(57)【要約】  本発明は、細胞への核酸、必要に応じてさらにタンパク質や医薬などの化合物の導入効率をさらに高める手段を提供することを主な課題とする。  斯かる課題を解決するための手段として、アニオン性高分子と正電荷高分子の複合体及びアニオン性リポソームを含み、前記リポソームは気泡を(bubble)含み、前記複合体はカチオン性であるアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスを提供する。
2014030601.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）アニオン性高分子と
プロタミン、ヒストン、HelΔ１、ゼラチン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、ジエチルアミノエチル−デキストラン、キトサン、スペルミン及びスペルミジンからなる群から選ばれる少なくとも１種の正電荷高分子との複合体及び
（Ｂ）アニオン性リポソームを含み、
前記リポソームは気泡を(bubble)含み、前記複合体はカチオン性であるアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。
【請求項２】
前記正電荷高分子はプロタミンを含む、請求項１に記載のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。
【請求項３】
前記アニオン性高分子は核酸である、請求項１又は２に記載のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。
【請求項４】
前記核酸は、DNAまたはRNAである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。
【請求項５】
前記核酸は、遺伝子発現プラスミドDNA、アンチセンスDNA、DNAアプタマー、siRNAもしくはshRNAを発現するDNA、mRNA、siRNA、miRNA、shRNA、アンチセンスRNAまたはRNAアプタマーである、請求項３又は４に記載のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。
【請求項６】
プロタミン及びアニオン性リポソームを含み、前記リポソームは気泡を(bubble)含む、アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。
【請求項７】
前記アニオン性リポソームが、タンパク質又は薬物を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アニオン性を有する新規ナノバブルポリ−リポ・プレックスの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
負電荷を有した高分子である遺伝子、ＲＮＡなどの核酸は細胞内取り込みに乏しく、また、静脈内投与した場合には速やかに尿中へ排出されることから、それ単体での医薬品への応用は困難である。このため、遺伝子を細胞内へ送達するためのベクターの開発が必須である。また、非特異的な核酸導入は予期しない副作用の原因となることから、標的となる臓器の特定の細胞のみに核酸を導入する技術の開発が望まれている。これまでに、非ウイルス性の遺伝子ベクターとして正電荷を有した高分子やリポソームを用いた遺伝子との正電荷複合体が細胞内取り込みに優れ、高い遺伝子発現効果を示すことが報告されている。しかしながら、遺伝子医薬品の臨床応用を考えると主薬は遺伝子であり、ベクターは添加物として定義される。また、日本においては医薬品に用いる添加物は全て安全性試験が必要である。一方で、これまでに開発された遺伝子ベクターの詳細な安全性についてはほとんどが報告されていない。このため、遺伝子医薬品の実現には完全且つ効果的に遺伝子を導入するための遺伝子ベクター開発が必要であった。【０００３】
特許文献１，２は、バブルを含むリポソームを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2005-154282
【特許文献２】特開2012-36095
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、細胞への核酸、必要に応じてさらにタンパク質や薬物などの化合物の導入効率をさらに高めることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下のアニオン性を有するナノバブルポリ−リポ・プレックスを提供するものである。【０００７】
項１．  アニオン性高分子と正電荷高分子の複合体及びアニオン性リポソームを含み、前記リポソームは気泡を(bubble)含み、前記複合体はカチオン性であるアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。【０００８】
項２．  前記アニオン性高分子は核酸である、項１に記載のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。【０００９】
項３．  前記核酸は、DNAまたはRNAである、項２に記載のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。【００１０】
項４．  前記核酸は、遺伝子発現プラスミドDNA、アンチセンスDNA、DNAアプタマー、siRNAもしくはshRNAを発現するDNA、mRNA、siRNA、miRNA、shRNA、アンチセンスRNAまたはRNAアプタマーである、項２又は３に記載のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。【００１１】
項５．  前記正電荷高分子は、プロタミン、ヒストン、HelΔ１、ゼラチン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマー、ジエチルアミノエチル−デキストラン、キトサン、スペルミン及びスペルミジンからなる群から選ばれる少なくとも１種である、項１〜４のいずれかに記載のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。【００１２】
項６．  前記正電荷高分子はプロタミンを含む、項５に記載のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。【００１３】
項７．  プロタミン及びアニオン性リポソームを含み、前記リポソームは気泡を(bubble)含む、アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。【００１４】
項８．  前記アニオン性リポソームが、タンパク質又は薬物を含む、項１〜７のいずれかに記載のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は安全且つ効率的な核酸などの物質導入を可能とする複合体及びその用途に関するものである。【００１６】
本発明の複合体は超音波照射後に肝臓、腎臓、脾臓で非常に高い遺伝子発現効果を示す。さらに、複合体にリガンドを導入することで特定の細胞への標的化が可能である。【００１７】
細胞への導入は、超音波を与えた部位で選択的に生じるので、毒性、副作用の軽減を実現できる。【００１８】
具体的には、本発明の複合体は、安全性が確認されている成分により構成されるため、細胞への障害を引き起こすことがない。この点は、細胞毒性等の障害を誘発することが知られているカチオン性リポソームとは対照的である。また、超音波照射をしない場合は、本発明の複合体は遺伝子発現効果が見られない。このような部位選択的に細胞への導入することができる特性は、従来のカチオン性リポソームには見られない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスの調製方法の一例を模式的に示す。
【図２】本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスのパーフルオロプロパンガスバブル封入前後の外観を観察した結果。
【図３】本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスの安定性のアガロースゲル電気泳動による評価結果。
【図４−１】pDNA/PEI/AL複合体による遺伝子導入効果。
【図４−２】pDNA/PLL/AL複合体による遺伝子導入効果。
【図４−３】pDNA/PS/AL複合体による遺伝子導入効果。
【図５】肝臓への遺伝子導入後の遺伝子発現細胞。
【図６】脾臓への遺伝子導入後の遺伝子発現細胞。
【図７】標的化された細胞への遺伝子導入。
【図８】超音波造影と崩壊の確認。
【図９】siRNAを用いたsiRNA/PS/DSPG複合体の調製。
【図１０】mRNAを用いたmRNA/PS/DSPG複合体の調製。
【図１１】薬剤封入アニオン性リポソームの調製。
【図１２】本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスの調製方法の一例を模式的に示す。
【図１３】（ａ）本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスのパーフルオロプロパンガスバブル封入前後の外観を観察した結果。各パネルにおいて、右側（Bubble(+)）は、左側（Bubble(-)）を、超音波処理することで得られたアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスである。（ｂ）得られたpDNA/PS/BL複合体の、酢酸ウラニルを用いたネガティブ染色による、TEM観察像を示す。バー：200nm。
【図１４】本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスの安定性のアガロースゲル電気泳動による評価結果。
【図１５】EAhy926細胞へのアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスの遺伝子導入効率。バーは、標準誤差（S.E.）を表す。**: P<0.01; *: P<0.05 （他の群全てに対して）。##: P<0.01; #: P<0.05。
【図１６】pDNA/PS/BL複合体の細胞内局在を示す。（a）Lipofectamin 2000、(b)pDNA/PS/BL複合体；US(-)（超音波照射なし）、（c）pDNA/PS/BL複合体；US(+)群（超音波照射あり群）。
【図１７】アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスのEAhy926細胞に対する細胞毒性の評価。未処理（対照）に対する比率で示す。**: P<0.01; *: P<0.05 （コントロールに対して）。
【図１８】アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスの赤血球との凝集（位相差顕微鏡画像）。(a) Lipofectamine 2000, (b) polyethylenimine, (c) pDNA/PS/BL, (d) pDNA/PLL/BL, (e) pDNA/PLA/BL, (f) pDNA/DPLL/BL, (g) PBS。
【図１９】生体へのアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスによる遺伝子導入効果。（a）肝臓、（b）腎臓、（c）脾臓。**: P<0.01; *: P<0.05 （US(-)群（超音波照射なし群）に対して）。
【図２０】アニオン性脂質の効果。(a)EAhy926細胞への遺伝子導入効率、（b）生体への遺伝子導入効率、（c）細胞毒性の評価。**: P<0.01; *: P<0.05。
【図２１】pDNA/PS/AL複合体の投与後の動態。（a）血液、(b)肝臓、（c）腎臓、(d)脾臓、(e)心臓、（f）肺。
【図２２】肝臓への遺伝子導入後の遺伝子発現細胞。（a）肝実質細胞（Parenchymal cell）と肝非実質細胞(Non parenchymal cell)、（b）クッパー細胞（Kupffer cell）及び内皮細胞（endothelial cell）。 *: P<0.05 （肝実質細胞に対して）。
【図２３】肝臓障害の評価。（a）血清中のAST活性、（b）血清中のALT活性。
【図２４】細胞への障害（サイトカインの誘導）の評価。（a）血清中のTNF-α濃度、（b）血清中のIL-6濃度。
【図２５】腹部または胸部に対して超音波照射の比較。（a）腹部に対して超音波照射、（b）胸部に対して超音波照射。
【図２６】がん細胞への遺伝子導入。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のアニオン性を有する新規ナノバブルポリ−リポ・プレックスは、アニオン性リポソーム、アニオン性高分子(好ましくは核酸)、正電荷高分子及び気泡(バブル)を含む。アニオン性高分子(好ましくは核酸)と正電荷高分子は全体として正電荷を有する複合体となり、このカチオン性の複合体とアニオン性リポソームがさらに複合体化し、さらにリポソーム内に気泡を含めることで、本発明のアニオン性を有する新規ナノバブルポリ−リポ・プレックスを得ることができる。
【００２１】
アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスの粒径は、50〜1000nm程度、400〜800nm程度、特に500〜600nm程度である。あるいは、100〜800nm程度、150〜600nm程度とすることもできる。
【００２２】
アニオン性リポソームの粒径は、30〜500nm程度、好ましくは50〜300nm程度、特に100〜250nm程度である。アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス及びアニオン性リポソームの粒径は、エクストルーダーを使用して制御することができる。
【００２３】
なお、リポソームの粒径は、動的光散乱法により測定をすることができる。
【００２４】
本発明で使用されるアニオン性リポソームは、多重層リポソーム（例えば、multilamellar vesicles: MLV）、一枚膜リポソーム（例えば、small unilamellar. vesicles: SUV、large unilamellar vesicles: LUV）のいずれであってもよい。アニオン性リポソームは超音波処理法、逆相蒸発法、凍結融解法、脂質溶解法、噴霧乾燥法などにより作製され、リン脂質、糖脂質、ステロール類、グリコール類、アニオン性脂質、ポリエチレングリコール基を有する脂質（例えばＰＥＧ-リン脂質）などが含まれる。本発明のアニオン性リポソームは、リポソーム全体で「アニオン性」であればよく、カチオン性脂質を含んでいてもよいが、その場合にはアニオン性脂質をより多く含み、リポソーム全体としてアニオン性になるようにする。
【００２５】
本明細書において、「複合体化」とは、アニオン性リポソームと核酸−正電荷高分子の複合体が一体化することと、核酸と正電荷高分子が一体化することの両方を包含する。
【００２６】
アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスは、内部又は表面に薬物、タンパク質を含む任意の生理活性物質を包含させることができる。タンパク質、薬物などの生理活性物質は、疎水性部分がリポソームに埋め込まれていてもよい。
【００２７】
アニオン性リポソームの脂質膜と生理活性物質の吸着、結合は、イオン結合、水素結合、疎水性相互作用などにより行われる。例えば、イオン結合は、リポソームの構成要素のアニオンと、生理活性物質であるカチオンのイオン結合による結合が挙げられる。アニオン性リポソームの表面が疎水性であれば、疎水性の生理活性物質(薬物など)を表面又は膜の内部に吸着又は結合させることができる。
【００２８】
本発明のアニオン性リポソームには、アニオン性リン脂質と中性リン脂質が含まれ、カチオン性リン脂質が少量含まれていてもよい。また、糖脂質が含まれていてもよい。
【００２９】
本発明のアニオン性リポソームに含まれる好ましい中性リン脂質として、大豆、卵黄などから得られるレシチン、リゾレシチンおよび／またはこれらの水素添加物、水酸化物の誘導体を挙げることができる。本発明のアニオン性リポソームに含まれるリン脂質を構成する高級脂肪酸は、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸のいずれでもよいが、飽和脂肪酸が好ましい。
【００３０】
アニオン性リポソームに含まれるリン脂質として、卵黄、大豆またはその他の動植物に由来するか、または合成した炭素鎖n（nは3〜30の整数を示す）から成る飽和または不飽和脂肪酸を構成成分に有するホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジルセリン（PS）、ホスファチジルグリセロール（PG）、ホスファチジリックアシッド（PA）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、カルジオリピン、スフィンゴシン、セラミド、スフィンゴミエリン、ガングリオシド、スフィンゴリン脂質、卵黄レシチン、水素添加卵黄レシチン、大豆レシチン、水素添加大豆レシチンなどが挙げられる。より好ましくは、飽和脂肪酸を構成成分とする脂質である。
【００３１】
上記リン脂質の具体例としては、ジラウロイルホスファチジルコリン（DLPC）、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジリノレオイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン；ジラウロイルホスファチジルグリセロール（DLPG）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（DMPG）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール等のホスファチジルグリセロール；ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（DLEA）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（DMEA）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPEA）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSEA）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOEA）、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン等のホスファチジルエタノールアミン；ジラウロイルホスファチジルセリン（DLPS）、ジミリストイルホスファチジルセリン（DMPS）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（DPPS）、ジステアロイルホスファチジルセリン（DSPS）、ジオレオイルホスファチジルセリン（DOPS）、ジリノレオイルホスファチジルセリン等のホスファチジルコリンなどが挙げられる。
【００３２】
本発明のリポソームを構成する脂質膜のアニオン性構成成分として、炭素鎖n2（n2は3〜30の整数を示す）から成る飽和または不飽和脂肪酸を構成成分に有するホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリンなどが挙げられる。リポソームの脂質膜を構成するアニオン性の脂質膜成分には、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロールなどの負に荷電したリン脂質のほかに、炭素鎖n2（n2は3〜30の整数を示す）から成る飽和または不飽和脂肪酸を構成成分に有するホスファチジン酸、ジセチルリン酸(DCP)、ジラウリルリン酸、ジミリスチルリン酸、ホスファチジルグリセロールリン酸などを挙げることができる。
【００３３】
必要に応じて使用されるカチオン性脂質としては、例えば3β-［N-（N’、N’-ジメチルアミノエタン）-カルバモイル］コレステロール（DC-chol）、1、2-ジオレオイルオキシ-3-（トリメチルアンモニウム）プロパン（DOTAP）、N、N-ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）、N-［1-（2、3-ジオレイルオキシ）プロピル］-N、N、N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、2、3-ジオレイルオキシ-N-［2（スペルミン−カルボキサミド）エチル］-N、N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）及びN-［1-（2、3-ジミリスチルオキシ）プロピル］-N、N-ジメチル-N-（2-ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（DMRIE）、さらにジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）とヒドロキシエチレンジアミンとのエステル、またはジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）とヒドロキシエチレンジアミンとのエステルなどが挙げられる。
【００３４】
糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステルなどのグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4などのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができる。
【００３５】
アニオン性脂質は、全脂質量に対し1〜100質量％、好ましくは全脂質量に対し10〜75質量％、より好ましくは全脂質量に対し25〜60質量％の割合で含有するように添加すればよい。
【００３６】
リポソームに包含され得る生理活性物質としては、タンパク質、薬物などが広く挙げられる。本発明のアニオン性リポソーム複合体は、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）が正電荷高分子との複合体として含まれるので、核酸と組み合わせて使用するのに適した生理活性物質が好ましい。タンパク質、薬物としては、抗ガン剤、抗アレルギー剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、免疫抑制剤、ワクチン、インターフェロン、インターロイキン、成長因子、ペプチドホルモン、酵素、ステロイドホルモン、抗リウマチ薬、抗原、抗体、受容体又はそのリガンドなどが挙げられる。
【００３７】
核酸としては、DNA、RNAのいずれでもよい。DNAは、遺伝子を発現するものが挙げられ、例えばプラスミド、或いはプロモーターに連結された遺伝子を含む遺伝子構築物、人工遺伝子などが挙げられる。DNAとしては、遺伝子発現プラスミドDNA、アンチセンスDNA、DNAアプタマー、siRNA・shRNAなどのRNAを発現するDNAが挙げられる。RNAとしては、mRNA、siRNA、アンチセンスRNA、RNAアプタマー、shRNA、miRNAなどが挙げられる。核酸、タンパク質、薬物などの生理活性物質は、細胞内に取り込まれたとき、もしくは細胞内で発現されたときに細胞毒性、アポトーシス誘導作用などの細胞に障害を与えるか、細胞死を誘導する作用を有するものが挙げられる。
【００３８】
正電荷高分子としては、プロタミン、ヒストン、HelΔ１、ゼラチンなどのカチオン性タンパク質、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマーなどのデンドリマー、ジエチルアミノエチル−デキストランなどのデキストラン、キトサンなどのポリカチオン性多糖、スペルミン、スペルミジンなどのポリアミンなどが挙げられる。中でも、核酸等が超音波を当てた部位において特異的に細胞に導入されるとの観点から、プロタミン、ヒストン、スペルミン、スペルミジンが好ましく、プロタミン、ヒストンがより好ましく、プロタミンが特に好ましい。
【００３９】
核酸と正電荷高分子の複合体は、複合体の電荷が正電荷になるように、正電荷高分子の総正電荷量が核酸の総負電荷量を上回り、アニオン性リポソームとの複合体が形成できるように核酸と正電荷高分子を溶液中で混合して生成させる。
【００４０】
リポソームの製造法の例を具体的に説明すると、例えば前記したアニオン性リン脂質を含むリン脂質等を適当な有機溶媒に溶解し、これを適当な容器に入れて減圧下に溶媒を留去して容器内面にリン脂質膜を形成し、これに水、好ましくは緩衝液を加えて攪拌して、アニオン性リポソームを得ることができる。当該リポソームを直接、核酸と正電荷高分子の複合体と混合することにより、アニオン性リポソームとカチオン性粒子の複合粒子を得ることができる。
【００４１】
本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスは、全体として中性より好ましくはアニオン性である。
【００４２】
本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスは、アニオン性リポソームとカチオン性粒子との複合体を先に製造し、この複合体中のアニオン性リポソームにバブルを導入することにより製造することができる。
【００４３】
リポソーム内でのバブルの生成は公知の方法に従い実施することができ、例えば以下の方法により実施することができる。
【００４４】
先ず、アニオン性リポソームを密封容器に封入し、空隙部にバブルとしてリポソームに導入されるガスを充填する。充填されるガスとしては、特に限定されないが、例えばフッ化物ガス又は窒素ガスが挙げられる。充填されるガスの圧力としては、0.1〜1.0ＭＰａ程度である。フッ化物ガスとしては、硫化ヘキサフルオライド、パーフルオロ炭化水素ガスが挙げられる。
【００４５】
次いでガスを封入した密閉容器を超音波処理する。超音波処理は、例えば、２０〜５０kHzの超音波を１〜５分照射すればよい。当該超音波処理により、リポソーム内部の水溶液とフッ化物ガス又は窒素ガスとが置換し、ガス封入リポソームが得られる。
【００４６】
本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスは、生体内に投与後に、特定の場所で超音波を照射することで、リポソームからガスが放出され、同時に核酸とリポソーム内の薬物、タンパク質等が細胞内に導入される。超音波の照射は、超音波診断装置などを用いて行うことができる。
【００４７】
リポソームは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖鎖などを導入して生体内でのステルス性を高めて半減期を長くしておくことが好ましい。ＰＥＧ、糖鎖などは、これらを導入したリン脂質をアニオン性リポソーム製造の原料として使用すればよい。
【００４８】
本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスは、ＮＧＲ、ＲＧＤなどの細胞認識リガンドを結合することで、特定の細胞に認識されるようになり、これと超音波を当てる部位を限定することで、核酸、必要に応じてさらに組み合わせられる薬物、タンパク質を導入する細胞をさらに特定することができ、副作用、毒性の低減を実現できる。細胞認識リガンドとしては、これらのペプチド性リガンドであってもよく、糖鎖、タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ペプチドホルモン、抗体又はその一部などが挙げられる。
【００４９】
本発明のリポソームのゼータ電位は、-50〜40mV程度、好ましくは-50〜30mV程度、より好ましくは-45〜20mV程度である。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。【００５１】
実施例で使用した材料を以下に示す。【００５２】
核酸
pDNA（pCMV-Luc）：plasmid DNA（pGL3 controlベクター(Promega)からHind IIIとXba Iを用いて切り出したホタルルシフェラーゼcDNAをinvitrogen社のpcDNA3ベクターのポリリンカー部位に組み込むことで作製したものを使用した。）
pDNAは、Endo Free Plasmid Giga Kit（Qiagen GmbH社製；Hilden, Germany）を使用して増幅し、注射用水（滅菌した蒸留水）に溶解した。【００５３】
mRNA：ホタルルシフェラーゼ mRNA。【００５４】
siRNA：ホタルルシフェラーゼに対するsiRNAであり、その配列を以下に示す。
センス鎖（5'→3'）CUUACGCUGAGUACUUCGAtt(配列番号1)
アンチセンス鎖（5'→3'）UCGAAGUACUCAGCGUAAGtt(配列番号2)。【００５５】
リポソームを構成する脂質
Distearoylphosphatidylglycerol (DSPG)
Distearoylphosphatidylcholine (DSPC)
Polyethyleneglycol 2000-distearoylphosphatidylethanolamine (PEG-DSPE)
Distearoylphosphatidylic acid (DSPA)
Distearoylphosphatidylserine (DSPS)
Dioleoyltrimethylammoniumpropane (DOTAP)。【００５６】
カチオン性ポリマー
プロタミン（プロタミン硫酸塩）(PS)
ポリ-L-リジン(PLL)
ポリ-L-アルギニン(PLA)
ポリエチレンイミン(PEI)
ポリ-L-リジンデンドリグラフト(DPLL)（COLCOM社製；Montpellieer, France）。【００５７】
バブル
バブル作製用のガスとしてパーフルオロプロパンを使用した。【００５８】
また、超音波を「US」と略すことがある。【００５９】
実施例１：アニオン性バブルリポソームの作製（１）
（１）アニオン性リポソーム(AL)の作製
アニオン性のリポソームはDSPG, DSPC, PEG-DSPEを脂質として用いて調製した。まず、各脂質をクロロホルムに溶解し、モル比がDSPG:DSPC:PEG-DSPE=7:2:1となるようにナスフラスコで混合した。ロータリーエバポレーターを用いてクロロホルムを除去し、ナスフラスコ内に脂質の薄膜を形成した。また、デシケーターでクロロホルムを完全に除去した。この脂質薄膜に注射用水を添加し、65℃で30分間インキュベートし、水和した。水和後の脂質溶液をバス型ソニケーターで10分間超音波処理し、さらに、プローブ型ソニケーターを用いて3分間超音波処理した。得られた脂質溶液を0.45μmのフィルターに通し、アニオン性リポソーム溶液とした。【００６０】
（２）pDNAとカチオン性ポリマーの複合体(polyplex)の作製
バイアル瓶内で注射用水に溶解したpDNAと様々なカチオン性の高分子(PEI, PLA, PLL, PS)を表１〜４に示す適当な割合で混合し、室温で15分間インキュベートすることで、表面がカチオン性を帯びたpDNAとカチオン性ポリマーの複合体（polyplex）を調製した。【００６１】
（３）アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスの作製(図１)
上記（２）で得られたpolyplexを上記（１）で得られたアニオン性リポソームと表１〜４に示す適切な割合で混合し、さらに15分間インキュベートした。次に、10倍濃度のPBS(リン酸緩衝生理食塩水)を用いて浸透圧を調整した。バイアル瓶内にパーフルオロプロパンガスを封入し、バイアル瓶を密封した。さらに、7.5mLのパーフルオロプロパンガスを用いてバイアル内を加圧し、バス型ソニケーターを用いて5分間超音波処理することで本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスを構築した【００６２】
【表１】
2014030601.tif 000003
【００６３】
【表２】
2014030601.tif 000004
【００６４】
【表３】
2014030601.tif 000005
【００６５】
【表４】
2014030601.tif 000006
【００６６】
PEIとPLL, PLAについてはpDNAのリン酸基とカチオン性高分子のアミノ基、DSPGのリン酸基の比を用いて複合体を表記した。一方で、PSに関しては分子中のアミノ基の正確な量が不明なため、pDNAとPS, ALの質量比で複合体を表記した。すなわち、pDNA/PEI/AL複合体の1:8:3とはpDNAのリン酸基とカチオン性高分子のアミノ基、DSPGのリン酸基の比が1:8:3となるように各成分を混合した物である。様々な組成の複合体の粒子径とζ電荷をゼーターサイザーナノ（マルバーン社）を用いて測定した。ALの添加によってζ電位が添加量依存的に減少し、プラトーに達した。特記しない場合はこのプラトーに達した比率を用いて複合体を調製した。すなわち、pDNA/PEI/AL複合体は1:8:3, pDNA/PLL/AL複合体は1:4:3, pDNA/PLA/AL複合体は1:4:4, pDNA/PS/AL複合体は1:1.25:2.5の割合で調製した。【００６７】
（４）複合体の外観(図２)
表１〜４に示される本発明のアニオン性バブルリポソーム複合体のバブル封入前後の外観を光学的に観察した結果を図２に示す。図２に示されるように、バブル(パーフルオロプロパンガス)の封入前のリポソーム複合体はほぼ透明であるが、バブルの封入により白濁した。【００６８】
（５）複合体の安定性(図３)
上記で得られた本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスの安定性をアガロースゲル電気泳動により評価した。【００６９】
すなわち、1%アガロースゲルに各複合体をpDNAとして1μgアプライし、100Vで30分間電気泳動した。核酸はGelRedTM Nucleic Acid Gel Stain を用いて染色し、Image Quant LAS4000 (GEヘルスケア社)を用いて測定した。結果を図３に示す。【００７０】
図３に示されるように、本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスは、アガロースゲル電気泳動によってもpDNA或いはpDNAとカチオン性ポリマーの複合体(polyplex)は外れることはなく、安定であることが示された。【００７１】
（６）遺伝子導入の効果(図４−１〜図４−３)
ホタルルシフェラーゼを発現するpCMV-LucをpDNAとして用いた。ICR系雌性マウスに上記で得られた各pDNAとカチオン性ポリマー（PEI、PLL又はPS）の複合体(polyplex；pDNA/PEI、pDNA/PLL又はpDNA/PS)、アニオン性リポソーム複合体（pDNA/PEI/AL、pDNA/PLL/AL又はpDNA/PS/AL）、アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス（pDNA/PEI/AL＋bubble、pDNA/PLL/AL＋bubble又はpDNA/PS/AL＋bubble）をDNA量が50 μgとなるように投与した。US(+)群（超音波照射群）では、投与から5分後にSonnopore-4000 sonicator（ネッパジーン社）を用いて直径20mmのプローブを利用して体外から腹部に対して超音波(frequency, 1.045 MHz; duty, 50%; burst rate, 10 Hz; intensity, 1.0 W/cm2)を2分間照射した。複合体投与6時間後に各臓器を摘出し、臓器中のルシフェラーゼ発現量をLuc assayによって評価した。結果を図４−１〜図４−３に示す。【００７２】
pDNAとカチオン性ポリマーの複合体(polyplex)及びアニオン性リポソーム複合体では、超音波照射の有無（US(+)群とUS(-)群）でpDNAの導入効果に実質的な差異はないが、アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスでは超音波照射の有無（US(+)群とUS(-)群）でpDNAの導入効果に有意な差があった。特に、カチオン性ポリマーにプロタミン(PS)を用いた場合、polyplex（pDNA/PS）とアニオン性リポソーム複合体（pDNA/PS/AL）は、ほとんどpDNAの遺伝子導入効果はないが、アニオン性バブルリポソーム複合体のみ超音波照射群（US(+)群）で特異的なpDNAの遺伝子導入効果が得られることが明らかになった（図４-３)。従って、アニオン性バブルリポソーム複合体を生体内に投与し、特定の部位に超音波を照射することで、超音波の照射箇所に特異的に核酸、薬物などを導入可能である。【００７３】
（７）肝臓への遺伝子導入(図５)
図５に示すプロトコールに従い、pDNA/PS/AL + BubbleをICR系雌性マウスへ尾静脈内投与した。図４−３と同様の方法で超音波を照射した。複合体の投与から6時間後にマウスの肝臓をコラゲナーゼ処理し、肝実質細胞（Parenchymal cell）と肝非実質細胞(Non parenchymal cell)を得た。106個の細胞当たりのルシフェラーゼ活性を測定し、遺伝子発現細胞を確認した。結果を図５に示す。【００７４】
図５に示されるように、本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス（pDNA/PS/AL + Bubble）は、肝臓の非実質細胞に多く導入されることが明らかになった。【００７５】
（８）脾臓への遺伝子導入(図６)
図６に示すプロトコールに従い、図５と同様の方法でpDNA/PS/AL + BubbleをICR系雌性マウスへ投与し、超音波を照射した。遺伝子を導入したマウスの脾臓を分散させ、脾細胞を得た。脾細胞を磁気分離システム（Robosep）を用いてCD11c陽性細胞（樹状細胞）と陰性細胞に分離し、mRNAを抽出した。各細胞中のルシフェラーゼmRNA発現量をグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)発現量で除した値を比較した。結果を図６に示す。【００７６】
図６に示されるように、本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス（pDNA/PS/AL + Bubble）は、樹状細胞への遺伝子導入は少なく、他の脾臓細胞へ特異的に導入されることが明らかになった。【００７７】
（９）標的化された細胞への遺伝子導入(図７)
NGR, RGDペプチドとARA(Scramble)ペプチドを固相合成法を用いて調製した。このペプチドとNHS-PEG2000-DSPEを混合し、PEG鎖の末端をペプチドリガンドで標識したPEG-DSPEを合成した(図７)。【００７８】
In vitro実験にはヒト血管内皮系細胞EAhy926を用いた。図７に示すプロトコールに従い、48well plateで24時間前培養した細胞に各ペプチドリガンドで標識したpDNA/PS/AL + Bubbleを10μg/wellとなるように添加した。 添加から10分後にSonnopore-4000 sonicatorを用いて超音波(frequency, 2.035 MHz; duty, 50%; burst rate, 10 Hz; intensity, 6.0 W/cm2)を30秒間照射した。照射から24時間後にルシフェラーゼアッセイを行って遺伝子発現量を測定した。結果を図７に示す。【００７９】
図７に示すようにNGRペプチド, RGDペプチドなどを本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスに導入することにより、遺伝子導入の選択性がより向上することが明らかになった。【００８０】
（１０）超音波造影と崩壊の確認(図８)
本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス（pDNA/PS/AL + Bubble）の超音波造影効果を解析した。VEVO2100システム（プライムテック社）を用いてチューブに注入したpDNA/PS/AL + Bubbleの超音波造影画像を得た。また、この画像撮影中にfrequency, 3 MHz; duty, 100; intensity, 2.0 W/cm2の超音波を照射し、pDNA/PS/AL + Bubbleを破壊した(図８)。図８に示されるように、本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスは、超音波照射により複合体中のバブルがはじけて複合体が破壊されることが確認された。【００８１】
（１１）siRNAを用いたsiRNA/PS/DSPG複合体の調製(図９)
図２〜３と同様の検討を、核酸として配列番号１，２で表されるホタルルシフェラーゼに対するsiRNAで行った。表５で示すsiRNAとPS, ALの様々な質量比で調製した複合体の粒子径とζ電位を測定し、1:2:5の複合体にパーフルオロプロパンガスを封入した。また、アガロースゲル電気泳動で安定性を評価した。結果を図９に示す。【００８２】
【表５】
2014030601.tif 000007
【００８３】
siRNAを核酸として含む本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス（siRNA/PS/AL + Bubble）は、pDNAを含む複合体と同様に安定であり、バブルがアニオン性リポソーム内に封入されていることが明らかになった。【００８４】
（１２）mRNAを用いたmRNA/PS/DSPG複合体の調製(図１０)
pDNAに代えてホタルルシフェラーゼのmRNAを用いて上記と同様にして、本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス（mRNA/PS/AL + Bubble）を構築し、図３と同様な方法により安定性を評価した。結果を図１０に示す。【００８５】
図１０に示されるように、本発明の複合体は、アガロースゲル電気泳動でもmRNAを放出することはなく、安定な複合体であることが明らかになった。【００８６】
（１３）薬剤封入アニオン性リポソームの調製(図１１)
DSPG, DSPC, PEG-DSPE, ヘマトポルフィリンのクロロホルム溶液を各成分のモル比が7:2:1:5の割合になるように混合し、ALと同様の方法でヘマトポルフィリン内包リポソームを調製した。ヘマトポルフィリンの封入率は99.2%であった。【００８７】
このヘマトポルフィリン内包リポソームにパーフルオロプロパンガスを内封し、光学的に観察した（図１１（A））。【００８８】
作製した脂質薄膜を0.3 Mのクエン酸溶液で水和し、リポソームを作製した。リポソームの脂質としてDSPG, DSPC, PEG-DSPEを用いた。【００８９】
さらに、ゲル濾過によって外水層を20 mMのHEPES含有5%グルコース溶液（pH=7.5）に置換した。このリポソーム溶液にドキソルビシンを質量比で12.5:1の割合になるように添加し、60℃で30分間インキュベートし、リポソーム内へドキソルビシンを内包した。このときの封入率は97.7%であった。
このドキソルビシン内包リポソームにパーフルオロプロパンガスを内封し、光学的に観察した（図１１（B）） 。【００９０】
アニオン性リポソームの部分に種々の薬剤が封入できることが明らかになった。【００９１】
実施例２：アニオン性バブルリポソームの作製（２）
（１）アニオン性リポソーム(AL)の作製
実施例１と同様にして、アニオン性リポソーム溶液を得た。【００９２】
（２）pDNAとカチオン性ポリマーの複合体(polyplex)の作製
バイアル瓶内で注射用水に溶解したpDNAと様々なカチオン性の高分子(PS, PLL, PLA, DPLL)を適当な割合で混合し、室温で15分間インキュベートすることで、表面がカチオン性を帯びたpDNAとカチオン性ポリマーの複合体（polyplex）を調製した。【００９３】
（３）アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスの作製
上記（２）で得られたpolyplexを上記（１）で得られたアニオン性リポソーム適切な割合で混合し、さらに15分間インキュベートした。
混合割合（重量比）は、下記の通りとした。pDNA:PLL:AL、pDNA:PLA:AL、及びpDNA:DPLL:ALのそれぞれについては1.0:1.5:17.6、並びに、pDNA:PS:ALについては1.0:1.25:2.5。
次に、10倍濃度のPBS(リン酸緩衝生理食塩水)を用いて浸透圧を調整した。バイアル瓶内にパーフルオロプロパンガスを封入し、バイアル瓶を密封した。さらに、7.5mLのパーフルオロプロパンガスを用いてバイアル内を加圧し、バス型ソニケーターを用いて5分間超音波処理することで本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスを構築した。【００９４】
（４）アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスの理化学的性質
得られた複合体の粒子径とζ電荷をゼーターサイザーナノ（マルバーン社）を用いて測定した。結果を表６に示す。【００９５】
【表６】
2014030601.tif 000008
【００９６】
（５）複合体の外観（図１３）
上記（３）で得たアニオン性バブルリポソーム複合体のバブル封入前後の外観を光学的に観察した結果を図１３（ａ）に示す。pDNA/PS/BL複合体の、酢酸ウラニルを用いたネガティブ染色による、TEM観察像を、図１３（ｂ）に示す。【００９７】
（６）複合体の安定性（図１４）
上記で得られたアニオン性バブルリポソーム複合体の安定性を、実施例１と同様にしてアガロースゲル電気泳動により評価した。比較対照として、未処理のpDNA（Naked pDNA）も泳動した。【００９８】
図１４に示されるように、本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスは、アガロースゲル電気泳動によってもpDNA或いはpDNAとカチオン性ポリマーの複合体(polyplex)は外れることはなく、安定であることが示された。【００９９】
（７）in vitro遺伝子導入の効果（図１５）
ヒト静脈内皮細胞EAhy926細胞に上記で得られた複合体を導入した。【０１００】
複合体は、上記で得られたpDNAとカチオン性ポリマー（PS、PLL、PLA又はDPLL）の複合体(polyplex；pDNA/PS、pDNA/PLL、pDNA/PLA又はpDNA/PS)、アニオン性リポソーム複合体（pDNA/PS/AL、pDNA/PLL/AL、pDNA/PLA/AL又はpDNA/PS/AL）、アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス（pDNA/PS/BL、pDNA/PLL/BL、pDNA/PLA/BL又はpDNA/PS/BL）を用いた。なお、「BS」は、本明細書において「AL+bubble」と交換可能に用いられ、バブルを封入したアニオン性バブルリポソームを表す。【０１０１】
EAhy926細胞は、10% FBS（fetal bovine serum）、ペニシリン100 IU/mL、ストレプトマイシン100μg/mL、L-グルタミン2mM、non-essential amino acids 100μMを添加したDMEM培地中で、37℃及び二酸化炭素濃度5%の環境下で維持した。24時間のプレインキュベーション後、各種複合体（pDNA 10μg）を含むOpti-MEM I培地へと培地を交換した。各種複合体を添加から10分後に、EAhy926細胞に超音波(frequency, 2.0 MHz; duty, 50%; burst rate, 10 Hz; intensity, 4.0 W/cm2)を20秒間照射した。超音波照射は、Sonnopore-4000 sonicator（ネッパジーン社）を用いて、直径6mmのプローブを利用して行った。【０１０２】
その後、培地を培養培地へと交換し、さらに24時間培養を継続した。培養後、細胞をlysis buffer（0.05% Triton X-100, 2 mM EDTA, and 0.1 M Tris; pH 7.8）に懸濁し、細胞中のルシフェラーゼ発現量を評価した。結果を図１５に示す。【０１０３】
pDNAとカチオン性ポリマーの複合体(polyplex)及びアニオン性リポソーム複合体では、超音波照射の有無（US(+)群とUS(-)群）でpDNAの導入効果に実質的な差異はないが、アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスでは超音波照射の有無（US(+)群とUS(-)群）でpDNAの導入効果に有意な差があった。また、用いる正電荷高分子の種類は遺伝子導入効果にほとんど影響しなかった。【０１０４】
（８）pDNAの細胞内局在（図１６）
フルオレセイン標識したpDNA及びリソソームマーカーであるLysoTracker Red DND-99を用いて、pDNAの細胞内局在を評価した。【０１０５】
上記と同様にして、フルオレセイン標識したpDNAを用いて調製したpDNA/PS/BL複合体をEAhy926細胞に添加し、超音波照射（US）をした。常法によりpDNAをLipofectamine 2000を用いてpDNAを細胞に導入した群、及び、超音波照射（US）をしない群を対照とした。処理から6時間後、各群をLysoTracker Red DND-99で処理した。結果を図１６に示す。【０１０６】
Lipofectamine 2000によりトランスフェクションを行った場合、pDNAはリソソームと共局在した（図１６（a））。また、pDNA/PS/BL複合体に超音波を併用しない場合にもpDNAはリソソームと共局在した（図１６(b)）一方、pDNA/PS/BL複合体の添加及び超音波照射（US）をした細胞では、pDNAはリソソームとは局在しなかった（図１６（c））。このことは、アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスがエンドサイトーシス経路を介さず、細胞質内へ直接的にpDNAを送達していることを示唆する結果である。【０１０７】
（９）細胞毒性試験（図１７）
WST-1アッセイにより、各複合体の細胞毒性を評価した。上記（７）と同様にして、各種アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス（pDNA/PS/BS、pDNA/PLL/BS、pDNA/PLA/BS又はpDNA/PS/BS）を細胞に添加し、超音波照射（US）をした。複合体の添加及び超音波照射をしない群（Control）を、対照群とした。超音波照射（US）のみをした群も実施した。その後、24時間培養を行った後に、 Cell Proliferation Reagent WST-1（Roche Diagnostics Corporation社製）を用いて、対照に対する細胞生存率（Cell viability (% of control)）を評価した。結果を図１７に示す。【０１０８】
図１７に示されるように、各種アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスは細胞生存率を若干低下させた。一方で、pDNA/PS/BL複合体においては有意な細胞障害性は認められなかった。【０１０９】
（１０）エリスロサイトの凝集（図１８）
アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスの、エリスロサイトを凝集する活性を評価した。【０１１０】
マウスからエリスロサイト（erythrocyte）を取得し、PBS緩衝液を用いて、4℃における5,000xgでの遠心分離5分間を３回繰り返すことで洗浄し、2%(v/v)のエリスロサイトストック懸濁液を調製した。各種アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス（pDNA/PEI/BL、pDNA/PS/BL、pDNA/PLL/BL、pDNA/PLA/BL又はpDNA/PS/BL）をエリスロサイトストック懸濁液に添加し、室温で15分間静置した。pDNA/Lipofectamine 2000（カチオン性リポソーム）の添加、及び、PBSのみの添加を対照とした。ガラスプレートに10μLの試料を滴下し、位相差顕微鏡下で凝集を観察した。結果を図１８に示す。【０１１１】
市販の遺伝子導入用試薬であるLipofectamine 2000では赤血球の溶血と凝集が、遺伝子導入実験に汎用されるpolyethylenimineでは非常に強い凝集が認められたものの、各種アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスでは凝集や溶血は認められなかった。【０１１２】
（１１）in vivo遺伝子導入の効果（図１９）
ICR系雌性マウスに、上記で得られた各種アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス（pDNA/PS/BL、pDNA/PLL/BL、pDNA/PLA/BL又はpDNA/PS/BL）を、pDNA（pCMV-Luc）量が50 μgとなるように、溶液400μLを26ゲージの注射針を用いて尾静脈内投与した。US(+)群（超音波照射群）では、投与直後にSonnopore-4000 sonicator（ネッパジーン社）を用いて直径20mmのプローブを利用して体外から腹部に対して超音波(frequency, 1.0 MHz; duty, 50%; burst rate, 10 Hz; intensity, 0.5 W/cm2)を１分間照射した。複合体投与から6時間後に各臓器（肝臓、腎臓、脾臓）を摘出し、臓器中のルシフェラーゼ発現量をLuc assayによって評価した。結果を図１９に示す。
各種アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスは超音波と併用しなかった場合には遺伝子導入効果がほとんど認められなかったものの、超音波と併用する事で非常に高い遺伝子導入効果が確認された。一方で、用いる正電荷高分子の種類は遺伝子導入効果に大きな影響を及ぼさなかった。【０１１３】
（１２）アニオン性脂質の効果の検証（図２０）
脂質としてDSPG、DSPA又はDSPSを用いて、上記と同様に各種pDNA/PS/BLを構築した。【０１１４】
得られた複合体を上記と同様の手法により、EAhy926細胞に各複合体を導入し、細胞中のルシフェラーゼ発現量を評価した。結果を図２０（a）に示す。【０１１５】
また、得られた複合体を上記と同様の手法により、マウスへpDNA/PS/BLを尾静脈内投与し、投与直後に腹部に対して超音波照射をした。複合体投与から6時間後に各臓器（肝臓、腎臓、脾臓）を摘出し、臓器中のルシフェラーゼ発現量をLuc assayによって評価した。結果を図２０（b）に示す。【０１１６】
さらに、得られた複合体について、上記と同様の手法により、WST-1アッセイによる各複合体の細胞毒性を評価した。結果を図２０（c）に示す。
DSPAを用いたpDNA/PS/BLはDSPGやDSPSを用いたpDNA/PS/BLと比較して遺伝子導入効果が大きく減少した。一方で、DSPGを用いたpDNA/PS/BLは最も高い遺伝子導入効果を示しながら、細胞障害性が認められなかった。以上より、BLを構成するアニオン性脂質としてDSPGが最適であることが示された。【０１１７】
（１３）pDNA/PS/BL複合体の体内動態（図２１）
32P標識したpDNAを用いて構築したpDNA/PS/BL複合体を用いる以外は上記と同様にして、マウスへpDNA/PS/BLを尾静脈内投与し、投与直後に腹部に対して超音波照射をした。投与から所定時間（0.25、0.5、1、3及び6時間）後に、ペントバルビタール麻酔下での大動脈からの採血、並びに、肝臓、腎臓、脾臓、心臓及び肺の各臓器を摘出した。摘出された臓器は生理食塩水で洗浄後、重量を計測した。血液及び各臓器をSoluene-350中で60℃において溶解し、得られたライセートをイソプロパノール及び30%H2O2で脱色処理、その後5N HCLで中和した。シンチレーションカウンターを用いて、32P標識pDNAの放射線強度を測定した。尾静脈内投与後の所定時間経過後（Time after intravenous administtration）における、血液中及び各臓器に取り込まれた32P標識したpDNAの投与した全量の32P標識したpDNAに対する割合（% of dose）を評価した。結果を図２１に示す。【０１１８】
pDNA/PS/BLは静脈内投与後に速やかに血液中から消失し、肝臓にそのほとんどが取り込まれることが明らかになった。一方で、超音波の照射の有無（US(+)又はUS(-)）によってpDNA/PS/BLの体内動態はほとんど影響を受けなかった。【０１１９】
（１４）pDNA/PS/BL複合体の肝臓への遺伝子導入（図２２）
上記と同様にして、マウスへpDNA/PS/BL（pDNA量50 μg）を尾静脈内投与した。投与直後に腹部又は胸部への超音波照射を上記と同様の条件で行った。【０１２０】
実施例１と同様の手法で、投与から6時間後にマウスの肝臓をコラゲナーゼ処理し、肝実質細胞（Parenchymal cell）と肝非実質細胞(Non parenchymal cell)を得た。106個の細胞当たりのルシフェラーゼ活性（Luciferase activities (pg/106 cells)）を測定し、遺伝子発現細胞を確認した。結果を図２２（a）に示す。【０１２１】
さらに、得られた肝非実質細胞から免疫磁気 ビーズシステム（immunomagnetic cell isolation system）により、クッパー細胞（Kupffer cell）及び内皮細胞（endothelial cell）を分離した。リアルタイムRT-PCR法により、対照mRNA（GAPDH）に対する、ルシフェラーゼmRNAの相対量（Relative luciferase mRNA expressions (luciferase mRNA/GAPDH mRNA)）を測定した。結果を図２２（b）に示す。【０１２２】
図２２（a）に示されるように、本発明のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス（pDNA/PS/BL）は、肝臓の非実質細胞に多く導入されることが明らかになった。図２２（b）に示されるように、非実質細胞のうちではクッパー細胞及び内皮細胞に同程度導入されることが明らかとなった。pDNA/PS/BLの粒子径は500nm程度と肝臓のフェネストラを通過するには大きかったものと推察される。【０１２３】
（１５）pDNA/PS/BL複合体による肝臓障害の評価（図２３）
pDNA（pCMV-Luc）量を25 μgとした以外は上記と同様にして、マウスへpDNA/PS/BLを尾静脈内投与し、投与直後に腹部に対して超音波照射をした。投与から所定時間（6、12、及び24時間）後に、ペントバルビタール麻酔下での大動脈からの採血をした。対照として、文献（Liu F, Song Y, Liu D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 1999;6:1258-66.）に記載の方法に準じて、hydrodynamic transfectionにより2.5mlの生理食塩水に溶解したpDNAを5秒以内に尾静脈内投与した。【０１２４】
得られた血清中のAST（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Asparatate transaminase）及びALT（アラニンアミノトランスフェラーゼ、Alanine transaminase）の活性を、Transaminase CII-Test Wako Kit（和光純薬社製）を用いて評価した。結果を図２３に示す。【０１２５】
図２３に示すように、pDNA/PS/BL複合体（Bubble lipopolyplex）の投与及び超音波照射（US(+)）は、肝臓障害の指標となるAST及びALT活性の上昇をほとんど生じさせない。このことは、アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスの肝毒性は極めて低い事を示している。【０１２６】
（１６）pDNA/PS/BL複合体による炎症性サイトカイン分泌の評価（図２４）
pDNA（pCMV-Luc）量を25 μgとした以外は上記と同様にして、マウスへpDNA/PS/BLを尾静脈内投与し、投与直後に腹部に対して超音波照射をした。投与から所定時間（6、12、及び24時間）後に、ペントバルビタール麻酔下での大動脈からの採血をした。対照として、文献（Ito Y, Kawakami S, Charoensit P, Higuchi Y, Hashida M. Evaluation of proinflammatory cytokine production and liver injury induced by plasmid DNA/cationic liposome complexes with various mixing ratios in mice. Eur J Pharm Biopharm. 2009;71:303-9.に記載の方法に準じてpDNA-DOTAP/コレステロール複合体（DOTAP/Cholリポプレックス、DOTAP/Chol lipoplex）を構築した、これを投与した。pDNA-DOTAP/コレステロール複合体は、pDNAとDOTAP/Cholリポソームのチャージ比（-:+）が1.0:2.3となるように、２成分を混合した。【０１２７】
得られた血清中のTNF-α及びIL-6のレベル（Serum TNF-α concentrarion, Serum IL-6 concentrarion）をBD OptEIA ELISA Set（BD社製）を用いて測定した。結果を、図２４に示す。【０１２８】
図２４に示すように、pDNA/PS/BL複合体（Bubble lipopolyplex）の投与及び超音波照射（US(+)）は、炎症の原因となるTNF-α及びIL-6のレベルの上昇を生じさせない。このことは、アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスは投与後に炎症の原因とならない事を示している。【０１２９】
（１７）腹部又は胸部への超音波照射の評価（図２５）
上記と同様にして、マウスへpDNA/PS/BL（pDNA量50 μg）を尾静脈内投与した。投与直後に腹部又は胸部への超音波照射を上記と同様の条件で行った。投与から6時間後、肝臓、腎臓、脾臓、心臓及び肺を摘出し、各臓器におけるルシフェラーゼ活性を評価した。結果を図２５に示す。【０１３０】
図２５に示すように、腹部に超音波を照射した場合には肝臓や腎臓、脾臓に高い遺伝子導入効果を示すものの、胸部に存在する心臓や肺への遺伝子導入効果はほとんど認められない。一方で胸部への照射によって、胸部の臓器（心臓、肺）において、腹部への照射と比べて高いルシフェラーゼ活性が観察された。以上の結果は、pDNA/PS/BLが超音波照射部位選択的に遺伝子を導入する事が可能であることを示している。【０１３１】
（１８）がん細胞への遺伝子導入効果（図２６）
５週齢の雌Bulb/cマウスにおいて、colon-26細胞を腹腔へと注入した。２週間後、上記と同様にしてマウスへpDNA/PS/BLを尾静脈内投与し、投与直後（immediately after injection）又は投与から５分後（5mim after injection）に腹部に対して超音波照射（US(+)）をした。投与から６時間後に腫瘍を摘出し、腫瘍におけるルシフェラーゼ活性を評価した。結果を図２６に示す。【０１３２】
図２６に示すように、アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックスを用いてがん細胞への遺伝子導入も行えることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明の製剤は、肝硬変治療薬、抗癌剤、細胞選択的薬物・核酸導入試薬（研究用試薬）などとして有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月26日(2014.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）アニオン性高分子と
プロタミン、ポリリジン、ポリアルギニン、及びポリリジンデンドリマー、からなる群から選ばれる少なくとも１種の正電荷高分子との複合体及び
（Ｂ）アニオン性リポソームを含み、
前記リポソームは気泡を（ｂｕｂｂｌｅ）含み、前記複合体はカチオン性であるアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。
【請求項２】
前記正電荷高分子はプロタミンを含む、請求項１に記載のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。
【請求項３】
前記アニオン性高分子は核酸である、請求項１又は２に記載のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。
【請求項４】
前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。
【請求項５】
前記核酸は、遺伝子発現プラスミドＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、ＤＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡアプタマーである、請求項３又は４に記載のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。
【請求項６】
プロタミン及びアニオン性リポソームを含み、前記リポソームは気泡を（ｂｕｂｂｌｅ）含む、アニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。
【請求項７】
前記アニオン性リポソームが、タンパク質又は薬物を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアニオン性ナノバブルポリ−リポ・プレックス。
【国際調査報告】
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