(57)【要約】  アルカリによる中和を必要とせず、高い生産性で乳酸を産生できる形質転換体およびその製造方法、ならびに該形質転換体を用いた乳酸の製造方法の提供を目的とする。すなわち、シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、ラクトバチルス・ペントーサスの乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活していることを特徴とする形質転換体、該形質転換体の製造方法、ならびに該形質転換体を用いた乳酸の製造方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、ラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）の乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活している、形質転換体。
【請求項２】
さらに、ヒトの乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれている、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
欠失または失活しているピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子がＰＤＣ２遺伝子である、請求項１または２に記載の形質転換体。
【請求項４】
前記乳酸脱水素酵素遺伝子がシゾサッカロミセス・ポンベの染色体に組み込まれている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の形質転換体。
【請求項５】
シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、シゾサッカロミセス・ポンベ内で機能するプロモーターとターミネーターとラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）の乳酸脱水素酵素遺伝子とを含む発現カセットを有するベクターを用いて、前記発現カセットを前記宿主に導入して形質転換体を得て、
前記宿主としてピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活した宿主を用いるか、または前記得られた形質転換体のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部を欠失または失活させる、
ラクトバチルス・ペントーサスの乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれかつピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活している形質転換体の製造方法。
【請求項６】
前記宿主として、ヒトの乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれており、かつピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活した宿主を用いるか、または
前記得られた形質転換体にヒトの乳酸脱水素酵素遺伝子を組み込んだ後、該形質転換体のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部を欠失または失活させる、請求項５に記載の形質転換体の製造方法。
【請求項７】
請求項５に記載の形質転換体の製造方法により得られた形質転換体を宿主とし、シゾサッカロミセス・ポンベ内で機能するプロモーターとターミネーターとヒトの乳酸脱水素酵素遺伝子とを含む発現カセットを有するベクターを用いて、前記発現カセットを前記宿主に導入して形質転換体を得る、ラクトバチルス・ペントーサスの乳酸脱水素酵素遺伝子およびヒトの乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれかつピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活している形質転換体の製造方法。
【請求項８】
欠失または失活しているピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子がＰＤＣ２遺伝子である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の形質転換体の製造方法。
【請求項９】
前記ベクターがさらにシゾサッカロミセス・ポンベの染色体に対して相同組換えを行わせる組換え部位を有し、このベクターを使用して発現カセットをシゾサッカロミセス・ポンベの染色体に導入する、請求項５〜８のいずれか一項に記載の形質転換体の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の形質転換体を培養液中で培養し、該培養液から乳酸を取得する乳酸の製造方法。
【請求項１１】
濃度１〜５０質量％のグルコースを含む培養液を使用して培養を行う、請求項１０に記載の乳酸の製造方法。
【請求項１２】
前記形質転換体により産生される乳酸により、前記培養液のｐＨが３．５以下になった後にさらに培養を継続する、請求項１０または１１に記載の乳酸の製造方法。
【請求項１３】
前記培養液中の形質転換体の初発菌体濃度を０．１〜５ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌとする、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の乳酸の製造方法。
【請求項１４】
前記形質転換体により産生された培養液中の乳酸を中和することなく培養を継続する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の乳酸の製造方法。
【請求項１５】
前記形質転換体により産生された培養液中の乳酸を中和することなく、培養液から乳酸を分離する、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法に関する。より詳細には、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、以下、「Ｓ．ポンベ」）に、ラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）の乳酸脱水素酵素遺伝子を組み込み、かつピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部を欠失または失活させた形質転換体、該形質転換体の製造方法、および該形質転換体を培養液中で培養し、該培養液から乳酸を取得する乳酸の製造方法に関する。【０００２】
本願は、２０１２年８月２４日に日本国に出願された特願２０１２−１８５６８０号に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００３】
乳酸は食品用途や、医療、化粧品等の化学原料用途に広く用いられている。また、乳酸を用いて得られるポリ乳酸は、微生物等により最終的に二酸化炭素と水にまで分解される生分解性プラスチックとして注目されている。そのため、乳酸を安価に高い生産性で製造することが必要である。【０００４】
乳酸の製造方法としては、乳酸菌により糖を発酵させ製造する生物学的方法が知られている。しかし、乳酸菌は耐酸性が低いため、この方法で高い生産性を得るには発酵により産生される乳酸をアルカリにより中和して乳酸塩とする必要がある。このようなアルカリによる中和は、乳酸塩から乳酸に戻す工程が必要となるため、製造工程が煩雑になり製造コストも高くなる。【０００５】
アルカリによる中和を行わずに乳酸を得る方法としては、酵母に乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換体を用いる方法がある。たとえば特許文献１には、Ｓ．ポンベに、ヒト等の哺乳動物由来の乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつＳ．ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部を欠失または失活させた形質転換体を培養することにより、アルカリによる中和工程を行わずに高い生産性で乳酸を製造し得ることが開示されている。また、特許文献２には、培養培地中で培養した際に本質的にエタノールを産生しないサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に、ラクトバチルス・プランタラム(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ)のＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した形質転換体を培養することにより乳酸が得られることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０２１６２９号
【特許文献２】日本国特表２００７−５１２０１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に記載の形質転換体は、高濃度の糖存在下での乳酸産生に適し、かつ高密度発酵にも適しており、アルカリによる中和工程を行わずに、乳酸を従来になく高効率で製造できる。しかし、微生物を用いて工業上安定して乳酸を産生するためには、特許文献１に記載の形質転換体と同程度またはそれ以上の乳酸生産性を有する酵母が複数種類あることが好ましい。【０００８】
そこで本発明では、アルカリによる中和を必要とせずに高い生産性で乳酸を産生できるＳ．ポンベの形質転換体および該形質転換体の製造方法を目的とする。
また、前記形質転換体を用いて、アルカリによる中和工程を行わずに高い生産性で乳酸を製造する方法を目的とする。
なお、本発明において乳酸とは生物学的方法で得られるＬ−乳酸をいう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第一の態様に係る形質転換体は、Ｓ．ポンベを宿主とし、ラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）の乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ前記Ｓ．ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活していることを特徴とする。
本発明の第一の態様に係る形質転換体においては、さらに、ヒトの乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれていることが好ましい。また、前記形質転換体においては、前記欠失または失活しているピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子がＰＤＣ２遺伝子であることが好ましい。さらに、前記乳酸脱水素酵素遺伝子はＳ．ポンベの染色体に組み込まれていることが好ましい。【００１０】
また、本発明の第二の態様に係る形質転換体の製造方法は、Ｓ．ポンベを宿主とし、Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとターミネーターとラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）の乳酸脱水素酵素遺伝子とを含む発現カセットを有するベクターを用いて、前記発現カセットを前記宿主に導入して形質転換体を得ること、および、前記宿主としてピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活した宿主を用いるかまたは前記得られた形質転換体のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部を欠失または失活させることを特徴とする、ラクトバチルス・ペントーサスの乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれかつピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活している形質転換体を製造する方法である。
本発明の第二の態様に係る形質転換体の製造方法においては、前記宿主として、ヒトの乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれており、かつピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活した宿主を用いるか、または前記得られた形質転換体にヒトの乳酸脱水素酵素遺伝子を組み込んだ後、該形質転換体のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部を欠失または失活させることが好ましい。
また、前記形質転換体の製造方法により得られた形質転換体を宿主とし、Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとターミネーターとヒトの乳酸脱水素酵素遺伝子とを含む発現カセットを有するベクターを用いて、前記発現カセットを前記宿主に導入して形質転換体を得ることもできる。また、前記ベクターはさらにＳ．ポンベの染色体に対して相同組換えを行わせる組換え部位を有し、このベクターを使用して発現カセットをＳ．ポンベの染色体に導入することが好ましい。
また、前記形質転換体の製造方法においては、前記欠失または失活しているピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子がＰＤＣ２遺伝子であることが好ましい。【００１１】
さらに、本発明の第三の態様に係る乳酸の製造方法は、前記形質転換体を培養液中で培養し、該培養液から乳酸を取得する。
本発明の第三の態様に係る乳酸の製造方法において、濃度１〜５０質量％のグルコースを含む培養液を使用して培養を行うことが好ましい。また、前記形質転換体により産生される乳酸により、前記培養液のｐＨが３．５以下になった後にさらに培養を継続することが好ましい。さらに、前記培養液中の形質転換体の初発菌体濃度を０．１〜５ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌとすることが好ましい。また、前記形質転換体により産生された培養液中の乳酸を中和することなく培養を継続することが好ましく、また、培養液中の乳酸を中和することなく培養液から乳酸を分離することが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の第一の態様に係るＳ．ポンベの形質転換体は、アルカリによる中和を必要とせずに高い生産性で乳酸を産生できる。また、高濃度の糖、特にグルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、の存在下での乳酸産生に適し、かつ高密度培養にも適している。
前記形質転換体は、本発明の第二の態様に係る形質転換体の製造方法により簡便に得ることができる。
また、本発明の第三の態様に係る乳酸の製造方法は、アルカリによる中和工程を行わずに高い生産性で乳酸を製造できる。
すなわち、本発明に係る形質転換体およびそれを用いた乳酸の製造方法は、低ｐＨでもアルカリによる中和を行わずに高い生産性で乳酸を生産できるため、乳酸の工業的な製造方法として好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、組換えベクターｐＸＬＴ−ＴＬ２の構造の模式図である。
【図２】図２は、組換えベクターｐＴｆ２（ＭＣＳ）−ｕｒａ４の構造の模式図である。
【図３】図３は、組換えベクターｐＳＬ６の構造の模式図である。
【図４】図４は、組換えベクターｐＳＬ１２の構造の模式図である。
【図５】図５は、組換えベクターｐＳＬ１７の構造の模式図である。
【図６】図６は、実施例［例３］における、ジャーファーメンター培養中のＯＤ６６０ の経時変化を示すグラフである。図中の三角印は、試験管発酵のため、菌体を含む少量の培養液を抜き出した時点を示す。
【図７】図７は、実施例［例３］における、ジャーファーメンター培養中の乳酸濃度の経時変化を示すグラフである。図中の三角印は、試験管発酵のため、菌体を含む少量の培養液を抜き出した時点を示す。
【図８】図８は、実施例［例３］における、ジャーファーメンター培養中のグルコース濃度の経時変化を示すグラフである。図中の三角印は、試験管発酵のため、菌体を含む少量の培養液を抜き出した時点を示す。
【図９】図９は、実施例［例３］における、ジャーファーメンター培養中のエタノール濃度の経時変化を示すグラフである。図中の三角印は、試験管発酵のため、菌体を含む少量の培養液を抜き出した時点を示す。
【図１０】図１０は、実施例［例３］における、試験管発酵中の乳酸濃度の経時変化を示すグラフである。
【図１１】図１１は、実施例［例３］における、試験管発酵中のグルコース濃度の経時変化を示すグラフである。
【図１２】図１２は、実施例［例３］における、試験管発酵中のエタノール濃度の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［形質転換体Ａ］
本発明の第一の態様に係る形質転換体（以下、「形質転換体Ａ」）は、シゾサッカロミセス・ポンベ（以下、Ｓ．ポンベともいう）を宿主とし、ラクトバチルス・ペントーサスの乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつＳ．ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活している、形質転換体である。
【００１５】
＜Ｓ．ポンベ＞
宿主であるＳ．ポンベは、シゾサッカロミセス属に属する酵母（分裂酵母）であり、他の酵母に比べて特に耐酸性に優れる微生物である。また、Ｓ．ポンベは、サッカロミセス・セレビシエ等の他の酵母に比べ、高濃度のグルコース下における乳酸の生産性に優れ、高密度培養（大量の酵母を用いた培養）にも適していることがわかった。そのため、Ｓ．ポンベの形質転換体を用いることにより、極めて高い生産性で乳酸を製造できる。
なお、Ｓ．ポンベの染色体の全塩基配列は、サンガー研究所のデータベース「ＧｅｎｅＤＢ」に「Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  Ｇｅｎｅ  ＤＢ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｄｂ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅｄｂ／ｐｏｍｂｅ／）」として、収録され、公開されている。本明細書記載のＳ．ポンベの遺伝子の配列データは上記データベースから遺伝子名や上記系統名で検索して、入手できる。
【００１６】
＜ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子＞
Ｓ．ポンベにおけるピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子（ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子、以下「ＰＤＣ遺伝子」ともいう。）群には、ピルビン酸脱炭酸酵素１をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ１遺伝子」という。）、ピルビン酸脱炭酸酵素２をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ２遺伝子」という。）、ピルビン酸脱炭酸酵素３をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ３遺伝子」という。）、ピルビン酸脱炭酸酵素４をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ４遺伝子」という。）の４種類がある。なかでも、Ｓ．ポンベにおいては、ＰＤＣ２遺伝子とＰＤＣ４遺伝子が主要な機能を持つＰＤＣ遺伝子である。各ＰＤＣ遺伝子の系統名は以下の通りである。
ＰＤＣ１遺伝子（Ｐｄｃ１）；ＳＰＡＣ１３Ａ１１．０６
ＰＤＣ２遺伝子（Ｐｄｃ２）；ＳＰＡＣ１Ｆ８．０７ｃ
ＰＤＣ３遺伝子（Ｐｄｃ３）；ＳＰＡＣ１８６．０９
ＰＤＣ４遺伝子（Ｐｄｃ４）；ＳＰＡＣ３Ｇ９．１１ｃ
上記ＰＤＣ遺伝子の配列データは、前記Ｓ．ポンベ遺伝子データベースから遺伝子名や系統名で検索して入手できる。
【００１７】
野生型Ｓ．ポンベでは、解糖系によりグルコースをピルビン酸まで代謝し、前述のＰＤＣ遺伝子から発現されるピルビン酸脱炭酸酵素によりピルビン酸がアセトアルデヒドに変換され、次いで該アセトアルデヒドがアルコール脱水素酵素によりエタノールへと変換されることでエタノール発酵が行われる。また、野生型Ｓ．ポンベは機能を持った乳酸脱水素酵素遺伝子（乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をコードする遺伝子、以下「ＬＤＨ遺伝子」ともいう。）を有していないことより、ピルビン酸から乳酸が生成するルートは存在しない。
一方、組み込まれたＬＤＨ遺伝子から発現されるＬＤＨは、ピルビン酸を乳酸に還元することにより乳酸を産生させる。そのため、野生型Ｓ．ポンベにＬＤＨ遺伝子を組み込んで乳酸を産生できるようにしても、そのままではエタノール発酵と乳酸発酵の両方を行うことになるため、乳酸の生産性が充分に高くならない。
【００１８】
本発明に係る形質転換体Ａは、前記ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち、一部が欠失または失活した染色体を有する。形質転換体のＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活していることにより、形質転換体のエタノール発酵の効率が低下し、エタノールに変換されるピルビン酸量が少なくなるため、乳酸の生産性が向上する。ただし、ＰＤＣ遺伝子群を完全に欠失または失活させると、エタノール発酵が全く行えなくなって生育が阻害されるため、欠失または失活させるのはＰＤＣ遺伝子群の一部とする。
【００１９】
欠失または失活させるＰＤＣ遺伝子は、ＰＤＣ２遺伝子であることが特に好ましい。ＰＤＣ２遺伝子は、特に主要な機能を持つＰＤＣ遺伝子である。
前述のように、ＰＤＣ遺伝子を全て欠失または失活させてしまうと、その形質転換体はエタノール発酵が行えなくなるために生育が阻害される。そのため、ＰＤＣ遺伝子の欠失または失活は、生育に必要なエタノール発酵能を残して充分な形質転換体量が得られるようにしつつ、エタノール発酵能を低下させて乳酸の発酵効率を向上させられるように行わなければならない。この課題に対して本発明者等が検討を行った結果、ＰＤＣ２遺伝子を欠失または失活させるとＰＤＣ４遺伝子がある程度活性化し、充分な形質転換体量が得られる程度のエタノール発酵能と、高い発酵効率での乳酸の生産が両立できることを見い出した。
【００２０】
ＰＤＣ遺伝子の欠失や失活は、公知の方法で行うことができる。たとえば、Ｌａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｒｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、国際公開第２００７／０６３９１９号等に記載）を用いることによりＰＤＣ遺伝子を欠失させることができる。
また、ＰＤＣ遺伝子の塩基配列の一部に欠失、挿入、置換、付加を起こすことにより、該ＰＤＣ遺伝子を失活させることもできる。これらの欠失、挿入、置換、付加による変異は、それらのいずれか１つのみを起こしてもよく、２つ以上を起こしてもよい。
【００２１】
ＰＤＣ遺伝子の一部に前記変異を導入する方法は、公知の方法を用いることができる。たとえば、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用したランダム変異法（ピーシーアール・メソッズ・アプリケーション（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．）、１９９２年、第２巻、ｐ．２８−３３．）等が挙げられる。
【００２２】
また、一部に変異が導入されたＰＤＣ遺伝子は、温度感受性の変異型ピルビン酸脱炭酸酵素を発現するものであってもよい。温度感受性の変異型ピルビン酸脱炭酸酵素とは、ある培養温度においては野生型のピルビン酸脱炭酸酵素と同等の活性を示すが、特定の培養温度以上になると活性の消失または低下が見られる酵素である。
このような変異型ピルビン酸脱炭酸酵素を発現する突然変異株は、温度により活性が制限されない条件下では野生型酵母と同等の生育速度を示し、活性が制限される特定の温度条件下において生育速度が著しく低下するものを選択することで得ることができる。
【００２３】
＜ＬＤＨ遺伝子＞
本発明に係る形質転換体Ａは、ＬＤＨ遺伝子を有する。前記のように、Ｓ．ポンベは本来ＬＤＨ遺伝子を有していない。したがって、Ｓ．ポンベ以外の生物のＬＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法でＳ．ポンベに導入して形質転換体を得る。
【００２４】
本発明に係る形質転換体Ａは、ラクトバチルス・ペントーサスのＬＤＨ（ＬｐＬＤＨ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｄ９０３４０）遺伝子を有する。なお、ＧｅｎＢａｎｋはＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のデータベースである。
【００２５】
本発明に係る形質転換体Ａに組み込まれるＬｐＬＤＨ遺伝子は、１つであってもよく、２以上であってもよい。ＬＤＨ遺伝子を複数導入することにより、ＬＤＨ遺伝子の発現効率を高めることができ、ひいては乳酸の生産効率が向上すると考えられる。
【００２６】
本発明に係る形質転換体Ａは、ＬｐＬＤＨ遺伝子に加えて、他の生物種由来のＬＤＨ遺伝子が組み込まれていてもよい。ただし、後記実施例に示すように、ＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活しているＳ．ポンベ形質転換体に組み込むことによって乳酸を産生する形質転換体が得られるＬＤＨ遺伝子は、限定される。当該他の生物種由来のＬＤＨ遺伝子としては、ヒト等の哺乳動物のＬＤＨ遺伝子、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）のＬＤＨ遺伝子（ＰａＬＤＨ遺伝子）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｑ５９６４５）が挙げられる。中でも、ヒトのＬＤＨ遺伝子（ＨｓＬＤＨ）が好ましい。ＬｐＬＤＨ遺伝子とＨｓＬＤＨ遺伝子を組み合わせて組み込むことにより、同数のＨｓＬＤＨ遺伝子を組み込んだ場合よりも、顕著に乳酸産生能が向上する。
【００２７】
［形質転換体の製造］
本発明に係る形質転換体Ａは、ＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、これにＬｐＬＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法でＳ．ポンベに導入して得られる。また、ＰＤＣ遺伝子群が欠失も失活もしていないＳ．ポンベを宿主とし、該Ｓ．ポンベにＬｐＬＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法で導入して形質転換体を得て、その後得られた形質転換体のＰＤＣ遺伝子群の一部を欠失または失活させて、本発明に係る形質転換体Ａを得ることもできる。後述の実施例では、前者の方法で目的の形質転換体を製造したが、後者の方法でもほぼ同等の形質転換体を製造できる。
【００２８】
本発明に係る形質転換体Ａが、ＬｐＬＤＨ遺伝子とＨｓＬＤＨ遺伝子の両方が組み込まれている場合、該形質転換体は、前記の方法により得られた形質転換体（すなわち、ＬｐＬＤＨ遺伝子が組み込まれており、かつＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活したＳ．ポンベ形質転換体）を宿主とし、該形質転換体にＨｓＬＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法で導入して得られる。また、ＨｓＬＤＨ遺伝子が組み込まれており、かつＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活したＳ．ポンベ形質転換体を宿主とし、該Ｓ．ポンベ形質転換体にＬｐＬＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法で導入してもよい。さらに、ＰＤＣ遺伝子群が欠失も失活もしていないＳ．ポンベを宿主とし、該Ｓ．ポンベに遺伝子工学的方法によりＬｐＬＤＨ遺伝子およびＨｓＬＤＨ遺伝子を同時または順次（順不同）導入して形質転換体を得て、その後得られた形質転換体のＰＤＣ遺伝子群の一部を欠失または失活させることによっても、本発明に係る形質転換体ＡのうちのＬｐＬＤＨ遺伝子とＨｓＬＤＨ遺伝子の両方が組み込まれたものを得られる。
【００２９】
以下、ＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、これにＬｐＬＤＨ遺伝子（必要に応じて、ＬｐＬＤＨ遺伝子とＨｓＬＤＨ遺伝子の両方）を遺伝子工学的方法で導入する方法を例に、形質転換体の製造方法を説明する。
【００３０】
＜宿主＞
宿主とするＳ．ポンベは、野生型であってもよく、用途に応じて特定の遺伝子を欠失または失活させた変異型であってもよい。特定の遺伝子を欠失または失活させる方法としては、公知の方法を用いられる。具体的には、Ｌａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ誌、第３４巻、ｅ１１ページ、２００６年；国際公開第２００７／０６３９１９号等に記載）を用いることにより遺伝子を欠失させられる。また、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用したランダム変異法（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ誌、第２巻、２８−３３ページ、１９９２年）等により遺伝子の一部に変異を導入することにより該遺伝子を失活させられる。特定遺伝子を欠失または失活させたシゾサッカロミセス属酵母宿主としては、たとえば、国際公開第２００２／１０１０３８号、国際公開第２００７／０１５４７０号等に記載されている。
また、特定の遺伝子の削除または不活性化を行う部分はＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）部分であってもよく、発現調節配列部分であってもよい。特に好ましい方法は、構造遺伝子のＯＲＦ部分をマーカー遺伝子に置換するＰＣＲ媒介相同組換え法（Ｙｅａｓｔ誌、第１４巻、９４３−９５１ページ、１９９８年）による削除または不活性化の方法である。
【００３１】
ＰＤＣ遺伝子が欠失または失活した変異体は、本発明に係る形質転換体Ａを製造するための宿主として好ましく使用できる。さらに、ＰＤＣ遺伝子以外にさらにＰＤＣ遺伝子以外の特定遺伝子を欠失または失活させたＳ．ポンベを宿主とすることもできる。プロテアーゼ遺伝子等を欠失または失活させることにより異種蛋白質の発現効率を高めることができ、本発明における宿主に適用することにより乳酸の生産効率の向上が期待できる。
【００３２】
さらに宿主として使用するＳ．ポンベには、形質転換体を選択するためのマーカーを有するものを用いることが好ましい。たとえば、ある遺伝子が欠落していることにより特定の栄養成分が生育に必須である宿主を使用することが好ましい。目的遺伝子配列を含むベクターにより形質転換をして形質転換体を作製する場合、ベクターにこの欠落している遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を組み込んでおくことにより、形質転換体では宿主の栄養要求性が消失する。この宿主と形質転換体の栄養要求性の相違により、両者を区別して形質転換体を得ることができる。
たとえば、オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４遺伝子）が欠失または失活してウラシル要求性となっているシゾサッカロミセス属酵母を宿主とし、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を有する発現ベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、発現ベクターが組み込まれた形質転換体を得ることができる。宿主において欠落により栄養要求性となる遺伝子は、形質転換体の選択に用いられるものであればｕｒａ４遺伝子には限定されず、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）等であってもよい。
【００３３】
また、ＰＤＣ遺伝子群が欠失も失活もしていないＳ．ポンベを形質転換体製造のための宿主として使用することもできる。この場合の宿主としては、ＰＤＣ遺伝子以外の前記のような遺伝子（栄養要求性マーカーやプロテアーゼ遺伝子など）が欠失または失活しているものを使用できる。該宿主を用いて形質転換体を製造した後、得られた形質転換体のＰＤＣ遺伝子群の一部を欠失または失活させて、本発明に係る形質転換体Ａを得ることができる。
【００３４】
＜ＬＤＨ遺伝子導入方法＞
遺伝子工学的方法で宿主にＬＤＨ遺伝子を導入する方法としては、公知の方法を使用できる。Ｓ．ポンベを宿主としてこれに異種蛋白質の構造遺伝子を導入する方法としては、たとえば、日本国特開平５−１５３８０号公報、国際公開第９５／０９９１４号、日本国特開平１０−２３４３７５号公報、日本国特開２０００−２６２２８４号公報、日本国特開２００５−１９８６１２号公報、国際公開第２０１１／０２１６２９号などに記載の方法を使用できる。
【００３５】
＜発現カセット＞
発現カセットとは、目的の蛋白質を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、目的の蛋白質をコードする構造遺伝子と宿主内で機能するプロモーターとターミネーターを含む。本発明に係る形質転換体Ａの製造において、ＬｐＬＤＨ遺伝子またはＨｓＬＤＨ遺伝子の発現カセットは、それぞれ、ＬｐＬＤＨ遺伝子またはＨｓＬＤＨ遺伝子とＳ．ポンベ内で機能するプロモーターとＳ．ポンベ内で機能するターミネーターを含む。該発現カセットは、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。さらに、前記栄養要求性相補マーカーが含まれていてもよい。好ましい発現カセットは、ＬＤＨ遺伝子、プロモーター、ターミネーター、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、栄養要求性相補マーカーを含む発現カセットである。１の発現カセットには複数のＬＤＨ遺伝子が存在していてもよい。１の発現カセット中のＬＤＨ遺伝子の数は１〜８が好ましく、１〜５がより好ましい。また、１の発現カセット中に複数のＬＤＨ遺伝子が含まれている場合、２種類以上のＬＤＨ遺伝子（たとえば、１または２以上のＬｐＬＤＨ遺伝子と、１または２以上のＨｓＬＤＨ遺伝子）を含んでいてもよい。
【００３６】
発現カセットに含めるＬｐＬＤＨ遺伝子またはＨｓＬＤＨ遺伝子の遺伝子配列としては、野生型がコードする遺伝子をそのまま用いてもよいが、宿主として用いるＳ．ポンベ内での発現量を増大させるために、野生型の遺伝子配列を、Ｓ．ポンベにおいて使用頻度の高いコドンに改変してもよい。
【００３７】
Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとターミネーターは、本発明に係る形質転換体Ａにより乳酸が蓄積して酸性になっても（ｐＨ６以下になっても）、形質転換体内で機能してＬＤＨの発現を維持できるものであればよい。Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するプロモーター（転写開始活性が高いものが好ましい）やＳ．ポンベが本来有しないプロモーター（ウイルス由来のプロモーターなど）を使用できる。なお、プロモーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
【００３８】
Ｓ．ポンベが本来有するプロモーターとしては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するｎｍｔ１遺伝子プロモーター、グルコースの代謝に関与するフルクトース−１、６−ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号参照）、熱ショック蛋白質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号参照）などが挙げられる。
Ｓ．ポンベが本来有しないプロモーターとしては、たとえば、日本国特開平５−１５３８０号公報、日本国特開平７−１６３３７３号公報、日本国特開平１０−２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。
【００３９】
Ｓ．ポンベ内で機能するターミネーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するターミネーターやＳ．ポンベが本来有しないターミネーターを使用できる。なお、ターミネーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
ターミネーターとしては、たとえば、日本国特開平５−１５３８０号公報、日本国特開平７−１６３３７３号公報、日本国特開平１０−２３４３７５号公報に記載されているヒト由来のターミネーターが挙げられ、ヒトリポコルチンＩのターミネーターが好ましい。
【００４０】
＜発現ベクターＡ＞
本発明に係る形質転換体Ａは、ＬｐＬＤＨ遺伝子を含む発現カセット、またはＬｐＬＤＨ遺伝子を含む発現カセットおよびＨｓＬＤＨ遺伝子を含む発現カセットの両方を、染色体中に有するか、または染色体外遺伝子として有する。発現カセットを染色体中に有するとは、宿主細胞の染色体中の１カ所以上に発現カセットが組み込まれていることであり、染色体外遺伝子として有するとは、発現カセットを含むプラスミドを細胞内に有するということである。ＬｐＬＤＨ遺伝子を含む発現カセットを含む形質転換体、またはＨｓＬＤＨ遺伝子を含む発現カセットを含む形質転換体は、それぞれ、各発現カセットを含む発現ベクターを用いて宿主であるＳ．ポンベを形質転換することにより得られる。
なお、以下、ＬＤＨ遺伝子を含む発現カセットを含む発現ベクターを、本発明に係る「発現ベクターＡ」ということがある。
【００４１】
発現ベクターＡは、環状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するベクターに、該発現カセットを組み込むことにより製造できる。後述するように、該発現カセットが、宿主の細胞内で染色体外遺伝子として保持される形質転換体を作製する場合には、発現ベクターＡは、シゾサッカロミセス属酵母内で複製されるための配列、即ち、自律複製配列（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：  ＡＲＳ）を含むプラスミドであることが好ましく、該発現カセットが、宿主細胞の染色体中に組み込まれた形質転換体を作製する場合には、発現ベクターＡは、線状ＤＮＡ構造であり、かつＡＲＳを有していないものとして、宿主細胞へ導入されることが好ましい。たとえば、発現ベクターＡは、線状ＤＮＡからなるベクターであってもよく、宿主への導入時に、線状ＤＮＡに切り開くための制限酵素認識配列を備える環状ＤＮＡ構造のベクターであってもよい。また、発現ベクターＡは、後述するような形質転換体を選択するためのマーカーを有することが好ましい。該マーカーとしては、たとえば、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）が挙げられる。
【００４２】
各ＬＤＨ遺伝子はＳ．ポンベの染色体に導入することが好ましい。染色体にＬＤＨ遺伝子を導入することにより継代の維持安定性に優れた形質転換体が得られる。また、ＬＤＨ遺伝子は染色体に複数導入することもできる。本発明に係る形質転換体Ａにおいて、染色体に組み込まれたＬｐＬＤＨ遺伝子の数は１〜２０が好ましく、特に１〜８が好ましい。また、本発明に係る形質転換体ＡがＨｓＬＤＨ遺伝子も有する場合、該形質転換体の染色体に組み込まれたＨｓＬＤＨ遺伝子の数は１〜２０が好ましく、特に１〜８が好ましい。
【００４３】
染色体にＬＤＨ遺伝子を導入する方法としては、公知の方法を使用できる。たとえば、前記日本国特開２０００−２６２２８４号公報に記載の方法で染色体にＬＤＨ遺伝子を複数導入できる。また、この方法で染色体にＬＤＨ遺伝子を１個導入することもできる。また、後述のように、染色体の複数の箇所に１個または複数のＬＤＨ遺伝子を導入することもできる。
ＬｐＬＤＨ遺伝子またはＨｓＬＤＨ遺伝子をＳ．ポンベの染色体に導入する方法としては、各ＬＤＨ遺伝子を有する発現カセットと組換え部位とを有するベクターを用い、相同組換え法により導入する方法が好ましい。
【００４４】
ベクターの組換え部位は、Ｓ．ポンベの染色体における相同組換えの標的部位に対して相同組換えを行わせることのできる塩基配列を有する部位である。また、標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体内で発現カセットを組み込む標的となる部位である。標的部位は、ベクターの組換え部位を該標的部位に対して相同組換えを行わせる塩基配列とすることにより自由に設定できる。
前記組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は７０％以上とすることが必要である。また、組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は、相同組換えが起きやすくなる点から、９０％以上とすることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。このような組換え部位を有するベクターを用いることにより、発現カセットが相同組換えにより標的部位に組み込まれる。
組換え部位の長さ（塩基数）は、２０〜２０００ｂｐであることが好ましい。組換え部位の長さが２０ｂｐ以上であれば、相同組換えが起きやすくなる。また、組換え部位の長さが２０００ｂｐ以下であれば、ベクターが長くなりすぎて相同組換えが起き難くなることを防ぎやすい。組換え部位の長さは１００ｂｐ以上であることがより好ましく、２００ｂｐ以上であることがさらに好ましい。また、組換え部位の長さは８００ｂｐ以下であることがより好ましく、４００ｂｐ以下であることがさらに好ましい。
【００４５】
発現ベクターＡは、前記発現カセットと組換え部位以外に他のＤＮＡ領域を有していてもよい。たとえば、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域や抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）が挙げられる。これらは大腸菌を使用してベクターを構築する場合に通常必要とされる遺伝子である。ただし、上記複製開始領域は後述のようにベクターを宿主の染色体に組み込む際には除去されることが好ましい。
【００４６】
染色体にＬＤＨ遺伝子を組み込む場合、発現ベクターＡは、Ｓ．ポンベの細胞に導入する際には線状ＤＮＡ構造で導入することが好ましい。すなわち、通常用いられるプラスミドＤＮＡのような環状ＤＮＡ構造を有するベクターである場合には、制限酵素でベクターを線状に切り開いた後にＳ．ポンベの細胞に導入することが好ましい。
この場合、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く位置は、組換え部位内とする。これにより、切り開かれたベクターの両端にそれぞれ組換え部位が部分的に存在することとなり、相同組換えによりベクター全体が染色体の標的部位に組み込まれる。
発現ベクターＡは、両端それぞれに組換え部位の一部が存在するような線状ＤＮＡ構造とすることができれば、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く方法以外の方法で構築してもよい。
【００４７】
発現ベクターＡとしては、たとえば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等の大腸菌由来のプラスミドを好適に用いることができる。
この場合、相同組換えに用いる際のプラスミドベクターは、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域が除去されていることが好ましい。これにより、上述したベクターを染色体に組み込む際に、その組み込み効率を向上させることができる。
複製開始領域が除去されたベクターの構築方法は特に限定されないが、日本国特開２０００−２６２２８４号公報に記載されている方法を用いることが好ましい。すなわち、組換え部位内の切断箇所に複製開始領域が挿入された前駆体ベクターを構築しておき、前述のように線状ＤＮＡ構造とすると同時に複製開始領域が切り出されるようにする方法が好ましい。これにより、簡便に複製開始領域が除去されたベクターを得ることができる。
また、日本国特開平５−１５３８０号公報、日本国特開平７−１６３３７３号公報、国際公開第９６／２３８９０号、日本国特開平１０−２３４３７５号公報等に記載された発現ベクターやその構築方法を適用して、発現カセットおよび組換え部位を有する前駆体ベクターを構築し、さらに通常の遺伝子工学的手法で該前駆体ベクターから複製開始領域を除去して相同組換えに用いるベクターを得る方法であってもよい。
【００４８】
＜標的部位＞
発現ベクターＡを組み込む標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体中の１箇所のみに存在していてもよく、２箇所以上に存在していてもよい。標的部位が２箇所以上存在している場合、Ｓ．ポンベの染色体の２箇所以上に該ベクターを組み込める。また、１の発現カセット中のＬＤＨ遺伝子を複数とした場合には、標的部位の１箇所に複数のＬＤＨ遺伝子を組み込むことができる。さらに、２種以上の標的部位に、それぞれの標的部位に対応する組換え部位を有する２種以上のベクターを用いて、発現カセットを組み込むこともできる。該方法で、Ｓ．ポンベの染色体に複数のＬＤＨ遺伝子を組み込むことができ、これによりＬＤＨの発現量を増大させ、乳酸の生産性を向上させることができる。たとえば、ＬｐＬＤＨ遺伝子を含む発現カセットを第１の標的部位を有するベクターに組み込み、ＨｓＬＤＨ遺伝子を含む発現カセットを第２の標的部位を有するベクターに組み込み、該ベクターを用いてＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活しているＳ．ポンベを宿主として形質転換することにより、本発明に係る形質転換体ＡのうちＨｓＬＤＨ遺伝子も有する形質転換体が得られる。
【００４９】
１箇所の標的部位に発現カセットを組み込む場合、たとえば日本国特開２０００−２６２２８４号公報に記載の方法記載の標的部位を使用できる。異なる組込み部位を有する２種以上のベクターを用いて、異なる標的部位にそれぞれベクターを組み込むことができる。しかし、染色体の２箇所以上にベクターを組み込む場合、この方法は煩雑である。
【００５０】
染色体中に複数箇所存在する互いに実質的に同一の塩基配列部分を標的部位として、この複数箇所の標的部位にそれぞれベクターを組み込むことができれば、１種類のベクターを使用して染色体の２箇所以上にベクターを組み込むことができる。互いに実質的に同一の塩基配列とは、塩基配列の相同性が９０％以上であることを意味する。標的部位同士の相同性は９５％以上であることが好ましい。また、互いに実質的に同一である塩基配列の長さは、前記ベクターの組換え部位を包含する長さであり、１０００ｂｐ以上であることが好ましい。１箇所の標的部位に複数のＬＤＨ遺伝子が組み込まれている場合に比較して、ＬＤＨ遺伝子の組み込み数が同一であっても、複数存在する標的部位にＬＤＨ遺伝子が分散して組み込まれている場合には、形質転換体が増殖する際にＬＤＨ遺伝子が染色体から１度に脱落することが少なくなり、形質転換体の継代における維持安定性が向上する。
【００５１】
染色体中に複数箇所存在する標的部位としては、トランスポゾン遺伝子Ｔｆ２が好ましい。Ｔｆ２は、Ｓ．ポンベの３本（一倍体）の染色体それぞれに合計１３箇所存在するトランスポゾン遺伝子であり、長さ（塩基数）は約４９００ｂｐであり、それらの遺伝子間における塩基配列相同性は９９．７％であることが知られている（下記文献参照）。
Ｎａｔｈａｎ  Ｊ．  Ｂｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  “Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌ  ＩＩ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ：  Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ”，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２００３ １３：  １９８４−１９９７
【００５２】
染色体に１３箇所存在するＴｆ２の１箇所のみにベクターを組み込むことができる。この場合、２個以上のＬＤＨ遺伝子を有する発現ベクターＡを組み込むことにより、２個以上のＬＤＨ遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。また、Ｔｆ２の２箇所以上に発現ベクターＡを組み込むことにより、２個以上のＬＤＨ遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。この場合、２個以上のＬＤＨ遺伝子を有する発現ベクターＡを組み込むことにより、さらに多くのＬＤＨ遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。Ｔｆ２の１３箇所すべてに発現ベクターＡが組み込まれると、形質転換体の生存や増殖に対する負荷が大きくなりすぎるおそれがある。好ましくは、１３箇所のＴｆ２の８箇所以下に発現ベクターＡが組み込まれることが好ましく、５箇所以下に発現ベクターＡが組み込まれることがより好ましい。
【００５３】
＜形質転換方法＞
形質転換方法は、公知の形質転換方法がいずれも用いられる。該形質転換方法としては、たとえば、酢酸リチウム法［Ｋ．  Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８，  ６４８５−６４８９  （１９９０）］、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、ガラスビーズ法など従来周知の方法や、日本国特開２００５−１９８６１２号公報記載の方法が挙げられる。また、市販の酵母形質転換用キットを用いてもよい。
【００５４】
Ｓ．ポンベ宿主を相同組み換え法で形質転換する方法としては、公知の相同組み換え法を使用できる。本発明に係る形質転換体を製造する際の形質転換方法としては、上述のＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、その染色体に上述のベクターを用いて、発現カセットを相同組換えにより組み込む方法が好ましい。該方法によれば、本発明に係る形質転換体を簡便に製造できる。
【００５５】
形質転換体の製造では、通常、相同組換えを行った後、得られた形質転換体を選択する。選択する方法としては、たとえば、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。次に、それらを別々に液体培養した後、それぞれの培養液における異種蛋白質（本発明においては、ＬｐＬＤＨまたはＨｓＬＤＨ）の発現量を調べ、該異種蛋白質の発現量がより多い形質転換体を選択する。それら選択した形質転換体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組み込まれたベクターの数や発現カセットの数を調べられる。
染色体に組み込まれるベクターの数は組み込み条件などを調整することによりある程度は調整可能である。ベクターの大きさ（塩基数）や構造により、組み込み効率や組み込み数も変化すると考えられる。
【００５６】
一般には発現カセットの数が多いほどＬＤＨの発現効率が高まり、ひいては乳酸の生産効率が高まると予想される。このため、Ｓ．ポンベの染色体に複数のＬＤＨ遺伝子を組み込むことによりＬＤＨの発現量を増大させ、乳酸の生産性を向上させることができると考えられる。しかし、発現カセットの数が多すぎると細胞の生存や増殖に対する負荷が増大し、ひいては乳酸生産効率が低下することも考えられる。一方で、１の発現カセットに複数の遺伝子を含ませることにより、染色体に組み込む発現カセットの数を抑えつつ、多数のＬＤＨ遺伝子を染色体に組み込むことができる。しかし、ベクターが大きくなると、染色体に組み込まれる確率が低下し、組み込まれるベクター数を多くすることが困難となり、ひいては形質転換体を得ること自体が困難となると考えられる。
【００５７】
そこで、本発明者等は、適度な大きさの発現カセットを染色体に比較的少数組み込んだ場合でも、より高い乳酸生産効率を有するＳ．ポンベ形質転換体を得るためには、Ｓ．ポンベにおける発現効率が高く、かつ発現したＬＤＨの活性も高い外来ＬＤＨ遺伝子を選択して導入することが必要であると考えた。様々な微生物由来のＬＤＨ遺伝子を調べたところ、ＬｐＬＤＨ遺伝子をＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活しているＳ．ポンベ形質転換体に組み込むことにより、ＨｓＬＤＨ遺伝子を組み込んだ場合と同様に、乳酸産生効率が非常に高い形質転換体が得られることがわかった。さらに驚くべきことに、ＬｐＬＤＨ遺伝子とＨｓＬＤＨ遺伝子をともに組み込むことによって、同数のＨｓＬＤＨ遺伝子を組み込んだ場合よりも乳酸産生効率が顕著に高い形質転換体が得られた。
【００５８】
［乳酸の製造方法］
本発明に係る乳酸の製造方法は、前記本発明に係る形質転換体Ａを培養液中で培養し、該培養液から乳酸を取得する乳酸の製造方法である。
本発明に係る形質転換体Ａを、糖を含む培養液中で培養することにより、解糖系により該糖から得られるピルビン酸が乳酸脱水素酵素により還元されて乳酸が産生され、培養液に産出された乳酸を培養液から取得することで乳酸を製造できる。
【００５９】
乳酸の製造に用いる培養液としては、糖を含有する公知の酵母培養培地を用いることができ、さらにＳ．ポンベが資化しうる窒素源、無機塩類等を含有し、Ｓ．ポンベの培養を効率良く行えるものであればよい。培養液としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
炭素源である糖としては、たとえば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース等の糖が挙げられる。窒素源としては、たとえば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸、イーストエキス等が挙げられる。無機塩類としては、たとえば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。さらには、プロテオリピドなどの発酵促進因子などを含ませることができる。
【００６０】
本発明に係る乳酸の製造方法では、糖として特にグルコースを含有する培養液を用いることが好ましい。培養初期の培養液（１００質量％）中のグルコース濃度は１質量％以上が好ましく、１〜５０質量％がより好ましく、２〜１６質量％がさらに好ましい。培養によりグルコース濃度が低下することより、必要によりグルコースを添加して培養を継続することが好ましい。培養終期のグルコース濃度は１質量％以下となってもよい。また、乳酸を分離しながら培養液を循環させて連続的に培養を行う場合には、上記グルコース濃度を維持することが好ましい。グルコース濃度を２質量％以上とすることにより、乳酸の生産性がより向上する。また、培養液中のグルコースを１６質量％以下とすることにより、乳酸の生産効率がより向上する。
【００６１】
また、乳酸製造の生産性を高くするために、高密度培養を行うことが好ましい。高密度培養では、培養液中の形質転換体の初発菌体濃度を乾燥菌体重量換算値で表して０．１〜５ｇ／Ｌとすることが好ましい。培養液中の形質転換体の初発菌体濃度を乾燥菌体重量換算値で表して０．２〜２ｇ／Ｌとすることがより好ましい。初発菌体濃度を高くすることにより短時間で高い生産性を達成できる。また、初発菌体濃度があまりに高すぎると菌体の凝集や精製効率の低下などの問題が生じるおそれがある。
なお、後述の実施例等で示す菌体濃度は、日本分光社製可視紫外分光器Ｖ５５０によって測定した波長６６０ｎｍの光の吸光度（ＯＤ６６０）から換算した値である。６６０ｎｍにおけるＯＤ６６０＝１は、分裂酵母乾燥重量の０．２ｇ、湿重量の０．８ｇに相当する。
【００６２】
培養には公知の酵母培養方法を用いることができ、たとえば振とう培養、攪拌培養等により行うことができる。
また、培養温度は、２３〜３７℃であることが好ましい。また、培養時間は適宜決定できる。
また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。たとえば、回分培養で培養を行った後、菌体を培養液から分離して、乳酸を含む培養液を取得できる。また、連続培養法では、たとえば、培養中の培養槽から培養液の一部を抜き出し、抜き出した培養液から乳酸を分離するとともに、培養上清を回収し、該培養上清にグルコースや新たな培養液を加えて培養槽に戻すことを繰り返して、連続的に培養する方法が挙げられる。連続培養を行うことにより、乳酸の生産性がより向上する。
【００６３】
本発明に係る形質転換体Ａ用いた乳酸の製造方法では、耐酸性に特に優れたＳ．ポンベを用いているため、乳酸の蓄積により低ｐＨ（ｐＨ２〜４程度）となっても中和を行わずに乳酸を生産できる。そのため、培養液のｐＨが３．５以下になった後も、さらに培養を継続する連続培養により乳酸を製造できる。培養終期のｐＨや連続培養におけるｐＨは、２〜３．５が好ましく、特に２．３〜３．５が好ましい。乳酸の生産性を高くするために、培養液のｐＨが３．５以下になった後にさらに培養を継続することが好ましい。本発明に係る形質転換体Ａは耐酸性が優れているため、該形質転換体により産生された培養液中の乳酸を中和することなく培養を継続できる。
【００６４】
培養液からの乳酸の取得は、公知の方法を用いることができる。特に、培養液中の乳酸を中和することなく、培養液と乳酸を分離して、乳酸を取得することが好ましい。たとえば、培養終了後の培養液から遠心分離により菌体を分離し、ｐＨ１以下にした後にジエチルエーテルや酢酸エチル等により抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着させて洗浄した後に溶出させる方法、活性炭を用いて不純物を除去する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させた後に蒸留する方法、分離膜を用いて分離する方法が挙げられる。また、場合によっては培養液中の乳酸を中和した後培養液と乳酸塩を分離して、乳酸を取得することもできる。たとえば、培養液中の乳酸をカルシウム塩またはリチウム塩に変換し、この中和塩を晶析する方法で乳酸を取得することもできる。
【００６５】
以上説明した本発明に係る乳酸の製造方法は、特に耐酸性に優れたＳ．ポンベを宿主とする形質転換体を用いるため、アルカリによる中和を行わなくても高い生産性で簡便に乳酸を製造できる。また、ＰＤＣ遺伝子群の一部が欠失または失活していることでエタノール発酵の効率が低下しているため、乳酸の対糖収率（消費された糖の量に対する乳酸の生産量の割合）が向上する。本発明においては、乳酸の対糖収率を５０％以上とすることが容易にできる。場合により、乳酸の対糖収率は７０％以上にも達する。また、本発明に係る乳酸の製造方法は、高濃度のグルコース存在下、および高濃度の形質転換体による高密度培養にも適している。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例および比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。また、本実施例においては特に断りのない限り「％」は「質量％」を意味する。【００６７】
［例１］  
＜Ｓ．ポンベＰＤＣ２遺伝子削除株の作製＞
Ｓ．ポンベのウラシル要求性株ＡＲＣ０１０株（遺伝子型：ｈ− 、ｌｅｕ１−３２、ｕｒａ４−Ｄ１８）（国際公開第２００７／０１５４７０号参照。）をＬａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、国際公開第２００７／０６３９１９号に記載）に従って形質転換し、ＰＤＣ２遺伝子（系統名：ＳＰＡＣ１Ｆ８．０７ｃ）を削除した削除株（ＩＧＦ５４３株）を作製した。
削除断片の作製には、Ｓ．ポンベのＡＲＣ０３２株（遺伝子型：ｈ−）（国際公開第２００７／０１５４７０号参照。）からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示す塩基配列を有する８種の合成オリゴＤＮＡ（オペロン社製）を使用した。【００６８】
【表１】
2014030655.tif 000002
【００６９】
具体的には、ＵＦとＵＲでＵＰ領域を、ＯＦとＯＲでＯＬ領域を、ＤＦとＤＲでＤＮ領域をそれぞれＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって作製したのち、さらにそれらを鋳型として、それぞれＦＦとＦＲを用いた同様のＰＣＲ法によって全長の削除断片を作製した。全長の削除断片作製時には、表２に示す塩基配列を有する２種の合成オリゴＤＮＡ（オペロン社製）を用い、ＡＲＣ０３２株より同様に調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、同様のＰＣＲ法によって調製したｕｒａ４領域断片も鋳型として合わせて使用した。【００７０】
【表２】
2014030655.tif 000003
【００７１】
得られたＳ．ポンベＰＤＣ２遺伝子削除株（ＩＧＦ５４３株、ｈ−  ｌｅｕ１−３２ ｕｒａ４−Ｄ１８  ｐｄｃ２−Ｄ２３）は生育速度が遅いものであった。そこで、その生育速度を回復すべく、ＩＧＦ５４３株をＹＥＳプレート（イーストエキス０．５％／グルコース３％／ＳＰサプリメント）にストリークして２５℃にて培養し、得られたコロニーをＹＰＤ培地（イーストエキス１％／ペプトン２％／グルコース２％）に植え継ぎ２５℃にて培養し、充分に生育した培養液を用いてグリセロールストックを作製し、−８０℃にて保存した。上記作業を適切な生育速度が得られるまで繰り返し、生育速度の回復した株を作製した（名称はＩＧＦ５４３を継承）。【００７２】
［例２］  
＜Ｓ．ポンベＬＤＨ遺伝子１コピー導入株の作製＞
ＨｓＬＤＨ遺伝子、ＬｐＬＤＨ遺伝子、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）のＬＤＨ遺伝子（ＬｂＬＤＨ遺伝子）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢＪ５７７８３）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のＬＤＨ遺伝子（ＬｐｌＬＤＨ遺伝子）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ５９３９０）、ＰａＬＤＨ遺伝子、またはスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のＬＤＨ遺伝子（ＳａＬＤＨ遺伝子）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｑ５ＨＪＤ７）を導入したポンベ形質転換株を作製した。
具体的には、例１で作製したＩＧＦ５４３株（Ｓ．ポンベの遺伝子削除株）を、ＨｓＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＸＬＴ−ＨｓＬＤＨ、ＬｐＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＸＬＴ−ＬｐＬＤＨ、ＬｂＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＸＬＴ−ＬｂＬＤＨ、ＬｐｌＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＸＬＴ−ＬｐｌＬＤＨ、ＰａＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＸＬＴ−ＰａＬＤＨ、またはＳａＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＸＬＴ−ＳａＬＤＨの制限酵素ＢｓｉＷＩ消化物で、Ｂａｈｌｅｒらの方法（Ｙｅａｓｔ誌、１９９８年、１４巻、９４３−９５１頁）に従い形質転換した。【００７３】
ｐＸＬＴ−ＨｓＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、分裂酵母用組込型ベクターｐＸＬ４（Ｉｄｉｒｉｓほか、Ｙｅａｓｔ誌、２００６年、２３巻、８３−９９頁）を制限酵素で二重消化して得られた断片を末端平滑化したのちにライゲーションして得られた分裂酵母用発現ベクターｐＸＬ1（ｄｅｌｔａ−ｎｅｏ）を、さらに制限酵素で二重消化して得られた断片を末端平滑化したのちに、ＡＲＣ０１０株ゲノムよりクローニングしたｔｏｐ２遺伝子断片を挿入して、配列表の配列番号１１にその配列（５’→３’、環状）を示すｐＸＬＴ−ＴＬ２（６３１２ｂｐ、図１）を作製した。【００７４】
つぎに、岡山ベクター（文献：Ｏｋａｙａｍａ，  Ｈ．  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，  Ｐ．：  Ａ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｐｅｒｍｉｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｉｎｓｅｒｔｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３  （１９８３）  ２８０−２８９．）に組込まれたヒト線維芽細胞ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、５’−末端側に制限酵素ＮｃｏＩ認識配列を、３’−末端側に制限酵素ＳａｌＩ認識配列を付加した表３に記載のプライマーセット（ＨｓＬＤＨ−Ｆ、ＨｓＬＤＨ−Ｒ、オペロン社製）を用いて、文献（Ｔｓｕｊｉｂｏほか、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．誌、１９８５年、１４７巻、９−１５頁）に記載のヒトＬ−乳酸脱水素酵素構造遺伝子（ＨｓＬＤＨ−ＯＲＦ）をコードする遺伝子断片を、ＰＣＲによって増幅した。当該ＯＲＦ断片は、ＨｓＬＤＨ（配列番号１４）をコードしていた。【００７５】
【表３】
2014030655.tif 000004
【００７６】
得られた増幅断片を、制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩを用いた二重消化ののち、日本国特開２０００−２６２２８４号公報記載のマルチクローニングベクターｐＴＬ２Ｍ５のＡｆｌＩＩＩ−ＳａｌＩ間に組み込み、ＬＤＨ発現ベクターｐＴＬ２ＨｓＬＤＨを作製した。さらにｐＴＬ２ＨｓＬＤＨより発現カセット（ｈＣＭＶプロモーター／ＨｓＬＤＨ−ＯＲＦ／ＬＰＩターミネ―ター）を制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｓｔ１１０７Ｉを用いた二重消化によって切り出し、ｐＸＬＴ−ＴＬ２に組み込んで、ｐＸＬＴ−ＨｓＬＤＨを作製した。【００７７】
ｐＸＬＴ−ＬｐＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ラクトバチルス・ペントーサスＮＢＲＣ１０６４６７株（ＮＢＲＣ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，  ＮＩＴＥ）より入手）の培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表４に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＬｐＬＤＨ−Ｆ、ＬｐＬＤＨ−Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって、ＬｐＬＤＨ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。当該ＯＲＦ断片は、ＬｐＬＤＨ（配列番号１７）をコードしていた。【００７８】
【表４】
2014030655.tif 000005
【００７９】
得られた増幅断片を、制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩを用いた二重消化ののち、前記ｐＴＬ２Ｍ５のＡｆｌＩＩＩ−ＳａｌＩ間に組み込み、ＬＤＨ発現ベクターｐＴＬ２ＬｐＬＤＨを作製した。さらにｐＴＬ２ＬｐＬＤＨより発現カセット（ｈＣＭＶプロモーター／ＬｐＬＤＨ−ＯＲＦ／ＬＰＩターミネ―ター）を制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｓｔ１１０７Ｉを用いた二重消化によって切り出し、ｐＸＬＴ−ＴＬ２に組み込んで、ｐＸＬＴ−ＬｐＬＤＨを作製した。【００８０】
ｐＸＬＴ−ＬｂＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ラクトバチルス・ブルガリクスＮＢＲＣ１３９５３株（ＮＢＲＣより入手）の培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表５に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＬｂＬＤＨ−Ｆ、ＬｂＬＤＨ−Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって、ＬｂＬＤＨ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。【００８１】
【表５】
2014030655.tif 000006
【００８２】
得られた増幅断片を、制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩを用いた二重消化ののち、前記ｐＴＬ２Ｍ５のＡｆｌＩＩＩ−ＳａｌＩ間に組み込み、ＬＤＨ発現ベクターｐＴＬ２ＬｂＬＤＨを作製した。さらにｐＴＬ２ＬｂＬＤＨより発現カセット（ｈＣＭＶプロモーター／ＬｂＬＤＨ−ＯＲＦ／ＬＰＩターミネ―ター）を制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｓｔ１１０７Ｉを用いた二重消化によって切り出し、ｐＸＬＴ−ＴＬ２に組み込んで、ｐＸＬＴ−ＬｂＬＤＨを作製した。【００８３】
ｐＸＬＴ−ＬｐｌＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ラクトバチルス・プランタラムＮＢＲＣ１５８９１株（ＮＢＲＣより入手）の培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＬｐｌＬＤＨ−Ｆ、ＬｐｌＬＤＨ−Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって、ＬｐｌＬＤＨ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。【００８４】
【表６】
2014030655.tif 000007
【００８５】
得られた増幅断片を、制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩを用いた二重消化ののち、前記ｐＴＬ２Ｍ５のＡｆｌＩＩＩ−ＳａｌＩ間に組み込み、ＬＤＨ発現ベクターｐＴＬ２ＬｐｌＬＤＨを作製した。さらにｐＴＬ２ＬｐｌＬＤＨより発現カセット（ｈＣＭＶプロモーター／ＬｐｌＬＤＨ−ＯＲＦ／ＬＰＩターミネ―ター）を制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｓｔ１１０７Ｉを用いた二重消化によって切り出し、ｐＸＬＴ−ＴＬ２に組み込んで、ｐＸＬＴ−ＬｐｌＬＤＨを作製した。【００８６】
ｐＸＬＴ−ＰａＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ペディオコッカス・アシディラクティシＮＢＲＣ３０７６株（ＮＢＲＣより入手）の培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＰａＬＤＨ−Ｆ、ＰａＬＤＨ−Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって、ＰａＬＤＨ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。【００８７】
【表７】
2014030655.tif 000008
【００８８】
得られた増幅断片を、制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩを用いた二重消化ののち、前記ｐＴＬ２Ｍ５のＡｆｌＩＩＩ−ＳａｌＩ間に組み込み、ＬＤＨ発現ベクターｐＴＬ２ＰａＬＤＨを作製した。さらにｐＴＬ２ＰａＬＤＨより発現カセット（ｈＣＭＶプロモーター／ＰａＬＤＨ−ＯＲＦ／ＬＰＩターミネ―ター）を制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｓｔ１１０７Ｉを用いた二重消化によって切り出し、ｐＸＬＴ−ＴＬ２に組み込んで、ｐＸＬＴ−ＰａＬＤＨを作製した。【００８９】
ｐＸＬＴ−ＳａＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、スタヒロコッカス・アウレウスＮＢＲＣ１０２１３５株（ＮＢＲＣより入手）の培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＳａＬＤＨ−Ｆ、ＳａＬＤＨ−Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によってＳａＬＤＨ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。【００９０】
【表８】
2014030655.tif 000009
【００９１】
得られた増幅断片を、制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩを用いた二重消化ののち、前記ｐＴＬ２Ｍ５のＡｆｌＩＩＩ−ＳａｌＩ間に組み込み、ＬＤＨ発現ベクターｐＴＬ２ＳａＬＤＨを作製した。さらにｐＴＬ２ＳａＬＤＨより発現カセット（ｈＣＭＶプロモーター／ＳａＬＤＨ−ＯＲＦ／ＬＰＩターミネ―ター）を制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｓｔ１１０７Ｉを用いた二重消化によって切り出し、ｐＸＬＴ−ＴＬ２に組み込んで、ｐＸＬＴ−ＳａＬＤＨを作製した。【００９２】
【表９】
2014030655.tif 000010
【００９３】
＜培養試験＞
得られた各形質転換体をＹＰＤ６液体培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース６％）に植菌して、温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で２４時間培養を行った。培養終了後、菌体を回収し、４．５ｍＬの１１．１％グルコース水溶液に初発菌体濃度を３６ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌになるように接種し、温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で３、６または２４時間培養を行い、終了後、培養液中のグルコース、エタノールおよび乳酸の濃度（ｇ／Ｌ）を測定した。測定結果ならびに該測定結果より計算した、乳酸の対糖収率（選択率、％）と生産速度（ｇ／（Ｌ・ｈ））を表１０に示す。【００９４】
【表１０】
2014030655.tif 000011
【００９５】
この結果、ＨｓＬＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ３５０９株と、ＬｐＬＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ３５２１株と、ＰａＬＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ３５１７株では、乳酸産生が確認された。特に、ＡＳＰ３５２１株では、ＡＳＰ３５０９株と同等の高い対糖収率であった。これに対して、ＬｂＬＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ３５７５株、ＬｐｌＬＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ３５１９株、およびＳａＬＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ３５１５株では、乳酸産生は確認されなかった。特にＬｐｌＬＤＨ遺伝子は、ＬｐＬＤＨ遺伝子と同じラクトバチルス属菌由来のＬＤＨ遺伝子であり、かつサッカロミセス・セレビシエに導入することによって乳酸産生株が得られるとされている（特許文献２参照。）にもかかわらず、乳酸産生株が得られなかった。【００９６】
［例３］
＜ＬＤＨ遺伝子２コピー導入株の作製＞
例１で作製したＩＧＦ５４３株の染色体中の２箇所に、同種または異種の生物由来のＬＤＨ遺伝子を導入した形質転換体を作製し、それぞれの乳酸産生能を調べた。
具体的には、まず、例１で作製したＩＧＦ５４３株（Ｓ．ポンベの遺伝子削除株）を、ＨｓＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持したＴｆ２多座組込型組換えベクターｐＴｆ２−ＨｓＬＤＨ、ＬｐＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持したＴｆ２多座組込型組換えベクターｐＴｆ２−ＬｐＬＤＨ、ＬｂＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持したＴｆ２多座組込型組換えベクターｐＴｆ２−ＬｂＬＤＨ、ＬｐｌＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持したＴｆ２多座組込型組換えベクターｐＴｆ２−ＬｐｌＬＤＨ、ＰａＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持したＴｆ２多座組込型組換えベクターｐＴｆ２−ＰａＬＤＨ、またはＳａＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持したＴｆ２多座組込型組換えベクターｐＴｆ２−ＳａＬＤＨを用い、岡崎らの方法（Ｏｋａｚａｋｉほか、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．誌、１９９０年、１８巻、６４８５−６４８９頁）により形質転換し、Ｌｅｕ１座近傍にｈＣＭＶプロモーターによって制御されたＬＤＨ遺伝子が１コピー導入されたＳ．ポンベＬＤＨ遺伝子１コピー導入株を作製した。ＨｓＬＤＨ遺伝子が２コピー導入された株をＡＳＰ２９１４株、ＬｐＬＤＨ遺伝子とＨｓＬＤＨ遺伝子が１コピーずつ導入された株をＡＳＰ３６３１株、ＬｂＬＤＨ遺伝子とＨｓＬＤＨ遺伝子が１コピーずつ導入された株をＡＳＰ３６１９株、ＬｐｌＬＤＨ遺伝子とＨｓＬＤＨ遺伝子が１コピーずつ導入された株をＡＳＰ３６２２株、ＰａＬＤＨ遺伝子とＨｓＬＤＨ遺伝子が１コピーずつ導入された株をＡＳＰ３６２３株、ＳａＬＤＨ遺伝子とＨｓＬＤＨ遺伝子が１コピーずつ導入された株をＡＳＰ３６２１株とした。【００９７】
ｐＴｆ２−ＨｓＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、Ｓ．ポンベの全ゲノムＤＮＡを鋳型として、５’末端側に制限酵素ＢｓｉＷＩの認識配列（ＣＧＴＡＣＧ）を導入した２種の合成オリゴＤＮＡ（Ｔｆ２−２−Ｆ、Ｔｆ２−２−Ｒ、オペロン社製）を使用したＰＣＲ法によって、Ｓ．ポンベのＴｆ２−２（ＧｅｎｅＤＢ収載の系統名ＳＰＡＣ１６７．０８遺伝子）のＤＮＡ断片（約３９５０ｂｐ）を増幅した。増幅ＤＮＡ断片の両末端を制限酵素ＢｓｉＷＩで処理したものを、インサート断片として調製した。
これとは別に、染色体組込み用ベクターｐＸＬ４（Ｉｄｉｒｉｓほか、Ｙｅａｓｔ誌、２３巻、８３−９９頁、２００６年）を同じ制限酵素ＢｓｉＷＩで消化し、アンピシリン耐性遺伝子（ＡｐＲ）と大腸菌の複製起点（ｐＢＲ３２２  ｏｒｉ）を含む領域（約２１３０ｂｐ）のＤＮＡ断片を得、さらに脱リン酸化処理したものを、ベクター断片として調製した。
前記インサート断片とベクター断片とをライゲースを用いて連結した後、大腸菌ＤＨ５（東洋紡社製）への形質転換後、構築ベクターｐＴｆ２−２（６０７１ｂｐ）を得た。
前記構築ベクターｐＴｆ２−２を鋳型として、５’末端側に制限酵素ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩの認識配列を持つ合成オリゴＤＮＡ（ＭＣＳ−Ｔｆ２−２−Ｆ、オペロン社製）と５’末端側に制限酵素ＫｐｎＩ、ＳｔｕＩ、ＸｈｏＩ、ＮｈｅＩの認識配列を持つ合成オリゴＤＮＡ（ＭＣＳ−Ｔｆ２−２−Ｒ、オペロン社製）を使用したＰＣＲ法によって全長を増幅し、６０６０ｂｐの断片を得た。該断片の両末端をＫｐｎＩで消化した後に自己環状化することによって、トランスポゾン遺伝子Ｔｆ２−２配列の内部にさらにマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を持つ６０５８ｂｐのベクターｐＴｆ２（ＭＣＳ）を作製した。
Ｓ．ポンベのウラシル要求性マーカーｕｒａ４（ＧｅｎｅＤＢ収載の系統名ＳＰＣＣ３３０．０５ｃ、オロチジン−５’−リン酸脱炭酸酵素遺伝子）の両端に制限酵素ＫｐｎＩおよびＮｈｅＩの認識配列を付加した断片をＰＣＲ法により作製し、該断片を制限酵素ＫｐｎＩおよびＮｈｅＩを用いて二重消化して得られた２２０６ｂｐの断片と、前記構築ベクターｐＴｆ２（ＭＣＳ）を制限酵素ＫｐｎＩおよびＮｈｅＩを用いて二重消化して得られた６０４０ｂｐの断片とをライゲーションにより連結し、トランスポゾン遺伝子Ｔｆ２−２配列の内部にさらにマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）とｕｒａ４領域を持つ７８１６ｂｐのＴｆ２多座組込型組換えベクターｐＴｆ２（ＭＣＳ）−ｕｒａ４（図２、配列番号３０）を作製した。【００９８】
【表１１】
2014030655.tif 000012
【００９９】
例２で作製したｐＴＬ２ＨｓＬＤＨより発現カセット（ｈＣＭＶプロモーター／ＨｓＬＤＨ−ＯＲＦ／ＬＰＩターミネ―ター）を制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｓｔ１１０７Ｉを用いた二重消化によって切り出し、ｐＴｆ２（ＭＣＳ）−ｕｒａ４の制限酵素ＮｈｅＩ−ＫｐｎＩ（末端平滑化）認識配列間に組み込んで、ｐＴｆ２−ＨｓＬＤＨを作製した。【０１００】
同様にして、例２で作製したｐＴＬ２ＬｂＬＤＨ、ｐＴＬ２ＬｐＬＤＨ、ｐＴＬ２ＬｐｌＬＤＨ、ｐＴＬ２ＰａＬＤＨ、およびｐＴＬ２ＳａＬＤＨより発現カセットを制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｓｔ１１０７Ｉを用いた二重消化によって切り出し、それぞれをｐＴｆ２（ＭＣＳ）−ｕｒａ４の制限酵素ＮｈｅＩ−ＫｐｎＩ（末端平滑化）認識配列間に組み込んで、ｐＴｆ２−ＬｂＬＤＨ、ｐＴｆ２−ＬｐＬＤＨ、ｐＴｆ２−ＬｐｌＬＤＨ、ｐＴｆ２−ＰａＬＤＨ、およびｐＴｆ２−ＳａＬＤＨを作製した。【０１０１】
次いで、作製したＳ．ポンベＬＤＨ遺伝子１コピー導入株を、ＨｓＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬ１７−ＨｓＬＤＨを用い、岡崎らの方法（Ｏｋａｚａｋｉほか、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．誌、１９９０年、１８巻、６４８５−６４８９頁）により形質転換し、Ｌｅｕ１座近傍にｉｈｃプロモーターによって制御されたＨｓＬＤＨ遺伝子をさらに１コピー導入したＳ．ポンベＬＤＨ遺伝子２コピー導入株を作製した。【０１０２】
ｐＳＬ１７−ＨｓＬＤＨは、例２で作製したｐＴＬ２ＨｓＬＤＨより、ＨｓＬＤＨのＯＲＦ断片を制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩを用いた二重消化によって切り出し、以下に示す工程で作製した単座組込型組換えベクターｐＳＬ１７に組み込んで作製した。【０１０３】
単座組込型組換えベクターｐＳＬ１７は、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、公知の分裂酵母用組込型ベクターｐＳＬ６（図３、５９６０ｂｐ、配列番号３１）のｈＣＭＶプロモーター領域を、Ｓ．ポンベのｉｈｃ１遺伝子のプロモーター（ｉｈｃ１プロモーター）と置換することにより、マルチクローニングベクターｐＳＬ１２（図４、５８４７ｂｐ）を作製した。【０１０４】
具体的には、まず、Ｓ．ポンベのｉｈｃ１遺伝子中、ＯＲＦの５’末端（開始コドンＡＴＧのＡ）の上流１〜５０１ｂｐの領域（配列番号３２）を、Ｓ．ポンベの野生株（ＡＲＣ０３２株、ＡＴＣＣ３８３６６、９７２ｈ−相当）由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、５’末端にＢｌｎＩの制限酵素認識配列を備えるフォワードプライマー（ｉｈｃ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｆ）と、５’末端にＫｐｎＩの制限酵素認識配列を備えるリバースプライマー（ｉｈｃ１−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｒ）とを用いたＰＣＲによって増幅し、該領域の５’末端にＢｌｎＩ、３’末端にＫｐｎＩの制限酵素認識配列を備える断片（ｉｈｃプロモーター断片）を得た。
ｐＳＬ６を制限酵素ＢｌｎＩおよびＫｐｎＩで二重消化した断片に、ｉｈｃプロモーター断片を制限酵素ＢｌｎＩおよびＫｐｎＩで二重消化した断片をライゲーションにより組み込み、分裂酵母用組込型ベクターｐＳＬ１２（配列番号３５）を得た。【０１０５】
次いで、ｐＳＬ１２のＬＰＩターミネーター領域を、Ｓ．ポンベのｉｈｃ１遺伝子のターミネーター（ｉｈｃ１ターミネーター）と置換することにより、マルチクローニングベクターｐＳＬ１７（図５、５８３１ｂｐ）を作製した。【０１０６】
具体的には、まず、Ｓ．ポンベのｉｈｃ１遺伝子中、ＯＲＦの３’末端（終止コドンの３文字目）の下流１〜２００ｂｐの領域（配列番号３６）を、Ｓ．ポンベの野生株（ＡＲＣ０３２株、ＡＴＣＣ３８３６６、９７２ｈ−相当）由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎプライマー（ｉｈｃ１−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ−Ｆとｉｈｃ１−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ−Ｒ）を用いたＰＣＲによって増幅し、ｉｈｃターミネーター領域を含む断片（ｉｈｃターミネーター断片）を得た。
ｐＳＬ１２を鋳型とし、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎプライマー（ｐＳＬ１２−ＦとｐＳＬ１２−Ｒ）を用いたＰＣＲによって増幅し、ｐＳＬ１２の全長からＬＰＩターミネーター領域を欠損させた断片を得、当該断片にｉｈｃターミネーター断片をＩｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニングキット（製品名：Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｗ／Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ、タカラバイオ社製）を用いて組み込み、マルチクローニングベクターｐＳＬ１７（配列番号４１）を作製した。【０１０７】
【表１２】
2014030655.tif 000013
【０１０８】
＜ＨｓＬＤＨ遺伝子１コピー導入株の作製＞
作製したＬＤＨ遺伝子２コピー導入株の乳酸産生能を測定する際の比較対象として、ＨｓＬＤＨ遺伝子１コピー導入株を作製した。
具体的には、例１で作製したＩＧＦ５４３株（Ｓ．ポンベの遺伝子削除株）を、ＨｓＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持し、ｉｈｃ１プロモーターを有する単座組込型組換えベクターｐＳＬ１７−ＨｓＬＤＨの制限酵素ＢｓｉＷＩ消化物で、Ｂａｈｌｅｒらの方法（Ｙｅａｓｔ誌、１９９８年、１４巻、９４３−９５１頁）に従い形質転換し、Ｌｅｕ１座近傍にｉｈｃプロモーターによって制御されたＨｓＬＤＨ遺伝子を１コピー導入した形質転換株を作製した。該形質転換株をＡＳＰ３５０９株とした。【０１０９】
＜培養試験＞
例２と同様にして、各株をそれぞれＹＰＤ６液体培地に植菌して培養し、回収した菌体を１１．１％グルコース水溶液中で培養を行い、終了後、培養液中のグルコース、エタノールおよび乳酸の濃度（ｇ／Ｌ）を測定した。培養時間、測定結果ならびに該測定結果より計算した、乳酸の対糖収率（選択率、％）と生産速度（ｇ／（Ｌ・ｈ））を表１３および表１４に示す。【０１１０】
【表１３】
2014030655.tif 000014
【０１１１】
【表１４】
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【０１１２】
この結果、培養時間が３時間経過した時点の乳酸の対糖収率は、ＨｓＬＤＨ遺伝子を１コピーのみ導入したＡＳＰ３５０９株では６８．６％であり、ＨｓＬＤＨ遺伝子を２コピー導入したＡＳＰ２９１４株では７０．５％であり、２コピー株のほうが１コピー株よりもやや乳酸産生能が高くなったことがわかった。これに対して、ＡＳＰ３６１９株、ＡＳＰ３６２２株、ＡＳＰ３６２３株、およびＡＳＰ３６２１株では、いずれもＡＳＰ３５０９株よりも乳酸の対糖収率が低かった。特に、ＬｐｌＬＤＨ遺伝子１コピーと組み合わせたＡＳＰ３６２２株では、明らかにＡＳＰ３５０９株よりも乳酸産生能が低下していた。これに対して、ＨｓＬＤＨ遺伝子１コピーとＬｐＬＤＨ遺伝子１コピーを導入したＡＳＰ３６３１株では、乳酸の対糖収率が８２．５％であり、ＡＳＰ３５０９株やＡＳＰ２９１４株よりも顕著に乳酸産生能が向上していた。【０１１３】
また、乳酸の対糖収率が良好であったＡＳＰ３５０９株、ＡＳＰ２９１４株、およびＡＳＰ３６３１株については、さらに培養を継続したところ、表１３に示すように、ＡＳＰ３５０９株では７２．１％であり、ＡＳＰ２９１４株では７７．０％であり、ＡＳＰ３６３１株では８４．５％であった。【０１１４】
ＨｓＬＤＨ遺伝子とＬｐＬＤＨ遺伝子は、ＩＧＦ５４３株に１コピーのみ導入した場合には、いずれも同程度の乳酸産生能であったにもかかわらず、ＨｓＬＤＨ遺伝子１コピーとＬｐＬＤＨ遺伝子１コピーを導入した株は、ＨｓＬＤＨ遺伝子を２コピー導入した株よりも顕著に乳酸産生能が高かった。この理由は明らかではないが、一の酵母内にＨｓＬＤＨとＬｐＬＤＨが共に存在することにより、何らかの相乗的効果が得られるためではないかと推察される。【０１１５】
＜ジャーファーメンターでの培養試験および試験管発酵試験＞
作製した２コピー導入株であるＡＳＰ３６３１株および国際公開第２０１２／１１４９７９号記載の１コピー導入株であるＡＳＰ３０５４株の乳酸生産能を比較し評価した。より実生産に近い系として、ジャーファーメンターで培養した菌体を用いて発酵試験を実施した。【０１１６】
試験管に入った５ｍＬ ＹＥＳ培地（ｐＨ４．５）に、ＡＳＰ３０５４株またはＡＳＰ３６３１株を植菌し、各株について２０本ずつの試験管を用いて、３２℃で２４時間の振とう培養（前培養）を行った。
次いで、２Ｌジャーファーメンター（２基）を用いて、ＹＰＤ培地各９００ｍＬに、前培養で得られた各菌株の培養液１００ｍＬを加え、３０℃で培養を開始した。１０Ｎ  ＫＯＨの添加制御により、ｐＨを４．５に保った。攪拌回転数は、溶存酸素濃度（ＤＯ）カスケード制御とし、ＤＯを１ｐｐｍに保った。
培地中のグルコースを消費した時点で、培養液を一部抜出し、試験管での発酵試験を実施した。培養試験は５４時間目まで継続した。測定した培養液中のＯＤ６６０値、乳酸、グルコースおよびエタノールの濃度（ｇ／Ｌ）の結果を図６、図７、図８、および図９に示す。【０１１７】
ジャーファーメンター培養結果からＡＳＰ３６３１株は、ＡＳＰ３０５４株と比較して、菌体の増殖速度は若干遅かったが、エタノールは殆ど生産せず、Ｌ−乳酸生産量は２倍を示した。 ＡＳＰ３６３１株では、菌体増殖能は若干低下している傾向があったが、その一方で、グルコースから乳酸への代謝が強化されていることが確認された。【０１１８】
試験管での発酵試験は、ジャーファーメンターから少量抜き出した培養液から菌体を回収し、４．５ｍＬの１１．１質量％グルコース水溶液に初発菌体濃度を３６ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌになるように接種し、温度３２℃、振盪速度１１０ｒｐｍの条件下で７時間発酵を行った。発酵終了後に測定した発酵液中の乳酸、グルコースおよびエタノールの濃度（ｇ／Ｌ）を図１０、図１１、図１２に示す。ならびに、試験管発酵での該測定結果より計算した、発酵培地中のグルコースを全て消費した時点での、乳酸の対糖収率（選択率、％）と生産速度（ｇ／（Ｌ・ｈ））を表１５に示す。【０１１９】
【表１５】
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【０１２０】
ジャーファーメンターでの培養菌体を用いた試験管発酵試験において、ＡＳＰ３６３１株では９０ｇ／Ｌと高い乳酸濃度を示した。より実生産に近い系であるジャーファーメンターでの培養菌体も、問題なく乳酸生産能を有することが確認された。ＡＳＰ３６３１株の乳酸生産速度はＡＳＰ３０５４株と同等であり、乳酸の対糖収率はＡＳＰ３０５４株と比較して１０％程度高い値を示した。対糖収率が向上したことにより、ＡＳＰ３６３１株ではコスト優位性が高まったと考えられた。【０１２１】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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