(57)【要約】  逆相高速液体クロマトグラフィー（以下、逆相HPLCと記す）により検体中の２−アミノ−３−［２−（α−マンノピラノシル）インドール−３−イル］プロピオン酸（以下、Trp-Manと記す）を正確に測定するための方法を提供する。  検体中のTrp-Manを逆相HPLCにより測定する方法であって、移動相として、スルホン酸系のイオン対試薬を含む移動相を用いることを特徴とする測定方法。  本発明の逆相HPLCによるTrp-Manの測定方法は、腎臓機能の診断等に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の２−アミノ−３−［２−（α−マンノピラノシル）インドール−３−イル］プロピオン酸を逆相高速液体クロマトグラフィーにより測定する方法であって、移動相として、スルホン酸系のイオン対試薬を含む移動相を用いることを特徴とする測定方法。
【請求項２】
スルホン酸系のイオン対試薬が、アルキルスルホン酸塩である請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
アルキルスルホン酸塩が、ヘキサンスルホン酸塩である請求項２記載の測定方法。
【請求項４】
検体が、尿又は血清である、請求項１〜３のいずれかに記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中のアミノ−３−［２−（α−マンノピラノシル）インドール−３−イル］プロピオン酸の高速液体クロマトグラフィーによる測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２−アミノ−３−［２−（α−マンノピラノシル）インドール−３−イル］プロピオン酸（以下、Trp-Manと記す）は、式１に示す構造を有するＣ−グリコシドであり、尿中より蛍光性物質として単離された化合物である（非特許文献１、特許文献１参照）。【０００３】
【化１】
2014046163.tif 000002
【０００４】
Trp-Manは、生体機能、特に、腎臓機能、中枢神経機能、胎児の発育機能、腎糸球体濾過量の指標となることが知られている（特許文献２参照）。Trp-Manを高速液体クロマトグラフィー（以下、HPLCと記す）で測定する方法はこれまでにも知られているが（特許文献１、非特許文献２〜３参照）、検体中の夾雑物がしばしば問題となり、正確な測定ができないという問題があった。特に、検体として尿を用いる場合には、尿中に含まれる多種の蛍光性夾雑物がしばしばTrp-Manの正確な測定の妨げとなっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平６−２２００５６号公報
【特許文献２】国際公開第９９／０９４１１号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Biochemistry, 1994年, 115巻, 362-366頁
【非特許文献２】The American Journal of Medicine, 2001年, 110巻, 192-197頁
【非特許文献３】Kidney International, 2004年, 65巻, 1395-1399頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、逆相HPLCにより検体中のTrp-Manを正確に測定するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、逆相HPLCを用いる検体中のTrp-Manの測定方法において、移動相として、スルホン酸系のイオン対試薬を含む移動相を用いることにより、検体中の夾雑物とTrp-Manとを効率的に分離することができる、という知見を見出して、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の［１］〜［４］に関する。
［１］  検体中のTrp-Manを逆相HPLCにより測定する方法であって、移動相として、スルホン酸系のイオン対試薬を含む移動相を用いることを特徴とする測定方法。
［２］  スルホン酸系のイオン対試薬が、アルキルスルホン酸塩である［１］記載の測定方法。
［３］  アルキルスルホン酸塩が、ヘキサンスルホン酸塩である［２］記載の測定方法。
［４］  検体が、尿又は血清である、［１］〜［３］のいずれかに記載の測定方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、逆相HPLCによる検体中のTrp-Manの正確な測定方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】イオン対試薬として１−ヘキサンスルホン酸ナトリウムを含む移動相を用いた逆相HPLCによる尿検体中のTrp-Manの測定のクロマトグラムを表す。
【図２】イオン対試薬として１−ヘキサンスルホン酸ナトリウムを含む移動相を用いた逆相HPLCによる血清検体中のTrp-Manの測定のクロマトグラムを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（検体）
本発明における検体としては、本発明のHPLCによるTrp-Manの測定を可能とする検体であれば特に制限はなく、例えば尿、全血、血清、血漿、髄液、羊水、細胞抽出液等が挙げられ、尿及び血清が好ましい。本発明において、検体として、生体試料そのものを用いても、生体試料を前処理したものを用いてもよい。生体由来の検体の前処理としては、例えば遠心分離処理、フィルター処理、還元剤処理、酸処理等が挙げられる。還元剤処理で使用される還元剤としては、例えばアスコルビン酸等が挙げられる。酸処理使用される酸としては、例えば塩酸、過塩素酸等が挙げられる。
【００１２】
（逆相HPLC）
本発明における逆相HPLCは、Trp-Manの測定を可能とする逆相HPLCであれば特に制限はない。逆相HPLCにおける固定相としては、例えばオクタデシルシリル(ODS)基が結合したシリカゲル等が挙げられる。逆相HPLCにおける移動相は、スルホン酸系のイオン対試薬を含む移動相であり、例えば、当該イオン対試薬を含む、有機溶媒と緩衝液の混合溶媒等が挙げられる。有機溶媒としては、例えばアセトニトリル等が挙げられる。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、メタンスルホン酸緩衝液、ギ酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が挙げられる。移動相における有機溶媒と緩衝液の比率は適宜選択することができ、また、当該比率を変更して濃度勾配を持った移動相とすることもできる。検出は、蛍光、吸光、示差屈折、電気化学的検出等、公知の検出方法が用いられる。
【００１３】
逆相HPLCによる検体中のTrp-Manの測定は、内部標準物質を用いる方法でも、内部標準物質を用いない方法でもよい。内部標準物質を用いる方法における内部標準物質としては、例えばＮ−メチルセロトニン等の蛍光物質が用いられる。内部標準物質を用いる、検体中のTrp-Manの測定は、例えば以下の工程により行うことができる。
(1)生体試料又は前記の前処理を施された生体試料に既知濃度の内部標準物質を添加して検体を調製する工程；
(2)工程(1)で調製した検体を逆相HPLCに供する工程；
(3)得られたクロマトグラムにおいて、Trp-Manに該当するピークの面積、及び、内部標準物質に該当するピークの面積を算出する工程；
(4)工程(3)で算出されたTrp-Manに該当するピークの面積と内部標準物質に該当するピークの面積の比から、検体中のTrp-Man濃度を決定する工程。
【００１４】
内部標準物質を用いない、検体中のTrp-Manの測定は、例えば以下の工程により行うことができることができる。
(1)既知濃度のTrp-Manの標準溶液を調製する工程；
(2)工程(1)で調製した標準溶液を逆相HPLCに供する工程；
(3)得られたクロマトグラムにおいて、Trp-Manに該当するピークの面積を算出する工程；
(4)工程(3)で算出されたTrp-Manに該当するピークの面積から、Trp-Man濃度と、Trp-Manに該当するピークの面積との関係を表す検量線を作成する工程；
(5)検体をHPLCに供する工程；
(6)得られたクロマトグラムにおいて、Trp-Manに該当するピークの面積を算出する工程；
(7)上記工程(4)で作成した検量線に、上記(6)で算出した面積を照らし合わせて、検体中のTrp-Man濃度を決定する工程。
【００１５】
（イオン対試薬）
本発明におけるスルホン酸系のイオン対試薬としては、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、アルキル硫酸塩等が挙げられ、アルキルスルホン酸塩が好ましい。アルキルスルホン酸塩としては、例えば炭素数が３〜１８のアルキルを有するプロパンスルホン酸塩、ブタンスルホン酸塩、ペンタンスルホン酸塩、ヘキサンスルホン酸塩、ヘプタンスルホン酸塩、オクタンスルホン酸塩、ノナンスルホン酸塩、デカンスルホン酸塩、ウンデカンスルホン酸塩、ドデカンスルホン酸塩、トリデカンスルホン酸塩、テトラデカンスルホン酸塩、ペンタデカンスルホン酸塩、ヘキサデカンスルホン酸塩、ヘプタデカンスルホン酸塩、オクタデカンスルホン酸塩等が挙げられる。アリールスルホン酸塩としては、例えば２−ナフタレンスルホン酸塩等が挙げられる。アルキル硫酸エステル塩としては、例えばドデシル硫酸塩等が挙げられる。アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、及び、アルキル硫酸塩における塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。
【００１６】
移動相中のイオン対試薬の濃度としては、Trp-Manの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば0.005〜1.0 mol/Lであり、0.01〜0.5 mol/Lが好ましい。
【００１７】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００１８】
逆相HPLCによる尿検体中のTrp-Manの測定
（１）逆相HPLCシステム
以下の逆相HPLCシステムを使用した。
ポンプ：L-7100（日立製作所社製）
蛍光検出器：L-7485（日立製作所社製）
カラム：Shim-pack HRC-ODS（4.6 mmφ×25 cm、島津製作所社製）
（２）移動相の調製
１−ヘキサンスルホン酸ナトリウム(0.05 mol/L)を含む0.05 mol/Lリン酸二水素カリウム緩衝液（pH3.0）を調製し、この緩衝液とアセトニトリルを８：１の体積比で混合し、移動相とした。
（３）標準溶液の調製
Trp-Manを蒸留水に溶解し、1 mg/mLのTrp-Manの水溶液を調製した。調製した1 mg/mLのTrp-Manの水溶液を上記（２）の移動相で希釈し、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mLのTrp-Man溶液を調製し、これらのTrp-Man溶液、1 mg/mLのTrp-Manの水溶液及び上記（２）の移動相（Trp-Man 0 mg/mL）を標準溶液とした。
（４）尿検体の調製
ヒト由来の尿を上記（２）の移動相で10倍に希釈した後、0.45μmフィルターでろ過し、逆相HPLC用の検体（尿検体）とした。
（５）検量線の作成
上記（３）で調製した標準溶液を検体として用いて、以下の条件下に逆相HPLCに供し、Trp-Man濃度と、Trp-Manに該当するピークの面積との間の関係を示す検量線を作成した。
カラム温度：30℃
流速：1 mL/分
励起波長：302 nm
検出波長：350 nm
（６）尿検体中のTrp-Manの測定
上記（４）で調製した尿検体を、上記（５）と同じ条件下に逆相HPLCに供し、図１に示すクロマトグラムを得た。【００１９】
図１から明らかな様に、イオン対試薬を含む移動相を用いた逆相HPLCでは、Trp-Manのピークが他の蛍光物質のピークからよく分離していた。従って、イオン対試薬を含む移動相を用いた逆相HPLCにより、尿検体中のTrp-Manが正確に測定できることが分かった。
【実施例２】
【００２０】
逆相HPLCによる血清検体中のTrp-Manの測定
検体として、実施例１の（４）で調製した尿検体の代わりに、以下の方法によって調製した血清検体を用いる以外は実施例１と同様の方法により、当該血清検体中のTrp-Manを逆相HPLCにより測定した。逆相HPLCにより得られたクロマトグラムを図２に示す。【００２１】
・血清検体の調製
ヒト由来の血清100μLに、1%(w/v)アスコルビン酸を含む0.1 mol/L塩酸90μLを添加し、さらに、60％過塩素酸を10μL添加した。血清を含む混合物を激しく振り、さらにボルテックスミキサーで混合した後、4℃、6000 rpmで7分間遠心分離した。得られた上清を0.45μmフィルターでろ過し、血清検体とした。【００２２】
図２から明らかな様に、血清検体を用いた場合でも、イオン対試薬を含む移動相を用いた逆相HPLCにおいて、Trp-Manのピークが他の蛍光物質のピークからよく分離していた。従って、イオン対試薬を含む移動相を用いた逆相HPLCにより、血清検体中のTrp-Manが正確に測定できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明により、逆相HPLCによる検体中のTrp-Manの測定方法が提供される。本発明の測定方法は、腎臓機能の診断等に有効である。
【図１】
2014046163.tif 000003
【図２】
2014046163.tif 000004
【国際調査報告】
2014046163.tif 000005
2014046163.tif 000006