【手続補正書】
【提出日】平成27年11月10日(2015.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の末端部分のアミノ酸配列である末端アミノ酸配列に基づいて該タンパク質を同定するためのタンパク質同定方法であって、
a)既知である種々のタンパク質と各タンパク質の少なくとも末端アミノ酸配列とが対応付けられた情報を利用して、調査対象として与えられた目的末端アミノ酸配列に該当するタンパク質を検索しタンパク質候補として抽出する同定候補抽出ステップと、
b)該同定候補抽出ステップにおいて抽出されたタンパク質候補が一つである場合に、該候補を前記目的末端アミノ酸配列に対応するタンパク質同定結果として決定する同定結果決定ステップと、
c)前記同定候補抽出ステップにおいて抽出されたタンパク質候補が複数である場合に、その複数のタンパク質候補の末端アミノ酸配列を参照して前記目的末端アミノ酸配列にさらに付加し得るアミノ酸残基を決定し、該アミノ酸残基を前記目的末端アミノ酸配列に付加して作成される末端アミノ酸配列を持つタンパク質が一つに絞られるか否かを、その作成される末端アミノ酸配列毎に調べることによって、どの程度までアミノ酸配列長を延ばしたときにタンパク質が一意に同定可能となるかを予測する同定可能性予測ステップと、
を有することを特徴とするタンパク質同定方法。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質同定方法であって、
前記同定可能性予測ステップは、前記目的末端アミノ酸配列にアミノ酸残基を付加して作成する末端アミノ酸配列の配列長の上限値に達してもタンパク質が一意に同定できない場合に、末端アミノ酸配列からタンパク質の同定が不可であると結論付けることを特徴とするタンパク質同定方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のタンパク質同定方法であって、
既知であるタンパク質のアミノ酸配列情報に基づいて、タンパク質の末端部分の所定長のアミノ酸配列を抽出し、該末端アミノ酸配列とそれに該当するタンパク質とを対応付けて収録した末端配列データベースを構築する末端配列データベース構築ステップをさらに有し、前記同定候補抽出ステップは、与えられた末端アミノ酸配列を前記末端配列データベースに含まれる末端アミノ酸配列と照合することにより、その与えられた末端アミノ酸配列に該当するタンパク質を検索しタンパク質候補として抽出することを特徴とするタンパク質同定方法。
【請求項４】
タンパク質の末端部分のアミノ酸配列である末端アミノ酸配列に基づいて該タンパク質を同定するためのタンパク質同定装置であって、
a)既知である種々のタンパク質と各タンパク質の少なくとも末端アミノ酸配列とが対応付けられた情報を利用して、調査対象として与えられた目的末端アミノ酸配列に該当するタンパク質を検索しタンパク質候補として抽出する同定候補抽出部と、
b)該同定候補抽出部により抽出されたタンパク質候補が一つである場合に、該候補を前記目的末端アミノ酸配列に対応するタンパク質同定結果として決定する同定結果決定部と、
c)前記同定候補抽出部により抽出されたタンパク質候補が複数である場合に、その複数のタンパク質候補の末端アミノ酸配列を参照して前記目的末端アミノ酸配列にさらに付加し得るアミノ酸残基を決定し、該アミノ酸残基を前記目的末端アミノ酸配列に付加して作成される末端アミノ酸配列を持つタンパク質が一つに絞られるか否かを、その作成される末端アミノ酸配列毎に調べることによって、どの程度までアミノ酸配列長を延ばしたときにタンパク質が一意に同定可能となるかを予測する同定可能性予測部と、
を備えることを特徴とするタンパク質同定装置。
【請求項５】
請求項４に記載のタンパク質同定装置であって、
前記同定可能性予測部は、前記目的末端アミノ酸配列にアミノ酸残基を付加して作成する末端アミノ酸配列の配列長の上限値に達してもタンパク質が一意に同定できない場合に、末端アミノ酸配列からタンパク質の同定が不可であると結論付けることを特徴とするタンパク質同定装置。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のタンパク質同定装置であって、
既知であるタンパク質のアミノ酸配列情報に基づいて、タンパク質の末端部分の所定長のアミノ酸配列を抽出し、該末端配列とそれに該当するタンパク質とを対応付けて収録した末端アミノ酸配列データベースを構築する末端配列データベース構築部をさらに備え、
前記同定候補抽出部は、与えられた末端アミノ酸配列を前記末端配列データベースに含まれる末端アミノ酸配列と照合することにより、その与えられた末端アミノ酸配列に該当するタンパク質を検索しタンパク質候補として抽出することを特徴とするタンパク質同定装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
上述したように、質量分析及びその結果の解析によって判明した末端アミノ酸配列に基づいてタンパク質を同定するための従来の方法ではいずれも、タンパク質を同定できなかった場合に、そのときに与えられた末端アミノ酸配列では、該当する末端を持つ複数の配列が得られ、そのままでは同定が不可である、という結果が得られるだけであって、それ以上の情報、具体的には、そもそも末端アミノ酸配列に基づく同定が可能なタンパク質であるか否かといった情報さえ得られない。このため、末端アミノ酸配列に基づく同定が不可能なタンパク質であるにもかかわらず、同定できるものと誤った認識をし、末端アミノ酸配列だけで同定と判断してしまうおそれがあった。或いは、逆に、末端アミノ酸配列だけで同定できるケースであるにもかかわらず、それ以外のアミノ酸配列までも調べようとして作業効率を低下させる可能性もあった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
そこで、本発明に係るタンパク質の同定方法では、既知であるタンパク質のアミノ酸配列情報に基づいて、タンパク質の末端部分の所定長のアミノ酸配列を抽出し、該末端アミノ酸配列とそれに該当するタンパク質とを対応付けて収録した末端配列データベースを構築する末端配列データベース構築ステップをさらに有し、
前記同定候補抽出ステップは、与えられた末端アミノ酸配列を前記末端配列データベースに含まれる末端アミノ酸配列と照合することにより、その与えられた末端アミノ酸配列に該当するタンパク質を検索しタンパク質候補として抽出するようにするとよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
同定対象であるタンパク質は、例えばトリプシン等適宜の消化酵素を用いた前処理によりペプチド断片に分解される。このペプチド混合物は、タンパク質のＮ−及びＣ−末端ペプチドと、Ｎ−及びＣ−末端ペプチド以外のペプチドである内部ペプチドと、が混在したものである。そこで、周知のタンパク質末端配列解析法により、Ｎ−及び／又はＣ−末端ペプチドのスペクトルデータを質量分析計１を用いて測定する。スペクトルデータ収集部２は質量分析計１によって得られたマススペクトルデータ、ＭＳnスペクトルデータを収集して一旦記憶する。末端ペプチドのアミノ酸配列は主としてＭＳn（典型的にはＭＳ2）スペクトルデータから推定される。アミノ酸配列はデノボ解析法又はＭＳ／ＭＳイオンサーチにより求めることができる。ＭＳ／ＭＳイオンサーチを利用する場合には、ペプチド由来の分子イオンであると推測されるイオンをプリカーサイオンに設定してＭＳ2分析（場合によってはｎが３以上のＭＳn分析）を実行し、それによって得られたＭＳnスペクトルのピーク情報を後述するアミノ酸配列の推定に利用すればよい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
同定処理部４には、上述したように被検試料に対する質量分析の結果から推定されたタンパク質の末端部分のアミノ酸配列が調査対象として供される。この同定処理部４に含まれる末端配列データベース４６は、上述したようなタンパク質データベースやゲノム配列データベースに収録されているタンパク質末端部分のアミノ酸配列をインデクスとし、それに合致する、つまりはそうしたアミノ酸配列を末端部分に持つタンパク質の情報、エントリ名やアクセッション番号などを収録したデータベースである。情報読込部４４は例えばインターネット等の通信回線を通じて外部からデータを受領する機能を有し、上記タンパク質データベース７やそのほかのデータベースから必要な情報を収集する。データベース作成・管理部４５は情報読込部４４が受領した情報を整理して、末端配列データベース４６を構築し、また必要に応じて末端配列データベース４６を更新する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
そのあと、配列長予測部４３は、アミノ酸残基を１個だけ付加することによって新たに作成された末端アミノ酸配列を末端部分に有するタンパク質がそれぞれ１個ずつであるか否かを判定する（ステップＳ８）。即ち、これは、ステップＳ７において、与えられた末端アミノ酸配列にアミノ酸残基を１個だけ加えて配列長が１だけ長い末端アミノ酸配列としたときに、その全ての末端アミノ酸配列において必ずタンパク質が一意に同定できるようになるか、或いは、依然としてタンパク質が一意に同定できないのか、を判定する処理である。ステップＳ８でＹｅｓである場合には、ステップＳ７において、与えられた末端アミノ酸配列にアミノ酸残基を１個追加することによって、タンパク質が一意に同定可能となることを意味する。そこで、その旨をそのときの末端アミノ酸配列の配列長又は追加するアミノ酸残基の個数とともに表示部５に表示して（ステップＳ９）処理を終了する。このときには、始めに指定した調査対象末端配列ではタンパク質の同定結果は得られないものの、分析者は、始めに指定した調査対象末端配列に対してアミノ酸残基があと何個判明すればタンパク質を一意に同定できるようになるかを知ることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
ステップＳ８においてＮｏである場合、即ち、末端アミノ酸配列をアミノ酸残基1個分だけ延ばしても依然としてタンパク質を一意に同定できない場合には、直前のステップＳ７において新たに作成された末端アミノ酸配列の配列長が事前に定めた所定の上限値未満であるか否かを判定し（ステップＳ１０）、そのときの配列長が所定上限値未満であればステップＳ７へと戻る。即ち、ステップＳ７〜Ｓ１０の繰り返しによって、配列長が最大限、所定上限値に一致する個数までアミノ酸残基を元の調査対象末端配列に追加してゆき、その間に異なるアミノ酸残基を追加した全ての末端アミノ酸配列においてタンパク質が一意に同定できるようになればステップＳ８からＳ９へと進む。一方、配列長が所定上限値に一致するような個数だけアミノ酸残基を付加することで末端アミノ酸配列を延ばしても、依然としてタンパク質を一意に決めることができないケースが存在する場合には、ステップＳ１０でＮｏと判定される。このときには、タンパク質同定のための配列長推定処理をこれ以上継続してもタンパク質の同定に至らないと判断できるから、その旨を表示部５により表示し（ステップＳ１１）、処理を終了する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
以上のようにして、本実施例のタンパク質同定システムによれば、実験の結果等に基づいて与えられた調査対象の末端アミノ酸配列でタンパク質が一意に同定可能である場合にはその旨が表示部５に表示される一方、調査対象の末端アミノ酸配列でタンパク質が一意に同定できない場合でも、あと何個のアミノ酸残基が判明すればタンパク質の同定が可能となるかの予測結果が表示部５に表示される。また、所定の上限値まで末端アミノ酸配列の配列長を延ばしてもタンパク質を一意に同定できる可能性がない場合には、その旨が表示部５に表示される。これにより、タンパク質が同定できない場合でも、以降の実験のために有用な情報が分析者に提供されることになる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
図３（ｂ）に示した７種のタンパク質はいずれも、調査対象末端配列［ＡＣＤＥＦ］をＮ末端部分に有している。そのため、ステップＳ３ではＹｅｓと判定され、続くステップＳ５ではＮｏと判定される。つまり、これは、最初に分析者が指定した調査対象末端配列ではタンパク質が一意に決定できない例である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
図３（ｂ）に示すように、Ｎ末端から６番目のアミノ酸残基は全て「Ｇ」であるから、ステップＳ７が初めて実行される際に作成される新たな末端アミノ酸配列は［ＡＣＤＥＦ］に「Ｇ」を付加した［ＡＣＤＥＦＧ］の１種類のみである（図４（ａ）参照）。ただし、７種類のタンパク質は全て、この末端アミノ酸配列［ＡＣＤＥＦＧ］を有しているから、ステップＳ８ではＮｏと判定される。上述したように、ステップＳ１０における「所定上限値」が「２０」であるとすると、このときの末端アミノ酸配列の配列長は「６」であって「２０」未満であるから、ステップＳ１０ではＹｅｓと判定され、ステップＳ７へと戻る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
以下同様にして、ステップＳ１０からＳ７へと戻ると、新たに［ＡＣＤＥＦＧＡＨ］、［ＡＣＤＥＦＧＡＫ］、［ＡＣＤＥＦＧＡＹ］、［ＡＣＤＥＦＧＦＦ］、［ＡＣＤＥＦＧＦＴ］の５種類の末端アミノ酸配列が作成される（図４（ｃ）参照）。この場合、仮に実験によって［ＡＣＤＥＦＧＡＨ］や［ＡＣＤＥＦＧＡＹ］である末端アミノ酸配列が得られたとしたならば、候補となるタンパク質はそれぞれ１種類のみであるから、タンパク質を一意に同定することができる。しかしながら、実験によって得られる末端アミノ酸配列が［ＡＣＤＥＦＧＡＫ］であった場合には、タンパク質２、３のいずれであるか区別がつかない。したがって、依然としてステップＳ８でＮｏと判定され、ステップＳ１０を経てＳ７へと戻る。