(57)【要約】  本発明は、組織、臓器および細胞の保存性に優れ、再生医療、移植医療等の分野において有用な組織保存液を提供する。本発明の組織保存液はＮｒｆ２活性化作用を有する化合物を含有することを特徴とする。Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物は親電子性物質が好ましく、エブセレンまたはｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンが好ましい。基礎となる保存液にはハンクス平衡塩類溶液を用いることが好ましい。
2014017267.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を含有することを特徴とする組織保存液。
【請求項２】
Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物が、親電子性物質であることを特徴とする請求項１に記載の組織保存液。
【請求項３】
Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物が、エブセレンおよび／またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンであることを特徴とする請求項１または２に記載の組織保存液。
【請求項４】
Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を含有するハンクス平衡塩類溶液である請求項１に記載の組織保存液。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の組織保存液を保存対象と接触させることを特徴とする組織保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物を構成する組織、臓器、細胞等を保存するための組織保存液および組織保存方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
角膜、心臓、表皮などの分野においては、既存の治療法が有効でない重症疾患や難治性疾患に対して、患者自身の細胞を用いて作製した培養細胞シート等を用いた再生治療法が開発されており、既に臨床応用が行われている。例えば角膜分野においても、患者自身の口腔粘膜上皮や輪部上皮に存在する前駆細胞を用いて作製した培養上皮シートの移植が行われており、複数の施設において本治療法が難治性角膜疾患に極めて有効であることが実証されている。このような培養細胞シートを用いる再生治療法をより多くの患者に適用するためには、製造施設において培養上皮細胞シートを製造し、各病院へ輸送し、一定期間保存できることが重要である。また、産業化を想定した場合においては、細胞シートを一定期間保存する技術はさらに重要性が増す。【０００３】
また、免疫抑制剤の進歩等により組織移植の重要性も増している。組織移植においては、組織提供者（ドナー）から摘出された組織が直ちに受容者（レシピエント）に移植されるのが理想的ではあるが、必ずしも直ちに移植できるとは限らない。そのため、摘出した組織を一定期間保存する技術は非常に重要である。したがって、今後の再生医療や組織移植の普及に当たっては、細胞シート等の再生医療製品や移植用組織（細胞、臓器を含む）の保存液の開発が必須である。【０００４】
従来の組織保存液としては、例えばユーロ−コリンズ液（Ｅｕｒｏ−Ｃｏｌｌｉｎｓ液）、ＵＷ液（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ液、特許文献１）、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液（特許文献２）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１−２４６２０１号公報
【特許文献２】特開平６−４０８０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、生物を構成する組織、臓器、細胞等の保存性に優れ、再生医療、移植医療等の分野において有用な組織保存液を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記の課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を含有することを特徴とする組織保存液。
［２］Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物が、親電子性物質であることを特徴とする前記［１］に記載の組織保存液。
［３］Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物が、エブセレンおよび／またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンであることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の組織保存液。
［４］Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を含有するハンクス平衡塩類溶液である前記［１］に記載の組織保存液。
［５］前記［１］〜［４］のいずれかに記載の組織保存液を保存対象と接触させることを特徴とする組織保存方法。
［６］ハンクス平衡塩類溶液を保存対象と接触させることを特徴とする組織保存方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、生物を構成する組織、臓器、細胞等の保存性に優れ、再生医療、移植医療等の分野において有用な組織保存液を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】細胞シートの保存に用いる基礎保存溶液のスクリーニング結果を示す図であり、（Ａ）はルシフェラーゼトランスジェニックラット由来口腔粘膜細胞シートを基礎保存溶液に浸漬して７日間保存した後のＡＴＰ残存量を示し、（Ｂ）は７日間保存後のルシフェラーゼトランスジェニックラット由来口腔粘膜細胞シートを、ＫＣＭ培地を用いて７日間再培養した後のＡＴＰ残存量を示す。
【図２】細胞シートの保存に用いる基礎保存溶液への添加物のスクリーニング結果を示す図である。
【図３】ヒト由来口腔細胞シートの保存後７日目における生細胞率を測定した結果を示す図である。
【図４】保存後７日目におけるヒト由来口腔細胞シートをＨＥ染色し、形態を観察した結果を示す図である。
【図５】保存液にエブセレン添加ＰＢＳを用いてルシフェラーゼトランスジェニックラット由来口腔粘膜細胞シートを保存し、保存後７日目および再培養７日目のＡＴＰ残存量を測定した結果を示す図である。
【図６】保存液にエブセレン添加Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）を用いてルシフェラーゼトランスジェニックラット由来口腔粘膜細胞シートを保存し、保存後７日目および再培養７日目のＡＴＰ残存量を測定した結果を示す図である。
【図７】保存後１４日目におけるブタ角膜のパラフィン切片をＨＥ染色し、形態を観察した結果を示す図である。
【図８】保存後１４日目におけるブタ角膜の凍結切片をＺＯ−１免疫染色し、形態を観察した結果を示す図である。
【図９】ヒト由来口腔細胞シートをエブセレン添加ＨＢＳＳに７日間保存し、再培養を開始した後のＮＱＯ−１遺伝子の発現量を経時的に測定した結果を示す図である。
【図１０】ヒト由来口腔細胞シートをエブセレン添加ＨＢＳＳに７日間保存し、再培養を開始した後のＨＯ−１遺伝子の発現量を経時的に測定した結果を示す図である。
【図１１】保存液にｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン添加ＨＢＳＳを用いてルシフェラーゼトランスジェニックラット由来口腔粘膜細胞シートを保存し、保存後７日目のＡＴＰ残存量を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
〔組織保存液〕
本発明は、Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を含有する組織保存液を提供する。
本発明の組織保存溶液の保存対象には、生物を構成する全ての組織、臓器、細胞等が含まれ、いわゆる狭義の組織に限定されるものではない。保存対象の細胞には、組織や臓器を構成する細胞が含まれ、分散された状態の細胞も含まれる。組織としては、例えば、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などが挙げられる。臓器としては、例えば、脳、脊髄、胃、膵臓、膵島、腎臓、肝臓、甲状腺、骨髄、皮膚、筋肉、肺、消化管（例えば、大腸、小腸など）、血管、心臓、胸腺、脾臓、末梢血、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、骨格筋などが挙げ得られる。細胞としては、例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、膵β細胞、骨髄細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞 （例えば、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、単球など）、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞などが挙げられる。また、不妊治療などに用いる精子、卵子、受精卵なども本発明の保存液の保存対象として好適である。また、これら細胞の前駆細胞、幹細胞（間葉系幹細胞、神経前駆細胞、造血幹細胞など）、がん細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞なども保存対象として好適である。さらに、培養技術を利用して調製した再生医療用製品も保存対象として好適である。再生医療用製品としては、例えば、培養皮膚、培養軟骨、培養角膜上皮、各種細胞シート（例えば、培養表皮細胞シート、口腔粘膜細胞シート、角膜輪部上皮細胞シート、角膜内皮細胞シート、心筋シート、筋芽細胞シート、培養軟骨細胞シート、膵島細胞シート、肝細胞シート、繊維芽細胞シート、歯根膜細胞シートなど）、再生医療用の各種培養細胞などが挙げられる。
【００１１】
保存対象は、どのような生物由来であってもよい。好ましくは動物由来であり、より好ましくは脊椎動物由来であり、さらに好ましくは哺乳動物由来である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット動物、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができる。中でもヒト由来であることが特に好ましい。
【００１２】
本発明の組織保存液は、Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を含有するものであればよい。Ｎｒｆ２は、哺乳類に存在する塩基性ロイシンジッパー（ｂａｓｉｃ−ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ）モチーフを有する転写因子の１つで、ＮＦ−Ｅ２関連因子２、Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ２−ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２、 Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ２−ｌｉｋｅ ２ （Ｎｆｅ２ｌ２）、Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｅｒｈｙｔｈｒｏｉｄ ２−ｒｅｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２などとも称される（Proc Natl Acad Sci U S A. 91 9926-30 (1994); Biochem Biophys Res Commun. 209 40-6 (1995); 生化学 78 79-92 (2006)）。
【００１３】
Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物は、Ｎｒｆ２活性化剤と同義であり、転写因子Ｎｒｆ２を活性化する作用を有するものであれば特に制限されない。例えば、Ｎｒｆ２活性化剤として以下の食品成分または医薬関連成分が知られている。
【００１４】
食品成分：スルフォラファン(J Nutr. 131 (Suppl 11) 3027S-33S (2001))、tert-ブチルヒドロキノン(TBHQ)(Toxicol. Appl. Pharmacol. 141 59-67 (1996))、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)(Mol Carcinog. 45 841-50 (2006)、Biochem Soc Trans. 28 (2000)、Toxicol. Appl. Pharmacol. 126, 150-55 (1994))、6-エトキシ-1,2-ジヒドロ-2,2,4-トリメチルキノリン(エトキシキン)(Biochem Soc Trans. 28 (2000))、6-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート(6-HITC) (J.Biol.Chem. 277 3456-63 (2002))、カフェストール (Food Chem Toxicol. 40 1155-63 (2002))、カウェオール（kahweol）(Food Chem Toxicol.40 1155-63 (2002))、クルクミン(Biochem J. 371 887-95 (2003)、Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 E645-55 (2007))、デメトキシクルクミン(Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 E645-55 (2007))、ビスデメトキシクルクミン(Am J Physiol Endocrinol Metab. in press (2007))、ピペリン(J Nutr Biochem. 18 615-22 (2007))、フェネチルイソチオシアネート(Pharm Res. 20 1351-6 (2003))、カルノソール(carnosol)(J Biol Chem. 279 8919-29 (2004))、ゼルンボン(zerumbone)(FEBS Lett. 572 245-50 (2004))、レスベラトロール(Biochem Biophys Res Commun. 331 993-1000 (2005))、リコピン(Mol CancerTher. 4 177-86 (2005))、硫化ジアリル(Free Radic Biol Med. 37 1578-90 (2004)、Arch Biochem Biophys. 432 252-60 (2004))、三硫化ジアリル(Free Radic Biol Med. 37 1578-90 (2004))、キサントフモル(Chem Res Toxicol. 18 1296-305 (2005))、3-O-カフェオイル-1-メチルキナ酸（methylquinic acid）（Free Radic Biol Med. 40 1349-61 (2006)）、クロロゲン酸(J Biol Chem. 280 27888-95 (2005))、α-リポ酸(Proc Natl Acad Sci U S A. 101 3381-6 (2004))、アセチルカルニチン(J Neurosci Res. 79 509-21 (2005))、アヴィシンス(avicins)(J Clin Invest. 113 65-73 (2004))、フィセチン(fisetin)(Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 3164-77 (2006))、ルテオリン（luteolin）(Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 3164-77 (2006))、エリオジクチオール(eriodictyol)(Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 3164-77 (2006))、ガランギン(galangin)(Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 3164-77 (2006))、エピガロカテキン-3-ガレート(Pharm Res. 22 1805-20 (2005))、ケルセチン(Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 3164-77 (2006)、Free Radic Biol Med.42 1690-703 (2007))、ケルセチン3-O-β-L-アラビノピラノシド(Food Chem Toxicol. 44 1299-307 (2006))、ケルセチン3-O-β-D-グルコピラノシド(Food Chem Toxicol. 44 12 99-307 (2006))、1,2,3,4,6-ペンタ-O-ガロイル-β-D-グルコース(World J Gastroenterol. 12 214-21 (2006))、アクテオシド(Pharmazie. 61 356-8 (2006))、イソフムロン(PCT/JP2005/019415)、イソコフムロン（PCT/JP2005/019415）、4-アセチル-3-メチル-ジヒドロ-フラン-2-オン、4-（1-ヒドロキシ-エチル）-3-メチル-ジヒドロ-フラン-2-オン、5-ヒドロキシ-3, 4, 5-トリメチル-5-H-フラン-2-オン、酢酸1-（4-メチル-5-オキソ-テトラヒドロ-フラン-3-イル）-エチルエステル、（5-エチル-テトラヒドロ-フラン-2-イル）-酢酸、2-フェニル-ピラン-4-オン、ジヒドロ-4-フェニル-2（3H）-フラノン、2-（2-ホルミルピロール-1-イル）-4-メチル吉草酸（特願2007-043783）、デヒドロコスタスラクトン(Eur J Pharmacol. 565 37-44 (2007))、トリフロレトールA（triphlorethol-A）(FEBS Lett. 581 2000-8 (2007))など。
【００１５】
医薬関連成分：oltipraz(4-メチル-5-[2-ピラジニル]-1,2-ジチオール-3-チオン)(Proc Natl Acad Sci USA 98 3410-5 (2001))、アセタミノフェン(Hepatology 39 1267-76 (2004))、アスピリン（Carcinogenesis 27, 803-10(2006)）、フルナリジン(Cell Death Differ. 13 1763-75(2006))、α-ルミノール一ナトリウム(Galavit)(J Virol. 80(9):4557-69 (2006))、アポモルフィン(J Neurosci Res. 84 860-6.(2006))、ブシラミン(Biochem Pharmacol. 72 455-62 (2006))、エブセレン(Chem Res Toxicol. 19 1196-204 (2004))、デルタメトリン(Toxicol Lett. 171 87-98 (2007)、15-デオキシ-Δ(12,14)-プロスタグランジンJ2(15d-PGJ2)(J Biol Chem. 275 11291-9 (2000))、4-ヒドロキシ-2-ノネナール(Circ Res. 94 609-16 (2004))、2-インドール-3-イル-メチレンキヌクリジン-3-オール(Cancer Res. 63 5636-45 (2003))、4-ヒドロキシエストラジオール(Biochim Biophys Acta. 1629 92-101 (2003))、3',4',5',3,4,5-ヘキサメトキシ-カルコン(Br J Pharmacol. 142 1191-9 (2004))、2-シアノ-3,12-ジオキソオレアナ-1,9(11)-ジエン-28-酸(Cancer Res. 65 4789-98 (2005))、1-[2-シアノ-3-,12-ジオキソオレアナ-1,9(11)-ジエノ-28-イル]イミダゾール(Cancer Res. 65 4789-98 (2005))、α-メチレン-γ-ブチロラクトン(Eur J Pharmacol. 56537-44 (2007))、ニトロ-リノール酸(Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 H770-6 (2007))、3-ヒドロキシアントラニル酸(Atherosclerosis. 187 274-84 (2006))、ビス(2-ヒドロキシベンジリデン)アセトン(Cancer Lett. 245 341-9 (2007))、2',4',6'-トリス(メトキシメトキシ)カルコン(Biochem Pharmacol. 74 870-80 (2007))など。
【００１６】
本発明の組織保存液は、上記のようなＮｒｆ２活性化作用を有する化合物の１種以上を含有するものであればよい。Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物の中でも、親電子性物質が好ましい。親電子性物質は、分子中に極性の偏りによる電子密度の低い部位をもつ分子である。親電子性物質が、非ストレス状態の細胞においてＮｒｆ２の抑制に働くＫｅａｐ１を刺激することにより、Ｎｒｆ２がＫｅａｐ１から開放されて活性化する。上記Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物のうち、親電子性物質としては、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（以下「ｔＢＨＱ」と記す）、エブセレン、スルフォラファン、クルクミンなどが挙げられる。なかでも好ましくはｔＢＨＱおよびエブセレンである。
【００１７】
本発明の組織保存液は、基礎となる保存溶液（基礎保存溶液）にＮｒｆ２活性化作用を有する化合物を１種または２種以上添加し、溶解することにより製造することができる。例えば、滅菌済みの基礎保存溶液にＮｒｆ２活性化作用を有する化合物を無菌的に添加して製造してもよく、Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を添加した後に滅菌処理を行ってもよい。滅菌にはオートクレーブ滅菌、ろ過滅菌等の公知の滅菌法を用いることができる。製造された組織保存液は、使用時まで約２〜８℃の低温で保管することが好ましい。
【００１８】
本発明の組織保存液におけるＮｒｆ２活性化作用を有する化合物の含量は、保存する組織に対して毒性を示さない含量であれば特に限定されない。用いるＮｒｆ２活性化作用を有する化合物に応じて、適宜至適含量を設定すればよい。例えば、エブセレンを単独で用いる場合、０．１μＭ〜１００μＭが好ましく、より好ましくは０．５μＭ〜５０μＭであり、さらに好ましくは１μＭ〜１０μＭである。また、ｔＢＨＱを単独で用いる場合、０．１μＭ〜１００μＭが好ましく、より好ましくは０．５μＭ〜５０μＭ、さらに好ましくは１μＭ〜１０μＭである。
【００１９】
基礎保存溶液は特に限定されず、一般的な緩衝液、生理的緩衝液、平衡塩類溶液、細胞培養用の基礎保存溶液、組織保存液等の公知の溶液から適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、生理食塩液、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩類溶液（以下「ＨＢＳＳ」と記す）、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＭＥＭ−α、Ｆ−１２、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ＲＰＭＩ−１６４０、ユーロ−コリンズ液、ＵＷ、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）などが挙げられる。好ましくは、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＵＷ、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）であり、より好ましくは、ＨＢＳＳおよびＵＷである。本発明の組織保存液は、保存中の組織の膨張または収縮するのを防ぐために、浸透圧が約２７０〜約４５０Ｏｓｍ／ｌの範囲にあることが好ましい。また、細胞の酸性分解を防止するために、ｐＨが約７〜８の範囲にあることが好ましい。
【００２０】
〔組織保存方法〕
本発明は、上記本発明の組織保存液を用いる組織保存方法を提供する。本発明の組織保存方法は、本発明の組織保存液を保存対象の組織、臓器、細胞等と接触させるものであればよい。
本発明の組織保存方法の第１の実施形態は、保存対象の組織、臓器、細胞等を本発明の組織保存液に浸漬することにより、保存液と保存対象とを接触させて組織、臓器、細胞等を保存する方法である。保存対象に対する保存液の量は特に限定されないが、保存対象が完全に浸漬する量以上の量であればよい。
容器は特に限定されず、密封容器および解放容器のいずれも使用可能である。目的に応じて適宜選択すればよい。好ましくは、好気条件（酸素、二酸化炭素、窒素などの気体が自由に通気可能な条件）を維持できる容器である。
保存温度は特に限定されないが、−１９６℃〜２０℃の範囲が好ましく、より好ましくは−２０℃〜１５℃、さらに好ましくは０℃〜１０℃である。なお、本発明の組織保存液中に保存対象を浸漬して凍結保存する場合は、所望により組織保存液に公知の凍結保護剤（例えば、ＤＭＳＯ、グリセリン等）を添加してもよい。
保存期間は目的に応じて適宜設定することができる。通常数分〜３か月程度の保存期間を設定することができる。好ましくは３０分〜１か月程度であり、より好ましくは３０分〜２０日間程度である。
【００２１】
本発明の組織保存方法の第２の実施形態は、保存対象の組織の表面に本発明の組織保存液を散布等することにより保存液と組織とを接触させて組織を保存する方法である。第２の実施形態は、本発明の組織保存液を切開手術や内視鏡手術における組織洗浄液または潅流液として使用する場合の形態である。第２の実施形態は、生体の組織をそのままの状態で短時間保存する場合に適している。第２の実施形態の保存期間は、通常１分〜１０時間程度、好ましくは５分〜５時間程度、より好ましくは５分〜２時間程度である。保存期間中は、組織の表面に本発明の組織保存液を散布、潅流等することにより、組織の表面と本発明の組織保存液との接触状態を維持すればよい。
【００２２】
本発明者らは、Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を添加していないＨＢＳＳに組織（細胞シート）を保存したところ、既存の組織保存液を用いた場合より保存後のＡＴＰ残存量（細胞生存率）および再培養後のＡＴＰ残存量（細胞生存率）が高いことを新たに見出した。つまり、ＨＢＳＳは既存の組織保存液より組織保存性に優れていることを新たに見出した（実施例１参照）。それゆえ、本発明は、ＨＢＳＳを組織と接触させることを特徴とする組織保存方法を提供する。ＨＢＳＳを用いる組織保存方法は、上記と同様の形態で実施することができる。
【００２３】
〔本発明の有用性〕
本発明の組織保存液を用いれば、既存の組織保存液を用いた場合より保存後の細胞生存率が高いことが示された。また、本発明の組織保存液にブタ角膜組織を２週間保存しても組織形態が維持されることを確認した。このように、本発明の保存液は、既存の組織保存液より組織保存性が極めて優れており、組織保存液として非常に有用である。それゆえ、移植医療分野に本発明の組織保存液を用いれば、組織提供者（ドナー）から摘出された組織を一定期間保存できるので、遠隔地の受容者（レシピエント）に移植することが可能となる。また、再生医療分野に本発明の組織保存液を用いれば、製造施設で製造した培養細胞シート等の再生医療製品を一定期間保存することができるので、再生治療法をより多くの患者に適用することが可能となる。また、本発明の組織保存液は、細胞の生存率を高く維持することが可能であるため、細胞の生存状態が極めて重要である不妊治療法の成績を向上させることができる。さらに、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の保存液としても有用である。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００２５】
〔実施例１：ルシフェラーゼトランスジェニックラット由来口腔粘膜細胞シートを用いた基礎保存溶液のスクリーニング〕
（１）細胞シートの作製
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｔｇ  ｒａｔ（Ｈａｋａｍａｔａ  Ｙ，Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｔ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｅ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００６；  ８１（８）：  １１７９−１１８４）口腔組織（自治医科大学先端治療開発部門  小林英司先生より提供）を１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ（ＡｂＡｍ、Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で２回洗浄した。続いて、洗浄した組織を１％ＡｂＡｍを添加したＤＭＥＭで溶解したＤｉｓｐａｓｅ Ｉ （１，０００ ＰＵ/ｍｌ）溶液に４℃で４時間浸漬した。Ｄｉｓｐａｓｅ処理後、０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）へ組織を移し、室温で２分間浸漬した後、ＰＢＳで２回洗浄した。続いて、ピンセットを用いて口腔組織から基底膜とともに口腔粘膜上皮を剥離した。剥離した上皮を０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ）に浸漬し、３７℃で２０分間処理した後、１０％ＫＣＭ培地（Ｈａｙａｓｈｉ  Ｒ，Ｙａｍａｔｏ  Ｍ，Ｔａｋａｙａｎａｇｉ  Ｈ，Ｏｉｅ  Ｙ，Ｋｕｂｏｔａ  Ａ，Ｈｏｒｉ  Ｙ，Ｏｋａｎｏ  Ｔ，Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｋ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１０；１６（４）：５５３−５６０）で懸濁した。その後、ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ処理をしたＮＩＨ／３Ｔ３を播種しておいた６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに４×１０５ｃｅｌｌｓ / ｗｅｌｌの濃度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。コンフレントに達するまで培養した口腔粘膜上皮細胞を０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液で３７℃で５分間処理し、１０％ＫＣＭ培地で再懸濁した。続いて、細胞懸濁液を９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｗｈｉｔｅ / ｃｌｅａｒ , Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｐｌａｔｅ, Ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ ｗｉｔｈ Ｌｉｄ （ＢＤ ＦａｌｃｏｎＴＭ） に１ｗｅｌｌ当たり１ / １５０量の濃度で播種し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で１４日間培養し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｔｇ  ｒａｔ由来口腔粘膜細胞シートを作製した。実験には、継代数 ５以下の口腔粘膜上皮細胞シートを用いた。【００２６】
（２）細胞シートのＡＴＰ測定方法
細胞シートのＡＴＰ量は細胞シートのＶｉａｂｉｌｉｔｙと相関することから、保存前、保存後、および再培養後の細胞シートのＡＴＰ量を測定し、細胞シートのＶｉａｂｉｌｉｔｙの指標とした。細胞シートのＡＴＰ測定方法は以下のとおりである。すなわち、９６ウェルプレート  ｗｈｉｔｅ / ｃｌｅａｒ , Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｐｌａｔｅに作製したＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｔｇ  ｒａｔ由来口腔粘膜細胞シートをＨＢＳＳで２回洗浄した後、ＨＢＳＳを１９０μｌを添加し、４℃で１時間静置した。続いて、発光マイクロプレートリーダーＣｅｎｔｒｏ  ＬＢ９６０（Berthold Technologies GmbH & Co.KG）に静置後の９６ウェルプレートを準備し、機器設定によりＬｕｃｉｆｅｒｉｎの添加（終濃度；０．１９ｍｇ／ｍｌ）、およびＡＴＰ量の測定を行った。測定は４℃で２秒間の測定を１２分間行い、発光量の最大値をＡＴＰ量の測定値とした。測定終了後、ＨＢＳＳで３回洗浄した後、各保存液を用いて細胞シートを４℃で７日間保存した。保存期間終了後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、同様にしてＡＴＰ量の測定を行った。測定後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、１０％ＫＣＭ２００μｌを添加して３７℃、５％ＣＯ２の環境下で７日間培養をした。７日間培養した後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、再び同様の方法でＡＴＰ量を測定した。【００２７】
（３）保存試験および再培養試験
基礎保存溶液として、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＵＷ、ＥＴ−ＫｙｏｔｏおよびＯｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）の６種類を用いた。保存前のＡＴＰ量を測定したＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｔｇ  ｒａｔ由来口腔粘膜細胞シートをＨＢＳＳで３回洗浄し、各基礎保存溶液３００μｌを添加し、４℃で７日間保存した。保存期間終了後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、ＡＴＰ量を測定した。測定後、ＨＢＳＳで２回洗浄し、１０％ＫＣＭ２００μｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で再培養を行った。７日間培養した後、ＡＴＰ量を測定した。【００２８】
（４）結果
結果を図１（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）は保存後７日目のＡＴＰ残存量を示し、（Ｂ）は再培養７日目のＡＴＰ残存量を示す。図１（Ａ）から明らかなように、保存後７日目のＡＴＰ残存量は、ＨＢＳＳが約５％で最も高く、以下ＵＷ、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）の順で高かった。また、図１（Ｂ）から明らかなように、再培養によりシートを再形成したのはＨＢＳＳおよびＵＷで保存した細胞シートであり、ＨＢＳＳで保存した細胞シートのほうが再培養後のＡＴＰ残存量が高く（約５０％）、ＵＷより保存性に優れていることが示された。【００２９】
〔実施例２：ルシフェラーゼトランスジェニックラット由来口腔粘膜細胞シートを用いた基礎保存溶液への添加物のスクリーニング〕
（１）実験方法
基礎保存溶液にＨＢＳＳを用い、添加物として、デキストラン４０（０．２ｇ／ｌ、２ｇ／ｌ、２０ｇ／ｌ）、コンドロイチン硫酸（０．０１％、０．１％。１％）、Ｎ−アセチルシステイン（０．１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ）、アロプリノール（０．１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ）、グルタチオン（０．３ｍＭ、３ｍＭ、３０ｍＭ）、アデノシン（０．０５ｍＭ、０．５ｍＭ、５ｍＭ）、ヒアルロン酸（０．０１％、０．１％、０．５％）、ジブチリルｃＡＭＰ（０．２ｍＭ、２ｍＭ、２０ｍＭ）、トレハロース（１２ｍＭ、１２０ｍＭ、１２００ｍＭ）およびエブセレン（１μＭ、１０μＭ、１００μＭ）の１０種類を用いた。添加物の濃度はそれぞれ括弧内に示した通りとし、それぞれｎ＝３で実験を行った。実施例１と同様にして、保存開始前と保存後７日目のＡＴＰ量を測定した。【００３０】
（２）結果
結果を図２に示した。図２から明らかなように、エブセレンを添加した場合に保存後７日目のＡＴＰ残存量の著しい増加が認められた。【００３１】
〔実施例３：ヒト由来口腔細胞シートを用いたエブセレン添加保存液の効果の検証〕
（１）細胞シートの作製
凍結保存されたＨｕｍａｎ  Ｏｒａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ（ＨＯＫ、ＳｃｉｅｎｃｅｌｌＴＭ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を３７℃で溶解し、ＣｎＴ−２４に懸濁した。続いて、Ｔ７５フラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。コンフレントに達したＨＯＫを０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで処理し、剥離した後、Ｃｎｔ−２４を添加し懸濁液とした。続いて、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去した後、ＣｎＴ−２４で再懸濁した。細胞懸濁液は、５×１０５ｃｅｌｌずつＴ７５フラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。再びコンフレントに達したＨＯＫを上記と同様の方法で剥離し、１０％ＫＣＭで細胞懸濁液とした。続いて、ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ処理をしたＮＩＨ／３Ｔ３を播種した３５ｍｍＵｐＣｅｌｌ（登録商標、ＣｅｌｌＳｅｅｄ）にＨＯＫ細胞懸濁液を３×１０５ｃｅｌｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１４日間培養し、ヒト口腔粘膜細胞シートを作製した。【００３２】
（２）保存後７日目における生細胞率の測定
保存液として、ＰＢＳ、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）、ＨＢＳＳおよびエブセレン（１０μＭ）添加ＨＢＳＳを用いた。実施例１と同様に、細胞シートを保存液に浸漬し、４℃で７日間保存した。保存前と保存後７日目に生細胞率を測定した。生細胞率の測定は、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）染色によるフローサイトメトリー法で行った。すなわち、剥離した細胞シートの１／２を０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで処理し、細胞懸濁液とした後、５％ＦＢＳを添加したＰＢＳで中和し、１２００ｒｐｍで５分間遠心した。遠心後、上清を除去し５％ＦＢＳを添加したＰＢＳ１ｍｌで細胞懸濁液とし、細胞数測定を行った。続いて７−ＡＡＤを２０μｌ添加し、室温、暗所で２０分間静置した後、フローサイトメトリーによる解析を行った。７−ＡＡＤ陰性の細胞集団を生細胞、７−ＡＡＤ陽性の細胞集団を死細胞とし、生細胞率を算出した。【００３３】
（３）保存後７日目における細胞シートの形態（ＨＥ染色）
細胞シートの１／４を１０％ホルマリン溶液に一晩浸漬した後、パラフィン包埋した。包埋した細胞シートを３μｍの厚さに切薄し、パラフィン切片を作製した。続いて、脱パラフィンを行うためにキシレンに２回、１００％エタノール、９９％エタノール、９５％エタノール、９０％エタノール、８０％エタノール、７０％エタノール、蒸留水の順に切片を浸漬した。続いて、ＴＢＳに５分間浸漬した後、蒸留水に通し、ヘマトキシリンで１０分間染色した。ヘマトキシリン染色後、流水で１０分間洗浄し、１％塩酸エタノール中で１０秒間脱色した。脱色後、ただちに流水で１分間洗浄し、蒸留水に１５分間浸漬した。続いて、エオジンで２分間染色し、流水で５分間洗浄した。切片を透徹、封入するために、１００％エタノールに５回、キシレンに３回浸漬した後、封入剤（ＭＧＫ−Ｓ、松浪硝子工業株式会社）を用いて切片を封入した。観察は、ＢＩＯＲＥＶＯ  ＢＺ−９０００顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ）で対物レンズ２０倍を使用して行った。【００３４】
（４）生細胞率の結果
図３にフローサイトメトリーのチャートを示した。また、表１に保存前および保存後の各保存液における細胞数、生細胞率および細胞シート当たりの生細胞数を示した。図３および表１から明らかなように、エブセレン添加ＨＢＳＳを用いた場合の生細胞率は９１．１％であり、エブセレンを添加していないＨＢＳＳと比較して２４％高く、エブセレン添加によって生細胞数は約４倍多く維持されることが示された。【００３５】
【表１】
2014017267.tif 000003
【００３６】
（５）ＨＥ染色の結果
結果を図４に示した。図４から明らかなように、エブセレン添加ＨＢＳＳで保存した細胞シートは厚さや形態が良好に維持されていた。エブセレンを添加していないＨＢＳＳで保存した細胞シートは、エブセレン添加ＨＢＳＳには劣るものの厚さや形態は維持されていた。一方、ＰＢＳで保存した細胞シートは形態が大きく崩れており、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）保存した細胞シートは重層上皮が脱落し、ほぼ単層になっていた。【００３７】
〔実施例４：ＰＢＳ、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）へのエブセレンの添加〕
（１）実験方法
ＰＢＳにエブセレンを添加した保存液、またはＯｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）にエブセレンを添加した保存液を用いて実施例１と同様にして、保存開始前、保存後７日目および再培養７日目のＡＴＰ量を測定した。エブセレンの濃度は１μＭ、１０μＭおよび１００μＭの３段階とした。【００３８】
（２）結果
ＰＢＳの結果を図５に、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）の結果を図６にそれぞれ示した。図５から、保存液にエブセレン添加ＰＢＳを用いた場合には、１０μＭ以上のエブセレン添加により再培養において増殖が認められた。図６から、保存液にエブセレン添加Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）を用いた場合には、１μＭ以上のエブセレン添加により再培養において増殖が認められた。これらの結果から、単独では細胞シートを保存することが難しいＰＢＳおよびＯｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）でも、エブセレンを添加することにより保存液として使用できることが明らかとなった。【００３９】
〔実施例５：ブタ由来角膜組織を用いたエブセレン添加保存液の効果の検証〕
（１）ブタ角膜の採取
ブタ眼球の角膜輪部周辺にメスで切れ目を入れた後、強膜を２〜３ｍｍ残し鋏で取り除いた。続いて、ピンセットを用いて水晶体を取り除き、さらに実態顕微鏡下で虹彩を取り除き、強角膜片とした。【００４０】
（２）保存前および１４日間保存後における組織形態の対比
保存液として、ＰＢＳ、エブセレン添加ＰＢＳ、Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）、エブセレン添加Ｏｐｔｉｓｏｌ ＧＳ（商品名）、ＨＢＳＳ、およびエブセレン添加ＨＢＳＳの６種類を用いた。エブセレン濃度はいずれも１０μＭとした。９ｍｌの保存液に採取したブタ角膜を浸漬し、４℃で１４日間保存した。１４日目に角膜を取り出し、鋏を用いて１／２に切断した。一方は、１０％ホルマリン溶液に一晩浸漬した後、パラフィン包埋し、もう一方は、凍結切片作製用包埋剤（Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ、サクラファインテックジャパン株式会社）を用いて凍結ブロックとした。【００４１】
ブタ強角膜片のＨＥ染色方法は以下の通りである。パラフィン包埋した角膜組織を３μｍの厚さに切薄し、パラフィン切片を作製した。続いて、脱パラフィンを行うためにキシレンに２回、１００％エタノール、９９％エタノール、９５％エタノール、９０％エタノール、８０％エタノール、７０％エタノール、蒸留水の順に切片を浸漬した。続いて、ＴＢＳに５分間浸漬した後、蒸留水に通し、ヘマトキシリンで１０分間染色した。ヘマトキシリン染色後、流水で１０分間洗浄し、１％塩酸エタノール中で１０秒間脱色させた。脱色後、ただちに流水で１分間洗浄し、蒸留水に１５分間浸漬した。続いて、エオジンで２分間染色し、流水で５分間洗浄した。切片を透徹、封入するために、１００％エタノールに５回、キシレンに３回浸漬した後、封入剤（ＭＧＫ−Ｓ、松浪硝子工業株式会社）を用いて切片を封入した。観察は、ＢＩＯＲＥＶＯ  ＢＺ−９０００顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ）で対物レンズ２０倍を使用して行った。【００４２】
ＺＯ−１免疫染色方法は以下の通りである。凍結包埋した角膜組織を１０μｍの厚さに切薄し、凍結切片を作製した。十分に乾燥させた後、０．１Ｍ  ＴＢＳに５分間洗浄し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄを除去した。続いて、５％ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、および０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した０．１Ｍ  ＴＢＳ（５％ＮＳＴ）に室温で１時間浸漬し、ブロッキングを行った。５％ＮＳＴを除去した後、１％ロバ血清、および０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した０．１Ｍ  ＴＢＳ（１％ＮＳＴ）にＺＯ−１、Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を終濃度５μｇ／ｍｌとなるように添加した一次抗体溶液に４℃で一晩浸漬した。続いて、０．１Ｍ  ＴＢＳで１０分間、３回洗浄した後、１％ＮＳＴにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８  Ｄｏｎｋｅｙ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を終濃度２０μｇ／ｍｌになるように添加した二次抗体溶液に室温で１時間浸漬した。二次抗体溶液を除去した後、１％ＮＳＴにｂｉｓＢｅｎｚｉｍｉｄｅ  Ｈ３３３４２  ｔｒｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した溶液に室温で１時間浸漬し、核染色した。次に、０．１Ｍ  ＴＢＳで１０分間、２回洗浄した後、封入剤（Ｍｏｕｎｔ  Ｐｅｒｍａｆｌｕｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて封入した。観察は、ハイエンド倒立蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ  ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｄ１、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用した。【００４３】
（３）結果
ＨＥ染色の結果を図７に示し、ＺＯ−１免疫染色の結果を図８に示した。図７では、ＰＢＳで保存したブタ角膜は、上皮が脱落しかけている部分が多くみられたが、エブセレン添加ＰＢＳで保存した場合は、脱落部分はみられなかった。図８から、１４日間保存後において、エブセレン添加ＨＢＳＳでは角膜上皮のタイトジャンクションの形成が保持されていた（図中、点線で囲った部分）。【００４４】
〔実施例６：ヒト由来口腔細胞シートの再培養期間におけるＮｒｆ２関連遺伝子の発現〕
ヒト由来口腔細胞シートをＨＢＳＳにエブセレン添加した保存液を用いて４℃で７日間保存し、その後１０％ＫＣＭを用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で再培養を開始した。エブセレンの濃度は１μＭ、１０μＭおよび１００μＭの３段階とし、コントロールとしてエブセレン無添加のＨＢＳＳを用いた。Ｎｒｆ２関連遺伝子として、ＮＱＯ−１およびＨＯ−１を選択した。ＮＱＯ−１は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（キノンオキシドレダクターゼ１）の略称であり、キノン類を二電子還元しヒドロキノンに変換し、他の薬物代謝酵素により抱合・排出されやすい形にする酸化還元反応を触媒する酵素である。ＮＱＯ−１は、その発現がＮｒｆ２の活性化により調節されていることが知られている。ＨＯ−１は、ヘムオキシゲナーゼの略称であり、ヘムを鉄イオン、一酸化炭素、ビリベルジンに分解する。さらに、ビリベルジンは還元酵素によりビリルビンとなるが、これらビリベルジン、およびビリルビンがフリーラジカルスカベンジャーとなり、生体を酸化ストレスから防御する。ＨＯ−１もＮＱＯ−１同様に、Ｎｒｆ２の活性化により発現が調節されていることが知られている。【００４５】
Ｌｕｃ  ｔｇ  ｒａｔ由来口腔粘膜細胞シートを１２ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに作製し、保存前、保存７日後の再培養０時間後、６時間後、および２４時間後にｍＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙ  ｐｌｕｓ  ｍｉｃｒｏ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。続いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｕｐｅｒ  ｍｉｘ  ｆｏｒ  ｑＲＴ−ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、精製したｍＲＮＡからｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡを合成し、７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ｇａｐｄｈ（Ｒｎ０１７７５７６３＿ｇ１，Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｈｍｏｘ１（Ｒｎ０１５３６９３３＿ｍ１，Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｎｑｏ１（Ｒｎ００５６６５２８＿ｍ１，Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ（ＣＴ）値を測定した。次に、ｇａｐｄｈをハウスキーピング遺伝子として、ＮＱＯ−１およびＨＯ−１の相対的な発現量をそれぞれ算出した。【００４６】
ＮＱＯ−１の結果を図９に示し、ＨＯ−１の結果を図１０に示した。エブセレンを１０μＭ以上添加したＨＢＳＳで保存した細胞シートは、再培養後６時間でＮＱＯ−１およびＨＯ−１ともに発現上昇が認められた。この結果から、エブセレンの添加によりＮｒｆ２が活性化した結果、細胞保存効果が発現していることが示唆された。【００４７】
〔実施例７：ルシフェラーゼトランスジェニックラット由来口腔粘膜細胞シートを用いたｔＢＨＱの添加ＨＢＳＳの効果〕
ＨＢＳＳにｔＢＨＱを添加した保存液を用いて実施例１と同様にして、保存後７日目のＡＴＰ量を測定した。ｔＢＨＱの濃度は１μＭ、１０μＭおよび１００μＭの３段階とした。何も添加していないＨＢＳＳを陰性対照およびエブセレン添加ＨＢＳＳ（１０μＭ）を陽性対照とした。【００４８】
結果を図１１に示した。図１１から明らかなように、ＨＢＳＳにｔＢＨＱを添加することにより、保存後７日目のＡＴＰ残存量の増加が認められた。この結果から、ｔＢＨＱもエブセレンと同様に保存液に添加することで細胞の生存率を向上させることが示された。【００４９】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
2014017267.tif 000004
【図２】
2014017267.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2014017267.tif 000009
【図７】
2014017267.tif 000010
【図８】
2014017267.tif 000011
【図９】
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【図１０】
2014017267.tif 000013
【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年5月23日(2014.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を含有することを特徴とする組織保存液。
【請求項２】
Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物が、親電子性物質であることを特徴とする請求項１に記載の組織保存液。
【請求項３】
Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物が、エブセレンおよび／またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンであることを特徴とする請求項１または２に記載の組織保存液。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
ハンクス平衡塩類溶液及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ液から選択される基礎保存溶液を含む請求項１〜３のいずれかに記載の組織保存液。
【請求項７】
Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を含有するハンクス平衡塩類溶液である請求項１〜３のいずれかに記載の組織保存液。
【請求項８】
エブセレンを含有するハンクス平衡塩類溶液である請求項１〜３のいずれかに記載の組織保存液。
【請求項９】
請求項１〜３および６〜８のいずれかに記載の組織保存液を保存対象と接触させることを特徴とする組織保存方法。
【手続補正書】
【提出日】平成28年3月9日(2016.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物を含有することを特徴とする組織保存液であって、エブセレンおよび／またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンを含有するハンクス平衡塩類溶液である組織保存液。
【請求項２】
エブセレンを含有するハンクス平衡塩類溶液である請求項１に記載の組織保存液。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の組織保存液を保存対象と接触させることを特徴とする組織保存方法。
【国際調査報告】
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