(57)【要約】  結節性硬化症では、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質量が増加していることを明らかにした。また、このｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質量の増加に伴い、スパイン形成を誘導する因子として知られている、ｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質とＣＡＳＫタンパク質との結合が阻害されることにより、スパイン形成異常が生じることも明らかにした。そして、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子特異的なｓｉＲＮＡを投与することによって、結節性硬化症におけるスパイン形成異常を抑制できること、さらには行動異常の改善及びてんかん発作の抑制もできることを見出し、スパイン形成異常を抑制するための医薬組成物及びワクチン組成物、並びにスパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法を提供した。
2014017462.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の機能を抑制する分子を有効成分として含む、スパイン形成異常を抑制するための医薬組成物。
【請求項２】
ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の機能を抑制する分子が、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１に記載の分子である、請求項１に記載の医薬組成物
（ａ）ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ、又は該ＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）抗ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質抗体
（ｃ）ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質に結合するＲＮＡ又はＤＮＡ。
【請求項３】
ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質又はその部分ペプチドを有効成分として含む、スパイン形成異常を抑制するためのワクチン組成物。
【請求項４】
下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、スパイン形成異常を抑制する活性を有する候補化合物のスクリーニング方法
（ａ）被検化合物とｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とを接触させる工程、
（ｂ）被検化合物とｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質との結合を検出する工程、
（ｃ）前記ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質と結合する化合物を選択する工程。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、スパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法
（ａ）被検化合物の存在下で、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質とを接触させる工程、
（ｂ）ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質との結合を検出する工程、
（ｃ）前記結合を抑制する化合物を選択する工程。
【請求項６】
下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、スパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法
（ａ）ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）該細胞内におけるｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の発現を検出する工程、
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の発現を減少させる化合物を選択する工程。
【請求項７】
下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、スパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法
（ａ）ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞に、被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）該細胞内における前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程、
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現を減少させる化合物を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スパイン形成異常を抑制するための医薬組成物及びワクチン組成物に関する。また、本発明は、スパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
結節性硬化症は、プリングル病とも言われ、全身に過誤腫と呼ばれる良性腫瘍が多発する母斑症である。また、中枢神経症状として、てんかん、精神遅滞、自閉症等を合併する。自閉症が遺伝的に発症することは最近報告されるようになってきたが、結節性硬化症は、最も早くから遺伝性の自閉症を起こすと言われている疾患である。【０００３】
自閉症を含む発達障害では、脳の神経細胞の微細な形態変化があることが報告されている。特に、樹状突起の棘状構造物（スパイン）は興奮性シナプスの後シナプス側を形成するが、発達障害患者ではスパインの形成不全や形態変化が認められている。結節性硬化症でも樹状突起スパインの形成異常が確認されている（非特許文献１）。スパイン形成異常は、通常の興奮性シナプス伝達に異常があることを意味しており、それが発達障害の中枢症状の原因と考えられる。【０００４】
結節性硬化症の原因遺伝子は、ＴＳＣ１遺伝子又はＴＳＣ２遺伝子であることが知られている。ＴＳＣ１タンパク質とＴＳＣ２タンパク質とは複合体を作り、Ｒｈｅｂという低分子ＧＴＰ結合タンパク質のＧＴＰａｓｅを活性化する。すなわち、Ｒｈｅｂに対するＧＴＰａｓｅ活性化因子（ＧＡＰ）として働く。しかし、ＴＳＣ１タンパク質又はＴＳＣ２タンパク質に変異があると、Ｒｈｅｂタンパク質がＧＴＰ型（活性型）となり、ｍＴＯＲタンパク質というセリンスレオニンキナーゼを活性化する。そして、ｍＴＯＲタンパク質の活性化によってタンパク質合成が亢進し、自閉症等を発症すると考えられてきた（非特許文献２）。【０００５】
しかし、非特許文献１において示されているように、また、後述の実施例においても示す通り、ｍＴＯＲ阻害薬であるラパマイシンを投与しても、結節性硬化症におけるスパイン形成異常は改善されないことが明らかになっている。【０００６】
一方、シンテニン（ｓｙｎｔｅｎｉｎ）タンパク質は、ＳＤＣＢＰ（シンデカン結合タンパク質）、ＭＤＡ９（メラノーマ分化関連遺伝子９）又はＴＡＣＩＰ１８（プロ−ＴＧＦ−α細胞質ドメイン結合タンパク質１８）とも称されるタンパク質であり、Ｃ末側に有する２つのＰＤＺドメインを介して、様々な種類のタンパク質と結合することが知られている（非特許文献３）。また、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質は、シナプスの形成・安定期等にあるニューロンにおいて多く発現していることが知られている。さらに、幼若ニューロン及び成熟ニューロンにおいて、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質を過剰発現させると、樹状突起上の小突起（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎ）の増加により、ニューロンの形態が顕著に変化することが明らかになっている（非特許文献４）。しかしながら、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質と結節性硬化症との関連の有無については明らかにされていなかった。【０００７】
このように、スパイン形成異常を引き起こす機序については未だ解明されていないため、結節性硬化症等のスパイン形成異常を伴う疾患に対する有効な治療薬等は依然として開発がなされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔａｖａｚｏｉｅ  ＳＦ．ら、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００５年、８巻、１７２７〜１７３４ページ
【非特許文献２】Ｉｎｏｋｉ  Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、３７巻、１９〜２４ページ
【非特許文献３】Ｂｅｅｋｍａｎ  ＪＭ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、２００８年、１２１巻（Ｐｔ  ９）、１３４９〜１３５５ページ
【非特許文献４】Ｈｉｒｂｅｃ  Ｈ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００５年、２８巻、４号、７３７〜７４６ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、スパイン形成異常を抑制するための医薬組成物及びワクチン組成物、並びにスパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、先ず、結節性硬化症の発症の機序において、結節性硬化症の原因となるＴＳＣ２タンパク質の下流に位置するＲｈｅｂタンパク質に着目し、該タンパク質に結合するタンパク質を探索した。その結果、Ｒｈｅｂタンパク質に結合するタンパク質として、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質を新たに見出した。さらに、本発明者らは、結節性硬化症では、活性化したＲｈｅｂタンパク質とｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質との結合が弱まり、ユビキチン−プロテアソーム系によるｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の分解が抑制され、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質量が増加していることを明らかにした。また、このｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質量の増加に伴い、スパイン形成を誘導する因子として知られている、ｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質とＣＡＳＫタンパク質との結合が阻害されることにより、スパイン形成異常が生じることも明らかにした（図１及び２  参照）。そして、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子特異的なｓｉＲＮＡを投与して、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の機能を抑制することによって、結節性硬化症におけるスパイン形成異常を抑制できること、さらには行動異常（文脈依存的恐怖弁別）の改善及びてんかん発作の抑制もできることを見出した。【００１１】
本発明は上記知見に基づくものであり、より詳しくは以下を提供するものである。
＜１＞  ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の機能を抑制する分子を有効成分として含む、スパイン形成異常を抑制するための医薬組成物。
＜２＞  ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の機能を抑制する分子が、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１に記載の分子である、＜１＞に記載の医薬組成物
（ａ）ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ、又は該ＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）抗ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質抗体
（ｃ）ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質に結合するＲＮＡ又はＤＮＡ。
＜３＞  ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質又はその部分ペプチドを有効成分として含む、スパイン形成異常を抑制するためのワクチン組成物。
＜４＞  下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、スパイン形成異常を抑制する活性を有する候補化合物のスクリーニング方法
（ａ）被検化合物とｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とを接触させる工程、
（ｂ）被検化合物とｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質との結合を検出する工程、
（ｃ）前記ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質と結合する化合物を選択する工程。
＜５＞  下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、スパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法
（ａ）被検化合物の存在下で、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質とを接触させる工程、
（ｂ）ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質との結合を検出する工程、
（ｃ）前記結合を抑制する化合物を選択する工程。
＜６＞  下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、スパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法
（ａ）ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）該細胞内におけるｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の発現を検出する工程、
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の発現を減少させる化合物を選択する工程。
＜７＞  下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、スパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法
（ａ）ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞に、被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）該細胞内における前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程、
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現を減少させる化合物を選択する工程。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、スパイン形成異常を抑制するための医薬組成物及びワクチン組成物、並びにスパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法を提供することが可能となり、ひいては、結節性硬化症等のスパイン形成異常を伴う疾患の治療及び予防が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】正常（野生型）ニューロンのスパイン形成における分子機構を示す概略図である。図中、「ｓｙｎｔ」はｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質を示し、「ｓｄｃ２」はｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質を示し、「Ｕｂ」はユビキチンを示す（図２においても同じ）。
【図２】結節性硬化症（ＴＳＣ２＋／−）ニューロンのスパイン形成異常における分子機構を示す概略図である。
【図３】野生型及びＴＳＣ２＋／−由来のニューロンを、ＥＧＦＰ及び抗ｖＧｌｕｔ１（小胞グルタミン酸輸送体）抗体にて染色して、蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。なお、ＥＧＦＰはニューロン全体を染色し、抗ｖＧｌｕｔ１抗体は興奮性シナプスのマーカー分子（ｖＧｌｕｔ１）を特異的に標識する。図中、白い矢印は樹状突起スパインが形成されていることを示す（以下、図７、１４、１７、２４、２７、３１及び４３において同じ）。また、図中のスケールバーは５μｍであることを示す（以下、図７、１４、１７、２４、２７、３１、３４、４３及び４６において同じ）。
【図４】野生型及びＴＳＣ２＋／−由来のニューロンにおける、樹状突起上の突起の長さの累積確率を示すグラフである。
【図５】ＴＳＣ２＋／−由来のニューロンにおける、スパインシナプス密度の相対値を示すグラフである。該相対値は、野生型由来のニューロンにおけるスパインシナプス密度を１００％とした際の値である。
【図６】ＴＳＣ２＋／−由来のニューロンにおける、シャフトシナプス密度の相対値を示すグラフである。該相対値は、野生型由来のニューロンにおけるシャフトシナプス密度を１００％とした際の値である。
【図７】１００ｎＭ  ラパマイシン又はＤＭＳＯ存在下にて培養したＴＳＣ２＋／−由来のニューロンを、ＥＧＦＰ及び抗ｖＧｌｕｔ１抗体にて染色し、蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。
【図８】１００ｎＭ  ラパマイシン又はＤＭＳＯ存在下にて培養したＴＳＣ２＋／−由来のニューロンにおける、樹状突起上の突起の長さの累積確率を示すグラフである。
【図９】１００ｎＭ  ラパマイシン存在下にて培養したＴＳＣ２＋／−由来のニューロンと、ＤＭＳＯ存在下にて培養したＴＳＣ２＋／−由来のニューロンとにおける、各樹状突起１０μｍあたりのスパインシナプス密度を示すグラフである。
【図１０】ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質及びその変異体の構造を示す概略図である。
【図１１】ＧＳＴ沈降法により、ｓｙｎｔｅｎｉｎ（ｓｙｎｔ）タンパク質と、活性型Ｒｈｅｂ（ＲｈｅｂＱ６４Ｖ）タンパク質又は不活性型Ｒｈｅｂ（ＲｈｅｂＤ６０Ｉ）タンパク質との結合を解析した結果を示す写真である。
【図１２】ＧＳＴ沈降法により、ｓｙｎｔｅｎｉｎ（ｓｙｎｔ）タンパク質と、ＲｈｅｂＤ６０Ｉタンパク質又はそのエフェクタードメイン変異体（図中「Ｔ３８Ｍ／Ｄ６０Ｉ」若しくは「Ｉ３９Ｋ／Ｄ６０Ｉ」）との結合を解析した結果を示す写真である。
【図１３】ＧＳＴ沈降法により、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質（図中、「ｓｙｎｔ」）又は図１０に示すｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質変異体と、Ｒｈｅｂタンパク質との結合を解析した結果を示す写真である。
【図１４】ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子を過剰発現させた野生型由来のニューロン（図中「ｓｙｎｔ」）を、ＥＧＦＰ及び抗ｖＧｌｕｔ１抗体にて染色して、蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。また、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子を過剰発現させていない野生型由来のニューロン（図中「対照」）の観察結果も示す。
【図１５】ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子を過剰発現させた野生型由来のニューロン（図中「ｓｙｎｔ」）における、樹状突起上の突起の長さの累積確率を示すグラフである。また、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子を過剰発現させていない野生型由来のニューロン（図中「対照」）における結果も示す。
【図１６】ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子を過剰発現させた野生型由来のニューロン（図中「ｓｙｎｔ」）と、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子を過剰発現させていない野生型由来のニューロン（図中「対照」）とにおける、各樹状突起１０μｍあたりのスパインシナプス数を示すグラフである。
【図１７】ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡを導入したＴＳＣ２＋／−由来のニューロン（図中「ｓｙｎｔ  ｓｉＲＮＡ」）と、非特異的ｓｉＲＮＡを導入したＴＳＣ２＋／−由来のニューロン（図中「非特異的ｓｉＲＮＡ」）と、ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡ及びＥＣＦＰ−ｓｙｎｔｅｎｉｎを導入したＴＳＣ２＋／−由来のニューロン（図中「ｓｙｎｔ  ｓｉＲＮＡ＋ＥＣＦＰ−ｓｙｎｔ＊」）とを、ＥＧＦＰ及び抗ｖＧｌｕｔ１抗体にて染色して、蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。図中の「ＥＣＦＰ−ｓｙｎｔ」に付されている「＊」は、ｓｙｎｔ  ｓｉＲＮＡの標的配列に縮重変異が導入されているため、ｓｙｎｔ  ｓｉＲＮＡに対して抵抗性を有している、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質又はその変異体をコードする核酸であることを表わす（図１９、２４〜２６においても同じ）。
【図１８】ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡを導入したＴＳＣ２＋／−由来のニューロン（図中「ｓｙｎｔ  ｓｉＲＮＡ」）と、非特異的ｓｉＲＮＡを導入したＴＳＣ２＋／−由来のニューロン（図中「非特異的ｓｉＲＮＡ」）と、ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡ及びＥＣＦＰ−ｓｙｎｔｅｎｉｎを導入したＴＳＣ２＋／−由来のニューロン（図中「ｓｙｎｔ  ｓｉＲＮＡ＋ｓｙｎｔ＊」）とにおける、樹状突起上の突起の長さの累積確率を示すグラフである。
【図１９】ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡを導入したＴＳＣ２＋／−由来のニューロン（図中「ｓｙｎｔ  ｓｉＲＮＡ」）と、非特異的ｓｉＲＮＡを導入したＴＳＣ２＋／−由来のニューロン（図中「非特異的ｓｉＲＮＡ」）と、ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡ及びＥＣＦＰ−ｓｙｎｔｅｎｉｎを導入したＴＳＣ２＋／−由来のニューロン（図中「ｓｙｎｔ  ｓｉＲＮＡ＋ＥＣＦＰ−ｓｙｎｔ＊」）とにおける、各樹状突起１０μｍあたりのスパインシナプス数を示すグラフである。図中、「＊＊＊」はｐ＜０．００１であることを示す。
【図２０】野生型ラットの海馬及びＴＳＣ２＋／−ラットの海馬におけるｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の量（図中、「ｓｙｎｔ」）を、ウェスタンブロット法により解析した結果を示す写真である。図中、「１」は野生型ラットの海馬についての結果を示し、「２」はＴＳＣ２＋／−ラットの海馬についての結果を示す。
【図２１】ＴＳＣ２＋／−ラットの海馬におけるｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質量の相対値を示すグラフである。該相対値は、野生型ラットの海馬におけるｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質量を１００％とした際の値である。図中、「＊＊」はｐ＜０．０１であることを示す。
【図２２】不活性型Ｒｈｅｂ（ＲｈｅｂＤ６０Ｉ）タンパク質又は活性型Ｒｈｅｂ（ＲｈｅｂＱ６４Ｖ）タンパク質の存在下において、ユビキチン化されたｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質（Ｕｂ−ｓｙｎｔ）の量を解析した結果を示す写真である。なお、このユビキチン化アッセイに用いた、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質にはＦＬＡＧタグが融合してある。図中、「１」及び「２」は抗ＦＬＡＧ抗体（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ）にて免疫沈降（ＩＰ）を行い、沈降してきたタンパク質を抗ＦＬＡＧ抗体（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ）を用いたウェスタンブロット法（ＩＢ）にて解析した結果を示す。「３」及び「４」は抗ＦＬＡＧ抗体にて免疫沈降（ＩＰ）を行い、沈降してきたタンパク質を抗ポリユビキチン抗体（ａｎｔｉ−ｐｏｌｙ−Ｕｂ）を用いたウェスタンブロット法（ＩＢ）にて解析した結果を示す。
【図２３】不活性型Ｒｈｅｂ（ＲｈｅｂＤ６０Ｉ）タンパク質及び活性型Ｒｈｅｂ（ＲｈｅｂＱ６４Ｖ）タンパク質に関し、ユビキチン化されたＲｈｅｂタンパク質（Ｕｂ−Ｒｈｅｂ）の量を解析した結果を示す写真である。なお、このユビキチン化アッセイに用いた、Ｒｈｅｂタンパク質にはＥＧＦＰタグが融合してある。図中、「１」及び「２」は抗ＧＦＰ抗体（ａｎｔｉ−ＧＦＰ）にて免疫沈降（ＩＰ）を行い、沈降してきたタンパク質を抗ＧＦＰ抗体（ａｎｔｉ−ＧＦＰ）を用いたウェスタンブロット法（ＩＢ）にて解析した結果を示す。「３」及び「４」は抗ＧＦＰ抗体にて免疫沈降（ＩＰ）を行い、沈降してきたタンパク質を抗ポリユビキチン抗体（ａｎｔｉ−ｐｏｌｙ−Ｕｂ）を用いたウェスタンブロット法（ＩＢ）にて解析した結果を示す。
【図２４】ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子又はその変異体（図１０  参照）と、ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡ（ｓｙｎｔ  ｓｉＲＮＡ）とを導入した、野生型由来のニューロンを、ＥＧＦＰ及び抗ｖＧｌｕｔ１抗体にて染色して、蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。
【図２５】ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子又はその変異体（図１０  参照）と、ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡとを導入した、野生型由来のニューロンにおける、樹状突起上の突起の長さの累積確率を示すグラフである。
【図２６】ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子又はその変異体（図１０  参照）と、ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡとを導入した、野生型由来のニューロンにおける、各樹状突起１０μｍあたりのスパインシナプス数を示すグラフである。図中、「＊＊＊」はｐ＜０．００１であることを示す。
【図２７】ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡ（ｓｙｎｔ  ｓｉＲＮＡ）及びｓｙｎｄｅｃａｎ−２  ｓｉＲＮＡ（ｓｄｃ２  ｓｉＲＮＡ）を導入したＴＳＣ２＋／−由来のニューロンと、ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡ及び非特異的ｓｉＲＮＡを導入したＴＳＣ２＋／−由来のニューロンとを、ＥＧＦＰ及び抗ｖＧｌｕｔ１抗体にて染色して、蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。
【図２８】ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡ及びｓｙｎｄｅｃａｎ−２  ｓｉＲＮＡを導入したＴＳＣ２＋／−由来のニューロン（図中、「ｓｄｃ２  ｓｉＲＮＡ」）と、ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡ及び非特異的ｓｉＲＮＡを導入したＴＳＣ２＋／−由来のニューロン（図中、「非特異的ｓｉＲＮＡ」）とにおける、樹状突起上の突起の長さの累積確率を示すグラフである。
【図２９】ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡ及びｓｙｎｄｅｃａｎ−２  ｓｉＲＮＡを導入したＴＳＣ２＋／−由来のニューロン（図中、「ｓｄｃ２  ｓｉＲＮＡ」）と、ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡ及び非特異的ｓｉＲＮＡを導入したＴＳＣ２＋／−由来のニューロン（図中、「非特異的ｓｉＲＮＡ」）とにおける、各樹状突起１０μｍあたりのスパインシナプス数を示すグラフである。図中、「＊＊＊」はｐ＜０．００１であることを示す。
【図３０】ＧＳＴ沈降法により、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質（図中、「ＦＬＡＧ−ｓｙｎｔ」）の量を増やした際の、一定量のＣＡＳＫタンパク質（図中、「ＦＬＡＧ−ＣＡＳＫ」）に結合するｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質（図中、「ＧＳＴ−ｓｄｃ２  ＩＣ」）の量を解析した結果を示す写真である。
【図３１】ＣＡＳＫタンパク質の量を一定にし、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の量を増やした野生型由来のニューロンを、ＥＧＦＰ及び抗ｖＧｌｕｔ１抗体にて染色して、蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。図中の数値は、リポフェクション法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００を使用）により、野生型ラット由来の初代培養ニューロン（培養後１１日目）に導入された、ＥＧＦＰ−ＣＡＳＫ融合タンパク質をコードするプラスミド（図中、「ＣＡＳＫ」）及びＥＣＦＰ−ｓｙｎｔｅｎｉｎ融合タンパク質をコードするプラスミド（図中、「ｓｙｎｔ」）の質量（μｇ）を各々示している。
【図３２】ＣＡＳＫタンパク質の量を一定にし、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の量を増やした野生型由来のニューロンにおける、各樹状突起１０μｍあたりのスパインシナプス数を示すグラフである。図中、「＊＊＊」はｐ＜０．００１であることを示す。また、「ｓｙｎｔ０」は、ＣＡＳＫタンパク質１μｇのみ導入されている野生型由来のニューロンについての結果を示し、「ｓｙｎｔ０．５」は、ＣＡＳＫタンパク質１μｇに対して０．５μｇのｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質が導入されている野生型由来のニューロンについての結果を示し、「ｓｙｎｔ１」は、ＣＡＳＫタンパク質１μｇに対して１μｇのｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質が導入されている野生型由来のニューロンについての結果を示す。
【図３３】ｄｉｏｌｉｓｉｔｉｃ法を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏ樹状突起スパインの可視化の方法を示す、写真である。
【図３４】野生型ラット及びＴＳＣ２＋／−ラットの海馬を、ｄｉｏｌｉｓｉｔｉｃ法によりＤｉＩ標識し、ニューロンの形態を観察した結果を示す、顕微鏡写真である。
【図３５】野生型ラット及びＴＳＣ２＋／−ラットの海馬における、樹状突起上の突起の幅の累積確率を示すグラフである。
【図３６】野生型ラット及びＴＳＣ２＋／−ラットの海馬における、樹状突起上の突起の長さの累積確率を示すグラフである。
【図３７】ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡを導入したＴＳＣ２＋／−ラットの海馬（図中、「ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡ」）と、非特異的ｓｉＲＮＡを導入したＴＳＣ２＋／−ラットの海馬（図中、「非特異的ｓｉＲＮＡ」）と、ｓｉＲＮＡを導入していないＴＳＣ２＋／−ラットの海馬（図中、「手術のみ」）とを、ｄｉｏｌｉｓｉｔｉｃ法によりＤｉＩ標識し、ニューロンの形態を観察した結果を示す、顕微鏡写真である。
【図３８】ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡを導入したＴＳＣ２＋／−ラットの海馬（図中、「ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡ」）と、非特異的ｓｉＲＮＡを導入したＴＳＣ２＋／−ラットの海馬（図中、「非特異的ｓｉＲＮＡ」）と、ｓｉＲＮＡを導入していないＴＳＣ２＋／−ラットの海馬（図中、「手術のみ」）とにおける、樹状突起上の突起の幅の累積確率を示すグラフである。
【図３９】ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡを導入したＴＳＣ２＋／−ラットの海馬（図中、「ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡ」）と、非特異的ｓｉＲＮＡを導入したＴＳＣ２＋／−ラットの海馬（図中、「非特異的ｓｉＲＮＡ」）と、ｓｉＲＮＡを導入していないＴＳＣ２＋／−ラットの海馬（図中、「手術のみ」）とにおける、樹状突起上の突起の長さの累積確率を示すグラフである。
【図４０】ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡを脳室内に持続注入したＴＳＣ２＋／−ラットに対して行った文脈依存的恐怖弁別試験の概略を示す図である。
【図４１】ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡを脳室内に持続注入したＴＳＣ２＋／−ラット（ＴＳＣ２＋／−  ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡ）に対して行った文脈依存的恐怖弁別試験の結果を示すグラフである。野生型ラット（ＷＴ）と、ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡを注入していないＴＳＣ２＋／−ラット（ＴＳＣ２＋／−）とについての文脈依存的恐怖弁別試験の結果も、対照として示す。
【図４２】ｓｙｎｔｅｎｉｎ＋／−マウスの作製スキームを示す概略図である。
【図４３】野生型マウス（ＷＴ）、ＴＳＣ２＋／−マウス（Ｔｓｃ２＋／−）及びＴＳＣ２＋／−；ｓｙｎｔｅｎｉｎ＋／−マウス（Ｔｓｃ２＋／−；ｓｙｎｔ＋／−）由来の海馬ニューロンを、ＥＧＦＰ及び抗ｖＧｌｕｔ１（小胞グルタミン酸輸送体）抗体にて染色して、蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。
【図４４】野生型マウス（ＷＴ）、ＴＳＣ２＋／−マウス（Ｔｓｃ２＋／−）及びＴＳＣ２＋／−；ｓｙｎｔｅｎｉｎ＋／−マウス（Ｔｓｃ２＋／−；ｓｙｎｔ＋／−）由来の海馬ニューロンにおける、スパインシナプス密度の相対値を示すグラフである。該相対値は、野生型マウス由来のニューロンにおけるスパインシナプス密度を１００％とした際の値である。図中、「＊＊＊」はｐ＜０．００１であることを示す。
【図４５】野生型マウス（ＷＴ）、ＴＳＣ２＋／−マウス（Ｔｓｃ２＋／−）及びＴＳＣ２＋／−；ｓｙｎｔｅｎｉｎ＋／−マウス（Ｔｓｃ２＋／−；ｓｙｎｔ＋／−）由来の海馬ニューロンにおける、シャフトシナプス密度の相対値を示すグラフである。該相対値は、野生型由来のニューロンにおけるシャフトシナプス密度を１００％とした際の値である。図中、「＊＊＊」はｐ＜０．００１であることを示す。
【図４６】野生型マウス（ＷＴ）、ＴＳＣ２＋／−マウス（Ｔｓｃ２＋／−）及びＴＳＣ２＋／−；ｓｙｎｔｅｎｉｎ＋／−マウス（Ｔｓｃ２＋／−；ｓｙｎｔ＋／−）由来の海馬を、ｄｉｏｌｉｓｉｔｉｃ法によりＤｉＩ標識し、ニューロンの形態を観察した結果を示す、顕微鏡写真である。
【図４７】野生型マウス（ＷＴ）、ＴＳＣ２＋／−マウス（Ｔｓｃ２＋／−）及びＴＳＣ２＋／−；ｓｙｎｔｅｎｉｎ＋／−マウス（Ｔｓｃ２＋／−；ｓｙｎｔ＋／−）由来の海馬ニューロンにおける、各樹状突起１μｍあたりの突起数を示すグラフである。
【図４８】野生型マウス（ＷＴ）、ＴＳＣ２＋／−マウス（Ｔｓｃ２＋／−）及びＴＳＣ２＋／−；ｓｙｎｔｅｎｉｎ＋／−マウス（Ｔｓｃ２＋／−；ｓｙｎｔ＋／−）由来の海馬における、樹状突起上の突起の幅の累積確率を示すグラフである。
【図４９】野生型マウス（ＷＴ）、ＴＳＣ２＋／−マウス（Ｔｓｃ２＋／−）及びＴＳＣ２＋／−；ｓｙｎｔｅｎｉｎ＋／−マウス（Ｔｓｃ２＋／−；ｓｙｎｔ＋／−）由来の海馬における、樹状突起上の突起の長さの累積確率を示すグラフである。
【図５０】野生型マウス（ＷＴ）、ＴＳＣ２＋／−マウス（Ｔｓｃ２＋／−）及びＴＳＣ２＋／−；ｓｙｎｔｅｎｉｎ＋／−マウス（Ｔｓｃ２＋／−；ｓｙｎｔ＋／−）に対して行った文脈依存的恐怖弁別試験の結果を示すグラフである。
【図５１】野生型マウス（ＷＴ）、ＴＳＣ２＋／−マウス（ｔｓｃ）及びＴＳＣ２＋／−；ｓｙｎｔｅｎｉｎ＋／−マウス（ｔｓｃ；ｓｙｎ）にペンチレンテトラゾールを注射し、誘導されたてんかん発作の強度を示すグラフである。図中、横軸にペンチレンテトラゾールの投与回数を示し、縦軸に発作スコア（てんかん発作の強度）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜スパイン形成異常を抑制するための医薬組成物＞
本発明は、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の機能を抑制する分子を有効成分として含む、スパイン形成異常を抑制するための医薬組成物を提供する。
【００１５】
本発明において「スパイン」とは、興奮性シナプスの後シナプス側を形成する、樹状突起上の棘状構造物を意味する。また「スパイン形成異常」とは、スパインの形状、大きさ、数が、正常（野生型）ニューロンと比較して異なっている状態を意味し、例えば、スパインの形成不全（例えば、スパインになる前の未熟な形態であるフィロポディアからスパインへの移行の停止）が挙げられる。
【００１６】
本発明における「遺伝子の機能の抑制」は、遺伝子の発現の抑制（転写の抑制、翻訳の抑制）並びに、遺伝子の翻訳産物（タンパク質）の活性の抑制の双方を含む意である。
【００１７】
本発明において、機能の抑制の対象となる「ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子」は、ヒト由来のものであれば典型的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（配列番号：１に記載の塩基配列からなる遺伝子）である。マウス由来のものであれば典型的には、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿０５８０８７．１で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿０１６８０７．１で特定される塩基配列からなる遺伝子）である。ラット由来のものであれば、典型的には、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿１１４１９２．１で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿０３１９８６．１で特定される塩基配列からなる遺伝子）である。しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異などにより、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。従って、本発明においては、このような天然の変異体も、機能の抑制の対象となりうる。
【００１８】
なお、ＢＬＡＳＴＰを用いたアミノ酸配列レベルでの相同性解析によれば、ラット由来のｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質と、ヒト由来のｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質との相同性は８９％と高く、特にＰＤＺ１及び２ドメインやＣ末端側は極めて高度に保存されている。また、後述の実施例において示す通り、本発明においてｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質と結合することが明らかになったＲｈｅｂタンパク質に関しても、ラット由来のＲｈｅｂタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿０３７３４８．１で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質）と、ヒト由来のＲｈｅｂタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００５６０５．１で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質）との相同性は９９％と極めて高い。さらに、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質と結合するｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質に関しても、ラット由来のｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿０３７２１４．１で特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質）と、ヒト由来のｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質（配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）との相同性は８１％と高い。このように、図１及び２に示す、ＴＳＣタンパク質からｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質に至る、スパイン形成に関与するシグナル伝達物質は、ラットとヒトとにおいて高度に保存されている。
【００１９】
「ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の機能を抑制する分子」としては、例えば、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ又は該ＲＮＡをコードするＤＮＡ、抗ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質抗体、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質に結合するＲＮＡ又はＤＮＡが挙げられる。
【００２０】
なお、後述の実施例において示す通り、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子に対するｓｉＲＮＡによってスパインの形成異常が抑制されること並びに行動異常（文脈依存的恐怖弁別）も改善されることが明らかになり、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の機能の抑制と、スパインの形成異常等の抑制との間に因果関係があることも明らかになった。従って、ｓｉＲＮＡのみならず、抗ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質抗体等、前記遺伝子の機能を抑制する分子を用いることにより、スパインの形成異常等を抑制できる。
【００２１】
−ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ−
スパイン形成異常を抑制するための医薬組成物の有効成分として含有されるｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ又は該ＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質をコードする遺伝子の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ）又は該ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡが挙げられる。
【００２２】
ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）のいずれかの領域に対するアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスＤＮＡと、該ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードしたセンスＤＮＡを含み、該アンチセンスＤＮＡ及び該センスＤＮＡより、それぞれアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡを発現させることができる。また、これらのアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡよりｄｓＲＮＡを作製することができる。
【００２３】
ｄｓＲＮＡの発現システムをベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡを発現させる場合がある。同一のベクターからアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスＤＮＡ及びセンスＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌIII系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットとセンスＲＮＡ発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入する構成である。
【００２４】
また、異なる鎖上に対向するように、アンチセンスＤＮＡとセンスＤＮＡとを逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスＲＮＡコード鎖とセンスＲＮＡコード鎖とが対となった一つの二本鎖ＤＮＡ（ｓｉＲＮＡコードＤＮＡ）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとを発現し得るようにプロモーターを対向して備える。この場合には、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスＲＮＡコード鎖、センスＲＮＡコード鎖）の３’末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、Ａ（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモーターの種類は異なっていることが好ましい。
【００２５】
また、異なるベクターからアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスＤＮＡ及びセンスＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌIII系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットとセンスＲＮＡ発現カセットとをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させる構成である。なお、上記ｄｓＲＮＡは、当業者であればそれぞれの鎖を化学合成して調製することも可能である。
【００２６】
本発明に用いるｄｓＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｐｉｎ  ＲＮＡ）が好ましい。ｓｉＲＮＡは、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡを意味する。また、ｓｈＲＮＡは、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとがスぺーサー配列を配置した１本鎖のＲＮＡであり、細胞内等でセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとの間で水素結合が生じ、スぺーサー配列がヘアピン構造となるもので、該ヘアピン構造が細胞内で切断されることにより、ｓｉＲＮＡとなり得るものを意味する。
【００２７】
さらに、標的遺伝子の発現を抑制することができ、かつ、毒性を示さなければ、その鎖長に特に制限はない。ｄｓＲＮＡの鎖長は、例えば、１５〜４９塩基対であり、好適には１５〜３５塩基対であり、さらに好適には２１〜３０塩基対である。
【００２８】
ｄｓＲＮＡ又は該ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的遺伝子の塩基配列と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、ＢＬＡＳＴプログラムにより決定することができる。
【００２９】
本発明に用いるｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質をコードする遺伝子の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡとしては、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の発現に対する抑制効果の高さから、ヒト由来のｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子に関しては、配列番号：１に記載の８９４〜９１８位の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なｄｓＲＮＡであることが好ましい。
【００３０】
本発明における「ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ」の他の態様としては、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡ又は該ＲＮＡをコードするＤＮＡ（アンチセンスＤＮＡ）が挙げられる。
【００３１】
アンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡが標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、及び核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等が挙げられる。これらは、転写、スプライシング、又は翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する（平島及び井上、「新生化学実験講座２  核酸IV  遺伝子の複製と発現」、日本生化学会編，東京化学同人、１９９３年、３１９〜３４７ページ）。本発明で用いられるアンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡは、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、標的遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域又は３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＲＮＡ又はＤＮＡも、本発明で利用されるアンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。
【００３２】
アンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡは、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の配列情報を基にホスホロチオエート法（Ｓｔｅｉｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９８８年、１６巻、３２０９〜３２２１ページ）等の記載に基づき調製することが可能である。
【００３３】
アンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡの配列は、ｓｙｎｔｅｎｉｎの転写産物と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。アンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の相補性を有する。効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡの長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
【００３４】
本発明における「ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡ」の他の態様としては、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡ、又は該ＲＮＡをコードするＤＮＡが挙げられる。リボザイムには、グループIイントロン型や、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠及び大塚栄子、蛋白質核酸酵素、１９９０年、３５巻、２１９１ページ）。
【００３５】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５のＣ１５の３’側を切断するが、活性にはＵ１４が９位のＡと塩基対を形成することが重要とされ、１５位の塩基はＣの他にＡ又はＵでも切断されることが示されている。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的になるように設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵ又はＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することが可能である（Ｋｏｉｚｕｍｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９８８年、２３９巻、２８５〜２８８ページ、小泉誠及び大塚栄子、蛋白質核酸酵素、１９９０年、３５巻、２１９１ページ、Ｋｏｉｚｕｍｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９８９年、１７巻、７０５９ページ）。
【００３６】
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ，Ｎａｔｕｒｅ、１９８６年、３２３巻、３４９ページ）。このリボザイムも、標的特異的なＲＮＡ切断を起こすように設計できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ及びＳａｓａｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１９９２年、１９巻、６７５１ページ、菊池洋，化学と生物、１９９２年、３０巻、１１２ページ）。標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、神経細胞等にて転写されるようにプロモーター及び転写終結配列に連結される。このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる（Ｙｕｙａｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９２年、１８６巻、１２７１ページ）。
【００３７】
−抗ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質抗体−
抗ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、また、抗体の機能的断片であってもよい。また、「抗体」には、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスが含まれる。抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体などが挙げられる。
【００３８】
また、抗ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及び、これら抗体の機能的断片が含まれる。本発明の抗体を治療薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体が望ましい。
【００３９】
本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平８−２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。また、本発明において「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、公知である（例えば、ＥＰ２３９４００、ＥＰ１２５０２３、ＷＯ９０／０７８６１、ＷＯ９６／０２５７６  参照）。本発明において、「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。ヒト抗体の作製においては、免疫することで、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用することが可能である。ヒト抗体の作製手法は、公知である（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，１９９３年，３６２巻，２５５〜２５８ページ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９５年，１３巻，６５〜９３ページ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９１年，２２２巻，５８１〜５９７ページ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９７年，１５巻，１４６〜１５６ページ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００年，９７巻、７２２〜７２７ページ、特開平１０−１４６１９４号公報、特開平１０−１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１−２０６３８７号公報、特表平８−５０９６１２号公報、特表平１１−５０５１０７号公報）。
【００４０】
また、抗ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質抗体には、望ましい活性（ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質への結合活性、スパイン形成異常を抑制する活性、及び／又は他の生物学的特性等）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。アミノ酸配列変異体は、抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、又はペプチド合成によって作製することができる。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖又は軽鎖の定常領域であってもよく、さらに、可変領域（フレームワーク領域及びＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，２００５年、１０２巻、８４６６〜８４７１ページ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２００８年、２１巻、４８５〜４９３ページ、ＷＯ２００２／０５１８７０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００５年、２８０巻、２４８８０〜２４８８７ページ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，、２００８年、２１巻、３４５〜３５１ページ）。
【００４１】
改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。アミノ酸配列変異体は、抗原への結合活性が対象抗体と同等であることが好ましい。抗原への結合活性は、例えば、フローサイトメーター、ＥＬＩＳＡ，ウェスタンブロッティング、免疫沈降法等を用いて解析することにより評価することができる。
【００４２】
さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。
【００４３】
また、本発明の抗体としては、前述の通り、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質を特異的に認識するものであればよいが、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質との結合を阻害して、ｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質とＣＡＳＫタンパク質との相互作用を維持することにより、スパイン形成異常を抑制できるという観点から、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質のＰＤＺ２ドメインを特異的に認識する抗体が好ましい。なお、ＰＤＺ２ドメインは、ヒト由来のｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質（配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）においては、１９６〜２６９番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００４４】
−ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質に結合するＲＮＡ又はＤＮＡ−
スパイン形成異常を抑制するための医薬組成物の有効成分として含有されるｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質に結合するＲＮＡ又はＤＮＡは、典型的には核酸アプタマーである。
【００４５】
本発明の核酸アプタマーとしては、生体内における安定性が高いという観点から、ＤＮＡが好ましい。さらに、本発明の核酸アプタマーは、同観点から、核酸分子構造中のリン酸骨格に修飾を加え、生体内における安定性を増大させた核酸分子を含んでもよい。かかるリン酸骨格としては、例えば、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホラミドチオエート結合、ホスホラミデート結合、ホスホルジアミデート結合、メチルホスホネート結合を含むリン酸骨格が挙げられる。
【００４６】
本発明の核酸アプタマーは、構造的特徴として、少なくとも１つのループ構造、デオキシグアノシン（グアノシン、グアノシンアナログを含む）を多く包含する一次構造、又は、デオキシグアノシンが４量体クラスター構造（いわゆる「Ｇカルテット構造」）を含んでいても良い。また、本発明の核酸アプタマーは、二本鎖からなる核酸及び一本鎖からなる核酸のいずれでもよいが、一本鎖からなる核酸が好ましい。
【００４７】
本発明の核酸アプタマーの長さは、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質に特異的に結合することができる塩基数を有していれば、特に制限はないが、例えば、１０〜２００塩基、好ましくは、２０〜１５０塩基、より好ましくは３０〜１５０塩基、さらに好ましくは５０〜１５０塩基であり、具体的には５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０及び１５０塩基のアプタマーが挙げられる。
【００４８】
また、本発明の核酸アプタマーとしては、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質と特異的に結合するものであればよいが、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質との結合を阻害して、ｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質とＣＡＳＫタンパク質との相互作用を維持することにより、スパイン形成異常を抑制できるという観点から、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質のＰＤＺ２ドメインと特異的に結合する核酸が好ましい。
【００４９】
本発明の核酸アプタマーは、当業者であれば公知の手法を適宜選択し、製造することができる。公知の手法としては、例えば、インビトロセレクション法（ＳＥＬＥＸ法）（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９０年、２４９巻、５０５〜５１０ページ、Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．ら、Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９１年、２巻、７５〜８６ページ、Ｇｏｌｄ，Ｌ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９５年、６４巻、７６３〜７９７ページ、Ｕｐｈｏｆｆ，Ｋ．Ｗ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、１９９６年、６巻、２８１〜２８８ページ）が挙げられる。
【００５０】
インビトロセレクション法は、ランダムな配列を含む核酸のプールから所望のタンパク質に対して親和性を有する核酸を選択し、親和性を持たない核酸を排除する方法のことである。
【００５１】
本発明の核酸アプタマーをインビトロセレクション法にて製造する場合に、具体的には、先ず、２０〜３００塩基、好ましくは３０〜１５０塩基、より好ましくは３０〜１００塩基程度のランダムな塩基配列を含む核酸を調製する。該核酸は、直接合成してもよく、ＲＮＡ分子の場合には、まずＤＮＡ分子を合成した後、転写反応により調製してもよい。該核酸がＤＮＡの場合は、その両端にＰＣＲ増幅を可能にするためのプライマーとなる塩基配列を有することが好ましい。プライマー結合配列部分は、ＰＣＲ増幅後にプライマー部分を制限酵素によって切除するための適当な制限酵素認識配列を有するように調製してもよい。プライマー結合配列部分の長さは、特に制限はないが、通常２０〜５０、好ましくは２０〜３０塩基長である。また、該プライマーの５’側末端にＰＣＲ増幅後のＤＮＡを電気泳動等で分離するために、放射物質、蛍光物質等を用いて標識を行ってもよい。さらに、ＲＮＡを調製する場合には、５’末端側のプライマーに適当なプロモーター、例えば、Ｔ７プロモーター配列を有するＤＮＡ等を用いて、ＤＮＡ分子からＲＮＡ分子へ転写して調製してもよい。
【００５２】
次に、ＰＣＲ増幅によって得られたランダムな核酸と、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質又はその部分ペプチドとを混合し、インキュベートする。インキュベート後、混合物を電気泳動にかけて、核酸とｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質との複合体と、遊離核酸とを分離する。そして、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質と複合体を形成している核酸を公知の手法に従って抽出する。回収された核酸がＤＮＡの場合には、さらにＰＣＲ増幅を行い、増幅されたＤＮＡを熱変性する等して、一本鎖からなるＤＮＡとして回収する。回収された核酸がＲＮＡの場合には、該ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡとしたのち、ＰＣＲ増幅し、増幅されたＤＮＡを転写してＲＮＡを調製する。また、前述の核酸とｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とを混合する工程、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質と結合した核酸を分離する工程、ＰＣＲ増幅（ＲＮＡの場合には、逆転写後増幅）の工程、増幅された核酸を再びｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質との結合に使用する工程からなる操作を、数回繰り返し行う。得られた核酸の配列決定を、公知の方法に従い行うことができる。
【００５３】
また、本発明の核酸アプタマーの製造は、前記操作により得られた核酸の配列に基づき、化学合成、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いたインビトロでの転写、ＰＣＲによる増幅により行ってもよい。
【００５４】
本発明の医薬組成物は、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の機能を抑制することにより、スパイン形成異常を抑制することができるため、スパイン形成異常を伴う疾患、例えば、結節性硬化症（プリングル病）、てんかん（結節性硬化症における難治性てんかん等）、精神遅滞、自閉症、アルツハイマー病等の治療又は予防のために投与される医薬組成物として好適に用いることができる。
【００５５】
本発明の医薬組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経口的又は非経口的に使用することができる。
【００５６】
これら製剤化においては、薬理学上許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ｐＨ調節剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、前記自閉症等の治療又は予防に用いられる公知の医薬組成物と併用してもよい。また、本発明の医薬組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができる。ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。
【００５８】
本発明の医薬組成物の投与形態としては特に制限はなく、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与、脳内に直接投与（局所投与）が挙げられる。
【００５９】
本発明の医薬組成物を脳内に直接投与する方法としては、例えば、後述の実施例に示す通り、本発明の医薬組成物を入れた徐放系ドラッグデリバリーシステム（例えば、ＡＬＺＥＴ社製の浸透圧ポンプ）を、脳内に埋め込む方法や、開頭し、本発明の医薬組成物を電気穿孔法により導入する方法や、定位脳手術方法によってカニューレ等を挿入し、当該カニューレを通じて脳内に投与する方法が挙げられる。
【００６０】
また、本発明の医薬組成物を脳内に直接投与しない場合には、前記ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の機能を抑制する分子に脳関門透過物質を結合させて投与する方法を利用してもよい。なお、脳関門透過物質としては、例えば、狂犬病ウィルス由来の２９アミノ酸からなる糖タンパク質（Ｋｕｍａｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年７月５日、４４８巻、３９〜４３ページ  参照）が挙げられるが、これに制限されない。
【００６１】
本発明の医薬組成物を投与する場合、その投与量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態等に応じて、適宜選択されるが、例えば、本発明の医薬組成物の投与量（有効成分換算量）は、有効成分の種類に応じて異なるが、例えば、有効成分がＲＮＡ又はＤＮＡである場合には、通常、０．１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、有効成分が抗体である場合には、通常、１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。また、１日あたりの投与又は摂取の回数としても、特に制限はなく、前記のような様々な要因を考慮して、適宜選択することができる。有効成分がｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の転写産物に結合するＲＮＡをコードするＤＮＡである場合には、適切な量のＲＮＡが発現するように、発現構築物を作製して投与すればよい。
【００６２】
本発明は、このように、本発明の医薬組成物を対象（自閉症の患者等）に投与させることを特徴とする、対象におけるスパイン形成を伴う疾患の治療又は予防の方法をも提供する。
【００６３】
本発明の医薬組成物又の製品（医薬品）又はその説明書は、スパイン形成を伴う疾患の治療又は予防に用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。スパイン形成を伴う疾患の治療又は予防に用いられる旨の表示においては、本発明のｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の機能を抑制する分子を投与することにより、スパイン形成異常が抑制される機序についての情報を含むことができる。
【００６４】
＜ワクチン組成物＞
本発明において、抗ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質抗体等のｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の機能を抑制する分子が、スパイン形成異常を抑制する活性を有することが判明したことから、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質又はその部分ペプチドをワクチンとして、ヒトを含む哺乳動物に投与することも可能である（例えば、特開２００７−２７７２５１号公報、特開２００６−０５２２１６号公報）。本発明は、このようなワクチン用途に用いられる、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質又はその部分ペプチドを有効成分として含む、スパイン形成異常を抑制するためのワクチン組成物をも提供するものである。ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の「部分ペプチド」としては、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質との結合を阻害し、ｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質とＣＡＳＫタンパク質との相互作用を維持することにより、スパイン形成異常を抑制できるという観点から、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質のＰＤＺ２ドメインが好ましい。製剤化する場合には、前記本発明の医薬組成物と同様に、薬理学上許容される担体、例えば、安定剤、防腐剤、等張化剤等を適宜組み合わせて含有させることができる。
【００６５】
本発明は、このように、本発明のワクチン組成物を対象（自閉症の患者等）に投与させることを特徴とする、対象におけるスパイン形成を伴う疾患の治療又は予防の方法をも提供することができる。
【００６６】
本発明のワクチン組成物の製品（ワクチン）又はその説明書は、スパイン形成を伴う疾患の治療又は予防に用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。スパイン形成を伴う疾患の治療又は予防に用いられる旨の表示においては、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質又はその部分ペプチドを投与することにより、スパイン形成異常が抑制される機序についての情報を含むことができる。
【００６７】
＜スクリーニング方法＞
後述の実施例において示す通り、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の機能を抑制することにより、スパイン形成異常が抑制されることを見出した。従って、スパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物のスクリーニングに際し、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の機能を抑制する化合物の候補として、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質と結合する化合物を選択することは有効である。すなわち、本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、スパイン形成異常を抑制する活性を有する候補化合物のスクリーニング方法を、本発明のスクリーニング方法の第一の態様として提供する。
（ａ）被検化合物とｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とを接触させる工程、
（ｂ）被検化合物とｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質との結合を検出する工程、
（ｃ）前記ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質と結合する化合物を選択する工程。
【００６８】
本発明のスクリーニング方法において使用する「被検化合物」としては特に制限はなく、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、ポリヌクレオチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。被検化合物は、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の立体構造を基にしたｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのデザインを基に合成したものであってもよい。
【００６９】
また、本発明のスクリーニング方法において使用する「ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質」は、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。また、本発明のスクリーニング方法において使用するｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質としては、その部分ペプチドであってもよく、部分ペプチドとしては、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質との結合を阻害し、ｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質とＣＡＳＫタンパク質との相互作用を維持することにより、スパイン形成異常を抑制できるという観点から、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質のＰＤＺ２ドメイン（例えば、配列番号；２に記載の１９６〜２６９番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド）が好ましい。
【００７０】
また、本発明のスクリーニング方法において使用するｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質は、前記天然型のタンパク質やその部分ペプチドに加え、改変体、修飾体等を用いることができる。例えば、検出を容易にするためのマーカー蛋白質、アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ等の酵素、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等の蛍光蛋白質との融合蛋白質として発現させて得られるものを用いることができる。
【００７１】
工程（ｂ）において、被検化合物とｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質との結合を検出するが、かかる結合の検出には、公知の手法を適宜採用することができる。例えば、被検化合物が、合成低分子化合物、天然物（細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製又は部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物又は動物由来の抽出物、土壌）又はランダムファージペプチドディスプレイライブラリーである場合には、固定したｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質に、これら化合物を作用させ、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質に結合する分子をスクリーニングする方法が挙げられる。また、被検化合物が、合成低分子化合物である場合には、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ
ＮＣら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９６年、２７３巻、４５８〜４６４ページ、Ｖｅｒｄｉｎｅ ＧＬ．Ｎａｔｕｒｅ１９９６年、３８４巻、１１〜１３ページ、Ｈｏｇａｎ ＪＣ
Ｊｒ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９９６年、３８４巻、１７〜１９ぺージ）が挙げられる。さらに、被検化合物がポリヌクレオチドライブラリーである場合には、前述のインビトロセレクション法が挙げられる。また、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質を固定したアフィニティカラムに、合成低分子化合物、前記天然物、ペプチドライブラリーを供して、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質に結合する化合物を精製して同定する方法も挙げられる。さらに、被検化合物が遺伝子ライブラリーである場合には、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質をベイトタンパク質として発現させて利用する、酵母ツーハイブリッドシステムを好適に用いることができる。また、被検化合物がペプチドライブラリーや抗体である場合には、ＧＳＴ沈降法や免疫沈降法を利用することができる。さらに、本発明において、被検化合物とｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質との結合を検出する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。
【００７２】
なお、工程（ａ）における「被検化合物とｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質との接触」及び工程（ｃ）における「ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質と結合する化合物の選択」の方法は、当業者であれば、前記結合の検出に用いる方法の種類に応じて実施することができる。
【００７３】
また、後述の実施例において示す通り、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質はｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質と結合することによって、ｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパクとＣＡＳＫタンパク質との相互作用を抑制し、スパイン形成の異常を引き起こすことが明らかになった。従って、スパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物のスクリーニングにおいて、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質との結合を抑制する化合物を選択することが有効である。すなわち、本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、スパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法を、本発明のスクリーニング方法の第二の態様として提供する。
（ａ）被検化合物の存在下で、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質とを接触させる工程、
（ｂ）ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質との結合を検出する工程、
（ｃ）前記結合を抑制する化合物を選択する工程。
【００７４】
第二の態様において用いる「被検化合物」及び「ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質」については前述の通りである。本発明のスクリーニング方法において使用する「ｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質」としては、例えば、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。また、本発明のスクリーニング方法において使用するｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質としては、その部分ペプチドであってもよく、部分ペプチドとしては、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質との結合を阻害し、ｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質とＣＡＳＫタンパク質との結合を維持することにより、スパイン形成異常を抑制できるという観点から、ｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質の細胞内ドメインが好ましい。
【００７５】
第二の態様の工程（ａ）において、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質とを被検化合物存在下で接触させるが、かかる接触は、被験化合物の非存在下において、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質との結合が抑制されない条件下で行われればよい。
【００７６】
また、第二の態様の工程（ｂ）における、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質との結合の検出には、免疫沈降法、ＧＳＴ沈降法、ＥＬＩＳＡ法、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質を固定化したアフィニティクロマトグラフィーを用いる方法、表面プラズモン共鳴現象を利用した方法、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した方法等、公知の手法を適宜採用することができる。
【００７７】
さらに、第二の態様の工程（ｃ）において、前記結合を抑制する化合物を選択するが、例えば、免疫沈降法を用いた場合においては、被検化合物存在下で、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質をその特異的な抗体によって沈降させた際に共沈してくるｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質の量と、被検化合物非存在下におけるｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質の量（対照値）とを比較することにより評価することができる。すなわち、被検化合物存在下におけるｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質の量が被検化合物非存在下の量と比較して低い場合（例えば、対照値の８０％以下、５０％以下、３０％以下の場合）には、該被検化合物をスパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物と評価することができる。前記結合の検出において免疫沈降法以外の方法を用いる場合も同様に、被検化合物非存在下における前記結合の程度を対照値として用いて評価することができる。
【００７８】
また、後述の実施例において示す通り、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の量は、正常（野生型）ニューロンよりも、結節性硬化症ニューロンの方が多く、このｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の量の多さが、スパイン形成異常に寄与していることが明らかになった。従って、スパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物のスクリーニングにおいて、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の発現量又はｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）を減少させる化合物を選択することが有効である。すなわち、本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、スパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法を、本発明のスクリーニング方法の第三の態様として提供する。
（ａ）ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）該細胞内におけるｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の発現を検出する工程、
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の発現を減少させる化合物を選択する工程。
【００７９】
第三の態様において用いる「被検化合物」については前述の通りである。本発明のスクリーニング方法において検出の対象となる「ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子」としては、例えば、配列番号：１に記載の塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
【００８０】
本発明のスクリーニング方法において使用する「ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子を発現する細胞」としては、例えば、結節性硬化症モデル動物由来の神経細胞、自閉症等の患者由来の細胞が挙げられる。「結節性硬化症モデル動物」としては、後述のＴＳＣ２＋／−ラット、ＴＳＣ２＋／−マウス（Ｄａｎ  Ｅｈｎｉｎｇｅｒら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．、２００８年、１４巻、８号、８４３〜８４８ページ、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９９年、５９巻、１２０６〜１２１１ページ  参照）が挙げられる。
【００８１】
第三の態様の工程（ａ）において、「接触」は、例えば、前記細胞の培養液に被検化合物を添加等することにより行うことができる。
【００８２】
第三の態様の工程（ｂ）における「ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の発現の検出」には、公知の手法を用いることができる。「遺伝子の発現の検出」は、転写レベル（ｍＲＮＡレベル）で検出してもよく、翻訳レベル（タンパク質レベル）で検出してもよい。転写レベルで検出する方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法が挙げられる。また、翻訳レベルで検出する方法としては、例えば、免疫組織化学的染色法、イメージングサイトメトリー、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、ウェスタンブロット法等の抗体を用いて検出する方法（免疫学的手法）が挙げられる。
【００８３】
第三の態様の工程（ｃ）において、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の発現を減少させる化合物を選択するが、例えば、ウェスタンブロット法を用いた場合においては、被検化合物存在下で、該法において検出されるｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の量（例えば、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質に由来するバンドの強さ）と、被検化合物非存在下におけるｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の量（対照値）とを比較することにより評価することができる。すなわち、被検化合物存在下におけるｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の量が被検化合物非存在下の量と比較して低い場合（例えば、対照値の８０％以下、５０％以下、３０％以下の場合）には、該被検化合物をスパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物と評価することができる。前記発現の検出において、ウェスタンブロット法以外の方法を用いる場合も同様に、被検化合物非存在下における前記発現量を対照値として用いて評価することができる。
【００８４】
また、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の発現レベルを減少させる化合物のスクリーニングは、レポーター遺伝子を用いた系でも行うことができる。すなわち、本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、スパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物のスクリーニング方法を、本発明のスクリーニング方法の第四の態様として提供する。
（ａ）ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞に、被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）該細胞内における前記レポーター遺伝子の発現を検出する工程、
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記レポーター遺伝子の発現を減少させる化合物を選択する工程。
【００８５】
「ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子のプロモーター領域」は、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の転写を制御する領域であり、転写因子が結合することのできるｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子のコーディング領域の上流領域を意味する。「ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子のプロモーター領域」は、当業者であれば、例えば、配列番号：１に記載の塩基配列又はその一部をプローブとしたゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、クローニングして調製することができる。
【００８６】
「レポーター遺伝子」としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）及びＧＦＰ遺伝子を挙げることができる。
【００８７】
本発明において、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が「機能的に結合した」とは、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。
【００８８】
第四の態様における「ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子」、「被検化合物」及び「接触」は前記第三の態様と同じである。第四の態様において使用する「細胞」としては、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導される細胞であればよく、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ細胞、結節性硬化症モデル動物由来の神経細胞、自閉症等の患者由来の細胞が挙げられる。
【００８９】
第四の態様の工程（ｂ）において、検出されるレポーター遺伝子の発現は、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により検出することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現を検出することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による化学発光を検出することにより、また、ＧＵＳである場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるグルクロンの発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現を検出することができる。
【００９０】
第四の態様の工程（ｃ）において、前記レポーター遺伝子の発現を減少させる化合物を選択するが、例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合においては、被検化合物存在下で、検出される化学発光の強度と、被検化合物非存在下における化学発光の強度（対照値）とを比較することにより評価することができる。すなわち、被検化合物存在下における発光強度が被検化合物非存在下における発光強度と比較して低い場合（例えば、対照値の８０％以下、５０％以下、３０％以下の場合）には、該被検化合物をスパイン形成異常を抑制する活性を有する化合物と評価することができる。前記発現の検出において、ルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合以外の場合も同様に、被検化合物非存在下における前記発現量を対照値として用いて評価することができる。
【００９１】
以上、本発明のスクリーニング方法について説明したが、これら方法によって選択された化合物については、さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける活性を検証することが好ましい。例えば、後述の実施例において示すように、当該化合物を結節性硬化症モデル動物由来の神経細胞（ニューロン）と接触させ、該ニューロンにおけるスパイン形成異常の抑制の程度について評価することにより、結節性硬化症等の疾患の予防又は治療により有効な化合物として選抜することができる。また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける活性の検証は、後述の実施例において示すように、結節性硬化症モデル動物の脳内に、本発明のスクリーニング方法にて選択された化合物を投与し、行動異常の改善の程度を評価することによっても行うことができる。
【実施例】
【００９２】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００９３】
＜海馬ニューロンの初代培養＞
胎生２０日目ＴＳＣ２＋／−（Ｅｋｅｒ）ラット又は野生型ラットより海馬を摘出し、０．２５％トリプシン含有ハンクス緩衝液中において３７℃１０分間処理した。洗浄した後、細胞を縣濁し、Ｂ−２７添加物含有ニューロベイサル（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）培養液（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２条件下にて培養した。遺伝子強制発現にはリポフェクトアミン２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。【００９４】
＜ｓｉＲＮＡ＞
ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の発現を抑制するために、下記塩基配列からなるｓｉＲＮＡ
（ｄｓＲＮＡ）を用いた。
ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡ
５’−ＧＡＡＧＧＡＵＧＣＵＣＡＧＡＵＵＧＣＡＧＡＵＡＵＡ−３’（配列番号：５）
５’−ＵＡＵＡＵＣＵＧＣＡＡＵＣＵＧＡＧＣＡＵＣＣＵＵＣ−３’（配列番号：６）
前記ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡに対する陰性対照として、下記塩基配列からなるｓｉＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）も用いた。
非特異的  ｓｉＲＮＡ（ｓｙｎｔｅｎｉｎ）
５’−ＧＡＡＣＧＵＡＧＡＣＵＧＵＵＡＡＧＡＣＵＧＧＡＵＡ−３’（配列番号：７）
５’−ＵＡＵＣＣＡＧＵＣＵＵＡＡＣＡＧＵＣＵＡＣＧＵＵＣ−３’（配列番号：８）
ｓｙｎｄｅｃａｎ−２遺伝子の発現を抑制するために、下記塩基配列からなるｓｉＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いた。
ｓｙｎｄｅｃａｎ−２  ｓｉＲＮＡ
５’−ＣＡＡＣＵＧＡＵＵＣＣＡＡＧＧＡＵＣＵＣＣＣＵＣＡ−３’（配列番号：９）
５’−ＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＣＣＵＵＧＧＡＡＵＣＡＧＵＵＧ−３’（配列番号：１０）
前記ｓｙｎｄｅｃａｎ−２  ｓｉＲＮＡに対する陰性対照として、下記塩基配列からなるｓｉＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）も用いた。
非特異的  ｓｉＲＮＡ（ｓｙｎｄｅｃａｎ−２）
５’−ＣＡＡＵＵＡＧＡＡＣＣＵＡＧＧＣＣＵＣＣＵＣＵＣＡ−３’（配列番号：１１）
５’−ＵＧＡＧＡＧＧＡＧＧＣＣＵＡＧＧＵＵＣＵＡＡＵＵＧ−３’（配列番号：１２）。【００９５】
＜タンパク質間相互作用の解析＞
ＧＳＴ沈降法又は免疫沈降法により、Ｒｈｅｂとｓｙｎｔｅｎｉｎとの結合部位、ＣＡＳＫとｓｙｎｄｅｃａｎ−２との結合を、定法に沿って解析した。【００９６】
＜ユビキチン化アッセイ＞
Ｒｈｅｂ及びｓｙｎｔｅｎｉｎのユビキチン化アッセイにおいては、先ず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＥＧＦＰ−Ｒｈｅｂ融合タンパク質及びＦＬＡＧ−ｓｙｎｔｅｎｉｎ融合タンパク質を強制発現させた。次いで、該細胞のタンパク質抽出液を調製し、ＧＦＰ抗体にて免疫沈降を行った。そして、得られたサンプルを、抗ユビキチン抗体を用いたウェスタンブロッティングにより解析した。【００９７】
＜免疫細胞染色＞
培養ニューロンを４％パラホルムアルデヒドにて固定した。固定したニューロンを１０％ヤギ血清含有緩衝液にてブロッキングし、一次抗体と反応させた。更に、蛍光二次抗体を用いて目的タンパク質を標識した。【００９８】
＜ｄｉｏｌｉｓｉｔｉｃ標識法＞
正常ラット及びＴＳＣ２変異ラットを開頭し、各々の脳内にｓｉＲＮＡを電気穿孔法にて導入した。そして、ｓｉＲＮＡを導入した脳を摘出し、２％パラホルムアルデヒドにて固定した。次いで、固定した脳を摘出し、ビブラトームにて２５０μｍの厚さに前額断にて薄切にした。薄切した脳切片に対し、ＤｉＩ色素を付着させた金粒子を遺伝子銃にて導入することにより、ニューロンを蛍光標識した（図３３  参照）。そして、標識したニューロンをレーザー顕微鏡（製品名：ＬＳＭ７８０、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）にて観察した。【００９９】
＜ｓｉＲＮＡの投与＞
浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ社製、ｍｉｎｉ  ｐｕｍｐ＃１００２）にｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡ  ２５０μＭ／生理食塩水溶液を１５０μｌ入れ、側脳室内に留置することにより、一日あたり６μｌのｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡを１４日間、側脳室に持続投与した。【０１００】
＜文脈依存的恐怖弁別試験＞
文脈依存的恐怖弁別試験は、「Ｏｓｔｅｒｗｅｉｌ  ＥＫ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１１年、４８０巻、７３７５号、６３〜６８ページ」に記載の方法に準じて行った（図４０  参照）。すなわち、正常ラット又はＴＳＣ２＋／−ラット（いずれも６〜１２週齢の成体ラット）に、前記の通り、浸透圧ポンプを埋め込む手術を施した。２週間後、明室内にて１秒間の電気刺激（フットショック）を３回与えた。そして、その２４時間後に、先と同環境である明室又は異なる環境である暗室にラットを移し、ラットのフリージング（動かない状態）の時間を測定した。【０１０１】
（実施例１）
＜ｍＴＯＲタンパク質とスパイン形成との関連性の有無についての検証＞
結節性硬化症の原因遺伝子ＴＳＣ２に変異があるラット（「Ｅｋｅｒラット」、「ＴＳＣ２＋／−ラット」とも称する）から、海馬ニューロンを単離し、初代培養した。そして、培養２１日後の海馬ニューロンの形態を野生型ラットのそれと比較した。得られた結果を図３〜６に示す。【０１０２】
図３及び４に示す通り、野生型ラットにおいてはスパインを形成していたのに対し、ＴＳＣ２＋／−ラットではスパインが形成されず、スパインになる前の未熟な形態であるフィロポディアが観察された。また、興奮性シナプスが出来ているかどうかをｖＧｌｕｔ１に対する抗体を用いて、免疫細胞染色にて検討したところ、ＴＳＣ２＋／−ラットのフィロポディアはシナプスを形成していなかったが、樹状突起に直接シナプスを形成する像が見られた（図３、５及び６  参照）。【０１０３】
このようなＴＳＣ２＋／−ラットにおけるスパイン形成異常には、ｍＴＯＲタンパク質の活性化が寄与しているのではと推測されている。すなわち、ＴＳＣ２に変異が生じると、Ｒｈｅｂタンパク質が活性型（Ｒｈｅｂ−ＧＴＰ)となり、下流のｍＴＯＲタンパク質の活性化を介してスパインにおけるタンパク質の局所翻訳が亢進される。そして、異常に合成されたタンパク質がスパイン形成を阻害すると推測されている。【０１０４】
そこで、このスパイン形成異常がｍＴＯＲタンパク質の活性化によるものかどうかを調べるため、ｍＴＯＲ阻害薬であるラパマイシンを培地に添加し、前記同様に、ＴＳＣ２＋／−ラットの海馬ニューロンの形態を観察した。得られた結果を図７〜９に示す。【０１０５】
図７〜９に示した結果から明らかなように、ラパマイシンを添加した培地にて培養した海馬ニューロンと、陰性対照としてＤＭＳＯを添加した培地にて培養したそれとの間において、ニューロンの形態、樹状突起上の突起の長さ、スパインシナプス密度に関し、有意な差は認められなかった。このように、ラパマイシンによってＴＳＣ２＋／−ラットにおけるスパイン形成異常は回復されなかったことから、ｍＴＯＲタンパク質はスパイン形成に寄与していないことが示唆された。【０１０６】
（実施例２）
＜Ｒｈｅｂタンパク質とｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質との結合に関する解析＞
実施例１に記載の結果を受け、ｍＴＯＲタンパク質を介さないスパイン形成機構を想定し、ｍＴＯＲタンパク質の上流のＲｈｅｂタンパク質と結合するタンパク質を、酵母ツーハイブリッド法を用いて探索した。その結果、シンテニン（ｓｙｎｔｅｎｉｎ）タンパク質とＲｈｅｂタンパク質とが結合することが明らかになった。ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質は、図１０に示す通り、Ｃ末側に２つのＰＤＺドメインを有し、様々なタンパク質と結合することが知られている（非特許文献３  参照）。しかし、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とＲｈｅｂタンパク質とが結合することは、今回初めて明らかになった知見である。【０１０７】
前述の通り、ＴＳＣ２＋／−ラットにおいては、ＴＳＣ２の変異により、Ｒｈｅｂタンパク質が活性型（Ｒｈｅｂ−ＧＴＰ)となっている。そこで、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質との結合に関し、活性型Ｒｈｅｂタンパク質と不活性型Ｒｈｅｂタンパク質との間に差があるのかどうかを解析した。すなわち、活性型変異体として知られている、６４番目のアミノ酸がグルタミンからバリンに置換されているＲｈｅｂ（ＲｈｅｂＱ６４Ｖ）タンパク質と、不活性型変異体として知られている、６０番目のアミノ酸がアスパラギン酸からイソロイシンに置換されているＲｈｅｂ（ＲｈｅｂＤ６０Ｉ）タンパク質とを用い、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質との結合について、ＧＳＴ沈降法により解析した。得られた結果を図１１に示す。【０１０８】
図１１に示した結果から明らかなように、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質に結合するＲｈｅｂＱ６４Ｖタンパク質の量は、Ｒｈｅｂタンパク質及びＲｈｅｂＤ６０Ｉタンパク質のそれらと比較して、顕著に低いものであった。従って、Ｒｈｅｂタンパク質は、活性化すると、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質との結合が弱まることが明らかになった。【０１０９】
次に、Ｒｈｅｂタンパク質におけるｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の結合部位の同定を試みた。すなわち、先ず、エフェクタードメイン変異体として、３８番目のアミノ酸がスレオニンからメチオニンに置換されているＲｈｅｂＤ６０Ｉタンパク質（Ｔ３８Ｍ／Ｄ６０Ｉ）と、３９番目のアミノ酸がイソロイシンからリシンに置換されているＲｈｅｂＤ６０Ｉタンパク質（Ｉ３９Ｋ／Ｄ６０Ｉ）とを調製した。そして、これらＲｈｅｂタンパク質変異体とｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質との結合について、ＧＳＴ沈降法により解析した。得られた結果を図１２に示す。【０１１０】
なお、Ｒｈｅｂタンパク質は低分子ＧＴＰ結合タンパク質の１種であり、他の低分子ＧＴＰ結合タンパク質と同じく、エフェクター分子と結合することにより、シグナルを下流に伝えることが知られている。このエフェクター分子が結合する領域が、エフェクタードメインであり、Ｒｈｅｂタンパク質においては、３５〜４３番目のアミノ酸からなる領域であることも明らかになっている。【０１１１】
図１２に示した結果から明らかなように、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質に結合するエフェクタードメイン変異体の量は、Ｒｈｅｂタンパク質及びＲｈｅｂＤ６０Ｉタンパク質（Ｄ６０Ｉ）のそれらと比較して低く、特にＴ３８Ｍ／Ｄ６０Ｉ変異体においては、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質との結合がほとんど検出されなかった。従って、Ｒｈｅｂタンパク質は、エフェクタードメインを介して、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質と結合していることが明らかになった。【０１１２】
次に、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質におけるＲｈｅｂタンパク質の結合部位の同定を試みた。すなわち、先ず、図１０に示すｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の変異体を調製した。そして、これらｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質変異体とＲｈｅｂタンパク質との結合について、ＧＳＴ沈降法により解析した。得られた結果を図１３に示す。【０１１３】
図１３に示した結果から明らかなように、ＰＤＺ２ドメインよりもＣ末側の領域に変異を導入したｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質（ΔＣ（２７８−３００）及びΔＣ（２８９−３００）））のＲｈｅｂタンパク質に対する結合量は、野生型ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質（ｓｙｎｔ）及び他の変異体と比して、著しく低いものであった。従って、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質は、Ｃ末端領域を介して、Ｒｈｅｂタンパク質と結合していることが明らかになった。【０１１４】
（実施例３）
＜ｓｙｎｔｅｎｉｎとスパイン形成との関連性の有無についての検証＞
次に、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とスパイン形成との関連性の有無を調べるため、野生型ラット由来の培養海馬ニューロンに、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子発現ベクターを導入することにより、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子を過剰発現させた。また、ＴＳＣ２＋／−ラット由来の培養海馬ニューロンにおけるｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の発現を、ＲＮＡｉによりノックダウンした。得られた結果を図１４〜２０に示す。【０１１５】
図１４〜１６に示した結果から明らかなように、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の過剰発現により、野生型ラット由来の培養海馬ニューロンにおいて、フィロポディアが増加した。一方、図１７〜１９に示す通り、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の発現を抑制することにより、ＴＳＣ２＋／−ラット由来の培養海馬ニューロンにおいて、スパインが形成されることが明らかになった。【０１１６】
さらに、ＴＳＣ２＋／−ラット由来の培養海馬ニューロンにおけるｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の量をウェスタンブロッティングにより解析したところ、野生型のそれと比較して、増加していることが明らかになった（図２０及び２１  参照）。そこで、このＴＳＣ２＋／−ラットにおけるｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の量の増加についての機序を解明すべく、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質及びＲｈｅｂタンパク質におけるユビキチン化の程度を評価した。得られた結果を図２２及び２３に示す。【０１１７】
図２２に示す通り、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質のユビキチン化の程度は、活性型Ｒｈｅｂ（ＲｈｅｂＱ６４Ｖ）タンパク質の存在下と、不活性型Ｒｈｅｂ（ＲｈｅｂＤ６０Ｉ）タンパク質の存在下とにおいて差は認められなかった。【０１１８】
一方、図２３に示す通り、Ｒｈｅｂタンパク質のユビキチン化においては、不活性型Ｒｈｅｂ（ＲｈｅｂＤ６０Ｉ）タンパク質の方が、活性型Ｒｈｅｂ（ＲｈｅｂＱ６４Ｖ）タンパク質よりも、よりユビキチン化され易いということが明らかになった。【０１１９】
以上の結果から、野生型ラットのニューロン（正常ニューロン）においては、Ｒｈｅｂタンパク質が不活性型にて存在しており、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質と複合体を形成していることが明らかになった。さらに、不活性型のＲｈｅｂタンパク質はユビキチン化され易いため、ユビキチン−プロテアソーム系によって、当該複合体ごとｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質が分解されることにより、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の量は低く抑えられていることも明らかになった（図１  参照）。【０１２０】
一方、ＴＳＣ２＋／−ラットのニューロン（結節性硬化症のニューロン）においては、ＴＳＣタンパク質の変異により、Ｒｈｅｂタンパク質は活性型にて存在している。そして、活性型Ｒｈｅｂタンパク質とｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質との結合は弱く、さらに活性型Ｒｈｅｂタンパク質は不活性型よりもユビキチン化されにくい。そのため、ＴＳＣ２＋／−ラットのニューロンにおいては、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の分解はあまり生じず、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の量は、野生型ラットのそれと比して高くなっていることが明らかになった（図２  参照）。【０１２１】
（実施例４）
＜ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質によるスパイン形成抑制に関する解析＞
実施例３において示した通り、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質量の増加によって、スパイン形成は抑制されることが明らかになった。そこで、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質がどのような作用機序にて、スパイン形成を抑制するのかを明らかにするため、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質において、スパイン形成の抑制に必要な領域を同定することを試みた。すなわち、野生型ラット由来の培養海馬ニューロンに、内在性ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子特異的なｓｉＲＮＡと、ＲＮＡｉ抵抗性のｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子を発現できるプラスミドとを導入することにより、内在性ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の代わりに、外来的に導入した各種ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質変異体（図１０  参照）等を、野生型ラット由来の培養海馬ニューロンにおいて過剰発現させ、該ニューロンの形態、樹状突起上の突起の長さ、スパインシナプス密度を解析した。得られた結果を図２４〜２６に示す。【０１２２】
図２４〜２６に示した結果から明らかなように、ＰＤＺ２に変異を挿入したｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質だけは、スパイン形成に対する抑制作用を示されなかった。従って、スパイン形成に対する抑制効果は、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質のＰＤＺ２ドメインを介して奏されることが明らかになった。【０１２３】
かかる知見に基づき、ＰＤＺ２ドメインと相互作用することが明らかになっており、またスパイン形成に関与することが知られているｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質に着目した。そして、ＴＳＣ２＋／−ラット由来の培養海馬ニューロンにおける、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子及びｓｙｎｄｅｃａｎ−２遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制し、該ニューロンの形態、樹状突起上の突起の長さ、スパインシナプス密度を解析した。得られた結果を図２７〜２９に示す。【０１２４】
図２７〜２９に示した結果から明らかなように、ＴＳＣ２＋／−ラット由来の培養海馬ニューロンにおいて、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質量を低減させることにより回復されるスパイン形成は、ｓｙｎｄｅｃａｎ−２遺伝子の発現を抑制することにより解消された。【０１２５】
次に、ｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質と相互作用することにより、スパイン形成を制御することが知られているＣＡＳＫタンパク質に着目した（Ｃｈａｏ  ＨＷ.ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２００８年、１８２巻、１号、１４１〜１５５ページ  参照）。そして、スパイン形成に必要なｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質とＣＡＳＫタンパク質との相互作用が、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質によって分断されると考え、ｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパクとの結合において、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質とＣＡＳＫタンパク質とは競合し得るのかどうかを、ＧＳＴ沈降法により検討した。得られた結果を図３０に示す。さらに、野生型ラット由来の培養海馬ニューロンにおいて、一定量のＣＡＳＫタンパク質に対し、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質量を増やした際の、該ニューロンの形態及びスパインシナプス数を評価した。得られた結果を図３１及び３２に示す。【０１２６】
図３０〜３２に示した結果から明らかなように、一定量のＣＡＳＫタンパク質に対して、ｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質量を増やしていくと、ＣＡＳＫタンパク質とｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質との結合が弱まり、ＣＡＳＫタンパク質によるスパイン形成も抑えられた。【０１２７】
以上の結果から、結節性硬化症のニューロンにおいては、増加したｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質が、ｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質と結合することにより、ＣＡＳＫ及びｓｙｎｄｅｃａｎ−２タンパク質間の結合を競合的に抑制し、スパイン形成を抑えることが明らかになった（図２  参照）。【０１２８】
（実施例５）
＜ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子特異的ｓｉＲＮＡによる、結節性硬化症の治療効果の検証＞
前述の通り、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子に対するｓｉＲＮＡによって、結節性硬化症の培養ニューロンのスパイン形成が回復されることが明らかになった。そこで、次にｉｎ  ｖｉｖｏにおいても同様の効果があるかどうかを検討した。すなわち、ＴＳＣ２＋／−ラットの海馬に、電気穿孔法によりｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡを導入し、その脳切片を作製した。それらをｄｉｏｌｉｓｉｔｉｃ法によりＤｉＩ標識し、個々のニューロンの形態を調べた（図３３  参照）。得られた結果を図３７〜３９に示す。【０１２９】
図３４〜３６に示す通り、ＴＳＣ２＋／−ラットでは、培養ニューロンと同じく、スパイン形成が野生型に比べて遅れている。対して、ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡを導入したＴＳＣ２＋／−ラットにおいては、スパイン形成が回復することが明らかになった（図３７〜３９  参照）。【０１３０】
さらに、このｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡが、結節性硬化症における行動異常にも効果があるかどうかを検討した。結節性硬化症モデルマウスでは、文脈依存的恐怖弁別に異常があることが知られている。ＴＳＣ２＋／−ラットに対し、文脈依存的恐怖弁別試験（図４０  参照）を行ったところ、同様の異常が確認された（図４１、特に「ＴＳＣ２＋／−」の「異なる環境」における結果  参照）。そこで、ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡをＴＳＣ２＋／−ラットの脳室内に持続注入し、脳全体のｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の量を減らしたところ、文脈依存的恐怖弁別が改善することが明らかになった（図４１  参照）。従って、ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡ等により、脳内のｓｙｎｔｅｎｉｎタンパク質の量を抑制することにより、結節性硬化症の中枢症状を軽減できることが明らかになった。【０１３１】
（実施例６）
＜ｓｙｎｔｅｎｉｎヘテロノックアウトによる、ＴＳＣ２＋／−マウスのスパイン形成と記憶との回復についての検証＞
ＴＳＣ２＋／−ラットを用いて得られた結果をマウスにて確認するため、ＴＳＣ２＋／−マウスとｓｙｎｔｅｎｉｎ＋／−マウスとを交配し、ＴＳＣ２＋／−；ｓｙｎｔｅｎｉｎ＋／−マウスを作製した。【０１３２】
なお、ＴＳＣ２＋／−マウスは、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９９年、５９巻、１２０６〜１２１１ページに記載のマウスを用いた。また、ｓｙｎｔｅｎｉｎ＋／−マウスは、Ｃｒｅ／ｌｏｘ及びＦＲＴ／ＦＬＰの部位特異的組換えシステムを用い、定法に従って作製した。すなわち先ず、図４２に記載のターゲティングベクターと野生型アレルとの間で相同組換えを生じさせることにより、マウスｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子領域（図４２中  野生型アレル）において、両端にＦＲＴ配列を有する選択マーカー遺伝子（ｌａｃＺ及びｎｅｏ等）を、エクソン２及び３の間に挿入し、さらに当該エクソン３の両側にｌｏｘｐ配列を挿入することを試みた（図４２中、標的アレル  参照）。次いで、前記選択マーカー遺伝子の発現を指標に、標的アレルを有するマウスを選抜し、当該マウスとＦＬＰマウスとを交配させることにより、該選択マーカー遺伝子が除去されたマウスを調製した（図４２中、フロックスアレル  参照）。そして、フロックス（ｆｌｏｘｅｄ）アレルを有するマウスと、Ｃｒｅマウスとを交配させることにより、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子のエクソン３が除去されたマウスを調製した（図４２中、Ｆｌｏｘｅｄアレル  参照）。なお、マウスｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子領域から、エクソン３を欠失させることにより、１〜１７番目のアミノ酸からなるｓｙｎｔｅｎｉｎ変異体が転写・翻訳されることになる。【０１３３】
以上の通りに調製した、ＴＳＣ２＋／−ヘテロノックアウトマウス及びＴＳＣ２＋／−；ｓｙｎｔｅｎｉｎ＋／−マウスと、野生型マウスとにおける、海馬ニューロンの樹状突起を観察した。得られた結果を図４３〜４９に示す。また、これらマウスを用い、前述のラット同様に文脈依存的恐怖弁別学習試験を行った。得られた結果を図５０に示す。【０１３４】
図４３〜４９に示す通り、前述のＴＳＣ２＋／−ラットと同じく、ＴＳＣ２＋／−マウスでもスパイン形成が顕著に抑制されており、大部分がフィロポディアであることが確認された。しかし、ｓｙｎｔｅｎｉｎとのダブルヘテロマウス（ＴＳＣ２＋／−；ｓｙｎｔｅｎｉｎ＋／−マウス）においては、スパイン形成が野生型と同程度にまで回復していることが明らかになった。【０１３５】
また、図５０に示す通り、前述のラット同様に、ＴＳＣ２＋／−マウスでは弁別が認められたが、ＴＳＣ２＋／−；ｓｙｎｔｅｎｉｎ＋／−マウスでは野生型と同程度にまで回復していた。【０１３６】
以上の結果は、ｓｙｎｔｅｎｉｎの減少により、ＴＳＣマウスにおけるスパイン形成が回復し、記憶が正常化したためであると考えられる。したがって、ｓｙｎｔｅｎｉｎ  ｓｉＲＮＡ等のｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の機能を抑制する分子は、結節性硬化症の精神遅滞の治療において有効であることが明らかになった。【０１３７】
（実施例７）
＜ｓｙｎｔｅｎｉｎ欠損によるＴＳＣマウスのてんかん抑制効果＞
結節性硬化症は難治性てんかんを合併する。そこで、てんかんに対するｓｙｎｔｅｎｉｎノックアウトの効果を検討した。すなわち、野生型マウス、ＴＳＣ２＋／−マウス及びＴＳＣ２＋／−；ｓｙｎｔｅｎｉｎ＋／−マウスに、各々けいれん誘発剤であるペンチレンテトラゾール（２ｍｇ／ｍｌ、シグマ社製）を、マウス体重１ｋｇあたり３０ｍｇとなるように一日おきに腹腔内注射し、てんかん発作を誘導した。そして、各注射後３０分間マウスの行動を観察し、Ｉｔｏらの指標（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００４年、１２９巻、７５７〜７６６ページ）を改変したものに従い、てんかん発作の強度をスコア化（０〜６）した。
具体的には、発作強度のスコア化を以下の基準に基づき行った。得られた結果を図５１に示す。
０：通常状態、探索行動
１：脱力、不動状態
２：首ふり運動、１肢から２肢にわたる不随意運動
３：３肢から４肢にわたる不随意運動、体の動きが止まる間代性けいれん
４：転倒、強直けいれん、強く体を折り曲げるあるいは反らせる間代性けいれん
５：繰り返し発生する強直けいれん、激しい跳躍行動
６：死。【０１３８】
図５１に示す通り、ＴＳＣ２＋／−マウスは、野生型マウスより、早期に重度のてんかん発作を起こすことが明らかになった。しかし、ＴＳＣ２＋／−；ｓｙｎｔｅｎｉｎ＋／−マウスでは、てんかん発作の進展は野生型とほぼ同じく、ＴＳＣ２＋／−マウスより常に軽度であることが明らかになった。【０１３９】
したがって、ｓｙｎｔｅｎｉｎ
ｓｉＲＮＡのｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の機能を抑制する分子は、結節性硬化症の難治性てんかんの治療又は予防にも有効であることが明らかになった。【０１４０】
前述の通り、ＴＳＣ２＋／−マウスにおいてはスパインシナプスが減少し、代償的にシャフトシナプスが増加している。スパインシナプスでは、細胞外のＣａ２＋イオン等の流入はスパイン頭部内に留まるが、シャフトシナプスではイオンが直接樹状突起へ流入するため、シナプス伝達が増強されると考えられる。すなわち、ＴＳＣ２＋／−マウスではイオンの樹状突起への流入が多いため、過剰興奮を起こしやすく、てんかん原性が亢進していると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
以上説明したように、本発明によれば、ｓｙｎｔｅｎｉｎ遺伝子の機能を抑制することにより、スパイン形成異常を抑制することが可能となる。したがって、本発明の医薬組成物は、スパイン形成異常疾患、例えば、てんかん、精神遅滞、自閉症、結節性硬化症等の治療又は予防において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１４２】
配列番号５〜１２
＜２２３＞  人工的に合成されたｓｉＲＮＡの配列
【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２６】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３２】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３８】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４７】
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【図５０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２７】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３７】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４６】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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