(57)【要約】  本発明が解決すべき課題は、本発明は、糸状菌を高密度培養し、それにより有用物質を大量生産することを可能とすることである。本発明は、α−１，３−グルカンを発現しない変異型の糸状菌を培養して、当該糸状菌に物質を生成させる工程、及び得られた物質を回収する工程を含む、物質生産方法を提供する。
2014073674.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−１，３−グルカンを発現しない変異型の糸状菌を培養して、当該糸状菌に物質を生成させる工程、及び
得られた物質を回収する工程
を含む、物質生産方法。
【請求項２】
前記変異型糸状菌がα−１，３−グルカン合成酵素ａｇｓの少なくとも一つを欠損している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糸状菌が、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ属、セファロスポリウム属、又はアクレモニウム属に属する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
糸状菌が、アスペルギルス  ニドランス、アスペルギルス  オリゼ、アスペルギルス  ニガー、又はアスペルギルス  フミガタスである、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１２年１１月９日に出願された、日本国特許出願第２０１２−２４７２７６号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。
本発明は、糸状菌を用いた有用物質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌とは、菌糸と呼ばれる管状の細胞から構成されているものの総称であり、有機酸、色素、農薬原体等の化成品、ペニシリン、スタチン類等の医薬品等の低分子化合物；アミラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼの産業用酵素等の発酵生産に使用されている。【０００３】
例えば、特許文献１には、グルコース含有溶液に好熱性菌由来β−グルコシダーゼを添加し、縮合反応により２糖類含有溶液を製造する工程、および２糖類含有溶液を含む培地を使用して糸状菌培養によりセルラーゼを製造する工程を含む、セルラーゼの製造方法が記載されている。【０００４】
また、特許文献２には、真菌ペプチドをプロセシングしてC-末端からペプチドおよび/またはN-末端からペプチドを切除して、ホスホリパーゼ活性をもつ特定のアミノ酸配列からなるコアペプチドを生成せしめる工程を含むホスホリパーゼの製造方法が記載されている。【０００５】
また、特許文献３〜７には、糸状菌による物質生産の効率化を目的に、糸状菌を宿主として機能するように構築された発現ベクター、また該発現ベクターに同種または異種タンパク質をコードする遺伝子が機能的に連結されてなるプラスミドを糸状菌へ導入し形質転換体を作成する方法、さらに該形質転換体の利用がアミラーゼ、セルラーゼ等の酵素や、ペニシリン等の低分子化合物の増産に資すること、が記載されている。【０００６】
上記のように、糸状菌は、多種多様な有用物質を生産できるという利点を有する。しかし、糸状菌は、その液体培養工程において、菌糸が絡まり塊状に集塊し、高密度培養ができないという問題、有用物質の生産量が低下するという問題、有用物質の生産工程の煩雑化という問題を発生し、様々な視点から解決が試みられている（例えば、特許文献８〜９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−２２７０３２
【特許文献２】特開２０１０−１７２３４３
【特許文献３】特開２００１−４６０７８
【特許文献４】特開２００５−５２１１６
【特許文献５】特開２００９−１１８７８３
【特許文献６】特表平１１−５０６０２５
【特許文献７】特表２００７−５０８０２２
【特許文献８】特開２００２−２１８９７０
【特許文献９】特開２０１０−２２７０３１
【特許文献１０】特再公表２０１０−１０７１２６
【特許文献１１】特開２０１０−２２０５９０
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hogan, L. H., et al （1994） Altered expression of surface α-1,3-glucan in genetically related strains of Blastomyces dermatitidis that differ in  virulence. Infect. Immun. 62:3543-3546.
【非特許文献２】Rappleye, C.A., et al (2004) RNA interference in Histoplasma capsulatumdemonstrates a role for a-(1,3)-glucan in virulence. Mol. Microbiol. 53: 153-165.
【非特許文献３】Beauvais, A., et al (2005) Two α(1-3) Glucan Synthases with Different Functions in  Aspergillus fumigates. Appl. Environ. Microbiol. 71: 1531-1538.
【非特許文献４】Maubon, D., et al (2006) AGS3, an α(1-3)glucan synthase gene family member of Aspergillusfumigatus, modulates mycelium growth in the lung of experimentally infected mice. Fungal Genet. Biol. 43:366-375.
【非特許文献５】Henry C., et al (2011) α1,3 glucansare dispensable in Aspergillus fumigatus. Eukariot. Cell 11: 26-29
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、糸状菌を高密度培養し、それにより有用物質を大量生産することを可能とすることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の状況の下、鋭意研究した結果、α−１，３−グルカンを発現しない糸状菌の変異株を用いた場合、培養の際の菌体の凝集が有意に抑制されて培地中に菌体が均一に分散し、高密度培養が可能となることを見出した。さらに、かかる変異株を用いた場合、有用物質の単位体積当たりの生産量を向上できることを見出した。本発明は、かかる新規の知見に基づく。【００１１】
α−１，３−グルカンは、糸状菌の細胞壁の主要な構成要素の1つであるほか、病原性の発現への関与も知られている。細胞壁中α−１，３−グルカンの変動と病原性発現との関係から病原性発現機序を調べる研究では、グルカン合成酵素遺伝子破壊株の作成、またはグルカン合成酵素遺伝子発現を抑制すること、によって細胞壁中α−１，３−グルカン量を変化させ、その変動と病原性発現の関係から、病原性発現機序の解明が試みられてきた（例えば、非特許文献１〜４）。またα−１，３−グルカンを標的分子とする薬剤に関する技術提案（特許文献１０）や、α−１，３−グルカンを標的とする創薬シーズをスクリーニングする方法においてグルカン合成酵素遺伝子の発現量変動を指標に用いるという技術提案（特許文献１１）、などがなされてきたが、α−１，３−グルカンを発現しない菌を物質の増産に利用するという着想ならびに技術開発は行われてこなかった。【００１２】
従って、本発明は、以下の項を提供する：
項１．α−１，３−グルカンを発現しない変異型の糸状菌を培養して、当該糸状菌に物質を生成させる工程、及び
得られた物質を回収する工程
を含む、物質生産方法。【００１３】
項２．前記変異型糸状菌がα−１，３−グルカン合成酵素ａｇｓの少なくとも一つを欠損している、項１に記載の方法。【００１４】
項３．糸状菌が、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ属、セファロスポリウム属、又はアクレモニウム属に属する、項１又は２に記載の方法。【００１５】
項４．糸状菌が、アスペルギルス  ニドランス、アスペルギルス  オリゼ、アスペルギルス  ニガー、又はアスペルギルス  フミガタスである、項３に記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法によれば、糸状菌の液体培養において、菌糸の絡まり及び菌体の凝集が抑制されるため、高密度培養が可能になる。従って、有用物質の単位体積当たりの生産量を飛躍的に上昇させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、製造例３における定量RT-PCRでのａｇｓＡ遺伝子及びａｇｓＢ遺伝子の発現を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例１及び比較例１における培養後の乾燥菌体重量のグラフを示す。
【図３】図３は、実施例１及び比較例１における培養後のフラスコ写真を示す。
【図４】図４は、実施例１及び比較例１での各グルコース濃度、各菌株における培養液中の菌体量、グルコース残量及びｐＨの推移を示す。
【図５】図５は、実施例２及び比較例２における培養後の乾燥菌体重量のグラフを示す。
【図６】図６は、実施例３及び比較例３における培養後の乾燥菌体重量及びペニシリン濃度のグラフを示す。
【図７】図７は、実施例４及び比較例４における乾燥菌体重及びアミラーゼ活性の推移を示す。
【図８】図８は、異種タンパク質を高発現するΔagsB株の設計の概略を示す。
【図９】アスペルギルス  ニドランスのａｇｓＡの推定アミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図１０】アスペルギルス  ニドランスのａｇｓＡをコードする核酸分子の塩基配列（イントロン含む）（配列番号２）を示す。
【図１１】アスペルギルス  ニドランスのａｇｓＡをコードする核酸分子の塩基配列（イントロン含む）（配列番号２）を示す。
【図１２】アスペルギルス  ニドランスのａｇｓＡをコードする核酸分子の塩基配列（イントロン含む）（配列番号２）を示す。
【図１３】アスペルギルス  ニドランスのａｇｓＢの推定アミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図１４】アスペルギルス  ニドランスのａｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（イントロン含む）（配列番号４）を示す。
【図１５】アスペルギルス  ニドランスのａｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（イントロン含む）（配列番号４）を示す。
【図１６】実施例７におけるags破壊株作製の概略を示す。
【図１７】実施例７におけるags破壊用ベクター導入の概略を示す。
【図１８】実施例７における二重破壊株、三重破壊株作製の概略を示す。
【図１９】実施例７、比較例７における麹菌の野生株およびAGS三重破壊株（asgA△agsB△agsC△ 株）の培養性状を示す。
【図２０】アスペルギルス  オリゼのａｇｓＡの推定アミノ酸配列（配列番号２７）を示す。
【図２１】アスペルギルス  オリゼのａｇｓＡの塩基配列（配列番号２８）を示す。
【図２２】アスペルギルス  オリゼのａｇｓＡの塩基配列（配列番号２８）を示す。
【図２３】アスペルギルス  オリゼのａｇｓＢの推定アミノ酸配列（配列番号２９）を示す。
【図２４】アスペルギルス  オリゼのａｇｓＢの塩基配列（配列番号３０）を示す。
【図２５】アスペルギルス  オリゼのａｇｓＢの塩基配列（配列番号３０）を示す。
【図２６】アスペルギルス  オリゼのａｇｓＣの推定アミノ酸配列（配列番号３１）を示す。
【図２７】アスペルギルス  オリゼのａｇｓＣの塩基配列（配列番号３２）を示す。
【図２８】アスペルギルス  オリゼのａｇｓＣの塩基配列（配列番号３２）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、
α−１，３−グルカンを発現しない変異型の糸状菌を培養して、当該糸状菌に物質を生成させる工程、及び
得られた物質を回収する工程
を含む、物質生産方法
を提供する。
【００１９】
糸状菌変異株
本発明において、「α−１，３−グルカンを発現しない変異型の糸状菌」とは、糸状菌の変異株であって、α−１，３−グルカンを全く発現しないものだけでなく、α−１，３−グルカンを実質的に発現しないものも包含する。より具体的には、α−１，３−グルカンを実質的に発現しない変異株とは、ごくわずかにα−１，３−グルカンを発現するにとどまり、本発明の効果である菌体の凝集が有意に抑制されている変異株を示し、例えば、α−１，３−グルカンの発現量が野生株の３０％以下、より好ましくは野生株の１０％以下である株等が挙げられる。
【００２０】
糸状菌としては、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、セファロスポリウム（Cephalosporium）属、アクレモニウム（Acremonium）属、ニューロスポラ（Neurospora）属等が挙げられる。これらのうち、アスペルギルス属がより好ましい。本発明において用いるアスペルギルス属の糸状菌としては、例えば、アスペルギルス  ニドランス（Aspergillus nidulans)）、アスペルギルス  オリゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス  フミガタス（Aspergillus fumigatus）等が挙げられ、アスペルギルス  ニドランス、アスペルギルス  オリゼ、またはアスペルギルス  ニガーが好ましい。
【００２１】
本発明の方法は、糸状菌の変異株であって、α−１，３−グルカンを発現しないものを用いることを特徴とする。かかる変異型糸状菌としては、α−１，３−グルカン合成酵素ａｇｓの少なくとも一つを欠損しているものが挙げられる。α−１，３−グルカン合成酵素ａｇｓとしては、アスペルギルス  ニドランスのａｇｓＡ（Genbank accession No. XM_658397）、ａｇｓＢ（Genbank accession No. XM_655819）、アスペルギルス  オリゼのａｇｓＡ、ａｇｓＢ、ａｇｓＣ、アスペルギルス  フミガタスのａｇｓ１（Genbank accession No. XM_743319）、アスペルギルス  ニガーのａｇｓＥ（Genbank accession No.AY530790）、ペニシリウム  クリソゲナムのａｇｓＢ（Genbank accession No.AY530792）、などが挙げられる。ここで、アスペルギルス  オリゼのａｇｓＡ、ａｇｓＢ、ａｇｓＣは、アスペルギルスデータベースAspGD（http://www.aspergillusgenome.org）に、遺伝子番号agsA（AO090026000523）、agsB（AO090003001500）、agsC（AO090010000106）で登録されている。アスペルギルス  ニドランスのａｇｓＡのアミノ酸配列（配列番号１）を図９に、アスペルギルス  ニドランスのａｇｓＡをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２）を図１０〜１２に示す。また、アスペルギルス  ニドランスのａｇｓＢのアミノ酸配列（配列番号３）を図１３に、アスペルギルス  ニドランスのａｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号４）を図１４〜１５に示す。アスペルギルス  オリゼのａｇｓＡのアミノ酸配列（配列番号２７）を図２０に、アスペルギルス  オリゼのａｇｓＡをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２８）を図２１〜２２に示す。アスペルギルス  オリゼのａｇｓＢのアミノ酸配列（配列番号２９）を図２３に、アスペルギルス  オリゼのａｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号３０）を図２４〜２５に示す。アスペルギルス  オリゼのａｇｓＣのアミノ酸配列（配列番号３１）を図２６に、アスペルギルス  オリゼのａｇｓＣをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号３２）を図２７〜２８に示す。変異型糸状菌としては、これらのα−１，３−グルカン合成酵素の１つ又は２つ以上を欠損しているものが挙げられる。本発明において、糸状菌としてアスペルギルス  ニドランスを用いる場合、少なくともａｇｓＢを欠損している株が好ましい。
【００２２】
本発明において、α−１，３−グルカン合成酵素ａｇｓの欠損とは、ゲノム中のα−１，３−グルカン合成酵素のコード領域の全部または一部が欠失しているもの、コード領域の全部または一部に別の核酸分子が挿入されているもの、当該コード領域の全部または一部が別の核酸分子で置換されているもの等が挙げられる。また、α−１，３−グルカン合成酵素ａｇｓの欠損には、上記コード領域への所定の核酸分子の付加、欠失及び置換だけでなく、α−１，３−グルカンが一定の条件下でのみ発現されるように設計された、コンディショナルな遺伝子欠損も含まれる。従って、本発明の方法には、上記コンディショナルな遺伝子欠損のされた変異株を、α−１，３−グルカンが発現しない条件下で培養する工程を含む方法も含まれる。
【００２３】
本発明の方法を糸状菌が本来産生能を有するアミラーゼ、セルラーゼ等の酵素、ペニシリン等の低分子化合物等の有用物質の生産に用いてもよいが、本発明の方法においては、糸状菌が本来産生能を有する有用物質の発現を増強する、又は糸状菌が本来産生能を有さない物質を発現するように形質転換を行ってもよい。かかる形質転換方法としては、糸状菌を宿主とできるように構築された発現ベクターと、該発現ベクターに同種または異種タンパク質をコードする遺伝子を機能的に連結して構築されるプラスミドを利用する、自体公知の方法（例えば特開２００１−４６０７８号公報、特開２００５−５２１１６号公報、特開２００９−１１８７８３号公報、特表平１１−５０６０２５号公報、特表２００７−５０８０２２号公報に記載の方法）を用いることが可能である。
【００２４】
かかる変異株の作製方法としては、自体公知の方法（例えば、非特許文献２〜５に記載の方法）を適宜用いて、例えば、α−１，３−グルカン遺伝子の破壊カセットの構築及びゲノム遺伝子への当該カセットの導入等により行うことができる。
【００２５】
本発明により製造することができる有用物質としては、特に限定されず、例えば、ペニシリン、スタチン類、セファロスポリン、麹酸、クエン酸、リンゴ酸等の低分子化合物；アミラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ペプチターゼ、エステラーゼ、酸化酵素等の高分子化合物等が挙げられる。また有用物質としては、上記以外にも、有機酸、色素、農薬原体等の化成品、医薬品として用いられる各種物質が挙げられる。また、本発明の方法は、バイオマスの分解によるバイオエタノールの生産（セルラーゼ等を高生産するよう遺伝子組換えをしたカビを使用するもの等）等にも応用が可能である。
【００２６】
培養工程
本発明の方法は、α−１，３−グルカンを発現しない変異型の糸状菌を培養して、当該糸状菌に物質を生成させる工程を含む。当該工程で用いる培地としては、特に限定されず、糸状菌の培養に用いることができるものを広く使用することができる。例えば、CD最小培地、YPD培地、TSB培地、モルト培地、PDA培地等が挙げられる。上記培地には、炭素源として、グルコース、でんぷん、可溶性でんぷん等を添加してもよい。かかる炭素源の添加量としては特に限定されないが、例えば、0.5〜10％、より好ましくは1〜4％の範囲で適宜設定できる。培養温度は特に限定されず、20〜45℃、より好ましくは25〜37℃の範囲で適宜設定できる。培養時間も特に限定されないが、例えば、12〜72時間、より好ましくは24〜48時間の範囲で適宜設定できる。
【００２７】
培養培地からの有用物質の回収方法としては、特に限定されず、自体公知の方法（遠心分離、再結晶、蒸留法、溶媒抽出法、クロマトグラフィー等）を適宜用いることができる。
【実施例】
【００２８】
製造例１  ａｇｓＡ遺伝子の破壊カセットの構築
ａｇｓＡ遺伝子の破壊カセットを構築するために、第１ラウンドのＰＣＲで、５’非コード領域（アンプリコン１）及びコード領域（アンプリコン２）を含む遺伝子断片をＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  ＡＢＰＵ１ゲノムＤＮＡテンプレートから増幅し、ｐｙｒＧ遺伝子（アンプリコン３）をＡ．ｏｒｙｚａｅゲノムＤＮＡテンプレートから増幅した。アンプリコン１は、プライマーａｇｓＡ−ＬＵ（5’-AGTGGAGGAGTTAGGGAGTGAT-3’（配列番号５））及びａｇｓＡ−ＬＬ（5’-CACAGGGTACGTCTGTTGTGAAAGAGTAAGGTAGAAGCCCC-3’（配列番号６））を用いて増幅し、アンプリコン２は、ａｇｓＡ−ＲＵ（5’-TTCTTCTGAGGTGCAGTTCAGCAGATTATTACGCACCGGA-3’（配列番号７））及びａｇｓＡ−ＲＬ（5’-AACCGTGGTTTTGGTGGCAAAG-3’（配列番号８））を用いて増幅し、アンプリコン３は、ａｇｓＡ−ＰＵ（5’-TACCTTACTCTTTCACAACAGACGTACCCTGTGATGTTC-3’（配列番号９））及びａｇｓＡ−ＰＬ（5’-GTAATAATCTGCTGAACTGCACCTCAGAAGAAAAGGATG-3’（配列番号１０））を用いて増幅した。プライマーａｇｓＡ−ＬＵ、ａｇｓＡ−ＲＵ、ａｇｓＡ−ＰＵ及びａｇｓＡ−ＰＬは、それぞれＰＣＲフュージョンの逆相補的配列を含む、キメラオリゴヌクレオチドである。得られた３つのＰＣＲ産物をゲル精製し、ａｇｓＡ−ＬＵ及びａｇｓＡ−ＲＬを用いる第２ラウンドのＰＣＲの基質として使用した。当該第２ラウンドのＰＣＲにより、第１ラウンドで得られた３つのフラグメントを融合して、破壊カセットを作製した。全てのＰＣＲ反応は、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）を用いて行った。得られたＰＣＲ産物をゲル精製し、ＡＢＰＵ１株の形質転換に用いた。【００２９】
製造例２  ａｇｓＢ遺伝子の破壊カセットの構築
第１ラウンドのＰＣＲで、プライマーａｇｓＢ−ＬＵ(5’-GCAATGAGAGCTGGAATCAGTG-3’ （配列番号１１）)及びａｇｓＢ−ＬＬ(5’-TGAGTCGGCCACAGCGGATGGAATTCGTCGTCTGGCTGTGAGTGTAAC-3’ （配列番号１２）)（アプリコン１用）、ａｇｓＢ−ＲＵ(5’-TCTTCCAGTTACTCCGTCGGTACCCAGCAACATGCTGGCCATACGAC-3’ （配列番号１３）)及びａｇｓＢ−ＲＬ(5’-AAAGTCCTGGGTCTCTTCGTTC-3’ （配列番号１４）)（アプリコン２用）、及びａｇｒＢ−Ｆ(5’-GAATTCCATCCGCTGTGGCCGACTCA-3’ （配列番号１５）)及びａｇｒＢ−Ｒ(5’-GGTACCGACGGAGTAACTGGAAAGATACGA-3’ （配列番号１６）)（アプリコン３用）を用い、第２ラウンドのＰＣＲで、プライマーａｇｓＢ−ＬＵ及びａｇｓＢ−ＲＬを用いる以外、上記製造例１と同様にして、ａｇｓＢ遺伝子の破壊カセットを構築した。【００３０】
製造例３  変異株の作製及びα−１，３−グルカン発現量の測定
ａｇｓＡおよびａｇｓＢ遺伝子欠失破壊のための形質転換はプロトプラスト-PEG法を改良した方法を用い、形質転換するDNA断片は、上記で作製したａｇｓＡおよびａｇｓＢ遺伝子欠失破壊用DNA断片を用いた。アスペルギルス  ニドランスABPU1 ΔligD::ptrA(ビオチン（biA1）、アルギニン（argB2）、ウリジン（pyrG89）、ピリドキシン（pyroA4）要求性株(東北大学大学院農学研究科・藤岡智則博士より供与))の分生子懸濁液をYPD培地に植菌し、37℃、20時間振盪培養した。17G1滅菌済ガラスフィルターを用いて集菌後、菌体を50 ml容の遠心チューブに移し、滅菌水で洗浄した。その後、菌体を30 mlのプロトプラスト化溶液(0.8M NaCl、10mM NaH2PO4、10mg/ml Lysingenzyme (Sigma Chemical社製)、5mg/ml Cellulase Onozuka R-10 (Yakult Pharmaceutical Ind.社製)、2.5mg/ml Yatalase (タカラバイオ社製)を加え懸濁し、30℃、90rpm、3時間振盪しプロトプラスト化反応を行った。滅菌したMIRACLOTH（CALBIOCHEM社製）にて濾過し、濾液中のプロトプラストを3,000×g、4℃、5分間遠心分離して沈澱として得た。0.8M NaClにて1回プロトプラストを洗浄し、3,000×g、4℃、5分間遠心分離して沈澱させた。このプロトプラストをSolution 1（0.8M NaCl、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl、pH8.0）で懸濁した。プロトプラスト懸濁液を200μlずつ15ml容の遠心チューブに移し、それぞれにSolution 2（40%(w/v) PEG♯4000、 50mM CaCl2、50mM Tris-HCl、pH8.0）40μlと前述の形質転換用DNA溶液各5μl（DNA量として5μg）を加えよく混合し、氷中で30分間放置した。1 mlのSol.2を加え混合し、室温で20分間放置した。5mlのSol.1で2回洗浄し、Sol.2をなるべく取り除いた。agsA破壊株の選抜の場合は、50℃に温めておいた終濃度0.02μg/mlのビオチン、0.2mg/mlのアルギニン、0.5μg/mlのピリドキシンを添加したCzapek-Dox(CD)軟寒天培地にプロトプラスト縣濁液を加え混合し、終濃度0.02μg/mlのビオチン、0.2mg/mlのアルギニン、0.5μg/mlのピリドキシンを添加したCD寒天培地に重層した。その後、30℃で分生子を形成するまで培養した。形質転換体からのａｇｓＡ破壊株の選択は以下のプライマー（5’- GTACGGTGTAAGCTGCTCGCTGGAC-3’（配列番号１７）、5’- TCCTGGATCTTGTAAACTGAGTCTC-3’（配列番号１８））を用いて形質転換体のゲノムDNAに対してPCRを行い、約6,200bpの増幅断片のみがみられたものをａｇｓＡ破壊候補株とし、最終的に定量RT-PCRによりａｇｓＡ遺伝子が発現していないことを確認した（図１）。ａｇｓＢ破壊株の選抜の場合は、50℃に温めておいた終濃度0.02μg/mlのビオチン、5mMのウリジン、10mMのウラシル、0.5μg/mlのピリドキシンを添加したCzapek-Dox(CD)軟寒天培地にプロトプラスト縣濁液を加え混合し、終濃度0.02μg/mlのビオチン、5mMのウリジン、10mMのウラシル、0.5μg/mlのピリドキシンを添加したCD寒天培地に重層した。その後、30℃で分生子を形成するまで培養した。形質転換体からのａｇｓＢ破壊株の選択は以下のプライマー（5’-AGGAAAGACTGTTGGATGAG-3’（配列番号１９）、5’-GACTTATTCGTGTTGACGTTGTA-3’（配列番号２０））を用いて形質転換体のゲノムDNAに対してPCRを行い、約5,150bpの増幅断片のみがみられたものをａｇｓＢ破壊候補株とし、最終的に定量RT-PCRによりａｇｓＢ遺伝子が発現していないことを確認した（図１）。【００３１】
実施例１、比較例１
上記製造例で得られたΔａｇｓＢ株を下記培養条件で培養し、培養後１２時間毎に、培養液中の菌体量、グルコース残量及びｐＨを測定し、培養後の乾燥菌体重量を測定した（実施例１）。ΔａｇｓＢ株の代わりに野生株を用いる以外、同様にして、培養後の乾燥菌体重を測定した（比較例１）：
培養条件
・培地： CD最小培地 200ml ( 500 ml バッフル付フラスコ )
・培養温度： 37.0 ℃
・培養時間： 72hr
・回転数： 160 rpm
・分生子数： 108  個/L  
・炭素源：グルコース濃度 2％ または 4％
・試行回数： 5 回。
結果を図２〜図４に示す。【００３２】
図２は、培養後の乾燥菌体重量を示す。図２に示されるように、液体培養において、野生株よりΔagsB 株の菌体量は増加する。また、ΔagsB株では、グルコース濃度4%のほうが2%時に比べて菌体量が増加している。図３は、グルコース濃度2％での上記試験後のフラスコの写真を示す。図３に示されるように、ΔagsB株は、液体培地中に均一に増殖しているが、野生株は凝集してしまっている。図４は、各グルコース濃度、各菌株における培養液中の菌体量、グルコース残量及びｐＨの推移を示す。野生株は、グルコース２％、４％のいずれにおいても、培養液中の菌体量は、４％程度で増加が止まってしまっている。これに対し、ΔａｇｓＢ株では、グルコース２％では６０時間付近でグルコースが枯渇しているが、グルコース４％ではグルコースが枯渇せず、菌体重も増加し続けている。【００３３】
図２〜４から、野生株では凝集により、菌体量が一定以上増加できなくなっていること、一方、ΔａｇｓＢ株では培養液中に均一に増殖し、野生株よりも大幅に菌体量を増殖させることができることが分かる。【００３４】
実施例２、比較例２
上記製造例で得られたΔａｇｓＢ株（実施例２）及び野生株（比較例２）をそれぞれ、ジャー型培養装置により下記培養条件で培養し、培養後の乾燥菌体重量を測定した：
培養条件
・培地:  CD培地 3 L
・培養温度:  37.0 ℃
・培養時間：48hr
・回転数   :  300 rpm
・分生子数:  108  個/L
・炭素源：グルコース濃度 2％
・加圧量:  0.3 MPa
・試行回数:  各5 回
結果を図５に示す。図５に示されるように、ジャー型培養装置においても、野生株よりΔagsB 株の菌体量は大幅に増加する。【００３５】
実施例３、比較例３
低分子化合物の生産能の評価として、ペニシリン生産量を測定した。【００３６】
具体的には、まず、上記製造例で得られたΔａｇｓＢ株（実施例３）及び野生株（比較例３）を下記培養条件で培養した：
培養条件
・培地:  YPD培地 100ｍL（200ｍL  フラスコ）
・培養温度:  37 ℃
・培養時間：48hr
・回転数   :  160 rpm
・分生子数:  107  個/100mL
・炭素源：グルコース濃度 2％
培養液を遠心分離し、培養上清をペーパーディスクに塗布し、ペニシリンアッセイ用標準菌体に対する阻止円の直径を測定することにより、ペニシリン生産量を測定した。具体的には、ペニシリンアッセイ用標準菌株であるBacillus stearothermophilusvar. calidolactis(NBRC 100862:独立行政法人  製品評価技術基盤機構より分譲を受けた)を最終濁度O.D.=0.1となるように3%の Tryptic soy broth(Becton, Dickinson and Company社製)寒天培地に混ぜ込み、シャーレ中央に置いた滅菌済ペーパーディスクに100μlの培養上清をしみ込ませた。シャーレを５５℃で１６時間培養し、ペニシリンアッセイ用標準菌株が生育できない阻止円の直径を計測した。ペニシリンの定量は、市販のペニシリンG（SIGMA社製）を0.01、0.025、0.05、0.1μg/mlに調整し、同様にペーパーディスクに塗布して得られた阻止円の直径から算出した。ペニシリン生産量は、野生株で１５．９ｎｇ／ｍｌであったのに対し、ΔａｇｓＢ株で５８．６ｎｇ／ｍｌと大幅にペニシリンの生産量が増加した（図６）。【００３７】
また、遠心分離により得られた沈殿物を用いて乾燥菌体重量測定を行った。乾燥菌体重は、野生株で１７５．７ｍｇに対し、ΔａｇｓＢ株で２２７．６ｍｇと約１．３倍に菌体量も増加していた（図６）。【００３８】
実施例４、比較例４
高分子化合物の生産能の評価として、アミラーゼ生産量を測定した。【００３９】
具体的には、上記製造例で得られたΔａｇｓＢ株（実施例４）及び野生株（比較例４）を下記培養条件で培養した：
培養条件
・培地:  CD最小培地 200ｍL（500ｍL  フラスコ）
・培養温度:  37 ℃
・培養時間：48hr or 36hr
・回転数   :  160 rpm
・分生子数:  107  個/100mL
・炭素源：でんぷん２％  or 可溶性でんぷん２％
培養液から菌体を濾過し、培養上清のアミラーゼ活性を測定した。具体的には、培養開始２４時間、３６時間、４８時間（でんぷん添加条件のみ）経過時の菌体をMIRACLOTH(CALBIOCHEM社製)にて濾過し、培養濾液のアミラーゼ活性をα-アミラーゼ測定キット（キッコーマンバイオケミファ株式会社製）にて測定した。測定法は付属の取扱説明書に従い、培養上清中のアミラーゼ活性を1U = N3-G5-β-CNP から 1 分間に1 μ molのCNPが遊離する力価として評価した。また、濾過した菌体を凍結乾燥し、乾燥菌体重量測定を行った。結果を図７に示す。【００４０】
図７から明らかなように、ΔａｇｓＢ株は、でんぷん添加条件及び可溶性でんぷん添加条件のいずれにおいても、野生株と比較して約２倍もの高いアミラーゼ活性を示すことが分かる。【００４１】
実施例５、比較例５
麹菌アミラーゼ高発現ベクターの作製法（図８）
麹菌ゲノムDNAより、PCR反応によりアミラーゼ遺伝子を増幅し、アスペルギルス  ニドランスのagdA遺伝子のターミネーターと接続し、このDNA断片をAoamyB-agdAtとした。アミラーゼ遺伝子の増幅には、PCRプライマーとしてAoamyB-Not I-F（配列：5’- TGAATTCGCGGCCGCTATTTATGATGGTCGCGTGGTG-3’（配列番号２１））およびAoamyB-R+（配列: 5’-CTTCTTGAGTGAGCTCACGAGCTACTACAGATCT-3’（配列番号２２））を用い、agdA遺伝子のターミネーターの増幅には、PCRプライマーとしてTagdA-Xx-F（配列: 5’-TGTAGTAGCTCGTGAGCTCACTCAAGAAGCGTAACAGGATAGCCT-3’ （配列番号２３））およびTagdA-XbaI-R（配列: 5’-GCTATCTAGAGGCCTGCAGGAGATC-3’ （配列番号２４））を使用した。AoamyB-Not I-Fには制限酵素のNot Iの認識配列が付加されている（下線部）。また、TagdA-Xx-FにはAoamyB遺伝子の配列の一部とオーバーラップする配列が付加されており（下線部）、TagdA-XbaI-Rには制限酵素のXba Iの認識配列が付加されている（下線部）。AoamyB-Not I-FおよびAoamyB-R+を用いて増幅した遺伝子断片（AoamyB断片）とTagdA-Xx-FおよびTagdA-XbaI-Rを用いて増幅した遺伝子断片（agdAt断片）の接続にはヒュージョンPCR法を用いた。これはAoamyB断片およびagdAt断片の混合物をテンプレートとし、AoamyB-Not I-FおよびTagdA-XbaI-Rを用いてPCR反応を行う方法で、両遺伝子断片を接続することができる方法である。接続したDNA断片AoamyB-agdAtは、制限酵素のNot IおよびXba Iで消化し、pNA(N)EGFP（Furukawa et al. Biosci. Biothechnol. Biochem.,71(7), 1724-1730, 2007）のNot I、Xba Iサイトに導入した。pNA(N)EGFPは、アスペルギルス  ニドランス内での選択マーカーとしてオーレオバシジン耐性遺伝子（auAr）を持つベクターであり、これをNot IおよびXba Iで消化したものを遺伝子導入に用いた。DNA断片AoamyB-agdAtを導入したプラスミドpNA(N)AoamyBは制限酵素のNot Iで消化した後、Bacterial alkaline phosphatase(BAP)（Takara社製）処理を行い、アスペルギルス  ニドランスで強発現するプロモーターAnenoApを導入した。AnenoApはアスペルギルス  ニドランスのゲノムDNAから、PCRプライマーPenoA-F（配列：5’-TGGTAAGAGTCGTCATATCGAG-3’ （配列番号２５））およびPenoA-Not I-R（配列：5’-TAGCGGCCGCGAATTCGATGAACTAGAAGGATAGAG-3’ （配列番号２６））を用いて増幅した。PenoA-Not I-Rには制限酵素のNot Iの認識配列が付加されており（下線部）、AnenoApの断片を一旦、プラスミドpZErOTM-2（Invitrogen社製）のEcoRVサイトに導入し、Not Iで切り出すことにより断片の両端にNot Iサイトが付加されたAnenoApの断片を得た。このAnenoApの断片をpNA(N)AoamyBのNot Iサイトに導入し、麹菌のアミラーゼを高発現するベクターpNAenoA::AoamyBとした。このベクターをアスペルギルス  ニドランスのΔagsB株に導入することにより、異種タンパク質を高発現するΔagsB株を作製することができる。【００４２】
実施例６、比較例６
アミラーゼ高発現株においてアミラーゼ活性を測定した。具体的には、実施例５、比較例５に記載の方法で作製した麹菌のアミラーゼを高発現するベクターpNAenoA::AoamyBをAspergillus nidulans の野生株およびα-1,3-グルカンが欠損株した株（AG欠損株）に導入し、異種タンパク質を高発現する野生株およびAG欠損株を作製した。これらの株について、培養上清に分泌されるアミラーゼの量を測定した。
具体的には、AG欠損株及び野生株、アミラーゼ高発現AG欠損株及びアミラーゼ高発現野生株を下記培養条件で培養した：
培養条件
・培地:  CD最小培地 50ｍL（200ｍL  フラスコ）
・培養温度:  37 ℃
・培養時間：24 hr
・回転数   :  160 rpm
・分生子数:  107  個/100mL
・炭素源：2% マルトース培養液から菌体を濾過し、培養上清のアミラーゼ活性を測定した。具体的には、培養開始２４時間経過時の菌体をMIRACLOTH(CALBIOCHEM社製)にて濾過し、培養濾液のアミラーゼ活性をα-アミラーゼ測定キット（キッコーマンバイオケミファ株式会社製）にて測定した。測定法は付属の取扱説明書に従い、培養上清中のアミラーゼ活性を1U = N3-G5-β-CNP から1 分間に1 μ molのCNPが遊離する力価として評価した。結果を下記表１に示す。【００４３】
【表１】
2014073674.tif 000003
【００４４】
表１から明らかなように、アミラーゼ高発現AG欠損株は、アミラーゼ高発現野生株と比較して約6倍もの高いアミラーゼ活性を示すことが分かる。【００４５】
実施例７、比較例７
麹菌アスペルギルス  オリゼ（Aspergillus oryzae）においてα-1,3-グルカン合成酵素（AGS）遺伝子の三重破壊株を造成し、培養性状を比較した。【００４６】
麹菌のAGS遺伝子はゲノム中に３種類存在し、それぞれ、agsA（AO090026000523）、agsB（AO090003001500）、agsC（AO090010000106）と命名されている（遺伝子番号は、アスペルギルスデータベースAspGD（http://www.aspergillusgenome.org）に登録されている）。これら３種のAGS遺伝子について、Cre-loxPシステムを用いた多重遺伝子破壊法（Applied and Environmental Microbiology, Volume 78 Number 12 June 2012 p. 4126-4133参照）をもちいて３重遺伝子破壊株を造成した。上記３つの遺伝子が全て破壊されていることは、下記の方法により確認した。三重破壊株の作製試験の概略を図１６〜１８に示す。具体的には、まず、各 ags 遺伝子の 5’上流領域と ags 遺伝子中の領域をPCR増幅した（図１６（１））。ここで、5’上流領域のリバースプライマーと ags 遺伝子中のフォワードプライマーには、loxP 配列の相同領域が含まれている。また、破壊用プライマーの配列を表２に示す。【００４７】
【表２】
2014073674.tif 000004
【００４８】
次に、酵母の相同組換えシステムを利用し、麹菌内選択マーカー（adeA）を含む Cre 発現カセットと ags 遺伝子の 5’上流領域および ags 遺伝子中の領域を連結し、ags gene破壊用ベクターを構築した（図１６（２））。次に、得られたags gene 破壊ベクターを麹菌の野生株（adeA△株）に導入した（図１７（３））。キシロース（１％）入り培地に移し、Cre の発現を誘導した（図１７（４））。この操作によりCre の働きにより、loxP 配列で組換えが起こる。それぞれの ags 遺伝子特異的なプライマーにより破壊を確認した（図１７（５））。プライマー配列は表３に示す。【００４９】
【表３】
2014073674.tif 000005
【００５０】
次に、一重破壊株を宿主として、同様の方法で二重破壊株を作製した（図１８（６））。具体的には、△agsA 株を宿主株とし、agsB とagsC をそれぞれ破壊した（△agsA△agsB、△agsA△agsC）。また、同様にして、△agsC 株を宿主株とし、agsB を破壊した（△agsC△agsB）。さらに、二重破壊株を宿主として、同様の方法で三重破壊株を作製した（図１８（７））。具体的には、△agsA△agsB 株を宿主株とし、agsC を破壊した。【００５１】
次に、上記操作で作製したこの麹菌AGS三重破壊株について、液体培養時の培養性状を観察した。
具体的には、麹菌AGS三重破壊株及び野生株を下記培養条件で培養した：
培養条件
・培地:  CD最小培地 50ｍL（200ｍL  フラスコ）
・培養温度:  30 ℃
・培養時間：48 hr
・回転数   :  160 rpm
・分生子数:  107  個/100mL
・炭素源：2% グルコース  または  2%  マルトース
結果を図１９及び表４に示す。【００５２】
【表４】
2014073674.tif 000006
【００５３】
図１９に示すように、麹菌の野生株においても菌糸は凝集し粒状に生育するのに対し、麹菌AGS三重破壊株では菌糸の凝集性はあまり無く、比較的分散して生育する。また、炭素源をグルコースあるいはマルトースにした培地においても同様な結果が得られた。48時間培養後の菌体重を比較したところ、麹菌AGS三重破壊株は野生株と比較して菌体重量が増加していた（表４）。麹菌AGS三重破壊株の菌体重は野生株比１３０％に達しており、A. nidulansの場合と同じくAGS遺伝子の欠損により、高密度に培養できる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明によれば、糸状菌を用いた物質生産方法において、有用物質の生産量を飛躍的に上昇させることができる。また、本発明の方法により生産することができる有用物質は、特に限定されず、多岐にわたるため、産業上、非常に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号５はプライマーである。【００５６】
配列番号６はプライマーである。【００５７】
配列番号７はプライマーである。【００５８】
配列番号８はプライマーである。【００５９】
配列番号９はプライマーである。【００６０】
配列番号１０はプライマーである。【００６１】
配列番号１１はプライマーである。【００６２】
配列番号１２はプライマーである。【００６３】
配列番号１３はプライマーである。【００６４】
配列番号１４はプライマーである。【００６５】
配列番号１５はプライマーである。【００６６】
配列番号１６はプライマーである。【００６７】
配列番号１７はプライマーである。【００６８】
配列番号１８はプライマーである。【００６９】
配列番号１９はプライマーである。【００７０】
配列番号２０はプライマーである。【００７１】
配列番号２１はプライマーである。【００７２】
配列番号２２はプライマーである。【００７３】
配列番号２３はプライマーである。【００７４】
配列番号２４はプライマーである。【００７５】
配列番号２５はプライマーである。【００７６】
配列番号２６はプライマーである。【００７７】
配列番号３３はプライマーである。【００７８】
配列番号３４はプライマーである。【００７９】
配列番号３５はプライマーである。【００８０】
配列番号３６はプライマーである。【００８１】
配列番号３７はプライマーである。【００８２】
配列番号３８はプライマーである。【００８３】
配列番号３９はプライマーである。【００８４】
配列番号４０はプライマーである。【００８５】
配列番号４１はプライマーである。【００８６】
配列番号４２はプライマーである。【００８７】
配列番号４３はプライマーである。【００８８】
配列番号４４はプライマーである。【００８９】
配列番号４５はプライマーである。【００９０】
配列番号４６はプライマーである。【００９１】
配列番号４７はプライマーである。【００９２】
配列番号４８はプライマーである。【００９３】
配列番号４９はプライマーである。【００９４】
配列番号５０はプライマーである。【００９５】
配列番号３３はプライマーである。
【図１】
2014073674.tif 000007
【図２】
2014073674.tif 000008
【図３】
2014073674.tif 000009
【図４】
2014073674.tif 000010
【図５】
2014073674.tif 000011
【図６】
2014073674.tif 000012
【図７】
2014073674.tif 000013
【図８】
2014073674.tif 000014
【図９】
2014073674.tif 000015
【図１０】
2014073674.tif 000016
【図１１】
2014073674.tif 000017
【図１２】
2014073674.tif 000018
【図１３】
2014073674.tif 000019
【図１４】
2014073674.tif 000020
【図１５】
2014073674.tif 000021
【図１６】
2014073674.tif 000022
【図１７】
2014073674.tif 000023
【図１８】
2014073674.tif 000024
【図１９】
2014073674.tif 000025
【図２０】
2014073674.tif 000026
【図２１】
2014073674.tif 000027
【図２２】
2014073674.tif 000028
【図２３】
2014073674.tif 000029
【図２４】
2014073674.tif 000030
【図２５】
2014073674.tif 000031
【図２６】
2014073674.tif 000032
【図２７】
2014073674.tif 000033
【図２８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年10月17日(2014.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−１，３−グルカンを発現しない変異型の糸状菌を培養して、当該糸状菌に物質を生成させる工程、及び
得られた物質を回収する工程
を含む、物質生産方法。
【請求項２】
前記変異型糸状菌がα−１，３−グルカン合成酵素ａｇｓの少なくとも２つを欠損しており、かつ少なくともａｇｓＢが欠損している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糸状菌が、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ属、セファロスポリウム属、又はアクレモニウム属に属する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
糸状菌が、アスペルギルス  ニドランス、アスペルギルス  オリゼ、アスペルギルス  ニガー、又はアスペルギルス  フミガタスである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
糸状菌がアスペルギルス  オリゼである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記α−１，３−グルカンを発現しない変異型の糸状菌を培養して、当該糸状菌に物質を生成させる工程を液体培地で行い、かつ前記物質がα−１，３−グルカン、β−１，３−グルカン、ポリガラクトース、グルコース、ガラクトース、グルコサミン、アミノ酸、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びキチン以外の物質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記物質がペニシリン、スタチン類、セファロスポリン、麹酸、クエン酸及びリンゴ酸からなる群より選択される少なくとも一種の低分子化合物；アミラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ペプチターゼ、エステラーゼ及び酸化酵素からなる群より選択される少なくとも一種の高分子化合物；有機酸、色素、農薬原体からなる群より選択される少なくとも一種の化成品；ならびに医薬品として用いられる物質からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項６に記載の方法。
【国際調査報告】
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