(57)【要約】  煩雑な手順を伴わず、簡便に核酸を含む試料を核酸増幅反応に適した状態に調製する方法を提供する。  核酸を含む試料に熱を加える加熱手順と、前記試料の電気伝導度を２０００μＳ／ｃｍ以下にする電気透析手順と、を含む、核酸増幅反応用試料の調製方法を提供する。この核酸増幅反応用試料の調製方法によれば、簡便な操作で、核酸を含む試料について、核酸増幅反応に適した核酸増幅反応用試料として調製することが可能となる。
2014017187.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む試料に熱を加える加熱手順と、
前記試料の電気伝導度を２０００μＳ／ｃｍ以下にする電気透析手順と、を含む、
核酸増幅反応用試料の調製方法。
【請求項２】
前記電気透析手順で用いる多孔膜の平均孔径は１００ｎｍ以下である、
請求項１記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
【請求項３】
前記加熱手順の前記試料の加熱温度は、５０℃以上６５℃以下である、
請求項１記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
【請求項４】
前記試料を超音波処理する手順を含む、
請求項３記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
【請求項５】
前記試料を希釈する手順を含む、
請求項３記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
【請求項６】
前記試料は、生体由来の試料を含む、
請求項３記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
【請求項７】
前記生体由来の試料は、血漿、血清、又は脳脊髄液である、
請求項６記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
【請求項８】
前記生体由来の試料が脳脊髄液であるときに、
前記加熱手順と、
前記加熱手順の後に前記電気透析手順を含む、
請求項７記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
【請求項９】
前記核酸が、前記生体由来の試料に含まれる細胞に存在する核酸であるときに、
前記加熱手順と、
前記加熱手順の後に前記電気透析手順と、
前記電気透析手順の後に前記試料を超音波処理する手順を含む、
請求項７記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
【請求項１０】
前記生体由来の試料が血漿又は血清であるときに、
前記電気透析手順と、
前記電気透析手順の後に前記加熱手順と、
前記加熱手順の後に前記試料を希釈する手順を含む、
請求項７記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
【請求項１１】
前記核酸増幅反応は、等温核酸増幅反応である、
請求項７記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
【請求項１２】
前記等温核酸増幅反応を、Loop-Mediated Isothermal Amplification法で行う、
請求項１１記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
【請求項１３】
試料を収容する第一空間と、
陽極を含んで配設された第二空間と、
陰極を含んで配設された第三空間と、を有し、
前記第二空間と前記第三空間の前記第一空間との境界は、各々多孔膜で区切られ、
前記陽極及び前記陰極に印加する電源と、
前記第一空間に熱を加える加熱部と、を備える、
核酸増幅反応用試料の調製装置。
【請求項１４】
超音波を発生させる超音波発生部を備え、
前記第一空間を構成する面の一部は、前記超音波が前記試料に伝達可能となるよう形成されている、
請求項１３記載の核酸増幅反応用試料の調製装置。
【請求項１５】
試料を収容する第一空間と、
陽極を含んで配設された第二空間と、
陰極を含んで配設された第三空間と、を有し、
前記第二空間と前記第三空間の前記第一空間との境界は、各々多孔膜で区切られている、
核酸増幅反応用試料の調製用容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、核酸増幅反応用試料の調製方法及び核酸増幅反応用試料の調製装置に関する。より詳しくは、試料の加熱手順と電気透析手順を含む調製方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料に含まれる核酸を分析する手法は、例えば医療分野では、感染症の診断のための核酸検査などに利用されている。このような核酸検査では、予め試料中の核酸について、核酸増幅反応を行い、目的の核酸を検査に必要な量まで増幅させることが一般的である。特に、検査対象の核酸が試料に低濃度で含まれる場合、核酸増幅反応は、核酸の分析に不可欠な工程である。【０００３】
核酸を含む試料には、核酸増幅反応を阻害する物質が含まれている場合が多い。このため、試料に含まれる核酸を増幅するためには、該試料から核酸以外の物質を除去し、核酸を精製することが一般的に行われている。例えば、特許文献１には、試料中の核酸を核酸吸着性多孔膜に吸着させて核酸を単離する方法が記載されている。【０００４】
この方法では、核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、核酸吸着性多孔膜内に核酸を吸着させる工程と、洗浄液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、核酸吸着性多孔膜を核酸が吸着した状態で洗浄する工程と、回収液を核酸吸着性多孔膜に通過させ、核酸吸着性多孔膜内から核酸を脱着させる工程を含む。【０００５】
また、核酸を含む試料、あるいは上記のような精製方法によって回収された核酸を含む回収液などに残存する核酸増幅反応を阻害する成分に対し、別途試薬を加え、核酸増幅反応における阻害物質の影響を低減させる方法も開示されている。【０００６】
例えば、特許文献２に開示されている核酸分析方法では、試料中あるいは核酸精製試薬中に含まれる増幅阻害物質に作用してより増幅阻害の少ない物質に変換する酵素で、核酸精製液を処理する手順が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−９５００３号公報
【特許文献２】特開２００７−３２５５６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記特許文献１に記載された核酸の分離精製方法によって、核酸は核酸増幅反応に適した精製度まで精製され得る。しかし、核酸吸着性多孔膜を利用した核酸精製方法では、吸着、洗浄、回収の各工程で、各工程に用いる液体が核酸吸着性多孔膜を通過しなければならず、精製作業は煩雑である。【０００９】
一方、特許文献２に記載された核酸分析方法では、核酸を含む溶液にアルコール分解酵素等を含む酵素溶液を添加し、核酸増幅反応への阻害物質の影響を低減する。しかし、一般的に酵素溶液は用事調製とすることが望ましく、核酸増幅反応用の試料を調製する都度、酵素や緩衝液などの酵素溶液に含まれる成分を所定の濃度に混合する作業を行わなければならないため、核酸増幅反応のための試料の調製作業が煩雑となる。そこで、本技術は、煩雑な手順を伴わず、簡便に核酸を含む試料を核酸増幅反応に適した状態に調製する方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題解決のため、本技術は、核酸を含む試料に熱を加える加熱手順と、前記試料の電気伝導度を２０００μＳ／ｃｍ以下にする電気透析手順と、を含む、核酸増幅反応用試料の調製方法を提供する。
前記電気透析手順で用いる多孔膜の平均孔径は１００ｎｍ以下であることが好ましく、前記加熱手順の前記試料の加熱温度は、５０℃以上６５℃以下であることが好ましい。
また、前記試料を超音波処理する手順を含む、核酸増幅反応用試料の調製方法や、前記試料を希釈する手順を含む、核酸増幅反応用試料の調製方法であってもよい。
前記試料は、生体由来の試料を含んでいてもよく、前記生体由来の試料は、血漿、血清、又は脳脊髄液とすることができる。
前記生体由来の試料が脳脊髄液であるときには、前記加熱手順と、前記加熱手順の後に前記電気透析手順を含む、核酸増幅反応用試料の調製方法であってもよい。
また、前記核酸が、前記生体由来の試料に含まれる細胞に存在する核酸であるときには、前記加熱手順と、前記加熱手順の後に前記電気透析手順と、前記電気透析手順の後に前記試料を超音波処理する手順を含む、核酸増幅反応用試料の調製方法であってもよい。
さらに、前記生体由来の試料が血漿又は血清であるときには、前記電気透析手順と、前記電気透析手順の後に前記加熱手順と、前記加熱手順の後に前記試料を希釈する手順を含む、核酸増幅反応用試料の調製方法であってもよい。
前記核酸増幅反応は、等温核酸増幅反応とすることができる。
また、前記等温核酸増幅反応を、Loop-Mediated Isothermal Amplification法で行うことができる。【００１１】
本技術はまた、試料を収容する第一空間と、陽極を含んで配設された第二空間と、陰極を含んで配設された第三空間と、を有し、前記第二空間と前記第三空間の前記第一空間との境界は、各々多孔膜で区切られ、前記陽極及び前記陰極に印加する電源と、前記第一空間に熱を加える加熱部と、を備える、核酸増幅反応用試料の調製装置を提供する。
また、超音波を発生させる超音波発生部を備え、前記第一空間を構成する面の一部は、前記超音波が前記試料に伝達可能となるよう形成されている、核酸増幅反応用試料の調製装置であってもよい。【００１２】
本技術はさらに、試料を収容する第一空間と、陽極を含んで配設された第二空間と、陰極を含んで配設された第三空間と、を有し、前記第二空間と前記第三空間の前記第一空間との境界は、各々多孔膜で区切られている、核酸増幅反応用試料の調製用容器を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本技術により、簡便な操作で、核酸を含む試料を核酸増幅反応用試料として調製する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法を説明するためのフローチャートである。
【図２】本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製装置に備えられる調製用容器の断面模式図である。
【図３】本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製装置の模式図である。
【図４】試料の希釈による核酸増幅反応に対する阻害物質の影響の低減を示す図面代用グラフである（実施例１）。
【図５】試料の電気伝導度と核酸増幅反応に要する時間との関係を示す図面代用グラフである（実施例２）。
【図６】試料の加熱温度と核酸増幅反応に要する時間との関係を示す図面代用グラフである（実施例３）。
【図７】試料の加熱時間と核酸増幅反応に要する時間との関係を示す図面代用グラフである（実施例４）。
【図８】試料の加熱後の冷却方法と核酸増幅反応に要する時間との関係を示す図面代用グラフである（実施例５）。
【図９】超音波処理による試料中の細胞からの核酸の放出を示す図面代用グラフである（実施例６）。
【図１０】本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法によって調製した細菌ゲノムを含む試料の核酸増幅反応の結果を示す図面代用グラフである（実施例７）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法
（１）試料及び核酸増幅反応
（２）調製方法
（２−１）加熱手順
（２−２）電気透析手順
（２−３）超音波処理手順
（２−４）希釈手順
２．本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法の具体例
（１）脳脊髄液
（２）細胞を含む試料
（３）血漿
３．本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製用容器
（１）調製用容器の構成
（２）調製用容器を用いた核酸増幅反応用試料の調製
【００１６】
１．本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法
図１は、本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法を示すフローチャートである。核酸増幅反応用試料の調製方法（以下、単に「試料の調製方法」とも称す）には、フローチャートに示す、加熱手順Ｓ１、電気透析手順Ｓ２、超音波処理手順Ｓ３、希釈手順Ｓ４の各手順が含まれる。
【００１７】
（１）試料及び核酸増幅反応
図１に示す各手順を説明する前に、先ず、本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法の対象とする試料及び核酸増幅反応について述べる。
【００１８】
本技術に係る試料の調製方法において、「試料」とは、動物由来、植物由来、菌類由来、細菌類由来、あるいはウィルス由来などの、核酸増幅反応において増幅対象である核酸が含まれる試料であればよく、特に限定されない。核酸は、一本鎖、二本鎖の何れでもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡの何れでもよい。また、核酸の分子量についても特に限定されない。なお、試料に含まれる核酸は、細菌の細胞内に存在する細菌ゲノムなどのように、直接試料中に分散されず、細胞膜などの膜に囲まれた状態や粒子内に存在する状態であってもよい。
【００１９】
核酸を含む試料には、例えば、生体由来の試料を含むものが挙げられる。生体由来の試料としては、全血、血漿、血清、脳脊髄液、尿、精液、唾液等の体液が含まれる。生体由来の試料を含む「試料」には、ヘパリンやＥＤＴＡ等の抗凝固剤など、採材する際に生体由来の試料に添加される成分が含まれていてもよい。本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法は、特に、血漿、血清、又は脳脊髄液に好適である。
【００２０】
本技術に係る試料の調製方法の対象とする「核酸増幅反応」としては、温度サイクルを実施する従来のＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法や、温度サイクルを伴わない各種等温増幅法によって行われる核酸増幅反応が含まれる。等温増幅法としては、例えばＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法やＴＲＣ（Transcription-Reverse transcription Concerted）法等が挙げられる。本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法は、等温増幅法に好適であり、等温増幅法としては、例えば、ＬＡＭＰ法が好ましい。
【００２１】
（２）調製方法
次に、本技術に係る試料の調製方法について、フローチャート（図１）を参照しながら、順に説明する。なお、加熱手順Ｓ１及び電気透析手順Ｓ２は、本技術に係る試料の調製方法において必須の手順であるが、超音波処理手順Ｓ３と希釈手順Ｓ４は、必須の手順ではなく、超音波処理手順Ｓ３と希釈手順Ｓ４は、選択した試料に応じて適宜加えられ得る手順である。また、加熱手順Ｓ１、電気透析手順Ｓ２、希釈手順Ｓ４の各手順の順序は、図１に示すフローチャートの順序には限定されず、何れの手順から行ってもよい。
【００２２】
超音波処理手順Ｓ３は、後述するように、例えば、細菌等の細胞内に存在する核酸が増幅対象である場合、本技術に係る試料の調製方法に加えられることが好ましい。核酸は、試料中の細胞内に保持されている方が試料の加熱や塩濃度の変化による影響を受けにくいため、超音波処理手順Ｓ３は、加熱手順Ｓ１及び電気透析手順Ｓ２の後に行うことが好ましい。
【００２３】
（２−１）加熱手順
図１中、符号Ｓ１は、核酸を含む試料を加熱する手順である。本手順では、核酸を含む試料を加熱し、核酸増幅反応を阻害する物質の核酸増幅反応への影響を低減する。加熱手順Ｓ１における試料の加熱温度は、５０℃以上６５℃以下が好ましい。試料の加熱温度が低すぎると、核酸増幅反応への阻害物質の影響の低減が不十分となり、試料を核酸増幅反応に用いた際、試料中の核酸が増幅されない。一方、試料の加熱温度が高すぎると、試料に含まれるタンパク質などが変性して試料がゲル化し、加熱後の試料を核酸増幅反応に用いることが困難となる。
【００２４】
試料の加熱時間は、６０℃の場合、１０分以上であることが好ましい。また、加熱手順Ｓ１を行った後、核酸増幅反応に用いる前に試料を一度冷却することが好ましいが、試料の冷却は、氷上に置くなどして積極的に試料を冷やす「急冷」で行ってもよく、また、試料を室温に静置し徐々に冷ます「徐冷」で行ってもよく、冷却方法は特に限定されない。
【００２５】
（２−２）電気透析手順
図１中、符号Ｓ２は、核酸を含む試料の電気伝導度を２０００μＳ／ｃｍ以下にする電気透析手順である。本手順では、電気透析によって、試料に含まれる荷電性の分子の一部を試料から除き、試料の電気伝導度を下げる。電気透析は、電気伝導度をモニターしながら透析を行うことができるため、所望の電気伝導度に到達するように透析操作を行うことが容易である。本技術に係る試料の調製方法では、電気透析手順Ｓ２によって試料の電気伝導度を２０００μＳ／ｃｍ以下とすることが好ましく、１０００μＳ／ｃｍ以下がより好ましい。電気透析の条件については、各種試料の特性などに応じて操作者が電流値や電圧値を適宜選択すればよく、特に限定されない。
【００２６】
電気透析に用いる多孔膜には、試料に含まれる荷電性の分子のうち、塩など試料からの分離を目的とする分子が透過でき、かつ核酸などの分子は透過できずに試料中に留まるような大きさの孔が設けられている。このため、電気透析手順Ｓ２によって、試料から主に塩が取り除かれ、試料の脱塩が可能となる。
【００２７】
多孔膜の平均孔径は、選択する試料の組成や核酸の種類などに応じて選択すればよいが、例えば、１００ｎｍ以下であることが好ましい。また、多孔膜の材質は、セルロースアセテート、再生セルロース、ポリカーボネイト等の透析膜の材料として公知の材料から選択することが可能である。さらに多孔膜として、イオン交換膜を用いることもできる。
【００２８】
（２−３）超音波処理手順
図１中、符号Ｓ３は、試料に超音波処理を行う手順（図１、超音波処理手順Ｓ３）である。本手順は、本技術に係る試料の調製方法において必須ではないが、例えば、試料に含まれる細胞内に存在する核酸が核酸増幅反応の対象である場合、本手順を試料の調製方法に含むことが好ましい。超音波処理手順Ｓ３を行うことによって、試料に含まれる細胞の細胞膜が超音波によって破砕され、核酸が細胞内から試料中に放出され易くなり、核酸増幅反応の効率が上昇する。
【００２９】
超音波処理手順Ｓ３は、公知の超音波発生装置を利用して行うことができる。試料への超音波の照射には、例えば、ホーン浸漬タイプの超音波発生装置のような接触型の超音波発生装置を用いてもよく、また、非接触型の超音波発生装置で、容器等を介し超音波を試料に伝えてもよい。超音波の周波数は、ｋＨｚからＭＨｚの範囲において、超音波発生装置の性能や試料の性質に合わせ適宜選択できる。
【００３０】
（２−４）希釈手順
図１中、符号Ｓ４は、核酸を含む試料を希釈する手順である（図１、希釈手順Ｓ４）。本手順は、超音波処理手順Ｓ３と同様、本技術に係る試料の調製方法において必須ではないが、例えば試料が血漿や血清など、タンパク質濃度が高い試料の場合、試料の調製方法に本手順を加えることが好ましい。希釈手順Ｓ４を行うことで、試料に含まれる核酸増幅反応の阻害物質の濃度が低下し、核酸の増幅の効率が上昇する。
【００３１】
希釈に用いる溶媒は特に限定されず、例えば、滅菌水や生理食塩水などが挙げられる。例えば、電気透析手順Ｓ２を行う前の試料の希釈には生理食塩水を用い、電気透析手順Ｓ２後の試料の希釈には滅菌水を用いるなどしてもよい。希釈手順Ｓ４では、酵素やプライマーなどが添加された核酸増幅反応のために調製される最終的な核酸増幅反応用試料において、調製前の試料の２倍から１０倍程度の希釈となるように、試料に滅菌水や生理食塩水が加えられることが好ましい。
【００３２】
本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法は、上記のように、加熱手順Ｓ１、電気透析手順Ｓ２、超音波処理手順Ｓ３、及び希釈手順Ｓ４で構成されている。本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法のうち、加熱手順Ｓ１と電気透析手順Ｓ２のみを行って試料を核酸増幅反応に使用する場合には、各手順が行われる間、試料は各手順に用いる容器に収容された状態が保たれるため、容器を開閉して試薬液を加えたり、容器から廃液を除去したりするなどの煩雑な操作が不要であり、核酸増幅反応用試料の調製を簡便に行うことができる。
【００３３】
また、超音波処理手順Ｓ３や希釈手順Ｓ４が、本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法に含まれることにより、増幅対象の核酸が細胞内に存在する場合や、試料中に高濃度にタンパク質が含まれる場合であっても、煩雑な操作を行うことなく、試料を用いて核酸増幅反応を行うことができる。
【００３４】
さらに、本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法では、特許文献２に記載された酵素液のような用事調製が必要とされる試薬液を用いないため、核酸増幅反応用試料を調製するための準備が簡便となり、より短時間で核酸増幅反応用試料の調製を行うことができる。
【００３５】
２．本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法の具体例
上述した本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法について、脳脊髄液、細胞を含む試料、血漿の各試料を例として、以下に説明する。
【００３６】
（１）脳脊髄液
試料が脳脊髄液であり、この脳脊髄液に含まれるウィルスが核酸増幅反応の対象である場合、上述した本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法の、加熱手順Ｓ１と、加熱手順Ｓ１の後に電気透析手順Ｓ２を行うことによって、試料を核酸増幅反応に用いることができる。
【００３７】
（２）細胞を含む試料
上記のウィルスを含む試料などと異なり、細菌類のゲノム等、増幅の対象の核酸が生体由来の試料に含まれる細胞に存在する核酸である場合、該核酸は、細胞膜に囲まれて試料中に存在するため、前述の加熱手順Ｓ１と電気透析手順Ｓ２のみでは、核酸が細胞内に留まり、試料中に放出され難い。そこで、このような試料については、本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法の、加熱手順Ｓ１と、加熱手順Ｓ１の後に行う電気透析手順Ｓ２の後に、超音波処理手順Ｓ３を含めることにより、試料中に放出される核酸の割合を高め、核酸増幅反応の効率を高めることが可能となる。
【００３８】
（３）血漿
血漿は、タンパク質濃度が脳脊髄液などと比べ、高い。このため、核酸増幅反応を阻害する成分の含有量も多く、前述の加熱手順Ｓ１及び電気透析手順Ｓ２による試料の処理のみでは、核酸増幅反応における阻害物質の影響の低減が不十分な場合もある。そこで、このような試料については、本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法の、加熱手順Ｓ１と、加熱手順Ｓ１の後に行う電気透析手順Ｓ２の後に、希釈手順Ｓ４を含めることにより、試料中の阻害物質の濃度を下げ、核酸増幅反応の効率を高めることが可能となる。
【００３９】
３．本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製用容器
図２は、本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製用容器の断面模式図である。図２を参照しながら、調製用容器について説明する。
【００４０】
（１）調製用容器の構成
図２において符号Ａで示す調製用容器は、筐体１と、陽極２２及び陰極２３の電極を有する。筐体１の内部には、第一空間、第二空間、第三空間の３つの空間Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３が存在する。図２及びその説明においては、空間Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３は各々、調製用容器Ａにおける機能に合わせ、試料が収容される試料収容部１１（第一空間）、陽極２２を含んで形成され電解液が収容される電解液収容部１２（第二空間）、陰極２３を含んで形成され電解液が収容される電解液収容部１３（第三空間）と称する。試料収容部１１と電解液収容部１２，１３との各々の境界には、多孔膜３１，３１が設けられ、各空間Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３が区切られている。
【００４１】
筐体１の材料は、絶縁性を有し、かつ、前述の試料の調製方法における加熱や超音波照射に対し耐性を有する材料で構成されていれば、特に限定されず、公知の熱可塑性樹脂などとできる。例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、アクリル樹脂、環状ポリオレフィンなどが挙げられる。
【００４２】
また、筐体１の試料収容部１１を構成する面の一部は、超音波が試料に伝達可能となるよう形成されている。例えば図２に示す調製用容器Ａのように、超音波伝達部１４が設けられていてもよい。例えば、超音波伝達部１４は、硬質プラスチックや金属などの材料で構成されることにより、超音波発生装置によって発生した超音波を超音波伝達部１４に照射して、空間Ｅ１内の試料に超音波伝達部１４を介して振動を伝えることが可能となる。
【００４３】
また、超音波伝達部１４を、シリコーン系エラストマー、アクリル系エラストマー等のエラストマーや天然ゴムなどの弾性を有する材料で構成することにより、超音波発生装置の振動伝達金具の一部を超音波伝達部１４に穿刺し、超音波を直接空間Ｅ１内の試料に照射することも可能である。超音波伝達部１４は、試料収容部１１内の試料に超音波を伝達可能なように構成されていればよく、超音波伝達部１４の材料や構成は特に限定されない。また、超音波伝達部１４が設けられる位置も図２に示す位置に限定されない。
【００４４】
試料収容部１１と電解液収容部１２，１３とを区切る多孔膜３１，３１は、前述した材質の多孔膜から、試料の特性などに合わせて適宜選択できる。なお、空間Ｅ１と空間Ｅ２との境界に設けられる多孔膜３１と、空間Ｅ１と空間Ｅ３との境界に設けられる多孔膜３１は、同一である必要はなく、材料や性質の異なる多孔膜３１を各々の境界に設けてもよい。
【００４５】
陽極２２と陰極２３の各電極の材料には、電極に使用する公知の材料を用いることができ、例えば、金、白金、酸化イリジウム、窒化チタン等の金属が挙げられる。
【００４６】
また、図３に示すように、上記の調製用容器Ａには、陽極２２及び陰極２３に印加する電源４や、試料収容部１１（第一空間）に熱を加える加熱部５を備えることにより、核酸増幅反応用試料の調製装置Ｂとして構成することもできる。また、核酸増幅反応用試料の調製装置Ｂには、超音波を発生させる超音波発生部６が備わっていてもよい。
【００４７】
（２）調製用容器を用いた核酸増幅反応用試料の調製
次に、図２に示す調製用容器Ａを用いた、核酸増幅反応用試料の調製方法について説明する。
【００４８】
先ず、核酸を含む試料を調製用容器Ａの試料収容部１１に導入し、電解液収容部１２，１３には、電解液を導入する。調製用容器Ａに導入する電解液の種類は特に限定されず、試料の特性や電気透析の条件に合わせ適宜選択され得る。例えば、電解液には、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム等が含まれ得る。
【００４９】
調製用容器Ａを用いた核酸増幅反応用試料の調製方法では、調製用容器Ａに収容された試料について、上述した加熱手順Ｓ１、電気透析手順Ｓ２及び超音波処理手順Ｓ３を、調製用容器Ａ内に収容された状態で行う。なお、希釈手順Ｓ４については、調製用容器Ａに導入する前か、あるいは各手順が完了して調製用容器Ａから回収した後に、適切な液体を試料に加え希釈すればよい。
【００５０】
調製用容器Ａを用いて行う試料の調製において、加熱手順Ｓ１と電気透析手順Ｓ２の順序は、特に限定されないが、ここでは図１のフローチャートに示す順に説明する。また、超音波処理手順Ｓ３及び希釈手順Ｓ４は、調製用容器Ａを用いて行う試料の調製において必須の手順ではなく、試料の特性などに合わせて加えることができる。
【００５１】
試料の加熱手順Ｓ１では、ヒートブロックや恒温槽などの加熱装置に調製用容器Ａを設置することで試料収容部１１を加熱して、試料を加熱する。加熱手順Ｓ１における好適な加熱時間及び加熱温度については、上述の通りである。加熱手順Ｓ１が完了した後、調製用容器Ａを、急冷、あるいは徐冷によって冷ます。
【００５２】
加熱手順Ｓ１を経た調製用容器Ａは、電気透析手順Ｓ２において、陽極２２と陰極２３に電圧が印加され、試料の電気透析が行われる。電極への印加によって、試料に含まれる荷電性の物質は、その電荷に応じて陽極２２方向又は陰極２３方向へ移動する。試料収容部１１と電解液収容部１２，１３との間には多孔膜３１，３１が備えられているため、多孔膜３１，３１に存在する孔の径より大きい分子は多孔膜を通過することができず、孔の径より小さい分子のみ多孔膜を通過することができる。このため、主に塩などの低分子が電気透析により試料収容部１１外へ移動し、ゲノムなどの高分子は試料収容部１１に留まり、試料は脱塩される。
【００５３】
電気透析手順Ｓ２において、電気伝導度が２０００μＳ／ｃｍ以下となった試料については、超音波処理手順Ｓ３によって超音波処理が施される。試料収容部１１内に収容された試料への超音波処理は、前述の通り、超音波伝達部１４を介して行うことが可能である。超音波処理手順Ｓ３における好適な超音波の周波数や照射時間は、前述の通りである。
【００５４】
上述したように、本技術に係る調製用容器Ａを用いて核酸増幅反応用試料を調製することにより、特に加熱手順Ｓ１と電気透析手順Ｓ２のみで試料を調製した場合には、簡便に核酸増幅反応に適した試料を調製することができる。また、調製用容器Ａを用いて試料を調製する場合、試料を調製用容器Ａ内に収容した状態で加熱手順Ｓ１、電気透析手順Ｓ２及び超音波処理手順Ｓ３を行うことができるため、試料の汚染を防止することが容易となる。さらに試料に細菌類やウィルスなどの病原体が含まれている場合、操作者が病原体に曝される機会が低減し、より安全に試料を調製することが可能となる。
【００５５】
なお本技術は、以下のような構成もとることができる。  
（１）核酸を含む試料に熱を加える加熱手順と、前記試料の電気伝導度を２０００μＳ／ｃｍ以下にする電気透析手順と、を含む、核酸増幅反応用試料の調製方法。
（２）前記電気透析手順で用いる多孔膜の平均孔径は１００ｎｍ以下である、上記（１）記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
（３）前記加熱手順の前記試料の加熱温度は、５０℃以上６５℃以下である、上記（１）又は（２）記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
（４）前記試料を超音波処理する手順を含む、上記（１）〜（３）の何れかに記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
（５）前記試料を希釈する手順を含む、上記（１）〜（４）の何れかに記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
（６）前記試料は、生体由来の試料を含む、上記（１）〜（５）の何れかに記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
（７）前記生体由来の試料は、血漿、血清、又は脳脊髄液である、上記（６）記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
（８）前記生体由来の試料が脳脊髄液であるときに、前記加熱手順と、前記加熱手順の後に前記電気透析手順を含む、上記（７）記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
（９）前記核酸が、前記生体由来の試料に含まれる細胞に存在する核酸であるときに、前記加熱手順と、前記加熱手順の後に前記電気透析手順と、前記電気透析手順の後に前記試料を超音波処理する手順を含む、上記（７）記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
（１０）前記生体由来の試料が血漿又は血清であるときに、前記電気透析手順と、前記電気透析手順の後に前記加熱手順と、前記加熱手順の後に前記試料を希釈する手順を含む、上記（７）記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
（１１）前記核酸増幅反応は、等温核酸増幅反応である、上記（１）〜（１０）の何れかに記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
（１２）前記等温核酸増幅反応を、Loop-Mediated Isothermal Amplification法で行う、上記（１１）記載の核酸増幅反応用試料の調製方法。
【実施例】
【００５６】
＜実施例１＞
１．試料中の核酸増幅反応の阻害物質に対する希釈の効果
核酸を含む試料を希釈することによる、核酸増幅反応への影響を調べた。本実施例においては、ウシ血漿を疑似検体として用い、３〜１００倍に滅菌水で希釈したウシ血漿を用意した。また、希釈していないウシ血漿も用意した。希釈血漿の各々と希釈していないウシ血漿に、予めＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社製）によって精製されたビフィズス菌ゲノムを１０００コピー／μｌとなるように加え混合した。【００５７】
ビフィズス菌ゲノムを加えた各血漿に、試料と等量のＬＡＭＰ用の試薬液を加えて混合し、これを核酸増幅反応用サンプルとして、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行った。ＬＡＭＰ反応に用いたサンプルには、希釈血漿と等量のＬＡＭＰ用試薬を加えているため、核酸増幅反応に供している時点では、サンプルに含まれる血漿成分は、上記の希釈（３〜１００倍）が、さらに倍に希釈されている（６〜２００倍）。なお、後述する実施例２〜５においても、等量のＬＡＭＰ反応用の試薬液を加えている場合には、核酸増幅反応に供されるサンプルにおける検体の最終濃度は、本実施例と同様に、調製過程の希釈倍数のさらに２倍である。【００５８】
本実施例の結果を、図４に示す。図４の縦軸は、核酸増幅反応におけるＴｔ値である。Ｔｔ値とは、核酸増幅反応を始めてから核酸増幅反応液の濁度の上昇速度が所定の閾値を超えた時点までに要した時間であり、Ｔｔ値が小さいほど、効率的に核酸増幅反応が起こっていることを示す。【００５９】
図４の「posi」は、ビフィズス菌ゲノムを１０００コピー／μｌの濃度となるよう滅菌水で調製した、ウシ血漿が含まれていないサンプルである。本実施例のポジティブコントロールに当たる「posi」では、ＬＡＭＰ法による核酸の増幅が認められ、そのＴｔ値は１６．６分であった。【００６０】
図４に示すように、ウシ血漿を含むサンプルにおいては、希釈していないウシ血漿（図４、血漿）や、希釈倍数が１０倍までのウシ血漿の場合、核酸の増幅は認められなかった（図４中、ＮＤは増幅核酸鎖の未検出を示す。）。一方、ウシ血漿を１００倍に希釈したサンプルでは、核酸の増幅が認められ（図４、血漿１００倍希釈）、そのＴｔ値は２０．７分であった。本実施例の結果から、血漿に含まれる核酸増幅反応を阻害する成分について、所定の濃度まで低下させることで、核酸増幅反応への影響を低減できることが確認された。【００６１】
＜実施例２＞
２．核酸増幅反応を可能とする試料の電気伝導度の検討
本実施例では、試料の電気伝導度に着目し、核酸増幅反応が可能となる試料の電気伝導度を調べた。【００６２】
本実施例では、市販の生理食塩水（大塚製薬）を疑似検体として用いた。生理食塩水を、電気伝導度が７３００μＳ／ｃｍ〜２８０μＳ／ｃｍの範囲となるよう、滅菌水で希釈した。希釈生理食塩水に、１００コピー／μｌとなるようにビフィズス菌ゲノムを添加し、希釈生理食塩水と等量のＬＡＭＰ用試薬液と混合し、核酸増幅反応用サンプルとした。ＬＡＭＰ法で核酸増幅反応用サンプル中の核酸の増幅を行った。【００６３】
図５に本実施例の結果を示す。図５の縦軸は、Ｔｔ値を表す。図５に示す「posi（ポジティブコントロール）」は、ビフィズス菌ゲノムが１００コピー／μｌとなるよう滅菌水で希釈された、生理食塩水を含まないサンプルである。また、「ＮＴＣ」は、鋳型核酸（ビフィズス菌ゲノム）を含まないサンプルである。【００６４】
電気伝導度が３８５０μＳ／ｃｍ以上のサンプルでは、核酸の増幅が認められなかった（図５中、ＮＤは増幅核酸鎖の未検出を示す。）。一方、電気伝導度が２０００μＳ／ｃｍ以下のサンプルについては、核酸の増幅が認められた。特に、電気伝導度１０００μＳ／ｃｍ以下のサンプルのＴｔ値（２０．９−２４．４）は、posiのＴｔ値（２７．３）より低く、核酸増幅反応の阻害物質を含まないサンプルと同程度の効率で核酸が増幅されることが確認された。【００６５】
＜実施例３＞
３．核酸の増幅を可能とする試料の加熱温度の検討
試料に含まれる核酸増幅反応の阻害物質に対する加熱処理の効果に着目し、阻害物質の影響が低減する加熱温度を検討した。本実施例では、疑似検体として、ＥＤＴＡを含むウシ血漿を用いた。ウシ血漿については、予め電気透析によって電気伝導度が１０００μＳ／ｃｍ以下になるまで脱塩を行ってから本実施例に使用した。【００６６】
上記のウシ血漿を容器に分注し、４０℃、５０℃、６０℃又は６５℃の何れかの温度で１０分間加熱し、その後、室温に置いて冷ました。なお、本実施例の予備検討において、ウシ血漿を７０℃以上で加熱した場合、ウシ血漿がゲル化し、核酸増幅反応用試料に適さなくなることを確認している。【００６７】
加熱後のウシ血漿に滅菌水を加え、１倍（希釈せず）、３倍又は５倍の何れかの希釈倍数に希釈し、各々の希釈血漿に、別途精製済みのビフィズス菌ゲノムを１００コピー／μｌとなるように加え、混合した。未加熱のウシ血漿についても、同様に、１倍（希釈せず）、３倍又は５倍に滅菌水で希釈した後、ビフィズス菌ゲノムを１００コピー／μｌとなるように加えた。これらの加熱又は未加熱のウシ血漿を含むサンプルについては、等量のＬＡＭＰ用試薬液を加えた後、ＬＡＭＰ法によってサンプル中の核酸の増幅を行った。【００６８】
図６に本実施例の結果を示す。図６の縦軸は、Ｔｔ値を示す。図６に示すように、未加熱のウシ血漿を含むサンプルでは、核酸の増幅が認められなかった（図６中、ＮＤは増幅核酸鎖の未検出を示す。）。また、加熱温度が４０℃のサンプルについても、核酸の増幅が認められなかった。一方、加熱温度が５０℃又は６５℃のサンプルでは、滅菌水による希釈を行っていないサンプル（図６、希釈倍数１）では核酸の増幅が認められなかったものの、３倍希釈と５倍希釈のサンプルについては、核酸の増幅が認められた。６０℃で加熱したサンプルについては、滅菌水による希釈の有無にかかわらず、核酸の増幅が認められた。【００６９】
本実施例の結果から、試料を加熱することにより、試料に含まれる核酸増幅反応の阻害物質の影響を低減できることが確認され、試料の加熱が核酸増幅反応用試料の調製において有効であることが示された。加熱温度としては、例えば、５０℃以上６５℃以下が望ましい。【００７０】
また、同じ加熱温度で処理したサンプルでは、希釈されたサンプルほどＴｔ値が低く、核酸増幅反応が効率的であることが示された。この結果は、試料に含まれる核酸増幅反応の阻害物質の影響が、試料の希釈によって低減可能であることを示している。【００７１】
＜実施例４＞
４．試料に含まれる核酸の増幅を可能とする試料の加熱時間の検討
実施例３において、試料の加熱が核酸増幅反応用試料の調製として有効な方法であることが示された。そこで、次に試料の加熱時間について検討を行った。【００７２】
本実施例において、疑似検体には、実施例３と同様に、電気透析によって電気伝導度が１０００μＳ／ｃｍ以下となるように脱塩されたウシ血漿を用いた。ウシ血漿を容器に分注し、加熱温度６０℃で、１分、１０分又は２０分の何れかの時間加熱した。加熱後のウシ血漿を氷上に静置し冷却した。その後、ウシ血漿に、１倍希釈（希釈せず）、３倍希釈又は５倍希釈の何れかとなるように滅菌水を加えた。これらの希釈ウシ血漿には、ビフィズス菌ゲノム（１００コピー／μｌ）を加え、希釈ウシ血漿と等量のＬＡＭＰ用試薬液を加えた後、ＬＡＭＰ法によって核酸の増幅を行った。【００７３】
本実施例の結果を図７に示す。図７の縦軸は、Ｔｔ値を示す。図７に示すように６０℃で加熱したサンプルでは、加熱時間が１分、１０分、２０分の何れの時間であっても、核酸の増幅が確認された。しかし、加熱時間が１分のサンプルに比べ、１０分のサンプルではＴｔ値が小かった。これは、加熱時間を１０分とした方が、核酸増幅反応がより効率的であることを示している。加熱時間１０分と２０分とのサンプル間では、Ｔｔ値に大きな差は見られなかった。本実施例の結果から、試料の加熱時間は１分程度でも核酸増幅反応用試料の調製として有効であることが示された。また、核酸増幅反応がより効率的となるため、試料の加熱時間を１０分以上とすることが好ましいことが示された。【００７４】
＜実施例５＞
５．加熱後の試料の冷却方法の検討
上記の実施例３及び実施例４によって、試料の加熱が、核酸増幅反応用試料の調製として有効な方法であることが示された。そこで、本実施例において、加熱後の試料の冷却方法の違いによる核酸増幅反応への影響を調べた。【００７５】
本実施例において、疑似検体には、実施例３及び実施例４と同様に、電気透析によって電気伝導度が１０００μＳ／ｃｍ以下となるように脱塩されたウシ血漿を用いた。ウシ血漿を容器に分注し、６０℃で１０分間加熱した。加熱後のウシ血漿については、徐冷、あるいは急冷の何れかの冷却方法によって冷ました。「徐冷」では、加熱後のウシ血漿が入った容器を室温に静置し冷ました。「急冷」では、加熱後のウシ血漿が入った容器を氷上に静置し冷ました。「徐冷」又は「急冷」によって冷却された後のウシ血漿に、１倍希釈（希釈せず）、３倍希釈又は５倍希釈となるよう滅菌水を加え、予め精製されたビフィズス菌ゲノムを１００コピー／μｌとなるように加えた。これらの希釈ウシ血漿を含むサンプルについては、希釈ウシ血漿と等量のＬＡＭＰ用試薬液を加えた後、ＬＡＭＰ法により核酸の増幅を行った。【００７６】
本実施例の結果を図８に示す。図８の縦軸は、Ｔｔ値を示す。図８に示すように、「徐冷」と「急冷」の冷却方法によるＴｔ値の差は認められず、試料の冷却方法の違いによる核酸増幅反応への影響は認められなかった。【００７７】
＜実施例６＞
６．試料の超音波処理による、細胞内の核酸の細胞外への放出の検証
試料に超音波を照射することで、試料に含まれる細胞に存在する核酸が細胞外へ放出されるか、検証した。培養したビフィズス菌を回収し、血球計数盤を用いてビフィズス菌が滅菌水に１０００個／μｌとなるようにビフィズス菌分散液を調製し、サンプルとした。サンプルを容器に分注し、サンプルの１つには、ホーン浸漬型の超音波発生装置を用いて、３８ｋＨｚの超音波を６０秒間照射した。また、別のサンプルには、非接触型の超音波発生装置で２．４ＭＨｚの超音波を１０分間照射した。超音波照射後の各サンプルについて、上清を回収した。超音波照射を行っていないビフィズス菌分散液についても、同様に上清を回収した。【００７８】
超音波処理を行った各サンプルの上清と未処理のサンプルの上清について、リアルタイムＰＣＲを行い、ゲノムのコピー数を定量した。ゲノムのコピー数を算出には、精製されたビフィズス菌ゲノムを所定の濃度で含む滅菌水の希釈系列を作製し、希釈系列の各々についてリアルタイムＰＣＲを行い、検量線を作成した。【００７９】
図９に本実施例の結果を示す。図９の縦軸は、ビフィズス菌ゲノムの濃度（コピー数／μｌ）を表す。また、「ＮＴＣ」は、核酸を含まないサンプル、「ｓｔｄ１０００」は、精製したビフィズス菌ゲノムを１０００コピー／μｌの濃度で含むサンプルである。【００８０】
図９に示すように、ホーン浸漬型の超音波発生装置によってｋＨｚレベルの超音波を用いた場合（図９、ｋＨｚ超音波破砕参照。）であっても、非接触型の超音波発生装置によってＭＨｚレベルの超音波を用いた場合（図９、ＭＨｚ超音波破砕参照。）であっても、超音波によってビフィズス菌の細胞が破砕され、精製されたビフィズス菌ゲノムを含む「ｓｔｄ１０００」と同程度の量のビフィズス菌ゲノムが、滅菌水中に放出されていることが確認された。この結果から、試料の超音波処理は、試料に含まれる細胞に存在する核酸が増幅対象である場合、核酸増幅反応の効率を上昇させるために、有効な処理であることが確認された。【００８１】
＜実施例７＞
７．本技術に係る試料の調製用容器を用いた核酸増幅反応用試料の調製
上述した調製用容器Ａ（図２参照）を用いて、核酸増幅反応用試料の調製が可能であるか、検証した。【００８２】
本実施例において、試料にはビフィズス菌を添加したブタ髄液を用いた。電解液収容部１２，１３には、電解液として水道水を充填した。また、試料収容部１１と電解液収容部１２とを区切る多孔膜３１には、陰イオン交換膜（平均孔径１００ｎｍ）を用い、試料収容部１１と電解液収容部１３とを区切る多孔膜３１には、陽イオン交換膜（平均孔径１００ｎｍ）を用いた。【００８３】
試料である、ビフィズス菌を含むブタ髄液を、図２に示す試料収容部１１に充填し、調製用容器Ａごと６０℃で１０分間加熱した。加熱後、調製用容器Ａを室温に静置し、冷ました。その後、陽極２２及び陰極２３に印加し、試料収容部１１に収容された試料を電気透析し、電気伝導度が１０００μＳ／ｃｍに達するまで電気透析を続けた。電気透析後の試料には、超音波発生装置によって発生した超音波（２．４ＭＨｚ）を、超音波伝達部１４を介して伝え、試料に対する超音波処理を５分間行った。【００８４】
超音波処理が終了した後、調製用容器Ａから試料を回収し、試料の一部を容器に分注した。分注した試料と等量のＬＡＭＰ用試薬を試料が入った容器に加え混合し、これをＬＡＭＰ反応に供した。ＬＡＭＰ法における増幅核酸鎖の検出には、Ｑプローブを用いた。Ｑプローブには、蛍光標識されたシトシンが末端に存在し、Ｑプローブが核酸鎖とハイブリダイズしていない状態では、蛍光物質は発光する。一方、Ｑプローブが核酸鎖とハイブリダイズすると、蛍光標識されたシトシンがグアニンと対合するため、グアニンの影響により蛍光物質が消光する。従って、Ｑプローブに相補的でハイブリダイズ可能な、Ｑプローブの標的核酸鎖がサンプル中に存在する場合には、アニーリングの際、Ｑプローブは消光する。また、核酸増幅反応によるＱプローブの標的核酸鎖の増幅に伴い、Ｑプローブの消光の程度は大きくなる。【００８５】
図１０に、本実施例の結果を示す。図１０の縦軸は、サンプルの蛍光強度を表し、横軸はＬＡＭＰ反応開始後の時間（分）を表す。上述した調製用容器Ａを用いて調製された試料（処理サンプル）では、ＬＡＭＰ反応開始後２５分頃から、蛍光強度が減少し始め、５０分頃には、蛍光強度が２５分頃に比べ９０％以上低下した。この結果から、処理サンプルに含まれる核酸の増幅が確認された（図１０、処理サンプル参照。）。一方、調製用容器Ａによる調製を行っていない試料（未処理サンプル）では、処理サンプルに見られたような蛍光強度の大幅な減少は見られず、核酸の増幅は確認されなかった（図１０、未処理サンプル参照。）。本実施例の結果から、本技術に係る調製容器Ａを用いて、試料を核酸増幅反応用試料として調製することによって、核酸増幅反応に適した状態にできることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本技術に係る核酸増幅用試料の調製方法によれば、簡便な操作で核酸増幅反応に適した試料の調製が可能である。このため、臨床における遺伝子型判定や病原体判定などのための核酸検査に用いる試料を調製する方法として、本技術に係る核酸増幅反応用試料の調製方法は用いられ得る。
【符号の説明】
【００８７】
Ａ：調製用容器、Ｂ：調製装置、１：筐体、１１：試料収容部、１２，１３：電解液収容部、１４：超音波伝達部、２２：陽極、２３：陰極、３１：多孔膜、４：電源、５：加熱部、６：超音波発生部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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