(57)【要約】  試料分離用粒子の浮力を用いて目的物の分離を行う場合の、試料分離用粒子の浮上性と、試料分離用粒子の分散性・安定性と、の間の背反関係を解消する。試料を捕捉する捕足分子が表面に結合しており、第１の比重を有する第１の粒子と、前記第１の比重よりも大きい第２の比重を有する第２の粒子と、第１の粒子と、第２の粒子と、を連結し、第１の条件下で解離する連結部と、を備える粒子複合体を、液体中での試料の分離に用いる。
2013187382.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体中の試料を捕捉する捕足分子が表面に結合しており、第１の比重を有する第１の粒子と、
前記第１の比重よりも大きい第２の比重を有する第２の粒子と、
前記第１の粒子と、前記第２の粒子と、を連結し、第１の条件下で解離する連結部と、を備える、
ことを特徴とする粒子複合体。
【請求項２】
前記第１の比重は、前記液体の比重よりも小さい、ことを特徴とする請求項１に記載の粒子複合体。
【請求項３】
前記第２の比重は、前記液体の比重よりも大きい、ことを特徴とする請求項２に記載の粒子複合体。
【請求項４】
前記捕捉分子は、抗原抗体反応によって前記試料が有する抗原と結合する抗体である、ことを特徴とする請求項１に記載の粒子複合体。
【請求項５】
前記連結部は、前記第１の条件として、所定の波長を有する光を受光すると解離する、ことを特徴とする請求項１に記載の粒子複合体。
【請求項６】
前記連結部は、少なくとも４０５nmの波長を有する光を受光すると解離する、ことを特徴とする請求項５に記載の粒子複合体。
【請求項７】
前記第１の粒子の表面の少なくとも一部は、前記第１の条件とは異なる第２の条件下で分解する分解材料で構成され、
前記捕捉分子は、前記分解材料で構成された前記表面に結合している、
ことを特徴とする請求項１に記載の粒子複合体。
【請求項８】
液体中の試料を捕捉する捕足分子が表面に結合した第１の比重を有する第１の粒子と、前記第１の比重よりも大きい第２の比重を有する第２の粒子と、前記第１の粒子と前記第２の粒子を連結する連結部と、を備えた粒子複合体が入った第１の容器を保持する第１の保持部と、
前記試料を含む前記溶液が入った第２の容器を保持する第２の保持部と、
前記第１の容器から前記粒子複合体を採取し、前記粒子複合体を前記第２の容器に入れる粒子投入部と、
前記第２の容器中の前記粒子複合体を、前記連結部が解離する第１の条件下に置く粒子分離部と、
前記解離後に、前記液体から前記第１の粒子を回収する粒子回収部と、を備える、
ことを特徴とする試料分取装置。
【請求項９】
前記第１の粒子は前記第１の比重が前記液体の比重よりも小さい粒子であり、前記粒子回収部は前記解離後に前記溶液中から浮上してきた前記第１の粒子を回収する、ことを特徴とする請求項８に記載の試料分取装置。
【請求項１０】
前記第２の粒子は前記第２の比重が前記液体の比重よりも大きい粒子であり、前記粒子分離部は前記解離によって前記第２の粒子を前記液体中に沈降させることを特徴とする請求項９に記載の試料分取装置。
【請求項１１】
前記粒子複合体を前記第２の容器に入れた後に、前記第２の容器中の前記液体を攪拌し、前記試料が有する抗原と、前記捕捉分子として前記第１の粒子の表面に結合した前記抗体と、の間の抗原抗体反応を進行させる溶液攪拌部、を更に備える、ことを特徴とする請求項８に記載の試料分取装置。
【請求項１２】
前記第１の保持部は前記第１の容器を遮光条件下で保持し、
前記第２の保持部は、前記粒子複合体を前記第２の容器に入れてから所定時間経過するまでは前記第２の容器を遮光条件下で保持し、
前記粒子分離部は、少なくとも前記所定時間経過した後に、前記第１の条件として、前記解離が起こる所定の波長を有する光を前記粒子複合体に照射する、
ことを特徴とする請求項８に記載の試料分取装置。
【請求項１３】
前記第１の条件として前記所定の波長を有する光として、少なくとも４０５nmの波長を有する光を前記照射する、ことを特徴とする請求項１２に記載の試料分取装置。
【請求項１４】
前記粒子投入部は、前記粒子複合体として、前記第１の粒子の表面の少なくとも一部が、前記第１の条件とは異なる第２の条件下で分解する分解材料で構成され、前記捕捉分子が前記分解材料で構成された前記表面に結合している粒子を、前記第２の容器に入れ、
前記回収後に、前記第１の粒子を前記第２の条件下に置き、前記第１の粒子から解離した前記試料を抽出する試料抽出部、を更に備える、ことを特徴とする請求項８に記載の試料分取装置。
【請求項１５】
液体中の試料を捕捉する捕足分子が表面に結合しており、第１の比重を有する第１の粒子と、前記第１の比重よりも大きい第２の比重を有する第２の粒子と、前記第１の粒子と前記第２の粒子を連結する連結部と、を備えた粒子複合体を前記液体中に入れ、
前記粒子複合体を前記液体中に入れてから所定時間経過後に、前記粒子複合体を、前記連結部が解離する第１の条件下に置き、
前記解離後に、前記液体から前記第１の粒子を回収する、
ことを特徴とする試料分取方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の分離に用いる粒子、装置及び方法に関する。特に、微粒子の複合体を用いた生体物質の分離精製に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体類を表面に有する微粒子は細胞などの生体物質の分離精製や免疫計測における固相分離の担体として幅広く用いられている。これらの微粒子では、目的とする特定の生体物質を選択的に捕捉するために、抗体類を表面に備えている。【０００３】
例えば、特許文献１では、気体を含むマイクロカプセルを用い、抗体をマイクロカプセルの外側に結合させたものを細胞の分離に用いる方法が開示されている。気体を含むマイクロカプセルは、リポゾームと同様の方法で作成し、その壁材料として脂質、アルブミン、ポリマーが例示されている。細胞を含む溶液にマイクロカプセルを添加し、攪拌後サンプルを静止させると、この間に標的細胞は浮上するため、上澄み液を採取することで目的細胞を分離できるとしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２８７３７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述した特許文献１に開示される技術では、気体を含むマイクロカプセルの浮力を活用して細胞を浮遊させて選別する方法を提案するものの、実施に際して以下の課題がある。即ち、マイクロカプセルのような粒子を効果的に浮遊させるためにその比重を小さくすればするほど、粒子は直ぐに浮上してしまい、液中に安定に留まることができない。保管中に粒子が水面に浮上すると、水面上に露出した粒子表面は乾燥し、粒子や粒子表面に結合した抗体などが変性する。また粒子同士が互いに接触し浮力により圧接されて凝集し、分散した状態を安定に維持することが困難である。また、浮上性の高い粒子を用い、試料との反応時に激しく攪拌することにより粒子を分散する方法も考えられるが、過度の攪拌は細胞など目的試料の活性の低下をもたらしてしまう。また、激しく攪拌せずとも試料との反応を十分に行える程度に、比重が試料を含む液体に近い粒子を用いると、その浮上性は失われ、選別に極めて長い時間がかかる、という問題がある。【０００６】
本発明は上記課題に鑑みて為されたものであり、その目的とするところは、試料分離用粒子の浮力を用いて目的物の分離を行う場合の、試料分離用粒子の浮上性と、試料分離用粒子の分散性・安定性と、の間の背反関係を解消することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した課題の少なくとも一の課題を解決するための本発明の一態様として、試料を捕捉する捕足分子が表面に結合しており、第１の比重を有する第１の粒子と、前記第１の比重よりも大きい第２の比重を有する第２の粒子と、第１の粒子と、第２の粒子と、を連結し、第１の条件下で解離する連結部と、を備える粒子複合体を、液体中での試料の分離に用いる。【０００８】
また、上述した課題の少なくとも一の課題を解決するための本発明の一態様として、粒子複合体を構成する第１の粒子の比重である第１の比重は、試料を含む液体の比重よりも小さくなるよう構成される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、試料分離用粒子の浮力を用いて液体中の目的物の分離を行う場合の、試料分離用粒子の浮上性と、試料分離用粒子の分散性・安定性と、の間の背反関係を解消することが可能となる。【００１０】
上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】複合型ビーズの構成の一例を示す模式図。
【図２】複合型ビーズの使用方法の一例を示す工程図。
【図３Ａ】試料溶液と複合型ビーズとを混合する工程の一例を示す図。
【図３Ｂ】試料溶液中で試料と複合型ビーズとが結合した状態の一例を示す図。
【図３Ｃ】試料溶液中で複合型ビーズの光解離部が解離した状態の一例を示す図。
【図３Ｄ】試料溶液中で解離した複合型ビーズが浮上/沈降する状態の一例を示す図。
【図４】実施例１によるクマリン化合物の構造の一例を示す図。
【図５】実施例１による中間体の作成法の一例を示す図。
【図６】実施例１による中間体の作成法の一例を示す図。
【図７】実施例１によるクマリン化合物の作成法の一例を示す図。
【図８】実施例１による抗体を低比重ビーズに導入する手順の一例を示す図。
【図９】実施例２によるクマリン化合物の作成法の一例を示す図。
【図１０】実施例３によるクマリン化合物の作成法の一例を示す図。
【図１１】実施例４によるクマリン化合物の作成法の一例を示す図。
【図１２】実施例５によるクマリン化合物の構造の一例を示す図。
【図１３】実施例６によるニトロベンジル化合物の作成法の一例を示す図。
【図１４】実施例７によるビーズの使用方法の一例を示す図。
【図１５】実施例８による複合型ビーズの構成の一例を示す図。
【図１６】実施例８による複合型ビーズの構造と作成法の一例を示す図。
【図１７】実施例８による複合型ビーズの使用方法の一例を示す図。
【図１８】実施例８による複合型ビーズの化学構造と作成法の一例を示す図。
【図１９】実施例８の第１の変形例による複合型ビーズの化学構造と作成法の一例を示す図。
【図２０】実施例８の第２の変形例による複合型ビーズの化学構造と作成法の一例を示す図。
【図２１Ａ】浮選分離装置の構成の一例を示す図。
【図２１Ｂ】浮選分離装置の構成の動作態様の一例を示す図。
【図２１Ｃ】浮選分離装置の構成の動作態様の一例を示す図。
【図２１Ｄ】浮選分離装置の構成の動作態様の一例を示す図。
【図２２】浮選分離装置の動作フローを示す図。
【図２３】実施例４における抗体の結合方法の一例を示す図。
【図２４】磁場発生機構を備えた浮選分離装置の構成の一例を示す図である。
【図２５】磁場発生機構を備えた浮選分離装置の構成の一例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
図１は、本発明による粒子複合体の好ましい構成の一例について概略を示す模式図である。図１に示すように、本実施形態における粒子複合体１は、低比重ビーズ２、高比重ビーズ３、所定の条件を満たす光を照射すると解離反応を起こす光解離部４、抗体５から構成される。以下、本実施形態では粒子複合体１を複合型ビーズ１と呼ぶこととする。ただし、本実施形態では低比重ビーズ２、高比重ビーズ３のようなビーズ（微粒子）を例として説明を行うが、これらの粒子には必ずしもビーズ構造を有する粒子を用いる必要はなく、その他の粒子を用いることも可能である。なお、本実施形態においては、ある物質の比重は、水を基準としたものであり、ある物質の密度と基準物質である水の密度との比を示す。
【００１３】
以下本発明によるビーズの構成と使用形態について詳細に説明する。本発明における複合型ビーズ１は低比重ビーズ２と高比重ビーズ３とを光解離部４で結合した構造をもち、低比重ビーズ２の表面には抗体５を備える。ここで、低比重ビーズ２とは使用する液体の比重よりも小さい比重を持つビーズを示し、高比重ビーズ３とは使用する液体の比重よりも大きい比重を持つビーズを示す。例えば水系で使用する場合は、低比重ビーズ２の比重は１より十分に低く、また高比重ビーズ３の比重は１より十分に高い。また複合型ビーズ１の比重は概ね使用する液体の比重と同じとなるように、低比重ビーズ２、高比重ビーズ３、及び光解離部４の比重が選択されている。例えば、水系で使用する場合には、複合型ビーズ１の比重は概ね１となるように低比重ビーズ２、高比重ビーズ３、及び光解離部４の比重が選択されている。
【００１４】
ここで概ね使用する液体の比重と同じ範囲とは、好適には使用する液体の比重に対する比重の比が１±０.０５、より好ましくは１±０.０１、さらに好ましくは１±０.００５といえるが、必ずしもこの範囲には限定されない。このビーズは図示しないトリス−EDTA緩衝液などの水溶液系の保存液中に、暗所（遮光容器内）で保管する。保存液の比重も概ね１であり、ビーズの比重と概ね等しいため、複合型ビーズ１は保存液中で沈降したり浮上したりせず、均一に分散された状態を安定に維持する。従って、保存中の凝集の不具合は無く、また使用前に再分散させるために激烈な振動などを加える必要も無いという特長がある。
【００１５】
図２は、本発明によるビーズの好ましい使用態様の概略を示すフローチャートである。はじめに複合型ビーズ１を試料溶液と混合する（１０１）。次に、複合型ビーズ１を混合した試料溶液に光照射を行う（１０２）。次に、低比重ビーズ２と試料６とが結合した複合体を浮上させ、高比重ビーズ３を沈降させるために所定の時間待機する（１０３）。次に、浮上／沈降によって、浮上した低比重ビーズ２と試料６とが結合した複合体と、沈降した高比重ビーズ３と、が分離すると（１０４）、低比重ビーズ２と試料６とが結合した複合体の分画回収（１０５）と、高比重ビーズ３の分画回収（１０６）とをそれぞれ行う。
【００１６】
以上の各工程について、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、を用いてより詳細に説明する。
まず、混合工程１０１において、図３Ａに示すように、細胞や蛋白、核酸等の採取目的の生体物質を含む試料６を含む溶液１０（以下試料溶液、比重約１）と複合型ビーズ１とを準備し、両者を混合する。この工程１０１は暗所（遮光装置または短波長を除去したイエローランプ下、遮光容器内）で執り行う。試料溶液１０の比重も概ね１であるため、複合型ビーズ１は試料溶液１０中で均一に分散し、おだやかな攪拌により試料６と効率よく混合し、図３Ｂに示すように試料６表面上の抗原７と抗体５とが効率よく抗原抗体反応を行って結合する。即ち複合型ビーズ１は目的とする試料６と選択的かつ効率よく結合し、目的外の夾雑物は複合型ビーズ１と結合しない。
【００１７】
次に、光照射工程１０２において、光解離部４が解離するに十分な波長と強度の光を図３Ｂに示した工程１０１の産物に対して照射する。すると、図３Ｃに示すように、複合型ビーズ１の光解離部４は解離し、低比重ビーズ２と試料６とが結合した複合体８と、高比重ビーズ３とが分離する。
【００１８】
次に、浮上/沈降工程１０３において、試料６は細胞や蛋白、核酸等の採取目的の生体物質であり、これらの生体物質の比重は概ね１であるため、試料６と低比重ビーズ２との結合体である複合体８の比重は１より十分低く、図３Ｄに示すように、複合体８は浮上する。一方、高比重ビーズ３の比重は１より十分高いため、図３Ｄに示すように、高比重ビーズ３は沈降する。所定の時間待機することにより、複合体８の浮上と高比重ビーズ３の沈降を確実に行うことができる。ここで、所定の時間とは、例えば、対象粒子の粒径や濃度、溶媒との比重の比、溶媒の粘性、希望する回収率などで決定する。また遠心操作を行うことにより浮上と沈降を加速することができる。この浮上/沈降工程１０３の結果、複合体８は試料溶液１０の上部に、高比重ビーズ３は試料溶液１０の底部に集まる。また目的外の夾雑物は試料溶液１０の中に浮遊するか、あるいは試料溶液１０の底部に集まる。
【００１９】
次に、分画回収工程１０４ないし１０６において、浮上分画を溶液上部から、またその他の分画を溶液上部以外から分取する。ここで、浮上／沈降によって、浮上した低比重ビーズ２と試料６とが結合した複合体と、沈降した高比重ビーズ３と、が分離すると（１０４）、試料溶液１０の上部に集まった浮上分画は分画工程１０５において浮上分画回収容器に回収し、試料溶液１０の中に浮遊するか、あるいはその底部に集まったその他の分画（目的外の夾雑物も含む）は分画工程１０６においてその他分画回収容器に回収する。浮上分画回収容器に回収した浮上分画を、洗浄液を用いて洗浄し、再度浮上／沈降工程１０３と分画回収工程１０４ないし１０６を行ったり、このサイクルを複数回繰り返すことにより、試料溶液１０の中に浮遊する可能性のある夾雑物をより効率的に除去することもできる。浮上分画の回収の際には、例えば、実施例８にて後述するように２段階の解離によって低比重ビーズ２から試料６を切り離して試料６のみを回収することができる。また、他の手段としては、例えば本実施例の様に試料６と複合型ビーズ１とを抗原抗体反応を使って結合する場合は、過剰量の抗原（のエピトーブ）や抗体（の抗原認識部位）を投与し、拮抗させて解離を促す方法も考えられる。他の反応を用いる場合にも、結合に拮抗する物質を投与すれば原理的に切り放すことが可能である。また、回収において、遠心分離の後にピペッティングやデカンテーションを行ってもよい。
【００２０】
以上により目的とする試料６を浮上分画回収容器に、目的外の夾雑物などをその他分画回収容器に、それぞれ選択的に回収できる。
【００２１】
複合型ビーズ１が試料と反応を行うまでは複合型ビーズ１の比重は約１であるため、試料溶液１０中のビーズの安定性や分散性、反応性が高い。分離の際は試料と結合したビーズの複合体８の比重は１より十分低いため浮上性が高い。また試料溶液１０の激しい攪拌や加減圧といった生体物質を損傷する恐れのある操作も不要であるため、生体物質への適用性が高い。従って、ビーズの反応性や安定性と、目的試料の浮上性や生体物質への適用性という、従来技術において互いに背反していた技術要件を両立させることができる。即ち本発明は、反応性、安定性、浮上性、生体物質への適用性がいずれも高い高性能なビーズを提供できるという効果がある。
【００２２】
また、低比重ビーズ２の材料の一例として、ガスバリア性の隔壁の内部に気体を封入した構造を有する材料を用いることができる。この材料をここでは中空マイクロカプセルと称す。他に中空マイクロスフェアー、中空多孔質マイクロスフェアー、プラスチックマイクロバルーン（熱膨張性マイクロカプセルの既膨張品）、マイクロバブル、中空樹脂粒子、などと称される市販材料のうち、内部に気体を安定に保持し、比重が低い材料も同様に使用可能である。また、マイクロバブルを芯物質として気液界面で樹脂膜形成させ直接形成した中空マイクロカプセルも使用可能である。
【００２３】
低比重ビーズ２として中空マイクロカプセルをそのまま使用することも可能であり、また中空マイクロカプセルを少なくとも１つ内包する混合体粒子を使用することも可能である。本発明における低比重ビーズ２として比重０.００６ないし０.３、平均粒子径１ないし１,０００μｍの中空マイクロカプセルが使用可能であり、好ましくは比重約０.０２５ないし０.３、さらに好ましくは比重約０.０５、粒径約５〜２５μｍのものが使用可能である。中空マイクロカプセルの隔壁の材料としてはポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリメチルメタクリレート、アクリル酸ブチル/ジメタクリル酸グリコールクロスポリマー、フェノール樹脂、ユリア樹脂、メラミン−ホルムアルデヒド樹脂など各種の高分子材料製のものや、シリカなどの無機材料製のものが使用可能である。
【００２４】
また、これら材料の表面には原料として特定の官能基を含む材料を用いて合成したり、合成後にそれらの官能基に対して表面改質剤による修飾反応を行うなどの技術を用いてアミノ基やカルボキシル基等の各種官能基を導入することが可能である。表面にアミノ基やカルボキシル基を導入した中空マイクロカプセルが低比重ビーズ２として好適に使用可能である。
高比重ビーズ３の材料として、金属やガラス類、セラミックスなどの高比重材料からなる微粒子、さらに好ましくは表面を生体適合性が高く低比重の高分子で被覆した高比重材料や、高比重材料を内部に埋めこんだ高分子微粒子等を用いることができる。金属としては鉄、コバルト、ニッケル、ジルコニア、ジルコン、チタニア、ステンレス、銀、金、白金など、ガラス類としてはソーダガラス、ソーダレスガラス、高比重ガラス、石英など、セラミックスとしてはアルミナや窒化珪素などが使用可能である。また高比重材料として酸化鉄などの可磁性物質を用いることも可能であり、その場合、高比重ビーズ３は磁気ビーズとしての機能も発揮する。
【００２５】
本発明における高比重ビーズ３の比重は微粒子中に含まれる高比重材料の種類と割合を変更することにより自在に調節可能であり、好ましくは比重１.５ないし５g/mL、特に好ましくは比重約２のものが使用可能である。このビーズの表面には公知の技術を用いてアミノ基やカルボキシル基等の各種官能基を導入することが可能である。表面にアミノ基やカルボキシル基を導入した磁気ビーズが高比重ビーズ３として好適に使用可能である。
【００２６】
なお、本実施形態では、低比重ビーズ２の表面に抗体５を備える構成を示したが、高比重ビーズ３の表面に抗体５を備える構成とし、分画工程１０６において沈降した分画を回収することで、高比重ビーズ３に捕捉された試料６の回収を行う構成とすることも可能である。
【００２７】
次に本発明を特徴づける機能材料である光解離部４、並びに低比重ビーズ２と高比重ビーズ３とを光解離部４で結合する方法、ビーズの浮選分離に用いる装置の構成について、以下の実施例により詳細に説明する。
【実施例１】
【００２８】
本実施例では、光解離部４として、青色可視光ないし近紫外光に対する感度を有するクマリン化合物を採用した例について説明する。この光解離部４の比重は約１である。本実施例で採用したクマリン化合物３１００の化学構造を図４に示す。クマリン化合物３１００は、低比重ビーズ２の表面の一部、並びに高比重ビーズ３の表面の一部の間を架橋する構造を有する。【００２９】
クマリン化合物３１００の作成法を図５ないし図７を用いて説明する。３００１は低比重ビーズ２の表面の一部、３００２は高比重ビーズ３の表面の一部、３０１０はアジ基を有するカルボン酸、３０２０はアルキン基とカルボキシル基を有するクマリン誘導体、３０３０は低比重ビーズ２にアジ基を導入した中間体、３０３１は高比重ビーズ３にクマリン誘導体を導入した中間体である。低比重ビーズ２の表面３００１と、高比重ビーズ３の表面３００２はそれぞれアミノ基を備える。図５に例示した通り、低比重ビーズ２の表面３００１のアミノ基と、アジ基を有するカルボン酸３０１０とをカルボジイミドやHOBt等の触媒の存在下で反応させると、両者は縮合して酸アミド結合を形成し、低比重ビーズ２にアジ基を導入した中間体３０３０を得る。同様に図６に例示した通り、高比重ビーズ３の表面３００２と、アルキン基とカルボキシル基を有するクマリン誘導体３０２０とを同様に反応させると、両者は酸アミド結合を形成し、高比重ビーズ３にクマリン誘導体を導入した中間体３０３１を得る。なお図示は省略したが、中間体３０３０や３０３１に対してそれぞれSulfo-NHS Acetateを用いる同様の反応を行うことにより、未反応のまま残された表面のアミノ基３００１や３００２をブロックし、非特異吸着を防止できる。【００３０】
図７に例示した通り、低比重ビーズ２にアジ基が結合した中間体３０３０と、高比重ビーズ３にクマリン誘導体が結合した中間体３０３１とを臭化第１銅やTBTA等の触媒の存在下で反応すると、両者のアジ基とアルキン基とはいわゆるフイスゲン反応により付加環化して1,2,3-トリアゾール環結合を形成し、クマリン化合物３１００が得られる。この化合物は両端の低比重ビーズ２と高比重ビーズ３との間をクマリン誘導体を介して架橋するため、この化合物により２種のビーズが結合される。【００３１】
中間体３０３０（を表面に有する低比重ビーズ２）と、中間体３０３１（を表面に有する高比重ビーズ３）とをともに低濃度とし、かつ適切な濃度比で反応することにより、反応が過度に進行して多数のビーズ同士が互いに凝集することを防止し、両中間体（ビーズ）の構成が所定の産物を主に得ることができる。【００３２】
例えば両中間体（ビーズ）を概ね１：１の濃度比で反応することにより、図１に例示したごとく両中間体（ビーズ）がそれぞれ１つずつ結合した形の産物が主に得られる。あるいは両中間体を概ね１２：１の濃度比で反応することにより、一つの高比重ビーズ３の周囲を十二個の低比重ビーズ２が六方晶形で包囲する形の産物を主に得ることができる。【００３３】
次に抗体５を低比重ビーズ２に導入する手順を図８を用いて説明する。目的試料６の抗原７に対する抗体５を準備し、抗体５に対し、アミノ基反応性アルキン試薬３０１２、例えば3-Propargyloxypropanoic Acid Succinimidyl Ester（ライフテクノロジーズ社製品番号A１０２７９）を推奨条件で反応させる。アミノ基反応性アルキン試薬３０１２は一端にアミノ基反応性のスクシンイミドエステル基、他端にアルキン基を有する。すると抗体５上のアミノ基と３０１２のスクシンイミドエステル基が縮合し、アルキン基が導入された抗体３０３８が得られる。【００３４】
一方、中間体３０３０の作成工程により、低比重ビーズ２の表面にはこの中間体が多数導入される。クマリン化合物３１００の合成工程において全ての中間体３０３０が中間体３０３１と反応するわけではなく、一部の中間体（特に低比重ビーズ２の表面上で、高比重ビーズ３と対向する表面以外に導入された中間体）３０３０は未反応のまま残っている。そこでアルキンが導入された抗体３０３８と、クマリン化合物３１００で架橋された低比重ビーズ２と高比重ビーズ３の架橋体とを、フイスゲン反応により付加環化させる。すると低比重ビーズ２の表面上の未反応の中間体３０３０のアジ基と、抗体に導入されたアルキン基が反応し、1，2，3-トリアゾール環結合を形成する。即ち低比重ビーズ２の表面上（高比重ビーズ３と対向する表面以外）に抗体５が結合した構造３１０８が形成される。なお図示は省略するが、この後、アルキン−PEG、並びにアジ化PEG等を順番に用いて同様にフイスゲン反応を行うことにより、中間体３０３０の未反応のアジ基や、中間体３０３１の未反応のアルキン基に対しそれぞれPEG鎖を導入し、非特異的な吸着を防止可能なビーズ表面が形成される。以上により図１に示す複合型ビーズ１が完成する。【００３５】
ここでは目的試料を捕捉するための捕捉用物質として抗体を例示したが、捕捉用物質は抗体に限定されず、生体物質を結合可能な様々な物質が捕捉用物質として使用できる。捕捉用物質の例としては、プロテインAやプロテインGや二次抗体など抗体との親和性が高い物質、ビオチンなどストレプトアビジンと親和性の高い物質、アビジンやストレプトアビジンなどビオチンと親和性の高い物質、His-tagなどたんぱく質の特定の配列と親和性の高い物質、核酸の相補鎖など核酸と親和性の高い物質、フィブロネクチンやラミニンやコラーゲンなどの細胞間マトリックスやRGDペプチドなど細胞との親和性が高い各種物質、などが挙げられる。【００３６】
なお図示しない第２の抗体を高比重ビーズ３に結合することも可能である。この場合、抗体を修飾する試薬としてアミノ基反応性アルキン試薬３０１２の代わりにアミノ基反応性アジド試薬を用い、抗体をアジ基で標識する。高比重ビーズ３には未反応の中間体３０３１に由来するアルキン基が残っているため、上記第１の抗体を結合する反応を行った後、十分に洗浄した後、第２の抗体とビーズ架橋体とをフイスゲン反応させることにより、第２の抗体上のアジ基と高比重ビーズ３上のアルキン基とが結合し、第２の抗体を高比重ビーズ３上に結合できる。第２の抗体としては目的試料以外の夾雑物に対する抗体を用いることができ、それにより、夾雑物を高比重ビーズ３とともに浮上分画から積極的に排除することができる。【００３７】
クマリン化合物３１００は３７５nm付近に吸収極大をもち、この波長付近の光を吸収することにより炭酸エステル基部分が切断される。従って、このクマリン化合物３１００は、上記波長の光の照射により解離し、その結果２種のビーズの間の結合が解離する。つまり光解離部４として機能する。本実施例ではクマリン系の光解離材料４を十分に解離可能な条件、即ち波長４０５nm、光量１０J/cm２で光照射を行った。この波長、光量は細胞に対する影響が少なく、光解離条件として温和である。
以上のように、本実施例は、光解離条件が温和であるため、細胞試料に対する影響が少なく、活性の高い細胞を回収できる、という特有の効果がある。
【実施例２】
【００３８】
実施例１とは別の実施例２について図９を用いて説明する。本実施例は実施例１と類似であるが、低比重ビーズ２の表面の一部３００３と、高比重ビーズ３の表面の一部３００４にはそれぞれアミノ基の代わりにカルボキシル基が備わること、アジ基を有するカルボン酸３０１０の代わりにアジ基を有するアミン３０１１、アルキン基とカルボキシル基を有するクマリン誘導体３０２０の代わりにアルキン基とアミノ基を有するクマリン誘導体３０２１を用いる点が主要な相違点である。【００３９】
反応スキームは概ね実施例１と同様であり、低比重ビーズ２の表面の一部３００３とアジ基を有するアミン３０１１から中間体３０３２、また高比重ビーズ３の表面の一部３００４とアルキン基とアミノ基を有するクマリン誘導体３０２１から中間体３０３３を合成し、両中間体からクマリン化合物３１０１を合成し、低比重ビーズ２と高比重ビーズ３を結合する。【００４０】
表面３００３や表面３００４の未反応のカルボキシル基はエステルや酸アミドなどの形でブロックすることにより非特異吸着を防止可能であり、中間体３０３２や中間体３０３３の未反応のアジ基やアルキン基は、実施例１同様、アルキン−PEG、並びにアジ化PEG等でブロックすることにより非特異吸着を防止可能である。【００４１】
最終的に得られるクマリン化合物３１０１の構造は上記変更に応じて実施例１のクマリン化合物３１００と異なるが、このクマリン化合物３１０１が低比重ビーズ２と高比重ビーズ３との間を架橋して結合する点は同様である。従って、光を吸収する前は両ビーズの結合は維持され、光の照射後に両ビーズが解離する点も同様である。従って本実施例は実施例１と同様の効果を奏する。
【実施例３】
【００４２】
実施例１ないし２とは別の実施例３について図１０を用いて説明する。本実施例は実施例１と類似であるが、アジ基を有するカルボン酸３０１０を低比重ビーズ２の代わりに高比重ビーズ３の表面に結合すること、アルキン基とカルボキシル基を有するクマリン誘導体３０２２として、実施例１で用いた３０２０と比較してアルキン基とカルボキシル基のクマリン骨格上の置換位置が逆転した構造の化合物３０２２を用い、それを高比重ビーズ３の代わりに低比重ビーズ２の表面に結合すること、最終的にクマリン化合物３１０２を得ること、などが主要な相違点である。【００４３】
本実施例では低比重ビーズ２表面に抗体５を導入する手順も実施例１と異なり、ヒンジ法を用いる。本実施例では低比重ビーズ２表面にクマリン誘導体３０２２を結合した後、低比重ビーズ２表面に残った未反応のアミノ基をブロッキングする前に、ヘテロバイファンクショナルクロスリンカーの１種であるNHS-PEGn-Maleimide（SM（PEG）n、Thermo社）を低比重ビーズ２表面と反応して結合する。NHS-PEGn-Maleimideの代わりに、両端にNHSとMaleimideを有するGMBS、EMCS、SMCCやそれらのsulfo誘導体などを用いても良い。この反応により、低比重ビーズ２表面にPEG鎖を介してMaleimide基が導入される。その後低比重ビーズ２表面にさらに残った未反応のアミノ基をブロッキングし、残りの反応を実施例１と同様に行ってクマリン化合物３１０２で架橋された低比重ビーズ２と高比重ビーズ３を得る。ここで低比重ビーズ２表面にはMaleimide基が導入されている。【００４４】
次に抗体５に対し、２-メルカプトエチルアミンなどの還元剤を作用させることにより抗体のヒンジ部のジスルフィド結合を開裂させ、SH基を有する抗体断片１５を得る。この抗体断片を、クマリン化合物３１０２で架橋された低比重ビーズ２と高比重ビーズ３の架橋体とを反応することにより、抗体のスルフヒドリル基が低比重ビーズ２上のMaleimide基と結合する（ヒンジ法）。これにより低比重ビーズ２上に抗体が結合し、図１に示す複合型ビーズ１が完成する。【００４５】
最終的に得られるクマリン化合物３１０２の構造は上記変更に応じて実施例１のクマリン化合物３１００とは異なるが、このクマリン化合物３１０２が低比重ビーズ２と高比重ビーズ３との間を架橋して結合する点は同様である。従って、光を吸収する前は両ビーズの結合は維持され、光の照射後に両ビーズが解離する点も同様であり、実施例１と同様の効果が得られる。【００４６】
ただし、SH基を介して抗体をビーズに結合するヒンジ法を採用したため、上記効果に加えて、抗原認識部位の修飾を回避でき、特異性の低下や非特異吸着を回避できるという特有の効果がある。
ちなみに本実施例で採用したクマリン誘導体３０２２の代わりに、クマリン誘導体３０２０を用いることも可能である。
【実施例４】
【００４７】
実施例１ないし３とは別の実施例４について図１１を用いて説明する。本実施例は実施例２と類似であるが、アジ基を有するアミン３０１１を低比重ビーズ２の代わりに高比重ビーズ３の表面に結合すること、アルキン基とアミノ基を有するクマリン誘導体３０２３として、実施例２で用いた３０２１と比較してアルキン基とアミノ基のクマリン骨格上の置換位置が逆転した構造の化合物３０２３を用い、それを高比重ビーズ３の代わりに低比重ビーズ２の表面に結合すること、などが主要な相違点である。【００４８】
実施例４は抗体の結合法も実施例２と異なり、ヒンジ法を用いる（図２３）。具体的には、実施例３で採用したNHS-PEGn-Maleimideの代わりに、アミノ基とMaleimide基を両端にもつPEG化合物３０１４ （Nanocs社製品番号PG２-AMML-６００）をヘテロバイファンクショナルクロスリンカーとして採用し、低比重ビーズ２の表面３００３と反応させて結合する。この反応により、低比重ビーズ２表面にPEG鎖を介してMaleimide基が導入された中間体３０４１を得る。クマリン化合物３１０３で架橋された低比重ビーズ２と高比重ビーズ３の架橋体を得た後、抗体断片１５をヒンジ法によって低比重ビーズ２上のMaleimide基に結合した構造３１０９を得る。即ち図１に示す複合型ビーズ１が完成する。
最終的に得られるクマリン化合物３１０３の構造も上記変更に応じてクマリン化合物３１０１と異なるが、このクマリン化合物３１０３が低比重ビーズ２と高比重ビーズ３との間を架橋して結合する点は同様である。従って、光を吸収する前は両ビーズの結合は維持され、光の照射後に両ビーズが解離する点も同様であり、本実施例の効果は実施例３と同様である。
【実施例５】
【００４９】
実施例１ないし４とは別の実施例５について図１２を用いて説明する。実施例５で用いる光解離部４は３１０４、３１０５, ３１０６,３１０７に示されるクマリン化合物である。これらのクマリン化合物の構造はそれぞれ実施例１〜４によるクマリン化合物の構造と類似であるが、低比重ビーズ２表面の官能基（アミノ基とカルボキシル基）が逆転している点、従って対応するリンカーやクマリン誘導体の官能基も逆転している点が主に異なる。それに伴いクマリン化合物の合成法も、低比重ビーズ２表面における反応について実施例１、実施例２、実施例３、実施例４とそれぞれ同様に行う点が異なる。実施例５の効果も、実施例１から４と同様である。
【実施例６】
【００５０】
実施例１ないし５とは別の実施例６について図１３を用いて説明する。本実施例は実施例１と類似であるが、最大の相違点は光解離部４として、ニトロベンジル化合物４１００を用いたこと、それに伴ってクマリン誘導体３０２０の代わりに、ニトロベンジル誘導体４０２０を原料として用いたことである。ニトロベンジル誘導体４０２０は一端に活性エステル（NHS）基、もう一端にアルキン基を有する。【００５１】
本実施例におけるニトロベンジル化合物４１００の作成法は実施例１と同様である。ただしニトロベンジル誘導体４０２０は活性エステル基を有するため、触媒を用いなくても低比重ビーズ２の表面３００１のアミノ基と反応し、低比重ビーズ２にニトロベンジル誘導体を導入した中間体４０３０を得た。高比重ビーズ３の表面３００２には、実施例３と同様の手順でアジ基を有するカルボン酸３０１０を反応させて、アジ基を導入した中間体３０３４を得た。両中間体４０３０、３０３４をフイスゲン反応させることにより、ニトロベンジル化合物４１００を得た。【００５２】
最終的に得られるニトロベンジル化合物４１００の構造は上記変更に応じて実施例１のクマリン化合物３１００と異なるが、このニトロベンジル化合物４１００が低比重ビーズ２と高比重ビーズ３との間を架橋して結合する点は同様である。またニトロベンジル化合物は３６５nm付近に吸収極大をもち、この波長付近の光を吸収することによりカルバメート部（オキシカルボニル基）が切断される。従って、このニトロベンジル化合物４１００は、上記波長の光の照射により解離し、その結果２種のビーズの間の結合が解離する。換言すると、光を吸収する前は両ビーズの結合は維持され、光の照射後に両ビーズが解離し、つまり光解離部４として機能する。【００５３】
従って、本実施例の効果は実施例１と同様である。ただし光に対する感度はニトロベンジル化合物の方が一般に低いため、解離にはより強力な光源や長い照射時間が必要になる。従って、本実施例ではニトロベンジル系の光解離材料４を十分に解離可能な条件、即ち波長３６５nm、光量１,０００J/cm２で光照射を行った。本実施例においては、入手が比較的容易なニトロベンジル系化合物を用いる為に複合型ビーズ１の作製を容易に行うことが可能となる。
【実施例７】
【００５４】
実施例１ないし６とは別の実施例７について図１４を用いて説明する。本実施例ではビーズとして本発明の実施例１ないし９で説明した浮選方式の複合型ビーズ１と、図示しない一般のビーズ９を用いる。いずれのビーズも抗体を有し、複合型ビーズ１を構成する低比重ビーズ２には抗体５として抗ＣＤ４５抗体、ビーズ９には抗体として抗ＣＤ３４抗体を有するものを用いた。複合型ビーズ１を構成する高比重ビーズ３の高比重材料として、可磁性物質を含まないものを用い、ビーズ９には可磁性物質を含むものを用いた。つまり複合型ビーズ１は非磁性ビーズ、ビーズ９は磁性ビーズである。【００５５】
本実施例の工程を図１４を用いて説明する。本実施例の工程の前半は図２に示す工程と類似であり、分離工程１０４までは、異なる操作は１点のみである。即ち、本実施例のビーズと試料の混合工程１０１においては、複合型ビーズ１とビーズ９とを、細胞試料と混合する。その結果、細胞試料のうち、CD４５抗原を発現する細胞には複合型ビーズ１、CD３４抗原を発現する細胞にはビーズ９、両抗原を共発現する細胞には複合型ビーズ１とビーズ９が結合し、いずれの抗原も発現しない細胞にはビーズは結合しない。【００５６】
光照射工程１０２により複合型ビーズ１から高比重ビーズ３が解離し、低比重ビーズ２（並びに抗体等）が残る。浮上/沈降工程１０３において、低比重ビーズ２（並びにその抗体に結合していた細胞試料、即ち少なくともCD４５抗原を発現している細胞）は浮上し、それ以外は沈降する。分離工程１０４において、浮上した分画、即ちCD４５陽性の細胞を含む分画を回収し、それ以外の分画は廃棄する。磁場作用工程１１３において、浮上分画に対して外部から磁場を作用させる。すると（CD４５陽性細胞を含む分画のうち）ビーズ９に結合したCD３４陽性の細胞、即ちCD４５陽性かつCD３４陽性の細胞がビーズ９とともに磁場に応答して吸引され、それ以外の成分は磁場に応答せずその場にとどまる。【００５７】
分離工程１１４において、磁場を作用させたまま、磁場に応答しない成分を洗浄により除去することにより、磁場応答分画を得る。磁場応答分画回収工程１１５において、磁場応答分画、即ちCD４５陽性かつCD３４陽性の細胞を回収する。分離工程１０４や分離工程１１４で浮上や磁場応答しなかった分画は廃棄工程１１６において廃棄する。【００５８】
以上の通り、本実施例は、浮力選別と磁気選別の２種類の分離原理を組み合わせて用いることにより、２種類のパラメータを指標とする２パラメータ分離を行うことができる、という特有の効果がある。本実施例では両パラメータとも陽性（＋＋）の分画を分取する方法を例示したが、分離において沈降分画や磁場非応答分画といった陰性（−）分画を分取することも可能である。即ち、＋＋ばかりでなく＋−、−＋、--といった各種の分画を同様に分取することも可能である。
【実施例８】
【００５９】
実施例１ないし７とは別の実施例８について以下にて説明する。本実施例で用いる複合型ビーズ１１の構成の概要について図１５を用いて説明する。この複合型ビーズ１１は実施例１ないし５による複合型ビーズ１と類似であるが、複合型ビーズ１における低比重ビーズ２に相当する部分が２層構造となっており、内部の低比重ビーズ２と、その表面に形成された第２の光解離部１４とから構成されることが主要な相違点である。即ち、ビーズ１１は、低比重ビーズ２の表面に形成された第２の光解離部１４を介し、さらに（第１の）光解離部４を介して高比重ビーズ３が結合され、また、低比重ビーズ２の表面に形成された第２の光解離部１４を介して抗体５が結合された構造を有する。【００６０】
次にビーズ１１の化学構造を図１６を用いて以下説明する。４１０２はビーズ１１の構造を示す模式図である。この図において低比重ビーズ２は３００１、高比重ビーズ３は３００２の球形で示す。このビーズ１１の作成法を以下説明する。まずニトロベンジル誘導体４０２０とアジ基を両端に有するPEG試薬３０１３とのフイスゲン反応により、ニトロベンジル誘導体にアジ基を導入した中間体４０３１を得る。この中間体４０３１が光解離部１４に相当する。この中間体４０３１と、表面にアミノ基を有する低比重ビーズ２（図中番号３００１）とを反応させ、低比重ビーズ２の表面にニトロベンジル誘導体（即ち第２の光解離部１４）を導入した中間体４０３２を得る。【００６１】
一方、表面にアミノ基を有する高比重ビーズ３（図中番号３００２）と、アルキン基とカルボキシル基を有するクマリン誘導体３０２０（光解離部４に相当する）とを反応させ、高比重ビーズ３にクマリン誘導体を導入した中間体３０３９を得る。中間体４０３２と中間体３０３９との反応により、低比重ビーズ２と高比重ビーズ３とがニトロベンジル誘導体とクマリン誘導体とで架橋された化合物４１０１を得る。【００６２】
この化合物表面、特に低比重ビーズ２の表面のうち高比重ビーズ３と対向しない面上（ただし図中には紙面の都合で低比重ビーズ２の下方に表示した）には、未反応のニトロベンジル誘導体が残る。この化合物４１０１と、アルキン基が導入された抗体３０３８とを反応させることにより化合物４１０２を得る。この化合物４１０２は、低比重ビーズ２と高比重ビーズ３とがニトロベンジル誘導体（第２の光解離部１４に相当）とクマリン誘導体（光解離部４に相当）とで架橋され、低比重ビーズ２と抗体５とがニトロベンジル誘導体（第２の光解離部１４に相当）で架橋された構造を有する。換言すると、この化合物４１０２は、低比重ビーズ２の表面に形成された第２の光解離部１４を介し、さらに（第１の）光解離部４を介して高比重ビーズ３が結合され、また、低比重ビーズ２の表面に形成された第２の光解離部１４を介して抗体５が結合された構造を有する、ビーズ１１である。【００６３】
次に、本実施例によるビーズ１１の使用方法を図１７を用いて説明する。図１７は本実施例によるビーズ１１の好ましい使用方法の概略を示す工程図である。本工程の前半（分離工程１０４まで）は実施例１〜８（図２）と共通である。唯一異なるのは、光照射工程が、浮上/沈降工程１０３の前の第１の光照射工程１２２と、浮上分画の際の第２の光照射工程１２３の２段階で行われる点である。第１の光照射工程１２２の内容は実施例１〜５における光照射工程１０２と同じであり、クマリン系の光解離部４を解離するに必要な条件、即ち波長４０５nm、光量１０J/cm２で光照射を行う。この操作により高比重ビーズ３が低比重ビーズ２から解離する。この条件ではニトロベンジル系の光解離部１４は解離しないため、低比重ビーズ２と抗体５との結合は維持されるのは実施例１〜５と同様である。【００６４】
次に、本実施例特有の工程、即ち分離工程１０４以降の工程について説明する。分離工程１０４で得た浮上分画は、試料細胞に対し、抗体を介して低比重ビーズ２が結合し、それ以外の夾雑物の混入がないものである。この浮上分画に対し、第２の光照射工程１２３を実施する。この第２の光照射工程１２３において、ニトロベンジル系の光解離材料１４を十分に解離可能な条件、即ち波長３６５nm、光量１,０００J/cm２で光照射を行った。この操作により抗体５（と試料細胞との結合体）から低比重ビーズ２が解離し、低比重ビーズだけが浮上し、抗体５と試料細胞との結合体は溶液中に残る。分離工程１２４において浮上しなかった、その他の分画（試料細胞を含む）を分離し、その他の分画回収工程１２５において、この分画を回収することにより、試料細胞を回収する。【００６５】
一方、分離工程１２４において浮上した分画（低比重ビーズを含む）は、廃棄工程１２６において廃棄する。従って、本実施例によって回収した試料細胞にはビーズが含まれない、という特長がある。
本実施例の変形例を以下説明する。図１９、図２０はそれぞれ本実施例の第１、第２の変形例によるビーズ１１の化学構造と作成法を示す模式図である。ちなみに図１８に、同様の書き方に基づく本実施例によるビーズ１１の化学構造の模式図である。図１８は図１６と同じ内容を簡略化して示したものであり、主に末端の官能基と主要な骨格を強調して、途中の詳細な化学構造は省略あるいは簡略化したものである。例えば、ニトロベンジル誘導体はNB、クマリン誘導体はクマリン、ポリオキシエチレン鎖はPEG、N-ヒドロキシスクシンイミドはNHS、マレイミド基はMaleimide等と略記した。【００６６】
第１の変形例では、図１９に示した通り、低比重ビーズ２と高比重ビーズ３としてそれぞれ表面にアジ基を有するものを用いた。アルキンとNHSを両端に持つニトロベンジル誘導体４０２０と、ニトロベンジル誘導体にマレイミド基を導入した中間体４０３３とを低比重ビーズ２に反応させ、低比重ビーズ２にニトロベンジル誘導体とマレイミドを導入した中間体４０３４を得た。一方高比重ビーズ３にはアルキン基とアミノ基を有するクマリン誘導体３０２１を反応させ、高比重ビーズ３にクマリン誘導体を導入した中間体３０４０を得た。両ビーズを反応させ、低比重ビーズ２と高比重ビーズ３とがニトロベンジル誘導体とクマリン誘導体とで架橋された化合物４１０３を得た。これにSH基を有する抗体断片１５を反応させ、低比重ビーズ２と高比重ビーズ３とがニトロベンジル誘導体とクマリン誘導体とで架橋され、低比重ビーズ２と抗体５とがニトロベンジル誘導体で架橋された化合物４１０４、即ち本実施例第１の変形例によるビーズ１１を得た。
第２の変形例では図２０に示した通り、第１の変形例と類似の材料並びに方法を用いてビーズ１１を得た。異なるのは、アルキンとNHSを両端に持つニトロベンジル誘導体４０２０の代わりに、アルキンとNHSを両端にもつ（即ちニトロベンジル誘導体を持たない）試薬３０１２を原料として用いたことである。これに伴い、中間体４０３５、４１０５、並びに最終産物４１０６のクマリン結合部分はニトロベンジル誘導体を持たず、従って低比重ビーズ２と高比重ビーズ３とはクマリン誘導体だけで架橋される。これら第１、第２の変形例によるビーズ１１は、本実施例と同様に使用可能である。【００６７】
本実施例の第３の変形例を以下説明する。上記実施例１１では図１７に示す工程を１回だけおこなう場合を例に説明した。この工程（以下単位工程）により、１種類の抗体を用いて、対応する抗原を有する試料細胞を選別可能であり、かつ、ビーズが細胞に残らない。従って、この単位工程の産物である試料細胞を、次の単位工程の原料として用いることができる。本変形例では、単位工程ごとに抗体（抗原）の種類をA、B、Cのように変えて、複数回繰り返す。すると回収される細胞は、１回目はA、２回目はAかつB、３回目はAかつBかつC（を発現する細胞）のごとく、繰り返すごとに絞り込むことができる。換言すると、従来ビーズ法で困難であった、マルチパラメータ分離が可能になる、という特有の効果がある。
【実施例９】
【００６８】
実施例１ないし８とは別の実施例９について以下にて説明する。本実施例では、ビーズの浮選分離のための装置構成の概要について図２１Ａ、図２１Ｂ、図２１Ｃ、図２１Ｄ、図２２、図２４を用いて説明する。図２１Ａに示すように、浮選分離装置１０００は、遮光筐体１００１、遮光蓋１００２、複合型ビーズ１を液体中で格納する遮光容器であるビーズ容器１０１０、試料６を含む試料溶液を格納する容器である試料容器１０１１、低比重ビーズ２と試料６とが結合した複合体を回収する回収容器１０１２、ビーズを分取する分注ノズル１０２１、分注ノズルを稼働させる分注機構１０２０、試料容器１０１１内の溶液の攪拌を行うボルテックスミキサーやマグネチックスターラー等の攪拌機構１０３０、光を照射する光照射機構１０４０、回収容器１０１２を保持する回収容器保持部１０１３、試料容器１０１１を保持する試料容器保持部１０１４、ビーズ容器１０１０を保持するビーズ容器保持部１０１５からなる。なお、図２１Ａでは攪拌機構１０３０は試料容器保持部１０１４の下部に位置するが、攪拌機構１０３０と試料容器保持部１０１４が一体となっていてもよい。【００６９】
そして、図２１Ａ、図２４に示すように、分注機構１０２０、攪拌機構１０３０、光照射機構１０４０は、制御装置２４００と接続しており、制御プログラム２４０５によって制御されることで稼働する。図２４に示すように、制御装置２４００は、ＣＰＵ２４０３と、メモリ２４０４と、インタフェース２４０６と、を備え、メモリ２４０４中に制御プログラム２４０５が格納されており、制御プログラム２４０５はＣＰＵ２４０３によって実行される。また、制御装置２４００は、インタフェース２４０６を介して浮選分離装置１０００や、ユーザが制御プログラムを稼働させるための信号入力に用いるキーボード２４０１やディスプレイ２４０２と接続している。ただし、制御プログラム２４０５が実行する処理は、その一部ないし全てを集積回路化するなどしてハードウェアで実現してもよい。【００７０】
次に、本浮選分離装置１０００の基本動作を図２１Ａ、図２１Ｂ、図２１Ｃ、図２１Ｄ、と図２２を用いて説明する。
まず、装置の稼働に先立って、図２２の工程２００において、複合型ビーズ１を含むビーズ容器１０１０をビーズ容器保持部１０１５に、試料６を含む試料容器１０１１を試料容器保持部１０１４に、回収容器１０１２を回収容器保持部１０１３に、それぞれ設置する。【００７１】
そして、浮選分離装置１０００は制御装置２４００の制御の下で、図２２に示す工程２０１ないし２０５の操作を自動で実施する。
まず、工程２０１において、図２１Ａに示すように、分注機構１０２０は分注ノズル１０２１をビーズ容器１０１０の位置に移動し、分注ノズル１０２１は複合型ビーズ１が分散している溶液を吸引することで複合型ビーズ１をビーズ容器１０１０から分取する。そして、図２１Ｂに示すように、分注機構１０２０は分注ノズル１０２１を試料容器１０１１の位置に移動し、分注ノズル１０２１は、複合型ビーズ１を試料容器１０１１中の試料溶液に添加する。そして、攪拌機構１０３０を用いて試料溶液を攪拌することで、両者を混合する。以上の操作は遮光筐体１００１の中で遮光蓋１００２を閉じた状態で即ち遮光条件で実施する。この操作により、複合型ビーズ１は目的とする試料６と結合する。【００７２】
次に、工程２０２において、図２１Ｃに示すように、光照射機構１０４０を用いて、試料容器１０１１内の複合型ビーズ１と試料６との結合体に光を所定時間照射する。すると、複合型ビーズ１の光解離部４が解離する。工程２０３において、試料６と低比重ビーズ２との複合体８は浮上し、高比重ビーズ３や目的試料以外の夾雑物（図示しない）は沈降するか、溶液中に留まる。工程２０４において、両者の分離を所定時間待つ。【００７３】
次に、工程２０５において、浮上した試料６と低比重ビーズ２との複合体８を、試料容器１０１１内の試料溶液の上部から、分注機構１０２０の分注ノズル１０２１を用いて分取する。分注機構は、図２１Ｄに示すように、分注ノズル１０２１を回収容器１０１２の位置に移動し、分注ノズル１０２１は複合体８を吐出することにより、複合体８を回収容器１０１２に回収する。
工程２０６において、沈降あるいは溶液中に留まった高比重ビーズ３や目的試料以外の夾雑物（図示しない）を廃棄する。高比重ビーズ３の廃棄は、分注ノズル１０２１を用いて高比重ビーズ３を別の回収容器に吐出してもよい。【００７４】
また、浮選分離装置１０００は必要に応じて図２５に示すように、磁場発生機構１０５０を備えることも可能であり、実施例７のごとく、浮選複合型ビーズ１と磁気ビーズ９とを用い、磁場を発生させる磁場発生機構１０５０を用いて磁気ビーズ９を磁気分離することも可能である。本装置を用いることにより操作を自動化できるため、省力化ばかりでなく、スループットや再現性を向上できる。
【実施例１０】
【００７５】
実施例１ないし９とは別の実施例９について以下にて説明する。本実施例による浮選分離装置１０００は実施例１３と同様であるが、その使用方法が以下の通り異なる。複合型ビーズ１を本装置の内部に設置し、試料に対して自動分注して使用する代わりに、外部の試料、好ましくはイエローライト下の顕微鏡下で観察した細胞試料、好ましくは接着性生細胞に添加する点が異なる。【００７６】
顕微鏡下で観察した試料生細胞のうち、目的とする細胞を分取するために、その試料にビーズを添加し、反応させる。接着生細胞の場合はそれを剥離した後、細胞試料を収納した遮光試料容器１０１１を本装置に設置し、以下は前記実施例１２と同様に分離操作を行う。本実施例は、細胞の観察と、目的細胞の分取とを一貫した操作で行うことができる、という特有の効果がある。【００７７】
本実施例の変形例として、顕微鏡を外部に設けず、本装置に内蔵する構成も可能である。この構成を採用することにより、細胞の観察と、細胞の分取を同じ装置内で一貫した操作で行うことができる、という特有の効果がある。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明によるビーズは、反応時において比重が概ね１であるため保存安定性、分散性、反応性、生体物質への適用性が高く、また分離時において試料に結合する低比重ビーズの比重は１より十分小さいため、浮上性が高く、選別を迅速に行える。従って、本発明によるビーズは細胞、細胞内器官、蛋白、イムノグロブリン、核酸、などの生体物質の分離精製や、免疫計測の前処理における分離や検出における担体として好適に適用可能である。
【符号の説明】
【００７９】
１…複合型ビーズ、２…低比重ビーズ、３…高比重ビーズ、４…光解離部、５…抗体、６…試料、７…抗原、１１…実施例８による複合型ビーズ、１４…第２の光解離部、１０００…浮選分離装置、１００２…遮光筐体、１０１０…ビーズ容器、１０１１…試料容器、１０２１…分注ノズル、１０４０…光照射機構、３０３０…低比重ビーズにアジ基を導入した中間体、３０３１…高比重ビーズにクマリン誘導体を導入した中間体、３１００…実施例１におけるクマリン化合物、３１０１…実施例２におけるクマリン化合物、３１０２…実施例３におけるクマリン化合物、３１０３…実施例４におけるクマリン化合物、４１００…実施例６におけるニトロベンジル化合物
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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