(57)【要約】  本発明は、増大された継代能を有する神経幹細胞、前記増大された継代能を有する神経幹細胞の製造方法、および、その他を提供することをその課題とする。  本発明は、一実施態様において、増大された継代能を有する神経幹細胞であって、以下の特徴；   （ａ）当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウト、または、ノックダウンされており、  （ｂ）当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネルを介したＣａ２＋の流入が、実質的に無くなっているか、または、抑制されており、  （ｃ）当該細胞は、少なくとも４代（より好ましくは、１５代）以上継代を行うことが可能であり、および、  （ｄ）当該細胞は、４代（より好ましくは、１５代）継代後においても、神経細胞への分化能を維持している、を有する、神経幹細胞を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
増大された継代能を有する神経幹細胞であって、以下の特徴； 
（ａ）当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウト、または、ノックダウンされており、
（ｂ）当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネルを介したＣａ２＋の流入が、（１）Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウトされている場合には、実質的に無くなっており、または、（２）Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックダウンされている場合には、抑制されており、
（ｃ）当該細胞は、少なくとも４代以上継代を行うことが可能であり、および、
（ｄ）当該細胞は、４代継代後においても、神経細胞への分化能を維持している、
を有する、
神経幹細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の、増大された継代能を有する神経幹細胞であって、
前記「Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子のノックアウトまたはノックダウン」が、Ｎ型カルシウムチャネルのα１Ｂサブユニットをコードする遺伝子を標的としたノックアウトまたはノックダウンである、
神経幹細胞。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の神経幹細胞であって、
前記神経幹細胞は、４代継代後においても、ｎｅｓｔｉｎ陽性を示すことを特徴とする、
神経幹細胞。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の、増大された継代能を有する神経幹細胞であって、
前記神経幹細胞は、４代継代後においても、高い増殖能及び高いｓｐｈｅｒｅ形成能を有することを特徴とする、
神経幹細胞。
【請求項５】
増大された継代能を有する神経幹細胞の製造方法であって、
前記製造方法は、
（Ａ）Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウトまたはノックダウンされた非ヒト遺伝子改変動物を調製するステップ、
（Ｂ）前記非ヒト遺伝子改変動物から取得された組織から、神経幹細胞を単離するステップ、
および、
（Ｃ）所望により、前記単離された神経幹細胞をさらに継代培養するステップ、
を含み、
前記「増大された継代能を有する神経幹細胞」は、以下の特徴；
（ａ）当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウト、または、ノックダウンされており、
（ｂ）当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネルを介したＣａ２＋の流入が、（１）Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウトされている場合には、実質的に無くなっており、または、（２）Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックダウンされている場合には、抑制されており、
（ｃ）当該細胞は、少なくとも４代以上継代を行うことが可能であり、および、
（ｄ）当該細胞は、４代継代後においても、神経細胞への分化能を維持している、
を有する、
製造方法。
【請求項６】
増大された継代能を有する神経幹細胞の製造方法であって、
前記製造方法は、
（Ｊ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経幹細胞を調製するステップ、
（Ｋ）前記神経幹細胞のＮ型カルシウムチャネル遺伝子をノックアウトまたはノックダウンするステップ、および、
（Ｈ）所望により、前記Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウトまたはノックダウンされた神経幹細胞をさらに継代培養するステップ、
を含み、
前記「増大された継代能を有する神経幹細胞」は、以下の特徴；
（ａ）当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウト、または、ノックダウンされており、
（ｂ）当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネルを介したＣａ２＋の流入が、（１）Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウトされている場合には、実質的に無くなっており、または、（２）Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックダウンされている場合には、抑制されており、
（ｃ）当該細胞は、少なくとも４代以上継代を行うことが可能であり、および、
（ｄ）当該細胞は、４代継代後においても、神経細胞への分化能を維持している、
を有する、
製造方法。
【請求項７】
請求項５または請求項６に記載の、増大された継代能を有する神経幹細胞の製造方法であって、
前記「Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子のノックアウトまたはノックダウン」が、Ｎ型カルシウムチャネルのα１Ｂサブユニットをコードする遺伝子を標的としたノックアウトまたはノックダウンである、
製造方法。
【請求項８】
請求項５に記載の、増大された継代能を有する神経幹細胞の製造方法であって、
前記非ヒト遺伝子改変動物がげっ歯類である、
製造方法。
【請求項９】
請求項６に記載の、増大された継代能を有する神経幹細胞の製造方法であって、
前記ステップ（Ｊ）における神経幹細胞がヒト由来の細胞である、
製造方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の、増大された継代能を有する神経幹細胞の製造方法であって、
前記ステップ（Ｊ）における神経幹細胞が、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を、神経幹細胞に分化誘導することによって調製された神経幹細胞である、
製造方法。
【請求項１１】
神経幹細胞の継代能を増大させるための神経幹細胞の培養方法であって、
（Ｘ）神経幹細胞を調製するステップ、および、
（Ｙ）前記神経幹細胞を、Ｎ型カルシウムチャネルを阻害させる条件下において、培養するステップ
を含む、
培養方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の培養方法であって、
前記「Ｎ型カルシウムチャネルを阻害させる条件下において培養するステップ」が、Ｎ型カルシウムチャネルを阻害する薬剤を細胞に適用するステップを含む、
培養方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の培養方法であって、
前記薬剤が、ω−コノトキシンＧＶＩＡ、および／または、サイクリンタンパク質である、
培養方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の培養方法であって、
前記「Ｎ型カルシウムチャネルを阻害させる条件下において培養するステップ」が、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子の転写または翻訳を阻害する薬剤を細胞に適用するステップを含む、
培養方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の培養方法であって、
前記薬剤が、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、
培養方法。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の培養方法によって得られる神経幹細胞。
【請求項１７】
増大された継代能を有する神経幹細胞であって、以下の特徴； 
（ａ）当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネルを阻害させる条件下において培養されることにより、Ｎ型カルシウムチャネルが阻害されており、
（ｂ）当該細胞は、４代継代後においても、ｎｅｓｔｉｎ陽性を示し、および、
（ｃ）当該細胞は、４代継代後においても、神経細胞への分化能を維持している、
神経幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（１）増大された継代能（「亢進された継代増殖能」ということもある。）を有する神経幹細胞、（２）前記増大された継代能を有する神経幹細胞の製造方法、（３）神経幹細胞の継代能を増大させるための神経幹細胞の培養方法、（４）神経幹細胞の継代能を増大させるための、神経幹細胞の培養における、薬剤の使用、等に関する。【０００２】
より具体的には、本発明は、一態様において、増大された継代能を有する神経幹細胞であって、以下の特徴； 
（ａ）当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウト、または、ノックダウンされており、
（ｂ）当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネルを介したＣａ２＋の流入が、（１）Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウトされている場合には、実質的に無くなっており、または、（２）Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックダウンされている場合には、抑制されており、
（ｃ）当該細胞は、少なくとも４代（より好ましくは、１５代）以上継代を行うことが可能であり、および、
（ｄ）当該細胞は、４代（より好ましくは、１５代）継代後においても、神経細胞への分化能を維持している、
を有する、
神経幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００３】
従来、中枢神経系の再生は起こらないと考えられてきた。しかし、近年の成体脳における内在性神経幹細胞の発見によって、成熟した脳でも神経再生が起こる可能性が指摘されている。例えば、これまでに、成体ラット脳の脳室周囲・嗅神経系及び海馬の歯状回において、神経幹細胞による恒常的なニューロン新生が示されている。また、脳病変に伴って、それ以外の部位、例えば大脳新皮質や線条体に神経幹細胞が出現し、増殖することが知られており、この出現し、増殖した神経幹細胞の脳脊髄損傷や神経変性疾患等への治療応用が大いに期待されている（非特許文献１、２）。【０００４】
動物の神経幹細胞は、神経細胞とグリア細胞（アストロサイト及びオリゴデンドロサイト）に分化することが知られている（多分化能）。また、動物の神経幹細胞は、同じ多分化能を有する細胞を分裂によって複製することができる（自己複製能）。【０００５】
動物の神経幹細胞は、再生医療（例えば、移植治療など）において用いることができ、また、アッセイツール（例えば、分化制御様式を探るためのアッセイツール）としても用いることができる。したがって、動物の神経幹細胞は、大きな注目を集め、動物の神経幹細胞について、様々な解析が行われている。【０００６】
動物の神経幹細胞は、増殖因子（ＥＧＦ，ＦＧＦ）を添加することにより培養可能である（非特許文献３、４）。動物の神経幹細胞を、再生医療において用いる場合やアッセイツールとして用いる場合には、（１）増殖することができる能力（「自己増殖能」、または、単に「増殖能」）の維持や（２）分化誘導によって神経細胞を産生することができる能力（「神経細胞への分化能」）の維持、等が重要である。【０００７】
しかし、一般的に、神経幹細胞は、継代を重ねるごとに、（１）その自己増殖能を減じるとともに、（２）その神経細胞への分化能を失い、グリア細胞に分化しやすくなる、ことが知られている（非特許文献５）。したがって、「自己増殖能」および「神経細胞への分化能」の両者を維持したまま、神経幹細胞を、より長い世代において、継代させ続ける技術は重要である。【０００８】
なお、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウトされた非ヒト遺伝子改変動物は知られている。また、当該動物が血圧の制御、痛みの伝達、血糖値の制御等に関与する薬剤のスクリーニングに用いることは知られている（特許文献１、２）。また、神経幹細胞内のＮ型カルシウムチャネルの機能または発現を阻害物質で阻害し、神経活動の阻害状況を確認することは知られている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開公報（ＷＯ／２００１／０３０１３７）
【特許文献２】日本国出願公開公報（特開２００７−１０５０４６）
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｉｎｇ  Ｇ，  Ｓｏｎｇ  Ｈ．  Ａｄｕｌｔ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００５；２８：２２３−２５０．
【非特許文献２】Ｅｍｓｌｅｙ  ＪＧ，  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ＢＤ，  Ｋｅｍｐｅｒｍａｎｎ  Ｇ，  Ｍａｃｋｌｉｓ  ＪＤ．  Ａｄｕｌｔ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ＣＮＳ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ，  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ２００５；７５：３２１−３４１．
【非特許文献３】Ｒｅｙｎｉｌｄｓ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９２，  ２５５，  １７０７−１７１０．
【非特許文献４】Ｓｔｅｖｅｎ  Ｍ．  Ｐｏｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  （ＮＳ）  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｆｅｔａｌ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔ  ｆｏｒｅｂｒａｉｎ．  Ｃｅｒｅｂ．  Ｃｏｒｔｅｘ．  ２００６：１６：１１２−１２０．
【非特許文献５】Ｍｅｌｌｓｓａ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．１９９９：１５８：２６５−２７８．
【非特許文献６】Ｓｔｅｆａｎ  Ａ．  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｄｅｖｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００：１８：２０１−２１２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、（１）増大された継代能を有する神経幹細胞、（２）前記増大された継代能を有する神経幹細胞の製造方法、（３）神経幹細胞の継代能を増大させるための神経幹細胞の培養方法、（４）神経幹細胞の継代能を増大させるための、神経幹細胞の培養における、薬剤の使用、等の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子をノックアウトした非ヒト遺伝子改変動物を用いて、神経に関する病態の解明とその治療法の開発、等をめざして検討を重ねてきた。【００１３】
そして、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、（１）増大された継代能を有する神経幹細胞、（２）前記増大された継代能を有する神経幹細胞の製造方法、（３）神経幹細胞の継代能を増大させるための神経幹細胞の培養方法、（４）神経幹細胞の継代能を増大させるための、神経幹細胞の培養における、薬剤の使用、等の開発に成功した。【００１４】
すなわち、本発明は、一態様において、
増大された継代能を有する神経幹細胞であって、以下の特徴； 
（ａ）当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウト、または、ノックダウンされており、
（ｂ）当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネルを介したＣａ２＋の流入が、（１）Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウトされている場合には、実質的に無くなっており、または、（２）Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックダウンされている場合には、抑制されており、
（ｃ）当該細胞は、少なくとも４代（より好ましくは、１５代）以上継代を行うことが可能であり、および、
（ｄ）当該細胞は、４代（より好ましくは、１５代）継代後においても、神経細胞への分化能を維持している、
を有する、
神経幹細胞に関する。【００１５】
また、本発明の一態様においては、前記（ａ）における、「Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子のノックアウトまたはノックダウン」は、Ｎ型カルシウムチャネルのα１Ｂサブユニットをコードする遺伝子を標的としたノックアウトまたはノックダウンであってもよい。また、本発明の一態様においては、前記「増大された継代能を有する神経幹細胞」は、４代（より好ましくは、１５代）継代後においても、ｎｅｓｔｉｎ陽性を示す。また、本発明の一態様においては、前記「増大された継代能を有する神経幹細胞」は、４代（より好ましくは、１５代）継代後においても、高い増殖能及び高いｓｐｈｅｒｅ形成能を有する。【００１６】
また、本発明は、一態様において、
増大された継代能を有する神経幹細胞の製造方法であって、
前記製造方法は、
（Ａ）Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウトまたはノックダウンされた非ヒト遺伝子改変動物を調製するステップ、
（Ｂ）前記非ヒト遺伝子改変動物から取得された組織から、神経幹細胞を単離するステップ、
および、
（Ｃ）所望により、前記単離された神経幹細胞をさらに継代培養するステップ、
を含み、
前記「増大された継代能を有する神経幹細胞」は、以下の特徴；
（ａ）当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウト、または、ノックダウンされており、
（ｂ）当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネルを介したＣａ２＋の流入が、（１）Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウトされている場合には、実質的に無くなっており、または、（２）Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックダウンされている場合には、抑制されており、
（ｃ）当該細胞は、少なくとも４代（より好ましくは、１５代）以上継代を行うことが可能であり、および、
（ｄ）当該細胞は、４代（より好ましくは、１５代）継代後においても、神経細胞への分化能を維持している、
を有する、
製造方法に関する。
ここで、本発明の一態様においては、前記非ヒト遺伝子改変動物は、げっ歯類であってもよい。【００１７】
また、本発明は、一態様において、
増大された継代能を有する神経幹細胞の製造方法であって、
前記製造方法は、
（Ｊ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経幹細胞を調製するステップ、
（Ｋ）前記神経幹細胞のＮ型カルシウムチャネル遺伝子をノックアウトまたはノックダウンするステップ、および、
（Ｈ）所望により、前記Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウトまたはノックダウンされた神経幹細胞をさらに継代培養するステップ、
を含み、
前記「増大された継代能を有する神経幹細胞」は、以下の特徴；
（ａ）当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウト、または、ノックダウンされており、
（ｂ）当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネルを介したＣａ２＋の流入が、（１）Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウトされている場合には、実質的に無くなっており、または、（２）Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックダウンされている場合には、抑制されており、
（ｃ）当該細胞は、少なくとも４代（より好ましくは、１５代）以上継代を行うことが可能であり、および、
（ｄ）当該細胞は、４代（より好ましくは、１５代）継代後においても、神経細胞への分化能を維持している、
を有する、
製造方法に関する。
ここで、本発明の一態様においては、前記ステップ（Ｊ）における神経幹細胞は、ヒト由来の細胞であってもよい。また、本発明の一態様においては、前記ステップ（Ｊ）における神経幹細胞は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を、神経幹細胞に分化誘導することによって調製された神経幹細胞であってもよいし、ｉＮＳ細胞として調製された神経幹細胞であってもよい。【００１８】
本発明の一態様においては、増大された継代能を有する神経幹細胞の、上述の二つの製造方法において、前記「Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子のノックアウトまたはノックダウン」が、Ｎ型カルシウムチャネルのα１Ｂサブユニットをコードする遺伝子を標的としたノックアウトまたはノックダウンであってもよい。【００１９】
また、本発明は、一態様において、
神経幹細胞の継代能を増大させるための神経幹細胞の培養方法であって、
（Ｘ）神経幹細胞を調製するステップ、および、
（Ｙ）前記神経幹細胞を、Ｎ型カルシウムチャネルの機能または発現を阻害させる条件下において、培養するステップ
を含む、
培養方法に関する。
なお、上記ステップ（Ｙ）における「培養するステップ」は、「培養することにより、神経幹細胞を増殖させるステップ」であってもよい。
また、本発明は、一態様において、上記ステップ（Ｘ）およびステップ（Ｙ）に加えて、さらに、（Ｚ）前記ステップ（Ｙ）で培養された前記神経幹細胞が、増大した継代能を有していることを評価するステップ、を含んでもよい。
さらに、本発明は、一態様において、上記の培養方法によって得られる神経幹細胞に関する。【００２０】
本発明の上記培養方法の一態様においては、前記「Ｎ型カルシウムチャネルの機能または発現を阻害させる条件下において培養するステップ」は、Ｎ型カルシウムチャネルの機能または発現を阻害する薬剤を細胞に適用するステップを含んでいてもよい。そのような薬剤の限定的ではない例としては、ω−コノトキシンＧＶＩＡ、および／または、サイクリンタンパク質が挙げられる。【００２１】
本発明の上記培養方法の一態様においては、前記「Ｎ型カルシウムチャネルの機能または発現を阻害させる条件下において培養するステップ」は、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子の転写または翻訳を阻害する薬剤を細胞に適用するステップを含んでいてもよい。そのような薬剤の限定的ではない例としては、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡが挙げられる。【００２２】
また、本発明は、一態様において、
増大された継代能を有する神経幹細胞であって、以下の特徴； 
（ａ）当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネルの機能または発現を阻害させる条件下において培養されることにより、Ｎ型カルシウムチャネルが阻害されており、
（ｂ）当該細胞は、４代（より好ましくは、１５代）継代後においても、ｎｅｓｔｉｎ陽性を示し、および、
（ｃ）当該細胞は、４代（より好ましくは、１５代）継代後においても、神経細胞への分化能を維持している、
神経幹細胞に関する。【００２３】
また、本発明は、一態様において、
神経幹細胞の継代能を増大させるための、神経幹細胞の培養における、Ｎ型カルシウムチャネルの機能または発現を阻害する薬剤の使用に関する。そのような薬剤の限定的ではない例としては、ω−コノトキシンＧＶＩＡ、および／または、サイクリンタンパク質が挙げられる。【００２４】
また、本発明は、一態様において、
神経幹細胞の継代能を増大させるための、神経幹細胞の培養における、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子の転写または翻訳を阻害する薬剤の使用に関する。そのような薬剤の限定的ではない例としては、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡが挙げられる。【００２５】
このように、本発明者は、本発明の増大された継代能を有する神経幹細胞が、
・当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウト、または、ノックダウンされており、
・当該細胞において、Ｎ型カルシウムチャネルを介したＣａ２＋の流入が、実質的に無くなっているか抑制されていること、
・当該細胞は、少なくとも４代（より好ましくは、１５代）以上継代を行うことが可能であること、
・当該細胞は、４代（より好ましくは、１５代）継代後においても、神経細胞への分化能を維持していること、
・当該細胞は、４代（より好ましくは、１５代）継代後においても、ｎｅｓｔｉｎ陽性を示すこと、および／または、
・当該細胞は、４代（より好ましくは、１５代）継代後においても、高い増殖能及び高いｓｐｈｅｒｅ形成能を有すること、
を見出した。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によって提供される神経幹細胞は、通常の神経幹細胞よりも、増大された継代能を有する。さらに、本発明によって提供される神経幹細胞は、単に増大された継代能を有するのみならず、「自己増殖能」および「神経細胞への分化能」の両者を維持している。
したがって、本発明によって提供される神経幹細胞を用いることにより、種々の実験（例えば、薬剤に関する薬効や副作用等を評価する実験、等）において、神経幹細胞や（そこから分化して得られる）神経細胞を、容易に調製（準備）することができる。また、それらの神経幹細胞や（そこから分化して得られる）神経細胞は、再生医療に好適に用いることができることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＮＶＤＣＣ欠損マウス由来神経幹細胞、および、ＷＴマウス由来神経幹細胞のそれぞれについて、ｓｐｈｅｒｅ形成能を示した図である（実施例１）。
【図２】ＮＶＤＣＣ欠損マウス由来神経幹細胞のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅが継代を繰り返しても増殖能を有することを示した図である（実施例１）。
【図３】神経幹細胞からさまざまな種類の神経に分化した様子を示す図である（実施例１）。
【図４】ＮＶＤＣＣ欠損マウス由来神経幹細胞のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅが８０継代を繰り返しても神経細胞への分化能を維持していることを示した図である（実施例１）。
【図５】ＮＶＤＣＣ特異的阻害剤を適用したＷＴマウス由来神経幹細胞のｓｐｈｅｒｅ形成能と増殖能を示した図である（実施例２）。
【図６】ＮＶＤＣＣ特異的阻害剤を適用したＷＴマウス由来神経幹細胞が、Ｔｕｊ１陽性の神経細胞、および、ＧＦＡＰ陽性のアストロサイト、に分化していることを示した図である（実施例２）。
【図７】ＮＶＤＣＣ特異的阻害剤を適用したヒト由来神経前駆細胞が第６継代後に至っても繰り返しｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成する能力を維持していることを示した図である（実施例３）。
【図８】ＮＶＤＣＣ欠損マウスの側脳室由来神経幹細胞から分化させた神経細胞（分化ニューロン）が、ＡＭＰＡで活性化されるグルタミン酸受容体を有する神経細胞に分化することを示した図である（実施例４）。
【図９】ＮＶＤＣＣ欠損マウスの側脳室由来神経幹細胞から分化させた神経細胞（分化ニューロン）が、ムスカリン受容体サブタイプおよびニコチン受容体サブタイプを含むアセチルコリン受容体を有する神経細胞に分化することを示した図である（実施例４）。
【図１０】ＮＶＤＣＣ欠損マウス由来の神経幹細胞を分化誘導することにより活性電位が４−ＡＰにより顕著に増加していることを示した図である（実施例５）。
【図１１】ＮＶＤＣＣ欠損マウス由来の神経幹細胞を分化誘導することにより活性電位がＴＴＸにより抑制されたことを示した図である（実施例５）。
【図１２】ＮＶＤＣＣ特異的阻害剤を適用したヒト由来神経前駆細胞が第８継代後に至っても繰り返しｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成する能力を維持していることを示した図である（実施例６）。
【図１３】ＮＶＤＣＣ特異的阻害剤を適用したヒト由来神経前駆細胞が、Ｔｕｊ１陽性の神経細胞、および、ＧＦＡＰ陽性のアストロサイト、に分化していることを示した図である（実施例６）。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下に本発明の形態について説明する。以下の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、さまざまな形態で実施することができる。
【００２９】
なお、特段の断りが無い限り、本明細書中で使用される全ての技術的用語、科学的用語及び専門用語は、本発明が属する技術分野の通常の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有し、単に特定の態様を説明することを目的として用いられ、限定することを意図したものではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。本明細書において引用された全ての先行技術文献、および、公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられ、本発明の実施のために用いることができる。
【００３０】
［１．神経幹細胞］
神経幹細胞は、増殖し継代を繰り返すことができる（自己複製能）。また、神経幹細胞は、中枢神経系を構成する３種類の細胞（すなわち、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト）を作り出すことができる（多分化能）未分化な細胞である。
しかし、本発明において神経幹細胞は、神経細胞に分化し得る細胞であれば特に限定されない。したがって、本発明では、神経幹細胞は、神経前駆細胞等も含む概念である。
本発明で用いる神経幹細胞は、胚性の神経組織、胎児の神経組織、出産後の個体の神経組織、若年性の個体の神経組織、又は成体の神経組織から周知の方法を用いて得ることができる。脳組織に由来する神経幹細胞の単離は、Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号、および、同第５，８５１，８３２号等の方法を用いることができる。
【００３１】
また、別の取得方法として、本発明で用いる神経幹細胞としては、ＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｉｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ）又はｉＰＳ細胞等の幹細胞から周知の方法（例えば、Ｗａｔｔｓ  Ｃ，  Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ａｄｕｌｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ａｎａｔ．  Ｓｅｐ；２０７（３）：１９７−２０８．（２００５）等）から、分化させた神経幹細胞を用いてもよいし、ｉＮＳ細胞として調製された神経幹細胞を用いてもよい。
ＥＳ細胞は、例えば受精卵を胚にまで育て、内部にある内部細胞塊（Ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ：ＩＣＭ）を取り出し、特定の培地で培養する等の周知の方法で取得できる。
ｉＰＳ細胞は、例えば動物の皮膚、髪又は他の組織から細胞を取得し、数個の特定の遺伝子を、例えば、トランスフェクションやウイルスベクター、等を用いて当該細胞に導入し、特定の培地で培養する等の周知の方法で取得できる。
本明細書において、ｉＮＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）とは、動物の皮膚、髪、または、他の組織から取得された細胞を、ｉＰＳ細胞への誘導を介さずに、直接的に神経幹細胞へと分化させた細胞をいう。ｉＮＳ細胞は、例えば動物の皮膚、髪、または、他の組織から細胞を取得し、数個の特定の遺伝子を、例えば、トランスフェクションやウイルスベクター、等を用いて当該細胞に導入し、特定の培地で培養する等の周知の方法で取得できる（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２０１２  Ｊｕｎ；３０（６）：１１０９−１１１９）。
【００３２】
本発明の神経幹細胞を供給する動物は、特に限定されないが、例えば、鳥類、両生類、は虫類、魚類、哺乳動物などが含まれる。本明細書において、本発明の神経幹細胞を供給する動物の好ましい態様は、哺乳動物である。そのような動物としては、マウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、ヒトがとくに好ましく、マウス、ラット、ヒトがもっとも好ましい。
【００３３】
［２．Ｎ型カルシウムチャネル（ＮＶＤＣＣ）］
カルシウムチャネル（「Ｃａチャネル」とも呼ばれる）は、細胞内へのＣａ２＋の流入を調節することにより細胞内への情報伝達を行う膜タンパク質である。
カルシウムチャネルには、広義には、イオンチャネル内蔵型受容体も含まれ得るが、一般には、単に、電位依存性のカルシウムチャネルを指して使われる。
神経細胞及び筋肉細胞からは種々の電位依存性カルシウムチャネルが同定されている（Ｂｅａｎ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５１：３６７−３８４，１９８９、Ｈｅｓｓ  Ｐ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，５６：３３７，１９９０）。電位依存性カルシウムチャネルは、電気生理学的性質、および、アンタゴニストに対する感受性、等により、一過性／低閾値活性化型（Ｔ型）、および、持続性／高閾値活性化型（Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ型）の６つの型に分類されている。
Ｎ型、Ｐ型、Ｑ型及びＲ型のカルシウムチャネルは、いずれも、神経に特異的に存在する。そして、これらのカルシウムチャネルの神経機能に対する役割が注目されている（Ｌａｎｅ  Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：５７−６１，１９８８、Ｄｉａｎｅ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：６３９−６４２，１９８９等）。
【００３４】
このうちＮ型カルシウムチャネルは、イモ貝より単離されたペプチド毒素ω−コノトキシンＧＶＩＡによりＣａ２＋の流入が抑制されることにより特徴づけられるカルシウムチャネルである。Ｎ型カルシウムチャネルは、ＮＶＤＣＣ（Ｎ−Ｔｙｐｅ  Ｖｏｌｔａｇｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｃｈａｎｎｅｌ）ともいわれる。
本明細書において、Ｎ型カルシウムチャネルをコードする遺伝子を、単に、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子という。
【００３５】
［３．ノックアウトおよびノックダウン］
本発明の増大された継代能を有する神経幹細胞は、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子をノックアウト、または、ノックダウンすることにより得ることもできる。
【００３６】
［３−１．ノックアウト（遺伝子破壊）］
ノックアウト（遺伝子破壊ということがある。）とは、遺伝子に変異を導入して、その遺伝子産物の機能を失わせることを意味する。
ノックアウトの方法としては、ターゲッテド・ディスラプション（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）が挙げられる。ターゲッテド・ディスラプションは、遺伝子ターゲッティングにより遺伝子を破壊する方法である。
例えば、ターゲッテド・ディスラプションは、標的となる遺伝子の塩基配列に関して、当該遺伝子の遺伝子産物の機能が失われるように、何らかの塩基配列（好ましくは、選択マーカー遺伝子（もっとも典型的には、薬剤に対する耐性遺伝子）の塩基配列を含む塩基配列）を、当該標的となる遺伝子の塩基配列またはその前後の塩基配列に組み込む方法である。
本発明でターゲットとなる遺伝子は、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子である。Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウトされれば、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子の遺伝子産物が産生されず、その当然の結果として、Ｎ型カルシウムチャネルは、機能を発揮することはない。
なお、ターゲッテド・ディスラプションは、Ｎ型カルシウムチャネルをコードする遺伝子の塩基配列の情報に基づいて該遺伝子を破壊する技術の例示である。本発明におけるノックアウトの方法は、該遺伝子の塩基配列の情報に基づいて破壊したのであれば、他の方法であってもよい。
また、本発明でＮ型カルシウムチャネル（すなわち、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子の遺伝子産物）の機能は、Ｃａ２＋の流入の調節である。したがって、Ｎ型カルシウムチャネルの機能が発揮されなくなっていることは、そうでなければω−コノトキシンＧＶＩＡにより抑制されるであろうＣａ２＋の流入が実質的に無くなっているか否かを検証することにより、確認することができる。
ここで、ω−コノトキシンＧＶＩＡは、イモ貝毒（Ｃｏｎｕｓ  ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）より精製されるペプチドであり（Ｂａｌｄｏｍｅｒｏ  Ｍ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３，５０８７，１９８４）、配列番号７に記載のアミノ酸配列により特徴づけられる。
【００３７】
ノックアウトの対象となるＮ型カルシウムチャネルをコードする遺伝子としては、Ｎ型カルシウムチャネルのサブユニットであるα１Ｂサブユニットをコードする遺伝子（以下、「Ｃａｃｎａ１ｂ」ということがある。）を用いることができる。
Ｎ型カルシウムチャネルのα１Ｂサブユニットをコードする遺伝子の具体例としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｄ）のＤＮＡからなる遺伝子を挙げることができる。
（ａ）配列番号１、３又は５記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１、３又は５に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、機能を持つＮ型カルシウムチャネルのα１Ｂサブユニットをコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｃ）配列番号２、４又は６記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号２、４又は６に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、機能を持つＮ型カルシウムチャネルのα１Ｂサブユニットをコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
【００３８】
なお、配列番号１の塩基配列および配列番号２のアミノ酸配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ０００７１８．３としてＧｅｎＢａｎｋに登録されており、配列番号３の塩基配列および配列番号４のアミノ酸配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ００１０４２５２８．１としてＧｅｎＢａｎｋに登録されており、配列番号５の塩基配列および配列番号６のアミノ酸配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ００１１９５１９９．１としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている。
【００３９】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。本発明におけるハイブリダイゼーション条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」等の条件を挙げることができる。
【００４０】
［３−２．ノックアウト（遺伝子破壊）動物］
本発明の神経幹細胞を単離するためのノックアウト非ヒト動物は、Ｎ型カルシウムチャネルをコードする遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物であって、常法の遺伝子ターゲティングによるノックアウト非ヒト動物の作製法にしたがって作製することができる。
【００４１】
なお、本発明で使用されるＮ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウトされた動物は、非ヒト動物である。本発明で使用されるＮ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物の好ましい態様は、齧歯類である。そのような動物としては、マウスがとくに好ましい。
【００４２】
以下、Ｎ型カルシウムチャネルをコードする遺伝子のターゲッテドディスラプションを例として、Ｎ型カルシウムチャネルα１Ｂサブユニット遺伝子のクローニング、ターゲッテドディスラプションに用いるターゲッティングベクターの構築、相同組換えを起こした胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、非ヒトノックアウト動物の取得の順に説明する。
【００４３】
１．Ｎ型カルシウムチャネルα１Ｂサブユニット遣伝子の一部を含むＤＮＡのクローニング
Ｎ型カルシウムチャネルα１ＢサブユニットをコードするＤＮＡは、ＴｈｌｅｒｒｙＣ．ｅｔ．ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３３８，１，１９９４に記載のＮ型カルシウムチャネルα１ＢサブユニットをコードするＤＮＡの塩基配列を基にプライマーを設定し、非ヒト動物のゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡを基にＰＣＲを行うことにより、あるいは、前記プライマーを用いて非ヒト動物のＲＮＡを基にＲＴ−ＰＣＲを行うことにより得ることができる。
また別法としては、前述のＴｈｌｅｒｒｙＣ．ｅｔ．ａｌに記載のＮ型カルシウムチャネルα１ＢサブユニットをコードするＤＮＡの塩基配列を基にプローブを合成して、非ヒト動物のゲノムＤＮＡライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーから当該プローブとハイブリダイズするクローンを選び出し、選び出したクローンの塩基配列を決定することにより、Ｎ型カルシウムチャネルα１Ｂサブユニット遺伝子あるいはその一部、好ましくは５００ｂｐ以上、更に好ましくは１ｋｂｐ以上の塩基配列を含むクローンを選択しても良い。
【００４４】
前記クローニングされたＤＮＡの制限酵素地図は、前記クローニングされたＤＮＡの塩基配列に含まれる制限酵素部位を確認することにより作製される。
【００４５】
相同組換えするのに十分な長さのＤＮＡ、好ましくは７ｋｂｐ以上、更に好ましくは１０ｋｂｐ以上のクローンが得られなかった場合、相同組換えするのに十分な長さのＤＮＡは、複数のクローンを適切な制限酵素部位でＤＮＡを切り出して、繋ぎ合わせることにより作製してもよい。
【００４６】
２．ターゲッティングベクターの構築
本明細書において、ターゲッティングベクターとは、遺伝子ターゲッティングに用いられるベクターであり、標的となる遺伝子と接触した際に、ＤＮＡの相同組換えが起こるような塩基配列が組み込まれているものをいう。
相同組換えに用いるＤＮＡは、前記のクローニングによって得られた、相同組換えに十分な長さのＤＮＡ中のエクソン領域の制限酵素部位に、薬剤耐性遺伝子などのポジティブ選択マーカー、好ましくはネオマイシン耐性遺伝子を導入することにより得られる。また、前記相同組換えに用いるＤＮＡは、エクソンの一部を取り除いて、代わりに薬剤耐性遺伝子に置き換えてもよい。前記クローニングによって得られたＤＮＡの塩基配列に適当な制限酵素部位が無い場合、相同組換えに用いるＤＮＡは、制限酵素部位を含むように設計したプライマーを用いるＰＣＲ、制限酵素部位を含むオリゴヌクレオチドのライゲーション等により、適当な制限酵素部位を導入し、この制限酵素部位を用いることによって薬剤耐性遺伝子等を導入してもよい。
【００４７】
本発明において、ターゲッティングベクターは、細胞に導入したターゲッティングベクター上のＤＮＡと、ターゲッティングベクターを導入されたＥＳ細胞のＮ型カルシウムチャネルα１Ｂサブユニット遺伝子の間に相同組換えが起こらず、そのかわりに、導入したターゲッティングベクター上のＤＮＡがＮ型カルシウムチャネルα１Ｂサブユニット遺伝子以外の部位に挿入されてしまったＥＳ細胞を除去するために、ネガティブ選択マーカー、例えばチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素遺伝子等を含むことが好ましい。
【００４８】
これらの組換えＤＮＡ技術は、例えばＳａｍｂｒｕｃｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載された方法によって行うことができるが、適当な組換えＤＮＡを得ることができれば、この方法に限られるものではない。
【００４９】
３．相同組換えを起こした胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の取得
作製した前記ターゲッティングベクターは、制限酵素で切断することによって直鎖状ＤＮＡとし、例えばフェノール・クロロフォルム抽出、アガロース電気泳動、超遠心等の方法により精製される。そして、精製された前記直鎖状ＤＮＡは、ＥＳ細胞、例えばＴＴ２へトランスフェクトされる。トランスフェクションの方法は、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクションなどを挙げることができるが、本発明のトランスフェクションの方法は、これらの方法に限られるものではない。
【００５０】
ターゲッティングベクターをトランスフェクトされたＥＳ細胞は、適当な選択培地中（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子とチミジンキナーゼ遺伝子を組み込んだターゲティングベクターを構築した場合、培地中にネオマイシンとガンシクロビルを含む選択培地中）で培養される。
【００５１】
選択培地中で薬剤耐性を呈して増殖してきた前記ＥＳ細胞のＤＮＡに適当な相同組換えが起こっていることは、例えば、以下のような方法で確認することができる。
（i）ネオマイシン耐性遺伝子およびチミジンキナーゼ遺伝子（これらの遺伝子を、本明細書において「導入遺伝子」ということがある。）が組み込まれたことを、ＰＣＲ等で容易に確認することができる。（ii）更に、ターゲティングベクターの外側の５’上流または３’下流のＤＮＡ一部をプローブとして、前記ＥＳ細胞のＤＮＡをサザンブロット解析することにより、相同組み換えを起こしたかどうかを確認することもできる。（iii）また、ターゲティングベクターが目的の遺伝子部位以外の部分に挿入されていないことは、ターゲティングベクター内のＤＮＡをプローブとしてサザンブロット解析することにより確認できる。これらの方法を組み合わせることにより、相同組み換えを起こしたＥＳ細胞を取得することができる。
【００５２】
遺伝子産物の機能が失われるように挿入した遺伝子を胚性幹細胞に導入し、導入した遺伝子と標的遺伝子との間で相同組換えを起こした胚性幹細胞を選択して、標的遺伝子に変異を導入する方法は、例えば、Ｓｕｚａｎｎｅ  Ｌ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３６，３４８，１９８８、に記載の方法によっても行うことができる。
【００５３】
４．非ヒトノックアウト動物の作製法
本発明で使用することができるＮ型カルシウムチャネル遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物の好ましい態様は、齧歯類である。そのような動物としては、マウスがもっとも好ましい。
以下、マウスを例にして非ヒトノックアウト動物の作製法を述べる。
【００５４】
ノックアウトマウスは、受精後８細胞期胚あるいは胚盤胞の採取、相同組み換えを起こしたＥＳ細胞のマイクロインジェクション、偽妊娠マウスへの操作卵の移植、偽妊娠マウスの出産と産仔の育成、ＰＣＲ法及びサザンブロット法による遺伝子導入マウスの選抜、導入遺伝子をもつマウスの系統樹立、のステップを経て作製される（Ｙａｇｉ  Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４，７０，１９９３）。
【００５５】
（１）８細胞期胚あるいは胚盤胞の採取
８細胞期胚は、雌マウスに過剰排卵を誘発させるため、妊馬血清性生殖腺刺激ホルモン５国際単位とヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン２．５国際単位をそれぞれ腹腔内投与した後、雄マウスと交配させ、交配後２．５日目の雌マウスより卵管および子宮を摘出し、潅流することによりにより得る。なお、胚盤胞を用いる場合、胚は、交配後３．５日目の雌マウスの子宮を摘出し、潅流することにより得る。
【００５６】
（２）相同組換えを起こしたＥＳ細胞のマイクロインジェクション
前記「３．相同組換えを起こした胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の取得」に記載の方法により取得された、相同組換えを起こしたＥＳ細胞は、（１）で得られた８細胞期胚または胚盤胞に、マイクロインジェクトされる。マイクロインジェクションは、例えば、Ｈｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．Ｍ．，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６、Ｙａｇｉ  Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４，７０，１９９３に記載の方法に基づき、倒立顕微鏡下で、マイクロマニピュレータ、マイクロインジェクター、インジェクションピペット及びホールディングピペットを用いて行うことができる。また、インジェクション用ディッシュは、例えばＦａｌｃｏｎ  ３００２（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）に、培地５μｌの液滴およびＥＳ細胞を浮遊させた液滴を作り、流動パラフィンを重層したものを用いることができる。
【００５７】
本明細書において、相同組換えを起こしたＥＳ細胞をマイクロインジェクトした８細胞期胚あるいは胚盤胞を、「操作卵」と称す。
【００５８】
（３）偽妊娠マウスへの操作卵の移植
偽妊娠マウスは、精管結紮雄マウスと野生型雌マウスとを交配させることにより作成され、偽妊娠の状態となった後に、（２）で作成された操作卵を移植される。
操作卵の移植は、例えばＨｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．Ｍ．，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６やＹａｇｉ  Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４，７０，１９９３に記載の方法に基づいて行うことができる。
以下に具体的操作の例を記すが、本発明の操作卵の移植は、これに限られるものではない。
【００５９】
偽妊娠マウスは、例えば５０ｍｇ／ｋｇ体重のペントバルビタールナトリウムを用いて全身麻酔され、両けん部を約１ｃｍ切開して卵巣および卵管を露出され、実体顕微鏡下で卵巣嚢をピンセットで切開し卵管采を露出される。次に、操作卵は、卵管あたり７〜８個程度の割合で卵管采から送り込まれる。この時、卵管内に移植されたことの確認は、操作卵とともに入れた微小気泡を実体顕微鏡下で目視することによってできる。
操作卵を移植されたマウスは、卵管及び卵巣を腹腔に戻され、両切開部を縫合された後、麻酔から覚醒される。
場合によっては、操作卵は、作成の翌日まで培養し、胚盤胞の段階まで発生させてから、偽妊娠マウスの子宮に移植しても良い。
【００６０】
（４）偽妊娠マウスの出産と産仔の育成
仔マウスは、多くの場合、操作卵の移植後１７日目までに得られる。仔マウスは、通常、相同組換えを起こしたＥＳ細胞由来の細胞と受精卵を採取したマウス由来の細胞とのキメラとなる。例えばＥＳ細胞としてＴＴ２を用い、相同組換えを起こしたＴＴ２を、ＩＣＲマウスより採取した８細胞期胚に注入した場合、キメラ率の高い仔マウスは体毛色がアグウチ優位となり、キメラ率の低いマウスは体毛色が白色優位となる。
【００６１】
（５）ＰＣＲ法及びサザンブロット法による遺伝子導入マウスの選抜
導入遺伝子が前記キメラマウスの生殖細胞に入っているか否かの確認は、例えば、以下のような方法により行うことができる。
（i）前記キメラマウスを、体毛色が白色のマウス（たとえばＩＣＲ）と交配させた場合は、得られた仔マウスの体毛色を確認することにより、導入遺伝子の有無を容易に確認することができる。（ii）また、得られた仔マウスの尾よりＤＮＡを抽出してＰＣＲに供することにより、導入遺伝子の有無を確認することができる。（iii）また、より確実な遺伝子型の同定は、ＰＣＲの代わりにサザンブロット解析を行うことによって行うことができる。
【００６２】
ここで、キメラ率の高いキメラマウスは生殖細胞も導入遺伝子を含んでいることが期待されることから、できるだけキメラ率の高いマウスを交配に供することが好ましい。
【００６３】
（６）導入遺伝子をもつマウスの系統樹立
導入遺伝子がホモに存在するＮ型カルシウムチャネルノックアウトマウス（本明細書において、「Ｎ−ＫＯマウス」、または、「ＮＶＤＣＣ欠損マウス」ということがある。）は、ヘテロに存在するＮ型カルシウムチャネルノックアウトマウス（本明細書において、「Ｈｅマウス」ということがある。）同士を交配することによって得ることができる。Ｎ−ＫＯマウスは、Ｈｅマウス同士、ＨｅマウスとＮ−ＫＯマウス、Ｎ−ＫＯマウス同士のいずれの交配でも得ることができる。
【００６４】
Ｎ型カルシウムチャネルがノックアウトされた神経幹細胞は、このようにして得られたノックアウト動物の胚性の神経組織、胎児の神経組織、出産後の個体の神経組織、若年性の個体の神経組織、または、成体の神経組織から、後述する調製法を用いて得ることができる。
【００６５】
［３−３．ノックダウン］
本発明において、ノックダウンとは、形質転換によって、特定の遺伝子の転写量を減少させること、または翻訳を阻害することをいう。すなわち、遺伝子の機能を完全に失わせるものではなく、標的とする遺伝子の機能を減少（減弱）させるものをいう。
遺伝子のノックダウンの方法は、ｍＲＮＡのアンチセンス鎖に相当するＲＮＡを細胞に導入するアンチセンス法を用いることができる。また、遺伝子のノックダウンの方法は、２本鎖のＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）やｍｉｃｒｏＲＮＡ等を用いるＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を利用することもできる。
より具体的には、遺伝子のノックダウンの方法は、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターを用いて細胞を形質転換させることにより、または、ｓｉＲＮＡを用いて細胞を形質転換させることにより、特定の遺伝子の転写量を減少させる、または、翻訳を阻害する方法を用いることができる。
【００６６】
哺乳動物細胞では、３０ｂｐ以下の短いＲＮＡによるＲＮＡ干渉では、単一のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のみが特異的に抑制されることが知られている。
【００６７】
［３−４．ノックダウン動物］
ノックダウン動物は、当該動物を構成する細胞に、標的遺伝子のｍＲＮＡに対応する短い２本鎖のＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）やアンチセンス核酸を人為的に導入・発現させることにより、当該ｓｉＲＮＡやアンチセンス核酸の作用により標的遺伝子の発現を抑制させた動物である。このようなノックダウン動物は、例えば、ベクター系によるｓｉＲＮＡの発現システムを用いて作製することができる（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：  ５５０−５５３（２００２）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：５００−５０５（２００２）等）。
【００６８】
なお、本発明で使用することができるＮ型カルシウムチャネル遺伝子がノックダウンされた動物は、非ヒト動物である。そのような動物としては、齧歯類がとくに好ましく、マウスがもっとも好ましい。
【００６９】
以下、Ｎ型カルシウムチャネルをノックダウンした動物の作製方法の一例を述べる。以下に示す例において、ノックダウンの対象となるＮ型カルシウムチャネルをコードする遺伝子は、Ｎ型カルシウムチャネルのサブユニットであるα１Ｂサブユニットをコードする遺伝子である。
【００７０】
Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子を阻害するためのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどは、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子の転写または翻訳を阻害することのできる核酸であれば特に限定されず、当業者であればｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどの配列を適宜設計し、製造することができる。
【００７１】
Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子の転写または翻訳を阻害するｓｈＲＮＡを発現するベクターは、ｓｈＲＮＡをコードする領域の配列について、例えば、以下の特徴を有するように設計することができる。
（i）：Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子をコードする塩基配列のうち、連続する１１〜３０塩基（好ましくは２１〜２５塩基）の配列、
（ii）：（i）の配列に対し相補的な塩基配列であり、かつ逆配向の塩基配列、および、
（iii）：（i）の塩基配列と（ii）の塩基配列とを連結する塩基配列、を含み、
（i）〜（iii）の領域がＲＮＡに転写された際に、（i）から転写されたＲＮＡ部分と（ii）から転写されたＲＮＡ部分が二本鎖ＲＮＡを形成し、（iii）から転写されたＲＮＡ部分が前記二本鎖ＲＮＡを連結するループ領域を形成する。
【００７２】
上記ｓｈＲＮＡ発現ベクターは、更にポリメラーゼＩＩ系プロモーター、または、発生過程特異的プロモーターを含むことが好ましく、かかるプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期遺伝子プロモーターを挙げることができる。
【００７３】
また、上記ｓｈＲＮＡ発現ベクターは、更に前記（i）〜（iii）の領域の塩基配列の上流に、自己触媒的にＲＮＡを切断する配列、例えばリボザイム部位等を含むことが好ましい。
【００７４】
上記ｓｈＲＮＡ発現ベクターは、更に前記（i）〜（iii）の領域の塩基配列の下流に、ＲＮＡポリメラーゼを停止させる配列、例えばＭＡＺドメイン配列等を含むことが好ましい。
【００７５】
また、上記ｓｈＲＮＡ発現ベクターにおける（iii）の塩基配列は、適切なループ構造をとることができれば、特に限定されない。
【００７６】
Ｎ型カルシウムチャネル非ヒトノックダウン動物は、例えば、本明細書の「３−２．ノックアウト（遺伝子破壊）動物」に記載の方法と同様の方法を用いて作製することができる。この場合、「３−２．ノックアウト（遺伝子破壊）動物」に記載の方法で用いたターゲッティングベクターの代わりに、ｓｈＲＮＡ発現ベクターを用いることにより、Ｎ型カルシウムチャネル非ヒトノックダウン動物を作製することができる。
【００７７】
Ｎ型カルシウムチャネルがノックダウンされた神経幹細胞は、このようにして得られた非ヒトノックダウン動物の胚性の神経組織、胎児の神経組織、出産後の個体の神経組織、若年性の個体の神経組織、または、成体の神経組織から、後述する調製法を用いて得ることができる。
【００７８】
［４．Ｎ型カルシウムチャネルの機能または発現を阻害する薬剤］
本発明で使用することができる、Ｎ型カルシウムチャネルの機能または発現を阻害する薬剤は、神経幹細胞のＮ型カルシウムチャネルを一過的に阻害、減少（減弱）するものであれば特に限定されず、例えば化学物質、タンパク質、遺伝子等を挙げることができる。より具体的には、ω−コノトキシンＧＶＩＡ、サイクリンタンパク質等を挙げることができる。
また、本明細書において、Ｎ型カルシウムチャネルの機能または発現を阻害する薬剤には、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子の転写または翻訳を阻害する薬剤も含まれる。より具体的には、化学合成したｓｉＲＮＡ、酵素を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎしたｓｉＲＮＡ、ＤｉｃｅｒやＲＮａｓｅ  ＩＩＩでｄｓＲＮＡを切断して生じたｓｉＲＮＡのミックス、ＰＣＲで合成したｓｉＲＮＡ発現カセット等を挙げることができる。
【００７９】
これらのＮ型カルシウムチャネルの機能または発現を阻害する薬剤を用いた神経幹細胞のＮ型カルシウムチャネルの阻害は、適切な温度下、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２）等の適切な培地中で、神経幹細胞に当該Ｎ型カルシウムチャネルの機能または発現を阻害する薬剤を添加することによって達成することができる。
【００８０】
［５．神経幹細胞の調製］
本発明の神経幹細胞は、例えば、以下に示す方法によって調製することができる。
【００８１】
［５−１．非ヒトノックアウト動物由来神経幹細胞、または、非ヒトノックダウン動物由来神経幹細胞の調製］
Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子が、本明細書の［３．ノックアウトおよびノックダウン］に記載の方法によってノックアウト、または、ノックダウンされた非ヒト動物の脳、好ましくは大脳、海馬、側脳室等を常法により摘出し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２）培地等の適切な培地中でほぐして単細胞浮遊液は調製される。続いて、前記単細胞浮遊液は、ナイロンメッシュ等を用いてろ過した後、例えば１００〜３００ｇ程度で組織を数分間の遠心にかけ、沈殿物として集められる。次に、前記沈殿物として集められた細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２）培地等の適切な培地中に再浮遊される。さらに、前記再浮遊させた細胞を遠心して沈殿物を集め、さらに再浮遊する操作を数回繰り返すことにより、細胞は洗浄される。次に、前記洗浄された細胞は、ＥＧＦ、ＦＧＦ等の成長因子、Ｎ２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ等の血清代替サプリメント、および、必要に応じてペニシリンＧ、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ等の抗生物質を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２）培地等の適切な培地中に浮遊される。
前記培地に浮遊された細胞を培養すると、一部の細胞は増殖を始めｓｐｈｅｒｅ（細胞塊）の形成を始める。１週間に数回の割合で培地を交換しながら、更に培養を続けると、２週間程度でｓｐｈｅｒｅ（細胞塊）を得ることができる。
【００８２】
［５−２．遺伝子改変されていない動物由来の神経幹細胞からＮ型カルシウムチャネル遺伝子をノックアウトして得る神経幹細胞の調製］
遺伝子改変されていない動物由来の神経幹細胞は、本明細書の［５−１．非ヒトノックアウト動物由来神経幹細胞、または、非ヒトノックダウン動物由来神経幹細胞の調製］に記載の方法と同様の方法によって、遺伝子改変されていない動物由来の組織から調製することができる。
さらに、前記のように調製した遺伝子改変されていない動物由来の神経幹細胞のＮ型カルシウムチャネル遺伝子を、ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅやＴＡＬＥＮ等の技術を用いてノックアウトすることにより、所望の神経幹細胞を得ることができる。また、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の段階で、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子を周知の方法を用いてノックアウトし、例えば、後述する［８．分化能］に記載の方法で分化誘導することで、所望の神経幹細胞を得ることができる。
【００８３】
［５−３．遺伝子改変されていない動物由来の神経幹細胞からＮ型カルシウムチャネル遺伝子をノックダウンして得る神経幹細胞の調製］
遺伝子改変されていない動物由来の神経幹細胞は、本明細書の［５−１．非ヒトノックアウト動物由来神経幹細胞、または、非ヒトノックダウン動物由来神経幹細胞の調製］に記載の方法と同様の方法によって、遺伝子改変されていない動物由来の組織から調製することができる。
さらに、前記のように調製した遺伝子改変されていない動物由来の神経幹細胞のＮ型カルシウムチャネル遺伝子を、ｓｈＲＮＡ発現ベクターまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターを用いてノックダウンすることにより、または、ｓｉＲＮＡを用いて細胞を形質転換させることにより、所望の神経幹細胞を得ることができる。
【００８４】
前記ｓｈＲＮＡ発現ベクターまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターには、ヘアピン型のＲＮＡ発現ベクターやタンデム型のＲＮＡ発現ベクターを用いることができる。ヘアピン型ＲＮＡベクターは、プロモーター配列の下流にｓｈＲＮＡの塩基配列を挿入した発現ベクターであり、導入された発現ベクターから転写されたｓｈＲＮＡは、核から細胞質へ輸送され、Ｄｉｃｅｒによるプロセシングを受けてｓｉＲＮＡと同様の２本鎖ｓｉＲＮＡになる。タンデム型ＲＮＡベクターは、それぞれがプロモーター配列をもつセンス鎖とアンチセンス鎖の鋳型配列が挿入されたベクターで、それぞれ別々に転写されたセンス鎖とアンチセンス鎖がアニーリングしてｓｉＲＮＡを形成する。
【００８５】
［５−４．遺伝子改変されていない動物由来の神経幹細胞に、Ｎ型カルシウムチャネルの機能または発現を阻害する薬剤を添加することによる神経幹細胞の調製］
遺伝子改変されていない動物由来の神経幹細胞は、本明細書の［５−１．非ヒトノックアウト動物由来神経幹細胞、または、非ヒトノックダウン動物由来神経幹細胞の調製］に記載の方法と同様の方法によって、遺伝子改変されていない動物由来の組織から調製することができる。
【００８６】
また、遺伝子改変されていない動物由来の神経幹細胞は、次のように調製することもできる。遺伝子改変されていないＥＳ細胞若しくはｉＰＳ細胞から、例えば、後述する［８．分化能］に記載の方法で分化誘導した神経幹細胞を得、または、遺伝子改変されていない動物由来の細胞から分化誘導したｉＮＳ細胞として調製した神経幹細胞を得、必要に応じてＢｕｌｌｅｔＫｉｔ等の培地を添加しつつ、シャーレ上に回収する。次に、神経幹細胞から形成されたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅは、遠心分離により回収される。所望の細胞は、当該ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅにω−コノトキシンＧＶＩＡ及びサイクリンタンパク質等のＮ型カルシウムチャネル阻害剤を含むＢｕｌｌｅｔＫｉｔ  ｍｅｄｉｕｍ等の培地で培養することによって得ることができる。更に、当該培養方法は、必要に応じて培地を週に数回交換し、また必要に応じて細胞を数日に一度継代してもよい。
【００８７】
遺伝子改変されていない動物由来の神経幹細胞、または、遺伝子改変されていないＥＳ細胞若しくはｉＰＳ細胞から分化誘導した神経幹細胞、または、遺伝子改変されていない動物由来の細胞から分化誘導したｉＮＳ細胞は、必要に応じて凍結し、使用時に解凍してもよい。
【００８８】
前記のように調製された神経幹細胞に対し、例えば、以下のような方法でＮ型カルシウムチャネルの機能または発現を阻害することにより、所望の細胞を得ることができる。
【００８９】
（１）Ｎ型カルシウムチャネルの機能または発現を阻害する物質を細胞に適用する方法
培地中に懸濁された神経幹細胞は、フラスコに播種され、必要に応じてＦＧＦ−ｂおよびＥＧＦを添加し、さらに、ω−コノトキシンＧＶＩＡ、サイクリンタンパク質、等の薬剤を添加して培養する。また、培地は、必要に応じて数日毎に半分量を交換してもよい。
（２）化学合成したｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを細胞に導入する方法
化学合成した２本のＲＮＡ（センス鎖とアンチセンス鎖）をアニーリングしたｓｉＲＮＡは、化学合成、または、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社等から購入して、ｓｈＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社等から購入して、トランスフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法等の周知の方法で神経幹細胞に導入される。導入されたｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、細胞質でＲＩＳＣを形成し、ターゲット遺伝子のｍＲＮＡの配列特異的な分解を引き起こすことにより、Ｎ型カルシウムチャネルの発現を阻害する。
（３）酵素を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎしたｓｉＲＮＡを細胞に導入する方法
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎで使用されるプロモーター（Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６）と組み合わせた鋳型配列から、ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用してｓｉＲＮＡを合成する。合成したｓｉＲＮＡを精製した後に、トランスフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法等の周知の方法を用いて神経幹細胞に導入することにより、Ｎ型カルシウムチャネルの機能または発現を阻害する。
（４）ＤｉｃｅｒやＲＮａｓｅ  ＩＩＩでｄｓＲＮＡを切断して生じたｓｉＲＮＡのミックスを細胞に導入する方法
長鎖のｄｓＲＮＡをＤｉｃｅｒやＲＮａｓｅ  ＩＩＩで切断した断片（ｓｉＲＮＡ）のミックスをトランスフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法等の周知の方法を用いて神経幹細胞に導入することにより、Ｎ型カルシウムチャネルの機能または発現を阻害する。導入するＲＮＡ断片には、ターゲット遺伝子のさまざまな部分の塩基配列に対応するｓｉＲＮＡが混ざっているので、ターゲット遺伝子をノックダウンできる確率を高めることができる。
（５）ＰＣＲで合成したｓｉＲＮＡ発現カセットを細胞に導入する方法
プロモーター−ｓｈＲＮＡの鋳型配列−転写終結シグナル、という配列で構成されるＰＣＲ産物を、トランスフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法等の周知の方法を用いて神経幹細胞に導入することにより、Ｎ型カルシウムチャネルの機能または発現を阻害する。
【００９０】
［６．神経幹細胞の培養］ 
神経幹細胞の培養法は、当該細胞が生存、増殖又は神経細胞に分化することができる培養方法であれば、特に限定されないが、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ法が好ましい。
本発明で使用することができるｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ法は、汎用されている神経幹細胞の選択的培養方法の一つである。ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ法は、適切な温度条件下でＥＧＦおよび／またはｂＦＧＦを含む無血清培地を用いて神経幹細胞を浮遊培養し、球状の細胞塊（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）として神経幹細胞を増殖させる方法である。
ヒト神経幹細胞は、齧歯類神経幹細胞と同様に、マイトジェン（代表的には、上皮増殖因子および／または塩基性線維芽細胞増殖因子）を含む無血清培養培地中で維持することができる。前記培地中に懸濁された神経幹細胞は、増殖して細胞塊（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）として知られる細胞の凝集体を形成する。
【００９１】
［７．継代培養］
本発明の神経幹細胞は、周知の方法により継代することができる。継代とは、新たな培地に細胞の一部を移して、次世代として培養することをいう。通常のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ法による神経幹細胞の継代は、３継代程度である。本発明によって得られる神経幹細胞は、４継代以上、好ましくは５継代以上、より好ましくは６継代以上、更に好ましくは７継代以上、中でも好ましくは８継代以上、特に好ましくは９継代以上、最も好ましくは１０継代以上継代することができる神経幹細胞であるが、神経細胞に分化する分化能を保持する限り当該継代数は特に限定されない。
【００９２】
また、神経幹細胞を継代培養する基材は、神経幹細胞が分化・誘導を促進されることなく、正常に継代する基材であれば特に限定されない。当該基材は、例えば、ジルコニア、イットリア、チタニア、アルミナ、シリカ、ハイドロキシアパタイト及びβ−リン酸三カルシウムのうちの少なくともいずれか１種のセラミックス又はガラスからなることが好ましい。
これらのセラミックス又はガラスは、未分化細胞の分化・誘導を促進することがなく、生体安定性が高いため、好適に用いることができる。
【００９３】
本発明で使用される神経幹細胞の継代培養方法は、上記のような培養基材を用いて、当該神経幹細胞を該培養基材中に少なくとも１ヶ所に播種して培養することにより、神経幹細胞が未分化な状態のままで増殖した細胞塊を得ることができる。
更に、当該継代培養方法は、上記において培養して得られた細胞塊を単一細胞又は細胞小集団に分散し、得られた神経幹細胞を用いて、上記培養方法を繰り返すことにより継代培養を行うことができる。また、細胞塊の分離は、細胞塊をパパイン、トリプシン等で処理することにより、または、細胞塊をピペッティングすることにより、容易に行うことができる。
【００９４】
［８．分化能］
分化能とは、ある細胞が異なる細胞種へ分化する能力のことをいう。本明細書において、神経分化能とは、神経細胞に分化する能力をいう。本発明で神経細胞に分化する能力を有する細胞は、例えば神経幹細胞、神経前駆細胞等を挙げることができる。また、神経細胞に分化する能力を有する細胞は、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の幹細胞から周知の方法を用いて分化誘導した神経幹細胞、神経前駆細胞等も含む。さらに、神経細胞に分化する能力を有する細胞は、ｉＮＳ細胞として調製した神経幹細胞、および、当該細胞から分化誘導した神経前駆細胞等も含む。
【００９５】
ＥＳ細胞から神経幹細胞に分化させる場合、例えば以下のような方法で行うことができる。
【００９６】
まず、前記のような方法で調製されたＥＳ細胞を、フィーダー細胞やＬＩＦの存在しない条件下で培養する。次に、前記培養したＥＳ細胞を、酵素処理または機械的剥離によって一旦浮遊させ、それをピペッティングにより小塊に分離する。さらに、前記分離したＥＳ細胞の小塊を、新しい培養皿でさらに培養することにより、ＥＳ細胞は、胚様体を経て、神経幹細胞へと自発的に分化する（Ｒｏｙ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １８：  ３９４７−３９５５  （１９９８））。
【００９７】
この胚様体は、ＥＳ細胞を非コート培養皿にてＬＩＦを除いたＥＳ細胞用培地を用いて７日間〜１４日間程度培養し、顕微鏡下で細胞が凝集して形成される球状体の出現を観察することにより得ることができる。なお、この胚様体は、必要に応じてビタミンＢ１２、および、ヘパリン若しくはヘパリン様作用を有する物質の存在下で培養することによっても得ることができる（再公表特許公報（再表２００６−００４１４９号））。
【００９８】
ＥＳ細胞は、例えば当業者らに周知の方法（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ  ＴＣ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｅｍｂｒｙｏｌ  Ｅｘｐ  Ｍｏｒｐｈｏｌ，  １９８５，  ８７，  ２７−４５，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  １９８８，  ３３６，  ６８４−６８７）によって調製したものを用いることもできる。
【００９９】
ｉＰＳ細胞等の幹細胞から分化させた神経幹細胞は、前記のＥＳ細胞を神経幹細胞へと分化させる方法と同様の方法を用いて得ることができる。
【０１００】
ｉＮＳ細胞として調製した神経幹細胞は、周知の方法（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２０１２  Ｊｕｎ；３０（６）：１１０９−１１１９）によって調製したものを用いることもできる。
【０１０１】
［９．神経幹細胞から神経細胞への分化］
本発明の神経幹細胞は、周知の方法によって神経細胞に分化させることができる。具体的には、本発明の神経幹細胞は、例えばＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２  Ｈａｍ  ｍｅｄｉｕｍ等の培地中で、必要に応じてＥＧＦ、ＦＧＦ等の成長因子等を添加して培養される。本発明の神経幹細胞は、好ましくはｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅの形態で培養される。本発明の神経幹細胞は、必要に応じて１週間に数回程度培地の半分程度を交換しつつ培養される。
【０１０２】
ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅは、５〜１００継代、好ましくは１０〜７０継代、更に好ましくは３０〜５０継代を行った後、ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ等の酵素を用いて個々の細胞に分散される。次に、個々の細胞に分散された神経幹細胞は、セルウェア上に１×１０３〜１×１０６個、好ましくは１×１０４〜５×１０５個の細胞密度で播種される。播種した細胞は、増殖因子を含まない培地で適当な温度条件下、必要に応じて数％二酸化炭素の存在下で数週間培養し、神経細胞に分化させることができる。
【０１０３】
また、本発明の神経幹細胞は、ｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ等で事前にコーティングした多電極培養皿（ｍｕｌｔｉ−ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｄｉｓｈ）上に播種され、適当な温度条件下、必要に応じて数％の二酸化炭素存在下で数週間培養することによっても、分化誘導される。分化工程の間、当該神経幹細胞は、増殖因子を含まない培地中で維持される。
【０１０４】
以上の工程によって、本発明の神経幹細胞は、神経細胞に分化させることができる。培地は、必要に応じて一週間毎に数回程度半分量を交換してもよい。
【０１０５】
［１０．培養条件］
本発明における細胞の培養の温度条件は、２０℃〜４０℃であるが、好ましくは３３〜３９℃、更に好ましくは３６〜３８℃、最も好ましくは３７℃である。
その他の培養条件は、細胞が適切に生育できる条件であれば、特に限定されない。細胞は、浮遊した状態（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ状態）で培養されても、培養容器に付着した状態で培養されてもよい。
【０１０６】
［１１．薬剤の評価］
本発明の神経幹細胞を用いた薬剤の評価は、例えば、神経幹細胞、または、神経幹細胞から分化した神経細胞に薬剤を添加し、薬剤を添加した前後の当該細胞の活動電位の変化や細胞の形態変化を調べることにより、行うことができる。
具体的には、以下に例示する方法によって評価を行うことができる。
【０１０７】
電極培養皿上の当該神経細胞は、活動電位を測定している間適当な温度条件下のインキュベーター内に静置される。６４か所のプローブ上で生じた電場電位は、全てｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ等の計測器を用いて数〜数十ｋＨｚのサンプリング速度で記録し、同時に数十〜数百Ｈｚ帯域フィルターでフィルタリングする。ニューロンの自発的活動による電位のベースライン閾値は、各実験を行うたびに測定し、評価の対象となる薬剤を添加したのちに平均周波数の変化を記録することができる。
【０１０８】
前記ベースライン閾値は、薬剤に応じて適宜調製することができ、例えば４−アミノピリジン（４−ＡＰ）活性化実験では±０．００１〜０．０２０Ｖに、テトロドトキシン（ＴＴＸ）抑制実験では−０．００１〜０．０１０  ｍＶに設定することができる。必要に応じて閾値を超えるスパイク頻度（Ｈｚ）は平均化することができる。それぞれの薬剤の活性化実験は、ベースライン活性及び刺激後の活性をそれぞれ数百秒測定される。
【０１０９】
また、細胞の活動電位の測定は、マニピュレーターやマイクロマニピュレーター等を用いて本発明の神経幹細胞を固定し、インジェクションピペット等を当該神経幹細胞、または、当該神経幹細胞から分化した神経細胞に直接差し込み、細胞内の電位を測定することによっても行うことができる。
【０１１０】
薬剤の評価（例えば、薬剤の神経幹細胞または神経細胞への影響（主作用、副作用問わない））は、本発明の神経幹細胞、または、当該神経幹細胞から分化した神経細胞の活動電位を、薬剤添加の前後について調べることによって、当該薬剤を直接ヒトに投与することなく行うことができる。
【０１１１】
［１２．再生医療］
ヒトは、事故や病気等によって、身体の細胞、組織、臓器、器官等の欠損状態、機能障害、または、機能不全に陥る場合がある。再生医療とは、細胞、組織、臓器、器官等の失われた機能を再生するために、細胞、組織、臓器、器官等を身体に移植し、前記細胞、組織、臓器、器官等の機能を再建する医療である。
【０１１２】
本発明の神経幹細胞は、必要に応じて、適宜増殖させることができ、更に神経細胞に分化するように培養することができる。そのため、本発明の神経幹細胞は、脊髄損傷、パーキンソン病等をはじめとする神経疾患への再生医療の材料となり得る。即ち、本発明は、再生医療用の神経幹細胞、および、当該神経幹細胞から分化した神経細胞を提供することができる。
【実施例】
【０１１３】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。【０１１４】
［実施例１］Ｎ型カルシウムチャネルノックアウト（ＮＶＤＣＣ欠損）マウス由来神経幹細胞の樹立と増殖能、および、神経細胞への分化能の解析【０１１５】
１．ＮＶＤＣＣ欠損マウス由来神経幹細胞の樹立【０１１６】
神経幹細胞の調製を、次の方法によって行った。
先ず、常法により、１０週令、オス、ＮＶＤＣＣ欠損マウス（Ｃ５７ＢＬ６Ｎ）の側脳室周囲組織を摘出した。そして、摘出された細胞組織を、Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ｐａｐａｉｎ）を用いて分散し、Ａｎｔｉ−Ｐｒｏｍｉｎｉｎ−１  マイクロビーズ（カタログ番号１３０−０９２−７５２、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて神経幹細胞へと分離した。【０１１７】
上述のようにして得られた細胞を、ｘ１  Ｂ−２７ＴＭ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（カタログ番号１２５８７０１０、ＧＩＢＣＯ社製）、ｘ１  Ｎ２−Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（カタログ番号１７５０２−０４８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｘ１  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ混合液（カタログ番号Ｐ４３３３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むＤ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２  （１：１）培地（カタログ番号１１０３９−０２１、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、２５  ｃｍ２  フラスコ（カタログ番号３１０３−０２５Ｘ、ＩＷＡＫＩ社製）に播種し、終濃度  ２５  ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ  （ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）−ｂ  （カタログ番号４５０−３３、ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）及びＥＧＦ  （ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）  （カタログ番号ＰＧＭ８０４５、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加した。【０１１８】
培養開始日を０日とし、３、６日目に付加的にＦＧＦ−ｂ及びＥＧＦを添加し、９〜１０日目に、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを回収・分散し、上記と同様の環境条件で播種し、これを継代とした。ただし、継代時には、当該継代前に培養に用いてきた培地と新たに用いる培地を１：１で混合した培地を用いた。【０１１９】
また、対照実験として１０週令オス野生型（ＷＴ）マウス（Ｃ５７ＢＬ６Ｎ）の側脳質周囲組織から、同様の方法で神経幹細胞を調製・継代した。【０１２０】
本明細書において、組織から取得した時点の神経幹細胞を、継代０の神経幹細胞という。すなわち、組織から取得した神経幹細胞を１回継代したものを、第１継代後の神経幹細胞という。【０１２１】
２．ＮＶＤＣＣ欠損マウス由来神経幹細胞のｓｐｈｅｒｅ形成と増殖能の観察【０１２２】
第１継代後のＮＶＤＣＣ欠損マウス由来神経幹細胞、および、ＷＴマウス由来神経幹細胞の、ｓｐｈｅｒｅ形成能は、それぞれ、２８  ｓｐｈｅｒｅｓ／ｍｏｕｓｅ、６．２  ｓｐｈｅｒｅｓ／ｍｏｕｓｅ（３回の試行の平均値）であった。すなわち、ＮＶＤＣＣ欠損マウス由来神経幹細胞がＷＴマウス由来神経幹細胞に比べて高い値を示した。【０１２３】
また、第３継代後９日目の、ＮＶＤＣＣ欠損マウス由来神経幹細胞、および、ＷＴマウス由来神経幹細胞のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ像（写真）、および、各ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅの直径の測定結果のヒストグラムを図１に示す。【０１２４】
ＮＶＤＣＣ欠損マウス由来神経幹細胞のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅはＷＴマウス由来神経幹細胞のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅに比べて、大型かつ健康な様相を示した。事実、この後、継代した第４継代後では、ＷＴマウス由来神経幹細胞はｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成せず、増殖することもなく細胞死に至った。一方、ＮＶＤＣＣ欠損マウス由来神経幹細胞は、その後も、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成することができ、増殖能も良好なまま、継代を重ねることが可能であった。実際、継代を重ねるごとに、その増殖能は、安定化し、第５継代を超える頃には、巨大ｓｐｈｅｒｅが形成されるに至った。巨大ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ像（写真）を図２に示す。【０１２５】
３．ＮＶＤＣＣ欠損マウス由来神経幹細胞の神経細胞への分化能【０１２６】
一般的に、神経幹細胞は、継代を重ねるごとに、（１）その自己増殖能を減じるとともに、（２）その神経細胞への分化能を失い、グリア細胞に分化しやすくなる、ことが知られている。しかし、ＮＶＤＣＣ欠損マウス由来神経幹細胞は、（１）その自己増殖能を減じることなく、また、（２）その神経細胞への分化能を失うことなく、継代を重ねることができた。【０１２７】
例えば、第１５継代後のＮＶＤＣＣ欠損マウス由来神経幹細胞のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅは、多能性神経幹細胞マーカーであるｎｅｓｔｉｎ（ｃｌａｓｓ  ＶＩ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）陽性である。これは、第１５継代後においても、当該神経幹細胞が、多能性を保持していることを意味する。
そして、当該神経幹細胞に対して、１０  ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）−ＡＡで５日間分化誘導を行うと、（１）Ｔｕｊ１（ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  β−ｔｕｂｕｌｉｎ）陽性の神経細胞、（２）ＧＦＡＰ（ｇｒａｉｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）陽性のアストロサイト、および、（３）Ｏ４（ｓｕｌｆａｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）陽性のオリゴデンドロサイト、への分化を確認できた（図３）。
また、当該神経幹細胞に対して、１００  ｎｇ／ｍｌのＡＴＲＡ（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）で５日間分化誘導を行うと、ほとんどの細胞がＭＡＰ２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）陽性の神経細胞に分化し、様々なタイプの神経細胞（例えば、グルタミン酸陽性の神経細胞、ＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）陽性の神経細胞、ＴＨ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ：ドパミン含有神経マーカー）陽性の神経細胞、等）への終分化も確認された（図３）。【０１２８】
更に、神経幹細胞の継代数を増しても、（１）その自己増殖能を減じることなく、また、（２）その神経細胞への分化能を失うこともなかった。それどころか、分化誘導刺激に対しては、むしろ神経細胞への分化能が上昇し、グリア産生能は低下した。その結果を、図４に示す。図４において、Ｔｕｊ−１陽性の細胞は神経細胞、ＧＦＡＰ陽性の細胞はグリア細胞をそれぞれ示している。また、Ｈｏｅｃｈｓｔは細胞の核を染色している。【０１２９】
したがって、ＮＶＤＣＣ欠損マウス由来神経幹細胞は、無限継代能にも匹敵するほどの、増大された継代能を有し、大量の初代培養神経細胞の供給を可能とする。【０１３０】
［実施例２］Ｎ型カルシウムチャネル（ＮＶＤＣＣ）特異的阻害剤を適用したＷＴマウス由来神経幹細胞の増殖能、および、神経細胞への分化能の解析【０１３１】
１．ＷＴマウス由来神経幹細胞の調製と継代【０１３２】
神経幹細胞の調製を、次の方法によって行った。
先ず、常法により、新生児８日齢マウス（Ｃ５７ＢＬ６Ｎ、日本チャールズリバー社）のｆｏｒｅｂｒａｉｎを摘出した。そして、摘出された細胞組織を、Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（＃  １３０−０９２−６２８，  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて細胞へと分離した。【０１３３】
上述のようにして得られた細胞を、（１）×１  Ｂ−２７（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（カタログ番号１２５８７０１０、ＧＩＢＣＯ社製）、（２）×１  Ｎ２−Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（カタログ番号１７５０２−０４８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、および、（３）×１  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ混合液（カタログ番号Ｐ４３３３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を、それぞれ含む、Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２  （１：１）培地（カタログ番号１１０３９−０２１、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、７×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。【０１３４】
続いて、複数の２５ｃｍ２フラスコに、上述の通り調製した細胞懸濁液を各１０ｍｌ播種した。さらに、それぞれ終濃度２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−ｂ（カタログ番号４５０−３３、ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、および、ＥＧＦ（カタログ番号３１５−０９、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加した。【０１３５】
上記フラスコに播種した細胞懸濁液を２つのグループに分けた。
「第１のグループ」は、１５ｍＭ  ＫＣｌの存在下で、ω−コノトキシンＧＶＩＡ（カタログ番号４１６１−ｖ、ＰＥＰＴＩＤＥ社製）を終濃度１μＭで添加し、３〜４日毎に培地を半換えした。１４日目に、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを回収・懸濁し、４×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ  に調製し、２４  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに５００μｌで播種しこれを継代とした。ただし、継代時には、継代前培養時の細胞培地と新たな培地を１：１で混合した培地を用いた。
「第２のグループ」は、ＫＣｌ、および、ω−コノトキシンＧＶＩＡを添加せずに培養すること以外は、第１のグループと同じ条件で培養および継代を行った。【０１３６】
２．ＮＶＤＣＣ特異的阻害剤を適用したＷＴマウス由来神経幹細胞のｓｐｈｅｒｅ形成と増殖能の観察【０１３７】
ω−コノトキシンＧＶＩＡを添加せずに培養した、ＷＴマウス由来神経幹細胞（すなわち第２のグループ）は、第５継代後では、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成せず、増殖することもなく細胞死に至った。一方、ω−コノトキシンＧＶＩＡを添加し続けたＷＴマウス由来神経幹細胞（すなわち、第１のグループ）は、第１５継代後もｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成しながら、増殖し続けることができた。本実験における、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ像（写真）および増殖状況を図５に示す。【０１３８】
３．ＮＶＤＣＣ特異的阻害剤を適用したＷＴマウスの由来神経幹細胞の神経細胞への分化能【０１３９】
１５ｍＭ  ＫＣｌの存在下で、ω−コノトキシンＧＶＩＡを添加し続けることによって行った、第１５継代後のＷＴマウス由来神経幹細胞のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを、ｐｏｌｙ−Ｌ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ（カタログ番号Ｐ３６５５、ｓｉｇｍａ社製）およびｌａｍｉｎｉｎ（カタログ番号２３０１７−０１５、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によってコートされたスライドガラス上に播き、ＥＧＦ、および、ＦＧＦ−ｂが共に非存在下の培地中で、３７℃、３日間分化誘導した。【０１４０】
培養した細胞を４％ＰＦＡ／ＰＢＳで４℃、２０分間固定し、ＰＢＳで４℃、１０分間の洗浄を２回行った。その後、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで室温にて、前記細胞に対して、１５分間の透過処理を行った。その後、ブロックエース（株式会社ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いて、室温にて、２０分間のブロッキングを、前記透過処理された細胞に対して行った。続いて、前記ブロッキング処理された細胞を、一次抗体を含む溶液（１０％ブロックエース、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳ）と、室温にて１時間反応させ、引き続き、４℃で一晩反応させた。翌日、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで、室温にて１０分間の洗浄を３回行った後、蛍光標識した二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製：一次抗体Ｔｕｊ−１に対する二次抗体の型番は、７１５−０９６−１５１、一次抗体ＧＦＡＰに対する二次抗体の型番は、７１１−１６６−１５２）を含む溶液（１０μｇ／ｍｌ二次抗体、１０％ブロックエース、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳ）と、室温にて３０分間反応させた。その後、ＰＢＳで室温にて洗浄し、常法により、封入して観察した。
なお、一次抗体としては、以下のものを使用した。
Ｔｕｊ‐１：Ｃｏｖａｎｃｅより購入（カタログ番号：ＣＯＶＡＮＣＥ  ＃ＭＭＳ−４３５Ｐ）
ＧＦＡＰ：ＤＡＫＯより購入（カタログ番号：ＤＡＫＯ  ＃Ｚ０３３４）【０１４１】
その結果、Ｔｕｊ−１（ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  β−ｔｕｂｕｌｉｎ）陽性の神経細胞と、ＧＦＡＰ（ｇｒａｉｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）陽性のアストロサイトへの分化を確認できた（図６）。【０１４２】
したがって、阻害剤を用いてＮ型カルシウムチャネル（ＮＶＤＣＣ）を阻害することにより、ＮＶＤＣＣ欠損マウス由来神経幹細胞と同様に、野生型神経幹細胞を長期間継代することが可能であることが示された。また、この方法で継代された神経幹細胞も、ＮＶＤＣＣ欠損マウス由来神経幹細胞と同様に、神経細胞への分化能を保持し続けることも示された。
すなわち、阻害剤を用いてＮ型カルシウムチャネル（ＮＶＤＣＣ）を阻害することによっても（実施例２）、Ｎ型カルシウムチャネル遺伝子を遺伝的にノックアウトすることによっても（実施例１）、神経幹細胞の無限培養に近い継代を行うことができ、大量の初代培養神経細胞の供給が可能となる。【０１４３】
［実施例３］ＮＶＤＣＣ特異的阻害剤を適用したヒト由来神経前駆細胞の増殖能の解析【０１４４】
遺伝子改変されていないヒト神経前駆細胞（ＮＨＮＰ）（継代数１：購入時に記載）をＬｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ．（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から購入した。【０１４５】
液体窒素で凍結された前記細胞を、常法により、３７℃で解凍し、１４ｍＬのＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）ｍｅｄｉｕｍを添加したｌｏｗ−ｃｅｌｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｉｓｈ  （９０  ｍｍ  ｉｎ  ｄｉａｍｅｔｅｒ，  Ｎｕｎｃ）上に播種した。翌日、ＮＨＮＰから形成されたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを遠心（１２０  ｘ  ｇ、５分間）により回収した。【０１４６】
続けて、細胞を２つのグループに分けた。「第１のグループ」は、フィルター滅菌した１００ｎＭのω−コノトキシンＧＶＩＡ（ω−ＣＴＸ，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，  Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）を含むＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）ｍｅｄｉｕｍで培養した。「第２のグループ」は、ω−コノトキシンＧＶＩＡを含まないＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）ｍｅｄｉｕｍで培養した。それぞれのグル―プについて、培地は週に３回交換した。また、それぞれのグル―プについて、細胞は７〜１０日に一度継代した。
増殖した細胞で形成されたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを遠心（１２０  ｘ  ｇ、５分間）により回収した。ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅをＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）で３７℃にて１０分間処理することにより分散させた（すなわち、シングルセルで懸濁させた。）。３１０  ｘ  ｇで５分間遠心し、得られたペレットを各培地に懸濁した。【０１４７】
培養初期の段階（すなわち、細胞を２つのグループに分ける前の段階）では殆どのＮＨＮＰが大型のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成した。
しかし、細胞を２グループに分けた後の段階では、「第２のグループ」（つまり、ω−ＣＴＸを含まない培地で培養したグループ）においては、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを分散して得た細胞は、通常の培地では、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成することができず、第２継代後、生存が止まった。これに対し、「第１のグループ」（つまり、ω−ＣＴＸを含む培地で培養したグループ）では、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを分散して得た細胞は、第６継代後に至っても、繰り返しｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成する能力を維持していた（図７）。この結果からω−ＣＴＸを用いてＮ型カルシウムチャネル（ＮＶＤＣＣ）を阻害すると、ヒト神経前駆細胞の継代能が増大することがわかる。【０１４８】
［実施例４］ＮＶＤＣＣ欠損マウスの側脳室由来神経幹細胞から分化させた神経細胞のグルタミン酸作動性活性、および、コリン作動性活性【０１４９】
ＮＶＤＣＣ欠損マウスの側脳室由来神経幹細胞を、（１）１％  Ｎ２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、（２）２％  Ｂ−２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、（３）２５ｎｇ／ｍｌのマウスｂａｓｉｃ  ＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．）、および、（４）２５ｎｇ／ｍｌのマウス上皮増殖因子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２  Ｈａｍ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅの形態で、維持培養した。【０１５０】
１週間に２度、培地の半分量を交換した。ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅは３０〜４０代にわたる継代後、ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、シングルセルに分散した。
このようにして得たシングルセルに分散された細胞を、９６  ＢＩＯＣＯＡＴ  Ｐｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅ  ｂｌａｃｋ／ｃｌｅａｎ  ｃｅｌｌｗａｒｅ  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に、２×１０４、６×１０４、２×１０５、６×１０５細胞／２００μＬ／ウェル（それぞれ、図８の「２ｅ４」、「６ｅ４」、「２ｅ５」、「６ｅ５」に対応する）又は６×１０４細胞／２００μＬ／ウェル（図９）の細胞密度で播種した。【０１５１】
続いて、播種した細胞を、増殖因子が含まれない培地で３７℃、５％  ＣＯ２の条件で２週間分化させた。【０１５２】
分化させた細胞に３７℃で１時間  Ｃａｌｃｉｕｍ  ５  ｄｙｅ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を添加し、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ＦＤＳＳ  ６０００  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  ａｎｄ  ｌｉｑｕｉｄ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いてイオンチャネルの活性を測定した。【０１５３】
最初にバックグラウンドの蛍光強度（励起波長：４８０ｎｍ、発光波長：５４０ｎｍ）を１２秒間モニターし、次にリガンド溶液（ＡＭＰＡ（α−ａｍｉｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｘａｚｏｌｅ−４−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、アセチルコリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）、ムスカリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）、および、ニコチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製））を一度に２０μｌ／ウェル添加し、図８および図９に示すレセプター（グルタミン酸受容体、ムスカリン様受容体およびニコチン様受容体を含むアセチルコリン受容体）を活性化させた。この条件で、蛍光反応を０．３秒のインターバルで９３秒間キャプチャーした。【０１５４】
データを解析し、各化合物についての最大反応率（ＣＴＬ％）に対して正規化した。シグモイド容量反応曲線はソフトウェアＰｒｉｓｍ  （ＭＤＦ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）（図８、図９）を用いて計算した。使用した化合物の容量は図に示すとおりである。【０１５５】
ＮＶＤＣＣ欠損マウスの側脳室神経幹細胞に由来する神経細胞（分化ニューロン）は、ＡＭＰＡに対し容量及び細胞数に依存的に反応した（図８）。２×１０４、６×１０４、２×１０５、６×１０５細胞／ウェルの各条件のＥＣ５０はそれぞれ１１．３μＭ、６．５μＭ、５．０μＭ、５．１μＭであった。前記細胞は、アセチルコリンに対しても濃度依存的に反応した。また、前記細胞は、ムスカリンおよびニコチンに対しても反応した（図９）。
すなわち、本発明の神経幹細胞を分化させることによって得られた神経細胞は、神経伝達物質に対する応答において、通常の神経細胞と同様の特性を有していることが示された。【０１５６】
［実施例５］ＮＶＤＣＣ欠損マウス由来神経幹細胞から産生した神経細胞の電気生理的解析【０１５７】
ＮＶＤＣＣ欠損マウスの海馬由来神経幹細胞を、０．１ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって、事前にコーティングされたｍｕｌｔｉ−ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｄｉｓｈ（ＭＥＤ−Ｐ２１０Ａ  ，  Ａｌｐｈａ  ＭＥＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）上に播種し、３７℃、５％  ＣＯ２の条件で６週間分化させた。
分化工程の間、前記細胞は、（１）Ｎ２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および、（２）Ｂ−２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２  Ｈａｍ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（増殖因子を含んでいない）中で維持し、１週間に２回培地の半分量を交換した。【０１５８】
電気生理学的試験の間、ＭＥＤプローブ上の分化された細胞（分化ニューロン）は、小型のインキュベーター（３７℃）内に静置した。６４か所のプローブ上で生じた電場電位は全てｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（ＭＥＤ６４  ｓｙｓｔｅｍ；  Ａｌｐｈａ  ＭＥＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて２０ｋＨｚのサンプリング速度で記録し、同時に１００Ｈｚ帯域フィルターでフィルタリングした。ニューロンの自発的活動による電位のベースライン閾値は各実験を行うたびに測定し、１ｍＭの４−アミノピリジン（４−ＡＰ）（図１０）または１００ｎＭのテトロドトキシン（ＴＴＸ）（図１１）を添加したのちに平均周波数の変化を記録した。【０１５９】
閾値は４−ＡＰ活性化実験では±０．００７ｍＶに設定し、ＴＴＸ抑制実験では−０．０１５〜０．００５ｍＶに設定した。閾値を超えるスパイク頻度（Ｈｚ）は平均化した。４−ＡＰ活性化実験ではベースライン活性及び刺激後の活性をそれぞれ２１０秒間及び４９０秒間測定した。ＴＴＸ抑制実験ではベースライン活性及び刺激後の活性は両方とも１８０秒間測定した。平均値と標準誤差バーを図１０及び図１１に示す。【０１６０】
ＮＶＤＣＣ欠損マウスの海馬由来神経幹細胞を６週間分化誘導すると自発的な活性電位が観察された。ニューロンの活性電位を記録するためには分化ニューロンの細胞体が電極プローブに接触している必要がある。６４個のプローブのうち５６個のプローブ（４−ＡＰ活性化実験）、および、１５個のプローブ（ＴＴＸ抑制実験）が反応活性電位を記録した（図１０）。この結果から、本実験においてニューロンの細胞体は電極プローブに接触しており、活動電位の測定が正常に行われていたことが確認された。
さらに、分化ニューロンの活性電位は４−ＡＰにより顕著に増加し（図１０）、ＴＴＸにより抑制された（図１１）。この結果から、本発明の神経幹細胞から分化させた神経細胞を用いて、電気生理学的に薬剤の評価を行うことができることがわかった。【０１６１】
［実施例６］ＮＶＤＣＣ特異的阻害剤を適用したヒト由来神経前駆細胞の分化能の解析【０１６２】
１．ＮＶＤＣＣ特異的阻害剤を適用したヒト由来神経前駆細胞の調整と継代【０１６３】
遺伝子改変されていないヒト神経前駆細胞（ＮＨＮＰ）（継代数１：購入時に記載）をＬｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ  Ｉｎｃ．（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から購入した。【０１６４】
液体窒素で凍結された前記細胞を、常法により、３７℃で解凍し、１４ｍＬのＮＰＭＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ，  カタログ番号ＣＣ３２０９）  を添加したｌｏｗ−ｃｅｌｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｉｓｈ  （６０  ｍｍ  ｉｎ  ｄｉａｍｅｔｅｒ，  Ｎｕｎｃ）上に播種した。翌日、ＮＨＮＰから形成されたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを遠心（９０  ｘ  ｇ、３分間）により回収した。【０１６５】
続けて、細胞を２つのグループに分けた。「第１のグループ」は、フィルター滅菌した１μＭのω−コノトキシンＧＶＩＡ（ω−ＣＴＸ，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，  Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）を含むＮＰＭＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）ｍｅｄｉｕｍで培養した。「第２のグループ」は、ω−コノトキシンＧＶＩＡを含まないＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）ｍｅｄｉｕｍで培養した。それぞれのグループについて、培地は週に３回交換した。また、それぞれのグル―プについて、細胞は４〜７日に一度継代した。
増殖した細胞で形成されたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを遠心（９０  ｘ  ｇ、３分間）により回収した。ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅをＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）で室温にて５分間処理することにより分散させた（すなわち、シングルセルで懸濁させた。）。２００  ｘ  ｇで５分間遠心し、得られたペレットを各培地に懸濁した。【０１６６】
培養初期の段階（すなわち、細胞を２つのグループに分ける前の段階）では殆どのＮＨＮＰが大型のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成した。
しかし、細胞を２グループに分けた後の段階では、「第２のグループ」（つまり、ω−ＣＴＸを含まない培地で培養したグループ）においては、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを分散して得た細胞は、通常の培地では、大型のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成することができず、増殖は次第に低下した。これに対し、「第１のグループ」（つまり、ω−ＣＴＸを含む培地で培養したグループ）では、ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを分散して得た細胞は、第２０継代後に至っても、繰り返しｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成する能力を維持していた。第１のグループにおける、第８継代時のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ形成の様子を、図１２に示す。【０１６７】
２．ＮＶＤＣＣ特異的阻害剤を適用したヒト由来神経前駆細胞の神経細胞への分化能【０１６８】
ω−コノトキシンＧＶＩＡ存在下で培養した、第８継代後のヒト由来神経前駆細胞のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを、ｐｏｌｙ−Ｌ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ（カタログ番号Ｐ３６５５、ｓｉｇｍａ社製）およびｌａｍｉｎｉｎ（カタログ番号２３０１７−０１５、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によってコートされたスライドガラス上に播き、ＥＧＦ、および、ＦＧＦ−ｂが共に非存在下の培地中で、３７℃、３日間分化誘導した。【０１６９】
培養した細胞を４％ＰＦＡ／ＰＢＳで４℃、２０分間固定し、ＰＢＳで４℃、１０分間の洗浄を２回行った。その後、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで室温にて、前記細胞に対して、１５分間の透過処理を行った。その後、ブロックエース（株式会社ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いて、室温にて、２０分間のブロッキングを、前記透過処理された細胞に対して行った。続いて、前記ブロッキング処理された細胞を、一次抗体を含む溶液（１０％ブロックエース、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳ）と、室温にて１時間反応させ、引き続き、４℃で一晩反応させた。翌日、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで、室温にて１０分間の洗浄を３回行った後、蛍光標識した二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製：一次抗体Ｔｕｊ−１に対する二次抗体の型番は、７１５−０９６−１５１、一次抗体ＧＦＡＰに対する二次抗体の型番は、７１１−１６６−１５２）を含む溶液（１０μｇ／ｍｌ二次抗体、１０％ブロックエース、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳ）と、室温にて３０分間反応させた。その後、ＰＢＳで室温にて洗浄し、常法により、封入して観察した。
なお、一次抗体としては、以下のものを使用した。
Ｔｕｊ‐１：Ｃｏｖａｎｃｅより購入（カタログ番号：ＣＯＶＡＮＣＥ  ＃ＭＭＳ−４３５Ｐ）
ＧＦＡＰ：ＤＡＫＯより購入（カタログ番号：ＤＡＫＯ  ＃Ｚ０３３４）【０１７０】
その結果、多くの細胞がＴｕｊ−１（ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  β−ｔｕｂｕｌｉｎ）陽性の神経細胞に分化し、一部の細胞はＧＦＡＰ（ｇｒａｉｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）陽性のアストロサイトへ分化することを確認できた（図１３）。【０１７１】
したがって、阻害剤を用いてＮ型カルシウムチャネル（ＮＶＤＣＣ）を阻害することにより、マウス由来神経幹細胞と同様に、ヒト神経前駆細胞を神経細胞への分化能を保持したまま長期間継代することが可能であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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