(57)【要約】【課題】  ヒト筋萎縮性側索硬化症および／またはヒト前頭側頭葉変性症と同様な症状を有するモデルマウスを作製すること。【解決手段】  脊椎動物の内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号１の３８２番目に対応するアミノ酸のアラニンがチロシンに置換された変異タンパク質、または配列番号１の３４８番目に対応するアミノ酸のグリシンがシステインに置換された変異タンパク質の発現が、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子プロモーターによって制御されるように、脊椎動物に変異を起こさせることによって、ヒト筋萎縮性側索硬化症および／またはヒト前頭側頭葉変性症と同様な症状を有するモデルマウスを作製することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号１の３８２番目に対応するアミノ酸のアラニンがチロシンに置換された変異タンパク質、または配列番号１の３４８番目に対応するアミノ酸のグリシンがシステインに置換された変異タンパク質の発現が、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子プロモーターによって制御されている脊椎動物（ただし、ヒトを除く）。
【請求項２】
内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の少なくとも一方のアレルにおいて、外来性ＤＮＡによって、配列番号１の３８２番目に対応するアミノ酸のアラニンがチロシンに置換した変異、または配列番号１の３４８番目に対応するアミノ酸のグリシンがシステインに置換した変異を有する、請求項１に記載の脊椎動物。
【請求項３】
筋萎縮性側索硬化症モデル動物である、請求項１または２に記載の脊椎動物。
【請求項４】
前頭側頭葉変性症モデル動物である、請求項１または２に記載の脊椎動物。
【請求項５】
ヒトＴＤＰ−４３遺伝子のノックインマウスである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の脊椎動物。
【請求項６】
筋萎縮性側索硬化症モデル動物を作製する方法であって、
脊椎動物（ただし、ヒトを除く）の内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号１の３８２番目に対応するアミノ酸のアラニンがチロシンに置換された変異タンパク質、または配列番号１の３４８番目に対応するアミノ酸のグリシンがシステインに置換された変異タンパク質の発現が、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子プロモーターによって制御されるように、前記脊椎動物に変異を起こさせる工程を含む方法。
【請求項７】
前記脊椎動物の内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の少なくとも一方のアレルにおいて、外来性ＤＮＡを用いて、配列番号１の３８２番目に対応するアミノ酸のアラニンをチロシンに置換する工程、または配列番号１の３４８番目に対応するアミノ酸のグリシンをシステインに置換する工程、によって、前記脊椎動物に変異を起こさせることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記脊椎動物の内在性ＴＤＰ−４３遺伝子又はその一部を、外来性ヒトＴＤＰ−４３遺伝子又はその一部と置換することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前頭側頭葉変性症モデルマウスを作製する方法であって、
脊椎動物（ただし、ヒトを除く）の内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号１の３８２番目に対応するアミノ酸のアラニンがチロシンに置換された変異タンパク質、または配列番号１の３４８番目に対応するアミノ酸のグリシンがシステインに置換された変異タンパク質の発現が、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子プロモーターによって制御されるように、前記脊椎動物に変異を起こさせる工程を含む方法。
【請求項１０】
前記脊椎動物の内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の少なくとも一方のアレルにおいて、外来性ＤＮＡを用いて、配列番号１の３８２番目に対応するアミノ酸のアラニンをチロシンに置換する工程、または配列番号１の３４８番目に対応するアミノ酸のグリシンをシステインに置換する工程、によって、前記脊椎動物に変異を起こさせることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記脊椎動物の内在性ＴＤＰ−４３遺伝子又はその一部を、外来性ヒトＴＤＰ−４３遺伝子又はその一部と置換することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋萎縮性側索硬化症および／または前頭側頭葉変性症のモデルマウスに関する。
【背景技術】
【０００２】
TAR DNA-binding protein 43kD (ＴＤＰ−４３)は、不均一核内リボ核酸タンパク質（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein; hnRNP）の一種であり、ｍＲＮＡや他のｈｎＲＮＰと結合し、ｍＲＮＡの安定化、ｈｎＲＮＡの選択的スプライシング、転写調節などに関与する。最近、ＴＤＰ−４３が、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）や筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の変性部位に出現するユビキチン陽性封入体の構成因子であることが明らかになった（M.Neumann et al. 2006 vol.314 p.130-133）。その後、家族性ＡＬＳの病因遺伝子として、多数のＴＤＰ−４３突然変異が同定された（J.Sreedharan et al. 2008 vol.319 p.1668-1672；E.Lee wt al. 2012 vol.13 p.38-50）。【０００３】
そこで、ヒトで同定された変異を模して、変異型ＴＤＰ−４３トランスジェニックマウスや変異型ＴＤＰ−４３（Ｑ３４３Ｒ）ノックインマウス等が、ＴＤＰ−４３を利用したＡＬＳのモデルマウスとして、作製された（科学研究費２００９年度研究実績報告書「筋萎縮性側索硬化症とＴＤＰ−４３：その病理像の全貌と分子病態機序の解明」（研究課題番号２０２４００３７、代表者：高橋均））。しかしながら、ＦＴＬＤやＡＬＳと同様な神経症状は出現せず、神経細胞死に至る原因になるような細胞内異常封入体も検出されなかった。この結果より、変異型ＴＤＰ−４３による神経症状の発症のためには、変異に加え、他の要因が必要であると考えられていた（科学研究費２００９年度研究実績報告書「筋萎縮性側索硬化症とＴＤＰ−４３：その病理像の全貌と分子病態機序の解明」（研究課題番号２０２４００３７、代表者：高橋均））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ヒト筋萎縮性側索硬化症および／またはヒト前頭側頭葉変性症と同様な症状を有するモデルマウスを作製することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一実施態様は、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号１の３８２番目に対応するアミノ酸のアラニンがチロシンに置換された変異タンパク質（配列番号２）、または配列番号１の３４８番目に対応するアミノ酸のグリシンがシステインに置換された変異タンパク質（配列番号３）の発現が、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子プロモーターによって制御されている脊椎動物（ただし、ヒトを除く）である。当該脊椎動物は、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の少なくとも一方のアレルにおいて、外来性ＤＮＡによって、配列番号１の３８２番目に対応するアミノ酸のアラニンがチロシンに置換した変異、または配列番号１の３４８番目に対応するアミノ酸のグリシンがシステインに置換した変異を有してもよい。当該脊椎動物は、筋萎縮性側索硬化症モデル動物または前頭側頭葉変性症のモデル動物であってもよく、ヒトＴＤＰ−４３遺伝子のノックインマウスであってもよい。【０００６】
本発明のさらなる一実施態様は、前頭側頭葉変性症モデル動物または筋萎縮性側索硬化症モデル動物を作製する方法であって、脊椎動物（ただし、ヒトを除く）の内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号１の３８２番目に対応するアミノ酸のアラニンがチロシンに置換された変異タンパク質、または配列番号１の３４８番目に対応するアミノ酸のグリシンがシステインに置換された変異タンパク質の発現が、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子プロモーターによって制御されるように、前記脊椎動物に変異を起こさせる工程を含む。当該方法において、前記脊椎動物の内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の少なくとも一方のアレルにおいて、外来性ＤＮＡを用いて、配列番号１の３８２番目に対応するアミノ酸のアラニンをチロシンに置換する工程、または配列番号１の３４８番目に対応するアミノ酸のグリシンをシステインに置換する工程、によって、前記脊椎動物に変異を起こさせてもよい。また、当該方法において、前記脊椎動物の内在性ＴＤＰ−４３遺伝子又はその一部を、外来性ヒトＴＤＰ−４３遺伝子又はその一部と置換してもよい。【０００７】
＝＝関連文献とのクロスリファレンス＝＝
本出願は、２０１２年５月３１日付で出願した日本国特許出願２０１２−１２４９４７、及び２０１２年７月３０日付で出願した日本国特許出願２０１２−１６８００１に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明による一実施例において、変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）を一過的にＨｅＬａ細胞に発現させたときに生じる異常封入体の様々な観察像である。
【図２】本発明による一実施例において、変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）を一過的にＨｅＬａ細胞に発現させたときに生じるアポトーシス観察像を時系列に示したものである。
【図３】本発明による一実施例において、変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）を一過的にラット脳神経細胞に発現させたときに生じる異常封入体の観察像である。白く光っているのが、Venusによる蛍光シグナルである。そして、中央にある神経細胞の細胞質に異常封入体が観察される。
【図４】本発明による一実施例における、変異型ＴＤＰ−４３ノックインベクターの構成（Targeting vector）、ノックイン前の内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の構成（Tardbp genome）、及びノックイン後の内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の構成を示す。
【図５】本発明による一実施例において、野生型マウス及び変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスの中枢神経における野性型または変異型ＴＤＰ−４３の発現を示したデータである。なお、＜Ｇ＞は変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウス、＜Ａ＞は変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）ノックインマウスを示す。
【図６】本発明による一実施例において、野生型マウス及び変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスの体重を生後１４ヶ月に至るまで測定し、その平均体重の推移を示したグラフである。
【図７】本発明による一実施例において、変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスの上位運動ニューロンの障害による行動異常を示した図である。
【図８】本発明による一実施例において、変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスの行動異常（四肢反射と振戦）を５段階評価し、野生型マウスの評価と共に、各個体別に、時間経過を追って作製した図である。なお、＜Ｇ＞は変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウス、＜Ａ＞は変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）ノックインマウスを示す。
【図９】本発明による一実施例において、時間経過を追って変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスの行動異常（振戦、握力および四肢反射）を評価し、各個体別にその評価を、野生型マウスの評価と共に示した図である。なお、＜Ｇ＞は変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウス、＜Ａ＞は変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）ノックインマウスを示す。ｘは死亡したため、測定できなかったことを示す。
【図１０】本発明による一実施例において、生後４カ月の変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウスの筋電図を測定した結果において、MUP(Moter unit potential)の時間延長が見られた筋電図（Ａ）、異常筋電図(B)、MUPが正常時間内に終了した筋電図（Ｃ）を示す図である。
【図１１】本発明による一実施例において、生後５ヶ月の変異ノックインマウスの脳の組織切片で、Venusからの蛍光像を蛍光顕微鏡で観察した写真である。矢印は封入体からの蛍光シグナルを示す。
【図１２】本発明による一実施例において、ホームケージ活動性試験におけるノックインマウス（■）および野生型マウス（●）の水平方向への行動量の推移を示す図である。
【図１３】本発明による一実施例において、オープンフィールド試験における、ノックインマウス（右バー）および野生型マウス（左バー）の壁側に滞在する時間と中心範囲に滞在する時間を示す図である。
【図１４】本発明による一実施例において、新奇物体認識試験における、ノックインマウス（右バー）および野生型マウス（左バー）の新奇物の近くに滞在する時間を示す図である。
【図１５】本発明による一実施例において、３チャンバー試験における、ノックインマウス（右バー）および野生型マウス（左バー）の、他のマウスがいる部屋に滞在した時間（stranger-near）と、他のマウスがいない部屋に滞在した時間（empty-near）を示す図である。
【図１６】本発明による一実施例において、８方向放射状迷路試験における、ノックインマウス（■）および野生型マウス（●）の、８本のアーム全ての餌を食べ終えるまでの時間、既に餌を食べたアームに浸入してしまった回数（作業記憶エラー）、およびアームへの総浸入回数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１０】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１１】
＝＝筋萎縮性側索硬化症および／または前頭側頭葉変性症のモデル動物の作製方法＝＝
筋萎縮性側索硬化症および／または前頭側頭葉変性症と同様な症状を有するモデル動物を作製する方法には、脊椎動物の内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号１の３８２番目に対応するアミノ酸のアラニンがチロシンに置換された変異タンパク質、または配列番号１の３４８番目に対応するアミノ酸のグリシンがシステインに置換された変異タンパク質の発現が、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子プロモーターによって制御されるように、前記脊椎動物に変異を起こさせる工程を含む。
【００１２】
ＴＤＰ−４３遺伝子は、ヒト（Gene ID: 23435）、マウス（Gene ID: 230908）、キイロショウジョウバエ（Gene ID: 37781）などで同定されている遺伝子であって、脊椎動物には広く存在する。従って、用いる脊椎動物は、特に限定されないが、ヒト以外の霊長類、またはげっ歯類であることが好ましく、マーモセット、マウスまたはラットであることが特に好ましい。その脊椎動物の内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の少なくとも一方のアレルでは、配列番号１の３８２番目に対応するアミノ酸がアラニンであるか、配列番号１の３４８番目に対応するアミノ酸がグリシンである。なお、配列番号１の３８２番目に対応するアミノ酸は、その脊椎動物においては、必ずしも３８２番目である必要はなく、配列番号１の３８２番目に対応すれば、つまり、配列番号１の３８２番目周辺のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列の中で、配列番号１の３８２番目に相当するアミノ酸であれば良い。これは、配列番号１の３４８番目に対応するアミノ酸についても同様である。
【００１３】
筋萎縮性側索硬化症および／または前頭側頭葉変性症のモデル動物を作製するには、例えば、forward geneticsを利用し、脊椎動物に変異源を与え、多数の変異体の中から、このアラニンまたはグリシンを、それぞれチロシンまたはシステインに変異した個体を選択しても良いが、reverse geneticsを利用し、外来性ＤＮＡを用いて、このアラニンまたはグリシンを、それぞれチロシンまたはシステインに置換してもよい。なお、アミノ酸を置換する場合、変異タンパク質の発現が、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子プロモーターによって制御され、その変異タンパク質の効果が生じる限り、他に外来ＤＮＡの挿入等があっても良い。以下にアミノ酸の置換方法の一例を示すが、置換方法は、この例に限定されるものではない。
【００１４】
まず、公知のin vitro mutagenesis法を用いて、単離されたＴＤＰ−４３遺伝子またはｃＤＮＡにおいて、配列番号１の３８２番目に対応するアミノ酸のアラニンをチロシンに置換するか、または配列番号１の３４８番目に対応するアミノ酸のグリシンをシステインに置換する。必要であれば、タグをコードするＤＮＡをin frameで結合させ、変異ＴＤＰ−４３との融合タンパクが発現するようにする。あるいは、変異ＴＤＰ−４３遺伝子またはｃＤＮＡとタグをコードする遺伝子との間に、ＩＲＥＳ配列（internal ribosomal entry site；リボソーム内部進入部位）を挿入し、２つのタンパク質が別々に発現するようにしてもよい。
【００１５】
ここで、ＴＤＰ−４３遺伝子またはｃＤＮＡの由来は特に限定されないが、脊椎動物ＴＤＰ−４３遺伝子またはｃＤＮＡであることが好ましく、ヒトＴＤＰ−４３遺伝子またはｃＤＮＡであることがより好ましい。また、タグは特に限定されず、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグなどのオリゴペプチド、ＧＦＰ、ＥＧＦＰなどの蛍光タンパク質、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素などが例示できる。融合タンパク質にする場合は、オリゴペプチドまたは蛍光タンパク質が、ＩＲＥＳ配列を用いる場合は、蛍光タンパク質または酵素タンパク質が好ましい。
【００１６】
こうして作成したノックイン用ＤＮＡを、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞に導入し、ノックイン用ＤＮＡが内在性ＴＤＰ−４３遺伝子と置換された細胞を選択する。得られた細胞では、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の一方のアレルにおいて、配列番号１の３８２番目に対応するアミノ酸のアラニンがチロシンに置換された変異タンパク質、または配列番号１の３４８番目に対応するアミノ酸のグリシンがシステインに置換された変異タンパク質の発現が、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子プロモーターによって制御される。
【００１７】
その後、得られた細胞を用いてキメラ動物を作製し、多能性幹細胞が生殖系列に入ったキメラ動物から、変異ＴＤＰ−４３遺伝子がノックインされた子孫を得ることができる。あるいは、ノックイン用ＤＮＡを、受精卵に注入し、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子と置換された個体を選択し、選ばれた個体を成体まで育てることで、ノックイン動物を作製することもできる。これらのノックイン動物は、変異ＴＤＰ−４３遺伝子のヘテロ接合であるが、導入した変異は優性変異であるので、これらのヘテロ接合体を、筋萎縮性側索硬化症および／または前頭側頭葉変性症のモデル動物として用いることができる。ヘテロ接合体の雌雄を交配させることによって、ホモ接合体も得ることができる。
【００１８】
＝＝筋萎縮性側索硬化症および／または前頭側頭葉変性症のモデル動物＝＝
上述した方法によって作製された脊椎動物は、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の少なくとも一方のアレルにおいて、配列番号１の３８２番目に対応するアミノ酸のアラニンがチロシンに置換された変異タンパク質、または配列番号１の３４８番目に対応するアミノ酸のグリシンがシステインに置換された変異タンパク質の発現が、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子プロモーターによって制御されている。この変異脊椎動物は、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の少なくとも一方のアレルにおいて、外来性ＤＮＡによって、配列番号１の３８２番目に対応するアミノ酸のアラニンがチロシンに置換した変異、または配列番号１の３４８番目に対応するアミノ酸のグリシンがシステインに置換した変異を有する脊椎動物であってもよい。なお、変異脊椎動物は、変異タンパク質の発現が、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子プロモーターによって制御され、その変異タンパク質の効果が生じる限り、他に外来ＤＮＡの挿入等があっても良い。
【００１９】
これらの変異は優性変異であるので、変異脊椎動物は、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の一方のアレルにおいて置換が生じたヘテロ接合でもよいが、両方のアレルにおいて置換が生じたホモ接合でもよい。
【００２０】
なお、内在性ＴＤＰ−４３遺伝子は、外来性ヒトＴＤＰ−４３遺伝子と置換されていることが好ましい。
【００２１】
この変異脊椎動物は、生後、振戦（ふるえ）や四肢異常反射のような、異常な神経症状を呈する。また、握力が低下し、ものを掴む動作が困難になる。脊髄や脳の中枢神経細胞では、ＴＤＰ−４３の細胞内異常封入体が生じる。このように、この脊椎動物には、筋萎縮性側索硬化症特有の症状が現れるため、筋萎縮性側索硬化症モデル動物として有用である。
【００２２】
一方、ヒトＦＴＬＤ病理所見においても、脳内でＴＤＰ−４３の細胞内異常封入体が観察されており、この病理学的要素が前頭葉と側頭葉における神経細胞の脱落・減少と、ＭＲＩなどの画像診断による脳（前頭葉・側頭葉）の委縮に繋がると考えられている。このように、この脊椎動物には、ＴＤＰ−４３の細胞内異常封入体蓄積という、前頭側頭葉変性症特有の症状が現われ、脳細胞の変性が始まっていることを示しているため、前頭側頭葉変性症モデル動物として有用である。
【実施例】
【００２３】
（１）ベクター構築
ＴＤＰ−４３ｃＤＮＡ（Human cDNA clone, FCC-101, TOYOBO Co.,LTD.）（配列番号９）をpBluescriptSK(+)プラスミドベクターのHindIII及びBamHI部位に挿入したプラスミドを用い、下記プライマーを用い、in vitro mutagenesis法（Nuc. Acids Res. 2000 vol.28 E78）によって変異型ＴＤＰ−４３ｃＤＮＡ（Ｇ２９８Ｓ、Ａ３１５Ｔ、Ｇ３４８Ｃ、Ｎ３５２Ｓ、Ａ３８２Ｔ）を作製した。  
Ｇ２９８Ｓプライマー： attgtttcccaaactagctccaccccc（配列番号４）
Ａ３１５Ｔプライマー： attaatgctgaacgtaccaaagttc（配列番号５）
Ｇ３４８Ｃプライマー： attacccgatgggcatgactggttc （配列番号６）
Ｎ３５２Ｓプライマー： ttggttttggttactacccgattggcc（配列番号７）
Ａ３８２Ｔプライマー： tccccaaccaattgttgcaccagaatt（配列番号８）
次に、Venus/pcDNA3 (VenusがpcDNA3ベクターのBamHIとEcoRI部位に挿入されているプラスミド)のHindIII及びKpnI部位へ、同じ酵素で切断した変異型ＴＤＰ−４３ｃＤＮＡを挿入した。このようにして、変異型ＴＤＰ−４３に蛍光蛋白質Venusを融合させた発現ベクターを作製した。【００２４】
（２）封入体形成
ＨｅＬａ細胞に、変異型ＴＤＰ−４３発現ベクターをLipofectamin2000を用いてリポフェクションし、２４時間後に共焦点蛍光顕微鏡でVenusの蛍光を観察したところ、細胞質にVenusを含む封入体を持つ細胞の頻度は、変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）及び変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）が最も高く、一方、野生型ＴＤＰ−４３の強制発現では封入体は少数しか見られなかった。そこで、変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスを作製するのに、これらの変異型を用いた。なお、以下のいずれの実験でも、変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）及び変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）について、同様の実験結果が得られたが、本明細書では、一例として、変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）で得られた結果を記載する。【００２５】
図１には、ＨｅＬａ細胞において、変異型ＴＤＰ−４３で観察された様々な封入体を示す。（Ａ）〜（Ｃ）は、細胞質に生じた封入体で、比較的小さく拡散しているもの（Ａ）、中くらいで塊になっているもの（Ｂ）、比較的大きな塊になっているもの（Ｃ）の一例である。（Ｄ）は、核に生じた封入体である。【００２６】
次に、明視野と蛍光の顕微鏡ライブイメージングにより、ＨｅＬａ細胞の細胞死を検出した。すなわち、図２で示すように、時間とともに変異型ＴＤＰ−４３が核から細胞質に漏出し、封入体を形成するとともに、細胞の形態がつぶれていった。そして、明視野で観察された細胞死の時期と同時に、変異型ＴＤＰ−４３の発現を示す蛍光も薄れていった。これは、細胞内異常封入体形成が、細胞死の原因であることを示している。【００２７】
次に、ラット脳神経細胞を用いて、同様に変異型ＴＤＰ−４３の影響を観察した。まず、妊娠１９日目のWistar Ratを麻酔後に頸椎脱臼し、開腹して取り出した胎児から脳を採取し、実体顕微鏡下において海馬を切り出した。採取した海馬を、酵素（Papain及びDnaseI）を含有したＰＢＳに３７℃で１０分間浸漬し、ガラスピペットにより海馬組織の細胞を分散させた。直径３５ｍｍのイメージング用デッシュに海馬から採取した細胞を培養した。ここで培地は２％ＦＢＳ／ＭＥＭにＮ２及びＢ２７を添加したものを用いた。培養４日目に、変異型ＴＤＰ−４３発現ベクターをリン酸カルシウム法によりラット海馬培養細胞へトランスフェクトしたところ、図３に示すように、やはり、細胞内に異常封入体の形成が観察された。【００２８】
（３）変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスの作製
まず、pBluescriptベクターのXhoI HindIIIの間にNeoカセットが挿入されたベクターをApaI及びXhoIで切断し、変異型ＴＤＰ−４３の発現ベクターから、ApaI及びXhoIで切り出した変異型TDP-Venus-polyAを挿入し、TDP43-Venus-polyA-Neoカセット/pBstSKを作製した。【００２９】
このベクターを鋳型とし、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片と、野生型ＴＤＰ−４３遺伝子が挿入されたＢＡＣ(bacterial artificial chromosome)ベクターとを大腸菌へエレクトロポレーション法により導入して、相同組み換えを誘発させることにより、ノックインベクターを完成させた。【００３０】
このベクターをＥＳ細胞にエレクトロポレーションにて導入し、G418で選択して得たクローンから、相同組換えを起こしたＥＳ細胞をスクリーニングして、変異型ＴＤＰ−４３タンパク質の最初のメチオニンからHindIIIまでが内在性ＴＤＰ−４３遺伝子のエクソン２に置換されたクローンを選択した。図４に、ノックインベクターの構成、ノックイン前の内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の構成、及びノックイン後の内在性ＴＤＰ−４３遺伝子の構成を示す。【００３１】
このＥＳ細胞を用いて、キメラマウスを作製し、生殖系列キメラマウスを選択して、その子孫から変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスを得た。【００３２】
この変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスにおいて、ノックインした変異型ＴＤＰ−４３の発現を調べるため、ウエスタンブロットを行った。すなわち、生後４ヶ月の野生型マウスおよび変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスの脳を摘出し、粗抽出液を調製して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離した。ＰＶＤＦメンブレンにトランスファーした後で、抗ＴＡＲＤＢＰポリクローナル抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製、型番：１２８９２−１−ＡＰ）を用いて、変異型ＴＤＰ−４３のシグナルを得た。その結果を図５に示す。【００３３】
野生型マウスでは、野性型ＴＤＰ−４３を示すシグナルが検出され、変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）ノックインマウスでは、野性型ＴＤＰ−４３および変異型ＴＤＰ−４３の発現を示すシグナルが検出された。ここで、野生型マウスの野生型ＴＤＰ−４３の発現量と、変異型マウスの野生型ＴＤＰ−４３および変異型ＴＤＰ−４３の合計発現量とがほぼ同程度だった。なお、変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）ノックインマウスでは、これらのシグナルの他に、分子量の小さいシグナルも弱く検出されたが、一般に、変異タンパク質は分解されやすいと考えられており、この余分なシグナルは変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）が部分的に分解されたものと考えられる。【００３４】
このように、変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）ノックインマウスでは、ノックインした変異遺伝子が、野生型マウスと同様な制御を受けていることが確認された。【００３５】
（４）変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスの体重計測
野生型マウス（雄７匹、雌９匹）、変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウス（雄６匹、雌３匹）、変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）ノックインマウス（雄４匹、雌５匹）について、生後すぐから、生後１４ヶ月に至るまで、体重を測定し、その平均体重を算出し、その平均体重の推移をグラフ化した（図６）。  
図６で示すように、両方のノックインマウスは、野生型に比べて体重の増加が遅く、１４ヶ月後でも、野生型マウスより、有意に体重が軽かった。【００３６】
（５）変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスの行動解析
野生型マウスと変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスに対し、ケージ中のマウスの行動を観察すると、野生型マウスは、ケージの網を掴みながら自由にケージ内を動きまわるが、変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスは、両方とも、握力が低下しており、ケージの網を掴んでも、自分自身の体重を支えきれないことから、ケージ内での動きが緩慢になっていた。なお、この異常は、下位運動ニューロンの障害によると考えられる。【００３７】
次に、マウスの尾を持って、下にぶらさげると、正常マウスは、下肢を広げて突っ張るようにして、体全体のバランスを保とうとするが、異常マウスは、両方とも、下肢を縮めてしまって、体のバランスを保つことができない（図７）。この異常は、１６匹の野生型マウスでは観察されなかったが、変異マウスでは、生後６ヶ月位から出現し始め、変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウスで１０匹中６匹、変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）ノックインマウスで９匹中６匹に持続的に生じた。なお、この異常は、上位運動ニューロンの障害によると考えられる。【００３８】
さらに、マウスが、１−２分間ケージ内を自由に移動するところを観察し、振戦が生じるかどうか調べたところ、１６匹の野生型マウスでは観察されなかったが、変異マウスでは、変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウスで１０匹中８匹、変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）ノックインマウスで９匹中７匹に持続的に生じた。【００３９】
これらの行動異常を定量化するため、四肢反射と振戦を点数化して６ヶ月齢から１０ヶ月齢まで毎週、５段階評価（０〜４：異常反射や振戦がみられる肢の本数をそのまま点数とした）を行った。そして、各個体別に、時間経過を追って、評価を図にした（図８）。図８からは、変異マウスの振戦が、生後６ヶ月から１０ヶ月までの間に、徐々に悪化していることがわかる。また、四肢反射は、生後６ヶ月後において、多くの変異マウスで、すでに異常が観察された。【００４０】
さらに、観察期間を延長し、変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウスおよび変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）ノックインマウスの振戦、握力および四肢反射について、生後３３週から７８週まで１５週ごとに評価を行った。振戦については、振戦が見られる場合は「０」、見られない場合は「１」とした。握力については、４本の肢でケージの網にぶら下がることができる場合は「０」、４本の肢でケージの網にぶら下がることができるがすぐに落下してしまう場合は「１」、２本の前肢でケージの網を握ることはできるが４本の肢でケージの網にぶら下がることが出来ない場合は「２」、肢でケージの網を握ることができない場合は「３」とした。四肢反射については異常反射や振戦がみられる肢の本数をそのまま点数とした。そして、各個体別に、時間経過を追って、振戦、握力、および四肢反射について評価を図に表した（図９）。【００４１】
図９に示されるように、ＡＬＳを示唆する運動機能障害である、振戦、握力の低下および異常反射のうち少なくとも２つの症状が、生後３３週から７８週までの間に、全てのマウスにおいて現れた。【００４２】
このように、変異マウスは、ＡＬＳに類似した異常を有するため、ＡＬＳモデル動物として有用である。【００４３】
（６）変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスの筋電図測定
生後４カ月の変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウスにおいて、筋電図を測定し、その結果を図１０に示した。  
変異ノックインマウスでは、motor unit potential（ＭＵＰ）が基線に戻るまでの時間が異常に延長したり（図１０Ａ）、下位運動神経の障害で起こるfibrilation potentialと見られる微弱な異常波形が出現したり(図１０Ｂ)した。なお、比較のため、ＭＵＰが正常時間内に終了した時の筋電図を図１０Ｃに示した。  
このように、変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウスでは、運動神経障害が、筋電図波形にも現れた。 
（７）変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスの脳細胞の解析
生後５ヶ月の変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスを４％ホルムアルデヒド溶液で還流固定後、脳を採取し、再度、４％ホルムアルデヒド溶液で１晩固定後、Sucroseに置換した。その後、リトラトームで厚さ３０マイクロメートルの凍結切片を作製した。  
この切片において、Venusからの蛍光像を蛍光顕微鏡で観察したところ、図１１に示すように、変異型ＴＤＰ−４３は、核に局在する他に、細胞質に封入体を形成した。  
このように、変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスは、ヒトＡＬＳと同様の症状を示すＡＬＳモデル動物およびヒトＦＴＬＤと同様の症状を示すＦＴＬＤモデル動物として有用である。【００４４】
（８）変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスの高次脳機能解析
以下のように、生後５ヶ月から９ヶ月の変異型ＴＤＰ−４３のノックインマウスの高次脳機能解析を行った。【００４５】
＝＝ホームケージ活動性試験＝＝
まず、変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）ノックインマウスを用いてホームケージ活動性試験を行い、このマウスの環境への適応性を評価した。【００４６】
１２匹の変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）ノックインマウス、および、１１匹の野性型マウスの、ホームゲージに戻した直後から３６０分経過するまでの水平方向の行動量を、行動解析装置（有限会社メルクエスト製、ＳＣＡＮＥＴ）を用いて調べた。装置内の赤外線をマウスが遮る回数（カウント数）を、３０分毎に集計した。結果を図１２に示す（■変異型マウス；●野生型マウス）。【００４７】
図１２のグラフからわかるように、変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）ノックインマウスは、ホームケージへ戻してから２４０分経過するまで、野生型と比較して行動量が有意に多く（ｐ値＝０．００８３）、その後は、両方のマウスの行動量には有意差が見られなかった。このように、変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）ノックインマウスは、野性型マウスと比較して、環境に適応するのが遅い。【００４８】
＝＝オープンフィールド試験＝＝
次に、オープンフィールド試験を行い、変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスの新規環境に対する不安耐性を評価した。【００４９】
マウスを５０ｃｍ×５０ｃｍのフィールドに置き、壁側に滞在する時間と、フィールドの中心範囲（１８ｃｍ×１８ｃｍ）に滞在する時間を計測した。試験には、１１匹の変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウス、および、１１匹の野性型マウスを用いた。結果を図１３に示す（左バー  野生型マウス；右バー  変異型マウス）。【００５０】
図１３のグラフからわかるように、変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウスは、野性型よりも、中心範囲に滞在する時間が有意に長かった。このように、変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウスは、新規環境において、不安の程度が低く、不安を感じにくい傾向がある。変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３８２Ｔ）ノックインマウスについてもオープンフィールド試験を行ったところ、同様の傾向であった。【００５１】
＝＝新奇物体認識試験＝＝
次に、新奇物体認識試験を行い、変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスの新奇物に対する不安耐性についての評価を行った。【００５２】
新奇物としての物体を設置した装置内にマウスを入れ、その物体の近くに滞在する時間を計測した。試験には、１１匹の変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウス、１２匹の変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３４８Ｔ）ノックインマウス、および、１１匹の野性型マウスを用いた。結果を図１４に示す（左バー  野生型マウス；右バー  変異型マウス）。【００５３】
図１４のグラフからわかるように、変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウスは、野性型マウスと比較して新奇物の近くに滞在する時間が有意に長かった（ｐ値＝０．１９２１）。また、変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３４８Ｔ）ノックインマウスも、野性型マウスと比較して新奇物の近くに滞在する時間が有意に長かった（ｐ値＝０．１７２８）。このように、変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウスおよび変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３４８Ｔ）ノックインマウスのいずれも、野性型と比較して、新奇物に対して不安の程度が低く不安を感じにくい。【００５４】
＝＝３チャンバー試験＝＝
次に、３チャンバー試験を行い、変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスの社会性を評価をした。【００５５】
３部屋に自由に出入りできる環境にしたケージを用意し、この３部屋のうち１部屋に、被験体とは今まで同居したことのないマウスを入れた。そして、この装置に入れた被験体がその部屋に滞在する時間（stranger-near）および別の部屋に滞在する時間（empty-near）を測定した。試験には被験体として、１１匹の変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウス、１１匹の変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３４８Ｔ）ノックインマウス、および、１１〜１２匹の野性型マウスを用いた。結果を図１５に示す（左バー  野生型マウス；右バー  変異型マウス）。【００５６】
図１５のグラフからわかるように、変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウスが、他のマウスのいる部屋に滞在する時間は、野性型マウスの滞在時間と比較して有意に短かった（ｐ値＝０．０１９８）。変異型ＴＤＰ−４３（Ａ３４８Ｔ）ノックインマウスについても同様の評価を行ったところ、今まで同居したことのないマウスのいる部屋に滞在する時間は、野性型マウスと比較して短い傾向であった。このことから、変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスの社会性は野生型マウスと比較して低い傾向であることがわかった。【００５７】
＝＝８方向放射状迷路試験＝＝
次に、８方向放射状迷路試験を行い、変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスの空間記憶を評価した。【００５８】
放射状に伸びた８本のアームを有する装置を用意し、各アームの先端に餌を配置し、マウスを装置内に入れた。そして、８本のアーム全ての餌を食べ終えるまでの時間、既に餌を食べ終えたアームに浸入した回数（作業記憶エラー回数）、およびアームへの総浸入回数を測定した。この試験は１４日間、繰り返し行なった。試験には、１１匹の変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウス、および、１１匹の野性型マウスを用いた。結果を図１６に示す（■変異型マウス；●野生型マウス）。【００５９】
図１６のグラフからわかるように、変異型ＴＤＰ−４３（Ｇ３４８Ｃ）ノックインマウスは、野性型マウスと比較して、作業記憶エラーが多かった（ｐ値＝０．００３９）。また、野性型マウスより８本のアーム全ての餌を食べ終えるまでの時間は短いが（Ｐ値＝０．００２７）、アームへの総浸入回数が多く（ｐ値＝０．００７７）、過活動であった。【００６０】
このように、生後５ヶ月以降の変異型ＴＤＰ−４３ノックインマウスには、ヒトＦＴＬＤを反映していると考えられる高次機能障害がみられ、ＦＴＬＤモデル動物として有用であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明によって、ヒト筋萎縮性側索硬化症および／またはヒト前頭側頭葉変性症と同様な症状を有するモデルマウスを作製することができるようになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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