(57)【要約】  ガラス化法に代わる緩慢凍結法に用いられ、高い細胞生存率を有し、かつ、簡便で効率良い、幹細胞の保存媒体、保存方法および保存システムを提供する。幹細胞保存媒体は、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、エチレングリコール(ＥＧ)を含有する。幹細胞保存方法は、プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離する剥離工程と、剥離した幹細胞を幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる凍結工程とを備える。本発明の幹細胞保存媒体、或いは、ＨＥＳとＤＭＳＯと、培地もしくはアルブミン溶液とを含む媒体を用いる。幹細胞保存システムは、幹細胞を剥離する剥離手段としてのプロナーゼ溶液、本発明の幹細胞保存媒体、剥離した幹細胞を細胞保存媒体中で緩慢凍結させる緩慢凍結手段を備える。
2013187077.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を保存するための媒体であって、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、エチレングリコール(ＥＧ)を含有する幹細胞保存媒体。
【請求項２】
エチレングリコール(ＥＧ)が、２〜１５％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、請求項１に記載の幹細胞保存媒体。
【請求項３】
ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)が、４〜８％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、請求項１又は２に記載の幹細胞保存媒体。
【請求項４】
ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)が、４〜６％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、請求項１〜３のいずれかに記載の幹細胞保存媒体。
【請求項５】
血清、血清の代替成分、蛋白成分、動物由来成分のいずれの成分も含有していない、請求項１〜４のいずれかに記載の幹細胞保存媒体。
【請求項６】
幹細胞を緩慢凍結させる保存方法であって、
プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離する剥離工程と、
剥離した幹細胞を幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる凍結工程と、
を備え、
前記幹細胞保存媒体は、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)を含有する媒体、
或いは、
ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)と、培地（culture medium）もしくはアルブミン溶液とを含む媒体、
である、幹細胞保存方法。
【請求項７】
上記の剥離工程において、クランプサイズが２００〜１００００μｍ２である、請求項６に記載の幹細胞保存方法。
【請求項８】
上記の凍結工程において、前記幹細胞保存媒体中の幹細胞は、前記保存媒体１ミリリットル当り１×１０３〜１×１０６個の範囲で存在する、請求項６に記載の幹細胞保存方法。
【請求項９】
上記の凍結工程において、前記幹細胞保存媒体は、凍結チューブ１本当り略０．２〜１ミリリットルとする、請求項８に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１０】
エチレングリコール(ＥＧ)が、２〜１５％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、請求項６に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１１】
ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)が、４〜８％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、請求項６に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１２】
ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)が、４〜６％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、請求項６に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１３】
前記培地は、ダルベッコ改変Eagle(ＤＭＥＭ培地)およびＦ１２培地からなる群より選択される培地またはそれらの混合物を含む、請求項６に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１４】
前記アルブミン溶液は、略４％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項６に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１５】
前記幹細胞保存媒体は、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)を含有する媒体であり、
上記の凍結工程の後、急速解凍を行う解凍工程を更に含み、
該解凍工程は、凍結チューブに温培地を添加して急速解凍、もしくはウォーターバス（３７℃湯浴）にて融解するものである、請求項６〜１４のいずれかに記載の幹細胞保存方法。
【請求項１６】
上記解凍工程の後、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した温培地で培養する培養工程を更に含む、請求項１５に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１７】
前記幹細胞が、組織幹細胞および胚性幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹(ｉＰＳ)細胞からなる群より選択される幹細胞である、請求項６に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１８】
幹細胞を保存するためのシステムであって、
幹細胞を剥離する剥離手段としてのプロナーゼ溶液、
請求項１〜５のいずれかの幹細胞保存媒体、
剥離した幹細胞を上記の幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる緩慢凍結手段、
を備える幹細胞保存システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞、特に霊長類の誘導性多能性幹細胞（以下、ｉＰＳ細胞）や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の保存媒体、保存方法、保存システムであって、ガラス化法ではなく、緩慢凍結保存により簡便で効率良い保存のための技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞の産業利用としては、再生医療分野と創薬研究分野が考えられているが、両分野において共通して重要な点は、細胞を一定の品質で培養し供給することである。特に、ヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞の場合、マウスのものと異なり凍結保存後の生存率が低いという問題点を抱えており、産業化には凍結保存の技術が必要である。【０００３】
ヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞の凍結保存には、ガラス化法(vitrification)と緩慢凍結法とがある。現在、日本国内では、例えば、理化学研究所バイオリソースセンターの研究用ｉＰＳバンクでは、ＤＡＰ２１３というガラス化液を用いてヒトｉＰＳ細胞をガラス化法により凍結保存している。ＤＡＰ２１３はマウスの受精卵の保存用に開発されたガラス化液であるが、ＤＭＳＯ
２Ｍ,アセトアミド １Ｍ,プロピレングリコール ３Ｍという高い溶質濃度をもつため、浸透圧による毒性が非常に高く、ヒトを含む霊長類ｉＰＳ／ＥＳ細胞を凍結する際には、懸濁を始めてから液体窒素に浸漬するまでに要する時間を１０秒程度という短時間処理や解凍時に液体窒素から取り出した後、ただちに、３７℃にあらかじめ温めておいた培地を迅速に添加し急速解凍が必要であり、インキュベータによるチューブごと解凍ができないなど手技的にかなりの熟練を要する。【０００４】
特に、ガラス化法では、水を結晶化させずにガラス状態で固化、凍結する。そのためには、溶質（細胞凍害保護剤）の濃度を高めることと、冷却速度を大きくするということが必要となる。溶質の濃度が高いほど水の分子運動が制限されてガラス化しやすくなるが、一方で浸透圧が高くなり、細胞への毒性も高くなる。
また、凍結時よりもむしろ溶解時に再結晶化が起こることにより細胞がダメージを受けることがより大きな問題となっている。【０００５】
一方、ヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞の緩慢凍結法としては、Ｈａ  ＳＹらが、ヒトＥＳ細胞（ＳＮＵｈＥＳ−３株）を０．２５％(ｗ／ｖ)ｔｒｙｐｓｉｎ−０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液で細胞剥離した後、凍結保存液  ５％  ＤＭＳＯ＋５０％  ＦＢＳ(fetal bovine serum)＋１０％  ＥＧ５％＋ＤＭＥＭ／Ｆ１２を緩慢凍結後、急速解凍し、生存率３０．２％を報告している（非特許文献１を参照）。
ＷｕＣＦらは、ヒトＥＳ細胞（ｈＥＳ１株）のトレハロースを含む凍結保存液により緩慢凍結後、急速解凍し、生存率４８％であったことを報告している（非特許文献２を参照）。【０００６】
また、Ｈｏｌｍ  Ｆらは、ヒトＥＳ細胞株ＨＳ２９３，ＨＳ３０６およびヒトｉＰＳ細胞株（ＣＨｉＰＳＡ株）をセルスクレイパーにて物理的に細胞剥離した後、独自の凍結保存液  ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）（ＤＭＳＯ、anhydrous dextrose とpolymerを含む)にて緩慢凍結後、融解時に 独自の解凍液ＣＥＬＬＯＴＩＯＮ（登録商標）を用いて急速解凍し、生存率９０〜９０．６％を報告している（非特許文献３を参照）。【０００７】
類似技術として、Ｔ’Ｊｏｅｎらは、ヒトＥＳ細胞の複数株に対してＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ IVに続いてＣｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎの二段階処理により細胞クランプを小さくなるように細胞剥離し、凍結保存液５％  ＨＥＳ  ＋５％  ＤＭＳＯ
＋保存用培地 (８０％  ＤＭＥＭ／Ｆ１２  ＋  ２０％  ＫＳＲ  ＋  ４００μＬ  ＨＥＰＥＳ)を用いてプログラムフリーザーを用いて緩慢凍結した後、融解時に０．１Ｍスクロースを含む特殊な回復培地を添加して５分間インキュベート処理すると生存率８０％を報告している（非特許文献４を参照）。
なお、彼らは、凍結保存液５％  ＨＥＳ＋５％もしくは１０％  ＥＧ
＋凍結用培地 （８０％  ＤＭＥＭ／Ｆ１２  ＋  ２０％  ＫＳＲ  ＋  ４００μＬ  ＨＥＰＥＳ)を用い緩慢凍結した場合、生存率が０％であることも報告しており、ＤＭＳＯは有効であるが、エチレングリコール単独では凍結保護効果がないことも報告している。【０００８】
以上のように、ガラス化法に代わる緩慢凍結法の試みに関していくつかの報告があるが、まだ一般的な方法としては普及していない。その理由として、低い再現性や、ガラス化法と比較して簡便ではないこと、長時間作業を必要とすること等が挙げられる。
また、最近ではＴｒｙｐＬＥ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓやｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡを用いて細胞をシングルセルに細胞剥離した後、凍結保存し、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２を１０μＭ添加培養により生存率を向上させる方法も複数のグループから報告もある（非特許文献５〜非特許文献９を参照）。
従って、もっとハンドリングが容易で効率が高く、毒性が低く、再現性が高く堅牢な新しい凍結保存方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】HumanReproduction 20,1779-1785, 2005
【非特許文献２】ReprodBiomed Online 11,733-739, 2005
【非特許文献３】HumanReproduction 25,1271-1279 2010
【非特許文献４】T’Joen et al., An efficient, economical slow-freezing method for large-scale humanembryonic stem cell banking Stem Cells and Dev 2012 21:721-8
【非特許文献５】WatanabeK etal.,Nat Biotechnol 25,681-686, 2007
【非特許文献６】Martin-IbanezR etal., Human Reprod 23,2744-2754,2008
【非特許文献７】Martin-IbanezR etal., Human Reprod 24,492-493,2009
【非特許文献８】LiXY etal., Human Reprod 24, 580-589, 2009
【非特許文献９】MollamohammadiS etal., Human Reprod 24, 2468-2476
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述の如く、ガラス化法では、細胞凍害保護剤の濃度を高めることと、冷却速度を大きくするといった煩雑な操作が必要である。一方、ガラス化法に代わり試行されている緩慢凍結法では、低い細胞生存率であり、またガラス化法と比較して簡便でない。
上記状況に鑑みて、本発明は、ガラス化法に代わる緩慢凍結法に用いられ、高い細胞生存率を有し、かつ、簡便で効率良い、幹細胞の保存媒体、保存方法および保存システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞のような幹細胞に対して緩慢凍結保存の保存媒体に関して、鋭意研究を行い、細胞凍害保護剤としてヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)とを組合せることにより、高い細胞生存率が得られることの知見を得た。
また、緩慢凍結保存の保存方法における細胞剥離操作において、プロナーゼ溶液を用いて細胞クランプのサイズを小さくして緩慢凍結することにより、高い細胞生存率が得られることの知見を得た。【００１２】
すなわち、上記目的を達成すべく、本発明の幹細胞保存媒体は、幹細胞を保存するための媒体であって、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、エチレングリコール(ＥＧ)を含有することを特徴とする。
本発明の幹細胞保存媒体は、好ましくは、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、エチレングリコール(ＥＧ)を含有し、かつ、血清、血清の代替成分、蛋白成分（例えばアルブミン）、動物由来成分のいずれの成分も含まない。血清、血清の代替成分、アルブミンなどの蛋白成分、動物由来成分のいずれの成分も含まない、いわゆるアニマルコンポーネントフリーの幹細胞保存液の場合、ヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞を用いた再生医療の臨床応用に有益である。
また、本発明の幹細胞保存媒体は、常温で保存可能な媒体であり、利便性に優れている。【００１３】
一般的に細胞凍害保護剤としてジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)が用いられているが、ＤＭＳＯ単独ではプログラムフリージング（超低温までの冷却過程をプログラムし自動的に冷却・凍結を行うこと）による段階凍結法を行い、液体窒素中で保管をおこなっても幹細胞の生存率の低下がある。そこで、骨髄や末梢血の細胞凍害保護剤の研究用試薬として知られているＣＰ−１（極東製薬工業株式会社製）では、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)の混合液を用いて、幹細胞の生存率を向上している。ＣＰ−１の組成は、ＨＥＳ１２ｇとＤＭＳＯ１０ｍＬと生理食塩水から成り、使用時にヒト血清アルブミン溶液とＲＰＭＩ１６４０培地を加える。ＣＰ−１の特徴としては、−８０℃での冷凍保存が可能であり、また、プログラムフリージングが不要なことである。【００１４】
本発明の幹細胞保存媒体は、ＨＥＳとＤＭＳＯの混合液に、更に、エチレングリコール(ＥＧ)を加えたものであり、ＣＰ−１よりも高い細胞生存率が得られた。上記非特許文献４のＴ’Ｊｏｅｎらは、ＨＥＳとエチレングリコール単独では凍結保護効果がないことも報告しているが、本発明による効果は、ＨＥＳとＤＭＳＯとＥＧが適当な濃度で共存すると高い細胞保護効果を示すという新しい知見である。
また、本発明の幹細胞保存媒体を用いて緩慢凍結保存した凍結チューブを、温培地を添加して超急速解凍、もしくはウォーターバス（３７℃湯浴）にて急速融解した場合でも、他の幹細胞保存媒体を用いた場合より、高い細胞生存率が得られた。ここで温培地の温度は、例えば２０℃以上、好ましくは２５℃以上、より好ましくは３０℃以上であり、例えば４０℃以下、好ましくは３９℃以下、より好ましくは３８℃以下であり、最も好ましくは約３７℃である。また、独自の解凍液ＣＥＬＬＯＴＩＯＭ（登録商標）や０．１Ｍスクロースを含む特殊な回復培地を用いず、通常の培地添加による高い生存率が得られた。プログラムフリージング不要、特殊な回復培地が不要、通常の細胞株と同様に凍結融解が可能である点は、操作が簡便であり、堅牢性が向上し、ヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞を用いた再生医療の臨床応用に有益である。【００１５】
ここで、エチレングリコール(ＥＧ)は、２〜１５％（ｖ／ｖ）、好ましくは４〜１２．５％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在することが好ましい。ＥＧ濃度が２％以上になると、ウォーターバス（３７℃湯浴）にて融解した場合でも、細胞生存率が２０％を超えるようになる。また、ＥＧ濃度が１５％でも細胞生存率が２０％を超える。特に、ＥＧ濃度が４〜１２．５％（ｖ／ｖ）の範囲内で存在する場合、ウォーターバス（３７℃湯浴）にて融解した場合でも、温培地添加による急速融解と同様な高い細胞生存率が得られる。ＥＧ濃度が４％（ｖ／ｖ）未満や１２．５％（ｖ／ｖ）より大きい場合は細胞生存率が低くなる。なお、細胞生存率の観点から、エチレングリコール(ＥＧ) 濃度は、４〜１０％（ｖ／ｖ）が更に好ましく、５〜６％（ｖ／ｖ）が特に好ましい。
すなわち、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)の３成分が適当な濃度で共存すると、優れた細胞保護効果を示すのである。【００１６】
また、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)は、経験的に４〜８％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度で存在することが好ましく、５〜６％（ｖ／ｖ）が更に好ましい。
ＨＥＳは多糖類であり、細胞膜を透過せず、細胞表面において氷塊形成による細胞障害から細胞膜を保護する効果があり、融解後の細胞生存率の向上に寄与すると考えられている。【００１７】
また、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)は、４〜６％（ｖ／ｖ）がより好ましく、略５％（ｖ／ｖ）が更に好ましい。ＤＭＳＯは、細胞膜透過性があり、細胞内における氷塊形成による細胞障害から細胞膜を保護する効果がある一方、細胞毒性があり、細胞分化を誘導するなどが懸念されることから、ＤＭＳＯ濃度は、一般的な凍結保存時の濃度の１０％に対して約１／２の４〜６％にする。
また、エチレングリコール(ＥＧ)添加により、ＤＭＳＯの細胞分化の誘導作用を軽減できる。ＤＭＳＯおよびエチレングリコール(ＥＧ)は、凍害防止剤として作用して、凍結の際の氷の結晶の形成を抑制する。ＤＭＳＯは、細胞分化作用があることが指摘されているが、エチレングリコール(ＥＧ)がその作用と拮抗し低減するものと考えられる。
さらに、解凍時に温培地添加による急速解凍と希釈と遠心除去によりにＤＭＳＯとの接触時間を極力短時間にすることにより分化誘導遺伝子の遺伝子発現を極力おさえることが可能である。実際、幹細胞のマーカーやin vitro三胚葉分化の確認により多能性が維持されていることを確認している。【００１８】
次に、本発明の幹細胞保存方法について説明する。本発明の幹細胞保存方法は、幹細胞を緩慢凍結させる保存方法であって、プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離する剥離工程と、剥離した幹細胞を幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる凍結工程とを備える。
ここで、幹細胞保存媒体は、上述の本発明の幹細胞保存媒体であり、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)を含有する媒体である。
或いは、幹細胞保存媒体は、既存のＣＰ−１と同様、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)と、培地（culture medium）もしくはアルブミン溶液とを含む媒体である。【００１９】
本発明の幹細胞保存方法においては、緩衝液や培地に懸濁した幹細胞を、プロナーゼ溶液を用いた処理によりフィーダー細胞を除去した細胞コロニーを一定サイズに細分化した後、凍結保存剤としての幹細胞保存媒体と混合して冷却する。冷却は、プログラムフリーザーによる緩速凍結、または、超低温フリ−ザ−による簡易式凍結により行うことができる。ここで、プログラムフリーザーは、毎分−１℃〜−２℃に計画された速さで冷却する方法である。一方、簡易凍結法は、凍結チューブを発砲スチロール箱や市販のフリージングコンテナに入れ−８０℃の冷凍庫内に入れて、上記と同様の速度で緩慢凍結させるものである。
本発明の幹細胞保存方法においては、簡易凍結法により簡便で効率良く作業を行うことができる。【００２０】
本発明の幹細胞保存方法の剥離工程において、クランプサイズ（細胞塊の大きさ）が、２００〜１００００μｍ２であることが好ましい。プロナーゼ溶液を用いて幹細胞剥離処理を行って、経験的に得たものである。【００２１】
また、本発明の幹細胞保存方法の凍結工程において、幹細胞保存媒体中の幹細胞は、保存媒体１ミリリットル当り１×１０３〜１×１０６個の範囲で存在することが好ましい。凍結保存する幹細胞と幹細胞保存媒体との比率が、上記の範囲内とすることにより、高い細胞生存率を得ることができる。【００２２】
本発明の幹細胞保存方法の凍結工程において、幹細胞保存媒体は、凍結チューブ１本当り略０．２〜１ミリリットルとすることが好ましい。【００２３】
本発明の幹細胞保存方法において、エチレングリコール(ＥＧ)は、２〜１５％（ｖ／ｖ）、好ましくは４〜１２．５％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在することが好ましく、細胞生存率の観点から、エチレングリコール(ＥＧ) 濃度は、４〜１０％（ｖ／ｖ）がより好ましく、５〜６％（ｖ／ｖ）が更にも好ましい。
また、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)は、４〜８％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度で存在することが好ましく、５〜６％（ｗ／ｖ）が更に好ましい。一方、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)は、４〜６％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在することが好ましく、略５％（ｖ／ｖ）が更に好ましい。【００２４】
また、本発明の幹細胞保存方法において、培地は、ダルベッコ改変Eagle(ＤＭＥＭ培地)およびＦ１２培地からなる群より選択される培地またはそれらの混合物を含むことが好ましい。
また、本発明の幹細胞保存方法において、アルブミン溶液は、略４％（ｗ／ｖ）の濃度で存在することが好ましい。【００２５】
本発明の幹細胞保存方法において、幹細胞保存媒体は、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)を含有する媒体であり、凍結工程の後、凍結保存をおこなう。更に、急速解凍を行う解凍工程を含み、該解凍工程は、凍結チューブに温培地を添加して急速解凍するものが好ましい。本発明の幹細胞保存方法では、上述の本発明の幹細胞保存媒体を用いて凍結保存したものは、凍結チューブをウォーターバス（３７℃湯浴）にて融解した場合でも、高い細胞生存率を得ることができる。
また、上記解凍工程の後、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した温培地で培養する培養工程を更に含むことが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤を添加した培養を行うことにより、ＲＯＣＫ阻害剤を添加しない培養に比べて高い細胞生存率を得ることができる。効率よりも安全性やコストや重視する臨床応用の場合、ＲＯＣＫ阻害剤を添加しないで培養させるのが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤の添加による培養は、研究試薬レベルにおいては、高い細胞生存率を得る重要なファクターのひとつである。ＲＯＣＫ阻害剤としては、Rho-associated coiled-coilキナーゼ（ＲＯＣＫ）を阻害する任意の物質を使用することができ、例えば、Ｙ−２７６３２、ＦａｓｕｄｉｌおよびＨ−１１５２が例示される。【００２６】
なお、上述の本発明の幹細胞保存方法において、幹細胞は、例えば、組織幹細胞および胚性幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹(ｉＰＳ)細胞からなる群より選択される幹細胞である。本発明の幹細胞保存媒体を用いて凍結保存するのに適した細胞としては、幹細胞（特に、ヒトおよび霊長類の誘導性多能性幹細胞(ｉＰＳ細胞)や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）が挙げられる。これらの細胞は、すでに樹立した細胞株であってもよいし新たに樹立した細胞株でもよい。【００２７】
次に、本発明の幹細胞保存システムについて説明する。本発明の幹細胞保存システムは、幹細胞を保存するためのシステムであって、以下の１）〜３）を備える。
１）幹細胞を剥離する剥離手段としてのプロナーゼ溶液
２）上述の本発明の幹細胞保存媒体
３）剥離した幹細胞を細胞保存媒体中で緩慢凍結させる緩慢凍結手段
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、簡便で効率良く幹細胞を緩慢凍結保存することができる。これにより、多能性と増殖能力を維持したまま細胞を半永久的に保存でき、また融解後に高い細胞生存率を得ることができる。
また、本発明によれば、高い細胞生存率であり、従来のガラス化法による凍結保存に伴う細胞生存率の不安定化を避けることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】凍結保存液Ａ〜Ｅを用いて緩慢凍結法を行ったヒトｉＰＳ細胞の生存率を示す。
【図２】対照実験として、ＤＡＰ２１３を用いたガラス化法と比較した結果を示す。
【図３】エチレングリコール(ＥＧ)の最終濃度が１〜１５％の凍結保存液を調製し、各々の生存率を比較した結果を示す。
【図４】様々なプロテアーゼと凍結保存液Ａとの組合せが生存率に与える影響を示す。
【図５】各種プロテアーゼによる細胞剥離処理後のクランプの面積を顕微鏡の画像データから定量化した結果を示す
【図６】ＲＯＣＫ阻害剤の添加の有無による生存率の比較を示す。
【図７】ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株、２５３Ｇ１株および株化ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ１株において、ＨＥＳ，ＤＭＳＯ，ＥＧを含有する幹細胞保存媒体を用いた本発明の幹細胞保存方法の生存率を示す。
【図８】凍結前後においてヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞の主要な幹細胞マーカーをＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析および免疫細胞化学的解析を行った結果を示す。
【図９】ヒトｉＰＳ細胞を胚葉体（ＥＢ）形成後、ｉｎｖｉｔｒｏで分化させ、主要な分化マーカーをＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析および免疫細胞化学的解析を行った結果を示す。
【図１０】実施例２の幹細胞保存方法のフロー図
【図１１】凍結保存液Ａのバッチ間でヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７の凍結融解後の生存率にほとんど差が無いことを示すグラフである。
【図１２】ヒトｉＰＳ細胞２０１B７の凍結融解前後で増殖性に変化が無いことを示すグラフである。
【図１３】ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株の凍結融解後の染色体が正常に維持されていることを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら詳細に説明していく。なお、本発明の範囲は、以下の実施例や図示例に限定されるものではなく、幾多の変更及び変形が可能である。
【実施例１】
【００３１】
本発明の幹細胞保存媒体の一実施形態として、生理食塩水１００ｍＬにヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）６ｇとジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)５ｍＬとエチレングリコール(ＥＧ)５ｍＬを溶解することにより、幹細胞保存媒体を製造することができる。
そして、緩衝液や培地に懸濁した幹細胞を、プロナーゼ溶液を用いた処理によりフィーダー細胞を除去した細胞コロニーを一定サイズに細分化した後、幹細胞の遠心後の細胞ペレットと上記の幹細胞保存媒体を混合する。幹細胞保存媒体と幹細胞を混合した後、毎分１〜２℃の速度で−８０℃まで冷却し凍結保存する。冷却は、保護ケースに入れた細胞浮遊液を−８０℃の冷凍庫内の発砲スチロール箱に入れて行う。なお、さらに液体窒素の温度まで冷却して、液体窒素中で保存してもよい。【００３２】
解凍は、あらかじめ３７℃に温めておいた培地を氷塊に１０倍希釈以上になるように添加し急速解凍するか、或いは、３７℃に温水に浸すことにより急速解凍することができる。具体的には、凍結した細胞を３７〜４０℃の恒温層に入れて、よく震盪しながら急速に解凍を行う。０．５ｍＬの凍結チューブの細胞浮遊液であれば、目安として２〜３分以内で解凍することが望ましい。
【実施例２】
【００３３】
本発明の幹細胞保存方法について、ヒトｉＰＳ細胞の凍結保存後の細胞生存率（以下、生存率とする）を検討した。
上述の如く、本発明の幹細胞保存方法は、プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離する剥離工程と、剥離した幹細胞を幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる凍結工程を備える。
また、使用する凍結保存液としての幹細胞保存媒体は、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)を含有する媒体、或いは、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)と、培地（culture medium）もしくはアルブミン溶液とを含む媒体である。【００３４】
実施例では、プロナーゼ溶液は、細胞分散用プロナーゼ溶液（極東製薬工業社製）を用いた。
また、下記の５種の凍結保存液を調製した。以下の濃度表記は最終濃度を表している。
（凍結保存液Ａ）６％
ＨＥＳ ＋ ５％ ＤＭＳＯ ＋ ５％ ＥＧ＋ ０．９％ ＮａＣｌ
（凍結保存液Ｂ）６％
ＨＥＳ ＋ ５％ ＤＭＳＯ ＋ ４％ ＢＳＡ＋５０％ ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ ０．９％ ＮａＣｌ
（凍結保存液Ｃ）６％
ＨＥＳ ＋ ５％ ＤＭＳＯ ＋ ４％ ＢＳＡ＋ ０．９％ ＮａＣｌ
（凍結保存液Ｄ）６％
ＨＥＳ ＋ ５％ ＤＭＳＯ＋５０％ ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ ０．９％ ＮａＣｌ
（凍結保存液Ｅ）６％
ＨＥＳ ＋ ５％ ＤＭＳＯ＋ ０．９％ ＮａＣｌ【００３５】
上記ＢＳＡとは、２５％ウシ血清アルブミン溶液（Sigma社製アルブミンを大塚製薬社製の生理食塩水に溶解したもの）である。また、上記ＤＭＥＭ／Ｆ１２とは、ダルベッコ改変Ｅａｇｌｅ(ＤＭＥＭ培地)およびＦ１２培地を混合した培地である。【００３６】
凍結保存液Ａ〜Ｅの調製は、細胞凍害保護液ＣＰ−１（極東製薬工業社製 ５５１−２７２００−０、ＨＥＳ１２ｇとＤＭＳＯ１０ｍＬを含む生理食塩水６８ｍＬ)を用いて行った。
具体的には、凍結保存液Ａは、ＣＰ−１原液６．８ｍＬに、生理食塩水３．２ｍＬを添加し１０ｍＬとし、よく混合した後、１０％のＥＧ（和光純薬社製）を含む生理食塩水を等量１０ｍＬにおだやかに低温で混合し調製した。
また、凍結保存液Ｂは、ＣＰ−１原液６．８ｍＬに、２５％ＢＳＡ３．２ｍＬを添加し１０ｍＬとし、よく混合した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を等量１０ｍＬにおだやかに低温で混合し調製した。【００３７】
また、凍結保存液Ｃは、ＣＰ−１原液６．８ｍＬに、２５％ＢＳＡ溶液３．２ｍＬを添加し１０ｍＬとし、よく混合した後、生理食塩水を等量１０ｍＬにおだやかに低温で混合し調製した。
また、凍結保存液Ｄは、ＣＰ−１原液６．８ｍＬに、生理食塩水３．２ｍＬを添加し１０ｍＬとし、よく混合した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を等量１０ｍＬにおだやかに低温で混合し調製した。
また、凍結保存液Ｅは、ＣＰ−１原液６．８ｍＬに、生理食塩水３．２ｍＬを添加し１０ｍＬとし、おだやかに低温で混合し調製した。【００３８】
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株、２５３Ｇ１株、またはヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ１株、Ｈ１株の培養は、ヒトｉＰＳ細胞の維持培養プロトコール（理化学研究所  発生・再生科学総合研究センター  ヒト幹細胞研究支援室）に準じて行った。すなわち、培地は、８０％
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Glutamax含ＨＥＰＥＳ不含) 、１％ 非必須アミノ酸、２０％代替血清ＫＳＲ（以上、Invitrogen社製）、１００ＩＵ／ｍＬ ペニシリン／１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（明治製菓社製）と使用直前に０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（和光純薬社製）、５ｎｇ／ｍＬ
ｂＦＧＦ（和光純薬社製）を添加し使用した。【００３９】
また、フィーダー細胞は、ＳＮＬ細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）をあらかじめ最終濃度１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（協和発酵キリン社製）処理により増殖停止させ、３×１０５／ｗｅｌｌ／６ｗｅｌｌプレートにて、０．１％ Gelatin Type Ａ（Sigma社製）溶液にてゼラチンコートした培養プレートに前日に播種し用いた。培地交換は1日おこない、１継代４日間で継代培養した。継代時は、ＣＴＫヒトＥＳ細胞用解離液（１ｍｇ／ｍＬ Collagenase ＩＶ＋０．２５％ Trypsin＋２０％ ＫＳＲ＋１ｍＭ
ＣａＣｌ２／ＰＢＳ）（ＣａＣｌ２はナカライテスク社製、その他はInvitrogen社製）を用いて剥離し、６分の１希釈にて継代培養を行った。【００４０】
緩慢凍結は、コンフルエント状態のヒトｉＰＳ細胞の培地を除き、リン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ（−）２〜３ｍＬにて洗浄した。これに細胞分散用プロナーゼ溶液１ｍＬを添加し、３７℃で約１分間処理により、フィーダー細胞のみを先に剥離浮遊させ吸引除去した。ただちにＰＢＳ（−）にて洗浄し吸引除去し、培地２ｍＬを添加し、Ｐ１０００ピペットにて穏やかなピペッティングにて剥離回収し、トリパンブルー染色によりセルカウントを行った。約２．５×１０４個を１．５ｍＬチューブに分注後、遠心し（３００ｇ,３分間,４℃)、上清をできるだけ取り除き、細胞ペレットを調製した。これに上述の凍結保存液Ａ〜Ｅ０．５ｍＬをそれぞれ添加し、すばやく凍結チューブに移し蓋をしてフリージングコンテナ（Nalgene）に移し、−８０℃で一晩凍結し、翌日に−１５０℃のディープフリーザーに移し、最低７日間凍結保存した。【００４１】
融解は、下記の融解法１、融解法２の２つのプロトコールで行った。
ａ）融解法１：プレインキュベーションした温培地を直接バイアルに添加する希釈による急速融解（温培地添加による希釈融解）
具体的には、−１５０℃のディープフリーザーからチューブを取り出し、あらかじめ３７℃にてプレインキュベーションしておいた培地５ｍＬにて急速解凍し、１５ｍＬの遠心チューブ（培地３ｍＬをあらかじめ添加）に移し、遠心し（３００ｇ,３分間,４℃)、上清を吸引除去する。
ｂ）融解法２：温浴（ウォーターバス）による融解
具体的には、−１５０℃のディープフリーザーからチューブを取り出し、３７℃湯浴にて急速融解し、培地を５ｍＬ添加した後、１５ｍＬの遠心チューブ（培地３ｍＬをあらかじめ添加）に移し、遠心し（３００ｇ,３分間,４℃)、上清を吸引除去する。【００４２】
上記のａ）或いはｂ）の解凍操作で回収した細胞ペレットに、１０μＭＹ−２７６３２を含む新しい培地を加え、６ｗｅｌｌプレートにてオンフィーダー培養した。４８時間は、ＲＯＣＫ阻害剤添加培地で培養し、培地交換後は、ＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地でさらに３日間（計５日間）培養した。
本実施例における幹細胞保存方法のフローを図１０に示す。図１０のフローは、融解法１（温培地添加による希釈融解）を用いた場合の幹細胞保存方法を示している。具体的には、図１０に示すように、プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離し（剥離工程：ステップＳ０１）、次に、剥離した幹細胞を幹細胞保存媒体中で緩慢凍結して（凍結工程：ステップＳ０３）、凍結保存する（ステップＳ０５）。凍結工程で用いる幹細胞保存媒体は、上述の凍結保存液Ａ〜Ｅのいずれかを用いる。
凍結保存された幹細胞を解凍する時は、凍結チューブに温培地を添加するか（超急速融解）、若しくは３７℃のウオーターバスにて急速融解した後、遠心により凍結媒体を迅速に除去し（解凍工程：ステップＳ０７）、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した培地で培養（最大４８時間）し、その後は通常培地にて培養する（培養工程：ステップＳ０９）。そして、拡大培養（ステップＳ１１）するか、或いは、剥離工程（ステップＳ０１）に戻り、再び凍結保存する。
なお、融解の際、急速融解と超急速融解のどちらも使用可能である。特に３７℃のウオーターバスにて融解する急速融解法は、通常の細胞株の融解法と同じであり、操作ミスが少なく堅牢性が高まるというメリットがある。【００４３】
また、対照実験としてＤＡＰ２１３を用いたガラス化法と比較した。コンフルエント状態のヒトｉＰＳ細胞の培地を除き、ＰＢＳ（−）２〜３ｍＬにて洗浄した後、ＣＴＫ
１ｍＬ、３７℃で約１分間処理により、フィーダー細胞のみを先に剥離浮遊させ、吸引除去した。ただちにＰＢＳ（−）にて洗浄し吸引除去し、培地５ｍＬを添加し、Ｐ１０００ピペットにより穏やかにピペッティングし、クランプを崩さないように５００ μＬ（約２．５×１０５個／チューブ）を１．５ｍＬチューブに分注した。遠心（３００ｇ,３分間,４℃)後、上清をできるだけ取り除き、細胞ペレットにＤＡＰ２１３凍結液（２Ｍ
ＤＭＳＯ（カルビオケム社製）、１Ｍ アセトアミド（シグマ社製）、３Ｍ プロピレングリコール（ナカライテスク社製））０．２ｍＬを加え、１０秒以内に迅速に液体窒素にて急速凍結し、液体窒素または−１５０℃のディープフリーザーに移し、７日間凍結保存した。【００４４】
培養後は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色は、６ｗｅｌｌプレートの培地を吸引除去し、ＰＢＳ（−）(ｐＨ７．４)（Invitrogen社製）で３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ナカライテスク社製）を含むＰＢＳ（−）にて室温で１５分間固定、ＰＢＳ（−）で３回洗浄後、ＡＬＰ染色液を１ｍＬ（１００ｍＭ Tris−ＨＣｌ (ｐＨ９．５)を２．５ｍＬに対し、ＡＬＰ Substrate Kit ＩＶ（Vector Laboratory社製、ＳＫ−５４００）のReagent−1、Reagent−2、Reagent−3を１滴ずつ順に添加）加え、室温で静置し黒色に発色させた。イメージングシステム（キーエンス社製）により得られたデジタル画像（４ｘ）を基に、コロニー数をカウントした。【００４５】
生存率は、以下の計算式により算出した。
生存率（％）＝
凍結融解後５日間培養後のコロニー数／継代後５日間培養後のコロニー数×１００で算出した。
その結果を図１に示す。図１は、凍結保存液Ａ〜Ｅを用いて緩慢凍結法を行ったヒトｉＰＳ細胞の生存率を示すグラフである。
融解法１（温培地添加による希釈融解）で解凍した場合、凍結保存液Ａを用いたものの生存率は８８．４％であり、凍結保存液Ｂを用いたものの生存率は９６．４％であり、凍結保存液Ｃを用いたものの生存率は９４．３％であり、凍結保存液Ｄを用いたものの生存率は７６．３％であり、凍結保存液Ｅを用いたものの生存率は８８．１％である（いずれの生存率も中間点の値）。
一方、融解法２（温浴による融解）で解凍した場合、凍結保存液Ａを用いたものの生存率は７８．７％であり、凍結保存液Ｂを用いたものの生存率は４４．５％であり、凍結保存液Ｃを用いたものの生存率は４７．３％であり、凍結保存液Ｄを用いたものの生存率は３３．５％であり、凍結保存液Ｅを用いたものの生存率は３８．５％である（いずれの生存率も中間点の値）。【００４６】
図１に示すように、上述の凍結保存液Ａ〜Ｅを用いて緩慢凍結法を行い、融解法１（温培地添加による希釈融解）で解凍したものは、いずれも生存率が７５％以上であった。このことから、ヒトｉＰＳ細胞について凍結保存可能であることがわかる。特に、ＢＳＡを含まない生理食塩水や培地にて希釈した凍結保存液Ａ，Ｄ，Ｅにおいても凍結保存可能であることがわかる。
また、図１に示すように、上述の凍結保存液Ａ〜Ｅを用いて緩慢凍結法を行い、融解法２（温浴による融解）で解凍したものは、凍結保存液Ａのみが生存率が７５％以上であった。凍結保存液Ａを用いて緩慢凍結法を行ったものは、融解法に左右されず、高い生存率を示したことがわかる。【００４７】
また、対照実験として、ＤＡＰ２１３を用いたガラス化法と比較した結果を図２に示す。図２に示すように、ＤＡＰ２１３を用いたガラス化法で凍結保存して、融解法１（温培地添加による希釈融解）で解凍した場合は、生存率が８０％以上であったが、融解法２（温浴による融解）で解凍した場合は、生存率はゼロであった。
また、図１１は、凍結保存液Ａの用いて緩慢凍結法をバッチ間で比較実験をおこなったものである。異なるバッチにおいても融解法に左右されず、高い生存率を示したことがわかる。【００４８】
以上から、プロナーゼ溶液を用いて細胞剥離し、凍結保存液Ａ〜Ｅを用いて緩慢凍結法を行ったものを、融解法１で解凍したものは、生存率が８０％以上であることがわかった。
特に、凍結保存液Ａ（本発明の幹細胞保存媒体）を用いて緩慢凍結法を行ったものは、融解法に左右されず、生存率が８０％以上であることがわかった。凍結保存液Ａ（本発明の幹細胞保存媒体）は、ＢＳＡおよび培地を含まないアニマルコンポーネントフリーの凍結保存液であり、ヒトｉＰＳ細胞を用いた再生医療の臨床応用に有益である。
【実施例３】
【００４９】
実施例３では、エチレングリコール(ＥＧ)の最適濃度を探索することを目的として、実施例２の凍結保存液Ａ（本発明の幹細胞保存媒体）において、エチレングリコール(ＥＧ)の最終濃度が１〜１５％の凍結保存液を調製し、各々の生存率を比較した。
その結果を図３に示す。図３に示すように、様々な濃度のエチレングリコール(ＥＧ)の凍結保存液の検討結果、エチレングリコール(ＥＧ)濃度が５％のものが、融解法に左右されず、９０％以上の生存率であることが確認できた。【００５０】
実施例２の融解法１では、エチレングリコール(ＥＧ)が無添加の場合、生存率が１４．５で低かった。エチレングリコール(ＥＧ)濃度が５〜１０％になると生存率が改善したが、１２．５％以上になると再び低下した。
実施例２の融解法２では、エチレングリコール(ＥＧ)が無添加、エチレングリコール(ＥＧ)濃度が２〜５％で、８０％以上の生存率であった。エチレングリコール(ＥＧ)濃度が５％で１０２％の生存率であり改善が最大になった。エチレングリコール(ＥＧ)濃度が４〜１０％では、融解法に左右されず安定して回復した。【００５１】
この結果は、作業者の利便性やプロトコールの頑強性を考慮すると、エチレングリコール(ＥＧ)濃度が５％の場合、温浴融解もしくは急速融解のどちらでも高い生存率が維持でき、作業スピードにも大きく左右されない頑強なプロトコールであることがわかる。
【実施例４】
【００５２】
実施例４では、プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離する本発明の幹細胞保存方法について、様々なプロテアーゼによる細胞剥離と比べて、凍結保存による生存率が高いことを示す。
具体的には、以下の５種類のプロテアーゼの細胞剥離液にて剥離を行い、実施例２の凍結保存液Ａ（本発明の幹細胞保存媒体）により凍結保存し、温浴培地添加による急速解凍により融解し培養し、最適な組合せを検討した。【００５３】
（細胞剥離液Ａ）プロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ）溶液、３７℃、１分間
（細胞剥離液Ｂ）０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（インビトロジェン社製）、３７℃、１分間
（細胞剥離液Ｃ）２ｍｇ／ｍＬ Ｄｉｓｅａｓｅ II（ロシュ社製、10xストックをＤＭＥＭ／Ｆ１２で希釈）、３７℃、１５分間
（細胞剥離液Ｄ）１．５ｍｇ／ｍＬ Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ IV（粉末をＤＭＥＭ／Ｆ１２で溶解）、３７℃、４０分間
（細胞剥離液Ｅ）ＣＴＫ、３７℃、１分間【００５４】
その結果を図４に示す。図４からプロナーゼが最適であることがわかる。
なお、図４および図５において、Pronaseは細胞剥離液Ａ、Trypsinは細胞剥離液Ｂ、Diseaseは細胞剥離液Ｃ、Collagenaseは細胞剥離液Ｄ、ＣＴＫは細胞剥離液Ｅを示している。
また、様々なプロテアーゼを用いた場合の細胞剥離時の細胞塊の大きさ（クランプサイズ）を、２０１Ｂ７株を用いて、その後のクランプサイズの定量化した。
細胞剥離後、細胞をコンベンショナル培地で回収し、６ｗｅｌｌプレートに懸濁液を入れてイメージングシステム（キーエンス社製）によりデジタル画像（４ｘ）を撮影し、付属ソフトウェアのエリア計測モードを用いてクランプサイズを定量した。【００５５】
その結果を図５に示す。プロナーゼ溶液を用いて細胞剥離した処理（プロナーゼ処理）の場合、クランプサイズは、２０８９±１４８５
μｍ２であった。このサイズは、ディスパーゼ処理の場合の２５４５４±４１００２μｍ２、コラゲナーゼ処理の場合の８５５１±１８８８４μｍ２、ＣＴＫ処理で８６００±１３２６７μｍ２と比較して、有意（Ｐ＜０．０１）に小さく、またばらつきも小さかった。一方、トリプシン処理の場合は、１９３６±１６６３μｍ２とプロナーゼ処理の場合とほぼ同等であり、有意差がなかった。
また、それぞれの剥離液での剥離後の凍結保存において、クランプサイズの細かったプロナーゼおよびトリプシンに関しては、保存することが可能であった。
しかしながら、プロナーゼ処理とトリプシン処理の２つの生存率を比較すると、プロナーゼが８８％、トリプシンが３０％であり、プロナーゼが有意に高かった。【００５６】
プロナーゼ処理がトリプシン処理よりも優位な理由としては、下記ａ），ｂ）が推察される。
ａ）細胞表面のｉＰＳ細胞の生存に必要な未知の蛋白を分解や、細胞死を誘導する蛋白質が影響した。
ｂ）トリプシンのプロテアーゼ効力は、プロナーゼと比べ強く、作用後の不活化も難しく、コロニーサイズを測定した後も残存活性により、ピペット操作やチューブ間移動により、一部のｉＰＳ細胞がシングルセルまでにばらばらになった。特に、エピステム状態にあるヒトｉＰＳ細胞はある程度の細胞塊の状態であれば生存率はよいが、シングルセルになった場合、マウスＥＳ細胞のような内部細胞塊由来のグランドステート状態にある細胞と違って生存できなくなった。【００５７】
一方、クランプサイズが大きかった他の３種のプロテアーゼに関しては、継代時のような大きなコロニーは凍結保存後生存できず、小さいコロニーのみが非常に低い確率で生存した。
クランプサイズの微小化が凍結保存の成功には不可欠であり、本発明の幹細胞保存方法のプロナーゼ溶液を用いた細胞剥離によれば、短時間にフィーダー細胞との分離、コロニーの細分化が行え、また生存率が高く、さらに動物由来成分を含まないといった利点がある。
【実施例５】
【００５８】
実施例５では、本発明の幹細胞保存方法において、ＲＯＣＫ阻害剤（＋）培養の場合と、ＲＯＣＫ阻害剤（−）培養の場合で、生存率の違いについて説明する。
幹細胞保存方法における培養および凍結は、実施例２と同様の方法により行った。融解は、温培地を用いた急速融解をおこなった後、ＲＯＣＫ阻害剤１０μＭ Ｙ−２７６３２の添加の有無による生存率の違いについて測定した。添加する場合は、Ｙ−２７６３２存在下で２日培養し、その後は、Ｙ−２７６３２を含まない培地でさらに３日間培養した。一方、添加しない場合は、通常培地で５日間培養した。双方とも、実施例２の方法に従い生存率を測定した。
図６に示すように、測定の結果、ＲＯＣＫ阻害剤（＋）培養の場合は約１２０％の生存率であり、ＲＯＣＫ阻害剤（−）培養の場合の約３０％の生存率よりも高い生存率を示した。以上から、ＲＯＣＫ阻害剤（＋）培養が、幹細胞保存方法において高い生存率を支持する重要な試薬であることがわかる。【００５９】
なお、将来において再生医療等、臨床応用を考慮した場合、ＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地の方が、安全性や工程管理やコスト面から好ましい。図５から、ＲＯＣＫ阻害剤（−）の場合、約３０％の生存率を示し、非存在下でも生存が確認された。効率よりも安全性やコストや重視する臨床応用の場合、ＲＯＣＫ阻害剤（−）培養下でも応用可能である。
【実施例６】
【００６０】
実施例６では、株化ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株、２５３Ｇ１株および株化ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ１株、Ｈ１株について、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、エチレングリコール(ＥＧ)を含有する幹細胞保存媒体を用いた本発明の幹細胞保存方法の有効性を説明する。
その結果を図７に示す。ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株、２５３Ｇ１株および株化ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ１株、Ｈ１株において、８０〜１００％の高い生存率が確認できた。すなわち、ＨＥＳ，ＤＭＳＯ，ＥＧを含有する幹細胞保存媒体を用いた本発明の幹細胞保存方法が、複数の幹細胞株の凍結保存において有効であることを示された。
【実施例７】
【００６１】
実施例７では、凍結前後のヒトｉＰＳ細胞の状態について、遺伝子発現の変動の有無を、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcriptase−Polymerase Chain
Reaction）により半定量的に遺伝子発現解析を行った結果を示す。表１に、ＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現解析用プライマーリストを示す。プライマーは、論文（Takenaka et al. Experimental Hematology. 2010. 38(2):154-62.）に基づき、Invitrogen社に依頼して合成した。【００６２】
【表１】
2013187077.tif 000003
【００６３】
凍結前（継代後４日目）および融解後（７日）のｉＰＳ細胞を６ｗｅｌｌプレートの３ｗｅｌｌ分をＣＴＫ液により剥離し、ｉＰＳ細胞を遠心回収し、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（QIAGEN社製）のプロトコールに従い、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。具体的には、ＲＬＴ Ｂｕｆｆｅｒ ６００μＬ（直前に１／１００量の２ＭＥを添加）にて溶解し、−８０℃にて保存した後、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（QIAGEN社製）、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｉ ｋｉｔ（QIAGEN社製）によるオンカラムでＤＮａｓｅ処理（室温、１５分間）し、最終的にＲＮａｓｅ-ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ５０μＬに溶解した。
ＲＮＡ濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（ThermoFisher社製）を用いて２６０ｎｍの吸光度を測定し定量した。逆転写反応は、Ｒｅｖｅｒ  Ｔｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  ｋｉｔ（東洋紡社製）の添付プロトコールに従い、６５℃、５分間の加温処理後に急冷し、変性させたＴｏｔａｌ ＲＮＡ １００ｎｇに対し、５ｘ  ＲＴ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、ＲＴ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  ０．５μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ  ０．５μＬを添加した１０μＬの系で、３７℃、１５分間逆転写反応、続いて９８℃５分間の加熱処理にて酵素の失活処理を行い、ｃＤＮＡを調製した。【００６４】
得られたｃＤＮＡは、ＲＮａｓｅ-ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ９０μＬを添加して１０倍に希釈しｃＤＮＡ溶液とした。ＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡ溶液１μLを鋳型とし、Ｔｏｔａｌ １０μＬの系で１０ｘ  ＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ
１μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．８μＬ、ＥｘＴａｑ  ＨＳ  ０．０５μＬ（すべてTakara社製）、１０μＭ
ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ １μＬにて９８℃で１０秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で３０秒間を３０サイクルおこない、さらに７２℃で５分間のＰＣＲを行った。反応液全量に１０ｘ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを１μＬずつ添加し、全量を２％アガロースゲルにて定電圧１２０Ｖ、１０分間電気泳動した。エチジウムブロマイド染色後ＵＶにより検出した。【００６５】
また、凍結前後のヒトｉＰＳ細胞の多能性マーカー（ＯＣＴ４，ＳＳＥＡ３，ＳＳＥＡ４，ＴＲＡ−１−６０，ＴＲＡ−１−８１）に対して、蛍光標識抗体を用いた免疫細胞化学的解析を行った。具体的には、２４穴プレートにてオンフィーダーにて５日間培養したヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を、培地を吸引除去した後、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ(−)を５００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１５分間、静置し固定した。固定液を吸引除去し、ＰＢＳ(−)約２ｍＬ（５分間）にて３回洗浄した。ＯＣＴ４の検出の場合のみ、氷冷メタノール１ｍＬを加え、−２０℃１０分間の透過処理後、ＰＢＳで１回洗浄した。そのほかは、ブロッキング溶液（５％ヤギ血清、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳ（−））にて室温で６０分間静置しブロッキングを行った。【００６６】
ブロッキング溶液を除去し、一次抗体として抗ＯＣＴ４マウスモノクローナル抗体（Santa Cruz社）、抗ＳＳＥＡ３ラットモノクローナル抗体（Millipore社）、抗ＳＳＥＡ４マウスモノクローナル抗体（CST社）、抗ＴＲＡ−１−６０マウスモノクローナル抗体（CST社）、抗ＴＲＡ−１−８１マウスモノクローナル抗体（CST社）を用い、すべて抗体希釈液（１％ＢＳＡ、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ（−））にて２００倍希釈し、４℃で一晩静置により反応させた。続いて、ＰＢＳ（−）約２ｍＬ（５分間）にて３回洗浄し、蛍光標識二次抗体としてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ４８８標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ４８８標識抗マウスＩｇＭヤギ抗体、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ４８８標識抗ラットＩｇＭヤギ抗体（全てInvitrogen社製）を同様に抗体希釈液にて５００倍希釈し添加し、アルミホイルで遮光して室温にて２時間反応させた。【００６７】
そして、０．４Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳにて１回洗浄し、核染色を、ＤＡＰＩ溶液（Invitrogen社製、原液をＰＢＳ（−）にて１０００倍希釈）を添加し、遮光のもと室温で５分間静置することにより行った。ＰＢＳ（−）約２ｍＬにて５分間にて３回洗浄して、イメージングシステム（キーエンス社製）にて蛍光観察を行った。
その結果を図８に示す。図８（１）に示すように、ヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞（ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７，ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ−１）の主要な幹細胞マーカー（ＯＣＴ４，ＫＬＦ４，ＳＯＸ２，Ｃ−ＭＹＣ，ＮＡＮＯＧ）をＲＴ−ＰＣＲによる解析によりバンドが確認でき遺伝子発現が凍結前後において顕著な差がないことが確認できた。また、図８（２）に示すように、主要な幹細胞マーカー（ＯＣＴ４，ＳＳＥＡ３，ＳＳＥＡ４，ＴＲＡ−１−６０，ＴＲＡ−１−８１）が、免疫細胞化学的解析により全ての場合で染色されることから、凍結前後において顕著な差がないことが確認できた。
【実施例８】
【００６８】
実施例８では、In vitroでの三胚葉分化を検討した結果を示す。
ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、エチレングリコール(ＥＧ)を含有する本発明の幹細胞保存媒体による凍結融解後、７日間オンフィーダー培養した２０１Ｂ７株をＣＴＫ剥離液により、ＳＮＬ細胞を除去後、ヒトｉＰＳ細胞培地（−ｂＦＧＦ）にて回収し、そのまま低接着表面プレート（コーニング社製）にて１０日間培養し胚葉体（ＥＢ）を形成させた。培地交換は１日置きに行った。
胚葉体（ＥＢ）の半分量をチューブに回収し、ＲＴ−ＰＣＲにより三胚葉特異的マーカーの遺伝子発現解析を行った。具体的には、ＲＬＴ
Ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン社製ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ付属）によりＲＮＡ抽出し、常法どおり、逆転写反応とＰＣＲを行った。表２にＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現解析用プライマーリストを示す。【００６９】
【表２】
2013187077.tif 000004
【００７０】
残り半分の胚葉体（ＥＢ）は、ゼラチンコートした２４ｗｅｌｌプレートに播種し、接着させた後、ヒトｉＰＳ細胞培地（−ｂＦＧＦ）により、４日間培養した。その後、下記表３に示す三胚葉特異的マーカーの一次抗体、二次抗体を用いて染色後、ＤＡＰＩにて核染色し、蛍光イメージングシステム（キーエンス社製）を用いて検出した。表３は蛍光免疫抗体染色に用いた抗体を纏めたものである。【００７１】
【表３】
2013187077.tif 000005
【００７２】
結果を図９に示す。図９（１）に示すように、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を胚葉体（ＥＢ）形成後、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで分化させ、主要な分化マーカー（外胚葉
ＰＡＸ６、中胚葉ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、内胚葉ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４）をＲＴ−ＰＣＲによる解析によりバンドが確認でき分化遺伝子の遺伝子発現を確認した。また、図９（２）に示すように、主要な分化細胞マーカー（外胚葉β-ｔｕｂｕｌｉｎ、中胚葉αＳＭＡ、内胚葉αＦｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ））が、免疫細胞化学的解析により全ての場合で染色されることから、三胚葉分化能が維持されていることが確認できた。
【実施例９】
【００７３】
実施例９で、ヒトｉＰＳ細胞について、凍結融解前後において増殖性に変化がなく、幹細胞保存媒体を用いた本発明の幹細胞保存方法の有効性と安定性を説明する。
凍結前では、株化ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を初期播種濃度約  ２５，０００／well／６ウエルプレートから４日おきにＣＴＫにて剥離し、１／６希釈により継代培養した。融解後は、２５，０００／vialを、１０ｃｍディッシュにて１週間培養し、４日おきにＣＴＫにて剥離し、１／６希釈により継代培養した。細胞数は、経時的にサンプリングし、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ処理（３７℃、１０分間）にてシングルセルまでに分散した後、トリパンブルー染色し、血球算定盤にて顕微鏡下にて測定した。
その結果を図１２に示す。株化ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株について凍結融解前後でほぼ一定であることを確認できた。
【実施例１０】
【００７４】
実施例１０で、ヒトｉＰＳ細胞について、凍結融解後の染色体が正常に維持され幹細胞保存媒体を用いた本発明の幹細胞保存方法の有効性と安全性を説明する。
その結果を図１３に示す。融解後３〜５継代した株化ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株についてＧ-バンド分析を行い、正常核型であることを確認できた。【００７５】
以上、本発明について説明した。
なお、２０１２年６月１５日に出願された日本国特許出願第２０１２−１３６４２２号をそのまま参照により本明細書に取り込むものとする。また、本明細書中で引用する全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参照により本明細書に取り込むものとする。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は、幹細胞（特に、ヒトｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞）の細胞生物学的研究に、ならびに幹細胞の細胞バンクや幹細胞から分化した細胞を用いた臓器移植などの再生医療分野に有用である。
【図１】
2013187077.tif 000006
【図２】
2013187077.tif 000007
【図３】
2013187077.tif 000008
【図４】
2013187077.tif 000009
【図５】
2013187077.tif 000010
【図６】
2013187077.tif 000011
【図７】
2013187077.tif 000012
【図８】
2013187077.tif 000013
【図９】
2013187077.tif 000014
【図１０】
2013187077.tif 000015
【図１１】
2013187077.tif 000016
【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年3月31日(2014.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を保存するための媒体であって、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール（ＥＧ）を含有し、
エチレングリコール（ＥＧ）が、４〜１２．５％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、
ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）が、４〜８％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が、４〜６％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、
幹細胞保存媒体。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
血清、血清の代替成分、蛋白成分、動物由来成分のいずれの成分も含有していない、請求項１に記載の幹細胞保存媒体。
【請求項６】
幹細胞を緩慢凍結させる保存方法であって、
プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離する剥離工程と、
剥離した幹細胞を幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる凍結工程と、
を備え、
前記幹細胞保存媒体は、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）とジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とエチレングリコール（ＥＧ）を含有する媒体であり、
上記の凍結工程の後、急速解凍を行う解凍工程を更に含み、
該解凍工程は、凍結チューブに温培地を添加して急速解凍、もしくは温浴（ウォーターバス）にて融解するものである、幹細胞保存方法。
【請求項７】
上記の剥離工程において、クランプサイズが２００〜１００００μｍ２である、請求項６に記載の幹細胞保存方法。
【請求項８】
上記の凍結工程において、前記幹細胞保存媒体中の幹細胞は、前記保存媒体１ミリリットル当り１×１０３〜１×１０６個の範囲で存在する、請求項６に記載の幹細胞保存方法。
【請求項９】
上記の凍結工程において、前記幹細胞保存媒体は、凍結チューブ１本当り略０．２〜１ミリリットルとする、請求項８に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１０】
エチレングリコール（ＥＧ）が、２〜１５％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、請求項６に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１１】
ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）が、４〜８％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、請求項６に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１２】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が、４〜６％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、請求項６に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１３】
前記培地は、ダルベッコ改変Ｅａｇｌｅ（ＤＭＥＭ培地）およびＦ１２培地からなる群より選択される培地またはそれらの混合物を含む、請求項６に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１４】
前記アルブミン溶液は、略４％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項６に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
上記解凍工程の後、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した温培地で培養する培養工程を更に含む、請求項６に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１７】
前記幹細胞が、組織幹細胞および胚性幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞からなる群より選択される幹細胞である、請求項６に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１８】
幹細胞を保存するためのシステムであって、
幹細胞を剥離する剥離手段としてのプロナーゼ溶液、
請求項１の幹細胞保存媒体、
剥離した幹細胞を上記の幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる緩慢凍結手段、を備える幹細胞保存システム。
【請求項１９】
プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離した幹細胞を保存するために用いられる請求項１に記載の幹細胞保存媒体。
【請求項２０】
前記エチレングリコール（ＥＧ）が、４〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、凍結チューブに温培地を添加して急速解凍、もしくは温浴（ウォーターバス）にて融解のいずれの融解法にも左右されず生存率が６０％以上で安定して回復し得る請求項１又は１９に記載の幹細胞保存媒体。
【手続補正書】
【提出日】平成26年10月29日(2014.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を保存するための媒体であって、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、及びエチレングリコール(ＥＧ)を含有し、
エチレングリコール(ＥＧ)が、４〜１２．５％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)が、４〜８％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)が、４〜６％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、幹細胞保存媒体。
【請求項２】
血清、血清の代替成分、蛋白成分、動物由来成分のいずれの成分も含有していない、請求項１に記載の幹細胞保存媒体。
【請求項３】
幹細胞を緩慢凍結させる保存方法であって、
プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離する剥離工程と、
剥離した幹細胞を幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる凍結工程と、
を備え、
前記幹細胞保存媒体は、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)を含有する媒体であり、
上記の凍結工程の後、急速解凍を行う解凍工程を更に含み、
該解凍工程は、凍結チューブに温培地を添加して急速解凍、もしくは温浴（ウォーターバス）にて融解するものである、幹細胞保存方法。
【請求項４】
上記の剥離工程において、クランプサイズが２００〜１００００μｍ２である、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項５】
上記の凍結工程において、前記幹細胞保存媒体中の幹細胞は、前記保存媒体１ミリリットル当り１×１０３〜１×１０６個の範囲で存在する、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項６】
上記の凍結工程において、前記幹細胞保存媒体は、凍結チューブ１本当り略０．２〜１ミリリットルとする、請求項５に記載の幹細胞保存方法。
【請求項７】
エチレングリコール(ＥＧ)が、２〜１５％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項８】
ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)が、４〜８％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項９】
ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)が、４〜６％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１０】
前記培地は、ダルベッコ改変Eagle(ＤＭＥＭ培地)およびＦ１２培地からなる群より選択される培地またはそれらの混合物を含む、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１１】
前記アルブミン溶液は、略４％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１２】
上記解凍工程の後、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した温培地で培養する培養工程を更に含む、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１３】
前記幹細胞が、組織幹細胞および胚性幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹(ｉＰＳ)細胞からなる群より選択される幹細胞である、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１４】
幹細胞を保存するためのシステムであって、
幹細胞を剥離する剥離手段としてのプロナーゼ溶液、
請求項１の幹細胞保存媒体、
剥離した幹細胞を上記の幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる緩慢凍結手段、
を備える幹細胞保存システム。
【請求項１５】
プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離した幹細胞を保存するために用いられる請求項１に記載の幹細胞保存媒体。
【請求項１６】
前記エチレングリコール(ＥＧ)が、４〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、凍結チューブに温培地を添加して急速解凍、もしくは温浴（ウォーターバス）にて融解のいずれの融解法にも左右されず生存率が６０％以上で安定して回復し得る請求項１又は１５に記載の幹細胞保存媒体。
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月26日(2015.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を保存するための媒体であって、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、及びエチレングリコール(ＥＧ)を含有し、
エチレングリコール(ＥＧ)が、４〜１２．５％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)が、４〜８％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)が、４〜６％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、幹細胞保存媒体。
【請求項２】
血清、血清の代替成分、蛋白成分、動物由来成分のいずれの成分も含有していない、請求項１に記載の幹細胞保存媒体。
【請求項３】
幹細胞を緩慢凍結させる保存方法であって、
プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離する剥離工程と、
剥離した幹細胞を幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる凍結工程と、
を備え、
前記幹細胞保存媒体は、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)を含有する媒体であって、
エチレングリコール(ＥＧ)が、４〜１２．５％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)が、４〜８％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)が、４〜６％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、媒体であり、
上記の凍結工程の後、急速解凍を行う解凍工程を更に含み、
該解凍工程は、凍結チューブに温培地を添加して急速解凍、もしくは温浴（ウォーターバス）にて融解するものである、幹細胞保存方法。
【請求項４】
上記の剥離工程において、クランプサイズが２００〜１００００μｍ２である、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項５】
上記の凍結工程において、前記幹細胞保存媒体中の幹細胞は、前記保存媒体１ミリリットル当り１×１０３〜１×１０６個の範囲で存在する、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項６】
上記の凍結工程において、前記幹細胞保存媒体は、凍結チューブ１本当り略０．２〜１ミリリットルとする、請求項５に記載の幹細胞保存方法。
【請求項７】
前記培地は、ダルベッコ改変Eagle(ＤＭＥＭ培地)およびＦ１２培地からなる群より選択される培地またはそれらの混合物を含む、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項８】
前記アルブミン溶液は、略４％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項９】
上記解凍工程の後、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した温培地で培養する培養工程を更に含む、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１０】
前記幹細胞が、組織幹細胞および胚性幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹(ｉＰＳ)細胞からなる群より選択される幹細胞である、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１１】
幹細胞を保存するためのシステムであって、
幹細胞を剥離する剥離手段としてのプロナーゼ溶液、
請求項１の幹細胞保存媒体、
剥離した幹細胞を上記の幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる緩慢凍結手段、
を備える幹細胞保存システム。
【請求項１２】
プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離した幹細胞を保存するために用いられる請求項１に記載の幹細胞保存媒体。
【請求項１３】
前記エチレングリコール(ＥＧ)が、４〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、凍結チューブに温培地を添加して急速解凍、もしくは温浴（ウォーターバス）にて融解のいずれの融解法にも左右されず生存率が６０％以上で安定して回復し得る請求項１又は１２に記載の幹細胞保存媒体。
【手続補正書】
【提出日】平成27年6月7日(2015.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を保存するための媒体であって、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、及びエチレングリコール(ＥＧ)を含有し、
エチレングリコール(ＥＧ)が、４〜１２．５％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)が、４〜８％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)が、４〜６％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、幹細胞保存媒体。
【請求項２】
血清、血清の代替成分、蛋白成分、動物由来成分のいずれの成分も含有していない、請求項１に記載の幹細胞保存媒体。
【請求項３】
幹細胞を緩慢凍結させる保存方法であって、
プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離する剥離工程と、
剥離した幹細胞を幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる凍結工程と、
を備え、
前記幹細胞保存媒体は、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)を含有する媒体であって、
エチレングリコール(ＥＧ)が、４〜１２．５％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)が、４〜８％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)が、４〜６％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、媒体であり、
上記の凍結工程の後、急速解凍を行う解凍工程を更に含み、
該解凍工程は、凍結チューブに温培地を添加して急速解凍、もしくは温浴（ウォーターバス）にて融解するものである、幹細胞保存方法。
【請求項４】
上記の剥離工程において、クランプサイズが２００〜１００００μｍ２である、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項５】
上記の凍結工程において、前記幹細胞保存媒体中の幹細胞は、前記保存媒体１ミリリットル当り１×１０３〜１×１０６個の範囲で存在する、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項６】
上記の凍結工程において、前記幹細胞保存媒体は、凍結チューブ１本当り略０．２〜１ミリリットルとする、請求項５に記載の幹細胞保存方法。
【請求項７】
前記培地は、ダルベッコ改変Eagle(ＤＭＥＭ培地)およびＦ１２培地からなる群より選択される培地またはそれらの混合物を含む、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項８】
上記解凍工程の後、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した温培地で培養する培養工程を更に含む、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項９】
前記幹細胞が、組織幹細胞および胚性幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹(ｉＰＳ)細胞からなる群より選択される幹細胞である、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１０】
幹細胞を保存するためのシステムであって、
幹細胞を剥離する剥離手段としてのプロナーゼ溶液、
請求項１の幹細胞保存媒体、
剥離した幹細胞を上記の幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる緩慢凍結手段、
を備える幹細胞保存システム。
【請求項１１】
プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離した幹細胞を保存するために用いられる請求項１に記載の幹細胞保存媒体。
【請求項１２】
前記エチレングリコール(ＥＧ)が、４〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、凍結チューブに温培地を添加して急速解凍、もしくは温浴（ウォーターバス）にて融解のいずれの融解法にも左右されず生存率が６０％以上で安定して回復し得る請求項１又は１１に記載の幹細胞保存媒体。
【手続補正書】
【提出日】平成27年7月1日(2015.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を保存するための媒体であって、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、及びエチレングリコール(ＥＧ)を含有し、
エチレングリコール(ＥＧ)が、４〜１２．５％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)が、４〜８％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)が、４〜６％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、幹細胞保存媒体。
【請求項２】
血清、血清の代替成分、蛋白成分、動物由来成分のいずれの成分も含有していない、請求項１に記載の幹細胞保存媒体。
【請求項３】
幹細胞を緩慢凍結させる保存方法であって、
プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離する剥離工程と、
剥離した幹細胞を幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる凍結工程と、
を備え、
前記幹細胞保存媒体は、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)を含有する媒体であって、
エチレングリコール(ＥＧ)が、４〜１２．５％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)が、４〜８％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)が、４〜６％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在する、媒体であり、
上記の凍結工程の後、急速解凍を行う解凍工程を更に含み、
該解凍工程は、凍結チューブに温培地を添加して急速解凍、もしくは温浴（ウォーターバス）にて融解するものである、幹細胞保存方法。
【請求項４】
上記の剥離工程において、クランプサイズが２００〜１００００μｍ２である、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項５】
上記の凍結工程において、前記幹細胞保存媒体中の幹細胞は、前記保存媒体１ミリリットル当り１×１０３〜１×１０６個の範囲で存在する、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項６】
上記の凍結工程において、前記幹細胞保存媒体は、凍結チューブ１本当り略０．２〜１ミリリットルとする、請求項５に記載の幹細胞保存方法。
【請求項７】
前記培地は、ダルベッコ改変Eagle(ＤＭＥＭ培地)およびＦ１２培地からなる群より選択される培地またはそれらの混合物を含む、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項８】
上記解凍工程の後、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した温培地で培養する培養工程を更に含む、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項９】
前記幹細胞が、組織幹細胞および胚性幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹(ｉＰＳ)細胞からなる群より選択される幹細胞である、請求項３に記載の幹細胞保存方法。
【請求項１０】
幹細胞を保存するためのシステムであって、
幹細胞を剥離する剥離手段としてのプロナーゼ溶液、
請求項１の幹細胞保存媒体、
剥離した幹細胞を上記の幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる緩慢凍結手段、
を備える幹細胞保存システム。
【請求項１１】
プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離した幹細胞を保存するために用いられる請求項１に記載の幹細胞保存媒体。
【請求項１２】
前記エチレングリコール(ＥＧ)が、４〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度で存在し、凍結チューブに温培地を添加して急速解凍、もしくは温浴（ウォーターバス）にて融解のいずれの融解法にも左右されず生存率が６０％以上で安定して回復し得る請求項１又は１１に記載の幹細胞保存媒体。
【国際調査報告】
2013187077.tif 000019
2013187077.tif 000020
2013187077.tif 000021
2013187077.tif 000022