(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、化学合成法や遺伝子工学的方法により簡単に作製が可能な、ＥｐＣＡＭに高い結合能を有する新規のペプチドを提供することにある。【解決手段】  ファージライブラリのスクリーニング方法の改良により、従来のペプチドと比較して高い結合能を有するペプチドのスクリーニングに成功した。また、すでに開示しているＥｐＣＡＭ結合能を有するペプチドをリード化合物として、その派生体の多様性集団を作製し、その中から、ＥｐＣＡＭに強く結合するペプチドを選択した。得られたペプチドは従来のペプチドに比べ、１０倍以上高いＥｐＣＡＭ結合能を示すことから、癌細胞の検出、診断に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１（ＸＨＬＸＣＸＸＸＸＣＷＸ）に示されるアミノ酸配列を含むＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド。
【請求項２】
配列番号１（ＸＨＬＸＣＸＸＸＸＣＷＸ）に示されるアミノ酸配列からなるＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド。
【請求項３】
配列番号２（ＥＨＬＨＣＬＧＳＬＣＷＰ；Ｅｐ１３３）に示されるアミノ酸配列からなるＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド。
【請求項４】
配列番号３（ＫＨＬＱＣＶＲＮＩＣＷＳ；Ｅｐ１１４）に示されるアミノ酸配列からなるＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチド。
【請求項５】
検出可能なマーカーで標識された請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチドとマーカーたんぱく質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチド。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項記載のペプチド、若しくは請求項６記載の融合ペプチドと、ＥｐＣＡＭとが結合したＥｐＣＡＭ−ペプチド複合体。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチドを、その粒子表面上に提示することを特徴とするＥｐＣＡＭに結合能を有するファージ。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド、又は請求項６記載の融合ペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９記載のＤＮＡを含み、かつＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドを発現することができる組換えベクター。
【請求項１１】
組換えプラスミドベクターである請求項１０記載の組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１０又は１１記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項記載のペプチド、又は請求項６記載の融合ペプチドを用いることを特徴とする、ＥｐＣＡＭの検出及び／又は定量方法。
【請求項１４】
請求項３及び４のペプチドを認識する抗体。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか１項記載のペプチド、又は請求項６記載の融合ペプチドを含むことを特徴とする、癌の診断用組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥｐＣＡＭに高い結合能を有するペプチド、かかるペプチドを含む融合タンパク質等の派生物、かかるペプチドを認識する抗体、かかるペプチドを用いたＥｐＣＡＭの検出・定量方法やかかるペプチドを含む癌の診断用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮細胞接着因子（ＥｐＣＡＭ; Epithelial cell adhesion molecule, ＣＤ３２６）は、大腸癌で発現している癌特異的細胞表面抗原として報告されたI型膜タンパク質である（非特許文献１）。ＥｐＣＡＭは正常組織では主として上皮細胞の基底膜に発現しているが、上皮由来のほとんどの癌細胞で発現が認められることから、いわゆる癌抗原として知られ、診断マーカーとして有用であることが示されている（非特許文献２）。【０００３】
近年、感度良く癌細胞を検出する技術の確立に伴い、血液中を循環している循環腫瘍細胞が存在することが見出されてきている。循環腫瘍細胞の存在は、癌の転移と密接な関係にあることから、予後予測に非常に重要である。ＥｐＣＡＭは上述のようにほとんどの上皮由来の癌細胞で検出されることから、ＥｐＣＡＭ抗原を表面に有する細胞を抗体によって集め、これを検出することによる予後予測がすでに行われている（特許文献１）。【０００４】
また、ＥｐＣＡＭが腫瘍細胞表面から解離して、悪性腫瘍患者の血清中で、その濃度が優位に増加することも示されており、腫瘍細胞の表面マーカーとしてだけではなく、血清中の腫瘍マーカーとして利用できることも示唆されてきている。【０００５】
さらに、近年診断だけではなく、治療においてもＥｐＣＡＭの有用性が示されてきている。すでにＥｐＣＡＭを利用した癌ワクチンが開発されており、バキュロウイルス等による昆虫細胞発現系を利用して調製したＥｐＣＡＭタンパク質や抗ＥｐＣＡＭ抗体の抗原認識部位に結合する抗イディオタイプ抗体を用いたワクチン療法も報告されている。また、癌治療用抗ＥｐＣＡＭ抗体も開発され、Ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ（ＭＴ２０１）、ＩＮＧ−１等の抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いた治験が行われている。これらの抗体を用いた治療では、癌細胞表面上のＥｐＣＡＭに抗体が結合し、生体内の免疫系により細胞性免疫（細胞障害活性）を誘導することにより癌を縮小させることを狙いとしている。さらに、抗ＥｐＣＡＭ抗体による細胞障害活性を高める目的で、抗ＥｐＣＡＭ抗体と緑膿菌外毒素を融合させたＰｒｏｘｉｎｉｕｍｓ  Ｖｉｖｅｎｄｉｕｍｓ (ＶＢ４−８４５)や、ＩＬ−２と融合させたＥＭＤ ２７３ ０６６(ｈｕＫＳ−ＩＬ２)や、抗ＣＤ３活性を併せ持つＥＵ承認薬であるカツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｉｍａｂ）等が開発されている（非特許文献３、４）。【０００６】
上述のように、ＥｐＣＡＭは癌の診断、予後予測、治療のうえで非常に重要であり、抗体等、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する分子の癌の診断、治療面における有用性が認められている。ＥｐＣＡＭに特異的に結合する分子としては、上記抗体の他に、α-アクチニン、クローディン７、ＣＤ４４のスプライシングバリアントであるＣＤ４４ｖ４‐ｖ７、テトラスパニンの一種であるＤ６．１Ａタンパク質などが知られている(非特許文献５)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００８−５３３５８７号公報
【特許文献２】特開２０１１−１９３７２８号公報
【特許文献３】特許第４８４３５０５号
【特許文献４】特許第３９１６６５３号
【特許文献５】特許第４５９２７５２号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Herlyn M et al., Proc Natl Acad SciUSA, 1979, Vol.76: p.1438-1442,
【非特許文献２】van der Gun BT., Br J Cancer. 2011, Vol.105(2),  p.312-319
【非特許文献３】Chaudry MA., Br J Cancer. 2007 , Vol.96(7), p.1013-1019.
【非特許文献４】Linke R, MAbs. 2010, Vol.2(2), p.129-136
【非特許文献５】Kuhn, S. et al., Mol Cancer Res., 2007, Vol.5, p.553-567
【非特許文献６】Okuda, M. et al., Biotechnol Bioeng. 2003, Vol.84, p.187-194
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、これまでに知られている抗体や内在するＥｐＣＡＭに結合能を有する分子は、単離や調製に手間がかかることから、高いコストを必要とする。また、培養細胞系を用いる抗体の場合には、タンパク質調製の際の有害物質のコンタミネーションの可能性を排除することができず、治療に用いる際には安全性の面で細心の注意を払わなければならない。【００１０】
そこで、ポスト抗体医薬、ポスト抗体診断薬として、細胞培養系を用いず、安価に調製が可能なＥｐＣＡＭに結合能を有する化合物が望まれている。【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために、すでに化学合成法や遺伝子工学的手法を用いて簡単に作製することができる、ＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドを開示している（特許文献２）。これは、固相化したＥｐＣＡＭタンパク質に、多様なペプチド配列をファージ粒子上に提示するファージ集団を接触させ、ＥｐＣＡＭタンパク質に結合したファージ粒子を回収し、ＥｐＣＡＭに特異的に結合するファージクローンから選択されたものである。このファージクローンのＤＮＡ配列の解析から、ＥｐＣＡＭに特異的に結合するペプチドのアミノ酸配列がＫＳＬＱＣＩＮＮＬＣＷＰであることが明らかにされ、このペプチドはＥｐ３０１と命名された。【００１２】
しかしながら、上記ペプチドＥｐ３０１はＥｐＣＡＭに対する結合能が弱く、ファージ上では結合能を発揮するものの、ファージから切り離すとＥｐＣＡＭに対する結合能が弱くなるために、診断等に用いるには精度のうえで問題があり、また、治療に用いることも難しかった。【００１３】
そこで、本発明では、ＥｐＣＡＭに対する結合能が強く、ＥｐＣＡＭ発現細胞をより認識するペプチドを提供し、該ペプチドを用いたＥｐＣＡＭを検出する様々な方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために、ファージライブラリのスクリーニング方法を改良することにより、ＥｐＣＡＭに対する結合能が強いクローンＥｐ１３３のクローニングに成功した。【００１５】
また、Ｅｐ３０１をリード化合物として、その派生体の多様性集団を作製し、その中からＥｐＣＡＭ分子により強く結合するＥｐ１１４のクローニングに成功した。【００１６】
すなわち本発明は、配列番号１（ＸＨＬＸＣＸＸＸＸＣＷＸ）に示されるアミノ酸配列を含むＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドであることを特徴とする。【００１７】
今回得られたＥｐＣＡＭに強く結合する２つのペプチドの配列解析から、２、３、５、１０、１１番目のアミノ酸配列が、各々ヒスチジン、ロイシン、システイン、システイン、トリプトファンに保存されており、これら配列がＥｐＣＡＭに強く結合するために極めて重要であると考えられる。【００１８】
上記５つのアミノ酸が保存された配列を含むペプチドはＥｐＣＡＭに強く結合する可能性が高いことから、これら配列が保存されたライブラリを作製し、スクリーニングを行うことによって、さらに新規のＥｐＣＡＭに高い結合能を有するペプチドを得ることができる。【００１９】
また、本発明は、配列番号２（ＥＨＬＨＣＬＧＳＬＣＷＰ；Ｅｐ１３３）、又は配列番号３（ＫＨＬＱＣＶＲＮＩＣＷＳ；Ｅｐ１１４）の配列を有するペプチドであることを特徴とする。【００２０】
上記２つのペプチドは、本発明者らがすでに開示しているペプチドＥｐ３０１と比較して、１０倍程度強く結合する。したがって、感度良くＥｐＣＡＭの検出を行うことができるため、精度の高い診断が可能である。【００２１】
また本発明は、検出可能なマーカーで標識された上記いずれかのペプチドや、上記いずれかのペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチド、又は上記いずれかのペプチド若しくは上記融合ペプチドと、ＥｐＣＡＭとが結合したＥｐＣＡＭ−ペプチド複合体、及び上記いずれかのペプチドを、その粒子表面上に提示することを特徴とするＥｐＣＡＭに結合能を有するファージや、上記いずれかのペプチドを認識する抗体であることを特徴とする。【００２２】
検出可能なマーカーやタグ等とペプチドを結合させることにより、様々な応用が可能となることから、診断等に幅広く活用することができる。また、ファージに提示させた形態や、ＥｐＣＡＭ結合ペプチドを認識する抗体によっても、ＥｐＣＡＭを感度良く検出することができるようになり、診断の精度を上げることが可能となる。【００２３】
さらに本発明は、上記いずれかのペプチドをコードするＤＮＡや、該ＤＮＡを含み、かつＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドを発現することができる組換えベクター、特に組換えプラスミドベクター、これら組換えベクターが導入された形質転換体であることを特徴とする。【００２４】
上記ペプチドをコードするＤＮＡ、組換えベクターを用いることによって、公知の遺伝子工学の手法を用い、簡便に大量のＥｐＣＡＭ結合ペプチドを製造することが可能となる。【００２５】
また本発明は、上記いずれかのペプチド、若しくは上記融合ペプチドを用いる、ＥｐＣＡＭの検出・定量方法であることを特徴とする。本発明で開示するペプチドは、ＥｐＣＡＭに対する結合能が高いことから、非常に感度良くＥｐＣＡＭを検出することができ、したがって、ＥｐＣＡＭを正確に定量することができる。【００２６】
ＥｐＣＡＭは、上皮由来のほとんどの癌で発現が見られることから、精度の高い、正確な検出により、ＥｐＣＡＭペプチドを用いた癌の診断を行うことが可能となる。特にＥｐＣＡＭは、癌の転移との相関が知られていることから、癌の予後診断を精度良く行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Ｄ−１２ファージライブラリを用いた、ＥｐＣＡＭへのバイオパニングの方法を模式図、バイオパニングの結果、及び固相化条件を変えたＥｐＣＡＭに対するファージ結合能を示す図。
【図２】ＥｐＣＡＭ結合ペプチドのＥｐＣＡＭへの結合を蛍光偏光解消法により測定した結果を示す図である。
【図３】変異体ファージによるＥｐ１１４の機能部位の特定を示す図。
【図４】変異体ファージによるＥｐ１１４の１残基目のリシンの機能を示す図。
【図５】Ｅｐ１１４を用いた免疫沈降法によるＥｐＣＡＭ検出応用例とリンカーの役割を示す図。
【図６】蛍光標識エクソソームを用いた検出方法を示す図。
【図７】Ｅｐ１１４を用いたＥＬＩＳＡによる検出例を示す図。
【図８】フェリチンＥｐ１１４を用いた応用例を示す図。
【図９】スフェロイド培養した細胞のＥｐＣＡＭペプチドによる細胞染色を示す図。
【図１０】ＥｐＣＡＭペプチドによる細胞染色を示す図。
【図１１】Ｅｐ１１４が自動酸化によりＳ−Ｓ結合を形成することを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明者らは、研究を重ねた結果、ＥｐＣＡＭに強く結合する配列番号２及び配列番号３として開示する２種類のペプチドをクローニングすることに成功した。
【００２９】
配列番号２に示されるアミノ酸配列ＥＨＬＨＣＬＧＳＬＣＷＰ（以下Ｅｐ１３３という）及び、配列番号３に示されるアミノ酸配列ＫＨＬＱＣＶＲＮＩＣＷＳ（以下Ｅｐ１１４という）は、先に本発明者らにより開発されたＥｐＣＡＭ結合ペプチドＥｐ３０１（配列ＫＳＬＱＣＩＮＮＬＣＷＰ）と比較して、１０倍以上高いＥｐＣＡＭ結合能を有する。
【００３０】
また、配列番号２及び配列番号３の２種類のペプチドに保存されている共通のアミノ酸配列ＸＨＬＸＣＸＸＸＸＣＷＸ（配列番号１）は、ＥｐＣＡＭに対して強く結合するペプチドを含み得る。したがって、上記配列を含むペプチドを用いれば、新たなＥｐＣＡＭに高い結合能を有するペプチドをクローニングすることが期待できる。
【００３１】
上記本発明のペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。
【００３２】
さらに、上記本発明のペプチドは、本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列情報により、遺伝子工学的手法を用いて定法により調製することもできる。このようにして得られる本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドは、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。
【００３３】
上記本発明のペプチドは、検出可能なマーカーで標識されていてもよく、上記検出可能なマーカーとしては、従来知られているペプチド標識用のマーカーであれば特に制限されるものではないが、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ等の放射性同位体や、ダンシルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質や、ビオチン、ジゴキシゲニンのような生化学研究ツールとして汎用されている生体由来の分子や、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート、画像処理剤等を具体的に挙げることができる。
【００３４】
また、本発明のペプチドは、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグに結合した融合ペプチドであってもよい。本発明の融合ペプチドとしては、本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよい。上記マーカータンパク質やペプチドタグは従来知られているものであれば特に制限されるものではないが、上記マーカータンパク質としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、フェリチンなどを具体的に挙げることができ、また、上記ペプチドタグとしては、例えば、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ビオチン化ペプチド 、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどを具体的に例示することができる。以上のような、本発明の標識されたペプチドや融合ペプチドは、定法により作製することができ、本発明のペプチドの精製や、本発明のペプチドの検出の際に有用であるだけでなく、被検試料中のＥｐＣＡＭの検出・定量やＥｐＣＡＭを発現する細胞の検出・分離等を行う際にも非常に有用である。
【００３５】
さらに、本発明には、上記ペプチドや融合ペプチドを、ＥｐＣＡＭタンパク質と結合させたＥｐＣＡＭ−ペプチド複合体も含まれる。本発明のＥｐＣＡＭ−ペプチド複合体としては、本発明のペプチドや融合ペプチドとＥｐＣＡＭとが結合したＥｐＣＡＭ−ペプチド複合体であれば特に制限されるものではなく、ＥｐＣＡＭと細胞内の他の分子との相互作用の検討など、ＥｐＣＡＭの分子レベルでの機能解析に有用に用いることができる。
【００３６】
本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するファージとしては、本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドをその粒子表面上に提示するファージであればどのようなものでもよく、かかるＥｐＣＡＭに結合能を有するファージは、配列番号１のアミノ酸配列を有するファージライブラリスクリーニングの過程で、ＥｐＣＡＭに強く結合したペプチド提示ファージを、その他のファージ集団から分離することにより得られる他、本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドをコードするＤＮＡを、定法によりファージミドベクターに組み込んで大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、ヘルパーファージを感染させることで得ることもできる。
【００３７】
本発明のペプチドを認識する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等を具体的に挙げることができ、これらは上記本発明のペプチドを抗原として用いて定法により作製することができる。
【００３８】
本発明のペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物に本発明のペプチド又はその断片を免疫することにより産生される。具体的には、本発明のペプチドを合成し、キーホールリンペットヘモシアニン等のキャリアタンパク質に結合させ、ウサギ、ヤギ、マウス等の動物に免疫し、抗体価の上昇を確認後、血清を採取する。
【００３９】
また、モノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature, 1975, Vol. 256, p.495-497）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today, 1983, Vol.4, p.72）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 1985, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc.）など任意の方法を用いることができる。
【００４０】
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明のＤＮＡを含み、かつＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドを発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡを発現するベクター、好ましくは発現プラスミドベクターに適切に挿入することにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明のＤＮＡが転写できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。
【００４１】
上記発現ベクターとして、例えば、ｐＣＭＶ６‐ＸＬ３（オリジンテクノロジーズ社製）、ＥＧＦＰ-Ｃ１（クロンテック社製）、ｐＧＢＴ‐９(クロンテック社製)、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 1990, Vol.3, p.133）、ｐＣＤＭ８（Nature, 1987, Vol.329, p.840）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 1987, Vol.101, p.1307）、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。また、プロモーターとしては、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。さらに、プロモーターの下流に蛍光蛋白質をコードする遺伝子等のレポーター遺伝子を融合することができる。蛍光蛋白質としては、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）、青色蛍光蛋白質（ＢＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）、赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼを例示することができる。
【００４２】
また、特許文献３〜５に示されている方法により、本発明のＥｐＣＡＭ結合ペプチドをフェリチン、フェリチンの一部、又は修飾されたフェリチンと融合させて用いることによって、ＥｐＣＡＭタンパク質に対する結合能を有する、鉄、マグネタイト、金、化合物半導体、などの無機材料を含むナノキャリア体を作製することができる。鉄、マグネタイトのような磁性を有する無機材料と融合させることにより、磁力による分離が可能となり、また、マグネタイトと融合させることにより、ＭＲＩに利用することができるようになる。
【００４３】
また、本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが宿主細胞に導入され、かつ本発明のＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドを発現する形質転換体であれば特に制限されるものではなく、形質転換酵母、形質転換植物（細胞、組織、個体）、形質転換細菌、形質転換動物（細胞、組織、個体）等を挙げることができるが、形質転換動物細胞が好ましい。
【００４４】
本発明のペプチド又は融合ペプチドは、ＥｐＣＡＭの検出・定量に利用することができる。本発明のＥｐＣＡＭの検出・定量方法としては、本発明のペプチド又は融合ペプチドを用いるものであれば、どのような方法でもよい。検出可能なマーカーで標識された本発明のペプチドや、本発明の融合ペプチドを用いる場合は、使用したマーカー等の標識物質の種類に応じて適切な検出・定量手法を選択することができる。また、上記ＥｐＣＡＭの検出・定量方法としては、本発明のペプチドと本発明の抗体を組み合わせて行うこともできる。例えば、ＥｐＣＡＭと本発明のペプチドを結合させた後、本発明の抗体でペプチドを認識させ、さらに標識した二次抗体により本発明の抗体を検出させれば、非常に感度の良い検出が可能となる。また、本発明の抗体を認識する二次抗体の標識を代えることにより、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、免疫染色法、ウエスタンブロット法等の公知の免疫学的測定方法への簡便な応用が可能である。
【００４５】
さらに、上記本発明のペプチド又は融合ペプチドを用いることにより、ＥｐＣＡＭを発現する細胞を検出・分離することができる。ＥｐＣＡＭを発現する細胞を検出するには、検出可能なマーカーで標識された本発明のペプチドや、本発明の融合ペプチドを用いることができる。また、使用するマーカー等、標識物質の種類に応じて公知の分離手法により、ＥｐＣＡＭ発現細胞の分離が可能である。例えば、標識物質として蛍光物質を使用した場合には、蛍光を指標としたフローサイトメトリーによって、効率的かつ高精度のＥｐＣＡＭ発現細胞の分離が可能となる。
【００４６】
本発明の癌の診断用組成物としては、本発明のペプチド又は本発明の融合ペプチドを含むものであれば特に制限されるものではない。また、本発明の抗体と組み合わせて用いることもできる。
【００４７】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４８】
［Ｅｐ１３３のスクリーニング］
１．ファージライブライリ
スクリーニングには、Ph.D.-12 peptide phage display kit（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）を使用した。このライブラリは、１２残基の直線状ランダムペプチドを提示するファージライブラリであり、２．７ｘ１０９の多様性を有する。
２．パニング
パニングの方法は図１（Ａ）に模式的に示す。非特異的に吸着するファージを除去するために、ファージは予め、精製ＥｐＣＡＭを結合させていない、抗体のみを固相化したビーズに前結合させ、結合しなかったものを回収して用いる。なお、この操作はすべてのラウンドの前に行い、非特異的に吸着するファージの除去を行った。ストレプトアビジンを被覆したＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  Ｍ?２８０（商標）に、ビオチン化ポリクロ―ナルＥｐＣＡＭ抗体を固定化し、このビーズを用いてＥｐＣＡＭを固定化する。パニングはＴＢＳＴ（０．０１％Tween20, Tris buffered saline）中で行った。３μｇのＥｐＣＡＭをビーズに固定化した。ＥｐＣＡＭ固相化ビーズにファージを添加し、洗浄後、酸処理でビーズから溶出されたファージを大腸菌で増殖後、２回目のスクリーニングに回した。【００４９】
ＥｐＣＡＭタンパク質は、ＥｐＣＡＭｃＤＮＡがｐＩＮＣＹに挿入されているプラスミド（オープンバイオシステムズ社製、MHS-1010-74356）を用い、ＥｐＣＡＭの細胞外ドメインのＣ末にｍｙｃ及びＨｉｓタグをつけてコンストラクトを構築し、これをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞で発現させ、精製した。【００５０】
２回目のバイオパニングでは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、３００μｇをコートしたＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｇ（商標）に２．４μｇのモノクローナルＥｐＣＡＭ抗体（Ｖｕ?１Ｄ９，アブカム社）を固定化し、このビーズにさらに３μｇの精製ＥｐＣＡＭを結合させた。第１ラウンドで得られたファージを力価１ｘ１０１１で加え、洗浄後、酸処理でビーズから溶出されたファージを大腸菌で増殖し、３回目のパニングに回した。以下、３回目、５回目のパニングは１回目のパニングと同じ条件で行い、さらに、４回目のパニングを２回目と同じ条件で行った。【００５１】
ＥｐＣＡＭ固定化ビーズに添加したファージの力価と、最終的に溶出したファージの力価との比を求め選別回数ごとにプロットした（図１Ｂ）。【００５２】
同一条件でパニングを行っている１回目、３回目、５回目、そして２回目、４回目で力価の比を比較する。いずれの場合もラウンドを重ねるごとに添加したファージの力価に対する溶出したファージの力価の比が増加し、ＥｐＣＡＭに結合するファージの濃縮が進んでいることが示されている。【００５３】
なお、力価測定及びファージの増幅は定法（Phage Display-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）に従い行った。ファージの増幅には、対数増殖中のＥＲ２７３８菌［Ｆ‘ｌａｃｌｑ△（ｌａｃＺ）Ｍ１５ｐｒｏＡ＋Ｂ＋ｚｚｆ：：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ）ｆｈｕＡ２ｓｕｐＥｔｈｉ△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）△（ｈｓｄＭＳ−ｍｃｒＢ）５（ｒｋ−ｍｋ−ＭｃｒＢＣ−）］を用いて行った。【００５４】
３．ファージクローンの配列決定
パニング４回目で溶出されたファージを１１個ランダムに選び、その提示するペプチドの配列を、定法による該当部分のＤＮＡ配列解析（Phage Display A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）に従い決定した。【００５５】
塩基配列の決定は、提示ペプチド領域から９６塩基下流に位置する塩基配列の相補鎖に相当するプライマー(−９６ｇIII シーケンシングプライマー：配列番号４（ccctcatagt tagcgtaacg）を用いたダイデオキシターミネイト法により行った（CEQ DTCS Quick start kit、ベックマン社製）。反応産物の泳動とデータ解析にはキャピラリーシーケンサーを用いた。その結果、１１個のクローンは全て、同一配列のペプチドを提示しており、Ｅｐ１３３と名づけた。Ｅｐ１３３の配列はＥＨＬＨＣＬＧＳＬＣＷＰ（配列番号２）であった。【００５６】
クローン化したＥｐ１３３を提示するファージを用いて、固相化条件を変えたＥｐＣＡＭに対するファージ結合能を解析した（図１Ｃ）。Ｅｐ１３３を提示するファージの結合能を、特許文献２で本発明者らがすでに開示しているＥｐＣＡＭ結合ペプチドＥｐ３０１、及びペプチドを提示しないファージ（＃４４７）と比較した。用いた条件は以下の通りである。【００５７】
条件１は、ＴＡＬＯＮ（商標）ビーズ０．４ｍｇに、ＥｐＣＡＭを１μｇ固相化（図１Ｃ中１、３、５、+と表示）させたものと、させていないもの（図１Ｃ中２、４、６、-と表示）に、各ファージを（図１Ｃ中、１、２は、Ｅｐ１３３を発現するファージ、３、４はＥｐ３０１を発現するファージ、５、６はペプチドを提示しないファージ４４７を示す。）、力価１×１０10で添加し、５回ＴＢＳＴで洗浄後、結合しているファージの力価を測定した。【００５８】
条件２は、プロテインＧビーズに、抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体（Ｖｕ-1Ｄ９、アブカム社）２．４μｇを固相化し、さらに抗体を介して、精製ＥｐＣＡＭを３μｇ固相化した。ＥｐＣＡＭを固相化（図１Ｃ中１、３、５、+と表示）させたものと、させていないもの（図１Ｃ中２、４、６、-と表示）に、各ファージを（図１Ｃ中、１、２は、Ｅｐ１３３を発現するファージ、３、４はＥｐ３０１を発現するファージ、５、６はペプチドを提示しないファージ４４７を示す。）、力価１×１０10で添加し、１回ＴＢＳＴで洗浄後、結合しているファージの力価を測定した。【００５９】
図１Ｃに示されているように、いずれの条件でも、Ｅｐ１３３を提示するファージは、固相化ビーズを用いた条件で、Ｅｐ３０１に比べ、およそ１０倍以上高いＥｐＣＡＭ結合能を示した。
【実施例２】
【００６０】
［Ｅｐ１１４のスクリーニング］
１．ファージライブラリ
先に特許文献２で開示したＥｐＣＡＭ結合ペプチドＥｐ３０１の配列（ＫＳＬＱＣＩＮＮＬＣＷＰ）のアラニンスキャンの解析より、ＥｐＣＡＭに対する結合に重要であることが示された、４番目、５番目、１０番目、１１番目のアミノ酸の４つを保存し、その他の部分には多様性をもたせたライブラリ（(ＫＲ）−Ｘ（ＬＩＭＶ）−Ｑ−Ｃ−（ＩＬＭＶ）−Ｘ−（ＮＱＨＫ）−（ＩＬＭＶ）−Ｃ−Ｗ−Ｘ）を作製してスクリーニングを行った。このライブラリは９．８×１０７の多様性を有する。【００６１】
２．パニング
ストレプトアビジンを被覆したＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  Ｍ?２８０（商標）３００μｇに、ビオチン化ポリクロ―ナルＥｐＣＡＭ抗体１．５μｇを固定化し、さらに１００ｎｇの精製ＥｐＣＡＭを加えて、ビーズにＥｐＣＡＭを固定化する。パニングはＴＢＳＴ中で行った。非特異的吸着ファージ除去のために、ファージは予め、精製ＥｐＣＡＭを結合させていない、抗体のみを固相化したビーズに前結合させ、結合しなかったものを回収して用いる。ＥｐＣＡＭが固定化されたビーズに力価１ｘ１０１１のファージを加え、１００μＭのＥｐ１３３をコンペティターとして加えた状態で、１５分間吸着させ、吸着ファージを酸処理で回収し、大腸菌で増殖させ、次のラウンドのパニングに用いた。２ラウンド目以降も同じ条件で、合計５回のパニングを行った。【００６２】
なお、力価測定及びファージの増幅は定法（Phage Display-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）に従い行った。ファージの増幅には、対数増殖中のＥＲ２７３８菌［Ｆ‘ｌａｃｌｑ△（ｌａｃＺ）Ｍ１５ｐｒｏＡ＋Ｂ＋ｚｚｆ：：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ）ｆｈｕＡ２ｓｕｐＥｔｈｉ△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）△（ｈｓｄＭＳ−ｍｃｒＢ）５（ｒｋ−ｍｋ−ＭｃｒＢＣ−）］を用いて行った。【００６３】
３．ファージクローンの配列決定
実施例１と同様にして配列を決定した。高いＥｐＣＡＭ結合能を有するペプチドとしてスクリーニングされたＥｐＣＡＭ結合ペプチド、Ｅｐ１１４の配列はＫＨＬＱＣＶＲＮＩＣＷＳ（配列番号３）であった。【００６４】
４．ＥｐＣＡＭ結合ペプチドにおける保存残基
実施例１及び実施例２で得られたＥｐＣＡＭに強く結合するペプチドＥｐ１３３とＥｐ１１４の配列によれば、２、３、５、１０、１１番目のアミノ酸配列が保存されており、これら５残基が、ＥｐＣＡＭに高い結合能を有するために重要である。すなわち、配列番号１のアミノ酸配列ＸＨＬＸＣＸＸＸＸＣＷＸを有するペプチドはＥｐＣＡＭに高い結合能を有することが期待される。【００６５】
したがって、これら５つのアミノ酸残基が保存されたペプチドライブラリをスクリーニングすることにより、新たにＥｐＣＡＭ結合能の高いペプチドを選択することも可能である。
【実施例３】
【００６６】
［蛍光偏光解消法によるＥｐＣＡＭ結合ペプチドとＥｐＣＡＭとの解離定数の測定］
分子間相互作用を評価する方法である蛍光偏光解消法によって、得られたＥｐＣＡＭペプチドのＥｐＣＡＭに対する結合力を測定した。蛍光標識したＥｐＣＡＭペプチドとＥｐＣＡＭとを用い、ブラウン運動による偏光の解消のカイネティクスから結合力を求める。【００６７】
ＦＩＴＣで修飾したＥｐＣＡＭペプチド、又はコントロールペプチドの濃度が１００μＭ程度になるようにＰＢＳに懸濁し、遠心後上清を回収し、１０倍希釈して４９５ｎｍで吸光度を測定した。測定値から下記式１のBeer-Lambertの公式を用いてペプチドのモル濃度を求めた。
【数１】
2014042209.tif 000002
【００６８】
（Ａ：吸光度、Ｅ：モル吸光係数（Ｌ／モル‐ｃｍ）、ｂ：光路長（ｃｍ）、Ｃ：モル濃度）
ＥｐＣＡＭを０から平衡に達するまで（Ｅｐ１３３ペプチドでは４０ｎＭ）、数点の濃度をＰＢＳで希釈して用意し、上記方法により正確な濃度を測定したＦＩＴＣ修飾ペプチドを添加する。測定する温度で３０分以上放置し、自動偏光測定ユニット(日本分光、ＡＰＨ−１０３)を装着した日本分光社製蛍光分光装置ＦＰ−６５００を用い偏光測定を行った。図２及び表１に得られた測定結果を示す。ヒルの式（Hill equation）でカーブフィッティングを行い、Ｋｄを求めた。【００６９】
本発明で得られたＥｐＣＡＭに高い結合能を有する２種類のペプチドＥｐ１３３（図２（Ａ））及びＥｐ１１４（図２（Ｃ））の解離定数を蛍光偏光解消法により測定した。また、いずれのＥｐＣＡＭ結合ペプチドも２つのシステイン残基が保存され、Ｓ−Ｓ結合の形成がＥｐＣＡＭ結合に必要であることが本発明者らの解析により明らかとなったことから、コントロールとして、Ｅｐ１３３の５番目と１０番目のシステインをセリンに置換したコントロールペプチド、Ｅｐ１３３コントロール（図２（Ｂ））を用いた。【００７０】
また、特許文献２に開示しているＥｐＣＡＭ結合ペプチドＥｐ３０１（図２（Ｄ））、及びＥｐ３０１の５番目と１０番目のシステインをセリンに置換したコントロールペプチドＥｐ３０１コントロール（図２（Ｅ））の結合定数及び、ＥｐＣＡＭ１０６−１１９番目のＥｐＣＡＭ結合ペプチドと部分的に相同性を有する配列（図２（Ｆ）)についても解離定数を同様に測定した。結果を図２及び表１に示す。【００７１】
【表１】
2014042209.tif 000003
Ｎ．Ｂ．：結合を認めず。【００７２】
上記示したように、今回新たに得られた２種類のペプチドＥｐ１３３及びＥｐ１１４は、既に得ていたＥｐ３０１に比べて１０倍以上強くＥｐＣＡＭに結合することが示された。【００７３】
また、５番目と１０番目のシステインをセリンに置換したペプチドはＥｐＣＡＭ結合性を示さなかったことから、これら２つのシステイン残基のＳ−Ｓ結合の形成が、ＥｐＣＡＭとの結合に重要であることが示唆される。【００７４】
さらに、ＥｐＣＡＭ１０６−１１９番目の配列は、ＥｐＣＡＭ結合ペプチドと部分的に相同性を示すが、ＥｐＣＡＭとの結合は認められなかった。
【実施例４】
【００７５】
［Ｅｐ１１４ペプチドの機能部位の解析］
１．アラニンスキャンニングによるＥｐ１１４ペプチドの機能部位の特定
Ｅｐ１１４の機能部位を特定するために、Ｅｐ１１４のアラニン置換変異体を発現するファージを作成し、ＥｐＣＡＭへの結合性、及び抗Ｅｐ１１４抗体との結合性を解析した。【００７６】
なお、抗ＥｐＣＡＭ抗体は以下のようにして作成したものを用いた。合成したＥｐ１１４ペプチドを抗原として用い、キャリアタンパク質であるウシサイログリシンにコンジュゲートした後に、ウサギに合計８回免疫した。予備的調査で、血清中の抗体価が上がっていることを確認し、ＩｇＧ親和性クロマトグラフィーを用い、ＩｇＧを精製し、抗Ｅｐ１１４抗体（ＩｇＧ）を得た。【００７７】
Ｅｐ１１４アラニン置換変異体は、Inverse PCR法に基づく部位特異的変異導入キット、KOD-Plus-Mutagenseis Kit（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いＥｐ１１４を構成する各アミノ酸を１つずつアラニンに置換して作成した。以下、Ｅｐ１１４の変異体は、例えば一残基目のリシン（Ｋ）をアラニン（Ａ）に置換した変異体はＥｐ１１４（Ｋ１Ａ）のように表し、かっこ内に変異前のアミノ酸、位置、変異後のアミノ酸を記載して表す。【００７８】
作成した変異体ファージは、以下の方法によりＥｐＣＡＭとの結合性、抗ＥｐＣＡＭ抗体との結合性の解析を行った。【００７９】
９６ウェルプレートにＥｐＣＡＭ又は抗Ｅｐ１１４抗体を１μｇ／ｗｅｌｌ、４℃で一晩固相化し、０．５％ＢＳＡを含む０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中、室温で１時間ブロッキングを行い、ＴＢＳＴを用いて洗浄する。【００８０】
ＥｐＣＡＭ又は抗Ｅｐ１１４抗体を固相化したプレートに、Ｅｐ１１４の各アミノ酸をアラニンに置換したペプチドを発現するファージを加え、室温で１時間静置する。ＴＢＳＴで洗浄後、ＨＲＰ標識抗Ｍ１３抗体を反応させ、ＡＢＴＳ（２、２‘−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）を用いて検出を行った。ＥｐＣＡＭに対する結合性を図３Ａ、抗Ｅｐ１１４抗体に対する結合性を図３Ｂに示す。Ｍ１３ＫＥは、ペプチドを提示していないファージであり、陰性コントロールである。【００８１】
ＥｐＣＡＭへの結合性は、２残基目のヒスチジン、３残基目のロイシン、８残基目のアスパラギン、９残基目のイソロイシン、１０残基目のシステイン、１１残基目のトリプトファンがアラニンに置換されることにより大きく減少し、抗Ｅｐ１１４抗体の認識には、５残基目のシステイン、８残基目のアスパラギン、９残基目のイソロイシン、１０残基目のシステインがアラニンに置換されることにより減少することが明らかとなった。【００８２】
特に、８残基目のアスパラギン、９残基目のイソロイシン、１０残基目のシステインは、ペプチドのＥｐＣＡＭ、抗Ｅｐ１１４抗体両者の結合性に影響を及ぼすことから、構造的に重要であることが示唆される。また、Ｅｐ１１４の３残基目のリシンをアラニンに置換した変異体Ｅｐ１１４（Ｌ３Ａ)はＥｐＣＡＭとの結合性が低く、また、非特異的吸着も低いことから、以後陰性コントロールとして用いることとした。
２．Ｅｐ１１４ペプチドの１残基目のリシンのＥｐＣＡＭ結合に及ぼす効果
Ｅｐ１１４ペプチドの１残基目のリシンを種々のアミノ酸に置換して、ＥｐＣＡＭに対する結合性の解析を行った。ペプチド合成後に蛍光分子などを結合させて修飾する場合には、Ｃ末に余分なリシンを予め付加して合成しておき、リシンの側鎖を利用することが多い。その際にＮ末にリシンがあるとＮ末のリシンも修飾されてしまうことから、修飾の程度等を調節することが困難になる。そのため、１残基目のリシンを他のアミノ酸に置換することができれば、Ｃ末のリシンの側鎖のみを利用して修飾することができる。また、Ｎ末のリシンが必要なければ、１残基短いペプチドを合成すればよいので、ペプチド合成の費用も比較的安くなる。【００８３】
上記アラニン置換変異体と同様に、Inverse PCR法に基づき１残基目のリシンに特異的に変異を導入し、変異体ファージを作成し、ＥｐＣＡＭに対する結合性を解析した。解析方法は、上記アラニンスキャンニングによるＥｐ１１４ペプチドの機能解析の場合と同様、ＥＬＩＳＡによる評価を行った。結果を図４Ａに示す。図中、ＥｐＣＡＭ＋、ＥｐＣＡＭ−は、プレートのＥｐＣＡＭ固相化の有無を示し、補正値はＥｐＣＡＭ＋の測定値からＥｐＣＡＭ−の測定値を引いて補正した値を示す。ＥｐＣＡＭ−の値が高いことはペプチドの非特異吸着が高いことを示す。【００８４】
Ｅｐ１１４の１残基目のリシンを他のアミノ酸に置換しても、Ｅｐ１１４と比較して結合能は若干低くなるもののＥｐＣＡＭに対する結合能は失われない。しかしながら、アミノ酸の種類によっては非特異吸着が強くなる傾向が示された。特に、リシンをトリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）、チロシン（Ｙ）に置換した変異体では、ＥｐＣＡＭがプレートに固相化されていない場合であっても、固相に対して非特異的に吸着する割合が高くなっている。一方、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）に置換した変異体は、Ｅｐ１１４とほぼ同程度の非特異吸着を示す。【００８５】
ＥＬＩＳＡの結果によれば、リシンをトリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）、チロシン（Ｙ）に置換した変異体では非特異吸着が顕著であり、ＥｐＣＡＭへの結合能が低くなっている。そこで、これら変異体のＥｐＣＡＭへの結合能をビーズを用いてさらに解析を行った。【００８６】
１残基目のリシンをアラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、イソロイシン（Ｉ）に置換した変異体、及びコントロールとしてＭ１３ＫＥ、Ｅｐ１１４、３残基目のロイシンをアラニンに置換した変異体を用いて解析を行った。１×１０１０ＰＦＵの各ファージとＥｐＣＡＭ１μｇとを結合させた後、０．５％ＢＳＡ、Ｂ＆Ｗ buffer (5mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 mM EDTA, 1M NaCl)で一晩前処理したビーズ、０．４ｍｇを添加して、ビーズに結合するファージの数をカウントした。結果を図４Ｂに示す。【００８７】
図４Ｂに示すように、ビーズを用いた実験結果からは、１残基目のリシンを上記アミノ酸に変異させた変異体ファージの結合能は、Ｅｐ１１４と大きくは変わらない。一方、Ｌ３Ａの変異体ファージでは、ＥｐＣＡＭに対する結合率が他のファージと比較して１桁低いことが示されている。【００８８】
ＥＬＩＳＡと、ビーズを用いた実験結果は一見異なるもののようであるが、これはＥＬＩＳＡでのプラスチック基板への物理吸着を利用した固相化法と、磁気ビーズへのＨｉｓタグを用いた固相化法との間の、バックグラウンド吸着の性質の違いに起因するものと推察される。バックグラウンド吸着を補正して考慮すると、一残基目のリシンを他のアミノ酸に代えても、ＥｐＣＡＭに対する結合能はほとんど変わらないものと考えられる
【実施例５】
【００８９】
［ビオチン化Ｅｐ１１４を用いた免疫沈降法への応用］
ペプチドを合成の段階でビオチン化し、ストレプトアビジンビーズに固定化し、抗ＥｐＣＡＭ抗体との反応性、ＥｐＣＡＭとの検出の解析を行った。
１．抗Ｅｐ１１４抗体との結合
ビオチン化したＥｐ１１４ペプチド２０μｇに、２％ＢＳＡを含むＴＢＳ中で２５０μｇのストレプトアビジン磁気ビーズ（Dynabeads M-280 streptavidin、ベリタス社製）を添加し室温で３０分震盪した後、ＴＢＳで洗浄を行った。なお、ペプチドを添加せずに反応を行ったものをコントロールとした。ＴＢＳＴ中で抗Ｅｐ１１４抗体を添加し、室温で１時間反応させ、ＴＢＳで洗浄後ビーズを回収した。回収したビーズは、ＳＤＳサンプルバッファー中で９５℃５分加熱し、ウェスタンブロットを行い、ＨＲＰ標識抗ウサギ抗体により抗Ｅｐ１１４抗体の検出を行った。【００９０】
磁気ビーズとの反応を図５Ａ左に模式的に、ウェスタンブロットの結果を右に示す。図５Ａは、ビーズ結合分画（ビーズ）、上清において、レーン１：Ｅｐ１１４、抗Ｅｐ１１４抗体、レーン２：Ｅｐ１１４、コントロール血清（Ｅｐ１１４免疫前の血清）、レーン３：ペプチドなし、抗Ｅｐ１１４抗体、レーン４：ペプチドなし、コントロール血清の結果を示す。【００９１】
Ｅｐ１１４、抗Ｅｐ１１４抗体を磁気ビーズに添加して反応させたレーン１のみ、ウサギ抗体と反応するタンパク質が検出された。すなわち、ビオチン化Ｅｐ１１４ペプチドがストレプトアビジン磁気ビーズに結合し、さらに抗Ｅｐ１１４抗体との結合していることを示す。
２．ＥｐＣＡＭとの結合
上記１．と同様にウェスタンブロットの系を用いて、Ｅｐ１１４とＥｐＣＡＭとの結合を確認した。具体的には、ストレプトアビジン磁気ビーズ２５０μｇにビオチン化したＥｐ１１４ペプチドを２０μｇを結合させた後、ＥｐＣＡＭ４００ｎｇと反応させ、ウェスタンブロットを行い、抗ＥｐＣＡＭポリクローナル抗体により検出を行った（図５Ｂ左参照）。【００９２】
ビオチン化ペプチドとして上記１．で用いたペプチドの他にリンカーを付加し、ビオチンにより修飾した下記配列（１）〜（３）で示す３種類の合成ペプチド（各々ＰＥ１８３、ＰＥ１８４、ＰＥ１８５という。）を用いて同様にＥｐＣＡＭとの結合を確認した。なお、下線部はリンカー部を示す。
ＰＥ１８３  Ac-KHLQCVRNICWSPPPPPPKK(biotin)-NH2         (1)
ＰＥ１８４  Ac-KHLQCVRNICWSGGSGGSK (biotin)-NH2         (2)
ＰＥ１８５  Ac-KHLQCVRNICWSNNNNSNNNNK(biotin)-NH2       (3)
結果を図５Ｂに示す。ビーズ結合分画（ビーズ）、上清において、レーン１：ペプチドなし、レーン２：ビオチン化Ｅｐ１１４、レーン３：ＰＥ１８３ペプチド、レーン４：ＰＥ１８４ペプチド、レーン５：ＰＥ１８５ペプチドの結果を示す。【００９３】
レーン３、４に示したリンカーとしてアミノ酸配列ＰＰＰＰＰＰＫＫ、又はＧＧＳＧＧＳＫを用いたものは、リンカーを用いずにビオチン化したペプチドやＮＮＮＮＳＮＮＮＮＫリンカーを用いたものに比べ、ＥｐＣＡＭと非常によく結合した。適切なリンカー配列があることにより、立体阻害が生じることなくＥｐ１１４へＥｐＣＡＭが結合するものと考えられる。
３．エクソソームとの結合
上記（１）と同様にウェスタンブロットの系を用いて、エクソソームとの結合を確認した。具体的には、ストレプトアビジン磁気ビーズ２５０μｇにビオチン化Ｅｐ１１４ペプチド、ＰＥ１８３ペプチド、ＰＥ１８４ペプチド、ＰＥ１８５ペプチドを各２０μｇを結合させた後、ＥｐＣＡＭ陽性細胞であるＨＴ−２９細胞より単離したエクソソームと反応させ、ウェスタンブロットを行い、抗ＥｐＣＡＭポリクローナル抗体により検出を行った（図５Ｃ左参照）。【００９４】
エクソソームとの結合には、いずれのリンカーを用いた場合でも、あるいはリンカーを用いずにビオチン化したペプチドも同程度の結合能を示した。
【実施例６】
【００９５】
［蛍光標識を用いた検出］
蛍光標識を用いて本発明のペプチドとＥｐＣＡＭとの結合の検出を行った。ＰＫＨ２６（シグマアルドリッチ社製）で蛍光標識したエクソソーム用いて、ペプチドとの結合を検出した（図６）。【００９６】
ストレプトアビジン磁気ビーズ２５０μｇにビオチン化Ｅｐ１１４ペプチド（１）、ＰＥ１８３ペプチド（２）、ＰＥ１８４ペプチド（３）、レＰＥ１８５ペプチド（４）を各２０μｇを結合させた後洗浄し、蛍光強度を測定した。その後、ＰＫＨ２６標識エクソソームを添加し、室温で１時間反応後、洗浄し、各試料の蛍光強度を測定した。図６はコントロールに対する蛍光強度の増加を示す。【００９７】
いずれのビオチン化ペプチドを用いた場合も、コントロールに比べて蛍光強度の増強が検出されたことから、エクソソームを蛍光標識して測定に用いることも可能であることが示された。
【実施例７】
【００９８】
［ＥＬＩＳＡによる検出］
ＥＬＩＳＡ用プレートに、ストレプトアビジンを介してＰＥ１８３ペプチド（Ac-KHLQCVRNICWSPPPPPPKK(biotin)-NH2）を固相化し、精製ＥｐＣＡＭを０、１０、１００ｎｇ添加し反応させ、洗浄後、結合したＥｐＣＡＭを抗ＥｐＣＡＭ抗体によって検出した。コントロールとして、ＥｐＣＡＭに結合しない変異体であるＬ３Ａ変異体のビオチン修飾ペプチドＰＥ１９４（Ac-KHAQCVRNICWSPPPPPPKK(biotin)-NH2）を用いている。結果を図７Ａに示す。【００９９】
ＰＥ１８３ペプチドを用いた場合には、ＥｐＣＡＭの添加量に比例して、ＥＬＩＳＡのシグナルの増強が観察される。一方、ＥｐＣＡＭに結合しない変異体では、ＥｐＣＡＭの添加量を増加してもシグナル強度の増加はほとんど観察されなかった。【０１００】
次に、ＥＬＩＳＡ用プレートに、ストレプトアビジンを介してＰＥ１８３ペプチド（Ac-KHLQCVRNICWSPPPPPPKK(biotin)-NH2）を固相化し、ＨＴ−２９由来のエクソソームを添加し反応させ、洗浄後、結合したエクソソームを抗ＥｐＣＡＭ抗体によって検出した。コントロールとして、上記と同様にＬ３Ａ変異体のビオチン修飾ペプチドＰＥ１９４を固相化して用いた。結果を図７Ｂに示す。【０１０１】
添加するエクソソームの増加に伴って、Ｅｐ１１４ペプチドを固相化した試料ではＥＬＩＳＡシグナルの増強が観察された。
【実施例８】
【０１０２】
［フェリチン融合Ｅｐ１１４ペプチドを用いた検出］
フェリチンは内部に含む水酸化鉄の電子密度が高いため、電子顕微鏡解析の標識として用いられてきたが、近年ＭＲＩで画像解析をする場合にも有用な標識であることが報告され、注目されるようになってきている。【０１０３】
フェリチン派生株の１つである、Ｆｅｒ８（非特許文献６）のＮ末にＥｐ１１４を融合させ解析に用いた。【０１０４】
ＥＬＩＳＡプレートに１μｇのフェリチン融合Ｅｐ１１４ペプチド（Ｅｐ１１４／ｆｅｒ８）、あるいはフェリチン（ｆｅｒ８）を固相化した後、濃度を変えた精製ＥｐＣＡＭを加えて、結合したＥｐＣＡＭを抗ＥｐＣＡＭ抗体で検出した（図８A）。【０１０５】
次にＥＬＩＳＡプレートに０．２μｇの精製ＥｐＣＡＭを固相化した後、濃度を変えたフェリチン融合Ｅｐ１１４ペプチド（Ｅｐ１１４／ｆｅｒ８）、あるいはフェリチン（ｆｅｒ８）を加えて、結合したＥｐ１１４ペプチド（Ｅｐ１１４／ｆｅｒ８）、あるいはフェリチン（ｆｅｒ８）を抗フェリチン抗体で検出した（図８B）。【０１０６】
フェリチン融合Ｅｐ１１４ペプチドもＥｐＣＡＭを感度良く検出可能であることから、ＭＲＩを用いた診断や治療への応用を期待することができる。
【実施例９】
【０１０７】
［細胞染色への応用］
先に本発明者らが開示したＥｐ３０１ペプチドはファージに提示した状態でのみ、ＥｐＣＡＭへの結合が見られ、ペプチド単独でＥｐＣＡＭへの結合が見られなかった。したがって、ファージから切り離した状態で細胞染色を行うことはできなかった。今回得られた２種類のペプチドは、上記表１で示したように、Ｅｐ３０１ペプチドよりも、ＥｐＣＡＭに対する結合力が１０倍以上強い。したがって、ファージから切り離した状態で染色に用いても、充分に細胞染色に用いることが可能であると考えられた。そこで、スフェロイド培養した細胞塊の染色を行った。【０１０８】
ＥｐＣＡＭ発現細胞であるＨＴ−２９細胞は以下のようにスフェロイド培養により培養した。２０ｎｇ／ｍｌヒトＥＧＦ（ミルテニーバイオテク社製）、２０ｎｇ／ｍｌヒトＥＧＦ−２（ミルテニーバイオテク社製）、Ｂ−２７（ギブコ社製）、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Dulbecco’s  Modified n Eagle Medium：Nutrient Mixture 12, １：１混合）（ギブコ社製）３ｍｌに４×１０５細胞を懸濁し、ＭＰＣポリマーでコートされた直径３．５ｃｍのシャーレ、ＥＺ−ＳｐｈｅｒｅＴＭに播種する。７２時間静置培養後、ピペットで培地を懸濁しながら、細胞を回収し、ＦＩＴＣ修飾したペプチドで染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。染色は、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ  培地中に４μＭペプチドを加えて３０分間室温静置することでおこなった。【０１０９】
図９に染色結果を示す。ＦＩＴＣでラベルしたＥｐ１１４ペプチド（図９Ａ：１１４−ＦＩＴＣ）、Ｅｐ１３３ペプチド（図９Ｂ：１３３−ＦＩＴＣ）、どちらのペプチドを用いた場合でも、０．４μＭ濃度でＨＴ−２９上のＥｐＣＡＭが染色される。これに対し、５番目と１０番目のシステインをセリンに置換したコントロールペプチドを用いた場合には、染色は観察されない（図９Ａ：１１４ｃｏｎｔｒｏｌ−ＦＩＴＣ、Ｂ：１３３ｃｏｎｔｒｏｌ−ＦＩＴＣ）。さらに、データは示さないがこれらコントロールペプチドを４μＭ濃度で用いてもＥｐＣＡＭ染色は観察されなかった。【０１１０】
データは示さないが、ＨＴ−２９の他に、ＥｐＣＡＭを発現することが知られている、ＭＣＦ−７でも同様の方法で、Ｅｐ１１４を用いてＥｐＣＡＭが染色されることを確認した。【０１１１】
次に、コントロールとしてＬ３Ａ変異体ペプチドを用いた染色を行った結果を示す。ＨＴ−２９細胞のスフェロイドの染色結果は、図９Ａと同様、Ｅｐ１１４ペプチドでは染色されるが、Ｌ３Ａ変異体では染色されないという結果が得られた。
【実施例１０】
【０１１２】
［細胞染色への応用］
ＥｐＣＡＭ発現細胞であるＨＴ−２９、発現していないＨｓ５７８Ｔ細胞をシャーレで１０％ウシ胎児血清を含む培地で４８時間培養し、ＦＩＴＣ標識したＥｐ１１４ペプチド、Ｌ３Ａコントロール標識ペプチドで、最終濃度０．４μMで３７℃１時間インキュベートした後、すぐに共焦点顕微鏡観察を行った。【０１１３】
結果を図１０に示す。Ｅｐ１１４ペプチドでは、ＥｐＣＡＭ発現細胞ＨＴ−２９の細胞膜部分の染色が観察されるのに対し、コントロールペプチド、ＥｐＣＡＭ非発現細胞であるＨｓ５７８Ｔ細胞では染色は観察されなかった。
【実施例１１】
【０１１４】
［Ｅｐ１１４のシステインの架橋］
Ｅｐ１３３ペプチド及びＥｐ１１４ペプチド、また、先に開示しているＥｐ３０１ペプチド、いずれのペプチドも５番目及び１０番目のアミノ酸はシステインに保存されていることから、システインの重要性が示唆される。また、実施例３で示しているように、これら２つのシステインをセリンに置換するとＥｐＣＡＭに対する結合性を示さなくなることからもシステイン残基の重要性は示唆される。【０１１５】
さらに、本発明者らは、Ｅｐ３０１ペプチドは酸化処理によって、Ｓ−Ｓ結合を形成させると、ＥｐＣＡＭとの結合活性を有するようになることを見出していた。今回、クローニングしたＥｐ１３３に関しても、酸化処理によって、システインをＳ−Ｓ結合させた後、ＨＰＬＣにより分離してＳ−Ｓ結合を有する分画のみがＥｐＣＡＭに対する結合活性を有している。【０１１６】
これに対し、Ｅｐ１１４ペプチドは、化学合成後すぐに蛍光偏光解消法で結合能を測定するとＥｐＣＡＭとの結合性を示さない。しかしながら、１０％ＦＣＳ存在下では、すぐに酸化され、積極的な酸化処理を行わなくとも、ＥｐＣＡＭとの結合が観察されるようになる。【０１１７】
図１１は、ＦＩＴＣ修飾したＥｐ１１４ペプチドを用いて、細胞染色したものである。内在性のＥｐＣＡＭを発現していない２９３Ｔ細胞に、ＥｐＣＡＭ遺伝子の全長を発現プラスミドに組み込んだｐｋｋ１９６をトランスフェクションし、強制発現させ、ＦＩＴＣ修飾Ｅｐ１１４を用い染色を行った。酸化処理を行って、積極的にＳ−Ｓ結合を形成させたもの（図１１左、Ｅｐ１１４）も、酸化処理を行っていないもの（図１１右、Ｅｐ１１４Ｃｙｓ）も同等にＥｐＣＡＭに対して染色能を有する。これに対し、データは示さないがＥｐ１３３ペプチドは積極的な酸化処理を行わないと、ＥｐＣＡＭに対して結合能を示さない。【０１１８】
Ｅｐ１１４のＳ−Ｓ結合形成に関し、蛍光偏光解消法、ＨＰＬＣを用いて詳細に検討した。その結果、データは示さないがＰＢＳ中で４℃、あるいは−２０℃で凍結保存しても１０日後には酸化され、Ｓ−Ｓ結合を形成していることが明らかとなった。【０１１９】
酸化処理を行わなくてもＳ−Ｓ結合を形成し、ＥｐＣＡＭに対し結合能を有するようになるというＥｐ１１４のこの性質は、化学合成したペプチドをそのまま使用可能であることを意味し、臨床応用等に用いる際に非常に有用である。【０１２０】
以上のように、本発明で開示した２種類のＥｐＣＡＭ結合ペプチド、Ｅｐ１３３及びＥｐ１１４はＥｐＣＡＭに対して強い結合能を有することから、癌の診断、予後診断おいて非常に有用である。【０１２１】
以上示してきたように、本発明はＥｐＣＡＭに高い結合能を示すペプチドを提供し、該ペプチドを用いた応用方法を示すものである。【０１２２】
本明細書では示していないが、本発明のペプチドはＥｐＣＡＭに対する結合能が強いことから、細胞表面上にＥｐＣＡＭを発現する細胞を標的とするドラッグデリバリーシステムの運搬体に用いることや、作用物質としてジフテリア毒素のような毒素と結合させて治療に用いる等の応用も期待できる。【０１２３】
また、ペプチドは化学合成が可能であることから、大量に安定した品質で、精製過程で夾雑物質が混入する危険性の少ない安価な製品を提供することが可能となる。【０１２４】
さらに、本発明のペプチドに対する抗体も得られていることから、抗ペプチド抗体を用い、慣用の免疫学的手法による幅広い応用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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