(57)【要約】アスタキサンチンを含むカロテノイドを産生する微生物の培養物から、低級アルコールという従来知られた溶媒を用いた簡易な工程で抽出及び精製を行なうにも拘わらず、カロテノイドの分解を抑え、高い含有量のアスタキサンチン及び高純度のカロテノイドを含有し、且つ良好な結晶性状を有するカロテノイド含有組成物を得る方法を開発した。更に、アスタキサンチンの異性化を促進する簡易な工程を追加することで、カロテノイドの収量を向上させることに成功した。
2014054669.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスタキサンチンを含むカロテノイドを産生する微生物を培養して得られる培養物を、炭素数１〜３のアルコールを用いて抽出処理する抽出工程と、
前記微生物と抽出液とを分離して抽出液を得る抽出液分離工程と、
前記抽出液を液量１．２５倍〜２０倍まで濃縮して濃縮液を得る濃縮工程と、
前記濃縮液中にカロテノイド含有組成物の結晶を生成させる結晶化工程と、
前記結晶を母液から分離して得る結晶分離工程と、
を含む、アスタキサンチンの全組成物に対する含有量が４０質量％以上であり、最大長が５μｍ以上の針状又は類針状結晶であるカロテノイド含有組成物の製造方法。
【請求項２】
前記濃縮工程における濃縮倍率が１０倍未満である、請求項１記載のカロテノイド含有組成物の製造方法。
【請求項３】
前記濃縮液を前記結晶化工程に供する前に、結晶化工程の温度よりも高い温度に加熱する加熱工程を更に含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記加熱工程の前において前記濃縮液に水を加える水添加工程、前記濃縮工程の進行中に前記濃縮液に水を加える水添加工程、および前記濃縮工程の前において前記微生物から分離した前記抽出液に水を加える水添加工程からなる群より選択される工程を更に含む、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
前記加熱工程の温度が４０〜７０℃である、請求項３又は請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
アスタキサンチンを含むカロテノイドを産生する微生物由来のカロテノイド含有組成物であって、全組成物の質量を基準とするアスタキサンチンの含有量が４０質量％以上であり、最大長が５μｍ以上の針状又は類針状結晶であるカロテノイド含有組成物。
【請求項７】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の製造方法によって製造される、請求項６記載のカロテノイド含有組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物由来の、アスタキサンチンを含むカロテノイド含有組成物の製造方法に関する。また、本発明は、微生物由来の、針状又は類針状結晶であるアスタキサンチンを含むカロテノイド含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
カロテノイドは自然界に広く存在する天然色素であり、黄色から赤色又は紫色に及ぶポリエン色素である。アスタキサンチンは天然で見出されるカロテノイドの1種であり、遊離の状態あるいはエステルとして存在するほか、タンパク質と結合して種々の色素タンパク質として存在する。
アスタキサンチンは、魚類、鶏卵の色揚げ剤として広く使用されている。また、食品添加物としても認められており、油脂加工食品、タンパク質性食品、水性液状食品などに幅広く使用されている。さらに、フリーラジカルによって誘起される脂質の過酸化に対する抗酸化活性、α−トコフェロールの数百倍に達する一重項酸素消去作用などから、アスタキサンチンは、その強力な抗酸化活性を生かした機能性食品、化粧品、又は医薬品としての用途が期待されている。
アスタキサンチンは、サケ、マス、マダイ等の魚類、カニ、エビ、オキアミ等の甲殻類など広く自然界に分布すると共に、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、パラコッカス(Paracoccus)属、ブレバンディモナス（Brevundimonas）属、エリスロバクター（Erythrobacter）属に属する細菌類、ヘマトコッカス(Haematococcus)属緑藻類、ファフィア(Phaffia)属酵母類等の微生物によっても産生される。アスタキサンチンやゼアキサンチン等のカロテノイドは、化学合成法により工業的に生産されているが、安全性の観点から天然物由来のものが求められている。【０００３】
こうした背景から特に、大量生産に適していると考えられている緑藻類や酵母類等の微生物由来のアスタキサンチンを含有するカロテノイド類の製造方法が数多く報告されている。しかし、緑藻類や酵母類は、カロテノイドの生産性が低いうえに強固な細胞壁を持つため、培養物からのカロテノイドの抽出が困難である。
一方、パラコッカス属に属する細菌は、カロテノイドの生産性が高い上に増殖速度が大きく、カロテノイドの抽出が容易である等の利点を有している。【０００４】
パラコッカス属に属するアスタキサンチン生産菌株の例としてはＥ−３９６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２８３：１９９３年４月２７日付（原寄託日）、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６））（特許文献１）が知られている。該菌株から精製されたカロテノイド含有組成物を得る方法としては、食品等の製造には安全性の面から使用することが好ましくない環状親水性有機化合物に菌体を接触させて抽出処理する方法（特許文献２）、超臨界流体抽出を用いる方法（特許文献３）、菌体を水溶性有機溶媒、非極性溶媒及び水に接触させ、液液抽出を行う方法（特許文献４）の他、菌体を低級アルコール類に接触させて抽出し、抽出液を濃縮して得られる沈殿物を水含有低級アルコール類で洗浄する方法（特許文献５、６）などが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平８−９９６４号公報
【特許文献２】特開平７−２４２６２１号公報
【特許文献３】特開平８−８９２８０号公報
【特許文献４】特開平８−２５３６９５号公報
【特許文献５】特開２００７−３１９０１５号公報
【特許文献６】特開２００９−５０２３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述の従来技術においてはそれぞれ、抽出・精製工程において安全性の観点から好ましくない溶剤を使用すること、抽出・精製の工程が煩雑であること、得られる結晶を水を含むアルコール等の溶媒中で懸濁させて洗浄する工程が必要であること、水を多量に含む有機溶媒の廃液が発生しその処理が必要なこと、アスタキサンチン含有量及びカロテノイド純度が十分に高いカロテノイド含有組成物を高い収量で得ることが困難であること、更には、得られるカロテノイド含有組成物の結晶性状が良好でないことに起因してその取り扱いが煩雑となること等の問題があった。【０００７】
本発明は、上述の従来技術の問題点に鑑みてなされたものであり、安価かつ安全な溶剤を使用した簡易な工程にて、微生物由来であって、高い含有量のアスタキサンチン及び高純度のカロテノイドを含有し、且つ良好な結晶性状を有するカロテノイド含有組成物を高い収量で得ることが可能なカロテノイド含有組成物の製造方法及び前記カロテノイド含有組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、アスタキサンチンを含むカロテノイドを産生する微生物の培養物から、低級アルコールという従来知られた溶媒を用いた簡易な工程で抽出及び精製を行なうにも拘わらず、カロテノイドの分解を抑え、高い含有量のアスタキサンチン及び高純度のカロテノイドを含有し、且つ良好な結晶性状を有するカロテノイド含有組成物を得る方法を開発した。更に、アスタキサンチンの異性化を促進する簡易な工程を追加することで、カロテノイドの収量を向上させることに成功した。
より具体的には、本発明は以下の構成を有する。
〔１〕アスタキサンチンを含むカロテノイドを産生する微生物を培養して得られる培養物を、炭素数１〜３のアルコールを用いて抽出処理する抽出工程と、
前記微生物と抽出液とを分離して抽出液を得る抽出液分離工程と、
前記抽出液を液量１．２５倍〜２０倍まで濃縮して濃縮液を得る濃縮工程と、
前記濃縮液中にカロテノイド含有組成物の結晶を生成させる結晶化工程と、
前記結晶を母液から分離して得る結晶分離工程と、
を含む、アスタキサンチンの全組成物に対する含有量が４０質量％以上であり、最大長が５μｍ以上の針状又は類針状結晶であるカロテノイド含有組成物の製造方法。
〔２〕前記濃縮工程における濃縮倍率が１０倍未満である、〔１〕記載のカロテノイド含有組成物の製造方法。
〔３〕前記濃縮液を前記結晶化工程に供する前に、結晶化工程の温度よりも高い温度に加熱する加熱工程を更に含む、〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕前記加熱工程の前において前記濃縮液に水を加える水添加工程、前記濃縮工程の進行中に前記濃縮液に水を加える水添加工程、および前記濃縮工程の前において前記微生物から分離した前記抽出液に水を加える水添加工程からなる群より選択される工程を更に含む、〔３〕記載の製造方法。
〔５〕前記加熱工程の温度が４０〜７０℃である、〔３〕又は〔４〕記載の製造方法。
〔６〕アスタキサンチンを含むカロテノイドを産生する微生物由来のカロテノイド含有組成物であって、全組成物の質量を基準とするアスタキサンチンの含有量が４０質量％以上であり、最大長が５μｍ以上の針状又は類針状結晶であるカロテノイド含有組成物。
〔７〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の製造方法によって製造される、〔６〕記載のカロテノイド含有組成物。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】アスタキサンチンを含むカロテノイドを含有する乾燥菌体から、アスタキサンチンを含むカロテノイド含有組成物を製造する本発明の一態様を示す図である。
【図２】アスタキサンチンを含むカロテノイドを含有する乾燥菌体から、アスタキサンチンを含むカロテノイド含有組成物を製造する本発明の一態様を示す図である。本態様は、抽出液の濃縮後に加熱処理による再異性化工程を含むことを特徴とする。
【図３】アスタキサンチンを含むカロテノイドを含有する乾燥菌体から、アスタキサンチンを含むカロテノイド含有組成物を製造する本発明の一態様を示す図である。本態様は、抽出液の濃縮後、加熱処理前に水を添加する工程を含むことを特徴とする。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明について、好ましい実施形態の例に沿って具体的に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の実施形態の例以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
【００１１】
本実施形態の、アスタキサンチンの全組成物に対する含有量が４０質量％以上であり、最大長が５μｍ以上の針状又は類針状結晶であるカロテノイド含有組成物の製造方法は、アスタキサンチンを含むカロテノイドを産生する微生物を培養して得られる培養物を、炭素数１〜３のアルコールを用いて抽出処理する抽出工程と、前記微生物と抽出液とを分離して抽出液を得る抽出液分離工程と、前記抽出液を液量１．２５倍〜２０倍まで濃縮して濃縮液を得る濃縮工程と、前記濃縮液中にカロテノイド含有組成物の結晶を生成させる結晶化工程と、前記結晶を母液から分離して得る結晶分離工程と、を含む。
【００１２】
本実施形態の製造方法によって得られるカロテノイド含有組成物は、アスタキサンチンを、全組成物の質量を基準として、好ましくは４０質量％以上、より好ましくは５０質量％以上、最も好ましくは５５％以上含む。
また、前記組成物は、針状又は類針状結晶であり、その最大長は、2μm超であり、好ましくは5μm以上、より好ましくは7μm以上、最も好ましくは10μm以上である。また、これらの結晶長は、必ずしも揃っていなくてもよく、例えば、3μm〜10μmの針状又は類針状結晶を含んでいてもよい。ここで、結晶の最大長とは、顕微鏡等の対象物を拡大して観察する手段における視野中で、最も大きな結晶長をいう。
【００１３】
〔カロテノイド含有組成物の産生、抽出、及び菌体からの分離〕
（カロテノイド産生微生物とその培養）
本実施形態の製造方法に係る培養物を構成するカロテノイドを産生する微生物としては、アスタキサンチンを含むカロテノイドを産生する微生物であれば何ら限定されないが、アグロバクテリウム属細菌、ブレビバクテリウム属細菌、パラコッカス属細菌、ブレバンディモナス属細菌、エリスロバクター属細菌、ヘマトコッカス属藻類、ファフィア属酵母などを用いることができる。
【００１４】
これらの微生物の中でも増殖速度の速さ、カロテノイドの生産性の観点から、１６ＳリボソームＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と実質的に相同である細菌が好ましい。実質的に相同であるとは、ＤＮＡの塩基配列決定のエラー頻度等を考慮し、配列が、９４％以上、好ましくは９６％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を有することを意味する。このような細菌の中でも、特にＥ−３９６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２８３）が好ましい。また、これらの微生物を変異処理してカロテノイド生産性を向上させるために選択したカロテノイド高生産株を用いることも大変に好適な例として挙げられる。
なお、Ｅ−３９６菌株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに以下の通り国際寄託されている。
国際寄託当局：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
（旧名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
〒305-8566
茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６
識別のための表示：Ｅ−３９６
受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−４２８３
原寄託日：平成５年（１９９３年）４月２７日
【００１５】
ここで、前記変異処理する方法は、突然変異を誘発するものであれば特に限定されない。例えば、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）などの変異剤による化学的方法、紫外線照射、Ｘ線照射などの物理的方法、遺伝子組換え、トランスポゾンなどによる生物学的方法などを用いることができる。この変異処理は１回でもよいし、また、例えばこの変異処理によりカロテノイドを産生する微生物の変異体を得て、これを更に変異処理するというように２回以上の変異処理を行うこともできる。
【００１６】
本実施形態の製造方法に係る培養工程で使用するカロテノイドを産生する微生物の培養物は、上記微生物を効率良く培養できる方法、例えば、下記の培地を用いて、液体培養、固体培養、又はそれらの組み合わせによって培養する方法を用いることで得られる培養物であれば何ら限定されない。
【００１７】
本実施形態の製造方法に係るカロテノイドを産生する微生物の培養に使用される栄養培地としては、当該微生物の生育に必要な炭素源、窒素源及び無機塩を含む栄養培地であれば十分であるが、ビタミン類を添加するとさらに好ましい場合がある。また、更にアミノ酸、核酸塩基等を添加すると好ましい場合もある。その他として、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、コーンスチープリカー、乾燥酵母、大豆粕等を適宜添加してもよい。
炭素源としてはグルコース、シュークロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、マルトース等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸、ピルビン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール、グリセノール等のアルコール類、大豆油、ヌカ油、オリーブ油、トウモロコシ油、ゴマ油、アマニ油等の油脂類などが挙げられ、１種又は２種以上の炭素源を用いることができる。添加割合は炭素源の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌ当たり１〜１００ｇ、好ましくは２〜５０ｇである。
窒素源としては、例えば硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素等の１種又は２種以上が用いられる。添加割合は窒素源の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．１ｇ〜３０ｇ、好ましくは１〜１０ｇである。
無機塩としてはリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム等の１種又は２種以上が用いられる。添加割合は無機塩の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．００１〜１０ｇである。
ビタミン類を加える場合、添加割合はビタミン類の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．１〜１０００ｍｇであり、好ましくは１〜１００ｍｇである。
アミノ酸、核酸塩基、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、コーンスチープリカー、乾燥酵母、大豆粕等の添加割合は、物質の種類により異なり適宜調整すれば足りるが、通常、培地１Ｌに対し０．２ｇ〜２００ｇ、好ましくは３〜１００ｇである。
培地のｐＨは２〜１２、好ましくは６〜９に調整する。培養条件は１５〜８０℃、好ましくは２０〜３５℃の温度であり、通常１日〜２０日間、好ましくは２〜８日間、好気条件で培養を行う。好気条件としては、例えば、振とう培養又は通気撹拌培養等が挙げられる。
【００１８】
本実施形態の製造方法に係るカロテノイドを産生する微生物が産生したカロテノイドを前記微生物の培養物から抽出するに際しては、培養後、培養液、又は培養液から得られる菌体の濃縮液、湿菌体又は乾燥菌体を以下の抽出処理に供する方法が、より好適な例として挙げられる。上記菌体の濃縮液は、例えば、培養液を膜濾過濃縮することによって得ることができ、上記湿菌体は、培養液を遠心分離、加圧又は減圧濾過などの一般的に知られている濾過方法に供することによって得ることができる。更に、この湿菌体を噴霧乾燥、流動乾燥、回転ドラム式乾燥又は凍結乾燥など一般的に知られる乾燥方法によって乾燥させることによって、乾燥菌体を得ることができる。また、抽出を行う前に、培養液、菌体濃縮液、湿菌体又は乾燥菌体の段階において、アルカリ試薬や界面活性剤などを用いた化学的処理、溶菌酵素、脂質分解酵素又はタンパク質分解酵素などを用いた生化学処理、又は超音波もしくは粉砕などの物理的処理のうち１つ又は２つ以上の処理を行ってもよい。
なお、前記微生物の培養物としては、乾燥菌体を基準として、その１ｇ中に典型的には約２０ｍｇ程度のアスタキサンチン、約３０ｍｇ程度のカロテノイドが含有されていると考えられる。
【００１９】
（抽出工程）
本実施形態の製造方法に係る抽出工程に用いる溶媒としては、炭素数１〜３のアルコールが挙げられ、具体的にはエタノール、メタノール、イソプロパノール又はノルマルプロパノールであり、中でもエタノールが特に好ましく用いられる。抽出時の前記アルコールの温度は８０℃以上が好ましく、８５℃以上がより好ましく、９０℃以上が更に好ましく、９３℃以上が特に好ましい。この抽出時の温度は、前記アルコールへのアスタキサンチンを含むカロテノイドの溶解度の上昇と関係しており、抽出効率を向上させるために重要な要素となる。また抽出時の前記アルコールの温度の上限については、１５０℃以下が好ましく、１３０℃以下がより好ましく、１２０℃以下が更に好ましく、１１０℃以下が特に好ましく、１００℃以下が最も好ましい。この上限温度は、アスタキサンチンを含むカロテノイドの熱分解を抑えるために重要である。このとき、前記アルコールの沸点以上又は沸点付近の温度を必要とするため、圧力容器内にて処理を行うことが好ましい。このときの圧力は、最大でもゲージ圧で０．８ＭＰａ以下、好ましくは０．４ＭＰａ以下、さらに好ましくは０．２ＭＰａ以下で行うことが、圧力容器設備によるコスト増加を低減する観点から好ましい。
抽出工程で使用する前記アルコールの量としては、抽出時の温度によっても変化するが、菌体内に含有されるアスタキサンチンの好ましくは全量を溶解できる量であればよく、菌体内に含まれるアスタキサンチン量１ｇに対して、３００〜３，０００ｇ、好ましくは、５００〜２，０００ｇ、より好ましくは、８００〜１，６００ｇである。
例えば、前記した約２０ｍｇのアスタキサンチンを含む乾燥菌体１ｇからの抽出を９５℃のエタノールで行う場合は、５ｇ〜１００ｇ程度、好ましくは８ｇ〜６０ｇ、更に好ましくは１０ｇ〜３５ｇ程度の量のエタノールを用いるとよい。
【００２０】
抽出工程においてカロテノイドの酸化を極力防止したい場合には、窒素ガスなどの不活性ガス雰囲気で処理することができ、また、医薬品や食品で用いられている酸化防止剤を選択して抽出溶媒に加えることができる。あるいは、これらの方法を組み合わせてもよい。
上記酸化防止剤は、最終的にはカロテノイド含有組成物から除くことが望ましいが、用いる酸化防止剤の種類（例えば、ビタミンＣ）によっては除去不要である。
また、光によるカロテノイドの分解を極力防止するために遮光した条件下で抽出を行うことができる。
また、抽出時間については特に制限する必要はないが、熱分解によるカロテノイド含有組成物の収量低下を少なくするためにも短時間の処理がよく、１２０分以内が好ましく、６０分以内がより好ましく、３０分以内が最も好ましい。
【００２１】
（抽出液分離工程）
本実施形態の製造方法に係る抽出液分離工程、すなわち、抽出処理により得られる抽出液を微生物菌体から分離する工程で使用する方法は限定されないが、膜濾過、濾過、デカンテーションなどが用いられ、濾過が好ましい。また抽出液分離の温度は特に限定されない。８０℃以上の温度の炭素数１〜３のアルコールにカロテノイドが溶解した溶液は、−２０℃〜７０℃程度に冷却しても過飽和状態となり、短時間ではカロテノイドは析出しないので、このような温度でも安定的に抽出液の微生物菌体からの分離を行うことができる。
【００２２】
（濃縮工程）
本実施形態の製造方法においては、前記抽出液分離工程で得られる抽出液を、下記に詳述する結晶化工程に供する前に、低い濃縮倍率で濃縮することが好ましい。本発明においては、高い濃縮倍率での濃縮による結晶化を行わず、それにより、最大長が５μｍ以上の針状又は類針状結晶を得ることができる。
【００２３】
（結晶化工程）
前記抽出液分離工程によって得られる抽出液からカロテノイド含有組成物の結晶を得る方法としては、一般的には加熱及び／又は減圧濃縮や貧溶媒を添加し、結晶の溶解度を低下させる晶析操作が挙げられる。この他、低温におけるカロテノイドの析出、酸・アルカリ薬剤や各種塩類による析出によってカロテノイド色素を濃縮せずに分離してもよい。また、本操作下での過飽和状態は、例えば常温で１時間以上放置することで解除され、カロテノイド含有組成物の結晶を析出させることができる。このとき、攪拌したり振動を与えたりすること、あるいは種結晶を添加すること等により過飽和状態の解除を早めることもできる。ただし抽出温度によって過飽和状態が変化するため、抽出温度に応じた過飽和解除条件を選択することが好ましい。
上記操作により過飽和状態が解除されると、フリー体のトランス型アスタキサンチンは常温のエタノールに対して難溶性となり、更にエタノールを加えても溶解せず懸濁状態になる。これらの操作を行うことによりフリー体のトランス型カロテノイドを結晶として得ることができる。
本実施形態の製造方法においては、前記抽出液分離工程で得られる抽出液を、低い濃縮倍率で濃縮し、続いて濃縮以外の方法によりカロテノイド含有組成物の結晶化を進めることが好ましい。
【００２４】
ここで「低い濃縮倍率」とは、抽出液の重量に対して濃縮倍率３０倍未満 を指し、好ましくは１倍〜２０倍（例えば、濃縮倍率２０倍以内、１５倍以内、１３倍以内、１１倍以内等）、より好ましくは濃縮倍率１０倍以内、特に好ましくは濃縮倍率１０倍未満（例えば、濃縮倍率８倍以内、７倍以内、６倍以内、５．５倍以内、５倍以内等）であり、「高い濃縮倍率」とは、抽出液の重量に対して 濃縮倍率３０倍以上を指し、好ましくは濃縮倍率１００倍以上、より好ましくは濃縮倍率２００倍以上である。
【００２５】
または、「低い濃縮倍率」とは、得られる濃縮液中のアスタキサンチン重量濃度（ｗｔ／ｗｔ）にして２．１％までの濃縮を指し、好ましくは１．４％以内（例えば、１．１％以内、０．９１％以内、０．７７％以内等）の範囲での濃縮、より好ましくは０．７０％以内の範囲での濃縮、特に好ましくは０．７０％までの濃縮（例えば、０．５６％以内、０．４９％以内、０．４２％以内、０．３９％以内、０．３５％以内等）の範囲での濃縮であり、「高い濃縮倍率」とは、アスタキサンチン重量濃度（ｗｔ／ｗｔ）にして、２．１％以上、好ましくは７．０％以上、より好ましくは１４％以上である。
【００２６】
あるいは、「低い濃縮倍率」とは、得られる濃縮液中のカロテノイド重量濃度（ｗｔ／ｗｔ）にして３．０％までの濃縮を指し、好ましくは２．０％以内（例えば、１．５％以内、１．３％以内、１．１％以内等）の範囲での濃縮、より好ましくは１．０％以内の範囲での濃縮、特に好ましくは１．０％までの濃縮（例えば、０．８０％以内、０．７０％以内、０．６０％以内、０．５５％以内、０．５０％以内等）の範囲での濃縮であり、「高い濃縮倍率」とは、カロテノイド重量濃度（ｗｔ／ｗｔ）にして、３．０％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上である。
【００２７】
より具体的には、濃縮倍率として１．２５倍〜２０倍、更により具体的には１．２５倍〜１０倍、更により具体的には２倍〜１０倍を例示することができる。
または、アスタキサンチン重量濃度（ｗｔ／ｗｔ）として、０．０８８〜１．４％、更により具体的には、０．０８８〜０．７０％、更により具体的には０．１４〜０．７０％を例示することができる。
あるいは、カロテノイド重量濃度（ｗｔ／ｗｔ）として、０．１３〜２．０％、更により具体的には、０．１３〜１．０％、更により具体的には、０．２０〜１．０％を例示することができる。
【００２８】
濃縮工程は、加熱下に抽出溶媒を留去する加熱濃縮、減圧下に抽出溶媒を留去する減圧濃縮などによって行われることが好ましく、カロテノイドの分解を抑制するとの観点から、缶温を低くすることができる減圧濃縮によることがより好ましい。減圧濃縮における好ましい缶温は５０℃以下、より好ましくは４０℃以下であり、また溶媒留去の効率の観点から、缶温は０℃以上が好ましく、１０℃以上がより好ましい。
また、抽出液の濃縮で得られた留去液は、そのまま微生物培養物からの抽出に再利用することができる。
【００２９】
（熟成工程）
本実施形態の製造方法に係る結晶化工程、すなわち、前記濃縮液中にカロテノイド含有組成物の結晶を生成させる工程で使用される方法は限定されないが、例えば前記濃縮液を１０℃〜６０℃でインキュベートすることにより結晶を得る熟成工程等が用いられる。熟成時の温度は、好ましくは１０℃〜６０℃、より好ましくは２０℃〜４０℃、特に好ましくは３０℃である。熟成に適した時間は、好ましくは１時間〜４８時間、より好ましくは２時間〜２４時間、特に好ましくは一晩である。
【００３０】
（加熱工程）
前記熟成工程の前に、熟成工程の温度より高い温度で前記濃縮液をインキュベートして、前記濃縮液中のトランス型カロテノイド異性体の一部を結晶として析出せしめ、且つ、シス型カロテノイド異性体の少なくとも一部をトランス型異性体に異性化する、加熱工程を更に加えてもよい。
本加熱工程の温度は、前記熟成工程の温度よりも高い温度であり、好ましくは濃縮液の溶媒である炭素数１〜３のアルコールの常圧における沸点以下の温度である。具体的には、好ましくは３０〜８０℃、より好ましくは４０〜７０℃、特に好ましくは５０〜６０℃である。本加熱工程の処理を行う時間は、好ましくは１時間〜４８時間、より好ましくは２時間〜２６時間、特に好ましくは２時間〜８時間である。
また、この加熱工程を、濃縮工程にあわせて行うこともできる。すなわち、減圧濃縮時の温度を高く維持することで、この異性化を行わせることは、工程時間の短縮にも効果的である。
【００３１】
熟成工程の前に加熱工程を加えることにより、熟成工程を経て得られるカロテノイド含有組成物結晶の量が増加する。すなわち、本実施形態の製造方法により得られるカロテノイド含有組成物の収量が増加する。
本発明者らは、本加熱工程において、以下が進行するものと考えている。
本実施形態の製造方法の抽出工程は、８０℃以上といった比較的高温において行われるため、カロテノイドのトランス型異性体の一部がシス型異性体に異性化する。このようなカロテノイドを含む抽出液が濃縮工程を経て過飽和状態の濃縮液となる。加熱工程において、この濃縮液の過飽和状態が解除されることにより、炭素数１〜３のアルコールに対して相対的に溶解度が低いトランス型カロテノイド異性体の一部が結晶化し、一方、前記アルコールに対する溶解度が相対的に高いシス型カロテノイド異性体は該アルコール中に溶解した状態が維持される。すると溶媒中に溶解したカロテノイドのシス型異性体／トランス型異性体の比率が増加し、当該温度における平衡組成からずれた比率となる。この平衡組成からのずれと、濃縮液の加熱による異性化反応の反応速度の高まりが相俟って、シス型異性体の一部がトランス型異性体へと異性化する。異性化によって生成したトランス型異性体の一部は結晶化する。
熟成工程においても、トランス型異性体の結晶化に伴い、シス型異性体からトランス型異性体への異性化は進行すると思われるが、加熱工程においては温度が熟成工程の温度よりも高いために、異性化反応速度がより大きく、異性化がより進行するものと考えられる。
加熱工程の後、同工程より得られた結晶を含む濃縮液を、同工程よりも低い温度の熟成工程に供することにより、溶媒中に溶解していたトランス型異性体を主とするカロテノイドが更に結晶化する。
このようにして、加熱工程を加え、トランス型異性体の比率を高めることによって、本実施形態の製造方法の目的物である、カロテノイド含有組成物結晶の収量を向上させることができる。
【００３２】
（水添加工程）
前記加熱工程の前に、前記濃縮工程により得られた濃縮液に水を添加する、水添加工程を更に加えてもよい。この水添加工程において加える水の量は、水添加後の溶液中の水の濃度が、好ましくは０．１〜４０質量％、より好ましくは０．５〜３０質量％、特に好ましくは１〜２０質量％となる量である。
また、この水添加工程を、濃縮工程にあわせて行うこともできる。すなわち、カロテノイドを含む抽出液に対し、その濃縮前または濃縮時に水を添加することもできる。
加熱工程の前に水添加工程を加えることにより、カロテノイド含有溶液中のカロテノイドの溶解度が低下し、加熱工程および熟成工程を経て得られるカロテノイド含有組成物結晶の量が増加する。すなわち、本実施形態の製造方法により得られるカロテノイド含有組成物の収量が増加する。
【００３３】
（結晶分離工程）
本実施形態の製造方法に係る結晶分離工程、すなわち、前記熟成工程により生成された結晶を母液から分離して得る工程で使用する方法は限定されないが、濾過、遠心分離等が利用され、濾過が好ましい。また結晶分離の温度は特に限定されない。
【００３４】
分離されたカロテノイド含有組成物結晶は、好ましくは洗浄される。洗浄方法は特に限定されないが、常温の炭素数１〜３のアルコール、前記アルコールと水との混合物、ヘキサン等の炭化水素等の溶媒を用いた洗浄が好ましく用いられる。洗浄は、例えば濾過により分離された結晶ケーキの上から、前記溶媒を注ぐことで行うことができる。
【００３５】
結晶分離工程又はその後の洗浄工程を経たカロテノイド含有組成物結晶は乾燥されることが好ましい。乾燥方法は特に限定されず、不活性雰囲気下での常圧での加熱乾燥、減圧下の乾燥等が利用され、減圧下での乾燥が好ましい。
【００３６】
本願発明のカロテノイド含有組成物の製造方法の具体的な一例としては、以下の方法が挙げられるが、本発明は当然、以下の方法に制限されない。
１）アスタキサンチンを含む微生物菌体から、エタノールで９０〜１００℃、１５分以上抽出する。
２）菌体を熱時濾過（６０〜７０℃）により除去する。
３）濾液（抽出液）を、３０℃に冷却し、缶温が３０℃になるよう減圧度を調整し、液量１／５（アスタキサンチン重量濃度０．３５％（ｗｔ／ｗｔ）またはカロテノイド重量濃度０．５０％（ｗｔ／ｗｔ）程度）まで濃縮する。
４）濃縮後、３０℃で熟成する。
５）熟成後、濾過により結晶を回収する。
６）結晶を、真空下１００℃で加熱乾燥する。
また、３）の濃縮後、６０℃で２〜４時間加温することで、シス体のアスタキサンチンを、トランス体に再異性化し、４）に進んでもよい。この再異性化は、５０℃でも実施することができ、効率を上げるために、時間を伸ばしてもよい。４０℃で実施した場合は、さらに時間を伸ばしてもよい。
さらに、３）の濃縮後、濃縮液に終濃度１〜２０質量％の水を添加した上で、４）に進んでもよい。この水添加は、終濃度０．１〜４０質量％となる量の水の添加でも実施することができるが、より好ましくは０．５〜３０質量％となる量の水の添加であり、特に好ましくは１〜２０質量％となる量の水の添加である。
【００３７】
上記の製造方法を用いて得られるカロテノイド含有組成物におけるカロテノイド含量、及びアスタキサンチン等の主成分含量の調整は、収量が最大となる様に上記製造方法の各工程の条件を適宜変更することによって行うことができる。本発明のカロテノイド含有組成物におけるカロテノイド含量は、菌体内におけるカロテノイド中のアスタキサンチン量に規定される。上記菌体としてＥ−３９６株またはその変異株を使用すると、組成物に対してアスタキサンチンを４０％以上含有するカロテノイド含有組成物を得ることができる。
【００３８】
本実施形態のカロテノイド含有組成物の製造方法は、上記の通り、カロテノイドを産生する微生物の培養物を、炭素数１〜３のアルコールを用いて抽出処理した後、該抽出液を適切な濃縮倍率まで減圧濃縮し、続いて該濃縮液中にカロテノイド含有組成物の結晶を生成させることを特徴とする。これらの極めて簡易な操作のみにより、カロテノイドを高純度で得ることができ、その後の煩雑なリパルプ工程を回避することができる。
本実施形態のカロテノイド含有組成物の製造方法は、従来技術と比較して、１）複雑な操作を必要としない、２）濃縮乾固物の懸濁洗浄やリパルプのような煩雑かつ非効率的な洗浄操作を必要としない、３）加熱工程の前に水添加工程を含む場合を除いて、水を含む廃液の処理を必要としないという点において、工業的な観点から著しく有利である。そして４）アスタキサンチンを高含量で含む高純度のカロテノイド含有組成物を安価に提供できる点、５）得られる結晶の粉体物性が良好で成形性等が良好という点でも優れた工業的製造方法を提供するものである。
【００３９】
本発明はまた、アスタキサンチンを含むカロテノイドを産生する微生物由来のカロテノイド含有組成物であって、全組成物の質量を基準として、アスタキサンチンの含有量が４０質量％以上（又は４０〜９０質量％）であり、カロテノイドの含有量が７０質量％以上（又は７０〜１００質量％）であり、最大長が５μｍ以上の針状又は類針状結晶であるカロテノイド含有組成物を提供する。
前記結晶の最大長としては、好ましくは７μｍ以上、より好ましくは１０μｍ以上である。
前記本発明のカロテノイド含有組成物は、好ましくは、上述の本発明のカロテノイド含有組成物の製造方法によって製造される。
【００４０】
本発明のカロテノイド含有組成物を含有する医薬品、食品、又は化粧品も本発明の範囲内である。
本発明のカロテノイド含有組成物を含有する医薬品の剤型としては、散剤、顆粒剤、丸剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル剤、速崩剤、シロップ、液剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、粘付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は定法に従って調製されるが、カロテノイドは水に難溶性であるため、植物性油、動物性油等の非親水性有機溶媒に溶解するか又は、乳化剤、分散剤もしくは界面活性剤等とともに、ホモジナイザー（高圧ホモジナイザー）を用いて水溶液中に分散、乳化させたり、温度をかけて溶解させたりして用いる。さらに、カロテノイドの吸収性を高めるために、平均粒子径を１ミクロン程度まで微粉砕し用いることも可能である。
【００４１】
製剤化のために用いることができる添加剤としては、例えば大豆油、サフラワー油、オリーブ油、胚芽油、ひまわり油、グレープシード油、牛脂、いわし油等の動植物性油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール等の多価アルコール、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル等の界面活性剤、精製水、乳糖、デンプン、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、レシチン、アラビアゴム、ソルビトール液、糖液等の賦形剤、その他の甘味料、着色料、ｐＨ調整剤、香料などをあげることができる。尚、液体製剤は、服用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよいし、ゾル状又はゲル状物質等で包んでもよい。
【００４２】
注射剤の形で投与する場合としては、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、関節内、滑液嚢内、胞膜内、骨膜内、舌下、口腔内などに投与することが好ましく、特に静脈内投与又は腹腔内投与が好ましい。静脈内投与は、点滴投与、ボーラス投与のいずれであってもよい。
カロテノイドを医薬品として使用する場合、用法及び用量として、大人1 日あたり、１ｍｇ〜３ｇ 、好ましくは３ｍｇ 〜１ｇ 、より好ましくは１０ｍｇ〜６７０ｍｇである。体重１ｋｇ換算では、それぞれ１７μｇ〜５０ｍｇ 、５４μｇ〜１７ｍｇ 、１６０μｇ〜１２ｍｇとなる。上記用量は１から数回に分けて投与される。但し、薬学的な有効量、投与方法または投与手段及び投与期間は、投与対象の臨床状態、性別、年齢、体重などに応じて当業者により適宜設定することができる。
【００４３】
本発明のカロテノイド含有組成物を含有する食品の形態としては、例えばサプリメント（散剤、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等）、飲料（お茶、炭酸飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料等）、菓子（グミ、ゼリー、ガム、チョコレート、クッキー、キャンデー等）、油、油脂食品（マヨネーズ、ドレッシング、バター、クリーム、マーガリン等）、調味料（ケチャップ、ソース等）、流動食、乳製品（牛乳、ヨーグルト、チーズ等）、パン類、麺類（うどん、そば、ラーメン、パスタ、焼きそば、きしめん、ソーメン、冷麦、ビーフン等）等が挙げられる。但し、これらの形態に限定されるものではない。
【００４４】
本発明のカロテノイド含有組成物を含有する機能性食品としては、必要に応じて各種栄養素、各種ビタミン類（ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＥ等）、各種ミネラル類、食物繊維、多価不飽和脂肪酸、その他の栄養素（コエンザイムＱ１０、カルニチン、セサミン、α−リボ酸、イノシトール、Ｄ−カイロイノシトール、ピニトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルＤＨＡ、ホスファチジルイノシトール、タウリン、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、Ｓ−アドノシルメチオニン等）、分散剤、乳化剤などの安定剤、甘味料、呈味成分（クエン酸、リンゴ酸等）、フレーバー、ローヤルゼリー、プロポリス、アガリクス等を配合することができる。また、ペパーミント、ベルガモット、カモミール、ラベンダー、タイム等のハーブ類を配合してもよい。またテアニン、デヒドロエピアンドステロン、メラトニンなどの素材を配合してもよい。
カロテノイドを食品又はサプリメントとして使用する場合、用法及び用量として特に限定されるものではないが、体重１ｋｇ換算で、１７μｇ〜５０ｍｇ 、好ましくは５４μｇ〜１７ｍｇ 、より好ましくは１６０μｇ〜１２ｍｇである。
【００４５】
本発明のカロテノイド含有組成物を含有する化粧品としては、クリーム、乳液、ローション、マイクロエマルジョンエッセンス、入浴剤等が挙げられ、香料等を混合してもよい。
カロテノイドを化粧品として使用する場合、化粧品１００ｇあたり１０μｇ〜５ｇ 、好ましくは１０μｇ〜２ｇ 、より好ましくは１０μｇ〜１ｇの量を配合することができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００４６】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の例に限定されるものではない。
なお、実施例及び比較例におけるアスタキサンチン及びカロテノイドの定量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行った。カラムはＷａｋｏｓｉｌ−ＩＩ ＳＩＬ−１００（φ４．６×２５０ｍｍ）（和光純薬製）を２本連結して使用した。溶出は、移動相であるｎ−ヘキサン／テトラヒドロフラン／メタノール混合液（容量比４０：２０：１）を室温付近一定の温度にて毎分１．０ｍＬの流量で流通されることで行った。測定においては、サンプルをテトラヒドロフランで溶解した溶液を移動相にて１００倍希釈した液２０μＬを注入量とし、カラム溶離液中のカロテノイドの検出は波長４７０ｎｍで行った。また、定量のための標準品としては、シグマ社製アスタキサンチン（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ９３３５）を用いた。標準液のアスタキサンチン濃度の設定は、標準液の４７７ｎｍの吸光度（Ａ）及び上記条件でＨＰＬＣ分析を行ったときのアスタキサンチンピークの面積百分率％（Ｂ）を測定した後に、以下の式を用いて行った。
アスタキサンチンの濃度（ｍｇ／Ｌ）＝Ａ÷２１５０×Ｂ×１００・・・（１）【００４７】
サンプル調製方法
以下、テトラヒドロフランは、酸化防止剤であるブチルヒドロキシトルエン 250ppm含有品を使用する。50mLのガラス遠沈管に、乾燥菌体 50〜80mgを精秤し、次いで蒸留水を150μL添加し、菌体を湿らせた。ここに、テトラヒドロフラン／メタノール＝20／1 を15mL添加し、5分間十分混合した後、ヘキサンを30mL添加する。この液より遠心分離により菌体を沈殿させ、上清をHPLCの移動相で10倍に希釈し、HPLCで分析を行った。【００４８】
計算方法
アスタキサンチン濃度は式（２）に従って、カンタキサンチン濃度は式（３）に従って、その他カロテノイド濃度は式（４）に従って算出した。
アスタキサンチン（mg/g）＝（標準溶液中のアスタキサンチン濃度（mg/L））／（アスタキサンチン標準溶液のピークエリア）×（サンプル中のアスタキサンチンピークエリア）／（サンプル質量（mg））×450・・・（２）
カンタキサンチン濃度は、式（３）に従って算出した。
カンタキサンチン（mg/g）＝（標準溶液中のアスタキサンチン濃度（mg/L））／（アスタキサンチン標準溶液のピークエリア）×（サンプル中のカンタキサンチンピークエリア）／（サンプル質量（mg））×450×0.92・・・（３）
カロテノイド濃度は、式（４）に従って算出した。
カロテノイド（mg/g）＝（標準溶液中のアスタキサンチン濃度（mg/L））／（アスタキサンチン標準溶液のピークエリア）×（サンプル中のカロテノイドピークエリア）／（サンプル質量（mg））×450・・・（４）【００４９】
［実施例１］アスタキサンチンの高含量の高純度カロテノイドの製造１（図１）
工程１：Ｅ−３９６菌株の培養工程
特許文献５の実施例１に記載の方法に準拠してＥ−３９６菌株の培養を行い、培養物として１ｇ中に約１７ｍｇのアスタキサンチンを含むカロテノイドを含有する乾燥菌体を得た。【００５０】
工程２：エタノール抽出工程
本実施例の工程１で得られた乾燥菌体２５ｇに、エタノール５５０ｇを加え、高圧容器内で窒素雰囲気下９０℃にて１５分間攪拌しながらアスタキサンチンを含むカロテノイドの抽出を行った。液温を６５℃に冷却後、圧力容器を開放し、濾過にて抽出液から菌体を除き、更に菌体ケークをエタノールにて洗浄してアスタキサンチン０．０７％（ｗｔ／ｗｔ）、カロテノイド重量濃度０．１％（ｗｔ／ｗｔ）の抽出液５５０ｇを得た。
続いて同様の操作を更に６回繰り返して、合計７バッチの抽出液を得た。【００５１】
工程３：抽出液の濃縮及び結晶化工程
本実施例の工程２で得られた１バッチ分の抽出液を、缶温３０℃となるように減圧度を調節し、ロータリー・エバポレーターを用いてエタノールの一部を留去し、固形分濃度を抽出液の１．２５倍に濃縮し、その後、この濃縮液について缶温３０℃で一晩熟成を行い、結晶を析出させた。
更に、本実施例の工程２で得られた他の６バッチ分の抽出液について、濃縮率をそれぞれ１．５倍、２倍、３．３倍、５倍、１０倍、２０倍とした以外は上記と同様の操作により、それぞれ濃縮及び結晶化を行った。【００５２】
工程４：結晶の濾取及び乾燥工程
本実施例の工程３で得られたそれぞれの結晶を含む液から、濾過にて結晶を回収した。これらのそれぞれの結晶を１００℃で２時間減圧乾燥して乾燥結晶を得た。この乾燥結晶のアスタキサンチン及びカロテノイド含有量を前述の方法により定量し、回収した結晶量、アスタキサンチンの回収率と共に表１に示す。
表1に示した濃縮倍率5倍で得られた結晶をキーエンス社製デジタルマイクロスコープ（VHX-90）を使用し200倍で撮影し、結晶の大きさを測定した。10μm以上の部分がある結晶であった。【００５３】
【表１】
2014054669.tif 000003
【００５４】
表１に示すように、本実施例の方法により、カロテノイドを産生する微生物培養物から、極めて簡易な方法で、カロテノイド高含有組成物を回収できた。従来の方法では、本実施例の工程１と同様にして得られた抽出液を、高い濃縮率で減圧濃縮していたため、得られた濃縮物は粘ちょうな液体または濃縮乾固物となり、取り出しが困難であった。この場合、溶媒を添加して行う懸濁洗浄工程等が必要となるが、水等の貧溶媒を添加することで不純物を抱き込むことになるため濾過性が悪く、含量を上げるためにさらなる洗浄工程（リパルプ工程）が必要となり、操作が煩雑であった（例えば、濃縮温度６０℃にて高い濃縮倍率にて濃縮後、溶解度を低下させるためにまず水を添加し、次いでエタノールを添加して懸濁洗浄して濾過を行い、濾過物をさらにエタノールで洗浄した上で乾燥工程を行う）。加えて、水を含んだ低級アルコール液が濾液（廃液）となるため、この廃液を排液処理するにはＢＯＤ負荷が高くなり困難であった。また、燃焼処理する場合は水を含むため熱量が低く大量の徐燃剤が必要であった。一方、本実施例の方法では、（１）濃縮倍率を適度に抑えるため、濃縮液の取扱いが容易、（２）濃縮液の状態で結晶化を進め、５μm以上の部分がある結晶形状の整った（針状または類針状の）結晶が得られるため、濾過性が良好、（３）得られた結晶性粉末は、容器等への付着性がほとんど見られず回収が容易であり、またその粉は舞いにくい顆粒性を有すなど良好であり、成形性等が良好、（４）廃液に水を含まないため、燃焼処理が容易等の改善点が得られた。【００５５】
［比較例１］
特許文献５の実施例１に記載の方法に準拠してＥ−３９６菌株の培養を行い、培養物として１ｇ中に約１７ｍｇのアスタキサンチンを含むカロテノイドを含有する乾燥菌体を得た。更に、特許文献６の実施例１に従いアスタキサンチンを含むカロテノイド含有組成物の結晶を得た。この結晶を実施例1と同様な方法でデジタルマイクロスコープにて撮影し、結晶の大きさを測定した。結晶の大きさは１〜２μｍであった。【００５６】
［実施例２］アスタキサンチンの高含量の高純度カロテノイドの製造２
（濃縮後異性化工程を含む製造方法：図２）
工程１：Ｅ−３９６菌株の培養工程
上記実施例１の工程１と同様にして、１ｇ中に約１７ｍｇのアスタキサンチンを含むカロテノイドを含有する乾燥菌体を得た。【００５７】
工程２：エタノール抽出工程
上記実施例１の工程２と同様の操作にて、同様の抽出液５５０ｇを得た。続いて同様の操作を更に４回繰り返して、合計５バッチの抽出液を得た。【００５８】
工程３：抽出液の濃縮、加熱処理（インキュベーション）及び結晶化工程
本実施例の工程２で得られた抽出液を、缶温３０℃となるように減圧度を調節し、ロータリー・エバポレーターを用いてエタノールの一部を留去し、固形分濃度を抽出液の５倍（アスタキサンチン重量濃度０．３５％（ｗｔ／ｗｔ）、カロテノイド重量濃度０．５０％（ｗｔ／ｗｔ））に濃縮し、その後この濃縮液を４０℃で２５．５時間窒素雰囲気下に加熱（インキュベーション）処理し、その後缶温３０℃で一晩熟成を行い、結晶を析出させた。
更に、本実施例の工程２で得られた他の４バッチ分の抽出液について、加熱処理温度及び加熱処理時間を表２に記載のそれぞれの条件とした以外は上記と同様の操作により、それぞれ濃縮、加熱処理及び結晶化を行った。【００５９】
工程４：結晶の濾取、洗浄及び乾燥工程
本実施例の工程３で得られた結晶を含む液から、濾過にて結晶を回収した。この結晶を１００℃で２時間減圧乾燥して乾燥結晶を得た。この乾燥結晶のアスタキサンチン及びカロテノイド含有量を前述の方法により定量し、回収した結晶量、アスタキサンチンの回収率と共に表２に示す。【００６０】
【表２】
2014054669.tif 000004
【００６１】
表２に示すように、濃縮後に加熱処理を行うことにより、表１における濃縮率が同一の条件（濃縮率５倍）であって加熱処理を行わない場合と比較して、回収される結晶量及びアスタキサンチン回収率が向上することを確認できた。これは、抽出時の高温条件下でトランス型アスタキサンチンの一部が平衡反応によりシス型アスタキサンチン（常温のエタノールに易溶）に異性化し、熟成（結晶化）時にエタノールに溶解していたものが、トランス型アスタキサンチンが結晶化により系外に出て平衡がずれ、加熱処理により反応速度が上昇し、シス型アスタキサンチンの一部がエタノールに難溶性のトランス型アスタキサンチンへと平衡反応により再異性化したことにより、濾液への溶解量が低下したためと考えられる。
このように、濃縮後の加熱処理という簡単な工程を加えるのみで、カロテノイド含有組成物中のアスタキサンチン含量及びカロテノイド含量を低下させることなく、カロテノイド含有組成物の収率を向上させることができることが明らかとなった。【００６２】
［実施例３］アスタキサンチンの高含量の高純度カロテノイドの製造３
（水添加工程および濃縮後異性化工程を含む製造方法：図３）
工程１：Ｅ−３９６菌株の培養工程
上記実施例１の工程１と同様にして、１ｇ中に約１７ｍｇのアスタキサンチンを含むカロテノイドを含有する乾燥菌体を得た。【００６３】
工程２：エタノール抽出工程
上記実施例１の工程２と同様の操作にて、同様の抽出液５５０ｇを得た。続いて同様の操作を更に５回繰り返して、合計６バッチの抽出液を得た。【００６４】
工程３：抽出液の濃縮、水添加、加熱処理（インキュベーション）及び結晶化工程
本実施例の工程２で得られた抽出液を、缶温３０℃となるように減圧度を調節し、ロータリー・エバポレーターを用いてエタノールの一部を留去し、固形分濃度を抽出液の５倍（アスタキサンチン重量濃度０．３５％（ｗｔ／ｗｔ）、カロテノイド重量濃度０．５０％（ｗｔ／ｗｔ））に濃縮した。これら６バッチ分の濃縮液のうち、５バッチ分については、それぞれイオン交換水を１、３、５、１０、２０質量％となるよう添加した。これらのイオン交換水を添加した、又は添加していない溶液を６０℃で２時間窒素雰囲気下に加熱（インキュベーション）処理し、その後缶温３０℃で一晩熟成を行い、結晶を析出させた。【００６５】
工程４：結晶の濾取、洗浄及び乾燥工程
本実施例の工程３で得られた結晶を含む液から、濾過にて結晶を回収した。この結晶を１００℃で２時間減圧乾燥して乾燥結晶を得た。この乾燥結晶のアスタキサンチン及びカロテノイド含有量を前述の方法により定量し、回収した結晶量、アスタキサンチンの回収率と共に表３に示す。【００６６】
【表３】
2014054669.tif 000005
【００６７】
表３に示すように、濃縮後、加熱処理前に水を添加することにより、加熱処理前に水を添加しない場合と比較して、回収される結晶量及びアスタキサンチン回収率が向上することを確認できた。これは、水を添加することによってカロテノイド含有溶液中のカロテノイドの溶解度が低下したためと考えられる。
このように、濃縮後、加熱処理前に水を添加するという簡単な工程を加えるのみで、カロテノイド含有組成物中のアスタキサンチン含量及びカロテノイド含量を大きく低下させることなく、カロテノイド含有組成物の収率を向上させることができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明により、安価かつ安全な溶剤を使用した簡易な工程にて、微生物由来であって、高い含有量のアスタキサンチン及び高純度のカロテノイドを含有し、且つ良好な結晶性状を有するカロテノイド含有組成物を高い収量で得ることが可能なカロテノイド含有組成物の製造方法及び前記カロテノイド含有組成物を提供することが可能となる。
【図１】
2014054669.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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