(57)【要約】  毒性スクリーニング方法は、被験化合物が肝臓の薬物代謝酵素によって代謝されて毒性を示すか否かを判定する方法であり、複数の肝細胞を立体的に培養する工程（例えば凝集体の製造）と、被験化合物を含まない第１溶液、被験化合物を含む第２溶液、及び、薬物代謝酵素反応を阻害する１種類以上の化合物と被験化合物との第３溶液を、各肝細胞と接触させ、異なる溶液と接触させた複数の肝細胞を取得する工程と、生細胞を認識する蛍光プローブまたは死細胞を認識する蛍光プローブを含む溶液と複数の肝細胞とを接触させる工程と、染色後の複数の肝細胞を用いて蛍光染色像を得て、蛍光染色像のデータを元に被験化合物の毒性を判定する工程と、を含む。
2014061244.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験化合物が肝臓の薬物代謝酵素によって代謝されて毒性を示すか否かを判定する毒性スクリーニング方法であって、
複数の肝細胞を立体的に培養する工程と、
前記被験化合物を含まない第１溶液、前記被験化合物を含む第２溶液、及び、薬物代謝酵素反応を阻害する１種類以上の阻害剤と前記被験化合物との第３溶液のそれぞれを、各肝細胞と曝露させることによって、異なる溶液と接触させた前記複数の肝細胞を取得する工程と、
生細胞を認識する蛍光プローブ、死細胞を認識する蛍光プローブ、及びこれらの組合せからなる群から選択される蛍光プローブを含む溶液と前記複数の肝細胞とを接触させる工程と、
染色後の前記複数の肝細胞を用いて蛍光染色像を得て、前記蛍光染色像のデータを元に被験化合物の毒性を判定する工程と、
を含む毒性スクリーニング方法。
【請求項２】
前記被験化合物の毒性を判定する工程は、前記第１溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第１生領域、前記第２溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第２生領域、前記第３溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第３生領域、前記第１溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第１死領域、前記第２溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第２死領域、前記第３溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第３死領域とした場合、
第１生領域＞第２生領域、かつ、第２生領域＜第３生領域と、
第１死領域＜第２死領域、かつ、第２死領域＞第３死領域と、
の少なくともとも一方であるとき、各肝細胞による代謝を受けた被験化合物が細胞毒性の要因であると判定することを特徴とする請求項１記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項３】
前記被験化合物の毒性を判定する工程は、前記第１溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第１生領域、前記第２溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第２生領域、前記第３溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第３生領域、前記第１溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第１死領域、前記第２溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第２死領域、前記第３溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第３死領域とした場合、
（第１死領域／第１生領域）＜（第２死領域／第２生領域）、かつ、（第２死領域／第２生領域）＞（第３死領域／第３生領域）であるとき、各肝細胞による代謝を受けた被験化合物が細胞毒性の要因であると判定することを特徴とする請求項１記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項４】
前記被験化合物の毒性を判定する工程は、前記第１溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光強度を第１生強度、前記第２溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光強度を第２生強度、前記第３溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光強度を第３生強度、前記第１溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光強度の第１死強度、前記第２溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光強度の第２死強度、前記第３溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光強度の第３死強度とした場合、
第１生強度＞第２生強度、かつ、第２生強度＜第３生強度と、
第１死強度＜第２死強度、かつ、第２死強度＞第３死強度と、
の少なくともとも一方であるとき、各肝細胞による代謝を受けた被験化合物が細胞毒性の要因であると判定することを特徴とする請求項１記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項５】
前記複数の肝細胞は、複数のウェルを有する培養プレートを用いて培養され、
各ウェル内で前記複数の肝細胞を培養し、培養した前記複数の肝細胞を他の容器に移し替えることなく、前記各ウェルに前記第１乃至第３溶液のいずれかを添加し反応させた後、前記各ウェルに前記蛍光プローブを添加することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項６】
各肝細胞は、細胞が凝集した凝集体を形成していることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項７】
前記凝集体の相当直径が３０μｍ以上２００μｍ未満であることを特徴とする請求項６記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項８】
前記薬物代謝酵素反応を阻害する１種類以上の化合物が、チトクロムＰ４５０酵素群、第ＩＩ相薬物代謝酵素、及びこれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項９】
前記薬物代謝酵素反応を阻害する１種類以上の化合物が、チトクロムＰ４５０酵素群であって、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ１１、ＣＹＰ２Ｄ６、及びＣＹＰ２Ｅ１からなる群から選択されることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１０】
前記複数の肝細胞の由来が、ヒト、げっ歯類、ラット、イヌ、及びサルのうちいずれかから選択されることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１１】
前記複数の肝細胞が初代肝細胞であることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１２】
前記複数の肝細胞は、複数のウェルを有する培養プレートを用いて培養され、
各ウェルは、複数の培養空間を有する培養容器が形成され、
前記複数の培養空間は、各培養容器の底からの高さが２５〜５００μｍの範囲の壁で囲まれ、かつ、相当直径５０〜１０００μｍの範囲の空間が規則的に配列して形成され、
前記複数の肝細胞を立体的に培養する工程は、前記複数の培養空間を用いて複数の肝細胞の凝集体を作製することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１３】
前記壁の厚さが１０μｍ以上５０μｍ未満であることを特徴とする請求項１２記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１４】
前記培養容器の底部を構成するポリマーの全光線透過率が８５％以上９９％未満であることを特徴とする請求項１２または１３に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１５】
前記培養容器が、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、シリコン樹脂、及びこれらの組合せからなる群から選択される樹脂成形品であることを特徴とする請求項１２乃至１４のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１６】
前記培養容器の底部の厚さが３００μｍ以下であることを特徴とする請求項１２乃至１５のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１７】
前記培養容器の底部培養面が親水化処理されていることを特徴とする請求項１２乃至１６のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１８】
前記培養容器の底部培養面が、ガラスであって、水接触角を４５度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項１２乃至１７のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１９】
前記培養容器の底部培養面が、プラズマ処理により官能基を形成させて、水接触角を４５度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項１２乃至１８のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項２０】
前記親水化処理された前記底部培養面に、さらに、細胞接着性を促進するポリマーである、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、及びこれら組合せからなる群から選択されるポリマーが固定化されていることを特徴とする請求項１７記載の毒性スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物のスクリーニング方法に関し、特に分析技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞は非常に多くの生理的機能を有しており、薬物、食品添加物、環境汚染物質などの代謝に重要な機能を有している。代謝には肝細胞に存在する多くの酵素が関与しているといわれており、例えば、エステルなどの加水分解酵素、酸化反応に重要な役割を果たす第Ｉ相薬物代謝酵素であるチトクロムＰ４５０、還元酵素、及び、第ＩＩ相薬物代謝酵素である、硫酸、酢酸、グルタチオン、またはグルクロン酸などを付与する抱合酵素がある。これら酵素反応により反応性に富む中間体（反応性代謝物）が生成される場合がある。反応性代謝物の化学構造は不安定で寿命が短く、ほとんどが内在性のグルタチオンにより解毒されるが、タンパク質やＤＮＡとも結合し肝毒性を示すことがある。また、反応性代謝物が大量に生成されるとグルタチオンが枯渇するため、周辺のタンパク質やＤＮＡと結合し非常に強い毒性を発現する。その結果、重篤な肝障害を招くことがある。このため、肝細胞の代謝物毒性を解析する様々な方法が開発されている。【０００３】
例えば、特許文献１には、ヒト細胞に及ぼす毒性影響について薬物候補をスクリーニングする方法、被験化合物の特異体質の毒性を測定する方法が開示されている。より具体的には、特許文献１では、被験化合物が第Ｉ相薬物代謝酵素による代謝を受けて生成された代謝物が毒性を示すか否かをスクリーニングする方法について開示されている。第Ｉ相薬物代謝酵素が発現している細胞を用いる方法が開示されており、好ましい様態として、各々異なるチトクロムＰ４５０を発現する複数の細胞を使用することと、第Ｉ相薬物代謝酵素の発現が第ＩＩ相薬物代謝酵素の２０倍大きいことが推奨されている。これは、第Ｉ相薬物代謝酵素による代謝の後に第ＩＩ相薬物代謝酵素により代謝されて毒性を示す化合物が生成、または無毒化されることがあるため第ＩＩ相薬物代謝酵素反応の影響を排除するために上述したような特性をもつ細胞を使用している。このように、代謝物の毒性を評価するうえで細胞内の代謝機能を意図的にコントロールする方法を組合せることで正確な毒性が評価できるようになる。【０００４】
また、非特許文献１には、ヒト初代肝細胞を用いコラーゲン−マトリゲルのサンドウィッチ法で培養、活性酸素量、ミトコンドリア膜活性、抗酸化物質であるグルタチオン（ＧＳＨ）の消費量を可視化することで生体内における毒性発現のメカニズムを予測する方法が開示されている。しかし、特許文献１に示されているように、細胞内には第Ｉ相薬物代謝酵素で代謝され生成した代謝物が第ＩＩ相薬物代謝酵素で代謝されて毒性を示す物質が生成される可能性もあり、この方法ではどの代謝酵素で代謝されたか否かを正確に判定することはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５１１０９３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Jinghai J. Xu, Peter V. Henstock, Margaret C. Dunn, Arthur R. Smith, Jeffrey R. Chabot, David de Graaf著、"Cellular Imaging Predictions of Clinical Drug-Induced Liver Injury"、TOXICOLOGICAL SCIENCES 105(1)、２００８年、ｐｐ．９７-１０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１では、第Ｉ相薬物代謝酵素が第ＩＩ相薬物代謝酵素の発現量に対して大幅に高い複数種の細胞を用いる。このため細胞の維持管理に手間を要するという問題がある。また、非特許文献１で用いられているサンドウィッチ法は初代肝細胞の機能を長期間維持できる点で優れているが、ゲルの取扱いには容易ではなく操作が煩雑になるという問題がある。加えて、マトリゲルは高価であるため、コストが高くなるという問題もある。一方、一般的な平板培養法の操作は簡便で低コストであるものの、細胞が培養底面に扁平に広がった生体内とまったく異なる形態をしている。このため、細胞機能をｉｎ  ｖｉｔｒｏで再現できないことが知られている。その結果、平板培養では反応性代謝物による細胞死が検知できない可能性がある。
この課題を解決するために、生体内に近い組織構造をｉｎ  ｖｉｔｒｏで再現する方法、例えば凝集体状の塊を作製するための方法が多く研究され市販されている。例えば、ＡｌｇｉＭａｔｒｉｘ（登録商標）など３次元培養システムが販売されている。これらの方法では、操作が煩雑である上、担体の光透過性が平板と比較して低い。このため、非特許文献１に開示されたイメージング手法には適さない。
このような事情から、化合物のスクリーニング方法において、細胞機能を高度に保つことができる三次元培養細胞を用い、被験化合物が代謝されることにより毒性を生じさせる薬物代謝酵素をイメージング法で特定する分析技術が要請されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、立体的に培養した細胞に被験物質と代謝酵素阻害剤を同時に添加することによって、代謝物による毒性か否かを生細胞と死細胞を可視化して評価する新しいスクリーニング方法を発見した。
一実施形態の毒性スクリーニング方法は、被験化合物が肝臓の薬物代謝酵素によって代謝されて毒性を示すか否かを判定する方法であり、次の構成を含む。
（１）複数の肝細胞を立体的に培養する工程。
（２）前記被験化合物を含まない第１溶液、前記被験化合物を含む第２溶液、及び、薬物代謝酵素反応を阻害する１種類以上の阻害剤と前記被験化合物との第３溶液のそれぞれを、各肝細胞に曝露させることによって、異なる溶液と接触させた前記複数の肝細胞を取得する工程。ここでは、各肝細胞に第１乃至第３溶液のいずれかを曝露させ、第１乃至第３溶液のうちの一つと接触させた、３種類の肝細胞を得る。
（３）生細胞を認識する蛍光プローブ、死細胞を認識する蛍光プローブ、及びこれらの組合せからなる群から選択される蛍光プローブを含む溶液と前記複数の肝細胞とを接触させる工程。
（４）染色後の前記複数の肝細胞を用いて蛍光染色像を得て、前記蛍光染色像のデータを元に被験化合物の毒性を判定する工程。
立体的に培養した細胞に、被験物質と代謝酵素阻害剤を同時に添加することによって、肝細胞と同様の代謝機能を発現することが可能になる。加えて、蛍光プローブを用いて解析することにより、培養した肝細胞の代謝酵素が被験化合物を代謝した代謝物による毒性か否かを、生細胞と死細胞を可視化して評価することができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細胞機能を高度に保つことができる三次元培養細胞を用い、被験化合物が代謝されることにより毒性を生じさせる代謝酵素をイメージング法で特定する分析技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施形態で用いる培養プレートの全体を示す図である。
【図２Ａ】図１に示す培養プレートのＩＩ−ＩＩ線断面図である。
【図２Ｂ】図１に示す培養プレートの他のＩＩ−ＩＩ線断面図である。
【図３】本発明の一実施形態で用いる培養容器の全体を示す図である。
【図４】図３に示す培養容器のＩＶ−ＩＶ線断面図である。
【図５Ａ】培養空間で凝集体を培養する状態を表す概略図である。
【図５Ｂ】培養空間で培養した凝集体の好ましいサイズの一例を説明する模式図を示す図である。
【図５Ｃ】培養空間でスフェロイドを培養する状態を表す概略図である。
【図５Ｄ】培養空間で培養したスフェロイドの好ましいサイズの一例を説明する模式図を示す図である。
【図６Ａ】培養空間の他の形状例を示す図である。
【図６Ｂ】培養空間のさらに他の形状例を示す図である。
【図７Ａ】培養空間の他の側面の形状例を示す断面図である。
【図７Ｂ】培養空間のさらに他の側面の形状例を示す断面図である。
【図７Ｃ】培養空間のさらに他の側面の形状例を示す断面図である。
【図８】実施例で用いる培養プレートの一例を示す写真である。
【図９】実施例で培養した肝細胞の一例を示す写真である。
【図１０】実施例において、溶液（ｉ）〜（ｉｉｉ）を接触させた肝細胞の蛍光染色像の写真である。
【図１１】比較例において、溶液（ｉ）〜（ｉｉｉ）を接触させた肝細胞の蛍光染色像の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、実施形態について、図面を参照しながら説明する。説明の明確化のため、以下の記載及び図面は、適宜、省略、及び簡略化がなされている。各図面において同一の構成または機能を有する構成要素および相当部分には、同一の符号を付し、その説明は省略する。
【００１２】
本明細書では次の用語を用いる。
用語「凝集体」は、複数の細胞が少なくとも２層以上積層し立体的な形状を有する態様をいう。
用語「チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）」は、細菌から植物，哺乳動物に至るまでのほとんどすべての生物に存在する、異物（薬物）代謝の役割を果たす酵素である。動物では、主に肝臓に存在する。
【００１３】
用語「ウェルプレート」は、多数のくぼみ（穴またはウェル）のついた平板からなる実験・検査器具であり、各ウェルを試験管あるいはシャーレとして利用するものをいう。ウェルの数には、ウェルの数には例えば、６、２４、９６、３８４などがあり、それ以上の数のものもある。ウェルの底は平らなもの、丸いもののほか、細長いマイクロチューブを多数組み合わせた形式のもの（ディープウェルプレート）もある。
用語「薬物代謝酵素」は、薬、毒物などの生体外物質（ゼノバイオティクスXenobiotics、異物ともいう）を分解あるいは排出するための反応に関わる酵素の総称である。
用語「第Ｉ相薬物代謝酵素」は、第Ｉ相反応と呼ばれる対象物質の分子量を低くする（分解）、または大きく変えない反応として、エステルなどの加水分解、酸化反応、還元反応に関わる酵素群である。酸化反応は、主にシトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）による酸化である。
用語「第ＩＩ相薬物代謝酵素」は、第ＩＩ相反応と呼ばれる他の分子を付加する（分子量は大きくなる）反応で、抱合（ほうごう）ともいう反応において、付加される分子として、硫酸、酢酸、グルタチオン、グルクロン酸などを抱合する酵素群である。本明細書では「第ＩＩ相薬物代謝酵素」を、「第ＩＩ相酵素群」とも記載する。
【００１４】
以下の説明において、「値Ａから値Ｂの範囲」という場合には、特に明記していない限り、「値Ａ以上値Ｂ以下」を意味する。
加えて、「Ａ、Ｂ、・・・、Ｃ、及びこれらの組合せ」という記載の「これらの組合せ」は、その前に記載のＡ、Ｂ、・・・、Ｃのうちの二つ以上の任意の数の組合せであることを意味する。言い換えると、「Ａ、Ｂ、・・・、Ｃ、及びこれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、・・・、Ｃのうちのいずれか一つと、これらの任意の数の組合せとのうちの一方、ということもできる。
【００１５】
一実施形態は、立体培養した細胞に被験物質と代謝酵素阻害剤を同時に添加することで代謝物による毒性か否かを生細胞と死細胞を可視化して評価する新しいスクリーニング系を提供する。この方法では、非特許文献１のようなゲルを用いることなく立体培養でき、さらに、光透過性の高い培養方法であるため顕微鏡を使った可視化も可能である。毒性スクリーニング方法は、例えば、第１乃至第４工程の手順を実施する。以下に第１乃至第４工程の概略を説明する。なお、第１乃至第４工程は説明を容易にするために工程を分けたものであり、これに限られるものではない。
第１工程は、複数の肝細胞を立体的に培養する培養処理である。
第２工程は、被験化合物を含む溶液、被験化合物と薬物代謝酵素の阻害剤を含む溶液、または被験化合物を含まない溶液を立体的に培養した複数の肝細胞と接触させる被験化合物処理である。
第３工程は、蛍光プローブを含む溶液と複数の肝細胞とを接触させる蛍光プローブ処理である。
第４工程は、被験化合物の毒性を判定する判定処理である。
以下、一実施形態の評価方法について、最初に培養処理で用いる培養容器について説明し、次に、培養処理から判定処理までを実施する毒性スクリーニング方法の手順について詳細に説明する。
【００１６】
１．培養容器
培養容器は、肝細胞を立体的に培養できる培養容器を用いる。言い換えると、複数の細胞が積層して立体的な形状を有する肝細胞を製造できる培養容器であればよい。特に、凝集体形状を有する肝細胞を製造することが好ましい。以下に、培養容器の一例として、凝集体を形成させるための容器の好ましい例を説明する。
【００１７】
＊  培養容器の概略
図１は、本発明の一実施形態で用いる培養プレートの全体を示す図である。図２Ａは、図１に示す培養プレートのＩＩ−ＩＩ線断面図であり、図２Ｂに、他の態様の断面図を示す。培養プレート１は、複数のウェル２１を備える。複数のウェル２１は、仕切り部２２によって、隣り合うウェル２１と隔てられる。複数のウェル２１それぞれには、培養容器１０が形成されている。
図３に、本発明の実施形態で用いる培養容器の構成例を示す。図４は、図３に示す培養容器のＩＶ−ＩＶ線断面図である。
培養容器１０は、培養空間１１と、壁１２と、底部１３とを有する。
培養空間１１は、壁１２と底部１３とで仕切られた領域であり、細胞を培養する三次元の空間領域（培養領域）となる。培養空間１１は、単に「空間」、または「マイクロ空間」とも称する。
壁１２は、培養空間１１を仕切る隔壁であり、培養容器１０に凹凸パターンを形成する凸部ともいえる。培養空間１１が仕切り部２２に隣接する場合、壁１２は、図２Ａに示すように、仕切り部２２の壁面の一部分と同じになってもよいし、図２Ｂに示すように、仕切り部２２の壁面に隣接して壁１２が配置されてもよい。
底部１３は、培養容器１０の基板として機能するとともに、培養空間１１が配置される側の表面は、培養領域（培養表面）の一部となる。底部１３は、培養プレート１に形成された各ウェル２１の底部と同じ領域であり、各ウェル２１の底部が用いられる。底部１３は、培養空間１１の底を形成する。底部１３のうち、培養空間１１を形成する面の一部分であり、かつ、培養領域となる底部の表面を、「底部培養面１４」とも称する。
【００１８】
図３，４では、培養容器１０に形成される培養空間１１に関して、相当直径Ｄ、高さ（深さ）Ｈ、壁１２の幅（厚さ）Ｗ、及び、底部１３の厚さＴを示す。図３，４では、底部１３は、壁１２と一体として作製された場合を示している。
相当直径Ｄは、培養空間１１に内接する内接円の直径をいう。より詳しくは、相当直径Ｄは、培養空間１１の底部１３と平行する面の形状（正面の形状）、言い換えると、培養空間１１の高さＨの方向と垂直になる面の形状の内接円の直径をいう。培養空間１１の正面の形状が、高さＨに応じて異なる場合、肝細胞を培養する空間領域の最大値を相当直径とする。
高さＨは、培養空間１１の底（底部培養面１４）から壁１２の上面までの長さであり、培養空間１１の深さでもあるともいえる。また、底部培養面１４が平面の場合、高さＨは、壁１２の高さと同じである。
壁１２の幅Ｗは、壁１２の厚さであるとともに、隣接する培養空間１１間を隔てる距離であるともいえる。
【００１９】
培養容器１０内（言い換えると、各ウェル２１内）において、複数の培養空間１１は、図３に示すようにアレイ状に配置される。培養容器１０に含まれる培養空間１１の数または大きさは、培養プレート１に作製されるウェル２１の数（ウェル２１の大きさ）と培養空間１１及び壁１２の大きさに依存するものである。具体的には、ウェル２１の数が多くなるに従って、培養空間１１の数が小さくなる関係にある。同じ大きさのウェル２１のとき、ウェル２１の中の培養空間１１の数は、相当直径Ｄが大きい場合や幅Ｗが大きい場合に小さくなる関係にある。図１乃至４では、構成をわかりやすく説明するため、培養空間１１の数を少なくして表した概略図であり、培養容器１０に含まれる培養空間１１の数は実際とは異なる。加えて、図３，４では、９個の培養空間１１を示している。これは説明のために示したものであり、実際の培養容器１０（各ウェル２１）に含まれる培養空間１１の数に対応するものではない。
【００２０】
発明者らは、凝集体の直径が３０〜２００μｍであって、この大きさの凝集体を作製するためには、相当直径Ｄが所望する凝集体の直径の１〜５倍であり、高さＨが相当直径Ｄの０．１倍〜３倍である培養空間１１を複数有するとともに、該培養空間表面の水接触角が４５度以下である培養容器１０を使用し、各培養空間１１で肝細胞を培養することによって、上述した直径の肝細胞の凝集体を培養することができることを見出した。
【００２１】
図１乃至４を参照して、所望の凝集体を形成させるためのマイクロオーダの培養空間１１の大きさ、形状等と、培養表面の特性を説明する。
＊  培養空間の大きさ、形状等
細胞を播種した後、壁１１を乗り越えて隣り合う培養空間１１に移動しない、すなわち凝集体を形成するまでは、培養空間１１に細胞を保持しておくことが重要となる。そのため、高さＨが相当直径Ｄの０．１倍〜３倍であることが好ましく、細胞を保持するためにはＨは高いほうがよく、かつ、栄養分の供給を円滑に行うためには、高さＨは低い方が良いことから、高さＨが相当直径Ｄの０．２〜１倍がより好ましい。凝集体の相当直径は、培養空間１１によって規定されるため、培養空間１１の相当直径Ｄは、所望する凝集体の直径の１〜５倍の範囲が好ましく、１．２〜４倍の範囲がより好ましい。
例えば、直径１００μｍの肝細胞の凝集体を形成させるために、所望する凝集体の直径の１〜５倍の範囲、即ち、相当直径Ｄが１００〜５００μｍの範囲で、高さＨが相当直径の０．１〜３倍の範囲の培養空間１１が規則的に配置されている底部１３を有する培養容器１０を用いる。
【００２２】
一実施形態では、試験溶液を凝集体中心部まで拡散または輸送させるためには、凝集体の直径は最大２００μｍ未満、好ましくは１５０μｍ以下が好ましい。さらに加えて、細胞間の相互作用を最大限に引き出すためには、凝集体の直径は、最小５０μｍが好ましく、６０μｍ〜１５０μｍの範囲がより好ましい。
【００２３】
壁１２の幅Ｗは、培養空間１１と隣接する培養空間１１を隔てる壁１２の厚みである。従って、壁１２の幅Ｗは、壁１２の上面を超えて細胞が移動することを防ぐため、かつ、細胞が培養空間１１内に入りやすくするため、１０μｍ以上５０μｍ未満がよく、好ましくは、細胞体１個以下の大きさ、即ち５〜３０μｍの範囲が好ましく、５〜１０μｍの範囲がより好ましい。さらに、同様の観点から、壁１２の上面と培養空間１１の側面とのなす角θは、９０〜１３５度の範囲が好ましく、９０度〜１２０度の範囲がより好ましい。
【００２４】
図５Ａに、培養空間１１で凝集体を培養する状態を表す概略図を示す。図５Ａでは、図４に示す断面図を用い、凝集体９を、○印で示す。凝集体９は、複数の培養空間１１それぞれにおいて培養される。
図１に示す培養プレート１で培養する場合、ウェル２１毎に培養条件の設定、培地の交換等を実施することになる。そのため、各ウェル２１に複数の培養空間１１を形成するため、各ウェル２１において、同条件で複数の凝集体を培養することが可能になる。加えて、ウェルプレートを用いて凝集体を培養することができるため、従来の細胞培養で用いる装置等を利用することが可能になる。
凝集体９の直径ＤＳＰを値ｄｓｐ（ｄｓｐは正の数値）とすると、培養空間１１の相当直径Ｄは、値ｄｓｐから値ｄｓｐの５倍の範囲（ｄｓｐ≦Ｄ≦５ｄｓｐ）が好ましい範囲となる。また、培養空間１１の高さＨは、値ｄｓｐの０．３倍から値ｄｓｐの２５倍（５×５）の範囲（０．３ｄｓｐ≦Ｈ≦２５ｄｓｐ）が好ましい範囲となる。
【００２５】
図５Ｂに、培養空間で培養した凝集体の好ましいサイズの一例を説明する模式図を示す。図５Ｂは、凝集体９の相当直径Ｄに沿って切断した切断部端面を模式的に示した図である。上述したように、凝集体の直径の平均が３０μｍ以上２００μｍ未満であることが好ましく、特に、６０μｍ〜１５０μｍの範囲が好ましい。図５Ｂでは、凝集体９の切断部端面が５個の細胞８により形成されている様子を示す。例えば、細胞８の直径ＤＣＬが２０μｍであり、凝集体９の直径ＤＳＰが６０μｍの凝集体９を形成する場合には、例えば、細胞８が直線上に３個並ぶことにより形成される。同様に、凝集体９の直径ＤＳＰが１５０μｍの凝集体９を形成する場合には、例えば、細胞８が直線上に５個並ぶことにより形成される。図５Ｂは説明を容易にするために細胞８を直線上に並べて模式的に示したものであり、細胞８は必ずしも直線上に並ぶとは限らない。
加えて、培養する立体的な細胞は、凝集体９の下位概念である、スフェロイドを培養する場合であってもよい。図５Ｃに、培養空間１１でスフェロイド９ａを培養する状態を表す概略図を示し、図５Ｄに、培養空間で培養したスフェロイド９ａの好ましいサイズの一例を説明する模式図を示す。スフェロイド９ａは、凝集体９より球状に形成される細胞塊である。
【００２６】
加えて、１試験領域（１ウェル、１シャーレ）にある凝集体は、その直径が半値幅の範囲内にあるものが全体の７０％以上含まれることが好ましい。言い換えると、凝集体の直径の大きさがそろっていることが好ましい。その理由は以下の通りである。まず、凝集体の大きさによって代謝活性値が異なることが知られていることから、様々な直径の凝集体が混在していると精度の高い結果が得られない。また、小さい（５０μｍ以下の）凝集体の代謝機能は極端に低いことが知られている。即ち小さい凝集体は代謝物の生成量が少なく細胞死が観察できない場合が考えられる。毒性を判定する際には、１ウェル内で細胞死が起きている部分とそうでない部分が混在するため毒性有無を正確に判定することができない可能性がある。
【００２７】
培養空間１１の形状（正面の形状）、あるいは、底部１３と平行な面の形状は、図３に示す形状に限定されるものではなく、例えば、図６Ａ〜６Ｂに示すような形状であっても、その他の形状（楕円や菱形など）であってもよい。より高密度で均一な直径を有する凝集体を形成させるためには、左右対称構造であることが好ましい。
培養空間１１の側面の形状は、図４に示す形状に限定されるものではなく、例えば、図７Ａ〜７Ｃに示すような形状であってもよい。
【００２８】
培養容器１０を構成する材料としては、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、シリコン樹脂、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【００２９】
培養容器１０の底部１３の厚さＴは、観察性の観点から、１ｍｍ以下が好ましい。ただし、顕微鏡での観察に支障をきたさない限り、１ｍｍ以上であってもよく、底部１３の厚さＴを限定するものではない。培養容器の底部１３の観察性を確保することにより、培養プレートをそのまま用いて、培養した凝集体を観察することが可能になる。培養容器の観察性を確保することにより、培養容器をそのまま用いて、免疫組織学法による蛍光染色観察などのイメージング技術を適用することが可能となる。
加えて、培養容器１０の底部１３を構成するポリマーの全光線透過率が、８５％以上９９％未満であることが好ましい。全光線透過率（total luminous transmittance）は、日本工業規格（ＪＩＳ  Ｋ７３７５）により測定する。全光線透過率を高くすることにより、底部１３の上に培養された凝集体の観察性を確保することができる。さらに加えて、培養容器１０（ウェル）の底部の厚さが３００μｍ以下であることが好ましい。
【００３０】
＊  培養表面の特性
次に、細胞を培養する培養表面、すなわち、培養空間１１を囲む壁１２及び底部培養面１４の特性、特に親水化処理について説明する。培養表面は、各培養空間１１内に培地を入れるため、また、コーティング溶液を用いる場合には、その溶液が培養空間１１内に入り込まなければ表面を覆うことができない。このため、水接触角を４５度以下にすることが好ましい。より好ましくは０度〜２０度の範囲である。また、水接触角の値は、培養空間１１と壁１２の凹凸パターンが形成されていない平板を、培養容器１０と同条件で作製して測定した値を前提とする。
【００３１】
培養空間１１をアレイ状に配置した表面に関して、当該表面の疎水性が高く水接触角が４５度を超えると、すなわち濡れ性が低い場合は、培地やコート溶液を添加した際、空間に気泡が入りやすくなり、細胞が培養できない空間が生じることがある。そのため、水接触角が４５度以下になるよう、親水化を行うことが必要である。親水化する方法としては、ＳｉＯ２を蒸着する方法や、プラズマ処理を行う方法が挙げられる。
【００３２】
加えて、培養容器１０で効率よく凝集体を形成させるため、初代肝細胞では細胞接着性を高め、株化肝細胞の場合は細胞接着性を抑制することが好ましい。
上述した親水化処理を行った後、細胞接着性を促進する物質または細胞接着性を抑制する物質をコートして接着性を制御することにより、効率よく凝集体を形成させることができる。例えば、プラズマ処理を施し、水接触角を４５度以下にした後、ポリ‐L-リシンをコートして細胞接着性を高めてもよい。
【００３３】
２．培養処理から判定処理までの手順
一実施形態の毒性スクリーニング方法は、操作性の観点から、複数のウェルを備える培養プレートを用いることが好ましい。特に、培養処理（第１工程）から蛍光プローブ処理（第３工程）までを同一のウェル２１内（言い換えると、同一の細胞容器１０内）で行うことがより好ましい。特に、培養プレートの各ウェルには、凹凸パターンによって形成される複数の培養空間を有する培養容器が形成されていることが好ましい。そのため、一実施形態では、図１に示す培養プレート１の複数のウェル２１を用い、複数のウェル２１のうち、一つのウェル２１内で培養処理から蛍光プローブ処理までの工程を実施する場合を説明する。言い換えると、一つのウェル２１内で培養処理、被験化合物処理、及び蛍光プローブ処理を実施し、各処理で細胞を別のウェル２１に移動させることはない。
例えば、多数の化合物を同時にスクリーニングするような場合、自動培養装置や自動分析装置を用いる。このような場合には、コンタミネーションのリスクを減らすために、培養処理で形成させた立体的に培養した肝細胞を別の容器に移し替えることなく被験化合物処理及び蛍光プローブ処理を行うことが望ましい。
加えて、複数のウェルを有する培養プレート（ウェルプレート）形状を使用し検体数に応じて、６、２４、４８、９６、３８４ウェルのいずれかの培養プレートを選択することが好ましい。
【００３４】
＊  培養処理
培養処理では、上述した培養容器１０によって形成される複数の培養空間１１を用いる。ウェルプレート内の各ウェル２１には複数の培養空間１１が形成されている。各培養空間１１で肝細胞を立体的に培養し、複数の培養空間１１に複数の肝細胞を形成させる。言い換えると、ウェルプレート内で細胞を三次元的に培養し、所望の大きさの複数の肝細胞を形成する。
培養する肝細胞の由来は、ヒト、げっ歯類、ラット、イヌ、及びサルのうちいずれかから選択されることが好ましい。加えて、肝細胞は、初代肝細胞であることがより好ましい。
【００３５】
製造する肝細胞の相当直径は、３０μｍ以上２００μｍ未満が好ましい。
形成した凝集体が、被験化合物を代謝する代謝酵素を発現しているかを確認したうえで添加処理を実施することが好ましい。
【００３６】
凝集体形状の肝細胞を得る方法として、ローラーボトル培養、スピナーフラスコ培養、ハンギングドロップ培養など特に限定されない。しかし、これらの方法では培養方法に応じた装置を使用するため、凝集体形成処理と接触処理とを別々の容器で行う必要が生じる。発明者らは、上述した培養容器１０が形成されたウェル２１を用いることにより、同一の容器で凝集体形成処理と接触処理とを実施できることを発見した。これにより、操作が簡便になり、形成した凝集体を移動させることなく、細胞に第１乃至第３培地を添加することが可能になる。特に、多くの化合物を一度に評価するような医薬品のスクリーニングにおいて、自動培養装置に利用することが可能となる。加えて、細胞の損傷や汚染を防止することが可能になる。
【００３７】
＊  被験化合物処理
被験化合物処理では、被験化合物を含むまたは被験化合物を含まない、第１乃至第３溶液のいずれかを立体的に培養した肝細胞へ曝露させる。第１溶液は、被験物質を含まないコントロール溶液である。第２溶液は、被験化合物を含む被験溶液である。第３溶液は、薬物代謝酵素反応を阻害する１種類以上の化合物（薬物代謝酵素の阻害剤）と被験化合物とを混合した混合溶液である。第１乃至第３溶液のいずれかを各肝細胞へ曝露させることにより、異なる溶液と接触させた複数の肝細胞を得る。言い換えると、第１溶液と曝露させた複数の肝細胞、第２溶液と曝露させた複数の肝細胞、及び、第３溶液と曝露させた複数の肝細胞を得る。
各肝細胞に接触させる第１乃至第３溶液に用いる溶媒としては、蛍光染色像を得る際のバックグラウンドを小さくするためにフェノールレッドを含まない培地を用いることが好ましい。加えて、血清中に含まれるサイトカインによる細胞への影響を排除するために血清を含まないことが好ましい。一方で、各試験溶液と細胞を４８時間以上接触させる場合は細胞の生理機能を保つため０．１〜１％の範囲の血清を加えても良い。
【００３８】
第１乃至第３溶液の溶媒は２００〜３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏの浸透圧であって、ｐＨ域が６．８〜８．４に緩衝作用があればよい。加えて、細胞の生理機能を一定に保つためには、グルコース及びアミノ酸、ビタミン類などの栄養素が含まれているものを使用することが好ましい。例えばダルベッコ変法イーグル培地（ＤＥＭ：Dulbecco's Eagle medium）とNutrient Mixture F-12の混合培地を用いることで生理機能が一定に保たれる。
被験物質および薬物代謝酵素阻害剤の濃度は、任意の薬剤の濃度の溶液を１時間から９６時間の範囲で肝細胞と接触させ、生存率が８０％を超える濃度を採用する。濃度が低すぎる場合は反応性代謝物による毒性が観察されない場合も想定されるため、生存率が８０％を下回らない範囲でできる限り高い濃度の被験物質の溶液を最大濃度として用いることが好ましい。最大濃度の１／２〜１／１００の範囲の複数の濃度の被験物質を用いることがより好ましい。
【００３９】
＊  蛍光プルーブ処理
蛍光プローブ処理は、蛍光プローブを含む溶液と複数の肝細胞とを接触させる。蛍光プローブは、生細胞を認識する蛍光プローブ、死細胞を認識する蛍光プローブ、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
蛍光染色像を得る装置としては、共焦点レーザ顕微鏡または蛍光顕微鏡を用いる。
【００４０】
＊  判定処理
第４工程は、被験化合物の毒性を判定する判定処理である。判定処理は、染色後の複数の肝細胞を用いて蛍光染色像を得て、蛍光染色像のデータを元に被験化合物の毒性を判定する。蛍光染色像から判定条件を満たすことが検出されると、肝細胞による代謝を受けた被験化合物（反応性代謝物）が細胞毒性の要因であると判定する。言い換えると、被験化合物が肝細胞に有する薬物代謝酵素によって代謝を受けると、反応性代謝物が生成され、細胞毒性の要因となると判定できる。
蛍光染色像の判定は、蛍光領域または蛍光強度を用いる。以下に、３種類の判定条件を示す。これらの判定条件のいずれか一つまたは複数を用いて判定することができる。
【００４１】
蛍光領域を用いる場合には次の二種類の判定条件がある。
蛍光領域を次のように定義する。
第１溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第１生領域（Ａ）とする。
第２溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第２生領域（Ｂ）とする。
第３溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第３生領域（Ｃ）とする。
第１溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第１死領域（Ｄ）とする。
第２溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第２死領域（Ｅ）とする。
第３溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第３死領域（Ｆ）とする。
【００４２】
一つ目の判定条件は、以下の（１）と（２）との少なくとも一方であるときに肝細胞による代謝を受けた被験化合物が細胞毒性の要因であると判定する。
（１）第１生領域が第２生領域より大きく、かつ、第２生領域が第３生領域より小さい（Ａ＞Ｂ、かつ、Ｂ＜Ｃ）。
（２）第１死領域が第２死領域より小さく、かつ、第２死領域が第３死領域より大きい（Ｄ＜Ｅ、かつ、Ｅ＞Ｆ）
二つ目の判定条件は、
第１死領域を第１生領域で割った値が、第２死領域を第２生領域で割った値より小さく、かつ、第２死領域を第２生領域で割った値が、第３死領域を第３生領域で割った値より大きいとき、肝細胞による代謝を受けた被験化合物が細胞毒性の要因であると判定する。記号で表すと次のような関係式になる。
（Ｄ／Ａ）＜（Ｅ／Ｂ）、かつ、（Ｅ／Ｂ）＞（Ｆ／Ｃ）
【００４３】
蛍光強度を用いる場合には次の判定条件となる。
蛍光強度を次のように定義する。
第１溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光強度を第１生強度（Ｇ）とする。
第２溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光強度を第２生強度（Ｈ）とする。
第３溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光強度を第３生強度（Ｉ）とする。
第１溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光強度の第１死強度（Ｊ）とする。
第２溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光強度の第２死強度（Ｋ）とする。
第３溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光強度の第３死強度（Ｌ）とする。
判定条件は、以下の（３）と（４）との少なくとも一方であるときに肝細胞による代謝を受けた被験化合物が細胞毒性の要因であると判定する。
（３）第１生強度が第２生強度より大きく、かつ、第２生強度が第３生強度より小さい（Ｇ＞Ｈ、かつ、Ｈ＜Ｉ）。
（４）第１死強度が第２死強度より小さく、かつ、第２死強度が第３死強度より大きい（Ｊ＜Ｋ、かつ、Ｋ＞Ｌ）。
【００４４】
蛍光観察を行う領域について、目視または定量化して第１乃至第３溶液を接触させた肝細胞の蛍光強度または面積（領域）を比較する方法で判定する。このため、被験化合物処理の操作の前の細胞の状態がすべての観察領域で同じである必要がある。同条件（細胞播種密度、培地等）で培養した場合であっても培養底面の細胞の接着面積が視野によって異なることが想定される。そのため、被験化合物処理の操作を行う前にあらかじめ顕微鏡を用い、第１乃至第３溶液それぞれを接触させた肝細胞が存在する領域（面積）が同じ場所を数箇所選択し、蛍光プルーブ処理の工程では、あらかじめ決定しておいた場所を撮影することが好ましい。
この方法を用いることができない場合は、死細胞の面積と生細胞の面積との割合（死細胞の面積／生細胞の面積）を計算し判定することが好ましい。
【００４５】
以上説明したように、一実施形態によれば、立体的に培養した細胞に被験物質と代謝酵素阻害剤を同時に添加することによって、被験物質が代謝酵素により代謝された代謝物による毒性か否かを生細胞と死細胞を可視化して評価する新しいスクリーニング系を提供することができる。
また、一実施形態の培養処理は、特許文献１の培養方法に比べ、単一の細胞で毒性が発現した場合にそれがどの代謝酵素によるものかを評価できるので、複数種の細胞を維持する手間を省くことができる点で優れている。加えて、一実施形態の培養工程は、非特許文献１のようなゲルを用いることなく立体培養できる。さらに、一実施形態のスクリーニング方法は、培養処理から蛍光プローブ処理までの工程を、光透過性の高い培養プレートを用い、かつ、一連の処理を同じ培養プレートを用いる。このため、顕微鏡を使った可視化も可能である点で優れている。
【００４６】
一実施形態の毒性スクリーニング方法の実施例について説明するが、一実施形態はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４７】
［実施例］
１．細胞の準備（培養処理）
（１−１）肝細胞の調製
培養に用いる初代ラット肝細胞は以下のように調製した。６週齢のＳＤ系ラットの門脈にサーフロー留置針を挿入し、ＥＤＴＡ含有溶液を流して脱血液を行った後、コラゲナーゼ溶液を還流した。その後、コラゲナーゼ溶液で処理された肝臓を培養液へ入れ、メスピペットによるピペッティングで肝細胞を分散させた。肝細胞懸濁液を３回洗浄し、肝細胞以外の細胞を除去し、単離した肝細胞を培養に用いた。
【００４８】
（１−２）培養容器
図８に示す、２４個のウェル２１ａを有する培養プレート（２４ウェル培養プレート）１ａを使用した。各ウェル２１ａの底部培養面には凹凸パターン（微細パターン）によって複数の培養容器１０ａが形成されている。各培養容器１０ａは、相当直径Ｄが２００μｍ、高さＨが５０μｍで形成される培養空間１１ａを、底部培養面１４（培養底面）に有する。また、壁１２ａの幅Ｗは１０μｍである。
上述の凹凸パターンをフォトリソグラフィにより作製し、Ｎｉ電解メッキを行い、対応する凹凸形状を有する金型を得た。その金型を用い、ホットエンボス成形によりポリスチレン上にパターン転写を行い、前記寸法の樹脂基材を作製した。その樹脂基材表面へ真空蒸着により二酸化ケイ素膜を１００ｎｍ形成させ、γ線滅菌を行い、凹凸パターンによって形成される複数の細胞容器１０を得た。複数の培養容器１０によって形成される複数の培養空間１１で肝細胞を培養した。
【００４９】
（１−３）培養方法
ラット初代肝細胞を１×１０５個／ｃｍ２になるように培地に播種して５日間培養した。
培養に用いる培養液は以下のように調製した。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１０％  ウシ胎児血清、１μｇ／ｍｌ  インシュリン、１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ  デキサメタゾン、１０ｍＭ  ニコチンアミド、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン、５０μｍ  β−メルカプトエタノール、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、５９μｇ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを添加した。凹凸パターン基材上に、１．０×１０５細胞／ｃｍ２の濃度で肝細胞を播種し、５ｖｏｌ％ＣＯ２、３７℃で所定時間培養した。また、同組成の新鮮培地０．５ｍＬを用い、１日から２日毎に培地交換を行った。
【００５０】
（１−４）培養した細胞
図９に培養した肝細胞を示す。立体的に培養できていることが分かる。
【００５１】
２．試験条件・手順
（２−１）被験化合物
表１に示す溶液（ｉ）〜（ｉｉｉ）を用いた。被験物質として、アセトアミノフェン、チトクロムＰ４５０の阻害剤として、１−アミノベンゾトリアゾール（ＡＢＴ）を用いた。
アセトアミノフェンはチトクロムＰ４５０種に属するＣＹＰ２Ｅ１により代謝され毒性を示すことが知られている。
【００５２】
【表１】
2014061244.tif 000003
【００５３】
（２−１）試験手順
項目１．細胞の準備で説明した手順に従って、肝細胞を立体的に培養する。
次に、培地を吸い取り燐酸緩衝液で洗浄した後、表１の溶液（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかをそれぞれのウェルに添加し、異なる溶液を添加した複数のウェルを得る。各ウェルにおいて、肝細胞と添加した溶液とを２４時間反応させた。
反応後、生細胞を染色するためにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭとＭＣＢの２種類の蛍光試薬を用いた。Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭは細胞透過性があり、細胞内のエステラ−ゼによる加水分解を受けてＣａｌｃｅｉｎになり緑色の蛍光を示す。また、細胞死はグルタチオンの枯渇によって起こることが知られていることから、グルタチオンと反応し青色の蛍光を発するＭＣＢ（monochlorobimane）を用いて細胞を染色した。
【００５４】
３．試験結果（目視観察結果）
図１０に溶液（ｉ）〜（ｉｉｉ）を接触させた肝細胞の蛍光染色像の写真を示す。
Ｃａｌｃｅｉｎの列は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色した蛍光染色像である。ＭＣＢの列は、ＭＣＢで染色した蛍光染色像である。Ｍｅｒｇｅの列は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭの蛍光染色像とＭＣＢの蛍光染色像とを合併させた画像である。
溶液（ｉ）〜（ｉｉｉ）により蛍光強度に違いが見られる。生細胞を認識するＣａｌｃｅｉｎ、ＭＣＢは、Ａ＞Ｂ、Ｂ＜ＣとなりアセトアミノフェンがチトクロムＰ４５０で代謝されたことにより毒性を示すことが判断できる。
【００５５】
［比較例］
１．細胞の準備（培養処理）
培養プレートは市販されている培養底面が平板な培養プレート（ベクトン・ディッキンソン製、ファルコン（登録商標）のγ線滅菌済み平面状２４ウェル培養プレート）を用いた。
ラット初代肝細胞を１×１０５個／ｃｍ２になるように播種し７日間培養した。
上記以外は実施例と同じ条件とした。
２．試験条件・手順
（２−１）被験化合物
表２に示す溶液（ｉ）〜（ｉｉｉ）を用いた。
【００５６】
【表２】
2014061244.tif 000004
【００５７】
（２−１）試験手順
項目１．細胞の準備で説明した手順に従って、肝細胞を平面状の培養プレートを用いて培養する。
次に、培地を吸い取り燐酸緩衝液で洗浄した後、表２の溶液（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかをそれぞれのウェルに添加し、異なる溶液を添加した複数のウェルを得る。各ウェルにおいて、肝細胞と添加した溶液とを２４時間反応させた。
反応後、生細胞を染色するためにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭとＭＣＢの２種類の蛍光試薬を用いた。
３．試験結果（目視観察結果）
図１１に溶液（ｉ）〜（ｉｉｉ）を接触させた肝細胞の蛍光染色像の写真を示す。図１１は、図１０と同様に、各列に染色した染色試薬ごとに結果を示している。
溶液（ｉ）〜（ｉｉｉ）ともに同程度の染色強度で毒性が検知できなかった。
【００５８】
上述した実施例で用いた被験物質、代謝酵素、及びその阻害剤は一例であり、他の阻害剤であっても一実施形態の評価方法を適用することができることは言うまでもない。
【００５９】
なお、本発明は上記に示す実施形態に限定されるものではない。本発明の範囲において、上記実施形態の各要素を、当業者であれば容易に考えうる内容に変更、追加、変換することが可能である。
【００６０】
この出願は、２０１２年１０月１８日に出願された日本出願特願２０１２−２３１２２６を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【符号の説明】
【００６１】
１、１ａ  培養プレート
８  細胞
９  凝集体
９ａ  スフェロイド
１０、１０ａ  培養容器
１１、１１ａ  培養空間
１２  壁
１３  底部
１４  底部培養面
２１、２１ａ  ウェル
２２  仕切り部
【図１】
2014061244.tif 000005
【図２Ａ】
2014061244.tif 000006
【図２Ｂ】
2014061244.tif 000007
【図３】
2014061244.tif 000008
【図４】
2014061244.tif 000009
【図５Ａ】
2014061244.tif 000010
【図５Ｂ】
2014061244.tif 000011
【図５Ｃ】
2014061244.tif 000012
【図５Ｄ】
2014061244.tif 000013
【図６Ａ】
2014061244.tif 000014
【図６Ｂ】
2014061244.tif 000015
【図７Ａ】
2014061244.tif 000016
【図７Ｂ】
2014061244.tif 000017
【図７Ｃ】
2014061244.tif 000018
【図８】
2014061244.tif 000019
【図９】
2014061244.tif 000020
【図１０】
2014061244.tif 000021
【図１１】
2014061244.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成26年3月11日(2014.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験化合物が肝臓の薬物代謝酵素によって代謝されて毒性を示すか否かを判定する毒性スクリーニング方法であって、
複数の肝細胞を立体的に培養する工程と、
前記被験化合物を含まない第１溶液、前記被験化合物を含む第２溶液、及び、薬物代謝酵素反応を阻害する１種類以上の阻害剤と前記被験化合物との第３溶液のそれぞれを、各肝細胞と曝露させることによって、異なる溶液と接触させた前記複数の肝細胞を取得する工程と、
生細胞を認識する蛍光プローブ、死細胞を認識する蛍光プローブ、及びこれらの組合せからなる群から選択される蛍光プローブを含む溶液と前記複数の肝細胞とを接触させる工程と、
染色後の前記複数の肝細胞を用いて蛍光染色像を得て、前記蛍光染色像のデータを元に被験化合物の毒性を判定する工程と、
を含む毒性スクリーニング方法。
【請求項２】
前記被験化合物の毒性を判定する工程は、前記第１溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第１生領域、前記第２溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第２生領域、前記第３溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第３生領域、前記第１溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第１死領域、前記第２溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第２死領域、前記第３溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第３死領域とした場合、
第１生領域＞第２生領域、かつ、第２生領域＜第３生領域と、
第１死領域＜第２死領域、かつ、第２死領域＞第３死領域と、
の少なくともとも一方であるとき、各肝細胞による代謝を受けた被験化合物が細胞毒性の要因であると判定することを特徴とする請求項１記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項３】
前記被験化合物の毒性を判定する工程は、前記第１溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第１生領域、前記第２溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第２生領域、前記第３溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光領域を第３生領域、前記第１溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第１死領域、前記第２溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第２死領域、前記第３溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光領域の第３死領域とした場合、
（第１死領域／第１生領域）＜（第２死領域／第２生領域）、かつ、（第２死領域／第２生領域）＞（第３死領域／第３生領域）であるとき、各肝細胞による代謝を受けた被験化合物が細胞毒性の要因であると判定することを特徴とする請求項１記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項４】
前記被験化合物の毒性を判定する工程は、前記第１溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光強度を第１生強度、前記第２溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光強度を第２生強度、前記第３溶液と接触させた肝細胞の生細胞を認識する蛍光強度を第３生強度、前記第１溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光強度の第１死強度、前記第２溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光強度の第２死強度、前記第３溶液と接触させた肝細胞の死細胞を認識する蛍光強度の第３死強度とした場合、
第１生強度＞第２生強度、かつ、第２生強度＜第３生強度と、
第１死強度＜第２死強度、かつ、第２死強度＞第３死強度と、
の少なくともとも一方であるとき、各肝細胞による代謝を受けた被験化合物が細胞毒性の要因であると判定することを特徴とする請求項１記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項５】
前記複数の肝細胞は、複数のウェルを有する培養プレートを用いて培養され、
各ウェル内で前記複数の肝細胞を培養し、培養した前記複数の肝細胞を他の容器に移し替えることなく、前記各ウェルに前記第１乃至第３溶液のいずれかを添加し反応させた後、前記各ウェルに前記蛍光プローブを添加することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項６】
各肝細胞は、細胞が凝集した凝集体を形成していることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項７】
前記凝集体の相当直径が３０μｍ以上２００μｍ未満であることを特徴とする請求項６記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項８】
前記薬物代謝酵素反応を阻害する１種類以上の化合物が、チトクロムＰ４５０酵素群、第ＩＩ相薬物代謝酵素、及びこれらの組合せからなる群から選択される薬物代謝酵素の薬物代謝酵素反応を阻害する１種類以上の化合物であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項９】
前記薬物代謝酵素反応を阻害する１種類以上の化合物が、チトクロムＰ４５０酵素群であって、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ１１、ＣＹＰ２Ｄ６、及びＣＹＰ２Ｅ１からなる群から選択される薬物代謝酵素の薬物代謝酵素反応を阻害する１種類以上の化合物であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１０】
前記複数の肝細胞の由来が、ヒト、げっ歯類、ラット、イヌ、及びサルのうちいずれかから選択されることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１１】
前記複数の肝細胞が初代肝細胞であることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１２】
前記複数の肝細胞は、複数のウェルを有する培養プレートを用いて培養され、
各ウェルは、複数の培養空間を有する培養容器が形成され、
前記複数の培養空間は、各培養容器の底からの高さが２５〜５００μｍの範囲の壁で囲まれ、かつ、相当直径５０〜１０００μｍの範囲の空間が規則的に配列して形成され、
前記複数の肝細胞を立体的に培養する工程は、前記複数の培養空間を用いて複数の肝細胞の凝集体を作製することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１３】
前記壁の厚さが１０μｍ以上５０μｍ未満であることを特徴とする請求項１２記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１４】
前記培養容器の底部を構成するポリマーの全光線透過率が８５％以上９９％未満であることを特徴とする請求項１２または１３に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１５】
前記培養容器が、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、シリコン樹脂、及びこれらの組合せからなる群から選択される樹脂成形品であることを特徴とする請求項１２乃至１４のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１６】
前記培養容器の底部の厚さが３００μｍ以下であることを特徴とする請求項１２乃至１５のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１７】
前記培養容器の底部培養面が親水化処理されていることを特徴とする請求項１２乃至１６のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１８】
前記培養容器の底部培養面が、ガラスであって、水接触角を４５度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項１２乃至１７のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項１９】
前記培養容器の底部培養面が、プラズマ処理により官能基を形成させて、水接触角を４５度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項１２乃至１８のいずれか一項に記載の毒性スクリーニング方法。
【請求項２０】
前記親水化処理された前記底部培養面に、さらに、細胞接着性を促進するポリマーである、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、及びこれら組合せからなる群から選択されるポリマーが固定化されていることを特徴とする請求項１７記載の毒性スクリーニング方法。
【国際調査報告】
2014061244.tif 000023
2014061244.tif 000024
2014061244.tif 000025
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