(57)【要約】  本発明は、有効性の高いフィラグリン産生促進作用を有する物質を提供する。さらに、フィラグリン産生低下を伴う皮膚疾患、特に、アトピー性皮膚炎の治療に有用な治療薬を提供する。フィラグリン産生促進剤の探索を鋭意行った結果、Ａ）N-キノリルベンズアミド誘導体（化合物１）、Ｂ）イベルメクチン（化合物２）又はＣ）フェニルアラニンアミド誘導体（化合物３）が、皮膚におけるフィラグリンの産生を促進させ、角層の水分保持能やバリア機能を良好に改善することがわかった。本発明は、特定のN-キノリルベンズアミド誘導体又は製薬上許容されるその塩を有効成分として含有することを特徴とする、フィラグリン産生促進剤に関するものである。
2014017319.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
GPR142アゴニストを有効成分として含有するフィラグリン（FLG）産生低下に伴う疾患治療剤。
【請求項２】
FLG産生低下に伴う疾患が、皮膚疾患である請求項１記載の疾患治療剤。
【請求項３】
皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎である、請求項２記載の疾患治療剤。
【請求項４】
皮膚疾患が、尋常性魚鱗癬である、請求項２記載の疾患治療剤。
【請求項５】
GPR142アゴニストが、N-(4-アミノ-2-メチル-6-キノリル)-2-[(4-エチルフェノキシ)メチル]ベンズアミド又は製薬上許容されるその塩である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の疾患治療剤。
【請求項６】
GPR142アゴニストが、下記一般式（I）表される化合物又は製薬上許容されるその塩である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の疾患治療剤。
2014017319.tif 000006
[式中、R1及びR2は各々について水素原子、ハロゲン原子又は炭素数1〜3のアルキル基を表し、R3は炭素数1〜3のアルキル基を表し、R4は炭素数1〜3のアルコキシカルボニル基又はヒドロキシカルボニル基を表し、R5、R6及びR7は各々について水素原子又はハロゲン原子を表す。]
【請求項７】
請求項６記載の一般式（I）において、R1及びR2は水素原子を表し、R3はメチル基を表し、R4はエトキシカルボニル基又はヒドロキシカルボニル基を表し、R5、R6及びR7は水素原子を表すものである、請求項６記載の疾患治療剤。
【請求項８】
GPR142アゴニストが、イベルメクチンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の疾患治療剤。
【請求項９】
FLG産生低下に伴う疾患の症状を改善するためのFLG産生低下に伴う疾患治療剤であって、GPR142アゴニストを有効成分として含有することを特徴とするFLG産生低下に伴う疾患治療剤。
【請求項１０】
FLG産生低下に伴う疾患が、皮膚疾患である請求項９記載の疾患治療剤。
【請求項１１】
アトピー性皮膚炎に伴う皮膚の角層の水分保持能及び／又はバリア機能低下を改善するためのアトピー性皮膚炎治療剤であって、GPR142アゴニストを有効成分として含有することを特徴とするアトピー性皮膚炎治療剤。
【請求項１２】
GPR142アゴニストを有効成分として含有する、FLG産生促進剤。
【請求項１３】
FLG産生低下に伴う疾患の症状を呈する患者に、GPR142アゴニストを有効成分として含有する薬剤を有効量投与して、当該患者の症状を改善することを特徴とするFLG産生低下に伴う疾患を治療する方法。
【請求項１４】
FLG産生が低下しているアトピー性皮膚炎患者に、GPR142アゴニストを有効成分として含有する薬剤を有効量投与して、当該患者のアトピー性皮膚炎に伴う皮膚の角層異常を改善することを特徴とするアトピー性皮膚炎を治療する方法。
【請求項１５】
被験物質がGPR142の活性又は発現を促進し得るか否かを評価することを含む、FLG産生低下に伴う疾患治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１６】
以下の(a)〜(c)の工程を含む、請求項１５記載のスクリーニング方法。
(a) GPR142発現細胞又はその膜画分と被験物質とを接触させる工程、
(b)当該被験物質と接触させた後の当該細胞又はその膜画分におけるGPR142の活性又は発現を測定する工程、及び
(c)当該細胞又はその膜画分におけるGPR142の活性又は発現を促進し得る物質を選択する工程。
【請求項１７】
FLG産生低下に伴う疾患が皮膚疾患である、請求項１５又は１６記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎である、請求項１７記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
GPR142発現細胞が、GPR142遺伝子を含む発現ベクターで形質転換して得られたものである、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】
GPR142遺伝子が、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するヒトGPR142遺伝子又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつGPR142の活性を保持するヒトGPR142の機能的改変体をコードする遺伝子である、請求項１９記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のG蛋白質共役型受容体（G protein-coupled receptor: GPR）アゴニストを有効成分とするフィラグリン（filaggrin: FLG）産生促進剤及びフィラグリン産生低下に伴う疾患治療剤、並びに、当該治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮の最外層に位置する数層から数十層に規則正しく重なる角層（角質層）は、外部からの物質やアレルゲンの侵入、紫外線などに対するバリア層として機能している。また、角層は、外部環境の乾燥から身を守るため、体内からの水分を放出するのを抑制する作用とその角層自身の水分を保持する作用を持っている。角層自身の水分を保持する作用を有するものとしては天然保湿因子（natural moisturizing factor: NMF）が知られている。このNMFの主成分であるアミノ酸は、特に角層における水分量と高い相関性が知られており、角層の水分保持には極めて重要である。このアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒由来のフィラグリンが角層内で分解することによって産生される。フィラグリンは、表皮ケラチノサイトにおいてプロフィラグリンとして発現し、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積する。このプロフィラグリンは、約400KDaのヒスチジンリッチの蛋白質で、324個のアミノ酸からなるフィラグリン（以下、単に「FLG」又は「FLGモノマー」ともいう。）を繰り返し単位として、タンデムに10〜12個結合したものである。その後、プロフィラグリン（プロFLG）は脱リン酸及び加水分解を経てFLGへと分解されて角層に移行する。角層においてFLGはケラチンフィラメントの凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与している（J. Invest. Dermatol. (1994) 103(5): 731-740、J. Cell Science (2009) 122(9): 1285-1294）。このようにFLGは皮膚のバリア機能において重要な役割を果たしている。【０００３】
FLGと皮膚疾患との関係についての多くの報告がなされている。例えば、FLGの遺伝子変異が尋常性魚鱗癬を引き起こすことやアトピー性皮膚炎発症の主要因子であることが報告されている（Nature Genetics (2006) 38: 337-342、Nature Genetics (2006) 38: 441-446、J. Allergy Clin. Immunol. (2007) 119(2): 434-44 ）。魚鱗癬は、皮膚の表面が魚の鱗の状態で硬くなり剥がれ落ちる角質形成異常の先天性皮膚疾患である。表皮の角化がうまくいかないため、皮膚の保湿機能が低下し、外部からのアレルゲン等の侵入を防ぐ機能が損なわれる。また、日本のアトピー性皮膚炎患者において、患者全体の約1/3がFLG遺伝子変異を有しているとの報告がある（British Journal of Dermatology (2009) 161: 1387-1390）。【０００４】
アトピー性皮膚炎は、先進国では小児の約20％に認められる高頻度の難治性アレルギー疾患である。アトピー性皮膚炎の原因はまだ不明であり、遺伝的要因に加えて、環境要因、食物、精神的ストレス、全身及び局所の感染など様々な要素が関与すると考えられている。アトピー性皮膚炎は、IgE抗体量が上昇しているタイプ（外因性アトピー皮膚炎）と正常なタイプ（内因性アトピー皮膚炎）に分けることができる。内因性アトピー皮膚炎は、精神的ストレスなどの要因によるもので、このタイプではFLG遺伝子の変化がない場合が多い。これに対し、外因性アトピー皮膚炎は、上述のようなFLG遺伝子の変異が関連することが多い。【０００５】
このようなアトピー性皮膚炎の治療の基本は、発症・悪化因子の除去、異常な皮膚機能の補正及び炎症を抑制するための薬物療法を組み合わせて行われている。また、アトピー性皮膚炎における主な皮膚機能異常として、角層の水分保持能・バリア機能の低下、痒み閾値の低下、易感染性が挙げられる。【０００６】
角層の水分保持能・バリア機能の低下と痒み閾値の低下、易感染性に対する薬物療法は、その処方対象及び処方時期等において区別される。一般に痒みには、ヒスタミンや好酸球が産生する痒み物質が関与する末梢性の痒みとオピオイド受容体が関与する中枢性の痒みがある。このような痒みを治療する薬剤は、痒みの程度によって処方されるものである。痒みの程度は、「痒みを感じない」から「痒みを我慢できない」までの段階に分けて診断され、我慢できない程度の痒みが発症したときに鎮痒剤が処方される。また、アトピー性皮膚炎患者は、伝染性膿痂疹、単純ヘルペス、伝染性軟属腫など皮膚の感染症に罹りやすい、すなわち易感染性と診断された場合は、それらの感染に対する薬剤がそれぞれ処方される。一方、角層の水分保持能・バリア機能の低下に対する薬剤は、痒みの程度や痒みの発症時期、或いは、感染症発症時期に関わりなく、FLG産生の低下により角層の水分保持能やバリア機能が低下しているアトピー性皮膚炎患者に対して処方される。【０００７】
アトピー性皮膚炎において、FLG産生が低下する原因として、FLG遺伝子変異のほかに、FLG遺伝子に変異がない場合でも、何らかの理由でTh1細胞とTh2細胞の平衡バランスがTh2細胞優位側に傾き、IL-4、IL-13などのTh2サイトカインが過剰に産生され、FLGの発現を低下させることが知られている（非特許文献１：J. Investigative Dermatology (2008) 128: 2248-2258）。【０００８】
これまで、FLGの産生を促進する成分としては、ケブラニン類（特許文献１：特開2009-256269号公報）、リクイリチン（特許文献２：特開2003-146886号公報）、糖脂質類（特許文献３：特開2006-241095号公報）、ロズマリン酸及びエリオジクチオール-7-O-ルチノシド（特許文献４：特開2010-90037号公報）等の天然由来成分が提案されているが、更にアトピー性皮膚炎等の皮膚疾患の治療／予防に用いることができるような、安全で有効性の高いFLG産生促進作用を有する物質の開発が望まれている。しかしながら、そのような物質の標的受容体は不明であり、従って未だ系統的にFLG産生促進作用を有する物質のスクリーニングはできないのが現状である。【０００９】
G蛋白質共役型受容体142（以下、単に「GPR142」という。）は、ロドプシンファミリーに属するオーファンG蛋白質共役型受容体（オーファンGPR）である。ヒトGPR142は462個のアミノ酸配列からなる蛋白質である（FEBS Letters 554 (2003) 381-388）。マウスのPgr（GPR142）はランゲルハンス島に発現していることが報告されている（Cell 135, 561-571, Supplemental Data (2008)）。また、マウスのGPR142のmRNAは脳、脾臓、肝臓、腎臓、精巣において発現していることが報告されている（Neuropharmacology 50 (2006): 512-520）。また、Nutrition & Metabolism (2008) 5: 23には、ゼブラフィッシュのGPR142aをアンチセンスでノックダウンしたところ、脂肪の有意な減少が見られたことから、GPR142のアンタゴニストが抗肥満治療の候補薬となり得ることが記載されている。また、242nd ACS National Meeting & Exposition, Denver, CO, United States, August 28-September 1, 2011 (2011), MEDI-134及びMEDI-135には、GPR142が膵臓のβ細胞に発現しており、II型糖尿病治療用のGPR142アゴニストとしてのフェニルアラニン誘導体及びアミノピラゾールフェニルアラニンが、GPR142依存的にインスリンの分泌を促進することの報告がなされており、それらの化合物が特許文献５（国際公開WO2010/093849号パンフレット）に記載されている。しかしながら、本発明者らの知る限り、GPR142とFLG産生効果との関連について記載する報告はない。もとより、GPR142アゴニストがFLGの産生を促進することや皮膚疾患治療に用いられることについて記載する報告もない。【００１０】
特許文献６（特開2004-175687号公報）には、ヘアレスマウスの皮膚にテープストリッピングを施して物理的に皮膚バリア破壊した後、サイクリックAMP（環状AMP又はcAMP）アンタゴニストを塗布することによって細胞内カルシウムのレベルを低下させ、当該バリアを回復することが記載されている。しかしながら、cAMPアンタゴニストがFLGの産生低下に伴う皮膚バリア破壊を回復することついての記載も、FLGの産生がGPR142を介して促進されることについての記載もない。【００１１】
特許文献７（国際公開WO2002/074341号パンフレット）には、N-(4-アミノ-2-メチル-6-キノリル)-2-[(4-エチルフェノキシ)メチル]ベンズアミドを含むN-キノリルベンズアミド誘導体などのノシセプチンアンタゴニストを、掻痒を伴う疾患、局所性掻痒症、結節性痒疹等、数多くの疾患などに伴って起こる痒みの予防や治療のための鎮痒剤として使用することが記載されている。そして、掻痒を伴う数多くの疾患の中の例示の一つとしてアトピー性皮膚炎が挙げられている。しかしながら、特許文献７には、N-キノリルベンズアミド誘導体にFLG産生促進効果があることも、GPR142に関する記載も、皮膚の水分保持能やバリア機能低下を改善してアトピー性皮膚炎等の皮膚疾患を治療する薬剤として使用し得ることを予測させるような記載も示唆もない。また、特許文献７には、具体的にアトピー性皮膚炎に伴って起こる痒みのモデルでの試験例もない。【００１２】
特許文献８（特許第3013989号公報、特開平11-335355号公報）には、ノシセプチンアンタゴニストとして、N-(4-アミノ-2-メチル-6-キノリル)-2-[(4-エチルフェノキシ)メチル]ベンズアミドを含むN-キノリルベンズアミド誘導体が開示されているが、その用途としては鎮痛剤が挙げられているものの、GPR142に関する記載もFLG産生促進効果についての記載もない。【００１３】
イベルメクチンは、商品名ストロメクトールとして、腸管糞線虫症及び疥癬の治療薬として販売されている。その他、イベルメクチンがアレルギー性喘息のマウスモデルに対する効果が報告されている（Inflammation Research (2011) 60(6): 589-596）が、GPR142に関する記載もFLG産生促進効果についての記載もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開2009-256269号公報
【特許文献２】特開2003-146886号公報
【特許文献３】特開2006-241095号公報
【特許文献４】特開2010-90037号公報
【特許文献５】国際公開WO2010/093849号パンフレット
【特許文献６】特開2004-175687号公報
【特許文献７】国際公開WO2002/074341号パンフレット
【特許文献８】特許第3013989号公報、特開平11-335355号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】J. Investigative Dermatology (2008) 128: 2248-2258
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、フィラグリン（FLG）産生促進剤及びFLG産生低下に伴う疾患、特に、アトピー性皮膚炎等の皮膚疾患の治療に有用な治療剤を提供することを課題とする。さらに、当該治療剤として有用な物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、FLG産生促進剤の探索及び当該FLG産生促進剤の標的受容体の探索を鋭意行った結果、特定のG蛋白質共役型受容体（GPR）を介してFLGの産生が促進されることを見出した。さらに、特定のGPRのアゴニスト作用を有する化合物が、皮膚におけるFLGの産生を促進させ、角層の水分保持能及び／又はバリア機能を良好に改善することを見出し、本発明を完成した。【００１８】
即ち本発明は、以下よりなる。
１．GPR142アゴニストを有効成分として含有するフィラグリン（FLG）産生低下に伴う疾患治療剤。
２．FLG産生低下に伴う疾患が、皮膚疾患である前項１記載の疾患治療剤。
３．皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎である、前項２記載の疾患治療剤。
４．皮膚疾患が、尋常性魚鱗癬である、前項２記載の疾患治療剤。
５．GPR142アゴニストが、N-(4-アミノ-2-メチル-6-キノリル)-2-[(4-エチルフェノキシ)メチル]ベンズアミド又は製薬上許容されるその塩である、前項１〜４のいずれか１項に記載の疾患治療剤。
６．GPR142アゴニストが、下記一般式（I）表される化合物又は製薬上許容されるその塩である、前項１〜４のいずれか１項に記載の疾患治療剤。
【化１】
2014017319.tif 000003
[式中、R1及びR2は各々について水素原子、ハロゲン原子又は炭素数1〜3のアルキル基を表し、R3は炭素数1〜3のアルキル基を表し、R4は炭素数1〜3のアルコキシカルボニル基又はヒドロキシカルボニル基を表し、R5、R6及びR7は各々について水素原子又はハロゲン原子を表す。]
７．前項６記載の一般式（I）において、R1及びR2は水素原子を表し、R3はメチル基を表し、R4はエトキシカルボニル基又はヒドロキシカルボニル基を表し、R5、R6及びR7は水素原子を表すものである、前項６記載の疾患治療剤。
８．GPR142アゴニストが、イベルメクチンである、前項１〜４のいずれか１項に記載の疾患治療剤。
９．FLG産生低下に伴う疾患の症状を改善するためのFLG産生低下に伴う疾患治療剤であって、GPR142アゴニストを有効成分として含有することを特徴とするFLG産生低下に伴う疾患治療剤。
１０．FLG産生低下に伴う疾患が、皮膚疾患である前項９記載の疾患治療剤。
１１．アトピー性皮膚炎に伴う皮膚の角層の水分保持能及び／又はバリア機能低下を改善するためのアトピー性皮膚炎治療剤であって、GPR142アゴニストを有効成分として含有することを特徴とするアトピー性皮膚炎治療剤。
１２．GPR142アゴニストを有効成分として含有する、FLG産生促進剤。
１３．FLG産生低下に伴う疾患の症状を呈する患者に、GPR142アゴニストを有効成分として含有する薬剤を有効量投与して、当該患者の症状を改善することを特徴とするFLG産生低下に伴う疾患を治療する方法。
１４．FLG産生が低下しているアトピー性皮膚炎患者に、GPR142アゴニストを有効成分として含有する薬剤を有効量投与して、当該患者のアトピー性皮膚炎に伴う皮膚の角層異常を改善することを特徴とするアトピー性皮膚炎を治療する方法。
１５．被験物質がGPR142の活性又は発現を促進し得るか否かを評価することを含む、FLG産生低下に伴う疾患治療剤のスクリーニング方法。
１６．以下の(a)〜(c)の工程を含む、前項１５記載のスクリーニング方法。
(a) GPR142発現細胞又はその膜画分と被験物質とを接触させる工程、
(b)当該被験物質と接触させた後の当該細胞又はその膜画分におけるGPR142の活性又は発現を測定する工程、及び
(c)当該細胞又はその膜画分におけるGPR142の活性又は発現を促進し得る物質を選択する工程。
１７．FLG産生低下に伴う疾患が皮膚疾患である、前項１５又は１６記載のスクリーニング方法。
１８．皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎である、前項１７記載のスクリーニング方法。
１９．GPR142発現細胞が、GPR142遺伝子を含む発現ベクターで形質転換して得られたものである、前項１５〜１８のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
２０．GPR142遺伝子が、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するヒトGPR142遺伝子又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつGPR142の活性を保持するヒトGPR142の機能的改変体をコードする遺伝子である、前項１９記載のスクリーニング方法。【００１９】
また、本発明の他の態様として、以下よりなる。 
（Ａ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有するFLG産生促進用医薬組成物。
（Ｂ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する角層異常改善用医薬組成物。
（Ｃ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する皮膚保湿用医薬組成物。
（Ｄ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する皮膚バリア機能改善用医薬組成物。
（Ｅ）アトピー性皮膚炎の予防又は治療に用いられるものである、前記（Ａ）〜（Ｄ）記載の医薬組成物。
（Ｆ）疾患が尋常性魚鱗癬の予防又は治療に用いられるものである、前記（Ａ）〜（Ｄ）記載の医薬組成物。
（Ｇ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有するFLG産生低下に伴う疾患の予防用又は治療用医薬組成物。
（Ｈ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する角層異常を伴う疾患の予防用又は治療用医薬組成物。
（Ｉ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する皮膚水分保持能低下を伴う疾患の予防用又は治療用医薬組成物。
（Ｊ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する皮膚バリア機能低下を伴う疾患の予防用又は治療用医薬組成物。
（Ｋ）疾患がアトピー性皮膚炎である、前記（Ｇ）〜（Ｊ）記載の医薬組成物。
（Ｌ）疾患が尋常性魚鱗癬である、前記（Ｇ）〜（Ｊ）記載の医薬組成物。
（Ｍ）FLG産生低下に伴う疾患の予防若しくは治療のためのGPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩。
（Ｎ）角層異常を伴う疾患の予防若しくは治療のためのGPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩。
（Ｏ）皮膚水分保持能低下を伴う疾患の予防若しくは治療のためのGPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩。
（Ｐ）皮膚バリア機能低下を伴う疾患の予防若しくは治療のためのGPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩。
（Ｑ）予防若しくは治療の対象がアトピー性皮膚炎患者に含まれるものである、前記（Ｍ）〜（Ｐ）記載の化合物又はその塩。
（Ｒ）予防若しくは治療の対象が尋常性魚鱗癬患者に含まれるものである、前記（Ｍ）〜（Ｐ）記載の医薬組成物。
（Ｓ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩の有効量を対象に投与することからなるFLG産生促進方法。
（Ｔ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩の有効量を対象に投与することからなる角層異常を伴う疾患の予防若しくは治療方法。
（Ｕ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩の有効量を対象に投与することからなる皮膚水分保持能低下を伴う疾患の予防若しくは治療方法。
（Ｖ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩の有効量を対象に投与することからなる皮膚バリア機能低下を伴う疾患の予防若しくは治療方法。
（Ｗ）対象がFLG産生低下に伴うアトピー性皮膚炎患者である、前記（Ｓ）〜（Ｖ）記載の方法。
（Ｘ）対象が尋常性魚鱗癬患者である、前記（Ｓ）〜（Ｖ）記載の方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係るGPR142アゴニストは、皮膚におけるFLGの産生を促進させ、角層の水分保持能やバリア機能を良好に改善し、FLG産生促進剤の有効成分として作用することが確認された。また、FLG産生低下に伴う疾患治療剤、特に、アトピー性皮膚炎等の皮膚疾患の治療剤の有効成分としても作用しうる。また、GPR142を標的とすることにより、FLG産生低下に伴う疾患治療剤を系統的にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】（ａ）化合物１、化合物１＋カルシウム、（ｂ）比較化合物１、比較化合物１＋カルシウム、（ｃ）化合物１、比較化合物２によるFLGプロモーターの転写活性効果を、ルシフェラーゼアッセイにより確認した図である。（実施例１）
【図２】NHEK細胞を予めカルシウム処理をした場合としない場合における、化合物１及び化合物２によるFLG mRNAの発現上昇効果を、リアルタイムPCRにより確認した図である。（実施例２）
【図３】化合物１又は化合物１＋カルシウム処理によるNHEK細胞におけるGPR142及びGPR22のmRNAの発現を、リアルタイムPCRにより確認した図である。（実施例４）
【図４】GPR142のRNAi存在下に、化合物１又は化合物１＋カルシウム処理によるNHEK細胞におけるGPR142 mRNA及びFLG mRNAの発現量を、リアルタイムPCRにより確認した図である。（実施例５）
【図５】GPR142のRNAi存在下に、化合物１、化合物２又は化合物３処理によるNHEK細胞におけるGPR142 mRNA及びFLG mRNAの発現量を、リアルタイムPCRにより確認した図である。（実施例６）
【図６】GPR22のRNAi存在下に、化合物１又は化合物１＋カルシウム処理によるNHEK細胞におけるGPR22 mRNA及びFLG mRNAの発現量を、リアルタイムPCRにより確認した図である。（参考例１）
【図７】GPR142過剰発現NHEK細胞における化合物１によるFLG mRNA及びGPR142 mRNAの発現を、リアルタイムPCRにより確認した図である。（実施例７）
【図８】GPR142過剰発現HEK293T細胞における化合物１によるアデニル酸シクラーゼ活性に対する作用を確認した図である。（実施例８）
【図９】GPR142過剰発現HEK293T細胞における化合物２、化合物３又は比較化合物２によるアデニル酸シクラーゼ活性に対する作用を確認した図である。（実施例９）
【図１０】三次元培養皮膚における化合物１又は比較化合物２によるFLG mRNAの発現上昇効果を、リアルタイムPCRにより確認した図である。（実施例１０）
【図１１】三次元培養皮膚における化合物１、比較化合物２又は比較化合物３によるFLGモノマーの産生能をイムノブロッティング法で確認した写真図である。（実施例１１）
【図１２】ヒト正常皮膚における化合物１によるFLG蛋白の産生状況を、組織免疫染色により確認した写真図である。（実施例１２）
【図１３】FLG遺伝子欠損ホモ及びヘテロモデルマウスに化合物１を投与したときのFLGモノマーの産生能をイムノブロッティング法で確認した写真図である。（実施例１３）
【図１４】アトピー性皮膚炎発症モデルマウス（NC/Nga）に化合物１を投与したときの臨床症状の経時変化を示す図である。（実施例１４の(i)）
【図１５】アトピー性皮膚炎発症モデルマウス（NC/Nga）に化合物１を投与したときの経皮水分蒸散量（TEWL）の測定結果を示す図である。(a)は投与開始から８週間後、(b)は１２週間後の結果を示す。（実施例１４の(ii)）
【図１６】アトピー性皮膚炎発症モデルマウス（NC/Nga）に化合物１を投与開始後１２週間目における当該マウスの外観を表す写真図である。(a)は対照マウス、(b)は化合物１投与マウスの結果を示す。（実施例１４の(iii)）
【図１７】アトピー性皮膚炎モデルマウス（NC/Nga）に化合物１を投与したときのFLGモノマーの産生能をイムノブロッティング法で確認した結果を示す。（実施例１５）
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明者らは、後述の実施例に記載するように、G蛋白質共役型受容体(GPR)の一種であるGPR142を介してFLGの産生が促進されることを初めて見出した。本明細書において、GPR142依存的な細胞内シグナル伝達を介してFLGの産生を促進しうる物質を「GPR142アゴニスト」ということとする。GPR142アゴニストはFLG産生促進剤として有効であり、FLG産生低下に伴う疾患治療剤に使用し得る。
【００２３】
また、GPR142を介してFLGの産生が促進されることから、このGPR142を標的受容体としてGPR142アゴニストを同定することによって、FLG産生促進剤を系統的にスクリーニングすることができる。同定されたGPR142アゴニストは、FLG産生低下に伴う疾患治療剤として有用である。
【００２４】
本発明は、GPR142アゴニストを有効成分として含有することを特徴とする、FLG産生促進剤及びFLG産生低下に伴う疾患治療剤等の薬剤に関する。本発明薬剤の有効成分であるGPR142アゴニストは、GPR142に作用し、当該受容体を介してFLG mRNA及びFLG蛋白質の産生を促進しうる。本発明薬剤の有効成分であるGPR142アゴニストは、好ましくは、FLG蛋白質（すなわち、FLGモノマー）の産生を促進しうる。本発明は、GPR142アゴニストを細胞（好ましくは皮膚細胞）に接触させることにより、FLGの産生を促進する方法も包含する。
【００２５】
本発明において、GPR142アゴニストとしては、例えば、N-(4-アミノ-2-メチル-6-キノリル)-2-[(4-エチルフェノキシ)メチル]ベンズアミド又は製薬上許容されるその塩が挙げられる。
【００２６】
また本発明において、GPR142アゴニストとして、特許文献５（WO2010/093849号パンフレット）に記載されているようなフェニルアラニン誘導体又はアミノピラゾールフェニルアラニン又は製薬上許容されるそれらの塩が挙げられる。具体的には、例えば、下記一般式（I）表わされる化合物又は製薬上許容されるその塩が好ましい。
【化１】
2014017319.tif 000004
[式中、R1及びR2は各々について水素原子、ハロゲン原子又は炭素数1〜3のアルキル基を表し、R3は炭素数1〜3のアルキル基を表し、R4は炭素数1〜3のアルコキシカルボニル基又はヒドロキシカルボニル基を表し、R5、R6及びR7は各々について水素原子又はハロゲン原子を表す。]
【００２７】
好ましくは、上記一般式（I）において、R1及びR2は水素原子を表す。また好ましくは、R3はメチル基を表す。好ましくは、R4はメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基又はヒドロキシカルボニル基を表す。好ましくは、R5、R6及びR7は水素原子を表す。一般式（I）で表される化合物としては、最も好ましくは、メチル2-(1-(1-メチル-3-(ピリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-5-イルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)アセテート 2塩酸塩、エチル2-(1-(1-メチル-3-(ピリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-5-イルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)アセテート 2塩酸塩、2-(1-(1-メチル-3-(ピリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-5-イルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)酢酸 2塩酸塩が挙げられる。
【００２８】
さらに本発明において、GPR142アゴニストとして、イベルメクチンが挙げられる。具体的には、22,23-ジヒドロアベルメクチン（dihydroavermectin）B1a 90％以上と22,23-ジヒドロアベルメクチンB1b 10％以下の混合物が挙げられる。その他、欧州特許第0001689B1号公報やUS2010/0004200A1号公報に記載されているようなものも使用することができる。
【００２９】
本明細書において、「製薬上許容されるその塩」とは、医薬品に使用可能であり、本発明疾患治療剤の有効成分であるGPR142アゴニスト、例えば上記一般式（I）で示される化合物と塩を形成するものであればいかなる塩でもよく、例えば塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸等の無機酸；又はシュウ酸、マロン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、マンデル酸、酢酸、プロピオン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸と反応させることにより得ることができる。本発明においては、塩酸塩が好ましい。なお、本発明においては各化合物の含水物あるいは水和物及び溶媒和物、結晶多形も包含される。
【００３０】
また、本発明のGPR142アゴニストに係る各化合物のプロドラッグ及び代謝物も包含される。「プロドラッグ」とは、化学的又は代謝的に分解し得る基を有し、生体に投与された後、元の化合物に復元して本来の薬効を示す本発明化合物の誘導体であり、共有結合によらない複合体及び塩を含む。
【００３１】
本発明において、GPR142アゴニストを医薬製剤として用いる場合、通常それ自体公知の製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、その他添加剤、具体的には水、植物油、エタノール又はベンジルアルコール等のアルコール、ポリエチレングリコール、グリセロールトリアセテート、ゼラチン、ラクトース、デンプン等の炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラノリン、ワセリン等と混合して用いることができる。医薬製剤としては、液剤、ロ−ション剤、懸濁剤、乳剤、軟膏剤、ゲル剤、カプセル剤、錠剤、糖衣錠、顆粒剤、坐剤、などが挙げられる。所望により、これらの製剤に、佐剤、安定剤、湿潤又は乳化剤、緩衝剤、その他常用の添加剤を配合しうる。
【００３２】
本発明治療剤の有効成分であるGPR142アゴニストは、FLG産生促進作用を有することから、FLG産生低下に伴う疾患、好ましくは、皮膚疾患治療剤として用いられる。FLG産生低下に伴う皮膚疾患の例として、例えばアトピー性皮膚炎、尋常性魚鱗癬、金属（ニッケル）アレルギー接触性皮膚炎（J. Investigative Dermatology (2008) 128: 1430-1435）、皮脂欠乏性湿疹（老人性乾皮症）（Arch Dermatol Res. (2004) 295: 448-452）等が挙げられるが、FLG産生低下に伴う皮膚疾患であれば、上記に限定されるものではない。
【００３３】
背景技術の欄でも詳述したように、アトピー性皮膚炎における主な皮膚機能異常として、角層の水分保持能・バリア機能の低下、痒み閾値の低下、易感染性が挙げられるが、本発明のGPR142アゴニストは、特にアトピー性皮膚炎に伴う皮膚の角層の水分保持能及び／又はバリア機能の低下を改善するためのアトピー性皮膚炎治療剤として有用である。
【００３４】
本明細書において、角層異常とは、角層の水分保持能すなわち保湿機能が損なわれている状態、角層のバリア機能が低下し、外部からのアレルゲン等の侵入を防ぐ機能が損なわれている状態をいう。
角層は、外界との境となり、外界からの内部の防御（乾燥などの外部環境から身を守るために体内からの水分放出を調整する作用や角層自身の水分を保持する作用）や内部物質の保持（外部からの物質やアレルゲンの侵入、紫外線などに対するバリア層としての作用）などの機能を持っている。例えば、アトピー性皮膚炎では皮膚の炎症のない部分でも毛孔一致性の丘疹を伴う皮膚の乾燥（カサカサ）が認められ、体表面の１平方メートルあたりから、皮膚表面から１時間に蒸散する水分量、即ち経皮水分蒸散量（transepidermal water loss: TEWL）を測定すると健常人（7.4g/h・m2程度）に比べて上昇している。従って、本発明において、角層の水分保持能及び／又はバリア機能の確認は、経皮水分蒸散量や皮膚の乾燥（カサカサ）の程度を測定することにより行うことができる。
【００３５】
ヒトにおける皮膚の水分保持能やバリア機能の測定方法は、以下の方法により行うことができる。水分保持能の測定は、例えば、J. Dermatology (2011) 38: 685-692に記載された方法に従って、行うことができる。具体的には、以下の手順による。被検体を室温21℃、湿度50±5％の部屋に20分間静置する。その際、被検体には試験用T-シャツを着用させる。試験用T-シャツを脱いだ5分後に、試験用T-シャツを水分蒸散測定装置によって経皮水分蒸散量（TEWL）を測定する、或いは、角層水分測定装置によって皮膚コンダクタンス（SCWC）を測定する。バリア機能の測定は、例えば、J. Dermatology (2011) 38: 685-692に記載された方法に従って行うことができる。具体的には、（i）視診により皮膚の乾燥（カサカサ）の程度を５段階（乾燥程度：（0）null（なし）；（1）modest（少し粗い）；（2）moderate（粗い）；（3）severe（角層の剥がれがあり明らかに粗い）；（4）significant（著明））に分けて診断する、或いは、（ii）角層の変化をダーモスコピーにより観察して、角層の異常を５段階（（0）null（滑らか）；（1）modest（少し粗い）；（2）moderate（粗い）；（3）severe（角層の剥がれがあり明らかに粗い）；（4）significant（著明））に分けて診断することができる。
【００３６】
さらに、FLG産生低下の判断は、皮膚におけるFLGのmRNA量（例えば、PCR法）やFLGの蛋白量（例えば、ウエスタンブロット法）を測定することによって行うことができる。或いは、FLG産生の低下の程度は水分蒸散量や皮膚の乾燥の程度と相関する（J. Invest. Dermatol. (2009) 129(3):682-689）ので、上記の水分蒸散量を測定する方法や視診によって皮膚のカサカサ（乾燥）の程度を評価する方法などにより行うことができるが、視診によって皮膚のカサカサ（乾燥）の程度を評価して調べる方法が簡便で便利である。
【００３７】
本発明の薬剤の投与方法としては特に制限はなく、目的に応じて適宜決定されるが、例えば経口、動脈内、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、経皮、経粘膜などの投与方法を挙げることができる。本発明の薬剤の剤形としては特に制限はなく、それぞれの目的に応じて適宜決定される。GPR142アゴニストを有効成分とする本発明の薬剤を経口投与する場合、例えば、１日の投与量としては、0.001〜100 mg/kg、好ましくは、0.1〜30 mg/kgの範囲で、薬剤を１日１回〜複数回、又は２〜４日に１回投与することができる。静脈内投与する場合は、１日の投与量としては、約0.0001〜10 mg/kgが適当で、１日１回〜複数回に分けて投与することができる。また、経皮剤としては、体重当たり約0.001〜100 mg/kgを１日１回〜複数回に分けて投与することができる。投与量は症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。本発明の治療剤によれば、後述の実施例に示すように、FLGの産生が促進される。また、アトピー性皮膚炎に伴う皮膚の角層異常（水分保持能及び／又はバリア機能低下）が改善される。
【００３８】
また本発明は、FLG産生低下に伴う疾患治療剤のスクリーニング方法にも及ぶ。後述の実施例に示すように、GPR142依存的な細胞内シグナル伝達を介してFLGの産生が促進されることから、GPR142を標的受容体としてGPR142アゴニストを同定することによって、FLG産生促進剤を系統的にスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法で同定されたGPR142アゴニストは、FLG産生低下に伴う疾患治療剤として有用である。
【００３９】
本発明のFLG産生低下に伴う疾患治療剤のスクリーニング方法は、GPR142の活性又は発現を促進し得るか否かを評価する工程を含み、例えば、GPR142を発現する細胞（「GPR142発現細胞」とも称する）を用いて行うことができる。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法に用いる、「GPR142発現細胞」は、GPR142ポリペプチドを内在的に発現している天然の細胞（例えば、正常ヒト表皮角化細胞（NHEK））や、GPR142遺伝子が導入された形質転換細胞のいずれであってもよく、細胞の形質転換方法としては当該分野で公知の種々の方法を使用することができる。本発明の方法においては、これらの細胞を用いることが好適であるが、GPR142を含む当該細胞の膜画分を使用することもできる。
細胞にGPR142を発現させるために使用する「GPR142遺伝子」としては、任意の哺乳動物由来のGPR142又はその活性を保持する機能的改変体をコードする遺伝子であればよく、特に限定されないが、ヒトGPR142をコードする遺伝子を使用するのが好ましい。具体的には、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するヒトGPR142、又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と90％以上、好ましくは、95％以上、特に好ましくは、98％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつGPR142の活性を保持するヒトGPR142改変体をコードする塩基配列からなるヒトGPR142遺伝子を用いることができる。具体的には、GenBank accession number：NM_181790、AY288421（FEBS Lett. 554(3), 381-388(2003)）に示す配列に基づくヒトGPR142遺伝子が挙げられる。配列番号：２に記載の塩基配列を有するヒトGPR142遺伝子を特に好適に使用することができる。
【００４１】
本発明の方法で使用されるGPR142遺伝子が導入された「GPR142発現細胞」は、例えば、宿主細胞に上記GPR142遺伝子を含む発現ベクターを導入して形質転換させることによって得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、昆虫細胞、動物細胞など公知のいずれのものも使用できるが、CHO細胞、COS細胞、HEK293（Human embryonic kidney293）細胞、NHEK（Normal Human Epidermal Keratinocytes）細胞、HaCaT（Human Skin keratinocyte）細胞、FreeStyleTM293-F細胞（インビトロジェン社）などが好適に使用することができる。
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞の種類に応じたプロモーターを含むベクターを適宜選択する。ベクターとしては、例えば、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pCXN（Gene 108:193-199(1991)）、pUB110、pTP5、pC194、λファージ、レトロウイルス、バキュロウイルスなどが挙げられる。また、プロモーターとしてはTrpプロモーター、T7プロモーター、lacプロモーター、SPO1プロモーター、penPプロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、GALプロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、AGプロモーターなどが挙げられる。
プロモーターの下流に上記GPR142遺伝子を結合した発現ベクターで、公知の方法に従って宿主細胞を形質転換して、スクリーニングに使用する「GPR142発現細胞」を作製することができる。かくして得られる「GPR142発現細胞」の培養液及び培養条件は使用する細胞の種類によって公知の範囲で適宜選択することができる。
【００４２】
本発明のスクリーニング方法における「GPR142の活性」は、GPR142 依存的な細胞内シグナル伝達活性であり、被験物質が「GPR142の活性」を促進し得るか否かは、例えば、当該シグナル伝達における以下に例示するような種々の指標により評価することができる。
例えば、GPR142のシグナル伝達活性は、アデニル酸シクラーゼ活性を指標として測定することができる。アデニル酸シクラーゼ活性は、例えば、細胞内におけるcAMP濃度（量）の測定により測定することができる。具体的には、例えば、GPR142発現細胞を、フォルスコリン、NKH-477（Colforsin daropate）、IBMX（1-メチル-3-イソブチルキサンチン）などの存在下、或いは、予めそれらで処理して当該細胞内のcAMP量を上昇させた後に被験物質と接触させ、cAMP EIA System（GEヘルスケア）、LANCE(R) cAMP Detection Kit（Perkin Elmer）、cAMP cell-based assay（Cisbio）、環状AMP EIAキット（Cayman Chemical）など用いて細胞内のcAMP量を測定することができる。GPR142アゴニストはアデニル酸シクラーゼ活性を抑制するので、GPR142の活性が促進されるとcAMPの産生が抑制される。
【００４３】
また、GPR142発現細胞に、さらにCRE（cAMP response element）を介してルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子を結合したベクターを導入して共発現させた細胞を作製し、当該細胞をフォルスコリン、NKH-477、IBMXなどの存在下、或いは、予めそれらで処理した後に被験物質と接触させ、当該レポーター遺伝子の発現量を測定することもできる。
【００４４】
また、GPR142の刺激によって引き起こされるMAPキナーゼカスケードによりリン酸化されるERK1/2のレベルの増減を、SureFire pERK kit（PerkinElmer）、Phospho-ERK（Cisbio）などで測定、或いは、GPR142の刺激によって引き起こされるPI3K-AKT経路におけるAKTのリン酸化のレベルをPathScan(R)（CSTジャパン）、Phospho-AKT（Cisbio）、Pan Specific Phospho-Akt ELISA Kit（Cayman Chemical）などで測定することもできる。
【００４５】
また、常法に従い、Gq蛋白質のホスホリパーゼC促進活性を有する部分ポリペプチドとGi蛋白質のGPR142受容体との共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるG蛋白質キメラ（Gqi）を共発現させた形質転換細胞を作製し、当該細胞を被験物質と接触させ、カルシウムイオン濃度の変動を、例えば、FLEXstation（Molecular Devices）などで測定し、カルシウム濃度を指標とすることができる。
【００４６】
本発明のスクリーニング方法において、被験物質が「GPR142の発現」を促進し得るか否かは、被験物質を接触させたGPR142発現細胞におけるGPR142のmRNA又は蛋白質の量を測定することにより評価することができ、これは、当該細胞からGPR142のmRNAや蛋白質を抽出して、定量的PCRやウエスタンブロッティングなどの常法に従い測定することができる。
【００４７】
本発明のスクリーニング方法において、好ましくは、GPR142発現細胞において、被験物質不在下と比較して、被験物質存在下でGPR142の活性又は発現が増加された場合に、当該被験物質がGPR142の活性又は発現を促進する物質であると判定することができる。例えば、GPR142の活性を促進する物質としては、実施例に記載されるようなGPR142アゴニストと同程度に細胞内cAMP濃度を低下させる物質、具体的には、実施例９の条件下で10％以上、好ましくは20％以上低下させる物質を選択することが好ましい。また、GPR142の発現を促進する物質としては、実施例に記載されるようなGPR142アゴニストと同程度にGPR142のmRNAの発現量を増加させる物質、具体的には、実施例７の条件下で１．５倍以上、好ましくは２倍以上増加させる物質を選択することが好ましい。
また、本発明においては、上記の指標によりGPR142アゴニスト活性を有するとして選択された被験物質がFLG産生低下に伴う疾患の治療に有効であるかを判断する工程をさらに含んでいてもよい。FLG産生促進活性を有するGPR142アゴニストの治療効果は、例えば、実施例１０〜１４に示す方法により確認することができる。
【００４８】
かくして、GPR142アゴニストをスクリーニングすることで、FLG産生低下に伴う疾患治療剤をスクリーニングすることができる。本発明のGPR142アゴニストは、FLG産生促進作用を有することから、FLG産生低下に伴う疾患、好ましくは、皮膚疾患治療剤として用いられる。FLG産生低下に伴う皮膚疾患の例として、例えば、アトピー性皮膚炎、尋常性魚鱗癬、金属（ニッケル）アレルギー接触性皮膚炎、皮脂欠乏性湿疹（老人性乾皮症）等が挙げられるが、FLG産生低下に伴う皮膚疾患であれば、上記に限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
本発明の理解を深めるために、本発明を実施例に示してより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではないことはいうまでもない。【００５０】
以下の各実施例において、Ａ）N-キノリルベンズアミド誘導体（化合物１）、Ｂ）イベルメクチン（化合物２）及びＣ）フェニルアラニンアミド誘導体（化合物３）の効果を確認した。比較化合物として、下記のＤ）比較化合物１、Ｅ）比較化合物２及びＦ）比較化合物３のいずれかを用いた。【００５１】
Ａ）化合物１（N-キノリルベンズアミド誘導体）
N-(4-アミノ-2-メチル-6-キノリル)-2-[(4-エチルフェノキシ)メチル]ベンズアミド 塩酸塩（N-(4-Amino-2-methyl-6-quinolyl)-2-[(4-ethylphenoxy)methyl]benzamide hydrochloride;N-(4-Amino-2-methylquinolin-6-yl)-2-[(4-ethylphenoxy)methyl]benzamide hydrochloride）
Ｂ）化合物２
イベルメクチン（TOCRIS社）
Ｃ）化合物３（フェニルアラニンアミド誘導体）
メチル2-(1-(1-メチル-3-(ピリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-5-イルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)アセテート 2塩酸塩（Methyl 2-(1-(1-methyl-3-(pyridine-4-yl)-1H-pyrazol-5-ylamino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-ylamino)acetate dihydrochloride）
Ｄ）比較化合物１（J113397）（特許文献７に記載の化合物）
1-[(3R, 4R)-1-シクロオクチルメチル-3-ヒドロキシメチル-4-ピペリジル]-3-エチル-1,3-ジヒドロ-2H-ベンズイミダゾール-2-オン 塩酸塩（1-[(3R,4R)-1-(Cyclooctylmethyl)-3-(hydroxymethyl)-4-piperidyl]-3-ethyl-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one) hydrochloride）
Ｅ）比較化合物２（スクリプタイド（TOCRIS社））
6-(1,3-ジオキソ-1H,3H-ベンゾ[de]イソキノリン-2-イル)ヘキサン酸ヒドロキシアミド
（6-(1,3-Dioxo-1H,3H-benzo[de]isoquinolin-2-yl) hexanoic acid hydroxyamide）
Ｆ）比較化合物３（3M344（TOCRIS社））
4-ジメチルアミノ-N-（6-ヒドロキシカルバモイルヘキシル）-ベンズアミド（4-Dimethylamino-N-(6-hydroxycarbamoylhexyl) benzamide）【００５２】
（実施例１）FLGプロモーターの転写活性効果
本実施例では、NHEK細胞（正常ヒト新生児表皮角化細胞）を用いてN-キノリルベンズアミド誘導体（化合物１）によるFLGプロモーターの転写活性を確認した。FLGプロモーターの転写活性は、ルシフェラーゼアッセイにより行った。【００５３】
１） NHEK細胞（クラボウ社）1.2×105個/mlを96ウェルプレートに80μl/ウェル(9.6×103個/well)播種し、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（HuMedia-KG2, クラボウ社）に、hEGF (human Epidermal Growth Factor) (0.1 ng/ml)、インシュリン (10μg/ml)、ヒドロコルチゾン (0.5μg/ml), ゲンタマイシン (50μg/ml)、アムホテリシンB(50 ng/ml)及び BPE (bovine brain pituitary extract) (0.4％, v/v) を加えた培養液100μlを添加して、37℃、5％CO2の条件下にて培養した。
２）ルシフェラーゼレポーターベクター（pGL4 Luciferase Reporter Vectors, Promega社）のクローニングサイトに、FLG転写開始点（エクソン１上の「CTTTTGGTGAACAAG」）から約2.2Kb上流までのプロモーター領域を組み込んで、2.2Kb FLGプロモーターとルシフェラーゼを含むプラスミドDNAを作製した。FLG転写開始点から5'側上流のプロモーター領域を含む配列は、例えば、Ensembl Genome Browser 64：Homo sapiens-Exons-TranscriptのFLG-001（ENST00000368799）に記載されており、下記のホームページにより確認できる。
(http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Exons?db=core;g=ENSG00000143631;r=1:152274651-152297679;t=ENST00000368799)
上記１）の条件下にて培養１日後、96ウェルプレートの１ウェルあたり、上記プラスミドDNAを0.1μgをOPTI-MEM（Invitrogen社）10μlに加え、さらに導入用試薬（TransIT(R) -LT1 Transfection Reagent, Mirus社) 0.3μlを加えて、室温でNHEK細胞にトランスフェクションした。
３） 上記２）よりさらに培養１日後、下記Ａ）又はＢ）の薬剤をジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、１ウェルあたり1μMとなるように添加した。また、Ｃ）の薬剤を同様に１ウェルあたり1μM及び0.1μMとなるように添加した。さらに、Ａ）又はＢ）とカルシウム(Ca)を含む系についても確認した。CaとしてCaCl2（Ca換算で1.45 mM）を用いた。
Ａ）化合物１（N-キノリルベンズアミド誘導体）
Ｂ）比較化合物１（J113397）
Ｃ）比較化合物２（スクリプタイド）
対照例としては、溶媒のみ（対照）又はCaCl2のみ（カルシウム）とした。なお、Caイオンはin vitroでの皮膚角化細胞の分化促進に関与している。
４）上記３）の薬剤添加３日後、ルシフェラーゼアッセイ用試薬（Bright-Glo(R) Luciferase Assay System, Promega社）を使用し、そのプロトコールに従ってルシフェラーゼ活性を測定した。薬剤処理した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）にて2回洗浄後、DMEM培地（Invitrogen社）を50μl加え、次いで、Bright-Glo(R) 試薬を50μl加えた。２分静置後、その70μlについてルシフェラーゼの吸光度を測定した。
図１（ａ）（ｂ）及び（ｃ）の結果から、化合物１がFLGプロモーターの転写活性を有することが確認された。また、比較化合物２にFLGプロモーターの転写活性が見られた。これに対し、ノシセプチンアンタゴニストとして知られる比較化合物１(J113397)にはFLGプロモーターの転写活性はないことが確認された。【００５４】
（実施例２）NHEK細胞におけるFLG mRNA発現上昇効果
本実施例では、NHEK細胞を用いて化合物１又は化合物２によるFLG mRNA発現上昇効果を確認した。【００５５】
１）NHEK細胞（Invitrogen社）5×104個/ウェルを24ウェルプレートに播種し、次いで、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（HuMedia-KG2, クラボウ社）にhEGF (0.1 ng/ml)、インシュリン(10μg/ml)、ヒドロコルチゾン(0.5μg/ml)、ゲンタマイシン(50μg/ml)、アムホテリシンB(50 ng/ml)、及びBPE (bovine brain pituitary extract) (0.4％, v/v) を加えた培養液500μlを添加し、37℃、5％C02の条件下にて培養した。次に、以下の２）又は３）の条件で培養した後、サンプルを調製した。
２）上記１）の条件下にて培養１日後、化合物１又は化合物２のDMSO溶液を１ウェル当たり10 nMとなるように添加した上記１）の培養液で培地交換を行い、37℃、5％C02の条件下にて培養した。この操作を１日毎に繰り返し、３日間培養した。
３）NHEK細胞（Invitrogen社）5×104個/ウェルを24ウェルプレートに播種し、次いで、上記１）の培養液に、さらにCaとしてCaCl2（Ca換算で1.2 mM）を加えた培養液500μlを添加し、37℃、5％C02の条件下にて培養した。培養１日後に、Caを含む同培養液で培地交換して、さらに１日間培養した（カルシウムプライミング）。その後、化合物１又は化合物２のDMSO溶液を１ウェル当たり10 nMとなるように添加した上記１）の培養液で培地交換を行い、さらに１日間培養した。なお、上記２）及び３）の対照例としては溶媒のみ（vehicle）を添加した。
４）抽出試薬（TRIzol(R)、Invitrogen社）を用い、そのプロトコールに従って、上記２）及び３）で薬剤（化合物１又は化合物２）処理した各細胞について全RNAを抽出した。逆転写酵素試薬（Prime Script(R), Takara社）を用い、そのプロトコールに従って全RNAのcDNAを作製した。次いで、下記のプライマー及びSYBR(R) Premix Ex Taq （Takara社） を使用し、そのプロトコールに従って、CFX96リアルタイムPCR装置（バイオラッド社）でリアルタイムPCRを行い、FLG mRNA量を測定した。測定結果はGAPDH（グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素）比で示した。
使用したプライマーの配列を以下に示す。
FLG Forward primer  : 5'-GCTGAAGGAACTTCTGGAAAAGG-3'  （配列番号：３）
FLG Reverse primer  : 5'-GTTGTGGTCTATATCCAAGTGATC-3'  （配列番号：４）
GAPDH Forward primer: 5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'  （配列番号：５）
GAPDH Reverse primer: 5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'  （配列番号：６）
図２に示す通り、NHEK細胞において、化合物１及び化合物２が、FLG mRNAの発現を上昇させることが確認された。また、カルシウムプライミングによりそのFLG mRNAの発現をさらに上昇させることが確認された。NHEK細胞を用いてFLG産生のCell-based assayを行う場合は、カルシウムプライミングを行う方が好ましい。【００５６】
（実施例３）NHEK細胞におけるG蛋白質共役型受容体（GPCR）アレイ
本実施例では、NHEK細胞に関し、GPCRアレイを用いて化合物１によるGPCRの発現上昇効果を確認した。【００５７】
１）NHEK細胞（Invitrogen社）5×104個/ウェルを24ウェルプレートに播種し、次いで、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（HuMedia-KG2, クラボウ社）にhEGF(0.1 ng/ml)、インシュリン(10μg/ml)、ヒドロコルチゾン(0.5μg/ml)、ゲンタマイシン(50μg/ml)、アムホテリシンB (50 ng/ml)、及びBPE (bovine brain pituitary extract) (0.4％, v/v) を加えた培養液500μlを添加して、80〜85％コンフルエントの状態になるまで3〜4日間、37℃、5％C02の条件下にて培養した。
２）次いで、化合物１のDMSO溶液を１ウェル当たり1μMとなるように添加し、培地交換なしでさらに３日間培養した。また、CaとしてCaCl2（Ca換算で1.5 mM）のみを添加した系及び化合物１とCaとしてCaCl2（Ca換算で1.5 mM）との併用系についても同様にして３日間培養した。対照例としては溶媒のみ（vehicle）を添加した。
３）抽出試薬（TRIzol(R)、Invitrogen社）を用い、そのプロトコールに従って、上記２）で処理した各細胞について全RNAを抽出した。逆転写酵素試薬（Prime Script(R), Takara社）を用い、そのプロトコールに従って全RNAのcDNAを作製した。次いで、TaqMan (R) human GPCR アレイ（AB 4365295、Applied Biosystems社）を使用し、ABI PRISM(R)7900HT 遺伝子解析装置（Applied Biosystems社）により解析した。測定結果はコントロールの18SリボソームRNAとのサイクル数比較（ΔCt値）で示した（比較Ct法）。
化合物１及び／又はカルシウム処理によって、対照に比べて発現が顕著に上昇したGPCR結果を表１に示した。表１に示す通り、NHEK細胞において、カルシウムはGPR142 mRNAの発現を誘導することが分かった。また、化合物１及び化合物１とカルシウムとの併用系はGPR142 mRNA及びGPR22 mRNAの発現を誘導することが確認された。
【表１】
2014017319.tif 000005
【００５８】
（実施例４）NHEK細胞におけるGPR142及びGPR22の発現確認
本実施例では、NHEK細胞に関し、化合物１によるGPR142 mRNA及びGPR22 mRNAの発現誘導効果を確認した。【００５９】
１）NHEK細胞（Invitrogen社）5×104個/ウェルを24ウェルプレートに播種し、次いで、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（HuMedia-KG2, クラボウ社）にhEGF(0.1 ng/ml)、インシュリン(10μg/ml)、ヒドロコルチゾン(0.5μg/ml)、ゲンタマイシン(50μg/ml)、アムホテリシンB(50 ng/ml)、及びBPE (bovine brain pituitary extract) (0.4％, v/v) を加えた培養液500μlを添加して、37℃、5％C02の条件下にて培養した。
２）上記１）の条件下にて培養１日後、化合物１のDMSO溶液を１ウェルあたり1μMとなるように添加した上記１）の培養液で１日毎に培地交換して３日間培養した。また、化合物１の代わりに、CaとしてCaCl2（Ca換算で1.2 mM）を使用した系及びCa（Ca換算で1.2 mM）と化合物１（１ウェルあたり1μM）との併用系についても同様に３日間培養した。対照としては溶媒のみ（vehicle）を添加した。
３）抽出試薬（TRIzol(R)、Invitrogen社）を用い、そのプロトコールに従って、上記薬剤処理した各細胞について全RNAを抽出した。逆転写酵素試薬（Prime Script(R), Takara社）を用い、そのプロトコールに従って全RNAのcDNAを作製した。下記のプライマー及びSYBR(R) Premix Ex Taq（Takara社）を使用し、そのプロトコールに従って、CFX96リアルタイムPCR装置でリアルタイムPCRを行い、GPR142 mRNA及びGPR22 mRNAの発現量を測定した。測定結果はGAPDH比で示した。【００６０】
使用したプライマーの配列を以下に示す。
GPR142 Forward primer :5'-CTTGTCTCAGCCATTCCAGGTG-3'  （配列番号：７）
GPR142 Reverse primer :5'-GATCCTTACGCAGACACTGAGC-3'  （配列番号：８）
GPR22 Forward primer  :5'-CCACACAACATGAGGCTACAGAC-3'  （配列番号：９）
GPR22 Reverse primer  :5'-CTTTCTCGTCGTTCACGGTGTC-3'  （配列番号：１０）
GAPDH Forward primer  :5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'  （配列番号：５）
GAPDH Reverse primer  :5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'  （配列番号：６）【００６１】
図３に示す通り、NHEK細胞において、対照と比較してカルシウム、化合物１及び化合物１とカルシウムとの併用系でGPR142 mRNAの発現が誘導されていることが確認された。また、化合物１はGPR22 mRNAの発現を誘導することが確認された。これらの実験結果は、上記実施例３のGPCRアレイの結果（GPR142及びGPR22の発現）と一致することが確認された。【００６２】
（実施例５）GPR142のRNAiによるブロック効果
本実施例では、NHEK細胞に関し、化合物１による、GPR142 mRNA及びFLG mRNAの発現誘導効果がGPR142のRNAiでブロックされることを確認した。【００６３】
１）NHEK細胞（Invitrogen社）5×104個/ウェルを24ウェルプレートに播種し、次いで、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（HuMedia-KG2, クラボウ社）にhEGF(0.1 ng/ml)、インシュリン(10μg/ml)、ヒドロコルチゾン(0.5μg/ml)、ゲンタマイシン(50μg/ml)、アムホテリシンB(50 ng/ml)、及びBPE(bovine brain pituitary extract) (0.4％, v/v)を加えた培養液500μlを添加して、37℃、5％C02の条件下にて培養した。
２）上記１）の条件下にて培養１日後、上記１）の培養液に、さらにCaとしてCaCl2（Ca換算で1.2 mM）加えた培養液で培地交換し、37℃、5％C02の条件下にて培養した。培養１日後に、Caを含む同培養液で培地交換して、さらに１日間培養した。
３）上記２）のNHEK細胞に、24ウェルプレートの１ウェルあたり50 nMのsiRNAを、導入試薬リポフェクタミン RNA Max（Invitrogen社）を用い、そのプロトコールに従ってトランスフェクションした。【００６４】
用いた３種類のGPR142のsiRNAの配列及びコントロールのsiRNAの配列（いずれのsiRNAもInvitrogen社）を以下に示す。
GPR142-1(#HSS139493):
Sense Sequence    : GGCGUCAUCCCUGUCAUCUACUACA;  （配列番号：１１）
Antisense Sequence: UGUAGUAGAUGACAGGGAUG;   （配列番号：１２）
GPR142-2(#HSS139494):
Sense Sequence    : CCAACAUCCUGGAGUUUGCUGCCAA;  （配列番号：１３）
Antisense Sequence: UUGGCAGCAAACUCCAGGAUGU;   （配列番号：１４）
GPR142-3(#HSS179846):
Sense Sequence    : GCUGUCCUGAGUGCUGCCCUGUUGA;  （配列番号：１５）
Antisense Sequence: UCAACAGGGCAGCACUCAGGAC;  （配列番号：１６）
Control -1(LOW GC, #129350-200):
Sense Sequence    : GGAUGUCAACUUGAGCAACUUAUUU;  （配列番号：１７）
Antisense Sequence: AAAUAAGUUGCUCAAGUUGACAUCC;  （配列番号：１８）
Control -2(MED GC, #129350-300);
Sense Sequence    : GGUAGGUGAGUGUACAGACGCAAUA;  （配列番号：１９）
Antisense Sequence: UAUUGCGUCUGUACACUCACCUACC;  （配列番号：２０）
Control-3(HIGH GC, #129350-400):
Sense Sequence     :GGCGGCUCGUGCAACACAGGCGCUU;  （配列番号：２１）
Anti Sense Sequence:AAGCGCCUGUGUUGCACGAGCCGCC;  （配列番号：２２）【００６５】
４）上記３）において、siRNAでトランスフェクションして１日培養後、化合物１のDMSO溶液を１ウェルあたり10 nMとなるように添加した上記１）の培養液で培地交換し、さらに１日間培養した。対照としては溶媒のみ（vehicle）を添加した。
５）抽出試薬（TRIzol(R)、Invitrogen社）を用い、そのプロトコールに従って、上記薬剤処理した各細胞について全RNAを抽出した。逆転写酵素試薬（Prime Script(R), Takara社）を用い、そのプロトコールに従って全RNAのcDNAを作製した。下記のプライマー及びSYBR(R) Premix Ex Taq（Takara社）を使用し、そのプロトコールに従って、CFX96リアルタイムPCR装置でリアルタイムPCRを行い、GPR142 mRNA及びFLG mRNA発現量を測定した。測定結果はGAPDH比で示した。【００６６】
使用したプライマーの配列を以下に示す。
GPR142 Forward primer :5'-CTTGTCTCAGCCATTCCAGGTG-3'  （配列番号：７）
GPR142 Reverse primer :5'-GATCCTTACGCAGACACTGAGC-3'  （配列番号：８）
FLG Forward primer    :5'-GCTGAAGGAACTTCTGGAAAAGG-3'  （配列番号：３）
FLG Reverse primer    :5'-GTTGTGGTCTATATCCAAGTGATC-3'  （配列番号：４）
GAPDH Forward primer  :5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'  （配列番号：５）
GAPDH Reverse primer  :5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'  （配列番号：６）【００６７】
図４に示す通り、カルシウム、化合物１及びカルシウムと化合物１との併用系において、GPR142のsiRNAにより、GPR142 mRNA 及びFLG mRNAの発現が抑制されていることから、実施例４で示したFLG mRNAの発現は、GPR142を介するものであることが確認された。【００６８】
（実施例６）GPR142のRNAiによるブロック効果
本実施例では、NHEK細胞に関し、化合物２又は３による、GPR142 mRNA及びFLG mRNAの発現誘導効果がGPR142のRNAiでブロックされることを確認した。【００６９】
実施例５の１）〜３）において、GPR142のsiRNA及びコントロールのsiRNAとして、それぞれGPR142-1(#HSS139493)とGPR142-3(#HSS179846)及びControl -1(LOW GC, #129350-200)とControl -3(HIGH GC, #129350-400)のそれぞれ２種類のsiRNAを使用するほかは、実施例５と同様に、NHEK細胞をトランスフェクションした。実施例５の４）と同様にトランスフェクションして１日培養後、化合物１のDMSO溶液、化合物２のDMSO溶液及び化合物３のメタノール溶液を、１ウェルあたりそれぞれ10 nMとなるように添加した培養液で培地交換し、さらに１日間培養した。対照としては溶媒のみ（vehicle）を添加した。実施例５の５）と同様にして、上記薬剤処理した各細胞についてリアルタイムPCRを行い、GPR142 mRNA 及びFLG mRNA量を測定した。測定結果はGAPDH比で示した。
図５に示す通り、化合物１と同様、化合物２及び化合物３によるFLG mRNAの発現誘導もGPR142を介するものであることが確認された。【００７０】
（参考例１）GPR22のRNAiによるブロック効果
本参考例では、NHEK細胞に関し、化合物１によるFLG mRNAの発現誘導効果がGPR22のRNAiによるブロックで抑制されないことを確認した。【００７１】
１）NHEK細胞（Invitrogen社）5×104個/ウェルを24ウェルプレートに播種し、次いで、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（HuMedia-KG2, クラボウ社）にhEGF(0.1 ng/ml)、インシュリン(10μg/ml)、ヒドロコルチゾン(0.5μg/ml)、ゲンタマイシン(50μg/ml)、アムホテリシンB(50 ng/ml)、及びBPE(bovine brain pituitary extract) (0.4％, v/v)  を含む培養液を500μl添加して、37℃、5％C02の条件下にて培養した。
２）上記１）より１日後、カルシウムを加えた培地を毎日交換し、２日間培養（プライミング）した。
３）上記２）より、24ウェルプレートの１ウェルあたり10 nMのsiRNAを導入試薬リポフェクタミン RNA Max（Invitrogen社）を用い、そのプロトコールに従ってNHEK細胞にトランスフェクションした。
用いたsiRNAの配列を以下に示す。
GPR22-1(#HSS104365):
Sense Sequence     :UAGUCAUGGCUUAUGGAACAACUAU  （配列番号：２３）
Anti Sense Sequence:AUAGUUGUUCCAUAAGCCAUGACUA  （配列番号：２４）
GPR22-2(#HSS104367):
Sense Sequence     :GAGUUGUUUCUAUAGUAGAAGCUGA  （配列番号：２５）
Anti Sense Sequence:UCAGCUUCUACUAUAGAAACAACUC  （配列番号：２６）
GPR22-3(#HSS178711):
Sense Sequence     :GGCAGAGCUGUAAUGUUAAUGAUAU  （配列番号：２７）
Anti Sense Sequence:AUAUCAUUAACAUUACAGCUCUGCC  （配列番号：２８）
Control-1(Low GC, #129350-200):
Sense Sequence     :GGAUGUCAACUUGAGCAACUUAUUU  （配列番号：１７）
Anti Sense Sequence:AAAUAAGUUGCUCAAGUUGACAUCC  （配列番号：１８）
Control-2(MED GC, #129350-300):
Sense Sequence     :GGUAGGUGAGUGUACAGACGCAAUA  （配列番号：１９）
Anti Sense Sequence:UAUUGCGUCUGUACACUCACCUACC  （配列番号：２０）
Control-3(HIGH GC, #129350-400):
Sense Sequence     :GGCGGCUCGUGCAACACAGGCGCUU  （配列番号：２１）
Anti Sense Sequence:AAGCGCCUGUGUUGCACGAGCCGCC  （配列番号：２２）【００７２】
４）上記３）より培養１日後、化合物１をDMSOに溶解し、24ウェルの１ウェルあたり、10 nMとなるように添加した培地に交換し、１日間培養した。対照例としては溶媒のみ（vehicle）を添加した。
５）抽出試薬（TRIzol(R)、Invitrogen社）を用い、そのプロトコールに従って、上記薬剤処理した各細胞について全RNAを抽出した。逆転写酵素試薬（Prime Script(R), Takara社）を用い、そのプロトコールに従って全RNAのcDNAを作製した。SYBR(R) Premix Ex Taq（Takara社）を使用し、そのプロトコールに従って、CFX96リアルタイムPCR装置でリアルタイムPCRを行い、GPR22 mRNA及びFLG mRNA量を測定した。測定結果はGAPDH比で示した。
図６に示す通り、カルシウム、化合物１及びカルシウムと化合物１の併用系において、GPR22のsiRNAにより、GPR22 mRNAの発現がコントロールに比べて抑制されたが、FLG mRNAの発現は抑制されなかった。実施例５及び６の結果から、化合物１によるFLG mRNAの発現はGPR142を介するものであることが確認された。【００７３】
（実施例７）GPR142過剰発現NHEK細胞における化合物１のFLG mRNA産生効果
本実施例では、GPR142過剰発現NHEK細胞に関し、化合物１によるFLG mRNAの発現誘導効果を確認した。【００７４】
１）NHEK細胞（Invitrogen社）5×104個/ウェルを24ウェルプレートに播種し、次いで、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（HuMedia-KG2, クラボウ社）にhEGF(0.1 ng/ml)、インシュリン(10μg/ml)、ヒドロコルチゾン(0.5μg/ml)、ゲンタマイシン(50μg/ml)、アムホテリシンB(50 ng/ml)及びBPE(bovine brain pituitary extract) (0.4％, v/v)を加えた培養液を添加して、37℃、5％C02の条件下にて培養した。
２）配列番号：２に示す塩基配列を含むヒトGPR142遺伝子コーディング領域を哺乳類発現ベクターpCXN（Gene 108:193-199(1991)）のクローニングサイトの制限部位EcoRIに組み込み、GPR142pCXN哺乳類発現ベクターを作製した。
３）上記１）の条件にて１日培養後、１ウェルあたり0.5μgのGPR142哺乳類発現ベクターpCXNを、導入試薬Fugene(R)HD（Promega社）を用い、そのプロトコールに従ってNHEK細胞にトランスフェクションした。コントロールとして哺乳類発現ベクターpCXNのみをトランスフェクションした。
４）上記によりトランスフェクションして１日培養後、化合物１のDMSO溶液を、１ウェルあたり10 nMとなるように添加した培養液で培地交換し、さらに１日間培養した。対照としては溶媒のみ（vehicle）を添加した。
５）抽出試薬（TRIzol(R)、Invitrogen社）を用い、そのプロトコールに従って、上記薬剤処理した各細胞について全RNAを抽出した。逆転写酵素試薬（Prime Script(R), Takara社）を用い、そのプロトコールに従って全RNAのcDNAを作製した。実施例４で使用したGPR142、FLG及びGAPDHと同様のプライマー及びSYBR(R) Premix Ex Taq（Takara社）を使用し、そのプロトコールに従って、CFX96リアルタイムPCR装置でリアルタイムPCRを行い、GPR142 mRNA 及び、FLG mRNA量を測定した。測定結果はGAPDH比で示した。
図７に示す通り、GPR142を過剰発現するNHEK細胞において、化合物１によって、FLG mRNAの発現が増加することが確認された。これらのことから、GPR142がFLGの発現に関与しており、化合物１はGPR142を介してFLGを発現していることが確認された。さらにまた、化合物１によりGPR142がNHEK細胞に誘導されることが確認された（GPR142 mRNAの発現量が対照に比べて約2.2倍増加した。）。【００７５】
（実施例８）アデニル酸シクラーゼ活性に対する作用の測定
本実施例では、化合物１によるcAMPの産生抑制効果を確認した。【００７６】
１）HEK293T細胞 6×104個/ウェルをコラーゲンコート24ウェルプレートに播種し、DMEM培地（Invitrogen社）にペニシリン(50μg/ml)、ストレプトマイシン(50μg/ml)、FBS（ウシ胎仔血清）(10％, v/v)を加えた培養液を添加して、37℃、5％C02の条件下にて培養した。
２）実施例７の２）と同様にしてGPR142PCXN哺乳類発現ベクターを作製した。
３）上記１）の条件にて１日培養後、１ウェルあたり0.2μgのGPR142PCXN哺乳類発現ベクターを、導入試薬Fugene(R)HD（Promega社）を用い、そのプロトコールに従ってHEK293T細胞にトランスフェクションした。コントロールとしてPCXN哺乳類発現ベクターのみをトランスフェクションしたものを用いた。
４）上記によりトランスフェクションして１日培養後、HEK293T細胞を1 mMのcAMPホスフォジエステラーゼ阻害物質であるイソブチルメチルキサンチン(IBMX)を添加後、10分間、37℃で培養した。
５）次いで、化合物１のDMSO溶液を、１ウェルあたり0.1 nM〜1000 nM、10μMフォルスコリン、1mM IBMXとなるように添加した培養液で培地に交換し、さらに20分間、37℃で培養した。対照としては溶媒（vehicle）、10μMフォルスコリン、1 mM IBMXを添加した。
６）上記５）で培養した細胞をHCl 0.1 mol/Lで溶解した。細胞内cAMP濃度を、環状AMP EIAキット（Cayman Chemical社）を使用し、そのプロトコールに従って測定した。結果は対照例のcAMP濃度を100％とし、それに対する化合物１で処理した細胞のcAMP濃度の割合（％）で表した。【００７７】
図８に示すように、化合物１はGPR142を介して用量依存的にcAMPの産生を低下させることが確認された。【００７８】
（実施例９）アデニル酸シクラーゼ活性に対する作用の測定
本実施例では、化合物２又は３によるcAMPの産生抑制効果を確認した。【００７９】
実施例８の１）〜４）と同様にしてHEK293T 細胞を培養した。次いで、実施例８の５）において、化合物１の代わりに、化合物３のメタノール溶液、化合物２のDMSO溶液及び比較化合物２のDMSO溶液をそれぞれ１ウェルあたり1000 nMとなるように使用するほかは、実施例８の５）と同様にして培養した。培養した細胞を、実施例８の６）と同様にしてcAMP濃度を測定した。【００８０】
図９に示すように、化合物３及び化合物２はGPR142を介してcAMPの産生を低下させること（それぞれ約24%および約20%の低下）が確認された。一方、比較化合物２による刺激においてはcAMPの産生抑制作用は見られなかった。【００８１】
（実施例１０） 三次元培養皮膚におけるFLG mRNAの発現上昇効果
本実施例では、三次元培養皮膚を用いて化合物１によるFLG mRNAの発現上昇効果を調べた。FLG mRNAの発現は、リアルタイムPCR法により測定した。【００８２】
１）市販のヒト皮膚三次元モデル（TEST SKIN(R) LSE-013, TOYOBO社）を、TEST SKIN LSE ASSAY MEDIUM(TOYOBO社)を用い、そのプロトコールに従って培養した。
２）培養２日後、下記Ａ）又はＣ）の薬剤をDMSOに溶解し、1μMとなるように培地に加え、細胞の薬剤処理を行った。
Ａ）化合物１（N-キノリルベンズアミド誘導体）
Ｃ）比較化合物２（スクリプタイド）
対照例としては、溶媒のみ（vehicle）を添加した。
３）さらに培養２日後（培養開始後４日目）、上記薬剤を加えた培地で培地交換した。さらに培養３日後（培養開始後７日目）、三次元培養した皮膚を回収し、液体窒素で凍結後-30℃で保存した。
４） RNA抽出用試薬（RNeasy(R), QIAGEN社）を用い、そのプロトコールに従って、上記薬剤処理した各細胞について全RNAを抽出した。逆転写酵素試薬（Prime Script(R), TaKaRa社）を用い、そのプロトコールに従って全RNAからcDNAを作製した。 Light Cycler 480 SYBR Green I Master（Roche社）を使用し、そのプロトコールに従ってリアルタイムPCRを行い、FLG mRNA量を測定した。測定結果はGAPDH比で示した。【００８３】
図１０に示す通り、ヒト皮膚三次元モデルにおいて、化合物１及び比較化合物２は、FLGのmRNAの発現を上昇させることが確認された。【００８４】
（実施例１１）三次元培養皮膚におけるFLGモノマーの発現上昇効果
本実施例では、三次元培養皮膚を用いて化合物１によるFLGモノマーの発現上昇効果を調べた。FLGモノマーの発現は、ウエスタンブロッティング法により確認した。【００８５】
本実施例では、まず上記実施例１０の１）〜３）と同じ操作を行った。但し、薬剤としてＤ）比較化合物３（M344）についても実施例１０のＡ）化合物１、Ｃ）比較化合物２と同様に行った。
４）実施例１０の１）〜３）と同手法により三次元培養した皮膚を回収し、ハサミでバラバラにした後、Lysis緩衝液（0.1 M Tris-HCl(pH 9.0), 6M Urea, 1％ 2-mercapto-ethanol, 1％ SDS, 1 mM EDTA, Protease inhibitor cocktail）を100μｌ加え、電動ペッスルでホモジナイズした。ホモジナイズした細胞を15,000 rpm、4℃で20分間遠心処理し、その上清を回収し、測定用試料とした。プロテインアッセイ試薬（BIO-RAD社）を使用し、プロトコールに従って試料中の全蛋白質を定量した。各試料について、15μg/laneとなるように蛋白質を調整し、SDS-PAGE（Invitrogen社、NuPAE Novex Bis-Tris mini Gel 4-12％）で、100V、2時間の条件で電気泳動を行なった。マーカーとしてPrecision Plus Protein Standards（BIO-RAD社）を用いた。電気泳動で分離した蛋白質をPVDF膜に転写（ブロッティング）し、抗FLG抗体（Filaggrin AKH1, Santa Crus社）によりFLGモノマーの発現を確認した。その際、二次抗体としてAnti-mouse IgG-HRP（GE Healthcare社）を使用し、発色剤としてAmersham ECL Plus Western Blotting Detection Reagents（GE Healthcare社）を使用した。【００８６】
図１１の結果から、化合物１は多くのプロFLGを産生していることが分かった。また、化合物１の場合は明瞭なFLGモノマーの産生が確認された。これに対し、比較化合物２及び比較化合物３の場合は、明瞭なFLGモノマーの産生は見られなかった。【００８７】
（実施例１２）ヒト正常皮膚の培養におけるFLGモノマーの発現上昇効果
本実施例では、ヒト正常皮膚を用いて化合物１（N-キノリルベンズアミド誘導体）によるFLGモノマーの発現上昇効果を調べた。FLGモノマーの発現は、抗ヒトFLG抗体による組織免疫染色法により確認した。培地は、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（HuMedia-KG2, クラボウ社）を用いた。なお、本実施例では、皮膚疾患部の摘出術に伴い余剰となった正常皮膚の部分を、京都大学の倫理委員会を経て提供者の承諾の下に使用した。【００８８】
１）ヒト正常皮膚（5×5×5mm角）を24ウェルトランスウエルプレートのトランスウェルにのせ、下方に化合物１(1μM)又は対照（vehicle(DMSO)）を添加した培地を500μl加え、の条件下にて培養した。２日後同じ培地で培地交換した。
２）４日後に上記培養した皮膚を回収し、10％ホルマリンに一晩浸けた後、常法に従い6mm厚のパラフィン切片を作製した。常法により脱パラフィン後、一次抗体として抗ヒトFLG抗体（抗ヒトFilaggrin抗体sc-66192, Santa Cruz社）を用い、二次抗体としてビオチン化抗マウスIgG抗体（eBioscience社）を用い、ジアミノベンジジン（DAB）にて発色させ、組織免疫染色によりFLG蛋白の発現状況を確認した。【００８９】
図１２（ｂ）において、点線で囲んだ部位で染色が顕著な部分を矢印で示した。（ａ）及び（ｂ）の結果から、化合物１を添加した（ｂ）の角層は、対照（ａ）に比べて発達しており、また、皮膚内部のFLG蛋白が大幅に増加していることが確認された。【００９０】
（実施例１３）モデル動物におけるFLGの発現上昇効果
本実施例では、FLG遺伝子のホモ又はヘテロ変異型マウス（Jackson Laboratory、flaky tail mice）を用いて、化合物１（N-キノリルベンズアミド誘導体）によるFLGモノマーの発現上昇効果を確認した。FLG蛋白の発現は、ウエスタンブロッティング法により確認した。【００９１】
１）超純水（milliQ、ミリポア社）に溶解した化合物１(1μM)を、FLGのホモ又はヘテロ変異型マウスの左右の耳に皮内注射(10μl/ear)した。対照として、超純水（milliQ、ミリポア社）を同様に皮内注射した。
２）３日後、さらに化合物１又は超純水を同様に皮内注射した。
３）８日後、各マウスの耳を麻酔下で切り取り、当該切り取った耳の軟骨を挟んで耳の皮膚を剥がし、真皮側を20 mM EDTA含有PBSに37 ℃で30分間浸けた。次に耳の表皮を剥がし50 mlの Lysis緩衝液（0.1 M Tris-HCl(pH 9.0), 6M Urea, 1％ 2-mercapto-ethanol, 1％ SDS, 1 mM EDTA, Protease inhibitor cocktail）を加えて電動ペッスルでホモジナイズ後、上記実施例１１の４）と同様に試料を調製し、電気泳動後ウエスタンブロット法により、FLGモノマーの発現を確認した。一次抗体は抗マウスFLG抗体（抗マウスFilaggrin抗体、COVANCE社）1μg/mlを使用し、二次抗体としてAnti-rabbit IgG-HRP（GE Healthcare社）を使用し、発色剤としてAmersham ECL Plus Western Blotting Detection Reagents（GE Healthcare社）を使用した。【００９２】
図１３の結果から、FLGのヘテロ変異型マウスにおいて、化合物１によりFLGモノマーの産生が確認された。一方、FLGのホモ変異型マウスにおいてはFLGモノマーの産生は見られなかった。これらは、化合物１によりFLGの遺伝子が転写されてプロFLGが発現し、次いで、脱リン酸化、加水分解の一連の反応によってFLGモノマーが産生したことを示しているものと推測される。【００９３】
（実施例１４）アトピー性皮膚炎モデルマウス（NC/Nga）における皮膚炎改善効果
６〜１０週齢のダニ付きアトピー性皮膚炎発症NC/Ngaマウス（日本SLC社）を通常の環境下で飼育しながら実験を行った。すなわち、耳介及び頭部を中心に皮膚炎が出現しているNC/Ngaマウスに化合物１をメチルセルロース溶液（0.5 W/V％Methyl Cellulose 400 Solution、Wako、133-14255）に0.75 mg/mlとなるように溶解した溶液500μlを隔日で内服投与（マウスに1回当たり、化合物１を0.375 mg投与）して、皮膚炎の改善効果を測定した。対照としてメチルセルロース溶液500μlを隔日で内服投与した。【００９４】
(i) 皮膚炎の臨床症状の観察
臨床症状に関して、紅斑、浮腫、びらん、鱗屑の４項目について、視診により、なし（0）、弱い（1）、普通（2）、ひどい（3）の４段階に分けて評価を行った。内服開始前（0 wk）、内服４週間後（4 wk）、８週間後（8 wk）において、上記４項目の評価を合算してスコア化し、モデルマウスの臨床症状をクリニカルスコアとして測定した。さらに、内服８週間で内服を終了し、その後、同条件下で飼育を継続した。内服終了してから４週間後（内服開始から12 wk）に臨床症状を同様にしてスコア化した。それらの結果を図１４に示した。
図１４から明らかなように、化合物１の内服開始後８週後において皮膚炎の症状は改善されていた。また、内服終了後４週間目においても対照に比べて皮膚炎の症状は抑えられていた。【００９５】
(ii) 水分蒸散量（TEWL）の測定
上記(i)において、内服開始後８週間及び１２週間におけるTEWLの計測を帯型閉鎖チャンバー方式水分蒸散量測定装置VAPO SCAN AS-VT100RS（ASAHI BIOMED社）を使用し、そのマニュアルに従って行った。その結果を図１５（ａ）及び（ｂ）に示した。
図１５（ａ）から明らかなように、対照の発症NC/Ngaマウスでは８週間後におけるTEWLは約60 g/h・m2と高い値であったのに対し、化合物１を内服した発症NC/Ngaマウスでは約10 g/h・m2と低い数値であった。未発症NC/NgaマウスのTEWLが5〜10 g/h・m2であることから、化合物１により水分蒸散量が未発症マウスと同程度まで改善されたことが分かった。また、図１５（ｂ）から、内服終了後４週間目（内服開始後１２週間）においても、対照に比べて水分蒸散量が抑えられていることが分かった。これらの結果から、化合物１は、アトピー性皮膚炎に伴う皮膚の角層異常の改善に有用であることが分かった。【００９６】
(iii) 内服開始１２週間後の発症NC/Ngaマウスの外観
上記(i)において、内服開始から１２週間目（８週間目で内服を終了）における発症NC/Ngaマウスの外観を図１６（ａ）及び（ｂ）に示した。
図１６（ａ）から明らかなように、対照のマウスにおいては、眼の周り、頭部、耳介部分の臨床症状が劣悪な状態であった。また、頭部の脱毛も観察された。一方、図１６（ｂ）から明らかなように、化合物１を投与したマウスにおいては、内服投与を終了してから４週間後においても、耳介部分に一部軽度の湿疹の再発が観察されたが、ほぼ良好な臨床症状が維持されていた。【００９７】
（比較例２）特許文献６（特開2004-175687号公報）に記載の技術について
特許文献６（特開2004-175687号公報）にはヘアレスマウスの皮膚にテープストリッピングを施して物理的に皮膚バリア破壊した後、cAMPアンタゴニストを塗布することによって細胞内カルシウムのレベルを低下させ、当該バリアを回復することが記載されている。
当該特許文献にcAMPアンタゴニストとして例示されている多くの化合物（（−）−キンピロール塩酸塩、（＋）−PD128907、PD168077、８−ヒドロキシPIPAT、オキソトレモリン、（S）-3,4-DCPG、SNC80、SB205607、BRL-52537、SCH23390、CY208-243、RS39604、RS23597-190、ピモジド、ICI-118,551、ベタキソール）について、FLG mRNAの発現促進効果を確認した。
HaCaT細胞を、J. Investigative Dermatology (2011)131:1660-1667に記載された培養条件下に、上記化合物1〜10μMの濃度で処理した後、全RNAを抽出してRT-PCRにてFLG mRNAを測定したが、FLG mRNAの発現は見られなかった。これにより、cAMPアンタゴニストであれば、必ずFLGの産生促進活性があるということではないことが確認された。
これに対し、GPR142アゴニストは、cAMPアンタゴニストとしての作用を有するものの、上記各実施例に示したように、FLGの産生促進作用を有する。従って、本願発明は、特許文献６に記載の発明とは明らかに相違することが確認された。【００９８】
（実施例１５）アトピー性皮膚炎モデルマウス（NC/Nga）におけるFLGモノマー産生効果
６〜１０週齢のダニ付きアトピー性皮膚炎発症NC/Ngaマウス（日本SLC社）を通常の環境下で飼育しながら実験を行った。すなわち、耳介及び頭部を中心に皮膚炎が出現しているNC/Ngaマウスに、化合物１をメチルセルロース溶液（0.5W/V％Methyl Cellulose 400 Solution、Wako、133-14255）に1.5mg/mlとなるように溶解した溶液500μlを隔日で内服投与（マウスに1回当たり、化合物１を0.75mg投与）した。対照としてメチルセルロース溶液500μlを隔日で内服投与した。化合物１投与群及び対照群共、それぞれ５頭のマウスで実験を行った。【００９９】
投与開始後2週間目に、各マウスの耳を麻酔下で切り取り、当該切り取った耳の軟骨を挟んで耳の皮膚を剥がし、真皮側を20 mM EDTA含有PBSに37 ℃で30分間浸けた。次に耳の表皮を剥がし50 mlの Lysis緩衝液（0.1 M Tris-HCl(pH 9.0), 6M Urea, 1％ 2-mercapto-ethanol, 1％ SDS, 1 mM EDTA, Protease inhibitor cocktail）を加えて電動ペッスルでホモジナイズ後、ホモジナイズした細胞を15,000 rpm、4℃で20分間遠心処理し、その上清を回収し、測定用試料を調製し、電気泳動後ウエスタンブロット法により、FLGモノマーの発現を確認した。一次抗体は抗マウスFLG抗体（抗マウスFilaggrin抗体、COVANCE社）1μg/mlを使用し、二次抗体としてAnti-rabbit IgG-HRP（GE Healthcare社）を使用し、発色剤としてAmersham ECL Plus Western Blotting Detection Reagents（GE Healthcare社）を使用した。【０１００】
図１７（ａ）に電気泳動の結果を示した。PFGはプロフィラグリンのバンドを示し、FGはFLGモノマーのバンドを示す。また、図１７（ｂ）に、GAPDHに対するFLGモノマーの相対濃度（５サンプルの平均値）をグラフで示した。これらの結果から、化合物１を投与した場合、対照に比べて明らかなFLGモノマーの産生促進が確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
以上詳述したように、本発明治療剤の有効成分であるGPR142アゴニストは、皮膚におけるFLGの産生を促進させ、角層の水分保持能やバリア機能を良好に改善し、FLG産生促進剤の有効成分として作用することが確認された。また、FLG産生低下に伴う皮膚疾患治療剤の有効成分としても作用しうる。また、GPR142アゴニストの一種であるＡ）N-キノリルベンズアミド誘導体（化合物１）、Ｂ）イベルメクチン（化合物２）又はＣ）フェニルアラニンアミド誘導体（化合物３）は、化学合成により容易に合成することができ、FLG産生低下に伴う皮膚疾患、特に、アトピー性皮膚炎の治療薬として有用である。さらに、GPR142を標的とし、FLG産生低下に伴う疾患治療剤のスクリーニングを系統的に行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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