(57)【要約】  胆管および門脈を熱湯洗浄し、その後肝臓を塩素系消毒剤を使用して消毒することにより、肝臓に存在する微生物の殺菌が可能なことがわかった。また塩素系消毒剤による消毒後、肝臓を冷凍処理することにより、さらに殺菌効果を高めることが可能なことがわかった。
2013180256.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、微生物が殺菌された肝臓の製造方法；
（ａ）摘出された非ヒト動物の肝臓の胆管内および門脈の両方またはいずれか一方に熱湯を高圧注入する工程、および
（ｂ）工程（ａ）の肝臓の胆管内および門脈の両方またはいずれか一方に塩素系消毒剤を注入する工程。
【請求項２】
肝臓に塩素系消毒剤を浸透させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
肝臓を冷凍する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
以下の工程をさらに含む、請求項１に記載の方法；
（ａ）肝臓表面を塩素系消毒剤により消毒する工程、および
（ｂ）工程（ａ）の肝臓を冷凍する工程。
【請求項５】
肝臓を冷凍する工程の前に、肝臓に塩素系消毒剤を浸透させる工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
肝臓を解凍する工程をさらに含む、請求項３から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
微生物が食中毒を引き起こす微生物である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
食中毒を引き起こす微生物がカンピロバクター、病原性大腸菌、サルモネラ属菌、シゲラ属菌、エロモナス属菌、スタフィロコッカス属菌、E型肝炎ウィルスからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法によって得られる、殺菌された肝臓組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全な生食用食品を提供するための消毒処理方法に関する。具体的には、食品を熱湯洗浄、消毒、冷凍することによる、食品に存在する食中毒細菌の殺菌方法に関する。また本発明は、殺菌された食品の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レバーはビタミンA、ビタミンB群、鉄分、葉酸等を多く含む。なかでも、葉酸、鉄分は造血を助ける働きがあり、貧血防止や妊婦など、多量の鉄分摂取が必要な人には理想的な食べ物であるといわれている。また、レバーの良質なたんぱく質は、肝細胞を再生し、ビタミン・ミネラルが肝機能を活発にする働きがあるため、肝臓病の治療食等、古くから食されてきた食材である。中でも、生レバーは加熱したレバーに比べて、熱によるビタミン等の栄養素の失活が無いため、特に栄養豊富な食材である。元々日本には生食文化が存在しており、韓国等から伝わった焼肉料理の中でもレバーを生で食することに大きな抵抗は無かった為、広まったと考えられている。しかしながら、牛の肝臓には様々な食中毒細菌が存在している為、まれに食中毒を引き起こすことがあり、社会問題となっている。【０００３】
牛肝臓に食中毒細菌であるカンピロバクターが存在することはよく知られており、以前よりレバーの生食による食中毒のリスクが高いことが訴えられていた。平成23年には腸管出血性大腸菌（以下EHEC）が肝臓内に存在する場合があることが報告され、厚生労働省からレバーの生食提供に対する注意喚起が出された（食安発1220第1号（平成23年12月20日））。牛肝臓に存在するカンピロバクターやEHECの由来の詳細は未だ明らかになっていないものの、一つには解体時の腸管内容物からの交差汚染、もう一つには肝臓―胆嚢―腸管内の胆汁の循環によって腸管から肝臓に移動した胆汁に起因する汚染が考えられている。さらに、門脈を介した腸管からの菌のトランスロケーションによる肝臓内への菌の移動の可能性も考えられている。実際、牛胆汁液にカンピロバクターが存在することが知られている。【０００４】
以上のような背景から、食材としての安全性を高めるために肝臓の消毒が行われてきた。従来の肝臓の消毒方法としては主に水道水による表面洗浄が知られており、これに加えて、オゾン水等の機能水、氷水および塩素系消毒剤等の浸漬による表面殺菌を行う方法などが知られている。塩素系消毒剤のうち最も汎用されているものとして次亜塩素酸ナトリウムが挙げられる。次亜塩素酸ナトリウムは工業的には水酸化ナトリウム（NaOH）溶液に塩素ガスを吸収させることにより製造されており、市販の次亜塩素酸ナトリウム濃厚溶液は遊離有効塩素を5〜12 %含むpH12.5〜13.5の強アルカリ性溶液である。次亜塩素酸ナトリウム溶液の主成分は次亜塩素酸（HOCl）とNaOHであり、HOClは溶液のpH がアルカリ性の場合には解離型（OCl-）で存在し、酸性に傾くと、イオンは徐々にプロトン化し非解離型（HOCl）となる。さらに酸性化すると、HOClの一部は溶存塩素（Cl2）に変化する（図１０）。これらHOCl、OCl-、Cl2はいずれも殺菌効力を有しているが、Cl2は飛散して消失する速度が速く、不安定な為、通常はHOCl、OCl-イオンが主体となるpH領域で消毒、殺菌が行われている。また、OCl-は細胞壁や細胞膜を通過せず、細胞膜の外側から酸化作用を及ぼし、損傷を与えることで、殺菌効果を発揮する。一方HOClは、微生物細胞壁を通過し、細胞質や形質膜に存在する酵素類、核酸などの必須組織に対して酸化作用を及ぼし、殺菌効果を発揮すると考えられている。したがって、一般的にHOClの方が、OCl-よりも殺菌力が強いとされている。そのため、殺菌の効果を高めるために、希薄な食塩水や塩酸を電気分解してHOClを製造する電解法や、次亜塩素酸ナトリウムと酸性溶液を水道水に混合希釈することでHOClの存在比率を高める二液法などが用いられている。【０００５】
塩素系消毒剤は食品添加物として認められており、生鮮食品等様々なところで使用されている。しかし欠点として、有機物が混入する場合に極端に殺菌効果が減少することが知られている。実際に、次亜塩素酸液による表面洗浄では消毒後にも菌が確認され、殺菌効果は必ずしも十分とは言えないとの報告がある（非特許文献１、２）。さらに、これらの方法は肝臓表面のみの殺菌であるため、胆管および血管内の細菌、胆管内有機物を死滅させることは不可能であった。また、特許文献１に記載の超高圧をかけることにより殺菌する方法では、加圧装置の設置にかかるコストや加圧により肝臓の色や食感が変化する可能性があるといった問題が指摘されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１６１８９
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】厚生労働省  食品衛生分科会乳肉水産食品部会  ２０１２年２月２４日会議資料４
【非特許文献２】病原微生物検出情報  Ｖｏｌ.２３  Ｎｏ．６（２００２．６）（１４１〜２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上述の状況を鑑みてなされたものである。本発明は、非ヒト動物の生食用肝臓（レバー）に存在する微生物の殺菌方法、および、殺菌された生食用肝臓の製造方法の提供を課題とする。また本発明は、殺菌された肝臓の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、牛の解体時に起こる交差汚染を適当な方法で消毒し、肝臓に存在する細菌を死滅させることができるか否かを検討した。また、胆管内および／または門脈内を適当な消毒法にて消毒し、さらに肝臓を冷凍することにより肝臓内に存在する細菌を死滅させることができるか否かを検討した。
具体的には本発明者らは、腸管出血性大腸菌あるいはカンピロバクターを肝臓表面に人為的に付着させ、塩素系消毒剤の殺菌効果を検討した。その結果本発明者らは、塩素系消毒剤により、肝臓表面に存在する細菌を殺菌できることを見出した。
また本発明者らは、腸管出血性大腸菌あるいはカンピロバクターを肝臓の胆管内および門脈に注入して人為的に汚染させ、熱湯による洗浄効果および塩素系消毒剤の殺菌効果を検討した。その結果、肝臓内部に存在する細菌についても、胆管および／または門脈を熱湯洗浄し、その後胆管および／または門脈と肝臓表面を塩素系消毒剤を使用して消毒することにより、肝臓に存在する細菌の殺菌が可能なことを見出した。さらに本発明者らは、塩素系消毒剤による消毒後、肝臓を冷凍処理することにより、さらに殺菌効果を高めることが可能なことを見出した。
加えて、本発明者らは肝臓表面消毒後に肝臓に塩素系消毒剤を浸透させる消毒工程を追加することによる殺菌効果を検討した。その結果、殺菌効果を顕著に高めることが可能なことを見出した。
また冷凍された肝臓の解凍を氷水中の温度で行えば、より効果的に肝臓内部や表面の微生物を減少させることが可能なことを見出した。【００１０】
本発明はこのような知見に基づくものであり、以下〔１〕〜〔９〕に関する。
〔１〕以下の工程を含む、微生物が殺菌された肝臓の製造方法；
（ａ）摘出された非ヒト動物の肝臓の胆管内および門脈の両方またはいずれか一方に熱湯を高圧注入する工程、および
（ｂ）工程（ａ）の肝臓の胆管内および門脈の両方またはいずれか一方に塩素系消毒剤を注入する工程。
〔２〕肝臓に塩素系消毒剤を浸透させる工程をさらに含む、〔１〕に記載の方法。
〔３〕肝臓を冷凍する工程をさらに含む、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕以下の工程をさらに含む、〔１〕に記載の方法；
（ａ）肝臓表面を塩素系消毒剤により消毒する工程、および
（ｂ）工程（ａ）の肝臓を冷凍する工程。
〔５〕肝臓を冷凍する工程の前に、肝臓に塩素系消毒剤を浸透させる工程をさらに含む、〔４〕に記載の方法。
〔６〕肝臓を解凍する工程をさらに含む、〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕微生物が食中毒を引き起こす微生物である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕食中毒を引き起こす微生物がカンピロバクター、病原性大腸菌、サルモネラ属菌、シゲラ属菌、エロモナス属菌、スタフィロコッカス属菌、E型肝炎ウィルスからなる群より選択される、〔７〕に記載の方法。
〔９〕〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法によって得られる、殺菌された肝臓組織。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、肝臓や胆管または血管内に存在する微生物の殺菌方法が提供された。当該方法により、カンピロバクターや病原性大腸菌などの微生物に起因する、肝臓の生食に伴う食中毒のリスクを低減することが可能となった。特に本発明の方法は、牛の解体時に起こる腸管内容物からの交差に起因する肝臓の微生物汚染の防止に有用である。
あるいは本発明は、肝臓の生食が可能な状態で、胆管内や門脈内に存在するカンピロバクターや病原性大腸菌などの食中毒細菌微生物の除去を可能とする技術を確立した。本発明により、肝臓表面のみならず、内部についても微生物が除かれた安全な肝臓を提供することができる。
塩素系消毒剤による殺菌については、肝臓に付着した有機物により殺菌効果が極端に減少するという問題があった。しかし本発明の方法では、塩素系消毒剤による殺菌の後、肝臓を冷凍し、解凍することにより、肝臓に残存する微生物をさらに殺菌することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】EHECおよびC.jejuniによる表面汚染の除菌効果を示す図である。A: EHEC 105 cfu塗布、B: C. jejuni 105 cfu塗布、C: EHEC 106 cfu塗布、D: C. jejuni 106 cfu塗布、N: no treat、DW: DW洗浄、400: 400 ppm 消毒剤処理、800: 800 ppm消毒剤処理
【図２】消毒によるコロニー形状の変化を示す写真である。A, Cは無処理群のコロニー形状を、B, Dは塩素処理群（2,000 ppm )のコロニー形状を示す。
【図３】EHEC O157に対する塩素系消毒剤の血管洗浄液存在下の殺菌効果を示すグラフである。400 ppmの消毒液と菌液（約5 x 105 、 5 x 107 cfu/ml）を1:1で混合し、10分後にチオ硫酸ナトリウムにて塩素を中和した。その後、100 μlをSMAC培地に植菌し、得られたコロニー数を算出した。
【図４】C. jejuniに対する塩素系消毒剤の血管洗浄液存在下での殺菌効果を示すグラフである。400 ppmの消毒液と菌液（約5 x 105 、 5 x 107 cfu/ml）を1:1で混合し、10分後にチオ硫酸ナトリウムにて塩素を中和した。その後、100 μlをmCCDA培地に植菌し、得られたコロニー数を算出した。
【図５】胆道系の構造および胆管内や門脈への熱湯、塩素系消毒剤の注入についての説明を示す図である。
【図６】ウシの肝臓の構造を示す図である。
【図７】実施例６において使用した肝臓左葉の各ブロックの番号を示す図である。
【図８】実施例７において使用した肝臓左葉の各ブロックの番号を示す図である。
【図９】実施例９〜１１において使用した肝臓左葉の各ブロックの番号を示す図である。
【図１０】遊離有効塩素の化学平衡とpHの関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、以下の工程を含む微生物が殺菌された肝臓の製造方法に関する。また肝臓に存在する微生物の殺菌方法に関する。
（ａ）摘出された非ヒト動物の肝臓の胆管内および／または門脈に熱湯を高圧注入する工程、および
（ｂ）工程（ａ）の肝臓の胆管内および／または門脈に塩素系消毒剤を注入する工程。
本発明の方法を使用することにより、その表面および／または内部が殺菌された肝臓を製造することができる。また本発明の方法によって、肝臓表面および／または内部に存在する微生物を殺菌することができる。本発明において「殺菌」は「除菌」と表現することもできる。
【００１４】
本発明において殺菌の対象となる微生物には、細菌やウィルス、原虫類などが含まれる。従って本発明における「殺菌」には細菌を死滅させることに加え、ウィルスや原虫類を死滅させることも含まれる。本発明において殺菌の対象となる細菌やウィルス、原虫類は特に限定されないが、食中毒等の感染症を引き起こす細菌、ウィルス、原虫類が挙げられる。また、「消毒」とは生存する微生物の数を減らすために用いられる処置法で、本発明における殺菌には消毒も含まれる。
【００１５】
食中毒を引き起こす細菌としては、感染型細菌、毒素型細菌が知られている。
感染型細菌としては
・カンピロバクター属菌
・エシェリヒア属菌（病原性大腸菌）
・サルモネラ属菌
・シゲラ属菌
・ビブリオ属菌
・エロモナス属菌
・プレシオモナス属菌
・エルシニア属菌
・リステリア属菌
・クロノバクター属菌
・シトロバクター属菌
・エンテロバクター属菌
・プロテウス属菌
・プロビデンシア属菌
・ブルセラ属菌
・ヘリコバクター属菌
・セラチア属菌
などを例示することができるがこれらに限定されない。
一方、毒素型細菌としては
・スタフィロコッカス属菌
・クロストリジウム属菌
・バシラス属菌
などを例示することができるがこれらに限定されない。
【００１６】
また食中毒を引き起こすウィルスとしては、
・ノロウィルス
・ロタウィルス
・アデノウィルス
・アストロウィルス
・A型肝炎ウィルス
・E型肝炎ウィルス
などを例示することができるがこれらに限定されない。
【００１７】
また食中毒を引き起こす原虫類としては、
・クリプトスポリジウム
・サイクロスポラ
・クドア（住肉胞子虫）
・アメーバ赤痢
・ザルコシスティス
などを例示することができるがこれらに限定されない
【００１８】
カンピロバクター属細菌は、ヒト、および野生または家畜動物の病原菌であって、動物における流産や腸炎、ヒトにおける腸炎の原因菌である。ヒトの場合、カンピロバクター感染症の起因菌としては、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）およびカンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）が知られており、これらの細菌は、食中毒菌として指定されている（特開昭６２−２２８０９６号公報、特開平２−８４２００号公報）。
【００１９】
カンピロバクターは15菌種9亜種に分類されている。そのうち、ヒトの下痢症から分離される菌種は、C.ジェジュニが95〜99 %を占め、C.コリなどのその他の菌種は数%である（特開平２−１５４７００号公報）。なお、C.コリはブタでの保菌率が極めて高い。近年、カンピロバクター感染症は、東南アジアを中心とした輸入食肉の増加に伴い増加傾向にあり、特にBSEやO157等の問題によって牛肉の代替品として消費量が伸びている鶏肉関連食品による感染例が急増している。
【００２０】
その他、C.フィータス（Campylobacter fetus）は、ヒツジやウシの流産菌として知られていたが、近年ヒトの流産や早産に関与しているとの報告がある。また、C.フィータスで汚染されたレバーや牛肉の生食によるC.フィータス感染では、敗血症や髄膜炎などの症状を呈することもある。ヒトへの感染源は、腸管内に高濃度に保菌する鶏肉が最も重要である。（特開平３−１１２４９８号公報）
【００２１】
一方大腸菌には無害のものも多いが、病原性大腸菌として人体に有害なものもある。本発明において殺菌の対象となる病原性大腸菌としては、
・腸管出血性大腸菌（EHEC）（O26、O103、O111、O128、O145、O157など）、
・腸管病原性大腸菌（EPEC）（O6、O44、O55、O86、O111、O114、O119、O125、O127、O128、O142、O158など）、
・腸管侵入性大腸菌（EIEC）（O28ac、O112、O121、O124、O136、O143、O144、O152、O164など）、
・毒素原性大腸菌（ETEC）（O6、O8、O11、O15、O25、O27、O29、O63、O73、O78、O85、O114、O115、O128、O139、O148、O149、O159、O166、O169など）、
・腸管凝集性大腸菌（EAggEC）（O44、0104、O127、O128など）
などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２２】
サルモネラ属菌は主にヒトや動物の消化管に生息する腸内細菌の一種であり、その一部はヒトや動物に感染して病原性を示す。ヒトに対して病原性を持つサルモネラ属菌の内、感染型食中毒を起こすものはネズミチフス菌 S. Typhimurium や腸炎菌 S. Enteritidisなどが知られている。典型的な感染型食中毒であり、その主な症状は、腹痛、嘔吐、下痢（ときに粘血便）などの消化器症状、発熱（高熱）などで、抵抗力のない者は菌血症を起こし重症化することがある。まれに内毒素による敗血症を合併し、死亡することがある。サルモネラ属菌に汚染された鶏卵に由来する食中毒事例が多いが、解体時に腸管内容物等により汚染された肉やレバーの生食、それらの汚染食材から調理器具を介した二時汚染により、食中毒の原因となる。また、ペットなどを介した感染も知られている。
【００２３】
E型肝炎は、従来、経口伝播型非A非B型肝炎とよばれてきたウィルス性の急性肝炎で、その病原体はE型肝炎ウイルス（HEV）である。E型肝炎の致死率はA型肝炎の10倍といわれ、妊婦では実に20 %に達することがある。ブタやシカ、イノシシなどの動物が保有しており、これら動物の生刺しやレバ刺しなどの喫食による感染経路が最近になり指摘されている。
【００２４】
非ヒト動物の胆管内や門脈への熱湯の高圧注入は、例えば加圧式スプレーガン等によって行うことができる。すなわち、胆嚢側の総胆管にノズルを差し込み、腸管へ向かう胆管の端を結紮または栓、指などで封鎖した上で注入する。総胆管から肝臓に入るところで胆管が左葉側と右葉側に分岐するので、それぞれの分岐の奥までノズルを入れた後、角度を変えて左葉側、右葉側にまんべんなく注入する。必要に応じて腸管へ向かう胆管にノズルを差し込み、胆嚢側の総胆管を封鎖した後、逆方向からも注入する（図５および図６を参照）。門脈内への注入は切除され、解放された門脈からノズルを注入し、漏れないようにノズルと門脈をクランプ、指等で固定し、注入する。
【００２５】
胆管内や門脈へ熱湯を高圧注入することにより、胆管や血管内（門脈内）に存在する微生物や胆管内有機物を殺菌および洗浄することができる。この操作は複数回行うことが好ましい。複数回としては2回、3回、4回、5回などが挙げられるがこれらに限定されない。非ヒト動物の胆管内および門脈へ注入される熱湯の温度および量は、肝臓が熱による変性を起こさない範囲とすることが好ましい。このような温度範囲として、例えば55 ℃〜90 ℃、好ましくは70 ℃〜85 ℃、さらに好ましくは80 ℃〜85 ℃を例示することができるがこれらに限定されない。また熱湯の注入量は、例えば100〜300 ml、好ましくは150〜250 ml、さらに好ましくは100〜200 mlとすることができるがこれらに限定されない。熱湯の注入は、一度に行うことも、複数回に分けて行うこともできる。1回あたりの注入時間は、例えば1〜20秒、好ましくは3〜15秒、さらに好ましくは5〜10秒とすることができるがこれらに限定されない。
【００２６】
熱湯は高圧注入することが好ましい。好ましい圧力として、例えば0.05 MPa〜0.5 MPaもしくは0.1 MPa〜0.4 MPa、特に好ましくは0.2 MPa〜0.3 MPaなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２７】
熱湯による高圧注入の後、熱湯を取り除き、胆管および／または門脈に塩素系消毒剤を注入する。塩素系消毒剤の注入も、例えば加圧式スプレーガン等によって行うことができる。具体的な方法は上述のとおりである。1回あたりの注入量は例えば100〜2,000 ml、好ましくは150〜1,000 ml、さらに好ましくは200〜500 mlとすることができるがこれらに限定されない。塩素系消毒剤の注入は、一度に行うことも、複数回に分けて行うこともできる。1回あたりの注入時間は、例えば1〜20秒、好ましくは3〜15秒、さらに好ましくは5〜10秒とすることができるがこれらに限定されない。
【００２８】
本発明における非ヒト動物としては、牛、豚、鶏、鴨、馬、山羊、羊、猪、鹿、ウサギ、犬、鯨、イルカなどが挙げられるがこれらに限定されない。本発明における肝臓は、胆管および／または門脈が切り落とされていない非ヒト動物の肝臓が好ましいが、特に限定されない。
【００２９】
本発明に使用される塩素系消毒剤は、肝臓に存在する微生物を減少させることが可能なものである限り限定されない。本発明において塩素系消毒剤とは、消毒に効果のある有効塩素を含む薬剤をいう。塩素系消毒剤としては、次亜塩素酸ナトリウムや次亜塩素酸カルシウムなど、水に溶解したときに次亜塩素酸や次亜塩素酸イオンが生じる化合物を含む消毒剤や、強酸性水、次亜塩素酸水、電解次亜水といった電気分解などを利用して次亜塩素酸や次亜塩素酸イオンを含む消毒剤、二酸化塩素水、安定型複合塩素製剤などが知られており、当業者であればその組成や性質に基づき適切な消毒剤を選択することができる。次亜塩素酸イオンなどを含む消毒剤としては、
・shitenクリーン（販売元：株式会社Shiten）
・Vアイナック（販売元：株式会社ルピナス、登録商標）
・テルロンブリーチ（販売元：ADEKAクリーンエイド株式会社、登録商標）
・ミルトン（販売元：キョーリン製薬、登録商標）
・ピュリファンP（販売元：健栄製薬株式会社、登録商標）
・テキサント（販売元：日本ケミファ株式会社、登録商標）
・ハイポライト（販売元：サンケミファ株式会社、登録商標）
・ピューラックス（販売元：株式会社オーヤラックス、登録商標）
・ヤクラックスD（販売元：ヤクハン製薬株式会社）
・ハイクロソフト水（製造器販売元：株式会社オーク）
・クレベリン（販売元：大幸薬品株式会社、登録商標）
・エヴァ水（販売元：エヴァテック株式会社、登録商標）
・Kガード（販売元：エイトノット株式会社）
などが市販されており、容易に入手することが可能である。あるいは、塩素系消毒剤を調製し、それを使用することもできる。塩素系消毒剤は、例えば次亜塩素酸ナトリウムや次亜塩素酸カルシウムなどを使用して、当業者に周知の方法によって調製することができる。
【００３０】
本発明においては、食品添加物タイプの消毒剤を使用することが好ましい。また本発明においては、塩素系消毒剤を他の薬剤と併用してよい。他の薬剤としてはアルコール系消毒剤（例えばエタノール）、有機酸やその塩類、無機酸やその塩類、界面活性剤などを含む薬剤、電解酸性水、オゾン水などを挙げることができるがこれらに限定されない。
胆管に注入する塩素系消毒剤と門脈に注入する塩素系消毒剤は同じものであっても異なるものであってもよい。
【００３１】
当業者であれば、殺菌の対象となる肝臓が由来する動物種や肝臓の大きさ、肝臓に存在する微生物の種類や量などに応じ、塩素系消毒剤の最適な濃度や使用量を選択することが可能である。塩素系消毒剤の濃度としては、例えば50〜2,000 ppm、100〜2,000 ppm、好ましくは100〜1,000 ppm、より好ましくは100〜500 ppm、200〜500 ppm、特に好ましくは200〜400 ppmを例示することができるがこれらに限定されない。また1回あたりの注入量は、例えば50〜2,000 ml、好ましくは150〜1,000 ml、さらに好ましくは200〜500 mlとすることができるがこれらに限定されない。また注入時間は、例えば1〜20秒、好ましくは3〜15秒、さらに好ましくは5〜10秒とすることができるがこれらに限定されない。
【００３２】
また本発明においては、塩素系消毒剤による消毒後、肝臓を洗浄することが好ましい。洗浄は水道水を用いて行うことができる。表面は十分な流水にて洗浄できる。注入する場合、注入量は、例えば100〜300 ml、好ましくは150〜250 ml、さらに好ましくは100〜200 mlとすることができるがこれらに限定されない。洗浄は、一度に行うことも、複数回に分けて行うこともできる。1回あたりの注入時間は、例えば1〜20秒、好ましくは3〜15秒、さらに好ましくは5〜10秒とすることができるがこれらに限定されない。
【００３３】
本発明の方法においては、熱湯および塩素系消毒剤の注入前と比較し、肝臓や胆嚢内の胆汁液に含まれる微生物数が減少した場合、殺菌されたと判定することができる。
カンピロバクター属細菌および病原性大腸菌の検出方法は周知である。例えば当業者であれば、培養による方法、PCR、real time PCR等により胆汁液中の菌数を定量する方法の他、イムノクロマト法、ELISA等の市販の検出試薬を使用することにより、肝臓や胆嚢内の胆汁液に含まれる微生物数を計測することができるが、これらの方法に限定されない。培養による方法の場合、カンピロバクター属細菌の検出は例えばmCCDA培地、血液寒天培地、スキロー培地などを、病原性大腸菌の場合は例えばSMAC培地、CT-SMAC培地、LB培地などを、サルモネラ属菌の場合は例えば、DHL寒天培地、MLCB寒天培地、SS寒天培地などを使用することができるがこれらに限定されない。
当業者であれば、例えば「戸田新細菌学、南山堂ISBN978-4-525-16013-5」などの文献を参照することにより、最適な検出方法を選択し、実施することができる。
【００３４】
あるいは病原性大腸菌の場合、コロニーの形状を指標として殺菌の有無を判定することもできる。すなわち本発明においては、熱湯および塩素系消毒剤の注入により菌数が変化しない場合でも、コロニーの形状がスムース型からラフ型に変化した場合、大腸菌による殺菌効果がみられたと判定することもできる。
【００３５】
本発明の方法では、上述の（ａ）および（ｂ）の工程に加え、以下の工程をさらに含むことができる。
（ｃ）肝臓を冷凍する工程
塩素消毒処理に加え、肝臓を真空包装後に冷凍処理することにより、熱湯処理および塩素系消毒剤処理によりダメージを受けた微生物の殺菌、消滅効果をより高めることができる。
【００３６】
あるいは本発明の方法では、上述の（ａ）および（ｂ）の工程に加え、以下の工程をさらに含むこともできる。
（ｃ）肝臓表面を塩素系消毒剤により消毒する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）の肝臓を冷凍する工程。
【００３７】
（ｃ）および（ｄ）の工程を行うことにより、（ａ）および（ｂ）の工程によって損傷した微生物を完全に殺菌することができる。塩素系消毒剤による消毒は、例えば上述の消毒剤を霧吹きなどで振りかけることなどにより行うことができる。塩素系消毒剤は、上述のものを、上述の濃度で使用することができる。
【００３８】
一方肝臓の冷凍は、例えば-196 ℃〜-1 ℃、好ましくは-80 ℃〜-5 ℃、特に好ましくは-40 ℃〜-10 ℃、さらに好ましくは-30 ℃〜-20 ℃の範囲で、例えば1時間〜2ヶ月、好ましくは2時間〜1週間、特に好ましくは5時間〜72時間行うことができる。冷凍条件として、-196 ℃、28時間を例示することができるがこれに限定されない。また冷凍後、例えば-10〜10 ℃、好ましくは-3〜5 ℃、特に好ましくは氷水中の温度（例えば-1〜1 ℃の範囲、好ましくは0 ℃）で緩やかに解凍し、-3℃〜10 ℃、好ましくは氷水中の温度（例えば-1 ℃〜1 ℃、特に好ましくは0 ℃）で保存することが好ましい。すなわち本発明は、冷凍された肝臓を解凍する工程を含むことができる。さらに本発明は、解凍された肝臓を保存する工程を含むことができる。肝臓の冷凍および保存はナイロンバック等の密封容器に入れた後、一般的な真空包装機等を用いて真空包装の後、行うのが好ましい。
一般に凍結保存が可能とされている大腸菌やカンピロバクター等の微生物に対する殺菌作用が、熱処理および塩素処理後の冷凍および氷水中での保存により増強されることは驚くべき効果である。
【００３９】
なお、非ヒト動物の肝臓、胆管、門脈などを含む摘出された非ヒト動物の肝臓組織は一般の流通経路を通して入手することが可能である。流通過程における微生物汚染を考慮すると、できるだけ清浄な肝臓組織が好ましい。また解体時に本発明に記載の方法により肝臓組織を処理することが好ましい。
【００４０】
本発明においては、肝臓表面消毒後、肝臓に塩素系消毒剤を浸透させる消毒工程を付加的に含むことができる。追加の消毒工程では、例えば塩素系消毒剤含有吸液・吸湿材（吸湿・吸液の性質を持つシート）を使用して肝臓を塩素系消毒剤に浸透（浸漬）させることができる。これにより、塩素系消毒剤の揮散を防止することができる。あるいは、直接肝臓表面に塩素系消毒剤を添加することもできる。
吸湿・吸液材としては例えば食品用脱水シート（ドリップキーパー（登録商標、販売元：日本バイリーン株式会社）、ピチット（登録商標、販売元：オカモト株式会社）、セラキーパー（販売元：株式会社ショーテック）等が用いられるが、これらと同様の性質を持つものであれば特に限定されない。あるいは、浸透（浸漬）は真空の包装容器の中で行うこともできる。
本発明においては、追加の消毒工程の後、肝臓を冷凍することができる。
【００４１】
追加の消毒工程に使用する消毒剤は、上述のものを例示することができる。胆管や門脈の消毒に使用する消毒剤と同じものであっても異なるものであってもよい。
塩素系消毒剤の濃度は、100〜2,000 ppm、200〜2,000 ppm、500〜2,000 ppm、200〜500 ppmなどを採用することができるがこれらに限定されない。また浸透液の量は検体50 gあたり1〜50 ml、好ましくは5〜30 ml、さらに好ましくは8〜20 mlとすることができるがこれらに限定されない。
また浸漬時間は、例えば10〜60秒、好ましくは20〜50秒、さらに好ましくは30〜40秒とすることができるがこれらに限定されない。
【００４２】
このような方法により得られる肝臓は、その表面および／または内部において微生物（特に食中毒を引き起こす微生物）が殺菌された肝臓である。すなわち本発明は、本発明の方法によって得られる、その表面および／または内部が殺菌された肝臓組織をも提供する。本発明の肝臓組織は、カンピロバクターや病原性大腸菌などの微生物を含む肝臓組織とは異なる肝臓組織であり、生食による食中毒のリスクを有しない肝臓組織である。このような肝臓組織は、密閉された状態で流通させることが好ましい。また肝臓組織を含む真空パックを2000〜4500気圧の超高圧条件下で処理することもできる。このような処理により、肝臓の食感や旨さを損なうことなく、肝臓の無菌化状態を維持することができる。
本発明の肝臓組織は、例えば、洗浄された肝臓そのもの、もしくは左葉、右葉などに小分けした肝臓、もしくは可食部を切り出したブロック状の肝臓としてナイロンバック等で密封、もしくは真空包装した形で流通させることができる。その際、肝臓以外の食肉とセットで流通させることができる。
【００４３】
また本発明は、以下の工程を含む肝臓の保存方法を提供する。
（ａ）本明細書に記載の方法により殺菌された肝臓を取得する工程、
（ｂ）工程（ａ）の肝臓を氷水中の温度下において保存する工程。
肝臓の保存は、例えば0〜4 ℃の範囲、好ましくは氷水中の温度の範囲（例えば-1 ℃〜1 ℃、特に好ましくは0 ℃）で行うことができるがこれに限定されない。本発明の保存方法を使用することにより、食中毒を引き起こす微生物がさらに減少し、微生物の感染リスクを低減させることができる。加えて、食感、味覚を損なうことなく安全に肝臓を保存、流通させることができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に制限されるものではない。
実施例１  肝臓表面汚染除去実験
表面汚染対策：解体時の腸管内容物による交差汚染を想定して、一定の腸管出血性大腸菌あるいはカンピロバクターをレバー表面に人為的に汚染させ、塩素系消毒剤の殺菌効果を検討した。
方法
１．対数増殖期の腸管出血性大腸菌O157 Sakai株（以下EHEC O157）とカンピロバクター・ジェジュニ 81-176株（以下C. jejuni 81-176）をそれぞれPBSにて約105、106 cfu/mlとなるように調整した。調整後コロニーを計測するためそれぞれに適した培地にて培養した。なお、EHEC O157は大阪大学微生物病研究所（購入番号：RIMD0509952）、C. jejuni 81-176はAmerican Type Culture Collection（ATCC）（購入番号：BAA-2151）より入手した。
２．牛レバーの表面それぞれ、約10 cm 四方になるように煮沸およびアルコールにて滅菌した包丁、もしくは外科用メスにてブロック状に切り取った。
３．菌の混液1 mlずつを均等に塗り付けた。
４．30分間静置後、水洗浄群は約10 mlの水、消毒群は塩素系消毒剤テルロンブリーチ（ADEKAクリーンエイド株式会社）(400 ppm, 800 ppm)約10 mlを霧吹きで振りかけ、30分間静置した。
５．それぞれのブロックの表面を滅菌プース等を用いて一定圧力で2往復、100 cm2を拭き取り、拭き取ったプース等をPBSに懸濁し、揉み出した。揉みだし液を原液、10倍希釈、100倍希釈し、それぞれ100 μLずつを各3枚のSMAC培地とmCCDA培地上に広げ、それぞれ培養した。SMAC培地は好気条件下で37 ℃、1日、mCCDA培地は微好気条件（5 % O2, 10 % CO2, 85 % N2）で37 ℃、2日培養し、得られたEHEC様コロニーとC. jejuni様のコロニーを計測した。【００４５】
結果
EHEC O157、C. jejuni 81-176の105 cfu/ml塗布群では400 ppmの塩素系消毒剤により表面汚染菌が完全に除去できた。また、EHEC O157の106 cfu/ml塗布群でも400 ppmの塩素系消毒剤によりEHEC O157は約1/2000、800 ppmでは約1/10000まで除菌できた。C. jejuni 81-176の106 cfu/ml塗布群においても400 ppmでは約1/1000に、800 ppmでは完全に除菌する事ができた（図１）。【００４６】
実施例２  肝臓内部汚染除去実験
内部汚染対策：一定の腸管出血性大腸菌あるいはカンピロバクターを肝臓の胆管内に注入して人為的に汚染させ、温湯による洗浄効果および塩素系消毒剤の殺菌効果を検討した。
方法
１．無菌的に胆汁を採取した後、胆嚢、膵臓を切除した牛肝臓の胆管内を緩やかに洗浄し、約40 ℃に保った。採取した胆汁はCT-SMAC培地、mCCDA培地に接種し、バックグラウンドの生菌数を計測した。また、必要に応じてreal time PCRにより、菌数を測定した。
２．胆管から肝臓内にEHEC O157 105 cfu/mlとC. jejuni 81-176 の106 cfu/mlを20 ml胆管内に注入した。
３．30分間静置後、約150 mlの温湯（約85 ℃）を胆管内に高圧注入（0.2 Mpa）し洗浄した。この操作を再度繰り返した。さらに、門脈内に約50 mlの温湯（約85 ℃）を高圧注入（0.2 Mpa）し洗浄した。その後、約200 mlもしくは500 mlの塩素系消毒剤Shitenクリーン（株式会社Shiten）（400 ppmおよび2,000 ppm）を胆管内に高圧注入（0.2 Mpa）し消毒した。さらに約200 mlのShitenクリーンを門脈内に高圧注入（0.2 Mpa）し消毒した。
４．消毒後30分間静置後、400 ppmのテルロンブリーチと80 %エタノールをスプレーし、肝臓表面を消毒した。
５．熱湯消毒、およびアルコール消毒した包丁もしくは外科用メスを用いて左葉から約10 cm3程度のブロックを2カ所切り出した。切り出したブロックの表面、裏面、切断部分を無菌的にトリミングし、ブロックの中心部から約50 g (4 cm x 4 cm x 3 cm)を2つ、滅菌的に切り出した。
６．切り出した約50ｇのサンプルのうち一方は凍結させずそのまま等量のPBSを加え、30秒間ストマッカー処理を行ない、等量揉み出し液を作製した。
７．もう一方のサンプルについては-35 ℃で凍結させ、28時間保存した。その後、4 ℃で緩やかに解凍し、16時間4℃で保存した後、上記と同様の方法で揉み出し液を作製した。
８．揉みだし液100 μlをそれぞれCT-SMAC培地とmCCDA培地上に接種し、CT-SMAC培地は好気条件下で37 ℃、1日、mCCDA培地は微好気条件（5 % O2, 10 % CO2, 85 % N2）で42 ℃、2日培養し、得られたEHEC様コロニーとC. jejuni様のコロニーを計測した。【００４７】
まれに肝臓内にCT-SMAC培地で増殖する菌が含まれることがあり、EHEC O157を用いた実験に影響を与える可能性があるため、あらかじめ無菌的に胆汁を採取し、胆汁をCT-SMAC培地に接種し、106 cfu/ml以上の大腸菌様コロニーが認められた肝臓はEHEC O157を用いた実験から棄却した。C. jejuni 81-176を用いた実験に関しては、肝臓内に106 cfu/ml程度のカンピロバクター属菌が存在する事がある。しかし本実施例ではC. jejuni 81-176の投与菌量（106 cfu/ml）に大きな影響を与える事は考えにくい為、特に棄却は行わなかった。【００４８】
結果
消毒を行わない群では個体差はあるが、平均で46.7〜111.8 cfuのEHEC O157が肝臓内に存在した。また、塩素系消毒剤により消毒を行っても菌数は消毒しなかった群と大きな差は認められず、12.3〜570.0 cfu のEHEC O157が検出された。しかし、消毒しない群のコロニー形状と消毒群のコロニー形状を比較したところ、無消毒群ではEHEC O157に典型的なスムースなコロニー形状を示していたが、塩素系消毒処理群では表面が粗くなったラフ型のコロニー形状を示していた（図２）。【００４９】
また、消毒後、冷凍によるEHEC O157へのダメージを検討したところ、無消毒群では冷凍により菌数が約1/48から1/28へと減少したが、完全に0 cfuにはならなかった。一方、塩素消毒処理群では、全ての群で完全に菌数が0となり、減少度合も無消毒群より高い値を示した。
C. jejuni 81-176を用いた投与実験では、塩素系消毒剤による消毒と冷凍により、完全に0 cfuにはならなかったが、コロニー数の減少度合（冷凍無/冷凍後）は無消毒群の約9から18と比べ、塩素系消毒処理群では約7から66と無消毒群と同等か、それ以上の菌の減少効果が認められた。【００５０】
【表１】
2013180256.tif 000003
【００５１】
【表２】
2013180256.tif 000004
【００５２】
実施例３  風味等に関する検討
新鮮な牛生レバーについて、未処理品（水道水による表面洗浄の後、4 ℃で冷蔵）と実施例に従って処理した（85 ℃温湯洗浄150 ml 2回、200 ppm のShitenクリーン200 mlの注入、400 ppm のテルロンブリーチによる表面消毒、ブロックに切り分け後、真空包装機にて真空度約-0.07〜-0.09 MPa程度に真空包装した後に-35 ℃凍結の後、4 ℃で緩やかに解凍）処理品を11名（男性10名、女性1名）に試食してもらい、処理した生レバーの色、食感（ぷりぷり感があるか）、美味しさ、臭い（塩素臭等）の項目について次の5段階で評価し、採点を受けた。【００５３】
〔  評  価  〕                                        〔  点  数  〕
良い。ほとんど変わらない。違いがわからない。    ・・・・・    ５ 点
やや良い。違いがわずかにあるが、気にはならない。・・・・・    ４ 点
普通。違いが少しあるが、喫食には問題ない。      ・・・・・    ３ 点
やや劣る。明らかに違いがあり、気になる          ・・・・・    ２ 点
劣る。明らかに違いがある。喫食をためらう        ・・・・・    １ 点【００５４】
結果
11名とも形状、臭い、味覚、食感等の品質に対する悪影響を認めず、商品価値の高い物であると判定した（表３）。また、処理済み生レバーの試食後の感想として・処理済みのほうが、レバー独特のにおいがなく、食べやすい・熟成している・おいしい・あまみがある・逆にいい・くせがない・もちもちしている、といった味や風味、食感の向上を訴えた感想が見られた。【００５５】
【表３】
2013180256.tif 000005
【００５６】
実施例４  有機物存在下での塩素系消毒剤の効果
方法
200 ppmのShitenクリーンと門脈洗浄液（主に血液を含む）を1:1混合し、10分間室温で反応させた。その後、10倍量のチオ硫酸ナトリウムで塩素を中和した後、100 μlをEHEC O157はSMAC培地、C. jejuni 81-176はmCCDA培地に植菌し、得られたコロニー数を算出した。【００５７】
結果
EHEC O157、C.ｊejuni 81-176とも、濃い濃度(0.8 mg/ml)の門脈洗浄液（血液タンパク）が存在している場合、塩素系消毒剤の効果が減弱した。
一方、1/4希釈した門脈洗浄液 (血液 タンパク量0.2 mg/ml)の場合、消毒効果が見られ、約5 x 106 cfuのEHEC O157、C.ｊejuni 81-176 が検出限界である0 cfu（100 cfu/ml以下）まで減少した（図３、４）。【００５８】
実施例５  氷水中で保存した場合の菌の減少率
方法
無菌的に胆汁を採取した後、胆嚢、膵臓を切除した牛肝臓の胆管内を緩やかに洗浄し、約40 ℃に保った。採取した胆汁はCT-SMAC培地、mCCDA培地に接種し、バックグラウンドの生菌数を計測した。また、必要に応じてreal time PCRにより、菌数を測定した。次に、胆管から肝臓内にEHEC O157の 105 cfu/mlとC. jejuni 81-176の 106 cfu/mlを20 ml胆管内に注入した。30分間静置後、約150 mlの温湯（約85 ℃）を胆管内に高圧注入（0.2 Mpa）し洗浄し、この操作を再度繰り返した。さらに、門脈内に約50 mlの温湯（約85 ℃）を高圧注入（0.2 Mpa）し洗浄した。
その後、約200 mlのShitenクリーン（400 ppm、200 ppm、100 ppm）を胆管内に高圧注入（0.2 Mpa）し消毒した。さらに約200 mlのShitenクリーン（400 ppm、200 ppm、100 ppm）を門脈内に高圧注入（0.2 Mpa）し消毒した。消毒後30分間静置し、400 ppmのテルロンブリーチと80 %エタノールをスプレーし、肝臓表面を消毒した。その後、熱湯消毒、およびアルコール消毒した包丁もしくは外科用メスを用いて左葉から約10 cm3程度のブロックを2カ所切り出した。切り出したブロックの表面、裏面、切断部分を無菌的にトリミングし、ブロックの中心部から約50 g (4 cm x 4 cm x 3 cm)を3つ、滅菌的に切り出した。切り出した3つのサンプルのうち1つは凍結処理を行わずに等量のPBSを加え、30秒間ストマッカー処理を行ない、等量揉み出し液を作製した。また、残り2つのサンプルのうち一方は、-35 ℃で凍結させ28時間保存後、4 ℃で緩やかに解凍し、4 ℃で16時間保存した。さらにもう一方は、凍結・解凍後、氷水中で40時間保存した。これらは保存後、上記と同様の方法で揉み出し液を作製した。得られた揉みだし液100 μlをそれぞれCT-SMAC培地とmCCDA培地上に接種し、CT-SMAC培地は好気条件下で37 ℃、1日、mCCDA培地は微好気条件（5 % O2, 10 % CO2, 85 % N2）で42 ℃、2日培養し、得られたEHEC様コロニーとC. jejuni様のコロニーを計測し、温湯による洗浄効果および塩素系消毒剤の内部汚染に対する殺菌効果を検討した。
実験に影響を与える可能性のある肝臓については実施例２と同様の方法で棄却を行った。【００５９】
結果
表４に各処理を行った肝臓内EHEC O157の平均コロニー数およびコロニー数減少度合（冷凍無/4 ℃、冷凍無/氷水中）を示す。消毒を行わない群では個体差はあるが、平均で約80〜約150 cfuのEHEC O157が肝臓内に存在した。また、塩素系消毒剤により消毒を行っても菌数は消毒しなかった群と大きな差は認められず、約44〜805 cfu のEHEC O157が検出された。
消毒後、冷凍によるEHEC O157へのダメージを検討したところ、無消毒群では4 ℃保存群で菌数が約1/12から1/16へと減少した。さらに氷水中で保存した群では菌数が無処理群に比べ1/30から1/180に減少した。一方、塩素消毒100 ppm、200 ml処理群では無処理群と比べ冷凍（4 ℃保存および氷水中での保存）による菌数減少率に、大きな差は見られなかった。しかしながら、200 ppm、400 ppm処理群では無処理群と比べ冷凍による菌数の減少が見られ、4 ℃保存群の減少率は57から1000以上を示した。さらに氷水中での保存により、一部を除いて、ほぼ全ての群で減少率は増加し、塩素濃度100 ppm や200 ppmといった低い濃度でも菌数が0となる群も認められた。【００６０】
【表４】
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【００６１】
表５に各処理を行った肝臓内C. jejuniの平均コロニー数およびコロニー数減少度合（冷凍無/4 ℃、冷凍無/氷水中）を示す。C. jejuni 81-176では、無消毒群と塩素系消毒群間でコロニー数の減少度合に大きな差は認められなかったが、ほぼ全ての群において、4 ℃より、氷水中での保存の方が高い減少率を示した。【００６２】
【表５】
2013180256.tif 000007
【００６３】
実施例６  人工的に摂取した菌による内部汚染のばらつきおよび均一性の確認
消毒効果を正確に測定するため、人工的に肝臓に菌を摂取させ各部位における菌の分布を確認した。
方法
胆管から肝臓内にEHEC O157 3x106 cfu/mlを20 ml胆管内に注入した。その後、400 ppmのテルロンブリーチと80 %エタノールをスプレーし、肝臓表面を消毒した。次に図７に示す様に肝臓の左葉および方形葉下部9カ所から熱湯消毒、およびアルコール消毒した包丁もしくは外科用メスを用いて約100 cm3程度のブロックを切り出した。切り出したブロックの表面、裏面、切断部分を無菌的にトリミングし、ブロックの中心部から約50 g (4 cm x 4 cm x 3 cm)を切り出した。切り出した約50 gのサンプルに等量のPBSを加え、30秒間ストマッカー処理を行ない、等量揉み出し液を作製し、得られた揉みだし液100 μlをそれぞれCT-SMAC培地上に接種し、好気条件下で37 ℃、1日培養し、得られたEHEC様コロニーを計測し、人工的に摂取した菌による内部汚染のばらつきおよび均一性を確認した（表６）。【００６４】
結果
EHEC O157を胆管内に注入し、その分布を観察したところ、部位によって若干の差は見られるが、ほぼ全域に肝臓1 g あたり約105 cfuの菌が均一に分布していることが分かった。【００６５】
【表６】
2013180256.tif 000008
【００６６】
実施例７  各塩素系消毒剤の殺菌効果
一般的に市販されている性質の異なる塩素系消毒剤を使用して殺菌効果の検討を行った。
方法
胆管内にEHEC O157 3x106 cfu/mlを20 ml胆管内に注入し、10分間静置後、約150 mlの温湯（約85 ℃）を胆管内に高圧注入（0.2 Mpa）し洗浄し、この操作を再度繰り返した。さらに、門脈内に約50 mlの温湯（約85 ℃）を高圧注入（0.2 Mpa）し洗浄した。
その後、約500 mlの塩素系消毒剤Vアイナック（登録商標、株式会社ルピナス）（500 ppm）（表８）、エヴァ水（登録商標、エヴァテック株式会社）（500 ppm）(表９)、テルロンブリーチ（500 ppm）（表１０）を胆管内に高圧注入（0.2 Mpa）し消毒した。さらに約300 mlのVアイナックを注入後、約300 mlのエヴァ水を注入した群（表１１）も検討した。消毒剤注入後、400 ppmの塩素系消毒剤テルロンブリーチと80 %エタノールをスプレーし、肝臓表面を消毒した。その後、熱湯消毒、およびアルコール消毒した包丁もしくは外科用メスを用いて左葉から約100 cm3程度のブロックを4カ所(A〜D)切り出し、各ブロックの中心部から約50 g (4 cm x 4 cm x 3 cm)を2サンプル（例えばA1, A2）、切り出した（図８）。そのうち一方は-35 ℃で急速凍結し28時間保存し、その後、4 ℃で緩やかに解凍し、16時間4 ℃に保存した。切り出した約50 gのサンプルに等量のPBSを加え、30秒間ストマッカー処理を行ない、等量揉み出し液を作製した。得られた揉みだし液100 μlをそれぞれCT-SMAC培地上に接種し、好気条件下で37 ℃、1日培養し、得られたEHEC様コロニーを計測し、塩素系消毒剤の内部汚染に対する殺菌効果を検討した（表８〜１１）。【００６７】
結果
注入した菌の殺菌効果をそれぞれ性質の異なる塩素系消毒剤、Vアイナック（CCクラスター製剤）、エヴァ水（緩衝法次亜塩素酸水）、テルロンブリーチ（塩素系除菌・漂白剤）を用いて検討した。結果、肝臓の個体差は見られるが、塩素系消毒剤による単独消毒では、どの塩素系消毒剤を用いても肝臓1 gあたりの菌数を約1/2〜1/10程度低下させる程度であった。しかしながら、塩素処理に凍結処理を加えると、すべての群において約1/1000〜1/5000程度にまで低下させることができ、もっとも消毒効果が強かった例では肝臓1 gあたり10個程度の菌数にまで低下させることが出来た。また、異なる塩素系消毒剤の併用による効果を検討したが、CCクラスター製剤であるVアイナックと緩衝法次亜塩素酸水であるエヴァ水との併用では特に相乗効果等は認められなかった。
各塩素系消毒剤の特徴を表７に示した。【００６８】
【表７】
2013180256.tif 000009
【００６９】
【表８】
2013180256.tif 000010
【００７０】
【表９】
2013180256.tif 000011
【００７１】
【表１０】
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【００７２】
【表１１】
2013180256.tif 000013
【００７３】
実施例８  冷凍温度および解凍温度の違いによる消毒効果
冷凍温度および解凍温度の違いによる消毒効果の影響を検討した。
方法
胆管内にEHEC O157 1x106 cfu/mlを20 ml胆管内に注入し、その後、約150 mlの温湯（約85 ℃）を胆管内に高圧注入（0.2 Mpa）し洗浄し、この操作を再度繰り返した。さらに、門脈内に約50 mlの温湯（約85℃）を高圧注入（0.2 Mpa）し洗浄した。
次に、約500 mlの Vアイナックを胆管内に高圧注入（0.2 Mpa）し消毒した。消毒後、400 ppmのテルロンブリーチと80 %エタノールをスプレーし、肝臓表面を消毒した。その後、熱湯消毒、およびアルコール消毒した包丁もしくは外科用メスを用いて左葉から約80 cm3程度のブロックを5カ所（A〜E）切り出し、各ブロックの中心部から約50 g（4 cm x 4 cm x 3 cm）を切り出した。切り出したサンプルを無菌袋に入れ、卓上真空包装機（DZ-300、株式会社アスクワークス）を用いて約30秒〜1分かけて真空度約-0.1 MPa付近(約-0.07〜-0.09 MPa程度)になるまで真空にし、真空包装した。真空包装した各サンプルを冷凍なし、-30 ℃、-196 ℃で急速凍結する3群に分け、冷凍した後28時間保存し、その後、氷水中（0 ℃）と4 ℃で緩やかに解凍し、16時間それぞれ0 ℃、4 ℃に保存した。冷凍処理しない群はすぐに次の操作に移った。解凍した約50 gの各サンプルに等量のPBSを加え、30秒間ストマッカー処理を行ない、等量揉み出し液を作製した。得られた揉みだし液100 μlをそれぞれCT-SMAC培地上に接種し、好気条件下で37 ℃、1日培養し、得られたEHEC様コロニーを計測し、冷凍温度および解凍温度による影響を検討した（表１２）。【００７４】
結果
冷凍温度と解凍温度の違いによる消毒効果の影響を調べたところ、凍結温度の違いによる差はあまり認められなかったが、-196 ℃で凍結した群の菌数が低い傾向が見られた。解凍温度の違いでは、一部効果が見られない群があるが、4 ℃での解凍より氷水中（0 ℃）での解凍が効果的である傾向が認められた。一方、消毒処理を行っていない群では、冷凍、解凍によって1/10程度の菌数減少効果しか見られなかった。【００７５】
【表１２】
2013180256.tif 000014
【００７６】
実施例９  凍結工程および塩素系消毒剤含有吸湿・吸液材による追加消毒効果
凍結工程および塩素系消毒剤含有吸湿・吸液材の使用による追加消毒の殺菌効果を検討した。
方法
胆管内にEHEC O157 1x107 cfu/mlを20 ml胆管内に注入した後、約150 mlの温湯（約85℃）を胆管内に高圧注入（0.2 Mpa）し洗浄し、この操作を再度繰り返した。さらに、門脈内に約50 mlの温湯（約85℃）を高圧注入（0.2 Mpa）し洗浄した。
その後、約500 mlのエヴァ水を胆管内に高圧注入（0.2 Mpa）し消毒した。消毒後、400 ppmのテルロンブリーチと80 %エタノールをスプレーし、肝臓表面を消毒した。その後、熱湯消毒、およびアルコール消毒した包丁もしくは外科用メスを用いて左葉から約80 cm3程度のブロックを3カ所（A〜C）切り出し、各ブロックの中心部から約50 g（4 cm x 4 cm x 3 cm）のサンプルを2か所切り出した（図9）。切り出したサンプルを無菌袋に入れ、さらに約10 mlの500 ppmのエヴァ水を含ませた吸湿・吸液材（（ドリップキーパー、約9 cm x 15 cm）（登録商標、日本バイリーン株式会社））を入れ、卓上真空包装機を用いて約30秒〜1分かけて真空度約-0.1 MPa付近(約-0.07〜-0.09 MPa程度)になるまで真空にし、真空包装した。真空包装した各サンプルを-30 ℃で急速凍結し、28時間保存後、4 ℃で緩やかに16時間かけて解凍した。冷凍処理しない群はすぐに次の操作に移った。解凍した約50 gｇの各サンプルに等量のPBSを加え、30秒間ストマッカー処理を行ない、等量揉み出し液を作製した。得られた揉みだし液100 μlをそれぞれCT-SMAC培地上に接種し、好気条件下で37 ℃、1日培養し、得られたEHEC O157様コロニーを計測し、冷凍温度およびドリップキーパーによる影響を検討した（表１３）。【００７７】
結果
消毒剤注入、凍結・解凍による消毒工程に加え、肉汁などの吸収材としてよく用いられるドリップキーパーに塩素系消毒剤を含ませたものを用いて肝臓肉片に対する追加消毒を試みた。結果、塩素系消毒剤含有ドリップキーパーによる追加消毒により、通常の消毒より1/2〜1/5まで低下させることが出来た。また、消毒剤注入後、凍結処理していないサンプルに対しても塩素系消毒剤含有ドリップキーパーによる追加消毒によって菌数が減少する傾向が見られた。【００７８】
【表１３】
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【００７９】
実施例１０  塩素系消毒剤添加による追加消毒効果
塩素系消毒剤添加による追加消毒の殺菌効果を検討した。
方法
胆管内にEHEC 1x107 cfu/mlを20 ml胆管内に注入した後、約150 mlの温湯（約85 ℃）を胆管内に高圧注入（0.2 Mpa）し洗浄し、この操作を再度繰り返した。さらに、門脈内に約50 mlの温湯（約85 ℃）を高圧注入（0.2 Mpa）し洗浄した。
その後、約500 mlのエヴァ水（2,000 ppm）を胆管内に高圧注入（0.2 Mpa）し消毒した。消毒後、400 ppmの塩素系消毒剤テルロンブリーチと80 %エタノールをスプレーし、肝臓表面を消毒した。その後、熱湯消毒、およびアルコール消毒した包丁もしくは外科用メスを用いて左葉から約100 cm3程度のブロックを3カ所（A〜C）切り出し、各ブロックの中心部から約50 g（4 cm x 4 cm x 3 cm）のサンプルを2か所切り出した（図９）。切り出したサンプルを無菌袋に入れ、さらに約10 mlの2,000 ppmのエヴァ水を入れ、卓上真空包装機を用いて約30秒〜1分かけて真空度約-0.1 MPa付近(約-0.07〜-0.09 MPa程度)になるまで真空にし、真空包装した。真空包装した各サンプル-30 ℃で急速凍結し、28時間保存後、4 ℃で緩やかに16時間かけて解凍した。冷凍処理しない群はすぐに次の操作に移った。解凍した約50 gの各サンプルに等量のPBSを加え、30秒間ストマッカー処理を行ない、等量揉み出し液を作製した。得られた揉みだし液100 μlをそれぞれCT-SMAC培地上に接種し、好気条件下で37 ℃、1日培養し、得られたEHEC様コロニーを計測し、エヴァ水による追加消毒効果を検討した（表１４）。【００８０】
結果
塩素系消毒剤含有吸液・吸湿材による追加消毒の代わりに塩素系消毒剤を添加し、真空包装を行ったところ、同様の効果が認められ、1/2から1/10程度まで菌数が低下した。【００８１】
【表１４】
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【００８２】
実施例１１  安定型複合塩素製剤による追加消毒効果
安定型複合塩素製剤であるKガードによる追加消毒の殺菌効果を検討した。
方法
胆管内にEHEC O157 1x107 cfu/mlを20 ml胆管内に注入した後、約150 mlの温湯（約85 ℃）を胆管内に高圧注入（0.2 Mpa）し洗浄し、この操作を再度繰り返した。さらに、門脈内に約50 mlの温湯（約85 ℃）を高圧注入（0.2 Mpa）し洗浄した。
次に、約500 mlのKガード（商品名、エイトノット株式会社）（200 ppm）を胆管内に高圧注入（0.2 Mpa）し消毒した。消毒後、400 ppmの塩素系消毒剤テルロンブリーチと80 %エタノールをスプレーし、肝臓表面を消毒した。その後、熱湯消毒、およびアルコール消毒した包丁もしくは外科用メスを用いて左葉から約100 cm3程度のブロックを3カ所（A〜C）切り出し、各ブロックの中心部から約50 g（4 cm x 4 cm x 3 cm）のサンプルを2か所切り出した（図９）。切り出したサンプルを無菌袋に入れ、さらに約10 mlのKガード（200 ppm）を入れ、卓上真空包装機を用いて約30秒〜1分かけて真空度約-0.1 MPa付近(約-0.07〜-0.09 MPa程度)になるまで真空にし、真空包装した。真空包装した各サンプル-30 ℃で急速凍結し、28時間保存後、4 ℃で緩やかに16時間かけて解凍した。冷凍処理しない群はすぐに次の操作に移った。解凍した約50 gの各サンプルに等量のPBSを加え、30秒間ストマッカー処理を行ない、等量揉み出し液を作製した。得られた揉みだし液100 μlをそれぞれCT-SMAC培地上に接種し、好気条件下で37 ℃、1日培養し、得られたEHEC様コロニーを計測し、Kガードによる消毒および追加消毒効果を検討した（表１５）。【００８３】
結果
安定型複合塩素製剤と呼ばれる塩素系消毒剤Kガードについても他の消毒剤と同様の効果が認められるかを検討した。結果、Kガードにも強い殺菌効果が認められた。【００８４】
【表１５】
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【００８５】
表面および内部を塩素系消毒剤で消毒し、さらに冷凍、解凍する事により、肝臓内外に存在する食中毒細菌をほぼ殺菌できる事がわかった。塩素系消毒剤によって肝臓内菌数は減少するが、菌数もさることながら、EHEC O157のコロニー形態がスムースからラフへと変化することがわかった。これは、塩素系消毒剤により殺菌されるまでには至らなくても、菌に何らかのダメージがあったと考えられる。事実、塩素系消毒剤により、大腸菌の膜表面の構造変化が変化していることが報告されている。このダメージによって、冷凍によるストレスが相乗的に作用したと考えられた。
さらに、食品、特に牛肝臓（胆汁内）には比較的高濃度（106 cfu/ml以上）の大腸菌様細菌やカンピロバクターが存在する個体がまれに認められた。高濃度の菌が存在する場合、消毒効果が減弱する可能性もある。生食やレアステーキなどのそれほど強い加熱を行わない調理法に利用する食材においては、何らかの方法で食材に存在する菌数をモニタリングする必要があると思われる。肝臓の場合、胆汁内の菌数を直接培養、PCR等で菌数をモニタリングするのが最適であると考えられた。
また、本発明の方法に沿って消毒、冷凍、解凍した食材は味覚等に何の影響も見られなかったうえに、食材の欠点である臭み、くせ等の減弱が見られ、むしろ味や風味が向上することから、本発明は食品、特に生レバー等の生食用食肉の従来の加工、流通、販売法に大きく資する発明であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明により、肝臓や胆管または血管内に存在する微生物の殺菌方法が提供された。当該方法により、カンピロバクターや病原性大腸菌などの微生物に起因にする、肝臓の生食に伴う食中毒のリスクを低減することが可能となった。本発明の方法は、食中毒のリスクが低減された食品の提供あるいは当該食品の流通の分野において有用である。
本発明の方法に従って得られる肝臓は、味覚等に何らの影響も現れなかった。従って本発明は、生食用食肉の加工、流通、販売の分野において有用である。
また日本の食文化を守るうえでも有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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