(57)【要約】  本発明は、ワクチン用のボンビュクス・モリにおける発現にコドン最適化された核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターを含むボンビュクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）およびそれらを利用するワクチンの生産方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスに対するワクチンをボンビュクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）で産生するための、ボンビュクス・モリにおける発現にコドン最適化された該ウイルスの核酸配列を含む核酸。
【請求項２】
ウイルスが、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイルス、西ナイルウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、および口蹄疫ウイルスからなる群より選択される、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
ウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスである、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
ウイルスが、Ｈ５型およびＨ７型からなる群より選択される、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
核酸配列が、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質をコードする、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
核酸配列が、弱毒化遺伝子改変を有する、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
核酸配列が、配列番号４、配列番号１２、配列番号１８からなる群より選択される核酸配列である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８】
ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルスである、請求項２に記載の核酸。
【請求項９】
核酸配列が、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ１タンパク質、Ｅ２タンパク質および／または核タンパク質をコードする、請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
核酸配列が、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ１タンパク質、Ｅ２タンパク質および核タンパク質をコードする、請求項８に記載の核酸。
【請求項１１】
核酸配列が、配列番号１５である、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
核酸配列が、配列番号４、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、または３３である、請求項２に記載の核酸。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを用いて産生された組み換え体バキュロウイルス。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸、請求項１３に記載のベクター、または請求項１４に記載の組み換え体バキュロウイルスを含む、ボンビュクス・モリ。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸がコードするアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸、請求項１３に記載のベクター、請求項１４に記載の組み換え体バキュロウイルス、または請求項１５に記載のボンビュクス・モリを使用する、ワクチンの生産方法。
【請求項１８】
以下の工程：
１）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸、請求項１３に記載のベクター、または請求項１４に記載の組み換え体バキュロウイルスを得る工程
２）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸、請求項１３に記載のベクター、または請求項１４に記載の組み換え体バキュロウイルスをボンビュクス・モリに導入する工程；および
３）ボンビュクス・モリからタンパク質を回収する工程
を含む、請求項１７に記載のワクチンの生産方法。
【請求項１９】
ウイルスの感染に対する、動物のワクチン接種のための、請求項１６に記載のポリペプチドを含むか、または請求項１７もしくは１８に記載の生産方法に従って生産される、ワクチン。
【請求項２０】
ウイルス様粒子構造である、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
ウイルス様粒子構造の直径が５０ｎｍ〜１５０ｎｍである、請求項２０に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン用の核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターを含むボンビュクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）およびそれらを利用するワクチンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、ヒト領域でのワクチン対策が緊急の課題となっている。例えばインフルエンザについては以下の問題が生じている：インフルエンザウイルス粒子の表面にはヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）のタンパク質が存在しているが、ＨＡサブタイプは１６種、そしてＮＡのサブタイプは９種が存在していて、トリの世界にはその全てのサブタイプが存在している。その中でも、多数のトリを殺す強毒（強病原性）ウイルスはＨ５とＨ７のサブタイプに限られている。Ｈ５のサブタイプをもつ強毒ウイルスによるインフルエンザは、１９６１年、ウミ鳥のアジサシで大流行して南アフリカで初めて発見された。それ以来、１９８３〜１９８４年にかけ米国で大流行し、さらに、１９９７年に香港のニワトリとヒトで流行し、それ以降、世界各地で流行してきた。その予防の為、ヒトとニワトリに用いる全粒子不活化ワクチンが既に開発されている。さらに、トリで強毒性を発揮するＨ７ウイルスも、１９２７年以来、世界の各地で流行している。特に、オランダでは１９８０年代後半にヒトで多くの被害者を出し、２００３年にもＨ７Ｎ７ウイルスが家禽に流行した後、８９人の感染者が確認され、１人が死亡した。その後の調査により、感染した家禽に接触したヒトの５９％が抗体陽性であり、最低でも１，０００人が感染したと推定されている。さらに、２０１３年の３月から中国で発生したトリインフルエンザはヒトにも伝播し、その原因はＨ７Ｎ９型の弱毒株であることが明らかにされた。【０００３】
またＣ型肝炎ウイルスはその感染により急性肝炎症状を惹起するだけでなく、慢性肝炎、それに続く肝硬変の発生や、その後の肝臓癌の進展にも大きな負の役割を演じている。ウイルス性肝炎には経口感染により感染が広がるものと血液を介して感染するものとの２種があり、後者はＢ型肝炎ウイルスやＣ型肝炎ウイルスによって代表される。近年、Ｂ型肝炎ウイルスに関しては、ワクチンが利用できるようになったが、Ｃ型肝炎については化学療法の進歩は著しいものの、全てのウイルス株に有効な決定的な治療法はなく、文明国を中心に精力的な研究が進められているものの、未だ実用に供されるワクチンは全く無いのが現状である。【０００４】
日本脳炎の原因ウイルスは、１９３５年に日本で分離されたウイルスであり、当時は日本においても多くの患者が発生していた。その後、１９５４年からワクチン接種が開始され、劇的に患者は減少し、平成４年以降年間１０名以下の患者が報告されている状況である。ただし、日本からウイルスが消えた訳ではない。日本脳炎ウイルスはブタからカを介してヒトに感染すると考えられているが、現在でも日本国内の多くのブタの血清は抗日本脳炎ウイルス抗体陽性である。また、海外に目を転じれば、アジアを中心に年間３５，０００−５０，０００人の患者が発生し、その内１０，０００−１５，０００人が亡くなっており、対策を必要とする重要な感染症である。現在日本で用いられているワクチンは、２００９年に接種が開始されたものであり、それ以前のワクチンに比較し副作用が少ないとされている。しかしながら、２０１２年にもワクチン接種後の２例の死亡が報告されている。以上の状況を考慮すれば、安価で副作用の少ないワクチンの早急な開発が必要であることは明らかである。【０００５】
日本は、イギリス、オーストラリア、ニュージーランド、台湾、スウェーデン等と共に、例外的に狂犬病の発生が見られない国である。他の諸国では発生があり、年間３０，０００−５０，０００人の死亡者がある。狂犬病ウイルスは、多くの野生動物中で増殖が可能であり、狂犬病を完全に防ぐには野生動物への免疫の導入が必要である。組み換え体ワクシニアウイルスを用いた生ワクチンが成果を得、注目を集めている。しかしながら、現在のところ問題は報告されていないものの、広く自然界への生ワクチンの導入が予測できない結果を生む可能性は否定できない。安く有効な経口不活化ワクチンの開発が望まれる。【０００６】
西ナイルウイルスは１９３５年ウガンダで初めて分離された。このウイルスの感染環はトリとカの間で成立しており、時として、カによりヒトが感染する。感染したヒトが症状を示す率は８０％程度であるが、発症患者の１５０人に１人程度の割合で重篤な脳炎、髄膜炎症状を示し、重症患者の３−１５％が亡くなる。１９９９年の夏にニューヨークでの流行が起こるまで、西半球に侵入することはなかった。その後ほぼ米国全土で感染患者が見られる状況となっており、日本への侵入が危惧される。米国では、１９９９−２０１２年の間に、３６，５００の患者が確認され、１，５００人が亡くなっている。日本に既に存在するカもウイルスの伝播を担い得るとされており、いつ日本に侵入があってもおかしくない状況である。早急な有効なワクチンの開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０４６４３９
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍａｅｄａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９８５）  ３１５，  ５９２−５９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような状況に在って、例えば未だにインフルエンザワクチンの生産には、伝統的に１０〜１１日齢の発育受精卵が使用されている。今日の科学技術の進歩により、培養細胞のＭＤＣＫあるいはＶＥＲＯでの生産も可能になってきた。特に注目されるのは、様々なベクターを用いた遺伝子操作技術で、目的とするインフルエンザワクチン用タンパク質を、酵母やカイコ（ボンビュクス・モリ）の個体、あるいはボンビュクス・モリの培養細胞で生産できるようになってきたことである。本発明者らは、１９９８年にＨ５のトリインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質をボンビュクス・モリで大量に生産することに成功した。その時には、１９９７年に香港でヒトから分離されたＡ／ＨＫ／４８３／９７（Ｈ５Ｎ１）インフルエンザＲＮＡウイルスから、ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質をコードするＤＮＡを逆転写し、これを大腸菌のプラスミドにクローニングした遺伝子を用いた。インフルエンザワクチン生産用のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡを、さらにバキュロウイルスのトランスファーベクターに組換え、ワクチン用タンパク質の生産を実施した。【００１０】
この方法で作出した組換えバキュロウイルス感染ボンビュクス・モリの赤血球凝集活性（ＨＡ活性）は、感染５日目で８，１９２の値を示した。その結果、発育鶏卵で産生されるワクチン用ウイルスのＨＡ活性が、一般的には１，０２４であることと比較した場合、１個の発育鶏卵から産生されるウイルス液はほぼ１０mlであり、その総ＨＡ活性は１０，２４０となる。一方、ボンビュクス・モリ１頭で産生されるＨＡタンパク質溶液１５ml中の総ＨＡ活性の平均値は１２２，８００という値になり、その生産比は、およそ１２倍の高さということになった。これが、天然の高病原性トリインフルエンザウイルスのＨＡを、ＤＮＡを設計変更することなくバキュロウイルスベクターで産生した、これまでの技術による発現効率である。【００１１】
発育鶏卵によるワクチンの生産は、ワクチンに用いる種ウイルスを扱うためにＰ３施設など大規模な施設を必要とし、抗原性を変えずに安全な種ウイルスにするためにはコストが高いこと、また、安全にワクチンを生産するためには感染性のあるウイルスを安全に取り扱う施設を作る必要があり設備的にも生産という面でもコストが高いこと、卵アレルギーの原因となること、大量の卵を必要とすること、鶏卵で増やすためには、時として抗原性に変化を与えてしまうこと、また、有効成分だけのコンポーネントワクチンの製造が困難であること、といった種々の問題がある。他方、これまでのボンビュクス・モリによるワクチン生産技術は、界面活性剤を加えての精製が必要であった。
このように、これまでの発育鶏卵を使用するワクチン生産の技術には、コスト、生産量の限界があり、さらに、有効成分のＨＡだけでの生産には、コストと精製技術の大きな問題がある。これを乗り越えるためには、新たなＨＡタンパク質の量産技術が必要である。【００１２】
よって、本発明の課題は、ワクチン用の核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターを含むボンビュクス・モリおよびそれらを利用するワクチンの生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意研究したところ、ボンビュクス・モリにおける発現にコドン最適化された核酸配列を用いることにより、ボンビュクス・モリにより生産されるワクチン用タンパク質の力価が著しく増大することを、初めて見出し、本発明を完成させた。【００１４】
すなわち、本発明は以下のとおりである：
［１］ウイルスに対するワクチンをボンビュクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）で産生するための、ボンビュクス・モリにおける発現にコドン最適化された該ウイルスの核酸配列を含む核酸、
［２］ウイルスが、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイルス、西ナイルウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、および口蹄疫ウイルスからなる群より選択される、［１］に記載の核酸、
［３］ウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスである、［２］に記載の核酸、
［４］ウイルスが、Ｈ５型およびＨ７型からなる群より選択される、［３］に記載の核酸、
［５］核酸配列が、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質をコードする、［４］に記載の核酸、
［６］核酸配列が、弱毒化遺伝子改変を有する、［５］に記載の核酸、
［７］核酸配列が、配列番号４、配列番号１２、配列番号１８からなる群より選択される核酸配列である、［１］〜［６］のいずれかに記載の核酸、
［８］ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルスである、［２］に記載の核酸、
［９］核酸配列が、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ１タンパク質、Ｅ２タンパク質および／または核タンパク質をコードする、［８］に記載の核酸、
［１０］核酸配列が、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ１タンパク質、Ｅ２タンパク質および核タンパク質をコードする、［８］に記載の核酸、
［１１］核酸配列が、配列番号１５である、［１０］に記載の核酸、
［１２］核酸配列が、配列番号４、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、または３３である、［２］に記載の核酸、
［１３］［１］〜［１２］のいずれかに記載の核酸を含む、ベクター、
［１４］［１３］に記載のベクターを用いて産生された組み換え体バキュロウイルス、
［１５］［１］〜［１２］のいずれかに記載の核酸、［１３］に記載のベクター、または［１４］に記載の組み換え体バキュロウイルスを含む、ボンビュクス・モリ、
［１６］［１］〜［１２］のいずれかに記載の核酸がコードするアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
［１７］［１］〜［１２］のいずれかに記載の核酸、［１３］に記載のベクター、［１４］に記載の組み換え体バキュロウイルス、または［１５］に記載のボンビュクス・モリを使用する、ワクチンの生産方法、
［１８］以下の工程：
１）［１］〜［１２］のいずれかに記載の核酸、［１３］に記載のベクター、または［１４］に記載の組み換え体バキュロウイルスを得る工程
２）［１］〜［１２］のいずれかに記載の核酸、［１３］に記載のベクター、または［１４］に記載の組み換え体バキュロウイルスをボンビュクス・モリに導入する工程；および
３）ボンビュクス・モリからタンパク質を回収する工程
を含む、［１７］に記載のワクチンの生産方法、
［１９］ウイルスの感染に対する、動物のワクチン接種のための、［１６］に記載のポリペプチドを含むか、または［１７］もしくは［１８］に記載の生産方法に従って生産される、ワクチン、
［２０］ウイルス様粒子構造である、［１９］に記載のワクチン、
［２１］ウイルス様粒子構造の直径が５０ｎｍ〜１５０ｎｍである、［２０］に記載のワクチン、
［２２］ウイルスの感染に対するワクチンを、動物に接種する方法であって、［１６］に記載のポリペプチドを含むかまたは［１７］もしくは［１８］に記載の生産方法に従って生産されるワクチンの有効量を、前記動物に投与することを含む方法、
［２３］ウイルスに対する免疫応答を、動物に誘導する方法であって、［１６］に記載のポリペプチドを含むかまたは［１７］もしくは［１８］に記載の生産方法により生産されるワクチンの有効量を、前記動物に投与することを含む方法
である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、より力価の高い、ワクチン用の核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターを含むボンビュクス・モリおよびそれらを利用するワクチンの生産方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ボンビュクス・モリ（学名：Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）におけるコドン使用頻度を示す。ボンビュクス・モリの１１８０のコーディング領域（ＣＤＳ）中の４５００４３コドン中の使用頻度を調べた表である。それぞれのコドンの１０００個当たりの出現頻度を示す。括弧内の数字は、出現総数を示す。太字で示したところが、各アミノ酸に対するもっとも使用頻度の高い遺伝子コドンであることを示す。
【図２】図１で示した最も使用頻度の高い遺伝子コドンを元にした最適化したコドン対応表を示す。セリン（Ｓ）はＵＣＡであり、その相補鎖はＴＧＡであり、終止コドンである。そのため、セリンの相補鎖は終止コドンとなり、相補鎖に大きなフレームが出現することはない。
【図３−１】トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。高病原性トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、弱毒化、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を決定した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図３−２】トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。高病原性トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、弱毒化、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を決定した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図３−３】トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線は弱毒化部位を示す。高病原性トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、弱毒化、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を決定した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図３−４】トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。高病原性トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、弱毒化、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を決定した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図４】合成したワクチン用ＨＡタンパク質をコードする遺伝子のコーディングフレームの解析の結果である。下からＮ１＞−、Ｎ２＞−、Ｎ３＞−は、それぞれプラス鎖を３つのコーディングフレームを解析した結果である。上にあるバーは、開始コドンであるＡＴＧの位置を示し、下につきだしたバーは、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）の場所を示す。Ｎ１＞−のみが１つの大きなコーディングフレームとなるが、他のフレームでは、下につきだしたバーが多く、仮に発現したとしても大きなタンパク質を作ることは出来ない。下から４番目から一番上までのＮ１＜−、Ｎ２＜−、Ｎ３＜−は、相補鎖のコーディングフレームを解析した結果である。いずれのフレームも、仮に、発現したとしても大きなタンパク質を作ることは出来ない。
【図５−１】コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とトリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子ｃＤＮＡ配列とのアラインメントを示す。Ｑｕｅｒｙはコドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列（ＦＬＡＧ ＴＡＧを除くコーディング領域の配列）、ＳｂｊｃｔはトリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）（ＨＡのコーディング領域配列）を示す。配列が同じ部分は＊で示し、−はギャップを示している。相同性は７７％と非常に低くなっているが、強毒性配列を改変し、削除した以外は、同じアミノ酸配列を発現するように設計されている。
【図５−２】コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とトリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）  ウイルスのＨＡ遺伝子ｃＤＮＡ配列とのアラインメントを示す。Ｑｕｅｒｙはコドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列（ＦＬＡＧ ＴＡＧを除くコーディング領域の配列）、ＳｂｊｃｔはトリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）（ＨＡのコーディング領域配列）を示す。配列が同じ部分は＊で示し、−はギャップを示している。相同性は７７％と非常に低くなっているが、強毒性配列を改変し、削除した以外は、同じアミノ酸配列を発現するように設計されている。
【図６】ボンビュクス・モリを用いて生産したトリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）のコドン最適化ＨＡ遺伝子からのＨＡタンパク質のウェスタンブロッティングによる発現確認を示す。Ｍａｒｋｅｒ：分子量マーカー。Ｃｏｎｔｒｏｌ：非感染ボンビュクス・モリ。Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ：コドン最適化ＨＡ遺伝子感染ボンビュクス・モリ。矢印は、特異的バンドを示す。
【図７】ｐＢｍ−８ＨＡを用いて作成したＨＡ溶液によるニワトリにおけるＨＩ抗体の種々のインフルエンザウイルスに対するＨＩ活性を示す。天然のウイルスと幅広く反応した。
【図８】ショ糖密度勾配の各分画のＨＡ活性を示す。天然のウイルスの沈降位置よりも低密度の位置にＨＡ活性が分布していた。
【図９】ショ糖密度勾配分画中の電子顕微鏡像を示す。直径６０〜１２０ｎｍのウイルス様粒子が多数観察された。
【図１０−１】トリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。トリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１０−２】トリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。トリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１０−３】トリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線は弱毒化部位を示す。トリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１０−４】トリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。トリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１１】ボンビュクス・モリを用いて生産したトリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）のコドン最適化ＨＡ遺伝子からのＨＡタンパク質のウェスタンブロッティングによる発現確認を示す。Ｍａｒｋｅｒ：分子量マーカー。Ｃｏｎｔｒｏｌ：非感染ボンビュクス・モリ。Ｓｕｋａｂｕｍｉ：コドン最適化ＨＡ遺伝子感染ボンビュクス・モリ。矢印は、特異的バンドを示す。
【図１２−１】Ｃ型肝炎ウイルスコドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。コアタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５７３位、Ｅ１タンパク質：５７４位〜１１４９位、Ｅ３タンパク質：１１５０位〜２２３８位、ＦＬＡＧタグ：２２３９位〜２２６２位。
【図１２−２】Ｃ型肝炎ウイルスコドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。コアタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５７３位、Ｅ１タンパク質：５７４位〜１１４９位、Ｅ３タンパク質：１１５０位〜２２３８位、ＦＬＡＧタグ：２２３９位〜２２６２位。
【図１２−３】Ｃ型肝炎ウイルスコドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。コアタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５７３位、Ｅ１タンパク質：５７４位〜１１４９位、Ｅ３タンパク質：１１５０位〜２２３８位、ＦＬＡＧタグ：２２３９位〜２２６２位。
【図１２−４】Ｃ型肝炎ウイルスコドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。コアタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５７３位、Ｅ１タンパク質：５７４位〜１１４９位、Ｅ３タンパク質：１１５０位〜２２３８位、ＦＬＡＧタグ：２２３９位〜２２６２位。
【図１２−５】Ｃ型肝炎ウイルスコドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。コアタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５７３位、Ｅ１タンパク質：５７４位〜１１４９位、Ｅ３タンパク質：１１５０位〜２２３８位、ＦＬＡＧタグ：２２３９位〜２２６２位。
【図１３】ボンビュクス・モリを用いて生産したＣ型肝炎ウイルスコドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質遺伝子からのＣｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質のウェスタンブロッティングによる発現確認を示す。Ｍａｒｋｅｒ：分子量マーカー。Ｃｏｎｔｒｏｌ：非感染ボンビュクス・モリ。ＨＣＶ：コドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質遺伝子感染ボンビュクス・モリ。矢印は、特異的バンドを示す。ボンビュクス・モリを用いて生産したＣｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質のウェスタンブロッティングによる発現確認を示す。
【図１４−１】トリインフルエンザウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。トリインフルエンザウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１４−２】トリインフルエンザウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線は予測される変異を示す。トリインフルエンザウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１４−３】トリインフルエンザウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。トリインフルエンザウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１４−４】トリインフルエンザウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３コドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。トリインフルエンザウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）のＨＡ遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１５】ボンビュクス・モリを用いて生産したトリインフルエンザウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３のコドン最適化ＨＡ遺伝子からのＨＡタンパク質のウェスタンブロッティングによる発現確認を示す。Ｍａｒｋｅｒ：分子量マーカー。Ｃｏｎｔｒｏｌ：非感染ボンビュクス・モリ。Ｈ７Ｎ９：コドン最適化ＨＡ遺伝子感染ボンビュクス・モリ。矢印は、特異的バンドを示す。
【図１６−１】日本脳炎ウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。日本脳炎ウイルスのＰｒｅＭタンパク質遺伝子、Ｍタンパク質遺伝子、Ｅタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。ＰｒｅＭ／Ｍタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５０１位、Ｅタンパク質：５０２位〜２００１位、ＦＬＡＧタグ：２００２位〜２０２５位。
【図１６−２】日本脳炎ウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。日本脳炎ウイルスのＰｒｅＭタンパク質遺伝子、Ｍタンパク質遺伝子、Ｅタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。ＰｒｅＭ／Ｍタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５０１位、Ｅタンパク質：５０２位〜２００１位、ＦＬＡＧタグ：２００２位〜２０２５位。
【図１６−３】日本脳炎ウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。日本脳炎ウイルスのＰｒｅＭタンパク質遺伝子、Ｍタンパク質遺伝子、Ｅタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。ＰｒｅＭ／Ｍタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５０１位、Ｅタンパク質：５０２位〜２００１位、ＦＬＡＧタグ：２００２位〜２０２５位。
【図１６−４】日本脳炎ウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。日本脳炎ウイルスのＰｒｅＭタンパク質遺伝子、Ｍタンパク質遺伝子、Ｅタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。ＰｒｅＭ／Ｍタンパク質：ＤＮＡ配列１位〜５０１位、Ｅタンパク質：５０２位〜２００１位、ＦＬＡＧタグ：２００２位〜２０２５位。
【図１７】ボンビュクス・モリを用いて生産した日本脳炎ウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子からのＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質のウェスタンブロッティングによる発現確認を示す。Ｍａｒｋｅｒ：分子量マーカー。Ｃｏｎｔｒｏｌ：非感染ボンビュクス・モリ。ＪＥＶ：コドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子感染ボンビュクス・モリ。矢印は、特異的バンドを示す。
【図１８−１】狂犬病ウイルスコドン最適化Ｇタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。狂犬病ウイルスのＧタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１８−２】狂犬病ウイルスコドン最適化Ｇタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。狂犬病ウイルスのＧタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１８−３】狂犬病ウイルスコドン最適化Ｇタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。狂犬病ウイルスのＧタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１８−４】狂犬病ウイルスコドン最適化Ｇタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。囲み線はＦＬＡＧタグを示す。狂犬病ウイルスのＧタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１９−１】西ナイルウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。西ナイルウイルスのＥタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１９−２】西ナイルウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。西ナイルウイルスのＥタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図１９−３】西ナイルウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。西ナイルウイルスのＥタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図２０−１】ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化スパイク糖タンパク質（Ｓタンパク質）遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。ＭＥＲＳコロナウイルスのＳタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図２０−２】ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化スパイク糖タンパク質（Ｓタンパク質）遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。ＭＥＲＳコロナウイルスのＳタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図２０−３】ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化スパイク糖タンパク質（Ｓタンパク質）遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。ＭＥＲＳコロナウイルスのＳタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図２０−４】ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化スパイク糖タンパク質（Ｓタンパク質）遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。ＭＥＲＳコロナウイルスのＳタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図２０−５】ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化スパイク糖タンパク質（Ｓタンパク質）遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。ＭＥＲＳコロナウイルスのＳタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図２０−６】ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化スパイク糖タンパク質（Ｓタンパク質）遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。ＭＥＲＳコロナウイルスのＳタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｃ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図２１−１】口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。口蹄疫ウイルスのＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ａ、３Ｃタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｎ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図２１−２】口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。口蹄疫ウイルスのＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ａ、３Ｃタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｎ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図２１−３】口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。口蹄疫ウイルスのＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ａ、３Ｃタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｎ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図２１−４】口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。口蹄疫ウイルスのＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ａ、３Ｃタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｎ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【図２１−５】口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の対応を示す。口蹄疫ウイルスのＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ａ、３Ｃタンパク質遺伝子の塩基配列に基づき、Ｎ末端へのＦＬＡＧタグ導入、ボンビュクス・モリ細胞のコドン使用頻度の最適化を考慮し、合成遺伝子の塩基配列を設計した。合成遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を併記した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明に係る核酸は、ボンビュクス・モリにおける発現にコドン最適化されているウイルスの核酸配列を含む。コドン最適化は、具体的には、ボンビュクス・モリのｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  （図１）をもとに作成したアミノ酸配列と遺伝子配列の対応表(図２)を用い、対象となる核酸配列を置換する。この対応表において、相補鎖に長いコーディングフレームが出来ることで思わぬ副産物が合成されるのを防ぐため、Ｓｅｒの配列は、ＵＣＡ（最もボンビュクス・モリでの使用頻度も高い）を用い、相補鎖に多くのＵＧＡ（終止コドン）が生じるように設計されている。【００１８】
本発明に係るワクチンが対象とするウイルスは、特に限定されないが、例えばインフルエンザウイルスＣ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイルス、西ナイルウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、口蹄疫ウイルスがあげられる。インフルエンザウイルスにおいては、Ａ型インフルエンザウイルスが好ましく、更にＨ５型およびＨ７型が好ましい。Ｃ型肝炎ウイルスにおいては、ジェノタイプ１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、または３ａが好ましい。【００１９】
本発明に係るウイルスの核酸配列は、ワクチンとなり得る限り、ウイルスの任意のタンパク質をコードする。インフルエンザウイルスの場合は、ウイルスの核酸配列は、好ましくは、ＨＡタンパク質をコードする。Ｃ型肝炎ウイルスの場合は、ウイルスの核酸配列は、好ましくは核（Ｃｏｒｅ）タンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、またはその組み合わせをコードする。日本脳炎ウイルスの場合は、ウイルスの核酸配列は、好ましくはＰｒｅＭタンパク質、Ｍタンパク質、および／またはＥタンパク質をコードする。狂犬病ウイルスの場合は、ウイルスの核酸配列は、好ましくはＧタンパク質をコードする。西ナイルウイルスの場合は、ウイルスの核酸配列は、好ましくはＰｒｅＭタンパク質、Ｍタンパク質および／またはＥタンパク質をコードする。ＭＥＲＳコロナウイルスの場合は、ウイルスの核酸配列は、好ましくはスパイク糖タンパク質（Ｓタンパク質）をコードする。口蹄疫ウイルスの場合は、ウイルスの核酸配列は、好ましくはＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ａ、および／または３Ｃタンパク質をコードする。【００２０】
本発明に係るウイルスの核酸配列は、弱毒化遺伝子改変を有していても良い。弱毒化は、当業者に公知の任意の改変によって行い得る。例えばインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質の場合、病原性を支配するＨＡ１とＨＡ２分子を接合する開裂部位の配列を改変する。一つの態様では、ＨＡタンパク質において配列番号７で示されるアミノ酸配列を配列番号８で示されるアミノ酸配列に置換する。【００２１】
従って、本発明に係る核酸は、好ましくは配列番号４、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、または３３の核酸配列を含むまたはからなる核酸である。【００２２】
本発明において、ワクチンはボンビュクス・モリで産生される。ボンビュクス・モリを用いたワクチン産生方法は、本技術分野における当業者に周知の任意の方法を利用して行うことができる。具体的には、ボンビュクス・モリに本発明の核酸を導入して、該ウイルスの核酸配列がコードするウイルスタンパク質を発現させる。核酸の導入方法は、特に限定されないが、例えば、本発明の核酸を含む組み換え体バキュロウイルスをボンビュクス・モリに接種することによって行う。【００２３】
従って、１つの実施態様において、本発明は、本発明に係る核酸を含むベクターである。本発明のベクターは、核酸がコードするタンパク質が発現することができる任意のベクターである。本発明のベクターは、ボンビュクス・モリに直接導入されてもよい。好ましくは、本発明のベクターは、バキュロウイルス用トランスファーベクターである。【００２４】
また、１つの実施態様において、本発明は、上記本発明に係るベクターを用いて産生された組み換え体バキュロウイルスである。組み換え体バキュロウイルスの産生の方法は、本技術分野における当業者に周知の任意の方法を利用して行うことができる。１つの実施態様において、本発明組み換え体のバキュロウイルスは、本発明のベクターとバキュロウイルスより抽出したＤＮＡとをボンビュクス・モリ細胞に同時に導入することにより、産生することができる。【００２５】
従って１つの実施態様において、本発明は、本発明に係る核酸、ベクター、または組み換え体バキュロウイルスを含むボンビュクス・モリである。ベクターまたは組み換え体バキュロウイルスを含む様式に特に制限はなく、ベクターまたは組み換え体バキュロウイルスがボンビュクス・モリのゲノムとは独立して存在していても良いし、ボンビュクス・モリのゲノムに組み込まれていても良い。【００２６】
１つの実施態様において、本発明は、本発明に係る核酸がコードするアミノ酸配列からなるポリペプチドである。【００２７】
１つの実施態様において、本発明は、本発明に係る核酸、ベクター、組み換え体バキュロウイルス、またはボンビュクス・モリを使用する、ワクチン生産方法である。【００２８】
１つの実施態様において、本発明に係るワクチンの生産方法は、以下の工程：
１）本発明に係る核酸またはベクターを得る工程
２）本発明に係る核酸、ベクター、または組み換え体バキュロウイルスをボンビュクス・モリに導入する工程；および
３）ボンビュクス・モリからタンパク質を回収する工程
を含む。【００２９】
ボンビュクス・モリへの本発明の核酸、ベクター、または組み換え体バキュロウイルスの導入は、本技術分野における当業者に周知の任意の方法を利用して行うことができる。好ましくは、バキュロウイルスを用いて導入することができる。本発明の核酸、ベクター、または組み換え体バキュロウイルスのボンビュクス・モリへの導入時期は特に限定はされない。好ましくは、導入時期は、蛹期である。【００３０】
ボンビュクス・モリからのタンパク質の回収は、本技術分野における当業者に周知の任意の方法を用いることができる。例えば、ＨＡタンパク質であれば、ボンビュクス・モリを等張緩衝溶液中にホモゲナイズ後、固定化赤血球あるいはシアル酸カラム（フェツインカラム）を用いて回収する。【００３１】
１つの実施態様において、本発明は、ウイルスの感染に対する、動物のワクチン接種のための、本発明に係るポリペプチドまたは本発明の生産方法に従って生産されるワクチンである。【００３２】
１つの実施態様において、本発明のワクチンは、ウイルス様粒子構造である。ウイルス様粒子構造とは、５０〜１５０ｎｍ前後の直径を有する粒子の表面に明瞭なＨＡスパイクが密に配置し、形態的にウイルス粒子に酷似しているが、当然のことながら、非病原性である構造を指す。好ましくは、ウイルス様粒子構造は、スパイクをもつ球状である。好ましくは、ウイルス様粒子の粒子径は６０ｎｍ〜１２０ｎｍである。本発明のウイルス様粒子構造の例を、図９に示す。【００３３】
１つの実施態様において、本発明は、ウイルスの感染に対するワクチンを、動物に接種する方法であって、本発明に係るポリペプチドを含むかまたは本発明に係る生産方法に従って生産されるワクチンの有効量を、前記動物に投与することを含む方法である。【００３４】
１つの実施態様において、本発明は、ウイルスに対する免疫応答を、動物に誘導する方法であって、本発明に係るポリペプチドを含むかまたは本発明に係る記載の生産方法により生産されるワクチンの有効量を、前記動物に投与することを含む方法である。【００３５】
本発明に係る動物は、ワクチンを接種することによりウイルスに対する十分な体液性免疫または細胞性免疫を獲得することが出来る任意の動物を指す。好ましくは、本発明に係る動物は、脊椎動物であり、より好ましくはヒト、トリ、ブタ、ウマである。最も好ましくは、ヒトである。【００３６】
ワクチンの有効量は、ウイルスに対する十分な体液性免疫または細胞性免疫を誘発するなどの生物学的効果を達成するのに十分な量をいう。また、投与方法は、吸入、鼻腔内、経口、非経口（例えば皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下投与）の投与が含まれる。有効量および投与方法は、投与されるヒトの年齢、性別、状態、体重に依存してよい。例えばインフルエンザワクチンの場合、一般には、１ｍｌ中に一株あたり１５μg以上のＨＡタンパク質を含むワクチンを、６ヶ月以上３歳未満の者には０．２５ｍｌを皮下に、３歳以上１３歳未満の者には０．５ｍｌを皮下に、およそ２〜４週間の間隔をおいて２回注射する。１３歳以上の者については、０．５ｍｌを皮下に、１回、又は、およそ１〜４週間の間隔をおいて２回注射する。
【実施例】
【００３７】
以下に、具体的な実験例をあげて本発明をさらに詳しく説明する。【００３８】
実施例１：トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子情報に基づく、ボンビュクス・モリで産生するのに適したインフルエンザワクチン開発用ＤＮＡの設計【００３９】
コドン最適化ＨＡ遺伝子の核酸配列設計
２０１１年に野生のカモで発見された高病原性トリインフルエンザウイルス  Ａ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子情報を次のように設計変更した。【００４０】
まず、トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）のヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を、Ｇｅｎｂａｎｋ（ＵＲＬ：  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）にＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡＫ２４０７８で登録されている遺伝子配列（配列番号１）より予測した。【００４１】
次に、予測したアミノ酸配列中の、高病原性に関連すると推定されるＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ配列（配列番号７）をＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ配列（配列番号８）に置換し、さらにＣ末端にＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＬｙｓからなるＦＬＡＧタグ配列（配列番号５）を付加して、弱毒化ＨＡタンパク質アミノ酸配列（配列番号３）を設計した。【００４２】
ボンビュクス・モリを用いたタンパク質発現の向上を目的として、コドン最適化を行った。かずさＤＮＡ研究所が提供するＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅから得られるボンビュクス・モリのｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  （ＵＲＬ：  http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=7091）（図１）をもとに、作成されたアミノ酸配列と遺伝子配列の対応表（図２）を作成した。この対応表において、相補鎖に長いコーディングフレームが出来ることで思わぬ副産物が合成されるのを防ぐため、Ｓｅｒの配列は、ＵＣＡ（最もボンビュクス・モリでの使用頻度も高い）を用い、相補鎖に多くのＵＧＡ（終止コドン）が生じるように設計した。設計後の遺伝子配列（配列番号４）と対応するアミノ酸配列を、図３に示す。発現したいタンパク質以外には、大きなコーディングフレームが出来ないことを確認した（図４）。【００４３】
コドン最適化ＨＡ遺伝子の合成およびベクターの構築
上記設計したコドン最適化ＨＡ遺伝子の配列情報を基に、ＤＮＡの全合成をタカラバイオ株式会社に依頼した。合成したコドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡをトランスファーベクターであるｐＢｍ−８（バキュロテクノロジー社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法（クロンテック社）を用いて挿入し、ｐＢｍ−８ＨＡを作製した。【００４４】
コドン最適化ＨＡ遺伝子導入バキュロウイルスのボンビュクス・モリへの感染および乳剤の作製
ｐＢｍ−８ＨＡとバキュロウイルスより抽出したＤＮＡとをボンビュクス・モリ細胞に同時に導入することにより、細胞上清中にワクチン生産用の組換え体バキュロウイルスを得た。この組換え体バキュロウイルスを、ボンビュクス・モリの蛹に接種した。すなわち、ウイルス力価１×１０８ｐｆｕ／ml以上のウイルス原液を昆虫細胞用培地 ＴＣ−１００で１０倍に希釈した。この希釈液５０μlを脱皮２日目のボンビュクス・モリの蛹腹部に注射により接種し、その後、蛹を２６℃のインキュベーターで飼育した。７２時間後、氷上で蛹をハサミにより半分に切り開き中腸をピンセットで取り除いた後、ポッター型ホモジナイザーを用い、フェニールチオ尿酸含有ＰＢＳ中で破砕乳化した。乳化液にＰＢＳを５０mlになるように加え、さらに最終０．０１％になるようホルマリンを５μl加えてボンビュクス・モリの蛹乳剤を得た。【００４５】
ＨＡタンパク質の回収および発現確認
得られたボンビュクス・モリの蛹乳剤をソニケーター（ＵＲ−２０Ｐ、トミー精工製）で５分間超音波処理し、これに固定ニワトリ赤血球を加えてＨＡタンパク質を回収した。さらにＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフで精製することにより、タンパク質レベルで、９５％以上に精製することができた。精製タンパク質を、ウェスタンブロッティング（１次抗体：抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体、２次抗体：抗マウスＩｇＧウサギポリクローナル抗体）により発現を確認した。図６に示す様に、６５ｋＤａ付近にバンドが確認された。【００４６】
ＨＡ活性の評価
インフルエンザウイルスは様々な動物の赤血球と混和すると凝集する性質があり、これは赤血球凝集反応と呼ばれ、ウイルス表面のヘマグルチニン(Ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＨＡ)が赤血球の糖鎖と結合し、複数の赤血球同士を架橋させて大きな凝集体を作ることによる。この性質を利用して、ウイルスを階段希釈したときにどこまで凝集するかを調べることで、原液に含まれるウイルス濃度（ＨＡ活性）を算出できるため、インフルエンザウイルスの定量に用いられる。具体的には、９６穴のマイクロプレートを用いて、被検体５０μlをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）５０μlで階段希釈した後に、０.５％に調整したニワトリ赤血球を等量加えてよく混和し、３０分〜６０分間室温に静置する。被検体にＨＡ活性があれば赤血球と凝集塊を形成するが、ウイルスが存在しない場合は、凝集塊ができず、プレートの底に日の丸のように沈んでしまう。この日の丸が形成される前の希釈点の倍率を以て、ＨＡ凝集活性としてのＨＡ価を表現する。【００４７】
評価の結果
得られたＨＡタンパク質溶液を上記条件で評価した。その結果、ＨＡ活性は２，０９７，１５２のＨＡ活性を示した。その結果、３０頭のボンビュクス・モリ蛹で産生された総ＨＡ活性は、２，０９７，１５２×５０ml＝１０４，８５７，６００となり、蛹１頭当たりのＨＡ活性量は３，４９５，２５３となった。組換え体のボンビュクス・モリ１頭のＨＡ活性量のこの値は、１９９８年にヒト由来の高病原性トリインフルエンザウイルスＡ／ＨＫ／４８３／９７（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子をボンビュクス・モリで発現させた時のボンビュクス・モリ１頭の３０７，１６０のＨＡ活性のおよそ１１．４倍となり、さらに１個の発育鶏卵から産生されるＨＡ活性１０，２４０の、およそ３４０倍という驚異的なＨＡ活性量の増大ということになる。【００４８】
ＨＡタンパク質溶液によるニワトリの免疫化
上記のＨＡタンパク質溶液を用いて、ニワトリを免疫化した。ＨＡ活性を４，０９６〜８，１９２の間に調整した０．５mlのＨＡタンパク質溶液を、１６日間隔で２回、ニワトリに脚部筋肉接種した。初回接種から３３日後、４０日後、４７日後、および５０日後にニワトリから５ｍｌずつ採血した。【００４９】
免疫化ニワトリにより産生された抗体のＨＩ活性評価
上記ニワトリ血液をそれぞれ、室温で放置し、その後室温で遠心分離することにより、ニワトリ血清を得た。各々のニワトリ血清の赤血球凝集抑制活性（ＨＩ活性）を、以下の方法で検討した。まず、９６ウェルプレートを用い、各ウェル２５μｌを含む、血清の１/２段階希釈列を作製した。次に、各ウェルに２５μｌの上記ＨＡタンパク質（ＰＢＳで８ＨＡに調製したもの）を加えた。プレートを室温で３０分間静置後、０．５％／ＰＢＳのニワトリ赤血球５０μｌを各ウェルに加えた。１時間後に、赤血球凝集パターンを観察し、赤血球の凝集がみられる最大の希釈倍率を、ＨＩ活性値とした。初回接種後３３日後の血清は、８，１９２のＨＩ活性を示した。【００５０】
種々のインフルエンザウイルスに対するＨＩ活性の評価
また、初回接種４０日後のニワトリ血清を用いて、種々のインフルエンザウイルスに対するＨＩ活性の有無を検討した。Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｌｅｇｏｋ／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｗｅｓｔ  Ｊａｖａ／２００９（Ｈ５Ｎ１）の各ウイルスを用いて、上記と同様の条件でＨＩ活性を測定した。結果を図７に示す。ニワトリ血清は、全てのウイルスに対して、ＨＩ活性を示した。【００５１】
ショ糖密度勾配によるＨＡタンパク質溶液の分画
また、ＨＡタンパク質溶液を、ショ糖密度勾配法により分画した。各分画液のＨＡ活性を、上記と同様の方法で検討した。その結果を図８に示す。天然のウイルスの１．１８ｇ／ｌの浮遊密度である分画４はＨＡ活性を示さなかった。一方、より小さい浮遊密度を示す分画７〜９において、ＨＡ活性が認められた。【００５２】
電子顕微鏡によるＨＡタンパク質溶液分画の観察
上記のショ糖密度勾配の分画７を、電子顕微鏡で観察した。その結果を図９に示す。スパイクを有する球形で、粒子径が６０ｎｍ〜１２０ｎｍであるウイルス粒子様構造が認められた。天然のウイルスは、原則として６０〜１５０ｎｍの球形、１００〜１０００ｎｍの細長い繊維状、又、８０〜２００ｎｍの環状の形態をしている。これに対し、ボンビュクス・モリ由来のＨＡタンパク質は図１０に示すように、天然ウイルス同様に多彩な形態を示し、球形のものは６０〜１５０ｎｍ、繊維状が２００ｎｍ前後、そして環状が６０〜１５０ｎｍの形をしていることが本研究で初めて明らかになった。この形態学特徴が、ＨＡタンパク質の、これまでに見られなかった上記強い免疫力に反映されていると考えられる。【００５３】
このように、トリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１のＨＡタンパク質の活性量がボンビュクス・モリの蛹で高くなったのは、遺伝情報を背景にしたＤＮＡの設計変更と、これに基づく合成ＤＮＡの遺伝子操作が有益に働いた為ではないかと考えられる。更に、ボンビュクス・モリの蛹期を用いて目的遺伝子が高発現したために、得られたワクチンがウイルス粒子様構造を示したと考えられる。このように、遺伝情報を背景にして、ＤＮＡの設計変更と合成を利用した新しいワクチンの製造法は、今後、多領域で利用されていくものと考えられる。
結論としては、この度の、設計変更をしたＤＮＡによる、ボンビュクス・モリを利用したワクチン生産の意義の第一は、ボンビュクス・モリの蛹１頭で、発育鶏卵３４０個分のワクチン量を生産することである。【００５４】
実施例２：トリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子情報に基づく、ボンビュクス・モリで産生するのに適したインフルエンザワクチン開発用ＤＮＡの設計【００５５】
ウイルスは、ヒトも動物も含めて時間の経過に伴って変異することが多いので、先に述べたトリインフルエンザウイルスＡ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１株のＤＮＡ単独では不安が残る。そこで、インドネシアで２００８年に分離されたトリインフルエンザウイルスＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ遺伝子配列（配列番号９）より予測されたアミノ酸配列情報（配列番号１０に基づき、実施例１と同様にインフルエンザウイルス用ワクチン開発用ＤＮＡを設計した（配列番号１２）。対応するアミノ酸配列（配列番号１１）を、図１０に示す。実施例１と同様に、上記開発用ＤＮＡを含むバキュロウイルス組み替え体を、ボンビュクス・モリの蛹に摂取してＨＡタンパク質を合成・回収し、ウェスタンブロットにより発現を確認した（図１１）。ＨＡ活性を評価したところ、蛹１頭当たりのＨＡ活性量は４１９,４３０となった。【００５６】
実施例３：ボンビュクス・モリで産生するのに適したＣ型肝炎ウイルスワクチン開発用ＤＮＡの設計【００５７】
Ｃ型肝炎ウイルスの粒子構造は、Ｅ１とＥ２糖タンパク質を含む脂質層で覆われていて、粒子の内部には核タンパク質、又は、コアタンパク質と呼ばれているタンパク質とウイルス遺伝子が納められている。ウイルスが感染を開始するためには、これらＥ１タンパク質とＥ２タンパク質が重要な役割を果たしていることが明らかになっており、逆に、Ｅ１タンパク質とＥ２タンパク質は感染防御抗原でもあり、従ってワクチン用タンパクとしても大事な機能をもっている。実際、Ｅ１タンパク質とＥ２タンパク質で試験ワクチンを作り、チンパンジーでの予防効果で、不十分ながら軽度の感染予防効果のあったことも報告されている。ただ、もっと十分な予防効果を期待するためには、より高濃度のＥ１タンパク質とＥ２タンパク質が必要である。【００５８】
コドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質遺伝子の核酸配列設計
そこで、本発明者らは、Ｃ型肝炎ウイルスワクチンを開発するために、Ｃ型肝炎ウイルスの核（Ｃｏｒｅ）タンパク質−Ｅ１タンパク質−Ｅ２タンパク質の融合タンパク質発現のための遺伝子情報を設計した。ここで融合タンパク質を設計したのは、同時に発現させることによりウイルス粒子様タンパク質が合成できることを期待したからであった。まず、ＧｅｎｂａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.ＡＣＫ２８１８５で登録されているＨＣＶ遺伝子のアミノ酸配列中の、Ｃｏｒｅタンパク質から、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質までのアミノ酸配列（配列番号１３）に、ＦＬＡＧタグ配列（配列番号５）を付加して、核酸設計の基となる融合タンパク質のアミノ酸配列を得た（配列番号１４）。この融合タンパク質のアミノ酸配列を基に、実施例１と同様にして、コドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質の核酸配列を設計した（配列番号１５）。設計したキメラ合成ＤＮＡの核酸配列とアミノ酸配列の対応を図１２に示す。【００５９】
コドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質遺伝子のＤＮＡ合成およびベクターの構築
設計したコドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質遺伝子の核酸配列を基に、実施例１と同様に全長遺伝子ＤＮＡを合成し、ｐＢｍ−８ベクターに挿入し、ｐＢＭ−８Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２を作成した。【００６０】
コドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質遺伝子導入バキュロウイルスの感染
実施例１と同様にしてｐＢｍ−８Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２を用いてバキュロウイルス組み換え体を得、ボンビュクス・モリの蛹に接種し、ボンビュクス・モリ蛹乳剤を得た。【００６１】
Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質の回収および発現確認
得られたボンビュクス・モリの蛹乳剤をソニケーター（ＵＲ−２０Ｐ、トミー精工製）で５分間超音波処理後、蔗糖密度勾配遠心法（蔗糖濃度１０−５０％、１００，０００Ｇ、２４時間）により、Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質を精製した。精製したＣｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質を実施例１と同様にウェスタンブロッティングによって発現を確認した。図１３に示す様に、６０ｋＤａ付近にバンドが確認された。【００６２】
活性の評価
タンパクの生産量より、免疫反応が予想でき、これによって産生された抗体による中和試験での効果を推定する。【００６３】
結果の考察
Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質が連結して発現したとすると８３ｋダルトン以上の分子量を示すことが予想され、従って６０ｋダルトンの分子サイズは  Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２が細胞内でプロテアーゼによるプロセッシングを受け成熟したＥ２が合成されたことが示唆された。この事実は、紛れもなくＤＮＡで設計したワクチン用タンパク質が寸分の違いもなく産生されたことを示すもので、タンパクのバンドの濃さから見ても、Ｃ型肝炎用ワクチンが効率よく合成されたことが示唆された。【００６４】
参考例１：トリインフルエンザウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子情報に基づく、ボンビュクス・モリで産生するのに適したインフルエンザワクチン開発用ＤＮＡの設計【００６５】
ＧＩＳＡＩＤにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＥＰＩ４３９５０２で登録されている中国で２０１３年に分離されたトリインフルエンザウイルスＡ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１０（Ｈ７Ｎ９）のＨＡ遺伝子配列のアミノ酸配列情報（配列番号１６）に基づき実施例１と同様にインフルエンザウイルス用ワクチン開発用ＤＮＡを設計した（配列番号１８）。対応するアミノ酸配列（配列番号１７）を、図１４に示す。Ｈ７Ｎ９インフルエンザウイルスによるインフルエンザがヒトにおいて大流行する時に、ＨＡタンパク質の１９９番目のＧｌｕがＡｓｐに、２３４番目のＧｌｙがＡｓｐに変異していることが予測されるので、当該変異を導入してある。実施例１と同様に、上記開発用ＤＮＡを含むバキュロウイルス組み替え体を、ボンビュクス・モリの蛹に摂取してＨＡタンパク質を合成・回収し、発現を確認した（図１５）。実施例１と同様にして、そのＨＡ活性を評価する。【００６６】
参考例２：ボンビュクス・モリで産生するのに適した日本脳炎ウイルスワクチン開発用ＤＮＡの設計【００６７】
日本脳炎ウイルスは、主としてコガタアカイエカによって媒介される脳炎ウイルスで、現在は東南アジアやインド、中国地域で流行している。それを予防するため、ワクチンは同ウイルスに感染させたマウス脳が使用されてきたが、最近では培養細胞でのワクチン用ウイルスが培養されている。しかし、ワクチンの免疫力強化、副作用の削減、生産コストの低下を求めて新しいワクチン開発が求められ、品質の向上に大きな期待が寄せられている。【００６８】
日本脳炎ウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子の核酸配列設計
そこで、本発明者らは、日本脳炎ウイルスワクチンを開発するために、日本脳炎ウイルスのＥタンパク質発現のための遺伝子情報を設計した。まず、ＧｅｎｂａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.ＡＢＱ５２６９１で登録されているアミノ酸配列中のｐｒｅＭタンパク質から、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質までのアミノ酸配列（配列番号１９）にＦＬＡＧタグ配列（配列番号５）を付加して、核酸設計の基となる日本脳炎ウイルスＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質のアミノ酸配列を得た（配列番号２０）。この日本脳炎ウイルスＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質のアミノ酸配列を基に、実施例１と同様にして、日本脳炎ウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質の核酸配列を設計した（配列番号２１）。設計したキメラ合成ＤＮＡの核酸配列とアミノ酸配列の対応を図１６に示す。【００６９】
日本脳炎ウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子のＤＮＡ合成およびベクターの構築
設計した日本脳炎コドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子の核酸配列を基に、実施例１と同様に全長遺伝子ＤＮＡを合成し、ｐＢｍ−８ベクターに挿入し、ｐＢＭ−８ＪｅｖｐＭＭＥを作成する。【００７０】
日本脳炎ウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子導入バキュロウイルスによる感染
実施例１と同様にしてｐＢｍ−８ＪｅｖｐＭＭＥを用いて組み換え体バキュロウイルスを得、ボンビュクス・モリの蛹に接種し、ボンビュクス・モリ蛹乳剤を得る。【００７１】
日本脳炎ウイルスＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質の回収および発現確認
得られたボンビュクス・モリの蛹乳剤を実施例３と同様に超音波処理し、精製する。精製した日本脳炎ウイルスＥタンパク質を実施例３と同様にウェスタンブロッティングによって発現を確認した（図１７）。【００７２】
活性の評価
タンパクの生産量より、免疫反応が予想でき、これによって産生された抗体による中和試験での効果を推定する。【００７３】
参考例３：ボンビュクス・モリで産生するのに適した狂犬病ウイルスワクチン開発用ＤＮＡの設計【００７４】
狂犬病ウイルスは地球規模に分布し、多くの死亡危害が発生し、有効で安全な、そして安価なワクチン開発が国際的に求められているが、遅々として進んでいないのが現状である。そこで、もし、免疫力が強く、安全で、安価なワクチンが開発されれば、そのニーズは地球規模であると考える。現在使用されているワクチンは、ウサギやヤギ、マウスの脳由来のもので、それに加え、ヒト二倍体細胞、ニワトリ胚細胞が使用されている。今後のワクチン開発は、供給量とコストの面で安価で使用できるコンポーネントワクチンの開発が望まれ、ボンビュクス・モリの利用によるコンポーネントワクチンの開発が成功すれば、その利用は世界的な規模になると考えられる。【００７５】
狂犬病ウイルスコドン最適化Ｇタンパク質遺伝子の核酸配列設計
そこで、本発明者らは、狂犬病ウイルスワクチンを開発するために、狂犬病ウイルスのＧタンパク質発現のための遺伝子情報を設計する。まず、ＧｅｎｂａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.ＡＢＸ４６６５７で登録されているアミノ酸配列（配列番号２２）にＦＬＡＧタグ配列（配列番号５）を付加して、核酸設計の基となる狂犬病ウイルスＧタンパク質のアミノ酸配列を得た（配列番号２３）。この狂犬病ウイルスＧタンパク質のアミノ酸配列を基に、実施例１と同様にして、狂犬病ウイルスコドン最適化Ｇタンパク質の核酸配列を設計した（配列番号２４）。設計したキメラ合成ＤＮＡの核酸配列とアミノ酸配列の対応を図１８に示す。【００７６】
狂犬病ウイルスコドン最適化Ｇタンパク質遺伝子のＤＮＡ合成およびベクターの構築
設計した狂犬病ウイルスコドン最適化Ｇタンパク質遺伝子の核酸配列を基に、実施例１と同様に全長遺伝子ＤＮＡを合成し、ｐＢｍ−８ベクターに挿入し、ｐＢＭ−８ｒｖＧを作成する。【００７７】
狂犬病ウイルスコドン最適化Ｇタンパク質遺伝子導入バキュロウイルスによる感染の感染
実施例１と同様にしてｐＢｍ−８ｒｖＧを用いてバキュロウイルス組み換え体を得、ボンビュクス・モリの蛹に接種し、ボンビュクス・モリ蛹乳剤を得る。【００７８】
狂犬病ウイルスＧタンパク質の回収および発現確認
得られたボンビュクス・モリの蛹乳剤を実施例３と同様に超音波処理し生成する。精製した狂犬病ウイルスＧタンパク質を実施例３と同様にウェスタンブロッティングによって発現を確認する。【００７９】
活性の評価
タンパクの生産量より、免疫反応が予想でき、これによって産生された抗体による中和試験での効果を推定する。【００８０】
参考例４：ボンビュクス・モリで産生するのに適した西ナイルウイルスワクチン開発用ＤＮＡの設計【００８１】
西ナイルウイルスは、アメリカ、東欧やヨーロッパに広がり、近い将来、日本への伝播も危惧されている。カ−トリ−カの生態系に加え、このサイクルからヒトへ、あるいはウマにも伝播していく。未だ利用できるワクチンは無いが、このワクチン開発は世界的に急がれている。ワクチンの研究開発は、アメリカやヨーロッパでも盛んに行われているが、未だ成功していない。そこで、西ナイル熱ワクチンを、安価で大量に生産できれば、世界的に利用できる。【００８２】
西ナイルウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子の核酸配列設計
そこで、本発明者らは、西ナイルウイルスワクチンを開発するために、西ナイルウイルスのＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質発現のための遺伝子情報を設計する。まず、ＧｅｎｂａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.ＡＡＴ９５３９０で登録されているアミノ酸配列中のｐｒｅＭタンパク質から、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質までのアミノ酸配列（配列番号２５）にＦＬＡＧタグ配列（配列番号５）を付加して、核酸設計の基となる西ナイルウイルスＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質のアミノ酸配列を得た（配列番号２６）。この西ナイルウイルスＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質のアミノ酸配列を基に、実施例１と同様にして、西ナイルウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質の核酸配列を設計した（配列番号２７）。設計したキメラ合成ＤＮＡの核酸配列とアミノ酸配列の対応を図１９に示す。【００８３】
西ナイルウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子のＤＮＡ合成およびベクターの構築
設計した西ナイルウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子の核酸配列を基に、実施例１と同様に全長遺伝子ＤＮＡを合成し、ｐＢｍ−８ベクターに挿入し、ｐＢＭ−８ｗｎｖｐＭＭＥを作成する。【００８４】
西ナイルウイルスコドン最適化Ｅタンパク質遺伝子導入バキュロウイルスの感染
実施例１と同様にしてｐＢｍ−８ｗｎｖｐＭＭＥを用いてバキュロウイルス組み換え体を得、ボンビュクス・モリの蛹に接種し、ボンビュクス・モリ蛹乳剤を得る。【００８５】
西ナイルウイルスＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質の回収および発現確認
得られたボンビュクス・モリの蛹乳剤を実施例３と同様に超音波処理し生成した。精製した西ナイルウイルスＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質を実施例３と同様にウェスタンブロッティングによって発現を確認する。【００８６】
活性の評価
タンパクの生産量より、免疫反応が予想でき、これによって産生された抗体による中和試験での効果を推定する。【００８７】
参考例５：ボンビュクス・モリで産生するのに適したＭＥＲＳコロナウイルスワクチン開発用ＤＮＡの設計【００８８】
ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化スパイク糖タンパク質（Ｓタンパク質）遺伝子の核酸配列設計
本発明者らは、ＭＥＲＳコロナウイルスワクチンを開発するために、ＭＥＲＳコロナウイルスのＳタンパク質発現のための遺伝子情報を設計する。まず、ＧｅｎｂａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.ＡＧＮ５２９３６で登録されているアミノ酸配列（配列番号２８）にＦＬＡＧタグ配列（配列番号５）を付加して、核酸設計の基となる西ナイルウイルスＥタンパク質のアミノ酸配列を得た（配列番号２９）。このＭＥＲＳコロナウイルスＳタンパク質のアミノ酸配列を基に、実施例１と同様にして、ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化Ｓタンパク質の核酸配列を設計した（配列番号３０）。設計したキメラ合成ＤＮＡの核酸配列とアミノ酸配列の対応を図２０に示す。【００８９】
ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化Ｓタンパク質遺伝子のＤＮＡ合成およびベクターの構築
設計したＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化Ｓタンパク質遺伝子の核酸配列を基に、実施例１と同様に全長遺伝子ＤＮＡを合成し、ｐＢｍ−８ベクターに挿入し、ｐＢＭ−８ｍｃｖＳを作成する。【００９０】
ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化Ｓタンパク質遺伝子導入バキュロウイルスの感染
実施例１と同様にしてｐＢｍ−８ｍｃｖＳを用いてバキュロウイルス組み換え体を得、ボンビュクス・モリの蛹に接種し、ボンビュクス・モリ蛹乳剤を得る。【００９１】
ＭＥＲＳコロナウイルスＳタンパク質の回収および発現確認
得られたボンビュクス・モリの蛹乳剤を実施例３と同様に超音波処理し生成した。精製したＭＥＲＳコロナウイルスＳタンパク質を実施例３と同様にウェスタンブロッティングによって発現を確認する。【００９２】
活性の評価
タンパクの生産量より、免疫反応が予想でき、これによって産生された抗体による中和試験での効果を推定する。【００９３】
参考例６：ボンビュクス・モリで産生するのに適した口蹄疫ウイルスワクチン開発用ＤＮＡの設計【００９４】
口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質遺伝子の核酸配列設計
本発明者らは、口蹄疫ウイルスワクチンを開発するために、口蹄疫ウイルスのＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質発現のための遺伝子情報を設計する。まず、ＧｅｎｂａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ.ＨＶ９４００３０で登録されている核酸配列から予想される、アミノ酸配列中のＶＰ４、Ｖｐ２、ＶＰ１、２Ａ、３Ｃタンパク質のアミノ酸配列をＮ末端側からＣ末端側にむけて結合したアミノ酸配列（配列番号３１）にＦＬＡＧタグ配列（配列番号５）を付加して、核酸設計の基となる口蹄疫ウイルスのアミノ酸配列を得た（配列番号３２）。この口蹄疫ウイルスＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を基に、実施例１と同様にして、口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質の核酸配列を設計した（配列番号３３）。設計したキメラ合成ＤＮＡの核酸配列とアミノ酸配列の対応を図２１に示す。【００９５】
口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質遺伝子のＤＮＡ合成およびベクターの構築
設計した口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質遺伝子の核酸配列を基に、実施例１と同様に全長遺伝子ＤＮＡを合成し、ｐＢｍ−８ベクターに挿入し、ｐＢＭ−８ｆｍｄｖＰを作成する。【００９６】
口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質遺伝子導入バキュロウイルスの感染
実施例１と同様にしてｐＢｍ−８ｆｍｄｖＰを用いてバキュロウイルス組み換え体を得、ボンビュクス・モリの蛹に接種し、ボンビュクス・モリ蛹乳剤を得る。【００９７】
口蹄疫ウイルスＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質の回収および発現確認
得られたボンビュクス・モリの蛹乳剤を実施例３と同様に超音波処理し生成した。精製した口蹄疫ウイルスＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質を実施例３と同様にウェスタンブロッティングによって発現を確認する。【００９８】
活性の評価
タンパクの生産量より、免疫反応が予想でき、これによって産生された抗体による中和試験での効果を推定する。【００９９】
本発明に係る核酸は、以下の顕著な効果を有する：
１）危険なウイルスを取り扱うことなく、人工合成したＤＮＡを用いることで危険なウイルス由来のタンパク質も得られる。（Ｐ４やＰ３施設を必要とせず、危険なウイルスを取り扱わないので、ウイルスが人に感染したり衣服に付着したりすることで外部に漏れ出る可能性は無く、安全である）。
２）最初から、バイオインフォマティクスに基づき、病原性の低いアミノ酸配列を設計できること。
３）最初から、バイオインフォマティクスおよび進化解析により、将来のアミノ酸変異を予測し設計できること。
４）アミノ酸配列より遺伝子配列を求めており、アミノ酸配列では、例えばＨＡタンパク質においては、強毒部位とＦＬＡＧタグを除いては、元のアミノ酸配列と全く同じであるが、遺伝子配列にすると、そのホモロジーは７７％に過ぎない（例えば図５参照）ため、ウイルス遺伝子とは容易に区別が可能である。
５）Ｃ末にＦＬＡＧタグ配列をつけているため、万一、ウイルスが細胞に感染したとしても、ウイルスのＲＮＰあるいはＭ１タンパクと相互作用することはないので安全性が高い。
６）ボンビュクス・モリ細胞に最適化したＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅを用いて遺伝子配列を人工的に設計し、ベクターに組み込んでいるため、ボンビュクス・モリ細胞での発現量が、ウイルス遺伝子由来の配列を用いたものより顕著に高い発現量となり、かつ、抗原性は元のウイルスと全く同じである。
７）ボンビュクス・モリ細胞を用いているため、糖鎖構造は複雑でなく、糖鎖による抗原性のマスキング作用は非常に弱い。そのため、ワクチンとしての抗体価上昇は、鶏卵で増殖させたウイルス由来の精製ＨＡタンパク質の３４０倍の活性量と、遥かに高い結果となった。
８）ＦＬＡＧタグを用いることで、発現の確認や精製が容易となる。【０１００】
このように本願の新しい技術により、ボンビュクス・モリでワクチンを作ることは、より短期間で量産できる上に、低コストで有効成分だけのコンポートワクチンを作ることが出来る。また、同時に卵アレルギーの問題も解決することが可能となる。さらに、発育鶏卵で高度増殖用種ウイルスを作る為の時間を大幅に節約できる、等の優位性が明白である。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明の、ボンビュクス・モリにおける発現にコドン最適化された核酸配列設計に基づく人工合成した核酸は、上記で述べたように、ワクチンを大量に生産するのに有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０２】
配列番号１：Ａ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）  トリインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号２：Ａ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）  トリインフルエンザウイルスのＨＡアミノ酸配列
配列番号３：Ａ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）トリインフルエンザウイルスの改変ＨＡアミノ酸配列
配列番号４：Ａ／ｔｕｆｔｅｄ  ｄｕｃｋ／Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ／１６／２０１１（Ｈ５Ｎ１）トリインフルエンザウイルスのコドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号５：ＦＬＡＧタグアミノ酸配列
配列番号６：ＦＬＡＧタグＤＮＡ配列
配列番号７：高病原性アミノ酸配列
配列番号８：低病原性アミノ酸配列
配列番号９：Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）トリインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号１０：Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）トリインフルエンザウイルスのＨＡアミノ酸配列
配列番号１１：Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）トリインフルエンザウイルスの改変ＨＡアミノ酸配列
配列番号１２：Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｕｋａｂｕｍｉ／２００８（Ｈ５Ｎ１）トリインフルエンザウイルスのコドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号１３：Ｃ型肝炎ウイルスのＣｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質アミノ酸配列
配列番号１４：Ｃ型肝炎ウイルスの改変Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２融合タンパク質アミノ酸配列
配列番号１５：Ｃ型肝炎ウイルスのコドン最適化Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号１６：Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスのＨＡアミノ酸配列
配列番号１７：Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスの改変ＨＡアミノ酸配
配列番号１８：Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／０２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスのコドン最適化ＨＡ遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号１９：日本脳炎ウイルスのＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質アミノ酸配列
配列番号２０：日本脳炎ウイルスのＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質＋ＦＬＡＧタグアミノ酸配列
配列番号２１：日本脳炎ウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号２２：狂犬病ウイルスのＧタンパク質アミノ酸配列
配列番号２３：狂犬病ウイルスのＧタンパク質＋ＦＬＡＧタグアミノ酸配列
配列番号２４：狂犬病ウイルスコドン最適化Ｇタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号２５：西ナイルウイルスのＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質アミノ酸配列
配列番号２６：西ナイルウイルスのＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質＋ＦＬＡＧタグアミノ酸配列
配列番号２７：西ナイルウイルスコドン最適化ＰｒｅＭ−Ｍ−Ｅ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号２８：ＭＥＲＳコロナウイルスのＳタンパク質アミノ酸配列
配列番号２９：ＭＥＲＳコロナウイルスのＳタンパク質＋ＦＬＡＧタグアミノ酸配列
配列番号３０：ＭＥＲＳコロナウイルスコドン最適化Ｓタンパク質遺伝子ＤＮＡ配列
配列番号３１：口蹄疫ウイルスのＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質アミノ酸配列
配列番号３２：口蹄疫ウイルスのＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質＋ＦＬＡＧタグアミノ酸配列
配列番号３３：口蹄疫ウイルスコドン最適化ＶＰ４−ＶＰ２−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ−３Ｃ融合タンパク質遺伝子ＤＮＡ配列
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図７】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２０−５】
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【図２０−６】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２１−５】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2014017493.tif 000055
2014017493.tif 000056
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