(57)【要約】  本発明は、抗原抗体反応にみられるような交差反応を排除し、多能性幹細胞を効率よく厳密に評価・選別するための、新たな方法を提供する。本発明は、１つの細胞試料から、細胞表面のＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖、ＧＳＬ、ＧＡＧ、およびＦＯＳをグライコブロッティング法またはＢＥＰ法により分離、精製し、これら糖鎖の総合的な定量・定性的解析をMALDI-TOF/MSにより行うことによって、多能性幹細胞に特異的な糖鎖マーカーを決定し、これらの糖鎖マーカーを多能性細胞の判定に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の分化状態を判定する方法であって、
以下のＡ群〜Ｅ群：
Ａ群：ハイマンノース型糖鎖、ハイブリッド型糖鎖、コンプレックス型糖鎖からなる群から選択されるＮ−結合型糖鎖
Ｂ群：（ネオ）ラクト系列、グロボ系列およびガングリオ系列からなる群から選択されるスフィンゴ糖脂質
Ｃ群：（Ｍａｎ）ｎ（ＧｌｃＮＡｃ）２型、（Ｍａｎ）ｎ（ＧｌｃＮＡｃ）１型からなる群から選択される遊離オリゴ糖
Ｄ群：ＣＳ（△ＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ）から選択されるコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸、ＨＳ（△ＵＡβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）から選択されるヘパラン硫酸、およびＨＡ（△ＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）から選択されるヒアルロン酸構成２糖からなる群から選択されるグリサミノグリカン
Ｅ群：（ＮｅｕＡｃ）ｎ（ＨｅｘＮＡｃ）ｎ（Ｆｕｃ）ｎ（Ｈｅｘ）ｎ（ＧａｌＮＡｃ）１からなる群から選択されるＯ−結合型糖鎖
から選択される少なくとも１つの糖鎖について、被験細胞における該糖鎖の量を測定するステップと、該量を多能性幹細胞以外の細胞における該糖鎖の量と比較するステップを含んでなる、方法。
【請求項２】
前記Ａ群〜Ｅ群がそれぞれ以下の糖鎖：
Ａ群：
【表１】
2013186946.tif 000025
【表２】
2013186946.tif 000026
Ｂ群
【表３】
2013186946.tif 000027
【表４】
2013186946.tif 000028
Ｃ群
【表５】
2013186946.tif 000029
Ｄ群
【表６】
2013186946.tif 000030
Ｅ群
【表７】
2013186946.tif 000031
からなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記Ａ群〜Ｅ群がそれぞれ以下の糖鎖：
Ａ群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１（ＮｅｕＧｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（ＮｅｕＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
Ｂ群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
Ｃ群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
Ｄ群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ、
ＨＳ−ＮＳ
Ｅ群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）２
からなる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
被験細胞からＮ−結合型糖鎖画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ａ群から選択される糖鎖の量を測定する、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
被験細胞からスフィンゴ糖脂質画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ｂ群から選択される糖鎖の量を測定する、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項６】
被験細胞から遊離オリゴ糖画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ｃ群から選択される糖鎖の量を測定する、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項７】
被験細胞からグリサミノグリカン画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ｄ群から選択される糖鎖の量を測定する、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項８】
被験細胞からＯ−結合型糖鎖画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ｅ群から選択される糖鎖の量を測定する、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項９】
前記画分をグライコブロッティング法により分離および精製する、請求項４〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記糖鎖の量の測定をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより行う、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
多能性幹細胞がＥＳ細胞である、請求項１〜１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、請求項１〜１０のいずれか記載の方法。
【請求項１３】
多能性幹細胞がヒト由来である、請求項１〜１２のいずれか記載の方法。
【請求項１４】
前記被検細胞におけるＮ−結合型糖鎖のうち、複数のフコース残基を有する糖鎖、バイセクト型もしくはＬａｃｄｉＮＡｃ型もしくは多分岐型糖鎖の量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して増大している、または分解型糖鎖もしくは３シアリル化３分岐糖鎖の量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して減少しているとき、該被検細胞は多能性細胞であると判定される、請求項１〜１３のいずれか記載の方法。
【請求項１５】
複数のフコース残基を有する糖鎖が
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１（ＮｅｕＧｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
であり、
バイセクト型またはＬａｃｄｉＮＡｃ型または多分岐型糖鎖が
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
であり、
分解型糖鎖が
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、または
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１
であり、
３シアリル化３分岐糖鎖が
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（ＮｅｕＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
である、（１４）に記載の方法。
【請求項１６】
前記被検細胞におけるＧＳＬのうち、（Ｈｅｘ）３、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２の量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して増大しているとき、該被検細胞は多能性細胞であると判定される、請求項１〜１３のいずれか記載の方法。
【請求項１７】
前記被検細胞におけるＦＯＳのうち、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２の量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して減少しているとき、またはＦＯＳとＮ−結合型糖鎖の相対的量比（ＦＯＳ／Ｎ−結合型糖鎖）が２．０％以下のとき該被検細胞は多能性細胞であると判定される、請求項１〜１３のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
前記被検細胞におけるＧＡＧのうち、ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、ＣＳ−０Ｓ、ＨＳ−６Ｓ、ＣＳ−２Ｓ、ＣＳ−４Ｓ、ＨＳ−ＮＳ、ＨＳ−０Ｓ、ＨＡの量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して増大しているとき、該被検細胞は多能性細胞であると判定される、請求項１〜１３のいずれか記載の方法。
【請求項１９】
前記被検細胞におけるＯ−結合型糖鎖のうち、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、（ＨｅｘＮＡｃ）２の量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して増大しているとき、該被検細胞は多能性細胞であると判定される、請求項１〜１３のいずれか記載の方法。
【請求項２０】
多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
【表８】
2013186946.tif 000032
【表９】
2013186946.tif 000033
【表１０】
2013186946.tif 000034
【表１１】
2013186946.tif 000035
【表１２】
2013186946.tif 000036
【表１３】
2013186946.tif 000037
【表１４】
2013186946.tif 000038
から選択される糖鎖の使用。
【請求項２１】
多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
Ａ群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１（ＮｅｕＧｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（ＮｅｕＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
Ｂ群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
Ｃ群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２
Ｄ群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ、
ＨＳ−ＮＳ、
Ｅ群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）２
から選択される糖鎖の使用。
【請求項２２】
多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
Ａ’群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１（ＮｅｕＧｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（ＮｅｕＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
Ｂ’群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
Ｃ’群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
Ｄ’群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ、
ＨＳ−ＮＳ
から選択される糖鎖の使用。
【請求項２３】
多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
Ａ”群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（ＮｅｕＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
Ｂ”群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３、
Ｃ”群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
Ｄ”群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ、
ＨＳ−ＮＳ
から選択される糖鎖の使用。
【請求項２４】
多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
Ａ”’群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
Ｂ”’群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
Ｄ”’群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ
から選択される糖鎖の使用。
【請求項２５】
樹立したｉＰＳ細胞から多能性を有しない細胞を検出するための方法であって、以下からなる群：
Ｆ群：
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）３、
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ６Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
Ｇ群：
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２  ＋  （Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１  ＋  （Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）３、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２ＳＮＳ
から選択される少なくとも１つの糖鎖について、被験細胞における該糖鎖の量を測定するステップと、該量を正常ｉＰＳにおける該糖鎖の量と比較するステップを含んでなり、
該糖鎖がＦ群から選択される場合は被験細胞において該糖鎖が検出されないかまたは該正常ｉＰＳ細胞における糖鎖の量と比較して減少しているときに、
該糖鎖がＧ群から選択される場合は被験細胞において該糖鎖の量が該正常ｉＰＳ細胞における糖鎖の量と比較して増加しているときに、該被検細胞は多能性を有しない細胞であると判定される、方法。
【請求項２６】
樹立したｉＰＳ細胞から多能性を有しない細胞を検出するためのマーカーとしての、以下からなる群
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）３、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）３、
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ６Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２ＳＮＳ、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１および
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３
から選択される糖鎖の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の分化状態を評価する方法、具体的には、多能性幹細胞の分化状態を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
1998年にヒトＥＳ細胞が樹立され、最近、マウス及びヒトで繊維芽細胞、皮膚、胃、肝臓などの成体の体細胞から人工多能性幹細胞（iPS細胞）樹立を作成することが可能になった。これにより、再生医療や創薬への応用の期待がますますふくらみ、これらの幹細胞を利用した基礎及び応用研究開発が加速している。【０００３】
このような幹細胞研究の現状から、未分化状態の細胞を的確に評価し選別する技術が非常に重要になってきている。特に移植を最終目的とした組織再生技術においては、分化誘導に先立ち、完全な未分化状態の細胞のみを効率的に選別し、分離し、濃縮する技術が極めて重要である。また、ES細胞から様々な細胞を分化誘導するとどうしても一部に未分化な幹細胞が残存・混入してしまい、このような細胞が移植組織中で奇形腫などのガンを形成することが指摘されており、分化細胞中の未分化細胞を徹底的に除去する技術が安全な再生医療に不可欠であることが示唆されている。【０００４】
未分化ES細胞の選別方法のＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＰＥＣＡＭ−１を用いた選別方法（特許文献１）や、Ｐｓｂｐ遺伝子発現産物の検出による選別法（特許文献２）、Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＣＤ３０、Ｃｒｉｐｔｏなどに対する抗体を用いる方法（非特許文献１）などが種々の選択用マーカーとして提案されている。【０００５】
しかし、従来提案されている未分化ＥＳ細胞の選別方法で用いられる上記の各表面マーカーは、いずれも未分化細胞以外でも発現が確認されているものであるため、その評価・選別は不完全とならざるを得なかった。ES細胞のみで発現する厳密な意味での特異的選別マーカーは，少なくとも現在までは見出されておらず、未分化状態で発現する特異的選択マーカーの検出に基づく従来の選別方法では、未分化細胞を効率よく厳密に評価・選別することは難しかった（非特許文献２）。【０００６】
ところで、ＳＳＥＡ−１、３，４やＴＲＡ１−６０，ＴＲＡ１−８１をはじめとする未分化マーカーとして汎用されるマーカーの本体の多くが複合糖質であることが知られている。これらは、未分化細胞特異的な抗体が認識するエピトープを精査したらたまたま複合糖質であることが分かったものである。もし、複合糖質全般を標的にして細胞マーカー探索を行うことができれば、細胞マーカー探索のプロセスを高効率化することが期待できるが、複合糖質の解析は一般に難しいため、これまでそのアプローチをとることは非常に困難であった。【０００７】
また、実際に樹立された細胞のなかには「iPS化が不完全な」細胞株もあり、例えば、ヒト多能性幹細胞の未分化マーカーである上記TRA-1-60, TRA-1-81を発現しておらず、Nanogの発現量も非常に低いという性質を有するものも存在し得る。したがって、ヒトiPS細胞株を樹立する際には、このような「不完全な」コロニーを除去し、ES細胞と同等の性質を持つ、品質の良いiPS細胞のコロニーを選別して樹立を行う必要がある。【０００８】
細胞表面の糖鎖の解析には従来からレクチンや糖鎖特異的抗体による細胞染色法が汎用されてきた。しかし、レクチンや糖鎖抗原に対する抗体の反応は、構造の類似性により、古くから抗体による交差反応が報告され、抗原抗体反応による正確な糖鎖抗原の定量が問題になることがある（非特許文献３）。また、同じエピトープ構造を有する糖鎖が別のクラスの複合糖質に含まれる場合がある。例えば、ルイスX抗原（Ｌｅｘ）は複合型Ｎ−結合型糖鎖上にその構造がしばしば観測されるが、同時にスフィンゴ糖脂質上にも発現する場合がある。スフィンゴ糖脂質上に発現した場合、これはＳＳＥＡ−１（ＣＤ１５）とよばれる未分化マーカーとして広く知られる糖脂質となる。【０００９】
近年、多種のレクチンを固定化したレクチンマイクロアレイ上に細胞を播種し、未分化細胞を検出する方法が開発されている（非特許文献４−７）。これは未分化細胞に特徴的に発現している糖鎖構造をレクチンによって認識させ、蛍光検出する方法である。レクチンは糖鎖の結合様式をしばしば認識できる半面、１〜数残基程度の糖鎖の認識にとどまる他、認識された糖鎖が細胞表層のどの複合糖質由来か不明であり、クラスター効果などにより結合量が影響を受けることから定量が困難なうえ、交差反応の問題が残る。【００１０】
質量分析法等を用いた個別のクラス毎の複合糖質の解析は、上記の問題の幾つかを解決する。近年ヒトＥＳ細胞について、Ｎ−結合型糖鎖（非特許文献８、９）およびスフィンゴ糖脂質（非特許文献１０）の解析が行われ、そのプロファイルが発表された。しかし、絶対量に関する検討や考察はなく、構成する糖鎖の相対的な量比に関する知見に関してのみの報告である。また、ヒトＥＳ細胞のグリコサミノグリカン、Ｏ−結合型糖鎖の詳細な解析例は報告がなく、ｉＰＳ細胞に関してはいずれのクラスについても質量分析法による詳細な発現プロファイルはまだ報告されていない。【００１１】
細胞表面において異なるクラスの複合糖質は巧妙に配置されることによって、「細胞の顔」として細胞−細胞間、細胞−基質間との相互作用や情報伝達に機能を果たすと考えられており、また上述の通り、異なるクラスの複合糖質間でしばしば共通のエピトープを有することが知られている。また、あるクラスの糖鎖合成不全が他のクラスの複合糖質によって補償される例も知られていることから、細胞を的確に評価し、選別するようなマーカーを探索するためには、細胞に含まれる種々の複合糖質糖鎖を総合的に解析することが極めて有効なアプローチになると考えられる。しかし、細胞の各種複合糖質糖鎖の総合的な定量解析を行うことは技術的に困難であり、細胞の主要な複合糖質のクラスを超えた定量解析については、これまで報告がなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００４−３１３１８４号公報
【特許文献２】特開２００６−４２６６３号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Reubinoff B. E., Pera M. F., Fong C. Y., Trounson A. and Bongso A., Nature Biotechnology 18 (２000) 399
【非特許文献２】”The Cell Surface Glycosphingolipids SSEA-3 and SSEA-4 Are Not Essential for Human ESC Pluripotency” Sandii N. Brimble, Eric S. Sherrer, Elizabeth W. Uhl, Elaine Wang, Samuel Kelly, Alfred H. Merrill Jr., Allan J. Robins and Thomas C. Schulz. Stem Cells (２007) ２5, 54-6２
【非特許文献３】” New globoseries glycosphingolipids in human teratocarcinoma reactive with the monoclonal antibody directed to a developmentally regulated antigen, stage-specific embryonic antigen 3” Reiji Kannagi, Steven B. Levery, Fumitsugu Ishigami, Sen-itiroh Hakomori, Lynne H. Shevinsky, Barbara B. Knowlesll, Davor Solter. J. Biol. Chem. ２58, 8934-894２
【非特許文献４】”Lectin microarray analysis of pluripotent and multipotent stem cells” Masashi Toyoda, Mayu Yamazaki-Inoue, Yoko Itakura, Atsushi Kuno, Tomohisa Ogawa, Masao Yamada, Akutsu Hidenori, Yuji Takahashi, Seiichi Kanzaki, Hisashi Narimatsu, Jun Hirabayashi and Akihiro Umezawa Gene to Cells (２011) 16, 1-11.
【非特許文献５】”Differing lectin binding profiles among human embryonic stem cells and derivatives aid in the isolation of neural progenitor cells” Mahesh C. Dodla, Amber, Young, Alison Venable, Kowser Hanseen, Raj R. Rao, David W. Machacek, Steven L. Stice. PLoS One (２011) 6, e２3２66.
【非特許文献６】”Specific lectin biomarkers for isolation of human pluripotent stem cells identified through array-based glycomic analysis” Yu-Chieh Wang, Masato Nakagawa, Ibon Garitaonandia, Ileana Slavin, Gulsah Altun, Robert M. Lacharite, Kristopher L. Nazor, Ha T. Tran, Candace L. Lynch, Trevor R. Leonardo, Ying Liu, Suzanne E. Peterson, Louise C. Laurent, Shinya Yamanaka, Jeanne F. Loring. Cell Research (２011) ２1, 1551-1563.
【非特許文献７】”Glycome diagnosis of human induced pluripotent stem cells using lectin microarray” Hiroaki Tateno, Masashi Toyota, Shigeru Saito, Yasuko Onuma, Yuzuru Ito, Keiko Hiemori, Mihoko Fukumura, Asako Matsushima, Mio Nakanishi, Kiyoshi Ohnuma, Hidenori Akutsu, Akihiro Umezawa, Katsuhisa Horimoto, Jun Hirabayashi, Makoto Asashima. J. Biol. Chem. (２011) ２86, ２0345-２0353.
【非特許文献８】”The N-glycome of human embryonic stem cells” BMC Cell Biology, (２009) 10, 4２.
【非特許文献９】”Extensive determination of glycan heterogeneity reveals an unusual abundance of high mannose glycans in enriched plasma membranes of human embryonic stem cells.” An HJ, Gip P, Kim J, Wu S, Park KW, McVaugh CT, Schaffer DV, Bertozzi CR, Lebrilla CB. Mol Cell Proteomics. (２01２) 11, M111
【非特許文献１０】”Switching of the core structures of glycosphingolipids from globo- and lacto- to ganglio-series upon human embryonic stem cell differentiation.” Liang YJ, Kuo HH, Lin CH, Chen YY, Yang BC, Cheng YY, Yu AL, Khoo KH, Yu J. Proc Natl Acad Sci U S A. (２010) 107, ２２564-２２569.
【非特許文献１１】”A versatile method for analysis of serine/threonine posttranslational modifications by β-elimination in the presence of pyrazolone analogues.” Jun-ichi Furukawa, Naoki Fujitani, Kayo Araki, Yasuhiro Takegawa, Kota Kodama, Yasuro Shinohara. Anal. Chem. (２011) 83, 9060-9007.
【非特許文献１２】” Qualitative and Quantitative Cellular Glycomics of Glycosphingolipids Based on Rhodococcal EGCase -Assisted Glycan Cleavage, Glycoblotting-Assisted Sample Preparation and MALDI-TOF/TOF MS Analysis” Naoki Fujitani, Yasuhiro Takegawa, Yohei Ishibashi, Kayo Araki, Jun-ichi Furukawa, Susumu Mitsutake, Yasuyuki Igarashi, Makoto Ito and Yasuro Shinohara. J. Biol. Chem. (２011) ２86, 41669-41679.
【非特許文献１３】” Simultaneous analysis of heparan sulfate, chondroitin/dermatan sulfates and hyaluronan disaccharides by glycoblotting-assisted sample preparation followed by single-step ZIC-HILIC chromatography” Yasuhiro Takegawa, Kayo Araki, Naoki Fujitani, Jun-ichi Furukawa, H Sugiyama, H Sakai, Yasuro Shinohara. Anal. Chem. (２011) 83, 9443-9449.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、抗原抗体反応にみられるような交差反応を排除し、多能性幹細胞を効率よく厳密に評価・選別するための、新たな方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、細胞の主要な複合糖質として、Ｎ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖（非特許文献１１）、スフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）糖鎖（非特許文献１２）、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（非特許文献１３）に着目し、個々の絶対量を解析する方法を開発した。【００１６】
本発明では、細胞のＮ−結合型糖鎖、さらに細胞の遊離オリゴ糖（ＦＯＳ）について、新たに定量的な方法論を確立するとともに、個々のクラスの複合糖質糖鎖の解析法を統合し、１つの細胞試料から、タンパク質のＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖、ＧＳＬ、ＧＡＧ、およびＦＯＳを全て定量解析する手法を確立した。そして、これらの複合糖質の総合的な定量・定性的解析を行うことによって、多能性幹細胞に特異的に発現している新規な複合糖質を探索した。【００１７】
本発明の方法によれば、１ｘ１０4〜１ｘ１０６個程度からなる細胞ペレットから、細胞の個々のクラスの複合糖質糖鎖（Ｎ−結合型糖鎖、ＦＯＳ、ＧＳＬ、ＧＡＧおよびＯ−結合型糖鎖）をそれぞれ抽出し、これら個々のクラスの複合糖質糖鎖について、例えばＷＯ２００６／０３０５８４、ＷＯ２００７／１０８２０４およびＷＯ２００８／０１８１７０、Comprehensive approach to structural and functional glycomics based on chemoselective glycoblotting and sequential tag conversion” Jun-ichi Furukawa, Yasuro Shinohara, Hiromitsu Kuramoto, Yoshiaki Miura, Hideyuki Shimaoka, Masaki Kurogochi, Mika Nakano, Shin-ichiro Nishimura. (2008) Anal. Chem. 80, 1094-1101に記載のグライコブロッティング法やＢＥＰ法等（非特許文献１１）による糖鎖分析法を系統的に適用し、飛行時間質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ/ＴＯＦＭＳ）または液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるこれら複合糖質糖鎖の総合的な定量・定性的解析を行う。得られた全ての糖鎖の定量値を用いた多変量解析の１つであるクラスター解析により、細胞の分類を行うとともに、糖鎖のクラスター情報から未分化マーカーの探索を行う。【００１８】
本発明は、
（１）多能性幹細胞の分化状態を判定する方法であって、
以下のＡ群〜Ｅ群：
Ａ群：ハイマンノース型糖鎖、ハイブリッド型糖鎖、コンプレックス型糖鎖からなる群から選択されるＮ−結合型糖鎖
Ｂ群：（ネオ）ラクト系列、グロボ系列およびガングリオ系列からなる群から選択されるスフィンゴ糖脂質
Ｃ群：（Ｍａｎ）ｎ（ＧｌｃＮＡｃ）２型、（Ｍａｎ）ｎ（ＧｌｃＮＡｃ）１型からなる群から選択される遊離オリゴ糖
Ｄ群：ＣＳ（△ＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ）から選択されるコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸、ＨＳ（△ＵＡβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）から選択されるヘパラン硫酸、およびＨＡ（△ＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）から選択されるヒアルロン酸構成２糖からなる群から選択されるグリサミノグリカン
Ｅ群：（ＮｅｕＡｃ）ｎ（ＨｅｘＮＡｃ）ｎ（Ｆｕｃ）ｎ（Ｈｅｘ）ｎ（ＧａｌＮＡｃ）１からなる群から選択されるＯ−結合型糖鎖
から選択される少なくとも１つの糖鎖について、被験細胞における該糖鎖の量を測定するステップと、該量を多能性幹細胞以外の細胞における該糖鎖の量と比較するステップを含んでなる、方法；
（２）前記Ａ群〜Ｅ群がそれぞれ以下の糖鎖：
Ａ群：
【表１】
2013186946.tif 000002
【表２】
2013186946.tif 000003
Ｂ群
【表３】
2013186946.tif 000004
【表４】
2013186946.tif 000005
Ｃ群
【表５】
2013186946.tif 000006
Ｄ群
【表６】
2013186946.tif 000007
Ｅ群
【表７】
2013186946.tif 000008
からなる、（１）記載の方法；
（３）前記Ａ群〜Ｅ群がそれぞれ以下の糖鎖：
Ａ群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１（ＮｅｕＧｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（ＮｅｕＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
Ｂ群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１      （本明細書中「ＳＳＥＡ４」と記載することもある）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１      （本明細書中「Ｇｂ５，ＳＳＥＡ−３」と記載することもある）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （本明細書中「（Ｇｂ４」と記載することもある）、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （本明細書中「ＳＳＥＡ−１／５」と記載することもある）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （本明細書中「（ｎ）Ｌｃ４」と記載することもある）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、（本明細書中「ｄｉＦｕｃ−（ｎ）Ｌｃ４」と記載することもある）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （本明細書中「ｇｌｏｂｏ Ｈ」と記載することもある）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｇａｌ−（ｎ）Ｌｃ４）、
（Ｈｅｘ）３      （本明細書中「Ｇｂ３」と記載することもある）、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１      （本明細書中「Ｌｃ３」と記載することもある）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
Ｃ群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
Ｄ群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ
ＨＳ−ＮＳ、
Ｅ群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）２
からなる、（１）記載の方法；
（４）被験細胞からＮ−結合型糖鎖画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ａ群から選択される糖鎖の量を測定する、（１）〜（３）のいずれか記載の方法；
（５）被験細胞からスフィンゴ糖脂質画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ｂ群から選択される糖鎖の量を測定する、（１）〜（３）のいずれか記載の方法；
（６）被験細胞から遊離オリゴ糖画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ｃ群から選択される糖鎖の量を測定する、（１）〜（３）のいずれか記載の方法；
（７）被験細胞からグリサミノグリカン画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ｄ群から選択される糖鎖の量を測定する、（１）〜（３）のいずれか記載の方法；
（８）被験細胞からＯ−結合型糖鎖画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ｅ群から選択される糖鎖の量を測定する、（１）〜（３）のいずれか記載の方法；
（９）前記画分をグライコブロッティング法により分離および精製する、（４）〜（８）のいずれかに記載の方法；
（１０）前記糖鎖の量の測定をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより行う、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法；
（１１）多能性幹細胞がＥＳ細胞である、（１）〜（１０）のいずれか記載の方法；
（１２）多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、（１）〜（１０）のいずれか記載の方法；
（１３）多能性幹細胞がヒト由来である、（１）〜（１２）のいずれか記載の方法；
（１４）前記被検細胞におけるＮ−結合型糖鎖のうち、複数のフコース残基を有する糖鎖、バイセクト型もしくはＬａｃｄｉＮＡｃ型もしくは多分岐型糖鎖の量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して増大している、または分解型糖鎖もしくは３シアリル化３分岐糖鎖の量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して減少しているとき、該被検細胞は多能性細胞であると判定される、（１）〜（１３）のいずれか記載の方法；
（１５）複数のフコース残基を有する糖鎖が
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１（ＮｅｕＧｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、または（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
であり、
バイセクト型またはＬａｃｄｉＮＡｃ型または多分岐型糖鎖が
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、または
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
であり、
分解型糖鎖が
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、または
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１
であり、
３シアリル化３分岐糖鎖が
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（ＮｅｕＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
である、（１４）に記載の方法；
（１６）前記被検細胞におけるＧＳＬのうち、
（Ｈｅｘ）３（Ｇｂ３）、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（「Ｇｂ４」）、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（「Ｇｂ５，ＳＳＥＡ−３」）、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１（「ＳＳＥＡ４」）、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（「ｇｌｏｂｏ Ｈ」）、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（「（ｎ）Ｌｃ４」）、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（本明細書中「Ｇａｌ−（ｎ）Ｌｃ４」と記載することもある）、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（「ＳＳＥＡ−１／５」）、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２（本明細書中「ｄｉＦｕｃ−（ｎ）Ｌｃ４」と記載することもある）、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（本明細書中「（ｎ）Ｌｃ５」と記載することもある）、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（「Ｌｃ３」）、（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２の量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して増大しているとき、該被検細胞は多能性細胞であると判定される、（１）〜（１３）のいずれか記載の方法；
（１７）前記被検細胞におけるＦＯＳのうち、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２の量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して減少しているとき、またはＦＯＳとＮ−結合型糖鎖の相対的量比（ＦＯＳ／Ｎ−結合型糖鎖）が２．０％以下のとき該被検細胞は多能性細胞であると判定される、（１）〜（１３）のいずれか記載の方法；
（１８）前記被検細胞におけるＧＡＧのうち、ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、ＣＳ−０Ｓ、ＨＳ−６Ｓ、ＣＳ−２Ｓ、ＣＳ−４Ｓ、ＨＳ−ＮＳ、ＨＳ−０Ｓ、ＨＡの量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して増大しているとき、該被検細胞は多能性細胞であると判定される、（１）〜（１３）のいずれか記載の方法；
（１９）前記被検細胞におけるＯ−結合型糖鎖のうち、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、（ＨｅｘＮＡｃ）２の量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して増大しているとき、該被検細胞は多能性細胞であると判定される、（１）〜（１３）のいずれか記載の方法；
（２０）多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
【表８】
2013186946.tif 000009
【表９】
2013186946.tif 000010
【表１０】
2013186946.tif 000011
【表１１】
2013186946.tif 000012
【表１２】
2013186946.tif 000013
【表１３】
2013186946.tif 000014
【表１４】
2013186946.tif 000015
から選択される糖鎖の使用；
（２１）多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
Ａ群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１（ＮｅｕＧｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（ＮｅｕＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
Ｂ群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１      （「ＳＳＥＡ４」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇｂ５，ＳＳＥＡ−３」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇｂ４」）、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ＳＳＥＡ−１」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、（「ｄｉＦｕｃ−（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ｇｌｏｂｏ Ｈ」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇａｌ−（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３      （「Ｇｂ３」）、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｌｃ３」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
Ｃ群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
Ｄ群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ
ＨＳ−ＮＳ、
Ｅ群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）２
から選択される糖鎖の使用；
（２２）多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
Ａ’群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１（ＮｅｕＧｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（ＮｅｕＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
Ｂ’群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１      （「ＳＳＥＡ４」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇｂ５，ＳＳＥＡ−３」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇｂ４」）、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ＳＳＥＡ−１」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、（「ｄｉＦｕｃ−（ｎ）Ｌｃ４」）
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ｇｌｏｂｏ Ｈ」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇａｌ−（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３      （「Ｇｂ３」）、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｌｃ３」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
Ｃ’群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
Ｄ’群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ
ＨＳ−ＮＳ
から選択される糖鎖の使用；
（２３）多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
Ａ”群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（ＮｅｕＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
Ｂ”群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ＳＳＥＡ−１／５」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２      （「ｄｉＦｕｃ−（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２      （「（ｎ）Ｌｃ５」）
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇａｌ−（ｎ）Ｌｃ４」）
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇｂ４」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇｂ５，ＳＳＥＡ−３」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１      （「ＳＳＥＡ４」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ｇｌｏｂｏ Ｈ」）、
（Ｈｅｘ）３      （「Ｇｂ３」）、
Ｃ”群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
Ｄ”群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ
ＨＳ−ＮＳ
から選択される糖鎖の使用；
（２４）多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
Ａ”’群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
Ｂ”’群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ＳＳＥＡ−１／５」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２      （「ｄｉＦｕｃ−（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２      （「（ｎ）Ｌｃ５」）
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇｂ４」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇｂ５，ＳＳＥＡ−３」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１      （「ＳＳＥＡ４」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ｇｌｏｂｏ Ｈ」）、
Ｄ”’群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ
から選択される糖鎖の使用；
（２５）樹立したｉＰＳ細胞から多能性を有しない細胞を検出するための方法であって、以下からなる群：
Ｆ群：
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ＳＳＥＡ−５」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２      （「ｄｉＦｕｃ−（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３      （「Ｇｂ３」）、
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ６Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３
Ｇ群：
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２  ＋  （Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１  ＋  （Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）３、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２ＳＮＳ
から選択される少なくとも１つの糖鎖について、被験細胞における該糖鎖の量を測定するステップと、該量を正常ｉＰＳにおける該糖鎖の量と比較するステップを含んでなり、
該糖鎖がＦ群から選択される場合は被験細胞において該糖鎖が検出されないかまたは該正常ｉＰＳ細胞における糖鎖の量と比較して減少しているときに、
該糖鎖がＧ群から選択される場合は被験細胞において該糖鎖の量が該正常ｉＰＳ細胞における糖鎖の量と比較して増加しているときに、該被検細胞は多能性を有しない細胞であると判定される、方法；
（２６）樹立したｉＰＳ細胞から多能性を有しない細胞を検出するためのマーカーとしての、以下からなる群
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ＳＳＥＡ−５」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２      （「ｄｉＦｕｃ−（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３      （「Ｇｂ３」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）３、
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ６Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２ＳＮＳ、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３
から選択される糖鎖の使用
を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の方法によれば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を含む種々の多能性幹細胞の、主要な全ての複合糖質糖鎖の量、発現プロファイル情報を精密に入手することが可能であり、適当な対照群と比較することによって、細胞の未分化状態を的確に評価し、多能性幹細胞を効率的に選別するための細胞マーカーを探索することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】各種細胞における糖鎖のＭＡＬＤＩスペクトルを示す。ＩＳは内部標準（（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１）を示す。上からＨＬ６０のＮ−結合型糖鎖、 ｉＰＳ１ＡのＮ−結合型糖鎖、ＨＬ６０の遊離糖鎖、 ｉＰＳ１Ａの遊離糖鎖のマススペクトルを示す。
【図２】両イオン性親水性クロマトグラフィーの結果を示す。ＩＳは内部標準（イソマルトース）を示す。（＋）はヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ヘパリナーゼ／ヘパリチナーゼ消化を行ったもの、また（−）はヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ヘパリナーゼ／ヘパリチナーゼ消化を行っていないもののＨＰＬＣクロマトグラフを示す。
【図３】各種細胞における糖鎖の定量結果を示す。５角形の中央に細胞名を表示し、各頂点にはそれぞれ、Ｎ−結合型糖鎖（Ｎ）、ＦＯＳ，ＧＡＧ，ＧＳＬ，Ｏ−結合型糖鎖（Ｏ）の発現プロファイルを円グラフで示す。円の大きさが糖鎖の発現量を反映し、色（濃淡）は各糖鎖の構造を反映する。
【図４】図３のグラフの凡例である。各円グラフ内の色（濃淡）は各糖鎖の構造に対応する。円グラフ中央の「Ｎ」はＮ−結合型糖鎖、「Ｏ」はＯ−結合型糖鎖を示す。
【図５】細胞間の相関行列の結果を示す。18種類の各細胞において観測された全ての糖鎖の定量データを用い、各細胞間の相関係数（ｒ）を算出した。点線で囲まれたセルは相関係数が大きい細胞の組み合わせを示し、セルの色が濃いほど相関が高い。点線で囲まれていないセルは相関係数が小さい細胞の組み合わせを示し、セルの色が濃いほど相関が低い。
【図６】階層型クラスター解析の結果を示したものである。図下部は、幹細胞群と非幹細胞群を分離するのに寄与した糖鎖のクラスターを拡大表示したものである。階層型クラスター分析は，対象となるデータ群を数学的に類似しているもの同士に分類する方法で、個体間の類似度として，ユークリッド距離を用い、クラスター間の類似度として群平均法を用いた。幹細胞マーカーとして汎用されるＳＳＥＡ−３，４、５、Ｇｌｏｂｏ ＨおよびＴｒａ−１エピトープは、系統樹中で点線で囲んだ分岐群の中に揃って分類された。
【図７】幹細胞（Stem）と非幹細胞（Non-stem）間で有意差の認められた各種Ｎ−結合型糖鎖（複数のフコース残基を有する糖鎖）の発現量の比較を示した箱ひげ図である。
【図８】幹細胞（Stem）と非幹細胞（Non-stem）間で有意差の認められた各種Ｎ−結合型糖鎖（複数のフコース残基を有する糖鎖）の発現量の比較を示した箱ひげ図である（図７の続き）。
【図９】幹細胞（Stem）と非幹細胞（Non-stem）間で有意差の認められた各種Ｎ−結合型糖鎖（バイセクト型またはＬａｃｄｉＮＡｃ型または多分岐型糖鎖）の発現量の比較を示した箱ひげ図である。
【図１０】幹細胞（Stem）と非幹細胞（Non-stem）間で有意差の認められた各種Ｎ−結合型糖鎖（３分岐３シアリル化糖鎖および分解型糖鎖）の発現量の比較を示した箱ひげ図である。
【図１１】幹細胞（Stem）と非幹細胞（Non-stem）間で有意差の認められた各種スフィンゴ糖脂質（（ネオ）ラクト系列）の発現量の比較を示した箱ひげ図である。
【図１２】幹細胞（Stem）と非幹細胞（Non-stem）間で有意差の認められた各種スフィンゴ糖脂質（（ネオ）ラクト系列）の発現量の比較を示した箱ひげ図である（図１１の続き）。
【図１３】幹細胞（Stem）と非幹細胞（Non-stem）間で有意差の認められた各種スフィンゴ糖脂質（グロボ系列）の発現量の比較を示した箱ひげ図である。
【図１４】幹細胞（Stem）と非幹細胞（Non-stem）間で有意差の認められた遊離オリゴ糖の発現量の比較を示した箱ひげ図である。
【図１５】遊離オリゴ糖の総量とＮ−結合型糖鎖の総量の相対的な量比をがん細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞間で比較した棒グラフである。
【図１６】幹細胞（Stem）と非幹細胞（Non-stem）間で有意差の認められた各種グリコサミノグリカンの発現量の比較を示した箱ひげ図である。
【図１７】幹細胞（Stem）と非幹細胞（Non-stem）間で有意差の認められた各種グリコサミノグリカンの発現量の比較を示した箱ひげ図である（図１６のつづき）。
【図１８】幹細胞（Stem）と非幹細胞（Non-stem）間で有意差の認められた各種Ｏ−結合型糖鎖の発現量の比較を示した箱ひげ図である。
【図１９】正常ｉＰＳ細胞（good）とｉＰＳ化が不完全な細胞ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−３Ｃ（bad）間の各種Ｎ−結合型糖鎖の発現量の比較を示した箱ひげ図である。
【図２０】正常ｉＰＳ細胞（good）とｉＰＳ化が不完全な細胞ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−３Ｃ（bad）間の各種スフィンゴ糖脂質の発現量の比較を示した箱ひげ図である。
【図２１】正常ｉＰＳ細胞（good）とｉＰＳ化が不完全な細胞ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−３Ｃ（bad）間の各種グリコサミノグリカンの発現量の比較を示した箱ひげ図である。
【図２２】正常ｉＰＳ細胞（good）とｉＰＳ化が不完全な細胞ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−３Ｃ（bad）間の各種遊離オリゴ糖の発現量の比較を示した箱ひげ図である。
【図２３】正常ｉＰＳ細胞（good）とｉＰＳ化が不完全な細胞ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−３Ｃ（bad）間の各種Ｏ−結合型糖鎖の発現量の比較を示した箱ひげ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
図７〜２３に示した箱ひげ図の見方を以下に示す。
【表１５】
2013186946.tif 000016
【００２２】
図面に示した糖鎖の構造における各記号の意味は以下のとおりである。
白の丸印：ガラクトース
黒の丸印：グルコース
グレーの丸印：マンノース
白の四角印：Ｎ−アセチルガラクトサミン
黒の四角印：Ｎ−アセチルグルコサミン
黒の三角印：フコース
黒の菱形印：Ｎ−アセチルノイラミン酸
【００２３】
本発明において、「多能性幹細胞」とは、個体を構成するすべての組織細胞に分化する能力、すなわち「多能性」、を有する幹細胞を意味する。多能性幹細胞の例としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、組織幹細胞、生体幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等を挙げることができる。但し、多能性を有する細胞であれば、上記の細胞に限定されない。
【００２４】
上記「多能性幹細胞」は動物由来のものであることができ、例えば、哺乳類、魚類等であることができる。哺乳類の例としては、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、サル等を挙げることができ、魚類の例としてはメダカ、ゼブラフィッシュ等を挙げることができるが、これらの例に限定されない。
【００２５】
「多能性幹細胞以外の細胞」とは、上に記載した多能性幹細胞以外の全てを包含し、例えば組織由来の正常細胞、がん細胞、または株化した正常細胞、がん細胞、不死化がん細胞を挙げることができるが、これらの例に限定されない。
【００２６】
本発明において用いられる上記の「多能性幹細胞」および「多能性幹細胞以外の細胞」はいずれも、商業的に、または分譲により入手可能であり、また、当分野における慣用技術により容易に作製することができる。
【００２７】
本発明において用いられる「ハイマンノース型糖鎖」とは、コア構造（（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２）の先の伸長がマンノース残基だけで構成される糖鎖を意味する。
【００２８】
本発明において用いられる「コンプレックス型糖鎖」とは、コア構造（（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２）の先の伸長が、グルコサミン、ガラクトース、シアル酸、フコースなどの残基で構成される糖鎖を意味し、分岐の数の違いに応じて１本鎖、２本鎖、３本鎖、４本鎖を構成する。
【００２９】
本発明において用いられる「ハイブリッド型糖鎖」とは、分岐の一部がハイマンノース型のようにマンノースのみで構成され、他の分岐がコンプレックス型のようにグルコサミン残基等を含む糖鎖を意味する。
【００３０】
本発明において検出され用いられる細胞の主要な複合糖質としては、Ｎ−結合型糖鎖、遊離オリゴ糖（以下「ＦＯＳ」と記載することもある）、スフィンゴ糖脂質（（以下「ＧＳＬ」と記載することもある））糖鎖、グリコサミノグリカン（以下「ＧＡＧ」と記載することもある）、Ｏ−結合型糖鎖が挙げられる。
【００３１】
本発明では、細胞に含まれるこれら複合糖鎖を分離、精製する処理に付し、分離、精製されたこれら糖鎖について個別に定量的プロファイルを取得することができる。糖鎖の分離、精製は、例えば、グライコブロッティング法（例えば、上記のＷＯ２００６／０３０５８４、ＷＯ２００７／１０８２０４およびＷＯ２００８／０１８１７０、Comprehensive approach to structural and functional glycomics based on chemoselective glycoblotting and sequential tag conversion” Jun-ichi Furukawa, Yasuro Shinohara, Hiromitsu Kuramoto, Yoshiaki Miura, Hideyuki Shimaoka, Masaki Kurogochi, Mika Nakano, Shin-ichiro Nishimura. (2008) Anal. Chem. 80, 1094-1101に記載）やＢＥＰ法（非特許文献１１）により行うのが、所望の糖鎖をもれなくかつ迅速に分離、精製できる観点から好ましい。
【００３２】
細胞から各糖鎖（Ｎ−結合型糖鎖、遊離オリゴ糖（ＦＯＳ）、スフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）糖鎖、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、Ｏ−結合型糖鎖）画分の試料を調製する手順について、以下にその一例を示す。
【００３３】
Ｎ−結合型糖鎖画分の分離・精製法
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を含む種々の多能性幹細胞ペレットに2%SDS100mM Tris-acetate緩衝液を加え、超音波破砕を行い細胞抽出液を回収する。細胞抽出液はTCEPによる還元、DNase処理、ヨードアセトアミドによるアルキル化を行った後、エタノールを加え-30℃3時間静置し遠心処理によりペレットを回収する。回収したペレットはトリプシンによりタンパク質を消化した後、ペプチドＮグリカナーゼＦを用いてＮ−結合型糖鎖の切断を行う。回収した糖鎖は、上記文献に記載されるようなグライコブロッティング法を用いて精製とラベル化を行う。
【００３４】
スフィンゴ糖脂質画分の分離・精製法
１．（規定個数を含む）細胞ペレットをクロロホルム：メタノール＝２：１の組成の溶液（４５０マイクロリットル）中で超音波（１０秒照射＋１０秒インターバルを６回。合計照射時間1分）により破砕する。
２．次に、メタノールを１５０マイクロリットル加え（この時点での溶媒組成はクロロホルム：メタノール＝１：１である）、同様に超音波処理を施す。
３．メタノールをさらに３００マイクロリットル加え（この時点での溶媒組成はクロロホルム：メタノール＝１：２である）、同様に超音波処理を施す。
４．上記１〜３の手順で得られた溶液を、２００００ｇ、１０分の遠心分離によりタンパク質画分を沈殿させ、得られた上清をスフィンゴ糖脂質を含む総脂質抽出物として新しいサンプルチューブに回収する。回収された溶液は遠心エバポレーターで溶媒を除去する。
５．得られた細胞由来の総脂質画分を、４０マイクロリットルの０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（もしくは０．２％コール酸ナトリウム）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に懸濁し、これに２５ ｍＵのＲｈｏｄｏｃｏｓｓｕｓ属由来のエンドグルコセラミダーゼ（ＥＧＣａｓｅ）ＩおよびＩＩを加えてスフィンゴ脂質から糖鎖を切断する（３７℃、終夜）
６．酵素反応液を２００００ｇ、１０分の遠心分離により不純物を沈殿させ、上清を切断された糖鎖を含む溶液として回収し、上記文献に記載されるようなグライコブロッティング法に供する。
【００３５】
遊離オリゴ糖画分の分離・精製法
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を含む種々の多能性幹細胞ペレットに2%SDS100mM Tris-acetate緩衝液を加え、超音波破砕を行い細胞抽出液を回収する。細胞抽出液はTCEPによる還元、DNase処理、ヨードアセトアミドによるアルキル化を行った後、エタノールを加え-30℃3時間静置し遠心処理によりエタノール上清を回収する。回収したエタノール画分は遠心濃縮装置を用いて濃縮した後、上記文献に記載されるようなグライコブロッティング法を用いて糖鎖の精製とラベル化を行う。
【００３６】
グリサミノグリカン画分の分離・精製法
１．上記のスフィンゴ糖脂質の分離・精製の１〜３の手順に準じて、細胞に含まれるタンパク質を沈殿として回収する。
２．沈殿は０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む９０マイクロリットルの５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液に溶解後、１０マイクロリットルのプロナーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）によってタンパク質を消化する（終夜、３７℃）。
３．プロナーゼを失活後（９０℃、１０分）、３０％酢酸ナトリウム水溶液２０マイクロリットルを加え、氷冷エタノール４８０マイクロリットルを加えてグリコサミノグリカン鎖を沈殿させる（−３０℃、２時間）。遠心分離（５０００ ｒｐｍ、１０分、４℃）によってグリコサミノグリカン鎖の沈殿を回収し、乾燥後、８０マイクロリットルの１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（含、５ｍＭ 酢酸カルシウム）に溶解し、各５マイクロリットルのヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼＡＢＣ（各１ ｍＵ／ｕＬ）および各１０マイクロリットルのヘパリナーゼ／ヘパリチナーゼ（各１０ ｍＵ／ｕＬ）を加えてＧＡＧを二糖ユニットに消化する（終夜、３７℃）。
４．回収したエタノール画分は遠心濃縮装置を用いて濃縮した後、上記文献に記載されるようなグライコブロッティング法を用いて糖鎖の精製とラベル化を行う。
【００３７】
Ｏ−結合型糖鎖画分の分離・精製法
１．１×１０６個からなる細胞ペレットを２％ドデシル硫酸ナトリウムを含むトリス酢酸緩衝液中（１００マイクロリットル）で、超音波処理（５秒照射＋１０秒インターバルを４セット）により溶解する。
２.  ２マイクロリットルの０．５Ｍトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン（終濃度約１００ ｍＭ）と２００ｍＭのヨードアセトアミド（終濃度約２０ ｍＭ）を加え、タンパク質のジスルフィド結合を還元アルキル化する（室温、３０分）。
３．  ４７２マイクロリットル（４倍量）の氷冷エタノールを加えてエタノール沈殿（−３０℃, ２時間）を行う。
４．  遠心分離（２００００×ｇ、１０分、４℃）により、沈殿（タンパク質画分）と上清に分け、沈殿をＯ−結合型糖鎖解析に使用する。
５.  沈殿は、超純水に溶解し、Ａｍｉｃｏｎにより分子量３０００以上の画分とした後、濃縮乾固する。
６．沈殿物を１０μＬの超純水で再溶解し、内部標準にテトラアセチルキトテトラオース（１０μＭ、１０μＬ）を添加し、さらに２０μＬの０．４Ｍ ＮａＯＨおよび２０μＬの０．５Ｍ  ３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）のメタノール溶液を加え、８５℃で１６時間静置する。反応後にＨＣｌにより中和し、クロロホルムを加え洗浄することで過剰試薬を除去した後、グラファイトカーボンおよびイアトロビーズにより糖鎖部分を精製する。
【００３８】
糖鎖の定量的プロファイルは、好ましくは、分離、精製した糖鎖をMALDI-TOF/MS（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight /mass spectrometry)またはLC-ESI/SSI-TOF/MS(liquid chromatography-electrospray ionization/sonic spray ionization-time of flight/mass spectrometry)により得られる。MALDI-TOF/MSまたはLC-ESI/SSI-TOF/MSを用いることで、迅速にかつ高精度に糖鎖量を測定し、定量的プロファイルを得ることができる。例えば、精製および標識したN-結合型糖鎖、O-結合型糖鎖、FOS,GSL糖鎖は、2,5-dihydroxybenzoic acid（10mg/mL 30%アセトニトリル）と混合し、MALDI-TOF MS解析に供することができる。測定には、例えばブルカーダルトニクス社のUltraFlex II  TOF/TOFを用い、全てのスペクトルはリフレクターモードで取得することができる。シグナルの検出および定量は、例えば同社のFlexAnalysis 3.0を用いて行うことができる。濃度既知の標準糖鎖（（Ｎｅｕ５Ａｃ）２（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１）を内部標準として用い、面積比から各シグナルの定量を行うことができる。
【００３９】
Ｎ−結合型糖鎖の測定
精製した糖鎖は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを用いた定量解析を行う。各糖鎖のピーク面積値を濃度既知の内部標準と比較することで糖鎖の定量化を行う。
【００４０】
スフィンゴ糖脂質の測定
精製した糖鎖は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを用いた定量解析を行う。各糖鎖のピーク面積値を濃度既知の内部標準と比較することで糖鎖の定量化を行う。
【００４１】
遊離オリゴ糖の測定
精製した糖鎖は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを用いた定量解析を行う。各糖鎖のピーク面積値を濃度既知の内部標準と比較することで糖鎖の定量化を行う。
【００４２】
グリサミノグリカンの測定
精製したＧＡＧ糖鎖の解析は両イオン性親水性クロマトグラフィ法により行う。内部標準としてイソマルトトリオースを添加し、蛍光検出による定量解析を行う。
【００４３】
Ｏ−結合型糖鎖の測定
Ｏ−結合型糖鎖の定量的プロファイルは、好ましくは、分離、精製した糖鎖をMALDI-TOF/MS（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight /mass spectrometry)により得られる。上記方法により精製した糖鎖部分を２、５−ジヒロド安息香酸（１０ｍｇ/ｍＬ）をマトリクスとして、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（/ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩ、ブルカー社）により解析を行う。
【００４４】
本発明の方法において検出され用いることができる糖鎖（Ｎ−結合型糖鎖（Ｎ−ｇｌｙｃａｎ）、スフィンゴ糖脂質（ＳＧＬ）、遊離オリゴ糖（ＦＯＳ）、グリサミノグリカン（ＧＡＧ）、Ｏ−結合型糖鎖（Ｏ−ｇｌｙｃａｎ）））は、例えば、上で具体的に記載したものが挙げられるが、それらに限られない。
【００４５】
Ｎ−結合型糖鎖のうち、
複数のフコース残基を有する糖鎖としては、例えば、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１（ＮｅｕＧｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
が挙げられる。
バイセクト型またはＬａｃｄｉＮＡｃ型または多分岐型糖鎖としては、例えば、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
が挙げられる。
分解型糖鎖としては、例えば、
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、または
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１
が挙げられる。
３シアリル化３分岐糖鎖としては、例えば、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（ＮｅｕＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
が挙げられる。
【００４６】
スフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）のうち、
（ネオ）ラクト系列のスフィンゴ糖脂質としては、例えば、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（（ｎ）Ｌｃ４）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｇａｌ−（ｎ）Ｌｃ４）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（ＳＳＥＡ−１／５）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２（ｄｉＦｕｃ−（ｎ）Ｌｃ４）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２（（ｎ）Ｌｃ５）、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｌｃ３）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
が挙げられる。
グロボ系列のスフィンゴ糖脂質としては、例えば、
（Ｈｅｘ）３（Ｇｂ３）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｇｂ４）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｇｂ５，ＳＳＥＡ−３）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１（ＳＳＥＡ４）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（ｇｌｏｂｏ Ｈ）
が挙げられる。
【００４７】
遊離オリゴ糖としては、例えば、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２
が挙げられる。
【００４８】
グリコサミノグリカン
グリコサミノグリカンの二糖を表１６に示す。たとえばＨＳ（ヘパラン硫酸）系としてはａ）に示す８種類のものが挙げられる。ＣＳ（コンドロイチン硫酸）系についてはｂ）に示す８種類のものが挙げられる。ＨＡ（ヒアルロン酸）はｃ）に示すものが挙げられる。より好ましくは、ＨＳとして、ＨＳ−０Ｓ（無硫酸 化ヘパラン硫酸２糖）、ＨＳ−６Ｓ（６位硫酸化ヘパラン硫酸２糖）、ＨＳ−ＮＳ（Ｎ−硫酸化ヘパラン硫酸２糖）が、ＣＳとして、ＣＳ−０Ｓ（無硫酸化 コンドロイチン硫酸２糖）、ＣＳ−２Ｓ（２位硫酸化コンドロイチン硫酸２糖）、ＣＳ−４Ｓ（４位硫酸化コンドロイチン２糖）、ＣＳ−２Ｓ４Ｓ（２，４位硫酸化コンドロイチン硫酸２糖）が挙げられる。
【表１６】
2013186946.tif 000017
【００４９】
Ｏ−結合型糖鎖としては、例えば、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）２
が挙げられる。
【００５０】
さらに、本発明者らは、正常のｉＰＳ細胞で発現がみられる糖鎖のうち、分化抵抗性を有するｉＰＳ化が不完全な、いわゆる「欠陥ｉＰＳ」において、発現動態が著しく変化する糖鎖群を見い出した。したがって、本発明の別の実施形態では、これら糖鎖を用いた欠陥ｉＰＳを検出するための方法、および欠陥ｉＰＳの検出マーカーとしてのこれら糖鎖の使用を提供する。また、これらの糖鎖は、作製されたｉＰＳ細胞の多能性の指標となる品質管理のためのマーカーとしても有用である。
【００５１】
樹立したｉＰＳ細胞から多能性を有しない細胞を検出するためのＮ−結合型糖鎖としては、例えば、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
が挙げられ、
スフィンゴ糖脂質としては、例えば、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ＳＳＥＡ−５」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２      （「ｄｉＦｕｃ−（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３      （「Ｇｂ３」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）３
が挙げられ、
グリコサミノグリカンとしては、例えば、
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ６Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２ＳＮＳ
が挙げられ、
遊離オリゴ糖としては、例えば、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
が挙げられ、
Ｏ−結合型糖鎖としては、例えば、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３
が挙げられる。
【実施例１】
【００５２】
種々のヒト細胞に含まれる複合糖質由来糖鎖の定量解析を行い、その定量データによる細胞の分類を行った。用いた細胞は以下のとおりであり、いずれも理研セルバンクより入手可能である。
多能性幹細胞：
ｉＰＳ細胞５種
臍帯由来の細胞より樹立した、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１Ａ、２Ａ、１２Ａ
脱落膜組織より樹立した、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−３Ａ
羊膜周辺組織より樹立した、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１１Ａ
ヒトＥＳ細胞５種
ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２、ＫｈＥＳ−３、ＫｈＥＳ−４、ＫｈＥＳ−５
非多能性幹細胞（対照ヒト細胞）：
ＨＬ６０（ヒト前骨髄性白血病由来細胞株）
ＨｅＬａ（ヒト子宮頸部がん由来細胞株）
Ａ５４９（ヒト非小細胞肺がん由来細胞株）
ＫＬＭ−１（ヒト膵臓癌細胞由来細胞株）
Ｃａｃｏ−２（ヒト大腸がん由来細胞株）
ＨｅｐＧ２（ヒト肝がん由来細胞株）
ＮＥＣ８（ヒト精巣腫瘍由来細胞株）
ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓由来細胞株）
ＭＲＣ５（ヒト胎児肺組織由来細胞）【００５３】
各細胞のＮ−結合型糖鎖，Ｏ−結合型糖鎖，ＦＯＳ、ＧＳＬ糖鎖、ＧＡＧを下記の通り抽出した。
Ｎ−結合型糖鎖、ＦＯＳ解析のためのサンプル調製
１.  １×１０６個からなる細胞ペレットを２％ドデシル硫酸ナトリウムを含むトリス酢酸緩衝液中（１００マイクロリットル）で、超音波処理（５秒照射＋１０秒インターバルを４セット）により溶解した。
２.  ２マイクロリットルの０．５Ｍトリス(２−カルボキシエチル)ホスフィン（終濃度約１００ ｍＭ）と２００ｍＭのヨードアセトアミド（終濃度約２０ ｍＭ）を加え、タンパク質のジスルフィド結合を還元アルキル化した（室温、３０分）。
３．  ４７２マイクロリットル（４倍量）の氷冷エタノールを加えてエタノール沈殿（−３０℃, ２時間）を行った。
４．  遠心分離（２００００×ｇ、１０分、４℃）により、沈殿（タンパク質画分）と上清に分けた。沈殿はＮ−結合型糖鎖解析へ、上清はＦＯＳ解析に使用した。
５.  沈殿を０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む重炭酸アンモニウム水溶液９５マイクロリットルに溶解し、５マイクロリットルのトリプシン溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）でタンパク質を消化した（終夜、３７℃）。トリプシン失活後（９０℃、１０分）、ペプチドＮグリカナーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ, ２Ｕ、３７℃、終夜）により糖鎖をタンパク質から切断した。後に濃縮乾固した。
６．上清（エタノール層）はそのまま濃縮乾固した。
７．両サンプルを２０マイクロリットルの脱イオン水に溶解した。【００５４】
ＧＳＬ糖鎖、ＧＡＧ解析のためのサンプル調製
１．  １×１０６個からなる細胞ペレットをクロロホルム：メタノール２：１の組成からなる混合液４５０マイクロリットルで脂質を１分間の超音波破砕により抽出した。抽出液に１５０マイクロリットルのメタノールを加え（溶液組成；クロロホルム：メタノール＝１：１）、超音波破砕した。さらにメタノール３００マイクロリットルを加え（溶液組成；クロロホルム：メタノール＝１：２）、超音波破砕した。遠心分離（２００００ ｘ ｇ, １０分）後、上清をＧＳＬ解析へ、沈殿をＧＡＧ解析に用いた。
２.  上清は濃縮乾固後、界面活性剤（２％  Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００もしくはコール酸ナトリウム）を含む５０ ｍＭトリス酢酸緩衝液に再懸濁し、２５ ｍＵのＲｈｏｄｏｃｏｓｓｕｓ属由来のエンドグルコセラミダーゼＩおよびＩＩを加えてセラミド鎖から糖鎖を切断した（３７℃、終夜）。
３．  沈殿は９０マイクロリットルの５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液に溶解後、１０マイクロリットルのプロナーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）によってタンパク質を消化した（終夜、３７℃）。プロナーゼを失活後（９０℃、１０分）、３０％酢酸ナトリウム水溶液２０マイクロリットルを加え、氷冷エタノール４８０マイクロリットルを加えてエタノール沈殿を行った（−３０℃、２時間）。遠心分離（５０００ ｒｐｍ、１０分、４℃）によってＧＡＧの沈殿を回収し、乾燥後、８０マイクロリットルの１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（含、５ｍＭ 酢酸カルシウム）に溶解し、各５マイクロリットルのヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼＡＢＣ（各１ ｍＵ／ｕＬ）および各１０マイクロリットルヘパリナーゼ／ヘパリチナーゼ（各１０ ｍＵ／ｕＬ）を加えてＧＡＧを二糖ユニットに消化した（終夜、３７℃）。
上記のように調製したＮ−結合型糖鎖、ＦＯＳ、ＧＳＬのサンプルは、糖鎖のみをグライコブロッティング法によって精製後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを用いた定量解析を行った（非特許文献７による）。ＧＡＧの解析は両イオン性親水性クロマトグラフィにより、定量解析を行った（非特許文献９）。図１は代表的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルと液体クロマトグラフィの結果を示す。【００５５】
Ｏ−結合型糖鎖解析のためのサンプル調製
１．  １ｘ１０６個からなる細胞ペレットを２％ドデシル硫酸ナトリウムを含むトリス酢酸緩衝液中（１００マイクロリットル）で、超音波処理（５秒照射＋１０秒ｉｎｔｅｒｖａｌを４セット）により溶解した。
２．  ２マイクロリットルの０．５Ｍ トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（終濃度約１００ ｍＭ）と２００ｍＭのヨードアセトアミド（終濃度約２０ ｍＭ）を加え、タンパク質のジスルフィド結合を還元アルキル化した（室温、３０分）。
３．  ４７２マイクロリットル（４倍量）の氷冷エタノールを加えてエタノール沈殿（−３０℃, ２時間）を行った。
４．  遠心分離（２００００×ｇ、１０分、４℃）により、沈殿（タンパク質画分）と上清に分けた。沈殿をＯ−結合型糖鎖解析に使用した。
５.  沈殿を超純水に溶解し、amiconにより分子量３０００以上の画分とした。後に濃縮乾固した。
６．沈殿物を１０μＬの超純水で再溶解し、内部標準にテトラアセチルキトテトラオース（１０μＭ、１０μＬ）を添加し、さらに２０μＬの０．４Ｍ ＮａＯＨおよび２０μＬの０．５Ｍ  ３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）のメタノール溶液を加え、８５℃で１６時間静置した。反応後にＨＣｌにより中和し、クロロホルムを加え洗浄することで過剰試薬を除去した後、グラファイトカーボンおよびイアトロビーズにより糖鎖部分を精製した。（非特許文献１０による）。【００５６】
上記多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞５種、ヒトＥＳ細胞５種）および非多能性幹細胞（９種）の計１９種において合計約２００種類の糖鎖を定量的に検出した。検出されたＮ−結合型糖鎖（Ｎ−ｇｌｙｃａｎ）、Ｏ−結合型糖鎖（Ｏ−ｇｌｙｃａｎ）、遊離オリゴ糖（ＦＯＳ）、スフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）、グリサミノグリカン（ＧＡＧ）を下記の表に示す。
【表１７】
2013186946.tif 000018
（Ｎ−ｇｌｙｃａｎ続き）
【表１８】
2013186946.tif 000019
【表１９】
2013186946.tif 000020
（ＧＳＬ続き）
【表２０】
2013186946.tif 000021
【表２１】
2013186946.tif 000022
【表２２】
2013186946.tif 000023
【表２３】
2013186946.tif 000024
【００５７】
図３に各細胞の定量結果の例を示す。５角形の頂点は、時計回りに、ＧＳＬ、Ｏ−結合型糖鎖、ＧＡＧ、ＦＯＳ、Ｎ−結合型糖鎖の発現プロファイルを示しており、円グラフの大きさが糖鎖の発現量を表し、色が構造を反映する。細胞の総合グライコームは高度に細胞特異的である。図５は細胞間の相関行列の結果を示す。多能性幹細胞群（ＥＳ、ｉＰＳ）と非多能性幹細胞は明確に区別され、総合グライコームによる解析が細胞の性質に応じて分類可能であることが示された。また図６に階層型クラスター解析結果を示す。本解析でも多能性幹細胞群（ＥＳ、ｉＰＳ）と非多能性幹細胞は明確に区別された。同時に、糖鎖構造側のクラスタリングにおいても、未分化マーカーとして実績のあるＳＳＥＡは同じクラスターは同じ階層にクラスタリングされ、本法の妥当性を示すと共に、その階層の近傍に存在する糖鎖構造を有力な未分化マーカー候補とすることができた。【００５８】
多能性幹細胞群と非多能性幹細胞群の発現プロファイルの比較から有意差が認められた糖鎖群を図７〜１８に示す。これらは多能性幹細胞に特異的な糖鎖マーカーであると考えられる。【００５９】
各複合糖質別に比較すると、多能性幹細胞におけるＮ−結合型糖鎖では以下の特徴を認めた。
１．複数のフコース残基を有する糖鎖
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
の量がｐ＜０．００１で、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
の量がｐ＜０．０１で、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１（ＮｅｕＧｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
の量がｐ＜０．０５で有意に高い。本糖鎖にはＳＳＥＡ−１／５エピトープもしくはシアリルＳＳＥＡ−１エピトープが含まれる。
２．バイセクト型またはＬａｃｄｉＮＡｃ型または多分岐型糖鎖
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
の量がｐ＜０．０１で有意に高い。
３．分解型糖鎖
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、または
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１
の量がｐ＜０．０５で有意に低い。
４．３シアリル化３分岐糖鎖
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（ＮｅｕＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
の量がｐ＜０．０１で有意に低い。
【００６０】
ＧＳＬ糖鎖では以下の特徴を認めた。
１．（ネオ）ラクト系列の中で、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ＳＳＥＡ−１／５」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２      （「ｄｉＦｕｃ−（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２      （「（ｎ）Ｌｃ５」）
の量がｐ＜０．００１で、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇａｌ−（ｎ）Ｌｃ４」）
の量がｐ＜０．０１で、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｌｃ３」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
の量がｐ＜０．０５で、ＥＳおよびｉＰＳ細胞において有意に増大した。
２．グロボ系列では、ＥＳおよびｉＰＳ細胞における
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇｂ４」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇｂ５，ＳＳＥＡ−３」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１      （「ＳＳＥＡ４」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ｇｌｏｂｏ Ｈ」）
の量がｐ＜０．００１で、
（Ｈｅｘ）３      （「Ｇｂ３」）
の量がｐ＜０．０１で、有意な増加が認められた。ＳＳＥＡ−３，４は幹細胞マーカーとしてルーチンに用いられており、本解析で予備知識なく、ＳＳＥＡ−３，４が幹細胞マーカーとして検出されたことは、本アプローチの妥当性を実証する結果と言える。
【００６１】
ＦＯＳでは以下の特徴を認めた。
１．（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１の量がｐ＜０．０１で、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２の量がｐ＜０．０５で、ＥＳとｉＰＳ細胞において有意な減少が認められた。
２．ＦＯＳとＮ−結合型糖鎖の相対的量比（ＦＯＳ／Ｎ−結合型糖鎖）がＥＳとｉＰＳ細胞において有意に低い。ＦＯＳとＮ−結合型糖鎖の相対的量比（ＦＯＳ／Ｎ−結合型糖鎖）は、細胞におけるタンパク質の合成が盛んなときに高くなると考えられることから、幹細胞における低下傾向は幹細胞の休眠状態、または比較対象として用いたがん細胞のタンパク質の合成亢進を反映している可能性が考えられる。【００６２】
ＧＡＧでは以下の特徴を認めた。
１．ｉＰＳ細胞において、ＨＳにおいて硫酸基ゼロの割合が高く検出された。
２．ｉＰＳ細胞において、ＣＳにおいて６位修飾が少なく４位修飾が多い傾向が認められた。
３．ｉＰＳ細胞において、ＨＳにおいてはＮ位修飾が多く検出された。
４．ｉＰＳ細胞におけるＧＡＧのうち、ＣＳ−０Ｓ、ＣＳ−２Ｓ、ＣＳ−４Ｓ、ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、ＨＳ−０Ｓの量がｐ＜０．００１で、ＨＳ−６Ｓ、ＨＳ−ＮＳ、ＨＡの量がｐ＜０．０１で、非ｉＰＳ細胞における糖鎖の量と比較して増大していた。【００６３】
Ｏ−結合型糖鎖では以下の特徴を認めた。
１．（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、（ＨｅｘＮＡｃ）２などの糖鎖が増大していた。
【実施例２】
【００６４】
さらに、以下に示す細胞について、実施例１と同様に複合糖質由来糖鎖の定量解析を行った。用いた細胞は以下のとおりである（いずれも理研セルバンクより入手）。
ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１Ａ、
ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−２Ａ、
ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１１Ａ、
ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１２Ａ、
ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−３Ｃ、
ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−３Ｃ細胞は、脱落膜組織よりＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１Ａ細胞と同時に樹立された細胞株であるが、ｉＰＳの特徴である多能性を有しておらず「ｉＰＳ化が不完全な」細胞である。ヒト多能性幹細胞の未分化マーカーであるTRA-1-60, TRA-1-81を発現しておらず、Nanogの発現量も非常に低いという性質を持つ。正常ｉＰＳ細胞（ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１Ａ、２Ａ、３Ａ、１１Ａ、１２Ａ）の発現プロファイルと比較した結果、正常ｉＰＳ細胞で共通して発現し、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−３Ｃにおいて発現が著しく変動した糖鎖が認められた。結果を図１９〜２３に示す。【００６５】
Ｎ−結合型糖鎖（図１９）
下記の糖鎖が「iPS化が不完全な」細胞株では発現が顕著に増大した。
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
また、下記の糖鎖が「iPS化が不完全な」細胞株では発現が顕著に減少した。
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２  ＋  （Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２【００６６】
ＧＳＬ糖鎖（図２０）
幹細胞マーカーとして同定された下記の糖鎖が「iPS化が不完全な」細胞株では発現が顕著に減少した。
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ＳＳＥＡ−５」）
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２      （「ｄｉＦｕｃ−（ｎ）Ｌｃ４」）
（Ｈｅｘ）３      （「Ｇｂ３」）
また、下記の糖鎖が「iPS化が不完全な」細胞株では発現が顕著に増大した。
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）３【００６７】
ＧＡＧ（図２１）
下記の糖鎖が「iPS化が不完全な」細胞株では発現が顕著に減少した。
ＣＳ−０Ｓ
ＣＳ−２Ｓ
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ
ＣＳ−４Ｓ６Ｓ
ＨＳ−０Ｓ
また、下記の糖鎖が「iPS化が不完全な」細胞株では発現が顕著に増大した。
ＨＳ−２ＳＮＳ【００６８】
ＦＯＳ（図２２）
下記の糖鎖が「iPS化が不完全な」細胞株では発現が顕著に減少した。
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）１
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２【００６９】
Ｏ−結合型糖鎖（図２３）
下記の糖鎖が「iPS化が不完全な」細胞株では発現が顕著に減少した。
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３【００７０】
これらの結果から、ｉＰＳ化が不完全な細胞の検出マーカーとして、また、作製されたｉＰＳの多能性の指標となる品質管理のためのマーカーとして、これらの糖鎖が有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の方法は、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞のみならず、各組織中の幹細胞に対しても多能性幹細胞の評価、選別に利用できる。また、幹細胞一般の脱分化効率の評価、脱分化した細胞の選別にも利用できる。分化誘導した細胞群に残存しそのまま移植すると奇形腫を生じるような未分化幹細胞が混入しているかどうか評価し、これらの多能性幹細胞を除去することで癌化の危険を低減する再生医療基礎技術としても利用できる。また、再生医療のための材料（セルサスペンジョン、細胞シート）の評価にも応用可能であり、移植のタイミングの評価や、品質管理への応用もはかれる可能性がある。更には、正常細胞と疾患細胞の比較、がん細胞とがん幹細胞の比較に方法を応用することによって、疾患特異的なバイオマーカー探索における基盤技術としても本発明の方法を応用することができる。
【図１】
2013186946.tif 000039
【図２】
2013186946.tif 000040
【図３】
2013186946.tif 000041
【図４】
2013186946.tif 000042
【図５】
2013186946.tif 000043
【図６】
2013186946.tif 000044
【図７】
2013186946.tif 000045
【図８】
2013186946.tif 000046
【図９】
2013186946.tif 000047
【図１０】
2013186946.tif 000048
【図１１】
2013186946.tif 000049
【図１２】
2013186946.tif 000050
【図１３】
2013186946.tif 000051
【図１４】
2013186946.tif 000052
【図１５】
2013186946.tif 000053
【図１６】
2013186946.tif 000054
【図１７】
2013186946.tif 000055
【図１８】
2013186946.tif 000056
【図１９】
2013186946.tif 000057
【図２０】
2013186946.tif 000058
【図２１】
2013186946.tif 000059
【図２２】
2013186946.tif 000060
【図２３】
2013186946.tif 000061
【手続補正書】
【提出日】平成26年9月8日(2014.9.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の分化状態を判定する方法であって、
以下のＣ群またはＤ群：
Ｃ群：（Ｍａｎ）ｎ（ＧｌｃＮＡｃ）２型、（Ｍａｎ）ｎ（ＧｌｃＮＡｃ）１型からなる群から選択される遊離オリゴ糖
Ｄ群：ＣＳ（△ＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ）から選択されるコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸、ＨＳ（△ＵＡβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）から選択されるヘパラン硫酸、およびＨＡ（ΔＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）から選択されるヒアルロン酸構成２糖からなる群から選択されるグリサミノグリカン
から選択される少なくとも１つの糖鎖について、被験細胞における該糖鎖の量を測定するステップと、該量を多能性幹細胞以外の細胞における該糖鎖の量と比較するステップを含んでなり、該多能性幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、方法。
【請求項２】
前記Ｃ群およびＤ群がそれぞれ以下の糖鎖：
Ｃ群
【表５】
2013186946.tif 000062
Ｄ群
【表６】
2013186946.tif 000063
からなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記Ｃ群およびＤ群がそれぞれ以下の糖鎖：
Ｃ群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
Ｄ群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ、
ＨＳ−ＮＳ
からなる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
被験細胞から遊離オリゴ糖画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ｃ群から選択される糖鎖の量を測定する、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項７】
被験細胞からグリサミノグリカン画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ｄ群から選択される糖鎖の量を測定する、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
前記画分をグライコブロッティング法により分離および精製する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
前記糖鎖の量の測定をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより行う、請求項１〜３、６、７、９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
多能性幹細胞がヒト由来である、請求項１〜３、６、７、９、１０のいずれか記載の方法。
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
前記被検細胞におけるＦＯＳのうち、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２の量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して減少しているとき、またはＦＯＳとＮ−結合型糖鎖の相対的量比（ＦＯＳ／Ｎ−結合型糖鎖）が２．０％以下のとき該被検細胞は多能性細胞であると判定される、請求項１〜３、６、９、１０、１３のいずれか記載の方法。
【請求項１８】
前記被検細胞におけるＧＡＧのうち、ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、ＣＳ−０Ｓ、ＨＳ−６Ｓ、ＣＳ−２Ｓ、ＣＳ−４Ｓ、ＨＳ−ＮＳ、ＨＳ−０Ｓ、ＨＡの量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して増大しているとき、該被検細胞は多能性細胞であると判定される、請求項１〜３、７、９、１０、１３のいずれか記載の方法。
【請求項１９】
多能性幹細胞の分化状態を判定する方法であって、被験細胞における該糖鎖の量を測定するステップと、該量を多能性幹細胞以外の細胞における該糖鎖の量と比較するステップを含んでなり、前記被検細胞におけるＯ−結合型糖鎖のうち、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、（ＨｅｘＮＡｃ）２の量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して増大しているとき、該被検細胞は多能性細胞であると判定され、該多能性幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、方法。
【請求項２０】
ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
ＧＳＬ
【表１０】
2013186946.tif 000064
【表１１】
2013186946.tif 000065
ＦＯＳｓ
【表１２】
2013186946.tif 000066
ＧＡＧ
【表１３】
2013186946.tif 000067
Ｏ−ｇｌｙｃａｎｓ
【表１４】
2013186946.tif 000068
から選択される糖鎖の使用。
【請求項２１】
ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
Ｂ群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
Ｃ群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２
Ｄ群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ、
ＨＳ−ＮＳ、
Ｅ群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）２
から選択される糖鎖の使用。
【請求項２２】
ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
Ｂ’群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
Ｃ’群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
Ｄ’群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ、
ＨＳ−ＮＳ
から選択される糖鎖の使用。
【請求項２３】
ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
Ｂ”群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３、
Ｃ”群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
Ｄ”群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ、
ＨＳ−ＮＳ
から選択される糖鎖の使用。
【請求項２４】
ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
Ｂ”’群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
Ｄ”’群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ
から選択される糖鎖の使用。
【請求項２５】
樹立したｉＰＳ細胞から多能性を有しない細胞を検出するための方法であって、以下からなる群：
Ｆ群：
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）３、
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ６Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
Ｇ群：
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）３、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２ＳＮＳ
から選択される少なくとも１つの糖鎖について、被験細胞における該糖鎖の量を測定するステップと、該量を正常ｉＰＳにおける該糖鎖の量と比較するステップを含んでなり、
該糖鎖がＦ群から選択される場合は被験細胞において該糖鎖が検出されないかまたは該正常ｉＰＳ細胞における糖鎖の量と比較して減少しているときに、
該糖鎖がＧ群から選択される場合は被験細胞において該糖鎖の量が該正常ｉＰＳ細胞における糖鎖の量と比較して増加しているときに、該被検細胞は多能性を有しない細胞であると判定される、方法。
【請求項２６】
樹立したｉＰＳ細胞から多能性を有しない細胞を検出するためのマーカーとしての、以下からなる群
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）３、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）３、
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ６Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２ＳＮＳ、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１および
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３
から選択される糖鎖の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１      （本明細書中「ＳＳＥＡ４」と記載することもある）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１      （本明細書中「Ｇｂ５，ＳＳＥＡ−３」と記載することもある）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （本明細書中「（Ｇｂ４」と記載することもある）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （本明細書中「ＳＳＥＡ−１／５」と記載することもある）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （本明細書中「（ｎ）Ｌｃ４」と記載することもある）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、（本明細書中「ｄｉＦｕｃ−（ｎ）Ｌｃ４」と記載することもある）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （本明細書中「ｇｌｏｂｏ  Ｈ」と記載することもある）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｇａｌ−（ｎ）Ｌｃ４）、
（Ｈｅｘ）３      （本明細書中「Ｇｂ３」と記載することもある）、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１      （本明細書中「Ｌｃ３」と記載することもある）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
Ｃ群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
Ｄ群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇｂ５，ＳＳＥＡ−３」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇｂ４」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ＳＳＥＡ−１」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、（「ｄｉＦｕｃ−（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ｇｌｏｂｏ  Ｈ」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇａｌ−（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３      （「Ｇｂ３」）、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｌｃ３」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
Ｃ群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
Ｄ群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ
ＨＳ−ＮＳ、
Ｅ群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３（ＮｅｕＡｃ）３＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
Ｂ’群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１      （「ＳＳＥＡ４」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇｂ５，ＳＳＥＡ−３」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇｂ４」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ＳＳＥＡ−１」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、（「ｄｉＦｕｃ−（ｎ）Ｌｃ４」）
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ｇｌｏｂｏ  Ｈ」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇａｌ−（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３      （「Ｇｂ３」）、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｌｃ３」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
Ｃ’群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
Ｄ’群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇｂ４」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１      （「Ｇｂ５，ＳＳＥＡ−３」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１      （「ＳＳＥＡ４」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ｇｌｏｂｏ  Ｈ」）、
Ｄ”’群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ
から選択される糖鎖の使用；
（２５）樹立したｉＰＳ細胞から多能性を有しない細胞を検出するための方法であって、以下からなる群：
Ｆ群：
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ＳＳＥＡ−５」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２      （「ｄｉＦｕｃ−（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３      （「Ｇｂ３」）、
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
該糖鎖がＦ群から選択される場合は被験細胞において該糖鎖が検出されないかまたは該正常ｉＰＳ細胞における糖鎖の量と比較して減少しているときに、
該糖鎖がＧ群から選択される場合は被験細胞において該糖鎖の量が該正常ｉＰＳ細胞における糖鎖の量と比較して増加しているときに、該被検細胞は多能性を有しない細胞であると判定される、方法；
（２６）樹立したｉＰＳ細胞から多能性を有しない細胞を検出するためのマーカーとしての、以下からなる群
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ＳＳＥＡ−５」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２      （「ｄｉＦｕｃ−（ｎ）Ｌｃ４」）、
（Ｈｅｘ）３      （「Ｇｂ３」）、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）３、
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）２
が挙げられる。
［００５０］
さらに、本発明者らは、正常のｉＰＳ細胞で発現がみられる糖鎖のうち、分化抵抗性を有するｉＰＳ化が不完全な、いわゆる「欠陥ｉＰＳ」において、発現動態が著しく変化する糖鎖群を見い出した。したがって、本発明の別の実施形態では、これら糖鎖を用いた欠陥ｉＰＳを検出するための方法、および欠陥ｉＰＳの検出マーカーとしてのこれら糖鎖の使用を提供する。また、これらの糖鎖は、作製されたｉＰＳ細胞の多能性の指標となる品質管理のためのマーカーとしても有用である。
［００５１］
樹立したｉＰＳ細胞から多能性を有しない細胞を検出するためのＮ−結合型糖鎖としては、例えば、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
が挙げられ、
スフィンゴ糖脂質としては、例えば、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ＳＳＥＡ−５」）、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２      （「ｄｉＦｕｃ−（ｎ
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
１Ａ、２Ａ、３Ａ、１１Ａ、１２Ａ）の発現プロファイルと比較した結果、正常ｉＰＳ細胞で共通して発現し、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−３Ｃにおいて発現が著しく変動した糖鎖が認められた。結果を図１９〜２３に示す。
［００６５］
Ｎ−結合型糖鎖（図１９）
下記の糖鎖が「ｉＰＳ化が不完全な」細胞株では発現が顕著に増大した。
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
また、下記の糖鎖が「ｉＰＳ化が不完全な」細胞株では発現が顕著に減少した。
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１＋（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）２  ＋  （Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２
［００６６］
ＧＳＬ糖鎖（図２０）
幹細胞マーカーとして同定された下記の糖鎖が「ｉＰＳ化が不完全な」細胞株では発現が顕著に減少した。
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１      （「ＳＳＥＡ−５」）
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２      （「ｄｉＦｕｃ−（ｎ）Ｌｃ４」）
（Ｈｅｘ）３      （「Ｇｂ３」）
また、下記の糖鎖が「ｉＰＳ化が不完全な」細胞株では発現が顕著に増大した。
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１
【手続補正書】
【提出日】平成27年6月10日(2015.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の判定方法であって、以下からなる群：
Ｂ群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
からなる群から選択されるスフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）、
Ｃ群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２
からなる群から選択される遊離オリゴ糖（ＦＯＳ）、
Ｄ群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ、
ＨＳ−ＮＳ、
からなる群から選択されるグリサミノグリカン（ＧＡＧ）
Ｅ群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）２
からなる群から選択されるＯ−結合型糖鎖（Ｏ−ｇｌｙｃａｎｓ）
から選択される少なくとも１つの糖鎖について、被験細胞における該糖鎖の量を測定するステップと、該量を多能性幹細胞以外の細胞における該糖鎖の量と比較するステップを含んでなり、該多能性幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、方法。
【請求項２】
被験細胞から遊離オリゴ糖画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ｃ群から選択される糖鎖の量を測定する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
被験細胞からグリサミノグリカン画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ｄ群から選択される糖鎖の量を測定する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
被験細胞からスフィンゴ糖脂質画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ｂ群から選択される糖鎖の量を測定する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
被験細胞からＯ−結合型糖鎖画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ｅ群から選択される糖鎖の量を測定する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記画分をグライコブロッティング法により分離および精製する、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記糖鎖の量の測定をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより行う、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
多能性幹細胞がヒト由来である、請求項１〜７のいずれか記載の方法。
【請求項９】
前記被検細胞におけるＦＯＳのうち、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２の量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して減少しているとき、またはＦＯＳとＮ−結合型糖鎖の相対的量比（ＦＯＳ／Ｎ−結合型糖鎖）が２．０％以下のとき該被検細胞は多能性細胞であると判定される、請求項１、２、６〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
前記被検細胞におけるＧＡＧのうち、ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、ＣＳ−０Ｓ、ＨＳ−６Ｓ、ＣＳ−２Ｓ、ＣＳ−４Ｓ、ＨＳ−ＮＳ、ＨＳ−０Ｓ、ＨＡの量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して増大しているとき、該被検細胞は多能性細胞であると判定される、請求項１、３、６〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
多能性幹細胞の判定方法であって、被験細胞における該糖鎖の量を測定するステップと、該量を多能性幹細胞以外の細胞における該糖鎖の量と比較するステップを含んでなり、前記被検細胞におけるＯ−結合型糖鎖のうち、（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、（ＨｅｘＮＡｃ）２の量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して増大しているとき、該被検細胞は多能性細胞であると判定され、該多能性幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、方法。
【請求項１２】
ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
Ｂ群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
Ｃ群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２
Ｄ群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ、
ＨＳ−ＮＳ、
Ｅ群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（ＨｅｘＮＡｃ）２
から選択される糖鎖の使用。
【請求項１３】
ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
Ｂ”群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３、
Ｃ”群：
（Ｈｅｘ）１（ＨｅｘＮＡｃ）１、
Ｄ”群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ、
ＨＳ−ＮＳ
から選択される糖鎖の使用。
【請求項１４】
ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
Ｂ”’群：
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
Ｄ”’群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ
から選択される糖鎖の使用。
【請求項１５】
樹立したｉＰＳ細胞から多能性を有しない細胞を検出するための方法であって、以下からなる群：
Ｆ群：
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）３、
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ６Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３、
Ｇ群：
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）３、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２ＳＮＳ
から選択される少なくとも１つの糖鎖について、被験細胞における該糖鎖の量を測定するステップと、該量を正常ｉＰＳにおける該糖鎖の量と比較するステップを含んでなり、
該糖鎖がＦ群から選択される場合は被験細胞において該糖鎖が検出されないかまたは該正常ｉＰＳ細胞における糖鎖の量と比較して減少しているときに、
該糖鎖がＧ群から選択される場合は被験細胞において該糖鎖の量が該正常ｉＰＳ細胞における糖鎖の量と比較して増加しているときに、該被検細胞は多能性を有しない細胞であると判定される、方法。
【請求項１６】
樹立したｉＰＳ細胞から多能性を有しない細胞を検出するためのマーカーとしての、以下からなる群
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｈｅｘ）３、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）３、
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ６Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２ＳＮＳ、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２（ＮｅｕＡｃ）１および
（Ｈｅｘ）３（ＨｅｘＮＡｃ）３
から選択される糖鎖の使用。
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月26日(2015.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の判定方法であって、以下からなる群：
Ｂ群：
（Ｇａｌ）２（Ｇｌｃ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｇａｌ）２（Ｇｌｃ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｇａｌ）２（Ｇｌｃ）１、
（Ｇａｌ）１（Ｇｌｃ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｇａｌ）３（Ｇｌｃ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
からなる群から選択されるスフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）、
Ｃ群：
（Ｍａｎ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２
からなる群から選択される遊離オリゴ糖（ＦＯＳ）、
Ｄ群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ、
ＨＳ−ＮＳ、
からなる群から選択されるグリサミノグリカン（ＧＡＧ）
Ｅ群：
（Ｇａｌ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（ＧａｌＮＡｃ）１、
（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）１（ＧａｌＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）１（ＧａｌＮＡｃ）１、
（Ｇａｌ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１（ＧａｌＮＡｃ）１、
（ＧｌｃＮＡｃ）１（ＧａｌＮＡｃ）１
からなる群から選択されるＯ−結合型糖鎖（Ｏ−ｇｌｙｃａｎｓ）
から選択される少なくとも１つの糖鎖について、被験細胞における該糖鎖の量を測定するステップと、該量を多能性幹細胞以外の細胞における該糖鎖の量と比較するステップを含んでなり、該多能性幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、方法。
【請求項２】
被験細胞から遊離オリゴ糖画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ｃ群から選択される糖鎖の量を測定する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
被験細胞からグリサミノグリカン画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ｄ群から選択される糖鎖の量を測定する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
被験細胞からスフィンゴ糖脂質画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ｂ群から選択される糖鎖の量を測定する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
被験細胞からＯ−結合型糖鎖画分を分離および精製し、該画分を対象として前記Ｅ群から選択される糖鎖の量を測定する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記画分をグライコブロッティング法により分離および精製する、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記糖鎖の量の測定をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより行う、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
多能性幹細胞がヒト由来である、請求項１〜７のいずれか記載の方法。
【請求項９】
前記被検細胞におけるＦＯＳのうち、（Ｍａｎ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１、（Ｍａｎ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２の量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して減少しているとき、またはＦＯＳとＮ−結合型糖鎖の相対的量比（ＦＯＳ／Ｎ−結合型糖鎖）が２．０％以下のとき該被検細胞は多能性細胞であると判定される、請求項１、２、６〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
前記被検細胞におけるＧＡＧのうち、ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、ＣＳ−０Ｓ、ＨＳ−６Ｓ、ＣＳ−２Ｓ、ＣＳ−４Ｓ、ＨＳ−ＮＳ、ＨＳ−０Ｓ、ＨＡの量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して増大しているとき、該被検細胞は多能性細胞であると判定される、請求項１、３、６〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
多能性幹細胞の判定方法であって、被験細胞における該糖鎖の量を測定するステップと、該量を多能性幹細胞以外の細胞における該糖鎖の量と比較するステップを含んでなり、前記被検細胞におけるＯ−結合型糖鎖のうち、（Ｇａｌ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（ＧａｌＮＡｃ）１、（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）１（ＧａｌＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）１（ＧａｌＮＡｃ）１、（Ｇａｌ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１（ＧａｌＮＡｃ）１、（ＧｌｃＮＡｃ）１（ＧａｌＮＡｃ）１の量が、前記多能性幹細胞以外の細胞における糖鎖の量と比較して増大しているとき、該被検細胞は多能性細胞であると判定され、該多能性幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である、方法。
【請求項１２】
ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
Ｂ群：
（Ｇａｌ）２（Ｇｌｃ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｇａｌ）２（Ｇｌｃ）１、
（Ｇａｌ）１（Ｇｌｃ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｇａｌ）３（Ｇｌｃ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２
Ｃ群：
（Ｍａｎ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２
Ｄ群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ、
ＨＳ−ＮＳ、
Ｅ群：
（Ｇａｌ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２（ＧａｌＮＡｃ）１、
（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）１（ＧａｌＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１、
（Ｇａｌ）２（ＧｌｃＮＡｃ）１（ＧａｌＮＡｃ）１、
（Ｇａｌ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１（ＧａｌＮＡｃ）１、
（ＧｌｃＮＡｃ）１（ＧａｌＮＡｃ）１
から選択される糖鎖の使用。
【請求項１３】
ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
Ｂ”群：
（Ｇａｌ）２（Ｇｌｃ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｇａｌ）２（Ｇｌｃ）１、
Ｃ”群：
（Ｍａｎ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１、
Ｄ”群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＨＳ−６Ｓ、
ＨＡ、
ＨＳ−ＮＳ
から選択される糖鎖の使用。
【請求項１４】
ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である多能性細胞の判定用マーカーとしての、以下からなる群
Ｂ”’群：
（Ｇａｌ）２（Ｇｌｃ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
Ｄ”’群：
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ
から選択される糖鎖の使用。
【請求項１５】
樹立したｉＰＳ細胞から多能性を有しない細胞を検出するための方法であって、以下からなる群：
Ｆ群：
（Ｇａｌ）２（Ｇｌｃ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｇａｌ）２（Ｇｌｃ）１、
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ６Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｇａｌ）２（ＧａｌＮＡｃ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｇａｌ）２（ＧａｌＮＡｃ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｇａｌ）３（ＧａｌＮＡｃ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２、
Ｇ群：
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１、
（Ｇａｌ）２（Ｇｕｌ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）３、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２ＳＮＳ
から選択される少なくとも１つの糖鎖について、被験細胞における該糖鎖の量を測定するステップと、該量を正常ｉＰＳにおける該糖鎖の量と比較するステップを含んでなり、
該糖鎖がＦ群から選択される場合は被験細胞において該糖鎖が検出されないかまたは該正常ｉＰＳ細胞における糖鎖の量と比較して減少しているときに、
該糖鎖がＧ群から選択される場合は被験細胞において該糖鎖の量が該正常ｉＰＳ細胞における糖鎖の量と比較して増加しているときに、該被検細胞は多能性を有しない細胞であると判定される、方法。
【請求項１６】
樹立したｉＰＳ細胞から多能性を有しない細胞を検出するためのマーカーとしての、以下からなる群
（Ｇａｌ）２（Ｇｌｃ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）２、
（Ｇａｌ）２（Ｇｌｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１、
（Ｇａｌ）２（Ｇｕｌ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１（Ｆｕｃ）１（Ｎｅｕ５Ａｃ）１、
（Ｈｅｘ）２（ＨｅｘＮＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１（ＮｅｕＡｃ）２、
（Ｈｅｘ）４（ＨｅｘＮＡｃ）２（Ｆｕｃ）１、
（Ｈｅｘ）５（ＨｅｘＮＡｃ）３、
ＣＳ−０Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ、
ＣＳ−２Ｓ４Ｓ、
ＣＳ−４Ｓ６Ｓ、
ＨＳ−０Ｓ、
ＨＳ−ＮＳ、
ＨＳ−２ＳＮＳ、
（Ｍａｎ）５（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）２（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｍａｎ）４（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）２、
（Ｇａｌ）２（ＧａｌＮＡｃ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１、
（Ｇａｌ）２（ＧａｌＮＡｃ）１（ＧｌｃＮＡｃ）１（ＮｅｕＡｃ）１および
（Ｇａｌ）３（ＧａｌＮＡｃ）１（ＧｌｃＮＡｃ）２
から選択される糖鎖の使用。
【国際調査報告】
2013186946.tif 000069
2013186946.tif 000070
2013186946.tif 000071
2013186946.tif 000072
2013186946.tif 000073
2013186946.tif 000074
2013186946.tif 000075
2013186946.tif 000076
2013186946.tif 000077