(57)【要約】  本発明は、ヒトＢＭＰ９（Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−９）に結合する、抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体又はその抗体断片、該抗体又は該抗体断片を産生するハイブリドーマ、該抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマ又は該形質転換体を用いる抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とする治療薬を提供する。また本発明は、該抗体又は該抗体断片を有効成分として含有する、異所性骨化疾患の治療に使用するための医薬組成物及びそれを用いた異所性骨化疾患の治療方法を提供する。
2014051109.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれる１の抗体と競合してヒトＢＭＰ９に結合し、ヒトＢＭＰタイプＩ受容体とヒトＢＭＰ９の結合を阻害し、かつ、ヒトＢＭＰタイプＩ受容体由来シグナルのうち、ＦＯＰ−ＡＬＫ２由来シグナルを選択的に阻害するモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（ａ）相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、以下ＣＤＲと記す）１〜３がそれぞれ配列番号５４〜５６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、及び／又はＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５７〜５９で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（ｂ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６０〜６２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、及び／又はＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６３〜６５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（ｃ）配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、及び／又は配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含む抗体
（ｄ）配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、及び／又は配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含む抗体
【請求項２】
前記（ａ）〜（ｄ）から選ばれる１の抗体と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
【請求項３】
遺伝子組換え抗体である、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
【請求項４】
ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、請求項３に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれる１のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（ａ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５４〜５６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、及び／又はＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５７〜５９で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
（ｂ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６０〜６２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、及び／又はＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６３〜６５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
【請求項６】
配列番号６７で表されるヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列のうち、１番目から７４番目に含まれるアミノ酸に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体及び該抗体断片。
【請求項７】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体断片。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体又は該抗体断片を採取することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いるヒトＢＭＰ９の免疫学的検出又は測定方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片と薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を投与することを含む、ヒトＢＭＰ９が関与する異所性骨化疾患の治療方法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を含む、ヒトＢＭＰ９が関与する異所性骨化疾患の治療薬。
【請求項１６】
ヒトＢＭＰ９に結合し、ヒトＢＭＰタイプＩ受容体とヒトＢＭＰ９の結合を阻害し、かつ、ヒトＢＭＰタイプＩ受容体のうち、ＦＯＰ−ＡＬＫ２由来シグナルを選択的に阻害するモノクローナル抗体又は該抗体断片を投与することを含む、ヒトＢＭＰ９が関与する異所性骨化疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＢＭＰ９（Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−９）に結合し、ヒトＢＭＰ９とＡＬＫ１との結合阻害活性を有し、かつ、ヒトＢＭＰタイプＩ受容体のうち、ＦＯＰ−ＡＬＫ２由来シグナルを選択的に阻害する抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体又はその抗体断片、該抗体又は該抗体断片を産生するハイブリドーマ、該抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマ又は該形質転換体を用いる抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とする治療薬に関する。また本発明は、該抗体又は該抗体断片を有効成分として含有する、異所性骨化疾患の治療に使用するための医薬組成物及びそれを用いた異所性骨化疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢＭＰ９は、Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ９の略で、別名ＧＤＦ２とも呼ばれる。ＢＭＰ９は約２０種類からなるＢＭＰ（骨形成蛋白質）ファミリー分子に属し、ヒトＢＭＰ９は４２９アミノ酸からなる分泌蛋白質である（非特許文献１）。ＢＭＰ９は、胎児期では脊髄または体節間膜で、成体期では肝臓で主に発現し（非特許文献２、３、４）、ヒトＢＭＰ９は血液中に２−１２ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する血中循環因子であることが知られている（非特許文献５）。【０００３】
生体内におけるＢＭＰ９の役割について、これまでＢＭＰ９欠損マウスまたは動物への抗ＢＭＰ９抗体投与に基づく報告は行われたことがないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの知見に基づく報告はいくつか行われている。例えば、肥大軟骨細胞の形成若しくは間葉細胞から軟骨への分化に対する促進作用の発現（非特許文献６、７、８）、または血液前駆細胞の産生若しくはコロニー形成に対する促進作用の発現（非特許文献９）である。【０００４】
異所性骨化とは、本来骨形成の起こらない軟部組織（筋肉、腱、靭帯、臓器）に起こる骨形成の総称で、異所的骨形成ともいう。異所性骨化を伴う疾患である進行性骨化性線維異形成症（Ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖａ：ＦＯＰ、以下ＦＯＰと記載）では、小児期から全身の骨格筋、筋膜、腱または靭帯などの線維性組織が進行性に骨化し、このために四肢関節の可動域低下若しくは強直、または体幹の可動性低下若しくは変形を生じる。【０００５】
本疾患は、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のタイプＩ受容体であるａｃｔｉｖｉｎ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２（ＡＬＫ２、ＡＣＶＲ１とも呼ばれるときがある）の遺伝子変異（６１７Ｇ＞Ａ；Ｒ２０６Ｈ）が原因とされている（非特許文献１０）。【０００６】
この遺伝子変異は、ＡＬＫ２のリガンドである、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ａｃｔｉｖｉｎが結合しなくても、シグナルが細胞内に伝わることにより骨化が生じる、構成的活性化変異と考えられている（非特許文献１０）。【０００７】
また、この遺伝子変異のあるＡＬＫ２（以下、ＦＯＰ−ＡＬＫ２と記載）は、ＡＬＫ２リガンドの一つであるＢＭＰ６に対する応答性が亢進した変異体であるとの報告もなされている（非特許文献１１）。【０００８】
一方、このＦＯＰ−ＡＬＫ２は、ＢＭＰ９に対する対する応答性も亢進した変異体であるとの報告はない。さらに、ＦＯＰを含む、異所性骨化疾患とＢＭＰ９との関連性も報告されていない。つまり、従来技術から、抗ＢＭＰ９抗体が異所性骨化疾患の治療作用を有することを予想することは極めて困難であった。【０００９】
抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体として、Ｒ＆Ｄシステムズ社よりＢＭＰ９に対する中和活性を有するモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、クローンＮｏ．３６０１０７、以下、Ｒ＆Ｄ抗体と記載）が市販されているが、その他の抗体は知られていない。【００１０】
現在のＦＯＰ治療は、骨化を抑えることが可能な根本的な治療法はなく、痛みを抑えるなどの対処的な療法に留まっている。ＡＬＫ２に対するキナーゼ阻害活性を有する低分子化合物が、ＦＯＰ治療に有効である可能性は示されているが（非特許文献１２）、非選択的なキナーゼ阻害活性による副作用が懸念されている。このような背景から、ＦＯＰには新たな治療薬の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０，２６，２５１１１（２００５）
【非特許文献２】Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１，２９４（２００３）
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，２４，１７９３７（２０００）
【非特許文献４】Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｐａｒｉｓ，９６，５３（２００２）
【非特許文献５】Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，１０２，８，９１４（２００８）
【非特許文献６】Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１１，１７，１３１２（２００４）
【非特許文献７】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４，１，６４９（２００９）
【非特許文献８】Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，２６，６，１１６６（２０１１）
【非特許文献９】Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，２１，２，７１（２００３）
【非特許文献１０】Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，１，１９１（２００８）
【非特許文献１１】Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，６，１２０８（２０１０）
【非特許文献１２】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｄｉｃｉｎｅ，１４，１３６３（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ＦＯＰを含む異所性骨化疾患の治療に用いることのできる、抗ヒトＢＭＰ９抗体を有効成分とする治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ＢＭＰ９欠損マウスを用いて抗ＢＭＰ９抗体の取得を試みたところ、Ｒ＆Ｄ抗体に比して、著しくＢＭＰ９に対する結合性が向上した抗ＢＭＰ９抗体の取得に成功した。取得した抗ＢＭＰ９抗体は、Ｒ＆Ｄ抗体とは異なるエピトープを認識し、Ｒ＆Ｄ抗体にはない、ＢＭＰタイプＩレセプターへの結合阻害作用を有する抗体であった。さらに、この抗ＢＭＰ９抗体は、ＢＭＰ９によるＡＬＫ１由来シグナルに対し、ＦＯＰ−ＡＬＫ２由来シグナルに基づく骨分化を選択的に阻害できる抗体であった。【００１４】
本発明者らはこれらの知見に基づき、抗ＢＭＰ９抗体を有効成分とする、異所性骨化疾患に対する治療剤を提供できると考え、本発明を完成させるに至った。【００１５】
本発明の要旨は以下である。
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれる１の抗体と競合してヒトＢＭＰ９に結合し、ヒトＢＭＰタイプＩ受容体とヒトＢＭＰ９の結合を阻害し、かつ、ヒトＢＭＰタイプＩ受容体由来シグナルのうち、ＦＯＰ−ＡＬＫ２由来シグナルを選択的に阻害するモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（ａ）相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、以下ＣＤＲと記す）１〜３がそれぞれ配列番号５４〜５６で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と記す）を含み、及び／又はＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５７〜５９で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖（以下、Ｌ鎖と記す）を含む抗体
（ｂ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６０〜６２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、及び／又はＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６３〜６５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（ｃ）配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨと記す）を含み、及び／又は配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変領域（以下、ＶＬと記す）を含む抗体
（ｄ）配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、及び／又は配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含む抗体
（２）前記（ａ）〜（ｄ）から選ばれる１の抗体と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である、（１）に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（３）遺伝子組換え抗体である、（１）または（２）に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（４）ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、（３）に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（５）以下の（ａ）〜（ｂ）から選ばれる１のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（ａ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５４〜５６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、及び／又はＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５７〜５９で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
（ｂ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６０〜６２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、及び／又はＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６３〜６５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
（６）配列番号６７で表されるヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列のうち、１番目から７４番目に含まれるアミノ酸に結合する、（１）〜（５）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体及び該抗体断片。
（７）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（１）〜（６）のいずれか１に記載の抗体断片。
（８）（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ。
（９）（８）に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（１０）（９）に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（１１）（１０）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体又は該抗体断片を採取することを特徴とする（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の製造方法。
（１２）（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いるヒトＢＭＰ９の免疫学的検出又は測定方法。
（１３）（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片と薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物。
（１４）（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を投与することを含む、ヒトＢＭＰ９が関与する異所性骨化疾患の治療方法。
（１５）（１）〜（７）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を含む、ヒトＢＭＰ９が関与する異所性骨化疾患の治療薬。
（１６）ヒトＢＭＰ９に結合し、ヒトＢＭＰタイプＩ受容体とヒトＢＭＰ９の結合を阻害し、かつ、ヒトＢＭＰタイプＩ受容体のうち、ＦＯＰ−ＡＬＫ２由来シグナルを選択的に阻害するモノクローナル抗体又は該抗体断片を投与することを含む、ヒトＢＭＰ９が関与する異所性骨化疾患の治療方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体および該抗体断片は、Ｒ＆Ｄ抗体とは異なるエピトープを認識し、Ｒ＆Ｄ抗体にはない、ＢＭＰタイプＩレセプターへの結合阻害作用を有する抗体である。また、本発明のモノクローナル抗体および該抗体断片は、ＢＭＰ９によるＡＬＫ１由来シグナルに対し、ＦＯＰ−ＡＬＫ２由来シグナルに基づく骨分化を選択的に阻害できるとともに、副作用の懸念が少ないという利点を有する。したがって、本発明のモノクローナル抗体および該抗体断片によれば、該抗体および抗体断片を有効成分とする、ＦＯＰを含む異所性骨化疾患に対する治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、マウスＢＭＰ９  遺伝子ノックアウト用ベクターの構造を示す図である。ｍｏｕｓｅ  ５’  ｇｅｎｏｍｅは、ＢＭＰ９遺伝子ノックアウトベクター  ５’相同領域を、Ｎｅｏｒはネオマイシン耐性遺伝子を、ｍｏｕｓｅ  ３’  ｇｅｎｏｍｅはＢＭＰ９遺伝子ノックアウトベクター３’相同領域を、ＤＴ−ＡはジフテリアトキシンＡ鎖遺伝子を、Ｔ３はＴ３プロモーターを、Ｔ７はＴ７プロモーターを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔはクローニングベクターをそれぞれ表す。
【図２】図２は、取得した抗ヒトＢＭＰ９モノクローナル抗体のヒトＢＭＰ９への結合特異性を酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって示した図である。縦軸は吸光度（４５０−５７０ｎｍ）を示す。固相化した抗原がヒトＢＭＰ９の場合を黒、ヒトＢＭＰ１０の場合を白で示す。
【図３】図３は、取得した抗ヒトＢＭＰ９モノクローナル抗体のヒトＢＭＰ９への結合性をＥＬＩＳＡによって示した図である。横軸に抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、縦軸に各抗体濃度における吸光度（４５０−５７０ｎｍ）を示す。それぞれ、抗体なしは○、３Ｂ７−３−３抗体は△、３Ｃ７−３−１抗体は□、Ｒ＆Ｄ抗体は●で示す。
【図４】図４は、取得した抗ヒトＢＭＰ９モノクローナル抗体のヒトＢＭＰ９と標識Ｒ＆Ｄ抗体の結合に対する阻害作用を示した図である。横軸は標識をしていない抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、縦軸は各抗体のＢＭＰ９／Ｒ＆Ｄ抗体の結合に対する阻害活性（％）を示す。それぞれ、３Ｂ７−３−３抗体は△、３Ｃ７−３−１抗体は□、Ｒ＆Ｄ抗体は●で示す。
【図５】図５は既存及び取得した抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体の非標識抗体による、各標識抗体とヒトＢＭＰ９の結合に対する阻害作用を酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）で検出した図である。横軸は、検出に用いたビオチン標識抗体を、縦軸は吸光度（４５０−５７０ｎｍ）を示す。３Ｂ７−３−３抗体は黒、３Ｃ７−３−１抗体は斜線、Ｒ＆Ｄ抗体は格子、抗体なしは白で示す。
【図６】図６は、取得した抗ヒトＢＭＰ９モノクローナル抗体のヒトＢＭＰ９とヒトＡＬＫ１の結合に対する阻害作用を示した図である。横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、縦軸は各抗体のＢＭＰ９／ＡＬＫ１結合に対する阻害活性（％）を示す。それぞれ、３Ｂ７−３−３抗体は△、３Ｃ７−３−１抗体は□、Ｒ＆Ｄ抗体は●で示す。
【図７】図７は、取得した抗ヒトＢＭＰ９モノクローナル抗体のＢＭＰ９依存性ＡＬＫ１由来シグナルに対する阻害作用を示した図である。横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、縦軸は各抗体のＢＭＰ９依存性ＡＬＫ１由来シグナルに対する阻害活性（％）を示す。それぞれ、３Ｃ７−３−１抗体は□、Ｒ＆Ｄ抗体は●で示す。
【図８】図８は、ＦＯＰ−ＡＬＫ２遺伝子導入Ｃ２Ｃ１２細胞の骨分化に対する血清（ＦＣＳ）濃度の影響を５％と２０％で比較した図である。縦軸は各細胞中のアルカリフォスファターゼ活性値；吸光度（４１４ｎｍ）を示す。ＦＯＰ−ＡＬＫ２遺伝子を黒、野生型ｈＡＬＫ２遺伝子を斜線、コントロールベクターを白で示す。統計学的有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて解析し、＊＊はＰ＜０．０１を示す。図内のエラーバーは標準偏差（ＳＤ、ｎ＝３）を示す。
【図９】図９は、ＦＯＰ−ＡＬＫ２遺伝子導入Ｃ２Ｃ１２細胞の血清（ＦＣＳ）高濃度添加による骨分化に対する、Ｒ＆Ｄ抗体の作用を示した図である。縦軸は各細胞中のアルカリフォスファターゼ活性値；吸光度（４１４ｎｍ）を示す。Ｒ＆Ｄ抗体添加時を黒、非添加時を白で示す。統計学的有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて解析し、＊＊はＰ＜０．０１を、＊＊＊はＰ＜０．００１を示す。図内のエラーバーは標準偏差（ＳＤ、ｎ＝３）を示す。
【図１０】図１０は、ＦＯＰ−ＡＬＫ２遺伝子導入Ｃ２Ｃ１２細胞株のヒトＢＭＰ９組換え蛋白質に対する反応性を示した図である。横軸はヒトＢＭＰ９組換え蛋白質添加濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、縦軸は各細胞中のアルカリフォスファターゼ活性値；吸光度（４１４ｎｍ）を示す。それぞれ、野生型ＡＬＫ２遺伝子導入２Ｃ１２細胞株は△、ＦＯＰ−ＡＬＫ２遺伝子導入Ｃ２Ｃ１２細胞株は□、コントロールベクター導入Ｃ２Ｃ１２細胞株は●で示す。図内のエラーバーは標準偏差（ＳＤ、ｎ＝３）を示す。
【図１１】図１１は、ＦＯＰ−ＡＬＫ２遺伝子導入Ｃ２Ｃ１２細胞株のヒトＢＭＰ９組換え蛋白質添加による骨分化（アルカリフォスファターゼ活性上昇）に対する、抗ヒトＢＭＰ９モノクローナル抗体の作用を示した図である。横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、縦軸は各抗体のＢＭＰ９組換え蛋白質添加による骨分化に対する阻害活性（％）を示す。それぞれ、３Ｃ７−３−１抗体は△、Ｒ＆Ｄ抗体は●で示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ヒトＢＭＰ９に結合するモノクローナル抗体に関する。
【００１９】
本発明において、抗体と競合してヒトＢＭＰ９に結合する抗体とは、ヒトＢＭＰ９に本発明のモノクローナル抗体と同一又は部分的に同一のエピトープ（抗原決定基ともいう）を有し、該エピトープに結合する抗体をいう。本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体とは、本発明のモノクローナル抗体が認識するヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列と同じ配列を認識し結合する抗体をいう。
【００２０】
ヒトＢＭＰ９は、配列番号６６で表されるアミノ酸配列を持つ、一本鎖の前駆体蛋白質蛋白質（Ｐｒｅ−Ｐｒｏ体）として合成される。この一本鎖のＰｒｅ−Ｐｒｏ体は、配列番号６６で表されるアミノ酸配列のうち、ゴルジ体にて、１から２２番目までのシグナルペプチド領域が切断された後、３９２番目に存在するシステイン残基間によるジスルフィド結合を介し、２量体（Ｐｒｏ２量体）を形成する。
【００２１】
その後、ｆｕｒｉｎ様プロテアーゼにより、配列番号６６で表されるアミノ酸配列の３１９番目と３２０番目のアミノ酸残基間で切断が起こり、ジスルフィド結合を持たないＮ末側段片のプロペプチド領域（配列番号６６で表されるアミノ酸配列のうち、２３番目のアミノ酸から３１９番目のアミノ酸までを含むペプチド）と配列番号６７で表されるアミノ酸配列からなるＣ末側断片（ｍａｔｕｒｅ領域）に分割される。
【００２２】
前記ｍａｔｕｒｅ領域は、プロペプチド領域の切断後も、配列番号６７で表されるアミノ酸配列の７３番目に残るシステイン残基間によるジスルフィド結合を介し、２量体を形成する（以下、ｍａｔｕｒｅ２量体と表記する）。
【００２３】
切断されたＮ末側のプロペプチド領域の２分子は、前記ｍａｔｕｒｅ２量体１分子と非共有結合を介し複合体を形成し、その複合体の形で細胞から分泌される［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０，２６，２５１１１（２００５）］。ｍａｔｕｒｅ２量体及びｍａｔｕｒｅ２量体にＮ末プロペプチド領域が結合した複合体のいずれも、ＢＭＰ９の機能を有している。
【００２４】
従って、本発明におけるヒトＢＭＰ９としては、配列番号６６又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８で示されるアミノ酸配列のうち、ｍａｔｕｒｅ領域に相当する３２０番目から４２９番目までのアミノ酸配列（配列番号６７）を含み、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチド、ｍａｔｕｒｅ領域に相当する３２０番目から４２９番目までのアミノ酸配列（配列番号６７）において、１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチド、及び配列番号６７で示されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチド、ならびに上述のｍａｔｕｒｅ２量体、及びｍａｔｕｒｅ２量体にＮ末プロペプチド領域が結合した複合体も包含される。
【００２５】
前記ＢＭＰ９の機能としては、ＢＭＰ９の細胞内のシグナル伝達への関与をいう。細胞内のシグナル伝達では、ＢＭＰ９がＴＧＦβスーパーファミリーに属するＢＭＰタイプＩ及びＢＭＰタイプＩＩの２つの受容体に結合することにより、当該受容体が活性化され、Ｓｍａｄ１／５／８がリン酸化され、さらにリン酸化により活性化されたＳｍａｄ１／５／８が、Ｓｍａｄ４と複合体を形成後、核内に移行し、転写因子として機能する。
【００２６】
ＢＭＰタイプＩ受容体としては、ＡＬＫ１及びＡＬＫ２が挙げられる。ＡＬＫ２としては、ＦＯＰの原因とされている遺伝子変異（６１７Ｇ＞Ａ；Ｒ２０６Ｈ）のある、ＦＯＰ−ＡＬＫ２も含まれる。また、ＢＭＰタイプＩＩ受容体としては、ＢＭＰタイプＩＩ受容体（ＢＭＰＲＩＩ）、ａｃｔｉｖｉｎタイプＩＩａ受容体（ＡｃｔＲＩＩａ）、及びａｃｔｉｖｉｎタイプＩＩｂ受容体（ＡｃｔＲＩＩｂ）が挙げられる。
【００２７】
配列番号６７で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得る方法としては、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ、３４、３１５（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４８８（１９８５）］などを用いて、例えば、配列番号６７で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子に部位特異的変異を導入する方法が挙げられる。
【００２８】
欠失、置換又は付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個〜数十個、例えば、１〜２０個、より好ましくは１個〜数個、例えば、１〜５個のアミノ酸である。
【００２９】
ヒトＢＭＰ９をコードする遺伝子としては、配列番号６８又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６２０４で示される塩基配列が挙げられる。そのうち、ｍａｔｕｒｅ領域に相当する配列番号６９で示される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、配列番号６９で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、ならびに配列番号６９で示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつヒトＢＭＰ９の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子なども、本発明のヒトＢＭＰ９をコードする遺伝子に包含される。
【００３０】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号６９で示される塩基配列を有するＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、又はＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味する。
【００３１】
具体的には、ハイブリダイズしたコロニーもしくはプラーク由来のＤＮＡ、又は該配列を有するＰＣＲ産物又はオリゴＤＮＡを固定化したフィルター又はスライドガラスを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）］を行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルター又はスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
【００３２】
前記ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号６９で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
【００３３】
真核生物の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明のＢＭＰ９をコードする遺伝子に包含される。
【００３４】
本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよい。塩基配列については、例えば、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３（１９９０）］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
【００３５】
また、アミノ酸配列については、例えば、ＢＬＡＳＴ２［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５、３３８９（１９９７）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、７、６４９（１９９７）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌ］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
【００３６】
デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、−Ｅ（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、−ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈ）が−３、−ｒ（ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍａｔｃｈ）が１、−ｅ（ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）が１０、−Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、−ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ  ｂｌａｓｔ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、−Ｘ（Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂｉｔｓ）が１５及びＺ（ｆｉｎａｌ  Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍｌ／ｂｌａｓｔｃｇｉｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）。
【００３７】
配列番号６６又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができ、例えば、配列番号６６で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。
【００３８】
また、上記の方法で作製されるポリペプチド又はＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号６６又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。
【００３９】
さらに、配列番号６６又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド、又は配列番号６６又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。
【００４０】
本発明のモノクローナル抗体（以下、本発明の抗体ともいう。）は、ヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列、又はその立体構造を認識し、かつ結合する抗体又はその抗体断片であり、ヒトＢＭＰタイプＩ受容体とヒトＢＭＰ９の結合を阻害し、ヒトＢＭＰタイプＩ受容体由来シグナルのうち、ＦＯＰ−ＡＬＫ２由来シグナルを選択的に阻害する性質を有する。
【００４１】
本発明におけるヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号６７で表されるヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列を２つ含み、７３番目のシステイン残基間がジスルフィド結合を形成しているものが挙げられる。
【００４２】
本発明におけるヒトＢＭＰ９の立体構造としては、配列番号６６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７２８８又は配列番号６７で示されるアミノ酸配列を含むヒトＢＭＰ９が天然状態でとりうる構造と同等の構造を有していればいずれの構造でもよい。ヒトＢＭＰ９が天然状態でとりうる立体構造とは、ヒトＢＭＰ９の天然型の立体構造のことをいう。
【００４３】
本発明におけるヒトＢＭＰタイプＩ受容体としては、ヒトＡＬＫ１及びヒトＡＬＫ２が挙げられる。ヒトＡＬＫ１としては、配列番号１８又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ４２６３７で示されるアミノ酸配列のうち、細胞外領域に相当する２２番目から１１８番目までのアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
【００４４】
ヒトＡＬＫ２としては、配列番号７０若しくはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０９６で示されるアミノ酸配列、又は、配列番号７０若しくはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０９６で示されるアミノ酸配列中、２０６番目アミノ酸がアルギニンからヒスチジンに変異したアミノ酸配列（配列番号７１）のうち、細胞外領域に相当する２２番目から１１８番目までのアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
【００４５】
前記抗体として、具体的には、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）のモノクローナル抗体及びその抗体断片が挙げられる。
（ｉ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５４〜５６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５７〜５９で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
（ｉｉ）ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６０〜６２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６３〜６５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
また、本発明のモノクローナル抗体としてより具体的には、以下の（ａ）及び（ｂ）のモノクローナル抗体及びその抗体断片が挙げられる。
（ａ）配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
（ｂ）配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むモノクローナル抗体及びその抗体断片
【００４６】
さらに、本発明のモノクローナル抗体としては、前記モノクローナル抗体が結合するヒトＢＭＰ９に存在するエピトープと、同じエピトープに結合するモノクローナル抗体及びその抗体断片を挙げることができる。
【００４７】
本発明の抗体又はその抗体断片が、ヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列、又はその立体構造に結合することは、固相抗原を用いた酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）など、ヒトＢＭＰ９またはヒトＢＭＰ９を発現した組織に対する公知の免疫学的検出法、特定の抗原と特定抗原に対する抗体の結合性を調べることができる方法などにより確認することができる。
【００４８】
例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）などを用いた表面プラズモン共鳴、ＩＴＣ（ＤＫＳＨ社製）などを用いた等温滴定カロリメトリーなどの方法が挙げられる。
【００４９】
抗原に対する抗体の結合解離定数（Ｋｄ値）は、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、等温滴定カロリメトリー、いずれの方法からも、スキャッチャード・プロットまたは各装置の添付文書に従った解析を行うことで、求めることができる。
【００５０】
例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて測定したセンサーグラムから、シングルサイクルカイネティクス算出法（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒ．３、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により解析することで、算出することができる。
【００５１】
また、公知の免疫学的検出法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを組み合わせて確認することもできる。
【００５２】
ヒトＢＭＰ９を発現した組織としては、該ＢＭＰ９を発現していればいずれの組織でもよく、例えば、血液、肝臓などが挙げられる。
【００５３】
本発明の抗体又はその抗体断片が、ヒトＢＭＰタイプＩ受容体とヒトＢＭＰ９の結合を阻害することは、固相抗原を用いた酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）など、ヒトＢＭＰ９やまたはヒトＢＭＰ９を発現した組織に対する公知の免疫学的検出法により確認できる。例えば、固相化したヒトＢＭＰ９に対し、ヒトＡＬＫ１又はヒトＡＬＫ２が、本発明の抗体又はその抗体断片の存在下で結合しないことにより、確認することができる。
【００５４】
本発明の抗体又はその抗体断片が、ヒトＢＭＰタイプＩ受容体シグナルのうち、ＦＯＰ−ＡＬＫ２由来シグナルを選択的に阻害することは、ヒトＡＬＫ１発現細胞とヒトＦＯＰ−ＡＬＫ２発現細胞を作製し、レポーターアッセイなど、公知の検出法を用いることにより確認できる。例えば、播種したヒトＡＬＫ１発現細胞に、ヒトＢＭＰ９を添加することで観測される細胞の応答に比べ、播種したヒトＦＯＰ−ＡＬＫ２発現細胞に、ヒトＢＭＰ９を添加することで観測される細胞の応答を、本発明の抗体又はその抗体断片がより強く阻害することにより、確認することができる。
【００５５】
ヒトＡＬＫ１発現細胞としては、該ＡＬＫ１と検出に必要な蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換した細胞であれば、いずれの細胞でもよい。ヒトＦＯＰ−ＡＬＫ２発現細胞も、同様である。
【００５６】
本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、又は抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。
【００５７】
モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（１次構造）が均一であることが特徴である。
【００５８】
エピトープとしては、例えば、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、糖鎖が結合したアミノ酸配列及び糖鎖が結合したアミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。
【００５９】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列に結合することが好ましい。
本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープは、ヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列に含まれることが好ましい。
【００６０】
ハイブリドーマは、例えば、上記のヒトＢＭＰ９を抗原として調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性を有する抗体生産細胞を誘導し、さらに、該抗体生産細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより、調製することができる。該ハイブリドーマを培養するか、又は該ハイブリドーマ細胞を動物に投与して該動物を腹水がん化させ、該培養液又は腹水を分離、精製することにより抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体を取得することができる。
【００６１】
抗原を免疫する動物としては、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができるが、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、ニワトリ又はラビットなどが用いられる。また、このような動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫を施した後に、骨髄腫細胞と融合して作製したハイブリドーマが生産する抗体なども本発明の抗体に包含される。
【００６２】
本発明における遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、ヒト抗体又は抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。遺伝子組換え抗体は、例えば、上記本発明のモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を用いて改変したものが挙げられる。
【００６３】
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬとヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨと記す）及び軽鎖定常領域（以下、ＣＬと記す）からなる抗体をいう。本発明のヒト型キメラ抗体は、前記のハイブリドーマより、ＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００６４】
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものが用いられ、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３又はｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラス又はλクラスのものを用いることができる。
【００６５】
本発明のヒト型キメラ抗体として、具体的には、配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、配列番号５２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むキメラ抗体が挙げられる。また、配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、配列番号５３で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むキメラ抗体が挙げられる。
【００６６】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト化抗体という場合もあり、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒトＢＭＰ９を特異的に認識し、かつヒトＢＭＰ９のアミノ酸配列、又はその立体構造に結合するヒト以外の動物のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから産生されるヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を任意のヒト抗体のＶＨ及びＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００６７】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものが用いられ、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３又はｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラス又はλクラスのものを用いることができる。
【００６８】
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体として具体的には、ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５４〜５６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号５７〜５９で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むヒト化抗体が挙げられる。
【００６９】
また、ＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６０〜６２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつＣＤＲ１〜３がそれぞれ配列番号６３〜６５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むヒト化抗体が挙げられる。
【００７０】
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリー及びヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
【００７１】
ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。
【００７２】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖及び２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
【００７３】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法を用い、ヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積させることにより作製できる。
【００７４】
上述の抗体又は抗体断片を構成するアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、付加、置換又は挿入され、かつ上述の抗体又はその抗体断片と同様な活性を有するモノクローナル抗体又はその抗体断片も、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片に包含される。
【００７５】
欠失、置換、挿入及び／又は付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ、３４、３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３、４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４８８（１９８５）］などの周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数である。例えば、好ましくは１〜数十個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。
【００７６】
上記の抗体のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、次のことを示す。即ち、同一配列中の任意、かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中において、１又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入又は付加があることを意味する。また、欠失、置換、挿入又は付加が同時に生じる場合もあり、置換、挿入又は付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある。
【００７７】
天然型アミノ酸残基としては、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、又はＬ−システインなどが挙げられる。
【００７８】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２、４−ジアミノブタン酸、２、３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【００７９】
本発明において、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
【００８０】
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素であるパパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂは、本発明のモノクローナル抗体をパパインで処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することもできる。
【００８１】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域のジスルフィド結合の下部を蛋白質分解酵素であるペプシンで分解して得られた、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約１０万の抗原結合活性を有する断片である。
【００８２】
本発明のＦ（ａｂ’）２は、本発明のモノクローナル抗体をペプシンで処理して得ることができる。また、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合又はジスルフィド結合させ、作製することもできる。
【００８３】
Ｆａｂ’は、前記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、本発明のＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することもできる。
【００８４】
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００８５】
本発明のｓｃＦｖは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００８６】
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
【００８７】
本発明のｄｉａｂｏｄｙは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００８８】
ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は既知の方法［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
【００８９】
本発明のｄｓＦｖは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００９０】
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
【００９１】
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。
【００９２】
本発明のモノクローナル抗体には、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的又は遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
【００９３】
抗体の誘導体を検出方法、定量方法、検出用試薬、又は定量用試薬として使用する場合には、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片に結合する薬剤として、通常の免疫学的検出又は測定法で用いられる標識体が挙げられる。
【００９４】
本発明における、抗体の誘導体は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片のＨ鎖又はＬ鎖のＮ末端側又はＣ末端側、抗体又はその抗体断片中の適当な置換基又は側鎖、さらにはモノクローナル抗体又はその抗体断片中の糖鎖などに、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的手法［抗体工学入門、地人書館（１９９４）］により結合させることにより製造することができる。
【００９５】
また、本発明における、抗体の誘導体は、本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させる遺伝子工学的手法より製造することができる。
【００９６】
放射性同位元素としては、例えば、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、９９Ｔｃ、７７Ｌｕ、又は２１１Ａｔなどが挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、例えば、１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）などが挙げられる。
【００９７】
低分子の薬剤としては、例えば、アクリジニウムエステルもしくはロフィンなどの発光物質、又はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）もしくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質などが挙げられる。
【００９８】
低分子の薬剤と抗体とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して薬剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法、又は水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などが挙げられる。
【００９９】
高分子の薬剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、又はヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。
【０１００】
これらの高分子化合物を抗体又は抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的又は生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失又は抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。
【０１０１】
ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、例えば、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などが挙げられる［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε−アミノ基への修飾剤（日本国特開昭６１−１７８９２６号公報）、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシル基への修飾剤（日本国特開昭５６−２３５８７号公報）、又はアルギニンのグアニジノ基への修飾剤（日本国特開平２−１１７９２０号公報）などが挙げられる。
【０１０２】
蛋白質としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼもしくはルシフェラーゼなどの酵素が挙げられる。
【０１０３】
また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分として含有するＢＭＰ９が関与する異所性骨化疾患の治療薬に関する。
【０１０４】
ＢＭＰ９が関与する異所性骨化疾患としては、例えば、ＦＯＰが挙げられる。
【０１０５】
本発明の治療剤としては、上述した本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を有効成分として含有する。
【０１０６】
本発明の抗体又は該抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
【０１０７】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましい。例えば、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内もしくは静脈内などの非経口投与が挙げられ、好ましくは静脈内投与もしくは皮下投与を挙げられる。
【０１０８】
投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。
【０１０９】
投与量又は投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢及び体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１１０】
さらに、本発明は、ＢＭＰ９のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分として含有する、ＢＭＰ９の免疫学的検出又は測定方法に関する。
【０１１１】
本発明においてＢＭＰ９の量を検出又は測定する方法としては、任意の公知の方法が挙げられる。例えば、免疫学的検出又は測定方法などが挙げられる。
【０１１２】
免疫学的検出又は測定方法とは、標識を施した抗原又は抗体を用いて、抗体量又は抗原量を検出又は測定する方法である。免疫学的検出又は測定方法としては、例えば、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット法又は物理化学的手法などが挙げられる。
【０１１３】
以下に、本発明の抗体の製造方法、及び疾患の治療方法について、具体的に説明する。
【０１１４】
１．モノクローナル抗体の製造方法
（１）抗原の調製
抗原となるＢＭＰ９又はＢＭＰ９を発現した組織は、ＢＭＰ９全長又はその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、ＢＭＰ９を多量に発現しているヒト組織からＢＭＰ９を精製し、得ることが出来る。また、該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によりＢＭＰ９の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
【０１１５】
本発明で用いられるＢＭＰ９は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、該ＢＭＰ９をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
【０１１６】
まず、ＢＭＰ９をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られた該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
【０１１７】
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製又は染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。
【０１１８】
宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
【０１１９】
大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ＢＭＰ９をコードする部分を含むＤＮＡ、及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
【０１２０】
該組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列ともいう）と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【０１２１】
また、該ＢＭＰ９をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするＢＭＰ９の生産率を向上させることができる。
【０１２２】
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８、６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５３、２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）より調製、日本国特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ６７９８）より調製、日本国特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２、２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、又はｐＭＥ１８ＳＦＬ３などが挙げられる。
【０１２３】
プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、又はＴ７プロモーターなどの、大腸菌又はファージなどに由来するプロモーターを挙げることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、又はｌｅｔ  Ｉプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。
【０１２４】
宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、又は大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。
【０１２５】
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９、２１１０（１９７２）、Ｇｅｎｅ、１７、１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６８、１１１（１９７９）］が挙げられる。
【０１２６】
動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができる。例えば、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３−２２９７９号公報；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、ｐｃＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ、３２９、８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡ  Ｉ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１０１、１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、又はｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）などが挙げられる。
【０１２７】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができる。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、又はモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーターもしくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【０１２８】
宿主細胞としては、例えば、ヒト白血病細胞Ｎａｍａｌｗａ細胞、サル細胞ＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０８、９４５（１９５８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６０、１２７５（１９６８）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、５５、５１３（１９６８）；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ、４１、１２９（１９７３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８、１１５（１９９６）；Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１４８、２６０（１９９７）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６（１９８０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６０、１２７５（１９６８）；Ｃｅｌｌ、６、１２１（１９７５）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｉ、ＩＩ（ｐｐ．８８３−９００））、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、Ｐｒｏ−３、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫ又はＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３−０００２９９号公報）などが挙げられる。
【０１２９】
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、又はリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、７４１３（１９８７）］などが挙げられる。
【０１３０】
以上のようにして得られるＢＭＰ９をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、又は動物細胞などの由来の形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ＢＭＰ９を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ＢＭＰ９を製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【０１３１】
真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖又は糖鎖が付加されたＢＭＰ９を得ることができる。
【０１３２】
誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。
【０１３３】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９、５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２２、５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８、３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、７３、１（１９５０）］、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、又はこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。
【０１３４】
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン又はペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１３５】
ＢＭＰ９をコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産又は融合蛋白質発現などの方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］を用いることができる。
【０１３６】
ＢＭＰ９の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、又は宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞、又は生産させるＢＭＰ９の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
【０１３７】
ＢＭＰ９が宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４、１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．、４、１２８８（１９９０）］、日本国特開平０５−３３６９６３号公報、又は国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ＢＭＰ９を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【０１３８】
また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２−２２７０７５号公報）を利用してＢＭＰ９の生産量を上昇させることもできる。
【０１３９】
得られたＢＭＰ９は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。ＢＭＰ９が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、又はダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
【０１４０】
前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、又は等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独又は組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【０１４１】
ＢＭＰ９が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ＢＭＰ９の不溶体を回収する。回収した該ＢＭＰ９の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、該ＢＭＰ９を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
【０１４２】
ＢＭＰ９又はその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ＢＭＰ９又はその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【０１４３】
また、本発明において用いられるＢＭＰ９は、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル−ベガ社製、パーセプチブ社製、又は島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【０１４４】
（２）動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
３〜２０週令のマウス、ラット又はハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、ＢＭＰ９ノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。
【０１４５】
免疫は、動物の皮下、静脈内又は腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、又は水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、又はＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
【０１４６】
抗原の投与は、１回目の投与の後、１〜２週間おきに２〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を融合用抗体産生細胞の供給源とする。
【０１４７】
抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。
【０１４８】
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、８−アザグアニン耐性マウス（Ｂａｌｂ／Ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８、１（１９７８）］、Ｐ３−ＮＳ１／１Ａｇ４１（ＮＳ−１）［Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６、５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ、２７６、２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２３、１５４８（１９７９）］、又はＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５（１９７５）］などが用いられる。
【０１４９】
該骨髄腫細胞は、正常培地［グルタミン、２−メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、ＦＢＳ、及び８−アザグアニンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地］で継代し、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
【０１５０】
（４）細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地又はＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。
【０１５１】
沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）、ＭＥＭ培地及びジメチルスルホキシドの混液を３７℃で、攪拌しながら加える。さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２  ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０  ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、融合用抗体産生細胞にＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジン、及びアミノプテリンを加えた正常培地］中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
【０１５２】
培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のバインディングアッセイなどのハイブリドーマの選択方法により、ＢＭＰ９を含む抗原に反応し、ＢＭＰ９を含まない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目はＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。
【０１５３】
（５）精製モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８〜１０週令のマウス又はヌードマウスに、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０〜２１日でハイブリドーマは腹水がん化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラム又はゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ又はＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
【０１５４】
また、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ添加を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地に懸濁し、３〜７日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡ−カラム又はプロテインＧ−カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地には５％ダイゴＧＦ２１を添加することもできる。
【０１５５】
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法又は２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
【０１５６】
（６）モノクローナル抗体の選択
モノクローナル抗体の選択は以下に示す酵素免疫測定法によるバインディングアッセイ、及びＢｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析により行う。
【０１５７】
（６−ａ）バインディングアッセイ
抗原としては、（１）で得られるＢＭＰ９をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入して得られた遺伝子導入細胞、リコンビナント蛋白質、又はヒト組織から得た精製ポリペプチド又は部分ペプチドなどを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ又はＫＬＨなどのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製して、これを用いてもよい。
【０１５８】
抗原を９６ウェルプレートなどのプレートに分注し、固相化した後、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を分注し、反応させる。ＰＢＳ又はＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎなどで、よく洗浄した後、第２抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質又は放射線化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した後、第２抗体の標識物質に応じた反応を行ない、免疫原に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。
【０１５９】
また、本発明のモノクローナル抗体は、上述のバインディングアッセイ系に、被検抗体を添加して反応させることで取得できる。すなわち、被検抗体を加えた時にモノクローナル抗体の結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ＢＭＰ９のアミノ酸配列、又はその立体構造への結合について、取得したモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体を取得することができる。
【０１６０】
さらに、本発明のモノクローナル抗体が認識するエピトープと、同じエピトープに結合する抗体は、上述のバインティングアッセイ系で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの、部分的な合成ペプチド、又はエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで、取得することができる。
【０１６１】
（６−ｂ）Ｂｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用い、抗原と被験物の間の結合におけるｋｉｎｅｔｉｃｓを測定し、その結果を機器付属の解析ソフトウエアで解析をする。抗マウスＩｇＧ抗体をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリング法により固定した後、ハイブリドーマ培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を流し、適当量結合させ、さらに濃度既知の複数濃度の抗原を流し、結合、解離を測定する。
【０１６２】
得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、１：１バインディングモデルによりｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。又は、ヒトＢＭＰ９をセンサーチップ上に、例えばアミンカップリング法により固定した後、濃度既知の複数濃度の精製モノクローナル抗体を流し、結合、解離を測定する。得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、バイバレントバインディングモデルによりｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。
【０１６３】
２．遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製方法を示す。
【０１６４】
（１）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
【０１６５】
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨ及びκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。
【０１６６】
動物細胞用発現ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３、１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０１、１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ、２７、２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８、１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ｂｄ２−４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４、１７３（１９９０）］、又はｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１−３［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１３、７９（１９９３）］などを用いる。
【０１６７】
動物細胞用発現ベクターのうちプロモーターとエンハンサーには、ＳＶ４０の初期プロモーター［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０１、１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１４９、９６０（１９８７）］、又は免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ、４１、４７９（１９８５）］とエンハンサー［Ｃｅｌｌ、３３、７１７（１９８３）］などを用いる。
【０１６８】
遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）の遺伝子組換え抗体発現用ベクター［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６７、２７１（１９９４）］を用いるが、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１７、５５９（１９９８）］などを用いる。
【０１６９】
（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析
非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
【０１７０】
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ又はプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。
前記ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分又はＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ又は組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ又は組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨ又はＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨ又はＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
【０１７１】
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物には、マウス、ラット、ハムスター、又はラビットなどを用いるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
【０１７２】
ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５４、３（１９８７）］、又はＲＮＡ  ｅａｓｙ  ｋｉｔ（キアゲン社製）などのキットなどを用いる。
【０１７３】
全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］、又はＯｌｉｇｏ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）、又はＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ファルマシア社製）などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。
【０１７４】
ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）］、又はＳｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）、又はＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などのキットなどを用いる。
【０１７５】
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターには、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。
【０１７６】
例えば、ＺＡＰ  ＥｘＰｒｅｓｓ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、５、５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７、９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ、４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘ  Ｃｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３−１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３、２８０（１９８３）］、又はｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ、３３、１０３（１９８５）］などが挙げられる。
【０１７７】
ファージ又はプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。
【０１７８】
例えば、ＸＬ−１Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、５、８１（１９９２）］、Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３９、４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２、７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６６、１（１９８３）］、Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６、１１８（１９６６）］、又はＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ、３８、２７５（１９８５）］などが挙げられる。
【０１７９】
ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープ又は蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、又はプラーク・ハイブリダイゼーション法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］などを用いる。
【０１８０】
また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、ＰＣＲ法と表記する、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）］を行うことよりＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
【０１８１】
選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、５４６３（１９７７）］などの反応を行った後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７００（ＰＥバイオシステムズ社製）又はＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などを用いる。
【０１８２】
決定した塩基配列からＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。
【０１８３】
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨ及びＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することによって見出すことができる。
【０１８４】
また、得られたＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ又はＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３（１９９０）］などの相同性検索を行い、ＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものかを確認できる。
【０１８５】
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
【０１８６】
非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを作製する。
【０１８７】
作製されたＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築する。
【０１８８】
また、非ヒト抗体ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
【０１８９】
（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。
【０１９０】
非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。
【０１９１】
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、又はヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。
【０１９２】
次に、選択したヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
【０１９３】
設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＨ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計する。
【０１９４】
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターに容易にヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。
【０１９５】
又は、設計したＤＮＡ配列に基づき、１本のＤＮＡとして合成された各Ｈ鎖、Ｌ鎖全長合成ＤＮＡを用いることで実施できる。
【０１９６】
ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
【０１９７】
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、９、２６６（１９９１）］。
【０１９８】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、及び抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。
【０１９９】
抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１２、５３５（１９７７）］又はコンピューターモデリング［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、１５０１（１９９４）］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築及び解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有する改変ヒト型ＣＤＲ移植抗体を取得できる。
【０２００】
ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、改変させることができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
【０２０１】
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
【０２０２】
例えば、（４）及び（５）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
【０２０３】
（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
（３）及び（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、又はそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト型ＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
【０２０４】
発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えばＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６５１）を用いる［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２８３（１９９１）］。
【０２０５】
ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）］、又はリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、７４１３（１９８７）］などを用いる。
【０２０６】
発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを用いて測定する。
【０２０７】
（８）遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
（３）及び（６）で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
【０２０８】
宿主細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法［日本国特開平２−２５７８９１号公報、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］などを用いる。
【０２０９】
遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳＯ、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６（１９８０）］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２、５５（１９８６）］、α１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２）などを用いる。
【０２１０】
発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８硫酸塩などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２−２５７８９１号公報）。
動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、又はこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。
【０２１１】
得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、形質転換株は、ＤＨＦＲ増幅系（日本国特開平２−２５７８９１号公報）などを利用して遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。
【０２１２】
遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡ−カラムを用いて精製する［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過などの蛋白質の精製で用いられる方法を組み合わすこともできる。
【０２１３】
精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０（１９７０）］、又はウェスタンブロッティング法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］など用いて測定することができる。
【０２１４】
３．精製モノクローナル抗体又はその抗体断片の活性評価
精製した本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。
【０２１５】
ＢＭＰ９及びＢＭＰ９発現組織に対する結合活性は、前述の１．（６−ａ）記載のバインディングアッセイ及び（６−ｂ）記載のＢｉａｃｏｒｅシステムなどを用いた表面プラズモン共鳴法を用いて測定する。また、蛍光抗体法［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３６、３７３（１９９３）］などを用いて測定できる。
【０２１６】
４．本発明の抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いた疾患の治療方法
本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片は、ＢＭＰ９が関与する異所性骨化を伴う疾患の治療に用いることができる。
【０２１７】
本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。
【０２１８】
投与経路としては、例えば、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内もしくは静脈内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。
【０２１９】
経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、又は顆粒剤などでが挙げられる。
【０２２０】
乳剤又はシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトールもしくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコールもしくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油もしくは大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、又はストロベリーフレーバーもしくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。
【０２２１】
カプセル剤、錠剤、散剤又は顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖もしくはマンニトールなどの賦形剤、デンプンもしくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースもしくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤又はグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。
【０２２２】
非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、坐剤又は噴霧剤などが挙げられる。
【０２２３】
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、又はその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。
【０２２４】
坐剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸などの担体を用いて製造する。
【０２２５】
噴霧剤は受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。担体としては、例えば乳糖又はグリセリンなどを用いる。また、エアロゾル又はドライパウダーとして製造することもできる。
【０２２６】
さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０２２７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。使用する試薬類は、特に記載がない限り、添付文書に従い使用するものとする。
【実施例】
【０２２８】
［実施例１］
マウスＢＭＰ９  遺伝子ノックアウト用ターゲティングベクターの構築
１−１）カセットベクターｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａの構築  
ノックアウト（ＫＯ）用ターゲティングベクターを作製するための基本ベクターとなるカセットベクターｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに制限酵素サイトを付加した後、ネオマイシン耐性マーカー遺伝子発現ユニットの両端にＬｏｘＰ配列を有するＬｏｘＰ−Ｎｅｏ及びジフテリア毒素Ａ鎖遺伝子（ＤＴ−Ａ）を挿入したベクターで、国際公開第２００６／０７８０７２号の実施例７で記載したベクターと同一である。以下に、当該ベクター作製の概略を記載する。【０２２９】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（東洋紡社製）ベクターに新たな制限酵素サイトを付加するため以下のオリゴＤＮＡ（ＬｉｎｋＡ１：配列番号１、ＬｉｎｋＡ２：配列番号２、ＬｉｎｋＢ１：配列番号３、及びＬｉｎｋＢ２：配列番号４）を合成した。【０２３０】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで処理し、反応液からプラスミド断片をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。このプラスミド断片に、新たな制限酵素サイト、ＮｒｕＩ、ＳｇｒＡＩ及びＡｓｃＩを付加するため、ＬｉｎｋＡ１及びＬｉｎｋＡ２からなるリンカーを挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりプラスミドｐＢｌｕｅＬＡを取得した。【０２３１】
ｐＢｌｕｅＬＡを制限酵素ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩで処理し、反応液からプラスミド断片をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。このプラスミド断片に新たな制限酵素サイト、ＰａｃＩ、ＦｓｅＩ及びＳａｌＩを付加するため、ＬｉｎｋＢ１及びＬｉｎｋＢ２からなるリンカーを挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりプラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢを取得した。【０２３２】
国際公開第００／１０３８３号に記載されたプラスミドｐＬｏｘＰ−ＳＴｎｅｏをＸｈｏＩで酵素消化し、両端にＬｏｘＰ配列を持つＮｅｏ耐性遺伝子（ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ）を取得した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いてＬｏｘＰ−Ｎｅｏの両末端を平滑化しＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−Ｂを取得した。【０２３３】
ｐＢｌｕｅＬＡＢをＥｃｏＲＶで酵素消化し、反応液からプラスミド断片をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。得られたプラスミド断片に、ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−Ｂを挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりプラスミドｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏを取得した。【０２３４】
ｐＭＣ１ＤＴ−Ａ（ライフテックオリエンタル社製）をＸｈｏＩ及びＳａｌＩで酵素消化後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＤＴ−Ａ遺伝子を含む断片を回収した。【０２３５】
ｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−ＮｅｏをＸｈｏＩで酵素消化し、反応液からプラスミド断片をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。得られたプラスミド断片に、ＤＴ−Ａ遺伝子を含む断片を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりカセットベクターｐＢｌｕｅＬＡＢ−ＬｏｘＰ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａを取得した。【０２３６】
１−２）マウスＢＭＰ９遺伝子３’側ゲノム領域断片の取得
Ｅｎｓｅｍｂｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒより取得したマウスＢＭＰ９（ＧＤＦ２）遺伝子を含むゲノムＤＮＡ配列（アクセッション番号：ＥＮＳＭＵＳＧ００００００７２６２５）よりプライマー（配列番号５、６）を設計した。【０２３７】
大腸菌人工染色体［Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＢＡＣ）］のうちＣ５７ＢＬ／６ＪマウスＢＭＰ９遺伝子を含むクローンＲＰ２３−１８１Ｎ８由来のＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び６のプライマーを各１０ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を含む５０μＬの反応液を調製し、９４℃で３分間保温した後、９８℃で１０秒間、及び６８℃で５分間を１サイクルとして３５サイクルＰＣＲを行った。【０２３８】
得られたＰＣＲ増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて２．１ｋｂｐの断片を回収した。回収したＰＣＲ増幅断片をＣｌａＩ及びＡｓｃＩで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  を用いて酵素処理断片（ＣｌａＩ−ＡｓｃＩ断片）を回収した。【０２３９】
ｐＢｌｕｅＬＡＢをＣｌａＩ及びＡｓｃＩで酵素消化し、Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＳＡＰ）処理した後、このＣｌａＩ−ＡｓｃＩ断片をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。上記で回収したＣｌａＩ−ＡｓｃＩ断片を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。【０２４０】
得られた形質転換体より、ＰＣＲに起因する変異がない挿入遺伝子を有するクローンを選択した。このプラスミドＤＮＡをＣｌａＩ及びＡｓｃＩで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて２．１ｋｂｐのマウスＢＭＰ９遺伝子の３’側ゲノム配列を含む酵素処理断片を回収した。【０２４１】
１−３）マウスＢＭＰ９遺伝子５’側ゲノム領域断片の取得
Ｅｎｓｅｍｂｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒより取得したマウスＢＭＰ９遺伝子を含むゲノムＤＮＡ配列（アクセッション番号：ＥＮＳＭＵＳＧ００００００７２６２５）よりプライマー（配列番号７、８）を設計した。【０２４２】
ＢＡＣクローンＲＰ２３−１８１Ｎ８由来のＤＮＡを鋳型とし、配列番号７及び８のプライマーを各１０  ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を含む５０μＬの反応液を調製し、９４℃で３分間保温した後、９８℃で１０秒間、及び６８℃で５分間を１サイクルとして３５サイクルＰＣＲを行った。【０２４３】
得られたＰＣＲ増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて５．１ｋｂｐの断片を回収した。回収したＰＣＲ増幅断片をＰａｃＩ及びＦｓｅＩで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  を用いて酵素処理断片（ＰａｃＩ−ＦｓｅＩ断片）を回収した。【０２４４】
ｐＢｌｕｅＬＡＢをＰａｃＩ及びＦｓｅＩで酵素消化し、ＳＡＰ処理した後、このＰａｃＩ−ＦｓｅＩ断片をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。上記で回収したＰａｃＩ−ＦｓｅＩ断片を挿入し、大腸菌ＤＨ５αに導入した。【０２４５】
得られた形質転換体より、ＰＣＲに起因する変異がない挿入遺伝子を有するクローンを選択した。このプラスミドＤＮＡをＰａｃＩ及びＦｓｅＩで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて５．１ｋｂｐのマウスＢＭＰ９遺伝子の５’側ゲノム配列を含む酵素処理断片を回収した。【０２４６】
１−４）カセットベクターへのマウスＢＭＰ９遺伝子３’側ゲノム領域断片の挿入
実施例１−１で得られたｐＢｌｕｅＬＡＢ−Ｌｏｘ−Ｎｅｏ−ＤＴ−ＡをＣｌａＩ及びＡｓｃＩで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を回収した。【０２４７】
回収した約７．６ｋｂｐのＤＮＡ断片に、実施例１−２で得られた酵素処理断片を挿入した後、大腸菌ＤＨ５αに導入した。得られた形質転換体よりＤＮＡ断片が挿入されているクローンを選択した。連結部分の塩基配列に問題がないことを確認した。【０２４８】
１−５）マウスＢＭＰ９遺伝子３’側ゲノム領域断片を持つカセットベクターへのマウスＢＭＰ９遺伝子５’側ゲノム領域断片の挿入
実施例１−４で得られたプラスミドをＰａｃＩ及びＦｓｅＩで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  を用いて酵素処理断片を回収した。回収した９．７ｋｂｐのＤＮＡ断片に、実施例１−３で作製した酵素処理断片を挿入した後、大腸菌ＤＨ５αに導入した。【０２４９】
得られた形質転換体よりＤＮＡ断片が挿入されているクローンを選択した。連結部分の塩基配列に問題がないことを確認し、マウスＢＭＰ９  遺伝子ノックアウト用のターゲティングベクターｐＢｌｕｅｍＢｍｐ９−Ｌｏｘ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯ（図１）を取得した。【０２５０】
［実施例２］
マウスＢＭＰ９遺伝子ターゲティングベクターの調製
実施例１−５で得られたｐＢｌｕｅｍＢｍｐ９−Ｌｏｘ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯ  ６０μｇを、終濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにスペルミジン（シグマ社製）を添加し、ｐＨを７．０に調整した、制限酵素用Ｈバッファー（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）中で、ＮｏｔＩで酵素消化した。【０２５１】
反応液から、ベクター断片をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。ＤＮＡ濃度が０．５μｇ／μＬとなるよう、ｐＨ７．０５のＨＢＳ溶液［１リットルあたり、ＨＥＰＥＳ  ５ｇ、ＮａＣｌ  ８ｇ、ＫＣｌ  ０．３７ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．１２５ｇ、Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ）１ｇを含む溶液］を加え、１時間室温で保存することによって、エレクトロポレーション用マウスＢＭＰ９遺伝子ターゲティング用ベクターｐＢｌｕｅｍＢｍｐ９−Ｌｏｘ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯ−ＮｏｔＩを調製した。【０２５２】
［実施例３］
ゲノムサザンブロット解析用プローブの調製
３−１）マウスＢＭＰ９遺伝子の５’側ゲノム確認用プローブの作製
ＢＡＣクローンＲＰ２３−１８１Ｎ８の塩基配列情報を基に、マウスＢＭＰ９遺伝子の５’側ゲノム領域約５００ｂｐを含むプローブを取得するため、プライマー（配列番号９、１０）を設計した。【０２５３】
ＢＡＣクローンＲＰ２３−１８１Ｎ８由来のＤＮＡを鋳型とし、配列番号９及び１０のプライマーを各１０ｐｍｏｌ、ＴａＫａＲａ  Ｚ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を含む５０μＬの反応液を調製し、９４℃で２分間保温した後、９４℃で３０秒間、６０℃で２０秒間、及び７２℃で１分間を１サイクルとして２５サイクルＰＣＲを行った。【０２５４】
得られたＰＣＲ増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて約５００ｂｐの５’側ゲノムサザンブロット用プローブ（５’ＫＯ−ｐｒｏｂｅ）を回収した。【０２５５】
３−２）マウスＢＭＰ９遺伝子の３’側ゲノム確認用プローブの作製
ＢＡＣクローンＲＰ２３−１８１Ｎ８の塩基配列情報を基に、マウスＢＭＰ９遺伝子の３’側ゲノム領域約５００ｂｐを含むプローブを取得するため、プライマー（配列番号１１、１２）を設計した。【０２５６】
ＢＡＣクローンＲＰ２３−１８１Ｎ８由来のＤＮＡを鋳型とし、配列番号１１及び１２のプライマーを各１０ｐｍｏｌ、ＴａＫａＲａ  Ｚ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を含む５０μＬの反応液を調製し、９４℃で２分間保温した後、９４℃で３０秒、６０℃で２０秒、及び７２℃で１分間を１サイクルとして２５サイクルＰＣＲを行った。【０２５７】
得られたＰＣＲ増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて約５００ｂｐの３’側ゲノムサザンブロット用プローブ（３’ＫＯ−ｐｒｏｂｅ）を回収した。【０２５８】
［実施例４］
マウスＢＭＰ９  ＫＯ  ＥＳ細胞株の取得
相同組換えを用いたマウスＢＭＰ９遺伝子ＫＯ  ＥＳ細胞の取得のため、確立されている方法（相沢慎一著、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、１９９５）に従って、実施例２において調製したｐＢｌｕｅｍＢｍｐ９−Ｌｏｘ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯ−ＮｏｔＩをマウスＥＳ細胞ＴＴ２（Ｙａｇｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１４：７０、１９９３）へ導入した。詳細な方法を以下に記載する。【０２５９】
栄養細胞としてマイトマイシンＣ（シグマ社製）で処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（インビトロジェン社製）を用いてＴＴ２細胞の培養増殖を３７℃、５％ＣＯ２の条件下に行った。ＴＴ２細胞をトリプシン処理し、３×１０７個／ｍＬとなるように実施例２に記載したＨＢＳ溶液で懸濁した。【０２６０】
細胞懸濁液を０．５ｍＬと、ｐＢｌｕｅｍＢｍｐ９−Ｌｏｘ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯ−ＮｏｔＩを１０μｇ混和し、ジーンパルサーキュペット（電極距離：０．４ｃｍ、バイオラッド社製）に入れ、エレクトロポレーションを行った（容量：９６０μＦ、電圧：２４０Ｖ、室温）。【０２６１】
エレクトロポレーションした細胞を、ＥＳ培地［１リットルあたり、牛胎仔血清（ＦＢＳ）１８０ｍＬ、Ｄ−グルコース３．５ｇ、ダルベッコ改変イーグル培地粉末（インビトロジェン社製）１０ｇ、非必須アミノ酸溶液（１００倍濃縮液；インビトロジェン社製）１０ｍＬ、炭酸水素ナトリウム１．９ｇを含む溶液］１０ｍＬに懸濁し、あらかじめ前述の栄養細胞を播種した１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（ファルコン社製）１枚に播種した。【０２６２】
２４時間後、培地を２００μｇ／ｍＬのネオマイシン（シグマ社製）を含むＥＳ培地に置き換えた。７日後に生じたコロニーをピックアップし、それぞれ２４穴プレートに播種した。コンフルーエントになるまで増殖させた後、３分の１の細胞を１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養することにより、１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ社製）で調製した。これらネオマイシン耐性ＴＴ２細胞ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。【０２６３】
次に、実施例３−２で得た３’ＫＯ−ｐｒｏｂｅを用いたサザンブロットを行った。野生型ＴＴ２細胞では、１本のバンド（約１５．５ｋｂｐ）が検出され、相同組換え体においては、２本のバンド（約１１．５ｋｂｐと約１５．５ｋｂｐ）が検出された。更に、相同組換えが確認されたクローンのゲノムＤＮＡをＮｃｏＩで酵素消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。【０２６４】
次に、実施例３−１で得た５’ＫＯ−ｐｒｏｂｅを用いたサザンブロットを行った。野生型ＴＴ２細胞では、１本のバンド（約１３．４ｋｂｐ）が検出され、相同組換え体においては、２本のバンド（約８．５ｋｂｐと約１３．４ｋｂｐ）が検出された。【０２６５】
以上の結果、マウスＢＭＰ９遺伝子を脱落したことが予想される相同組換え体は７株見出された。次に、相同組換体の核型解析を既報（相沢慎一著、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、１９９５）に従い行った結果、見出された７株のうち５株は正常核型を有するマウスＢＭＰ９遺伝子ＫＯ  ＥＳ細胞であることが確認された。【０２６６】
［実施例５］
ＢＭＰ９  ＫＯヘテロ接合型マウスの作製
実施例４において取得したＥＳ細胞は、毛色が濃茶色ＣＢＡ×Ｃ５７ＢＬ／６  Ｆ１マウス由来（Ｙａｇｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１４：７０−７６、１９９３）のＴＴ２細胞である。そこで、ＥＳ細胞由来の遺伝子を有するキメラマウスと、ＥＳ細胞由来の遺伝子を有さない宿主マウスを簡便に判別するため、宿主マウスには、毛色が白色のＩＣＲマウスを選択した。【０２６７】
まず、実施例４において正常核型を持つことが確認できたマウスＢＭＰ９遺伝子ＫＯ  ＥＳ細胞のうち４株を、ＩＣＲ系統の雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に、それぞれ胚１つあたり８〜１０個注入した。その後、ＥＳ培地を用いて一晩培養することで、インジェクション胚を胚盤胞まで発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＩＣＲマウス（日本クレア社）の子宮に、片側の子宮あたりそれぞれ約１０個の胚盤胞まで発生させたインジェクション胚を移植した。【０２６８】
胚盤胞まで発生させたインジェクション胚を計２６０個移植した結果、１０２匹の子キメラマウスが誕生した。誕生した１０２匹のうち毛色が濃茶色を含むマウス、すなわちＥＳ細胞の貢献が認められたキメラマウスは８９匹であった。これら８９匹のうち、毛色が全て濃茶色で白色部分を含まないマウス、すなわち、ＥＳ細胞由来のキメラ率の高いキメラマウスは４０匹であった。次に、これらのキメラ率の高いオスのキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６のメスと交配させた結果、毛色が濃茶色の子マウスが誕生したことから、ＥＳ細胞ゲノムの生殖細胞系列への伝達が確認された。【０２６９】
ＢＭＰ９遺伝子がターゲティングされたヘテロ接合型マウスのスクリーニングは、尾部生検由来ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ解析により行った。そのために、実施例１にて作製したマウスＢＭＰ９遺伝子ノックアウト用ベクターｐＢｌｕｅｍＢｍｐ９−Ｌｏｘ−Ｎｅｏ−ＤＴ−Ａ−３’ＫＯ−５’ＫＯ内のネオマイシン耐性遺伝子領域に特異的なプライマーであるｍＢＭＰ９＿ＦＷ５９１５（配列番号１３）及びｍＢＭＰ９＿ＲＶ１７１６５（配列番号１４）を作製した。【０２７０】
出生後３週以上を経たマウスから尻尾を取得し（勝木元也著、発生工学実験マニュアル、講談社サイエンティフィク、１９８７）、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３及び１４のプライマーを各１０ｐｍｏｌ、ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を含む５０μＬの反応液を調製し、９５℃で３０秒、６０℃で１分間、及び７２℃で２分間を１サイクルとして３５サイクルＰＣＲを行った。【０２７１】
アガロースゲル電気泳動を行った結果、約１．３ｋｂｐの増幅産物が検出される個体が複数存在した。この結果は、内在性ＢＭＰ９遺伝子が相同組換えされ、ネオマイシン耐性遺伝子が挿入されたヘテロ接合型マウス［ＢＭＰ９ＫＯ（＋／−）］が複数得られたことを示している。【０２７２】
［実施例６］
ＢＭＰ９ＫＯホモ接合型マウスの作製
実施例５で作製されたＢＭＰ９ＫＯ（＋／−）の雌雄個体を交配させ、子マウスを得た。実施例５と同様に、マウスの尻尾からＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、実施例５と同様にＰＣＲを行った。さらに、アガロース電気泳動を行うことにより、ＢＭＰ９ＫＯへテロ接合型［ＢＭＰ９ＫＯ（＋／−）］とホモ接合型［ＢＭＰ９ＫＯ（−／−）］を選抜した。【０２７３】
選抜した個体のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５及び１６のプライマーを各１０ｐｍｏｌ、ＥＸ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を含む５０μＬの反応液を調製し、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、及び７２℃で１分間を１サイクルとして３５サイクルＰＣＲを行った。【０２７４】
アガロースゲル電気泳動を行った結果、約２００ｂｐの増幅産物が検出される個体、及び検出されない個体が存在することが明らかとなった。野生型対立遺伝子をもつＢＭＰ９ＫＯ（＋／−）では約２００ｂｐの増幅産物が検出されるが、ＢＭＰ９ＫＯ（−／−）では検出されないことから、この結果は、ＢＭＰ９ＫＯ（−／−）が得られたことを示している。抗ＢＭＰ９モノクローナル抗体取得には、得られた雌雄のホモ接合型［ＢＭＰ９ＫＯ（−／−）］のうち、雌マウスを１０匹用いた。【０２７５】
［実施例７］
抗ヒトＢＭＰ９モノクローナル抗体の作製
７−１）免疫原の調製
免疫原として用いたヒトＢＭＰ９組換え蛋白質は、国際公開第２０１０／１２６１６９号の実施例１２に記載された方法に従い調製した。【０２７６】
７−２）動物への免疫と抗体産生細胞の調製
アジュバントに、ＲＩＢＩアジュバント（Ｃｏｒｉｘａ社製）、又はＴｉｔｅｒ  Ｍａｘ  Ｇｏｌｄ（Ｔｉｔｅｒ  Ｍａｘ社製）を用いて、実施例７−１で調製したヒトＢＭＰ９組換え蛋白質を、実施例６で得られたＢＭＰ９  ＫＯ（−／−）マウスに免疫した。【０２７７】
具体的には、ＲＩＢＩアジュバントの添付文書に従って、ヒトＢＭＰ９組換え蛋白質の懸濁液を調製した後、１匹あたり２５μｇのヒトＢＭＰ９組換え蛋白質が投与されるよう、該懸濁液をＫＯマウスの腹腔内に投与した。Ｔｉｔｅｒ  Ｍａｘ  Ｇｏｌｄを用いる際も同様に、添付文書に従い、ヒトＢＭＰ９組換え蛋白質の懸濁液を調製した後、１匹あたり２５μｇのヒトＢＭＰ９組換え蛋白質が投与されるよう、該懸濁液をＫＯマウスの皮下に投与した。免疫は最終ブーストを含めていずれも計３回行った。脾臓は、最終投与の３日後に摘出した。【０２７８】
摘出した脾臓をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）中で細断した後、脾細胞を遠心分離（１５００ｒｐｍ、３分間）により回収した。得られた脾細胞画分は、赤血球を含むことから、ＲＥＤ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（シグマ社製）を添加し、氷上で処理することにより、赤血球を除去した。得られた脾細胞は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；インビトロジェン社製）培地で２回洗浄した後、細胞融合に供した。【０２７９】
７−３）マウス骨髄腫細胞の調製
マウス骨髄腫細胞株（Ｓｐ２／０，  ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１５８１）を１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭにて培養し、細胞融合の親株として用いた。【０２８０】
７−４）ハイブリドーマの作製
実施例７−２で得られたマウス脾細胞と実施例７−３で得られた骨髄腫細胞を５：１になるよう混合し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、３分間）した。得られた沈殿画分（細胞群）に対して、ポリエチレングリコール−１５００（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）１ｍＬを、穏やかに揺らしながら、徐々に加えた。【０２８１】
次に、該細胞液にＤＭＥＭ培地５ｍＬを穏やかに揺らしながら加え、更にＤＭＥＭ培地を１０ｍＬ添加した。次に、上記の該細胞液を含むチューブを３７℃で５分間インキュベートし、遠心分離（１５００ｒｐｍ、３分間）した。得られた沈殿画分（細胞群）をコンプリート培地（ＦＣＳ  １０ｖ／ｖ％、β−メルカプトエタノール  ５０μｍｏｌ／Ｌ、インシュリン  ５０μｇ／ｍＬ、及びＩＬ−６  １０ｎｇ／ｍＬを含むＤＭＥＭ培地］を用いて脾細胞数が１×１０６個／ｍＬになるように懸濁した後、９６ウェルプレートに１００μＬずつ播種した。【０２８２】
その１．５時間後、メーカーが推奨する終濃度の２倍のＨＡＴ  ｍｅｄｉａ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（シグマ社製、Ｃａｔ＃Ｈ０２６２−１０ＶＬ）を含むコンプリート培地を各ウェルに１００μＬずつ加え、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で培養した。培地交換は、ウェル内の細胞がスクリーニングに適した細胞数になるまで、メーカーが推奨する終濃度のＨＡＴｍｅｄｉａ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むコンプリート培地を用いて週３回の頻度で行った。【０２８３】
７−５）ＡＬＫ１／ＢＭＰ９サンドイッチＥＬＩＳＡの構築
ＡＬＫ１／ＢＭＰ９サンドイッチＥＬＩＳＡは、抗ヒトＢＭＰ９マウスモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ抗体）、及びヒトＢＭＰ９のタイプＩ受容体として知られているヒトＡＬＫ１細胞外領域ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域フュージョン蛋白質（ｈｓＡＬＫ１−Ｆｃ）を用いて、以下のように構築した。【０２８４】
まず、９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３９４５４）に、国際公開第２０１０／１２６１６９号の実施例１に記載の方法に従い調製したｈｓＡＬＫ１−Ｆｃを、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９１−０１３０５）で０．０５μｇ／ｍＬに調整したものを１００μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置して吸着させた。【０２８５】
固相化液を取り除いた後、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、Ｃａｔ＃３７５３５）を２５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間静置してブロッキングし、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。【０２８６】
次に、ヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製Ｃａｔ＃３２０９−ＢＰ）をＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋとＰＢＳ−Ｔを１：９の割合で混合した１０％  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔで１ｎｇ／ｍＬの濃度に調整したものを１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置し、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。【０２８７】
次に、ＳｕｒｅＬＩＮＫ  Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｉｃ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＫＰＬ社製）を用いてビオチン標識したＲ＆Ｄ抗体を１０％  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔで３０ｎｇ／ｍＬに調整した後、１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置した。【０２８８】
このプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、１０％  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔで５００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｏｌｙＨＲＰ８０（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｃａｔ＃ＳＰ８０Ｄ５０）を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で３０分〜１時間静置した。【０２８９】
このプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＴＭＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ、Ｄａｋｏ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１５９９）を１００μＬ／ウェル添加して発色させ、適当な発色が得られたところで、１Ｎ  硫酸溶液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９２−０４７５５）を１００μＬ／ウェル添加し、ＡＲＶＯ（パーキンエルマー社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。【０２９０】
７−６）ＡＬＫ１／ＢＭＰ９サンドイッチＥＬＩＳＡを用いた抗ヒトＢＭＰ９抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
実施例７−５で構築したサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、ヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質の添加の際に、１ｎｇ／ｍＬ濃度のヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質、及び５０％濃度の実施例７−４で作製したハイブリドーマの培養上清を含むように調製した１０％  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔ溶液を、１００μＬ／ウェルで分注した。陰性コントロールには、ハイブリドーマ用培地を用いた。【０２９１】
ハイブリドーマ用培地を添加したウェルを基準として、発色が抑制されたウェルを陽性と判断し、ｈｓＡＬＫ１−Ｆｃとヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質、又は、ヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質とＲ＆Ｄ抗体の相互作用を阻害する抗体を産生するハイブリドーマ株を選抜した。【０２９２】
選抜したハイブリドーマについては、ＨＴ（シグマ社製、Ｃａｔ＃Ｈ０１３７−１０ＶＬ）を含むコンプリート培地にて限界希釈し、９６ウェルプレートに播種しクローン化を行った。クローン化は、１回目に陽性と判断したウェル由来のハイブリドーマに対して計３回行った。以上の操作により、ヒトＢＭＰ９中和活性を有する３Ｂ７−３−３抗体及び３Ｃ７−３−１抗体を産生するハイブリドーマ株を単離した。【０２９３】
７−７）ハイブリドーマからの抗体の調製【０２９４】
実施例７−６で得た３Ｂ７−３−３抗体及び３Ｃ７−３−１抗体を産生するハイブリドーマは、抗体取得のため、コンプリート培地を用いてスケールアップさせた後、培地をＣＤハイブリドーマ培地（インビトロジェン社製）に置換し、３７℃にて６日間培養した。【０２９５】
フィルトレーションにて、培養上清から細胞除去を行った。細胞を除去した上清から、ＰｒｏｔｅｉｎＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  ヘルスケア社製）を充填したオープンカラムを用いて、抗ヒトＢＭＰ９抗体を精製した。得られた抗体は、０．２２μｍフィルターを用いて滅菌した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に供した。【０２９６】
［実施例８］
固相抗原を用いた酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）による取得抗体の特異性の評価
取得した抗体のヒトＢＭＰ９への特異性を確かめるため、ヒトＢＭＰ９及びヒトＢＭＰ９とホモロジーが最も高い分子であるヒトＢＭＰ１０への結合性を比較する実験を行った。【０２９７】
まず、９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４４２４０４）に、ヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃３２０９−ＢＰ）、又はヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ１０組換え蛋白質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製Ｃａｔ＃２９２６−ＢＰ）を、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９１−０１３０５）で１００ｎｇ／ｍＬに調製したものを５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置して吸着させた。【０２９８】
固相化液を取り除いた後、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、Ｃａｔ＃３７５３５）を２００μＬ／ウェル加え、室温で１時間静置してブロッキングし、ＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｗｅｅｎ  ２０；ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ社製、ＳＣ−２４９５３）で３回洗浄した。【０２９９】
次に、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（コスモ・バイオ社製、Ｃａｔ＃ＬＫ０３）を用いてビオチン標識した３Ｂ７−３−３抗体、３Ｃ７−３−１抗体、Ｒ＆Ｄ抗体、又は抗ＢＭＰ１０抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃ＭＡＢ２９２６）を、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋとＴＢＳＴを１：９の割合で混合した１０％  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ＴＢＳＴで１００ｎｇ／ｍＬに調整した後、一次抗体として５０μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置した。【０３００】
このプレートをＴＢＳＴで３回洗浄した後、１０％  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ＴＢＳＴで５００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｏｌｙＨＲＰ８０（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｃａｔ＃ＳＰ８０Ｄ５０）を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置した。【０３０１】
このプレートをＴＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＢ基質液（ＴＭＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ、Ｄａｋｏ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１５９９）を５０μＬ／ウェル添加して発色させ、適当な発色が得られたところで、１Ｎ  硫酸溶液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９２−０４７５５）を５０μＬ／ウェル添加し、サンプル波長４５０ｎｍ、リファレンス波長５７０ｎｍにおける吸光度（４５０ｎｍ−５７０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。【０３０２】
結果を図２に記載する。３Ｂ７−３−３抗体及び３Ｃ７−３−１抗体は、Ｒ＆Ｄ抗体と同様に、ヒトＢＭＰ９に強く結合すること、またヒトＢＭＰ１０には結合しないことが示された。この結果は、３Ｂ７−３−３抗体及び３Ｃ７−３−１抗体が、ヒトＢＭＰ９に特異的に結合する抗体であることを示している。【０３０３】
［実施例９］
固相抗原を用いた酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）による取得抗体の結合性の評価
取得された抗ヒトＢＭＰ９抗体のヒトＢＭＰ９への結合活性を測定するために、以下の実験を行った。【０３０４】
まず、９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３９４５４）に、ヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃３２０９−ＢＰ）を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３緩衝液で１００ｎｇ／ｍＬに調整したものを５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置して吸着させた。【０３０５】
固相化液を取り除いた後、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、Ｃａｔ＃３７５３５）を２００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間静置してブロッキングし、ＴＢＳＴで３回洗浄した。【０３０６】
次に、ビオチン標識した３Ｂ７−３−３抗体、３Ｃ７−３−１抗体又はＲ＆Ｄ抗体を、１０％  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ＴＢＳＴでそれぞれ１、５、２０、１００、３００ｎｇ／ｍＬになるように調整したものを、それぞれ５０μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置した。このプレートをＴＢＳＴで３回洗浄した後、１０％  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ＴＢＳＴで５００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｏｌｙＨＲＰ８０を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置した。【０３０７】
このプレートをＴＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＢ基質液（ＴＭＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ、Ｄａｋｏ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１５９９）を５０μＬ／ウェル添加して発色させ、適当な発色が得られたところで１Ｎ  硫酸溶液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９２−０４７５５）を５０μＬ／ウェル添加し、サンプル波長４５０ｎｍ、リファレンス波長５７０ｎｍにおける吸光度（４５０ｎｍ−５７０ｎｍ）をプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。【０３０８】
結果を図３に記載する。３Ｂ７−３−３抗体及び３Ｃ７−３−１抗体は、Ｒ＆Ｄ抗体と同様に、抗体濃度が高くなるに従ってヒトＢＭＰ９に結合した。さらに３Ｃ７−３−１抗体のヒトＢＭＰ９に対する結合活性はＲ＆Ｄ抗体に比して高いことが明らかとなった。【０３０９】
［実施例１０］
ヒトＢＭＰ９とＲ＆Ｄ抗体の結合に対する取得抗体の作用
実施例７で用いた系の特徴より、取得抗体はｈｓＡＬＫ１−Ｆｃとヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質の相互作用、もしくはヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質とＲ＆Ｄ抗体の相互作用のいずれかを阻害する抗体であると考えられる。そこで、まず、ヒトＢＭＰ９とＲ＆Ｄ抗体の結合アッセイ系を構築し、取得抗体のヒトＢＭＰ９とＲ＆Ｄ抗体の結合に対する作用を検討した。【０３１０】
９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３９４５４）に、実施例７−１で調製したヒトＢＭＰ９組換え蛋白質を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３緩衝液で１００ｎｇ／ｍＬに調整したものを１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置して吸着させた。【０３１１】
固相化液を取り除いた後、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋを２５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間静置しブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次に、１０％  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔでそれぞれ１００〜３０００ｎｇ／ｍＬに調整した取得抗体及び５０ｎｇ／ｍＬのビオチン標識したＲ＆Ｄ抗体を含む溶液を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置した。【０３１２】
このプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、１０％  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔで５００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｏｌｙＨＲＰ８０（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｃａｔ＃ＳＰ８０Ｄ５０）を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で３０分〜１時間静置した。【０３１３】
このプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＴＭＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ、Ｄａｋｏ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１５９９）を１００μＬ／ウェル添加して発色させ、適当な発色が得られたところで、１Ｎ硫酸溶液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９２−０４７５５）を１００μＬ／ウェル添加し、ＡＲＶＯ（パーキンエルマー社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図４に記載する。【０３１４】
ヒトＢＭＰ９とビオチン標識Ｒ＆Ｄ抗体の結合は、非標識のＲ＆Ｄ抗体の添加で阻害された。一方、３Ｂ７−３−３抗体及び３Ｃ７−３−１抗体の添加では、阻害されなかった。この結果は、３Ｂ７−３−３抗体及び３Ｃ７−３−１抗体のヒトＢＭＰ９認識部位（エピトープ）は、Ｒ＆Ｄ抗体の認識部位とは異なることを示している。【０３１５】
［実施例１１］
固相抗原を用いた酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）による取得抗体のエピトープ解析
取得した抗体の性質の違いを更に明らかにするために、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を利用して、取得した抗体のエピトープ解析を行った。具体的には、固相化したＢＭＰ９にビオチン標識抗体を反応させる際に、過剰量のそれぞれの非ビオチン標識抗体を同時添加する方法で行った。【０３１６】
この方法によれば、非標識抗体により反応が減弱された場合、標識抗体と非標識抗体のエピトープが、同じ又は近傍であることが示唆される。さらに、標識抗体と非標識抗体の性質が、同じ又は似ていることが示唆される。【０３１７】
アッセイは実施例９と同様の方法で行った。ただし、実施例９の結果を踏まえて、最終的な吸光度が１．０から１．５前後となる様に、ビオチン標識した３Ｂ７−３−３抗体、３Ｃ７−３−１抗体、及びＲ＆Ｄ抗体をそれぞれ最終濃度３０．０、４．０及び５．０ｎｇ／ｍＬで反応させた。さらに、これら標識抗体の添加と同時に、非標識抗体をそれぞれ最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加した。【０３１８】
結果を図５に記載する。非標識抗体がない場合、吸光度は１．０から１．５前後となり、標識抗体と固相化したＢＭＰ９との結合が観察された。また、非標識抗体として、標識抗体と同じ抗体を用いた場合には、いずれも標識抗体の結合を阻害することが確認された。【０３１９】
さらに、３Ｂ７−３−３抗体と３Ｃ７−３−１抗体は、いずれが非標識抗体の場合でも、互いの標識抗体の結合を阻害することが明らかとなった。一方、３Ｂ７−３−３抗体及び３Ｃ７−３−１抗体は、実施例１０の結果と同様に、Ｒ＆Ｄ抗体の標識抗体とＢＭＰ９の結合を阻害しなかった。【０３２０】
この結果は、３Ｂ７−３−３抗体及び３Ｃ７−３−１抗体は、エピトープが同じ又は近傍であることを示唆している。さらに、両抗体が認識するエピトープは、Ｒ＆Ｄ抗体とは異なることを示唆している。【０３２１】
［実施例１２］
ヒトＢＭＰ９とヒトＡＬＫ１の結合に対する取得抗体の作用
実施例１０の結果より、３Ｂ７−３−３抗体及び３Ｃ７−３−１抗体は、ヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質とＲ＆Ｄ抗体の相互作用ではなく、ヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質とｈｓＡＬＫ１−Ｆｃの相互作用を抑制する抗体である可能性が示唆された。そこで、ヒトＢＭＰ９とヒトＡＬＫ１の結合アッセイ系を構築し、取得抗体のヒトＢＭＰ９とヒトＡＬＫ１結合に対する作用を検討した。【０３２２】
９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４３９４５４）に、実施例７−１で調製したヒトＢＭＰ９組換え蛋白質を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３緩衝液で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したものを１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置して吸着させた。固相化液を取り除いた後、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋを２５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間静置しブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。【０３２３】
次に、１０％  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔでそれぞれ１００、１０００又は１００００ｎｇ／ｍＬに調整した取得抗体もしくはＲ＆Ｄ抗体、及び１００ｎｇ／ｍＬのビオチン標識したｈｓＡＬＫ１−Ｆｃ蛋白質を含む溶液を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置した。【０３２４】
このプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、１０％  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔで５００倍希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｏｌｙＨＲＰ８０（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｃａｔ＃ＳＰ８０Ｄ５０）を１００μＬ／ウェルで分注し、室温で３０分〜１時間静置した。【０３２５】
このプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＴＭＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ、Ｄａｋｏ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１５９９）を１００μＬ／ウェル添加して発色させ、適当な発色が得られたところで、１Ｎ硫酸溶液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９２−０４７５５）を１００μＬ／ウェル添加し、ＡＲＶＯ（パーキンエルマー社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。ビオチン標識したヒトＡＬＫ１−Ｆｃのみを添加したウェルの吸光度を０％、希釈液のみを添加したウェルの吸光度を１００％とし、各抗体の阻害活性（％）を算出した。結果を図６に記載する。【０３２６】
ヒトＢＭＰ９とヒトＡＬＫ１−Ｆｃの結合は、３Ｂ７−３−３抗体及び３Ｃ７−３−１抗体の添加で阻害された。一方、Ｒ＆Ｄ抗体の添加では、阻害されなかった。この結果は、３Ｂ７−３−３抗体及び３Ｃ７−３−１抗体は、ヒトＢＭＰ９とヒトＡＬＫ１との結合を阻害する抗ＢＭＰ９抗体であり、Ｒ＆Ｄ抗体は、ヒトＢＭＰ９とヒトＡＬＫ１との結合を阻害しない抗ＢＭＰ９抗体であることを示している。【０３２７】
また、ヒトＢＭＰ９に対するヒトＡＬＫ１とヒトＡＬＫ２の結合領域は同じであることが知られていることから、この結果は、３Ｂ７−３−３抗体及び３Ｃ７−３−１抗体は、ヒトＢＭＰ９とヒトＢＭＰタイプＩ受容体との結合を阻害する抗ＢＭＰ９抗体であることを示唆している。【０３２８】
［実施例１３］
取得抗体のヒトＢＭＰ９組換え蛋白質に対する結合活性（ビアコア解析）
３Ｃ７−３−１抗体及びＲ＆Ｄ抗体のヒトＢＭＰ９組換え蛋白質に対する結合活性（アフィニティー）をＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて検討した。Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、抗マウスＩｇＧ抗体をセンサーチップＣＭ５上に固定化した後、抗ヒトＢＭＰ９抗体をＲＵ値として７００−１１００になるように結合させた。【０３２９】
その後、実施例７−１で調整したヒトＢＭＰ９組換え蛋白質をＨＢＳ−ＥＰ溶液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて０．１５２ｎｍｏｌ／Ｌ、０．４５７ｎｍｏｌ／Ｌ、１．３７ｎｍｏｌ／Ｌ、４．１ｎｍｏｌ／Ｌ、１２．３ｎｍｏｌ／Ｌ、３６．８９ｎｍｏｌ／Ｌ、１１０．６７ｎｍｏｌ／Ｌ、３２２ｎｍｏｌ／Ｌの濃度に調整したものをアナライトとして添加し、結合強度を測定した。【０３３０】
結合解離定数（Ｋｄ値）は、得られた値を基にシングルサイクルカイネティクス算出法（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒ．３、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にて算出した。結果を表１に記載する。【０３３１】
【表１】
2014051109.tif 000003
【０３３２】
Ｒ＆Ｄ抗体のＫｄ値は、６．１６×１０−１０  ｍｏｌ／Ｌであったのに対し、３Ｃ７−３−１抗体のＫｄ値は、２．６４×１０−１１  ｍｏｌ／Ｌを示し、３Ｃ７−３−１抗体のヒトＢＭＰ９への結合活性は、Ｒ＆Ｄ抗体に比して、２３．３倍と著しく高いものであることが明らかとなった。【０３３３】
［実施例１４］
取得抗体のＢＭＰ９依存性ＡＬＫ１由来シグナルに対する阻害作用
ヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞株を作製し、取得抗体のヒトＢＭＰ９依存性ヒトＡＬＫ１由来シグナルに対する阻害作用を評価した。【０３３４】
１４−１）ヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞株の作製
ヒトＡＬＫ１発現レポーター細胞は、国際公開第２０１０／１２６１６９号の実施例２に記載のＢＭＰシグナル検出株［ｐ（ＧＣＣＧ）１２−Ｌｕｃ／ＨｅｐＧ２（３８．５）］に全長ヒトＡＬＫ１遺伝子を強制発現させることにより［ＡＬＫ１／ｐ（ＧＣＣＧ）１２−Ｌｕｃ／ＨｅｐＧ２（３８．５）］、作製した。【０３３５】
ヒトＡＬＫ１発現ベクターは、両端にＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素サイトを持つヒトＡＬＫ１の全長ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化したものを、ｐＥＡＫ８発現ベクター（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に組み込むことにより、作製した。【０３３６】
ヒトＡＬＫ１の全長ｃＤＮＡ（ｃＤＮＡのＧｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号：ＢＣ０４２６３７．１、配列番号１７、アミノ酸配列のＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号：ＡＡＨ４２６３７、配列番号１８）は、ヒト肺ｃＤＮＡライブラリーとプライマー（配列番号１９、２０）を用いたＰＣＲにより作製した。【０３３７】
１４−２）ヒトＢＭＰ９添加によるＡＬＫ１由来シグナルに対する抗ヒトＢＭＰ９抗体の作用
上記の方法により作出したヒトＡＬＫ１レポーター細胞株［ＡＬＫ１／ｐ（ＧＣＣＧ）１２−Ｌｕｃ／ＨｅｐＧ２（３８．５）］を１μｇ／ｍＬのｈｓＡＬＫ１−Ｆｃを含むＤＭＥＭ増殖培地［ＦＣＳを１０％になるように添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］に懸濁し、１．５×１０４個／ウェルになるように９６ウェル白色プレート（パーキンエルマー社製）に播種した。【０３３８】
翌日、ウェル内を２００μＬの血清を含まないＤＭＥＭで洗浄した後、種々の濃度（１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００ｎｇ／ｍＬ）の抗ヒトＢＭＰ９抗体、及び１０ｎｇ／ｍＬのヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃３２０９−ＢＰ）を含む０．１％  ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）含有ＤＭＥＭ培地を、１００μＬずつ添加し、５．５−６時間培養した。化学発光試薬［Ｓｔｅａｄｙ  Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ、プロメガ社製］を４５μＬ添加し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定した。【０３３９】
陰性対照ウェルには、０．１％  ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ培地を添加した。ヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質のみを添加したウェルのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を０％、０．１％  ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ培地のみを添加したウェルのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を１００％とし、各抗体のＢＭＰ９依存性ＡＬＫ１由来シグナル阻害活性（％）を以下の式にて算出した。【０３４０】
ＢＭＰ９依存性ＡＬＫ１由来シグナル阻害活性（％）＝［（ヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質のみ添加したウェルのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性）−（ヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質及び抗ヒトＢＭＰ９抗体を添加したウェルのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性）］／［（ヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質のみ添加したウェルのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性）−（０．１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ培地のみを添加したウェルのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性）］×１００【０３４１】
結果を図７に示す。【０３４２】
３Ｃ７−３−１抗体は、Ｒ＆Ｄ抗体同様に、高濃度で添加するほどＢＭＰ９依存性ＡＬＫ１由来シグナルを抑制し、ヒトＢＭＰ９に対する中和活性を持つ抗体であることが示された。しかし、その阻害活性はＲ＆Ｄ抗体に比して１／１６程度と弱いものであった。【０３４３】
これまでの結果から、３Ｃ７−３−１抗体は、Ｒ＆Ｄ抗体に比べてヒトＢＭＰ９に対する高いアフィニティーを持ち（実施例１３）、Ｒ＆Ｄ抗体とは異なるエピトープを認識し（実施例１０、１１）、Ｒ＆Ｄ抗体に比べてヒトＢＭＰ９依存性ＡＬＫ１由来シグナルに対する阻害活性が弱いことが明らかとなった。【０３４４】
［実施例１５］
ヒトＦＯＰ−ＡＬＫ２変異体ｃＤＮＡ及び発現ベクターの作製
ヒトＦＯＰ−ＡＬＫ２変異体ｃＤＮＡは、変異を導入したプライマーを用いたＰＣＲにより作製した。ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ；ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）より単離したヒトＡＬＫ２  ｃＤＮＡを鋳型として、５’末端にＥｃｏＲＩサイトを含むｈＡＬＫ２  ＦＰＩＮＴ（配列番号２１）と５’末端にＮｏｔＩサイトを含むｈＡＬＫ２  Ｇ６１７Ａ  ＲＰ（配列番号２２）をプライマーに、Ｅｘ  ｔａｑ（タカラバイオ社製）をＰＣＲ酵素に用いて、９４℃で２分間、５６℃で１５秒間、及び７２℃で１分間を１サイクルとした２５サイクルのＰＣＲを行った。【０３４５】
また同様に、ヒトＡＬＫ２遺伝子を鋳型に、ｈＡＬＫ２  ＲＰ（配列番号２３）、ｈＡＬＫ２  Ｇ６１７Ａ  ＦＰ（配列番号２４）をプライマーに用いたＰＣＲを行った。得られた各ＰＣＲ増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。【０３４６】
得られた各フラグメントを約５０ｎｇずつ混合し、Ｔａｑ酵素（タカラバイオ社製）を用いて９４℃で２分間、５６℃で１５秒、７２℃で１分間を１サイクルとした５サイクルのＰＣＲ伸長反応を行った。更に、同溶液にｈＡＬＫ２  ＦＰＩＮＴ（配列番号２１）及びｈＡＬＫ２  ＲＰ（配列番号２３）のプライマーを加え、９４℃で２分間、５６℃で１５秒間、７２℃で１分間を１サイクルとした２５サイクルのＰＣＲを行った。得られた各ＰＣＲ増幅断片をアガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。【０３４７】
得られたＰＣＲフラグメントを、ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクター（プロメガ社製）とｌｉｇａｔｉｏｎさせた後、大腸菌ＤＨ５α株に導入した。この形質転換クローンからプラスミドベクターを回収し、ＰＣＲフラグメントの挿入を確認した。更に、シークエンス解析により、変異部位の置換を確認した。【０３４８】
置換を確認できたＦＯＰ−ＡＬＫ２  ｃＤＮＡ、野生型ｈＡＬＫ２  ｃＤＮＡ、及びｐＴｒａｃｅｒＣＭＶベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）について、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩを用いて制限酵素処理を行った後、アガロースゲル電気泳動に供し、各断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。【０３４９】
得られたＦＯＰ−ＡＬＫ２  ｃＤＮＡ断片及び野生型ｈＡＬＫ２  ｃＤＮＡは、それぞれｐＴｒａｃｅｒＣＭＶベクターとｌｉｇａｔｉｏｎさせた後、ＤＨ５α大腸菌に導入した。目的とするｃＤＮＡが入っていることが確認できた各クローン（ＦＯＰ−ＡＬＫ２／ｐＴｒａｃｅｒＣＭＶ、又は野生型ｈＡＬＫ２／ｐＴｒａｃｅｒＣＭＶ）を大量調製し、以下の実験に供した。【０３５０】
［実施例１６］
ＦＯＰ−ＡＬＫ２遺伝子導入Ｃ２Ｃ１２細胞の骨分化に対する血清濃度の影響（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験）
Ｃ２Ｃ１２細胞を４×１０３個／ウェルにて９６ウェルプレートに播種した。翌日、まず、０．２μｇのＦＯＰ−ＡＬＫ２／ｐＴｒａｃｅｒＣＭＶ、野生型ｈＡＬＫ２／ｐＴｒａｃｅｒＣＭＶ、又はコントロールベクター（ｐＴｒａｃｅｒＣＭＶ）を、２０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に希釈し、５分後に０．０５μＬのＰＬＵＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、室温で５分間放置した。【０３５１】
次に、この混合溶液に、０．１２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、室温で３０分間放置した後、Ｃ２Ｃ１２細胞を播種したプレートに１ウェルあたり２０μＬずつ加えることにより、各ベクターをＣ２Ｃ１２細胞に遺伝子導入した。【０３５２】
遺伝子導入してから９．５時間後、５％又は２０％濃度のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に交換し、約９０時間培養した。その後、上清を取り除き、２００μＬのＴＢＳ［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ］で洗浄した後、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ７．４）を１００μＬ加え、プレートミキサーで１０分間攪拌し、細胞を溶解させた。【０３５３】
その細胞溶解液を９６ウェルプレートに回収し、３０００ｒｐｍ、１０分間で遠心した後、沈殿画分を吸わないように上澄みを回収し、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性測定に供した。【０３５４】
ＡＬＰ活性測定は、ラボアッセイＡＬＰキット（ＷＡＫＯ社製）を使用した。具体的には、回収した上澄み溶液２０μＬにＡＬＰキット添付の反応液を１００μＬ加え、３０分間反応させた後、４１４ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定した。結果を図８に記載する。【０３５５】
ＦＯＰの原因遺伝子であるＦＯＰ−ＡＬＫ２遺伝子を導入したＣ２Ｃ１２細胞では、５％ＦＣＳ存在下ではＡＬＰ活性の上昇は認められなかったものの、２０％のＦＣＳ存在下では、コントロールベクター又は野生型ｈＡＬＫ２遺伝子を導入した細胞と比して、有意にＡＬＰ活性の上昇が認められた。【０３５６】
Ｃ２Ｃ１２細胞では、その骨分化に伴い、ＡＬＰ活性が上昇することがわかっている。この結果は、ＦＯＰ−ＡＬＫ２による骨分化の誘導には、ＦＯＰ−ＡＬＫ２だけでは不十分であり、血清中に含まれる因子も必要であることを示唆している。【０３５７】
［実施例１７］
ＦＯＰ−ＡＬＫ２遺伝子導入Ｃ２Ｃ１２細胞の骨分化に対する抗ヒトＢＭＰ９中和抗体（Ｒ＆Ｄ抗体）の作用（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験）
ＦＯＰ−ＡＬＫ２遺伝子導入Ｃ２Ｃ１２細胞においてＡＬＰ活性の上昇（骨分化誘導）が生じる２０％ＦＣＳ存在下において、３μｇ／ｍＬのＲ＆Ｄ抗体を添加し、ＦＯＰ−ＡＬＫ２遺伝子導入Ｃ２Ｃ１２細胞の骨分化に対するＢＭＰ９の関与を調べた。結果を図９に記載する。【０３５８】
２０％ＦＣＳ存在下において、ＦＯＰ−ＡＬＫ２遺伝子導入Ｃ２Ｃ１２細胞で観察されたＡＬＰ活性の上昇は、Ｒ＆Ｄ抗体の添加により、完全に抑制された。この結果は、ＦＯＰ−ＡＬＫ２遺伝子導入Ｃ２Ｃ１２細胞の骨分化を誘導する血清中の因子は、ＢＭＰ９であることを示唆している。また、ＢＭＰ９に対する中和活性を持つ抗体は、ＦＯＰ疾患治療薬になりうることを示唆している。【０３５９】
［実施例１８］
ＦＯＰ−ＡＬＫ２安定発現Ｃ２Ｃ１２細胞の骨分化に対する抗ヒトＢＭＰ９抗体の作用（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験）
１８−１）ＦＯＰ−ＡＬＫ２安定発現Ｃ２Ｃ１２細胞株の作製とＢＭＰ９に対する反応性の検討
２０％ＦＣＳ存在下におけるＡＬＰ上昇が、ＦＯＰ−ＡＬＫ２を導入したＣ２Ｃ１２細胞のみで認められた実施例１６の結果は、ＦＯＰ−ＡＬＫ２のＢＭＰ９に対する応答性が野生型ｈＡＬＫ２と比して亢進している可能性を示唆している。そこでまず、ＦＯＰ−ＡＬＫ２を安定発現するＣ２Ｃ１２細胞を作製した。【０３６０】
実施例１５で作製したＦＯＰ−ＡＬＫ２／ｐＴｒａｃｅｒＣＭＶ、野生型ｈＡＬＫ２／ｐＴｒａｃｅｒＣＭＶ及びｐＴｒａｃｅｒＣＭＶについて、ＳｃａＩで酵素消化し、それぞれ一本鎖化したプラスミド８μｇを４００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に希釈した。５分後に２．０μＬ  のＰＬＵＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、さらに室温で５分間放置した。【０３６１】
次に、４．８μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、室温で３０分間放置した後、Ｃ２Ｃ１２細胞を１．５×１０５個になるように播種した６ウェルプレートにそれぞれ約４４０μＬずつ加え、３７℃で２４時間インキュベートした。【０３６２】
２４時間後、プレートから細胞を回収し、１５０μｇ／ｍＬ  Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１μｇ／ｍＬ  ｈｓＡＬＫ１−Ｆｃ及び１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地にて懸濁した。各懸濁細胞を新しいプレートに播種し、薬剤選別を行った。【０３６３】
得られた薬剤耐性細胞株（ＦＯＰ−ＡＬＫ２／Ｃ２Ｃ１２細胞、野生型ｈＡＬＫ２／Ｃ２Ｃ１２細胞及びｐＴｒａｃｅｒＣＭＶ／Ｃ２Ｃ１２細胞）を用いてヒトＢＭＰ９に対する応答性を検討した。具体的には、それぞれの細胞を５％ＦＣＳ入りＤＭＥＭ培地で懸濁し、９６ウェルプレートに４×１０３個／ウェルとなるように播種した。【０３６４】
翌日、ウェル内を２００μＬの血清を含まないＤＭＥＭで洗浄した後、種々の濃度（０．５、１．５、５．０、１５．０ｎｇ／ｍＬ）のヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃３２０９−ＢＰ）及び５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地を、２００μＬずつ添加し、３７℃にて７２時間培養した。【０３６５】
上清を取り除き、２００μＬのＴＢＳ［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ］で洗浄した後、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ７．４）を１００μＬずつ加え、プレートミキサーで１０分間攪拌し、細胞を溶解させた。この細胞溶解液を新たな９６ウェルプレートに移し、３０００ｒｐｍにて１０分間遠心した後、上清をＡＬＰ活性測定に供した。【０３６６】
ＡＬＰ活性測定は、ラボアッセイＡＬＰキット（ＷＡＫＯ社製）を使用した。具体的には、前述の上清２０μＬにＡＬＰキット添付の反応液を１００μＬ加え、３０分間反応させた後、マイクロプレートリーダーにて４１４ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１０に記載する。【０３６７】
ＦＯＰ−ＡＬＫ２安定発現Ｃ２Ｃ１２細胞は、コントロールベクターを導入した細胞及び野生型ｈＡＬＫ２を導入した細胞に比して、ヒトＢＭＰ９に対する応答性が亢進していることが分かった。【０３６８】
１８−２）ＦＯＰ−ＡＬＫ２安定発現Ｃ２Ｃ１２細胞の骨分化に対する抗ヒトＢＭＰ９抗体の作用
実施例１８−１で得られたＦＯＰ−ＡＬＫ２安定発現Ｃ２Ｃ１２細胞を用いて、骨分化に対する抗ヒトＢＭＰ９抗体の作用を検討した。【０３６９】
ＦＯＰ−ＡＬＫ２安定発現Ｃ２Ｃ１２細胞を１μｇ／ｍＬ  ｈｓＡＬＫ１−Ｆｃ及び５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で懸濁し、９６ウェルプレートに４×１０３個／ウェルとなるように播種した。翌日、ウェル内を２００μＬの血清を含まないＤＭＥＭで洗浄した後、種々の濃度（３０、１００、３００、１０００、３０００ｎｇ／ｍＬ）のＲ＆Ｄ抗体又は３Ｃ７−３−１抗体、１０ｎｇ／ｍＬ  ヒトｍａｔｕｒｅ２量体ＢＭＰ９組換え蛋白質（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、Ｃａｔ＃３２０９−ＢＰ）及び５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地を、２００μＬずつ添加し、３７℃にて７２時間培養した。【０３７０】
上清を取り除き、２００μＬのＴＢＳ［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ］で洗浄した後、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ７．４）を１００μＬずつ加え、プレートミキサーで１０分間攪拌し、細胞を溶解させた。この細胞溶解液を新たな９６ウェルプレートに移し、３０００ｒｐｍにて１０分間遠心した後、上清をＡＬＰ活性測定に供した。【０３７１】
ＡＬＰ活性測定は、ラボアッセイＡＬＰキット（ＷＡＫＯ社製）を使用した。具体的には、前述の上清２０μＬにＡＬＰキット添付の反応液を１００μＬ加え、３０分間反応させた後、マイクロプレートリーダーにて４１４ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１１に記載する。【０３７２】
ＦＯＰ−ＡＬＫ２安定発現細胞におけるヒトＢＭＰ９依存性のＡＬＰ活性の上昇は、３Ｃ７−３−１抗体又はＲ＆Ｄ抗体の添加により抑制された。この結果は、３Ｃ７−３−１抗体及びＲ＆Ｄ抗体に、ＢＭＰ９依存性の骨分化に対する抑制作用があることを示唆している。【０３７３】
【表２】
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【０３７４】
また、表２に示すように、３Ｃ７−３−１抗体は、ＢＭＰ９依存性のＢＭＰタイプＩ受容体由来シグナルのうち、ＢＭＰ９依存性のＦＯＰ−ＡＬＫ２由来シグナルに基づく骨分化を選択的に抑制することが明らかとなった。【０３７５】
ＡＬＫ１は血管内皮の機能維持に重要な受容体であることから、ＡＬＫ１由来シグナルとＦＯＰ−ＡＬＫ２由来シグナルに対する選択性がないＲ＆Ｄ抗体に比べ、３Ｃ７−３−１抗体は、副作用の懸念が少ない抗体であると考えられ、治療薬として有用である可能性を示唆している。【０３７６】
［実施例１９］
抗ヒトＢＭＰ９モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子配列の単離
１９−１）抗ヒトＢＭＰ９モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞からの総ＲＮＡの調製
実施例７に記載の３Ｂ７−３−３抗体及び３Ｃ７−３−１抗体を産生するハイブリドーマ  １×１０６個より、ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、Ｃａｔ＃７４１０４）及びＱＩＡ  ｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製、Ｃａｔ＃７９６５４）を用いて、総ＲＮＡを調製した。【０３７７】
１９−２）抗ヒトＢＭＰ９モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬの遺伝子クローニング
実施例１９−１で取得した各ハイブリドーマの総ＲＮＡ  １μｇから、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、Ｃａｔ＃６３４９２４）を用いて、ｃＤＮＡを作製した。【０３７８】
得られたｃＤＮＡを鋳型として、キット添付のユニバーサルプライマーＡ  ｍｉｘ（フォワードプライマーを含有する）と、マウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする特異的な異なる２種のリバースプライマーを組み合わせて使用することで、ＶＨのｃＤＮＡ配列決定を行った。【０３７９】
具体的には、マウスＩｇＧ１に特異的なプライマー（配列番号２５及び２６）、マウスＩｇＧ２ａに特異的なプライマー（配列番号２７及び２８）、マウスＩｇＧ２ｂに特異的なプライマー（配列番号２９及び３０）、マウスＩｇＧ２ｃに特異的なプライマー（配列番号３１）、又はマウスＩｇＧ３に特異的なプライマー（配列番号３２及び３３）を用いてそれぞれユニバーサルプライマーＡと組み合わせることでＰＣＲ反応を行い、各抗体のＶＨのｃＤＮＡ断片を増幅した。【０３８０】
また、マウスＩｇ（κ）特異的なプライマー（配列番号３４及び３５）又は、マウスＩｇ（λ）特異的なプライマー（配列番号３６及び３７）を同様に用いてそれぞれユニバーサルプライマーＡと組み合わせることでＰＣＲを行い、各抗体のＶＬのｃＤＮＡ断片を増幅した。【０３８１】
ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、７２℃で３分間からなる反応サイクルを５回、９４℃で３０秒間、７０℃で３０秒間、７２℃で３分間からなる反応サイクルを５回、９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で３分間からなる反応サイクルを２５回行った。【０３８２】
アガロースゲル電気泳動を行った結果、３Ｂ７−３−３抗体産生ハイブリドーマ由来のｃＤＮＡは、ＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする特異的プライマーを用いたときにＰＣＲ増幅産物が得られた。一方、３Ｃ７−３−１抗体産生ハイブリドーマ由来のｃＤＮＡに関しては、ＩｇＧ１重鎖定常領域をコードする特異的プライマーを用いたときにＰＣＲ増幅産物が得られた。【０３８３】
また、両ハイブリドーマ由来のｃＤＮＡは、マウスＩｇ（κ）特異的プライマーを用いたときにもＰＣＲ増幅産物が得られた。それぞれのＰＣＲ増幅産物をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＥＸ  ＩＩ、ＱＩＡＧＥＮ社製、Ｃａｔ＃２００２１）を用いて精製した。【０３８４】
得られた遺伝子断片を、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（インビトロジェン社製、Ｃａｔ＃Ｋ２８７５４０ＳＰ）を用い、ｐＣＲ４ベクター（インビトロジェン社製）に挿入した。得られたプラスミドを、大腸菌ＤＨ５α株に導入した。【０３８５】
得られた形質転換体より自動プラスミド抽出機（クラボウ社製）を用いてプラスミドを抽出し、塩基配列を解析した。その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する完全長のＶＨ  ｃＤＮＡ、及びＶＬ  ｃＤＮＡが取得されたことを確認した。【０３８６】
１９−３）抗ヒトＢＭＰ９モノクローナル抗体Ｖ領域の遺伝子配列の解析
実施例１９−２で得られた３Ｂ７−３−３抗体及び３Ｃ７−３−１抗体のＶＨの全塩基配列を配列番号３８、３９に、該配列から推定された、シグナル配列を含んだＶＨの全アミノ酸配列を配列番号４０、４１に、ＶＬの全塩基配列を配列番号４２、４３に、該配列から推定された、シグナル配列を含んだＶＬの全アミノ酸配列を配列番号４４、４５にそれぞれ示した。【０３８７】
また、配列番号３８、３９からシグナル配列を除いた塩基配列を配列番号４６、４７に、配列番号４２、４３からシグナル配列を除いた塩基配列を配列番号４８、４９に、配列番号４０、４１からシグナル配列を除いたアミノ酸配列を配列番号５０、５１に、配列番号４４、４５からシグナル配列を除いたアミノ酸配列を配列番号５２、５３にそれぞれ示した。【０３８８】
既知のマウス抗体の配列データ［ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］との比較から、単離した各々のｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含む３Ｂ７−３−３抗体及び３Ｃ７−３−１抗体をコードする完全長ｃＤＮＡであることが確認できた。【０３８９】
各モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。３Ｂ７−３−３抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号５４、５５及び５６に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号５７、５８及び５９にそれぞれ示した。３Ｃ７−３−１抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号６０、６１及び６２に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号６３、６４及び６５にそれぞれ示した。【０３９０】
［実施例２０］
抗ヒトＢＭＰ９抗体のエピトープ解析
２０−１）組換え３Ｃ７−３−１抗体の調製
３Ｃ７−３−１抗体の軽鎖、重鎖可変領域（シグナル配列含む）の塩基配列を、マウス軽鎖（κ鎖）、重鎖（ＩｇＧ１）定常領域の塩基配列とそれぞれ結合させ、抗体発現用のベクターにサブクローニングした。３Ｃ７−３−１抗体の軽鎖および重鎖可変領域部分の塩基配列の増幅の際には、実施例１９にて作製したベクターを鋳型として、配列番号７２〜７５で示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲを行った。【０３９１】
マウス軽鎖（κ鎖）、重鎖（ＩｇＧ１）定常領域部分の塩基配列の増幅は、人工遺伝子合成（タカラバイオ社）によって作製された配列番号８０、８１で示される塩基配列をそれぞれ鋳型として、配列番号７６〜７９で示される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲを行った。【０３９２】
いずれのＰＣＲも、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ（Ｐｒｅｍｉｘ）（タカラバイオ社製、Ｒ０４０Ａ）を用い、９６℃で２分間保温した後、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、及び７２℃で１〜２分間（増幅物のサイズによって調整した）を１サイクルとして３０サイクル反応を行った。得られたＰＣＲ増幅段片をアガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製し、インサートとした。【０３９３】
Ｎ５ＫＧ１ベクター（Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ社）をＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩを用いて酵素処理し、上記と同様の手順にて精製し、インサート挿入用ベクターとした。【０３９４】
３Ｃ７−３−１抗体の軽鎖可変領域およびマウス軽鎖定常領域のインサートをＩｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて酵素処理したＮ５ＫＧ１ベクターに組み込み、大腸菌に導入した。【０３９５】
得られた形質転換体より、正しい配列が挿入されたプラスミドＤＮＡを選択した。このプラスミドＤＮＡをＳａｌＩ、ＢａｍＨＩを用いて酵素消化し、上記と同様の手順によって精製した。【０３９６】
３Ｃ７−３−１抗体の重鎖可変領域およびマウス重鎖定常領域のインサートを、既に軽鎖が挿入された上記のベクターに組み込み、大腸菌に導入した。得られた形質転換体より、軽鎖と重鎖の両方が挿入された抗体発現ベクターを選択した。シーケンスにより、このベクターには、３Ｃ７−３−１抗体（マウスＩｇＧ１、κ）配列が挿入されていることを確認した。【０３９７】
作製した３Ｃ７−３−１抗体発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍａｘｉ（タカラバイオ社製、Ｕ０４１４Ｂ）によってベクターを調製した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社製を用いて一過性発現を行い、組換え抗体を発現させた。培養上清を、遠心分離と０．２２μｍフィルターを用いた濾過により培養液から取得した。【０３９８】
続いて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製した。ＮＡＰ−２５カラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いてバッファーをクエン酸バッファー（１０ｍＭ  クエン酸−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に置換した。２８０ｎｍの吸光度を測定して濃度を決定した。分子吸光係数として、１．４ｍＬ／（ｍｇ・ｃｍ）を使用した。【０３９９】
２０−２）ヒトＢＭＰ９／ＢＭＰ１０キメラ蛋白質およびヒトＢＭＰ１０蛋白質の調製
実施例８及び９の結果より、３Ｃ７−３−１抗体およびＲ＆Ｄ抗体はヒトＢＭＰ９のｍａｔｕｒｅ領域に結合するが、ヒトＢＭＰ９と最も高い相同性を有するヒトＢＭＰ１０には交差結合しないことが示されている。【０４００】
次に、３Ｃ７−３−１抗体およびＲ＆Ｄ抗体のエピトープを探索するため、ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域の一部をヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域に置換したキメラ蛋白質を種々作成し、それらへの結合性を調べた。【０４０１】
置換体を作製するにあたり、ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域（配列番号６７）を３つの領域に分け、それぞれヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域Ａ、ＢおよびＣと定義した。【０４０２】
より具体的には、ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域Ａは配列番号６７で表されるヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域の１番目から３７番目までのアミノ酸配列であり、ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域Ｂは配列番号６７で表されるヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域の３８番目から７４番目までのアミノ酸配列であり、ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域Ｃは配列番号６７で表されるヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域の７５番目から１１０番目までのアミノ酸配列である。またヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域についても、ＢＭＰ９との一次構造の相同性を基にして、対応する３領域（ＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域Ａ，ＢおよびＣ）を定義した。【０４０３】
より具体的には、ヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域Ａは配列番号９６で表されるヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域の１番目から３６番目までのアミノ酸配列であり、ヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域Ｂは配列番号９６で表されるヒトＢＭＰ１０ｍａｔｕｒｅ領域の３７番目から７３番目までのアミノ酸配列であり、ヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域Ｃは配列番号９６で表されるヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域の７４番目から１０８番目までのアミノ酸配列である。【０４０４】
ヒトＢＭＰ９及びＢＭＰ１０の各領域に含まれるアミノ酸を、配列番号８２〜８７で示す。キメラ蛋白質Ａ、ＢおよびＣは、ＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域の領域Ａ、ＢおよびＣのアミノ酸残基を、ＢＭＰ９と対応するＢＭＰ１０のアミノ酸残基に置換することにより、設計した。このように設計したＢＭＰ９／１０キメラ蛋白質Ａ、ＢおよびＣのアミノ酸配列を配列番号８８〜９０に示す。【０４０５】
ヒトＢＭＰ１０発現ベクターは以下の手順で作製した。国際公開第２０１０／１２６１６９号の実施例１２及び図７に記載のＮ末Ｈｉｓ型ｈＢＭＰ９  ｃｏｍｐｌｅｘ組換え体発現ベクター（以下、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９と記載）をＮｈｅＩおよびＸｈｏＩを用いて酵素処理し、アガロースゲル電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。【０４０６】
次に、Ｈｕｍａｎ  Ｈｅａｒｔ  ＰＣＲ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社、３３２６）をテンプレートとして、配列番号９１〜９４に示すＦｗｄ−１／Ｒｖ−１、Ｆｗｄ−２／Ｒｖ−２のプライマーの組み合わせでＰＣＲを行った。【０４０７】
ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ（Ｐｒｅｍｉｘ）を用い、９６℃で２分間保温した後、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、及び７２℃で２分間を１サイクルとして３２サイクル反応を行った。【０４０８】
得られた２つのＰＣＲ増幅断片をアガロース電気泳動に供した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、インサートとした。Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、インサートを先に精製したｐＬＮ１Ｖ５ベクターに挿入してサブクローニングを行い、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ１０ベクターとした。【０４０９】
配列番号９５〜９８に、ヒトＢＭＰ１０とそのｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列および塩基配列を示す。配列番号９９及び１００に、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ１０のＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ認識部位間へ挿入された塩基配列および発現される蛋白質のアミノ酸配列を示す。【０４１０】
ＢＭＰ９／１０キメラ蛋白質Ａ、ＢおよびＣの発現ベクターは以下の手順で作製した。まず、ＤＮＡ断片Ａ−１を作製するために、配列番号１０１と１０２のプライマーを使用し、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９をテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳを用い、９６℃で２分間保温した後、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、及び７２℃で２分間を１サイクルとして３２サイクル反応を行った。アガロースゲル電気泳動により、得られたＰＣＲ断片を精製した。【０４１１】
同様に、他のＤＮＡ断片を作製した。それぞれの作製断片名、使用プライマー組わ合わせ、鋳型を｛Ａ−１，配列番号１０１／１０２、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９｝のように記載すると、他のＤＮＡ断片は次の通りである。
｛Ａ−２，配列番号１０３／１０４、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ１０｝
｛Ａ−３，配列番号１０５／１０６、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９｝
｛Ｂ−１，配列番号１０１／１０７、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９｝
｛Ｂ−２，配列番号１０８／１０９、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ１０｝
｛Ｂ−３，配列番号１１０／１０６、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９｝
｛Ｃ−１，配列番号１０１／１１１、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９｝
｛Ｃ−２，配列番号１１２／１１３、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ１０｝【０４１２】
次に、ｉｎｓｅｒｔＡ、ＢおよびＣを作製した。前述のＤＮＡ断片と同様に記載すると、次の通りである。
｛ｉｎｓｅｒｔＡ，配列番号１０１／１０６、Ａ−１とＡ−２とＡ−３精製断片の混合物｝
｛ｉｎｓｅｒｔＢ，配列番号１０１／１０６、Ｂ−１とＢ−２とＢ−３精製断片の混合物｝
｛ｉｎｓｅｒｔＣ，配列番号１０１／１１３、Ｃ−１とＣ−２精製断片の混合物｝【０４１３】
得られたＰＣＲ増幅断片をそれぞれ制限酵素ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行って精製することにより、ｉｎｓｅｒｔＡ、ＢおよびＣを取得した。これらを、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩで切断されたｐＬＮ１Ｖ５の切断ベクターに、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製、６０２２）を用いて挿入し、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９／１０Ａ、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９／１０ＢおよびｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９／１０Ｃをそれぞれ取得した。【０４１４】
ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９／１０Ａ、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９／１０ＢおよびｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９／１０Ｃはそれぞれ、ヒトＢＭＰ９のシグナル配列、Ｈｉｓ６タグ配列、ヒトＢＭＰ９プロペプチド領域配列に続き、ヒトＢＭＰ９のｍａｔｕｒｅ領域の一部（それぞれ領域Ａ、ＢまたはＣ）がＢＭＰ１０の対応する配列に置換されたヒトＢＭＰ９ｍａｔｕｒｅ領域配列がｐＬＮ１Ｖ５に挿入されたヒトＢＭＰ９／１０キメラ蛋白質発現ベクターである。【０４１５】
前項で作製したｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９ベクター、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ１０ベクター、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９／１０Ａベクター、ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９／１０ＢベクターおよびｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ９／１０Ｃベクターを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍａｘｉ（タカラバイオ社製、Ｕ０４１４Ｂ）を用いてベクターを調製した。【０４１６】
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社製）を用いて一過性発現を行い、ヒトＢＭＰ９、ヒトＢＭＰ１０、およびヒトＢＭＰ９／１０キメラ蛋白質Ａ、ＢおよびＣを培養液中に発現させた。細胞上清を遠心分離と０．２２μｍフィルターを用いた濾過により培養液から取得した。【０４１７】
続いて、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて各蛋白質を精製した。Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒとして２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ４０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを用い、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒとして２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ２００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを用いた。【０４１８】
ＮＡＰ−２５カラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、バッファーをＰＢＳに置換した。２８０ｎｍの吸光度を測定して各蛋白質溶液の濃度を決定した。分子吸光係数として、ヒトＢＭＰ９、ヒトＢＭＰ１０、ヒトＢＭＰ９／１０キメラＡ、ＢおよびＣはそれぞれ  １．０５、０．９６、１．１２、１．０８および１．０６ｍＬ／（ｍｇ・ｃｍ）を使用した。【０４１９】
２０−３）３Ｃ７−３−１抗体のキメラ蛋白質に対する特異的結合性
キメラ蛋白質を用いて、取得抗体の固相抗原ＥＬＩＳＡを行った。実施例２０−２で調製したヒトＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９／１０キメラ組換え蛋白質Ａ、ＢおよびＣを５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３緩衝液で３μｇ／ｍＬに調製し、９６ウェルのＥＬＩＳＡ用プレート（Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ  ＰＬＡＴＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｃａｔ＃４４２４０４）に５０μＬ／ウェル加えて４℃で一晩静置して吸着させた。【０４２０】
固相化液を取り除いた後、１％  ＢＳＡ−ＰＢＳを２００μＬ／ウェル加え、室温で１時間静置してブロッキングし、ＰＢＳＴで５回洗浄した。次に、１％  ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００ｎｇ／ｍＬに調整した３Ｃ７−３−１抗体（実施例２０−１で作製したもの）、Ｒ＆Ｄ抗体（マウスＩｇＧ２ｂ）、ＢＭＰ１０抗体（Ｒ＆Ｄ社製、Ｃａｔ＃ＭＡＢ２９２６、マウスＩｇＧ２ａ）、ＢＭＰ９ヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社製、Ｃａｔ＃ＡＦ３２０９）、陰性対照マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社製、それぞれＣａｔ＃ＭＡＢ００２、Ｃａｔ＃ＭＡＢ００４）を５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間静置した。【０４２１】
このプレートをＰＢＳＴで５回洗浄した後、１％  ＢＳＡ−ＰＢＳで２０００倍希釈したＧｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製、Ｃａｔ＃Ｐ０４４７）またはＲａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製、Ｃａｔ＃Ｐ０１６０）を５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間静置した。【０４２２】
プレートをＰＢＳＴで１０回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＴＭＢ＋  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ、Ｄａｋｏ社製、Ｃａｔ＃Ｓ１５９９）を５０μＬ／ウェル添加して発色させ、十分な発色が得られたところで、１Ｎ硫酸溶液（Ｗａｋｏ社製、Ｃａｔ＃１９２−０４７５５）を５０μＬ／ウェル添加し、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて４５０、５７０ｎｍの吸光度を測定した。【０４２３】
結果を表３に記載する。表内の＋および−は、吸光度の値が１以上であった場合を＋とし、１未満であった場合を−とした。【０４２４】
【表３】
2014051109.tif 000005
【０４２５】
表２に示すように、抗原が適当量固相化されていることを確認するために用いたＢＭＰ９ヤギポリクローナル抗体については、ヒトＢＭＰ９、ヒトＢＭＰ９／１０キメラ蛋白質Ａ、ＢおよびＣのいずれに対しても結合を示し、プレート上に十分な抗原が固相化できていることを確認した。【０４２６】
また、３Ｃ７−３−１抗体はヒトＢＭＰ９およびヒトＢＭＰ９／１０キメラ蛋白質Ｃに特異的に結合したのに対し、ヒトＢＭＰ９／１０キメラ蛋白質ＡおよびＢには結合しなかった。さらに、Ｒ＆Ｄ抗体はヒトＢＭＰ９およびヒトＢＭＰ９／１０キメラ蛋白質ＡおよびＢに特異的に結合したが、ヒトＢＭＰ９／１０キメラ蛋白質Ｃには結合しなかった。【０４２７】
これらの結果は、３Ｃ７−３−１抗体は、ヒトＢＭＰ９の領域Ｃ以外、すなわち領域Ａ、Ｂ内に存在するエピトープを認識していること、Ｒ＆Ｄ抗体はヒトＢＭＰ９の領域Ｃ内にあるエピトープを認識していることを示している。以上のことから、３Ｃ７−３−１抗体は、既存のＲ＆Ｄ抗体とは異なるＢＭＰ９のエピトープを認識する抗体であることが明らかとなった。【０４２８】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１２年９月２８日付けで出願された米国仮出願（６１／７０７，０８０号）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【配列表フリーテキスト】
【０４２９】
配列番号１：ＬｉｎｋＡ１の塩基配列
配列番号２：ＬｉｎｋＡ２の塩基配列
配列番号３：ＬｉｎｋＢ１の塩基配列
配列番号４：ＬｉｎｋＢ２の塩基配列
配列番号５：Ｂｍｐ９ＫＯＣｌａＩ−３’Ｆｗの塩基配列
配列番号６：Ｂｍｐ９ＫＯＡｓｃＩ−３’Ｒｖの塩基配列
配列番号７：Ｂｍｐ９ＫＯＰａｃＩ−５’Ｆｗの塩基配列
配列番号８：Ｂｍｐ９ＫＯＦｓｅＩ−５’Ｒｖの塩基配列
配列番号９：Ｂｍｐ９  ＫＯ５’  ｐｒｏｂｅ  ＦＷ２の塩基配列
配列番号１０：Ｂｍｐ９  ＫＯ５’  ｐｒｏｂｅ  ＲＶ２の塩基配列
配列番号１１：Ｂｍｐ９  ＫＯ３’  ｐｒｏｂｅ  ＦＷ２の塩基配列
配列番号１２：Ｂｍｐ９  ＫＯ３’  ｐｒｏｂｅ  ＲＶ２の塩基配列
配列番号１３：ｍＢＭＰ９＿ＦＷ５９１５の塩基配列
配列番号１４：ｍＢＭＰ９＿ＲＶ１７１６５の塩基配列
配列番号１５：ｍＢＭＰ９＿ＦＷ１の塩基配列
配列番号１６：ｍＢＭＰ９＿ＲＶ１の塩基配列
配列番号１７：ヒトＡＬＫ１の全長ｃＤＮＡの塩基配列
配列番号１８：ヒトＡＬＫ１の全長アミノ酸配列
配列番号１９：ｓｈＡＬＫ１  ＦＰＮの塩基配列
配列番号２０：ｈＡＬＫ１  ＲＰの塩基配列
配列番号２１：ｈＡＬＫ２  ＦＰＩＮＴの塩基配列
配列番号２２：ｈＡＬＫ２  Ｇ６１７Ａ  ＲＰの塩基配列
配列番号２３：ｈＡＬＫ２  ＲＰの塩基配列
配列番号２４：ｈＡＬＫ２  Ｇ６１７Ａ  ＦＰの塩基配列
配列番号２５：マウスＩｇＧ１に特異的なプライマーＲＶ１の塩基配列
配列番号２６：マウスＩｇＧ１に特異的なプライマーＲＶ２の塩基配列
配列番号２７：マウスＩｇＧ２ａに特異的なプライマーＲＶ１の塩基配列
配列番号２８：マウスＩｇＧ２ａに特異的なプライマーＲＶ２の塩基配列
配列番号２９：マウスＩｇＧ２ｂに特異的なプライマーＲＶ１の塩基配列
配列番号３０：マウスＩｇＧ２ｂに特異的なプライマーＲＶ２の塩基配列
配列番号３１：マウスＩｇＧ２ｃに特異的なプライマーＲＶの塩基配列
配列番号３２：マウスＩｇＧ３に特異的なプライマーＲＶ１の塩基配列
配列番号３３：マウスＩｇＧ３に特異的なプライマーＲＶ２の塩基配列
配列番号３４：マウスＩｇ（κ）特異的プライマーＲＶ１の塩基配列
配列番号３５：マウスＩｇ（κ）特異的プライマーＲＶ２の塩基配列
配列番号３６：マウスＩｇ（λ）特異的なプライマーＲＶ１の塩基配列
配列番号３７：マウスＩｇ（λ）特異的なプライマーＲＶ２の塩基配列
配列番号３８：３Ｂ７−３−３抗体のＶＨの全塩基配列（シグナル配列を含む）
配列番号３９：３Ｃ７−３−１抗体のＶＨの全塩基配列（シグナル配列を含む）
配列番号４０：３Ｂ７−３−３抗体のＶＨの全アミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号４１：３Ｃ７−３−１抗体のＶＨの全アミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号４２：３Ｂ７−３−３抗体のＶＬの全塩基配列（シグナル配列を含む）
配列番号４３：３Ｃ７−３−１抗体のＶＬの全塩基配列（シグナル配列を含む）
配列番号４４：３Ｂ７−３−３抗体のＶＬの全アミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号４５：３Ｃ７−３−１抗体のＶＬの全アミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号４６：３Ｂ７−３−３抗体のＶＨの塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号４７：３Ｃ７−３−１抗体のＶＨの塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号４８：３Ｂ７−３−３抗体のＶＬの塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号４９：３Ｃ７−３−１抗体のＶＬの塩基配列（シグナル配列を除く）
配列番号５０：３Ｂ７−３−３抗体のＶＨのアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号５１：３Ｃ７−３−１抗体のＶＨのアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号５２：３Ｂ７−３−３抗体のＶＬのアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号５３：３Ｃ７−３−１抗体のＶＬのアミノ酸配列（シグナル配列を除く）
配列番号５４：３Ｂ７−３−３抗体ＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号５５：３Ｂ７−３−３抗体ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号５６：３Ｂ７−３−３抗体ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号５７：３Ｂ７−３−３抗体ＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号５８：３Ｂ７−３−３抗体ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号５９：３Ｂ７−３−３抗体ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号６０：３Ｃ７−３−１抗体ＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号６１：３Ｃ７−３−１抗体ＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６２：３Ｃ７−３−１抗体ＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号６３：３Ｃ７−３−１抗体ＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号６４：３Ｃ７−３−１抗体ＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６５：３Ｃ７−３−１抗体ＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号６６：ヒトＢＭＰ９蛋白質のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号６７：ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列
配列番号６８：ヒトＢＭＰ９蛋白質をコードする塩基配列（シグナル配列含む）
配列番号６９：ヒトＢＭＰ９  ｍａｔｕｒｅ領域をコードする塩基配列
配列番号７０：ヒトＡＬＫ２のアミノ酸配列
配列番号７１：ヒトＦＯＰ−ＡＬＫ２のアミノ酸配列
配列番号７２：３Ｃ７−３−１抗体の軽鎖プライマーＦｗｄの塩基配列
配列番号７３：３Ｃ７−３−１抗体の軽鎖プライマーＲｖの塩基配列
配列番号７４：３Ｃ７−３−１抗体の重鎖プライマーＦｗｄの塩基配列
配列番号７５：３Ｃ７−３−１抗体の重鎖プライマーＲｖの塩基配列
配列番号７６：マウス軽鎖（κ鎖）定常領域プライマーＦｗｄの塩基配列
配列番号７７：マウス軽鎖（κ鎖）定常領域プライマーＲｖの塩基配列
配列番号７８：マウス重鎖（ＩｇＧ１）定常領域プライマーＦｗｄの塩基配列
配列番号７９：マウス重鎖（ＩｇＧ１）定常領域プライマーＲｖの塩基配列
配列番号８０：マウス軽鎖（κ鎖）定常領域の塩基配列
配列番号８１：マウス重鎖（ＩｇＧ１）定常領域の塩基配列
配列番号８２：ヒトＢＭＰ９領域Ａのアミノ酸配列
配列番号８３：ヒトＢＭＰ１０領域Ａのアミノ酸配列
配列番号８４：ヒトＢＭＰ９領域Ｂのアミノ酸配列
配列番号８５：ヒトＢＭＰ１０領域Ｂのアミノ酸配列
配列番号８６：ヒトＢＭＰ９領域Ｃのアミノ酸配列
配列番号８７：ヒトＢＭＰ１０領域Ｃのアミノ酸配列
配列番号８８：キメラ蛋白質Ａのアミノ酸配列
配列番号８９：キメラ蛋白質Ｂのアミノ酸配列
配列番号９０：キメラ蛋白質Ｃのアミノ酸配列
配列番号９１：ヒトＢＭＰ１０蛋白質プライマーＦｗｄ−１の塩基配列
配列番号９２：ヒトＢＭＰ１０蛋白質プライマーＲｖ−１の塩基配列
配列番号９３：ヒトＢＭＰ１０蛋白質プライマーＦｗｄ−２の塩基配列
配列番号９４：ヒトＢＭＰ１０蛋白質プライマーＲｖ−２の塩基配列
配列番号９５：ヒトＢＭＰ１０蛋白質のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）
配列番号９６：ヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域のアミノ酸配列
配列番号９７：ヒトＢＭＰ１０蛋白質をコードする塩基配列（シグナル配列含む）
配列番号９８：ヒトＢＭＰ１０  ｍａｔｕｒｅ領域をコードする塩基配列
配列番号９９：ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ１０に挿入された塩基配列
配列番号１００：ｐＬＮ１Ｖ５＿ｈＢＭＰ１０ベクターにより発現するアミノ酸配列
配列番号１０１：キメラ蛋白質プライマー１の塩基配列
配列番号１０２：キメラ蛋白質プライマー２の塩基配列
配列番号１０３：キメラ蛋白質プライマー３の塩基配列
配列番号１０４：キメラ蛋白質プライマー４の塩基配列
配列番号１０５：キメラ蛋白質プライマー５の塩基配列
配列番号１０６：キメラ蛋白質プライマー６の塩基配列
配列番号１０７：キメラ蛋白質プライマー７の塩基配列
配列番号１０８：キメラ蛋白質プライマー８の塩基配列
配列番号１０９：キメラ蛋白質プライマー９の塩基配列
配列番号１１０：キメラ蛋白質プライマー１０の塩基配列
配列番号１１１：キメラ蛋白質プライマー１１の塩基配列
配列番号１１２：キメラ蛋白質プライマー１２の塩基配列
配列番号１１３：キメラ蛋白質プライマー１３の塩基配列
【図１】
2014051109.tif 000006
【図２】
2014051109.tif 000007
【図３】
2014051109.tif 000008
【図４】
2014051109.tif 000009
【図５】
2014051109.tif 000010
【図６】
2014051109.tif 000011
【図７】
2014051109.tif 000012
【図８】
2014051109.tif 000013
【図９】
2014051109.tif 000014
【図１０】
2014051109.tif 000015
【図１１】
2014051109.tif 000016
【配列表】
2014051109000001.app
【国際調査報告】
2014051109.tif 000017
2014051109.tif 000018
2014051109.tif 000019
2014051109.tif 000020
2014051109.tif 000021
2014051109.tif 000022
2014051109.tif 000023