(57)【要約】  粘膜免疫賦活化剤は、滋養強壮作用を有する漢方薬及び粘膜アジュバントを含有する。ＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物は、ＨＰＶのＥ７ポリペプチドと、滋養強壮作用を有する漢方薬とを少なくとも含む。
2013191225.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
滋養強壮作用を有する漢方薬と、粘膜アジュバントとを含有することを特徴とする粘膜免疫賦活化剤。
【請求項２】
滋養強壮作用を有する漢方薬が、十全大補湯及び補中益気湯の少なくともいずれかである請求項１に記載の粘膜免疫賦活化剤。
【請求項３】
粘膜アジュバントが、コレラ毒素（ＣＴ）、大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）、ベロ毒素（ＶＴ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、及び百日咳毒素（ＰＴ）に由来する野生型ポリペプチド又は変異型ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド並びに合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）のうちの少なくとも１つである請求項１から２のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤。
【請求項４】
粘膜アジュバントは、ＬＴのＢサブユニット（ＬＴＢ）ポリペプチド及び合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）のいずれかである請求項３に記載の粘膜免疫賦活化剤。
【請求項５】
経口で投与される場合に、患者の粘膜において、その前後又は同時に経口投与される抗原に特異的な細胞性免疫を賦活化させる請求項１から４のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤。
【請求項６】
抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）由来のポリペプチドである請求項５に記載の粘膜免疫賦活化剤。
【請求項７】
ＨＰＶ由来のポリペプチドは、１から数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加する変異を有する請求項６に記載の粘膜免疫賦活化剤。
【請求項８】
ＨＰＶ由来のポリペプチドは、ＨＰＶ由来のポリペプチドを発現させたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉの組換え体を死菌化させた粉体に含有される、又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉを死菌化させた粉体に添加される請求項６から７のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤。
【請求項９】
ＨＰＶ由来のポリペプチドは、ＨＰＶのＥ７ポリペプチドである請求項６から８のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤。
【請求項１０】
ＨＰＶのＥ７ポリペプチドは、ＨＰＶ１６に由来する請求項９に記載の粘膜免疫賦活化剤。
【請求項１１】
ＨＰＶのＥ７ポリペプチドは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる請求項１０に記載の粘膜免疫賦活化剤。
【請求項１２】
ＨＰＶのＥ７ポリペプチドと、滋養強壮作用を有する漢方薬とを含有することを特徴とするＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物。
【請求項１３】
滋養強壮作用を有する漢方薬が、十全大補湯及び補中益気湯の少なくともいずれかである請求項１２に記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物。
【請求項１４】
更に粘膜アジュバントを含有する請求項１２から１３のいずれかに記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物。
【請求項１５】
ＨＰＶのＥ７ポリペプチドは、ＨＰＶ１６に由来する請求項１２から１４のいずれかに記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物。
【請求項１６】
ＨＰＶのＥ７ポリペプチドは、１から数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加する変異を有する請求項１２から１５のいずれかに記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物。
【請求項１７】
ＨＰＶのＥ７ポリペプチドは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる請求項１６に記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物。
【請求項１８】
ＨＰＶのＥ７ポリペプチドは、ＨＰＶのＥ７ポリペプチドを発現させたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉの組換え体を死菌化させた粉体に含有される、又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉを死菌化させた粉体に添加される請求項１２から１７のいずれかに記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物。
【請求項１９】
患者の粘膜において、ＨＰＶのＥ７ポリペプチド特異的な細胞性免疫を賦活化させる請求項１２から１８のいずれかに記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物。
【請求項２０】
患者は、子宮頚癌前癌病変患者及び子宮頚癌患者のいずれかである請求項１９に記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物。
【請求項２１】
粘膜アジュバントは、ＣＴ、ＬＴ、ＶＴ、ＤＴ、及びＰＴに由来する野生型ポリペプチド又は変異型ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド並びに合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）のうちの少なくとも１つである請求項１４から２０のいずれかに記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物。
【請求項２２】
粘膜アジュバントは、ＬＴＢポリペプチド及び合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）のいずれかである請求項２１に記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粘膜免疫賦活化剤及びＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物に関し、更に詳しくは、粘膜アジュバントと、滋養強壮作用を有する漢方薬とを含有する粘膜免疫賦活化剤、並びにＨＰＶワクチンと、滋養強壮作用を有する漢方薬とを含有するＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）はＤＮＡウイルスであって、現在まで１００種類以上の異なる型が報告されている。前記ＨＰＶは皮膚（例えばＨＰＶ−１、ＨＰＶ−２）や粘膜表面（例えばＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１）に感染することで、数ヶ月から数年単位で存在する良性腫瘍（イボ）を形成する。
更に、前記ＨＰＶの一部（例えばＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３）は、粘膜に長期間感染することで、悪性腫瘍を引き起こす。【０００３】
女性特有の癌として乳癌に次いで罹患率が高い子宮頚癌については、そのほぼ１００％が、前記ＨＰＶの生殖器への長期間感染により発症するものであり、世界で５０万人、日本でも１万５千人の新規患者が毎年報告されている。
子宮頚癌による年間の死亡者数は、世界で２７万人、日本でも３，５００人に達する。
理論的には、前記ＨＰＶの感染の全てを未然に防ぐことができれば、前記子宮頚癌は完全に根絶することができる。【０００４】
前記ＨＰＶの感染は、前記子宮頚癌以外にも、外陰癌、肛門癌、口腔癌、腟癌、陰茎癌、咽頭癌、そして尖圭コンジローマ（性器イボ）にも関連していることが明らかになっており、これらの癌及び性感染症の予防のために、前記ＨＰＶの感染に対する予防ワクチンは有効であると考えられる。【０００５】
前記ＨＰＶの中でも、特にＨＰＶ１６とＨＰＶ１８が、日本人女性の前記子宮頚癌の発症原因の約６５％、特に２０代では子宮頚癌の発症原因の約９０％を占めている。
前記ＨＰＶ１６と前記ＨＰＶ１８は、前記外陰癌に先行してみられる外陰上皮内腫瘍の高度病変においても発症原因の５０％弱を占め、更に前記膣癌に進行する可能性のある膣上皮内腫瘍の発症の８５％にも関連していることが知られている。【０００６】
今日、ＨＰＶ感染予防ワクチン、特に前記子宮頚癌に対する予防ワクチンとして、前記ＨＰＶ１６と前記ＨＰＶ１８に特異的な２価ワクチン（商標名：サーバリックス）（特許文献１参照）と、前記ＨＰＶ１６、前記ＨＰＶ１８に加え、尖圭コンジローマの発症原因の約９０％を占めるＨＰＶ６及びＨＰＶ１１にも特異的な４価ワクチン（商標名：ガーダシル）（特許文献２参照）が使用されている。これら２つのワクチンのいずれも、前記ＨＰＶ由来のＬ１たんぱく質ウイルス様粒子を含んでいる。【０００７】
しかしながら、より広範囲の前記ＨＰＶに対する予防ワクチンが開発され、それが世界中の前記ＨＰＶに未感染の思春期女性に１００％適用されない限り、前記子宮頚癌及びその前癌病変をもつ患者がいなくなることは期待できない。そのため、現在においても、子宮頚部細胞診のコストだけでも膨大なものとなっている。【０００８】
インビトロにおいて、前記ＨＰＶのＥ７タンパク質はＲｂタンパク質との結合能を有し、前記Ｒｂタンパク質と結合することで、転写因子Ｅ２Ｆと前記Ｒｂタンパク質の結合を阻害する。その結果、前記Ｒｂタンパク質から遊離した状態にある前記Ｅ２Ｆは活性化され、細胞の細胞周期をＧ１期からＳ期へ移行させる。
一方、前記ＨＰＶのもうひとつのタンパク質、Ｅ６タンパク質は、ｐ５３タンパク質と結合してユビキチン化を促進することで、前記ｐ５３タンパク質は分解される。
これらのことから、前記Ｅ７タンパク質及び前記Ｅ６タンパク質の機能により、前記ＨＰＶに感染した細胞は細胞周期チェックポイントの機構や前記ｐ５３タンパク質が制御しているアポトーシスを回避し、癌化に至ることが予想された。【０００９】
実際に、子宮頚癌細胞においては、ＨＰＶのＥ７及びＥ６のｍＲＮＡが常に高発現している。
また、子宮頚癌細胞におけるＨＰＶのＥ６、Ｅ７の発現をアンチセンスなどで抑制すると、前記子宮頚癌細胞の増殖活性は抑制される。
更に、アンチセンスなどでＥ６及びＥ７の発現を抑制した前記子宮頚癌細胞は、マウスに移植しても、その造腫瘍能を失っていることも示されている。
以上のことから、前記ＨＰＶのＥ６及びＥ７が前記子宮頚癌、及びその他のＨＰＶ関連癌の病態や発癌過程に機能的に深く関与することは明らかである。【００１０】
前記ＨＰＶ感染による前記子宮頚癌の前癌病変である子宮頚部上皮内腫瘍（Ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ；ＣＩＮ）の多くが子宮の移行帯と呼ばれる部分に発生する。前記移行帯において、子宮膣部（子宮頚部の下半分、膣に突き出している部分）にびらんが生じたときの修復時には扁平上皮化生（膣内の予備細胞の扁平上皮化）が起こる。その際、生じた上皮の基底細胞へのＨＰＶ感染が子宮頚癌の起源であると考えられている。
上皮の基底細胞に感染した、前記ＨＰＶのＤＮＡは細胞１個あたり数十から百コピー程度であって、前記Ｅ６、前記Ｅ７の発現は少ない。
通常の前記ＨＰＶの感染初期における前記Ｅ６、前記Ｅ７の発現が低い状態において、前記子宮頚癌の発症の高リスク群に属する前記ＨＰＶを含め、前記ＨＰＶの多くは潜伏状態となり、前記ＨＰＶの増殖は止まっている。
子宮頚部ＨＰＶ感染のうち、浸潤癌に進行するのはそのうちの０．１３％以下であるという報告が米国疾病予防管理センターによってなされている。【００１１】
一方、前記子宮頚癌の発生過程では、基底細胞への前記ＨＰＶの増殖が持続状態に至り、低レベルであった前記Ｅ６と前記Ｅ７の発現が持続的に亢進されるという変化が生じると考えられる。
前記Ｅ６と前記Ｅ７の発現は、ＣＩＮ１（軽度異形成）では非常に低いのに対して、ＣＩＮ２（中度異形成）とＣＩＮ３（高度異形成）では高発現が認められることから、前記Ｅ６と前記Ｅ７の発現の持続的な亢進は前記ＣＩＮ１の段階で起こると考えられる。【００１２】
前記ＨＰＶの感染が制御されるのは、宿主の免疫応答によると考えられ、実際に、ＨＩＶ感染者や臓器移植患者など、免疫応答が低下している女性では前記子宮頚癌の発症率が高いことも報告されている。【００１３】
ＨＰＶなどのウイルスに対する宿主の免疫応答は、ＮＫ細胞やマクロファージなどの細胞群やインターフェロンが機能することで、感染直後より作動する自然免疫と呼ばれる非特異的な機構と、それとは別のウイルス抗原特異的な免疫応答である獲得免疫と呼ばれる機構がある。
前記獲得免疫は、感染後数日してから働く免疫機構であって、液性免疫と細胞性免疫に分けられる。
ＨＰＶの感染排除に関する免疫応答は、前記ＮＫ細胞と前記細胞性免疫に関わる細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による細胞性の応答が主体であると考えられている。【００１４】
前記ＮＫ細胞は、前記ＨＰＶの感染の初期に作動する免疫細胞である。
一方、ＨＰＶ特異的細胞免疫に関しては、前記ＨＰＶ１６の前記Ｅ７タンパク質に対する遅延型アレルギー反応がＣＩＮ退縮と相関すること、前記Ｅ７に特異的なヘルパーＴ細胞が前記ＨＰＶの感染制御に重要な機能を担っていることが示されている（非特許文献１参照）。【００１５】
既に述べてきたように、前記ＨＰＶの前記Ｅ６タンパク質と前記Ｅ７タンパク質、その中でも特に前記Ｅ７タンパク質が、ＨＰＶ関連癌に対する治療用ワクチンの開発においてとても魅力的なターゲットであると考えられる。
これまでにも前記ＨＰＶの前記Ｅ７タンパク質を抗原とした前記治療用ワクチンが既にいくつか開発されているものの、それらが患者子宮頚部の前癌病変（前記ＣＩＮ）や癌細胞を排除することまでは示されてはおらず、実際に治療効果をもったワクチンの開発が強く望まれていた（非特許文献２〜４参照）。【００１６】
最近、本発明者らは、前記ＨＰＶ１６の前記Ｅ７タンパク質において、前記Ｒｂタンパク質との結合に関与する第２１番目のＡｓｐ、第２４番目のＣｙｓ及び第２６番目のＧｌｕを全てＧｌｙに置換した変異型Ｅ７タンパク質を、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉに発現させ、熱処理により死菌化したものを乾燥、粉末化したワクチン（ＬａｃＥ７）をマウスに経口投与することで、脾臓だけでなく、粘膜においてもＥ７特異的細胞性免疫応答を誘導できることを示した（非特許文献５参照）。【００１７】
更に、本発明者らは、製剤化ＬａｃＥ７に関して、前記子宮頚癌の前記前癌病変（ＣＩＮ）に対する探索的臨床試験を実施し、安全性の評価と病理学的有効性を検討した。
また、子宮頚部リンパ球、末梢血中のＥ７特異的細胞性免疫の誘導についても解析した。【００１８】
ＨＰＶ１６陽性の前癌病変（ＣＩＮ３）患者７人で、１カプセル（２５０ｍｇ）１日１回５日間経口投与を１クールとして、１カプセル／日投与群（ｎ＝１）、２カプセル／日投与群（ｎ＝３）、４カプセル／日投与群（ｎ＝３）で、第１、２、４、８週の合計４クール、ＬａｃＥ７製剤の投与を実施した。
その結果、前記１カプセル／日投与群及び前記２カプセル／日投与群は試験終了後に円錐切除となったが、前記４カプセル／日投与群は、前記ＣＩＮ３が完全消失し、その後の憎悪も認められなかった。【００１９】
免疫学的解析では、前記子宮頚部リンパ球中に前記ＨＰＶ１６に対する前記Ｅ７特異的細胞性免疫の誘導（Ｅ７特異的ＩＦＮ−γ産生細胞、Ｅ７特異的グランザイムＢ産生細胞の誘導）が認められた。
病理学的にも、投与前の前記前癌病変にみられなかった、前記前癌病変内への著明なリンパ球の浸潤が認められた。
したがって、本発明者らが開発した前記ＬａｃＥ７は、前記前癌病変（ＣＩＮ３）患者に対する初の治療ワクチンとなりうることが期待されている。【００２０】
しかしながら、前記前癌病変患者だけでなく、子宮頚癌患者に対しても十分な臨床効果を持つ治療用のＨＰＶワクチンとして、未だ満足なものが見出させていないのが現状である。
即ち、依然として、子宮頚癌患者に対しても十分な臨床効果を持つ治療用ＨＰＶワクチンが提供されていないという問題がある。
また、より少量、短期間の前記ＬａｃＥ７の経口投与や、前記ＬａｃＥ７以外のＨＰＶワクチンの経口投与によっても、効果的に前記ＨＰＶに対する獲得免疫を誘導する方法、特に粘膜でのＨＰＶ特異的細胞性免疫誘導方法が未開発であるという問題もある。【００２１】
前記ＨＰＶやＨＩＶなどのウイルスを含む多くの病原体は、粘膜を介して宿主に侵入し感染が成立することから、局所粘膜に存在する粘膜免疫系が宿主の感染防御機構において重要な役割を果たしていると考えられる。
前記局所粘膜における液性免疫に関しては、分泌型のＩｇＡ抗体が重要な役割を果たしている。
前記ＩｇＡ抗体は、Ｂ細胞やＴ細胞、マクロファージから分泌される、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β、インターロイキン（ＩＬ）−４やＩＬ−６などのサイトカインによってその産生が制御されており、それら液性因子の機能が前記粘膜における前記液性免疫の維持・調節に重要である。【００２２】
近年、前記局所粘膜における免疫として、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を中心とした細胞性免疫応答が、消化管や生殖器の粘膜において誘導されることが明らかにされている。抗原特異的な前記ＣＴＬの活性化にはインターフェロン（ＩＦＮ）−γなどが関与している。【００２３】
漢方薬である十全大補湯と補中益気湯、及び粘膜アジュバントは、粘膜において獲得免疫の一つである液性免疫を賦活化する粘膜免疫賦活化剤として既に知られている。【００２４】
漢方薬（和漢生薬）の中には、漢方医学における「傷寒論」にあるように感染症の治療にも用いられる一群の生薬がある。
現代において、前記漢方薬は風邪やインフルエンザ、ウイルス性肝炎、ヘリコバクターピロリ感染などの各種感染症や感染症関連疾患の治療に使用され、有効性も示されている。その作用は、原因ウイルスや原因細菌に対する直接的な作用だけでなく、免疫調節作用を通じた生態防御機構の増強によることが多い。【００２５】
現代医療においては、細菌感染症の治療には抗生物質が用いられ、ウイルス感染症の予防にはワクチンが一般的に用いられる。これに対して、前記漢方薬の一部は宿主側の免疫能力を高めることによる感染防御効果をもつことが知られている。【００２６】
例えばインフルエンザ感染において、葛根湯はインフルエンザウイルスに対する直接的な増殖抑制効果は認められないが、その代わりに、解熱効果や肺炎の改善効果、死亡率の低下などの治療効果を奏する。
マウスに前記インフルエンザウイルスを経鼻感染させると血清中のＩＦＮの量が上昇し、次いでＩＬ−１αの量が上昇し、脳内シクロオキシゲナーゼ活性が上昇することで、プロスタグランジンＥ２の量が上昇して発熱する。
アスピリンが前記シクロオキシゲナーゼを阻害するのに対して、前記葛根湯は前記ＩＦＮにより誘導される前記ＩＬ−１αの産生を抑制することで解熱効果を呈する。【００２７】
十全大補湯や補中益気湯は、術後、病後、産後、慢性疾患による消耗、疲労の蓄積、夏痩せなどで衰弱した際の全身倦怠感、食欲不振などの治療に用いられる漢方薬である。前記十全大補湯が貧血などにも用いられるのに対して、前記補中益気湯は風邪が長引いたとき、虚弱な人が風邪を引いたときの微熱、咳、寝汗、動悸などの症状の改善や体質の改善に用いられる。
前記十全大補湯や前記補中益気湯は、いずれも腸管や気管の粘膜においてＢ細胞による液性免疫機構を活性化することも示されている（特許文献３、及び非特許文献６参照）。即ち、十全大補湯及び補中益気湯は、粘膜の液性免疫を賦活化する粘膜免疫賦活化剤であることが明らかになっている。【００２８】
その他、小紫胡湯や小青竜湯なども感染症の治療や予防に使用されるが、これらも宿主の免疫機構を活性化させると考えられている。【００２９】
免疫学において一般的にアジュバントと呼ばれるものは、抗原とともに注射されることによって、抗原性の増強（免疫促進）に使用される試薬であって、前記抗原を不溶化することで長くとどめて、前記抗原を徐々に長期間遊離させることや、前記抗原を投与した部分に炎症を起こさせることで、マクロファージが集まり、前記抗原が貪食されやすくなることで、抗原提示を促進することや、免疫細胞を活性化させることなどが考えられているが、それらの作用機構は様々であって不明なものも多い。
前記葛根湯、十全大補湯、補中益気湯、小紫胡湯、小青竜湯などのいわゆる滋養強壮作用を有する漢方薬も、液性免疫の増強効果を有する点において、広義のアジュバントであるといえる。【００３０】
粘膜アジュバントとしてよく知られているのは、細菌由来のコレラ毒素（ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ：ＣＴ）と毒素原性大腸菌の易熱性毒素（ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ：ＬＴ）、腸管出血性大腸菌のベロ毒素（ｖｅｒｏｔｏｘｉｎ：ＶＴ）、ジフテリア毒素（ｄｉｐｈｔｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ：ＤＴ）、百日咳毒素（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ：ＰＴ）で、それらは免疫原性が強く実験上は最も効果的なアジュバントである。【００３１】
細菌由来の前記粘膜アジュバントはいずれも、粘膜及び全身において優れたアジュバント効果を発揮するものの、視神経麻痺などの重篤な副作用を呈することが明らかになっている為、そのままヒトの治療に用いることはできない。
そこで、最近になって、前記副作用を回避できる変異型粘膜アジュバントが新たに開発され、利用可能になっている。【００３２】
また、細菌由来の野生型と変異型の前記粘膜アジュバント以外にも、副作用がなく、臨床で使用可能な粘膜アジュバントとして、合成セラミドであるαＧａｌＣｅｒ（α−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、リン脂質とアポタンパク質からなる生体界面活性剤からなる肺サーファクタントタンパク質−Ｃ（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃ，ＳＰ−Ｃ、別名：サーファクテン）、肺サーファクタントタンパク質−Ｂ（ＳＰ−Ｂ）、野生型又は変異型ＩＦＮ−α、二本鎖ＲＮＡ、並びに活性増幅型ＴＮＦ変異体などが使用可能である（特許文献４〜６、及び非特許文献７〜１１参照）。【００３３】
しかしながら、前記ＨＰＶなどのウイルス及び細菌の感染防御あるいは感染症の治療において、前記ウイルス及び前記細菌に対するワクチンと併用投与する粘膜免疫賦活化剤として、未だ満足なものが見出せていないのが現状である。
即ち、依然として、粘膜において細胞性免疫の賦活化に十分な効果をもつ、ＨＰＶワクチンなどのウイルスワクチン及び細菌ワクチンと併用投与可能な粘膜免疫賦活化剤が提供されていないという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３４】
【特許文献１】国際公開第２００３／０７８４５５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０００／０４５８４１号パンフレット
【特許文献３】特開２００６−０７０２１７号公報
【特許文献４】国際公開第２００７／０１８１５２号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００４／０２８５６１号パンフレット
【特許文献６】特開２００５−０９７２６７号公報
【非特許文献】
【００３５】
【非特許文献１】Ｒ．  Ｈｏｐｆｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  ２０００，  ｖｏｌ．３５６，  ｐｐ．１９８５−１９８６
【非特許文献２】Ｃ．Ｌ．  Ｔｒｉｍｂｌｅ  ａｎｄ  Ｉ．Ｈ．  Ｆｒａｚｅｒ，  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．，  ２００９，  ｖｏｌ．１０，  ｐｐ．９７５−９８０
【非特許文献３】Ｈ．  Ｐｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ２００６，  ｖｏｌ．１１９，  ｐｐ．１７０２−１７０９
【非特許文献４】Ｎ．Ｇ．  Ｃｏｒｔｅｓｓ−Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ，２００７，  ｖｏｌ．２５，  ｐｐ．６５８１−６５８８
【非特許文献５】Ｋ．  Ａｄａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ，  ２０１０，  ｖｏｌ．２８，  ｐｐ．２８１０−２８１７
【非特許文献６】Ｈ．  Ｋｉｙｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｖｉｄ．  Ｂａｓｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ．  Ａｌｔｅｒｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  ２００６，  ｖｏｌ．３，  ｐｐ．４５９−４６７
【非特許文献７】Ａ．  Ｄａｌｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２００１，  ｖｏｌ．２０４，  ｐｐ．６６７−６７６
【非特許文献８】Ｄ．  Ｍｉｚｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ，  ２０１１，  ｖｏｌ．２９，  ｐｐ．５３６８−５３７８
【非特許文献９】Ｈ．  Ｋａｙａｍｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２００９，  ｖｏｌ．３０，  ｐｐ．５８６９−５８７６
【非特許文献１０】Ｈ．Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２００９，  ｖｏｌ．１８３，  ｐｐ．２５４−２６０
【非特許文献１１】Ｙ．Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２００５，  ｖｏｌ．３５，  ｐｐ．２８０３−２８１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３６】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、粘膜における細胞性免疫の賦活化に十分な効果をもつ、ＨＰＶワクチンなどのウイルスワクチン及び細菌ワクチンと併用投与可能な、滋養強壮作用を有する漢方薬と、粘膜アジュバントとを含有する粘膜免疫賦活化剤、並びに子宮頚癌や外陰癌、肛門癌、口腔癌、腟癌、陰茎癌、咽頭癌とそれらの前癌病変、及び尖圭コンジローマの治療に使用可能な、ＨＰＶワクチンとしてのＨＰＶのＥ７ポリペプチドと、滋養強壮作用を有する漢方薬とを含有するＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３７】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下の知見を得た。
即ち、本発明者らは、前記ＨＰＶワクチンと、漢方アジュバントとして液性免疫増強効果は知られていた、前記十全大補湯や前記補中益気湯などの滋養強壮作用を有する漢方薬とを併用投与することで、脾臓における前記ＨＰＶワクチン特異的な細胞性免疫が増強されることを新たに見出した。更に前記ＨＰＶワクチンと、前記十全大補湯や前記補中益気湯などの滋養強壮作用を有する漢方薬と、粘膜アジュバントとを併用投与することで、粘膜部分における前記ＨＰＶワクチン特異的な細胞性免疫応答が増強されることも新たに見出した。前記十全大補湯や前記補中益気湯などの滋養強壮作用を有する漢方薬と、粘膜アジュバントとを含有する粘膜免疫賦活化剤は、ＨＰＶワクチンに対する効果的な粘膜免疫賦活化剤として機能するだけでなく、他のウイルスワクチン及び細菌ワクチンに対する粘膜免疫賦活化剤としての効果が期待される。【００３８】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段は、以下の通りである。即ち、
本発明の粘膜免疫賦活化剤は、滋養強壮作用を有する漢方薬と、粘膜アジュバントとを含有することを特徴とする。
本発明のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物は、ＨＰＶのＥ７ポリペプチドと、滋養強壮作用を有する漢方薬とを含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００３９】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、粘膜における細胞性免疫の賦活化に十分な効果をもつ、ＨＰＶワクチンなどのウイルスワクチン及び細菌ワクチンと併用投与可能な、滋養強壮作用を有する漢方薬と、粘膜アジュバントとを含有する粘膜免疫賦活化剤、並びに子宮頚癌や外陰癌、肛門癌、口腔癌、腟癌、陰茎癌、咽頭癌とそれらの前癌病変、及び尖圭コンジローマの治療に使用可能な、ＨＰＶワクチンとしてのＨＰＶのＥ７ポリペプチドと、滋養強壮作用を有する漢方薬とを含有するＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、ＬａｃＥ７経口投与において、十全大補湯（ＪＴＴ）又は補中益気湯（ＨＥＴ）を同時投与することによる、全身性及び粘膜における１型Ｔ細胞応答への影響を示す図である。
【図２】図２は、ＬａｃＥ７経口投与において、十全大補湯（ＪＴＴ）又は補中益気湯（ＨＥＴ）とＬＴＢを同時投与することによる、全身性及び粘膜における１型Ｔ細胞応答への影響を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＬａｃＥ７経口投与において、十全大補湯（ＪＴＴ）又は補中益気湯（ＨＥＴ）とＬＴＢを同時投与することによる、全身性の液性免疫応答への影響を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＬａｃＥ７経口投与において、十全大補湯（ＪＴＴ）又は補中益気湯（ＨＥＴ）とＬＴＢを同時投与することによる、粘膜における液性免疫応答への影響を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＬａｃＥ７経口投与において、十全大補湯（ＪＴＴ）又は補中益気湯（ＨＥＴ）とＬＴＢを同時投与することによる、粘膜での１型細胞応答への影響を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＬａｃＥ７経口投与において、十全大補湯（ＪＴＴ）又は補中益気湯（ＨＥＴ）とＬＴＢを同時投与することによる、粘膜での２型Ｔ細胞応答への影響を示す図である。
【図５】図５は、ＬａｃＥ７経口投与において、補中益気湯（ＨＥＴ）とαガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）又はＬＴＢを同時投与することによる、粘膜におけるＥ７特異的１型Ｔ細胞応答への影響を示す図である。
【図６】図６は、ＬａｃＥ７経口投与により、Ｅ７特異的ＣＴＬが腸管粘膜上内皮に誘導されていることを示す図である。
【図７】図７は、ＬａｃＥ７経口投与により、Ｅ７特異的ＣＴＬが腸管粘膜上内皮に誘導されていることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
（粘膜免疫賦活化剤）
本発明の免疫賦活化剤は、滋養強壮作用（免疫増強作用）を有する漢方薬（免疫増強漢方薬）と粘膜アジュバントとを少なくとも含み、必要に応じて適宜選択したその他の成分を含む。
【００４２】
＜免疫増強漢方薬＞
滋養強壮作用（免疫増強作用）を有する前記免疫増強漢方薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、葛根湯、十全大補湯、補中益気湯、小紫胡湯、小青竜湯などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、十全大補湯と補中益気湯が好ましい。
【００４３】
＜＜十全大補湯＞＞
前記十全大補湯は、漢方薬の一種で、黄耆（オウギ）、人参（ニンジン）、桂皮（ケイヒ）、当帰（トウキ）、川きゅう（センキュウ）、芍薬（シャクヤク）、熟地黄（ジオウ）、蒼朮（ソウジュツ）又は白朮（ビャクジュツ）、茯苓（ブクリョウ）、及び甘草（カンゾウ）からなる。例えば、日局オウギ３．０ｇ、日局ニンジン３．０ｇ、日局ケイヒ３．０ｇ、日局トウキ３．０ｇ、日局センキュウ３．０ｇ、日局シャクヤク３．０ｇ、日局ジオウ３．０ｇ、日局ソウジュツ３．０ｇ、日局ブクリョウ３．０ｇ及び日局カンゾウ１．５ｇを混合した混合生薬５．０ｇを全量７．５ｇ中に含有するものであってもよく、更に前記混合生薬以外に日局ステアリン酸マグネシウムと日局乳糖水和物などが添加されていてもよい。
前記十全大補湯としては、市販品であってもよく、該市販品としては、例えば、ツムラ十全大補湯エキス顆粒（識別コード：ツムラ／４８）などが挙げられる。
【００４４】
＜＜補中益気湯＞＞
前記補中益気湯は漢方薬の一種で、黄耆、人参、蒼朮又は白朮、当帰、甘草、柴胡（サイコ）、陳皮（チンピ）、大棗（タイソウ）、生姜（ショウキョウ）、及び升麻（ショウマ）からなる。例えば、日局オウギ４．０ｇ、日局ニンジン４．０ｇ、日局ソウジュツ４．０ｇ、日局トウキ３．０ｇ、日局カンゾウ１．５ｇ、日局サイコ２．０ｇ、日局チンピ２．０ｇ、日局タイソウ２．０ｇ、日局ショウキョウ０．５ｇ、及び日局ショウマ１．０ｇを混合した混合生薬５．０ｇを全量７．５ｇ中に含有するものであってよく、更に前記混合生薬以外に日局ステアリン酸マグネシウムと日局乳糖水和物などが添加されていてもよい。
前記補中益気湯としては、市販品であってもよく、該市販品としては、例えば、ツムラ補中益気湯エキス顆粒（識別コード：ツムラ／４１）などが挙げられる。
【００４５】
＜粘膜アジュバント＞
前記粘膜アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ウイルスや細菌などのタンパク質に由来する経口ワクチン特異的な獲得免疫を更に増強するものが好ましい。例えば、細菌毒素、合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＳＰ−Ｃ（サーファクテン）、ＳＰ−Ｂ、ＩＦＮ−α（野生型又は変異型）、二本鎖ＲＮＡ及び活性増幅型ＴＮＦ変異体が挙げられ、それらを１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
細菌毒素に由来するアジュバント（細菌毒素由来アジュバント）が、従前より粘膜アジュバントとして頻繁に使用されている点で好ましい。
細菌毒素に由来しないという点においては、合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＳＰ−Ｃ（サーファクテン）、ＳＰ−Ｂ、ＩＦＮ−α（野生型又は変異型）、二本鎖ＲＮＡ及び活性増幅型ＴＮＦ変異体などのアジュバントが好ましいが、それらの中でも、前記合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）がヒトに対するアジュバント効果が確認されている点でより好ましい。
複数の抗原に対するアジュバント効果が知られている点では、前記細菌毒素と前記合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）が好ましい。
【００４６】
＜＜細菌毒素由来アジュバント＞＞
前記細菌毒素由来アジュバントしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＴ、ＬＴ、ＶＴ、ＤＴ、ＰＴなどに由来するポリペプチドが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、ヒトへの経口投与において重篤な副作用を生じないようにあらかじめ変異が導入された変異型細菌毒素由来アジュバントが好ましい。
【００４７】
−変異型細菌毒素由来アジュバント−
前記変異型細菌毒素由来アジュバントとしては、ヒトへの経口投与において重篤な副作用を生じないものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、変異型ＣＴ、変異型ＬＴ、変異型ＶＴ、変異型ＤＴ、変異型ＰＴなどが挙げられる。
変異型ＣＴ、変異型ＬＴ、変異型ＶＴ、変異型ＤＴ、変異型ＰＴとしては、例えば、既に文献（国際公開第９８／０４２３７５号、国際公開第００／０３７６０９号、国際公開第２００６／１００１０８号、国際公開第１９９６／００６６２７号）に記載されているものが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００４８】
−−ＬＴＢポリペプチド−−
前記ＬＴに由来するポリペプチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＬＴＢポリペプチドが好ましい。前記ＬＴＢポリペプチドは、ＬＴのＢサブユニット（ＬＴＢ）に由来し、粘膜アジュバント効果をもつこと以外には、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、全長であるＬＴＢタンパク質などが挙げられる。
前記ＬＴＢは、ＬＴのＡサブユニット（ＬＴＡ）と２量体（ホロトキシン）の形では毒性を示すが、前記ＬＴＢは単独では毒性を持たない。
それにも関わらず、経口や経鼻投与により、前記ＬＴＢタンパク質は単独で粘膜においてアジュバントとして機能することが示されている（国際公開第９９／０２６６５４号）。
したがって、ヒトへ投与する経口ワクチンの製造においても、前記ＬＴＢポリペプチドを粘膜アジュバントとして使用することが可能である。
前記ＬＴＢポリペプチドとしては、市販品であってもよく、該市販品としては、例えば、シグマアルドリッチ株式会社の易熱性エンテロトキシンＢサブユニット（ＬＴＢ）大腸菌由来（カタログ番号：Ｅ８６５６）などが挙げられる。
【００４９】
＜＜合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）＞＞
胆癌マウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで抗腫瘍効果を示す天然化合物のスクリーニングにより、海綿由来のアゲラフィン類が単離された。更に、より抗腫瘍効果が強い前記アゲラフィン類の誘導体として、前記合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）は取得された。その後の研究で、前記合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）は、抗原提示細胞に取り込まれた後に、ＮＫ細胞とＴ細胞の両方のキャラクターを持つＮＫＴ細胞と会合して、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の産生を誘導することから、いわゆるアジュバントであることが示されている。前記合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）は、経鼻投与することで、鼻でＩｇＡ産生を誘導することができることが報告されていることから粘膜アジュバントでもある。
前記合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）としては、市販品であってもよく、該市販品としては、例えば、協和発酵キリン株式会社のα−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ（ＫＲＮ７０００）などが挙げられる。
【００５０】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。
【００５１】
＜＜担体＞＞
前記担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する前記粘膜免疫賦活化剤の剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記粘膜免疫賦活化剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて、適宜選択することができる。
【００５２】
−剤型−
前記剤型としては、経口投与できるものである以外、特に制限はなく、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）などが挙げられる。
【００５３】
＜用途＞
前記粘膜免疫賦活化剤は、患者に対して経口で投与することができる。その場合、前記粘膜免疫賦活化剤は、患者の粘膜において、その前後又は同時に投与される抗原に特異的な細胞性免疫を賦活化する。
【００５４】
＜＜抗原＞＞
前記粘膜免疫賦活化剤に対して、その前後又は同時に経口投与される前記抗原としては、ウイルス又は細菌に由来し、ワクチンとして使用できるペプチドである以外、特に制限はない。前記抗原は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。子宮頚癌などのＨＰＶ関連癌に対する治療用途においては、抗原としてＨＰＶに由来するポリペプチド（ＨＰＶ由来ポリペプチド）が好ましい。
【００５５】
−ＨＰＶ由来ポリペプチド−
前記ＨＰＶ由来ポリペプチドとしては、抗原性を有するものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＨＰＶ由来タンパク質の全長であってもよい。また、前記ＨＰＶ由来ポリペプチドは、１から数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加する変異を有するものであってもよい。前記ＨＰＶ由来ポリペプチドは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００５６】
前記ＨＰＶ由来ポリペプチドをワクチンとして使用するための製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成や遺伝子組換え技術を用いる製造方法などが挙げられる。
これら製造方法の中でも、形質転換細菌を用いる遺伝子組換えによる製造方法がコストなどの点で好ましい。
前記宿主に用いる細菌としては、特に制限はなく、目的に応じて選択することができ、例えば、酵母、大腸菌、枯草菌、乳酸菌などが挙げられるが、乳酸菌が好ましく、乳酸菌の中でもＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属がより好ましく、ヘルパーＴ細胞１型（Ｔｈ１）細胞の誘導能が確認されている点で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉが特に好ましい。
宿主細菌における発現に適した発現ベクターは適宜選択することができる。
前記ＨＰＶ由来ポリペプチドをコードする核酸を含んだ発現ベクター（ＨＰＶ由来ポリペプチド発現ベクター）を用いて、目的に応じて適宜選択した形質転換方法で、前記宿主細菌を形質転換することができる。
前記ＨＰＶ由来ポリペプチドは、前記発現ベクターを適宜選択することで、前記宿主細菌の細胞表面若しくは細胞内に発現、又は細胞外に分泌させることができる。
前記ＨＰＶ由来ポリペプチド発現ベクターで形質転換された宿主細菌（ＨＰＶ由来ポリペプチド発現宿主細菌）の培養方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
ワクチンとして使用するために、培養後の前記ＨＰＶ由来ポリペプチド発現宿主細菌の培養物から前記ＨＰＶ由来ポリペプチドポリペプチドを精製してもよいが、前記ＨＰＶ由来ポリペプチド発現宿主細菌をそのままワクチンとして使用することもできる。
前記ＨＰＶ由来ポリペプチド発現宿主細菌をそのままワクチンとして使用する際には、目的に応じて菌体を熱処理するなどして死菌化してもよい。
死菌化した前記ＨＰＶ由来ポリペプチド発現宿主細菌を培地から回収した後に、乾燥・粉体状にしたものをワクチンとして使用することができる。
使用するまで、前記乾燥・粉体状にしたものを低温で保存することができる。
また、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉを死菌化させた粉体に、前記ＨＰＶ由来ポリペプチドを添加したものを、ワクチンとして使用することもできる。
【００５７】
−−ＨＰＶのＥ７ポリペプチド−−
前記ＨＰＶ由来ポリペプチドとしては、前記ＨＰＶのＥ７ポリペプチドが好ましい。前記ＨＰＶのＥ７ポリペプチドとしては、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、癌に関しての高リスク群に属するＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、ＨＰＶ８２、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ５３及びＨＰＶ６３からなる群より選択される少なくとも１つのＨＰＶのＥ７に由来するものがより好ましい。
これらの中でも、ＨＰＶ１６及びＨＰ１８の少なくともいずれか１つのＨＰＶのＥ７に由来するものが特に好ましく、ＨＰＶ１６のＥ７に由来するものが最も好ましい。
前記ＨＰＶのＥ７ポリペプチドは、抗原性を有するものであればよく、例えば、全長Ｅ７タンパク質であってもよい。
前記Ｅ７ポリペプチドとして、野生型Ｅ７に由来するものの他に、変異型Ｅ７に由来する変異型Ｅ７ポリペプチドを使用してもよい。
【００５８】
−−−変異型Ｅ７ポリペプチド−−−
前記変異型Ｅ７ポリペプチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１から数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されることで、Ｒｂタンパク質との結合性を失ったものなどが挙げられる。前記変異型Ｅ７ポリペプチドは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これら変異型Ｅ７ポリペプチドの中でも、ＨＰＶ１６の野生型Ｅ７タンパク質（配列番号１）における第２１番目のＡｓｐ、第２４番目のＣｙｓ及び第２６番目のＧｌｕに相当する、Ｅ７タンパク質のＲｂタンパク質との結合に関与するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置換したものが好ましい。例えば、ＨＰＶ１６の野生型Ｅ７タンパク質（配列番号１）の前記第２１番目のＡｓｐ、第２４番目のＣｙｓ及び第２６番目のＧｌｕの全てをＧｌｙに置換したものとして、ＨＰＶ１６の変異型Ｅ７タンパク質（配列番号２）が挙げられる。
【００５９】
本発明の粘膜免疫賦活化剤は、免疫原として経口投与されるウイルス抗原や細菌抗原などのワクチンと共に経口投与された場合に、前記ワクチンに対して特異的な獲得免疫、特に細胞性免疫を増強する。
【００６０】
（ＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物）
本発明のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物は、ＨＰＶのＥ７ポリペプチドと、滋養強壮作用（即ち免疫増強効果）を有する漢方薬（免疫増強漢方薬）とを少なくとも含み、必要に応じて適宜選択したその他の成分を含む。
【００６１】
＜ＨＰＶのＥ７ポリペプチド＞
前記ＨＰＶのＥ７ポリペプチドとしては、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、癌に関しての高リスク群に属するＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、ＨＰＶ８２、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ５３及びＨＰＶ６３からなる群より選択される少なくとも１つのＨＰＶのＥ７に由来するものが好ましい。
これらの中でも、ＨＰＶ１６及びＨＰ１８の少なくともいずれか１つのＨＰＶのＥ７に由来するものがより好ましく、ＨＰＶ１６のＥ７に由来するものが特に好ましい。
前記ＨＰＶのＥ７ポリペプチドは、抗原性を有するものであればよく、例えば、全長Ｅ７タンパク質であってもよい。
前記Ｅ７ポリペプチドとして、野生型Ｅ７に由来するものの他に、変異型Ｅ７に由来する変異型Ｅ７ポリペプチドを使用してもよい。
【００６２】
＜＜変異型Ｅ７ポリペプチド＞＞
前記変異型Ｅ７ポリペプチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１から数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されることで、Ｒｂタンパク質との結合性を失ったものなどが挙げられる。前記変異型Ｅ７ポリペプチドは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これら変異型Ｅ７ポリペプチドの中でも、ＨＰＶ１６の野生型Ｅ７タンパク質（配列番号１）における第２１番目のＡｓｐ、第２４番目のＣｙｓ及び第２６番目のＧｌｕに相当する、Ｅ７タンパク質のＲｂタンパク質との結合に関与するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置換したものが好ましい。例えば、ＨＰＶ１６の野生型Ｅ７タンパク質（配列番号１）の前記第２１番目のＡｓｐ、第２４番目のＣｙｓ及び第２６番目のＧｌｕの全てをＧｌｙに置換したものとして、ＨＰＶ１６の変異型Ｅ７タンパク質（配列番号２）が挙げられる。
【００６３】
前記Ｅ７ポリペプチドをワクチンとして使用するための製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成や遺伝子組換え技術を用いる製造方法などが挙げられる。
これら製造方法の中でも、形質転換細菌を用いる遺伝子組換えによる製造方法がコストなどの点で好ましい。
前記宿主に用いる細菌としては、特に制限はなく、目的に応じて選択することができ、例えば、酵母、大腸菌、枯草菌、乳酸菌などが挙げられるが、乳酸菌が好ましく、乳酸菌の中でもＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属がより好ましく、ヘルパーＴ細胞１型（Ｔｈ１）細胞の誘導能が確認されている点で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉが特に好ましい。
宿主細菌における発現に適した発現ベクターは適宜選択することができる。
前記Ｅ７ポリペプチドをコードする核酸を含んだ発現ベクター（Ｅ７発現ベクター）を用いて、目的に応じて適宜選択した形質転換方法で、前記宿主細菌を形質転換することができる。
前記Ｅ７ポリペプチドは、前記発現ベクターを適宜選択することで、前記宿主細菌の細胞表面若しくは細胞内に発現、又は細胞外に分泌させることができる。
前記Ｅ７発現ベクターで形質転換された宿主細菌（Ｅ７発現宿主細菌）の培養方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
ワクチンとして使用するために、培養後の前記Ｅ７発現宿主細菌の培養物から前記Ｅ７ポリペプチドを精製してもよいが、前記Ｅ７発現宿主細菌をそのままワクチンとして使用することもできる。
前記Ｅ７発現宿主細菌をそのままワクチンとして使用する際には、目的に応じて菌体を熱処理するなどして死菌化してもよい。
死菌化した前記Ｅ７発現宿主細菌を培地から回収した後に、乾燥・粉体状にしたものをワクチンとして使用することができる。
使用するまで、前記乾燥・粉体状にしたものを低温で保存することができる。
また、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉを死菌化させた粉体に前記Ｅ７ポリペプチドを添加したものを、ワクチンとして使用することもできる。
【００６４】
＜免疫増強漢方薬＞
滋養強壮作用（免疫増強作用）を有する前記免疫増強漢方薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、葛根湯、十全大補湯、補中益気湯、小紫胡湯、小青竜湯などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、十全大補湯と補中益気湯が好ましい。
【００６５】
＜＜十全大補湯＞＞
前記十全大補湯については、上記の通りである。
【００６６】
＜＜補中益気湯＞＞
前記補中益気湯については、上記の通りである。
【００６７】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粘膜アジュバント、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。また、前記医薬組成物中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて、適宜選択することができる。
【００６８】
＜＜粘膜アジュバント＞＞
前記粘膜アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記十全大補湯や前記補中益気湯と協調して、前記ＨＰＶの前記Ｅ７ポリペプチドなどの経口ワクチン特異的な液性免疫と細胞性免疫を更に増強するものが好ましい。例えば、細菌毒素、合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＳＰ−Ｃ（サーファクテン）、ＳＰ−Ｂ、ＩＦＮ−α（野生型又は変異型）、二本鎖ＲＮＡ及び活性増幅型ＴＮＦ変異体が挙げられ、それらを１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
細菌毒素由来アジュバントが、従前より粘膜アジュバントとして頻繁に使用されている点で好ましい。
細菌毒素に由来しないという点においては、合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＳＰ−Ｃ（サーファクテン）、ＳＰ−Ｂ、ＩＦＮ−α（野生型又は変異型）、二本鎖ＲＮＡ及び活性増幅型ＴＮＦ変異体などのアジュバントが好ましいが、それらの中でも、前記合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）がヒトに対するアジュバント効果が確認されている点でより好ましい。
複数の抗原に対するアジュバント効果が知られている点では、前記細菌毒素と前記合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）が好ましい。
前記ＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物に関して、前記粘膜アジュバントは必須の成分ではないが、添加されることで、前記ＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物の効果を顕著に増強することができる点で、含有することが好ましい。
【００６９】
−細菌毒素由来アジュバント−
前記細菌毒素由来アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＴ、ＬＴ、ＶＴ、ＤＴ、ＰＴなどに由来するポリペプチドが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、ヒトへの経口投与において重篤な副作用を生じないようにあらかじめ変異が導入された変異型細菌毒素由来アジュバントが好ましい。
【００７０】
−−変異型細菌毒素由来アジュバント−−
前記変異型細菌毒素由来アジュバントとしては、ヒトへの経口投与において重篤な副作用を生じないものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、変異型ＣＴ、変異型ＬＴ、変異型ＶＴ、変異型ＤＴ、変異型ＰＴなどが挙げられる。
変異型ＣＴ、変異型ＬＴ、変異型ＶＴ、変異型ＤＴ、変異型ＰＴとしては、例えば、既に文献（国際公開第９８／０４２３７５号、国際公開第００／０３７６０９号、国際公開第２００６／１００１０８号、国際公開第１９９６／００６６２７号）に記載されているものが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００７１】
−−−ＬＴＢポリペプチド−−−
前記ＬＴに由来するポリペプチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＬＴＢポリペプチドが好ましい。前記ＬＴＢポリペプチドについては、上記の通りである。
【００７２】
−合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）−
前記合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）については、上記の通りである。
【００７３】
＜＜担体＞＞
前記担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する前記医薬組成物の剤型等に応じて適宜選択することができる。
【００７４】
−剤型−
剤型としては、経口投与できるものである以外、特に制限はなく、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）などが挙げられる。
【００７５】
＜用途＞
前記ＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物は、子宮頚癌前癌病変患者及び子宮頚癌患者などの患者の粘膜において、ＨＰＶのＥ７ポリペプチド（ＨＰＶワクチン）に特異的な細胞性免疫を賦活化させるために使用できる。
【実施例】
【００７６】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００７７】
（実施例１）
＜インビボ解析のためのマウスの免疫＞
マウスのＬａｃＥ７製剤による経口免疫は、Ｋ．  Ａｄａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ，  ２０１０，  ｖｏｌ．２８，  ｐｐ．２８１０−２８１７に記載の方法に従って行った。その際、必要に応じて、十全大補湯（以下「ＪＴＴ」という）と補中益気湯（以下「ＨＥＴ」という）、更に必要に応じて、ＬＴＢポリペプチド又は合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）をマウスに経口投与した。【００７８】
＜＜ＬａｃＥ７製剤の製造＞＞
ＬａｃＥ７製剤は公知の方法に従って製造した（Ｐｏｏ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００６，ｖｏｌ．１１９，ｐｐ．１７０２−１７０９）。簡単に述べると、ＨＰＶ１６由来の変異型Ｅ７タンパク質（配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる、野生型Ｅ７タンパク質のＲｂ結合部位の３つのアミノ酸残基が置換されたもの）を、ヘルパーＴ細胞１型（Ｔｈ１細胞）の誘導能が確認されているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉに発現ベクターを用いて導入した。培養後の組換え体（ＬａｃＥ７）は、熱で死菌化した。培地から精製したＬａｃＥ７を蒸留水で何度か洗浄した後、乾燥・粉体化し（ＬａｃＥ７製剤）、使用するまで４℃で保存した。前記ＬａｃＥ７製剤は水性溶媒に不溶性であった。【００７９】
＜＜マウスへのＬａｃＥ７製剤の経口投与＞＞
６週齢の雌ＳＰＦ  Ｃ６７ＢＬマウス（日本クレア株式会社）に対して、前記ＬａｃＥ７製剤を経口投与することで免疫した。
１匹当たり１．０ｍｇの前記ＬａｃＥ７製剤を第１週、第２週、第４週、及び第６週の合計４クール投与した。全ての投与は、前記ＬａｃＥ７製剤を２００μＬのＰＢＳに懸濁したものを経胃チューブを用いて、毎週連続５日間、１日１回３時間の絶食後に行った。【００８０】
＜＜マウスへの十全大補湯と補中益気湯の経口投与＞＞
１日１匹当たり４０ｍｇのＪＴＴ（ツムラ株式会社製）又はＨＥＴ（ツムラ株式会社製）を、５ｇの粉末飼料に混ぜた状態で、１つのゲージに入っている５匹のマウスそれぞれに完全に摂取させた。ＬａｃＥ７製剤が投与される６週間（第１週〜第６週）の間、毎日ＪＴＴ又はＨＥＴのいずれかを摂取させた。【００８１】
＜＜マウスへのＬＴＢポリペプチド経口投与＞＞
ＬＴＢポリペプチドは、前記ＬａｃＥ７製剤と一緒に１匹当たり１０μｇ、毎クールの３日目に経口投与した。ＬＴＢポリペプチドとしては、シグマアルドリッチ株式会社の易熱性エンテロトキシンＢサブユニット（ＬＴＢ）大腸菌由来、（カタログ番号：Ｅ８６５６）を用いた。【００８２】
＜＜マウスへのαＧａｌＣｅｒ経口投与＞＞
合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）は、前記ＬａｃＥ７製剤と一緒に１匹当たり２μｇ、毎クールの３日目に経口投与した。合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）としては、協和発酵キリン株式会社のα−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ（ＫＲＮ７０００）を用いた。【００８３】
＜脾臓、腸洗浄液、末梢血試料、及び粘膜組織の回収＞
前記ＬａｃＥ７製剤の最後の接種から１週間後（接種開始から７週目）に、リンパ球、血清、及び腸洗浄液を回収した。
前記ＬａｃＥ７製剤を接種した５匹のマウスを解剖し、脾臓、腸、及び末梢血を採取した。前記脾臓は、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で洗浄した。前記腸は、排泄物を除いた後、腸管内部をプロテアーゼ阻害剤を加えたＨＢＳＳ１０ｍＬで洗浄し、回収した液を腸洗浄液とした。回収した血清と腸洗浄液は−８０℃で保存した。【００８４】
同様に、前記ＬａｃＥ７製剤を接種した２５匹のマウスを解剖し、粘膜組織として腸管上皮を回収した。前記腸管上皮を、４％パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にて室温で１時間固定した後、ＰＢＳですすぎ、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）、Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｚｏｅｔｅｒｗｏｕｄｅ、オランダ）にサンプルを包埋して凍結させ、−８０℃で保存した。クライオスタット（ＣＭ１５１０Ｓ、Ｌｅｉｃａ）を用いて凍結切片（厚み６μｍ）を作製し、免疫組織学解析のためにスライドグラスに載せた。【００８５】
＜マウスの脾臓細胞及び粘膜リンパ球の調製＞
腸は縦方向に切開して１０質量％  ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０（１０質量％  非働化牛胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１×非必須アミノ酸、５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール含有）培地で３７℃、３０分間激しく振とうした。回収した細胞懸濁液は、ＢＤファルコン（商標）セルストレーナー（ＢＤバイオサイエンス株式会社，米国）で組織残屑を除き、次いで、７０質量％と４０質量％のＰｅｒｃｏｌｌ  ＰＬＵＳを重層した１５ｍＬチューブを用いた不連続濃度勾配遠心を行った。約１０７個〜１０８個の細胞を上に重層し、６００×ｇ、室温で２０分間遠心することで、７０質量％と４０質量％のＰｅｒｃｏｌｌ  ＰＬＵＳの界面に粘膜リンパ球（生存率９５％）が集まった。
脾臓細胞は、ＰＢＳの中で脾臓をゆっくりと裂くことで得られた。塊状の残屑は遠心で除いた。
それぞれ、約５×１０６個〜１０×１０６個の粘膜リンパ球と、約１０７個の脾臓細胞が各マウスから得られた。【００８６】
＜ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ＞
腸粘膜リンパ球又は脾臓細胞（５×１０６細胞／ｍＬ）の懸濁液５０μＬを、２４時間、３７℃で抗原提示細胞と共にインキュベートした。５０μＬの脾臓細胞（５×１０６細胞／ｍＬ）については、マイトマイシンで処理した後、３回ＰＢＳで洗浄した。マウスＩＦＮ−γ用ＥＬＩＳＰＯＴキット（マブテックＡＢ、スウェーデン）のメーカープロトコールに従い、ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質（配列番号１）においてＣＴＬエピトープとして報告されている、Ｅ７タンパク質の第４９番から第５７番のアミノ酸配列からなる１０μＬの合成ペプチド（１μｇ／ｍＬ）、マイトジェン（ホルボールミリステートアセテート  ４０ｎｇ／ｍＬ＋イオノマイシン  ４μｇ／ｍＬ）、又は培地のみ（コントロール）を、抗マウスＩＦＮ−γ抗体でコートされた９６ウェルプレート（例えば、ＥＬＩＩＰプレート、ミリポア株式会社、ＵＳＡ）に滴下した。９６ウェルプレート上のＩＦＮ−γ陽性のスポット数を解析した。その際、ＫＳ  ＥＬＩＳＰＯＴ（カールツァイスビジョン社、ドイツ）のコンピュータ完全補助ビデオイメージング解析システムを用いた。【００８７】
＜ＥＬＩＳＡアッセイ＞
血清中のＩｇＧ及び腸洗浄液中のＩｇＡを、マウスＩｇＧ又はマウスＩｇＡに対するＥＬＩＳＡ定量セット（ベチル  ラボラトリーズ社，米国）を用いて定量した。ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質に対して特異的なＩｇＧとＩｇＡの量は、Ｈｉｓタグを付加したＥ７タンパク質を抗原として定量する。方法はメーカープロトコールに従った。
簡単に述べると、９６ウェルプレート（例えば、イムノプレート，ヌンク社，デンマーク）を１００ｎｇ／ウェルＨｉｓタグ―Ｅ７（５０ｍＭ  炭酸塩−重炭酸塩  ｐＨ９．６のコーティング緩衝液に懸濁）、４℃で一晩置くことでコートした。その後、ブロッキング処理を行った前記プレートに対して、２倍希釈した血清又は腸洗浄液を適用した。洗浄後に２次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体又は抗マウスＩｇＡ抗体を各ウェルに加え（それぞれ、１：６０，０００倍、１：２０，０００倍希釈）、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄、発色処理後に吸光度４５０ｎｍを測定した。非免疫マウスの血清及び腸洗浄液をネガティブコントロールとした。抗Ｅ７抗体価は、抗Ｅ７  ＩｇＧ／全ＩｇＧ又は抗Ｅ７  ＩｇＡ／全ＩｇＡ（相対値）として示した。【００８８】
＜サイトカイン濃度の測定＞
腸洗浄液中のサイトカイン濃度は、５匹のマウスのものをプールしてマウスＴｈ１／Ｔｈ２  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ  ＳＥＴ  Ｇｏ（登録商標）  Ｋｉｔ（ＢＤバイオサイエンス株式会社，米国）を用いて測定した。Ｔｈ１細胞が発現するサイトカインとしてＩＦＮ−γを、Ｔｈ２細胞が発現するサイトカインとしてＩＬ−４を測定に用いた。各サンプルに関して少なくとも３回同じ測定を繰り返した。【００８９】
＜統計解析＞
ＥＬＩＳＰＯＴ及びＥＬＩＳＡのデータを平均値±標準偏差で示した。これらの値又は相対値は免疫グループ（各グループはマウス５匹）間で比較した。その際、両側ステューデントｔ−検定を行った。ｐ値が＜０．０５の場合有意とみなした。【００９０】
＜免疫組織学的解析＞
ＬａｃＥ７を経口投与したマウスにおけるＥ７タンパク質特異的な細胞障害性Ｔ細胞（Ｅ７特異的ＣＴＬ）の誘導及びその組織内浸潤を、Ｔ−Ｓｅｌｅｃｔ  ｍｏｕｓｅ  ＭＨＣ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ（株式会社医学生物学研究所製）を用いて調べた。メーカープロトコールに従い、ＭＣＨ及びＥ７ペプチド複合体をビオチン化し、フィコエリスリン標識化ストレプトアビジンによりこれを４量体（テトラマー）化することにより、Ｅ７特異的ＭＨＣテトラマーを作製した。Ｅ７ペプチドとして、ＨＰＶ１６のＥ７タンパク質（配列番号１）においてＣＴＬエピトープとして報告されている、Ｅ７タンパク質の第４９番から第５７番のアミノ酸配列からなる合成ペプチド（１μｇ／ｍＬ）を用いた。【００９１】
上述の通り、ＬａｃＥ７を経口投与したマウスから腸管上皮の切片を作製し、前記Ｅ７特異的ＭＨＣテトラマーを用いたＥ７ペプチド認識ＭＨＣの検出、又は前記Ｅ７特異的ＭＨＣテトラマー及び抗ＣＤ８抗体を用いた二重染色を行った。具体的には、前記腸管上皮の切片試料を、０．１質量％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含むＰＢＳを用いて３０分間透過処理した後、試料をすすぎ、５質量％スキムミルクを含むＰＢＳで３０分間浸透させた。これらを、前記Ｅ７特異的ＭＨＣテトラマー（希釈率１：２５）及び場合により１：５０で希釈した抗ＣＤ８抗体（Ｒａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ８ａ／Ｌｙｔ−２  ＦＩＴＣ（Ｃｌｏｎｅ  ５３−６．７）、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｉｎｃ．）と共に４℃で一晩インキュベートした。各工程について、前記Ｅ７特異的ＭＨＣテトラマー及び抗体を１質量％スキムミルク及び０．１質量％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含むＰＢＳで希釈した。ＤＡＰＩ（４’, ６−Ｄｉａｍｉｄｉｎｅ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｒｏｃｈｅ）で核を染色した後、切片をＰＢＳ／グリセロール（１／１）中に置き、蛍光顕微鏡（ＬＳＭ  ７００、Ｚｅｉｓｓ）によって観察した。【００９２】
＜Ｅ７特異的１型Ｔ細胞応答における漢方薬のアジュバント効果＞
ＨＰＶのＥ６タンパク質とＥ７タンパク質の発現によって不死化された細胞のクリアランスには、ＩＦＮ−γを産生するＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞と、ＨＰＶのＥ７タンパク質を認識するＣＤ８＋ＣＴＬによる、Ｅ７特異的なＴ細胞応答（以下「１型Ｔ細胞応答」という）が必要となる。
そこで、Ｅ７特異的な前記１型Ｔ細胞応答に対するＬａｃＥ７ワクチンと漢方薬の経口投与の影響を調べるために、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、粘膜リンパ球及び脾臓細胞中のＩＦＮ−γ産生細胞の数を調べた（図１）。【００９３】
各グループ５匹のマウスにＬａｃＥ７単独、又はＬａｃＥ７とＪＴＴ若しくはＨＥＴを経口投与した。最後の免疫から１週間後に腸管粘膜リンパ球及び脾臓細胞を採取して、粘膜及び全身性免疫に対する前記ＪＴＴと前記ＨＥＴの効果を調べた。
ＨＰＶ１６のＥ７の第４９番目〜第５７番目のアミノ酸残基部分は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されるＥ７−ＣＴＬエピトープとして知られている。そこで、前記ＨＰＶ１６の前記Ｅ７タンパク質に対する前記１型Ｔ細胞応答のＥＬＩＳＰＯＴアッセイには、前記Ｅ７−ＣＴＬエピトープ部位に相当するアミノ酸配列からなる合成ペプチドを使用した。
免疫しなかったマウスと比較して、ＬａｃＥ７で免疫したマウスでは、粘膜リンパ球と脾臓の両方でＥ７特異的なＩＦＮ−γ産生細胞の数が増加した。ＬａｃＥ７による経口免疫は、脾臓よりも粘膜リンパ球においてより顕著に（およそ１．５倍〜２倍）、Ｅ７特異的ＩＦＮ−γ産生細胞のレベルを上昇させた。
更に驚くべきことに、前記ＬａｃＥ７を前記ＪＴＴ又は前記ＨＥＴと同時投与することで、脾臓におけるＥ７特異的な１型Ｔ細胞応答が顕著に上昇した（図１）。【００９４】
前記ＪＴＴと前記ＨＥＴに関して、予防ワクチンアジュバントとして使用することで、液性免疫を増強させる効果は示唆されていた。
しかしながら、前記ＪＴＴと前記ＨＥＴが全身性の細胞性免疫を増強させることはこれまで知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。
一方、粘膜における１型Ｔ細胞応答に関しては、前記ＪＴＴ又は前記ＨＥＴの、ＬａｃＥ７との同時経口投与による顕著な効果は観られなかった（図１）。【００９５】
＜粘膜免疫反応に対する漢方薬及びＬＢＴポリペプチドのアジュバント効果＞
Ｅ７タンパク質に対する粘膜細胞の免疫応答性を最適化するためには、前記ＪＴＴ又は前記ＨＥＴ以外にアジュバントを用いることを検討することが必要と考えられた。
そこで、ＬＴＢポリペプチドをＬａｃＥ７経口投与期間中に前記ＪＴＴ又は前記ＨＥＴと同時に投与した。【００９６】
ＬａｃＥ７単独投与に比べ、ＬａｃＥ７とＬＴＢポリペプチドの同時投与によって、マウスにおけるＥ７特異的な１型Ｔ細胞応答のレベルは、粘膜リンパ球及び脾臓において１．５倍〜２倍上昇した（図２）。ＪＴＴ又はＨＥＴを、前記ＬａｃＥ７及び前記ＬＴＢポリペプチドと同時に投与すると、前記ＬａｃＥ７と前記ＬＴＢポリペプチドの同時投与と比較して、全身性の１型Ｔ細胞応答レベルが上昇した。その効果はＨＥＴにおいて特に顕著であった。
更に期待したように、粘膜における１型Ｔ細胞応答も、ＬａｃＥ７とＬＴＢの同時投与に比べ、ＪＴＴ又はＨＥＴを追加で同時投与することにより２倍〜２．５倍上昇した（図２）。【００９７】
即ち、ＪＴＴ及びＨＥＴは、ＬＴＢと同時に投与することで、経口ワクチンによる全身性及び粘膜における１型Ｔ細胞応答を顕著に上昇させることが明らかになった。【００９８】
＜漢方薬アジュバントによるＥ７に対する液性免疫応答の増強効果＞
次にＬａｃＥ７の経口投与を受けたマウスにおける、漢方薬、ＬＴＢ、又はその両方を同時投与することによる、ＨＰＶ１６のＥ７に対する液性免疫応答への影響を調べた（図３Ａ、図３Ｂ）。各グループ５匹のマウスにＬａｃＥ７単独、又はＬａｃＥ７とＪＴＴ若しくはＨＥＴを経口投与して、最後の免疫から１週間後に腸管粘膜リンパ球及び脾臓細胞を採取した前記マウスに関して、最終免疫後１週間目に血液及び腸洗浄液も採取した。前記ＬａｃＥ７の経口投与による全身性及び粘膜における液性免疫に関して、血清中の抗Ｅ７  ＩｇＧ抗体及び腸洗浄液中の抗Ｅ７  ＩｇＡ抗体の量をサンドイッチＥＬＩＳＡで調べた（図３Ａ、図３Ｂ）。サンプリングにおけるバイアスを無くすために、抗Ｅ７抗体価は、サンプル中の全ＩｇＧ及び全ＩｇＡ量に対する相対値で表した。【００９９】
全ＩｇＧ又は全ＩｇＡ量に対する抗Ｅ７抗体の量比（抗Ｅ７  ＩｇＧ／全ＩｇＧ、抗Ｅ７  ＩｇＡ／全ＩｇＡ）はそれぞれ、Ｅ７タンパク質に対する全身性及び粘膜における液性免疫応答を表している。ＬａｃＥ７で免疫していないマウスの前記量比を１とし、それに対する比で示した。
ＬａｃＥ７を単独で経口投与されたマウスにおいては、血清中の抗Ｅ７  ＩｇＧ抗体価が７倍以上上昇していた。ＬＴＢをＬａｃＥ７と同時投与した場合に、ＬＢＴは前記抗Ｅ７  ＩｇＧ抗体価に殆ど影響を与えなかった。
それに対して、ＬａｃＥ７及びＬＴＢと同時にＨＥＴを投与したマウスでは、ＬａｃＥ７単独、並びにＬａｃＥ７とＬＴＢが同時投与されたマウスに比べ、血清中の抗Ｅ７  ＩｇＧの抗体価が２倍上昇していた。
一方、ＪＴＴをＬａｃＥ７、ＬＴＢと同時投与しても、抗Ｅ７  ＩｇＧの抗体価には殆ど影響しなかった（図３Ａ）。【０１００】
腸洗浄液中の抗Ｅ７  ＩｇＡに関しても、ＨＥＴがＬａｃＥ７とＬＴＢと同時に投与された場合に顕著な抗体価の上昇が観られた（図３Ｂ）。
これらの結果は、ＨＥＴとＬＢＴは相乗的に、経口ワクチンによる全身性及び粘膜における液性免疫を亢進させることを強く示唆している。【０１０１】
＜ＬａｃＥ７による粘膜でのサイトカイン産生に対する漢方アジュバントの影響＞
漢方薬をＬａｃＥ７と同時に経口投与することによる、粘膜組織における１型Ｔ細胞応答を促進するサイトカイン、及びＴｈ２細胞による細胞応答（以下「２型Ｔ細胞応答」という）を促進するサイトカインの産生を調べた。
ＬａｃＥ７を経口投与したマウスから得られた腸洗浄液中のＩＦＮ−γとＩＬ−４のレベルを、それぞれ前記１型Ｔ細胞応答及び前記２型Ｔ細胞応答の指標とした。【０１０２】
免疫していないマウスに比べ、ＬａｃＥ７で免疫したマウスにおいては、腸洗浄液中の前記ＩＦＮ−γと前記ＩＬ−４の両方の量が顕著に上昇していた。ＬａｃＥ７とＪＴＴを同時投与した場合には、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４の両方の量が３倍上昇していた。一方、前記ＬａｃＥ７と前記ＨＥＴ又は前記ＬＴＢを同時投与した場合には、前記ＬａｃＥ７のみを単独投与した場合と顕著な差異は認められなかった。
ＬａｃＥ７と、ＪＴＴ又はＨＥＴに加えて、ＬＴＢを同時に投与した場合には、ＩＦＮ−γの量が６倍〜８倍に、ＩＬ−４の量が３倍〜４倍に上昇していた（図４Ａ、図４Ｂ）。【０１０３】
即ち、サイトカイン産生を指標にした場合、経口ワクチンによる粘膜での１型細胞応答には、ＪＴＴの方がＨＥＴよりもより強い効果を持つこと、ＬＴＢを一緒に使用することで、ＪＴＴとＨＥＴの効果が更に昂進されること、及び１型Ｔ細胞応答と２型Ｔ細胞応答の両方が同じ傾向を示すことが明らかになった。【０１０４】
また、脾臓においては、１型Ｔ細胞応答及び２型Ｔ細胞応答はそれぞれ、細胞性免疫及び液性免疫を誘導するのとは異なり、ＪＴＴ、ＨＥＴの粘膜における細胞性免疫及び液性免疫の誘導効果と１型Ｔ細胞応答及び２型Ｔ細胞応答の間に顕著な相互関連性が認められなかった。
このことは、粘膜においては、Ｔｈ１とＴｈ２だけでなく、Ｔｈ１７など、他のＴ細胞も細胞性免疫及び液性免疫の誘導に関与している可能性を示唆している。【０１０５】
＜粘膜免疫反応に対する漢方薬及び合成セラミドのアジュバント効果＞
Ｅ７タンパク質と漢方薬と粘膜アジュバントとの同時投与において、臨床で使用可能な粘膜アジュバントであるαＧａｌＣｅｒを用いた場合においても粘膜における１型Ｔ細胞応答の上昇が観察されるか調べた。
そこで、ＬＴＢポリペプチドに代えてαＧａｌＣｅｒを、ＬａｃＥ７経口投与期間中に前記ＪＴＴと同時に投与し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによりＥ７特異的な１型Ｔ細胞応答のレベルを調べた。【０１０６】
図２においても観察されたように、マウスの粘膜リンパ球におけるＥ７特異的な１型Ｔ細胞応答のレベルは、ＬａｃＥ７単独投与に比べ、ＬａｃＥ７とＬＴＢポリペプチドの同時投与によって上昇し、更にＨＥＴを、前記ＬａｃＥ７及び前記ＬＴＢポリペプチドと同時に投与すると、前記ＬａｃＥ７と前記ＬＴＢポリペプチドの同時投与と比較して上昇する傾向が観察された（図５）。
Ｅ７タンパク質と漢方薬と粘膜アジュバントとの同時投与において、粘膜アジュバントとしてＨＥＴに代えてαＧａｌＣｅｒを用いた場合にも、ＨＥＴを用いた場合と同程度、或いはそれ以上に、マウスの粘膜リンパ球におけるＥ７特異的な１型Ｔ細胞応答のレベルを顕著に上昇させることが明らかとなった（図５）。なお、ＬａｃＥ７とαＧａｌＣｅｒだけの同時投与は、ＬａｃＥ７と同等の応答であった（データは示さず）。【０１０７】
即ち、αＧａｌＣｅｒは、ＬＴＢと同時に投与することで、経口ワクチンによる粘膜における１型Ｔ細胞応答を顕著に上昇させることが明らかになった。【０１０８】
＜ＬａｃＥ７によるＥ７特異的ＣＴＬの誘導及び組織内浸潤＞
ＬａｃＥ７を経口投与したマウスの粘膜組織において、Ｅ７タンパク質特異的な細胞障害性Ｔ細胞（Ｅ７特異的ＣＴＬ）が誘導されていることを免疫組織学的解析により調べた。その結果、粘膜組織である腸管上皮の粘膜面及び粘膜固有層において、Ｅ７ペプチド特異的ＭＨＣが検出された。したがって、Ｅ７特異的ＣＴＬの誘導が認められ、さらに、Ｅ７特異的ＣＴＬが粘膜組織内に浸潤することが明らかになった。
この結果は、ＬａｃＥ７の経口投与がＥ７特異的な粘膜免疫を誘導することを示すものである。【０１０９】
以上の結果から、十全大補湯及び補中益気湯のいずれかを含んだＬａｃＥ７ワクチンは、ＣＩＮ３患者だけでなく、子宮頚癌患者、更に他のＨＰＶ関連癌の患者、及び前記ＨＰＶ関連癌の前癌病変患者に対しても治療効果をもつ可能性が十分期待できる。
更に適当な免疫アジュバントを含有させた、十全大補湯及び補中益気湯のいずれかを含んだＬａｃＥ７ワクチンは、より優れた治療効果をもつことが期待できる。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明の粘膜免疫賦活化剤は、ＨＰＶワクチンなどのウイルスワクチン及び細菌ワクチンと併用することで粘膜免疫を賦活化するのに好適である。
本発明のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物は、ＨＰＶ感染症の患者に投与することにより、その治療用ワクチンとして使用するのに好適である。【０１１１】
本発明の態様としては、例えば、以下の通りである。
＜１＞  滋養強壮作用を有する漢方薬と、粘膜アジュバントとを含有することを特徴とする粘膜免疫賦活化剤である。
＜２＞  滋養強壮作用を有する漢方薬が、十全大補湯及び補中益気湯の少なくともいずれかである前記＜１＞に記載の粘膜免疫賦活化剤である。
＜３＞  粘膜アジュバントが、コレラ毒素（ＣＴ）、大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）、ベロ毒素（ＶＴ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、及び百日咳毒素（ＰＴ）に由来する野生型ポリペプチド又は変異型ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド並びに合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）のうちの少なくとも１つである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤である。
＜４＞  粘膜アジュバントは、ＬＴのＢサブユニット（ＬＴＢ）ポリペプチド及び合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）のいずれかである前記＜３＞に記載の粘膜免疫賦活化剤である。
＜５＞  経口で投与される場合に、患者の粘膜において、その前後又は同時に経口投与される抗原に特異的な細胞性免疫を賦活化させる前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤である。
＜６＞  抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）由来のポリペプチドである前記＜５＞に記載の粘膜免疫賦活化剤である。
＜７＞  ＨＰＶ由来のポリペプチドは、１から数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加する変異を有する前記＜６＞に記載の粘膜免疫賦活化剤である。
＜８＞  ＨＰＶ由来のポリペプチドは、ＨＰＶ由来のポリペプチドを発現させたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉの組換え体を死菌化させた粉体に含有される、又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉを死菌化させた粉体に添加される前記＜６＞から＜７＞のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤である。
＜９＞  ＨＰＶ由来のポリペプチドは、ＨＰＶのＥ７ポリペプチドである前記＜６＞から＜８＞のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤である。
＜１０＞  ＨＰＶのＥ７ポリペプチドは、ＨＰＶ１６に由来する前記＜９＞に記載の粘膜免疫賦活化剤である。
＜１１＞  ＨＰＶのＥ７ポリペプチドは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる前記＜１０＞に記載の粘膜免疫賦活化剤である。
＜１２＞  ＨＰＶのＥ７ポリペプチドと、滋養強壮作用を有する漢方薬とを含有することを特徴とするＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物である。
＜１３＞  滋養強壮作用を有する漢方薬が、十全大補湯及び補中益気湯の少なくともいずれかである前記＜１２＞に記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物である。
＜１４＞  更に粘膜アジュバントを含有する前記＜１２＞から＜１３＞のいずれかに記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物である。
＜１５＞  ＨＰＶのＥ７ポリペプチドは、ＨＰＶ１６に由来する前記＜１２＞から＜１４＞のいずれかに記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物である。
＜１６＞  ＨＰＶのＥ７ポリペプチドは、１から数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加する変異を有する前記＜１２＞から＜１５＞のいずれかに記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物である。
＜１７＞  ＨＰＶのＥ７ポリペプチドは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる前記＜１６＞に記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物である。
＜１８＞  ＨＰＶのＥ７ポリペプチドは、ＨＰＶのＥ７ポリペプチドを発現させたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉの組換え体を死菌化させた粉体に含有される、又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉを死菌化させた粉体に添加される前記＜１２＞から＜１７＞のいずれかに記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物である。
＜１９＞  患者の粘膜において、ＨＰＶのＥ７ポリペプチド特異的な細胞性免疫を賦活化させる前記＜１２＞から＜１８＞のいずれかに記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物である。
＜２０＞  患者は、子宮頚癌前癌病変患者及び子宮頚癌患者のいずれかである前記＜１９＞に記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物である。
＜２１＞  粘膜アジュバントは、ＣＴ、ＬＴ、ＶＴ、ＤＴ、及びＰＴに由来する野生型ポリペプチド又は変異型ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド並びに合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）のうちの少なくとも１つである前記＜１４＞から＜２０＞のいずれかに記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物である。
＜２２＞  粘膜アジュバントは、ＬＴＢポリペプチド及び合成セラミド（αＧａｌＣｅｒ）のいずれかである前記＜２１＞に記載のＨＰＶ感染症治療用経口医薬組成物である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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