(57)【要約】  セリシンカイコ系統において、桑葉をほとんど含まない低コストの人工飼料であっても全幼虫期で飼育が可能な広食性セリシンカイコ系統の作出方法等の提供を課題とする。  フィブロインの合成経路に関与する遺伝子に変異を有するセリシンカイコ系統に、広食性カイコ系統を交配して得られる交雑個体に広食性カイコ系統を少なくとも2回交配し、セリシンカイコ系統の形質及び広食性カイコ系統の形質に基づいて5回以上の同系交配を行うことを含む広食性セリシンカイコ系統の作出方法を提供する。
2014065217.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）フィブロインの合成経路に関与する少なくとも1の遺伝子に変異を有するセリシンカイコ系統に、広食性カイコ系統を交配する第１交配工程、
（ｂ）第１交配工程後の交雑個体に、前記又は他の広食性カイコ系統を少なくとも2回交配する第２交配工程、及び
（ｃ）5回以上の同系交配を行い、セリシンカイコ系統の形質及び広食性カイコ系統の形質を有する個体を選抜する広食性セリシンカイコ選抜工程
を含む広食性セリシンカイコ系統の作出方法。
【請求項２】
前記遺伝子の変異が優性変異である、請求項１に記載の作出方法。
【請求項３】
前記遺伝子がNd、Nd-s又はNd-sDである、請求項２に記載の作出方法。
【請求項４】
前記セリシンカイコ系統が1頭あたり50mg以上の吐糸量を有する営繭性セリシンカイコ系統である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の作出方法。
【請求項５】
（ｄ）前記第２交配工程後の交雑個体に、前記又は他の営繭性セリシンカイコ系統を少なくとも1回交配する営繭性交配工程、及び
（ｅ）営繭性交配工程後の広食性セリシンカイコ選抜工程において、営繭性を有する個体をさらに選抜する営繭性広食性セリシンカイコ選抜工程
を含む、請求項４に記載の作出方法。
【請求項６】
（ｆ）前記変異遺伝子のホモ接合体を選抜する工程
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の作出方法。
【請求項７】
フィブロインの合成経路に関与する少なくとも1の遺伝子に変異を有する広食性セリシンカイコ系統及びその後代。
【請求項８】
フィブロインの合成経路に関与する少なくとも1の遺伝子に変異を有するセリシンカイコ系統に広食性カイコ系統を交配して得られる交雑個体を、前記又は他の広食性カイコ系統と少なくとも2回交配し、さらにセリシンカイコ系統の形質及び広食性カイコ系統の形質に基づいて5回以上の同系交配を行うことによって得られる、請求項７に記載の広食性セリシンカイコ系統及びその後代。
【請求項９】
前記遺伝子の変異が優性変異である、請求項７又は８に記載の広食性セリシンカイコ系統及びその後代。
【請求項１０】
前記遺伝子がNd、Nd-s又はNd-sDである、請求項９に記載の広食性セリシンカイコ系統及びその後代。
【請求項１１】
前記セリシンカイコ系統は、1頭あたり50mg以上の吐糸量を有する営繭性セリシンカイコ系統である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の広食性セリシンカイコ系統及びその後代。
【請求項１２】
前記交雑個体を前記又は他の広食性カイコ系統と少なくとも2回交配した後に、前記又は他の営繭性セリシンカイコ系統を少なくとも1回交配して得られる、営繭性を有する、請求項１１に記載の広食性セリシンカイコ系統及びその後代。
【請求項１３】
前記変異遺伝子のホモ接合体である、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の広食性セリシンカイコ系統及びその後代。
【請求項１４】
前記請求項７〜１３のいずれか一項に記載の広食性セリシンカイコ系統又はその後代を物質生産系宿主として用いて該カイコ系統の絹糸腺内で組換えペプチドを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、桑葉の含有率が低い人工飼料でも全幼虫期の飼育が可能な広食性セリシンカイコ系統及びその作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カイコ（Bombyx mori）は、多数飼育が容易で、大腸菌等の細菌と比較して短期間に大量のタンパク質合成が可能なことから組換えタンパク質等の物質生産系宿主として有用な生物である。カイコを用いて目的とする組換えタンパク質を生産する場合には、絹糸を生産する絹糸腺内で合成させる方法が知られている（非特許文献１〜３）。絹糸腺は、大型で摘出が容易な上、合成したタンパク質を中部絹糸腺内腔に貯蔵することから、目的の組換えタンパク質を回収するのにも好適である。ところが、通常、中部絹糸腺には、絹糸を構成する繊維タンパク質であるフィブロインが多量に蓄積されている。このフィブロインは、粘弾性を有しているため組換えタンパク質を回収する際の阻害要因となる（非特許文献４）。そのため、組換えタンパク質生産用にはセリシンカイコ系統が好適とされている。セリシンとは、フィブロインと共に絹糸を構成するタンパク質の1つで、フィブロインを層状に被覆するゼラチン様タンパク質である。通常のカイコの繭は、約75重量％のフィブロインと約25重量％のセリシンで構成されている。前述のセリシンカイコ系統は、フィブロインの合成経路に変異を生じているため、セリシンは正常に合成できるがフィブロインをほとんど合成できなくなった変異種である。そのため、セリシンカイコ系統は、通常、繭を形成できずに裸蛹状態で蛹化する。このようなセリシンカイコ系統には、現在までに異なる3つの遺伝子を原因とする系統が知られている。この系統を用いることで、前記フィブロインに基づく問題は解決することができる。【０００３】
ところで、カイコを組換えタンパク質生産系宿主として利用する場合、その組換えタンパク質の中で最も有望視される物質は医薬品である。カイコで医薬品を生産する場合には、品質の恒常性を担保できる飼育行程を確立すると共に、徹底した飼育上の管理及び衛生上の管理が求められる。それ故、無菌の人工飼料を用いた飼育が不可欠となる。また、医薬品の製造コストを抑えるためには、大量の飼料が必要な4〜5齢の幼虫期に、低コストの人工飼料で飼育する必要がある。一般的には、桑葉含有率が低いほど市販の人工飼料は廉価となる。【０００４】
ところが、前述のセリシンカイコ系統は、いずれも桑葉含有率の低い人工飼料の摂食性が悪いという大きな問題があった（非特許文献５及び６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第3374177号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ogawa S., et al., 2007, J Biotechnol, 128:531-544.
【非特許文献２】Tomita M., et al.,2003, Nat Biotechnol, 21:52-56.
【非特許文献３】Tomita M., et al.,2007, Transgenic Res 16:449-465.
【非特許文献４】Kataoka K. & Uematsu I., 1977, Kobunshi Ronbunshu (Japanese), 34; 7-13.
【非特許文献５】Yamamoto T., et al., 2003．Bio Industry, Vol.20, No.2 PP13-18.
【非特許文献６】Mase K., et al., 2006, Insect Biotechnology and Sericology 75, 85-88.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、セリシンカイコ系統において、桑葉含有率が低い人工飼料で全幼虫期の飼育が可能な性質を有する広食性カイコ系統を作出する方法、及びその広食性セリシンカイコ系統を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明者らは、セリシンカイコ系統の1つである営繭性セリシンカイコ系統（セリシンホープカイコ系統）（特許第3374177号、非特許文献２及び３)を用いて、桑葉含有率が低い人工飼料でも飼育が可能な広食性セリシンカイコ系統を作出することを試みた。ところが、セリシンホープカイコ系統は、本来営繭できないセリシンカイコ系統において、営繭が可能という特殊な形質を有するカイコ系統である。そのため、広食性カイコ系統を交配することによって遺伝的バランスが崩壊し、広食性を獲得できても、営繭性や蛹化性が失われてしまうという新たな問題を生じていた。本発明者らは、セリシンホープカイコ系統に広食性カイコ系統を交配した後、セリシンホープカイコ系統を戻し交配したところ営繭性や高い化蛹歩合を維持した広食性セリシンカイコ系統を作出することに成功した。従来の育種法では、ベースとなる系統に目的の形質（ここでは広食性）を導入する場合に、その目的に合わない形質を有する系統を交配する方法は、獲得した目的の形質が不安定化するリスクを伴うことから、当該分野では技術常識として行われない。しかし、本発明では、この技術常識に反して営繭性セリシンカイコ系統（セリシンホープ系統）を交配に用いることによって、営繭性広食性セリシンカイコ系統を効率的に作出することに成功した。本発明は、当該作出方法に基づくものであって、以下を提供する。【０００９】
（１）（ａ）フィブロインの合成経路に関与する少なくとも1の遺伝子に変異を有するセリシンカイコ系統に、広食性カイコ系統を交配する第１交配工程、（ｂ）第１交配工程後の交雑個体に前記又は他の広食性カイコ系統を少なくとも2回交配する第２交配工程、及び（ｃ）5回以上の同系交配を行い、セリシンカイコ系統の形質及び広食性カイコ系統の形質を有する個体を選抜する広食性セリシンカイコ選抜工程を含む広食性セリシンカイコ系統の作出方法。【００１０】
（２）前記遺伝子の変異が優性変異である、（１）に記載の作出方法。【００１１】
（３）前記遺伝子がNd、Nd-s又はNd-sDである、（２）に記載の作出方法。【００１２】
（４）前記セリシンカイコ系統が1頭あたり50mg以上の吐糸量を有する営繭性セリシンカイコ系統である、（１）〜（３）のいずれかに記載の作出方法。【００１３】
（５）（ｄ）前記第２交配工程後の交雑個体に、前記又は他の営繭性セリシンカイコ系統を少なくとも1回交配する営繭性交配工程、及び（ｅ）営繭性交配工程後の広食性セリシンカイコ選抜工程において営繭性を有する個体をさらに選抜する営繭性広食性セリシンカイコ選抜工程を含む、（４）に記載の作出方法。【００１４】
（６）（ｆ）前記変異遺伝子のホモ接合体を選抜する工程をさらに含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の作出方法。【００１５】
（７）フィブロインの合成経路に関与する少なくとも1の遺伝子に変異を有する広食性セリシンカイコ系統及びその後代。【００１６】
（８）フィブロインの合成経路に関与する少なくとも1の遺伝子に変異を有するセリシンカイコ系統に広食性カイコ系統を交配して得られる交雑個体を、前記又は他の広食性カイコ系統と少なくとも2回交配し、さらにセリシンカイコ系統の形質及び広食性カイコ系統の形質に基づいて5回以上の同系交配を行うことによって得られる、（７）に記載の広食性セリシンカイコ系統及びその後代。【００１７】
（９）前記遺伝子の変異が優性変異である、（８）に記載の広食性セリシンカイコ系統及びその後代。【００１８】
（１０）前記遺伝子がNd、Nd-s又はNd-sDである、（９）に記載の広食性セリシンカイコ系統及びその後代。【００１９】
（１１）前記セリシンカイコ系統は、1頭あたり50mg以上の吐糸量を有する営繭性セリシンカイコ系統である、（７）〜（１０）のいずれかに記載の広食性セリシンカイコ系統及びその後代。【００２０】
（１２）前記交雑個体を前記又は他の広食性カイコ系統と少なくとも2回交配した後に、前記又は他の営繭性セリシンカイコ系統を少なくとも1回交配して得られる、営繭性を有する、（１１）に記載の広食性セリシンカイコ系統及びその後代。【００２１】
（１３）前記変異遺伝子のホモ接合体である、（７）〜（１２）のいずれかに記載の広食性セリシンカイコ系統及びその後代。【００２２】
（１４）前記（７）〜（１３）のいずれかに記載の広食性セリシンカイコ系統又はその後代を物質生産系宿主として用いて該カイコ系統の絹糸腺内で組換えペプチドを製造する方法。【００２３】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2012-235259号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の広食性セリシンカイコ系統作出方法によれば、セリシンカイコ系統と広食性カイコ系統の両形質を有する広食性セリシンカイコ系統を作出することができる。【００２５】
本発明の広食性セリシンカイコ系統によれば、全幼虫期を桑葉の含有率が低い人工飼料で飼育可能な広食性セリシンカイコ系統を提供することができる。【００２６】
本発明の組換えペプチドを製造する方法によれば、本発明の広食性セリシンカイコ系統を物質生産系宿主として、短期間に大量に組換えタンパク質を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の作出方法により営繭性セリシンカイコ系統と広食性カイコ系統を交配して得られた広食性セリシンカイコ系統個体における桑葉低含有率人工飼料の摂食率の推移を示す図である。
【図２】本発明の作出方法により営繭性セリシンカイコ系統と広食性カイコ系統を交配して得られた広食性セリシンカイコ系統個体における営繭率の推移を示す図である。
【図３】本発明の作出方法により営繭性セリシンカイコ系統と広食性カイコ系統を交配して得られた広食性セリシンカイコ系統個体における化蛹歩合の推移を示す図である。
【図４】本発明の作出方法を用いた営繭性広食性セリシンカイコ系統MNS300の作出フローである。
【図５】本発明の作出方法を用いた営繭性広食性セリシンカイコ系統MCS300の作出フローである。
【図６】本発明の広食性セリシンカイコ系統を用いて組換えペプチドであるEGFPを製造した際の1個体あたりのEGFP発現量を示す図である。Aは、MNS300×(Ser1-Gal4×UAS-EGFP)を、Bは、(MNS300×MCS300)×(Ser1-Gal4×UAS-EGFP)を、及びCは、セリシンホープ×(Ser1-Gal4×UAS-EGFP)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の具体的な態様について以下で説明をする。
【００２９】
１．広食性セリシンカイコ系統の作出方法
１−１．概要
本発明の第１の態様は、広食性セリシンカイコ系統の作出方法である。本発明の作出方法によれば、セリシンカイコ系統と広食性カイコ系統の両形質を兼ね備えた広食性セリシンカイコ系統を作出することができる。
【００３０】
１−２．作出方法
本発明の作出方法は、必須工程として第１〜第２交配工程及び広食性セリシンカイコ選抜工程を含み、さらに営繭性交配工程及び営繭性広食性セリシンカイコ選抜工程、並びにホモ接合体選抜工程を選択工程として含むことができる。以下、各工程について具体的に説明をする。
【００３１】
（１）第１交配工程
「第１交配工程」は、広食性カイコ系統とセリシンカイコ系統を交配する必須工程である。
【００３２】
本明細書において「カイコ系統」とは、特定の形質を有するカイコの変異種をいう。
【００３３】
本明細書において「広食性（カイコ系統）」とは、クワ属（Morus）の葉（以下、本明細書では「桑葉」とする）を含有する人工飼料のみならず、桑葉を含有しない人工飼料又は桑葉含有率の低い人工飼料でも摂食が可能で、かつ全幼虫期を飼育できるカイコ系統をいう。
【００３４】
なお、摂食性に関して野生型のカイコ系統及び一般的に飼育されているカイコ系統は、通常、桑葉を含有しない人工飼料又は桑葉含有率の低い人工飼料を摂食できないため、広食性カイコ系統には該当しない。
【００３５】
「桑葉を含有する人工飼料」とは、本明細書においては、カイコの幼虫成育用に調製された桑葉を含有するカイコ用人工飼料を意味する。また、「桑葉含有率の低い人工飼料」とは、例えば、桑葉含有率が5重量％以下、3重量％以下、又は1重量％以下の人工飼料をいう。桑葉を含有する人工飼料の具体的な例としては、例えば、堀江保宏, 渡辺喜二郎 (1969) 日本蚕糸学雑誌, 30:377-385；柳川弘明, 渡辺喜二郎, 中村匡利 (1988) 蚕糸試験場報告30:569-588；柳川弘明, 渡辺喜二郎, 鈴木清 (1991) 蚕糸昆虫研報 3:57-75等に記載の人工飼料が挙げられる。桑葉を含有する人工飼料は、市販の人工飼料であってもよい。例えば、桑葉含有率の低いシルクメイトL4M（日本農産工業）及び桑葉含有率の高い原蚕種1〜3齢用（日本農産工業）等が挙げられる。
【００３６】
「桑葉を含有しない人工飼料」とは、本明細書においては桑葉を含まないカイコ用人工飼料、又は桑葉のみならず他の植物の葉を含まないカイコ用合成人工飼料等が該当する。
【００３７】
本発明における広食性カイコ系統は、広食性セリシンカイコ系統の作出における一方の親系統として用いられる。広食性カイコ系統は、絹糸量が多い形質、すなわち、多糸量性を伴う広食性多糸量性カイコ系統が好ましい。広食性多糸量性カイコ系統の具体例としては、日本種系統のTN29カイコ系統、TN38カイコ系統、日603号カイコ系統、日604号カイコ系統、又はNS2カイコ系統、あるいは中国種系統のTCS40カイコ系統、中604号カイコ系統、又はCS83カイコ系統が挙げられる。これらのカイコ系統は、いずれも独立行政法人 農業生物資源研究所（茨城県つくば市観音台2-1-2）に保存されており、所定の手続きにより分譲を受けることができる。
【００３８】
「セリシンカイコ系統」とは、フィブロイン（フィブロインH鎖、フィブロインL鎖及びp25タンパク質からなる複合体）の合成経路に関与する少なくとも1の遺伝子に変異を有する結果、フィブロインの合成量が野生型カイコ系統と比べて顕著に低下したカイコ系統をいう。このような遺伝子の具体例としては、フィブロインH鎖の合成に関与するNd遺伝子、フィブロインL鎖の合成に関与するNd-s遺伝子又はNd-sD遺伝子が挙げられる。前記遺伝子の変異は、優性変異及び劣性変異を問わないが、交配後の選抜を考慮した場合、次世代に形質が現れる優性変異が好ましい。ドミナントネガティブは、さらに好ましい。
【００３９】
前述のように、カイコの繭は、通常、約75重量％のフィブロインと約25重量％のセリシンで構成されている。ところが、セリシンカイコ系統は、フィブロインの合成経路に関与する遺伝子に変異を生じているため、フィブロインを繭糸中35重量％以下しか合成できず、残りは全てセリシンとなる。例えば、上記で例示したNd遺伝子に優性変異を有するNd遺伝子変異型セリシンカイコ系統（以下、本明細書では「Ndカイコ系統」とする）は、Nd変異がヘテロであってもフィブロインをほとんど合成できない系統である。また、Nd-s遺伝子に優性変異を有するNd-s遺伝子変異型セリシンカイコ系統（以下、本明細書では「Nd-sカイコ系統」とする）、及びNd-sD遺伝子に変異を有するNd-sD遺伝子変異型セリシンカイコ系統（以下、本明細書では「Nd-sDカイコ系統」とする）は、いずれも繭糸中のフィブロイン含有量が約30重量％以下の系統である。したがって、セリシンカイコ系統は、通常、全く吐糸できないことから営繭できない（仲野良男, 1950, 日本蚕糸学雑誌, 20:232-248；堀内彬明ら1963, 日本蚕糸学雑誌, 33:195-196；蒲生卓磨, 1979, 日蚕関東講要, 30:26）。これらのセリシンカイコ系統は、農林水産省のジーンバンクに登録されており、所定の手続きにより分譲を受けることができる。
【００４０】
セリシンカイコ系統は、本発明の広食性セリシンカイコ系統の作出方法における他方の親系統として用いられる。セリシンカイコ系統は、前述のように通常は吐糸できないため営繭できず、裸蛹又は半化蛹となる。しかしながら、例外的に吐糸でき、営繭可能な形質を有する「営繭性セリシンカイコ系統」も知られている。このような営繭性セリシンカイコ系統は、1頭あたり50mg以上、好ましくは60mg以上、より好ましくは70mg以上の吐糸量を有するか、又は60％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上の営繭率を有する。1頭（個体）あたりの「吐糸量」とは、営繭時に1個体が吐糸する絹糸の量をいう。この吐糸量は、1個体あたりから得られる繭のみの収量（繭層重）と同義である。また、「営繭率」とは、本工程で得られる交雑個体の総数における営繭可能な個体数の割合をいう。営繭性セリシンカイコ系統は、本発明の広食性セリシンカイコ系統の親系統として特に好適である。営繭性セリシンカイコ系統の吐糸する絹糸は、35重量％以下のフィブロインと、それ以外はセリシンで構成されている。したがって、繭は形成されるが通常の野生型繭とは異なる「セリシン繭」となる。また、営繭性に加えて、交雑第1世代（以下、しばしば「F1」として表記する）の成虫を得る目的上、化蛹歩合（蛹化率）の高いカイコ系統は、本発明の広食性セリシンカイコ系統の親系統としてさらに好適である。営繭性で、化蛹歩合が高く、かつセリシンカイコ系統の具体例としては、例えば、特許第3374177号又は前記非特許文献２及び３に記載のセリシンホープカイコ系統又はセリシンホープカイコ系統の交雑種が挙げられる。「セリシンホープカイコ系統」とは、Ndカイコ系統に強健性多糸量性系統を交配して得られたカイコ系統である。
【００４１】
広食性カイコ系統とセリシンカイコ系統の交配方法は、当該分野で公知の方法によって行えばよく、特に制限をしない。それぞれのカイコ系統の雌雄を同一容器内に投入し、自然交配させればよい。どちらのカイコ系統を雄にしてもよい。このとき、セリシンカイコ系統は、原因となる変異遺伝子がホモ接合体であることが好ましい。交配後は、当該分野で公知の方法によって採卵した後、公知の方法でF1を飼育する。
【００４２】
なお、広食性の選抜には、F1幼虫の飼育において初齢時から桑葉含有率の低い広食性カイコ系統用飼料（例えば、シルクメイトL4M）のみを与えればよい。2齢以降の成育が可能な個体を、広食性形質を獲得した個体と認定することができる。一方、セリシンカイコ系統の形質の選抜については、フィブロインの合成経路に関与する遺伝子の変異を確認できる方法であれば特に限定はなく、当該分野で公知のあらゆる方法を用いることができる。例えば、SNPs、RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）等の分子マーカーや形質マーカー等に基づいて行えばよい。また、セリシンホープカイコ系統のように原因遺伝子（Nd遺伝子）の変異が優性変異の営繭性セリシンカイコ系統であれば、セリシン繭を形成する個体を選択することによって達成できる。
【００４３】
（２）第２交配工程
「第２交配工程」は、前記第１交配工程後の交雑個体に、前記又は他の広食性カイコ系統を交配する必須工程である。本工程は、セリシンカイコ系統に広食性の形質をさらに導入する目的で行われる。
【００４４】
本工程において「第１交配工程後の交雑個体」とは、前記第１交配工程後に得られるF1個体、又はそのF1個体に対して同系交配を1〜4回行った交雑個体（F2〜F5に相当）をいう。同系交配については後述する。
【００４５】
本工程において「前記広食性カイコ系統」とは、第１交配工程で親系統として用いた広食性カイコ系統と同じカイコ系統をいう。例えば、第１交配工程において、広食性カイコ系統にTN38カイコ系統を使用した場合には、本工程の前記広食性カイコ系統はTN38カイコ系統となる。この場合、第２交配工程で行う交配は、広食性カイコ系統の戻し交配となる。一方、本工程において「他の広食性カイコ系統」とは、第１交配工程で親系統として用いた広食性カイコ系統とは異なる広食性カイコ系統をいう。例えば、第１交配工程において、広食性カイコ系統にTN38カイコ系統を使用したときに、本工程において広食性カイコ系統としてTCS40カイコ系統を使用する場合や、TN38カイコ系統とTCS40カイコ系統のF1個体を使用する場合が該当する。
【００４６】
前記第１交配工程で得られた交雑個体と広食性カイコ系統の交配方法は、第１交配工程に準じて行えばよい。交配に際して両系統の雌雄は問わない。一方を雄にし、他方を雌にすればよい。
【００４７】
本工程において、前記第１交配工程で得られた交雑個体に前記又は他の広食性カイコ系統を交配する回数は、少なくとも2回である。各回の間に後述する広食性セリシンカイコ選抜工程の同系交配を1〜4回行ってもよい。各回では、セリシンカイコ系統の形質及び広食性カイコ系統の形質に基づいて選抜を行う。それぞれの形質の選抜方法は、第１交配工程に準じて行えばよい。
【００４８】
（３）広食性セリシンカイコ選抜工程
「広食性セリシンカイコ選抜工程」とは、セリシンカイコ系統の形質及び広食性カイコ系統の形質を有する個体を選抜し、目的の形質を安定化させる必須工程である。本工程は、第１交配工程及び第２交配工程後の交雑個体において同系交配を行うことで達成される。
【００４９】
本明細書において「同系交配」（sib mating）とは、対象とする形質（より具体的にはその形質の原因遺伝子）が同一である個体間の交配をいう。例えば、広食性セリシンカイコ系統の同系交配であれば、交配する雌雄が共に広食性で、かつセリシン系統となる。また、同腹の雌雄どうしで、対象とする形質が同一である兄妹交配も同系交配に含まれる。
【００５０】
本工程では、同系交配後にセリシンカイコ系統の形質及び広食性カイコ系統の形質に基づいて選抜を行う。各選抜は、前記第１交配工程に記載の選抜方法に準じて行えばよい。
【００５１】
本工程は、5回以上、好ましくは7回以上、より好ましくは9回以上の同系交配で構成される。同系交配の回数の上限は特に制限はしないが、通常は15回以下で足りる。同系交配は、各回を連続して行う必要はなく、本態様の作出方法において目的とする形質に関して総計で5回以上選抜すればよい。したがって、本工程は、同系交配単位で他の工程間に分散させることができる。例えば、第２交配工程後、後述する営繭性交配工程前の広食性セリシンカイコ選抜工程で同系交配を2回行い、営繭性交配工程後の広食性セリシンカイコ選抜工程（この場合、後述する営繭性広食性セリシンカイコ選抜工程となる）で同系交配を3回以上行った後、各回でセリシンカイコ系統の形質及び広食性カイコ系統の形質について選抜すればよい。
【００５２】
（４）営繭性交配工程
「営繭性交配工程」とは、第２交配工程後の交雑個体に、営繭性セリシンカイコ系統を交配する工程である。
【００５３】
本工程は、第１交配工程で親系統として使用するセリシンカイコ系統が営繭性セリシンカイコ系統である場合に、必要に応じて行われる工程である。
【００５４】
第１交配工程で親系統に営繭性セリシンカイコ系統を使用した場合、第２交配工程後に広食性セリシンカイコ系統を得たとしても、営繭性や化蛹歩合の低下又は喪失を伴うという問題を生じる。本工程では、セリシンカイコ系統に広食性形質を導入するという最終目的に反して、営繭性ではあるが広食性ではないセリシンカイコ系統を敢えて交配させる点を特徴とする。このような交配方法は、当該分野で確立した従来の育種法に逆行した系統作出方法である。
【００５５】
本工程で交配に用いる営繭性セリシンカイコ系統は、前記又は他の営繭性セリシンカイコ系統である。
【００５６】
本工程において「前記営繭性セリシンカイコ系統」とは、第１交配工程で親系統として用いた営繭性セリシンカイコ系統と同じカイコ系統をいう。例えば、第１交配工程において、営繭性セリシンカイコ系統にセリシンホープカイコ系統を使用した場合には、本工程においてもセリシンホープカイコ系統を使用する。この場合、本工程で行う交配は、営繭性セリシンカイコ系統の戻し交配に相当する。
【００５７】
一方、本工程において「他の営繭性セリシンカイコ系統」とは、第１交配工程で親系統として用いた営繭性セリシンカイコ系統とは異なる営繭性セリシンカイコ系統をいう。例えば、第１交配工程において、営繭性セリシンカイコ系統にセリシンホープカイコ系統を使用した場合には、セリシンホープカイコ系統と日603号カイコ系統のF1個体が該当する。
【００５８】
本工程では、第２交配工程後の交雑個体に営繭性セリシンカイコ系統を少なくとも1回交配する。本工程は、図５に示すように第２交配工程間に行うことも可能であるが、その場合にも、最後の第２交配工程後に再度本工程を実行するようにする。交配方法は、第１交配工程に準じて行えばよい。第１交配工程と同様に、交配する両系統の雌雄は問わない。
【００５９】
（５）営繭性広食性セリシンカイコ選抜工程
「営繭性広食性セリシンカイコ選抜工程」は、営繭性交配工程後に行われる広食性セリシンカイコ選抜工程の一形態であって、営繭性交配工程に伴う付随工程である。前述の広食性セリシンカイコ選抜工程が2つの形質、すなわち、セリシンカイコ系統の形質及び広食性カイコ系統の形質を有する個体を選抜したのに対して、本工程では3つの形質、すなわち、セリシンカイコ系統の形質及び広食性カイコ系統の形質に加えて、さらに営繭性の形質を有する個体を選抜する点を特徴とする。
【００６０】
本工程において、セリシンカイコ系統の形質及び広食性カイコ系統の形質を有する個体の選抜方法については、前記広食性セリシンカイコ選抜工程に準じる。すなわち、セリシンカイコ系統の形質の選抜については、フィブロインの合成経路に関与する遺伝子の変異を公知の方法で確認すればよい。例えば、SNPs、RFLP等の分子マーカーや形質マーカー等に基づいて行うことができる。広食性カイコ系統の形質の選抜には、F1幼虫の飼育において初齢時から桑葉含有率の低い広食性カイコ系統用飼料のみを与えればよい。2齢以降の成育が可能な個体が広食性形質を獲得した個体と認定することができる。また、営繭性カイコ系統の形質を有する個体の選抜方法は、営繭率又は個体あたりの吐糸量に基づいて選抜すればよい。選抜において営繭率は、60％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上あればよい。また、1頭あたりの吐糸量が50mg以上、好ましくは60mg以上、より好ましくは70mg以上ある個体を選択すればよい。セリシンホープカイコ系統のように原因遺伝子（Nd遺伝子）の変異が優性変異の営繭性セリシンカイコ系統であれば、セリシン繭を形成した個体を選択することで、営繭性カイコ系統とセリシンカイコ系統の両形質を同時に選抜することができる。
【００６１】
本工程は、広食性セリシンカイコ選抜工程の一形態であることから、同系交配を5回以上、好ましくは7回以上、より好ましくは9回以上行い、各回後に目的の形質、すなわち、セリシンカイコ系統の形質、広食性カイコ系統の形質及び営繭性形質に対して選抜すればよい。
【００６２】
（６）ホモ接合体選抜工程
「ホモ接合体選抜工程」は、前記第１交配工程で用いたセリシンカイコ系統が有するフィブロインの合成経路に関与する変異遺伝子のホモ接合体を選抜する工程である。
【００６３】
本工程は、広食性セリシンカイコ選抜工程（営繭性広食性セリシンカイコ選抜工程を含む）において必要に応じて行う選択工程である。ホモ接合体選抜方法は、前記広食性セリシンカイコ選抜工程後の個体に対して、フィブロインの合成経路に関与する変異遺伝子がホモであるか、ヘテロであるかを検出可能な方法であれば、当該分野で公知の如何なる方法も用いることができる。例えば、既知の塩基変異情報に基づいて、TaqMan（登録商標）PCR法等によりDNAシークエンシングと塩基配列情報から変異部位のホモ、ヘテロをタイピングする方法や、SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism)法やRFLP法を用いて解析する方法等が挙げられる。これらの方法は、公知であり、例えば、Green & Sambrook, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法を参照すればよい。また、セリシンホープカイコ系統のように原因遺伝子（Nd遺伝子等）の変異が優性変異の営繭性セリシンカイコ系統であれば、営繭性広食性セリシンカイコ選抜工程において発生する個体の全てがセリシン繭を作るようになるまで同系交配を繰り返して候補個体を得るようにしてもよい。フィブロインの合成経路に関与する前記遺伝子が野生型ホモの個体と前記候補個体を交配して得られる幼虫が全てセリシン繭を形成した場合には、その候補個体を原因遺伝子に関してホモ変異接合体として選抜すればよい。
【００６４】
２．広食性セリシンカイコ系統
本発明の第２の態様は、広食性セリシンカイコ系統及びその後代である。本発明の広食性セリシンカイコ系統及びその後代によれば、セリシンカイコ系統と広食性カイコ系統の両形質を兼ね備えたカイコ系統を提供することができる。
【００６５】
本態様の広食性セリシンカイコ系統は、フィブロインの合成経路に関与する少なくとも1の遺伝子に変異を有し、かつ桑葉を含有していない人工飼料又は桑葉含有率の低い人工飼料で全幼虫期を飼育することのできるカイコ系統である。本態様の広食性セリシンカイコ系統は、卵、幼虫、蛹、又は成虫は問わない。
【００６６】
本明細書において「広食性セリシンカイコ系統の後代」とは、セリシンカイコ系統の形質及び広食性カイコ系統の形質を維持する広食性セリシンカイコ系統の子孫をいう。同系統を交配して得られる後代であってもよいし、異なる広食性セリシンカイコ系統を交配して得られる後代であってもよい。
【００６７】
本態様の広食性セリシンカイコ系統は、例えば、前記第１態様に記載の広食性セリシンカイコ系統の作出方法によって得ることができる。具体的には、例えば、フィブロインの合成経路に関与する少なくとも1の遺伝子に変異を有するセリシンカイコ系統に、広食性カイコ系統を交配して得られるF1個体を、前記又は他の広食性カイコ系統と少なくとも2回交配させ、さらにセリシンカイコ系統の形質及び広食性カイコ系統の形質に基づいて5回以上の同系交配を行うことによって得ることができる。
【００６８】
前記フィブロインの合成経路に関与する遺伝子としては、Nd、Nd-s又はNd-sD遺伝子が挙げられ、それらの遺伝子の変異は優性変異であることが好ましい。また、本態様の広食性セリシンカイコ系統及びその後代は、前記変異遺伝子のホモ接合体であることが好ましい。
【００６９】
また、親系統として使用した前記セリシンカイコ系統は、1頭あたり50mg以上、好ましくは60mg、より好ましくは70mgの吐糸量を有する、又は営繭率が60％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上の営繭性セリシンカイコ系統であってもよい。この場合、営繭性広食性セリシンカイコ系統は、営繭性セリシンカイコ系統に広食性カイコ系統を交配して得られるF1個体を前記又は他の広食性カイコ系統と前記又は他の営繭性セリシンカイコ系統を少なくとも1回交配して、営繭性、すなわち、繭を形成したか否かで選抜し、さらにセリシンカイコ系統の形質、及び広食性カイコ系統の形質に基づいて5回以上の同系交配を行うことによって得ることができる。また、営繭性広食性セリシンカイコ系統の後代は、同系統又は異系統の営繭性広食性セリシンカイコ系統どうしを交配して得ることもできる。例えば、後述する実施例に記載の2つの営繭性広食性セリシンカイコ系統、MNS300カイコ系統及びMCS300カイコ系統の後代であれば、MNS300カイコ系統どうし又はMCS300カイコ系統どうしの同系統間交配で得られる後代や、MNS300カイコ系統とMCS300カイコ系統による異系統間交配で得られる後代、そして前記同系統間交配で得られる後代又は異系統間交配で得られる後代にさらにTN29、TN38、日603号、日604号、CS40若しくは中604号のようなカイコ広食性多糸量性カイコ系統をさらに交配して得られる後代等が挙げられる。
【００７０】
本態様の広食性セリシンカイコ系統によれば、有用な組換えタンパク質等の物質生産に適し、かつ低コストの人工飼料でも全幼虫期の飼育が可能なセリシンカイコ系統を提供することができる。特に、本態様の営繭性広食性セリシンカイコ系統によれば、そのカイコ系統の体内で合成された組換えタンパク質等を繭から回収することができる。
【００７１】
３．組換えペプチド製造方法
本発明の第３の態様は、前記第２態様の広食性セリシンカイコ系統を物質生産系宿主として用いる組換えペプチド製造方法である。
【００７２】
本態様において「組換えペプチド」とは、遺伝子組換え技術を用いてカイコの絹糸腺内で合成し得るペプチドをいう。例えば、生体内又は細胞内において、特定の生物活性、例えば、酵素活性、触媒活性、基質としての機能、又は生物学的阻害若しくは亢進機能（例えば、細胞傷害活性）を有するペプチドをいう。具体的には、例えば、抗体（ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディのような多重特異性抗体、scFvのような単鎖抗体等を含む）及びその断片、酵素、抗原ペプチドが挙げられる。組換えペプチドは、天然型又は非天然型のいずれであってもよい。天然型の組換えペプチドとは、天然界に存在する（ポリ）ペプチドをいう。一方、非天然型の組換えペプチドとは、天然型の組換えペプチドのアミノ酸配列に基づいて、その組換えペプチドが有する特有の機能を失わない範囲においてアミノ酸配列に適当な変異（アミノ酸の付加、欠失、置換を行ったもの）を導入した改変型（ポリ）ペプチドをいう。組換えペプチドは、宿主であるカイコに影響を及ぼさない限り由来する生物種は問わない。例えば、ヒト由来の（ポリ）ペプチドであってもよい。
【００７３】
本態様の組換えペプチド製造方法では、まず、前記組換えペプチドをコードする遺伝子をカイコの絹糸腺で機能するプロモーター制御下等に配置し、それを含む発現ユニットを第２態様の広食性セリシンカイコ系統に導入した組換えカイコを作製する。ここでいう「発現ユニット」とは、目的とする遺伝子の他、その遺伝子の発現に必要な制御因子、例えば、プロモーター、ポリAシグナル、ターミネーター等を少なくとも1組包含する遺伝子発現システムをいう。カイコの絹糸腺で機能するプロモーターの具体例としては、例えば、中部絹糸腺で機能するセリシン１プロモーターが挙げられる。これらの方法は、当該分野では公知であり、例えば、Green & Sambrook, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; Tamura T, et al., 2007, J Insect Biotechnol Sericol 76:155-159に記載されている。
【００７４】
次に、絹糸腺内で合成された組換えペプチドを宿主カイコから回収する。回収方法は、特に限定はしない。前述のようにセリシンカイコ系統は、フィブロインの合成経路に変異を生じているためフィブロインをほとんど合成できず、通常は吐糸できない。それ故、絹糸腺内で合成された組換えペプチドは、そのまま中部絹糸腺内腔に蓄積されることが多い。この場合、宿主カイコを解剖して絹糸腺を摘出して、又は宿主カイコの中部絹糸腺にカイコ外部から注射して、中部絹糸腺内部に蓄積された目的の組換えペプチドを回収すればよい。また、第２態様の広食性セリシンカイコ系統が営繭性広食性セリシンカイコ系統の場合には、絹糸腺内で合成された組換えペプチドは、セリシンと共に吐糸されるため、繭から直接回収することができる。
【００７５】
本発明の組換えペプチド製造方法によれば、広食性セリシンカイコ系統を物質生産系宿主として用いることにより、組換えペプチドを短期間に大量に合成することができる。また、広食性セリシンカイコ系統を無菌環境下で無菌の人工飼料を給餌して飼育することで、当該カイコに医薬品としての組換えペプチドを製造させることもできる。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。また、以下の実施例では、しばしば「カイコ系統」を省略する。【００７７】
＜実施例１＞
（目的）
営繭性セリシンカイコ系統と広食性カイコ系統を交配して得られた広食性セリシンカイコ系統個体における桑葉含有率の低い人工飼料の摂食率、営繭率、及び化蛹歩合の推移について検証した。【００７８】
（方法）
１．交配
営繭性セリシンカイコ系統であるセリシンホープ（特許第3374177号）と広食性多糸量性カイコ系統（TN38、TCS40）を交配した。具体的には、雌のセリシンホープに雄の広食性多糸量性カイコ系統を交配した。以降、それぞれの交雑個体を同系交配し、雑種第6代（F6）まで交配を繰り返した。【００７９】
２．掃立て及び飼育
掃立ては、4〜10頭の同系の雌が産卵した卵を混合して孵化させた。孵化した幼虫は、羽箒を用いてカイコ卵台紙から蚕座である容器内に移した。1〜3齢の稚カイコ幼虫時の飼育には、プラスチック製弁当箱（DX-HS8：222×143×35 mm；又はDX-HS10：256×189×35 mm；いずれも中央化学）又はスチロール製ケース内に防乾紙（パラフィン加工紙）を敷いた容器を用いた。餌は、低コストで桑葉含有率の低い広食性カイコ用人工飼料であるシルクメイトL4M（日本農産工業）を防乾紙上に並べて与えた。餌の交換は、原則として1〜2齢では各1回、3齢では1〜3回行ったが、餌が不足した場合や乾燥した場合等は、適宜交換を行った。古い餌は食べ残しが多い場合には取り除いたが、僅かな場合にはそのままにして、新しい人工飼料を追加した。【００８０】
4〜5齢の壮カイコ幼虫時の飼育には、フィッシュコンテナーB（型番01120；三甲株式会社）内に蚕座紙（クラフト用紙）、防乾紙（パラフィン紙）又はその両方を重ねて敷いた容器を用いた。湿度や容器内の状態により、防乾紙、アクリル、又はメッシュのフタをした。4齢2日目以降に各容器内の頭数を調査し、容器の大きさに合わせて一容器あたり約80頭とした。餌は、稚カイコ幼虫期と同様、シルクメイトL4M（日本農産工業）を短冊状に切るか切削して与えた。餌の交換は、食べ残しの量や餌の乾燥状態によって異なるが、原則として１日に１回行った。食べ残しが僅かな場合には、古い餌を取り除かずにそのまま新しい人工飼料を切削で追加した。飼育温度は、全幼虫期を通して25〜28℃とした。【００８１】
摂食性の選抜は、初齢時から前記シルクメイトL4Mを与えることによって実施した。給餌後、27℃で5〜7日間観察し、2齢幼虫に成育した個体を広食性個体として選抜した。摂食率は、初齢頭数に対する2齢頭数から算出した。また、営繭性の選抜は、繭を形成した個体の選択によって行った。営繭率は、4齢頭数に対する繭を形成できた頭数から算出した。さらに、化蛹性の選抜は、正常に蛹化した個体の選択によって実施した。化蛹歩合は、4齢起蚕時の頭数に対する正常に蛹化した頭数から算出した。セリシンカイコ系統、すなわちNd変異の選抜は、当該遺伝子変異が優性変異であることから、営繭個体の繭がセリシン繭となった個体の選択によって実施した。【００８２】
（結果）
図１に摂食率の推移を、図２に営繭率の推移を、そして図３に化蛹歩合の推移を示す。【００８３】
図１で示すように、摂食性の選抜効果は、交配後、比較的早期に現れ、セリシンホープとTN38の交配個体（以下、しばしば「セリシンホープ×TN38」と表記する）とセリシンホープとTCS40の交配個体（以下、しばしば「セリシンホープ×TCS40」と表記する）は、いずれもF5でほぼ全個体が桑葉低含有率の広食性カイコ用人工飼料であるシルクメイトL4Mを摂食するに至った。すなわち、F5で広食性セリシンカイコ系統となったことを示している。【００８４】
一方、図２及び図３からも明らかなように、営繭率及び化蛹歩合は、それぞれの選抜効果は得られず、F6まで選抜を行ったが安定化しなかった。例えば、セリシンホープ×TCS40の営繭率は、F4で0％となり、ほとんどが裸蛹となってしまった。この結果から、営繭性セリシンカイコ系統と広食性カイコ系統を交配し、その後に広食性、営繭性、及び化蛹性について同時に選抜をした場合、広食性の形質を有するセリシンカイコ系統は、F5で得ることが可能であるが、一方で、営繭性セリシンカイコ系統が元来有していた営繭性や化蛹性は、広食性カイコ系統との交配によって、不安定化してしまうことが明らかとなった。【００８５】
＜実施例２＞
（目的）
本発明の広食性セリシンカイコ系統の作出方法を用いて、営繭性広食性セリシンカイコ系統（MNS300カイコ系統）を作出した。【００８６】
（方法）
１．育種
育種のフローチャートを図４に示す。まず、営繭性セリシンカイコ系統であるセリシンホープの雌に広食性多糸量系統のTN38の雄を交配し、孵化した幼虫をシルクメイトL4M（日本農産工業）で飼育することにより広食性についての選抜を行った（第１交配工程）。併せて、セリシン繭を営繭した個体で、繭層重（繭のみの重量：吐糸量／頭に相当）の多い個体を選抜した。この後、2世代同系交配を行い、さらにTN38を2回戻し交配し（第２交配工程）、次いで同系交配を1回行った。当該交雑選抜個体の人工飼料摂食性が上昇したところで、セリシンホープを交配して営繭率の向上を図った（営繭性交配工程）、その後同系交配を9世代にわたって行い、営繭率、繭層量等の選抜を行った（営繭性広食性セリシンカイコ選抜工程）。【００８７】
２．掃立て、飼育及び選抜
基本的な方法は、実施例１に準じる。4〜10蛾を混合して掃き立てるか（混合育）、複数蛾区を別々に掃立てた（1蛾育）。孵化した幼虫は、小型の蓋付きプラスチック弁当箱（DX-HS8：222×143×35 mm；中央化学）で飼育し、シルクメイトL4Mを摂食して正常に2齢に成育した個体のみを広食性として選抜した。4齢以降は、プラスチック製コンテナ（フィッシュコンテナーB 01120；三甲株式会社）を用いて、約80頭／容器で飼育した。基本的に1区は2容器（合計約160頭）とした。それぞれの容器でセリシン繭を形成した個体のうち、繭層重で上位20個体程度を選び、それらを同系交配し、採卵をして次世代を得た。１蛾育をした場合には、人工飼料摂食率、営繭率、化蛹歩合、繭層量等、総合的に判断し、上位2〜4区程度に絞った上で交配及び採卵をして次世代を得た。【００８８】
なお、セリシンホープは、幼虫時に雌のみに斑紋等の特徴が現れる限性形カイコであるため、斑紋は雌で形（形カイコ）、雄で姫（姫カイコ）となる。一方、TN38は、雌雄とも姫カイコである。それ故、セリシンホープ雌×TN38雄の交雑個体は、限性形カイコとなる。本実施例では、形カイコで雌、姫カイコで雄になった個体を選抜していくことによって、MNS300カイコ系統を限性形カイコにした。【００８９】
＜実施例３＞
（目的）
実施例２とは異なるフローで本発明の広食性セリシンカイコ系統の作出方法を用いて、営繭性広食性セリシンカイコ系統（MCS300カイコ系統）を作出した。【００９０】
（方法）
１．育種
育種のフローチャートを図５に示す。まず、セリシンホープの雌に広食性多糸量系統のTCS40の雄を交配した（第１交配工程）。得られた交雑個体について、同系交配を1回行った後（広食性セリシンカイコ選抜工程）、TCS40を戻し交配し（第２交配工程）、次いでセリシンホープを交配した（営繭性交配工程）。その後、再びTCS40を戻し交配し（第２交配工程）、同系交配を1回行った（営繭性広食性セリシンカイコ選抜工程）。続いて、交雑個体に、広食性多糸量系統の中604号とセリシンホープを交配して得られた営繭性広食性のF1個体を交配した。（営繭性交配工程）、その後、同系交配を9世代にわたって行った（営繭性広食性セリシンカイコ選抜工程）。【００９１】
２．掃立て、飼育及び選抜
基本的な方法は、実施例１に準じる。掃立ては、4〜10蛾を混合して行った。孵化した幼虫は、小型の蓋付きプラスチック弁当箱（DX-HS8：222×143×35 mm；中央化学）で飼育し、シルクメイトL4M（日本農産工業）を摂食して正常に2齢に成育した個体のみを広食性の形質を有する個体として選抜した。4齢以降は、プラスチック製コンテナ（フィッシュコンテナーB 01120；三甲株式会社）を用いて、約80頭／容器で飼育した。1区は2容器（合計約160頭）とした。それぞれの容器でセリシン繭を形成した個体をセリシンカイコ系統の形質を有する個体として選択した。そのうち、繭層重で上位20個体程度を用いて同系交配し、採卵をして次世代を得た。孵化した幼虫にシルクメイトL4Mを給餌し、セリシン繭を形成した個体を選択することで、広食性とセリシンカイコ系統の両形質について選抜した。その後、得られた成虫に広食性多糸量系統のTCS40を戻し交配し、採卵後、孵化した幼虫に対して、再びシルクメイトL4Mの給餌とセリシン繭形成個体の選択により広食性とセリシンカイコ系統の両形質について選抜した。次に、得られた交雑個体にセリシンホープを戻し交配して、採卵後、孵化した幼虫に対して、シルクメイトL4Mの給餌とセリシン繭形成個体の選択により営繭性広食性とセリシンカイコ系統の3つの形質について選抜した。上位20位程度の繭層重の個体間で同系交配を1回行い、採卵をして次世代を得た。この個体に中604号とセリシンホープを交配して得られた営繭性広食性のF1個体を交配した。採卵後、孵化した幼虫に対しては、前記と同様にシルクメイトL4Mの給餌とセリシン繭形成個体の選択により営繭性広食性とセリシンカイコ系統の3つの形質について選抜した。同系交配を9代にわたって行い、各代において、営繭性形質、広食性形質、及びセリシンカイコ系統の形質について選抜し、目的の営繭性広食性セリシンカイコ系統を得た。【００９２】
なお、TCS40及び中604号は、セリシンホープと同様、限性形カイコであり、斑紋は雌で形、雄で姫となり、幼虫期での雌雄判別可能であることから、4齢で雌雄を分けて、それぞれ80頭ずつ飼育した。【００９３】
＜実施例４＞
（目的）
実施例２及び３で得られた営繭性広食性セリシンカイコ系統等の広食性について検証した。【００９４】
（方法）
実験に用いたカイコ系統は、セリシンホープ、日604号（広食性多糸量系統）×セリシンホープ、MNS300、MCS300、MNS300とMCS300とを交配して得られたMNS300×MCS300、及び前記MNS300×MCS300カイコ系統と日604号とを交配して得られた（MNS300×MCS300）×日604号である。それぞれの系統を2区に分け、初齢時より、桑葉含有率が低く、低コストの広食性カイコ用人工飼料であるシルクメイトL4M（日本農産工業）を与える区と桑葉含有率が高いカイコ用人工飼料であるシルクメイト原蚕種1−3齢用（以下、「原蚕用」と表記する）（日本農産工業）を与えた区に分けた。孵化した幼虫をプラスチック製の飼育容器に移し、上記各人工飼料を与えて、27℃で5〜7日間観察した。2齢幼虫に成育した幼虫を摂食個体とし、摂食率は、初齢頭数に対する2齢頭数から算出した。【００９５】
（結果）
シルクメイトL4Mを与えた区の結果を表１に、シルクメイト原蚕用を与えた区の結果を表２に示す。
【表１】
2014065217.tif 000003
【表２】
2014065217.tif 000004
【００９６】
セリシンホープは、L4M人工飼料を全く摂食せず、原蚕用人工飼料であっても40％以下しか摂食しなかった。一方、セリシンホープと広食性多糸量系統の日604号の交配によって得られたF1は、広食性を獲得し、約10％の個体がL4Mを摂食するようになった。原蚕用であれば90％以上が摂食をした。さらに、営繭性広食性セリシンカイコ系統で実施例２に記載のMNS300、実施例３に記載のMCS300、及びそれらのF1（MNS300×MCS300）、並びにF1（MNS300×MCS300）に広食性多糸量系統の日604号を交配して得られた三元交雑個体である（MNS300×MCS300）×日604号は、原蚕用は言うまでもなく、L4Mであっても95％以上の非常に高い摂食率を示した。この結果から、MNS300、MCS300、MNS300×MCS300及び（MNS300×MCS300）×日604号は、いずれも広食性セリシンカイコ系統であることが示された。【００９７】
＜実施例５＞
（目的）
実施例２及び３で得られた営繭性広食性セリシンカイコ系統等の繭の収量について検証した。【００９８】
（方法）
基本的な方法は、実施例１に準じる。カイコ系統には、セリシンホープ、日604号×セリシンホープ、MNS300、MCS300、及びMNS300×MCS300を用いた。それぞれの系統を4区に分け、全幼虫期でシルクメイトL4Mを与えた餌区（L4M）、1〜4齢時にシルクメイトL4M（日本農産工業）を与え、5齢時にシルクメイト原蚕用（日本農産工業）を与えた餌区（L4M→原蚕用）、1〜4齢時にシルクメイト原蚕用を与え、5齢時にシルクメイトL4Mを与えた餌区（原蚕用→L4M）、及び全幼虫期でシルクメイト原蚕用を与えた餌区（原蚕用）のそれぞれに分けて飼育し、上蔟（じょうぞく：幼虫を蔟［まぶし］に移すこと）後、1個体あたりの繭の収量を測定して、平均値を算出した。【００９９】
（結果）
各餌区で得られた前記5つのカイコ系統の繭の収量（g）を表３に示す。
【表３】
2014065217.tif 000005
【０１００】
全幼虫期で原蚕用を与えた場合、MNS300、MCS300、及びMNS300×MCS300は、78〜84mgで、セリシンホープ（52mg）よりも高い収量を示した。MNS300、MCS300、MNS300×MCS300は、5齢カイコにおいて原蚕用からL4Mに切り換えても問題なく摂食することができ、繭の収量も全幼虫期で原蚕用を与えた場合と比較して若干減少した程度であった。また、全幼虫期でL4Mを与えた場合、最も収量の少ないMCS300（57mg）でも全幼虫期で原蚕用を与えたセリシンホープの収量（52mg）よりも多かった。この結果から、MNS300、MCS300及びMNS300×MCS300は、全幼虫期で低コストの広食性カイコ用人工飼料であるシルクメイトL4Mを与えても繭の収量が十分量である多糸量性を保持していることが示された。【０１０１】
＜実施例６＞
（目的）
実施例２及び３で得られた営繭性広食性セリシンカイコ系統等の営繭率、化蛹歩合について検証した。【０１０２】
（方法）
基本的な方法は、実施例１に準じる。カイコ系統には、セリシンホープ、MNS300、MCS300、及びMNS300×MCS300を用いた。【０１０３】
掃立ては4〜10蛾を混合して行った。孵化した幼虫は、小型の蓋付きプラスチック容器で飼育した。なお、本実施例では、前記いずれのカイコ系統に対しても全幼虫期で原蚕用を与えて飼育した。4齢以降は、プラスチック製コンテナを用い80頭／容器で飼育した。上蔟には山型の樹脂製蔟(万年蔟）を用いた。【０１０４】
（結果）
表４に結果を示す。
【表４】
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【０１０５】
営繭率は、セリシンホープ、MNS300、MCS300がほぼ同じであったのに対し、MNS300×MCS300では5％ほどの増加がみられた。化蛹歩合は、MNS300×MCS300が最も高く、MNS300が約90％、セリシンホープとMCS300は約80%であった。この結果から、本発明の広食性セリシンカイコ系統作出方法で得られた営繭性広食性セリシンカイコ系統やそのF1は、親系統である営繭性セリシンカイコ系統（セリシンホープ）と同等以上の、営繭性及び化蛹歩合を維持していることが立証された。【０１０６】
＜実施例７＞
（目的）
広食性セリシンカイコ系統を物質生産系宿主として用いて、該カイコ系統で組換えペプチドEGFPの製造を行った。【０１０７】
（方法）
広食性セリシンカイコ系統にはMNS300、MNS300×MCS300を、またコントロールとしてのセリシンカイコ系統にはセリシンホープを用いた。これらのカイコ系統に、セリシンプロモーターGAL4カイコ系統とUAS-EGFPカイコ系統とを交配して得たF1（Ser1-Gal4×UAS-EGFP）を交配した。ここで、Ser1-Gal4×UAS-EGFPカイコ系統では、セリシンプロモーターにより中部絹糸腺でGAL4タンパク質が発現し、発現したGAL4タンパク質が認識配列であるUASに結合することによって、その下流のEGFPタンパク質が中部絹糸腺で特異的に発現する。【０１０８】
MNS300×(Ser1-Gal4×UAS-EGFP)、(MNS300×MCS300)×(Ser1-Gal4×UAS-EGFP)、及びセリシンホープ×(Ser1-Gal4×UAS-EGFP)の各交雑種について、掃立ては4〜10蛾を混合して行い、全幼虫期をシルクメイト原蚕用（日本農産工業）で飼育した。4齢からはプラスチック製コンテナを用いて80頭／容器で飼育を行った。5齢6日目の吐糸直前カイコを氷上で麻酔にかけ、背側を切開してピンセットで中部絹糸腺を傷つけないように摘出し（森靖編，カイコによる新生物学実験，三省堂, 1970，pp．249-255参照）、10mLのextraction buffer (phosphate-buffered saline, pH7.2, containing 1% Tween-20 and 0.05% sodium azide)中で24時間室温にて緩やかに振盪させた。その後、2,000×gで10分間遠心し、EGFPが溶解した上清を回収した。EGFPの定量は、ELISA（enzyme-linked immunosorbent assays）で、Reacti-Bind Anti-GFP Coated Plates (Pierce, Rockford, IL, USA)を用いて、プロトコルに従って行った。具体的には、各中部絹糸腺溶液をELISAプレートの3ウェルに注ぎ、１時間室温に置いた。その後、ウェルをphosphate-buffered saline buffer (pH 7.2) containing 0.05% Tween-20 bufferで洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合型抗GFP抗体(Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA)を加え、1時間室温で反応させた後、洗浄した。次にTMB Peroxidase EIA Substrate Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を用いEGFP発色させ、1N H2SO4を添加して発色を停止させた。プレートリーダー (SpectraMax 250; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)を用いて450nmの吸収度を測定した。標準用として、市販されているGFPタンパク質（rGFP Protein; Takara Bio, Otsu, Japan)を用いた。【０１０９】
（結果）
結果を図６に示す。この図が示すように、Aで示すMNS300×(Ser1-Gal4×UAS-EGFP)のEGFP発現量は、Cで示すセリシンホープ×(Ser1-Gal4×UAS-EGFP)のEGFP発現量とほぼ同等であった。一方、Bで示す(MNS300×MCS300)×(Ser1-Gal4×UAS-EGFP)のEGFP発現量は、Cで示すセリシンホープ×(Ser1-Gal4×UAS-EGFP)のそれよりも多かった。この結果から、本発明の広食性セリシンカイコ系統は、物質生産系宿主として従来のセリシンカイコ系統と同等以上の利用可能性を有していることが明らかとなった。【０１１０】
なお、本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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