(57)【要約】【課題】薬剤耐性サイトメガロウィルスを検出するために、ＵＬ９７遺伝子および／またはＵＬ５４遺伝子の変異を迅速に検出するために使用する新規なプラーマーセットを提供する。【解決手段】新規なプライマーセットは、ＵＬ９７遺伝子の薬剤耐性に関わる変異が報告されている後半の領域と、ＵＬ５４遺伝子領域の９２％以上に相当する領域の解析を可能とした。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトメガロウイルスの薬剤耐性変異の検出方法であって、
サイトメガロウイルスのＵＬ９７遺伝子の変異を検出するための下記プラーマーセット（Ａ）と、サイトメガロウイルスのＵＬ５４遺伝子の変異を検出するためのプライマーセット（Ｂ）またはプライマーセット（Ｃ）のうち、いずれか１つとを組み合わせで用いる検出方法。
＜プライマーセット（Ａ）＞
プライマー１：５’−ｔｇｃｃｃａａａｇａｇｇａｃｇａｔｔｔｔ−３’ （配列番号１）
プライマー２：５’−ｇｔａｇｔｃｃａａａｃｔｃｇａｇａｃｇｃ−３’ （配列番号２）
＜プライマーセット（Ｂ）＞
プライマー３：５’−ａｃｇｇｔｃａｇａｃｇｇｇｇｔｔｇａｔｃａａｇｃａ−３’（配列番号３）
プライマー４：５’−ａｇｃａｃｇｔｔｇｇｔｔａｃａｇｃｃｔｔｇａｇａａｃｃｔ−３’（配列番号４）
＜プラーマーセット（Ｃ）＞
プライマー５：５’−ｔｃａｔｔｇｃｃａｇｃｇｔｇｇｇｃｇａａｃｔａｇｔｇ−３’（配列番号５）
プライマー４：５’−ａｇｃａｃｇｔｔｇｇｔｔａｃａｇｃｃｔｔｇａｇａａｃｃｔ−３’（配列番号４）
【請求項２】
サイトメガロウイルスの薬剤耐性変異が、サイトメガロウイルスのＵＬ９７遺伝子産物の４００番目のアミノ酸以降の変異およびサイトメガロウイルスのＵＬ５４遺伝子産物のアミノ変異である請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
検出方法がＰＣＲを利用する方法であって、サイトメガロウイルスのＵＬ５４の変異を検出するＰＣＲが、ステップダウンＰＣＲである請求項１または２記載の検出方法。
【請求項４】
サイトメガロウイルスの薬剤耐性変異の同定方法であって、以下の工程を含む同定方法。
（１）工程１：サイトメガロウイルスのＵＬ９７遺伝子の後半領域の約１．３ｋｂｐを以下のプライマーセット（Ａ）でＰＣＲ法により増幅して塩基配列を解析し、アミノ酸変異の有無を調べる工程、
＜プライマーセット（Ａ）＞
プライマー１：５’−ｔｇｃｃｃａａａｇａｇｇａｃｇａｔｔｔｔ−３’ （配列番号１）
プライマー２：５’−ｇｔａｇｔｃｃａａａｃｔｃｇａｇａｃｇｃ−３’ （配列番号２）
（２）工程２：サイトメガロウイルスのＵＬ５４遺伝子のほぼ全域の約３．４ｋｂｐを以下のプライマーセット（Ｂ）またはプライマーセット（Ｃ）でＰＣＲ法により増幅して塩基配列を解析し、アミノ酸変異の有無を調べる工程とを有する。
＜プライマーセット（Ｂ）＞
プライマー３：５’−ａｃｇｇｔｃａｇａｃｇｇｇｇｔｔｇａｔｃａａｇｃａ−３’（配列番号３）
プライマー４：５’−ａｇｃａｃｇｔｔｇｇｔｔａｃａｇｃｃｔｔｇａｇａａｃｃｔ−３’（配列番号４）
＜プラーマーセット（Ｃ）＞
プライマー５：５’−ｔｃａｔｔｇｃｃａｇｃｇｔｇｇｇｃｇａａｃｔａｇｔｇ−３’（配列番号５）
プライマー４：５’−ａｇｃａｃｇｔｔｇｇｔｔａｃａｇｃｃｔｔｇａｇａａｃｃｔ−３’（配列番号４）
【請求項５】
前記工程２におけるＰＣＲ法が、ステップダウンＰＣＲである請求項４記載の同定方法。
【請求項６】
サイトメガロウイルスの薬剤耐性変異の検出または同定に用いる以下のプライマーセット（Ａ）と、プライマーセット（Ｂ）又は（Ｃ）のうち、いずれか１つの組合せからなるプラーマーセット。
＜プライマーセット（Ａ）＞
プライマー１：５’−ｔｇｃｃｃａａａｇａｇｇａｃｇａｔｔｔｔ−３’ （配列番号１）
プライマー２：５’−ｇｔａｇｔｃｃａａａｃｔｃｇａｇａｃｇｃ−３’ （配列番号２）
＜プライマーセット（Ｂ）＞
プライマー３：５’−ａｃｇｇｔｃａｇａｃｇｇｇｇｔｔｇａｔｃａａｇｃａ−３’（配列番号３）
プライマー４：５’−ａｇｃａｃｇｔｔｇｇｔｔａｃａｇｃｃｔｔｇａｇａａｃｃｔ−３’（配列番号４）
＜プラーマーセット（Ｃ）＞
プライマー５：５’−ｔｃａｔｔｇｃｃａｇｃｇｔｇｇｇｃｇａａｃｔａｇｔｇ−３’（配列番号５）
プライマー４：５’−ａｇｃａｃｇｔｔｇｇｔｔａｃａｇｃｃｔｔｇａｇａａｃｃｔ−３’（配列番号４）
【請求項７】
サイトメガロウイルスのＵＬ９７遺伝子変異の検出または同定に用いる以下のプラーマーセット（Ａ）。
プライマー１：５’−ｔｇｃｃｃａａａｇａｇｇａｃｇａｔｔｔｔ−３’ （配列番号１）
プライマー２：５’−ｇｔａｇｔｃｃａａａｃｔｃｇａｇａｃｇｃ−３’ （配列番号２）
【請求項８】
サイトメガロウイルスのＵＬ５４遺伝子変異の検出または同定に用いる以下のプラーマーセット（Ｂ）。
プライマー３：５’−ａｃｇｇｔｃａｇａｃｇｇｇｇｔｔｇａｔｃａａｇｃａ−３’（配列番号３）
プライマー４：５’−ａｇｃａｃｇｔｔｇｇｔｔａｃａｇｃｃｔｔｇａｇａａｃｃｔ−３’（配列番号４）
【請求項９】
サイトメガロウイルスのＵＬ５４遺伝子変異の検出または同定に用いる以下のプラーマーセット（Ｃ）。
プライマー５：５’−ｔｃａｔｔｇｃｃａｇｃｇｔｇｇｇｃｇａａｃｔａｇｔｇ−３’（配列番号５）
プライマー４：５’−ａｇｃａｃｇｔｔｇｇｔｔａｃａｇｃｃｔｔｇａｇａａｃｃｔ−３’（配列番号４）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトメガロウイルスの薬剤耐性変異の迅速な検出方法およびサイトメガロウイルスの薬剤耐性変異遺伝子の同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトメガロウイルスは、ヘルペスウイルス科に属する２本鎖ＤＮＡウイルスであり、幼児期に不顕性感染し、一生涯にわたり潜伏感染する。
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）による感染は、人類の最大の感染症であり、米国では出生時期のＣＭＶ感染による難聴や精神発育遅延など恒久的な医療補助が必要とされる患者は５０００人程とされる。
また、移植や医療の高度化、ＨＩＶ感染等による免疫不全時に、ＣＭＶは肺炎、網膜炎、消化管潰瘍等の疾病を引き起こす。
その治療に、ガンシクロビル、フォスカビル、シドフォビル等の抗ＣＭＶ薬が使用されるが、臓器移植患者における長期の予防投与などにより、耐性ウイルスの出現が問題となっている。
ＣＭＶの薬剤耐性は、上記の治療薬の作用機序に関わる遺伝子の変異により生じる。
例えば、ガンシルビルは、ＣＭＶのＤＮＡポリメラーゼを阻害するために、ＣＭＶのＵＬ９７遺伝子にコードされるリン酸転移酵素で一リン酸化されることが活性型になる要件である。
そのため、ＣＭＶのガンシクロビル耐性株は、ＵＬ９７遺伝子に変異を持つか、またはＤＮＡポリメラーゼをコードするＵＬ５４遺伝子に変異を持つことが知られている（非特許文献１）。【０００３】
【非特許文献１】日本臨床，  Ｖｏｌ．６５増刊号２，  ４７６−４７９  （２００７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
患者から分離されたＣＭＶの薬剤感受性を調べるため、ＵＬ９７遺伝子とＵＬ５４遺伝子の塩基配列の決定が必要である。
しかしながら、従来の方法では、患者から分離された試料より得られるＤＮＡ量が少ないため、直接ＰＣＲでそれらの遺伝子のＯＲＦ全領域を増幅することはその困難であった。
すなわち、これまでは患者のリンパ球を分離し、培養細胞に重層し、ウイルスが増殖するのを待ち、ウイルス粒子を超遠心で濃縮し、ゲノムＤＮＡを精製し、ＰＣＲを行っていた。
この方法では、最終的に塩基配列を決定するまでに２ヶ月弱の時間を要していため、臨床現場へのフィードバックまでに大幅に時間がかかっていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ウイルスを増殖させる時間を省き、薬剤感受性に関係する塩基配列を短時間で決定する方法の開発を試みた。
その結果、これまでに報告されていないプライマーのセットを考案し、薬剤耐性遺伝子ＵＬ９７とＵＬ５４の遺伝子を増幅できる条件を決定した。
そして、両遺伝子の塩基配列を決定し、薬剤耐性遺伝子とが同定した。
さらに、その遺伝子と、ウイルス分離を行ったウイルスの遺伝子との配列は同一であり、この方法の有用性も確認した。
以下に本発明を詳細に説明する。【０００６】
（１）ＵＬ９７遺伝子の変異
ＣＭＶのＵＬ９７遺伝子産物（７０７アミノ酸、２１２４塩基）は、蛋白質リン酸化活性を有する酵素で、ガンシクロビルなどの抗ＣＭＶ薬をリン酸化し、活性型へと誘導することが知られている。
すなわち、ガンシクロビルに耐性を獲得したＣＭＶの多くはＵＬ９７遺伝子に変異を持つことが、これまで種々の耐性ＣＭＶの遺伝子解析からも報告されている。
また、これらの研究からガンシクロビル耐性に関わるＵＬ９７遺伝子の変異は、全長で７０７アミノ酸の内、４００番目のアミノ酸以降の後半に集中している。
そこで、新たに下記のプライマーセット（Ａ）を設計した。【０００７】
＜プラーマーセット（Ａ）＞
・プライマー１（ＵＬ９７  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ｔｇｃｃｃａａａｇａｇｇａｃｇａｔｔｔｔ−３’  （配列番号１）【０００８】
・プライマー２（ＵＬ９７  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）
５’−ｇｔａｇｔｃｃａａａｃｔｃｇａｇａｃｇｃ−３’  （配列番号２）【０００９】
（２）ＵＬ５４遺伝子の変異
ＵＬ５４遺伝子産物は、ＤＮＡ合成酵素の活性を担っており、これまでの研究によりガンシクロビル、シドフォビルに対する耐性、フォスカビルに対する耐性に関わる変異箇所が報告されてきている。
そこで、新たに下記のプライマーセット（Ｂ），（Ｃ）を設計した。【００１０】
＜プラーマーセット（Ｂ）＞
・プライマー３（ＵＬ５４  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  １）
５’−ａｃｇｇｔｃａｇａｃｇｇｇｇｔｔｇａｔｃａａｇｃａ−３’  （配列番号３）【００１１】
・プライマー４（ＵＬ５４  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  １）
５’−ａｇｃａｃｇｔｔｇｇｔｔａｃａｇｃｃｔｔｇａｇａａｃｃｔ−３’  （配列番号４）【００１２】
＜プラーマーセット（Ｃ）＞
・プライマー５（ＵＬ５４  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ２）
５’−ｔｃａｔｔｇｃｃａｇｃｇｔｇｇｇｃｇａａｃｔａｇｔｇ−３’（配列番号５）
・プライマー４（ＵＬ５４  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  １）【００１３】
本発明の方法は、以下の手順で行えばよい。
（１）患者の尿や血液から分離したリンパ球からＤＮＡを抽出する。
（２）抽出したＤＮＡをＰＣＲする際、以下の操作を行う。
ａ）ＰＣＲ反応のサイクル数を増やす。
ｂ）遺伝子変異領域に絞って増幅を行い、その増幅距離を短くする。
上記の手順で実施することにより、少ないＤＮＡ量から効率よく必要な塩基配列を決定することができる。【００１４】
患者の尿や血液からリンパ球の分離および分離したリンパ球からのＤＮＡの抽出は、公知の方法を用いればよい。【００１５】
ＰＣＲ反応のサイクル数を増やすとは、例えば、ＰＣＲ反応を３０回以上、好ましくは、３５回〜５０回行うことである。【００１６】
微量のＤＮＡサンプルから増幅するためには、例えば、プライマーセットを２種類組み合わせたＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法がよく用いられている。
しかし、ＰＣＲ反応を２度行う必要があり、ＰＣＲ反応終了後に希釈や一度目のＰＣＲに使ったプライマーを除去するなど手技が複雑になり所用時間もかかる。
本発明方法では、最初は厳しい条件でＰＣＲ反応を行い、少しずつアニーリングの温度条件を緩和していくことで、非特異反応を軽減し、目的の遺伝子の高率な増幅を行う。
具体的には、ステップダウンＰＣＲでアニーリングの温度を６８〜７０℃から１サイクルごとに１℃ずつ下げながら約１０サイクル増幅を行う。【００１７】
遺伝子変異領域に絞って増幅とは、ＵＬ９７遺伝子の変異として既に報告された遺伝子変異領域のことである。
具体的には、全長で７０７アミノ酸の内、４００番目のアミノ酸以降の後半である。
この領域の変異を検出するためには、上記のプラーマーセット（Ａ）（プラーマー１およびプライマー２）でＵＬ９７遺伝子の後半の遺伝子領域（約１．３ｋｂｐ）を、ＰＣＲ法により増幅して塩基配列を解析し、さらにアミノ酸変異の有無を検討すればよい。
塩基配列の解析およびアミノ酸変異の検討は公知の方法で行えばよい。【００１８】
ＵＬ５４遺伝子の変異を検出するには、上記のプラーマーセット（Ｂ）または（Ｃ）（プラーマー３〜５）でＵＬ５４遺伝子のほぼ全領域に相当する約３．４ｋｂｐ（５３番目から１２００番目のアミノ酸をコードする領域）をＰＣＲ法で増幅して塩基配列を解析し、アミノ酸変異の有無を検討すればよい。
塩基配列の解析およびアミノ酸変異の検討は公知の方法で行えばよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明方法および本発明のプライマーは、ＵＬ９７遺伝子の薬剤耐性に関わる変異が報告されている後半の領域と、ＵＬ５４遺伝子領域の９２％以上に相当する領域の解析を可能とした。
これにより、サイトメガロウイルス全ての薬剤耐性変異株を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＵＬ９７のＰＣＲの結果を示す写真である。ＵＬ９７の既報の薬剤耐性に関与するアミノ酸変異が多いＣ末より３００のアミノ酸をコードする領域に対するＰＣＲ。矢印で示した場所に約１．３ｋｂｐの増幅が認められる。
【図２】ＵＬ５４のＰＣＲの結果を示す写真である。ＵＬ５４のＡＴＧから１５５ｂｐ、５０９ｂｐ離れた領域から、３６０２ｂｐ離れた領域までのＰＣＲ。なお、ＣＭＶのＵＬ５４のＣＤＳは３７２９ｂｐである。
【図３】ＵＬ５４のアミノ酸比較である。分離株１では、３５５番目のバリンからアラニンに、６８８番目のアラニンからバリンへの変異がある。なお、３１５７および３３０１は、乳児の尿からの分離株、ＨＡＮ１３は、気管支肺胞洗浄からの分離株である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を実施例で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
（１）患者の血液・尿から分離したリンパ球からＤＮＡの抽出
患者の血液は凝固させないように、ＥＤＴＡを加えた状態のものを使用した。
患者血液をリン酸緩衝生理食塩液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；  ＰＢＳ）で２倍に希釈し、密度勾配遠心用担体（Ｆｉｃｏｌｌ）を３ｍＬ加えた１５ｍＬチューブに静かに重層し、低速（１，５００ｒｐｍ  ３０分）遠心分離を行う。
リンパ球は赤血球と血清の境界面に集積するので、静かにこれを抜き取る。
サイトメガロウイルスのゲノムＤＮＡの抽出には、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社のＱＩＡ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ、もしくはロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社のＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ  Ｋｉｔを使用した。
患者の全血より分離した血漿、末梢血リンパ球２００μＬ、もしくは尿２００μＬに溶解ｂｕｆｆｅｒ  ＡＬ （Ｑｉａｇｅｎ）、またはＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｒｏｃｈｅ）を加え常法により抽出を行った。【００２３】
（２ａ）抽出したＤＮＡのＰＣＲ（その１）
サイトメガロウイルスのリン酸化酵素をコードしているＵＬ９７およびＤＮＡ合成酵素をコードしているＵＬ５４遺伝子領域をＰＣＲで増幅する。
＜反応液の作成＞
５μＭ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆｏｒｗａｒｄ：２μＬ
５μＭ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ：２μＬ
１０×ＫＯＤ  ＦＸ  ｎｅｏ  ｂｕｆｆｅｒ：５μＬ
２ｍＭ  ｄＮＴＰ：５μＬ
ＫＯＤ  ＦＸ  ｎｅｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：０．５μＬ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ：５μＬ
ｄｗ：３０．５μＬ
Ｔｏｔａｌ：５０μＬ【００２４】
＜反応条件（ＵＬ９７）＞
９６℃、５ｍｉｎ
９６℃、３０ｓｅｃ
５８℃、１５ｓｅｃ（３０  ｃｙｃｌｅ繰り返す。）
７２℃、１ｍｉｎ３０ｍｉｎ
７２℃、７ｍｉｎ
４℃、∞【００２５】
＜反応条件（ＵＬ５４）ステップダウンＰＣＲ＞
９４℃、２ｍｉｎ
９８℃、１０  ｓｅｃ
７０℃、３０  ｓｅｃ  ［１０  ｃｙｃｌｅ  繰り返す。（１ｃｙｃｌｅごとに１℃／ずつアニーリングの温度を下げる。）］
６８℃、５ｍｉｎ
９８℃、１０  ｓｅｃ
６０℃、３０  ｓｅｃ  （４５  ｃｙｃｌｅ  繰り返す。）
６８℃、５ｍｉｎ【００２６】
（２ｂ）抽出したＤＮＡのＰＣＲ（その２）
サイトメガロウイルスのリン酸化酵素をコードしているＵＬ９７およびＤＮＡ合成酵素をコードしているＵＬ５４遺伝子領域をＰＣＲで増幅する。
＜反応液の作成＞
５μＭ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆｏｒｗａｒｄ：２μＬ
５μＭ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ：２μＬ
２×ＫＯＤ  ＦＸ  ｎｅｏ  ｂｕｆｆｅｒ：２５μＬ
２ｍＭ  ｄＮＴＰ：５μＬ
ＫＯＤ  ＦＸ  ｎｅｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：１μＬ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ：５μＬ
ｄｗ：１０μＬ
Ｔｏｔａｌ：５０μＬ【００２７】
＜反応条件（ＵＬ９７）＞
９６℃、５ｍｉｎ
９６℃、３０ｓｅｃ
５８℃、１５ｓｅｃ（３０  ｃｙｃｌｅ繰り返す。）
７２℃、１ｍｉｎ３０ｍｉｎ
７２℃、７ｍｉｎ
４℃、∞【００２８】
＜反応条件（ＵＬ５４）ステップダウンＰＣＲ＞
９４℃、２ｍｉｎ
９８℃、１０  ｓｅｃ
６８℃、３０  ｓｅｃ  ［１０  ｃｙｃｌｅ  繰り返す。（１ｃｙｃｌｅごとに１℃／ずつアニーリングの温度を下げる。）］
６８℃、５ｍｉｎ
９８℃、１０  ｓｅｃ
５８℃、３０  ｓｅｃ  （４５  ｃｙｃｌｅ  繰り返す。）
６８℃、５ｍｉｎ【００２９】
アガロースゲル電気泳動で目的のサイズのバンドが増幅されているかを確認する。
複数のバンドが見られる場合は、アガロースゲル電気泳動後、切り出し精製をおこなう。
１本バンドの場合はＰＣＲ反応後の反応液からｃｌｅａｎ  ｕｐ  ｋｉｔを用いてプライマーを除去する。
図１にＵＬ９７のＰＣＲの結果の写真例を示し、図２にＵＬ５４のＰＣＲの結果の写真例を示す。【００３０】
（３）塩基配列の解析
＜シークエンス反応液の調製＞
ＡＢＩ  ５×ｂｕｆｆｅｒ：３．５μＬ
ＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖ３．１：１μＬ
Ｄｗ：１２．５μＬ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ：２μＬ
Ｐｒｉｍｅｒ：１μＬ【００３１】
＜シークエンス反応のプログラム＞
９６℃、１ｍｉｎ
９６℃、１０ｓｅｃ
５０℃、５ｓｅｃ（２８  ｃｙｃｌｅ繰り返す。）
６０℃、４ｍｉｎ
４℃、∞【００３２】
エタノール沈殿により過剰な蛍光物質を除去する。
上記反応液：２０μＬ
９９．５％エタノール：７０μＬ
６２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ：１０μＬ
Ｔｏｔａｌ：１００μＬ【００３３】
ボルテックスミキサーでよく撹拌し、室温１５分放置
１２，０００ｒｐｍ×１５ｍｉｎ  遠心
上清を完全に抜き取る。
７０％エタノール１００μＬを加える。
１２，０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ  遠心
上清を完全に抜き取る。
乾燥（１０〜１５分放置）
９５℃ヒートブロックかサーマルサイクラーを準備
Ｈｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ  １５μＬを各チューブに入れる。【００３４】
９５℃、２ｍｉｎ
氷中で５ｍｉｎ以上冷やす。
シークエンス用プレートに気泡ができないようにサンプルを移す。
セプタをかぶせる。
シークエンス解析  ＡＢＩ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３１３０  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにて塩基配列の決定。【００３５】
（４）アミノ酸変異の検討
上記実験結果から塩基配列をＧＥＮＥＴＹＸ  遺伝子解析ソフトによりこれまで報告されているサイトメガロウイルスのＵＬ９７，ＵＬ５４遺伝子と相同性の比較検討を行った。
また、得られた塩基配列からアミノ酸配列に変換し、アミノ酸置換の有無を検討した。
アミノ酸配列に変異が認められた場合は、これまで報告されているガンシクロビルまたはフォスカビル耐性に関わる変異箇所と比較し、変異箇所が既報告と同一の場合には薬剤耐性に関わる変異とみなした。
図３にＵＬ５４のアミノ酸比較例を示す。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、ＵＬ９７遺伝子の薬剤耐性に関わる変異が報告されている後半の領域と、ＵＬ５４遺伝子領域の９２％以上に相当する領域の解析を可能とした。
本発明は、薬剤の耐性を獲得したサイトメガロウイルスの迅速な検出に有用である。
【図１】
2014014077.tif 000003
【図２】
2014014077.tif 000004
【図３】
2014014077.tif 000005
【配列表】
2014014077000001.app
【国際調査報告】
2014014077.tif 000006
2014014077.tif 000007
2014014077.tif 000008
2014014077.tif 000009