(57)【要約】  本発明は、癌のホウ素中性子捕捉療法において利用可能な、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＤＳ）効率の向上と腫瘍内のホウ素の高濃度化を実現しうる新規ホウ素担体化合物を提供する。本発明は、式（Ｉ）：【化７】2014030715.tif 000012［式中、ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜４の整数であり、ｑは、１〜２８０の整数であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、炭素数８〜２２の炭化水素基である。］で示されるホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体およびこれを含む分子集合体を提供する。
2014030715.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化６】
2014030715.tif 000011
［式中、ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜４の整数であり、ｑは、１〜２８０の整数であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、炭素数８〜２２の炭化水素基である。］
で示されるホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、炭素数１２〜２２の直鎖状または分岐状のアルキル基である、請求項１記載のＰＥＧ脂質誘導体。
【請求項３】
ｍが２であり、かつ、ｎが１である、請求項１または２記載のＰＥＧ脂質誘導体。
【請求項４】
請求項１から３の何れか１項記載のＰＥＧ脂質誘導体を含む分子集合体。
【請求項５】
ＰＥＧ脂質誘導体を分子集合体の全構成脂質に対してモル比で２〜２０％含む、請求項４記載の分子集合体。
【請求項６】
Ｌ−α−ホスファチジルコリンジアステロイルおよびコレステロールをさらに含む、請求項４または５記載の分子集合体。
【請求項７】
リポソームである、請求項４から６の何れか１項記載の分子集合体。
【請求項８】
動的光散乱法により測定したリポソームの粒子径が５０〜４００ｎｍである、請求項７記載の分子集合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍組織を認識し、ホウ素デリバリーを可能としたドラッグキャリアーとして有用なＰＥＧ脂質誘導体およびこれを用いた分子集合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌のホウ素中性子捕捉療法（以下「ＢＮＣＴ」ともいう。）は、あらかじめ腫瘍組織に取り込ませた１０Ｂ核と生体にほぼ影響を及ばさない熱中性子線の捕捉反応によって生じるα粒子および７Ｌｉ粒子によって腫瘍細胞を障害する放射線療法である。この核反応の結果生じる粒子線の飛程はおよそ細胞直径と等しいため、あらかじめ腫瘍組織にのみホウ素を高濃度で集積させることができれば、そのうえに熱中性子を照射することで、正常組織の損傷を最小限にしながら、腫瘍組織を細胞選択的に障害し、放射線感受性の低い腫瘍や浸潤性の腫瘍においても治療効果を有することが期待される。臨床的に浸潤性で予後不良である悪性脳腫瘍（神経膠芽腫）や、頭頸部癌の再発例にたいして臨床研究がおこなわれており、良好な成績が報告されている（非特許文献１）。
臨床で用いられているホウ素化合物は、ボロノフェニルアラニン（ＢＰＡ）および、ＢＳＨとよばれるホウ素イオンクラスターの単分子化合物である。これら化合物は、臨床応用されているものの、腫瘍集積の観点からは十分とはいえず、腫瘍・正常組織におけるホウ素濃度比（Ｔ／Ｎ比）をさらに向上させる試みが続けられている。さらに腫瘍組織のみへ高濃度でホウ素を集積させる技術として、表面をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で被覆したリポソームに、ＢＨＡ（１０Ｂ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ４−Ｂｏｒｏｎｏ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、Ｃ９Ｈ１２１０ＢＮＯ４）およびＢＳＨ（１０Ｂ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｍｅｒｃａｐｔｏｄｏｄｅｃａｂｏｒａｔｅ、ＢＳＨ［ＣＡＳ  Ｎｏ．１２４４８−２４−７］、［１０Ｂ１２Ｈ１１ＳＨ］Ｎａ２）などの親水性ホウ素化合物を封入する手法が用いられている（非特許文献２）。
しかしながら、これらの方法では有効な治療域までのホウ素集積が難しいこと、また、目標とされるＴ／Ｎ比の達成との両立ができていないため、正常組織でのホウ素による正常組織への放射線障害や治療効果の低減が大きな問題となっている。
脂質と水性ホウ素化合物を共有結合によって結合させ、リン脂質二重膜内にホウ素化合物を取り込ませる技術も開発されているが、多段階かつ複雑な合成を必要とするため、効率やコスト面から問題が多い。また動物実験において急性毒性が数例報告されており、安全面においても問題がある（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Boron neutron capture therapy for newly diagnosed glioblastoma.  Yamamoto T, Nakai K, Kageji T, Kumada H, Endo K, Matsuda M, Shibata Y, Matsumura A.Radiother Oncol. 2009 Apr;91(1):80-4. Epub 2009 Mar 11.
【非特許文献２】Intracellular targeting of sodium mercaptoundecahydrododecaborate (BSH) to solid tumors by transferrin-PEG liposomes, for boron neutron-capture therapy (BNCT).Maruyama K, Ishida O, Kasaoka S, Takizawa T, Utoguchi N, Shinohara A, Chiba M, Kobayashi H, Eriguchi M, Yanagie H.J Control Release. 2004 Aug 11;98(2):195-207.
【非特許文献３】Synthesis of boron cluster lipids: closo-dodecaborate as an alternative hydrophilic function of boronated liposomes for neutron capture therapy.Lee JD, Ueno M, Miyajima Y, Nakamura H.Org Lett. 2007 Jan 18;9(2):323-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在ホウ素中性子捕捉療法に用いるためのホウ素化合物に要求されている一般的な性能は以下のとおりである。
ｉ）腫瘍内に少なくとも２０ｕｇ／ｇ以上の１０Ｂ濃度を達成できる。ｉｉ）一方で正常組織において１０Ｂ濃度は可能な限り低濃度である。ｉｉｉ）Ｔｕｍｏｒ／ｂｌｏｏｄ比で５〜１０以上が望ましい。
この濃度を達成するためには、一般の医薬品と異なり、生体へのホウ素化合物の大量投与が必要である。そのため、ホウ素中性子捕捉療法に用いるためには、ホウ素化合物の毒性が低いことが重要となる。現在の化合物ＢＳＨではヒト成体あたり５ｇ、ＢＰＡでは１５〜２５ｇの急速静注投与を要しており、これは一般の医薬品の１０〜１００倍の重量である。
このような状況下、癌のホウ素中性子捕捉療法において利用可能なＤｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＤＳ）効率の向上と腫瘍内のホウ素の高濃度化、さらには低毒性を実現しうる新規ホウ素担体化合物の提供が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究した結果、分子集合体を構築する脂質へのホウ素修飾によって、腫瘍内のホウ素の高濃度化と、ＤＤＳを用いることによる正常細胞への低集積化とを実現できる可能性が高いことを見いだし、本発明を完成させるに至った。【０００６】
すなわち、本発明は、以下に示したホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体およびそれを含む分子集合体に関するものである。
［１］式（Ｉ）：
【化１】
2014030715.tif 000003
［式中、ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜４の整数であり、ｑは、１〜２８０の整数であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、炭素数８〜２２の炭化水素基である。］
で示されるホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体。
［２］Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、炭素数１２〜２２の直鎖状または分岐状のアルキル基である、［１］記載のＰＥＧ脂質誘導体。
［３］ｍが２であり、かつ、ｎが１である、［１］または［２］記載のＰＥＧ脂質誘導体。
［４］［１］から［３］の何れか１項記載のＰＥＧ脂質誘導体を含む分子集合体。
［５］ＰＥＧ脂質誘導体を分子集合体の全構成脂質に対してモル比で２〜２０％含む、［４］記載の分子集合体。
［６］Ｌ−α−ホスファチジルコリンジアステロイルおよびコレステロールをさらに含む、［４］または［５］記載の分子集合体。
［７］リポソームである、［４］から［６］の何れか１項記載の分子集合体。
［８］動的光散乱法により測定したリポソームの粒子径が５０〜４００ｎｍである、［７］記載の分子集合体。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、癌のホウ素中性子捕捉療法に利用可能な新規ホウ素担体化合物を提供することができる。本発明の好ましい態様によれば、本発明のホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体を含む分子集合体を用いることで、腫瘍内のホウ素の高濃度化とＤＤＳを用いることによる正常細胞への低集積化とを実現できる可能性が高い。なお、本発明者らは、ホウ素濃度２０００ｐｐｍ（脂質濃度として２１５．６ｍｇ/ｍｌ）までは急性毒性がないこと、さらには身体所見による異常がないことを確認している。したがって、本発明の分子集合体は低毒性であり、ホウ素中性子捕捉療法に好適に用いることができるホウ素担体化合物であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の一実施形態であるホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体を含むリポソームの概念図である。
【図２Ａ】実施例１で得られた化合物のマススペクトルである。
【図２Ｂ】実施例１で得られた化合物のマススペクトルにおけるピークの拡大図である。
【図３】実施例１で得られた化合物の高速液体クロマトグラフである。
【図４】実施例３で得られたゲル排除クロマトグラフィーにより分離される各分画の一例を示したグラフである。
【図５】実施例３で得られた各リポソームにおけるホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体の組込率を示したグラフである。
【図６】ＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ  ５％リポソームの透過型電子顕微鏡写真（加速電圧：１００ｋＶ）である。
【図７】実施例５で得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのチャートである。
【図８】実施例５で得られた化合物の１０Ｂ−ＮＭＲスペクトルのチャートである。
【図９Ａ】実施例５で得られた化合物のマススペクトルである。
【図９Ｂ】実施例５で得られた化合物のマススペクトルにおけるピークの拡大図である。
【図１０】実施例５で得られた化合物の高速液体クロマトグラフである。
【図１１】ＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ修飾リポソームに熱中性子線を照射したときの細胞毒性反応を示したグラフである。
【図１２】ＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ修飾リポソームに熱中性子線を照射したときの抗腫瘍効果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明のホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体およびそれを含む分子集合体について詳細に説明する。
【００１０】
１．ホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体
本発明のホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体は、式（Ｉ）：
【化２】
2014030715.tif 000004
［式中、ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜４の整数であり、ｑは、１〜２８０の整数であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、炭素数８〜２２の炭化水素基である。］
で示される化合物である。
本発明のホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体は、ＰＥＧ脂質に、ホウ素クラスター（１０Ｂ１２Ｈ１３）が修飾された構造を有していることにより、リポソームなどの分子集合体の構成脂質として用いることができ、ＢＮＣＴに用いるホウ素担体化合物として利用可能である。
式中、ｍおよびｎは、それぞれ独立して、１〜４の整数であり、好ましくは、１または２である。原料を入手しやすいことから、ｍは２であることが好ましく、ｎは１であることが好ましい。
ｑは、１〜２８０の整数であり、好ましくは、１０〜１１４の整数であり、より好ましくは、４４〜６６の整数である。この範囲であると、ＰＥＧによる水和相の厚さおよび運動による立体障害性から最も血中滞留性を得やすい。
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、炭素数８〜２２の炭化水素基である。炭化水素基は、直鎖状でも分岐状でもよいが、直鎖状であることが好ましい。また、炭化水素基は、カルボキシル基、水酸基、アミノ基およびメルカプト基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。炭化水素基の炭素数は、好ましくは１２〜２０であり、より好ましくは１４〜１８である。炭化水素基は、二重結合や三重結合などの不飽和結合を有していてもよく、その場合にその数は１〜４であることが好ましい。中でも、Ｒ１およびＲ２としては、炭素数１２〜２２の直鎖状または分岐状のアルキル基が好ましく、炭素数１４〜１８の直鎖状のアルキル基がより好ましく、炭素数１７の直鎖状のアルキル基が特に好ましい。
【００１１】
本発明のホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体は、式（ＩＩ）：
【化３】
2014030715.tif 000005
［式中のｍ、ｎ、ｑ、Ｒ１およびＲ２は、式（Ｉ）におけるものと同義である。］
で示されるマレイミド誘導体と、Ｋａｔｃｈｅｍ  ｓｐｏｌ．ｓｒ．ｏ．，  Ｌｔｄ．より販売されている、１０Ｂ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｍｅｒｃａｐｔｏｄｏｄｅｃａｂｏｒａｔｅ（ＢＳＨ）［ＣＡＳ  Ｎｏ．１２４４８−２４−７］、［１０Ｂ１２Ｈ１１ＳＨ］Ｎａ２とを、リン酸緩衝生理食塩水中で反応させることで簡便に製造することができる。
反応後は、凍結乾燥し、その後、粗生成物を超純水で溶解後、透析により純度を上げ、凍結乾燥することで目的の化合物を得ることができる。
式（ＩＩ）で示される化合物は、例えばアミノ酸の末端に疎水的なアルキル鎖を導入して、膜貫通型とし、その末端にマレイミドＰＥＧを結合することで製造することができる。また、式（ＩＩ）で示される化合物として市販品を用いることもできる。例えば、ＮＯＦ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮより販売されているＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＳＥＲＩＥＳ  ＤＳＰＥ−０２０ＭＡ、ＤＳＰＥ−０５０ＭＡ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（化合物名：Ｎ−［（３−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−１−ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｃａｒｂａｍｙｌ］  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社より販売されているＤＥＰＥ−ＰＥＧ（２０００）Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（化合物名：１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−［ｍａｌ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−２０００］（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ））などが挙げられる。
本発明のホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体は、分子集合体の構成脂質として用いることができる。
【００１２】
２．分子集合体
本発明の分子集合体は、構成脂質として、前記ホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体を含むものであれば特に制限されない。
本発明の分子集合体に用いられるホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体の量は、特に制限されないが、分子集合体の全構成脂質に対してモル比で２〜２０％が好ましく、３〜１５％がより好ましく、５〜１０％がさらに好ましい。ホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体の量を適宜調整することで、目的に応じて腫瘍内のホウ素の濃度を制御することが可能である。
【００１３】
本発明の分子集合体には、ホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体以外の他の構成脂質を含んでいてもよい。
他の構成脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、Ｌ−α−ホスファチジルコリンジアステロイル（ＤＳＰＣ）など）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、卵黄レシチン、水添卵黄レシチン、大豆レシチン、水添大豆レシチン等のグリセロリン脂質類；スフィンゴエミリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロールなどのスフィンゴリン脂質類；などのリン脂質が挙げられる。中でも、ホスファチジルコリンが好ましく、Ｌ−α−ホスファチジルコリンジアステロイル（ＤＳＰＣ）が特に好ましい。
本発明の分子集合体に用いられるリン脂質の量は、分子集合体の全構成脂質に対してモル比で４０〜９５％が好ましく、４０〜７０％がより好ましく、４０〜５０％がさらに好ましい。
【００１４】
また、他の構成脂質としてはステロイド類が挙げられる。ステロール類としては、例えば、エルゴステロール、コレステロール、トリグリセリド等が挙げられる。中でも、コレステロールが好ましい。
本発明の分子集合体に用いられるステロイド類の量は、分子集合体の全構成脂質に対してモル比で０〜５０％が好ましく、３０〜５０％がより好ましく、４０〜５０％がさらに好ましい。
【００１５】
さらに、本発明の分子集合体は、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステル等のグリセロ糖脂質類；ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドＧ７、ガングリオシドＧ６、ガングリオシドＧ４等のスフィンゴ糖脂質類；などの糖脂質を含んでいてもよい。中でも、ガングリオシドＧ４が好ましい。
糖脂質の量は、分子集合体の全構成脂質に対してモル比で４〜２４％が好ましい。
【００１６】
本発明の分子集合体の形態は、例えば、高分子集合体、高分子ミセル、エマルジョン、リピドマイクロフィア、二分子膜小胞体（リポソーム）、その他の分子集合体（チューブ、ファイバー、リボン、シート等）などが挙げられる。中でも、本発明の分子集合体はリポソームの形態であることが好ましい。
【００１７】
図１は、本発明の一実施形態であるホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体を含むリポソームの概念図である。図１に示されるように、本発明のリポソームにおいては、構成脂質が形成する脂質二分子膜の小胞体の表面をＰＥＧが包囲しており、そのさらに表面にホウ素クラスターが結合していると考えられる。
【００１８】
本発明の分子集合体がリポソームである場合、動的光散乱法により測定したリポソームの粒子径は５０〜４００ｎｍが好ましく、５０〜２００ｎｍがより好ましく、１００〜２００ｎｍがさらに好ましい。
【００１９】
本発明の分子集合体は、公知の方法に準じて製造することができる。
例えば、リポソームの製造方法としては、単独もしくは混合脂質の薄膜に水系溶媒を加え、水和・膨潤させ超音波処理する、プローブ法、浴槽法が挙げられる。また、単独もしくは混合脂質の薄膜に水系溶媒を加えてからボルテックス処理し、その後超音波処理する撹拌（ボルテックスミキシング、ホモジナイザー）法が挙げられる。
あるいは、単独または混合脂質を有機溶媒に溶解させ、その溶液を水相の中に注入するエタノール注入法、エーテル注入法が挙げられる。
あるいは、単独もしくは混合脂質の薄膜にコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、オクチルグリコシドまたはラウリルエーテルなどの非イオン性界面活性剤と共に水相に分散させてエマルジョンを形成させ、透析によって除去してリポソームを製造することもできる。
あるいは単独もしくは混合脂質の薄膜に水系溶媒を加え、激しく懸濁し、得られた溶液を超音波処理する。その後液体窒素による凍結・融解をおこなう凍結融解法が挙げられる。
あるいは、単独または混合脂質を有機溶媒に溶解させ、その溶液に水系溶媒を少量加え超音波振動を与える。そしてエタノール、エーテルなどの有機溶媒を減圧または透析などにより除去してリポソームを製造する逆相蒸発法（ＲＥＶ法）が挙げられる。
上記で得られたリポソームを高圧押出（エクストルージョン）法、フレンチプレス法などにより粒子径を調節する。
【００２０】
上記のようにして、ホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体を構成脂質として含む本発明の分子集合体を製造することができる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体は、ＤＤＳを用いることにより、ホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体に含まれる１０Ｂ核を効率よく腫瘍組織に取り込ませることができる。本発明の好ましい態様によれば、本発明の分子集合体はホウ素中性子捕捉療法に好適に用いることができる。
本発明の分子集合体は、例えば、経口、非経口、静脈、経皮、吸入経由さらには疾患部位に対して直接投与することができる。投与量は、有効量の範囲内であれば良く、対象疾患、投与対象、投与方法、症状などによっても異なるが、通常、体重１ｋｇ当たり、約１５００〜約７５００ｍｇ（脂質重量）である。
【００２１】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は、これらの実施例に制限されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
ホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体の製造（１）
ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＳＥＲＩＥＳ  ＤＳＰＥ−０２０ＭＡ（ＮＯＦ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）１２０ｍｇおよび１０Ｂ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｍｅｒｃａｐｔｏｄｏｄｅｃａｂｏｒａｔｅ（ＢＳＨ）（Ｋａｔｃｈｅｍ  ｓｐｏｌ．ｓｒ．ｏ．，  Ｌｔｄ．）４０ｍｇ、ＰＢＳ（６ｍＬ、ｐＨ７．０）を０．１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液にてｐＨ８．０に調製し、室温で、３時間反応させた。反応は、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）で進行度合いを確認しながら行った。
その後、透析（ＭＷＣＯ：５００〜１０００）により粗生成物の純度を上げ、凍結乾燥を行って次式で示される目的物を得た。目的物の純度は高速液体クロマトグラフの結果（図３）から８１．７％（重量基準）、収量は１１５．４ｍｇであった。
【化４】
2014030715.tif 000006
【００２３】
透析の条件およびＰＢＳ調製時に用いた各試薬は、以下に示したとおりである。
透析の条件：
外液：超純水
外液交換：５回/２時間
室温
ＰＢＳ調製時に用いた各試薬： 
リン酸水素ナトリウム１２水和物
リン酸二水素カリウム
塩化ナトリウム
塩化カリウム
上記試薬は、いずれも、ＳＩＧＭＡ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。【００２４】
化合物の同定は、マススペクトルおよび高速液体クロマトグラフにより行った。結果を図２Ａ、Ｂおよび３に示す。
図２ＡおよびＢに示されるとおり、本化合物のＥｘａｃｔ  ｍａｓｓである３１４６．０７に対し、３１４７．６９０の測定値を確認できた。これは分子量誤差（％）が０．０８％であり、本化合物の合成に成功したといえる。また、他のピークに関して、分子量４４ずつの差がみられているが、これはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１ｍｅｒ（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）に相当し、本化合物の合成が成功したことを裏付けている。
また、図３に示されるとおり、ピーク面積８１．７１％の測定値を確認できた。ゆえに本化合物は上記合成スキームにより高純度で得られたといえる。
【実施例２】
【００２５】
リポソームの調製
Ｌ−α−ホスファチジルコリンジアステロイル（ＤＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）および実施例１で製造したホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体（ＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ）を、表１に示した組成比（モル比）で用いて混合脂質を調製し、有機溶媒（クロロホルム、メタノール）に溶解させ、バンガム法によりリポソームを作製した。得られたリポソームは、エクストルージョンを用いて１００ｎｍサイジングし、ホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体をそれぞれ５％、１０％、１５％または２０％含むリポソーム（１）〜（４）を調製した。
【表１】
2014030715.tif 000007
【実施例３】
【００２６】
ホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体（ＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ）のリポソームへの組込率
実施例２で調製した各リポソームについて、ゲルサイズ排除クロマトグラフィーにより、ホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体のリポソームへの組込率を調べた。
まず、実施例２で得られたリポソーム混合溶液を、ゲルサイズ排除クロマトグラフィーにより、リポソーム画分、ミセル画分、単分子画分に分離した。各分画の一例を図４に示す。
次に、リポソーム分画に含まれるホウ素原子の濃度（ｐｐｍ）を誘導結合プラズマ発光分光分析装置（ＩＣＰ−ＡＥＳ）（株式会社島津製作所製、「ＩＣＰＳ−８１００」）により測定し、その測定値から、ホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体のリポソームへの組込率を算出した。
その結果、実施例２で得られた各リポソームにおいて、ホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体は効率よく組み込まれていることが分かった。実施例２で得られた各リポソームに対するホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体の組込率を表２および図５に示す。
【表２】
2014030715.tif 000008
【実施例４】
【００２７】
リポソームの物性
動的光散乱法（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．社製）により、Ｌ−α−ホスファチジルコリンジアステロイル（ＤＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、Ｌ−α−ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）−ＰＥＧ２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）および実施例１で製造したホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体の２種以上で構成される単分散の各リポソームの粒子径およびゼータ電位を測定し、比較した。各リポソームは、実施例２と同様に、脂質薄膜法、続いて押出法により調製した。結果を表３に示す。
【表３】
2014030715.tif 000009
表３に示すとおり、ホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体を含む本発明のリポソーム（ＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ  ５％リポソームあるいはＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ  １０％リポソーム）は、ＰＥＧ修飾リポソーム（ＰＥＧリポソーム）と同様、マイナスの値のゼータ電位を示した。また、本発明のリポソームの粒子径は、およそ１００ｎｍから２００ｎｍ以下であり、最もＥＰＲ効果（enhanced permeability and retention effect）が得られる粒子径にコントロールされている。
図６は、ＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ  ５％リポソームの透過型電子顕微鏡写真（加速電圧：１００ｋＶ）である（図中、矢印で示す。）。図６に示されるとおり、ＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ修飾リポソームは二重ラメラを形成し、単層構造である。
【実施例５】
【００２８】
ホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体の製造（２）
ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＳＥＲＩＥＳ  ＤＳＰＥ−０２０ＭＡ（ＮＯＦ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）１２０ｍｇおよび１０Ｂ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｍｅｒｃａｐｔｏｄｏｄｅｃａｂｏｒａｔｅ（ＢＳＨ）（Ｋａｔｃｈｅｍ  ｓｐｏｌ．ｓｒ．ｏ．，  Ｌｔｄ．）４０ｍｇ、ＰＢＳ（６ｍＬ、ｐＨ７．０）を０．１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液にてｐＨ８．０に調製し、遮光、室温で、３時間反応させた。反応は、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）で進行度合いを確認しながら行った。
その後、透析（ＭＷＣＯ：５００〜１０００）により粗生成物の純度を上げ、凍結乾燥を行って次式で示される目的物を得た。目的物の純度は、８９．０５％（重量基準）、収量は１３５．０ｍｇであった。
【化５】
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【００２９】
透析の条件およびＰＢＳ調製時に用いた各試薬は、以下に示したとおりである。
透析の条件：
外液：超純水
外液交換：５回/２時間
室温、遮光
ＰＢＳ調製時に用いた各試薬： 
リン酸水素ナトリウム１２水和物
リン酸二水素カリウム
塩化ナトリウム
塩化カリウム
上記試薬は、いずれも、ＳＩＧＭＡ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。【００３０】
化合物の同定は、１Ｈ−ＮＭＲ、１０Ｂ−ＮＭＲ、マススペクトル（飛行時間型質量分析法、ＴＯＦ−ＭＳ）および高速液体クロマトグラフにより行った。結果を図７、８、９および１０にそれぞれ示す。
図７に示されるとおり、ＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄはアルキル鎖末端のメチル基（２ＣＨ２ＣＨ３）のピーク δ＝０．８９［ｔ、６Ｈ］を観測し、合成物にアルキル鎖が２本あることを確認した。
また、図８に示されるとおり、ＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄはホウ素ピークδ＝−１１からδ＝−１６を観測し、合成物はホウ素化合物であることを確認した。
また、図９Ａ及びＢに示されるとおり、本化合物のＥｘａｃｔ  ｍａｓｓである３１４６．０７に対し、３１４５．５２０の測定値を確認できた。これは分子量誤差（％）が０．０１７％であり、本化合物の合成に成功したといえる。また、他のピークに関して、分子量４４ずつの差がみられているが、これはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１ｍｅｒ（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）に相当し、本化合物の合成が成功したことを裏付けている。
また、図１０に示されるとおり、ピーク面積８９．０５％の測定値を確認できた。ゆえに本化合物は上記合成スキームにより高純度で得られたといえる。
【実施例６】
【００３１】
中性子線照射による正常細胞への影響 (ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
以下に示す方法で、中性子線照射による正常細胞への影響 (ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を検討した。試験に用いた細胞腫はＶ７９  ３７９Ａ（ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｎｏｒｍａｌ）である。
＜方法＞
脂質組成比（ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ＝１：１：０．１２）、脂質濃度５０ｍｇ／ｍＬ、超音波処理法で調製したリポソーム懸濁液を超遠心分離（１００，０００×ｇ、２時間、４℃）し、得られたＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ  ５％リポソームを用いた。中性子線照射はＫＵＲで行った。２．６５×１０１２ｔｈｅｒｍａｌ  ｎｅｕｔｒｏｎ／ｃｍ２を各時間（１５分、３０分、５分）照射した。照射後、ギムザ染色液を用いて、コロニーフォメーションアッセイを行った。照射時に用いたサンプルは次の２つである。  
（１）ｗａｓｈ
Ｖ７９  ３７９Ａ細胞（４×１０５ｃｅｌｌｓ）を２５Ｔｆｌａｓｋに播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下６時間培養した。６時間後、培地を交換し、新鮮培養液４ｍＬにＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ  ５％リポソーム溶液を１ｍＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下２時間培養した。２時間後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、トリプシンを加えて細胞をはがし、細胞を遠心分離で沈殿させ、上清を除き、新鮮培養液２ｍＬを加えて細胞懸濁液とした。細胞懸濁液２ｍＬから５００μＬをクライオチューブに分取し、１サンプルとした。
（２）ｎｏｎ  ｗａｓｈ
Ｖ７９  ３７９Ａ  細胞（４×１０５ｃｅｌｌｓ）を２５Ｔｆｌａｓｋに播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下６時間培養した。６時間後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後トリプシンを加えて細胞をはがし、細胞数をカウントした。細胞を遠心分離で沈殿させ、上清を除き、新鮮培養液１ｍＬを加えて細胞懸濁液とした。クライオチューブにＶ７９  ３７９Ａ細胞  ２５０μｌ（１×１０５ｃｅｌｌｓ）を分取し、ＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ  ５％リポソーム溶液２５０μＬを添加し、２時間培養した細胞懸濁液を１サンプルとした。
＜結果＞
図１１に示されるとおり、ＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ  ５％リポソームをＶ７９  ３７９Ａ細胞に添加後、１ｗａｓｈの操作を行った群（ＰＢＬ（ｗａｓｈ））は、中性子線照射のみを行った群（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｏｎｌｙ）と比較して、中性子線照射のみを行った群と同等の殺細胞効果しか観察されず、ＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ  ５％修飾リポソーム添加による有意差がないことを確認した。検定にはスチューデントのｔ検定を用いた。また、２ｎｏｎ  ｗａｓｈの操作を行った群（ＰＢＬ（ｎｏｎ  ｗａｓｈ））においては、中性子線照射により殺細胞効果が観察され、ＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ  ５％修飾リポソームが１０Ｂ−ｅｎｒｉｃｈのホウ素原子団を含有していることを確認した。
Ｖ７９  ３７９Ａは、Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌであり、正常細胞との毒性実験として行った。その結果、ＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄは中性子照射によってのみ殺細胞効果を得ると考えられる。
【実施例７】
【００３２】
中性子照射による抗腫瘍効果の測定 （ｉｎ  ｖｉｖｏ）
以下に示す方法で中性子線照射による抗腫瘍効果を測定した（ｉｎ  ｖｉｖｏ）。
＜方法＞
実施例６と同様にして作製したＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ  ５％リポソームを担がんマウスに投与し、そのＢＮＣＴ治療効果を検討した。担がんモデルは、ＢＡＬＢ／ｃＡ  ｍｉｃｅ（ｆｅｍａｌｅ、４ｗｅｅｋｓ  ｏｌｄ，ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ  １６−２０ｇ）にマウス大腸がん細胞（ＣＴ２６、５×１０６ｃｅｌｌｓ）を右大腿部に播種し、腫瘍直径６−８ｍｍとなるように作製した（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ後、約８日）。実験の際には、マウスはイソフルレンの吸入麻酔器を用いて、苦痛なく処置を行った。一連の動物実験にあたっては、あらかじめ、動物実験計画書を筑波大学動物実験委員会に提出し、動物実験に関する法規、基準に準拠し、動物に対する苦痛の軽減等についても考慮した計画とし、認可を得た。また、同様の手続きを京都大学共同利用申請において行った。
作製した担がんマウスにＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ  ５％リポソームを１０ｍｇ１０Ｂ／ｋｇで尾静注し、２４時間後に中性子線照射をＫＵＲで行った。中性子線量は、４．５−７．０×１０１２ｎｅｕｔｒｏｎ／ｃｍ２とした。
腫瘍増殖抑制効果を照射後の腫瘍径を経時的に２１日目まで測定し、コントロール群と比較した。コントロールには、ＢＳＨ溶液群（ＢＳＨ、６例）、中性子線照射のみ群（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｏｎｌｙ、６例）、投薬・照射なし群（ｎｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、１２例）を用いて、比較検討した。腫瘍サイズの測定は下記の計算式を用いた。
（長径（ｍｍ））×（短径（ｍｍ））２  ＝  腫瘍サイズ（ｍｍ３）
＜結果＞
図１２に示されるとおり、ＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ  修飾リポソームは１０、１４、１７、２１日目において、いずれの群とも比較して有意に腫瘍増殖抑制が見られ、特に１４日までは腫瘍が増大することはなかった。また、ＰＥＧ−Ｂｏｒｏｎ−ｌｉｐｉｄ  ５％リポソーム投与群６例のうち１例に腫瘍の完全消失を確認した。
腫瘍増殖抑制効果は図１２からはＢＳＨとの比較によってのみの結果である。しかし、臨床例として用いられているＢＳＨよりも良好な結果を得たことから、その効果は高いといえる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明のホウ素クラスター修飾ＰＥＧ脂質誘導体は、ホウ素デリバリーを可能としたドラッグキャリアーとして有用である。本発明の好ましい態様によれば、該ＰＥＧ脂質誘導体を含む本発明の分子集合体は、腫瘍内のホウ素の高濃度化と、ＤＤＳを用いることによる正常細胞への低集積化とを実現できる可能性が高く、癌のホウ素中性子捕捉療法におけるホウ素担体化合物としての利用が期待される。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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