(57)【要約】内包させる標識剤や薬剤の種類や目的に応じて、標的部位での保持時間が調整された分子集合体、また、ＡＢＣ現象が抑制され、短期間での複数回投与を可能とする分子集合体を提供する。サルコシンを含む分岐した親水性ブロックと、ポリ乳酸鎖を有する疎水性ブロックとを有する分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ、及び機能性部位とポリ乳酸鎖とを有する機能性物質Ｆ、を含む分子集合体であって、前記両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖がＬ−乳酸単位から構成され、前記機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖がＤ−乳酸単位から構成されているか、又は、前記両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖がＤ−乳酸単位から構成され、前記機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖がＬ−乳酸単位から構成されている、分子集合体。
2014038558.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルコシンを含む分岐した親水性ブロックと、ポリ乳酸鎖を有する疎水性ブロックとを有する分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ、及び
機能性部位とポリ乳酸鎖とを有する機能性物質Ｆ、
を含む分子集合体であって、
前記両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖がＬ−乳酸単位から構成され、前記機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖がＤ−乳酸単位から構成されているか、又は、
前記両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖がＤ−乳酸単位から構成され、前記機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖がＬ−乳酸単位から構成されている、分子集合体。
【請求項２】
前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位の合計が２〜２００個である、請求項１に記載の分子集合体。
【請求項３】
前記親水性ブロックの分岐数が３である、請求項１又は２に記載の分子集合体。
【請求項４】
前記疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖を構成する乳酸単位が１０〜４００個である、請求項１〜３のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項５】
前記疎水性ブロックは分岐していない、請求項１〜４のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項６】
前記複数の親水性ブロックが、前記疎水性ブロックにおける前記ポリ乳酸鎖を含む分子鎖における１つの炭素原子から分岐している、請求項５に記載の分子集合体。
【請求項７】
前記両親媒性ブロックポリマーＡは、下記式（Ｉ）：
【化１】
2014038558.tif 000013
（式中、ｎ１、ｎ２及びｎ３は、それらの合計が３〜２００となる数、ｍは１５〜６０の数を表し、Ｒは、水素原子又は有機基を表す。）
で示される構造を有する、請求項６に記載の分子集合体。
【請求項８】
前記両親媒性ブロックポリマーＡにおいて、前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位数の合計の、前記疎水性ブロックに含まれる乳酸単位数の合計に対する比が、０．０５以上１．８未満である、請求項１〜７のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項９】
前記機能性物質Ｆにおける機能性部位は、シグナル剤及び薬剤からなる群から選ばれる部位である、請求項１〜８のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項１０】
前記機能性物質Ｆは、前記両親媒性ブロックポリマーＡを基準として、２０ｍｏｌ％以下の量で含まれている、請求項１〜９のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項１１】
粒子径が１０〜３０ｎｍである、請求項１〜１０のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項１２】
以下の工程：
容器中に、前記分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ及び前記機能性物質Ｆを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液から前記有機溶媒を除去し、前記容器の内壁に前記分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ及び前記機能性物質Ｆを含むフィルムを得る工程、及び
前記容器中に水又は水溶液を加え、超音波処理を行い、前記フィルムを分子集合体に変換して分子集合体の分散液を得る工程、
を含む調製方法によって得られたものである、請求項１〜１１のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項１３】
以下の工程：
容器中に、前記分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ及び前記機能性物質Ｆを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液を水又は水溶液中に分散させる工程、及び
前記有機溶媒を除去する工程、
を含む調製方法によって得られたものである、請求項１〜１１のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の分子集合体を分子プローブとして非ヒト動物内に投与することを含む、薬剤搬送システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超分子化学、医工薬学連携領域、及びナノメディシンの分野に属する。本発明は、分子イメージング用の分子プローブとしてのナノキャリア、薬剤搬送用のナノキャリア、及び疎水性化合物の分散剤に関する。より具体的には、本発明は、分岐型両親媒性ブロックポリマーを用いた分子集合体及び薬剤搬送システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
国際公開第２００９／１４８１２１号パンフレット（特許文献１）及びバイオマテリアルズ（Biomaterials）、２００９年、第３０巻、ｐ．５１５６−５１６０（非特許文献１）に、疎水性ブロックがポリ乳酸鎖、親水性ブロックがポリサルコシン鎖である直鎖型の両親媒性ブロックポリマーが、水溶液中において自己組織化し、粒径が３０ｎｍ以上の高分子ミセル（ラクトソーム）を形成することが開示されている。ラクトソームは、高い血中滞留性を有するほか、それまでに既に開発されていた高分子ミセルと比べて肝臓への集積量が著しく減少することが分かっている。このラクトソームは、血中に滞留している粒子径が数十〜数百ｎｍのナノ粒子が癌疾に溜まりやすいという性質（Enhanced Permeation and Retention effect（ＥＰＲ効果））を利用することによって、癌疾部位を標的とした分子イメージング又は薬剤搬送用のナノキャリアとして適用可能である。【０００３】
Journal of Controlled Release, Volume 161, Issue 3, 10 August 2012, Pages 821-825（非特許文献２）には、上記の疎水性ブロックがポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）鎖、親水性ブロックがポリサルコシン鎖である直鎖型の両親媒性ブロックポリマーからなる高分子ミセル（ラクトソーム）に、立体化学の異なる３種のＩＣＧ（インドシアニングリーン）標識ポリ乳酸（ＩＣＧ−ＰＬＬＡ，ＩＣＧ−ＰＤＬＡ，ＩＣＧ−ＰＤＬＬＡ）をそれぞれ包含させて、３種のラクトソームを調製したことが開示され、生体内におけるＩＣＧ標識ポリ乳酸の立体化学が及ぼす挙動が開示されている。ラクトソームの粒径は３５ｎｍ以上のものである。【０００４】
合成高分子から構成される高分子ミセルにおいて、一度生体内に投与すると免疫系が賦活化され、同じ高分子ミセルを再び投与すると、免疫系の働きによって肝臓へ集積してしまう現象、すなわちAccelerated Blood Clearance（ＡＢＣ）現象が知られている。このＡＢＣ現象発現のメカニズムの詳細については明らかにされていない。薬学会誌、２００９年、第１２９巻、第１２号、ｐ．１４４５−１４５１（非特許文献３）には、粒子径が３０ｎｍ以下になると、ＡＢＣ現象の発現が抑制されたという報告がなされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００９／１４８１２１号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】バイオマテリアルズ（Biomaterials）、２００９年、第３０巻、ｐ．５１５６−５１６０
【非特許文献２】Journal of Controlled Release, Volume 161, Issue 3, 10 August 2012, Pages 821-825
【非特許文献３】薬学会誌、２００９年、第１２９巻、第１２号、ｐ．１４４５−１４５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１及び非特許文献１、２に開示されたラクトソームは、上述のように、高い血中滞留性を有するほか、それまでに既に開発されていた高分子ミセルと比べて肝臓への集積量が著しく減少する。また、ＥＰＲ効果によって、腫瘍や炎症部位を標的とした分子イメージング又は薬剤搬送用のナノキャリアとして適用可能である。【０００８】
しかしながら、上記のラクトソームは、粒径３０ｎｍ以上のものである。より細い毛細血管への流通、及び毛細血管から小さな癌などの疾病部位への侵入、より高いＥＰＲ効果の観点から、より小さい粒径を有する分子集合体の開発が望まれる。【０００９】
また、分子集合体に内包させる標識剤(シグナル剤)や薬剤の種類や目的によっては、標的部位に送達されてから、比較的短時間で排泄されることが望ましい場合や、標的部位での保持時間が長い方が望ましい場合もある。【００１０】
さらに、上記のラクトソームにおいても、（合成高分子から構成される高分子ミセルの場合と同様に）ＡＢＣ現象が認められた。このため、免疫学的メモリー効果が低下するまでの間、ラクトソームを複数回投与ができないといった問題があった。【００１１】
そこで、本発明の目的は、内包させる標識剤や薬剤の種類や目的に応じて、標的部位での保持時間が調整された分子集合体（高分子ミセル製剤）を提供することにある。また、ＡＢＣ現象が抑制され、短期間での複数回投与を可能とする分子集合体（高分子ミセル製剤）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、両親媒性ブロックポリマーを、親水性ブロックにおいて複数本のサルコシン鎖から構成される分岐構造を有するよう分子設計することによって、さらに、前記両親媒性ブロックポリマーの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖と、分子集合体に内包させるべき標識剤及び／又は薬剤含有ポリ乳酸鎖との乳酸単位の立体化学を特定のものとすることによって、上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１３】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）  サルコシンを含む分岐した親水性ブロックと、ポリ乳酸鎖を有する疎水性ブロックとを有する分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ、及び
機能性部位とポリ乳酸鎖とを有する機能性物質Ｆ、
を含む分子集合体であって、
前記両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖がＬ−乳酸単位から構成され、前記機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖がＤ−乳酸単位から構成されているか、又は、
前記両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖がＤ−乳酸単位から構成され、前記機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖がＬ−乳酸単位から構成されている、分子集合体。【００１４】
前記両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）の立体化学と、前記機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＡ）の立体化学を異ならしめることによって、標的部位での分子集合体の保持時間が長くなる。
【００１５】
（２）  前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位の合計が２〜２００個である、上記（１）に記載の分子集合体。【００１６】
（３）  前記親水性ブロックの分岐数が３である、上記（１）又は（２）に記載の分子集合体。【００１７】
（４）  前記疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖を構成する乳酸単位が１０〜４００個である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の分子集合体。【００１８】
（５）  前記疎水性ブロックは分岐していない、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の分子集合体。【００１９】
（６）  前記複数の親水性ブロックが、前記疎水性ブロックにおける前記ポリ乳酸鎖を含む分子鎖における１つの炭素原子から分岐している、上記（５）に記載の分子集合体。
（７）  前記両親媒性ブロックポリマーＡは、下記式（Ｉ）：
【化１】
2014038558.tif 000003
（式中、ｎ１、ｎ２及びｎ３は、それらの合計が３〜２００となる数、ｍは１５〜６０の数を表し、Ｒは、水素原子又は有機基を表す。）
で示される構造を有する、上記（６）に記載の分子集合体。【００２０】
（８）  前記両親媒性ブロックポリマーＡにおいて、前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位数の合計の、前記疎水性ブロックに含まれる乳酸単位数の合計に対する比が、０．０５以上１．８未満である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の分子集合体。【００２１】
（９）  前記機能性物質Ｆにおける機能性部位は、シグナル剤及び薬剤からなる群から選ばれる部位である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の分子集合体。【００２２】
（１０）  前記機能性物質Ｆは、前記両親媒性ブロックポリマーＡを基準として、２０ｍｏｌ％以下の量で含まれている、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の分子集合体。【００２３】
（１１）  粒子径が１０〜３０ｎｍである、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の分子集合体。【００２４】
（１２）  以下の工程：
容器中に、前記分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ及び前記機能性物質Ｆを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液から前記有機溶媒を除去し、前記容器の内壁に前記分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ及び前記機能性物質Ｆを含むフィルムを得る工程、及び
前記容器中に水又は水溶液を加え、超音波処理を行い、前記フィルムを分子集合体に変換して分子集合体の分散液を得る工程、
を含む調製方法によって得られたものである、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の分子集合体。【００２５】
（１３）  以下の工程：
容器中に、前記分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ及び前記機能性物質Ｆを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液を水又は水溶液中に分散させる工程、及び
前記有機溶媒を除去する工程、
を含む調製方法によって得られたものである、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の分子集合体。【００２６】
（１４）  上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の分子集合体を分子プローブとして非ヒト動物内に投与することを含む、薬剤搬送システム。【００２７】
（１５）  サルコシンを含む分岐した親水性ブロックと、ポリ乳酸鎖を有する疎水性ブロックとを有する分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ、及び
機能性部位とポリ乳酸鎖とを有する機能性物質Ｆ、
を含む分子集合体であって、
前記両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖がＬ−乳酸単位から構成され、前記機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖がＤＬ−乳酸単位から構成されているか、又は、
前記両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖がＤ−乳酸単位から構成され、前記機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖がＤＬ−乳酸単位から構成されている、分子集合体。【００２８】
前記両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）の立体化学に対して、前記機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＡ）をＤＬ−乳酸単位から構成することによって、標的部位での分子集合体の保持時間が短くなり、体外への排泄が早くなる。【００２９】
上記（２）〜（１３）のいずれかに記載された要件は、上記（１５）の分子集合体にも同様に適用される。また、上記（１４）に記載された薬剤搬送システムについても、上記（１５）の分子集合体にも同様に適用される。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によると、親水性ブロックにおける分岐構造により、従来のラクトソームでは調製することができなかった小さい粒径（例えば３０ｎｍを下回る粒径）を有する分子集合体（すなわち、高分子ミセル；ラクトソーム）が提供される。本発明の分子集合体は、粒径が小さく、より細い毛細血管へも流通し易く、毛細血管から小さな癌などの疾病部位への侵入がより容易で、より高いＥＰＲ効果によって、癌部位への分子集合体の集積速度を速めることが可能になる。【００３１】
前記両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖（これを「Ａ−ＰＬＡ」と称する）の立体化学と、前記機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖（これを「Ｆ−ＰＬＡ」と称する）の立体化学を異ならしめることによって、標的の癌部位に送達されてから、分子集合体に内包させる標識剤(シグナル剤)や薬剤は、標的部位で長い時間にわたって保持され得る。これは、前記ポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）と前記ポリ乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＡ）とが互いにステレオコンプレックスを形成し、小さい粒径でありながらも、分子集合体の安定性が保たれるためと考えられる。また、前記ポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）と、前記ポリ乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＡ）とは互いに異なるヘリックス構造をとると考えられ、前記ポリ乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＡ）に結合している疎水性の機能性部位が、コア／シェル構造の分子集合体の疎水性内部に保持されやすく、さらに安定性が増すものと考えられる。【００３２】
一方、前記両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）の立体化学に対して、前記機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＡ）をＤＬ−乳酸単位から構成することによって、標的部位での分子集合体の保持時間が短くなり、体外への排泄が早くなる。これは、上述したような、前記ポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）と前記ポリ乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＡ）との間でのステレオコンプレックス形成が起こらず、ステレオコンプレックス形成による分子集合体の安定性効果が得られないためであろうと考えられる。さらに、前記ポリ乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＡ）に結合している疎水性の機能性部位が、コア／シェル構造の分子集合体の疎水性内部に保持される効果も弱いものと考えられる。【００３３】
また、本発明の分子集合体によると、上記のいずれの立体化学の場合においても、より細い血管への分布が促進され全身に分布することでバックグラウンドのシグナルを低下させることが可能になる。すなわち、腫瘍部位とバックグラウンドとのコントラスト比を向上させることができる。これにより、短時間でのイメージングが可能になる。【００３４】
また、本発明の分子集合体によると、親水性ブロックにおける分岐構造により、表面にサルコシン鎖の稠密なポリマーブラシ構造を有するので、粒子径が３０ｎｍを下回るか否かに関わらず、ＡＢＣ現象の発現を抑制することができる。【００３５】
本発明によると、内包させる標識剤や薬剤の種類や目的に応じて、標的部位での保持時間が調整された分子集合体（高分子ミセル製剤）が提供される。また、ＡＢＣ現象が抑制され、短期間での複数回投与を可能とする分子集合体（高分子ミセル製剤）が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】合成例１において合成された分岐型両親媒性ブロックポリマーの1Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図２】実験例２において、ポリＬ−乳酸PLLAによるラクトソームの粒子径変化を表すグラフである。
【図３】実験例２において、ポリＤ−乳酸PDLAによるラクトソームの粒子径変化を表すグラフである。
【図４】実験例３において、各ＩＣＧ標識ポリ乳酸ＩＣＧ−ＰＬＬＡ，ＩＣＧ−ＰＤＬＡ，ＩＣＧ−ＰＤＬＬＡ）内包ラクトソーム粒子を用いた担癌マウスのin vivo蛍光イメージング結果を示す。
【図５】実験例３において、担癌マウスの蛍光イメージングにおける、腫瘍（Tumor）における蛍光強度の経時変化を示すグラフである。
【図６】実験例３において、担癌マウスの蛍光イメージングにおける、背中（Background）における蛍光強度の経時変化を示すグラフである。
【図７】実験例３において、担癌マウスの蛍光イメージングにおける、肝臓 (Liver)における蛍光強度の経時変化を示すグラフである。
【図８】実験例３において、担癌マウスの蛍光イメージングにおける、腫瘍（Tumor）と背中（Background）との蛍光強度比(Tumor/Background)を解析したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
［１．分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ］
本発明の両親媒性ブロックポリマーＡは、サルコシンを含む分岐した親水性ブロックと、ポリ乳酸鎖を有する疎水性ブロックとを有する。親水性ブロックと疎水性ブロックとは、リンカー部を介して結合している。
【００３８】
［１−１．親水性ブロック］
本発明において、分岐型両親媒性ブロックポリマーＡの親水性ブロックが有する「親水性」という物性の具体的な程度としては、特に限定されるものではないが、少なくとも、親水性ブロックの全体が、後述の疎水性ブロックとしてのポリ乳酸鎖に対して相対的に親水性が強い性質をいう。或いは、親水性ブロックが疎水性ブロックとコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の親水性をいう。さらに或いは、両親媒性ブロックポリマーＡが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、特に粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の親水性をいう。
【００３９】
本発明の両親媒性ブロックポリマーＡは、親水性ブロックにおいて分岐した構造を有する。親水性ブロックの分岐それぞれには、サルコシンが含まれる。
【００４０】
親水性ブロックにおいて、構成単位の種類及び比率は、ブロック全体が上述したような親水性となるように、当業者によって適宜決定されるものである。具体的には、分岐全てに含まれるサルコシン単位の合計は、例えば、２〜２００、２〜１００、又は２〜１０個でありうる。あるいは、複数の親水性ブロック全てに含まれるサルコシン単位の合計は、例えば、３０〜２００、又は５０〜１００個でありうる。１つの分岐当たりのサルコシン単位数の平均は、例えば、１〜６０、１〜３０、１〜１０、又は１〜６でありうる。すなわち、親水性ブロックそれぞれは、サルコシン又はポリサルコシン鎖を含んで構成されることができる。
【００４１】
構成単位数が上記範囲を超えると、分子集合体を形成した場合に、形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。上記範囲を下回ると、両親媒性ブロックポリマーとしての体をなさないか、又は、分子集合体の形成自体が困難となる傾向にある。
【００４２】
親水性ブロックにおける分岐は２以上であればよいが、分子集合体を形成する際に粒子形状のミセルを効率的に得る観点から、好ましくは３以上である。親水性ブロックにおける分岐の数の上限は特に限定されるものではないが、例えば２７である。特に、本発明においては、親水性ブロックの分岐の数が３であることが好ましい。
【００４３】
サルコシン（すなわちＮ−メチルグリシン）は水溶性が高く、また、サルコシンのポリマーはＮ置換アミドを有することから通常のアミド基に比べてシス−トランス異性化が可能であり、さらに、Ｃα炭素まわりの立体障害が少ないことから、高い柔軟性を有するものである。このような構造を構成ブロックとして用いることは、当該ブロックに高い親水性の基本特性、又は、高い親水性と高い柔軟性とを併せ持つ基本特性が備わる点で非常に有用である。
さらに、親水性ブロックは、末端（すなわちリンカー部と反対側の末端）に親水性基（例えば水酸基に代表される）を有していることが好ましい。
【００４４】
なお、ポリサルコシン鎖においては、全てのサルコシン単位が連続していてもよいし、非連続であってもかまわないが、当該ポリペプチド鎖全体として上述の基本特性を損なわないように分子設計されたものであることが好ましい。
【００４５】
［１−２．疎水性ブロック］
本発明において、疎水性ブロックが有する「疎水性」という物性の具体的な程度としては、特に限定されるものではないが、少なくとも、疎水性ブロックが、上記の親水性ブロックの全体に対して相対的に疎水性が強い領域であり、当該親水性ブロックとコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の疎水性を有していれば良い。或いは、当該両親媒性ブロックポリマーＡが溶媒中で自己組織化して、自己集合体、好ましくは粒子状の自己集合体を形成することが可能となる程度の疎水性を有していれば良い。
【００４６】
１本の両親媒性ブロックポリマーＡ中に存在する疎水性ブロックは分岐していなくともよいし、分岐していてもよい。しかしながら、疎水性ブロックは分岐していない方が、疎水性コア部に対して、親水性分岐型シェル部の稠密度が増すので、より小さい粒径の安定したコア／シェル型分子集合体を形成し易いと考えられる。
【００４７】
本発明において、疎水性ブロックは、ポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）を含むものである。疎水性ブロックにおいて構成単位の種類及び比率は、ブロック全体が上述したような疎水性となるように、当業者によって適宜決定されるものである。具体的には、例えば疎水性ブロックが分岐していない場合、乳酸単位の数は、例えば５〜１００、１５〜６０個、又は２５〜４５個でありうる。疎水性ブロックが分岐している場合は、分岐全てに含まれる乳酸単位の数の合計が、例えば１０〜４００、好ましくは２０〜２００個でありうる。この場合、１つの分岐当たりの乳酸単位数の平均は、例えば、５〜１００、好ましくは１０〜１００個である。
【００４８】
構成単位数が上記範囲を上回ると、分子集合体を形成した場合に、当該形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。構成単位数が上記範囲を下回ると、分子集合体の形成自体が困難となる傾向にある。
【００４９】
疎水性ブロックが分岐する場合、分岐の数は特に限定されないが、分子集合体を形成する際に粒子形状のミセルを効率的に得る観点から、例えば、親水性ブロックにおける分岐数以下とすることができる。
【００５０】
ポリ乳酸は、以下の基本特性を有する。
ポリ乳酸は、優れた生体適合性及び安定性を有するものである。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体は、生体、特に人体への応用性という点で非常に有用である。
また、ポリ乳酸は、優れた生分解性を有することから代謝が早く、生体内においてがん組織以外への組織への集積性が低い。このため、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から得られる分子集合体は、がん組織への特異的な集積性という点で非常に有用である。
そして、ポリ乳酸は、低沸点溶媒への溶解性に優れるものであることから、このようなポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性物質から分子集合体を得る際に、有害な高沸点溶媒の使用を回避することが可能である。このため、このような分子集合体は、生体への安全性という点で非常に有用である。
【００５１】
なお、疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）においては、全ての乳酸単位が連続していてもよいし、非連続であってもかまわないが、ポリペプチド鎖全体として上述の基本特性を損なわないように分子設計されたものであることが好ましい。
【００５２】
疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）は、後述する機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＡ）との立体的相互作用のために、Ｌ−乳酸単位から構成されているポリＬ−乳酸鎖（Ａ−ＰＬＬＡ）か、又は、Ｄ−乳酸単位から構成されているポリＤ−乳酸鎖（Ａ−ＰＤＬＡ）である。
【００５３】
ここで、Ｌ−乳酸単位から構成されているポリＬ−乳酸鎖（Ａ−ＰＬＬＡ）とは、ポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）を構成する全乳酸単位を基準として、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特別には１００％がＬ−乳酸単位であることを意図している。このような構成により、機能性物質Ｆに含まれるポリＤ−乳酸鎖（Ｆ−ＰＤＬＡ）とのステレオコンプレックス形成が期待される。
【００５４】
Ｄ−乳酸単位から構成されているポリＤ−乳酸鎖（Ａ−ＰＤＬＡ）とは、ポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）を構成する全乳酸単位を基準として、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特別には１００％がＤ−乳酸単位であることを意図している。このような構成により、機能性物質Ｆに含まれるポリＬ−乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＬＡ）とのステレオコンプレックス形成が期待される。
【００５５】
［１−３．サルコシン単位数の乳酸単位数に対する比］
両親媒性ブロックポリマーＡにおいて、サルコシン単位数（すなわち、親水性ブロックの分岐全てに含まれるサルコシン単位の数の合計）をＮＳとし、ポリ乳酸単位数（すなわち、疎水性ブロックに含まれる乳酸単位の数、又は、疎水性ブロックが分岐している場合は分岐全てに含まれる乳酸単位数の合計）をＮＬとすると、それらの比ＮＳ／ＮＬは、例えば０．０５〜５又は０．０５〜４でありうる。
さらに好ましくは、ＮＳ／ＮＬは、０．０５以上１．８未満、例えば０．０５以上１．７以下、０．０５以上１．６７以下、０．１以上１．７以下、又は０．１以上１．６７以下であってよい。
【００５６】
［１−４．分岐構造］
親水性ブロックと疎水性ブロックとを連結するリンカー部位の構造は、化学的に許容可能な構造であれば特に限定されるものではない。
例えば、親水性ブロック側の分枝の数が２である場合は、ポリ乳酸鎖を含む分子鎖のリンカー部位にある１つのＮ原子から、ポリサルコシン鎖を含む２本の分子鎖が分岐しうる。言い換えれば、ポリ乳酸鎖に直接的又は間接的に結合しているＮ原子が、直接的又は間接的に２本のポリサルコシン鎖に結合していることができる。
【００５７】
また例えば、親水性ブロック側の分枝の数が３である場合は、ポリ乳酸鎖を含む分子鎖のリンカー部位にある１つのＣ原子から、ポリサルコシン鎖を含む３本の分子鎖が分岐しうる。言い換えれば、ポリ乳酸鎖に直接的又は間接的に結合しているＣ原子が、直接的又は間接的に３本のポリサルコシン鎖に結合していることができる。リンカー部位にある１つのＰ原子やＳｉ原子から分岐している場合や、両親媒性ブロックポリマー分子全体が四級アンモニウム分子を形成している場合も同様である。
親水性ブロック側の分枝の数が３を超える場合は、分枝がさらなる分岐構造を有するように分子設計されることができる。
疎水性ブロック側も分岐している場合についても、上記と同様の観点で分子設計されることができる。
【００５８】
下記式（I）に、親水性ブロック側の分岐の数が３、疎水性ブロック側の分岐なしである場合の分岐型両親媒性ブロックポリマーの好ましい構造を示す。
【００５９】
【化２】
2014038558.tif 000004
【００６０】
式（I）中、ｎ１、ｎ２及びｎ３は、それらの合計が３〜２００となる数、ｍは５〜１００の数を表し、Ｒは、水素原子又は有機基を表す。有機基の炭素数は、１〜２０でありうる。具体的には、アルキル基やアルキルカルボニル基などが挙げられる。
【００６１】
下記式（II）に、親水性ブロック側の分岐の数が３、疎水性ブロック側の分岐が２である場合の分岐型両親媒性ブロックポリマーの好ましい構造を示す。
【００６２】
【化３】
2014038558.tif 000005
【００６３】
式（II）中、ｎ１、ｎ２及びｎ３、並びにＲは、式（I）における場合と同じである。ｍ１及びｍ２は、それらの合計が１０〜４００となる数を表す。
【００６４】
［１−５．分岐型両親媒性ブロックポリマーＡの合成法］
分岐型両親媒性ブロックポリマーの合成においては、疎水性ブロック部（ポリ乳酸部）の合成、親水性ブロック部（サルコシン部又はポリサルコシン部）の合成、及びそれらブロックを連結するリンカー部の合成がなされる。
【００６５】
例えば、サルコシン又はポリサルコシン鎖とポリ乳酸鎖とを連結させるリンカー試薬を合成し、それを開始剤として、サルコシン部位の付加又はポリサルコシン部位の重合反応による伸長及びポリ乳酸部位の重合反応により伸長させることによって、分岐型両親媒性ブロックポリマーを合成することができる。
【００６６】
また例えば、サルコシンをリンカー試薬に付加させた後に、又は、ポリサルコシン鎖を親水性ブロックとして予め重合反応により調製し、リンカー試薬に付加させた後に、ポリ乳酸鎖を伸長させることによって、分岐型両親媒性ブロックポリマーを合成することができる。
【００６７】
さらに例えば、ポリサルコシン又はポリサルコシン鎖及びポリ乳酸鎖の両方をそれぞれ親水性ブロック及び疎水性ブロックとして予め用意しておき、別途合成されたリンカー試薬を用いてそれらブロックを連結させることによって、分岐型両親媒性ブロックポリマーを合成することができる。
【００６８】
リンカー試薬の構造は、乳酸モノマー（乳酸やラクチド）又はポリ乳酸鎖と結合可能な官能基（例えば、水酸基、アミノ基等）を１個又は所望の疎水性ブロック側分岐数に相当する数だけ有し、且つ、サルコシンモノマー（例えばサルコシンやＮ−カルボキシサルコシン無水物）又はポリサルコシンと結合可能な官能基（例えばアミノ基）を所望の親水性ブロック側分岐数に相当する数だけ有することができる。この場合、リンカー試薬において、サルコシンモノマー又はポリサルコシンと結合可能な官能基のそれぞれが可能な限り同様の反応性を有するように、当業者によって適宜分子設計がなされる。
【００６９】
乳酸モノマー又はポリ乳酸鎖と結合可能な官能基と、サルコシンモノマー又はポリサルコシンと結合可能な官能基とは、それぞれ保護基によって保護されうる。この場合、それぞれの保護基としては、必要に応じて選択的に脱離させることが可能なものが当業者によって適宜選択される。
例えば、親水性ブロック側分岐数が３である分岐型両親媒性ブロックポリマーを合成する場合のリンカー試薬は、例えばトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）構造を元に調製することができる。
【００７０】
さらに、疎水性ブロック側を分岐させる場合は、例えば上記のトリスヒドロキシメチルアミノメタン構造にさらに分岐点を増やした構造を元に調製することができる。さらに分岐点を増やした構造は、トリスヒドロキシメチルアミノメタンに、ポリ乳酸鎖と結合可能な官能基として例えばアミノ基を側鎖に有するアミノ酸（具体例として、リジン及びオルニチンが挙げられる）の、すべてのアミノ基が保護されているアミノ酸誘導体を付加し、その後脱保護することによって得ることができる。脱保護してフリーになったアミノ基に対して、さらに同様のアミノ酸誘導体を付加することによって、分岐点を増やしていくことができる。
【００７１】
ポリサルコシン鎖及びポリ乳酸鎖の合成方法は、リンカー試薬における官能基に応じて当業者が適宜決定することができるものであり、公知のペプチド合成法及びポリエステル合成法から選択されてよい。
ペプチド合成は、例えば、リンカー試薬におけるアミノ基などの塩基性基を開始剤として、Ｎ−カルボキシサルコシン無水物(サルコシンＮＣＡ)を開環重合することなどによって行うことが好ましい。
ポリエステル合成は、例えば、リンカー試薬におけるアミノ基などの塩基性基を開始剤として、ラクチドを開環重合することなどによって行うことが好ましい。
【００７２】
なお、分岐数が上記具体例と異なる分岐型両親媒性ブロックポリマーを合成する場合は、有機化学的観点から当業者が種々の変更を適宜加えることによって調製することができる。
【００７３】
ポリサルコシン鎖及びポリ乳酸鎖の鎖長の調整は、重合反応における開始剤とモノマーとの仕込み比を調整することによって行うことができる。また、鎖長は、例えば１ＨＮＭＲによって確認することができる。
【００７４】
［２．機能性部位とポリ乳酸鎖とを有する機能性物質Ｆ］
本発明の分子集合体は、機能性部位とポリ乳酸鎖とを有する機能性物質Ｆを含んでいる。機能性物質Ｆは、疎水性化合物であり、分子集合体の疎水コア部に位置することによって分子集合体に内包される。これによって、本発明の分子集合体は、分子イメージングにおけるプローブとしてや、薬剤搬送システムにおける製剤として有用な構造体となる。
【００７５】
［２−１．機能性部位］
機能性物質Ｆにおける機能性部位は、標識剤（シグナル剤）及び薬剤からなる群から選ばれる部位（基）である。
【００７６】
シグナル剤としては、次のシグナル基を有する分子を用いることができる。シグナル基は、検出によりイメージングを可能にする特性を有するものであればよい。例えば、蛍光基、放射性元素含有基、磁性基などが挙げられる。これらの基を検出する手段は、当業者によって適宜選択されるものである。
【００７７】
蛍光基としては、特に限定されないが、フルオレセイン系色素、インドシアニン色素などのシアニン系色素、ローダミン系色素、量子ドットなどに由来する基が挙げられる。本発明においては、近赤外蛍光基（例えばシアニン系色素、量子ドットなどに由来する基）を用いることが好ましい。
【００７８】
近赤外領域（７００〜１３００ｎｍ）では、水素結合を有する各置換基の吸収が存在するものの、その吸収は比較的小さい。このため、近赤外光は生体組織を透過しやすい特性を有する。このような近赤外光の特性を利用すれば、身体に無用の負荷を与えることなく体内の情報を得ることも可能であるといえる。特に、測定対象を小動物、体表面に近い部位に特定すると、近赤外蛍光は、有用な情報を与えることが可能になる。
【００７９】
近赤外蛍光基のより具体的な例としては、ＩＣＧ（インドシアニングリーン）などのインドシアニン系色素、Ｃｙ７、ＤＹ７７６、ＤＹ７５０、Ａｌｅｘａ７９０、Ａｌｅｘａ７５０などに由来する基が挙げられる。本発明の分子集合体を、例えばがんを標的として用いる場合は、がんへの集積性という観点で、ＩＣＧなどのインドシアニン系色素に由来する基を用いることが好ましい場合がある。
【００８０】
放射性元素含有基としては、特に限定されないが、18Ｆなどの放射性同位体でラベルした、糖、アミノ酸、核酸などに由来する基が挙げられる。放射性元素含有基の導入方法の具体例の一つとしては、モノFmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl) エチレンジアミンを用いてラクチドの重合を行う工程、末端OHをシリル保護基で保護する工程、ピペリジン処理でFmocを脱離する工程、サルコシン-N-カルボキシ無水物（SarNCA）の重合を行い、重合物末端をターミネーションする工程、シリル保護基を外し、スルホン酸エステル（例えば、トリフルオロメタンスルホン酸エステル、パラトルエンスルホン酸エステルなど）に変換する工程、及び放射性元素含有基を導入する工程により行う方法が挙げられる。さらに、当該具体例は当業者によって適宜変更されて良い。
【００８１】
磁性基としては、特に限定されないが、フェリクロームなどの磁性体を有するものや、フェライトナノ粒子、ナノ磁性粒子などにみられるものが挙げられる。
【００８２】
これらの中でも、本発明においては、インドシアニングリーン系色素などの近赤外蛍光物質や、18Ｆなどの放射性同位体でラベルした、糖、アミノ酸、核酸などの放射性元素含有物質が好ましい場合がある。これら標識剤は、単独で又は複数種の組み合わせで用いることができる。
【００８３】
薬剤としては、対象となる疾患に適したものが当業者によって適宜選択される。具体的には、抗がん剤、抗菌剤、抗ウィルス剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、ステロイド剤、ホルモン剤、血管新生阻害剤などが挙げられる。これら薬剤分子は、単独で又は複数種の組み合わせで用いることができる。
【００８４】
［２−２．ポリ乳酸鎖］
分子集合体に内包されるべき機能性物質Ｆは、上記の標識剤（シグナル剤）及び薬剤からなる群から選ばれる部位（基）とポリ乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＡ）（基）とが結合されているものである。
【００８５】
機能性物質Ｆを構成するポリ乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＡ）は、前述した疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）との立体的相互作用のために、Ｄ−乳酸単位から構成されているポリＤ−乳酸鎖（Ｆ−ＰＤＬＡ）か、又は、Ｌ−乳酸単位から構成されているポリＬ−乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＬＡ）である。
【００８６】
ここで、Ｄ−乳酸単位から構成されているポリＤ−乳酸鎖（Ｆ−ＰＤＬＡ）とは、ポリ乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＡ）を構成する全乳酸単位を基準として、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特別には１００％がＤ−乳酸単位であることを意図している。このような構成により、疎水性ブロックを構成するポリＬ−乳酸鎖（Ａ−ＰＬＬＡ）とのステレオコンプレックス形成が期待される。
【００８７】
ここで、Ｌ−乳酸単位から構成されているポリＬ−乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＬＡ）とは、ポリ乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＡ）を構成する全乳酸単位を基準として、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特別には１００％がＬ−乳酸単位であることを意図している。このような構成により、疎水性ブロックを構成するポリＤ−乳酸鎖（Ａ−ＰＤＬＡ）とのステレオコンプレックス形成が期待される。
【００８８】
機能性物質Ｆを構成するポリ乳酸鎖の乳酸単位数は、１５〜６０個、好ましくは２５〜４５個である。この範囲内で、ポリ乳酸結合機能性物質Ｆ全体の長さが上述の両親媒性ブロックポリマーＡの長さを超えないように分子設計される。好ましくは、両親媒性ブロックポリマーＡにおける疎水性ブロックの２倍の長さを超えないように分子設計される。構成単位数が上記範囲を上回ると、分子集合体を形成した場合に、形成された分子集合体の安定性を欠く傾向にある。構成単位数が上記範囲を下回ると、機能性物質Ｆと両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックとの親和性、特にステレオコンプレックス形成が弱くなる傾向にある。
【００８９】
機能性物質Ｆの内包量としては特に限定されるものではないが、例えば、前記機能性物質Ｆは、前記両親媒性ブロックポリマーＡを基準として、例えば２０ｍｏｌ％以下、好ましくは０．５〜２０ｍｏｌ％、より好ましくは１．０〜２０ｍｏｌ％の量で含まれていることが好ましい。２０ｍｏｌ％を超えると、分子集合体の粒径が３０ｎｍよりも大きくなるか、あるいは、分子集合体の一次粒子が凝集してしまう傾向がある。
【００９０】
［３．分子集合体］
［３−１．分子集合体］
本発明の分子集合体（ラクトソーム）は、上記の分岐型両親媒性ポリマーＡの凝集により、或いは自己集合的な配向により成り立つ構造体である。本発明は、内側（コア部）が疎水性ブロック、外側（シェル部）が親水性ブロックとなるように構成されたミセル形状の分子集合体であることが実用性の観点から好ましい。本発明の分子集合体は、適切な機能性構造（機能性部位とポリ乳酸鎖とを有する機能性物質Ｆ）を具備することによって、分子イメージングにおけるプローブとしてや、薬剤搬送システムにおける製剤として有用な構造体となる。
【００９１】
分岐型両親媒性ブロックポリマーＡは、分岐鎖としての複数のポリサルコシン鎖の存在により、直鎖型両親媒性ブロックポリマーに比べて親水性部位の分子断面積が大きくなる。このため、分岐型両親媒性ブロックポリマーから形成された分子集合体は、粒子としての安定性に優れている。さらにこの粒子は大きな曲率を備えることができる。このことから、本発明の分子集合体は、後述するように粒子の小型化が可能になるという基本的特徴を有する。
【００９２】
また、分岐型両親媒性ブロックポリマーＡから構成される分子集合体は、分岐鎖としての複数のポリサルコシン鎖の存在により、従来のラクトソームに比べて表面における親水性基の密度が高く、疎水性部位の露出が少ないという基本的特徴を有する。
【００９３】
なお、本発明における分子集合体には、分岐型両親媒性ブロックポリマーＡの他に、本発明の目的を損なわない範囲で、親水性ブロックが分岐型ではない直鎖型の両親媒性ブロックポリマーを少量併用してもよい。しかしながら、直鎖型両親媒性ブロックポリマーを用いると、分子集合体の粒径が大きくなる傾向があるので、注意を要する。分岐型両親媒性ブロックポリマーと直鎖型両親媒性ブロックポリマーとの混合比は、モル基準で５０：５０〜１００：０、好ましくは６７：３３〜１００：０、より好ましくは９５：５〜１００：０とすることができる。この場合にも、疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）の立体化学は、上述のとおりとする。
【００９４】
［３−２．粒子径］
本発明の分子集合体の粒子径は、例えば１０〜３０ｎｍでありうる。この範囲に含まれる上限値は、２８ｎｍ、２５ｎｍ、又は２３ｎｍであってもよい。また、下限値は１５ｎｍであってもよい。本発明において、分岐型両親媒性ブロックポリマーＡの鎖長を短く調整することによって、上記範囲の下限値より小さい分子集合体を得ることも可能である。ここで「粒子径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒径、すなわち中心粒径をいう。本発明の分子集合体は、既に述べたように、両親媒性ブロックポリマーにおける親水性ブロックの分岐構造により、基本的に、従来のものに比べて粒子径が小さい傾向にある。
【００９５】
上記範囲を上回る場合は、直鎖型両親媒性ブロックポリマーからなる分子集合体の粒径（国際公開第２００９／１４８１２１号：３０ｎｍ以上）とあまり差がなく、分子プローブとして生体内に投与した場合に、好ましいＥＰＲ効果が得にくくなる。
【００９６】
粒子径の調節の方法としては、例えば、分子集合体の分岐型両親媒性ブロックポリマーＡの鎖長を短くすることによってより小さい粒子径に調整すること、直鎖型両親媒性ブロックポリマーを用いないか、配合量をできるだけ少なくすることによってより小さい粒子径に調整すること、前記機能性物質Ｆの量を少なくすることによってより小さい粒子径に調整することなどが挙げられる。
【００９７】
本発明の分子集合体の大きさを測定するための方法は特に限定されるものではなく、当業者によって適宜選択されるものである。例えば、透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope;ＴＥＭ）又は原子間力顕微鏡（Atomic Force Microscope;ＡＦＭ）による観察法や、動的光散乱（Dynamic Light Scattering;ＤＬＳ）法などが挙げられる。ＤＬＳ法においては、溶液中でブラウン運動している粒子の移動拡散係数を測定する。
【００９８】
［３−３．分子集合体の作成］
分子集合体の作成法は特に限定されず、所望する分子集合体の大きさ、特性、担持させる機能性構造の種類、性質、含有量などに応じて、当業者が適宜選択することができる。必要に応じ、下記のように分子集合体を形成した後に、得られた分子集合体に対して、公知の方法によって表面修飾を行っても良い。なお、粒子が形成されたことの確認は、電子顕微鏡観察によって行うと良い。
【００９９】
［３−３−１．フィルム法］
本発明における分岐型両親媒性ブロックポリマーＡは低沸点溶媒への溶解性を有するため、フィルム法を用いた分子集合体の調製が可能である。
【０１００】
フィルム法は、次の工程を含む。すなわち、容器（例えばガラス容器）中に、分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ及び機能性物質Ｆを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程；
前記の溶液から有機溶媒を除去し、容器の内壁に前記分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ及び前記機能性物質Ｆを含むフィルムを得る工程；及び、
前記の容器中に水又は水溶液を加え、超音波処理又は加温処理を行い、フィルム状物質を、分子集合体（機能性物質Ｆを内包する分子集合体）に変換して分子集合体の分散液を得る工程、
を含む。さらに、フィルム法は、分子集合体の分散液を凍結乾燥処理に供する工程を含んでも良い。
【０１０１】
分岐型両親媒性ブロックポリマーＡと機能性物質Ｆとを有機溶媒中に含む溶液は、分岐型両親媒性ブロックポリマーＡのみをあらかじめフィルムの状態でストックしておき、ナノ粒子調製時に、機能性物質Ｆを含む溶液を加えてフィルムを溶解することによって調製してもよい。
【０１０２】
フィルム法に用いる有機溶媒としては、低沸点溶媒を用いることが好ましい。本発明における低沸点溶媒とは、１気圧における沸点が１００℃以下、好ましくは９０℃以下のものをいう。具体的には、クロロホルム、ジエチルエーテル、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ヘキサンなどが挙げられる。
このような低沸点溶媒を使用することによって、溶媒の除去が非常に簡単になる。溶媒の除去の方法としては特に限定されることなく、使用する有機溶媒の沸点などに応じ、当業者が適宜決定すればよい。例えば、減圧下における溶媒除去を行ってもよいし、自然乾燥による溶媒除去を行ってもよい。
【０１０３】
有機溶媒が除去された後は、容器内壁に分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ及び機能性物質Ｆを含むフィルムが形成される。このフィルムが張り付いた容器中に、水又は水溶液を加える。水又は水溶液としては特に限定されることなく、生化学的、薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよい。例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。
【０１０４】
水又は水溶液が加えられた後、加温処理を行う。加温によりフィルムが容器内壁から剥がれる過程で分子集合体を形成する。加温処理は、例えば７０〜１００℃、５〜６０分の条件下で行うことができる。加温処理終了時には、分子集合体（機能性物質Ｆを内包した態様の分子集合体）が前記の水又は水溶液中に分散された分散液が容器中に調製される。また、フィルムの剥離の際、必要に応じ超音波処理を併せて行ってもよい。
【０１０５】
得られた分散液は、直接生体に投与されることが可能である。すなわち、無溶媒の分子集合体そのものの状態で保存されなくてもよい。
【０１０６】
一方、得られた分散液を凍結乾燥処理しても良い。凍結乾燥処理の方法としては公知の方法を特に限定されることなく用いることができる。たとえば、上記のようにして得られた分子集合体の分散液を液体窒素などによって凍結させ、減圧下で昇華させることによって行うことができる。これにより、分子集合体の凍結乾燥処理物が得られる。すなわち、分子集合体を凍結乾燥処理物として保存することが可能になる。必要に応じ、この凍結乾燥物に水又は水溶液を加えて、分子集合体の分散液を得ることによって、分子集合体を使用に供することができる。水又は水溶液としては特に限定されることなく、生化学的、薬学的に許容することができるものを当業者が適宜選択すればよい。例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。
【０１０７】
［３−３−２．インジェクション法］
インジェクション法は、以下の工程を含む。すなわち、容器（例えば試験管など）中に、分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ及び機能性物質Ｆを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記の溶液を水又は水溶液に分散させる工程、及び
有機溶媒を除去する工程が行われる。さらに、インジェクション法は、有機溶媒を除去する工程の前に、適宜精製処理工程を行ってもよい。
【０１０８】
インジェクション法に用いる有機溶媒としては、例えばトリフルオロエタノール、エタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが用いられる。水又は水溶液としては、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが用いられる。
【０１０９】
精製処理としては、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、フィルタリング、超遠心などの処理を行うことができる。
【０１１０】
［４．薬剤搬送システム・分子イメージング］
［４−１．分子集合体の投与対象］
本発明の薬剤搬送システム及び分子イメージングは、上記の分子集合体を生体内に投与することを含む。分子集合体を投与される生体としては特に限定されないが、ヒト又は非ヒト動物でありうる。非ヒト動物としては特に限定されないが、ヒト以外の哺乳類、より具体的には、霊長類、齧歯類（マウス、ラットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマなどが挙げられる。
【０１１１】
本発明の方法において用いられる分子集合体は、血管病変部位（例えば、悪性腫瘍部位、炎症部位、動脈硬化部位、血管新生部位など）への特異的集積性に優れたものである。本発明分子集合体は、ＥＰＲ (enhanced permeability and retention) 効果によりこれらの部位の組織へ集積するため、その集積性は血管病変部位の組織の種類によらない。本発明の蛍光プローブの投与ターゲットとしてはがんであることが好ましい。投与ターゲットとなりうるがんは多岐に亘る。例えば、肝臓がん、すい臓がん、肺がん、子宮頸がん、乳がん、大腸がんなどが挙げられる。
【０１１２】
［４−２．投与］
生体内への投与の方法としては特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。従って、投与の方法としては、全身投与及び局所投与とを問わない。すなわち、分子プローブの投与は、注射（針有型、針無型）、内服、外用のいずれの方法によっても行うことができる。
【０１１３】
本発明の分子集合体は、必須構成要素である分岐型両親媒性ブロックポリマーＡの分岐構造により、粒子表面にサルコシン鎖の稠密なポリマーブラシ構造を有する。このため、従来のラクトソームに比べて、粒子の疎水性部位の外部環境への露出が少なくなり、粒子外部環境による異物認識が抑制されると考えられる。本発明の分子集合体は、このことに起因するとみられるＡＢＣ現象の減弱化を可能にする。これにより、本発明の分子集合体は、複数回の投与が可能である。例えば、同一個体に２回以上必要回数（例えば２〜１０回）を行ってよい。また、投与スパンは例えば１〜６０日とすることができる。
【０１１４】
本発明の分子集合体は、前記両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）の立体化学と、前記機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＡ）の立体化学が異ならしめられている。このことにより、前記ポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）と前記ポリ乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＡ）とが互いにステレオコンプレックスを形成し、３０ｎｍ未満の小さい粒径でありながらも、分子集合体の安定性が保たれる。また、前記ポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）と、前記ポリ乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＡ）とは互いに異なるヘリックス構造をとると考えられ、前記ポリ乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＡ）に結合している疎水性の機能性部位が、コア／シェル構造の分子集合体の疎水性内部に保持されやすく、さらに安定性が増すものと考えられる。これらの作用により、分子集合体が標的の癌部位に送達されてから、分子集合体に内包させる標識剤(シグナル剤)や薬剤は、標的部位で長い時間にわたって保持され得る。従って、小さな病変部位にまで到達し且つより長い薬剤の効果が期待できる。
【０１１５】
［４−３．分子集合体の検出］
本発明の分子イメージングにおいては、投与された分子集合体に由来するシグナルを検出する工程を含む。投与された分子集合体を検出することによって、体外から投与ターゲットの様子（特にがんなどの組織の位置・大きさ）を観測することができる。
【０１１６】
検出方法としては、投与された分子集合体を可視化させることができるあらゆる手段を用いることができる。当該手段としては、分子集合体が有するシグナル基又はシグナル物質の種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。
【０１１７】
投与から検出開始までの時間は、分子集合体の粒子径が従来法におけるものと同様である場合は、投与される分子集合体が有する機能性物質Ｆの種類、及び投与ターゲットの種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。例えば、投与後１〜２４時間とすることができる。上記範囲を下回ると、シグナルが強すぎ、投与ターゲットと他の部位（バックグラウンド）とを明確に分けることができない傾向にある。また、上記範囲を上回ると、分子集合体が投与ターゲットから排泄されてしまう傾向にある。
【０１１８】
一方、本発明の分子集合体は、必須構成要素である分岐型両親媒性ブロックポリマーＡの分岐構造、及び前記分岐型両親媒性ブロックポリマーＡのポリ乳酸鎖（Ａ−ＰＬＡ）と前記機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖（Ｆ−ＰＬＡ）の立体化学の特定組み合わせにより粒子としての安定性に優れ、従来では不可能であった小粒子径の分子集合体の調製が可能である。粒子径の小さい分子集合体を生体に投与した際、ＥＰＲ効果によるターゲット組織への分子集合体の集積速度の加速化、及び腎臓による分子集合体の対外排出の加速化が可能になる。このため、分子集合体の粒子径が従来法におけるものより小さい場合、投与から検出開始までの時間を、従来の方法に比べて短くすることが可能である。例えば、１〜２４時間好ましくは１〜９時間とすることができる。本発明においては、分子集合体の粒子径の小型化を可能にしたため、血中投与後短時間の間に、腫瘍部位とバックグラウンドとのコントラスト比が向上し、短時間での癌疾部位選択的なイメージングが可能になる。
【０１１９】
なお、分子集合体の検出は、正確性の観点から、生体の一方向からではなく、複数の方向からの測定によって行うことが好ましい。具体的には、少なくとも３方向、より好ましくは少なくとも５方向からの測定を行うと良い。５方向からの測定を行う場合は、例えば、左右両腹側から、左右両体側から、及び背中側からの測定を行うことができる。
【実施例】
【０１２０】
以下に本発明をより詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。【０１２１】
［合成例１：分岐型両親媒性ブロックポリマーの合成］
本実施例においては、１本のポリ乳酸（Ｌ−ポリ乳酸；ＰＬＬＡ）鎖に３本のポリサルコシン（ＰＳａｒ）鎖が結合した分岐型両親媒性ブロックポリマーの合成を行った。【０１２２】
【化４】
2014038558.tif 000006
【０１２３】
概略として、まず、リンカー試薬の合成を行った。リンカー試薬は、PLLA重合の開始剤となるアミノ基１つと、サルコシン部位のNCA（N-carboxy anhydride）重合法のための開始剤となる水酸基３つとを有するトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）１から合成した。さらに、Tris１のアミノ基及び水酸基を必要に応じて脱保護することができるように、適切な保護基を付加した。具体的には、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（EEDQ）存在下、N‐tert‐ブトキシカルボニルグリシン（Boc-Gly-OH）を用い、Boc基を有する保護基でアミノ基が保護された化合物２を得て、さらに、ジクロロジシアノベンゾキノン（DDQ）及びジメチルアミノピリジン（DMAP）存在下、ベンジルオキシカルボニルサルコシン（Cbz-Sar-OH）を用い、Cbz基を有する保護基で水酸基が保護された化合物３をリンカー試薬として得た。HCl-Dioxaneを用いてリンカー試薬３のBoc基のみを選択的に脱保護することアミノ基含有化合物４を得た。
具体的な合成手順は以下の通りである。【０１２４】
［化合物２］
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン 1.9 g（0.016 mol）のEtOH溶液（75 mL）にBoc-glycine 2.5 g（0.014 mol）とEEDQ 6.0 g（0.024 mol）とを加え、リフラックス（95℃）しながら4.5時間撹拌した。反応終了後、濾紙で沈殿物を取り除き、EtOHを減圧留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製を行った（溶離液は、CHCl3/MeOH混合比（v/v）が1/0、40/1、及び10/1のものの順に用いた）。得られた生成物２の重量は3.2 g（0.012 mol）、収率82%であった。【０１２５】
［化合物３］
化合物２（278 mg, 1.0 mmol）、Cbz-Sar-OH（804 mg, 3.6 mmol）、DCC（887 mg, 4.3mmol）、及びDMAP（26 mg, 0.21 mmol）の混合物に氷冷したジクロロメタンを10 mL加えた後、室温にて一晩撹拌した。反応終了後、酢酸エチルにて洗浄し、白色沈殿（ウレア）を除去した後、シリカゲルクロマトグラフィーにて精製を行った（溶離液は、n-ヘキサン/酢酸エチル混合比（v/v）が2/1、1/1、及び1/2のものの順に用いた）。これにより、目的とする化合物３（719 mg）を収率84%で得た。【０１２６】
［化合物４］
氷冷した化合物３（710 mg）に4 mol/L HCl/Dioxane（7.0 mL）を加えて溶解させた後、室温で5分撹拌した。その後、反応溶液から溶媒を減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィーにて精製を行った（溶離液は、CHCl3/MeOH混合比（v/v）が10/0のものを用いた）。
得られた白色沈殿をクロロホルムに溶解させ、1N NaOH水溶液と分液操作をすることによって、末端アミノ基のHCl塩の脱塩操作を行った。引き続き、無水硫酸マグネシウムにて脱水し、セライト濾過によって硫酸マグネシウムを除去することで化合物４を得た。【０１２７】
【化５】
2014038558.tif 000007
【０１２８】
次に、アミノ基含有化合物４を開始剤とし、ラクチド５を重合反応に供することによって、PLLA鎖の合成を行い、化合物６を得た。化合物６の残りの保護基であるCbz基を、HBr-AcOHで脱保護すると同時にPLLA末端の水酸基をアセチル基で保護した。化合物７における3つのアミノ基を開始剤として、サルコシン−ＮＣＡをN-カルボキシ無水物重合反応に供することによって、PS鎖の合成を行い、化合物８を得た。さらに、化合物８に、グリコール酸、Ｏ−（ベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（HATU）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）を加えてカルボキシル基を導入し、分岐型両親媒性ブロックポリマー９を得た。なお、式中、重合数の表記を省略している。
具体的な合成手順は以下の通りである。【０１２９】
［化合物６］
開始剤４（485 mg, 0.61 mmol）の溶解したDMF溶液（2 mL）に開始剤に対して15当量（1.32 g, 9.2 mmol）のL-lactide（５）とDMAP（75 mg, 0.61 mmol）とを加えた後、アルゴン雰囲気下中、55℃にて一晩（約15時間）撹拌した。減圧留去によって反応溶媒であるDMFをある程度除去、濃縮した後、冷MeOH中に滴下した。得られた白色沈殿を遠心分離することによって回収することで、化合物６を得た。【０１３０】
［化合物７］
化合物６をジクロロメタン10 mLに溶解させ、反応溶液を0 ℃に冷却した後、25% HBr-AcOHを20 mL加えた。室温で一晩撹拌した後、溶媒を減圧留去し、得られた白色沈殿についてNMR測定を行うことによって、Cbz基の脱保護が完了していることを確認した。
得られた白色沈殿をクロロホルムに溶解させ、1N NaOH水溶液と分液操作をすることによって、末端アミノ基のHBr塩の脱塩操作を行った。引き続き、無水硫酸マグネシウムにて脱水し、セライト濾過によって硫酸マグネシウムを除去することで化合物７を得た。【０１３１】
［化合物８及び９］
化合物７をマクロイニシエーターとして親水性部位の重合反応を行った。化合物７のDMF溶液に、開始剤に対して40又は60当量のSar-NCAを加えた後、Sar-NCA濃度が0.50 Mとなるように調整した。室温にて24時間撹拌し化合物８を得た後、グリコール酸とHATU及びDIEAとをそれぞれ加え、更に24時間撹拌した。反応終了後、サイズ排除クロマトグラフィー（Sephadex LH20, 溶離液：DMF）を用いて濃縮した反応溶液を精製し、目的の両親媒性ブロックポリマー９を得た。【０１３２】
得られた両親媒性ブロックポリマー９の1H NMR測定結果を図１に示す。図１より、本合成で得られた分岐型両親媒性ブロックポリマーの組成は、PLLA鎖が乳酸単位３０個、PSar鎖一本あたりのサルコシン単位３４個であると同定した。この両親媒性ブロックポリマーはPLLA30-(Psar34)3と表記される。ただし、平均重合度である。【０１３３】
［合成例２：ＺポリＬ−乳酸（Ｚ−ＰＬＬＡ）の合成］
Ｌ−ラクチド（１１）とＮ−カルボベンゾキシ−１，２−ジアミノエタン塩酸塩（１２）とを用いて、ＺポリL-乳酸（Ｚ−ＰＬＬＡ）を合成した。【０１３４】
【化６】
2014038558.tif 000008
【０１３５】
重合開始剤であるＮ−カルボベンゾキシ−１，２−ジアミノエタン塩酸塩（１２）（400 mg, 2.06 mmol）に、オクタン酸スズ（22.25 mg）をトルエン（1.0 ｍL）に拡散させたものを加えた。トルエンを減圧留去した後、Ｌ−ラクチド（１1）（4.45 g, 30.9 mmol）を加え、Ar雰囲気下、120 ℃にて重合反応を行った。8時間後、反応容器を室温に空冷した。得られた黄白色固体を少量のジメチルホルムアミド（10 mL程度）に溶解し、LH20カラムで精製した。270nmの吸収があるフラクションを回収し濃縮後、濃縮液をクロロホルムに溶解した。クロロホルム溶液を冷メタノール（100 mL）に滴下することにより白色沈殿を得た。得られた白色沈殿は遠心分離により回収し、減圧乾燥することにより、ＺポリＬ−乳酸Ｚ−ＰＬＬＡ30を得た。【０１３６】
［合成例３：ＺポリＤ−乳酸（Ｚ−ＰＤＬＡ）の合成］
Ｌ−ラクチド（１１）の代わりに、Ｄ−ラクチド（１０）を用いたこと以外は、上記Ｚ−ＰＬＬＡの合成と同じ方法によって、ＺポリＤ−乳酸（Ｚ−ＰＤＬＡ30）を得た。
【化７】
2014038558.tif 000009
【０１３７】
［合成例４：アミノ化ポリＬ−乳酸（ａ−ＰＬＬＡ）の合成］
Ｌ−ラクチド（１１）とＮ−カルボベンゾキシ−１，２−ジアミノエタン塩酸塩（１２）とを用いて、アミノ化ポリＬ−乳酸（ａ−ＰＬＬＡ）を合成した。【０１３８】
【化８】
2014038558.tif 000010
【０１３９】
重合開始剤であるＮ−カルボベンゾキシ−１，２−ジアミノエタン塩酸塩（１２）（310 mg, 1.60 mmol）に、オクタン酸スズ（6.91 mg）をトルエン（1.0 ｍL）に拡散させたものを加えた。トルエンを減圧留去した後、Ｌ−ラクチド（１１）（3.45 g, 24 mmol）を加え、Ar雰囲気下、120 ℃にて重合反応を行った。12時間後、反応容器を室温に空冷した。得られた黄白色固体を少量のクロロホルム（10 mL程度）に溶解させた。クロロホルムを冷メタノール（100 mL）に滴下することにより白色沈殿を得た。得られた白色沈殿は遠心分離により回収し、減圧乾燥した。【０１４０】
得られた白色沈殿（500 mg）のジクロロメタン(1 ml)溶液に25v/v%臭化水素／酢酸（2.0 mL）を加え、遮光、乾燥空気下にて2時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を冷メタノール（100 mL）に滴下し、析出してきた沈殿を遠心分離にて回収した。得られた白色沈殿はクロロホルムに溶解させた後、飽和NaHCO3水溶液にて洗浄し、無水MgSO4にて脱水操作を行った。セライト(R)濾過によりMgSO4を除去した後、真空乾燥することにより、白色のアモルファス状粉末のａ−ＰＬＬＡ（440 mg）を得た。なお、乳酸単位数は、平均重合度である。【０１４１】
［合成例５：ＩＣＧ標識ポリＬ−乳酸（ＩＣＧ−ＰＬＬＡ）の合成］
アミノ化ポリＬ−乳酸（ａ−ＰＬＬＡ）にＩＣＧ標識を行い、ＩＣＧ標識ポリＬ−乳酸（ＩＣＧ−ＰＬＬＡ）を得た。具体的には、ａ−ＰＬＬＡを1.9 mg (1.0 eq)含むＤＭＦ溶液に、インドシアニングリーン誘導体（ICG-sulfo-OSu）1mg (1.3 eq)を溶かしたＤＭＦ溶液を加え、室温で約20時間攪拌した。その後、溶媒を減圧留去し、LH20カラムにて精製を行い、ＩＣＧ標識ポリＬ−乳酸ＩＣＧ−ＰＬＬＡを得た。【０１４２】
【化９】
2014038558.tif 000011
【０１４３】
［合成例６：アミノ化ポリＤ−乳酸（ａ−ＰＤＬＡ）の合成］
合成例４におけるＬ−ラクチド（１１）の代わりにＤ−ラクチドを用いた以外は合成例４と同様にして、アミノ化ポリＤ−乳酸（ａ−ＰＤＬＡ）を合成した。【０１４４】
［合成例７：ＩＣＧ標識ポリＤ−乳酸（ＩＣＧ−ＰＤＬＡ）の合成］
合成例５におけるアミノ化ポリＬ−乳酸（ａ−ＰＬＬＡ）の代わりにアミノ化ポリＤ−乳酸（ａ−ＰＤＬＡ）を用いた以外は合成例５と同様にして、ＩＣＧ標識ポリＤ−乳酸ＩＣＧ−ＰＤＬＡを得た。【０１４５】
【化１０】
2014038558.tif 000012
【０１４６】
［合成例８：アミノ化ポリＤＬ−乳酸（ａ−ＰＤＬＬＡ）の合成］
合成例４におけるＬ−ラクチド（１１）の代わりにＤＬ−ラクチド（メソラクチド）を用いた以外は合成例４と同様にして、アミノ化ポリＤＬ−乳酸（ａ−ＰＤＬＬＡ）を合成した。【０１４７】
［合成例９：ＩＣＧ標識ポリＤ−乳酸（ＩＣＧ−ＰＤＬＬＡ）の合成］
合成例５におけるアミノ化ポリＬ−乳酸（ａ−ＰＬＬＡ）の代わりにアミノ化ポリＤＬ−乳酸（ａ−ＰＤＬＬＡ）を用いた以外は合成例５と同様にして、ＩＣＧ標識ポリＤＬ−乳酸ＩＣＧ−ＰＤＬＬＡを得た。【０１４８】
［実験例１：分子集合体ラクトソームの調製法］
分岐型両親媒性ブロックポリマーとして、PLLA鎖が乳酸単位３０個、Psar鎖一本あたりのサルコシン単位２３個のもの [PLLA30-(Psar23)3] を用いた。【０１４９】
ガラス試験管にPLLA30-(Psar23)3 (MW=7405) 2〜3 mgを秤量し、クロロホルム0.5 mlに溶解し、溶媒を減圧下留去し、ガラス壁面にフィルムを形成させた。得られたフィルムに超純水を2 ml加え、85℃の湯浴中で20分間加温処理を行うことにより粒子化を行った。このようにして、分岐型両親媒性ブロックポリマーPLLA30-(Psar23)3のみからなるラクトソーム粒子の分散液を得た。【０１５０】
［実験例２：ポリ乳酸添加によるラクトソームの粒子径変化］
分岐型両親媒性ブロックポリマーPLLA30-(Psar23)3と共に、所定量のＺポリＬ−乳酸 (Ｚ−ＰＬＬＡ30) 、又はＺポリＤ−乳酸 (Ｚ−ＰＤＬＡ30) をクロロホルムに溶解した以外は、上記実験例１と同様にして粒子化を行った。このようにして、各立体化学の異なるＺポリ乳酸添加ラクトソーム粒子の分散液を得た。【０１５１】
分岐型両親媒性ブロックポリマーPLLA30-(Psar23)3に対するＺポリＬ−乳酸 (Ｚ−ＰＬＬＡ30)の添加量を、それぞれ０、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、又は１５０ｍｏｌ％とした。得られた各ラクトソーム粒子の粒子径を動的光散乱測定装置（Malvern Instruments 社製、Zetasizer Nano）を用いて、動的散乱法（DLS）によって測定した。得られたラクトソーム粒子の粒子径を、図２に示す。図２において、縦軸は粒子径 [(Diameter (nm)]、横軸はZ-PLLA30の添加量(mol%）を示す。PLLA30-(Psar23)3に対して、同じ立体化学を有するZ-PLLA30を添加すると、添加量が増えるにしたがって、粒子径も大きくなった。Z-PLLA30の添加量が１００ｍｏｌ％を超えると、粒子径は３０ｎｍを超えるようになった。【０１５２】
[Z-PLLA30の添加量]    [粒子径]
０  ｍｏｌ％      ２０ｎｍ
１５  ｍｏｌ％      ２０ｎｍ
２５  ｍｏｌ％      ２１ｎｍ
５０  ｍｏｌ％      ２４ｎｍ
７５  ｍｏｌ％      ２７ｎｍ
１００  ｍｏｌ％      ３０ｎｍ
１２５  ｍｏｌ％      ３３ｎｍ
１５０  ｍｏｌ％      ３８ｎｍ【０１５３】
分岐型両親媒性ブロックポリマーPLLA30-(Psar23)3に対するＺポリＤ−乳酸 (Ｚ−ＰＤＬＡ30)の添加量を０、２．５、５、１０、１５、２０ｍｏｌ％とした。得られたラクトソーム粒子の粒子径を、図３に示す。図３において、縦軸は粒子径 [(Diameter (nm)]、横軸はZ-PDLA30の添加量(mol%）を示す。PLLA30-(Psar23)3に対して、異なる立体化学を有するZ-PDLA30を２０ｍｏｌ％まで添加しても、添加量が増えるにしたがって、粒子径は２３ｎｍまでしか大きくならなかった。このように、小さな粒子径が維持されることが分かった。【０１５４】
[Z-PDLA30の添加量]    [粒子径]
０  ｍｏｌ％      １７ｎｍ
２．５  ｍｏｌ％      １８ｎｍ
５  ｍｏｌ％      １９ｎｍ
１０  ｍｏｌ％      ２１ｎｍ
１５  ｍｏｌ％      ２２ｎｍ
２０  ｍｏｌ％      ２３ｎｍ【０１５５】
［実験例３：ＩＣＧ標識ポリ乳酸添加によるラクトソームの体内動態評価］
分岐型両親媒性ブロックポリマーPLLA30-(Psar23)3と共に、PLLA30-(Psar23)3に対して１．５ｍｏｌ％の上記各ＩＣＧ標識ポリ乳酸（ＩＣＧ−ＰＬＬＡ，ＩＣＧ−ＰＤＬＡ，ＩＣＧ−ＰＤＬＬＡ）をクロロホルムに溶解した以外は、上記実験例１と同様にして粒子化を行った。得られたラクトソーム分散液はゲルろ過（ＰＤ−１０カラム、ＧＥヘルスケア）により生理食塩水に置換した。このようにして、立体化学の異なる各ＩＣＧ標識ポリ乳酸内包ラクトソーム粒子の分散液を調製した。いずれのラクトソーム粒子の粒子径も２２ｎｍであった。【０１５６】
本実験例で得られた各ＩＣＧ標識ポリ乳酸内包ラクトソーム粒子を用い、担癌マウス（右下肢、皮下移植）のin vivo蛍光イメージングを行った。【０１５７】
動物は、Balb/c nu/nu mice (クレア) ７週齢を用い、ヒトすい臓がん細胞(Suit2)を、マウスの右下肢に5×105個/0.02 ml皮下移植した。2週間後にがん組織が3〜7 mmに成長した時点で、マウスを下記造影試験に供した。【０１５８】
上記担がんマウスをイソフルランにより麻酔し、各ＩＣＧ標識ポリ乳酸（ＩＣＧ−ＰＬＬＡ，ＩＣＧ−ＰＤＬＡ，ＩＣＧ−ＰＤＬＬＡ）内包ラクトソーム粒子を、担がんマウスに1匹あたりICG濃度で0.2 nmol投与し、経時的にICGの蛍光強度を観察した。撮影は、全身を５方向、すなわち、マウスの左腹、左体側、背中、右体側及び右腹の全ての方向から行った。蛍光剤は785nmで励起して、845nm付近の蛍光を経時的に測定した。【０１５９】
その結果得られた画像を図４に示す。画像は上から順番にICG標識ラクトソーム投与後、1時間から168時間後までの測定結果を示し、左から順番にラクトソームに対してそれぞれICG-PLLA、ICG-PDLA、ICG-PDLLAを内包したICG標識ラクトソームの測定結果を示す。図４においては、蛍光強度の違い(強弱)を、色調の変化として示している。【０１６０】
測定の結果から、すべてのICG標識ラクトソームで右下肢の腫瘍への集積が観察された。腫瘍（Tumor）、背中（Background）、及び肝臓(Liver)の蛍光強度（Fluorescence intensity）の経時変化を解析した結果を図５、６、７に示す。各図において、縦軸は蛍光強度（Fluorescence intensity）、横軸は時間（Time(H)）を示す。腫瘍への集積極大時間は、ICG-PLLAもしくはICG-PDLLAを内包した場合が投与9時間後であるのに対して、ICG-PDLAを内包した場合は腫瘍への集積極大時間が24時間後であった。この結果から、ICG-PDLAを内包した場合は、腫瘍での保持時間が長くなっていると考えられる。また、バックグラウンドの蛍光強度は投与2時間後から48時間後の間でICG-PDLLAを内包した場合の蛍光強度が、ICG-PLLAもしくはICG-PDLAを内包した場合と比較して低く、肝臓の蛍光強度は投与6時間後から168時間後の間で同様にICG-PDLLAを内包した場合の蛍光強度が低かった。この結果から、ICG-PDLLAを内包した場合は、体外への排泄速度が早くなっていると考えられる。ICG-PDLLAはより短時間でのイメージングに適している。【０１６１】
腫瘍とバックグラウンドの蛍光強度比(Tumor/Background)を解析した結果を図８に示す。図８において、縦軸は蛍光強度比(Fluorescence intensity ratio of Tumor/Background）、横軸は時間（Time(H)）を示す。この結果から、ICG標識ラクトソーム投与24時間後では、ICG-PDLLAを内包した場合のT/Bが最も高く5.9であった。また、ICG標識ラクトソーム投与72時間後では、ICG-PDLAを内包した場合のT/Bが最も高く5.5であった。ICG-PDLAを内包した場合に、長い時間後においてはT/Bコントラストが高い結果であった。
【図２】
2014038558.tif 000014
【図３】
2014038558.tif 000015
【図５】
2014038558.tif 000016
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年1月13日(2015.1.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルコシンを含む分岐した親水性ブロックと、ポリ乳酸鎖を有する疎水性ブロックとを有する分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ、及び
機能性部位とポリ乳酸鎖とを有する機能性物質Ｆ、
を含む分子集合体であって、
前記両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖がＬ−乳酸単位から構成され、前記機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖がＤ−乳酸単位から構成されているか、又は、
前記両親媒性ブロックポリマーＡの疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖がＤ−乳酸単位から構成され、前記機能性物質Ｆに含まれるポリ乳酸鎖がＬ−乳酸単位から構成されている、分子集合体。
【請求項２】
前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位の合計が２〜２００個である、請求項１に記載の分子集合体。
【請求項３】
前記親水性ブロックの分岐数が３である、請求項１又は２に記載の分子集合体。
【請求項４】
前記疎水性ブロックを構成するポリ乳酸鎖を構成する乳酸単位が１０〜４００個である、請求項１〜３のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項５】
前記疎水性ブロックは分岐していない、請求項１〜４のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項６】
前記複数の親水性ブロックが、前記疎水性ブロックにおける前記ポリ乳酸鎖を含む分子鎖における１つの炭素原子から分岐している、請求項５に記載の分子集合体。
【請求項７】
前記両親媒性ブロックポリマーＡは、下記式（Ｉ）：
【化１】
2014038558.tif 000022
（式中、ｎ１、ｎ２及びｎ３は、それらの合計が３〜２００となる数、ｍは１５〜６０の数を表し、Ｒは、水素原子又は有機基を表す。）
で示される構造を有する、請求項６に記載の分子集合体。
【請求項８】
前記両親媒性ブロックポリマーＡにおいて、前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位数の合計の、前記疎水性ブロックに含まれる乳酸単位数の合計に対する比が、０．０５以上１．８未満である、請求項１〜７のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項９】
前記機能性物質Ｆにおける機能性部位は、シグナル剤及び薬剤からなる群から選ばれる部位である、請求項１〜８のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項１０】
前記機能性物質Ｆは、前記両親媒性ブロックポリマーＡを基準として、２０ｍｏｌ％以下の量で含まれている、請求項１〜９のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項１１】
粒子径が１０〜３０ｎｍである、請求項１〜１０のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項１２】
以下の工程：
容器中に、前記分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ及び前記機能性物質Ｆを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液から前記有機溶媒を除去し、前記容器の内壁に前記分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ及び前記機能性物質Ｆを含むフィルムを得る工程、及び
前記容器中に水又は水溶液を加え、超音波処理を行い、前記フィルムを分子集合体に変換して分子集合体の分散液を得る工程、
を含む調製方法によって得られたものである、請求項１〜１１のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項１３】
以下の工程：
容器中に、前記分岐型両親媒性ブロックポリマーＡ及び前記機能性物質Ｆを有機溶媒中に含む溶液を用意する工程、
前記溶液を水又は水溶液中に分散させる工程、及び
前記有機溶媒を除去する工程、
を含む調製方法によって得られたものである、請求項１〜１１のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の分子集合体を分子プローブとして非ヒト動物内に投与することを含む、薬剤搬送方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
（１４）  上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の分子集合体を分子プローブとして非ヒト動物内に投与することを含む、薬剤搬送方法。
【国際調査報告】
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2014038558.tif 000024
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