(57)【要約】  本発明は、好熱性糸状菌由来のタンパク質であって、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質である。本発明は、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性（特にマルトースに対する作用性が低いこと）にも優れているというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、従来よりもさらに熱安定性に優れた、グルコース測定用の酵素を提供する。
2014045912.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
好熱性糸状菌由来のタンパク質であって、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質。
（ａ）  配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）  配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ）  上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）  上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３】
配列番号５〜７の塩基配列、ならびに、配列番号８および９の塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列でコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【請求項４】
好熱性糸状菌由来である、請求項２または３に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記好熱性糸状菌は、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉまたはＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓである、請求項１または４に記載のタンパク質。
【請求項６】
糖鎖が付加された、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項８】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
（Ａ）  配列番号３または４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ）  配列番号３または４に記載の塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｃ）  上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ、
（Ｄ）  上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項７または８に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項７または８に記載の遺伝子を含む形質転換体。
【請求項１１】
請求項７または８に記載の遺伝子を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質を用いたグルコースセンサ。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質を用いたバイオ燃料電池。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該遺伝子を含む形質転換体、上記遺伝子または上記形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法、ならびに、上記タンパク質を用いたグルコースセンサ、グルコース濃度測定方法およびバイオ燃料電池に関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサには、グルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の従来の例としては、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼは、血糖センサ用酵素として古くから利用されているが、その理由は、グルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有しているからである。【０００３】
グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいて、グルコースの測定は、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることによってなされる。しかし、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため、溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。【０００４】
このような問題を回避するために、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存性またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）依存性のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（ＮＡＤ（Ｐ）ＧＤＨ：ＥＣ１．１．１．４７）や、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性のＧＤＨ（ＰＱＱＧＤＨ：ＥＣ１．１．５．２）が、血糖センサ用酵素として用いられている。【０００５】
これらは、溶存酸素の影響を受けない点で有利である。しかし、ＮＡＤ（Ｐ）ＧＤＨは安定性に乏しく、補酵素の添加が必要であり測定が煩雑であるといった欠点がある。また、ＰＱＱＧＤＨは基質特異性に乏しく、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため、測定値の信頼性に乏しいという欠点がある。【０００６】
このような欠点が解消された酵素として、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素（ＦＡＤＧＤＨ：ＥＣ１．１．９９．１０）が注目されている。ＦＡＤＧＤＨは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素としてグルコースからＤ−グルコノ−１，５−ラクトンへの酸化反応を触媒する酵素であり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅやＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓといった常温性糸状菌から発見されている。ＦＡＤＧＤＨは、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているという利点を有している。【０００７】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のＦＡＤＧＤＨについては、例えば、特許文献１（国際公開第２００４／０５８９５８号）、特許文献２（国際公開第２００６／１０１２３９号）、特許文献３（特開２００８−１７８３８０号公報）、特許文献４（特開２００８−１５４５７３号公報）、特許文献５（特開２００８−１５４５７４号公報）、特許文献６（特開２０１０−１９３９１３号公報）、特許文献７（国際公開第２００８／００１９０３号公報）、特許文献８（特開２０１１−５５８３６号公報）、特許文献９（特開２０１１−２１７７５５号公報）に開示されている。【０００８】
酵素等を含むグルコースセンサ用試薬の作製工程において、酵素に加熱乾燥処理を施す場合があり、グルコースセンサ用試薬等の保管時の環境温度が高温になる場合も考えられるため、グルコースセンサに用いる酵素は熱安定性が高いことが望ましい。【０００９】
上述のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨは、野生株から培養・精製して得られたものである場合は、ある程度の熱安定性を有している。しかし、大量生産に最も適している遺伝子組換え大腸菌での発現によって製造されたＦＡＤＧＤＨは、野生株から培養・精製して得られたＦＡＤＧＤＨと比べて、熱安定性が大きく劣ることが分かっている（特許文献１０：国際公開第２００９／１１９７２８号）。なお、このように熱安定性が低下するのは、遺伝子組換え大腸菌によって生産された酵素には、表面に糖鎖が付加されていないためであると考えられている。【００１０】
このような遺伝子組換え大腸菌での発現によって製造されたＦＡＤＧＤＨの熱安定性を向上させるために、例えば、遺伝子レベルでアミノ酸配列を改変する方法が検討されている（特許文献１０）。ここでは、特定の変異を加えたＦＡＤＧＤＨの構造遺伝子を用いて大腸菌で組換えＦＡＤＧＤＨを発現させた場合に、野生株で産生されたＦＡＤＧＤＨと同等程度の熱安定性（５０℃で１５分間加熱処理した場合のＧＤＨ活性の安定性）を有するＦＡＤＧＤＨが得られることを開示している。しかし、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨを部分的に改変したものであるため、野生株のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨよりも、さらに熱安定性に優れ、より過酷な条件でも失活し難い特性を有するＦＡＤＧＤＨを得ることは容易でないと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００４／０５８９５８号
【特許文献２】国際公開第２００６／１０１２３９号
【特許文献３】特開２００８−１７８３８０号公報
【特許文献４】特開２００８−１５４５７３号公報
【特許文献５】特開２００８−１５４５７４号公報
【特許文献６】特開２０１０−１９３９１３号公報
【特許文献７】国際公開第２００８／００１９０３号公報
【特許文献８】特開２０１１−５５８３６号公報
【特許文献９】特開２０１１−２１７７５５号公報
【特許文献１０】国際公開第２００９／１１９７２８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性（特にマルトースに対する作用性が低いこと）にも優れているというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、従来よりもさらに熱安定性に優れた、グルコース測定用の酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、好熱性糸状菌由来のタンパク質であって、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質である。【００１４】
また、本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質にも関する。
（ａ）  配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）  配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）  上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）  上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
なお、このタンパク質も好熱性糸状菌由来であることが好ましい。【００１５】
また、本発明は、配列番号５〜７の塩基配列、ならびに、配列番号８および９の塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列でコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質にも関する。なお、このタンパク質も好熱性糸状菌由来であることが好ましい。【００１６】
前記好熱性糸状菌は、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉまたはＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓであることが好ましい。また、上記のタンパク質は、糖鎖付加されたタンパク質であることが好ましい。【００１７】
また、本発明は、上記のタンパク質をコードする遺伝子にも関する。
また、本発明は、以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子にも関する。【００１８】
（Ａ）  配列番号３または４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ）  配列番号３または４に記載の塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｃ）  上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ、
（Ｄ）  上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。【００１９】
また、本発明は、上記の遺伝子を含む組換えベクターにも関する。
また、本発明は、上記の遺伝子を含む形質転換体にも関する。【００２０】
また、本発明は、上記の遺伝子を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法にも関する。【００２１】
また、本発明は、上記の形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法にも関する。【００２２】
また、本発明は、上記のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬にも関する。
また、本発明は、上記のタンパク質を用いたグルコースセンサにも関する。【００２３】
また、本発明は、上記のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法にも関する。
また、本発明は、上記のタンパク質を用いたバイオ燃料電池にも関する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明においては、好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質（酵素）を見出したことにより、溶存酸素の影響を受けず、補酵素の添加も必要なく、そして、基質特異性にも優れているというＦＡＤＧＤＨの優れた特性を保ちつつ、従来よりもさらに熱安定性に優れた、グルコース測定用の酵素を提供することができる。また、このようなグルコース測定用酵素を用いることにより、グルコース濃度測定試薬やグルコースセンサ作製時や輸送時の酵素の熱失活が低減され、該酵素の使用量低減や測定精度の向上が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例１でのＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ（ＮＢＲＣ３１２３２）の縮重ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図２】実施例１でのＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ（ＮＢＲＣ９１２９）の縮重ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図３】実施例１でのＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ（ＮＢＲＣ９８１６）の縮重ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図４】Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を示す図である。
【図５】図４に示す塩基配列におけるエキソンの構成を示す模式図である。
【図６】Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦの塩基配列と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す図である。
【図７】好熱性糸状菌（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ）由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列と、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列の相同性を示す図である。
【図８】Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を示す図である。
【図９】図８に示す塩基配列におけるエキソンの構成を示す模式図である。
【図１０】Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦの塩基配列と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す図である。
【図１１】実施例４のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図１２】実施例５のＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨについての吸収スペクトルを示す図である。
【図１３】実施例５のＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨについての吸収スペクトルを示す図である。
【図１４】実施例８のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図１５】実施例９のＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨについての吸収スペクトルを示す図である。
【図１６】実施例９のＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨについての吸収スペクトルを示す図である。
【図１７】実施例１０のｐＨ安定性評価におけるＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨの残活性率を示すグラフである。
【図１８】実施例１０のｐＨ安定性評価におけるＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの残活性率を示すグラフである。
【図１９】実施例１０のｐＨ依存性評価におけるＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨの相対活性を示すグラフである。
【図２０】実施例１０のｐＨ依存性評価におけるＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの相対活性を示すグラフである。
【図２１】実施例１０の温度安定性評価におけるＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨの残活性率を示すグラフである。
【図２２】実施例１０の温度安定性評価におけるＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの残活性率を示すグラフである。
【図２３】実施例１０の温度依存性評価におけるＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨの相対活性を示すグラフである。
【図２４】実施例１０の温度依存性評価におけるＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの相対活性を示すグラフである。
【図２５】実施例１０のグルコースセンサーチップでの応答性評価におけるＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ（glycosylated）についての電流値を示すグラフである。
【図２６】実施例１０のグルコースセンサーチップでの応答性評価におけるＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ（non  glycosylated）についての電流値を示すグラフである。
【図２７】実施例１０のグルコースセンサーチップでの応答性評価におけるＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ（glycosylated）についての電流値を示すグラフである。
【図２８】実施例１０のグルコースセンサーチップでの応答性評価におけるＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ（non  glycosylated）についての電流値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（実施形態１）
本実施形態の発明は、好熱性糸状菌由来のタンパク質であって、ＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質（酵素）である。
【００２７】
これまで、好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質は知られておらず、ＦＡＤＧＤＨの熱安定性を向上する方策としての、好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質の探索も行われていなかった。また、好熱性糸状菌の産生するタンパク質を分析することにより、ＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質を探索するのは、ＦＡＤＧＤＨの産生量がごく微量であるため、現実的には困難である。
【００２８】
本発明者らは、好熱性糸状菌のゲノムＤＮＡを独自の手法で調べることにより、いくつかの好熱性糸状菌がＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質を産生していることを見出した。すなわち、ＦＡＤＧＤＨを産生することが知られている常温性糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌）に由来するＦＡＤＧＤＨの一次構造（アミノ酸配列）の共通部分に着目し、該共通部分のうちの特定のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当するプライマーを用いて、好熱性糸状菌ゲノムＤＮＡを鋳型とする縮重ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行ない、そのＰＣＲ産物を分析することにより、好熱性糸状菌がＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質を産生しているかどうかを判別することができた。
【００２９】
常温性糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列の共通部分のうちの特定のアミノ酸配列は、好ましくは、ＹＤＹＩＶＶＧＧＧＴＳＧＬ、ＱＶＬＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴＩＮＧＭＡＹＴＲＡＥＤＶＱＩＤ、ＲＳＮＦＨＰＶＧＴＡＡＭＭ、または、ＮＶＲＶＶＤＡＳＶＬＰＦＱＶＣＧＨＬＶＳＴＬＹＡＶＡＥＲＡである。
【００３０】
縮重ＰＣＲ用のプライマーは、これらのアミノ酸配列の少なくとも一部をコードする塩基配列またはこれと相補的な塩基配列を含むプライマーを用いることが好ましい。
【００３１】
このような好ましいプライマーのうち、センスプライマーの塩基配列としては、
（Ａ）  ５’−ＴＡＹＧＡＹＴＡＹＡＴＣＧＴＴＹＴＫＧＧＡＧＧＣＧＧ−３’（配列番号５）、
（Ｂ）  ５’−ＣＡＡＧＴＫＣＴＮＣＧＴＧＣＲＧＧＲＡＡＧＧＣＣＣＴＴＧＧ−３’（配列番号６）、
（Ｃ）  ５’−ＡＣＳＣＧＣＧＣＭＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＡＴ−３’（配列番号７）
が挙げられる。
【００３２】
アンチセンスプライマーの塩基配列としては、
（Ｄ）  ５’−ＣＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＭＧＴＫＣＣＧＡＣＧＧＧＲＴＧＧＡＡＧＴＴ−３’（配列番号８）、
（Ｅ）  ５’−ＧＴＧＣＴＭＡＣＣＡＡＲＴＧＧＣＣＧＣＡＲＡＣＣＴＧＧＡＡ−３’（配列番号９）
が挙げられる。
【００３３】
したがって、本実施形態の具体的なタンパク質としては、配列番号５〜７の塩基配列、ならびに、配列番号８および９の塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの塩基配列でコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００３４】
好熱性糸状菌は、ＦＡＤＧＤＨ活性を有し、熱安定性に優れたタンパク質を産生するものであれば特に限定されないが、至適生育温度が３５°Ｃ以上であるか、あるいは、生育限界温度が５０°Ｃ以上であることが好ましい。より好ましい好熱性糸状菌は、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）またはＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ（Ｔｈ．  ｃｒｕｓｔａｓｅｕｓ）である。
【００３５】
本発明のタンパク質（酵素）は、糖鎖が付加されたものであることが好ましい。一般に糖鎖が付加されたタンパク質は糖鎖が付加されたタンパク質よりも熱安定性等に優れる場合が多いからである。ただし、本発明のＦＡＤＧＤＨ活性を有する組換えタンパク質は、意外にも、表面に糖鎖が付加されている場合（例えば、組換え酵母や好熱性糸状菌の野生株が産生したＦＡＤＧＤＨ）だけでなく、表面に糖鎖が付加されていない場合（例えば、組換え大腸菌によりＦＡＤＧＤＨを製造した場合）でも、従来と比べれば比較的優れた熱安定性を有する傾向を有している。このため、実用的に問題のない熱安定性を有するものが得られる限り、組換え大腸菌により糖鎖が付加されていない組換えＦＡＤＧＤＨを製造してもよく、この場合、製造効率の面では非常に有利であり、大幅な製造コストの削減が可能である。なお、熱安定性は、所定の温度および時間の熱処理後に、酵素のＦＡＤＧＤＨ活性を測定し、その熱処理前のＦＡＤＧＤＨ活性値に対する比率を求めることにより判断される。ＦＡＤＧＤＨ活性は、種々公知の方法で測定することができる。
【００３６】
（実施形態２）
本実施形態の発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質である。
（ａ）  配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）  配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ）  上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｄ）  上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ、フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【００３７】
配列番号１は、「野生型のＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列」であって、シグナルペプチドも含んでいる。配列番号２は、「野生型のＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列」であって、シグナルペプチドも含んでいる。Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉおよびＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓはいずれも好熱性糸状菌である。
【００３８】
シグナルペプチドは、糸状菌等によるタンパク質分子の生合成の過程において、細胞内で生合成されたタンパク質を、適切な場所に輸送するために不可欠な構造である。シグナルペプチド部分は、例えば配列番号１のような「シグナルペプチドを含むアミノ酸配列」をコードする遺伝子の情報に基づいて、いったんは合成されるが、最終的にはその役割を終えたのち切除される。
【００３９】
なお、本実施形態のタンパク質も、好熱性糸状菌由来のタンパク質であることが好ましい。
【００４０】
（実施形態３）
本実施形態の発明は、上記実施形態１または２のタンパク質をコードする遺伝子である。具体的には、以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
（Ａ）  配列番号３または４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ）  配列番号３または４に記載の塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列を除いた塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｃ）  上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ、
（Ｄ）  上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００４１】
配列番号３は、「野生型のＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の塩基配列」であって、シグナルペプチドをコードする塩基配列および終止コドンも含んでいる。配列番号４は、「野生型のＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来のＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の塩基配列」であって、シグナルペプチドをコードする塩基配列および終止コドンも含んでいる。
【００４２】
「上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含むＤＮＡ」とは、上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列をエキソンとし、そのエキソン配列の途中にイントロン配列が介在しているＤＮＡである。
【００４３】
また、本実施形態の遺伝子には、上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も含まれる。
【００４４】
ここで、ストリンジェントな条件とは、用いられるプローブ・標識方法によっても異なるが、例えば、ハイブリダイズの条件としては、「０．０２％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ中で４０〜７０℃」の条件が挙げられる。なお、ストリンジェントな条件は、結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。ハイブリダイズ後の洗浄条件としては、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温（２５℃）」の条件が挙げられる。ストリンジェントな条件では、配列番号３または４に示す塩基配列と９０％以上の相同性、好ましくは９５％以上の相同性、より好ましくは９７％以上の相同性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることが好ましい。
【００４５】
本実施形態の遺伝子の塩基配列は、これらの具体例に限定されず、実施形態１または２のタンパク質をコードするものであればよく、ＦＡＤＧＤＨの発現を向上させるように、コドン出現頻度（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）を変えた塩基配列なども含まれる。
【００４６】
（実施形態４）
本実施形態の発明は、実施形態３の遺伝子を含む組換えベクターである。実施形態３の遺伝子は、例えば、プラスミドベクターと連結された状態にて宿主微生物に導入され、該宿主はＦＡＤＧＤＨを生産する形質転換体となる。
【００４７】
（実施形態５）
本実施形態の発明は、実施形態３の遺伝子を含む形質転換体である。形質転換体の宿主としては、大腸菌、酵母、糸状菌、動物細胞、昆虫細胞など目的に応じて様々な宿主を用いることができるが、好ましくは大腸菌、酵母、糸状菌等の微生物由来の真核生物である。生産効率の点からは大腸菌を用いることが好ましい。大腸菌としては、例えば、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌Ｃ６００などが使用できる。また、糖鎖が付加されたタンパク質を生産するためには、宿主として真核生物を用いることが好ましい。真核生物の中でも酵母は産業上多くの利用実績があり、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅが使用できる。
【００４８】
本実施形態の具体例としては、例えば、実施形態４の組換えベクターで形質転換された大腸菌または酵母が挙げられる。
【００４９】
（実施形態６）
本実施形態の発明は、実施形態３の遺伝子を用いた好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨの製造方法である。本実施形態では、例えば、実施形態５の形質転換体を用いることにより、ＦＡＤＧＤＨを製造することができる。具体的には、例えば、以下に示すような手順で製造することが可能である。
【００５０】
好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨの遺伝情報を有するＤＮＡ（実施形態３の遺伝子）は、プラスミドベクターと連結された状態にて宿主に導入される。宿主については、上記実施形態５で説明した宿主と同様である。なお、大腸菌でＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質を生産する場合、上記遺伝子のＮ末端にあるシグナルペプチドを残したままでは十分な生産能が得られないことがあるため、シグナルペプチド（ゲノム情報からシグナルペプチドと推定されるアミノ酸配列）を削除した上記遺伝子を大腸菌に導入することが好ましい。
【００５１】
宿主に組換えベクターを導入する方法としては、例えば宿主が大腸菌に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの導入を行う方法などを採用することができる。また、エレクトロポレーション法を用いても良い。さらに、市販のコンピテントセル（例えばコンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績）を用いても良い。宿主が酵母の場合には、スフェロプラスト法や酢酸リチウム法などが用いられる。また、エレクトロポレーション法などを用いても良い。宿主が糸状菌の場合には、プロトプラスト化された細胞等が用いられる。
【００５２】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＦＡＤＧＤＨを安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００５３】
培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００５４】
培地温度は菌が発育し、ＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、大腸菌の場合、好ましくは２０〜４２℃程度であり、酵母の場合、好ましくは２０〜３５℃程度である。培養時間は培養条件によって異なるが、ＦＡＤＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、通常は６〜７２時間程度である。培地ｐＨは菌が発育しＦＡＤＧＤＨを生産する範囲で適宜変更しうるが、特に好ましくはｐＨ５．０〜９．０程度である。
【００５５】
培養物中のＦＡＤＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般にはＦＡＤＧＤＨが培養液中に存在する場合は、濾過、遠心分離などにより、タンパク質の含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。一方、ＦＡＤＧＤＨが菌体内に存在する場合は、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加してＦＡＤＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００５６】
このようにして得られたＦＡＤＧＤＨ含有溶液からＦＡＤＧＤＨを回収する方法としては、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニムや硫酸ナトリウムなどを用いた塩析処理、または、親水性有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、アセトン）による分別沈殿法が挙げられる。また、加温処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤或やゲル濾過剤などを用いたゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、ＦＡＤＧＤＨを精製することもできる。
【００５７】
好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨの製造はこのような方法に限定されず、例えば、実施形態３の遺伝子を用いて無細胞タンパク質翻訳系によって好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨを製造することも可能である。
【００５８】
（実施形態７）
本実施形態の発明は、実施形態１または２のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬を用いたグルコースセンサである。
【００５９】
グルコース濃度測定試薬は、実施形態６の方法により製造されたＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回の測定に十分な量で含む。また、グルコース濃度測定試薬は、該ＦＡＤＧＤＨ以外に、例えば、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液を含み得る。グルコース濃度測定試薬の形態は特に限定されないが、グルコースセンサ用に適した種々の形態（例えば、凍結乾燥された試薬や、適切な保存容器中の溶液）で提供され得る。
【００６０】
グルコースセンサに用いられる電極は、特に限定されないが、カーボン電極、金電極、白金電極などを用いることができる。例えば、この電極上には、本発明のタンパク質（酵素：ＦＡＤＧＤＨ）が固定化される。
【００６１】
固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて、本発明のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドを架橋する方法が用いられる。
【００６２】
（実施形態８）
本実施形態の発明は、実施形態１または２のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法である。グルコース濃度の測定は、例えば、以下のようにして行うことができる。
【００６３】
恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００６４】
（実施形態９）
本実施形態の発明は、実施形態１または２のタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）を用いたバイオ燃料電池である。ＦＡＤＧＤＨは、グルコースの脱水素反応を触媒し、この反応により生じた電子が電力として供給される。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００６６】
（実施例１）
独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物資源部門（ＮＢＲＣ）より購入した表１に示す好熱性糸状菌１７種を対象として、好熱性糸状菌からのＦＡＤＧＤＨ遺伝子のスクリーニングを行った。【００６７】
【表１】
2014045912.tif 000003
【００６８】
購入した好熱性糸状菌は、ポテトデキストロース培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または麦芽エキス培地（２％麦芽エキス、２％グルコース、０．１％ペプトン）を用いて好気的に培養した。培養後の好熱性糸状菌からＷｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。【００６９】
既報のアスペルギルス属糸状菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）に由来するＦＡＤＧＤＨの一次構造（アミノ酸配列）の共通部分に着目して、本発明者らが独自に設計した後述のプライマーを用いて、好熱性糸状菌ゲノムＤＮＡを鋳型とする縮重ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行なった。【００７０】
縮重ＰＣＲ用のセンスプライマーとしては、
プライマーＡ（５’−ＴＡＹＧＡＹＴＡＹＡＴＣＧＴＴＹＴＹＧＧＡＧＧＣＧＧ−３’）、
プライマーＢ（５’−ＣＡＡＧＴＫＣＴＮＣＧＴＧＣＲＧＧＲＡＡＧＧＣＣＣＴＴＧＧ−３’）、
プライマーＣ（５’−ＡＣＳＣＧＣＧＣＭＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＡＴ−３’）
のいずれかを用いた。【００７１】
アンチセンスプライマーとしては、
プライマーＤ（５’−ＣＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＣＭＧＴＫＣＣＧＡＣＧＧＧＲＴＧＧＡＡＧＴＴ−３’）、
プライマーＥ（５’−ＧＴＧＣＴＭＡＣＣＡＡＲＴＧＧＣＣＧＣＡＲＡＣＣＴＧＧＡＡ−３’）のいずれかを用いた。【００７２】
なお、上記プライマーＡ〜Ｅは配列中にミックス塩基（Ｋ、Ｎ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｙ）を含んでいるが、プライマーＡ〜Ｅの各々は、ミックス塩基の箇所において塩基配列が異なる複数種のプライマーの混合物を意味する。【００７３】
上記１７種の好熱性糸状菌から得たゲノムＤＮＡを鋳型として、上記３種のセンスプライマーと２種のアンチセンスプライマーとの組み合わせによる６通りの縮重ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動（１．２％アガロースゲル）に供し、泳動後のゲルについて臭化エチジウム染色を施すことによりＰＣＲ産物の存在を確認した。【００７４】
その結果、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ（ＮＢＲＣ３１２３２）、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ（ＮＢＲＣ９１２９）、および、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ（ＮＢＲＣ９８１６）の３種の好熱性糸状菌のゲノムを鋳型として得られたＰＣＲ産物について、約１．８ｋｂのＤＮＡバンドが検出された（図１〜図３中の＊印）。なお、図１〜３において、レーンＭはマーカーであり、レーン１はプライマーＡとＤの組合せを用いた場合、レーン２はプライマーＡとＥの組合せを用いた場合、レーン３はプライマーＢとＤの組合せを用いた場合、レーン４はプライマーＢとＥの組合せを用いた場合、レーン５はプライマーＣとＤの組合せを用いた場合、レーン６はプライマーＣとＥの組合せを用いた場合を示している。【００７５】
縮重ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に連結した後に、大腸菌ＤＨ５α（宝酒造）にサブクローニングした。挿入ＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、既報のアスペルギルス属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子と高い相同性を有する遺伝子断片の増幅が確認された。このことから、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉとＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓのゲノムにＦＡＤＧＤＨ遺伝子が存在することが示唆された。なお、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓのＮＢＲＣ９１２９とＮＢＲＣ９８１６は、同一のＦＡＤＧＤＨ遺伝子の塩基配列を含んでいた。【００７６】
なお、上記プライマーＡ〜Ｅ以外のいくつかのプライマーを用いてスクリーニングを行った場合は、アスペルギルス属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子と高い相同性を有する遺伝子断片の増幅は確認できなかった。【００７７】
（実施例２）
本実施例では、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨを大腸菌を用いて製造した。以下、詳細について説明する。【００７８】
（１）Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ（ＮＢＲＣ３１２３２）からのＦＡＤＧＤＨ遺伝子のクローニング
クローニングに先立ち、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子部分断片をプローブとするゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析を行なった。Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉゲノムＤＮＡを各種制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）で切断し、アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルに含まれているＤＮＡ断片を２０  Ｘ  ＳＳＣ（３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  クエン酸三ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いたキャピラリー法によりナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋；  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写した。転写後のナイロンメンブレンとジゴキシゲニン標識プローブＤＮＡ（ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；  Ｒｏｃｈｅ）を混合し、６５℃でハイブリダーゼーションを行なった。プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片はアルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて検出した。【００７９】
その結果、ＥｃｏＲＩのレーンから約４．０ｋｂの位置にプローブとハイブリダイズするＤＮＡバンドが検出された。既報のアスペルギルス属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が約１．８ｋｂであることから、プローブとハイブリダイズするこの約４．０ｋＢのＥｃｏＲＩ断片が、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の全領域を包括しているものと考えられた。【００８０】
次に、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲにより、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の開始コドン近傍領域を含む５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域と、終始コドン近傍領域を含む３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域のクローニングを試みた。ＥｃｏＲＩで切断したＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉのゲノムＤＮＡを調製用アガロースゲルに供し、約４．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をＴ４リガーゼ（宝酒造）により環状化し、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲの鋳型とした。【００８１】
Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子内部配列に基づいて設計したプライマー３１２３２ＧＳＰ３（５’−ＧＴＴＧＴＴＧＧＧＣＴＧＣＡＴＣＴＣＧＡＴＧＡＡＧＣＣ−３’）、および、プライマー３１２３２ＧＳＰ５（５’−ＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＣＧＧＡＣＣＴＣＴＴＴＧＧＣＡＡＣＣＧＣ−３’）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを行なった結果、約３．０ｋｂの位置に単一のＤＮＡ断片が検出された。【００８２】
このＤＮＡ断片をサブクローニングし塩基配列解析を行なったところ、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域と３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域の増幅に成功したことがわかった。【００８３】
次に、５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域および３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域の配列に基づいて設計したプライマー３１２３２ＧＳＰ９（５’−ＧＣＡＴＧＣＣＧＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＧＴＡＴＴＣＣＧＧＧＡＴ−３’）と３１２３２ＧＳＰ１０（５’−ＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＴＴＴＣＧＧＧＣＡＴＴＣＣＴＡＴＣＴＣＴ−３’）を用いてＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行なった。その結果、単一の約２．８ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が確認され、このＤＮＡ断片がＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含んでいることがわかった。【００８４】
（２）Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の塩基配列解析
Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列はプライマーウォーキング法により決定した。Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を図４に示す。【００８５】
スプライシング部位をＧＴ−ＡＧ則に基づいて予測することにより、この塩基配列中のエキソンとイントロンを特定した。Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子は、４つのエキソン（エキソン１；３４６ｂｐ、エキソン２；５９８ｂｐ、エキソン３；６１４ｂｐ、エキソン４；２２１ｂｐ）から構成される１７７９ｂｐのＯＲＦ（５９３アミノ酸をコード）を含んでいた(図４の下線部および図５参照）。【００８６】
図６に、このようにして特定されたＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦ（ＦＡＤＧＤＨコーディング領域）の塩基配列と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す。【００８７】
図６に示すアミノ酸配列について、シグナルペプチドの存在の有無およびシグナルペプチド切断部位を、シグナルペプチド予測サーバーＳｉｇｎａｌＰ４．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）により推測した。その結果、開始コドンに由来するメチオニン（Ｍｅｔ１）から１７番目のアラニン（Ａｌａ１７）までの配列がシグナルペプチドとして同定された。また、図６に示すアミノ酸配列において、ＦＡＤ結合に重要なＦＡＤ結合モチーフ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）は完全に保存されていた。【００８８】
さらに、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（図６）を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨと比較したところ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨと４２％の相同性を有し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨと４０％の相同性を有していた（図７）。【００８９】
（３）Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミドの作製
Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域をＯｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより合成した。【００９０】
まず、各エキソンをＰＣＲ増幅した。エキソン１のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、３１２３２ＧＳＰ１１（５’−ＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＧＣＣＧＧＡＣＣＧＴＴＧＧＣＡＴＣＣＴＣ−３’）と３１２３２Ｅ１Ａ（５’−ＧＧＣＣＡＴＴＣＣＡＴＴＧＡＴＣＧＴＧＣＴＣＧＴＧＣＣＴＣＣ−３’）を用いた。エキソン２のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、３１２３２Ｅ２Ｓ（５’−ＡＴＣＡＡＴＧＧＡＡＴＧＧＣＣＴＡＴＡＣＧＣＧＣＧＣＣＣＡＡ−３’）と３１２３２Ｅ２Ａ（５’−ＣＡＧＡＡＴＧＣＴＴＧＧＡＴＴＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＡＧ−３’）を用いた。エキソン３のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、３１２３２Ｅ３Ｓ（５−ＡＡＴＣＣＡＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＡＣＡＡＣＡＴＴ−３）と３１２３２Ｅ３Ａ（５’−ＣＧＡＣＣＧＡＴＡＴＧＴＣＴＣＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＧＣＣＴＣ−３）を用いた。エキソン４のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、３１２３２Ｅ４Ｓ（５’−ＧＡＧＡＣＡＴＡＴＣＧＧＴＣＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＣＣＣＧＴＣ−３’）と３１２３２ＧＳＰ１２（５’−ＧＣＧＴＣＡＡＴＴＧＣＣＣＡＡＴＣＴＧＧＣＣＧＣＡＴＣＣＴＣ−３’）を用いた。【００９１】
増幅したエキソン１とエキソン２をＯｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより連結し、また同時にエキソン３とエキソン４もＯｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより連結した。Ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ  により合成した両ＤＮＡ断片を再度Ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより連結し、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域を合成した。【００９２】
次に、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子コーディング領域を鋳型として、発現型プラスミド作製用プライマー３１２３２Ｅｓｃ２（５’−ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣ−３’）および３１２３２Ｅｓｃ４（５’−ＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧＣＣＣＡＡＴＣＴＧＧＣＣＧＣＡＴＣ−３’）を用いたＰＣＲを行ない、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子を増幅した。なお、増幅したＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子のＣ末端側にはヒスチジンタグを融合するためのヒスチジンのコドン（ＣＡＣ）が付加されている。【００９３】
増幅したＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した後に、大腸菌用発現ベクターｐＥＴ−２１ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）の同一制限酵素サイトに連結することにより、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミドを作製した。【００９４】
（４）Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の大腸菌における発現と組換え酵素の精製
Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミドを大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入した。発現型プラスミドを保有するＢＬＲ（ＤＥ３）をＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）で一晩培養した（前培養）。本培養用ＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）に前培養液を１％植菌し、４時間ほど３７℃で好気的に培養した。その後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１％となるように添加し、２５℃で約２０時間培養を続けた。【００９５】
培養後の大腸菌を集菌し、ＰＢＳ緩衝液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  リン酸水素二ナトリウム１２水和物、１．５ｍＭ  リン酸二水素カリウム、ｐＨ７．４）に懸濁することにより菌体を洗浄した。遠心分離により、再度集菌した菌体をＰＢＳ緩衝液に懸濁した。ＰＢＳ緩衝液に懸濁した菌体は超音波により破砕した。超音波破砕後の破砕液を遠心分離（８０００ｇ、１０分間、４℃）することにより上清（全菌体画分）と沈殿（未破砕菌体）に分離した。全菌体画分をさらに遠心分離（１２０００ｇ、２０分間、４℃）し、可溶性画分と不溶性画分とに分画した。可溶性画分をＰＢＳ緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ）カラム（直径０．７ｃｍ、高さ１．０ｃｍ）に供した。カラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄した後に、吸着したタンパク質を１００ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。【００９６】
溶出画分を２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム（直径０．７ｃｍ、高さ２．５ｃｍ）に供した。カラムを２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）で洗浄した後に、吸着したタンパク質を１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。溶出画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ＭＷＣＯ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩処理を施し、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ  １ｍＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に供した。吸着したタンパク質を０〜１．０Ｍ  ＮａＣｌ  直線濃度勾配（２０カラム体積）により溶出した。溶出画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  ＭＷＣＯ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩処理を施し、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ精製標品とした。【００９７】
なお、シグナルペプチドをコードする遺伝子を付加したＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミドを作製し大腸菌における発現を試みたが、発現は確認されなかった。【００９８】
（実施例３）
本実施例では、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ（ＮＢＲＣ９１２９）由来ＦＡＤＧＤＨを大腸菌を用いて製造した。以下、詳細について説明する。【００９９】
（１）Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ（ＮＢＲＣ９１２９）からのＦＡＤＧＤＨ遺伝子のクローニング
クローニングに先立ち、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子部分断片をプローブとするゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーション解析を行なった。Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓゲノムＤＮＡを各種制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルに含まれているＤＮＡ断片を２０  Ｘ  ＳＳＣを用いたキャピラリー法によりナイロンメンブレンに転写した。転写後のナイロンメンブレンとジゴキシゲニン標識したプローブＤＮＡを混合し、６５℃でハイブリダーゼーションを行なった。プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片はアルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体を用いて検出した。【０１００】
その結果、ＨｉｎｄＩＩＩのレーンの約５．０ｋｂの位置にプローブとハイブリダイズするＤＮＡバンドが検出された。既報のアスペルギルス属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦが約１．８ｋｂであることから、プローブとハイブリダイズするこの約５．０ｋＢのＨｉｎｄＩＩＩがＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を包括しているものと考えられた。【０１０１】
次に、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲにより、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の開始コドン近傍領域を含む５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域と終始コドン近傍領域を含む３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域のクローニングを試みた。【０１０２】
ＨｉｎｄＩＩＩで切断したＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓゲノムＤＮＡを調製用アガロースゲルに供し、約５．０  ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をＴ４リガーゼにより環状化し、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲの鋳型とした。Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子内部配列に基づいて設計したプライマー９１２９ＧＳＰ３（５’−ＧＣＴＧＣＣＧＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＣＧＴＡＧＧＴＣＣＡＧＣＣ−３’）、および、９１２９ＧＳＰ５（５’−ＧＧＣＡＧＣＡＡＣＧＴＧＡＣＡＡＡＣＧＴＧＧＣＣＡＡＧ−３’）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを行ない、約３．５ｋｂの位置に単一のＤＮＡ断片が検出された。このＤＮＡ断片をサブクローニングし塩基配列解析を行なったところ、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域と３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域の増幅に成功した。【０１０３】
次に、５’−および３’−ｆｌａｎｋｉｎｇ領域の配列に基づいて設計したプライマー９１２２９ＧＳＰ９（５’−ＣＴＣＧＡＧＣＡＡＴＴＴＡＡＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＧＡＣＧＧＴ−３’）と９１２９ＧＳＰ１０（５’−ＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＣＣＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＣＧＧＴ−３’）を用いてＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行なった。【０１０４】
その結果、電気泳動的に単一な約２．６ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が確認され、このＤＮＡ断片がＴｈ．  ｃｒｕａｔａｃｅｕｓ  ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含んでいることがわかった。【０１０５】
（２）Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の塩基配列解析
Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列はプライマーウォーキング法により決定した。Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子全領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列を図８に示す。【０１０６】
スプライシング部位をＧＴ−ＡＧ則に基づいて予測することにより、この塩基配列中のエキソンとイントロンを特定した。Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子は４つのエキソン（エキソン１；  ３１９  ｂｐ、エキソン２；  ６０４  ｂｐ、エキソン３；  ６２０  ｂｐ、エキソン４；  ２０９  ｂｐ）から構成される１７５２  ｂｐのＯＲＦ（５９４アミノ酸をコード）を含んでいた(図８の下線部および図９参照）。【０１０７】
図１０に、このようにして特定されたＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のＯＲＦ（ＦＡＤＧＤＨコーディング領域）の塩基配列と、その塩基配列から類推されるアミノ酸配列を示す。【０１０８】
図１０に示すアミノ酸配列について、シグナルペプチドの存在の有無およびシグナルペプチド切断部位をシグナルペプチド予測サーバーＳｉｇｎａｌＰ４．０により推測した。その結果、開始コドンに由来するメチオニン（Ｍｅｔ１）から１６番目のアラニン（Ａｌａ１６）までの配列がシグナルペプチドとして同定された。また、図１０に示すアミノ酸配列において、ＦＡＤ結合に重要なＦＡＤ結合モチーフ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）は完全に保存されていた。【０１０９】
さらに、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（図１０）を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌由来ＦＡＤＧＤＨと比較したところ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来ＦＡＤＧＤＨと５５％の相同性を有し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨと５６％の相同性を有していた（図７）。なお、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（図６）と、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列（図１０）とは、６２％の相同性を有していた。【０１１０】
（３）Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミドの作製
Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域をＯｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより合成した。【０１１１】
まず、各エキソンをＰＣＲ増幅した。エキソン１のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、９１２９ＧＳＰ１１（５’−  ＧＣＡＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＣＴＣＴＣＣ  −３’）と９１２９Ｅ１Ａ（５’−  ＧＧＣＣＡＴＧＣＣＧＴＴＧＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣ−３’）を用いた。エキソン２のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、９１２９Ｅ２Ｓ（５’−  ＡＴＣＡＡＣＧＧＣＡＴＧＧＣＣＴＡＴＡＣＣＣＧＴＧＣＧＧＡＧ  −３’）と９１２９Ｅ２Ａ（５’−  ＧＡＧＧＡＣＡＧＴＴＧＧＧＴＴＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＧＡＧＣＧ−３’）を用いた。エキソン３のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、９１２９Ｅ３Ｓ（５−  ＡＡＣＣＣＡＡＣＴＧＴＣＣＴＣＡＧＣＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＴＴ−３）と９１２９Ｅ３Ａ（５’−  ＧＧＡＡＣＧＡＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣ−３）を用いた。エキソン４のＰＣＲ増幅には、プライマーとして、９１２９Ｅ４Ｓ（５’−  ＴＣＴＧＴＣＴＣＴＣＧＴＴＣＣＡＡＣＴＴＣＣＡＣＣＣＣＧＴＣ  −３’）と９１２９ＧＳＰ１２（５’−  ＣＣＣＴＴＡＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＴＴＧＡＴＧＡＧＧＴＣ  −３’）を用いた。【０１１２】
増幅したエキソン１とエキソン２をＯｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより連結し、また同時にエキソン３とエキソン４もＯｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより連結した。Ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ  により合成した両ＤＮＡ断片を再度Ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲにより連結し、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子のコーディング領域を合成した。【０１１３】
次に、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子コーディング領域を鋳型として、発現型プラスミド作製用プライマーである９１２９Ｅｓｃ２（５’−ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＣＣＴＣＣＴＡＴＧＡＣＴＡＣＡＴＴＡＴＣ−３’）および９１２９Ｅｓｃ４（５’−ＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＴＴＧＡＴＧＡＧ−３’）を用いたＰＣＲを行ない、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子を増幅した。なお、増幅したＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子のＣ末端側にはヒスチジンタグを融合するためのヒスチジンのコドン（ＣＡＣ）が付加されている。【０１１４】
増幅したＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した後に、大腸菌用発現ベクターｐＥＴ−２１ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）の同一制限酵素サイトに連結することにより、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミドを作製した。【０１１５】
（４）Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の大腸菌における発現と組換え酵素の精製
Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミドを大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入した。発現型プラスミドを保有するＢＬＲ（ＤＥ３）をＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）で一晩培養した（前培養）。本培養用ＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）に前培養液を１％植菌し、４時間ほど３７℃で好気的に培養した。その後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１％となるように添加し、２５℃で約２０時間培養を続けた。【０１１６】
培養後の大腸菌を集菌し、ＰＢＳ緩衝液に懸濁することにより菌体を洗浄した。遠心分離により、再度集菌した菌体をＰＢＳに懸濁した。ＰＢＳ緩衝液に懸濁した菌体は超音波により破砕した。超音波破砕後の破砕液を遠心分離（８０００ｇ、１０分間、４℃）することにより上清（全菌体画分）と沈殿（未破砕菌体）を分離した。全菌体画分をさらに遠心分離（１２０００ｇ、２０分間、４℃）し、可溶性画分と不溶性画分とに分画した。可溶性画分をＰＢＳ緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ）カラム（直径０．７ｃｍ、高さ１．０ｃｍ）に供した。カラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄した後に、吸着したタンパク質を１００ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。【０１１７】
溶出画分を２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム（直径０．７ｃｍ、高さ２．５ｃｍ）に供した。カラムを２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後に、吸着したタンパク質を１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。溶出画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ＭＷＣＯ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩処理を施し、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ  １ｍＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に供した。吸着したタンパク質は０〜１．０Ｍ  ＮａＣｌの直線濃度勾配（２０カラム体積）により溶出した。溶出画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  ＭＷＣＯ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩処理を施し、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ精製標品とした。【０１１８】
なお、シグナルペプチドをコードする遺伝子を付加したＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子発現型プラスミドを作製し大腸菌における発現を試みたが、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨは、大腸菌細胞内で不溶性インクルージョンボディとして生産された。【０１１９】
（実施例４）
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
実施例２および３で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品（大腸菌で発現し、精製されたＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを含む溶液）中のタンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度は、市販のタンパク質定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ；  サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いたＢＣＡ法により測定した。なお、該キットでは、標準タンパク質としては牛血清アルブミンを使用している。得られた濃度測定値に基づいて、ＦＡＤＧＤＨ５μｇを含む精製標品を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。【０１２０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉの方法に準じて行なった。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとしては、「ｅ−ＰＡＧＥＬ  １２．５％」（アトー株式会社）を使用した。泳動後のゲルはＣＢＢ（Coomassie  Brilliant  Blue）ベースの染色液「ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ」（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）により染色した。タンパク質マーカーには、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ  （１０−２５０ｋＤａ）」（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を使用した。【０１２１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１１に示す。図１１に示されるように、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの両者共に、電気泳動的に単一な精製標品の取得に成功したことがわかった。【０１２２】
（実施例５）
＜吸収スペクトル計測＞
実施例２および３で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品（大腸菌で発現し、精製されたＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを含む溶液）を実施例４での濃度測定値に基づいて希釈し、５００μｇ／ｍＬの酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。該ＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルを、ＵＶ／可視分光光度計ＤＵ−８００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）用いて計測した。また、上記ＦＡＤＧＤＨ溶液にグルコースを終濃度１００ｍＭとなるように添加した溶液、および、上記ＦＡＤＧＤＨ溶液に還元剤である亜二チオン酸ナトリウム粉末を添加した溶液についても同様に吸収スペクトルを計測した。得られた吸収スペクトルを図１２（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ）、図１３（Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）に示す。【０１２３】
図１２および１３に示されるように、ＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルでは、典型的なＦＡＤ由来のピークが観察された（図１２および１３の「ＦＡＤＧＤＨ」）。一方、グルコース添加後のＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルでは、ＦＡＤに由来するピーク（３５０〜５００ｎｍの吸収ピーク）が消失した（図１２および１３の「ＦＡＤＧＤＨ＋グルコース」）。亜二チオン酸ナトリウム添加後のＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルでも、ＦＡＤに由来するピークは消失した（図１２および１３の「ＦＡＤＧＤＨ＋亜二チオン酸ナトリウム」）。【０１２４】
これらの結果から、大腸菌にて発現し、精製されたＦＡＤＧＤＨ（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ、および、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）は、両者共に補酵素として酸化型ＦＡＤを含んだホロ型酵素として精製されたことが分かる。したがって、大腸菌によって生産された本発明の好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨは、補酵素の添加を必要とせずにグルコース濃度測定試薬などとして使用できるというＦＡＤＧＤＨの利点を有している。【０１２５】
（実施例６）
本実施例では、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨを酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いて製造した。以下、詳細について説明する。【０１２６】
まず、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子コーディング領域を鋳型として、分泌発現型プラスミド作製用プライマー３１２３２Ｐｉｃ１（５’-ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣ−３’）および３１２３２Ｐｉｃ２（５’-ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧＣＣＣＡＡＴＣＴＧＧＣＣＧＣＡＴＣ−３’）を用いたＰＣＲを行ない、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子を増幅した。なお、増幅したＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子のＣ末端側にはヒスチジンタグを融合するためのヒスチシ゛ンのコドン（ＣＡＣ）が付加されている。増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断した後に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）用分泌発現ベクターｐＰＩＣ９（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の同一制限酵素サイトに連結することにより、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドを作製した。成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子をｐＰＩＣ９に連結することにより、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の上流には酵母用シグナル配列が融合されている。【０１２７】
Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５株（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に導入した。分泌発現型プラスミドを導入したＧＳ１１５株をＢＭＧ培地（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液：ｐＨ６．０、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール）で２日間培養した（前培養）。前培養により取得した菌体をＢＭＭ培地（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液：ｐＨ６．０、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０−５％ビオチン、０．５％メタノール）に植菌し、５日間ほど３０℃で好気的に培養した。【０１２８】
培養後の培養上清を回収し、ＰＢＳ緩衝液に対して透析を行なった。透析後の培養上清をＰＢＳ緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ）カラム（直径２．０ｃｍ、高さ２．０ｃｍ）に供した。カラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄した後に、吸着したタンパク質を２００ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。溶出画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  ＭＷＣＯ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩処理を施し、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ精製標品とした。【０１２９】
（実施例７）
本実施例では、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いて製造した。以下、詳細について説明する。【０１３０】
まず、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子コーディング領域を鋳型として、分泌発現型プラスミド作製用プライマー９１２９Ｐｉｃ１（５’-ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＣＣＴＣＣＴＡＴＧＡＣＴＡＣＡＴＴＡＴＣ−３’）および９１２９Ｐｉｃ２（５’-ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＴＴＧＡＴＧＡＧ−３’）を用いたＰＣＲを行ない、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子を増幅した。なお、増幅したＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子のＣ末端側にはヒスチジンタグを融合するためのヒスチジンのコドン（ＣＡＣ）が付加されている。増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断した後に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ用分泌発現ベクターｐＰＩＣ９（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の同一制限酵素サイトに連結することにより、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドを作製した。成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子をｐＰＩＣ９に連結することにより、成熟型ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の上流には酵母用シグナル配列が融合されている。【０１３１】
Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ遺伝子分泌発現型プラスミドをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５株（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に導入した。分泌発現型プラスミドを導入したＧＳ１１５株をＢＭＧ培地（１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０−５％ビオチン、１％グリセロール）で２日間培養した（前培養）。前培養により取得した菌体をＢＭＭ培地（１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０、１．３４％酵母ニトロゲンベース、４×１０−５％ビオチン、０．５％メタノール）に植菌し、５日間ほど３０℃で好気的に培養した。
培養後の培養上清を回収し、ＰＢＳ緩衝液に対して透析を行なった。透析後の培養上清をＰＢＳ緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ）カラム（直径２．０ｃｍ、高さ２．０ｃｍ）に供した。カラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄した後に、吸着したタンパク質を２００ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。溶出画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  ＭＷＣＯ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩処理を施し、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ精製標品とした。【０１３２】
（実施例８）
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
実施例６および７で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにて発現し、精製されたＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）について、ＦＡＤＧＤＨ精製液中のタンパク質濃度を実施例４と同様にして測定した。この濃度測定値に基づいて、ＦＡＤＧＤＨ５μｇを含む精製標品を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。【０１３３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉの方法に準じて行なった。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとしては、「ｅ−ＰＡＧＥＬ  １２．５％」（アトー株式会社）を使用した。泳動後のゲルはＣＢＢ（Coomassie  Brilliant  Blue）ベースの染色液「ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ」（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）により染色した。タンパク質マーカーには、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ  （１０−２５０ｋＤａ）」（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を使用した。【０１３４】
また、別途、染色液として、ＰＡＳ（Periodic  acid−Schiff  stain）染色液を用いる以外は、同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。なお、ＰＡＳ染色液は、糖を選択的に酸化してアルデヒドを生成し、シッフ試薬によって赤紫色に変色する。【０１３５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１４に示す。なお、図の左側がＣＢＢベースの染色液を用いた場合、図の右側がＰＡＳ染色液を用いた場合の結果である。図１４（左側）に示されるように、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの両者共に、電気泳動的に単一な精製標品の取得に成功したことがわかった。また、図１４（右側）に示されるように、これらの精製標品は、いずれも糖鎖付加されたタンパク質（ＦＡＤＧＤＨ）であることが分かった。【０１３６】
（実施例９）
＜吸収スペクトル計測＞
実施例６および７で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにて発現し、精製されたＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）を実施例８での濃度測定値に基づいて希釈し、２ｍｇ／ｍＬの酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。該ＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルを、ＵＶ／可視分光光度計ＤＵ−８００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）用いて計測した。また、上記ＦＡＤＧＤＨ溶液にグルコースを終濃度１５０ｍＭとなるように添加した溶液、および、上記ＦＡＤＧＤＨ溶液に還元剤である亜二チオン酸ナトリウム粉末を添加した溶液についても同様に吸収スペクトルを計測した。得られた吸収スペクトルを図１５（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ）、図１６（Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）に示す。【０１３７】
図１５および１６に示されるように、ＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルでは、典型的なＦＡＤ由来のピークが観察された（図１５および１６の「ＦＡＤＧＤＨ」）。一方、グルコース添加後のＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルでは、ＦＡＤに由来するピーク（３５０〜５００ｎｍの吸収ピーク）が消失した（図１５および１６の「ＦＡＤＧＤＨ＋グルコース」）。亜二チオン酸ナトリウム添加後のＦＡＤＧＤＨ溶液の吸収スペクトルでも、ＦＡＤに由来するピークは消失した（図１５および１６の「ＦＡＤＧＤＨ＋亜二チオン酸ナトリウム」）。【０１３８】
これらの結果から、酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）にて発現し、精製されたＦＡＤＧＤＨ（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ、および、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）は、補酵素として酸化型ＦＡＤを含んだホロ型酵素として精製されたことが分かる。したがって、酵母によって生産された本発明の好熱性糸状菌由来のＦＡＤＧＤＨは、補酵素の添加を必要とせずにグルコース濃度測定試薬などとして使用できるというＦＡＤＧＤＨの利点を有している。【０１３９】
（実施例１０）
本実施例では、実施例２および３で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品（大腸菌で発現し、精製されたＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを含む溶液）、ならびに、実施例６および７で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにて発現し、精製されたＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）について（計４種のＦＡＤＧＤＨ精製標品）、ＦＡＤＧＤＨの酵素活性に関する以下の各種特性（ｐＨ安定性、ｐＨ依存性、温度安定性、温度依存性、基質特異性、グルコースセンサーチップでの応答性）に関する評価試験を行った。なお、本実施例における酵素活性測定原理、酵素活性の定義、活性測定方法は次のとおりである。【０１４０】
［酵素活性測定原理］
Ｄ−グルコース  ＋  １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ  ＋  ＦＡＤＧＤＨ
→  Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン  ＋  １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ（還元型）
＋  ＦＡＤＧＤＨ（酸化型）
１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ（還元型）  ＋  ＤＣＰＩＰ
→  １−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ  ＋  ＤＣＰＩＰ（還元型）
還元型１−メトキシフェナジンメトサルフェート（１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ）による２，６−ジクロロフェノリンドフェノール（ＤＣＰＩＰ）の還元により生じた還元型ＤＣＰＩＰ量は、分光光度計を用いて６００ｎｍの吸光度を測定することにより計測した。また、基質特異性の検討においては、Ｄ−グルコースを他の糖類に変更し、それぞれの糖類（基質）に対する酵素活性を測定した。【０１４１】
［酵素活性の定義］
酵素の活性（ＦＡＤＧＤＨ活性）は、３７℃、ｐＨ７．０の条件下において還元型ＤＣＰＩＰを１分あたりに１マイクロモル形成させるＦＡＤＧＤＨ量を１ユニットとして定義する。【０１４２】
具体的に、ＦＡＤＧＤＨ活性は、後述の吸光度変化（ΔＯＤTEST、ΔＯＤBLANK）から以下の式により求められる。【０１４３】
ＦＡＤＧＤＨ活性（Ｕ／ｍＬ）
＝［（ΔＯＤTEST−ΔＯＤBLANK）×３．１］／（１６．３×０．１×希釈率）
なお、式中の各定数は、
３．１  ：  ＦＡＤＧＤＨ溶液混和後の反応液の容量（ｍＬ）
１６．３  ：  ＤＣＰＩＰのミリモル分子吸光係数（ｍＭ−１・ｃｍ−１）
０．１  ：  ＦＡＤＧＤＨ溶液の容量（ｍＬ）
である。【０１４４】
［活性測定方法］
（１）  キュベット内で以下の組成で反応液を混合する。
０．１Ｍ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）                １．５ｍＬ
１Ｍ  グルコース溶液                                            ０．９ｍＬ
１．７５ｍＭ  2,6-Dichlorophenolondophenol（ＤＣＰＩＰ）        ０．１２ｍＬ
２０ｍＭ  1-Methoxy-5-methylphenazium  methylsulfate（1-mPMS）  ０．０２１ｍＬ
１０％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００                                  ０．０６ｍＬ
Ｈ２Ｏ                                                  ０．３９９ｍＬ
（２）  ３７℃で１０分間プレインキュベートする。
（３）  ＦＡＤＧＤＨ溶液を０．１ｍＬ加えて転倒混和し、３７℃で反応させる。この間、吸光光度計を用いて６００ｎｍでの吸光度を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤTEST）を算出する。
（４）  対照として、酵素液（上述の反応液にＦＡＤＧＤＨ溶液を加えた液）の代わりに等量の酵素希釈用液（５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した液）について、（３）と同様に吸光度変化を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤBLANK）を算出する。【０１４５】
＜ｐＨ安定性＞
ここでは、酵素活性のｐＨ安定性の評価を行った。まず、実施例２および３で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品（大腸菌で発現し、精製されたＴａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを含む溶液）、ならびに、実施例６および７で得られたＦＡＤＧＤＨ精製標品の４種の精製標品各々について、上記活性測定方法により酵素活性を測定した。それらの測定値に基づいて各精製標品を水で希釈することで、酵素活性が１４Ｕ／ｍＬとなるような酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。【０１４６】
これらのＦＡＤＧＤＨ溶液に対して、所定のｐＨに調整された０．１ＭのＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ広域緩衝液を等量混合し、ｐＨを２．０〜１１．０の範囲で変化させた複数の酵素溶液を調製し、各酵素溶液の調製直後の酵素活性を測定した。次に、各試料溶液を２５℃で２０時間インキュベートした後に酵素活性を測定して、インキュベート前の酵素活性に対するインキュベート後の酵素活性の割合（残活性率）を求めた。結果を図１７（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ）および図１８（Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）に示す。【０１４７】
図１７において、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨの場合、大腸菌で発現した糖鎖が付加していないもの（以下、「non  glycosylated」と表記する。）では、ｐＨ３．０〜７．０で安定で、ｐＨ７．０〜８．０で残活性率９０％以上を示した。酵母で発現した糖鎖が付加しているもの（以下、「glycosylated」と表記する。）では、ｐＨ２．０〜９．０の広範域にわたって安定であった。また、図１８において、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの場合も、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨの場合とほぼ同様の傾向が示された。【０１４８】
＜ｐＨ依存性＞
ここでは、酵素活性のｐＨ依存性の評価を行った。上記ｐＨ安定性の評価試験と同様にして、酵素活性が０．２Ｕ／ｍＬとなるような酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。ｐＨを３．０〜１０．０の範囲で変化させた複数の酵素活性測定溶液を調製し、それぞれのｐＨ条件における酵素活性を測定した。最も活性が高かったｐＨ条件における酵素活性を１００（％）とし、他の各ｐＨ条件における酵素活性の比率を相対活性として求めた。結果を図１９（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ）および図２０（Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）に示す。【０１４９】
図１９において、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨは、「glycosylated」ではｐＨ５．０、「non  glycosylated」ではｐＨ６．０が至適ｐＨであり、ｐＨ３．０〜１０．０の広範囲で５０％以上の相対活性を保っていることが示された。また、図２０において、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨは、糖鎖付加にかかわらず、ｐＨ５．０で最も高い活性を示し、酸性領域で高い酵素活性をもつことが示された。【０１５０】
＜温度安定性＞
ここでは、酵素活性の温度安定性の評価を行った。まず、上記ｐＨ安定性の評価試験と同様にして、酵素活性が７Ｕ／ｍＬとなるように酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。これらのＦＡＤＧＤＨ溶液をマイクロチューブに分注し、ＰＣＲマシーンを用いて４０℃〜７０℃の範囲の数種の温度で１５分間加熱した。加熱前後の酵素活性を測定し、加熱前の酵素活性に対する加熱後の酵素活性の比率（残活性率）を求めた。結果を図２１（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ）および図２２（Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）に示す。【０１５１】
図２１において、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ（glycosylated）は６０℃でも約９０％の活性を保持しており、熱安定性が極めて高いことが示された。また、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ（non  glycosylated）は、６０℃ではほぼ活性を失っていたが、４５℃以下では極めて高い安定性を示し、５０℃でも８０％以上の活性を保持していた。さらに、図２２において、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ（glycosylated）は６０℃でも８０％近くの活性を保持しており、熱安定性が極めて高いことが示された。また、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ（non  glycosylated）は、６０℃ではほぼ活性を失っていたが、４５℃以下では極めて高い安定性を示し、５０℃でも７０％近くの活性を保持していた。なお、天然のＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉは糖鎖付加をする真核生物であるため、天然の酵素も高い熱安定性を示すことが推測される。【０１５２】
これらの結果から、本発明のＦＡＤＧＤＨ活性を有するタンパク質は、特に糖鎖が付加された場合に極めて高い熱安定性を有していることが分かる。また、糖鎖が付加されていない場合でも、通常の物流輸送等における温度環境に対しては十分な熱安定性を有していると考えられる。【０１５３】
＜温度依存性＞
ここでは、酵素活性の温度依存性の評価を行った。まず、上記ｐＨ安定性の評価試験と同様にして、酵素活性が０．０５〜０．２Ｕ／ｍＬとなるように酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。これらのＦＡＤＧＤＨ溶液について、４℃〜７５℃の範囲で酵素活性を測定し、３７℃での活性を１００（％）としたときの相対活性を求めた。結果を図２３（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ）および図２４（Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ）に示す。【０１５４】
図２３に示されるように、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨの場合、「non  glycosylated」では、５５℃〜６０℃で活性がピークとなり、それ以上の高温域では活性が低下した。「glycosylated」では、５５℃までは「non  glycosylated」とほぼ同じ活性を示すがそれ以上の高温域でも活性が上昇し、６５℃〜７０℃で活性がピークとなりそれ以上の温度で活性が低下した。また、図２４に示されるように、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの場合、「non  glycosylated」では、４５℃〜６０℃で活性がピークとなり、それ以上の高温域では活性が低下した。「glycosylated」では、４５℃までは「non  glycosylated」とほぼ同じ活性を示すがそれ以降も活性が上昇して６０℃〜６５℃でピークとなり、それ以上の高温域では活性が低下した。なお、「glycosylated」では、３７℃の時に比較してピークの時にＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓで３倍以上、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉでは４倍以上の活性が見られた。【０１５５】
＜基質特異性＞
ここでは、グルコース以外の糖類を基質とするかどうかを確認した。まず、グルコース濃度が４０ｍＭの場合に十分な酵素活性が得られる酵素濃度に、それぞれの酵素溶液（ＦＡＤＧＤＨ溶液）を調製した。これらのＦＡＤＧＤＨ溶液について、上記活性測定方法を上記反応液中の糖類の濃度が４０ｍＭとなるように変更し、酵素活性を測定した。測定は、表２に示す１４種類の糖類について行った。なお、酵素が含まれない場合を対照とし、それぞれの糖に対して対照をとった。グルコースについて酵素活性の測定値を１００（％）としたときの他の各糖類の相対活性を算出し、表２にまとめた。なお、ＤＣＰＩＰ吸光度の変化量が対照と比較して有意差がないものに関しては活性がないと判断し、０．０と表記した。【０１５６】
【表２】
2014045912.tif 000004
【０１５７】
表２に示す結果において、調べた１４種類の糖類のうち、Ｄ−アラビノース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトース、マルトース、マルトテトラオース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ラフィノース、Ｄ−ソルビトール、スクロースおよびＤ−トレハロースに対しては、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨの両者とも反応しないことが示された。マルトトリオースに対しても、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨは反応せず、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨはわずかに反応がみられる程度であった。Ｄ−マンノースに対しても、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨは反応せず、Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨはわずかに反応がみられる程度であった。なお、２−デオキシ−Ｄ−グルコースとＤ−キシロースについては、両者のＦＡＤＧＤＨで基質として認識されていたが、マルトースのように医療用の輸液等に含まれる成分ではなく、血中に存在したとしても通常はグルコース量と比較して無視できる程度の微量であるため、グルコースセンサ等に用いる上での支障は少ないと考えられる。【０１５８】
＜グルコースセンサーチップでの応答性＞
絶縁性基板上に作用電極、対極を配した電極基盤を作製し、粘着層を利用して反応層を規定した。その電極表面に、上記の組換えＦＡＤＧＤＨ精製標品とメディエーター（フェリシアン化カリウム）塗布し、自然乾燥させ、カバー層を重ねて個片化しセンサーチップを作製した。なお、上記４種の組換えＦＡＤＧＤＨの各々を用いた４種のチップを作製した。【０１５９】
ｐＨ７．４のリン酸カリウムバッファーを溶媒とする０〜６００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液を調製し、このグルコース溶液１μＬを試料導入口からチップに導入した時に生じる電流値を測定し、各測定値をグルコース濃度に対してプロットした。そのプロットに対し、０〜６００ｍｇ／ｄＬの範囲において、最小二乗法により回帰直線を引いた。結果を図２５（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ：glycosylated）、図２６（Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨ：non  glycosylated）、図２７（Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ：glycosylated）、および、図２８（Ｔｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨ：non  glycosylated）に示す。【０１６０】
図２５〜図２８において、それぞれＲ２（決定係数：相関係数Ｒの二乗）は１．０００、１．０００、０．９９４、０．９９６であり、ほぼ１であることから、非常に直線性が高いことが示された。したがって、大腸菌での発現か酵母での発現かにかかわらず、Ｔａ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ由来ＦＡＤＧＤＨおよびＴｈ．ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ由来ＦＡＤＧＤＨを用いて、精度よくグルコース濃度を定量できることが示唆される。
【図４】
2014045912.tif 000005
【図５】
2014045912.tif 000006
【図６】
2014045912.tif 000007
【図７】
2014045912.tif 000008
【図８】
2014045912.tif 000009
【図９】
2014045912.tif 000010
【図１０】
2014045912.tif 000011
【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
2014045912.tif 000014
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2014045912.tif 000020
【図２２】
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【図２３】
2014045912.tif 000022
【図２４】
2014045912.tif 000023
【図２５】
2014045912.tif 000024
【図２６】
2014045912.tif 000025
【図２７】
2014045912.tif 000026
【図２８】
2014045912.tif 000027
【図１】
2014045912.tif 000028
【図２】
2014045912.tif 000029
【図３】
2014045912.tif 000030
【図１１】
2014045912.tif 000031
【図１４】
2014045912.tif 000032
【配列表】
2014045912000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年5月16日(2016.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
好熱性糸状菌由来のタンパク質であって、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを含むフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有し、フラビンアデニンジヌクレオチド結合モチーフを有するタンパク質。
（ａ）  配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）  配列番号１または２に記載のアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）  （ａ）に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と相同性が９１％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項２】
前記フラビンアデニンジヌクレオチド結合モチーフが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記好熱性糸状菌はＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉまたはＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓである、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１の（ｃ）における相同性を有する配列部分が、配列番号１、配列番号２、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素、および、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ由来のフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素に共通するアミノ酸配列を全て含んでいる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
糖鎖が付加された、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
（Ａ）  配列番号３または４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）  配列番号３または４に記載の塩基配列からシグナルペプチドをコードする塩基配列を除いた塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｃ）  上記（Ａ）または（Ｂ）のＤＮＡの塩基配列と、イントロンとを含み、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ
（Ｄ）  上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのＤＮＡと９７％以上の相同性を有し、かつフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ
【請求項７】
請求項６に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項６に記載の遺伝子を含む形質転換体。
【請求項９】
請求項６に記載の遺伝子を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の形質転換体を用いたフラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質を含むグルコース濃度測定試薬。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質を用いたグルコースセンサ。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質を用いたグルコース濃度測定方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質を用いたバイオ燃料電池。
【国際調査報告】
2014045912.tif 000033
2014045912.tif 000034
2014045912.tif 000035
2014045912.tif 000036