(57)【要約】  好適な培養環境を実現可能な細胞培養装置を提供する。  細胞培養装置（１）は、細胞を含む培養液を収納する円筒形状の培養槽（１０）と、培養槽内の底部（１２）の内面の中央から直立する支柱（２０）と、支柱の上部分に支柱に対して回転可能に取り付けられる取付部（３２）と、取付部にその上部が固着され支柱を回転中心として回転する撹拌翼（３４）とを有する撹拌手段（３０）とを備える。
2013187359.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む培養液を収納する円筒形状の培養槽（１０，１１０，２１０）と、
前記培養槽の底部（１２，１１２，２１２）の内面の中央から直立する支柱（２０，１２０，２２０，３２０）と、
前記支柱の上部分（２４，１２４，３２４）に当該支柱に対して回転可能に取り付けられる取付部（３２，１３２）と、当該取付部にその上部が固着され当該支柱を回転中心として回転する撹拌翼（３４，１３４）とを有する撹拌手段（３０，１３０，２３０）と、
を備える、細胞培養装置（１，１０１，２０１，３０１）。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養装置において、
前記支柱は、前記底部の内面からの立ち上がり部分が当該底部の内面に向かう方向に拡径の円錐状に形成された円錐状部分（２２，１２２）を有し、
前記支柱の前記上部分が培養液の液面より上にある、細胞培養装置。
【請求項３】
請求項２に記載の細胞培養装置において、
前記撹拌手段の前記撹拌翼は、当該撹拌手段が回転するとき、当該撹拌翼の下部が前記支柱の前記円錐状部分の外面に沿うような形状に形成されている、細胞培養装置。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の細胞培養装置において、
前記撹拌手段の前記撹拌翼は、当該撹拌手段が回転するとき、当該撹拌翼が前記培養槽内の前記底部の内面に沿うような形状に形成されている、細胞培養装置。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の細胞培養装置において、
前記撹拌手段の前記撹拌翼は、当該撹拌手段が回転するとき、当該撹拌翼が前記培養槽の内側面（１４，１１４）に沿うような形状に形成されている、細胞培養装置。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載の細胞培養装置において、
培養液に直接接触することなく前記撹拌手段の前記撹拌翼を回転させる駆動手段（５０；５２，１５０；１５４，２５０；２５２）を更に備える、細胞培養装置。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞培養装置において、
前記撹拌手段の撹拌翼は、下端に固着される磁力体（３６）を有し、
前記培養槽の下に配置される前記駆動手段（５０）は、当該培養槽の底部を介して前記磁力体に対向する位置で水平に回転する別の磁力体である駆動手段（５２）を備え、
前記別の磁力体が駆動回転することで前記撹拌翼が水平に回転する、細胞培養装置。
【請求項８】
請求項６に記載の細胞培養装置において、
前記駆動手段は、前記培養槽の下に配置され、
前記駆動手段の駆動軸（１５４）は、前記支柱の内部を貫通して当該支柱の前記上部分まで延び、当該上部分にて前記撹拌手段の前記撹拌翼に取り付けられる、細胞培養装置。
【請求項９】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の細胞培養装置において、
前記支柱は、培養液の温度を計測する温度センサ（２８０）の感温部（２４０）が前記培養槽の前記底部の外面側から当該支柱の内部に挿入される孔（２２０ａ）を有する、細胞培養装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞培養装置において、
前記温度センサの感温部を更に備える、細胞培養装置。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の細胞培養装置において、
前記温度センサの感温部は、前記培養槽（２１０）の前記底部（２１２）の外面から２０乃至３０ｍｍだけ離れて配置される、細胞培養装置。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の細胞培養装置を用い、
前記培養槽内に培地とともに細胞凝集塊を形成する細胞を播種する第１工程と、
細胞凝集塊が前記培養槽の前記底部の内面上に沈殿せず、かつ、当該細胞凝集塊が崩壊しない速度で前記撹拌手段を回転して培養する第２工程と、
を含み、均一な粒径の細胞凝集塊を維持しながら培養する、細胞培養方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の細胞培養方法において、
細胞凝集塊を形成する細胞が多能性幹細胞であり、
前記培地に体細胞へ分化誘導する因子を添加して培養する第３工程を更に含み、多能性幹細胞から体細胞へ分化誘導する、細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創薬、薬学、医学、生物等の分野において有用な細胞培養装置及びそれを用いる細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞は生体のあらゆる組織・臓器の細胞へと分化し得ることから、近年、研究開発が盛んに行われている。これらの多能性幹細胞は、細胞治療の新たな細胞供給源となり得ることから、臨床応用への期待が高まっている。しかし、多能性幹細胞はあらゆる組織の細胞への分化能を有しているがために、未分化な状態を維持しつつ、大量に増幅培養させることが難しく、従来の培養法とは異なる培養法が必要である。【０００３】
多能性幹細胞の未分化状態を維持しつつ増幅培養させる方法として、胚様体（embryoid body：ＥＢ）と呼ばれる細胞凝集塊を形成させて培養する方法が知られている。これは、脊椎動物が受精後、卵割を繰り返して形成する胚を模倣するよう、細胞の塊を形成させる培養方法である。胚様体を形成させることにより、胚の発生を模倣し、各種の成長因子等を添加することで任意の細胞へと分化誘導することが可能となる。【０００４】
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を分化誘導するには、胚様体形成の過程を経る必要がある。胚様体の形成には様々な手法がある（非特許文献１参照）。例えば、細胞に対して低接着性の培養皿を用いる方法や、ハンギングドロップ法と呼ばれる培養皿の蓋に細胞を含む培養液を付着させる方法や、浮遊撹拌培養する方法などが挙げられる。浮遊撹拌による３次元培養は、工程の制御が可能で、且つ、スケールアップに適している。一方、特にヒト由来のＥＳ／ｉＰＳ細胞は、シェアストレスに対して非常に敏感であるため、浮遊撹拌培養において低シェアストレスの撹拌手段が求められる。そのために、例えば、撹拌翼の翼面積を小さくする、撹拌時の翼の先端速度を抑える、などの手段がとられる。胚様体形成では、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞は未分化性を維持しながら胚様体内で増殖し、胚様体の比重が増すので、このような手段を画一的に採用すると、不均一な培養になり目的とする細胞を高収率で得られない。その主な原因として、培養槽内の液流が不均一な箇所に胚様体が凝集し、さらに比重が増すことにより浮遊撹拌自体が成り立たなくなることが挙げられる。【０００５】
また、粒径があまりにも大きくなった胚様体は、胚様体内部の細胞が虚血（低栄養、低酸素）状態に陥り細胞死を助長するし、培地中に添加した分化誘導因子の内部への均一な到達（拡散）にも支障を来す。胚様体などの細胞凝集塊において、中心部まで良好に酸素や栄養分を供給させ、かつ、任意の細胞に分化するには、直径２００μｍ前後が好ましいといわれている。従って、胚様体などの細胞凝集塊から任意の細胞への分化誘導には、胚様体形成過程で１００〜３００μｍの均一な粒径の細胞凝集塊（胚様体など）の集団を得、これを培養することが重要である（非特許文献２参照）。不均一な粒径の細胞凝集塊が形成された場合には、任意の細胞へ分化させるに際し、添加する栄養、酸素、分化誘導因子等を細胞凝集塊内部に浸透させることができず、細胞生育と分化誘導とを阻害してしまう。【０００６】
液流の観点からの培養方法としては、従来、撹拌軸に対して一定の傾斜角度で取り付けられた複数枚の翼からなる撹拌翼を用いて撹拌軸に対して鉛直な流れを作り出す方法（軸流培養）（非特許文献３参照）や、培養槽の底部の内面に対して垂直に立てた数枚の大型パドルや先端が太くなったバルブ形状の撹拌軸を回転することにより水平方向（上からみるとドーナツ状）の流れをつくる方法（層流培養）などが一般的であった。ここで、図４に、撹拌軸に対して一定の傾斜角度で取り付けられた複数枚の翼からなる撹拌翼を備えた細胞培養装置の一例としてのパドル型撹拌翼を備えた細胞培養装置の概略断面図を示し、また、図３に、先端が太くなったバルブ形状の撹拌軸を回転することにより水平方向の流れをつくる細胞培養装置の一例としてのインテグラ社製の細胞培養装置の概略断面図を示す。いずれも後述する。【０００７】
軸流培養は、培養槽内全体を低回転で均一にかき回すために、多枚数の撹拌翼が必要となり、回転によるシェアストレスが増大する恐れがある。また、構造上軸直下に淀みが出来やすく、細胞の増殖に伴って比重が増した細胞凝集塊（胚様体など）が沈殿して均一な粒径の細胞凝集塊が得難いという問題もある。層流培養は、乱流を起こさない程度の回転速度に設定すれば極低シェアストレスの撹拌を実現しやすいが、ドーナツ状の液流の中心部は淀みが出来やすいという問題がある。【０００８】
培養時に、培養槽内には、ｐＨ、溶存酸素（ＤＯ）、温度等を計測する各種センサを挿入するが、多能性幹細胞を数１０ｍＬから１００ｍＬ程度の小容量で培養するためには、従来型のセンサでは液量に対するセンサの排除体積が大きすぎるために均一な撹拌を妨げる恐れがある。従って、好適な培養環境を実現するためには、培養槽や撹拌翼の形状工夫だけではなく、均一撹拌の妨げにならない程度まで各種センサの形状や構造、配置を工夫する必要がある。温度センサに関しては、従来、培養槽天板から培養槽内の液面から数１０ｍｍ下に突入するさや管を配置し、さや管内に温度センサを挿入することで間接的に液温を計測していた。温度センサは、先端が閉じられたステンレス製のシース管から成るが、一般に先端部から数ｍｍの位置に温度を計測するための感温部があり、その部位には測温抵抗体等が埋め込まれている。直径３ｍｍの温度センサの場合、センサの先端部は液面から１５ｍｍ（温度センサの直径の５倍）より下に通常配置される。これより浅いと正確な温度は計測できないし深いと均一撹拌の妨げになってしまう。また、操作者が温度センサをさや管に挿入し忘れるミスにより培養液がオーバーヒートしてしまい、結果的に培養に失敗してしまうトラブルが発生している。ｐＨやＤＯセンサの場合、万が一センサコネクターの結線を忘れても値の変化が緩慢であり、すぐに気づいて対処できれば培養の失敗につながることは少ないが、温度センサの場合、測温値が培養液温なのかつけ忘れによる室温なのかが装置側では判断できないので、気づいたときには培養液温が５０℃を越えていることもある。多能性幹細胞の培養では、培地が高額であること、培養期間が長期にわたることなどから、温度センサを培養槽にセットする操作において、オペレーションミスをゼロにする対策がユーザから強く望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Sasitorn Rungarunlert et al., World J Stem Cells 1(1):11-21(2009)
【非特許文献２】Bahram Valamehr et al., PNAS 105,38(2008)
【非特許文献３】Olmer R et al., Suspension culture of human pluripotent Stem cells in controlled, stirrer bioreactors,［online］,Tissue Engineering Part C Methods.2012 Apr 20.［Epub ahead of print］［2012 May10 検索］、インターネット<URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed>
【非特許文献４】Willems et al, Circulation Research, USA, American Heart Association, July 7,2011, 109(4), p.360-364
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の問題を解決するために本発明はなされたのであって、その課題とするところは、好適な培養環境を実現することが可能な細胞培養装置を提供することにある。具体的には、細胞培養に際し、低シェアストレスで、かつ、培養槽内の液流の淀みのない、特に、底部中心近傍に淀みのない層流培養を可能とし、もって均一な粒径の細胞凝集塊（胚様体など）の集団を、簡便に、且つ、再現性良く得ることが可能な細胞培養装置を提供することにある。また、任意の細胞への分化誘導効率が高い細胞凝集塊（胚様体など）の集団を得ることが可能な細胞培養装置を提供することにある。更に、均一撹拌の妨げることなく培養液の温度を計測することが可能な温度センサを備えた細胞培養装置を提供することにある。【００１１】
そしてまた、本発明に係る細胞培養装置を用いて、簡便に、且つ、再現性良く、均一な粒径の細胞凝集塊の集団を得る細胞培養方法、更には、多能性幹細胞から体細胞への分化誘導効率が高い細胞培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
以下、本発明について上記課題を解決するための手段を説明する。尚、本発明の理解を容易にするために添付図面の参照符号を括弧書きにて付記するが、それにより本発明が図示の形態に限定されるものではない。【００１３】
上記課題を解決するために、本発明に係る細胞培養装置（１，１０１，２０１，３０１）は、細胞を含む培養液を収納する円筒形状の培養槽（１０，１１０，２１０）と、培養槽の底部（１２，１１２，２１２）の内面の中央から直立する支柱（２０，１２０，２２０，３２０）と、支柱の上部分（２４，１２４，３２４）に支柱に対して回転可能に取り付けられる取付部（３２，１３２）と、取付部にその上部が固着され支柱を回転中心として回転する撹拌翼（３４，１３４）とを有する撹拌手段（３０，１３０，２３０）とを備える。【００１４】
また、支柱は、底部の内面からの立ち上がり部分が底部の内面に向かう方向に拡径の円錐状に形成された円錐状部分（２２，１２２）を有し、支柱の上部分が培養液の液面より上にあることを特徴とすれば、培養液の回転による底部中心近傍が円錐状部分で占められている（この円錐状部分は、スペーサーとして機能する。）ので、底部中心近傍で液流の淀みが生じる余地がなく、従って、細胞凝集塊（胚様体など）の体積の増加に伴う底部中心近傍への沈殿を防ぐことができる。また、支柱の上部分とこれに回転可能に取り付けられる取付部（３２、１３２）との摺動部分に細胞凝集塊が実質的に入り込むことはなく、強いせん断力による細胞凝集塊の物理的な破壊や細胞死を防ぐことができる。【００１５】
更に、撹拌手段の撹拌翼は、撹拌手段が回転するとき、撹拌翼の下部が支柱の円錐状部分の外面に沿うような形状に形成されていることを特徴とすれば、円錐状部分に細胞凝集塊が沈殿するのをより確実に防止することができる。【００１６】
更にまた、撹拌手段の撹拌翼は、撹拌手段が回転するとき、撹拌翼が培養槽内の底部の内面に沿うような形状に形成されていることを特徴とすれば、底部の内面に細胞凝集塊が沈殿するのを防止することができる。【００１７】
更にまた、撹拌手段の撹拌翼は、撹拌手段が回転するとき、撹拌翼が培養槽の内側面（１４，１１４）に沿うような形状に形成されていることを特徴とすれば、均一な層流とすることができ、沈降しやすい細胞凝集塊の沈降を防止できる。【００１８】
すなわち、理想的な層流は、液層の縦断面に対してどの位置も同じ流速であることから、撹拌翼が培養槽の内側面に沿うような形状とするのが好ましい。【００１９】
更にまた、培養液に直接接触することなく撹拌手段の撹拌翼を回転させる駆動手段（５０；５２，１５０；１５４，２５０；２５２）を更に備えることを特徴とすれば、培養液を汚染の恐れなく撹拌することができる。【００２０】
更にまた、撹拌手段の撹拌翼は、下端に固着される磁力体（３６）を有し、培養槽の下に配置される駆動手段（５０）は、培養槽の底部を介して磁力体に対向する位置で水平に回転する別の磁力体である駆動手段（５２）を備え、別の磁力体が駆動回転することで撹拌翼が水平に回転することを特徴とすれば、別の磁力体が水平に駆動回転することで底部を介しての上下２磁力体による磁力吸引作用により、培養槽外から培養槽内の撹拌翼を水平に回転させることができる。【００２１】
なお、この上下２磁力体は、両者とも永久磁石であるときには、異磁極が対向するように配置される。【００２２】
更にまた、駆動手段は、培養槽の下に配置され、駆動手段の駆動軸（１５４）は、支柱の内部を貫通して支柱の上部分まで延び、上部分にて撹拌手段の撹拌翼に取り付けられることを特徴とすれば、駆動手段の回転力を撹拌翼に直接伝達できる。【００２３】
更にまた、支柱は、培養液の温度を計測する温度センサ（２８０）の感温部（２４０）が培養槽の底部の外面側から支柱の内部に挿入される孔（２２０ａ）を有することを特徴とすれば、均一撹拌の妨げることなく培養液の温度を計測する温度センサの感温部を孔内、すなわち培養槽内の培養液の温度を計測できる適正な位置に配置することができる。【００２４】
更にまた、温度センサの感温部を更に備えることを特徴とすれば、支柱の孔に予め挿入された温度センサの感温部により培養液の温度を計測することができる。【００２５】
更にまた、温度センサの感温部は、培養槽（２１０）の底部の外面（２１２）から２０乃至３０ｍｍだけ離れて配置されることを特徴とすれば、外部からの影響を排除して培養液の温度を計測することができる。【００２６】
更にまた、本発明に係る細胞培養装置を用い、培養槽内に培地とともに細胞凝集塊を形成する細胞を播種する第１工程と、細胞凝集塊が培養槽の底部の内面上に沈殿せず、かつ、細胞凝集塊が崩壊しない速度で撹拌手段を回転して培養する第２工程とを含み、均一な粒径の細胞凝集塊を維持しながら培養する細胞培養方法によれば、簡便に、且つ、再現性良く、均一な粒径の細胞凝集塊の集団を得ることができる。【００２７】
更にまた、細胞凝集塊を形成する細胞が多能性幹細胞であり、培地に体細胞へ分化誘導する因子を添加して培養する第３工程を更に含み、多能性幹細胞から体細胞へ分化誘導する細胞培養方法によれば、簡便に、且つ、再現性良く、均一な粒子の細胞凝集塊の集団を得ることでき、更に、多能性幹細胞から体細胞への分化誘導の効率を高くすることができる。
【発明の効果】
【００２８】
以上の構成を備えた本発明によれば、好適な培養環境を実現可能な細胞培養装置を提供することができる。具体的には、細胞培養に際し、低シェアストレスで、かつ、培養槽内の液流の淀みのない、特に、底部中心近傍に淀みのない層流培養を可能とし、もって均一な粒径の細胞凝集塊（胚様体など）の集団を、簡便に、且つ、再現性良く得ることが可能な細胞培養装置を提供できる。また、任意の細胞への分化誘導効率が高い細胞凝集塊（胚様体など）の集団を得ることが可能な細胞培養装置を提供できる。更に、均一撹拌の妨げることなく培養液の温度を計測することが可能な温度センサを備えた細胞培養装置を提供することができる。【００２９】
そしてまた、本発明に係る細胞培養装置を用いて、簡便に、且つ、再現性良く、均一な粒径の細胞凝集塊の集団を得る細胞培養方法、更には、多能性幹細胞から体細胞への分化誘導効率が高い細胞培養方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】第１実施形態に係る細胞培養装置の全体を示す断面図である。
【図２】第２実施形態に係る細胞培養装置の全体を示す断面図である。
【図３】先端が太くなったバルブ形状の撹拌軸を回転することにより水平方向の流れをつくる細胞培養装置の一例としてのインテグラ社製の細胞培養装置の概略断面図である。
【図４】撹拌軸に対して一定の傾斜角度で取り付けられた複数枚の翼からなる撹拌翼を備えた細胞培養装置の一例としてのパドル型撹拌翼を備えた細胞培養装置の概略断面図である。
【図５】実験例１で行った、撹拌翼の相違によるヒトｉＰＳ細胞胚様体形態の経時変化を示す図である。なお比較例と本発明の図は、同一倍率のものである。
【図６】（Ａ）実験例２で行った、撹拌翼の相違によるヒトｉＰＳ細胞胚様体形態の経時変化を示す図である。（Ｂ）実験例２で行った、撹拌翼の相違によるヒトｉＰＳ細胞の細胞数の経時変化を示す図である。
【図７】実験例３で行った、ｉＰＳ細胞から心筋細胞へ分化誘導させる培養手順を示す図である。
【図８】実験例３で行った、ｉＰＳ細胞から心筋細胞へ分化した細胞の割合を示すフローサイトメーターの図である。
【図９】第３実施形態に係る細胞培養装置の全体を示す断面図である。
【図１０】第４実施形態に係る細胞培養装置の全体を示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（第１実施形態）
本発明を実施するための形態を、図面を参照しつつ、以下に説明する。図１は、第１実施形態に係る細胞培養装置１の全体を示す断面図である。細胞培養装置１は、円筒形状の培養槽１０と、培養槽１０内に直立して固定された支柱２０と、支柱２０に回転可能に取り付けられた撹拌手段３０とを有して構成される。また、培養槽１０は、培養液内に浸かって培養液の状態を計測する計測手段の一例としてのｐＨセンサ４０を備えている。更に、細胞培養装置１は、培養槽１０の下に、撹拌手段３０の撹拌翼３４（下端に磁力体（永久磁石等）３６が固着されている。後述）を回転させる駆動手段の一例としての駆動モータ５０及び別の磁力体（永久磁石等）である駆動手段５２を備えている。
【００３２】
なお、上記のごとく、上下の両磁力体が永久磁石のときには、異磁極が対向するように配置される。
【００３３】
培養槽１０には、細胞を含む培養液が入れられている。培養槽１０は、培養液成分に不活性で細胞毒性を有さず、且つ、滅菌（除染、除菌又は無菌ともいう。）処理に対して耐性を有する材料で形成されることが好ましく、例えばガラス、合成樹脂、ステンレス鋼などが挙げられる。ここで、培養槽１０の内容量、形状などは培養液の量に応じて適宜決定される。培養槽１０の内容量（全容量）としては特に限定されないが、例えば２０ｍｌ乃至１０００ｍｌ等が挙げられる。撹拌と通気の効率の観点から、培養槽１０の形状は、所望量の培養液を投入した際に、培養槽内の直径と液深とが１：１の関係となり、内容量に対して培養液の所定量が半分程度となるように設計するのが好ましい。
【００３４】
支柱２０は、培養槽１０内の底部１２の内面の中央に直立して固定されている。支柱２０は、培養液に不活性で、且つ、耐性を有する材料で形成されることが好ましく、例えば合成樹脂、ステンレス鋼等が挙げられる。支柱２０は、培養槽１０内の底部１２の内面への固定部が下方向に拡径の円錐状に形成された円錐状部分２２を有しており、培養液の回転による底部中心近傍の液流の淀みは、その部分が円錐状部分２２で占められていることから生じる余地もなく、従って、細胞増殖に伴って比重が増大した細胞凝集塊の沈殿はない。
【００３５】
なお、図１において、支柱２０を培養槽１０内の底部１２の内面の中央に直立して固定する方法としては、特に制限されないが、同図に示すごとく、培養槽１０と支柱２０とが別体の場合には、Ｏリング２２ａを介してビス２２ｂで螺着固定したり、耐熱性接着剤（例えば、シリコンゴム系接着剤）等で接着固定したり（図示省略）等することができ、また、培養槽１０と支柱２０とを一体成型することもできる。
【００３６】
支柱２０の上部分２４は、培養液の液面より上にあり、撹拌手段３０が回転可能に取り付けられている。
【００３７】
なお、支柱２０において、円錐状部分２２の上部から上部分２４までの部分の太さ等については特に制限はされないが、支柱２０の強度を確保する観点から、下部を太くして上方向に徐々に縮径とするのが好ましい。
【００３８】
撹拌手段３０は、支柱２０の上部分２４に支柱２０に対して回転可能に取り付けられた取付部３２と、取付部３２にその上部が固着され支柱２０を回転中心として培養槽１０内を回転する撹拌翼３４とを有している。取付部３２は、培養液に不活性で、且つ、耐性を有する材料で形成されることが好ましく、例えば合成樹脂、ステンレス鋼などが挙げられる。撹拌翼３４も、培養液に不活性で、且つ、耐性を有する板材で形成されることが好ましく、例えば薄板状の合成樹脂、ステンレス鋼（例えば１ｍｍ厚のＳＵＳ３１６）などが挙げられる。撹拌手段３０の撹拌翼３４は、培養槽１０の内壁方向の下端にテトラフルオロエチレン等で被覆の磁力体（永久磁石等）３６を有している。この磁力体３６は、撹拌翼３４の先端下部を折り曲げ加工された部分によって固定され保持されている。
【００３９】
ここで、図１には左右２枚の撹拌翼３４が示されているが、本発明はこれに限定されるものではない。撹拌翼３４の数については、撹拌手段の回転数にもよるが、支柱２０を中心に等間隔に備えるのが、撹拌時における撹拌翼３４のバランスから好ましく、例えば２〜４枚が好適である。
【００４０】
撹拌手段３０の撹拌翼３４は、支柱２０の円錐状部分２２との間の隙間が小さくなるように形成され、撹拌手段３０が回転するとき、撹拌翼３４は円錐状部分２２の外面（表面）に沿う。これにより、円錐状部分２２付近の培養液を回転させて、培養液中に細胞を浮遊させ、円錐状部分２２の近傍に細胞凝集塊が沈殿するのをより確実に防止することができる。また、撹拌翼３４は、培養槽１０内の底部１２の内面との間の隙間が小さくなるように形成され、撹拌手段３０が回転するとき、撹拌翼３４は底部１２の内面に沿う。これにより、底部１２の内面付近の培養液を撹拌して細胞と細胞凝集塊が培養液中を継続的に浮遊させ、底部１２の内面に沈殿するのを防止する。更に、撹拌翼３４は、培養槽１０の内側面１４との間の隙間が小さくなるように形成され、撹拌軸３０が回転するとき、撹拌翼３４は内側面１４に沿う。これにより、内側面１４付近の培養液を撹拌して均一な層流とすることができ、細胞増殖に伴って比重が増大した細胞凝集塊が沈殿するのを防止できる。なお、このとき、撹拌翼は、この内側面の少なくとも下部近傍に沿うような形状にするのが好ましい。
【００４１】
また、攪拌翼３４は、その支柱２０に向き合う部分と支柱２０との間の間隙が小さくなるように形成されるのが好ましく、この場合、撹拌手段３０が回転するとき、攪拌翼３４は支柱２０の外面に沿う。これにより支柱２０付近の均一な液流を確保し培養液全体の液流をより均一にすることができる。
【００４２】
駆動モータ（駆動手段）５０及び別の磁力体（永久磁石）（駆動手段）５２が、培養槽１０の外側下方に配置されている。駆動モータ５０は、回転軸が支柱２０と同軸となるように配置されている。別の磁力体５２は、培養槽１０の底部を介して撹拌翼３４の下端に取り付けられた磁力体３６と対向する位置になるように、また、駆動モータ５０で水平回転されるように取り付けられている。駆動モータ５０によって別の磁力体５２が水平に駆動回転するとき、別の磁力体５２の磁力と撹拌翼３４の下端の磁力体３６の磁力とによって撹拌手段３０の撹拌翼３４が支柱２０周りに回転する。ここで、駆動モータ５０は、回転速度の制御が可能な例えばサーボモータが好ましい。
【００４３】
なお、培養槽１０の内外に配置された磁力体３６、別の磁力体５２として永久磁石を用いる場合には、互いに吸引するように異磁極（Ｎ極、Ｓ極）を対向させて配置すればよい。
【００４４】
また、細胞培養時の撹拌手段の回転数は、特に制限されず、低シェアストレス、細胞凝集塊の沈殿防止等が確保される回転数が適宜選択して採用され、例えば、１０〜８０ｒｐｍが好ましい。
【００４５】
ｐＨセンサ４０は、先端が培養液に浸かって培養液のｐＨを計測している。撹拌翼３４は、撹拌手段３０が回転するとき、ｐＨセンサ４０に接触しないような形状、ｐＨセンサ４０を回避する形状に形成されている。撹拌翼３４がこのような形状を有することにより、撹拌手段３０の回転を妨げない。
【００４６】
なお、必要により、培養槽の天板から各種器具等が挿入されたり、開口部に除菌用フィルターが設けられたり、理想的な層流を妨げないように配慮するため浸漬部の排除体積が極小になる光学式の各種センサーチップ（溶存酸素濃度測定等）が槽内に設けられたりする。
【００４７】
（第２実施形態）
次に、図２は、第２実施形態に係る細胞培養装置１０１の全体を示す断面図である。図１に示す第１実施形態に係る細胞培養装置１と類似の構成要素は、類似の参照符号を付すことで説明を省略する。細胞培養装置１０１は、培養槽１１０と、支柱１２０と、撹拌手段１３０とを有して構成される。また、細胞培養装置１０１は、駆動手段の一例としての駆動モータ１５０及び駆動軸１５４を備えている。図２に示す第２実施形態に係る細胞培養装置１０１は、培養槽１１０の下に配置された駆動モータ１５０の駆動軸１５４が、支柱１２０の内部を貫通して上部分１２４まで延び、撹拌翼１３４に直接取り付けられている点で、磁力を介して回転力を伝達している図１に示された細胞培養装置１と相違する。また、ｐＨセンサを有していない点で、図１に示された細胞培養装置１と相違する。
【００４８】
支柱１２０は、培養槽１１０内の底部１１２の内面の中央に直立して固定されている。支柱１２０は、下部に円錐状部分１２２を有している。撹拌手段１３０は、支柱１２０の上部分１２４に回転可能に取り付けられた取付部１３２と、撹拌翼１３４とを備えている。
【００４９】
なお、図２において、撹拌翼１３４の形状は、下部が広く上部が狭いものであるが、撹拌翼１３４の培養槽の内面方向の形状については、特に制限されず、培養槽の天板から内部への挿入器具等がなければ、例えば、下部と上部が同一幅等であってもよい。
【００５０】
また、細胞培養装置１０１では、駆動軸１５４が支柱１２０の上部分１２４で撹拌翼１３４に直接取り付けられているので、駆動モータ１５０の回転力を撹拌翼１３４に直接伝達できる。
【００５１】
なお、撹拌手段の駆動手段が図２に示したものと異なって、培養槽の上方からの駆動軸を撹拌手段の取り付け部の近傍に連結し、撹拌手段を回転させるようにしてもよい。
【００５２】
（第３実施形態）
次に、図９は、第３実施形態に係る細胞培養装置２０１の全体を示す断面図である。図１に示す第１実施形態に係る細胞培養装置１と類似の構成要素は、類似の参照符号を付すことで説明を省略する。細胞培養装置２０１は、円筒形状の培養槽２１０と、培養槽２１０内に直立して固定された支柱２２０と、支柱２２０に回転可能に取り付けられた撹拌手段２３０とを有して構成される。また、細胞培養装置２０１は、透磁性材料で構成された支持台２７０の上に設置されている。支持台２７０の下には、駆動手段の一例としての駆動モータ２５０及び駆動手段２５２が配置されている。ここで、第３実施形態では、培養槽２１０と支柱２２０とが一体として構成されている。
【００５３】
更に、図９に示す第３実施形態に係る細胞培養装置２０１は、培養槽２１０の底部２１２の外面側から支柱２２０の内部に、温度センサ２８０のシース管（金属保護管）２６０が挿入される孔２２０ａが穿かれている点で、図１に示された細胞培養装置１と相違する。シース管２６０は、支持台２７０に適宜の固定部材２７０ａ等により直立して固定されている。
【００５４】
なお、温度センサ２８０としては、一般に、先端封止のシース管２６０の先端部分に温度を感知する感温部(測温体)２４０が内蔵されているものが使用される。
【００５５】
シース管２６０が挿入される孔２２０ａの内径、シース管２６０の太さ等は特に制限されず、適宜選択決定される。孔２２０ａの内径は挿入されるシース管２６０の先端部分に感温部２４０を内蔵）の外径によって適宜に調整されるが、シース管２６０の挿入の際に抵抗がない適度な隙間は必要であることから、孔２２０ａの内周とシース管２６０の外周との間には０．１ｍｍ程度の隙間があるのが望ましい。過度な隙間は計測誤差の原因ともなり得る。また、上記のような隙間を設けることにより、シース管２６０が孔２２０ａに対して着脱自在にともなる。
【００５６】
ここで、支柱２２０に形成される孔２２０ａは、内径が例えば３．２ｍｍである。そして、孔２２０ａに挿入されるシース管２６０は、例えば外径が３．０ｍｍのステンレス管で構成される。そして、前記のごとく、先端封止のシース管２６０の先端部分には、その内部に、培養液の温度を計測する手段の一例としての温度センサ２８０の感温部２４０が挿入、配置されている。温度センサ２８０の感温部２４０としては、例えば種々の測温抵抗体、熱電対等が挙げられる。培養槽２１０が支持台２７０上の所定位置に配置されて、温度センサ２８０の感温部２４０は、培養槽２１０の底部の外面側から支柱２２０の孔２２０ａに挿入される。より具体的には、その先端部分に感温部２４０を内蔵するシース管２６０が支柱２２０の孔２２０ａに挿入される。このとき、温度センサ２８０の感温部２４０は、培養槽２１０の底部２１２の内面から、例えば２０乃至３０ｍｍだけ離れて配置されるが、これに限定されることなく、支柱２２０の外径、形状、シース管２６０の太さ等により適宜選択される。かかる構成を有することで、第３実施形態に係る細胞培養装置２０１では、外部の影響を受けることなく培養液の液温を適切に測定できる位置に、温度センサ２８０の感温部２４０が配置されるので、培養時の温度を監視することができる。尚、温度センサ２８０の感温部２４０は、培養槽２１０の底部２１２の外面側から、支持台２７０を介することなく、直接取り付けることも可能である（図示省略）。
【００５７】
培養液の温度の計測時おいて、温度センサ２８０のシース管２６０に内蔵の感温部２４０からの電気信号は、リード線を介して温度計測装置（図示省略）に送られ、温度として表示、記録等される。
【００５８】
なお、温度センサ２８０は、公知のものであり、例えば市販品等が有効に使用される。
【００５９】
（第４実施形態）
次に、図１０は、第４実施形態に係る細胞培養装置３０１の全体を示す断面図である。図９に示された第３実施形態に係る細胞培養装置２０１では、支柱２２０は下部が太く上方向に徐々に縮径とする形状を有しているのに対して、図１０に示す第４実施形態に係る細胞培養装置３０１では、支柱３２０は軸方向に同一の外径を有して形成されている点で相違する。また、細胞培養装置３０１では、支柱３２０の上部分３２４が培養液の液面より下にある点でも、細胞培養装置２０１と相違する。かかる構成の細胞培養装置３０１も培養時の温度を監視することができる。
【００６０】
本発明の細胞培養装置で培養する細胞は限定されるものではなく、例えば、動物、昆虫、植物等の細胞、糸状菌や放線菌等の糸状の微生物等が挙げられる。この中で、動物細胞は市販されているものが多く好都合である。動物細胞の由来として、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、ヌードマウス、マウス、モルモット、ブタ、ヒツジ、チャイニーズハムスター、ウシ、マーモセット、アフリカミドリザル等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００６１】
本発明の細胞培養装置を用いて培養する細胞の種類は特に限定されないが、シェアストレスが増殖又は成育に影響を与えるような細胞種の培養に用いると、本発明の効果が発揮され、好ましい。例えば、多能性幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞など）、神経幹細胞等の幹細胞などの培養が挙げられる。これらの細胞は細胞凝集塊を形成することで、未分化性を維持しながら増殖する。シェアストレスに対する感受性が高い細胞であれば、適宜採用することが可能であり、特に限定されない。また、幹細胞を未分化の状態を維持して増殖させつつ、他の組織の細胞に分化誘導することも可能である。
【００６２】
なお、本発明の細胞培養装置は、使い捨てとすることもできる。
【００６３】
また、本発明の細胞培養装置を用いる細胞培養方法は、培養槽内に培地とともに細胞凝集塊を形成する細胞を播種する第１工程、及び細胞凝集塊が培養槽の底部に沈殿せず、かつ、細胞凝集塊が崩壊しない速度で撹拌手段を回転して培養する第２工程を含むものであり、簡便に、且つ、再現性良く、均一な粒径の細胞凝集塊の集団を得ることができる。
【００６４】
そして、本発明の細胞培養装置を用いるこの細胞培養方法に関しては、下記実験例に詳細に記載されている。この第１工程については、例えば、実験例１における「（使用した細胞・培地・試薬）」、「（細胞培養装置を利用した培養方法）」等の欄に、また、この第２工程については、例えば、同実験例の「（細胞培養装置によるｉＰＳ細胞の増幅培養）」等の欄に、その培養結果については、同実験例の「（結果）」の欄にそれぞれ記載されている。更に、実験例２においても、これらのことが記載されている。
【００６５】
更にまた、本発明の細胞培養装置を用いる細胞培養方法は、細胞凝集塊を形成する細胞が多能性幹細胞であり、第１工程及び第２工程に第３工程として培地に体細胞へ分化誘導する因子を添加して培養する工程を更に含む、多能性幹細胞から体細胞へ分化誘導するものであり、簡便に、且つ、再現性良く、均一な粒径の細胞凝集塊の集団を得ることができ、更に、多能性幹細胞から体細胞への分化誘導効率が高い。
【００６６】
そして、本発明の細胞培養装置を用いて多能性幹細胞から体細胞への分化誘導をするこの細胞培養方法に関しては、下記実験例に詳細に記載されている。この第１工程及び第２工程については、例えば、実験例３における「（使用した細胞・培地・試薬）」、「（ｉＰＳ細胞の胚様体形成過程）」等の欄に、また、第３工程については、例えば、同実験例の「（ｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化誘導過程）」等の欄に、その培養結果については、同実験例の「（結果）」の欄にそれぞれ記載されている。更に、実験例４においてもこれらのことが記載されている。
【実施例】
【００６７】
以下に、本発明を利用した細胞の培養・増幅方法について、実験例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。【００６８】
［実験例１］
本発明の細胞培養装置を用い、ヒトｉＰＳ細胞を培養し増幅させた。以下にその実験例を示す。【００６９】
（使用した細胞・培地・試薬）
細胞：マウス胚線維芽細胞（リプロセル社）、ヒトｉＰＳ細胞  201B7株、及び253G1株        【００７０】
（理化学研究所）
培地：霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（商品名：Primate ES Cell Medium、リプロセル社）
試薬：組み換えヒト線維芽細胞塩基性増殖因子（一般名：bFGF、リプロセル社）、ＥＳ／ｉＰＳ細胞剥離液（商品名：CTK溶液、リプロセル社）、りん酸緩衝生理食塩水（ライフテクノロジーズ社）、細胞培養分散溶液（商品名：AccuMax、ミリポア社）、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞維持用無血清培地（商品名：mTeSR1、ステムセルテクノロジーズ社）、Y-27632（化合物一般名称、カルビオケム社）【００７１】
（細胞培養装置を利用した培養方法）
本発明に係る細胞培養装置で培養するｉＰＳ細胞を準備する方法として、以下に示す（１）細胞凝集塊での播種、（２）単一細胞浮遊液での播種、等の方法が挙げられる。本発明に係る細胞培養装置で培養する細胞を準備する際、（１）または（２）の方法に限定するものではなく、適宜、増幅させる細胞の種類や状態等に応じて公知の方法を利用しても良い。
（１）細胞凝集塊での播種
マウス胚線維芽細胞上で培養されたヒトｉＰＳ細胞（１０ｃｍ  培養皿  １０枚分）を用意した。ヒトｉＰＳ細胞は１０ｃｍの細胞培養皿内で組み換えヒト線維芽細胞塩基性増殖因子（１０ｎｇ／ｍｌ）入りの霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（Primate ES Cell Medium）で培養した。培地を吸引除去し、各培養皿にりん酸緩衝生理食塩水１０ｍＬを添加し、すぐに吸引除去した。その後、ＥＳ／ｉＰＳ細胞剥離液（CTK溶液）を各培養皿に０．５ｍＬ添加し、３７℃のＣＯ2インキュベーターで１０分間静置した。ＥＳ／ｉＰＳ細胞剥離液（CTK溶液）を吸引除去し、組み換えヒト線維芽細胞塩基性増殖因子（１０ｎｇ／ｍＬ）入りの霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（Primate ES Cell Medium）を各培養皿に４ｍＬ添加し、ピペッティングにより、培養皿上より細胞凝集塊を回収し、５０ｍＬのコニカルチューブに移した。その後、１９０Ｇで３分間、室温で遠心分離し、上清を吸引除去し、１００ｍＬのヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞維持用無血清培地（mTeSR1）で再懸濁した。Y27632を１０μＭ添加し、本発明にかかる全容量２５０ｍＬのベッセル（培養槽）に培養液量１００ｍＬを播種した。尚、培養条件は公知の方法に従えばよく、何ら限定するものではない。
（２）単一細胞浮遊液での播種
（１）の方法で調整した細胞凝集塊を１９０Ｇで３分間、室温で遠心分離し、上清を吸引除去し、りん酸緩衝生理食塩水を添加（添加量は、１０ｃｍ  培養皿  １枚分に対し４ｍＬ）し、再混濁した。再び１９０Ｇで３分間、室温で遠心分離し、りん酸緩衝生理食塩水を吸引除去し、細胞培養分散溶液（AcuuMax）を添加（添加量は、１０ｃｍ  培養皿  １枚分に対し１ｍＬ）、３７℃の恒温槽で１０分間浸透培養した。ピペッティングにて十分に細胞塊をほぐしたのちに、細胞培養分散溶液（AcuuMax）と等量のmTeSR1を添加し、１９０Ｇで３分間、室温で遠心分離した。上清を吸引除去し、１０ｍＬのヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞維持用無血清培地（mTeSR1）で再懸濁し、細胞数を計測した。２×１０7個分を分取し、細胞維持用無血清培地（mTeSR1）で１００ｍＬにメスアップした。Y27632を１０μＭ添加し、１００ｍＬのベッセルに播種した。【００７２】
（細胞培養装置によるｉＰＳ細胞の増幅培養）
上記の方法で準備したｉＰＳ細胞を、本発明に係る細胞培養装置と比較例としてのインテグラ社製の細胞培養装置（背景技術の欄で層流培養として説明した「先端が太くなったバルブ形状の撹拌軸を回転することにより水平方向の流れをつくる」細胞培養装置）（図３参照）とで培養し比較した。【００７３】
なお、上記インテグラ社製の細胞培養装置のベッセルの全容量は上記本発明の場合と同様であり、また、播種量も同様とした。そして、両者とも、５％ＣＯ2の３７℃インキュベーター内で４０ｒｐｍの条件で培養した。培地交換は２４時間毎に全量交換した。培養開始翌日以降は、Y27632の添加は行わなかった。【００７４】
（結果）
本発明に係る細胞培養装置とインテグラ社製の細胞培養装置を用いて、ヒトｉＰＳ細胞の浮遊培養の可否を検討した。培養結果を図５に示す。図５は、撹拌翼の相違によるヒトｉＰＳ細胞胚様体形態の経時変化を示す図である。ヒトｉＰＳ細胞は、細胞凝集塊の状態で播種し、経時的な胚様体の形状を評価した。ヒトｉＰＳ細胞を細胞凝集塊の状態で、各細胞培養装置に播種したところ、本発明に係る細胞培養装置では培養開始３日目以降に均一な胚様体（１００〜３００μｍ）が数多く観察されたのに対し、インテグラ社製の細胞培養装置では胚様体は形成されるものの、図５からも明らかなように径が大きく（５００μｍ以上）、また胚様体数も顕著に少なかった。両撹拌翼とも４０ｒｐｍの回転数では、層流で低シェアストレス培養を可能にしているが、低速での撹拌故、通常は培養槽中央部に淀みが生じる。インテグラ社製の細胞培養装置では、培養槽中央部に細胞凝集塊の蓄積（沈殿）が経時的に増加することが観察されており、結果胚様体数の減少、胚様体径の拡大を認めているものと考えられる。本発明に係る細胞培養装置では、低シェアストレスの培養を可能にするとともに、培養槽中央部への細胞凝集塊の集積を予防するための機構を付加したことにより、効果的な胚様体形成、細胞の増幅が可能になったと考えられる。【００７５】
なお、前述の（１）細胞凝集塊での播種、（２）単一細胞浮遊液での播種、の何れの方法で準備したｉＰＳ細胞を用いて、本発明に係る細胞培養装置で増幅培養しても、結果に差は見られなかった。そのため、実験例２においては、（２）単一細胞浮遊液での播種を利用した方法で準備したｉＰＳ細胞を用いた。【００７６】
［実験例２］
実験例１と同様の方法に従い、本発明に係る細胞培養装置と、一般的に使用されている６枚のパドル型撹拌翼（上昇流、下降流）を備えた細胞培養装置（背景技術の欄で軸流培養として説明した「撹拌軸に対して一定の傾斜角度で取り付けられた複数枚の翼からなる撹拌翼」を備えた細胞培養装置）（図４参照）との比較も行った。本検討においては、４０ｒｐｍ、３７℃、ｐＨ  ７．２、４０％飽和酸素濃度で培養を行なった。【００７７】
比較結果を図６に示す。図６（Ａ）は、撹拌翼の相違によるヒトｉＰＳ細胞胚様体形態の経時変化を示す図である。図６（Ｂ）は、撹拌翼の相違によるヒトｉＰＳ細胞の細胞数の経時変化を示す図である。単一細胞浮遊液の状態のヒトｉＰＳ細胞を各細胞培養装置に播種したところ、本発明に係る細胞培養装置では、細胞凝集塊播種時と同様に径が均一な胚様体が形成され、また経時的な細胞数の増加も観察され、培養開始５日目には、２×１０6個／ｍＬ（２×１０8個：播種細胞数の１０倍）に達した。一方、上向きおよび下向きのパドル型撹拌翼を備えた細胞培養装置では、胚様体形成が促進されず、細胞増殖も確認されなかった。前述のように本発明に係る細胞培養装置を用いた４０ｒｐｍの撹拌では層流となるが、６パドル型撹拌翼を備えた細胞培養装置では軸流が観察される。層流に対し軸流で生じる縦横方向へのシェアストレスがヒトｉＰＳ細胞の生育には不適と考えられる。【００７８】
実験例１および実験例２において、本発明に係る細胞培養装置を用いて細胞培養を行った結果では、細胞凝集塊播種および単一細胞播種の方法のいずれにおいても、培養開始５日目の胚様体内の細胞のほとんどは、ｉＰＳ細胞の未分化マーカー遺伝子であるOCT3/4, NANOG, SOX2, TRA-1-60, SSEA-4を発現していた。またフローサイトメトリーによる解析では、約９９％がSSEA-4陽性であり、一方分化マーカーであるSSEA-1が確認されなかったことから、本発明に係る細胞培養装置によってヒトｉＰＳ細胞は、未分化状態を維持しつつ増幅したものと考えられた。【００７９】
［実験例３］
本発明に係る細胞培養装置を利用してｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化誘導を行った。【００８０】
（使用した細胞・培地・試薬）
細胞：マウス胚線維芽細胞（リプロセル社）、ヒトｉＰＳ細胞253G1（理化学研究所）
培地：霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（商品名：Primate ES Cell Medium、リプロセル社）
試薬：組み換えヒト線維芽細胞塩基性増殖因子（一般名：bFGF、リプロセル社）、ＥＳ／ｉＰＳ細胞剥離液（商品名：CTK溶液、リプロセル社）、りん酸緩衝生理食塩水（ライフテクノロジーズ社）、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞維持用無血清培地（商品名：mTeSR1、ステムセルテクノロジーズ社）、Y27632（化合物一般名、カルビオケム社）、組み換えヒトアクチビン−Ａ（アールアンドディーシステムズ社）、組み換えヒト骨形成タンパク質４（一般名：BMP-4、アールアンドディーシステムズ社）、組み換えヒト血管内皮細胞成長因子（一般名：VEGF、アールアンドディーシステムズ社）、Wntシグナル伝達経路阻害物質IWR-1（シグマアルドリッチ社）
心筋分化基本培地：以下１）−４）を含む。
１）ヒト造血幹細胞用無血清培地（商品名：ステムプロ−３４、ライフテクノロジーズ社）
２）１−チオグリセロール（最終濃度４００μＭ：シグマアルドリッチ社）
３）アスコルビン酸（最終濃度５０μｇ／ｍＬ：和光純薬工業社）
４）Ｌ−グルタミン（最終濃度２ｍＭ：ライフテクノロジーズ社）【００８１】
（ｉＰＳ細胞の胚様体形成過程）
（１）実験例１に記載したと同様にして、細胞凝集塊での播種の方法により調整した細胞凝集塊を本発明に係る細胞培養装置に播種し、培養を行った。結果を図７に示す。図７は、ｉＰＳ細胞から心筋細胞へ分化誘導させる培養手順を示す図である。尚、図７において、本発明に係る細胞培養装置に細胞を播種した時点を「Ｄ０」と表記し、以下、２４時間毎にＤ１、Ｄ２・・・と表記する。【００８２】
（ｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化誘導過程）
ｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化誘導方法としては、Willems et al, Circulation Research, USA, American Heart Association, July 7,2011, 109(4), p.360-364を参考にした（非特許文献４参照）。本発明に係る細胞培養装置で実施するに当たり、図７で示す培養スケジュールで行った。以下にその具体的な手順を説明する。【００８３】
本発明に係る細胞培養装置にて３日間培養後（図７  Ｄ３）、組み換えヒト骨形成タンパク質４（BMP-4、０．５ｎｇ／ｍＬ）を添加した１００ｍＬの心筋分化基本培地と全量交換し、本発明に係る細胞培養装置にて培養した（回転数：４０ｒｐｍ、ｐＨ：７．２、温度：３７℃、溶存酸素：４０％飽和酸素濃度、以下、同様の条件で撹拌培養を行った）。１日後（図７  Ｄ４）、組み換えヒト骨形成タンパク質４（BMP-4、１０ｎｇ／ｍＬ）、組み換えヒト線維芽細胞塩基性増殖因子（bFGF、５ｎｇ／ｍＬ）、アクチビン−Ａ（３ｎｇ／ｍＬ）を添加した１００ｍＬの分化基本培地と全量交換し、本発明に係る細胞培養装置にて培養した。３日後（図７  Ｄ７）、Wntシグナル伝達経路阻害物質IWR-1（４μＭ）を添加した１００ｍＬの分化基本培地と全量交換し、本発明に係る細胞培養装置にて培養した。２日後（Ｄ９）、組み換えヒト血管内皮細胞成長因子（VEGF、５ｎｇ／ｍＬ）、組み換えヒト線維芽細胞塩基性増殖因子（bFGF、１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した１００ｍＬの分化基本培地と全量交換し、本発明に係る細胞培養装置にて培養した。２日後（Ｄ１１）、組み換えヒト血管内皮細胞成長因子（VEGF、５ｎｇ／ｍＬ）、組み換えヒト線維芽細胞塩基性増殖因子（bFGF、０ｎｇ／ｍＬ）を添加した１００ｍＬの分化基本培地と全量交換し、本発明に係る細胞培養装置にて培養した。３日後（Ｄ１４）、血管内皮細胞成長因子（VEGF、５ｎｇ／ｍＬ）、組み換えヒト線維芽細胞塩基性増殖因子（bFGF、１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した１００ｍＬの分化基本培地と全量交換し、本発明に係る細胞培養装置にて培養した。【００８４】
（結果）
上述のように細胞維持用無血清培地（商品名：mTeSR1）を用いて３日間の胚様体形成過程の後、各種増殖因子、低分子化合物を用いて心筋分化誘導を行った。本発明に係る細胞培養装置で培養することにより、培地環境の変化にも関わらず胚様体形成が維持された。一方、比較例であるインテグラ社製の細胞培養装置では、前述の未分化培養と同様に胚様体同士の凝集および培養槽中央部への細胞凝集塊を認め、細胞培養が維持できなかった。【００８５】
本発明に係る細胞培養装置では、心筋分化１１日目には（図７  Ｄ１４）には、ほとんどすべての胚様体に自律拍動が観察された。心筋細胞のマーカーである心筋トロポニンＴに対する抗体及び血管内皮細胞のマーカーであるＣＤ３１に対する抗体を用い、フローサイトメトリーによる評価を行った。結果を図８に示す。図８は、ｉＰＳ細胞から心筋細胞へ分化した細胞の割合を示すフローサイトメーターの図であり、左図がネガティブコントロール、右図が心筋トロポニンＴ陽性細胞を検出した図である。Ｃｙ３標識抗心筋トロポニンＴ抗体を用いて心筋トロポニンＴ陽性細胞を検出した。細胞の自家蛍光を検出しているため（ＦＬ１蛍光）、右図において、ＦＬ１陰性、ＦＬ２陽性細胞を心筋トロポニンＴ陽性細胞とした。枠線で囲まれた領域に存在する細胞が心筋トロポニンＴを発現している細胞であることを示す。図８に示されているように、８０−９０％の細胞が心筋トロポニンＴ陽性の心筋細胞、５−６％がＣＤ３１陽性の血管内皮細胞であった。この細胞を温度応答性培養皿上（セルシード社製、商品名：UpCell（登録商標））に播種すると、翌日には心筋細胞の自律拍動が観察され、播種５日目には培養皿上のすべての心筋細胞が自律的かつ同期的に収縮する様子が観察され、温度降下処理により細胞シートが形成された。また細胞シート内の細胞の８０−９０％はフローサイトメトリーの結果同様、心筋トロポニンＴおよびサルコメリックアクチニン陽性であり、また明瞭な横紋構造を呈しており、成熟した心筋細胞への分化および機能的な組織が形成されていることが確認された。【００８６】
［実験例４］
本発明に係る細胞培養装置を利用してマウスＥＳ細胞から心筋細胞への分化誘導を行った。用いられる細胞がマウスＥＳ細胞である以外、実験例３と同様の方法で分化誘導を行った。その結果、実験例３と同様、均一な大きさの胚様体を得ることが出来、その結果、８０−９０％の細胞が心筋トロポニンＴ陽性の心筋細胞を得ることが出来た。本発明の効果は、ｉＰＳ細胞とＥＳ細胞の間においても差が無いことが確認された。
【符号の説明】
【００８７】
１，１０１，２０１，３０１：細胞培養装置、１０，１１０，２１０：培養槽、１２，１１２，２１２：底部、１４，１１４：内側面、２０，１２０，２２０，３２０：支柱、２２，１２２：円錐状部分、２２ａ：Ｏリング、２２ｂ：ビス、２４，１２４，３２４：上部分、３０，１３０，２３０：撹拌手段、３２，１３２：取付部、３４，１３４：撹拌翼、３６：磁力体、４０：ｐＨセンサ（計測手段）、５０，１５０，２５０：駆動モータ（駆動手段）、５２，２５２：別の磁力体（駆動手段）、１５４：駆動軸（駆動手段）、
２２０ａ：孔、２４０：感温部、２６０：シース管、２７０：支持台、２７０ａ：固定部材、２８０：温度センサ
【図１】
2013187359.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
2013187359.tif 000009
【図５】
2013187359.tif 000010
【図６】
2013187359.tif 000011
【図８】
2013187359.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成26年4月10日(2014.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む培養液を収納する円筒形状の培養槽（１０，１１０，２１０）と、
前記培養槽の底部（１２，１１２，２１２）の内面の中央から直立する支柱（２０，１２０，２２０）と、
前記支柱の上部分（２４，１２４）に当該支柱に対して回転可能に取り付けられる取付部（３２，１３２）と、当該取付部にその上部が固着され当該支柱を回転中心として回転する撹拌翼（３４，１３４）とを有する撹拌手段（３０，１３０，２３０）と、
を備え、
前記支柱は、前記底部の内面からの立ち上がり部分が当該底部の内面に向かう方向に拡径の円錐状に形成された円錐状部分（２２，１２２）を有し、
前記支柱の前記上部分が培養液の液面より上にある、細胞培養装置（１，１０１，２０１）。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
請求項１に記載の細胞培養装置において、
前記撹拌手段の前記撹拌翼は、当該撹拌手段が回転するとき、当該撹拌翼の下部が前記支柱の前記円錐状部分の外面に沿うような形状に形成されている、細胞培養装置。
【請求項４】
請求項１又は３に記載の細胞培養装置において、
前記撹拌手段の前記撹拌翼は、当該撹拌手段が回転するとき、当該撹拌翼が前記培養槽内の前記底部の内面に沿うような形状に形成されている、細胞培養装置。
【請求項５】
請求項１，３，４のいずれか１項に記載の細胞培養装置において、
前記撹拌手段の前記撹拌翼は、当該撹拌手段が回転するとき、当該撹拌翼が前記培養槽の内側面（１４，１１４）に沿うような形状に形成されている、細胞培養装置。
【請求項６】
請求項１，３，４，５のいずれか１項に記載の細胞培養装置において、
培養液に直接接触することなく前記撹拌手段の前記撹拌翼を回転させる駆動手段（５０；５２，１５０；１５４，２５０；２５２）を更に備える、細胞培養装置。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞培養装置において、
前記撹拌手段の撹拌翼は、下端に固着される磁力体（３６）を有し、
前記培養槽の下に配置される前記駆動手段（５０）は、当該培養槽の底部を介して前記磁力体に対向する位置で水平に回転する別の磁力体である駆動手段（５２）を備え、
前記別の磁力体が駆動回転することで前記撹拌翼が水平に回転する、細胞培養装置。
【請求項８】
請求項６に記載の細胞培養装置において、
前記駆動手段は、前記培養槽の下に配置され、
前記駆動手段の駆動軸（１５４）は、前記支柱の内部を貫通して当該支柱の前記上部分まで延び、当該上部分にて前記撹拌手段の前記撹拌翼に取り付けられる、細胞培養装置。
【請求項９】
請求項１及び３乃至７のいずれか１項に記載の細胞培養装置において、
前記支柱は、培養液の温度を計測する温度センサ（２８０）の感温部（２４０）が前記培養槽の前記底部の外面側から当該支柱の内部に挿入される孔（２２０ａ）を有する、細胞培養装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞培養装置において、
前記温度センサの感温部を更に備える、細胞培養装置。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の細胞培養装置において、
前記温度センサの感温部は、前記培養槽（２１０）の前記底部（２１２）の外面から２０乃至３０ｍｍだけ離れて配置される、細胞培養装置。
【請求項１２】
請求項１及び３乃至１１のいずれか１項に記載の細胞培養装置を用い、
前記培養槽内に培地とともに細胞凝集塊を形成する細胞を播種する第１工程と、
細胞凝集塊が前記培養槽の前記底部の内面上に沈殿せず、かつ、当該細胞凝集塊が崩壊しない速度で前記撹拌手段を回転して培養する第２工程と、
を含み、均一な粒径の細胞凝集塊を維持しながら培養する、細胞培養方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の細胞培養方法において、
細胞凝集塊を形成する細胞が多能性幹細胞であり、
前記培地に体細胞へ分化誘導する因子を添加して培養する第３工程を更に含み、多能性幹細胞から体細胞へ分化誘導する、細胞培養方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
テグラ社製の細胞培養装置の概略断面図を示す。いずれも後述する。
［０００７］
軸流培養は、培養槽内全体を低回転で均一にかき回すために、多枚数の撹拌翼が必要となり、回転によるシェアストレスが増大する恐れがある。また、構造上軸直下に淀みが出来やすく、細胞の増殖に伴って重量が増した細胞凝集塊（胚様体など）が沈殿して均一な粒径の細胞凝集塊が得難いという問題もある。層流培養は、乱流を起こさない程度の回転速度に設定すれば極低シェアストレスの撹拌を実現しやすいが、ドーナツ状の液流の中心部は淀みが出来やすいという問題がある。
［０００８］
培養時に、培養槽内には、ｐＨ、溶存酸素（ＤＯ）、温度等を計測する各種センサを挿入するが、多能性幹細胞を数１０ｍＬから１００ｍＬ程度の小容量で培養するためには、従来型のセンサでは液量に対するセンサの排除体積が大きすぎるために均一な撹拌を妨げる恐れがある。従って、好適な培養環境を実現するためには、培養槽や撹拌翼の形状工夫だけではなく、均一撹拌の妨げにならない程度まで各種センサの形状や構造、配置を工夫する必要がある。温度センサに関しては、従来、培養槽天板から培養槽内の液面から数１０ｍｍ下に突入するさや管を配置し、さや管内に温度センサを挿入することで間接的に液温を計測していた。温度センサは、先端が閉じられたステンレス製のシース管から成るが、一般に先端部から数ｍｍの位置に温度を計測するための感温部があり、その部位には測温抵抗体等が埋め込まれている。直径３ｍｍの温度センサの場合、センサの先端部は液面から１５ｍｍ（温度センサの直径の５倍）より下に通常配置される。これより浅いと正確な温度は計測できないし深いと均一撹拌の妨げになってしまう。また、操作者が温度センサをさや管に挿入し忘れるミスにより培養液がオーバーヒートしてしまい、結果的に培養に失敗してしまうトラブルが発生している。ｐＨやＤＯセンサの場合、万が一センサコネクターの結線を忘れても値の変化が緩慢であり、すぐに気づいて対処できれば培養の失敗につながることは少ないが、温度センサの場合、測温値が培養液温なのかつけ忘れによる室温なのかが装置側では判断できないので、気づいたときには培養液温が５０℃を越えて
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
［００１１］
そしてまた、本発明に係る細胞培養装置を用いて、簡便に、且つ、再現性良く、均一な粒径の細胞凝集塊の集団を得る細胞培養方法、更には、多能性幹細胞から体細胞への分化誘導効率が高い細胞培養方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
［００１２］
以下、本発明について上記課題を解決するための手段を説明する。尚、本発明の理解を容易にするために添付図面の参照符号を括弧書きにて付記するが、それにより本発明が図示の形態に限定されるものではない。
［００１３］
上記課題を解決するために、本発明に係る細胞培養装置（１，１０１，２０１）は、細胞を含む培養液を収納する円筒形状の培養槽（１０，１１０，２１０）と、培養槽の底部（１２，１１２，２１２）の内面の中央から直立する支柱（２０，１２０，２２０）と、支柱の上部分（２４，１２４）に支柱に対して回転可能に取り付けられる取付部（３２，１３２）と、取付部にその上部が固着され支柱を回転中心として回転する撹拌翼（３４，１３４）とを有する撹拌手段（３０，１３０，２３０）とを備え、支柱は、底部の内面からの立ち上がり部分が底部の内面に向かう方向に拡径の円錐状に形成された円錐状部分（２２，１２２）を有し、支柱の上部分が培養液の液面より上にある。
［００１４］
これにより、底部中心近傍が円錐状部分で占められている（この円錐状部分は、スペーサーとして機能する。）ので、培養液の回転による底部中心近傍の液流の淀みが生じる余地がなく、従って、細胞凝集塊（胚様体など）の体積の増加に伴う底部中心近傍への沈殿を防ぐことができる。また、支柱の上部分とこれに回転可能に取り付けられる取付部（３２、１３２）との摺動部分に細胞凝集塊が実質的に入り込むことはなく、強いせん断力による細胞凝集塊の物理的な破壊や細胞死を防ぐことができる。
［００１５］
更に、撹拌手段の撹拌翼は、撹拌手段が回転するとき、撹拌翼の下部が支柱の円錐状部分の外面に沿うような形状に形成されていることを特徴とすれ
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
０は、培養槽１０内の底部１２の内面への固定部が下方向に拡径の円錐状に形成された円錐状部分２２を有しており、培養液の回転による底部中心近傍の液流の淀みは、その部分が円錐状部分２２で占められていることから生じる余地もなく、従って、細胞増殖に伴って重量が増大した細胞凝集塊の沈殿はない。
［００３５］
なお、図１において、支柱２０を培養槽１０内の底部１２の内面の中央に直立して固定する方法としては、特に制限されないが、同図に示すごとく、培養槽１０と支柱２０とが別体の場合には、Ｏリング２２ａを介してビス２２ｂで螺着固定したり、耐熱性接着剤（例えば、シリコンゴム系接着剤）等で接着固定したり（図示省略）等することができ、また、培養槽１０と支柱２０とを一体成型することもできる。
［００３６］
支柱２０の上部分２４は、培養液の液面より上にあり、撹拌手段３０が回転可能に取り付けられている。従って、支柱２０の上部分２４とこれに回転可能に取り付けられる取付部３２（後述）との摺動部分に細胞凝集塊が実質的に入り込むことはなく、強いせん断力による細胞凝集塊の物理的な破壊や細胞死を防ぐことができる。
［００３７］
なお、支柱２０において、円錐状部分２２の上部から上部分２４までの部分の太さ等については特に制限はされないが、支柱２０の強度を確保する観点から、下部を太くして上方向に徐々に縮径とするのが好ましい。
［００３８］
撹拌手段３０は、支柱２０の上部分２４に支柱２０に対して回転可能に取り付けられた取付部３２と、取付部３２にその上部が固着され支柱２０を回転中心として培養槽１０内を回転する撹拌翼３４とを有している。取付部３２は、培養液に不活性で、且つ、耐性を有する材料で形成されることが好ましく、例えば合成樹脂、ステンレス鋼などが挙げられる。撹拌翼３４も、培養液に不活性で、且つ、耐性を有する板材で形成されることが好ましく、例えば薄板状の合成樹脂、ステンレス鋼（例えば１ｍｍ厚のＳＵＳ３１６）などが挙げられる。撹拌手段３０の撹拌翼３４は、培養槽１０の内壁方向の下端にテトラフルオロエチレン等で被覆の磁力体（永久磁石等）３６を有している。この磁力体３６は、撹拌翼３４の先端下部を折り曲げ加工された部分によって固定され保持されている。
［００３９］
ここで、図１には左右２枚の撹拌翼３４が示されているが、本発明はこれ
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
2013187359.tif 000013
【国際調査報告】
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