(57)【要約】  通常用いられている市販抗体と比較して品質が安定した抗ＧＰＣ３および抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を作成し、それを用いて再現性の高いメラノーマの診断キットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）２０１２年４月２３日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）にそれぞれ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２６、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２７、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３２８、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２９、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３０、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３１、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３２、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３４、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３５、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３６およびＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３７として寄託された、クローン名２Ｃ１１、２Ｅ１１、２Ｈ１０、３Ｅ３、３Ｅ１０、３Ｅ１１、４Ｆ５、５Ｅ５、７Ｃ８、７Ｇ６、１０Ａ４およびＵ３Ｅからなる群から選択される１種以上のハイブリドーマにより生産される、ｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ２Ｅ１１、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂ４Ｆ５、ｍＡｂ５Ｅ５、ｍＡｂ７Ｃ８、ｍＡｂ７Ｇ６、ｍＡｂ１０Ａ４およびｍＡｂＵ３Ｅからなる群から選択される１種以上の抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を含む組成物、および、（２）２０１２年４月２３日に、ＮＰＭＤにそれぞれ、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３８、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３９、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４０、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４１、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４２、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４４およびＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４５として寄託された、クローン名Ｓ２Ｆ９、Ｓ１４Ａ７、Ｓ１４Ｃ１２、Ｓ１９Ｂ１、Ｓ２０Ｄ１０、Ｓ２３Ｃ１０、Ｓ２３Ｅ９およびＳ２５Ｈ９からなる群から選択される１種以上のハイブリドーマにより生産される、ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ａ７、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ１９Ｂ１、ｍＡｂＳ２０Ｄ１０、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択される１種以上の抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を含む組成物、を含む、悪性黒色腫（メラノーマ）の診断キット。
【請求項２】
抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体が、ｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ１０Ａ４、ｍＡｂＵ３Ｅ、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０およびｍＡｂ３Ｅ１１からなる群から選択される１種以上であり、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体が、ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択される１種以上である、請求項１に記載の診断キット。
【請求項３】
抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体が、ｍＡｂＵ３Ｅ、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１およびｍＡｂ３Ｅ３からなる群から選択される１種以上であり、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体が、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ２５Ｈ９およびｍＡｂＳ２３Ｅ９からなる群から選択される１種以上である、請求項１または２に記載の診断キット。
【請求項４】
ＥＬＩＳＡキットの形態にて提供される請求項１から３いずれかに記載の診断キット。
【請求項５】
サンドウィッチＥＬＩＳＡキットの形態にて提供される請求項４に記載の診断キット。
【請求項６】
抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ２Ｅ１１、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂ４Ｆ５、ｍＡｂ５Ｅ５、ｍＡｂ７Ｃ８、ｍＡｂ７Ｇ６、ｍＡｂ１０Ａ４およびｍＡｂＵ３Ｅからなる群から選択され、かつ、検出抗体がｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ２Ｅ１１、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂ４Ｆ５、ｍＡｂ５Ｅ５、ｍＡｂ７Ｃ８、ｍＡｂ７Ｇ６、ｍＡｂ１０Ａ４およびｍＡｂＵ３Ｅからなる群から選択される一種以上であるが、いずれも捕獲抗体とは異なるものであり、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ａ７、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ１９Ｂ１、ｍＡｂＳ２０Ｄ１０、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択され、かつ、検出抗体がｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ａ７、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ１９Ｂ１、ｍＡｂＳ２０Ｄ１０、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択される一種以上であるが、いずれも捕獲抗体とは異なるものである、請求項５に記載の診断キット。
【請求項７】
抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ１０Ａ４、ｍＡｂＵ３ＥおよびｍＡｂ３Ｅ１１からなる群から選択され、かつ、検出抗体がｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３およびｍＡｂ３Ｅ１０からなる群から選択される一種以上であり、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２およびｍＡｂＳ２３Ｃ１０からなる群から選択され、かつ、検出抗体がｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択される一種以上であるが、いずれも捕獲抗体とは異なるものである、請求項５または６に記載の診断キット。
【請求項８】
抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂＵ３ＥまたはｍＡｂ３Ｅ１１であり、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂＳ２３Ｃ１０またはｍＡｂＳ２Ｆ９である、請求項５から７いずれかに記載の診断キット。
【請求項９】
抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂＵ３ＥまたはｍＡｂ３Ｅ１１のいずれかであり、かつ、検出抗体がｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ１０およびｍＡｂ３Ｅ３からなる群から選択される一種以上であり、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂＳ２Ｆ９またはｍＡｂＳ２３Ｃ１０のいずれかであり、かつ、検出抗体がｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２５Ｈ９およびｍＡｂＳ２３Ｅ９からなる群から選択される一種以上であるが、いずれも捕獲抗体とは異なるものである、請求項５から８のいずれかに記載の診断キット。
【請求項１０】
被験者の血液、血清または血漿サンプルに対して用いられる請求項１から９いずれかに記載の診断キット。
【請求項１１】
被験者が白色人種である請求項１０に記載の診断キット。
【請求項１２】
（１）請求項１に記載の、ｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ２Ｅ１１、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂ４Ｆ５、ｍＡｂ５Ｅ５、ｍＡｂ７Ｃ８、ｍＡｂ７Ｇ６、ｍＡｂ１０Ａ４およびｍＡｂＵ３Ｅからなる群から選択される１種以上の抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を含む組成物、および、（２）請求項１に記載の、ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ａ７、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ１９Ｂ１、ｍＡｂＳ２０Ｄ１０、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択される１種以上の抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を含む組成物、を被験者からのサンプルと接触させることを含む、悪性黒色腫（メラノーマ）の検出方法。
【請求項１３】
サンプルが、被験者の血液、血清または血漿である請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
被験者が白色人種である請求項１３に記載の検出方法。
【請求項１５】
ＥＬＩＳＡ法によって行う請求項１２から１４いずれかに記載の検出方法。
【請求項１６】
免疫染色法によって行う請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の、ｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ２Ｅ１１、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂ４Ｆ５、ｍＡｂ５Ｅ５、ｍＡｂ７Ｃ８、ｍＡｂ７Ｇ６、ｍＡｂ１０Ａ４およびｍＡｂＵ３Ｅからなる群から選択される抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体。
【請求項１８】
ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂＵ３ＥおよびｍＡｂ３Ｅ３からなる群から選択される、請求項１７に記載の抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体。
【請求項１９】
請求項１に記載の、ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ａ７、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ１９Ｂ１、ｍＡｂＳ２０Ｄ１０、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択される抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体。
【請求項２０】
ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２５Ｈ９およびｍＡｂＳ２３Ｅ９からなる群から選択される、請求項１９に記載の抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体。
【請求項２１】
請求項１に記載の、２０１２年４月２３日に、ＮＰＭＤにそれぞれ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２６、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２７、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３２８、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２９、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３０、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３１、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３２、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３４、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３５、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３６およびＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３７として寄託された、クローン名２Ｃ１１、２Ｅ１１、２Ｈ１０、３Ｅ３、３Ｅ１０、３Ｅ１１、４Ｆ５、５Ｅ５、７Ｃ８、７Ｇ６、１０Ａ４およびＵ３Ｅからなる群から選択されるハイブリドーマ。
【請求項２２】
クローン名２Ｈ１０、３Ｅ１０、３Ｅ１１、Ｕ３Ｅおよび３Ｅ３からなる群から選択される、請求項２１に記載のハイブリドーマ。
【請求項２３】
請求項１に記載の、２０１２年４月２３日に、ＮＰＭＤにそれぞれ、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３８、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３９、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４０、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４１、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４２、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４４およびＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４５として寄託された、クローン名Ｓ２Ｆ９、Ｓ１４Ａ７、Ｓ１４Ｃ１２、Ｓ１９Ｂ１、Ｓ２０Ｄ１０、Ｓ２３Ｃ１０、Ｓ２３Ｅ９およびＳ２５Ｈ９からなる群から選択されるハイブリドーマ。
【請求項２４】
クローン名Ｓ２Ｆ９、Ｓ２３Ｃ１０、Ｓ２５Ｈ９およびＳ２３Ｅ９からなる群から選択される、請求項２３に記載のハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、悪性黒色腫（メラノーマ）の新規な診断キット、悪性黒色腫（メラノーマ）の検出方法、および該診断キットに使用される新規なモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】  メラノーマは、悪性黒色腫と呼ばれる皮膚癌の一種である。皮膚癌には種々の種類があるが、メラノーマは、悪性度が非常に高い皮膚癌である。皮膚を構成する細胞のなかに存在する、メラニン色素を産生する細胞を色素細胞（メラノサイト）と呼ぶが、この細胞が癌化したものがメラノーマである。【０００３】  日本におけるメラノーマの発生数は人口１０万人あたり１．５〜２人くらいと見積もられており、年間１５００人〜２０００人程度発生していると推測されている。欧米では人口１０万人あたり１０数人以上の発生数とされ、オーストラリアでは人口１０万人あたり２０数人以上の発生数が報告されており、世界で最も発生数が高いとされている。したがって、欧米やオーストラリアの人々、特に白色人種は、メラノーマに関心を有しており、メラノーマの発生に注意している。また、外国においても日本においてもメラノーマの発生は年々増加傾向が認められている。ある調査によると、日本におけるこの病気による年間死亡者数は４５０人前後にのぼると報告されている。【０００４】  メラノーマは何歳の人でも発生しているが、特に４０歳以上になると発生率が高くなり、６０歳〜７０歳台において最も発生率が高くなっている。小児の発生率は非常に少ないが、発生しないということはなく、最近２０〜３０歳台の若年者における発生が多くなっている傾向がある。性別では特にどちらかに多いという傾向はなく、男女どちらにも発生する。日本人において、メラノーマが発生しやすい部位は、足底（足のうら）が最も多く、約３割ぐらいを占めている。足や指の爪の部分にも多くできることが、日本人の特徴である。そのほか、欧米人と同様に体、手、足、顔、頭など、どこの皮膚においても発生する。【０００５】  一方、血清腫瘍マーカーの測定は、メラノーマの診断のみならず、術後症例における再発の早期発見と、進行期例の治療効果の判定に重要である。メラノーマの腫瘍マーカーとしては、従来、血清のＬＤＨや５−Ｓ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌｄｏｐａ（５−Ｓ−ＣＤ）の有用性が知られており、さらにより最近では、Ｓ−１００β蛋白およびｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＭＩＡ）がより鋭敏なマーカーとして報告されている。【０００６】  日本においては、既存の腫瘍マーカーとして、５−Ｓ−ＣＤが主に用いられているが、これらの従来用いられていた腫瘍マーカーは、ＳｔａｇｅＩＶといったかなり進行したものでないと陽性にならず、メラノーマの早期診断や、術後再発の早期発見という面では、有用性は限られているといわざるを得なかった。【０００７】  本発明者等はＧＰＣ３（グリピカン３；ｇｌｙｐｉｃａｎ−３）とＳＰＡＲＣ（Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｃｉｄｉｃ  ｒｉｃｈ  ｉｎ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ；別名ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎまたはＢＭ−４０）の腫瘍マーカーとしての有用性に関する研究を行っており、以前に、ＧＰＣ３およびＧＰＣ３とＳＰＡＲＣとの組み合わせが、メラノーマの腫瘍マーカーとして有用であり得ることを報告している（特許文献１および２）。【０００８】  しかし、特許文献１に記載のＧＰＣ３に対する抗体を用いる方法では、メラノーマ患者の陽性率は４０％程度であり、特許��献２に記載のＧＰＣ３に対する抗体とＳＰＡＲＣに対する抗体とを組み合わせて用いる方法でも、メラノーマ患者の陽性率は６０％程度であり、検出感度についてまだ改善の余地があった。【０００９】  さらに、これらの腫瘍マーカーの検出に通常用いられている市販抗体の品質が安定していないため、再現性が低いことも問題になっていた。【００１０】  なお、本明細書および図面、特に実施例において、本発明により提供する新規なモノクローナル抗体を「新規抗体」、当該新規抗体を用いる本発明の方法を「新規法」と称することがある。一方、現在通常用いられている市販の抗ＧＰＣ３抗体および抗ＳＰＡＲＣ抗体を「市販抗体」と称することがある。さらに、従来から既存の腫瘍マーカーとして用いられている、血清ＬＤＨや５−Ｓ−ＣＤを「従来の腫瘍マーカー」または「既存腫瘍マーカー」と称することがある。また、これらの従来の（既存）腫瘍マーカーを用いる方法を「従来法」と称することがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／０３９３８０号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００６／０４３３６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】  本発明の一つの目的は、メラノーマの早期診断を実現するために、抗ＧＰＣ３抗体や抗ＳＰＡＲＣ抗体を用いる診断キットの高感度化を図ることである。【００１３】  本発明のさらなる目的は、市販の抗ＧＰＣ３抗体および抗ＳＰＡＲＣ抗体（市販抗体）と比較して品質が安定した抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体および抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を作成し、それを用いて再現性の高い診断キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】  本発明は、上記課題に鑑み、メラノーマの早期診断に有用な腫瘍マーカーであるＧＰＣ３とＳＰＡＲＣを検出する新規なモノクローナル抗体、かかる新規抗体を用いたメラノーマの診断キット、およびメラノーマの検出方法を提供する。【００１５】  すなわち、本発明は以下：［１］：（１）２０１２年４月２３日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）にそれぞれ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２６、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２７、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３２８、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２９、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３０、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３１、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３２、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３４、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３５、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３６およびＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３７として寄託された、クローン名２Ｃ１１、２Ｅ１１、２Ｈ１０、３Ｅ３、３Ｅ１０、３Ｅ１１、４Ｆ５、５Ｅ５、７Ｃ８、７Ｇ６、１０Ａ４およびＵ３Ｅからなる群から選択される１種以上のハイブリドーマにより生産される、ｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ２Ｅ１１、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂ４Ｆ５、ｍＡｂ５Ｅ５、ｍＡｂ７Ｃ８、ｍＡｂ７Ｇ６、ｍＡｂ１０Ａ４およびｍＡｂＵ３Ｅからなる群から選択される１種以上の抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を含む組成物、および、（２）２０１２年４月２３日に、ＮＰＭＤにそれぞれ、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３８、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３９、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４０、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４１、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４２、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４４およびＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４５として寄託された、クローン名Ｓ２Ｆ９、Ｓ１４Ａ７、Ｓ１４Ｃ１２、Ｓ１９Ｂ１、Ｓ２０Ｄ１０、Ｓ２３Ｃ１０、Ｓ２３Ｅ９およびＳ２５Ｈ９からなる群から選択される１種以上のハイブリドーマにより生産される、ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ａ７、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ１９Ｂ１、ｍＡｂＳ２０Ｄ１０、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択される１種以上の抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を含む組成物、を含む、悪性黒色腫（メラノーマ）の診断キット；［２］：抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体が、ｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ１０Ａ４、ｍＡｂＵ３Ｅ、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０およびｍＡｂ３Ｅ１１からなる群から選択される１種以上であり、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体が、ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択される１種以上である、［１］に記載の診断キット；［３］：抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体が、ｍＡｂＵ３Ｅ、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１およびｍＡｂ３Ｅ３からなる群から選択される１種以上であり、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体が、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ２５Ｈ９およびｍＡｂＳ２３Ｅ９からなる群から選択される１種以上である、［１］または［２］に記載の診断キット；［４］：ＥＬＩＳＡキットの形態にて提供される［１］から［３］いずれかに記載の診断キット；［５］：サンドウィ���チＥＬＩＳＡキットの形態にて提供される［４］に記載の診断キット；［６］：抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ２Ｅ１１、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂ４Ｆ５、ｍＡｂ５Ｅ５、ｍＡｂ７Ｃ８、ｍＡｂ７Ｇ６、ｍＡｂ１０Ａ４およびｍＡｂＵ３Ｅからなる群から選択され、かつ、検出抗体がｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ２Ｅ１１、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂ４Ｆ５、ｍＡｂ５Ｅ５、ｍＡｂ７Ｃ８、ｍＡｂ７Ｇ６、ｍＡｂ１０Ａ４およびｍＡｂＵ３Ｅからなる群から選択される一種以上であるが、いずれも捕獲抗体とは異なるものであり、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ａ７、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ１９Ｂ１、ｍＡｂＳ２０Ｄ１０、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択され、かつ、検出抗体がｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ａ７、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ１９Ｂ１、ｍＡｂＳ２０Ｄ１０、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択される一種以上であるが、いずれも捕獲抗体とは異なるものである、［５］に記載の診断キット；［７］：抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ１０Ａ４、ｍＡｂＵ３ＥおよびｍＡｂ３Ｅ１１からなる群から選択され、かつ、検出抗体がｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３およびｍＡｂ３Ｅ１０からなる群から選択される一種以上であり、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２およびｍＡｂＳ２３Ｃ１０からなる群から選択され、かつ、検出抗体がｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択される一種以上であるが、いずれも捕獲抗体とは異なるものである、［５］または［６］に記載の診断キット；［８］：抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂＵ３ＥまたはｍＡｂ３Ｅ１１であり、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂＳ２３Ｃ１０またはｍＡｂＳ２Ｆ９である、［５］から［７］いずれかに記載の診断キット；［９］：抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂＵ３ＥまたはｍＡｂ３Ｅ１１のいずれかであり、かつ、検出抗体がｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ１０およびｍＡｂ３Ｅ３からなる群から選択される一種以上であり、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂＳ２Ｆ９またはｍＡｂＳ２３Ｃ１０のいずれかであり、かつ、検出抗体がｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２５Ｈ９およびｍＡｂＳ２３Ｅ９からなる群から選択される一種以上であるが、いずれも捕獲抗体とは異なるものである、［５］から［８］のいずれかに記載の診断キット；［１０］：被験者���血液、血清または血漿サンプルに対して用いられる［１］から［９］いずれかに記載の診断キット；［１１］：被験者が白色人種である［１０］に記載の診断キット；［１２］：（１）［１］に記載の、ｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ２Ｅ１１、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂ４Ｆ５、ｍＡｂ５Ｅ５、ｍＡｂ７Ｃ８、ｍＡｂ７Ｇ６、ｍＡｂ１０Ａ４およびｍＡｂＵ３Ｅからなる群から選択される１種以上の抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を含む組成物、および、（２）［１］に記載の、ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ａ７、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ１９Ｂ１、ｍＡｂＳ２０Ｄ１０、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択される１種以上の抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を含む組成物、を被験者からのサンプルと接触させることを含む、悪性黒色腫（メラノーマ）の検出方法；［１３］：サンプルが、被験者の血液、血清または血漿である［１２］に記載の検出方法；［１４］：被験者が白色人種である［１３］に記載の検出方法；［１５］：ＥＬＩＳＡ法によって行う［１２］から［１４］いずれかに記載の検出方法；［１６］：免疫染色法によって行う［１２］に記載の検出方法；［１７］：［１］に記載の、ｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ２Ｅ１１、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂ４Ｆ５、ｍＡｂ５Ｅ５、ｍＡｂ７Ｃ８、ｍＡｂ７Ｇ６、ｍＡｂ１０Ａ４およびｍＡｂＵ３Ｅからなる群から選択される抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体；［１８］：ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂＵ３ＥおよびｍＡｂ３Ｅ３からなる群から選択される、［１７］に記載の抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体；［１９］：［１］に記載の、ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ａ７、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ１９Ｂ１、ｍＡｂＳ２０Ｄ１０、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択される抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体；［２０］：ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２５Ｈ９およびｍＡｂＳ２３Ｅ９からなる群から選択される、［１９］に記載の抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体；［２１］：［１］に記載の、２０１２年４月２３日に、ＮＰＭＤにそれぞれ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２６、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２７、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３２８、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２９、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３０、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３１、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３２、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３４、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３５、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３６およびＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３７として寄託された、クローン名２Ｃ１１、２Ｅ１１、２Ｈ１０、３Ｅ３、３Ｅ１０、３Ｅ１１、４Ｆ５、５Ｅ５、７Ｃ８、７Ｇ６、１０Ａ４およびＵ３Ｅからなる群から選択されるハイブリドーマ；［２２］：クローン名２Ｈ１０、３Ｅ１０、３Ｅ１１、Ｕ３Ｅおよび３Ｅ３からなる群から選択される、［２１］に記載のハイブリドーマ；［２３］：［１］に記載の、２０１２年４月２３日に、ＮＰＭＤにそれぞれ、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３８、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３９、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４０、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４１、Ｎ��ＴＥ  Ｐ−１３４２、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４４およびＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４５として寄託された、クローン名Ｓ２Ｆ９、Ｓ１４Ａ７、Ｓ１４Ｃ１２、Ｓ１９Ｂ１、Ｓ２０Ｄ１０、Ｓ２３Ｃ１０、Ｓ２３Ｅ９およびＳ２５Ｈ９からなる群から選択されるハイブリドーマ；および、［２４］：クローン名Ｓ２Ｆ９、Ｓ２３Ｃ１０、Ｓ２５Ｈ９およびＳ２３Ｅ９からなる群から選択される、［２３］に記載のハイブリドーマ；を提供するものである。【００１６】寄託の説明  本明細書中、表１０において要約するように、本発明によって提供されるハイブリドーマのうち、クローン２Ｃ１１（日本国内受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２６）、２Ｅ１１（同ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２７）、４Ｆ５（同ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３２）、５Ｅ５（同ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３３）、７Ｃ８（同ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３４）、７Ｇ６（同ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３５）、１０Ａ４（同ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３６）、Ｓ１４Ａ７（同ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３９）、Ｓ１４Ｃ１２（同ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４０）、Ｓ１９Ｂ１（同ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４１）、およびＳ２０Ｄ１０（同ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４２）は、２０１２年４月２３日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、日本国内寄託されており、日本国内での寄託は継続中である。一方、クローン２Ｈ１０（国際受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３２８）、３Ｅ１０（同ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３０）、３Ｅ１１（同ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３１）、Ｕ３Ｅ（同ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３７）、Ｓ２Ｆ９（同ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３８）、Ｓ２３Ｃ１０（同ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４３）、およびＳ２５Ｈ９（同ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４５）については、いずれも２０１２年４月２３日に、ＮＰＭＤに日本国内寄託された後、２０１３年４月１日に、ブダペスト条約に基づく国際寄託への移管請求を行い、２０１３年６月７日に、国際寄託についての受託証が発行されている。さらに、クローン３Ｅ３（国内受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２９）およびＳ２３Ｅ９（国内受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４４）については、いずれも２０１２年４月２３日に、ＮＰＭＤに日本国内寄託された後、２０１３年６月１２日に、ブダペスト条約に基づく国際寄託への移管請求を行ったが、本願国際出願日において、国際寄託についての受託証は未発行である。これらの２クローンについては、生存試験に合格した後、それぞれ、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３２９およびＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４４という国際受託番号が付与された、国際寄託についての受託証が発行される予定である。
【発明の効果】
【００１７】  本発明により作成された新規モノクローナル抗体の組合せを含むメラノーマの診断キットは、例えば、サンドウィッチＥＬＩＳＡキットとして提供した場合、通常、ＧＰＣ３やＳＰＡＲＣに対して用いられている市販抗体を組み合わせたときよりも高感度なものである。本発明のモノクローナル抗体を用いたメラノーマの診断キットおよびメラノーマの検出方法は、早期のメラノーマの診断での陽性率が非常に高く、メラノーマの正確な診断を早期に行うために非常に有用である。さらに、本発明によって作成されたモノクローナル抗体は、メラノーマの診断・検出において、擬陽性がほぼ排除されており、特異性が高いものである。【００１８】  さらに、本発明によると、メラノーマと他の皮膚疾患との鑑別診断が可能である。また、本発明の新規抗体は、市販抗体と比較して優れた検出感度を示す。さらに、本発明によると、メラノーマ全体においても、ＡＬＭ（末端黒子型メラノーマ）、ＳＳＭ（表在拡大型メラノーマ）の診断においても、従来のＬＤＨや５−Ｓ−ＣＤによる診断よりも優れている。さらに、メラノーマの進行ステージにかかわらず本発明の方法ではメラノーマの診断が可能であり、ＬＤＨ検査などの従来法では判定できない、早期の症例も、本発明の方法では診断可能である。特に、根治の可能性がほぼ１００％と高いステージ０−１では、本発明の方法により優れた診断結果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】精製した抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡデータである。
【図２】精製した抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体のＥＬＩＳＡデータである。
【図３】抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体についてのサンドウィッチＥＬＩＳＡのための抗体の組み合わせの検討結果である。
【図４】抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体についてのサンドウィッチＥＬＩＳＡのための抗体の組み合わせの検討結果である。
【図５】捕獲抗体としてｍＡｂＵ３Ｅを用いた場合の血清ＧＰＣ３のサンドウィッチＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図６】捕獲抗体としてｍＡｂＳ２３Ｃ１０を用いた場合の血清ＳＰＡＲＣのサンドウィッチＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図７】新規抗体を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡを用いた日本人健常者１００人の血清中ＧＰＣ３、ＳＰＡＰＲＣ値によるカットオフの設定。
【図８】日本人メラノーマ以外皮膚科疾患２２例のＧＰＣ３、ＳＰＡＲＣ値。
【図９】日本人メラノーマ以外皮膚科疾患患者（ｎ＝２２）と日本人メラノーマ患者（ｎ＝５６）のＧＰＣ３値とＳＰＡＲＣ値の分布。
【図１０】メラノーマ病型別のＧＰＣ３とＳＰＡＲＣの陽性率。
【図１１】メラノーマ病期別のＧＰＣ３とＳＰＡＲＣの陽性率。
【図１２】ＧＰＣ３検出のための市販抗体を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡの性能（病型別・病期別）。
【図１３】病型別に分類した従来の腫瘍マーカーＬＤＨ・５−Ｓ−ＣＤ検査によるメラノーマ検出感度。
【図１４】病期別に分類した従来の腫瘍マーカーＬＤＨ・５−Ｓ−ＣＤ検査によるメラノーマ検出感度。
【図１５】オーストラリア人メラノーマ患者のＧＰＣ３およびＳＰＡＲＣの陽性率。
【図１６】オーストラリア健常者（ｎ＝１１）とオーストラリアメラノーマ患者（ｎ＝２８）のＧＰＣ３値とＳＰＡＲＣ値の分布。
【発明を実施するための形態】
【００２０】  以下、本発明の具体的な態様について説明するが、まず、本発明によって使用される、新規な抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体および抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体について説明する。
【００２１】  本発明において使用する抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体は、マウス脾臓細胞とマウスミエローマとの融合細胞である、ハイブリドーマ（クローン名）、２Ｃ１１、２Ｅ１１、２Ｈ１０、３Ｅ３、３Ｅ１０、３Ｅ１１、４Ｆ５、５Ｅ５、７Ｃ８、７Ｇ６、１０Ａ４またはＵ３Ｅにより生産される抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体である。当該ハイブリドーマは、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（本明細書および請求の範囲中、単にＮＰＭＤと称することもある）に、平成２４年（２０１２年）４月２３日付で寄託され、それぞれ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２６、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２７、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３２８、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２９（国際出願日後に、国際受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３２９が付与される予定）、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３０、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３１、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３２、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３４、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３５、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３６およびＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３７を付与された。なお、国内寄託、国際寄託の詳細については、上記［００１６］段落および下記表１０を参照されたい。
【００２２】  一方、本発明において使用する抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体は、マウス脾臓細胞とマウスミエローマとの融合細胞である、ハイブリドーマ（クローン名）、Ｓ２Ｆ９、Ｓ１４Ａ７、Ｓ１４Ｃ１２、Ｓ１９Ｂ１、Ｓ２０Ｄ１０、Ｓ２３Ｃ１０、Ｓ２３Ｅ９またはＳ２５Ｈ９により生産される抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体である。当該ハイブリドーマは、ＮＰＭＤに、平成２４年（２０１２年）４月２３日付で寄託され、それぞれ、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３８、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３９、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４０、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４１、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４２、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４４（国際出願日後に、国際受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４４が付与される予定）およびＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４５を付与された。なお、国内寄託、国際寄託の詳細については、上記［００１６］段落および下記表１０を参照されたい。
【００２３】  本明細書および特許請求の範囲において、上記ハイブリドーマは、単にそれぞれのクローン名で称することもある。一方、上記ハイブリドーマによって生産されるそれぞれのモノクローナル抗体は、それを生産するハイブリドーマのクローン名の前にモノクローナル抗体を表す略称である、「ｍＡｂ」をつけて表す。
【００２４】  すなわち、ＮＰＭＤにそれぞれ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２６、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２７、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３２８、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２９、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３０、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３１、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３２、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３４、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３５、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３６およびＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３７として寄託された、クローン名２Ｃ１１、２Ｅ１１、２Ｈ１０、３Ｅ３、３Ｅ１０、３Ｅ１１、４Ｆ５、５Ｅ５、７Ｃ８、７Ｇ６、１０Ａ４およびＵ３Ｅと称するハイブリドーマにより生産される抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体をそれぞれ、ｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ２Ｅ１１、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂ４Ｆ５、ｍＡｂ５Ｅ５、ｍＡｂ７Ｃ８、ｍＡｂ７Ｇ６、ｍＡｂ１０Ａ４およびｍＡｂＵ３Ｅと称し、ＮＰＭＤにそれぞれ、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３８、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３９、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４０、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４１、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４２、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４４およびＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４５として寄託された、クローン名Ｓ２Ｆ９、Ｓ１４Ａ７、Ｓ１４Ｃ１２、Ｓ１９Ｂ１、Ｓ２０Ｄ１０、Ｓ２３Ｃ１０、Ｓ２３Ｅ９およびＳ２５Ｈ９と称するハイブリドーマにより生産される抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体をそれぞれ、ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ａ７、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ１９Ｂ１、ｍＡｂＳ２０Ｄ１０、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９と称することとする。ただし、実施例および図面において、簡略化のために、各モノクローナル抗体の上記名称から「ｍＡｂ」を省き、各モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマのクローン名の上記名称のみによって、各モノクローナル抗体を特定することもある。
【００２５】  なお、本明細書および特許請求の範囲において、上記ｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ２Ｅ１１、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂ４Ｆ５、ｍＡｂ５Ｅ５、ｍＡｂ７Ｃ８、ｍＡｂ７Ｇ６、ｍＡｂ１０Ａ４およびｍＡｂＵ３Ｅを総称する場合、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体あるいは抗ＧＰＣ３ｍＡｂと称し、単に抗ＧＰＣ３抗体と称する場合もある。同様に、上記ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ａ７、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ１９Ｂ１、ｍＡｂＳ２０Ｄ１０、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９を総称する場合、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体あるいは抗ＳＰＡＲＣｍＡｂと称し、単に抗ＳＰＡＲＣ抗体と称する場合もある。
【００２６】  本明細書および特許請求の範囲において、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体および抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体は、それぞれのフラグメント、およびキメラ抗体およびヒト化抗体などの改変抗体ならびに変異抗体も含む。抗体のフラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメントが挙げられる。これらのフラグメント、改変抗体および変異抗体もまた、元の抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体または抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体と同様に、それぞれＧＰＣ３またはＳＰＡＲＣタンパク質に対する特異性を有するものである。これらは、当業者に周知の手段・方法により製造されうる。
【００２７】  次に、本発明に使用する抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体および抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体の取得方法について説明する。
【００２８】  抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体の取得に用いたヒトＧＰＣ３タンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋのタンパク質データベースにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００４４７５として登録されており、当業者であれば容易に入手することができる。一方、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体の取得に用いたヒトＳＰＡＲＣタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋのタンパク質データベースにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００３１１８として登録されており、当業者であれば容易に入手することができる。
【００２９】  本発明の抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体および抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体は、例えば、マウスなどの哺乳動物をそれぞれＧＰＣ３タンパク質またはその断片あるいはＳＰＡＲＣタンパク質またはその断片で免疫し、免疫動物の脾臓細胞とミエローマとを融合させてハイブリドーマを作製し、これを培養することにより得ることができる。一方、他の当業者に周知の方法、例えば、遺伝子組み換え法、化学合成法などを用いてかかるモノクローナル抗体を製造してもよい。なお、本発明のためのモノクローナル抗体は、ＧＰＣ３またはＳＰＡＲＣのいかなるエピトープを認識する抗体であって良い。
【００３０】  具体的には、後述の実施例に記載するように、ＧＰＣ３およびＳＰＡＲＣに対するモノクローナル抗体を作製するために、ＧＰＣ３タンパク質またはＳＰＡＲＣタンパク質をフロイント不完全アジュバントあるいは人工アジュバントであるＴｉｔｅｒＭａｘ  ＧＯＬＤ（ＴｉｔｅｒＭＡＸ）と混合エマルジョンを作製して、ＢＡＬＢ／ｃマウスの鼠蹊部リンパ節やフットパットに免疫し、頻回免疫を行った。最終免疫後、脾臓を採取して、脾臓Ｂ細胞とミエローマとをＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ）を用いて細胞融合を行った。ＨＡＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）存在下のＲＰＭＩ１６４０培地中でハイブリドーマの選択培養を２週間行い、融合細胞を選択した。さらに培養上清に分泌された抗体をＧＰＣ３またはＳＰＡＲＣを被覆したＥＬＩＳＡによりスクリーニングを行い、抗体を産生するハイブリドーマを選択した。かかるハイブリドーマを、当業者に周知の培養条件により培養することにより、本発明の抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体および抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を得ることができる。なお、得られたモノクローナル抗体は、以下のようにして精製することができる。
【００３１】  目的の抗体を産生するハイブリドーマを培養して得られる培養上清、あるいはハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃまたはヌードマウスの腹腔に接種して数週間後に得られる腹水よりモノクローナル抗体を精製する。抗体の精製はＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたアフィニティー精製によって行うことができる。またはＧＰＣ３またはＳＰＡＲＣは、ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの、リガンドカップリング担体に固定化して作製される抗原カラムによっても精製できる。
【００３２】  次に、本発明の具体的な態様について詳細に説明する。  本発明は、第一の態様において、上記［１］に記載の悪性黒色腫（メラノーマ）の診断キットを提供する。かかる診断キットは、（１）ｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ２Ｅ１１、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂ４Ｆ５、ｍＡｂ５Ｅ５、ｍＡｂ７Ｃ８、ｍＡｂ７Ｇ６、ｍＡｂ１０Ａ４およびｍＡｂＵ３Ｅからなる群から選択される１種以上の抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を含む組成物（以下、組成物（１）とも称する）、および、（２）ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ａ７、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ１９Ｂ１、ｍＡｂＳ２０Ｄ１０、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択される１種以上の抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を含む組成物（以下、組成物（２）とも称する）を必須に含む。本発明のキットは、上記組成物（１）および組成物（２）の他に、例えば、サンプル採取手段、標識、反応容器、検出用試薬（例えば、二次抗体、発色試薬、緩衝液等）等を適宜含んでいてもよい。具体的には、例えば、本発明のキットは、サンドウィッチ法、競合法、直接吸着法などのＥＬＩＳＡに必要な試薬や、ウェスタンブロッティング法などの分析を行うために必要な試薬を含んでいてもよい。一般的には、キットには取扱説明書を添付する。
【００３３】  本発明のキットに含まれる組成物（１）および組成物（２）は、それぞれｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ２Ｅ１１、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂ４Ｆ５、ｍＡｂ５Ｅ５、ｍＡｂ７Ｃ８、ｍＡｂ７Ｇ６、ｍＡｂ１０Ａ４およびｍＡｂＵ３Ｅからなる群から選択される１種以上の抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体、およびｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ａ７、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ１９Ｂ１、ｍＡｂＳ２０Ｄ１０、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択される１種以上の抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を必須に含むものである。各組成物中に含まれる抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体または抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体はそれぞれ１種でもよいし、２種以上でもよい。２種以上のモノクローナル抗体を含めることで、本発明の診断キットの感度、特異性、精度を向上させることができる。
【００３４】  本発明のキットにおいて、上記組成物（１）および組成物（２）に含まれる抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体および抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体は標識されたものであってもよい。様々な標識が当業者に周知であり、適宜選択して用いることができる。標識としては、例えば、ビオチン、Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ＤＩＧ）、Ａｃｒｉｄｉｕｍ  Ｅｓｔｅｒ、Ｆｌａｓｈｌｉｇｈｔなどの化学物質、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ＡＬＰ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素、ＦＩＴＣ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ類、ＢＯＤＩＰＹ類、ＩＲＤｙｅ類、ＭＦＰ類、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ類、ＡＭＣＡ、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、ＢＭＰ、Ｃｙ２、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５、ＤＴＡＦ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４７、ＦｌｕｏｒｏＮａｎｏｇｏｌｄ、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ、Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ、Ｒ−ＰＥ、Ｓａｐｏｒｉｎ、ＴＲＩＴＣなどの蛍光標識、６０ｍｍ  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄなどのビーズ、ＭａｇＣｅｌｌｅｃｔ  Ｆｅｒｒｏｆｌｕｉｄ（登録商標）などの磁気ビーズ、１２５Ｉなどの放射標識、金粒子、Ａｇａｒｏｓｅなどの標識が挙げられる。
【００３５】  さらに本発明のキットに含まれる組成物（１）および組成物（２）は、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体または抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体の他に、必要に応じて、バッファー、培地成分、賦形剤、添加剤、および担体などの種々の物質を含んでいてもよい。
【００３６】  本発明のキットに含まれる組成物（１）および組成物（２）に含まれる、所望により標識されていてもよい抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体または抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体の濃度は特に限定されず、キットの形態等に応じて適宜選択できる。例えば、モノクローナル抗体は、組成物中それぞれ０．１から１０μｇ／ｍｌ程度の濃度で用いることができる。
【００３７】  抗原に対する特異性や、メラノーマの検出感度の点から、本発明のキットに含まれる組成物（１）に含まれる抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体として好ましいものは、ｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ１０Ａ４、ｍＡｂＵ３Ｅ、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０およびｍＡｂ３Ｅ１１からなる群から選択される１種以上であり、組成物（２）に含まれる抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体として好ましいものは、ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択される１種以上である。
【００３８】  さらに好ましくは、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体は、ｍＡｂＵ３Ｅ、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１およびｍＡｂ３Ｅ３からなる群から選択される１種以上である。また、さらに好ましい抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体はｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ２５Ｈ９およびｍＡｂＳ２３Ｅ９からなる群から選択される１種以上である。
【００３９】  本発明のキットにおいて採用される診断・検出方法としては、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などのＥＬＩＳＡ法、イムノブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、免疫沈降法、プロテインアレイを用いる方法、フローサイトメーターを用いる方法、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、生物発光酵素免疫測定法（ＢＬＥＩＡ）、毛細管現象によって輸液可能な展開器材（免疫測定用試験片）を用いる測定法、イムノクロマト法、免疫染色法、凝集法などが挙げられる。
【００４０】  本発明においては、診断キットは、好ましくはＥＬＩＳＡキットの形態にて提供され、さらに好ましくはサンドウィッチＥＬＩＳＡキットの形態にて提供される。ＥＬＩＳＡキットは、特殊な設備などを必要とせず、抗原抗体反応を迅速かつ容易に行うことができる。サンドイッチＥＬＩＳＡキットでは、同一タンパク質を異なるエピトープで認識する２種類の抗体を使用する必要があるが、同一タンパク質を捕獲抗体と検出抗体の２種類の抗体を用いて検出する性質上、特異性が非常に高い点で特に好ましい。
【００４１】  具体的には、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡでは、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を用意し、一方の抗体（捕獲抗体）はプレートに吸着させておく。サンプルをプレートに接触させて反応を行い、さらに抗原認識部位の異なる他方の抗体（検出抗体）を反応させ、検出抗体の結合を標識の使用等により検出する。検出抗体の結合の検出は、例えば、実施例に記載のように、検出抗体をビオチン化し、ビオチン化検出抗体の添加後、（ストレプト）アビジンとセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素の複合体をプレートに添加する。次いで酵素により発色する基質を添加して発色反応させた後、分光光度計により発色強度を測定することにより、サンプル中のＧＰＣ３およびＳＰＡＲＣの検出または測定を行うことができる。検出抗体に結合させる標識としてはビオチンが代表的であるが、その他の標識を用いてもよいし、直接酵素を結合させてもよい。
【００４２】  本発明の診断キットをサンドウィッチＥＬＩＳＡの形態で提供する場合、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ２Ｅ１１、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂ４Ｆ５、ｍＡｂ５Ｅ５、ｍＡｂ７Ｃ８、ｍＡｂ７Ｇ６、ｍＡｂ１０Ａ４およびｍＡｂＵ３Ｅからなる群から選択され、かつ、検出抗体がｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ２Ｅ１１、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂ４Ｆ５、ｍＡｂ５Ｅ５、ｍＡｂ７Ｃ８、ｍＡｂ７Ｇ６、ｍＡｂ１０Ａ４およびｍＡｂＵ３Ｅからなる群から選択される一種以上であるが、いずれも捕獲抗体とは異なるものであり、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ａ７、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ１９Ｂ１、ｍＡｂＳ２０Ｄ１０、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択され、かつ、検出抗体がｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ａ７、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ１９Ｂ１、ｍＡｂＳ２０Ｄ１０、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択される一種以上であるが、いずれも捕獲抗体とは異なるものであるのが好ましい。なお、検出抗体は、１種類のｍＡｂを用いてもよいし、２種以上のｍＡｂを混合したカクテルとして用いてもよい。
【００４３】  本発明の診断キットをサンドウィッチＥＬＩＳＡの形態で提供する場合、特異性や検出感度の点から、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ１０Ａ４、ｍＡｂＵ３ＥおよびｍＡｂ３Ｅ１１からなる群から選択され、かつ、検出抗体がｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３およびｍＡｂ３Ｅ１０からなる群から選択される一種以上であり、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２およびｍＡｂＳ２３Ｃ１０からなる群から選択され、かつ、検出抗体がｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択される一種以上であるが、いずれも捕獲抗体とは異なるものであることがより好ましく、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂＵ３ＥまたはｍＡｂ３Ｅ１１であり、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂＳ２３Ｃ１０またはｍＡｂＳ２Ｆ９であるのがさらに好ましい。
【００４４】  さらに、本発明の診断キットにおいて、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂＵ３ＥまたはｍＡｂ３Ｅ１１のいずれかであり、かつ、検出抗体がｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ１０およびｍＡｂ３Ｅ３からなる群から選択される一種以上であり、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法における捕獲抗体がｍＡｂＳ２Ｆ９またはｍＡｂＳ２３Ｃ１０のいずれかであり、かつ、検出抗体がｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２５Ｈ９およびｍＡｂＳ２３Ｅ９からなる群から選択される一種以上であるが、いずれも捕獲抗体とは異なるものであるのが特に好ましい。
【００４５】  本発明の診断キットによって分析されるサンプルは、特に限定されず、ＧＰＣ３タンパク質および／またはＳＰＡＲＣタンパク質が含まれる可能性があるいずれのサンプルであってもよい。好ましくは、サンプルは、被験者の血液、血清または血漿サンプルである。
【００４６】  また、被験者も特に限定されず、日本人、オーストラリア人等の欧米人をはじめ世界中いかなる地域の被験者であってもよいが、陽性率の点から特にオーストラリア人などの白色人種であるのが好ましい。
【００４７】  本発明の診断キットを用いることにより、メラノーマの早期診断を特異的かつ高い陽性率にて行うことができる。
【００４８】  本発明は、第二の態様において、上記［１２］に記載の、上記第一の態様において詳細に説明した、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を含む組成物（組成物（１））、および、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を含む組成物（組成物（２））を被験者からのサンプルと接触させることを含む、悪性黒色腫（メラノーマ）の検出方法を提供する。
【００４９】  本発明の検出方法では、サンプルと抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を含む組成物（組成物（１））を接触させること、および、サンプルと、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を含む組成物（組成物（２））を接触させることによって、サンプル中のＳＰＡＲＣおよびＧＰＣ３の存在または量を検出することができる。サンプル中のＳＰＡＲＣおよび／またはＧＰＣ３の存在は、被験者が悪性黒色腫（メラノーマ）に罹患していることの指標となる。
【００５０】  サンプルと組成物（１）および組成物（２）との接触は、当該技術分野において通常行われている方法に基づいて行えばよく、特に限定するものではない。本発明の検出方法は、好ましくはインビトロにて行う。
【００５１】  サンプルに存在するＧＰＣ３タンパク質および／またはＳＰＡＲＣタンパク質と、本発明の抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体および／または抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体との結合の検出は、当業者に周知のいかなる方法によって行ってもよく、詳しくは上記第一の態様において記載した検出手段が挙げられる。また、本発明の検出方法において用いる組成物（１）および組成物（２）に含まれる抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体および抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体はいずれも抗原抗体反応の検出手段に応じて適宜標識したものであってもよい。標識は、当業者に周知のいかなるものであってもよく、詳しくは上記第一の態様において記載した標識が挙げられる。
【００５２】  例えば、本発明の検出方法によりサンプル中のＧＰＣ３および／またはＳＰＡＲＣの存在または量を検出するためには、サンプルと組成物（１）および組成物（２）に含まれる抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体および抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体とを反応させ、反応生成物である複合体を検出すればよい。酵素、放射性物質、蛍光物質などの標識をあらかじめ抗体に結合させておくことにより、反応生成物である複合体を検出することが可能になる。具体的には、例えばサンドイッチ法、競合法、直接吸着法などのＥＬＩＳＡ、凝集法、またはウエスタンブロッティング法などの公知の検出・測定法によりＧＰＣ３および／またはＳＰＡＲＣの存在または量を検出することによって、被験者が悪性黒色腫（メラノーマ）に罹患しているか否かの診断のための指標が得られる。
【００５３】  また、検出のための反応をウェル等の液相中で行ってもよく、あるいは抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体または抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を固定した固相支持体上で行ってもよい。この場合、メラノーマに罹患していない正常なサンプル、あるいはメラノーマであることが判明しているサンプルを用いて予め作製した標準値と比較することによって、測定された値がメラノーマ陽性であるか否かを判定することができる。また、検出の際には、多数のメラノーマ患者と健常人の血清中ＧＰＣ３およびＳＰＡＲＣ量を測定して、カットオフ値を設定することが好ましい。
【００５４】  本発明の検出方法に供されるサンプルは特に限定されず、いずれのサンプルであってもよいが、好ましくはメラノーマに罹患しているおそれのある被験者から得られる血液、唾液又は尿などの体液、あるいは皮膚組織切片等が挙げられ、特に好ましくは被験者の血液、血清または血漿である。
【００５５】  例えば、皮膚組織切片をサンプルとする場合は、常法に従って作製した臓器の組織切片に対して、本発明の組成物（１）および組成物（２）にそれぞれ含まれる抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体および抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を用いて、免疫染色を行い、ＧＰＣ３およびＳＰＡＲＣの発現の有無を見ることによって、悪性黒色腫（メラノーマ）の検出を行うことができる。
【００５６】  一方、被験者の血液、血清または血漿などの体液をサンプルとする場合には、例えばサンプルと本発明の組成物（１）および組成物（２）にそれぞれ含まれる抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体および抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体との接触の後、サンプル中に存在し得るＧＰＣ３および／またはＳＰＡＲＣと抗体との特異的結合を、蛍光物質や発光物質、酵素等の標識を使用して検出することができる。
【００５７】  本発明の検出方法に供する被験者も特に限定されず、日本人、オーストラリア人等の欧米人をはじめ世界中いかなる地域の被験者であってもよいが、陽性率の点から特にオーストラリア人などの白色人種であるのが好ましい。
【００５８】  上記の通り、本発明の検出方法において、サンプルに存在するＧＰＣ３タンパク質および／またはＳＰＡＲＣタンパク質と、本発明の抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体および／または抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体との結合の検出は、当業者に周知のいかなる方法によって行ってもよく、詳しくは上記第一の態様において記載した検出手段が挙げられる。
【００５９】  上記第一の態様において記載した検出手段のなかでも、ＥＬＩＳＡ法が、特殊な設備を必要とせず、ＧＰＣ３タンパク質および／またはＳＰＡＲＣタンパク質の存在または量の検出を迅速かつ容易に行うことができるため、好ましく用いられる。ＥＬＩＳＡ法のなかでも、上記のようにサンドウィッチＥＬＩＳＡ法が特に好ましい。
【００６０】  本発明の検出方法において、別の好ましい検出手段としては、免疫染色法が挙げられる。免疫染色法は当業者に周知の方法によって行うことができる。
【００６１】  本発明の検出方法において用いる、好ましい抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体および抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体の具体的な例については、上記第一の態様において記載したとおりである。
【００６２】  本発明の検出方法は、メラノーマに罹患しているか否かを診断するための指標を得るために用いることができる他、メラノーマに対する治療の効果の指標を得るために経時的に行うこともできる。
【００６３】  本発明は、第三の態様において、上記第一の態様の診断キットおよび第二の態様の検出方法に好適に用いられる、ｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ２Ｅ１１、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂ４Ｆ５、ｍＡｂ５Ｅ５、ｍＡｂ７Ｃ８、ｍＡｂ７Ｇ６、ｍＡｂ１０Ａ４およびｍＡｂＵ３Ｅからなる群から選択される抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体、および、ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ａ７、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ１９Ｂ１、ｍＡｂＳ２０Ｄ１０、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９からなる群から選択される抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体を提供する。
【００６４】  特に好ましくは、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体は、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ１１、ｍＡｂＵ３ＥおよびｍＡｂ３Ｅ３からなる群から選択され、抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体は、ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２５Ｈ９およびｍＡｂＳ２３Ｅ９からなる群から選択される。
【００６５】  上記の通り、本発明の抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体および抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体は、それぞれのフラグメント、およびキメラ抗体およびヒト化抗体などの改変抗体ならびに変異抗体も含む。抗体のフラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメントが挙げられる。これらのフラグメント、改変抗体および変異抗体もまた、元の抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体または抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体と同様に、それぞれＧＰＣ３またはＳＰＡＲＣタンパク質に対する特異性を有するものである。これらは、当業者に周知の手段・方法により製造されうる。
【００６６】  本発明は、第四の態様において、上記第三の態様のモノクローナル抗体を生産する、ＮＰＭＤにそれぞれ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２６、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２７、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３２８、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２９、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３０、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３１、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３２、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３４、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３５、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３６およびＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３７として寄託された、クローン名２Ｃ１１、２Ｅ１１、２Ｈ１０、３Ｅ３、３Ｅ１０、３Ｅ１１、４Ｆ５、５Ｅ５、７Ｃ８、７Ｇ６、１０Ａ４およびＵ３Ｅからなる群から選択されるハイブリドーマ；および、ＮＰＭＤにそれぞれ、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３８、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３９、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４０、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４１、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４２、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４４およびＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４５として寄託された、クローン名Ｓ２Ｆ９、Ｓ１４Ａ７、Ｓ１４Ｃ１２、Ｓ１９Ｂ１、Ｓ２０Ｄ１０、Ｓ２３Ｃ１０、Ｓ２３Ｅ９およびＳ２５Ｈ９からなる群から選択されるハイブリドーマを提供する。
【００６７】  特に好ましくは、クローン名２Ｈ１０、３Ｅ１０、３Ｅ１１、Ｕ３Ｅおよび３Ｅ３からなる群から選択されるハイブリドーマ；および、クローン名Ｓ２Ｆ９、Ｓ２３Ｃ１０、Ｓ２５Ｈ９およびＳ２３Ｅ９からなる群から選択されるハイブリドーマを提供する。
【００６８】  以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６９】  本発明では、従来知られている抗ＧＰＣ３抗体や抗ＳＰＡＲＣ抗体を用いるメラノーマの診断キットの更なる高感度化を目的に、新規なモノクローナル抗体の作製を実施した。具体的には、以下に詳細に説明するように、２０クローンのハイブリドーマを樹立し、抗体精製を行った。精製した抗体を基にサンドウィッチＥＬＩＳＡを構築し、日本人メラノーマ患者血清（１０名）およびオーストラリア人メラノーマ患者血清（１０名）を用いて検証実験を実施した。その結果、用いるモノクローナル抗体の組合せによると、１００％ないし１００％に近い、メラノーマ患者の非常に高い陽性率が達成された。【００７０】  さらに、日本人健常人血清（１００名）、日本人メラノーマ以外皮膚科疾患患者血清（２２名）、日本人メラノーマ患者血清（５６名）およびオーストラリア人健常人血清（１１名）、オーストラリア人メラノーマ患者血清（２８名）を用いて追加の検証実験を実施した。日本人メラノーマにおいて、新規法ＧＰＣ３／ＳＰＡＲＣ組み合わせによる診断は、遠隔転移のないステージ０−３のメラノーマの診断、特に根治の可能性の高いステージ０−１の診断において、従来の腫瘍マーカー、ＬＤＨ、５−Ｓ−ＣＤによる診断より優れていた。また、メラノーマ以外皮膚科疾患患者との鑑別にも有用なことが示された。オーストラリア人メラノーマにおいても、ＧＰＣ３陽性率８２.１％、ＳＰＡＲＣ陽性率６７.９％と極めて高いことが示された。【００７１】  実施例において、以下の略語を用いる。（略語）ＧＰＣ３；  ｇｌｙｐｉｃａｎ−３ＳＰＡＲＣ；  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ａｃｉｄｉｃ  ｒｉｃｈ  ｉｎ  ｃｙｓｔｅｉｎｅＬＤＨ；ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  乳酸脱水素酵素５−Ｓ−ＣＤ；  ５−Ｓ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｄｏｐａＡＬＭ；  Ａｃｒａｌ  ｌｅｎｔｉｇｉｎｏｕｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ  末端黒子型メラノーマＳＳＭ；  Ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ｍｅｌａｎｏｍａ  表在拡大型メラノーマＬＭＭ；  Ｌｅｎｔｉｇｏ  ｍａｌｉｇｎａ  ｍｅｌａｎｏｍａ  悪性黒子型メラノーマＮＮ；  ｎｏｄｕｌａｒ  ｍｅｌａｎｏｍａ  結節型メラノーマ  なお、実施例において「室温」とは約１０〜３５℃を意味するものとする。【００７２】［実施例１］モノクローナル抗体の作製方法【００７３】［１−１］抗原の調整  １０μｇの組み換え  ＧＰＣ３（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＰ＿００４４７５）またはＳＰＡＲＣ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｌｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＭ＿００３１１８）を１００μＬ  ＰＢＳ中に調整し、人工アジュバントＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）  （ＴｉｔｅｒＭａｘ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．）とエマルジョンシリンジを用いて混合して免疫抗原とした。【００７４】［１−２］マウスの免疫  ＧＰＣ３タンパク質またはＳＰＡＲＣタンパク質とアジュバントとの混合エマルジョンをＢＡＬＢ／ｃマウスの鼠蹊部リンパ節周辺、腹腔、フットパットに接種した。２週間ごとにタンパク質のみの頻回免疫を３回行い、同時に尾静脈から少量採血してＥＬＩＳＡを用いて血清抗体価を測定した。細胞融合の３日前に１０μｇのＧＰＣ３タンパク質またはＳＰＡＲＣタンパク質で最終免疫した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢雌、ＳＰＦ飼育）を抗ＧＰＣ３抗体作製用または抗ＳＰＡＲＣ抗体作製用に各々５匹ずつ用いた。【００７５】［１−３］ＥＬＩＳＡを用いた血清抗体価の測定  ０．１μｇ／ｍＬに調整したＧＰＣ３タンパク質またはＳＰＡＲＣタンパク質を９６  ウェルＥＬＩＳＡプレート（９６  ｗｅｌｌ  Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ））に固定化した後、ＰＢＳ中４％Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）を２００μＬ／ウェルにて添加してブロッキングした。室温で１時間以上インキュベーションして、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を用いて洗浄した。免疫したマウス血清を１００から１００００倍希釈して、上記のＥＬＩＳＡプレートに５０μＬ／ウェルにて添加して２時間、室温でインキュベーションした。ＰＢＳＴで洗浄した後、ヤギ  抗マウス  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）  ＨＲＰ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ，（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｉｎｃ．）を添加して２時間インキュベーションした。ＰＢＳＴで洗浄後、水分を十分に除去してからＴＭＢ  基質を５０μＬ／ウェルにて添加し、発色させた。【００７６】  ０．１８Ｍ  硫酸を重層して発色反応を停止した。プレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  ｍｏｄｅｌ  ５５０）により４５０ｎｍにおける吸光度を測定して解析を行った。【００７７】  ＥＬＩＳＡにより血清抗体価上昇が確認されたマウスを細胞融合に用いた。【００７８】［１−４］細胞融合  本工程では目的に応じて下記の組成で構成される４種類の調整培地を用いた：１）無血清培地；ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ）＋ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン、２）ＨＡＴ選択培地；ＨＡＴ（ヒポキサンチン・チミジン・アミノプテリン）＋１０％牛胎児血清＋ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン＋ＢＭ  ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１（Ｒｏｃｈｅ）＋ＲＰＭＩ１６４０、３）ＨＴ選択培地；ＨＴ（ヒポキサンチン・チミジン）＋１０％牛胎児血清＋ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン＋ＢＭ−ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１（Ｒｏｃｈｅ）＋ＲＰＭＩ１６４０、４）ハイブリドーマ培養培地；１０％牛胎児血清＋ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン＋ＢＭ−ｃｏｎｄｉｍｅｄ  ＭＥＭ＋ＮＡＥＥ＋ピルビン酸ナトリウム溶液  ＋ＲＰＭＩ１６４０。  なお、これらの培地成分について以下に詳細に説明する。・ＨＡＴ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、商品名：ＨＡＴ  サプリメント（５０Ｘ）、組成；５ｍＭヒポキサンチンナトリウム、２０μＭチミジン、０．８ｍＭアミノプテリン；５０倍希釈にて使用。・ＨＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、商品名：ＨＴ  サプリメント（１００Ｘ）、組成；１０ｍＭヒポキサンチンナトリウム、１．６ｍＭチミジン；１００倍希釈にて使用。・ＢＭ  ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１（Ｒｏｃｈｅ）；公開されている主な組成；  ＰＭＡ刺激マウスリンパ腫細胞系の上澄と、１  ｍＭ  オキザロ酢酸，２００  ｎＭ  インスリン，  １  ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−６，１０  ｎＭ  ＰＭＡ，１５％  ＦＢＳ；最終濃度１０％添加して使用。・ペニシリン−ストレプトマ���シン−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、商品名；ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（１００×）、濃度；１０，０００単位／ｍｌペニシリン、１０，０００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２９．２ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−グルタミン；１００倍希釈にて使用。・ＮＥＡＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、商品名；ＭＥＭ  非必須アミノ酸溶液（１００×）、組成；１０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ，  １０ｍＭ  Ｌ−Ａｌａｎｉｎｅ，  １０ｍＭ  Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，  １０ｍＭ  Ｌ−Ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ，  １０ｍＭ  −Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ，  １０ｍＭ  Ｌ−Ｐｒｏｌｉｎｅ，  １０ｍＭ  Ｌ−Ｓｅｒｉｎｅ；１００倍希釈にて使用。・ピルビン酸ナトリウム溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、商品名；ピルビン酸ナトリウム溶液  １００ｍＭ（１００×）、濃度１００ｍＭ；１００倍希釈で使用。【００７９】  ＢＡＬＢ／ｃマウスを最終免疫後３日以内に、脾臓を採取してフロストスライドグラスの粗面でホモジナイズして細胞浮遊液をナイロンメッシュでろ過した。【００８０】  遠心洗浄した脾細胞を２０ｍＬの無血清培地に再浮遊させて、総細胞数を血球計算盤で数えた。脾臓融合パートナーのミエローマ細胞株Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ．１４（マウスミエローマ細胞株Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ．１４はＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋより入手した。）を遠心洗浄して、無血清培地に浮遊し細胞数を数えた。【００８１】  脾細胞とミエローマの細胞比を５：１として混合して遠心洗浄した。５０％ＰＥＧ１５００  溶液（３７℃保温）１ｍＬを細胞混合ペレットにゆっくりと２分間をかけてピペットで攪拌しながら添加した。【００８２】  無血清培地（３７℃保温）１ｍＬを１分間かけてゆっくりと撹拌しながら２回添加を行った。さらに無血清培地（３７℃）７ｍＬを３分間かけてゆっくりと攪拌しながら添加した。融合操作を終えた細胞浮遊液を１，０００ｒｐｍ５分間室温で遠心洗浄した。脾細胞の細胞数が２．５×１０５  細胞／１００μＬとなるようにハイブリドーマ培養培地に浮遊させて、９６ウェル培養プレートに１ウェル当たり１００μＬの細胞浮遊液を添加した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。１８時間の培養後、ＨＡＴ選択培地を添加して２週間培養した。【００８３】［１−５］融合細胞の選択培養とスクリーニング  ２週間の選択培養後、顕微鏡下で生細胞（細胞融合陽性コロニー）を観察し、陽性コロニーの培養上清を１００μＬ回収して抗原を固定化したＥＬＩＳＡを行った。陽性コロニーが多く、個別に培養上清を回収するのが困難な場合は、実験計画法（詳しくは「単クローン抗体実験操作入門（１９９１年発行）」安東民衛、千葉丈  講談社サイエンティフィック）を応用した培養上清のサンプリングを行った。【００８４】［１−６］ＥＬＩＳＡによるスクリーニング方法  実験操作法は、上記［１−３］に記載の「ＥＬＩＳＡを用いた血清抗体価の測定」と同様の操作を行った。培養上清は原液で使用した。【００８５】［１−７］ハイブリドーマのクローニング  抗体産生が確認されたハイブリドーマを９６ウェルプレートから２４ウェル培養プレートに移して、細胞がセミコンフルエントになるまで選択培地で培養した。ＨＴに訓化するためＨＴ選択培地へ細胞を移してＨＴ選択培地に訓化させた。２４ウェルで培養した融合細胞をセミコンフルエントになるまで培養させた。ＨＴ培地で充分に増殖するようになったら、２４ウェルから６ウェル培養プレートに移して、ハイブリドーマ培養培地に移して７日間ほど訓化させた。ハイブリドーマが通常のＲＰＭＩ１６４０で安定に増殖するまで培養した後、限界希釈法を用いて増殖が速くかつ抗体産生量の多いクローンをクローニングした。【００８６】  選択され、クローニングされた、ハイブリドーマから産生された抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡの結果を図１に示す。同様に、選択され、クローニングされた、ハイブリドーマから産生された抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体のＥＬＩＳＡの結果を図２に示す。【００８７】  得られたハイブリドーマのクローンのうち、抗ＧＰＣ３抗体産生能の高いクローンである、２Ｃ１１、２Ｅ１１、２Ｈ１０、３Ｅ３、３Ｅ１０、３Ｅ１１、４Ｆ５、５Ｅ５、７Ｃ８、７Ｇ６、１０Ａ４およびＵ３Ｅを、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）にそれぞれ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２６、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２７、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３２８、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２９、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３０、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３１、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３２、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３４、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３５、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３６およびＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３７として寄託した。寄託の詳細については、段落［００１６］（寄託の説明）および表１０を参照されたい。【００８８】  また、得られたハイブリドーマのクローンのうち、抗ＳＰＡＲＣ抗体産生能の高いクローンである、Ｓ２Ｆ９、Ｓ１４Ａ７、Ｓ１４Ｃ１２、Ｓ１９Ｂ１、Ｓ２０Ｄ１０、Ｓ２３Ｃ１０、Ｓ２３Ｅ９およびＳ２５Ｈ９を、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）にそれぞれ、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３３８、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３９、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４０、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４１、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４２、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３４４およびＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３４５として寄託した。寄託の詳細については、段落［００１６］（寄託の説明）および表１０を参照されたい。【００８９】［１−８］抗体精製方法  目的の抗体を産生するハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃまたはヌードマウスの腹腔に接種して数週間後に得られる腹水、あるいは目的の抗体を産生するハイブリドーマを培養して得られる培養上清から、モノクローナル抗体を精製した。【００９０】・腹水の調整  ＢＡＬＢ／ｃマウス（９−１０  週齢）に３．５ＧｙのＸ線を照射し、３日後にプリスタン０．２ｍｌを腹腔に注射して７−１０日間飼育した。培養で増やしたハイブリドーマを回収し、無血清培地５ｍｌで２回遠心洗浄した。  ＲＰＭＩで細胞浮遊液を調製して１×１０６細胞をマウスの腹腔に接種した。７〜１０日後に１８Ｇの注射針を腹腔に刺して、遠心管に腹水を回収した。腹水を１２００ｒｐｍで５分間遠心し、赤血球を分離した。上清を集め、抗体精製の操作を行うまで−２０℃で凍結保存した。【００９１】・腹水またはハイブリドーマの培養上清���らの抗体の精製（抗体のアフィニティー精製）  抗体の精製はＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  （ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたアフィニティー精製により行った。尚、別法として、ＧＰＣ３またはＳＰＡＲＣをＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの、リガンドカップリング担体に固定化して作製した抗原カラムを用いても抗体を精製することができる。【００９２】  具体的には、腹水からの抗体の精製は、腹水を適当に（１／２〜１／５）程度にＰＢＳで希釈して、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅにより精製した。洗浄バッファーとしてはＰＢＳを用い、溶出バッファーとしては０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ  ｐＨ２．８を用いた。【００９３】  ハイブリドーマの培養上清からの抗体の精製は、ハイブリドーマを２５０ｍＬ〜１Ｌにて大量培養した培地を回収して、カラムの劣化を防ぐために、０．２ミクロンのフィルターでろ過した。培地をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａを充填したカラムに流して、抗体を吸着させた。１０倍カラム体積以上のＰＢＳで洗浄した後、０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ  ｐＨ２．７を用いて抗体を酸溶出し、直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８を溶出液に添加してｐＨを中和した。【００９４】［実施例２］サンドウィッチ  ＥＬＩＳＡのために好適な抗体（捕獲抗体・検出抗体）の組合せの検討【００９５】［２−１］ＧＰＣ３のサンドウィッチ  ＥＬＩＳＡ  捕獲抗体（抗ＧＰＣ３抗体の中の１種類）をＰＢＳ、ｐＨ７．４に１μｇ／ｍＬに調整して、９６ウェル  Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）に１ウェル当たり５０μＬをコートして、室温で１時間以上インキュベーションした。４％ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ（−ＤＳファーマバイオメディカル株式会）  （４ｇ／１００ｍＬ  ＰＢＳ）あるいは１％ＢＳＡ（１ｇＢＳＡ／１００ｍＬＰＢＳ）を用いて、室温で１時間ブロッキングした。患者血漿あるいは血清を３倍以上に０．４％  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ（−ＤＳファーマバイオメディカル株式会）により希釈した検体サンプル、あるいはメラノーマ細胞の培養上清の原液を、１ウェル当たり５０μＬ添加して、室温で２時間インキュベーションした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ（ＰＢＳＴ）により３回洗浄した後、４％  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅで調整した１μｇ／ｍＬビオチン化・検出抗体（抗ＧＰＣ３抗体の中の１種類）を５０μＬ添加し、室温で１時間インキュベーションした。抗体のビオチン化はＥＺ−ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。ＰＢＳＴで３回洗浄後、０．４％  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅにより５０００倍希釈した１ｍｇ／ｍＬ  セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ストレプトアビジンを、各ウェルあたり５０μＬ加えて３０分、室温でインキュベーションした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加して発色させ、０．１８Ｍ硫酸を５０μＬ添加して発色反応を停止した。プレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  ｍｏｄｅｌ  ５５０）により４５０ｎｍにおける吸光度を測定して解析を行った。【００９６】  ＧＰＣ３のサンドウィッチ  ＥＬＩＳＡの結果を図３および表１に示す。ＧＰＣ３についての捕獲抗体としては、ｍＡｂ２Ｃ１１、ｍＡｂ１０Ａ４、ｍＡｂＵ３ＥおよびｍＡｂ３Ｅ１１が優れており、検出抗体としては、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ３が優れていた。【００９７】  また、捕獲抗体をｍＡｂＵ３Ｅに固定し、検出抗体としてｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ３のいずれかを用いて、日本人、オーストラリア人のメラノーマ患者サンプルの検出を行った。結果を図５および表３の左側に示す。ｍＡｂＵ３ＥとｍＡｂ３Ｅ３を組み合わせて用いた場合のオーストラリア人のメラノーマの陽性率は１００％であった。また、健常者に対してはいずれも陽性率は０％であり、特異性は高かった。【００９８】［２−２］ＳＰＡＲＣのサンドウィッチ  ＥＬＩＳＡ  抗ＳＰＡＲＣ抗体を用いたサンドウィッチ  ＥＬＩＳＡでは、上記の抗ＧＰＣ３抗体と同様の条件でサンドウィッチ  ＥＬＩＳＡでメラノーマ患者血液・血漿あるいはメラノーマ細胞培養上清からＳＰＡＲＣを検出した。【００９９】  ＳＰＡＲＣのサンドウィッチ  ＥＬＩＳＡの結果を図４および表２に示す。ＳＰＡＲＣについての捕獲抗体としては、ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ１４Ｃ１２、ｍＡｂＳ２３Ｃ１０が優れており、検出抗体としては、ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ２５Ｈ９、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２３Ｃ１０が優れていた。【０１００】  また、捕獲抗体をｍＡｂＳ２３Ｃ１０に固定し、検出抗体としてｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ２５Ｈ９、ｍＡｂＳ２３Ｅ９のいずれかを用いて、日本人、オーストラリア人のメラノーマ患者サンプルの検出を行った。結果を図６および表３の右側に示す。ｍＡｂＳ２３Ｃ１０とｍＡｂＳ２Ｆ９またはｍＡｂＳ２５Ｈ９を組み合わせて用いた場合のオーストラリア人のメラノーマの陽性率は１００％であった。また、健常者に対してはいずれも陽性率は０％であり、特異性は高かった。【０１０１】［２−３］ＧＰＣ３のサンドウィッチ  ＥＬＩＳＡとＳＰＡＲＣのサンドウィッチ  ＥＬＩＳＡとの組合せ  上記［２−１］および［２−２］のＧＰＣ３のサンドウィッチ  ＥＬＩＳＡとＳＰＡＲＣのサンドウィッチ  ＥＬＩＳＡとを組合せて、日本人メラノーマ患者、オーストラリア人メラノーマ患者、日本人健常者のサンプルを用いて検出を行った。【０１０２】  ＧＰＣ３に対する捕獲抗体としてはｍＡｂＵ３Ｅを用い、検出抗体としては、ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ１０、ｍＡｂ３Ｅ３のいずれかを用いた。  一方、ＳＰＡＲＣに対する捕獲抗体としてはｍＡｂＳ２３Ｃ１０を用い、検出抗体としては、ｍＡｂＳ２Ｆ９、ｍＡｂＳ２５Ｈ９、ｍＡｂＳ２３Ｅ９のいずれかを用いた。【０１０３】  結果を表４〜６に示す。ＧＰＣ３のサンドウィッチ  ＥＬＩＳＡとＳＰＡＲＣのサンドウィッチ  ＥＬＩＳＡとを組み合わせた場合、オーストラリア人メラノーマ患者の陽性率は９０〜１００％と非常に高く、日本人メラノーマ患者の陽性率も３０〜８０％と比較的高かった。また、日本人健常者に対してはいずれも陽性率は０％であり、特異性は高かった。【０１０４】
【表１】
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【０１０５】
【表２】
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【０１０６】  表３は、ＧＰＣ３またはＳＰＡＲＣについてのサンドウィッチＥＬＩＳＡの結果をまとめた表である。【表３】
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【０１０７】  表４〜６は、ＧＰＣ３およびＳＰＡＲＣについてのサンドウィッチＥＬＩＳＡを組み合わせた場合の結果をまとめた表である。【表４】
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【０１０８】
【表５】
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【０１０９】
【表６】
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【０１１０】［実施例３］方法［３−１］健常者比較対照群の検体  日本人健常者検体は、健康診断・外来診察で採血した余剰検体を用いた。臨床背景の内訳は、がん、糖尿病、緑内障の既往歴がなく、平均年齢５０．２歳、男女比は５０／５０、１００検体の血清を用いた。オーストラリア人健常者は男女比３／８、平均年齢５６．０歳の血清を用いた。【０１１１】［３−２］メラノーマ患者およびメラノーマ以外の皮膚科疾患患者の検体  日本人メラノーマ患者は病型あるいは病期が確定した患者５６人、男女比２６／３０、平均年齢６４．１歳となる血清を用いた。メラノーマ以外の皮膚科疾患２２人は、男女比１１／１１、平均年齢６０．５５歳となる血清を用いた。オーストラリア人のメラノーマ患者２８人は、男女比２０／８、平均年齢５６．３歳となる血清を用いた。【０１１２】［３−３］抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体および抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体の調製  ＢＡＬＢ／ｃマウスはハイブリドーマ接種７日前に３．５Ｇｙの放射線照射、３日後にプリスタンを腹腔に接種した。１ｘ１０５個以上のハイブリドーマを接種して、１〜２週間後に腹水を回収した。回収した腹水を遠心（１５０００ｒｐｍ／３０ｍｉｎ）して不溶性粒子を除去した後、０．４５μｍポアサイズのシリンジフィルター（Ｎｕｎｃ）を用いてフィルター濾過した。腹水から抗体を精製するために、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーを行った。腹水をＰＢＳで５倍希釈して、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムに流して抗体を吸着させた。非特異吸着した夾雑物を除去するために、ＰＢＳでカラムを洗浄し、０．１  Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ  ｐＨ  ２．７を用いて抗体を酸溶出した。溶出した抗体は即座に１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０を混合してｐＨを中性付近に調整した。精製抗体は２８０ｎｍの紫外線吸収の測定値と分子吸光係数１．４から抗体濃度を算出した。【０１１３】［３−４］抗体のビオチン化  ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）とＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、製造元のプロトコールに従って抗体のビオチン化を行った。【０１１４】［３−５］サンドウィッチＥＬＩＳＡ［３−５−１］新規抗体によるＧＰＣ３のサンドウィッチＥＬＩＳＡ  ＧＰＣ３検出用サンドウィッチＥＬＩＳＡは捕獲抗体ｍＡｂＵ３Ｅ、ｍＡｂ３Ｅ１１を各５μｇ／ｍＬに調整して、９６  ｗｅｌｌ  ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅの１ウエル当たり５０μＬを添加して吸着させた。非特異吸着を防ぐために１〜２％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）でブロッキングした。０．１％ブロックエースで２〜４倍希釈した測定血清サンプル５０μＬを捕獲抗体でコートしたＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅに添加して１２時間以上４℃でインキュベートした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ビオチンラベルした検出抗体カクテル（ｍＡｂ２Ｈ１０、ｍＡｂ３Ｅ３、ｍＡｂ３Ｅ１０を含む）を１ウェル当たり５０μＬ添加して、室温で２時間以上インキュベートした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む��ＢＳで洗浄後、Ａｖｉｄｉｎ−Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを添加して３０分、室温でインキュベートした後０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで洗浄した。ＴＭＢ基質溶液を添加して発色させ、十分に発色反応させた後５０μＬの０．１８  Ｍ硫酸を加えて反応を停止させた。Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を測定して定量化した。【０１１５】［３−５−２］市販抗体によるＧＰＣ３のサンドウィッチＥＬＩＳＡ  捕獲抗体に抗−ヒトＧＰＣ３モノクローナル抗体１Ｇ１２（Ｂｉｏｍｏｓｉｃ）、検出抗体に抗−ＧＰＣ３ポリクローナル抗体（＃ＡＦ２１１９，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＥＬＩＳＡの実験操作は上記の新規法と同様に行った。【０１１６】［３−５−３］新規抗体によるＳＰＡＲＣのサンドウィッチＥＬＩＳＡ  捕獲抗体をｍＡｂＳ２Ｆ９、検出抗体はビオチン化ｍＡｂＳ２３Ｃ１０、ｍＡｂＳ２３Ｅ９およびｍＡｂＳ２５Ｈ９を含む検出抗体カクテルを用いた。ＥＬＩＳＡの実験操作はＧＰＣ３と同様に行った。【０１１７】結果［３−Ａ］日本人検体を用いた検討結果【０１１８】［３−Ａ−１］新規抗体を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡを用いた日本人健常者１００人の血清中ＧＰＣ３、ＳＰＡＰＲＣ値によるカットオフの設定（図７）  新規抗体を用いたＥＬＩＳＡにおけるＧＰＣ３、ＳＰＡＲＣのカットオフを決定するため、日本人健常者１００人の血清のＥＬＩＳＡを行った（図７）。図７（ａ）にＧＰＣ３、図７（ｂ）にＳＰＡＲＣの定量結果を示した。１００人の健常者のＧＰＣ３、ＳＰＡＲＣの血清中の濃度平均値と標準偏差からカットオフ値を算出した。決定したカットオフ値をグラフ上には点線で示した。【０１１９】［３−Ａ−２］新規抗体を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡにおける日本人健常者のカットオフ（表７）  メラノーマ患者に対する比較対照群（健常者）の内訳は、平均年齢５０．２歳、男女比は５０／５０、がん・生活習慣病の既往歴はない健常者の血清を選び測定を行った。健常者から決定したカットオフは平均＋１．５×ＳＤとしてＧＰＣ３のカットオフ＝１９．９３ｎｇ／ｍＬ、特異度９５％で偽陽性例は５例見られた（図７（ａ））。ＳＰＡＲＣではカットオフ＝２７４ｎｇ／ｍＬ、特異度９６％で偽陽性は４例見られた（図７（ｂ））。【０１２０】
【表７】
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【０１２１】［３−Ａ−３］日本人メラノーマ以外皮膚科疾患２２例のＧＰＣ３、ＳＰＡＲＣ値（図８）  メラノーマ以外の皮膚科疾患の血清ＧＰＣ３、ＳＰＡＲＣについて新規抗体を用いたＥＬＩＳＡを行った結果を図８に示した。ＧＰＣ３、ＳＰＡＲＣとも健常者のＧＰＣ３およびＳＰＡＲＣ測定から決定したカットオフを当てはめてみたところ、陽性判定の症例は見られなかった（図８（ａ）、（ｂ））。従って、これらの結果からメラノーマと他の皮膚科疾患との鑑別診断が出来ることが示された。【０１２２】［３−Ａ−４］日本人メラノーマ以外皮膚科疾患患者（ｎ＝２２）と日本人メラノーマ患者（ｎ＝５６）のＧＰＣ３値とＳＰＡＲＣ値の分布（図９）  日本人メラノーマ患者５６症例の血清ＧＰＣ３のＥＬＩＳＡ測定（図９（ａ））および血清ＳＰＡＲＣのＥＬＩＳＡ測定（図９（ｂ））を行った。ＧＰＣ３は５６症例中２５症例が陽性で、陽性率４４．６％、ＳＰＡＲＣは５６症例中１２症例が陽性で陽性率２１．４％であった。メラノーマ患者５６名とメラノーマ以外皮膚科疾患患者群２２名の２群間の比較をマンホイットニーＵ検定を用いて行った。図９（ａ）にＧＰＣ３測定値の検定、図９（ｂ）にＳＰＡＲＣの検定結果を示した。検定により、ＧＰＣ３は  Ｐ＜０．００１、ＳＰＡＲＣは  Ｐ＝０．００９となり２群間に有意な差を認めた。【０１２３】［３−Ａ−５］メラノーマ病型別のＧＰＣ３とＳＰＡＲＣの陽性率（図１０）  ＧＰＣ３の病型別の陽性率はＡＬＭが２９．６％（２７症例中８例）、ＬＭＭが０％（３症例中検出なし）、ＮＭが５０％（６症例中３例）、ＳＳＭが７２．７％（１１症例中８例）、粘膜型では１００％（２症例中２例）、分類不明症例では５７．１％（７症例中４例）の陽性率となった（図１０（ａ））。ＳＰＡＲＣの病型別のＥＬＩＳＡ測定結果を図１０（ｂ）に示した。病型別の陽性率はＡＬＭが２２．２％（２７症例中６例）、ＬＭＭが３３．３％（３症例中１例）、ＮＭが１６．７％（６症例中１例）、ＳＳＭが１８．２％（１１症例中２例）、粘膜型では０％（２症例中０例）、分類不能症例では２８．６％（７症例中２例）となった。【０１２４】［３−Ａ−６］メラノーマ病期別のＧＰＣ３とＳＰＡＲＣの陽性率（図１１）  図１１（ａ）では日本人患者５６症例のＧＰＣ３の病期別の陽性率、図１１（ｂ）はＳＰＡＲＣの病期別の陽性率を示した。ＧＰＣ３の陽性率は、ステージ０では５０％（２症例中１例）、ステージ１では５０％（１２症例中６例）、ステージ２では２０％（１５症例中３例）、ステージ３は６８．８％（１６症例中１１例）、ステージ４は３６．４％となった。ＳＰＡＲＣの陽性率は、ステージ０は０％（２例中０例）、ステージ１は２５％（１２症例中３例）、ステージ２は２６．７％（１５症例中４例）、ステージ３は２５％（１６症例中４例）、ステージ４では９．１％（１１症例中１例）となった。【０１２５】［３−Ａ−７］ＧＰＣ３検出のための市販抗体を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡの性能（病型別・病期別）（図１２）  日本人メラノーマ患者の治療前検体２６症例の検体を用いて市販抗体を用いたＧＰＣ３のＥＬＩＳＡ結果を図１２に示した。図１２（ａ）は病型別、図１２（ｂ）は病期別に示した。Ｇ���Ｃ３の健常人１９９症例（男女比９９／１００、平均年齢６２．４歳）の平均値０．８０ｎｇ／ｍＬ、標準偏差１．１８より決定したカットオフを１．９８ｎｇ／ｍＬとした時（点線）、陽性率は１９．２％（２６症例中５例が陽性）であった。新規抗体を用いたＥＬＩＳＡでの陽性率（図９−１１）と比較してみると、明らかに新規抗体の方が優れた検出感度であった。【０１２６】［３−Ａ−８］病型別に分類した従来の腫瘍マーカーＬＤＨ・５−Ｓ−ＣＤ検査によるメラノーマ検出感度（図１３）  図１３（ａ）は新規法で検討した血清サンプルと同じ血清サンプル３０例のＬＤＨ測定結果を病型別に示した。ＬＤＨはＪＳＣＣ標準化対応法を用いて測定し基準値範囲（１１０〜２５０  ＩＵ／Ｌ）を超えた症例を陽性と判断した。病型別では（図１３（ａ））、ＡＬＭでは２７症例中４症例が陽性（１４．８％）、ＬＭＭ、ＮＭ、ＳＳＭでは陽性症例の検出が無く（０％）、分類不能症例では７症例中３症例（４２．９％）、粘膜型で２症例中１症例（５０％）になった。全５６症例の内８症例が陽性となり、全体の陽性率は１４．３％であった。【０１２７】  メラノーマ症例３０例の５−Ｓ−ＣＤ測定結果を図１３（ｂ）に示した。５−Ｓ−ＣＤの測定はＨＰＬＣ法を用いて、基準値範囲（１．５〜１０  ｎｍｏｌ／Ｌ）を超えた症例を陽性と判断した。ＡＬＭでは１７症例中６症例が陽性（３５．３％）、ＬＭＭは陽性症例の検出が無く、ＮＭは３症例中２例（６６．７％）、ＳＳＭは５症例中２例（４０％）、分類不能症例では２症例中２例（１００％）、全３０症例の内１２症例が陽性となり、全体の陽性率は４０％であった。【０１２８】［３−Ａ−９］病期別に分類した従来の腫瘍マーカーＬＤＨ・５−Ｓ−ＣＤ検査によるメラノーマ検出感度（図１４）  図１４（ａ）に病期別の日本人メラノーマ患者５６症例のＬＤＨ測定結果を示した。ステージ０では２症例中検出症例はなく（０％）、ステージ１では１２症例中１例（８．３％）、ステージ２では１５症例中２例（１３．３％）、ステージ３では１６症例中１症例（６．３％）、ステージ４では１１症例中４症例（３６．４％）となった。【０１２９】  図１４（ｂ）ではメラノーマ症例３０例の５−Ｓ−ＣＤ測定結果を病期別に示した。ステージ１では４症例中１例（陽性率２５％）、ステージ２では１２症例中４例（陽性率３３．３％）、ステージ３では８症例中３例（陽性率３７．５％）、ステージ４では６症例中４症例（陽性率６６．７％）であった。【０１３０】［３−Ａ−１０］病型別のＧＰＣ３とＳＰＡＲＣ単独あるいは組み合わせた時の検出数と陽性率、および既存腫瘍マーカー検出数と陽性率（表８）  メラノーマ病型別にまとめた結果を示した。日本人に多い病型ＡＬＭのＧＰＣ３による陽性率は２９．６％（２７症例中８症例を検出）、ＳＰＡＲＣでは２２．２％（２７症例中６例）であった。ＧＰＣ３とＳＰＡＲＣを組み合わせた陽性率は４０．７％となった。欧米白人のメラノーマの多くはＳＳＭであるが、ＳＳＭはＧＰＣ３が７２．７％（１１症例中８症例）、ＳＰＡＲＣでは１８．２％（１１症例中２例）で、ＧＰＣ３とＳＰＡＲＣを組み合わせた陽性率７２．７％であった。日本人に多いＡＬＭよりも欧米白人のメラノ��マの多くを占めるＳＳＭで高感度を示した。全５６症例では、ＧＰＣ３（４４．６％）とＳＰＡＲＣ（２１．４％）の陽性率を組み合わせると５３．６％の陽性率（５６症例中３０症例）になり、ＧＰＣ３とＳＰＡＲＣを組み合わせる診断方法は単独の腫瘍マーカーで診断するよりも、メラノーマの診断成績が高くなる結果であった。【０１３１】  従来法のＬＤＨ測定では、ＡＬＭは２７症例中４例が陽性で陽性率１４．８％、５−Ｓ−ＣＤでは１７症例中６例が陽性になり、陽性率３５．３％になった。ＬＤＨはＳＳＭを１１症例中１例も検出できなかった。５−Ｓ−ＣＤはＳＳＭで５症例中２例となり陽性率４０％であった。ＬＤＨは全５６症例中、８例で陽性率１４．３％、５−Ｓ−ＣＤでは全３０症例中１２例で陽性率４０％になった。新規法ＧＰＣ３・ＳＰＡＲＣ組み合わせによる診断の方が、メラノーマ全体においても、ＡＬＭ、ＳＳＭの診断においてもＬＤＨ、５−Ｓ−ＣＤによる診断より優れていた。【０１３２】
【表８】
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【０１３３】［３−Ａ−１１］病期別のＧＰＣ３とＳＰＡＲＣ単独あるいは組み合わせた時の検出数と陽性率、および既存腫瘍マーカー検出数と陽性率（表９）  ステージ０から１ではＧＰＣ３・ＳＰＡＲＣを組み合わせた陽性率は５０％であった。ステージ２は陽性率４０％、ステージ３は陽性率７５％となった。ステージ４は陽性率４５．５％であった。以上の結果から進行ステージに関わらず、ＧＰＣ３とＳＰＡＲＣの測定によりメラノーマ診断が可能であり、さらにＬＤＨ検査などの従来法では判定できない早期の症例も、新規法では診断が可能であることが示された。【０１３４】  ＬＤＨ検査および５−Ｓ−ＣＤ検査の結果を病期別に分類したところ、ＬＤＨと５−Ｓ−ＣＤ用いた従来法はステージ４では診断に効力を示すが、ステージ１ではＬＤＨが８．３％、５−Ｓ−ＣＤが２５％の陽性率に対して、新規法のＧＰＣ３・ＳＰＡＲＣの組み合わせでは陽性率５０％であった。新規法は早期ステージの診断に有効である。ステージ２ではＬＤＨ１３．３％、５−Ｓ−ＣＤが３３．３％に対して、新規法が４０％で、ステージ３ではＬＤＨが６．３％、５−Ｓ−ＣＤが３７．５％に対して、新規法が７５％となり、新規法は既存腫瘍マーカーよりも優れていた。ＧＰＣ３／ＳＰＡＲＣの組み合わせによる診断では病期に関わらずメラノーマを診断できる点において、従来法と比較して優位性を有する結果になった。治癒する可能性の低い遠隔転移のあるステージ４の診断においては５−Ｓ−ＣＤに劣るものの、遠隔転移のない根治の可能性のあるステージ０−３のメラノーマの診断においては、ＬＤＨが８．９％、５−Ｓ−ＣＤが３３．３％に対して、新規法は陽性率が５５．６％と優れていた。特に根治の可能性がほぼ１００％と高いステージ０−１では、新規法の陽性率は５０％となり優れた診断結果が得られた。【０１３５】
【表９】
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【０１３６】［３−Ｂ］オーストラリア人の検体を用いた検討結果【０１３７】［３−Ｂ−１］オーストラリア人メラノーマ患者のＧＰＣ３およびＳＰＡＲＣの陽性率（図１５）  オーストラリア人メラノーマ健常者１１例のＧＰＣ３検出結果（図１５（ａ））と患者２８症例のＧＰＣ３検出結果（図１５（ｂ））を示した。患者群の陽性率はオーストラリア人健常者から決定したカットオフ値（点線にて表示。２２．８１ｎｇ／ｍＬ）から、オーストラリア人メラノーマ患者の陽性率を算出した。健常者群には明らかに高値を示した健常者例が１例含まれていた。メラノーマ患者の臨床背景は病型不明（多くはＳＳＭと考えられる）、すべてステージ４ではあるが、２８症例中２３例陽性で陽性率８２．１％と高い検出感度であった。【０１３８】  ＳＰＡＲＣでも同様にオーストラリア人１１例からＳＰＡＲＣのカットオフ値（点線にて表示。２１７．５４ｎｇ／ｍＬ）を決定し、メラノーマ患者のＳＰＡＲＣ陽性率を算出した（図１５（ｄ））。健常者群１１例には偽陽性例はなかった（図１５（ｃ））。メラノーマ患者群の陽性率は２８症例中１９例陽性で６７．９％となった。【０１３９】［３−Ｂ−２］オーストラリア健常者（ｎ＝１１）とオーストラリアメラノーマ患者（ｎ＝２８）のＧＰＣ３値とＳＰＡＲＣ値の分布（図１６）  メラノーマ患者と健常者群の測定値を、散布図として図１６に示した。メラノーマ患者２８名、健常者１１名で、マンホイットニーＵ検定を用いて２群間の比較をすると、ＧＰＣ３はＰ＜０．００１、ＳＰＡＲＣはＰ＜０．００１で有意な差を認めた。【０１４０】［受託番号］【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【産業上の利用可能性】
【０１４１】  本発明のモノクローナル抗体の組合せを用いたメラノーマの診断キットおよびメラノーマの検出方法は、特に早期のメラノーマの正確かつ特異性の高い診断を行うために非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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