(57)【要約】分離媒体は、シリカゲルである担体又はシリカゲルを成分として含む担体と、前記担体に疎水性を与えるように前記担体に結合した５０ｐｐｍ以上の金属とを含む。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカゲルである担体又はシリカゲルを成分として含む担体と、
前記担体に疎水性を与えるように前記担体に結合した５０ｐｐｍ以上の金属と、を含む分離媒体。
【請求項２】
前記金属は前記担体に飽和状態となる濃度で結合している請求項１に記載の分離媒体。
【請求項３】
前記金属は、Ａｌ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｍｇ及びＡｇからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１又は２に記載の分離媒体。
【請求項４】
前記担体には、分析対象成分に対してシリカゲルとは異なる親和力を与える官能基が結合していない請求項１から３のいずれか一項に記載の分離媒体。
【請求項５】
前記担体には前記金属のほかに分析対象成分に対してシリカゲルとは異なる親和力を与える官能基がさらに結合している請求項１から３のいずれか一項に記載の分離媒体。
【請求項６】
前記官能基はオクタデシルシリル基、オクチル基、ブチル基及びアミノプロピル基からなる群から選ばれる１種である請求項５に記載の分離媒体。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の分離媒体がチューブに充填されたカラム。
【請求項８】
請求項４に記載の分離媒体が充填されオフラインで使用されるカートリッジ形状に構成された請求項７に記載のカラム。
【請求項９】
請求項４に記載の分離媒体が充填されオンラインで使用されるカラム形状に構成された請求項７に記載のカラムからなる前処理カラムと、
前記前処理カラムに試料中の１又は複数の分析対象成分を保持させる第１の溶媒を前記前処理カラムに供給する第１溶媒供給流路と、
前記前処理カラムに保持された分析対象成分を溶出させる第２の溶媒であって、前記第１の溶媒とは異なる溶媒を前記前処理カラムに供給する第２溶媒供給流路と、
前記前処理カラムからの溶出液が流れる流路に接続される分析対象成分分離用の分析カラムと、
前記分析カラムの下流に接続されて前記分析カラムで分離された分析対象成分を検出する検出器と、
前記第１溶媒供給流路を前記前処理カラムに接続する第１流路と、前記第２溶媒供給流路を前記前処理カラムに接続し前記前処理カラムからの溶出液流路を前記分析カラムに接続する第２流路との間で切り換える流路切換え機構と、
を備えた液体クロマトグラフ。
【請求項１０】
前記分析カラムは請求項５又は６に記載の分離媒体が充填されオンラインで使用されるカラム形状に構成された請求項７に記載のカラムからなる請求項９に記載の液体クロマトグラフ。
【請求項１１】
以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を含んで請求項１から３のいずれか一項に記載の分離媒体を製造する方法。
（Ａ）シリカゲルである担体又はシリカゲルを成分として含む担体を金属の金属塩水溶液に浸した後、前記担体を乾燥する工程
（Ｂ）その後、４００〜１２００℃の範囲の温度で加熱処理する工程
【請求項１２】
前記工程（Ａ）はシリカゲルに金属を飽和状態に結合させる請求項１１に記載の分離媒体製造方法。
【請求項１３】
前記金属は、Ａｌ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｍｇ及びＡｇからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１１又は１２に記載の分離媒体製造方法。
【請求項１４】
さらに、前記工程（Ａ）の前若しくは後又は前記工程（Ｂ）の後の少なくとも何れかにおいて、前記担体にオクタデシルシリル基、オクチル基、ブチル基及びアミノプロピル基からなる群から選ばれる官能基を結合させる工程を含む請求項１１から１３のいずれか一項に記載の分離媒体製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分析化学の分野に関し、特に、試料成分の分離に使用するカラムや前処理用のカートリッジの充填材として使用される分離媒体に関する。本発明は、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を主とする液体クロマトグラフで使用する分析カラムや、分析前の前処理などに使用するカラム（カートリッジ形状を含む。）のような、その分離媒体を用いた装置にも関する。
【背景技術】
【０００２】
分離媒体の用途の１つは液体クロマトグラフ用のカラム充填材である。カラム充填材としては、シリカゲル及びシリカゲルにＯＤＳ（オクタデシルシリル）基などの官能基を結合させたものがよく用いられている。そのような充填材を用いた液体クロマトグラフィーでは、シリカゲル中の残留不純物（主に金属成分）が、分析対象成分のピーク形状の悪化を引き起こしていた。特に金属配位性の高い成分を分析する場合にピークテーリングが起こることから、その原因はシリカゲル中の金属不純物と配位性化合物との二次的相互作用によるものであると考えられている。そのため、シリカゲル又はシリカゲルに官能基を結合させた充填材の合成や、カラムへの充填の際には、できるだけこの金属成分を除去する工夫がなされている。【０００３】
しかし、シリカゲル中の金属不純物を完全に除去することは困難である。そこで、ＯＤＳシリカゲル充填材の場合に、ＯＤＳシリカゲル充填材に対する二次シリル化、すなわち、エンドキャッピングの回数や反応試薬を工夫することによって、ＯＤＳシリカゲル充填材に残ったシラノール基と金属不純物を不活性化する提案がなされている（特許文献１参照。）。そこでは、アミン化合物を用いた一次エンドキャッピング、別のアミン化合物を用いた二次エンドキャッピング、さらに第三級アミンを用いた追加のエンドキャッピングを行っている。【０００４】
現在使用されているＯＤＳシリカゲル充填材のシリカゲル内の金属不純物は一定濃度以下になるように管理されている。例えば、金属として、Ｎａ，Ｃａ，Ｍｇ，Ａｌ，Ｆｅ、Ｔｉなどをそれぞれ１０ｐｐｍ以下、全金属不純物の合計で３０ｐｐｍ以下となるように管理されている（例えば、株式会社島津製作所の製品であるShim-pack）。したがって、通常、全金属不純物の合計３０ｐｐｍ以下という濃度が充填材のシリカゲル内の不純物濃度の基準値である。【０００５】
分離媒体の他の用途としては、分析対象を液体クロマトグラフに供する前に夾雑物などを除去するための前処理を行うカラムの充填材がある。そのような充填材においても分析カラムの充填材と同様の問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２３２８０２号公報
【特許文献２】特表２００６−５０４８５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１記載の方法はＯＤＳシリカゲル充填材に残ったシラノール基と金属不純物を不活性化することによりそれらによる悪影響を除去する上では有効な方法であり、本来のＯＤＳ官能基の機能のみを発揮させようとするものである。そのため、ＯＤＳシリカゲル充填材の機能としてはＯＤＳ基の機能のみが発揮され、それ以外の機能は発揮されない。【０００８】
本発明は、分析対象成分と分離媒体中の金属イオンとの間の相互作用を利用する新しいシリカベースの分離媒体を提供することを目的とするものである。【０００９】
さらに、本発明は、その分離媒体を用いて分析カラムや前処理用カラムを得ること、そのようなカラムを利用して液体クロマトグラフを構成することも目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
分離媒体の残留金属成分を完全に除去するのは困難であるため、本発明は残留金属成分を完全に除去するのではなく、逆にその残留金属成分よりも高濃度に金属成分を導入することにより金属成分を分離特性に影響を与えるように積極的に利用することにより、新たな分離特性をもった分離媒体を得ることができるとの知見を得た。【００１１】
本発明の分離媒体は、シリカゲルである担体又はシリカゲルを成分として含む担体と、前記担体に疎水性を与えるように前記担体に結合した５０ｐｐｍ以上の金属とを含む。本明細書において、上記「金属」は、「金属塩」、「金属イオン」、「金属アコイオン」等と特に別の記載をしない限り、金属塩を構成する金属イオン及び当該金属イオンに由来する金属（例えば、ＦｅＣｌ3におけるＦｅ）を含む概念である。上記「金属」は、少なくとも分離媒体の使用時には、水又は水溶液に浸漬された担体において、金属イオンを与えると考えられる。本明細書において、「金属イオン」は、金属アコイオンを含む概念である。本明細書において、担体に対する「結合」とは、担体構成分子の三次元構造による捕捉のほか、吸着、水素結合等の分子間力による相互作用をも含む概念であり、本明細書における、担体に対する「固定化」と実質的に同義である。【００１２】
通常、液体クロマトグラフの充填材に使用されているシリカゲル内の金属不純物濃度は合計で３０ｐｐｍ以下となるように管理されている。本発明においては、担体に対し、金属不純物よりも高濃度に金属を導入する。従って、本発明における５０ｐｐｍ以上の金属濃度は、担体に導入した金属のみならず、担体に予め不純物として含まれる金属をも含むものであってよく、担体に不純物として含まれる金属の種類及び導入した金属の種類の全ての合計である。金属は担体に飽和状態となる濃度で結合しているのが好ましい。【００１３】
合計で５０ｐｐｍ以上となる金属を構成する各金属の種類は、好ましくは、通常シリカゲルに不純物として含まれる金属の種類であり、例えば、Ａｌ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｍｇ又はＡｇなどを含む。担体に導入する金属の種類は、好ましくは、通常シリカゲルに不純物として含まれる金属の種類から選択し、より好ましくは、Ａｌ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｍｇ及びＡｇからなる群から選ばれる少なくとも１種である。【００１４】
本発明はシリカゲルの残留金属不純物に起因する問題を解決するものであるので、そのような問題をもつ担体はシリカゲルに限らずシリカゲルを成分として含む担体も含む。シリカゲルを成分として含むそのような担体としては、特許文献２に記載されているような無機／有機ハイブリッド粒子を挙げることができる。【００１５】
分離媒体の第１の形態は、担体には、分析対象成分に対してシリカゲルとは異なる親和力を与える官能基が結合していないものである。上記官能基は、ＯＤＳ基等の、後述する分離媒体の第２の形態を特徴づける官能基である。【００１６】
分離媒体の第２の形態は、担体には５０ｐｐｍ以上の金属のほかに分析対象成分に対してシリカゲルとは異なる親和力を与える官能基がさらに結合しているものである。そのような官能基としては、ＯＤＳ基、オクチル基、ブチル基又はアミノプロピル基などを挙げることができる。具体的には、例えばシリカゲルにＯＤＳ基等の官能基を結合させる工程の前後に、担体に金属塩水溶液を添加し、金属もシリカゲルに固定化する。その結果、得られる分離媒体は、金属塩水溶液添加前のシリカゲル中の残留金属量と比較すると圧倒的に多量の金属がシリカゲルに存在することにより、新たな分離選択性を生み、ピーク形状の悪化等も見られない分離媒体となる。【００１７】
エンドキャッピングに関しては、シラノール基の影響を抑えるための通常程度のエンドキャッピングを行うことは排除しない。【００１８】
本発明のカラムは、第１の形態又は第２の形態の分離媒体がチューブに充填されたものである。そのカラムの第１の形態の一例は、第１の形態の分離媒体が充填されオフラインで使用されるカートリッジ形状に構成されたものであり、液体クロマトグラフィーの前処理カラムとして使用するのに適したものである。そのような前処理カラムは、例えば、試料中の分析対象成分を捕捉し夾雑物を排出した後、その捕捉された分析対象成分を溶出させて液体クロマトグラフィーの試料に供するように使用される。【００１９】
そのカラムの第１の形態の他の例は、第１の形態の分離媒体が充填されオンラインで使用されるカラム形状に構成された前処理カラムである。このような前処理カラムは液体クロマトグラフの一構成要素として使用することができる。そのような液体クロマトグラフの一例は、この前処理カラムと、この前処理カラムに試料中の１又は複数の分析対象成分を保持させる第１の溶媒をこの前処理カラムに供給する第１溶媒供給流路と、この前処理カラムに保持された分析対象成分を溶出させる第２の溶媒であって、第１の溶媒とは異なる溶媒をこの前処理カラムに供給する第２溶媒供給流路と、この前処理カラムからの溶出液が流れる流路に接続される分析対象成分分離用の分析カラムと、分析カラムの下流に接続されて分析カラムで分離された分析対象成分を検出する検出器と、第１溶媒供給流路をこの前処理カラムに接続する第１流路と、第２溶媒供給流路をこの前処理カラムに接続しこの前処理カラムからの溶出液流路を分析カラムに接続する第２流路との間で切り換える流路切換え機構とを備えたものである。【００２０】
本発明のカラムの第２の形態は、担体に５０ｐｐｍ以上の金属のほかに分析対象成分に対してシリカゲルとは異なる親和力を与える官能基がさらに結合している第２の形態の分離媒体が充填されオンラインで使用されるカラム形状に構成されたものである。第２の形態のカラムは前処理カラムを備えているか否かに拘わらず、液体クロマトグラフでの分析カラムとして使用することができる。そのような液体クロマトグラフとしては、第１の形態のカラムを前処理カラムとして備えた液体クロマトグラフも含む。【００２１】
本発明の分離媒体は以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を含んで製造する。
（Ａ）シリカゲルである担体又はシリカゲルを成分として含む担体を金属の金属塩水溶液に浸した後、前記担体を乾燥する工程、及び
（Ｂ）その後、４００〜１２００℃の範囲の温度で加熱処理する工程。【００２２】
上記工程（Ａ）における「浸す」は、担体を金属塩水溶液によって十分に湿潤した状態にする方法であれば特に限定されず、例えば、担体を金属塩水溶液に浸漬する方法、カラム又はカートリッジに充填した担体に金属塩水溶液を滴下する方法によるもの等が挙げられる。【００２３】
前記金属は、好ましくは、Ａｌ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｍｇ及びＡｇからなる群から選ばれる少なくとも１種である。【００２４】
得られる分離媒体は、上記加熱処理を施す前よりも疎水性をもつ。シリカゲルに疎水性をもたせる方法としてシリル化が考えられるが、本発明の上記方法は、シリル化剤を使用せずに、シリカゲルの加熱処理（シラノール基の不活性化）による疎水性相互作用と、シリカゲルの表面に存在する金属アコイオンによる陽イオン交換相互作用とを同時にシリカゲルに与える点に特徴がある。【００２５】
一実施形態では、工程（Ａ）はシリカゲルに金属を飽和状態に結合させる。【００２６】
他の実施形態では、工程（Ａ）の前若しくは後又は工程（Ｂ）の後に、担体にオクタデシルシリル基、オクチル基、ブチル基又はアミノプロピル基からなる官能基を結合させる工程をさらに含む。
【発明の効果】
【００２７】
第１の形態の分離媒体は、オクタデシルシリル基などの、分析対象成分に対してシリカゲルとは異なる親和力を与える官能基が担体に結合していないものである。この分離媒体は、疎水性の性質をもち、疎水性相互作用メカニズムによって酸性化合物、中性化合物及び塩基性化合物と相互作用することができる。さらに、シリカゲルの表面上の金属イオンは、酸性の性質をもっており、選択的な静電的相互作用メカニズム（つまり陽イオン交換モード）によって塩基性化合物と相互作用することができる。陽イオン交換相互作用の強さは、Ｆｅ（III）イオン、Ａｌイオン、Ａｇイオン又はＮｉイオン等のそれぞれの酸性度、つまりｐＫａ値に依存するので、金属種を選択することにより金属イオンの酸性度の違いにより静電的相互作用を制御することができる。この結果は、広範囲な塩基性化合物の分析に金属イオン親和クロマトグラフィーを適用できることを意味している。【００２８】
第２の形態の分離媒体は、担体に５０ｐｐｍ以上の金属のほかに分析対象成分に対してシリカゲルとは異なる親和力を与えるＯＤＳ基などの官能基がさらに結合しているものである。この分離媒体が充填された分析カラムを用いて分析することにより、固定化する金属の種類によって、例えば塩基性化合物の保持がより強くなり、一般的なＯＤＳカラムとは異なる選択性を示すようになる。これは分析対象成分である塩基性化合物のｐＫａ値と疎水性に依存すると推測される。また、固定化する金属の種類により、その分離媒体としての挙動も異なるので、分離しようとする分析対象成分に応じて固定化する金属種を異ならせることにより分離の最適化を図ることができる。さらに、移動相の有機溶媒量、緩衝液のｐＨおよび塩濃度等、種々のパラメータを最適化することにより、さらに柔軟な対応が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】分離媒体の一実施形態であるカートリッジを示す断面図である。
【図１Ｂ】分離媒体の他の実施形態であるカラムを示す一部切欠き断面図である。
【図２】一実施例の前処理カラムが実装された液体クロマトグラフを示す流路構成図である。
【図３Ａ】〜
【図３Ｅ】酸性条件下での各種前処理カラムによる分析対象成分ごとの回収率を示すグラフである。
【図４Ａ】〜
【図４Ｅ】中性条件下での各種前処理カラムによる分析対象成分ごとの回収率を示すグラフである。
【図５Ａ】前処理カラムによる酸性条件下での分析対象成分のlogＰと回収率との関係を示すグラフである。
【図５Ｂ】前処理カラムによる中性条件下での分析対象成分のlogＰと回収率との関係を示すグラフである。
【図６Ａ】〜
【図６Ｅ】各種前処理カラムによる分析対象成分ごとの酸性溶媒濃度と回収率との関係を示すグラフである。
【図７Ａ】〜
【図７Ｅ】各種前処理カラムによる分析対象成分ごとの中性溶媒濃度と回収率との関係を示すグラフである。
【図８】一実施例の分析カラムが実装された液体クロマトグラフを示す流路構成図である。
【図９】第１のグラジエント分析における実施例の金属固定化ＯＤＳカラムによるクロマトグラフを比較例のＯＤＳカラムによるクロマトグラフと比較して示す図である。
【図１０】同グラジエント分析における実施例の金属固定化ＯＤＳカラムによるクロマトグラフを比較例のＯＤＳカラムによるクロマトグラフと比較して示す図である。
【図１１】第２のグラジエント分析における実施例の金属固定化ＯＤＳカラムによるクロマトグラフを比較例のＯＤＳカラムによるクロマトグラフと比較して示す図である。
【図１２】同グラジエント分析における実施例の金属固定化ＯＤＳカラムによるクロマトグラフを比較例のＯＤＳカラムによるクロマトグラフと比較して示す図である。
【図１３】第３のグラジエント分析における実施例の金属固定化ＯＤＳカラムによるクロマトグラフを比較例のＯＤＳカラムによるクロマトグラフと比較して示す図である。
【図１４】同グラジエント分析における実施例の金属固定化ＯＤＳカラムによるクロマトグラフを比較例のＯＤＳカラムによるクロマトグラフと比較して示す図である。
【図１５】第４のグラジエント分析における実施例の金属固定化ＯＤＳカラムによるクロマトグラフを比較例のＯＤＳカラムによるクロマトグラフと比較して示す図である。
【図１６】同グラジエント分析における実施例の金属固定化ＯＤＳカラムによるクロマトグラフを比較例のＯＤＳカラムによるクロマトグラフと比較して示す図である。
【図１７】移動相に塩としてＫＣｌを添加した場合と添加しなかった場合について、実施例の（Ｆｅ（III）−ＯＤＳカラムによるクロマトグラフを比較例のＯＤＳカラムによるクロマトグラフと比較して示す図である。
【図１８】移動相に塩としてＫＣｌを添加した場合と添加しなかった場合について、実施例の（Ｆｅ（II）−ＯＤＳカラムによるクロマトグラフを比較例のＯＤＳカラムによるクロマトグラフと比較して示す図である。
【図１９】移動相に塩としてＫＣｌを添加した場合と添加しなかった場合について、実施例のＡｌ−ＯＤＳカラムによるクロマトグラフを比較例のＯＤＳカラムによるクロマトグラフと比較して示す図である。
【図２０】移動相に塩としてＫＣｌを添加した場合と添加しなかった場合について、実施例のＡｇ−ＯＤＳカラムによるクロマトグラフを比較例のＯＤＳカラムによるクロマトグラフと比較して示す図である。
【図２１】移動相に塩としてＰＦＰＡを添加した場合と添加しなかった場合について、実施例の（Ｆｅ（III）−ＯＤＳカラムによるクロマトグラフを比較例のＯＤＳカラムによるクロマトグラフと比較して示す図である。
【図２２】移動相に塩としてＰＦＰＡを添加した場合と添加しなかった場合について、実施例のＡｌ−ＯＤＳカラムによるクロマトグラフを比較例のＯＤＳカラムによるクロマトグラフと比較して示す図である。
【図２３】移動相に塩としてＰＦＰＡを添加した場合と添加しなかった場合について、実施例のＡｇ−ＯＤＳカラムによるクロマトグラフを比較例のＯＤＳカラムによるクロマトグラフと比較して示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（第１の実施形態）
分析対象成分に対してシリカゲルとは異なる親和力を与える官能基が担体に結合していない分離媒体：
担体としてシリカゲルを用いる場合、シリカゲルの形態は特に限定されないが、好ましい形態としては、粒子径は１〜３００μｍ、より好ましくは１〜２００μｍ、さらにより好ましくは１〜１５０μｍ、細孔径は２〜１００ｎｍ、より好ましくは３〜３０ｎｍ、比表面積は５０〜８００ｍ2／ｇ、より好ましくは２００〜４００ｍ2／ｇを挙げることができる。上記粒子径は、更に、前処理用には１０〜１００μｍが特に好ましく、分析カラム用には２〜２０μｍが特に好ましい。担体としては無機／有機ハイブリッド粒子を用いてもよい。以下の説明ではシリカゲルを用いる場合について説明するが、無機／有機ハイブリッド粒子を用いる場合も同様である。
【００３１】
担体に金属を結合させる。その方法として、担体をＡｌ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ａｇ等の金属の金属塩水溶液に浸す等接触させ、乾燥させた後に加熱する。上記金属塩としては、ＡｌＣｌ3、ＦｅＣｌ3、ＦｅＣｌ2、ＺｎＣｌ2、ＭｎＣｌ2、ＮｉＣｌ2、ＭｇＣｌ2、ＡｇＮＯ3等が挙げられる。金属塩水溶液は、特に限定されないが、例えば、金属塩の０．０１〜１質量％水溶液、好ましくは０．０５〜０．５質量％水溶液を、担体の乾燥質量として１００質量部に対し、例えば０．２〜２０質量部、好ましくは０．５〜１０質量部の割合で担体に添加し、例えば３〜２４時間、好ましくは５〜１２時間攪拌する。次に、金属を含む担体をガラスフィルタ等で濾過し、水等で洗浄する。得られる担体を例えば８０〜２００℃、好ましくは１００〜１７０℃において、例えば３０分〜１０時間、好ましくは１〜５時間乾燥し、続いて、例えば３００〜１５００℃、好ましくは４００〜１２００℃、より好ましくは４００〜１１００℃において、例えば３０分〜１０時間、好ましくは２〜４時間加熱して分離媒体を得ることができる。
【００３２】
分離媒体を得る具体的な例を示す。塩化第二鉄の０．２％水溶液、塩化アルミニウム６水和物の０．２％水溶液、硝酸銀の０．２％水溶液及び硝酸ニッケルの０．２％水溶液のそれぞれを、別々のシリカゲル（粒径：５０μｍ、気孔サイズ：１２ｎｍ）に加え、５〜１０時間攪拌した。その結果、シリカゲルに金属が飽和状態に結合したと推定される状態となった。次に、金属を含むシリカゲルをガラスフィルタ（３番）で濾過し、２００ｍＬの水で洗浄した。最後に、金属を含むシリカゲルを１５０℃で２時間乾燥し、続いて、４００〜１０００℃で２〜４時間加熱して分離媒体を得た。
【００３３】
このようにして得られる分離媒体を本明細書において「金属−シリカゲル」と表すことがある。具体的な金属として、Ａｌ、Ｆｅ（II）（第１鉄）、Ｆｅ（III）（第２鉄）等の記号が入る。
【００３４】
このようにして得た分離媒体は、試料を液体クロマトグラフに導入する前に夾雑物などを除去するための前処理用の分離媒体として利用することができ、また、液体クロマトグラフの分離分析用の分離媒体として利用することもできる。
【００３５】
前処理用分離媒体としてのひとつの利用形態は、図１Ａに示されるカートリッジ２である。円筒状の本体４の上端に注ぎ口６が設けられ下端に出口８が設けられた筒状の容器に、フィルター１２を介して分離媒体１４が充填されたものである。
【００３６】
カートリッジ２はオフラインで使用するものである。夾雑物を含む試料溶液を注ぎ口６から注入することにより、分析対象成分が分離媒体１４に捕捉され、夾雑物は出口８から排出される。その後、分離媒体１４に捕捉された分析対象成分を溶出させるための溶媒を注ぎ口６から注入することにより、分析対象成分が出口８から溶出されて、夾雑物のない試料溶液となる。
【００３７】
前処理用分離媒体としての他の利用形態は、図１Ｂに示されるようなオンライン用のカラム１６である。カラム１６はステンレス製チューブなどのカラム本体１８に分離媒体２０が充填されたものである。カラム本体１８の両端には液体クロマトグラフの流路に接続するための接続口２２、２４が設けられている。
【００３８】
このようなカラム１６は、前処理カラムだけでなく、液体クロマトグラフで分析対象成分を分離するための分析カラムとしても使用される。分析カラムとして使用するときは、一般に前処理カラムよりも長いものが用いられる。
【００３９】
カラム１６を前処理カラムとして液体クロマトグラフに備えた例を図２に示す。分析対象成分に対してシリカゲルとは異なる親和力を与える官能基が担体に結合していない分離媒体が充填された前処理カラム１６Ａは、流路切換え機構を構成する六方バルブ３０の２つのポート間に接続されている。前処理カラム１６Ａは、ステンレス製のカラム管（長さ１０ｍｍ、内径４．０ｍｍ）に分離媒体を充填したものである。
【００４０】
バルブ３０の他のポートには、前処理カラム１６Ａに分析対象成分を捕捉させ夾雑物などを排出するための前処理用溶媒を供給する流路３５が接続されている。その流路３５には、溶媒３６Ａを供給するポンプ３８Ａからなる流路と、溶媒３６Ｂを供給するポンプ３８Ｂからなる流路が並列に接続されている。流路３５には試料溶液を注入するインジェクタ４０が設けられている。
【００４１】
バルブ３０のさらに他のポートには液体クロマトグラフの分析カラム３２が接続されている。分析カラム３２はカラムオーブン（図示せず。）に収容されて一定温度に保たれている。分析カラム３２の下流には分析カラム３２から溶出した分析対象成分を検出する紫外可視分光光度計などの検出器３４が接続されている。分析カラム３２は前処理カラム１６Ａよりも長く、分析カラム３２内には前処理カラム１６Ａとは異なる別の分離媒体が充填されている。分析カラム３２の分離媒体は、特に限定されず、例えば、後述の第２の実施形態である、シリカゲルに金属とＯＤＳなどの官能基を結合させた分離媒体であってもよいが、図２における液体クロマトグラフ装置では、シリカゲルに官能基としてＯＤＳが結合された逆相クロマトグラフィー用カラムである。
【００４２】
前処理カラム１６Ａに捕捉された分析対象成分を溶出して分析カラム３２に導くために、バルブ３０のさらに他のポートには分析用溶媒を供給する流路４１が接続されている。その流路４１は、２種類の溶媒によるグラジエント分析を行うことができるように、溶媒４２Ａを供給するポンプ４４Ａからなる流路と、溶媒４２Ｂを供給するポンプ４４Ｂからなる流路が並列に接続されている。
【００４３】
バルブ３０のさらに他のポートは液を排出するドレイン用ポートとなっている。
【００４４】
前処理カラムに試料溶液とともに供給する溶媒は、何種類を用いてもよく、例えば１〜５種類の溶媒を用いることができる。かかる溶媒としては、試料成分に適切であれば特に限定されないが、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液等が挙げられ、必要に応じ、アセトニトリル、メタノール、エタノール等の有機溶媒との混合液（体積比は、有機溶媒：水＝９０：１０〜１：９９が好ましく、８０：２０〜２０：８０がより好ましい。）を用いることができる。上記溶媒の供給は、例えば０．５〜２０ｍＬ／分、好ましくは１〜１０ｍＬ／分の流量により、例えば０．２〜１０分間、好ましくは１〜５分間行う。
【００４５】
図２における液体クロマトグラフ装置では、前処理として溶媒３６Ａ又は３６Ｂがそれぞれのポンプ３８Ａ又は３８Ｂにより供給され、インジェクタ４０から試料溶液が注入される。試料溶液は前処理カラム１６Ａを経てドレインへ流れる。その間に分析対象成分が前処理カラム１６Ａに捕捉され、夾雑物が排出される。前処理中も液体クロマトグラフの分析流路を安定化させるために、流路４１から分析カラム３２へ溶媒を一定流量で流す。
【００４６】
前処理終了後、バルブ３０が切り換えられ、流路４１から分析用溶媒が前処理カラム１６Ａを経て分析カラム３２に流される。これにより、前処理カラム１６Ａに捕捉されていた分析対象成分が分析用溶媒により溶出されて分析カラム３２に導入される。分析カラム３２で分離された分析対象成分は検出器３４で検出される。分析用溶媒によるグラジエント分析は、行わなくてもよいが、図２における液体クロマトグラフ装置では、ポンプ４４Ａと４４Ｂを時間的に調節することにより、その混合比を変化させ、グラジエント分析を行うことができる。
【００４７】
溶媒の具体的な例を示す。溶媒３６Ａとして酢酸アンモニウム５ｍｍｏｌ／Ｌの水溶液、又は酢酸０．１％の水溶液を使用し、溶媒３６Ｂ（図３〜図７ではＭ４と表示されている。）として酢酸アンモニウム５ｍｍｏｌ／Ｌを含むアセトニトリルと水の混合液（体積比６：４）、又は酢酸０．１％を含むアセトニトリルと水の混合液（体積比６：４）を使用する。前処理は溶媒３６Ａ又は３６Ｂを均一濃度で流量２ｍＬ／分で１分間流す。
【００４８】
溶媒４２Ａとしてトリフルオロ酢酸の０．１％水溶液を使用し、溶媒４２Ｂとしてトリフルオロ酢酸０．１％を含むアセトニトリルと水の混合液（体積比６：４）を使用する。これらの溶媒は、１ｍＬ／分の流量でグラジエント溶離モードで導入する。グラジエント条件は、溶媒４２Ｂの濃度を１２分間で０から１００％に変化させる条件と、溶媒４２Ｂの濃度を３分間で０から１００％に変化させる条件とする。
【００４９】
分析カラム３２としてＯＤＳカラム（長さ１５０ｍｍ、内径４．６ｍｍ、シリカゲル粒径５μｍ）を使用し、カラム温度を４０℃とする。インジェクタ４０への試料注入量を１０μＬとする。検出器３４では２８０ｎｍでの紫外線吸光度を測定する。
【００５０】
（第１の形態のシリカゲルの評価）
図２に示した液体クロマトグラフ装置により、その前処理カラム１６Ａとして使用した分離媒体の保持特性を評価した。評価には回収率を求める方法を採用した。回収率は次のように求めた。モデル化合物を試料として注入し、前処理カラム１６Ａに捕捉した後、バルブ３０を切り換えて分析カラム３２で分離して検出器３４で検出したときの各モデル化合物のピーク面積（Ａ）と、前処理カラム１６Ａを経ないでモデル化合物を分析カラム３２へ導入し分離して検出器３４で検出したときの各モデル化合物のピーク面積（Ｂ）とを測定する。回収率は次の式により求めた。
回収率（％）＝（Ａ／Ｂ）×１００
【００５１】
第１の形態のシリカゲルとして、加熱処理された５種類のＦｅ（III）−シリカゲルを使用した。加熱処理条件は次の５種類である。
（１）１０００℃で４時間
（２）１０００℃で２時間
（３）８００℃で２時間
（４）６００℃で２時間
（５）４００℃で２時間
【００５２】
比較のために、金属を含まず加熱処理もされていないシリカゲル（コントロールという。）も分離媒体として回収率を測定した。金属を含まないというのは、実施例のように意図的に金属を含ませないという意味であり、不純物として３０ｐｐｍ程度の金属が含まれていてもよい。
【００５３】
回収率は５つのモデル化合物（酸性化合物、中性化合物及び塩基性化合物）について求めた。図３−４、６−７において、（Ａ）から（Ｅ）はそれぞれ次のモデル化合物を表わす。
【００５４】
（酸性化合物）
（Ａ）ケトプロフェン（Ketoprofen：pKa = 3.9, logＰ = 2.911）
（中性化合物）
（Ｂ）プロピルパラベン（Propyl paraben：logＰ = 2.901）（塩基性化合物）
（Ｃ）トリメトプリム（Trimethoprim：pKa = 7.1, logＰ = 0.79）
（Ｄ）ドネペジル（Donepezil：pKa = 9.4, logＰ = 3.913）
（Ｅ）イミプラミン（Imipramine：pKa = 9.4, logＰ = 4.355）
【００５５】
前処理の移動相を酸性条件（溶媒３６Ａが酢酸０．１％水溶液、溶媒３６Ｂが酢酸０．１％を含むアセトニトリルと水の混合溶液で、溶媒３６Ｂの割合を０〜４０％の範囲で変化させた。ｐＨは約４）としたときの結果を図３Ａ〜図３Ｅに示し、前処理の移動相を中性条件（溶媒３６Ａが酢酸アンモニウム５ｍｍｏｌ／Ｌ水溶液、溶媒３６Ｂが酢酸アンモニウム５ｍｍｏｌ／Ｌを含むアセトニトリルと水の混合溶液で、溶媒３６Ｂの割合を０〜４０％の範囲で変化させた。ｐＨは約７）としたときの結果を図４に示す。
【００５６】
Ｆｅ（III）−シリカゲルは、コントロールに比べて、何れのモデル化合物についても回収率の増加を示したが、特に３つの塩基性化合物（トリメトプリム、ドネペジルおよびイミプラミン）について、回収率の増加は著しく、酸性条件下でその傾向は強かった。
【００５７】
また、酸性条件下でも中性条件下でも、モデル化合物の回収率はＦｅ（III）−シリカゲルの加熱処理の温度が高くなるほど増加した。
【００５８】
上記の結果は、シリカゲルを加熱処理することによりシリカゲルの表面の疎水性が増加すること、また、当該疎水性は加熱処理の温度が高くなると増加することを示す。
【００５９】
以上から、酸性条件下でも中性条件下でも、加熱処理されたシリカゲルによるモデル化合物の回収率は、当該シリカゲルとの疎水性相互作用によって増加するといえる。
【００６０】
ケトプロフェンは、中性条件下よりも酸性条件下で回収率が増加した。この結果は、ケトプロフェンは中性条件下では、疎水性を減少させ、Ｆｅ（III）アコイオンによって反発される陰イオンとして存在することを示す。
【００６１】
次に、加熱処理（１０００℃で２時間）されたＦｅ（III）−シリカゲルを用い、移動相を酸性条件（Ａ）と中性条件（Ｂ）で溶媒３６Ｂの濃度を２０％としたときの各種モデル化合物の回収率を、モデル化合物のlogＰとの関係において、図５に示す。高い疎水性（高いlogＰ）の塩基性化合物であるドネペジルとイミプラミン、及び、低い疎水性（低いlogＰ）の塩基性化合物であるトリメトプリムは何れも高い回収率を示した。酸性化合物と中性化合物は、トリメトプリムよりもlogＰが高いにも拘わらず、加熱処理されたＦｅ（III）−シリカゲルにはほとんど保持されなかった。
【００６２】
以上から、Ｆｅ（III）−シリカゲル中の金属イオンは酸性であり、回収率がlogＰ値に対する依存性を示さなかったことからも、塩基性化合物は陽イオン交換モードと同様の静電的相互作用の機構により選択的に保持されるといえる。
【００６３】
以上のように、３つの塩基性化合物は、疎水性相互作用と陽イオン交換相互作用の両方により、回収率が著しく増加する。特に、ドネペジルとイミプラミンは、トリメトプリムより高いｐＫａ値をもち、陽イオン交換相互作用により強く保持される。
【００６４】
３つの塩基性化合物は、酸性条件下よりも中性条件下でより高い回収率を示した。これは、中性条件下での塩基性化合物の疎水性の増加、加熱処理されたシリカゲルの表面の疎水性の増加、及び塩基性化合物とＦｅ（III）イオンとの間の陽イオン交換相互作用によるものと推定される。もっとも、中性条件下では、加熱処理されたＦｅ（III）−シリカゲル上の金属イオンと塩基性化合物との間の陽イオン交換相互作用よりも、塩基性化合物の疎水性の増加による効果が大きい。
【００６５】
次に、異なる酸性度（すなわちｐＫａ値）の金属イオン（金属種はＦｅ（III）、Ａｌ、ＡｇおよびＮｉ）と塩基性化合物との間の相互作用に関し、１０００℃で２時間の加熱処理を施した金属−シリカゲルを用いて、５つのモデル化合物の回収率を測定した。前処理に酸性移動相を使用した酸性条件下での結果を図６に、中性移動相を使用した中性条件下での結果を図７にそれぞれ示す。
【００６６】
３つの塩基性化合物は、酸性条件下と中性条件下での前処理において、加熱処理された金属−シリカゲル（金属種はＦｅ（III）、Ａｌ、ＡｇまたはＮｉ）で様々な回収率を示した。加熱処理されたＦｅ（III）−シリカゲルは、酸性条件下では塩基性化合物で最も高い回収率を示した。一方、すべての加熱処理された金属−シリカゲルは、酸性条件下よりも中性条件下の方が塩基性化合物の回収率が高くなった。
【００６７】
これらの結果は、金属アコイオンと塩基性化合物との間の相互作用の程度はＦｅ（III）、Ａｌ、ＡｇおよびＮｉの各アコイオンの酸性度が影響することを示している。尚、金属アコイオンは種々のｐＫａ値を示す。ｐＫａ値は金属イオンのサイズ及び電荷に依存し、さらに元素の電気陰性度に依存する。一般に、金属イオンのサイズが小さくなるほど、またサイズが同じであれば電荷が大きくなるほど、金属イオンはより酸性になる。元素の電気陰性度が高くなるほど金属イオンは酸性になる。Ｆｅ（III）、Ａｌ、ＡｇおよびＮｉの各アコイオンのｐＫａ値はそれぞれ２.２、５.０、１２.０および９.９であることが知られている。
【００６８】
したがって、加熱処理された金属−シリカゲルの金属アコイオン（特にＦｅ（III）アコイオン）を使用すると、塩基性化合物は静電的相互作用（つまり陽イオン交換モード）によって保持され、移動相のｐＨにより疎水性相互作用によっても保持される。例えば、酸性条件（０．１％の酢酸；ｐＨは約４）下では疎水性相互作用によっても保持される。
【００６９】
それぞれの加熱処理された金属−シリカゲルをオンライン固体抽出カラムとし、それぞれに試験溶液を注入したが、クロマトグラフィー性能の低下もカラム圧力の目立った変化も見られなかった。これらの結果は、それらの加熱処理された金属−シリカゲルは十分な安定性と再利用可能性をもっていることを示している。
【００７０】
上述の結果からわかることは、これらの加熱処理された金属−シリカゲルは、ミックスモード逆相−陽イオン交換ＨＰＬＣカラムとして使用すれば、疎水性のアルキル鎖とイオン性官能基に適応できるということである。従来は、ミックスモードのＨＰＬＣは、ＯＤＳ固定相をもつカラムと陽イオン交換固定相をもつカラムの２つのカラムを接続したり、逆相固定相とイオン交換固定相の２種類の固定相を１つのカラム内で混合したり、又はアルキル鎖中のイオン化可能な官能基をシリカベースの担体に化学的に結合させたりすることによって実現されてきた。
【００７１】
そこで、加熱処理された金属−シリカゲルの代表として、加熱処理（１０００℃で２時間）されたＦｅ（III）−シリカゲルを用い、そのミックスモード逆相−陽イオン交換についての能力を検討した。カラム切換え式ＨＰＬＣシステムで前処理用移動相として酸性移動相（０．１％酢酸をむ水溶液）と中性移動相（５ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸アンモニウムを含む水溶液）を用い、試料として濃度０．５ｍｇ／ｍＬのイミプラミン溶液を使用した。加熱処理されたＦｅ（III）−シリカゲルに注入したイミプラミンの量とピーク面積との関係を調べた。その結果、酸性移動相を使用した場合も中性移動相を使用した場合も、イミプラミンの量とピーク面積の関係は注入量２５μｇまでほとんど直線的であった。その結果、加熱処理された金属−シリカゲルは、塩基性化合物用のミックスモード逆相−陽イオン交換に対して十分な能力をもっていることがわかる。
【００７２】
（第２の実施形態）
シリカゲルに金属とＯＤＳなどの官能基を結合させた分離媒体：
担体としてシリカゲルを用いる場合、シリカゲルの形態は特に限定されないが、化学修飾を効率的に行うことのできるものであることが好ましい。シリカゲルのそのような好ましい形態としては、粒子径は１〜２００μｍ、より好ましくは１〜１５μｍ、細孔径は４〜１００ｎｍ、より好ましくは４〜３０ｎｍ、比表面積は５０〜８００ｍ2／ｇ、より好ましくは２００〜４００ｍ2／ｇを挙げることができる。担体としては無機／有機ハイブリッド粒子を用いてもよい。以下の説明ではシリカゲルを用いる場合について説明するが、無機／有機ハイブリッド粒子を用いる場合も同様である。
【００７３】
シリカゲルに金属を結合させる。その方法として、シリカゲルとＡｌ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｍｇ又はＡｇの金属塩水溶液を接触させ、乾燥させた後に加熱する。そのような金属塩としては、ＡｌＣｌ3、ＦｅＣｌ3、ＦｅＣｌ2、ＺｎＣｌ2、ＭｎＣｌ2、ＮｉＣｌ2、ＭｇＣｌ2、ＡｇＮＯ3などを挙げることができる。
【００７４】
シリカゲルにオクタデシルシリル基、オクチル基、ブチル基、シアノプロピル基又はアミノプロピル基等の官能基を結合させる。シリカゲルにオクタデシルシリル基等の官能基を結合させる反応はカラム充填材製造分野ではよく知られた方法である。例えば、オクタデシルシリル基を結合させる場合を説明すると以下のようになる。トルエンなどの非極性溶媒中でモノクロロジメチルオクタデシルシラン等のシリル化剤とシリカゲルを混合し、還流しながら反応させる。使用溶媒、温度、時間、触媒添加の有無などによって反応収率は異なる。また、シリル化剤の種類によって結合形式が異なるが、ここではそれらを制限しない。
【００７５】
このようにして得られた分離媒体を液体クロマトグラフ用カラム充填材として使用する場合は、通常エンドキャッピング処理をすることが多い。エンドキャッピング処理法はカラム充填材製造分野でよく知られた方法であるが、エンドキャッピング処理の有無、および、その方法については制限しない。
【００７６】
シリカゲルに金属を結合させる工程とシリカゲルに官能基を結合させる工程は、いずれを先に行ってもよい。また、結合をより強固にするために、これらの工程を複数回行ってもよい。
【００７７】
実施例（１）として、さらに具体的に示す。シリカゲル粒子を約２ｇはかりとる。シリカゲル粒子は特に限定されるものではないが、例えば平均粒子径５μｍ、平均細孔径１２ｎｍ、平均比表面積３５０ｍ2／ｇのものである。
【００７８】
これに適当な濃度（例えば、０．２重量％）の金属塩（例えば、塩化第二鉄、又は塩化アルミニウム）水溶液を２００ｍＬ加える。この溶液を６〜１２時間攪拌した後、洗浄し、ろ過してシリカゲル粒子を捕集する。このシリカゲル粒子を約１５０℃で２時間程度乾燥させる。さらに、５００〜１２００℃で２〜５時間程度加熱する。金属塩水溶液の濃度及び添加量は厳密でなくてもよい。これらを変化させることにより、シリカゲルに対する金属の量を調節することは可能であるが、シリカゲルに残存する微量金属の影響を小さくするためには、飽和状態まで結合させることが好ましい。そのため、シリカゲルに金属を結合させる工程において、シリカゲルに対して金属が過剰になるように添加するだけで、所期の目的を達成させる金属固定化ＯＤＳ分離媒体を調製することができる。
【００７９】
固定化された金属はシリカゲルの表面に結合していればよい。シリカゲルは多孔質であるので、表面とはその外表面だけでなく、細孔内側の表面も含む。しかし、金属はシリカゲル結晶の内部にまで入っている必要はない。上に示した金属濃度は内部に取り込まれた金属も含めた平均としての金属濃度である。平均濃度が充填材の特性と直接に関係するものではない。
【００８０】
このようにして金属を固定化したシリカゲル粒子に、一般的な方法でオクタデシル基などのような官能基を結合させることにより、実施例（１）の分離媒体を調製する。シリカゲル粒子にオクタデシル基を官能基として結合させる一般的な方法として、例えばシリカゲルにトリエトキシオクタデシルシランを反応させる。
【００８１】
このようにして得られる実施例（１）の分離媒体は金属固定化ＯＤＳ分離媒体であり、これを以下「ＭＡｑＣ−ＯＤＳ」と表示することがある。金属を示すＭＡｑＣの具体的な金属として、Ａｌ、Ｆｅ（II）（第１鉄）、Ｆｅ（III）（第２鉄）などの記号が入る。実施例のＭＡｑＣ−ＯＤＳ分離媒体に対し、比較例として金属を固定化していないＯＤＳ分離媒体を使用する。比較例のＯＤＳ分離媒体は金属を結合させる工程を経ていない点で実施例の分離媒体と異なっている。
【００８２】
実施例（２）として、前処理カラムやカートリッジに使用するのに適する分離媒体を調製した。シリカゲル粒子を約２ｇはかりとる。シリカゲル粒子は特に限定されるものではないが、例えば平均粒子径５０μｍ、平均細孔径１２ｎｍ、平均比表面積３５０ｍ2／ｇのものである。このシリカゲル粒子は実施例（１）のものと比較すると、平均粒子径が大きい。
【００８３】
これに適当な濃度（例えば、０．２重量％）の金属塩（例えば、塩化第二鉄、又は塩化アルミニウム）水溶液を２００ｍＬ加える。この溶液を５〜１０時間接絆した後、水およびメタノールで洗浄し、ろ過してシリカゲル粒子を捕集する。このシリカゲル粒子を約１５０℃で２時間程度乾燥させる。
【００８４】
実施例（３）としては、実施例（１）の分離媒体にさらにオクタデシル基などのような官能基を結合させ、分離媒体を調製する。
【００８５】
この分離媒体も金属固定化ＯＤＳ分離媒体であり、これも以下「ＭＡｑＣ−ＯＤＳ」と表示することがある。金属を示すＭＡｑＣの具体的な金属として、Ａｌ、Ｆｅ（II）（第１鉄）、Ｆｅ（III）（第２鉄）などの記号が入る。本発明に係るＭＡｑＣ−ＯＤＳ分離媒体に対し、比較例として金属を固定化していないＯＤＳ分離媒体を使用する。比較例のＯＤＳ分離媒体は金属を結合させる工程を経ていない点で本発明に係るものと異なっている。
【００８６】
本発明に係る分離媒体と比較例の分離媒体を従来から用いられている方法により空カラムに充填することにより、ＨＰＬＣ用カラムを製作する。
【００８７】
＜ＨＰＬＣ用カラムの特徴＞
上記の方法で製作したカラムの保持特性を比較例のＯＤＳ分離媒体を充填したＯＤＳカラムと比較して示すために、それらのカラムをＨＰＬＣ装置に装着した。そのＨＰＬＣ装置の一例の流路構成図を図８に示す。分析流路６８上に、上流側から送液ポンプ５４、オートサンプラ５２、分析カラム１６Ｂ及び検出器５８が接続されている。送液ポンプ５４は２つのポンプ５４Ａ，５４Ｂを備え、ポンプ５４Ａの吸引側は移動相６２Ａを収容した容器に、ポンプ５４Ｂの吸引側は移動相６２Ａとは異なる移動相６２Ｂを収容した容器にそれぞれデガッサ６４を介して接続されている。分析カラム１６Ｂとして、本発明に係るカラム又は比較例のＯＤＳカラムを使用する。
【００８８】
ポンプ５４Ａ，５４Ｂの吐出側はともにミキサ６６に接続されている。ミキサ６６の下流側にはオートサンプラ５２が接続され、分析流路６８中に試料が注入される。オートサンプラ５２の下流側に接続された分析カラム１６Ｂはカラムオーブン５６内に収容されて一定温度に保持され、オートサンプラ５２により注入された試料を成分ごとに分離する。分析カラム１６Ｂの下流側に接続された検出器５８は分析カラム１６Ｂを経た液の光学的測定を行なうものである。検出器５８としては紫外吸光度検出器が使用されている。
【００８９】
ここに示したＨＰＬＣ装置は一例であり、本発明のカラムが使用される液体クロマトグラフは図８に示されたものに限られない。
【００９０】
また、本発明の分離媒体は、注入した試料を前処理した後に分析カラムに導くトラップカラムの充填材としても利用可能であり、トラップ注入方式の装置構成とすることも当然に可能である。
【００９１】
図８のＨＰＬＣ装置において、以下の条件で分析してクロマトグラムを得た。ここでの分析条件は、逆相モードでよく使用されるものである。
【００９２】
カラム１６Ｂ：内径４.６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ
ＨＰＬＣでの分析条件は次の通りである。
移動相：Ａ液（後述）
Ｂ液（後述）
グラジエントプログラム：
Ｂ液濃度：０％（０分）→１００％（１２分）
移動相流量：１.０ｍＬ／分
検出：波長２８０ｎｍ
カラム温度：４０℃
【００９３】
試料：以下の８成分がそれぞれ６２.５μｇ／ｍＬの濃度で含まれている。
（中性化合物）
（１）メチルパラベン
（２）プロピルパラベン（酸性化合物）
（３）安息香酸
（４）ケトプロフェン
（塩基性化合物）
（５）トリメトプリム
（６）イミプラミン
（７）アゼラスチン
（８）ドネペジル
【００９４】
ＨＰＬＣのインジェクタへの試料注入量：１０μＬ
【００９５】
クロマトグラムの説明：
カラム充填材の種類は各図中に示されている。図中のCapcell Pack ODSは金属が固定化されていないＯＤＳ充填材で株式会社資生堂の商品、ＯＤＳは本発明に係る分離媒体の製造方法における金属固定化の工程を省略して製造したものである。Capcell Pack ODSとＯＤＳのクロマトグラムは比較例として示したものである。
【００９６】
各クロマトグラムにおいて、ピークに付された数字は試料中の上記の成分を表わしている。各クロマトグラムの横軸は時間を表わし、最大（右端）の目盛は２０分である。クロマトグラムの縦軸は吸光度（ｍＡＵ）であり、各クロマトグラムのフルスケールは２００ｍＡＵである。これらのクロマトグラムで重要なのはピークが現れる順序、すなわち分析対象成分である化合物の溶出順序であり、保持時間とピーク高さの絶対値ではない。図９〜図２３は主として化合物の溶出順序を示すためのものである。
【００９７】
図９から図１６のクロマトグラムを得た移動相Ａ液とＢ液は次の通りである。
図９〜図１０：
Ａ液：水／酢酸＝１０００／１（Ｖ／Ｖ）
Ｂ液：アセトニトリル／水／酢酸＝６００／４００／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）
移動相の成分比率のＶは体積、Ｗは重量を表わしている。
図１１〜図１２：
Ａ液：水／酢酸＝１０００／１（Ｖ／Ｖ）
Ｂ液：アセトニトリル／水／ＴＦＡ＝６００／４００／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）
ＴＦＡはトリフルオロ酢酸である。
図１３〜図１４：
Ａ液：水／リン酸＝１０００／１（Ｖ／Ｖ）
Ｂ液：アセトニトリル／水／リン酸＝６００／４００／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）
図１５〜図１６：
Ａ液：水／酢酸アンモニウム＝１０００／０.７７（Ｖ／Ｗ）
Ｂ液：アセトニトリル／水／酢酸アンモニウム＝６００／４００／０.７７（Ｖ／Ｖ／Ｗ）
【００９８】
図９から図１６のクロマトグラムにおいて、金属を固定化していないＯＤＳカラムと固定化したＯＤＳカラムによるクロマトグラムと比較すると、移動相の種類にも依存するが、塩基性化合物に対する保持が選択的に強くなる傾向がみられる。特にＦｅ（III）、Ｆｅ（II）又はＡｌを固定化したＯＤＳカラムを用いた場合に顕著になる。移動相によっては塩基性化合物の保持が強すぎて溶出されなくなる場合もある。
【００９９】
金属の種類によっては塩基性化合物に対して選択的に保持力が強くなる傾向は顕著ではないものもあるが、それでも分析対象成分の溶出順序が比較例のＯＤＳカラムによるクロマトグラムとは異なっており、保持特性に対する固定化金属の効果が表れているということができる。
【０１００】
このように固定化させる金属種ごとに保持挙動が異なるので、様々な保持特性をもつカラムが製作可能となる。このことは分離しようとする成分に適したカラムを得る選択肢が広くなることを意味する。
【０１０１】
本発明に係る金属固定化ＯＤＳ分離媒体を用いたカラムは、移動相に塩を添加することによっても異なる保持特性を示すようになる。次に移動相中の塩の効果について示す。添加する塩としては、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、（ＮＨ4）2ＳＯ4、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸：キレート化剤）、ＰＦＰＡ（パーフルオロプロピオン酸：ペアードイオン試薬）などを用いることができる。そのうち、移動相にＫＣｌとＰＦＰＡをそれぞれ添加した場合の効果を図１７から図２３に示す。
【０１０２】
クロマトグラムの説明：
カラム充填材の種類、塩の種類及びその濃度は各図中に示されている。図中のＯＤＳ−ｏｎｌｙは本発明に係るＯＤＳ分離媒体の製造方法における金属固定化の工程を省略して製造したものであり、比較例として示したものである。
【０１０３】
図１７から図２３のクロマトグラムを得た移動相Ａ液とＢ液は次の通りである。
Ａ液：水／酢酸＝１０００／１（Ｖ／Ｖ）
Ｂ液：アセトニトリル／水／酢酸＝６００／４００／１（Ｖ／Ｖ）
塩はＢ液中に添加されており、その濃度は図中に記載されている。
【０１０４】
カラムのサイズ、ＨＰＬＣでの分析条件及び試料は図９から図１６のクロマトグラムを得たときのものと同じである。
【０１０５】
図１７から図２３の結果から明らかなように、例えば、逆相モードにおいて、移動相に塩を添加することにより、保持の強い塩基性化合物を溶出させることができる。つまり、本発明に係る金属固定化ＯＤＳ分離媒体を充填したカラムは移動相に塩を添加することによりその保持特性を制御できることがわかる。例えば、通常のＯＤＳカラムでは十分に分離できない成分に対し、固定化する金属の種類を選ぶことにより、さらに移動相に適当な塩を添加することにより分離させることができるようになるなど、多様な分析に寄与することができる。
【０１０６】
この分離媒体を充填した分析カラムの保持挙動は、逆相モードと陽イオン交換モードの両方を有し、また、上述のように固定化する金属種を変えることにより保持挙動も異なるので、分離モードに対する様々な要求に対応できる。陽イオン交換モードが発揮されていることは、例えば図１７から推測できる。“Ｃｏｌｕｍｎ：ＯＤＳ−Ｏｎｌｙ，ＫＣｌ＝０ｍＭ”と“Ｃｏｌｕｍｎ：ＯＤＳ−Ｏｎｌｙ，ＫＣｌ＝１０ｍＭ”を比較すると、両者のクロマトグラムにはほとんど変化がないのに対し、“Ｃｏｌｕｍｎ：Ｆｅ(III)−ＯＤＳ，ＫＣｌ＝０ｍＭ”と“Ｃｏｌｕｍｎ：，Ｆｅ(III)−ＯＤＳ，ＫＣｌ＝１０ｍＭ”を比較すると、ＫＣｌ＝０ｍＭでは溶出していなかった塩基性化合物が、ＫＣｌ＝１０ｍＭで塩を添加することにより溶出している。この結果は陽イオン交換モードが働いていることを示している。
【０１０７】
以上、本発明に係る金属固定化ＯＤＳ分離媒体を充填材としたカラムを液体クロマトグラフ装置に備えた構成に基づいて説明をしたが、このような特性を有する分離媒体はオフラインでの利用も可能である。オフラインで利用する場合は、本発明に係る分離媒体をカラム充填材として利用する場合よりも少し粒子径を大きく調整し、カートリッジとして使用することが好ましい。粒子径を大きくすれば、カートリッジへの通液のための大きな圧力は必要なく、シリンジ等の手操作による前処理も可能となる。ある成分に対して強い保持力を示すカートリッジを選択して使用することで、分析対象からその成分を除去する前処理カートリッジとして利用できる。オフラインであるため流路の組み替えも不要であり、条件検討が容易となる。
【符号の説明】
【０１０８】
２      カートリッジ
１４，２０      分離媒体
１６      カラム
１６Ａ      前処理カラム
１６Ｂ，３２    分析カラム
３０      六方バルブ
３４，５８      検出器
３５      前処理用溶媒を供給する流路
４０      インジェクタ
５２      オートサンプラ
６８      分析流路
【図１Ａ】
2014061723.tif 000003
【図１Ｂ】
2014061723.tif 000004
【図２】
2014061723.tif 000005
【図３Ａ】
2014061723.tif 000006
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年2月15日(2016.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカゲルである担体又はシリカゲルを成分として含む担体と、
前記担体に疎水性を与えるように前記担体に結合した５０ｐｐｍ以上の金属と、を含む分離媒体であって、
前記金属は、Ａｌ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｍｇ及びＡｇからなる群から選ばれる少なくとも１種であり、
該分離媒体は分析対象成分に対して疎水性相互作用と陽イオン交換相互作用の両方を行う分離媒体。
【請求項２】
前記金属は前記担体に飽和状態となる濃度で結合している請求項１に記載の分離媒体。
【請求項３】
前記担体には、分析対象成分に対してシリカゲルとは異なる親和力を与える官能基が結合していない請求項１又は２に記載の分離媒体。
【請求項４】
前記担体には前記金属のほかに分析対象成分に対してシリカゲルとは異なる親和力を与える官能基がさらに結合している請求項１又は２に記載の分離媒体。
【請求項５】
前記官能基はオクタデシルシリル基、オクチル基、ブチル基及びアミノプロピル基からなる群から選ばれる１種である請求項４に記載の分離媒体。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の分離媒体がチューブに充填されたカラム。
【請求項７】
請求項３に記載の分離媒体が充填され注ぎ口と出口をもつカートリッジ形状に構成された請求項６に記載のカラム。
【請求項８】
請求項３に記載の分離媒体がカラム本体に充填され前記カラム本体の両端に流路への接続口をもつカラム形状に構成された請求項６に記載のカラムからなる前処理カラムと、
前記前処理カラムに試料中の１又は複数の分析対象成分を保持させる第１の溶媒を前記前処理カラムに供給する第１溶媒供給流路と、
前記前処理カラムに保持された分析対象成分を溶出させる第２の溶媒であって、前記第１の溶媒とは異なる溶媒を前記前処理カラムに供給する第２溶媒供給流路と、
前記前処理カラムからの溶出液が流れる流路に接続される分析対象成分分離用の分析カラムと、
前記分析カラムの下流に接続されて前記分析カラムで分離された分析対象成分を検出する検出器と、
前記第１溶媒供給流路を前記前処理カラムに接続する第１流路と、前記第２溶媒供給流路を前記前処理カラムに接続し前記前処理カラムからの溶出液流路を前記分析カラムに接続する第２流路との間で切り換える流路切換え機構と、
を備えた液体クロマトグラフ。
【請求項９】
前記分析カラムは請求項４又は５に記載の分離媒体がカラム本体に充填され前記カラム本体の両端に流路への接続口をもつカラム形状に構成された請求項６に記載のカラムからなる請求項８に記載の液体クロマトグラフ。
【請求項１０】
以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を含んで請求項１又は２に記載の分離媒体を製造する方法。
（Ａ）シリカゲルである担体又はシリカゲルを成分として含む担体１００質量部を金属の０．０１〜１質量％金属塩水溶液０．２〜２０質量部に浸した後、前記担体を乾燥する工程
（Ｂ）その後、４００〜１２００℃の範囲の温度で加熱処理する工程
【請求項１１】
前記工程（Ａ）はシリカゲルに金属を飽和状態に結合させる請求項１０に記載の分離媒体製造方法。
【請求項１２】
前記金属は、Ａｌ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｍｇ及びＡｇからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１０又は１１に記載の分離媒体製造方法。
【請求項１３】
さらに、前記工程（Ａ）の前若しくは後又は前記工程（Ｂ）の後の少なくとも何れかにおいて、前記担体にオクタデシルシリル基、オクチル基、ブチル基及びアミノプロピル基からなる群から選ばれる官能基を結合させる工程を含む請求項１０から１２のいずれか一項に記載の分離媒体製造方法。
【国際調査報告】
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