、培養時間、湿度等を適宜調整し、設定することができる。
【００５５】
また、培養された形質転換体から発現させたＨＲＰポリペプチド等を採取する方法としては、例えば、形質転換体を回収（濾過、遠心分離等）し、回収した形質転換体から抽出（磨砕処理、加圧破砕等）し、さらに精製（塩析法、溶媒沈殿法等）する方法が挙げられる。
【００５６】
さらに、形質転換体から発現させたＨＲＰポリペプチド等を採取する方法としては、例えば、培養物フィルター（例えば、孔径０．２μｍ以下のフィルター）によって糸状菌を除去する方法や、抽出濾過、遠心分離、透析、濃縮、乾燥、凍結、吸着、脱着、各種溶液に対する溶解度の差を利用した方法（例えば、沈殿、塩析、結晶化、再結晶、転溶、クロマトグラフィー）等の公知の手法が挙げられる。また、かかる手法は単独で用いてもよく、若しくは任意の順序に組合せて又は反復して用いてもよい。
【００５７】
また、本発明のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが、前述のＨＲＰを精製するためのタグを含んでいる場合には、該タグが吸着する基質を用いて精製することもできる。
【００５８】
かかる製造方法によって、ＨＲＰポリペプチド、シグナル配列を含まないＨＲＰポリペプチド、又はこれらＨＲＰポリペプチドに所望のポリペプチドが付加されたポリペプチドを得ることができる。従って、本発明は、これらＨＲＰポリペプチド等も提供するものである。
【００５９】
また、西洋ワサビから抽出したＨＲＰ  Ｃ１ａポリペプチドには、糖鎖が約１０ｋＤａ程付加されているため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等による分析では約４０ｋＤａの分子量のポリペプチドとして検出される。一方、後述の実施例において示す通り、本発明の製造方法にて得られるＨＲＰ  Ｃ１ａポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等による分析において、約３２ｋＤａの分子量のポリペプチドとして検出される。さらに、後述の実施例において示してはいないが、西洋ワサビから抽出されるＨＲＰ  Ｃ１ａポリペプチドは、グリコシダーゼＦによって糖鎖が切断されないが、本発明の製造方法にて得られるＨＲＰ  Ｃ１ａポリペプチドの糖鎖は、該酵素によって切断されることを、本発明者らは見出しており、かかる知見から、西洋ワサビから抽出されるＨＲＰ  Ｃ１ａポリペプチドの糖鎖にはα１，３−結合コアフコース残基が付加されているが、本発明の製造方法にて得られるＨＲＰ  Ｃ１ａポリペプチドの糖鎖にはα１，３−結合コアフコース残基が付加されていないことが明らかになっている。
【００６０】
従って、本発明の製造方法によって得られたＨＲＰポリペプチド等は、西洋ワサビにおいて産生されるＨＲＰポリペプチドとは異なる糖鎖修飾が施されているため、本発明のポリペプチドとしては、本発明の製造方法によって製造され、糖鎖が除去されたポリペプチドであってもよい。糖鎖の除去は、糖鎖を分解除去する酵素を用いて行うことができる。かかる酵素としては、例えば、グリコシダーゼＦ（グリコペプチダーゼＦ）、エンドグリコシダーゼＨが挙げられる。
【００６１】
さらに、本発明は前記製造方法によって製造されたＨＲＰポリペプチド等を含む調製物をも提供する。本発明の調製物としては、前記製造方法によって製造されたＨＲＰポリペプチド等を含んでいればよいが、本発明のＨＲＰポリペプチド等の他、ＨＲＰポリペプチド等の調製物として許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩が挙げられる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
【００６２】
＜ＨＲＰポリペプチド等の使用方法＞
ＨＲＰポリペプチドを触媒として作用させることにより、ルミノールやＴＭＢ（テトラメチルベンヂジン）等の発光・発色基質が酸化され、化学発光や発色が生じることが知られている。そして、ＨＲＰポリペプチドと、標的分子とを結合させることにより、前記化学発光等を指標として該標的分子を検出することができる。従って、本発明は、標的分子を検出するための方法であって、本発明の製造方法によって製造されたポリペプチド（本発明のポリペプチド）を前記標的分子に結合させることを特徴とする方法を提供する。
【００６３】
本発明の方法により検出される標的分子としては、特に制限されず、例えば、ポリペプチド、核酸、糖、脂質が挙げられる。
【００６４】
本発明の標的分子を検出するための方法において、本発明のポリペプチドと標的分子とを結合させるため、本発明のポリペプチドには、該標的分子に特異的に結合する分子（例えば、抗体）が付加されていることが好ましい。また、当該分子に特異的に結合する分子（当該分子が抗体であれば、該抗体を認識する所謂２次抗体、プロテインＡ、プロテインＧ等）が付加されている本発明のポリペプチドも好適に用いられる。
【００６５】
かかる付加としては特に制限はなく、遺伝子レベルでの付加であってもよく、また化学的な付加であってもよい。遺伝子レベルでの付加は、前述の通り、本発明のポリヌクレオチドとして、前記抗体等をコードするポリヌクレオチドが付加されているコドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドを用いることにより達成される。また、化学的な付加は、共有結合であってもよく、非共有結合であってもよい。「共有結合」としては特に制限はなく、例えば、アミノ基とカルボキシル基とのアミド結合、アミノ基とアルキルハライド基とのアルキルアミン結合、チオールどうし間のジスルフィド結合、チオール基とマレイミド基又はアルキルハライド基とのチオエステル結合が挙げられる。「非共有結合」としては、例えば、ビオチン−アビジン間結合が挙げられる。
【００６６】
本発明の標的分子を検出するための方法として用いられる発光・発色基質としては、例えば、ルミノール、ＴＭＢ、ピロガロール、グアヤコール、ジアニシジンが挙げられる。
【００６７】
また、後述の実施例に示す通り、本発明のポリペプチドによれば、過酸化水素存在下にてアナトー等の色素を脱色することができる。従って、本発明は、色素の脱色方法であって、該色素に本発明の方法によって製造されたポリペプチドを過酸化水素存在下で作用させることを特徴とする方法を提供する。
【００６８】
本発明の方法によって脱色される色素としては、例えば、アナトー、オレンジII、アリザリンレッドＳ、トロペリオンＯ、カルコンが挙げられる。また、かかる色素の脱色における反応条件、すなわち、過酸化水素の濃度、温度、ＨＲＰポリペプチドと色素とを混合させる系（例えば、緩衝液）の種類及びｐＨ等は、当業者であれば、脱色させる色素の種類等に合わせ、適宜設定することができる。
【００６９】
さらに、ＨＲＰポリペプチドを触媒として作用させることにより、フェノール性化合物におけるフェノール部が、フェノキシラジカルへと酸化され、さらに該フェノキシラジカルは自己重合することにより、水不溶性の多量体を形成する。そして、該多量体は沈殿物として容易に除去できることが知られている。
【００７０】
従って、本発明は、フェノール性化合物の除去方法であって、該フェノール性化合物に本発明の方法によって製造されたポリペプチドを過酸化水素存在下で作用させることを特徴とする方法も提供することができる。
【００７１】
本発明の方法によって除去されるフェノール性化合物としては、前述の通り、ペルオキシダーゼにより酸化されるフェノール部を有している化合物であればよく、特に制限されないが、例えば、ｐ−クレゾール、ｐ−エチルフェノール、ｐ−ｎ−プロピルフェノールが挙げられる。また、かかるフェノール性化合物の除去における反応条件、すなわち、過酸化水素の濃度、温度、ＨＲＰポリペプチドとフェノール性化合物とを混合させる系（例えば、緩衝液）の種類及びｐＨ等は、当業者であれば、フェノール性化合物の種類に合わせ、適宜設定することができる。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００７３】
（比較例１）
野生型西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の糸状菌での発現検討
先ず、下記方法にて、野生型ＨＲＰポリペプチドをコードする野生型の塩基配列を用いて、糸状菌（トリコデルマ・ビリデ）を形質転換し、得られた形質転換体におけるＨＲＰポリペプチドの発現を調べた。【００７４】
（１）  野生型ＨＲＰ  Ｃ１ａ遺伝子の作製
野生型ＨＲＰ  Ｃ１ａ遺伝子の配列として、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８８年、１７３巻、３号，６８１〜６８７ページ」に記載の塩基配列（配列番号：３に記載の塩基配列）を用い、野生型ＨＲＰ遺伝子を人工的に合成した。人工合成の際、開始コドンの上流の配列に制限酵素ＳｔｕＩ認識サイトを、終始コドンの下流に制限酵素ＸｈｏＩ認識サイトを付加した。そして、合成して得られた野生型ＨＲＰ遺伝子を、制限酵素ＳｆｉＩにて処理したｐＭＡ−Ｔに挿入することにより、プラスミド「ｐＨＲＰ＿Ｎａｔｉｖｅ」を得た。【００７５】
（２）  野生型ＨＲＰ発現プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ＿Ｎａｔｉｖｅ」の構築
プラスミド「ｐＨＲＰ＿Ｎａｔｉｖｅ」をＳｔｕＩ及びＸｈｏＩで切断し、約１ｋｂｐの遺伝子断片「ＨＲＰ＿Ｎａｔｉｖｅ」を得た。一方、プラスミド「ｐＣＢ１−Ｅｇ３Ｘ−ｈｐｈｌｅｓｓ」（国際公開第２０１１／０２１６１６号  参照）をＳｔｕＩ及びＸｈｏＩで切断し、約６ｋｂｐの断片を回収した。これに「ＨＲＰ＿Ｎａｔｉｖｅ」をＴａＫａＲａ  ＤＮＡライゲ―ションキットマイティミックス（宝酒造社製）を用いて連結し、プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ＿Ｎａｔｉｖｅ」を作製した。酵素等の反応条件についてはキットに添付の説明書の条件に従った。プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ＿Ｎａｔｉｖｅ」にクローニングされた挿入ＤＮＡ断片のシークエンスは、ビッグダイターミネーターｖ３．１サイクルシークエンシングキット（アプライドバイオシステムズ社製）とＡＢＩ  ＰＲＩＳＭジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）とを用いて、添付のプロトコールに従って、決定した。プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ＿Ｎａｔｉｖｅ」は、宿主のトリコデルマ・ビリデ内にて、自身の開始コドンを用いてＨＲＰポリペプチドを発現するように構築した。【００７６】
（３）  プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ＿Ｎａｔｉｖｅ」によるトリコデルマ・ビリデの形質転換体の作製
プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ＿Ｎａｔｉｖｅ」によるトリコデルマ・ビリデの形質転換は、国際公開第２００５／０５６７８７号に記載の方法に従い、実施した。ウラシル生合成遺伝子（ｐｙｒ４）欠損株であるトリコデルマ・ビリデ株  ２株を宿主とし、選択マーカーとしてニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）のｐｙｒ４遺伝子を用いたコートランスフォーメーション法により形質転換を実施した。トリコデルマ・ビリデ株  ２株を５０ｍＬの菌体形成培地（１％  イーストエキス、１％  モルトエキス、２％  ポリペプトン、２．５％  グルコース、０．１％  リン酸水素２カリウム、０．０５％  硫酸マグネシウム７水和物、０．０００１％  ウリジン（ｐＨ７．０））において、２８℃で２４時間培養し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、集菌した。得られた菌体を０．５ｍｏｌ／Ｌ  シュークロースで洗浄し、綿で濾過したプロトプラスト化酵素溶液（１ｍｇ／ｍＬ  β−グルクロニダーゼ、０．３ｍｇ／ｍＬ  キチナーゼ、０．３ｍｇ／ｍＬ  ザイモリエース、０．５ｍｏｌ／Ｌ  シュークロース）に懸濁した。３０℃で６０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣ緩衝液（０．５ｍｏｌ／Ｌ  シュークロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス塩酸（ｐＨ７．５））で洗浄した。【００７７】
このプロトプラストを１００μＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、そこに７μｇ分のプラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ＿Ｎａｔｉｖｅ」が入ったＤＮＡ溶液７μＬとｐｙｒ４遺伝子とが入ったＤＮＡ溶液３μＬを加え、氷中に５分間静置した。次に４００μＬのＰＥＧ溶液（６０％  ＰＥＧ４０００、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス塩酸（ｐＨ７．５））を加え、氷中に２０分間静置した後、１０ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液を加え、２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。集めたプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、２００μＬずつ０．５ｍｏｌ／Ｌ  シュークロースを含む最少培地に軟寒天とともに重層し、２８℃で５日間培養後、生育したコロニーを再度最少培地に移植し、ここで形成したコロニーを形質転換体とした。【００７８】
（４）  「ｐＣＢ１−ＨＲＰ＿Ｎａｔｉｖｅ」の形質転換体の培養及び同定
プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ＿Ｎａｔｉｖｅ」を導入し最少培地で生育した株を選抜し、国際公開第９８／１１２３９号の記載の方法に準じ、Ｐ培地（１．０％グルコース、４．０％ラクトース、２．０％大豆粕、１．０％イーストエキス、０．５％リン酸カリウム、０．２％硫酸アンモニゥム、０．２％炭酸カルシウム、０．０３％硫酸マグネシウム）にて、フラスコを用い、２８℃にて培養した。そして、ＨＲＰが発現しているか否かを確認するため、得られた培養上清液を１２％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥミニ（テフコ社製）を用いて電気泳動分離を行い、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）上にブロットした。ブロットしたＰＶＤＦ膜について、抗ＨＲＰ抗体（ＪＩＲＬ社製、製品番号：１２３−０５５−０２１）を用いたウェスタンブロットを行った。得られた結果を図１に示す。【００７９】
図１に示した結果から明らかなように、ｐＣＢ１−ＨＲＰ＿Ｎａｔｉｖｅによる形質転換体の培養上清においては、抗ＨＲＰ抗体を用いたウェスタンブロットにより、ＨＲＰ由来のバンドを検出することができなかった。従って、ＨＲＰポリペプチドをコードする野生型の塩基配列と何ら異なる塩基配列を有していないポリヌクレオチドを用いて、糸状菌を形質転換しても、かかる形質転換体からＨＲＰは産生されないことが明らかになった。【００８０】
（実施例１）
フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ３種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案して修飾したＨＲＰポリヌクレオチドによる、フミコーラにおけるＨＲＰポリペプチド発現の検討
前記結果を受け、糸状菌においてＨＲＰポリペプチドを高発現させるべく、フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ３種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案し、これら３種全てにおける翻訳効率を向上させるべく、野生型ＨＲＰ遺伝子の塩基配列と異なる塩基配列を有する修飾されたポリヌクレオチドを作製した。そして、先ずは、このポリヌクレオチドを用いて、フミコーラ（フミコーラ・インソレンス）を形質転換し、得られた形質転換体におけるＨＲＰポリペプチドの発現を調べた。以下にこれらの方法並び得られた結果について示す。【００８１】
（１）  フミコーラ、アスペルギルス、トリコデルマ３種すべての発現に最適化するためのコドン表の作成
フミコーラ、アスペルギルス、トリコデルマで発現が確認できたポリペプチドのコドン使用頻度を考慮し、３種全てにおける翻訳効率を向上させるべく、表１に記載のコドン使用頻度表を作成した。具体的には、前記３種の菌において、１種類の菌でも使用頻度が極端に低い（使用頻度が５％未満である）コドンの使用頻度は「０％」と設定した。また、前記３種の菌全てにおいて、使用頻度が５％以上のコドンについては、３種又は２種の菌の使用頻度の平均値を算出し、さらに該平均値が５の倍数になるように変更することにより、表１に記載のコドン使用頻度表を作成した。【００８２】
【表１】
2013180208.tif 000002
【００８３】
（２）  フミコーラ、アスペルギルス、トリコデルマ３種すべての発現の最適化を目的としたコドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドの作製
ＨＲＰ遺伝子をフミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ３種において、活性あるポリペプチドとして高発現させるために、ＨＲＰポリヌクレオチドの修飾を行った。すなわち、表１に記載のコドン使用頻度に基づき、野生型ＨＲＰ遺伝子の塩基配列（配列番号：３に記載の塩基配列）から２８．５％の塩基の変更を伴う、配列番号：１に記載の塩基配列を設計した（図２及び３  参照）。なお、このようにして設計した修飾ＨＲＰポリヌクレオチドの塩基配列においては、全コドン数３３８のうち２４６のコドンを変更、すなわち全コドンのうち７２．８％のコドンが修飾（縮重変異）されている。そして、この塩基配列情報に基づき、ｐＨＲＰ＿Ｎａｔｉｖｅ同様に、修飾ＨＲＰポリヌクレオチドを人工的に合成し、ｐＭＡ−Ｔに挿入することにより、コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドが挿入されたプラスミド「ｐＨＲＰ」を得た。【００８４】
（３）  フミコーラ用コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチド発現プラスミド「ｐＮＣＥ２−ＨＲＰ−ｈｕｍｉｃｏｌａ」の構築
コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドの塩基配列を基に、さらに該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのＣ末端側にＨｉｓタグが付加されて発現されるように、以下のプライマーを設計し、作製した。
ＨＲＰ−ｈｕｍｉｃｏｌａ−Ｆ：ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧＣＡＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣ（配列番号：５）
ＨＲＰ−ｈｕｍｉｃｏｌａ−Ｒ：ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＡＧＴＴＧＧＡＧＴＴＧＡＣＧＡＣＧ（配列番号：６）。【００８５】
次いで、これらプライマーを使用し、「ｐＨＲＰ」を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲはプライムスターマックスＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて実施した。ＰＣＲは、「９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で１０秒」を３０サイクルで実施した。増幅された約１ｋｂｐのＤＮＡ断片をＢａｍＨIで切断し、約１ｋｂｐの遺伝子断片「ＨＲＰ−ｈｕｍｉｃｏｌａ」を得た。一方、プラスミド「ｐＪＮＤ−ｃ５」（国際公開第０１／０９０３７５号  参照）をＢａｍＨIで切断し、約８ｋｂｐの断片を回収した。これにＨＲＰ−ｈｕｍｉｃｏｌａをＴａＫａＲａ  ＤＮＡライゲ―ションキットマイティミックスを用いて連結し、プラスミド「ｐＮＣＥ２−ＨＲＰ−ｈｕｍｉｃｏｌａ」を作製した。プラスミド「ｐＮＣＥ２−ＨＲＰ−ｈｕｍｉｃｏｌａ」にクローニングされた挿入ＤＮＡ断片のシークエンスは、比較例１（２）に記載の方法により解析した。プラスミド「ｐＮＣＥ２−ＨＲＰ−ｈｕｍｉｃｏｌａ」は、宿主のフミコーラ・インソレンス内にて、自身の開始コドンを用いてＨＲＰポリペプチドを発現するように構築した。【００８６】
（４）  プラスミド「ｐＮＣＥ２−ＨＲＰ−ｈｕｍｉｃｏｌａ」によるフミコーラ・インソレンスの形質転換体の作製
「ｐＮＣＥ２−ＨＲＰ−ｈｕｍｉｃｏｌａ」によるフミコーラ・インソレンスの形質転換は、国際公開第０１／０９０３７５号に記載の方法に従い、実施した。フミコーラ・インソレンス  ＭＮ２００−１株を宿主とし、ハイグロマイシンを選択マーカーに用いて形質転換を実施した。フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１株を（Ｓ）培地中３７℃で培養し、２４時間後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離により集菌した。（Ｓ）培地の組成は、３．０％  グルコース、２．０％  酵母エキス、０．１％  ペプトン、０．０３％  塩化カルシウム、０．０３％  塩化マグネシウム、ｐＨ６．８である。得られた菌体を０．５Ｍシュークロースで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（３ｍｇ／ｍｌ  β−グルクロニダーゼ、１ｍｇ／ｍｌ  キチナーゼ、１ｍｇ／ｍｌ  ザイモリアーゼ、０．５Ｍシュークロース）１０ｍｌに懸濁した。３０℃で６０〜９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣ緩衝液（０．５Ｍシュークロース、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５））で洗浄した。【００８７】
このプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、そこに１０μｇ分のプラスミド「ｐＮＣＥ２−ＨＲＰ−ｈｕｍｉｃｏｌａ」を加え、氷中に５分間静置した。次に、４００μＬのＰＥＧ溶液（６０％  ＰＥＧ４０００、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５））を加え、氷中に２０分間静置した後、１０ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液を加え、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。集めたプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、最終的に１００μＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した。以上の処理を加えたプロトプラストを、ハイグロマイシン（２００μｇ／ｍＬ）添加再生ＹＭＧ培地（１％  グルコース、０．４％  酵母エキス、０．２％  モルトエキス、１７．８％  ラフィノース、１％  寒天、ｐＨ６．８）にソフトアガーとともに重層し、３７℃、５日間培養後、生育したコロニーを再度、ハイグロマイシン（２００μｇ／ｍＬ）添加再生ＹＭＧ培地に移植し、ここで生育したコロニーを形質転換体とした。【００８８】
（５）  「ｐＮＣＥ２−ＨＲＰ−ｈｕｍｉｃｏｌａ」の形質転換体の培養および同定
プラスミド「ｐＮＣＥ２−ＨＲＰ−ｈｕｍｉｃｏｌａ」を導入しハイグロマイシン添加再生ＹＭＧ培地で生育した株を選抜し、国際公開第０１／０９０３７５号に記載の方法に準じて培養した。そして、ＨＲＰが発現しているか否かを確認するため、得られた培養上清液を１２％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥミニを用いて電気泳動分離を行い、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）上にブロットした。ブロットしたＰＶＤＦ膜について、抗Ｈｉｓタグ抗体（ＭＢＬ社製、製品番号：Ｄ２９１−７）を用いたウェスタンブロットを行った。得られた結果を図４に示す。【００８９】
図４に示した結果から明らかなように、ｐＮＣＥ２−ＨＲＰ−ｈｕｍｉｃｏｌａによる形質転換体の培養上清においては、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロットにより、ＨＲＰ由来のバンドを検出することができなかった。従って、フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ３種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案し、修飾したポリヌクレオチド（コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチド）を用いて、フミコーラを形質転換しても、かかる形質転換体からＨＲＰは産生されないことが明らかになった。【００９０】
（実施例２）  フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ３種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案して修飾したＨＲＰポリヌクレオチドによる、アスペルギルスにおけるＨＲＰポリペプチドの発現検討
次に、前記コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドを用いて、アスペルギルス（アスペルギルス・ニガー）を形質転換し、得られた形質転換体におけるＨＲＰポリペプチドの発現を調べた。【００９１】
なお、アスペルギルスの形質転換は、ウラシル生合成遺伝子（ｐｙｒ４）欠損株であるアスペルギルス・ニガー  ｐｙｒ１株を宿主とし、選択マーカーとしてトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）由来ｐｙｒ４遺伝子を用いて、以下に示す方法にて実施した。【００９２】
（１）  アスペルギルス・ニガー用発現ベクターの構築
（１−１）選択マーカー用トリコデルマ・ビリデ由来ｐｙｒ４発現プラスミド「ｐＵＣ−Ｐｙｒ４」の構築
先ず、下記方法にて、アスペルギルス・ニガーの形質転換において選択マーカーとして利用するトリコデルマ・ビリデ由来ｐｙｒ４遺伝子のクローニングを行った。【００９３】
（１−１−１）  トリコデルマ・ビリデのゲノムＤＮＡライブラリーの作製
トリコデルマ・ビリデの菌体より、堀内らの方法（Ｈ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８８年、１７０巻、２７２〜２７８ページ  参照）に従ってゲノムＤＮＡを単離・精製した。単離したゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩにより部分消化した。これをファージベクターλＥＭＢＬ３クローニングキット（ストラタジーン社製）のＢａｍＨＩアームに、ライゲーションキットＶｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結させた。これをエタノール沈澱後、ＴＥ緩衝液に溶解した。連結混合物の全量をマックスプラックスλパッケージングキット（エピセンターテクノロジー社製）を用い、ファージ粒子を形成させ、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ  ＭＲＡ（Ｐ２）株に感染させた。この方法により１．１×１０４個のファージから成るゲノムＤＮＡライブラリーが得られた。【００９４】
（１−１−２）  トリコデルマ・ビリデ由来ｐｙｒ４プローブの作製
公開されているトリコデルマ・リセイの翻訳領域の配列を基に以下のプライマーを作製した。
ＰＹＲＭＥＴ：ＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＧＡＣＧ（配列番号：７）
ＰＹＲＳＴＯＰ：ＣＴＡＴＣＧＣＡＧＴＡＧＣＣＧＣＴＣ（配列番号：８）。【００９５】
これらプライマーを使用し、前記にて単離・精製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて実施した。ＰＣＲは、９４℃で３０秒、アニールを３０秒、７２℃で２分間を３０サイクル実施するプログラムで実施した。増幅された約１１００ｂｐのＤＮＡ断片を、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）により、添付のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミドベクターに挿入し、プラスミド「ＴＯＰＯ−ＰＹＲ」を得た。【００９６】
プラスミド「ＴＯＰＯ−ＰＹＲ」にクローニングされた挿入ＤＮＡ断片のシークエンスは、比較例１（２）記載の方法により解析した。その結果得られた塩基配列をホモロジー検索した結果、トリコデルマ由来のＰＹＲ４遺伝子と相同性を示したため、本ＤＮＡ断片をＰＹＲ４遺伝子の一部であると判断した。本ＤＮＡ断片をプラスミド「ＴＯＰＯ−ＰＹＲ」を鋳型として上記と同様の方法でＰＣＲに増幅し、得られたＰＣＲ産物はＥＣＬダイレクトシステム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて標識し、プローブとした。【００９７】
（１−１−３）  プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニング
前記にて作製したファージプラークは、ハイボンドＮ＋ナイロントランスファーメンブラン（アマシャム社製）に転写し、０．４Ｎ水酸化ナトリウムでアルカリ処理し、メンブラン上の組換えファージＤＮＡを１本鎖に変成後、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）で洗浄し、風乾させＤＮＡを固定した。その後、キットのマニュアルにしたがって、前記にて作製したプローブを用いてハイブリダイゼーションを行い、検出反応をし、ＦＵＪＩメディカルＸ線フィルム（富士写真フィルム社製）に感光させ、２個の陽性クローンを得た。陽性クローンからのＤＮＡ調製は、Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔ１ｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）に従い、宿主大腸菌としてＬＥ３９２を用いてファージＤＮＡを回収した。以上のように調製したファージＤＮＡをＰｓｔＩで処理し、前記プローブを用いてハイブリダイゼーションを行った結果、ファージクローン１では約０．８ｋｂｐのバンドを検出し、ファージクローン２では約２．２ｋｂｐのバンドを検出した。【００９８】
（１−１−４）  トリコデルマ・ビリデ由来ｐｙｒ４発現プラスミド「ｐＵＣ−Ｐｙｒ４」の構築
ファージクローン１の約０．８ｋｂｐのＰｓｔＩ断片及びファージクローン２の約２．２ｋｂｐのＰｓｔＩ断片をｐＵＣ１１８にクローン化し、それぞれプラスミド「ｐＵＣ−ＰＹＲ−ｃｌｏｎｅ１」及び「ｐＵＣ−ＰＹＲ−ｃｌｏｎｅ２」を得た。得られたプラスミドの塩基配列を実施例１−２記載の方法により解析した。その結果、「ｐＵＣ−ＰＹＲ−ｃｌｏｎｅ１」はＰｙｒ４遺伝子のターミネーター側が、「ｐＵＣ−ＰＹＲ−ｃｌｏｎｅ２」はプロモーター側が含まれていることが明らかになった。「ｐＵＣ−ＰＹＲ−ｃｌｏｎｅ１」及び「ｐＵＣ−ＰＹＲ−ｃｌｏｎｅ２」をＰｓｔＩ処理し、連結した状態でｐＵＣ１１８にサブクローニングし、プラスミド「ｐＵＣ−Ｐｙｒ４」を得た。【００９９】
（１−２）  アスペルギルス・ニガー用発現ベクター「ｐＡｍｙＢ−ｐｙｒ」の構築
プラスミド「ｐＵＣ−Ｐｙｒ４」にＸｂａIサイトを付加するために、Ｔｒｉｃｈｏ−ｐｙｒ−Ｎ−ｘｂａ及びＴｒｉｃｈｏ−ｐｙｒ−Ｃ−ｘｂａをプライマーとして使用し、「ｐＵＣ−Ｐｙｒ４」を鋳型にＰＣＲを行った。増幅された約２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片をＸｂａIで切断し、約２．５ｋｂｐの遺伝子断片「Ｐｙｒ４−ｘｂａＩ」を得た。
Ｔｒｉｃｈｏ−ｐｙｒ−Ｎ−ｘｂａ：ＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣＡＣＴＴＣＣＡＧＧＣＡ（配列番号：９）
Ｔｒｉｃｈｏ−ｐｙｒ−Ｃ−ｘｂａ：ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＡＣＧＡＡＴＡＣＡＴＡＴＣＡＡＡＣ（配列番号：１０）。【０１００】
一方、プラスミド「ｐＡＭＹ」（国際公開第９７／０００９４４号  参照）をＸｂａＩで切断し、約８．３ｋｂｐの断片を回収した。これにＰｙｒ４−ｘｂａＩをＴａＫａＲａ  ＤＮＡライゲ―ションキットマイティミックスを用いて連結し、プラスミド「ｐＡＭＹ−Ｐｙｒ４」を作製した。プラスミド「ｐＡＭＹ−Ｐｙｒ４」にＥｃｏＲＶサイトを付加するために、ａｍｙＢ−Ｐ−Ｒ５Ｒ及びａｍｙＢ−Ｔ−Ｒ５Ｒをプライマ−として使用し、「ｐＡＭＹ−Ｐｙｒ４」を鋳型にＰＣＲを行い、トリコデルマ・ビリデ由来ｐｙｒ４遺伝子を含有する、アスペルギルス・ニガー用発現ベクター「ｐＡｍｙＢ−ｐｙｒ」を得た。
ａｍｙＢ−Ｐ−Ｒ５Ｒ：ＧＡＴＡＴＣＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴＡＴＴＧＴＴＣＡＧＡＧＡＡ（配列番号：１１）
ａｍｙＢ−Ｔ−Ｒ５Ｒ：ＧＡＴＡＴＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧＴＡＴＡＴＧＡＴＧＧＴＡ（配列番号：１２）。【０１０１】
（２）  アスペルギルス用コドン改変ＨＲＰ発現プラスミド「ｐＡｍｙＢ−ｐｙｒ−ＨＲＰ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ」の構築
次に、前記にて構築したプラスミド「ｐＡｍｙＢ−ｐｙｒ」に、前記コドン改変ＨＲＰ遺伝子を挿入した。すなわち、先ず、コドン改変ＨＲＰ遺伝子の塩基配列を基に、さらに該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのＣ末端側にＨｉｓタグが付加されて発現されるように、以下のプライマーを設計し、作製した。
ＨＲＰ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ−Ｆ：ＧＧＣＡＴＴＴＡＴＧＣＡＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ（配列番号：１３）
ＨＲＰ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ−Ｒ：ＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＡＧＴＴＧＧＡＧＴＴＧＡＣＧＡＣＧ（配列番号：１４）。【０１０２】
次いで、これらプライマーを使用し、ｐＨＲＰを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲはプライムスターマックスＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。増幅された約１ｋｂｐのＤＮＡ断片をリン酸化し、約１ｋｂｐの遺伝子断片「ＨＲＰ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ」を得た。一方、実施例２（１−２）で作製したプラスミド「ｐＡｍｙＢ−ｐｙｒ」を、ＥｃｏＲＶで切断し約８．９ｋｂｐの断片を回収した。これに約１ｋｂｐの遺伝子断片「ＨＲＰ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ」をＴａＫａＲａ  ＤＮＡライゲーションキットマイティミックスを用いて連結し、プラスミド「ｐＡｍｙＢ−ｐｙｒ−ＨＲＰ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ」を作製した。プラスミド「ｐＡｍｙＢ−ｐｙｒ−ＨＲＰ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ」にクローニングされた挿入ＤＮＡ断片のシークエンスは、比較例１（２）記載の方法により解析した。プラスミド「ｐＡｍｙＢ−ｐｙｒ−ＨＲＰ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ」は、宿主のアスペルギルス・ニガー内にて、自身の開始コドンを用いてＨＲＰを発現するように構築した。【０１０３】
（３）  アスペルギルス・ニガー  ｐｙｒ１株の作出
次に、ウラシル生合成遺伝子（ｐｙｒ４）欠損株であるアスペルギルス・ニガー  ｐｙｒ１株を以下に示す方法にて作出した。【０１０４】
アスペルギルス・ニガー  ＮＲＲＬ３３７株の１０９ＣＦＵ／ｍＬ程度の胞子懸濁液をＵＶ２灯を３０ｃｍの高さで点灯下、穏やかに混和しながら照射した。これを選択培地に塗布し、３０℃で７日間培養した。生育した株を選抜し、アスペルギルス・ニガーｐｙｒ１株を取得した。この選択培地は、最少培地に１０μｇ／ｍＬのウリジン及び４ｍｇ／ｍＬの５−フルオロオロチン酸を添加したものである。【０１０５】
（４）  プラスミド「ｐＡｍｙＢ−ｐｙｒ−ＨＲＰ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ」によるアスペルギルス・ニガーの形質転換体の作製
ｐｙｒ４欠損株であるアスペルギルス・ニガー  ｐｙｒ１株を宿主とし、選択マーカーとしてｐｙｒ４遺伝子を用いた形質転換を実施した。【０１０６】
すなわち、先ずアスペルギルス・ニガー  ｐｙｒ１株を（Ｓ）培地中３０℃で培養し、２４時間後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離により集菌した。（Ｓ）培地の組成は、３．０％グルコース、２．０％酵母エキス、０．１％ペプトン、０．０３％塩化カルシウム、０．０３％塩化マグネシウム、ｐＨ６．８である。得られた菌体を４％塩化ナトリウムで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（３ｍｇ／ｍｌ  β−グルクロニダーゼ、１ｍｇ／ｍｌ  キチナーゼ、１ｍｇ／ｍｌ  ザイモリアーゼ、４％塩化ナトリウム）１０ｍｌに懸濁した。３０℃で６０〜９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣ緩衝液（０．５Ｍシュークロース、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５））で洗浄した。【０１０７】
このプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、そこに１０μｇ分のプラスミド「ｐＡｍｙＢ−ｐｙｒ−ＨＲＰ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ」を加え、氷中に５分間静置した。次に、４００μＬのＰＥＧ溶液（６０％ＰＥＧ４０００、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５））を加え、氷中に２０分間静置した後、１０ｍｌのＳＵＴＣ緩衝液を加え、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。集めたプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、最終的に１００μＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した。以上の処理を加えたプロトプラストを、２００μＬずつ０．５ｍｏｌ／Ｌ  シュークロースを含む最少培地に軟寒天とともに重層し、３０℃で５日間培養後、生育したコロニーを再度最少培地に移植し、ここで形成したコロニーを形質転換体とした。【０１０８】
（５）  「ｐＡｍｙＢ−ｐｙｒ−ＨＲＰ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ」の形質転換体の培養および同定
プラスミド「ｐＡｍｙＢ−ｐｙｒ−ＨＲＰ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ」を導入し最少再生培地で生育した株を選抜し、生産培地に植菌し３０℃、４日間培養した。得られた培養上清液を１２％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥミニを用いて電気泳動分離を行い、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）上にブロットした。ブロットしたＰＶＤＦ膜について、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロットを行った。得られた結果を図５に示す。【０１０９】
図５に示した結果から明らかなように、ｐＡｍｙＢ−ｐｙｒ−ＨＲＰ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓによる形質転換体の培養上清においては、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロットにより、ＨＲＰ由来のバンド（約２４ｋＤａ、２２ｋＤａ及び１５ｋＤａのＨＲＰ分解物）を検出することができた。従って、フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ３種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案し、修飾したポリヌクレオチド（コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチド）を用いて、アスペルギルスを形質転換した場合には、かかる形質転換体からＨＲＰポリペプチドが産生されることが明らかになった。【０１１０】
（６）  ｐＡｍｙＢ−ｐｙｒ−ＨＲＰ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓによる形質転換体培養上清中のＨＲＰ濃度測定
ｐＡｍｙＢ−ｐｙｒ−ＨＲＰ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓによる形質転換体の培養上清を適宜希釈し、該形質転換体の濃度が９×１０８ＣＦＵ／ｍＬとなるよう希釈した培養上清にテトラメチルベンヂジン試薬（コスモバイオ社製）を添加して、室温で１０分間静置した。１Ｎ硫酸を添加し、反応を停止した後、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＨＲＰ量を算出した。なお、検量線には、和光純薬社製ＨＲＰ試薬（和光：１６９−１０７９１）を使用し、ミリＱ水で０．６２５〜１０ｎｇ／ｍＬ程度に希釈したものを用いた。結果、ｐＡｍｙＢ−ｐｙｒ−ＨＲＰ−Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓによる形質転換体培養上清中のＨＲＰ濃度は０．００４ｍｇ／Ｌであった。【０１１１】
（実施例３）  フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ３種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案して修飾したＨＲＰポリヌクレオチドによる、トリコデルマにおけるＨＲＰポリペプチドの発現検討
次に、前記コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドを用いて、トリコデルマ（トリコデルマ・ビリデ）を形質転換し、得られた形質転換体におけるＨＲＰポリペプチドの発現を調べた。【０１１２】
（１）  コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチド発現プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」及び「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ」の構築
コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドの塩基配列を基に以下のプライマーを作製した。
ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ−Ｆ：ＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＣＡＴＣＡＴＧＣＡＣＴＴＣＴＣＣＡＧ（配列番号：１５）
ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ−Ｒ：ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＧＡＧＴＴＧＧＡＧＴＴＧＡＣＧＡＣ（配列番号：１６）
ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ−Ｒ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）：ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＧＡＧＴＴＧＧＡＧＴＴＧＡＣＧＡＣ（配列番号：１７）。【０１１３】
ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ−Ｆ及びＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ−Ｒ、ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ−Ｆ及びＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ−Ｒ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）を各々プライマーセットとして使用し、ｐＨＲＰを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲはプライムスターマックスＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。増幅された約１ｋｂｐのＤＮＡ断片をＳｔｕＩ及びＸｈｏＩで切断し、約１ｋｂｐの遺伝子断片「ＨＲＰ−Ｎ」及び「ＨＲＰ−Ｎ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）」を各々得た。一方、プラスミド「ｐＣＢ１−Ｅｇ３Ｘ−ｈｐｈｌｅｓｓ」をＳｔｕＩ及びＸｈｏＩで切断し、約６ｋｂｐの断片を回収した。これにＨＲＰ−Ｎ及びＨＲＰ−Ｎ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）をＴａＫａＲａ  ＤＮＡライゲーションキットマイティミックスを用いて各々連結し、プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」及び「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ」を作製した。プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」及び「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ」にクローニングされた挿入ＤＮＡ断片のシークエンスは、比較例１（２）記載の方法により解析した。プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」及び「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ」は、宿主のトリコデルマ・ビリデ内にて、自身の開始コドンを用いてＨＲＰを発現するように構築した。【０１１４】
（２）  プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」又は「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ」によるトリコデルマ・ビリデの形質転換体の作製
プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」又は「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ」によるトリコデルマ・ビリデの形質転換は、比較例１（３）記載の方法により実施した。【０１１５】
（３）  「ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」又は「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ」による形質転換体の培養及び同定
プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」及び「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ」を各々導入し、最少培地で生育した株を選抜し、国際公開第９８／１１２３９号に記載の方法に準じ、Ｐ培地にて、フラスコ又はジャーファーメンターを用い、２８℃にて培養した。ＨＲＰが発現しているか否かを確認するため、得られた培養上清液を１２％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥミニを用いて電気泳動分離を行い、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）上にブロットした。ブロットしたＰＶＤＦ膜について、ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏに関しては、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロットを行い、ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏに関しては、抗ＨＲＰ抗体を用いたウェスタンブロットを行った。得られた結果を図６及び７に示す。【０１１６】
図６及び７に示した結果から明らかなように、ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏによる形質転換体の培養上清及びｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏによる形質転換体の培養上清において、共にＨＲＰ由来のバンド（約３２ｋＤａのＨＲＰ）を検出することができた。従って、フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ３種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案し、修飾したポリヌクレオチド（コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチド）を用いて、トリコデルマを形質転換した場合には、かかる形質転換体からＨＲＰポリペプチドが産生されることが明らかになった。【０１１７】
（４）  「ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」又は「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ」による形質転換体の培養上清中のＨＲＰ濃度測定、並びにグアヤコール酸化活性
「ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」又は「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ」による形質転換体のフラスコ培養における培養上清を、該形質転換体の濃度が９×１０８ＣＦＵ／ｍＬとなるよう適宜希釈し、ＨＲＰ濃度の測定を実施例２（６）に従い、実施した。結果、ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏによる形質転換体の培養上清中のＨＲＰ濃度は１２３ｍｇ／Ｌであり、ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏによる形質転換体の培養上清中のＨＲＰ濃度は１６５ｍｇ／Ｌであった。同様に「ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」又は「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ」による形質転換体のジャーファーメンター培養における培養上清を、該形質転換体の濃度が９×１０８ＣＦＵ／ｍＬとなるよう適宜希釈し、ＨＲＰ濃度の測定を実施例２（６）に従い、実施した。結果、ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏによる形質転換体の培養上清中のＨＲＰ濃度は３１７ｍｇ／Ｌであり、ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏによる形質転換体の培養上清中のＨＲＰ濃度は５２５ｍｇ／Ｌであった。【０１１８】
また、「ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」又は「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ」による形質転換体のフラスコ培養における培養上清を用いてグアヤコール酸化活性を測定した。すなわち、グアヤコール１μｍｏｌ、過酸化水素０．３μｍｏｌを含む０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）３．０５ｍＬに、リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で適当に希釈した培養上清液０．０５ｍＬを添加し、反応１０〜１５分間の波長４３６ｎｍにおける吸光度変化を測定した。なお、グアヤコール酸化活性は、１分間に１μｍｏｌのグアヤコールを酸化する活性と定義し、培養上清に含まれるポリペプチド量１ｍｇ当りの活性（Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）として表した。その結果、ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏによる形質転換体培養上清中のグアヤコール酸化活性は１．５４Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであり、ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏによる形質転換体培養上清中のグアヤコール酸化活性は７．６０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。同様に、「ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」又は「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ」による形質転換体のジャーファーメンター培養における培養上清を用いてグアヤコール酸化活性を測定した。その結果、ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏによる形質転換体の培養上清中のグアヤコール酸化活性は３．９５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであり、ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏによる形質転換体の培養上清中のグアヤコール酸化活性は５．４９Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎであった。【０１１９】
（実施例４）  コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドを利用した、ＨＲＰとトリコデルマ由来ＣＢＨ１との融合ポリペプチドのトリコデルマにおける発現検討
前記コドン修飾ＨＲＰポリヌクレチドを用いることにより、ＨＲＰと他のポリペプチドとの融合ポリペプチドも、糸状菌にて高発現させることができるかどうかを、以下に示す方法にて調べた。【０１２０】
（１）  トリコデルマ・ビリデ用ＣＢＨ１共発現ベクター「ｐＣＢ１−ＫＲ」の構築
プラスミド「ｐＣＢ１−Ｅｇ３Ｘ−ｈｐｈｌｅｓｓ」のＣＢＨ１セルラーゼ結合部位欠失、並びにＨｐａＩサイト及びＰｓｔＩサイトを挿入するために、ＴｒｉｃｈｏＣＢＨ１ＨｐａＲ及びａＴｒｉｃｈｏＰｓｔＦをプライマーとして使用し、ｐＣＢ１−Ｅｇ３Ｘ−ｈｐｈｌｅｓｓを鋳型にＰＣＲを行い、ＣＢＨ１共発現用ベクター「ｐＣＢ１−ＫＲ」を得た。
ＴｒｉｃｈｏＣＢＨ１ＨｐａＲ：ＧＧＴＴＡＡＣＣＴＧＡＧＴＡＧＧＧＣＣＧＧＧＡＧＡＧＧＡ（配列番号：１８）
ａＴｒｉｃｈｏＰｓｔＦ：ＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＡＧＧＴＡＣＴＣＧＡＧＣＡＡＡＡＧＣＴＴ（配列番号：１９）。【０１２１】
（２）  ＨＲＰとＣＢＨ１との融合ポリペプチド発現用プラスミド「ｐＣＢ１−ＫＲ−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」の構築
コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドの塩基配列を基に以下のプライマーを作製した。
ＨＲＰＨｐａＫＲ：ＧＣＴＡＴＴＧＡＧＡＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＣＣＴＡＣＣＴＴＣＴＡＣＧＡＣ（配列番号：２０）
ＰＥＲＡｓｐｇｌａＣ：ＣＴＡＧＧＡＧＴＴＧＧＡＧＴＴＧＡＣＧＡＣ（配列番号：２１）。【０１２２】
これらプライマーを使用し、ｐＨＲＰを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲはプライムスターマックスＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。増幅された約１ｋｂｐのＤＮＡ断片をリン酸化し、約１ｋｂｐの遺伝子断片「ＨＲＰ−Ｈｐａ」を得た。一方、プラスミド「ｐＣＢ１−ＫＲ」をＨｐａＩで切断し、約６ｋｂｐの断片を回収した。これにＨＲＰ−ＨｐａをＴａＫａＲａ  ＤＮＡライゲ―ションキットマイティミックスを用いて連結し、プラスミド「ｐＣＢ１−ＫＲ−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」を作製した。プラスミド「ｐＣＢ１−ＫＲ−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」にクローニングされた挿入ＤＮＡ断片のシークエンスは、比較例１（２）記載の方法により解析した。プラスミド「ｐＣＢ１−ＫＲ−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」は、宿主のトリコデルマ・ビリデ内にて、ＣＢＨ１とＨＲＰとの融合ポリペプチドとして発現するように構築した。【０１２３】
（３）  プラスミド「ｐＣＢ１−ＫＲ−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」によるトリコデルマ・ビリデの形質転換体の作製
プラスミド「ｐＣＢ１−ＫＲ−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」によるトリコデルマ・ビリデの形質転換は、比較例１（３）記載の方法により実施した。【０１２４】
（４）  ｐＣＢ１−ＫＲ−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏによる形質転換体の培養及び同定
プラスミド「ｐＣＢ１−ＫＲ−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ」を導入し最少培地で生育した株を選抜し、国際公開第９８／１１２３９号に記載の方法に準じ、Ｐ培地にて、フラスコを用い、２８℃にて培養した。ＨＲＰが発現しているか否かを確認するため、得られた培養上清液を１２％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥミニを用いて電気泳動分離を行い、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）上にブロットした。ブロットしたＰＶＤＦ膜について、抗ＨＲＰ抗体を用いたウェスタンブロットを行った。得られた結果を図８に示す。【０１２５】
図８に示した結果から明らかなように、ｐＣＢ１−ＫＲ−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏによる形質転換体の培養上清において、約７０ｋＤａのバンド、すなわちＣＢＨ１とＨＲＰとの融合ポリペプチドを検出することができた。従って、フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ３種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案し、修飾したポリヌクレオチド（コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチド）を用いて、トリコデルマを形質転換した場合には、かかる形質転換体からＨＲＰを含む融合ポリペプチドが産生されることが明らかになった。【０１２６】
（５）  ｐＣＢ１−ＫＲ−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏによる形質転換体の培養上清中のＨＲＰ濃度測定
ｐＣＢ１−ＫＲ−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏによる形質転換体を、国際公開第９８／１１２３９号の記載の方法に準じ、Ｐ培地にて、フラスコを用い、２８℃にて培養した。そして、得られた培養上清を、該形質転換体の濃度が９×１０８ＣＦＵ／ｍＬとなるよう適宜希釈し、ＨＲＰ濃度の測定を実施例２（６）に従い、実施した。ｐＣＢ１−ＫＲ−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏによる形質転換体の培養上清中のＨＲＰ濃度は１２３ｍｇ／Ｌであった。【０１２７】
（実施例５）  コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドを利用した、ＨＲＰとＨｉｓタグとの融合ポリペプチドを用いた精製検討
（１）  ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラムによる精製
実施例３（３）で培養した、ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏによる形質転換体の培養上清２ｍｌを、０．０２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）バッファーで平衡化したＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ製）に供した。平衡化に使用したバッファーを用いてカラムを洗浄後、０．０２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  イミダゾール（ｐＨ７．５）バッファーにて溶出した。【０１２８】
溶出液中に含まれるＨＲＰ濃度の測定を実施例２（６）に従い、実施した。その結果、１０３．９ｎｇ／ｍｌ濃度のＨＲＰを回収することが出来た。【０１２９】
（実施例６）  コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドを利用した、ＨＲＰとトリコデルマ由来ＣＢＨ１との融合ポリペプチドを用いた精製検討
（１）  アビセルへの結合活性を用いた精製
実施例４の（４）にて培養した、ｐＣＢ１−ＫＲ−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏによる形質転換体培養上清１０μｌと２％濃度のアビセル溶液９０μｌ（２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）、１Ｍ硫安）とを良く混和し、２５℃で１０分間静置した。遠心後、上清を除去し、２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）及び１Ｍ硫安を加え、アビセル溶液を洗浄した（２回実施）。最終の遠心後、上清を除去し、ミリＱ水を混ぜ、３７℃で１０分間放置し、アビセルから剥離させた。剥離後の上清を回収し、上清中に含まれるＨＲＰ濃度の測定を実施例２（６）に従い、実施した。その結果、１２．７ｎｇ／ｍｌ濃度のＨＲＰを回収することが出来た。【０１３０】
（実施例７）  トリコデルマで発現させた西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ組換えポリペプチドのアナトー色素分解試験
実施例３（３）で培養した、ｐＣＢ１−ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏによる形質転換体の培養上清を用いてアナトー色素分解を測定した。１μｍｏｌのアナトー色素（和光純薬社製）、０．１４μｍｏｌの過酸化水素を含む０．１Ｍ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）１９０μＬに培養上清液１０μＬを添加し、３７℃において適当な時間静置した後、４５４ｎｍの吸光度変化を測定した。その結果、反応３０分後から吸光度の減少が検出され前記コドン改変ＨＲＰ遺伝子から発現されたＨＲＰは、アナトー色素分解活性を示すことが明らかになった。【０１３１】
（実施例８）  トリコデルマのコドン使用頻度のみに適合させたＨＲＰポリヌクレオチドによる、トリコデルマにおけるＨＲＰポリペプチドの発現検討
上記結果を受け、３種類の糸状菌の中で最も高いＨＲＰ産生能を示したトリコデルマにおいて、ＨＲＰポリペプチドをさらに高発現させるべく、トリコデルマの使用頻度に適合させた塩基配列を有する修飾されたＨＲＰポリヌクレオチドを作製した。そして、このポリヌクレオチドを用いてトリコデルマを形質転換し、得られた形質転換体におけるＨＲＰポリペプチドの発現を調べた。以下にその方法及び得られた結果について示す。【０１３２】
（１）トリコデルマでの発現を最適化するためのコドン表の作成
トリコデルマ（トリコデルマ・ビリデ）で発現が確認できたポリペプチドのコドン使用頻度を考慮し、表２に記載のコドン使用頻度表を作成した。【０１３３】
【表２】
2013180208.tif 000003
【０１３４】
（２）トリコデルマでの発現最適化を目的としたコドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドの作製
ＨＲＰ遺伝子をトリコデルマ（トリコデルマ・ビリデ）において、活性あるタンパク質として高発現させるために、ＨＲＰポリヌクレオチドの修飾を行った。すなわち、表２に記載のコドン使用頻度に基づき、野生型ＨＲＰ遺伝子の塩基配列（配列番号：３に記載の塩基配列）から２９．９％の塩基の変更を伴う、配列番号：２２に記載の塩基配列を設計した。なお、このようにして設計した修飾ＨＲＰポリヌクレオチドの塩基配列においては、全コドン数３３８のうち２４２のコドンを変更、すなわち全コドンのうち７１．６％のコドンが修飾（縮重変異）されている。そして、この塩基配列情報に基づき、ｐＨＲＰ＿Ｎａｔｉｖｅ同様に、修飾ＨＲＰポリヌクレオチドを人工的に合成し、ｐＭＡ−Ｔに挿入することにより、コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドが挿入されたプラスミド「ｐＨＲＰ−２」を得た。【０１３５】
（３）コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチド発現プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−２」の構築
コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドの塩基配列を基に以下のプライマーを作製した。
ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ−２−Ｆ：ＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＣＡＴＣＡＴＧＣＡＣＴＴＣＡ（配列番号：２４）
ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ−２−Ｒ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）：ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＧＡＣＧＣＧＧＣＡＧＴＴ（配列番号：２５）。【０１３６】
ＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ−２−Ｆ及びＨＲＰ−ｔｒｉｃｈｏ−２−Ｒ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）をプライマーセットとして使用し、ｐＨＲＰ−２を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲはプライムスターマックスＤＮＡ  ポリメラーゼを用いて実施した。増幅された約１ｋｂｐのＤＮＡ断片をＳｔｕＩ及びＳａｌＩで切断し、約１ｋｂｐの遺伝子断片「ＨＲＰ−Ｎ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−２」を得た。一方、プラスミド「ｐＣＢ１−Ｅｇ３Ｘ−ｈｐｈｌｅｓｓ」をＳｔｕI及びＸｈｏIで切断し、約６ｋｂｐの断片を回収した。これにＨＲＰ−Ｎ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−２をＴａＫａＲａ  ＤＮＡライゲーションキットマイティミックスを用いて連結し、プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−２」を作製した。プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−２」にクローニングされた挿入ＤＮＡ断片のシークエンスは、比較例１  （２）記載の方法により解析した。プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−２」は、宿主のトリコデルマ・ビリデ内にて、自身の開始コドンを用いてＨＲＰを発現するように構築した。【０１３７】
（４）プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−２」によるトリコデルマの形質転換体の作製
プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−２」によるトリコデルマ（トリコデルマ・ビリデ）の形質転換は、比較例１  （３）記載の方法により実施した。【０１３８】
（５）「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−２」による形質転換体の培養及び同定
プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−２」を導入し、最少培地で生育した株を選抜し、国際公開第９８／１１２３９号に記載の方法に準じ、Ｐ培地にて、フラスコを用い、２８℃にて培養した。ＨＲＰが発現しているか否かを確認するため、得られた培養上清液を１２％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ミニを用いて電気泳動分離を行い、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）上にブロットした。ブロットしたＰＶＤＦ膜について、抗ＨＲＰ抗体を用いたウェスタンブロットを行った。得られた結果を図９に示す。【０１３９】
（６）「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−２」による形質転換体の培養上清中のＨＲＰ濃度測定
「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ」による形質転換体のフラスコ培養における培養上清を、該形質転換体の濃度が９×１０８ＣＦＵ／ｍＬとなるよう適宜希釈し、ＨＲＰ濃度の測定を実施例２  （６）に従い、実施した。【０１４０】
図９に示した結果から明らかなように、ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−２による形質転換体の培養上清において、ＨＲＰ１由来のバンド（約３２ｋＤａのＨＲＰ）を検出することができた。しかしながら、ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−２による形質転換体のフラスコ培養における培養上清中のＨＲＰ濃度は２４ｍｇ／Ｌであり、「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ」による形質転換体のそれ（１６５ｍｇ／Ｌ、実施例３参照）と比較して、著しく低いものだった。【０１４１】
従って、フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ３種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案し、修飾したポリヌクレオチドを用いて、トリコデルマを形質転換した場合の方が、トリコデルマのコドン使用頻度のみに適合させたポリヌクレオチドを用いて、トリコデルマを形質転換した場合よりも、ＨＲＰポリペプチドを多く産生できることが明らかになった。【０１４２】
（実施例９）  フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ３種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案して修飾したＨＲＰポリヌクレオチドによる、トリコデルマにおけるＨＲＰポリペプチド発現検討（２）
上記結果を受け、フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ３種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案した塩基配列の有効性を確認するべく、実施例１〜３に記載のコドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドとは異なる配列を有する、当該３種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案し、修飾したポリヌクレオチドを作製した。そして、該ポリヌクレオチドを用いてトリコデルマを形質転換し、得られた形質転換体におけるＨＲＰポリペプチドの発現を調べた。以下にその方法及び得られた結果について示す。【０１４３】
（１）フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ３種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案して修飾したＨＲＰポリヌクレオチドの作製
ＨＲＰ遺伝子をトリコデルマにおいて活性あるタンパク質として高発現させるために、ＨＲＰポリヌクレオチドの修飾を行った。すなわち、表１に記載のコドン使用頻度に基づき、野生型ＨＲＰ遺伝子の塩基配列（配列番号：３に記載の塩基配列）から２８．０％の塩基の変更を伴う、配列番号：２６に記載の塩基配列を設計した。【０１４４】
なお、このようにして設計した修飾ＨＲＰポリヌクレオチドの塩基配列においては、全コドン数３３８のうち２４５のコドンを変更、すなわち全コドンのうち７２．５％のコドンが修飾（縮重変異）されている（図１０及び１１  参照）。また、本実施例にて設計した修飾ＨＲＰポリヌクレオチドの塩基配列（１０１７塩基）と、実施例１〜３に記載のコドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドの塩基配列（１０１７塩基）との間で相違する塩基数は１０個であり、相同性は９９％である（図１２及び１３  参照）。【０１４５】
そして、この塩基配列情報に基づき、ｐＨＲＰ＿Ｎａｔｉｖｅ同様に、修飾ＨＲＰポリヌクレオチドを人工的に合成し、ｐＭＡ−Ｔに挿入することにより、コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチドが挿入されたプラスミド「ｐＨＲＰ−３」を得た。【０１４６】
（２）コドン修飾ＨＲＰポリヌクレオチド発現プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−３」の構築
プラスミド「ｐＨＲＰ−３」及び「ｐＣＢ１−Ｅｇ３Ｘ−ｈｐｈｌｅｓｓ」をＳｔｕI及びＸｈｏIで切断し、約１ｋｂｐ及び約６ｋｂｐの断片を回収した。両者をＴａＫａＲａ  ＤＮＡライゲーションキットマイティミックスを用いて連結し、プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−３」を作製した。プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−３」にクローニングされた挿入ＤＮＡ断片のシークエンスを、比較例１  （２）記載の方法により解析した。プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−３」は、宿主のトリコデルマ・ビリデ内にて、自身の開始コドンを用いてＨＲＰを発現するように構築した。【０１４７】
（４）プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−３」によるトリコデルマの形質転換体の作製
プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−３」によるトリコデルマ（トリコデルマ・ビリデ）の形質転換は、比較例１  （３）記載の方法により実施した。【０１４８】
（５）「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−３」による形質転換体の培養及び同定
プラスミド「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−３」を導入し、最少培地で生育した株を選抜し、国際公開第９８／１１２３９号に記載の方法に準じ、Ｐ培地にて、フラスコを用い、２８℃にて培養した。ＨＲＰが発現しているか否かを確認するため、得られた培養上清液を１２％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ミニを用いて電気泳動分離を行い、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）上にブロットした。ブロットしたＰＶＤＦ膜について、抗ＨＲＰ抗体を用いたウェスタンブロットを行った。得られた結果を図１４に示す。【０１４９】
図１４に示した結果から明らかなように、ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−３による形質転換体の培養上清において、ＨＲＰ由来のバンド（約３２ｋＤａのＨＲＰ）を検出することができた。【０１５０】
（６）「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−３」による形質転換体の培養上清中のＨＲＰ濃度測定
「ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−３」による形質転換体を、国際公開第９８／１１２３９号に記載の方法に準じ、Ｐ培地にて、フラスコを用い、２８℃にて培養した。そして、その培養上清を、該形質転換体の濃度が９×１０８ＣＦＵ／ｍＬとなるよう適宜希釈し、ＨＲＰ濃度の測定を実施例２  （６）に従い、実施した。結果、ｐＣＢ１−ＨＲＰ（Ｈｉｓｌｅｓｓ）−ｔｒｉｃｈｏ−３による形質転換体の培養上清中のＨＲＰ濃度は２００ｍｇ／Ｌであった。【０１５１】
従って、実施例２〜５と同様に、フミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ３種の糸状菌のコドン使用頻度を勘案し、修飾したポリヌクレオチドを用いて、糸状菌を形質転換した場合には、かかる形質転換体からＨＲＰポリペプチドが生産されることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１５２】
以上説明したように、本発明によれば、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ポリペプチドをコードする野生型の塩基配列とコドンにおいて異なる塩基配列を有し、修飾されたコドンの使用頻度がフミコーラ、アスペルギルス及びトリコデルマ３種の糸状菌のコドン使用頻度である、修飾されたポリヌクレオチドを糸状菌に導入することにより、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼポリペプチドを大量に効率良く製造することが可能となる。【０１５３】
したがって、本発明のポリヌクレオチド、並びに該ポリヌクレオチドを利用するＨＲＰポリペプチドの製造方法は、均一のＨＲＰアイソザイムを大量に効率良く製造する点において優れるため、酵素免疫測定法、免疫組織染色法、サザンブロッティング法、ウエスタンブロッティング法等の各種試験における検出用酵素、臨床検査キット用酵素等の製造において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１５４】
配列番号：１及び２６
＜２２３＞  コドン使用頻度がトリコデルマ、フミコ―ラ及びアスペルギルスに適合されており、人工的に合成されたポリヌクレオチドの配列
配列番号：２
＜２２３＞  配列番号：１に記載の塩基配列からなる人工的に合成されたポリヌクレオチドがコードするポリペプチド
配列番号：５〜２１、２４及び２５
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号：２２
＜２２３＞  コドン使用頻度がトリコデルマに適合されており、人工的に合成されたポリヌクレオチドの配列
配列番号：２３
＜２２３＞  配列番号：２２に記載の塩基配列からなる人工的に合成されたポリヌクレオチドがコードするポリペプチド
配列番号：２７
＜２２３＞  配列番号：２６に記載の塩基配列からなる人工的に合成されたポリヌクレオチドがコードするポリペプチド
【図１】
2013180208.tif 000004
【図２】
2013180208.tif 000005
【図３】
2013180208.tif 000006
【図４】
2013180208.tif 000007
【図５】
2013180208.tif 000008
【図６】
2013180208.tif 000009
【図７】
2013180208.tif 000010
【図８】
2013180208.tif 000011
【図９】
2013180208.tif 000012
【図１０】
2013180208.tif 000013
【図１１】
2013180208.tif 000014
【図１２】
2013180208.tif 000015
【図１３】
2013180208.tif 000016
【図１４】
2013180208.tif 000017
【配列表】
2013180208000001.app
【国際調査報告】
2013180208.tif 000018
2013180208.tif 000019
2013180208.tif 000020
2013180208.tif 000021