(57)【要約】  本発明は、鉄濃度測定時のブランク値が低く、高感度な鉄濃度測定が行えるキレート発色剤、及びこれを用いた鉄濃度測定方法並びにキットを提供することを課題とし、下記式［１]で表される化合物又はその塩2014061623.tif 000019（式中、R1、R2はそれぞれ独立して−SO3H及び−CO2Hのいずれかを示す。）、これをキレート発色剤として用い、該化合物を試料中の鉄と接触させ、生じる発色の程度に基づいて試料中の鉄濃度を測定する、鉄濃度測定方法、及びそれに用いられるキットに関する。
2014061623.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式［１]で表される化合物又はその塩
2014061623.tif 000013
（式中、R1、R2はそれぞれ独立して−SO3H及び−CO2Hのいずれかを示す。）。
【請求項２】
下記式[２]又は［３］で表される、請求項１に記載の化合物又はその塩。
2014061623.tif 000014
2014061623.tif 000015
【請求項３】
下記式［１］で表される化合物又はその塩をキレート発色剤として用い、該化合物を試料中の鉄と接触させ、生じる発色の程度に基づいて試料中の鉄濃度を測定する、鉄濃度測定方法
2014061623.tif 000016
（式中、R1、R2はそれぞれ独立して−SO3H及び−CO2Hのいずれかを示す。）。
【請求項４】
式[１]で表される化合物又はその塩が、下記式［２］で表される化合物又はその塩である、請求項３に記載の測定方法。
2014061623.tif 000017
【請求項５】
下記式［１］で表される化合物又はその塩を構成試薬として含んでなる、鉄濃度測定用キット
2014061623.tif 000018
（式中、R1、R2はそれぞれ独立して−SO3H及び−CO2Hのいずれかを示す。）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物、及びこれをキレート発色剤として用いた試料中の鉄濃度測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清及び血漿中の鉄濃度測定は、貧血、鉄欠乏性貧血，肝硬変等の診断に利用されており、臨床検査の分野においては重要な測定項目の１つである。【０００３】
鉄濃度の測定方法としては、例えばジピリジル、ｏ−フェナントロリン等の各種金属キレート発色剤を用いた比色分析法が一般的であり、発色剤としてはバソフェナントロリンスルホン酸ナトリウム、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール（ニトロソＰＳＡＰ）、３−（２−ピリジル）−５,６−ビス［２−（５−フリルスルホン酸）］１,２,４−トリアジン・二ナトリウム塩、トリピリジルトリアジン、フェロジン等の鉄キレート発色剤がよく使われている。【０００４】
これらの鉄キレート発色剤は、全て二価の鉄とキレートを形成して発色する発色剤なので、使用に当たっては三価の鉄を還元するための還元剤の併用を必要とする。三価の鉄の還元剤としては、Ｌ−アスコルビン酸、チオグリコール酸、塩酸ヒドロキシルアミン、ハイドロキノン、ハイドロサルファイト、亜硫酸ナトリウム、硫酸ヒドラジン、メタ重亜硫酸塩（ピロ亜硫酸塩）等が知られている。【０００５】
しかしこれらの還元剤は保存中に分解することから、従来用いられている鉄濃度測定用試薬は、試薬の保存安定性に問題があった。【０００６】
そこで、本発明者らは、二価の鉄と三価の鉄の両方に反応する色素として下記式［A］で表される化合物（9−（2−カルボキシフェニル）−2,3,7−トリヒドロキシ−6−フルオロン、以下、ＣＰＦと略記する。）を開発した（非特許文献１）。【０００７】
2014061623.tif 000003
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Mituru Hoshino et al., Yakugaku Zassi, 2011, vol.131, No.7, p.1095−1101
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＣＰＦを鉄キレート発色剤として用いて鉄濃度を測定した場合には、試薬の保存安定性に問題がある還元剤を使用しなくて済むという利点がある。しかし、一方で、測定のブランク値が高くなるという問題があった。【００１０】
本発明は上記した如き状況に鑑みなされたもので、鉄濃度測定時のブランク値が低く、高感度な鉄濃度測定が行えるキレート発色剤、及びこれを用いた鉄濃度測定方法並びにキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであり、以下の構成よりなる。【００１２】
（１）下記式［１］で表される化合物又はその塩
2014061623.tif 000004
（式中、R1、R2はそれぞれ独立して−SO3H及び−CO2Hのいずれかを示す。）（以下、「式［１］で表される化合物」と記載した場合には、式［１］で表される化合物と、その塩を含む場合がある。）。
（２）式［１］で表される化合物又はその塩をキレート発色剤として用い、該化合物を試料中の鉄と接触させ、生じる発色の程度に基づいて試料中の鉄濃度を測定する、鉄濃度測定方法。
（３）式［１］で表される化合物またはその塩を構成試薬として含んでなる、鉄濃度測定用キット。【００１３】
すなわち本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、上記式［１］で表される新規化合物を合成した。そして、該化合物は鉄とキレートを形成したときの発色に優れており、また水溶性も高いことを見出した。更に、式［１］で表される化合物をキレート発色剤として用いて鉄濃度の測定を行うと、鉄濃度を高感度に測定することができるということを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、式［１］で表される新規化合物を提供する。該化合物をキレート発色剤として用いれば、還元剤を用いなくても試料中の鉄濃度の測定を行うことができる。しかも、試薬ブランク値が従来用いられてきたＣＰＦよりも低くなり、且つ鉄とのキレートの発色が退色せずに安定であることから、鉄濃度の測定を従来よりも高感度に、且つより精度よく実施することができる。さらに該化合物は二価の鉄と三価の鉄のどちらとも反応してキレートを構成する。そのため、該化合物を構成要件とする鉄濃度測定試薬及びキットは、還元剤を含有させる必要がなくなるので、試薬の保存安定性にも優れている、また、該化合物は水溶性が高いので、試薬としての使い勝手もよい、という効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例３で得られた、キレート発色剤として9−（2,4−ジスルホフェニル）−2,3,7−トリヒドロキシ−6−フルオロン（４Ｓ−ＳＰＦ）を用いて行った、吸光度の測定結果である。
【図２】実施例３で得られた、キレート発色剤として9−（4−カルボキシ−2−スルホフェニル）−2,3,7−トリヒドロキシ−6−フルオロン（２Ｓ−４ＣＰＦ）を用いて行った、吸光度の測定結果である。
【図３】比較例１で得られた、キレート剤として従来のＣＰＦを用いて行った、吸光度の測定結果である。
【図４】実施例４で得られた、キレート発色剤として9−（2,4−ジスルホフェニル）−2,3,7−トリヒドロキシ−6−フルオロン（４Ｓ−ＳＰＦ）を用いて行った、吸光度の測定結果である。
【図５】実施例４で得られた、キレート発色剤として9−（4−カルボキシ−2−スルホフェニル）−2,3,7−トリヒドロキシ−6−フルオロン（２Ｓ−４ＣＰＦ）を用いて行った、吸光度の測定結果である。
【図６】比較例２で得られた、キレート剤として従来のＣＰＦを用いて行った、吸光度の測定結果である。
【図７】実施例５で得られた、キレート発色剤として４Ｓ−ＳＰＦを用いて測定を行って得られた、５００〜７００ｎｍにおける吸収曲線である。
【図８】実施例５で得られた、キレート発色剤として２Ｓ−４ＣＰＦを用いて測定を行って得られた、５００〜７００ｎｍにおける吸収曲線である。
【図９】比較例３で得られた、キレート発色剤として従来のＣＰＦを用いて測定を行って得られた、５００〜７００ｎｍにおける吸収曲線である。
【図１０】実施例６で得られた、４Ｓ−ＳＰＦをキレート発色剤として用いて得られた血清鉄濃度測定値と、従来の鉄キレート発色剤であるバソフェナントロリンを用いて得られた血清鉄濃度測定値との相関図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の式［１］で表される化合物において、Ｒ１はキサンテン骨格の結合位置に対してオルト位の位置に、Ｒ２はキサンテン骨格の結合位置に対してパラ位の位置にあるものが好ましい。すなわち、下記式［Ｂ］で表される化合物又はその塩がより好ましい。
【００１７】
2014061623.tif 000005
【００１８】
（式中、R1、R2はそれぞれ独立して−SO3H及び−CO2Hのいずれかを示す。）。
【００１９】
式［１］において、R1とR2の少なくとも一方が−SO3Hであることが好ましい。
【００２０】
本発明の式［１］で表される化合物の塩としては、例えばナトリウム塩，カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩，マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩，トリエチルアミン塩，ジメチルアミン塩等の有機アミン塩等が挙げられる。特にナトリウム塩、カリウム塩が好ましい。
【００２１】
本発明の式［１］で表される化合物としては、例えば下記式［２］で表される9−（2,4−ジスルホフェニル）−2,3,7−トリヒドロキシ−6−フルオロン（式［Ｂ］において、R1＝SO3H, R2＝SO3Hの化合物、以下４Ｓ−ＳＰＦと記載する。）又はその塩、
【００２２】
2014061623.tif 000006
【００２３】
又は下記式［３］で表される9−（4−カルボキシ−2−スルホフェニル）−2,3,7−トリヒドロキシ−6−フルオロン（式［Ｂ］において、R1＝SO3H, R2＝COOHの化合物、以下、２Ｓ−４ＣＰＦと記載する。）又はその塩、
【００２４】
2014061623.tif 000007
等が挙げられる。
【００２５】
本発明の式［１］で表される化合物は、例えば次のような合成ルートに従って合成することができる。
【００２６】
４Ｓ−ＳＰＦは、例えば次のような合成ルート（合成ルートＡ）に従って合成することができる。
【００２７】
［合成ルートＡ］
2014061623.tif 000008
【００２８】
合成ルートＡで用いられるスルホン酸の、Ｍで示される対カチオンの種類は特に限定されないが、ナトリウム塩，カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩，マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩，トリエチルアミン塩，ジメチルアミン塩等の有機アミン塩等が挙げられる。特にナトリウム塩、カリウム塩が好ましい。
【００２９】
合成ルートＡで用いられる1,3,4−ベンゾトリオールのＲとしては、水素原子や、アセチル基，ピバロイル基，ベンゾイル基等のアシル系保護基が挙げられる。特に水素原子又はアセチル基が好ましい。
【００３０】
合成ルートＡで用いられる強酸（Strong acid）としては、硫酸、塩化水素、臭化水素、硝酸、過塩素酸、ヨウ化水素等が挙げられる。特に硫酸、塩化水素が好ましい。
【００３１】
合成ルートＡで用いられる溶媒（Solvent）としては、メタノール，エタノール，イソプロパノール，エチレングリコール，グリセリン等の低級アルコール類、カプリルアルコール，ラウリルアルコール，ミリスチルアルコール，セチルアルコール，ステアリルアルコール等の高級アルコール類（炭素数６以上の不飽和結合を含まないもの）が挙げられる。特にエタノール、イソプロパノールが好ましい。
【００３２】
合成ルートＡで用いられる酸化剤（Oxidizing agent）としては、溶液中で容易に遊離ラジカルを生成し、強力な酸化作用を持つ過硫酸塩類が挙げられる。例えば過硫酸カリウム（KPS）、過硫酸アンモニウム（APS）、過硫酸ナトリウム（NPS）が挙げられ、特に過硫酸カリウム（KPS）が好ましい。
【００３３】
４S−SPFの具体的な合成法としては、例えば2,4−ジスルホン酸ベンズアルデヒドと1,3,4−ベンゾトリオール（2,4−ジスルホン酸ベンズアルデヒドに対して2〜10倍mol）を適当量の上記強酸と溶媒の存在下で４０℃〜１８０℃程度に加熱し、次いで中間体を精製することなく、上記酸化剤の存在下で４０℃〜１８０℃程度に加熱することで合成できる。反応終了後、目的物の溶解度が低い溶媒、例えばエタノール、メタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトニトリル、アセトンなどの溶媒を用いて、未反応の試薬、その他の溶媒、原料試薬、不純物等を除去することができる。このようにして精製を行うことにより、目的とする化合物を得ることができる。
【００３４】
２Ｓ−４ＣＰＦは、例えば次のような合成ルート（合成ルートＢ）に従って合成することができる。
【００３５】
［合成ルートＢ］
2014061623.tif 000009
【００３６】
合成ルートＢで用いられるスルホン化剤（Sulfonation agent）としては親電子置換反応でスルホ基を導入する試薬であるクロロ硫酸、発煙硫酸、硫酸等が挙げられ、特にクロロ硫酸が好ましい。
【００３７】
合成ルートＢにおいて、メチル基からアルデヒド基へ変換する酸化剤（Oxidizing agent）としては酸化マンガン、硫酸化マンガン等が挙げられる。
【００３８】
合成ルートＢで用いられる1,3,4−ベンゾトリオールのＲとしては、水素原子、又はアセチル基，ピバロイル基，ベンゾイル基等のアシル系保護基が挙げられる。特に水素原子、アセチル基が好ましい。
【００３９】
合成ルートＢにおいて用いられる強酸（Strong acid）としては、硫酸、塩化水素、臭化水素、硝酸、過塩素酸、ヨウ化水素等が挙げられ、特に硫酸、塩化水素が好ましい。
【００４０】
合成ルートＢで用いられる溶媒（Solvent）としては、メタノール，エタノール，イソプロパノール，エチレングリコール，グリセリン等の低級アルコール類、カプリルアルコール，ラウリルアルコール，ミリスチルアルコール，セチルアルコール，ステアリルアルコール等の高級アルコール類（炭素数６以上の不飽和結合を含まないもの）が挙げられ、特にエタノールが好ましい。
【００４１】
合成ルートＢにおいて、アルデヒド体を目的物に変換するために用いられる酸化剤としては、溶液中で容易に遊離ラジカルを生成し、強力な酸化作用を持つ過硫酸塩類が挙げられる。例えば過硫酸カリウム（KPS）、過硫酸アンモニウム（APS）、過硫酸ナトリウム（NPS）が挙げられ、特に過硫酸カリウム（KPS）が好ましい。
【００４２】
２S−４CPFの具体的な合成法としては、以下の方法が挙げられる。まず、p−トルイル酸を上記スルホン化剤（p−トルイル酸に対して2〜10倍mol量）の存在下で０℃〜９５℃程度に加熱し、得られた化合物を順相カラム，又は逆相カラムにて精製する。次いで得られた化合物を、上記酸化剤（得られた化合物に対して5〜20倍mol：量）と過剰量の強酸の存在下で、０℃〜１２０℃程度に加熱することでアルデヒド体を製造する。更にアルデヒド体を精製することなく1,3,4−ベンゾトリオール（4−メチル−3−スルホ安息香酸に対して2〜10倍mol）を加え、適当量の上記強酸と溶媒の存在下で０℃〜９０℃程度に加熱し、反応させる。次いで、得られた反応産物を上記酸化剤（4−メチル−3−スルホ安息香酸に対して1〜10倍mol）の存在下で０℃〜９０℃程度に加熱し、反応させれば、目的の2S−4CPFが得られる。得られた2S−CPFを精製するには、更に2S−CPFの溶解度が低い溶媒、例えばエタノール、メタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトニトリル、アセトンなどの溶媒を用いて未反応の試薬、その他の溶媒、原料試薬、不純物等を除去すればよい。
【００４３】
本発明の鉄濃度測定方法は、「式［１］で表される化合物又はその塩をキレート発色剤として用い、該化合物を試料中の鉄と接触させ、生じる発色の程度に基づいて試料中の鉄濃度を測定する、鉄濃度測方法。」である。
【００４４】
本発明の鉄濃度測定方法に於いて用いられる［１］で表される化合物の具体例は上記した通りである。鉄濃度測定方法に用いられるキレート発色剤としては、４Ｓ−ＳＰＦ又は２Ｓ−４ＣＰＦが好ましい。
【００４５】
本発明に係るキレート発色剤の使用量は、そのキレート発色剤の特性に合わせて決定すれば良く、特に制限はないが、例えばキレート発色剤を含んでなる試液中の濃度としては０.５〜５ｍＭ、好ましくは０．５〜２ｍＭであり、鉄濃度測定時の最終の反応液中の濃度として、０.１〜１ｍＭ、好ましくは０.２〜０.５ｍＭである。
【００４６】
本発明の鉄濃度測定方法を実施するには、本発明のキレート発色剤を用いる以外は、自体公知の直接法や、国際標準法、国際標準法の松原変法による鉄濃度測定方法を実施すればよい。また測定条件（例えば反応時間、測定波長等）や、測定操作法も自体公知の方法に準じて実施すればよい。
【００４７】
本発明の鉄濃度測定方法において、本発明のキレート発色剤を試料中の鉄と接触させる方法としては、最終的に、試料、本発明のキレート発色剤を含有する溶液が得られる方法であればよい。
【００４８】
その具体的な方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
（１）緩衝剤を含んでなる溶液（第１試液）、本発明のキレート発色剤を含有する溶液（第２試液）を調製しておき、試料に第１試液、第２試液の順に加える方法、
（２）本発明のキレート発色剤を含んでなる溶液を調製し、試料に該溶液を加える方法。
【００４９】
自動分析装置を用いて測定を行う場合を考慮すると、（１）の方法（二試液法）が一般的であり、好ましい。
【００５０】
本発明のキレート発色剤を溶解する溶液としては、鉄濃度の測定をキレート発色剤の至適ｐＨ範囲内で行うことが望ましいため、緩衝液が好ましい。
【００５１】
本発明の鉄濃度測定方法における鉄濃度測定時の最終の反応液の好ましいｐＨは、ｐＨ６〜１０、更に好ましくはｐＨ６〜９である。ｐＨを上記した如き範囲とするために用いられる緩衝液を構成する緩衝剤としては、通常この分野で用いられるものは全て使用可能である。具体的には、例えばトリシン，ビシンなどのグッド緩衝剤、グリシン、酢酸、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
【００５２】
更に、本発明のキレート発色剤を含有する溶液には、これらの試薬の他に、防腐剤、安定化剤、反応促進剤、イオン濃度調整剤等の、通常この分野で用いられているものを共存させてもかまわない。
【００５３】
これら試薬類は、本発明のキレート発色剤の至適ｐＨ範囲内で安定性が高く、また本発明のキレート発色剤の発色を阻害しないものを選択することが望ましい。また、これら試薬類の濃度範囲等も、自体公知の該測定方法において通常用いられる濃度範囲等を適宜選択して用いることで足りる。
【００５４】
また、本発明の測定方法に用いられるキレート発色剤を含有する溶液、上記二試液法における第１試液、第２試液中には、界面活性剤が含まれていてもよい。
【００５５】
そのような界面活性剤としては、この分野において通常用いられる界面活性剤であって、本発明のキレート発色剤の発色を阻害するものでなければ特に限定されないが、具体的には、例えばポリビニルピロリドン類、ポリオキシエチレンセチルエーテル，ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル類、例えばポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート，ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート，ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート，ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート，ポリオキシエチレンソルビタントリオレート等のポリオキシエチレンアルキルエステル類、例えばオクタノイル−N−メチルグルカミド，ノナノイル−N−メチルグルカミド，デカノイル−N−メチルグルカミド等のメチルグルカミド誘導体、例えばn−オクチル−β−D−グルコシド等のアルキル糖誘導体等の非イオン界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、ラウリルベンゼンスルホン酸、デオキシコール酸、コール酸、 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンドデシルサルフェイト（Tris DS）等の アニオン界面活性剤、例えばオクタデシルアミン酢酸塩，テトラデシルアミン酢酸塩，ステアリルアミン酢酸塩，ラウリルアミン酢酸塩，ラウリルジエタノールアミン酢酸塩等のアルキルアミン塩、例えば塩化オクタデシルトリメチルアンモニウム，塩化ドデシルトリメチルアンモニウム，塩化セチルトリメチルアンモニウム，臭化セチルトリメチルアンモニウム，塩化ラウリルトリメチルアンモニウム，メチル硫酸アリルトリメチルアンモニウム，塩化ベンザルコニウム，塩化テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム，塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム，塩化ラウリルジメチルベンジルアンモニウム等の第４級アンモニウム塩、例えば塩化ラウリルピリジニウム，塩化ステアリルアミドメチルピリジニウム等のアルキルピリジニウム塩等のカチオン界面活性剤、ラウロイルメチル−β−アラニンナトリウム、3−［（3−コラミドアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−1−プロパンスルホネイト、3−［（3−コラミド アミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホネイト等の両性界面活性剤、等が挙げられる。また、これらは単独で用いても、二種以上を適宜組み合わせて用いてもよい。
【００５６】
上記界面活性剤の使用濃度は、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよい。上記界面活性剤の、本発明のキレート発色剤を含んでなる溶液、二試液法における第１試液及び／又は第２試液中の濃度としては、通常０.０００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）程度、好ましくは０.００１〜５％（Ｗ／Ｖ）程度であり、最終の反応液中の濃度として、通常０.００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）程度、好ましくは０.０１〜５％（Ｗ／Ｖ）程度である。
【００５７】
試料に本発明のキレート発色剤を作用させた後は、自体公知の直接法等の鉄濃度測定法に従い、キレート発色剤の発色による吸光度変化を測定すればよく、測定時に使用する自動分析装置、分光光度計等は、通常この分野で使用されているものは何れも例外なく使用し得る。また、吸光度変化は、主波長と副波長を使用する２波長測光により求めてもよいことは言うまでもない。
【００５８】
吸光度測定のための測定波長は、２波長で測定する場合には、使用する本発明のキレート発色剤の極大吸収波長近辺で、測定に使用する機器の設定波長にあわせて、適宜選択すればよい。汎用の血清鉄濃度測定用自動分析装置を使用する場合には、通常主波長６００ｎｍ付近、副波長７００ｎｍ付近で測定すればよい。
【００５９】
本発明の方法に用いられる試料としては、例えば尿、血清、血漿等の生体成分が挙げられる。
【００６０】
従来の鉄濃度測定方法では、二価の鉄とキレートを形成して発色する発色剤を用いるため、試料中のトランスフェリンに結合している三価の鉄をトランスフェリンから遊離させて、二価の鉄に還元する必要がある。そのために還元剤を用いていた。
【００６１】
しかし、本発明の鉄濃度測定方法に於いては、測定に用いられる本発明の式［１］で表される化合物は二価の鉄と三価の鉄の両方に反応するため、還元剤を用いる必要がない。
【００６２】
尚、本発明のキレート発色剤を用いれば、還元剤の非存在下に試料中の鉄濃度を測定することができるが、仮に還元剤の存在下に測定を行っても、測定に影響を及ぼすものではない。
【００６３】
本発明の鉄濃度測定方法を、前記（１）の方法（緩衝剤を含んでなる溶液（第１試液）と、本発明のキレート発色剤を含んでなる溶液（第２試液）を調製し、試料に第１試液、第２試液の順に加える方法。）を例にとって具体的に示すと、例えば以下の如くなる。
【００６４】
先ず、例えば鉄濃度を測定すべき試料と、緩衝剤を含んでなる第１試液（ｐＨ３〜９、試料が血清等の生体由来試料の場合はｐＨ３〜７）とを混合し、通常１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、通常２〜１０分間、好ましくは５分間程度反応させる。次いで、該反応液と、本発明のキレート発色剤を含んでなる第２試液（ｐＨ７〜１０）とを混合し、通常１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、通常２〜１０分間、好ましくは５分間程度反応させる。次いで、本発明のキレート発色剤と試料中の鉄との反応により生じる発色を吸光度として測定する。得られた測定値を、例えば予め濃度既知の鉄標準液を試料として用いて同様に測定を行い、作成された鉄濃度と吸光度との関係を示す検量線に当てはめることにより、試料中の鉄濃度が求められる。
【００６５】
上記鉄濃度の測定は、用手法によって行っても良いことはもちろんであるが、自動分析装置を用いて行っても良いことは云うまでもない。尚、用手法又は自動分析装置を用いて測定を行う場合の試薬類の組み合わせについては、特に限定はされず、適用する自動分析装置の環境、その他の要因等に合わせて適宜行えば良い。
【００６６】
本発明の鉄濃度測定用キットは、本発明のキレート発色剤を含む試薬を構成試薬として含んでなるものであればよい。夫々の構成要素の好ましい態様、具体例及び使用濃度等については先に述べた通りである。
【００６７】
本発明のキットの具体的な実施態様としては、１試液（試薬）系測定法用として調製されたものでも二試液（試薬）系測定法用として調製されたものでもよく、特に限定されない。例えば以下の如き構成が挙げられる
（１’）緩衝剤を含んでなる第１試液と、本発明のキレート発色剤を含んでなる第２試液とからなるもの、又は
（２’）本発明のキレート発色剤を含んでなる溶液を構成試薬とするもの。
【００６８】
また、上記した本発明のキットの具体的な実施態様において、１試薬系測定法用キット又は２試液系測定法用キットを構成するキレート発色剤を含んでなる試液中の濃度は０.５〜５ｍＭ、好ましくは０．５〜２ｍＭである。
【００６９】
該キットを構成する本発明のキレート発色剤のｐＨはｐＨ３〜１０、好ましくはｐＨ６〜１０である。該キットが、上記緩衝剤を含んでなる第１試液と、本発明のキレート発色剤を含んでなる第２試液とからなるものである場合、緩衝剤を含んでなる第1試液のｐＨはｐＨ３〜９、本発明のキレート発色剤を含んでなる第２試液のｐＨはｐＨ７〜１０が好ましい。また、血清等の生体由来試料を試料とし、二試液系測定で測定を行う場合のキットの場合、上記した通り、第１試液のｐＨはｐＨ３〜７、好ましくはｐＨ３〜６である。
【００７０】
また、当該キットの各試薬中には、この分野で通常用いられる、例えば界面活性剤、緩衝剤、防腐剤、安定化剤、反応促進剤等を、通常この分野で使用される範囲含有していてもよい。これらの具体例は、本発明の鉄濃度測定方法に関する説明で記載した通りである。さらにヘモグロビンから鉄を遊離させるための蛋白質変性剤や、溶血試料を測定する場合に測定値へ及ぼす影響を回避するためにイミダゾール等を含有していてもよい。
【００７１】
例えば二試液系測定用として調製されたキットの場合、第１試液には、緩衝剤やpH調整剤の他、上記した界面活性剤、有機酸等の反応促進剤、イオン濃度調整剤等を含んでいてもよい。また、血清等の生体由来試料中の鉄濃度を測定するためのキットの場合、第1試液には、ヘモグロビンから鉄を遊離させるための蛋白質変性剤や、を含有していてもよい。また、第２試液には、緩衝剤やpH調整剤、本発明のキレート発色剤の安定化剤を含有していてもよい。更に、第１試液又は第２試液には、溶血試料を測定する場合に測定値へ及ぼす影響を回避するためにイミダゾール等を含有していてもよい。
【００７２】
また、当該キットには還元剤を構成要件として含む必要はないが、還元剤は本発明の鉄濃度測定方法に影響を及ぼさないので、当該キットが還元剤を含んでいても問題はない。
【００７３】
尚、当該キットが上記（１）のように複数の試液で構成される場合、これら試薬類は、各試液を混合した時点で目的の成分測定の反応が開始されるように各試液の何れかに適宜分散させて含有させればよい。これら試液を構成する試薬類の使用濃度は、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよい。
【００７４】
更に、当該キットには、必要に応じて鉄標準品が組み合わされていてもよい。
【００７５】
以下に、実施例及び参考例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００７６】
実施例１．9−（2,4−ジスルホフェニル）−2,3,7−トリヒドロキシ−6−フルオロン（式［Ｂ］において、R1＝SO3H, R2＝SO3Hの化合物、以下４Ｓ−ＳＰＦと記載する。）の合成
2014061623.tif 000010
【００７７】
ベンズアルデヒド−2,4−ジスルホン酸二ナトリウム（１）（5.0g, 0.016mol, 和光純薬工業（株）製）と1,3,4−トリアセトキシベンゼン（8.2g, 0.032mol, 和光純薬工業（株）製）を、濃硫酸（10ml）, 50％エタノール（200ml）を溶媒として用い、80℃でFriedel−Crafts アシル化反応を行った。HPLCで原料の消失を確認した後、更に過硫酸カリウム（4.4g）を加えて、酸化的閉環反応を80℃で行った。反応終了後、反応液を終夜放置した。析出した結晶を、冷却した50％エタノールで洗浄して、目的の４Ｓ−ＳＰＦ（２）を得た（収量：5.98g, 収率：77%）。【００７８】
1H−NMR（DMSO−d6）δ（ppm）： 6.69（2H, s）, 7.15（1H, d）, 7.26（2H, s）, 7.76（1H, d）, 8.27（1H, s）。
MALDI TOF Mass（posi：481）。【００７９】
実施例２．2S−4CPF；9−（4−カルボキシ−2−スルホフェニル）−2,3,7−トリヒドロキシ−6−フルオロン（式［Ｂ］において、R1＝SO3H, R2＝CO2Hの化合物、以下、２Ｓ−４ＣＰＦと記載する。）の合成
2014061623.tif 000011
【００８０】
p−トルイル酸（３）（1.0g, 7.3mmol, 和光純薬製）を、クロロ硫酸（2.56g, 21.6mmol）の存在下、90℃で4時間加熱し、反応させた。反応終了後、得られた反応液を氷中に投入し、水酸化ナトリウム水溶液で中和した後、反応液を減圧留去した。次いて、得られた残渣を逆相カラム（溶出液；H2O→20%MeOHaq.）で精製して、化合物（４）を得た（収量：1.60g, 収率：quant.）。【００８１】
1H−NMR（DMSO−d6） δ（ppm）： 2.55（3H, s）, 7.23（1H, d）, 7.74（1H, d）, 8.29（1H, s）。 
MALDI TOF Mass （nega：215）。【００８２】
次いで、酸化剤として酸化マンガン・硫酸化マンガン（82mg, 1.15mmol）を用い、化合物（４）（50mg, 0.23mmol）を、60%硫酸中、110℃で4時間反応させた。反応終了後、得られた反応液をセライト濾過して、化合物（５）を含む濾液を得た。得られた濾液に1,3,4−トリアセトキシベンゼン（116mg, 0.46mmol）を加え、濃硫酸／50％エタノール存在下、80℃でFriedel−Crafts アシル化を行った。HPLCで原料の消失を確認した後、更に過硫酸カリウム（62mg, 0.23mmol）を加えて、酸化的閉環反応を80℃で行った。反応終了後、反応液を終夜放置した。析出した結晶を冷却した50％エタノールで洗浄して、目的の２Ｓ−４ＣＰＦ（６）を得た（収量：16mg, 収率：16%）。【００８３】
1H−NMR（DMSO−d6）δ（ppm）： 6.60（2H, s）, 7.11（1H, d）, 7.15（2H, s）, 7.73（1H, d）, 8.26（1H, s）。
MALDI TOF Mass （posi：444）。【００８４】
実施例３
［試液の調製］
（Ｒ−１）第１試液
０.５Ｗ／Ｖ％ポリビニルピロリドン（Ｋ−９０）（和光純薬工業（株）製）を含有する１００ｍＭ  トリシン緩衝液（ｐＨ８.０）を第１試液とした。
（Ｒ−２）第２試液
実施例１で合成した４Ｓ−ＳＰＦ又は実施例２で合成した２Ｓ−４ＣＰＦ １ｍＭを含有する１００ｍＭ  トリシン緩衝液（ｐＨ８.０）を第２試液とした。【００８５】
［試料］
硫酸第一鉄アンモニウム水溶液（鉄を200μg／dL含有） を調製して試料とした。【００８６】
［吸光度の測定］
上記試料について、上記した試液を用い、日本電子ＢＭ６０５０自動分析装置（日本電子（株）製）を用いて、以下の測定条件で吸光度の測定を行った。また、試薬ブランク測定の場合は、試料の代わりに生理食塩水を用いて、同様に測定を行った。【００８７】
〔測定条件〕
分析法／反応時間：［ＥＰＡ］［１０］
測定ポイント  ：［４４］、［４７］−［９５］、［９８］
波長（副／主）：［６９４］［５９６］
試料量    ：  ８μＬ（測定時２倍希釈）
Ｒ−１    ：  ６０μＬ
Ｒ−２    ：  ２０μＬ
測定温度  ：３７℃                      
なお、測定時の４Ｓ−ＳＰＦ又は２Ｓ−４ＣＰＦの濃度は０．２３mMである。
［結果］
４Ｓ−ＳＰＦを用いた測定結果を図１に、２Ｓ−４ＣＰＦを用いた測定結果を図２にそれぞれ鉄水溶液（―●―）、生理食塩水（―○―）で示す。【００８８】
比較例１
［試液の調製］
（Ｒ−１）第１試液
０.５Ｗ／Ｖ％ポリビニルピロリドン（Ｋ−９０）を含有する１００ｍＭ  トリシン緩衝液（ｐＨ８.０）を第１試液とした。
（Ｒ−２）第２試液
ＣＰＦ １ｍＭを含有する１００ｍＭ  トリシン緩衝液（ｐＨ８.０）を第２試液とした。ＣＰＦは、Mituru Hoshino et al., Yakugaku Zassi, 2011, vol.131, No.7, p.1095−1101（非特許文献１）に記載の方法に準じて合成して、用いた。【００８９】
［試料］
硫酸第一鉄アンモニウム水溶液（鉄を200μg／dL含有） を調製して試料とした。【００９０】
［吸光度の測定］
上記試料について、上記した試液を用い、日本電子ＢＭ６０５０自動分析装置（日本電子（株）製）を用いて、実施例３と同様の測定条件で測定を行った。また、試薬ブランク測定の場合は、試料の代わりに生理食塩水を用いて、同様に測定を行った。【００９１】
尚、測定時のＣＰＦの濃度は０．２３mMである。【００９２】
［結果］
結果を図３に鉄水溶液（―●―）、生理食塩水（―○―）で示す。【００９３】
図１〜３の結果から明らかなごとく、ＣＰＦをキレート発色剤として用いた場合には、ブランク値が高かった（図３）が、本発明の化合物である４Ｓ−ＳＰＦ（図１）及び２Ｓ−４ＣＰＦ（図２）をキレート発色剤として用いた場合には、それぞれブランク値を低く抑えることができた。【００９４】
また、ＣＰＦをキレート発色剤として用いた場合には、発色後に退色することが確認されたが（図３）、４Ｓ−ＳＰＦ（図１）及び２Ｓ−４ＣＰＦ（図２）をキレート発色剤として用いた場合には、発色後の退色も確認されず、発色が安定であることがわかる。【００９５】
以上のことから、本発明の化合物をキレート発色剤として用いると、ブランク値が抑えられ、より高感度な鉄濃度の測定を行えることが判る。【００９６】
実施例４
［試液の調製］
（Ｒ−１）第１試液
０.５Ｗ／Ｖ％ポリビニルピロリドン（Ｋ−９０）（和光純薬工業（株）製）を含有する１０ｍＭ  グリシン緩衝液（ｐＨ３．２）を第１試液とした。
（Ｒ−２）第２試液
実施例１で合成した４Ｓ−ＳＰＦ又は実施例２で合成した２Ｓ−４ＣＰＦ １ｍＭを含有する１００ｍＭ  トリシン緩衝液（ｐＨ９.０）を第２試液とした。【００９７】
［試料］
実施例３と同じものを試料とした。【００９８】
［吸光度の測定］
上記試料について、上記した試液を用い、日本電子ＢＭ６０５０自動分析装置（日本電子（株）製）を用いて、実施例３と同じ測定条件で吸光度の測定を行った。【００９９】
なお、測定時の４Ｓ−ＳＰＦ又は２Ｓ−４ＣＰＦの濃度は０．２３mMである。
［結果］
４Ｓ−ＳＰＦを用いた測定結果を図４に、２Ｓ−４ＣＰＦを用いた測定結果を図５にそれぞれ鉄水溶液（―●―）、生理食塩水（―○―）で示す。【０１００】
比較例２
［試液の調製］
（Ｒ−１）第１試液
０.５Ｗ／Ｖ％ポリビニルピロリドン（Ｋ−９０）を含有する１０ｍＭ  グリシン緩衝液（ｐＨ３．２）を第１試液とした。
（Ｒ−２）第２試液
ＣＰＦ １ｍＭを含有する１００ｍＭ  トリシン緩衝液（ｐＨ９.０）を第２試液とした。ＣＰＦは、Mituru Hoshino et al., Yakugaku Zassi, 2011, vol.131, No.7, p.1095−1101（非特許文献１）に記載の方法に準じて合成して、用いた。【０１０１】
［試料］
実施例４と同じものを試料とした。【０１０２】
［吸光度の測定］
上記試料について、上記した試液を用い、日本電子ＢＭ６０５０自動分析装置（日本電子（株）製）を用いて、実施例４と同様の測定条件で測定を行った。
尚、測定時のＣＰＦの濃度は０．２３mMである。【０１０３】
［結果］
結果を図６に鉄水溶液（―●―）、生理食塩水（―○―）で示す。【０１０４】
図４〜６の結果から明らかなごとく、ＣＰＦをキレート発色剤として用いた場合には、ブランク値が高かった（図６）が、本発明の化合物である４Ｓ−ＳＰＦ（図４）及び２Ｓ−４ＣＰＦ（図５）をキレート発色剤として用いた場合には、それぞれブランク値を低く抑えることができた。【０１０５】
また、ＣＰＦをキレート発色剤として用いた場合（図６）には、発色後に退色することが確認されたが、４Ｓ−ＳＰＦ（図４）及び２Ｓ−４ＣＰＦ（図５）をキレート発色剤として用いた場合には、発色後の退色も確認されず、発色が安定であることがわかる。【０１０６】
以上のことから、本発明の化合物をキレート発色剤として用いて、ブランク値を抑え、より高感度な鉄濃度の測定を行えることが判る。【０１０７】
また、実施例４及び比較例２では、ｐＨ３.２の第１試液を用いて測定を行った。血清鉄濃度を測定する際には、ｐＨ３〜７に調整した第１試液を使用するが、図３と図６を比較すると明らかな通り、従来の鉄キレート発色剤であるＣＰＦを用い、血清鉄濃度を測定する条件下で鉄濃度を測定した場合には、発色後の退色が顕著であった。これに対し、図１と図４，図２と図５を比較すると明らかな通り、本発明の化合物である４Ｓ−ＳＰＦ及び２Ｓ−４ＣＰＦをキレート発色剤として用いた場合には、血清鉄濃度測定条件下で測定を行っても、発色後の退色が認められなかった。このことから、本発明の化合物は、特に血清鉄濃度測定に使用するキレート発色剤として優れており、本発明の化合物をキレート発色剤として用いれば、より高感度な血清鉄濃度の測定を行えることがわかる。【０１０８】
実施例５
［試液の調製］
（Ｒ−１）第１試液：実施例３と同じものを用いた。
（Ｒ−２）第２試液：実施例３と同じものを用いた（4S−SPFまたは2S−4CPF含有）。【０１０９】
［試料］
実施例３と同じものを用いた。【０１１０】
［吸光度の測定］
上記試料について、上記した試液を用い、日立Ｕ−３９００Ｈ分光光度計（日立ハイテクノロジーズ（株）製）を用い、以下の測定条件で測定を行った。また、試薬ブランク測定には、生理食塩水を用いた。
〈測定条件〉
反応時間：５分−５分
測定波長：５００〜７００ｎｍ
試料量    ；  １６０μＬ
Ｒ−１    ；２４００μＬ
Ｒ−２    ；  ８００μＬ
測定温度  ；３７℃                      
2014061623.tif 000012
【０１１１】
なお、測定時の４Ｓ−ＳＰＦ又は２Ｓ−４ＣＰＦの濃度は０．２４mMである。【０１１２】
［結果］
４Ｓ−ＳＰＦを用いた測定で得られた吸収曲線を図７に、２Ｓ−４ＣＰＦを用いた測定で得られた吸収曲線を図８に示す。また、図７及び図８において、鉄水溶液を試料として用いた場合の結果を実線（―）で、生理食塩水を試料として用いた場合の結果を点線（−−−−）で、それぞれ示す。【０１１３】
比較例３
［試液の調製］
（Ｒ−１）第１試液：比較例１と同じものを用いた。
（Ｒ−２）第２試液：比較例１と同じものを用いた（CPF含有）。【０１１４】
［試料］
比較例１と同じものを用いた。【０１１５】
［吸光度の測定］
上記試料について、上記した試液を用い、日立Ｕ−３９００Ｈ分光光度計を用いて、実施例５と同様の測定条件で測定を行った。
尚、測定時のＣＰＦの濃度は０．２４mMである。【０１１６】
［結果］
得られた吸収曲線を、図９に示す。図９において、鉄水溶液を使用として用いた場合の結果を実線（―）で、生理食塩水を試料として用いた場合の結果を点線（−−−−）で、それぞれ示す。【０１１７】
図７〜９の結果から明らかなごとく、ＣＰＦをキレート発色剤として用いた場合には、鉄−キレート錯体の吸収波長である５９０〜６００nmでブランクの吸光度が高かった（図９）が、本発明の化合物である４Ｓ−ＳＰＦ（図７）及び２Ｓ−４ＣＰＦ（図８）をキレート発色剤として用いた場合には、５９０〜６００ｎｍでもブランクの吸光度が低く抑えられた。【０１１８】
以上の結果から、本発明の化合物をキレート発色剤として用いれば、ブランク値を抑え、高感度な鉄濃度の測定が行えることがわかる。【０１１９】
実施例６
［試液の調製］
（Ｒ−１）第１試液
０.５Ｗ／Ｖ％ポリビニルピロリドン（Ｋ−９０）を含有する１０ｍＭ  グリシン緩衝液（ｐＨ３.２）を第１試液とした。
（Ｒ−２）第２試液
実施例１で合成した４Ｓ−ＳＰＦ １ｍＭを含有する１００ｍＭ  トリシン緩衝液（ｐＨ９.０）を第２試液とした。【０１２０】
［試料］
ヒト血清を用いた。【０１２１】
［吸光度の測定］
上記試料について、上記した試液を用い、日立７１７０Ｓ形自動分析装置（日立ハイテク（株）製）を用いて、以下の測定条件で吸光度の測定を行い、１６ポイント（反応開始から５分後）から最終３４ポイント（反応開始から１０分後）の５分間の吸光度の差（ΔOD）を求めた。【０１２２】
得られたΔODを、予め血清試料の代わりに鉄濃度既知の試料としてマルチキャリブレーターＡ（和光純薬工業（株）製、鉄：200μg／dL含有）を用い、同様に測定を行って得られた鉄濃度と吸光度の関係を示す検量線に当てはめることにより、各試料中の鉄濃度を決定した。
なお、試薬ブランク測定には、生理食塩水を用いた。【０１２３】
〈測定条件〉
分析法／反応時間：［２ポイントエンド］［１０］
測定ポイント  ：［１６］−［３４］
波長（副／主）：［７００］［６００］
試料量    ：  １０μＬ
Ｒ−１    ：１５０μＬ
Ｒ−２    ：  ５０μＬ
測定温度  ：３７℃                      
第１試液と第２試液混合時の溶液のｐＨは８.０である。また測定時の４Ｓ−ＳＰＦ又は２Ｓ−４ＣＰＦの濃度は０．２３mMである。【０１２４】
また、従来の鉄キレート発色剤であるバソフェナントロリンを用いた直接法による鉄濃度測定キットであるＬタイプワコー Fe・Ｎ（和光純薬工業（株）製）を用い、キットの現品説明書に記載の標準操作法に従い、上記と同じ試料の鉄濃度を測定した。【０１２５】
［結果］
本発明の化合物（４Ｓ−ＳＰＦ）を用いた試薬を使用することで得られた血清鉄濃度測定値と、従来のバソフェナントロリンを用いた試薬（ＬタイプワコーＦｅ・Ｎ）を使用することで得られた血清鉄濃度測定値との相関図を図１０に示す。【０１２６】
図１０の結果の回帰分析を行って得られた回帰直線式と相関係数は下記の通りである。
ｙ＝０．９８８ｘ＋０．３
Ｒ＝０．９９９【０１２７】
以上の結果から明らかな通り、本発明の化合物（４Ｓ−ＳＰＦ）を用いた試薬を使用することで得られた血清鉄濃度測定値は、従来のバソフェナントロリンを用いた試薬（ＬタイプワコーＦｅ・Ｎ）を使用することで得られた血清鉄濃度測定値と良好な相関関係を示した。【０１２８】
このことから、本発明の化合物をキレート発色剤として用いて、定量的に血清中の鉄濃度を測定できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明は、本発明の式［１］で表される新規化合物及びその塩をキレート発色剤として用いた、高感度且つ精度よい鉄濃度の測定方法、及び該化合物をキレート発色剤として構成要件として含む鉄濃度測定試薬及びキットを提供する。
【符号の説明】
【０１３０】
図１、図２、図３、図４、図５、図６において、―●―は、鉄水溶液を試料として用いた場合の結果を、―○―は、生理食塩水を試料として用いた場合の結果を、それぞれ示す。
図７、図８、図９において、実線（−）は、鉄水溶液を試料として用いた場合の結果を、点線（−−−−）は、生理食塩水を試料として用いた場合の結果を、それぞれ示す。
【図１】
2014061623.tif 000020
【図２】
2014061623.tif 000021
【図３】
2014061623.tif 000022
【図４】
2014061623.tif 000023
【図５】
2014061623.tif 000024
【図６】
2014061623.tif 000025
【図７】
2014061623.tif 000026
【図８】
2014061623.tif 000027
【図９】
2014061623.tif 000028
【図１０】
2014061623.tif 000029
【国際調査報告】
2014061623.tif 000030
2014061623.tif 000031