(57)【要約】本発明の課題は、ロットによる成分の濃度にばらつきを排した培地を提供するべく、ＹＰＤ培地と同程度又はそれ以上の増殖能力を酵母に付与する培地、好ましくは化学合成培地を提供することにある。  酵母が資化可能な炭素源としての糖類と、窒素源としてのアミノ酸類と、ビタミン類と、イノシトールと、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）と、カリウムイオン（Ｋ＋）とマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）とが含まれ、かつ、イノシトール濃度が５０〜１００００ｍｇ／Ｌである、酵母用培地を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母が資化可能な炭素源としての糖類と、窒素源としてのアミノ酸類と、ビタミン類と、イノシトールと、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）と、カリウムイオン（Ｋ＋）とマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）とが含まれ、かつ、イノシトール濃度が５０〜１００００ｍｇ／Ｌである、酵母用培地。
【請求項２】
イノシトールが増殖制限因子であることを特徴とする請求項１記載の酵母用培地。
【請求項３】
さらに、窒素源として、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、チミンから選ばれる１又は２以上の核酸塩基が含まれる請求項１又は２記載の酵母用培地。
【請求項４】
窒素源としてのアミノ酸類として、アスパラギン酸が含まれることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の酵母用培地。
【請求項５】
窒素源としてのアミノ酸類として、アスパラギン酸、アルギニン、リジン、プロリン、グルタミン酸、アラニン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、チロシン、メチオニン、セリン、スレオニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、ロイシン、トリプトファン、ヒスチジンから選ばれる少なくとも３種類が含まれることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の酵母用培地。
【請求項６】
チロシンに代えてアセチルチロシンが含まれることを特徴とする請求項５記載の酵母用培地。
【請求項７】
窒素源として、硫酸アンモニウムを含まないことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の酵母用培地。
【請求項８】
窒素源として、塩化アンモニウムを含まないことを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の酵母用培地。
【請求項９】
窒素源として、酢酸アンモニウムを含まないことを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の酵母用培地。
【請求項１０】
ビタミン類として、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン、ピリドキシン、チアミンから選ばれる少なくとも２種類が含まれることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の酵母用培地。
【請求項１１】
パントテン酸に代えてβ−アラニンが含まれることを特徴とする請求項１０記載の酵母用培地。
【請求項１２】
酵母が資化可能な炭素源としての糖類として、グルコース、ラクトース、マンノース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラフィノースから選ばれる１又は２以上の糖類が含まれることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか記載の酵母用培地。
【請求項１３】
酵母抽出エキスを含まないことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載の酵母用培地。
【請求項１４】
サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株の２４時間後の酵母の増殖性をＯＤ６００で表した場合、ＯＤ６００の値が、ＹＰＤ培地の８０％以上であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の酵母用培地。
【請求項１５】
ＹＰＤ培地の９０％以上であることを特徴とする請求項１４記載の酵母用培地。
【請求項１６】
酵母が、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、及びシゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のいずれかに属することを特徴とする請求項１〜１５のいずれか記載の酵母用培地。
【請求項１７】
酵母がサッカロマイセス属に属し、ビタミン類としてビオチン及びパントテン酸が含まれることを特徴とする請求項１６記載の酵母用培地。
【請求項１８】
酵母がクルベイロマイセス属に属し、ビタミン類としてパントテン酸、ビオチン、及びナイアシンが含まれることを特徴とする請求項１６記載の酵母用培地。
【請求項１９】
酵母がキャンディダ属に属し、ビタミン類としてピリドキシン、ビオチン、パントテン酸、チアミン、及びナイアシンから選ばれる１又は２以上が含まれることを特徴とする請求項１６記載の酵母用培地。
【請求項２０】
以下の表１に示される培地組成を有する酵母用ＡＹＤ培地。
【表１】
2014030774.tif 000016
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか記載の酵母用培地で酵母を好気的条件下で培養することを特徴とする酵母の培養方法。
【請求項２２】
請求項２０記載の酵母用培地から、特定成分を除去した培地にて酵母を好気的条件下で増殖させることにより、該酵母の栄養要求性を判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母用培地や、該酵母用培地で酵母を好気的条件下で培養する酵母の培養方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物や培養細胞等の培養できる生物を培養する培地としては、富栄養培地（Ｒｉｃｈ  ｍｅｄｉｕｍ）と合成培地の２種類に大別される。微生物の増殖や有用物質生産の効率は培地組成によって大きく左右されることも多く、培地組成は非常に重要であるといわれている。通常、微生物を培養する培地は、炭素源、窒素源、ミネラル、ビタミン、特定の増殖因子等で構成されていることが知られているが、富栄養培地が増殖に至適とされ、個々の化学物質の種類と濃度がわかっている合成培地が、増殖性において富栄養培地を超えることはないとされている。
従来、酵母の培養に用いられる富栄養培地としては、１％のＹｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（酵母抽出エキス）と２％ペプトン（カゼイン部分分解物）と２％ｄｅｘｔｒｏｓｅ（＝グルコース）とで構成されるＹＰＤ培地が広く用いられているが、コスト的にも高価である。そのため、ＹＰＤ培地は、一般の企業では、研究レベルからパイロットプラントレベルまでの使用が大部分であるとされる。しかし、ＹＰＤ培地は、天然抽出物を組成として含むために詳細な構成化学物質成分が不明であり、製造ロットによる成分のばらつきがあり、その結果として、増殖性や発酵性など生物活性がロットにより大きく変動することがあるといわれている。また、大量発酵製造の際には、安価な廃糖蜜が使用されることがほとんどであるが、近年廃糖蜜についてもコストの上昇傾向がみられ、廃糖蜜に代わる安価な培地が求められている。
一方、酵母の培養に用いられる合成培地としては、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍにより１９４６年に作製されたＹＮＢ培地（イーストニトロジェンベース）が安価で入手できるため、未だに変異株の栄養要求性の検討等の研究に際しては広く用いられているが、富栄養培地と比べ酵母を培養した場合の増殖速度は遅いため、大規模な発酵生産を行う場合などには利用されておらず、また、構成成分が明確ではあるものの、いかなる構成成分が増殖や発酵においてどのような役割を果たしているかは明確になっていない。その他、０．６７％ＹＮＢ培地ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｗ／ｏ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅに０．５％（ＮＨ４）２ＳＯ４と２％グルコースを添加したＭＭ培地等が実験用合成培地として用いられている。
その他酵母用培地としては、酵母用栄養培地に３．５〜１０％（Ｗ／Ｖ）グルコース及び０．８〜１．２％（Ｗ／Ｖ）塩化マンガンを含み、１％（Ｗ／Ｖ）以上の食塩を含まないエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離識別用寒天培地（例えば、特許文献１参照）や、培地が２０〜１６０ｇ／Ｌの濃度のカザミノ酸を含むことを特徴とする、酵母細胞から外来遺伝子生成物を発現させるための培地（例えば、特許文献２参照）や、炭素源としてのペントース及び窒素源としてのアミノ酸が少なくとも配合されていることを特徴とする４−ハイドロキシ−２（又は５）−エチル−５（又は２）−メチル−３（２Ｈ）−フラノン製造用培地組成物（例えば、特許文献３参照）や、チゴサッカロミセス・ベイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）及びチゴサッカロミセス・ビスポラス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ）の酵母のための鑑別又は選択培地であって、例えばミオイノシトール４．０％（ｗ／ｖ）等のビタミン、微量元素、唯一の炭素源及びエネルギー源としてのグルコース及びギ酸、適合した酸−塩基指示薬、及び任意により抗生物質細菌発育阻止剤及び寒天で補足された基礎無機培地を含む培地（例えば、特許文献４参照）や、乳酸合成能力を有する酵母を含む微生物を培養する発酵によって乳酸を製造するための培地であって、葉酸又は葉酸前駆体を１０μｇ／Ｌ以上７０μｇ／Ｌ以下含む乳酸製造用培地（例えば、特許文献５参照）や、オレイン酸、乳酸、パルミチン酸、グルタミン酸、クエン酸、カリウムイオン、カルシウムイオン、亜鉛イオン、第二鉄イオン、マンガンイオン、ビオチン、チアミン、ピロドキシン、イノシトール、ニコチンアミド、葉酸、リボフラビン及びコリンイオンから構成される、酵母細胞抽出物を含まない、溶液での酵母発酵培地（例えば、特許文献６参照）や、自動的にｐＨを調整する乾燥粉末培養培地を用いて酵母細胞、植物細胞を含む真核細胞を培養する方法（例えば、特許文献７参照）が提案されている。
微生物や細胞の増殖用の完全合成培地としては、ヒト組換型上皮細胞増殖因子等を含有する基本培地に、ポリビニルピロリドン、アスコルビン酸リン酸エステル、脂質類及びコレステロールを添加した哺乳動物線維芽細胞用完全合成培地（例えば、特許文献８参照）や、グルココルチコイド、プロラクチン、コレラトキシンおよび肝臓細胞増殖因子を含有する、融解後のヒト凍結初代肝細胞培養用無血清完全合成培地（例えば、特許文献９参照）が提案されている。また、化学的に明確な培地の化学的に明確な構成成分が、グルコース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトデキストリン類、澱粉およびイヌリン等の炭水化物；グリセリン；植物油；炭化水素類；メタノールおよびエタノール等のアルコール類；酢酸塩およびより高級なアルカン酸等の有機酸からなる群から選ばれる炭素源と、尿素；アンモニア；硝酸塩；硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム等のアンモニウム塩；並びにグルタミン酸塩およびリシン等のアミノ酸類からなる群から選ばれる窒素源であることを特徴とする、本質的に化学的に明確な構成成分からなる化学的に明確な培地である発酵培地において工業的規模で微生物株の発酵を行うこと、および発酵培養液から有用化合物を回収することの各工程を含む有用化合物の生産方法（例えば、特許文献１０参照）が提案されている。
酵母の増殖に関しては、脂質と蛋白質の複合体を培地に添加する酵母増殖の促進方法（例えば、特許文献１１参照）や、β−グルカンを有効成分として含有する真菌増殖促進用組成物を含有する培地（例えば、特許文献１２参照）や、グルコース供給源およびアピオースを含有する微生物増殖促進組成物であり、グルコース１００質量部に対し、アピオースを１質量部以上含有する酵母等の真菌を含む微生物増殖促進組成物（例えば、特許文献１３参照）や、廃糖蜜中における酵母の増殖を促進する因子として同定されたフラボノイド類を化学合成して添加した、高糖生地発酵力を増強するための廃糖蜜由来成分を用いない酵母培養培地（例えば、特許文献１４参照）等が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許３９０４１８７号公報
【特許文献２】特公平７−１０６１４１号公報
【特許文献３】特開２００１−１２０２９３号公報
【特許文献４】特表２００３−５０１０４７号公報
【特許文献５】特開２００８−３０１７６６号公報
【特許文献６】特表２００５−５０３７８４号公報
【特許文献７】特開２００９−１６５４８５号公報
【特許文献８】特開２００６−１５８３８８号公報
【特許文献９】特開２００２−２３３３９９号公報
【特許文献１０】特開２００８−２０００５３号公報
【特許文献１１】特開２００６−０８１４４６号公報
【特許文献１２】特開２００９‐１４８２０１号公報
【特許文献１３】特開２００８‐２４５６０２号公報
【特許文献１４】特開２００７‐２５２３４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
高い発酵能を持つパン酵母の探索において、現在一般に使用されているＹＰＤ培地は、ロットにより成分の濃度にばらつきがあり、その結果として、増殖性など生物活性がロットにより大きく変動することが知られている。したがって、ロットごとの結果の相違に検討を要したり、優良ロットを選択するために労力と時間を費やしたりしなければならないという問題があり、ロットによる成分の濃度にばらつきを排した培地の提供が望まれている。
本発明の課題は、ＹＰＤ培地と同程度又はそれ以上の増殖能力を酵母に付与する培地、好ましくは化学合成培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明者らは、まず、窒素源として広く用いられている硫酸アンモニウムを添加した培地で酵母を培養すると、ｐＨが顕著に低くなることに着目し、硫酸アンモニウムをアミノ酸に代替して、増殖性を検討した。その結果、硫酸アンモニウムを添加した場合よりも著しく増殖性が高い培地を作製することができた。しかしながら、ＹＰＤ培地に匹敵するほどの増殖性を達成することはできなかったため、さらに検討を続け、ＹＰＤ培地に含まれる酵母抽出液中において、既存の合成培地に含まれていない増殖性を高めるために有用な成分があるのではないかと探索をおこなったが、顕著に増殖性を増大させる特定の因子を見いだすことはできなかった。そこで、既存の化学合成培地から構成成分を１又は２以上ドロップアウトさせることで、特に増殖性に有用と思われる成分を探索し、いくつかの成分が、酵母の増殖にとって必須であることや、いくつかの成分が、酵母の増殖にとって必須ではなく、あるいは悪影響を与えることを確認した。また、ＹＮＢに添加されているマンガン、銅、ホウ酸、ナトリウム、モリブデン、葉酸、ＰＡＢＡ、リボフラビンは、酵母の増殖性には特によい影響を与えることはないということを確認した。しかし、アミノ酸を全く添加しなければ増殖性は落ちるが、アミノ酸を一つずつドロップアウトさせても特に増殖性を減少させるアミノ酸は確認できず、構成成分が組み合わされることにより、酵母の増殖性に貢献するものであろうと推測せざるを得なかった。このように、ＹＰＤと同等の増殖性を有する培地の成分構成を決定することは困難を極めた。しかし、その後も試行錯誤を続け、驚くべきことにｍｙｏ−イノシトールについて、酵母の培養に広く用いられているＭＭ培地（ＹＮＢ（アミノ酸、硫酸アンモニウム、及びグルコースを含まない）（Ｙ２０３０、“Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ＡＡ，ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ＆  ｗ／ｏ  ＡＳ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ＵＳＡ社製）０．１７％に、窒素源として硫酸アンモニウム０．５％と、炭素源としてグルコース２％を添加した組成）の約５００倍の量を添加したところ、ＹＰＤ培地と同程度の増殖性を示すことを確認した。ｍｙｏ−イノシトールが律速段階となるよう他の構成成分について添加量を検討し、ＹＰＤと同等の増殖性を有する培地を有する成分構成を決定し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、（１）酵母が資化可能な炭素源としての糖類と、窒素源としてのアミノ酸類と、ビタミン類と、イノシトールと、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）と、カリウムイオン（Ｋ＋）とマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）とが含まれ、かつ、イノシトール濃度が５０〜１００００ｍｇ／Ｌである、酵母用培地や、（２）イノシトールが増殖制限因子であることを特徴とする上記（１）記載の酵母用培地や、（３）さらに、窒素源として、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、チミンから選ばれる１又は２以上の核酸塩基が含まれる上記（１）又は（２）記載の酵母用培地や、（４）窒素源としてのアミノ酸類として、アスパラギン酸が含まれることを特徴とする上記（１）〜（３）いずれか記載の酵母用培地や、（５）窒素源としてのアミノ酸類として、アスパラギン酸、アルギニン、リジン、プロリン、グルタミン酸、アラニン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、チロシン、メチオニン、セリン、スレオニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、ロイシン、トリプトファン、ヒスチジンから選ばれる少なくとも３種類が含まれることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の酵母用培地や、（６）チロシンに代えてアセチルチロシンが含まれることを特徴とする上記（５）記載の酵母用培地や、（７）窒素源として、硫酸アンモニウムを含まないことを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載の酵母用培地や、（８）窒素源として、塩化アンモニウムを含まないことを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれか記載の酵母用培地や、（９）窒素源として、酢酸アンモニウムを含まないことを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載の酵母用培地や、（１０）ビタミン類として、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン、ピリドキシン、チアミンから選ばれる少なくとも２種類が含まれることを特徴とする上記（１）〜（９）のいずれか記載の酵母用培地や、（１１）パントテン酸に代えてβ−アラニンが含まれることを特徴とする上記（１０）記載の酵母用培地や、（１２）酵母が資化可能な炭素源としての糖類として、グルコース、ラクトース、マンノース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラフィノースから選ばれる１又は２以上の糖類が含まれることを特徴とする上記（１）〜（１１）のいずれか記載の酵母用培地や、（１３）酵母抽出エキスを含まないことを特徴とする上記（１）〜（１２）のいずれか記載の酵母用培地や、（１４）サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株の２４時間後の酵母の増殖性をＯＤ６００で表した場合、ＯＤ６００の値が、ＹＰＤ培地の８０％以上であることを特徴とする上記（１）〜（１３）のいずれか記載の酵母用培地や、（１５）ＹＰＤ培地の９０％以上であることを特徴とする上記（１４）記載の酵母用培地に関する。
また、本発明は、（１６）酵母が、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、及びシゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のいずれかに属することを特徴とする上記（１）〜（１５）のいずれか記載の酵母用培地や、（１７）酵母がサッカロマイセス属に属し、ビタミン類としてパントテン酸及びビオチンが含まれることを特徴とする上記（１６）記載の酵母用培地や、（１８）酵母がクルベイロマイセス属に属し、ビタミン類としてパントテン酸、ビオチン、及びナイアシンが含まれることを特徴とする上記（１６）記載の酵母用培地や、（１９）酵母がキャンディダ属に属し、ビタミン類としてピリドキシン、ビオチン、パントテン酸、チアミン、及びナイアシンから選ばれる１又は２以上が含まれることを特徴とする上記（１６）記載の酵母用培地に関する。
さらに本発明は、（２０）以下の表１に示される培地組成を有する酵母用ＡＹＤ培地に関する。
【表１】
2014030774.tif 000002
本発明はまた、（２１）上記（１）〜（２０）のいずれか記載の酵母用培地で酵母を好気的条件下で培養することを特徴とする酵母の培養方法や、（２２）上記（２０）記載の酵母用ＡＹＤ培地から、特定成分を除去した培地にて酵母を好気的条件下で増殖させることにより、該酵母の栄養要求性を判定する方法に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によると、製パン酵母にとどまらず、酒、味噌、醤油、つけもの等の醸造飲食品の製造に使用される酵母など産業上有用な酵母の研究室レベルでの検討がより効率のよいものとなり、高い発酵能を持つ酵母培養法が確立でき、生産の安定化やコスト削減が可能となる。また、酵母培養における重要な因子の発見等、微生物学・発酵産業によりよい影響を与えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＹＮＢ０．１７％に、グルコース２％と、ポリペプトン又は酵母抽出エキスとを添加した培地における酵母の増殖性を示す図である。縦軸はＯＤ６００を示す。
【図２】ＹＮＢ０．１７％にグルコース２％と、アスパラギン酸又は硫酸アンモニウムとを添加した培地における酵母を培養したときのＯＤ６００を示す図である。縦軸はＯＤ６００を示す。
【図３】酵母抽出エキスの分画試料を培地に添加して培養した２４時間後のＯＤ６００を示す図である。縦軸はＯＤ６００を示す。
【図４】ＢＭ培地に以下の成分を添加した培地に酵母を培養した２４時間後のＯＤ６００を示す図である。ＹＰＤ及びＹＥ（酵母抽出エキス）をコントロールとした。縦軸はＯＤ６００を示す。（ａ）はＡｃｅｔｙｌ−ＣｏＡとＣｏＡの添加結果を、（ｂ）はイーストＲＮＡ（ＲＮＡ）の添加結果を、（ｃ）はＮＡＤの添加結果を示す。
【図５】ＢＭ培地においてグルコースの代わりに、ガラクトース、ラフィノース、トレハロース、フルクトース、マルトース、マンノース、スクロース、リボース、又はＤＮＡを添加した培地に酵母を培養したときの２４時間後のＯＤ６００を示す図である。縦軸はＯＤ６００を示す。
【図６】グルコースを含む又は含まないＢＭ培地にエタノール、グリセロール、アルブミンを添加し、酵母を培養したときの２４時間後のＯＤ６００を示す図である。（ａ）は、エタノール、グリセロールの結果を、（ｂ）はアルブミンの結果を示す。縦軸はＯＤ６００を示す。
【図７】グルコースを２％含むＢＭ培地に複数の糖を混合して添加した培地に酵母を培養したときのＯＤ６００を示す図である。（ａ）ガラクトースを添加した場合の結果を示す。（ｂ）は、フルクトース１％に、さらにラフィノース又はマンノースを混合して添加した場合の結果を示す。（ｃ）は、フルクトース１％に、さらにスクロースを添加した場合の結果を示す。（ｄ）はマルトースを添加した場合の結果を示す。いずれの場合もグルコース２％とＹＰＤとをコントロールとした。縦軸はＯＤ６００を示す。
【図８】ＳｙｎＡＡ培地から、ビタミンミックス（Ｖ）、金属イオンミックス（Ｍ）、及び無機イオンミックス（Ｉｏｎ）の３つの成分ミックスのうち１つずつ欠如させた培地で培養した結果を示す図である。
【図９】ＳｙｎＡＡ培地から無機イオンミックスを構成する成分について、一成分ずつ排除した培地で培養した結果を示す図である。凡例１（Ｉｏｎ  ｍｉｘ）は、ＳｙｎＡＡ培地の（ポジティブコントロール）の結果を示す。
【図１０】ＳｙｎＡＡ培地に含まれるＫＨ２ＰＯ４の濃度の相違によるサッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図１１】ＳｙｎＡＡ培地において、ＫＨ２ＰＯ４の代わりに０．１％のＮａＨ２ＰＯ４を添加した培地に、２０時間経過後に０．１％ＫＣｌを添加した場合のサッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図１２】ＳｙｎＡＡ培地に含まれるＭｇＳＯ４の濃度の相違による、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図１３】ＳｙｎＡＡ培地に含まれるＭｇＣｌ２の濃度の相違による、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図１４】ＳｙｎＡＡ培地からビタミンミックスを構成する成分について、一成分ずつ排除した培地で培養した結果を示す図である。（ａ）の凡例６及び（ｂ）のｖｉｔａｍｉｎ  ｍｉｘは、ＳｙｎＡＡ培地の（ポジティブコントロール）の結果を示す。
【図１５】サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株とサッカロマイセス・セルビシエＮＣＹＣ３２３３株を用いて、ＡＫＤ培地とＹＰＤ培地における増殖性を比較した図である。
【図１６】（ａ）ＡＫＤ培地に含まれるロイシンの濃度の相違による、サッカロマイセス・セルビシエロイシン要求性ＲＡＫ７７８株の増殖性を示す図である。（ｂ）ＡＫＤ培地に含まれるロイシンの濃度の相違による、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図１７】ＡＫＤ培地に含まれるヒスチジンの濃度の相違による、サッカロマイセス・セルビシエヒスチジン要求性ＢＹ４７１４株の増殖性を示す図である。
【図１８】ＡＫＤ培地に含まれるトリプトファンの濃度の相違による、サッカロマイセス・セルビシエトリプトファン要求性ＢＹ４７１０株の増殖性を示す図である。
【図１９】ＡＫＤ培地に含まれるウラシルの濃度の相違による、サッカロマイセス・セルビシエウラシル要求性ＢＹ４７００株の増殖性を示す図である。
【図２０】ＡＫＤ培地に含まれるアデニンの濃度の相違による、サッカロマイセス・セルビシエアデニン要求性ＢＹ４７２５株の増殖性を示す図である。
【図２１】サッカロマイセス・セルビシエＢＹ４７４１株（ｌｅｕ２Δ０  ｕｒａ３Δ０  ｈｉｓ３Δ１  ｍｅｔ１５Δ０）、ＢＹ４７００株（ｕｒａ３Δ０）、ＢＹ４７１２株（ｌｅｕ２Δ０）、ＢＹ４７１４株（ｈｉｓ３Δ１）、ＢＹ４７２５＋ＵＲＡ３株（ａｄｅ２Δ０）のＡＫＤ培地とＡＫＤ′培地における増殖性を示す図である。
【図２２】ＡＫＤ′培地に含まれるビオチンの濃度の相違による、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図２３】ＡＫＤ′培地に含まれるピリドキシンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図２４】ＡＫＤ′培地に含まれるパントテン酸の濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図２５】ＡＫＤ′培地に含まれるチアミンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図２６】ＡＫＤ′培地に含まれるニコチン酸の濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図２７】ＡＫＤ′培地に含まれるイノシトールの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。（ａ）と（ｂ）とで濃度を変えて検討した。
【図２８】ＡＫＤ′培地に含まれるＦｅＣｌ３の濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図２９】ＡＩＤ培地に添加するアラニン、メチオニン、セリン、スレオニン、グリシン、グルタミン、システインそれぞれのアミノ酸（ａ）、及びアスパラギン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンそれぞれのアミノ酸（ｂ）の濃度阻害を示す図である。
【図３０】ＡＩＤ培地に含まれるアラニンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図３１】ＡＩＤ培地に含まれるアセチルチロシンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図３２】ＡＩＤ培地に含まれるイソロイシンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図３３】ＡＩＤ培地に含まれるフェニルアラニンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図３４】ＡＩＤ培地に含まれるバリンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図３５】ＡＩＤ培地に含まれるセリンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図３６】ＡＩＤ培地に含まれるスレオニンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図３７】ＡＩＤ培地に含まれるアスパラギンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図３８】ＡＩＤ培地に含まれる各種ビタミンや金属イオン等について検討をした図を示す。
【図３９】パントテン酸の代替可能性について検討した図（ａ）、及び、β−アラニンの濃度の相違による、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図（ｂ）である。
【図４０】ＡＹＤ培地に含まれるグルタミンとシステインの濃度の相違によるＲＡＫ３５９９株の増殖性を示す図である。
【図４１】アミノ酸の併用効果を検討した図である。アミノ酸を５つのグループに分け、グループごとに培地から除いて影響を確認した結果を図４１（ａ）に示す。増殖性が顕著に低下することが確認されたＡＹ５グループの個別のアミノ酸成分について検討をした結果を図４１（ｂ）に示す。
【図４２】クルベイロマイセスＤＭＫＵ３−１０４２株とサッカロマイセスを用いてＡＹＤ培地と、ＹＰＤ培地及びＭＭ培地との比較を行った図である。
【図４３】シゾサッカロミセス・ポンベＦＹ７５０７株の栄養要求性を検討した図である。ビオチン、パントテン酸、亜鉛、ピリドキシンについては（ａ）で、チアミン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については、（ｂ）で検討されている。
【図４４】シゾサッカロミセスＲＡＫ５５７６株の栄養要求性を検討した図である。ビオチン、パントテン酸、亜鉛、ピリドキシンについては（ａ）で、チアミン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については、（ｂ）で検討されている
【図４５】クルベイロマイセス・マルキシアヌスＮＣＹＣ５８７株の栄養要求性を示した図である。パントテン酸、ピリドキシン、チアミン、亜鉛については（ａ）で、ビオチン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については、（ｂ）で検討されている。
【図４６】クルベイロマイセス・マルキシアヌスＮＣＹＣ１４２９株の栄養要求性を示した図である。パントテン酸、ピリドキシン、チアミン、亜鉛については（ａ）で、ビオチン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については、（ｂ）で検討されている。
【図４７】クルベイロマイセス・マルキシアヌスＮＣＹＣ２７９１株の栄養要求性を示した図である。パントテン酸、ピリドキシン、チアミン、亜鉛については（ａ）で、ビオチン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については、（ｂ）で検討されている。
【図４８】クルベイロマイセス・ラクチスＮＲＲＬＹ−１１４０株の栄養要求性を示した図である。ビオチン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については（ａ）で、パントテン酸、ピリドキシン、チアミン、亜鉛については、（ｂ）で検討されている。
【図４９】ピキア・スチピチスＮＢＲＣ１００６３株の栄養要求性を示した図である。ビオチン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については（ａ）で、パントテン酸、ピリドキシン、チアミン、亜鉛については、（ｂ）で検討されている。
【図５０】キャンディダ・グラブラタＢＹ２３８７６株の栄養要求性を示した図である。ビオチン、パントテン酸、亜鉛、ピリドキシンについては（ａ）で、チアミン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については、（ｂ）で検討されている。
【図５１】キャンディダ・ウティリスＪＣＭ９６２４株の栄養要求性を示した図である。ビオチン、パントテン酸、亜鉛、ピリドキシンについては（ａ）で、チアミン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については、（ｂ）で検討されている。
【図５２】キャンディダ・アルビカンスＪＣＭ１５４２株の栄養要求性を示した図である。ビオチン、パントテン酸、亜鉛、ピリドキシンについては（ａ）で、チアミン、鉄、ニコチン酸（ナイアシン）については、（ｂ）で検討されている
【図５３】ＳＤ培地とＹＰＤ培地と本発明の培地を用いてサッカロマイセス・セレビシエとクルベイロマイセス・マルキシアヌスを培養し、増殖性を比較した結果を（ａ）及び（ｂ）に示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の酵母用培地としては、酵母が資化可能な炭素源としての糖類と、窒素源としてのアミノ酸類と、ビタミン類と、イノシトールと、亜鉛イオンと、Ｋ＋とＭｇ２＋とが含まれ、かつイノシトール濃度が５０〜１００００ｍｇ／Ｌである培地であれば特に制限されず、本発明において菌の増殖とは、菌数が増える現象を意味し、菌の増殖の指標となる値の一つとしては、培養液の光学的濁度（ＯＤ：Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ）を挙げることができる。ＯＤを測定する波長は、試料、測定装置、測定方法により適宜決定できるが、例えば、ＯＤ６００を好適に挙げることができる。ＯＤを測定する方法は、常法により、一定時間経過後の培養液を必要に応じて希釈して吸光光度計を用いて測定することもでき、また、自動測定機器により行うこともできる。特定の自動測定機器により増殖性を判定する方法は、対数増殖期の正確な増殖カーブを連続的に得ることができる点で優れているが、培養液を希釈せずに測定するため、機器によって、例えばＯＤ６００の値が測定機器の測定能力を超えた場合は、増殖カーブの正確な記録を得ることができなくなる場合がある。また、本発明の酵母用培地としては、対数増殖期の増殖カーブがＹＰＤ培地における増殖カーブの傾きと非常に近似であるか、同等であるか、ＹＰＤ培地における増殖カーブの傾きを超えるものが好ましく、例えば、培養開始後６時間後、１２時間後、２４時間後、２８時間後、４８時間後、７２時間後等適宜時間経過後のＯＤ６００の値が、ＹＰＤ培地の６５％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは１００％以上の培地が好ましい。具体的には、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株の２４時間後の酵母の増殖性をＯＤ６００で表した場合、ＹＰＤ培地の８０％以上、好ましくは９０％以上である培地を好適に挙げることができ、中でも上記表１に示されるＡＹＤ培地を特に好適に挙げることができる。
上記酵母としては、分類学上酵母に属するものであれば特に制限されず、例えば、デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕａｌａ）、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、メチニコウィア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、ネマトスポラ属（Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロマイコデス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シュワニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ヤローウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）等を挙げることができ、より具体的には、キャンディダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、キャンディダ・ウティリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、キャンディダ・ボイジニィ（Ｃ．ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・リポリティカ（Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、キャンディダ・フレーベリ（Ｃ．ｆｌａｖｅｒｉ）キャンディダ・ビルサチルス（Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）等のキャンディダ属の酵母、デバリオマイセス・ハンセニイ（Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ）等のデバリオマイセス属の酵母、ハンゼヌラ・アノマラ（Ｈ．ａｎｏｍａｌａ）等のハンゼヌラ属の酵母、クルイベロマイセス・アフリカヌス（Ｋ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイベロマイセス・ファゼオロスポラス（Ｋ．ｐｈａｓｅｏｌｏｓｐｏｒｕｓ）等のクルイベロマイセス属の酵母、メチニコウィア・プルテェリマ（Ｍ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）等のメチニコウィア属の酵母、ピキア・スチピチス（Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ）ピキア・ファリノサ（Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａ）、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｒｉｓ）、ピキア・アノマラ（Ｐ．ａｎｏｍａｌａ）等のピキア属の酵母、ロドトルラ・ミニュータ（Ｒ．ｍｉｎｕｔａ）、ロドトルラ・ムシラギノーザ（Ｒ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）等のロドトルラ属の酵母、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（Ｓ．ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ドウグラシ（Ｓ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・パラドキサス（Ｓ．ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、サッカロマイセス・バヤヌス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・マンジニ（Ｓ．ｍａｎｇｉｎｉ）、サッカロマイセス・ミカタエ（Ｓ．ｍｉｋａｔａｅ）等のサッカロマイセス属の酵母、シュワニオマイセス・アルビウス（Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ）、シュワニオマイセス  オシデンタリス（Ｓ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、���ュワニオマイセス・カステリ（Ｓ．ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）、等のシュワニオマイセス属の酵母、サッカロマイコデス・ルドウイギ（Ｓ．ｌｕｄｗｉｇｉｉ）等のサッカロマイコデス属の酵母、ネマトスポラ  コリリ（Ｎ．ｃｏｒｙｌｉ）等のネマトスポラ属の酵母、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）等のシゾサッカロミセス属の酵母、トリコスポロン・プルランス（Ｔ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、トリコスポロン・ペニシァタム（Ｔ．ｐｅｎｉｃｉｌｌａｔｕｍ）等のトリコスポロン属の酵母、ヤローウィア（サッカロマイコプシス）・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などを例示することができ、これらの酵母変異株も含む。
上記酵母変異株としては、本発明の培地に培養した場合に当該酵母変異株がＲＡＫ３５９９株と比較して同程度の生育を示すような酵母変異株を例示することができる。また、上記酵母変異株は、変異が生じた酵母、又は酵母の集団を意味し、１つの遺伝子に変異が生じたものに限定されず、複数の遺伝子に変異が生じた多重酵母変異株も含まれ、変異としては、ＵＶ照射、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）処理等の変異誘導を行なう変異であっても、自然変異であってもよいし、遺伝子組換技術を用いて変異を生じさせた場合であってもよい。上記酵母変異株としては、栄養要求性酵母株を例示でき、上記栄養要求性酵母としては、ヒスチジン、ロイシン、リジン、トリプトファン、ウラシル、及び／又はアデニン要求性酵母株等が公知である（Ｂｒａｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，Ｖｏｌ．１４  １１５−１３２，１９９８等参照）。
上記培地組成に用いられる炭素源としての糖類としては、上記酵母において資化可能な糖類であれば特に制限されず、具体的には、グルコース、ラクトース、マンノース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類や、スクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類や、ラフィノース等の三糖類などを挙げることができるが、中でもグルコースが特に好ましい。これら糖類は、１又は２以上組み合わせて添加することができる。
上記糖類の使用時の本発明の培地への添加量としては、本発明の酵母用培地の効果を損なわない範囲で及び／又はコスト的に勘案して適宜決定することができ、培地へ添加される際の炭素源としての糖類終濃度としては、１〜２００ｇ／Ｌが好ましく、５〜１００ｇ／Ｌがより好ましく、１０〜５０ｇ／Ｌがさらに好ましく、１５〜２５ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の培地に含まれる窒素源としてのアミノ酸（類）としては、上記酵母の増殖性を阻害しないアミノ酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩であれば特に制限されず、具体的には、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アラニン（Ａｌａ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、バリン（Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、システイン（Ｃｙｓ）の２０種類のアミノ酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩を例示することができ、これらのアミノ酸は、各々Ｌ−体が好ましい。
上記アミノ酸の塩類としては、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム塩一水和物、Ｌ−アスパラギン酸カリウム、Ｌ−アスパラギン酸マグネシウム等のアスパラギン酸の塩や、Ｌ−アルギニン一塩酸塩等のアルギニンの塩、Ｌ−リジン塩酸塩等のリジンの塩や、Ｌ−グルタミン酸一ナトリウム塩等のグルタミン酸塩や、Ｌ−アスパラギン一水和物等のアスパラギン塩や、アセチルチロシン等のチロシンの誘導体や、塩酸システイン一水和物等のシステインの塩や、ヒスチジン塩酸塩一水和物等のヒスチジンの塩を例示することができる。
上記窒素源としての各アミノ酸の本発明の培地への使用時の添加量としては、本発明の酵母用培地の効果を損なわない範囲で及び／又はコスト的に勘案して適宜決定することができ、培地へ添加される際のアミノ酸総量の終濃度としては、１〜１００ｇ／Ｌが好ましく、１０〜５０ｇ／Ｌがより好ましく、２０〜４０ｇ／Ｌがさらに好ましく、２５〜３５ｇ／Ｌが特に好ましい。以下、個別のアミノ酸の含量について説明する。
本発明の酵母用培地におけるアスパラギン酸の濃度としては、例えばアスパラギン酸ナトリウム塩一水和物換算で、０．１〜１０ｇ／Ｌが好ましく、０．５〜８ｇ／Ｌがより好ましく、３〜７ｇ／Ｌがさらに好ましく、４〜６ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるアルギニンの濃度としては、例えばアルギニン一塩酸塩換算で、１〜５０ｇ／Ｌが好ましく、５〜２０ｇ／Ｌがより好ましく、８〜１２ｇ／Ｌがさらに好ましく、９〜１１ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるリジンの濃度としては、例えばリジン一塩酸塩換算で、０．１〜５ｇ／Ｌが好ましく、０．５〜３ｇ／Ｌがより好ましく、０．７〜２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８〜１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるプロリンの濃度としては、０．１〜５ｇ／Ｌが好ましく、０．５〜３ｇ／Ｌがより好ましく、０．７〜２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８〜１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるグルタミン酸の濃度としては、例えばグルタミン酸モノナトリウム塩水和物換算で、０．１〜５ｇ／Ｌが好ましく、０．５〜３ｇ／Ｌがより好ましく、０．７〜２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８〜１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるアラニンの濃度としては、０．１〜５ｇ／Ｌが好ましく、０．５〜３ｇ／Ｌがより好ましく、０．７〜２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８〜１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるイソロイシンの濃度としては、０．１〜５ｇ／Ｌが好ましく、０．５〜３ｇ／Ｌがより好ましく、０．７〜２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８〜１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるフェニルアラニンの濃度としては、０．１〜５ｇ／Ｌが好ましく、０．５〜３ｇ／Ｌがより好ましく、０．７〜２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８〜１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるバリンの濃度としては、０．１〜５ｇ／Ｌが好ましく、０．５〜３ｇ／Ｌがより好ましく、０．７〜２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８〜１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるチロシンの濃度としては、例えばＮ−アセチルチロシン（以下単に、「アセチルチロシン」ともいう）換算で、０．１〜５ｇ／Ｌが好ましく、０．５〜３ｇ／Ｌがより好ましく、０．７〜２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８〜１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるメチオニンの濃度としては、０．０１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．０２〜０．５ｇ／Ｌがより好ましく、０．０５〜０．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．０８〜０．１２ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるセリンの濃度としては、０．０１〜５ｇ／Ｌが好ましく、０．１〜２ｇ／Ｌがより好ましく、０．２〜１．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．３〜０．７ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるスレオニンの濃度としては、０．０１〜５ｇ／Ｌが好ましく、０．１〜２ｇ／Ｌがより好ましく、０．２〜１．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．３〜０．７ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるグリシンの濃度としては、０．０１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．０２〜０．５ｇ／Ｌがより好ましく、０．０５〜０．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．０８〜０．１２ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるアスパラギンの濃度としては、例えばアスパラギン一水和物換算で、０．０１〜５ｇ／Ｌが好ましく、０．１〜２ｇ／Ｌがより好ましく、０．２〜１．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．３〜０．７ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるグルタミンの濃度としては、０．１〜７．５ｇ／Ｌが好ましく、０．５〜７ｇ／Ｌがより好ましく、３〜６．５ｇ／Ｌがさらに好ましく、４〜６ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるシステインの濃度としては、システイン塩酸塩一水和物換算で、０．００１〜０．０８ｇ／Ｌが好ましく、０．００５〜０．０５ｇ／Ｌがより好ましく、０．００７５〜０．０２５ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．００８〜０．０１２ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるロイシンの濃度としては、０．１〜５ｇ／Ｌが好ましく、０．５〜３ｇ／Ｌがより好ましく、０．７〜２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８〜１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるトリプトファンの濃度としては、０．０１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．０２〜０．５ｇ／Ｌがより好ましく、０．０５〜０．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．０８〜０．１２ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地におけるヒスチジンの濃度としては、ヒスチジン一塩酸塩一水和物換算で、０．０１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．０２〜０．５ｇ／Ｌがより好ましく、０．０５〜０．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．０８〜０．１２ｇ／Ｌが特に好ましい。
上記窒素源としてのアミノ酸類として本発明の酵母用培地に添加するアミノ酸が１種類の場合、アスパラギン酸を添加することが好ましい。
上記窒素源としてのアミノ酸類として本発明の酵母用培地に添加するアミノ酸が２種類の場合、アスパラギン酸とグルタミン酸や、アスパラギン酸とアルギニンや、アスパラギン酸とリジンや、アスパラギン酸とプロリンや、アスパラギン酸とアラニンや、アスパラギン酸とイソロイシンや、アスパラギン酸とフェニルアラニンや、アスパラギン酸とバリンや、アスパラギン酸とチロシンや、アスパラギン酸とメチオニンや、アスパラギン酸とセリンや、アスパラギン酸とスレオニンや、アスパラギン酸とグリシンや、アスパラギン酸とアスパラギンや、アスパラギン酸とグルタミンや、アスパラギン酸とシステインや、アスパラギン酸とロイシンや、アスパラギン酸とトリプトファンや、アスパラギン酸とヒスチジン等の１９種類の組合せを例示することができる。
また、上記窒素源としてのアミノ酸類として、アスパラギン酸、アルギニン、リジン、プロリン、グルタミン酸、アラニン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、チロシン、メチオニン、セリン、スレオニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、ロイシン、トリプトファン、ヒスチジンから選ばれる少なくとも３種類が含まれることが好ましい。
上記窒素源として選ばれる少なくとも３種類のアミノ酸類としては、アスパラギン酸とグルタミン酸とアルギニンや、アスパラギン酸とグルタミン酸とアラニンや、アスパラギン酸とグルタミン酸とロイシンや、アスパラギン酸とグルタミン酸とイソロイシンや、アスパラギン酸とグルタミン酸とシステインや、アスパラギン酸とアルギニンとアラニンや、アスパラギン酸とアルギニンとロイシンや、アスパラギン酸とアルギニンとイソロイシンや、アスパラギン酸とアルギニンとバリンや、アスパラギン酸とアルギニンとグルタミンや、アスパラギン酸とアルギニンとシステインや、アスパラギン酸とアルギニンとアスパラギンや、アスパラギン酸とアルギニンとチロシンや、アスパラギン酸とリジンとロイシンや、アスパラギン酸とリジンとイソロイシンや、アスパラギン酸とリジンとバリンや、アスパラギン酸とリジンとグルタミンや、アスパラギン酸とリジンとシステインや、アスパラギン酸とリジンとアスパラギンや、アスパラギン酸とリジンとチロシンや、アスパラギン酸とプロリンとロイシンや、アスパラギン酸とプロリンとイソロイシンや、アスパラギン酸とプロリンとバリンや、アスパラギン酸とプロリンとグルタミンや、アスパラギン酸とプロリンとシステインや、アスパラギン酸とプロリンとアスパラギンや、アスパラギン酸とプロリンとチロシンや、グルタミン酸とアルギニンとアラニンや、グルタミン酸とアルギニンとロイシンや、グルタミン酸とアルギニンとイソロイシンや、グルタミン酸とアルギニンとバリンや、グルタミン酸とアルギニンとグルタミンや、グルタミン酸とアルギニンとシステインや、グルタミン酸とアルギニンとアスパラギンや、グルタミン酸とアルギニンとチロシンや、グルタミン酸とリジンとロイシンや、グルタミン酸とリジンとイソロイシンや、グルタミン酸とリジンとバリンや、グルタミン酸とリジンとグルタミンや、グルタミン酸とリジンとシステインや、グルタミン酸とリジンとアスパラギンや、グルタミン酸とリジンとチロシンや、グルタミン酸とプロリンとロイシンや、グルタミン酸とプロリンとイソロイシンや、グルタミン酸とプロリンとバリンや、グルタミン酸とプロリンとグルタミンや、グルタミン酸とプロリンとシステインや、グルタミン酸とプロリンとアスパラギンや、グルタミン酸とプロリンとチロシン等の、アスパラギン酸又はグルタミン酸や、アルギニンとアラニンとメチオニンや、アルギニンとロイシンとチロシンや、アルギニンとイソロイシンとスレオニンや、アラニンとバリンとセリンや、アルギニンとフェニルアラニンとグルタミンや、アルギニンとプロリンとシステインや、アルギニンとアスパラギンとグルタミン等少なくとも１１４０通りの３種類のアミノ酸類を少なくとも含む組合せを挙げることができる。
本発明の酵母用培地に含まれる窒素源として、上記酵母の増殖性を阻害しない限りにおいて、アミノ酸に加えて、ウラシル、アデニン、グアニン、シトシン、チミン等の核酸（類）若しくはその誘導体、又はそれらの塩を１又は２以上組み合わせてさらに添加することができる。上記誘導体としては、アデニンの誘導体として、アデニンヘミサルフェイトを例示することができる。本発明の酵母用培地における各核酸の濃度としては、０．０１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．０２〜０．５ｇ／Ｌがより好ましく、０．０５〜０．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．０８〜０．１２ｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の酵母用培地に含まれる窒素源としては、さらに上記酵母の培養に伴う培地のｐＨの過剰な低下を抑制し、かつ酵母の増殖性を維持できる窒素源が好ましいため、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウムイオンを酵母が資化可能な窒素源として含まないことが好ましい。
本発明の酵母用培地に含まれるビタミン類としては、上記酵母の増殖性を阻害しないビタミン類若しくはその誘導体、又はそれらの塩であれば特に制限されず、例えば、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン、ピリドキシン、チアミン等を挙げることができ、パントテン酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩としては、パントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウム、パンテノール等を例示することができ、ナイアシン若しくはその誘導体、又はそれらの塩としては、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ニコチニックアルコール等を例示することができ、チアミン誘導体としては、塩酸チアミン、硝酸チアミン、硝酸ビスチアミン、チアミンジセチル硫酸エステル塩、塩酸フルスルチアミン、オクトチアミン、ベンフォチアミン等を例示することができ、ピリドキシン若しくはその誘導体、又はそれらの塩としては、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキサール（リン酸ピリドキサール）、ピリドキサミン等のピリドキシンを例示することができる。上記ビタミンは、２種類以上含まれることが好ましく、３種類以上含まれることがより好ましく、４種類以上含まれることがさらに好ましい。
酵母がサッカロマイセス属に属する場合、上記ビタミン類として、ビオチン、パントテン酸や、ビオチン、パントテン酸及びナイアシンや、ビオチン、パントテン酸及びピリドキシンや、ビオチン、パントテン酸及びチアミンや、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン及びピリドキシンや、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン及びチアミンや、ビオチン、パントテン酸、ピリドキシン及びチアミンや、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン、ピリドキシン及びチアミンを含む組合せを挙げることができ、酵母がクルベイロマイセス属に属する場合は、ビオチン、パントテン酸、及びナイアシンや、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン及びピリドキシンや、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン及びチアミンや、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン、ピリドキシン及びチアミンを含む組合せを挙げることができ、酵母がキャンディダ属に属する場合は、上記ビタミン類として、ピリドキシン、ビオチン、パントテン酸、チアミン、及びナイアシンから選ばれる１又は２以上を含む組合せを挙げることができる。
上記各ビタミンの本発明の培地への使用時の添加量としては、本発明の酵母用培地の効果を損なわない範囲で及び／又はコスト的に勘案して適宜決定することができ、具体的には、以下のとおり例示できる。
本発明の培地におけるパントテン酸の濃度としては、１０〜５００００μｇ／Ｌが好ましく、１００〜２５０００μｇ／Ｌがより好ましく、１０００〜７５００μｇ／Ｌがさらに好ましく、３０００〜５０００μｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の培地におけるナイアシン（ニコチン酸）の濃度としては、１０〜５００００μｇ／Ｌが好ましく、１００〜２５０００μｇ／Ｌがより好ましく、１０００〜７５００μｇ／Ｌがさらに好ましく、３０００〜５０００μｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の培地におけるピリドキシンの濃度としては、１〜５０００μｇ／Ｌが好ましく、１０〜２５００μｇ／Ｌがより好ましく、１００〜７５０μｇ／Ｌがさらに好ましく、３００〜５００μｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の培地におけるチアミンの濃度としては、１〜５０００μｇ／Ｌが好ましく、１０〜２５００μｇ／Ｌがより好ましく、１００〜７５０μｇ／Ｌがさらに好ましく、３００〜５００μｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の培地におけるビオチンの使用時における添加量としては、例えば、０．０２〜１５０μｇ／Ｌを挙げることができ、０．２〜２０μｇ／Ｌが好ましく、０．５〜１０μｇ／Ｌがより好ましく、１〜５μｇ／Ｌがさらに好ましく、１．５〜３μｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の培地におけるイノシトールは、ｍｙｏ−イノシトールであり、有効量添加されることで、ＹＰＤと同等の対数増殖期の増殖曲線を得ることができることから本発明における増殖制限因子として添加されることが必須であり、本発明の培地におけるｍｙｏ−イノシトールの濃度は５０〜１００００ｍｇ／Ｌであり、１００〜７５００ｍｇ／Ｌが好ましく、５００〜５０００ｍｇ／Ｌがより好ましく、７５０〜３０００ｍｇ／Ｌがさらに好ましく、１０００〜２５００ｍｇ／Ｌが特に好ましい。
本発明の培地に添加される金属イオンとしては、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）を挙げることができ、上記酵母の増殖性を阻害しない金属イオンであれば適宜他の金属イオンをさらに加えることができ、かかる他の金属イオンとしては、具体的には、鉄イオン（Ｆｅ３＋及び／又はＦｅ２＋）を挙げることができる。
上記Ｚｎ２＋としては、具体的には、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４）等として添加することができ、本発明の培地におけるＺｎ２＋の濃度としては、ＺｎＳＯ４換算で、１〜５０００μｇ／Ｌが好ましく、５０〜１０００μｇ／Ｌがより好ましく、１００〜７５０μｇ／Ｌがさらに好ましく、３００μｇ／Ｌ〜５００μｇ／Ｌが特に好ましい。
上記Ｆｅ３＋としては、具体的には、塩化第二鉄（ＦｅＣｌ３）の無水物や水和物として添加することができ、本発明の培地におけるＦｅ３＋の使用時における添加量としては、例えば、ＦｅＣｌ３（無水物）換算で、１μｇ／Ｌ〜５０００００μｇ／Ｌを挙げることができ、２００〜４００００μｇ／Ｌが好ましく、５００〜１００００μｇ／Ｌがより好ましく、１０００〜７５００μｇ／Ｌがさらに好ましく、３０００〜５０００μｇ／Ｌが特に好ましい。また、上記Ｆｅ２＋としては、ＦｅＳＯ４の無水物や水和物、ＦｅＣｌ２の無水物や水和物等を挙げることができる。
本発明の培地に含まれる無機イオンとしては、上記酵母の増殖性を阻害しない無機イオンであれば特に制限されないが、カリウムイオン（Ｋ＋）とマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）は必須である。
上記Ｋ＋は、具体的には、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、塩化カリウム（ＫＣｌ）として添加することができ、これらは単独でも用いることができるし、複数で混合して用いることができる。本発明の培地におけるＫ＋の濃度としては、例えばＫＨ２ＰＯ４換算で、０．１〜１０ｇ／Ｌが好ましく、０．１〜５ｇ／Ｌがより好ましく、０．５〜２．５ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．８〜１．２ｇ／Ｌが特に好ましい。
上記Ｍｇ２＋は、具体的には、硫酸マグネシウム・７水和物、塩化マグネシウム・６水和物、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、塩化カリウムマグネシウムとして添加することができ、これらは単独でも用いることができるし、複数で混合して用いることができる。本発明の培地におけるＭｇ２＋濃度としては、例えば、硫酸マグネシウム・７水和物換算で、０．０１〜５ｇ／Ｌが好ましく、０．１〜２ｇ／Ｌがより好ましく、０．２〜１．２ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．３〜０．７ｇ／Ｌが特に好ましい。
その他、本発明の培地において、酵母の増殖性を高めることを特に重視する場合には、コーンスチープリカー、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス等を必要に応じて適宜添加することができるが、化学合成培地とする点でこれら酵母エキス、コーンスチープリカー、ポリペプトン、肉エキス等を含まない培地が、本発明の効果を有利に享受できる。
本発明の培地の形態としては、菌量、操作性等に応じて、液体培地でもよいし、寒天等の多糖類などを添加した固体培地でもよい。液体培地の場合、酵母の増殖性を高めるために、酸素が供給される好気的条件下で培養することが好ましく、好気的条件で培養を行う方法としては、公知の手段により、具体的には、振盪培養、通気攪拌培養、又は好気的回転培養を挙げることができる。
各菌種の生育温度に応じて高い増殖性を示すことができるが、好ましい生育温度としては、サッカロマイセス属の場合は２５〜３５℃、キャンディダ属の酵母の場合は２５〜３５℃、クルイベロマイセス属の酵母の場合は２５〜４５℃、ピキア属の酵母の場合は２５〜３５℃、シゾサッカロマイセス属の酵母の場合は２５〜３５℃を例示することができる。
本発明の培地への酵母の添加量としては、１〜１０％（Ｖ／Ｖ）が培養操作性、増殖速度、最終濃度到達時間等の点から好ましい。しかし、この範囲に限定されるわけではなく、使用原料や目的によっては、これより高い又は低い濃度で培養することができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、実施例の記載順序は、概ね実験の時系列に沿うものである。また、濃度の設定や必要成分の検討データは、以下の記載に限らず、試行錯誤の過程による莫大な量があるが、本発明の発明特定事項を説明するために必要となるデータのみを記載した。また、図８〜２０及び図２２〜５２までのグラフの縦軸はＯＤ６００を示す。
【実施例１】
【０００９】
（１）検討１
［材料と方法］
（供試酵母株）
酵母株としては、ＢＹ系列の酵母（Ｂｒａｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｙｅａｓｔ  １４：１１５−１３２等参照）と、ＲＡＫ系列の酵母を使用した。具体的には、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ２６８３株、サッカロマイセス・セルビシエＢＹ４７４１株（ｌｅｕ２Δ０  ｕｒａ３Δ０  ｈｉｓ３Δ１  ｍｅｔ１５Δ０）、サッカロマイセス・セルビシエＢＹ４７００株（ｕｒａ３Δ０）、サッカロマイセス・セルビシエＢＹ４７１２株（ｌｅｕ２Δ０）、サッカロマイセス・セルビシエＢＹ４７１４株（ｈｉｓ３Δ１）、サッカロマイセス・セルビシエＢＹ４７２５＋ＵＲＡ３株（ａｄｅ２Δ：：ｈｉｓＧ）、サッカロマイセス・セルビシエＢＹ４７１０株（ＴｒｐΔ６３）、シゾサッカロミセス・ポンベＦＹ７５０７株、チゴサッカロミセスＲＡＫ５５７６株、クルベイロマイセス・マルキシアヌスＮＣＹＣ５８７（ＲＡＫ３６８４）株、ＮＣＹＣ１４２９（ＲＡＫ３６８５）株、及びＮＣＹＣ２７９１（ＲＡＫ３６８６）株クルベイロマイセス・ラクチスＮＲＲＬＹ−１１４０株、ピキア・スチピチスＮＢＲＣ１００６３（ＲＡＫ５１２８）株、キャンディダ・グラブラタＢＹ２３８７６株等の酵母株を用いた。実施例記載の酵母株は国立大学法人山口大学工学部にて保管されており、一定条件下で分譲可能である。
（基本培養方法）
増殖性検討対象となる培地での培養実験の手順としては、特段の定めがない場合、検討する酵母をＹＰＤ液体培地で２８℃にて２４時間前培養後、ＯＤ６００＝２０になるように調整した。その後Ｌ型試験管に分注した検討用各培地５ｍＬにその培養液５μＬを植菌し（最終ＯＤ６０＝０．０２）、２８℃にて好気的に回転培養し、自動計測分光度計（バイオフォトレコーダーＴＶＳ０６２ＣＡ  アドバンテック社）で連続的にＯＤを測定した。また、分光光度計（Ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｃｅｔｅｒ  ｃｏ８０００  ＷＰＡ社）でＯＤ６００を１５分毎に測定した。以下、自動計測分光度計を用いた場合のグラフをデータとして示すが、これらは主として対数増殖期の増殖カーブの傾きを培地ごとに比較するために用いており、希釈せずにＯＤ６００を計測するため、ＯＤ６００＝３〜３．５以上の値については、不正確な場合もある。
［予備実験］
酵母の増殖性を高めるための合成培地の組成を確立するため、まず、目標となる増殖性を有する富栄養培地であるＹＰＤ培地と、最小合成培地として選択したＭＭ培地とにおける酵母の増殖性を検討した。ＭＭ培地としては、以下の表２に示すＹＮＢ（アミノ酸、硫酸アンモニウム、及びグルコースを含まない）（Ｙ２０３０、“Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ＡＡ，ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ＆  ｗ／ｏ  ＡＳ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ＵＳＡ社製）０．１７％に、窒素源として硫酸アンモニウム０．５％と、炭素源としてグルコース２％を添加した組成の培地を用いた。また、ＹＰＤ培地の組成としては、イーストエキストラクト１％、ペプトン２％、グルコース２％、ｐＨ５．６〜６．０を用いた。市販のパン酵母株を１ｍＬのそれぞれの液体培養液（ＯＤ６００＝３５）中に１０ｍＬ植菌し、一日後に１／２０溶液について、ＯＤ６００とｐＨとを測定した。
【表２】
2014030774.tif 000003
（増殖性と培養液ｐＨとの関連）
ＹＰＤ培地ではＯＤ６００の値が０．８２であり、ｐＨが６．０であったのに対し、ＭＭ培地では、ＯＤ６００の値が０．３５であり、ｐＨが２．４であった。ＹＰＤ培地と比較してＭＭ培地における培養後のｐＨが非常に低いため、培地のｐＨの変化について検討した。
（培地のｐＨの検討）
以下の表３に示された１ｍＬあたりの液体培地組成において、培養前の培地のｐＨを６．０に調整し、市販のパン酵母株の培養を２４時間行った。その結果、（１）のＭＭ＋バッファーは、ｐＨはそれほど低下しなかったが、増殖性は、（６）ＭＭｐＨ６（バッファーなし）に及ばなかった。（２）のＭＭ＋２％ＰＰ培地と（３）のＭＭ＋１％ＹＥ培地は、ｐＨはそれほど低下せず増殖性も（１）のＭＭ＋バッファーと比較するとよかったが（５）のＹＰＤ培地には及ばなかった。したがって、ｐＨの低下と増殖性が直接的な相関を見いだすことはできなかった。
【表３】
2014030774.tif 000004
（２）検討２
［酵母抽出エキスに含まれる増殖因子の検討］
上記表３において、（２）のＭＭ＋２％ＰＰ培地と（３）のＭＭ＋１％ＹＥ培地を用いた場合の増殖性が比較的高かったので、ＹＮＢ０．１７％（ｗ／ｏ  ＡＡ，ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ＆  ｗ／ｏ  ＡＳ）にグルコース２％と、ポリペプトン又は酵母抽出エキスとを添加した組成の培地を用いてＹＰＤ培地における増殖性と比較した。結果を図１に示す。２％の酵母抽出エキスを加えることでＹＰＤ培地レベル以上の増殖性が達成されたが、ポリペプトンでは増殖性はＹＰＤ培地レベルまでには高くならなかった。したがって、酵母抽出エキス中に含まれると予測される増殖因子について検討を行うことにした。
（３）検討３
［窒素源の検討］
ＭＭ培地における窒素源として、硫酸アンモニウムの代わりに、以下の表４に示す各種アミノ酸を単独で使用するか、あるいは、硫酸アンモニウム以外の他のアンモニウム塩としてリン酸アンモニウム、塩化アンモニウム（シグマＵ４４２６）、蟻酸アンモニウム（シグマ０４５０７ＡＣ）、酢酸アンモニウム（シグマＵ９４６９）をそれぞれ用いた培地で、酵母ＲＡＫ２６８３株を２４時間培養後、ＯＤ６００、ｐＨ等について検討した。結果を表４に示す。
【表４】
2014030774.tif 000005
上記表４より硫酸アンモニウムを添加すると、他の窒素源と比較して、ｐＨが低下するとともに、増殖性も非常に悪いことが確認された。また、アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン等を単独で添加すると良好な増殖性を示し、他方グリシン、ヒスチジン、スレオニン、リジンを単独で添加するとほとんど増殖性を示さなかった。また、硫酸アンモニウムに限らず、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の窒素源としてのアンモニウム塩は総じて良好な増殖性を示さなかった。
上記表４において、４８時間後のＯＤ６００の値が一番高かったアスパラギン酸（Ａｓｐ）を硫酸アンモニウムと代替した培地を作製し、ＭＭ培地とＹＰＤとにおける酵母（市販のパン酵母株）の増殖性を比較した。結果を図２に示す。ＹＰＤの増殖性レベルには到達しなかったものの、０．５〜２．０％のアスパラギン酸を添加した培地は、硫酸アンモニウムを添加した培地よりも増殖性が顕著によくなることがわかった。かかる知見に基づき、ＹＮＢ０．１７％とグルコース２％に、窒素源としてアスパラギン酸２％を添加したＢＭ培地を検討対象とした。
酵母抽出エキスに含まれる増殖因子を特定するために、まず分子量に着目し、酵母抽出エキス１０％を分子量５０００以下（Ｍ＜５０００）の物質と分子量５０００以上（Ｍ＞５０００）の物質とに分画し、両方の分画物を各種濃度で含む培地でＲＡＫ２６８３株を培養したところ、酵母抽出エキス（Ｍ＜５０００）の濃度の低下による増殖の減少は、通常の酵母抽出エキスの増殖の減少と変わらなかった。そのため、目的の重要な増殖因子は、Ｍ＜５０００に含まれるものと推定した。次いで、酵母抽出エキス（Ｍ＜５０００）をさらに分画し増殖性を試験した。結果を図３に示す。図３における分画数４〜６に含まれる物質（約５００＜Ｍ＜１０００）が増殖性を高めるのではないかと推定した。約５００＜Ｍ＜１０００の分子量を有する物質として、Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ、ＣｏＡ、イーストＲＮＡ（ＲＮＡ）、ＮＡＤを選択し、それぞれをＢＭ培地に添加し、酵母ＲＡＫ２６８３株を２４時間培養後、ＯＤ６００を測定した。なお、酵母抽出エキス（ＹＥ）添加培地及びＹＰＤ培地をポジティブコントロールとした。結果を図４（ａ）〜（ｃ）に示す。Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ、ＣｏＡ、イーストＲＮＡ、及びＮＡＤはいずれも、ＢＭ培地における増殖性と同程度であり、ＹＰＤの増殖レベルには及ばず増殖因子として顕著な役割を果たしているとはいえなかった。この段階で、酵母抽出エキスに含まれる増殖因子の検討を中止した。
（４）検討４
［炭素源の検討］
ＢＭ培地において、グルコースの代わりに、ガラクトース、ラフィノース、トレハロース、フルクトース、マルトース、マンノース、スクロース、リボース等の糖、又はＤＮＡ（ネガティブコントロール）をそれぞれ２％添加した培地で、酵母市販のパン酵母株を２８℃にて２４時間培養後にＯＤ６００を測定した。結果を図５に示す。トレハロース、リボース又はＤＮＡをグルコースの代わりに単独で添加した場合には、酵母はまったく増殖性を示さず、トレハロースやリボースは炭素源として用いられることが困難であることがわかった。
グルコースを含む又は含まないＢＭ培地にエタノール、グリセロールを添加した培地にて、酵母ＲＡＫ２６８３株を２４時間培養後にＯＤ６００を測定した。結果を図６（ａ）に示す。また、ＢＭ培地にアルブミンを０．１〜２％添加した培地に、酵母ＲＡＫ２６８３株を２４時間培養後にＯＤ６００を測定した。結果を図６（ｂ）に示す。培地にグルコースを添加せずにエタノール、グリセロール、又はアルブミンを添加した場合には、酵母はほとんど増殖性を示さず、エタノールやグリセロールやアルブミンは炭素源として用いることが困難であることが確認された。
ＢＭ培地に、ガラクトース、ラフィノース、フルクトース、マルトース、マンノース、スクロース等の各糖について０．５〜２％の濃度を混合した各種培地を作製し、増殖性の実験を行った。結果を図７（ａ）〜（ｄ）に示す。いずれの糖も資化性はあることが確認されたが、グルコース２％のみの場合と比べて特に高い増殖性は示されず、複数の糖を混合してもＹＰＤ培地のレベルの増殖性を示したものはなかった。これ以降、炭素源としては、グルコース２％に固定して検討を続けることとした。
（５）検討５
［各種成分ミックスの検討］
以下の表５〜８記載の４種の成分ミックス、すなわち、アミノ酸ミックス（ＡＡ）、ビタミンミックス（Ｖ）、金属イオンミックス（Ｍ）、及び無機イオンミックス（Ｉｏｎ）をそれぞれ構成成分とする各種成分ミックスを調製した。これら４つの成分ミックスとグルコース２０ｇ／Ｌと硫酸アンモニウム０．５ｇ／Ｌとを混合した培地（以下「ＳｙｎＡＡ培地」ともいう）から、ビタミンミックス（Ｖ）、金属イオンミックス（Ｍ）、及び無機イオンミックス（Ｉｏｎ）の３つの成分ミックスのうち１つずつ欠如させた培地で培養した結果を図８に示す。ビタミンミックス又は無機イオンミックスを欠如した培地（ＳｙｎＡＡ−Ｖ又はＳｙｎＡＡ−Ｉｏｎ）では増殖性がまったく見られなかった。また金属イオンミックスを欠如した培地（ＳｙｎＡＡ−Ｍ）は、ＹＰＤと比較すると顕著に増殖性は悪かった。ビタミンミックス、無機イオンミックス及び金属イオンミックスの構成成分の中にそれぞれ酵母の増殖に必須の又は重要な成分が含まれていると推測した。
【表５】
2014030774.tif 000006
【表６】
2014030774.tif 000007
【表７】
2014030774.tif 000008
【表８】
2014030774.tif 000009
（６）検討６
［無機イオン濃度の検討］
上記無機イオンミックスを構成する成分について、ＳｙｎＡＡ培地から一成分ずつ排除した培地を作製し、ＯＤ６００を測定した。結果を図９に示す。ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（図中ではＭｇで表される）又はＫＨ２ＰＯ４を添加しないイオンミックスは、非常に増殖性が低かったことが確認された。以下、無機イオン濃度について具体的に検討を行うこととした。なお、図９中の２（ＳｙｎＡＡ培地から硫酸アンモニウムを除いたもの）で示されるとおり、硫酸アンモニウムを添加しない培地が、無機イオンミックスを添加した培地よりも高い増殖性を示したため、硫酸アンモニウムは窒素源として必須ではないと判断した。サッカロマイセス・セルビシエの特別な栄養要求性を持たない株であるＲＡＫ３５９９株（以下、単に「ＲＡＫ３５９９株」ともいう）を用いて検討を行った。これ以降特段の定めがない限り、２８℃にて適宜時間回転培養を行い、ＯＤ６００を測定することで増殖性を検討した。
（Ｋイオン）
ＳｙｎＡＡ培地に含まれるＫＨ２ＰＯ４の濃度を０％，０．０００１％，０．００１％，０．０１％，０．１％，１％にそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図１０に示す。なお図１０には示されていないが、４２時間後の１／１００溶液のＯＤ６００は、それぞれ０．０２，０．０２，０．０３，０．１１，０．１３，０．１４であった。ＫＨ２ＰＯ４の濃度が０．１％〜１％でＯＤ６００が最大値に達した。
（Ｎａイオン）
ＳｙｎＡＡ培地において、ＫＨ２ＰＯ４の代わりに０．１％のＮａＨ２ＰＯ４（製品番号２８−３７９０、片山社製）を添加してＲＡＫ３５９９株を培養したところ、２０時間経過後も増殖が起こらなかった。しかし、２０時間経過後に０．１％ＫＣｌを添加したところ増殖が始まった。この結果を図１１に示す。この結果より、本発明の培地においては、Ｎａイオンではなく、Ｋイオンが増殖性に重要な影響を与えていると考えられた。
（Ｍｇイオン）
ＳｙｎＡＡ培地に含まれるＭｇＳＯ４の濃度を０％，０．０００１％，０．００１％，０．０１％，０．１％，１％にそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図１２に示す。４２時間後の１／１００溶液のＯＤ６００は、それぞれ０．０２，０．０４，０．０９，０．１２，０．１３，０．１３であり、ＭｇＳＯ４の濃度が０．０１％〜１％で最大値に達した。次に、ＳｙｎＡＡ培地に含まれるＭｇＣｌ２の濃度を０．００１％，０．０１％，０．１％，１％にそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図１３に示す。ＭｇＳＯ４同様に０．０１％〜１％で最大値に達し、Ｍｇ２＋は、増殖性に影響があるが、ＳＯ４２−とＣｌ−における相違は特にないものと考えられた。
（７）検討７
［ビタミンについての検討］
上記ビタミンミックスを構成する成分について、ＳｙｎＡＡ培地をコントロールとして、ＳｙｎＡＡ培地から一成分ずつ排除した培地を作製し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図１４（ａ）及び（ｂ）に示す。また、パントテン酸又はビオチンが、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を高めるために必要な成分であることが確認された。また、葉酸、ホウ酸（ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）、リボフラビンは必須の成分ではないと判断した。ビオチン、イノシトール、ニコチン酸、チアミン、ピリドキシン、パントテン酸は、必要量の検討がさらに必要と思われた。
（８）検討８
［ＡＫＤ培地］
これまでの検討結果に基づいて、増殖性が高いと考えられる培地組成の処方（ＡＫＤ培地）を一度作成してみた。ＡＫＤの処方例は以下の通りである。
【表９】
2014030774.tif 000010
ここで、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株とサッカロマイセス・セルビシエＮＣＹＣ３２３３株を用いて、ＡＫＤ培地とＹＰＤ培地における増殖性を比較した。結果を図１５に示す。かなりＹＰＤの増殖カーブに近くなってきたが、ＹＰＤ培地の増殖性がより高かったので、培地組成につき、引き続き検討を行うこととし、まずアミノ酸から検討した。
（９）検討９
［アミノ酸濃度の検討］
（栄養要求性株）
本発明の課題の一つは、栄養要求性酵母株であっても、本発明の培地において培養することにより高い増殖性を維持できる培地を作製することにあるところから、栄養要求性株を用いて検討を行った。
（ロイシン要求性株）
ＡＫＤ培地に含まれるロイシンの濃度を０％，０．０００１％，０．００１％，０．０１％，０．１％，１％にそれぞれ調整し、サッカロマイセス・セルビシエロイシン要求性ＲＡＫ７７８株（ＢＹ４７１２（ｌｅｕ２Δ０）株）の増殖性を検討した。結果を図１６（ａ）に示す。ロイシンの濃度が０．００１％未満では増殖性はほとんどみとめられなかったが、０．０１％で増殖性は上昇し、０．１％で最大値に達し、１％においては増殖性が阻害されることが確認された。同様の実験をサッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株を用いて行った結果を図１６（ｂ）に示す。ロイシンの濃度が０〜０．１％の場合、高い増殖性を示したが、１％においては増殖性が阻害されることが確認された。以上の結果より、ロイシンの濃度は、０．１％程度が好ましいことがわかった。
（ヒスチジン要求性株）
ＡＫＤ培地に含まれるヒスチジンの濃度を０．００１％，０．０１％，０．１％，１％にそれぞれ調整し、サッカロマイセス・セルビシエヒスチジン要求性ＢＹ４７１４（ｈｉｓ３Δ１）株の増殖性を検討した。結果を図１７に示す。０．０１％〜１％で最大値に達した。４２時間後の１／１００溶液のＯＤ６００は、それぞれ０．０７，０．１８，０．１８，０．１５であった。以上の結果より、ヒスチジンの濃度は、０．０１％程度が好ましいことがわかった。
（トリプトファン要求性株）
ＡＫＤ培地に含まれるトリプトファンの濃度を０．００１％，０．０１％，０．１％，１％にそれぞれ調整し、サッカロマイセス・セルビシエトリプトファン要求性ＢＹ４７１０（ｔｒｐ１△）株の増殖性を検討した。結果を図１８に示す。４８時間後の１／１００溶液のＯＤ６００は、それぞれ０．０８，０．１５，０．１３，０．１２であった。０．０１％で増殖性が顕著に高くなることが確認され、０．１％では増殖性が多少阻害されることが確認された。以上の結果より、トリプトファンの濃度は、０．０１％程度が好ましいことがわかった。
（ウラシル要求性株）
ＡＫＤ培地のアミノ酸ミックスに便宜上含まれているウラシルの濃度を０．００１％，０．００５％，０．０５％，０．１％，０．５％にそれぞれ調整し、サッカロマイセス・セルビシエウラシル要求性ＢＹ４７００（ｕｒａ３△）株の増殖性を検討した。結果を図１９に示す。４２時間後の１／１００溶液のＯＤ６００は、それぞれ０．１０，０．２１，０．２１，０．２２，０．２０であった。０．００１％では増殖性は低く、０．００５％で高くなり、０．０５％〜０．１％で顕著に高くなることが確認された。０．５％では増殖性が多少阻害されることが確認された。以上の結果より、ウラシルの濃度は、０．０１％程度が好ましいことがわかった。
（アデニン要求性株）
ＡＫＤ培地のアミノ酸ミックスに便宜上含まれているアデニンの濃度を０％，０．００５％、０．０１％，０．０５％，０．１％，０．５％にそれぞれ調整し、サッカロマイセス・セルビシエアデニン要求性ＢＹ４７２５（ａｄｅ２△）株の増殖性を検討した。結果を図２０に示す。４２時間後の１／２０溶液のＯＤ６００は、それぞれ４，１５，１８，１８，１３，１６であった。０では増殖性は低く、０．０１％〜０．０５％で最大であり、０．１％以上では増殖性がやや阻害されることが確認された。以上の結果より、アデニンの濃度は、０．０１％程度が好ましいことがわかった。
（１０）検討１０
［ＡＫＤ′培地］
以上のアミノ酸の検討結果に基づいて、ＡＫＤ培地と比較してロイシン、ヒスチジン、トリプトファン、ウラシル、アデニンの濃度を増やしたＡＫＤ′培地を以下の表１０の通り作製してみた。寒天（片山化学工業社製、１０１−１９００）を２０ｇ／Ｌ添加したＡＫＤ′寒天培地において検討９で用いた各要求株を２８℃にて、２日培養した。ネガティブコントロールとしてＡＫＤ培地を、ポジティブコントロールとしてＹＰＤ培地を用いた。結果を図２１に示す。その結果、サッカロマイセス・セルビシエＢＹ４７４１株（ｌｅｕ２Δ０  ｕｒａ３Δ０  ｈｉｓ３Δ１  ｍｅｔ１５Δ０）、ＢＹ４７００株（ｕｒａ３Δ０）、ＢＹ４７１２株（ｌｅｕ２Δ０）、ＢＹ４７１４株（ｈｉｓ３Δ１）、ＢＹ４７２５＋ＵＲＡ３株（ａｄｅ２Δ０）のすべての増殖性がＲＡＫ３５９９と同様、ＡＫＤ培地と比較して非常によくなったが、培地組成を引き続き検討することにした。
【表１０】
2014030774.tif 000011
（１１）検討１１
［ビタミン濃度の検討］
上述したように、無機イオン濃度及びアミノ酸濃度について詳細に検討してきた。次に、ビタミン濃度について検討することとした。ビタミンとして、ビオチン、ピリドキシン、パントテン酸、チアミン、ニコチン酸、イノシトールを対象とした。
（ビオチン）
ＡＫＤ′培地に含まれるビオチンの濃度を、０，０．０２ｎｇ／ｍＬ，０．２ｎｇ／ｍＬ，２ｎｇ／ｍＬ，０．０２μｇ／ｍＬ，０．２μｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図２２に示す。ビオチン含有量が０では増殖性はほとんどみとめられなかったが、０．２μｇ／Ｌ〜２０μｇ／Ｌで最大値に達し、２００μｇ／Ｌにおいては増殖性がやや阻害されることが確認された。これらの結果から、ビオチン濃度は２μｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（ピリドキシン）
ＡＫＤ′培地に含まれるピリドキシンの濃度を、０，０．００４，０．０４，０．４，４，４０μｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図２３に示す。ピリドキシン含有量が０でもある程度増殖性は認められたが、０．０４μｇ／ｍＬで増殖性は上昇し、０．４μｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬで最大値に達した。これらの結果から、ピリドキシン濃度は、４００μｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（パントテン酸）
ＡＫＤ′培地に含まれるパントテン酸の濃度を、０，０．００４，０．０４，０．４，４，４０μｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図２４に示す。パントテン酸含有量が０では、増殖性はまったくなく少なくともサッカロマイセス・セルビシエにおける必須の成分であることが確認された。０．０４μｇ／ｍＬで増殖性は上昇し、０．４μｇ／ｍＬ〜４μｇ／ｍＬで最大値に達し、４０μｇ／ｍＬにおいては増殖性がやや阻害されることが確認された。これらの結果から、パントテン酸濃度は、４０００μｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（チアミン）
ＡＫＤ′培地に含まれるチアミンの濃度を、０，０．００４，０．０４，０．４，４，４０μｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図２５に示す。チアミン含有量が０でもある程度増殖性は認められたが、０．４μｇ／ｍＬ〜４μｇ／ｍＬで最大値に達した。これらの結果から、チアミン濃度は、４００μｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（ニコチン酸）
ＡＫＤ′培地に含まれるニコチン酸の濃度を、０，０．００４，０．０４，０．４，４，４０μｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図２６に示す。図２６には明確には示されていないが、２８時間後のＯＤ６００は、それぞれ９，１０，１０，９，１０，８であった。ニコチン酸含有量が０でもかなりの程度増殖性は認められたが、０．０４μｇ／ｍＬで増殖性は上昇し、４μｇ／ｍＬで最大値に達した。４０μｇ／ｍＬにおいては増殖性がやや阻害されることが確認された。これらの結果から、ニコチン酸濃度は、４０００μｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（イノシトール）
ＡＫＤ′培地に含まれるｍｙｏ−イノシトールの濃度を、０，０．０２μｇ／ｍＬ，０．２μｇ／ｍＬ，２μｇ／ｍＬ，２０μｇ／ｍＬ，２００μｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図２７（ａ）に示す。イノシトール含有量の上昇に比例して増殖性は上昇した。そこで、ＡＫＤ´培地に含まれるイノシトールの濃度を、０、０．０１％，０．１％，１％，１０％（１００ｇ／Ｌ相当）にそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図２７（ｂ）に示す。０．０１％〜１％で最大値において、今まで解決できなかったＡＫＤ′の増殖性を上回り、ＹＰＤとの差を解消する増殖性のカーブの傾きの増加、すなわちラインの上昇（図の矢印）が確認され、イノシトールが律速段階であるという予想外の知見が得られた。なお、イノシトールを１０％添加した場合には増殖性がＡＫＤ′よりも下回ることが確認された。したがって、イノシトールの濃度は、５０〜１００００ｍｇ／Ｌが好ましいことがわかった。
（１２）検討１２［金属イオン濃度の検討］
無機イオン濃度、アミノ酸濃度、及びビタミン濃度に引き続いて、金属イオンであるＦｅイオン濃度について検討することとした。ＡＫＤ′培地に含まれるＦｅＣｌ３の濃度を、０，０．００２，０．０２，０．２，２，２０μｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図２８に示す。また、図２８には明確には示されていないが、２４時間後のＯＤは、１０，９，１１，１０，１３，１４であった。２〜２０μｇ／ｍＬにおいて、高い増殖性を示した。これらの結果から、ＦｅＣｌ３濃度は、４０００μｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（１３）検討１３
［ＡＩＤ培地］（本発明の培地Ａ）
以上、Ｆｅイオン濃度及びビタミン濃度の検討結果を踏まえて、ＡＫＤ′培地に比較して鉄、パントテン酸、イノシトール等の添加量を増やした本発明の培地１（ＡＩＤ培地）を作製した。ＡＩＤ培地の処方例は以下の通りである。
【表１１】
2014030774.tif 000012
（ＡＩＤ培地における検討）
以下に示すように、ＡＩＤ培地における各種アミノ酸濃度や、パントテン酸のアミノ酸への代替可能性について検討した。適宜ＹＰＤ培地をコントロールとした。
（アラニン、メチオニン、セリン、スレオニン、グリシン、グルタミン、システイン、アスパラギン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン）
ＡＩＤ培地に添加するアラニン、メチオニン、セリン、スレオニン、グリシン、グルタミン、システインそれぞれのアミノ酸について０．０６２５％，０．１２５％，０．２５％，０．５％，１％に培地添加濃度を調整し、ＯＤ６００を測定した。結果を図２９（ａ）に示す。次に、アスパラギン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンそれぞれのアミノ酸について、０．１５６％，０．０３１２％，０．０６２５％，０．１２５０％，０．２５００％に培地添加濃度を調整し、２４時間後にＯＤ６００を測定した。図２９（ａ）及び（ｂ）の結果より、メチオニン、スレオニン、グリシン、グルタミン、システイン、アスパラギンについては、高濃度に添加すると、増殖性がむしろ阻害することが確認された。一方、アラニン、セリン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンについては高濃度に添加しても増殖性に対してよい影響を与えることが示唆された。
（チロシン）
チロシンは溶解性が低く、これまで０．０１ｇ／Ｌの濃度で検討してきたが、溶解性を増加させるためチロシンに代えてアセチルチロシン（ａＹ）を用いることとした。アセチルチロシン（Ａ２５１３、シグマ社製）の濃度を０，０．０１，０．１，０．５，１，２ｍｇ／ｍＬにそれぞれ調整したＡＩＤ培地におけるＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図３０に示す。図３０には明確には示されていないが、２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ１３，１４，１５，１４，１５，１８であった。これらの結果から、これ以降、チロシンの誘導体としてアセチルチロシンを用いることとし、かつアセチルチロシン濃度としては１ｇ／Ｌ程度が好ましいと判断した。
（アラニン）
１ｇ／Ｌアセチルチロシン添加ＡＩＤ培地（ａＹ−ＡＩＤ培地）におけるアラニンの濃度を、０，０．１，１，５，１０ｍｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図３１に示す。図３１には明確には示されていないが、２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ１７，１８，１８，１７，１８であった。これらの結果から、アラニン含有量が１ｍｇ／ｍＬ程度において、一番増殖カーブの傾きが大きいと判断した。
（イソロイシン）
ａＹ−ＡＩＤ培地におけるイソロイシンの濃度を、０，０．０１ｍｇ／ｍＬ，０．１ｍｇ／ｍＬ，０．５ｍｇ／ｍＬ，１ｍｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図３２に示す。図３２には明確には示されていないが、２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ１６，１７，１６，１７，１９であった。これらの結果から、イソロイシン含有量は、１ｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（フェニルアラニン）
ａＹ−ＡＩＤ培地におけるフェニルアラニンの濃度を、０，０．０１，０．１，０．５，１ｍｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図３３に示す。図３３には明確には示されていないが、２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ１７，１７，１９，１９、１９であった。これらの結果から、フェニルアラニン含有量は、１ｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（バリン）
ａＹ−ＡＩＤ培地におけるバリンの濃度を、０，０．０１，０．１，０．５，１ｍｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図３４に示す。図３４には明確には示されていないが、２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ１６，１５，１５，１６、１６であった。これらの結果から、バリン含有量は、１ｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（セリン）
ＡＩＤ培地におけるセリンの濃度を、０，０．０１ｍｇ／ｍＬ，０．１ｍｇ／ｍＬ，０．５ｍｇ／ｍＬ，１ｍｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図３５に示す。図３５の結果より、セリン含有量が０．５ｍｇ／ｍＬ前後において増殖性が特に上昇したことが確認された。これらの結果から、セリン含有量は、０．５ｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（スレオニン）
ＡＩＤ培地におけるスレオニンの濃度を、０，０．０１，０．１，０．５，１ｍｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図３６に示す。スレオニン含有量が０．５ｍｇ／ｍＬ前後において増殖性が特に上昇したことが確認された。これらの結果から、スレオニン含有量は、０．５ｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（アスパラギン）
ＡＩＤ培地におけるアスパラギンの濃度を、０，０．０１，０．１，０．５，１ｍｇ／ｍＬにそれぞれ調整し、ＲＡＫ３５９９株の増殖性を検討した。結果を図３７に示す。図３７には明確には示されていないが、２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ１５，１６，１６，１７、１６であった。これらの結果から、アスパラギン含有量は、０．５ｇ／Ｌ程度が好ましいことがわかった。
（ビタミン濃度の検討）
ＡＩＤ培地に含まれるビタミンについて検討をした。結果を図３８に示す。この結果より、パラアミノ安息香酸（図中Ａｍｉで表す）は増殖性を特に増加させる効果はないと判断した。
（パントテン酸の代替可能性）
次に、パントテン酸と代替できる物質を検討した。結果を図３９（ａ）に示す。β−アラニンがパントテン酸と代替されることが確認された。次に、β−アラニンの濃度について検討した。結果を図３９（ｂ）に示す。β−アラニンが０．４μｇ／ｍＬ以上添加されるとパントテン酸と代替できることが確認された。
【実施例２】
【００１０】
（ＡＹＤ培地の完成）（本発明の培地３）
上記ＡＩＤ培地やａＹ−ＡＩＤ培地における検討結果に基づいて、さらに増殖性が高い培地組成の処方を作成し、ＡＹＤ′培地（本発明の培地２）と名づけた。ＡＹＤ′の処方例は以下の通りである。
【表１２】
2014030774.tif 000013
（グルタミン、システイン）
上記ＡＹＤ′培地において、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株を用いて、グルタミンとシステインの濃度について検討した。結果を図４０に示す。試行錯誤するうちグルタミンの濃度を、これまでの１０倍程度にしたところ、非常に生育がよくなったことが確認されたので、グルタミンは５ｇ／Ｌ、システインは０．０１ｇ／Ｌ程度が適当であると判断した。
ＡＹＤ培地（本発明の培地３）として増殖性の高い酵母用培地を完成した。
【表１３】
2014030774.tif 000014
【表１４】
2014030774.tif 000015
（アミノ酸の併用効果）
上記ＡＹＤ培地において、サッカロマイセス・セルビシエＲＡＫ３５９９株を用いて、アミノ酸を上記表１４に示される通り、５つのグループに分け、グループごとに培地から除いて影響を確認した。結果を図４１（ａ）に示す。セリン、スレオニン、グリシン、メチオニン、システインのグループを除いた培地（ＡＹＤ−ＡＹ５）では、増殖性が顕著に低下することが確認されたので、ＡＹ５グループの個別のアミノ酸成分について検討をした。結果を図４１（ｂ）に示す。この結果から、メチオニンが欠如すると増殖性が低下することがわかった。かかる結果は、前記ＡＩＤ培地におけるメチオニン単独添加における検討結果と一致していない。前記表２に示されるように、ＡＩＤ培地においてはメチオニンをアミノ酸として単独で添加した場合、酵母はほとんど増殖せず、また、高濃度で添加しても増殖性によい影響を与えないことが確認されていた。また、上記ＡＹＤ′培地においてグルタミンの濃度を、５ｇ／Ｌにしたところ、さらに生育がよくなったことが確認された。これらのことから、アミノ酸の複数併用の場合と、アミノ酸の単独使用の場合とでは、そのアミノ酸が酵母の増殖性に及ぼす影響は必ずしも一致しないことが示唆されている。
（ＹＰＤ培地との比較）
ＡＹＤ培地と、ＹＰＤ培地及びＭＭ培地との比較を行った。結果を図４２に示す。ＡＹＤ培地は、クルベイロマイセス、サッカロマイセスのどちらにおいても、ＹＰＤ培地と非常に近い増殖性を示した。クルベイロマイセスのほうがサッカロマイセスよりも高い増殖性を示したが、双方ともＡＹＤ培地における増殖性が、ＹＰＤ培地における増殖性よりも高いことが示され、本発明の培地の効果が確認された。
（栄養要求性株の検討）
ＡＹＤ培地において、以下の各種酵母株について、栄養要求性を検討し、ＡＹＤ培地の有用性を確認した。各種酵母株は、上記基本培養方法と同じ条件で培養した。結果を図４３〜図５２に示す。
シゾサッカロミセス・ポンベＦＹ７５０７株を７０時間培養したときのデータを示す。図４３には明確には示されていないが、ＡＹＤ培地、ビオチン欠如ＡＹＤ培地、パントテン酸欠如ＡＹＤ培地、Ｚｎ２＋欠如ＡＹＤ培地、ピリドキシン欠如ＡＹＤ培地、チアミン欠如ＡＹＤ培地、Ｆｅ３＋欠如ＡＹＤ培地、ナイアシン欠如ＡＹＤ培地、ＹＰＤ培地の７２時間後のＯＤ６００は、それぞれ１８〜２０，１，１５，８，１９，１９，１７，２，１５〜１７であった。シゾサッカロミセス・ポンベＦＹ７５０７株は、ビオチン要求性であるとともに、ニコチン要求性であることが確認された。また、この菌株の増殖にはＺｎ２＋が含有されることが好ましいことも確認された（図４３（ａ）と（ｂ）参照）。
チゴサッカロミセスＲＡＫ５５７６株を２４時間培養したときのデータを示す。図４４には明確には示されていないが、ＡＹＤ培地、ビオチン欠如ＡＹＤ培地、パントテン酸欠如ＡＹＤ培地、Ｚｎ２＋欠如ＡＹＤ培地、ピリドキシン欠如ＡＹＤ培地、チアミン欠如ＡＹＤ培地、Ｆｅ３＋欠如ＡＹＤ培地、ナイアシン欠如ＡＹＤ培地、ＹＰＤ培地の２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ、８〜１０，２，１，２，８，６，５，９，５〜６であった。チゴサッカロミセスＲＡＫ５５７６株は、ビオチン要求性であるとともに、パントテン酸要求性であることが確認された。この菌株の増殖にはＺｎ２＋が含有されることが好ましいことも確認された（図４４（ａ）と（ｂ）参照）。
クルベイロマイセス・マルキシアヌスＮＣＹＣ５８７（ＲＡＫ３６８４）株、ＮＣＹＣ１４２９（ＲＡＫ３６８５）株、及びＮＣＹＣ２７９１（ＲＡＫ３６８６）株をそれぞれ２４時間培養したときのデータを示す。図４５〜４７には明確には示されていないが、ＡＹＤ培地、ビオチン欠如ＡＹＤ培地、パントテン酸欠如ＡＹＤ培地、Ｚｎ２＋欠如ＡＹＤ培地、ピリドキシン欠如ＡＹＤ培地、チアミン欠如ＡＹＤ培地、Ｆｅ３＋欠如ＡＹＤ培地、ナイアシン欠如ＡＹＤ培地、ＹＰＤ培地の２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ、３５〜３７，２〜７，０〜４，１２〜２９，３４〜４５，２６〜５０，１３〜３５，１〜６，３４〜４４であった。これらの菌は、ビオチン要求性、ナイアシン要求性であるとともに、パントテン酸要求性であることが確認された。これらの菌株の増殖にはＺｎ２＋が必要なことも確認された（図４５（ａ）と（ｂ），図４６（ａ）と（ｂ）及び図４７（ａ）と（ｂ）参照）。
同様に、クルベイロマイセス・ラクチスＮＲＲＬＹ−１１４０株を２４時間培養したときのデータを示す。図４８には明確には示されていないが、ＡＹＤ培地、ビオチン欠如ＡＹＤ培地、Ｆｅ３＋欠如ＡＹＤ培地、ナイアシン欠如ＡＹＤ培地、パントテン酸欠如ＡＹＤ培地、ピリドキシン欠如ＡＹＤ培地、チアミン欠如ＡＹＤ培地、Ｚｎ２＋欠如ＡＹＤ培地、ＹＰＤ培地の２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ、２８〜３０，１，１８，１，０，２７，２９，６，４５であった。クルベイロマイセス・ラクチスは、ビオチン要求性、ナイアシン要求性であるとともに、パントテン酸要求性であることが確認された。これらの菌株の増殖にはＺｎ２＋が必要なことも確認された（図４８（ａ）と（ｂ）参照）。
ピキア・スチピチスＮＢＲＣ１００６３（ＲＡＫ５１２８）株を２４時間培養したときのデータを示す。図４９には明確には示されていないが、ＡＹＤ培地、ビオチン欠如ＡＹＤ培地、Ｆｅ３＋欠如ＡＹＤ培地、ナイアシン欠如ＡＹＤ培地、パントテン酸欠如ＡＹＤ培地、ピリドキシン欠如ＡＹＤ培地、チアミン欠如ＡＹＤ培地、Ｚｎ２＋欠如ＡＹＤ培地、ＹＰＤ培地の２４時間後のＯＤ６００は、それぞれ、３５〜３８，４，１２，４０，３４，３８，３５，２２，５８であった。ピキア・スチピチスは、ビオチン要求性であることが確認されたが、パントテン酸要求性ではなかった。この菌株の増殖にはＺｎ２＋や鉄イオンが含有されることが好ましいことも確認された（図４９（ａ）と（ｂ）参照）。
キャンディダ・グラブラタＢＹ２３８７６株はビオチン要求性であるとともに、ピリドキシン要求性、チアミン要求性、ニコチン要求性であることが確認された（図５０（ａ）と（ｂ）参照）。キャンディダ・ウティリスＪＣＭ９６２４株は、ビオチン要求性ではないが、チアミン要求性であることが確認された。また、この菌株の増殖にはＺｎイオンが含有されることが好ましいことも確認された（図５１（ａ）と（ｂ）参照）。キャンディダ・アルビカンスＪＣＭ１５４２株は、ビオチン要求性ではあることが確認された。この菌株の増殖にはＺｎ２＋が含有されることが好ましいことも確認された（図５２（ａ）と（ｂ）参照）。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
従来酵母用合成培地として広く用いられてきたＳＤ培地とＹＰＤ培地と本発明の培地を用いてサッカロマイセス・セレビシエとクルベイロマイセス・マルキシアヌスを培養し、増殖性を比較した。結果を図５３（ａ）及び（ｂ）に示す。本発明の培地は、富栄養培地に近い又は同等の増殖性を示し、本発明の培地の効果をもってすると、発酵産業等に有用な培地を提供するものといえる。
【図５】
2014030774.tif 000017
【図６】
2014030774.tif 000018
【図７】
2014030774.tif 000019
【図８】
2014030774.tif 000020
【図９】
2014030774.tif 000021
【図１０】
2014030774.tif 000022
【図１１】
2014030774.tif 000023
【図１２】
2014030774.tif 000024
【図１３】
2014030774.tif 000025
【図１４】
2014030774.tif 000026
【図１５】
2014030774.tif 000027
【図１６】
2014030774.tif 000028
【図１７】
2014030774.tif 000029
【図１８】
2014030774.tif 000030
【図１９】
2014030774.tif 000031
【図２０】
2014030774.tif 000032
【図２１】
2014030774.tif 000033
【図２２】
2014030774.tif 000034
【図２３】
2014030774.tif 000035
【図２４】
2014030774.tif 000036
【図２５】
2014030774.tif 000037
【図２６】
2014030774.tif 000038
【図２７】
2014030774.tif 000039
【図２８】
2014030774.tif 000040
【図３０】
2014030774.tif 000041
【図３１】
2014030774.tif 000042
【図３２】
2014030774.tif 000043
【図３３】
2014030774.tif 000044
【図３４】
2014030774.tif 000045
【図３５】
2014030774.tif 000046
【図３６】
2014030774.tif 000047
【図３７】
2014030774.tif 000048
【図３８】
2014030774.tif 000049
【図３９】
2014030774.tif 000050
【図４０】
2014030774.tif 000051
【図４１】
2014030774.tif 000052
【図４２】
2014030774.tif 000053
【図４３】
2014030774.tif 000054
【図４４】
2014030774.tif 000055
【図４５】
2014030774.tif 000056
【図４６】
2014030774.tif 000057
【図４７】
2014030774.tif 000058
【図４８】
2014030774.tif 000059
【図４９】
2014030774.tif 000060
【図５０】
2014030774.tif 000061
【図５１】
2014030774.tif 000062
【図５２】
2014030774.tif 000063
【図１】
2014030774.tif 000064
【図２】
2014030774.tif 000065
【図３】
2014030774.tif 000066
【図４】
2014030774.tif 000067
【図２９】
2014030774.tif 000068
【図５３】
2014030774.tif 000069
【国際調査報告】
2014030774.tif 000070
2014030774.tif 000071
2014030774.tif 000072
2014030774.tif 000073