(57)【要約】  本発明は、新規のポリアミントランスポーターの分野に関する。本発明に従って、ポリアミン輸送を担うトランスポーターおよびそれをコードする遺伝子が同定された。さらに、本発明に従って、そのようなトランスポーターおよびそのようなトランスポーターを含む人工膜を用いる、ポリアミントランスポーター活性調節剤のスクリーニング法が提供される。また、本発明に従って、ポリアミン代謝が関与する疾患の予防剤・治療剤の候補物質を提供するスクリーニング法が提供される。本発明に従って、ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングするためのキットもまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％同一である配列を含む核酸であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｄ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含む核酸配列を有する核酸配列であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｅ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸；
（ｆ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；ならびに、
（ｇ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
からなる群から選択される核酸によってコードされるポリペプチドを含む、人工膜。
【請求項２】
請求項１に記載の人工膜であって、以下：
（ｈ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列からなる核酸；ならびに、
（ｉ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される核酸によってコードされるポリペプチドを含む、人工膜。
【請求項３】
膜小胞である、請求項１に記載の人工膜。
【請求項４】
リポソームである、請求項１に記載の人工膜。
【請求項５】
さらに、プロトンポンプを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の人工膜。
【請求項６】
さらに、ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の人工膜。
【請求項７】
請求項１に記載の人工膜の製造方法であって、以下：
（ａ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％同一である配列を含む核酸であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｄ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含む核酸配列を有する核酸配列であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｅ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸；
（ｆ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；ならびに、
（ｇ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
からなる群から選択される核酸を用いて、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドを発現する工程
を包含する方法。
【請求項８】
請求項１に記載の人工膜の製造方法であって、以下：
（ａ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸；ならびに、
（ｉ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸；
からなる群から選択される核酸を用いて、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドを発現する工程
を包含する方法。
【請求項９】
請求項１に記載の人工膜の製造方法であって、以下：
（ｊ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸によってコードされるポリペプチド；
（ｋ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
（ｌ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％同一である配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
（ｍ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含む核酸配列を有する核酸配列によってコードされるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
（ｎ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｏ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；ならびに、
（ｐ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドを人工膜に組み込む工程、
を包含する方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の人工膜の製造方法であって、以下：
（ｑ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列からなる核酸によってコードされるポリペプチド；ならびに、
（ｒ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドを人工膜に組み込む工程、
を包含する方法。
【請求項１１】
ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤のスクリーニング法であって、
（１）請求項１〜６のいずれか一項に記載の人工膜を提供する工程；
（２）該人工膜に候補薬物を接触させる工程；
（３）該人工膜のポリアミン輸送活性を測定する工程；および、
（４）工程（３）で測定されたポリアミン輸送活性から、該候補薬物がポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤であるか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記活性調節剤が阻害剤である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記活性調節剤が活性促進剤である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法によって得られた、ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の人工膜を含む、ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングするための、組成物。
【請求項１６】
ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングするためのキットであって、以下：
（Ｉ）核酸であって、以下：
（ａ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％同一である配列を含む核酸であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｄ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含む核酸配列を有する核酸配列であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｅ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸；
（ｆ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；ならびに、
（ｇ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
からなる群から選択される核酸、ならびに、
（ＩＩ）脂質
を含む、キット。
【請求項１７】
請求項１６に記載のキットであって、前記（Ｉ）核酸が、以下：
（ａ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸；ならびに、
（ｉ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される、キット。
【請求項１８】
ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングするためのキットであって、以下：
（ＩＩＩ）ポリペプチドであって、以下：
（ｊ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸によってコードされるポリペプチド；
（ｋ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
（ｌ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％同一である配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
（ｍ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含む核酸配列を有する核酸配列によってコードされるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
（ｎ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｏ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；ならびに、
（ｐ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチド、ならびに、
（ＩＩ）脂質
を含む、キット。
【請求項１９】
請求項１８に記載のキットであって、前記（ＩＩＩ）ポリペプチドが、以下：
（ｑ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列からなる核酸によってコードされるポリペプチド、ならびに；
（ｒ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
からなる群から選択される、キット。
【請求項２０】
さらに、プロトンポンプを含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】
さらに、ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅを含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のポリアミントランスポーターの分野に関する。さらに、本発明は、ポリアミントランスポーターの輸送活性を調節する薬剤のスクリーニング、ならびに、ポリアミンの代謝異常が関連する疾患を予防・治療するための薬剤のスクリーニング、ならびに、これらスクリーニングに使用するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリアミンは第一級アミノ基を２つ以上持つ脂肪族で、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなど生物界に広く存在している。ポリアミンには多様な生理作用（細胞増殖促進、細胞分化促進、蛋白質合成促進、ＤＮＡの安定化、抗酸化作用、および、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体やカリウムチャンネル等に作用することによる神経伝達の調節）がある事が報告されている。ポリアミンは神経細胞やアストロサイト等の小胞に蓄積されていて、刺激によって細胞外へ放出され、グルタミン酸化学伝達をコントロールし、その結果、神経伝達をコントロールしている。以下に、その代表例を記載する。
（１）高酸素下での肺の損傷
高酸素下では肺が損傷を受け高酸素症になるが、ポリアミン合成が高酸素症下での生存率に重要である事が知られている（非特許文献１および５）。
（２）統合失調症等の神経疾患との関連
統合失調症、錐体外路症候群(筋の緊張状態の異常と不随意運動で、手指振戦、筋硬直
、頸・顔部のれん縮、眼球回転発作、焦燥感等)、気分障害、不安、自殺行動とポリアミ
ンが関連している（非特許文献２）。これらの神経疾患の原因のひとつとしてＮＭＤＡ受容体の過剰興奮が関連していると言われている。ポリアミンのひとつであるアグマチンは抗鬱、抗不安作用、気分障害を持つ(非特許文献２、６、７)。
（３）抗鬱作用との関連
エリプロジルはＮＭＤＡ受容体のポリアミン結合部位に結合し、抗鬱作用を示す(非特
許文献２、６)。
（４）神経変性
アルツハイマー病、パーキンソン病、虚血、脳卒中等の神経変性をともなう疾患において、ＮＭＤＡ受容体の過剰興奮が重要な役割を果たしている。メマンチンはＮＭＤＡ受容体を阻害する事で神経の過剰興奮を阻害し、神経細胞死を防ぐ。アルツハイマー病の治療薬として用いられている。また、ポリアミン類似体はＮＭＤＡ受容体の阻害を通して神経を変性から守る事が報告されている（非特許文献４）。【０００３】
単離シナプス小胞でポリアミン輸送は観察されているが（非特許文献８）、ポリアミンがどのような仕組みで、どのようなトランスポーターを介して、小胞内に蓄積されるのかは不明であった。【０００４】
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄｏｎａｌｄ  Ｆ．Ｔｉｅｒｎｅｙ，Ｌａｕｒｅｎｃｅ  Ｊ．Ｍａｒｔｏｎ，Ａｌｌｅｎ  Ｄ．Ｈａｃｋｅｒ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｌｏｗｅ，（１９８５）  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ｗｅｓｔ  Ｊ  Ｍｅｄ．１４２，６３-７３
【非特許文献２】Ｆｉｏｒｉ  ＬＭ，Ｔｕｒｅｃｋｉ  Ｇ．（２００８）  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｍｅｎｔａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３３，１０２−１１０．
【非特許文献３】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｋ．（２００９）  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＭＤＡ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｉｎ：  Ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ  ＡＭ，  ｅｄｉｔｏｒ．  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＭＤＡ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  （ＦＬ）：  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｃｈａｐｔｅｒ  １１．
【非特許文献４】Ｍａｓｕｋｏ  Ｔ，Ｎａｍｉｋｉ  Ｒ，Ｎｅｍｏｔｏ  Ｙ，Ｍｉｙａｋｅ  Ｍ，Ｋｉｚａｗａ  Ｙ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ，Ｋａｓｈｉｗａｇｉ  Ｋ，Ｉｇａｒａｓｈｉ  Ｋ，Ｋｕｓａｍａ  Ｔ．（２００９）  Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｏｓｙｌ−ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｏｎｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．  ３３１，５２２−５３０．
【非特許文献５】Ｈｏｅｔ  ＰＨ，Ｎｅｍｅｒｙ  Ｂ．（２０００）Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ：  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｏｒ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７８，Ｌ４１７−３３．
【非特許文献６】Ｌａｙｅｒ  ＲＴ，Ｐｏｐｉｋ  Ｐ，Ｏｌｄｓ  Ｔ，Ｓｋｏｌｎｉｃｋ  Ｐ．（１９９５）  Ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ−ｌｉｋｅ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｓｉｔｅ  ＮＭＤＡ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，  ｅｌｉｐｒｏｄｉｌ  （ＳＬ−８２．０７１５）．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｅｈａｖ．５２，６２１−６２７．
【非特許文献７】Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ＨＧ，Ｓｔｉｃｈ  Ｃ，Ｊａｇｅｒ  Ｋ，Ｄｏｂｒｏｗｏｌｎｙ  Ｈ，Ｗｉｃｋ  Ｍ，Ｓｔｅｉｎｅｒ  Ｊ，Ｖｅｈ  Ｒ，Ｂｏｇｅｒｔｓ  Ｂ，Ｌａｕｂｅ  Ｇ．（２０１２）Ａｇｍａｔｉｎａｓｅ，  ａｎ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ  ａｇｍａｔｉｎｅ，  ｉｓ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎｓ  ｏｆ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｏｏｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．６２，２３７−２４６．
【非特許文献８】Ｍａｓｕｋｏ  Ｔ，Ｋｕｓａｍａ−Ｅｇｕｃｈｉ  Ｋ，Ｓａｋａｔａ  Ｋ，Ｋｕｓａｍａ  Ｔ，Ｃｈａｋｉ  Ｓ，Ｏｋｕｙａｍａ  Ｓ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｋ，Ｋａｓｈｉｗａｇｉ  Ｋ，Ｉｇａｒａｓｈｉ  Ｋ．（２００３）Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８４：６１０−７．
【発明の概要】
【０００６】
一つの局面において、ポリアミン輸送を担うトランスポーターおよびそれをコードする遺伝子を同定し、さらに、そのようなトランスポーターを含む人工膜を用いる、トランスポーターの活性調節剤のスクリーニング法を提供することを、本発明の課題とする。別の局面において、そのようなスクリーニング法によって、ポリアミン代謝（例えば、輸送、合成、および／または、分解などポリアミンの任意の作用を含む）が関与する疾患の予防剤・治療剤の候補物質を提供することが、本発明の課題である。
【０００７】
本発明者らは、以下の実施例に記載される独創的方法により、ポリアミントランスポーターの同定およびその機能解析を行うことによって、本発明を完成した。
【０００８】
例えば、本発明によって以下が提供される。
（項目１）
以下：
（ａ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸；、
（ｂ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％同一である配列を含む核酸であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｄ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含む核酸配列を有する核酸配列であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｅ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸；
（ｆ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；ならびに、
（ｇ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
からなる群から選択される核酸によってコードされるポリペプチドを含む、人工膜。
（項目２）
項目１に記載の人工膜であって、以下：
（ｈ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列からなる核酸；ならびに、
（ｉ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される核酸によってコードされるポリペプチドを含む、人工膜。
（項目３）
膜小胞である、項目１に記載の人工膜。
（項目４）
リポソームである、項目１に記載の人工膜。
（項目５）
さらに、プロトンポンプを含む、項目１〜４のいずれか１項に記載の人工膜。
（項目６）
さらに、ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅを含む、項目１〜４のいずれか１項に記載の人工膜。（項目７）
項目１に記載の人工膜の製造方法であって、以下：
（ａ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸；、
（ｂ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％同一である配列を含む核酸であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｄ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含む核酸配列を有する核酸配列であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｅ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸；
（ｆ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；ならびに、
（ｇ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
からなる群から選択される核酸を用いて、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドを発現する工程
を包含する方法。
（項目８）
項目１に記載の人工膜の製造方法であって、以下：
（ａ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸；ならびに、
（ｉ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸；
からなる群から選択される核酸を用いて、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドを発現する工程
を包含する方法。
（項目９）
項目１に記載の人工膜の製造方法であって、以下：
（ｊ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸によってコードされるポリペプチド；
（ｋ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
（ｌ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％同一である配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
（ｍ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含む核酸配列を有する核酸配列によってコードされるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
（ｎ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｏ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；ならびに、
（ｐ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドを人工膜に組み込む工程、
を包含する方法。
（項目１０）
項目１に記載の人工膜の製造方法であって、以下：
（ｑ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列からなる核酸によってコードされるポリペプチド、ならびに；
（ｒ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドを人工膜に組み込む工程、
を包含する方法。
（項目１１）
ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤のスクリーニング法であって、
（１）項目１〜６のいずれか一項に記載の人工膜を提供する工程；
（２）該人工膜に候補薬物を接触させる工程；
（３）該人工膜のポリアミン輸送活性を測定する工程；および、
（４）工程（３）で測定されたポリアミン輸送活性から、該候補薬物がポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤であるか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
（項目１２）
前記活性調節剤が阻害剤である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記活性調節剤が活性促進剤である、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
項目１１に記載の方法によって得られた、ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤。
（項目１５）
項目１〜６のいずれか一項に記載の人工膜を含む、ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングするための、組成物。
（項目１６）
ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングするためのキットであって、以下：
（Ｉ）核酸であって、以下：
（ａ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸；、
（ｂ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％同一である配列を含む核酸であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｄ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含む核酸配列を有する核酸配列であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核  酸；
（ｅ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸；
（ｆ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；ならびに、
（ｇ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
からなる群から選択される核酸、ならびに、
（ＩＩ）脂質
を含む、キット。
（項目１７）
項目１６に記載のキットであって、前記（Ｉ）核酸が、以下：
（ａ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸；ならびに、
（ｉ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される、キット。
（項目１８）
ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングするためのキットであって、以下：
（ＩＩＩ）ポリペプチドであって、以下：
（ｊ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸によってコードされるポリペプチド；
（ｋ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
（ｌ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％同一である配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
（ｍ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含む核酸配列を有する核酸配列によってコードされるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
（ｎ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｏ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；ならびに、
（ｐ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチド、ならびに、
（ＩＩ）脂質
を含む、キット。
（項目１９）
項目１８に記載のキットであって、前記（ＩＩＩ）ポリペプチドが、以下：
（ｑ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列からなる核酸によってコードされるポリペプチド、ならびに；
（ｒ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
からなる群から選択される、キット。
（項目２０）
さらに、プロトンポンプを含む、項目１６〜１９のいずれか１項に記載のキット。
（項目２１）
さらに、ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅを含む、項目１６〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【０００９】
本発明に従って、ポリアミン輸送を担うトランスポーターおよびそれをコードする遺伝子が同定された。さらに、そのようなトランスポーターを含む人工膜を用いる、トランスポーターの活性調節剤のスクリーニング法が提供された。さらに、そのようなスクリーニング法によって、ポリアミン代謝が関与する疾患の予防剤・治療剤の候補物質をスクリーニングする方法およびそのような候補物質もまた、提供される。
【００１０】
ポリアミンの蓄積そして放出という過程における最初のステップであるポリアミンの小胞内への蓄積に関与するトランスポーターの解明によって、ポリアミン放出を制御する薬剤を開発するためのスクリーニング法が提供される。
【００１１】
神経疾患においてはセロトニントランスポーターやＮａ＋チャンネルをターゲットとした薬が開発され、うつ病やてんかん治療などに用いられている。しかし、決定的な治療薬は無く、新しい薬の開発が望まれている。種々の疾患にポリアミンが関与することが知られていることから、本発明は、全く新しい作用点をターゲットとした新規神経疾患治療薬の開発のためのスクリーニング法を提供するものである。
【００１２】
また、植物に存在するポリアミンのトランスポーターＲＭＶ１は、動物小胞に存在する小胞型ポリアミントランスポーターとは、構造的にも、能動輸送のメカニズムにおいても全く異なることから、たとえ、植物に存在するポリアミンのトランスポーターＲＭＶ１の情報に基づいても、本発明の小胞型ポリアミントランスポーターを取得できないことも明らかとなった。
【００１３】
大腸菌トランスポーターＣａｄＢ、ＹｊｄＥ、ＡｄｉＣ、ＰｕｕＰおよびＰｏｔＥがポリアミンを輸送する事が報告されているが、これらはリジン、アルギニン、オルニチン等のアミノ酸とのアンチポーターであり、本発明のトランスポーター（ＶＰＡＴ）とは、性質が異なる。これらのトランスポーターはＳＬＣ7ファミリーのホモログであり、ＶＰＡＴの属するＳＬＣ１８ファミリーとはアミノ酸配列、立体構造が全く異なる。ＰｏｔＦＧＨＩおよびＰｏｔＡＢＣＤはＡＴＰの加水分解エネルギーを利用してポリアミンを取り込むＡＢＣ型トランスポーターであり、ＶＰＡＴとアミノ酸配列、立体構造ともに全く異なるものである。
【００１４】
ＭｄｔＪＩも大腸菌ポリアミントランスポーターとして報告されているが、これはＳＭＲファミリーに属するトランスポーターで、１２１残基と非常に小さいものである。このファミリーのトランスポーターは動物では存在しない。
【００１５】
酵母ではＤｕｒ３、ＳＡＭ３、ＧＡＰ１、Ｄｕｒ３１、Ｄｕｒ３３、Ｄｕｒ３４、ＡＧＰ２、ＵＧＡ４、ＴＰＯ１、ＴＰＯ２、、ＴＰＯ３、ＴＰＯ４、ＴＰＯ５がポリアミン輸送体として報告されている。しかし、これらのトランスポーターはいずれもＳＬＣ５，６，７，２２もしくはＳＬＣ２型のファミリーに属するトランスポーターで本発明のＶＰＡＴとはアミノ酸配列が異なり、関連が無い。
【００１６】
イネＯｓＰＵＴ１がポリアミン輸送することが報告されているがこのタンパク質はＳＬＣ７ファミリーに属するもので、ＶＰＡＴとアミノ酸配列、構造が全く異なる。
【００１７】
ヒトではＯＣＴ２がＡｇｍａｔｉｎｅとＰｕｔｒｅｓｃｉｎｅを、ＯＣＴ１とＭＡＴＥ１が輸送する事が報告されている。ＯＣＴ１，２はＳＬＣ２２ファミリーにＭＡＴＥ１はＳＬＣ４７ファミリーに属するトランスポーターであり、ＶＰＡＴとはアミノ酸配列や特性が異なる。また、これらのトランスポーターは細胞膜に存在するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、小胞型ポリアミントランスポーター（ＶＰＡＴ）（ＳＬＣ１８Ｂ１）タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す。「＊」は、動物種に拘わらず保存されているアミノ酸残基を、アミノ酸残基の下線は、推定膜貫通領域を示す。
【図２】図２は、本発明の小胞型ポリアミントランスポーター（ＶＰＡＴ）（ＳＬＣ１８Ｂ１）と、ＳＬＣ１８型トランスポーターファミリーの属する他のトランスポーターのアミノ酸配列のアラインメントを示す。「＊」は、動物種に拘わらず保存されているアミノ酸残基を、アミノ酸残基の下線は、推定膜貫通領域を示す。
【図３】図３は、ヒトの種々の臓器におけるＶＰＡＴ遺伝子の発現を示すノーザンハイブリダイゼーションの結果を示すグラフである。
【図４】図４は、マウスの種々の臓器におけるＶＰＡＴ遺伝子の発現を示すノーザンハイブリダイゼーションの結果を示すグラフである。
【図５】図５は、肺および腎臓でのＶＰＡＴタンパク質の局在を示す、抗ＶＰＡＴ抗体によるブロッティングの結果である。図５のＡは肺の気管支周辺についての結果を、図５のＢは肺胞についての結果を、図５のＣは腎臓の皮質についての結果を、図５のＤは腎臓の髄質についての結果を示す。図５のＡ（肺の気管支周辺）において、ＣＣはクララ細胞を示し、Ｃは繊毛細胞を示し、そして、ＢＴは気管支を示す。図５のＢ（肺胞）において、Ｔ１は１型肺胞細胞を示し、そして、Ｔ２は２型肺胞細胞を示す。図５のＣ（腎臓の皮質）において、Ｇは糸球体を示し、ＰＴは腎近位尿細管を示し、そして、ＤＴは腎遠位尿細管を示す。図５のＤ（腎臓の髄質）において、ＤＴは腎遠位尿細管を示し、そして、ＣＤは集合管を示す。写真中の白棒は、１０μｍを示す。
【図６】図６は、脳でのＶＰＡＴタンパク質の局在を示す。左上段、左中段および左下段「ＶＰＡＴ」は抗ＶＰＡＴ抗体用いた結果を示し、中央上段、中央中段および中央下段「ＧＦＡＰ」は抗ＧＦＡＰ抗体を用いた結果を示し、右「ｍｅｒｇｅ」は左の写真と中央の写真を重ね合わせた結果を示す。写真中の白棒は、１０μｍを示す。「ｄｅｎｔａｔｅ  ｇｙｒｕｓ」は海馬歯状回を、「ＣＡ２」は海馬ＣＡ２領域を、「Ｃｏｒｔｅｘ」は大脳皮質示す。白棒は、１０μｍを示す。
【図７】図７は、ラット海馬より単離した初代培養アストロサイトおよび初代培養神経細胞でのＶＰＡＴの発現を調べた。図７のＡは初代培養ラット海馬アストロサイトでの結果を示し、図７のＢは初代培養ラット海馬神経細胞での結果を示す。白棒は、１０μｍを示す。
【図８】図８は、マウス肥満細胞でのＶＰＡＴの発現を調べた結果を示す。上段左は抗ＶＰＡＴ抗体による免疫染色の結果を、下段左はコントロール血清を用いた免疫染色の結果を示す。上段中央は、上段左で示した細胞の微分干渉顕微鏡による写真であり、上段右は、上段中央の写真に上段左の結果を重ねた写真である。下段中央は、下段左で示した細胞の微分干渉顕微鏡による写真であり、下段右は、下段中央の写真に下段左の結果を重ねた写真である。写真中の白棒は、１０μｍを示す。
【図９】図９のＡは、マウスＶＰＡＴポリペプチドとＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅとを再構成した人工膜内へのポリアミン（スペルミン）の輸送活性を示すグラフである。図９のＢは、マウスＶＰＡＴポリペプチドとＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅとを再構成した人工膜内へのポリアミン（スペルミン）の輸送のメカニズムを示す模式図である。
【図１０】図１０のＡは、「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ」はＶＰＡＴおよびＡＴＰを含む場合、「−ＡＴＰ」はＡＴＰを含まない場合、「−ＳＬＣ１８Ｂ１  ＋ＡＴＰ」はＶＰＡＴ（ＳＬＣ１８Ｂ１）を含まないリポソームを用いた場合のポリアミン（スペルミン）の輸送活性を示すグラフである。図１０のＢは、図１０のＡの「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ」において、スペルミン濃度を変化させて輸送活性を測定した結果である。図１０のＣは、ＶＰＡＴ（ＳＬＣ１８Ｂ１）を含むリポソームに：ＡＴＰを添加しなかった場合（「−ＡＴＰ」）、ＡＴＰを添加した場合（「＋ＡＴＰ」）；ＡＴＰを添加し、さらにナイジェリシンを添加した場合（「Ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ」）；ＡＴＰを添加し、さらにバリノマイシンを添加した場合（「Ｖａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ」）；ならびに、ＡＴＰを添加し、さらにナイジェリシンおよびバリノマイシンを添加した場合（「Ｎｉｇ＋Ｖａｌ」）のスペルミン輸送活性を示す。図１０のＤは、リポソームの内側を酸性に、外側を酸性（「ｐＨ５．５」）またはアルカリ性（「ｐＨ８．０」）にして、スペルミン輸送活性を促成した結果である。図１０のＥは、「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ」はＶＰＡＴおよびＡＴＰを含む場合、「−ＡＴＰ」はＡＴＰを含まない場合、「−ＳＬＣ１８Ｂ１  ＋ＡＴＰ」はＶＰＡＴ（ＳＬＣ１８Ｂ１）を含まないリポソームを用いた場合のスペルミジンの輸送活性を示すグラフである。図１０のＦは、図１０のＥの「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ」において、スペルミジン濃度を変化させて輸送活性を測定した結果である。図１０のＧは、ＶＰＡＴ（ＳＬＣ１８Ｂ１）を含むリポソームに：ＡＴＰを添加しなかった場合（「−ＡＴＰ」）、ＡＴＰを添加した場合（「＋ＡＴＰ」）；ＡＴＰを添加し、さらにナイジェリシンを添加した場合（「Ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ」）；ＡＴＰを添加し、さらにバリノマイシンを添加した場合（「Ｖａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ」）；ならびに、ＡＴＰを添加し、さらにナイジェリシンおよびバリノマイシンを添加した場合（「Ｎｉｇ＋Ｖａｌ」）のスペルミジン輸送活性を示す。
【図１１】図１１は、ＶＰＡＴとＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅとを再構成した人工膜に、（１）コントロール（ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅがなく、ＶＰＡＴのみを含む人工膜）、（２）１μＭ  レゼルピン（Ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ）、（３）１μＭ  テトラベナジン（Ｔｅｔｒａｂｅｎａｚｉｎｅ）、（４）１ｍＭ  スペルミン（Ｓｐｅｒｍｉｎｅ）、（５）１ｍＭ  アグマチン（Ａｇｍａｔｉｎｅ）、（６）１ｍＭ  ドーパミン（Ｄｏｐａｍｉｎｅ）、または、（７）１ｍＭ  アセチルコリン（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）を添加することによる、ＶＰＡＴ輸送活性への阻害効果を示したグラフである。縦軸は、人工膜内に輸送された放射性スペルミンの量を、上記（１）〜（７）を添加しなかった場合の相対値として示す。
【図１２】図１２は、精製したＶＰＡＴ、ＶＭＡＴ２、ＶＡＣｈＴをリポソームに組み込み、スペルミン（「Ｓｐｅｒｍｉｎｅ」）、スペルミジン（「Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ」）、セロトニン（「Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ」）、アセチルコリン（「Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ」）の輸送を測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００２０】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００２１】
本明細書において使用される用語「トランスポーター」とは、脂質二重膜を透過できない物質（例えば、ポリアミン）を、脂質二重膜を越えて輸送する物質をいう。典型的には、トランスポーターは、脂質二重膜中に存在する膜タンパク質である。タンパク質であるトランスポーターは、本明細書において「輸送タンパク質」と互換可能に使用される。
【００２２】
本明細書において使用される用語「輸送活性」とは、脂質二重膜を透過できない物質（例えば、ポリアミン）を、脂質二重膜を越えて輸送する活性をいう。ポリアミンの輸送活性を本明細書において「ポリアミン輸送活性」という。「ポリアミン輸送活性」を有するポリペプチドを「ポリアミントランスポーター」という。ポリアミントランスポーターには、動物の小胞に存在する小胞型ポリアミントランスポーター以外にも、例えば、植物のポリアミントランスポーターが知られている。本明細書において、「小胞型ポリアミントランスポーター」の略号を「ＶＰＡＴ」とし、そして、そうでないと記載しない限り、「小胞型ポリアミントランスポーター」を「ポリアミントランスポーター」とも記載する。
【００２３】
本明細書において使用される用語「ポリアミン」とは、第一級アミノ基を２つ以上持つ直鎖脂肪属炭化水素または分岐脂肪属炭化水素をいう。ヒトにおけるポリアミンとしては、代表的には、プトレシン、スペルミジン、および、スペルミンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２４】
本明細書において使用される用語「プロトンポンプ」とは、ＡＴＰをエネルギー源としてＨ＋を輸送する輸送活性を有するタンパク質をいう。代表的なプロトンポンプとしては、大腸菌、ミトコンドリアおよびクロロプラストに存在するＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅ、液胞およびクロマフィン顆粒に存在するＶ−ＡＴＰａｓｅ、細胞膜に存在するＨ／Ｋ−ＡＴＰａｓｅが挙げられるが、これに限定されない。
【００２５】
本明細書において使用される用語「人工膜」とは、脂質（例えば、純粋な脂質、脂質とタンパク質との混合物、脂質を含む細胞の膜画分、または、細胞膜もしくは細胞膜由来の粗精製物が挙げられるがこれらに限定されない）を含む膜画分または細胞膜を原料として人工的に調製された膜であり、好ましくは、脂質二重膜であるがこれに限定されない。「人工膜」としては、例えば、リポソームが挙げられるが、これに限定されない。
【００２６】
本明細書において使用される用語「ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤」とは、ポリアミン輸送タンパク質の輸送活性に影響を与える物質をいう。「ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤」は、輸送活性を促進する物質であっても、阻害する物質であってもよい。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「キット」とは、複数の容器、および製造業者の指示書を含み、そして各々の容器が、本発明の核酸および／またはポリペプチドを含む製品をいう。必要に応じて、本発明のキットは、リポソームのような人工膜、あるいは、人工膜を調製するための脂質を含む。
【００２８】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖形態、二本鎖形態、または他の形態である、リン酸エステルポリマー形態のリボヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、もしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオチド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン「ＤＮＡ分子」）、またはそれらの任意のホスホエステルアナログ（例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステル）を指し得る。
【００２９】
「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオシド」とも呼ばれる）であり、２つの以上のヌクレオチドの任意の鎖またはその相補鎖を意味する。本発明の好ましい核酸は、配列番号１および／または配列番号３に示される核酸、ならびにその相補鎖、改変体およびフラグメントを包含する。
【００３０】
「相補鎖」とは、ある核酸配列に対して塩基対を形成し得るようなヌクレオチドの鎖を意味する。例えば、二本鎖ＤＮＡの各々の鎖は互いに相補的な塩基配列を有し、一方の鎖から見て他方の鎖は相補鎖である。
【００３１】
「コード配列」または発現生成物（例えば、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、もしくは酵素）を「コードする」配列は、発現された場合にその生成物の生成をもたらすヌクレオチド配列である。
【００３２】
「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の連続列を含む。本発明の好ましいペプチドは、配列番号２および／または配列番号４に示されるペプチド、ならびにその改変体およびフラグメントを包含する。
【００３３】
「タンパク質配列」、「ペプチド配列」、または「ポリペプチド配列」または「アミノ酸配列」は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中にある一連の２つ以上のアミノ酸を指す。
【００３４】
本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の同一性とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が高い同一性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて相同性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、相同性と類似性とは同じ数値を示す。
【００３５】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて算出される。あるいは、アミノ酸配列および塩基配列の同一性は、比較する２つの配列を整列させ、配列全体に対する同一残基の割合を計算することによっても算出することができる。
【００３６】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
【００３７】
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
【００３８】
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００３９】
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。
【００４０】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００４１】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そして多数のミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、限定されることはないが、代表的には、（１）０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、（２）０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％  ホルムアミド、４２℃、（３）０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０３Ｍ  クエン酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、６５〜６８℃、（４）０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、６５〜６８℃、あるいは、（５）０．０３Ｍ塩化ナトリウム、０．００３Ｍ  クエン酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、６５〜６８℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
【００４２】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
【００４３】
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
【００４４】
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１ＭＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
【００４５】
配列番号２および／または配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１および／または配列番号３の核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。配列番号２および／または配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４２℃の温度で  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ  ＮａＣｌ；６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ；３０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１および／または配列番号３に示す配列またはその一部とハイブリダイズし得る。
【００４６】
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列（他の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする）と比較したときに、付加または欠失（すなわちギャップ）が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（８）：２４４４−２４４８、  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。
【００４７】
（１）  ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２）  ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３）  ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４）  ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５）  ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
【００４８】
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。
【００４９】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
【００５０】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プライマーとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、最も好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【００５１】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ポリアミンの輸送活性など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００５２】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ  ＥＳ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００５３】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００５４】
本明細書において核酸の存在を確認するには、放射能法、蛍光法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価され得る。
【００５５】
「抗体」は、抗体およびそのフラグメント（好ましくは、抗原結合フラグメント）を包含するが、これらに限定されない。この用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）２抗体フラグメント、Ｆｖ抗体フラグメント（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、単鎖Ｆｖ抗体フラグメント、およびｄｓＦｖ抗体フラグメントを包含する。さらに、本発明の抗体分子は、完全ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ニワトリ抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。本発明の抗体は、配列番号２および／または配列番号４のアミノ酸配列、ならびに／あるいは、これら配列のフラグメントからなるポリペプチドに、特異的に反応する。
【００５６】
本発明の遺伝子は、ｓｉＲＮＡを用いてその発現をノックダウン（抑制）することが可能である。所定の遺伝子からｓｉＲＮＡを調製する方法は周知であり、例えば、当該分野で公知のｓｉＲＮＡ提供業者（例えば、株式会社  ニッポンイージーティー、富山、日本）により、アニーリングしている２本鎖の合成ｓｉＲＮＡを入手することができる。その合成ｓｉＲＮＡをＲＮＡｓｅフリーの溶液に溶解し、最終濃度が２０μＭになるように調整し、その後細胞へ導入する。ｓｉＲＮＡを調製する場合には、例えば、（１）ＧまたはＣが連続して４つ以上存在しない、（２）ＡまたはＴが連続して４つ以上存在しない、（３）ＧあるいはＣが９塩基以上存在しない、などの条件を加えてもよい。本発明のｓｉＲＮＡは、１９塩基長、２０塩基長、２１塩基長、２２塩基長、２３塩基長、２４塩基長、２５塩基長、２６塩基長、２７塩基長、２８塩基長、２９塩基長、または３０塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、１９塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２０塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２１塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２２塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２３塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２４塩基長である。
【００５７】
用語「発現する」および「発現」は、遺伝子、ＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列中の情報が明らかになるのを可能にすることまたはそれを引き起こすこと（例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによって、タンパク質を生成すること）を意味する。ＤＮＡ配列は、細胞中でかまたは細胞によって、「発現生成物」（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質）を形成するように発現される。その発現生成物自体はまた、その細胞によって「発現される」と言われ得る。
【００５８】
用語「形質転換」とは、核酸を細胞中に導入することを意味する。導入される遺伝子または配列は、「クローン」と呼ばれ得る。その導入されるＤＮＡまたはＲＮＡを受ける宿主細胞は、「形質転換」されており、これは、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、任意の供給源由来であり得、宿主細胞と同じ属または種の細胞由来であっても、異なる属または種の細胞由来であってもよい。
【００５９】
用語「ベクター」は、宿主を形質転換し、必要に応じて導入された配列の発現および／または複製を促進するように、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が宿主細胞中に導入され得る媒体（例えば、プラスミド）を包含する。
【００６０】
本発明において使用され得るベクターとしては、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡフラグメント、および宿主ゲノム中への核酸の導入を促進し得る他の媒体が挙げられる。プラスミドは、最も一般的に使用される形態のベクターであるが、同様の機能を提供しかつ当該分野で公知であるかまたは公知となる他のすべての形態のベクターが、本明細書中で野使用のために適切である。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８５  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚら、（編），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ  １９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照のこと。
【００６１】
用語「発現系」とは、適切な条件下で、そのベクターにより保有されて宿主細胞中に導入されるタンパク質または核酸を発現し得る、宿主細胞および適合性ベクターを意味する。一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。
【００６２】
本発明の配列番号２および／または配列番号４に記載のポリペプチドをコードする核酸の発現は、好ましくは真核生物細胞において従来の方法によって実行され得る。核酸を発現するために適切な宿主細胞としては、高等真核生物が挙げられ、動物細胞（非哺乳動物起源（例えば、昆虫細胞）および哺乳動物起源（例えば、ヒト、霊長類、および齧歯類）の両方の動物細胞）由来の樹立された組織培養細胞株を包含する。
【００６３】
高等真核生物組織培養細胞もまた、本発明の配列番号２および／または配列番号４に記載のポリペプチド（あるいは、その改変体）の組換え生成のために使用され得る。任意の高等真核生物組織培養細胞株（昆虫バキュロウイルス発現系が挙げられる）が使用され得るが、哺乳動物細胞が、好ましい。このような細胞の形質転換、トランスフェクションおよび増殖は、慣用的手順となっている。有用な細胞株の例としては、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、Ｊ７７４細胞、Ｃａｃｏ２細胞、ラット乳児腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、鳥類細胞株、およびサル（ＣＯＳ）細胞株が挙げられる。そのような細胞株のための発現ベクターは、通常は、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位、および転写終結部位を含む。これらのベクターはまた、通常は、選択遺伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイルスのような供給源に由来するプロモーターを保有する、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。発現ベクターの例としては、ｐＣＲ（登録商標）３．１、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１１３６）、ｐＭＣ１ｎｅｏ  Ｐｏｌｙ−Ａ（Ｔｈｏｍａｓら、（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３）、ｐＲＥＰ８、ｐＳＶＳＰＯＲＴおよびそれらの誘導体、ならびにバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０）が挙げられる。
【００６４】
本発明の人工膜を調製する場合、宿主細胞において本発明の配列番号２および／または配列番号４に記載のポリペプチド（あるいは、その改変体）を組換え発現させ、その宿主細胞から膜画分を単離して人工膜を調製してもよい。
【００６５】
本発明はまた、本発明の配列番号２および／または配列番号４に記載のポリペプチドおよび配列番号１および／または配列番号３に記載のポリヌクレオチドと、第２ポリペプチド部分もしくは第２ポリヌクレオチド部分（「タグ」と呼ばれ得る）とを含む、融合物を包含する。本発明の融合ポリペプチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを、発現ベクター中に挿入することによって、簡便に構築され得る。本発明の融合物は、精製または検出を容易するタグを含み得る。そのようなタグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、セルロース結合タンパク質（ＣＢＰ）タグ、およびｍｙｃタグが挙げられる。検出可能なタグ（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、６８Ｇａ、１８Ｆ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１３ｍＩｎ、７６Ｂｒ、６７Ｇａ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎおよび６８Ｇａ）もまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを標識するために使用され得る。このような融合物を構築および使用するための方法は、当該分野で周知である。
【００６６】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【００６７】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【００６８】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
【００６９】
（ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤のスクリーニング法）
本発明のタンパク質を使用する種々の方法によって、ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングすることが可能である。例えば、
（ａ）リポソームにＡＴＰａｓｅ（例えば、液胞型ＡＴＰａｓｅ、ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅ、および／または、Ｈ／Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）と本発明の膜タンパク質を再構成し、
（ｂ）そのリポソームに（１）放射性標識したポリアミンのみ、（２）放射性標識したポリアミンと候補薬剤をそれぞれ添加してインキュベートし、
（ｃ）リポソームを遠心して沈澱させるか、または、リポソームを遠心カラムで分離させるなどして、リポソームを分離し、（１）の場合と（２）の場合とで、そのリポソームに取り込まれた放射性標識ポリアミンの量を比較し、
（ｄ）その候補薬剤がポリアミン輸送活性に影響を与えたか否かを決定する
ことによって、ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングすることが可能である。
【００７０】
あるいは、ＡＴＰａｓｅによって生成されるＨ＋濃度勾配に依存することなく、ポリアミン添加時にＨ＋濃度勾配を形成してもよい。例えば、以下の（Ｉ）〜（ＩＩ）が可能である：
（Ｉ）
（ａ）リポソームに本発明の膜タンパク質を再構成し、その際に、リポソームの内側を酸性にする、
（ｂ）そのリポソームに、アルカリ条件で（１）放射性標識したポリアミンのみ、（２）放射性標識したポリアミンと候補薬剤をそれぞれ添加してインキュベートし、
（ｃ）リポソームを遠心して沈澱させるか、または、リポソームを遠心カラムで分離させるなどして、リポソームを分離し、（１）の場合と（２）の場合とで、そのリポソームに取り込まれた放射性標識ポリアミンの量を比較し、
（ｄ）その候補薬剤がポリアミン輸送活性に影響を与えたか否かを決定する
ことによって、ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングする；
（ＩＩ）
（ａ）リポソームに本発明の膜タンパク質を再構成し、その際に、リポソームの内側を酸性〜中性にする、
（ｂ）そのリポソームに、リポソーム内部のｐＨと比較して、よりアルカリ条件で（１）放射性標識したポリアミンのみ、（２）放射性標識したポリアミンと候補薬剤をそれぞれ添加してインキュベートし、
（ｃ）リポソームを遠心して沈澱させるか、または、リポソームを遠心カラムで分離させるなどして、リポソームを分離し、（１）の場合と（２）の場合とで、そのリポソームに取り込まれた放射性標識ポリアミンの量を比較し、
（ｄ）その候補薬剤がポリアミン輸送活性に影響を与えたか否かを決定する
ことによって、ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングする。
【００７１】
あるいは、
（ａ）本発明の膜タンパク質を発現する細胞を調製し（例えば、本発明の遺伝子を用いて形質転換する）、
（ｂ）その細胞に、（１）放射性標識したポリアミンのみ、（２）放射性標識したポリアミンと候補薬剤をそれぞれ添加してインキュベートし、
（ｃ）細胞を破壊し、膜画分を調製し、（１）の場合と（２）の場合とで、膜画分に存在する放射性標識ポリアミンの量を比較し、
（ｄ）その候補薬剤がポリアミン輸送活性に影響を与えたか否かを決定する
ことによって、ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングすることが可能である。
【００７２】
あるいは、
（ａ）本発明の膜タンパク質を発現する細胞（例えば、本発明の遺伝子を用いて形質転換した細胞）から、天然膜または膜小胞を調製し、
（ｂ）その天然膜または膜小胞に、（１）放射性標識したポリアミンのみ、（２）放射性標識したポリアミンと候補薬剤をそれぞれ添加してインキュベートし、
（ｃ）インキュベートした溶液から天然膜または膜小胞を単離し、単離された天然膜または膜小胞について、（１）の場合と（２）の場合とで、放射性標識ポリアミンの量を比較し、
（ｄ）その候補薬剤がポリアミン輸送活性に影響を与えたか否かを決定する
ことによって、ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングすることが可能である。
【００７３】
リポソームの分離は、上記に記載の遠心分離、および、カラムによる分離以外に、フィルトレーションによる分離を用いてもよい。
【００７４】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００７５】
（実施例１：ポリアミントランスポーター候補遺伝子のクローニングおよび大量発現系の構築）
小胞型ポリアミントランスポーターは、従来報告されていない。本発明の発明者らは、ＳＬＣ１８型トランスポーターファミリーの各遺伝子をクローニングし、その、各々についてポリアミン輸送活性を検討した。試行錯誤の結果、ＳＬＣ１８Ｂ１がポリアミントランスポーターであることを、本発明の発明者らは見い出し、本発明を完成させた。
種々の生物種由来のＳＬＣ１８Ｂ１タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを図１に示す。ＳＬＣ１８Ｂ１遺伝子は動物界に広く存在する遺伝子であることから、動物の生存に必須であると考えられる。図１の「＊」は、動物種に拘わらず保存されているアミノ酸残基を、網掛けは、推定膜貫通領域を示す。【００７６】
本発明の小胞型ポリアミントランスポーター（ＶＰＡＴ）（ＳＬＣ１８Ｂ１）と、ＳＬＣ１８型トランスポーターファミリーの属する他のトランスポーターのアミノ酸配列のアラインメントを図２に示す。図２の図１の「＊」は、種々のトランスポーターで保存されているアミノ酸残基を、網掛けは、推定膜貫通領域を示す。【００７７】
ＳＬＣ１８型トランスポーターファミリーに属する公知のアミントランスポーターは、いずれもモノアミンを輸送するトランスポーターである。そのため、ポリアミントランスポーターが、従来公知のモノアミントランスポーターとは異なり、かつ、ＳＬＣ１８型トランスポーターファミリーに属することは、予想外の結果であった（実際大腸菌や酵母、植物のポリアミントランスポーターはＡＢＣ型やＳＬＣ２、６、７型であり、ＳＬＣ１８型に属するものはない）。【００７８】
クローニングの詳細は、以下のとおりである。なお、以下、本発明のポリアミントランスポーターを「ＶＰＡＴ」とも記載する。【００７９】
ヒトＶＰＡＴ  ｃＤＮＡのクローニングには５’−ｃａｃｃａｔｇｇａｇｇｃｇｃｔｇｇｇｔｇａｃ−３’（配列番号５）と５’−ａｃｔａｇｇｔｔｔｃａｔｔａｇｇｃａａｇａｇ−３’（配列番号６）との配列からなるプライマーを用いた。またマウスＶＰＡＴ  ｃＤＮＡのクローニングには５’−ＣＡＣＣａｔｇｇａｃｇａｇｇｃｇｇｇｃｔｃｃｃｃ−３’（配列番号７）と５’−ｃｔａｇｇｔｇｔｃａｔｔｇｇｇｃａａｇａ−３’（配列番号８）との配列からなるプライマーを用いた。クローニングしたｃＤＮＡについて、以下のとおり、インビトロジェン社のＧａｔｅｗａｙ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、昆虫細胞用大量発現システムを構築した。エントリーベクター（ｐＥＮＴＲ）にヒトおよびマウスのＶＰＡＴ  ｃＤＮＡをＰＣＲ法で組み込み、昆虫細胞用大量発現システムを構築した。その後、ＬＲ組換えにより、エントリーベクターからｐＤＥＳＴ１０発現ベクターに組み換えた。このプラスミドをバキュロウイルスゲノムを内包するＤＨ１０Ｂａｃ細胞にヒートショック法によって導入し、バクミドを得た。ＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬ  カナマイシン、７μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬ  テトラサイクリン）で一晩培養後、ミニプレップ法によってＶＰＡＴ  ｃＤＮＡを持つバクミドを回収した。得られたバクミド−はＰＣＲ法にて確認した。【００８０】
ウイルスはＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いて作製した。まずＳｆ９細胞を、３．５ｃｍのプレートあたり、細胞数が９×１０５になるように播種した。細胞がプレートに定着後、培地をＧｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＋  ０．３５ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨＣＯ３に交換した。バクミド１μｇとＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ  ６μＬを用い、リポフェクション法にてトランスフェクションした。インキュベーション後、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＴＭＮ−ＦＨ培地に交換し、感染兆候が見られるまで数日培養した。感染兆候が見られた後に培地を回収し、これをＰ１ウイルスとした。Ｐ１ウイルスにＶＰＡＴ  ｃＤＮＡが組み込まれていることを、ＰＣＲ法にて確認した。【００８１】
（実施例２：小胞型ポリアミントランスポーター（ＶＰＡＴ）の精製）
Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞にウイルスを感染（Ｍ．Ｏ．Ｉ．＝２）させ、ＥｘｐｒｅｓｓＦｉｖｅ  ＳＦＭ（１６ｍＭ  Ｌ−グルタミン)培地に交換後、２７℃で培養した。４８時間後、細胞を回収した。これをＤｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム、１０％グリセロール、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１０μｇ／ｍＬ  ロイペプチン、１０μｇ／ｍＬ  ペプスタチンＡ）で懸濁し、超音波処理により細胞を破砕した。この上清を回収し、超遠心して、得られた沈澱物を膜画分とした。この膜画分をオクチルグルコシドで可溶化し、１ｍＬのＮｉ-ＮＴＡ  ｓｕｐｅｒ  ｆｌｏｗ  レジン（ＱＩＡＧＥＮ）に吸着させた。その後、６０ｍＭのイミダゾールを含む溶出液（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ／Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、１％オクチルグルコシド、２０％グリセロール）でＶＰＡＴを溶出し、ＶＰＡＴを精製した。【００８２】
（実施例３：ＶＰＡＴ抗原ペプチドと抗体の作製）
マウスのＶＰＡＴ  ｃＤＮＡのＣ末領域（４２９-ＥＤＳＴＡＲＲＲＳＫＡＱＮＳＬＧＴＥＥＥＲＡＡＬＬＰＮＤＴ-４５７、配列番号９）をＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターであるｐＧＥＸ４Ｔ２（ＧＥヘルスケア）に組み込み、ｐＧＥＸ４Ｔ２−ＶＰＡＴとした。同様に、ヒトＶＰＡＴ  Ｎ末領域（１-ＭＥＡＬＧＤＬＥＧＰＲＡＰＧＧＤＤＰＡＧＳＡＧＥＴＰＧＷＬＳＲＥＱＶＦＶＬＩＳＡＡＳＶＮＬＧＳＭＭＣＹＳＩＬＧＰＦＦＰＫＥＡＥＫＫＧＡＳＮＴ-７０、配列番号１０）を発現するベクターを作製した。【００８３】
大腸菌Ｃ−４３株にヒートショック法によりｐＧＥＸ４Ｔ２−ＶＰＡＴを導入し、ＩＰＴＧにより、タンパク質発現を誘導した。この細胞を遠心操作で回収し、超音波処理により破菌した。終濃度が１％となるようにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加え、氷上で５分間放置し、可溶化した。遠心後の上清から、をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂレジン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、抗原タンパク質を精製した。【００８４】
（実施例４：ＶＰＡＴの発現パターン）
（１．各組織におけるＶＰＡＴの発現）
ヒトおよびマウスＶＰＡＴ遺伝子の各組織での発現をリアルタイムＰＣＲ法で解析した。ヒトＶＰＡＴ遺伝子の増幅には、核酸配列５'-ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ-３'からなるＦｗプライマー（配列番号１１）と、核酸配列５'-ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ-３'からなるＲｖプライマー（配列番号１２）とを用いた。マウスＶＰＡＴ遺伝子の増幅には、核酸配列５'-ＴＣＧＡＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧ-３'からなるＦｗプライマー（配列番号１３）と、核酸配列５'-ＣＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＡＧＧＣＴＡＧＧＴＧＴＣ-３'（配列番号１４）からなるＲｖプライマーを用いた。【００８５】
コントロールとしてＧ３ＰＤＨ遺伝子を用いた：ヒトＦｗプライマー：５’−ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ−３’（配列番号１５）、ヒトＲｖプライマー：５’−ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ−３’（配列番号１６）、マウスＦｗプライマー：５’−ＴＧＴＧＴＣＣＧＴＣＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡ−３’（配列番号１７）、マウスＲｖプライマー：５’−ＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＧＣＡＧＧＡＧ−３’（配列番号１８）。【００８６】
ヒトまたはマウスの各組織の全ＲＮＡ  １μｇをＴＡＫＡＲＡ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキットを用いて３７℃、１５分間反応し、その後８５℃で５秒間加熱してｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡをＴＡＫＡＲＡ  ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴｑｑＩＩキットと上記プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は９５℃、３０秒間のプレヒートの後、９５℃５秒間、６０℃３０秒間のサイクルを３５回繰り返した。【００８７】
ヒトについての結果を、図３に示す。ＶＰＡＴ遺伝子は、ポリアミンの分泌に関与する分泌小胞が多数存在する組織である脳および副腎に加え、精巣、肺、腎臓、胎盤などに多く発現していた。マウスを用いた場合も、同様の結果が得られた（図４）。【００８８】
（２．肺および腎臓におけるＶＰＡＴの発現）
抗マウスＶＰＡＴ抗体を用い、肺および腎臓におけるＶＰＡＴタンパク質の分布について実験をした。結果を図５に示す。図５のＡは、肺の気管支周辺についての結果である。図５のＢは、肺胞についての結果である。図５のＣは、腎臓の皮質についての結果である。図５のＤは、腎臓の髄質についての結果である。図５のＡ（肺の気管支周辺）において、ＣＣはクララ細胞を示し、Ｃは繊毛細胞を示し、そして、ＢＴは気管支を示す。図５のＢ（肺胞）において、Ｔ１は１型肺胞細胞を示し、そして、Ｔ２は２型肺胞細胞を示す。図５のＣ（腎臓の皮質）において、Ｇは糸球体を示し、ＰＴは腎近位尿細管を示し、そして、ＤＴは腎遠位尿細管を示す。図５のＤ（腎臓の髄質）において、ＤＴは腎遠位尿細管を示し、そして、ＣＤは集合管を示す。【００８９】
ＶＰＡＴは特に集合管に多く発現していた。また、ＶＰＡＴは、肺において、２型肺胞細胞およびクララ細胞で発現していた。写真中の白棒は、１０μｍを示す。【００９０】
（３．脳におけるＶＰＡＴの発現）
抗マウスＶＰＡＴ抗体を用い、脳における小胞型ポリアミントランスポーター（ＶＰＡＴ）の局在について実験をした。結果を図６に示す。【００９１】
図中、ｄｅｎｔａｔｅ  ｇｙｒｕｓは海馬歯状回をＣＡ２は海馬ＣＡ２領域を、Ｃｏｒｔｅｘは大脳皮質示す。左列はマウスのＶＰＡＴ抗体を用いた実験を、中列のＧＦＡＰ（Ｇｌｉａ  Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  Ａｃｉｄｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）はアストロサイトのマーカータンパク質の抗体を用いた結果を示す。右端の「ｍｅｒｇｅ」は左端と中央列の写真を重ね合わせた結果を示す。抗ＧＦＡＰ抗体は、脳アストロサイトの位置を示す。写真中の白棒は、１０μｍを示す。【００９２】
これらの結果から、（１）小胞型ポリアミントランスポーターは、脳アストロサイトに強く発現すること、および、（２）小胞型ポリアミントランスポーターは、アストロサイト以外の部分にも発現すること、が示された。【００９３】
次に、ラット海馬より単離した初代培養ラット海馬アストロサイトおよび初代培養ラット海馬神経細胞でのＶＰＡＴの発現を調べた。結果を図７に示す。写真中の白棒は、１０μｍを示す。図７のＡは初代培養ラット海馬アストロサイトでの結果を示し、図７のＢは初代培養ラット海馬神経細胞での結果を示す。図７の結果はＶＰＡＴがアストロサイトと一部の神経細胞に発現している事を示している。【００９４】
（４．肥満細胞におけるＶＰＡＴの発現）
免疫染色法により、マウス肥満細胞でのＶＰＡＴの発現を調べた。結果を図８に示す。写真中の白棒は、１０μｍを示す。上段左は抗ＶＰＡＴ抗体による免疫染色の結果を、下段左はコントロール血清を用いた免疫染色の結果を示す。上段中央は、上段左で示した細胞の微分干渉顕微鏡による写真であり、上段右は、上段中央の写真に上段左の結果を重ねた写真である。下段中央は、下段左で示した細胞の微分干渉顕微鏡による写真であり、下段右は、下段中央の写真に下段左の結果を重ねた写真である。図８の結果に示されるように、肥満細胞の顆粒においてＶＰＡＴの発現が見られた。これに対して、コントロールの血清では反応が見られなかった。肥満細胞はヒスタミンを分泌する免疫応答細胞であり、ＶＰＡＴがヒスタミン輸送を介して免疫反応にも関わっている事を示している。【００９５】
（実施例５：小胞型ポリアミントランスポーター（ＶＰＡＴ）の再構成と活性の測定）
（１．スペルミン輸送のタイムコース）
精製したＶＰＡＴ  ５０μｇ、リポソーム５５０μｇ、ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅ  ９０μｇを混合し、−８０℃にて１５分静置して凍結した。迅速に解凍し、Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ［２０ｍＭ  ＭＯＰＳ／Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム］にて３０倍に希釈し、超遠心（２００，０００×ｇ、１時間、４℃）した。沈澱物にＲｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２００μＬを加え懸濁し、再構成プロテオリポソームを得た。【００９６】
反応液［２０ｍＭ  ＭＯＰＳ／Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム］に作製した再構成プロテオリポソームを１．５μｇ加えて、２７℃水浴において２分間インキュベートした。これに終濃度５ｍＭのＡＴＰを加えてさらに２７℃、２分間インキュベートした。これに終濃度１０μＭのｔｅｒｍｉｎａｌ  ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−３Ｈ  スペルミン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．  １８．５  ＭＢｑ／μｍｏｌ）を加えて反応を開始した。このとき全量が１５０μＬとなるようにした。ここから１３０μＬ分取し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０  ｆｉｎｅスピンカラム（ＧＥヘルスケア）にアプライし、遠心（７００×ｇ、２分、４℃）した。その溶出液をクリアゾル  ３ｍＬに混ぜ、中に含まれる放射能（リポソーム内に取り込まれた基質の量に相当する）を液体シンチレーションカウンターにより計測した。その結果を図９のＡに示す。小胞型ポリアミントランスポーター（ＶＰＡＴ）によるポリアミン輸送は、ＡＴＰによって促進された。この結果は、小胞型ポリアミントランスポーター（ＶＰＡＴ）によるポリアミンの輸送が、人工膜上に存在するＨ＋ポンプ（ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅ）がＡＴＰを消費して形成するＨ＋濃度勾配を利用したこと、すなわち、小胞型ポリアミントランスポーター（ＶＰＡＴ）がＨ＋とポリアミン（スペルミン）を対向輸送で小胞内に輸送したことを示す（図９のＢ）。【００９７】
上記と同様に、マウスＶＰＡＴポリペプチドとＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅとを再構成した人工膜内へのポリアミン（スペルミン）の輸送活性を測定する実験を、ＶＰＡＴ（ＳＬＣ１８Ｂ１）を含まないコントロールおよびＡＴＰを含まないコントロールを用いて行った。結果を図１０のＡに示す。「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ」はＶＰＡＴおよびＡＴＰを含む場合、「−ＡＴＰ」はＡＴＰを含まない場合、「−ＳＬＣ１８Ｂ１  ＋ＡＴＰ」はＶＰＡＴ（ＳＬＣ１８Ｂ１）を含まないリポソームを用いた場合の結果である。【００９８】
（２．スペルミン濃度依存性）
図１０のＡの「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ」（すなわち、ＶＰＡＴおよびＡＴＰを含む場合）において、スペルミン濃度を変化させて輸送活性を測定した結果を図１０のＢに示す。Ｋｍは９４μＭであり、Ｖｍａｘは８．６ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであった。【００９９】
（３．スペルミン輸送の駆動力）
図１０のＡの「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ」（すなわち、ＶＰＡＴおよびＡＴＰを含む場合）において、スペルミン輸送はＨ＋濃度勾配を破壊するナイジェリシン（Ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ）の添加によって阻害された。一方、膜電位を消失させるバリノマイシン（Ｖａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ）では変化しなかった。また、ナイジェリシンとバリノマイシンを添加した場合（Ｎｉｇ＋Ｖａｌ）でも輸送活性は阻害された（図１０のＣ）。この事はＶＰＡＴがＨ＋の濃度勾配を駆動力とするＨ＋／ポリアミン対向輸送体である事を示している。【０１００】
（４．ｐＨ勾配によるスペルミン輸送）
ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅを組み込むことなく、ＶＰＡＴのみをリポソームに組み込み、リポソームの内側を酸性に、外側をアルカリ性（ｐＨ８．０）にして、スペルミンの輸送活性を測定した。その結果、図１０のＤに示すように、スペルミンの輸送活性が観察された。この結果はＶＰＡＴがＨ＋の濃度勾配を駆動力とするＨ＋／ポリアミン対向輸送体である事を示す
（５．スペルミジン輸送のタイムコース）
上記の「１．スペルミン輸送のタイムコース」と同様の実験を、スペルミンをスペルミジンに代えて行った。図１０のＥに示される結果から明らかなように、ＶＰＡＴはスペルミンと同様にスペルミジンを輸送する。【０１０１】
（６．スペルミジン濃度依存性）
上記の「２．スペルミン濃度依存性」と同様の実験を、スペルミンをスペルミジンに代えて行った。図１０のＦに示される結果から明らかなように、ＶＰＡＴはスペルミンと同様の濃度依存性でスペルミジンを輸送する。Ｋｍは４．２ｍＭであり、Ｖｍａｘは１７０ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであった。【０１０２】
（７．スペルミジン輸送の駆動力）
上記の「３．スペルミン輸送の駆動力」と同様の実験を、スペルミンをスペルミジンに代えて行った。図１０のＧに示される結果から明らかなように、ＶＰＡＴはスペルミンと同様にスペルミジンの輸送においても、Ｈ＋の濃度勾配を駆動力とするＨ＋／ポリアミン対向輸送体である。【０１０３】
（実施例６：小胞型ポリアミントランスポーター（ＶＰＡＴ）の輸送活性の阻害）
実施例５と同様に、ＶＰＡＴとＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅとを再構成した人工膜に、（１）ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅなしのリポソーム（Ｆ−ＡＴＰａｓｅ）、（２）１μＭ  レゼルピン（Ｒｅｓｅｒｐｉｎｅ）、（３）１μＭ  テトラベナジン（Ｔｅｔｒａｂｅｎａｚｉｎｅ）、（４）１ｍＭ  スペルミン（Ｓｐｅｒｍｉｎｅ）、（５）１ｍＭ  アグマチン（Ａｇｍａｔｉｎｅ）、（６）１ｍＭ  ドーパミン（Ｄｏｐａｍｉｎｅ）、または、（７）１ｍＭ  アセチルコリン（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）を添加することによる輸送活性の阻害を測定した。結果を図７に示す。縦軸は、人工膜内に輸送された放射性スペルミンの量を、上記（１）〜（７）を添加しなかった場合（Ｎｏ  Ａｄｄｉｔｉｏｎ）の相対値として示す。非放射性スペルミンを大過剰添加したコントロール（４）では、放射性スペルミンの輸送がほぼ完全に阻害された。ＡＴＰを分解し、Ｈ＋を輸送するＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅを含まないリポソームでは放射性スペルミンの輸送が見られなかった結果は（１）、ポリアミンの輸送が、Ｈ＋との対向輸送であることを支持する。小胞型モノアミントランスポーター（ＶＭＡＴ）阻害剤であるレゼルピン（２）またはテトラベナジン（３）を添加しても、ポリアミントランスポーターの輸送活性は、完全には阻害されなかった。このことは、ポリアミントランスポーターが、小胞型モノアミントランスポーター（ＶＭＡＴ）とは異なる性質を有することを示す。また、ドーパミン（６）は小胞型モノアミントランスポーター（ＶＭＡＴ）の基質であり、アセチルコリン（７）は小胞型アセチルコリントランスポーター（ＶＡＣｈＴ）の基質であるが、これらを大過剰に添加しても、ポリアミントランスポーターの輸送活性が阻害されなかったことは、ポリアミントランスポーターの基質が、小胞型モノアミントランスポーター（ＶＭＡＴ）とも、小胞型アセチルコリントランスポーター（ＶＡＣｈＴ）とも異なることを示す。【０１０４】
（実施例７：ＶＰＡＴの基質特異性）
精製したＶＰＡＴ、ＶＭＡＴ２、ＶＡＣｈＴをリポソームに組み込み、スペルミン、スペルミジン、セロトニン、アセチルコリンの輸送を測定した。ポリアミン（スペルミン、スペルミジン）はＶＰＡＴのみが輸送した。一方、いずれのトランスポーターもセロトニンを輸送した。アセチルコリンはＶＡＣｈＴによってのみ運ばれた。結果を、ＶＰＡＴによるスペルミンの輸送活性との相対値として図１２に示す。「Ｎ．Ｄ．」は検出限界以下であることを示す。この結果はＶＰＡＴがポリアミンだけでなく、モノアミン類が関わる化学伝達にも重要である事を示している。【０１０５】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明に従って、ポリアミン輸送を担うトランスポーターおよびそれをコードする遺伝子が同定された。本発明に従って、そのようなトランスポーターを含む人工膜を用いる、トランスポーターの活性調節剤のスクリーニング法が提供される。さらに、そのようなスクリーニング法によって、ポリアミン代謝が関与する疾患の予防剤・治療剤の候補物質をスクリーニングする方法およびそのような候補物質もまた、提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０１０７】
配列番号１は、ヒトポリアミントランスポーターの核酸配列である。【０１０８】
配列番号２は、ヒトポリアミントランスポーターのアミノ酸配列である。【０１０９】
配列番号３は、マウスポリアミントランスポーターの核酸配列である。【０１１０】
配列番号４は、マウスポリアミントランスポーターのアミノ酸配列である。【０１１１】
配列番号５は、ヒトポリアミントランスポーターのクローニングに使用したＦｗプライマーの核酸配列である。【０１１２】
配列番号６は、ヒトポリアミントランスポーターのクローニングに使用したＲｖプライマーの核酸配列である。【０１１３】
配列番号７は、マウスポリアミントランスポーターのクローニングに使用したＦｗプライマーの核酸配列である。【０１１４】
配列番号８は、マウスポリアミントランスポーターのクローニングに使用したＲｖプライマーの核酸配列である。【０１１５】
配列番号９は、マウスのＶＰＡＴのＣ末領域の配列である。【０１１６】
配列番号１０は、マウスのＶＰＡＴのＮ末領域の配列である。【０１１７】
配列番号１１は、ヒトＶＰＡＴ遺伝子  Ｆｗプライマーの配列である。【０１１８】
配列番号１２は、ヒトＶＰＡＴ遺伝子  Ｒｖプライマーの配列である。【０１１９】
配列番号１３は、マウスＶＰＡＴ遺伝子  Ｆｗプライマーの配列である。【０１２０】
配列番号１４は、マウスＶＰＡＴ遺伝子  Ｒｖプライマーの配列である。【０１２１】
配列番号１５は、ヒトＧ３ＰＤＨ遺伝子  Ｆｗプライマーの配列である。【０１２２】
配列番号１６は、ヒトＧ３ＰＤＨ遺伝子  Ｒｖプライマーの配列である。【０１２３】
配列番号１７は、マウスＧ３ＰＤＨ遺伝子  Ｆｗプライマーの配列である。【０１２４】
配列番号１８は、マウスＧ３ＰＤＨ遺伝子  Ｒｖプライマーの配列である。
【図１】
2014068991.tif 000002
【図２】
2014068991.tif 000003
【図３】
2014068991.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2014068991000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年1月31日(2014.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤のスクリーニング法であって、
（１）人工膜を提供する工程であって、ここで、該人工膜が、以下：
（ａ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％同一である配列を含む核酸であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｄ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含む核酸配列を有する核酸配列であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｅ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸；
（ｆ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；ならびに、
（ｇ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
からなる群から選択される核酸によってコードされるポリペプチドを含む、工程；
（２）該人工膜に候補薬物を接触させる工程；
（３）該人工膜のポリアミン輸送活性を測定する工程；および、
（４）工程（３）で測定されたポリアミン輸送活性から、該候補薬物がポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤であるか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記活性調節剤が阻害剤である、請求項１１または２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記活性調節剤が活性促進剤である、請求項１１または２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
以下：
（ａ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％同一である配列を含む核酸であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｄ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含む核酸配列を有する核酸配列であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｅ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸；
（ｆ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；ならびに、
（ｇ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
からなる群から選択される核酸によってコードされるポリペプチドを含む人工膜を含む、ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングするための、組成物。
【請求項１６】
ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングするためのキットであって、以下：
（Ｉ）核酸であって、以下：
（ａ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％同一である配列を含む核酸であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｄ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含む核酸配列を有する核酸配列であって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｅ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸；
（ｆ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；ならびに、
（ｇ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
からなる群から選択される核酸、ならびに、
（ＩＩ）脂質
を含む、キット。
【請求項１７】
請求項１６に記載のキットであって、前記（Ｉ）核酸が、以下：
（ａ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸；ならびに、
（ｉ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される、キット。
【請求項１８】
ポリアミン輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングするためのキットであって、以下：
（ＩＩＩ）ポリペプチドであって、以下：
（ｊ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸によってコードされるポリペプチド；
（ｋ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
（ｌ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％同一である配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
（ｍ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含む核酸配列を有する核酸配列によってコードされるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
（ｎ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｏ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；ならびに、
（ｐ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ポリアミン輸送活性を有するポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチド、ならびに、
（ＩＩ）脂質
を含む、キット。
【請求項１９】
請求項１８に記載のキットであって、前記（ＩＩＩ）ポリペプチドが、以下：
（ｑ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列からなる核酸によってコードされるポリペプチド、ならびに；
（ｒ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
からなる群から選択される、キット。
【請求項２０】
さらに、プロトンポンプを含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】
さらに、ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅを含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
請求項１１に記載の方法であって、前記人工膜が、以下：
（ｈ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列からなる核酸；ならびに、
（ｉ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される核酸によってコードされるポリペプチドを含む、方法。
【請求項２３】
請求項１１に記載の方法であって、前記人工膜が膜小胞である、方法。
【請求項２４】
請求項１１に記載の方法であって、前記人工膜がリポソームである、方法。
【請求項２５】
請求項１１に記載の方法であって、前記人工膜がさらにプロトンポンプを含む、方法。
【請求項２６】
請求項１１に記載の方法であって、前記人工膜がさらにＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅを含む、方法。
【請求項２７】
請求項１５に記載の組成物であって、前記人工膜が、以下：
（ｈ）配列番号１および配列番号３からなる群から選択される核酸配列からなる核酸；ならびに、
（ｉ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
からなる群から選択される核酸によってコードされるポリペプチドを含む、組成物。
【請求項２８】
請求項１５に記載の組成物であって、前記人工膜が膜小胞である、組成物。
【請求項２９】
請求項１５に記載の組成物であって、前記人工膜がリポソームである、組成物。
【請求項３０】
請求項１５に記載の組成物であって、前記人工膜がさらにプロトンポンプを含む、組成物。
【請求項３１】
請求項１５に記載の組成物であって、前記人工膜がさらにＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅを含む、組成物。
【国際調査報告】
2014068991.tif 000014
2014068991.tif 000015
2014068991.tif 000016
2014068991.tif 000017