(57)【要約】フィブリノゲンおよびトロンビンよりなる群から選ばれる少なくとも一種の蛋白質と、脂肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマーを含有してなるポリマー組成物のシート成形体、ならびにフィブリノゲンと水溶性ポリマーを含有してなる第１ポリマー組成物層およびトロンビンと脂肪族ポリエステルを含有してなる第２ポリマー組成物層を含有してなる積層シート成形体が提供される。これらの成形体は創傷部位に適用して止血材として機能する。
2013172472.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノゲンおよびトロンビンよりなる群から選ばれる少なくとも一種の蛋白質と、脂肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマーを含有してなるポリマー組成物のシート成形体。
【請求項２】
肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマーが、セルロース誘導体、Ｎ−ビニル環状ラクタム単位を有するポリマー、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、デキストラン、プルラン、デンプン、およびそれらの混合物からなる群から選ばれるものである、請求項１に記載のシート成形体。
【請求項３】
肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマーが、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、およびそれらの混合物からなる群から選ばれるものである、請求項１に記載のシート成形体。
【請求項４】
脂肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマーが、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、およびそれらの共重合体、ならびにそれらの混合物からなる群から選ばれるものである、請求項１に記載のシート成形体。
【請求項５】
シート成形体がフィルム成形体または繊維成形体である請求項１から４のいずれかに記載のシート成形体。
【請求項６】
フィブリノゲンと水溶性ポリマーを含有してなる第１ポリマー組成物層およびトロンビンと脂肪族ポリエステルを含有してなる第２ポリマー組成物層を含有してなる積層シート成形体。
【請求項７】
水溶性ポリマーがセルロース誘導体、Ｎ−ビニル環状ラクタム単位を有するポリマー、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、デキストラン、プルラン、デンプン、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項６に記載の積層シート成形体。
【請求項８】
水溶性ポリマーがヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項６に記載の積層シート成形体。
【請求項９】
脂肪族ポリエステルがポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、およびそれらの共重合体、ならびにそれらの混合物からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項６から８のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１０】
第１のポリマー組成物層が、血液凝固第ＸＩＩＩ因子、アルブミン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、界面活性剤、塩化ナトリウム、糖アルコール、トレハロース、クエン酸ナトリウム、アプロチニンおよび塩化カルシウムからなる群から選ばれる少なくとも一種の添加剤を含む、請求項６から９のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１１】
第１のポリマー組成物層がフィルム成形体または繊維成形体からなる請求項６から１０のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１２】
第１のポリマー組成物層がフィルム成形体からなる請求項６から１０のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１３】
フィルム成形体中の水溶性ポリマーの含量が０．１〜５０重量％である請求項１２に記載の積層シート成形体。
【請求項１４】
フィルム成形体がフィブリノゲンを０．０５〜１０ｍｇ／ｃｍ２含む請求項１２または１３に記載の積層シート成形体。
【請求項１５】
フィルム成形体が水溶性ポリマー溶液とフィブリノゲン粉末からなる懸濁溶液から製造された請求項１２から１４のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１６】
第２ポリマー組成物層が繊維成形体からなる請求項６から１５のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１７】
脂肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマー中に、止血性蛋白質または止血性蛋白質と添加剤との混合物が蛋白質粒子として分散して存在している請求項１６に記載の積層シート成形体。
【請求項１８】
止血性蛋白質がトロンビンである請求項１７に記載の積層シート成形体。
【請求項１９】
蛋白質粒子と脂肪族ポリエステルの重量比が１０：１０〜１００である請求項１８に記載の積層シート成形体
【請求項２０】
繊維成形体が脂肪族ポリエステル溶液とトロンビン粉末からなる懸濁溶液から製造された請求項１７から１９のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項２１】
請求項１から５のいずれかのシート成形体または請求項６から２０のいずれかの積層シート成形体からなる止血材。
【請求項２２】
請求項１から５のいずれかのシート成形体または請求項６から２０のいずれかの積層シート成形体からなる組織接着材または組織閉鎖材。
【請求項２３】
創傷部位に請求項２１に記載の止血材または請求項２２に記載の組織閉鎖材を適用する工程を含む、創傷部位の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シート成形体およびそれからなる止血材に関する。さらに詳しくは、フィブリノゲンおよび／またはトロンビンを含有し、これらの止血性蛋白質の溶出性および担持性が良好で止血性に優れたシート成形体およびそれからなる止血材に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィブリノゲンは、血液凝固カスケードの最終段階に存在する凝固因子である。血管が損傷を受けると凝固系の活性化が生じ、最終的に活性化されたトロンビンが可溶性フィブリノゲンを不溶性のフィブリンに変換する。このフィブリンは接着力を有し、止血および創傷治癒に重要な機能を発揮する。
医療現場、特に外科手術においては、止血および組織閉鎖等の組織接着操作は重要な位置づけにあり、本原理を応用したフィブリン糊接着材が幅広い外科手術の現場で利用されている。
フィブリン糊接着材の使用方法については、これまで様々な検討が加えられ、改善が図られており、フィブリノゲン溶液およびトロンビン溶液を患部に塗布または噴霧する液状型製剤（２液混合製剤：特公平９−２９７１号公報および国際公開ＷＯ９７／３３６３３号参照）や、コラーゲン等の支持体にフィブリノゲンとトロンビンを混合固定化したシートを患部に貼付するシート製剤（特表２００４−５２１１１５号公報参照）がある。
しかしながら、現行の液状型製剤においては、凍結乾燥されたフィブリノゲンとトロンビンそれぞれを使用時に溶解して用いるため、凍結乾燥製剤の溶解に数分程度の時間を要し、緊急時の手術への対応の面や簡便性において満足できる剤型とはいえない。
また、上記フィブリン糊接着材においては、フィブリノゲン濃度が高濃度であるほど強い接着力が得られることから、強力な接着力を実現させるためには、高濃度のフィブリノゲンに少量の高濃度トロンビンを作用させることが必要である。
しかしながら、現行の液状型製剤は、フィブリノゲン溶液とトロンビン溶液を等量混合するため濃度が半分になり、フィブリノゲンの最大効力を発揮できない。さらに、フィブリノゲンの濃度は現実的に１０％程度溶液が濃度限界であることから、２液等量混合の系において、濃度の改良も困難である。
この点、シート製剤はフィブリノゲン溶液を高濃度で患部に適用可能であるため、理論的には２液混合製剤より強固な接着力が期待される。また、シート製剤であれば、噴出性・滲出性の出血部位に対する圧迫止血・圧迫閉鎖が可能となり、優れた利便性が期待される。
シート状の組織接着材を使用する際には、フィブリノゲン溶液を高濃度で患部に適用するため、創傷部位に適用した際の、シート製剤の組織への浸透性を増大させる必要がある。また、シート製剤を創傷部位に密着させるために丸めたり、折り曲げたりすることがあるので、このような力に対してシートの破損やフィブリノゲン成分およびトロンビン成分の脱落が起こらないようにシートの柔軟性や２成分の保持力を上げる必要がある。
有効成分を各種基材に固定化したシート状組織接着材およびシート状止血材が報告されている（特公昭６１−３４８３０号公報、特表２００２−５１３６４５号公報、国際公開ＷＯ２００４／０６４８７８号および国際公開ＷＯ２００５／１１３０３０号参照）。特公昭６１−３４８３０号公報においては、ウマ由来のコラーゲン表層にフィブリノゲンおよびトロンビンを固定化したシート製剤が開示・実用化されている（タココンブ（登録商標））。しかしながら、コラーゲン基材は厚みがあり比較的硬質であるため、創傷部位での密着性が下がり、効果的な閉鎖が困難な場合がある。また、本シート製剤は、支持体が馬コラーゲンであり、適用対象がヒトである場合、異種タンパクに対する抗体の出現やプリオン病等の人畜共通感染症の危険性が存在するため理想的なものとは言い難い。
特表２００２−５１３６４５号公報においては、止血化合物が均等に分散した紙状組成物が開示されている。この組成物は非水性溶媒中で生体吸収性ポリマーと止血化合物（主としてトロンビン、フィブリノゲン）からなる繊維状パルプを形成し、製紙処理を施すことで製造される。前述のタココンブに対して止血時間を１４倍減少し、かつ使用中の貼り直しを可能としている。しかしながら紙状であるため、組織追従性に改善の余地がある。
国際公開ＷＯ２００４／０６４８７８号および国際公開ＷＯ２００５／１１３０３０号においては、トロンビンを生体吸収性合成不織布に固定化したシートとフィブリノゲン溶液を併用した材料が開示されている。これらの組成物においては、不織布を有効成分水溶液に浸漬し、凍結乾燥を施すことにより複合化を行っている。この方法においては、凍結乾燥工程の歩留まりが悪い、シートの柔軟性が低い、固定化した蛋白質の担持性が悪くシートから剥がれ落ちる、という問題点がある。
特開２００９−１８３６４９号公報には、凝固反応を制御する目的で、フィブリノゲンを含有する層とトロンビンを含有する層との中間にセルロース誘導体を材料とする中間層を設けたシート状組織止血材が示されているが、該組織止血材中に含まれるフィブリノゲンの溶解性が十分ではなく、また凍結乾燥品故にハンドリングが悪く、トリミングできないという問題がある。
その他、シート製剤として、非イオン界面活性剤を含むフィブリノゲンが固定化された生体吸収性支持体およびトロンビンが固定化された生体吸収性支持体よりなるシート状フィブリン糊接着材が特開２０１０−０６９０３１号公報に、フィブリノゲン層、トロンビン層、吸収物質層等からなる止血サンドウィッチ包帯が特表２００２−５１５３００号公報に、そして、第一の吸収性不織布、一つ以上の第二の吸収性織布または編地とトロンビンおよび／またはフィブリノゲンとを含む多孔の創傷手当て用品が特表２００９−５３３１３５号公報に、それぞれ開示されている。しかし、これらの止血材はフィブリノゲンおよびトロンビンの凍結乾燥により製造されているためフィブリノゲンおよびトロンビンの脱落が生じ易く、柔軟性も不十分であり、フィブリノゲンとトロンビンが隣接しているため上記のような組織接着効果が十分でない。また、フィブリノゲンとトロンビンが直接接している形態である場合、保存中にわずかな水分で凝固反応が進行してフィブリンを形成してしまうため、保存安定性にも問題がある。さらには、凍結乾燥工程を必要とするため、製造するのに多大な時間と手間がかかるという問題があった。
このようにフィブリノゲンとトロンビンの組み合わせにより、実際に効果と利便性が期待できるシート状止血材は確立されていない。また、強力な組織接着効果を発揮するためには、高濃度のフィブリノゲン溶液が必要であるが、フィブリノゲンの溶解性は悪いために、従来の組成のままでフィブリノゲンを支持体に固定化した場合、フィブリノゲンはほとんど溶解しないために十分な薬効を発揮することは期待できない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は、止血性蛋白質、つまりフィブリノゲンおよび／またはトロンビンの担持性および溶出性が良く、柔軟性（組織追従性）、ひいては止血性に優れたシート成形体を提供することにある。
本発明の他の目的は、本発明の上記シート成形体からなる、創傷部位に適用して優れた止血効果を達成できる止血材を提供することにある。
本発明のさらに他の目的および利点は以下の説明から明らかになろう。
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第１に、フィブリノゲンおよびトロンビンよりなる群から選ばれる少なくとも一種の蛋白質と、脂肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマーを含有してなるポリマー組成物のシート成形体によって達成される。
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第２に、前段落のシート成形体の組合せとしてフィブリノゲンと水溶性ポリマーを含有してなる第１のシート成形体層およびトロンビンと脂肪族ポリエステルを含有してなる第２のシート成形体層を含有してなる積層シート成形体によって達成される。
また、本発明によれば、本発明の上記目的およひ利点は、第３に、本発明の上記シート成形体または積層シート成形体からなる止血材によって達成される。すなわち、これらの成形体は創傷部位に適用され、止血材として創傷部位を処置するために用いられる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、トロンビンを含有するポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体の繊維成形体からのトロンビン溶出性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明のシート成形体は、フィブリノゲンおよびトロンビンよりなる群から選ばれる少なくとも一種の蛋白質と、脂肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマー（以下、「基材ポリマー」ともいう。）を含有するポリマー組成物のシート成形体である。ここで「蛋白質を含有する」とは、蛋白質の少なくとも一部分が基材ポリマー組成物内部に入り込んでいる状態をいう。このような構造は蛋白質が組成物表面や組成物の空隙に存在する凍結乾燥による複合体とは異なり、蛋白質の担持性に優れる。
本発明のシート成形体としては、シート状のものであれば特に制限はないが、繊維成形体およびフィルム成形体が好ましいものとして挙げられる。繊維成形体とは、得られた一本または複数本の繊維が積層され、織り、編まれ、もしくはその他の手法により形成された３次元の成形体をいう。具体的な繊維成形体の形態としては、例えば不織布が挙げられる。さらに、それをもとに加工したチューブ、メッシュなども繊維成形体に含まれる。フィルム成形体とは、インフレーション押出成形法、Ｔダイ押出成形法などの押出成形法、カレンダー法、流延法（キャスト法）などの成形法で作製されるフィルム状の成形体を示す。
本発明のシート成形体は、単独でも、フィブリン糊における相補蛋白質（トロンビンに対しフィブリノゲン、又はフィブリノゲンに対しトロンビン）を含有する第２のシートと組み合わせてもその効果を発揮しうる。単独で用いる場合は、脂肪酸ポリエステルにトロンビンを含有する繊維成形体であることが好ましい。
また、上記のシート成形体は、本発明の第２のシート成形体との積層シート成形体を構成するシート成形体として用いることができるが、本発明の第２のシート成形体との積層シート成形体は、フィブリノゲンと水溶性ポリマーを含有してなる第１のシート成形体およびトロンビンと脂肪族ポリエステルを含有してなる第２のシート成形体を含有してなる積層シート成形体である。
本発明で用いられる止血性蛋白質であるフィブリノゲンおよびトロンビンは、動物から調製したものでも、遺伝子組換え技術により製造したものでもよい。動物由来であればヒト由来が好ましい。また、アミノ酸配列を改変した蛋白質も使用できる。
なお、上記ポリマー組成物が、特に、フィブリノゲンおよびトロンビンを含有する場合など、保存中に一部でフィブリンを生じることがあるが、こうしたフィブリンを含む組成物も本発明の範囲である。
本発明で用いられる止血性蛋白質には、薬学的に許容しうる添加剤を加えてもよい。そのような添加剤の例として、血液凝固第ＸＩＩＩ因子、アルブミン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、界面活性剤、塩化ナトリウム、糖アルコール（グリセロール、マンニトール等）、トレハロース、クエン酸ナトリウム、アプロチニンおよび塩化カルシウムからなる群から選択される一種以上が挙げられる。
本発明で用いられる止血性蛋白質又は止血性蛋白質と添加剤との混合物は、基材ポリマーにそれぞれ分子として分散して存在してもよいが、それぞれ分子が集まった粒子（以下添加剤との混合粒子を含めて「蛋白質粒子」と記載する場合がある。）として基材ポリマー中に分散して存在することが好ましい。このことにより、止血性蛋白質の溶出性や、シート成形体が繊維状成形体の場合にはシートの柔軟性などを向上できる場合がある。
本発明において、含有される蛋白質粒子の平均粒子径は０．１〜２００μｍである。粒子径が０．１μｍよりも小さい粒子を作製することは技術的に困難である。また２００μｍよりも大きいと、得られるシート成形体が脆弱化し、取り扱いが困難になるため好ましくない。好ましくは０．５から１５０μｍ、さらに好ましくは１〜１００μｍである。
本発明のシート成形体は、繊維成形体の場合、蛋白質含有粒子を基材ポリマーに対して、通常１〜２００重量％、好ましくは１０〜１００重量％、より好ましくは２０〜１００重量％、さらに好ましくは５０〜１００重量％含有する。これらよりも少ないと、シート成形体からの蛋白質の溶出性、シート成形体の柔軟性または止血性が不良となる場合があり、また多いとシート成形体自体の自己支持性が低下するため好ましくない。また、フィルム成形体の場合、蛋白質含有粒子を基材ポリマーに対して、通常１００重量％以上、好ましくは５００重量％以上、より好ましくは８００〜９５０重量％含有する。これらより少ないと、止血性が不良となる場合があり、多いとフィルムの成形性が不良となる場合がある。
本発明において用いられる脂肪族ポリエステルとしては、具体的にはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリグリセロールセバシン酸、ポリヒドロキシアルカン酸、ポリブチレンサクシネート、およびこれらの誘導体が例示できる。これらの中でも、好ましくはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、およびそれらの共重合体、ならびにそれらの混合物からなる群から選ばれる。
ここで、ポリ乳酸の共重合体を用いる場合、伸縮性を付与するモノマー成分を含んでいてもよい。ここで伸縮性を付与するモノマー成分とは、カプロラクトンモノマーや、エチレングリコール、１，２−プロピレングリコール、１，３−プロピレングリコール、１，２−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、ポリカプロラクトンジオール、ポリアルキレンカーボネートジオール、ポリエチレングリコールユニットなどの軟質成分が例示できる。これらの軟質成分は少ないほうが好ましく、ポリマーユニットあたり５０ｍｏｌ％未満であることが好ましい。これよりも軟質成分が多いと自己支持性を失いやすく、やわらかすぎて取り扱いにくい。
ポリ乳酸またはその共重合体を用いる場合、ポリマーを構成するモノマーにはＬ−乳酸、Ｄ−乳酸があるが、特に制限はない。またポリマーの光学純度や分子量、Ｌ体とＤ体の組成比や配列には特に制限はないが、好ましくはＬ体の多いポリマーであり、ポリＬ乳酸とポリＤ乳酸のステレオコンプレックスを用いてもよい。また、ポリマーの分子量としては、通常１×１０３〜５×１０６であり、好ましくは１×１０４〜１×１０６、より好ましくは５×１０４〜５×１０５である。また、ポリマーの末端構造やポリマーを重合する触媒は任意に選択できる。
本発明に用いられる水溶性ポリマーとしては、例えばＮ−ビニル環状ラクタム単位を有するポリマーおよび水溶性セルロース誘導体を好ましいものとして挙げることができる。
Ｎ−ビニル環状ラクタム単位を有するポリマーとしては、例えばＮ−ビニルピロリドンやＮ−ビニルカプロラクタム類を重合あるいは共重合させて得られるホモポリマーあるいはコポリマーが挙げられる。このようなホモポリマーとしては、具体的には、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ（Ｎ−ビニル−５−メチル−２−ピロリドン）、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピペリドン）、ポリ（Ｎ−ビニル−６−メチル−２−ピペリドン）、ポリ（Ｎ−ビニル−ε−カプロラクタム）、ポリ（Ｎ−ビニル−７−メチル−ε−カプロラクタム）等が挙げられる。
また、前記コポリマーとしては、具体的には、Ｎ−ビニルピロリドンやＮ−ビニルカプロラクタム等を、例えば酢酸ビニル、（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸、マレイン酸エステル、マレイン酸、アクリロニトリル、スチレン、アルキルビニルエーテル、Ｎ−ビニルイミダゾール、ビニルピリジン、アリルアルコール、オレフィン類等と共重合させて得られるコポリマーが挙げられる。なお、前記エステルとしては、炭素数１〜２０のアルキルエステル、ジメチルアミノアルキルエステルおよびその四級塩、ヒドロキシアルキルエステル等が挙げられる。このような基幹ポリマーは、一種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。製造のしやすさや、入手のしやすさからポリビニルピロリドンが最も好ましい。
本発明において使用されるＮ−ビニル環状ラクタム単位を有するポリマーの平均分子量としては、特に限定されるものではないが、通常１×１０３〜５×１０６であり、好ましくは１×１０４〜１×１０６、より好ましくは５×１０４〜５×１０５である。また、ポリマーの末端構造やポリマーを重合する触媒は任意に選択できる。
また、水溶性セルロース誘導体は、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウム  カルボキシメチルセルロース、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
これらの中でも、好ましくはヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびそれらの混合物からなる群から選択され、最も好ましくはヒドロキシプロピルセルロースである。
また、本発明で用いられる水溶性セルロース誘導体の分子量としては、特に限定されないが、例えば濃度２％、２０℃で粘度測定を行った場合、通常１〜１００００ｍＰａ・ｓであり、好ましくは２〜５０００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは２〜４０００ｍＰａ・ｓである。
本発明のシート成形体においては、その目的を損なわない範囲で、他のポリマーや他の化合物を併用してもよい。例えばポリマー共重合、ポリマーブレンド、化合物混合である。化合物混合の例として、具体的にはリン脂質、界面活性剤等が挙げられる。
本発明で用いられるポリマーは高純度であることが好ましく、とりわけポリマー中に含まれる添加剤や可塑剤、残存触媒、残存物モノマー、成形加工や後加工に用いた残留溶媒などの残留物は少ないほうが好ましい。特に医療に用いる場合は、安全性の基準未満に抑える必要がある。
本発明のシート成形体の平均厚みは、繊維成形体の場合、通常１０〜１０００μｍ、好ましくは５０〜２００μｍ、より好ましくは１００〜１５０μｍである。これらよりも小さいと、シート成形体の強度が保てなくなり、トリミングすることができず好ましくなく、大きいと、シート成形体の柔軟性および／または止血性が低下するため好ましくない。シート成形体が、フィルム成形体の場合、その平均厚みは、通常５〜２００μｍ、好ましくは１０〜１００μｍである。
本発明のシート成形体がフィブリノゲンを含む場合、フィブリノゲンを０．０５〜３０ｍｇ／ｃｍ２の範囲で含むことが好ましい。フィブリノゲンの含有量が０．０５ｍｇ／ｃｍ２より少ないと蛋白質の特性に基づく効果を示さず、３０ｍｇ／ｃｍ２よりも多いと、繊維成形体自体が脆弱になり好ましくない。好ましい含有量は０．１〜２５ｍｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは０．２〜２５ｍｇ／ｃｍ２である。また、特にシート成形体がフィルム成形体の場合には、止血性の観点でフィブリノゲン含量は２ｍｇ／ｃｍ２以下、好ましくは１．５ｍｇ／ｃｍ２以下、さらに好ましくは１．４ｍｇ／ｃｍ２以下である。
本発明のシート成形体がトロンビンを含む場合、その含有量は０．１〜１００Ｕ／ｃｍ２の範囲が好ましい。トロンビンの含有量が０．１Ｕ／ｃｍ２より少ないと止血効果を示さず、１００Ｕ／ｃｍ２よりも多いと、シート成形体自体が脆弱になり好ましくない。好ましい含有量は２〜８０Ｕ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは５〜５０Ｕ／ｃｍ２である。
本発明で、繊維成形体とは、得られた一本または複数本の繊維が積層され、織り、編まれ、もしくはその他の手法により形成された３次元の成形体をいう。具体的な繊維成形体の形態としては、例えば不織布が挙げられる。さらに、それをもとに加工したチューブ、メッシュなども繊維成形体に含まれる。
本発明のシート成形体が繊維成形体である場合、好ましい平均繊維径は０．０１〜５０μｍである。平均繊維径が０．０１μｍよりも小さいと、繊維成形体の強度が保てないため好ましくない。また平均繊維径が５０μｍよりも大きいと、繊維の比表面積が小さくなるため止血性蛋白質の溶解性が悪くなり好ましくない。さらに好ましくは平均繊維径が０．０２〜３０μｍである。なお、繊維径とは繊維断面の直径を表す。繊維断面の形状は円形に限らず、楕円形や異形になることもありうる。この場合の繊維径とは、該楕円形の長軸方向の長さと短軸方向の長さの平均をその繊維径として算出する。また、繊維断面が円形でも楕円形でもないときには円または楕円に近似して繊維径を算出する。
本発明のシート成形体が繊維成形体である場合、その目付は０．１〜５０ｍｇ／ｃｍ２が好ましい。目付が０．１ｍｇ／ｃｍ２よりも小さいと止血性蛋白質を十分に担持できないため好ましくない。また、目付が５０ｍｇ／ｃｍ２よりも大きいと、炎症を引き起こす可能性が高くなるため好ましくない。さらに好ましくは０．２〜２０ｍｇ／ｃｍ２である。
本発明のシート成形体が繊維成形体である場合、その嵩密度は１００〜２００ｍｇ／ｃｍ３が好ましい。嵩密度が１００ｍｇ／ｃｍ３よりも小さいとハンドリング性が低下するため好ましくない。また嵩密度が２００ｍｇ／ｃｍ３よりも大きいと、繊維成形体の空隙が少なくなり、柔軟性および止血性蛋白質の溶出性が低下するため好ましくない。
本発明のシート成形体が繊維成形体である場合は、その製法は、プラスチック繊維の製造に採用されているいずれの方法も採用でき特に制限されないが、止血性蛋白質の活性低下を防ぐため、止血性蛋白質または止血性蛋白質含有粒子を容易に分散させるべく溶液成形によって行うことが好ましい。また、繊維成形体は長繊維であることが好ましい。長繊維とは、具体的には紡糸から繊維成形体への加工に至る工程の中で、繊維を切断する工程を加えずに形成される繊維成形体をいい、エレクトロスピニング法、スパンボンド法、メルトブロー法などで形成することができるが、エレクトロスピニング法が好ましく用いられる。
エレクトロスピニング法は、ポリマーを溶媒に溶解させた溶液に高電圧を印加することで、電極上に繊維成形体を得る方法である。工程としては、高分子を溶媒に溶解させて溶液を製造する工程と、該溶液に高電圧を印加する工程と、該溶液を噴出させる工程と、噴出させた溶液から溶媒を蒸発させて繊維成形体を形成させる工程と、任意に実施しうる工程として形成された繊維成形体の電荷を消失させる工程と、電荷消失によって繊維成形体を累積させる工程を含む。
エレクトロスピニング法における、紡糸液を製造する段階について説明する。本発明における紡糸液は、基材ポリマー溶液と止血性蛋白質粒子からなる懸濁液を使用することが好ましい。
懸濁液における基材ポリマーの濃度は１〜３０重量％であることが好ましい。ポリマーの濃度が１重量％より低いと、繊維成形体を形成することが困難となり好ましくない。また、３０重量％より高いと、得られる繊維成形体の繊維径が大きくなり、また懸濁液の粘度が高くなり好ましくない。より好ましい懸濁液におけるポリマーの濃度は１．５〜２０重量％である。
水溶性ポリマーの溶媒は、水溶性ポリマーを溶解可能で、かつ止血性蛋白質粒子と懸濁液を形成し、紡糸する段階で蒸発し、繊維を形成可能なものであれば特に限定されず、一種を単独で用いても複数の溶媒を組み合わせてもよい。例えば、クロロホルム、２−プロパノール、トルエン、ベンゼン、ベンジルアルコール、ジクロロメタン、四塩化炭素、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、トリクロロエタン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、アセトン、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、１−プロパノール、フェノール、ピリジン、酢酸、蟻酸、ヘキサフルオロ−２−プロパノール、ヘキサフルオロアセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド、１，３−ジオキソラン、水、およびこれらの溶媒の混合溶媒が挙げられる。これらのうちでも、取り扱い性や物性などから、ジクロロメタン、クロロホルム、２−プロパノール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いることが好ましい。
脂肪族ポリエステルを溶解する溶媒としては、脂肪族ポリエステルを溶解可能で、かつ止血性蛋白質粒子と懸濁液を形成し、かつ紡糸する段階で蒸発し、繊維を形成可能なものであれば特に限定されず、一種を単独で用いても複数の溶媒を組み合わせてもよい。例えばクロロホルム、２−プロパノール、トルエン、ベンゼン、ベンジルアルコール、ジクロロメタン、四塩化炭素、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、トリクロロエタン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、およびこれらの混合溶媒が挙げられる。また、エマルションを形成する範囲内においてアセトン、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、１−プロパノール、フェノール、ピリジン、酢酸、蟻酸、ヘキサフルオロ−２−プロパノール、ヘキサフルオロアセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド、１，３−ジオキソラン等の溶媒を含んでいてもよい。これらの中でも、取り扱い性や物性から、ジクロロメタン、エタノールを用いることが好ましい。
かかる懸濁液を調製する方法としては、特に限定されないが、超音波や各種攪拌方法を用いることができる。攪拌方法としては、ホモジナイザーのような高速攪拌やアトライター、ボールミル等の攪拌方法も使用することができる。なかでも超音波処理による分散方法が好ましい。
また、溶媒と止血性蛋白質粒子とで懸濁液を形成した後、水溶性ポリマーまたは脂肪族ポリエステルを添加して紡糸液を調製することも可能である。
また、懸濁液を調製する前に止血性蛋白質粒子を微細処理することができる。微細処理としては、乾式粉砕と湿式粉砕とがあり、本発明においてはいずれの方式も採用することができ、両者を組み合わせることもできる。乾式粉砕処理としては、ボールミルを用いた処理、遊星ミルや振動ミルを用いた処理、乳鉢を用い乳棒によりすり潰す処理、媒体攪拌型粉砕機、ハンマーミル等の衝撃式粉砕機、ジェットミル、石臼を用いてすりつぶす処理等が挙げられる。一方、湿式粉砕処理としては、適当な分散媒に止血性蛋白質を分散させた状態で、高い剪断力の攪拌装置、混練装置等により攪拌する処理や、媒体中に分散した状態でのボールミル、ビーズミル処理等が挙げられる。さらには、スプレードライヤーにより作製した止血性蛋白質粒子を使用することもできる。
次に、溶液に高電圧を印加する段階と、溶液を噴出させる段階と、噴出された溶液から溶媒を蒸発させて繊維成形体を形成させる段階について説明する。
本発明の繊維成形体の製造方法においては、ポリマー溶液と止血性蛋白質粒子からなる懸濁液を噴出させ、繊維成形体を形成させるために、懸濁液に高電圧を印加する必要がある。電圧を印加する方法については、懸濁液を噴出させ、繊維成形体が形成されるものであれば特に限定されないが、溶液に電極を挿入して電圧を印加する方法や、溶液噴出ノズルに対して電圧を印加する方法などがある。
また、溶液に印加する電極とは別に補助電極を設けることも可能である。また、印加電圧の値については、前記繊維成形体が形成されれば特に限定されないが、通常は５〜５０ｋＶの範囲が好ましい。印加電圧が５ｋＶより小さい場合は、紡糸液が噴出されずに繊維成形体が形成されないため好ましくなく、印加電圧が５０ｋＶより大きい場合は、電極からアース電極に向かって放電が起きるために好ましくない。より好ましくは１０〜３０ｋＶの範囲である。所望の電位は任意の適切な方法で作ればよい。
こうすることで、ポリマー溶液と止血性蛋白質粒子からなる懸濁液を噴出させた直後に使用した溶媒が揮発して繊維成形体が形成される。通常の紡糸は大気下、室温で行われるが、揮発が不十分である場合には陰圧下で行うことや、高温の雰囲気下で行うことも可能である。また、紡糸する温度は溶媒の蒸発挙動や紡糸液の粘度に依存するが、通常は０〜５０℃の範囲である。
次に、形成された繊維成形体の電荷を消失させ累積させる段階について説明する。繊維成形体の電荷を消失させ累積させる方法は特に限定はされないが、繊維成形体をアース電極に捕集することで電荷を消失させ、同時に累積させる方法が挙げられる。他にイオナイザー等により累積前に電荷を消失させる方法も挙げられる。この場合、繊維成形体を累積させる方法は、特に限定はされないが、通常の方法として、電荷消失により繊維成形体の静電力を失わせ、自重により落下、累積させる方法が挙げられる。また必要に応じて、静電力を消失させた繊維成形体を吸引してメッシュ上に累積させる方法、装置内の空気を対流させてメッシュ上に累積させる方法などを行ってもよい。なお、イオナイザーとは、内蔵のイオン発生装置によりイオンを発生させ、イオンを帯電物に放出させることにより帯電物の電荷を消失させうる装置である。本発明の繊維成形体の製造方法で用いられうるイオナイザーを構成する好ましいイオン発生装置として、内蔵の放電針に高電圧を印加することによりイオンを発生する装置が挙げられる。
かかるエレクトロスピニング法は公知であり、本発明の繊維成形体が調製できる限り、その装置や条件は限定されないが、後述する実施例のほか、例えば国際公開ＷＯ２００４／０７２３３６号明細書や国際公開２００５／０８７９８８号明細書の記載を参考にすることができる。
本発明のシート成形体がフィルム成形体である場合、その製法は、従来からフィルムの製法として採用されているいずれの方法でも製造できる。例えば流延法（キャスト法）を挙げることができる。こうした成形は、溶融成形によって行っても、溶液成形によって行ってもよいが、止血性蛋白質の活性低下を防ぐため、止血性蛋白質を容易に分散させるべく溶液成形を行うことが好ましい。
次に、本発明の積層シート成形体について説明する。
本発明の積層シート成形体は、フィブリノゲンと水溶性ポリマーを含有してなる第１ポリマー組成物層およびトロンビンと脂肪族ポリエステルを含有してなる第２ポリマー組成物層を含有してなる。
水溶性ポリマーは、セルロース誘導体、Ｎ−ビニル環状ラクタム単位を有するポリマー、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、デキストラン、プルランまたはデンプンあるいはこれらの混合物から選ばれる。
水溶性ポリマーは、セルロース誘導体もしくはＮ−ビニル環状ラクタム単位を有するポリマー、またはこれらの混合物であることが好ましい。
セルロース誘導体は、具体的にはヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびナトリウム  カルボキシメチルセルロース、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
これらの中でも、好ましくはヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、およびそれらの混合物からなる群から選択され、最も好ましくはヒドロキシプロピルセルロースまたはポリビニルピロリドンである。
また、水溶性ポリマーがＮ−ビニル環状ラクタム単位を有するポリマーである場合の平均分子量は特に限定されるものではないが、１×１０３〜５×１０６であり、好ましくは１×１０４〜１×１０６、より好ましくは５×１０４〜５×１０５である。また、ポリマーの末端構造やポリマーを重合する触媒は任意に選択できる。
また、水溶性ポリマーがセルロース誘導体である場合は、濃度２％、２０℃で粘度測定を行った場合、好ましくは０．０１〜１００００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは０．１〜５０００ｍＰａ・ｓ、さらに好ましくは０．１〜１０００ｍＰａ・ｓ、最も好ましくは０．１〜１００ｍＰａ・ｓの範囲内のものである。
水溶性ポリマーには、その目的を損なわない範囲で、他のポリマーや他の化合物を併用してもよい。例えば、ポリマー共重合、ポリマーブレンド、化合物混合である。
かかる水溶性ポリマーは高純度であることが好ましく、とりわけポリマー中に含まれる可塑剤、残存触媒、残存モノマー、成形加工や後加工に用いた残留溶媒などの残留物は、少ないほうが好ましい。特に、医療に用いる場合は、安全性の基準値未満に抑える必要がある。
また、水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層は、薬学的に許容しうる添加剤をさらに含んでいてもよい。そのような添加剤の例としては、前記シート成形体の説明で記載したものと同じものを挙げることができる。特にフィブリノゲンが平均粒子径０．０１〜１００μｍの粒子である場合、これらの添加剤は、該粒子中に添加されていることが好ましい。
脂肪族ポリエステルとしては、前記シート成形体の説明に記載したものが同様に用いられる。
なお、脂肪族ポリエステルには、その目的を損なわない範囲で、他のポリマーや他の化合物を併用してもよい。例えば、ポリマー共重合、ポリマーブレンド、化合物の混合である。
かかる脂肪族ポリエステルは高純度であることが好ましく、とりわけポリマー中に含まれる添加剤や可塑剤、残存触媒、残存モノマー、成形加工や後加工に用いた残留溶媒などの残留物は少ないほうが好ましい。特に、医療に用いる場合は、安全性の基準値未満に抑える必要がある。
また、脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層は、薬学的に許容しうる添加剤をさらに含んでいてもよい。そのような添加剤の例として、多価アルコール、界面活性剤、アミノ酸、少糖、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、および塩化カルシウムからなる群から選択される一種以上が挙げられる。これにより、トロンビンの安定性、溶解性、柔軟性などを向上できる場合がある。
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる第１ポリマー組成物層は、繊維成形体またはフィルムからなることが好ましい。繊維成形体とは、得られた一本または複数本の繊維が積層され、織り、編まれ、もしくはその他の手法により形成された３次元の成形体をいう。具体的な繊維成形体の形態としては、例えば不織布が挙げられる。さらに、それをもとに加工したチューブ、メッシュなども繊維成形体に含まれる。
フィルムは従来から採用されているいずれの方法でも製造できる。例えば流延法（キャスト法）を挙げることができる。こうした成形は、溶融成形によって行っても、溶液成形によって行ってもよいが、止血性蛋白質の活性低下を防ぐため、止血性蛋白質を容易に分散させるべく溶液成形を行うことが好ましい。
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる繊維成形体の平均繊維径は０．０１〜５０μｍである。平均繊維径が、０．０１μｍよりも小さいと、繊維成形体の強度が保てないため好ましくない。また平均繊維径が５０μｍよりも大きいと、繊維の比表面積が小さくなるため溶解性が悪くなり、好ましくない。さらに好ましくは、平均繊維径が０．０２〜３０μｍである。なお、繊維径とは繊維断面の直径を表す。繊維断面の形状は円形に限らず、楕円形や異形になることもありうる。この場合の繊維径とは、該楕円形の長軸方向の長さと短軸方向の長さの平均をその繊維径として算出する。また、繊維断面が円形でも楕円形でもないときには円または楕円に近似して繊維径を算出する。
本発明の積層シート成形体の平均厚みは、好ましくは５０〜３５０μｍ、より好ましくは１００〜３００μｍ、さらに好ましくは１００〜２５０μｍである。
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる繊維成形体の目付は０．１〜５０ｍｇ／ｃｍ２であることが好ましい。目付が０．１ｍｇ／ｃｍ２よりも小さいと、フィブリノゲンを十分に担持できないため好ましくない。また目付が５０ｍｇ／ｃｍ２よりも大きいと、炎症を引き起こす可能性が高くなるため好ましくない。
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる繊維成形体の嵩密度は１００〜２００ｍｇ／ｃｍ３であることが好ましい。嵩密度が１００ｍｇ／ｃｍ３よりも小さいと、ハンドリング性が低下するため好ましくない。また嵩密度が２００ｍｇ／ｃｍ３よりも大きいと、繊維成形体の空隙が低くなり、柔軟性および溶解性が低下するため好ましくない。
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる繊維成形体は、フィブリノゲンを通常０．０５〜３０ｍｇ／ｃｍ２の範囲で含んでいる。フィブリノゲンの含有量が０．０５ｍｇ／ｃｍ２より少ないと止血効果を示さず、３０ｍｇ／ｃｍ２よりも多いと繊維成形体自体が脆弱になり好ましくない。好ましい含有量は０．１〜２５ｍｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは、０．２〜２５ｍｇ／ｃｍ２である。また、特にシート成形体がフィルム成形体の場合には、止血性の観点でフィブリノゲン含量は２ｍｇ／ｃｍ２以下、好ましくは１．５ｍｇ／ｃｍ２以下、さらに好ましくは１．４ｍｇ／ｃｍ２以下である。
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる繊維成形体は長繊維よりなることが好ましい。長繊維とは、具体的には紡糸から繊維成形体への加工に至る工程の中で、繊維を切断する工程を加えずに形成される繊維成形体のことをいい、エレクトロスピニング法、スパンボンド法、メルトブロー法などで形成することができるが、エレクトロスピニング法が好ましく用いられる。
エレクトロスピニング法は、前記シート成形体の説明において記載した水溶性ポリマーとフィブリノゲン粉末を混合し懸濁液を調製したとき、フィブリノゲン粉末のサイズは、０．０１〜１００μｍの範囲にあることが好ましい。０．０１μｍよりも小さいフィブリノゲン粉末を作製することは技術的に困難であり、１００μｍよりも大きいと分散性が悪く、繊維成形体が脆弱となり好ましくはない。
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるフィルムは従来から採用されているいずれの方法でも製造できる。例えば流延法（キャスト法）を挙げることができる。こうした成形は、溶融成形によって行っても、溶液成形によって行ってもよいが、止血性蛋白質の活性低下を防ぐため、止血性蛋白質を容易に分散させるべく溶液成形を行うことが好ましい。
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるフィルム中の水溶性ポリマーの含量は、ポリマーの種類にもよるが、０．１〜５０重量％であることが好ましく、さらに好ましくは０．５〜２０重量％である。また、フィブリノゲンの蛋白質粒子は、水溶性ポリマーに対して、ポリマーの種類にもよるが、通常１００重量％以上、好ましくは５００重量％以上、より好ましくは８００〜９５０重量％含有する。これらより少ないと、止血性が不良となる場合があり、多いとフィルムの成形性が不良となる場合がある。
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるフィルムの平均厚みは１０〜１０００μｍであることが好ましい。
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるフィルムは、フィブリノゲンを好ましくは０．０５〜１０ｍｇ／ｃｍ２の範囲で含んでいる。０．０５ｍｇ／ｃｍ２より少ないと止血効果を示し難く、１０ｍｇ／ｃｍ２よりも多いとフィルム自体が脆弱になり好ましくない。より好ましい含有量は０．１〜８ｍｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは、０．２〜４ｍｇ／ｃｍ２である。
本発明において、脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる第２ポリマー組成物層は、繊維成形体からなることが好ましい。なお、繊維成形体の定義については前記した。
脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる繊維成形体の平均繊維径は０．０１〜５０μｍである。平均繊維径が、０．０１μｍよりも小さいと、繊維成形体の強度が保てないため好ましくない。また平均繊維径が５０μｍよりも大きいと、繊維の比表面積が小さくなるためトロンビンの放出性が悪くなり好ましくない。さらに好ましくは、平均繊維径が０．０２〜３０μｍである。
脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる繊維成形体の平均厚みは１０〜１０００μｍである。平均厚みが、１０μｍよりも小さいと、繊維成形体の強度が保てなくなりトリミングすることができず好ましくない。また平均厚みが１０００μｍよりも大きいと、繊維成形体の柔軟性が低下するため好ましくない。さらに好ましくは、平均厚みが２０〜５００μｍである。
脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる繊維成形体の目付は０．１〜５０ｍｇ／ｃｍ２である。目付が０．１ｍｇ／ｃｍ２よりも小さいと、トロンビンを十分に担持できないため好ましくない。また目付が５０ｍｇ／ｃｍ２よりも大きいと、炎症を引き起こす可能性が高くなるため好ましくない。さらに好ましくは０．２〜２０ｍｇ／ｃｍ２である。
脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる繊維成形体の嵩密度は１００〜２００ｍｇ／ｃｍ３である。嵩密度が１００ｍｇ／ｃｍ３よりも小さいと、ハンドリング性が低下するため好ましくない。また嵩密度が２００ｍｇ／ｃｍ３よりも大きいと、繊維成形体の空隙が低くなり、柔軟性およびトロンビンの放出能が低下するため好ましくない。
本発明において、脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる繊維成形体は、トロンビンを０．１〜１００Ｕ／ｃｍ２含んでいることが好ましい。トロンビンの含有量が０．１Ｕ／ｃｍ２より少ないと止血効果が不十分であり好ましくない。１００Ｕ／ｃｍ２より多いと繊維成形体自体が脆弱になり好ましくない。好ましい含有量は２〜８０Ｕ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは５〜５０Ｕ／ｃｍ２である。また、トロンビンの蛋白質含有粒子は、脂肪族ポリエステルに対して、通常１〜２００重量％、好ましくは１０〜１００重量％、より好ましくは２０〜１００重量％、さらに好ましくは５０〜１００重量％含有する。これらよりも少ないと、トロンビンの溶出性、シート成形体の柔軟性または止血性が不良となる場合があり、また多いとシート成形体の自己支持性が低下するため好ましくない。
脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる繊維成形体は長繊維よりなることが好ましい。長繊維の意味およびその製造法については前述のとおりである。
かかる脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる繊維成形体はエレクトロスピニング法で製造することができる。エレクトロスピニング法は前記シート成形体の説明において記載した。脂肪族ポリエステルとトロンビン粉末を混合して懸濁液を調製したとき、トロンビン粉末のサイズは特に限定されるものではないが、０．０１〜１００μｍの範囲にあることが好ましい。０．０１μｍよりも小さいトロンビン粉末を作製することは技術的に困難であり、１００μｍよりも大きいと分散性が悪く、繊維成形体が脆弱となり好ましくない。
本発明のシート成形体の表面または積層シート成形体における各層の表面に、さらに綿状の繊維構造物を積層することや、綿状構造物を本発明の積層シート成形体ではさんでサンドイッチ構造にするなどの加工は、本発明の目的を損ねない範囲で任意に実施しうる。
本発明のシート成形体および積層シート成形体における繊維成形体の繊維内部にも任意に薬剤を含ませることができる。エレクトロスピニング法で成形する場合は、有機溶媒もしくは水溶液に可溶であり、溶解によりその生理活性を損なわないものであれば、使用する薬剤に特に制限はない。
本発明の積層シート成形体は、１層以上の水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる第１ポリマー組成物層と、１層以上の脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる第２ポリマー組成物層を含むが、これら以外の層が設けられていてもよい。また、これら各層を積層する順は問わず、同種の層が隣接している部分があってもよい。
本発明の積層シート成形体は、水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる第１ポリマー組成物層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる第２ポリマー組成物層を各々重ねたものでもよく、形成されたいずれかの層に、通常のコーティング方法により積層することもできる。かかるコーティングの方法として、特に制限されるものではないが、エレクトロスピニング、エレクトロスプレー、キャスティング、浸漬、噴射、プレス、熱プレスなどの方法が挙げられる。なかでも、繊維成形体からなる層の上に繊維成形体からなる層を積層する方法としては、エレクトロスピニング法が好ましい。水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる繊維成形体に脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる繊維成形体を積層しても、脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる繊維成形体に水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる繊維成形体を積層してもよい。
本発明の積層シート成形体を止血材として創傷部位に適用する際、水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層が創傷部位に接触するように適用することが好ましい。そうすることで、水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層が創傷部位に接触するやいなや水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層が溶解し、創傷部位にフィブリノゲンが十分に浸透し、ついで脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層よりトロンビンが直ちに放出されることでフィブリン生成に伴う凝固反応が進行する。なお、脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層の脂肪族ポリエステルは、圧迫止血に必要な補強材として機能した後、時間をかけて分解される。
本発明のシート成形体および積層シート成形体は薄く、かつ柔軟性に優れるため創傷部位との密着性がよい。また、本発明のシート成形体および積層シート成形体は、繊維成形体などに有効成分であるフィブリノゲンおよび／またはトロンビンが含有されているため、凍結乾燥品と異なって担持性に優れる。その一方、フィブリノゲンの溶解性ならびにトロンビンの放出性およびフィブリノゲン層への溶出性にも優れるため、短時間での止血効果が発現する。また、短時間での止血効果発現のために必要なフィブリノゲン量が少なく、コスト面でも優れる。また、本発明のシート成形体は、使用する材料を選択することにより、創傷部位に適用後の創傷部位の視認性に優れるものとなる。これにより、これまでの製品では困難であった止血状態が視覚的に確認でき、縫合が必要な場合に縫合すべき部位が容易に特定できる。さらに、本発明のシート成形体および積層シート成形体を製造するのに凍結乾燥工程を必要としないため、生産性にも優れている。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例により本発明の実施の形態を説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
＜実施例１〜６および１６〜２９、比較例１、２についての測定法＞
１Ａ．蛋白質粒子粒子径（平均粒子径）：
フィブリノゲン凍結乾燥粉末を乳鉢で粉砕したものを、デジタルマイクロスコープ（キーエンス株式会社：商品名「ＶＨＸ−１００」）により、倍率１０００倍で撮影して得た写真から無作為に１０個の粒子を選んで直径を測定し、平均値を平均粒子径とした。
２Ａ．平均繊維径：
得られた繊維成形体の表面を走査型電子顕微鏡（キーエンス株式会社：商品名「ＶＥ８８００」）により、倍率３０００倍で撮影して得た写真から無作為に２０箇所を選んで繊維の径を測定し、すべての繊維径の平均値を求めて平均繊維径とした。ｎ＝２０である。
３Ａ．平均厚み：
得られた繊維成形体を高精度デジタル測長機（株式会社ミツトヨ：商品名「ライトマチックＶＬ−５０」）を用いて測定力０．０１Ｎによりｎ＝１５にて繊維成形体の膜厚を測定した平均値を算出した。なお、本測定においては測定機器が使用可能な最小の測定力で測定を行った。
４Ａ．目付：
得られた繊維成形体を、５０ｍｍ×１００ｍｍにカットし、その重量を測定し、換算することで目付けを算出した。
５Ａ．嵩密度
上記測定した目付と平均厚みの値から嵩密度を算出した。
６Ａ．溶解テスト：得られた繊維成形体を、１ｃｍ×１ｃｍにカットし、生理食塩水１５μＬを添加し、溶解性を確認した。
７Ａ．ＥＬＩＳＡ測定
（１）フィブリノゲン
ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ  ４６８６６７）に抗ヒトフィブリノゲン抗体（ＤＡＫＯ  Ａ００８０）を１０μｇ／ｍＬで固定化した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカルＵＫ−Ｂ８０）を各ウェルに添加し、マスキングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、検体を添加した。標準品としてヒトフィブリノゲン（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｎｏ．ＦＩＢ３）を用い、検量線を作成した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒトフィブリノゲン抗体（ＣＰＬ５５２３）を添加し、反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、ＴＭＢ試薬（ＫＰＬ  ５０−７６−０２  ５０−６５−０２）を添加し、６分間静置して発色させた。１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を加え、発色を停止し、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０−６５０ｎｍを測定した。
（２）トロンビン
ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ  ４６８６６７）に抗ヒトトロンビン抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、Ｎｏ．ＳＡＨＴ−ＡＰ）を５μｇ／ｍＬで固定化した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル  ＵＫ−Ｂ８０）を各ウェルに添加し、マスキングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、検体を添加する。標準品としてヒトトロンビン（ヘマトロジックテクノロジー社：ＨＣＴ−００２０）を用い、検量線を作成した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒトトロンビン抗体（（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、Ｎｏ．ＳＡＨＴ−ＨＲＰ）を０．１μｇ／ｍＬで添加した。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、ＴＭＢ試薬（ＤａＫｏＳ１５９９）を添加し、１０分間静置して発色させた。０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加え、発色を停止し、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０−６５０ｎｍを測定した。
８Ａ．トロンビン活性測定
ファルコン社製２００８チューブに試料２０μＬと５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．５）＋５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファー６０μＬ、０．１％  ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８を２０μＬ加え、３７℃で３分インキュベーションした。標準品としてヒトプラズマ由来精製α―トロンビン（ヘマトロジックテクノロジー社から購入：ＨＣＴ−００２０）を同バッファーで５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５Ｕ／ｍＬに希釈したものを用いた。その反応液にテストチーム発色基質Ｓ−２２３８（１ｍＭ：第一化学薬品工業）を１００μＬ添加して攪拌混合し、３７℃で５分間の反応後、０．１Ｍクエン酸溶液を８００μＬ加えて反応を停止した。反応液２００μＬを９６ウェルプレートに移し、ＯＤ４０５／６５０を測定した。
実施例１
フィブリノゲン凍結乾燥粉末（ボルヒール（登録商標、以下同じ）組織接着用：バイアル１）を乳鉢で粉砕し、平均粒子径が１４μｍの粉砕フィブリノゲン凍結乾燥粉末を作製した。エタノールにこの粉砕したフィブリノゲン凍結乾燥粉末を分散させた後、１０ｗｔ％になるようにポリビニルピロリドン（Ｋ９０  和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ポリビニルピロリドン＝１００／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１３．５ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は１５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は０．５１μｍ、平均厚みは２８５μｍ、目付は２．３５ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は８２ｍｇ／ｃｍ３であった。得られた繊維成形体の溶解テストを実施したところ、１秒以内に溶解した。また、得られたシートを０．５ｃｍ×０．５ｃｍに切断して、６２．５μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果、固定化蛋白質量は０．５４ｍｇ／ｃｍ２であった。得られたシートはハサミでトリミングが可能であった。
実施例２
エタノールに実施例１で粉砕したフィブリノゲン凍結乾燥粉末を分散させた後、１０ｗｔ％になるようにポリビニルピロリドン（Ｋ９０  和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ポリビニルピロリドン＝１００／２００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１７ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は１５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は０．３３μｍ、平均厚みは４６９μｍ、目付は５．２８ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１１３ｍｇ／ｃｍ３であった。得られた繊維成形体の溶解テストを実施したところ、１秒以内に溶解した。また、得られたシートを０．５ｃｍ×０．５ｃｍに切断し、６２．５μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果、固定化蛋白質量は１．６１ｍｇ／ｃｍ２であった。得られたシートはハサミでトリミングが可能であった。
実施例３
２−プロパノールに実施例１で粉砕したフィブリノゲン凍結乾燥粉末を分散させた後、１６ｗｔ％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（６−１０ｍＰａ・ｓ  和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース＝２０／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１１ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は１５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は０．８６μｍ、平均厚みは１３７μｍ、目付は１．５９ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１１６ｍｇ／ｃｍ３であった。得られた繊維成形体の溶解テストを実施したところ１秒以内に溶解した。また、得られたシートを０．５ｃｍ×０．５ｃｍに切断し、６２．５μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果、固定化蛋白質量は０．１７ｍｇ／ｃｍ２であった。得られたシートはハサミでトリミングが可能であった。
比較例１
１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール／ＭＩＮＩＭＵＭ  ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＭＥＤＩＵＭ  ＥＡＧＬＥ（シグマアルドリッチ社製）１０×（９／１＝ｖ／ｖ）に実施例１で粉砕したフィブリノゲン凍結乾燥粉末を１５ｗ／ｖ％になるように溶解させた。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は２３．５ｋＶ、紡糸液流量は２．４５ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は１２ｃｍであった。得られた繊維成形体の溶解テストを実施したところ溶解しなかった。
比較例２
フィブリノゲン溶解液にフィブリノゲン凍結乾燥粉末（いずれもボルヒール組織接着用に含まれる）を溶解させた後、１６ｗｔ％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（６−１０ｍＰａ・ｓ  和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース＝２０／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製したが、ヒドロキシプロピルセルロースとフィブリノゲンが相分離し、フィブリノゲンが析出し、エレクトロスピニングを行うことができなかった。
実施例４
２−プロパノールに実施例１で粉砕したフィブリノゲン凍結乾燥粉末を分散させた後、１６ｗｔ％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（６−１０ｍＰａ・ｓ  和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース＝４０／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１２．５ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は１５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は０．４３μｍ、平均厚みは１５２μｍ、目付は１．８６ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１２２ｍｇ／ｃｍ３であった。得られた繊維成形体の溶解テストを実施したところ１秒以内に溶解した。また、得られたシートを０．５ｃｍ×０．５ｃｍに切断し、６２．５μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果、固定化蛋白質量は０．３０ｍｇ／ｃｍ２であった。得られたシートはハサミでトリミングが可能であった。
実施例５
２−プロパノールに実施例１で粉砕したフィブリノゲン凍結乾燥粉末を分散させた後、１６ｗｔ％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（６−１０ｍＰａ・ｓ  和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース＝１００／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１２．５ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は１５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は０．３５μｍ、平均厚みは１９１μｍ、目付は２．７４ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１４３ｍｇ／ｃｍ３であった。得られた繊維成形体の溶解テストを実施したところ１秒以内に溶解した。また、得られたシートを０．５ｃｍ×０．５ｃｍに切断し、６２．５μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果、固定化蛋白質量は０．５１ｍｇ／ｃｍ２であった。得られたシートはハサミでトリミングが可能であった。
実施例６
＜脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層の作製＞
エタノールに実施例１と同様に乳鉢で粉砕したトロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０ｗｔ％になるようにポリ乳酸（ＰＬ１８  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、トロンビン凍結乾燥粉末／ポリ乳酸＝１００／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、紡糸液流量は３．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。得られたシートを２ｃｍ×２ｃｍに切断し、１ｍＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性・ＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果、活性測定値は２３Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は１６μｇ／ｃｍ２であった。
＜組織接着効果評価試験＞
フィブリノゲンの活性を確認するために、実施例５で作製した水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と実施例６で作製した脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層の組み合わせで接着試験を行った。接着力はウサギの皮と当該シート（２ｃｍ×２ｃｍ）を接着させ、フィブリンゲルが形成され、接着しているか確認した。この際、重ねたシートには事前に２００μＬの水を水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層に添加し、４０秒経過後に水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層をウサギの皮に貼付した。その後、３７℃で３分間静置後、皮とシートとの接着性を確認した。対照としてフィブリン接着材の成分が固定化されたコラーゲンシート製剤（製品名：タココンブ／ＣＳＬベーリング（株））：フィブリノゲンおよびトロンビン等の成分が、スポンジ状のウマコラーゲンのシートを支持体とし、シートの片面に真空乾燥により固着されたもの：２ｃｍ×２ｃｍ）を使用した。その結果、評価対象のシートは、比較対照のコラーゲンシート製剤以上の接着力を示した。
＜考察＞
比較例１で１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール／ＭＩＮＩＭＵＭ  ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＭＥＤＩＵＭ  ＥＡＧＬＥ  １０×（９／１＝ｖ／ｖ）を用いたのは、フィブリノゲン凍結乾燥粉末からエレクトロスピニング法による繊維成形体製造を可能にするためである。フィブリノゲンは水性溶媒に溶解することが困難なため、このフィブリノゲン凍結乾燥粉末にはフィブリノゲンの溶解性を増すための添加剤が含まれている。この比較例１ではかかるフィブリノゲン凍結乾燥粉末をそのまま用いているにもかかわらず、それを繊維成形体としたとき、そこからのフィブリノゲン溶出はみられなかった。
これに対し、実施例１−５にあるように、フィブリノゲンを平均粒子径０．０１〜１００μｍの粒子とし、その分散液を経てそれを水およびエタノールに溶解性のポリマーに含有させる形態とすることで、１秒以内の溶解が達成されたのである。また、実施例６からは、本発明のシート成形体においては、止血性蛋白質の生理活性は保持されていることがわかる。
一方、比較例２では、国際公開ＷＯ２００９／０３１６２０号に倣い、ボルヒールのフィブリノゲン凍結乾燥粉末をそのフィブリノゲン溶解液に溶解し、それを水溶性セルロース誘導体溶液と混合する方法を試みたが、均一な組成物を得ることができなかった。
＜実施例７〜１３についての測定法＞
１Ｂ．紡糸用ドープ中のフィブリノゲン、トロンビン、およびフィブリンの分散性：
脂肪族ポリエステル添加直前のフィブリノゲン、トロンビン、およびフィブリンの分散液を目視により観察し、これらの蛋白質の分散性を確認した。
２Ｂ．繊維成形体の厚み：１Ａと同じ方法により測定した。
３Ｂ．繊維径（平均繊維径）：２Ａと同じ方法により測定した。
４Ｂ．シートの取り扱い性：
得られた繊維成形体が容易に取り扱い可能であるかを定性的に評価した。
実施例７
フィブリノゲン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル１）を、ジェットミル（株式会社セイシン企業：商品名「超微少量ラボジェットミル」）を用いて微粒化した。これをエタノール（和光純薬（株）製）に添加し、超音波バスによる処理を５分間実施し、分散性に優れたフィブリノゲン分散液を調製した。得られた分散液にジクロロメタン（和光純薬（株）製）とＬ体１００％ポリ乳酸（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＬ１８、Ｐｕｒａｃ社製）を添加してポリ乳酸を溶解し、均一な溶液を調製した。得られた紡糸用ポリ乳酸溶液のポリ乳酸濃度は１０重量％、フィブリノゲン凍結乾燥粉末濃度は４重量％（フィブリノゲンとして１．８重量％）、エタノールとジクロロメタンの比が１：８重量比となるように調製した。ポリ乳酸添加前の蛋白質／有機溶媒分散液を目視観察すると、沈殿がなく均一な分散状態にあることがわかった。得られたポリ乳酸溶液を湿度３０％以下でエレクトロスピニング法により紡糸し、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体の平均繊維径は３．３μｍ、厚さは１６１μｍであり、柔軟かつ取り扱い可能であった。なお、上記エタノールの代わりにジクロロメタンを用いた場合（実施例１４）には得られた繊維成形体の取り扱い性に低下が認められ、この観点ではエタノールがより好ましいものと考えられた。
実施例８
トロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）をエタノール（和光純薬（株）製）に添加し、超音波バスによる処理を５分間実施し、分散性に優れたトロンビン分散液を調製した。得られた分散液にジクロロメタン（和光純薬（株）製）とＬ体１００％ポリ乳酸（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＬ１８、Ｐｕｒａｃ社製）を添加してポリ乳酸を溶解し、均一な溶液を調製した。得られた紡糸用ポリ乳酸溶液のポリ乳酸濃度は１０重量％、トロンビン凍結乾燥粉末濃度は４重量％（トロンビンとして０．０４５重量％）、エタノールとジクロロメタンの比が１：８重量比となるように調製した。ポリ乳酸添加前の蛋白質／有機溶媒分散液を目視観察すると、沈殿がなく均一な分散状態にあることがわかった。得られたポリ乳酸溶液を湿度３０％以下でエレクトロスピニング法により紡糸し、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体の平均繊維径は６．２μｍ、厚さは１７０μｍであり、柔軟かつ取り扱い可能であった。なお、上記エタノールの代わりにジクロロメタンを用いた場合（実施例１５）には得られた繊維成形体の取り扱い性に低下が認められ、この観点ではエタノールがより好ましいものと考えられた。
実施例９
トロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）をエタノール（和光純薬（株）製）に添加し、超音波バスによる処理を５分間実施し、分散性に優れたトロンビン分散液を調製した。得られた分散液にジクロロメタン（和光純薬（株）製）とＬ体１００％ポリ乳酸（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＬ１８、Ｐｕｒａｃ社製）を添加してポリ乳酸を溶解し、均一な溶液を調製した。得られた紡糸用ポリ乳酸溶液のポリ乳酸濃度は１０重量％、トロンビン凍結乾燥粉末濃度は７重量％（トロンビンとして０．０７８重量％）、エタノールとジクロロメタンの比が１：８重量比となるように調製した。ポリ乳酸添加前の蛋白質／有機溶媒分散液を目視観察すると、沈殿がなく均一な分散状態にあることがわかった。得られたポリ乳酸溶液を湿度３０％以下でエレクトロスピニング法により紡糸し、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体の平均繊維径は８．１μｍ、厚さは１７５μｍであり、柔軟かつ取り扱い可能であった。
実施例１０
トロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）をエタノール（和光純薬（株）製）に添加し、超音波バスによる処理を５分間実施し、分散性に優れたトロンビン分散液を調製した。得られた分散液にジクロロメタン（和光純薬（株）製）とＬ体１００％ポリ乳酸（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＬ１８、Ｐｕｒａｃ社製）を添加してポリ乳酸を溶解し、均一な溶液を調製した。得られた紡糸用ポリ乳酸溶液のポリ乳酸濃度は１０重量％、トロンビン凍結乾燥粉末濃度は１０重量％（トロンビンとして０．１１重量％）、エタノールとジクロロメタンの比が１：８重量比となるように調製した。ポリ乳酸添加前の蛋白質／有機溶媒分散液を目視観察すると、沈殿がなく均一な分散状態にあることがわかった。得られたポリ乳酸溶液を湿度３０％以下でエレクトロスピニング法により紡糸し、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体の平均繊維径は９．４μｍ、厚さは２１０μｍであり、柔軟かつ取り扱い可能であった。
実施例１１
トロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）をエタノール（和光純薬（株）製）に添加し、超音波バスによる処理を５分間実施し、分散性に優れたトロンビン分散液を調製した。得られた分散液にジクロロメタン（和光純薬（株）製）とポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＤＬＧ５０１０、Ｐｕｒａｃ社製）を添加してポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体を溶解し、均一な溶液を調製した。得られた紡糸用ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体溶液のポリマー濃度は１０重量％、トロンビン凍結乾燥粉末濃度は５重量％（トロンビンとして０．０６重量％）、エタノールとジクロロメタンの比が１：８重量比となるように調製した。ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体添加前の蛋白質／有機溶媒分散液を目視観察すると、沈殿がなく均一な分散状態にあることがわかった。得られたポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体溶液を湿度３０％以下でエレクトロスピニング法により紡糸し、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体の平均繊維径は４．８μｍ、厚さは３３０μｍであり、柔軟かつ取り扱い可能であった。
実施例１２
トロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）を２−プロパノール（和光純薬（株）製）に添加し、超音波バスによる処理を５分間実施し、分散性に優れたトロンビン分散液を調製した。得られた分散液にジクロロメタン（和光純薬（株）製）とポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＤＬＧ５０１０、Ｐｕｒａｃ社製）を添加してポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体を溶解し、均一な溶液を調製した。得られた紡糸用ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体溶液のポリマー濃度は１０重量％、トロンビン凍結乾燥粉末濃度は５重量％（トロンビンとして０．０６重量％）、２−プロパノールとジクロロメタンの比が１：８重量比となるように調製した。ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体添加前の蛋白質／有機溶媒分散液を目視観察すると、沈殿がなく均一な分散状態にあることがわかった。得られたポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体溶液を湿度３０％以下でエレクトロスピニング法により紡糸し、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体の平均繊維径は６．４μｍ、厚さは３２０μｍであり、柔軟かつ取り扱い可能であった。
実施例１３
エタノールにトロンビン凍結乾燥粉末（リコンビナントトロンビン１ｍｇ／ｍＬ、３．４％塩化ナトリウム、１．２％クエン酸ナトリウム、０．２９％塩化カルシウム、１％マンニトールｐＨ７を凍結乾燥したもの）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０重量％になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＤＬＧ５０１０、Ｐｕｒａｃ社製）を溶解し、トロンビン凍結乾燥粉末／ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体＝１００（トロンビンとして１．６７）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２６℃、湿度２９％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は２０Ｖ、紡糸液流量は４．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルからアースされた平板までの距離は３５ｃｍであった。得られた繊維成形体の厚さは１３６μｍであり、柔軟かつ取り扱い可能であった。得られたシートのトロンビン溶出性を溶出試験により確認した。試験方法は以下に示す通りである。
＜溶出試験＞
（１）試料を直径６ｍｍの大きさに打ち抜き、質量を測定した。
（２）試料をマイクロチューブに入れ、ＨＰＣ含有生理食塩水、又は生理食塩水にて溶出試験を実施した。
（３）サンプリング時間は１０、３０、６０、１２０秒とする。
（４）サンプリングした試料を液体クロマトグラフィーにより測定を行い、ピーク面積からトロンビン含量を求めた。
（５）溶出率を下記の式より求めた。
溶出率（％）＝得られたトロンビン含量／理論固定化トロンビン含量×１００
理論固定化トロンビン含量は、仕込んだトロンビン重量％と繊維成形体の目付け  から算出した。
溶出試験の結果を図１に示す。ＨＰＣ含有生理食塩水では、生理食塩水よりも溶出率が向上した。これより、本発明の積層シート成形体において、シート中にＨＰＣを含有させることがトロンビンの溶出率の向上に寄与していることがわかった。
＜実施例１４〜１５、比較例３〜４についての測定法＞
１Ｃ．止血性蛋白質粒子粒子径（平均粒子径）：
紡糸溶液をデジタルマイクロスコープ（キーエンス株式会社：商品名「ＶＨＸ−１００」）により、倍率１０００倍で撮影して得た写真から無作為に１０個の粒子を選んで直径を測定し、平均値を平均粒子径とした。
２Ｃ．繊維成形体の厚み：１Ａと同じ方法により測定した。
３Ｃ．繊維径（平均繊維径）：２Ａと同じ方法により測定した。
４Ｃ．止血性蛋白質の溶出試験：
得られた繊維成形体を２ｃｍ×２ｃｍに切り出し、１ｍＬの生理食塩水に３分間もしくは３時間浸漬して水溶性成分を溶出させた。ｎ＝３〜６にて前後の重量変化を測定し、以下の式により算出した抽出率の平均値を求めた。水溶性成分理論重量は、仕込み止血性蛋白質重量％と繊維成形体の目付けから算出した。
抽出率［％］＝（重量減少［ｍｇ］／水溶性成分理論重量［ｍｇ］）×１００
５Ｃ．止血性蛋白質の担持性試験：
得られた繊維成形体を１ｃｍ×１ｃｍに切り出し、これを鋏でおよそ４分割となるように切り分けた。前後の重量を測定し、重量変化を算出した。
重量変化［％］＝（分割後の重量［ｍｇ］／分割前の重量［ｍｇ］）×１００
６Ｃ．繊維成形体の柔軟性試験：
（ＪＩＳ−Ｌ−１９０６  ８．１９．２  Ｂ法）スライド法を参考とし、試験片の大きさを０．５ｃｍ×３．５ｃｍとして、以下の手順により柔軟性測定を行った。試験機本体と移動台の上面が一致するようにしてから、幅０．５ｃｍ分をカバーガラスと試験機本体とで挟み込み形で試験片を設置した。移動台を降下させ、試験片の自由端が移動台から離れるときの降下長さδ値をスケールから算出した（δ値が大きいほど柔軟性が高い）。
実施例１４
フィブリノゲン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル１）を、ジェットミル（株式会社セイシン企業：商品名「超微少量ラボジェットミル」）を用いて微粒化した。これをジクロロメタン（和光純薬（株）製）に添加し、超音波バスによる処理を５分間実施することでフィブリノゲン分散液を調製した。Ｌ体１００％ポリ乳酸（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＬ１８、Ｐｕｒａｃ社製）を添加してポリマーを溶解し、溶液を調製した。得られた紡糸用ポリマー溶液のポリマー濃度は１０重量％、フィブリノゲン凍結乾燥粉末濃度は４重量％（フィブリノゲンとして１．８重量％）となるように調製した。紡糸溶液中に分散したフィブリノゲンの粒子径は１２μｍであった。得られたポリマー溶液を湿度３０％以下でエレクトロスピニング法により紡糸し、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体の平均繊維径は１４．９μｍ、厚さは３２５μｍであった。シート重量と仕込み比から算出した、シートに含まれるフィブリノゲン量は０．４３ｍｇ／ｃｍ２であった。３時間浸漬後の抽出率は４０％であった。担持性試験における重量変化はなかった（１００％保持）。柔軟性試験から得られたδ値は２．７ｃｍであった。
実施例１５
トロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒールバイアル３）（凍結乾燥粉末４０ｍｇ中に１．１２％のトロンビン（７５０ｕｎｉｔ）を含む。）をジクロロメタン（和光純薬（株）製）に添加し、超音波バスによる処理を５分間実施することでトロンビン分散液を調製した。Ｌ体１００％ポリ乳酸（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＬ１８、Ｐｕｒａｃ社製）を添加してポリマーを溶解し、溶液を調製した。得られた紡糸用ポリマー溶液のポリマー濃度は１０重量％、トロンビン凍結乾燥粉末濃度は４重量％（トロンビンとして０．０４５重量％または７５０ユニット（Ｕ）／ｇ）となるように調製した。紡糸溶液中に分散したトロンビンの粒子径は９μｍであった。得られたポリマー溶液を湿度３０％以下でエレクトロスピニング法により紡糸し、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体の平均繊維径は１６．６μｍ、厚さは２９１μｍであった。シート重量と仕込み比から算出した、シートに含まれるトロンビン量は３１．３９Ｕ／ｃｍ２であった。
比較例３
トロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）をエタノール（和光純薬（株）製）に添加し、超音波バスによる処理を５分間実施し、トロンビン分散液を調製した。得られた分散液にジクロロメタン（和光純薬（株）製）とＬ体１００％ポリ乳酸（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＬ１８、Ｐｕｒａｃ社製）を添加してポリマーを溶解し、均一な溶液を調製した。得られた紡糸用ポリマー溶液のポリマー濃度は１０重量％、トロンビン凍結乾燥粉末濃度は４重量％（トロンビンとして０．０４５重量％または７５０Ｕ／ｇ）、エタノールとジクロロメタンの比が１：８重量比となるように調製した。紡糸溶液中に分散したトロンビンの粒子径は１２μｍであった。このポリマー溶液を風乾し、固体状態とした。繊維成形体と同様に溶出試験を行った結果、３分間浸漬後に約３％の水溶性成分が抽出された。
比較例４
繊維成形体として、ポリグリコール酸系不織布であるネオベール（登録商標、グンゼ株式会社製）を用い、以下の手順でフィブリノゲン固定化シートを作製した（凍結乾燥法）。市販の生体組織接着材（製品名：ボルヒール：一般財団法人化学及血清療法研究所製）のキットに含まれるフィブリノゲン溶液１．２５ｍＬを、上記の繊維成形体（５×５ｃｍ２）上に染み込ませた。この検体を凍結後、２４時間凍結乾燥させたものをフィブリノゲン固定化シートとした。担持性試験において、担持していたフィブリノゲンが崩壊し粉末として損失した（重量変化８９％）。柔軟性試験から得られたδ値は０．７ｃｍであった。
＜実施例１６〜２９についての測定法＞
１Ｄ．蛋白質粉末粒子径（平均粒子径）
フィブリノゲン凍結乾燥粉末を乳鉢で粉砕をしたものを、レーザー回折式粒度分布測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ：商品名「Ｍａｓｔｅｒ  ｓｉｚｅｒ２０００」）により粒度分布を測定し、Ｄ５０値（メディアン径）を平均粒子径とした。
２Ｄ．フィブリノゲン含量測定
得られたシートはΦ０．５ｃｍに切り出した後、０．１％ＴＦＡ溶液によりフィブリノゲンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーで定量した。
＜試験条件＞
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２１４ｎｍ）
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏ  ＳＥＣ−３（３μｍ、３０ｎｍ、４．６×３００ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
カラム温度：３５℃
サンプラー温度：５℃
移動相：０．１％ＴＦＡ含有水／０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル＝５０／５０
流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
分析時間：１０ｍｉｎ
実施例１６
＜水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるシート成形体の作製＞
２−プロパノールにフィブリノゲン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル１）を分散させた後、１６重量％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（６−１０ｍＰａ・ｓ、和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース＝１００（フィブリノゲンとして４６）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１２．５ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルからアースされた平板までの距離は１５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は０．３５μｍ、平均厚みは１９１μｍ、目付は２．７４ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１４３ｍｇ／ｃｍ３であった。得られたシートを０．５ｃｍ×０．５ｃｍに切断し、６２．５μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してＥＬＩＳＡ測定（「７Ａ．ＥＬＩＳＡ測定（１）フィブリノゲン」に記載の方法）を実施した。その結果、固定化蛋白質量は０．５１ｍｇ／ｃｍ２であった。
実施例１７
＜脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなるシート成形体の作製＞
エタノールにトロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０重量％になるようにポリ乳酸（ＰＬ１８  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、トロンビン凍結乾燥粉末／ポリ乳酸＝１００（トロンビンとして１．１）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、紡糸液流量は３．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルからアースされた平板までの距離は２５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は９．３７μｍ、平均厚みは２１０μｍ、目付は３．１５ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１５０ｍｇ／ｃｍ３であった。得られたシートを２ｃｍ×２ｃｍに切断し、１ｍＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性（「８Ａ．トロンビン活性測定」に記載の方法）・ＥＬＩＳＡ測定（「７Ａ．ＥＬＩＳＡ測定（２）トロンビン」に記載の方法）を実施した。その結果、活性測定値は２３．０Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は、１６μｇ／ｃｍ２であった。
実施例１８
＜積層シート成形体の組織接着効果評価試験＞
実施例１６で作製した水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるシート成形体と実施例１７で作製した脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなるシート成形体の組み合わせで使用した場合の効果を確認するために、接着力の比較を行った。接着力はウサギの皮と当該シート（２ｃｍ×２ｃｍ）を接着させ、フィブリンゲルが形成され、接着しているか確認した。この際、重ねたシートには事前に２００μＬの水を水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるシート成形体に添加し、４０秒経過後に水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるシート成形体をウサギの皮に貼付した。その後、３７℃で３分間静置後、皮とシート成形体との接着性を確認した。対照としてフィブリン接着材の成分が固定化されたコラーゲンシート製剤（製品名：タココンブ／ＣＳＬベーリング（株））：フィブリノゲンおよびトロンビン等の成分が、スポンジ状のウマコラーゲンのシートを支持体とし、シートの片面に真空乾燥により固着されたもの：２ｃｍ×２ｃｍ）を使用した。その結果、本発明の積層シート成形体は比較対照のコラーゲンシート製剤以上の接着力を示した。
実施例１９
＜水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるシート成形体の作製＞
２−プロパノールにフィブリノゲン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル１）を分散させた後、１６重量％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（６−１０ｍＰａ・ｓ  和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース＝１００（フィブリノゲンとして４６）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１２．５ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルからアースされた平板までの距離は１５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は０．３５μｍ、平均厚みは１９１μｍ、目付は２．７４ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１４３ｍｇ／ｃｍ３であった。得られたシートを２０ｋＧｙで電子線滅菌した。滅菌したシートを０．５ｃｍ×０．５ｃｍに切断して、６２．５μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してＥＬＩＳＡ測定（「７Ａ．ＥＬＩＳＡ測定（１）フィブリノゲン」に記載の方法）を実施した。その結果、固定化蛋白質量は０．７８ｍｇ／ｃｍ２であった。
実施例２０
＜脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなるシート成形体の作製＞
エタノールにトロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０重量％になるようにポリ乳酸（ＰＬ１８  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、トロンビン凍結乾燥粉末／ポリ乳酸＝１００（トロンビンとして１．１）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、紡糸液流量は３．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルからアースされた平板までの距離は２５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は９．３７μｍ、平均厚みは２１０μｍ、目付は３．１５ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１５０ｍｇ／ｃｍ３であった。得られたシート成形体を２０ｋＧｙで電子線滅菌した。得られたシート成形体を２ｃｍ×２ｃｍに切断し、１ｍＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性（「８Ａ．トロンビン活性測定」に記載の方法）・ＥＬＩＳＡ測定（「７Ａ．ＥＬＩＳＡ測定（２）トロンビン」に記載の方法）を実施した。その結果、活性測定値は１４．７Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は１１．４μｇ／ｃｍ２であった。
実施例２１
＜ウサギ肝臓滲出性出血に対する止血効果＞
実施例１９で作製した水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるシート成形体と実施例２０で作製した脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなるシート成形体の組み合わせで使用した場合の止血効果を、タココンブを使用した場合の止血効果と比較した。
動物の止血モデルとしてはウサギを用いた。ウサギを開腹し、肝臓の一部を切除して、その出血部位に対して、水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるシート成形体と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなるシート成形体を重ねて適用し、その止血効果（止血の有無、出血量）をみた。試験方法は以下に示す通りである。
（１）セラクタール１０ｍｇ／ｋｇ（約１．０ｍＬ）ケタラール５０ｍｇ／ｋｇ（約３．０ｍＬ）を筋肉内投与した。
（２）体重を測定し、腹部を剃毛後、仰臥位にて保定した。
（３）耳静脈より持続麻酔（２％ケタラール、２０Ｕ／ｍＬヘパリン添加生理食塩水）を行った。
（４）胸骨剣状突起直下から下腹部までを正中切開により開腹した。
（５）ヘパリンナトリウム注射液を耳静脈より３００Ｕ／ｋｇ投与した。
（６）腸用ピンセットやガーゼなどを用いて創傷作製に十分な厚みのある肝葉（外側左葉、内側左葉、右葉）を引き出した。
（７）肝葉に皮ポンチで直径１０ｍｍ、深さ４ｍｍの創傷を作り、その部分をメスで切除した。
（８）切除創からの出血を１０秒間、ベンシーツに吸収してその重量を測定した。創傷部出血が０．５ｇ以上の傷を試験に使用した。
（９）創傷部位に２．５ｃｍ角に切断した水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を重ねて、出血部位に水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層を適用し、１分間圧迫した。対照として用いるタココンブの場合は、２．５ｃｍ角に切断した後に生理食塩水を３１２．５μＬ滴下し、出血部位に適用し、１分間圧迫した。
（１０）圧迫後、出血の有無および創傷部位からの出血をベンシーツに吸収して、その重量を測定した。。
その結果、本発明の積層シート成形体を用いた場合、止血し（ｎ＝１）、適用後１分間の出血量は０．００３ｇと極めて微量であった。一方、対照として用いたタココンブの場合（ｎ＝５）、適用後１分間の出血量は１．５７ｇと止血効果は不十分であり、出血量が多かった。
実施例２２
＜脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなるシート成形体の作製＞
エタノールにトロンビン凍結乾燥粉末（リコンビナントトロンビン１ｍｇ／ｍＬ、３．４％塩化ナトリウム、１．２％クエン酸ナトリウム、０．２９％塩化カルシウム、１％マンニトールｐＨ７を凍結乾燥したもの）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０重量％になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＤＬＧ５０１０、Ｐｕｒａｃ社製）を溶解し、トロンビン凍結乾燥粉末／ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体＝１００（トロンビンとして１．６７）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は２０ｋＶ、紡糸液流量は４．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルからアースされた平板までの距離は３５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は３．８μｍ、平均厚みは１２７μｍ、目付は１．３８ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１０９ｍｇ／ｃｍ３であった。得られたシート成形体をΦ１ｃｍに切り出し、２００μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してトロンビン活性測定（「８Ａ．トロンビン活性測定」に記載の方法）を実施した。その結果、活性測定値は１８．３Ｕ／ｃｍ２であった。
実施例２３
＜水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体の作製＞
フィブリノゲン凍結乾燥粉末（リコンビナントフィブリノゲン１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭアルギニン、１３０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％マンニトール  ｐＨ８．５を凍結乾燥したもの）を乳鉢で粉砕し、平均粒子径が３０μｍの粉砕フィブリノゲン凍結乾燥粉末を作製した。２−プロパノールにこの粉砕したフィブリノゲン凍結乾燥粉末を分散させた後、１５重量％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（２．０−２．９ｍＰａ・ｓ  日本曹逹製）およびマクロゴール（分子量：４００  三洋化成工業製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース／マクロゴール＝５１（フィブリノゲンとして２５．９２）／３４／１５（ｗ／ｗ／ｗ）のドープ液を調製した。得られたドープ液を用い、流延法によりフィルムを作製した。塗工間隔は１２７μｍで、塗工速度は３０．１ｍｍ／ｓｅｃであった。フィルム作製後、１分以内に実施例２２で作製した脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を上部から積載することで水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体を得た。得られた積層シート成形体の平均膜厚は１５７μｍであった。得られた積層シート成形体を２０ｋＧｙで電子線滅菌した。得られた積層シート成形体をΦ１ｃｍに切り出し、２００μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してフィブリノゲンのＥＬＩＳＡ測定（「７Ａ．ＥＬＩＳＡ測定（１）フィブリノゲン」に記載の方法）を実施した。結果、固定化蛋白質量は０．５８ｍｇ／ｃｍ２であった。
実施例２４
＜ウサギ肝臓滲出性出血に対する止血効果＞
実施例２３で作製した水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体の止血効果を、タコシールを使用した場合の止血効果と比較した。
動物の止血モデルとしてはウサギを用いた。ウサギを開腹し、肝臓の一部を切除し、その出血部位に対して、水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体を適用し、その止血効果（止血の有無、出血量）をみた。試験方法は実施例２１に記載の方法と同じである。
その結果、本発明の積層シート成形体を用いた場合（ｎ＝４）、適用後１分間の出血量は０．００３ｇと極めて微量であった。一方、対照として用いたタコシールの場合（ｎ＝４）、適用後１分間の出血量は０．６５ｇと止血効果は不十分であり、出血量が多かった。
実施例２５
＜脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなるシート成形体の作製＞
エタノールにトロンビン凍結乾燥粉末（リコンビナントトロンビン１ｍｇ／ｍＬ、３．４％塩化ナトリウム、１．２％クエン酸ナトリウム、０．２９％塩化カルシウム、１％マンニトールｐＨ７を凍結乾燥したもの）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０重量％になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＤＬＧ５０１０、Ｐｕｒａｃ社製）を溶解し、トロンビン凍結乾燥粉末／ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体＝１００（トロンビンとして１．６７）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は２０ｋＶ、紡糸液流量は４．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルからアースされた平板までの距離は３５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は２．９７μｍ、平均厚みは１３７μｍ、目付は１．４９ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１０８ｍｇ／ｃｍ３であった。
実施例２６
＜水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体の作製＞
フィブリノゲン凍結乾燥粉末（リコンビナントフィブリノゲン１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭアルギニン、１３０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％マンニトール  ｐＨ８．５を凍結乾燥したもの）を乳鉢で粉砕し、平均粒子径が３０μｍの粉砕フィブリノゲン凍結乾燥粉末を作製した。２−プロパノールにこの粉砕したフィブリノゲン凍結乾燥粉末を分散させた後、２．９重量％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（２．０−２．９ｍＰａ・ｓ  日本曹逹製）およびマクロゴール（分子量：４００  三洋化成工業製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース／マクロゴール＝９０（フィブリノゲンとして３６．９８）／７／３（ｗ／ｗ／ｗ）のドープ液を調製した。得られたドープ液を用い、流延法によりフィルムを作製した。塗工間隔は５０．８μｍで、塗工速度は３０．１ｍｍ／ｓｅｃであった。フィルム作成後、１分以内に実施例２５で作製した脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を上部から積載することで、水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体を得た。得られた積層シート成形体の平均膜厚は１６９μｍであった。得られた積層シート成形体をΦ０．５ｃｍに切り出し、０．１％ＴＦＡ溶液でフィブリノゲンを抽出して高速液体クロマトグラフィーにより定量（「２Ｄ．フィブリノゲン含量測定」記載の方法）した。その結果、固定化蛋白質量は０．５４ｍｇ／ｃｍ２であった。
実施例２７
＜ウサギ肝臓滲出性出血に対する止血効果＞
実施例２６で作製した水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体の止血効果を、タコシールを使用した場合の止血効果と比較した。
動物の止血モデルとしてはウサギを用いた。ウサギを開腹し、肝臓の一部を切除し、その出血部位に対して水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体を適用し、その止血効果（止血の有無、出血量）をみた。試験方法は実施例２１に記載の方法と同じである。
その結果、本発明の積層シート成形体を用いた場合（ｎ＝６）、適用後１分間の出血量は０．００３ｇと極めて微量であった。一方、実施例２４に示したように対照として用いたタコシールの場合（ｎ＝４）、適用後１分間の出血量は０．６５ｇと止血効果は不十分であり、出血量が多かった。
実施例２８
フィブリノゲン凍結乾燥粉末（リコンビナントフィブリノゲン１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭアルギニン、１１０ｍＭ塩化ナトリウム、１％グリシン、０．２％マンニトール、０．２５％フェニルアラニン、０．４％ヒスチジン、０．１％クエン酸３ナトリウム  ｐＨ８．５を凍結乾燥したもの）を乳鉢で粉砕し、平均粒子径が２２μｍの粉砕フィブリノゲン凍結乾燥粉末を作製した。２−プロパノールにこの粉砕したフィブリノゲン凍結乾燥粉末を分散させた後、４．２重量％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（２．０−２．９ｍＰａ・ｓ  日本曹逹製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース／＝９０（フィブリノゲンとして２６．５５）／１０（ｗ／ｗ）のドープ液を調製した。得られたドープ液を用い、流延法によりフィルムを作製した。塗工間隔は１０１．６μｍで、塗工速度は３０．１ｍｍ／ｓｅｃであった。フィルム作成後、３分以内に実施例２５に記載の方法で作製したトロンビン凍結乾燥粉末／ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体＝２０／１００、４０／１００、６０／１００、８０／１００、１００／１００の比率のシート状繊維成形体を上部から積載することで、水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体を得た。これらの積層シート成形体の止血効果をラットｏｏｚｉｎｇモデル薬効評価（ラット肝臓に創傷をつけた滲出血モデルを用いて試験を実施した。被験シート成形体を創傷部に一定時間（本実施例では５分間）圧迫し、その後１分間出血の有無を目視にて評価。）で確認した。試験はｎ＝６で実施し、出血の有無を確認した。
その結果、表１に示すように、評価したトロンビン凍結乾燥粉末／ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体の比率、２０／１００〜１００／１００の範囲において、いずれもタコシールを上回る止血効果が確認された。
【表１】
2013172472.tif 000003
実施例２９
実施例２５に記載の方法で、トロンビン含量の異なるシート状繊維成形体を得た（トロンビン含量０．２３Ｕ／ｃｍ２、２．８Ｕ／ｃｍ２、１１．４Ｕ／ｃｍ２、２８．５Ｕ／ｃｍ２）。ついで実施例２６に記載の方法でフィブリノゲン含量が一定の水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体を得た。得られたフィブリノゲン含量が一定でトロンビン含量の異なる積層シート成形体を用いて、トロンビン含量の接着力に及ぼす影響を評価した。試験方法は下記に示す通りである。
（１）積層シート成形体及び陽性対照製剤（タコシール）（１ｃｍ×１ｃｍ）をプラスチック製四角柱の底部（１ｃｍ×１ｃｍ）に両面テープで接着させた。
（２）積層シート成形体及び陽性対照製剤（タコシール）を１ｍＬの生理食塩水に１０秒間浸し、ラワン板に密着させた。
（３）四角柱の上から１００ｇの加重を５分間かけた。
（４）四角柱を３０ｍｍ／ｍｉｎ．の速度で牽引し、デジタルフォースゲージにて張力を測定した。
試験はｎ＝５で実施し、張力平均値を接着力（ｇ）として評価した。その結果、表２に示すように、いずれの積層シート成形体もタコシールよりも高い接着力を示した。
【表２】
2013172472.tif 000004
実施例３０
実施例２５に記載の方法で、脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなるシート成形体を得た（トロンビン含量２４．２Ｕ／ｃｍ２）。このシート成形体の止血効果を実施例２８に記載の方法（圧迫時間は３分間）で確認した。試験はｎ＝６で実施した。その結果、６／６で止血が確認された。、
実施例３１
実施例２５に記載の方法で脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなるシート成形体（トロンビン含量範囲：１９〜２６Ｕ／ｃｍ２）を得て、ついで実施例２６に記載の方法で、水溶性ポリマーおよび含量が異なるフィブリノゲンからなる層と、脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体を得た。得られたトロンビン含量が一定範囲内でフィブリノゲン含量の異なる積層シート成形体の止血効果を実施例２８に記載の方法で確認した。その結果、表３に示すように、いずれのフィブリノゲン含量でも高い止血効果が確認されたが１．４７ｍｇ／ｃｍ２の場合やや効果が低下した。
【表３】
2013172472.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明のシート成形体は止血材として用いられ、医療品製造業で利用できる。
【図１】
2013172472.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月13日(2015.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シート成形体およびそれからなる止血材に関する。さらに詳しくは、フィブリノゲンおよび／またはトロンビンを含有し、これらの止血性蛋白質の溶出性および担持性が良好で止血性に優れたシート成形体およびそれからなる止血材に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィブリノゲンは、血液凝固カスケードの最終段階に存在する凝固因子である。血管が損傷を受けると凝固系の活性化が生じ、最終的に活性化されたトロンビンが可溶性フィブリノゲンを不溶性のフィブリンに変換する。このフィブリンは接着力を有し、止血および創傷治癒に重要な機能を発揮する。
医療現場、特に外科手術においては、止血および組織閉鎖等の組織接着操作は重要な位置づけにあり、本原理を応用したフィブリン糊接着材が幅広い外科手術の現場で利用されている。
フィブリン糊接着材の使用方法については、これまで様々な検討が加えられ、改善が図られており、フィブリノゲン溶液およびトロンビン溶液を患部に塗布または噴霧する液状型製剤（２液混合製剤：特許文献１および特許文献２参照）や、コラーゲン等の支持体にフィブリノゲンとトロンビンを混合固定化したシートを患部に貼付するシート製剤（特許文献３参照）がある。
しかしながら、現行の液状型製剤においては、凍結乾燥されたフィブリノゲンとトロンビンそれぞれを使用時に溶解して用いるため、凍結乾燥製剤の溶解に数分程度の時間を要し、緊急時の手術への対応の面や簡便性において満足できる剤型とはいえない。
【０００３】
また、上記フィブリン糊接着材においては、フィブリノゲン濃度が高濃度であるほど強い接着力が得られることから、強力な接着力を実現させるためには、高濃度のフィブリノゲンに少量の高濃度トロンビンを作用させることが必要である。
しかしながら、現行の液状型製剤は、フィブリノゲン溶液とトロンビン溶液を等量混合するため濃度が半分になり、フィブリノゲンの最大効力を発揮できない。さらに、フィブリノゲンの濃度は現実的に１０％程度溶液が濃度限界であることから、２液等量混合の系において、濃度の改良も困難である。
この点、シート製剤はフィブリノゲン溶液を高濃度で患部に適用可能であるため、理論的には２液混合製剤より強固な接着力が期待される。また、シート製剤であれば、噴出性・滲出性の出血部位に対する圧迫止血・圧迫閉鎖が可能となり、優れた利便性が期待される。
シート状の組織接着材を使用する際には、フィブリノゲン溶液を高濃度で患部に適用するため、創傷部位に適用した際の、シート製剤の組織への浸透性を増大させる必要がある。また、シート製剤を創傷部位に密着させるために丸めたり、折り曲げたりすることがあるので、このような力に対してシートの破損やフィブリノゲン成分およびトロンビン成分の脱落が起こらないようにシートの柔軟性や２成分の保持力を上げる必要がある。
【０００４】
有効成分を各種基材に固定化したシート状組織接着材およびシート状止血材が報告されている（特許文献４、特許文献５、特許文献６および特許文献７参照）。特許文献４においては、ウマ由来のコラーゲン表層にフィブリノゲンおよびトロンビンを固定化したシート製剤が開示・実用化されている（タココンブ（登録商標））。しかしながら、コラーゲン基材は厚みがあり比較的硬質であるため、創傷部位での密着性が下がり、効果的な閉鎖が困難な場合がある。また、本シート製剤は、支持体が馬コラーゲンであり、適用対象がヒトである場合、異種タンパクに対する抗体の出現やプリオン病等の人畜共通感染症の危険性が存在するため理想的なものとは言い難い。
特許文献５においては、止血化合物が均等に分散した紙状組成物が開示されている。この組成物は非水性溶媒中で生体吸収性ポリマーと止血化合物（主としてトロンビン、フィブリノゲン）からなる繊維状パルプを形成し、製紙処理を施すことで製造される。前述のタココンブに対して止血時間を１４倍減少し、かつ使用中の貼り直しを可能としている。しかしながら紙状であるため、組織追従性に改善の余地がある。
特許文献６および特許文献７においては、トロンビンを生体吸収性合成不織布に固定化したシートとフィブリノゲン溶液を併用した材料が開示されている。これらの組成物においては、不織布を有効成分水溶液に浸漬し、凍結乾燥を施すことにより複合化を行っている。この方法においては、凍結乾燥工程の歩留まりが悪い、シートの柔軟性が低い、固定化した蛋白質の担持性が悪くシートから剥がれ落ちる、という問題点がある。
【０００５】
特許文献８には、凝固反応を制御する目的で、フィブリノゲンを含有する層とトロンビンを含有する層との中間にセルロース誘導体を材料とする中間層を設けたシート状組織止血材が示されているが、該組織止血材中に含まれるフィブリノゲンの溶解性が十分ではなく、また凍結乾燥品故にハンドリングが悪く、トリミングできないという問題がある。
その他、シート製剤として、非イオン界面活性剤を含むフィブリノゲンが固定化された生体吸収性支持体およびトロンビンが固定化された生体吸収性支持体よりなるシート状フィブリン糊接着材が特許文献９に、フィブリノゲン層、トロンビン層、吸収物質層等からなる止血サンドウィッチ包帯が特許文献１０に、そして、第一の吸収性不織布、一つ以上の第二の吸収性織布または編地とトロンビンおよび／またはフィブリノゲンとを含む多孔の創傷手当て用品が特許文献１１に、それぞれ開示されている。しかし、これらの止血材はフィブリノゲンおよびトロンビンの凍結乾燥により製造されているためフィブリノゲンおよびトロンビンの脱落が生じ易く、柔軟性も不十分であり、フィブリノゲンとトロンビンが隣接しているため上記のような組織接着効果が十分でない。また、フィブリノゲンとトロンビンが直接接している形態である場合、保存中にわずかな水分で凝固反応が進行してフィブリンを形成してしまうため、保存安定性にも問題がある。さらには、凍結乾燥工程を必要とするため、製造するのに多大な時間と手間がかかるという問題があった。
このようにフィブリノゲンとトロンビンの組み合わせにより、実際に効果と利便性が期待できるシート状止血材は確立されていない。また、強力な組織接着効果を発揮するためには、高濃度のフィブリノゲン溶液が必要であるが、フィブリノゲンの溶解性は悪いために、従来の組成のままでフィブリノゲンを支持体に固定化した場合、フィブリノゲンはほとんど溶解しないために十分な薬効を発揮することは期待できない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公平９−２９７１号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ９７／３３６３３号
【特許文献３】特表２００４−５２１１１５号公報
【特許文献４】特公昭６１-３４８３０号公報
【特許文献５】特表２００２-５１３６４５号公報
【特許文献６】国際公開ＷＯ２００４／０６４８７８号
【特許文献７】国際公開ＷＯ２００５／１１３０３０号
【特許文献８】特開２００９−１８３６４９号公報
【特許文献９】特開２０１０−０６９０３１号公報
【特許文献１０】特表２００２−５１５３００号公報
【特許文献１１】特表２００９−５３３１３５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、止血性蛋白質、つまりフィブリノゲンおよび／またはトロンビンの担持性および溶出性が良く、柔軟性（組織追従性）、ひいては止血性に優れたシート成形体を提供することにある。
本発明の他の目的は、本発明の上記シート成形体からなる、創傷部位に適用して優れた止血効果を達成できる止血材を提供することにある。
本発明のさらに他の目的および利点は以下の説明から明らかになろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第１に、フィブリノゲンおよびトロンビンよりなる群から選ばれる少なくとも一種の蛋白質と、脂肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマーを含有してなりそして該蛋白質の少なくとも一部分が該ポリマー内部に入り込んでいるポリマー組成物のシート成形体によって達成される。
【０００９】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第２に、前段落のシート成形体の組合せとしてフィブリノゲンと水溶性ポリマーを含有してなりそしてフィブリノゲンの少なくとも一部分が該水溶性ポリマー内部に入り込んでいる第１のシート成形体層およびトロンビンと脂肪族ポリエステルを含有してなりそしてトロンビンの少なくとも一部分が該脂肪族ポリエステル内部に入り込んでいる第２のシート成形体層を含有してなる積層シート成形体によって達成される。
【００１０】
また、本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第３に、本発明の上記シート成形体または積層シート成形体からなる止血材によって達成される。すなわち、これらの成形体は創傷部位に適用され、止血材として創傷部位を処置するために用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】トロンビンを含有するポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体の繊維成形体からのトロンビン溶出性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のシート成形体は、フィブリノゲンおよびトロンビンよりなる群から選ばれる少なくとも一種の蛋白質と、脂肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマー（以下、「基材ポリマー」ともいう。）を含有するポリマー組成物のシート成形体である。ここで「蛋白質を含有する」とは、蛋白質の少なくとも一部分が基材ポリマー組成物内部に入り込んでいる状態をいう。このような構造は蛋白質が組成物表面や組成物の空隙に存在する凍結乾燥による複合体とは異なり、蛋白質の担持性に優れる。
本発明のシート成形体としては、シート状のものであれば特に制限はないが、繊維成形体およびフィルム成形体が好ましいものとして挙げられる。繊維成形体とは、得られた一本または複数本の繊維が積層され、織り、編まれ、もしくはその他の手法により形成された３次元の成形体をいう。具体的な繊維成形体の形態としては、例えば不織布が挙げられる。さらに、それをもとに加工したチューブ、メッシュなども繊維成形体に含まれる。フィルム成形体とは、インフレーション押出成形法、Ｔダイ押出成形法などの押出成形法、カレンダー法、流延法（キャスト法）などの成形法で作製されるフィルム状の成形体を示す。
【００１３】
本発明のシート成形体は、単独でも、フィブリン糊における相補蛋白質（トロンビンに対しフィブリノゲン、又はフィブリノゲンに対しトロンビン）を含有する第２のシートと組み合わせてもその効果を発揮しうる。単独で用いる場合は、脂肪酸ポリエステルにトロンビンを含有する繊維成形体であることが好ましい。
また、上記のシート成形体は、本発明の第２のシート成形体との積層シート成形体を構成するシート成形体として用いることができるが、本発明の第２のシート成形体との積層シート成形体は、フィブリノゲンと水溶性ポリマーを含有してなる第１のシート成形体およびトロンビンと脂肪族ポリエステルを含有してなる第２のシート成形体を含有してなる積層シート成形体である。
本発明で用いられる止血性蛋白質であるフィブリノゲンおよびトロンビンは、動物から調製したものでも、遺伝子組換え技術により製造したものでもよい。動物由来であればヒト由来が好ましい。また、アミノ酸配列を改変した蛋白質も使用できる。
なお、上記ポリマー組成物が、特に、フィブリノゲンおよびトロンビンを含有する場合など、保存中に一部でフィブリンを生じることがあるが、こうしたフィブリンを含む組成物も本発明の範囲である。
【００１４】
本発明で用いられる止血性蛋白質には、薬学的に許容しうる添加剤を加えてもよい。そのような添加剤の例として、血液凝固第ＸＩＩＩ因子、アルブミン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、界面活性剤、塩化ナトリウム、糖アルコール（グリセロール、マンニトール等）、トレハロース、クエン酸ナトリウム、アプロチニンおよび塩化カルシウムからなる群から選択される一種以上が挙げられる。
本発明で用いられる止血性蛋白質又は止血性蛋白質と添加剤との混合物は、基材ポリマーにそれぞれ分子として分散して存在してもよいが、それぞれ分子が集まった粒子（以下添加剤との混合粒子を含めて「蛋白質粒子」と記載する場合がある。）として基材ポリマー中に分散して存在することが好ましい。このことにより、止血性蛋白質の溶出性や、シート成形体が繊維状成形体の場合にはシートの柔軟性などを向上できる場合がある。
【００１５】
本発明において、含有される蛋白質粒子の平均粒子径は０．１〜２００μｍである。粒子径が０．１μｍよりも小さい粒子を作製することは技術的に困難である。また２００μｍよりも大きいと、得られるシート成形体が脆弱化し、取り扱いが困難になるため好ましくない。好ましくは０．５から１５０μｍ、さらに好ましくは１〜１００μｍである。
本発明のシート成形体は、繊維成形体の場合、蛋白質含有粒子を基材ポリマーに対して、通常１〜２００重量％、好ましくは１０〜１００重量％、より好ましくは２０〜１００重量％、さらに好ましくは５０〜１００重量％含有する。これらよりも少ないと、シート成形体からの蛋白質の溶出性、シート成形体の柔軟性または止血性が不良となる場合があり、また多いとシート成形体自体の自己支持性が低下するため好ましくない。また、フィルム成形体の場合、蛋白質含有粒子を基材ポリマーに対して、通常１００重量％以上、好ましくは５００重量％以上、より好ましくは８００〜９５０重量％含有する。これらより少ないと、止血性が不良となる場合があり、多いとフィルムの成形性が不良となる場合がある。
【００１６】
本発明において用いられる脂肪族ポリエステルとしては、具体的にはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸-ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリグリセロールセバシン酸、ポリヒドロキシアルカン酸、ポリブチレンサクシネート、およびこれらの誘導体が例示できる。これらの中でも、好ましくはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、およびそれらの共重合体、ならびにそれらの混合物からなる群から選ばれる。
ここで、ポリ乳酸の共重合体を用いる場合、伸縮性を付与するモノマー成分を含んでいてもよい。ここで伸縮性を付与するモノマー成分とは、カプロラクトンモノマーや、エチレングリコール、１，２−プロピレングリコール、１，３−プロピレングリコール、１，２−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、ポリカプロラクトンジオール、ポリアルキレンカーボネートジオール、ポリエチレングリコールユニットなどの軟質成分が例示できる。これらの軟質成分は少ないほうが好ましく、ポリマーユニットあたり５０ｍｏｌ％未満であることが好ましい。これよりも軟質成分が多いと自己支持性を失いやすく、やわらかすぎて取り扱いにくい。
ポリ乳酸またはその共重合体を用いる場合、ポリマーを構成するモノマーにはＬ−乳酸、Ｄ−乳酸があるが、特に制限はない。またポリマーの光学純度や分子量、Ｌ体とＤ体の組成比や配列には特に制限はないが、好ましくはＬ体の多いポリマーであり、ポリＬ乳酸とポリＤ乳酸のステレオコンプレックスを用いてもよい。また、ポリマーの分子量としては、通常１×１０３〜５×１０６であり、好ましくは１×１０４〜１×１０６、より好ましくは５×１０４〜５×１０５である。また、ポリマーの末端構造やポリマーを重合する触媒は任意に選択できる。
【００１７】
本発明に用いられる水溶性ポリマーとしては、例えばＮ−ビニル環状ラクタム単位を有するポリマーおよび水溶性セルロース誘導体を好ましいものとして挙げることができる。
Ｎ−ビニル環状ラクタム単位を有するポリマーとしては、例えばＮ−ビニルピロリドンやＮ−ビニルカプロラクタム類を重合あるいは共重合させて得られるホモポリマーあるいはコポリマーが挙げられる。このようなホモポリマーとしては、具体的には、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ（Ｎ−ビニル−５−メチル−２−ピロリドン）、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピペリドン）、ポリ（Ｎ−ビニル−６−メチル−２−ピペリドン）、ポリ（Ｎ−ビニル−ε−カプロラクタム）、ポリ（Ｎ−ビニル−７−メチル−ε−カプロラクタム）等が挙げられる。
また、前記コポリマーとしては、具体的には、Ｎ−ビニルピロリドンやＮ−ビニルカプロラクタム等を、例えば酢酸ビニル、（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸、マレイン酸エステル、マレイン酸、アクリロニトリル、スチレン、アルキルビニルエーテル、Ｎ−ビニルイミダゾール、ビニルピリジン、アリルアルコール、オレフィン類等と共重合させて得られるコポリマーが挙げられる。なお、前記エステルとしては、炭素数１〜２０のアルキルエステル、ジメチルアミノアルキルエステルおよびその四級塩、ヒドロキシアルキルエステル等が挙げられる。このような基幹ポリマーは、一種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。製造のしやすさや、入手のしやすさからポリビニルピロリドンが最も好ましい。
【００１８】
本発明において使用されるＮ−ビニル環状ラクタム単位を有するポリマーの平均分子量としては、特に限定されるものではないが、通常１×１０３〜５×１０６であり、好ましくは１×１０４〜１×１０６、より好ましくは５×１０４〜５×１０５である。また、ポリマーの末端構造やポリマーを重合する触媒は任意に選択できる。
また、水溶性セルロース誘導体は、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウム  カルボキシメチルセルロース、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
これらの中でも、好ましくはヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびそれらの混合物からなる群から選択され、最も好ましくはヒドロキシプロピルセルロースである。
また、本発明で用いられる水溶性セルロース誘導体の分子量としては、特に限定されないが、例えば濃度２％、２０℃で粘度測定を行った場合、通常１〜１００００ｍＰａ・ｓであり、好ましくは２〜５０００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは２〜４０００ｍＰａ・ｓである。
【００１９】
本発明のシート成形体においては、その目的を損なわない範囲で、他のポリマーや他の化合物を併用してもよい。例えばポリマー共重合、ポリマーブレンド、化合物混合である。化合物混合の例として、具体的にはリン脂質、界面活性剤等が挙げられる。
本発明で用いられるポリマーは高純度であることが好ましく、とりわけポリマー中に含まれる添加剤や可塑剤、残存触媒、残存物モノマー、成形加工や後加工に用いた残留溶媒などの残留物は少ないほうが好ましい。特に医療に用いる場合は、安全性の基準未満に抑える必要がある。
本発明のシート成形体の平均厚みは、繊維成形体の場合、通常１０〜１０００μｍ、好ましくは５０〜２００μｍ、より好ましくは１００〜１５０μｍである。これらよりも小さいと、シート成形体の強度が保てなくなり、トリミングすることができず好ましくなく、大きいと、シート成形体の柔軟性および／または止血性が低下するため好ましくない。シート成形体が、フィルム成形体の場合、その平均厚みは、通常５〜２００μｍ、好ましくは１０〜１００μｍである。
【００２０】
本発明のシート成形体がフィブリノゲンを含む場合、フィブリノゲンを０．０５〜３０ｍｇ／ｃｍ２の範囲で含むことが好ましい。フィブリノゲンの含有量が０．０５ｍｇ／ｃｍ２より少ないと蛋白質の特性に基づく効果を示さず、３０ｍｇ／ｃｍ２よりも多いと、繊維成形体自体が脆弱になり好ましくない。好ましい含有量は０．１〜２５ｍｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは０．２〜２５ｍｇ／ｃｍ２である。また、特にシート成形体がフィルム成形体の場合には、止血性の観点でフィブリノゲン含量は２ｍｇ／ｃｍ２以下、好ましくは１．５ｍｇ／ｃｍ２以下、さらに好ましくは１．４ｍｇ／ｃｍ２以下である。
本発明のシート成形体がトロンビンを含む場合、その含有量は０．１〜１００Ｕ／ｃｍ２の範囲が好ましい。トロンビンの含有量  が０．１Ｕ／ｃｍ２より少ないと止血効果を示さず、１００Ｕ／ｃｍ２よりも多いと、シート成形体自体が脆弱になり好ましくない。好ましい含有量は２〜８０Ｕ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは５〜５０Ｕ／ｃｍ２である。
本発明で、繊維成形体とは、得られた一本または複数本の繊維が積層され、織り、編まれ、もしくはその他の手法により形成された３次元の成形体をいう。具体的な繊維成形体の形態としては、例えば不織布が挙げられる。さらに、それをもとに加工したチューブ、メッシュなども繊維成形体に含まれる。
本発明のシート成形体が繊維成形体である場合、好ましい平均繊維径は０．０１〜５０μｍである。平均繊維径が０．０１μｍよりも小さいと、繊維成形体の強度が保てないため好ましくない。また平均繊維径が５０μｍよりも大きいと、繊維の比表面積が小さくなるため止血性蛋白質の溶解性が悪くなり好ましくない。さらに好ましくは平均繊維径が０．０２〜３０μｍである。なお、繊維径とは繊維断面の直径を表す。繊維断面の形状は円形に限らず、楕円形や異形になることもありうる。この場合の繊維径とは、該楕円形の長軸方向の長さと短軸方向の長さの平均をその繊維径として算出する。また、繊維断面が円形でも楕円形でもないときには円または楕円に近似して繊維径を算出する。
【００２１】
本発明のシート成形体が繊維成形体である場合、その目付は０．１〜５０ｍｇ／ｃｍ２が好ましい。目付が０．１ｍｇ／ｃｍ２よりも小さいと止血性蛋白質を十分に担持できないため好ましくない。また、目付が５０ｍｇ／ｃｍ２よりも大きいと、炎症を引き起こす可能性が高くなるため好ましくない。さらに好ましくは０．２〜２０ｍｇ／ｃｍ２である。
本発明のシート成形体が繊維成形体である場合、その嵩密度は１００〜２００ｍｇ／ｃｍ３が好ましい。嵩密度が１００ｍｇ／ｃｍ３よりも小さいとハンドリング性が低下するため好ましくない。また嵩密度が２００ｍｇ／ｃｍ３よりも大きいと、繊維成形体の空隙が少なくなり、柔軟性および止血性蛋白質の溶出性が低下するため好ましくない。
【００２２】
本発明のシート成形体が繊維成形体である場合は、その製法は、プラスチック繊維の製造に採用されているいずれの方法も採用でき特に制限されないが、止血性蛋白質の活性低下を防ぐため、止血性蛋白質または止血性蛋白質含有粒子を容易に分散させるべく溶液成形によって行うことが好ましい。また、繊維成形体は長繊維であることが好ましい。長繊維とは、具体的には紡糸から繊維成形体への加工に至る工程の中で、繊維を切断する工程を加えずに形成される繊維成形体をいい、エレクトロスピニング法、スパンボンド法、メルトブロー法などで形成することができるが、エレクトロスピニング法が好ましく用いられる。
エレクトロスピニング法は、ポリマーを溶媒に溶解させた溶液に高電圧を印加することで、電極上に繊維成形体を得る方法である。工程としては、高分子を溶媒に溶解させて溶液を製造する工程と、該溶液に高電圧を印加する工程と、該溶液を噴出させる工程と、噴出させた溶液から溶媒を蒸発させて繊維成形体を形成させる工程と、任意に実施しうる工程として形成された繊維成形体の電荷を消失させる工程と、電荷消失によって繊維成形体を累積させる工程を含む。
エレクトロスピニング法における、紡糸液を製造する段階について説明する。本発明における紡糸液は、基材ポリマー溶液と止血性蛋白質粒子からなる懸濁液を使用することが好ましい。
【００２３】
懸濁液における基材ポリマーの濃度は１〜３０重量％であることが好ましい。ポリマーの濃度が１重量％より低いと、繊維成形体を形成することが困難となり好ましくない。また、３０重量％より高いと、得られる繊維成形体の繊維径が大きくなり、また懸濁液の粘度が高くなり好ましくない。より好ましい懸濁液におけるポリマーの濃度は１．５〜２０重量％である。
水溶性ポリマーの溶媒は、水溶性ポリマーを溶解可能で、かつ止血性蛋白質粒子と懸濁液を形成し、紡糸する段階で蒸発し、繊維を形成可能なものであれば特に限定されず、一種を単独で用いても複数の溶媒を組み合わせてもよい。例えば、クロロホルム、２−プロパノール、トルエン、ベンゼン、ベンジルアルコール、ジクロロメタン、四塩化炭素、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、トリクロロエタン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、アセトン、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、１−プロパノール、フェノール、ピリジン、酢酸、蟻酸、ヘキサフルオロ−２−プロパノール、ヘキサフルオロアセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド、１，３−ジオキソラン、水、およびこれらの溶媒の混合溶媒が挙げられる。これらのうちでも、取り扱い性や物性などから、ジクロロメタン、クロロホルム、２−プロパノール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いることが好ましい。
【００２４】
脂肪族ポリエステルを溶解する溶媒としては、脂肪族ポリエステルを溶解可能で、かつ止血性蛋白質粒子と懸濁液を形成し、かつ紡糸する段階で蒸発し、繊維を形成可能なものであれば特に限定されず、一種を単独で用いても複数の溶媒を組み合わせてもよい。例えばクロロホルム、２−プロパノール、トルエン、ベンゼン、ベンジルアルコール、ジクロロメタン、四塩化炭素、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、トリクロロエタン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、およびこれらの混合溶媒が挙げられる。また、エマルションを形成する範囲内においてアセトン、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、１−プロパノール、フェノール、ピリジン、酢酸、蟻酸、ヘキサフルオロ−２−プロパノール、ヘキサフルオロアセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド、１，３−ジオキソラン等の溶媒を含んでいてもよい。これらの中でも、取り扱い性や物性から、ジクロロメタン、エタノールを用いることが好ましい。
かかる懸濁液を調製する方法としては、特に限定されないが、超音波や各種攪拌方法を用いることができる。攪拌方法としては、ホモジナイザーのような高速攪拌やアトライター、ボールミル等の攪拌方法も使用することができる。なかでも超音波処理による分散方法が好ましい。
また、溶媒と止血性蛋白質粒子とで懸濁液を形成した後、水溶性ポリマーまたは脂肪族ポリエステルを添加して紡糸液を調製することも可能である。
【００２５】
また、懸濁液を調製する前に止血性蛋白質粒子を微細処理することができる。微細処理としては、乾式粉砕と湿式粉砕とがあり、本発明においてはいずれの方式も採用することができ、両者を組み合わせることもできる。乾式粉砕処理としては、ボールミルを用いた処理、遊星ミルや振動ミルを用いた処理、乳鉢を用い乳棒によりすり潰す処理、媒体攪拌型粉砕機、ハンマーミル等の衝撃式粉砕機、ジェットミル、石臼を用いてすりつぶす処理等が挙げられる。一方、湿式粉砕処理としては、適当な分散媒に止血性蛋白質を分散させた状態で、高い剪断力の攪拌装置、混練装置等により攪拌する処理や、媒体中に分散した状態でのボールミル、ビーズミル処理等が挙げられる。さらには、スプレードライヤーにより作製した止血性蛋白質粒子を使用することもできる。
次に、溶液に高電圧を印加する段階と、溶液を噴出させる段階と、噴出された溶液から溶媒を蒸発させて繊維成形体を形成させる段階について説明する。
【００２６】
本発明の繊維成形体の製造方法においては、ポリマー溶液と止血性蛋白質粒子からなる懸濁液を噴出させ、繊維成形体を形成させるために、懸濁液に高電圧を印加する必要がある。電圧を印加する方法については、懸濁液を噴出させ、繊維成形体が形成されるものであれば特に限定されないが、溶液に電極を挿入して電圧を印加する方法や、溶液噴出ノズルに対して電圧を印加する方法などがある。
また、溶液に印加する電極とは別に補助電極を設けることも可能である。また、印加電圧の値については、前記繊維成形体が形成されれば特に限定されないが、通常は５〜５０ｋＶの範囲が好ましい。印加電圧が５ｋＶより小さい場合は、紡糸液が噴出されずに繊維成形体が形成されないため好ましくなく、印加電圧が５０ｋＶより大きい場合は、電極からアース電極に向かって放電が起きるために好ましくない。より好ましくは１０〜３０ｋＶの範囲である。所望の電位は任意の適切な方法で作ればよい。
こうすることで、ポリマー溶液と止血性蛋白質粒子からなる懸濁液を噴出させた直後に使用した溶媒が揮発して繊維成形体が形成される。通常の紡糸は大気下、室温で行われるが、揮発が不十分である場合には陰圧下で行うことや、高温の雰囲気下で行うことも可能である。また、紡糸する温度は溶媒の蒸発挙動や紡糸液の粘度に依存するが、通常は０〜５０℃の範囲である。
【００２７】
次に、形成された繊維成形体の電荷を消失させ累積させる段階について説明する。繊維成形体の電荷を消失させ累積させる方法は特に限定はされないが、繊維成形体をアース電極に捕集することで電荷を消失させ、同時に累積させる方法が挙げられる。他にイオナイザー等により累積前に電荷を消失させる方法も挙げられる。この場合、繊維成形体を累積させる方法は、特に限定はされないが、通常の方法として、電荷消失により繊維成形体の静電力を失わせ、自重により落下、累積させる方法が挙げられる。また必要に応じて、静電力を消失させた繊維成形体を吸引してメッシュ上に累積させる方法、装置内の空気を対流させてメッシュ上に累積させる方法などを行ってもよい。なお、イオナイザーとは、内蔵のイオン発生装置によりイオンを発生させ、イオンを帯電物に放出させることにより帯電物の電荷を消失させうる装置である。本発明の繊維成形体の製造方法で用いられうるイオナイザーを構成する好ましいイオン発生装置として、内蔵の放電針に高電圧を印加することによりイオンを発生する装置が挙げられる。
かかるエレクトロスピニング法は公知であり、本発明の繊維成形体が調製できる限り、その装置や条件は限定されないが、後述する実施例のほか、例えば国際公開ＷＯ２００４／０７２３３６号明細書や国際公開２００５／０８７９８８号明細書の記載を参考にすることができる。
本発明のシート成形体がフィルム成形体である場合、その製法は、従来からフィルムの製法として採用されているいずれの方法でも製造できる。例えば流延法（キャスト法）を挙げることができる。こうした成形は、溶融成形によって行っても、溶液成形によって行ってもよいが、止血性蛋白質の活性低下を防ぐため、止血性蛋白質を容易に分散させるべく溶液成形を行うことが好ましい。
次に、本発明の積層シート成形体について説明する。
【００２８】
本発明の積層シート成形体は、フィブリノゲンと水溶性ポリマーを含有してなる第１ポリマー組成物層およびトロンビンと脂肪族ポリエステルを含有してなる第２ポリマー組成物層を含有してなる。
水溶性ポリマーは、セルロース誘導体、Ｎ−ビニル環状ラクタム単位を有するポリマー、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、デキストラン、プルランまたはデンプンあるいはこれらの混合物から選ばれる。
水溶性ポリマーは、セルロース誘導体もしくはＮ−ビニル環状ラクタム単位を有するポリマー、またはこれらの混合物であることが好ましい。
セルロース誘導体は、具体的にはヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびナトリウム  カルボキシメチルセルロース、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
これらの中でも、好ましくはヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、およびそれらの混合物からなる群から選択され、最も好ましくはヒドロキシプロピルセルロースまたはポリビニルピロリドンである。
また、水溶性ポリマーがＮ−ビニル環状ラクタム単位を有するポリマーである場合の平均分子量は特に限定されるものではないが、１×１０３〜５×１０６であり、好ましくは１×１０４〜１×１０６、より好ましくは５×１０４〜５×１０５である。また、ポリマーの末端構造やポリマーを重合する触媒は任意に選択できる。
【００２９】
また、水溶性ポリマーがセルロース誘導体である場合は、濃度２％、２０℃で粘度測定を行った場合、好ましくは０．０１〜１００００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは０．１〜５０００ｍＰａ・ｓ、さらに好ましくは０．１〜１０００ｍＰａ・ｓ、最も好ましくは０．１〜１００ｍＰａ・ｓの範囲内のものである。
水溶性ポリマーには、その目的を損なわない範囲で、他のポリマーや他の化合物を併用してもよい。例えば、ポリマー共重合、ポリマーブレンド、化合物混合である。
かかる水溶性ポリマーは高純度であることが好ましく、とりわけポリマー中に含まれる可塑剤、残存触媒、残存モノマー、成形加工や後加工に用いた残留溶媒などの残留物は、少ないほうが好ましい。特に、医療に用いる場合は、安全性の基準値未満に抑える必要がある。
また、水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層は、薬学的に許容しうる添加剤をさらに含んでいてもよい。そのような添加剤の例としては、前記シート成形体の説明で記載したものと同じものを挙げることができる。特にフィブリノゲンが平均粒子径０．０１〜１００μｍの粒子である場合、これらの添加剤は、該粒子中に添加されていることが好ましい。
【００３０】
脂肪族ポリエステルとしては、前記シート成形体の説明に記載したものが同様に用いられる。
なお、脂肪族ポリエステルには、その目的を損なわない範囲で、他のポリマーや他の化合物を併用してもよい。例えば、ポリマー共重合、ポリマーブレンド、化合物の混合である。
かかる脂肪族ポリエステルは高純度であることが好ましく、とりわけポリマー中に含まれる添加剤や可塑剤、残存触媒、残存モノマー、成形加工や後加工に用いた残留溶媒などの残留物は少ないほうが好ましい。特に、医療に用いる場合は、安全性の基準値未満に抑える必要がある。
また、脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層は、薬学的に許容しうる添加剤をさらに含んでいてもよい。そのような添加剤の例として、多価アルコール、界面活性剤、アミノ酸、少糖、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、および塩化カルシウムからなる群から選択される一種以上が挙げられる。これにより、トロンビンの安定性、溶解性、柔軟性などを向上できる場合がある。
【００３１】
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる第１ポリマー組成物層は、繊維成形体またはフィルムからなることが好ましい。繊維成形体とは、得られた一本または複数本の繊維が積層され、織り、編まれ、もしくはその他の手法により形成された３次元の成形体をいう。具体的な繊維成形体の形態としては、例えば不織布が挙げられる。さらに、それをもとに加工したチューブ、メッシュなども繊維成形体に含まれる。
フィルムは従来から採用されているいずれの方法でも製造できる。例えば流延法（キャスト法）を挙げることができる。こうした成形は、溶融成形によって行っても、溶液成形によって行ってもよいが、止血性蛋白質の活性低下を防ぐため、止血性蛋白質を容易に分散させるべく溶液成形を行うことが好ましい。
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる繊維成形体の平均繊維径は０．０１〜５０μｍである。平均繊維径が、０．０１μｍよりも小さいと、繊維成形体の強度が保てないため好ましくない。また平均繊維径が５０μｍよりも大きいと、繊維の比表面積が小さくなるため溶解性が悪くなり、好ましくない。さらに好ましくは、平均繊維径が０．０２〜３０μｍである。なお、繊維径とは繊維断面の直径を表す。繊維断面の形状は円形に限らず、楕円形や異形になることもありうる。この場合の繊維径とは、該楕円形の長軸方向の長さと短軸方向の長さの平均をその繊維径として算出する。また、繊維断面が円形でも楕円形でもないときには円または楕円に近似して繊維径を算出する。
【００３２】
本発明の積層シート成形体の平均厚みは、好ましくは５０〜３５０μｍ、より好ましくは１００〜３００μｍ、さらに好ましくは１００〜２５０μｍである。
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる繊維成形体の目付は０．１〜５０ｍｇ／ｃｍ２であることが好ましい。目付が０．１ｍｇ／ｃｍ２よりも小さいと、フィブリノゲンを十分に担持できないため好ましくない。また目付が５０ｍｇ／ｃｍ２よりも大きいと、炎症を引き起こす可能性が高くなるため好ましくない。
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる繊維成形体の嵩密度は１００〜２００ｍｇ／ｃｍ３であることが好ましい。嵩密度が１００ｍｇ／ｃｍ３よりも小さいと、ハンドリング性が低下するため好ましくない。また嵩密度が２００ｍｇ／ｃｍ３よりも大きいと、繊維成形体の空隙が低くなり、柔軟性および溶解性が低下するため好ましくない。
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる繊維成形体は、フィブリノゲンを通常０．０５〜３０ｍｇ／ｃｍ２の範囲で含んでいる。フィブリノゲンの含有量が０．０５ｍｇ／ｃｍ２より少ないと止血効果を示さず、３０ｍｇ／ｃｍ２よりも多いと繊維成形体自体が脆弱になり好ましくない。好ましい含有量は０．１〜２５ｍｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは、０．２〜２５ｍｇ／ｃｍ２である。また、特にシート成形体がフィルム成形体の場合には、止血性の観点でフィブリノゲン含量は２ｍｇ／ｃｍ２以下、好ましくは１．５ｍｇ／ｃｍ２以下、さらに好ましくは１．４ｍｇ／ｃｍ２以下である。
【００３３】
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる繊維成形体は長繊維よりなることが好ましい。長繊維とは、具体的には紡糸から繊維成形体への加工に至る工程の中で、繊維を切断する工程を加えずに形成される繊維成形体のことをいい、エレクトロスピニング法、スパンボンド法、メルトブロー法などで形成することができるが、エレクトロスピニング法が好ましく用いられる。
エレクトロスピニング法は、前記シート成形体の説明において記載した水溶性ポリマーとフィブリノゲン粉末を混合し懸濁液を調製したとき、フィブリノゲン粉末のサイズは、０．０１〜１００μｍの範囲にあることが好ましい。０．０１μｍよりも小さいフィブリノゲン粉末を作製することは技術的に困難であり、１００μｍよりも大きいと分散性が悪く、繊維成形体が脆弱となり好ましくはない。
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるフィルムは従来から採用されているいずれの方法でも製造できる。例えば流延法（キャスト法）を挙げることができる。こうした成形は、溶融成形によって行っても、溶液成形によって行ってもよいが、止血性蛋白質の活性低下を防ぐため、止血性蛋白質を容易に分散させるべく溶液成形を行うことが好ましい。
【００３４】
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるフィルム中の水溶性ポリマーの含量は、ポリマーの種類にもよるが、０．１〜５０重量％であることが好ましく、さらに好ましくは０．５〜２０重量％である。また、フィブリノゲンの蛋白質粒子は、水溶性ポリマーに対して、ポリマーの種類にもよるが、通常１００重量％以上、好ましくは５００重量％以上、より好ましくは８００〜９５０重量％含有する。これらより少ないと、止血性が不良となる場合があり、多いとフィルムの成形性が不良となる場合がある。
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるフィルムの平均厚みは１０〜１０００μｍであることが好ましい。
水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるフィルムは、フィブリノゲンを好ましくは０．０５〜１０ｍｇ／ｃｍ２の範囲で含んでいる。０．０５ｍｇ／ｃｍ２より少ないと止血効果を示し難く、１０ｍｇ／ｃｍ２よりも多いとフィルム自体が脆弱になり好ましくない。より好ましい含有量は０．１〜８ｍｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは、０．２〜４ｍｇ／ｃｍ２である。
【００３５】
本発明において、脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる第２ポリマー組成物層は、繊維成形体からなることが好ましい。なお、繊維成形体の定義については前記した。
脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる繊維成形体の平均繊維径は０．０１〜５０μｍである。平均繊維径が、０．０１μｍよりも小さいと、繊維成形体の強度が保てないため好ましくない。また平均繊維径が５０μｍよりも大きいと、繊維の比表面積が小さくなるためトロンビンの放出性が悪くなり好ましくない。さらに好ましくは、平均繊維径が０．０２〜３０μｍである。
脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる繊維成形体の平均厚みは１０〜１０００μｍである。平均厚みが、１０μｍよりも小さいと、繊維成形体の強度が保てなくなりトリミングすることができず好ましくない。また平均厚みが１０００μｍよりも大きいと、繊維成形体の柔軟性が低下するため好ましくない。さらに好ましくは、平均厚みが２０〜５００μｍである。
【００３６】
脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる繊維成形体の目付は０．１〜５０ｍｇ／ｃｍ２である。目付が０．１ｍｇ／ｃｍ２よりも小さいと、トロンビンを十分に担持できないため好ましくない。また目付が５０ｍｇ／ｃｍ２よりも大きいと、炎症を引き起こす可能性が高くなるため好ましくない。さらに好ましくは０．２〜２０ｍｇ／ｃｍ２である。
脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる繊維成形体の嵩密度は１００〜２００ｍｇ／ｃｍ３である。嵩密度が１００ｍｇ／ｃｍ３よりも小さいと、ハンドリング性が低下するため好ましくない。また嵩密度が２００ｍｇ／ｃｍ３よりも大きいと、繊維成形体の空隙が低くなり、柔軟性およびトロンビンの放出能が低下するため好ましくない。
【００３７】
本発明において、脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる繊維成形体は、トロンビンを０．１〜１００Ｕ／ｃｍ２含んでいることが好ましい。トロンビンの含有量が０．１Ｕ／ｃｍ２より少ないと止血効果が不十分であり好ましくない。１００Ｕ／ｃｍ２より多いと繊維成形体自体が脆弱になり好ましくない。好ましい含有量は２〜８０Ｕ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは５〜５０Ｕ／ｃｍ２である。また、トロンビンの蛋白質含有粒子は、脂肪族ポリエステルに対して、通常１〜２００重量％、好ましくは１０〜１００重量％、より好ましくは２０〜１００重量％、さらに好ましくは５０〜１００重量％含有する。これらよりも少ないと、トロンビンの溶出性、シート成形体の柔軟性または止血性が不良となる場合があり、また多いとシート成形体の自己支持性が低下するため好ましくない。
脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる繊維成形体は長繊維よりなることが好ましい。長繊維の意味およびその製造法については前述のとおりである。
かかる脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる繊維成形体はエレクトロスピニング法で製造することができる。エレクトロスピニング法は前記シート成形体の説明において記載した。脂肪族ポリエステルとトロンビン粉末を混合して懸濁液を調製したとき、トロンビン粉末のサイズは特に限定されるものではないが、０．０１〜１００μｍの範囲にあることが好ましい。０．０１μｍよりも小さいトロンビン粉末を作製することは技術的に困難であり、１００μｍよりも大きいと分散性が悪く、繊維成形体が脆弱となり好ましくない。
【００３８】
本発明のシート成形体の表面または積層シート成形体における各層の表面に、さらに綿状の繊維構造物を積層することや、綿状構造物を本発明の積層シート成形体ではさんでサンドイッチ構造にするなどの加工は、本発明の目的を損ねない範囲で任意に実施しうる。
本発明のシート成形体および積層シート成形体における繊維成形体の繊維内部にも任意に薬剤を含ませることができる。エレクトロスピニング法で成形する場合は、有機溶媒もしくは水溶液に可溶であり、溶解によりその生理活性を損なわないものであれば、使用する薬剤に特に制限はない。
本発明の積層シート成形体は、１層以上の水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる第１ポリマー組成物層と、１層以上の脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる第２ポリマー組成物層を含むが、これら以外の層が設けられていてもよい。また、これら各層を積層する順は問わず、同種の層が隣接している部分があってもよい。
【００３９】
本発明の積層シート成形体は、水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる第１ポリマー組成物層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる第２ポリマー組成物層を各々重ねたものでもよく、形成されたいずれかの層に、通常のコーティング方法により積層することもできる。かかるコーティングの方法として、特に制限されるものではないが、エレクトロスピニング、エレクトロスプレー、キャスティング、浸漬、噴射、プレス、熱プレスなどの方法が挙げられる。なかでも、繊維成形体からなる層の上に繊維成形体からなる層を積層する方法としては、エレクトロスピニング法が好ましい。水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる繊維成形体に脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる繊維成形体を積層しても、脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる繊維成形体に水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる繊維成形体を積層してもよい。
本発明の積層シート成形体を止血材として創傷部位に適用する際、水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層が創傷部位に接触するように適用することが好ましい。そうすることで、水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層が創傷部位に接触するやいなや水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層が溶解し、創傷部位にフィブリノゲンが十分に浸透し、ついで脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層よりトロンビンが直ちに放出されることでフィブリン生成に伴う凝固反応が進行する。なお、脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層の脂肪族ポリエステルは、圧迫止血に必要な補強材として機能した後、時間をかけて分解される。
【００４０】
本発明のシート成形体および積層シート成形体は薄く、かつ柔軟性に優れるため創傷部位との密着性がよい。また、本発明のシート成形体および積層シート成形体は、繊維成形体などに有効成分であるフィブリノゲンおよび／またはトロンビンが含有されているため、凍結乾燥品と異なって担持性に優れる。その一方、フィブリノゲンの溶解性ならびにトロンビンの放出性およびフィブリノゲン層への溶出性にも優れるため、短時間での止血効果が発現する。また、短時間での止血効果発現のために必要なフィブリノゲン量が少なく、コスト面でも優れる。また、本発明のシート成形体は、使用する材料を選択することにより、創傷部位に適用後の創傷部位の視認性に優れるものとなる。これにより、これまでの製品では困難であった止血状態が視覚的に確認でき、縫合が必要な場合に縫合すべき部位が容易に特定できる。さらに、本発明のシート成形体および積層シート成形体を製造するのに凍結乾燥工程を必要としないため、生産性にも優れている。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例により本発明の実施の形態を説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００４２】
＜実施例１〜６および１６〜２９、比較例１、２についての測定法＞
１Ａ．蛋白質粒子粒子径（平均粒子径）：
フィブリノゲン凍結乾燥粉末を乳鉢で粉砕したものを、デジタルマイクロスコープ（キーエンス株式会社：商品名「ＶＨＸ-１００」）により、倍率１０００倍で撮影して得た写真から無作為に１０個の粒子を選んで直径を測定し、平均値を平均粒子径とした。
２Ａ．平均繊維径：
得られた繊維成形体の表面を走査型電子顕微鏡（キーエンス株式会社：商品名「ＶＥ８８００」）により、倍率３０００倍で撮影して得た写真から無作為に２０箇所を選んで繊維の径を測定し、すべての繊維径の平均値を求めて平均繊維径とした。ｎ＝２０である。
３Ａ．平均厚み：
得られた繊維成形体を高精度デジタル測長機（株式会社ミツトヨ：商品名「ライトマチックＶＬ−５０」）を用いて測定力０．０１Ｎによりｎ＝１５にて繊維成形体の膜厚を測定した平均値を算出した。なお、本測定においては測定機器が使用可能な最小の測定力で測定を行った。
４Ａ．目付：
得られた繊維成形体を、５０ｍｍ×１００ｍｍにカットし、その重量を測定し、換算することで目付けを算出した。
５Ａ．嵩密度
上記測定した目付と平均厚みの値から嵩密度を算出した。
６Ａ．溶解テスト：得られた繊維成形体を、１ｃｍ×１ｃｍにカットし、生理食塩水１５μＬを添加し、溶解性を確認した。
７Ａ．ＥＬＩＳＡ測定
【００４３】
（１）フィブリノゲン
ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ  ４６８６６７）に抗ヒトフィブリノゲン抗体（ＤＡＫＯ  Ａ００８０）を１０μｇ／ｍＬで固定化した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル  ＵＫ−Ｂ８０）を各ウェルに添加し、マスキングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、検体を添加した。標準品としてヒトフィブリノゲン（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｎｏ．ＦＩＢ３）を用い、検量線を作成した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒトフィブリノゲン抗体（ＣＰＬ５５２３）を添加し、反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、ＴＭＢ試薬（ＫＰＬ  ５０−７６−０２  ５０−６５−０２）を添加し、６分間静置して発色させた。１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を加え、発色を停止し、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０−６５０ｎｍを測定した。
【００４４】
（２）トロンビン
ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ  ４６８６６７）に抗ヒトトロンビン抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、Ｎｏ．ＳＡＨＴ−ＡＰ）を５μｇ／ｍＬで固定化した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル  ＵＫ−Ｂ８０）を各ウェルに添加し、マスキングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、検体を添加する。標準品としてヒトトロンビン（ヘマトロジックテクノロジー社：ＨＣＴ−００２０）を用い、検量線を作成した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒトトロンビン抗体（（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、Ｎｏ．ＳＡＨＴ−ＨＲＰ）を０．１μｇ／ｍＬで添加した。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、ＴＭＢ試薬（ＤａＫｏ  Ｓ１５９９）を添加し、１０分間静置して発色させた。０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加え、発色を停止し、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０−６５０ｎｍを測定した。
８Ａ．トロンビン活性測定
ファルコン社製２００８チューブに試料２０μＬと５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．５）＋５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファー６０μＬ、０．１％  ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８を２０μＬ加え、３７℃で３分インキュベーションした。標準品としてヒトプラズマ由来精製α―トロンビン（ヘマトロジックテクノロジー社から購入：ＨＣＴ−００２０）を同バッファーで５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５Ｕ／ｍＬに希釈したものを用いた。その反応液にテストチーム発色基質Ｓ−２２３８（１ｍＭ：第一化学薬品工業）を１００μＬ添加して攪拌混合し、３７℃で５分間の反応後、０．１Ｍクエン酸溶液を８００μＬ加えて反応を停止した。反応液２００μＬを９６ウェルプレートに移し、ＯＤ４０５／６５０を測定した。
【００４５】
実施例１
フィブリノゲン凍結乾燥粉末（ボルヒール（登録商標、以下同じ）組織接着用：バイアル１）を乳鉢で粉砕し、平均粒子径が１４μｍの粉砕フィブリノゲン凍結乾燥粉末を作製した。エタノールにこの粉砕したフィブリノゲン凍結乾燥粉末を分散させた後、１０ｗｔ％になるようにポリビニルピロリドン（Ｋ９０  和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ポリビニルピロリドン＝１００／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１３．５ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は１５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は０．５１μｍ、平均厚みは２８５μｍ、目付は２．３５ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は８２ｍｇ／ｃｍ３であった。得られた繊維成形体の溶解テストを実施したところ、１秒以内に溶解した。また、得られたシートを０．５ｃｍ×０．５ｃｍに切断して、６２．５μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果、固定化蛋白質量は０．５４ｍｇ／ｃｍ２であった。得られたシートはハサミでトリミングが可能であった。
【００４６】
実施例２
エタノールに実施例１で粉砕したフィブリノゲン凍結乾燥粉末を分散させた後、１０ｗｔ％になるようにポリビニルピロリドン（Ｋ９０  和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ポリビニルピロリドン＝１００／２００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１７ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は１５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は０．３３μｍ、平均厚みは４６９μｍ、目付は５．２８ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１１３ｍｇ／ｃｍ３であった。得られた繊維成形体の溶解テストを実施したところ、１秒以内に溶解した。また、得られたシートを０．５ｃｍ×０．５ｃｍに切断し、６２．５μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果、固定化蛋白質量は１．６１ｍｇ／ｃｍ２であった。得られたシートはハサミでトリミングが可能であった。
【００４７】
実施例３
２−プロパノールに実施例１で粉砕したフィブリノゲン凍結乾燥粉末を分散させた後、１６ｗｔ％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（６−１０ｍＰａ・ｓ  和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース＝２０／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１１ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は１５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は０．８６μｍ、平均厚みは１３７μｍ、目付は１．５９ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１１６ｍｇ／ｃｍ３であった。得られた繊維成形体の溶解テストを実施したところ１秒以内に溶解した。また、得られたシートを０．５ｃｍ×０．５ｃｍに切断し、６２．５μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果、固定化蛋白質量は０．１７ｍｇ／ｃｍ２であった。得られたシートはハサミでトリミングが可能であった。
【００４８】
比較例１
１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール／ＭＩＮＩＭＵＭ  ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＭＥＤＩＵＭ  ＥＡＧＬＥ（シグマアルドリッチ社製）１０×（９／１＝ｖ／ｖ）に実施例１で粉砕したフィブリノゲン凍結乾燥粉末を１５ｗ／ｖ％になるように溶解させた。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は２３．５ｋＶ、紡糸液流量は２．４５ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は１２ｃｍであった。得られた繊維成形体の溶解テストを実施したところ溶解しなかった。
【００４９】
比較例２
フィブリノゲン溶解液にフィブリノゲン凍結乾燥粉末（いずれもボルヒール組織接着用に含まれる）を溶解させた後、１６ｗｔ％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（６−１０ｍＰａ・ｓ  和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース＝２０／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製したが、ヒドロキシプロピルセルロースとフィブリノゲンが相分離し、フィブリノゲンが析出し、エレクトロスピニングを行うことができなかった。
【００５０】
実施例４
２−プロパノールに実施例１で粉砕したフィブリノゲン凍結乾燥粉末を分散させた後、１６ｗｔ％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（６−１０ｍＰａ・ｓ  和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース＝４０／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１２．５ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は１５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は０．４３μｍ、平均厚みは１５２μｍ、目付は１．８６ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１２２ｍｇ／ｃｍ３であった。得られた繊維成形体の溶解テストを実施したところ１秒以内に溶解した。また、得られたシートを０．５ｃｍ×０．５ｃｍに切断し、６２．５μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果、固定化蛋白質量は０．３０ｍｇ／ｃｍ２であった。得られたシートはハサミでトリミングが可能であった。
【００５１】
実施例５
２−プロパノールに実施例１で粉砕したフィブリノゲン凍結乾燥粉末を分散させた後、１６ｗｔ％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（６−１０ｍＰａ・ｓ  和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース＝１００／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１２．５ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は１５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は０．３５μｍ、平均厚みは１９１μｍ、目付は２．７４ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１４３ｍｇ／ｃｍ３であった。得られた繊維成形体の溶解テストを実施したところ１秒以内に溶解した。また、得られたシートを０．５ｃｍ×０．５ｃｍに切断し、６２．５μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果、固定化蛋白質量は０．５１ｍｇ／ｃｍ２であった。得られたシートはハサミでトリミングが可能であった。
【００５２】
実施例６
＜脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層の作製＞
エタノールに実施例１と同様に乳鉢で粉砕したトロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０ｗｔ％になるようにポリ乳酸（ＰＬ１８  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、トロンビン凍結乾燥粉末／ポリ乳酸＝１００／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、紡糸液流量は３．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。得られたシートを２ｃｍ×２ｃｍに切断し、１ｍＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性・ＥＬＩＳＡ測定を実施した。結果、活性測定値は２３Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は１６μｇ／ｃｍ２であった。
【００５３】
＜組織接着効果評価試験＞
フィブリノゲンの活性を確認するために、実施例５で作製した水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と実施例６で作製した脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層の組み合わせで接着試験を行った。接着力はウサギの皮と当該シート（２ｃｍ×２ｃｍ）を接着させ、フィブリンゲルが形成され、接着しているか確認した。この際、重ねたシートには事前に２００μＬの水を水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層に添加し、４０秒経過後に水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層をウサギの皮に貼付した。その後、３７℃で３分間静置後、皮とシートとの接着性を確認した。対照としてフィブリン接着材の成分が固定化されたコラーゲンシート製剤（製品名：タココンブ／ＣＳＬベーリング（株））：フィブリノゲンおよびトロンビン等の成分が、スポンジ状のウマコラーゲンのシートを支持体とし、シートの片面に真空乾燥により固着されたもの：２ｃｍ×２ｃｍ）を使用した。その結果、評価対象のシートは、比較対照のコラーゲンシート製剤以上の接着力を示した。
【００５４】
＜考察＞
比較例１で１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール／ＭＩＮＩＭＵＭ  ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＭＥＤＩＵＭ  ＥＡＧＬＥ  １０×（９／１＝ｖ／ｖ）を用いたのは、フィブリノゲン凍結乾燥粉末からエレクトロスピニング法による繊維成形体製造を可能にするためである。フィブリノゲンは水性溶媒に溶解することが困難なため、このフィブリノゲン凍結乾燥粉末にはフィブリノゲンの溶解性を増すための添加剤が含まれている。この比較例１ではかかるフィブリノゲン凍結乾燥粉末をそのまま用いているにもかかわらず、それを繊維成形体としたとき、そこからのフィブリノゲン溶出はみられなかった。
これに対し、実施例１−５にあるように、フィブリノゲンを平均粒子径０．０１〜１００μｍの粒子とし、その分散液を経てそれを水およびエタノールに溶解性のポリマーに含有させる形態とすることで、１秒以内の溶解が達成されたのである。また、実施例６からは、本発明のシート成形体においては、止血性蛋白質の生理活性は保持されていることがわかる。
一方、比較例２では、国際公開ＷＯ２００９／０３１６２０号に倣い、ボルヒールのフィブリノゲン凍結乾燥粉末をそのフィブリノゲン溶解液に溶解し、それを水溶性セルロース誘導体溶液と混合する方法を試みたが、均一な組成物を得ることができなかった。
【００５５】
＜実施例７〜１３についての測定法＞
１Ｂ．紡糸用ドープ中のフィブリノゲン、トロンビン、およびフィブリンの分散性：
脂肪族ポリエステル添加直前のフィブリノゲン、トロンビン、およびフィブリンの分散液を目視により観察し、これらの蛋白質の分散性を確認した。
２Ｂ．繊維成形体の厚み：１Ａと同じ方法により測定した。
３Ｂ．繊維径（平均繊維径）：２Ａと同じ方法により測定した。
４Ｂ．シートの取り扱い性：
得られた繊維成形体が容易に取り扱い可能であるかを定性的に評価した。
【００５６】
実施例７
フィブリノゲン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル１）を、ジェットミル（株式会社セイシン企業：商品名「超微少量ラボジェットミル」）を用いて微粒化した。これをエタノール（和光純薬（株）製）に添加し、超音波バスによる処理を５分間実施し、分散性に優れたフィブリノゲン分散液を調製した。得られた分散液にジクロロメタン（和光純薬（株）製）とＬ体１００％ポリ乳酸（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＬ１８、Ｐｕｒａｃ社製）を添加してポリ乳酸を溶解し、均一な溶液を調製した。得られた紡糸用ポリ乳酸溶液のポリ乳酸濃度は１０重量％、フィブリノゲン凍結乾燥粉末濃度は４重量％（フィブリノゲンとして１．８重量％）、エタノールとジクロロメタンの比が１：８重量比となるように調製した。ポリ乳酸添加前の蛋白質／有機溶媒分散液を目視観察すると、沈殿がなく均一な分散状態にあることがわかった。得られたポリ乳酸溶液を湿度３０％以下でエレクトロスピニング法により紡糸し、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０.８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体の平均繊維径は３.３μｍ、厚さは１６１μｍであり、柔軟かつ取り扱い可能であった。なお、上記エタノールの代わりにジクロロメタンを用いた場合（実施例１４）には得られた繊維成形体の取り扱い性に低下が認められ、この観点ではエタノールがより好ましいものと考えられた。
【００５７】
実施例８
トロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）をエタノール（和光純薬（株）製）に添加し、超音波バスによる処理を５分間実施し、分散性に優れたトロンビン分散液を調製した。得られた分散液にジクロロメタン（和光純薬（株）製）とＬ体１００％ポリ乳酸（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＬ１８、Ｐｕｒａｃ社製）を添加してポリ乳酸を溶解し、均一な溶液を調製した。得られた紡糸用ポリ乳酸溶液のポリ乳酸濃度は１０重量％、トロンビン凍結乾燥粉末濃度は４重量％（トロンビンとして０．０４５重量％）、エタノールとジクロロメタンの比が１：８重量比となるように調製した。ポリ乳酸添加前の蛋白質／有機溶媒分散液を目視観察すると、沈殿がなく均一な分散状態にあることがわかった。得られたポリ乳酸溶液を湿度３０％以下でエレクトロスピニング法により紡糸し、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０.８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体の平均繊維径は６.２μｍ、厚さは１７０μｍであり、柔軟かつ取り扱い可能であった。なお、上記エタノールの代わりにジクロロメタンを用いた場合（実施例１５）には得られた繊維成形体の取り扱い性に低下が認められ、この観点ではエタノールがより好ましいものと考えられた。
【００５８】
実施例９
トロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）をエタノール（和光純薬（株）製）に添加し、超音波バスによる処理を５分間実施し、分散性に優れたトロンビン分散液を調製した。得られた分散液にジクロロメタン（和光純薬（株）製）とＬ体１００％ポリ乳酸（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＬ１８、Ｐｕｒａｃ社製）を添加してポリ乳酸を溶解し、均一な溶液を調製した。得られた紡糸用ポリ乳酸溶液のポリ乳酸濃度は１０重量％、トロンビン凍結乾燥粉末濃度は７重量％（トロンビンとして０．０７８重量％）、エタノールとジクロロメタンの比が１：８重量比となるように調製した。ポリ乳酸添加前の蛋白質／有機溶媒分散液を目視観察すると、沈殿がなく均一な分散状態にあることがわかった。得られたポリ乳酸溶液を湿度３０％以下でエレクトロスピニング法により紡糸し、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０.８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体の平均繊維径は８.１μｍ、厚さは１７５μｍであり、柔軟かつ取り扱い可能であった。
【００５９】
実施例１０
トロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）をエタノール（和光純薬（株）製）に添加し、超音波バスによる処理を５分間実施し、分散性に優れたトロンビン分散液を調製した。得られた分散液にジクロロメタン（和光純薬（株）製）とＬ体１００％ポリ乳酸（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＬ１８、Ｐｕｒａｃ社製）を添加してポリ乳酸を溶解し、均一な溶液を調製した。得られた紡糸用ポリ乳酸溶液のポリ乳酸濃度は１０重量％、トロンビン凍結乾燥粉末濃度は１０重量％（トロンビンとして０．１１重量％）、エタノールとジクロロメタンの比が１：８重量比となるように調製した。ポリ乳酸添加前の蛋白質／有機溶媒分散液を目視観察すると、沈殿がなく均一な分散状態にあることがわかった。得られたポリ乳酸溶液を湿度３０％以下でエレクトロスピニング法により紡糸し、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０.８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体の平均繊維径は９.４μｍ、厚さは２１０μｍであり、柔軟かつ取り扱い可能であった。
【００６０】
実施例１１
トロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）をエタノール（和光純薬（株）製）に添加し、超音波バスによる処理を５分間実施し、分散性に優れたトロンビン分散液を調製した。得られた分散液にジクロロメタン（和光純薬（株）製）とポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＤＬＧ５０１０、Ｐｕｒａｃ社製）を添加してポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体を溶解し、均一な溶液を調製した。得られた紡糸用ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体溶液のポリマー濃度は１０重量％、トロンビン凍結乾燥粉末濃度は５重量％（トロンビンとして０．０６重量％）、エタノールとジクロロメタンの比が１：８重量比となるように調製した。ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体添加前の蛋白質／有機溶媒分散液を目視観察すると、沈殿がなく均一な分散状態にあることがわかった。得られたポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体溶液を湿度３０％以下でエレクトロスピニング法により紡糸し、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０.８ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体の平均繊維径は４．８μｍ、厚さは３３０μｍであり、柔軟かつ取り扱い可能であった。
【００６１】
実施例１２
トロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）を２−プロパノール（和光純薬（株）製）に添加し、超音波バスによる処理を５分間実施し、分散性に優れたトロンビン分散液を調製した。得られた分散液にジクロロメタン（和光純薬（株）製）とポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＤＬＧ５０１０、Ｐｕｒａｃ社製）を添加してポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体を溶解し、均一な溶液を調製した。得られた紡糸用ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体溶液のポリマー濃度は１０重量％、トロンビン凍結乾燥粉末濃度は５重量％（トロンビンとして０．０６重量％）、２−プロパノールとジクロロメタンの比が１：８重量比となるように調製した。ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体添加前の蛋白質／有機溶媒分散液を目視観察すると、沈殿がなく均一な分散状態にあることがわかった。得られたポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体溶液を湿度３０％以下でエレクトロスピニング法により紡糸し、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０.８ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体の平均繊維径は６.４μｍ、厚さは３２０μｍであり、柔軟かつ取り扱い可能であった。
【００６２】
実施例１３
エタノールにトロンビン凍結乾燥粉末（リコンビナントトロンビン１ｍｇ／ｍＬ、３．４％塩化ナトリウム、１．２％クエン酸ナトリウム、０．２９％塩化カルシウム、１％マンニトールｐＨ７を凍結乾燥したもの）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０重量％になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体（Ｐｕｒａｓｏｒｂ ＰＤＬＧ５０１０、Ｐｕｒａｃ社製）を溶解し、トロンビン凍結乾燥粉末／ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体＝１００（トロンビンとして１．６７）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２６℃、湿度２９％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は２０Ｖ、紡糸液流量は４．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルからアースされた平板までの距離は３５ｃｍであった。得られた繊維成形体の厚さは１３６μｍであり、柔軟かつ取り扱い可能であった。得られたシートのトロンビン溶出性を溶出試験により確認した。試験方法は以下に示す通りである。
【００６３】
＜溶出試験＞
（１）試料を直径６ｍｍの大きさに打ち抜き、質量を測定した。
（２）試料をマイクロチューブに入れ、ＨＰＣ含有生理食塩水、又は生理食塩水にて溶出試験を実施した。
（３）サンプリング時間は１０、３０、６０、１２０秒とする。
（４）サンプリングした試料を液体クロマトグラフィーにより測定を行い、ピーク面積からトロンビン含量を求めた。
（５）溶出率を下記の式より求めた。
溶出率（％）＝得られたトロンビン含量／理論固定化トロンビン含量×１００
理論固定化トロンビン含量は、仕込んだトロンビン重量％と繊維成形体の目付け  から算出した。
溶出試験の結果を図１に示す。ＨＰＣ含有生理食塩水では、生理食塩水よりも溶出率が向上した。これより、本発明の積層シート成形体において、シート中にＨＰＣを含有させることがトロンビンの溶出率の向上に寄与していることがわかった。
【００６４】
＜実施例１４〜１５、比較例３〜４についての測定法＞
１Ｃ．止血性蛋白質粒子粒子径（平均粒子径）：
紡糸溶液をデジタルマイクロスコープ（キーエンス株式会社：商品名「ＶＨＸ-１００」）により、倍率１０００倍で撮影して得た写真から無作為に１０個の粒子を選んで直径を測定し、平均値を平均粒子径とした。
２Ｃ．繊維成形体の厚み：１Ａと同じ方法により測定した。
３Ｃ．繊維径（平均繊維径）：２Ａと同じ方法により測定した。
４Ｃ．止血性蛋白質の溶出試験：
得られた繊維成形体を２ｃｍ×２ｃｍに切り出し、１ｍＬの生理食塩水に３分間もしくは３時間浸漬して水溶性成分を溶出させた。ｎ＝３〜６にて前後の重量変化を測定し、以下の式により算出した抽出率の平均値を求めた。水溶性成分理論重量は、仕込み止血性蛋白質重量％と繊維成形体の目付けから算出した。
抽出率［％］＝（重量減少［ｍｇ］／水溶性成分理論重量［ｍｇ］）×１００
５Ｃ．止血性蛋白質の担持性試験：
得られた繊維成形体を１ｃｍ×１ｃｍに切り出し、これを鋏でおよそ４分割となるように切り分けた。前後の重量を測定し、重量変化を算出した。
重量変化［％］＝（分割後の重量［ｍｇ］／分割前の重量［ｍｇ］）×１００
６Ｃ．繊維成形体の柔軟性試験：
（ＪＩＳ−Ｌ−１９０６  ８．１９．２  Ｂ法）スライド法を参考とし、試験片の大きさを０．５ｃｍ×３．５ｃｍとして、以下の手順により柔軟性測定を行った。試験機本体と移動台の上面が一致するようにしてから、幅０．５ｃｍ分をカバーガラスと試験機本体とで挟み込み形で試験片を設置した。移動台を降下させ、試験片の自由端が移動台から離れるときの降下長さδ値をスケールから算出した（δ値が大きいほど柔軟性が高い）。
【００６５】
実施例１４
フィブリノゲン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル１）を、ジェットミル（株式会社セイシン企業：商品名「超微少量ラボジェットミル」）を用いて微粒化した。これをジクロロメタン（和光純薬（株）製）に添加し、超音波バスによる処理を５分間実施することでフィブリノゲン分散液を調製した。Ｌ体１００％ポリ乳酸（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＬ１８、Ｐｕｒａｃ社製）を添加してポリマーを溶解し、溶液を調製した。得られた紡糸用ポリマー溶液のポリマー濃度は１０重量％、フィブリノゲン凍結乾燥粉末濃度は４重量％（フィブリノゲンとして１．８重量％）となるように調製した。紡糸溶液中に分散したフィブリノゲンの粒子径は１２μｍであった。得られたポリマー溶液を湿度３０％以下でエレクトロスピニング法により紡糸し、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０.８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体の平均繊維径は１４.９μｍ、厚さは３２５μｍであった。シート重量と仕込み比から算出した、シートに含まれるフィブリノゲン量は０．４３ ｍｇ／ｃｍ２であった。３時間浸漬後の抽出率は４０％であった。担持性試験における重量変化はなかった（１００％保持）。柔軟性試験から得られたδ値は２．７ｃｍであった。
【００６６】
実施例１５
トロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒールバイアル３）（凍結乾燥粉末４０ｍｇ中に１．１２％のトロンビン（７５０ｕｎｉｔ）を含む。）をジクロロメタン（和光純薬（株）製）に添加し、超音波バスによる処理を５分間実施することでトロンビン分散液を調製した。Ｌ体１００％ポリ乳酸（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＬ１８、Ｐｕｒａｃ社製）を添加してポリマーを溶解し、溶液を調製した。得られた紡糸用ポリマー溶液のポリマー濃度は１０重量％、トロンビン凍結乾燥粉末濃度は４重量％（トロンビンとして０．０４５重量％または７５０ユニット（Ｕ）／ｇ）となるように調製した。紡糸溶液中に分散したトロンビンの粒子径は９μｍであった。得られたポリマー溶液を湿度３０％以下でエレクトロスピニング法により紡糸し、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０.８ｍｍ、電圧は１２ｋＶ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。上記平板は、紡糸時は陰極として用いた。得られた繊維成形体の平均繊維径は１６.６μｍ、厚さは２９１μｍであった。シート重量と仕込み比から算出した、シートに含まれるトロンビン量は３１．３９Ｕ／ｃｍ２であった。
【００６７】
比較例３
トロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）をエタノール（和光純薬（株）製）に添加し、超音波バスによる処理を５分間実施し、トロンビン分散液を調製した。得られた分散液にジクロロメタン（和光純薬（株）製）とＬ体１００％ポリ乳酸（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＬ１８、Ｐｕｒａｃ社製）を添加してポリマーを溶解し、均一な溶液を調製した。得られた紡糸用ポリマー溶液のポリマー濃度は１０重量％、トロンビン凍結乾燥粉末濃度は４重量％（トロンビンとして０．０４５重量％または７５０Ｕ／ｇ）、エタノールとジクロロメタンの比が１：８重量比となるように調製した。紡糸溶液中に分散したトロンビンの粒子径は１２μｍであった。このポリマー溶液を風乾し、固体状態とした。繊維成形体と同様に溶出試験を行った結果、３分間浸漬後に約３％の水溶性成分が抽出された。
【００６８】
比較例４
繊維成形体として、ポリグリコール酸系不織布であるネオベール（登録商標、グンゼ株式会社製）を用い、以下の手順でフィブリノゲン固定化シートを作製した（凍結乾燥法）。市販の生体組織接着材（製品名：ボルヒール：一般財団法人化学及血清療法研究所製）のキットに含まれるフィブリノゲン溶液１．２５ｍＬを、上記の繊維成形体（５×５ｃｍ２）上に染み込ませた。この検体を凍結後、２４時間凍結乾燥させたものをフィブリノゲン固定化シートとした。担持性試験において、担持していたフィブリノゲンが崩壊し粉末として損失した（重量変化８９％）。柔軟性試験から得られたδ値は０．７ｃｍであった。
【００６９】
＜実施例１６〜２９についての測定法＞
１Ｄ．蛋白質粉末粒子径（平均粒子径）
フィブリノゲン凍結乾燥粉末を乳鉢で粉砕をしたものを、レーザー回折式粒度分布測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ：商品名「Ｍａｓｔｅｒ ｓｉｚｅｒ２０００」）により粒度分布を測定し、Ｄ５０値（メディアン径）を平均粒子径とした。
２Ｄ．フィブリノゲン含量測定
得られたシートはΦ０．５ｃｍに切り出した後、０．１％ＴＦＡ溶液によりフィブリノゲンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーで定量した。
【００７０】
＜試験条件＞
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２１４ｎｍ）
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏ  ＳＥＣ−３（３μｍ、３０ｎｍ、４．６×３００ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
カラム温度：３５℃
サンプラー温度：５℃
移動相：０．１％ＴＦＡ含有水／０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル＝５０／５０
流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
分析時間：１０ｍｉｎ
【００７１】
実施例１６
＜水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるシート成形体の作製＞
２−プロパノールにフィブリノゲン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル１）を分散させた後、１６重量％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（６−１０ｍＰａ・ｓ、和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース＝１００（フィブリノゲンとして４６）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１２．５ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルからアースされた平板までの距離は１５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は０．３５μｍ、平均厚みは１９１μｍ、目付は２．７４ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１４３ｍｇ／ｃｍ３であった。得られたシートを０．５ｃｍ×０．５ｃｍに切断し、６２．５μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してＥＬＩＳＡ測定（「７Ａ．ＥＬＩＳＡ測定（１）フィブリノゲン」に記載の方法）を実施した。その結果、固定化蛋白質量は０．５１ｍｇ／ｃｍ２であった。
【００７２】
実施例１７
＜脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなるシート成形体の作製＞
エタノールにトロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０重量％になるようにポリ乳酸（ＰＬ１８  Ｐｕｒａｃ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、トロンビン凍結乾燥粉末／ポリ乳酸＝１００（トロンビンとして１．１）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、紡糸液流量は３．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルからアースされた平板までの距離は２５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は９．３７μｍ、平均厚みは２１０μｍ、目付は３．１５ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１５０ｍｇ／ｃｍ３であった。得られたシートを２ｃｍ×２ｃｍに切断し、１ｍＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性（「８Ａ．トロンビン活性測定」に記載の方法）・ＥＬＩＳＡ測定（「７Ａ．ＥＬＩＳＡ測定（２）トロンビン」に記載の方法）を実施した。その結果、活性測定値は２３．０Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は、１６μｇ／ｃｍ２であった。
【００７３】
実施例１８
＜積層シート成形体の組織接着効果評価試験＞
実施例１６で作製した水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるシート成形体と実施例１７で作製した脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなるシート成形体の組み合わせで使用した場合の効果を確認するために、接着力の比較を行った。接着力はウサギの皮と当該シート（２ｃｍ×２ｃｍ）を接着させ、フィブリンゲルが形成され、接着しているか確認した。この際、重ねたシートには事前に２００μＬの水を水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるシート成形体に添加し、４０秒経過後に水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるシート成形体をウサギの皮に貼付した。その後、３７℃で３分間静置後、皮とシート成形体との接着性を確認した。対照としてフィブリン接着材の成分が固定化されたコラーゲンシート製剤（製品名：タココンブ／ＣＳＬベーリング（株））：フィブリノゲンおよびトロンビン等の成分が、スポンジ状のウマコラーゲンのシートを支持体とし、シートの片面に真空乾燥により固着されたもの：２ｃｍ×２ｃｍ）を使用した。その結果、本発明の積層シート成形体は比較対照のコラーゲンシート製剤以上の接着力を示した。
【００７４】
実施例１９
＜水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるシート成形体の作製＞
２−プロパノールにフィブリノゲン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル１）を分散させた後、１６重量％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（６−１０ｍＰａ・ｓ  和光純薬製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース＝１００（フィブリノゲンとして４６）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１２．５ｋＶ、紡糸液流量は１．２ｍＬ／ｈ、噴出ノズルからアースされた平板までの距離は１５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は０．３５μｍ、平均厚みは１９１μｍ、目付は２．７４ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１４３ｍｇ／ｃｍ３であった。得られたシートを２０ｋＧｙで電子線滅菌した。滅菌したシートを０．５ｃｍ×０．５ｃｍに切断して、６２．５μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してＥＬＩＳＡ測定（「７Ａ．ＥＬＩＳＡ測定（１）フィブリノゲン」に記載の方法）を実施した。その結果、固定化蛋白質量は０．７８ｍｇ／ｃｍ２であった。
【００７５】
実施例２０
＜脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなるシート成形体の作製＞
エタノールにトロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０重量％になるようにポリ乳酸（ＰＬ１８  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、トロンビン凍結乾燥粉末／ポリ乳酸＝１００（トロンビンとして１．１）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、紡糸液流量は３．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルからアースされた平板までの距離は２５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は９．３７μｍ、平均厚みは２１０μｍ、目付は３．１５ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１５０ｍｇ／ｃｍ３であった。得られたシート成形体を２０ｋＧｙで電子線滅菌した。得られたシート成形体を２ｃｍ×２ｃｍに切断し、１ｍＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性（「８Ａ．トロンビン活性測定」に記載の方法）・ＥＬＩＳＡ測定（「７Ａ．ＥＬＩＳＡ測定（２）トロンビン」に記載の方法）を実施した。その結果、活性測定値は１４．７Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は１１．４μｇ／ｃｍ２であった。
【００７６】
実施例２１
＜ウサギ肝臓滲出性出血に対する止血効果＞
実施例１９で作製した水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるシート成形体と実施例２０で作製した脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなるシート成形体の組み合わせで使用した場合の止血効果を、タココンブを使用した場合の止血効果と比較した。
動物の止血モデルとしてはウサギを用いた。ウサギを開腹し、肝臓の一部を切除して、その出血部位に対して、水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなるシート成形体と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなるシート成形体を重ねて適用し、その止血効果（止血の有無、出血量）をみた。試験方法は以下に示す通りである。
（１）セラクタール１０ｍｇ／ｋｇ（約１.０ｍＬ）ケタラール５０ｍｇ／ｋｇ（約３.０ｍＬ）を筋肉内投与した。
（２）体重を測定し、腹部を剃毛後、仰臥位にて保定した。
（３）耳静脈より持続麻酔（２％ケタラール、２０Ｕ／ｍＬヘパリン添加生理食塩水）を行った。
（４）胸骨剣状突起直下から下腹部までを正中切開により開腹した。
（５）ヘパリンナトリウム注射液を耳静脈より３００Ｕ／ｋｇ投与した。
（６）腸用ピンセットやガーゼなどを用いて創傷作製に十分な厚みのある肝葉（外側左葉、内側左葉、右葉）を引き出した。
（７）肝葉に皮ポンチで直径１０ｍｍ、深さ４ｍｍの創傷を作り、その部分をメスで切除した。
（８）切除創からの出血を１０秒間、ベンシーツに吸収してその重量を測定した。創傷部出血が０.５ｇ以上の傷を試験に使用した。
（９）創傷部位に２.５ｃｍ角に切断した水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を重ねて、出血部位に水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層を適用し、１分間圧迫した。対照として用いるタココンブの場合は、２.５ｃｍ角に切断した後に生理食塩水を３１２.５μＬ滴下し、出血部位に適用し、１分間圧迫した。
（１０）圧迫後、出血の有無および創傷部位からの出血をベンシーツに吸収して、その重量を測定した。
その結果、本発明の積層シート成形体を用いた場合、止血し（ｎ＝１）、適用後１分間の出血量は０．００３ｇと極めて微量であった。一方、対照として用いたタココンブの場合（ｎ＝５）、適用後１分間の出血量は１．５７ｇと止血効果は不十分であり、出血量が多かった。
【００７７】
実施例２２
＜脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなるシート成形体の作製＞
エタノールにトロンビン凍結乾燥粉末（リコンビナントトロンビン１ｍｇ／ｍＬ、３．４％塩化ナトリウム、１．２％クエン酸ナトリウム、０．２９％塩化カルシウム、１％マンニトールｐＨ７を凍結乾燥したもの）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０重量％になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＤＬＧ５０１０、Ｐｕｒａｃ社製）を溶解し、トロンビン凍結乾燥粉末／ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体＝１００（トロンビンとして１．６７）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は２０ｋＶ、紡糸液流量は４．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルからアースされた平板までの距離は３５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は３．８μｍ、平均厚みは１２７μｍ、目付は１．３８ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１０９ｍｇ／ｃｍ３であった。得られたシート成形体をΦ１ｃｍに切り出し、２００μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してトロンビン活性測定（「８Ａ．トロンビン活性測定」に記載の方法）を実施した。その結果、活性測定値は１８．３Ｕ／ｃｍ２であった。
【００７８】
実施例２３
＜水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体の作製＞
フィブリノゲン凍結乾燥粉末（リコンビナントフィブリノゲン１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭアルギニン、１３０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％マンニトール  ｐＨ８．５を凍結乾燥したもの）を乳鉢で粉砕し、平均粒子径が３０μｍの粉砕フィブリノゲン凍結乾燥粉末を作製した。２−プロパノールにこの粉砕したフィブリノゲン凍結乾燥粉末を分散させた後、１５重量％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（２．０−２．９ｍＰａ・ｓ  日本曹逹製）およびマクロゴール（分子量：４００  三洋化成工業製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース／マクロゴール＝５１（フィブリノゲンとして２５．９２）／３４／１５（ｗ／ｗ／ｗ）のドープ液を調製した。得られたドープ液を用い、流延法によりフィルムを作製した。塗工間隔は１２７μｍで、塗工速度は３０．１ｍｍ／ｓｅｃであった。フィルム作製後、１分以内に実施例２２で作製した脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を上部から積載することで水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体を得た。得られた積層シート成形体の平均膜厚は１５７μｍであった。得られた積層シート成形体を２０ｋＧｙで電子線滅菌した。得られた積層シート成形体をΦ１ｃｍに切り出し、２００μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してフィブリノゲンのＥＬＩＳＡ測定（「７Ａ．ＥＬＩＳＡ測定（１）フィブリノゲン」に記載の方法）を実施した。結果、固定化蛋白質量は０．５８ｍｇ／ｃｍ２であった。
【００７９】
実施例２４
＜ウサギ肝臓滲出性出血に対する止血効果＞
実施例２３で作製した水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体の止血効果を、タコシールを使用した場合の止血効果と比較した。
動物の止血モデルとしてはウサギを用いた。ウサギを開腹し、肝臓の一部を切除し、その出血部位に対して、水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体を適用し、その止血効果（止血の有無、出血量）をみた。試験方法は実施例２１に記載の方法と同じである。
その結果、本発明の積層シート成形体を用いた場合（ｎ＝４）、適用後１分間の出血量は０．００３ｇと極めて微量であった。一方、対照として用いたタコシールの場合（ｎ＝４）、適用後１分間の出血量は０．６５ｇと止血効果は不十分であり、出血量が多かった。
【００８０】
実施例２５
＜脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなるシート成形体の作製＞
エタノールにトロンビン凍結乾燥粉末（リコンビナントトロンビン１ｍｇ／ｍＬ、３．４％塩化ナトリウム、１．２％クエン酸ナトリウム、０．２９％塩化カルシウム、１％マンニトールｐＨ７を凍結乾燥したもの）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０重量％になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体（Ｐｕｒａｓｏｒｂ ＰＤＬＧ５０１０、Ｐｕｒａｃ社製）を溶解し、トロンビン凍結乾燥粉末／ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体＝１００（トロンビンとして１．６７）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は２０ｋＶ、紡糸液流量は４．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルからアースされた平板までの距離は３５ｃｍであった。得られた繊維成形体の平均繊維径は２．９７μｍ、平均厚みは１３７μｍ、目付は１．４９ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度は１０８ｍｇ／ｃｍ３であった。
【００８１】
実施例２６
＜水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体の作製＞
フィブリノゲン凍結乾燥粉末（リコンビナントフィブリノゲン１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭアルギニン、１３０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％マンニトール  ｐＨ８．５を凍結乾燥したもの）を乳鉢で粉砕し、平均粒子径が３０μｍの粉砕フィブリノゲン凍結乾燥粉末を作製した。２−プロパノールにこの粉砕したフィブリノゲン凍結乾燥粉末を分散させた後、２．９重量％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（２．０−２．９ｍＰａ・ｓ  日本曹逹製）およびマクロゴール（分子量：４００  三洋化成工業製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース／マクロゴール＝９０（フィブリノゲンとして３６．９８）／７／３（ｗ／ｗ／ｗ）のドープ液を調製した。得られたドープ液を用い、流延法によりフィルムを作製した。塗工間隔は５０．８μｍで、塗工速度は３０．１ｍｍ／ｓｅｃであった。フィルム作成後、１分以内に実施例２５で作製した脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を上部から積載することで、水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体を得た。得られた積層シート成形体の平均膜厚は１６９μｍであった。得られた積層シート成形体をΦ０．５ｃｍに切り出し、０．１％ＴＦＡ溶液でフィブリノゲンを抽出して高速液体クロマトグラフィーにより定量（「２Ｄ．フィブリノゲン含量測定」記載の方法）した。その結果、固定化蛋白質量は０．５４ｍｇ／ｃｍ２であった。
【００８２】
実施例２７
＜ウサギ肝臓滲出性出血に対する止血効果＞
実施例２６で作製した水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体の止血効果を、タコシールを使用した場合の止血効果と比較した。
動物の止血モデルとしてはウサギを用いた。ウサギを開腹し、肝臓の一部を切除し、その出血部位に対して水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体を適用し、その止血効果（止血の有無、出血量）をみた。試験方法は実施例２１に記載の方法と同じである。
その結果、本発明の積層シート成形体を用いた場合（ｎ＝６）、適用後１分間の出血量は０．００３ｇと極めて微量であった。一方、実施例２４に示したように対照として用いたタコシールの場合（ｎ＝４）、適用後１分間の出血量は０．６５ｇと止血効果は不十分であり、出血量が多かった。
【００８３】
実施例２８
フィブリノゲン凍結乾燥粉末（リコンビナントフィブリノゲン１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭアルギニン、１１０ｍＭ塩化ナトリウム、１％グリシン、０．２％マンニトール、０．２５％フェニルアラニン、０．４％ヒスチジン、０．１％クエン酸３ナトリウム  ｐＨ８．５を凍結乾燥したもの）を乳鉢で粉砕し、平均粒子径が２２μｍの粉砕フィブリノゲン凍結乾燥粉末を作製した。２−プロパノールにこの粉砕したフィブリノゲン凍結乾燥粉末を分散させた後、４．２重量％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（２．０−２．９ｍＰａ・ｓ  日本曹逹製）を溶解し、フィブリノゲン凍結乾燥粉末／ヒドロキシプロピルセルロース／＝９０（フィブリノゲンとして２６．５５）／１０（ｗ／ｗ）のドープ液を調製した。得られたドープ液を用い、流延法によりフィルムを作製した。塗工間隔は１０１．６μｍで、塗工速度は３０．１ｍｍ／ｓｅｃであった。フィルム作成後、３分以内に実施例２５に記載の方法で作製したトロンビン凍結乾燥粉末／ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体＝２０／１００、４０／１００、６０／１００、８０／１００、１００／１００の比率のシート状繊維成形体を上部から積載することで、水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体を得た。これらの積層シート成形体の止血効果をラットoozingモデル薬効評価（ラット肝臓に創傷をつけた滲出血モデルを用いて試験を実施した。被験シート成形体を創傷部に一定時間（本実施例では５分間）圧迫し、その後1分間出血の有無を目視にて評価。）で確認した。試験はｎ＝６で実施し、出血の有無を確認した。
その結果、表１に示すように、評価したトロンビン凍結乾燥粉末／ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体の比率、２０／１００〜１００／１００の範囲において、いずれもタコシールを上回る止血効果が確認された。
【００８４】
【表１】
2013172472.tif 000007
【００８５】
実施例２９
実施例２５に記載の方法で、トロンビン含量の異なるシート状繊維成形体を得た（トロンビン含量０．２３Ｕ／ｃｍ２、２．８Ｕ／ｃｍ２、１１．４Ｕ／ｃｍ２、２８．５Ｕ／ｃｍ２）。ついで実施例２６に記載の方法でフィブリノゲン含量が一定の水溶性ポリマーおよびフィブリノゲンからなる層と脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体を得た。得られたフィブリノゲン含量が一定でトロンビン含量の異なる積層シート成形体を用いて、トロンビン含量の接着力に及ぼす影響を評価した。試験方法は下記に示す通りである。
（１）積層シート成形体及び陽性対照製剤（タコシール）（１ｃｍ×１ｃｍ）をプラスチック製四角柱の底部（１ｃｍ×１ｃｍ）に両面テープで接着させた。
（２）積層シート成形体及び陽性対照製剤（タコシール）を１ｍＬの生理食塩水に１０秒間浸し、ラワン板に密着させた。
（３）四角柱の上から１００ｇの加重を５分間かけた。
（４）四角柱を３０ｍｍ／ｍｉｎ．の速度で牽引し、デジタルフォースゲージにて張力を測定した。
試験はｎ＝５で実施し、張力平均値を接着力（ｇ）として評価した。その結果、表２に示すように、いずれの積層シート成形体もタコシールよりも高い接着力を示した。
【００８６】
【表２】
2013172472.tif 000008
【００８７】
実施例３０
実施例２５に記載の方法で、脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなるシート成形体を得た（トロンビン含量２４．２Ｕ／ｃｍ２）。このシート成形体の止血効果を実施例２８に記載の方法（圧迫時間は３分間）で確認した。試験はｎ＝６で実施した。その結果、６／６で止血が確認された。
【００８８】
実施例３１
実施例２５に記載の方法で脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなるシート成形体（トロンビン含量範囲：１９〜２６Ｕ／ｃｍ２）を得て、ついで実施例２６に記載の方法で、水溶性ポリマーおよび含量が異なるフィブリノゲンからなる層と、脂肪族ポリエステルおよびトロンビンからなる層を含んでなる積層シート成形体を得た。得られたトロンビン含量が一定範囲内でフィブリノゲン含量の異なる積層シート成形体の止血効果を実施例２８に記載の方法で確認した。その結果、表３に示すように、いずれのフィブリノゲン含量でも高い止血効果が確認されたが１．４７ｍｇ／ｃｍ２の場合やや効果が低下した。
【００８９】
【表３】
2013172472.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明のシート成形体は止血材として用いられ、医療品製造業で利用できる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノゲンおよびトロンビンよりなる群から選ばれる少なくとも一種の蛋白質と、脂肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマーを含有してなりそして該蛋白質の少なくとも一部分が該ポリマー内部に入り込んでいるポリマー組成物のシート成形体。
【請求項２】
肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマーが、セルロース誘導体、Ｎ−ビニル環状ラクタム単位を有するポリマー、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、デキストラン、プルラン、デンプン、およびそれらの混合物からなる群から選ばれるものである、請求項１に記載のシート成形体。
【請求項３】
肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマーが、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウム  カルボキシメチルセルロース、およびそれらの混合物からなる群から選ばれるものである、請求項１に記載のシート成形体。
【請求項４】
脂肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマーが、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、およびそれらの共重合体、ならびにそれらの混合物からなる群から選ばれるものである、請求項１に記載のシート成形体。
【請求項５】
シート成形体がフィルム成形体または繊維成形体である請求項１から４のいずれかに記載のシート成形体。
【請求項６】
フィブリノゲンと水溶性ポリマーを含有してなりそしてフィブリノゲンの少なくとも一部分が該水溶性ポリマー内部に入り込んでいる第１ポリマー組成物層およびトロンビンと脂肪族ポリエステルを含有してなりそしてトロンビンの少なくとも一部分が該脂肪族ポリエステル内部に入り込んでいる第２ポリマー組成物層を含有してなる積層シート成形体。
【請求項７】
水溶性ポリマーがセルロース誘導体、Ｎ−ビニル環状ラクタム単位を有するポリマー、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、デキストラン、プルラン、デンプン、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項６に記載の積層シート成形体。
【請求項８】
水溶性ポリマーがヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウム  カルボキシメチルセルロース、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項６に記載の積層シート成形体。
【請求項９】
脂肪族ポリエステルがポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、およびそれらの共重合体、ならびにそれらの混合物からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項６から８のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１０】
第１のポリマー組成物層が、血液凝固第ＸＩＩＩ因子、アルブミン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、界面活性剤、塩化ナトリウム、糖アルコール、トレハロース、クエン酸ナトリウム、アプロチニンおよび塩化カルシウムからなる群から選ばれる少なくとも一種の添加剤を含む、請求項６から９のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１１】
第１のポリマー組成物層がフィルム成形体または繊維成形体からなる請求項６から１０のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１２】
第１のポリマー組成物層がフィルム成形体からなる請求項６から１０のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１３】
フィルム成形体中の水溶性ポリマーの含量が０．１〜５０重量％である請求項１２に記載の積層シート成形体。
【請求項１４】
フィルム成形体がフィブリノゲンを０．０５〜１０ｍｇ／ｃｍ２含む請求項１２または１３に記載の積層シート成形体。
【請求項１５】
フィルム成形体が水溶性ポリマー溶液とフィブリノゲン粉末からなる懸濁溶液から製造された請求項１２から１４のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１６】
第２ポリマー組成物層が繊維成形体からなる請求項６から１５のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１７】
脂肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマー中に、フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲンと添加剤との混合物および／またはトロンビンまたはトロンビンと添加物の混合物が蛋白質粒子として分散して存在している請求項６〜１６のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１８】
止血性蛋白質がトロンビンである請求項１７に記載の積層シート成形体。
【請求項１９】
蛋白質粒子と脂肪族ポリエステルの重量比が１０：１０〜１００である請求項１８に記載の積層シート成形体
【請求項２０】
繊維成形体が脂肪族ポリエステル溶液とトロンビン粉末からなる懸濁溶液から製造された請求項１７から１９のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項２１】
請求項１から５のいずれかのシート成形体または請求項６から２０のいずれかの積層シート成形体からなる止血材。
【請求項２２】
請求項１から５のいずれかのシート成形体または請求項６から２０のいずれかの積層シート成形体からなる組織接着材または組織閉鎖材。
【手続補正書】
【提出日】平成27年6月5日(2015.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノゲンおよびトロンビンよりなる群から選ばれる少なくとも一種の蛋白質と、脂肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種の繊維状のポリマーを含有してなりそして該蛋白質の少なくとも一部分が該ポリマー内部に入り込んでいるポリマー組成物のシート成形体。
【請求項２】
脂肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマーが、セルロース誘導体、Ｎ−ビニル環状ラクタム単位を有するポリマー、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、デキストラン、プルラン、デンプン、およびそれらの混合物からなる群から選ばれるものである、請求項１に記載のシート成形体。
【請求項３】
脂肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマーが、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウム  カルボキシメチルセルロース、およびそれらの混合物からなる群から選ばれるものである、請求項１に記載のシート成形体。
【請求項４】
脂肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマーが、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、およびそれらの共重合体、ならびにそれらの混合物からなる群から選ばれるものである、請求項１に記載のシート成形体。
【請求項５】
シート成形体がフィルム成形体または繊維成形体である請求項１から４のいずれかに記載のシート成形体。
【請求項６】
フィブリノゲンと水溶性ポリマーを含有してなりそしてフィブリノゲンの少なくとも一部分が該水溶性ポリマー内部に入り込んでいる第１ポリマー組成物層およびトロンビンと繊維状の脂肪族ポリエステルを含有してなりそしてトロンビンの少なくとも一部分が該脂肪族ポリエステル内部に入り込んでいる第２ポリマー組成物層を含有してなる積層シート成形体。
【請求項７】
水溶性ポリマーがセルロース誘導体、Ｎ−ビニル環状ラクタム単位を有するポリマー、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、デキストラン、プルラン、デンプン、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項６に記載の積層シート成形体。
【請求項８】
水溶性ポリマーがヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウム  カルボキシメチルセルロース、およびそれらの混合物からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項６に記載の積層シート成形体。
【請求項９】
脂肪族ポリエステルがポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、およびそれらの共重合体、ならびにそれらの混合物からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項６から８のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１０】
第１のポリマー組成物層が、血液凝固第ＸＩＩＩ因子、アルブミン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、界面活性剤、塩化ナトリウム、糖アルコール、トレハロース、クエン酸ナトリウム、アプロチニンおよび塩化カルシウムからなる群から選ばれる少なくとも一種の添加剤を含む、請求項６から９のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１１】
第１のポリマー組成物層がフィルム成形体または繊維成形体からなる請求項６から１０のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１２】
第１のポリマー組成物層がフィルム成形体からなる請求項６から１０のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１３】
フィルム成形体中の水溶性ポリマーの含量が０．１〜５０重量％である請求項１２に記載の積層シート成形体。
【請求項１４】
フィルム成形体がフィブリノゲンを０．０５〜１０ｍｇ／ｃｍ２含む請求項１２または１３に記載の積層シート成形体。
【請求項１５】
フィルム成形体が水溶性ポリマー溶液とフィブリノゲン粉末からなる懸濁溶液から製造された請求項１２から１４のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１６】
第２ポリマー組成物層が繊維成形体からなる請求項６から１５のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１７】
脂肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種のポリマー中に、フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲンと添加剤との混合物および／またはトロンビンまたはトロンビンと添加物の混合物が蛋白質粒子として分散して存在している請求項６〜１６のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項１８】
止血性蛋白質がトロンビンである請求項１７に記載の積層シート成形体。
【請求項１９】
蛋白質粒子と脂肪族ポリエステルの重量比が１０：１０〜１００である請求項１８に記載の積層シート成形体
【請求項２０】
繊維成形体が脂肪族ポリエステル溶液とトロンビン粉末からなる懸濁溶液から製造された請求項１７から１９のいずれかに記載の積層シート成形体。
【請求項２１】
請求項１から５のいずれかのシート成形体または請求項６から２０のいずれかの積層シート成形体からなる止血材。
【請求項２２】
請求項１から５のいずれかのシート成形体または請求項６から２０のいずれかの積層シート成形体からなる組織接着材または組織閉鎖材。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第１に、フィブリノゲンおよびトロンビンよりなる群から選ばれる少なくとも一種の蛋白質と、脂肪族ポリエステルおよび水溶性ポリマーよりなる群から選ばれる少なくとも一種の繊維状のポリマーを含有してなりそして該蛋白質の少なくとも一部分が該ポリマー内部に入り込んでいるポリマー組成物のシート成形体によって達成される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第２に、前段落のシート成形体の組合せとしてフィブリノゲンと水溶性ポリマーを含有してなりそしてフィブリノゲンの少なくとも一部分が該水溶性ポリマー内部に入り込んでいる第１のシート成形体層およびトロンビンと繊維状の脂肪族ポリエステルを含有してなりそしてトロンビンの少なくとも一部分が該脂肪族ポリエステル内部に入り込んでいる第２のシート成形体層を含有してなる積層シート成形体によって達成される。
【国際調査報告】
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