(57)【要約】  本発明によれば、重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、７であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）から（３４）から選択される、ヒトＴｆＲと特異的に反応する抗体：
（１）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、７であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（２）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、８であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（３）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、９であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（４）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、１０であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（５）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、１１であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（６）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、１２であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（７）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、１３であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（８）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、１４であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（９）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、１５であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１０）重鎖が配列番号１６を有し、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１１）重鎖が配列番号１７を有し、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１２）重鎖が配列番号１８を有し、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１３）重鎖が配列番号１９を有し、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１４）重鎖が配列番号２０を有し、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１５）重鎖が配列番号２１を有し、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１６）重鎖が配列番号２２を有し、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１７）重鎖が配列番号２３を有し、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１８）重鎖が配列番号２４を有し、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１９）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号２５である抗体：
（２０）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号２６である抗体：
（２１）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号２８である抗体：
（２２）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号２９である抗体：
（２３）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号３１である抗体：
（２４）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号３２である抗体：
（２５）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号３４である抗体：
（２６）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号３６である抗体：
（２７）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号３７である抗体：
（２８）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号３８である抗体：
（２９）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号４０である抗体：
（３０）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号４１である抗体：
（３１）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号４２である抗体：
（３２）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、５２、３であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（３３）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、５３、３であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（３４）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、５４、３であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
【請求項２】
抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')2、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化V領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化V領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１から３のいずれか１項に記載の抗体を生成蓄積させ、培養物から抗体を採取することを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。
【請求項８】
請求項１から３の何れか１項に記載の抗体を有する医薬組成物。
【請求項９】
抗体に細胞傷害性物質が結合している、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
細胞傷害性物質が薬剤、毒素、又は放射性物質である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
抗がん剤として使用される、請求項８から１０の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
がんが、固形がんまた血液がんである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
固形がんが肺がん、大腸がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、肝がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、頭頸部がん、皮膚がんである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
血液がんが白血病、リンパ腫、骨髄腫である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
血液がんが成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）である請求項１１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトＴｆＲ抗原に特異的に反応する抗ＴｆＲ抗体に関する。さらに本発明は、抗ＴｆＲ抗体を含む医薬組成物、特に悪性腫瘍の治療に関わる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、日本における死亡原因の第一位を占め、高齢化に伴って患者数は年々増加してきており、有効性及び安全性の高い薬剤や治療法の開発が強く望まれている。従来の化学療法や、放射線療法など、がん細胞を殺すと同時に、正常細胞にもダメージを与え、強い副作用を引き起こしている問題点がある。これを解決するために、がん細胞に特異的に発現する分子を標的として薬剤を設計し、治療を行う分子標的治療が盛んに研究されている。この分子標的がん治療薬の中、抗体薬は半減期が長く、副作用が少ないなどメリットがあるため大変注目を浴びる。開発の成功例として、ＣＤ２０を標的としたキメラ抗体リツキサン（非特許文献１）や、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを標的としたヒト化抗体ハーセプチン（非特許文献２）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的としたヒト化抗体アバスチンなど挙げられる。これらの抗体ががんを対象疾患として使用されており、その治療効果が認められている。【０００３】
治療薬としての抗体の使用は、非標識と標識抗体に分けられる。非標識抗体の作用メカニズムは、（１）免疫系細胞や分子を関与する抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）（非特許文献３）また補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）（非特許文献４）、（２）標的分子により細胞内生存や増殖と関わるシグナルの阻害、（３）アポトーシスの誘導、（４）サイトカインの分泌調節などと考えられる。それぞれのメカニズムの組み合わせにより腫瘍細胞を死亡させたり増殖を停止させたりして、治療効果を発揮する。標識抗体は、抗体に放射線物質や、毒素、酵素、また薬剤など細胞傷害物質とリンカーさせ、抗体の特異性を利用し、がん組織だけにこれらの物質を送達し、治療効果の向上と副作用の低減を図る。【０００４】
トランスフェリンレセプター(ＴｆＲ)は,トランスフェリン(Ｔｆ)と結合した鉄を細胞内に取り込むための細胞膜構造として、最初網状赤血球上にあると同定された（非特許文献５）。以後、胎盤の栄養膜細胞(非特許文献１０から１２)や、活性化されたリンパ球（非特許文献１２）、更にさまざまな腫瘍細胞などに発現していることが分かった。たとえば、乳がん（非特許文献６）、前立腺がん（非特許文献７）、肺がん（非特許文献８），膵臓がん（非特許文献９）大腸がん（非特許文献３０、３１）胃がん（非特許文献３１）、膀胱癌（非特許文献３２，３３）、肝癌（非特許文献３４）、子宮頸がん（非特許文献３５）、脳腫瘍（非特許文献３６）、慢性リンパ性白血病（非特許文献３７，３８）、非ホジキンリンパ腫（非特許文献３８，３９）、成人T 細胞白血病（非特許文献４０）においてトランスフェリンレセプターの高い発現を報告されていた。また、ＴｆＲは様々な癌細胞表面に高発現し、正常細胞における発現が低いため、古くからがん治療の分子標的と認識された（非特許文献１３から１６、特許文献１、２）。しかしながら、今まで開発された抗ヒトＴｆＲ抗体はすべて動物由来の抗体であり、その上、顕著な腫瘍増殖抑制効果がなかった。一般にヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体をヒトに投与すると、異物として認識されることにより、ヒト体内にマウス抗体に対するヒト抗体（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ：以下、ＨＡＭＡと表記する）が誘導されることが知られている。ＨＡＭＡは投与されたマウス抗体と反応し、副作用を引き起こしたり（非特許文献１７から２０）、投与されたマウス抗体の体内からの消失を速めたりをし（非特許文献１８、２１及び２２）、マウス抗体の治療効果を減じてしまうことが知られている（非特許文献２３及び２４）。実際にあるマウス抗ヒトＴｆＲ抗体によりフェーズ１臨床試験を行われ、ＨＡＭＡの産生が観察され、顕著な治療効果を見られなかった（非特許文献２５）。【０００５】
このような問題を回避するためにキメラ抗体が開発された（特許文献３及び４）。キメラ抗体は、２つまたはそれ以上の種由来の抗体の一部（マウス抗体の可変領域及びヒト抗体の定常領域など）を含む。このようなキメラ抗体の利点はマウス抗体の特徴は保持するが、ヒトＦｃを持つためヒト補体または細胞傷害活性を刺激することができる。しかし、このようなキメラ抗体も依然として「ヒト抗キメラ抗体」すなわちＨＡＣＡ（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ−  Ｃｈｉｍｅｒａ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）応答を惹起する（非特許文献２６）。さらに、置換された抗体の一部のみが相補性決定領域（すなわち「ＣＤＲ」）である組換え抗体が開発された（特許文献５及び６）。ＣＤＲ移植技術を使用してマウスＣＤＲ、ヒト可変部フレームワーク及び定常領域からなる抗体、すなわち「ヒト化抗体」が産生されている（非特許文献２７）。しかしながら、このようなヒト化抗体でも人に対して免疫原性があり、ＨＡＨＡ（Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）反応を引き起こす（非特許文献２８、２９）。従って、臨床応用において、より安全有効な免疫原性を持たない抗体治療薬を望まれている。【０００６】
さらに、治療抗体の免疫原性を克服するために、完全なヒト抗体の作製法も開発された。たとえば、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（特許文献７−１２）。また、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。このｓｃＦｖのＤＮＡ配列により適当な発現ベクターを作製し、完全なヒト抗体を取得することができる（特許文献１３−１８）。このようなヒト抗体ｓｃＦｖのファージディスプレイ法によりヒト抗ＴｆＲファージ抗体が取得された（特許文献２０）。ところで、抗体創薬においては、細胞膜表面に存在する「ｎａｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ」標的がん抗原を認識する抗体の取得が大事で、パンニング方法、あるいはスクリーニングの違いによって取得した抗体の薬理的な効果も異なる。本発明者らはこれまでに１０００億個もの独立したクローンからなる巨大なヒト抗体ライブラリーを作製し、数十種類癌細胞を用いて、独自な技術でがん細胞膜表面に存在するタンパク質（細胞表面抗原）に対する抗体の網羅的取得法を確立した（特許文献１９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，６６７，７８１号
【特許文献２】米国特許第７，９７６，８４１号
【特許文献３】欧州特許１２０６９４号
【特許文献４】欧州特許１２５０２３号
【特許文献５】英国特許ＧＢ２１８８６３８Ａ
【特許文献６】米国特許第５,５８５,０８９号
【特許文献７】ＷＯ９３／１２２２７
【特許文献８】ＷＯ１９９２／０３９１８
【特許文献９】ＷＯ１９９４／０２６０２,
【特許文献１０】ＷＯ１９９４／２５５８５，
【特許文献１１】ＷＯ１９９６／３４０９６,
【特許文献１２】ＷＯ１９９６／３３７３５
【特許文献１３】ＷＯ１９９２／０１０４７
【特許文献１４】ＷＯ１９９２／２０７９１,
【特許文献１５】ＷＯ１９９３／０６２１３
【特許文献１６】ＷＯ１９９３／１１２３６
【特許文献１７】ＷＯ１９９３／１９１７２
【特許文献１８】ＷＯ１９９５／０１４３８
【特許文献１９】日本特許４８７０３４８
【特許文献２０】ＷＯ２０１１／０７３９４３
【非特許文献】
【０００８】
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【非特許文献３９】Lancet 1983;1: 498-501
【非特許文献４０】Blood 2004; 103: 1838-1845
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＴｆＲを標的とした強い腫瘍増殖抑制効果を持つ完全なヒト抗体を提供することを解決すべき課題とした。また、これらの抗体の製造方法および抗体を用いるがんなどの疾患の治療薬を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述のように、ＴｆＲを標的とした抗体は抗腫瘍剤として開発されたが、動物由来の抗体であるため、ＨＡＭＡの産生や、薬効の不足などにより開発成功に至らなかった。そこで、本発明者らは、特許文献１９に記載した独自の抗体作成方法を鋭意に研究し、ヒト抗体ライブラリーファージ Ｄｉｓｐｌａｙにより癌細胞膜上にあるＴｆＲと反応するファージ抗体（ｓｃＦｖ抗体）を取得した。これらのｓｃＦｖ抗体をＩｇＧ化し、完全なヒトＩｇＧ抗体を作製した。【００１１】
更に、抗体の１）生産性の向上  ２）保存安定性の向上、及び３）抗腫瘍効果の向上を目的として、得られた完全なヒト抗ＴｆＲ抗体の可変領域のＣＤＲについて少なくとも一つのアミノ酸を改変し、抗ＴｆＲ抗体を臨床応用のため最適化を試みた。その結果、得られた変異抗体が親株と同様にヒトＴｆＲと反応し、より強い抗腫瘍効果を持つことを分かった。特に、上記により得られた本発明の抗体は、特許文献２０及びＷＯ２０１２／１５３７０７に記載されたヒト抗ＴｆＲ抗体より腫瘍抑制効果において顕著に優れていた。以上のことより、これらの抗体を利用しいろいろなＴｆＲ高発現しているがん治療における有用性が示され、本発明を完成するに至った。【００１２】
即ち、本発明によれば、下記（１）から（３４）から選択される、ヒトＴｆＲと特異的に反応する抗体が提供される。
（１）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、７であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（２）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、８であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（３）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、９であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（４）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、１０であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（５）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、１１であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（６）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、１２であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（７）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、１３であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（８）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、１４であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（９）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、１５であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１０）重鎖が配列番号１６を有し、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１１）重鎖が配列番号１７を有し、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１２）重鎖が配列番号１８を有し、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１３）重鎖が配列番号１９を有し、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１４）重鎖が配列番号２０を有し、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１５）重鎖が配列番号２１を有し、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１６）重鎖が配列番号２２を有し、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１７）重鎖が配列番号２３を有し、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１８）重鎖が配列番号２４を有し、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（１９）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号２５である抗体：
（２０）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号２６である抗体：
（２１）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号２８である抗体：
（２２）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号２９である抗体：
（２３）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号３１である抗体：
（２４）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号３２である抗体：
（２５）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号３４である抗体：
（２６）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号３６である抗体：
（２７）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号３７である抗体：
（２８）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号３８である抗体：
（２９）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号４０である抗体：
（３０）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号４１である抗体：
（３１）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、２、３であり、及び軽鎖可変領域が配列番号４２である抗体：
（３２）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、５２、３であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（３３）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、５３、３であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：
（３４）重鎖第１相補性決定領域（VH CDR1）、重鎖第２相補性決定領域（VH CDR2）、重鎖第３相補性決定領域（VH CDR3）がそれぞれ配列番号１、５４、３であり、及び軽鎖第１相補性決定領域（VL CDR1）、軽鎖第２相補性決定領域（VL CDR2）、軽鎖第３相補性決定領域（VL CDR3）がそれぞれ配列番号４、５、６である抗体：【００１３】
好ましくは、本発明の抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。
好ましくは、本発明の抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ab')2、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化V領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化V領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である。【００１４】
本発明によれば、上記した本発明の抗体をコードするＤＮＡが提供される。
本発明によれば、上記した本発明のＤＮＡを含有する組換えベクターが提供される。
本発明によれば、上記した本発明の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株が提供される。
本発明によれば、上記した本発明の形質転換株を培地に培養し、培養物中に本発明の抗体を生成蓄積させ、培養物から抗体を採取することを含む、本発明の抗体の製造方法が提供される。【００１５】
本発明によれば、上記した本発明の抗体を有する医薬組成物が提供される。
本発明によれば、抗体に細胞傷害性物質が結合している上記医薬組成物が提供される。
好ましくは、細胞傷害性物質が薬剤、毒素、又は放射性物質である。
好ましくは、本発明の医薬組成物は抗がん剤として使用される。【００１６】
好ましくは、がんが、固形がんまた血液がんである。
好ましくは、固形がんが肺がん、大腸がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、肝がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、頭頸部がん、皮膚がんである。
好ましくは、血液がんが白血病、リンパ腫、骨髄腫である。
更に好ましくは、血液がんが成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）である。【００１７】
本発明によればさらに、上記した本発明の抗体を対象者に投与することを含む、がんを抑制又は治療する方法が提供される。
本発明によればさらに、医薬組成物又は抗がん剤の製造のための、上記した本発明の抗体の使用が提供される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の抗体は、ヒトＴｆＲと特異的に認識し、ＴｆＲ発現しているがん細胞の生存や増殖を阻害する完全なヒト抗体である。ヒト抗体はヒトに投与する際、抗体の抗原性が回避され、ＨＡＨＡが産生されないので、より副作用が少ない高い抗腫瘍作用を発揮できる。即ち、本発明の抗ヒトＴｆＲ抗体は、抗がん剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、それぞれの抗ＴｆＲ００６抗体の改変抗体と白血病細胞株Ｋ５６２とのフローサイトメトリ結果を示す
【図２】図２は、それぞれの抗ＴｆＲ００６抗体の改変抗体のＫ５６２細胞の増殖抑制効果を示す。
【図３】図３は、ＴｆＲ００６抗体のＶＨアミノ酸配列 (配列番号４３)、ＩＧＨＶ３−３０アミノ酸配列（配列番号４４）とヒト生殖系列遺伝子のサブグループIIIのコンセンサス・アミノ酸配列（配列番号４５）とのアライメントを示す。
【図４】図４は、ＡＴＬモデルにおける抗ＴｆＲ００６抗体の改変抗体の腫瘍増殖抑制効果を示す。
【図５】図５は、ＡＴＬモデルにおける抗ＴｆＲ００６抗体の改変抗体の腫瘍増殖抑制効果を示す。
【図６】図６は、白血病モデルにおける抗ＴｆＲ００６抗体の改変抗体の腫瘍増殖抑制効果を示す。
【図７】図７は、白血病モデルにおける抗ＴｆＲ００６抗体の改変抗体の腫瘍増殖抑制効果を示す。
【図８】図８は、白血病モデルにおける抗ＴｆＲ００６抗体の改変抗体の腫瘍増殖抑制効果を示す。
【図９】図９は、固形癌モデルにおける抗ＴｆＲ００６抗体の改変抗体の腫瘍増殖抑制効果を示す。
【図１０】図１０は、抗ＴｆＲ００６抗体の改変抗体と先行抗体の抗原抗体ＥＬＩＳＡ効果を示す。
【図１１】図１１は、抗ＴｆＲ００６抗体の改変抗体と先行抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ薬効比較結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
定義および一般的技術
本明細書において別段定義しない限り、本発明に関して使用した科学技術用語は、当業者に通常理解されている意味を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して使用した命名法およびその技術は、当技術分野で周知のものであり、通常使用されている。
【００２１】
本発明の方法および技術は一般に、別段示さない限り、当技術分野で周知である従来の方法に従って、本明細書全体にわたって引用し論じた種々の一般的参照文献およびより具体的な参照文献に記載されているように実施する。
【００２２】
ＴｆＲ
ヒトトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）は人三番染色体にコードされる７６０アミノ酸から構成される一回膜貫通型タンパクである(配列番号５１)。このタンパクはＣＤ７１抗原としても知られ、細胞の鉄の取り込みに関与し、細胞の増殖に関与すると考えられている。本発明のＴｆＲは、構造上特別に限定せず、単量体、多量体、細胞膜に発現しているｉｎｔａｃｔ  ｆｏｒｍ、細胞外領域に構成された可溶化ｆｏｒｍ、ｔｒｕｎｃｔｅｄ  ｆｏｒｍ、また、遺伝子の変異や、欠損などによりｍｕｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒｍ、リン酸化などにより翻訳後修飾を受けたｆｏｒｍなども含め、すべてヒトＴｆＲを意味する。
【００２３】
反応する及び反応性
本明細書において、「反応する」と「反応性」は特別に示さない限り、同じのことを意味する。すなわち、抗体が抗原を認識すること。この抗原は、細胞膜に発現するｉｎｔａｃｔ  ＴｆＲでもよいし、ｔｒｕｎｃｔｅｄ  ｆｏｒｍや、可溶化ｆｏｒｍでも良い。また、立体構造を保ったＴｆＲでもよいし、変性したＴｆＲでもよい。反応性を検討する手段として、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ、蛍光微量測定技術（ＦＭＡＴ）表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）、免疫染色、免疫沈降などが挙げられる。
【００２４】
フローサイトメーターに用いる抗体としては、ＦＩＴＣなどの蛍光物質、ビオチンなどにより標識された抗体であっても、標識をされていない抗体であってもよい。用いた抗体の標識の有無、その種類により、蛍光標識アビジン、蛍光標識抗ヒト免疫グロブリン抗体などを使用する。反応性は、十分量の抗ＴｆＲ抗体（通常最終濃度が０．０１〜１０μｇ／ｍＬ）を検体に加えて行い、陰性対照抗体、陽性対照抗体の反応性との比較を行うことにより評価することができる。
【００２５】
抗体
本明細書では必要に応じて、慣習に従い以下の略号（括弧内）を使用する。
重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）、第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）重鎖の第１相補性決定領域（ＶＨ  ＣＤＲ１）、重鎖の第２相補性決定領域（ＶＨ  ＣＤＲ２）、重鎖の第３相補性決定領域（ＶＨ  ＣＤＲ３）軽鎖の第１相補性決定領域（ＶＬ  ＣＤＲ１）、軽鎖の第２相補性決定領域（ＶＬ  ＣＤＲ２）、軽鎖の第３相補性決定領域（ＶＬ  ＣＤＲ３）。
【００２６】
本明細書において、「抗体」という用語は、イムノグロブリンと同義であり、当技術分野で通常知られている通りに理解されるべきである。具体的には、抗体という用語は、抗体を作製する任意の特定の方法により限定されるものではない。例えば、抗体という用語には、それだけに限らないが、組換え抗体、モノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体がある。
【００２７】
本明細書において、「ヒト抗体」という用語は、可変領域および定常領域の配列がヒト配列である任意の抗体を意味する。その用語は、ヒト遺伝子に由来する配列を有するが、例えば、考えられる免疫原性の低下、親和性の増大、望ましくない折りたたみを引き起こす可能性があるシステインの除去などを行うように変化させている抗体を包含する。その用語はまた、ヒト細胞に特有でないグリコシル化を施すことができる、非ヒト細胞中で組換えにより作製されたそのような抗体をも包含する。これらの抗体は、様々な形で調製することができる。
【００２８】
本明細書において、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト由来の抗体を指し、非ヒト種の抗体配列に特徴的なアミノ酸残基が、ヒト抗体の対応する位置で認められる残基と置換されている。この「ヒト化」の工程が、その結果得られる抗体のヒトでの免疫原性を低下させると考えられる。当技術分野で周知の技術を使用して、非ヒト由来の抗体をヒト化できることが理解されるであろう。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１４：４３〜４６（１９９３）を参照されたい。対象とする抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメイン、および／またはフレームワークドメインを対応するヒト配列と置換する組換えＤＮＡ技術によって工学的に作製することができる。例えば、ＷＯ９２／０２１９０、ならびに米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７９２号、第５，７１４，３５０号、および第５，７７７，０８５号を参照できる。本明細書において、「ヒト化抗体」という用語は、その意味の範囲内で、キメラヒト抗体およびＣＤＲ移植抗体を含む。
【００２９】
本発明の抗体の可変領域においてフレームワーク領域（ＦＲ）の配列は、対応する抗原に対する特異的結合性に実質的な影響のない限り、特に限定されない。ヒト抗体のＦＲ領域を用いることが好ましいが、ヒト以外の動物種（例えばマウスやラット）のＦＲ領域を用いることもできる。
【００３０】
本明細書において、「ファージ抗体」という用語は、ファージにより産生されたｓｃＦｖ抗体を意味する。つまり、ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む抗体断片である。この断片は、Ｌｉｎｋｅｒとしてのアミノ酸以外、タグとしてのアミノ酸配列を含むことでもよい。
【００３１】
本発明の抗体の一態様において、可変領域に加えて定常領域を含む（例えばIgG型抗体）。定常領域の配列は特に限定されない。例えば、公知のヒト抗体の定常領域を用いることができる。ヒト抗体の重鎖定常領域（ＣＨ）としては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇＧと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、軽鎖定常領域（ＣＬ）としては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。また、ヒト以外の動物種（例えばマウスやラット）の定常領域を用いることもできる。
【００３２】
本明細書において、「改変体」や「改変抗体」とは、親抗体の可変領域（ＣＤＲ配列および／またはＦＲ配列）のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されていることである。「親抗体」とは、ＶＨは配列番号４３、ＶＬは配列番号４６で示されたアミノ酸配列を有するＴｆＲ００６抗体である。アミノ酸配列において、１または数個（例えば、１から８個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から３個、特に好ましくは１または２個）のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／または挿入されている。ＴｆＲに対する結合活性、および／または抗腫瘍活性を有する抗体のアミノ酸配列を調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, anＤＮＡkagawa, M. (１995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene １5２, ２7１-２75、Zoller, MJ, and Smith, M.(１98３) Oligonucleotide-directed mutagenesis of ＤＮＡ fragments cloned into M１３ vectors.Methods Enzymol. １00, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V,Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(１984) The gapped duplex ＤＮＡ approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. １２,944１-9456、Kramer W, and Fritz HJ(１987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex ＤＮＡ Methods. Enzymol. １54, ３50-３67、Kunkel,TA(１985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 8２, 488-49２）などを用いて、ＴｆＲに対する結合活性および／または抗腫瘍活性を有する抗体のアミノ酸配列に適宜変異を導入することにより、ＴｆＲに対する結合活性および／または抗腫瘍活性を有する抗体と機能的に同等な変異体を調製することができる。
【００３３】
本明細書において、「活性が親抗体と同等である」とは、ヒトＴｆＲへの結合活性および／または抗腫瘍活性が同等であることを意味する。「同等」とは、必ずしも同程度の活性である必要はなく、活性が増強されていてもよいし、又、活性を有する限り活性が減少していてもよい。活性が減少している抗体としては、例えば、元の抗体と比較して３０％以上の活性、好ましくは５０％以上の活性、より好ましくは８０％以上の活性、さらに好ましくは９０％以上の活性、特に好ましくは９５％以上の活性を有する抗体を挙げることができる。
【００３４】
結合活性としては、抗原を認識することを意味する。この抗原は、細胞膜に発現するｉｎｔａｃｔ  ＴｆＲでもよいし、ｔｒｕｎｃｔｅｄ  ｆｏｒｍや、可溶化ｆｏｒｍでも良い。また、立体構造を保ったＴｆＲでもよいし、変性したＴｆＲでもよい。たとえば、結合活性を検討する手段として、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ、蛍光微量測定技術（ＦＭＡＴ）表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）などが挙げられる。
【００３５】
抗腫瘍活性としては、腫瘍細胞の増殖また生存を阻害する活性を意味する。この腫瘍細胞の増殖また生存の阻害は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、また、ｉｎ  ｖｉｖｏでもよい。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞の数が減少させる活性、腫瘍細胞の数の増加を阻害する活性、腫瘍細胞の細胞死を引き起こす活性、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙーｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）など。ｉｎ  ｖｉｖｏでは腫瘍重量または体積を減少させる活性、腫瘍重量または体積の増加を抑制させる活性、他薬剤による腫瘍重量または体積の減少を促進させる活性、腫瘍細胞による個体死亡を抑制する活性等が挙げられる。
【００３６】
Ｉｎ  ｖｉｖｏの動物モデルとしては、ヌードマウス等の免疫不全マウスにヒト癌組織由来の培養細胞株を移植した異種移植モデル、培養マウス癌細胞株を正常な免疫系を有する野生型マウスへ移植した同系移植モデルなどがあげられる。
【００３７】
異種移植モデルはヌードマウス等の免疫不全マウスの皮下、皮内、腹腔内、静脈内等様々な部位にヒト癌細胞株を移植することにより作製することができる。
【００３８】
上述の抗体は、ＴｆＲに対する同等な結合活性を有する、あるいは、同等な抗腫瘍活性を有する限り、可変領域（ＣＤＲ配列および／またはＦＲ配列）のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。アミノ酸配列において、１または数個（例えば、１から８個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から３個、特に好ましくは１または２個）のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／または挿入されており、ＴｆＲに対する結合活性、および／または抗腫瘍活性を有する抗体のアミノ酸配列を調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, anＤＮＡkagawa, M. (１995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene １5２, ２7１-２75、Zoller, MJ, and Smith, M.(１98３) Oligonucleotide-directed mutagenesis of ＤＮＡ fragments cloned into M１３ vectors.Methods Enzymol. １00, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V,Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(１984) The gapped duplex ＤＮＡ approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. １２,944１-9456、Kramer W, and Fritz HJ(１987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex ＤＮＡ Methods. Enzymol. １54, ３50-３67、Kunkel,TA(１985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 8２, 488-49２）などを用いて、ＴｆＲに対する結合活性および／または抗腫瘍活性を有する抗体のアミノ酸配列に適宜変異を導入することにより、ＴｆＲに対する結合活性および／または抗腫瘍活性を有する抗体と機能的に同等な変異体を調製することができる。
【００３９】
このように、可変領域において、１または数個のアミノ酸が変異しており、ＴｆＲに対する結合活性および／また抗腫瘍活性を有する抗体もまた本発明の抗体に含まれる。
【００４０】
本発明の抗体は、その由来で限定されず、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体など、如何なる動物由来の抗体でもよい。又、キメラ化抗体、ヒト化抗体などでもよい。本発明における抗体の好ましい様態の一つとして、ヒト抗体である。
【００４１】
本発明の抗体は、後述する抗体を産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。得られた抗体が、本発明の抗体と同等の活性を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明で記載されているアミノ酸配列に翻訳後に修飾を受ける場合も本発明に含まれる。更に、既知の翻訳後修飾以外の部位に対する翻訳後修飾も、本発明の抗体と同等の活性を有している限り、本発明に含まれる。また、本発明の抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明の抗体はこのような抗体も包含する。既知の翻訳後修飾以外の部位に対する翻訳後修飾も、本発明の抗体と同等の活性を有している限り、本発明に含まれる。
【００４２】
抗体の作製
（１）ファージディスプレイライブラリーにより抗原と反応するｓｃＦｖ
本発明の抗体の取得は、当技術分野で知られているいくつかの方法に従って調製することができる。例えば、ファージディスプレイ技術を使用して、ＴｆＲに対する親和性が様々である抗体のレパートリーを含むライブラリーを提供することができる。次いで、これらのライブラリーをスクリーニングして、ＴｆＲに対する抗体を同定し単離することができる。好ましくは、ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬおよびＶＨｃＤＮＡを使用して生成されるｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。そのようなライブラリーを調製しスクリーニングする方法は当技術分野で知られている。ヒトＴｆＲを抗原としてスクリーニングした反応性を示すファージクローンから遺伝物質を回収する。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＶＨ及びＶＬのＤＮＡ配列を決定することができる。このｓｃＦｖの配列を用いて、ｓｃＦｖをＩｇＧ化すれば、ヒト抗体を取得することができる。
【００４３】
（２）ｓｃＦｖのＩｇＧ化（ヒト抗体の作製）
Ｈ鎖またＬ鎖の発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製によりヒト抗体を取得する。また、ＶＨ及びＶＬを同一ベクターに発現すること（タンデム型）によりヒト抗体の取得もできる。これらの方法は周知であり、ＷＯ９２/０１０４７、ＷＯ９２/２０７９１、ＷＯ９３/０６２１３、ＷＯ９３/１１２３６、Ｗ０９３/１９１７２、ＷＯ９５/０１４３８、ＷＯ９５/１５３８８、ＷＯ９７/１０３５４などを参考にすることができる。
【００４４】
具体的には、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする他のＤＮＡ分子と連結することによって、完全長重鎖遺伝子を取得することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤの定常領域でよいが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２の定常領域である。ＩｇＧ１定常領域配列は、Ｇｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）やＧｍ（１７）など、異なる個人間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子またはアロタイプでよい。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域中の天然に存在するアミノ酸置換に相当する。
【００４５】
ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子と連結することによって、完全長Ｌ鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）を取得することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλの定常領域でよい。κ定常領域は、Ｉｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）やＩｎｖ（３）など、異なる個人間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子でよい。λ定常領域は、３つのλ遺伝子のいずれかに由来するものでよい。
【００４６】
上記のように得られたＨ鎖またＬ鎖コードするＤＮＡを発現ベクター中に挿入することにより、発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製によりヒト抗体を取得する。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルスやタバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用する発現用宿主細胞と適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクター中に挿入することができるし、また両方の遺伝子を同じ発現ベクター中に挿入することもできる。抗体遺伝子を、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補的な制限部位とベクターの連結、または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）によって発現ベクター中に挿入する。
【００４７】
好都合なベクターは、上記に記載のように任意のＶＨまたはＶＬ配列を容易に挿入し発現させることができるように工学的に作製された適当な制限部位を有する機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬイムノグロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターでは、通常、挿入されたＪ領域中のスプライス供与部位とヒトＣドメインに先行するスプライス受容部位の間で、またヒトＣＨエキソン内に存在するスプライス領域でもスプライシングが起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流にある天然の染色体部位で起こる。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞由来の抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることもできる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがインフレームでイムノグロブリン鎖のアミノ末端と連結するようにベクター中にクローン化することができる。シグナルペプチドは、イムノグロブリンシグナルペプチドでもよく、あるいは異種性シグナルペプチド（すなわち非イムノグロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）でもよい。
【００４８】
本発明の抗体の発現ベクターは、抗体遺伝子および制御配列に加えて、宿主細胞中でのベクターの複製を制御する配列（例えば複製起点）や選択マーカー遺伝子などのさらなる配列を有してよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンやメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、デヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞でメトトレキセート選択／増幅とともに使用する）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇ４１８選択用）、およびグルタミン酸合成酵素遺伝子がある。
【００４９】
以上の方法で作製された抗体遺伝子発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、本発明の抗体を産生させる可能であればいかなる細胞でもよいが、動物細胞が好ましい。動物細胞として、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ/ｄｈｆｒ (−)細胞ＣＨＯ/ＤＧ４４細胞、サル由来細胞ＣＯＳ細胞(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immunol.１60, ３３９３-３４０２ (１９９８))、ＳＰ２／Ｏ細胞(マウスミエローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.５,５１２-５１９9(１９９６),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.５０,１４９５-１５０２ (１９９０)) など挙げられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８６,６００７ (１９８９), P.L.Felgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA  ８４,７４１３ (１９８７)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology ５２,４５６-４６７(１９７３))、ＤＥＡＥ-Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。
【００５０】
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト抗体を分離する。抗体の分離・精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて利用することができる。
【００５１】
抗体断片
本発明の抗体を基にして又は本発明の抗体をコードする遺伝子の配列情報を基にして抗体断片を作製することができる。抗体断片としてはＦａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')2、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ抗体が挙げられる。
【００５２】
Ｆａｂは、ＩｇＧをシステイン存在下パパイン消化することにより得られる、Ｌ鎖とＨ鎖可変領域、並びにＣＨ１ドメイン及びヒンジ部の一部からなるＨ鎖フラグメントとから構成される分子量約５万の断片である。本発明では、上記抗体をパパイン消化することにより得ることができる。また、上記抗体のＨ鎖の一部及びＬ鎖をコードするＤＮＡを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりＦａｂを調製することもできる。
【００５３】
Ｆａｂ'は、後述のF(ａｂ')2のＨ鎖間のジスルフィド結合を切断することにより得られる分子量が約５万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化し、還元剤を用いてジスルフィド結合を切断することにより得られる。また、Ｆａｂ同様に、Ｆａｂ'をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
【００５４】
Ｆ(ａｂ')2は、ＩｇＧをペプシン消化することにより得られる、Ｌ鎖とＨ鎖可変領域、並びにＣＨ１ドメイン及びヒンジ部の一部からなるＨ鎖フラグメントとから構成される断片（Ｆａｂ'）がジスルフィド結合で結合した分子量約１０万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化することにより得られる。また、Ｆａｂ同様に、Ｆ(ａｂ')2をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
【００５５】
ｓｃＦｖは、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とからなるＦｖを、片方の鎖のＣ末端と他方のＮ末端とを適当なペプチドリンカーで連結し一本鎖化した抗体断片である。ペプチドリンカーとしては例えば柔軟性の高い（ＧＧＧＧＳ）3などを用いることができる。例えば、上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡとペプチドリンカーをコードするＤＮＡを用いてｓｃＦｖ抗体をコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりｓｃＦｖを調製することができる。
【００５６】
ｄｓＦｖは、Ｈ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域の適切な位置にＣｙｓ残基を導入し、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とをジスルフィド結合により安定化させたＦｖ断片である。各鎖におけるＣｙｓ残基の導入位置は分子モデリングにより予測される立体構造に基づき決定することができる。本発明では例えば上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域のアミノ酸配列から立体構造を予測し、かかる予測に基づき変異を導入したＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をそれぞれコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、そして当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりｄｓＦｖを調製することができる。
【００５７】
尚、適当なリンカーを用いてｓｃＦｖ抗体、ｄｃＦｖ抗体などを連結させたり、ストレプトアビジンを融合させたりして抗体断片を多量体化することもできる。
【００５８】
医薬組成物
本発明によれば、本発明の抗体を含有する医薬組成物が提供される。本発明一つの実施形態としてはがんの治療であるが、これに限らない。ＴｆＲの高発現によるがん以外の疾患でも本発明の範囲以内である。更に好ましい実施形態としてがんは、固形癌（例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、肝がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、頭頸部がん、皮膚がんなど）、または血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫など）である。本発明の他の好ましい実施形態では、がんは成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）である。
【００５９】
本発明の医薬組成物の一態様として、本発明の抗体が有効成分として利用される。これは、抗体の細胞増殖抑制活性、細胞死誘導活性、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性などを利用し、抗腫瘍効果を発揮する。抗体が、以上の活性を一つだけを持つことでもよいし、また複数の活性を同時に持つことでもよい。つまり、ｎａｋｅｄ抗体が医薬組成物の有効成分である。
【００６０】
もう一つの態様では、本発明の抗体はがん治療薬としてがん組織に特異的にターゲティングさせるミサイル療法に用いることができる。すなわち、がん細胞に傷害をもたらす物質を結合させた抗体を投与することにより、がん部特異的に移行させ、治療効果および副作用の軽減を意図した治療方法である。
【００６１】
がん細胞に傷害する物質は、薬剤、毒素又は放射線物質などの細胞障害性物質を挙げられる。細胞障害性物質と抗体の結合は、当業者に公知の方法で行うことができる（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ２００４ Ｊｕｌ １;１０(１３):４５３８-４９。
抗体に結合させる薬剤は、がん細胞に傷害をもたらす公知の物質を用いることができる。例としては例えばデュオカルマイシン、デュオカルマイシンのアナログ及び誘導剤、ＣＣ−１０６５、ＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＭＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＣＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ドキソルビシン、ドキソルビシンコンジュゲート、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン、ドレスタチン−１０、コンブレタスタチン、カリケアマイシン(calicheamicin)、メイタンシン、メイタンシンアナログ、ＤＭ１，ＤＭ２，ＤＭ３，ＤＭ４、ＤＭＩ、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、５−ベンゾイルバレリン酸ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）、チューブリシン、ジソラゾール、エポシロン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＳＮ−３８、トポテカン、リゾキシン、エキノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エストラムスチン、セマドチン、エリューテロビン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、リューロシン、リューロシダイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシンコンジュゲート、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン誘導体、エトポシド、エトポシドリン酸塩、ビンクリスチン、タキソール、タキソテールレチノイン酸、酪酸、Ｎ8−アセチルスペルミジン並びにカンプトセシン等をあげることができるが、これだけに限定されるわけではない。
【００６２】
抗体と薬剤の結合には、それら自身が有する連結基などを介して直接結合されてもよいし、また、リンカーや他の物質を介して間接的に結合されてもよい。
【００６３】
薬剤が直接結合される場合の連結基は、例えばＳＨ基を用いたジスルフィド結合やマレイミドを介する結合が挙げられる。例えば、抗体のＦｃ領域の分子内ジスルフィド結合と、薬剤のジスルフィド結合を還元して、両者をジスルフィド結合にて結合する。また、マレイミドを介する方法もある。また別の方法として、抗体内にシステインを遺伝子工学的に導入する方法もある。
【００６４】
抗体と薬剤を、他の物質（リンカー）を介して間接的に結合することも可能である。リンカーには、抗体または薬剤または両方と反応する官能基を１または２種類以上有することが望ましい。官能基の例としてはアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、マレイミド基、ピリジニル基等をあげることができる。
【００６５】
リンカーの例としては、Ｎ−スクシンイミジル４−(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−(Ｎ−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−１−カルボキシ−(６−アミドカプロエート) （ＬＣ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−(α−マレイミドアセトキシ)−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−(β−マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−(ｐ−マレイミドフェニル)−ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ−(ｐ−マレイミドフェニル)イソシアネート（ＰＭＰＩ）、６-マレイミドカプロイル(ＭＣ)、マレイミドプロパノイル(ＭＰ)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(ＰＡＢ)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(ＳＰＰ) 及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(ＳＩＡＢ)等があげられるが、これらに限定されるものではない。また、このリンカーは例えば、バリン−シトルリン（Ｖａｌ-Ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン(ａｌａ−ｐｈｅ)のようなペプチドリンカーであってもよいし、上記にあげたリンカーをそれぞれ適時組み合わせて使用しても良い。
【００６６】
薬剤と抗体との結合方法に関しては、例えば、Cancer Research ;68 (22) 9280（2008）、Nature Biotechnology;26(8) 925（2008）、Bio Conjugate Chemistry;19、1673 (2008)、Cancer Research ;68 (15) 6300（2008）、又は特表2008-516896号公報などに記載の方法に準じて行うことができる。
【００６７】
毒素としては、抗体に毒素を化学的または遺伝子工学的に結合した、いわゆるイムノトキシンをあげることができる。毒素として、たとえば、ジフテリアトキシンＡ鎖、シュードモナスエンドトキシン、リシン鎖；無糖鎖リシンＡ鎖ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）等をあげることができる。
【００６８】
利用する放射性物質は、当業者に公知の物質を用いることができるが。例えばイットリウム９０（90Ｙ）、レニウム１８６（186Ｒｅ）、レニウム１８８（188Ｒｅ）、銅６７（67Ｃｕ）、鉄５９（59Ｆｅ）、ストロンチウム８９（89Ｓｒ）、金１９８（198Ａｕ）、水銀２０３（203Ｈｇ）、鉛２１２（212Ｐｂ）、ジスプロシウム１６５（165Ｄｙ）、ルテニウム１０３（103Ｒｕ）、ビスマス２１２（212Ｂｉ）、ビスマス２１３（213Ｂｉ）、ホルミウム１６６（166Ｈｏ）、サマリウム１５３（153Ｓｍ）、ルテチウム１７７（177Ｌｕ）などを挙げることができる。好ましくは、90Ｙ  153Ｓｍ、177Ｌｕである。
抗体と放射性物質の結合は、当業者公知の方法により行うことができる（Bioconjug Chem. １994 Mar-Apr;5(２):１0１-4.）。
【００６９】
放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を用いたがん治療は、当業者公知の方法により行うことができる（Bioconjug Chem. １998 Nov-Dec;9(6):77３-8２.）。具体的には、最初に少量の放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を患者に投与し、全身のシンチグラムを行う。正常組織の細胞と抗体の結合が少なく、癌細胞と抗体の結合が多いことを確認した上で、放射性同位元素を含む化合物を結合させた抗体を大量に投与する。
【００７０】
本発明の抗ヒトＴｆＲ抗体を含有する医薬組成物による製剤も本発明の範囲内に含まれる。このような製剤は、好ましくは、抗体を含有する医薬組成物に加え、生理学的に許容され得る希釈剤又はキャリアを含んでおり、他の抗体又は抗がん剤のような他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。或いは、抗体は凍結乾燥（フリーズドライ）し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用してもよい。投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、又は、注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺、坐薬等による非経口投与を挙げることができる。本発明の医薬組成物による製剤単独の投与でもよいし、他の薬剤と併用でもよい。
【００７１】
本発明の医薬組成物の投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、通常、経口投与では、抗体の量として、成人に対して、１日約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇであり、これらを１回、又は数回に分けて投与することができる。また、非経口投与では、１回約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇを皮下注射、筋肉注射又は静脈注射によって投与することができる。
【００７２】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００７３】
実施例１：癌細胞株を使用したファージ抗体スクリーニング
（１）癌細胞に結合するファージ抗体のスクリーニング（肝癌細胞株ＨｅｐＧ２）
ＨｅｐＧ２細胞を１５ｃｍ デイッシュで培養し、２ｍｇ/ｍＬｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩ/ ｃｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）によりデイッシュから剥離した。細胞を回収し、冷却したＰＢＳで洗浄した後、１×１０13ｃｆｕのヒト抗体ファージライブラリーを混ぜ、最終容積１．６ｍＬになるように反応液（１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、ＭＥＭ）を添加し、４℃にて４時間ゆっくり回転させて反応させた。反応終了後、反応液を二つに分け、それぞれに事前に用意した０．６ｍＬの有機溶液(ｄｉｂｕｔｙｌ  ｐｈｔａｌａｔｅ  ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ９：１)を重層し、マイクロ遠心機により２分間遠心（３０００ｒｐｍ）した。上清を捨て、チューブの底に沈降した細胞を０．７ｍＬの１％ＢＳＡ/ＭＥＭで懸濁し、更に０．７ｍＬの有機溶媒を重層した。同じように遠心により上清を捨て、細胞を０．３ｍＬのＰＢＳで懸濁し、液体窒素で凍結した（特許文献１９、ＷＯ２００８／００７６４８）。【００７４】
凍結した細胞を３７℃で解凍し、２０ｍＬの大腸菌ＤＨ１２Ｓ（ＯＤ０．５）に１時間で感染させた。ファージに感染した大腸菌を６００ｍＬの２×ＹＴＧＡ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬ ａｍｐｉｃｉｓｕｌｆａｔｅ、１％  Ｇｌｕｃｏｓｅ）に入れ、３０℃で一晩培養した。その後１０ｍＬを取り、２００ｍＬ  ２×ＹＴＡ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬ ａｍｐｉｃｉｓｕｌｆａｔｅ）に入れ、３７℃で１．５時間培養した。１×１０11ヘルパーファージＫＯ７を入れ、更に３７℃で１時間培養した。８００ｍＬの２×ＹＴＧＡＫ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬ ａｍｐｉｃｉｓｕｌｆａｔｅ、０．０５％  Ｇｌｕｃｏｓｅ、５０μｇ/ｍＬｋａｎａｍｙｃｉｎ）を添加し、３０℃で一晩培養した。１０分間の遠心（８０００ｒｐｍ）により上清を回収した。回収した上清に２００ｍＬのＰＥＧ液（２０％  ｐｏｌｙｅｔｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ６０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）を入れよく攪拌した後、１０分間の遠心（８０００ｒｐｍ）によりファージを沈殿させた。これを１０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、これが１ｓｔスクリーニングのファージとした。【００７５】
次は、２ｎｄスクリーニングを行った。２×１０7培養細胞と１×１０10１ｓｔスクリーニングのファージを混合し、最終容積０．８ｍＬになるように反応液を（１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、ＭＥＭ）入れた。その後は上記１ｓｔスクリーニングと同様の手法を行い、２ｎｄスクリーニングのファージを取得した。【００７６】
３ｒｄスクリーニングは１×１０9の２ｎｄスクリーニングのファージを使用し、上記と同じように行った。【００７７】
（２）ファージ抗体の解析
３ｒｄスクリーニングしたファージを回収し、既存法によりＤＮＡ配列を解析し、欠損領域を保持する不完全な抗体や配列が重複する抗体を排除し、独立した抗体配列を持つファージ抗体を取得した（特許第４８７０３４８を参照）。【００７８】
同様の手法により、下記の表１に示す２１種類のがん細胞を用いて、がん抗原に反応するファージ抗体のスクリーニングを行った。その結果、表１に示したように、独立配列を有するファージ抗体１８６３個を取得した。【００７９】
【表１】
2014073641.tif 000002
【００８０】
実施例２：可溶性ヒトＴｆＲと反応するファージのスクリーニング
（１）可溶性ＴｆＲ抗原産生細胞の作製
癌細胞株ＭＩＡＰａＣａ２, ＳＫＯＶ−３を用いて、ＴｆＲのｃＤＮＡをＰＣＲ法により作製した。常法によりＴｆＲ 細胞外ドメインのｃＤＮＡを調整し、ｐＣＭＶ-Ｓｃｒｉｐｔ（クロンテク社製）に挿入することにより、可溶性ＴｆＲ抗原発現ベクターを作製した。この発現ベクターを細胞株２９３Ｔへ導入し、可溶性ＴｆＲ抗原を産生する発現細胞を作製した。【００８１】
（２）ＥＬＩＳＡによる陽性ファージのスクリーニング
上記可溶性ＴｆＲ産生細胞の上清を回収し、精製により可溶性ＴｆＲ抗原を取得した。この可溶性ＴｆＲ抗原を用いてＥＬＩＳＡによる抗原抗体の反応性を検討した。すなわち、可溶性ＴｆＲ抗原をＰＢＳで１0μg/ｍＬになるように調整し、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｍｏｄｕｌｅ／Ｓｔｒｉｐ  Ｐｌａｔｅｓ（ＮＵＮＫ）に50μＬ/ｗｅｌｌに添加し、３７℃で２時間静置した。その後、可溶性ＴｆＲ抗原を捨て、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ液（５％ スキムミルク / ０．０５％ ＮａＮ３/ ＰＢＳ)２００μＬ/ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２時間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除き、ＰＢＳにより洗浄し、上記（表１）ファージの培養上清を１00μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＰＢＳ/０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈した１μｇ/ｍＬＲａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｃｐ３を１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、更にＰＢＳ/０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で２０００倍希釈したａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰを１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＯＰＤ  ｉｎ  ０．１Ｍクエン酸リン酸バーファー（ｐＨ５．１）＋０．０１％Ｈ2Ｏ2 を１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し室温で５分間反応させた。  ２ＮＨ2ＳＯ2を１００μＬ/ｗｅｌｌ加え、発色反応を停止した。その後、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果、１８６３株のファージの中、可溶性ＴｆＲ抗原と顕著な陽性反応を示すものは２０株であった。この２０株ファージのＤＮＡ配列を解析し、それぞれのＣＤＲ配列が新規であることが確認された。そのうち、ＴｆＲ００６抗体のＣＤＲ配列は下記の通りである。【００８２】
ＴｆＲ００６
VH CDR1：配列番号１、VH CDR2：配列番号２、VH CDR3：配列番号３
VL CDR1：配列番号４、VL CDR2：配列番号５、VL CDR3：配列番号６【００８３】
配列番号１：SYGMH
配列番号２：VISFDGSSKYYADSVKG
配列番号３：DSNFWSGYYSPVDV
配列番号４：TRSSGSIASNSVQ
配列番号５：YEDTQRPS
配列番号６：QSYDSAYHWV【００８４】
実施例３：ＴｆＲ００６抗体のＶＨ改変
（１) ＴｆＲ００６抗体のＶＨ ＣＤＲ３配列における一つのアミノ酸置換
ＴｆＲ００６抗体のＶＨ（配列番号４３）ＣＤＲ３（配列番号３）のカバット番号９６、９７、９８、１００をそれぞれ別のアミノ酸に置換した。改変抗体ＴｆＲ４０２抗体のＶＨはカバット番号９６のアミノ酸をＳからＧへ（配列番号７）、ＴｆＲ４０３抗体のＶＨはカバット番号９７のアミノ酸をＮからＡへ（配列番号８）、ＴｆＲ４０４抗体のＶＨはカバット番号98のアミノ酸をＦからＬへ（配列番号９）、ＴｆＲ４０６抗体のＶＨはカバット番号１００のアミノ酸をＳからＧへ（配列番号１０）になるように変異した。置換後の配列は表２で示している。また、すべての改変体のカバット番号1のＱはＮ末端ピログルタミン酸が形成されないＤに置換した。【００８５】
【表２】
2014073641.tif 000003
【００８６】
（２)  ＴｆＲ００６抗体のＶＨ  ＣＤＲ３配列における３つのアミノ酸置換
ＴｆＲ００６抗体ＶＨ  ＣＤＲ３配列の３個のアミノ酸を置換した改変抗体を作製した。  該ＣＤＲ３のカバット番号９５から１００までの６個のアミノ酸のうち３個のアミノ酸を置換した。ＴｆＲ４０７抗体のＶＨはカバット番号Ｎ９７Ａ（９７番目のアミノ酸をＮからＡへ置換）, Ｆ９８Ｌ  , Ｓ１００Ｇ  （配列番号１１）、ＴｆＲ４０８抗体ＨＶはカバット番号Ｓ９６Ｇ、Ｆ９８Ｌ、Ｓ１００Ｇ  （配列番号１２）、ＴｆＲ４０９抗体ＨＶはカバット番号Ｓ０９Ｇ、Ｎ９７Ａ、Ｓ１００Ｇ  （配列番号1３）、ＴｆＲ４１０抗体ははカバット番号Ｓ９６Ｇ、Ｎ９７Ａ、Ｆ９８Ｌ（配列番号1４）に変異した（表３）。  また、すべての改変体のカバット番号1のＱはＮ末端ピログルタミン酸が形成されないＤに置換した。【００８７】
【表３】
2014073641.tif 000004
【００８８】
（３）ＴｆＲ００６抗体のＶＨ  ＣＤＲ３配列における４個のアミノ酸置換
ＴｆＲ００６抗体のＶＨ  ＣＤＲ３配列における４個のアミノ酸を置換した改変抗体ＴｆＲ４１１抗体を作製した。該ＣＤＲ３のカバット番号９５から１００までの６個のアミノ酸のうち、カバット番号Ｓ９６Ｇ、Ｎ９７Ａ、Ｆ９８Ｌ、Ｓ１００Ｇに変異した（配列番号１５）（表４）。また、この改変体のカバット番号1のＱはＮ末端ピログルタミン酸が形成されないＤに置換した。【００８９】
【表４】
2014073641.tif 000005
【００９０】
（４）ＴｆＲ００６抗体のＶＨ  ＣＤＲ２配列におけるアミノ酸置換
ＴｆＲ００６抗体ＶＨ  ＣＤＲ２配列のアミノ酸を置換した改変抗体も作製した。  改変は下記の表に示したようにした。【００９１】
【表５】
2014073641.tif 000006
【００９２】
（５）その他のＴｆＲ００６抗体ＶＨ改変
ＴｆＲ００６抗体のＶＨアミノ酸配列に最も近い生殖系列の遺伝子をＩＭＧＴで調べたところＩＧＨＶ３−３０であることが判明した。図３はＴｆＲ００６抗体のＶＨアミノ酸配列 (配列番号４３)、ＩＧＨＶ３−３０アミノ酸配列（配列番号４４）とヒト生殖系列遺伝子のサブグループIIIのコンセンサス・アミノ酸配列（配列番号４５）とのアライメントである。それぞれの異なるアミノ酸の組み合せをもつＴｆＲ００６ＶＨ変異体をＴｆＲ４１２ＶＨ（配列番号１６）からＴｆＲ４２０ＨＶ（配列番号２４）まで作製した。【００９３】
配列番号１６：ＴｆＲ４１２  ＶＨ
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFKSYGMQWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSSRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVS
配列番号１７：ＴｆＲ４１３  ＶＨ
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFKSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
配列番号１８：ＴｆＲ４１４  ＶＨ
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFKSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS【００９４】
配列番号１９：ＴｆＲ４１５  ＶＨ
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFKSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGGSRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
配列番号２０：ＴｆＲ４１６  ＶＨ
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFKSYGMQWVRQAPGKGLEWVAVISFDGGSRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
配列番号２１：ＴｆＲ４１７  ＶＨ
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVAVISFDGGSRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS【００９５】
配列番号２２：ＴｆＲ４１８  ＶＨ
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMQWVRQAPGKGLEWVAVISFDGGSRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
配列番号２３：ＴｆＲ４１９  ＶＨ
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVSVISFDGGNRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPVDVWGQGTLVTVSS
配列番号２４：ＴｆＲ４２０  ＶＨ
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVSIVSFDGGNRYYADSIKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGALWGGYYSPIDVWGQGTLVTVSS【００９６】
配列番号４３：ＴｆＲ００６  ＶＨ
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFPFKSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRGEDTAVYYCARDSNFWSGYYSPVDVWGQGTTVTVSS
配列番号４４：IGHV3-30
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
配列番号４５：Human VH3 consensus
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISGDGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR【００９７】
実施例４：ＴｆＲ００６抗体のＶＬ改変
（１）ＴｆＲ００６抗体のＶＬ改変
ＴｆＲ００６  ＶＬ（配列番号４６）が使用していると推定される生殖系列の遺伝子をIMGTで検索した結果、ＩＧＬＶ６−５７（アクセッション番号： Z73673、配列番号４７）であることが判明した（表６）。ＶＬ遺伝子部分のアミノ酸置換は５ヶ所あり、これをもとにＴｆＲ００６抗体のVＬ改変体ＴｆＲ４２１、ＴｆＲ４２２をつくった（ＴｆＲ４２１：配列番号２５、ＴｆＲ４２２：配列番号２６）。また、この改変体のカバット番号1のQはN末端ピログルタミン酸が形成されないDに置換した。【００９８】
【表６】
2014073641.tif 000007
【００９９】
配列番号２５：ＴｆＲ４２１  ＶＬ
DFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNHWVFGGGTKLAVL
配列番号２６：ＴｆＲ４２２  ＶＬ
DFMLTQPQSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNQWVFGGGTKLAVL【０１００】
配列番号４６：ＴｆＲ００６  ＶＬ
配列番号４７： ＩＧＬＶ６−５７
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSN【０１０１】
ＩＭＧＴのサブグループ６の生殖系列遺伝子は1個なのため、コンセンサス配列がつくれない。そこでサブグループ６とサブグループ１と２でコンセンサス配列を作成した（配列番号２７）。これをもとにＴｆＲ００６抗体の改変体ＴｆＲ４２３ＶＬ（配列番号２８）、及びＴｆＲ４２４ＶＬ（配列番号２９）を作製した。【０１０２】
配列番号２７ ： ＶＬ１，２，６コンセンサス配列
QSxLTQPPSVSGSPGQSVTISCTGSSSNIGSxNyVSWYQQxPGtAPKLMIYENNKRPSGVPDRFSGSKxxSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSWDsSlSx
配列番号２８：ＴｆＲ４２３  ＶＬ
DSALTQPPSVSGSPGQSVTISCTGSSSNIIASNSVQWYQQLPGtAPKTVIYEDTQRPSGVPDRFSGSKDSSGNTASLTISGLQAEDEADYYCQSYDSAYHWVFGGGTKLAVL
配列番号２９：ＴｆＲ４２４  ＶＬ
DSALTQPPSVSGSPGQSVTISCTGSSSNIIASNSVQWYQQLPGtAPKTVIYENTQRPSGVPDRFSGSKDSSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYDSAYHWVFGGGTKLAVL【０１０３】
ＴｆＲ００６ＶＬに最も配列の近いヒト抗体ＶＬはＳＵＴ（アクセッション番号：Ｐ０６３１７, 配列番号３０）でＶＬのアミノ酸配列は全部で１５個異なっている。この情報をもとにヒト化技術と同様な改変方法でＴｆＲ４２５ＶＬ（配列番号３１）及びＴｆＲ４２６ＶＬ（配列番号３２）の配列を得た。【０１０４】
配列番号３０：ＳＵＴ
DFMLTQPHSVSESPGKTVIISCTRSDGTIAGYYVQWYQQRPGRAPTTVIFEDTQRPSGVPDRFSGSIDRSSNSASLTISGLQTEDEADYYCQSYDRDHWVFGGGTKLTVLG
配列番号３１：ＴｆＲ４２５  ＶＬ
DFMLTQPHSVSESPGKTVIISCTRSDGTIAGYYVQWYQQRPGRAPTTVIFEDTQRPSGVPDRFSGSIDRSSNSASLTISGLQTEDEADYYCQSYDSRDHWVFGGGTKLTVL
配列番号３２：ＴｆＲ４２６  ＶＬ
DFMLTQPQSVSESPGKTVIISCTRSTGTIASNSVQWYQQRPGRAPTTVIFDETQRPSGVPDRFSGSIDRSSNSASLTISGLQTEDEADYYCQSYDSRDQWVFGGGTKLTVL【０１０５】
（２）ＴｆＲ００６抗体Ｌ鎖の改変
ＴｆＲ００６抗体のラムダ鎖のＣＤＲをカッパ鎖のサブグループIのコンセンサス配列（配列番号３３）にグラフティングし、ＴｆＲ４２７抗体のＶＬアミノ酸配列（配列番号３４）を得た。さらに、このアミノ酸を塩基配列に変換したときに最も近い生殖系列の遺伝子をＩＭＴＧで検索した結果ＩＧＫＶ１−５であることがわかった。このＩＧＫＶ１−５（アクセッション番号：Ｚ００００１、配列番号３５）のフレームにＴｆＲ００６のラムダ鎖のＣＤＲをグラフティングし、ＴｆＲ４２８抗体のＶＬ（配列番号３６）を得た。  さらに、それぞれＴｆＲ４２８抗体のＶＬ  ＣＤＲ３のＤ９２Ｎ、Ｈ９５Ｑを置換し、ＴｆＲ４２９抗体（配列番号３７）及びＴｆＲ４３０抗体（配列番号３８）のＶＬ配列を得た。【０１０６】
配列番号３３：Human KVIコンセンサス配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSLPWTFGQGTKVEIK
配列番号３４：ＴｆＲ４２７  ＶＬ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQIASNSVQWYQQKPGKAPKTVIYEDTQLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSYDSAYHWVFGQGTKVEIK
配列番号３５：  IGKV1-5
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYS【０１０７】
配列番号３６：ＴｆＲ４２８  ＶＬ
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQIASNSVQWYQQKPGKAPKTVIYEDTQLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQSYDSAYHWVFGQGTKVEIK
配列番号３７：ＴｆＲ４２９  ＶＬ
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQIASNSVQWYQQKPGKAPKTVIYEDTQLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQSYNSAYHWVFGQGTKVEIK
配列番号３８：ＴｆＲ４３０  ＶＬ
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQIASNSVQWYQQKPGKAPKTVIYEDTQLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQSYNSAYQWVFGQGTKVEIK【０１０８】
ＴｆＲ４１７抗体のＶＬアミノ酸配列に近いヒト抗体κ鎖はＷＥＡ（アクセッション番号：Ｐ０１６１０、配列番号３９）で、このフレームにＴｆＲ００６のラムダ鎖のＣＤＲをグラフティングした。このようにＴｆＲ４３１抗体（配列番号４０）のＶＬ配列を得た。さらにＴｆＲ４３１抗体のＣＤＲ３にそれぞれＤ９２Ｎ，Ｈ９５Ａを置換し、ＴｆＲ４３２、ＴｆＲ４３３抗体のＶＬ配列を得た。【０１０９】
配列番号３９：ＷＥＡ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLTWYQQKPGTAPKRLIYGATSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTINSLQPEDFATYYCLQYSSFPWTFGQGTKVEVK
配列番号４０：ＴｆＲ４３１  ＶＬ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQIASNSVQWYQQKPGTAPKTVIYEDTQLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTINSLQPEDFATYYCQSYDSAYHWVFGQGTKVEIK
配列番号４１：ＴｆＲ４３２  ＶＬ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQIASNSVQWYQQKPGTAPKTVIYEDTQLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTINSLQPEDFATYYCQSYNSAYHWVFGQGTKVEIK
配列番号４２：ＴｆＲ４３３  ＶＬ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQIASNSVQWYQQKPGTAPKTVIYEDTQLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTINSLQPEDFATYYCQSYNSAYQWVFGQGTKVEIK【０１１０】
実施例５：各改変抗体の作製
（１）各ＴｆＲ００６改変抗体を発現するｐｌａｓｍｉｄの作製
上記得られたそれぞれのＴｆＲ００６改変ＶＨ、ＶＬをそれぞれにヒトG１の定常領域（配列番号４８）、また対応するL鎖定常領域（λ：配列番号４９、κ：配列番号５０）と連結した。5'側にＮｈｅＩ、3'側にＥｃｏＲＩを付加したH鎖、Ｌ鎖遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社で全合成した。。合成した重鎖、軽鎖の遺伝子はそれぞれ別々の発現ベクターに組み込んだ。すなわちH鎖、L鎖それぞれの人工合成遺伝子をＮｈｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＮｈｅＩとＥｃｏＲＩ部位に組み込み、それぞれのは異変抗体Ｈ鎖発現ベクター、およびＬ鎖発現ベクターを得た。【０１１１】
（２）ＴｆＲ００６改変抗体の一過性発現
ＴｆＲ００６改変抗体の一過性発現にはＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  （ライフテクノロジーズ）を用いた。遺伝子導入用浮遊細胞である２９３-Ｆ  （ライフテクノロジーズ）  は前日に継代した。トランスフェクション当日に、一抗体あたり１ｘ１０6細胞／ｍＬの細胞濃度に調整した４００ｍＬの細胞懸濁液を準備した。これにそれぞれの抗体の重鎖発現ベクターを１００  μｇ、軽鎖発現ベクターを１００μｇ合計２００μｇのプラスミドをＯｐｔｉＰｒｏ  ＳＦＭに懸濁した溶液（Ｉ）を調整した。次に２００μＬのＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔを８ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ  ＳＦＭに加えた（溶液ＩＩ）。  溶液（Ｉ）と（ＩＩ）を混合して室温で１０分から２０分静置した。この合計１６ｍＬの反応液を２９３-F細胞を懸濁した４００ｍＬの２９３発現培地に加え、６日から７日間３７°C、８％ＣＯ2で細胞培養震盪機のＴＡＩＴＥＣ  ＢｉｏＳｈａｋｅｒ  ＢＲ-４３ＦＬで培養した。６日から７日間後、ＴＦＲ００６組換え抗体を含む培養上清を回収し、これを材料に精製をおこなった。【０１１２】
（３）ＴｆＲ００６ＩｇＧ抗体の精製
一過性で発現した培養上清含まれる各抗体タンパク質は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅを用いたＡｂ-Ｃａｐｃｈｅｒ  ＥｘＴｒａ（プロテノバ）アフィニティーカラムで精製した。得られたピークフラクションは、溶媒としてダルベッコのＰＢＳで平衡化したセファクリルＳ-３００カラムによるゲルろ過をして、さらに精製した。精製した抗体タンパク質の定量は、吸光係数を用いて算出した。【０１１３】
（４）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による抗体の定量
抗体生産細胞の培地上清に含まれる抗体や、精製した抗体の濃度は、吸光度による定量とともに、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による定量もおこなった。固相抗体としてプレートにヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）（コスモバイオ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．；ＡＱＩ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ-１１０ＵＤ）を１００μｌ／ｗｅｌｌ（５μｇ／ｍＬの濃度）で加えて４℃で一昼夜静置した。次にブロックエースを２００μＬ／ｗｅｌｌで加えて室温で１時間ブロックした後、試料の抗体を段階希釈し、各ｗｅｌｌに加えて１時間インキュベーションして反応させた。ＰＢＳＴ(０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ)で５回洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）-ＨＲＰ（コスモバイオ：ＡＱＩ，Ｃａｔ．Ａ-１１０ＰＤ）をＰＢＳＴで１００００倍希釈した検出抗体溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌの割合で加えた。１時間インキュベーション後、ＰＢＳＴで5回洗浄してから基質緩衝液TMBを１００μL/ｗｅｌｌの割合で加えた。室温暗所で１5分間インキュベーションした後、反応停止液を１００μL/ｗｅｌｌの割合で加えて反応を停止してから、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準品として精製ヒトＩｇＧを用いて検量線を作成し、これを用いてヒト抗体の濃度を算出した。【０１１４】
実施例６：ＴｆＲ００６改変抗体の反応性
ＴｆＲ発現細胞Ｋ５６２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３：ＣＭＬ）を用いて、各改変抗体の抗原反応性を検討した。K５６２細胞を遠心により回収し、ＰＢＳで１回洗浄した。その後、ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（１％ＢＳＡ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％ＮａＮ３  入りＰＢＳ）で細胞を１×１０6／ｍＬなるように懸濁しに。  この細胞懸濁液１００μＬを９６- ｗｅｌｌ Ｖ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３８９７）に分注し、さらにそれぞれの抗体をＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒで０．２μｇ〜２／ｍＬに調製し、それぞれの抗体溶液１００μＬを細胞に添加した、４℃で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣS  Ｂｕｆｆｅｒにより２回洗浄した後、ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ  で７５０倍に希釈したＡｌｅｘａ４８８−ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ）溶液１００μＬを添加し、攪拌した後更に４℃で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ  で遠心により２回洗浄し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）のＨＴＳにセットして各ｗｅｌｌのＦＬ１蛍光強度を測定した。図１に示すように、各改変抗体（a:１ｎｇ/ｍＬ；ｂ：１０ｎｇ/ｍＬ；ｃ：１００ｎｇ/ｍＬ; d: １μｇ/ｍＬ）が、Ｋ５６２細胞に対し、親抗体ＴｆＲ００６と同等な反応性を示した。【０１１５】
実施例７：ＴｆＲ改変抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏがん細胞増殖抑制効果
ＴｆＲ発現細胞株Ｋ５６２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３）またＡＴＬ細胞株ＭＴ−２細胞を２５００／ｍＬ密度になるよう培養液で調製し、９６ｗｅｌｌ平底プレート（ＮＵＮＣ  １６７００８）に１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。それぞれのＴｆＲ００６改変抗体４．６ｎｇ〜１０μｇ／ｍＬの抗体希釈系列を作製し、その１００μＬを細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％空気で９６時間培養した。培養終了後、プレートにＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  （ＤＯＪＩＮＤＯ）２０μｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％空気で３時間培養した。Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ４５０ｎｍ  で測定した。各濃度の抗体添加による増殖率を下記の計算式で算出した。Ｍａｓｔｅｒ  Ｐｌｅｘ  ２０１０ソフトウエア（日立ソリューションズ）を使用して、増殖率５０％を示す抗体濃度（ＩＣ５０）を求めた（表７）。図２で示したように、ＴｆＲ００６改変抗体は、ほぼ親抗体と同程度にがん細胞の増殖を抑制した。
増殖率＝抗体添加ｗｅｌｌ値−Ｂｌａｎｋ（培養液のみ）/Ｃｏｎｔｒｏｌ値（抗体なしｗｅｌｌ）−Ｂｌａｎｋ（培養液のみ）Ｘ１００％【０１１６】
【表７】
2014073641.tif 000008
【０１１７】
実施例８：ＡＴＬ細胞株ゼノグラフトモデルにおけるＴｆＲ改変抗体の抗腫瘍効果
ＡＴＬ細胞株ＳＵ９Ｔ１細胞を１０％ＦＢＳ添加したＲＰＭＩ１６４０培養液（ＳＩＧＭＡ）で培養した。移植時遠心により細胞を回収し、細胞を１×１０8/ｍＬになるようにＲＰＭＩ１６４０に懸濁した。この細胞懸濁液と同量のＭａｔｒｉｇｅｌ（ベクトンディッキンソン）を混ぜ、ＳＣＩＤマウス（メス、６週齢、九動株式会社)の右腹側部皮下に移植した。移植後、週二回ノギスにより腫瘍径を測定し、腫瘍平均体積が１５０ｍｍ３前後に到達した時点で、腫瘍体積に対する無作為化割付により、マウスを１群あたり５匹になるよう割付けを行った。ＴｆＲ００６、ＴｆＲ４０２、ＴｆＲ４０３、ＴｆＲ４０４、ＴｆＲ４０６抗体それぞれの群に５ｍｇ/ｋｇ、ＴｆＲＴｆＲ４３５、ＴｆＲ４３６抗体をそれぞれの群に１０ｍｇ/ｋｇ、３ｍｇ/ｋｇで尾静脈投与した。陰性コントロール群には０．２ｍＬ/２０ｇマウスでＰＢＳを尾静脈より投与した。投与は、週２回（３日または４日毎）、合計５回行った。投与後も割付け前と同様に、週２回ノギスによる腫瘍径の測定を行い、各群の腫瘍体積を求めた。抗腫瘍効果の判定は最終測定日の腫瘍体積について、ＰＢＳ群をコントロールとしたパラメトリックＤｕｎｎｅｔ多重比較検定により判定した。
腫瘍体積は下式にて算出した。
腫瘍体積＝（短径）2 ×  長径  ×  ０．５
また、無作為化割付および、多重比較検定は生物実験データ統計解析ソフトＥＸＳＵＳ（株式会社シーエーシー）を用いて行った。【０１１８】
各群の腫瘍体積の平均値の経時的変化を図４及び図５に示す。図４及び図５に示したように腫瘍の増殖は、投与したそれぞれのＴｆＲ抗体により抑制された。特に、図４に示したように、改変抗体ＴｆＲ４０２は親抗体ＴｆＲ００６よりもっと強い腫瘍増殖抑制効果を示した。ＴｆＲ４３５、ＴｆＲ４３６抗体が１０ｍｇ/ｋｇの用量で、腫瘍の増殖を抑制するだけではない、顕著な腫瘍縮小効果も発揮した（図５）。【０１１９】
実施例９：白血病ゼノグラフトモデルにおけるＴｆＲ改変抗体の抗腫瘍効果
白血病細胞株細胞Ｋ５６２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３）を１０％ＦＢＳ添加したＲＰＭＩ１６４０培養液で培養した。移植時遠心により細胞を回収し、細胞を５×１０7/ｍＬになるようにＲＰＭＩ１６４０に懸濁した。ＳＣＩＤマウス（メス、７週齢、日本クレア)の右腹側部皮下に５×１０6個／マウスとなるように上記がん細胞懸濁液１００μＬ／匹で移植した。移植後、ノギスによる腫瘍径を測定し、下記の式により体積を求めた。腫瘍平均体積が１５０ｍｍ3以上に至る時点で、群分けソフト（ＥＸＳＡＳｖｅｒｓｉｏｎ７．６  シーエーシ）によりマウスの群分けを行った  （ｎ＝５）。それぞれの抗体投与群において、マウスに５ｍｇ/ｋｇのＴｆＲ００６抗体、ＴｆＲ４０２抗体、ＴｆＲ４０４抗体、ＴｆＲ４０６抗体、ＴｆＲ４３５抗体、ＴｆＲ４３６抗体を尾静脈より投与した。また、低用量投与群において、マウスに１ｍｇ/ｋｇのＴｆＲ４０２、ＴｆＲ４３４抗体、ＴｆＲ４３５抗体、ＴｆＲ４３６抗体を投与した。陰性コントロール群に０．２ｍＬ/２０ｇマウスでＰＢＳを尾静脈より投与した。投与は、週２回（３日または４日毎）、合計５回行った。投与後週２回ノギスによる腫瘍径の測定を行い、各群の腫瘍体積を求めた。抗腫瘍効果の判定は腫瘍体積により判定した。
腫瘍体積は下式にて算出した。
腫瘍体積＝（短径）2 ×  長径  ×  ０．５【０１２０】
抗体５ｍｇ/ｋｇの投与各群の腫瘍体積平均値の経時的変化を図６及び図７に示す。図６及び図７に示したように腫瘍の増殖は、投与したそれぞれのＴｆＲ抗体により抑制された。特に、図６に示したように、改変抗体ＴｆＲ４０２、ＴｆＲ４０４、ＴｆＲ４０６抗体は、いずれも親抗体ＴｆＲ００６より強い腫瘍増殖抑制効果を示した。特に注目すべきことに、ＴｆＲ４３５、ＴｆＲ４３６抗体は１ｍｇ/ｋｇの低用量でも、著しく腫瘍の増殖を抑制した（図８）。【０１２１】
実施例１０：固形癌ゼノグラフトモデルにおけるＴｆＲ改変抗体の抗腫瘍効果
膀胱癌細胞株ＢＦＴＣ-９０５（ＤＳＭＺ；ＡＣＣ３６１）を１０％ＦＢＳ添加したＤＭＥＭ培養液（ＳＩＧＭＡ）で培養した。移植時遠心により細胞を回収し、細胞を５×１０7/ｍＬになるようにＲＰＭＩ１６４０に懸濁した。ＳＣＩＤマウス（メス、７週齢、日本クレア)の右腹側部皮下に５×１０6個／マウスとなるように上記がん細胞懸濁液１００μＬ／匹で移植した。移植後、ノギスによる腫瘍径を測定し、下記の式により体積を求めた。腫瘍平均体積が２００ｍｍ3前後に至る時点で、群分けソフト（ＥＸＳＡＳｖｅｒｓｉｏｎ７．６  シーエーシ）によりマウスの群分けを行った  （ｎ＝５）。それぞれの抗体投与群において、マウスに１０ｍｇ/ｋｇのＴｆＲ４３５抗体、ＴｆＲ４３６抗体を尾静脈より投与した。陰性コントロール群に０．２ｍＬ/２０ｇマウスでＰＢＳを尾静脈より投与した。投与は、週２回（３日または４日毎）、合計５回行った。投与後週２回ノギスによる腫瘍径の測定を行い、各群の腫瘍体積を求めた。抗腫瘍効果の判定は腫瘍体積により判定した。
腫瘍体積は下式にて算出した。
腫瘍体積＝（短径）2 ×  長径  ×  ０．５【０１２２】
投与各群の腫瘍体積平均値の経時的変化を図９に示す。図９に示したように腫瘍の増殖は、ＴｆＲ４３５抗体、ＴｆＲ４３６抗体の投与により抑制された。【０１２３】
実施例１１：抗体３ＴＦ１２、３ＧＨ７（ＷＯ２０１１／０７３９４３）のＩｇＧ抗体発現ｐｌａｓｍｉｄの作製
ＷＯ２０１１／０７３９４３には、ヒトＴｆＲに対するｓｃＦｖ単量体、二量体抗体が記載されている。本発明の抗体とＷＯ２０１１／０７３９４３に記載の抗体とを比較するため、ＷＯ２０１１／０７３９４３に記載の３ＴＦ１２、３ＧＨ７ｓｃＦｖ抗体のＩｇＧ１抗体を作製した。３ＴＦ１２のｓｃＦｖアミノ酸配列及び塩基配列はそれぞれ配列番号５５番と５６番で示し、３ＧＨ７のｓｃＦｖアミノ酸配列及び塩基配列はそれぞれ配列番号５７番と５８番で示す。【０１２４】
ＩｇＧ１抗体の作製について、本発明の抗体の作製と同じように、重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を別々の発現ベクターに組み込んで、重鎖発現ベクターと軽鎖発現ベクターの2種類のプラスミドを遺伝子導入時にコトランスフェクションして抗体を生産する方法を採用した。【０１２５】
重鎖については可変領域の塩基配列をヒトG1遺伝子がすでに組み込まれているカセット・ベクターに挿入した。可変領域は、それぞれ、３ＴＦ１２ｓｃＦｖの重鎖可変領域（アミノ酸配列番号５９、塩基配列番号６０）および３ＧＨ７ｓｃＦｖ重鎖可変領域（アミノ酸配列番号６１、塩基配列番号６２）である。【０１２６】
軽鎖に関しては可変領域に定常領域を接続した全体の軽鎖遺伝子を発現ベクターに組み込んだ。軽鎖の可変領域は、３ＴＦ１２  ｓｃＦｖの軽鎖可変領域（アミノ酸配列番号６３、塩基配列番号６４）および３ＧＨ７ｓｃＦｖ軽鎖可変領域（アミノ酸配列番号６５、塩基配列番号６６）である。【０１２７】
それぞれの可変領域の塩基配列に、ラムダ定常領域のひとつであるIGLC3*01（GenBankアクセッション番号：J00254）を接続した。データベース上のアクセッション番号J00254で欠失が確認されているN端の2アミノ酸GQ（塩基配列ではGGTCAG）は加えてある（アミノ酸配列番号６７、塩基配列番号６８）。【０１２８】
なお、それぞれの遺伝子は元のアミノ酸配列を変更しないで、塩基配列の最適化をおこない、GenScript社で合成した。合成した３ＴＦ１２の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６９に、最適化した塩基配列は配列番号７０に、軽鎖のアミノ酸配列は配列番号７１に、最適化した塩基配列は配列番号７２に示した。合成した３ＧＨ７の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号７３に、最適化した塩基配列は配列番号７４に、軽鎖のアミノ酸配列は配列番号７５に、最適化した塩基配列は配列番号７６に示した。使用したヒトＩＧＨＧ１のアミノ酸配列はＵｎｉｐｒｏｔ（Ｐ０１８５７）に開示されており、アミノ酸配列は配列番号７７に、塩基配列は配列番号７８に示した。なお、遺伝子を全合成するにあたり、構築の便宜上、合成遺伝子の５プライム側には制限酵素ＮｈｅＩの認識部位を、３プライム側には制限酵素ＥｃｏＲ１の認識部位を付加した。これらの制限酵素で合成遺伝子を処理することによりサブクローニングベクターから発現ベクターへの抗体遺伝子の組み換えをおこなった。【０１２９】
実施例１２：抗体３ＴＦ１２、３ＧＨ７（ＷＯ２０１１／０７３９４３）のＩｇＧ抗体の一過性発現
トランスフェクション前日に、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ライフテクノロジーズ）を1 ｍＬあたり1.4 x 106細胞になるように８５ｍＬのＰｏｗｅｒＣＨＯ−２ＣＤ培地（ＬＯＮＺＡ）でを三角フラスコに調整し、３７℃、８％ＣＯ２の条件で、毎分回転数（ｒｐｍ）１３５に設定して震盪培養した。【０１３０】
抗体遺伝子のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞への導入は、２種類のプラスミド、すなわち、重鎖発現ベクターと軽鎖発現ベクターを用いておこなった。【０１３１】
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞へのトランスフェクションは、チューブ１に５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ライフテクノロジーズ）に５０ μｇの重鎖発現ベクターと５０μｇの軽鎖発現ベクターを加えて、よく混合した。次にチューブ２に５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭと０．２７ｍＬのＥｘｐｉFｅｃｔａｍｉｎｅ２９３ｒｅａｇｅｎｔを加え、よく混合した。チューブ１混合液にチューブ２混合液を加え、攪拌し、室温で２０分から３０分間静置した。この混合液を、前日から震盪培養しておいたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に加えた（トランスフェクション）。トランスフェクションから１６時間から１８時間後に０．５ｍＬのＥｘｐｉFｅｃｔａｍｉｎｅ２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ１と５ｍＬのＥｘｐｉFｅｃｔａｍｉｎｅ２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ２を加えた。その後、３７℃、８％ＣＯ２、１３５ｒｐｍ回転速度で６日間培養した。トランスフェクションから７日後に培養上清を回収した。遠心によって細胞を除去した後、０．２μｍのフィルターをとおして、これを抗体の精製に用いた。【０１３２】
実施例１３：抗体３ＴＦ１２、３ＧＨ７（ＷＯ２０１１／０７３９４３）のＩｇＧ抗体の精製
抗体の精製は、はじめに陰イオン交換担体を、次にプロテインA担体を用いておこなった。一過性発現Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞の培養上清をAKTAprime plusを用いて精製した。流速毎分あたり５ｍＬでＣａｐｔｏＱ（ＧＥヘルスケア）カラム（カラム容量１０ｍＬ）にアプライした。抗体を含む取得画分はフロースルー（通過画分）であるが、タンパク質のほか核酸（ゲノムやＲＮＡ）が陰イオン交換担体に結合して除去できるので、次のプロテインＡの結合容量を有効に利用することが可能になる。プロテインＡ担体（Ａｂ−Ｃａｐｃｈｅｒ  ＥｘＴｒａ：プロテノバ社；１０ｍＬ）に流速毎分あたり５ｍＬでアプライし、その後、洗浄緩衝液はアプライと同一の流速でＤ−ＰＢＳでおこなった。溶出のフラクション容量は試験管あたり４ｍＬに設定して分取した。溶出は０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液, ｐＨ２．７を用い、流速毎分３ｍＬでおこなった。溶出液を分取する試験管には予め１２０μL の１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を入れておき、溶出と同時にｐＨを酸性からｐＨ６．５の中性付近に速やかに戻した。タンパク質量は２８０ｎＭの吸光度で検出し、ピークフラクションを分取した。このピークフラクションは、分子量３万カットのウルトラセル限外ろ過ディスクを使用したミリポア撹拌式セルで、緩衝液をＤ−ＰＢＳに交換しながら溶出液の濃縮をおこなった。【０１３３】
実施例１４：３ＴＦ１２、３ＧＨ７  ＩｇＧ抗体との親和性比較
実施例２で作製した可溶性ＴｆＲ抗原を、２μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ（２．６８  ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７  ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4，１３６．８９  ｍＭ  ＮａＣｌ，８．０４  ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4）に懸濁させ、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ イムノモジュール  マキシソープ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ．４６８６６７））に１００μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置した。【０１３４】
翌日、ウェル内の溶液を捨て、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社、ｃａｔ．ＵＫ−Ｂ４０）の原液を２００μＬ／ウェルで分注し、室温においてプレートシェーカー（ＩＫＡ、ｃａｔ．ＭＴＳ  ２／４  ｄｅｇｉｔａｌ）で１時間震盪してブロッキングを行った。その後溶液を捨て、プレートの洗浄（プレートウォッシャー（バイオテック、ｃａｔ．ＭＷ−９６ＡＲ）を用いて、ＢｕｆｆｅｒＡ（ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）２５０μＬｘ５回洗浄）を行った。次に、精製抗体ＴＦＲ４３６、３ＴＦ１２及び３ＧＨ７を、濃度を変えてＢｕｆｆｅｒＡに希釈したものを調製し、１００μＬ／ウェルで分注し、室温においてプレートシェーカーで１時間震盪した。【０１３５】
溶液を捨て、プレートの洗浄を行った後、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ‘）2 Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ   Ｆｃγ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ(Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ， ｃａｔ．１０９−０３６−０９８）)をＢｕｆｆｅｒＡで５０，０００倍希釈したものを調製し、１００μＬ／ウェルで分注し、室温においてプレートシェーカーで１時間震盪した。【０１３６】
プレートの洗浄を行った後、ＴＭＢ発色液（ＳＣＹＴＥＣ，ｃａｔ．ＴＭ４９９９）を１００μＬ／ウェルで加え、暗所で８分静置して発色を行った。停止液（ＳＣＹＴＥＣ，ｃａｔ．ＴＳＢ９９９）を１００μＬ／ウェルで加えた後、プレートリーダー（コロナ、ｃａｔ．ＭＴＰ４５０）で４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）を測定した。【０１３７】
得られた結果を図１０に示す。図１０に示したように、ＴＦＲ４３６抗体は、顕著に３ＴＦ１２及び３ＧＨ７より高い反応性を示した。３ＴＦ１２及び３ＧＨ７抗体より、ＴＦＲ４３６抗体のほうがＴＦＲ抗原に親和性が強いことを示唆した。【０１３８】
実施例１５：３ＴＦ１２、３ＧＨ７  ＩｇＧ抗体とのｉｎ  ｖｉｖｏ薬効比較
白血病細胞株細胞Ｋ５６２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３）を１０％ＦＢＳ添加したＲＰＭＩ１６４０培養液で培養した。移植時遠心により細胞を回収し、細胞を５×１０7/ｍＬになるようにＲＰＭＩ１６４０に懸濁した。ＳＣＩＤマウス（メス、７週齢、日本クレア)の右腹側部皮下に５×１０6個／マウスとなるように上記がん細胞懸濁液１００μＬ／匹で移植した。移植後、ノギスによる腫瘍径を測定し、下記の式により体積を求めた。腫瘍平均体積が１５０ｍｍ3以上に至る時点で、群分けソフト（ＥＸＳＡＳｖｅｒｓｉｏｎ７．６  シーエーシ）によりマウスの群分けを行った  （ｎ＝５）。それぞれの抗体投与群において、マウスに１ｍｇ/ｋｇのＴｆＲ４３５抗体、ＴｆＲ４３６抗体、３ＴＦ１２抗体、、３ＧＨ７Ｔ抗体を尾静脈より投与した。陰性コントロール群に０．２ｍＬ/２０ｇマウスでＰＢＳを尾静脈より投与した。投与は、週２回（３日または４日毎）、合計５回行った。投与後週２回ノギスによる腫瘍径の測定を行い、各群の腫瘍体積を求めた。抗腫瘍効果の判定は腫瘍体積により判定した。
腫瘍体積は下式にて算出した。
腫瘍体積＝（短径）2 ×  長径  ×  ０．５【０１３９】
投与各群の腫瘍体積平均値の経時的変化を図１１に示す。図１１に示したように、１ｍｇ/ｋｇの投与で、ＴｆＲ４３５、ＴｆＲ４３６抗体は腫瘍の増殖を著しく抑制したが、３ＴＦ１２、３ＧＨ７抗体は有意に腫瘍の増殖を抑制しなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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