(57)【要約】本発明は、ｈＤｌｋ−１と特異的に反応しｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗体（抗ｈＤｌｋ−１抗体、特にヒト型化抗体）、当該抗体の断片、当該抗体を産生するハイブリドーマ、当該抗体又は抗体断片と薬剤との複合体、当該抗体等を含む医薬組成物、腫瘍治療剤、腫瘍診断剤、腫瘍細胞のアポトーシス誘導剤、腫瘍の治療方法、腫瘍の検出方法、腫瘍細胞のアポトーシス誘導方法、腫瘍の検出用及び／又は診断用キット、並びに腫瘍細胞のアポトーシス誘導用キット等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号３５、４０、６９、７３、７７、８１、８５及び８９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなり、Ｌ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号４５に示されるアミノ酸配列からなる、ヒトＤｌｋ−１に対する抗体。
【請求項２】
抗体がｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有するものである、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
腫瘍が、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌、ヒト膵臓癌、ヒト小細胞肺癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項２記載の抗体。
【請求項４】
抗体がヒト型化抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
抗体がモノクローナル抗体である、求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
配列番号２に示されるヒトＤｌｋ−１のアミノ酸配列中の、第２４番目〜第９１番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部と結合するものである、求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体に由来する抗体断片。
【請求項８】
配列番号３５、４０、６９、７３、７７、８１、８５及び８９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項７記載の抗体断片。
【請求項９】
配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項７記載の抗体断片。
【請求項１０】
配列番号３５、４０、６９、７３、７７、８１、８５及び８９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、配列番号４５に示されるアミノ酸配列とを含むものである、請求項７記載の抗体断片。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物とを含む、抗体−薬剤複合体。
【請求項１２】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載の抗体断片と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物とを含む、抗体断片−薬剤複合体。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の抗体断片、及び請求項１１又は１２記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
腫瘍の治療に用いるものである、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
体重減少の副作用を有さないものである、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
腫瘍の診断に用いるものである、請求項１３記載の組成物。
【請求項１７】
腫瘍細胞のアポトーシス誘導に用いるものである、請求項１３記載の組成物。
【請求項１８】
腫瘍が、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌、ヒト膵臓癌、ヒト小細胞肺癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の抗体断片、及び請求項１１又は１２記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍治療剤。
【請求項２０】
体重減少の副作用を有さないものである、請求項１９記載の治療剤。
【請求項２１】
腫瘍が、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌、ヒト膵臓癌、ヒト小細胞肺癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１９又は２０記載の治療剤。
【請求項２２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の抗体断片、及び請求項１１又は１２記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍細胞のアポトーシス誘導剤。
【請求項２３】
腫瘍が、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌、ヒト膵臓癌、ヒト小細胞肺癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項２２記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項２４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の抗体断片、及び請求項１１又は１２記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を、患者に投与することを含む、腫瘍の治療方法。
【請求項２５】
患者において体重減少の副作用を有さないものである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の抗体断片、及び請求項１１又は１２記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種と、生体から採取された試料とを反応させ、反応した抗体及び／又は抗体断片のシグナルを検出することを含む、腫瘍の検出方法。
【請求項２７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の抗体断片、及び請求項１１又は１２記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を、患者に投与することを含む、腫瘍細胞のアポトーシス誘導方法。
【請求項２８】
腫瘍が、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌、ヒト膵臓癌、ヒト小細胞肺癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の抗体断片、及び請求項１１又は１２記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍の治療用、診断用又は検出用キット。
【請求項３０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の抗体断片、及び請求項１１又は１２記載の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍細胞のアポトーシス誘導用キット。
【請求項３１】
腫瘍が、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌、ヒト膵臓癌、ヒト小細胞肺癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項２９又は３０記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍活性を有する抗ヒトＤｌｋ−１抗体、特にｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗ヒトＤｌｋ−１抗体に関する。また本発明は、当該抗体を産生するハイブリドーマ、及び当該抗体の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＤｌｋ−１（ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  １  ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）；以下「ｈＤｌｋ−１」ということがある。）は、全長３８３アミノ酸残基の１回膜貫通型の１型膜タンパク質であり、細胞外領域に６つのＥＧＦ様モチーフを有する。その細胞外領域は、Ｎｏｔｃｈ／Ｄｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅファミリーと相同性を示す。ｈＤｌｋ−１遺伝子は、ＧＲＰ（ｇａｓｔｒｉｎ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）応答性の肺小細胞癌由来細胞株で発現する分子（非特許文献１）あるいは前脂肪細胞の分化を抑制する因子としてクローニングされた（非特許文献２）。ｈＤｌｋ−１は、細胞分化制御因子であるＮｏｔｃｈレセプターのリガンドであるＤｅｌｔａとのアミノ酸配列の相同性から、ＤＬＫ１という遺伝子シンボルで称されるのが一般的であり、その他に、Ｐｒｅｆ−１（非特許文献２）、ｐＧ２（非特許文献３）、ＳＣＰ−１（非特許文献４）及びＺＯＧ（非特許文献５）といった複数の遺伝子シンボルを持つが、これらは基本的に同一分子である。
また、ｈＤｌｋ−１は、細胞外領域の細胞膜近傍が未同定のプロテアーゼにより切断され、血液中に分泌される。遊離ｈＤｌｋ−１（ｈＤｌｋ−１細胞外領域）は、２２５〜２６２アミノ酸残基のＦＡ−１（Ｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−１）（非特許文献６）と呼ばれる糖タンパク質と同一の分子である。
ｈＤｌｋ−１遺伝子及びその遺伝子産物は、未分化で増殖能の高い胎児細胞で高発現を示す。特に、胎児肝臓、胎児腎臓、胎児骨格筋、胎児脳などで高い発現を示すが、出生後はほとんどの組織で発現が認められなくなり、正常な成体組織においては副腎、胎盤、下垂体に限局している（特許文献１、非特許文献２）。
さらに、成体組織においても、未分化な幹細胞や前駆細胞と考えられている細胞には、ｈＤｌｋ−１の発現が認められる。例えば、成体肝臓における未分化で多分化能を有する肝オーバル細胞（非特許文献７、８）、骨／軟骨／脂肪細胞の幹細胞である間葉系幹細胞（非特許文献９）、及び前立腺の基底細胞層の前立腺上皮前駆細胞（非特許文献１８）において、ｈＤｌｋ−１の発現が報告されている。また、マウスの間葉系幹細胞においては、遊離Ｄｌｋ−１（マウスＤｌｋ−１細胞外領域）がＥＲＫ／ＭＡＰキナーゼを活性化し、Ｓｏｘ−９の発現を誘導することによって、脂肪細胞への分化を抑制し、同時に軟骨細胞への分化を誘導するが、骨芽細胞への分化と軟骨細胞の成熟に対してはそれらを抑制することが報告されている（非特許文献１９、２０）。これらのことから、ｈＤｌｋ−１は、組織幹細胞の性質、例えば未分化能の維持等、に関与していることが示唆される。
このような、胎児期の細胞や幹細胞に限局しているｈＤｌｋ−１の発現様式や、ＥＧＦ様モチーフを有する遺伝子／遺伝子産物のファミリー（Ｎｏｔｃｈ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｎｏｔｃｈ  ｌｉｇａｎｄ（Ｄｅｌｔａ，Ｊａｇｇｅｄ，ｓｅｒｒａｔｅ）など）は、一般にＥＧＦ様モチーフを介する細胞間相互作用により、細胞の増殖や分化を制御することから、ｈＤｌｋ−１もそのような機能を有することが示唆されている。事実、脂肪前駆細胞の分化にともない、発現が低下し、また脂肪前駆細胞にｈＤｌｋ−１遺伝子を強制発現させると脂肪分化が抑制されることがよく知られている（非特許文献２）。しかしながら、現時点において、ｈＤｌｋ−１と相互作用する分子（リガンド）についての詳細は不明である。
一方、ｈＤｌｋ−１遺伝子及びその遺伝子産物は、様々な癌や腫瘍でも高頻度で発現していることが報告されている。現在までに、その発現が確認されている癌の種類としては、固形癌では、神経内分泌腫瘍、神経芽細胞腫、神経膠腫、１型神経線維腫症、小細胞肺癌、肝臓癌、腎臓癌、卵巣癌、大腸癌、乳癌及び膵臓癌が知られており（特許文献１、２、４、５、及び、非特許文献１、３、１０、１１、１２、１３、１４、２１）、血液癌では、骨髄異形成症候群（特許文献３、及び、非特許文献１５、１６）及び急性骨髄性白血病（非特許文献１６）が知られている。赤白血病細胞株（ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ）であるＫ５６２細胞にｈＤｌｋ−１遺伝子を導入すると細胞増殖が亢進されること（非特許文献１６）、同様に、グリア芽種細胞にｈＤｌｋ−１遺伝子を導入すると、細胞増殖の亢進に加えて、細胞の接触阻止が失われ、足場非依存的な細胞増殖能を獲得することが報告されており、ｈＤｌｋ−１と発癌との関連性が示唆されている（非特許文献１７）。
従来、ヒトの肝癌細胞に対し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて補体存在下で細胞傷害活性を示す抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体としては、ラット抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体である１Ｃ１、４Ｃ４及び３１Ｃ４（クローン名）が知られているが（特許文献１）、一方で、これらクローン抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（ヒト癌細胞担癌マウスにおける治療モデル）における抗腫瘍活性（腫瘍成長阻害活性）を示さないことも知られている（特許文献４、５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ  ２００５／０５２１５６
【特許文献２】ＷＯ  ０２／０８１６２５
【特許文献３】特開２００１−２６９１７４号
【特許文献４】ＷＯ  ２００８／０５６８３３
【特許文献５】ＷＯ  ２００９／１１６６７０
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｌａｂｏｒｄａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２６８（６），ｐ．３８１７−３８２０（１９９３）
【非特許文献２】Ｓｍａｓ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．７３（４），ｐ．７２５−７３４（１９９３）
【非特許文献３】Ｈｅｌｍａｎ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８４，ｐ．２３３６−２３３９（１９８７）
【非特許文献４】Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ，Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｄ１６８４７（１９９３）
【非特許文献５】Ｈａｌｄｅｒ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１３９，ｐ．３３１６−３３２８（１９９８）
【非特許文献６】Ｆａｙ，Ｔ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２９，ｐ．７３−８５（１９８８）
【非特許文献７】Ｔａｎｉｍｉｚｕ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ，ｖｏｌ．５，ｐ．２０９−２１８（２００４）
【非特許文献８】Ｊｅｎｓｅｎ，ＣＨ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，ｖｏｌ．１６４（４），ｐ．１３４７−１３５９（２００４）
【非特許文献９】Ａｂｄａｌｌａｈ，Ｂ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１９（５），ｐ．８４１−８５２（２００４）
【非特許文献１０】Ｊｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，ｖｏｌ．１４０（６），ｐ．１０５４−１０５９（１９９９）
【非特許文献１１】Ｊｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２０（５），ｐ．２５６−２６２（１９９９）
【非特許文献１２】Ｙｉｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，ｖｏｌ．２４（４），ｐ．１０１１−１０１５（２００４）
【非特許文献１３】Ｙｉｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２５（１３），ｐ．１８５２−１８６１（２００６）
【非特許文献１４】Ｆｕｋｕｚａｗａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，ｖｏｌ．５８，ｐ．１４５−１５０（２００６）
【非特許文献１５】Ｍｉｙａｚａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．９８，ｐ．４２２−４２７（２００１）
【非特許文献１６】Ｓａｋａｊｉｒｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，ｖｏｌ．１９（８），ｐ．１４０４−１４１０（２００５）
【非特許文献１７】Ｙｉｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２５（１３），ｐ．１８５２−１８６１（２００６）
【非特許文献１８】Ｃｅｄｅｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．５４（６），ｐ１３４４−１３５３（２００８）
【非特許文献１９】Ｓｕｌ，ＨＳ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，ｖｏｌ．２３（１１），ｐ１７１７−１７２５（２００９）
【非特許文献２０】Ｗａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．３０（１４），ｐ３４８０−３４９２（２０１０）
【非特許文献２１】Ｙａｎａｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１４８（１），ｐ８５−９２（２０１０）
【発明の概要】
【０００５】
上述したように、ｈＤｌｋ−１の発現は正常組織では胎児期の細胞や幹細胞に限局しているが癌組織では種々の腫瘍で高頻度に発現していること、及びｈＤｌｋ−１が細胞膜タンパク／分泌タンパクであることから、ｈＤｌｋ−１は、各種腫瘍の治療等において良い標的になると考えられる。そして、このｈＤｌｋ−１を標的とする場合、抗ｈＤｌｋ−１抗体が有用であると考えられる。また、例えば癌治療用抗体として用いるためには、ヒト癌細胞を用いた担癌マウス治療モデルにおいて抗体単独投与で顕著な抗腫瘍活性を示すことに加えて、液剤処方中及びヒト又はサルの血中において安定的な抗原結合活性の保持能を有するものであることがより望ましい。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、抗腫瘍活性を有する抗ｈＤｌｋ−１抗体、具体的にはｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体、特に当該抗体であってヒト型化抗体であるものを提供することにある。また、当該抗体を産生するハイブリドーマ、当該抗体と薬剤との複合体等を提供することにある。さらに、上記抗体や上記複合体等を用いる、腫瘍の診断用又は治療用医薬組成物、腫瘍細胞のアポトーシス誘導用医薬組成物、腫瘍治療剤、腫瘍診断剤、腫瘍細胞のアポトーシス誘導剤、腫瘍の治療方法、腫瘍の検出方法、腫瘍細胞のアポトーシス誘導方法、腫瘍の検出用又は診断用キット、並びに腫瘍細胞のアポトーシス誘導用キット等を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、ｈＤｌｋ−１と特異的に反応する抗体（特に抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体）であって抗腫瘍活性を有する抗体（特に、ヒト型化抗体）を見出し、これらがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗腫瘍活性を有することを確認した。また、このような抗体としてヒト型化抗体の作製にも成功した。さらに、これら抗体及び複合体が、腫瘍の治療、診断及び検出、並びに腫瘍細胞のアポトーシス誘導に有用であることも見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｈ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号３５、４０、６９、７３、７７、８１、８５及び８９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなり、Ｌ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号４５に示されるアミノ酸配列からなる、ヒトＤｌｋ−１に対する抗体。
上記（１）の抗体は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有するものが挙げられる。ここで、腫瘍としては、例えば、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌、ヒト膵臓癌、ヒト小細胞肺癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
上記（１）の抗体は、例えば、ヒト型化抗体であるものが挙げられる。
上記（１）の抗体は、例えば、モノクローナル抗体であるものが挙げられる。
上記（１）の抗体は、例えば、配列番号２に示されるヒトＤｌｋ−１のアミノ酸配列中の、第２４番目〜第９１番目のアミノ酸からなる領域の少なくとも一部と結合するものが挙げられる。
（２）上記（１）の抗体に由来する抗体断片。
上記（２）の抗体断片は、例えば、配列番号３５、４０、６９、７３、７７、８１、８５及び８９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むもの、及び、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含むもの、並びに、配列番号３５、４０、６９、７３、７７、８１、８５及び８９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と配列番号４５に示されるアミノ酸配列とを含むものが挙げられる。
（３）上記（１）の抗体と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物とを含む、抗体−薬剤複合体。
（４）上記（２）の抗体断片と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物とを含む、抗体断片−薬剤複合体。
（５）上記（１）の抗体、上記（２）の抗体断片、及び上記（３）又は（４）の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、医薬組成物。
上記（５）の医薬組成物は、例えば、腫瘍の治療に用いるものが挙げられ、特に、体重減少の副作用を有さないものが挙げられる。また、上記（５）の医薬組成物は、例えば、腫瘍の診断に用いるものが挙げられる。さらに、上記（５）の医薬組成物は、例えば、腫瘍細胞のアポトーシス誘導に用いるものが挙げられる。
（６）上記（１）の抗体、上記（２）の抗体断片、及び上記（３）又は（４）の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍治療剤。
上記（６）の腫瘍治療剤は、例えば、体重減少の副作用を有さないものが挙げられる。
（７）上記（１）の抗体、上記（２）の抗体断片、及び上記（３）又は（４）の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍細胞のアポトーシス誘導剤。
ここで、上記（５）の医薬組成物、上記（６）の腫瘍治療剤、及び上記（７）のアポトーシス誘導剤において、腫瘍としては、例えば、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌、ヒト膵臓癌、ヒト小細胞肺癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
（８）上記（１）の抗体、上記（２）の抗体断片、及び上記（３）又は（４）の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を、患者に投与することを含む、腫瘍の治療方法。
上記（８）の治療方法は、例えば、患者において体重減少の副作用を有さないものが挙げられる。
（９）上記（１）の抗体、上記（２）の抗体断片、及び上記（３）又は（４）の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種と、生体から採取された試料とを反応させ、反応した抗体及び／又は抗体断片のシグナルを検出することを含む、腫瘍の検出方法。
（１０）上記（１）の抗体、上記（２）の抗体断片、及び上記（３）又は（４）の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種と、生体から採取された試料とを反応させ、反応した抗体及び／又は抗体断片のシグナルを検出することを含む、腫瘍細胞のアポトーシス誘導方法。
ここで、上記（８）の治療方法、上記（９）の検出方法、及び上記（１０）のアポトーシス誘導方法において、腫瘍としては、例えば、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌、ヒト膵臓癌、ヒト小細胞肺癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
（１１）上記（１）の抗体、上記（２）の抗体断片、及び上記（３）又は（４）の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍の治療用、診断用又は検出用キット。
（１２）上記（１）の抗体、上記（２）の抗体断片、及び上記（３）又は（４）の複合体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、腫瘍細胞のアポトーシス誘導用キット。
ここで、上記（１１）及び（１２）のキットにおいて、腫瘍としては、例えば、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌、ヒト膵臓癌、ヒト小細胞肺癌及びヒト神経芽細胞腫からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、マウス抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体クローンＢＡ−１−３ＤのＨ鎖（重鎖）可変領域（ＶＨ）のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１２）と推定アミノ酸配列（配列番号１３）を示す図である。アミノ酸残基は一文字表記で示し、シグナルペプチド（当該推定アミノ酸配列のＮ末端から１９アミノ酸からなるペプチド）はイタリックで表している。二重下線を引いたグルタミン（Ｑ）は、ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨの成熟ペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示す。ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨの成熟ペプチドのｃＤＮＡ塩基配列は配列番号１４に示し、その推定アミノ酸配列は配列番号１５に示す。ＣＤＲ配列（下線を付した配列）は、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，Ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）の定義に従った。ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨのＣＤＲ１（ＤＹＡＭＨ）、ＣＤＲ２（ＶＩＳＴＹＹＧＮＴＮＹＮＱＫＦＫＧ）及びＣＤＲ３（ＧＧＬＲＥＹＹＹＡＭＤＹ）のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号１６〜１８に示す。
図２は、マウス抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体クローンＢＡ−１−３ＤのＬ鎖（軽鎖）可変領域（ＶＬ）のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号１９）と推定アミノ酸配列（配列番号２０）を示す図である。アミノ酸残基は一文字表記で示し、シグナルペプチド（当該推定アミノ酸配列のＮ末端から２０アミノ酸からなるペプチド）はイタリックで表している。二重下線を引いたアスパラギン酸（Ｄ）は、ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬの成熟ペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示す。ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬの成熟ペプチドのｃＤＮＡ塩基配列は配列番号２１に示し、その推定アミノ酸配列は配列番号２２に示す。ＣＤＲ配列（下線を付した配列）は、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，Ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）の定義に従った。ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬのＣＤＲ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＳＴＰＰＴ）のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号２３〜２５に示す。
図３は、ＳｐｅＩサイト（ＡＣＴＡＧＴ；下線）とＨｉｎｄＩＩＩサイト（ＡＡＧＣＴＴ；下線）で挟まれる形にデザインされたＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ遺伝子の塩基配列（配列番号２６）とアミノ酸配列を示す。塩基配列のイタリック体で示した配列（ＨｉｎｄＩＩＩサイトを含む３’末端側の２２塩基）はイントロン配列を示す。それ以外は、図１の説明と同様である。
図４は、ＮｈｅＩサイト（ＧＣＴＡＧＣ；下線）とＥｃｏＲＩサイト（ＧＡＡＴＴＣ；下線）で挟まれる形にデザインされたＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ遺伝子の塩基配列（配列番号２７）とアミノ酸配列を示す。塩基配列のイタリック体で示した配列（ＥｃｏＲＩサイトを含む３’末端側の２２塩基）はイントロン配列を示す。それ以外は、図２の説明と同様である。
図５は、キメラ及びヒト型化ＢＡ−１−３Ｄ  ＩｇＧａ／κ抗体の発現ベクターの構造を示す模式図である。発現ベクターは、ＳａｌＩによる制限酵素部位を先頭に、時計まわりにヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要最初期プロモーター／エンハンサー（ＣＭＶプロモーター）により抗体のＨ鎖の転写を開始する転写ユニットを含む。ＣＭＶプロモーターに続けて、ＶＨエキソン、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３エキソン、およびそれらエキソン間に介在するイントロンの順に並び、ＣＨ３エキソンの後にポリアデニレーション配列を繋げた。Ｈ鎖遺伝子配列に続き、Ｌ鎖の転写ユニットとして、ＣＭＶプロモーター、ＶＬエキソン、イントロン配列の一部に続けてヒトκ鎖定常領域のエキソン（ＣＬ）、ポリアデニレーション配列を繋げた。Ｌ鎖遺伝子に続けてＳＶ４０アーリープロモーター（ＳＶ４０プロモーター）、大腸菌のｘａｎｔｈｉｎｅ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子（ｇｐｔ）、ＳＶ４０ポリアデニレーション部位（ＳＶ４０ｐｏｌｙ（Ａ）ｓｉｔｅ）を含むセグメントを繋げ、最終的に大腸菌の複製起点（ｐＵＣ  ｏｒｉ）とβラクタマーゼ遺伝子（ｂｅｔａ  ｌａｃｔａｍａｓｅ）を含んだｐＵＣ１９プラスミドの配列の一部を繋げた。
図６は、ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ、２種類のヒト型化ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ（ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ２）、並びにアクセプターであるＵ００５０３ＶＨのアミノ酸配列のアライメントを示す。アミノ酸は一文字表記で示し、配列の上部に示すアミノ酸番号はＫａｂａｔら（１９９１）の定義に従った。ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨのアミノ酸配列中の下線は、Ｋａｂａｔら（１９９１）の定義によるＣＤＲ配列を示す（ＤＹＡＭＨ，ＶＩＳＴＹＹＧＮＴＮＹＮＱＫＦＫＧ，ＧＧＬＲＥＹＹＹＡＭＤＹ）。ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１とＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ２のアミノ酸配列中の下線は、対応するマウスＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨのアミノ酸配列中のアミノ酸を保持したアミノ酸残基であって、ＣＤＲの構造の形成に重要と推察されるアミノ酸残基を示す。Ｕ００５０３ＶＨのＣＤＲ配列の表記は省略している。
なお、図中のＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１５に示し（それをコードする塩基配列は配列番号１４）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１のアミノ酸配列は配列番号３５に示し（それをコードする塩基配列は配列番号３４）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ２のアミノ酸配列は配列番号４０に示し（それをコードする塩基配列は配列番号３９）、Ｕ００５０３ＶＨのアミノ酸配列は配列番号２９に示し（それをコードする塩基配列は配列番号２８）に示す。
図７は、ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ、ヒト型化ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ（ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ）、及びアクセプターであるＺ４６６２２ＶＬのアミノ酸配列のアライメントを示す。アミノ酸は一文字表記で示し、配列の上部に示すアミノ酸番号はＫａｂａｔら（１９９１）の定義に従った。ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬのアミノ酸配列中の下線は、Ｋａｂａｔら（１９９１）の定義によるＣＤＲ配列を示す（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡ，ＦＡＳＴＲＥＳ，ＱＱＨＹＳＴＰＰＴ）。ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬのアミノ酸配列中の下線は、対応するマウスＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬのアミノ酸配列中のアミノ酸を保持したアミノ酸残基であって、ＣＤＲの構造の形成に重要と推察されるアミノ酸残基を示す。Ｚ４６６２２ＶＬのＣＤＲ配列の表記は省略している。
なお、図中のＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬのアミノ酸配列は配列番号２２に示し（それをコードする塩基配列は配列番号２１）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬのアミノ酸配列は配列番号４５に示し（それをコードする塩基配列は配列番号４４）、Ｚ４６６２２ＶＬのアミノ酸配列は配列番号３１に示し（それをコードする塩基配列は配列番号３０）に示す。
図８は、ＳｐｅＩサイト（ＡＣＴＡＧＴ；下線）とＨｉｎｄＩＩＩサイト（ＡＡＧＣＴＴ；下線）で挟まれる形にデザインされたＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１遺伝子の塩基配列（配列番号３６）とアミノ酸配列を示す。塩基配列のイタリック体で示した配列（ＨｉｎｄＩＩＩサイトを含む３’末端側の２３塩基）はイントロン配列を示す。
ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１のｃＤＮＡ塩基配列は配列番号３２に示し、その推定アミノ酸配列は配列番号３３に示す。アミノ酸残基は一文字表記で示し、シグナルペプチド（当該推定アミノ酸配列のＮ末端から１９アミノ酸からなるペプチド）はイタリックで表している。二重下線を引いたグルタミン（Ｑ）は、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１の成熟ペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示す。ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１の成熟ペプチドのｃＤＮＡ塩基配列は配列番号３４に示し、その推定アミノ酸配列は配列番号３５に示す。ＣＤＲ配列（下線を付した配列）は、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，Ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）の定義に従った。ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１のＣＤＲ１（ＤＹＡＭＨ）、ＣＤＲ２（ＶＩＳＴＹＹＧＮＴＮＹＮＱＫＦＫＧ）及びＣＤＲ３（ＧＧＬＲＥＹＹＹＡＭＤＹ）のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号１６〜１８に示す。
図９は、ＳｐｅＩサイト（ＡＣＴＡＧＴ；下線）とＨｉｎｄＩＩＩサイト（ＡＡＧＣＴＴ；下線）で挟まれる形にデザインされたＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ２遺伝子の塩基配列（配列番号４１）とアミノ酸配列を示す。塩基配列のイタリック体で示した配列（ＨｉｎｄＩＩＩサイトを含む３’末端側の２３塩基）はイントロン配列を示す。
ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ２のｃＤＮＡ塩基配列は配列番号３７に示し、その推定アミノ酸配列は配列番号３８に示す。アミノ酸残基は一文字表記で示し、シグナルペプチド（当該推定アミノ酸配列のＮ末端から１９アミノ酸からなるペプチド）はイタリックで表している。二重下線を引いたグルタミン（Ｑ）は、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ２の成熟ペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示す。ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ２の成熟ペプチドのｃＤＮＡ塩基配列は配列番号３９に示し、その推定アミノ酸配列は配列番号４０に示す。ＣＤＲ配列（下線を付した配列）は、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，Ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）の定義に従った。ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ２のＣＤＲ１（ＤＹＡＭＨ）、ＣＤＲ２（ＶＩＳＴＹＹＧＮＴＮＹＮＱＫＦＫＧ）及びＣＤＲ３（ＧＧＬＲＥＹＹＹＡＭＤＹ）のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号１６〜１８に示す。
図１０は、ＮｈｅＩサイト（ＧＣＴＡＧＣ；下線）とＥｃｏＲＩサイト（ＧＡＡＴＴＣ；下線）で挟まれる形にデザインされたＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ遺伝子の塩基配列（配列番号４６）とアミノ酸配列を示す。塩基配列のイタリック体で示した配列（ＥｃｏＲＩサイトを含む３’末端側の２３塩基）はイントロン配列を示す。
ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬのｃＤＮＡ塩基配列は配列番号４２に示し、その推定アミノ酸配列は配列番号４３に示す。アミノ酸残基は一文字表記で示し、シグナルペプチド（当該推定アミノ酸配列のＮ末端から２０アミノ酸からなるペプチド）はイタリックで表している。二重下線を引いたアスパラギン酸（Ｄ）は、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬの成熟ペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示す。ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬの成熟ペプチドのｃＤＮＡ塩基配列は配列番号４４に示し、その推定アミノ酸配列は配列番号４５に示す。ＣＤＲ配列（下線を付した配列）は、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，Ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）の定義に従った。ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬのＣＤＲ１（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡ）、ＣＤＲ２（ＦＡＳＴＲＥＳ）及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＳＴＰＰＴ）のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号２３〜２５に示す。
図１１は、本願実施例４における、Ｈ鎖及びＬ鎖のｃＤＮＡのＰＣＲ増幅、並びにシーケンス反応に用いたオリゴヌクレオチドプライマー（ＣＭＶ２、ＪＮＴ０２６、ＪＮＴ０８２、ＪＮＴ０９７及びＪＮＴ０９８）の塩基配列を示す。ＣＭＶ２、ＪＮＴ０２６、ＪＮＴ０８２、ＪＮＴ０９７及びＪＮＴ０９８の塩基配列は、それぞれ順に、配列番号４７〜５１に示す。
図１２は、ｐＣｈＢＡ−１−３ＤベクターのＨ鎖（γ１鎖）のコーディング領域の塩基配列（配列番号５２）とアミノ酸配列（配列番号５３）を示す。アミノ酸は一文字表記で表し、ターミネーションコドンの位置は“・”で示している。
図１３は、ｐＣｈＢＡ−１−３ＤベクターのＬ鎖（κ鎖）のコーディング領域の塩基配列（配列番号５４）とアミノ酸配列（配列番号５５）を示す。アミノ酸は一文字表記で表し、ターミネーションコドンの位置は“・”で示している。
図１４は、ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１ベクターのＨ鎖（γ１鎖）のコーディング領域の塩基配列（配列番号５６）とアミノ酸配列（配列番号５７）を示す。アミノ酸は一文字表記で表し、ターミネーションコドンの位置は“・”で示している。
図１５は、ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２ベクターのＨ鎖（γ１鎖）のコーディング領域の塩基配列（配列番号５８）とアミノ酸配列（配列番号５９）を示す。アミノ酸は一文字表記で表し、ターミネーションコドンの位置は“・”で示している。
図１６は、ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１ベクター、ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２ベクター、ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋベクター、及びｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋベクターの、Ｌ鎖（κ鎖）のコーディング領域の塩基配列（配列番号６０）とアミノ酸配列（配列番号６１）を示す。要するに、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋ及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの各抗体のＬ鎖（κ鎖）は、すべて同一の塩基配列及びアミノ酸配列である。図中、アミノ酸は一文字表記で表し、ターミネーションコドンの位置は“・”で示している。
図１７は、精製した各抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である（レーン１：分子量マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅＰｌｕｓ２  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、レーン２：ＣｈＢＡ−１−３Ｄ、レーン３：ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１、レーン４：ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２、レーン５：ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋ、レーン６：ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ）。各抗体７．５μｇをＭＥＳ−ＳＤＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、還元条件下でＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４−２０％ゲルで展開した結果である。図の左側の数値は分子量を示す。
図１８は、ｈＤｌｋ−１細胞外領域のリコンビナントタンパク質（ｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓ）のＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２に対する結合活性を示すＥＬＩＳＡの結果である。ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍＬのＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２でコーティングし、ｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓは１μｇ／ｍＬから２倍ずつ希釈系列を作製し反応させた。ｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓの結合は、ＨＲＰ標識の抗Ｈｉｓタグ抗体で検出した。
図１９は、ＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２のｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓに対する結合活性を示すＥＬＩＳＡの結果である。ＥＬＩＳＡプレートを０．５μｇ／ｍＬのｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓでコーティングし、被検抗体（ＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２）は、５μｇ／ｍＬから２倍ずつ希釈系列を作製し反応させた。図中にＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２のＥＣ５０値を示した。
図２０は、ＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２のｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓに対する結合活性を示すＥＬＩＳＡの結果である。ＥＬＩＳＡプレートを０．０５μｇ／ｍＬのｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓでコーティングし、被検抗体（ＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２）は、５μｇ／ｍＬから２倍ずつ希釈系列を作製し反応させた。
図２１は、ＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２、ＨｕＶＨ／ＭｕＶＬ（ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２のＶＬ（ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ）をマウスＢＡ−１−３ＤのＶＬに置換したもの）及びＭｕＶＨ／ＨｕＶＬ（ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２のＶＨ（ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ２）をマウスＢＡ−１−３ＤのＶＨに置換したもの）のｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓに対する結合活性を示すＥＬＩＳＡの結果である。ＥＬＩＳＡプレートを０．０５μｇ／ｍＬのｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓでコーティングし、被検抗体（ＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２、ＨｕＶＨ／ＭｕＶＬ及びＭｕＶＨ／ＨｕＶＬ）をそれぞれ一過性発現させた細胞の培養上清の２倍希釈系列を作製し反応させた。
図２２は、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１、及びそのアミノ酸置換変異体（Ｖ５Ｑ〜Ｔ７３Ｋ／Ｔ７５Ｓ）のアミノ酸配列を示した図である。アミノ酸は一文字表記で示した。各アミノ酸置換変異体では、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１のアミノ酸と同じアミノ酸については“−”で示し、置換したアミノ酸についてのみ一文字表記で示した。配列上部の数字はアミノ酸番号を示す（Ｋａｂａｔら，１９９１）。
図２３は、ＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋ及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３ＫのｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓに対する結合活性を示すＥＬＩＳＡの結果である。ＥＬＩＳＡプレートを０．０５μｇ／ｍＬのｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓでコーティングし、被検抗体（ＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋ及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ）をそれぞれ一過性発現させた細胞の培養上清の２倍希釈系列を作製し反応させた。
図２４は、ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３ＫのＨ鎖（γ１鎖）のコーディング領域の塩基配列（配列番号６２）とアミノ酸配列（配列番号６３）を示す。アミノ酸は一文字表記で表し、ターミネーションコドンの位置は“・”で示している。
ここで、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３ＫのＨ鎖可変領域（ＶＨ）のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号７０）は、配列番号６２に示す塩基配列の第１番目〜第４２０番目の塩基からなる配列であり、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３ＫのＶＨの推定アミノ酸配列（配列番号７１）は、配列番号６３に示すアミノ酸配列の第１番目〜第１４０番目のアミノ酸からなる配列である。上記ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３ＫのＶＨの推定アミノ酸配列（配列番号７１）中、Ｎ末端から１９アミノ酸からなるペプチドはシグナルペプチドである。ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３ＫのＶＨの成熟ペプチドのｃＤＮＡ塩基配列は配列番号７２に示し、その推定アミノ酸配列は配列番号７３に示す。
図２５は、ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３ＫのＨ鎖（γ１鎖）のコーディング領域の塩基配列（配列番号６４）とアミノ酸配列（配列番号６５）を示す。アミノ酸は一文字表記で表し、ターミネーションコドンの位置は“・”で示している。
ここで、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３ＫのＨ鎖可変領域（ＶＨ）のｃＤＮＡ塩基配列（配列番号７４）は、配列番号６４に示す塩基配列の第１番目〜第４２０番目の塩基からなる配列であり、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３ＫのＶＨの推定アミノ酸配列（配列番号７５）は、配列番号６５に示すアミノ酸配列の第１番目〜第１４０番目のアミノ酸からなる配列である。上記ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３ＫのＶＨの推定アミノ酸配列（配列番号７５）中、Ｎ末端から１９アミノ酸からなるペプチドはシグナルペプチドである。ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３ＫのＶＨの成熟ペプチドのｃＤＮＡ塩基配列は配列番号７６に示し、その推定アミノ酸配列は配列番号７７に示す。
図２６は、ＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋ及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３ＫのｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓに対する結合活性を示すＥＬＩＳＡの結果である。ＥＬＩＳＡプレートを０．０５μｇ／ｍＬのｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓでコーティングし、被検抗体は５μｇ／ｍＬから２倍希釈系列を作製し反応させた。
図２７は、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの液剤中での抗原結合活性の安定性を示す図である。ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋを各ｐＨの液剤中で４０℃、１ヶ月保存した後、結合活性をフローサイトメーター及び抗原固相化ＥＬＩＳＡを用いて検証した。各ｐＨの液剤中で−８０℃保存した抗体を活性標準品として使用した。
（Ａ）ｈＤｌｋ−１を恒常的に発現する２９３細胞を用いてフローサイトメーターによる抗原結合活性の測定を行った。縦軸は蛍光強度の平均値（ＭＦＩ：ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｏ−ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を表し、横軸は抗体濃度を表す。
（Ｂ）ｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓをコーティングした抗原固相化ＥＬＩＳＡを用いて抗原結合活性の検討を行った。縦軸は吸光度を表し、横軸は抗体濃度を表す。
図２８は、カニクイザル血漿中での抗原結合活性の安定性の解析結果を示す図である。ＨｕＢＡ−１−３−Ｄ１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋをカニクイザル血漿中で、図中に示した期間、３７℃で保存した後、ｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓをコーティングした抗原固相化ＥＬＩＳＡを用いて抗原結合活性の検討を行った。縦軸は０ｈを１００％とした場合の各保存期間後の抗原結合活性（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ値）の割合を表し、横軸は保存期間を表す。
図２９は、ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２細胞を用いたＸｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：ＰＢＳ）とＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与群（○：１ｍｇ／ｋｇ、△：５ｍｇ／ｋｇ、□：１０ｍｇ／ｋｇ）との腫瘍形成を経時的に表した（平均値±標準偏差）。横軸上の矢頭は、抗体投与時を表す。すべての抗体投与群において、１３日目（Ｄａｙ１３）以降、対照群と比して有意な抗腫瘍効果（Ｐ＜０．０１（ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ））が認められる。
Ｂ：Ａの実験において、２３日目（Ｄａｙ２３）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）
図３０は、ヒト神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞を用いたＸｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：ＰＢＳ）とＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与群（○：１ｍｇ／ｋｇ、△：５ｍｇ／ｋｇ、□：１０ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍形成を経時的に表した（平均値±標準偏差）。横軸上の矢頭は、抗体投与時を表す。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：Ａの実験において、３４日目（Ｄａｙ３４）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）
図３１は、ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２細胞を用いたＸｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋとネクサバールの抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：ＰＢＳ）とＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与群（○：０．１ｍｇ／ｋｇ、△：０．５ｍｇ／ｋｇ、□：１ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍体積を経時的に表した（平均値±標準偏差）。横軸上の矢頭は、抗体投与を表す。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：コントロール群（●：ＰＢＳ）とネクサバール投与群（○：４０ｍｇ／ｋｇ、△：８０ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍体積を経時的に表した（平均値±標準偏差）。横軸上の矢頭は、抗体投与時を表す。＊Ｐ＜０．０５（ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｃ：ＡおよびＢの実験において、マウスの体重変化を経時的に示した図である。各群における群分け時（Ｄａｙ１０）のマウスの体重を１００％とした場合の各測定日における体重の割合として表した（平均値±標準偏差）。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）
図３２は、ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を用いたＸｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：ＰＢＳ）とＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与群（○：０．１ｍｇ／ｋｇ、△：０．５ｍｇ／ｋｇ、□：１ｍｇ／ｋｇ、◇：５ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍体積を経時的に表した（平均値±標準偏差）。横軸上の矢頭は、抗体投与を表す。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：Ａの実験において、２６日目（Ｄａｙ２６）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。＊＊Ｐ＜０．０１（ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）
図３３は、ヒト小細胞肺癌細胞株Ｌｕ−１３５細胞を用いたＸｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの抗腫瘍活性を示す図である。
Ａ：コントロール群（●：ＰＢＳ）とＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与群（○：１ｍｇ／ｋｇ、△：１０ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍体積を経時的に表した（平均値±標準偏差）。横軸上の矢頭は、抗体投与を表す。＊Ｐ＜０．０５（ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）
Ｂ：Ａの実験において、３４日目（Ｄａｙ３４）（実験最終日）の時点での各マウスにおける腫瘍重量をプロットした図である。＊Ｐ＜０．０５（ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）
図３４は、ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２細胞を用いたＸｅｎｏｇｒａｆｔ  ＴｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおけるＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与後のＸｅｎｏｇｒａｆｔ腫瘍の凍結切片において、アポトーシスによる細胞死を検出した写真である。
Ａ：ＴＵＮＥＬ染色により、アポトーシスによる細胞死を検出した写真である。左からＰＢＳ投与４８時間後、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（５ｍｇ／ｋｇ）投与２４時間後、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（５ｍｇ／ｋｇ）投与４８時間後の染色像を示す。茶褐色の核染色が見られる癌細胞が、ＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシス細胞を示す（顕微鏡の対物レンズ：４００倍）。
Ｂ：抗Ｃｌｅａｖｅｄ  Ｃａｓｐａｓｅ−３抗体を用いた免疫組織化学により、アポトーシスによる細胞死を検出した写真である。左からＰＢＳ投与４８時間後、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（５ｍｇ／ｋｇ）投与２４時間後、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（５ｍｇ／ｋｇ）投与４８時間後の染色像を示す。細胞質が茶褐色に染色されている癌細胞が、活性型カスパーゼ３陽性のアポトーシス細胞を示す（顕微鏡の対物レンズ：４００倍）。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる米国仮出願６１／７０９，２８２号明細書（２０１２年１０月３日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．本発明の概要
ヒトＤｌｋ−１（ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  １  ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）；ｈＤｌｋ−１）は、前述したように、全長３８３アミノ酸残基の１回膜貫通型の１型膜タンパク質であり、細胞外領域に６つのＥＧＦ様モチーフを有する。そして、ｈＤｌｋ−１遺伝子及びその遺伝子産物は、種々の癌や腫瘍細胞において高頻度で発現していることが知られている。一般的に、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を示す抗体を作製し取得することは困難であるため、抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体を作製したとしても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは抗腫瘍活性を有するがｉｎ  ｖｉｖｏでは同活性を示さないことが多い。また、ｈＤｌｋ−１の癌細胞の増殖などに対する機能的ドメインや、ｈＤｌｋ−１のリガンド（または受容体）及び細胞内シグナル伝達経路などは明らかではないため、ターゲットを絞って効率的に抗体作製を行うことも実質的に不可能である。このような状況の下、本発明においては、多数のクローンからスクリーニングを行うことによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有するクローンを取得することに成功した。
まず、本発明者は、公知の抗ｈＤｌｋ−１抗体を用いた免疫組織化学により、これまでｈＤｌｋ−１の発現が確認されていた前述の癌や腫瘍細胞以外に、新たに大腸癌、乳癌及び膵臓癌においてもｈＤｌｋ−１が発現していることを見出した。
次いで、本発明者は、個体レベルでｈＤｌｋ−１発現癌細胞を死滅させ得る又は腫瘍成長を阻害し得る抗ｈＤｌｋ−１抗体、すなわちｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗腫瘍活性を有する抗ｈＤｌｋ−１抗体を作製することを目的として、新たに抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体を約１００クローン作製した。そして、これらクローンにつき、各種癌細胞株をヌードマウス皮下に移植し確立した担癌マウスを用いてｉｎ  ｖｉｖｏにおける薬効（抗腫瘍作用）の評価を行った。その結果、顕著な腫瘍成長阻害活性を示すクローンを複数得ることに成功した（クローン名：ＢＡ−１−３Ｄ，ＤＩ−２−１４，２−１３，ＤＩ−６，Ｍ３−１）。
また本発明者は、上述した抗ｈＤｌｋ−１抗体の中でも、癌治療用抗体として開発を行う上で重要となる、ヒト癌細胞を用いた担癌マウス治療モデルにおいて抗体単独投与で顕著な抗腫瘍活性を示す抗体を見出し、そのヒト型化抗体も開発した。さらに本発明者は、このヒト型化抗ｈＤｌｋ−１抗体に特定の改変（アミノ酸置換変異）を加えることにより、より一層アビィディティー（Ａｖｉｄｉｔｙ；抗原結合活性）を高めた、親抗体（マウスＢＡ−１−３Ｄ）と同等程度のアビィディティーを有する改変ヒト型化抗ｈＤｌｋ−１抗体も見出し、また、この改変ヒト型化抗ｈＤｌｋ−１抗体が、液剤処方中及びサルやヒトの血中（血漿中）等において長期安定的な抗原結合活性を保持すること示した。
２．抗ｈＤｌｋ−１抗体の作製
（１）抗原の調製
ｈＤｌｋ−１のアミノ酸配列（配列番号２）の情報は、例えばＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に「Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＰ＿００３８２７」として公表されている。なお、ｈＤｌｋ−１のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号１）の情報は、同ウェブサイトに「Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００３８３６」として公表されている。
抗原としては、ｈＤｌｋ−１のアミノ酸配列の少なくとも一部（全部又は一部）を含むポリペプチド又はペプチド（単にペプチドともいう）を使用することができ、好ましくは、ｈＤｌｋ−１の細胞外領域（ＦＡ−１）のアミノ酸配列の少なくとも一部（全部又は一部）を含むペプチドを使用することができる。ｈＤｌｋ−１の細胞外領域は、前述したように６つのＥＧＦ様モチーフ（ＥＧＦ−１〜ＥＧＦ−６）を含む領域を言い、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうちの第２４番目〜第２４４番目のアミノ酸を含む領域、好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうちの「第２４番目」から「第２４８〜２８５番目」までのアミノ酸からなる領域（およそ２２５〜２６２アミノ酸残基）のことを言う。
ここで、抗原に用いるペプチドにつき、上記「アミノ酸配列の少なくとも一部」とは、長さが特に限定されるわけではなく、例えば、６つのＥＧＦ様モチーフのうちの１つ又は２つ以上を含む領域が好ましい。より好ましくは、例えば、ＥＧＦ−１及びＥＧＦ−２を含む領域（すなわち配列番号２に示されるアミノ酸配列のうちの第２４番目〜第９１番目のアミノ酸からなる領域）、ＥＧＦ−３及びＥＧＦ−４を含む領域（すなわち配列番号２に示されるアミノ酸配列のうちの第９２番目〜第１６７番目のアミノ酸からなる領域）、並びに、ＥＧＦ−４、ＥＧＦ−５及びＥＧＦ−６を含む領域（すなわち配列番号２に示されるアミノ酸配列のうちの第１３１番目〜第２４４番目のアミノ酸からなる領域）である。
抗原とするペプチドの作製方法は、化学合成でも、大腸菌などを用いる遺伝子工学的手法による合成でもよく、当業者に周知の方法を用いることができる。
ペプチドの化学合成を行う場合は、ペプチドの合成の周知方法によって合成することができる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置（例えば、島津製作所製：ＰＳＳＭ−８など）を使用してもよい。
ペプチドを遺伝子工学的に合成する場合は、まず、当該ペプチドをコードするＤＮＡを設計し合成する。当該設計及び合成は、例えば、全長ｈＤｌｋ−１遺伝子を含むベクター等を鋳型とし、所望のＤＮＡ領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により行うことができる。そして、上記ＤＮＡを適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクターを得、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）。
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。組換えベクターの作製は、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。ヤギ等の哺乳動物を宿主として使用することも可能である。宿主への組換えベクターの導入方法は公知である。
そして、前記形質転換体を培養し、その培養物から抗原として使用されるペプチドを採取する。「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
培養後、目的ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりペプチドを抽出する。また、目的ペプチドが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、ペプチドの単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
本発明においては、無細胞合成系を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳により抗原となるペプチドを得ることもできる。この場合は、ＲＮＡを鋳型にする方法とＤＮＡを鋳型にする方法（転写／翻訳）の２通りの方法を用いることができる。無細胞合成系としては、市販のシステム、例えばＥｘｐｒｅｓｓｗａｙＴＭシステム（インビトロジェン社）、ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標；ポストゲノム研究所）、ＴＮＴシステム（登録商標；プロメガ社）等を用いることができる。
上記のごとく得られたペプチドは、適当なキャリアタンパク質、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヒトチログロブリン、ニワトリガンマグロブリン等に結合することも可能である。
また抗原は、ｈＤｌｋ−１のアミノ酸配列（配列番号２）又は前述したその部分配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。例えば、ｈＤｌｋ−１のアミノ酸配列又はその部分配列のうち１又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個））のアミノ酸が欠失しており、１又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されており、あるいは、１又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを使用することもできる。
本発明において、細胞等に導入するための遺伝子としては、ｈＤｌｋ−１タンパク質若しくはその部分断片又はこれらの変異型のタンパク質又は断片をコードする遺伝子が挙げられる。そのような遺伝子としては、例えば、配列番号１に示される塩基配列又はその部分配列を有するものを使用することができる。
また、細胞等に導入するための遺伝子としては、配列番号１に示される塩基配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つｈＤｌｋ−１活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、又はその部分配列を使用することも可能である。
「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイズさせた後の洗浄時の条件であって、バッファーの塩（ナトリウム）濃度が１０〜５００ｍＭであり、温度が４２℃〜７２℃、好ましくは、上記塩濃度が５０〜３００ｍＭであり、温度が５５〜６８℃での条件をいう。
遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  ｋｉｔ、Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）を用いて行うことができる。
（２）ポリクローナル抗体の作製
調製した抗原を、免疫のため哺乳動物に投与する。哺乳動物は特に限定はされず、例えばラット、マウス及びウサギなどを挙げることができ、なかでもマウスが好ましい。
抗原の動物一匹あたりの投与量は、アジュバントの有無により適宜設定することができる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、足蹠、皮下、腹腔内等に注入することにより行うことができる。また、免疫の間隔については、特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは１週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜３回免疫を行う。そして、最終の免疫日から３〜７日後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡ）や放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、所望の抗体価を示した日に採血して、抗血清を得ることができる。上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製することができる。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。
（３）モノクローナル抗体の作製
（３−１）抗体産生細胞の採取
本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体は、限定はされないが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
調製した抗原を、免疫のため哺乳動物、例えばラット、マウス及びウサギなどに投与する。抗原の動物一匹あたりの投与量は、アジュバントの有無により適宜設定することができる。アジュバントとしては上記と同様である。免疫手法も前記と同様である。そして、最終の免疫日から１〜６０日後、好ましくは１〜１４日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞及び末梢血細胞などが挙げられるが、なかでもリンパ節細胞及び脾臓細胞が好ましい。
（３−２）細胞融合
ハイブリドーマ（抗体産生細胞株）を得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を用いることができる。用いる細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。
ミエローマ細胞としては、例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ１）及びＳｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。ミエローマ細胞の選択は、抗体産生細胞との適合性を適宜考慮して行うことができる。
次いで、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ及びＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞用培地中で、１×１０６〜１×１０７個／ｍＬの抗体産生細胞と２×１０５〜２×１０６個／ｍＬのミエローマ細胞とを混合する。抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比（抗体産生細胞：ミエローマ細胞）は、限定はされないが、通常、１：１〜１０：１とすることが好ましく、より好ましくは３：１である。次に、細胞融合促進剤の存在下で融合反応を行う。細胞融合促進剤として、例えば、平均分子量１，０００〜６，０００ダルトン（Ｄ）のポリエチレングリコールなどを使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
（３−３）ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などに適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に播き、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリーマとして得ることができる。
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、ｈＤｌｋ−１に反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定はされない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採取し、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ及びＲＩＡなどによってスクリーニングすることができる。
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行うことができる。ｈＤｌｋ−１に強い反応性を示す抗体をフローサイトメトリー等により判定し、これを産生するハイブリドーマを選択し、クローンとして樹立する。
（３−４）モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマを培養し、得られる培養物からモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法、又は腹水形成法等を採用することができる。「培養」とは、ハイブリドーマを培養皿又は培養ボトル中で生育させること、あるいはハイブリドーマを下記のように動物の腹腔内で増殖させることを意味する。
細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で７〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得することができる。
腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、２〜３週間後に腹水を採取することが好ましい。
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
（３−５）抗腫瘍活性を有するクローンの選別
本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗体である。
ここで、「抗腫瘍活性」とは、腫瘍細胞（癌細胞）を死滅させる活性又は腫瘍成長を阻害する活性を意味する。本発明において、抗腫瘍活性としては、例えば、腫瘍血管新生阻害活性が好ましく挙げられる。また、本発明の抗体が抗腫瘍活性を発揮しうるヒト腫瘍（腫瘍細胞）の種類としては、ｈＤｌｋ−１の発現が確認されている前述した公知のヒト腫瘍（具体的には、固形癌では、神経内分泌腫瘍、神経芽細胞腫、神経膠腫、１型神経線維腫症、小細胞肺癌、肝臓癌、腎臓癌及び卵巣癌など、血液癌では、骨髄異形成症候群及び急性骨髄性白血病など。）ならびに本発明者が新たにｈＤｌｋ−１の発現を確認したヒト大腸癌、ヒト乳癌及びヒト膵臓癌が挙げられる。なかでも特に、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト膵臓癌、ヒト肝癌、ヒト小細胞肺癌及びヒト神経芽細胞腫のうちの１種又は２種以上が好ましく挙げられる。
ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性の確認は、例えば、所望の腫瘍細胞をマウスの皮下に移植した担癌マウスを用い、このマウスに前記のとおり得られた抗体を投与することにより行うことができる。この場合、抗体の投与は、腫瘍細胞の移植直後から行ってもよいし（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデル）、移植に腫瘍が所定の体積になったのを確認してから行ってもよい（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデル）。投与方法は、何ら限定はされないが、例えば、３日に１回、２０ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内投与としてもよい。Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎモデルの場合は、腫瘍形成頻度と腫瘍体積により抗腫瘍活性の有無及びレベルを評価することができる。Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルの場合は、腫瘍体積及び腫瘍重量により抗腫瘍活性の有無及びレベルを評価することができる。
本発明において、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する抗ｈＤｌｋ−１抗体としては、例えば、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３３７であるハイブリドーマにより産生される抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体（クローン名：ＢＡ−１−３Ｄ）、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０７であるハイブリドーマにより産生される抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体（クローン名：Ｍ３−１）、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９９であるハイブリドーマにより産生される抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体（クローン名：ＤＩ−２−１４）、及び受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９００であるハイブリドーマにより産生される抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体（クローン名：ＤＩ−６）などが好ましく挙げられる。
ここで、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３３７であるハイブリドーマは、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＢＡ−１−３Ｄ」と称し２０１１年２月１日付けで、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０７であるハイブリドーマは、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ｍ３−１」と称し２００６年１０月１８日付で、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９９であるハイブリドーマは、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＤＩ−２−１４」と称し２００７年８月２１日付で、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９００であるハイブリドーマは、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＤＩ−６」と称し２００７年８月２１日付で、いずれも、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に寄託されたものである。
また、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体としては、例えば、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号１６〜１８に示されるアミノ酸配列であるもの、及び／又は、Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号２３〜２５に示されるアミノ酸配列であるものが、好ましく挙げられる。上記Ｈ鎖Ｖ領域としては、例えば、配列番号１３に示されるアミノ酸配列、特に配列番号１５に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）からなるものが好ましく、上記Ｌ鎖Ｖ領域としては、例えば、配列番号２０に示されるアミノ酸配列、特に配列番号２２に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）からなるものが好ましい。
さらに、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体としては、例えば、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３３７、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０７、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８９９、又はＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９００であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が結合（認識）する部位（例えばエピトープ）に結合する抗ｈＤｌｋ−１抗体も好ましく挙げられる。
（３−６）抗ｈＤｌｋ−１抗体のエピトープ
本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体のエピトープ（抗原決定基）は、抗原であるｈＤｌｋ−１の少なくとも一部であればよく限定はされないが、例えば、配列番号２に示されるｈＤｌｋ−１のアミノ酸配列中の、第２４番目〜第９１番目のアミノ酸からなる領域（ｈＤｌｋ−１のＥＧＦ−１〜ＥＧＦ−２を含む領域）、第９２番目〜第１６７番目のアミノ酸からなる領域（ｈＤｌｋ−１のＥＧＦ−３〜ＥＧＦ−４を含む領域）、若しくは第１３１番目〜第２４４番目のアミノ酸からなる領域（ｈＤｌｋ−１のＥＧＦ−４〜ＥＧＦ−６を含む領域）の少なくとも一部であることが好ましい。なかでも、ｈＤｌｋ−１のＥＧＦ−１〜ＥＧＦ−２を含む領域がより好ましい。当該領域を認識する（当該領域と結合する）抗ｈＤｌｋ−１抗体は、例えば、腫瘍細胞内へのインターナリゼーション活性が高く、後述するイムノコンジュゲート等の用途に極めて有用なものである。
（４）遺伝子組換え抗体、及び抗体断片
（４−１）遺伝子組換え抗体
本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト化抗体等が挙げられる。
キメラ抗体（すなわちヒト型キメラ抗体）は、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結（接合）した抗体であり（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，６８５１−６８５５，（１９８４）等を参照）、キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよう、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。ここで、マウス由来抗体の可変領域としては、Ｈ鎖Ｖ領域は、例えば、配列番号１３に示されるアミノ酸配列、特に配列番号１５に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）からなるものが好ましく、Ｌ鎖Ｖ領域は、例えば、配列番号２０に示されるアミノ酸配列、特に配列番号２２に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）からなるものが好ましい。
ヒト型化抗体を作製する場合は、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域（ＦＲ）はヒト由来のものでＣＤＲはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する（いわゆるＣＤＲグラフティング（ＣＤＲ移植））。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。ここで、ヒト型化された再構成ヒト可変領域としては、Ｈ鎖Ｖ領域は、例えば、配列番号３３に示されるアミノ酸配列、特に配列番号３５に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）からなるもの、又は配列番号３８に示されるアミノ酸配列、特に配列番号４０に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）からなるものが好ましく、Ｌ鎖Ｖ領域は、例えば、配列番号４３に示されるアミノ酸配列、特に配列番号４５に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）からなるものが好ましい。これらヒト型化抗体の作製法は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１−９１７（１９８７）；Ｑｕｅｅｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９−１００３３（１９８９）；特表平４−５０２４０８号公報（特許第２８２８３４０号公報；クイーンら）等を参照することができる。ここで、本発明のヒト型化抗ｈＤｌｋ−１抗体に用いることができるマウス由来のＣＤＲ配列としては、限定はされないが、例えば、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３として（それぞれ順に）配列番号１６〜１８に示されるアミノ酸配列が、Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３として（それぞれ順に）配列番号２３〜２５に示されるアミノ酸配列が、好ましく挙げられる。
さらに本発明においては、上記ヒト型化抗体のＨ鎖又はＬ鎖のＶ領域の一部（ＣＤＲ配列を除く）のアミノ酸（好ましくは１〜数個、より好ましくは１〜２個のアミノ酸）を他のアミノ酸置換した、改変型のアミノ酸も包含される。
改変型のアミノ酸としては、例えば、上記ヒト型化抗体のＨ鎖Ｖ領域（ＣＤＲ配列を除く）の１又は２アミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものが好ましい。このように置換されたアミノ酸としては、例えば、Ｈ鎖Ｖ領域が、
（１−１）配列番号６７に示されるアミノ酸配列（塩基配列は配列番号６６）、特に配列番号６９に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）（塩基配列は配列番号６８）からなるもの、
（１−２）配列番号７１に示されるアミノ酸配列（塩基配列は配列番号７０）、特に配列番号７３に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）（塩基配列は配列番号７２）からなるもの、
（１−３）配列番号７５に示されるアミノ酸配列（塩基配列は配列番号７４）、特に配列番号７７に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）（塩基配列は配列番号７６）からなるもの、
（２−１）配列番号７９に示されるアミノ酸配列（塩基配列は配列番号７８）、特に配列番号８１に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）（塩基配列は配列番号８０）からなるもの、
（２−２）配列番号８３に示されるアミノ酸配列（塩基配列は配列番号８２）、特に配列番号８５に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）（塩基配列は配列番号８４）からなるもの、
（２−３）配列番号８７に示されるアミノ酸配列（塩基配列は配列番号８６）、特に配列番号８９に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）（塩基配列は配列番号８８）からなるもの
等が好ましく挙げられ、より好ましくは（１−３）及び（２−３）のアミノ酸配列である。このようにＨ鎖Ｖ領域が上記（１−１）〜（２−３）のいずれかのアミノ酸配列に改変され、かつＬ鎖Ｖ領域が前述した配列番号４３に示されるアミノ酸配列、特に配列番号４５に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）からなる、改変ヒト型化抗ｈＤｌｋ−１抗体は、より一層アビィディティー（Ａｖｉｄｉｔｙ；抗原結合活性）の高いヒト型化抗体であり、例えば、細胞表面における抗原の発現量が少ない癌細胞との結合活性の保持を可能とするものである。また、当該改変ヒト型化抗ｈＤｌｋ−１抗体は、液剤処方中及びサルやヒトの血中（血漿中）等において長期安定的な抗原結合活性を保持し得るものである。
ここで、上記（１−１）の配列番号６７に示されるアミノ酸配列は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列の第４３番目のアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）に置換されたものであり、配列番号６９に示されるアミノ酸配列は、配列番号３５に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）の第２４番目のアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）に置換されたものである。
また、上記（１−２）の配列番号７１に示されるアミノ酸配列は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列の第９３番目のスレオニン（Ｔ）がリジン（Ｋ）に置換されたものであり、配列番号７３に示されるアミノ酸配列は、配列番号３５に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）の第７４番目のスレオニン（Ｔ）がリジン（Ｋ）に置換されたものである。
また、上記（１−３）の配列番号７５に示されるアミノ酸配列は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列の第４３番目のアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）に置換され、かつ、第９３番目のスレオニン（Ｔ）がリジン（Ｋ）に置換されたものであり、配列番号７７に示されるアミノ酸配列は、配列番号３５に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）の第２４番目のアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）に置換され、かつ、第７４番目のスレオニン（Ｔ）がリジン（Ｋ）に置換されたものである。
さらに、上記（２−１）の配列番号７９に示されるアミノ酸配列は、配列番号３８に示されるアミノ酸配列の第４３番目のアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）に置換されたものであり、配列番号８１に示されるアミノ酸配列は、配列番号４０に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）の第２４番目のアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）に置換されたものである。
また、上記（２−２）の配列番号８３に示されるアミノ酸配列は、配列番号３８に示されるアミノ酸配列の第９３番目のスレオニン（Ｔ）がリジン（Ｋ）に置換されたものであり、配列番号８５に示されるアミノ酸配列は、配列番号４０に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）の第７４番目のスレオニン（Ｔ）がリジン（Ｋ）に置換されたものである。
また、上記（２−３）の配列番号８７に示されるアミノ酸配列は、配列番号３８に示されるアミノ酸配列の第４３番目のアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）に置換され、かつ、第９３番目のスレオニン（Ｔ）がリジン（Ｋ）に置換されたものであり、配列番号８９に示されるアミノ酸配列は、配列番号４０に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）の第２４番目のアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）に置換され、かつ、第７４番目のスレオニン（Ｔ）がリジン（Ｋ）に置換されたものである。
ヒト化抗体（完全ヒト抗体）は、一般にＶ領域の抗原結合部位である超過変領域（Ｈｙｐｅｒ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）、Ｖ領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。但し、超可変部位は他の動物由来であってもよい。ヒト化抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト化抗体は、例えば、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９７７）１６，１３３−１４３；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，（１９９８）２６，３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｓｐｅｃｔｓ，（１９９９）１０，６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２０００）９７，７２２−７２７等を参照）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．，（２００２）４３（７），２３０１−８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，（２００２）１（２），１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，（２００２）１０９（３），４２７−４３１等を参照）により取得することができる。
上記キメラ抗体、ヒト型抗体及びヒト化抗体は、例えば、抗体Ｆｃ領域におけるＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖であるものが好ましく、詳しくは、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖を抗体分子のＦｃ領域に有する遺伝子組換え抗体分子からなる抗体が挙げられる。このような抗体であれば、ＡＤＣＣ活性を飛躍的に向上させることができる。なお、この点（抗体Ｆｃ領域におけるＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の特徴）は、前述したポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体についても同様に好ましい。
（４−２）抗体断片
本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体の断片も、本発明の抗体に含まれるものとする。ここで、本発明の抗体断片は、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体（マウス抗体以外のヒト型化抗体等を含む）と同様に、ｈＤｌｋ−１に対する結合活性を有するものであってｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有するものである。
当該抗体の断片としては、抗ｈＤｌｋ−１ポリクローナル抗体又は抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体の一部分の領域（すなわち、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体に由来する抗体断片）を意味し、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、一本鎖抗体（Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｈ鎖Ｖ領域、及びＬ鎖Ｖ領域等）、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｓｃＦｖ二量体）、ｄｓＦｖ（ジスルフィド安定化Ｖ領域）、並びに、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）を少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。
Ｆａｂは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを、原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することもできる。
Ｆ（ａｂ’）２は、抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、後述するＦａｂをチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させて、作製することもできる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを、原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することもできる。
ｓｃＦｖは、１本のＨ鎖Ｖ領域（ＶＨ）と１本のＬ鎖Ｖ領域（ＶＬ）とを適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。ｓｃＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築して、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。ｄｉａｂｏｄｙは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをＰのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築して、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は、Ｒｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。ｄｓＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築して、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３）の少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。ＣＤＲを含むペプチドは、抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入して、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）及びｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
本発明の抗体断片としては、そのままの形状でＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体Ｆｃ領域の一部または全部を含む抗体断片でもよく、また、上述した抗体断片とＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体Ｆｃ領域の一部または全部との融合タンパク質であってもよい。このような抗体断片であれば、ＡＤＣＣ活性を飛躍的に向上させることができるため、好ましい。
本発明の抗体断片の具体例としては、限定はされないが、例えば、配列番号１６〜１８に示されるアミノ酸配列（Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３）を少なくとも一部に含むものが挙げられ、具体的には、配列番号１３（特に配列番号１５）、配列番号３３（特に配列番号３５）、配列番号３８（特に配列番号４０）、配列番号６７（特に配列番号６９）、配列番号７１（特に配列番号７３）、及び配列番号７５（特に配列番号７７）、配列番号７９（特に配列番号８１）、配列番号８３（特に配列番号８５）、配列番号８７（特に配列番号８９）に示されるアミノ酸配列（Ｈ鎖Ｖ領域）を含むものが挙げられる。また、当該抗体断片の他の具体例としては、例えば、配列番号２３〜２５（Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３）に示されるアミノ酸配列を少なくとも一部に含むものが挙げられ、具体的には、配列番号２０（特に配列番号２２）及び配列番号４３（特に配列番号４５）に示されるアミノ酸配列（Ｌ鎖Ｖ領域）を含むものが挙げられる。
以下、本明細書中の説明においては、上述した抗体断片も、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体に含まれるものとする。
３．抗体−薬剤複合体の作製
上記本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体を用いたイムノコンジュゲート等として、当該抗体と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物とを含む、抗体−薬剤複合体を提供することができる。なお、予め、当該抗体分子と、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物とを、それぞれ調製したのち、これらを複合化させて得られたものは、一般に、イムノコンジュゲートと称される。また、遺伝子組換え技術を用い、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物としてのタンパク質トキシンを、遺伝子上で抗体遺伝子と連結させて、１つのタンパク質（融合タンパク質）として発現させて得られたものは、一般に、イムノトキシンと称される。
抗腫瘍活性を有する化合物としては、例えば、ドキソルビシン、カリケアマイシン、マイトマイシンＣ、Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  Ｅなどが挙げられる。
殺細胞活性を有する化合物としては、例えば、サポリン、リシン、緑膿菌外毒素、ジフテリアトキシン等が挙げられ、なかでもサポリン及び緑膿菌外毒素が好ましく用いられる。
抗体−薬剤複合体の作製方法としては、限定はされないが、例えば、ジスルフィド結合やヒドラゾン結合によって抗体と薬剤とをカップリングする方法などが挙げられる。
上記本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体は、ｈＤｌｋ−１を発現する標的腫瘍細胞内へのインターナリゼーション活性に優れたものである。そのため、予め、抗腫瘍活性及び／又は殺細胞活性を有する化合物を複合化させておくことにより、これら化合物を腫瘍細胞に直接かつ高選択的に作用させることができる。本発明の抗体−薬剤複合体は、標的腫瘍細胞への薬剤送達能に極めて優れたものである。
なお、細胞内へのインターナリゼーション活性は、抗体をローダミン等により蛍光標識し、細胞内への移行挙動及び抗体の局在性について蛍光顕微鏡等を用いて観察することにより評価することができる。
また本発明においては、抗体−薬剤複合体において、抗体の代わりに前述の抗体断片を用いた抗体断片−薬剤複合体を提供することもできる。抗体断片−薬剤複合体の詳細については、上述の抗体−薬剤複合体の説明を適宜適用することができる。
以下、本明細書中の説明においては、抗体断片−薬剤複合体も、本発明の抗体−薬剤複合体に含まれるものとする。
４．医薬組成物
本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び抗体−薬剤複合体は、医薬組成物に含まれる有効成分として有用である。
当該医薬組成物は、腫瘍の治療用及び／又は診断用の医薬組成物として有用である。すなわち、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び抗体−薬剤複合体は、腫瘍治療剤や腫瘍診断剤に含まれる有効成分として有用なものである。ここで、腫瘍の治療としては、腫瘍血管新生阻害も含まれる（以下、本明細書において同様）。
本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び抗体−薬剤複合体は、腫瘍の治療に用いた場合に、体重減少などの副作用を有さない点で、好ましいものである。
また、当該医薬組成物は、腫瘍細胞のアポトーシス誘導用の医薬組成物として有用である。すなわち、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び抗体−薬剤複合体は、腫瘍細胞のアポトーシス誘導剤に含まれる有効成分として有用なものである。
本発明の医薬組成物は、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び／又は抗体−薬剤複合体を有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。
本発明の医薬組成物の適用の対象となる疾患（腫瘍）としては、ｈＤｌｋ−１の発現が確認されている前述した公知のヒト腫瘍（具体的には、固形癌では、神経内分泌腫瘍、神経芽細胞腫、神経膠腫、１型神経線維腫症、小細胞肺癌、肝臓癌、腎臓癌及び卵巣癌など、血液癌では、骨髄異形成症候群及び急性骨髄性白血病など。）ならびに本発明者が新たにｈＤｌｋ−１の発現を確認したヒト大腸癌、ヒト乳癌及びヒト膵臓癌が挙げられる。なかでも特に、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌、ヒト膵臓癌、ヒト小細胞肺癌及びヒト神経細胞腫のうちの１種又は２種以上が好ましく挙げられる。これらの疾患は単独であってもよく、２つ以上が併発してもよい。
「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の１種以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、１つ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に溶解または懸濁することにより製造することができる。
特に、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体由来の抗体断片（中でも低分子のもの）を生体内に投与する場合は、上記に加えて、コロイド分散系を用いることができる。コロイド分散系は化合物（抗体断片）の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであればよく限定はされないが、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げることができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Ｍａｎｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８，６，６８２；Ｂｌｕｍｅ  ａｎｄ  Ｃｅｖｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，１９９４，２３，１１９；Ｃｈｏｎｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９５，６，６９８）。
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは医薬組成物に含有される本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び抗体−薬剤複合体の種類などにより異なる。通常、成人一人あたり、一回につき６００μｇから６０００ｍｇの範囲で投与することができるが、この範囲に限定されるものではない。
例えば注射剤により投与する場合は、ヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１０μｇ〜１００ｍｇ、又は３０μｇ〜１００ｍｇ、又は５０μｇ〜１００ｍｇ、又は１００μｇ〜１００ｍｇの量、又は２００μｇ〜１００ｍｇ、又は３００μｇ〜１００ｍｇ、又は５００μｇ〜１００ｍｇの用量、あるいはこれら用量範囲の下限を適宜組み合わせた範囲の用量（例えば、３０μｇ〜２００μｇや１００μｇ〜５００μｇ）を、１日平均あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤の配合等により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。すなわち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
なお、本発明は、腫瘍を治療する、腫瘍を診断する、及び／又は腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する医薬（薬剤）を製造するための、前記本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び／又は抗体−薬剤複合体の使用を提供するものでもある。また、本発明は、腫瘍の治療用、腫瘍の診断用、及び／又は腫瘍細胞のアポトーシス誘導用の、前記本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び／又は抗体−薬剤複合体を提供するものでもある。
さらに、本発明は、前記本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び／又は抗体−薬剤複合体を用いる（すなわち患者に投与する）ことを特徴とする、腫瘍の治療方法、腫瘍の診断方法、及び／又は腫瘍細胞のアポトーシス誘導方法を提供するものであり、また、腫瘍を治療する、腫瘍を診断する、及び／又は腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するための、前記本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び／又は抗体−薬剤複合体の使用を提供するものでもある。
５．腫瘍の検出方法
本発明の腫瘍の検出方法（腫瘍の診断方法であってもよい）は、前記本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体と、生体から採取された試料（以下、生体試料）とを反応させ、反応した抗体のシグナルを検出することを特徴とする方法である。
前述したように、ｈＤｌｋ−１は各種腫瘍細胞において特異的に発現することが確認されているため、ｈＤｌｋ−１、特に遊離ｈＤｌｋ−１（ｈＤｌｋ−１の細胞外領域部分）は、各種腫瘍マーカーとして利用することが可能である。なかでも、ヒト大腸癌、ヒト乳癌、ヒト肝癌及びヒト膵臓癌のマーカーとして利用することが好ましい。
そこで、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体を生体試料と反応させ、反応した抗体のシグナルを検出することにより、腫瘍を検出することができる。得られた抗体のシグナルは、生体試料中の抗原量（すなわちｈＤｌｋ−１量又は遊離ｈＤｌｋ−１量）の指標となる。本発明の抗体を用いた腫瘍の検出は、まず、検体として被験者から採取した生体試料、例えば検査対象とする組織片又は血液等と、本発明の抗体とを、抗原抗体反応によって結合させる。次いで、結合した抗体量の測定結果に基づいて、生体試料中の目的とする抗原量を測定することにより行う。当該測定は、公知の免疫学的測定法に従って行えばよく、例えば、免疫沈降法、免疫凝集法、標識免疫測定法、免疫比懸濁法、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリー法などを用いることができる。標識免疫測定法では、抗体のシグナルは、標識抗体を用いて直接検出した標識量で表すほか、既知濃度あるいは既知抗体価の抗体を標準液として相対的に表してもよい。すなわち、標準液と検体を測定計により測定し、標準液の値を基準にして生体試料中の抗体シグナルを相対的に表すことができる。標識免疫測定法としては、例えばＥＬＩＳＡ法、ＥＩ法、ＲＩＡ法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）等が挙げられる。なかでも特に、ＥＬＩＳＡ法が、簡便かつ高感度という点で好ましい。
本発明においては、上記検出方法により得られた検出結果を指標として腫瘍の状態を評価又は診断することができる。例えば、検出結果が所定の基準値を超えるものを腫瘍陽性、所定の基準値以下のものを腫瘍陰性とし、陽性の場合には、いずれかの腫瘍を発症している可能性があると判断し、腫瘍の状態を評価することができる。ここで、腫瘍の状態とは、腫瘍の罹患の有無又はその進行度を意味し、腫瘍の発症の有無、進行度、悪性度、転移の有無及び再発の有無等が挙げられる。
上記評価にあたり、腫瘍の状態としては１つを選択してもよいし、複数個を組み合わせて選択してもよい。腫瘍の有無の評価は、得られた検出結果に基づいて、所定の基準値を境界として腫瘍に罹患しているか否かを判断することにより行うことができる。腫瘍の悪性度は、癌がどの程度進行しているのかを示す指標となるものであり、検出結果に基づいて、病期（Ｓｔａｇｅ）を分類して評価したり、あるいは早期癌や進行癌を分類して評価したりすることも可能である。例えば、検出結果を指標として早期癌又は進行癌であると評価することもできる。腫瘍の転移は、検出結果を指標として、原発巣の位置から離れた部位に新生物が出現しているか否かにより評価することができる。再発は、間欠期又は寛解の後に検出結果が再び所定の基準値を超えたか否かにより評価することができる。
６．腫瘍の検出用又は診断用キット、及び腫瘍の治療用又は腫瘍細胞のアポトーシス誘導用キット
本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体は、腫瘍の検出用キット又は腫瘍の診断用キットの形態で提供することができる。また、本発明の抗ｈＤｌｋ−１抗体及び抗体−薬剤複合体は、腫瘍の治療用キット又は腫瘍細胞のアポトーシス誘導用キットの形態で提供することができる。
本発明のキットは抗体を含むが、その他に、標識物質、あるいは抗体又はその標識物を固定した固相化試薬などを含めることができる。抗体の標識物質とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等によって標識されたものを意味する。本発明のキットは、上記の構成要素のほか、本発明の検出を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素基質（発色性基質等）、酵素基質溶解液、酵素反応停止液、あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。また、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反応容器（エッペンドルフチューブ等）、ブロッキング剤（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ），Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ，ヤギ血清等の血清成分）、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、アジ化ナトリウム等の防腐剤、及び実験操作マニュアル（説明書）等を含んでいてもよい。
本発明のキットは、前述した本発明に係る腫瘍の検出方法、あるいは、本発明に係る腫瘍の治療方法又は腫瘍細胞のアポトーシス誘導方法等を行うために有効に用いることができ、極めて有用性が高いものである。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００８】
マウス抗ヒトＤｌｋ−１モノクローナル抗体（クローンＢＡ−１−３Ｄ）の抗体遺伝子のクローニングと可変領域配列の決定
マウス抗ヒトＤｌｋ−１モノクローナル抗体として、ＷＯ  ２００８／０５６８３３（前掲  特許文献４）及びＷＯ  ２００９／１１６６７０（前掲  特許文献５）において、顕著な腫瘍生長阻害活性が示されたクローンＢＡ−１−３Ｄ（マウスＩｇＧ２ａ）（以下、マウスＢＡ−１−３Ｄ）を用いた。マウスＢＡ−１−３Ｄを産生するハイブリドーマは、「Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＢＡ−１−３Ｄ」と称して、２０１１年２月１日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３３７）。
上記マウスＢＡ−１−３Ｄ産生ハイブリドーマは、２０％牛胎児血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ），１ｍＭピルビン酸ナトリウム，１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び１ｘ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で、３７℃、７．５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。１０７個のハイブリドーマから、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した後、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて、該キット添付の方法に従い、オリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。マウスＢＡ−１−３ＤのＨ鎖可変領域（ＶＨ）及びＬ鎖可変領域（ＶＬ）をコードする遺伝子は、上記合成後のｃＤＮＡを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用い、ＰＣＲ法によりクローニングした。この際、５’−プライマーとしては、キットに添付されているＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ（ＵＰＭ）又はＮｅｓｔｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ（ＮＵＰ）を用いた。また、ＶＨ増幅用３’−プライマーとしては、マウスγ２ａ定常領域に相補的な配列を有するものを使用し、ＶＬ増幅用３’−プライマーとしては、マウスκ定常領域に相補的な配列を有するものを使用した。
５’−プライマー（Ｆプライマー；Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ（ＵＰＭ））：
2014054820.tif 000002
５’−プライマー（Ｆプライマー；Ｎｅｓｔｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ（ＮＵＰ））：
2014054820.tif 000003
３’−プライマー（Ｒプライマー）：
2014054820.tif 000004
上記各プライマーを用いたＰＣＲは、以下の反応液組成及び反応条件で行った。
＜反応液組成＞
鋳型ｃＤＮＡ：                                                    ２．５μＬ
５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  バッファー（Ｍｇ２＋  ｐｌｕｓ）：        １０μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ：                                            ４μＬ
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．０Ｕ／μｌ）：  ０．５μＬ
１０×ＵＰＭ  ｏｒ  ＮＵＰ：                                      ５μＬ
Ｒプライマー（１０μＭ）：                                        １μＬ
滅菌水：                                                          ２７μＬ  
合計：                                                            ５０μＬ
＜反応条件＞
９４℃（１０ｓｅｃ）反応させた後、「熱変性・解離：９８℃（１０ｓｅｃ）→アニーリング：６０℃（５ｓｅｃ）→合成・伸長：７２℃（６０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計３０サイクル反応させた後、最後に７２℃（３ｍｉｎ）反応させた。
合成したマウスＢＡ−１−３ＤのＶＨ及びＶＬ（ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ、ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ）のｃＤＮＡを、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングして、塩基配列を決定した。複数のＶＨクローン及びＶＬクローンの塩基配列を解読し、マウスＨ鎖及びＬ鎖の可変領域に典型的な塩基配列を同定した。図１及び図２に、ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ及びＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬのコンセンサスｃＤＮＡ塩基配列、並びに推定アミノ酸配列を示した。
【実施例２】
【０００９】
マウス−ヒトキメラＢＡ−１−３Ｄ  ＩｇＧ１／κ発現ベクターの構築
ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨをコードする遺伝子（ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ遺伝子）は、マウス生殖細胞系列ＪＨ４配列由来のスプライス供与シグナルと、両端に適切な制限酵素部位とを付加したエキソンとして作製した。具体的には、ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ遺伝子のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を用いて合成した。この際、５’−プライマーは動物細胞発現ベクターに挿入するための制限酵素部位としてＳｐｅＩサイトを付加したものを用い、３’−プライマーには同じくＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加したものを用いた。
５’−プライマー（Ｆプライマー）：
2014054820.tif 000005
３’−プライマー（Ｒプライマー）：
2014054820.tif 000006
2014054820.tif 000007
上記各プライマー（配列番号８、９）を用いたＰＣＲは、以下の反応液組成及び反応条件で行った。
＜反応液組成＞
鋳型ｃＤＮＡ：                                                  １．０μＬ
５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  バッファー（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）：        １０μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ：                                          ４μＬ
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．０Ｕ／μｌ）：０．５μＬ
Ｆプライマー（１０μＭ）：                                      ３μＬ
Ｒプライマー（１０μＭ）：                                      １．０μＬ
滅菌水：                                                        ３０．５μＬ  
合計：                                                          ５０μＬ
＜反応条件＞
「熱変性・解離：９８℃（１０ｓｅｃ）→アニーリング：５７℃（１０ｓｅｃ）→合成・伸長：７２℃（６０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計３５サイクル。
同様に、ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬをコードする遺伝子（ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ遺伝子）は、マウス生殖細胞系列Ｊκ５配列由来のスプライス供与シグナルと、両端に適切な制限酵素部位とを付加したエキソンとして作製した。具体的には、ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ遺伝子のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を用いて合成した。この際、５’−プライマーは動物細胞発現ベクターに挿入するための制限酵素部位としてＮｈｅＩサイトを付加したものを用い、３’−プライマーには同じくＥｃｏＲＩサイトを付加したものを用いた。
５’−プライマー（Ｆプライマー）：
2014054820.tif 000008
３’−プライマー（Ｒプライマー）：
2014054820.tif 000009
上記各プライマー（配列番号１０、１１）を用いたＰＣＲは、以下の反応液組成及び反応条件で行った。
＜反応液組成＞
鋳型ｃＤＮＡ：                                                  １．０μＬ
５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  バッファー（Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）：        １０μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ：                                          ４μＬ
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．０Ｕ／μｌ）：０．５μＬ
Ｆプライマー（１０μＭ）：                                      ３μＬ
Ｒプライマー（１０μＭ）：                                      １．０μＬ
滅菌水：                                                        ３０．５μＬ  
合計：                                                          ５０μＬ
＜反応条件＞
「熱変性・解離：９８℃（１０ｓｅｃ）→アニーリング：５７℃（１０ｓｅｃ）→合成・伸長：７２℃（６０ｓｅｃ）」を１サイクルとして計３５サイクル。
以上のようにして作製された、エキソンとしての機能を持つＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ遺伝子及びＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ遺伝子を、それぞれ図３及び図４に示した。
作製した上記ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ遺伝子及びＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ遺伝子をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングして、配列の確認を行った後、ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ遺伝子の挿入にはＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位を用い、ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ遺伝子の挿入はＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ部位を用いて、ヒトγ１鎖及びκ鎖の定常領域を含む動物細胞発現ベクター（図５）に挿入し、マウス−ヒトキメラＢＡ−１−３Ｄ  ＩｇＧ１／κ抗体（ＣｈＢＡ−１−３Ｄ）発現ベクター（ｐＣｈＢＡ−１−３Ｄ）を作製した。
【実施例３】
【００１０】
ヒト型化ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ及びＶＬ遺伝子の作製
ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ及びＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬのヒト型のデザインはＱｕｅｅｎらの方法に従って以下のように行った（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３，１９８９）。まず、ＢＡ−１−３Ｄ抗体の可変領域の立体構造の分子モデリングをコンピュータで行い、ＣＤＲ構造の形成に重要なフレームワーク配列中のアミノ酸を同定した。並行してヒト抗体遺伝子の可変領域配列とのホモロジー検索によって、ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨのヒト型化に必要なフレームワーク（ＦＲ）配列を提供するアクセプターとして、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｕ００５０３のｃＤＮＡ（Ｕ００５０３  ＶＨ）（Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：５２９０，１９９３）を選択した。同様に、ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬのヒト型化に必要なフレームワーク（ＦＲ）配列を提供するアクセプターとして、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｚ４６６２２のｃＤＮＡ（Ｚ４６６２２  ＶＬ）（Ｇｉａｃｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１２４５，１９９５）を選択した。
ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨのヒト型化では、まずＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨのＣＤＲ配列をアクセプターであるＵ００５０３  ＶＨの対応する位置に移植した。次に、マウスＢＡ−１−３Ｄの可変領域のコンピュータモデリングによる立体構造解析により、ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨのＣＤＲに隣接し、その構造維持に重要な役割を果たしていると考えられるＦＲ配列中のアミノ酸残基（４８番目のイソロイシン（Ｉ）、６６番目のリジン（Ｋ）、６７番目のアラニン（Ａ）、７１番目のバリン（Ｖ））についてはＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨのものを保持し、それ以外のＦＲ領域をアクセプター配列に置き換えた。ＶＨのアミノ酸残基位置番号はＫａｂａｔらの定義（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，Ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）に準拠した。このようにして作製されたヒト型化ＢＡ−１−３ＤのＶＨを、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１とした。
ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨにおける６６番目のリジン（Ｋ）は、ＣＤＲ配列に隣接しているが、さらに詳しいＢＡ−１−３Ｄ可変領域のコンピュータモデリングによる解析の結果、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１における６６番目のリジン（Ｋ）は、Ｕ００５０３  ＶＨの対応する位置のアルギニン（Ｒ）に、抗原との親和性を損なうことなく置換可能であることが示唆された。そこで、抗原性（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を軽減する目的で、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１の６６番目のリジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）に置換したヒト型化ＢＡ−１−３ＤのＶＨも併せて作製した。当該置換後のヒト型化ＢＡ−１−３ＤのＶＨを、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ２とした。
ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ２及びＵ００５０３  ＶＨのアミノ酸配列アライメントを、図６に示した。
ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬのヒト型化についても同様に、ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬのＣＤＲ配列をアクセプターであるＺ４６６２２ＶＬの対応する位置に移植した。次に、マウスＢＡ−１−３Ｄの可変領域のコンピュータモデリングによる立体構造解析により、ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬのＣＤＲに隣接し、その構造維持に重要な役割を果たしていると考えられるＦＲ配列中のアミノ酸残基（４８番目のバリン（Ｖ））はＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬのものを保持し、それ以外のＦＲ領域をアクセプター配列に置き換えた。ＶＬのアミノ酸残基位置番号はＫａｂａｔらの定義（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，Ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）に準拠した。このようにして作製されたヒト型化ＢＡ−１−３ＤのＶＬを、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬとした。
ＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ及びＺ４６６２２  ＶＬのアミノ酸配列アライメントを、図７に示した。
ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ２をコードする遺伝子は、それぞれマウスＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨのシグナルペプチド、ヒト生殖細胞系列ＪＨ３配列由来のスプライス供与シグナルを含み、また動物細胞遺伝子発現ベクターに挿入するための適切な制限酵素部位を両端に付加した（５’末端側にＳｐｅＩ、３’末端側にＨｉｎｄＩＩＩ）エキソンとして遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により作製した。このように作製したＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１遺伝子及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ２遺伝子の遺伝子配列、並びに、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ２のアミノ酸配列を、それぞれ図８及び図９に示した。
同様に、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬをコードする遺伝子は、マウスＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬのシグナルペプチド、ヒト生殖細胞系列Ｊκ２配列由来のスプライス供与シグナルを含み、また動物細胞遺伝子発現ベクターに挿入するための適切な制限酵素部位を両端に付加した（５’末端側にＮｈｅＩ、３’末端側にＥｃｏＲＩ）エキソンとして遺伝子合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により作製した。このように作製したＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ遺伝子の遺伝子配列、及び、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬのアミノ酸配列を、図１０に示した。
次に、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１及びＶＨ２遺伝子の挿入にはＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位を用い、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ遺伝子の挿入にはＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ部位を用いて、それぞれ、ヒトγ１鎖及びκ鎖の定常領域を含む動物細胞発現ベクター（図５）に挿入した。具体的には、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１遺伝子とＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ遺伝子との組合せ、及び、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ２遺伝子とＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ遺伝子との組合せで、それぞれ上記発現ベクターに挿入した。このようにして、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬから構成されるヒト型化ＢＡ−１−３Ｄ  ＩｇＧ１／κ抗体（ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１）を発現する発現ベクター（ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１）、並びに、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ２及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬから構成されるヒト型化ＢＡ−１−３Ｄ  ＩｇＧ１／κ抗体（ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２）を発現する発現ベクター（ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２）を作製した。
【実施例４】
【００１１】
マウス−ヒトキメラＢＡ−１−３Ｄ抗体（ＣｈＢＡ−１−３Ｄ）、及び、ヒト型化ＢＡ−１−３Ｄ抗体（ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１，ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２）の安定産生ＮＳ０細胞株の作製
マウスミエローマ細胞株ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）は１０％牛胎児血清を含むＤＭＥ培地で３７℃、７．５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。ＣｈＢＡ−１−３Ｄ，ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２を安定的に産生する細胞株を作製するために、それぞれの抗体遺伝子発現ベクター（ｐＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２）２０μｇ（事前に制限酵素ＦｓｐＩでリニアライズしたもの）を約１０７個のＮＳ０細胞に、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎらの方法（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９−１７５，１９９２）に従い、エレクトロポーレーション法で遺伝子導入した。４８時間後、選択培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥ  ｍｅｄｉｕｍ，ＨＴ  ｍｅｄｉａ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），０．２５ｍｇ／ｍｌキサンチン、及び１μｇ／ｍｌミコフェノール酸）に交換し、約１０日後に培養上清中の抗体産生の有無を解析した。
培養上清中のＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２はサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって検出及び測定した。具体的には、９６穴プレートをＰＢＳで１／２，０００に希釈したｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆｃ  γ−ｃｈａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに１００μｌずつ加えて４℃で一晩コーティングした後、洗浄バッファー（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄した。次に、ブロッキングバッファー（２％スキムミルクと０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）を各ウェルに３００μｌずつ加えて３０分間、室温にてブロッキングを行った。洗浄バッファーで洗浄した後、各ウェルに１００μｌずつ、ＥＬＩＳＡバッファー（ＰＢＳ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １％  Ｓｋｉｍ  Ｍｉｌｋ  ａｎｄ  ０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で適当な希釈倍率に希釈した培養上清を加えて、室温で１時間反応させた。標準品としては、ヒト又はヒト型化ＩｇＧ１／κ抗体を用いた。洗浄バッファーで洗浄した後、検出用抗体として、各ウェルに１００μｌずつ、ＥＬＩＳＡバッファーで１／２，０００に希釈したＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を加えて、室温で３０分間反応させた。洗浄バッファーで洗浄した後、各ウェルに１００μｌずつＡＢＴＳ基質を加えて発色反応を行い、各ウェルに１００μｌずつ２％  ｏｘａｌｉｃ  ａｃｉｄを加えて反応を停止した後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
ＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２抗体を安定的に産生するＮＳ０細胞株として、それぞれＮＳ０−ＣｈＢＡ−１−３Ｄ  ２Ａ４、ＮＳ０−ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１  ２Ｄ２及びＮＳ０−ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２  ３Ｆ７を樹立し、無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に順化した。
当該ＮＳ０−ＣｈＢＡ−１−３Ｄ  ２Ａ４、ＮＳ０−ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１  ２Ｄ２及びＮＳ０−ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２  ３Ｆ７の各ＮＳ０細胞株が産生する抗体のＨ鎖とＬ鎖の配列は、ｃＤＮＡシーケンスによって確認した。具体的には、まず、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各細胞株から全ＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、キット添付の方法に従い、オリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。次いで、ヒトγ１鎖のコーディング領域は、ＣＭＶ２とＪＮＴ０９８をプライマーとしてＰＣＲで増幅した後、ＣＭＶ２、ＪＮＴ０８２、ＪＮＴ０９７及びＪＮＴ０９８をプライマーとしてシーケンスを行った。同様に、ヒトκ鎖のコーディング領域は、ＣＭＶ２とＪＮＴ０２６をプライマーとしてＰＣＲで増幅した後、ＣＭＶ２とＪＮＴ０２６をプライマーとしてシーケンスを行った。なお、上記各プライマー（ＣＭＶ２、ＪＮＴ０２６、ＪＮＴ０８２、ＪＮＴ０９７及びＪＮＴ０９８）は、図１１に示した塩基配列からなるものである。
その結果、上記各ＮＳ０細胞株が産生するＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２のＨ鎖及びＬ鎖のｃＤＮＡ配列は、ｐＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２の各ベクターの対応するｃＤＮＡ配列（図１２〜１６）と完全に一致した。
【実施例５】
【００１２】
ＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２の精製
ＮＳ０−ＣｈＢＡ−１−３Ｄ  ２Ａ４、ＮＳ０−ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１  ２Ｄ２及びＮＳ０−ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２  ３Ｆ７の各ＮＳ０細胞株を、ローラーボトルを用いて培養した。培地はＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、約１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度に達した段階で、１／１０量の６０ｍｇ／ｍｌ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒｅｄ  Ｓｏｙ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）（ＳＦＭ４ＭＡｂ  ｍｅｄｉａ（ＨｙＣｌｏｎｅ）に溶解したもの）を添加して、生細胞が５０％以下になるまで培養を行った。培養上清を遠心とフィルトレーションで回収した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＨｉＴｒａｐ  ＭＡＢＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ，ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に培養上清をロードし、ＰＢＳでカラムを洗浄した後、０．１ＭのＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）で溶出した。１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した後、透析によってＰＢＳにバッファー置換を行った。抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度測定により決定した（１ｍｇ／ｍｌ＝１．４ＯＤ）。各ＮＳ０細胞株５００ｍＬの培養での抗体の収量は、ＣｈＢＡ−１−３Ｄが６．１ｍｇ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１が５．０ｍｇ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２が３．８ｍｇであった。
精製したＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２の各抗体を常法に従い、還元下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、いずれの抗体についても、約５０ｋＤａのＨ鎖と約２５ｋＤａのＬ鎖のバンドが確認された（図１７）。また、いずれの抗体も、精製後の純度は９５％以上であった。
【実施例６】
【００１３】
ＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２のキャラクラリゼーション
ＣｈＢＡ−１−３Ｄ，ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２の抗原（ヒトＤｌｋ−１）との結合活性について、３種類の異なるフォーマットのＥＬＩＳＡを用いて解析を行った。
最初のフォーマットのＥＬＩＳＡとして、一価の抗原抗体反応を解析するＥＬＩＳＡを行った。９６穴プレートに、ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈したＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２抗体をそれぞれ１００μｌ／ウェルで添加し、４℃で一晩コーティングを行った。洗浄バッファーでプレートを洗浄後、ブロッキングバッファーでブロッキングした後、再度洗浄バッファーでプレートを洗浄後、ｈＤｌｋ−１細胞外領域のリコンビナントタンパク質（ｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓ）（Ｎａｋａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｔａｊｉｍａ，ＵＳ２００９／０３２６２０５  Ａ１）を１μｇ／ｍｌの濃度から２倍希釈ずつの希釈系列をＥＬＩＳＡバッファーで作製し、１００μｌ／ウェルで添加し室温で１時間反応させた。次いで、洗浄バッファーで洗浄後、ＥＬＩＳＡバッファーで１／２，０００に希釈したＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−Ｈｉｓ  ｔａｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｈｙｐｒｏｍａｔｒｉｘ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で３０分間反応させた。洗浄バッファーで洗浄後、各ウェルに１００μｌずつＡＢＴＳ基質を加えて発色反応を行い、各ウェルに１００μｌずつ２％  ｏｘａｌｉｃ  ａｃｉｄを加えて反応を停止した後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ｈＤｌｋ−１−ＨｉｓのＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２との結合カーブは完全に重なり（図１８）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２の抗原親和性（アフィニティー）はＣｈＢＡ−１−３Ｄの抗原親和性を保持していることが示され、ＢＡ−１−３Ｄのヒト型化が成功したことが示された。
２番目のフォーマットのＥＬＩＳＡとして、９６穴プレートに、ＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌの濃度に希釈したｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓを１００μｌ／ウェルで添加して、４℃で一晩コーティングし、洗浄バッファーでプレートを洗浄後、ブロッキングバッファーでブロッキングした後、再度洗浄バッファーでプレートを洗浄した。ＥＬＩＳＡバッファーで５μｇ／ｍｌの濃度から２倍希釈系列を作製した、ＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。洗浄バッファーで洗浄した後、ＥＬＩＳＡバッファーで１／２，０００に希釈したＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙを１００μｌ／ウェルで添加し、室温で３０分間反応させた後、上記と同じ方法で発色反応を行った。その結果、ＣｈＢＡ−１−３ＤのＥＣ５０値は１１６ｎｇ／ｍｌ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１のＥＣ５０値は１４８ｎｇ／ｍｌ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２のＥＣ５０値は１５４ｎｇ／ｍｌであり（図１９）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２のいずれのヒト型化抗体もＣｈＢＡ−１−３Ｄと同等の抗原親和性（アフィニティー）を示した。
３番目のフォーマットのＥＬＩＳＡとして、９６穴プレートをコーティングするｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓの濃度を１／１０に希釈し、０．０５μｇ／ｍｌのｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓを１００μｌ／ウェルで加えて４℃で一晩コーティングし、低濃度のｈＤｌｋ−１−ＨｉｓでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを作製した。それ以外は、前述した２番目のフォーマットのＥＬＩＳＡと同様に、ＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２のｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓとの結合を測定した。その結果、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２の結合活性は、ＣｈＢＡ−１−３Ｄと比較して、予期されないほどに低下していた（図２０）。
最初のフォーマットのＥＬＩＳＡで示したとおり、ＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２のｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓとの一価の結合には互いに実質的な相違がなく（図１８）、２番目のフォーマットのＥＬＩＳＡで示したとおり、高濃度のｈＤｌｋ−１−ＨｉｓをコーティングしたＥＬＩＳＡにおいてもＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２のｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓタンパクとの結合には互いに実質的な相違が認められなかったことから（図１８）、３番目のフォーマットのＥＬＩＳＡで示された低濃度のｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓに対するＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２の結合がＣｈＢＡ−１−３Ｄと比較して低下した結果（図２０）の原因としては、ヒト型化抗体では抗原との２つの結合アームの運動能に関するフレキシビィリティーが低下していることによる、アビィディティー（Ａｖｉｄｉｔｙ；抗原結合活性）の低下が考えられた。２番目のフォーマットのＥＬＩＳＡの場合のように、抗原の密度が高い場合には、ＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２はいずれも抗原に対して二価の結合が可能であるため、これらの結合活性は同等に検出されるが（図１９）、３番目のフォーマットのＥＬＩＳＡにように抗原密度が低い場合には、ＣｈＢＡ−１−３Ｄは二価の抗原結合が可能であるが、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２はアビィディティーが低下しているため、一価での抗原結合しかできず、そのためＣｈＢＡ−１−３Ｄと比べて、低い抗原結合を示したと考えられた。
【実施例７】
【００１４】
ヒト型化ＢＡ−１−３Ｄ抗体の変異体の作製とキャラクラリゼーション
ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２のアビィディティーの低下がＶＨとＶＬのどちらに原因があるのかを以下の実験で検討した。まず、ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２ベクターのＮｈｅＩとＥｃｏＲＩの制限酵素部位に挟まれたＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬ遺伝子の断片（図１０）をマウスＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬのＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片（図４）に置き換えて、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ２とマウスＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬから構成される、すなわちヒト型化ＶＨとマウスＶＬ（ＨｕＶＨ／ＭｕＶＬ）から構成される発現ベクター（ｐＨｕＶＨ２／ＭｕＶＬ）を作製した。次に、ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２ベクターのＳｐｅＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素部位に挟まれたＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ２遺伝子の断片（図９）をマウスＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨのＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（図３）に置き換え、マウスＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨとＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬから構成される、すなわちマウスＶＨとヒト型化ＶＬ（ＭｕＶＨ／ＨｕＶＬ）から構成される発現ベクター（ｐＭｕＶＨ／ＨｕＶＬ）を作製した。
次に、ｐＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２、ｐＨｕＶＨ２／ＭｕＶＬ及びｐＭｕＶＨ／ＨｕＶＬの各発現ベクターを、それぞれＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、添付の方法に従い、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションを行い、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥ培地で３７℃、７．５％ＣＯ２インキュベーターで数日間培養を行った後、培養上清を回収した。培養上清中の抗体濃度は、前述したサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。ＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２、ＨｕＶＨ２／ＭｕＶＬ及びＭｕＶＨ／ＨｕＶＬそれぞれのｈＤｌｋ−１との結合は、前述した３番目のフォーマットのＥＬＩＳＡ（すなわち０．０５μｇ／ｍｌの濃度でｈＤｌｋ−１−ＨｉｓをコーティングしたＥＬＩＳＡ）で測定した。その結果、ＨｕＶＨ２／ＭｕＶＬ及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−２のｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓへの結合は弱いのに対して、ＭｕＶＨ／ＨｕＶＬのｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓへの結合は、ＣｈＢＡ−１−３Ｄと同程度の結合を示し（図２１）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＬはアビィディティーの低下には寄与しておらず、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨにアビィディティーの低下の原因があることが示された。
低下したアビィディティーを回復させるために、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１のアミノ酸の置換を行った。図６に示したとおり、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１とマウスＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨのアミノ酸配列のアライメントにおいては、アミノ酸番号（Ｋａｂａｔらの定義（１９９１）に従って付与）が５，９，１１，１２，１３，１６，２０，２４，３８，４０，４１，４２，４３，４４，７３，７５，８２ａ，８２ｂ，８３，８５，８７，８９及び１０８番目の合計２３個のアミノ酸が両者間で異なっている。そこで、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１中のこれらアミノ酸番号のアミノ酸を、それぞれ対応するマウスＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨのアミノ酸に置換した変異体の発現ベクター（ｐＨｕＢＡ１−３Ｄ−１変異体）を作製した。
なお、図６のアライメントにおけるアミノ酸番号では、例えば、５２と５２ａ、８２と８２ａ、８２ｂ、８２ｃというように、同じ５２や８２でも区別される番号（５２ａや８２ａ等）も付与されている（この点は、図２２においても同様である。）。従って、図６（及び図２２）におけるアミノ酸番号と、各図中のＶＨの成熟ペプチドのアミノ酸配列（配列番号１５、３５、４０、６７、７３）におけるアミノ酸番号とには、差異が生じる。本願明細書及び図面においては、置換したアミノ酸の番号は、図６（及び図２２）におけるアミノ酸番号の記載に基づいて表記するため（Ｔ７３Ｋ等）、例えば、図６（及び図２２）における７３番目のアミノ酸は、図１、８及び９のＶＨの成熟ペプチドのアミノ酸配列（配列番号１５、３５及び４０）においては７４番目のアミノ酸に対応する（他のアミノ酸番号のアミノ酸や、ＶＬのアミノ酸番号についても同様）。
ここで、各アミノ酸置換変異体は、遺伝子組換え技術に関する当業者の技術常識に基づき、それをコードするＤＮＡによって調製することができる。各置換変異体を調製するためにＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  ｋｉｔ、Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）を用いて行うことができる。各置換変異体の発現ベクターは、例えば、ｐＨｕＢＡ１−３Ｄ−１ベクター中のＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１をコードするＤＮＡに変異導入することにより調製することができる。
図２２に、作製した２３種類のＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１変異体のそれぞれの名称（Ｖ５Ｑ〜Ｔ７３Ｋ／Ｔ７５Ｓ）とアミノ酸配列（ＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１のアミノ酸配列と異なるアミノ酸のみ表示）を示した。
各ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１変異体の発現ベクターを、それぞれＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、培養上清を用いて、各アミノ酸置換抗体のｈＤｌｋ−１との結合活性を、３番目のフォーマットのＥＬＩＳＡ（すなわち低濃度（０．０５μｇ／ｍｌ）のｈＤｌｋ−１−ＨｉｓをコーティングしたＥＬＩＳＡ）で測定した。２３種類のＨｕＢＡ−１−３Ｄ  ＶＨ１変異体のうち、アミノ酸番号が７３番目のスレオニン（Ｔ）をリジン（Ｋ）に置換したＴ７３Ｋ変異体（ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋ）が、部分的ではあるが、明らかな抗原結合活性の回復が認められ、また、アミノ酸番号が２４番目のアラニン（Ａ）をグリシン（Ｇ）に置換したＡ２４Ｇ変異体（ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ）でも抗原結合活性の回復が認められた（図２３）。その他の２１種類の変異体では、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１と比較して、抗原結合の回復は認められないか、ごく僅かに認められる程度であった。
さらに、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１で低下していたアビィディティーを回復させるために、Ａ２４ＧとＴ７３Ｋのアミノ酸置換を組み合わせた２アミノ酸置換（Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ）を行った変異体を作製した（図２２）。また、５番目のアミノ酸（Ｖ）と７５番目のアミノ酸（Ｔ）は、可変領域の三次元構造において、７３番目のアミノ酸に近接して位置しており、また１１番目のアミノ酸（Ｖ）はγ鎖のＶＨとＣＨの間のｂａｌｌ−ａｎｄ−ｓｏｃｋｅｔ  ｊｏｉｎｔに含まれることが以前に報告されていたため（Ｌａｎｄｏｌｆｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：１７４８，２００１）、Ｔ７３Ｋと組み合わせて５番目、１１番目、７５番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異体（Ｖ５Ｑ／Ｔ７３Ｋ、Ｖ１１Ｌ／Ｔ７３Ｋ及びＴ７３Ｋ／Ｔ７５Ｓ）も併せて作製した（図２２）。なお、これら各アミノ酸置換変異体、及びそれらの発現ベクターの調製は、前述した２３種の各アミノ酸置換変異体等の調製と同様の方法で行った。
上記４種類の２アミノ酸置換変異体（ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｖ５Ｑ／Ｔ７３Ｋ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｖ１１Ｌ／Ｔ７３Ｋ及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋ／Ｔ７５Ｓ）の発現ベクター（ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ、ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｖ５Ｑ／Ｔ７３Ｋ、ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｖ１１Ｌ／Ｔ７３Ｋ及びｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋ／Ｔ７５Ｓ）と、ｐＣｈＢＡ−１−３Ｄ及びｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１の発現ベクターを、それぞれＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、培養上清を用いて、各アミノ酸置換抗体のｈＤｌｋ−１との結合活性を、３番目のフォーマットのＥＬＩＳＡ（すなわち低濃度（０．０５μｇ／ｍｌ）のｈＤｌｋ−１−ＨｉｓをコーティングしたＥＬＩＳＡ）で測定した。その結果、上記４種類の変異体のうち、Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ変異体（ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ）が、ＣｈＢＡ−１−３Ｄと同等の、強いｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓとの結合を示し（図２３）、他の３種類の変異体は、１アミノ酸置換の変異体であるＴ７３Ｋ変異体（ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋ）と比較してほとんど改善は認められなかった。
【実施例８】
【００１５】
ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋ及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの発現、精製並びにキャラクラリゼーション
変異型抗体であるＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋ及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの発現ベクター（ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋ及びｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ）を、実施例４で述べた方法と同様の方法でＮＳ０細胞にトランスフェクションし、安定的に、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋを産生するＮＳ０細胞株（ＮＳ０−ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋ  ３Ｅ１２）と、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋを産生するＮＳ０細胞株（ＮＳ０−ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ  ２Ｇ３、ＮＳ０−ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ  ５Ｃ７及びＮＳ０−ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ  ５Ｆ９）を樹立し、無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に順化した。
これらＮＳ０−ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋ  ３Ｅ１２、ＮＳ０−ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ  ２Ｇ３、ＮＳ０−ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ  ５Ｃ７及びＮＳ０−ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ  ５Ｆ９の各ＮＳ０細胞株が産生する抗体のＨ鎖とＬ鎖は、実施例４で述べた方法と同様の方法でｃＤＮＡシーケンスによって配列を確認した。上記各ＮＳ０細胞株が産生するＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋ及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３ＫのＨ鎖及びＬ鎖のｃＤＮＡ配列は、それぞれ、ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋベクター及びｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋベクターの対応するｃＤＮＡ配列（図１６、２４、２５）と完全に一致した。
ＮＳ０−ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋ  ３Ｅ１２細胞とＮＳ０−ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ  ２Ｇ３細胞を、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ培地で、実施例５で述べた方法と同様の方法で培養し、培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを用いて、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３ＫとＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋを精製した。精製したＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３ＫとＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋを非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開したところ、約５０ｋＤａのＨ鎖と約２５ｋＤａのＬ鎖が確認され（図１７）、それぞれの抗体の純度は９５％以上であった。
次に、精製したＣｈＢＡ−１−３Ｄ、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋ及びＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの抗原とのアビィディティー（Ａｖｉｄｉｔｙ；抗原結合活性）を、ｈＤｌｋ−１−Ｈｉｓを０．０５μｇ／ｍｌの低濃度で９６穴プレートにコーティングした前記３番目のフォーマットのＥＬＩＳＡにより解析を行った。その結果、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ｔ７３Ｋの抗原結合活性は、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１よりも活性が強いものの、ＣｈＢＡ−１−３Ｄ抗体よりは弱かった。他方、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋでは、ＥＣ５０値は３５．５ｎｇ／ｍｌであり、ＣｈＢＡ−１−３ＤのＥＣ５０値である２５．４ｎｇ／ｍｌと近い値を示したことから、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋでは、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１で低下していたアビディティーが改善され、ＣｈＢＡ−１−３Ｄと同等の抗原結合活性を獲得したことが示された（図２６）。
【実施例９】
【００１６】
ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ高産生ＮＳ０細胞株の作製
ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３ＫベクターのＮＳ０細胞へのトランスフェクションと安定細胞株の構築、無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ）への順化は、実施例４及び実施例８と同様に行った。樹立したＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ抗体高産生ＮＳ０細胞の１つであるＮＳ０−ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ  ８Ａ３を、２５０ｍｌのプラスチック三角フラスコを用い、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１％  ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８溶液（Ｓｉｇｍａ）を含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ培地４０ｍｌで、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で回転数１００ｒｐｍのロータリーシェーカーにより培養を行った。
細胞密度が約２ｘ１０６／ｍｌに達した時点で１／１０量の３５ｍｇ／ｍｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ４（ＨｙＣｌｏｎｅ）と０．１％  ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８溶液を培地に添加した。さらに２日後、１／１０量のＳＦＭ４ＭＡｂ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）で希釈した６０ｍｇ／ｍｌ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒｅｄ  Ｓｏｙ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と０．１％  ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８溶液を培地に添加し、生細胞率が５０％以下になるまで培養を行った。培養上清中のＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの濃度は、７３μｇ／ｍｌであった。
ＮＳ０−ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ  ８Ａ３細胞が産生する抗体のＨ鎖及びＬ鎖は、実施例４で述べた方法と同様の方法でｃＤＮＡシーケンスにより配列を確認し、ｐＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋベクターの対応するｃＤＮＡ配列（図１６、２５）と完全に一致した。
【実施例１０】
【００１７】
ＨｕＢＡ−１−３−Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの抗原結合安定性の検討
変異型抗体であるＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの抗原結合安定性について、液剤中での加速試験、及びカニクイザル血漿中での保存試験により検討した。
まず、液剤中での加速試験は以下のように行った。ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３ＫをｐＨが異なる３種類のバッファー中で４０℃、１ヶ月間保存した。使用したバッファーは、１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム（Ｗａｋｏ）、２６２ｍＭ  Ｄ−ソルビトール（Ｗａｋｏ）、０．０５ｍｇ／ｍｌ  ポリソルベート８０（Ｗａｋｏ）を含む溶液で、ｐＨを４．０、５．５及び７．０の３種類に調製した。各ｐＨのバッファーにおける抗体濃度は０．９７７ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ４．０）、０．９９６ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ５．５）及び０．９５９ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ７．０）で４０℃保存を開始した。保存終了後、各サンプルは抗原結合活性測定まで−８０℃で保存した。また、活性標準品は４０℃、１ヶ月保存前の抗体溶液を−８０℃で保存していたサンプルを用いた。抗原結合活性の測定はＦＡＣＳ解析及び抗原固相化ＥＬＩＳＡ法により行った。ＦＡＣＳ解析は、ＨＥＫ２９３細胞にヒト全長Ｄｌｋ−１遺伝子を安定的に発現させたＨＥＫ２９３−ｈＤｌｋ−１細胞を用いて行った（Ｎａｋａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｔａｊｉｍａ，ＵＳ２００９／０３２６２０５  Ａ１）。トリプシン処理によって培養皿から剥がし、５ｘ１０５ｃｅｌｌｓの細胞懸濁液に対し、１次抗体として、加速試験サンプル及び活性標準品を１０％ＦＣＳを含む培地で１０、３、１、０．３及び０．１μｇ／ｍｌに希釈した抗体溶液１００μｌを加え、４℃で２０分間インキュベーションした。その後、１ｍｌの１０％ＦＣＳを含む培地で洗浄し、ビオチン標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を２，０００倍希釈し且つストレプトアビジン標識ＰＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を５００倍希釈した２次抗体溶液１００μｌを加えた。４℃で２０分間インキュベーションした後、再び１ｍｌの１０％ＦＣＳを含む培地で洗浄した。その後、標識細胞を含むサンプルは、１ｍｌの１％ＦＣＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳに懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析した。その結果、４０℃、１ヶ月間の加速試験サンプルは、検討した３種類のｐＨにおいて−８０℃保存の活性標準品と同等の抗原結合活性を示した（図２７Ａ）。
さらに、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法による抗原結合活性の測定を行った。抗原固相化ＥＬＩＳＡは以下のように行った。９６穴プレート（ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ）を、ＰＢＳで３μｇ／ｍｌに希釈したｈＤｌｋ−１細胞外領域のリコンビナントタンパク質（ｈＤｌｋ−１  Ｈｉｓ）により５０μｌ／ｗｅｌｌでコーティングした（４℃、一晩）。洗浄バッファー（０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）で洗浄後、ブロッキングバッファー（２％スキムミルク、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）を２００μｌ／ｗｅｌｌで添加してブロッキングを行った（室温、１時間）。洗浄バッファーで洗浄した後、試験抗体をＥＬＩＳＡバッファー（１％スキムミルク、０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）で１、０．１、０．０３、０．０１及び０．００１μｇ／ｍｌに希釈し、それぞれ５０μｌ／ｗｅｌｌで添加した（室温、２時間）。洗浄バッファーで洗浄した後、検出用抗体としてＥＬＩＳＡバッファーで２，０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトκ鎖抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を５０μｌ／ｗｅｌｌで添加した（室温、１時間）。洗浄バッファーで洗浄後、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン；ＳＩＧＭＡ）を基質溶液として５０μｌ／ｗｅｌｌで添加し、発色反応を行った。１Ｍ硫酸を２５μｌ／ｗｅｌｌで加えて反応を停止させた後、ｉＭａｒｋ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いて、６５５ｎｍの吸光度をリファレンスとして４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ＦＡＣＳ解析の結果と同様に、３種類のｐＨのバッファーにおける４０℃、１ヶ月間の保存による活性の低下は認められなかった（図２７Ｂ）。
これらの結果から、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋが液剤中では安定した抗原結合活性を保持することが明らかとなった。
次に、カニクイザル血漿中での抗原結合活性について、抗原固相化ＥＬＩＳＡ法により検討した。カニクイザル血漿はヘパリン処理したプール血漿で、日本エスエルシー株式会社から入手し、使用まで−８０℃で保存した。使用に際し、解凍したカニクイザル血漿は小型遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ）にて１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、その上清を使用した。抗原固相化ＥＬＩＳＡに用いるサンプルは以下のように調製した。ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋをカニクイザル血漿で１０μｇ／ｍｌに調製し、３７℃で１、６、２４、４８時間及び７日間保温した。各時間保温したサンプルは測定まで−８０℃で保存した。活性標準品としてカニクイザル血漿で１０μｇ／ｍｌに調製した直後のサンプルを用いた。抗原結合活性の測定に際し、解凍した測定サンプルは小型遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ）にて１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、その上清を使用した。抗原固相化ＥＬＩＳＡは以下のように行った。９６穴プレート（ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ）をＰＢＳで３μｇ／ｍｌに希釈したｈＤｌｋ−１細胞外領域のリコンビナントタンパク質（ｈＤｌｋ−１  Ｈｉｓ）を５０μｌ／ｗｅｌｌでコーティングした（４℃、一晩）。洗浄バッファー（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ）で洗浄後、ブロッキングバッファー（１％カゼインを含むＰＢＳ）を２００μｌ／ｗｅｌｌで添加してブロッキングを行った（室温、１時間）。洗浄バッファーで洗浄した後、測定サンプルをブロッキングバッファーで０．１μｇ／ｍｌに希釈し、各５０μｌ／ｗｅｌｌで添加した（室温、１時間）。洗浄バッファーで洗浄した後、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの検出にはブロッキングバッファーで２，０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトκ鎖抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を５０μｌ／ｗｅｌｌで添加した（室温、１時間）。洗浄バッファーによる洗浄後、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン；ＳＩＧＭＡ）を基質溶液として５０μｌ／ｗｅｌｌで添加し、発色反応を行った。１Ｍ硫酸を２５μｌ／ｗｅｌｌで加え反応を停止させた後、ｉＭａｒｋ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒもしくはＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ５５０（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いて、６５５ｎｍの吸光度をリファレンスとして４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋは７日間のインキュベーションでも顕著な抗原結合活性の低下は見られなかった（図２８）。よって、カニクイザル血漿中において、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋは安定した抗原結合活性を保持できることが示された。この結果から、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋは、ヒトの血漿中（血中）においても同様に安定した抗原結合活性を保持できることが、示唆された。
【実施例１１】
【００１８】
ヒト型化抗ヒトＤｌｋ−１抗体（ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ）のｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性（以下、実施例１１〜１６において同様）
＜ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２細胞Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ＴｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおけるＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの抗腫瘍活性＞
ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋのｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性を、内在的にｈＤｌｋ−１を細胞表面に発現するヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２細胞を用いたＸｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルで検討した。
５×１０６ｃｅｌｌｓのＨｅｐＧ２細胞を７週齢雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの右脇腹皮下に移植（Ｄａｙ０）し、移植から９日後（Ｄａｙ９）に平均の腫瘍体積が１００ｍｍ３程度に達した段階で、コントロール群（ＰＢＳ投与群、Ｎ＝８，９６．６±１１．０ｍｍ３）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（１ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８，９６．２±８．５ｍｍ３）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（５ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８，９６．３±８．６ｍｍ３）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８，９６．２±８．５ｍｍ３）に群分けを行い、同日より３日に１回の投与間隔で、抗体の腹腔内投与を行った。
その結果、癌細胞移植から２３日目（Ｄａｙ２３）における腫瘍体積については、コントロール群が９００．１±２４８．６ｍｍ３であったのに対して、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与群ではいずれの用量の投与群においても極めて高い抗腫瘍活性（腫瘍形成阻害活性）が観察され、１ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、９３．４±４７．３ｍｍ３（阻害率８９．６％，Ｐ＜０．０１  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）、５ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、１０２．６±３９．７ｍｍ３（阻害率８８．６％，Ｐ＜０．０１  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）、１０ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、１４０．６±５５．０ｍｍ３（阻害率８４．４％，Ｐ＜０．０１  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）であった（図２９Ａ）。
同様に、癌細胞移植から２３日目（Ｄａｙ２３）における腫瘍重量についても、コントロール群が０．４４０±０．１０５ｇであったのに対して、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与群ではいずれの用量の投与群においても極めて高い抗腫瘍活性（腫瘍形成阻害活性）が観察され、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（１ｍｇ／ｋｇ体重）投与群では、０．０３０±０．０２６ｇ（阻害率９３．２％，Ｐ＜０．０１  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）、５ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、０．０４２±０．０２６ｇ（阻害率９０．５％，Ｐ＜０．０１  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）、１０ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、０．０６５±０．０３９ｇ（阻害率８５．１％，Ｐ＜０．０１  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）であった（図２９Ｂ）。
【実施例１２】
【００１９】
＜ヒト神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ＴｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおけるＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ抗体の抗腫瘍活性＞
ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋのｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性を、内在的にｈＤｌｋ−１を細胞表面に発現するヒト神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞を用いたＸｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルで検討した。
約５×１０６ｃｅｌｌｓのＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞を７週齢雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの右脇腹皮下に移植（Ｄａｙ０）し、移植から１３日後（Ｄａｙ１３）に平均の腫瘍体積が１００ｍｍ３程度に達した段階で、コントロール群（ＰＢＳ投与群、Ｎ＝８，９１．７±１８．３ｍｍ３）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（１ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８，９１．９±１６．９ｍｍ３）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（５ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８，９１．５±１６．５ｍｍ３）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８，９０．２±１１．７ｍｍ３）に群分けを行い、同日より３日に１回の投与間隔で、抗体の腹腔内投与を行った。
その結果、癌細胞移植から３４日目（Ｄａｙ３４）における腫瘍体積については、コントロール群が１２３１．６±４１１．１ｍｍ３であったのに対して、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与群では用量依存的な抗腫瘍活性（腫瘍形成阻害活性）が観察され、１ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、７１３．６±３４３．８ｍｍ３（阻害率４２．１％，Ｐ＜０．０５  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）、５ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、３１７．０±１６０．６ｍｍ３（阻害率７４．３％，Ｐ＜０．０１  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）、１０ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、１８９．０±１０４．０ｍｍ３（阻害率８４．７％，Ｐ＜０．０１  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）であった（図３０Ａ）。
同様に、癌細胞移植から３４日目（Ｄａｙ３４）における腫瘍重量についても、コントロール群が０．５８４±０．２１３ｇであったのに対して、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与群では用量依存的な抗腫瘍活性（腫瘍形成阻害活性）が観察され、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（１ｍｇ／ｋｇ体重）投与群では、０．３７９±０．１８３ｇ（阻害率６４．８％）、５ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、０．１６５±０．１１５ｇ（阻害率７１．８％，Ｐ＜０．０１  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）、１０ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、０．０９３±０．０５９ｇ（阻害率８４．１％，Ｐ＜０．０１  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔであった（図３０Ｂ）。
【実施例１３】
【００２０】
＜ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２細胞Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、低用量のＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの薬効評価及び既存の抗癌剤との薬効比較＞
ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋのｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性を、内在的にｈＤｌｋ−１を細胞表面に発現するヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２細胞を用いたＸｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルで検討した。同時に、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋと、既存の肝癌治療薬として承認されている「ネクサバール」（ソラフェニブトシル酸塩錠，Ｂａｙｅｒ）の抗腫瘍活性の比較を行った。
５×１０６ｃｅｌｌｓのＨｅｐＧ２細胞を７週齢雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの右脇腹皮下に移植（Ｄａｙ０）し、移植から１０日後（Ｄａｙ１０）に平均の腫瘍体積が１００ｍｍ３程度に達した段階で、コントロール群（ＰＢＳ投与群、Ｎ＝８，１０７．０±１６．８ｍｍ３）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（０．１ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８，１０８．０±１３．９ｍｍ３）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（０．５ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８，１０７．９±１０．５ｍｍ３）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（１ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８，１０７．９±１０．０ｍｍ３）に群分けを行い、同日より３日に１回の投与間隔で、抗体の腹腔内投与を行った。また、ネクサバール（４０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８，１０７．７±９．７ｍｍ３）、ネクサバール（８０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８，１０７．９±９．６ｍｍ３）についても、同日より週５日投与、２日間休薬のサイクルで経口投与を行った。
その結果、癌細胞移植から２８日目（Ｄａｙ２８）における腫瘍体積は、コントロール群が９４５．２±５６２．１ｍｍ３であったのに対して、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの０．５ｍｇ／ｋｇ投与群および１ｍｇ／ｋｇ投与群の腫瘍体積は、それぞれ２１９．４±１８２．８ｍｍ３（阻害率７６．８％，Ｐ＜０．０１  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）、１１６．５±６９．２ｍｍ３（阻害率８７．７％，Ｐ＜０．０１  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）となり（図３１Ａ）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与群においては、０．５ｍｇ／ｋｇの低用量においても非常に強い抗腫瘍活性が確認された。ネクサバール投与群における抗腫瘍活性はＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与群と比べて弱く、４０ｍｇ／ｋｇ投与群ではコントロールと比べて有意な抗腫瘍活性は認められず（５８８．０±３１４．０ｍｍ３）、８０ｍｇ／ｋｇ投与群においても３８４．１＋１９０．４ｍｍ３（阻害率５９．４％，Ｐ＜０．０５  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）であった（図３１Ｂ）。
副作用の１つの指標として、癌細胞移植からのマウスの体重変化について、群分け時（Ｄａｙ１０）の各群のマウスの体重の平均値を１００％とし、２８日目（Ｄａｙ２８）までの各群のマウスの体重の増加率を経時的に調べた。コントロール群では、腫瘍の成長に伴いマウスの体重の減少が観察されたが（９３．０±８．５％，Ｎ＝８，Ｄａｙ２８）、抗腫瘍効果を示したＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与群ではマウスの体重減少は観察されなかった（０．５ｍｇ／ｋｇ投与群：９９．０±１０．０％，１ｍｇ／ｋｇ投与群：１００．０±４．２％）。ネクサバール投与群では、経時的な体重減少が観察され、Ｄａｙ２８における体重減少率は、ネクサバール４０ｍｇ／ｋｇ投与群で８３．０±５．２％（Ｎ＝８，Ｐ＜０．０１  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）、８０ｍｇ／ｋｇ投与群で８０．０±７．７％（Ｎ＝７，Ｐ＜０．０５  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）であった（図３１Ｃ）。以上の結果から、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ抗体は、０．５ｍｇ／ｋｇ体重の低用量においても、ほぼ完全に腫瘍の成長を阻害する活性を有することが明らかとなった。また既存の肝癌治療薬であるネクサバールと比較して強い抗腫瘍活性を示し、副作用は示さないことが明らかとなった。
【実施例１４】
【００２１】
＜ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ＴｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおけるＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの薬効評価＞
肝癌でのＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの抗腫瘍活性について、ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞（ＡＴＣＣ，Ｃａｔ＃ＣＲＬ−１０７４１）を用いたＸｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルで検討した。
５×１０６ｃｅｌｌｓのＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を７週齢雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの右脇腹皮下に移植（Ｄａｙ０）し、移植から１０日後（Ｄａｙ１０）に平均の腫瘍体積が１００ｍｍ３以上に達した段階で、コントロール群（ＰＢＳ投与群、Ｎ＝８，１２０．８±２２．６ｍｍ３）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（０．１ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８，１２０．４±１８．４ｍｍ３）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（０．５ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８，１２０．１±１８．８ｍｍ３）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（１ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８，１２０．３±１８．８ｍｍ３）、，ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（５ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８，１２０．６±２１．０ｍｍ３）に群分けを行い、同日より３日に１回の投与間隔で、抗体の腹腔内投与を行った。
その結果、癌細胞移植から２６日目（Ｄａｙ２６）における腫瘍体積は、コントロール群が６３７．６±３５３．９ｍｍ３（Ｎ＝８）であったのに対して、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与群では１ｍｇ／ｋｇ体重投与群と５ｍｇ／ｋｇ体重投与群で統計的に有意な抗腫瘍活性が観察された。１ｍｇ／ｋｇ体重投与群の腫瘍体積は１３２．９±２６６．１ｍｍ３（阻害率７９．２％，Ｎ＝８，Ｐ＜０．０１  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）、５ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、１２８．０±７５．６ｍｍ３（阻害率７９．９％，Ｎ＝８，Ｐ＜０．０１  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）であった（図３２Ａ）。
同様に、癌細胞移植から２６日目（Ｄａｙ２６）における腫瘍重量についても、コントロール群が０．６２４±０．３８１ｇであったのに対して、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与群では、１ｍｇ／ｋｇ体重投与群で０．１０７±０．１１７ｇ（阻害率８２．９％，Ｐ＜０．０１  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）、５ｍｇ／ｋｇ体重投与群で０．０７９±０．０５６ｇ（阻害率８７．３％，Ｐ＜０．０１  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）となり、非常に強い抗腫瘍活性が確認された（図３２Ｂ）。
【実施例１５】
【００２２】
＜ヒト小細胞肺癌細胞株Ｌｕ−１３５細胞Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ＴｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおけるＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの薬効評価＞
ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの小細胞肺癌における抗腫瘍活性を、内在的にｈＤｌｋ−１を細胞表面に発現するヒト小細胞肺癌細胞株Ｌｕ−１３５細胞（ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンクより購入，Ｃａｔ＃ＪＣＲＢ０１７０）を用いたＸｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルで検討した。
５×１０６ｃｅｌｌｓのＬｕ−１３５細胞を７週齢雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの右脇腹皮下に移植（Ｄａｙ０）し、移植から１０日後（Ｄａｙ１０）に平均の腫瘍体積が１００ｍｍ３程度に達した段階で、コントロール群（ＰＢＳ投与群、Ｎ＝８，１００．９±１２．７ｍｍ３）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（１ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８，１００．６±８．１ｍｍ３）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与群（Ｎ＝８，１０２．９±１２．０ｍｍ３）に群分けを行い、同日より３日に１回の投与間隔で、抗体の腹腔内投与を行った。その結果、癌細胞移植から３４日目（Ｄａｙ３４）における腫瘍体積は、コントロール群が９７２．７±２６６．８ｍｍ３であったのに対して、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与群では，１ｍｇ／ｋｇ体重投与群で６３１．９±２１８．９ｍｍ３（阻害率３５．０％，Ｐ＜０．０５  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）、１０ｍｇ／ｋｇ体重投与群で５８２．３±２２０．４ｍｍ３（阻害率４０．１％，Ｐ＜０．０５  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）となり、統計的に有意な抗腫瘍活性が確認された（図３３Ａ）。
同様に、癌細胞移植から３４日目（Ｄａｙ３４）における腫瘍重量についても、コントロール群が０．６３２±０．１７７ｇであったのに対して、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与群では、１ｍｇ／ｋｇ体重投与群で０．４２９±０．１６１ｇ（阻害率３２．１％，Ｐ＜０．０５  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）、１０ｍｇ／ｋｇ体重投与群で０．４２０±０．１７８ｇ（阻害率３３．５％，Ｐ＜０．０５  ｂｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）となり、統計的に有意な抗腫瘍活性が確認された（図３３Ｂ）。
【実施例１６】
【００２３】
＜ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２細胞Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔモデルにおける、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与による癌細胞のアポトーシス誘導＞
次に、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋが示す抗腫瘍活性の作用機序について、抗体投与後のＸｅｎｏｇｒａｆｔ腫瘍における癌細胞のアポトーシスを、ＴＵＮＥＬ法、および抗Ｃｌｅａｖｅｄ  Ｃａｓｐａｓｅ−３抗体を用いた免疫組織染色法により検討した。
５×１０６ｃｅｌｌｓのＨｅｐＧ２細胞を７週齢雌のＮＯＤ−ｓｃｉｄマウスの右脇腹皮下に移植し、平均の腫瘍体積が２００ｍｍ３以上に達した段階で、コントロール群（ＰＢＳ投与群）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与群（５ｍｇ／ｋｇ体重）に群分けを行った。コントロール群はＰＢＳ投与４８時間後（Ｎ＝３）、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ投与群は抗体投与２４時間後、４８時間後（各Ｎ＝３）に、Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ腫瘍を回収し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（ティシュー・テックＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド，フナコシ）で包埋したのち、液体窒素下で凍結ブロックを作製した。クリオスタットでＸｅｎｏｇｒａｆｔ腫瘍の凍結切片を作製し、ＴＵＮＥＬ法によるアポトーシスの検出を、ＴｕｍｏｒＴＡＣＳＴＭＩｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，４８１５−３０−Ｋ）に記載の方法に従って行った。
作製した凍結切片は、室温で十分に風乾させた後、エタノール系列で再水和を行い、３．７％のホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ，０６４−００４０６）を含むＰＢＳで固定した。ＰＢＳで室温下５分間の洗浄を２回行った後、Ｃｙｔｏｎｉｎ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，４８７６−０５−０１）による透過処理を行い、蒸留水で室温２分間２回の洗浄後、メタノールに終濃度３％となるように過酸化水素水（Ｗａｋｏ，０８１−０４２１５）を加えた溶液で室温下５分間の処理をし、内因性ペルオキシダーゼ活性を除いた。その後、ＰＢＳで室温下１分間の洗浄、及び１０×ＴｄＴ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，４８１０−３０−０２）を蒸留水で１０倍に希釈した溶液（以下、１×ＴｄＴ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）での前処理を行い、ＴｄＴ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，４８１０−３０−０４）、５０×Ｍｎ２＋（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，４８１０−３０−１４）、ＴｄＴ  Ｅｎｚｙｍｅ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，４８１０−３０−０５）、１×ＴｄＴ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ＢｕｆｆｅｒをＴｕｍｏｒＴＡＣＳＴＭＩｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔの説明書に従い混合して作製したＬａｂｅｌｉｎｇ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘを３７℃で１時間反応させ、ビオチン標識ｄＮＴＰを断片化ＤＮＡに付加させた。１０×Ｓｔｏｐ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，４８１０−３０−０３）を蒸留水で１０倍に希釈した溶液を室温で５分間反応させ、Ｌａｂｅｌｉｎｇ反応を停止させた後、ＰＢＳで室温下２分間の洗浄を２回行い、Ｓｔｒｅｐ−ＨＲＰ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，４８００−３０−０６）をＰＢＳで５０倍に希釈した溶液を室温下で１０分間反応させ、ＡＢＣ複合体を形成させた。ＰＢＳで室温下２分間の洗浄を２回行った後、ＰＢＳ、ＤＡＢ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，４８００−３０−０９）、３０％過酸化水素水をＴｕｍｏｒＴＡＣＳＴＭＩｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔの説明書に従い混合して作製したＤＡＢ  ｓｏｌｕｔｉｏｎにより発色を行った。発色を確認した後、脱イオン水で２分間４回の洗浄を行い、１％  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，４８００−３０−１８）により核を染色し、その後エタノールで脱水、キシレンで透徹してエンテランニュー（ＭＥＲＣＫ，１０７９６１０１００）で封入したのち、顕微鏡下で観察した。組織切片中の全癌細胞のうち、１０％以上の癌細胞が染色される組織切片を陽性とした。
その結果、コントロール群（ＰＢＳ投与群、Ｎ＝３）のＸｅｎｏｇｒａｆｔ腫瘍においてはＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシスを起こした癌細胞は観察されなかったのに対して、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの５ｍｇ／ｋｇ体重投与群では、投与２４時間後でＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシスが誘導された癌細胞が観察され、投与４８時間後では、３例全例で３０％以上の癌細胞においてアポトーシスが観察された（図３４Ａ）。
同様に、Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ腫瘍における癌細胞のアポトーシスを、活性型カスパーゼ３の免疫染色で検討した。凍結切片は、４％  Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（Ｗａｋｏ，１６０−１６０６１）を含むＰＢＳにて４℃で１５分間処理し固定した。ＰＢＳで室温下５分間の洗浄を２回行った後、メタノールに終濃度３％となるように過酸化水素水（Ｗａｋｏ，０８１−０４２１５）を加えた溶液で室温下１０分間処理し、内因性ペルオキシダーゼ活性を除いた。ＰＢＳで室温下５分間の洗浄を２回行った後、１．５％の正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｓ−１０００）を含むＰＢＳでブロッキングを行った（室温下で１時間）。
次に、ブロッキングバッファーで６００倍に希釈した抗Ｃｌｅａｖｅｄ  Ｃａｓｐａｓｅ−３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｃａｔ＃  ９６６１）を４℃で一晩反応させた後、ＣｈｅｍＭａｔｅ  ＥｎＶｉｓｉｏｎポリマー試薬（ＤＡＫＯ，Ｋ５０２７）を室温下で３０分間反応させた。ＰＢＳで室温下５分間の洗浄を３回行った後、ヒストファインペルオキシダーゼ基質シンプルステインＤＡＢ溶液（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，４１５１７１）によって発色を行った。脱イオン水で５分間洗浄し、マイヤーヘマトキシリン溶液（Ｗａｋｏ，１３１−０９６６５）によって核を染色し、その後エタノールで脱水、キシレンで透徹してエンテランニュー（ＭＥＲＣＫ，１０７９６１０１００）で封入したのち、顕微鏡下で観察した。組織切片中の全癌細胞のうち、１０％以上の癌細胞が染色される組織切片を陽性とした。
その結果、コントロール群（ＰＢＳ投与群、Ｎ＝３）のＸｅｎｏｇｒａｆｔ腫瘍では活性型カスパーゼ３は検出されなかったのに対して、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ（５ｍｇ／ｋｇ体重）投与群では、投与２４時間後では３例中２例、投与４８時間後では３例全例で活性型カスパーゼ３陽性のアポトーシスが誘導された癌細胞が観察され、特に投与４８時間後のＸｅｎｏｇｒａｆｔ腫瘍では全体の８０％以上の癌細胞で活性型カスパーゼ３陽性のアポトーシスによる細胞死が観察された（図３４Ｂ）。
以上の結果から、ＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋは、肝癌細胞株ＨｅｐＧ２細胞に対してアポトーシスによる細胞死を誘導することが明らかとなり、少なくともＨｕＢＡ−１−３Ｄ−１−Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋの抗腫瘍活性の作用機序の１つであることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明によれば、抗腫瘍活性を有する抗ｈＤｌｋ−１抗体、具体的にはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗体単独投与でも顕著な抗腫瘍活性を有する抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体、特にヒト型化抗体を提供することができる。さらに、当該ヒト型化抗体の中でも、より一層アビィディティー（Ａｖｉｄｉｔｙ；抗原結合活性）が高くなるよう改変された、アミノ酸置換変異型のヒト型化抗ｈＤｌｋ−１モノクローナル抗体を提供することができる。
また本発明は、当該抗体を産生するハイブリドーマ、当該抗体と各種薬剤との複合体を提供することができる。
さらに本発明は、上記抗体や上記複合体等を用いる、腫瘍の診断用又は治療用医薬組成物、腫瘍細胞のアポトーシス誘導用医薬組成物、腫瘍治療剤、腫瘍診断剤、腫瘍細胞のアポトーシス誘導剤、腫瘍の治療方法、腫瘍の検出方法、腫瘍の検出用又は診断用キット、並びに腫瘍細胞のアポトーシス誘導用キット等を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００２５】
配列番号３〜１１：合成ＤＮＡ
配列番号２６：組換えＤＮＡ
配列番号２７：組換えＤＮＡ
配列番号３２：組換えＤＮＡ
配列番号３３：組換えタンパク質
配列番号３４：組換えＤＮＡ
配列番号３５：組換えタンパク質
配列番号３６：組換えＤＮＡ
配列番号３７：組換えＤＮＡ
配列番号３８：組換えタンパク質
配列番号３９：組換えＤＮＡ
配列番号４０：組換えタンパク質
配列番号４１：組換えＤＮＡ
配列番号４２：組換えＤＮＡ
配列番号４３：組換えタンパク質
配列番号４４：組換えＤＮＡ
配列番号４５：組換えタンパク質
配列番号４６：組換えＤＮＡ
配列番号４７〜５１：合成ＤＮＡ
配列番号５２：組換えＤＮＡ
配列番号５３：組換えタンパク質
配列番号５４：組換えＤＮＡ
配列番号５５：組換えタンパク質
配列番号５６：組換えＤＮＡ
配列番号５７：組換えタンパク質
配列番号５８：組換えＤＮＡ
配列番号５９：組換えタンパク質
配列番号６０：組換えＤＮＡ
配列番号６１：組換えタンパク質
配列番号６２：組換えＤＮＡ
配列番号６３：組換えタンパク質
配列番号６４：組換えＤＮＡ
配列番号６５：組換えタンパク質
配列番号６６：組換えＤＮＡ
配列番号６７：組換えタンパク質
配列番号６８：組換えＤＮＡ
配列番号６９：組換えタンパク質
配列番号７０：組換えＤＮＡ
配列番号７１：組換えタンパク質
配列番号７２：組換えＤＮＡ
配列番号７３：組換えタンパク質
配列番号７４：組換えＤＮＡ
配列番号７５：組換えタンパク質
配列番号７６：組換えＤＮＡ
配列番号７７：組換えタンパク質
配列番号７８：組換えＤＮＡ
配列番号７９：組換えタンパク質
配列番号８０：組換えＤＮＡ
配列番号８１：組換えタンパク質
配列番号８２：組換えＤＮＡ
配列番号８３：組換えタンパク質
配列番号８４：組換えＤＮＡ
配列番号８５：組換えタンパク質
配列番号８６：組換えＤＮＡ
配列番号８７：組換えタンパク質
配列番号８８：組換えＤＮＡ
配列番号８９：組換えタンパク質
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図１７】
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【図３４】
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【国際調査報告】
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