(57)【要約】  より安全で自在に遺伝子を導入することができる、新たな遺伝子導入方法を提供すること。特に、脳内の特定の位置に、安全かつ自在に遺伝子を導入する方法を提供すること。ナノ粒子と、遺伝子導入用ベクター結合物質とを含んでなり、細胞による貪食を惹起する官能基を備え、前記遺伝子導入用ベクター結合物質は、前記官能基のうちの一部を介して、前記ナノ粒子の表面に結合され、前記官能基のうちの他の一部は、前記遺伝子導入用ベクター結合物質と結合せずに存在している、遺伝子導入用担体と、該遺伝子導入用担体の前記遺伝子導入用ベクター結合物質に遺伝子導入用ベクターが結合されてなる遺伝子導入剤と、を提供する。
2013179669.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子と、遺伝子導入用ベクター結合物質とを含んでなり、
細胞による貪食を惹起する官能基を備える遺伝子導入用担体であり、
前記遺伝子導入用ベクター結合物質は、前記官能基のうちの一部を介して、前記ナノ粒子の表面に結合され、
前記官能基のうちの他の一部は、前記遺伝子導入用ベクター結合物質と結合せずに存在している、遺伝子導入用担体。
【請求項２】
請求項１記載の遺伝子導入用担体の前記遺伝子導入用ベクター結合物質に遺伝子導入用ベクターが結合されてなる遺伝子導入剤。
【請求項３】
前記遺伝子導入用ベクターが、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される１以上である請求項２に記載の遺伝子導入剤。
【請求項４】
前記官能基が、正電荷を有する請求項２又は３に記載の遺伝子導入剤。
【請求項５】
前記官能基が、アミノ基である請求項２〜４のいずれか一項に記載の遺伝子導入剤。
【請求項６】
前記ナノ粒子の平均粒子径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍである請求項２〜５のいずれか一項に記載の遺伝子導入剤。
【請求項７】
前記遺伝子導入用ベクター結合物質が、ヘパリン及び／又はヘパラン硫酸である請求項２〜６のいずれか一項に記載の遺伝子導入剤。
【請求項８】
前記ナノ粒子が、磁性を有する請求項２〜７のいずれか一項に記載の遺伝子導入剤。
【請求項９】
ナノ粒子と、遺伝子導入用ベクターと、遺伝子導入用ベクター結合物質とを含んでなり、細胞による貪食を惹起する官能基を備える遺伝子導入剤であり、
前記遺伝子導入用ベクター結合物質は、前記官能基のうちの一部を介して、前記ナノ粒子の表面に結合され、
前記官能基のうちの他の一部は、前記遺伝子導入用ベクター結合物質と結合せずに存在し、
前記遺伝子導入用ベクターは、遺伝子導入用ベクター結合物質に結合している、
遺伝子導入剤を用いて、細胞へ遺伝子を導入する方法。
【請求項１０】
前記ナノ粒子と、前記遺伝子導入用ベクター結合物質とを含んでなり、
細胞による貪食を惹起する前記官能基を備える遺伝子導入用担体であり、
前記遺伝子導入用ベクター結合物質は、前記官能基のうちの一部を介して、前記ナノ粒子の表面に結合され、
前記官能基のうちの他の一部は、前記遺伝子導入用ベクター結合物質と結合せずに存在している、遺伝子導入用担体の、前記遺伝子導入用ベクター結合物質に前記遺伝子導入用ベクターを結合して遺伝子導入剤を調製する手順を含む、細胞へ遺伝子を導入する方法。
【請求項１１】
前記遺伝子導入剤をインジェクションにより標的細胞まで誘導する手順を含む請求項９又は１０記載の遺伝子導入方法。
【請求項１２】
前記ナノ粒子が磁性を有し、前記遺伝子導入剤に磁場を印加してインジェクション部位に保持する手順を含む請求項１１に記載の遺伝子導入方法。
【請求項１３】
細胞による貪食を惹起する官能基を表面に備えるナノ粒子に、前記官能基のうちの一部を介して、前記遺伝子導入用ベクター結合物質を結合させる工程を含む、
前記ナノ粒子と、前記遺伝子導入用ベクター結合物質とを含んでなる遺伝子導入用担体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の製造方法により得られる遺伝子導入用担体の前記遺伝子導入用ベクター結合物質に、遺伝子導入用ベクターを結合させる工程を含む遺伝子導入剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面に、ヘパリンまたはヘパラン硫酸が結合され、ヘパリンまたはヘパラン硫酸を介して遺伝子導入用ベクターが結合されていることを特徴とする遺伝子導入剤、該遺伝子導入剤を用いた遺伝子導入方法、および該遺伝子導入剤の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに、目的とする遺伝子を組み込んだウイルスを用いて、標的とする細胞、組織および臓器等に、該遺伝子を発現させる遺伝子導入方法が開発されている。例えば、遺伝子を組み込んだウイルスを、血管内に注入して血流によって標的臓器に移行させる方法や、注射器等を用いて標的臓器に直接注入する方法が開発されている。しかし、そのような方法では、注入したウイルスが拡散してしまい、所望の部位でウイルス濃度が低下して十分な遺伝子発現レベルを得ることができない、および所望の部位でない部位で遺伝子が発現して好ましくない作用を来すおそれがある、といった問題点がある。【０００３】
また、生体分子をコーティングした磁性粒子に核酸やウイルスを付着させ、外部磁場により該磁性粒子を所定の場所に集積させて遺伝子を導入する方法がある（特許文献２）。また、ヘパリンを結合させた繊維状構造体にウイルスを結合させ、該繊維状構造体を標的臓器等に導入することで、該繊維状構造体に接触した細胞に選択的にウイルスを感染させて遺伝子を発現させる方法もある（特許文献１）。また、ポリリジンを付加してアミノ基を持たせたビーズ（ＮＨ２残基型ビーズ）が開発されており、当該ビーズは神経繊維伸張作用を有する。【０００４】
しかし、現在でも、より安全で自在に遺伝子を導入するための技術は必要とされている。特に、定位手術が必要で患者への負担が大きいことから、例えばパーキンソン病に対する遺伝子治療のような、脳内への遺伝子導入において、そのような技術が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−２０１７９３号
【特許文献２】国際公開第２００５／０９５６２１号
【特許文献３】特開２００６−８８１３１号
【特許文献４】特表２００８−５０００４９号
【特許文献５】特開２００８−１２７４５４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】PNAS,Vol. 106, No. 1, pp44-49 (2009)
【非特許文献２】Infect.Immun. 1984, 43(2): 561
【非特許文献３】Infect. Immun. February 1984 vol. 43 no. 2 561-566
【非特許文献４】J Biomed Mater Res A. 2005 Mar 15;72(4):389-98
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、より安全で自在に遺伝子を導入することができる、新たな遺伝子導入方法を提供することにある。特に、臓器内の特定の位置に、安全かつ自在に遺伝子を導入する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、発明者らは、ナノ粒子の表面にアミノ基を介してヘパリンを結合させ、さらにアデノ随伴ウイルスベクターを付着させ、ラットの脳内の特定の位置に注入したところ、当該ナノ粒子に接触した神経細胞にアデノ随伴ウイルスベクターが移動し、その後当該ナノ粒子がマクロファージによる貪食作用により脳内から除去されることを見出して、本発明を完成させた。【０００９】
この知見に基づき、本発明は、以下の（ｉ）〜（ｘｉｖ）を提供する。
（ｉ）ナノ粒子と、遺伝子導入用ベクター結合物質とを含んでなり、
細胞による貪食を惹起する官能基を備え、
前記遺伝子導入用ベクター結合物質は、前記官能基のうちの一部を介して、前記ナノ粒子の表面に結合され、
前記官能基のうちの他の一部は、前記遺伝子導入用ベクター結合物質と結合せずに存在している、
遺伝子導入用担体。
（ｉｉ）（ｉ）記載の遺伝子導入用担体の前記遺伝子導入用ベクター結合物質に遺伝子導入用ベクターが結合されてなる遺伝子導入剤。
（ｉｉｉ）前記遺伝子導入用ベクターが、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される１以上である（ｉｉ）に記載の遺伝子導入剤。
（ｉｖ）前記官能基が、正電荷を有する（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）に記載の遺伝子導入剤。
（ｖ）前記官能基が、アミノ基である（ｉｉ）〜（ｉｖ）のいずれかに記載の遺伝子導入剤。
（ｖｉ）前記ナノ粒子平均粒子径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍである（ｉｉ）〜（ｖ）のいずれかに記載の遺伝子導入剤。
（ｖｉｉ）前記遺伝子導入用ベクター結合物質が、ヘパリン及び／又はヘパラン硫酸である（ｉｉ）〜（ｖｉ）のいずれかに記載の遺伝子導入剤。
（ｖｉｉｉ）前記ナノ粒子が、磁性を有する（ｉｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれかに記載の遺伝子導入剤。
（ｉｘ）ナノ粒子と、遺伝子導入用ベクターと、遺伝子導入用ベクター結合物質とを含んでなり、
細胞による貪食を惹起する官能基を備え、
前記遺伝子導入用ベクター結合物質は、前記官能基のうちの一部を介して、前記ナノ粒子の表面に結合され、
前記官能基のうちの他の一部は、前記遺伝子導入用ベクター結合物質と結合せずに存在し、
前記遺伝子導入用ベクターは、遺伝子導入用ベクター結合物質に結合している、
遺伝子導入剤を用いて、細胞へ遺伝子を導入する方法。
（ｘ）前記ナノ粒子と、前記遺伝子導入用ベクター結合物質とを含んでなり、
細胞による貪食を惹起する前記官能基を備え、
前記遺伝子導入用ベクター結合物質は、前記官能基のうちの一部を介して、前記ナノ粒子の表面に結合され、
前記官能基のうちの他の一部は、前記遺伝子導入用ベクター結合物質と結合せずに存在している、遺伝子導入用担体の、前記遺伝子導入用ベクター結合物質に前記遺伝子導入用ベクターを結合して前記遺伝子導入剤を調製する手順を含む、細胞へ遺伝子を導入する方法。
（ｘｉ）前記遺伝子導入剤をインジェクションにより標的細胞まで誘導する手順を含む（ｉｘ）又は（ｘ）に記載の遺伝子導入方法。
（ｘｉｉ）前記ナノ粒子が磁性を有し、前記遺伝子導入剤に磁場を印加してインジェクション部位に保持する手順を含む（ｘｉ）に記載の遺伝子導入方法。
（ｘｉｉｉ）細胞による貪食を惹起する官能基を表面に備えるナノ粒子に、前記官能基のうちの一部を介して、前記遺伝子導入用ベクター結合物質を結合させる工程を含む、
前記ナノ粒子と、前記遺伝子導入用ベクター結合物質とを含んでなる遺伝子導入用担体の製造方法。
（ｘｉｖ）（ｘｉｉｉ）に記載の製造方法により得られる遺伝子導入用担体の前記遺伝子導入用ベクター結合物質に、遺伝子導入用ベクターを結合させる工程を含む遺伝子導入剤の製造方法。【００１０】
また、本発明は、以下［１］〜［１３］をも提供する。
［１］ナノ粒子を含む、標的細胞、標的組織、または標的臓器に遺伝子を導入するための遺伝子導入剤であって、該ナノ粒子が、表面に結合を介してヘパリンまたはヘパラン硫酸が結合され、ヘパリンまたはヘパラン硫酸を介して遺伝子導入用ベクターが結合されていることを特徴とするナノ粒子である、遺伝子導入剤。
［２］結合が、ナノ粒子上のアミノ基、チオール基、若しくは活性エステル基を介した化学結合、または物理結合である、［１］に記載の遺伝子導入剤。
［３］ナノ粒子が１０ｎｍ〜１０００ｎｍの大きさである、［１］または［２］に記載の遺伝子導入剤。
［４］ナノ粒子が磁性粒子である、［１］〜［３］のいずれかに記載の遺伝子導入剤。
［５］遺伝子導入用ベクターが、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、［１］〜［４］のいずれかに記載の遺伝子導入剤。
［６］非ヒト哺乳動物または単離された標的細胞にナノ粒子を用いて遺伝子を導入する遺伝子導入方法であって、該ナノ粒子が、表面に結合を介してヘパリンまたはヘパラン硫酸が結合され、ヘパリンまたはヘパラン硫酸を介して遺伝子導入用ベクターが結合されていることを特徴とするナノ粒子である、遺伝子導入方法。
［７］結合が、アミノ基、チオール基、若しくは活性エステル基を介した化学結合、または物理結合である、［６］に記載の遺伝子導入方法。
［８］ナノ粒子が１０ｎｍ〜１０００ｎｍの大きさである、［６］または［７］に記載の遺伝子導入方法。
［９］ナノ粒子をインジェクションにより標的細胞まで誘導する工程を含む、［６］〜［８］のいずれかに記載の遺伝子導入方法。
［１０］ナノ粒子が磁性粒子であり、磁場を印加して該磁性粒子を標的細胞まで誘導する工程をさらに含む、［６］〜［９］のいずれかに記載の遺伝子導入方法。
［１１］遺伝子導入用ベクターが、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、［６］〜［１０］のいずれかに記載の遺伝子導入方法。
［１２］ナノ粒子を含む遺伝子導入剤を製造する方法であって、
（ｉ）ナノ粒子にアミノ基供与化合物またはチオール基供与化合物を反応させて、ナノ粒子表面にアミノ基またはチオール基を結合させる工程、
（ｉｉ）アミノ基またはチオール基を結合させたナノ粒子にヘパリンまたはヘパラン硫酸を結合させる工程、および
（ｉｉｉ）ヘパリンまたはヘパラン硫酸を介して遺伝子導入用ベクターを結合させる工程を含むことを特徴とする、該製造方法。
［１３］遺伝子導入用ベクターが、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、［１２］記載の製造方法。【００１１】
本発明において、「細胞による貪食を惹起する官能基」とは、マクロファージ系細胞によって認識されて該細胞の食作用を誘起し得る官能基を意味する。「細胞による貪食を惹起する官能基」は、遺伝子導入剤内に存在した場合、該官能基を認識したマクロファージ系細胞が生体内異物としての遺伝子導入剤を捕食することを誘発する。「細胞による貪食を惹起する官能基」は、マクロファージ系細胞による認識のため、正電荷を示すことが好ましく、このような官能基として、例えばアミノ基が挙げられる。なお、マクロファージ系細胞は、本発明に係る遺伝子導入用担体及び遺伝子導入剤が標的とする細胞、組織及び臓器に応じて異なり得るが、例えば、マクロファージ、ミクログリア、クッパー細胞などであってよい。【００１２】
「ナノ粒子」とは、平均粒子径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍである粒子状物質を意味する。平均粒子径は、分散溶媒中での水中粒径を意味する。水中粒径は、従来公知の動的光散乱法により計測できる。「ナノ粒子」は、マクロファージ系細胞が捕食可能な範囲の大きさとされる必要がある。「ナノ粒子」の材料や形状は特に限定されないが、一定の硬度を有する材料から形成され、生体内において一定期間にわたって形状を維持し得るものとされることが好ましい。本明細書において、「ナノ粒子」は、「ナノビーズ」、あるいは単に「粒子」又は「ビーズ」と称される場合がある。【００１３】
「遺伝子導入用ベクター結合物質」は、遺伝子導入用ベクターに結合性を有する物質であればよく、特に限定されないものとする。「遺伝子導入用ベクター結合物質」には、例えばベクターをウイルスベクターとする場合、ヘパリン又はヘパラン硫酸が用いられ得る。【００１４】
「遺伝子導入用ベクター」とは、特に制限されず、当技術分野で知られているベクターを使用することができ、例えばウイルスベクターを使用することができる。「ウイルスベクター」とは、特に制限されず、ウイルスの細胞へ感染する機構や細胞に維持される機構を利用した遺伝子導入用のベクターをいい、公知の任意のウイルスベクターを含む。本発明において、例えば、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ））ベクター等が使用されうる。本発明においては、好ましくはＡＡＶ１〜８型が使用され、特に好ましくはＡＡＶ２型が使用される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る遺伝子導入剤によれば、生体内の所望の位置に遺伝子導入用ベクターを導入できることから、位置特異的に遺伝子を導入することが可能となる。また、本発明に係る遺伝子導入剤は、やがてマクロファージ系細胞により貪食され、体内から除去されるので、遺伝子導入の安全性を高めることができる。【００１６】
本発明に係る遺伝子導入剤によれば、遺伝子導入用ベクターが破壊されることなく遺伝子導入用担体と遺伝子導入用ベクターとの安定した結合が長期間組織中で維持できる。このため、遺伝子導入剤に接触した細胞のみに選択的にウイルスを感染させることができ、体内の特定部位において、選択的かつ効率的に所望の遺伝子を発現させることが可能となる。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系においても、特定の部位にウイルスを感染させることができるので、標的部位に選択的に遺伝子を発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明に係る遺伝子導入用担体及び遺伝子導入剤の構成を説明する模式図である。
【図２】ＧＦＰ遺伝子を組み込んだアデノウイルス随伴ベクターを結合させた遺伝子導入剤を添加して２週間が経過した後の培養海馬神経細胞を示す（緑色：ＧＦＰ、赤色：ナノビーズ）。
【図３】アミノ化蛍光磁性ビーズを注入して２週間が経過した後のラット脳を、放射光ＣＴで超高解像度撮像した写真である（赤矢印で示された白い部分：アミノ化蛍光磁性ビーズ）。
【図４】Ａは、アミノ化蛍光磁性ビーズを注入して２週間が経過した後のラット脳（図３の赤矢印部位）の免疫組織化学染色像である（紫色：アストログリア細胞（astrocyte）、緑色：ミクログリア、赤色：アミノ化蛍光磁性ビーズ）。白矢印は、アミノ化蛍光磁性ビーズを大量に貪食したミクログリアを指す。Ｂは、非アミノ化蛍光磁性ビーズまたはアミノ化蛍光磁性ビーズを注入して２週間が経過した後のラット脳の免疫組織化学染色像である（赤色：ミクログリア、青色：蛍光磁性ビーズ）。
【図５】チャネルロドプシン２−ＧＦＰキメラ遺伝子を組み込んだアデノウイルス随伴ベクターを結合させた遺伝子導入剤を、ラットの脳内に注入して４週間が経過した後の脳切片の写真である。
【図６】チャネルロドプシン２−ＧＦＰキメラ遺伝子を組み込んだアデノウイルス随伴ベクターを結合させた遺伝子導入剤を、ラットの脳内に注入して４週間が経過した後、神経細胞に記録電極を刺して青色光を照射した時のチャートである。
【図７】チャネルロドプシン２−ＧＦＰキメラ遺伝子を組み込んだアデノウイルス随伴ベクターを結合させた遺伝子導入剤を、ラットの脳内に注入して２週間が経過した後のラット脳を、蛍光顕微鏡で撮像した写真である（Ａ；赤色：遺伝子導入剤、Ｂ；緑色：ＧＦＰ、Ｃ；Ａ＋Ｂの多重蛍光画像）。
【図８】チャネルロドプシン２−ＧＦＰキメラ遺伝子を組み込んだアデノウイルス随伴ベクターをラット脳に直接注射し、４週間が経過した後のラット脳を蛍光顕微鏡で撮影した写真である。
【図９】ＧＦＰ遺伝子を組み込んだＡＡＶを結合させた磁性ナノワイヤを、細胞上に乗せて３週間培養した後の培養皿を光学顕微鏡（Ａ）および蛍光顕微鏡（Ｂ）で撮影した写真、および該磁性ナノワイヤをラットの脳内に注入し、放射光ＣＴで超高解像度撮像した写真である（Ｃ）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、表面に結合を介してヘパリンまたはヘパラン硫酸が結合され、ヘパリンまたはヘパラン硫酸を介して遺伝子導入用ベクターが結合されていることを特徴とする遺伝子導入剤、該遺伝子導入剤を用いた遺伝子導入方法、および該遺伝子導入剤の製造方法等に関する。
【００１９】
１．遺伝子導入用担体・遺伝子導入剤
［遺伝子導入剤］
図１に本発明に係る遺伝子導入用担体及び遺伝子導入剤の構成を模式的に示す。図（Ａ）中符号１で示す遺伝子導入剤は、遺伝子導入用担体２とこれに結合された遺伝子導入用ベクター３とを含んでなる。
【００２０】
［遺伝子導入用ベクター］
遺伝子導入用ベクター３は、標的とする臓器、組織あるいは細胞（以下「標的臓器等」という）に発現させる遺伝子が組み込まれたものである。遺伝子導入用ベクター３には、例えばウイルスベクターを使用できる。ウイルスベクターとしては、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ））ベクター等を使用できる。遺伝子導入用ベクター３は、好ましくはＡＡＶ１〜８型、特に好ましくはＡＡＶ２型が使用される。
【００２１】
［遺伝子導入用担体］
遺伝子導入用担体２は、ナノ粒子２１と、遺伝子導入用ベクター結合物質２２とを含んでなる。上記の遺伝子導入用ベクター３は、遺伝子導入用ベクター結合物質２２に結合されている。なお、図では、簡略のため遺伝子導入用ベクター結合物質２２に結合する遺伝子導入用ベクター３を一つ示しているが、遺伝子導入用ベクター結合物質２２には複数の遺伝子導入用ベクター３が結合されていてよい。
【００２２】
［ナノ粒子］
ナノ粒子２１は、平均粒子径１０ｎｍ〜１０００ｎｍの大きさであってよいが、マクロファージ系細胞により貪食され易くするため、好ましくは粒子径１５０ｎｍ〜３００ｎｍ、より好ましくは粒子径１００ｎｍ〜２００ｎｍの大きさとされる。
【００２３】
ナノ粒子２１は、磁性を有するものであってもよい。ナノ粒子２１に磁性を付与することによって、標的臓器等に導入した遺伝子導入剤１を、外部磁場により所定の場所に集積させることができる。磁性を有するナノ粒子２１としては、金属から構成されるものや高分子から構成されるもの等、当技術分野で知られている磁性ナノ粒子を使用することができる。
【００２４】
限定するものではないが、本発明においては、凝集しにくいという利点を有することから、特許文献３に記載の、表面がポリマーで構成されているポリマー被覆磁性ビーズを使用できる。ポリマーには、スチレンモノマーとメタクリル酸グリシジル（ＧＭＡ）モノマーとの重合により形成されたポリマーを用いることができる。疎水性の強いスチレンを重合して得られるポリスチレンは適度の硬さを有するため、ビーズの主構成材料として好ましい。また、ＧＭＡのグリシジル基（エポキシ基）は、アミノ基などとよく反応することから、アミノ基などに置換したり、置換したアミノ基などに次に説明する遺伝子導入用ベクター結合物質やリンカーを結合させたりできる。
【００２５】
磁性ビーズを被覆するポリマーを形成するために用いられるモノマーは、ラジカル重合可能な官能基を有するモノマーであれば、特に限定されるものではない。モノマーとして、スチレン、α−メチルスチレン、ｏ−ビニルトルエン、ｍ−ビニルトルエン、ｐ−ビニルトルエン、ジビニルベンゼン等の芳香族ビニル化合物；（メタ）アクリル酸、クロトン酸等の不飽和カルボン酸類；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−プロピル（メタ）アクリレート、ｉ−プロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリレート類；（メタ）アクリロニトリル、シアン化ビニルデン等のシアン化ビニル化合物；塩化ビニル、塩化ビニリデン、ふっ化ビニル、ふっ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン等のハロゲン化ビニル化合物；などを挙げることができる。これらのモノマーのうち、芳香族ビニル化合物、（メタ）アクリレート類が特に好ましい。またこれらモノマーは、単独でまたは２種以上を混合して使用することができる。これらモノマーの少なくとも１種には、ポリマー形成後のポリマー被覆の表面に、次に説明する官能基２３ａ、２３ｂを有するか、あるいは官能基２３ａ、２３ｂと置換可能な官能基を有するものが好ましい。
【００２６】
［遺伝子導入用ベクター結合物質］
遺伝子導入用ベクター結合物質２２は、遺伝子導入用ベクター３に結合性を有する物質であればよく、特に限定されないものとする。遺伝子導入用ベクター結合物質２２には、例えばベクターをウイルスベクターとする場合、ヘパリン又はヘパラン硫酸が用いられ得る。
【００２７】
［官能基］
ナノ粒子２１は、細胞による貪食を惹起する官能基２３ａ、２３ｂを備えている。官能基２３ａ、２３ｂは、マクロファージ系細胞によって認識され、生体内異物としての遺伝子導入剤１の該細胞による捕食を誘発する官能基であって、例えばアミノ基等とされる（非特許文献３，４参照）。官能基２３ａ、２３ｂは同一であってもよく異なっていてもよい。なお、図では、簡略のため官能基２３ａ、２３ｂを一つずつ示しているが、ナノ粒子２１は、複数の官能基２３ａ、２３ｂを備えるものである。
【００２８】
遺伝子導入用ベクター結合物質２２は、官能基２３ａを介して、ナノ粒子２１の表面に結合されている。官能基２３ａと遺伝子導入用ベクター結合物質２２との結合は、化学結合又は物理結合であってよい。ここで、化学結合とは、分子や結晶中での原子の間の結びつきを言い、共有結合、イオン結合、金属結合、および配位結合に分類される。本発明においては、限定するものではないが、例えばアミノ基、チオール基、または活性エステル基を介した結合、スルフィド結合、およびジスルフィド結合が挙げられる。物理結合とは、ファンデルワールス力や静電気によって吸着している状態をいう。
【００２９】
官能基２３ａは、遺伝子導入用ベクター結合物質２２との化学結合又は物理結合の結果、細胞による貪食を惹起する能力を喪失していてもよい。一方、官能基２３ｂは、遺伝子導入用ベクター結合物質２２と結合せずに存在している。このため、官能基２３ｂは、細胞による貪食を惹起する能力を維持している。
【００３０】
［遺伝子導入剤の効果］
遺伝子導入剤１では、ナノ粒子２１に官能基２３ａを介して遺伝子導入用ベクター結合物質２２を結合し、遺伝子導入用ベクター結合物質２２にさらに遺伝子導入用ベクター３を結合して、ナノ粒子２１上に遺伝子導入用ベクター３を保持させている。このため、遺伝子導入剤１を標的臓器等に導入した場合、ナノ粒子２１上に保持された遺伝子導入用ベクター３が拡散することなく導入部位に留まる。従って、遺伝子導入剤１による遺伝子導入では、標的臓器等のうち遺伝子導入剤１の導入部位のみに目的遺伝子を発現させることが可能である。
【００３１】
さらに、遺伝子導入剤１では、遺伝子導入用ベクター結合物質２２と結合せずに存在している官能基２３ｂが、細胞による遺伝子導入剤１の貪食を惹起する。従って、遺伝子導入剤１による遺伝子導入では、標的臓器等の特定の部位に目的遺伝子を発現させた後の遺伝子導入剤１をマクロファージ系細胞によって貪食させ、体内から除去することが可能である。
【００３２】
マクロファージ系細胞による遺伝子導入剤１の貪食を促進するため、遺伝子導入用ベクター結合物質２２に、官能基２３ａあるいは官能基２３ｂと同一の官能基（アミノ基等）を結合させておくこともできる。
【００３３】
［リンカー］
官能基２３ａ、２３ｂは、図（Ｂ）に示すように、リンカー２４を介してナノ粒子２１上に存在していてもよい。リンカー２４には、特に限定されないが、分子構造中に「-CH2-CH2-O-」のユニットを持つエチレングリコール（ＥＧ）、「-CH(CH3)-CH2-O-」のユニットを持つプロピレングリコール、「-CH(CH3)-CH2-CH2-O-」のユニットを持つブチレングリコールなどの親水性分子を用いることができる。リンカー２４を導入することで、ナノ粒子２１の水和性を向上させ、ナノ粒子２１の凝集を抑制し、遺伝子導入剤１の溶媒分散性を高めることが可能である。
【００３４】
エチレングリコール鎖（ＥＧ鎖）は、「-(CH2-CH2-O)m-」（ｍは重合度を示す整数）で表され、ｍが２以上のＥＧ鎖をポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ鎖）と称することがある。リンカー２４としては、分子構造中にＥＧ鎖を含み、末端にエポキシ基やアミノ基、カルボキシル基、マレイミド基、ヒドロキシル基、スクシンイミド基、アジド基、アルキニル基、ジアジリン基などの反応性官能基を有する化合物が好ましい。リンカー２４は、ｍが１以上５以下で、分子両末端にグリシジル基などのエポキシ基を有するエチレングリコール系化合物が好ましく、ｍが１で、分子量末端にグリシジルエーテルを有するエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）が特に好ましい。
【００３５】
２．遺伝子導入用担体・遺伝子導入剤の製造方法
（１）遺伝子導入用担体の製造方法
［官能基の結合工程］
遺伝子導入用担体２を調製するには、まず、細胞による貪食を惹起する官能基２３ａ，２３ｂを有する化合物をナノ粒子２１に反応させて、ナノ粒子２１の表面に官能基２３ａ，２３ｂを結合させる処理を行う。以下では、官能基２３ａ，２３ｂをアミノ基とし、官能基２３ａ，２３ｂを有する化合物をアミノ基供与化合物とする場合を例に説明する。
【００３６】
アミノ基供与化合物としては、限定するものではないが、例えば、アンモニア、リジンやアルギニン等の塩基性アミノ酸、およびポリリジンやポリアルギニン等の塩基性ポリペプチド等を使用できる。アミノ基を結合させる処理にて採用される溶媒、温度、反応時間等の反応条件は、ナノ粒子２１および／またはアミノ基供与化合物に応じて、当業者であれば適宜設定することができる。
【００３７】
なお、本工程は、ナノ粒子２１として、主鎖あるいは側鎖中にアミノ基を有する高分子から構成されたナノビーズのように、本処理を行わずともアミノ基を有するナノビーズを用いる場合には、省略が可能な場合もある。
【００３８】
［遺伝子導入用ベクター結合物質の結合工程］
次に、ナノ粒子２１に対し、官能基２３ａを介して、遺伝子導入用ベクター結合物質２２を結合させる処理を行う。これにより、官能基２３ａ，２３ｂおよび遺伝子導入用ベクター結合物質２２が付加されたナノ粒子２１として、遺伝子導入用担体２を得る。以下では、遺伝子導入用ベクター結合物質２２をヘパリンとする場合を例として説明する。
【００３９】
ヘパリン結合処理には公知のヘパリン結合手法を用いることができ、例えば、ヘパリンを有機化合物等に結合させる市販の試薬を用いて化学処理により結合させることができる。係る処理により、ヘパリンは、アミノ基（官能基２３ａ）を介してナノ粒子２１表面に結合される。ヘパリンのかわりにヘパラン硫酸を用いてもよい。また、ナノ粒子２１とヘパリンとは、活性エステル基を利用して結合させることもできる。
【００４０】
ナノ粒子２１表面のアミノ基を介してヘパリンを結合させる場合、下記式１に示すとおり、ナノ粒子２１表面のアミノ基（ＮＨ２）とヘパリン中のホルミル基（ＣＨＯ）が結合してイミン（Ｒ−Ｎ＝ＣＨ−Ｒ）が形成され、次いで係るイミンを還元することにより、アミンとする。
【化１】
2013179669.tif 000003
【００４１】
なお、イミンの形成は平衡反応（式１の第１段階目）であるが、イミンの還元（式１の第２段階目）は不可逆反応である。
【００４２】
ナノ粒子２１表面のアミノ基とヘパリンとの結合は、ヘパリンの分子サイズ及びアミノ基とホルミル基との反応効率ため、ナノ粒子２１表面に存在する全てのアミノ基で生じることはない。このため、結合反応後のナノ粒子２１表面には、ヘパリンとの結合を形成するアミノ基（官能基２３ａ）と、ヘパリンと結合せずに存在しているアミノ基（官能基２３ｂ）が一定の比率で存在する。これは、官能基２３ａ，２３ｂをアミノ基以外の官能基とし、遺伝子導入用ベクター結合物質２２をヘパリン以外の物質とする場合についても同様である。本工程後のナノ粒子２１表面において、遺伝子導入用ベクター結合物質２２との結合を形成する官能基２３ａと、結合せずに存在している官能基２３ｂとの比率は、遺伝子導入用ベクター結合物質２２の種類及び反応条件によって異なるが、５：５〜１：９程度である。
【００４３】
（２）遺伝子導入剤の製造方法
［遺伝子導入用ベクターの結合工程］
遺伝子導入用担体２に、遺伝子導入用ベクター３を結合させる処理を行う。例えば、アミノ基およびヘパリンが付加された遺伝子導入用担体２をカラムに入れ、ウイルス粗精製サンプルを添加することにより、ヘパリンにウイルスベクターが結合した遺伝子導入剤１を得ることができる。なお、遺伝子導入用ベクター３の構築や精製は、市販の試薬を用いること等により、公知の方法で行うことができる。遺伝子導入用担体２では、目的とする遺伝子を組み込んだ、任意に選択される遺伝子導入用ベクター３を結合させることができるため、遺伝子導入の目的及び標的細胞の種類等に応じ、所望の遺伝子導入剤１を容易に調製することが可能である。
【００４４】
また、本発明の一態様において、遺伝子導入用ベクター３の他に、任意にヘパリンまたはヘパラン硫酸に結合性を有する接着分子（ラミニン等）や液性因子（ケモカイン等の誘導・栄養・刺激因子等）を遺伝子導入用ベクター３と混合して添加し、それらの分子をヘパリンまたはヘパラン硫酸を介して遺伝子導入剤１に結合させてもよい。
【００４５】
例えば、液性因子を利用して特定の細胞を誘因若しくは活性化することにより、または接着因子を利用して細胞を接着させることにより、標的細胞とウイルスベクターとの接触機会を増やし、ウイルスベクターの感染効率を向上させることができる。
【００４６】
なお、ヘパリンまたはヘパラン硫酸に結合性を有する分子をウイルスベクターと共に結合させない場合であっても、ナノ粒子２１表面に残存しているヘパリン残基に対し、遺伝子導入の標的とする細胞や組織等が有するヘパリン結合性タンパク質が結合するので、ナノ粒子２１のみの場合よりもウイルスベクターの感染効率は高くなる。
【００４７】
本発明に係る遺伝子導入用担体・遺伝子導入剤の製造方法では、官能基２３ａとして、アミノ基に替えて、チオール基を用いることができる場合もある。この場合、上記のアミノ基供与化合物に替えて、チオール基供与化合物が用いられる。チオール基供与化合物としては、限定するものではないが、例えばシステイン、カルボキシジスルフィド（Carboxy disulfide）、直鎖型チオール試薬、芳香環型ジチオール試薬等を使用することができる。遺伝子導入用ベクター結合物質２２は、チオール基を介した、スルフィド結合またはジスルフィド結合によって、ナノ粒子２１表面に結合される。
【００４８】
３．標的細胞、標的組織または標的臓器への遺伝子導入方法
本発明において「標的細胞」とは、特に制限されず、任意の細胞であってよい。例えば、生体の組織または臓器の細胞、および各種培養細胞等が標的細胞として含まれうる。また、本発明において「標的組織」および「標的臓器」とは、特に制限されず、任意の組織および臓器であってよい。限定するものではないが、例えば、脳、肝臓、心臓、腎臓、筋肉、肺、卵巣、子宮、精巣、消化管、および血管等が標的臓器として含まれうる。
【００４９】
本発明に係る遺伝子導入方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏだけではなく、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子導入にも使用できる。よって、本発明は、その他の態様として、本発明の遺伝子導入方法で遺伝子導入を行う工程を含む遺伝子治療方法も提供しうる。本発明の方法は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット等のげっ歯類）に適用することが可能である。遺伝子治療において導入する遺伝子としては、限定するものではないが、例えば、疾患の原因遺伝子や光応答遺伝子が挙げられる。例えば、本発明を用いて光応答遺伝子を標的臓器等に導入すると、光により臓器の機能を制御することができる。
【００５０】
遺伝子導入剤１は、ナノ粒子２１を用いているため、注射器またはカテーテルを利用して、インジェクションにより所望の位置に局所的に導入することができる。
【００５１】
遺伝子導入剤１を標的臓器等に導入すると、ナノ粒子２１表面に結合されている遺伝子導入用ベクター３に接触した細胞が遺伝子導入用ベクター３を細胞内に取り込み、所望の遺伝子を発現するようになる。
【００５２】
本発明に係る遺伝子導入方法では、局所的に注入した遺伝子導入剤１を局在化したまま保持できる、すなわち、遺伝子導入用ベクター３を所望の部位に長期間局在させることができることから、導入した遺伝子導入用ベクター３が拡散してしまう従来の遺伝子導入法に比べて、遺伝子の発現効率が改善される。また、本発明に係る遺伝子導入方法では、従来の遺伝子導入法に比べて所望の部位でない部位（目的外の部位）への遺伝子導入用ベクター３の拡散が極めて少ないため、目的外の部位での遺伝子発現を抑制し、好ましくない作用を低減させることができる。
【００５３】
さらに、ナノ粒子２１を磁性粒子とすると、外部より磁場を印加して、導入した遺伝子導入剤１を所望の位置に移動させる、または所望の位置（インジェクションされた部位）に局在化させ留めておくこともできる。外部より磁場を印加するには、例えば、特許文献１に開示されている、誘導針と、制御部と、磁石とから構成される磁場制御装置を使用してもよい。ここで、磁石は磁性粒子を誘導する磁場を発生させる磁場発生体であり、誘導針は、先端部分において、磁石から発生された磁場による磁束密度を高める針である。また、制御部は磁石と誘導針との間の磁場を制御する制御部である。
【００５４】
ナノ粒子２１を磁性粒子とした場合、遺伝子導入剤１をＸ線ＣＴによって検出できることから、遺伝子導入剤１が目的の場所に正しく導入されたことを確認すること、および遺伝子導入剤１が導入した場所から除去されたことを確認することが可能となる。
【００５５】
４．マクロファージ系細胞による遺伝子導入剤の除去
遺伝子導入剤１は、生体に投与された後、時間が経過すると、マクロファージ系細胞による貪食を受け、投与部位から除去される。これは、官能基２２ｂが、マクロファージ系細胞に対する貪食シグナルとして機能するためと考えられる。また、遺伝子導入用ベクター３が細胞に取り込まれた後、遺伝子導入用ベクター結合物質２２が溶解されることにより、ナノ粒子２１表面に露出した官能基２２ａも、貪食シグナルとして機能している可能性がある。
【００５６】
さらに、マクロファージ系細胞による遺伝子導入剤１の貪食を促進するため、遺伝子導入用ベクター結合物質２２に、官能基２３ａあるいは官能基２３ｂと同一の官能基（アミノ基等）を結合させてもよい。
【００５７】
本発明に係る遺伝子導入方法は、生体への投与後時間の経過に伴って遺伝子導入剤１が体内から除去されるため、従来の遺伝子導入法に比べて安全性が高い。
【００５８】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００５９】
１．遺伝子導入用担体の調製
（１）磁性ビーズ（FGビーズ）の作製
磁性ビーズのコアとして平均粒子径およそ40 nmのフェライト粒子を選択した。フェライト粒子の分散液に0.5 mmolの１０−ウンデセン酸（10-Undecenoic acid）を添加し、フェライト粒子の表面を完全に疎水化した。さらに、非イオン性の界面活性剤であるEmulgen 1150S-60(花王株式会社) 60%水溶液を0.47 g添加し、超音波処理を施すことで、フェライト粒子を再親水化した。その結果、水溶液中で粒子径およそ90 nmで分散させることが出来た。【００６０】
次に、フェライト粒子の分散液中にスチレンモノマー、グリシジルメタクリレート（GMA）モノマー、ジビニルベンゼン（DVB）モノマーをそれぞれ2.7 g、0.3 g、0.04 g 添加し、水を加え総重量240 gとした。70℃の恒温槽中で攪拌を行い、20分後重合開始剤であるV-50（和光純薬工業）を60 mg溶解した水溶液10 gを添加し重合反応を行った。重合開始から2時間後にGMA 0.3gを後添加し、その時点から16時間重合反応を行った。反応後の磁性ビーズ（FGビーズ）を遠心分離(20,000 G, 20 min)によって回収し、50 mlの超純水による洗浄を3回行った。洗浄操作後、10 mlの超純水にビーズを分散後、2Lの超純水に対しての透析処理を3回行った。磁性ビーズの平均粒子径は200 nmであった。【００６１】
（２）磁性ビーズへのリンカーとアミノ基の導入
（i）リンカー結合磁性ビーズ(EGDE ビーズ)の調製
磁性ビーズ(FG ビーズ) 1.0 gを100 mlのアンモニア水溶液(pH11.0)中に分散させ、70℃で24時間攪拌しながら反応を行った。反応後、磁性ビーズを遠心分離(20,000 G, 20 min)によって回収し、50 mlの超純水による洗浄を3回行った。洗浄操作後、10 mlの超純水にビーズを分散後、2Lの超純水に対しての透析処理を3回行った。【００６２】
続いて、得られた磁性ビーズ0.2 gを36 mlのエチレングリコールジグリシジルエーテル（EGDE）水溶液中(pH11.0)に分散させ、30℃で24時間攪拌しながら反応を行った。反応後、EGDEがリンカーとして結合された磁性ビーズ(EGDE ビーズ)を遠心分離(20,000 G, 20 min)によって回収し、50 mlの超純水による洗浄を3回行った。洗浄操作後、10 mlの超純水にビーズを分散後、2Lの超純水に対しての透析処理を3回行った。【００６３】
（ii）アミノ化磁性ビーズ(EGDEN  ビーズ)の調製
リンカー結合磁性ビーズ(EGDE  ビーズ)1.0 gを45 mlのアンモニア水溶液(pH11.0)中に分散させ、70℃で24時間攪拌しながら反応を行った。反応後のアミノ化磁性ビーズ(EGDEN ビーズ)を遠心分離(20,000 G, 20 min)によって回収し、50 mlの超純水による洗浄を3回行った。洗浄操作後、10 mlの超純水にビーズを分散後、2Lの超純水に対しての透析処理を3回行った。【００６４】
アミノ化磁性ビーズ(EGDEN ビーズ)には、特許文献５に記載の方法に従って、高分子層に蛍光ユーロピウム錯体を吸収させた。【００６５】
（３）遺伝子導入用担体の調製
アミノ化磁性ビーズ(EGDEN ビーズ)にヘパリンを結合させ、遺伝子導入用担体を調製した。アミノ化磁性ビーズ1.0 mgをPBS中に分散させ、遠心分離した後、上澄みを除去した。PBSを445 μL、30 mg/mLのヘパリン溶液（PBS）を50 μL、30 mg/mLのNaBH3CN溶液（PBS）を5.0μLそれぞれ加え、反応溶液中にビーズを分散させた。ミキサーを用いて10日間、室温で反応溶液を撹拌した。反応後、遠心分離によってビーズを回収し、上澄みを除去した後、超純水を加えて洗浄し、遺伝子導入用担体を得た。【００６６】
遺伝子導入用担体において、ヘパリンとの結合を形成するアミノ基と、結合を形成しない、フリーのアミノ基との存在比は、上記反応条件を前提とした場合、フリーのアミノ基が少なくとも５０％、最大で９０％以上と推計された。【００６７】
２．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遺伝子導入
（１）遺伝子導入剤の調製
上記１に従って調製した遺伝子導入用担体に、ＧＦＰ遺伝子を組み込んだアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を添加して、ヘパリンにＡＡＶを結合させ、遺伝子導入剤を得た。遺伝子導入剤は、封入されている蛍光ユーロピウム錯体により赤色（615nm）の蛍光を発する。【００６８】
なお、AAVの複製と増殖は、AAV−2ヘルパーフリー発現システム（セルバイオラボ社）を、当該製品の取扱説明書通りに使用して行った。【００６９】
（２）標的細胞への遺伝子導入
培養海馬神経細胞に、上記（１）で調製した遺伝子導入剤を添加した。添加から３週間後、蛍光顕微鏡を用いて培養海馬神経細胞を観察したところ（図２）、遺伝子導入剤に接触した神経細胞はＡＡＶに感染してＧＦＰ遺伝子を発現し、細胞全体から緑色蛍光を発していた。遺伝子導入剤は赤色蛍光を発していた。図２から、ＡＡＶがビーズからほとんど離脱しないこと、およびＡＡＶが活性を持った状態でビーズに結合していることが明らかである。【００７０】
３．ｉｎ  ｖｉｖｏでのアミノ基を導入したことにより生じる効果
（１）アミノ化磁性ビーズの調製
上記１（１）および（２）に従い、アミノ化磁性ビーズ(EGDEN ビーズ)を調製した。【００７１】
（２）標的部位へのアミノ化磁性ビーズの局在化
ラットの脳内に、アミノ化磁性ビーズを注入した。注入から２週間後、放射光ＣＴを用いて脳を高解像度撮影したところ（図３）、注入したビーズが脳の一部に局在している様が観察された（図３、白い部分がビーズ）。【００７２】
（３）アミノ化磁性ビーズのミクログリアによる貪食
(i)さらに、同じ部位を免疫組織化学染色に供し、蛍光顕微鏡を用いて観察した（図４Ａ）。グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を、一次抗体として抗ＧＦＡＰ抗体（Sigma,×1000）を、二次抗体として抗マウス抗体（Sigma、×500）を用いて染色し、アストログリア細胞を同定した。また、ミクログリアの細胞膜をレクチンを用いた選択的染色法で緑色に染色した。アミノ化磁性ナノビーズは、含有するユーロピウム錯体により、赤色蛍光を発していた。図４Ａより、ミクログリアが大量にビーズを貪食したことがわかる（図４Ａ、白色矢印）。【００７３】
(ii)ラットの脳内に、上記（１）で調製したアミノ化磁性ビーズ、または非アミノ化磁性ビーズ（FGビーズ）を注入した。上記(i)と同様のプロトコールに従い、注入から２週間後、免疫組織化学染色に供し、蛍光顕微鏡を用いて観察した（図４Ｂ）。ナノビーズを青色、ミクログリアの細胞膜を赤色で示す。アミノ化磁性ビーズ（NH2型ナノビーズ）のほとんどがミクログリア（大食細胞）により貪食されており、そのためミクログリア細胞はふくれあがっていた。一方、非アミノ化磁性ビーズ（非NH2型ナノビーズ）の場合、大部分のビーズは注入部に残存しており、ミクログリア細胞内のビーズ量はアミノ化磁性ビーズに比して少なかった。アミノ化磁性ビーズは４週で多くが貪食され、８〜１２週後には注入局所から大部分のナノビーズが除去された（データは示していない）。【００７４】
上記実験より、アミノ基を搭載した磁性ビーズは、ミクログリアにより一定期間後には貪食除去されることが明らかである。なお、アミノ化磁性ビーズは高いpHを有するが、脳内に注入しても神経毒性がなく、著明な炎症反応は惹起されなかった。【００７５】
４．ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子導入
（１）遺伝子導入剤の調製
上記１に従って調製した遺伝子導入用担体に、光応答イオンチャネル（チャネルロドプシン（channelrhodopsin）２）とＧＦＰとのキメラ遺伝子（channelrhodopsin 2-GFP）を導入したＡＡＶを添加して、ＡＡＶを遺伝子導入用担体に結合させ、遺伝子導入剤を得た。【００７６】
（２）標的部位への遺伝子導入
ラットの脳内に、上記（１）で調製した遺伝子導入剤を注入した。注入から４週間後にラットを実験殺し、脳切片を作成した（図５）。注入部位を青矢印で示す。図５より、遺伝子導入剤注入部位のみで遺伝子が発現しており、他の部位にウイルスが拡散していないことが明らかである。【００７７】
さらに、遺伝子導入剤注入部の神経細胞に記録電極を刺し、青色光（４７０ｎｍ）を照射すると神経活動が誘発された（図６）。すなわち、生理活性を有するＡＡＶが遺伝子導入剤に搭載されていることが明らかである。【００７８】
また、別途、ラットの脳内に上記（１）で調製した遺伝子導入剤を注入し、２週間後に蛍光顕微鏡を用いて脳を高解像度撮影したところ（図７）、遺伝子導入剤注入部のみで遺伝子が発現していた（赤色：遺伝子導入剤、緑色：ＧＦＰ）。緑色蛍光の周囲に点状の赤色の蛍光点がみられるが、当該赤色蛍光点がミクログリアに貪食された遺伝子導入剤である。すなわち、役目を終えた遺伝子導入剤はミクログリアにより除去される。【００７９】
５．磁性ナノワイヤへのチオール基の導入およびヘパリンの結合、ならびに当該磁性ナノワイヤの細胞への付与およびラットへの投与（参考例）
（１）金属ナノワイヤのヘパリン結合方法
ナノワイヤへのチオール基の導入およびヘパリンの結合は、以下のプロトコールに従って行った。
(i)ワイヤ・ポリマーのアセトン洗浄
(ii)ヘパリン反応試薬の調製
0.05M MESバッファー (pH5.4) （酸性領域になった場合はNaOHにて調整）
10mg  ヘパリン
15mg  EDC（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノ-プロピル）カルボジイミド
(1-ethyl-3-（3-dimethylamino- propyl）carbodiimide)）15分インキュベート ； ヘパリンの活性化  9mg NHS（N-ヒドロキシスクシンイミド(N-hydroxysuccinimide)）
(iii)シランカップリング(SUSなど無機基板のみ)
(iv)ワイヤ、ポリマーを(ii)の液に加え、室温で２４時間、攪拌しながらインキュベートした。
(v)洗浄
0.05M MES（2-モルホリノエタンスルホン酸一水和物(2-Morpholinoethanesulfonic acid, monohydrate)）、PBS (2時間)、4M NaCl(2時間)、蒸留水(2時間 × 2回)の順で洗浄を行った。ここで、PBSの組成は、KCl  0.2g/L、KH2PO4  0.2g/L、Na2HPO4・12H2O  2.9g/L、NaCl  8g/Lである。【００８０】
（２）ナノワイヤの細胞への付与
磁性ナノワイヤ（写真はステンレス極細線）にヘパリンを結合し、さらにAAVを搭載して培養細胞にウイルスベクターを感染させた。293細胞を培養皿一面に培養し、その上にAAVを搭載した磁性ナノワイヤの網を乗せ、3週間培養した。AAVには蛍光蛋白GFPの遺伝子をコードするベクターが組み込まれているため、感染してGFPを発現する細胞は緑色蛍光を発する。【００８１】
写真のように、磁性ナノワイヤ網に触れた細胞のみが緑色蛍光を発している（図９ＡおよびＢ）。このことは，AAVが磁性ナノワイヤ網からほとんど離脱しないこと、およびAAVが活性を持った状態で磁性ナノワイヤに結合していることを明示している。【００８２】
（３）ナノワイヤのラット脳への投与
ラットの脳内に、上記（１）および（２）で調製した磁性ナノワイヤを注入した。注入から２週間後、放射光ＣＴを用いて脳を高解像度撮影したところ（図９Ｃ）、注入した磁性ナノワイヤが脳の一部に局在している様が観察された（図９Ｃ、白い部分が磁性ナノワイヤ）。【００８３】
６．ナノ粒子を用いない、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子導入（比較例）
ラットを全身麻酔後、定位脳手術装置にラットの頭部を固定し、ラット脳に（図８  ×印の箇所）、マイクロマニピュレータを用いて、ＧＦＰ遺伝子を組み込んだＡＡＶを単純に注射した。４週間後、ラットを深麻酔により殺し、海馬領域を切り出して蛍光顕微鏡で観察した（図８）。ＧＦＰ遺伝子のＡＡＶへの組み込みは、上記２（１）と同様、セルバイオラボ社製の製品を使用した。ベクターを注射した部分のみならず、脳内の広範囲にＡＡＶが拡散してＧＦＰ遺伝子が発現していた。このように、単純にウイルスを注射した場合には、目的外の部位においても遺伝子が発現してしまうため、導入する遺伝子によっては重篤な副作用の危険がある。【００８４】
７．ナノ粒子表面に直接ヘパリンを結合させた遺伝子導入剤の調製（比較例）
発明者らは、上記１で調製したアミノ化磁性ビーズ(EGDEN ビーズ)の表面に、アミノ基を介さずにヘパリンを直接結合させることを試みた。しかし、磁性ビーズを壊さずに十分量のヘパリンを結合させることは出来なかった（温和な反応条件ではヘパリンの結合量が少なく、また、過激な反応条件では磁性ビーズが壊れた、または蛍光錯体が流出した）（データは示していない）。【００８５】
８．安全性試験
（１）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
上記１に従って調製した遺伝子導入用担体に、ＥＧＦＰ遺伝子を組み込んだアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を添加して、ヘパリンにＡＡＶを結合させ、遺伝子導入剤を得た。【００８６】
２４ウェルプレートに培養海馬神経細胞を播種し（４×１０４細胞／ウェル）、培養を行った。培養８日目に、遺伝子導入剤を培養液に添加した（添加濃度２μｇ／ｍｌ）。培養２１日目に、細胞を４％ＰＦＡで固定し、免疫組織化学的手法を用いてニューロフィラメントの観察を行った。【００８７】
ニューロフィラメントの繊維長を、遺伝子導入用担体の添加群下及び非添加条件群について測定した。その結果、両実験群間で繊維長の有意差は認められず、本発明に係る遺伝子導入用担体が細胞毒性を示さないことが明らかになった。【００８８】
（２）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
上記１で調製した遺伝子導入用担体に、光応答イオンチャネル（チャネルロドプシン（channelrhodopsin）２）を導入したＡＡＶを添加して、ＡＡＶを遺伝子導入用担体に結合させ、遺伝子導入剤を得た。【００８９】
ラットの脳内に、遺伝子導入剤を注入した。注入から２週間後に、放射光位相差ＣＴを用いて、脳浮腫の有無を評価した。【００９０】
さらに、遺伝子導入剤の注入部の神経細胞に記録電極を刺し、青色光（４７０ｎｍ）を照射した際の神経細胞の興奮を電気生理学的に測定することによって、光応答イオンチャネルの遺伝子発現を確認した。【００９１】
その結果、遺伝子導入剤の注入部において、光応答イオンチャネルの遺伝子発現が確認される一方、脳浮腫は認められないか極めて軽度であった。このことから、本発明に係る遺伝子導入剤が生体に対する毒性を有さないことが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明に係る遺伝子導入剤によれば、生体内の所望の位置に遺伝子発現用ベクターを導入でき、また一定期間経過すると遺伝子導入剤が体内から除去されることから、生体の特定の位置に、安全かつ自在に遺伝子を導入することができる。従って、本発明に係る遺伝子導入剤によれば、例えば脳疾患に対する遺伝子治療等、現在の遺伝子導入技術では手術が必要な治療において、患者への負担が小さい新たな治療法を提供することが可能となる。
【符号の説明】
【００９３】
１：遺伝子導入剤、２：遺伝子導入用担体、３：遺伝子導入用ベクター、２１：ナノ粒子、２２：遺伝子導入用ベクター結合物質、２３ａ，２３ｂ：官能基、２４：リンカー
【図１】
2013179669.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年10月23日(2013.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子と、遺伝子導入用ベクター結合物質とを含んでなり、
細胞による貪食を惹起する官能基を備える遺伝子導入用担体であり、
前記遺伝子導入用ベクター結合物質は、前記官能基のうちの一部を介して、前記ナノ粒子の表面に結合され、
前記官能基のうちの他の一部は、前記遺伝子導入用ベクター結合物質と結合せずに存在し、
前記官能基は、分子構造中にエチレングリコール鎖（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、プロピレングリコール鎖（−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−Ｏ−）又はブチレングリコール鎖（−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）を含む親水性分子であるリンカーを介して、前記ナノ粒子上に存在している、
遺伝子導入用担体。
【請求項２】
前記リンカーが、分子構造中にエチレングリコール鎖を１〜５含む親水性分子である請求項１記載の遺伝子導入用担体。
【請求項３】
請求項１又は２記載の遺伝子導入用担体の前記遺伝子導入用ベクター結合物質に遺伝子導入用ベクターが結合されてなる遺伝子導入剤。
【請求項４】
前記官能基が、正電荷を有する請求項３に記載の遺伝子導入剤。
【請求項５】
前記官能基が、アミノ基である請求項３又は４に記載の遺伝子導入剤。
【請求項６】
前記ナノ粒子の平均粒子径が１０ｎｍ〜１０００ｎｍである請求項３〜５のいずれか一項に記載の遺伝子導入剤。
【請求項７】
前記遺伝子導入用ベクター結合物質が、ヘパリン及び／又はヘパラン硫酸である請求項３〜６のいずれか一項に記載の遺伝子導入剤。
【請求項８】
前記ナノ粒子が、磁性を有する請求項３〜７のいずれか一項に記載の遺伝子導入剤。
【請求項９】
ナノ粒子と、遺伝子導入用ベクターと、遺伝子導入用ベクター結合物質とを含んでなり、細胞による貪食を惹起する官能基を備える遺伝子導入剤であり、
前記遺伝子導入用ベクター結合物質は、前記官能基のうちの一部を介して、前記ナノ粒子の表面に結合され、
前記官能基のうちの他の一部は、前記遺伝子導入用ベクター結合物質と結合せずに存在し、
前記官能基は、分子構造中にエチレングリコール鎖（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、プロピレングリコール鎖（−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−Ｏ−）又はブチレングリコール鎖（−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）を含む親水性分子であるリンカーを介して、前記ナノ粒子上に存在し、
前記遺伝子導入用ベクターは、遺伝子導入用ベクター結合物質に結合している、
遺伝子導入剤を用いて、細胞へ遺伝子を導入する方法。
【請求項１０】
前記ナノ粒子と、前記遺伝子導入用ベクター結合物質とを含んでなり、
細胞による貪食を惹起する前記官能基を備える遺伝子導入用担体であり、
前記遺伝子導入用ベクター結合物質は、前記官能基のうちの一部を介して、前記ナノ粒子の表面に結合され、
前記官能基のうちの他の一部は、前記遺伝子導入用ベクター結合物質と結合せずに存在し、
前記官能基は、分子構造中にエチレングリコール鎖（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、プロピレングリコール鎖（−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−Ｏ−）又はブチレングリコール鎖（−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）を含む親水性分子であるリンカーを介して、前記ナノ粒子上に存在している、遺伝子導入用担体の、前記遺伝子導入用ベクター結合物質に前記遺伝子導入用ベクターを結合して遺伝子導入剤を調製する手順を含む、細胞へ遺伝子を導入する方法。
【請求項１１】
前記遺伝子導入剤をインジェクションにより標的細胞まで誘導する手順を含む請求項９又は１０記載の遺伝子導入方法。
【請求項１２】
前記ナノ粒子が磁性を有し、前記遺伝子導入剤に磁場を印加してインジェクション部位に保持する手順を含む請求項１１に記載の遺伝子導入方法。
【請求項１３】
細胞による貪食を惹起する官能基を表面に備え、該官能基は分子構造中にエチレングリコール鎖（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、プロピレングリコール鎖（−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−Ｏ−）又はブチレングリコール鎖（−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）を含む親水性分子であるリンカー介して前記ナノ粒子上に存在しているナノ粒子に、前記官能基のうちの一部を介して、前記遺伝子導入用ベクター結合物質を結合させる工程を含む、
前記ナノ粒子と、前記遺伝子導入用ベクター結合物質とを含んでなる遺伝子導入用担体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の製造方法により得られる遺伝子導入用担体の前記遺伝子導入用ベクター結合物質に、遺伝子導入用ベクターを結合させる工程を含む遺伝子導入剤の製造方法。
【国際調査報告】
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