(57)【要約】  本発明は、オリゴヌクレオチドの5’末端に、式(I)｛式中、X1は酸素原子等であり、R1は式(IIA)(式中、R5Aはハロゲン等であり、R6Aは水素原子等である)、または式(IVA)(式中、Y3Aは窒素原子等であり、Y4AはCH等である)等であり、R2は水素原子、ヒドロキシ、ハロゲンまたは置換基を有していてもよい低級アルコキシであり、R3は水素原子等で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を有し、該ヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基は3位の酸素原子を介して隣接するヌクレオチド残基と結合する、AGO2との親和性が向上したオリゴヌクレオチド等を提供する。2014034934.tif 0001222014034934.tif 0001232014034934.tif 000124
2014034934.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドの5’末端に、式(I)
【化６２】
2014034934.tif 000088
｛式中、X1は酸素原子、硫黄原子、セレン原子またはNR4(式中、R4は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアロイルまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニルである)であり、
R1は式(II)
【化６３】
2014034934.tif 000089
｛式中、Y1は窒素原子またはCR8[式中、R8は水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、-NR9aR9b(式中、R9a及びR9bは同一または異なって、水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)、または-CONR9cR9d(式中、R9c及びR9dは同一または異なって、水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)である]であり、
R5は水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、-NR10aR10b(式中、R10a及びR10bはそれぞれ前記R9a及びR9bと同義である)、-CONR10cR10d(式中、R10c及びR10dはそれぞれ前記R9c及びR9dと同義である)、-N=C-R10e(式中、R10eは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)、-C=N-R10f(式中、R10fは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)または-N=N-R10g(式中、R10gは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)であり、R6は水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよいアリールオキシ、置換基を有していてもよいアリールチオ、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環チオ、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニル、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは、同一または異なって水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニル、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよいアリールスルホニル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニルまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環スルホニルである)、-CONR11cR11d(式中、R11c及びR11dは同一または異なって、水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)、-NHCONR11eR11f(式中、R11e及びR11fは同一または異なって、水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)、-NHCO2R11g(式中、R11gは置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換��を有していてもよい芳香族複素環基である)、-N=C-R11h(式中、R11hは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)、-C=N-R11i(式中、R11iは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)または-N=N-R11j(式中、R11jは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)であり、
R7は水素原子、核酸分野における水素原子の等価体、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよいアリールオキシ、置換基を有していてもよいアリールチオ、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環チオ、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニル、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは、同一または異なって水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニル、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよいアリールスルホニル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニルまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環スルホニルである)、-CONR11cR11d(式中、R11c及びR11dは同一または異なって、水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)、-NHCONR11eR11f(式中、R11e及びR11fは同一または異なって、水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)または-NHCO2R11g(式中、R11gは置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)であるが、Y1が窒素原子であり、R5が水素原子であり、R6が-NR11aR11bであり、R7が水素原子である場合、R11a及びR11bは同時に水素原子になることはない｝、式(III)
【化６４】
2014034934.tif 000090
(式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記Y1、R6及びR7と同義である)、式(IV)
【化６５】
2014034934.tif 000091
[式中、R12は水素原子、核酸分野における水素原子の等価体、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい低級アルカノイルまたは置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルであり、
---は単結合または二重結合であり、
---が単結合である場合、
Y3はNR13a(式中、R13aは水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい低級アルカノイルまたは置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルである)またはCR14aR14b(式中、R14a及びR14bは同一または異なって、水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、または置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキルである)であり、
Y4はNR13b(式中、R13bは前記R13aと同義である)またはCR14cR14d(式中、R14c及びR14dはそれぞれ前記R14a及びR14bと同義である)であり、
---が二重結合である場合、
Y3は窒素原子またはCR14e(式中、R14eは水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、または置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキルである)であり、
Y4は窒素原子またはCR14f(式中、R14fは水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、または置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキルである)であるが、R12が水素原子であり、Y3がCR14eであり、Y4がCR14fである場合、R14e及びR14fは同時に水素原子になること並びにR14eがメチルであってR14fが水素原子になることはない]、または式(V)
【化６６】
2014034934.tif 000092
(式中、R12aは前記R12と同義であり、環Aは芳香族環であり、n1は0〜4の整数であり、R16は、ハロゲン、ヒドロキシ、スルファニル、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルバモイル、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキルまたは置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルであり、n1が2〜4の整数の場合、それぞれのR16は同一でも異なっていてもよいが、環Aがベンゼン環であり、n1が2である場合、R16は低級アルコキシではない)であり、
R2は水素原子、ヒドロキシ、ハロゲンまたは置換基を有していてもよい低級アルコキシであり、
R3は水素原子または
【化６７】
2014034934.tif 000093
(式中、n2は1、2または3である)である｝で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を有し、該ヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基は3位の酸素原子を介して隣接するヌクレオチド残基と結合する、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
X1が酸素原子である、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
R1が式(II)である、請求項1または2記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
Y1が窒素原子である、請求項3記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
R5が水素原子、ハロゲン、シアノ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、-NR10aR10b(式中、R10a及びR10bはそれぞれ前記と同義である)、-CONR10cR10d(式中、R10c及びR10dはそれぞれ前記と同義である)、-N=C-R10e(式中、R10eは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)、-C=N-R10f(式中、R10fは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)または-N=N-R10g(式中、R10gは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)である、請求項3または4記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
R5が水素原子、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルケニルまたはシアノである、請求項3または4記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
R5が置換基を有していてもよい低級アルケニルまたはシアノである、請求項3または4記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
R6が置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bはそれぞれ前記と同義である)、-N=C-R11h(式中、R11hは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)、-C=N-R11i(式中、R11iは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)または-N=N-R11j(式中、R11jは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)である、請求項3〜7のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
R6が置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bはそれぞれ前記と同義である)である、請求項3〜7のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
R6が-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキルである)である、請求項3〜7のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
R6が置換基を有していてもよいアリールであり、置換基がアリールのメタ位またはパラ位に存在する請求項3〜7のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
R7が水素原子である、請求項3〜11のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
R1が式(III)である、請求項1または2記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
Y2が窒素原子である、請求項13記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
R6aがアミノ、メチルアミノまたはジメチルアミノである、請求項13または14記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
R7が水素原子である、請求項13〜15のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
R1が式(IV)である、請求項1または2記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
R12が水素原子または核酸分野における水素原子の等価体である、請求項17記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
---が二重結合であり、Y3がCR14e(式中、R14eは前記と同義である)であり、Y4が窒素原子またはCR14f(式中、R14fは前記と同義であるが、シアノである場合を除く)である、請求項18記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
R14eが水素原子である、請求項19記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
R14eがハロゲン、シアノ、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基であり、R14fが水素原子である、請求項19記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
R14eが水素原子であり、R14fがハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である、請求項19記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
R1が式(V)である、請求項1または2記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
環Aが式(A1)
【化６８】
2014034934.tif 000094
(式中、R16及びn1はそれぞれ前記と同義であるが、式(A1’)
【化６９】
2014034934.tif 000095
で表される場合を除く)、式(A2)
【化７０】
2014034934.tif 000096
(式中、R16は前記と同義であり、n1は0〜2の整数であり、X2はNH、酸素原子または硫黄原子である)、または式(A3)
【化７１】
2014034934.tif 000097
(式中、R16及びX2は前記と同義であり、n1は0〜2の整数である)である、請求項23記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
R16が、ハロゲン、ニトロ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノまたは置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノである、請求項23または24記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
R12aが水素原子または核酸分野における水素原子の等価体である、請求項25記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
n1が1または2である、請求項23〜26のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
R3が
【化７２】
2014034934.tif 000098
(式中、n2は前記と同義である)である、請求項1〜27のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
n2が1である、請求項28記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
R2が水素原子、ヒドロキシ、フッ素原子またはメトキシである、請求項1〜29のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
R2がヒドロキシである、請求項1〜29のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
X1が酸素原子であり、R2が水素原子、ヒドロキシ、フッ素原子またはメトキシである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
R1が式(IIA)
【化７３】
2014034934.tif 000099
(式中、R5A及びR6Aはそれぞれ前記R5及びR6と同義である)
である、請求項32記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
R5Aがハロゲン、カルバモイル、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である、請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
R5Aがハロゲンまたはシアノである、請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
R6Aが置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基またはNR11aR11b(式中、R11a及びR11bはそれぞれ前記と同義である)である、請求項33〜35のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
R6AがNR11aR11b(式中、R11a及びR11bはそれぞれ前記と同義である)である、請求項33〜35のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
R6Aがアミノ、置換基を有していてもよい低級アルケニルまたは置換基を有していてもよいアリールである、請求項33〜35のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
R1が式(IVA)
【化７４】
2014034934.tif 000100
(式中、Y3A及びY4Aはそれぞれ前記Y3及びY4と同義であるが、Y3A及びY4AがCR14e及びCR14fであり、R14eが水素原子である場合、R14fはシアノではない)である、請求項32記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
Y3AがCR14e(式中、R14eは前記と同義である)であり、Y4AがCR14f(式中、R14fは前記と同義である)である、請求項39記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
R14eが水素原子である、請求項40記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
R14eがハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基であり、R14fが水素原子である、請求項40記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
R14eが水素原子であり、R14fがハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である、請求項40記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
R1が式(VA)
【化７５】
2014034934.tif 000101
(式中、環AA、n1A及びR16Aはそれぞれ前記環A、n1、及びR16と同義であり、n1Aが2〜4の整数の場合、それぞれのR16Aは同一でも異なっていてもよいが、環AAがベンゼン環であり、n1Aが2である場合、R16Aは低級アルコキシではなく、環AAがベンゼン環であり、n1Aが1であり、R16Aが塩素原子である場合、式(A1’)
【化７６】
2014034934.tif 000102
で表される場合を除く)である、請求項32記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
環AAがベンゼン環またはチオフェン環である、請求項44記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
R16Aが、ハロゲン、ニトロ低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノまたは置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノである、請求項44または45記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
n1Aが1または2である、請求項44〜46のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
R3Aが
【化７７】
2014034934.tif 000103
(式中、n2Aは前記と同義である)である、請求項32〜47のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
n2Aが1である、請求項48記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
R2Aが水素原子、ヒドロキシ、フッ素原子またはメトキシである、請求項32〜49のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５１】
R2Aがヒドロキシである、請求項32〜49のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５２】
10〜80の塩基長を有する請求項1〜51のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５３】
20〜50の塩基長を有する請求項1〜51のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５４】
20〜30の塩基長を有する請求項1〜51のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５５】
21〜25の塩基長を有する請求項1〜51のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５６】
2本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項1〜55のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５７】
1本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項1〜55のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５８】
オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、請求項1〜55のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５９】
疾患に関与する蛋白質をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)に対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドにおいて、
該オリゴヌクレオチドの5’末端における塩基残基を、
式(II)
【化７８】
2014034934.tif 000104
(式中、Y1、R5、R6及びR7はそれぞれ前記と同義である)、式(III)
【化７９】
2014034934.tif 000105
(式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記と同義である)、式(IV)
【化８０】
2014034934.tif 000106
(式中、R12、---、Y3及びY4はそれぞれ前記と同義である)、または式(V)
【化８１】
2014034934.tif 000107
(式中、R12a、環A、n1及びR16は、それぞれ前記と同義である)で表される塩基残基に置換することを特徴とする、該ノックダウン活性を向上させる方法。
【請求項６０】
疾患に関与する蛋白質をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)に対するノックダウン活性を有し、5’末端における塩基がグアニンまたはシトシンであるオリゴヌクレオチドにおいて、
該オリゴヌクレオチドの5’末端におけるグアニン残基またはシトシン残基を、アデニン残基(6-アミノプリン-9-イル)、チミン残基(5-メチル-1,2,3,4テトラヒドロピリミジン-2,4ジオン-1-イル)、ウリジン残基(ピリミジン-2,4(1H,3H)ジオン-1-イル)または
式(II)
【化８２】
2014034934.tif 000108
(式中、Y1、R5、R6及びR7はそれぞれ前記と同義である)、式(III)
【化８３】
2014034934.tif 000109
(式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記と同義である)、式(IV)
【化８４】
2014034934.tif 000110
(式中、R12、---、Y3及びY4はそれぞれ前記と同義である)、もしくは式(V)
【化８５】
2014034934.tif 000111
(式中、R12a、環A、n1及びR16は、それぞれ前記と同義である)で表される塩基残基に置換することを特徴とする該ノックダウン活性を向上させる方法。
【請求項６１】
オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、請求項59または60記載の方法。
【請求項６２】
請求項59〜61のいずれかに記載の方法によって、オリゴヌクレオチドの標的メッセンジャーRNA(mRNA)に対するノックダウン活性を向上させたオリゴヌクレオチドを含有する核酸医薬。
【請求項６３】
疾患に関与する蛋白質をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)に対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドの5’末端のヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を置換することに使用される、該オリゴヌクレオチドの標的mRNAに対するノックダウン活性の向上のための、式(Ia)
【化８６】
2014034934.tif 000112
(式中、X1、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義である)で表されるヌクレオチドもしくはヌクレオシド、そのヒドロキシ、カルボキシルおよび/もしくはアミノを保護基で保護したもの、またはそのアミダイト、あるいはその塩。
【請求項６４】
オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、請求項63記載のヌクレオチドもしくはヌクレオシド、そのヒドロキシ、カルボキシルおよび/もしくはアミノを保護基で保護したもの、またはそのアミダイト、あるいはその塩。
【請求項６５】
疾患に関与する蛋白質をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)に対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドの5’末端のヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を置換することに使用される、該オリゴヌクレオチドの標的mRNAに対するノックダウン活性の向上のための、
式(II)
【化８７】
2014034934.tif 000113
(式中、Y1、R5、R6及びR7はそれぞれ前記と同義である)、式(III)
【化８８】
2014034934.tif 000114
(式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記と同義である)、式(IV)
【化８９】
2014034934.tif 000115
(式中、R12、---、Y3及びY4はそれぞれ前記と同義である)、または式(V)
【化９０】
2014034934.tif 000116
(式中、R12a、環A、n1及びR16は、それぞれ前記と同義である)で表される塩基残基を含有するヌクレオチドもしくはヌクレオシド、そのヒドロキシ、カルボキシルおよび/もしくはアミノを保護基で保護したもの、またはそのアミダイト、あるいはその塩。
【請求項６６】
オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、請求項65記載のヌクレオチドもしくはヌクレオシド、そのヒドロキシ、カルボキシルおよび/もしくはアミノを保護基で保護したもの、またはそのアミダイト、あるいはその塩。
【請求項６７】
標的蛋白質の発現抑制剤の製造のための、式(I)
【化９１】
2014034934.tif 000117
(式中、X1、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義である)で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を5’末端に有する、疾患に関与する蛋白質をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)に対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項６８】
標的蛋白質の発現抑制剤の製造のための、
式(II)
【化９２】
2014034934.tif 000118
(式中、Y1、R5、R6及びR7はそれぞれ前記と同義である)、式(III)
【化９３】
2014034934.tif 000119
(式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記と同義である)、式(IV)
【化９４】
2014034934.tif 000120
(式中、R12、---、Y3及びY4はそれぞれ前記と同義である)、または式(V)
【化９５】
2014034934.tif 000121
(式中、R12a、環A、n1及びR16は、それぞれ前記と同義である)で表される塩基残基を、5’末端における塩基残基として導入した、疾患に関与する蛋白質をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)に対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項６９】
オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、請求項67または68記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的メッセンジャーRNA(mRNA)に対するノックダウン活性(例えば、RNA干渉活性等)を有するオリゴヌクレオチド等に関する。
【背景技術】
【０００２】
短鎖干渉性RNA(small interfering RNA、以下siRNA)は、RNA干渉(RNA interference、以下RNAi)に関与しており、標的遺伝子の発現を抑制するためのガイドとしての機能を有するRNAである[ネイチャー(Nature)、第411巻、第6836号、494-498頁]。siRNAはメッセンジャーRNA(mRNA)の切断を介して、そのmRNAが発現を担う蛋白質の発現を選択的に抑制(ノックダウン)し得ることから、医薬への応用が期待されている[ネイチャー・レビューズ・キャンサー(Nature Reviews Cancer)、第11巻、59-67頁(2011年)]。
siRNAは通常、RNA induced silencing complex(RISC)と呼ばれる複合体に取り込まれ、その機能を発現する。そして、RISCの主要構成成分はArgonaute2(AGO2)と呼ばれる蛋白質であり、AGO2は、RNAi経路においてsiRNAに結合し、mRNAを切断する[トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンシーズ(Trends in Biochemical Sciences)、第35巻、第7号、368-376頁(2010年)]。RISCに取り込まれたsiRNAは、センス鎖が切断されアンチセンス鎖のみの一本鎖となった後、アンチセンス鎖と相補性を有する標的mRNAと結合する。標的mRNAは、AGO2中のRNAseドメインによって切断され、その結果として蛋白質の発現が抑制される[サイレンス(Silence)、第1巻、3頁(2010年)]ことが知られている。
一方、近年、hAGO2MID/AMP複合体、及びhAGO2MID/UMP複合体の立体構造解析[ネイチャー(Nature)、第465巻、818-822頁(2010年)]や、hAGO2とRNAオリゴ複合体に関する立体構造解析も報告されている[サイエンス(Science)、第336巻、25頁(2012年)]。
また、近年、特にX線を用いた蛋白質の構造解析が盛んに行われており、得られた構造情報を基に、蛋白質と、それを標的とする化合物の結合様式を原子レベルで解明し、その構造にフィットする化合物をデザインする試みが多数報告されている[ジャーナル・オブ・ポストグラデュエート・メディシン(Journal of Postgraduate Medicine)、第55巻、301-304頁(2009年)]。
しかしながら、非天然型ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを用いたオフターゲット効果の回避(特許文献1)やAGO2との親和性向上によるsiRNAの活性増強の可能性について示唆されているものの(非特許文献1)、AGO2との親和性を向上させ、ノックダウン活性を増強させる具体的な方法については開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第2011/119674号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】「モレキュラー・セラピー-ヌクレイック・アシッズ(Molecular Therapy - Nucleic Acids)」、2012年、第1巻、p.e5
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、AGO2との親和性が向上したオリゴヌクレオチド等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の(1)〜(69)に関する。
（1）オリゴヌクレオチドの5’末端に、式(I)【０００７】
【化１】
2014034934.tif 000003
｛式中、X1は酸素原子、硫黄原子、セレン原子またはNR4(式中、R4は水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアロイルまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニルである)であり、
R1は式(II)【０００８】
【化２】
2014034934.tif 000004
｛式中、Y1は窒素原子またはCR8[式中、R8は水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、-NR9aR9b(式中、R9a及びR9bは同一または異なって、水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)、または-CONR9cR9d(式中、R9c及びR9dは同一または異なって、水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)である]であり、
R5は水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、-NR10aR10b(式中、R10a及びR10bはそれぞれ前記R9a及びR9bと同義である)、-CONR10cR10d(式中、R10c及びR10dはそれぞれ前記R9c及びR9dと同義である)、-N=C-R10e(式中、R10eは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)、-C=N-R10f(式中、R10fは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)または-N=N-R10g(式中、R10gは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)であり、R6は水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよいアリールオキシ、置換基を有していてもよいアリールチオ、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環チオ、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニル、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは、同一または異なって水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニル、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよいアリールスルホニル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニルまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環スルホニルである)、-CONR11cR11d(式中、R11c及びR11dは同一または異なって、水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)、-NHCONR11eR11f(式中、R11e及びR11fは同一または異なって、水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)、-NHCO2R11g(式中、R11gは置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換��を有していてもよい芳香族複素環基である)、-N=C-R11h(式中、R11hは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)、-C=N-R11i(式中、R11iは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)または-N=N-R11j(式中、R11jは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)であり、
R7は水素原子、核酸分野における水素原子の等価体、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよいアリールオキシ、置換基を有していてもよいアリールチオ、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環チオ、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニル、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは、同一または異なって水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニル、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよいアリールスルホニル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニルまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環スルホニルである)、-CONR11cR11d(式中、R11c及びR11dは同一または異なって、水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)、-NHCONR11eR11f(式中、R11e及びR11fは同一または異なって、水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)または-NHCO2R11g(式中、R11gは置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)であるが、Y1が窒素原子であり、R5が水素原子であり、R6が-NR11aR11bであり、R7が水素原子である場合、R11a及びR11bは同時に水素原子になることはない｝、式(III)【０００９】
【化３】
2014034934.tif 000005
(式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記Y1、R6及びR7と同義である)、式(IV)【００１０】
【化４】
2014034934.tif 000006
[式中、R12は水素原子、核酸分野における水素原子の等価体、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい低級アルカノイルまたは置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルであり、
---は単結合または二重結合であり、
---が単結合である場合、
Y3はNR13a(式中、R13aは水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい低級アルカノイルまたは置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルである)またはCR14aR14b(式中、R14a及びR14bは同一または異なって、水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、または置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキルである)であり、
Y4はNR13b(式中、R13bは前記R13aと同義である)またはCR14cR14d(式中、R14c及びR14dはそれぞれ前記R14a及びR14bと同義である)であり、
---が二重結合である場合、
Y3は窒素原子またはCR14e(式中、R14eは水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、または置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキルである)であり、
Y4は窒素原子またはCR14f(式中、R14fは水素原子、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、または置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキルである)であるが、R12が水素原子であり、Y3がCR14eであり、Y4がCR14fである場合、R14e及びR14fは同時に水素原子になること並びにR14eがメチルであってR14fが水素原子になることはない]、または式(V)【００１１】
【化５】
2014034934.tif 000007
(式中、R12aは前記R12と同義であり、環Aは芳香族環であり、n1は0〜4の整数であり、R16は、ハロゲン、ヒドロキシ、スルファニル、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルバモイル、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキルまたは置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルであり、n1が2〜4の整数の場合、それぞれのR16は同一でも異なっていてもよい)であり、
R2は水素原子、ヒドロキシ、ハロゲンまたは置換基を有していてもよい低級アルコキシであり、
R3は水素原子または【００１２】
【化６】
2014034934.tif 000008
(式中、n2は1、2または3である)である｝で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を有し、該ヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基は3位の酸素原子を介して隣接するヌクレオチド残基と結合する、オリゴヌクレオチド。
（2）X1が酸素原子である、(1)記載のオリゴヌクレオチド。
（3）R1が式(II)である、(1)または(2)記載のオリゴヌクレオチド。
（4）Y1が窒素原子である、(3)記載のオリゴヌクレオチド。
（5）R5が水素原子、ハロゲン、シアノ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、-NR10aR10b(式中、R10a及びR10bはそれぞれ前記と同義である)、-CONR10cR10d(式中、R10c及びR10dはそれぞれ前記と同義である)、-N=C-R10e(式中、R10eは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)、-C=N-R10f(式中、R10fは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)または-N=N-R10g(式中、R10gは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)である、(3)または(4)記載のオリゴヌクレオチド。
（6）R5が水素原子、ハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルケニルまたはシアノである、(3)または(4)記載のオリゴヌクレオチド。
（7）R5が置換基を有していてもよい低級アルケニルまたはシアノである、(3)または(4)記載のオリゴヌクレオチド。
（8）R6が置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bはそれぞれ前記と同義である)、-N=C-R11h(式中、R11hは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)、-C=N-R11i(式中、R11iは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)または-N=N-R11j(式中、R11jは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである)である、(3)〜(7)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（9）R6が置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bはそれぞれ前記と同義である)である、(3)〜(7)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（10）R6が-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキルである)である、(3)〜(7)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（11）R6が置換基を有していてもよいアリールであり、置換基がアリールのメタ位またはパラ位に存在する（3）〜(7)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（12）R7が水素原子である、(3)〜(11)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（13）R1が式(III)である、(1)または(2)記載のオリゴヌクレオチド。
（14）Y2が窒素原子である、(13)記載のオリゴヌクレオチド。
（15）R6aがアミノ、メチルアミノまたはジメチルアミノである、(13)または(14)記載のオリゴヌクレオチド。
（16）R7が水素原子である、(13)〜(15)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（17）R1が式(IV)である、(1)または(2)記載のオリゴヌクレオチド。
（18）R12が水素原子または核酸分野における水素原子の等価体である、(17)記載のオリゴヌクレオチド。
(19)---が二重結合であり、Y3がCR14e(式中、R14eは前記と同義である)であり、Y4が窒素原子またはCR14f(式中、R14fは前記と同義であるが、シアノである場合を除く)である、(18)記載のオリゴヌクレオチド。
(20)R14eが水素原子である、(19)記載のオリゴヌクレオチド。
(21)R14eがハロゲン、シアノ、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基であり、R14fが水素原子である、(19)記載のオリゴヌクレオチド。
(22)R14eが水素原子であり、R14fがハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である、(19)記載のオリゴヌクレオチド。
(23）R1が式(V)である、(1)または(2)記載のオリゴヌクレオチド。
(24）環Aが式(A1)【００１３】
【化７】
2014034934.tif 000009
(式中、R16及びn1はそれぞれ前記と同義である)、式(A2)【００１４】
【化８】
2014034934.tif 000010
(式中、R16は前記と同義であり、n1は0〜2の整数であり、X2はNH、酸素原子または硫黄原子である)、式(A3)【００１５】
【化９】
2014034934.tif 000011
(式中、R16及びX2は前記と同義であり、n1は0〜2の整数である)、式(A4)【００１６】
【化１０】
2014034934.tif 000012
(式中、R16は前記と同義であり、n1は0〜3の整数である)、式(A5)【００１７】
【化１１】
2014034934.tif 000013
(式中、R16は前記と同義であり、n1は0〜3の整数である)、式(A6)【００１８】
【化１２】
2014034934.tif 000014
(式中、R16は前記と同義であり、n1は0〜3の整数である)、式(A7)【００１９】
【化１３】
2014034934.tif 000015
(式中、R16は前記と同義であり、n1は0〜3の整数である)、式(A8)【００２０】
【化１４】
2014034934.tif 000016
(式中、R16は前記と同義であり、n1は1である)、式(A9)【００２１】
【化１５】
2014034934.tif 000017
(式中、R16は前記と同義であり、n1は1である)、式(A10)【００２２】
【化１６】
2014034934.tif 000018
(式中、R16は前記と同義であり、n1は1である)、式(A11)【００２３】
【化１７】
2014034934.tif 000019
(式中、R16は前記と同義であり、n1は1である)である、(23)記載のオリゴヌクレオチド。
(25）R16が、ハロゲン、ニトロ、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノまたは置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノである、(23)または(24)記載のオリゴヌクレオチド。
(26）R12aが水素原子または核酸分野における水素原子の等価体である、(25)記載のオリゴヌクレオチド。
(27）n1が1または2である、(23)〜(26)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(28）R3が【００２４】
【化１８】
2014034934.tif 000020
(式中、n2は前記と同義である)である、(1)〜(27)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(29）n2が1である、(28)記載のオリゴヌクレオチド。
(30）R2が水素原子、ヒドロキシ、フッ素原子またはメトキシである、(1)〜(29)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(31）R2がヒドロキシである、(1)〜(29)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(32）X1が酸素原子であり、R2が水素原子、ヒドロキシ、フッ素原子またはメトキシである、(１)に記載のオリゴヌクレオチド。
(33）R1が式(IIA)【００２５】
【化１９】
2014034934.tif 000021
(式中、R5A及びR6Aはそれぞれ前記R5及びR6と同義である)
である、(32)記載のオリゴヌクレオチド。
(34）R5Aがハロゲン、カルバモイル、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である、(33)記載のオリゴヌクレオチド。
(35）R5Aがハロゲンまたはシアノである、(33)記載のオリゴヌクレオチド。
(36）R6Aが置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよい芳香族複素環基またはNR11aR11b(式中、R11a及びR11bはそれぞれ前記と同義である)である、(33)〜(35)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(37）R6AがNR11aR11b(式中、R11a及びR11bはそれぞれ前記と同義である)である、(33)〜(35)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(38）R6Aがアミノ、置換基を有していてもよい低級アルケニルまたは置換基を有していてもよいアリールである、(33)〜(35)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(39）R1が式(IVA)【００２６】
【化２０】
2014034934.tif 000022
(式中、Y3A及びY4Aはそれぞれ前記Y3及びY4と同義であるが、Y3A及びY4AがCR14e及びCR14fであり、R14eが水素原子である場合、R14fはシアノではない)である、(32)記載のオリゴヌクレオチド。
(40）Y3AがCR14e(式中、R14eは前記と同義である)であり、Y4AがCR14f(式中、R14fは前記と同義である)である、(39)記載のオリゴヌクレオチド。
(41）R14eが水素原子である、(40)記載のオリゴヌクレオチド。
(42）R14eがハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基であり、R14fが水素原子である、(40)記載のオリゴヌクレオチド。
(43）R14eが水素原子であり、R14fがハロゲン、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である、(40)記載のオリゴヌクレオチド。
(44）R1が式(VA)【００２７】
【化２１】
2014034934.tif 000023
(式中、環AA、n1A及びR16Aはそれぞれ前記環A、n1、及びR16と同義であり、n1Aが2〜4の整数の場合、それぞれのR16Aは同一でも異なっていてもよいが、環AAがベンゼン環であり、n1Aが2である場合、R16Aは低級アルコキシではなく、環AAがベンゼン環であり、n1Aが1であり、R16Aが塩素原子である場合、式(A1’)【００２８】
【化２２】
2014034934.tif 000024
で表される場合を除く)である、(32)記載のオリゴヌクレオチド。
(45）環AAがベンゼン環またはチオフェン環である、(44)記載のオリゴヌクレオチド。
(46）R16Aが、ハロゲン、ニトロ低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノまたは置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノである、(44)または(45)記載のオリゴヌクレオチド。
(47）n1Aが1または2である、(44)〜(46)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(48）R3Aが【００２９】
【化２３】
2014034934.tif 000025
(式中、n2Aは前記と同義である)である、(32)〜(47)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(49）n2Aが1である、(48)記載のオリゴヌクレオチド。
(50）R2Aが水素原子、ヒドロキシ、フッ素原子またはメトキシである、(32)〜(49)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(51）R2Aがヒドロキシである、(32)〜(49)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(52）10〜80の塩基長を有する、(1)〜(51)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(53）20〜50の塩基長を有する、(1)〜(51）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(54）20〜30の塩基長を有する、(1)〜(51)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(55）21〜25の塩基長を有する、(1)〜(51)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(56）2本鎖オリゴヌクレオチドである、(1)〜(55)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(57）1本鎖オリゴヌクレオチドである、(1)〜(55)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(58）オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、(1)〜(55)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
(59）疾患に関与する蛋白質をコードするmRNAに対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドにおいて、
該オリゴヌクレオチドの5’末端における塩基残基を、
式(II)【００３０】
【化２４】
2014034934.tif 000026
(式中、Y1、R5、R6及びR7はそれぞれ前記と同義である)、式(III)【００３１】
【化２５】
2014034934.tif 000027
(式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記と同義である)、式(IV)【００３２】
【化２６】
2014034934.tif 000028
(式中、R12、---、Y3及びY4はそれぞれ前記と同義である)、または式(V)【００３３】
【化２７】
2014034934.tif 000029
(式中、R12a、環A、n1及びR16は、それぞれ前記と同義である)で表される塩基残基に置換することを特徴とする、該ノックダウン活性を向上させる方法。
(60）疾患に関与する蛋白質をコードするmRNAに対するノックダウン活性を有し、5’末端における塩基がグアニンまたはシトシンであるオリゴヌクレオチドにおいて、
該オリゴヌクレオチドの5’末端におけるグアニン残基またはシトシン残基を、アデニン残基(6-アミノプリン-9-イル)、チミン残基(5-メチル-1,2,3,4テトラヒドロピリミジン-2,4ジオン-1-イル)、ウリジン残基(ピリミジン-2,4(1H,3H)ジオン-1-イル)または
式(II)【００３４】
【化２８】
2014034934.tif 000030
(式中、Y1、R5、R6及びR7はそれぞれ前記と同義である)、式(III)【００３５】
【化２９】
2014034934.tif 000031
(式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記と同義である)、式(IV)【００３６】
【化３０】
2014034934.tif 000032
(式中、R12、---、Y3及びY4はそれぞれ前記と同義である)、もしくは式(V)【００３７】
【化３１】
2014034934.tif 000033
(式中、R12a、環A、n1及びR16は、それぞれ前記と同義である)で表される塩基残基に置換することを特徴とする該ノックダウン活性を向上させる方法。
(61）オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、(59)または(60)記載の方法。
(62）(59)〜(61)のいずれかに記載の方法によって、オリゴヌクレオチドの標的 mRNAに対するノックダウン活性を向上させたオリゴヌクレオチドを含有する核酸医薬。
(63）疾患に関与する蛋白質をコードするmRNAに対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドの5’末端のヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を置換することに使用される、該オリゴヌクレオチドの標的mRNAに対するノックダウン活性の向上のための、式(Ia)【００３８】
【化３２】
2014034934.tif 000034
(式中、X1、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義である)で表されるヌクレオチドもしくはヌクレオシド、そのヒドロキシ、カルボキシルおよび/もしくはアミノを保護基で保護したもの、またはそのアミダイト、あるいはその塩。
(64）オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、(63)記載のヌクレオチドもしくはヌクレオシド、そのヒドロキシ、カルボキシおよび/もしくはアミノを保護基で保護したもの、またはそのアミダイト、あるいはその塩。
(65）疾患に関与する蛋白質をコードするmRNAに対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドの5’末端のヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を置換することに使用される、該オリゴヌクレオチドの標的mRNAに対するノックダウン活性の向上のための、
式(II)【００３９】
【化３３】
2014034934.tif 000035
(式中、Y1、R5、R6及びR7はそれぞれ前記と同義である)、式(III)【００４０】
【化３４】
2014034934.tif 000036
(式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記と同義である)、式(IV)【００４１】
【化３５】
2014034934.tif 000037
(式中、R12、---、Y3及びY4はそれぞれ前記と同義である)、または式(V)【００４２】
【化３６】
2014034934.tif 000038
(式中、R12a、環A、n1及びR16は、それぞれ前記と同義である)で表される塩基残基を含有するヌクレオチドもしくはヌクレオシド、そのヒドロキシ、カルボキシおよび/もしくはアミノを保護基で保護したもの、またはそのアミダイト、あるいはその塩。
(66）オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、(65)記載のヌクレオチドもしくはヌクレオシド、そのヒドロキシ、カルボキシおよび/もしくはアミノを保護基で保護したもの、またはそのアミダイト、あるいはその塩。
(67）標的蛋白質の発現抑制剤の製造のための、式(I)【００４３】
【化３７】
2014034934.tif 000039
(式中、X1、R1、R2及びR3はそれぞれ前記と同義である)で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を5’末端に有する、疾患に関与する蛋白質をコードする mRNAに対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドの使用。
(68）標的蛋白質の発現抑制剤の製造のための、
式(II)【００４４】
【化３８】
2014034934.tif 000040
(式中、Y1、R5、R6及びR7はそれぞれ前記と同義である)、式(III)【００４５】
【化３９】
2014034934.tif 000041
(式中、Y2、R6a及びR7aはそれぞれ前記と同義である)、式(IV)【００４６】
【化４０】
2014034934.tif 000042
(式中、R12、---、Y3及びY4はそれぞれ前記と同義である)、または式(V)【００４７】
【化４１】
2014034934.tif 000043
(式中、R12a、環A、n1及びR16は、それぞれ前記と同義である)で表される塩基残基を、5’末端における塩基残基として導入した、疾患に関与する蛋白質をコードするmRNAに対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドの使用。
(69）オリゴヌクレオチドが短鎖干渉性RNA(siRNA)である、(67)または(68)記載の使用。
【発明の効果】
【００４８】
本発明により、AGO2との親和性が向上したオリゴヌクレオチド等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端に8-Br-dAを有するsiRNAと、アデノシン一リン酸を有するsiRNAとのルシフェラーゼ発光レベルを比較する図である(濃度100 pmol/L)。縦軸は、陰性対照群の発光量を1とした場合のそれぞれのsiRNAの発光比率を表す。
【図２】ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端に8-Br-dAを有するsiRNA(874-BrdA)と、アデノシン一リン酸(874-A)、グアノシン一リン酸(874-G)、シチジン一リン酸(874-C)またはウリジン一リン酸(874-U)を有するsiRNAとのルシフェラーゼ発光レベルを比較する図である。縦軸は、陰性対照群の発光量を1とした場合のそれぞれのsiRNAの発光比率を表す。横軸の、Aは874-A、Gは874-G、Cは874-C、Uは874-U、BrdAは874-BrdAを意味する。それぞれ、3.2 pmol/L、16 pmol/L、80 pmol/L及び400 pmol/Lの濃度において試験を行った結果を示す。
【図３】D-グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、GAPDH、ジェンバンク  アクセッション番号 NM_001256799)を標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端に8-Br-dAを有するsiRNAと、アデノシン一リン酸を有するsiRNAとのGAPDH mRNA の発現レベルを比較する図である。縦軸は、陰性対照群におけるGAPDHのmRNA量を1とした場合の、GAPDH mRNAの相対発現レベルを表す。横軸は、各siRNAを表すが、左側がアンチセンス鎖5’末端にアデノシン一リン酸を有するsiRNA(217-A, 278-A, 516-A, 624-A, 715-A, 816-A, 936-A, 1096-A, 1134-A)を表し、右側がアンチセンス鎖の5’末端に8-Br-dAを有するsiRNA(217-BrdA, 278-BrdA, 516-BrdA, 624-BrdA, 715-BrdA, 816-BrdA, 936-BrdA, 1096-BrdA,1134-BrdA)を表す。
【図４】ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、ウリジン一リン酸(454-U)、8-Br-dA(454-BrdA)、I-37(6-NO2,7-Me-dQu)、I-21(6-napht-2-yl-dPu)、I-34(6-Me-dU)、またはI-25(6-napht-1-yl-dPu)を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50)を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。
【図５】ルシフェラーゼを標的とするsiRNAにおいて、アンチセンス鎖の5’末端にアデノシン一リン酸(454-A)、ウリジン一リン酸(454-U)、8-Br-dA(454-BrdA)、I-32(2'-OMe-6-styryl-dA)、またはI-19(di-Me-thienyl-dU)を有するsiRNAのノックダウン活性を示す図である。縦軸は50%阻害濃度(IC50)を表す。横軸は用いたsiRNAを表す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
以下、式(I)中のX1が酸素原子であり、R2が水素原子、ヒドロキシ、フッ素原子またはメトキシである化合物を化合物(Ia)という。他の式番号の化合物についても同様である。
式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(IIA)、(IIIA)、(IVA)、(VA)、(Ia)及び(A1)〜(A11)の各基の定義において、
(i)ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素の各原子を意味する。
【００５１】
(ii)低級アルキル、ならびに低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノ、低級アルキルカルバモイル、ジ低級アルキルカルバモイル、低級アルキルチオ及び低級アルキルスルホニルにおける低級アルキル部分としては、例えば直鎖状または分枝鎖状の炭素数1〜10のアルキルが挙げられる。具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等が挙げられる。ジ低級アルキルアミノ及びジ低級アルキルアミノカルバモイルの2つの低級アルキル部分はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００５２】
(iii)アラルキル及び芳香族複素環アルキルのアルキレン部分は、前記低級アルキル(ii)から水素原子を一つ除いたものと同義である。
(iv)低級アルケニルとしては、例えば直鎖状または分枝鎖状の炭素数2〜10のアルケニルが挙げられる。具体的には、ビニル、アリル、1-プロペニル、イソプロペニル、メタクリル、ブテニル、クロチル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル等が挙げられる。
(v)低級アルキニルとしては、例えば直鎖状または分枝鎖状の炭素数2〜10のアルキニルが挙げられる。具体的には、エチニル、プロパルギル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニル等が挙げられる。
(vi)低級アルカノイルとしては、例えば炭素数1〜8の直鎖または分枝鎖状の低級アルカノイルが挙げられる。具体的には、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル等が挙げられる。
【００５３】
(vii)アリール、ならびにアラルキル、アロイル、アリールオキシ、アリールチオ及びアリールスルホニルのアリール部分としては、例えば炭素数6〜14のアリールが挙げられる。具体的にはフェニル、ナフチル、インデニル、アントリル等が挙げられ、好ましくはフェニル、ナフチル等が挙げられる。
(viii)芳香族複素環基、ならびに芳香族複素環アルキル、芳香族複素環カルボニル、芳香族複素環オキシ、芳香族複素環チオ及び芳香族複素環スルホニルにおける芳香族複素環基部分としては、例えば窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる少なくとも1個の原子を含む5員または6員の単環性芳香族複素環基、3〜8員の環が縮合した二環または三環性で窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる少なくとも1個の原子を含む縮環性芳香族複素環基等が挙げられる。具体的にはピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキソピリダジニル、キノリル、イソキノリル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、シンノリニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアジニル、トリアゾリル、テトラゾリル、チエニル、フリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ピラゾロピリジル、ピラゾロピリミジニル、プリニル、ジベンゾフラニル、ジベンゾアゼピニル等が挙げられ、好ましくはピリジル、ピロリル、チエニル、オキサゾリル等が挙げられる。
(ix)芳香族環としては、例えばベンゼン環、ナフタレン環、芳香族複素環等が挙げられる。芳香族複素環は、前記芳香族複素環基、ならびに芳香族複素環アルキル、芳香族複素環カルボニル、芳香族複素環オキシ、芳香族複素環チオ及び芳香族複素環スルホニルにおける芳香族複素環基部分に水素原子を付加したものと同義である。
【００５４】
(x)置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、及び置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換数1〜3の、ハロゲン、ヒドロキシ、スルファニル、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルバモイル、C3-8シクロアルキル、脂肪族複素環基、C1-10アルコキシ、C3-8シクロアルコキシ、C6-14アリールオキシ、C7-16アラルキルオキシ、C1-8アルカノイルオキシ、C7-15アロイルオキシ、C1-10アルキルスルファニル、-NRXRY(式中、RX及びRYは同一または異なって、水素原子、C1-10アルキル、C3-8シクロアルキル、C6-14アリール、芳香族複素環基、C7-16アラルキル、C1-8アルカノイル、C7-15アロイル、C1-10アルコキシカルボニルまたはC7-16アラルキルオキシカルボニルである)、C1-8アルカノイル、C7-15アロイル、C1-10アルコキシカルボニル、C6-14アリールオキシカルボニル、C1-10アルキルカルバモイル及びジC1-10アルキルカルバモイル
からなる群から選ばれる置換基等が挙げられる。置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよい低級アルコキシ、置換基を有していてもよい低級アルコキシカルボニル、置換基を有していてもよい低級アルカノイル、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノ、置換基を有していてもよい低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよいジ低級アルキルカルバモイル、置換基を有していてもよい低級アルキルチオ、及び置換基を有していてもよい低級アルキルスルホニルにおける置換基は、前記に加え、C6-14アリール及び芳香族複素環基からなる群から選ばれる置換基であってもよい。
【００５５】
(xi)置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよいアリールオキシ、置換基を有していてもよいアリールチオ、置換基を有していてもよいアリールスルホニル、置換基を有していてもよいアロイル、置換基を有していてもよい芳香族複素環基、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環カルボニル、置換基を有していてもよい芳香族複素環オキシ、置換基を有していてもよい芳香族複素環チオ、置換基を有していてもよい芳香族複素環スルホニル及び置換基を有してもよいスチリルにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換数1〜3のハロゲン、ヒドロキシ、スルファニル、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルバモイル、C1-10アルキル、トリフルオロメチル、C3-8シクロアルキル、C6-14アリール、脂肪族複素環基、芳香族複素環基、C1-10アルコキシ、C3-8シクロアルコキシ、C6-14アリールオキシ、C7-16アラルキルオキシ、C1-8アルカノイルオキシ、C7-15アロイルオキシ、C1-10アルキルスルファニル、-NRXaRYa(式中、RXa及びRYaは同一または異なって、水素原子、C1-10アルキル、C3-8シクロアルキル、C6-14アリール、芳香族複素環基、C7-16アラルキル、C1-8アルカノイル、C7-15アロイル、C1-10アルコキシカルボニルまたはC7-16アラルキルオキシカルボニルである)、C1-8アルカノイル、C7-15アロイル、C1-10アルコキシカルボニル、C6-14アリールオキシカルボニル、C1-10アルキルカルバモイル及びジC1-10アルキルカルバモイルからなる群から選ばれる置換基等が挙げられ、好ましくは置換数1のハロゲン、ヒドロキシ、スルファニル、ニトロ、シアノ、カルボキシ、C1-3アルキル、トリフルオロメチル、C1-3アルコキシ等が挙げられる。
【００５６】
ここで示した、C1-10アルキルならびにC1-10アルコキシ、C1-10アルキルスルファニル、C1-10アルコキシカルボニル、C1-10アルキルカルバモイル及びジC1-10アルキルカルバモイルのC1-10アルキル部分としては、例えば前記低級アルキルの例示で挙げた基が例示される。ジC1-10アルキルカルバモイルにおける2つのC1-10アルキル部分は同一でも異なっていてもよい。
C1-8アルカノイル及びC1-8アルカノイルオキシのC1-8アルカノイル部分としては、例えば前記低級アルカノイルの例示で挙げた基が例示される。
C3-8シクロアルキル及びC3-8シクロアルコキシのC3-8シクロアルキル部分としては、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等が挙げられる。
C6-14アリールならびにC6-14アリールオキシ、C7-15アロイル、C7-15アロイルオキシ及びC6-14アリールオキシカルボニルのアリール部分としては、例えば前記アリールの例示で挙げた基が例示される。
C7-16アラルキルオキシ、C7-16アラルキル及びC7-16アラルキルオキシカルボニルのアリール部分としては、例えば前記アリールの例示で挙げた基が例示され、アルキレン部分としては、例えばC1-10のアルキレンが挙げられ、より具体的には前記低級アルキルの例示で挙げた基から水素原子を一つ除いた基が挙げられる。
【００５７】
脂肪族複素環基としては、例えば窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる少なくとも1個の原子を含む5員または6員の単環性脂肪族複素環基、3〜8員の環が縮合した二環または三環性で窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる少なくとも1個の原子を含む縮環性脂肪族複素環基等が挙げられる。具体的には、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジノ、ピペリジニル、アゼパニル、1,2,5,6-テトラヒドロピリジル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、ピラゾリニル、オキシラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロ-2H-ピラニル、5,6-ジヒドロ-2H-ピラニル、オキサゾリジニル、モルホリノ、モルホリニル、チオキサゾリジニル、チオモルホリニル、2H-オキサゾリル、2H-チオキサゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソインドリル、ジヒドロベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリジニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロベンゾチオキサゾリル、ベンゾジオキソリニル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ジヒドロ-2H-クロマニル、ジヒドロ-1H-クロマニル、ジヒドロ-2H-チオクロマニル、ジヒドロ-1H-チオクロマニル、テトラヒドロキノキサリニル、テトラヒドロキナゾリニル、ジヒドロベンゾジオキサニル等が挙げられる。
ハロゲン及び芳香族複素環基は、それぞれ前記と同義である。
ここで、前記式(II)中のY1は窒素原子等；R5は水素、ハロゲン、シアノまたは置換基を有していてもよい低級アルケニル等；R6は置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアルケニルまたは-NR11aR11b(式中、R11a及びR11bは前記と同義である)等；R7は水素原子、または核酸分野における水素原子の等価体（例えば、重水素原子、アミノ、ヒドロキシ、フッ素原子等）等であること好ましい。なお、前記R6が置換基を有するアリールの場合、置換基はアリールのメタ位またはパラ位に存在することが好ましい。
また、前記式（IV）中のR12は水素原子または核酸分野における水素原子の等価体（例えば、重水素原子、アミノ、ヒドロキシ、フッ素原子等）等；---は二重結合；Y3はCR14e；Y4は窒素原子またはCR14f；R14eおよびR14fは水素原子、ハロゲン、シアノ、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有してアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基等であることが好ましい。
さらに、前記式（V）中のR12ａは水素または核酸分野における水素原子等価体（例えば、重水素原子、アミノ、ヒドロキシ、フッ素原子等）等；環Ａはベンゼン環またはチオフェン環等；n１は１または２；R16はハロゲン、ニトロ、置換基を有していてもよりアルキル、置換基を有していてもよい低級アルキルアミノまたは置換基を有していてもよいジ低級アルキルアミノであることが好ましい。  
【００５８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基からなるポリマーまたはオリゴマーを意味する。
【００５９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、1本鎖オリゴヌクレオチド及び2本鎖オリゴヌクレオチドのいずれも包含する。2本鎖オリゴヌクレオチドにあっては、それぞれのオリゴヌクレオチド鎖の塩基長が異なっていてもよい。また、2本鎖オリゴヌクレオチドにあっては、1つ以上のミスマッチ塩基対を含んでいてもよい。さらに、3本鎖以上のオリゴヌクレオチドによって形成される複合体も本発明のオリゴヌクレオチドに包含される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば疾患に関与する蛋白質をコードする mRNAに対するノックダウン活性を有することが好ましい。ここで、本明細書における“ノックダウン活性を有する”とは、蛋白質等をコードする遺伝子(標的遺伝子)の発現を抑制することを意味し、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの5’末端に対応する天然型ヌクレオチドを含むsiRNAに比して、好ましくは２倍、より好ましくは５倍、さらに好ましくは１０倍の活性を有することが好ましい。
【００６０】
2本鎖オリゴヌクレオチドとしては、例えば構造遺伝子等の2本鎖DNA、siRNA、miRNAを始めとする小分子RNA等の2本鎖RNA等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６１】
1本鎖オリゴヌクレオチドとしては、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、microRNA、アプタマー、アンタゴマー、1本鎖RNAi剤(ヘアピン構造を有するsiRNA等)等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６２】
本発明のオリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは10〜100塩基であり、10〜80塩基がより好ましく、10〜50塩基がさらに好ましく、20〜50塩基が特に好ましく、20〜30塩基が最も好ましい。
【００６３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、5’末端のヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基に加え、さらに1つ以上のヌクレオチド残基が修飾されていてもよい。該修飾は、塩基、糖、リン酸のいずれの部位に含まれていてもよい。
【００６４】
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1〜10のアルキルで置換されたもの、メチルが水素もしくは炭素数2〜10のアルキルで置換されたもの、アミノが炭素数1〜10のアルキル基、炭素数1〜8のアルカノイル等の保護基で保護されたものが挙げられる。
【００６５】
糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
2’-修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの2’-OHが水素原子、-OR、-R、-R’、-SH、-SR、アミノ、-NHR、-NR2、N3、シアノ、及びハロゲンからなる群(ここで、Rは低級アルキルまたはアリールであり、低級アルキル、アリール及びハロゲンはそれぞれ前記と同義である)から選択される置換基で置換された2’-修飾ヌクレオチドが挙げられる。具体的には、2’-OHが、フッ素原子、メトキシ、2-(メトキシ)エトキシ、3-アミノプロポキシ、2-[(N,N-ジメチルアミノ)オキシ]エトキシ、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロポキシ、2-[2-(N,N-ジメチルアミノ)エトキシ]エトキシ、2-(メチルアミノ)-2-オキソエトキシ、2-(N-メチルカルバモイル)エトキシ及び2-シアノエトキシからなる群から選択される置換基で置換された2’-修飾ヌクレオチド等が挙げられる。
【００６６】
リン酸修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド等が挙げられる。
【００６７】
疾患に関与する蛋白質をコードするmRNAに対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドとしては、例えば蛋白質等をコードする遺伝子(標的遺伝子)のmRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含み、かつ標的遺伝子の発現を抑制するオリゴヌクレオチドであれば、例えばsiRNA(short interference RNA)、miRNA(micro RNA)等の二本鎖オリゴヌクレオチド、shRNA(short hairpin RNA)、アンチセンス核酸、リボザイム等の一本鎖オリゴヌクレオチド等、いずれの核酸を用いてもよいが、2本鎖オリゴヌクレオチドが好ましい。
標的遺伝子のmRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド鎖をアンチセンス鎖といい、アンチセンス鎖の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをセンス鎖という。センス鎖は、標的遺伝子の一部の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドそのもの等、アンチセンス鎖と対合して二重鎖形成部ができるオリゴヌクレオチドをいう。標的遺伝子のmRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む2本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、オリゴヌクレオチドの5’末端とは、アンチセンス鎖の5’末端を指す。
本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、アンチセンス鎖とセンス鎖が塩基と対合して形成している二重鎖形成部は、通常15〜27塩基対であり、15〜25塩基対が好ましく、15〜23塩基対がより好ましく、15〜21塩基対がさらに好ましく、15〜19塩基対が特に好ましい。該二重鎖形成部は、アンチセンス鎖とセンス鎖のそれぞれの塩基が対向していればよく、塩基対を形成していても、ミスマッチであってもよいが、アンチセンス鎖の5’末端の塩基とそれに対となるセンス鎖の塩基は、アデノシン-ウラシル(A-U)の塩基対であるかミスマッチであることが好ましい。
【００６８】
2本鎖オリゴヌクレオチドを構成するアンチセンス鎖、センス鎖のいずれか一方、または両方のオリゴヌクレオチドは、二重鎖形成部に続く3’側または5’側に二重鎖を形成しない追加のヌクレオチドを有してもよい。この二重鎖を形成しない部分を突出部(オーバーハング)ともいう。
突出部を有する2本鎖オリゴヌクレオチドとしては、例えば少なくとも一方の鎖の3’末端または5’末端に1〜4塩基、通常は1〜3塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、2塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、dTdTまたはUUからなる突出部を有するものがより好ましく用いられる。突出部は、アンチセンス鎖のみ、センス鎖のみ、およびアンチセンス鎖とセンス鎖の両方に有することができるが、アンチセンス鎖とセンス鎖の両方に突出部を有する二本鎖核酸が好ましく用いられる。
また、二重鎖形成部に続いて標的遺伝子のmRNAの塩基配列と一部または全てが一致する配列、または、二重鎖形成部に続いて標的遺伝子のmRNAの相補鎖の塩基配列と一部または全てが一致する配列を用いてもよい。さらに、2本鎖オリゴヌクレオチドとして、例えばダイサー(Dicer)等のリボヌクレアーゼの作用により前記の突出部を有する2本鎖オリゴヌクレオチドを生成する核酸分子(国際公開第2005/089287号パンフレット)や、3’末端や5’末端の突出部を有していない2本鎖オリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
【００６９】
また、前記の2本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、好ましくはアンチセンス鎖の5’末端側から3’末端側に向って少なくとも2〜17番目の塩基(ヌクレオシド)の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する16塩基の配列と相補的な塩基の配列であり、より好ましくは、該アンチセンス鎖は、5’末端側から3’末端側に向って2〜19番目の塩基の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する18塩基の配列と相補的な塩基の配列であるか、2〜21番目の塩基の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する20塩基の配列と相補的な塩基の配列であるか、2〜25番目の塩基の配列が、標的遺伝子のmRNAの連続する24塩基の配列と相補的な塩基の配列である。
アンチセンス鎖の5’末端の塩基の配列は、標的遺伝子のmRNAの塩基の配列と相補的であってもミスマッチであっても構わない。
【００７０】
さらに、本発明で用いられる核酸がsiRNAである場合、好ましくは該核酸中の糖の10〜70%、より好ましくは15〜60%、さらに好ましくは20〜50%が、2’-修飾ヌクレオチドである。本発明における2’-修飾ヌクレオチドは、2’-シアノ、2’-ハロゲン、2’-O-シアノ、2’-アルキル、2’-置換アルキル、2’-O-アルキル、2’-O-置換アルキル、2’-O-アルケニル、2’-O-置換アルケニル、2’-Se-アルキル、2’-Se-置換アルキル等が好ましく、2’-シアノ、2’-フルオロ、2’-クロロ、2’-ブロモ、2’-トリフルオロメチル、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-O-イソプロピル、2’-O-トリフルオロメチル、2'-O-[2-(メトキシ)エチル]、2'-O-(3-アミノプロピル)、2'-O-[2-(N,N-ジメチル)アミノオキシ]エチル、2'-O-[3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル]、2'-O-{2-[2-(N,N-ジメチルアミノ)エトキシ]エチル}、2'-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]、2’-Se-メチル、水素原子等がより好ましく、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-フルオロ、水素原子等がさらに好ましく、2’-O-メチルおよび2’-O-フルオロが最も好ましい。
【００７１】
化合物(Ia)は、式(I)で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基の残基部が、ヒドロキシになったヌクレオチドまたはヌクレオシドに相当し、化合物(Ia)の好ましい形態としては、前記(2)〜(51)に示された式(I)で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基に相当するヌクレオチドまたはヌクレオシドが挙げられ、より好ましい形態としては、前記(32)〜(51)に示された式(I)中のX1が酸素原子であり、R2が水素原子、ヒドロキシ、フッ素原子またはメトキシであるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基に相当するヌクレオチドまたはヌクレオシドが挙げられる。
【００７２】
化合物(Ia)は、例えば酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等の塩として得ることも可能である。
酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられ、アンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、有機アミン付加塩としては、例えば、モルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられ、アミノ酸付加塩としては、例えば、リジン、グリシン、フェニルアラニン等の付加塩が挙げられる。
【００７３】
化合物(Ia)の中には、幾何異性体、光学異性体等の立体異性体、互変異性体等が存在し得るものもあるが、これらを含め、全ての可能な異性体及びそれらの混合物を本発明に用いられる。
また、化合物(Ia)は、水または各種溶媒との付加物の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明に用いられる。
【００７４】
化合物(Ia)のアミダイトとしては、例えば、後記のオリゴヌクレオチドの製造法における化合物(B)等が挙げられる。
【００７５】
次に、本発明のオリゴヌクレオチドの製造法について説明する。
オリゴヌクレオチドの一般的合成法は、例えば、ヌクレオチドのアミダイト化、オリゴマー化(脱保護等の工程を含む)、(必要に応じて)アニーリングによる二本鎖化等の工程からなる。
本発明のオリゴヌクレオチドは例えば以下の製造法によって製造することができる。
【００７６】
(1)オリゴマー化の一般例
【００７７】
【化４２】
2014034934.tif 000044
[式中、mは例えば9〜99の整数であり、Poは例えばCPG(controlled pore glass)等の固相支持体であり、Raは例えばトリチル、p,p’-ジメトキシトリチル等の酸処理により除去できる保護基であり、Rbは例えばtert-ブチルジメチルシリル等のフッ化物イオンで除去できる保護基であり、Rcは例えば2-シアノエチル等の塩基処理により除去できる保護基であり、Rdは置換基を有してもよい低級アルキルであり、Bは核酸塩基(該核酸塩基は、必要により一つ以上の保護基により保護されていてもよく、保護基が二つ以上の場合、それぞれの保護基は同一でも異なっていてもよい)である。mが2以上の場合、m＋1個のB、m＋1個のRb及びm個のRcはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、各段階におけるRaは同一でも異なっていてもよい。ここで、低級アルキルは前記と同義であり、置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基は前記置換基を有していてもよい低級アルキルと同義である]
【００７８】
工程1
化合物(C)は、溶媒中、反応促進剤存在下、化合物(A)と化合物(B)を0 ℃と50 ℃の間の温度で、10秒間から30分間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、アセトニトリル、トルエン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン(THF)、1,4-ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、N-メチルピロリドン(NMP)、水等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
反応促進剤としては、1H-テトラゾール、4,5-ジシアノイミダゾール、5-エチルチオテトラゾール、5-ベンジルチオテトラゾール等が挙げられる。
化合物(A)は、例えば市販品として得られる。
化合物(B)は、例えば以下の方法によって製造することができる。
【００７９】
【化４３】
2014034934.tif 000045
(式中、Ra、Rb、Rc、Rd及びBはそれぞれ前記と同義であり、X3はハロゲンである。該ハロゲンは前記と同義である)
化合物(B)は、溶媒中、化合物(M)と化合物(N)を、塩基存在下、0 ℃と100 ℃の間の温度で、10秒間から24時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、アセトニトリル、トルエン、酢酸エチル、THF、1,4-ジオキサン、DMF、NMP等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば、トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
また、化合物(B)は、溶媒中、化合物(M)と化合物(O)を、反応促進剤存在下、0 ℃と100 ℃の間の温度で、10秒間から24時間反応させることによっても製造することができる。
溶媒としては、例えばアセトニトリル、THF等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
反応促進剤としては、前記のものが挙げられる。
【００８０】
工程2
工程1における、未反応の化合物(A)は溶媒中、アシル化試薬と塩基を0 ℃と50 ℃の間の温度で、10秒間から30分間反応させることによりキャッピングすることができる。この際、適当な添加物を加え、反応を促進させることもできる。
アシル化試薬としては、例えば無水酢酸が挙げられる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、アセトニトリル、酢酸エチル、THF、1,4-ジオキサン、DMF等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えばピリジン、2,6-ルチジン等が挙げられる。
添加剤としては、例えば4-ジメチルアミノピリジン、1-メチルイミダゾール等が挙げられる。
【００８１】
工程3
化合物(D)は、化合物(C)を溶媒中、酸化剤と、塩基存在下、0 ℃と50 ℃の間の温度で、10秒間から30分間反応させることにより製造することができる。
酸化剤としては、ヨウ素、過酸化水素水、m-クロロ過安息香酸、過酢酸、tert-ブチルヒドロペルオキシド等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基および溶媒としては、それぞれ前記工程2に記載のものが挙げられる。
【００８２】
工程4
化合物(E)は、溶媒中、化合物(D)に酸を0 ℃と50 ℃の間の温度で、10秒間から30分間反応させることにより製造することができる。
酸としては、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられる。
溶媒としてはジクロロメタン、クロロホルム等が挙げられる。
工程1〜4、及び下記の工程5及び6は核酸合成機を用いて行うこともできる。
【００８３】
(2)5’末端へのヌクレオチド残基(I)の導入の一般例
【００８４】
【化４４】
2014034934.tif 000046
(式中、m、X1、R1、R2、Po、Ra、Rb、Rc及びRdはそれぞれ前記と同義である)
【００８５】
工程5
工程5(化合物(F)の保護基Raの脱保護)は、前記工程4と同様の方法で行うことができる。
工程6
工程5においてRaが脱保護された化合物(F)(以下、化合物(Fa))と化合物(G)のカップリングは例えば、以下の方法によって行うことができる。
溶媒中、反応促進剤存在下、化合物(Fa)と1当量〜大過剰量の化合物Gを0 ℃と50 ℃の間の温度で、10秒間から30分間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、アセトニトリル、トルエン、酢酸エチル、THF、1,4-ジオキサン、DMF、NMP、水等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
反応促進剤としては、前記のものが挙げられる。
化合物Gは、例えば市販品として得られる。
【００８６】
工程7
前記工程3と同様の方法(リン原子の酸化)により、化合物(H)を得ることができる。
工程8
固相担持されたオリゴヌクレオチドに対して、塩基を作用させることにより、固相から切り出すことができる。即ち、化合物(J)は、溶媒中、化合物(H)を-80 ℃と200 ℃の間の温度で、10秒間から72時間塩基で処理することにより製造することができる。
塩基としては、例えばアンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)等が挙げられる。
溶媒としては、水、メタノール、エタノール等が挙げられる。
なお、本工程において、B(核酸塩基)に含まれる窒素原子の保護基の脱保護も同時に行われる。
【００８７】
工程9
化合物(K)は、溶媒中、化合物(J)とフッ素試薬を-80 ℃と200 ℃の間の温度で、10秒間から72時間反応させることにより製造することができる。このとき、塩基を加えることもできる。
フッ素試薬としては、例えばフッ化水素、フッ化水素酸トリエチルアミン塩、フッ化テトラブチルアンモニウム(TBAF)等が挙げられる。
塩基としては、例えば、トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、トルエン、酢酸エチル、THF、1,4-ジオキサン、DMF、N,N-ジメチルアセトアミド(DMA)、NMP、ジメチルスルホキシド(DMSO)等が挙げられる。
【００８８】
工程10
化合物(L)は、化合物(K)を溶媒中またはカラム中、0 ℃と50℃の間の温度で、5分間から100時間酸で処理することにより製造することができる。
酸としてはトリフルオロ酢酸等が挙げられる。
溶媒としては、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
カラムとしては、例えばC18逆相カートリッジカラム等が挙げられる。
【００８９】
(3)二本鎖オリゴヌクレオチド製造の一般例
化合物(L)と、それに対して等モル量の一本鎖オリゴヌクレオチドとを溶媒中、30 ℃と120 ℃の間の温度で10秒間から72時間反応させた後、10分間から24時間を要しながら室温まで徐冷することにより、二本鎖オリゴヌクレオチドを製造することができる。
溶媒としては、例えば酢酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、水等が挙げられ、これらを単独または混合して用いられる。
化合物(L)と反応させる一本鎖オリゴヌクレオチドは、化合物(L)と相補的なオリゴヌクレオチドであるが、1つ以上のミスマッチな塩基の組み合わせを含んでいてもよい。また、塩基長が異なっていてもよい。
【００９０】
上記のスキームにおいて、核酸塩基、各工程の反応条件等を種々変更することにより、所望のオリゴヌクレオチドを得ることができる。
これらは、例えば、
(i)テトラへドロン(Tetrahedron)、第48巻、第12号、2223-2311頁(1992);
(ii)カレント・プロトコールズ・イン・ヌクレイック・アシッズ・ケミストリー(Current Protocols in Nucleic Acids Chemistry)、John Wiley & Sons(2000);
(iii)プロトコールズ・フォー・オリゴヌクレオチズ・アンド・アナログズ(Protocols for Oligonucleotides and Analogs)、Human Press(1993);
(iv)ケミストリー・アンド・バイオロジー・オブ・アーティフィシャル・ヌクレイック・アシッズ(Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids)、Wiley-VCH(2012);
(v)ゲノムケミストリー  人工核酸を活用する科学的アプローチ、講談社(2003);
(vi)核酸化学のニュートレンド、化学同人(2011)
等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００９１】
(4)式(I)で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基に相当するヌクレオチドまたはヌクレオシドの一般的製造法
以下、式(I)で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基に相当するヌクレオチドまたはヌクレオシドの一般的製造法を示すが、本発明に用いられるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基の製造法はこれらに限定されるものではない。
以下に示す製造法において、定義した基が該製造法の条件下で変化するか、または該製造法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で常用される保護基の導入及び除去方法[例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第4版(Protective Groups in Organic Synthesis, forth edition)、グリーン(T.W.Greene)著、John Wiley & Sons Inc.(2006年)等]等を用いることにより、目的化合物を製造することができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
【００９２】
製造法4-1
【００９３】
【化４５】
2014034934.tif 000047
(式中、Ra及びRbはそれぞれ前記と同義である)
工程1
化合物(b)は、溶媒中、塩基存在下、化合物(a)と相当するアルキル化剤を、0 ℃と150 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。適当な活性化剤により、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばDMF、ピリジン、ジクロロメタン、THF、酢酸エチル、1,4-ジオキサン、NMP等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば、ピリジン、トリエチルアミン、N-エチル-N,N-ジイソプロピルアミン、2,6-ルチジン等が挙げられる。
アルキル化剤としては、例えば、トリチルクロリド、p,p'-ジメトキシトリチルクロリド等が挙げられる。
活性化剤としては、例えば、4-ジメチルアミノピリジン等が挙げられる。
化合物(a)は、例えば、公知の方法[Journal of Medicinal Chemistry, 2004, 47(6), 1987-1996]によって合成できる。
【００９４】
工程2
化合物(c)は、溶媒中、銀塩及び塩基存在下、化合物(b)とシリル化剤を、0 ℃と80 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えば、THF、エチレングリコールジメチルエーテル(DME)等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
銀塩としては、例えば硝酸銀、過塩素酸銀等が挙げられる。
塩基としては、例えば、トリエチルアミン、1,4-ジアザビシクロ[2,2,2]オクタン(DABCO)、ピリジン等が挙げられる。
シリル化剤としては、例えば、tert-ブチルジメチルシリルクロリド等が挙げられる。
【００９５】
製造法4-2
【００９６】
【化４６】
2014034934.tif 000048
(式中、Ra及びRbはそれぞれ前記と同義であり、Reは、例えばアセチル、ベンゾイル等の塩基により除去できる保護基であり、R11a-1は前記R11aの定義のうち、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、または置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)
【００９７】
工程1
化合物(e)は溶媒中、または無溶媒で、化合物(c)と化合物(d)を、塩基存在下または非存在下、0 ℃と150 ℃の間の温度で1時間から1週間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばDMF、ピリジン、ジクロロメタン、THF、酢酸エチル、NMP、アセトニトリル等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えばトリエチルアミン、N-エチル-N,N-ジイソプロピルアミン等が挙げられる。
【００９８】
工程2
化合物(f)は溶媒中、化合物(e)とシリル化剤を0 ℃と100 ℃の間の温度で10分間から3時間反応させた後、アシル化剤と0 ℃と100℃の間で1時間から72時間反応させ、さらに水またはアルコールで1時間から24時間処理することにより製造することができる。アシル化剤と適当な活性化剤を共存させることにより、反応を促進することもできる。
溶媒としては、例えばピリジン等が挙げられる。
シリル化剤としては、例えば、トリメチルシリルクロリド、トリフルオロメタンスルホニルトリメチルシリル、N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド、1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシラザン等が挙げられる。
アシル化剤としては、例えば、無水酢酸、酢酸クロリド、ベンゾイルクロリド等が挙げられる。
アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、1-プロパノール等が挙げられる。
活性化剤としては、例えば、4-ジメチルアミノピリジンが挙げられる。
【００９９】
製造法4-3
【０１００】
【化４７】
2014034934.tif 000049
(式中、Ra、Rb及びR11a-1はそれぞれ前記と同義であり、R11b-1は前記R11bの定義のうち、置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよい低級アルケニル、置換基を有していてもよい低級アルキニル、置換基を有していてもよいアリール、置換基を有していてもよいアラルキル、置換基を有していてもよい芳香族複素環アルキル、または置換基を有していてもよい芳香族複素環基である)
化合物(h)は溶媒中、または無溶媒で、化合物(c)と化合物(g)を、塩基存在下または非存在下、0 ℃と150 ℃の間の温度で1時間から1週間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばDMF、ピリジン、ジクロロメタン、THF、酢酸エチル、NMP、アセトニトリル等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えばトリエチルアミン、N-エチル-N,N-ジイソプロピルアミン等が挙げられる。
【０１０１】
製造法4-4
【０１０２】
【化４８】
2014034934.tif 000050
(式中、Ra及びRbはそれぞれ前記と同義であり、R6bは置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基であり、Xaは酸素原子または硫黄原子であり、Mはアルカリ金属原子である。ここで、低級アルキル、アリール及び芳香族複素環基はそれぞれ前記と同義であり、置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基は前記置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基と同義であり、置換基を有していてもよいアリール及び置換基を有していてもよい芳香族複素環基における置換基は前記置換基を有していてもよいアリール及び置換基を有していてもよい芳香族複素環基における置換基と同義である。アルカリ金属原子は、リチウム原子、ナトリウム原子、またはカリウム原子である)
化合物(k)は溶媒中、化合物(c)と化合物(i)を0 ℃と100 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより、または溶媒中、化合物(c)と化合物(j)を塩基存在下、0 ℃と120 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、2-プロパノール、THF、DME、DMF、NMP等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水素化ナトリウム、水素化カリウム、tert-ブトキシカリウム等が挙げられる。
【０１０３】
製造法4-5
【０１０４】
【化４９】
2014034934.tif 000051
(式中、Ra及びRbはそれぞれ前記と同義であり、Arは置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基であり、Rfは水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキルである。ここで、低級アルキル、アリール及び芳香族複素環基はそれぞれ前記と同義であり、置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基は前記置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基と同義であり、置換基を有していてもよいアリール及び置換基を有していてもよい芳香族複素環基における置換基は前記置換基を有していてもよいアリール及び置換基を有していてもよい芳香族複素環基における置換基と同義である)
化合物(m)は、溶媒中、化合物(c)と化合物(l)を塩基、及びパラジウム触媒存在下、0 ℃と120 ℃の間の温度で、30分間から72時間反応させることにより製造することができる。適当なホスフィンを添加することにより、反応を促進することもできる。
化合物(l)は市販品として得られるか、または公知の方法[例えば、「第5版実験化学講座18有機化合物の合成VI 金属を用いる有機合成」、p.97、丸善(2005年)]でもしくはそれに準じて得ることができる。
塩基としては、例えば炭酸カリウム、リン酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、カリウム  tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、DBU等が挙げられる。
パラジウム触媒としては、例えば酢酸パラジウム、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム、1,1’-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセンジクロロパラジウム・ジクロロメタン1:1付加物等が挙げられる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP、水等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
適当なホスフィンとしては、例えば1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン、1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン、4,5'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-9,9'-ジメチルキサンテン(Xantphos)、2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル(BINAP)等が挙げられる。
【０１０５】
製造法4-6
【０１０６】
【化５０】
2014034934.tif 000052
(式中、Ra、Rb及びRfはそれぞれ前記と同義であり、R15a、R15b及びR15cはそれぞれ、水素原子、置換基を有していてもよい低級アルキル、アリール、または芳香族複素環基である。ここで、低級アルキル、アリール及び芳香族複素環基はそれぞれ前記と同義であり、置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基は前記置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基と同義である)
化合物(p)は、溶媒中、化合物(c)と化合物(n)を塩基、及びパラジウム触媒存在下、0 ℃と120 ℃の間の温度で、30分間から72時間反応させることにより製造することができる。適当なホスフィンを添加することにより、反応を促進することもできる。
化合物(n)は、例えば市販品として得られる。
塩基としては、例えば炭酸カリウム、リン酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、カリウム  tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、DBU等が挙げられる。
パラジウム触媒としては、前記のものが挙げられる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP、水等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
また、化合物(p)は、化合物(c)と化合物(o)を、溶媒中、塩基とパラジウム触媒の存在下、0 ℃と140 ℃との間の温度で、30分間から72時間反応させることによっても製造することができる。
塩基としては、例えば酢酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウムtert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、DBU等が挙げられる。
パラジウム触媒としては、前記のものが挙げられる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
適当なホスフィンとしては、例えば1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン、1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン、Xantphos、BINAP等が挙げられる。
【０１０７】
製造法4-7
【０１０８】
【化５１】
2014034934.tif 000053
(式中、Ra、Rb及びR6bはそれぞれ前記と同義である)
化合物(r)は、溶媒中、化合物(c)と化合物(q)をパラジウム触媒存在下、0 ℃と150℃との間の温度で反応させることにより製造することができる。適当な添加剤及び／または適当なホスフィンにより反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
化合物(q)は、例えば市販品として得られる。
パラジウム触媒としては、前記のものが挙げられる。
適当な添加剤としては、たとえば、塩化リチウム、フッ化セシウム等が挙げられる。
適当なホスフィンとしては、例えば1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン、1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン、Xantphos、BINAP等が挙げられる。
【０１０９】
製造法4-8
【０１１０】
【化５２】
2014034934.tif 000054
(式中、Ra、Rb、R11c及びR11dはそれぞれ前記と同義である)
化合物(t)は溶媒中、化合物(c)と化合物(s)を一酸化炭素雰囲気下、塩基とパラジウム触媒の存在下、室温と120 ℃の間の温度で1時間から72時間反応させることにより製造することができる。適当なホスフィンを添加することにより、反応を促進することもできる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、カリウムtert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、DBU等が挙げられる。
パラジウム触媒としては、前記のものが挙げられる。
ホスフィンとしては、例えば1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン、1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン、Xantphos、BINAP等が挙げられる。
【０１１１】
製造法4-9
【０１１２】
【化５３】
2014034934.tif 000055
(式中、Ra及びRbはそれぞれ前記と同義であり、R6cは置換基を有していてもよい低級アルキル、置換基を有していてもよいアリールまたは置換基を有していてもよい芳香族複素環基である。ここで、低級アルキル、アリール及び芳香族複素環基はそれぞれ前記と同義であり、置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基は前記置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基と同義であり、置換基を有していてもよいアリール及び置換基を有していてもよい芳香族複素環基における置換基は前記置換基を有していてもよいアリール及び置換基を有していてもよい芳香族複素環基における置換基と同義である)
【０１１３】
工程1
化合物(w)は溶媒中、化合物(c)と化合物(u)を一酸化炭素雰囲気下、塩基とパラジウム触媒の存在下、室温と120 ℃の間の温度で1時間から72時間反応させることにより製造することができる。適当なホスフィンを添加することにより、反応を促進することもできる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノール、tert-ブチルアルコール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、カリウムtert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、DBU等が挙げられる。
パラジウム触媒としては、前記のものが挙げられる。
ホスフィンとしては、例えば1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン、1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン、Xantphos、BINAP等が挙げられる。
【０１１４】
工程2
化合物(y)は化合物(w)を溶媒中、塩基の存在下、0 ℃と100 ℃との間の温度で、5分間〜72時間処理することにより製造することができる。
塩基としては、例えば炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド等が挙げられる。
【０１１５】
溶媒としては、例えば水を含む溶媒が挙げられ、該溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP、ピリジン等が挙げられ、これらは水と混合して、またはそれぞれを混合してさらに水を添加して用いられる。
【０１１６】
製造法4-10
【０１１７】
【化５４】
2014034934.tif 000056
(式中、Ra及びRbはそれぞれ前記と同義であり、R6dは置換基を有していてもよい低級アルキル、アリールまたは芳香族複素環基である。ここで、低級アルキル、アリール及び芳香族複素環基はそれぞれ前記と同義であり、置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基は前記置換基を有していてもよい低級アルキルにおける置換基と同義である)
化合物(aa)は溶媒中、化合物(c)と化合物(z)を銅塩、塩基とパラジウム触媒の存在下、室温と150 ℃の間の温度で1時間から72時間反応させることにより製造することができる。適当なホスフィンを添加することにより、反応を促進することもできる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン、DMF、DMA、NMP等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
銅塩としては、例えばヨウ化銅(I)等が挙げられる。
塩基としては、例えば酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、カリウムtert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、DBU等が挙げられる。
パラジウム触媒としては、前記のものが挙げられる。
ホスフィンとしては、例えば1,2-ビス(ジフェニルホスフィノ)エタン、1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン、Xantphos、BINAP等が挙げられる。
【０１１８】
製造法4-11
以下の方法で得られる化合物aeを用い、前記製造法4-2〜4-10に準じて、本発明のオリゴヌクレオチド製造の原料に用いられるヌクレオシドを得ることができる。
【０１１９】
【化５５】
2014034934.tif 000057
(式中、Ra、Rb及びRcはそれぞれ前記と同義である)
【０１２０】
工程1
化合物(ac)は溶媒中、化合物(ab)とシリル化剤を0 ℃と100 ℃の間の温度で10分間から3時間反応させた後、アシル化剤と0 ℃と100℃の間で1時間から72時間反応させ、さらに水またはアルコールで1時間から24時間処理することにより製造することができる。
溶媒としては、例えばピリジン等が挙げられる。
シリル化剤としては、例えば、トリメチルシリルクロリド、トリフルオロメタンスルホニルトリメチルシリル、N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド、1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシラザン等が挙げられる。
アシル化剤としては、例えば、無水酢酸、酢酸クロリド、ベンゾイルクロリド等が挙げられる。
アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、1-プロパノール等が挙げられる。
化合物(ab)は、例えば、公知の方法[Tetrahedron, 1970, 26, 4251-4259]によって合成できる。
【０１２１】
工程2
化合物(ad)は、溶媒中、塩基存在下、化合物(ac)と相当するアルキル化剤を、0 ℃と150 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。適当な活性化剤により、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばDMF、ピリジン、ジクロロメタン、THF、酢酸エチル、1,4-ジオキサン、NMP等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば、ピリジン、トリエチルアミン、N-エチル-N,N-ジイソプロピルアミン、2,6-ルチジン等が挙げられる。
アルキル化剤としては、例えば、トリチルクロリド、p,p'-ジメトキシトリチルクロリド等が挙げられる。
活性化剤としては、例えば、4-ジメチルアミノピリジン等が挙げられる。
【０１２２】
工程3
化合物(ae)は、溶媒中、銀塩、及び塩基存在下、化合物(ad)とシリル化剤を、0 ℃と80 ℃の間で10分間から3日間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えば、THF、DME等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
銀塩としては、例えば硝酸銀、過塩素酸銀等が挙げられる。
塩基としては、例えば、トリエチルアミン、DABCO、ピリジン等が挙げられる。
シリル化剤としては、例えば、tert-ブチルジメチルシリルクロリド等が挙げられる。
【０１２３】
製造法4-12
【０１２４】
【化５６】
2014034934.tif 000058
(式中、Ra及びRbはそれぞれ前記と同義である)
【０１２５】
工程1
化合物(ag)は、溶媒中、塩基存在下、化合物(af)と相当するアルキル化剤を、0 ℃と150 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。適当な活性化剤により、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばDMF、ピリジン、ジクロロメタン、THF、酢酸エチル、1,4-ジオキサン、NMP等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば、ピリジン、トリエチルアミン、N-エチル-N,N-ジイソプロピルアミン、2,6-ルチジン等が挙げられる。
アルキル化剤としては、例えば、トリチルクロリド、p,p'-ジメトキシトリチルクロリド等が挙げられる。
活性化剤としては、例えば、4-ジメチルアミノピリジン等が挙げられる。
化合物(af)は、例えば、公知の方法[Journal of Medicinal Chemistry, 2004, 50(5), 915-921及びWO2011/51733]によって合成できる。
【０１２６】
工程2
化合物(ah)は、溶媒中、銀塩、及び塩基存在下、化合物(ag)とシリル化剤を、0 ℃と80 ℃の間で10分間から3日間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えば、THF、DME等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
銀塩としては、例えば硝酸銀、過塩素酸銀等が挙げられる。
塩基としては、例えば、トリエチルアミン、DABCO、ピリジン等が挙げられる。
シリル化剤としては、例えば、tert-ブチルジメチルシリルクロリド等が挙げられる。
【０１２７】
製造法4-13
【０１２８】
【化５７】
2014034934.tif 000059
(式中、Ra、Rb、Rf及びArはそれぞれ前記と同義である)
化合物(ai)は、化合物(ah)を用い、製造法4-5に準じて製造することができる。
【０１２９】
製造法4-14
【０１３０】
【化５８】
2014034934.tif 000060
(式中、Ra、Rb、Rf、R15a、R15b及びR15cはそれぞれ前記と同義である)
化合物(aj)は、化合物(ah)を用い、製造法4-6に準じて製造することができる。
【０１３１】
製造法4-15
【０１３２】
【化５９】
2014034934.tif 000061
(式中、Ra、Rb及びR6bはそれぞれ前記と同義である)
化合物(ak)は、化合物(ah)を用い、製造法4-7に準じて製造することができる。
【０１３３】
製造法4-16
【０１３４】
【化６０】
2014034934.tif 000062
(式中、Ra、Rb及びR6dはそれぞれ前記と同義である)
【０１３５】
化合物(al)は、化合物(ah)を用い、製造法4-10に準じて製造することができる。
【０１３６】
製造法4-17
【０１３７】
【化６１】
2014034934.tif 000063
(式中、Ra、環A、R16、n1及びRbはそれぞれ前記と同義であり、Rgは例えばジ-tert-ブチルシリル等のフッ化物イオンで除去できる保護基であり、Xaは例えばハロゲン、アシルオキシ基等の脱離基であり、R17、R18及びR19は、それぞれ例えばアシル基等の、塩基で脱保護できる保護基である)
【０１３８】
工程1
化合物(nb)は、溶媒中、シリル化剤存在下、化合物(na)と化合物(naa)を、0 ℃と150 ℃の間の温度で、10分間から1日間反応させた後、ルイス酸存在下、0 ℃と150 ℃の間の温度で、10分間から1日間処理することにより製造することができる。
溶媒としては、例えば、アセトニトリル、1,2-ジクロロエタン、THF、トルエン等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
シリル化剤としては、例えばトリメチルシリルクロリド、トリフルオロメタンスルホニルトリメチルシリル、N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド、1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシラザン等が挙げられる。
ルイス酸としては、例えば、トリフルオロメタンスルホニルトリメチルシリル、四塩化スズ等が挙げられる。
化合物(na)は市販品として得られるか、または例えば、公知の方法[テトラへドロン(Tetrahedron)、 2012年、68巻、8908-8915頁]で、もしくはそれに準じて得ることができる。
【０１３９】
工程2
化合物(nc)は、溶媒中または無溶媒で、化合物(nb)と塩基を室温と50 ℃の間の温度で、1時間から4日間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、THF、DMF、水等が挙げられ、これらを単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えばアンモニア、メチルアミン、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド等が挙げられる。
【０１４０】
工程3
化合物(nd)は、溶媒中、塩基存在下、化合物(nc)と例えば相当するシリル化剤を、0 ℃と80 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばDMF、DMA、NMP等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えばイミダゾール、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられる。
シリル化剤としては、例えば、ビス(トリフルオロメタンスルホン酸)ジ-tert-ブチルシリル等が挙げられる。
【０１４１】
工程4
化合物(ne)は、溶媒中、塩基存在下、化合物(nd)と例えば相当するシリル化剤を、0 ℃と80 ℃の間で10分間から3日間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、DMF等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えばイミダゾール、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられる。
シリル化剤としては、例えば、tert-ブチルジメチルシリルクロリド等が挙げられる。
【０１４２】
工程5
化合物(nf)は、溶媒中、塩基存在下、化合物(ne)を脱保護試薬で、0 ℃と80 ℃の間で10分間から3日間処理することにより製造することができる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサン等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン等が挙げられる。
脱保護試薬としては、例えば、フッ化水素-ピリジン等が挙げられる。
【０１４３】
工程6
化合物(ng)は、溶媒中、塩基存在下、化合物(nf)と相当するアルキル化剤を、0 ℃と150 ℃の間の温度で、10分間から3日間反応させることにより製造することができる。適当な活性化剤により、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、THF、ジオキサン、DMF、ピリジン等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン等が挙げられる。
アルキル化剤としては、例えば、トリチルクロリド、p,p'-ジメトキシトリチルクロリド等が挙げられる。
活性化剤としては、例えば、4-ジメチルアミノピリジン等が挙げられる。
【０１４４】
上記各製造法に含まれる化合物中の各基の変換は、公知の方法[例えば、コンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ第2版(Comprehensive Organic Transformations 2nd edition)、R. C. ラロック(Larock)著、Vch Verlagsgesellscaft Mbh(1999年)等]で、またはそれらに準じて行うこともできる。
上記各製造法の生成物に対し、公知の方法によってヒドロキシの脱保護、及びリン酸化[例えば、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(Journal of Medicinal Chemistry)、第55巻、1478-1489頁(2012年)等]を行うことにより、所望のヌクレオチドまたはヌクレオシドを得ることができる。
【０１４５】
上記各製造法における中間体及び目的化合物は、有機合成化学で常用される分離精製法、例えば、ろ過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグラフィー等に付して単離精製することができる。また、中間体においては特に精製することなく次の反応に供することも可能である。
上記ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、例えば酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等の塩として得ることも可能である。
酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられ、アンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、有機アミン付加塩としては、例えば、モルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられ、アミノ酸付加塩としては、例えば、リジン、グリシン、フェニルアラニン等の付加塩が挙げられる。
上記ヌクレオチドまたはヌクレオシドの塩を取得したいとき、上記ヌクレオチドまたはヌクレオシドが塩の形で得られるときはそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られるときは、上記ヌクレオチドまたはヌクレオシドを適当な溶媒に溶解または懸濁し、酸または塩基を加えて単離、精製すればよい。
上記ヌクレオチドまたはヌクレオシドの中には、幾何異性体、光学異性体等の立体異性体、互変異性体等が存在し得るものもあるが、これらを含め、全ての可能な異性体及びそれらの混合物を本発明に用いられる。
【０１４６】
また、上記ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、水または各種溶媒との付加物の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明に用いられる。
【０１４７】
化合物(Ia)の具体例を表1〜7に示す。ただし、本発明の化合物(Ia)および相当する式(I)で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基は、これらにおよび相当するヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基に限定されるものではない。
【０１４８】
【表１】
2014034934.tif 000064
【０１４９】
【表２】
2014034934.tif 000065
【０１５０】
【表３】
2014034934.tif 000066
【０１５１】
【表４】
2014034934.tif 000067
【０１５２】
【表５】
2014034934.tif 000068
【０１５３】
【表６】
2014034934.tif 000069
【０１５４】
【表７】
2014034934.tif 000070
【０１５５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、トランスフェクション用の担体、好ましくはカチオン性リポソーム等のカチオン性担体を用いて細胞内に導入することができる。また、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法またはマイクロインジェクション法等により、直接細胞内に導入することもできる。
例えばsiRNAはmRNAの切断を介してあらゆる蛋白質の発現を選択的に抑制し得ることから、医薬への応用が期待されている。疾患に関与する蛋白質をコードするmRNAに対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチド(例えばsiRNA)において、該オリゴヌクレオチドの5’末端のヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基を、式(I)で表されるヌクレオチド残基またはヌクレオシド残基に置換することで、標的mRNAに対するノックダウン活性することが期待される。
【０１５６】
また、疾患に関与する蛋白質をコードするmRNAに対するノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチド(例えばsiRNA)において、該オリゴヌクレオチドの5’末端における塩基残基を、式(II)〜(V)で表される塩基残基に置換することで、AGO2との親和性が向上したオリゴヌクレオチドになり、標的mRNAに対する高いノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドになる。また、5’末端における塩基がグアニンまたはシトシンであるオリゴヌクレオチドにおいて、該オリゴヌクレオチドの5’末端におけるグアニン残基またはシトシン残基を、アデニン残基(6-アミノプリン-9-イル)、チミン残基(5-メチル-1,2,3,4テトラヒドロピリミジン-2,4ジオン-1-イル)、ウリジン残基(ピリミジン-2,4(1H,3H)ジオン-1-イル)または式(II)〜(V)で表される塩基残基に置換することで、AGO2との親和性が向上したオリゴヌクレオチドになり、標的mRNAに対する高いノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドになる。
本発明によって得られる標的mRNAに対する高いノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドは、5’末端におけるリン酸部分や糖部が式(I)と同じであっても、異なっていても構わない。
本発明における式(II)〜(V)で表される塩基残基の好ましい形態としては、前記(4)〜(12)、(14)〜(16)、(18)〜(22)、(24)〜(27)に示された式(II)〜(V)で表される塩基残基が挙げられ、より好ましい形態としては、前記(34)〜(38)、(40)〜(43)、(45)〜(47)に示された式(IIA)〜(VA)で表される塩基残基が挙げられる。
【０１５７】
本発明のオリゴヌクレオチド及び本発明の方法により標的mRNAに対するノックダウン活性が向上したオリゴヌクレオチドは、そのまま単独で投与することも可能であるが、通常各種の医薬製剤として提供するのが望ましい。また、それら医薬製剤は、動物及び人に使用されるものである。
本発明に係わる医薬製剤は、活性成分として本発明のオリゴヌクレオチドを単独で、または任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それらの医薬製剤は、活性成分を薬学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。例えば本発明の医薬製剤の製造方法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクション、ウイルス法、ならびにカチオンリポソームを使用する方法などが挙げられる（Graham, F.L.およびvan der Eb, A.J.（1973）Virol. 52, 456；McCutchan, J.H.およびPagano, J.S.（1968）J. Natl. Cancer Inst. 41, 351；Chu, G.ら（1987）Nucl. Acids Res. 15, 1311；Fraley, Rら（1980）J. Biol. Chem. 255, 10431；Capechi, M.R.（1980）Cell 22, 479；Felgner, P.L.ら（1987）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413）。また、核酸を含有するカチオニックリピッドパーティクルやカチオニックポリマー、および核酸封入リピッドパーティクルなどを用いる方法が挙げられる。さらにポリエチレングリコール(PEG)等の水溶性高分子で、リピッドパーティクル等の表面を修飾することが、一般に行われており、前記核酸を含有するカチオニックリピッドパーティクル、カチオニックポリマー、核酸封入リピッドパーティクル等においても、PEG修飾リピッドパーティクルとすることができる。
投与経路としては、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内等の非経口を挙げることができる。
投与形態としては、例えば錠剤、注射剤等が挙げられる。
経口投与に適当な、例えば錠剤等は、乳糖等の賦形剤、澱粉等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤等を用いて製造できる。
【０１５８】
非経口投与に適当な、例えば注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩溶液とブドウ糖溶液の混合液等を用いて製造できる。
本発明のオリゴヌクレオチドの投与量及び投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度等により異なるが、通常、静脈内投与等の非経口投与の場合、成人1人当たり0.001〜100 mg、好ましくは0.01〜10 mgを一日一回ないし数回投与する。しかしながら、これら投与量及び投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
【０１５９】
以下に、本発明の態様を実施例及び参考例で説明する。特に記載のない場合、用いた原料及び試薬は市販品として、または既知の方法に準じて得た。なお、本発明はこれら実施例及び参考例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１６０】
表8に示すアンチセンス鎖の5’末端に8-ブロモ-2’-デオキシアデノシン一リン酸(8-Br-dA)を有する、ルシフェラーゼ標的siRNA(アンチセンス鎖の配列に含まれるXは、8-Br-dAを意味する)の合成を、核酸合成装置(Ultra Fast Parallel Syntheizer、シグマ社製、以下UFPS)を用いて、0.5μmolスケールで行った。固相担体にはCPG 500オングストローム, rA.rG(tac), SAFC-PROLIGOを用いた。DMT-2’-O-TBDMS-rA(tac)アミダイト(SAFC-PROLIGO社)、DMT-2’-O-TBDMS-rG(tac)アミダイト(SAFC-PROLIGO社)、DMT-2’-O-TBDMS-rC(tac)アミダイト(SAFC-PROLIGO社)、及びDMT-2’-O-TBDMS-rUアミダイト(SAFC-PROLIGO社)は0.1 mol/Lアセトニトリル溶液、8-Br-dA-CE ホスホロアミダイト(Glen Research社)は0.1 mol/Lアセトニトリル溶液、化学的リン酸化試薬II(GlenResearch社)は0.06 mol/Lアセトニトリル溶液に調製して縮合反応に用いた。ホスホロアミダイトのアクチベーターとして5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(SAFC-PROLIGO社)を用い、縮合時間は、各10分間とした。トリチルオフにて合成後、28%アンモニア溶液に浸し、55 ℃で4時間放置した。減圧下濃縮し、31%トリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加えて、65 ℃で3時間放置した後、1-ブタノールを加えて反応を停止した。逆相液体クロマトグラフィー(SHISEIDO, CAPSELL PAK C18, SG300, 6.0 mmx75 mm、5%アセトニトリル/0.1%酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液, B液:50%アセトニトリル/水によるグラジエント)を用いて精製し、目的のオリゴヌクレオチドを得た。
得られた1本鎖のオリゴヌクレオチドは、混合緩衝液[100 mmol/L酢酸カリウム、30 mmol/L 2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸、HEPES)-KOH(pH 7.4)、2 mmol/L酢酸マグネシウム]に溶解し、濃度50 μmol/Lとした。センス鎖、アンチセンス鎖を各々等量混合し、80 ℃で10分間静置した。徐々に温度を下げ、37 ℃で1時間静置し、2本鎖オリゴヌクレオチドを得た。【０１６１】
【表８】
2014034934.tif 000071
【０１６２】
試験例1:ルシフェラーゼ標的siRNAのRNAi活性
実施例1で得られたアンチセンス鎖の5’末端に8-Br-dAを有する、ルシフェラーゼ標的siRNAのRNAi活性を、以下に示したようにルシフェラーゼ発光抑制レベルを指標に評価した。
培養ディッシュ(コスター (Costar)社製アッセイプレート, 96ウェル, 蓋つき、型番3917)で、ルシフェラーゼ発現ベクター(pGL4.50 [luc2/CMV/Hygro] Vector、プロメガ (Promega)社)を導入したヒト子宮頸がん由来細胞株ヒーラ (Hela)細胞(CCL-2、ATCCより購入)を、10%ウシ胎仔血清を含むアールピーエムアイ(RPMI)培地(インビトロジェン (Invitrogen Life technologies)、11875093)中に懸濁し、1ウェルあたり5000細胞数となるように50μLの細胞懸濁液を各ウェルに播種した。【０１６３】
siRNAをオプティ-MEM(OPTI-MEM)(インビトロジェン (Invitrogen Life technologies)、31985-070)で希釈した。リポフェクタミンRNAi マックス (lipofectamine RNAiMAX、インビトロジェン(Invitrogen Life technologies)、13778-075)をオプティ-MEM(OPTI-MEM)で希釈した。調製したそれぞれの希釈液を混合し、siRNAとリポフェクタミンRNAi マックス複合体を形成させた。細胞懸濁液を含む各ウェルに、調製したsiRNA-ポフェクタミンRNAi マックス(インビトロジェン(Invitrogen Life technologies)、13778-075)複合体溶液を10μL添加することでsiRNAをヒーラ (Hela)細胞に導入した。siRNAの最終濃度は100 pmol/Lの1点、または3.2 pmol/L、16 pmol/L、80 pmol/L及び400 pmol/Lの4点とし、N=6で設定した。また陰性対照群としてリポフェクタミンRNAi マックスのみを添加した細胞を播種した。また、比較のために、各siRNAの8-Br-dAに相当する位置にアデノシン一リン酸を有するsiRNA(それぞれ239-A、874-A、904-A、1084-A、1203-A及び1556-Aという、表9)についても同様に試験を行った。さらに、874-BrdAの8-Br-dAに相当する位置にグアノシン一リン酸、シチジン一リン酸またはウリジン一リン酸を有するsiRNA(874-G、874-C及び874-Uという、表10)についても同様に試験を行った。【０１６４】
【表９】
2014034934.tif 000072
【０１６５】
【表１０】
2014034934.tif 000073
【０１６６】
siRNA導入後の細胞は、37 ℃、5%CO2条件下で24時間培養した。
培養後の細胞に対して市販ルシフェラーゼ定量試薬であるステディーグロルシフェラーゼアッセイシステム (Steady-Glo Luciferase Assay System、プロメガ(Promega)、 E2520)を、添付のプロトコルに則り各ウェルに40μL添加した。10分間のインキュベーション後、ARVO (パーキンエルマー (PerkinElmer))でプロトコルに則り、各ウェルの1秒あたり発光量(cps)を測定した。
ルシフェラーゼ標的siRNA処理群の発光量と同時に、陰性対照群の発光量も測定することでsiRNA導入検体のRNAi効果を、siRNA未導入群(陰性対照群)における発光量を1としたときの相対的な割合として表した。【０１６７】
本試験の結果を図1及び図2に示す。図1は、最終濃度100 pmol/Lにおける、本発明のsiRNAとその配列中の8-Br-dAに相当する位置にアデノシン一リン酸を有するsiRNAとの比較を示す図である。図2は、最終濃度3.2 pmol/L、16 pmol/L、80 pmol/L及び400 pmol/Lにおける、本発明のsiRNAである874-BrdAと、その配列中の8-Br-dAに相当する位置にアデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、シチジン一リン酸またはウリジン一リン酸を有する874-A、874-G、874-C及び874-Uとの比較を示す図である(図1及び2において、縦軸は陰性対照群の発光量を1とした場合の発光比率である)。なお、クラスカル-ウォリス検定 (Kruskal-Wallis test)により有意差の有無を判断した。統計解析には、統計解析ソフトサス (SAS、リリース 9.2、サスインスティチュート (SAS Institute Inc.))を用いた。表11に、239-BrdA、874-BrdA、904-BrdA、1084-BrdA、1203-BrdA及び1556-BrdAによる発光抑制率を、それぞれ239-A、874-A、904-A、1084-A、1203-A及び1556-Aによる発光抑制率と比較した有意差検定の結果を示す。いずれも0.05以下のp値を示し、アデノシン一リン酸を8-Br-dAに置換したsiRNAでは、発光抑制率が有意に向上したことがわかる。【０１６８】
【表１１】
2014034934.tif 000074
【０１６９】
試験例2:ルシフェラーゼ標的siRNAのRNAi活性
実施例1で得られたアンチセンス鎖の5’末端に8-Br-dAを有する、ルシフェラーゼ標的siRNAのRNAi活性を、以下に示したようにルシフェラーゼ  ジーエルフォー メッセンジャーRNA (Luciferase GL4 mRNA)(ジェンバンク  アクセッション番号 EU921840)の発現抑制効果を測定して評価した。
培養ディッシュ(ヌンク (Nunc)社製マルチディッシュ 24ウェル、型番142475)で、ヒト子宮頸がん由来細胞株ヒーラ細胞(CCL-2、ATCCより購入)を10%ウシ胎仔血清を含むアールピーエムアイ(RPMI)培地(インビトロジェン(Invitrogen Life technologies)、11875093)中に懸濁し、1ウェルあたり50000細胞数となるように500μLの細胞懸濁液を各ウェルに播種した。そこに、オプティ-MEM(OPTI-MEM)(インビトロジェン(Invitrogen Life technologies)、31985-070)中で混合したsiRNA-リポフェクタミン RNAiマックス(インビトロジェン(Invitrogen Life technologies)、13778-075)複合体溶液を100μL添加することでsiRNAをヒーラ (Hela)細胞に導入した。siRNAの最終濃度は10000 pmol/L、2000 pmol/L、400 pmol/L、80 pmol/L、16 pmol/L、3.2 pmol/L、0.64 pmol/Lの7点とした。また陰性対照群としてリポフェクタミンRNAi マックスのみを添加した細胞を播種した。
siRNA導入後の細胞は、37 ℃、5%CO2条件下で24時間培養した。RNAの回収にはキアゲン (QIAGEN)社RNA抽出キット(アールエヌイージー（RNeasy）、74106)を用い、培養後の細胞をリン酸緩衝液で1回洗浄した後、細胞をRNeasyキット添付のRLT バッファー(アールエヌイージー（RNeasy）添付)に溶解して回収し、キットに添付された説明書に従って全RNAを回収した。全RNA 1 μgを鋳型として、トランスクリプターファーストストランドcDNA合成キット (Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(ロシュ (Roche)社4897030001)を用いて逆転写反応を行い、cDNAを作成した。このcDNAをPCR反応の鋳型に用い、ABI7900HT Fast(アプライドバイオシステムズ (ABI)社)を用いたタックマンプローブ (Taqman probe)法によりGL4 (ジェンバンク  アクセッション番号 EU921840)遺伝子及び対照としてD-グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵 (D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、GAPDH、ジェンバンク  アクセッション番号 NM_001256799)をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、GAPDHのmRNA増幅量を内部対照として、GL4のmRNAの準定量値を算出した。GAPDHの測定には、タックマンプローブHs99999905 m1(アプライドバイオシステムズ (ABI)社)を用いた。GL4の測定には、ユニバーサルプローブライブラリーのプローブ#20(ロシュ社 (Roche) 04686934001)及び、増幅プライマーとして、配列番号63で表される塩基配列を有するDNA(フォワードプライマー)、配列番号64で表される塩基配列を有するDNA(リバースプライマー)を用いた。また、陰性対照群における、GL4のmRNA量及びGAPDHのmRNA増幅量を同様にそれぞれ測定し、GAPDHのmRNA増幅量を内部対照として、GL4のmRNAの準定量値を算出した。
siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群(陰性対照群)における、GL4のmRNA量を1としたときの相対的な割合として表した。
IC50値はロジット法により算出した。統計解析は統計解析ソフトサス
(SAS、リリース 9.2、サスインスティチュート (SAS Institute Inc.))を用いて行った。
表12に、本発明のsiRNAである874-BrdAと、比較として、その配列中の8-Br-dAに相当する位置にアデノシン一リン酸またはウリジン一リン酸を有する874-A及び874-UのIC50値を示す。【０１７０】
【表１２】
2014034934.tif 000075
【０１７１】
試験例1及び2の結果から、アンチセンス鎖の5’末端に8-Br-dAを有するsiRNA(874-BrdA)は、アンチセンス鎖の5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、ルシフェラーゼ発現に対して高いノックダウン活性を示すことが分かる。
【実施例２】
【０１７２】
表13に示すアンチセンス鎖の5’末端に8-オキソ-2’-デオキシアデノシン一リン酸を有する、ルシフェラーゼ標的siRNA(874-8-oxo-dAという、アンチセンス鎖の配列に含まれるXは、8-オキソ-2’-デオキシアデノシン一リン酸を意味する)を、市販の8-オキソ-dA-CE ホスホロアミダイトを用いて、実施例1と同様に合成して得た。
【実施例３】
【０１７３】
表13に示すアンチセンス鎖の5’末端に5-ブロモ-2’-デオキシウリジン一リン酸を有するsiRNA(874-5-Br-dUという、アンチセンス鎖の配列に含まれるXは、5-ブロモ-2’-デオキシウリジン一リン酸を意味する)を、市販の5-Br-dU-CE ホスホロアミダイトを用いて、実施例1と同様に合成して得た。
【実施例４】
【０１７４】
表13に示すアンチセンス鎖の5’末端に5-フルオロ-2’-デオキシウリジン一リン酸を有するsiRNA(454-5-F-dUおよび1556-5-F-dUという、アンチセンス鎖の配列に含まれるXは、5-フルオロ-2’-デオキシウリジン一リン酸を意味する)を、市販の5-F-dU-CEホスホロアミダイトを用いて、実施例1と同様に合成して得た。
MALDI-TOF/MS 
454-5-F-dU(アンチセンス鎖)
理論値 6668.85(M-H) 実測値 6673.35
1556-5-F-dU(アンチセンス鎖)
理論値 6669.03(M-H) 実測値 6671.33【０１７５】
【表１３】
2014034934.tif 000076
【０１７６】
試験例3:ルシフェラーゼ標的siRNAのRNAi活性
実施例4で得られたルシフェラーゼ標的siRNA(表13、Xの位置に5-F-dUを有する) のRNAi活性を、試験例2と同様に測定して評価した。それぞれアンチセンス鎖の5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNA(表14)と比較した。
表15に、それぞれのIC50値を示す。【０１７７】
【表１４】
2014034934.tif 000077
【０１７８】
【表１５】
2014034934.tif 000078
【０１７９】
試験例3の結果から、アンチセンス鎖の5’末端に5-フルオロ-2’-デオキシウリジン一リン酸を有するsiRNA(454-5-F-dU及び1556-5-F-dU)は、それぞれアンチセンス鎖の5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、ルシフェラーゼ発現に対して高いノックダウン活性を示すことが分かる。
【実施例５】
【０１８０】
表16に示すアンチセンス鎖の5’末端に8-オキソ-2’-デオキシアデノシン一リン酸を有する、D-グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、GAPDH)標的siRNA(アンチセンス鎖の配列に含まれるXは、8-オキソ-2’-デオキシアデノシン一リン酸を意味する)を、実施例1と同様に合成して得た。【０１８１】
【表１６】
2014034934.tif 000079
【０１８２】
試験例4: D-グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、GAPDH)標的siRNAのRNAi活性
アンチセンス鎖の5’末端に8-Br-dAを有する、GAPDH標的siRNAのRNAi活性を、以下に示したようにGAPDH mRNAの発現抑制効果を測定して評価した。
培養ディッシュ(ヌンク (Nunc)社製マルチディッシュ 24ウェル、型番142475)で、ヒト子宮頸がん由来細胞株ヒーラ (Hela)細胞(CCL-2、ATCCより購入)を10%ウシ胎仔血清を含むアールピーエムアイ(RPMI)培地(インビトロジェン (Invitrogen Life technologies)、11875093)中に懸濁し、1ウェルあたり50000細胞数となるように500μLの細胞懸濁液を各ウェルに播種した。そこに、オプティ-MEM(OPTI-MEM)(インビトロジェン (Invitrogen Life technologies)31985-070)中で混合したsiRNA-リポフェクタミンRNAiマックス (Lipofectamine RNAiMAX、インビトロジェン13778-075)複合体溶液を100μL添加することでsiRNAをヒーラ (Hela)細胞に導入した。siRNAの最終濃度は100 pmol/Lの1点とした。また陰性対照の群としてリポフェクタミンRNAi マックスのみを添加した細胞を播種した。
siRNA導入後の細胞は、37 ℃、5%CO2条件下で24時間培養した。RNAの回収はキアゲン社RNA抽出キット(アールエヌイージー（RNeasy） 74106)を用い、培養後の細胞はリン酸バッファーで1回洗浄した後、細胞をRNeasyキット添付のRLT バッファー(アールエヌイージー（RNeasy）添付)に溶解して回収し、キットに添付された説明書に従って全RNAを回収した。全RNA 1μgを鋳型として、トランスクリプターファーストストランドcDNA合成キット (Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、ロシュ社  、4897030001)を用いて逆転写反応を行い、cDNAを作成した。このcDNAをPCR反応の鋳型に用い、ABI7900HT Fast(ABI社)を用いたタックマンプローブ法によりGADPH遺伝子及び対照としてペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（PPIB）(pepytidyl-prolyl cis-trans isomerase B)遺伝子 (ジェンバンク  アクセッション番号NM_000942)をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、PPIBのmRNA増幅量を内部対照として、GAPDHのmRNAの準定量値を算出した。GAPDHの測定には、タックマンプローブHs99999905 m1(アプライドバイオシステムズ (ABI)社)、PPIBの測定には、Hs01018502 m1(アプライドバイオシステムズ (ABI)社)を用いた。また、陰性対照の群における、GAPDHのmRNA量及びPPIBのmRNA増幅量を同様にそれぞれ測定し、PPIBのmRNA増幅量を内部対照として、GAPDHのmRNAの準定量値を算出した。
siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群(陰性対照群)における、GAPDHのmRNA量を1としたときの相対的な割合として表した。
また、比較のために、各siRNAの8-Br-dAに相当する位置にアデノシン一リン酸を有するsiRNA(表17)についても同様に試験を行った。
本試験の結果を表18および図3に示す。【０１８３】
【表１７】
2014034934.tif 000080
【０１８４】
【表１８】
2014034934.tif 000081
【０１８５】
試験例4の結果から、アンチセンス鎖の5’末端に8-Br-dAを有するD-グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、GAPDH)標的siRNAは、アンチセンス鎖の5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、GAPDHの発現に対して高いノックダウン活性を示すことが分かる。
【実施例６】
【０１８６】
表19に示すアンチセンス鎖の5’末端に5-フルオロ-2’-デオキシウリジン一リン酸を有する、D-グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、GAPDH)標的siRNA(アンチセンス鎖の配列に含まれるXは、5-フルオロ-2’-デオキシウリジン一リン酸を意味する)を用いて、実施例1と同様に合成して得た。
MALDI-TOF/MS 
1096-5-F-dU(アンチセンス鎖)
理論値 6801.03(M-H) 実測値 6797.74【０１８７】
【表１９】
2014034934.tif 000082
【０１８８】
試験例 5 D-グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、GAPDH)標的siRNAのRNAi活性
実施例6で得られたGAPDDH標的siRNAの活性を、試験例4と同様にGAPDH mRNAの発現抑制効果を測定して評価した。
siRNA導入検体の標的mRNA量は、siRNA未導入群(陰性対照群)における、GAPDHのmRNA量を1としたときの相対的な割合として表した。GAPDHのmRNA量は、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1、HPRT1、ジェンバンク  アクセッション番号NM_000194)のmRNA増幅量を内部対照として、算出した。HPRT1の測定には、タックマンプローブHs99999909_m1(アプライドバイオシステムズ (ABI)社)を用いた。
また、比較のために、各siRNAのアンチセンス5’末端にウラシル一リン酸、アデノシン一リン酸またはグアニン一リン酸を有するsiRNA(表19)についても同様に試験を行った。
本試験の結果を表20に示す。【０１８９】
【表２０】
2014034934.tif 000083
【０１９０】
試験例5の結果から、アンチセンス鎖の5’末端に5-フルオロ-2’-デオキシウリジン一リン酸を有するD-グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、GAPDH)標的siRNAは、アンチセンス鎖の5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、GAPDHの発現に対して高いノックダウン活性を示すことが分かる。【０１９１】
参考例1.0; 化合物I-5
工程1
市販の6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(220 mg、0.991 mmol)、1-O-アセチル-2,3,5-トリ-O-ベンゾイル-β-D-リボフラノース(500 mg、0.991 mmol)をアセトニトリル(5 mL)に溶解し、N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(0.735 mL、2.97 mmol)を加えて60℃で20分間攪拌した。反応液を室温に冷却後、メタンスルホニルトリメチルシリル(0.627 mL、3.47 mmol) を加えて60℃で1時間攪拌した。反応液を室温に冷却後、飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去して得られた残渣をヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、(2R,3R,4R,5R)-2-((ベンゾイルオキシ)メチル)-5-(6,7-ジメトキシ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ジベンゾエート(599 mg、収率91 %)を得た。
工程2
工程1で得られた(2R,3R,4R,5R)-2-((ベンゾイルオキシ)メチル)-5-(6,7-ジメトキシ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ジベンゾエート(599 mg、0.899 mmol)をメタノール(9 mL)に溶解し、メチルアミン/メタノール溶液(4.58 mL、44.9 mmol)を加えて室温で終夜攪拌した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣にジエチルエーテルを加え、析出物を濾取することにより、1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(312 mg、収率98 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 353(M-1) 
工程3
工程2で得られた1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(310 mg、0.875 mmol)をアセトン(15 mL)に懸濁し、2,2-ジメトキシプロパン(0.536 mL, 4.37 mmol)、4-トルエンスルホン酸 一水和物(183 mg、0.962 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。反応液に飽和重曹水を加えた後、溶媒量が約半分になるまで減圧下で溶媒を留去し、得られた残渣をクロロホルム/メタノール系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、 1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(315 mg、収率91 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 395(M+1) 
工程4
工程3で得られた1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(310 mg、0.786 mmol)をジクロロメタン(8 mL)に溶解し、1H-テトラゾール(138 mg、1.97 mmol)、ジ-tert-ブチル ジイソプロピルホスホールアミド(0.522 mL、1.57 mmol)を加え、室温で5時間攪拌した。反応液を0℃に冷却し、m-クロロ過安息香酸(452 mg、1.97 mmol)を加え、0℃でさらに20分間攪拌した。反応液に飽和重曹水を加え、クロロホルムで抽出した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去することにより得られた残渣をヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6,7-ジメトキシ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(259 mg、収率56 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 587(M+1)
工程5
工程4で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6,7-ジメトキシ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(77.5 mg、0.132 mmol)をトリフルオロ酢酸/水(1:1)(2 mL)に溶解し、室温で2時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去した後、酢酸-トリエチルアミン緩衝液(pH 6.5)(2mL)を加え、再度減圧下、溶媒を留去した。得られた残渣をエタノールに溶解し、酢酸エチルを加え、析出物を濾取することにより、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6,7-ジメトキシ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-5) トリエチルアンモニウム塩(64.9 mg、収率92 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 7.43(s, 1H), 6.91(s, 1H), 6.08(d, J= 4.0 Hz, 1H), 4.77 - 4.58(m, 1H), 4.38(t, J= 7.3 Hz, 1H), 4.04 - 4.02(m, 3H), 3.90(s, 3H), 3.81(s, 3H), 3.08(q, J= 7.3 Hz, 6H), 1.16(t, J= 7.3 Hz, 9H).
ESI-MS(m/z): 435(M+1)【０１９２】
参考例1.1; 化合物am-1
工程1
参考例1.0の工程2で得られる1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(812 mg、2.29 mmol)をDMF(10.0 mL)に溶解し、氷冷下ビス(トリフルオロメタンスルホン酸)ジ-tert-ブチルシリル(1.00 mL、2.75 mmol)を加えた後、氷冷下6時間攪拌した。反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル/ヘプタン系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、1-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-ヒドロキシテトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル]-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(1.08 g、95.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 493(M-1)
工程2
工程1で得られた1-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-ヒドロキシテトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(1.73 mg、3.50 mmol)をDMF(18.0 mL)に溶解し、イミダゾール(1.19 g、17.5 mmol)、tert-ブチルジメチルシリルクロリド(791 mg、5.25 mmol)を加えた後、60 ℃で3時間攪拌した。反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル/ヘプタン系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(1.95 g、92.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 607(M-1)
工程3
工程2で得られた1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(500 mg、0.821 mmol)をジクロロメタン(8.00 mL)に溶解し、氷冷下ピリジン(0.531 mL、6.57 mmol)、フッ化水素-ピリジン(0.423 mL, 3.28 mmol)を加え、氷冷下1時間攪拌した。反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル/ヘプタン系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、1-((2R,3R,4R,5R)-3-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(336 mg、87.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 467(M-1)
工程4
工程3で得られた1-((2R,3R,4R,5R)-3-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-4-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(85.0 mg, 0.181 mmol)をピリジン(2.00 mL)に溶解し、p,p'-ジメトキシトリチルクロリド(184 mg、0.544 mmol)、4-ジメチルアミノピリジン(4.43 mg、0.0360 mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル/ヘプタン系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、1-((2R,3R,4R,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-3-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(138 mg、99.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 769(M-1)
工程5
工程4で得られた1-((2R,3R,4R,5R)-5-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-3-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)-6,7-ジメトキシキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン(74.0 mg、 0.0960 mmol)をTHF(2.00 mL)に溶解し、氷冷下ジイソプロピルアミン(0.084 mL, 0.480 mmol)、クロロ(ジイソプロピルアミノ)亜ホスフィン酸2-シアノエチル(0.043 mL、0.192 mmol)を加えた後、室温で3時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣を酢酸エチル/ヘプタン系のアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製後、さらに酢酸エチル/ヘプタン系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6,7-ジメトキシ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-1、63.0 mg、 67.6 %)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 300MHz) δ: 7.94(1H, brs), 7.55(1H, s), 7.47-7.39(2H, m), 7.38-7.12(7H, m), 6.93(1H, s), 6.81-6.70(4H, m), 5.92(1H, d, J= 4.8 Hz), 5.18-5.08(1H, m), 4.53-4.38(1H, m), 4.37-4.26(1H, m), 3.96-3.48(16H, m), 3.46-3.23(1H, m), 2.68-2.52(1H, m), 2.35-2.27(1H, m), 1.20-1.00(1H, m), 0.83, 0.81(9H, 2 s), 0.05, 0.03, -0.10, -0.09(6H, 4 s).
ESI-MS(m/z): 971(M+1)
【実施例７】
【０１９３】
後述の表24に示す454-Xuのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-5を有するsiRNAを、参考例1.1で得られる化合物am-1を用いて、実施例1と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖)：理論値 6776.96(M-H) 実測値 6776.21【０１９４】
参考例2.0; 化合物I-6
市販の6-クロロキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.0と同様にしてリン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-クロロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-6)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 7.88(d, J= 1.8 Hz, 1H), 7.64(dd, J= 9.2, 2.6 Hz, 1H), 7.58(d, J= 9.2 Hz, 1H), 6.14(d, J= 5.5 Hz, 1H), 4.70-4.68(m, 1H), 4.37(t, J= 5.9 Hz, 1H), 4.09-4.02(m, 3H).
ESI-MS(m/z): 409(M+1)【０１９５】
参考例2.1:化合物am-2
市販の6-クロロキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-クロロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-2)を得る。
【実施例８】
【０１９６】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-6を有するsiRNAを、参考例2.1で得られる化合物am-2を用いて、実施例1と同様に合成する。【０１９７】
参考例3.0; 化合物I-7
市販の7-クロロキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.0と同様にしてリン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(7-クロロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-7)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 7.95(d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.61(s, 1H), 7.30(d, J= 8.4 Hz, 1H), 5.99(d, J= 4.4 Hz, 1H), 4.79(t, J= 5.3 Hz, 1H), 4.38(t, J= 6.4 Hz, 1H), 4.04-3.92(m, 3H).
ESI-MS(m/z): 409(M+1)【０１９８】
参考例3.1:化合物am-3
市販の7-クロロキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(7-クロロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-3)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 500MHz) δ: 8.11(d, J= 8.5 Hz, 1H), 7.67(7.63)(d, J= 1.7 Hz, 1H), 7.45-6.76(m, 14H), 6.02(m, 1H), 5.12(5.07)(m, 1H), 4.45(m, 1H), 4.32(4.28)(m, 1H), 3.97-3.25(m, 12H), 2.70-2.23(m, 2H), 1.21-1.01(m, 12H), 0.80(0.82)(s, 9H), 0.03(0.05)(s, 3H), -0.12(s, 3H).
【実施例９】
【０１９９】
後述の表24に示す454-Xuのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-7を有するsiRNAを、参考例3.1で得られる化合物am-3を用いて、実施例1と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖)： 理論値 6751.35(M-H) 実測値 6751.83【０２００】
参考例4.0; 化合物I-8
市販の5-クロロキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.0と同様にしてリン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(5-クロロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-8)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 7.66(d, J= 4.8 Hz, 2H), 7.40(t, J= 4.4 Hz, 1H), 6.21(d, J= 5.5 Hz, 1H), 4.80(t, J= 5.9 Hz, 1H), 4.45(t, J= 5.9 Hz, 1H), 4.09(dd, J= 14.5, 7.1 Hz, 3H).
ESI-MS(m/z): 409(M+1)【０２０１】
参考例4.1:化合物am-4
市販の5-クロロキナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(5-クロロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-4)を得る。
【実施例１０】
【０２０２】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-8を有するsiRNAを、参考例4.1で得られる化合物am-4を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２０３】
参考例5.0; 化合物I-9
市販のチエノ[3,2-d]ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.0と同様にしてリン酸(2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロチエノ[3,2-d]ピリミジン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-9) トリエチルアンモニウム塩を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 7.96(d, J= 5.5 Hz, 1H), 7.45(d, J= 4.8 Hz, 1H), 6.14(d, J= 6.2 Hz, 1H), 4.73-4.56(m, 1H), 4.35(t, J= 5.7 Hz, 1H), 4.09(brs, 1H), 4.02(t, J= 4.8 Hz, 2H), 3.07(q, J= 7.3 Hz, 6H), 1.15(t, J= 7.3 Hz, 9H).
ESI-MS(m/z): 381(M+1)【０２０４】
参考例5.1:化合物am-5
市販のチエノ[3,2-d]ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロチエノ[3,2-d]ピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-5)を得る。
【実施例１１】
【０２０５】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-9を有するsiRNAを、参考例5.1で得られる化合物am-5を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２０６】
参考例6.0; 化合物I-10
工程1
公知の方法[ジャーナル・オブ・メディシナルケミストリー(J.Med.Chem.)、2012年,55巻,1478-1489頁]に記載された方法で合成した(2R,3R,4R,5R)-2-(アセトキシメチル)-5-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ジアセテート(10.9 g、26.4 mmol)から、公知の方法[ジャーナル・オブ・オーガニックケミストリー(J.Org.Chem.)、2002年、67巻、6788-6796頁]に記載された方法で(2R,3R,4S,5R)-2-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(5.47 g、収率72 %)を得た。
(2R,3R,4S,5R)-2-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(5.48 g、19.1 mmol)をアセトン(200 mL)に懸濁し、2,2-ジメトキシプロパン(11.7 mL、95.5 mmol)、4-トルエンスルホン酸  一水和物(9.09 g、47.8 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。反応液に飽和重曹水を加えた後、溶媒量が約半分になるまで減圧下で溶媒を留去した。クロロホルムを加え抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去して得られた残渣をヘプタン/酢酸エチル系のシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(5.17 g、収率83 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 327(M+1)
工程2
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(150 mg、0.459 mmol)、(E)-スチリルボロン酸(136 mg、0.918 mmol)、1,1′-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン-パラジウム(II)ジクロリド-ジクロロメタン錯体(37.5 mg、0.031 mmol)、炭酸セシウム(449 mg、1.38 mmol)に1,4-ジオキサン(2 mL)、水(1滴)を加え、窒素雰囲気下、80℃で3時間攪拌した。反応液を室温に冷却後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去して得られた残渣をヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(90.1 mg、収率50 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 395(M+1)
工程3
工程2で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-スチリル-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(90 mg、0.228 mmolをジクロロメタン(2 mL)に溶解し、1H-テトラゾール(32.0 mg,、0.456 mmol)、ジ-tert-ブチル ジイソプロピルホスホールアミド(0.144 mL、0.456 mmol)を加えて、0℃で2時間攪拌した。反応液に、m-クロロ過安息香酸(141 mg、0.612 mmol)を加えて0℃で15分間攪拌した。反応液に飽和重曹水と飽和食塩水を加え、クロロホルムで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去して得られた残渣をヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-スチリル-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(E/Z幾何異性体混合物、73.2 mg、収率55 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 587(M+1)
工程4
工程3で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-スチリル-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(73.0 mg、0.124 mmol)をトリフルオロ酢酸/水(1:1)(2 mL)に溶解し、室温で2時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣に酢酸-酢酸アンモニウム緩衝液(pH 5.7)を加えた後、分取HPLC(溶離液 0.01mmol/L 酢酸アンモニウム水溶液/メタノール系)にて精製することにより得られた粗精製物に2-プロパノールを加え、析出物を濾取することにより、リン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-10、21.3 mg、収率39 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.50(s, 1H), 8.42(s, 1H), 7.58(d, J= 15.6 Hz, 1H), 7.19 - 7.13(m, 2H), 7.08 - 6.97(m, 4H), 5.92(d, J= 4.9 Hz, 1H), 4.60 - 4.55(m, 1H), 4.38 - 4.34(m, 1H), 4.28 - 4.23(m, 1H), 4.10 - 3.97(m, 2H).
ESI-MS(m/z): 435(M+1)【０２０７】
参考例6.1:化合物am-6
工程1
参考例6.0の工程2で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソ-4-イル)メタノール(100 mg)にトリフルオロ酢酸/水(1:1)(2 mL)を加え、室温で2時間攪拌し、減圧下で溶媒を留去することにより(2R,3S,4R,5R)-2-(ヒドロキシメチル)-5-(6-((E)スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール トリフルオロ酢酸塩を得る。
工程2
工程1で得られる(2R,3S,4R,5R)-2-(ヒドロキシメチル)-5-6-((E)スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール トリフルオロ酢酸塩を用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-((E)スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-6)を得る。
【実施例１２】
【０２０８】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-10を有するsiRNAを、参考例6.1で得られる化合物am-6を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２０９】
参考例7.0; 化合物I-11
工程1
公知の方法[ジャーナル・オブ・メディシナルケミストリー(J.Med.Chem.)、2012年,55巻,1478-1489頁]に記載された方法で合成した(2R,3R,4R,5R)-2-(アセトキシメチル)-5-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ジアセテート(2.00 g、4.85 mmol)をTHF(15 mL)に溶解し、ジメチルアミン 塩酸塩(1.19 g、14.5 mmol)とトリエチルアミン(2.70 mL、19.38 mL)を加え、封管中、60℃で終夜攪拌した。反応液にジメチルアミン 塩酸塩(1.19 g、14.5 mmol)とトリエチルアミン(2.70 mL、19.38 mL)を加え、60℃でさらに終夜攪拌した。水を加えクロロホルムで抽出した後、減圧濃縮することにより(2R,3R,4R,5R)-2-(アセトキシメチル)-5-(6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ジアセテート(2.2 g、収率 108 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 422(M+1)
工程2
工程1で得られた(2R,3R,4R,5R)-2-(アセトキシメチル)-5-(6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルジアセテート(2.00 g、4.75 mmol)に7.0 mol/L アンモニア/メタノール溶液(33.9 mL)を加え、室温で終夜攪拌した。減圧下で溶媒を留去して得られた残渣にエーテル/酢酸エチル混合液を加え、不溶物を濾取することにより(2R,3R,4S,5R)-2-(6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(1.2 g、収率86 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 296(M+1)
工程3
工程2で得られた(2R,3R,4S,5R)-2-(6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(1.2 g、4.06 mmol)を0.5M 酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(pH 4.0)(40 mL)に懸濁し、臭素水(55.8 mL)を加え、室温で4時間攪拌した。反応液に、臭素の色が消えるまで硫酸水素ナトリウムを加え、炭酸ナトリウムで中和した。減圧下で溶媒量が約半分になるまで溶媒を留去し、不溶物を濾取した後、水、アセトンで順に洗浄し、減圧下で乾燥することにより(2R,3R,4S,5R)-2-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(1.09 g、収率72 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 374(M+1)
工程4
工程3で得られた(2R,3R,4S,5R)-2-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(2.90 g、7.75 mmol)をアセトン(39 mL)に懸濁し、2,2-ジメトキシプロパン(4.75 mL,38.8 mmol)、4-トルエンスルホン酸  一水和物(1.62 g、38.8 mmol)を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に飽和重曹水と飽和食塩水を加えた後、溶媒量が約半分になるまで減圧下で溶媒を留去した。クロロホルムを加え抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、クロロホルムで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去することにより、((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(1.96 g、収率61 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 414(M+1)
工程5
工程4で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(200 mg、0.483 mmol)をジクロロメタン(2 mL)に溶解し、1H-テトラゾール(84.6 mg、1.21 mmol)、ジ-tert-ブチル ジイソプロピルホスホールアミド(0.321 mL、0.966 mmol)を加え、室温で0.5時間攪拌した。反応液を0℃に冷却し、m-クロロ過安息香酸(222 mg、0.966 mmol)を加え、0℃でさらに15分間攪拌した。反応液に飽和重曹水、飽和食塩水を加え、クロロホルムで抽出した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去することにより得られた残渣をヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、リン酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル ジ-tert-ブチル(209 mg、収率71 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 606(M+1)
工程6
工程5で得られたリン酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル ジ-tert-ブチル(50.0 mg、0.082 mol)をトリフルオロ酢酸/水(1:1)(2 mL)に溶解し、室温で3時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣に酢酸-酢酸アンモニウム緩衝液(pH 5.7)を加えた後、分取HPLC(溶離液 0.01mmol/L 酢酸アンモニウム水溶液/メタノール系)にて精製することにより得られた粗精製物にエタノールを加え、析出物を濾取することにより、リン酸((2R,3S,4R,5R)-6-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシトトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-11、26.2 mg、収率70 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.06 - 7.92(m, 1H), 5.98 - 5.93(m, 1H), 5.15 - 5.07(m, 1H), 4.43(dd, J= 5.9, 5.9 Hz, 1H), 4.09(dd, J= 9.8, 4.9 Hz, 1H), 3.99 - 3.91(m, 1H), 3.90 - 3.82(m, 1H), 3.30 - 3.12(m, 6H).
ESI-MS(m/z): 454(M+1)【０２１０】
参考例7.1:化合物am-7
参考例7.0の工程3で得られる(2R,3R,4S,5R)-2-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオールを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-7)を得る。
【実施例１３】
【０２１１】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-11を有するsiRNAを、参考例7.1で得られる化合物am-7を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２１２】
参考例8.0; 化合物I-12
工程1
参考例7.0の工程5で得られるリン酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル ジ-tert-ブチル(100 mg、0.165 mmol)をDMF(1.5 mL)に溶解し、テトラエチルアンモニウム シアニド(129 mg、0.824 mmol)を加え、100℃で2時間攪拌した。反応液を室温に冷却後、飽和食塩水を加え、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣を、ヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、リン酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-シアノ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル ジ-tert-ブチル(52.6 mg、58 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 558(M+1)
工程2
工程2で得られるリン酸((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-シアノ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル ジ-tert-ブチル(80.0 mg、0.145 mmol)をトリフルオロ酢酸/水(1:1)(4 mL)に溶解し、室温で3時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣を、分取HPLC(溶離液0.01mmol/L トリフルオロ酢酸水溶液/アセトニトリル系)にて精製した粗精製物にエタノールを加え、析出物を濾取することにより、リン酸((2R,3S,4R,5R)-6-(8-シアノ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシトトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-12、8.4 mg、収率15 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.05(s, 1H), 5.97(d, J= 5.9 Hz, 1H), 4.95 - 4.53(m, 1H), 4.37 - 4.29(m, 1H), 4.24 - 4.15(m, 1H), 4.06 - 3.93(m, 2H), 3.66 - 2.83(m, 6H).
ESI-MS(m/z): 401(M+1)【０２１３】
参考例8.1:化合物am-8
工程1〜2
参考例7.0の工程3で得られる(2R,3R,4S,5R)-2-(8-ブロモ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオールを用い、参考例1.1の工程1〜2と同様にして、8-ブロモ-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-N,N-ジメチル-9H-プリン-6-アミンを得た。
ESI-MS(m/z): 628(M+1)
工程3 
工程2で得られた8-ブロモ-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-N,N-ジメチル-9H-プリン-6-アミン(10.0 mg, 0.0160 mmol)をDMF(1.00 mL)に溶解し、シアン化ナトリウム(7,79 mg, 0.159 mmol)、フッ化セシウム(7.25 mg, 0.0480 mmol) を加え、100 ℃で4時間撹拌した。反応液に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去して得られた残渣をヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-8-カルボニトリル(8.00 mg、収率44.8 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 575(M+1)
工程4〜6
工程3で得られた9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-8-カルボニトリルを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(8-シアノ-6-(ジメチルアミノ)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル (2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-8)を得る。
【実施例１４】
【０２１４】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-12を有するsiRNAを、参考例8.1で得られる化合物am-8を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２１５】
参考例9.0; 化合物I-13
市販の1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-ヨードピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン(866 mg、2.34 mmol)を用い、参考例1.0の工程3〜5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R) -5-(6-ヨード-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル トリエチルアミン(化合物I-13)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 6.52(s, 1H), 5.92(d, J= 3.3 Hz, 1H), 4.69 - 4.60(m, 1H), 4.33(t, J= 6.8 Hz, 1H), 4.02 - 3.86(m, 3H), 3.07(q, J= 7.3 Hz, 6H), 1.15(t, J= 7.3 Hz, 9H).
ESI-MS(m/z): 451(M+1)【０２１６】
参考例9.1:化合物am-9
市販の1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-ヨードピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-ヨード-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-9)を得る。
【実施例１５】
【０２１７】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-13を有するsiRNAを、参考例9.1で得られる化合物am-9を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２１８】
参考例10.0; 化合物I-14
工程1
市販の5-ブロモ-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン(3.34 g、10.3 mmol)を用い、参考例1.0の工程3と同様にして、5-ブロモ-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン(2.58 g、収率 69%)を得た。
ESI-MS(m/z): 363(M+1)
工程2
工程1で得られた5-ブロモ-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン(200 mg、0.551 mmol)、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(63.6 mg、0.055 mmol)を1,4-ジオキサンに溶解し、トリブチル(2-ピリジル)スズ(0.62 mL、1.93 mmol)を加えて110℃で終夜攪拌した。反応液を室温に冷却後、飽和重曹水を加え、Presep(登録商標; けいそう土、顆粒状タイプM, 4.5g/25mL)を通してろ過し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をクロロホルム/メタノール系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-5-(ピリジン-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン(45.2 mg、収率23 %)を得た。
ESI-MS(m/z)： 362(M+1)
工程3〜4
工程2で得られた1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-5-(ピリジン-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用いて参考例1.0の工程4〜5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-ジオキソ-5-(ピリジン-2-イル)-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-14)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.66(s, 1H), 8.56(d, J= 5.5 Hz, 1H), 8.40(t, J= 7.9 Hz, 1H), 8.20(d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.77(t, J= 6.8 Hz, 1H), 5.92(d, J= 4.0 Hz, 1H), 4.35(t, J= 4.2 Hz, 1H), 4.27 - 4.26(m, 2H), 4.15(dd, J= 12.1, 2.6 Hz, 1H), 4.04(dd, J= 13.0, 5.7 Hz, 1H)
ESI-MS(m/z): 402(M+1)【０２１９】
参考例10.1:化合物am-10
工程1
参考例10.0の工程2で得られる1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-5-(ピリジン-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例6.1の工程1と同様にして1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-5-(ピリジン-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを得る。
工程2
1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-5-(ピリジン-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(2,4-ジオキソ-5-(ピリジン-2-イル)-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-10)を得る。
【実施例１６】
【０２２０】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-14を有するsiRNAを、参考例10.1で得られる化合物am-10を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２２１】
参考例11.0; 化合物I-15
2-(トリ-n-ブチルスタンニル)オキサゾールを用いて参考例10.0の工程2〜4と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(5-(オキサゾール-2-イル)-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-15)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.52(s, 1H), 7.84(s, 1H), 7.19(s, 1H), 5.93(d, J= 4.9 Hz, 1H), 4.36(t, J= 4.9 Hz, 1H), 4.28-4.24(m, 2H), 4.11(dq, J= 11.7, 2.0 Hz, 1H), 4.03(dq, J= 11.7, 2.6 Hz, 1H).
ESI-MS(m/z): 392(M+1)【０２２２】
参考例11.1:化合物am-11
2-(トリ-n-ブチルスタンニル)オキサゾールを用いて参考例10.0の工程2と同様にして合成した1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-5-(オキサゾル-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例10.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(5-(オキサゾル-2-イル)-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-11)を得る。
【実施例１７】
【０２２３】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-15を有するsiRNAを、参考例11.1で得られる化合物am-11を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２２４】
参考例12.0; 化合物I-16
工程1
市販の5-ヨードピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.0の工程1と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ベンゾイルオキシ)メチル)-5-(5-ヨード-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ジベンゾエートを得た。
ESI-MS(m/z): 683(M+1)  
工程2
工程1で得られた(2R,3R,4R,5R)-2-((ベンゾイルオキシ)メチル)-5-(5-ヨード-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ジベンゾエート(200 mg、0.293 mmol)、(4-メトキシフェニル)ボロン酸(134.0 mg、0.879 mmol)、1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン-パラジウム(II)ジクロリド-ジクロロメタン錯体(23.9 mg、0.029 mmol)、2M 炭酸セシウム水溶液(0.6mL)に1,4-ジオキサン(3 mL)を加え、120℃で1時間攪拌した。反応液を室温に冷却後、飽和重曹水を加え、Presep(登録商標; けいそう土、顆粒状タイプM, 4.5g/25mL)を通してろ過し、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をクロロホルム/メタノール系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、(2R,3R,4R,5R)-2-((ベンゾイルオキシ)メチル)-5-(5-(4-メトキシフェニル)-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルジベンゾエート(118 mg、収率61 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 663(M+1)
工程3
工程2で得られた(2R,3R,4R,5R)-2-((ベンゾイルオキシ)メチル)-5-(5-(4-メトキシフェニル)-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルジベンゾエートを用い、参考例1.0の工程2〜5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(5-(4-メトキシフェニル)-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-16)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 7.77(s, 1H), 7.42(d, J= 8.8 Hz, 2H), 7.01(d, J= 8.8 Hz, 2H), 5.97(d, J= 5.5 Hz, 1H), 4.39(t, J= 5.9 Hz, 1H), 4.27(t, J= 4.4 Hz, 1H), 4.22 - 4.21(m, 1H), 4.04 - 4.02(m, 2H), 3.81(s, 3H).
ESI-MS(m/z): 431(M+1)【０２２５】
参考例12.1:化合物am-12
参考例12.0の工程2で得られる(2R,3R,4R,5R)-2-((ベンゾイルオキシ)メチル)-5-(5-(4-メトキシフェニル)-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ジベンゾエートを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(5-(4-メトキシフェニル)-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-12)を得る。
【実施例１８】
【０２２６】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-16を有するsiRNAを、参考例12.1で得られる化合物am-12を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２２７】
参考例13.0; 化合物I-17
工程1
参考例10.0の工程1で得られる5-ブロモ-1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用いて、参考例1.0の工程4と同様にして、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5-ブロモ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチルを得た。
ESI-MS(m/z): 555(M+1)
工程2
工程1で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5-ブロモ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(200 mg、0.360 mmol)をDMF(7mL)に溶解し、シアン化ナトリウム(88.0 mg、1.801 mmol)を加えて室温で終夜攪拌した。反応液に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去して得られた残渣をヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することによりリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-シアノ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(150 mg、収率83 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 502(M+1)
工程3
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-シアノ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチルを用い、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-シアノ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-17)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 6.51(d, J= 0.7 Hz, 1H), 5.81(d, J= 4.0 Hz, 1H), 4.28(t, J= 6.2 Hz, 1H), 4.01-3.95(m, 4H).
ESI-MS(m/z): 350(M+1)【０２２８】
参考例13.1:化合物am-13
工程1〜2
市販の5-ブロモ-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1の工程1〜2と同様にして、5-ブロモ-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを得た。
ESI-MS(m/z): 577(M+1)
工程3
工程2で得られた5-ブロモ-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例13.0の工程2と同様にして、3-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロピリミジン-4-カルボニトリルを得た。
ESI-MS(m/z): 524(M+1)
工程4
工程3で得られた3-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロピリミジン-4-カルボニトリルを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-シアノ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-13)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 500MHz) δ: 7.47-6.78(m, 13H), 6.27(6.26)(s, 1H), 5.84(m, 1H), 4.95(4.89)(m, 1H), 4.35-4.19(m, 2H), 3.96-3.27(m, 12H), 2.31(2.59)(m, 2H), 1.19-1.06(m, 12H), 0.87(0.88)(s, 9H), 0.06(0.08)(s, 3H), 0.01(s, 3H).
【実施例１９】
【０２２９】
後述の表24に示す454-Xuのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-17を有するsiRNAを、参考例13.1で得られる化合物am-13を用いて、実施例1と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖)： 理論値 6691.86(M-H) 実測値 6691.25【０２３０】
参考例14.0; 化合物I-18
工程1  
参考例6.0の工程2で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(249 mg、0.631 mmol)をクロロホルム(6.00 mL)に溶解し、氷冷下イミダゾール(86 mg、1.26 mmol)、tert-ブチルジメチルシリルクロライド(105 mg、0.694 mmol)を加え、室温で3時間攪拌した。その後、氷冷下イミダゾール(86 mg、1.26 mmol)、tert-ブチルジメチルシリルクロライド(105 mg、0.694 mmol)を追加し、室温でさらに1時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣を、ヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)- 6-((E)-スチリル)-9H-プリン(310 mg、97.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 509(M+1)
工程2   
工程1で得られた9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン(200 mg、0.393 mmol)をTHF(3.00 mL)に溶解し、-78 ℃でリチウムジイソプロピルアミド(0.393 mL, 0.786 mmol)を加え30分間攪拌後、1,2-ジブロモ-1,1,2,2-テトラクロロエタン(384 mg, 1.18 mmol) をTHF(2.00 mL)に溶解させた溶液を-78 ℃で加えた。その後、撹拌しながら1時間かけて室温まで昇温した。反応混合物に飽和重曹水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣を、ヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、8-ブロモ-9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン (198 mg、86.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 587(M+1)
工程3  
工程2で得られた8-ブロモ-9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-((tert-ブチルジメチルシリルオキシ)メチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-6-((E)-スチリル)-9H-プリン(198 mg、0.337 mmol)をトリフルオロ酢酸/水(1:1)(2 mL)に溶解し、室温で2時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣を、ヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、(2R, 3R, 4S, 5R)-2-(8-ブロモ-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(140 mg、96.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 433(M+1)
工程4    
工程3で得られた(2R, 3R, 4S,5R)-2-(8-ブロモ-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール(140 mg、0.323 mmol)を用い、参考例1.0の工程3と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-ブロモ-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(66.0 mg、43.2 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 473(M+1)
工程5〜6   
工程4で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-6-(8-ブロモ-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(65.0 mg、0.137 mmol)を用い、参考例6.0の工程3〜4と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(8-ブロモ-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-18、68.5 mg、75.0 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 400MHz) δ: 8.45(1H, s), 7.54(1H, d, J= 15.6 Hz), 7.24-7.17(2H, m), 7.11-7.00(3H, m), 6.95(1H, d, J= 15.6 Hz), 5.96(1H, d, J= 4.9 Hz), 5.18(1H, dd, J= 5.4, 5.4 Hz), 4.54(1H, dd, J= 5.4, 5.4 Hz), 4.19-4.13(1H, m), 4.12-3.95(2H, m).
ESI-MS(m/z): 513(M+1)【０２３１】
参考例14.1:化合物am-14
参考例14.0の工程3で得られる(2R, 3R, 4S, 5R)-2-(8-ブロモ-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール を用い、参考例1.1と同様にして、3-((2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-5-(8-ブロモ-6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-14)を得る。
【実施例２０】
【０２３２】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-18を有するsiRNAを、参考例14.1で得られる化合物am-14を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２３３】
参考例15.0; 化合物I-19
市販の5,6-ジメチルチエノ[2,3-d]ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.0と同様にしてリン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(5,6-ジメチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロチエノ[2,3-d]ピリミジン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-19) トリエチルアンモニウム塩を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 6.10(d, J= 5.5 Hz, 1H), 4.75-4.73(m, 1H), 4.40(t, J= 5.7 Hz, 1H), 4.24-4.14(m, 3H), 2.32(s, 3H), 2.31(s, 3H).
ESI-MS(m/z): 411(M+1)【０２３４】
参考例15.1:化合物am-15
市販の5,6-ジメチルチエノ[2,3-d]ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(5,6-ジメチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロチエノ[2,3-d]ピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-15)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 500MHz) δ: 7.62(s, 1H), 7.50-6.78(m, 13H), 5.98(m, 1H), 4.92(m, 1H), 4.34-4.25(m, 2H), 4.00-3.34(m, 12H), 2.29(2.64)(m, 2H), 2.35(s, 3H), 2.13(s, 3H), 1.23-1.03(m, 12H), 0.83(0.84)(s, 9H), 0.02(d, J= 6.0 Hz, 3H), -0.10(d, J= 5.0 Hz, 3H).
【実施例２１】
【０２３５】
後述の表24に示す454-Xuのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-19を有するsiRNA(di-Me-thienyl-dUという)を、参考例15.1で得られる化合物am-15を用いて、実施例1と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖)： 理論値 6750.99(M-H) 実測値 6754.34【０２３６】
参考例16.0; 化合物I-20
工程1  
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(100 mg、 0.306 mmol)及び3-イソプロピルフェニルボロン酸(100 mg、0.612 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-イソプロピルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(167 mg、133 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 411(M+1)
工程2
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-イソプロピルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール (126 mg、0.307 mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-イソプロピルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(96.2 mg、52.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 603(M+1)
工程3
工程1で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-イソプロピルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(96.0 mg、0.159 mmol)をトリフルオロ酢酸/水(1:1)(2 mL)に溶解し、室温で3時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣を分取HPLC(溶離液 0.01mmol/L 酢酸-トリエチルアミン緩衝液(pH 6.5) /アセトニトリル系)にて精製することにより、リン酸((2R,3S,4R,5R)- 3,4-ジヒドロキシ-5-(6-(3-イソプロピルフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-20) トリエチルアンモニウム塩(70.0 mg、80.0 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.72(2H, d, J= 7.0 Hz), 7.97(1H, s), 7.92-7.83(1H, m), 7.43-7.33(2H, m), 6.14(1H, d, J= 5.5 Hz), 4.73-4.64(14H, m), 4.44-4.38(1H, m), 4.32-4.25(1H, m), 4.08-3.93(2H, m), 3.06(11H, q, J= 7.3 Hz), 2.94-2.81(1H, m), 1.20-1.08(22H, m).
ESI-MS(m/z): 451(M+1)【０２３７】
参考例16.1:化合物am-16
参考例16.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-イソプロピルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノールを用い、参考例6.1と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-(3-イソプロピルフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-16)を得る。
【実施例２２】
【０２３８】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-20を有するsiRNAを、参考例16.1で得られる化合物am-16を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２３９】
参考例17.0; 化合物I-21
工程1
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(100 mg、 0.306 mmol)及び2-ナフタレンボロン酸(105 mg、0.612 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-(ナフタレン-2-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(147 mg、114 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 419(M+1)
工程2
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-(ナフタレン-2-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(128 mg、0.306 mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-(ナフタレン-2-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(90.0 mg、48.2 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 611(M+1)
工程3
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-(ナフタレン-2-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル (77.0 mg、0.126 mmol)を用い、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(6-(ナフタレン-2-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-21) トリエチルアンモニウム塩(20.0 mg、29.6 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 400MHz) δ: 8.30(1H, s), 8.05(1H, s), 7.80(1H, s), 7.55-7.40(1H, m), 7.27-6.92(5H, m), 5.73(1H, s), 4.52-4.18(3H, m), 4.15-3.92(2H, m), 3.06-2.96(6H, m), 1.16-1.04(9H, m).
ESI-MS(m/z): 459(M+1)【０２４０】
参考例17.1:化合物am-17
工程1〜2      
市販の(2R,3R,4S,5R)-2-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオールを用い、参考例1.1の工程1〜2と同様にして、6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを得た。
ESI-MS(m/z): 541(M+1)
工程3   
工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例17.0の工程1と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(ナフタレン-2-イル)-9H-プリンを得た。
ESI-MS(m/z): 633(M+1)
工程4〜6    
工程3で得られた9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(ナフタレン-2-イル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-(ナフタレン-2-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-17)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 500MHz) δ: 9.43(m, 1H), 8.96(m, 1H), 8.88(m, 1H), 8.40(m, 1H), 8.08(m, 1H), 8.02(m, 1H), 7.91(m, 1H), 7.59-7.52(m, 2H), 7.52-6.81(m, 13H), 6.19(6.13)(m, 1H), 5.11(m, 1H), 4.50-4.38(m, 2H), 4.02-3.32(m, 12H), 2.67(2.32)(m, 2H), 1.23-1.05(m, 12H), 0.76(0.77)(s, 9H), -0.03(0.00)(s, 3H), -0.19(-0.17)(s, 3H).
【実施例２３】
【０２４１】
後述の表24に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-21を有するsiRNA(6-napht-2-yl-dPuという)を、参考例17.1で得られる化合物am-17を用いて、実施例1と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖)： 理論値 6801.03(M-H) 実測値 6805.40【０２４２】
参考例18.0; 化合物I-22
工程1  
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(200 mg、 0.612 mmol)及び3-ホルミルフェニルボロン酸(184 mg、1.22 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-ホルミルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(216 mg、89 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 397(M+1)
工程2
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-ホルミルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(215 mg、 0.542 mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-ホルミルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(35.0 mg、11.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 589(M+1)
工程3
工程1で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-ホルミルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(33.0 mg、0.0560 mmol)を用い、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)- 3,4-ジヒドロキシ-5-(6-(3-ホルミルフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-22、20.0 mg、29.6 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 9.93(1H, s), 8.88(1H, s), 8.76(1H, s), 8.67-8.60(1H, m), 8.47-8.40(1H, m), 8.06-7.99(1H, m), 7.74-7.66(1H, m), 6.20(1H, d, J= 5.5 Hz), 4.76-4.68(2H, m), 4.46-4.41(1H, m), 4.34-4.29(1H, m), 4.12-4.00(2H, m).
ESI-MS(m/z): 437(M+1)【０２４３】
参考例18.1:化合物am-18
参考例18.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-ホルミルフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノールを用い、参考例6.1と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-(3-ホルミルフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-18)を得る。
【実施例２４】
【０２４４】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-22を有するsiRNAを、参考例18.1で得られる化合物am-18を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２４５】
参考例19.0; 化合物I-23 
市販の6-ニトロ-1H-キナゾリン-2,4-ジオンを用い、参考例1.0と同様にしてリン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-23) トリエチルアンモニウム塩を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.82(d, J= 2.9 Hz, 1H), 8.49(dd, J= 9.3, 2.4 Hz, 1H), 7.89(d, J= 9.5 Hz, 1H), 6.27(d, J= 5.9 Hz, 1H), 4.73(t, J= 6.2 Hz, 1H), 4.42(t, J= 5.9 Hz, 1H), 4.09-4.04(m, 3H), 3.08(q, J= 7.3 Hz, 6H), 1.16(t, J= 7.3 Hz, 9H).
ESI-MS(m/z): 420(M+1)【０２４６】
参考例19.1:化合物am-19
市販の6-ニトロ-1H-キナゾリン-2,4-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-19)を得る。
【実施例２５】
【０２４７】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-23を有するsiRNAを、参考例19.1で得られる化合物am-19を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２４８】
参考例20.0; 化合物I-24
工程1〜4
市販の5,6-ジメチルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1の工程1〜4と同様にしてリン酸ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5,6-ジメチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチルを得た。
ESI-MS(m/z): 505(M+1)
工程5
工程4で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(5,6-ジメチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(200 mg、0.396 mmol)を1,4-ジオキサン(4.00 mL)に溶解し、二酸化セレン(440 mg、3.96 mmol)を加え、加熱還流下で終夜攪拌した。反応液をセライトろ過し、減圧下、溶媒を留去して得られた残渣を、ヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(ヒドロキシメチル)-5-メチル2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(38.6 mg、収率19 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 521(M+1)
工程6
工程5で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(ヒドロキシメチル)-5-メチル2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(38.6 mg、0.074 mmol)をアセトニトリル(1.00 mL)に溶解し、ピリジン(0.06 mL、0.742 mmol)、デス-マーチンペルヨージナン(62.9 mg、0.148 mmol)を加え、60℃で終夜攪拌した。反応液を室温に冷却後、飽和重曹水を加え、Presep(登録商標; けいそう土、顆粒状タイプM, 4.5g/25mL)を通してろ過し、溶媒を減圧下留去した。残渣をプレパラティブ薄層クロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=20/80)で精製することにより、リン酸ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(ヒドロキシメチル)-5-メチル2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(32.8 mg、収率85 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 519(M+1)  
工程7
工程6で得られるリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(ヒドロキシメチル)-5-メチル2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(46.0 mg、0.089 mmol)をTHF(1.00 mL)に溶解し、ヒドロキシルアミン塩酸塩(30.8 mg、0.444 mmol)を加え、60℃で2時間攪拌した。反応液を室温に冷却後、飽和重曹水を加え、Presep(登録商標; けいそう土、顆粒状タイプM, 4.5g/25mL)を通してろ過し、溶媒を減圧下留去した。残渣をプレパラティブ薄層クロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=90/10)で精製することにより、リン酸ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-((E)-(ヒドロキシイミノ)メチル)-5-メチル2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(33.7 mg、収率71 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 534(M+1)  
工程8
トリフェニルホスフィンオキシド(1.76 mg、0.006 mmol) を酢酸エチル(1.00 mL)に溶解し、塩化オキサリル(0.017 mL、0.19 mmol)を加え、室温で5分間撹拌し反応液を調製した。工程7で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-((E)-(ヒドロキシイミノ)メチル)-5-メチル2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(33.7 mg、0.063 mmol)を酢酸エチル(1.00 mL)に溶解し、上記反応液をゆっくり加え、室温で終夜攪拌した。溶媒を留去して得られた残渣をトリフルオロ酢酸/水(1:1)(2 mL)に溶解し、室温で2時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去した後、酢酸-トリエチルアミン緩衝液(pH 6.5)(2mL)を加え、再度減圧下、溶媒を留去した。得られた残渣をエタノールに溶解し、酢酸エチルを加え、析出物を濾取することにより、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-シアノ-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-24) トリエチルアンモニウム塩(1.6 mg(2回分)、収率74 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 5.96(d, J= 4.0 Hz, 1H), 4.41(t, J= 6.4 Hz, 1H), 4.19-4.06(m, 3H), 3.21(q, J= 7.2 Hz, 6H), 2.19(s, 3H), 1.28(t, J= 7.5 Hz, 9H).
ESI-MS(m/z): 404(M+1)  【０２４９】
参考例20.1:化合物am-20
工程1
参考例20.0の工程1で得られる(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(5,6-ジメチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルベンゾエートを用い、参考例20.0の工程5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(6-(ヒドロキシメチル)-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルベンゾエートを得た。
ESI-MS(m/z): 601(M+1)
工程2
工程1で得られた(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(6-ヒドロキシメチル)-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルベンゾエートを用い、参考例20.0の工程6と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(6-ホルミル-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ベンゾエートを得た。
ESI-MS(m/z): 599(M+1)
工程3
工程2で得られた(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(6-ホルミル-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ベンゾエートを用い、参考例20.0の工程7と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(6-((E)-(ヒドロキシイミノ)メチル)-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ベンゾエートを得た。
ESI-MS(m/z): 614(M+1)
工程4
トリフェニルホスフィンオキシド(11.0 mg、0.039 mmol) を酢酸エチル(5.00 mL)に溶解し、塩化オキサリル(0.104 mL、1.183 mmol)を加え、室温で5分間撹拌し反応液を調製した。工程3で得られた(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(6-((E)-(ヒドロキシイミノ)メチル)-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ベンゾエート(242 mg、0.394 mmol)を酢酸エチル(5.00 mL)に溶解し、上記反応液をゆっくり加え、室温で2時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去して得られた残渣を、ヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(6-シアノ-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ベンゾエート(207 mg、収率88 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 596(M+1)
工程5
工程4で得られた(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(6-シアノ-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ベンゾエートを用い、参考例1.0の工程2と同様にして、3-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-5-メチル-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロピリミジン-4-カルボニトリルを得た。
ESI-MS(m/z): 284(M+1)
工程6〜10
工程5で得られた3-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-5-メチル-2,6-ジオキソ-1,2,3,6-テトラヒドロピリミジン-4-カルボニトリルを用い、参考例1.1の工程1〜5と同様にして、(2R,3R,4S,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-シアノ-5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-20)を得る。
【実施例２６】
【０２５０】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-24を有するsiRNAを、参考例20.1で得られる化合物am-20を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２５１】
参考例21.0; 化合物I-25
工程1    
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(100 mg、 0.306 mmol)及びナフタレン-1-イルボロン酸(105 mg、0.612 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)−2,2−ジメチル-6-(6-(ナフタレン-1-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(150 mg、117 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 419(M+1)
工程2    
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)−2,2−ジメチル-6-(6-(ナフチレン-1-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(128 mg、0.306 mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)−2,2−ジメチル-6-(6-(ナフタレン-1-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(70.0 mg、37.5 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 611(M+1)
工程3  
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)−2,2−ジメチル-6-(6-(ナフタレン-1-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(77.0 mg、0.126 mmol)を用い、参考例16.0の工程3と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(6-(ナフタレン-1-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-25) トリエチルアンモニウム塩(10.8 mg、15.3 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.87 (1H, s), 8.60 (1H, s), 8.07-7.84 (2H, m), 7.73-7.60 (2H, m), 7.58-7.40 (2H, m), 7.38-7.28 (1H, m), 6.21 (1H, d, J = 5.5 Hz), 4.75-4.66 (1H, m), 4.45-4.38 (1H, m), 4.35-4.28 (1H, m), 4.10-3.98 (2H, m), 3.05 (6H, q, J = 7.3 Hz), 1.13 (9H, t, J = 7.3 Hz).
ESI-MS(m/z): 459(M+1)【０２５２】
参考例21.1:化合物am-21
工程1
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例21.0の工程1と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(ナフタレン-1-イル)-9H-プリンを得た。
ESI-MS(m/z): 633(M+1)
工程2〜4
工程1で得られた9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(ナフタレン-1-イル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)−4−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)−5−(6-(ナフタレン-1-イル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-21)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 500MHz) δ: 9.04(m, 1H), 8.34(m, 1H), 8.20(m, 1H), 8.04-7.91(m, 2H), 7.93(m, 1H), 7.64(m, 1H), 7.54-7.45(m, 4H), 7.39-6.79(m, 11H), 6.21(6.15)(m, 1H), 5.16(m, 1H), 4.51-4.39(m, 2H), 4.04-3.32(m, 12H), 2.68(2.32)(m, 2H), 1.25-1.06(m, 12H), 0.76(0.77)(s, 9H), -0.01(0.01)(s, 3H), -0.16(-0.15)(s, 3H).
【実施例２７】
【０２５３】
後述の表24に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-25を有するsiRNA(6-napht-1-yl-dPu)を、参考例21.1で得られる化合物am-21を用いて、実施例1と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖)： 理論値 6801.03(M-H) 実測値 6800.94【０２５４】
参考例22.0; 化合物I-26
工程1    
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(100 mg、 0.306 mmol)及び(1,1’-ビフェニル)-3-イルボロン酸(121 mg、0.612 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)−6-(6-(ビフェニル-3-イル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(130 mg、95 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 445(M+1)
工程2    
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)−6-(6-(ビフェニル-3-イル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(125 mg、0.281 mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)−6-(6-(ビフェニル-3-イル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(107 mg、59.8 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 637(M+1)
工程3  
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)−6-(6-(ビフェニル-3-イル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(100 mg、0.157 mmol)を用い、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)−5-(6-(ビフェニル-3-イル)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-26)(47.0 mg、61.8 %)を得た。
1H-NMR(DMSO-d6, 300MHz) δ: 9.14 (1H, s), 9.06 (1H, s), 8.89 (1H, s), 8.82 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.89 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.79-7.68 (3H, m), 7.58-7.50 (2H, m), 7.47-7.40 (1H, m), 6.15 (1H, d, J = 5.5 Hz), 4.72-4.65 (1H, m), 4.27-4.22 (1H, m), 4.20-3.98 (3H, m).
ESI-MS(m/z): 485(M+1)【０２５５】
参考例22.1:化合物am-22
工程1  
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例22.0の工程1と同様にして、6-(ビフェニル-3-イル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを得る。
工程2〜4
工程1で得られた6-(ビフェニル-3-イル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(ビフェニル-3-イル)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-22)を得る。 
【実施例２８】
【０２５６】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-26を有するsiRNAを、参考例22.1で得られる化合物am-22を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２５７】
参考例23.0; 化合物I-27
工程1    
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(100 mg、 0.306 mmol)及び(3-アミノフェニル)ボロン酸(84 mg、0.612 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-アミノフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(77.2 mg、65.8 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 384(M+1)
工程2    
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-アミノフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(77.0 mg、0.201 mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-アミノフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(38.4 mg、33.2 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 576(M+1)
工程3  
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-アミノフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(38.0 mg、0.0660 mmol)を用い、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-アミノフェニル)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-27)(13.0 mg、43.3 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.82 (1H, s), 8.73 (1H, s), 8.22-8.15 (2H, m), 7.66-7.58 (1H, m), 7.55-7.48 (1H, m), 6.16 (1H, d, J = 5.5 Hz), 4.72-4.65 (1H, m), 4.45-4.38 (1H, m), 4.35-4.26 (1H, m), 4.14-3.98 (2H, m).
ESI-MS(m/z): 424(M+1)【０２５８】
参考例23.1:化合物am-23
工程1  
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例23.0の工程1と同様にして、6-(3-アミノフェニル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを得る。
工程2〜4  
工程1で得られた9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-アミノフェニル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-5-(6-(3-アミノフェニル)-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-23)を得る。
【実施例２９】
【０２５９】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-27を有するsiRNAを、参考例23.1で得られる化合物am-23を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２６０】
参考例24.0; 化合物I-28
工程1    
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(100 mg、 0.306 mmol)及び(3-モルフォリノフェニル)ボロン酸(127 mg、0.612 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-(3-モルフォリノフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(127 mg、92 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 454(M+1)
工程2   
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-(3-モルフォリノフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(120 mg、0.265 mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-(3-モルフォリノフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)mメチル(65.0 mg、38.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 646(M+1)
工程3  
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-2,2-ジメチル-6-(6-(3-モルフォリノフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(63.0 mg、0.0980 mmol)を用い、参考例16.0の工程3と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(6-(3-モルフォリノフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-28) トリエチルアンモニウム塩(9.00 mg、15.5 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.83 (1H, s), 8.72 (1H, s), 7.85-7.75 (2H, m), 7.52-7.44 (1H, m), 7.28-7.20 (1H, m), 6.21-6.19 (1H, m), 4.76-4.68 (1H, m), 4.45-4.40 (1H, m), 4.34-4.28 (1H, m), 4.06 (2H, s), 3.88-3.80 (4H, m), 3.23-3.15 (4H, m), 3.08 (6H, q, J = 7.3 Hz), 1.16 (9H, t, J = 7.3 Hz).
ESI-MS(m/z): 494(M+1)【０２６１】
参考例24.1:化合物am-24
工程1  
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例24.0の工程1と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-モルフォリノフェニル)-9H-プリンを得る。
工程2〜4  
工程1で得られた9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-モルフォリノフェニル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-(3-モルフォリノフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-24)を得る。
【実施例３０】
【０２６２】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-28を有するsiRNAを、参考例24.1で得られる化合物am-24を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２６３】
参考例25.0; 化合物I-29
工程1    
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(100 mg、 0.306 mmol)及び(3-(ベンジルオキシ)フェニル)ボロン酸(140 mg、0.612 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(ベンジルオキシ)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(180 mg、130 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 475(M+1)
工程2   
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(ベンジルオキシ)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール (140 mg、0.295 mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(ベンジルオキシ)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(95.0 mg、48.3 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 667(M+1)
工程3  
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(ベンジルオキシ)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(95.0 mg、0.142 mmol)を用い、参考例16.0の工程3と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-(ベンジルオキシ)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-29) トリエチルアンモニウム塩(32.0 mg、36.5 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 400MHz) δ: 8.63 (1H, s), 8.59 (1H, s), 7.67-7.55 (2H, m), 7.30-7.16 (6H, m), 6.94-6.88 (1H, m), 6.06 (1H, d, J = 5.9 Hz), 4.88 (2H, s), 4.71-4.62 (1H, m), 4.39-4.34 (1H, m), 4.28-4.22 (1H, m), 4.06-3.95 (2H, m), 3.14-2.95 (6H, q, J = 7.3 Hz), 1.12 (9H, t, J = 7.3 Hz).
ESI-MS(m/z): 515(M+1)【０２６４】
参考例25.1:化合物am-25
工程1    
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例25.0の工程1と同様にして、6-(3-(ベンジルオキシ)フェニル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを得る。
工程2〜4  
工程1で得られた6-(3-(ベンジルオキシ)フェニル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)−5−(6−(3−(ベンジルオキシ)フェニル-9H-プリン-9-イル)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-25)を得る。
【実施例３１】
【０２６５】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-29を有するsiRNAを、参考例25.1で得られる化合物am-25を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２６６】
参考例26.0; 化合物I-30
工程1    
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(100 mg、 0.306 mmol)及び(3-(メトキシカルボニル)フェニル)ボロン酸(110 mg、0.612 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(メトキシカルボニル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(160 mg、123 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 427(M+1)
工程2   
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(メトキシカルボニル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール (130 mg、0.305 mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(メトキシカルボニル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(100 mg、53.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 619(M+1)
工程3  
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-(3-(メトキシカルボニル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(68.7 mg、0.111 mmol)を用い、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-(メトキシカルボニル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(45.0 mg、87.0 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 467(M+1)
工程4
工程3で得られたリン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-(メトキシカルボニル)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(20.0 mg、0.0430 mmol)を1規定水酸化ナトリウム水溶液 (2 mL)に溶解し、室温で2時間撹拌した。酢酸-トリエチルアミン緩衝液(pH 6.5)を加え、減圧下、溶媒を留去して得られた残渣を分取HPLC(溶離液 0.01mmol/L 酢酸アンモニウム水溶液/メタノール系)にて精製することにより、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-(3-(カルボキシ)フェニル)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-30) トリエチルアンモニウム塩(10.0 mg、42.1%)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.88-8.53 (3H, m), 8.34-8.22 (1H, m), 8.03-7.92 (1H, m), 7.60-7.48 (1H, m), 6.22-6.15 (1H, m), 4.76-4.65 (1H, m), 4.47-4.42 (1H, m), 4.35-4.30 (1H, m), 4.15-4.00 (2H, m), 3.09 (6H, q, J = 7.2 Hz), 1.16 (9H, t, J = 7.3 Hz).
ESI-MS(m/z): 453(M+1)【０２６７】
参考例26.1:化合物am-26
工程1    
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例26.0の工程1と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-メトキシカルボニル)-9H-プリンを得る。
工程2
工程1で得られた9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-メトキシカルボニル)-9H-プリンを用い、参考例26.0の工程4と同様にして、9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-カルボキシル)-9H-プリンを得る。
工程3〜5  
工程2で得られた9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-(3-カルボキシル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-(3-カルボキシルフェニル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-26)を得る。
【実施例３２】
【０２６８】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-30を有するsiRNAを、参考例26.1で得られる化合物am-26を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２６９】
参考例27.0; 化合物I-31
工程1
参考例10.0の工程1で得られる5-ブロモ-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン(100 mg、0.275 mmol)を用いて、参考例6.0の工程2と同様にして、1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-5-スチリルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン(43.8 mg、41 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 385(M-1)
工程2
工程1で得られた1-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(ヒドロキシメチル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)-5-スチリルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン(16.3 mg、0.042 mmol)をジクロロメタン(2 mL)に溶解し、1H-テトラゾール(7.39 mg、0.105 mmol)、ジ-tert-ブチルジイソプロピルホスホールアミド(0.028 mL、0.084 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。反応液を0℃に冷却し、(2R,8aS)-(+)-(カンファリルスルホニル)オキサジリジン(19.4 mg、0.084 mmol)を加え、0℃でさらに30分間攪拌した。反応液を室温に冷却後、飽和重曹水を加え、Presep(登録商標; けいそう土、顆粒状タイプM, 4.5g/25mL)を通してろ過し、溶媒を減圧下留去した。残渣をヘプタン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、リン酸ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(2,4-ジオキソ-5-スチリル-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(10.0 mg、41 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 577(M-1)
工程3
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(2,4-ジオキソ-5-スチリル-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(10.0 mg、0.017 mmol)を用いて、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸 ((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-ジオキソ-5-スチリル-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-31)トリエチルアンモニウム塩(9.30 mg、102%)を得た。
1H-NMR (D2O, 300MHz) δ: 7.96 (s, 1H), 7.49 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.37-7.19 (m, 3H), 6.88 (d, J = 16.5 Hz, 1H), 5.91 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 4.32 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 4.26 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 4.21-4.20 (m, 1H), 4.11-3.99 (m, 2H), 3.09 (q, J = 7.3 Hz, 6H), 1.16 (t, J = 7.3 Hz, 9H).
ESI-MS(m/z): 425(M-1)【０２７０】
参考例27.1:化合物am-27
工程1
参考例13.1の工程2で得られた5-ブロモ-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用いて、参考例27.0の工程1と同様にして、1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル) -5-スチリルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを得る。
工程2
工程1で得られる1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル) -5-スチリルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用いて、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(2,4-ジオキソ-5-スチリル-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイトを得る。
【実施例３３】
【０２７１】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-31を有するsiRNAを、参考例27.1で得られる化合物am-27を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２７２】
参考例28.1; 化合物am-28
工程1
市販の(2R,3R,4S,5R)-2-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-3,4-ジオール (5.00 g, 17.4 mmol)をピリジン (42 mL)に溶解させ、1,3-ジクロロ-1,1,3,3-テトライソプロピルジシロキサン (6.70 ml, 20.9 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去して得られた残渣をヘキサン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、(6aR,8R,9R,9aS)-8-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2,4,4-テトライソプロピルテトラヒドロ-6H-フロ[3,2-f][1,3,5,2,4]トリオキサジシロシン-9-オール (8.64 g、収率94 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 530(M+1)
工程2  
工程1で得られた(6aR,8R,9R,9aS)-8-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2,4,4-テトライソプロピルテトラヒドロ-6H-フロ[3,2-f][1,3,5,2,4]トリオキサジシロシン-9-オール (6.50 g, 12.3 mmol)を参考例6.0の工程2と同様にして、(6aR,8R,9R,9aS)-2,2,4,4-テトライソプロピル-8-(6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロ-6H-フロ[3,2-f][1,3,5,2,4]トリオキサジシロシン-9-オール (4.77 g, 収率65 %)を得た。  
ESI-MS(m/z): 598(M+1)
工程3  
工程2で得られた(6aR,8R,9R,9aS)-2,2,4,4-テトライソプロピル-8-(6-((E)-スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロ-6H-フロ[3,2-f][1,3,5,2,4]トリオキサジシロシン-9-オール (4.50 g, 7.54 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド (50 mL)に溶解させ、0℃にて60%水素化ナトリウム (302 mg, 7.54 mmol)、ヨウ化メチル (0.471 mL, 7.54 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去して得られた残渣をヘキサン/酢酸エチル系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、6-((E)-スチリル)-9-((6aR,8R,9R,9aR)-2,2,4,4-テトライソプロピル-9-メトキシテトラヒドロ-6H-フロ[3,2-f][1,3,5,2,4]トリオキサジシロシン-8-イル)-9H-プリン (2.09 g, 収率45 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 612(M+1)
工程4  
工程3で得られた6-((E)-スチリル)-9-((6aR,8R,9R,9aR)-2,2,4,4-テトライソプロピル-9-メトキシテトラヒドロ-6H-フロ[3,2-f][1,3,5,2,4]トリオキサジシロシン-8-イル)-9H-プリン (569 mg, 0.931 mmol)をテトラヒドロフラン(10 mL)に溶解させ、酢酸 (0.117 mL, 2.049 mmol)とテトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液 (1 mol/L, 2.05 ml, 2.05 mmol)を加え、室温で30分間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、クロロホルム/メタノール系のカラムクロマトグラフィーで精製することにより、(2R,3S,4R,5R)-2-(ヒドロキシメチル)-4-メトキシ-5-(6-((E)スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オール (341 mf, 収率99%)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 500MHz) δ: 8.90 (s, 1H), 8.43 (d, J= 16.7 Hz, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.68 - 7.75 (m, 3H), 7.37 - 7.47 (m, 3H), 6.17 (dd, J= 2.2, 11.9 Hz, 1H), 5.95 (d, J= 7.0 Hz, 1H), 4.77 (dd, J= 4.7, 7.4 Hz 1H), 4.61 (d, J= 4.4 Hz, 1H)), 4.39 - 4.41 (m, 1H), 3.99 - 4.02 (m, 1H), 3.78 - 3.83 (m, 1H), 3.37 (s, 3H), 2.67 (s, 1H).
ESI-MS(m/z): 369(M+1)
工程5
工程4で得られる((2R,3S,4R,5R)-2-(ヒドロキシメチル)-4-メトキシ-5-(6-((E)スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-オールを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-メトキシ-5-(6-((E)スチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-28)を得た。この化合物は精製せず、次工程に使用した。
【実施例３４】
【０２７３】
後述の表24に示す454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-32を有するsiRNA(2'-OMe-6-styryl-dAという)を、参考例28.1で得られる化合物am-28を用いて、実施例1と同様に合成した。
ESI-MS(m/z)：理論値 6792.04 実測値 6792.18【０２７４】
参考例29.0; 化合物I-33
市販の5-メチルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.0と同様にしてリン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキ-5-(5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)  テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-33)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 7.67 (s, 1H), 5.86 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.23 (dt, J = 12.8, 4.9 Hz, 2H), 4.13 (dt, J = 6.0, 2.6 Hz, 1H), 4.02-3.89 (m, 2H), 1.80 (s, 3H). 
ESI-MS(m/z): 337(M-1)【０２７５】
参考例29.1:化合物am-29
工程1
市販の5-メチルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(5-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイトを得る。
【実施例３５】
【０２７６】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-33を有するsiRNAを、参考例29.1で得られる化合物am-29を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２７７】
参考例30.0; 化合物I-34
市販の6-メチルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.0と同様にしてリン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキ-5-(6-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)  テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-34)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 5.63 (s, 1H), 5.56 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 4.31 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 4.05-3.90 (m, 4H), 2.27 (s, 3H), 1.95 (s, 1H).
ESI-MS(m/z): 337(M-1)【０２７８】
参考例30.1:化合物am-30
市販の6-メチルピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(6-メチル-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-30)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 500MHz) δ: 7.80(m, 1H), 7.48-6.78(m, 13H), 5.55(s, 1H), 5.50(m, 1H), 5.10(m, 1H), 4.31-4.18(m, 2H), 3.93-3.22(m, 12H), 2.66-2.28(m, 5H), 1.18-1.05(m, 12H), 0.87(0.86)(s, 9H), 0.07(0.06)(s, 3H), 0.00(-0.01)(s, 3H).
【実施例３６】
【０２７９】
後述の表24に示す454-Xuのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-34を有するsiRNA(6-Me-dUという)を、参考例30.1で得られる化合物am-30を用いて、実施例1と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖)： 理論値 6680.87(M-H) 実測値 6681.08【０２８０】
参考例31.0; 化合物I-35
工程1
公知の方法[Organic Process Research & Development、2001年,5巻,426-433頁]に記載された方法で合成した7-クロロ-6-ニトロキナゾリン2,4(1H,3H)-ジオン(0.626 g、1.24 mmol)を用い、参考例1.0の工程1と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(7-クロロ-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルジベンゾエート(0.292 g、34%)を得た。  
ESI-MS(m/z): 684(M-1)
工程2
工程1で得られた(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(7-クロロ-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイル ジベンゾエート(3.00 g、4.37 mmol)を用いて、参考例7.0の工程2と同様にして、7-クロロ-1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-ニトロキナゾリン2,4(1H,3H)-ジオン(1.26g、77%)を得た。
ESI-MS(m/z): 372(M-1)
工程3
工程2で得られた7-クロロ-1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-ニトロキナゾリン2,4(1H,3H)-ジオンを用いて、参考例7.0の工程3〜4と同様にして、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-クロロ-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチルを得た。
ESI-MS(m/z): 604(M-1)
工程4
工程3で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-クロロ-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(32.5 mg、0.054 mmol)を用いて、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(7-クロロ-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-35) トリエチルアンモニウム塩(20.0 mg、67%)を得た。
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.67 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 6.08 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 4.77 (dd, J = 6.6, 4.8 Hz, 1H), 4.42 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 4.08-3.99 (m, 4H), 3.09 (q, J = 7.3 Hz, 6H), 1.17 (t, J = 7.3 Hz, 9H).
ESI-MS(m/z): 452(M-1)【０２８１】
参考例31.1:化合物am-31
工程1
参考例31.0の工程2で得られる7-クロロ-1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-6-ニトロキナゾリン2,4(1H,3H)-ジオンを用いて、参考例1.1の工程1〜2と同様にして、7-クロロ-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-ニトロキナゾリン)-2,4(1H,3H)-ジオンを得る。
工程2
参考例31.1の工程1で得られる7-クロロ-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-6-ニトロキナゾリン)-2,4(1H,3H)-ジオンを用いて、参考例1.1の工程3〜5と同様にして((2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(7-クロロ-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-31)を得る。
【実施例３７】
【０２８２】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-35を有するsiRNAを、参考例31.1で得られる化合物am-31を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２８３】
参考例32.0; 化合物I-36
工程1
参考例10.0の工程3で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-クロロ-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(20.0 mg、0.033 mmol)をTHF(１mL)に溶解し、ジメチルアミン/THF溶液(1mL, 2.00mmol)を加え、室温で30分攪拌した。減圧下、溶媒を留去した後、残渣をプレパラティブ薄層クロマトグラフィー(ヘプタン/酢酸エチル=25/75)で精製することにより、ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-(ジメチルアミノ)-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(14.4 mg、71％)を得た。
ESI-MS(m/z): 613(M-1)
工程2
工程1で得られたジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)-6-(7-(ジメチルアミノ)-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(22.0 mg、0.036 mmol)を用いて、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-5-(7-(ジメチルアミノ)-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-36)トリエチルアンモニウム塩(12.5 mg、62%)を得た。
ESI-MS(m/z): 461(M-1)
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.46 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.05 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 4.79 (dd, J = 6.6, 4.0 Hz, 1H), 4.38 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.11-3.98 (m, 4H), 3.09 (q, J = 7.3 Hz, 6H), 2.92 (s, 6H), 1.17 (t, J = 7.3 Hz, 9H).【０２８４】
参考例32.1:化合物am-32
工程1
参考例31.1の工程1で得られる7-クロロ-1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-ニトロキナゾリン) -2,4(1H,3H)-ジオンを用いて、参考例32.0の工程1と同様にして1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-7-(ジメチルアミノ)-6-ニトロキナゾリン)-2,4(1H,3H)-ジオンを得る。
工程2
工程1で得られる1-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル-7-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-7-(ジメチルアミノ)-6-ニトロキナゾリン)-2,4(1H,3H)-ジオンを用いて、参考例1.1の工程3〜5と同様にして((2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(7-(ジメチルアミノ)-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-32)を得る。
【実施例３８】
【０２８５】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-36を有するsiRNAを、参考例32.1で得られる化合物am-32を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２８６】
参考例33.0; 化合物I-37
工程1
参考例31.0の工程1で得られる(2R,3R,4R,5R)-2-(ベンゾイルオキシメチル)-5-(7-クロロ-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3,4-ジイルジベンゾエート(292 mg、0.426 mmol)を用いて、参考例1.0の工程2と同様にして、1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-7-(メチルアミノ)-6-ニトロキナゾリン2,4(1H,3H)-ジオン(110 mg、71%)を得た。
ESI-MS(m/z): 367(M-1)
工程2
工程1で得られる1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル)-7-(メチルアミノ)-6-ニトロキナゾリン2,4(1H,3H)-ジオンを用いて、参考例1.0の工程3〜5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(7-(メチルアミノ)-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-37)トリエチルアンモニウム塩を得た。
ESI-MS(m/z): 447(M-1)
1H-NMR(D2O, 300MHz) δ: 8.67 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 6.02 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.78 (dd, J = 6.6, 4.0 Hz, 1H), 4.37 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.12 (dt, J = 13.9, 5.6 Hz, 1H), 4.03-3.97 (m, 2H), 2.97 (s, 3H).（アミン、アミドのプロトン見えない）【０２８７】
参考例33.1:化合物am-33
参考例33.0の工程1で得られる1-(2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロフラン-2-イル-7-(メチルアミノ)-6-ニトロキナゾリン2,4(1H,3H)-ジオンを用い、参考例1.1と同様にして(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-5-(7-(メチルアミノ)-6-ニトロ-2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-1(2H)-イル)テトラヒドロフラン-3-イル(2-シアノエチル) ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-33)を得た。
1H-NMR(CDCl3, 500MHz) δ: 9.03(s, 1H), 8.40(m, 1H), 7.88(m, 1H), 7.48-6.73(m, 13H), 6.64(s, 1H), 5.88(m, 1H), 5.13(5.16)(m, 1H), 4.50-4.29(m, 2H), 3.93-3.25(m, 12H), 3.00(2.96)(d, J= 5.1 Hz, 3H), 2.60(2.32)(m, 2H), 1.20-1.05(m, 12H), 0.85(0.82)(s, 9H), 0.07(0.05)(s, 3H), -0.05(-0.06)(s, 3H).
【実施例３９】
【０２８８】
後述の表24に示す454-Xuのアンチセンス鎖の5’末端のXに化合物I-37を有するsiRNA(6-NO2,7-Me-dQuという)を、参考例33.1で得られる化合物am-33を用いて、実施例1と同様に合成した。
MALDI-TOF/MS(アンチセンス鎖)： 理論値 6790.94(M-H) 実測値 6794.76【０２８９】
参考例34.0; 化合物I-38
工程1    
参考例6.0の工程1で得られる((3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-クロロ-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(100 mg、 0.306 mmol)及び(E)-2-(3-クロロスチリル)-4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン(81.0 mg、0.306 mmol)を用い、参考例6.0の工程2と同様にして、((3aR,4R,6R,6aR)−6-(6-(3-クロロスチリル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(118 mg、90 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 429(M+1)
工程2    
工程1で得られた((3aR,4R,6R,6aR)−6-(6-(3-クロロスチリル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メタノール(115 mg、0.268 mmol)を用い、参考例6.0の工程3と同様にして、リン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)−6-(6-(3-クロロスチリル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(107 mg、59.8 %)を得た。
ESI-MS(m/z): 621(M+1)
工程3  
工程2で得られたリン酸 ジ-tert-ブチル((3aR,4R,6R,6aR)−6-(6-(3-クロロスチリル)-9H-プリン-9-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソル-4-イル)メチル(120 mg、0.193 mmol)を用い、参考例1.0の工程5と同様にして、リン酸((2R,3S,4R,5R)−5-(6-(3-クロロスチリル)-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メチル(化合物I-38)トリエチルアンモニウム塩(28.0 mg、25.4 %)を得た。
1H-NMR(D2O, 400MHz) δ: 8.45 (1H, s), 8.34 (1H, s), 7.32-7.20 (1H, m), 6.86-6.70 (3H, m), 6.64-6.50 (2H, m), 5.92-5.85 (1H, m), 4.60-4.54 (1H, m), 4.38-4.32 (1H, m), 4.28-4.20 (1H, m), 4.10-3.92 (2H, m), 3.04 (6H, q, J = 7.5 Hz), 1.11 (9H, t, J = 127.8 Hz).
ESI-MS(m/z): 469(M+1)【０２９０】
参考例34.1:化合物am-34
工程1  
参考例17.1の工程2で得られた6-クロロ-9-((4aR,6R,7R,7aS)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例22.0の工程1と同様にして、6-(3-クロロスチリル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを得る。
工程2〜4  
工程1で得られた6-(3-クロロスチリル)-9-((4aR,6R,7R,7aR)-2,2-ジ-tert-ブチル−7−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)テトラヒドロ-4H-フロ[3,2-d][1,3,2]ジオキサシリン-6-イル)-9H-プリンを用い、参考例1.1の工程3〜5と同様にして、(2R,3R,4R,5R)-2-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-4-(tert-ブチルジメチルシリルオキシ)-5-(6-(3-クロロスチリル)-9H-プリン-9-イル)テトラヒドロフラン-3-イル 2-シアノエチル ジイソプロピルホスホロアミダイト(化合物am-34)を得る。 
【実施例４０】
【０２９１】
アンチセンス鎖の5’末端に化合物I-38を有するsiRNAを、参考例34.1で得られる化合物am-34を用いて、実施例1と同様に合成する。【０２９２】
試験例6:
実施例1〜4で得られたアンチセンス鎖の5’末端に非天然型ヌクレオチド残基が導入された、ルシフェラーゼ標的siRNAのAGO2との親和性を、以下に示したように、ビアコア（Biacore） T100及びT200システム(ジーイーヘルスケアサイエンス(GE)社)を用い、siRNAとAGO2-MIDドメインの親和性を基盤表面に固定したオリゴDNAの5’末端との競合を測定することで評価した。
(1)試料の調製
ランニングバッファー原液(HBS-EP+ 10X、GE社、BR-1006-69)を純水で10倍希釈し、フィルターろ過することでHPS-EP+(10 mM HEPES (4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05%(v/v) SurfactantP20, pH7.4)とし、ランニングバッファーとして使用した。
HBS-EP+に終濃度2 mMとなるようにジチオトレイトール(dithiothreitol(DTT))を加え、本溶液でsiRNA溶液を200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nMへ希釈し、同様に希釈した5 μg/mL AGO2-MIDドメインと等量混合することで、siRNAをそれぞれ100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM含む2.5 μg/mL AGO2-MIDドメイン溶液を調製した。【０２９３】
(2)測定方法
(2-1)ビオチン化オリゴの固定化
チップ(Series S Sensor Chip SA、GE社  BR-1005-31)にビオチン化一本鎖DNA(dT(16)-Biotin)の固定化を行った。流速(Flow rate)は10 μL/分で一定、HBS-EP+で100 nM に希釈したビオチン化一本鎖DNA溶液を以下のプログラムでFc2もしくはFc4に固定化した。同時にFc1, Fc3はブランクの固定化操作を行った。
1. 1M NaCl/50 mM NaOH, 60秒(インジェクト(INJECT)コマンド), 3回
2. ランニングバッファー (ウォシュ(WASH)コマンド)
3. ランニングバッファー 120秒(インジェクト(INJECT)コマンド)
4. エイム・フォー・イモビライズド・レベル(Aim for Immobilized Level)を750 RUに設定し固定化(リガンド・インジェクト(LIGAND INJECT)コマンド)
5. 1M NaCl/50 mM NaOH/50% イソプロピルアルコール (WASHコマンド)
固定化したセルでは約700RUの固定量が確認された。【０２９４】
(2-2) オリゴヌクレオチド(siRNA)の競合実験
ビオチン化一本鎖DNAを固定化したチップを用いてsiRNAによる競合実験を行った。流速は全て30 μL/分で行い、1サイクルは結合60 秒、乖離5 秒、再生 1M NaCl, 5 秒で行う。
機械安定化のため、初めの10サイクルはHBS-EP+のみ添加し、その後は各siRNAごとにHBS-EP+(ブランク(BLANK))、2.5 μg/mL AGO2-MIDドメイン溶液(コントロール(CONTROL))、siRNAをそれぞれ100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM含む2.5 μg/mL AGO2-MIDドメイン溶液(サンプル(Sample))の順に測定する。  解析では、固定化したセルのグラフからブランク固定をしたグラフを差し引いたグラフのbinding levelを使用し、残存結合率(%)を([Sample]-[BLANK])/([CONTROL]-[BLANK])×100で算出し、阻害率(%)を100-(残存結合率)で算出する。
また、比較のために、各siRNAのアンチセンス鎖の5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAについても同様に試験を行った。
表21に、それぞれの阻害率(%)を示す。【０２９５】
【表２１】
2014034934.tif 000084
【０２９６】
試験例6の結果から、実施例1〜4で得られたアンチセンス鎖の5’末端に非天然型ヌクレオチド残基が導入された、ルシフェラーゼ標的siRNA(874-8-Br-dA、874-8-oxo-dA、874-5-Br-dU、454-5-F-dUおよび1556-5-F-dU)は、それぞれの5’末端に対応する天然型のヌクレオチドであるアデノシン一リン酸またはウリジン一リン酸を有するsiRNA(874-A及び874-U)と比較して、いずれも阻害率(%)が高く、AGO2との親和性が高いことが明らかとなった。【０２９７】
試験例7: ヌクレオチド(モノマー)のビアコア
実施例1および4で得られたsiRNAの5’末端の非天然型ヌクレオチドである、8-Br-dA(化合物I-1)および5-フルオロ-2’-デオキシウリジン一リン酸(化合物I-4)のAGO2との親和性を、以下に示したように、ビアコア（Biacore） T100及びT200システム(GE社)を用い、siRNAとAGO2-MIDドメインの親和性を基盤表面に固定したオリゴDNAの5’末端との競合を測定することで評価した。
(1)試料の調製
HBS-EP+ 10Xを純水で10倍希釈し、終濃度2 mMとなるようにDTTを加え、フィルターろ過することでHBS-EP+, 2 mM DTT水溶液とした。この溶液に終濃度1%となるようにジメチルスルホキシド(Dimethyl sulfoxide(DMSO))を加え、ランニングバッファーとした。
DMSOもしくは蒸留水に溶解したモノマー溶液を、200 μM, 40 μM, 8 μM, 1.6 μM/(2% DMSO, HBS-EP+, 2 mM DTT)となるように希釈し、HBS-EP+, 2 mM DTT溶液で希釈した5 μg/mL AGO2-MIDドメインと等量混合することで、HBS-EP+, 2 mM DTT, 1%DMSO溶液でモノマーをそれぞれ100 μM, 20 μM, 4 μM, 0.8 μM含む2.5 μg/mL AGO2-MIDドメイン溶液を調製した。【０２９８】
(2) ヌクレオチド(モノマー)の競合実験
試験例6と同様にdT(16)-Biotinオリゴを固定化したチップを用いてsiRNAによる競合実験を行った。流速は全て30 μL/分で行い、1サイクルは結合60秒、乖離5秒、再生 1M NaCl, 5秒で行う。
機械安定化のため、初めの10サイクルはHBS-EP+のみ添加し、その後は各モノマーについて、HBS-EP+(BLANK)、 2.5 μg/mL AGO2-MIDドメイン溶液(CONTROL)、モノマーをそれぞれ100 μM, 20 μM, 4 μM, 0.8 μM含む2.5 μg/mL AGO2-MIDドメイン溶液(Sample)、2.5 μg/mL AGO2-MIDドメイン溶液(CONTROL) の順に測定する。
解析では、固定化したセルのグラフからブランク固定をしたグラフを差し引いたグラフのbinding levelを使用し、残存結合率(%)を([Sample]-[BLANK])/([CONTROL]-[BLANK])×100で算出し、阻害率(%)を100-(残存結合率)で算出する。
表22に、8-Br-dA(化合物I-1)および5-フルオロ-2’-デオキシウリジン一リン酸(化合物I-4)と、それぞれの比較として、アデノシン一リン酸(AMP)およびウリジン一リン酸(UMP)の阻害率(%)を示す。【０２９９】
【表２２】
2014034934.tif 000085
【０３００】
試験例7の結果から、本発明のsiRNAのアンチセンス鎖の5’末端に導入した非天然型ヌクレオチドである、8-Br-dAおよび5-フルオロ-2’-デオキシウリジン一リン酸は、天然ヌクレオチドであるアデノシン一リン酸またはウリジン一リン酸と比較して、いずれも阻害率(%)が高く、AGO2との親和性が高いことが明らかとなった。【０３０１】
試験例8: モノマーのビアコア
実施例7〜33、及び35〜40で得られるsiRNAの5’末端の非天然型ヌクレオチドである、化合物I-5〜I-31、及びI-33〜I-38のAGO2との親和性を、試験例7と同様に評価した。
表23にそれぞれ測定した阻害率(%)を示す。【０３０２】
【表２３】
2014034934.tif 000086
【０３０３】
試験例8の結果から、実施例7〜33、及び35〜40で得られるsiRNAの5’末端の非天然型ヌクレオチドである、化合物I-5〜I-31、及びI-33〜I-38は、いずれも阻害率(%)が高く、AGO2との親和性が高いことが明らかとなった。よって、実施例7〜33、及び35〜40で得られるsiRNAは、AGO2との親和性が向上したオリゴヌクレオチドになり、標的mRNAに対する高いノックダウン活性を有するオリゴヌクレオチドになることが期待される。【０３０４】
試験例9：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
1ウェルあたりの細胞数を7500細胞数とし、siRNAの最終濃度を10000 pmol/L、1000 pmol/L、100 pmol/L、10 pmol/L、1 pmol/Lの5点としてN=5で設定した以外は試験例１と同様にして、実施例39、23、36、または27で得られたアンチセンス鎖の5’末端に各化合物を有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端に、I-37(6-NO2,7-Me-dQu)、I-21(6-napht-2-yl-dPu)、I-34(6-Me-dU)、またはI-25(6-napht-1-yl-dPu)を有するsiRNAのノックダウン活性を図4に示した。
なお、表24中の454-Xaのアンチセンス鎖の5’末端のXに8-Br-dAを有するsiRNA(454-BrdAという)を、8-Br-dAを用いて実施例１と同様に合成し、siRNAの活性を測定して評価した。さらに、アンチセンス鎖の5’末端がアデノシン一リン酸、またはウリジン一リン酸を有する天然型のヌクレオチドを有するsiRNA(454-A、または454-Uという)についても、同様にsiRNAの活性を測定して評価した。【０３０５】
試験例9の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にAgo2高親和性塩基アナログを有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。【０３０６】
試験例10：ルシフェラーゼ標的siRNAのノックダウン活性
1ウェルあたりの細胞数を7500細胞数とし、siRNAの最終濃度を10000 pmol/L、1000 pmol/L、100 pmol/L、10 pmol/L、1 pmol/Lの5点としてN=5で設定した以外は試験例１と同様にして、実施例34、及び21で得られたアンチセンス鎖の5’末端に各化合物を有するsiRNAの活性を測定して評価した。アンチセンス鎖の5’末端に、I-32(2'-OMe-6-styryl-dA)、またはI-19(di-Me-thienyl-dU)を有するsiRNAのノックダウン活性を図5に示した。
試験例10の結果から、アンチセンス鎖の5’末端にAgo2高親和性塩基アナログを有するsiRNAは、アンチセンス5’末端に対応する天然型のヌクレオチドを有するsiRNAと比較して、高いノックダウン活性を示すことが分かる。【０３０７】
【表２４】
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【０３０８】
上記試験例９及び10の結果から、本発明によって活性向上したsiRNAを医薬応用することにより、天然型のsiRNAを用いる場合と比較して、投与量の抑制が期待できる。
【産業上の利用可能性】
【０３０９】
本発明により、AGO2との親和性が向上したオリゴヌクレオチド等が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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