(57)【要約】  本発明は、新規な認知症治療剤又は予防剤を提供することである。  本発明は、配列番号１のＳｅｒ４１３周辺がリン酸化されたタウタンパク質に対して特異的に抗原抗体反応をする抗体や、Ｓｅｒ４１３周辺がリン酸化されたペプチドを有効成分として含有する認知症治療剤又は予防剤等を提供する。
2013180238.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるタウタンパク質の４１０位から４２１位に存在するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化を受けたタウタンパク質と抗原抗体反応する抗体を有効成分として含有する、認知症治療剤又は予防剤。
【請求項２】
該抗体が、認知症に特徴的なリン酸化を受けたタウタンパク質に抗原抗体反応する抗体である、請求項１に記載の認知症治療剤又は予防剤。
【請求項３】
該抗体が、Ｓｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウタンパク質に抗原抗体反応することを特徴とする、請求項１又は２に記載の認知症治療剤又は予防剤。
【請求項４】
該抗体が、タウタンパク質に対する結合において、配列番号２０に記載のアミノ酸からなるＶＨ及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＶＬを含む抗体と結合競合する抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
【請求項５】
該抗体が、配列番号２０に記載のアミノ酸からなるＶＨ及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＶＬを含む抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
【請求項６】
該抗体が、Ｓｅｒ４１３の部位がリン酸化されたタウタンパク質に抗原抗体反応する抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
【請求項７】
該抗体が、配列番号７から１３で表されるＨ鎖のＣＤＲ配列、配列番号７から１３の少なくとも１つで表されるＨ鎖のＣＤＲ配列、又は配列番号７から１３で表されるＨ鎖のＣＤＲ配列の少なくとも１つと８５％以上の相同性を有するＨ鎖のＣＤＲ配列、及び／あるいは、配列番号１４から１７で表されるＬ鎖のＣＤＲ配列、配列番号１４から１７の少なくとも１つで表されるＬ鎖のＣＤＲ配列、又は配列番号１４から１７で表されるＬ鎖のＣＤＲ配列の少なくとも１つと８５％以上の相同性を有するＬ鎖のＣＤＲ配列を有する抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
【請求項８】
該抗体が、配列番号１８から２４のいずれかで表されるＨ鎖可変領域、もしくは配列番号１８から２４のいずれかと８５％以上の相同性の配列を有するＨ鎖可変領域、及び／又は配列番号２５から３０のいずれかで表されるＬ鎖可変領域、もしくは配列番号２５から３０のいずれかと８５％以上の相同性の配列を有するＬ鎖可変領域を有する抗体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
【請求項９】
該抗体が、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
【請求項１０】
配列番号１のアミノ酸番号４１０〜４２１からなるアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する８つのアミノ酸配列を含むペプチドであり、当該ペプチドに含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドを有効成分として含有する、認知症治療剤又は予防剤。
【請求項１１】
該ペプチドに含まれるリン酸化されたアミノ酸残基の少なくとも一つが、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、又はＳｅｒ４１６のアミノ酸残基に相当するペプチドである、請求項１０に記載の認知症治療剤又は予防剤。
【請求項１２】
該ペプチドに含まれるリン酸化されたアミノ酸残基が、少なくとも配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基である、請求項１０又は１１に記載の認知症治療剤又は予防剤。
【請求項１３】
認知症が、タウオパチーである、請求項１から１２のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
【請求項１４】
タウオパチーが、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀性顆粒病）、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔａｕｏｐａｔｈｙ  ｗｉｔｈ  ｄｅｍｅｎｔｉａ（ＭＳＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うび慢性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う蛋白質タウオパチー（ＷＭＴ−ＧＧＩ）、又はタウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ−ｔａｕ）である、請求項１３に記載の認知症治療剤又は予防剤。
【請求項１５】
配列番号１のアミノ酸番号４１０〜４２１からなるアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する８つのアミノ酸配列を有するペプチドであり、当該ペプチドに含まれる配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドに、抗原抗体反応するモノクローナル抗体。
【請求項１６】
リン酸化されたタウタンパク質に対する抗体であって、当該抗体が、配列番号２０に記載のアミノ酸からなるＶＨ及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＶＬを含む抗体との間で抗原への結合が競合的である抗体。
【請求項１７】
リン酸化されたタウタンパク質に対する抗体であって、当該抗体が、配列番号２０に記載のアミノ酸からなるＶＨ及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＶＬを含む抗体。
【請求項１８】
配列番号７から１３で表されるＨ鎖のＣＤＲ配列、配列番号７から１３の少なくとも１つで表されるＨ鎖のＣＤＲ配列、又は配列番号７から１３で表されるＨ鎖のＣＤＲ配列の少なくとも１つと８５％以上の相同性を有する配列をＣＤＲ配列に有するＨ鎖、及び／あるいは、配列番号１４から１７で表されるＬ鎖のＣＤＲ配列、配列番号１４から１７の少なくとも１つで表されるＬ鎖のＣＤＲ配列、又は配列番号１４から１７で表されるＬ鎖のＣＤＲ配列の少なくとも１つと８５％以上の相同性を有する配列をＣＤＲ配列に有するＬ鎖を有するモノクローナル抗体。
【請求項１９】
配列番号１８から２４のいずれかで表されるＨ鎖可変領域、もしくは配列番号１８から２４のいずれかと８５％以上の相同性を有するＨ鎖可変領域、及び／又は配列番号２５から３０のいずれかで表されるＬ鎖可変領域、もしくは配列番号２５から３０のいずれかと８５％以上の相同性を有するＬ鎖可変領域を有するモノクローナル抗体。
【請求項２０】
抗体が、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項１５から１９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２１】
配列番号１のアミノ酸番号４１０〜４２１からなるアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する８つのアミノ酸配列からなるペプチドであり、当該ペプチドに含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化されたペプチド。
【請求項２２】
配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６のアミノ酸に相当するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化されたことを特徴とする、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２３】
リン酸化されたアミノ酸残基が、配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基である請求項２１又は２２に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、認知症治療剤又は予防剤に関する。具体的には、本発明は、優れた認知機能を改善する効果を有する新規の抗リン酸化タンパク質又はペプチド抗体、及び抗リン酸化タウ抗体又は抗リン酸化タウ抗体を誘導しうる抗原を含有する認知症治療剤又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症とは、いったん発達した知能が何らかの後天的理由によって低下し、社会的な適応困難を呈する状態をいう。認知症性の疾患は、神経変性疾患、血管性認知症、プリオン病、感染性疾患、代謝・内分泌疾患、外傷及び脳外科疾患、中毒性疾患等に分類される（非特許文献１）。わが国においては２０１０年現在約２１０万名程度の認知症患者が存在し、６５歳以上の高齢者における有病率は８〜１０％程度とも１０％以上ともいわれ、世界的な高齢化の流れの中で大きな問題と認識されている（非特許文献２）。認知症にける基礎疾患をみると、約３５％がアルツハイマー病（ＡＤ）、約１５％がＡＤと脳血管性の混合型、５％が前頭葉側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）と変性疾患であるＡＤやＦＴＬＤ等の神経変性疾患が多くの割合を占めている（非特許文献２）。神経変性疾患による認知症は少なくとも６ヶ月以上の期間をかけて進行する記憶障害及び／又は人格変化の潜行性の発症によって特徴づけられる疾患である。認知機能の障害の程度に高い相関性がある神経変性の過程における一貫した特長は、神経原線維変化（ＮＦＴ）である（非特許文献３）。【０００３】
タウ（タンパク質）とは、ヒトでは第１７番染色体（１７ｑ２１）に存在するＭＡＰＴ遺伝子によってコードされるタンパク質で、中枢系で多く発現している微小管結合タンパク質の一つである。タウは神経変性疾患の代表であるＡＤにおけるＮＦＴを構成するpaired helical filamentとstraight filamentの主要構成タンパク質であることが発見され、さらに種々の神経疾患において細胞内に蓄積することが明らかになった。このようなタウの細胞内蓄積が生じる疾患はタウオパチーと総称される（非特許文献４）。タウオパチーに含まれる神経変性疾患としては、アルツハイマー病 （ＡＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ又はＣＢＳ）、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀性顆粒病）、Multiple system tauopathy with dementia（MSTD）、17番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（FTDP-17）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うび慢性神経原線維変化病（DNTC）、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー（WMT-GGI）タウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（FTLD-tau）等があるが、神経変性疾患以外でもエコノモ脳炎後遺症や亜急性硬化性全脳症等の感染症によるもの、拳闘家脳症等の外傷によるものもタウオパチーに含まれる（非特許文献４）。【０００４】
ＭＡＰＴ遺伝子のゲノム上での構造は１３個のエクソンからなり、選択的スプライシングによって複数のアイソフォームとしてのタンパク質が発現される（非特許文献４）。また、タウの構造の特徴としては、エクソン２とエクソン３の選択的スプライシングに依拠する２９アミノ酸反復配列（Ｎ）が０〜２個（Ｎ０〜Ｎ２）となるＮ末端の酸性ドメイン、プロリンを多く含む中間ドメイン、及び微小管結合に関与する反復配列（Ｒ）を３個（３Ｒ）又は４個（４Ｒ）を含むＣ末端の微小管結合ドメイン（エクソン９から１２によってコードされる）からなる（非特許文献３及び４）。そのため、タウは、２９アミノ酸反復配列（Ｎ）と微小管結合に関与する反復配列（Ｒ）を含む数によって、３Ｒ０Ｎ（３５２アミノ酸）・３Ｒ１Ｎ（３８１アミノ酸）・３Ｒ２Ｎ（４１０アミノ酸）・４Ｒ０Ｎ（３８３アミノ酸）・４Ｒ１Ｎ（４１２アミノ酸）及び４Ｒ２Ｎ（４４１アミノ酸）の６種類が代表的なアイソフォームとされている。そのようなアイソタイプのうち、胎生期の脳においては３Ｒ０Ｎのみが存在するのに対し、成人のヒトの脳においては６つ全てのアイソタイプが存在するが、４Ｒ型が多く存在する（非特許文献３）。アイソタイプの３Ｒ型と４Ｒ型の違いはエクソン１０が選択的スプライシングによって除かれる（３Ｒ）か含まれる（４Ｒ）によって決まる。このようにタウにはいくつかのアイソフォームが存在するが、その対応する位置のアミノ酸番号を特定するため、一番長いアイソフォームである４Ｒ２Ｎ（配列番号１）におけるアミノ酸の番号（１〜４４１）で表す。例えば、Ｓｅｒ４１３と記載した場合には、４Ｒ２Ｎ（配列番号１）では４１３番目のアミノ酸残基であるセリンを表すが、４Ｒ１Ｎ（配列番号２）では３８４番目、４Ｒ０Ｎ（配列番号３）では３５５番目、３Ｒ２Ｎ（配列番号４）では３８２番目、３Ｒ１Ｎ（配列番号５）では３５３番目、３Ｒ０Ｎ（配列番号６）では３２４番目のアミノ酸残基であるセリンを表す。【０００５】
神経変性疾患におけるタウの関与は、最初１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）において、ＭＡＰＴ遺伝子の変異とタウの蓄積の関係から解明された経緯があり、ＦＴＤＰ−１７ではＭＡＰＴ遺伝子における４０種類以上の遺伝子変異が報告されている（非特許文献４）。このような遺伝子変異は、タウアイソフォームの比率の変化や変異タウの微小管への相互作用の変化が起こり、病態形成に関与している可能性が示唆されている。しかしながら、家族性の神経変性疾患と異なり、ＡＤ等孤発性の神経変性疾患では、ＭＡＰＴの変異が見られない場合が多い。また、神経変性疾患で蓄積するタウの特徴としては高度にリン酸化による修飾を受けているという特徴がある。また、軽度の認知機能障害を示す患者（ＭＣＩ）において髄液中のリン酸化タウの量と下垂体萎縮との間には相関が見られ、リン酸化タウはタウオパチーの患者での神経変性についての信頼性の高いバイオマーカーであると考えられている（非特許文献５）。そのため、タウのリン酸の過剰なリン酸化を抑制するためにリン酸化に関わる酵素であるキナーゼ、その中でも特にＧＳＫ−３βに対する酵素阻害剤を治療に使用する試みがされ、開発が行なわれている（非特許文献５）。しかしながらＧＳＫ−３β等のキナーゼは病態のみではなく、正常な生理作用においても機能制御に関連する酵素と考えられることから、副作用等が懸念される。事実、ＧＳＫ−３βによってタウがリン酸化される部位のうちのいくつかは、胎児や正常なヒトの脳で見られるタウのリン酸化部位と一致することから(非特許文献３)、正常なタウの機能に影響する可能性も考えられる。【０００６】
また、従来の考えでは細胞外に存在するタウは変性した神経細胞の細胞死によって細胞外に漏れだすと考えられていたが、最近の研究によるとタウは細胞内で過剰にリン酸化された後、プロセスを受けて細胞外に能動的に分泌されると考えられている。細胞外に分泌されたリン酸化タウは、一部のリン酸化部位で脱リン酸化を受けた上で、周辺の細胞のムスカリン受容体のM1およびM3に作用して、細胞内のタウリン酸化の亢進や細胞死の誘導などの作用に関与していると考えられている（非特許文献６、非特許文献７）。このように、タウが細胞外で作用する因子として働くと考えられるようになってきたことから、細胞内で作用させるのが難しい抗体などの高分子を薬効成分とする治療薬の可能性も重視されるようになってきた。しかしながら、上述のように細胞外に分泌されるタウは一部プロセスを受け、また脱リン酸化を受けるなど、今まで標的とされてきた過剰にリン酸化されたタウの構造情報からさらに変化を受けている可能性がある。さらに脱リン酸化されたタウの部分に対して作用する薬剤は正常のタウの機能にも影響する可能性も考えられる。抗体などで病態におけるタウを標的とする場合、どのような病態特異的な部位、つまりタウのリン酸化エピトープに作用するものを選ぶのかが重要になるが、このような複雑な情報があることによって、そのようなエピトープを選ぶのはさらに困難になっている状況といえる。【０００７】
タウに対する特異的な作用を目指した試みとして、タウタンパク質をターゲットとしたタウオパチーの免疫学的治療に関する発明が報告されている（非特許文献５、特許文献１、特許文献２、特許文献３）。免疫学的治療とは、ペプチドワクチンなどを投与することにより、特異的な抗体の産生を誘導することを目的に行なわれるもので、標的タンパク質又はペプチドに対する特異性の高さから副作用の低減が期待される。このような取り組みとして、リン酸化されたタウの部分ペプチド（Ｓｅｒ３９６及びＳｅｒ４０４に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたもの、並びにＳｅｒ２６２に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたもの）を用いたワクチンにより変異タウを発現する動物モデルを免疫することによって、当該モデル動物の運動機能改善等を改善したことを報告している。しかし、これらの報告ではＰ３０１Ｌ（タウの３０１番目のアミノ酸残基であるプロリンがロイシンに変化する変異）等の遺伝子変異を導入したトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）を用いた検討であり、当該ｔｇマウスは家族性の神経変性疾患の一つであるＦＴＤＰ−１７についての遺伝子変異モデルではあるものの、タウオパチーに含まれるタウ遺伝子変異を伴わない神経変性疾患の多くのもの、特に孤発性の神経変性疾患の病態を表しているわけではない。また、Ｐ３０１Ｌｔｇマウスは、運動機能障害のモデルであり、ヒトの認知症等で問題になる認知機能の障害を表すモデルではないため（非特許文献８）、この動物モデルでの結果によってヒトの認知症の治療に適応できるかを知ることは困難である。特許文献４では、Ｓｅｒ４０９がリン酸化されたタウペプチドに抗原抗体反応する抗体を投与して、タウオパチーの治療に関する効果をみている。しかしながら、高価なペプチドワクチンとしては全投与量が多く、また効果が現れるまでの期間が長い。また、ペプチドワクチンの効果は、投与されたヒトや動物の免疫応答の反応性が遺伝的背景によって異なり、全ての個体で有効に抗体産生を誘導できるとは限らない。そのため、抗体による受動免疫による免疫療法を用いることが考えられるが、タウにおけるリン酸化を受ける部位は非常に多数存在し、その中のどのリン酸化部位に対する抗体を用いることが有効であるかの情報はほとんど存在しない。また、現在存在する抗体での動物モデルでの効果を見ても、治療に用いるために十分な機能を有しているとは考えられない。【０００８】
さらに、抗体を治療剤又は予防剤の主剤として用いる場合、副作用の回避や医療経済的な問題から治療に用いられる抗体量についても留意が必要であり、特に慢性疾患や遺伝疾患などでは投与量については重要な課題となる。たとえば、ヒト抗IL-6R抗体であるアクテムラ（登録商標）（トシリズマブ）の治療での用量は体重１ｋｇあたり8mgで１〜4週間隔に投与され、ヒト化抗補体C5抗体であるソリリス（登録商標）（エクリズマブ）の治療に用量は、1回に成人一人当たり600〜900mgで2週から4週毎に投与される。これらは多くの抗体の中から選ばれて開発された優秀な抗体であるが、用量としては現状用いられている抗体医薬品の中では多いほうである。したがって、今後開発される抗体医薬品においてもこれらと同等以下の用量での効果が必要となる。さらに、ADなど認知症での治療対象となる臓器は脳になるが、静脈内や皮下での投与など全身投与を行う場合には、脳血管関門の存在によって血中から脳への抗体の移行率は低いといわれるため、認知症治療に用いられる抗体はほかの臓器の疾患を対象とする場合と比較して薬理効果が期待しにくく、大きな課題が存在する。【０００９】
ヒトの認知症においては、中心となる症状は記憶障害と認知機能の障害であり、特に認知機能は記憶に基づいて判断、コミュニケーション、遂行機能を発揮するために重要な機能であることから、認知症における症状として重要な位置をしめている。一方、運動機能については、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）や末期のアルツハイマー病において認められる症状ではあるものの、必ずしも認知症において示す中心となる症状ではない。したがって、認知症の治療を考える場合においては、認知機能を改善することが中心の課題となる。しかしながら、現状においてはそのような課題を解決するために必要な、タウオパチーによる認知機能障害の適切な動物モデルを用いて優れた認知機能改善効果を示す認知症治療剤又は予防剤を取得することができる方策は示されておらず、また、認知症に特異的で優れた効果を示す認知症治療剤又は予防剤は存在しない。
したがって、以上のような状況から、特に認知機能の改善に対して強い効果を有する治療剤又は予防剤が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＵＳ８０１２９３６
【特許文献２】ＷＯ２０１０／１４２４２３
【特許文献３】ＷＯ２０１０／１４４７１１
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】岸本年史、高橋茂樹編、STEP  Series  精神科  第2版、P103〜104、海馬書房、2008年
【非特許文献２】浅田隆、別冊医学のあゆみ「認知症」、ｐ５〜１０、医歯薬出版、2011年
【非特許文献３】Alistair Burns, John O’Brien and David Ames編、Dementia. 3rd Edition、P４０８〜４６４、2005年
【非特許文献４】新井哲明、神経内科、72巻特別増刊号（Suppl.6）、P４６〜５１、2010年
【非特許文献５】Wendy  Nobleら、Expert Opin. Drug Discov.、６巻８号、P７９７〜８１０、2011年
【非特許文献６】Miguel Diaz-Hernandes et al., Journal of Biological Chemistry、２８５巻、P３２５３９−３２５４８、2010年
【非特許文献７】Venessa Plouffeら、PLoS ONE、７巻、P３６８７３、2012年
【非特許文献８】Alistair Burns, John O’Brien and David Ames編、Dementia. 3rd Edition、P４５９、2005年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、タウオパチーでのタウリン酸化に着目し、認知症治療剤又は予防剤を提供することである。
また、本発明は、Ｓｅｒ４１３周辺に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたタウに対して特異的に抗原抗体反応する抗体や、Ｓｅｒ４１３周辺のアミノ酸配列を有し少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドを有効成分として含有する認知症治療剤又は予防剤を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、高い認知機能改善効果を有するモノクローナル抗体を提供し、さらにそのモノクローナル抗体の構造の解析からヒト化抗体等の、さらに認知症治療に適した抗体の作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、以下に示すものである。なお、本発明におけるタウタンパク質は、４Ｒ２Ｎだけでなく、全６種類のアイソフォームを含む意味である。また、本発明におけるアミノ酸残基の位置は、便宜上、配列番号１に示すものを基に特定しているが、例えば、配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基と表現した場合には、配列番号１（４Ｒ２Ｎ）の４１３番目のセリン、配列番号２（４Ｒ１Ｎ）の３８４番目、配列番号３（４Ｒ０Ｎ）の３５５番目、配列番号４（３Ｒ２Ｎ）の３８２番目、配列番号５（３Ｒ１Ｎ）の３５３番目、又は配列番号６（３Ｒ０Ｎ）の３２４番目のアミノ酸残基であるセリンを意味する。【００１４】
（１）配列番号１で示されるタウタンパク質の４１０位から４２１位に相当するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化を受けたタウタンパク質と抗原抗体反応する抗体を有効成分として含有する、認知症治療剤又は予防剤。
（２）該抗体が、認知症に特徴的なリン酸化を受けたタウタンパク質に抗原抗体反応する抗体である、（１）に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（３）該抗体が、Ｓｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウタンパク質に抗原抗体反応することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（４）該抗体が、タウタンパク質に対する結合において、配列番号２０に記載のアミノ酸からなるＶＨ及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＶＬを含む抗体と結合競合する抗体である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（５）該抗体が、配列番号２０に記載のアミノ酸からなるＶＨ及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＶＬを含む抗体である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（６）該抗体が、Ｓｅｒ４１３の部位に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたタウタンパク質に抗原抗体反応する抗体である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（７）該抗体が、配列番号７から１３で表されるＨ鎖のＣＤＲ配列、配列番号７から１３の少なくとも１つで表されるＨ鎖のＣＤＲ配列、又は配列番号７から１３で表されるＨ鎖のＣＤＲ配列の少なくとも１つと８５％以上の相同性を有するＨ鎖のＣＤＲ配列、及び／あるいは、配列番号１４から１７で表されるＬ鎖のＣＤＲ配列、配列番号１４から１７の少なくとも１つで表されるＬ鎖のＣＤＲ配列、又は配列番号１４から１７で表されるＬ鎖のＣＤＲ配列の少なくとも１つと８５％以上の相同性を有するＬ鎖のＣＤＲ配列を有する抗体である、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（８）該抗体が、配列番号１８から２４のいずれかで表されるＨ鎖可変領域、もしくは配列番号１８から２４のいずれかと８５％以上の相同性の配列を有するＨ鎖可変領域、及び／又は配列番号２５から３０のいずれかで表されるＬ鎖可変領域、もしくは配列番号２５から３０のいずれかと８５％以上の相同性の配列を有するＬ鎖可変領域を有する抗体である、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（９）該抗体が、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（１０）配列番号１のアミノ酸番号４１０〜４２１に相当するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する８つのアミノ酸配列を含むペプチドであり、当該ペプチドに含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドを有効成分として含有する、認知症治療剤又は予防剤。
（１１）該ペプチドに含まれるリン酸化されたアミノ酸残基の少なくとも一つが、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、又はＳｅｒ４１６のアミノ酸残基に相当するペプチドである、（１０）に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（１２）該ペプチドに含まれるリン酸化されたアミノ酸残基が、少なくとも配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基である、（１０）又は（１１）に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（１３）認知症が、タウオパチーである、（１）から（１２）のいずれか１項に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（１４）タウオパチーが、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀性顆粒病）、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔａｕｏｐａｔｈｙ  ｗｉｔｈ  ｄｅｍｅｎｔｉａ（ＭＳＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うび慢性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う蛋白質タウオパチー（ＷＭＴ−ＧＧＩ）、又はタウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ−ｔａｕ）である、（１３）に記載の認知症治療剤又は予防剤。
（１５）配列番号１のアミノ酸番号４１０〜４２１からなるアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する８つのアミノ酸配列を有するペプチドであり、当該ペプチドに含まれる配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドに、抗原抗体反応するモノクローナル抗体。
（１６）リン酸化されたタウタンパク質に対する抗体であって、当該抗体が、配列番号２０に記載のアミノ酸からなるＶＨ及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＶＬを含む抗体との間で抗原への結合が競合的である抗体。
（１７）リン酸化されたタウタンパク質に対する抗体であって、当該抗体が、配列番号２０に記載のアミノ酸からなるＶＨ及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＶＬを含む抗体。
（１８）配列番号７から１３で表されるＨ鎖のＣＤＲ配列、配列番号７から１３の少なくとも１つで表されるＨ鎖のＣＤＲ配列、又は配列番号７から１３で表されるＨ鎖のＣＤＲ配列の少なくとも１つと８５％以上の相同性を有する配列をＣＤＲ配列に有するＨ鎖、及び／あるいは、配列番号１４から１７で表されるＬ鎖のＣＤＲ配列、配列番号１４から１７の少なくとも１つで表されるＬ鎖のＣＤＲ配列、又は配列番号１４から１７で表されるＬ鎖のＣＤＲ配列の少なくとも１つと８５％以上の相同性を有する配列をＣＤＲ配列に有するＬ鎖を有するモノクローナル抗体。
（１９）配列番号１８から２４のいずれかで表されるＨ鎖可変領域、もしくは配列番号１８から２４のいずれかと８５％以上の相同性を有するＨ鎖可変領域、及び／又は配列番号２５から３０のいずれかで表されるＬ鎖可変領域、もしくは配列番号２５から３０のいずれかと８５％以上の相同性を有するＬ鎖可変領域を有するモノクローナル抗体。
（２０）抗体が、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、（１５）から（１９）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
（２１）配列番号１のアミノ酸番号４１０〜４２１に相当するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する８つのアミノ酸配列からなるペプチドであり、当該ペプチドに含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化されたペプチド。
（２２）配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及び
Ｓｅｒ４１６のアミノ酸に相当するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化されたことを特徴とする、（２１）に記載のペプチド。
（２３）リン酸化されたアミノ酸残基が、配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基である（２１）又は（２２）に記載のペプチド。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基周辺がリン酸化されたタウに対して特異的に抗原抗体反応する抗体や、配列番号１のＳｅｒ４１３周辺のアミノ酸配列を有し少なくとも１つのアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドを有効成分として含有することによって、認知症治療剤又は予防剤を提供することができる。
また、本発明は、高い認知機能改善効果を有するモノクローナル抗体を提供し、さらにそのモノクローナル抗体の構造の解析からヒト化抗体等のさらに認知症治療に適した抗体の作製方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒトタウタンパク質のアイソフォームの前半のアミノ酸配列をClustalWで並べたものを示す図である。
【図２】ヒトタウタンパク質のアイソフォームの後半のアミノ酸配列をClustalWで並べたものを示す図である。
【図３】ｐＳｅｒ４１３ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図４】ｐＳｅｒ４１３認識ウサギポリクローナル抗体を投与したモデルマウスのＴｒｉａｌ試験の結果を示す図である。
【図５】ｐＳｅｒ４１３認識ウサギポリクローナル抗体を投与したモデルマウスのＰｒｏｂｅ試験の結果を示す図である。
【図６】ｐＳｅｒ４１３認識ウサギポリクローナル抗体を投与したモデルマウスのＯｐｅｎ  Ｆｉｅｌｄ試験の結果を示す折れ線グラフである。
【図７】ｐＳｅｒ４１３認識ウサギポリクローナル抗体を投与したモデルマウスのＯｐｅｎ  Ｆｉｅｌｄ試験の結果を示す棒グラフである。
【図８】ｐＳｅｒ４１３認識マウスモノクローナル抗体を投与したモデルマウスのＴｒｉａｌ試験の結果を示す図である（Ｔａ１５０５）。
【図９】ｐＳｅｒ４１３認識マウスモノクローナル抗体を投与したモデルマウスのＰｒｏｂｅ試験の結果を示す図である（Ｔａ１５０５）。
【図１０】ｐＳｅｒ４１３認識マウスモノクローナル抗体を投与したモデルマウスのＯｐｅｎ  Ｆｉｅｌｄ試験の結果を示す折れ線グラフである（Ｔａ１５０５）。
【図１１】ｐＳｅｒ４１３認識マウスモノクローナル抗体を投与したモデルマウスのＯｐｅｎ  Ｆｉｅｌｄ試験の結果を示す棒グラフである（Ｔａ１５０５）。
【図１２】ｐＳｅｒ３９６認識マウスモノクローナル抗体を投与したモデルマウスのＴｒｉａｌ試験の結果を示す図である（Ｔａ９）。
【図１３】ｐＳｅｒ３９６認識マウスモノクローナル抗体を投与したモデルマウスのＰｒｏｂｅ試験の結果を示す図である（Ｔａ９）。
【図１４】ｐＳｅｒ３９６認識マウスモノクローナル抗体を投与したモデルマウスのＯｐｅｎ  Ｆｉｅｌｄ試験の結果を示す折れ線グラフである（Ｔａ９）。
【図１５】ｐＳｅｒ３９６認識マウスモノクローナル抗体を投与したモデルマウスのＯｐｅｎ  Ｆｉｅｌｄ試験の結果を示す棒グラフである（Ｔａ９）。
【図１６】Ｔａ１５０５抗体を投与したモデルマウスの海馬シナプトフィジン量を示す図である。
【図１７】タウ遺伝子が含まれる遺伝子断片を表す図である。
【図１８】Ｔａ１５０５抗体を投与した記憶学習障害マウス（Ｔａｕ−Ｔｇ）の水迷路Ｔｒｉａｌ試験の結果を示すグラフである。
【図１９】Ｔａ１５０５抗体を投与した記憶学習障害マウス（Ｔａｕ−Ｔｇ）の水迷路Ｐｒｏｂｅ試験の結果を示すグラフである。
【図２０】Ｔａ９抗体を投与した記憶学習障害マウス（Ｔａｕ−Ｔｇ）の水迷路Ｔｒｉａｌ試験の結果を示すグラフである。
【図２１】Ｔａ９抗体を投与した記憶学習障害マウス（Ｔａｕ−Ｔｇ）の水迷路Ｐｒｏｂｅ試験の結果を示すグラフである。
【図２２】コントロールＩｇＧ（１ｍｇ／匹）又はＴａ１５０５抗体（１ｍｇ／匹）を投与した記憶学習障害マウス（Ｔａｕ−Ｔｇ）の、Ｔａ１５０５抗体による海馬ＣＡ３領域及びＣＡ２３領域の免疫組織染色を示す写真である。
【図２３】コントロールＩｇＧ（１ｍｇ／匹）を投与した記憶学習損傷マウス（Ｔａｕ−Ｔｇ）の、Ｔａ１５０５抗体による海馬傍回領域の免疫組織染色を示す写真である。
【図２４】Ｔａ１５０５抗体（１ｍｇ／匹）を投与した記憶学習損傷マウス（Ｔａｕ−Ｔｇ）の、Ｔａ１５０５抗体による海馬傍回領域の免疫組織染色を示す写真である。
【図２５】コントロールＩｇＧ（１ｍｇ／匹）又はＴａ１５０５抗体（１ｍｇ／匹）を投与した記憶学習障害マウス（Ｔａｕ−Ｔｇ）の、ＡＴ８による海馬ＣＡ３領域及びＣＡ２３領域の免疫組織染色を示す写真である。
【図２６】コントロール抗体（１ｍｇ／匹）を投与した記憶学習損傷マウス（Ｔａｕ−Ｔｇ）の、ＡＴ８による海馬傍回領域の免疫組織染色を示す写真である。
【図２７】Ｔａ１５０５（１ｍｇ／匹）を投与した記憶学習損傷マウス（Ｔａｕ−Ｔｇ）の、ＡＴ８による海馬傍回領域の免疫組織染色を示す写真である。
【図２８】Ｔａ１５０５（１ｍｇ／匹）を投与した記憶学習損傷マウス（Ｔａｕ−Ｔｇ）の、ＴＢＳ可溶性脳分画中のＧ２、ＡＴ８、ＰＨＦ１及びＴａ１５０５の反応性Ｔａｕ量を示すグラフである。
【図２９】Ｔａ１５０５（１ｍｇ／匹）を投与した記憶学習損傷マウス（Ｔａｕ−Ｔｇ）の、ザルコシル可溶性脳分画中のＧ２、ＡＴ８、ＰＨＦ１及びＴａ１５０５の反応性Ｔａｕ量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者らは、ＡＤで特異的にリン酸化される部位である配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたタウに特異的に抗原抗体反応をする抗体を作製し、成熟に伴い認知機能障害を発症するｔｇマウスに投与したところ、対象群とほぼ同じ程度まで認知機能が回復できることを見出した。一方、同等の抗原に対して本発明の抗体よりも強い親和性を有する配列番号１のＳｅｒ３９６に相当するアミノ酸残基がリン酸化されたタウに対する抗体を、同様の濃度で用いて比較したところ、充分な認知機能の改善がみられなかった。配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基の周辺の部分は、タウの構造と機能との関係においては特に情報が無い領域であり、この部分に対して特異的に抗原抗体反応する抗体がこのような強い認知機能の改善効果を有することは全くの予想外の結果であった。従って、今まで注目をされていなかった、この配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基の周辺の部位は、タウオパチーにおいて認知機能障害の発症に重要な部位であることが本発明によって初めて解明され、本発明に至った。
【００１８】
[抗リン酸化タウ抗体]
本発明におけるタウ（タンパク質）とは、配列番号１〜６に示したヒトタウタンパク質に加えて、それらの遺伝子変異体を含む。上記の背景技術で示したように、認知症に関連する家族性神経変性疾患であるＦＴＤＰ−１７では、４０箇所以上の変異が知られているが、変異の部位においてはそれに限定されるものではない。また、変異の数は配列番号１〜６に対して１から５０箇所、好ましくは１から３０箇所、より好ましくは１から１０箇所のアミノ酸の変異があるものも本発明でのタウとして扱われる。さらに、配列番号１に示したヒトのタウタンパク質に対してＢＬＡＳＴ法（ＮＣＢＩのＰＢＬＡＳＴのデフォルト条件）で８０％以上の相同性（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を示すタンパク質及びそのアイソフォームも含まれる。そのようなものには、チンパンジー、アカゲザル、ウマ、ブタ、イヌ、マウス、ウサギ、ラット等ヒト以外の種におけるタウが含まれ、そのような動物の認知機能改善の目的でそのようなタウを標的とした治療剤又は予防剤の作製も可能である。
【００１９】
また、本発明におけるアミノ酸番号、すなわちアミノ酸残基の位置は、便宜上、配列番号１に示すものを基に特定する。従って、例えば、配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基と表現した場合には、配列番号１（４Ｒ２Ｎ）の４１３番目、配列番号２（４Ｒ１Ｎ）の３８４番目、配列番号３（４Ｒ０Ｎ）の３５５番目、配列番号４（３Ｒ２Ｎ）の３８２番目、配列番号５（３Ｒ１Ｎ）の３５３番目、又は配列番号６（３Ｒ０Ｎ）の３２４番目のアミノ酸残基であるセリンを意味する。表１に、各アイソフォームにおいて互いに同位置にあるアミノ酸残基の位置を示す。なお、表１では、配列番号１の４１０〜４２１に相当する各アイソフォームでのアミノ酸残基の位置を示しているが、これ以外の位置に存在するアミノ酸残基の互いの位置関係については、例えば、図１及び図２に基づいて容易に理解することができる。
【００２０】
【表１】
2013180238.tif 000003
【００２１】
抗リン酸化タウ抗体とは、上に示したタウにおけるアミノ酸配列のうち１箇所以上のアミノ酸残基がリン酸化されたタウと抗原抗体反応する抗体をいう。リン酸化されるアミノ酸残基としては、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）等が挙げられる。また、本発明の抗リン酸化タウ抗体が抗原抗体反応するリン酸化タウの部位としては、ＡＤ等の神経変性疾患で特異的にリン酸化される部位が望ましい。また、本発明の抗リン酸化タウ抗体が抗原抗体反応するリン酸化タウでの部位の別の望ましい形態としては、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４及びＳｅｒ４１６に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウの抗原抗体反応する抗体であり、より好ましくは配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基、又は両方の部位がリン酸化されたタウと抗原抗体反応する抗体であり、より好ましくは配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基の部位がリン酸化されたタウと抗原抗体反応する抗体である。ここで、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６に相当するアミノ酸残基とは、ヒトの４Ｒ２Ｎタウ（配列番号１）でのアミノ酸番号に相当する部位を指すが、上述の背景技術に記載したようにアイソフォームにおける対応する部位、またヒト以外の相同体に対応する部位についても、そのアミノ酸配列から付けられるアミノ酸番号に関わらず、同様に扱われるものとする。そのようなアイソフォームや相同体での対応部位を理解するためには、当業者であればNeedleman-Wunsch法やSmith-Waterman法等のPairwise Sequence Alignment による方法や、ClustalW法やPRRP法等のMultiple Sequence Alignmentによって、適宜解析して理解することができる。対応部位の解析方法の１例として図１及び図２にヒトでの６種類のアイソフォームのアミノ酸配列（１文字表示）をClustalWで並べたものを示す。これを見れば６つのアイソフォームにおいて配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６に相当するアミノ酸残基周辺の構造が保存されていて、対応するアミノ酸がいずれであるかを容易に理解できる。
【００２２】
本発明の治療剤又は予防剤で用いることができる抗リン酸化タウ抗体とは、配列番号１のタウタンパク質の４１０位から４２１位に存在するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化を受けたタウタンパク質と特異的に抗原抗体反応する抗体であり、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウタンパク質に特異的に抗原抗体反応する抗体であり、より望ましくはＶＨのアミノ酸配列が配列番号２０、ＶＬのアミノ酸配列が配列番号２６である抗体（以下、「１５０５抗体」ともいう。）と競合結合する抗体であり、さらに望ましくはＳｅｒ４１３の部位がリン酸化されたタウタンパク質に特異的に抗原抗体反応する抗体である。配列番号１の４１０位から４２１位に相当するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化を受けたタウタンパク質、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウタンパク質、又は配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基の部位がリン酸化されたタウタンパク質とは、前述のようにヒト又は他の種でのアイソタイプを含めて対応する部位がリン酸化されたタウタンパク質を表すが、より好ましくはヒトのタウタンパク質であり、より好ましくはヒトでの６つのアイソフォームのうちのいずれかである。
【００２３】
また、本発明における配列番号１の４１０位から４２１位に相当するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化を受けたタウタンパク質、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウタンパク質、又は配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基の部位がリン酸化されたタウタンパク質には、タウタンパク質の４１０位から４２１位に相当するアミノ酸残基のアミノ酸配列の一部分と完全に相同又は８０％以上の配列の相同性を有するペプチドであって、該当するアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドもそのようなリン酸化タウタンパク質に含まれ、そのようなペプチドと特異的に抗原抗体反応する抗体も、本発明での抗リン酸化タウ抗体である。
【００２４】
本発明において「抗原抗体反応する」とは配列番号１の４１０位から４２１位に相当するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化を受けたタウタンパク質、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウタンパク質、及び／又は配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基の部位がリン酸化されたタウタンパク質に対して、平衡解離定数（ＫＤ）が１×１０−６Ｍ以上の親和性で結合すること、望ましくは平衡解離定数１×１０−７Ｍ以上の親和性で結合すること、さらに望ましくは平衡解離定数１×１０−８Ｍ以上の親和性で結合することをいう。
【００２５】
また、「特異的に」とは配列番号１の４１０位から４２１位に相当するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化を受けたタウタンパク質、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウタンパク質、及び／又は配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基の部位がリン酸化されたタウタンパク質に対する結合が、当該部位がリン酸化されていないタウタンパク質（タウタンパク質のアミノ酸配列の一部分と完全に相同又は８０％以上の配列の相同性を有するペプチドを含む）に対する結合より１０倍以上強い、望ましくは３０倍以上強い、さらに望ましくは１００倍以上強い状態をいう。
【００２６】
さらに、ＶＨ配列のアミノ酸配列が配列番号２０、ＶＬのアミノ酸配列が配列番号２６である抗体（１５０５抗体）と「競合結合する」とは、当該モノクローナル抗体が抗原に結合する際に他の抗体を共存させたときに、当該モノクローナル抗体の結合が阻害される現象を意味し、一般的には一定量(濃度)の当該モノクローナル抗体に対して、量（濃度）を変えて別の抗体を加えていった際に、当該モノクローナル抗体の抗原への結合量が低下する添加量（濃度）を測定することによって測定が可能であり、その阻害の程度はＩＣ５０又はＫｉという値で表すことができる。本発明でのＶＨのアミノ酸配列が配列番号２０であり、ＶＬの配列が配列番号２６である抗体（１５０５抗体）と競合結合する抗体とは、当該モノクローナル抗体１０ｎＭで用いて抗原抗体結合を検出した際に、ＩＣ５０が１μＭより低い値のものをいい、さらに望ましくは１００ｎＭより低い値のものをいい、さらに望ましくは１０ｎＭより低いものをいう。
【００２７】
このような抗体のリン酸化タウタンパク質への抗体抗原結合は、当業者であれば固相又は液相の系での結合測定を適宜選択して行うことが可能であり、そのような方法としてはＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、表面プラズモン共鳴法、ＦＲＥＴ法、ＬＲＥＴ法等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。また、そのような抗原抗体結合を測定する際に、抗体及び／又は抗原（リン酸化タウタンパク質又はタウタンパク質）を酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素等で標識を行い、その標識した物質の物理的及び／又は化学的特性に適した測定方法を用いて抗原抗体反応を検出することも可能である。
【００２８】
また、本発明の抗リン酸化タウ抗体としては、Ｈ鎖可変領域がＣＤＲ−Ｈ１のアミノ酸配列が配列番号７又は８、ＣＤＲＨ−Ｈ２のアミノ酸配列が配列番号９、１０、１１及び１２のうちから選択されるいずれかとＣＤＲＨ−Ｈ３のアミノ酸配列が配列番号１３の組合せからなる、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖可変領域が、ＣＤＲ−Ｌ１のアミノ酸配列が配列番号１４又は１５、ＣＤＲ−Ｌ２のアミノ酸配列が配列番号１６、及びＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列が配列番号１７の組合せからなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列を含む抗体も含まれる。好ましくは、Ｈ鎖可変領域に含まれるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３のセットが、配列番号７、配列番号９及び配列番号１３；配列番号８、配列番号９及び配列番号１３；配列番号７、配列番号１０及び配列番号１３；配列番号８、配列番号１２及び配列番号１３；並びに配列番号７、配列番号１１及び配列番号１３；の組合せから選択されるいずれかであり、Ｌ鎖可変領域に含まれるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３のセットが、配列番号１４、配列番号１６及び配列番号１７；又は配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７である抗体、より好ましくはＨ鎖可変領域に含まれるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３のセット、並びにＬ鎖可変領域に含まれるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３のセットの組合せが、配列番号７、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６及び配列番号１７；配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６及び配列番号１７；配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６及び配列番号１７；配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６及び配列番号１７；並びに、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７の組合せから選択されるいずれかである抗体である。ここで、これらのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、又はＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列のうち、対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つがＢＬＡＳＴ法（ＮＣＢＩのＰＢＬＡＳＴのデフォルト条件）で配列番号７から１７のいずれかと８５％以上の相同性（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）、好ましくは９０％以上の相同性を示す配列であるものも、本発明の抗体に含まれる。
【００２９】
ここで、抗体におけるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、又はＣＤＲ−Ｌ３の配列を同定する方法としては、例えばＫａｂａｔの方法やＣｈｏｔｈｉａの方法を用いることで、当業者は各ＣＤＲに対応する部分の配列を同定することが可能であり、Ｋａｂａｔ（Kabat,E.A. and Wu,T.T.、 J. Immunol., 147, 1709-1719、1991年）やＣｈｏｔｈｉａ（Al-Lazikani,B., Lesk,A.M. and Chothia,C.、J. Mol.Biol., 273，927-948、1997年）の方法は、この領域の当業者にとっては技術常識であるが、たとえばDr. Andrew C.R. Martin’s Groupのホームページ（http://www.bioinf.org.uk/abs/）から概要を知ることも可能である。
【００３０】
本発明における抗体の別の形態としては、Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列が配列番号１８から２４から選択されるいずれか、Ｌ鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列が配列番号２５から３０から選択されるいずれかである抗体であり、好ましくはＶＨとＶＬのアミノ酸配列の組合せが、配列番号１８と配列番号２５、配列番号１９と配列番号２６、配列番号２０と配列番号２６、配列番号２１と配列番号２７、配列番号２２と配列番号２８、配列番号２３と配列番号２９、及び配列番号２４と配列番号３０の組合せから選択されるいずれかである抗体である。ここで、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列の少なくとも片方が、配列番号１８から２４に示したいずれかのＶＨのアミノ酸配列又は配列番号２５から３０に示したＶＬのいずれかのアミノ酸配列、及びＢＬＡＳＴ法（ＮＣＢＩのＰＢＬＡＳＴのデフォルト条件）で配列番号１８から３０と８５％以上の相同性（Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）、好ましくは９０％以上の相同性を示す配列であるものも、本発明の抗体に含まれる。
【００３１】
この抗体において、定常領域のアミノ酸配列は哺乳類のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤの各サブタイプ又はその変異体から選ばれる。
上記のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列、及び／又はそれをコードする遺伝子の塩基配列、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列、及び／又はそれをコードする遺伝子の塩基配列の情報を基に、当業者であればヒト化抗体等、目的の種に治療目的で投与するのに適した組換え体抗体をデザインすることが可能であり、Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列及び／又はそれをコードする遺伝子の塩基配列、Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列及び／又はそれをコードする遺伝子の塩基配列の情報を基に、当業者であれば目的に応じたキメラ抗体等をデザインすることができる。また、さらにＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列、及び／又はそれをコードする遺伝子の塩基配列、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列、及び／又はそれをコードする遺伝子の塩基配列の情報や、Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列及び／又はそれをコードする遺伝子の塩基配列、Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列及び／又はそれをコードする遺伝子の塩基配列の情報を基に、低分子抗体やスキャフォールド抗体を作製することは、公知の技術を用いることで、当業者であれば適宜実施することができる。
【００３２】
本発明における抗体は、Ｈ鎖及びＬ鎖が各２本によって構成される抗体であってもよく、Ｈ鎖が２本のみで構成される抗体であってもよい。また、本発明の抗体は、抗体の断片であってもよく、そのような抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ等の構造が例示できる。
【００３３】
本発明における抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明における抗体は、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体(ミルスタイン（Milstein）等、ネイチャー（Nature）（England）1983年10月6日発行、305巻5934号、p.537〜540)であることができる。例えば、ポリクローナル抗体は配列番号１の４１０位から４２１位に相当するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化を受けたタウタンパク質、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウタンパク質、配列番号１のＳｅｒ４１３の部位がリン酸化されたタウタンパク質、又は配列番号１のタウタンパク質の４１０位から４２１位のアミノ酸配列の少なくとも一部分と完全に相同又は８０％以上の配列の相同性を有するペプチドであって、該当するアミノ酸がリン酸化されたペプチドを抗原として哺乳動物に感作し、当該動物の血清等から回収することができる。また、ペプチドを抗原として用いる場合には、ＢＳＡやＫＬＨ等のキャリアタンパク質やポリリジン等に結合させた形態での抗原を用いることができる。また抗原として用いるペプチドの具体的例としては、実施例１及び２に記載のように、配列番号１のＳｅｒ４１３に相当する部位がリン酸化された配列番号３１又は３２のペプチドを用いることができるが、これに限定されるものではない。当該発明におけるモノクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞等と細胞融合させることにより得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から回収することができる。そのようなモノクローナル抗体の取得方法としては、実施例２に記載されており、それによって得られたモノクローナル抗体としては配列番号１８から２４のＶＨアミノ酸配列、配列番号２５から３０のＶＬ配列を有するモノクローナル抗体（Ｔａ１５０１、１５０２、１５０５〜１５０９）が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００３４】
得られたモノクローナル抗体は、その抗体のタンパク質のアミノ酸をコードする遺伝子配列を有する核酸分子を得ることも可能であり、そのような核酸分を用いて遺伝子工学的に抗体を作製することも可能である。当該抗体の遺伝子情報はH鎖、L鎖、それらの可変領域はCDR配列などの情報を用いて抗体の結合性や特異性の向上のための改変等を行うことや、マウス等の動物の抗体からヒト型抗体に改変することによって治療剤に用いるために適した構造の抗体を作製することは、この分野での当業者にはよく知られた技術である。また、抗原を感作する動物としてヒト抗体遺伝子が導入された非ヒト−トランスジェニック動物を用いることによって、ヒト型のモノクローナル抗体を取得することも可能である。それ以外にも、動物への感作を必要としない方法として、ヒト抗体の抗原結合領域またはその一部を発現するファージライブラリー（ヒト抗体ファージディスプレイ）を用いて、対応する抗原と特異的に結合する抗体や特定のアミノ酸配列からなるファージクローンを取得し、その情報からヒト抗体を作製する技術も当業者であれば適宜行うことができる。（例えば、Taketo Tanaka等、Keio J. Med., 60巻、p37-46のレビューなどを参照。）
【００３５】
また、前述のモノクローナル抗体を製造する方法としては、それぞれ取得したい抗体を産生するハイブリドーマを培養し、得られた培養上清から常法によって抗体を精製して取得することができる。また、別の製造方法としては、取得したい抗体を産生するハイブリドーマやヒト抗体ファージディスプレイで得られたファージクローン等から抗体をコードする遺伝子、より詳細には免疫グロブリンの重鎖および／又は軽鎖をコードする遺伝子を取得して、該遺伝子を発現するためのベクターを作製し、宿主細胞（哺乳類細胞、昆虫細胞、微生物等）に導入して、該抗体を産生させることも可能である。このとき、免疫グロブリンの重鎖および／又は軽鎖をコードする遺伝子について、望む形質を導入するための遺伝子改変を行ったり、免疫グロブリンの重鎖および／又は軽鎖の可変領域又はCDR領域の構造情報を用いてヒト型化抗体、抗体キメラタンパク質、低分子抗体やスキャフォールド抗体を作製することは、公知の技術を用いることで当業者であれば実施することができる。また、抗体の性能の向上や副作用の回避を目的に、抗体の定常領域の構造に改変を入れることや、糖鎖の部分での改変を行うことも、当業者によく知られた技術によって適宜行うことができる。
【００３６】
[タウに由来するアミノ酸配列を有するリン酸化ペプチド]
本発明には、タウのアミノ酸配列の一部を含み、その１つ以上のアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドも含まれる。アミノ酸残基がリン酸化されたとは、アミノ酸残基の側鎖に対してリン酸基がエステル結合した状態をいい、リン酸化されるアミノ酸残基の代表的なものとしては、セリン、スレオニン、チロシン等が挙げられる。当該リン酸化ペプチドは配列番号１のアミノ酸番号４１０〜４２１に相当するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する３アミノ酸を含む長さが８アミノ酸長以上のペプチド、好ましくは少なくとも連続する５アミノ酸を含む長さが８アミノ酸長以上のペプチド、より好ましくは少なくとも連続する８アミノ酸を含む長さが８アミノ酸長以上のペプチドである。さらに、当該リン酸化ペプチドにおいてリン酸化されるアミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸番号４１０〜４２１に相当するアミノ酸残基のいずれか、好ましくは配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、Ｓｅｒ４１６のアミノ酸に相当するアミノ酸残基のいずれか、より好ましくは配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基である。このようなリン酸化ペプチドの代表的なものとしては、実施例１で抗体作製で用いているリン酸化ペプチド（配列番号３１）が挙げられるが、これに限定されない。
【００３７】
本発明のタウに由来するアミノ酸配列を有するリン酸化ペプチドは、本発明における抗リン酸化タウ抗体の作製における抗原や当該ペプチドを含むことを特徴とする認知症治療剤又は予防剤に用いることができる。当該リン酸化ペプチドは、その配列のＮ末端及び／又はＣ末端に目的に応じて他の機能を有する物質で修飾することも可能である。例えば、当該リン酸化ペプチドのＮ末端に、メチオニン残基、アセチル基又はピログルタミン酸等が付加されたものや蛍光物質等で修飾された形であってもよい。また、当該リン酸化ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端を修飾する物質は、ペプチドやタンパク質であっても良く、そのようなものの例としてはＮ末端又はＣ末端に適当なタグ配列（典型的にはヒスチジンタグ又はＦＬＡＧタグ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）や主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）によって認識されるためのアミノ酸配列のペプチド、ウイルスや細菌のタンパク質やそれに由来する配列のペプチド等が付加されたものが挙げられる。また、本発明におけるリン酸化ペプチドには、Ｎ末端及びＣ末端以外の少なくとも一つのアミノ酸残基が化合物又はペプチドで修飾されたものも含まれる。このようなリン酸化ペプチドの修飾は、当業者であれば公知の方法、例えばハーマンソン（Hermanson）等著のバイオコンジュゲート・テクニックス（Bioconjugate techniques、USA、1996年発行、Academic Press）に記載の方法等を用いて実施することが可能である。
【００３８】
本発明におけるリン酸化ペプチドは、当業者であれば適宜合成法や遺伝子工学的方法等を用いて製造することができる。リン酸化ペプチドを合成によって製造する方法としては、Ｂｏｃ法による方法（Wakamiya T.ら、Chemistry Letters、Vol.22 P1401, 1993年）、Ｆｍｏｃ法による方法（PERICH, J. W., International Journal of Peptide and Protein Research, vol.40, P134-140, 1992年）、又は特許第３５８７３９０号に記載の方法等が例示できるが、当業者であれば適宜別の方法でも実施可能である。また、遺伝子工学的方法による製造方法は、製造するペプチド又はその前駆体をコードする塩基配列を有する遺伝物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を調製し、適宜発現用のベクターへの組込やプロモーター配列の付加等を行うことで、適当な宿主に導入して発現させるか無細胞系タンパク質合成系を用いる等の方法で製造することができる。この場合、望む部位がリン酸化されたリン酸化ペプチドを得るためには、適宜、宿主が有する又は遺伝子工学的に発現が誘導されたキナーゼ類により宿主内でリン酸化反応を行わせるか、目的のペプチドを一度回収した後にin vitroにおいてキナーゼ等を反応させることでリン酸化反応を行うことによって製造することが可能である。このin vitroでのリン酸化反応を行うためには、目的のペプチドをＧＳＫ３やＣＤＫ５等タウのリン酸化反応での機能が知られている酵素を利用することができる。このように宿主内、又はin vitroでリン酸化されたリン酸化ペプチドのうち、目的のアミノ酸残基がリン酸化されたものを取得するためには、上記の抗リン酸化タウに対する抗体による抗体抗原反応を用いて特異的に抗体と結合したリン酸化ペプチドを回収する方法等を用いても良い。
【００３９】
[抗リン酸化タウ抗体又はリン酸化タウペプチドを含有する認知症治療剤又は予防剤]
ヒトにおける認知症とは、いったん発達した、あるいは獲得された知的機能が低下する状態をいい、知能障害の一つとされるが（上島国利、丹羽真一編、NANKODO’s  ESSENTIALWELL-ADVANCED SERIES  New精神医学、ｐ６９−７０、2008年）、広い意味においては知能障害及び／又は記憶障害を呈する疾患と考えられる。ＡＤ等の神経変性疾患においては、「神経変性」を確定するには死後に組織学的な解析を行うことで神経原線維変化（ＮＦＴ）の存在を確認すること等で行うことができるが、医師は神経変性疾患の診断として、神経心理学的検査として質問によるもの／長谷川式簡易知能評価スケール改訂版（HDS-R）やMini-Mental State Examination(MMSE) 等、観察によるものClinical Dementia Rating(CDR) やFunctinal Assessment Staging(FAST) 等、生化学検査として脳脊髄液中でのタウやリン酸化タウの存在量の上昇やＡβの存在量の上昇、画像検査として頭部ＣＴ、頭部ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴやＰＥＴ等での得られた情報を基に、認知症、特に神経変性疾患としての認知症を診断する。従って、本発明の認知症治療剤又は予防剤は医師が認知症として診断した患者に投与され、上記の神経変性疾患における診断の項目の１以上において、投与前と比較して改善する効果、又は病状が進行する程度を投与によって抑制又は投与前の状態に維持又は回復させる効果を有するものである。
【００４０】
本発明の認知症治療剤又は予防剤が投与される患者としては、認知症の患者である、その中でもタウオパチーの患者であって、その中でもアルツハイマー病（ＡＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ又はＣＢＳ）、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀性顆粒病）、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔａｕｏｐａｔｈｙ  ｗｉｔｈ  ｄｅｍｅｎｔｉａ（ＭＳＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うび慢性神経原線維変化病  （ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー（ＷＭＴ−ＧＧＩ）タウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ−ｔａｕ）、エコノモ脳炎後遺症、亜急性硬化性全脳症や拳闘家脳症のうちのいずれかの患者である。したがって、本発明の認知症治療剤はタウオパチー治療剤又は予防剤でもあり、別の観点ではアルツハイマー病（ＡＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ又はＣＢＳ）、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀性顆粒病）、Multiple system tauopathy with dementia（ＭＳＴＤ）、１７番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うび慢性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー（ＷＭＴ−ＧＧＩ）タウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ−ｔａｕ）、エコノモ脳炎後遺症、亜急性硬化性全脳症や拳闘家脳症等の治療剤又は予防剤であるともいえる。
【００４１】
また、本発明の認知症治療剤又は予防剤は、非ヒト動物での認知機能を改善、又は認知機能の低下を抑制又は維持する効果を持つものであるともいえる。当該非ヒト動物としてヒトのタウを高い相同性を有するタウを発現する動物、チンパンジー、アカゲザル、ウマ、ブタ、イヌ、マウス、ウサギ、ラット、ネコ等が含まれるが、それに限定されるものではない。
【００４２】
[認知症のモデル動物]
本発明の認知症治療剤又は予防剤を研究するための動物としては、認知症のモデル動物が挙げられ、その中でも特にタウオパチーのモデル動物が挙げられる。また、タウオパチーの動物モデルとしては、正常型又は遺伝子変異型のタウを脳で発現する動物であり、特に認知機能の障害をおこす動物モデルである。このような正常型又は遺伝子変異型のタウを脳で発現する動物は遺伝子操作により作製することが可能であり、その代表的なものとしてはトランスジェニックマウス（Ｔｇマウス）が挙げられる。遺伝子変異型のタウを発現するＴｇマウス等の動物モデルは、遺伝的な家族性のタウオパチーのモデルとしては有用であるが、ヒトでの大多数をしめる孤発性のタウオパチーに対して治療剤又は予防剤の効果をみるためには正常型のタウを発現するＴｇマウスで効果を示すことが望ましい。そのような正常型のタウを発現するＴｇマウスとしては、本発明の製造例で作製しているマウスが最も適しているが、その他には神戸ら（Neurobiology of Disease, Vol.42, P404-414, 2011年）や木村ら（The EMBO J. vol.26. P5143-5152, 2007年）が報告しているＴｇマウス等を用いることができる。しかしながら、神戸らのマウス及び木村らのマウスにおいては、認知機能障害が認められるのが、それぞれ１４ヶ月齢及び２０ヶ月齢以降であることから、かなり老齢になってからの発症となり、加齢による影響も含んでいる可能性や、長期飼育による影響や手間の問題がある。それに対して、本発明の製造例で作製しているマウスは、ヒトの正常型のタウを発現し、６ヶ月齢程度と比較的早期に認知機能障害を発症するマウスであることから、加齢などの要因を排除できる認知症モデルとして最も適したものであり、このようなモデルを用いることでより明確に認知機能の改善効果を有する認知症治療剤又は予防剤を評価することが可能である。
【００４３】
動物モデルで本発明の認知症治療剤又は予防剤の作用を調べる方法としては、記憶学習試験等の認知機能を試験する方法が望ましい。そのような方法としては、Morris水迷路試験、ステップスルー型学習試験、新奇物質認識試験等の方法を用いることが可能であるが、行動量や動物の不安等の条件を裏付けるためにOpen Field Test 等の行動測定試験の方法を組み合わせるのが望ましい。
【００４４】
また、本発明の認知症治療剤又は予防剤の作用を調べる方法としては、認知症のモデル動物に投与した際に、脳組織におけるタウタンパク質またはリン酸化タウの増減を調べる方法も用いることができる。ＡＤや他の神経変性疾患において、タウタンパク質の発現量や異常リン酸化タウの増加が病態と関連しているといわれている（Khalid Iqbal等、 Curr. Alzheimer Res., 7巻、p654-664、2010年）。そして、いくつかの病態モデル動物においてタウの発現や異常リン酸化タウの量を低減することによって、認知機能や運動機能に改善がみられることも公知である（K. SantaCruz等、Science,  ３０９巻、p476-481、2005年；Sylvie Le Corre等、Porc. Nat. Acad. Sci. USA,  １０３巻p9673-9678、2006年）。タウタンパク質またはリン酸化タウの増減を調べる方法としては、実施例に記載されていように脳組織のホモジネートを用いてウエスタンブロティングなどの方法で実施できるが、その他ELISA法（Xiyun Chai等、J. Biol. Chem.,  ２８６巻、p34457-34467、2011年）や組織免疫化学法（David J. Irwin等、BRAIN，１３５巻、p807-818、2012年）など、当業者であれば適宜方法を選択して実施することが可能である。
【００４５】
本発明での認知症治療剤又は予防剤のモデル動物での効果は、ヒト等での治療剤又は予防剤の開発における薬理効果のデータとして用いられる。
【００４６】
［認知症治療剤又は予防剤］
本発明の認知症治療剤又は予防剤の形態としては、抗リン酸化タウ抗体を含有するものであり、好ましくはタウタンパク質の配列番号１の４１０位から４２１位に相当するアミノ酸残基の少なくとも一つがリン酸化を受けたタウタンパク質と特異的に抗原抗体反応する抗体であり、配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、及びＳｅｒ４１６に相当するアミノ酸残基から選ばれる１つ以上の部位がリン酸化されたタウタンパク質と抗原抗体反応する抗体であり、より望ましくはＶＨのアミノ酸配列が配列番号２０であり、ＶＬのアミノ酸配列が配列番号２６である（１５０５）抗体と競合結合する抗体であり、さらに望ましくは配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基の部位がリン酸化されたタウタンパク質に抗原抗体反応する抗体である。そのような抗体についての説明は、上述の[抗リン酸化タウ抗体]の部分に記載されている。
【００４７】
本発明の認知症治療剤又は予防剤の別の形態としては、タウの配列の一部を含み、その１つ以上のアミノ酸残基がリン酸化されたペプチドを含有するものであり、そのペプチドとしてはリン酸化ペプチドは配列番号１のアミノ酸番号４１０〜４２１に相当するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列のうち、少なくとも連続する３アミノ酸を含む長さが８アミノ酸長以上のペプチド、好ましくは少なくとも連続する５アミノ酸を含む長さが８アミノ酸長以上のペプチド、より好ましくは少なくとも連続する８アミノ酸を含む長さが８アミノ酸長以上のペプチドである。さらに、当該リン酸化ペプチドにおいてリン酸化されるアミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸番号４１０〜４２１に相当するアミノ酸残基のいずれか、好ましくは配列番号１のＳｅｒ４１２、Ｓｅｒ４１３、Ｔｈｒ４１４、Ｓｅｒ４１６のアミノ酸に相当するアミノ酸残基のいずれか、より好ましくは配列番号１のＳｅｒ４１３に相当するアミノ酸残基である。そのようなペプチドについての説明は上述の[タウに由来するアミノ酸配列を有するリン酸化ペプチド]の部分に記載されている。
【００４８】
本発明の認知症治療剤又は予防剤は、薬学的に許容されるいずれの添加剤を含有してもよい。薬学的に許容される添加剤を用いての製剤は「REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY 20th EDITION、フィラデルフィア科学大学（University of the Sciences in Philadelphia）著、Williams & Wilkins社、2000年12月15日発行」に記載の方法で実施することも可能である。このような治療剤又は予防剤の一つの形態としては、無菌の水性液又は油性液に溶解、懸濁、又は乳化することによって調製された液剤として供される。このような溶剤として、水性液としては注射用蒸留水、生理食塩水等が挙げられ、それに加えて浸透圧調節剤（例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）が添加されたり、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（例えばエタノール）、ポリアルコール（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０）等が併用される場合もある。また、溶剤としては油性液が用いられる場合もあり、該油性液の例としてはゴマ油、大豆油等があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等が併用される場合もある。このような液剤においては、適宜、緩衝剤（例えば、リン酸塩類緩衝剤、酢酸塩類緩衝剤）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、アスコルビン酸、エリソルビン酸及びそれらの塩等）、着色剤（例えば、銅クロロフィル、β−カロチン、赤色２号、青色１号等）、防腐剤（例えばパラオキシ安息香酸エステル、フェノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム等）、増粘剤（例えばヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びそれらの塩等）、安定化剤（例えば人血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール等）、矯臭剤（例えばメントール、柑橘香料等）の添加剤が用いられる場合がある。また別の治療剤又は予防剤の形態としては、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、トローチ剤等の固形剤があげられる。経口用製剤の形で投与する固形剤の場合には、添加剤として、賦形剤（例えば、結晶性セルロース、ラクトース、デンプン等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マクロゴール等）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム等）等が用いられる。また、必要に応じて、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル等）、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加剤を用いることができる。さらに別の形態として、粘膜適用用治療剤又は予防剤もあげられ、この製剤においては粘膜への吸着性、滞留性等を付与することを主な目的として、添加剤として粘着剤、粘着増強剤、粘稠剤、粘稠化剤等（例えば、ムチン、カンテン、ゼラチン、ペクチン、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム、ローカストビンガム、キサンタンガム、トラガントガム、アラビアゴム、キトサン、プルラン、ワキシースタ��チ、スクラルフェート、セルロース、及びその誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリグリセリン脂肪酸エステル、アクリル酸（メタ）アクリル酸アルキル共重合体、又はその塩、ポリグリセリン脂肪酸エステル等）が含有される場合もある。しかしながら、生体に供与される治療剤又は予防剤の形態及び溶剤や添加剤はこれらに限定されるものではなく、当業者であれば適宜選択できる。
【００４９】
本発明における認知症治療剤又は予防剤には、上記の抗リン酸化タウ抗体又はリン酸化ペプチドのほかに既存の認知症の進展を抑制する効果を有する物質を配合した治療剤又は予防剤も含まれる。また、本発明における認知症治療剤又は予防剤には、上記の抗リン酸化抗体又はリン酸化ペプチドを含む治療剤又は予防剤と既存の認知症の進展を抑制する効果を有する物質を含有する治療剤又は予防剤を併用するためのキットも含まれる。認知症の進展を抑制する物質としては、たとえばドネペジル（Donepezil）、ガランタミン（Galantamine）、メマンチン（Memantine）やリバスチグミン（Rivastigmine）などが挙げられるがこれに限定されるものではない。配合される認知症の進展を抑制する効果を有する物質や認知症の進展を抑制する効果を有する物質を含有する治療剤又は予防剤の用量としては、通常の治療に用いられる用量で行うことができるが、状況に応じて増減することも可能である。
【００５０】
また、本発明の実施例で用いている抗体は、腹腔内投与という末梢からの投与によっても脳血管関門を通過して脳で作用して薬効を示すことが実施例の結果より証明されているが、本発明における認知症治療剤又は予防剤にも用いる抗リン酸化タウ抗体を脳組織に効率的に供給するための製剤も作製可能であり、そのような製剤も本発明の認知症治療剤又は予防剤に含まれる。抗体やペプチドなどを効率的に脳組織に脳血管関門を通過させて供給する方法としては、ターゲッティング用の物質を付加する方法や、リポソームやナノパーティクル内に封入する方法などが知られている。ターゲッティングのための物質としては、抗体と結合させることによって全体又は部分的な電荷的特性を変化させるものを用いたり、特異的な受容体やトランスポーターなどと結合する特性を有するペプチドやタンパク質または化合物を用いることが可能である。特異的な受容体や膜たんぱく質などと結合する特性を有するペプチドやタンパク質または化合物の例としては、受容体のリガンドや膜たんぱく質に結合するリガンドやその類縁体、受容体のリガンドや膜たんぱく質に結合する抗体、アゴニスト化合物／アンタゴニスト化合物／アロステリックモジュレーターやそれらの類縁化合物などが挙げられる。特異的な受容体やトランスポーターなどと結合する特性を有するペプチドやタンパク質または化合物の標的となる受容体のリガンドや膜たんぱく質の例としては、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体（ＩＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、ＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）やジフテリア毒素受容体（ＨＢ−ＥＧＦ）などが挙げられるが、これに限定されるものではない（Angela R. Jones等、Pharm. Res.,  ２４巻、p1759−1771、2007年）。ターゲティングのための物質は本発明の認知症治療剤又は予防剤に用いる抗体に化学的に付加することが可能であり、その方法としては、公知の方法、たとえばハーマンソン（Hermanson）等  バイオコンジュゲート・テクニックス（Bioconjugate techniques）（USA）1996年発行 Academic Press）に記載の方法を参照して当業者であれば適宜行うことができる。また、ターゲッティングのための物質は、抗体やペプチドを包含させるリポソームやナノパーティクルに結合させてもよい（Sonu Bhaskar等、Particle and Fibre Toxicology，７巻３号、2010年）。さらに、ターゲッティングのための物質がペプチドやタンパク質である場合には、ペプチド化学合成による融合ペプチドとして製造したり、ペプチドやタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸を、使用する抗体やペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸と組み合わせたりすることによって、当業者であれば適宜融合タンパク質として遺伝子工学的な技術を用いて製造することが可能である。
【００５１】
本発明における治療剤又は予防剤は、症状の改善を目的として、経口又は非経口的に投与することができる。経口投与の場合には、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、乳剤又は懸濁剤、エリキシル剤等の剤型を選択することができる。非経口投与の場合には、例えば経鼻剤とすることができ、液剤、縣濁剤、固形製剤等を選択できる。また別の非経口投与の形態としては、注射剤とすることができ、注射剤としては、皮下注射剤、静脈注射剤、点滴注射剤、筋肉注射剤、脳室内注射剤又は腹腔内注射剤等を選択することができる。またその他の非経口投与に用いる製剤としては、坐剤、舌下剤、経皮剤、経鼻剤以外の経粘膜投与剤等も挙げられる。さらに、ステントや血管内栓塞剤に含有もしくは塗布する態様で、血管内局所投与することもできる。
【００５２】
本発明における治療剤又は予防剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間、又は該医薬組成物に含有される活性成分の種類等により異なるが、通常成人１人あたり、１回につき主剤を０．１ｍｇから１ｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから２００ｍｇの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
また本発明における治療剤又は予防剤は、短い投与期間で効果を得ることが可能である。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。実験は、大阪市立大学阿倍野地区動物実験委員会の承認のもとに行われた。【００５４】
［実施例１］ｐＳｅｒ４１３ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体の作製
ｐＳｅｒ４１３ペプチドに対する抗体作製のために、抗原として、ヒトタウタンパク質の配列番号１のアミノ酸配列の４１３番目に相当するＳｅｒがリン酸化された４１０番目のＡｓｎから４１６番目のＳｅｒまでに相当するアミノ酸配列のＣ末端部位にＣｙｓをつけた合成ペプチド（配列番号３１．株式会社医学生物学研究所[ＭＢＬ]で合成）を用いた（以下、該ペプチドをｐＳｅｒ４１３（Ｓ）ペプチドと呼ぶ）。【００５５】
ｐＳｅｒ４１３（Ｓ）ペプチド：Ｎ−ＡｓｎＶａｌＳｅｒ（ｐＳｅｒ）ＴｈｒＧｌｙＳｅｒＣｙｓ−Ｃ（配列番号３１）【００５６】
ｐＳｅｒ４１３（Ｓ）ペプチドは合成後、ＨＰＬＣにて精製し、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）と共有結合させた。得られたコンジュゲートはウサギ１羽に対して０．１ｍｇを１回分の免疫に用いた。一回目の免疫はコンジュゲート溶液０．２ｍＬ（コンジュゲート濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）と等量のフロイントのコンプリートアジュバントを混合し、毛剃りした日本白色種のウサギの背部に、５０μＬずつ８箇所に皮内注射することで行った。二回目以降の免疫はフロイントのインコンプリートアジュバントを用いて、同様の免疫を２週間おきに、さらに２回行った。最後の免疫から２週間後に血液を一部採取して、その血清中の抗体価を、免疫したペプチドコンジュゲートを用いたＥＬＩＳＡ法で確認し、その１週間後に動物を屠殺して全血を採取した。得られた血液から血清を作製し、その血清からｐＳｅｒ４１３（Ａｆ）ペプチド（配列番号３２）のアフィニティーカラムを用いて抗体を精製した。【００５７】
なお、血清抗体値の確認は以下の方法によった。ｐＳｅｒ４１３（Ｓ）ペプチドをＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈後、プレートに１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去後、ブロッキングバッファー（ＭＢＬ社製）を２５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃で一晩静置した。免疫前ウサギ血清と免疫後のウサギ血清の希釈系列を１００、５００、２,５００、１２,５００、６２,５００倍、ブランクとし、ＰＢＳで希釈したものを１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で６０分間反応させた。洗浄後、抗ウサギＩｇＧ−パーオキシダーゼ標識（ＭＢＬ社製）を希釈Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＢＬ社製）で８，０００倍希釈したものを１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で６０分間反応させた。洗浄後、発色液（ＭＢＬ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、３〜１０分間発色させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、反応を停止させた。反応停止後、測定波長４５０ｎｍ、参照波長６２０ｎｍで吸光度を測定した。【００５８】
また、精製抗体の抗体反応性の確認は、以下の方法によった。ｐＳｅｒ４１３（Ｌ）ペプチド［ｐＳｅｒ４１３（Ｓ）ペプチド（下線部）をＮ端、Ｃ端方向に更に延長したペプチド（配列番号３３．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社で合成）：Ｎ−ＰｒｏＡｒｇＨｉｓＬｅｕＳｅｒＡｓｎＶａｌＳｅｒ（ｐＳｅｒ）ＴｈｒＧｌｙＳｅｒＩｌｅＡｓｐＭｅｔＶａｌＡｓｐ−Ｃ］、あるいは同じアミノ酸配列を有するがＳｅｒ４１３に相当する部位がリン酸化されていないＮｏｎＰ（Ｌ）ペプチド（配列番号３４．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社で合成）をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈後、プレートに５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去後、ブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ−ＰＢＳ）を２５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、３７℃で１時間以上静置した。精製抗体をＰＢＳで希釈し、系列化したものを５０μＬ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で９０分間反応させた。洗浄後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−アルカリフォスファターゼ標識（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を、希釈Ｂｕｆｆｅｒ（３％ＢＳＡ−ＰＢＳ）で２，０００倍希釈したものを、５０μＬ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で６０分間反応させた。洗浄後、発色液（２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有０．１Ｍ  Ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ９．８に１ｍｇ／ｍＬ  ＰＮＰＰ［パラニトロ・フェニルフォスフェート］を添加した溶液）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、３０分間発色させ、測定波長４０５ｎｍ、参照波長５５０ｎｍで吸光度を測定した。【００５９】
＜結果＞
精製した抗体は図３に示すよう、ｐＳｅｒ４１３（Ｌ）ペプチドに特異性が高く、ｎｏｎＰ（Ｌ）ペプチドには殆ど反応しないことが判った。従って、当該抗体はｐＳｅｒ４１３（Ｌ）に特異的に抗原抗体反応する抗体である（本明細書では、「ｐＳｅｒ４１３認識ウサギポリクローナル抗体」又は「ｐS413AB」と記載する場合もある）。【００６０】
［実施例２］ｐＳｅｒ４１３ペプチドに対するモノクローナル抗体（Ｔａ１５シリーズ）の作製
抗原として、配列番号１に示されるヒトタウタンパク質のアミノ酸配列の４１３番目のＳｅｒに相当するアミノ酸残基がリン酸化された４０３番目Ｔｈｒから４２３番目のＰｒｏまでに相当する配列のＮ末端部位に、ＧｌｙＣｙｓＳｅｒＧｌｙをつけた合成ペプチドｐＳｅｒ４１３（Ｉｍ）ペプチド（配列番号３５）を用いた。ｐＳｅｒ４１３（Ｉｍ）ペプチドは合成後、ＨＰＬＣにて精製し、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）と共有結合させた。得られたコンジュゲートはマウス１匹に対して０．０４ｍｇを１回分の免疫に用いた。免疫はコンジュゲート溶液０．４ｍｌ（ペプチド換算で１．１ｍｇ／ｍｌ）とＳａｌｉｎｅ０．７ｍＬ及び１．１ｍＬのフロイントのコンプリートアジュバントを混合し、２００μＬずつ１０匹に腹腔内注射することで行った。同様の免疫（免疫箇所、抗原量は同じも、フロイントのインコンプリートアジュバンドを用いた）を２週間おきに、さらに３回行った。１０匹中、抗原に対する血清抗体価が唯一上昇した１匹に対して、最後の免疫から１ヶ月後に、ペプチド換算で０．５ｍｇ／ｍＬの抗原溶液（Ｓａｌｉｎｅに溶解）１００μＬを尾静脈内注射し、３日後に動物を屠殺して脾臓を採取した。１８Ｇ注射針２本を使用して脾臓を切りほぐした後、ゴム栓面で、切りほぐした脾臓を、緩やかに押しつぶした。押しつぶした脾細胞は、冷ＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬ程度で懸濁し、その上澄みを４０μｍセルストレナーで濾過し、濾液を５０ｍＬ遠心管に採取した。脾臓細胞のＤｅｂｒｉｓをさらにゴム栓面で押しつぶし、冷ＲＰＭＩ１６４０培地で同様に懸濁、濾過し、濾液を採取した。最終的に脾臓細胞懸濁液を４０ｍＬになるように冷ＲＰＭＩ１６４０培地（又は冷ＰＢＳ）を加えた。血球計算盤にて、懸濁液中のリンパ球濃度を測定し、最終的に２×１０７Ｃｅｌｌｓに相当するリンパ球を５０ｍＬの遠心チューブに移した。ここに、培養液Ｂ（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％胎児牛血清＋２ｍＭグルタミン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン＋１００単位／ｍＬペニシリン）で培養しておいた４×１０７Ｃｅｌｌｓに相当する対数増殖期のマウス・ミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８・Ｕ１株（Ｐ３・Ｕ１と略記する）を加え、１５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。細胞ペレットを、試験管をたたくことによって、よく分散させた。これに０．５ｍＬのポリエチレングリコール液（ＲＰＭＩ１６４０（２．３ｍＬ）＋ポリエチレングリコール２０００（１．４ｍＬ）＋ジメチルスルホキサイド（０．３ｍＬ）より構成：以下「ＰＥＧ液」と略記する）を加えて、細胞をゆるやかに浮遊させた。１分後に０．５ｍＬのＰＥＧ液を１分かけてゆっくり滴下し、更に１．０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０を１分かけてゆっくり滴下し、更にＲＰＭＩ１６４０を２ｍＬ、２分かけてゆっくり滴下した。その後、４ｍＬのＨＡＴ／ＧＩＴ培養液（ＧＩＴ培地［日本製薬］＋５％胎児牛血清＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン＋１００単位／ｍＬペニシリン＋９５μＭヒポキサンチン＋０．４μＭアミノプテリン＋１６μＭチミジン）を２分かけて滴下し、更に４ｍＬのＨＡＴ／ＧＩＴ培養液を２分かけて滴下した。最後に、ＨＡＴ／ＧＩＴ培養液を加え４０−５０ｍＬの細胞浮遊液とした。３７℃、３０分間恒温槽でインキュベーションした後、これを培養プレート（９６穴）７枚に播いた。なお、培養プレートとして、マウス（ＩＣＲ系）の腹腔マクロファージ（フィーダー細胞）を数日間培養した（＞１×１０５／ｗｅｌｌ）９６ｗｅｌｌプレート（フィーダープレート）を用いた。その後、このプレートを３７℃、５％ＣＯ２下で７〜１０日間培養した。【００６１】
１週間毎に半量の培養液を新しいＨＴ培養液（ＨＡＴ／ＧＩＴ培養液からアミノプテリンを除去したもの）で交換していき、ハイブリドーマを得た。
抗体のスクリーニングは以下の方法によった。ｐＳｅｒ４１３（Ｌ）ペプチドをＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈後、９６ｗｅｌｌプレートに５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去後、ブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ−ＰＢＳ）を２５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、室温で１時間以上放置した。ブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ−ＰＢＳ）を吸引し、ハイブリドーマの上清を３０〜５０μＬ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で６０分間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄後、２次抗体（ブロッキングバッファーに２０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識  ヤギ抗マウス  ＩｇＧ−Ｆｃ  抗体［ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社］を添加した溶液）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で６０分間反応させた。洗浄後、基質溶液（２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有０．１Ｍ  Ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ９．８に０．７〜１．２ｍｇ／ｍＬ  ＰＮＰＰ［パラニトロ・フェニルフォスフェート］を添加した溶液）１００μＬ／ｗｅｌｌを加え、２５℃で６０分間発色させた後、測定波長４０５ｎｍで吸光度を測定した。【００６２】
このスクリーニングで、陽性を示したＷｅｌｌから、細胞を取り出し、血球計算盤で細胞数を数えた後、１〜３ケ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌプレート（先のフィーダープレート）に播き、限界希釈法によるクローニングを行った（Ｔａ１５０１、Ｔａ１５０２、Ｔａ１５０５〜１５０９）。以後の解析用に、クローンを大量培養後、プロテインＧカラムにて、抗体を精製した。Ｔａ１５０５は、Ｔａ１５０５−２と同一である。アイソタイプの決定は  ＡｂＤ  ｓｅｒｏｔｅｃ社のキットを用いて行った。【００６３】
精製した抗体をタウの様々なリン酸化部位に対する部分ペプチドをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに反応させ、リン酸基特異性を調べた。方法は以下によった。
各種タウペプチド（ｐＳ４６［配列番号３６］，ｐＳ１９９［配列番号３７］，ｐＳ２０２［配列番号３８］，ｐＴ２１２［配列番号３９］，ｐＳ２１４［配列番号４０］，ｐＴ２１２／ｐＳ２１４［配列番号４１］，ｐＴ２１７［配列番号４２］，ｐＳ４１３［配列番号３３］, ｎｏｎ ｐＳ４１３［配列番号３４］）の１０％ＤＭＳＯ溶液あるいはペプチドをＢＳＡコンジュゲートしたもの（ｐＳ４００［配列番号４３］−ＢＳＡ，ｐＳ４１２［配列番号４４］−ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液をＰＢＳ（ｐＨ７）にて１μｇ／ｍＬに希釈して５０μＬ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ：Ｎｕｎｃ社）に添加し、４℃で終夜インキュベートし固定化した。その後、ペプチド溶液を除去して０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄後、３％ＢＳＡ／ＰＢＳを２８０μＬ／ｗｅｌｌにて添加し、３７℃、１時間ブロッキングをおこなった。【００６４】
ブロッキング液を吸引除去して、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄後、各種Ｔａ１５シリーズのモノクローナル抗体溶液１μｇ／ｍＬ  ｉｎ  ３％ＢＳＡ−ＰＢＳを５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温にて１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＴＢＳで３回洗浄後、３％ＢＳＡを含むＰＢＳで２０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｃｅ社）を５０μＬ加え、室温で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＴＢＳで３回洗浄後、０．１Ｍのジエタノールアミン（ｐＨ１０）に溶かした１ｍｇ／ｍＬＰＮＰＰ（パラニトロ・フェニルフォスフェート）溶液を１００μＬ加え、室温で１時間反応させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。各抗体の各種ペプチドに対する反応性評価結果を表２に示す。反応性は、３段階に分けて評価した。＋：反応性有り、−：反応性無し、±：若干の反応性を認めるが非常に弱い【００６５】
【表２】
2013180238.tif 000004
【００６６】
これらの抗体（以後、「Ｔａ１５シリーズ」と称する。）は、検討したペプチドのうち、ｐＳｅｒ４１３のみに反応し、極めてリン酸基特異性が高かった。【００６７】
［実施例３］Ｔａ１５シリーズ抗体の結合親和性測定
Ｔａ１５シリーズ抗体と抗原ペプチド（ｐＳｅｒ４１３ペプチド（Ｉｍ）：実施例２参照）との結合親和性を評価するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム  ビアコア（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００、ｃｏｄｅ＃ＢＲ−１１００−４５）及び各ビアコア製品を用い、取扱説明書に準拠し測定した。測定の一つの方法はＣＭ５チップ（カルボキシメチルデキストラン層形成済みチップ，ｃｏｄｅ＃ＢＲ−１１００−１４）に抗マウス抗体（ｃｏｄｅ＃ＢＲ−１００８−３８）をアミンカップリング反応による共有結合により固定化（ｃｏｄｅ＃ＢＲ−１００６−３３）し、固定化された抗マウス抗体にＴａ１５シリーズ抗体を結合し、結合したＴａ１５シリーズ抗体に対し、抗原ペプチドの結合動態を測定する方法であった。【００６８】
特異的結合の反応溶液をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ｃｏｄｅ＃ＢＲ−Ｔ−１００１−８８）とし、ＣＭ５チップをＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の混合溶液により活性化させた。抗マウス抗体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０により０．００１ｍｇ／ｍＬに希釈した溶液をチップ上の４個のフローセルに反応させ、抗マウス抗体をＣＭ５チップに共有結合させた後、エタノールアミンでブロッキングした。抗マウス抗体を固定した４個のフローセルのうち、一つには陰性抗体（マウスＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社，ｃｏｄｅ＃ＭＡＢ００３）を、その他のフローセルにはＴａ１５シリーズ抗体を、各１０００ＲＵ程度の密度で捕捉した。１Ｍ  ＮａＣｌを付加したＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  ｖ／ｖ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）を３分間反応させて、非特異的に吸着した抗体を除去し、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を流速５０ｕＬ／分で１０分間反応させ、ベースラインを安定にした。ペプチドをＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用いて、１００ｐＭから５ｍＭの濃度の間（概算結合解離定数[ＫＤ]近傍）で段階希釈し、得られたペプチド溶液（５濃度）を低濃度側から連続的に各６分の間隔を空けて４分間〜６分間（一律）反応させ、結合動態を測定した。【００６９】
抗原ペプチドの特異的結合動態データとして、操作によって生じるノイズの影響を除くため、陰性ペプチドとして非リン酸化ペプチド（ｎｏｎ  ｐＳｅｒ４１３ペプチド）による結合動態データを得て、抗原ペプチドの結合動態データから差し引いた。なお、測定濃度において、非リン酸化ペプチドの抗体への結合は認められない。特異的結合動態データをビアコア解析ソフト（BIAevaluation：シングルサイクルカイネティクス解析，code#AP-4000-01）を用いて、Single cycle kinetics 1:1 binding with drift modelで適合させ、動力学的会合速度（Ｋａ）及び解離速度（Ｋｄ）を同時に得た（Karlsson. R., Katsamba, P. S., Nordin, H., Pol, E. and Myszka, D. G. (2006). “Analyzing a kinetic titration series using affinity biosensors.” Anal. Biochem. 349(1): 136-47）。Ｔａ１５シリーズ抗体の親和性測定値である平衡解離定数（ＫＤ）値は、Ｋd／Ｋaより算出した。
＜結果＞【００７０】
【表３】
2013180238.tif 000005
【００７１】
Ｔａ１５シリーズ抗体のうち、抗原ペプチドへの親和性が最も強いＴａ１５０５抗体を記憶障害マウスを用いた行動試験に用いた。【００７２】
［実施例４］ｐＳｅｒ３９６及び／又はｐＳｅｒ４０４ペプチドを認識するモノクローナル抗体の作製
抗原として、配列番号１で示されるヒトタウタンパク質のアミノ酸配列の３９６番目、４０４番目のＳｅｒに相当するアミノ酸残基がリン酸化された３７９番目Ａｒｇから４０８番目のＬｅｕまでの配列のＮ末端部位にＧｌｙＣｙｓをつけた合成ペプチド（配列番号４７：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社で合成）を用いた（以下、該ペプチドをｐＳｅｒ３９６／ｐＳｅｒ４０４ペプチドと呼ぶ）。【００７３】
ｐＳｅｒ３９６／ｐＳｅｒ４０４ペプチド：Ｎ−ＧｌｙＣｙｓ−ＡｒｇＧｌｕＡｓｎＡｌａＬｙｓＡｌａＬｙｓＴｈｒＡｓｐＨｉｓＧｌｙＡｌａＧｌｕＩｌｅＶａｌＴｙｒＬｙｓ（ｐＳｅｒ）ＰｒｏＶａｌＶａｌＳｅｒＧｌｙＡｓｐＴｈｒ（ｐＳｅｒ）ＰｒｏＡｒｇＨｉｓＬｅｕ−Ｃ（配列番号４７）【００７４】
ｐＳｅｒ３９６／ｐＳｅｒ４０４ペプチドは合成後、ＨＰＬＣにて精製し、Maleimide activated KLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）(Thermo Scientific社)と共有結合させた得られたコンジュゲートはＢａｌｂ／ｃマウス１匹に対して約０．０４ｍｇを１回分の免疫に用いた。免疫はコンジュゲート溶液０．３ｍＬ（ペプチド換算で０．７７ｍｇ／ｍｌ）と０．３ｍＬのフロイントのコンプリートアジュバントを混合し、１００μＬずつ４匹に腹腔内注射することで行った。うち２匹には、腹腔内免疫（抗原量は同じで、フロイントのインコンプリートアジュバンドを用いた）及び足裏免疫（抗原＋Titer Maxのアジュバントを用いた）を、残りの２匹には腹腔内免疫のみを、各々２週間おきに、さらに２回行った。抗原への血清抗体価の高かった、腹腔内免疫及び足裏免疫を行ったマウスに対して、最後の免疫から１５日後に、抗原溶液（Ｓａｌｉｎｅに溶解）を尾静脈内注射し、３日後に動物を屠殺して脾臓を採取した。１８Ｇ注射針２本を使用し、脾臓を切りほぐした後、ゴム栓面で、切りほぐした脾臓を、緩やかに押しつぶした。押しつぶした脾細胞は、冷ＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬ程度で懸濁し、その上澄みを４０μｍセルストレナーで濾過し、濾液を５０ｍＬ遠心管に採取した。脾臓細胞のＤｅｂｒｉｓをさらにゴム栓面で押しつぶし、冷ＲＰＭＩ１６４０培地で同様に懸濁、濾過し、濾液を採取した。最終的に脾臓細胞懸濁液を４０ｍＬになるように、冷ＲＰＭＩ１６４０培地（又は冷ＰＢＳ）を加えた。血球計算盤にて、懸濁液中のリンパ球濃度を測定し、最終的に２×１０７Ｃｅｌｌｓに相当するリンパ球を５０ｍＬの遠心チューブに移した。ここに、培養液Ｂ（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％胎児牛血清＋２ｍＭグルタミン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン＋１００単位／ｍＬペニシリン）で培養しておいた４×１０７Ｃｅｌｌｓに相当する対数増殖期のマウス・ミエローマ細胞Ｐ３・Ｕ１を加え、１５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。細胞ペレットを、試験管をたたくことによって、よく分散させた。これに０．５ｍＬのＰＥＧ液を加えて、細胞をゆるやかに浮遊させた。１分後に０．５ｍＬのＰＥＧ液を１分かけてゆっくり滴下し、更に１．０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０を１分かけてゆっくり滴下し、更にＲＰＭＩ１６４０を２ｍＬ、２分かけてゆっくり滴下した。その後、４ｍＬのＨＡＴ／ＧＩＴ培養液（ＧＩＴ培地［日本製薬］＋５％胎児牛血清＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン＋１００単位／ｍＬペニシリン＋９５μＭヒポキサンチン＋０．４μＭアミノプテリン＋１６μＭチミジン）を２分かけて滴下し、更に４ｍＬのＨＡＴ／ＧＩＴ培養液を２分かけて滴下した。最後に、ＨＡＴ／ＧＩＴ培養液を加え、４０−５０ｍＬの細胞浮遊液とした。３７℃、３０分間恒温槽でインキュベーションした後、これを培養プレート（９６ｗｅｌｌ）７枚に播いた。なお、培養プレートとして、マウス（ＩＣＲ系）の腹腔マクロファージ（フィーダー細胞）を数日間培養した（＞１×１０５／ｗｅｌｌ）９６ｗｅｌｌプレート（フィーダープレート）を用いた。その後、このプレートを３７℃、５％ＣＯ２下で７〜１０日間培養した。
１週間毎に半量の培養液を新しいＨＴ培養液（ＨＡＴ／ＧＩＴ培養液からアミノプテリンを除去したもの）で交換していき、ハイブリドーマを得た。【００７５】
モノクローナル抗体のスクリーニングは以下のように行った。スクリーニング用抗原として、ｐＳｅｒ３９６／ｐＳｅｒ４０４ペプチド（Ｎ−ＧｌｙＣｙｓ−ＡｒｇＧｌｕＡｓｎＡｌａＬｙｓＡｌａＬｙｓＴｈｒＡｓｐＨｉｓＧｌｙＡｌａＧｌｕＩｌｅＶａｌＴｙｒＬｙｓ（ｐＳｅｒ）ＰｒｏＶａｌＶａｌＳｅｒＧｌｙＡｓｐＴｈｒ（ｐＳｅｒ）ＰｒｏＡｒｇＨｉｓＬｅｕ−Ｃ）（配列番号４７）のＮ端のＣｙｓにＢＳＡをコンジュゲートしたｐＳｅｒ３９６／ｐＳｅｒ４０４ペプチド−ＢＳＡ、及び非リン酸化ペプチド（Ｎ−ＧｌｙＣｙｓ−ＡｒｇＧｌｕＡｓｎＡｌａＬｙｓＡｌａＬｙｓＴｈｒＡｓｐＨｉｓＧｌｙＡｌａＧｌｕＩｌｅＶａｌＴｙｒＬｙｓＳｅｒＰｒｏＶａｌＶａｌＳｅｒＧｌｙＡｓｐＴｈｒＳｅｒＰｒｏＡｒｇＨｉｓＬｅｕ−Ｃ）（配列番号４８）のＮ端のＣｙｓにＢＳＡをコンジュゲートした非リン酸化ペプチド−ＢＳＡを用いた。非リン酸化ペプチド−ＢＳＡあるいはｐＳｅｒ３９６／ｐＳｅｒ４０４ペプチド−ＢＳＡをＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈後、９６ｗｅｌｌプレートに５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去後、ブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ−ＰＢＳ）を２５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、室温で１時間以上放置した。ブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ−ＰＢＳ）を吸引し、ハイブリドーマの上清を３０〜５０μＬ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で６０分間反応させた。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄後、検出用試薬（ブロッキングバッファーに２,０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａを添加した溶液）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、２５℃で６０分間反応させた。洗浄後、基質溶液（２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有０．１Ｍ  Ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ９．８に０．７〜１．２ｍｇ／ｍＬ  ＰＮＰＰ［パラニトロ・フェニルフォスフェート］を添加した溶液）１００μＬ／ｗｅｌｌを加え、２５℃で６０分間発色させた後、測定波長４０５ｎｍで吸光度を測定した。【００７６】
非リン酸化ペプチド−ＢＳＡに反応性が低く、ｐＳｅｒ３９６／ｐＳｅｒ４０４ペプチド−ＢＳＡに反応性が高いＷｅｌｌから細胞を取り出し、１−３細胞／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌプレート（先のフィーダープレート）に播き、限界希釈法によるクローニングを行った。その中から、Ｔａ９抗体（ＩｇＧ３／κ）を産生するクローンを選別した。以後の解析用に、クローンを大量培養後、プロテインＧカラムにて、抗体を精製した。
Ｔａ９抗体のｐＳｅｒ３９６／ｐＳｅｒ４０４ペプチドに対するＫＤ値を実施例３に記載した方法に準じて測定したところ、１．０８×１０−１０であり、ペプチドへの親和性はＴａ１５シリーズ抗体よりも高かった。【００７７】
［実施例５］行動試験  取得抗体の記憶学習障害マウスに及ぼす影響
以下の３種類の抗体の投与が、記憶学習障害マウス（Ｔａｕ−Ｔｇ）に及ぼす影響を調べた。
（１）ｐＳｅｒ４１３認識ウサギポリクローナル抗体：Ｔａｕ−Ｔｇ（ｌｉｎｅ６０９）マウスあるいはｎｏｎ−Ｔｇマウス（正常コントロール）９−１１か月齢を使用、ｎ＝９−１０／群
（２）Ｔａ１５０５（ｐＳｅｒ４１３認識モノクローナル抗体）：Ｔａｕ−Ｔｇ（ｌｉｎｅ７８４）マウスあるいはｎｏｎ−Ｔｇマウス１４か月齢を使用、ｎ＝９−１０／群
（３）Ｔａ９（ｐＳｅｒ３９６認識モノクローナル抗体）、Ｔａｕ−Ｔｇ（ｌｉｎｅ６０９）マウスあるいはｎｏｎ−Ｔｇマウス１４か月齢を使用、ｎ＝９−１０／群【００７８】
実験には９−１４か月齢のオスのヘテロ変異Ｔａｕ−Ｔｇマウス（ｌｉｎｅ  ６０９又はｌｉｎｅ  ７８４）、及びそのｎｏｎ−Ｔｇ  ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅｓを用いた。グループ間で平均体重に差がないようにグループ分けした。ヘテロ変異Ｔａｕ−Ｔｇマウスに対して、ＰＢＳ又はクエン酸緩衝液（ｐＨ５）で希釈された抗体を１週間に１回、計５回、毎回１匹当り１ｍｇを腹腔に投与した。陰性対照群として、抗体を調製する際に用いた緩衝液あるいはタウに反応性を有しないマウスＩｇＧモノクローナル抗体を同用量、腹腔に投与した。陽性対照として、ｎｏｎ−Ｔｇ  ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅｓに対して、抗体を調製する際に用いた緩衝液を同用量、腹腔に投与した。【００７９】
（１）〜（３）の群構成を以下に示す。
（１）<使用マウス>：変異Ｔａｕ−Ｔｇ（ｌｉｎｅ  ６０９），９−１１ｍｏ（９−１１か月齢）
＜群構成＞
評価抗体群：Ａｎｔｉ−ｔａｕ  ｐＳｅｒ４１３ウサギポリクローナル抗体１．６ｍｇ／ｍＬ  ｉｎ  ＰＢＳ（ｎ＝１０）
Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体群：ＰＢＳ（ｎ＝９）
ｎｏｎ−Ｔｇ群：ＰＢＳ（ｎ＝９）
（２）＜使用マウス＞：変異Ｔａｕ−Ｔｇ（ｌｉｎｅ  ７８４），１４ｍｏ（１４か月齢）
＜群構成＞
評価抗体群：Ａｎｔｉ−ｔａｕ  ｐＳｅｒ４１３マウスモノクローナル抗体  Ｔａ１５０５  ｉｎ  ０．１  Ｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）  ３．８４  ｍｇ／ｍｌ（ｎ＝１０）
Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体群：Ａｎｔｉ−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  マウスモノクローナル抗体  ４Ｃ１０Ｆ４  ｉｎ  ０．１  Ｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）  ４．２８  ｍｇ／ｍｌ（ｎ＝９）
ｎｏｎ−Ｔｇ群：０．１Ｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５）（ｎ＝９）
（３）＜使用マウス＞：変異Ｔａｕ−Ｔｇ（ｌｉｎｅ  ６０９），１４ｍｏ（１４か月齢）
＜群構成＞
評価抗体群：Ａｎｔｉ−ｔａｕ  ｐＳｅｒ３９６マウスモノクローナル抗体  Ｔａ９  ｉｎ  ０．０２Ｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６）（ｎ＝１０）２．６６ｍｇ／ｍｌ
Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体群：Ａｎｔｉ−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ６Ｆ１１  ｉｎ  ０．０２Ｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６）（ｎ＝９）４．５０  ｍｇ／ｍｌ
ｎｏｎ−Ｔｇ群：０．０２Ｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６）（ｎ＝９）
最終投与の翌週月曜日からモリス水迷路を用いて空間参照記憶（ｓｐａｔｉａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｍｅｍｏｒｙ）試験を行った（水迷路試験）。水迷路試験終了翌日からオープンフィールド装置を用いてマウスの自発運動量を測定した（Ｏｐｅｎ  Ｆｉｅｌｄ  試験）。【００８０】
＜水迷路試験；（１）〜（３）共通＞
準備：内径１００ｃｍ、高さ４５ｃｍの黒色プール内に１６ｃｍ深の水をはった。水温２１〜２３度に調整し、酸化チタン等による着色は行わず無色透明に保った。塩素の添加も行わず、毎ｔｒｉａｌ  ｄａｙ後に糞の排除と、水の入れ替えを約１０Ｌずつ行った。Ｔｒｉａｌ（獲得）試験：１５ｃｍ高の透明なプラットフォームを壁から２０ｃｍ（中心より３０ｃｍ）の位置に沈めた。プラットフォームを沈めた場所を含め４象限に区切り、マウスはプラットフォームのない３象限のいずれかからのみランダムに投入した。１試行６０秒を限度とし、５試行／日で行った。１試行の間隔は約５分。プラットフォームへ辿り着くまでのｅｓｃａｐｅ  ｔｉｍｅをデータとして記録した。６０秒以内に逃避しないマウスについては、オペレーターの手によってプラットフォームへ誘導し、ｅｓｃａｐｅ  ｔｉｍｅは６０秒として扱った。プラットフォーム上のマウスは１０秒後にプールから取り除き、次の試行まで自由に行動させ、体を乾燥させた。日毎のマウスの成績には、５試行のｅｓｃａｐｅ  ｔｉｍｅの平均秒数を用いた。
Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ｎｏｎＴｇ）の成績が安定した時点で獲得試験を終了し、翌日ｐｒｏｂｅ試験を行った。
Ｐｒｏｂｅ試験：最終日の翌日、プラットフォームをプールから取り除き、６０秒間の自由遊泳をビデオカメラで撮影した。撮影されたビデオを観察し、自由遊泳中のマウスが４象限のうち、プラットフォームの存在した象限（ｔａｒｇｅｔ  ｑｕａｄｒａｎｔ）内を泳いでいる時間を測定し、６０秒間におけるパーセンテージで表した。この時、プール投入後３０秒までの泳ぎについても同様に解析した。
Ｔｒｉａｌ（獲得）試験の有意差検定はｒｅｐｅａｔｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅ，Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ＰＬＳＤ、Ｐｒｏｂｅ  ｔｅｓｔの有意差検定はＦｉｓｈｅｒ’ｓ  ＰＬＳＤにより行った。【００８１】
＜Ｏｐｅｎ  Ｆｉｅｌｄ試験；（１）〜（３）共通＞
装置：５ｍｍ厚の透明アクリル板を用いて３０×３０×３０ｃｍの正方形の箱を作製し、防音環境に格納した。格納環境上部には４０ｗの白熱灯を設置し、床面を照度１１０ｌｕｘで照らした。
行動量：（ｉ）アクリル箱の側面外側、床面より１．５ｃｍの位置に、赤外線ビームを１０ｃｍ間隔で設置した。マウスが２個のビームを連続して遮断した際に、ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎとして検出し、カウントした。
（ｉｉ）向かい合う２側面の、床面より３．５ｃｍの位置に赤外線ビーム面を設けた。マウスがビーム面の一部を遮断した際に、ｒｅａｒｉｎｇとして検出しカウントした。
試験：マウスには２０分間のセッションを１回与えた。マウスをアクリル箱中央部に投入し、速やかにドアを閉じ防音環境にしたうえで、セッションを開始した。
セッションの前半１０分は明条件での自由行動、後半１０分は照明を消して暗条件での自由行動を測定した。
解析：マウスの１分毎の行動量をｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ、ｒｅａｒｉｎｇそれぞれについて折れ線グラフで示す。
セッション開始から１０分後の暗条件への環境変化に反応し、マウスの行動量に変化が現われていることが確認できた場合、視覚は正常であったと定義する。
明条件、暗条件それぞれの総行動量、及び２０分間の総行動量を棒グラフで示した。
Ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ、ｒｅａｒｉｎｇの総行動量について群間の有意差検定を行った。
Ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎは主に自発行動量、ｒｅａｒｉｎｇは主に探査行動量と解釈されるが、実際には両方の指標が互いに影響しあう（例：ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎが低下しているように見えても、その時間には実際にはｒｅａｒｉｎｇが上昇していれば、行動量が低下しているとは言えない）。【００８２】
＜免疫組織化学試験；（２）のみ実施＞
行動試験終了後、各グループから５匹ずつ選び、ホリマリンで還流固定した。パラフィン包埋後、脳から薄切切片をミクロトームで作成し、キシレン、エタノールで各１０分間、４回処理し、脱パラフィン処理した。クエン酸バッファー（ｐＨ６）で３０分間煮沸処理し（抗原賦活化処理）、室温に戻した後、トリス緩衝生理食塩水（ＴＳ）で１０分間、２回洗浄した。２０％牛血清含有ＴＳで室温、６０分間ブロッキング後、マウス抗ヒトシナプトフィジン抗体（ＳＩＧＭＡ社ＳＶＰ−３８を１０％牛血清含有ＴＳで２００倍希釈したもの）をマウントし、４℃で一晩処理した。ＴＳで１０分間、２回洗浄した後、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＶＥＣＴＯＲ社の当該抗体を１０％牛血清含有ＴＳで２０倍希釈したもの）をマウントし、室温で６０分間処理した。ＴＳで１０分間、２回洗浄した後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（ＶＥＣＴＯＲ社）をマウントし、顕微鏡観察した。蛍光強度をＮＩＨ  ｉｍａｇｅＪで定量・数値化し、ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔで表した。【００８３】
＜結果＞
１．各抗体の投与による記憶障害への影響
（１）ｐＳｅｒ４１３ウサギポリクローナル抗体
（１−１）〜（１−３）の結果を図４〜図７に示す。総合すると、抗ｐＳｅｒ４１３ポリクローナル抗体の受動免疫によリ、モデルマウス（Ｔａｕ−Ｔｇ）での記憶障害がｎｏｎ‐Ｔｇと同レベルにまで顕著に改善された。なお、（１−３）では、各群間の自発運動・視覚に有意差は見出されなかった。
（２）ｐＳｅｒ４１３マウスモノクローナル抗体（１５０５抗体）（２−１）〜（２−３）の結果を図８〜図１１に示す。総合すると、抗ｐＳｅｒ４１３モノクローナル抗体の受動免疫によリ、モデルマウスでの記憶障害がｎｏｎ  Ｔｇと同レベルにまで顕著に改善された。なお、（２−３）では、各群間の自発運動・視覚に有意差は見出されなかった。
（２−１）及び（２−２）の結果より、ｐＳｅｒ４１３エピトープはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれについても、受動免疫療法の標的として良好なエピトープと考えられた。
（３）ｐＳｅｒ３９６マウスモノクローナル抗体（Ｔａ９抗体）
（３−１）〜（３−３）の結果を図１２〜図１５に示す。総合すると、Ｔａ９投与により記憶障害が有意に、ｎｏｎ−Ｔｇと同じレベルにまで改善された。なお、（３−３）では、各群間の自発運動・視覚に有意差は見出されなかった。
しかしながら、Ｔａ９はＴａ１５０５に比べると、薬効が弱かった。抗原親和性はＴａ９＞Ｔａ１５０５である（実施例２、３参照）にも関わらず、薬効はＴａ９＜Ｔａ１５０５である（実施例５）ことから、リン酸化エピトープの違いによる薬効の差異が示唆された。【００８４】
［実施例６］Ｔａ１５０５抗体投与による神経機能への影響
神経機能を反映するマーカーとして知られているシナプトフィジン量に及ぼすＴａ１５０５抗体投与の影響を記憶の中枢である海馬ＣＡ３領域の抗シナプトフィジン抗体の免疫染色により調べた。蛍光強度はNIH-Image Jで定量化した。
結果を図１６に示す。Ｔａ１５０５抗体投与により、有意ではないが、海馬シナプトフィジン量の回復がみられた。【００８５】
［実施例７］Ｔａ１５シリーズモノクローナル抗体ｃＤＮＡの塩基配列決定
（１）ハイブリドーマ全ＲＮＡの精製
各種モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを培養し、６ウエルプレートの１ｗｅｌｌあたり１ｍＬのＩＳＯＧＥＮを使用し、細胞を溶解した。この溶解液に０．２ｍＬのクロロホルムを加え、ボルテックスで混和し、室温で２〜３分間放置した。１２０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心し、上層を新しいチュ−ブに移した。これに０．５ｍＬのイソプロピルアルコールを加え、混合し、室温で１０分間放置した。これを１５０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心して全ＲＮＡを沈殿させた。ペレットに７５％エタノールを１ｍＬ加え、よく混和した後、１００００ｒｐｍ、５分間４℃で遠沈した。ペレットを風乾し、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリーの水に溶解し、−８０℃で保存した。【００８６】
（２）５’−ＲＡＣＥ、３’−ＲＡＣＥによるＨ鎖、Ｌ鎖ｃＤＮＡの取得及び該ｃＤＮＡの塩基配列決定
既知のマウスＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂのＨ鎖のＣｏｎｓｔａｎｔ領域のｃＤＮＡ配列をもとに５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）及び３’−ＲＡＣＥ用のプライマーを合成した。同様にマウスＬ鎖のＣｏｎｓｔａｎｔ領域のｃＤＮＡ配列をもとに５’−ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）及び３’−ＲＡＣＥ用のプライマーを合成した。
一方、ハイブリドーマから採取したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを１μｇ使用して、ＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）を用いて、５’−ＲＡＣＥ、３’−ＲＡＣＥ用ｃＤＮＡの合成をおこない、５’−ＲＡＣＥ及び３’−ＲＡＣＥを施行した。ＰＣＲ反応はＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）を用い、添付のプロトコールに従って行った。５’−ＲＡＣＥ、３’−ＲＡＣＥによって得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、メインの増幅ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルより切り出し、ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社
製）に挿入し、大腸菌に形質転換してそれぞれ数クローンを得た。これらの形質転換体よりプラスミドを定法に従って調製し、挿入ＤＮＡフラグメントの塩基配列を決定した。【００８７】
（３）Ｈ鎖、Ｌ鎖全長ｃＤＮＡの取得及び該ｃＤＮＡの塩基配列決定
塩基配列情報を基に、Ｈ鎖及びＬ鎖のＮ末端、及びＣ末端をコードするｃＤＮＡ配列を決定して、全長の配列を増幅するためのＦｏｒｗａｒｄ及びＲｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒを設計した。このＰｒｉｍｅｒを使用し、Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＭａｘＰＣＲ（ＴａＫａＲａ社製）によりＨ鎖、Ｌ鎖の全長を増幅して、そのＰＣＲフラグメントをｐＥＦ４ベクターにクローニングした。これを使用して、全長のｃＤＮＡの配列を最終的に決定した。
得られた塩基配列情報から、アミノ酸配列に翻訳し、さらにＩｇＢＬＡＳＴ（NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）を用いて、ＫＡＢＡＴの方法（Kabat,E.A. and Wu,T.T.、 J. Immunol., 147, 1709-1719、1991年）でＣＤＲ領域の同定をおこなった。
得られたＣＤＲ領域の配列を配列番号１４〜に示した。
これらの配列の相同性から、ｐＳｅｒ４１３を特異的に認識するための抗体のＣＤＲ配列に関する情報を得た（表４〜表６）。【００８８】
【表４】
2013180238.tif 000006
【００８９】
【表５】
2013180238.tif 000007
【００９０】
【表６】
2013180238.tif 000008
【００９１】
［実施例８］行動試験  取得抗体の記憶学習障害マウスに及ぼす影響
以下の２抗体の投与が、記憶学習障害マウスに及ぼす影響を０．１ｍｇ投与において調べた。
（４）Ｔａ１５０５（ｐＳｅｒ４１３認識モノクローナル抗体）：Ｔａｕ  Ｔｇ（ｌｉｎｅ７８４）マウスあるいはｎｏｎ−Ｔｇマウス１０か月齢を使用、ｎ＝９−１０／群
（５）Ｔａ９（ｐＳｅｒ３９６認識モノクローナル抗体）、Ｔａｕ  Ｔｇ（ｌｉｎｅ７８４）マウスあるいはｎｏｎ−Ｔｇマウス１１か月齢を使用、ｎ＝８−１０／群
実験には１０−１１か月齢のオスのヘテロ変異Ｔａｕ−Ｔｇマウス（ｌｉｎｅ  ７８４）、及びそのｎｏｎ−Ｔｇ  ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅｓを用いた。グループ間で平均体重に差がないようにグループ分けした。ヘテロ変異Ｔａｕ−Ｔｇマウスに対して、ＰＢＳで希釈された抗体を１週間に１回、計５回、毎回１匹当り０．１ｍｇを腹腔に投与した。陰性対照群として、抗体を調製する際に用いたＰＢＳあるいはタウに反応性を有しないマウスＩｇＧモノクローナル抗体を同用量、腹腔に投与した。陽性対照として、ｎｏｎ−Ｔｇ  ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅｓに対して、抗体を調製する際に用いたＰＢＳを同用量、腹腔に投与した。【００９２】
（４）〜（５）の群構成を以下に示す。
（４）＜使用マウス＞：変異Ｔａｕ−Ｔｇ（ｌｉｎｅ  ７８４），１０ｍｏ
＜群構成＞
評価抗体群：Ａｎｔｉ−ｔａｕ  ｐＳｅｒ４１３マウスモノクローナル抗体  Ｔａ１５０５  ｉｎ  ＰＢＳ  ０．２５  ｍｇ／ｍｌ（ｎ＝１０）
Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体群：Ａｎｔｉ−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  マウスモノクローナル抗体  ４Ｃ１０Ｆ４  ｉｎ  ＰＢＳ  ０．２５  ｍｇ／ｍｌ（ｎ＝１０）ｎｏｎ−Ｔｇ群：ＰＢＳ（ｎ＝９）
（５）＜使用マウス＞  ：変異Ｔａｕ−Ｔｇ（ｌｉｎｅ  ７８４），１１ｍｏ
＜群構成＞
評価抗体群：Ａｎｔｉ−ｔａｕ  ｐＳｅｒ３９６マウスモノクローナル抗体  Ｔａ９  ｉｎ  ＰＢＳ（ｎ＝１０）０．２５ｍｇ／ｍｌ
Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体群：Ａｎｔｉ−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ６Ｆ１１  ｉｎ  ＰＢＳ（ｎ＝８）  ０．２５  ｍｇ／ｍｌ  ｎｏｎ−Ｔｇ群：ＰＢＳ（ｎ＝８）
最終投与の翌週月曜日からモリス水迷路を用いて空間参照記憶（ｓｐａｔｉａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｍｅｍｏｒｙ）試験を行った（水迷路試験）。水迷路試験は実施例５と同様に行った。【００９３】
＜結果＞
１．各抗体の投与による記憶障害への影響
（４）ｐＳｅｒ４１３マウスモノクローナル抗体（１５０５抗体）
Ｔｒｉａｌ試験（４−１）、Ｐｒｏｂｅ試験（４−２）の結果を図１８及び図１９に示す。総合すると、抗ｐＳｅｒ４１３モノクローナル抗体の受動免疫によリ、モデルマウスでの記憶障害がｎｏｎ  Ｔｇと比較して５０％以上のレベルで改善された。
（４−１）及び（４−２）の結果より、ｐＳｅｒ４１３エピトープモノクローナル抗体の薬効が０．１ｍｇ投与においても確認された。
（５）ｐＳｅｒ３９６マウスモノクローナル抗体（Ｔａ９抗体）
Ｔｒｉａｌ試験（５−１）、Ｐｒｏｂｅ試験（５−２）の結果を図２０及び図２１に示す。総合すると、Ｔａ９投与においては０．１ｍｇ投与において記憶障害は改善されなかった。
これらの試験から、リン酸化エピトープの違いによる薬効の差異が０．１ｍｇ投与においてさらに明確に示唆された。
なお、マウス１匹あたり０．１ｍｇの抗体投与は、約２．５ｍｇ／ｋｇの用量の投与に相当する。【００９４】
［実施例９］Ｔａ１５０５抗体投与による脳内リン酸化Ｔａｕ量の変化
Ｔａｕ−Ｔｇマウスの脳内におけるリン酸化Ｔａｕの量に及ぼすＴａ１５０５抗体投与の影響を記憶の中枢である海馬領域に関して、ｐＳｅｒ４１３認識Ｔａ１５０５抗体およびＡＴ８抗体（ＰＨＦ認識ｐＳｅｒ２０２／ｐＴｈｒ２０５エピトープ）の免疫組織染色により調べた。
行動試験終了後、各グループから５匹ずつ選び、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで還流固定した。脳を取り出してパラフィン包埋し、５μｍ薄切切片をミクロトームで作成した。キシレンおよびエタノールで各１０分間、４回処理し、脱パラフィン処理し、切片をｐＨ２で室温１０分間煮沸処理（抗原賦活化処理）した。室温に戻した後、トリス緩衝生理食塩水（ＴＳ）で１０分間、２回洗浄した。２０％牛血清含有ＴＳで室温、６０分間ブロッキングした。
１０％牛血清含有ＴＳで１ｕｇ／ｍＬに希釈した抗タウ抗体（Ｔａ１５０５、ＡＴ８）をマウントし、４℃で一晩処理した。ＴＳで１０分間、２回洗浄した後、１０％牛血清含有ＴＳで５００倍希釈したビオチン標識抗マウス抗体（ＶＥＣＴＯＲ社）をマウントし、室温で６０分間処理した。
ＴＳで１０分間、２回洗浄した後、ＨＲＰ標識ＡＢＣ液（ＶＥＣＴＯＲ社）をマウントし、室温で３０分間反応させ、再び洗浄後、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）で発色させた。エンテラン（Ｍｅｒｃｋ）で封入し、観察、撮影した。【００９５】
Ｔａ１５０５による免疫組織染色結果を図２２〜図２４に示す。
図２２では、コントロールＩｇＧ投与群５個体の海馬ＣＡ３領域（左から１列目）および海馬ＣＡ２３領域（左から２列目）においてＴａ１５０５陽性Ｔａｕの染色が認められたが、Ｔａ１５０５投与群５個体の海馬ＣＡ３領域（左から３列目）および海馬ＣＡ２３領域（左から４列目）の染色レベルは、コントロールＩｇＧ投与群より明らかに低下していることが認められた。このことからＴａ１５０５投与により、海馬ＣＡ３領域および海馬ＣＡ２３領域においてＴａ１５０５陽性ＴａｕつまりＳｅｒ４１３リン酸化Ｔａｕの減少が確認された。さらに詳細には、ＣｏｎｔｒｏｌＩｇＧ群は、茶色の細かい点が集まりＣＡ３では左から右へ太い線状に染色されている。ＣＡ２３では右上から左横へ太い曲線状に染まっている。Ｔａ１５０５投与群は、非常に薄い茶色の細かい点が集まりＣＡ３では左上から右下へ太い線状に染色されている。ＣＡ２３では右上から左横へ太い曲線状に染まっている。ＣＡ３の４個体とＣＡ２３の３個体では染色がほとんど認められない。
図２３及び２４では、コントロールＩｇＧ投与群５個体のＣｏｒｔｅｘ領域（Ｐｅｒｉｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ（図２３左から１列目）、Ｌａｔｅｒａｌ  Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ（図２３左から２列目）、Ｍｅｄｉａｌ  Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ（図２３左から３列目））においてＡＴ８陽性Ｔａｕの染色が認められた。（図２３において茶色い斑点のように染まっている）
Ｔａ１５０５投与群５個体のＣｏｒｔｅｘ領域（Ｐｅｒｉｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ（図２４左から１列目）、Ｌａｔｅｒａｌ  Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ（図２４左から２列目）、Ｍｅｄｉａｌ  Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ（図２４左から３列目））においての染色レベルは、コントロールＩｇＧ投与群より明らかに低下しており染色は認められないレベルであることが確認された。
このことからＴａ１５０５投与により、Ｃｏｒｔｅｘ領域（Ｐｅｒｉｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ、Ｌａｔｅｒａｌ  Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ、Ｍｅｄｉａｌ  Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ）においてＴａ１５０５陽性ＴａｕつまりＳｅｒ４１３リン酸化Ｔａｕの減少が確認された。
図２３では、茶色の斑点状に染まっているが、図２４では、ほとんど茶色い斑点状の染色が確認できなかった。
脳内（＝海馬ＣＡ３領域、海馬ＣＡ２３領域、ＰＲｈ、Ｅｎｔ（Ｌａｔｅｒａｌ、Ｍｅｄｉａｌ））において、Ｔａ１５０５抗体投与により、Ｓｅｒ４１３リン酸化Ｔａｕ量の減少が確認された。
ＰＲｈ＝Ｐｅｒｉｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ
Ｅｎｔ＝Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ
ＡＴ８による免疫組織染色結果を図２５〜図２７に示す。
図２５では、コントロールＩｇＧ投与群５個体の海馬ＣＡ３領域（左から１列目）および海馬ＣＡ２３領域（左から２列目）においてＡＴ８陽性Ｔａｕの染色が認められたが、Ｔａ１５０５投与群５個体の海馬ＣＡ３領域（左から３列目）および海馬ＣＡ２３領域（左から４列目）の染色レベルは、コントロールＩｇＧ投与群より明らかに低下していることが認められた。このことからＴａ１５０５投与により、海馬ＣＡ３領域および海馬ＣＡ２３領域においてＡＴ８陽性ＴａｕつまりＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５リン酸化Ｔａｕの減少が確認された。具体的には、図２５では、ＣｏｎｔｒｏｌＩｇＧ群は、茶色の細かい点が集まりＣＡ３では左上から右下へ太い線状に染色されている。ＣＡ２３では右上から左横へ太い曲線状に染まっている。Ｔａ１５０５投与群は、非常に薄い茶色の細かい点が集まりＣＡ３では左上から右下へ太い線状に染色されている。ＣＡ２３では右上から左横へ太い曲線状に染まっている。
図２６では、コントロールＩｇＧ投与群５個体のＣｏｒｔｅｘ領域（Ｐｅｒｉｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ（図２６左から１列目）、Ｌａｔｅｒａｌ  Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ（図２６左から２列目）、Ｍｅｄｉａｌ  Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ（図２６左から３列目））においてＡＴ８陽性Ｔａｕの染色が認められた。（図２６において茶色い斑点のように染まっている）
図２７では、Ｔａ１５０５投与群５個体のＣｏｒｔｅｘ領域（Ｐｅｒｉｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ（図２７左から１列目）、Ｌａｔｅｒａｌ  Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ（図２７左から２列目）、Ｍｅｄｉａｌ  Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ（図２７左から３列目））においての染色レベルは、コントロールＩｇＧ投与群より明らかに低下していることが認められた。（図２７において薄く茶色い斑点のように染まっている）
このことからＴａ１５０５投与により、Ｃｏｒｔｅｘ領域（Ｐｅｒｉｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ、Ｌａｔｅｒａｌ  Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ、Ｍｅｄｉａｌ  Ｅｎｔｒｈｉｎａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ）においてＡＴ８陽性ＴａｕつまりＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５リン酸化Ｔａｕの減少が確認された。脳内（＝海馬ＣＡ３領域、海馬ＣＡ２３領域、ＰＲｈ、Ｅｎｔ（Ｌａｔｅｒａｌ、Ｍｅｄｉａｌ））において、Ｔａ１５０５抗体投与により、ＡＴ８認識のＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５リン酸化Ｔａｕ量の減少傾向が確認された。
この結果は、抗体の投与によって脳内での病態の改善を示すものであり、上記の記憶障害の改善効果を裏付けるものである。また、この結果は腹腔内に投与した抗体が脳内で作用することを示している。【００９６】
［実施例１０］Ｔａ１５０５抗体投与による脳内Ｔａｕ量の影響
ＰＨＦを構成する過リン酸化Ｔａｕを認識すると考えられているＡＴ８抗体（ｐＳｅｒ２０２／ｐＴｈｒ２０５認識マウスモノクローナル抗体、ＩＮＮＡＸ社製）、Ｇ２（抗ヒト特異的Ｎ末端領域認識抗体：ウサギポリクローナル抗体）、ＰＨＦ１（ＰＨＦを構成する過リン酸化Ｔａｕを認識すると考えられているｐＳｅｒ３９６／ｐＳｅｒ４０４認識マウスモノクローナル抗体）およびＴａ１５０５を使用して、脳ホモジェネートにおけるＴａｕおよび過リン酸化Ｔａｕ量に及ぼす１５０５抗体投与の影響を抗体投与後のＴａｕ−Ｔｇマウス脳ホモジェネートを使用してウエスタンブロッティングにより調べた。
マウス大脳半球１００−２００ｍｇを５倍量のＴＢＳ（プロテアーゼ阻害剤カクテル、フォスファターゼ阻害剤カクテルを含有）にてソニケーションをおこなった。これを１００，０００ｇで１５分間、４℃にて遠心分離して上清をＴＢＳ可溶性画分として回収した。
さらに沈殿を１％ｓａｒｋｏｓｙｌ／ＴＢＳ（プロテアーゼ阻害剤カクテル、フォスファターゼ阻害剤カクテルを含有）に懸濁して、１時間、室温でインキュベートした。これを１００，０００ｇで１５分間、室温にて遠心分離し、上清をザルコシル可溶性画分とした。
このＴＢＳ可溶性画分、ザルコシル可溶性画分を７％Ｔｒｉｓ―Ａｃｅｔａｔｅ  Ｇｅｌにより電気泳動を行い分離し、ＰＶＤＦ膜に転写を行い、１％ＢＳＡ／３％ＳｋｉｍＭｉｌｋ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳにて室温で終夜、ブロッキングを行った。その後、抗体溶液を反応させ、２次抗体としてＨＲＰコンジュゲート抗体を使用して、ＥＣＬ法にて反応を行い、ＬＡＳ３０００  イメージアナライザーにて解析を行い定量化した。【００９７】
結果を図２８及び図２９に示す。
ＴＢＳ可溶性画分においては、Ｔａ１５０５抗体投与により、Ｔａｕ−Ｔｇマウス脳内のヒトＴａｕ（Ｇ２抗体で認識）および過リン酸化Ｔａｕ（ＡＴ８（ｐＳ２０２／ｐＴ２０５エピトープ）、ＰＨＦ１（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４エピトープ）にて認識）、ｐＳ４１３Ｔａｕ（Ｔａ１５０５認識）が有意に減少していることが確認された。
ザルコシル可溶性画分においては、Ｔａ１５０５抗体投与により、Ｔａｕ−Ｔｇマウス脳内の過リン酸化Ｔａｕ（ＡＴ８にて認識）が有意に減少していることが確認された。
この結果は、抗体の投与によって脳内での病態の改善を示すものであり、上記の記憶障害の改善の効果を裏付けるものである。また、この結果は腹腔内に投与した抗体が脳内で作用することを示している。【００９８】
[製造例１]認知機能障害モデルとしてのヒト正常型タウを発現するＴｇマウス（Ｔａｕ−Ｔｇマウス）
本発明での抗体による認知機能改善の薬理効果の検討は、ヒトの正常型タウ、特に胎生期においては３Ｒ型のタウのみを発現し、成長に伴い３Ｒ型と４Ｒ型の両方のタウが発現するというヒトでの個体発生と同様の発現パターンを示し、生後６ヶ月齢程度で認知機能障害を発症する特徴を有するＴｇマウスを用いた。当該Ｔｇマウスは以下のような方法で作製した。【００９９】
Ｔｇマウス作製のための遺伝子の構造は、αカルモジュリンキナーゼＩＩα（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター（８．５ｋｂ）の下流に、Ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０（ＳＶ４０）の５’イントロン、（０．３ｋｂ）、タウ遺伝子（Ｔａｕ；７．３ｋｂ）、ＳＶ４０の３’イントロン（０．８ｋｂ）、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡシグナル（０．３ｋｂ）の順番でならぶ形に構成した図１７に示す構造を有するタウ遺伝子供与核酸を用いた。その内で用いたタウ遺伝子は、Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｔ．等（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ，Ｖｏｌ．５７９，Ｐ２４１−２４４，２００５年）に記載の方法と同様に取得したものであり、ヒ
トタウをコードするｃＤＮＡからエクソン１から９に相当する部分の塩基配列、イントロン９の最初の１８塩基と最後の３ｋｂの部分の塩基配列、エクソン１０の塩基配列、イントロン１０の最初の３ｋｂと最後の３８塩基の部分（但し、イントロン１０の５’端方向から１６番目の塩基シトシンをチミンに置換している）、エクソン１１から１３に相当するｃＤＮＡの塩基配列を順番に含む７．３ｋｂの長さの遺伝子である。このタウ遺伝子をＳＶ４０の５’イントロン、３’イントロン及びｐｏｌｙ（Ａ）シグナル配列を有するベクターであるｐＮＮ２６５（Ｃｈｏｉ  Ｔ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．１１、ｐｐ３０７０−３０７４、１９９１年）の制限酵素ＥｃｏＲＶサイトにクローニングした。得られたプラスミドから制限酵素ＸｈｏＩとＮｏｔＩでＳＶ４０の５’イントロン、タウ遺伝子、ＳＶ４０の３’イントロンとｐｏｌｙ（Ａ）シグナル配列を含むＤＮＡ断片を切り出し、そのＤＮＡ断片をＣａＭＫＩＩプロモーターを有するｐＭＭ４０３ベクター（Ｍａｙｆｏｒｄ  Ｍ等、Ｃｅｌｌ  ｖｏｌ．８１  ｐｐ８９１−９０４  １９９５年）にクローニングした。そして、得られたプラスミドから制限酵素ＳｆｉＩでタウ遺伝子が含まれる図１７に示した構造の遺伝子断片（１７．２ｋｂ）を切り出してアガロース電気泳動で分離し、対応するゲルの部位からＱＩＡＧＥＮ（Ｒ）  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０４）を用いて精製した。得られた遺伝子（ＤＮＡ）断片は公知の方法［Ｈｏｇａｎ，Ｂ等、“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ．  Ａ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８６）］に従い、Ｃ５７ＢＬ／６系マウスの雌雄を掛け合わせて得られた前核期胚にインジェクションした。インジェクションを行なった偽妊娠させたメスのＣ５７ＢＬマウスの卵管に注入した。生まれた仔マウスについて尾を一部切断し、ＰＣＲ法によって導入した遺伝子が組み込まれているかを確認し、導入した遺伝子が組み込まれた雌又は雄のマウスを正常の雌又は雄とを掛け合わせることで、導入されたタウ遺伝子をヘテロで持つＴｇマウスとして維持し、実験に用いた。なお、実施例中に記載があるｌｉｎｅ  ６０９およびｌｉｎｅ  ７８４と記載されているＴａｕ−Ｔｇマウスは同様の方法で作製され、同等の形質を示すマウスである（または実施例でｌｉｎｅの記載は削除する）。
【図１】
2013180238.tif 000009
【図２】
2013180238.tif 000010
【図３】
2013180238.tif 000011
【図４】
2013180238.tif 000012
【図５】
2013180238.tif 000013
【図６】
2013180238.tif 000014
【図７】
2013180238.tif 000015
【図８】
2013180238.tif 000016
【図９】
2013180238.tif 000017
【図１０】
2013180238.tif 000018
【図１１】
2013180238.tif 000019
【図１２】
2013180238.tif 000020
【図１３】
2013180238.tif 000021
【図１４】
2013180238.tif 000022
【図１５】
2013180238.tif 000023
【図１６】
2013180238.tif 000024
【図１８】
2013180238.tif 000025
【図１９】
2013180238.tif 000026
【図２０】
2013180238.tif 000027
【図２１】
2013180238.tif 000028
【図２８】
2013180238.tif 000029
【図２９】
2013180238.tif 000030
【図１７】
2013180238.tif 000031
【図２２】
2013180238.tif 000032
【図２３】
2013180238.tif 000033
【図２４】
2013180238.tif 000034
【図２５】
2013180238.tif 000035
【図２６】
2013180238.tif 000036
【図２７】
2013180238.tif 000037
【配列表】
2013180238000001.app
【国際調査報告】
2013180238.tif 000038
2013180238.tif 000039
2013180238.tif 000040
2013180238.tif 000041