(57)【要約】  本発明は、モジュール内の任意の位置へ任意の大きさの物質を出し入れすることができる細胞培養用モジュール、チューブやシリンジなどの送流手段と液密性あるいは気密性高く接続できる細胞培養用モジュール、及び、細胞を本来の機能を維持したまま効率よく長期間培養することができる細胞培養用モジュール、並びに、前記細胞培養用モジュールを含む細胞培養装置に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
中空糸膜が配置された培養場と、
該培養場を含む内部空間を構成する枠体と、
取り外し可能な蓋体と、
を備え、
該蓋体が取り付けられる開口が、前記培養場全体を露出可能な大きさで設けられている細胞培養用モジュール。
【請求項２】
前記蓋体及び／又は枠体が、外部から前記内部空間へ又は前記内部空間から外部へ流体を通流させる通流口を有する請求項１に記載の細胞培養用モジュール。
【請求項３】
前記通流口が、外部から前記内部空間へ向かって縮径するメス型ルアーテーパを有する請求項１又は２に記載の細胞培養用モジュール。
【請求項４】
複数の通流口が設けられている請求項３記載の細胞培養用モジュール。
【請求項５】
２枚の基板と、
該基板の間に形成された培養領域内に中空糸膜が配置された培養場と、
前記培養領域の外部から内部へ又は内部から外部へ流体を通流させる複数の通流口と、を有し、前記通流口は、前記基板の前記培養場に対応する位置に配設され、かつ、前記培養領域の外部から内部へ向かって縮径するメス型ルアーテーパを備える細胞培養用モジュール。
【請求項６】
複数の通流口が、異なる基板に設けられている請求項５に記載の細胞培養用モジュール。
【請求項７】
通流口が、培養場の中心に対して対称に設けられている請求項４又は６記載の細胞培養用モジュール。
【請求項８】
繊維集合体が、中空糸膜から分離可能に配置されている請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞培養用モジュール。
【請求項９】
繊維集合体がナノファイバーからなる請求項８に記載の細胞培養用モジュール。
【請求項１０】
繊維集合体が、平均直径２５０ｎｍ〜９５０ｎｍのナノファイバーからなる請求項９に記載の細胞培養用モジュール。
【請求項１１】
中空糸膜と、
平均直径２５０ｎｍ〜９５０ｎｍのナノファイバーからなる繊維集合体とが、配置された培養場を備える細胞培養用モジュール。
【請求項１２】
中空糸膜が、ガス供給用中空糸膜及び培地供給用中空糸膜を含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞培養用モジュール。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞培養用モジュールと、酸素供給手段と、培地供給手段とを含む、細胞培養用装置。
【請求項１４】
さらに、モニター手段、分析手段、及びサンプリング手段から選ばれるいずれか１又は２以上の手段を含む、請求項１３記載の細胞培養用装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養用モジュールに関する。より詳しくは、モジュール内の任意の位置へ任意の大きさの物質を出し入れすることができる細胞培養用モジュール、チューブやシリンジなどの送流手段と液密性あるいは気密性高く接続できる細胞培養用モジュール、及び、細胞を本来の機能を維持したまま効率よく長期間培養することができる細胞培養用モジュール、並びに、前記細胞培養用モジュールを含む細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養細胞を用いた薬効、毒性、安全性等の評価試験系は、動物実験に代替する試験方法として重要である。しかしながら、細胞、特に初代細胞を生体外で長期間培養することは必ずしも容易ではない。また、培養細胞を用いた評価試験系では、生体内と同様の機能を保持した細胞を用いる必要があるが、本来の機能を維持しつつ細胞を効率よく分化増殖させることも容易ではない。【０００３】
生体外で細胞を効率的に培養するためには、培養細胞に栄養と空気（酸素）を補給する必要がある。そのための技術としては、従来から中空糸膜を用いて培養液を供給・排出する方法が知られている（特許文献１〜３）。【０００４】
一方、細胞本来の機能を維持しながら培養するためには、生体内に類似した環境で細胞を培養することが好ましい。そのための技術としては、従来ハイドロキシアパタイトやポリ乳酸等の多孔質材料を足場として、細胞を三次元的に培養する方法が知られている（特許文献４）。【０００５】
近年では、生体内組織の繊維状の構造を高度に模倣できることから、ナノオーダーの繊維径を有するナノファイバーを、細胞培養や組織形成の足場材料として用いる技術が注目されている（非特許文献１、非特許文献２）。例えば、溶融紡糸によって作製されたナノファイバーを足場材料に用いる方法（特許文献５）や、有機系ナノファイバーを溶媒に分散した混合液を利用してナノファイバーのパターンを形成し、さらに細胞培養に有効な機能性薬剤をこのパターンに吸着させることにより、細胞の接着、増殖、分化を制御する方法が示されている（特許文献６）。【０００６】
発明者らは、メッシュ状に配置した中空糸膜と、足場材料としてのナノファイバー層とを用いることにより、生体外で効率的に細胞を培養できる細胞培養用モジュールを開発している（特許文献７〜１０）。このモジュールでは、ナノオーダーの繊維径を有するナノファイバーが生体内類似の環境を創出し、中空糸膜が該環境に培養液と空気（酸素）を補給するとともに、培養細胞からの代謝老廃物の除去を行う。【０００７】
上記細胞培養用モジュールへ細胞懸濁液や培地（培養液）、ガスなどの流体を導入するため、モジュールを構成する基板に設けられた通流口（開口）にチューブを接続したり、注射針を刺し込んだりすることが行われている。この際、モジュールの内部空間の液密性あるいは気密性を確保するため、通流口をシリコンゴムからなるシートによって封止する技術が提案されている（例えば特許文献１０参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平４−３４１１７６号公報
【特許文献２】特開２００４−１６６７１７号公報
【特許文献３】特開２０００−１８９１８９号公報
【特許文献４】特開２００６−２５４７２２号公報
【特許文献５】特開２００７−４４１４９号公報
【特許文献６】特開２００７−４４１４９号公報
【特許文献７】特開２００９−１００号公報
【特許文献８】特開２０１０−１４８４９６号公報
【特許文献９】特開２０１０−１４８４９７号公報
【特許文献１０】特開２０１１−２３９７５６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】高分子，2006, Vol.55, No.3, pp.142
【非特許文献２】Tissue Engineering, 2005, Vol.11, No.1-2,pp.101
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のような細胞培養用モジュールでは、外部から内部に物質を導入したり、内部から外部へ物質を取り出したりするために、モジュールを構成する基板に、チューブやシリンジ等を接続可能な開孔（インレットあるいはアウトレット）を設けることが行われている。例えば、物質の導入は、インレットに接続したチューブ等から該物質を含む液体を送液することによって行われている。【００１１】
これらのインレットあるいはアウトレットは、通常０．５〜５ｍｍ程度の孔径とされるため、これを超える大きさの物質をモジュールの内部へ導入したり、外部へ排出したりすることはできない。また、これよりも小さな物質であっても、液体の流れにのせて内部へ導入する構成であるため、モジュール内部の任意の位置に物質を配置することはできない。同様に、モジュール内部の任意の物体を選択して外部へ排出させることもできない。【００１２】
上述のような細胞培養用モジュールを利用することで、生体外での細胞培養技術は一定の成果を挙げている。しかしながら、培養細胞を用いた試験系が、動物実験に代替する評価系として完成するためには、生体内と同様の機能を保持した状態で細胞が培養され、生体組織に類似した系が再現されなければならない。そのための検討は、まだ十分になされていない。【００１３】
そこで、本発明は、モジュール内の任意の位置へ任意の大きさの物質を出し入れすることができる細胞培養用モジュールを提供することを第１の課題とする。【００１４】
また本発明は、細胞培養用モジュールにおいて、細胞懸濁液や培地、ガスなどの通流口の封止性を高め、細胞の導入時等に細胞懸濁液等の漏れが生じるのを防止するための技術を提供することを第２の課題とする。【００１５】
さらに本発明は、脱分化等を抑制し、生体内と同様の機能を保持した状態で細胞を長期間培養でき、動物試験に代替する培養細胞評価系を提供することを第３の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記第１の課題解決のため、本発明は、中空糸膜とが配置された培養場と、該培養場を含む内部空間を構成する枠体と、取り外し可能な蓋体と、を備え、該蓋体が取り付けられる開口が、前記培養場全体を露出可能な大きさで設けられている細胞培養用モジュールを提供する。【００１７】
この細胞培養用モジュールでは、蓋体を取り外して培養場全体を露出させることで、培養場の任意の位置に物質を導入したり、任意の位置の物質を外部に取り出したりすることが、物質の大きさの制約なく可能とされる。【００１８】
前記細胞培養用モジュールにおいて、前記蓋体及び／又は枠体は、外部から前記内部空間へ又は前記内部空間から外部へ流体を通流させる通流口を有することが好ましく、該通流口は、外部から前記内部空間へ向かって縮径するメス型ルアーテーパを有することが好ましい。【００１９】
通流口は１つであっても複数であってもよく、蓋体及び／又は枠体（枠体を構成する２枚の基板あるいは型枠）の任意の位置に設けることができるが、後述のとおり、前記繊維集合体の中心に対して対称に設けられていることが特に好ましい。【００２０】
第２の課題解決のため、本発明は、２枚の基板と、該基板の間に形成された培養領域内に中空糸膜が配設された培養場と、前記培養領域の外部から内部へ又は内部から外部へ流体を通流させる複数の通流口と、を有し、前記通流口は、前記基板の前記足場材料に対応する位置に配設され、かつ、前記培養領域の外部から内部へ向かって縮径するメス型ルアーテーパを備える細胞培養用モジュールを提供する。【００２１】
通流口にメス型ルアーテーパを備える細胞培養用モジュールは、オス型ルアーテーパを有する、チューブやシリンジなどの送流手段と液密性あるいは気密性高く接続できる。【００２２】
前記細胞培養用モジュールにおいて、複数の通流口は、同一の前記基板に設けられていても、異なる前記基板に設けられていてもよいが、異なる基板に設けられていることが好ましい。【００２３】
本発明の細胞培養用モジュールにおいて、通流口は、培養場の中心に対して対称に設けられていることが好ましい。【００２４】
本発明の細胞培養用モジュールにおいて、繊維集合体は中空糸膜から分離可能に配置されていることが好ましい。また、前記繊維集合体はナノファイバーからなるものとすることができる。【００２５】
第３の課題解決のため、本発明は、中空糸膜と、平均直径２５０ｎｍ〜９５０ｎｍのナノファイバーからなる繊維集合体とが、配置された培養場を備える細胞培養用モジュールを提供する。【００２６】
上記した第１、第２の課題解決のための細胞培養用モジュールにおいても、繊維集合体は平均直径２５０ｎｍ〜９５０ｎｍのナノファイバーからなるものとすることができる。なお、ナノファイバーの平均直径は約３００ｎｍ又は約６００ｎｍがより好ましく、約６００ｎｍが特に好ましい。【００２７】
本発明の細胞培養用モジュールを用いて培養することで、高い活性を有する細胞が得られる。得られる細胞のチトクロム４５０（ＣＹＰ）活性は２pmol/106cells/min以上であることが好ましく、３pmol/106cells/min以上であることがより好ましく、４pmol/106cells/min以上であることが特に好ましい。【００２８】
本発明の細胞培養用モジュールにおいて、中空糸膜は、酸素供給用中空糸膜と培地供給用中空糸膜とからなることが好ましい。酸素供給用中空糸膜は、モジュール内に酸素を供給して吸気を促進させ、培地供給用中空糸膜は、モジュール内に培地を供給して、代謝（栄養添加・老廃物排出）を促進させる。【００２９】
本発明は、前記細胞培養用モジュールと、酸素供給手段と、培地供給手段とを含む、細胞培養用装置も提供する。【００３０】
本発明の細胞培養用装置は、さらに、モニター手段と、分析手段と、サンプリング手段から選ばれるいずれか１又は２以上の手段を含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００３１】
本発明により、モジュール内の任意の位置へ任意の大きさの物質を出し入れすることができる細胞培養用モジュールが提供される。さらには、細胞シートのような組織を形成することで、ばらばらの細胞とは異なる挙動を示す細胞塊を培養時の状態で取り出すことが可能となり、精度の高い評価試験が行える。【００３２】
また本発明により、細胞培養用モジュールの細胞懸濁液や培地、ガスなどの通流口の封止性を高め、細胞の導入時等に細胞懸濁液等の漏れが生じるのを防止するための技術が提供される。【００３３】
さらに本発明により、細胞をその本来の機能を維持した状態で効率よく長期間培養することができる。本発明の技術は、既存の足場材料やこれを用いた細胞培養用モジュールへの適用が可能であり、これにより、より優れた生体外での薬効、毒性、安全性等の評価が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の第一実施形態に係る細胞培養用モジュール１０１Ａの構成を説明する図である。Ａはキャップ１５０の取り外し時の断面図、Ｂは上面図である。
【図２】通流口１５３の構成を説明する図である。
【図３】培養場１１０の構成を説明する図である。Ａは上面図、ＢはＡ中Ｐ−Ｐ線の断面図、ＣはＡ中Ｑ−Ｑ線の断面図である。
【図４】第一実施形態に係る細胞培養用モジュール１０１Ａの変形例の構成を説明する図であり、キャップ１５０の取り外し時の断面図を示す。
【図５】培養場１１０の変形例の構成を説明する図である。Ａは上面図、ＢはＡ中Ｐ−Ｐ線の断面図である。
【図６】本発明の第二実施形態に係る細胞培養用モジュール１０１Ｂの構成を説明する図である。Ａはキャップ１５０の取り外し時の上面図、Ｂは断面図である。
【図７】本発明の第三実施形態に係る細胞培養用モジュール１０１Ｃの構成を説明する図である。Ａはキャップ１５０の取り外し時の上面図、Ｂは側面図である。
【図８】本発明の第四実施形態に係る細胞培養用モジュール１０１Ｄの構成を説明する図である。Ａはキャップ１５０の取り外し時の上面図、Ｂは断面図である。
【図９】本発明の第五実施形態に係る細胞培養用モジュール２０１Ａの構成を説明する図である。Ａは平面図、ＢはＡ中Ｐ−Ｐ線の断面図である。
【図１０】ルアーテーパによるポートとシリンジとの接続態様を説明する図である。
【図１１】ポートの封止態様を説明する図である。
【図１２】足場材料２１０の構成を説明する図である。Ａは平面図、ＢはＡ中Ｐ−Ｐ線の断面図、ＣはＡ中Ｑ−Ｑ線の断面図である。
【図１３】細胞培養用モジュール２０１Ａを用いた細胞培養方法の手順を説明する図である。
【図１４】本発明の第六実施形態に係る細胞培養用モジュール２０１Ｂの構成を説明する図である。Ａは平面図、ＢはＡ中Ｐ−Ｐ線の断面図である。
【図１５】細胞培養用モジュール２０１Ｂを用いた細胞培養方法の手順を説明する図である。
【図１６】本発明の細胞培養装置の構成の一例を示す。
【図１７】Ｈｃ細胞（上）とＨｃ細胞から誘導した肝芽細胞を、各ナノファイバー不織布（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．６）を足場として静置培養したときのチトクロム３Ａ４（ＣＹＰ）酵素活性を示す。
【図１８Ａ】各ナノファイバー不織布を足場としてＨｃ細胞由来肝芽細胞を静置培養したときの細胞増殖状態を位走査顕微鏡で観察した結果を示す（上から、Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３）。
【図１８Ｂ】各ナノファイバー不織布を足場としてＨｃ細胞由来肝芽細胞を静置培養したときの細胞増殖状態を位走査顕微鏡で観察した結果を示す（上から、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６）。
【図１９】ヒト凍結肝細胞をナノファイバー不織布又はシャーレを足場として静置培養したときのチトクロム３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）酵素活性を示す（左からＮｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６、シャーレ）。
【図２０】Ｈｃ細胞由来肝芽細胞を各ナノファイバー不織布を用いて静置培養したときの細胞数（×106cells/プレート）の経日変化を示す（-□-：Ｎｏ．２、-△-：Ｎｏ．３、-■-：Ｎｏ．４、-▲-：Ｎｏ．５、-◇-：Ｎｏ．６）。
【図２１】本発明の細胞培養装置を用いてＨｃ細胞を肝芽細胞に誘導し、さらに還流培養したときの細胞密度（×107cells/cm3）の経日変化を示す。
【図２２】本発明の細胞培養装置を用いてヒト凍結肝細胞を環流培養したときの、細胞密度（×107cells/cm3）の経日変化を示す。
【図２３】本発明の細胞培養装置を用いてヒト凍結肝細胞を環流培養したときの、溶存酸素濃度の経日変化を示す。
【００３５】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１２−１９２９８０号、特願２０１２−２６５４３６号、特願２０１３−０５１１７９号、及び特願２０１３−１０１８０５号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
１．第一実施形態に係る細胞培養用モジュール
（１）枠体及び蓋体の構成
図１に、本発明の第一実施形態に係る細胞培養用モジュール１０１Ａの構成を示す。細胞培養用モジュール１０１Ａは、基板１２０、１３０及び型枠１４０を含んだ枠体、並びに蓋体１５０（以下「キャップ１５０」と称する）を含んで構成されている。基板１３０には、キャップ１５０が取り付けられる開口１３１が設けられている。
【００３７】
開口１３１周面（内周面）にはネジ溝１３２が周設されている。キャップ１５０は、ネジ山１５１が周設され、開口１３１と同径とされた外周面を有している。キャップ１５０は、ネジ山１５１とネジ溝１３２との係合によって、開口１３１へ取り付けあるいは取り外し可能（スクリューキャップ）とされている。図１Ａは、キャップ１５０の取り外し時の細胞培養用モジュール１０１Ａの断面図を示し、図１Ｂは、キャップ１５０の取り外し時の基板１２０、１３０及び型枠１４０の上面図を示す。
【００３８】
キャップ１５０は、開口１３１へ取り付けられた状態において、基板１２０、１３０及び型枠１４０とともに、液密な（あるいは気密な）内部空間１０２（後述の図２Ｂ参照）を構成する。図１中符号１５２は、内部空間１０２の液密性（あるいは気密性）を高めるための封止部材（例えばＯリング等）を示す。封止部材１５２は、キャップ１５０の基板１３０との接触部に配設され、キャップ１５０の開口１３１への取り付け時において該接触部を封止する。
【００３９】
内部空間１０２内には、中空糸膜１１１ａ（１１３ａ）及び中空糸膜１１１ｂ（１１３ｂ）がメッシュ状に配設されて構成された培養場１１０が位置している。中空糸膜１１１ａ（１１３ａ）は、型枠１４０の対向する２辺を貫通して型枠１４０に挿通されており、ポッティング樹脂によって型枠１４０に固定されている。同様に、中空糸膜１１１ｂ（１１３ｂ）は、型枠１４０の他の対向する２辺を貫通して型枠１４０に挿通されて型枠１４０に固定されている。なお、中空糸膜１１１ａ（１１３ａ）、１１１ｂ（１１３ｂ）及び培養場１１０の構成については、図３を参照して詳しく後述する。
【００４０】
基板１２０、１３０は、中空糸膜１１１ａ（１１３ａ）、１１１ｂ（１１３ｂ）及び型枠１４０を挟んでしっかりと固定するのに適した強度を有するものであればよく、例えば、アクリル板とされる。基板１２０、１３０はそれぞれ一枚のアクリル板等から構成されるものであっても、それぞれ２枚以上のアクリル板等から構成されるものであってもよい。キャップ１５０も、例えばアクリル板であってよく、一枚あるいは２枚以上のアクリル板等から構成されるものであってよい。
【００４１】
型枠１４０の材料は、ポッティング樹脂との接着性が充分に得られるものであればよく、例えば、シリコンゴムとされる。また、ポッティング樹脂は、充分な接着性を有するものであればよく、例えば、エポキシ樹脂、ウレタン樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、シリコン樹脂等の各種の熱硬化性樹脂や熱可塑性樹脂等が用いられる。
【００４２】
基板１３０の開口１３１は、キャップ１５０の取り外し時において、培養場１１０全体を露出可能な大きさで設けられている。換言すると、上方視した場合（図１Ｂ参照）、開口１３１は、その内側に培養場１１０の全体が位置し得るような大きさとされている。
【００４３】
開口１３１の径Ｄは、培養場１１０の径ｄ以上とされていることが好ましい。より具体的には、開口１３１と培養場１１０は同心状に配置され、かつそれらの径は開口１３１の径Ｄが培養場１１０の径ｄ以上となるようにされていることが好ましい。換言すれば、上方視した場合（図１Ｂ参照）、開口１３１の開口面積は、培養場１１０の面積以上とされていることが好ましい。より具体的には、上方視した場合（図１Ｂ参照）、開口１３１と培養場１１０は、開口１３１の内側に培養場１１０の全体が位置するように配設されていることが好ましい。
【００４４】
これにより、細胞培養用モジュール１０１Ａでは、キャップ１５０の取り外し時において、培養場１１０全体を外部から視認したり操作したりすることが可能なように露出させることができる。従って、細胞培養用モジュール１０１Ａでは、キャップ１５０を取り外して培養場１１０全体を露出させることで、培養場１１０の任意の位置に物質を導入したり、任意の位置の物質を外部に取り出したりすることが、物質の大きさの制約なく可能とされる。
【００４５】
（２）通流口
次に、図２を参照する。キャップ１５０は、モジュールの外部から内部空間１０２へ又は内部空間１０２から外部へ、細胞懸濁液等の流体を通流させるための通流口１５３を有していてもよい（図Ａ参照）。通流口１５３は、キャップ１５０を貫通して設けられている。通流口１５３は、キャップ１５０の取り付け時において、外部と内部空間１０２とを連絡する。図では、キャップ１５０に穿設されたネジ溝穴に、ポート（接続部材）１５４をネジ込んで取り付けることにより、通流口１５３を構成する例を示した。
【００４６】
図には、キャップ１５０に通流口１５３を２つ設けた例を示すが、通流口１５３は１つ又は３つ以上を設けることができる。また、通流口１５３は、図２Ｂに示すように基板１２０にも設けることができる。通流口１５３は、細胞懸濁液や培地、ガスなどの流体を、内部空間１０２の外部から内部へ又は内部から外部へ通流させることができる限りにおいて、キャップ１５０、基板１２０、１３０及び型枠１４０の任意の位置に任意の数で設けることができる。
【００４７】
ポート１５４の材質は、特に限定されないが、通常、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）、環状ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等とされる。ポート１５４には、医療分野で汎用される、いわゆるシリンジポートを好適に用いることができる。
【００４８】
ポート１５４はメス型ルアーテーパを備え、その内壁が内部空間１０２の外部から内部へ向かう方向に徐々に縮径されていることが好ましい。これによって、ポート１５４は、オス型ルアーテーパを有する、チューブやシリンジなどの送流手段と液密性良く接続される。メス型及びオス型ルアーテーパのテーパ角度や大きさ等の規格は、従来公知のものを適用できる。
【００４９】
通流口１５３の大きさや形状は、特に限定されないが、例えば円形で、直径が５００μｍ〜５ｍｍ程度とされる。ポート１５４のメス型ルアーテーパは、その内壁の少なくとも一部に、オス型ルアーテーパを有する送流手段を刺し込み可能に設けられていればよいものとする。
【００５０】
（３）培養場
次に、図３を参照して、培養場１１０の構成を説明する。培養場１１０は、中空糸膜１１１ａ、１１１ｂ（中空糸膜１１１ａ、１１１ｂを併せて中空糸膜１１１と称する）がメッシュ状に配置された中空糸膜メッシュ１１２と、繊維集合体からなる足場材料１１５と、中空糸膜１１３ａ、１１３ｂ（中空糸膜１１３ａ、１１３ｂを併せて中空糸膜１１３と称する）がメッシュ状に配置された中空糸膜メッシュ１１４とが、この順に積層されている。
【００５１】
（３−１）中空糸膜
中空糸膜メッシュ１１２を形成する中空糸膜１１１の膜基材ポリマーは、中空糸膜上に成形できるものであればよく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリスルフォン、ポリアリルスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリアクリロニトリル、セルロースアセテート、ポリフッ化ビニリデン、これらの２種類以上を混合した混合物等が挙げられる。
【００５２】
中空糸膜１１１の外径は、５０〜３０００μｍが好ましく、１００〜２０００μｍがより好ましい。外径が５０μｍ以上であれば、中空糸膜１１１において充分な大きさの中空部分を確保しやすいため、培養液を送液する際の差圧が大きくなったり、代謝老廃物の除去が不充分になったりすることを抑制しやすい。また、外径が３０００μｍ以下であれば、単位体積あたりの中空糸膜１１１の表面積をより大きくすることができるため、培養細胞に充分な栄養及びガスを供給することが容易になる。
【００５３】
中空糸膜１１１の膜厚は、５〜５００μｍが好ましい。膜厚が５μｍ以上であれば、栄養供給やガス供給の際の加圧によって中空糸膜が破壊されることを防止しやすい。また、膜厚が５００μｍ以下であれば、ろ過抵抗がより小さくなるため、培養細胞への栄養供給やガス供給や、培養細胞からの代謝老廃物の除去の効率が向上する。なお、中空糸膜１１１が多層膜である場合の膜厚は、各層の膜厚の総和（全層の膜厚）である。中空糸膜１１１の内径は、１０μｍ以上２９９５μｍ以下が好ましい。
【００５４】
中空糸膜１１１としては、精密ろ過膜、限外ろ過膜、ガス分離膜等を用いることができる。これらは必要に応じて適宜選択することができる。物質選択透過性を有する中空糸膜を用いることにより、特定の物質を培養細胞に供給したり、特定の代謝老廃物を培養細胞から除去したりすることができる。また、培養液中の特定成分、化学物質、薬物等の被験物質を培養細胞に効率的に供給することや、老廃物や代謝物を系外に排出させてこれらをモニタリングすることが可能となる。物質選択透過性を有する中空糸膜としては、前記精密ろ過膜や限外ろ過膜を挙げることができ、さらに、膜素材そのものに物質選択透過性を有する中空糸膜や、中空部分に選択透過性を有する物質が充填された多孔質中空糸膜を挙げることができる。
【００５５】
また、ガス分離膜を用いることにより、培養細胞に空気、酸素、及びその他のガスを効率的、かつ選択的に供給することができる。ガス供給は多孔質中空糸膜を用いて行ってもよく、この場合、ガス分離機能を有する非多孔性の膜基材を、多孔性の膜基材で支持した中空糸膜が好ましい。このようなガス分離機能を有する中空糸膜を用いることにより、培養液中にバブルレスでガスを供給できるので、培養細胞へのダメージを防止しやすい。また、培養液等の液体が中空糸膜の中空部分に入り込んで該中空部を閉塞することを防止しやすい。
【００５６】
また、中空糸膜１１１は、親水化処理されていることが好ましい。中空糸膜を親水化処理することにより、培養細胞への培養液等の液体成分の供給が容易になり、また中空糸膜表面への細胞接着の抑制も容易になる。中空糸膜を親水化処理する方法としては、例えば、中空糸膜をエチレン−ビニルアルコール共重合体等の親水性高分子や、グリセリン、エタノールで処理する方法が挙げられる。
【００５７】
また、中空糸膜メッシュ１１２には、２種類以上の中空糸膜を用いることもできる。例えば、栄養の供給を行う精密ろ過膜、ガスの供給を行うガス分離膜、培養細胞への特定成分の供給あるいは培養細胞からの特定の代謝老廃物の排出を行う物質選択透過性を有する中空糸膜を、任意に組み合わせて用いることができる。
【００５８】
中空糸膜メッシュ１１２は、複数の中空糸膜を網目が形成するようにメッシュ状に配置したものである。中空糸膜メッシュ１１２の形態としては、例えば、複数の中空糸膜１１１ａを所定の間隔で平行に配置してシート状とし、それら中空糸膜１１１ａに対して直交する方向に沿って複数の中空糸膜１１１ｂを所定の間隔で平行に配置してシート状とすることにより、メッシュ状とした形態が挙げられる（図３Ａ）。中空糸膜メッシュ１１２における中空糸膜１１１からなるシートの層数は特に制限されず、２〜１０層が好ましい。この例では、シートは２層（中空糸膜１１１ａからなる層と中空糸膜１１１ｂからなる層）である。
【００５９】
中空糸膜メッシュ１１４及び中空糸膜１１３は、中空糸膜メッシュ１１２及び中空糸膜１１１と同じものを用いることができ、好ましい形態も同じである。
【００６０】
中空糸膜メッシュ１１２、１１４の形態は、中空糸膜１１１、１１３を介する栄養や気体の供給、代謝老廃物の除去に応じて選択すればよく、中空糸膜１１１、１１３をモジュール化する際のポート部の設計にも依存する。培養場１１０では、中空糸膜メッシュ１１２の中空糸膜１１１ａと中空糸膜メッシュ１１４の中空糸膜１１３ａは同一種類の中空糸膜であることが好ましい。同様に、中空糸膜メッシュ１１２の中空糸膜１１１ｂと中空糸膜メッシュ１１４の中空糸膜１１３ｂは同一種類の中空糸膜であることが好ましい。このような形態とすることで、中空糸膜１１１、１１３をモジュール化する際に、例えば中空糸膜１１１ａ及び中空糸膜１１３ａを集結させて一つのポート部に繋いでガス供給用中空糸膜とし、中空糸膜１１１ｂ及び中空糸膜１１３ｂを集結させて他のポート部につないで培地供給用中空糸膜として用いることができる。
【００６１】
（３−２）足場材料
足場材料１１５を構成する繊維集合体には、ナノファイバーの集合体が好適に用いられる。ナノファイバーの集合体は、基材上で、エレクトロスピニング（電界紡糸）により形成されたものであることが好ましい。基材は、特に制限されず、エレクトロスピニングにより表面にナノファイバーの集合体を形成できるものであればよく、例えば、アルミ箔等が挙げられる。
【００６２】
ナノファイバーの材質は、紡糸が容易である点から、溶剤可溶性のポリマーであることが好ましい。特にエレクトロスピニングが可能な溶剤可溶性のポリマーとしては、例えば、ナイロン４，６、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン１２、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエーテルイミド、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリスルフォン、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリフッ化ビニリデン、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、シルク、酢酸セルロース、キトサン、コラーゲン等が挙げられる。しかし、これらに限定されるものではなく、これらのポリマーの混合物や、無機物や炭素材料を含有させたものであってもよい。
【００６３】
また、ポリマーの分子量は特に限定されないが、分子量が低すぎると曳糸性が低下するおそれがあり、分子量が高すぎると粘度が高くなって紡糸が困難になるおそれがある。また、溶剤に不溶なポリマーであっても、レーザーエレクトロスピニング法を適用する場合は熱可塑性ポリマーを用いることができる。レーザーエレクトロスピニング法に適用できる熱可塑性ポリマーとしては、例えば、ポリエチレンテレフタレートが挙げられる。
【００６４】
ナノファイバー（単繊維）の平均直径（糸径）は２５０ｎｍ〜９５０ｎｍが好ましく、約３００又は約６００ｎｍがより好ましく、約６００ｎｍがさらに好ましい。この範囲の糸径を有するナノファイバーを用いれば、細胞を高い活性で長期間培養することができる。得られる細胞のチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）活性は２以上であることが好ましく、３以上であることがより好ましく、４以上であることが特に好ましい。
【００６５】
なお、ナノファイバーの単繊維の直径は、上記特許文献１０に記載の方法により測定することができる。例えば、ナノファイバーの単繊維の平均直径は、例えば、以下のようにして測定することができる。ナノファイバー、又はその集合体（ナノファイバー層）の表面を電子顕微鏡により観察し、得られた電子顕微鏡写真中の任意の20本のナノファイバー表面の幅を計測し、その平均をナノファイバーの単繊維の直径とする。電子顕微鏡としては、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）が好ましい。観察倍率は5000倍〜5万倍が好ましい。観察倍率が5000倍以上であれば、ナノファイバーの直径の決定が容易になる。また、単繊維の直径を求める際には、画像解析ソフトを用いることが好ましい。画像解析ソフトによって得られるナノファイバーの単繊維の直径は、画像解析のための画質調整、画像解析ソフトの種類等によって若干変動があるが、その差は通常の実験誤差の範囲内である。
【００６６】
繊維集合体の厚みは、０．５〜１００μｍが好ましく、１〜５０μｍがより好ましい。厚みが０．５μｍ以上であれば、繊維集合体１１５を中空糸膜メッシュ間に配置するのが容易になる。厚みが１００μｍ以下であれば、栄養やガスの供給や代謝老廃物の除去が足場材料１５に接着した細胞全体に均一に行えるため、細胞培養の効率が向上する。
【００６７】
足場材料１１５に生理活性物質を吸着または固定させることにより、培養細胞の接着、増殖、分化、機能発現の制御を行うことができる。生理活性物質としては、機能性ポリマー、アミノ酸、タンパク質、糖鎖、ビタミン類等が挙げられる。特に、細胞培養に有効な生理活性物質、例えば培養細胞の増殖、分化、機能発現に重要な役割を有する生理活性物質の総称であるサイトカインを用いると効果的である。サイトカインとしては、インターロイキン、増血因子、増殖因子等が挙げられる。また、細胞−細胞外マトリックス、細胞−細胞間の接着に関与するインテグリン、カドヘリン等の細胞接着基質を用いることも効果的である。また、薬剤や化学物質等の被験物質を足場材料１１５に吸着または固定することにより、細胞培養試験を行うことも可能である。
【００６８】
培養場１１０は、以上説明した中空糸膜メッシュ１１２と中空糸膜メッシュ１１４との間に、足場材料１１５が配置された積層体を有する。このように、ナノファイバー層を中空糸膜メッシュ間に配置することにより、足場材料１１５を中空糸膜メッシュ１１２、１１４に強固に固定することができ、培養細胞への栄養やガスの供給や、細胞培養からの代謝老廃物の除去をより安定して行うことができる。また、足場材料１１５を中空糸膜メッシュ１１２、１１４間に配置することで、足場材料１１５に接着させた培養細胞と中空糸膜１１１、１１３との距離が近くなるため、培養細胞への栄養やガスの供給や、細胞培養からの代謝老廃物の除去をより高い効率で行うことができ、培養細胞のネクローシスが減少して細胞培養の効率が向上する。
【００６９】
培養場１１０の大きさは、薬物試験に必要な細胞個数が確保できる大きさであればよく、１ｍ2〜０．１ｃｍ2が好ましく、６００ｃｍ2〜０．２ｃｍ2がより好ましく、５９ｃｍ2〜０．３５ｃｍ2が特に好ましい。この範囲内であると足場材の均一性が上昇する。
【００７０】
なお、本発明に係る細胞培養用モジュールにおいて、培養場１０の中空糸膜メッシュ１１２、１１４と足場材料１１５の積層数は特に限定されず、中空糸膜メッシュ１１４、足場材料１１５、中空糸膜メッシュ１１２、足場材料１１５、中空糸膜メッシュ１１２がこの順に積層されてもよく、これ以上の数の中空糸膜メッシュ１１２、１１４と足場材料１１５が積層されもよいものとする。
【００７１】
細胞培養用モジュール１０１Ａでは、上述のポート１５４に、例えばチューブ等を接続することにより、栄養やガスの供給や、代謝老廃物の除去の行う経路として、中空糸膜メッシュ１１２、１１４の中空糸膜１１１、１１３以外の第３の経路を設けることができる。そのため、中空糸膜のみを用いて栄養やガスを供給したり、代謝老廃物を除去したりする場合に比べて、より多くの条件でかつそれらの条件を独立に制御しながらの細胞培養を、より簡便に行うことができる。
【００７２】
（４）変形例
（４−１）蓋体の変形例
上記では、基板１３０の開口１３１周面（内周面）にネジ溝１３２を設け、キャップ１５０の外周面にネジ山１５１を設けて、キャップ１５０の開口１３１への着脱を行う例を説明した。この形態は、構造が単純で加工が容易であり、キャップ１５０の着脱も容易である。また、モジュールのサイズも小さくできる。
【００７３】
キャップ１５０の開口１３１への着脱は、図４に示すように、基板１３０の開口１３１の外周面にネジ溝１３２を設け、キャップ１５０の内周面にネジ山１５１を設けることによって行ってもよい。図４Ａは、キャップ１５０の取り外し時の細胞培養用モジュール１０１Ａの断面図を示す。
【００７４】
この変形例では、ネジ山１５１とネジ溝１３２が、内部空間１０２に導入される培地等と接触することがない。このため、乾燥した培地等によるネジ山１５１とネジ溝１３２との固着を防止して、キャップ１５０の着脱操作性を高めることができる。
【００７５】
（４−２）培養場の変形例
また、上記では、中空糸膜メッシュ１１２と中空糸膜メッシュ１１４との間に足場材料１１５を配して培養場１１０を構成する例を説明した。培養場１１０は、図５に示すように、中空糸膜メッシュ１１４、中空糸膜メッシュ１１２及び足場材料１１５をこの順に積層して構成してもよい。これにより、足場材料１１５を中空糸膜メッシュ１１２上に分離可能に配置することができる。従って、キャップ５０を取り外して培養場１１０全体を露出させれば、培養場１１０から中空糸膜メッシュ１１２上の足場材料１１５をそのまま外部に取り出すことできる。
【００７６】
２．第一実施形態に係る細胞培養用モジュールにおける細胞培養方法
上述の細胞培養用モジュール１０１Ａを用いた細胞培養方法について説明する。
【００７７】
（１）細胞導入手順
まず、培養場１１０に細胞を導入する。細胞の導入は、キャップ１５０を取り外した状態で行うことができる（図１参照）。キャップ１５０を取り外した状態では、開口１３１を通して培養場１１０全体が露出される。このため、培養場１１０全体を視認しながら、細胞を培養場１１０上の任意の位置に細胞を導入することが可能である。細胞の導入は、例えばピペット等を開口２３１から内部空間１０２内に挿入し、培養場１１０上の任意の位置に細胞懸濁液を滴下することによって行う。細胞懸濁液とともに試験物質等の物質を導入してもよい。例えばピンセット等を培養空間１０２内に挿入し、固形物質を培養場１１０上に配置することによって、物質の大きさに制約なく任意の位置に導入できる。
【００７８】
細胞の導入は、キャップ１５０に通流口１５３を設ける場合（図２参照）には、ポート１５４に細胞懸濁液の送液手段を接続して行ってもよい。通流口１５３から細胞懸濁液を送液することにより、内部空間１０２に細胞懸濁液の流れが形成され、該流れによって細胞が運搬されて培養場１１０上に分散される。ただし、この場合には、細胞を培養場１１０上の任意の位置にのみ導入することは難しい。また、細胞懸濁液とともに試験物質等の物質を導入してもよいが、この場合には、物質は溶液又は分散液で導入される必要があり、物質を培養場１１０上の任意の位置のみに導入することは難しい。
【００７９】
（２）培養手順
細胞の導入完了後、例えば中空糸膜１１１ａ及び中空糸膜１１３ａを集結させて一つのポート部に繋いでガス供給を行い、中空糸膜１１１ｂ及び中空糸膜１１３ｂを集結させて他のポート部につないで培地供給を行って細胞培養を行う。
【００８０】
細胞培養は、具体的には、例えば中空糸膜１１１ａ、１１３ａとしてガス分離膜である中空糸膜、中空糸膜１１１ｂ、１１３ｂとして物質選択透過性を有する中空糸膜を用い、中空糸膜１１１ａ、１１３ａの片端より酸素を含むガスを供給しつつ、他方の端部より該ガスを排出させる。また、中空糸膜１１１ｂ、１１３ｂの片端より培養細胞の栄養を供給し、他方の端部より該培養細胞の老廃物や代謝物を排出させる。これにより、排出される成分をオンラインで分析し、培養細胞を培養しながら連続的に培養細胞の生育状況を評価することも可能である。
【００８１】
また、培養細胞に、中空糸膜１１１ｂ、１１３ｂの片端より被験物質を投与し、老廃物や代謝物を含む溶液を中空糸膜１１１ｂ、１１３ｂの他方の端部より排出させ、この溶液を分析しモニタリングすることによって、被験物質を投与した場合の培養細胞が受けるストレスや培養細胞の状態を経時的に評価できる。
【００８２】
（３）細胞回収手順
培養後の細胞は、再度キャップ１５０を取り外して回収することができる。キャップ１５０を取り外した状態では、開口１３１を通して培養場１１０全体が露出される。このため、培養場１１０全体を視認しながら、培養場１１０上の任意の位置の細胞を選択的に回収することが可能である。細胞の回収は、例えばピペットを開口１３１から培養空間１０２内に挿入し、培養場１１０上の任意の位置の細胞を吸引することによって行う。あるいは、例えばスパチュラを培養空間１０２内に挿入し、培養場１１０上の任意の位置の細胞を掻き取って回収することもできる。
【００８３】
さらに、細胞の回収は、足場材料１１５を中空糸膜メッシュ１１２上に分離可能に配置した場合には、細胞が付着した足場材料１１５をそのまま外部に取り出すことによって行ってもよい。
【００８４】
また、培養場１１０に試験物質等の物質が導入されている場合には、細胞とともに該物質の回収を行うこともできる。例えばピンセット等で培養場１１０上の任意の位置の固形物質を選択的に取り出すことによって、物質の大きさに制約なく任意の位置から回収できる。
【００８５】
３．第二実施形態に係る細胞培養用モジュール
図６に、本発明の第二実施形態に係る細胞培養用モジュール１０１Ｂの構成を示す。上述した第一実施形態に係る細胞培養モジュール１０１Ａでは、キャップ１５０の開口１３１への着脱を、開口１３１のネジ溝１３２と、キャップ１５０のネジ山１５１との係合によって行う構成を説明した。本実施形態に係る細胞培養用モジュール１０１Ｂは、キャップ１５０の開口１３１への着脱をネジ１６１とネジ穴１６２とによって行う構成となっている点で、細胞培養モジュール１０１Ａと異なっている。
【００８６】
ネジ穴１６２は、キャップ１５０、基板１３０、型枠１４０及び基板１２０を貫通して設けられている。また、ネジ穴１６２は、開口１３１及び内部空間１０２、中空糸膜１１１ａ（１１３ａ）及び中空糸膜１１１ｂ（１１３ｂ）に干渉しない位置（好ましくは図に示すように細胞培養モジュール１Ｂの四隅）に設けられている。開口１３１へのキャップ１５０の取り付けは、キャップ１５０、基板１３０、型枠１４０及び基板１２０を、それぞれに穿設されたねじ穴１６２の位置を一致させるように重ね合わせ、ネジ穴１６２にネジ１６１をねじ込むことによって行う。
【００８７】
細胞培養用モジュール１０１Ｂは、加工が容易であり、細胞培養用モジュール１０１Ａで生じ得る培地の乾燥等によるネジ山５１とネジ溝１３２との固着の問題がない。なお、ネジ穴１６２は、開口１３１へのキャップ１５０の取り付けのため、キャップ１５０を貫通し、基板１３０の少なくとも一部にまで穿設されていることが必要である。しかし、ネジ穴１６２は、基板１３０全部、さらには型枠１４０及び基板１２０にまで穿設されていることは必須とはならない。また、ネジ穴１６２の数及び位置についても、図に示した形態に限られず、適宜変更が可能である。
【００８８】
４．第三実施形態に係る細胞培養用モジュール
図７に、本発明の第三実施形態に係る細胞培養用モジュール１０１Ｃの構成を示す。細胞培養用モジュール１０１Ｃは、キャップ１５０の開口１３１への着脱を、基板１３０に設けた係合穴１３３と、キャップ１５０に設けた係合ツメ１５５との係合によって行う構成となっている点で、上述した第一実施形態に係る細胞培養モジュール１０１Ａと異なっている。
【００８９】
係合穴１３３は、基板１３０の開口１３１周縁部に設けられている。また、係合ツメ１５５は、開口１３１にキャップ１５０を閉蓋した際に、係合穴１３３の位置に対応し得る位置に設けられている。係合穴１３３及び係合ツメ１５５は、係合可能な形状を有していればよいが、例えば図に示すように、係合ツメ１５５を係合穴１３３に挿入した後、キャップ１５０を回転させることによって係合ツメ１５５を係合穴１３３に係止させる構造を一般に採用可能である。
【００９０】
５．第四実施形態に係る細胞培養用モジュール
図８に、本発明の第四実施形態に係る細胞培養用モジュール１０１Ｄの構成を示す。細胞培養用モジュール１０１Ｄは、キャップ１５０の開口１３１への着脱を、留め具１６３によって行う構成となっている点で、上述した第一実施形態に係る細胞培養モジュール１０１Ａと異なっている。
【００９１】
留め具１６３には、例えば、開口１３１を閉蓋したキャップ１５０と基板１２０とを挟み込んで保持するものを採用できる。この場合、キャップ１５０の上面と基板１２０の下面には、留め具１６３をはめ込むための凹部（図中符号１６４参照）を設けてもよい。
【００９２】
細胞培養用モジュール１０１Ｃ、１０１Ｄは、キャップ１５０の着脱操作性に優れる。また、細胞培養用モジュール１０１Ｃ、１０１Ｄでは、細胞培養用モジュール１０１Ａで生じ得る培地の乾燥等によるネジ山１５１とネジ溝１３２との固着の問題がない。
【００９３】
以上のように、本発明に係る細胞培養用モジュールでは、キャップ１５０の取り外し時において、培養場１１０全体を外部から視認したり操作したりすることが可能なように露出させることができる。このため、本発明に係る細胞培養用モジュールでは、キャップ１５０を取り外して培養場１１０全体を露出させることで、培養場１１０の任意の位置に物質を導入したり、任意の位置の物質を外部に取り出したりすることが、物質の大きさの制約なく可能とされる。また、内部空間１０２内にｐＨ測定や溶存酸素濃度測定などのためのプローブを挿入し、計測を行うことも可能となる。
【００９４】
６．第五実施形態に係る細胞培養用モジュール
（１）概略構成
図８に、本発明の第五実施形態に係る細胞培養用モジュール２０１Ａの構成を示す。細胞培養用モジュール２０１Ａでは、基板２２０、２３０と型枠２４０によって液密な（あるいは気密な）培養空間（培養領域）２０２が構成されている。培養空間２０２には、中空糸膜と繊維集合体とからなる足場材料２１０が配設されている。足場材料２１０はポッティング樹脂で型枠２４０に固定されており、基板２２０、２３０はこれらを挟み込んで培養空間２０２を形成している。
【００９５】
基板２２０、２３０は、足場材料２１０及び型枠２４０を挟んでしっかりと固定するのに適した強度を有するものであればよく、例えば、アクリル板とされる。細胞培養用モジュール２０１Ａにおいて、基板２２０、２３０はそれぞれ一枚のアクリル板等から構成されるものであっても、それぞれ２枚以上のアクリル板等から構成されるものであってもよい。また、細胞培養用モジュール２０１Ａにおいて複数の培養空間２０２が設けられる場合には、これらを形成する基板２２０、２３０もそれぞれ２以上存在し得る。
【００９６】
型枠２４０の材料は、ポッティング樹脂との接着性が充分に得られるものであればよく、例えば、シリコンゴムとされる。また、ポッティング樹脂は、充分な接着性を有するものであればよく、例えば、エポキシ樹脂、ウレタン樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、シリコン樹脂等の各種の熱硬化性樹脂や熱可塑性樹脂等が用いられる。
【００９７】
（２）通流口
基板２２０にはねじ穴２２１が穿設されている。ねじ穴２２１は、基板層２２０を貫通し、細胞培養用モジュール２０１Ａの外部と内部の培養空間２０２とを連絡している。ねじ穴２２１の一部にはねじが切られており、ポート（接続部材）２２２がねじ込まれて取り付けられている。
【００９８】
ねじ穴２２１及びポート２２２は、細胞懸濁液や培地、ガスなどの流体を、培養空間２０２の外部から内部へ又は内部から外部へ通流させるための通流口を構成している。ねじ穴２２１及びポート２２２、並びにこれらから構成された通流口は、基板２２０において足場材料２１０（具体的には後述する繊維集合体２１５）に対応する位置に配設されている。また、２つの通流口は、足場材料２１０（具体的には後述する繊維集合体２１５）の中心に対して対称（点対称）となる位置に配設されている。
【００９９】
ポート２２２の材質は、特に限定されないが、通常、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）、環状ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等とされる。ポート２２２には、医療分野で汎用される、いわゆるシリンジポートを好適に用いることができる。
【０１００】
基板２３０にはねじ穴２３１が穿設されており、ねじ穴２３１にはポート２３２が取り付けられている。ねじ穴２３１及びポート２３２の構成は、ねじ穴２２１及びポート２２２と同様である。
【０１０１】
ポート２２２及びポート２３２はメス型ルアーテーパを備え、その内壁が培養空間２０２の外部から内部へ向かう方向に徐々に縮径されている。これによって、ポート２２２及びポート２３２は、オス型ルアーテーパを有する、チューブやシリンジなどの送流手段と液密性良く接続される。メス型及びオス型ルアーテーパのテーパ角度や大きさ等の規格は、従来公知のものを適用できる。
【０１０２】
ねじ穴２２１、２３１及びポート２２２、２３２の大きさや形状も、特に限定されないが、例えば円形で、直径が５００μｍ〜５ｍｍ程度とされる。ポート２２２及びポート２３２のメス型ルアーテーパは、それらの内壁の少なくとも一部に、オス型ルアーテーパを有する送流手段を刺し込み可能に設けられていればよいものとする。なお、ねじ穴２２１、２３１は、細胞培養用モジュール２０１Ａの外部と培養空間２０２内とを連絡し、かつポート２２２、２３２の取り付けが可能であれば、きり穴であってもよいものとする。
【０１０３】
（３）ルアーテーパによる接続
図９に、シリンジを送液手段として用いる場合を例にとり、ポートとの接続態様を示す。図中符号２０５で示されるシリンジでは、プランジャ２５３をシリンジ本体２５２に押し込むことにより、シリンジ本体２５２の内部に保持された流体（ここでは、細胞懸濁液を例とする）を先端部２５１の開口から外部に排出できる。シリンジ２０５には、医療分野で汎用される使い捨ての注射筒を好適に用いることができる。
【０１０４】
シリンジ２０５の先端部２５１は、細胞培養用モジュール２０１Ａのポート２２２及び／又は、シリンジ本体２５２との接続部から開口に向かって縮径するオス型ルアーテーパを備えている。シリンジ２０５の先端部２５１のオス型ルアーテーパと、細胞培養用モジュール２０１Ａのポート２２２及び／又はポート２３２のメス型ルアーテーパとは、ほぼ同一の形状とされており、嵌合可能とされている。従って、シリンジ２０５と細胞培養用モジュール２０１Ａとは、先端部２５１をポート２２２及び／又はポート２３２に差し込むことによって簡単に液密に接続できる。これにより、細胞培養用モジュール２０１Ａでは、シリンジ２０５内の細胞懸濁液を、漏れを生じることなく、培養空間２０２内に導入することが可能とされる。
【０１０５】
さらに、ポート２２２及びポート２３２は、ルアープラグ（封止部材）によって簡単に封止することができる（図１０参照）。図１３Ａは、ポート２２２及びポート２３２に着脱可能に被せることが可能なルアープラグ２２３ａ、２３３ａを示している。また、図１０Ｂには、ポート２２２及びポート２３２のメス型ルアーテーパに嵌合可能なオス型ルアーテーパを備えたルアープラグ２２３ｂ、２３３ｂを示した。
【０１０６】
これらのルアープラグによれば、シリンジ２０５内の細胞懸濁液を培養空間２０２内に導入した後、シリンジ２０５を抜き取ったポート２２２及び／又はポート２３２を簡単に封止できる。なお、ルアープラグは未使用状態の細胞培養用モジュール２０１Ａのポート２２２及びポート２３２に取り付けておくことも可能である。また、使用中の細胞培養用モジュール２０１Ａにおいても、シリンジ２０５等の取り付けが不要の際には、ポート２２２及びポート２３２に取り付けておくことができる。
【０１０７】
図９では、ポート２２２及びポート２３２に接続される送流手段としてシリンジ２０５を例に説明したが、ルアーテーパによる同様の接続は、培地などの液体及び酸素などのガスを含む種々の流体を送流するためのチューブやポンプ、活栓などの種々の送流手段との間で行い得る。チューブやポンプを接続する場合には、ポート２２２又はポート２３２のメス型ルアーテーパに嵌合可能なオス型ルアーテーパを備えたルアーフィッティングを介して、ポート２２２又はポート２３２に接続する。また、活栓には、ポート２２２又はポート２３２のメス型ルアーテーパに嵌合可能なオス型ルアーテーパを備えたものを用いればよい。
【０１０８】
ルアーテーパによる送流手段との接続により、細胞培養用モジュール２０１Ａでは、硬化性樹脂などを用いて接続部を封止することなく、細胞懸濁液や培地、ガスなどの流体を簡便に導入（又は排出）することが可能となった。
【０１０９】
（４）足場材料
次に、図１１を参照して、足場材料２１０の構成を説明する。足場材料２１０は、中空糸膜２１１ａ、２１１ｂ（２１１）がメッシュ状に配置された中空糸膜メッシュ２１２と、繊維集合体２１５と、中空糸膜２１３ａ、２１３ｂ（２１３）がメッシュ状に配置された中空糸膜メッシュ２１４とが、この順に積層されている。
【０１１０】
（４−１）中空糸膜
中空糸膜メッシュ２１２を形成する中空糸膜１１１の膜基材ポリマー、外径、膜厚等については、第一実施形態で記載したとおりである。
【０１１１】
中空糸膜メッシュ２１２は、複数の中空糸膜を網目が形成するようにメッシュ状に配置したものである。中空糸膜メッシュ２１２の形態としては、例えば、複数の中空糸膜２１１ａ（中空糸膜２１１）を所定の間隔で平行に配置してシート状とし、それら中空糸膜２１１ａに対して直交する方向に沿って複数の中空糸膜２１１ｂ（中空糸膜２１１）を所定の間隔で平行に配置してシート状とすることにより、メッシュ状とした形態が挙げられる（図１１Ａ）。中空糸膜メッシュ２１２における中空糸膜２１１からなるシートの層数は特に制限されず、２〜１０層が好ましい。この例では、シートは２層（中空糸膜２１１ａからなる層と中空糸膜２１１ｂからなる層）である。
【０１１２】
中空糸膜メッシュ２１４及び中空糸膜２１３は、中空糸膜メッシュ２１２及び中空糸膜２１１と同じものを用いることができ、好ましい形態も同じである。
【０１１３】
中空糸膜メッシュ２１２、２１４の形態は、中空糸膜を介する栄養や気体の供給、代謝老廃物の除去に応じて選択すればよく、足場材料２１０をモジュール化する際のポート部の設計にも依存する。足場材料２１０では、中空糸膜メッシュ２１２の中空糸膜２１１ａと中空糸膜メッシュ２１４の中空糸膜２１３ａは同一種類の中空糸膜であることが好ましい。同様に、中空糸膜メッシュ２１２の中空糸膜２１１ｂと中空糸膜メッシュ２１４の中空糸膜２１３ｂは同一種類の中空糸膜であることが好ましい。このような形態とすることで、足場材料２１０をモジュール化する際に、例えば中空糸膜２１１ａ及び中空糸膜２１３ａを集結させて一つのポート部に繋いでガス供給用中空糸膜とし、中空糸膜２１１ｂ及び中空糸膜２１３ｂを集結させて他のポート部につないで培地供給用中空糸膜として用いることができる。
【０１１４】
（４−２）繊維集合体
繊維集合体２１５には、ナノファイバーの集合体が好適に用いられる。ナノファイバーの集合体の材質、分子量、直径、厚みについては、後述する。
【０１１５】
足場材料２１０は、以上説明した中空糸膜メッシュ２１２と中空糸膜メッシュ２１４との間に、繊維集合体２１５が配置された積層体を有する。このように、ナノファイバー層を中空糸膜メッシュ間に配置することにより、ナノファイバーを中空糸膜メッシュに強固に固定することができ、培養細胞への栄養やガスの供給や、細胞培養からの代謝老廃物の除去をより安定して行うことができる。
【０１１６】
細胞培養用モジュール２０１Ａでは、上述のポート２２２,２３２に、例えばチューブ等を接続することにより、栄養やガスの供給や、代謝老廃物の除去の行う経路として、中空糸膜メッシュ２１２、２１４の中空糸膜２１１、２１３以外の第３の経路を設けることができる。そのため、中空糸膜のみを用いて栄養やガスを供給したり、代謝老廃物を除去したりする場合に比べて、より多くの条件でかつそれらの条件を独立に制御しながらの細胞培養を、より簡便に行うことができる。
【０１１７】
（５）変形例
本実施形態では、基板２２０に通流口（ねじ穴２２１及びポート２２２）を一つ、基板２３０に通流口（ねじ穴２３１及びポート２３２）を一つ配設する例を説明した。本発明に係る細胞培養用モジュールにおいて、通流口は、１つであってもよく、この場合には基板２２０及び基板２３０のいずれに配設されてもよい。また、本発明に係る細胞培養用モジュールにおいて、通流口は３つ以上を配設してもよく、この場合には基板２２０及び基板２３０にそれぞれ１以上を配設すればよい。
【０１１８】
また、本実施形態では、ねじ穴２２１、２３１とポート２２２、２３２によって通流口を構成する例を説明した。本発明に係る細胞培養用モジュールにおいて、通流口は、メス型ルアーテーパを備え、対応するオス型ルアーテーパを備えた送流手段と液密な接続な可能な構成であればよい。通流口の他の形態としては、例えば、基板２２０、２３０に穿設される穴そのものを、メス型ルアーテーパを有したものとした形態が挙げられる。
【０１１９】
さらに、本発明に係る細胞培養用モジュールにおいて、足場材料２１０の中空糸膜メッシュと繊維集合体の積層数は特に限定されず、中空糸膜メッシュ、ナノファイバー層、中空糸膜メッシュ、ナノファイバー層、中空糸膜メッシュがこの順に積層された細胞培養足場材料であってもよく、これ以上の数が積層された細胞培養足場材料であってもよいものとする。
【０１２０】
７．第五実施形態に係る細胞培養用モジュールにおける細胞培養方法
上述の細胞培養用モジュール２０１Ａを用いた細胞培養方法について、図１２を参照しながら説明する。
【０１２１】
（１）細胞導入手順
［手順１］
まず、細胞培養用モジュール２０１Ａのポート２２２、２３２に細胞懸濁液の送液手段を接続する。図１２中では図示を省略するが、送液手段には図９で説明したシリンジ（シリンジ２０５）を用いるものとして説明する。ただし、送液手段は、チューブやポンプなどであってもよい。
【０１２２】
本手順では、シリンジを２つ用意する。一方のシリンジは、シリンジ本体にプランジャを押し込んだ状態とし、ポート２２２に接続する。もう一方のシリンジは、シリンジ本体に細胞懸濁液を充填した状態で、ポート２３２に接続する。
【０１２３】
ポート２２２、２３２とシリンジとの接続は、シリンジの先端部のオス型ルアーテーパを、ポート２２２、２３２のメス型ルアーテーパに差し込むことによって液密に行うことができる。
【０１２４】
［手順２］
次に、ポート２３２に接続した細胞懸濁液が充填されたシリンジのプランジャを押し込み、細胞懸濁液を培養空間２０２内へ導入する（図１２Ａ参照）。同時に、ポート２２２に接続したシリンジのプランジャを引いて、培養空間２０２内に導入された細胞懸濁液の少なくとも一部を培養空間２０２からシリンジ本体内へ回収する。
【０１２５】
これにより、培養空間２０２内には、ポート２３２側からポート２２２側へ細胞懸濁液の流れが形成される（図１２Ａ矢印参照）。ここで先に説明したように、ポート２２２、２３２は、基板２２０、２３０において足場材料２１０（具体的には繊維集合体２１５）に対応する位置に配設されている。このため、培養空間２０２内に導入された細胞は、上記流れに運搬されて、繊維集合体２１５上に分散する。
【０１２６】
さらに、細胞培養用モジュール２０１Ａでは、ポート２２２、２３２は、足場材料２１０（具体的には繊維集合体２１５）の中心に対して対称（点対称）となる位置に配設されている。このため、ポート１３２側からポート２２２側へ向かう細胞懸濁液の流れを、培養空間２０２内全体に効果的に発生させることができ、該流れによって細胞を繊維集合体２１５上に効率よく分散させることが可能である。
【０１２７】
［手順３］
ポート２３２に接続されたシリンジの細胞懸濁液が全てあるいは大部分なくなったら、今度は、ポート２２２に接続したシリンジのプランジャを押し込み、シリンジ本体内に回収されている細胞懸濁液を再度培養空間２０２内へ導入する（図１２Ｂ参照）。同時に、ポート２３２に接続されたシリンジのプランジャを引いて、培養空間２０２内に再導入された細胞懸濁液の少なくとも一部を培養空間２０２からシリンジ本体内へ回収する。
【０１２８】
これにより、培養空間２０２内には、ポート２２２側からポート２３２側へ細胞懸濁液の流れが形成され（図１２Ｂ矢印参照）、培養空間２０２内に導入されて繊維集合体２１５上に分散された細胞が、上記流れに運搬されることによって繊維集合体２１５上においてさらに均一に分散される。
【０１２９】
［手順４］
ポート２２２に接続されたシリンジの細胞懸濁液が全てあるいは大部分なくなったら、必要に応じて、手順２と手順３を所望の回数繰り返す。手順２及び手順３において、それぞれポート２３２側からポート２２２側への流れ及びその逆方向の流れを交互に発生させることで、繊維集合体２１５上に細胞を万遍なく分散させることができる。
【０１３０】
手順２と手順３の繰り返し回数は、細胞の種類や懸濁液中の量（濃度）、目的とする培養密度などの条件によって適宜設定され得る。ただし、手順４は必須ではなく、上記条件によっては、手順２、３のみ（手順４なし）でも、細胞を繊維集合体２１５上に十分に均一に分散させられる場合もある。
【０１３１】
［手順５］
最後に、ポート２２２に接続されたシリンジ及びポート２３２に接続されたシリンジの両方のプランジャを押し込んで、細胞懸濁液を全て培養空間２０２内へ導入する。この際、培養空間２０２の容積を超過した液は、中空糸膜２１１、２１３（図１１参照）を通って排出される。
【０１３２】
以上の手順１〜５により、細胞培養用モジュール２０１Ａ内に、具体的には繊維集合体２１５上に、細胞を偏在させることなく、均一性の高い濃度分布で細胞導入を行うことが可能となる。
【０１３３】
（２）培養手順
細胞の導入完了後、例えば中空糸膜２１１ａ及び中空糸膜２１３ａを集結させて一つのポート部に繋いでガス供給を行い、中空糸膜２１１ｂ及び中空糸膜２１３ｂを集結させて他のポート部につないで培地供給を行って細胞培養を行う。この際、細胞は細胞培養用モジュール２０１Ａ内に均一に導入されているため、細胞が偏在した場合に生じる、高密度部分での栄養・酸素の不足による増殖速度低下や細胞の変性・壊死などを防止できる。
【０１３４】
細胞培養は、具体的には、例えば中空糸膜２１１ａ、２１３ａとしてガス分離膜である中空糸膜、中空糸膜２１１ｂ、２１３ｂとして物質選択透過性を有する中空糸膜を用い、中空糸膜２１１ａ、２１３ａの片端より酸素を含むガスを供給しつつ、他方の端部より該ガスを排出させる。また、中空糸膜２１１ｂ、２１３ｂの片端より培養細胞の栄養を供給し、他方の端部より該培養細胞の老廃物や代謝物を排出させる。これにより、排出される成分をオンラインで分析し、培養細胞を培養しながら連続的に培養細胞の生育状況を評価することも可能である。
【０１３５】
また、培養細胞に、中空糸膜２１１ｂ、２１３ｂの片端より被験物質を投与し、老廃物や代謝物を含む溶液を中空糸膜２１１ｂ、２１３ｂの他方の端部より排出させ、この溶液を分析しモニタリングすることによって、被験物質を投与した場合の培養細胞が受けるストレスや培養細胞の状態を経時的に評価できる。
【０１３６】
（３）変形例
ここでは、基板２２０に通流口を一つ、基板２３０に通流口を一つ配設した細胞培養用モジュール２０１Ａを用いた細胞培養方法を説明した。本発明に係る細胞培養用モジュールにおいて、３つ以上の通流口を配設する場合には、いずれか２つの通流口を選択し、細胞懸濁液を一方の通流口から導入し、他方の通流口から排出することで、図１２で説明したような細胞懸濁液の流れを生じさせればよい。この場合、２つの通流口は、足場材料２１０の中心に対して対称（点対称）の位置にあるものを選択することが好ましい。あるいは、一又は２以上の通流口を一つの群として通流口を２つの群に分け、一方の通流口群Ａから細胞懸濁液を導入し、他方の通流口群Ｂから排出を行って、図１２で説明したような細胞懸濁液の流れを生じさせてもよい。この場合においても、通流口群Ａと通流口群Ｂは、足場材料２１０（具体的には繊維集合体２１５）の中心に対して対称（点対称）となるようにされることが好ましい。
【０１３７】
８．第六実施形態に係る細胞培養用モジュール
（１）概略構成
図１３に、本発明の第六実施形態に係る細胞培養用モジュール２０１Ｂの構成を示す。細胞培養用モジュール２０１Ｂは、ねじ穴２２１及びポート２２２、並びにこれらから構成された通流口が基板２３０に配設されている点で、第五実施形態に係る細胞培養用モジュール２０１Ａと異なっている。すなわち、細胞培養用モジュール２０１Ａでは、２つの通流口が異なる基板２２０、２２０に設けられているのに対して（図８参照）、細胞培養用モジュール２０１Ｂでは、２つの通流口が同一の基板２３０に設けられている。細胞培養用モジュール２０１Ｂにおいても、２つの通流口は、足場材料２１０（具体的には後述する繊維集合体２１５）の中心に対して対称（ただし本実施形態では線対称）となる位置に配設されている。
【０１３８】
上記の通流口の構成以外の細胞培養用モジュール２０１Ｂの構成は、細胞培養用モジュール２０１Ａと同じである。
【０１３９】
（２）変形例
本実施形態では、基板２３０に通流口を２つ（ねじ穴２２１及びポート２２２、ねじ穴２３１及びポート２３２）配設している。本発明に係る細胞培養用モジュールにおいて、通流口は３つ以上を配設してもよく、この場合、通流口は基板２２０及び基板２３０のいずれに配設されてもよい。
【０１４０】
９．第六実施形態に係る細胞培養用モジュールにおける細胞培養方法
（１）細胞導入手順
細胞培養用モジュール２０１Ｂを用いた細胞培養方法の細胞導入手順を図１２に示す。細胞培養用モジュール２０１Ｂにおいても、上述の手順１〜５に従ってポート２３２側からポート２２２側への流れ及びその逆方向の流れを交互に発生させることで、繊維集合体２１５上に細胞を万遍なく分散させ、均一性の高い濃度分布で導入できる。そして、これにより、細胞の増殖速度低下や変性・壊死を引き起こすことなく、培養を行うことが可能である。
【０１４１】
（２）変形例
本発明に係る細胞培養用モジュールにおいて、３つ以上の通流口を配設する場合には、いずれか２つの通流口を選択し、細胞懸濁液を一方の通流口から導入し、他方の通流口から排出することで、図１２で説明したような細胞懸濁液の流れを生じさせればよい。あるいは、一又は２以上の通流口を一つの群として通流口を２つの群に分け、一方の通流口群Ａから細胞懸濁液を導入し、他方の通流口群Ｂから排出を行って、図１２で説明したような細胞懸濁液の流れを生じさせてもよい。この点は、第五実施形態に係る細胞培養用モジュールにおける細胞培養方法の項でも説明した通りである。
【０１４２】
１０．第七実施形態に係る細胞培養用モジュール
本発明は、中空糸膜と、平均直径２５０ｎｍ〜９５０ｎｍのナノファイバーからなる繊維集合体とが、配置された培養場を備える細胞培養用モジュールを提供する。ナノファイバーの平均直径は約３００ｎｍ又は約６００ｎｍが好ましく、約６００ｎｍがより好ましい。
【０１４３】
中空糸膜は好ましくはメッシュ状に配置され、ナノファイバーの集合体からなるナノファイバー層が、これと接する状態で中空糸膜外表面上及び／又は前記中空糸膜間に２枚のカバー（平板）に挟まれて、液密に配置される。前記カバーのナノファイバー層に対応する位置には、培養細胞を注入する細胞注入口と、該細胞注入口以外の開口とが形成される。開口は、チューブの接続による栄養や空気の供給もしくは代謝老廃物の除去、又は顕微鏡の接続による培養状態の観察等に使用される。細胞注入口と開口は、必要に応じて顕微鏡、チューブ等の接続、注射針の刺し込み等が可能なシートによって密封される。
【０１４４】
本発明の細胞培養用モジュールでは、栄養やガスの供給や、代謝老廃物の除去の行う経路として、開口部にチューブ等を接続することができる。これにより、より多くの条件でかつそれらの条件を独立に制御しながらの細胞培養を、より簡便に行うことができる。
【０１４５】
モジュールには、中空糸膜メッシュの中空糸膜の両端を集結させたものの開口部をポート部に繋げ、中空糸膜から排出された老廃物や代謝物等を外部機器に導入することで、オンラインでの分析が可能になる。
【０１４６】
また、モジュール中で培養した培養細胞に、中空糸膜の片端より被験物質を投与し、老廃物や代謝物を含む溶液を中空糸膜の他方の端部より排出させ、この溶液を分析しモニタリングすることによって、被験物質を投与した場合の培養細胞が受けるストレスや培養細胞の状態を経時的に評価することができる。この場合、被験物質の投与、及び老廃物や代謝物を含む溶液の排出を、開口部に接続したチューブ等によって行ってもよい。
【０１４７】
以上説明した本発明の細胞培養用モジュールは、２枚のカバーの間に細胞培養足場材料を配置し、液密に封入することで、培養領域を一定の領域に分画しているため、培養条件の制御が容易である。また、細胞培養足場材料を容器中の培養液に浸漬させるような形態のモジュールに比べ、モジュールをコンパクト化することができるため、複数のモジュールを並べて多検体、多条件の同時培養を行う場合でも培養スペースをより小さくすることができる。
【０１４８】
本発明の細胞培養用モジュールのカバーは、細胞注入口と該細胞注入口以外の開口を有し、それら細胞注入口と開口がシートで塞がれた形態である。そのため、カバーの開口にチューブ等を接続することにより、中空糸膜メッシュの中空糸膜以外の新たな経路を設けることができる。これにより培養細胞への経路が増えるため、より簡便な手法で、栄養やガスの供給や、代謝老廃物の除去の条件を多くでき、かつそれらの条件を独立に制御した細胞培養を行うことができる。また、培養細胞を注入する細胞注入口を独立して設けているため、モジュールの製造後に前記開口にチューブや顕微鏡等が接続された状態でも、モジュール内の細胞培養足場材料に容易に培養細胞を注入して接着できる。
【０１４９】
また、細胞培養ディッシュやプレートを用いた通常の培養では、細胞培養ディッシュやプレート上での平面的な細胞培養しか行えないのに対し、本発明の細胞培養用モジュールは、ナノファイバー層を有する細胞培養足場材料を備えているため、培養細胞が該ナノファイバー層の内部にまで入り込んで三次元的に付着増殖できる。そのため、培養された細胞形態が生体内の形態に近く、医薬品、化学物質、化粧品等の物質の薬効試験、毒性試験、安全性試験等において、より評価の信頼性の高い培養細胞が得られる。
【０１５０】
本発明の第七実施形態に係る細胞培養用モジュールの好ましい構成は、例えば、特開２００９−１００号公報、特開２０１０−１４８４９６号公報、特開２０１０−１４８４９７号公報、特開２０１１−２３９７５６号公報に記載されている。
【０１５１】
１１．細胞培養用装置
本発明は、本発明の細胞培養用モジュールを含む（環流）細胞培養用装置も提供する。本発明の細胞培養用装置は、細胞培養用モジュールと、酸素供給手段と、培地供給手段とを含む。また、必要に応じて、モニター手段、分析手段、サンプリング手段等を含んでいてもよい。本発明の細胞培養用装置の一例を図１６に示す（以下、括弧内の数字は図１６の番号に対応する）。
【０１５２】
（１）酸素供給手段
酸素供給手段は、前記中空糸膜を通じて細胞に酸素を供給するための手段であって、例えば、酸素を送りだすエアポンプ３０２、モジュール３０１への酸素供給回路を構成するチューブ３０３、必要以上の細かいゴミ（例えば、径0.22μm）が中空糸膜中に入り込まないようにするためのフィルター３０４、保湿用水の貯留槽３０５の等を含むことができる。
【０１５３】
（２）培地供給手段
培地供給手段は、例えば、供給する培地の貯液槽（培地ビン３０６）、培地を中空糸膜を通じて細胞に供給し、代謝老廃物を除去しつつ循環させるための培地供給（循環）用ポンプ３０７、培地供給（循環）回路としてのチューブ３０８を含む。
【０１５４】
（３）サンプリング手段
サンプリング手段は、細胞培養用モジュール３０１から適宜培地を採取するための手段で、細胞培養用モジュール３０１に接続したサンプリングポート３０９、採取した培地の貯液槽等３１０を含む。
【０１５５】
（４）その他
本発明の細胞培養用モジュールは、上記の手段のほか、サンプリングした培地や循環する培地の成分、被験物質、代謝産物の濃度等を経時的にモニターする手段（モニター手段）や、分析する手段（分析手段）を含んでいてもよい。
【０１５６】
本発明の細胞培養モジュールは、細胞を、脱分化等を防いで、その機能を維持した状態で長期間培養することができる。
【０１５７】
本発明の細胞培養モジュールに用いられる細胞は特に限定されないが、接着性の動物細胞、例えばヒト胎児包皮線維芽細胞、チャイニーズハムスター肺線維芽細胞、ニワトリ胎児線維芽細胞、シリアンハムスター新生児腎臓細胞などの線維芽細胞、ヒト子宮頸部癌細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、マウス乳癌細胞、アフリカミドリザル腎細胞などの上皮細胞、血管内皮細胞などが挙げられる。特に、細胞の機能を維持したまま培養することが困難な細胞、例えば肝実質細胞、冠状動脈内皮細胞、ゴールデンハムターランゲルハンス島細胞郡、ラット胸腺上皮細胞、ラット腎上皮細胞などの初代細胞の培養に好適である。
【０１５８】
本発明の細胞培養モジュールはまた、凍結細胞にも適用可能である。凍結細胞は一般に増殖速度の立ち上がりが遅く、機能を長期維持することが難しい。特に、肝細胞では数日で機能が大幅に低下してしまうことが知られている。本発明の細胞培養方法によれば、高い機能を維持したまま長期間培養することが可能である。
【０１５９】
培養に用いられる培地は、培養細胞の種類に応じて決定され、当該細胞の培地として通常用いられるものであればよい。本発明の培養方法は、無血清培養にも用いることができる。
【実施例】
【０１６０】
以下、実施例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。【０１６１】
［実施例１］ナノファイバー層からなる細胞培養足場材料を用いた細胞培養
１．不織布の作成及び分析
１．１  ナノファイバー層の作成
80℃恒温水槽にて加熱したジメチルアセトアミド（和光純薬工業）に重量比10%〜15%ポリアクリロニトリル粉体を添加し、良く攪拌して完全に溶解させて、室温に放置して安定なポリアクリロニトリルのドープを作製した。さらに、ドープをディスポシリンジ(テルモ20ml、SS-20ESz)に充填し、ノズル(18G×11/2)を装着し、エレトクロスピニング装置(カテック社)に設置した。【０１６２】
装置には、ターゲット(ロール)には銀紙を一周はりつけておく。電圧は12kVにて、シリンジのプランジャー押し出し速度0.03mm/min、ターゲット(ロール)との距離200mm、ターゲット回転速度1m/min、シリンジの左右反復移動(トラバース)速度 10cm/minで、紡糸時間120minで紡糸し、ナノファイバー層（不織布）を作製した。最後に銀紙毎不織布を剥がし、実験使用時には、銀紙からピンセットにて必要なシートで採取し、後述する細胞培養実験に使用した。【０１６３】
１．２  不織布の分析（ナノファイバーの単繊維の平均直径の分析）
不織布を、日本電子（株）製の走査型電子顕微鏡ＪＳＭ−６０６０Ａを用いて観察した。ナノファイバーの単繊維の直径は、得られたＳＥＭ写真を画像解析ソフト（（株）プラネトロン製、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ｖｅｒ．４．５．０．２４）を用いて画像解析することによって求めた。ＳＥＭ写真のスケールに対して、画像解析のスケールが合うように調整した後、ＳＥＭ写真中の任意の２０本のナノファイバーの表面の幅を求め、その平均値をナノファイバーの単繊維の直径（糸径）とした。以下、各糸径のナノファイバーにより作製された不織布を表１に示す番号（Ｎｏ．１〜６）を用いて記載する。【０１６４】
【表１】
2014034146.tif 000002
【０１６５】
２．細胞培養実験
２．１  材料及び使用機器
［使用機器］
（１）細胞培養モジュール
細胞培養モジュールは、既報にしたがって作製した（特開２０１１−２３９７５６号公報）。モジュール内部には酸素供給用中空糸膜、及び培地の栄養供給用中空糸膜が配列され、中空糸膜の間に細胞付着用ナノファイバー不織布シートが仕込まれて密封されている。不織布に付着した細胞は、三次元培養の状態で培地ビン中の多量の培地とエアポンプから常に豊富な栄養と酸素が供給を受け増殖することができる。【０１６６】
（２）細胞培養装置
以下の構成からなる環流細胞培養装置（図１６）を用いた。
・培地循環用チューブポンプ（ペリスタポンプ）１台  流量8mL/hr、60mL/hr
・エア供給用ポンプ１台  流量1.2L/hr、3L/hr（ポンプは、フィルター（ADVANTEC社  孔径0.2μm）により、吸引ガスを0.2μm以上のものが中空糸膜中に入り込まないようになっている。）
・瓶３本（培地ビン、エア廃棄用空ビン、吸気エアの保湿用水ビン）
・エア用ライン、培地循環用ライン（いずれもシリコンチューブ）
・サンプリングポート（培地を採取するためのポート）
・チューブのジョイント（樹脂製）
・装置を載せるプレート【０１６７】
（３）その他
・ＣＯ2インキュベーター：ダイレクトインキュベーター（サーモ社）
・エアポンプ：CHIKARA  Nα1500（NISSO社）
・培地ポンプ：低流量対応  SJ-1211L型（TOTO社）
・SEM：キーエンス社製【０１６８】
［細胞］
・Ｈｃ細胞：正常ヒト胎児肝細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社より購入）
・ヒト凍結肝細胞：フランスBIOPREDIC International社販売の成人肝細胞（Human Cryopreserved Hepatocytes, Bach:HEP187082を、国内のケー・エー・シー（株）より購入）【０１６９】
［培地］
・Ｈｃ細胞用培地：GIBCO社 D-MEM/F-12・11330032  500mlにFetal  Bovine  Serum、Hyclone・10437028/必要培地量の10パーセントを添加し、さらに、ナカライテスク社製・炭酸水素ナトリウム、及び注射用ペニシリンGカリウム(明治製菓社製)及び硫酸ストレプトマイシン(明治製菓社)、Human-acidic  FGF（コスモバイオ社）が添加したものを用いた。
・凍結保存用培地：正常細胞用凍結保存液・R-055-50(クラボウ社)
・成人肝細胞用培地：静置培養用培地(Incubation medium)(BIOPREDIC社)
長期維持培養用培地(Long-Term culture medium)(BIOPREDIC社)
細胞融解用培地(Thawing medium)(BIOPREDIC社)
細胞播種用培地(Seeding medium)(BIOPREDIC社)【０１７０】
［試薬・器具］
・PBSバッファー(Invitrogen)
・トリパンブルー：Trypan Blue solution・T8154(20mL)(SIGMA)
・トリプシン：Trypsin-EDTA（Cat：27250-018, Lot：1219490)(GIBCO BRL)
・ｎ−酪酸ナトリウム(生化学実験用)(SIGMA)
・ジクマロール(和光純薬社）
・βグルクロニダーゼ／アリールスルファターゼ(ROCHE)
・ベンジルオキシレゾルフィン(Molecular Probes)
・レゾルフィン(Molecular Probes)
・リファンピシン  生化学実験用(和光純薬工業)
・グルコース測定キット：グルコースCII-テストワコー・439-90901(WAKO社)
・血球計算盤(含カバーグラス)：ビルケルチュルク血球計算盤・A112(富士理科工業株式会社)【０１７１】
２．２  細胞培養
（１）Ｈｃ細胞由来肝芽細胞の静置培養による機能評価
１．１の方法にしたがい、様々な糸径（平均直径）を有するナノファイバー不織布を調製した。各不織布に解凍した細胞を播種し、以下の方法で細胞の機能発現を分析した。【０１７２】
シャーレ(直径35mm)は足場のための不織布を底面に敷き、直径2mmシリコンチューブで底面に固定した。次に、予め37℃に温めておいた培地を15mL遠沈管に9mL分注しておき、フリーザーから細胞入りチューブを取り出し、恒温水槽で温めた。0.5分程度温めてから取り出し、ピペットで穏やかに攪拌して完全に解凍した。さらに、スウィング遠心機(1000G)で遠沈後、上澄みを除去し、ピペットで沈殿した細胞を培地に懸濁させた。トリパンブルーで染色し、位相差顕微鏡下、血球計算盤により細胞数をカウントし、懸濁培地中の細胞密度を推算した。【０１７３】
細胞を培養に適した密度(104cells〜105cells/2mL)に培地で希釈し、不織布を底面に固定したシャーレに2mLの培地懸濁液を添加して播種した。蓋をして、シャーレの底面の不織布上を培地が揺らぐようにやさしく前後・左右に数回ずつゆすり、細胞が均一に分散するようにした。そして、CO2インキュベーターに静置し培養を開始した。5時間〜12時間後に培地を交換して、底面に接着しなかった細胞を培地毎除去し、CO2インキュベーターにて静置した。【０１７４】
培地を2日〜3日で交換し、培養7日目に、酪酸ナトリウムを1mM 添加した培地に交換し、さらに、8日目には、酪産ナトリウム1mMとチトクロム３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）酵素の誘導剤であるリファンプシン10μMを添加した培地に交換し14日目に、基質のベンジルオキシリゾルフィンを添加して37℃30分反応させ、反応液をβ−グルクロニダーゼとアリールスルファターゼ酢酸緩衝液で処理し、沈殿物を取り除き、エタノール中に溶解した生成物のレゾルフィンを蛍光測定(励起550nm蛍光600nm)で定量した数値を酵素活性として、培養した細胞の機能を計測した。濃度の算出には、レゾルフィンを溶解させたエタノールにて作成した検量線を用いた。【０１７５】
（２）ヒト凍結肝細胞の静置培養による機能評価
細胞融解の方法としては、アンプルの融解まではＨｃの時と同様、ＤＭＳＯを薄めるために、細胞融解用培地を使用(30ml)し、160×gで1分間遠心し、細胞融解用培地のみを除いた。そして、播種用培地(1ml)で細胞を懸濁し、シャーレに播種して使用した。【０１７６】
（１）と同様に、35mmシャーレにＮｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６の不織布（対照：シャーレのみ）を敷き詰め、融解用培地にて、解凍した成人肝細胞を播種用培地に交換した後、105cells/シャーレで播種して培養した。このとき、静置培養用培地を2mL加え、播種直後の24hrで培地をリファンピシン10μM入りの培地と交換をして固着せず浮遊している細胞を取り除き、播種後毎日リファンピシン10μM入りの培地と交換した。細胞の機能は、上述のＣＹＰ３Ａ４酵素の活性分析により比較した。【０１７７】
（３）Ｈｃ細胞の静置培養による増殖速度評価
解凍した細胞を１．１にしたがって作製した不織布に播種し、細胞の増殖速度を分析した。
表１に記載した不織布Ｎｏ.１〜Ｎｏ．６をそれぞれ底面に固定したシャーレにＨｃ細胞(105cells)を播種し、不織布を35mm径シャーレの底面に敷き詰め、Ｈｃ細胞を105cells/シャーレ播種した。このとき、Ｈｃ細胞用培地を2mL加え、播種直後の5hrで培地交換をして固着せず浮遊している細胞を取り除き、培養3日、5日、7日以降毎日培地を交換した。細胞数は添加培地中のグルコースが経過日数辺りに減少した濃度を分析比較した。【０１７８】
（４）Ｈｃ細胞由来肝芽細胞の還流培養による機能評価
還流培養にてＨｃ細胞を増殖培養して、誘導・成熟化により、肝実質細胞にして長期維持培養を行い、細胞の機能を測定した。【０１７９】
１）細胞準備
Ｈｃ細胞(胎児ヒト肝細胞)を解凍し、シャーレに播種し、シャーレにて細胞に増殖能があることを確認した。【０１８０】
２）培養の準備
ジョイントが接続されたライン及び、ビン、フィルターを銀紙で包装し、そのままオートクレーブ滅菌処理した。クリーンベンチ中で、包装をはずし、開発した細胞培養モジールと接続して環流培養装置を組み立てた（図１６）。【０１８１】
エタノール水を培地用のラインで循環運転してモジュール内を殺菌し、エタノール水を廃棄し、水で培地用のラインで循環運転して、エタノール水を完全に除去した。水を廃棄し、培地で培地用のラインで循環運転し、安定稼動を確認した。【０１８２】
３）環流細胞培養
ＣＯ2インキュベーター中に装置を設置し、培地で循環運転し、装置の安定稼動を確認した。培地ビンの培地量は40mLで開始した。【０１８３】
ディスポシリンジ1mLにて、26針をシリコンゴムシート刺し、モジュール内部に、所定の細胞が分散した培地を注入した。モジュール中にはナノファイバー不織布に細胞を付着させて三次元培養にて細胞を増殖させた。その後、ＣＯ2インキュベーターで還流培養を開始した。【０１８４】
サンプリングポートから培地をサンプリングして、グルコース濃度を分析し、グルコースの消費速度から、モジュール中の細胞数を推算して、継日変化をトレースした。また、細胞増殖の阻害因子であるアンモニアの増加も同様にトレースし、2mMを超えないところで培地を交換した。一回目の培地交換は最初9日間までに、50mg/dL以上のグルコースの消費が見られないときは、グルコース濃度と関係なく培地を交換した。培地のグルコース濃度が250mg/dL下回ったとき、及び、1日で50mg/dL以上のグルコースの消費速度のときに培地を新鮮な培地に交換した。細胞が増殖して、グルコース消費速度が向上したときは、培地交換の頻度に合わせ、必要に応じて培地ビン中の培地量を増加させた。【０１８５】
細胞密度1×108 cells/mL達成した段階で酪酸ナトリウム添加し、Ｈｃ細胞を肝芽細胞に誘導し、肝実質細胞に成熟させた。【０１８６】
細胞の機能は、細胞にチトクロム３Ａ４酵素を誘導し、与えた基質と反応速度との関係から定量的に評価した。具体的には、培地中に酪酸ナトリウムに加えて、さらに誘導剤のリファンプシンを添加して細胞中にチトクロム３Ａ４酵素を誘導し、基質のベンジルオキシリゾルフィンを添加して37℃30分反応させた。反応液をβ-グルクロニダーゼとアリールスルファターゼ酢酸緩衝液で処理し、沈殿物を除去した後、エタノール（特級、和光純薬工業）中に溶解した生成物のレゾルフィンを蛍光測定（励起550nm蛍光600nm）で定量した。この数値を酵素活性と定義して、培養した細胞の機能を計測した。濃度の算出には、レゾルフィンを溶解させたエタノールにて作成した検量線を用いた。【０１８７】
培地中に酪酸ナトリウムをさらに添加し、肝芽細胞を維持培養し、上述した方法で細胞の機能を分析した。【０１８８】
３．結果
（１）Ｈｃ細胞由来肝芽細胞の静置培養による機能評価
不織布Ｎｏ．１〜Ｎｏ．６を足場としてＨｃ細胞を培養したときの細胞におけるチトクロム３Ａ４酵素活性を図１７（上）に示す。また、Ｈｃ細胞から誘導した肝芽細胞を機能不織布Ｎｏ．１〜Ｎｏ．６を足場として維持培養したときのチトクロム３Ａ４酵素活性を図４（下）に示す。【０１８９】
不織布Ｎｏ．２とＮｏ．４を用いて培養した場合に、肝芽細胞は高い機能を発現していた（図１７）。一方、Ｎｏ．５の場合には肝芽細胞の機能は低かった（図１７下）。なお、細胞密度（到達密度）はＨｃ細胞から肝芽細胞への成熟化前後で差異はなかった。【０１９０】
また、図１８に各不織布における細胞増殖状態を位走査顕微鏡で観察した結果を示す。
Ｎｏ．１（平均直径  約170nm）では、不織布一面を細胞が覆い尽くして表面で多層化し、細胞形状も崩れていた。この結果は、細胞密度が高すぎると細胞機能（チトクロム３Ａ４酵素活性）が低くなる可能性を示唆する。【０１９１】
Ｎｏ．２（平均直径  約300nm）では、不織布のほぐれた層断面において、不織布内部で細胞が球状に成長し、微絨毛(小さい玉)の高い発達がみられた。これらは細胞の高い機能を示唆する。【０１９２】
Ｎｏ．３（平均直径  約500nm）では、空隙が大きく、細胞はファイバーに沿って増殖しており、微絨毛が見られなかった。【０１９３】
Ｎｏ．４（平均直径  約600nm）では、細胞は不織布の表面に増殖しており、細胞数個の集塊が確認された。不織布内部には細胞はあまり多くないが、不織内部の細胞はファイバーに囲まれ、微絨毛が発達していた。これらは細胞の高い機能を示唆する。【０１９４】
Ｎｏ．５（平均直径  約1000nm）では、細胞は空隙の大きい所で増殖しており、ファイバーが密な所では増殖していなかった。少し潜り込んでいるのは、不織布表面の毛羽立ちの下の不織布の上に増殖していたためと考えられる。なお、細胞には微絨毛が見られなかった。これらは細胞の低い機能を示唆する。【０１９５】
Ｎｏ．６（平均直径  約1300nm）では、細胞は不織布の内部多層でファイバーに絡んで高密度に増殖していた。細胞に微絨毛は見られなかった。この結果は、細胞密度が高すぎると細胞機能（チトクロム３Ａ４酵素活性）が低くなる可能性を示唆する。【０１９６】
（２）ヒト凍結肝細胞の静置培養による機能評価
Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．６の不織布（対照：シャーレのみ）を用いて培養したときの細胞におけるチトクロム３Ａ４酵素活性を図１９に示す。
ヒト凍結肝細胞を用いた場合にも、Ｈｃ細胞由来肝芽細胞と同様に、不織布Ｎｏ．２とＮｏ．４で細胞は高い機能を発現し、を有する不織布Ｎｏ．６やシャーレの場合には低い機能しか発現しなかった（図１９）。【０１９７】
（３）Ｈｃ細胞の静置培養による増殖速度評価
Ｎｏ．２〜Ｎｏ．６の不織布を用いて培養したときの細胞密度の経日変化を図２０に示す。Ｎｏ．２〜Ｎｏ．５の不織布に比較して、Ｎｏ．６の不織布では良好な増殖速度がみられ、このことから、糸径がφ1000nm以下の不織布では増殖速度は抑制されることが確認された。また、還流培養でもＮｏ．６の不織布のみ増殖速度が上がることが確認された（結果は示していない）。【０１９８】
（４）Ｈｃ細胞由来肝芽細胞の還流培養による機能維持
Ｎｏ．２の不織布を足場とする細胞培養用モジュールにより、図１６に示す装置を用いて環流培養を行ったときの、細胞密度の経日変化を図２１に示す。本発明の細胞培養用モジュールを用いることで、環流培養によりＨｃ細胞を細胞密度2.5×108cells/mLの高密度まで増殖させることが確認できた。【０１９９】
（５）ヒト凍結肝細胞の還流培養による機能維持
成人肝細胞は静置培養と同様に解凍し、播種用ポートからモジュール中に播種して、還流細胞培養を行った。長期維持用培地を用いて、培地交換頻度は、培養3日目までは培地量80mlで毎日培地交換、培養4日目からは100mLで毎日培地交換を行った。【０２００】
ヒト凍結肝細胞を4.8×106cells/moduleで播種して、Ｎｏ．２の不織布を足場とする細胞培養用モジュールにより、図１６に示す装置を用いて環流培養を行ったときの、細胞密度の経日変化を図２２に示す。本発明の細胞培養用モジュールを用いることで、環流培養によりを播種した細胞密度で33日間の長期維持培養できることが確認できた。【０２０１】
さらに、長期培養中に、ラインの溶存酸素濃度を分析したところ、図２３に示すように初期の溶存酸素濃度6.6ppmが細胞の消費されることにより5.8ppmで安定維持できたまま、細胞を維持できていることが確認できた。【０２０２】
４．考察  本発明の細胞培養足場材料（ナノファイバー不織布）により、Ｈｃ細胞から高機能の肝実質細胞を得ることができた。 また、用いる不織布の糸径（平均直径）が250-950nmの場合、高い機能発現を実現させることができた。【０２０３】
本発明の細胞培養用モジュールを用いた装置により環流培養を行うことで、Ｈｃ細胞を高い機能（ＣＹＰ３Ａ４酵素活性）を示す肝芽細胞に分化誘導させ、これを長期間培養・維持できた。また、ヒト凍結肝細胞についても、本発明の細胞培養用モジュールを用いた装置により環流培養を行うことで、高い機能を維持したまま長期間培養・維持できた。
【産業上の利用可能性】
【０２０４】
本発明によれば、細胞を本来の機能を維持したまま効率よく長期間培養することができる。よって、本発明は、医薬品、化学物質、化粧品等の物質の薬効、毒性、安全性評価のための、動物実験に代替する細胞培養評価系の構築に有用である。【０２０５】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【符号の説明】
【０２０６】
１０１Ａ、１０１Ｂ、１０１Ｃ、１０１Ｄ：細胞培養用モジュール、１１０：培養場、１１１、１１１ａ、１１１ｂ、１１３、１１３ａ、１１３ｂ：中空糸膜、１１２、１１４：中空糸膜メッシュ、１１５：足場材料、１０２：内部空間、１２０、１３０：基板、１３１：開口、１３２：ネジ溝、１３３：係合穴、１４０：型枠、１５０：蓋体（キャップ）、１５１：ネジ山、１５２：封止部材、１５３：通流口、１５４：ポート、１５５：係合ツメ、１６１：ネジ、１６２：ネジ穴、１６３：留め具、１６４：凹部
２０１Ａ、２０１Ｂ：細胞培養用モジュール、２１０：足場材料、２１１、２１１ａ、２１１ｂ、２１３、２１３ａ、２１３ｂ：中空糸膜、２１２、２１４：中空糸膜メッシュ、２１５：繊維集合体、２０２：培養空間（培養領域）、２２０、２３０：基板、２２１、２３１：ねじ穴、２２２、２３２：ポート、２２３ａ、２２３ｂ、２３３ａ、２３３ｂ：ルアープラグ、２４０：型枠、２５０：シリンジ、２５１：先端部、２５２：シリンジ本体、２５３：プランジャ
３０１：細胞培養用モジュール、３０２：エアポンプ、３０３：酸素供給回路を構成するチューブ、３０４：フィルター、３０５：保湿用水の貯留槽、３０６：培地の貯液槽、３０７：培地供給（循環）用ポンプ、３０８：培地供給（循環）回路としてのチューブ、３０９：サンプリングポート、３１０：採取した培地の貯液槽等
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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