(57)【要約】  本発明は、シクロ−トランス−４−Ｌ−ヒドロキシプロリル−Ｌ−セリンを有効成分とする眼疾患の予防・治療薬、該化合物を有効成分とするドライアイの予防・治療薬、特にムチン分泌促進作用及びドライアイに起因する眼組織損傷の修復を促進する作用を有するドライアイの予防・治療薬に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロ−トランス−４−Ｌ−ヒドロキシプロリル−Ｌ−セリンを有効成分とする、ドライアイの予防・治療薬。
【請求項２】
シクロ−トランス−４−Ｌ−ヒドロキシプロリル−Ｌ−セリンを有効成分とする、ムチン減少に起因するドライアイの予防・治療薬。
【請求項３】
シクロ−トランス−４−Ｌ−ヒドロキシプロリル−Ｌ−セリンを有効成分とする、ムチン分泌促進剤。
【請求項４】
ドライアイに起因する眼組織損傷の修復を促進する、請求項１又は２に記載のドライアイの予防・治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、眼疾患の予防・治療薬に関する。より詳細には、本発明は、ドライアイの予防・治療薬及びムチン分泌促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドライアイは、様々な要因による涙液及び角結膜上皮の慢性疾患であり、眼不快感や視機能異常を伴う眼疾患である。日本におけるドライアイ患者は推定２０００万人である。ドライアイの治療薬は、ヒアルロン酸ナトリウム点眼や人工涙液の投与に限られていたが、最近、ジクアホソルナトリウム又はレバミピドを有効成分とする、結膜組織からムチンの分泌促進作用を持つ薬が市販されるようになった。ムチンの中でもＭｕｃ５ａｃは、眼の結膜組織の杯細胞から分泌されるタンパク質であり、涙液を構成する重要な成分である。ムチンの減少は、ドライアイの一つの要因である。【０００３】
一方、シクロ−トランス−４−Ｌ−ヒドロキシプロリル−Ｌ−セリンは、ヒドロキシプロリン誘導体であり、細胞増殖作用、細胞保護作用を有すること（特許文献１）、アレルギー性疾患及び炎症性疾患の予防・治療に有効であること（特許文献２及び３）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３９６９８３１号公報
【特許文献２】特許第４２５３１６１号公報
【特許文献３】特許第４６０１１１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、新たな眼疾患の予防・治療薬を提供することにあり、より詳細には、ドライアイの予防・治療薬を提供することにあり、特にムチン分泌促進作用及びドライアイに起因する眼組織損傷の修復を促進する作用を有するドライアイの予防・治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、シクロ−トランス−４−Ｌ−ヒドロキシプロリル−Ｌ−セリン（以下、化合物１ともいう。）が、濃度依存的にムチンの分泌を促進することを見出した。化合物１のムチン分泌促進作用は、化合物１の既知の作用とは全く異なるものであり、かかる作用を有することは予想外の結果であった。【０００７】
本発明者らは更に、化合物１がドライアイに起因する眼組織損傷の修復をも促進することを見出した。特許文献１には、化合物１が組織修復及び再生に有用であることが記載されているものの、肝保護作用が記載されるのみであり、眼組織の修復については一切言及がない。肝臓と眼とは全く異なる組織であり、その修復・再生メカニズムも全く異なるものである。したがって、化合物１のドライアイに起因する眼組織損傷の修復促進作用は、予想外の作用である。【０００８】
以上の知見から、本発明者らは本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、化合物１を有効成分とするドライアイの予防・治療薬を提供する。特に、本発明は、化合物１を有効成分とするムチン減少に起因するドライアイの予防・治療薬を提供する。本発明のドライアイの予防・治療薬はまた、ドライアイに起因する眼組織損傷の修復をも促進する。【０００９】
本発明はまた、化合物１を有効成分とするムチン分泌促進剤を提供する。【００１０】
本発明は更に以下の（１）〜（１２）を提供する。
（１）有効量のシクロ−トランス−４−Ｌ−ヒドロキシプロリル−Ｌ−セリンを患者に投与する、ドライアイの予防・治療方法。
（２）有効量のシクロ−トランス−４−Ｌ−ヒドロキシプロリル−Ｌ−セリンを患者に投与する、ムチン減少に起因するドライアイの予防・治療方法。
（３）有効量のシクロ−トランス−４−Ｌ−ヒドロキシプロリル−Ｌ−セリンを患者に投与する、ムチン分泌の促進方法。
（４）有効量のシクロ−トランス−４−Ｌ−ヒドロキシプロリル−Ｌ−セリンを患者に投与する、ドライアイに起因する眼組織損傷の修復を促進する方法。
（５）ドライアイの予防・治療に使用するための、シクロ−トランス−４−Ｌ−ヒドロキシプロリル−Ｌ−セリン。
（６）ムチン減少に起因するドライアイの予防・治療に使用するための、シクロ−トランス−４−Ｌ−ヒドロキシプロリル−Ｌ−セリン。
（７）ムチン分泌の促進に使用するための、シクロ−トランス−４−Ｌ−ヒドロキシプロリル−Ｌ−セリン。
（８）ドライアイに起因する眼組織損傷の修復促進に使用するための、シクロ−トランス−４−Ｌ−ヒドロキシプロリル−Ｌ−セリン。
（９）ドライアイの予防・治療薬を製造するための、シクロ−トランス−４−Ｌ−ヒドロキシプロリル−Ｌ−セリンの使用。
（１０）ムチン減少に起因するドライアイの予防・治療薬を製造するための、シクロ−トランス−４−Ｌ−ヒドロキシプロリル−Ｌ−セリンの使用。
（１１）ムチン分泌促進剤を製造するための、シクロ−トランス−４−Ｌ−ヒドロキシプロリル−Ｌ−セリンの使用。
（１２）ドライアイに起因する眼組織損傷の修復促進剤を製造するための、シクロ−トランス−４−Ｌ−ヒドロキシプロリル−Ｌ−セリンの使用。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、新たな眼疾患の予防・治療薬が提供され、より詳細には、ドライアイの予防・治療薬、ムチン減少に起因するドライアイの予防・治療薬、ドライアイに起因する眼組織損傷の修復を促進するドライアイの予防・治療薬及びムチン分泌促進剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】化合物１の存在下及び非存在下における、結膜組織培養上清中のＭｕｃ５ａｃの量を表す図である。組織を示されている濃度の化合物１を含有するハンクス平衡塩溶液（以下、ＨＢＳＳともいう。）で、示されている時間で培養した後、培養上清を採取し、Ｍｕｃ５ａｃの量をＥＬＩＳＡ法で定量した。
【図２】結膜組織培養上清中のＭｕｃ５ａｃの量の、化合物１に対する濃度依存性を表す図である。組織を示されている濃度の化合物１を含有するＨＢＳＳで６時間培養した後、培養上清を採取し、Ｍｕｃ５ａｃの量をＥＬＩＳＡ法で定量した。
【図３】化合物１による角膜上皮組織の創傷治癒効果を経時的に表す図である。アステリスクは、有意差を表す（ｐ＜０．０１）。
【図４】化合物１によるｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｍｕｃ５ａｃ分泌作用促進効果を表す図である。（ａ）は培養上清中に分泌されたＭｕｃ５ａｃをＥＬＩＳＡ法で定量した結果である。合計は、０〜１．５時間及び１．５〜３時間に定量されたＭｕｃ５ａｃの量の合計を表す。（ｂ）は結膜組織内のＭｕｃ５ａｃタンパク質の量を定量した結果である。
【図５】化合物１によるｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｍｕｃ５ａｃ分泌作用促進効果を示すＰＡＳ染色の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。
【００１４】
本発明は、化合物１を有効成分とするドライアイの予防・治療薬を提供する。かかるドライアイの予防・治療薬を投与することにより、正常眼がドライアイに罹患する確率を下げることができ、更に、ドライアイに罹患する患者の症状を低減することができる。
【００１５】
本明細書において、化合物１は、下記化学式（１）で表す化合物である。化合物１の形態は、フリー体であってもよく、薬学的に許容される塩を形成していてもよい。
【化１】
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【００１６】
化合物１の製造方法は特に限定されないが、例えば、特許文献１及び３に記載の方法で得ることができる。
【００１７】
本実施形態に係る化合物１を有効成分とするドライアイの予防・治療薬は、適宜の薬学的に許容される添加剤等の製薬上に必要な成分と混合して使うことができる。かかる添加剤は例えば、担体、賦形剤、ｐＨ調整剤及び希釈剤である。
【００１８】
上記のドライアイの予防・治療薬の形態は特に限定されず、点眼薬、内服薬、注射薬の形態の医薬製剤に調製されることが好ましい。当該製剤の化合物１の含有量は当業者が適宜に調整することができ、また、当該製剤の調製方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
【００１９】
かかるドライアイの予防・治療薬の効果的な投与量及び投与スケジュールは、投与方法、病状、患者の体重及び年齢等によって当業者が適宜に決定することができる。
【００２０】
化合物１は、ムチン促進作用を有することから、ムチンの減少に起因するドライアイの予防・治療薬に対して、特に効果的である。なお、本明細書において、ムチンは特に限定されず、例えばＭｕｃ５ａｃが挙げられる。
【００２１】
本発明のドライアイの予防・治療薬はまた、ドライアイに起因する眼組織損傷の修復を促進する。これにより、本実施形態のドライアイの予防・治療薬は、ドライアイに起因する眼組織損傷の創傷治癒を促進することもできる。
【００２２】
眼組織は、眼を構成する組織であれば特に限定されず、角膜又は結膜であることが好ましく、角膜上皮組織又は結膜上皮組織であることが更に好ましい。
【００２３】
本発明は、また、化合物１を有効成分とする、ムチン分泌促進剤を提供する。化合物１を有効成分とするムチン分泌促進剤を投与することにより、涙液の成分であるムチンの分泌が上昇する。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００２５】
（実施例１：化合物１のＭｕｃ５ａｃ分泌量に対する影響）
化合物１のＭｕｃ５ａｃ分泌量に対する影響を確認するため、白色家兎（Ｓｌｃ：ＪＷ／ＣＳＫＳｌｃ：ＮＺＷ系統）の結膜組織を用いたｅｘ  ｖｉｖｏ実験を行った。【００２６】
具体的には、３ｍｍ径のトレパンを用いて白色家兎の結膜組織をサンプリングした。次に、組織サンプルを、１００μＭの化合物１を含有するＨＢＳＳ中に９０分、３時間、６時間、１２時間浸漬した。対照群の結膜組織は、化合物１と同等の量の生理食塩水を添加したＨＢＳＳ中に浸漬した。結膜組織を所定時間浸漬した後、培養上清を採取した。実験は、各群についてｎ＝５で行った。【００２７】
培養上清に含まれるＭｕｃ５ａｃの量を、以下の測定法を用いて検出した。【００２８】
Ｍｕｃ５ａｃ分泌量の測定法（ＥＬＩＳＡ法）
まず、対照群の結膜組織の培養上清を、ＨＢＳＳを用いて希釈し、それぞれのＭｕｃ５ａｃの濃度が５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６３、７．８１ＡＵ／ｍＬ（ＡＵは任意単位を表す。）となるように検量線を調製した。サンプル溶液は、波長４５０ｎｍにおける吸光度が検量線の波長４５０ｎｍにおける吸光度の範囲内になるようにＨＢＳＳで希釈した。次に、検量線溶液、試験群のサンプル溶液及び対象群のサンプル溶液を、９６ウェルのマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３５９０）に１００μＬ／ウェルで添加し、４０℃で一晩インキュベートした。測定は、各サンプルについてｎ＝２で行った。【００２９】
検量線溶液及びサンプル溶液を除去した後、ウェルを２００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。かかる洗浄緩衝液は、Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７．６）に、最終濃度が０．０５％となるようにＴｗｅｅｎ−２０を添加して調製した（以下、ＴＢＳＴ溶液ともいう。）。【００３０】
各ウェルにブロッキング緩衝液（１％ウシ血清アルブミンを含有するＴＢＳＴ溶液）を２００μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去した後、ブロッキング緩衝液で１００倍希釈された一次抗体溶液（抗ヒトＭｕｃ５ａｃ抗体、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ社製、Ｃｌｏｎｅ  ４５Ｍ１）を１００μＬ／ウェル加えて室温で１時間インキュベートした。一次抗体溶液を除去した後、ウェルを２００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。【００３１】
次に、ブロッキング緩衝液で２０００倍希釈された二次抗体溶液（ＨＲＰ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を１００μＬ／ウェル加えて室温で１時間インキュベートした。二次抗体溶液を除去した後、ウェルを２００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。【００３２】
各サンプルのＭｕｃ５ａｃの含有量を定量するため、各ウェルに１００μＬの３，３’，５，５’テトラメチルベンチジンを添加して室温で３０分間インキュベートして発色させた後、各ウェルに１００μＬの０．５Ｍ硫酸溶液を添加して反応を止めた。次に、マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの波長が４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。各サンプルのＭｕｃ５ａｃの含有量は、検量線を用いて算出した。【００３３】
図１（ａ）で示しているように、化合物１存在下で結膜組織を３時間培養した場合、Ｍｕｃ５ａｃの量は、化合物１非存在下で結膜組織を培養した場合に比べて上昇することが明らかになった。また、図１（ｂ）で示しているように、化合物１存在下におけるＭｕｃ５ａｃの量の上昇は、化合物１存在下で結膜組織を６時間及び１２時間培養した場合にも確認された。化合物１存在下及び非存在下におけるＭｕｃ５ａｃの量の差は、６時間培養した時点で最も顕著であった。【００３４】
（実施例２：Ｍｕｃ５ａｃ分泌量の化合物１に対する濃度依存性）
３ｍｍ径のトレパンを用いて白色家兎の結膜組織をサンプリングし、０、１、１０及び１００μＭの化合物１を含有するＨＢＳＳ中に浸漬した。対照群の結膜組織は、化合物１と同等の量の生理食塩水を添加したＨＢＳＳ中に浸漬した。結膜組織を６時間浸漬した後、培養上清を採取した。実験は、各郡についてｎ＝５で行った。【００３５】
培養上清に含まれるＭｕｃ５ａｃの量を、実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法を用いて検出した。【００３６】
図２で示しているように、培養上清に含まれるＭｕｃ５ａｃの量は、ＨＢＳＳ中の化合物１の濃度に依存的に上昇した。【００３７】
以上の結果から、化合物１は、結膜組織のムチン分泌を促進する作用があることが明らかになった。【００３８】
（実施例３：化合物１による角膜上皮組織の創傷治療効果）
化合物１による角膜上皮組織の創傷治療効果を確認するため、白色家兎（Ｓｌｃ：ＪＷ／ＣＳＫＳｌｃ：ＮＺＷ系統）を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行った。【００３９】
具体的には、８ｍｍ径トレパンを用いて白色家兎の角膜上皮組織に創傷を作製した。創傷を作製した同日より、試験群は、生理食塩水に溶かした１００μＭの化合物１溶液を１日４回、３０μＬ〜５０μＬ／回の投与量で点眼投与した。対称群は、生理食塩水で１日４回、３０μＬ〜５０μＬ／回の投与量で点眼投与した。実験は、各群についてｎ＝５で行った。【００４０】
角膜上皮組織の創傷面積を観察するため、角膜上皮組織を生理食塩水、フルオレセイン試験紙を用いてフルオレセイン染色し、角膜上皮の創傷面積の経時的な変化を写真で撮影して観察した。創傷面積をＩｍａｇｅ  Ｊソフトを用いて画像処理して統計解析をした。【００４１】
上記の方法で創傷面積を統計解析した結果を図３に示す。対象群に比べて、化合物１が投与された群における創傷面積は、投与一日目から小さいことが示され、また、ｔ検定を用いて統計解析した結果、その差は有意であった（ｐ＜０．０１）。また、創傷の完全治癒までの所要時間は、対照群の５日間に比べて、化合物１投与群は４日間であった。したがって、化合物１は、角膜上皮組織の創傷治癒を促進する効果があることが示唆された。【００４２】
（実施例４：化合物１によるｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｍｕｃ５ａｃ分泌作用促進）
化合物１によるＭｕｃ５ａｃ分泌作用促進を確認するため、白色家兎（Ｓｌｃ：ＪＷ／ＣＳＫＳｌｃ：ＮＺＷ系統）を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行った。【００４３】
具体的には、白色家兎の右眼に生理食塩水に溶かした１００μＭの化合物１溶液を１日４回、３０μＬ〜５０μＬ／回の投与量で点眼投与した。左眼には、対照として生理食塩水を１日４回、３０μＬ〜５０μＬ／回の投与量で点眼投与した。実験は、各群についてｎ＝６で行った。【００４４】
上記投与を３日間施行した後、白色家兎を安楽死させ、結膜組織を５ｍｍトレパンでサンプリングした。サンプルをＨＢＳＳ中に浸漬して、１時間半後に培養上清を採取し、更に３時間後に培養上清及び結膜組織を採取した。培養上清に含まれるＭｕｃ５ａｃの量を、実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法を用いて定量した。結果を図４ａに示す。対象群に比べて、化合物１投与群から採取された結膜組織の培養上清に含まれるＭｕｃ５ａｃの量が顕著に高いことが明らかとなった。【００４５】
採取した結膜組織に、ＳＤＳ（−）ＲＩＰＡ溶解緩衝液（ナカライテスク社製）を１５０μＬ添加して浸漬し、４℃で３０分間インキュベートしてホモジナイズした。その後、４℃にて１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心して上清を回収した。タンパク質濃度をＮａｎｏ  Ｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で測定した後、５００ｎｇ／μＬに調整した。次に、実施例１と同様にＥＬＩＳＡ法を用いて調製したタンパク質溶液中に含まれるＭｕｃ５ａｃを定量した。結果を図４ｂで示す。化合物１投与群から採取された結膜組織内のＭｕｃ５ａｃタンパク質の量は、対照群とほぼ同じである。この結果と、化合物１投与群から分泌されたＭｕｃ５ａｃの量が対照群に比べて顕著に高かった結果とを併せて、化合物１がムチンの合成及び分泌を促進する作用を有することを示している。【００４６】
さらに、対照群及び投与群の結膜組織に対して中性多糖や糖タンパク種を染めるＰＡＳ染色を行なった。具体的には、ウサギから結膜組織を採取し、採取した結膜組織を上側、鼻側、下側、耳側の領域に切り分け、パラフィン切片を作った。次に、脱パラフィンのため、切片を蒸留水で水洗した後、３％酢酸水になじませ、アルシアン青液に３０分間浸漬した。切片を蒸留水水洗した後、１％過ヨウ素酸水溶液に１０分間浸漬し、流水で５分間水洗して蒸留水で水洗した。切片をＣｏｌｄ  Ｓｃｈｉｆｆ液に１０分間浸漬した後、亜硫酸水で３分間浸漬し、亜硫酸水処理をした。この処理を３回繰り返した後、切片を流水で５分間水洗し、マイヤーのヘマトキシリン液に３〜５分間浸漬し、細胞核を染めた。切片を流水で１０分間水洗して色出しした後、脱水処理及び透徹処理して、封入した。切片を、顕微鏡を用いて観察し、写真を撮影した。【００４７】
結果を図５に示す。対象群に比べて、化合物１投与群の結膜組織内のＭｕｃ５ａｃの量（赤紫色に染色される）は明らかに少なかった。これは、化合物１投与群において、Ｍｕｃ５ａｃが細胞内に溜まっておらず細胞外に分泌され、化合物１がムチンの分泌を促進することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2014010281.tif 000008
【国際調査報告】
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2014010281.tif 000010
2014010281.tif 000011
2014010281.tif 000012