(57)【要約】要約  ２種類の抗ヘムアグルチニン抗体を用いるサンドイッチ免疫測定法よりも短期間で測定系を構築することができる、インフルエンザウイルスのヘムアグルチニンの新規な測定方法が開示されている。インフルエンザウイルスのヘムアグルチニンの測定方法は、ヘムアグルチニンと結合するが抗体と結合しないレクチンと、該ヘムアグルチニンと抗原抗体反応する抗ヘムアグルチニン抗体とで該ヘムアグルチニンをサンドイッチすることを含む、サンドイッチ免疫測定法による。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルスのヘムアグルチニンと結合するが抗体と結合しないレクチンと、該ヘムアグルチニンと抗原抗体反応する抗ヘムアグルチニン抗体とで該ヘムアグルチニンをサンドイッチすることを含む、サンドイッチ免疫測定法によるインフルエンザウイルスのヘムアグルチニンの測定方法。
【請求項２】
前記レクチンが固相に固定化され、前記抗ヘムアグルチニン抗体が標識されており、前記レクチンと前記ヘムアグルチニンを介して固相に結合した該標識抗体を測定することを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記レクチンが、ヒママメレクチン、チョウセンアサガオレクチン及びデイゴレクチンから成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ヘムアグルチニンが、インフルエンザウイルスを陽イオン性又は陰イオン性界面活性剤で処理することにより抽出されたものである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記陽イオン性又は陰イオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム及び塩化ヘキサデシルピリジニウムから成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記界面活性剤が、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムである請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスの抗原であるヘムアグルチニンの測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科に属し、ウイルス内部に存在する核タンパク質及びマトリクスタンパク質の抗原性の違いからA、B及びC型に分類されるウイルスである。毎年流行がみられるのはA型及びB型であり、特にA型ウイルスは、粒子表面抗原である糖タンパク質の違いからヘムアグルチニンは１６種類、ノイラミニダーゼは９種類の亜型に分類され、抗原性の変異を起こしやすいウイルスである。したがって、毎シーズン流行を予測してワクチン株を選定しなければならず、ワクチンの主要抗原であるヘムアグルチニン測定用試薬も株の変更に伴って準備しなければならない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Mahmood N, Hay AJ., An ELISA utilizing immobilised snowdrop lectin GNA for the detection of envelope glycoproteins of HIV and SIV. J Immunol Methods.,151(1992)9-13
【非特許文献２】Legastelois I., et al., Avian glycan-specific IgM monoclonal antibodies for the detection and quantitation of type A and B haemagglutinins in egg-derived influenza vaccines. J Virol Methods.,178(2011)129-136
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ヘムアグルチニンの高感度で検体処理能の高い測定法としてモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法が挙げられるが、株特異的な２種類の抗体が必要となり、新たなワクチン製造株若しくはパンデミックウイルスのヘムアグルチニン測定にモノクローナル抗体を供するのは、抗体作製期間を鑑みると困難である。更に、非特許文献２に記載されるような鳥類の糖鎖に特異的なモノクローナル抗体を用いる測定法では、特殊な抗体故に供給量等の問題より普及性が低い測定法となり、また動物細胞で増幅したインフルエンザウイルスのヘムアグルチニン測定には使用できない。【０００５】
従って、本発明の目的は、２種類の抗ヘムアグルチニン抗体を用いるサンドイッチ免疫測定法よりも短期間で測定系を構築することができる、インフルエンザウイルスのヘムアグルチニンの新規な測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、レクチンがインフルエンザウイルスのヘムアグルチニンに結合し、抗体とは結合しないことを見出し、レクチンと抗ヘムアグルチニン抗体とでヘムアグルチニンをサンドイッチすれば、必要な抗ヘムアグルチニン抗体は１種類だけとなり、２種類の抗ヘムアグルチニン抗体を用いるサンドイッチ免疫測定法よりも短期間で測定系を構築することが可能であることに想到し、本発明を完成した。【０００７】
すなわち、本発明は、インフルエンザウイルスのヘムアグルチニンと結合するが抗体と結合しないレクチンと、該ヘムアグルチニンと抗原抗体反応する抗ヘムアグルチニン抗体とで該ヘムアグルチニンをサンドイッチすることを含む、サンドイッチ免疫測定法によるインフルエンザウイルスのヘムアグルチニンの測定方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、１種類の抗ヘムアグルチニン抗体を用いて、サンドイッチ免疫測定により精度よくインフルエンザウイルスのヘムアグルチニンを測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−１】不活化全粒子ウイルスを以下の各界面活性剤にて処理した後に、しょ糖密度勾配遠心分離法によるフラクション解析をウエスタンブロッティングにより示す図である。Ａ．非処理、Ｂ．１．０％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００処理、Ｃ．１．０％  ＮＰ−４０処理、Ｄ．１．０％  Ｔｗｅｅｎ８０処理、Ｅ．１．０％  Ｂｒｉｊ３５処理、Ｆ．１．０％  ＣＨＡＰＳ処理、Ｇ．１．０％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４処理、Ｈ．１．０％  ＣＴＡＢ処理、Ｉ．０．３％  ＳＤＳ処理、Ｊ．４．０Ｍ  Ｕｒｅａ処理、Ｋ．３．０Ｍ  塩酸グアニジン処理。
【図１−２】同上。
【図２】下記実施例において行ったサンドイッチ免疫測定により測定された、ヘムアグルチニン濃度と吸光度の関係を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
上記の通り、本発明の方法は、インフルエンザウイルスのヘムアグルチニン（以下、単に「ヘムアグルチニン」と呼ぶことがある）と結合するが抗体と結合しないレクチンと、該ヘムアグルチニンと抗原抗体反応する抗ヘムアグルチニン抗体とで該ヘムアグルチニンをサンドイッチする、サンドイッチ免疫測定法によるヘムアグルチニンの測定方法に係る。
【００１１】
本発明の方法において用いられるレクチンは、ヘムアグルチニンと結合するものである。ヘムアグルチニンとの結合の有無は、下記参考例２に具体的に記載するレクチンブロット法（PVDF膜上に転写したヘムアグルチニンに、標識レクチンを反応させ、標識が検出されるか否か）により確認することができる。また、「抗体と結合しない」とは、免疫測定に用いられる抗体を構成している免疫グロブリンと同種、同クラスの免疫グロブリン（通常は、マウス、ウサギ又はヒツジ等のIgG）と結合しないことを意味し、マウス、ウサギ及びヒツジ等の各動物由来のＩｇＧとは結合しないことは、下記参考例３に具体的に記載する通り、各動物のHRP標識ＩｇＧとのELISAにより、測定される吸光度が、陰性対照(blank)平均値の２倍未満、好ましくは1.5倍未満か否かにより確認することができる。ヘムアグルチニンと結合し、抗体と結合しないレクチンの好ましい例としては、チョウセンアサガオレクチン（ＤＳＬ）、デイゴレクチン（ＥＣＬ）及びヒママメレクチン（ＲＣＡ１２０）を挙げることができる。ヘムアグルチニンと結合し、抗体と結合しないレクチンは、単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
【００１２】
本発明の方法では、上記レクチンを、固相に固定化してサンドイッチ法を行うことが好ましい。固相としては、サンドイッチELISA等の周知のサンドイッチ免疫測定において用いられているいずれのものをも用いることができ、プレート、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル等が上げられる。材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ラテックス、ガラス、架橋デキストリン、アガローズ、架橋アガローズ、ポリアクリルアミド等が挙げられる。
【００１３】
これらの固相にレクチンを吸着させる方法としては、共有結合法、物理的吸着法、イオン結合法及び生化学的特異結合法（例えば、ビオチン結合レクチンを、ストレプトアビジン結合固相に結合させる等）等を採用することができる。特に物理的吸着法及び生化学的特異結合法が、操作が簡便な点で好ましい。
【００１４】
ここで、物理的吸着法は、例えば、レクチンを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）を含むｐＨ７〜９の緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液生理食塩水、リン酸緩衝液生理食塩水、炭酸緩衝液等）に溶解して固相（例えば、マイクロプレートのウェル）に加え、室温で１〜２時間程度静置するか、４℃程度で一晩静置して吸着させる方法を挙げることができる。また、生化学的特異結合法は、ストレプトアビジン結合固相（プレートやビーズ）が市販されているので、例えば、レクチンを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）を含むｐＨ７〜９の緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液生理食塩水、リン酸緩衝液生理食塩水、炭酸緩衝液等）に溶解して市販のストレプトアビジン結合固相に添加し、室温で１〜２時間程度静置するか、４℃程度で一晩静置して吸着させる方法を挙げることができる（下記実施例参照）。物理的吸着法、生化学的特異結合法のいずれにおいても固相と反応させるレクチンの濃度は、特に限定されないが、通常、終濃度で１０μg／ｍＬ〜６０μg／ｍＬ程度である。
【００１５】
レクチンを吸着させた固相表面にはこれらが吸着していない表面部分が残存している場合があり、そこへ検体中のヘムアグルチニンや他の分子種が吸着すると正確な測定結果が得られなくなる恐れがある。よって、検体を固相と接触させる前にブロッキング物質を添加してレクチンが吸着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、哺乳動物、例えばウシ等から採取できる血清アルブミン、カゼイン、ミルクタンパク、乳酸発酵物、コラーゲン及びそれらの分解物質等が挙げられ、また、免疫測定におけるブロッキング物質として市販されるものを使用することもできる。
【００１６】
本発明の方法に用いられる抗ヘムアグルチニン抗体は、インフルエンザウイルスのヘムアグルチニンと抗原抗体反応するものであり、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。インフルエンザウイルスの型特異的に測定を行う場合には、通常、各型のヘムアグルチニンと特異的に抗原抗体反応する抗ヘムアグルチニンモノクローナル抗体が用いられる。
【００１７】
抗ヘムアグルチニン抗体は、通常、標識されている。標識に使用される標識物質としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等）、アイソトープ（１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ等）、蛍光色素（ルミノール、フルオレセインイソチオシアネート、ウンベリフェロン、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸等）、化学発光物質、ハプテン、ビオチン、アビジン（例えば、ストレプトアビジン等）が挙げられるが、通常タンパク質の標識に使用可能であるものであれば、特に限定されない。なお、ここで標識物質とは、ビオチンのようにそれ自体を直接検出せず、その物質と特異的に結合能を有する物質（例えばアビジン）に検出可能な標識を結合したものを組み合わせて用いる方法に使用する物質も包含する。
【００１８】
前述の抗体の標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、酵素を標識する際にはグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法等、放射性同位物質で標識する際にはクロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法等から適宜選択することができる。なお、標識抗ヘムアグルチニン抗体は、種々の型に対するものが市販されているので、市販品を用いることも可能である。
【００１９】
本発明の方法では、通常、上記した固相化レクチンと、標識抗ヘムアグルチニン抗体と、インフルエンザウイルスのヘムアグルチニンを含む検体とを反応させ、洗浄後、固相に結合した標識を測定する。
【００２０】
本発明の方法を適用する検体は、インフルエンザウイルスのヘムアグルチニンを含むものであれば、インフルエンザウイルス粒子を含むものでも、そこからヘムアグルチニンを抽出したものでもよい。ヘムアグルチニンを抽出する場合には、ヘムアグルチニンの存在様式に拘わらず測定可能であり、ウイルス粒子中に存在しても遊離ヘムアグルチニンとして存在しても測定することができ、測定精度も高まるので好ましい。ヘムアグルチニンの抽出には、陽イオン性又は陰イオン性界面活性剤（以下、両者を総称して「イオン性界面活性剤」）を用いることができる。イオン性界面活性剤の好ましい例としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム（ＬｉＤＳ）、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）及び塩化ヘキサデシルピリジニウム（ＨＰＣ）を挙げることができ、特に好ましくは、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）である。イオン性界面活性剤は、単独でも２種以上のものを組み合わせても用いることができる。
【００２１】
イオン性界面活性剤での処理条件は、好ましくは、検体に終濃度０．１〜２．０％となるようにイオン性界面活性剤を添加し、３７℃にて１〜２時間程度静置あるいは攪拌してヘムアグルチニンをウイルス粒子より抽出することができるが、これに限定されるものではない。
【００２２】
固相化レクチン、検体及び標識抗ヘムアグルチニン抗体は、同時に反応させてもよいし、先ず固相化レクチンと検体を反応させ、洗浄後、標識抗ヘムアグルチニン抗体を反応させてもよいし、先に検体と標識抗ヘムアグルチニン抗体を反応させて免疫複合物を形成後、固相化レクチンと反応させてもよい。各反応は、室温で３０分〜１２０分程度で行うことが可能である。反応系中のヘムアグルチニンの終濃度範囲は、通常、１ng/mL〜1μｇ/mL程度であり、標識抗ヘムアグルチニン抗体の終濃度範囲は、通常、0.2〜50μg/mL程度である。
【００２３】
反応後、固相を洗浄し、固相に結合した標識を測定する。洗浄液としては、例えばＴｗｅｅｎ（商品名）系界面活性剤等の界面活性剤を添加した緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝液生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液生理食塩水）等が挙げられる。標識物質の検出法としては、用いる標識物質により異なるが、例えば、標識物質にビオチンを使用する場合には、ストレプトアビジン等を介してペルオキシダーゼ等の酵素を標識物質としてビオチンを含む複合体へ結合させ、該酵素の基質としてテトラメチルベンジジン等の発色物質及び過酸化水素水を加え、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で測定する方法等を挙げることができる。また、標識物質に蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられる。
【００２４】
なお、標識抗ヘムアグルチニン抗体に代えて、標識していない抗ヘムアグルチニン抗体を反応させ、さらに標識抗イムノグロブリン抗体を反応させて、洗浄後、固相に結合した標識を測定することも可能である（間接抗体法）。もっとも、間接抗体法では、抗原抗体反応の回数が１回多くなるので、迅速な検査が求められる場合には、先に述べた、標識抗ヘムアグルチニン抗体を用いる直接法が好ましい。
【００２５】
本発明の測定方法においては、検体中のヘムアグルチニン濃度は、予め既知濃度のヘムアグルチニン標準液を用いてヘムアグルチニンと標識物質の検出結果との関係について検量線を作成し、未知濃度の検体についての検出結果と前述検量線とを用いる方法によって、定量することができる。
【００２６】
本発明の測定方法の好ましい一形態を以下に説明する。まず、固相にレクチンを吸着（コーティング）させる。好ましい吸着方法は、上記した通りである。
【００２７】
上記吸着後、スキムミルク等のブロッキング物質を含む緩衝液を添加して、室温で３０〜２時間程度静置して、レクチンが吸着していない部分を被覆しておくことが好ましい。
【００２８】
検体中のヘムアグルチニンがウイルス粒子中に存在している場合、検体中に終濃度０．１〜２．０％となるようにＣＴＡＢを添加し、３７℃にて１〜２時間程度静置あるいは攪拌してヘムアグルチニンをウイルス粒子より抽出する。
【００２９】
次いで、レクチンが吸着した固相に検体若しくはヘムアグルチニン抽出処理をした検体を添加し、例えば、室温で３０〜１２０分間の適切な時間静置あるいは攪拌し、上記レクチンにヘムアグルチニンを結合させる。
【００３０】
その後、この複合体が結合した固相を、Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等を含む緩衝液（例えば、トリス塩酸緩衝液生理食塩水、リン酸緩衝液生理食塩水等）等の洗浄液で洗浄する。さらに、前述固相に、標識物質で標識された抗ヘムアグルチニン抗体または抗ヘムアグルチニン抗体と標識物質で標識された抗抗ヘムアグルチニン抗体を添加して、例えば、室温で３０〜１２０分間静置あるいは攪拌し、ヘムアグルチニンに抗ヘムアグルチニン抗体（または抗ヘムアグルチニン抗体−抗抗ヘムアグルチニン抗体）を結合させる。この操作によって、固相−レクチン−ヘムアグルチニン−抗ヘムアグルチニン抗体（または固相−レクチン−ヘムアグルチニン−抗ヘムアグルチニン抗体−抗抗ヘムアグルチニン抗体）からなる複合体を形成させる。次に、前述複合体の標識物質を検出してヘムアグルチニンを測定する。
【００３１】
別に、ヘムアグルチニン標準品の濃度と標識物質の検出結果（例えば吸光度）との関係について検量線を作成し、未知試料についての検出結果と前記検量線とを用いて未知試料中のヘムアグルチニンを定量する。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。【００３３】
参考例１    ヘムアグルチニン抽出用界面活性剤の検討
発育鶏卵にて増幅し、限外ろ過、しょ糖密度勾配遠心分離法及びベータプロピオラクトンによって精製及び不活化したＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７株の不活化全粒子ウイルスに、終濃度が１．０％となるように、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名、シグマ アルドリッチ ジャパン社製）、ＮＰ−４０（商品名、ナカライテスク社製）、Ｔｗｅｅｎ８０（商品名、和光純薬工業社製）、Ｂｒｉｊ３５（商品名、和光純薬工業社製）、ＣＨＡＰＳ（商品名、同仁化学研究所社製）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４（商品名、Calbiochem社製）及びＣＴＡＢ（和光純薬工業社製）を添加し、終濃度が０．３％となるようにＳＤＳを、終濃度が４．０Ｍ及び３．０ＭとなるようにＵｒｅａ（エムピーバイオジャパン社製）及び塩酸グアニジン（エムピーバイオジャパン社製）を添加して、３７℃にて６０分間静置して反応させた。反応溶液に終濃度２０％となるようにしょ糖を添加して、これを分画密度２０〜５０ｗ／ｗ％のしょ糖密度勾配遠心分離法にて１７フラクションに分画した。各フラクション溶液とＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（８％ＳＤＳ，４０％グリセロール／２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ６．８）とを等量混合して１００℃にて５分間静置にて反応させた。反応溶液を１２．５％  ポリアクリルアミドゲル（アトー社製 ｅＰＡＧＥＬ）にて電気泳動し、セミドライ式転写装置（アトー社製）にてＰＶＤＦ膜への転写反応を行った。転写後のＰＶＤＦ膜を７５ｍＬのブロッキングバッファー（１０％スキムミルク含有ＴＢＳ）に浸し、室温にて４時間のマスキング反応を行った。反応後、適当量のＴＢＳにてＰＶＤＦ膜を３回洗浄し、その後ＰＶＤＦ膜を抗ＨＡ抗体溶液（ＳＲＤ(Single radial immunodiffusion)用抗血清）に浸して４℃にて約１６時間反応した（一次抗体反応）。一次抗体反応後、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）含有ＴＢＳにてＰＶＤＦ膜を５回洗浄し、ＨＲＰ標識抗ヒツジ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）溶液を添加して室温にて６０分間反応させた（二次抗体反応）。二次抗体反応後、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）含有ＴＢＳにてＰＶＤＦ膜を５回洗浄し、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（商品名、サーモサイエンチフィック社製）にてヘムアグルチニンの検出を行った。検出には、LAS-3000（商品名、ＧＥヘルスケア社製）を使用した。【００３４】
これにより、図１に示すとおり非処理の不活化全粒子ウイルスやタンパク質変性剤であるＵｒｅａや塩酸グアニジン処理では高密度領域にのみヘムアグルチニンが検出され、非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名）、ＮＰ−４０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ８０（商品名）及びＢｒｉｊ３５（商品名）や両イオン性界面活性剤であるＣＨＡＰＳ（商品名）及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４（商品名）では高密度から低密度にかけて様々な密度にヘムアグルチニンが検出された。一方で、イオン性界面活性剤であるＣＴＡＢやＳＤＳ処理によって低密度側にヘムアグルチニンのバンドが収束するため、イオン性界面活性剤処理が最もヘムアグルチニンの可溶化・抽出処理に適していることが判る。【００３５】
参考例２    各種レクチンとヘムアグルチニンの結合
ＭＤＣＫ細胞及び発育鶏卵にて、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８（Ｂ型  Ｖｉｃｔｏｒｉａ  ｌｉｎｅａｇｅ）及びＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（Ｂ型  Ｙａｍａｇａｔａ  ｌｉｎｅａｇｅ）の６株のウイルス溶液を調製した。調製したウイルスとＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（８％ＳＤＳ，４０％グリセロール／２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ６．８）とを等量混合して１００℃にて５分間静置にて反応させた。反応溶液を１２．５％  ポリアクリルアミドゲル（アトー社製 ｅＰＡＧＥＬ）にて電気泳動し、セミドライ式転写装置（アトー社製）にてＰＶＤＦ膜への転写反応を行った。転写後のＰＶＤＦ膜を７５ｍＬのブロッキングバッファー（１０％スキムミルク含有ＴＢＳ）に浸し、室温にて４時間のマスキング反応を行った。反応後、適当量のＴＢＳにてＰＶＤＦ膜を３回洗浄し、各種ビオチン化レクチン：ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）との反応を室温にて４時間行った。レクチンとの反応後、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）含有ＴＢＳにてＰＶＤＦ膜を５回洗浄し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（サーモサイエンティフィック社製）溶液を添加して室温にて６０分間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）含有ＴＢＳにてＰＶＤＦ膜を５回洗浄し、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（商品名、サーモサイエンチフィック社製）にてヘムアグルチニンとレクチンとの複合体を検出した。検出には、LAS-3000（商品名、ＧＥヘルスケア社製）を使用した。【００３６】
その結果、ＲＣＡ１２０、ＤＳＬ及びＥＣＬのいずれも、発現基材としてＭＤＣＫ細胞及び発育鶏卵のどちらを用いて調製したウイルス由来のヘムアグルチニンに対しても結合することが確認できた。【００３７】
参考例３    各種レクチンとＩｇＧとの結合
ストレプトアビジンコートしたマイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製）に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）／トリス塩酸緩衝液生理食塩水（ＴＢＳＴ）で終濃度が３０μｇ／ｍＬとなるように希釈した各ビオチン化レクチンを１００μＬ／ウェルで添加して２５℃で２時間反応させた。レクチン反応後、各ウェルをＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（ＴＢＳＴ）３００μＬで５回洗浄した。次に、２．５％スキムミルク／ＴＢＳＴを各ウェルに３００μＬ添加して、２５℃で１時間のブロッキングを行い、その後、各ウェルをＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ３００μＬで５回洗浄し、０．５％スキムミルク／ＴＢＳＴもしくは０．５％ＢＳＡ／ＴＢＳＴで希釈したＨＲＰ標識化ＩｇＧ抗体（マウス抗体：ＢｉｏＳＳ社製  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｈ＋Ｌ），ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ、ウサギ抗体：Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製  Ｓｈｅｅｐ  ＩｇＧ−ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ヒツジ抗体：Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製  Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ−ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を各ウェルに１００μＬ添加して２５℃で１時間反応させた。抗体反応後、各ウェルをＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ３００μＬで５回洗浄し、ＴＭＢ溶液（和光純薬工業社製）を各ウェルに２００μＬ添加して２５℃で２０分間反応させた後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸（和光純薬工業社製）を各ウェルに５０μＬ添加して反応を停止した。反応停止後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。【００３８】
結果を表１に示す。表１に示す通り、ＲＣＡ１２０、ＤＳＬ及びＥＣＬのいずれも、マウス、ウサギ及びヒツジＩｇＧと反応させた際の吸光度が、陰性対照(blank)の値の２倍未満であり、マウス、ウサギ及びヒツジＩｇＧと反応しないことがわかる。【００３９】
なお、ＲＣＡ１２０、ＤＳＬ及びＥＣＬのいずれも、ヘムアグルチニンと結合することは上記参考例２において確認されているので、これらのレクチンのいずれを用いても、ヘムアグルチニンをサンドイッチ免疫測定により測定可能であると考えられた。【００４０】
【表１】
2014054712.tif 000003
【００４１】
実施例１    サンドイッチ免疫測定
ＮＩＢＳＣ(The National Institute for Biological Standards and Control)より購入したＳＲＤ試験用標準抗原のバイアルに１ｍＬの水を加え、５分間静置後に十分に攪拌した（５０μｇ ＨＡ／ｍＬ）。５０μＬのＮＩＢＳＣ標準品（５０μｇ ＨＡ／ｍＬ）と５０μＬの１．０％ＣＴＡＢを混ぜて十分に攪拌した後（２５μｇ ＨＡ／ｍＬ）、３７℃で２時間静置した。次いで、１０倍希釈して２．５μｇＨＡ／ｍＬのヘムアグルチニン溶液を調製した。この標準液を希釈し、３．１３、６．２５、１２．５、２５、５０、１００及び２５０ｎｇＨＡ／ｍＬのヘムアグルチニンン溶液を調製した。【００４２】
ストレプトアビジンコートしたマイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製）に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）／トリス塩酸緩衝液生理食塩水（ＴＢＳＴ）で終濃度が３０μｇ／ｍＬとなるように希釈した各ビオチン化レクチンを１００μＬ／ウェルで添加して２５℃で２時間反応させた。レクチン反応後、各ウェルをＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（ＴＢＳＴ）３００μＬで５回洗浄した。次に、２．５％スキムミルク／ＴＢＳＴを各ウェルに３００μＬ添加して、２５℃で１時間のブロッキングを行い、その後、各ウェルをＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ３００μＬで５回洗浄し、調製した各濃度のヘムアグルチニン溶液を各ウェルに１００μＬ添加して２５℃で２時間反応させた。反応後、各ウェルをＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ３００μＬで５回洗浄し、０．５％スキムミルク／ＴＢＳＴで終濃度２μｇ／ｍＬとなるように希釈したＨＲＰ標識抗ヘムアグルチニン抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製 ２００９Ｈ１Ｎ１ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（Ｓｗｉｎｅ Ｆｌｕ）Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ添付）溶液を各ウェルに１００μＬ添加して２５℃で１時間反応させた。抗ヘムアグルチニン抗体との反応後、各ウェルをＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ３００μＬで５回洗浄し、ＴＭＢ溶液（和光純薬工業社製）を各ウェルに２００μＬ添加して２５℃で２０分間反応させた後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸（和光純薬工業社製）を各ウェルに５０μＬ添加して反応を停止した。反応停止後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。【００４３】
表２及び図２にＲＣＡ１２０、ＤＳＬ及びＥＣＬを用いたＥＬＩＳＡによるヘムアグルチニン測定結果を示すが、いずれのレクチンにおいてもヘムアグルチニン(HA)濃度と吸光度に良好な相関が確認できた。したがって、ヘムアグルチニン結合レクチン及び１種類の抗ヘムアグルチニン抗体にて高感度なヘムアグルチニン測定法が可能となる。【００４４】
【表２】
2014054712.tif 000004
【００４５】
実施例２    ＳＲＤ試験の測定値との相関確認
Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｘ−１７９Ａ）、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（ＩＶＲ−１６５）及びＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／０１／２０１０（ＢＸ−４１Ａ）の標準インフルエンザＨＡ抗原（一元放射免疫拡散試験用  国立感染症研究所）の各バイアルに１ｍＬの水を加え、５分間静置後に十分に攪拌した。５０μＬの標準インフルエンザＨＡ抗原溶液と５０μＬの１．０％ＣＴＡＢを混ぜて十分に攪拌した後、３７℃で２時間静置した。次いで、１０倍希釈してヘムアグルチニン溶液を調製した。この標準液を希釈し、１．９５、３．９１、７．８１、３１．３、６２．５及び１２５ｎｇＨＡ／ｍＬのヘムアグルチニンン溶液を調製してこれを検量線用標準溶液とした。また、一元放射免疫拡散試験（ＳＲＤ試験）によりＨＡ濃度を値付けた製造工程液（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｘ−１７９Ａ）株、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（ＩＶＲ−１６５）株及びＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／０１／２０１０（ＢＸ−４１Ａ）株）も上記の検量線用標準溶液と同様にＣＴＡＢ処理及び希釈操作を行い測定検体とした。【００４６】
ストレプトアビジンコートしたマイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製）に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）／トリス塩酸緩衝液生理食塩水（ＴＢＳＴ）で終濃度が３０μｇ／ｍＬとなるように希釈したビオチン化ＥＣＬを１００μＬ／ウェルで添加して２５℃で２時間反応させた。レクチン反応後、各ウェルをＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（ＴＢＳＴ）３００μＬで５回洗浄した。次に、２．５％スキムミルク／ＴＢＳＴを各ウェルに３００μＬ添加して、２５℃で１時間のブロッキングを行い、その後、各ウェルをＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ３００μＬで５回洗浄し、調製した検量線用標準溶液及び測定検体を各ウェルに１００μＬ添加して２５℃で２時間反応させた。反応後、各ウェルをＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ３００μＬで５回洗浄し、０．５％スキムミルク／ＴＢＳＴで２５００倍希釈した各株の参照抗血清（一元放射免疫拡散試験用、国立感染症研究所）溶液を抗ヘムアグルチニン抗体として各ウェルに１００μＬ添加して２５℃で１時間反応させた。抗ヘムアグルチニン抗体との反応後、各ウェルをＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ ３００μＬで５回洗浄し、０．５％スキムミルク／ＴＢＳＴで２５００倍希釈したＨＲＰ標識抗ヒツジＩｇＧ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を各ウェルに１００μＬ添加して２５℃で１時間反応させた。抗ヒツジＩｇＧ抗体の反応後、ＴＭＢ溶液（和光純薬工業社製）を各ウェルに２００μＬ添加して２５℃で２０分間反応させた後、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸（和光純薬工業社製）を各ウェルに５０μＬ添加して反応を停止した。反応停止後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。【００４７】
表３、表４及び表５にＡ／Ｈ１Ｎ1亜型（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９  Ｘ−１７９Ａ）、Ａ／Ｈ３Ｎ２亜型（Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１  ＩＶＲ−１６５）及びＢ型（Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／０１／２０１０  ＢＸ−４１Ａ）のＳＲＤ試験の測定結果、ヘムアグルチニン結合レクチンを用いたＥＬＩＳＡの測定結果及びＳＲＤ試験の測定値に対するＥＬＩＳＡの測定値の割合を示す。表に示すように、ＳＲＤ試験の測定値に対する本ＥＬＩＳＡ測定値の割合は、Ａ／Ｈ１Ｎ１亜型で９２．２〜１１１％、Ａ／Ｈ３Ｎ２亜型で９６．９％〜１３２％、Ｂ型で８０．４〜９１．６％となり、良好な相関が確認できた。したがって、ヘムアグルチニン結合レクチンを用いた本ＥＬＩＳＡにより、ワクチンの力価試験であるＳＲＤ試験結果と相関のある測定値を得ることが可能である。【００４８】
【表３】
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【００４９】
【表４】
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【００５０】
【表５】
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【図２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【国際調査報告】
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