(57)【要約】  本発明は、キシロースからエタノールを生産する酵母の提供を目的とする。本発明は、ＧＲＥ３（アルド・ケト酵素遺伝子３）、ＳＯＲ１およびＸＫＳ１（キシルロースリン酸化酵素遺伝子）の３つの遺伝子を染色体上に導入した酵母に、ＧＤＨ２（グルタミン酸脱水素酵素遺伝子２）およびＳＯＲ１（ソルビトール脱水素酵素遺伝子１）から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が導入された形質転換酵母、またはＧＲＥ３、ＳＯＲ１およびＸＫＳ１の３つの遺伝子を染色体上に導入した形質転換酵母に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子の３つの遺伝子を染色体上に挿入した形質転換酵母であり、
前記３つの遺伝子が、キシロース還元酵素をコードする遺伝子とキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子とを連結した遺伝子、およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子とキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子とを連結した遺伝子として染色体上に挿入された、前記酵母。
【請求項２】
前記遺伝子が当該酵母の内在性遺伝子である、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
キシロース還元酵素をコードする遺伝子が、ＧＲＥ３、ＹＪＲ０９６ｗ、ＹＰＲ１、ＧＣＹ１、ＡＲＡ１およびＹＤＲ１２４ｗからなる群から選択される遺伝子である、請求項１または２に記載の酵母。
【請求項４】
キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子が、ＳＯＲ１、ＳＯＲ２およびＹＬＲ０７０ｃからなる群からなる群から選択される遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項５】
キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子が、それぞれＧＲＥ３、ＳＯＲ１およびＸＫＳ１である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項６】
キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子の３つの遺伝子を染色体上に挿入した宿主酵母に、グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が発現可能に導入された形質転換酵母。
【請求項７】
前記遺伝子が宿主酵母に由来するものである、請求項６に記載の酵母。
【請求項８】
前記グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が、宿主酵母の染色体上に発現可能に挿入されたものである、請求項６または７に記載の酵母。
【請求項９】
ＧＲＥ３、ＳＯＲ１およびＸＫＳ１の３つの遺伝子を染色体上に挿入した宿主酵母に、ＧＤＨ２およびＳＯＲ１から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が発現可能に導入された、請求項６〜８のいずれか１項に記載の形質転換酵母。
【請求項１０】
キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子の３つの遺伝子を挿入される酵母が、サッカロマイセス属に属する酵母である、請求項１〜９のいずれか１項記載の酵母。
【請求項１１】
キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子の３つの遺伝子を挿入される酵母が、サッカロマイセス・セレビシアである、請求項１〜１０のいずれか１項記載の酵母。
【請求項１２】
キシロースからエタノールを生産する能力を有するものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の形質転換酵母をキシロース含有培地で培養し、得られる培養物からエタノールを採取することを含む、エタノールの生産方法。
【請求項１４】
請求項６〜１２のいずれかに記載の形質転換酵母に導入される、グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が、グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子であるか、または、グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子の両方である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項６〜１２のいずれかに記載の形質転換酵母に導入される、グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子であり、前記培養工程がＮＡＤ＋の存在下において行われる、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キシロースからエタノールを生産する酵母に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、CO2排出削減の観点から、輸送用燃料へのバイオエタノールの利用が注目されている。中でも、バイオエタノール生産方法として、セルロース系バイオマスからの生産が検討されている。セルロース系バイオマスから得られる糖の約三分の一はキシロースが占めることから、バイオマス資源の有効利用のためには、キシロースからエタノールを効率よく生産する微生物の開発が必要である。【０００３】
現在、エタノールの生産には、サッカロマイセス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）に代表される酵母が醸造用酵母として主に使用されている。サッカロマイセス・セレビシアはグルコースやマンノースなどの六炭糖からのエタノール生産能が高く、エタノールに対する高い耐性を有している。しかしながら、サッカロマイセス・セレビシアは、キシロースなどの五炭糖を利用することができない。【０００４】
キシロース資化能を有する酵母としてシファゾマイセス・スティピティス（Scheffersomyces stipitis）が知られている。サッカロマイセス・セレビシアは、シファゾマイセス・スティピティスの有するキシロースを資化するための遺伝子群に対応する遺伝子群を内在するが、サッカロマイセス・セレビシアにおけるこれらの遺伝子の多くは発現していないか、あるいは、発現していたとしてもその量は極めて少ないと考えられている。そのため、キシロース資化性酵母由来の遺伝子導入によるサッカロマイセス・セレビシアの改良が進められている。【０００５】
しかし、これらの遺伝子はサッカロマイセス・セレビシアにとって外来遺伝子であるので、上記の方法で作製した酵母は組換え体に該当し、外界への菌体の漏出を防ぐ手段が必要になるなど、その利用に様々な制約が生じるため好ましいものではない。【０００６】
一方、サッカロマイセス・セレビシアに内在するキシロース資化遺伝子を活性化することにより、キシロース資化能を付与した酵母の作製が検討されている（ＷＯ２０１０／００１９０６号、特許文献１）。この手法を用いて得られた酵母は、酵母自身に由来するキシロース資化遺伝子を利用していることから、遺伝子組換え体ではないという長所を有する。【０００７】
しかしながら、依然としてキシロースからのエタノール生産能をさらに向上させた酵母の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／００１９０６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
キシロース資化能を付与された酵母において、キシロースからのエタノール生産能をさらに向上させた酵母の開発が望まれている。したがって、本発明は、キシロース資化性遺伝子を導入した酵母を改良し、キシロースからエタノールへの生産能に優れた酵母、および副生成物の生産量の少ない酵母を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、酵母染色体上にＧＲＥ３（アルド・ケト還元酵素遺伝子３）、ＳＯＲ１（ソルビトール脱水素酵素遺伝子１）およびＸＫＳ１（キシルロースリン酸化酵素遺伝子１）の３つの遺伝子を導入し、さらに、ＧＤＨ２（グルタミン酸脱水素酵素遺伝子２）およびＳＯＲ１（ソルビトール脱水素酵素遺伝子１）の少なくともいずれかを過剰発現させると、エタノールの生産性の高い酵母が得られること、およびＧＤＨ２過剰発現株では、キシリトールまたはグリセロールなどの副生成物の生成量が減少することを見出した。さらに、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＧＲＥ３とＳＯＲ１との融合遺伝子およびＳＯＲ１とＸＫＳ１との融合遺伝子を酵母染色体上に導入することによっても、エタノールの生産性の高い酵母が得られることを見出した。そして、このようにして得られた酵母は、キシロース利用能が高く、キシロースからエタノールを生産するのに使用できることを見出し、本発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）  キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子の３つの遺伝子を染色体上に挿入した形質転換酵母であり、
前記３つの遺伝子が、キシロース還元酵素をコードする遺伝子とキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子とを連結した遺伝子、およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子とキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子とを連結した遺伝子として染色体上に挿入された、前記酵母。
（２）  前記遺伝子が当該酵母の内在性遺伝子である、（１）に記載の酵母。
（３）  キシロース還元酵素をコードする遺伝子が、ＧＲＥ３、ＹＪＲ０９６ｗ、ＹＰＲ１、ＧＣＹ１、ＡＲＡ１およびＹＤＲ１２４ｗからなる群から選択される遺伝子である、（１）または（２）に記載の酵母。
（４）  キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子が、ＳＯＲ１、ＳＯＲ２およびＹＬＲ０７０ｃからなる群からなる群から選択される遺伝子である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の酵母。
（５）  キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子が、それぞれＧＲＥ３、ＳＯＲ１およびＸＫＳ１である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の酵母。
（６）  酵母がサッカロマイセス属に属する酵母である、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の酵母。
（７）  酵母がサッカロマイセス・セレビシアである、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の酵母。
（８）  キシロースからエタノールを生産する能力を有するものである、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の酵母。
（９）  （１）〜（８）のいずれか１項に記載の形質転換酵母をキシロース含有培地で培養し、得られる培養物からエタノールを採取することを含む、エタノールの生産方法。
また、本発明は以下に関する。
[１]  キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子の３つの遺伝子を染色体上に挿入した宿主酵母に、グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が発現可能に導入された形質転換酵母。
[２]  前記遺伝子が宿主酵母に由来するものである、請求項１に記載の酵母。
[３]  前記グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が、宿主酵母の染色体上に発現可能に挿入されたものである、[１]または[２]に記載の酵母。
[４]  ＧＲＥ３、ＳＯＲ１およびＸＫＳ１の３つの遺伝子を染色体上に挿入した宿主酵母に、ＧＤＨ２およびＳＯＲ１から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が発現可能に導入された、[１]〜[３]のいずれか１項に記載の形質転換酵母。
[５]  キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子の３つの遺伝子を挿入される酵母が、サッカロマイセス属に属する酵母である、[１]〜[４]のいずれか１項記載の酵母。
[６]  キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子の３つの遺伝子を挿入される酵母が、サッカロマイセス・セレビシアである、[１]〜[５]のいずれか１項記載の酵母。
[７]  キシロースからエタノールを生産する能力を有するものである、[１]〜[６]のいずれか１項に記載の酵母。
[８]  [１]〜[７]いずれか１項に記載の形質転換酵母をキシロース含有培地で培養し、得られる培養物からエタノールを採取することを含む、エタノールの生産方法。
[９]  前記形質転換酵母に導入される、グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が、グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子であるか、または、グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子の両方である、[８]に記載の方法。
[１０]前記形質転換酵母に導入される、グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子であり、前記培養工程がＮＡＤ＋の存在下において行われる、[８]に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、キシロースからエタノールを生産可能な形質転換酵母が提供される。
本発明の一態様において、本発明の形質転換酵母は酵母自身の有する遺伝子を使用して形質転換しているために遺伝子組換え体に該当せず、安全性や取り扱いの容易さの点で好ましい。
また、本発明の形質転換酵母は、キシロースからのエタノールへの優れた生産能を有するため、本発明の形質転換酵母を用いれば、キシロースからエタノールを効率よく生産することができる。
また、本発明の形質転換酵母は、キシリトールやグリセロールなどの副生成物の生産量減少が認められたことから、本発明の形質転換酵母を用いてエタノールを生産する際に、副生成物が蓄積するという問題を回避することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に限定されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で当業者であれば適宜変更し実施することができる。
また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１４】
１．本発明の概要
本発明は、酵母自身に由来するキシロース資化内在性遺伝子の活性を高め、キシロース資化能を付与した宿主酵母にソルビトール脱水素酵素遺伝子１（ＳＯＲ１）および／またはグルタミン酸脱水素酵素遺伝子２（ＧＤＨ２）を過剰発現させた形質転換酵母が、優れたエタノール生産能を有するという知見に基づくものである。
また、本発明において、宿主酵母にＧＤＨ２を導入したＧＤＨ２過剰発現株では、キシリトールおよびグリセロールといった副生成物の生産量が減少することが見出された。ＧＤＨ２は、ＮＡＤ＋の還元型であるＮＡＤＨをＮＡＤ＋に変換するグルタミン酸脱水素酵素の遺伝子であるため、ＮＡＤ＋が副生成物の生産抑制に関係することが示された。そのため、宿主酵母にＳＯＲ１を導入したＳＯＲ１過剰発現株をＮＡＤ＋存在下に培養するか、あるいは、宿主酵母にＳＯＲ１とＧＤＨ２とを共発現させることによっても、ＧＤＨ２過剰発現株と同様に副生成物の生産量が減少するといえる。
【００１５】
本発明の形質転換酵母は、キシロース資化遺伝子、好ましくは酵母自身のキシロース資化遺伝子を染色体上に導入された宿主酵母を用いて作製することを特徴の一つとするものである。「キシロース資化（性）遺伝子」とは、キシロースの資化に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。本発明において宿主酵母に導入されるキシロース資化遺伝子は、キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子の少なくとも３つの遺伝子である。
また、本発明の一の態様において、本発明の形質転換酵母は、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子および／またはグルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子、好ましくはソルビトール脱水素酵素遺伝子１（ＳＯＲ１）および／またはグルタミン酸脱水素酵素遺伝子２（ＧＤＨ２）を宿主酵母に導入して作製されることを特徴の一つとするものである。本発明の別の態様において、宿主酵母に導入する遺伝子は宿主酵母に由来する遺伝子である。
また、本発明の別の態様において、本発明の形質転換酵母は、副生成物の生成量が低いという特徴を有するものである。
【００１６】
酵母の中には、キシロース資化酵素群が実質的に機能していない、いわゆる休眠状態にあるために、キシロースなどの五炭糖資化能を有さない酵母が存在する。例えば、サッカロマイセス属に属する酵母は、キシロース資化酵素群をコードする遺伝子群を有しているにもかかわらず、キシロースを利用してエタノールを生産することができない。
【００１７】
このようなエタノール生産能を有さないとされる酵母に、自身由来のキシロース資化性遺伝子を導入することで、キシロース資化内在性遺伝子の活性を高め、キシロース資化能を付与することができる。したがって、本発明の形質転換酵母は、キシロース還元酵素をコードする遺伝子（ＸＲ）、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子（ＸＤＨ）およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子（ＸＫ）が染色体上に挿入された酵母であってもよい。そして、自身由来のキシロース資化性遺伝子を導入した酵母に、さらにソルビトール脱水素酵素遺伝子１（ＳＯＲ１）および／またはグルタミン酸脱水素酵素遺伝子２（ＧＤＨ２）を過剰発現させた形質転換酵母は、驚くべきことに対照株と比較して、キシロースからのエタノールの生産能が向上する。また、所定の培養条件下において副生成物の生成量が減少する。すなわち、本発明により、エタノール生産能を有さないとされる酵母において、キシロースを利用してエタノールを効率よく生産させることができる。さらにまた、前記３種の遺伝子をＸＲとＸＤＨとの融合遺伝子およびＸＤＨとＸＫとの融合遺伝子として染色体に導入した本発明の形質転換酵母は、キシロースからのエタノールの生産能が向上する。当該融合遺伝子の形態とすることにより、上記３つの遺伝子の中、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子（ＸＤＨ）の酵母染色体への導入数を増加させることができる。
【００１８】
また、本発明は、上記形質転換酵母を培養し、得られる培養物からエタノールを採取することによるエタノールの生産方法も提供する。本発明では、生産させる副生成物の量を従来の方法に比べて格段に少なくすることが可能である。
【００１９】
２．本発明の形質転換酵母
本発明の形質転換酵母は、キシロース資化性遺伝子を染色体上に導入した宿主酵母に、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびグルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子、好ましくはソルビトール脱水素酵素遺伝子１（ＳＯＲ１）およびグルタミン酸脱水素酵素遺伝子２（ＧＤＨ２）から選ばれる少なくとも１つの遺伝子をさらに発現可能に導入された酵母である。
また、本発明の形質転換酵母は、キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子を染色体上に挿入した酵母であってもよい。
【００２０】
（１）キシロース資化性遺伝子を染色体上に導入した宿主酵母
本発明において、遺伝子導入または形質転換の対象となる酵母は、キシロースなどの五炭糖の資化能を有していない酵母であることが好ましい。前記酵母は遺伝子導入または形質転換の前に五炭糖資化能を有していないものであればよく、グルコースなどの六炭糖の資化能を有していてもよい。「五炭糖資化能」は、キシロースなどの五炭糖を炭素源として生育する能力をいう。五炭糖資化能を有する酵母は、炭素源として五炭糖のみを添加した培地中で生育可能であるため、五炭糖資化能は、炭素源として五炭糖のみを添加した培地中における酵母の生育程度を600 nmまたは660 nmなどの波長での濁度を測定することで確認することができる。
【００２１】
本発明において、五炭糖資化能を有していない酵母は、特に限定されるわけではないが、例えば、サッカロマイセス属に属する酵母などを挙げることができる。サッカロマイセス属に属する酵母としては、CEN.PK2-1C株などのサッカロマイセス・セレビシアを挙げることができる。また、本発明において、遺伝子導入または形質転換の対象となる酵母は１倍体だけでなく２倍体の酵母を使用することができる。２倍体の酵母は実用酵母として優れており、例えば協会７号などの協会系酵母、焼酎酵母Ｓ−２株などの焼酎酵母、ワイン酵母、Red Star株、Taiken No.396株などを挙げることができる。
【００２２】
また、本発明において、遺伝子導入または形質転換の対象となる酵母は、エタノールへの耐性を備えた醸造用酵母であることが好ましく、そのような酵母としては、特に限定されるわけではないが、サッカロマイセス属に属する酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシア）などを挙げることができる。
【００２３】
したがって、本発明において遺伝子導入または形質転換の対象となる酵母は、好ましくはサッカロマイセス属に属する酵母、より好ましくはサッカロマイセス・セレビシアである。
【００２４】
本発明において、宿主酵母の染色体上に挿入されるキシロース資化性遺伝子は、キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子であり、好ましくはＧＲＥ３（アルド・ケト還元酵素遺伝子３）、ＳＯＲ１（ソルビトール脱水素酵素遺伝子１）およびＸＫＳ１（キシルロースリン酸化酵素遺伝子）の３つの遺伝子である。本発明において当該キシロース資化性遺伝子は、外来の遺伝子または内在性の遺伝子のいずれも使用できるが、内在性の遺伝子であることが好ましい。「内在性遺伝子」とは、遺伝子挿入対象の酵母の有する遺伝子、遺伝子挿入対象の酵母由来の遺伝子、遺伝子挿入対象の酵母と同種の酵母由来の遺伝子を意味する。したがって、内在性遺伝子を導入された酵母は組換え体に該当しない。
【００２５】
酵母のキシロース還元酵素をコードする遺伝子として、ＧＲＥ３、ＹＪＲ０９６ｗ、ＹＰＲ１、ＧＣＹ１、ＡＲＡ１およびＹＤＲ１２４ｗが知られている。したがって、本発明において、キシロース還元酵素をコードする遺伝子として、ＧＲＥ３、ＹＪＲ０９６ｗ、ＹＰＲ１、ＧＣＹ１、ＡＲＡ１またはＹＤＲ１２４ｗを使用することができる。本明細書ではＧＲＥ３をキシロース還元酵素をコードする遺伝子の例に挙げて説明するが、ＹＪＲ０９６ｗ、ＹＰＲ１、ＧＣＹ１、ＡＲＡ１およびＹＤＲ１２４ｗは、ＧＲＥ３に関する本明細書での記載を適用し、本発明において同様に使用することができる。
【００２６】
ＧＲＥ３、ＹＪＲ０９６ｗ、ＹＰＲ１、ＧＣＹ１、ＡＲＡ１およびＹＤＲ１２４ｗの塩基配列情報は、当業者であれば、Genbankなどの公知のデータベースから入手することができる。以下にサッカロマイセス・セレビシアにおける各遺伝子の配列情報についてのアクセッション番号を示す。
ＧＲＥ３：Ｕ０００５９、ＹＪＲ０９６ｗ：Z49596、ＹＰＲ１：X80642、ＧＣＹ１：X13228、ＡＲＡ１：M95580、ＹＤＲ１２４ｗ：Z48758。
【００２７】
本発明において、ＧＲＥ３（アルド・ケト還元酵素遺伝子３）は、アルド・ケト還元酵素をコードする塩基配列を含む遺伝子であり、例えばサッカロマイセス・セレビシア由来の配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡである。ＧＲＥ３がコードするタンパク質は、酵母においてキシロース還元酵素としても機能することが知られている。
本発明において、ＧＲＥ３は、例えば、配列番号１で示される塩基配列を基にプライマーを設計し、酵母ライブラリー又はゲノムライブラリーから遺伝子増幅技術により得ることができる。
【００２８】
本発明で使用されるＧＲＥ３は、ＧＲＥ３タンパク質の変異体をコードする遺伝子を含む。ＧＲＥ３タンパク質の変異体をコードする遺伝子は、例えば、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキシロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む。キシロース還元酵素活性については後述する。
【００２９】
ＧＲＥ３タンパク質の変異体をコードするＤＮＡは、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーの作製方法については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th ed.」（Cold Spring Harbor Press（2012））等を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。
【００３０】
ここで、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件として、例えば、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば、「1×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、50℃」等の条件を挙げることができる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法によって行うことができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th ed.」（Cold Spring Harbor Laboratory Press（2012））、「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons（1987-1997））等を参照することができる。
【００３１】
また、本明細書において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡには、例えば、配列番号１で示される塩基配列と少なくとも50％以上、好ましくは70％以上、80％以上または85％以上、より好ましくは90％以上、95％以上、96％以上、97％以上または98％以上、さらに好ましくは99％以上、さらに一層好ましくは99.7％以上、特に好ましくは99.9％の同一性（相同性）を有する塩基配列を含むＤＮＡが含まれる。同一性を示す値は、BLASTなどの公知のプログラムを利用することにより算出することができる。
【００３２】
また、配列番号１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、例えば、配列番号１で示される塩基配列において１個又は数個の核酸に欠失、置換又は付加などの変異の生じた塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。このようなＤＮＡとしては、例えば、(i) 配列番号１で示される塩基配列中の１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が欠失したＤＮＡ、(ii) 配列番号１で示される塩基配列中の１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が他の塩基に置換したＤＮＡ、(iii) 配列番号１で示される塩基配列中に１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が付加したＤＮＡおよび(iv) それらの変異が組み合わされたＤＮＡであって、かつキシロース還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
【００３３】
本発明において、塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Sanger et al.（1977）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463）等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
【００３４】
本発明において、例えばサッカロマイセス・セレビシア由来のＧＲＥ３（アルド・ケト還元酵素遺伝子３）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものも含まれる。本発明では、サッカロマイセス・セレビシア由来のＧＲＥ３タンパク質又はそれらの変異体をコード遺伝子も、ＧＲＥ３（アルド・ケト還元酵素遺伝子３）に含まれる。
【００３５】
ＧＲＥ３タンパク質の変異体は、(i) 配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したタンパク質、(ii) 配列番号２で示されるアミノ酸配列中の１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したタンパク質、(iii) 配列番号２で示されるアミノ酸配列中に１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加したタンパク質および(iv) それらの変異が組み合わされたタンパク質であって、かつキシロース還元酵素活性を有するタンパク質などが挙げられる。
【００３６】
ここで、「キシロース還元酵素活性」とは、ＮＡＤ＋（またはＮＡＤＰ＋）の存在下でキシロースをキシリトールに変換する活性を意味する。本発明において、ＧＲＥ３タンパク質の変異体は、キシロース還元酵素活性を有する限り、その活性の程度に特に限定されないが、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の約１０％以上の活性を有していればよい。タンパク質の有するキシロース還元酵素活性は、公知の方法で測定することができる。
【００３７】
酵母は、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子として、ＳＯＲ１、ＳＯＲ２およびＹＬＲ０７０ｃを有することが知られている。したがって、本発明において、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子として、ＳＯＲ１、ＳＯＲ２またはＹＬＲ０７０ｃを使用することができる。本明細書ではＳＯＲ１をキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子の例に挙げて説明するが、ＳＯＲ２およびＹＬＲ０７０ｃはＳＯＲ１に関する本明細書での記載を適用し、本発明において同様に使用することができる。
【００３８】
ＳＯＲ１、ＳＯＲ２およびＹＬＲ０７０ｃの塩基配列情報は、当業者であれば、Genbankなどの公知のデータベースから入手することができる。以下にサッカロマイセス・セレビシアにおける各遺伝子の配列情報についてのアクセッション番号を示す。
ＳＯＲ１：L11039、ＳＯＲ２：Z74294、ＹＬＲ０７０ｃ：Z73242。
【００３９】
本発明において、ＳＯＲ１（ソルビトール脱水素酵素遺伝子１）は、ソルビトール脱水素酵素をコードする塩基配列を含む遺伝子であり、例えばサッカロマイセス・セレビシア由来の配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡである。ＳＯＲ１がコードするタンパク質は、酵母においてキシリトール脱水素酵素としても機能することが知られている。
【００４０】
本発明で使用されるＳＯＲ１は、ＳＯＲ１タンパク質の変異体をコードする遺伝子を含む。ＳＯＲ１タンパク質の変異体をコードする遺伝子は、例えば、サッカロマイセス・セレビシア由来の配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキシリトール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む。
また、本発明で使用されるＳＯＲ１は、以下のＳＯＲ１タンパク質の変異体をコードする遺伝子であってもよい：(i) 配列番号４で示されるアミノ酸配列中の１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したタンパク質、(ii) 配列番号４で示されるアミノ酸配列中の１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したタンパク質、(iii) 配列番号４で示されるアミノ酸配列中に１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加したタンパク質および(iv) それらの変異が組み合わされたタンパク質であって、かつキシリトール脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【００４１】
ここで「キシリトール脱水素酵素活性」は、キシリトールをキシルロースに脱水素化する活性を意味する。本発明において、ＳＯＲ１タンパク質の変異体は、キシリトール脱水素酵素活性を有する限り、その活性の程度に特に限定されないが、例えば配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の約１０％以上の活性を有していればよい。タンパク質の有するキシリトール脱水素酵素活性は、公知の方法で測定することができる。
【００４２】
上記ハイブリダイズするＤＮＡに含まれるＤＮＡ、およびハイブリダイズの条件等は、前述の説明が同様に適用できる。また、本発明において、ＳＯＲ１は、ＧＲＥ３に対して記載された方法と同様の方法により取得または製造することができる。
【００４３】
キシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子として、ＸＫＳ１（キシルロースリン酸化酵素遺伝子１）を使用することができる。ＸＫＳ１の塩基配列情報は、当業者であれば、Genbankなどの公知のデータベースから入手することができる。例えば、サッカロマイセス・セレビシアのＸＫＳ１のアクセッション番号は、Z72979である。
【００４４】
本発明において、ＸＫＳ１（キシルロースリン酸化酵素遺伝子１）は、キシルロースリン酸化酵素をコードする塩基配列を含む遺伝子であり、例えばサッカロマイセス・セレビシア由来の配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡである。
【００４５】
本発明で使用されるＸＫＳ１は、ＸＫＳ１タンパク質の変異体をコードする遺伝子を含む。ＸＫＳ１タンパク質の変異体をコードする遺伝子は、例えば、サッカロマイセス・セレビシア由来の配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキシルロースリン酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む。
また、本発明で使用されるＸＫＳ１は、以下のＸＫＳ１タンパク質の変異体をコードする遺伝子であってもよい：(i) 配列番号６で示されるアミノ酸配列中の１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したタンパク質、(ii) 配列番号６で示されるアミノ酸配列中の１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したタンパク質、(iii) 配列番号６で示されるアミノ酸配列中に１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加したタンパク質および(iv) それらの変異が組み合わされたタンパク質であって、かつキシルロースリン酸化酵素活性を有するタンパク質。
【００４６】
ここで「キシルロースリン酸化酵素活性」は、キシルロースをリン酸化する活性を意味する。本発明において、ＸＫＳ１タンパク質の変異体は、キシルロースリン酸化酵素活性を有する限り、その活性の程度に特に限定されないが、例えば配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の約１０％以上の活性を有していればよい。タンパク質の有するキシルロースリン酸化酵素活性は、公知の方法で測定することができる。
【００４７】
上記ハイブリダイズするＤＮＡに含まれるＤＮＡ、およびハイブリダイズの条件等は、前述の説明が同様に適用できる。また、本発明において、ＸＫＳ１は、ＧＲＥ３に対して記載された方法と同様の方法により取得または製造することができる。
【００４８】
本発明において、キシロース資化遺伝子であるＧＲＥ３、ＳＯＲ１およびＸＫＳ１の３つの遺伝子を酵母の染色体上に挿入することにより、本発明の宿主酵母を得ることができる。上記キシロース資化内因性遺伝子を酵母の染色体上に挿入することにより、酵母自身のキシロース還元酵素、キシリトール脱水素酵素およびキシルロースリン酸化酵素の活性が遺伝子導入前よりも向上し、当該酵母にキシロース資化能を付与することが可能になる。
【００４９】
本発明では、非組換え酵母が宿主酵母として好ましく採用される。非組換え酵母を作製するにあたり、酵母染色体上に導入されるキシロース資化性遺伝子は、当該酵母と同種由来の遺伝子であることが必要である。また、遺伝子を導入される酵母は、当該遺伝子の由来と同種の酵母であることが必要である。
【００５０】
本発明において、キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子の３つの遺伝子、好ましくはＧＲＥ３、ＳＯＲ１およびＸＫＳ１の３つの遺伝子を、好ましくは同種の酵母の染色体上に挿入する。これらの遺伝子は、それぞれの遺伝子を個別に染色体上に挿入してもよいし、またはプロモーターの支配下にタンデムに連結した発現カセットを作製して染色体上に挿入してもよい。タンデムに連結する場合、３つの遺伝子の配置の順番は特に限定されず、考えられる組合せのいずれでも良い。また、ＧＲＥ３、ＳＯＲ１およびＸＫＳ１の３つの遺伝子を含むプラスミドを用いて酵母の染色体上に遺伝子を導入しても良い。上記３つの遺伝子は、一つのプラスミドに含まれてもよいし、それぞれ別のプラスミドに含まれてもよい。また、挿入されるそれぞれの遺伝子の個数は限定されず、１個または複数である。染色体への遺伝子の導入の順は特に限定されない。
キシロース資化性遺伝子の３遺伝子は、キシロース還元酵素をコードする遺伝子（ＸＲ）とキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子（ＸＤＨ）とをタンデムに連結させた遺伝子、およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子（ＸＤＨ）とキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子（ＸＫ）とをタンデムに連結させた遺伝子として酵母の染色体に挿入してもよい。すなわち、本発明は、前記３種のキシロース資化性遺伝子を、キシロース還元酵素をコードする遺伝子とキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子とを連結した遺伝子、およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子とキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子とを連結した遺伝子として染色体上に挿入された、形質転換酵母を含む。例えば、ＧＲＥ３−ＳＯＲ１の融合遺伝子を含むプラスミド、およびＳＯＲ１−ＸＫＳ１の融合遺伝子を含むプラスミドを用いて、酵母の染色上にキシロース資化性遺伝子を導入することができる。融合遺伝子内の遺伝子の配置の順は特に限定されず、例えば、ＸＲとＸＤＨとを連結した遺伝子は、ＸＲ−ＸＤＨまたはＸＤＨ−ＸＲのいずれでもよい。同様に、ＸＤＨとＸＫとを連結した遺伝子は、ＸＤＨ−ＸＫでもよいし、ＸＫ−ＸＤＨでもよい。上記連結させた遺伝子カセットを用いると、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子（ＳＯＲ１）の発現量が特に増加する。このような形質転換酵母は、特に優れたキシロース資化能を有し、キシロールからエタノールを効率よく生成することができる。
【００５１】
また、遺伝子を挿入する染色体の位置は、酵母内で機能していない部位が好ましく、例えば、ＸＹＬ２部位（Genbankアクセッション番号Z73242）、ＨＸＴ１３部位、ＨＸＴ１７部位などが挙げられるがこれらに限定されない。遺伝子をコードしていない染色体上の部位に挿入することも可能である。遺伝子をコードしていない染色体上の部位としてTy因子の１つであるδ配列が挙げられる。δ配列は、酵母の染色体上に複数（約１００コピー）存在することが知られている。酵母染色体におけるδ配列の位置および配列情報は、公知である（例えば、Science 265, 2077 (1994)）。例えばδ配列の途中にキシロース資化性遺伝子を挿入したプラスミドを酵母に導入することで、染色体上の目的の位置に１または複数コピー当該遺伝子を挿入することができる。またδ配列のほかに同じくTy因子であるσ配列、τ配列に挿入することもできる。またＮＴＳ２などのリボソーム遺伝子部位に挿入することもできる。
【００５２】
遺伝子を染色体上に挿入するためのカセットまたはプラスミドの作製、染色体上での挿入位置の選択、あるいは染色体への挿入（例えば、酢酸リチウム法）は、当業者であれば、公知の方法に基づき適宜実施することができる。本発明は、ＧＲＥ３、ＳＯＲ１およびＸＫＳ１の３つの遺伝子をプロモーターの支配下にタンデムに連結した発現カセットまたはプラスミドを含む。このようなプラスミドの例として、プロモーター（例えばPGKプロモーター）の支配下にＧＲＥ３とＳＯＲ１とを連結したプラスミド、またはプロモーターの支配下にＳＯＲ１とＸＫＳ１とを連結したプラスミドなどが挙げられる。２つの遺伝子は、染色体に挿入された際にそれぞれの遺伝子が発現可能となるように連結される。２つの遺伝子を連結し、融合遺伝子を作製する際に必要であれば、リンカー配列や制限酵素部位等を適宜付加してもよい。これらの操作は、当分野でよく知られている慣用の遺伝子操作技術を用いて行うことができる。これらのプラスミドを用いることによって、３種のキシロース資化性遺伝子を酵母の染色体上に導入してもよい。
また、本発明で使用されるプラスミドは、酵母の染色体に遺伝子を導入可能なものであれば、特に限定されず、例えばpUC18などの市販のベクターを使用することができる。
五炭糖資化能を有していない酵母は、キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子の３つの遺伝子を全て発現しないと、キシロース利用能が付与されない。したがって、上記のように遺伝子導入した酵母をキシロース含有（エタノール不含）培地で培養することにより、形質転換酵母を選択することができる。
【００５３】
このように、ＧＲＥ３、ＳＯＲ１およびＸＫＳ１の３つの遺伝子を酵母の染色体上に導入することで、本発明における宿主酵母を作製することができる。
本発明の宿主酵母は、好ましくは内在性のキシロース資化遺伝子、すなわち、内在性のＧＲＥ３、ＳＯＲ１およびＸＫＳ１の３つの遺伝子を染色体上に含むため、ＧＲＥ３、ＳＯＲ１およびＸＫＳ１の発現が活性化され得る。ここで、「キシロース資化遺伝子の発現が活性化される」とは、宿主酵母内に存在する当該遺伝子が、発現可能な形で活性化され、目的タンパク質を適切に発現できる状態となっていることを意味する。また、本発明の宿主酵母では、キシロース資化遺伝子の発現が活性化され得るため、キシロース資化能を獲得し得る。したがって、本発明の宿主酵母は、キシロース資化能が付与された酵母、好ましくはキシロース資化能が付与された醸造用酵母であり得る。
【００５４】
（２）本発明の形質転換酵母
本発明の形質転換酵母は、前述の宿主酵母に、グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子、好ましくはＧＤＨ２（グルタミン酸脱水素酵素遺伝子２）および前述のＳＯＲ１（ソルビトール脱水素酵素遺伝子１）から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が発現可能に導入された酵母である。
【００５５】
本発明において、グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子として、ＧＤＨ２（グルタミン酸脱水素酵素遺伝子２）を使用することができる。ＧＤＨ２は補酵素としてＮＡＤを利用する酵素である。
【００５６】
ＧＤＨ２の塩基配列情報は、当業者であれば、Genbankなどの公知のデータベースから入手することができる。サッカロマイセス・セレビシアにおけるＧＤＨ２のアクセッション番号は、S66436である。
【００５７】
本発明において、ＧＤＨ２（グルタミン酸脱水素酵素遺伝子２）は、グルタミン酸脱水素酵素をコードする塩基配列を含む遺伝子であり、例えば、例えばサッカロマイセス・セレビシア由来の配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡである。
【００５８】
本発明で使用されるＧＤＨ２は、ＧＤＨ２タンパク質の変異体をコードする遺伝子を含む。ＧＤＨ２タンパク質の変異体をコードする遺伝子は、例えば、サッカロマイセス・セレビシア由来の配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタミン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む。
また、本発明で使用されるＧＤＨ２は、以下のＧＤＨ２タンパク質の変異体をコードする遺伝子であってもよい：(i) 配列番号８で示されるアミノ酸配列中の１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したタンパク質、(ii) 配列番号８で示されるアミノ酸配列中の１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したタンパク質、(iii) 配列番号８で示されるアミノ酸配列中に１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加したタンパク質および(iv) それらの変異が組み合わされたタンパク質であって、かつグルタミン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【００５９】
ここで「グルタミン酸脱水素酵素活性」は、グルタミン酸とα-ケトグルタル酸とを相互変換する活性を意味する。本発明において、ＧＤＨ２タンパク質の変異体は、グルタミン酸脱水素酵素活性を有する限り、その活性の程度に特に限定されないが、例えば配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の約１０％以上の活性を有していればよい。タンパク質の有するグルタミン酸脱水素酵素活性は、公知の方法で測定することができる。
【００６０】
上記ハイブリダイズするＤＮＡに含まれるＤＮＡ、およびハイブリダイズの条件等は、前述の説明が同様に適用できる。また、本発明において、ＧＤＨ２は、上記方法と同様の方法により取得または製造することができる。
【００６１】
本発明において、宿主酵母に導入されるＳＯＲ１に代えて、キシリトール脱水素酵素活性を有する前述のＳＯＲ２またはＹＬＲ０７０ｃを用いることもできる。ＳＯＲ２およびＹＬＲ０７０ｃはＳＯＲ１に関する本明細書での記載を適用し、本発明において同様に使用することができる。
【００６２】
本発明の宿主細胞に導入される遺伝子は、宿主酵母に内在性の遺伝子配列であることが好ましいが、外来性の遺伝子であってもよい。
【００６３】
本発明において、宿主酵母にＳＯＲ１が発現可能に導入される。また、本発明において、宿主酵母にＧＤＨ２が発現可能に導入される。また、本発明において、ＳＯＲ１とＧＤＨ２の両方が宿主酵母に発現可能に導入される。遺伝子導入は、対象遺伝子を発現可能な形で含有するプラスミドを用いて行うことができる。ＳＯＲ１とＧＤＨ２の両方を宿主酵母に導入する場合、ＳＯＲ１とＧＤＨ２は、一つのプラスミドに含まれてもよいし、それぞれ別のプラスミドに含まれてもよい。本発明はこれら遺伝子を含有するプラスミドを含む。
【００６４】
本発明で使用されるプラスミドは、酵母発現用のベクターに上記遺伝子を発現可能に挿入することで作製することができる。ベクターへの遺伝子の挿入は、リガーゼ反応、トポイソメラーゼ反応などを利用することができる。例えば、精製したＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片を、ベクター中の適当な制限酵素部位またはマルチクローニングサイトなどに挿入することでベクターに連結する方法などを採用することができる。
【００６５】
本発明で使用されるプラスミドは、その基本となるベクターの由来には特に限定されず、例えば、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどを使用することができる。例えば、pGADT7、pAUR135などの市販のベクターを使用することもできる。
【００６６】
本発明のプラスミドは、目的遺伝子を発現させ得る限り、マルチクローニングサイト、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、選択マーカーカセットなどを含んでもよい。また、ＤＮＡを挿入する際に必要であれば、適宜リンカーや制限酵素部位を付加してもよい。これらの操作は、当分野でよく知られている慣用の遺伝子操作技術を用いて行うことができる。
【００６７】
プロモーターは、目的遺伝子の上流に組み込むことができる。プロモーターは、形質転換体において目的タンパク質を適切に発現できるものであれば、特に限定されないが、PGKプロモーター、ADHプロモーター、TDHプロモーター、ENOプロモーターなどを使用することができる。
ターミネーターは、目的遺伝子の下流に組み込むことができる。
本発明において、酵母で目的遺伝子を効率よく発現させるために、PGKプロモーター及び／又はPGKターミネーターを用いることが好ましい。
【００６８】
選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ロイシン合成酵素遺伝子、ウラシル合成酵素遺伝子などを挙げることができる。
ベクターにロイシン、ヒスチジン、トリプトファンなどのアミノ酸合成遺伝子カセット又はウラシル合成遺伝子カセットが含まれる場合は、当該アミノ酸又はウラシルを含まない培地で酵母を培養することにより、形質転換酵母を選択することができる。
【００６９】
本発明のプラスミドを遺伝子導入対象の本発明の宿主酵母に導入することで、形質転換酵母を作製することができる。
【００７０】
宿主酵母に本発明のプラスミドを導入する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法などの公知の方法が挙げられる。これらの方法により、本発明の形質転換酵母が提供される。
【００７１】
また、本発明は、相同組換えによりＧＤＨ２（グルタミン酸脱水素酵素遺伝子２）およびＳＯＲ１（ソルビトール脱水素酵素遺伝子１）が宿主酵母の染色体上に組み込まれた形質転換酵母もその範囲に含む。宿主酵母の染色体上に遺伝子が挿入される場合、挿入部位は特に限定はされない。また、ＧＤＨ２およびＳＯＲ１を宿主酵母の染色体上に発現可能に挿入する方法としては、限定はされず、公知の遺伝子組換え技術を利用した方法等を用いることができる。
【００７２】
さらに、本発明の形質転換酵母としては、宿主細胞の有するＧＤＨ２またはＳＯＲ１の発現が活性化されたものであってもよい。すなわち、本発明は、宿主酵母の染色体上にもともと存在するＧＤＨ２の発現量が増大した酵母、または宿主酵母の染色体上にもともと存在するＳＯＲ１もしくは宿主酵母に導入したＳＯＲ１の発現量が増大した酵母も含むものである。ＧＤＨ２またはＳＯＲ１は、外部からプロモーターを導入すること、又は当該遺伝子自身の持つプロモーターをより強力なプロモーターに置換すること等によって、発現可能な形で活性化され、目的タンパク質を適切に発現し得る。
【００７３】
このように内在性遺伝子の発現を活性化させる方法としては、限定はされないが、目的タンパク質を適切に発現できるプロモーターを、公知の遺伝子組換え技術を用いて、染色体上に遺伝子置換により組み込む方法等が挙げられる。遺伝子置換の方法としては、Akada et al. Yeast 23: 399-405 (2006)（非特許文献）の方法を用いることができる。置換するプロモーターとしては、PGKプロモーター、ADHプロモーター、TDHプロモーター、ENOプロモーター等の公知のプロモーターを使用することができる。
【００７４】
３．エタノールの生産方法
本発明の形質転換酵母は、キシロース資化能を付与された宿主酵母にグルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子、例えばＳＯＲ１および／またはＧＤＨ２を導入したものであるため、本発明の形質転換酵母はキシロースの資化能を有する。また、本発明の形質転換酵母は、キシロースからエタノールを生産することが可能である。
また、本発明の宿主酵母は、キシロース資化能を付与された酵母であるため、キシロースからエタノールを生産することが可能である。特に、キシロース還元酵素をコードする遺伝子とキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子とを連結させた遺伝子、およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子とキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子とを連結させた遺伝子の両方を酵母染色体に導入した形質転換酵母は、キシロースからエタノールを生産することに特に適している。以下、本発明の形質転換酵母を例に挙げてエタノールの生産方法を説明するが、キシロースの資化能を有する本発明の形質転換酵母についても、同様にエタノールの生産方法に用いることができる。
【００７５】
本発明の形質転換酵母は、酵母の培養に用いられる通常の方法に従って培養することができる。当業者であれば、SD培地、SCX培地、YPD培地、YPX培地などの公知の培地から適切な培地を選択し、好ましい培養条件の下で酵母を培養することができる。液体培地で酵母を培養する場合は、振盪培養が好ましい。
【００７６】
本発明の形質転換酵母を培養し、得られる培養物からエタノールを採取することにより、エタノールを生産させることができる。
エタノールを生産させる場合、キシロースの10〜150 g/L、好ましくは70 g/Lの存在下に本発明の形質転換酵母を培養する。本培養の前に、形質転換酵母を前培養しても良い。前培養は、例えば、本発明の形質転換酵母を少量の培地に接種し、12〜24時間培養すればよい。本培養の培養量の0.1〜10％、好ましくは1％の前培養液を本培養の培地に加え、本培養を開始する。本培養は、キシロース含有培地で、0.5〜200時間、好ましくは10〜150時間、より好ましくは24〜137時間、20〜40℃、好ましくは30℃で振盪培養する。
【００７７】
生産されたエタノールは、上記のように本発明の酵母を培養して得られる培養物から採取することができる。培養物とは、培養液（培養上清）、培養酵母または培養酵母の破砕物等を意味する。エタノールは公知の精製方法により培養物から精製し、採取することができる。本発明において、エタノールは形質転換酵母から主に培養上清中に分泌されるため、培養上清から採取することが好ましい。
【００７８】
エタノールの生産量は、培地に含まれるエタノールを液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、市販のエタノール測定キットで分析することで測定できる。
また、エタノールの生産量を測定することにより、本発明の形質転換酵母のエタノール生産能を確認することができる。
【００７９】
本発明の形質転換酵母として、本発明の宿主酵母にグルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換酵母（例えば、ＧＤＨ２を導入したＧＤＨ２過剰発現株）、あるいは本発明の宿主酵母にグルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子の両方を導入した形質転換酵母（例えば、ＧＤＨ２およびＳＯＲ１の両方を導入したＧＤＨ２およびＳＯＲ１過剰発現株）を用いてエタノールを生産する場合、対照株と比較して副生成物であるキシリトールおよびグリセロールの生産量が減少する。
【００８０】
また、本発明の形質転換酵母として、本発明の宿主酵母にキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換酵母（例えば、ＳＯＲ１を導入したＳＯＲ１過剰発現株）を用いる場合は、ＮＡＤ＋の存在下にキシロース含有培地で培養することにより、対照株と比較して副生成物であるキシリトールおよびグリセロールの生産量が減少し得る。ＮＡＤ＋は、最終濃度が０．０１〜１００００μＭ、好ましくは０．１〜１０００μＭ、より好ましくは１〜１００μＭとなるようにキシロース含有培地に添加すればよい。
ＮＡＤ＋は培養の全期間において培養系に存在させてもよいし、培養の一定期間にのみ存在させることもできる。したがって、例えば、ＮＡＤ＋は、培養の開始前に培養系に添加してもよいし、培養開始から所定時間経過後に培養系に添加してもよい。
【００８１】
キシリトールおよびグリセロールの生産量は、培地に含まれるキシリトールまたはグリセロールを液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、市販の測定キットで分析することで測定できる。
また、キシリトールおよびグリセロールの生産量を測定することにより、本発明の形質転換酵母の副生成物生産抑制能やエタノール生産効率を確認することができる。
【００８２】
配列番号１：サッカロマイセス・セレビシアＧＲＥ３の塩基配列を示す。
配列番号２：サッカロマイセス・セレビシアＧＲＥ３タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号３：サッカロマイセス・セレビシアＳＯＲ１の塩基配列を示す。
配列番号４：サッカロマイセス・セレビシアＳＯＲ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号５：サッカロマイセス・セレビシアＸＫＳ１の塩基配列を示す。
配列番号６：サッカロマイセス・セレビシアＸＫＳ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号７：サッカロマイセス・セレビシアＧＤＨ２の塩基配列を示す。
配列番号８：サッカロマイセス・セレビシアＧＤＨ２タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００８３】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例で使用した酵母は、すべてサッカロマイセス・セレビシアである。
【００８４】
[酵素活性測定]
ＧＲＥ３（アルドケト還元酵素３）のキシロース還元酵素活性、ＳＯＲ１（ソルビトール脱水素酵素１）のキシリトール脱水素酵素活性、およびＸＫＳ１（キシルロースリン酸酵素１）のキシルロースリン酸酵素活性を、以下の条件で測定した。
粗抽出液は、酵母培養菌体からY-PER Protein Extraction Reagent（Pierce）を用いて調製した。
以下に示す組成の反応液を調製後、３０℃で５分静置し、吸光度を測定した。GRE3およびXKS1についてはNADHの酸化に基づく340nmの吸光度の減少を測定し、SOR1についてはNAD＋の還元に基づく340nmの吸光度の増加を測定することによって活性を測定した。
反応液の組成は以下のとおりである。
アルドケト還元酵素（GRE3）:  
50mM リン酸ナトリウム緩衝液  pH 6.8
0.2mM NADPH
100mM D−キシロース
粗抽出液
ソルビトール脱水素酵素(SOR1): 
50mM Tris-HCl pH8.5
1mM NAD+
5mM MgCl2
100mM キシリトール
粗抽出液
キシルロースリン酸化酵素(XKS1):  
20mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH 6.8
100mM KCl
5mM MgCl2
5mM ATP
0.2mM NADH
1mM ホスホエノールピルビン酸
5U/ml ピルビン酸キナーゼ
7U/ml 乳酸脱水素酵素
5mM キシルロース
粗抽出液
【実施例１】
【００８５】
１．キシロース資化能付与酵母の作製
醸造用酵母のキシロース資化内在性遺伝子GRE3（アルド・ケト還元酵素遺伝子：キシロース還元酵素遺伝子の代替として利用）、SOR1（ソルビトール脱水素酵素遺伝子：キシリトール脱水素酵素遺伝子の代替として利用）およびXKS1（キシルロースリン酸化酵素遺伝子）を、PGK1プロモーター支配下にタンデムに連結した発現カセットを作製した。作製した発現カセットを用いて上記遺伝子を染色体上XYL2部位に導入し、キシロース資化能付与醸造用酵母を得た。【００８６】
２．過剰発現株の作製
市販の発現ベクターpAUR135（タカラバイオ株式会社）に、PGK1プロモーター支配下に置いたSOR1またはGDH2（グルタミン酸脱水素酵素遺伝子）を組み込んだ。得られた組換えベクターを用いて、上記１．で作製したキシロース資化能付与醸造用酵母の染色体上AUR1部位にSOR1またはGDH2を導入した。得られた株をそれぞれSOR1過剰発現株およびGDH2過剰発現株とした。また、ベクターのみを組み込んだ株を同様に作製し、以下の実験で対照株として用いた。【００８７】
３．発酵性評価
上記２．で作製した株は、YPD（グルコース2％含有）で前培養した後、5％キシロースを含む改変CBS培地（非特許文献H. B. Klinke et al., Biotechnol. Bioeng., 81, 738 （2003）：pH 5.0）15 mlを含む50 ml容三角フラスコで、初期植菌量OD600 ＝ 20、30℃、140 rpmで旋回培養し、経時的にサンプリングを行い、発酵性を評価した。発酵代謝物は、Shodex SUGAR SP0810カラムを用い、HPLCにより定量した。菌体濃度は、分光光度計（λ＝600nm）で測定した。【００８８】
４．発酵性評価結果
結果を表１に示す。SOR1過剰発現株は、対照株と比べてキシロース消費速度は変わらず、エタノール生成量に向上が認められ、副生物のキシリトールおよびグリセロールの生成量はわずかに低下した。GDH2過剰発現株は、副生物のキシリトールおよびグリセロールの生成量が減少し、また、エタノール生成量が向上した。【００８９】
【表１】
2014058034.tif 000002
【実施例２】
【００９０】
１．染色体導入用ベクターの作製
市販ベクターpUC18をEcoRIおよびKpnIで切断し、酵母（協会７号）染色体より増幅したδ配列前半部分（1〜240bp）を導入した。得られたベクターをPstIおよびSphIで切断し、同じく酵母（協会７号）より増幅したδ配列後半部分（241〜334bp）を導入し、ベクターpUC-δを得た。pUC-δをSmaIで切断し、PGK1プロモーター支配下に２つの遺伝子をタンデムに連結したGRE3-SOR1およびXKS1-SOR1断片を導入し、それぞれpUC-δ-GRE3-SOR1ベクターおよびpUC-δ-XKS1-SOR1ベクターを得た。GRE3、SOR1およびXKS1の各遺伝子は、協会７号由来である。【００９１】
２．キシロース資化能付与酵母の作製
１．で得られたpUC-δ-GRE3-SOR1およびpUC-δ-XKS1-SOR1ベクターをStuIで切断し、直鎖状の断片とした後、等量ずつ混ぜ、酢酸リチウム法により焼酎酵母S-2株に導入した。遺伝子断片を導入した酵母の培養液を、アミノ酸を含んだSD-キシロース寒天プレート（キシロース5％）に塗布し、30℃で7〜10日間インキュベーションし、染色体組込み株（改良株Ａ〜Ｇ）を得た。SC-X（キシロース5％）液体培地で形質転換株を培養し（2ml/15ml培養チューブ、140rpm, 30℃）、生育の良好な株について、培養評価をおこなった。
また、対照株として、PGK1プロモーター支配下にタンデムに連結したGRE3-SOR1-XKS1をXYL2部位に導入し、キシロース資化能付与酵母（XYL2株）を作製した。この酵母（XYL2株）についても培養評価を行った。【００９２】
３．発酵性評価
上記２．で作製した株は、YPD（グルコース2％含有）で前培養した後、表２に示す組成の培地15 mLを含む50 mL容三角フラスコで、初期植菌量OD600 = 20、30℃、140 rpmで旋回培養し、経時的にサンプリングを行い、発酵性を評価した。発酵代謝物は、Shodex SUGAR SP0810カラムを用い、HPLCにより定量した。菌体濃度は、分光光度計で測定した。【００９３】
【表２】
2014058034.tif 000003
【００９４】
４．発酵性評価結果
結果を表３に示す。上記の手法により作製した改良株Ａ〜Ｇは、高いエタノール収率を示した。改良株Ａ〜Ｇは、PGK1プロモーター支配下にタンデムにGRE3-SOR1-XKS1をXYL2部位に導入して作製したキシロース資化能付与酵母（XYL2株）と比べ、エタノール生成量の向上が認められた。【００９５】
【表３】
2014058034.tif 000004
【実施例３】
【００９６】
実施例２と同様の方法で、協会７号酵母について試験を行った。
協会７号酵母から得られたGRE3、SOR1およびXKS1の各遺伝子を用いて、実施例２  １．と同様の方法でpUC-δ-GRE3-SOR1ベクターおよびpUC-δ-XKS1-SOR1ベクターを得た。得られたpUC-δ-GRE3-SOR1およびpUC-δ-XKS1-SOR1ベクターおよび酵母（協会７号）を用いて、実施例２  ２．と同様の方法でキシロース資化能付与酵母を作製した（改良株Ｈ〜Ｍ）。【００９７】
改良株Ｈ〜Ｍについて、発酵性評価を実施例２  ３．と同様の方法で行った。実施例１と同様の方法で作製したＳＯＲ１過剰発現株（協会７号）、および対照株としてPGK1プロモーター支配下にタンデムに連結したGRE3-SOR1-XKS1をXYL2部位に導入して作製したXYL2株（協会７号）についても発酵性評価を行った。【００９８】
結果を表４に示す。ＳＯＲ１過剰発現株および改良株Ｈ〜Ｍは、対照株に比べて高いエタノール収率を示した。特に、改良株Ｈ〜Ｍは、エタノールの生産量のより良い向上が認められた。【００９９】
【表４】
2014058034.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明により、キシロースからエタノールを生産可能な形質転換酵母が提供される。
本発明の一態様において、本発明の形質転換酵母は酵母自身の有する遺伝子を使用して形質転換しているために遺伝子組換え体に該当せず、安全性や取り扱いの容易さの点で好ましい。
また、本発明の形質転換酵母は、キシロースからのエタノールへの優れた生産能を有するため、本発明の形質転換酵母を用いれば、キシロースからエタノールを効率よく生産することができる。
また、本発明の形質転換酵母は、キシリトールやグリセロールなどの副生成物の生産量減少が認められたことから、本発明の形質転換酵母を用いてエタノールを生産する際に、副生成物が蓄積するという問題を回避することができる。
【配列表】
2014058034000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年7月15日(2015.7.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子の３つの遺伝子を染色体上に発現可能に挿入した形質転換酵母であり、
前記酵母はキシロースからエタノールを生産する能力を有し、
前記３つの遺伝子が、キシロース還元酵素をコードする遺伝子とキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子とを連結した遺伝子、およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子とキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子とを連結した遺伝子として染色体上に挿入され、
前記キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子が、ＳＯＲ１およびＳＯＲ２からなる群から選択される遺伝子である、前記酵母。
【請求項２】
前記遺伝子が当該酵母の内在性遺伝子である、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
キシロース還元酵素をコードする遺伝子が、ＧＲＥ３、ＹＪＲ０９６ｗ、ＹＰＲ１、ＧＣＹ１、ＡＲＡ１およびＹＤＲ１２４ｗからなる群から選択される遺伝子である、請求項１または２に記載の酵母。
【請求項４】
キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子が、それぞれＧＲＥ３、ＳＯＲ１およびＸＫＳ１である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項５】
キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子の３つの遺伝子を染色体上に発現可能に挿入した宿主酵母に、グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が発現可能に導入された形質転換酵母であり、
前記キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子が、ＳＯＲ１およびＳＯＲ２からなる群から選択される遺伝子であり、
キシロースからエタノールを生産する能力を有する前記酵母。
【請求項６】
前記遺伝子が宿主酵母に由来するものである、請求項５に記載の酵母。
【請求項７】
前記グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が、宿主酵母の染色体上に発現可能に挿入されたものである、請求項５または６に記載の酵母。
【請求項８】
ＧＲＥ３、ＳＯＲ１およびＸＫＳ１の３つの遺伝子を染色体上に挿入した宿主酵母に、ＧＤＨ２およびＳＯＲ１から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が発現可能に導入された、請求項５〜７のいずれか１項に記載の形質転換酵母。
【請求項９】
キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子の３つの遺伝子を挿入される酵母が、サッカロマイセス属に属する酵母である、請求項１〜８のいずれか１項記載の酵母。
【請求項１０】
キシロース還元酵素をコードする遺伝子、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシルロースリン酸化酵素をコードする遺伝子の３つの遺伝子を挿入される酵母が、サッカロマイセス・セレビシアである、請求項１〜９のいずれか１項記載の酵母。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の形質転換酵母をキシロース含有培地で培養し、得られる培養物からエタノールを採取することを含む、エタノールの生産方法。
【請求項１２】
請求項５〜１０のいずれかに記載の形質転換酵母に導入される、グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が、グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子であるか、または、グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子の両方である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項５〜１０のいずれかに記載の形質転換酵母に導入される、グルタミン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびキシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が、キシリトール脱水素酵素をコードする遺伝子であり、前記培養工程がＮＡＤ＋の存在下において行われる、請求項１１に記載の方法。
【国際調査報告】
2014058034.tif 000006
2014058034.tif 000007
2014058034.tif 000008
2014058034.tif 000009