(57)【要約】  任意の外来遺伝子をコードするＤＮＡの３’側にｈｐ７配列をコードするＤＮＡおよびポリＡ付加シグナルをコードするＤＮＡが付加されたＤＮＡを、非ヒト動物のゲノム上に存在する任意の標的遺伝子の同一読み取り枠に挿入したことを特徴とする非ヒト動物。
2014042251.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意の外来遺伝子をコードするＤＮＡの３’側にｈｐ７配列をコードするＤＮＡおよびポリＡ付加シグナルをコードするＤＮＡが付加されたＤＮＡを、非ヒト動物のゲノム上に存在する任意の標的遺伝子の同一読み取り枠に挿入したことを特徴とする非ヒト動物。
【請求項２】
前記外来遺伝子がヒトインターロイキン−６受容体遺伝子である、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項３】
前記非ヒト動物のゲノム上に存在する任意の標的遺伝子がインターロイキン−６受容体遺伝子である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項４】
健常なヒトにおける可溶型インターロイキン−６受容体の血中濃度と同等の血中濃度で可溶型ヒトインターロイキン−６受容体を発現する、請求項２〜３のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項５】
非ヒト動物がげっ歯類である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項６】
非ヒト動物がマウスである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項７】
ヒトインターロイキン−６を過剰発現させた、請求項１〜６のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項８】
被験物質における、ヒトインターロイキン−６またはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患の治療効果を評価する方法であって、
（ａ）被験物質を、請求項７に記載の非ヒト動物に投与する工程と、
（ｂ）前記被験物質を投与した非ヒト動物において、ヒトインターロイキン−６またはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患の症状が抑制されたか否かを測定する工程、
とを含んで成る方法。
【請求項９】
ヒトインターロイキン−６あるいはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患がキャッスルマン病である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
被験物質の薬物動態学的特性を評価する方法であって、
（ａ）被験物質を、請求項１〜７のいずれか１項に記載の非ヒト動物に投与する工程と、
（ｂ）前記被験物質を投与した非ヒト動物における被験物質の血中濃度を測定する工程、
とを含んで成る方法。
【請求項１１】
被験物質における、血中から可溶型ヒトインターロイキン−６受容体を除去する活性を評価する方法であって、
（ａ）被験物質を、請求項２〜７のいずれか１項に記載の非ヒト動物に投与し、
（ｂ）前記被験物質を投与した非ヒト動物において、可溶型ヒトインターロイキン−６受容体の血中濃度を測定する工程、
とを含んで成る方法。
【請求項１２】
被験物質がヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ヒトインターロイキン−６またはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患の治療効果を有する、ヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体の生産方法であって、
（ａ）ヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体を生産する工程、
（ｂ）前記抗体を、請求項７に記載の非ヒト動物に投与する工程、
（ｃ）前記抗体を投与した非ヒト動物において、ヒトインターロイキン−６またはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患の症状が抑制されたか否かを測定する工程、および
（ｄ）ヒトインターロイキン−６またはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患の症状を抑制する抗体を選抜する工程、
を含んで成る方法。
【請求項１４】
ヒトインターロイキン−６あるいはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患がキャッスルマン病である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
所望の薬物動態学的特性を有する、ヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体の生産方法であって、
（ａ）ヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体を生産する工程、
（ｂ）前記抗体を、請求項２〜７のいずれか１項に記載の非ヒト動物に投与する工程、
（ｃ）前記抗体を投与した非ヒト動物における前記抗体の血中濃度を測定する工程、
、および
（ｄ）所望の血中濃度を有する抗体を選抜する工程、
を含んで成る方法。
【請求項１６】
血中から可溶型ヒトインターロイキン−６受容体を除去する活性を有する、ヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体の生産方法であって、
（ａ）ヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体を生産する工程、
（ｂ）前記抗体を、請求項２〜７のいずれか１項に記載の非ヒト動物に投与する工程、
（ｃ）前記抗体を投与した非ヒト動物において、可溶型ヒトインターロイキン−６受容体の血中濃度を測定する工程、および
（ｄ）可溶型ヒトインターロイキン−６受容体の血中濃度を低下させる抗体を選抜する工程、
を含んで成る方法。
【請求項１７】
（ｅ）選抜された抗体をキメラ化、またはヒト型化する工程をさらに含んで成る、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の抗体の生産方法。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の非ヒト動物を作製するためのＤＮＡであって、任意の外来遺伝子をコードするＤＮＡの３’側にｈｐ７配列をコードするＤＮＡおよびポリＡ付加シグナルをコードするＤＮＡが付加されたＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の非ヒト動物を作製するためのベクターであって、請求項１８に記載のＤＮＡを保持するノックインベクター。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の非ヒト動物を作製するための形質転換細胞であって、請求項１９に記載のノックインベクターが導入された形質転換細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子ノックイン非ヒト動物および、遺伝子ノックイン非ヒト動物を用いた化合物の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬など、分子標的に対する特異性の高い治療薬の開発が数多くなされており、その前臨床評価をより適切に行うためにヒト化マウスなどのヒト化非ヒト動物の要望が高まっている。ヒト化マウスを作成する手法として、マウスにヒトの遺伝子を発現するようにした、いわゆるトランスジェニックマウスと、マウス遺伝子をヒト遺伝子に置換するジーンターゲティング法が広く知られており、かかる手法により作成されたヒト化マウスが数多く報告されている。しかしながら、トランスジェニックマウスのように、単純にヒトの遺伝子を発現するようにしたベクターを導入したマウスでは期待する発現様式を呈さないことが多い。例えばｐＣＡＧＧＳベクターを用いてヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）受容体遺伝子を過剰発現させたマウスが報告されているが（非特許文献１）、このトランスジェニックマウスはプロモーターが強力なため、ヒトＩＬ−６（ｈＩＬ−６）受容体の発現レベルは高く、本来の発現部位以外の組織や細胞にも異所性に発現する。また、マウス内因性のＩＬ−６受容体も発現する。一方、マウス遺伝子をヒト遺伝子に置換するジーンターゲティング法により作製する、いわゆるノックインマウスにおいては、全長のヒト遺伝子のコード配列を標的のマウス遺伝子に挿入する場合には、転写されたｍＲＮＡにおいては、マウス遺伝子の終止コドンの遥かに上流に、挿入したヒト遺伝子の終止コドン（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎ,  ＰＴＣ）が存在し、かつ、この終止コドンの下流にマウス遺伝子に由来するエキソン−エキソン結合部が存在するという構造となる。この構造が、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ機構）により認識されてｍＲＮＡが分解を受けるため、目的の遺伝子発現量が得られないことが多い。その対策として、コード配列の直下にポリＡ付加シグナルを付加してマウスに挿入することが行われている。これにより、転写されるｍＲＮＡにおいて、ＰＴＣの下流に標的遺伝子由来のエキソン−エキソン結合部が生じない構造となるため、ＮＭＤは生じない。しかしながら、一般的に、スプライスアウトされないｍＲＮＡの発現量は低下することが知られている（非特許文献２）。このように非ヒト動物内因性の遺伝子発現を抑え、かつ生理的に妥当なレベルで外来遺伝子を発現させることができる非ヒト動物の作成は非常に困難であった。【０００３】
ところで、ｈｐ７配列はＧＣに富んだ塩基配列であり、ＲＮＡに転写された際に強固なステムループを形成することが知られている。ｈｐ７配列の機能に関しては、これまでに２つの論文にて報告されている。１つ目の論文では、翻訳開始点より５’上流側にこの配列が存在する場合、４０Ｓリポソームサブユニットがヘアピンの５’側で停止し、翻訳が阻害されることが報告されている(非特許文献３)。最近報告されたもう１つの論文では、ｈｐ７配列がＮＭＤの対象となるＰＴＣとエキソン−エキソン結合部の間に存在すると、ＮＭＤが抑制されることが記載されている（非特許文献４）が、その効果は弱いものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊ．Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９９５、Ｎｏｖ．  １；１８２（５）：１４６１−１４６８
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ.Ｓ.Ａ．  ８５:８３６−８４０.
【非特許文献３】Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ.  １９８９：９:５１３４−５１４２．
【非特許文献４】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２０１２、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｓ３４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、非ヒト動物の内因性遺伝子（標的遺伝子）の発現を欠損させ、かつ生理的に妥当なレベルで外来遺伝子を発現させることができる非ヒト動物を提供するとともに、該動物を用いた化合物の評価方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、該評価方法を利用した所望の活性を有する抗体の生産方法を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、内因性の標的遺伝子の発現を欠損させ、生理的に妥当なレベルで、挿入した外来遺伝子を発現させることができるマウスの作製を試みた。そして、鋭意検討の結果、外来遺伝子の終止コドンの下流にｈｐ７配列とポリＡ付加シグナルを付加して、マウスの標的遺伝子内に挿入することにより、当該マウスにおいて、ヒトにおいて報告されている血中濃度と同等の濃度で外来遺伝子を発現させることができることを見出した。【０００７】
このマウスに挿入された外来遺伝子にはポリＡ付加シグナルが付加されているため、挿入した外来遺伝子からはスプライスアウトされないｍＲＮＡが生じる。上記の通り、スプライスアウトされないｍＲＮＡの発現量は低下することが知られているが（非特許文献２）、本発明においては、ｈｐ７配列の使用により、このような発現の低下を回避することができた。【０００８】
ｈｐ７配列をＮＭＤの対象となるＰＴＣとエキソン−エキソン結合部の間に挿入することによりＮＭＤを抑制することは知られているが（非特許文献４）、本発明においてはｈｐ７配列の下流にポリＡ付加シグナルが存在し、ＰＴＣの下流にエキソン−エキソン結合部は生じないため、ＮＭＤ機構による認識はない。【０００９】
このように、本発明において、ｈｐ７配列の使用により、ＮＭＤ機構の抑制以外の機序により、生理的に妥当なレベルで外来遺伝子を発現させることができたことは、予想外の驚くべき知見である。【００１０】
また、本発明者らは、マウスのインターロイキン−６受容体遺伝子内に、ヒトインターロイキン−６受容体遺伝子を挿入したマウスにおいて、ヒトインターロイキン６遺伝子を過剰発現させることにより、当該マウスが、ヒトインターロイキン−６あるいはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患の症状を呈し、この症状がヒト型化中和抗体の投与により改善されることを見出した。このヒト型化中和抗体を投与したマウスにおいては、可溶型ヒトインターロイキン−６受容体の血中濃度が上昇していたが、この点もヒトにおける症状と共通であった。さらなる利点として、ヒト型化中和抗体を投与したマウスにおいては、この中和抗体を認識する内因性のマウス抗体の産生が抑制されていた。すなわち、本発明者らは、ヒトインターロイキン−６あるいはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患の病態を示す優れたモデル動物の作製にも成功した。このモデル動物を利用すれば、被験物質における、疾患の治療効果、薬物動態、血中から可溶型ヒトインターロイキン−６受容体を除去する活性などを簡便に測定することが可能である。さらに、このような評価系を利用することにより、所望の活性を有する抗体などの開発を効率的に行うことが可能である。【００１１】
本発明は、以上の知見に基づくものであり、具体的には以下を含む。【００１２】
[１]  任意の外来遺伝子をコードするＤＮＡの３’側にｈｐ７配列をコードするＤＮＡおよびポリＡ付加シグナルをコードするＤＮＡが付加されたＤＮＡを、非ヒト動物のゲノム上に存在する任意の標的遺伝子の同一読み取り枠に挿入したことを特徴とする非ヒト動物。【００１３】
[２]  前記外来遺伝子がヒトインターロイキン−６受容体遺伝子である、[１]に記載の非ヒト動物。【００１４】
[３]  前記非ヒト動物のゲノム上に存在する任意の標的遺伝子がインターロイキン−６受容体遺伝子である、[１]〜[２]のいずれか１つに記載の非ヒト動物。【００１５】
[４]  健常なヒトにおける可溶型インターロイキン−６受容体の血中濃度と同等の血中濃度で可溶型ヒトインターロイキン−６受容体を発現する、[２]〜[３]のいずれか１つに記載の非ヒト動物。【００１６】
[５]  非ヒト動物がげっ歯類である、[１]〜[４]のいずれか１つに記載の非ヒト動物。【００１７】
[６]  非ヒト動物がマウスである、[１]〜[５]のいずれか１つに記載の非ヒト動物。【００１８】
[７]  ヒトインターロイキン−６を過剰発現させた、[１]〜[６]のいずれか１つに記載の非ヒト動物。【００１９】
[８]  被験物質における、ヒトインターロイキン−６またはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患の治療効果を評価する方法であって、
（ａ）被験物質を、[７]に記載の非ヒト動物に投与する工程と、
（ｂ）前記被験物質を投与した非ヒト動物において、ヒトインターロイキン−６またはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患の症状が抑制されたか否かを測定する工程、
とを含んで成る方法。【００２０】
[９]  ヒトインターロイキン−６あるいはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患がキャッスルマン病である、[８]に記載の方法。【００２１】
[１０]  被験物質の薬物動態学的特性を評価する方法であって、
（ａ）被験物質を、[１]〜[７]のいずれか１つに記載の非ヒト動物に投与する工程と、
（ｂ）前記被験物質を投与した非ヒト動物における被験物質の血中濃度を測定する工程、
とを含んで成る方法。【００２２】
[１１]  被験物質における、血中から可溶型ヒトインターロイキン−６受容体を除去する活性を評価する方法であって、
（ａ）被験物質を、[２]〜[７]のいずれか１つに記載の非ヒト動物に投与し、
（ｂ）前記被験物質を投与した非ヒト動物において、可溶型ヒトインターロイキン−６受容体の血中濃度を測定する工程、
とを含んで成る方法。【００２３】
[１２]  被験物質がヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体である、[７]〜[１１]のいずれか１つに記載の方法。【００２４】
[１３]  ヒトインターロイキン−６またはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患の治療効果を有する、ヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体の生産方法であって、
（ａ）ヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体を生産する工程、
（ｂ）前記抗体を、[７]に記載の非ヒト動物に投与する工程、
（ｃ）前記抗体を投与した非ヒト動物において、ヒトインターロイキン−６またはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患の症状が抑制されたか否かを測定する工程、および
（ｄ）ヒトインターロイキン−６またはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患の症状を抑制する抗体を選抜する工程、
を含んで成る方法。【００２５】
[１４]  ヒトインターロイキン−６あるいはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患がキャッスルマン病である、[１３]に記載の方法。【００２６】
[１５]  所望の薬物動態学的特性を有する、ヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体の生産方法であって、
（ａ）ヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体を生産する工程、
（ｂ）前記抗体を、[２]〜[７]のいずれか１つに記載の非ヒト動物に投与する工程、
（ｃ）前記抗体を投与した非ヒト動物における前記抗体の血中濃度を測定する工程、
、および
（ｄ）所望の血中濃度を有する抗体を選抜する工程、
を含んで成る方法。【００２７】
[１６]  血中から可溶型ヒトインターロイキン−６受容体を除去する活性を有する、ヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体の生産方法であって、
（ａ）ヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体を生産する工程、
（ｂ）前記抗体を、[２]〜[７]のいずれか１つに記載の非ヒト動物に投与する工程、
（ｃ）前記抗体を投与した非ヒト動物において、可溶型ヒトインターロイキン−６受容体の血中濃度を測定する工程、および
（ｄ）可溶型ヒトインターロイキン−６受容体の血中濃度を低下させる抗体を選抜する工程、
を含んで成る方法。【００２８】
[１７]  （ｅ）選抜された抗体をキメラ化、またはヒト型化する工程をさらに含んで成る、[１３]〜[１６]のいずれか１項に記載の抗体の生産方法。【００２９】
[１８]  [１]〜[７]のいずれかに記載の非ヒト動物を作製するためのＤＮＡであって、任意の外来遺伝子をコードするＤＮＡの３’側にｈｐ７配列をコードするＤＮＡおよびポリＡ付加シグナルをコードするＤＮＡが付加されたＤＮＡ。【００３０】
[１９]  [１]〜[７]のいずれかに記載の非ヒト動物を作製するためのベクターであって、[１８]に記載のＤＮＡを保持するノックインベクター。【００３１】
[２０]  [１]〜[７]のいずれかに記載の非ヒト動物を作製するための形質転換細胞であって、[１９]に記載のノックインベクターが導入された形質転換細胞。
【発明の効果】
【００３２】
本発明のノックイン非ヒト動物は、非ヒト動物内因性の遺伝子発現を抑え、かつ生理的に妥当なレベルで外来遺伝子を発現することができる。従って、本発明のノックイン非ヒト動物を利用すれば、抗体医薬などの分子標的に対する特異性の高い治療薬を適切に評価できる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】図１Ａは、マウスインターロイキン−６受容体（Ｉｌ６ｒａ）遺伝子のゲノムＤＮＡの構造（１）と、挿入されるノックインベクター（２）との関係を模式的に示す図である。ノックインベクターは、完全長ヒトインターロイキン−６受容体（ｈＩＬ６Ｒ）  ｃＤＮＡ、ｈｐ７配列、ポリＡ付加シグナル、およびネオマイシン耐性遺伝子を有する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、マウスインターロイキン−６受容体遺伝子のゲノムＤＮＡ（ａ）とノックインベクター（ｂ）とが相同性組換えを起して、ノックインされたゲノムＤＮＡ（ｃ）が生成される様子を模式的に示す図である。さらに（ｃ）に組換酵素Ｃｒｅを作用させて、ネオマイシン耐性遺伝子カセットを除去することにより、ヒトインターロイキン−６受容体遺伝子ノックインアレル（ｄ）を完成させる過程を示す。図中の矢印は、ヒトインターロイキン−６受容体遺伝子のノックインを検出するために使用したプライマーの設定位置を示す。
【図２】図２は、ヒトインターロイキン−６受容体遺伝子ノックインマウスの樹立の過程で得られた各遺伝子型を解析したＰＣＲの代表例を示す。
【図３】図３は、ヒトインターロイキン−６受容体遺伝子ノックインマウスおよび野生型マウスにおけるインターロイキン−６受容体の遺伝子発現特性を示す図である。
【図４】図４は、ホモ型およびヘテロ型のヒトインターロイキン−６受容体遺伝子ノックインマウスおよび野生型マウスにおける血漿中の可溶型ヒトインターロイキン−６受容体（ｈｓＩＬ−６Ｒ）濃度の測定結果を示すグラフである。ＫＩ／ＫＩ，ＫＩ／＋および＋／＋は、それぞれホモ型ノックインマウス、ヘテロ型ノックインマウスおよび野生型を示す。
【図５】図５は、野生型マウスおよびホモ型のヒトインターロイキン−６受容体遺伝子ノックインマウスでの、種特異的なインターロイキン−６（リガンド）に対する反応性を示したグラフである。
【図６】図６は、ヒトインターロイキン−６受容体遺伝子ノックインマウスとヒトインターロイキン−６トランスジェニックマウスとの交雑によるダブルトランスジェニックマウス樹立におけるＰＣＲによる遺伝子型解析の代表的な検出例を示す。
【図７】図７は、ヒト型化キャッスルマン病モデルマウスへの各種抗体（ＴＣＺあるいはＭＲ１６−１）投与実験における剖検時の脾臓重量を示すグラフである。
【図８】図８は、ヒト型化キャッスルマン病モデルマウスへのＴＣＺ投与実験での脾臓における形質細胞の増加の抑制効果を示す組織像である。Ａ：ｈＩＬ６Ｒノックインマウス、Ｂ：ＴＣＺ非投与のヒト型化キャッスルマン病モデルマウス、Ｃ：ＴＣＺを投与したヒト型化キャッスルマン病モデルマウス。
【図９】図９は、ヒト型化キャッスルマン病モデルマウスへの各種抗体（ＴＣＺあるいはＭＲ１６−１）投与実験における剖検時の血漿中可溶型ヒトインターロイキン−６受容体およびヒトインターロイキン−６濃度を示す図である。
【図１０】図１０は、ヒト型化キャッスルマン病モデルマウスへの各種抗体（ＴＣＺあるいはＲ１６−１）投与実験における剖検時の血漿中抗ＴＣＺ抗体タイターを示す図である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、マウスＰｏｕ５ｆ１遺伝子のゲノムＤＮＡの構造（１）と、挿入されるノックインベクター（２）との関係を模式的に示す図である。ノックインベクターのうち、コントロールベクターは、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ）遺伝子  ｃＤＮＡを有し、ｈｐ７ｐＡベクターは、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ）遺伝子  ｃＤＮＡ、ｈｐ７配列、およびポリＡ付加シグナルを有する。ノックインベクターにおいて、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ）遺伝子  ｃＤＮＡは、その翻訳開始点がマウスＰｏｕ５ｆ１遺伝子のエクソン１の翻訳開始点と一致するように、当該エクソン１内に挿入されている。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、マウスＰｏｕ５ｆ１遺伝子のゲノムＤＮＡ（ａ）とノックインベクター（ｂ）とが相同性組換えを起して、ノックインされたゲノムＤＮＡ（ｃ）が生成される様子を模式的に示す図である。図中の矢印は、ｎｅｏ遺伝子のノックインを検出するために使用したプライマーの設定位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、任意の外来遺伝子をコードするＤＮＡの３’側にｈｐ７配列をコードするＤＮＡおよびポリＡ付加シグナルをコードするＤＮＡが付加されたＤＮＡを、非ヒト動物のゲノム上に存在する任意の標的遺伝子の同一読み取り枠に挿入したことを特徴とする非ヒト動物を提供する。
【００３５】
本発明における「外来遺伝子」とは、本発明の非ヒト動物に導入する遺伝子を意味する。本発明における外来遺伝子は、由来する生物種を限定することなく使用することができる。例えば、ヒトの疾患治療薬の評価などの目的で本発明の非ヒト動物を使用する場合には、外来遺伝子としては、疾患治療薬の標的分子となるヒト遺伝子が好ましい。ヒトインターロイキン−６あるいはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患のモデルとして本発明の非ヒト動物を使用する場合には、外来遺伝子としては、ヒトインターロイキン−６受容体遺伝子が特に好ましい。本発明の「ヒトインターロイキン−６受容体遺伝子」は、ヒトインターロイキン−６と結合し、細胞膜上にシグナル伝達分子ｇｐ１３０と会合することによって細胞内にシグナルを伝達する機能を有する分子をコードする遺伝子である。典型的には、ＧｅｎｅＢａｎｋにて＃ＮＭ＿０００５６５の番号で登録されている塩基配列を本発明において使用することができる。
【００３６】
また、外来遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼなどのレポータ遺伝子、薬剤（ネオマイシン等）耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子を使用することも可能である。外来遺伝子としては、２以上の遺伝子の組み合わせを使用することも可能である。この場合において、特定の遺伝子の両側にｌｏｘＰ配列を付加しておけば、Ｃｒｅを作用させることにより、当該特定の遺伝子を事後的に除去することができる。また、外来遺伝子には、該遺伝子の発現を調節するエンハンサなどが付加されていてもよい。外来遺伝子の形態は特に限定されず、例えば、ｃＤＮＡであっても、ゲノムＤＮＡであってもよい。
【００３７】
本発明においては、外来遺伝子をコードするＤＮＡの３’側にｈｐ７配列をコードするＤＮＡおよびポリＡ付加シグナルをコードするＤＮＡを付加する。ここで「ｈｐ７配列」は、ＧＧＧＧＣＧＣＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＣＣＣＣの塩基配列（配列番号：１）である。また、「ポリＡ付加シグナル」は、真核生物遺伝子の最終エキソンの終止コドンの３’下流の非翻訳領域に存在し、ｍＲＮＡの３’末端におよそ５０〜２００個のアデニンヌクレオチドを付加するために必要な６塩基対のＡＡＴＡＡＡを含む塩基配列である。
【００３８】
本発明における「非ヒト動物」としては、特に限定されず、マウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類、サル、チンパンジーなどの非ヒト霊長類、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ブタなどの哺乳動物や、鳥類、両生類、爬虫類、魚類などを用いることが可能であるが、好ましくはげっ歯類であり、さらに好ましくはマウスである。
【００３９】
本発明における「標的遺伝子」とは、外来遺伝子を挿入する対象となる非ヒト動物の遺伝子を意味する。また、「同一読み取り枠」とはｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される際に読み取られる３塩基毎の塩基配列の単位を意味する。「同一読み取り枠に挿入」とは、標的遺伝子の開始コドンＡＴＧと外来遺伝子の開始コドンＡＴＧとが一致するように、外来遺伝子を挿入することを意味する。これにより、非ヒト動物における標的遺伝子のプロモーターと挿入した外来遺伝子とが作用可能に結合し、当該プロモーターの活性化に応答して外来遺伝子が発現するようになる。外来遺伝子の挿入の際には、破壊した標的遺伝子が元来の読み枠にて再び翻訳される可能性をなくす観点から、標的遺伝子のＡＴＧ以降の配列について、３の倍数ではない塩基数の配列を欠損させることが好ましい。また、本発明において外来遺伝子は、標的遺伝子の本来の翻訳開始点が存在するエキソンのみに挿入されている（すなわち、標的遺伝子の標的エキソンのみと相同組換えが生じている）ことが好ましい。また、ポリＡ付加シグナルの３‘下流側にはｌｏｘＰ配列、Ｆｒｔ配列やＲｏｘ配列といった組換え酵素の認識配列が存在していてもよい。
【００４０】
本発明の非ヒト動物は、挿入される外来遺伝子がヒトインターロイキン−６受容体である場合には、可溶型ヒトインターロイキン−６受容体の血中濃度が、健常なヒトにおける可溶型インターロイキン−６受容体と同等の濃度であることが好ましい。ここで、健常なヒトにおける可溶型インターロイキン受容体の濃度とは、１５〜７０ｎｇ／ｍｌをいう。非ヒト動物のが可溶型ヒトインターロイキン受容体の濃度の測定方法としては、実施例に記載の測定方法を用いることができる。
【００４１】
本発明の非ヒト動物は、例えば、ヒトインターロイキン−６あるいはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患のモデル動物として使用する場合には、さらにヒトインターロイキン−６を過剰発現していることが好ましい。ヒトインターロイキン−６の「過剰発現」とは、非ヒト動物のインターロイキン−６の内因性の発現量を超えて発現していることを意味する。ヒトインターロイキン−６を過剰発現させるための方法としては特に限定されないが、例えば主要組織適合性抗原Ｈ−２Ｌｄ遺伝子プロモータを使用した発現ベクターを用いて、ヒトインターロイキン−６遺伝子を非ヒト動物のゲノム内に導入することにより過剰発現させることができる。主要組織適合性抗原Ｈ−２Ｌｄ遺伝子プロモータとしては、文献（Ｍｉｙａｚａｋｉ，  Ｊ．−Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．  ８３，  ９５３７−９５４１）に記載のプロモータを利用することができる。発現ベクターとしては、遺伝子工学に利用されるベクターであれば特に限定されず、例えばプラスミドベクター、ウィルスベクター、コスミドベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）および他の非プラスミドベクターなどを使用することができる。「ヒトインターロイキン−６あるいはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患」としては、例えば、キャッスルマン病、慢性関節リウマチ、多発性骨髄腫、敗血症、メサンギウム増殖性腎炎、癌悪液質などが挙げられる。
【００４２】
本発明はまた、前記非ヒト動物を作製するためのＤＮＡ、前記ＤＮＡを保持するノックインベクターおよび前記ノックインベクターが導入された形質転換細胞を提供する。
【００４３】
本発明における、「非ヒト動物を作製するためのＤＮＡ」は、任意の外来遺伝子をコードするＤＮＡの３’側にｈｐ７配列をコードするＤＮＡおよびポリＡ付加シグナルをコードするＤＮＡが付加されたＤＮＡである。
【００４４】
本発明の「ＤＮＡを保持するノックインベクター」とは、前記非ヒト動物を作製するためのＤＮＡを、相同組換えによって、宿主中の標的遺伝子領域に挿入する能力を有するベクターであり、前記非ヒト動物を作製するためのＤＮＡの５’側に５’アーム（標的部位の５'上流の塩基配列と相同な塩基配列）が配置され、３’側に３’アーム（標的部位の３’下流の塩基配列と相同な塩基配列）が配置されている。本発明においてノックインベクターは、前記非ヒト動物を作製するためのＤＮＡが、宿主中の標的遺伝子の同一読み取り枠に挿入されるように構築される。ノックインベクターにおいて、任意の外来遺伝子は、その翻訳開始点が標的遺伝子のエクソン１の翻訳開始点と一致するように、当該エクソン１内に挿入されていることが好ましい。すなわち、ノックインベクターにおいて、任意の外来遺伝子の翻訳開始点の５’側には、標的遺伝子のエクソン１の翻訳開始点よりも上流の塩基配列が配置されていることが好ましい。
【００４５】
また、本発明のノックインベクターは、宿主細胞内において複製する能力を有することが好ましい。このようなベクターは、例えば、前記非ヒト動物を作製するためのＤＮＡを公知のベクターに挿入することにより構築することができる。公知のベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターが挙げられる。
【００４６】
本発明の「ノックインベクターが導入された形質転換細胞」は、前記非ヒト動物を作製するためのＤＮＡを保持するノックインベクターが導入された細胞である。ノックインベクターが導入される宿主細胞は、前記非ヒト動物の細胞または前記非ヒト動物の細胞に分化可能な細胞（細胞の集団を含む）である。このような宿主細胞としては、目的に応じて種々の細胞を用いることができ、例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞、精子幹細胞などの生殖細胞へ分化する能力を有する生殖系列幹細胞、受精卵が挙げられる。前記宿主細胞への前記ノックインベクターの導入は、エレクトロポレーション法などの公知の方法で行うことができる。前記多能性幹細胞をマイクロインジェクション法などの公知の方法で初期胚に注入し、これを仮親に移植して発生させることにより、キメラ動物を得ることができる。また、このキメラ動物を繁殖させることにより、その後代から、ノックインアレルがホモ接合体化された個体を得ることができる。また、生殖系列幹細胞を用いる場合には、エレクトロポレーション法などの公知の方法にてノックインベクターを導入して標的組換えを行なった細胞を、動物の生殖巣に移植して生殖細胞に分化させ、その動物を交配することにより、あるいは、動物より採取した生殖細胞を利用して、ノックイン動物を作出することが可能である。生殖系列幹細胞を用いた遺伝子改変動物の作出する方法に関しては、文献（Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．  ７９，  １１２１−１１２８）を参照のこと。受精卵を用いる場合には、ノックインベクターを、ゲノム上の標的領域に特異的な標的配列に結合して切断するＺｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）などの人工ヌクレアーゼやＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９などとともに受精卵へ注入し、その受精卵を仮親に移植して発生させることにより、ノックイン動物を作製することが可能である。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮを用いた方法に関しては、それぞれ文献（Ｃｕｉ，  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２９，  ６４−６７）および文献（Ｌｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３９，  ６３１５−６３２５）に記載されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いた方法に関しては、文献（Ｙａｎｇ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｃｅｌｌ．ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．）に記載されている。さらに、動物の精巣あるいは卵巣にノックインベクターを注入して、エレクトロポレーション等の手法により生殖細胞を、直接、遺伝子組換えし、その後、交配を行うことなどによりノックインアレルを有する個体を得ることが可能である（Ｎｉｕ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  ３５，７０１−７１４）。
【００４７】
本発明の非ヒト動物は、被験物質における、疾患の治療効果、薬物動態、血中から可溶型ヒトインターロイキン−６受容体を除去する活性など種々の評価に利用することが可能である。従って、本発明は、このような本発明の非ヒト動物を利用した被験物質の評価方法をも提供する。
【００４８】
本発明の評価方法に用いる「被験物質」としては、特に限定されるものではなく、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出物などが挙げられる。好ましくはヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体であり、例えばＰＭ−1抗体（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４３：２９００−２９０６，１９８９）、ｈＰＭ−１抗体（国際公開９２／１９７５９号公報）などが挙げられる。被験物質の非ヒト動物への投与は、例えば、尾静脈投与、皮下投与、腹腔内投与、経口投与、経鼻投与、経皮投与、経肺投与などで行うことができる。
【００４９】
被験物質の評価の態様としては、以下が挙げられる。例えば、被験物質を投与した本発明の非ヒト動物において、ヒトインターロイキン−６またはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患の症状が抑制されたか否かを測定することにより、被験物質における、ヒトインターロイキン−６またはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患の治療効果を評価することができる。疾患の症状が抑制されたか否かの評価においては、本発明の非ヒト動物（他の非ヒト動物との交配により得られる子孫も含む）のみならず、当該非ヒト動物から採取した臓器、組織、細胞、血液などの生体材料を用いることも可能である。ヒトインターロイキン−６あるいはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患の症状が抑制されたか否かは、例えば疾患がキャッスルマン病の場合には、脾臓腫大の改善および脾臓重量増加の正常化などで判断することができる。
【００５０】
また、被験物質を投与した本発明の非ヒト動物において、被験物質の血中濃度を測定することにより、被験物質の薬物動態学的特性を評価することもできる。ここで「薬物動態学的特性」とは、動物の体内における被験物質の有効血中濃度、血中半減期や消失速度等の特性を意味する。被験物質の血中濃度の測定の手法については特に限定されるものではない。被験物質がタンパク質（抗体を含む）である場合には、例えば、ＥＬＩＳＡ法が挙げられ、被験物質が低分子化合物である場合には、例えば、液体クロマトグラフ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）法が挙げられる。血中濃度から薬物動態学的特性を評価する方法論については、文献（Ｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ.  （２０１０）  Ｎａｔ.  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.  ２８:１２０３−１２０７）を参照のこと。
【００５１】
また、被験物質を投与した本発明の非ヒト動物において、可溶型ヒトインターロイキン−６受容体の血中濃度を測定することにより、被験物質における、血中から可溶型ヒトインターロイキン−６受容体を除去する活性を評価することもできる。可溶型ヒトインターロイキンー６受容体の濃度の測定の手法については特に限定されるものではないが、例えばＥＬＩＳＡ法が挙げられる。
【００５２】
この方法においては、さらに、被験物質の血中濃度も測定することにより、血中から可溶型ヒトインターロイキン−６受容体を除去するのに必要な被験物質の用量を評価することができる。被験物質の血中濃度の測定については、上記の方法を使用することができる。
【００５３】
上記本発明の被験物質の評価方法を利用することにより、所望の活性を有するヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体を効率的に生産することが可能である。従って、本発明は、このような抗体の生産方法をも提供する。
【００５４】
本発明の抗体の生産方法においては、まず、ヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体を生産する。
【００５５】
モノクローナル抗体を生産する方法としては、代表的には、コーラーおよびミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ,  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原であるヒトインターロイキン−６受容体で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球などである。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞またはリンパ球などに対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、ヒトインターロイキン−６受容体に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。ヒトインターロイキン−６受容体に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
【００５６】
上記抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞などからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入することにより、抗体を組換え抗体として産生させることもできる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ,１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ,２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ、Ｅｕｒ.Ｊ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.１９２：７６７-７７５(１９９０)）。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタなど）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
【００５７】
キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免役し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平７-１９４３８４号公報、特許３２３８０４９号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。
【００５８】
ヒト型化抗体は、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）することにより作製することができる（例えば、特許２９１２６１８号、特許２８２８３４０号公報、特許３０６８５０７号公報、欧州特許２３９４００号公報、欧州特許１２５０２３号公報、国際公開９０/０７８６１号公報、国際公開９６/０２５７６号公報参照）。
【００５９】
ヒト抗体の作製においては、免疫することで、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用することが可能である（例えば、Ｎａｔｕｒｅ,  ３６２：２５５-２５８(１９９２)、Ｉｎｔｅｒｎ.  Ｒｅｖ.  Ｉｍｍｕｎｏｌ,  １３：６５-９３(１９９５)、Ｊ.  Ｍｏｌ.  Ｂｉｏｌ,  ２２２：５８１-５９７(１９９１)、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ,  １５：１４６-１５６(１９９７)、Ｐｒｏｃ.  Ｎａｔｌ.  Ａｃａｄ.  Ｓｃｉ.  ＵＳＡ,  ９７：７２２-７２７(２０００)、特開平１０-１４６１９４号公報、特開平１０-１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１-２０６３８７号公報、特表平８-５０９６１２号公報、特表平１１-５０５１０７号公報）。
【００６０】
こうして生産した抗体を本発明の非ヒト動物に投与し、抗体を投与した非ヒト動物において、ヒトインターロイキン−６またはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患の症状が抑制されたか否かを測定し、当該症状を抑制する抗体を選抜することにより、ヒトインターロイキン−６またはヒトインターロイキン−６受容体に起因する疾患の治療効果を有する、ヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体を取得することができる。
【００６１】
また、生産した抗体を投与した非ヒト動物において、抗体の血中濃度を測定し、所望の血中濃度を有する抗体を選抜することにより、所望の体内動態を有する、ヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体を取得することができる。
【００６２】
さらに、生産した抗体を投与した非ヒト動物において、可溶型ヒトインターロイキン−６受容体の血中濃度を測定し、可溶型ヒトインターロイキン−６受容体の血中濃度を低下させる抗体を選抜することにより、血中から可溶型ヒトインターロイキン−６受容体を除去する活性を有する、ヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体を取得することができる。
【００６３】
こうして活性の評価および選抜を行った抗体がマウスモノクローナル抗体などである場合には、当該抗体をキメラ化またはヒト型化して、ヒトに投与した場合に抗原性が少なく、ひいては副作用の少ない抗体を取得することができる。
【実施例】
【００６４】
次に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６５】
[実施例１]  ヒトＩＬ６Ｒ遺伝子ノックインマウスの作出
（１）ノックインベクターの構築
マウスインターロイキン−６遺伝子（Ｉｌ６ｒａ）のゲノム領域がクローニングされている大腸菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを用いた。このＢＡＣ上のマウスＩｌ６ｒａ遺伝子の標的領域に、ヒトインターロイキン−６受容体遺伝子のコーディング配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ＃ＮＭ０００５６５）、ｈｐ７配列、ポリＡ付加シグナル、ｌｏｘＰ配列、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ）遺伝子カセットおよびｌｏｘＰの順に接続したＤＮＡ断片を、Ｒｅｄ／ＥＴシステム（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）を利用して相同組換えにて挿入した。その際、ＢＡＣ上のマウスＩｌ６ｒａ遺伝子のエクソン１に存在する翻訳開始点とヒトＩＬ６Ｒ遺伝子の翻訳開始点を一致させるように挿入し、かつマウスＩｌ６ｒａ遺伝子のエクソン１内部の翻訳開始点以降の塩基配列を４０塩基対だけ欠損させた。なお、薬剤耐性遺伝子であるｎｅｏにはｐｇｋ遺伝子のプロモータが付加されており、ＥＳ細胞内ではｎｅｏ遺伝子が発現する。しかしながら、ｎｅｏ遺伝子は上流に導入したｈＩＬ６Ｒ遺伝子の発現を抑制する可能性が予測される。そこで、後に、ｎｅｏ遺伝子を除去できるように、ｎｅｏ遺伝子の両側にはｌｏｘＰ配列（ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号：２））を配置した。Ｃｒｅを作用させると組換えによって、ｌｏｘＰ配列の間に挟まれたｎｅｏ遺伝子が除去される仕組みになっている。次いで、ノックインベクターを線状化可能とするため、ＢＡＣ上のマウスＩｌ６ｒａ遺伝子の５‘側上流の領域に制限酵素ＮｏｔＩ認識配列（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）をアンピシリン耐性遺伝子とともに挿入した。【００６６】
（２）ＥＳ細胞への導入
ＥＳ細胞（１２９ＳｖＥｖマウス由来）に上記のｈＩＬ６Ｒノックインベクターをエレクトロポレーションにより導入し、Ｇ４１８による選択培養後に得られた薬剤耐性クローンより、相同組換え体をＰＣＲ法によってスクリーニングした。ノックインベクターは、６０μｇをＮｏｔＩで直鎖状化し、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿させＰＢＳに溶解して用いた。【００６７】
スクリーニングで用いるＥＳ細胞は９６穴プレートで培養し、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ溶液で２回洗浄後、以下の組成の細胞溶解緩衝液（１０×ＬＡ緩衝液II（ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  Ｔａｑ用）５μｌ；５％  ＮＰ−４０  ５μｌ；プロティナーゼＫ（ＴＡＫＡＲＡ，２０ｍｇ／ｍｌ）４μｌ；蒸留水３６μｌ）を加えて５５℃２時間処理し、続いて９５℃にて１５分処理することで、プロティナーゼＫを失活させてＰＣＲサンプルとした。【００６８】
ＰＣＲ反応混合物は、サンプル１μｌ、１０×ＬＡ緩衝液II  ２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２．５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）４μｌ、プライマー（各５０μＭ）各０．２μｌ、ＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）０．２５μｌ、および蒸留水１４．３５μｌ（全２５μｌ）とした。また、ＰＣＲ条件は、９４℃にて５分間の前加熱、９８℃にて１０秒間、６８℃にて３分３０秒間の増幅サイクル３５サイクル、並びに６８℃にて７分間の複加熱とした。【００６９】
使用したプライマーは以下の通りである。相同組換えを起こしたＥＳ細胞のサンプルでは、約２．２ｋｂのバンドが増幅される。プライマーは、Ｐ６Ｒａ１をノックインベクター上の相同アームよりも５‘上流側のマウスＩｌ６ｒａゲノム領域に配置し、ｈＲＬＩ６＿１１６３８ＲをｈＩＬ６Ｒ  ｃＤＮＡ内に配置した（図１を参照）。Ｐ６Ｒａ１（前方）５’−ＡＣＡＧＧＧＣＣＴＴＡＧＡＣＴＣＡＣＡＧＣ−３’（配列番号：３）；ｈＲＬＩ６＿１１６３８Ｒ（後方）５’−ＡＡＣＴＴＧＣＴＣＣＣＧＡＣＡＣＴＡＣＴＧＧ−３’（配列番号：４）。【００７０】
（３）ノックインマウスの作出
相同組換えＥＳクローンをトリプシン処理により浮遊させ、ＥＳ細胞培地で洗浄した。４８時間間隔で５ＩＵのウマ絨毛ゴナドトロピン（ｅＣＧ）およびヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を腹腔内投与することにより、過剰排卵処理を施したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）の雌マウスを同系統の雄マウスと交配した。雌マウスのプラグが確認された日を０．５日とし、妊娠２．５日に子宮および卵管を灌流し、８細胞期から桑実期の胚を回収した。回収した胚を３７℃にて一晩培養し、胚盤胞に発生した胚を宿主胚として１０〜１５個のＥＳ細胞を注入した。注入後の胚は、偽妊娠２．５日齢のＩＣＲ系の受容雌の子宮内に移植し、１７日後に産仔を得た。ＥＳ細胞の胚盤胞への注入により得られた産仔の毛色での判別により、組換えＥＳ細胞（野生色）とホスト胚盤胞由来の細胞（黒色）の混在したキメラマウスが得られた。雄キメラマウスは性成熟後にＢ６雌マウスと交配し、ノックインアレルの次世代マウスへの伝達を、次世代マウスの尾より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により確認した。ＰＣＲは上述の相同組換えＥＳ細胞のスクリーニングの際に利用した方法にて実施した。その結果、２．２ｋｂのシグナルが検出された個体が得られ、これら個体にはノックインアレルが伝達していることが確認された。【００７１】
（４）ｎｅｏ遺伝子の除去
ノックインアレルの伝達が確認された個体の繁殖により得た受精卵の前核に組換酵素Ｃｒｅ発現ベクターを顕微注入することによって、ｎｅｏ遺伝子カセットを除去した。すなわち、一過性にＣｒｅを発現させることによって、ノックインアレルに配置した２ヶ所のｌｏｘＰ間の組換えが誘導され、ｎｅｏ遺伝子カセットが除去される。Ｃｒｅ発現ベクターの顕微注入後の受精卵は、偽妊娠０．５日のＩＣＲ系受容雌の卵管内に移植し、１９日後に産仔を得た。ｎｅｏ遺伝子カセットの除去の確認は、産仔の離乳後に採取した尾より抽出したゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ法によって実施した。【００７２】
ＰＣＲ反応液組成は、サンプル１μｌ、２×ＧＣ緩衝液Ｉ  １２．５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）４μｌ、プライマー（各５０μＭ）各０．２５μｌ、ＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）０．２５μｌ、および蒸留水６．７５μｌ（全２５μｌ）とした。また、ＰＣＲ条件は、９４℃にて４分間の前加熱、９４℃にて３０秒間、６２℃にて３０秒間、７２℃にて３分間の増幅サイクル３５サイクル、並びに７２℃にて７分間の複加熱とした。【００７３】
プライマーの設定位置は図１Ｂに示す。プライマーとしては、ｍＲＬＩ６＿１０３５５（５’−ＴＣＴＧＣＡＧＴＡＧＣＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＣ−３’（配列番号：５））およびｍＲＬＩ６＿１１１６６Ｒ（５’−ＡＡＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＣＡＣＡＴＴＣＣ−３’（配列番号：６））を使用した。ＰＣＲ反応により、ｎｅｏカセットが除去される前の個体のサンプルでは、ノックインアレルに由来する増幅産物として４．２ｋｂと野生型アレル由来の０．８ｋｂのシグナルが検出されるのに対して、ｎｅｏカセットが除去された個体のサンプルでは約２．７ｋｂと野生型アレル由来の０．８ｋｂのシグナルが検出された（図２）。【００７４】
（５）ノックインマウスの樹立
ｎｅｏ遺伝子カセットの除去が確認されたマウスの繁殖により、ノックインアレルをホモ接合体化した個体を得た。ホモ接合体の確認はＰＣＲにて行った。ＰＣＲ反応はｎｅｏ遺伝子カセットの除去を確認した際の反応系と同様に実施した。ホモ接合体ではノックインアレルに由来する２．７ｋｂのシグナルは検出されるが、野生型アレル由来の０．８ｋｂのシグナルは検出されないことを指標として、ホモ接合体を確認した（図２）。【００７５】
（６）ヒトＩＬ６ＲおよびマウスＩｌ６ｒａの発現確認
−組織ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ法での確認−
ホモ接合体のノックインマウスおよび野生型マウスの組織ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりヒトＩＬ６ＲおよびマウスＩｌ６ｒａの発現を解析した。肝臓、脾臓、胸腺、腎臓、心臓および肺より組織ＲＮＡを調製した。各１μｇの組織ＲＮＡを鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ（２０）プライマーを用いて逆転写反応を行なうことによってｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なうことによって、ヒトＩＬ６ＲおよびマウスＩｌ６ｒａを検出した。ヒトＩＬ６Ｒの検出は、ノックインアレルにおけるｈＩＬ６Ｒ遺伝子の挿入位置である翻訳開始点よりも上流側の５’非翻訳領域に設定したフォワードプライマー６ＲＩＫ−ｓ１（５’−ＣＣＣＧＧＣＴＧＣＧＧＡＧＣＣＧＣＴＣＴＧＣ−３’（配列番号：７））およびヒトＩＬ６Ｒ特異的なリバースプライマーＲＬＩ６−ａ１（５’−ＡＣＡＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＴ−３’（配列番号：８））の組合せを使用して実施した。一方、マウスＩｌ６ｒａの検出は、上述のフォワードプライマー６ＲＩＫ−ｓ１およびマウスＩｌ６ｒａ特異的なリバースプライマー６ＲＬＩｃＡ２（５’−ＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＴＧ−３’（配列番号：９））の組合せを使用して実施した。ＰＣＲ反応液の組成は、サンプル１μｌ、２×ＧＣ緩衝液Ｉ  １２．５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）４μｌ、プライマー（各５０μＭ）各０．２５μｌ、ＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）０．２５μｌ、および蒸留水６．７５μｌ（全２５μｌ）とした。また、ＰＣＲ条件は、９４℃にて２分間の前加熱、９４℃にて３０秒間、６２℃にて３０秒間、７２℃にて１分間の増幅サイクル３０サイクル、並びに７２℃にて５分間の複加熱とした。ヒトＩＬ６Ｒの増幅産物は８８０ｂｐ、マウスＩｌ６ｒａの増幅産物は８４６ｂｐに検出されるが、ホモ接合体のｈＩＬ６Ｒノックインマウスの各組織ではヒトＩＬ６Ｒのみが検出され、マウスＩｌ６ｒａは検出されなかった。また、野生型マウスの各組織からはヒトＩＬ６Ｒは検出されず、マウスＩｌ６ｒａのみが検出された（図３）。この結果より、デザイン通りにノックインベクターが相同組換えを起こし、マウスＩｌ６ｒａのかわりにヒトＩＬ６Ｒが発現するマウスが得られたことが確認された。【００７６】
−血漿中のヒトＩＬ６Ｒ濃度の測定−
イソフルラン吸入麻酔下にて開腹し、腹部大静脈より採取した血液より分離した血漿中の可溶型ヒトＩＬ６Ｒ濃度を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６ｓＲ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。その結果、血漿中可溶型ｈＩＬ６Ｒ濃度は、ホモ型のノックインマウスでは２２．１±５．０  ｎｇ／ｍｌ、ヘテロ型ノックインマウスでは１１．５±４．１  ｎｇ／ｍｌと定量された。なお、野生型マウスにおいては血漿中に可溶型ｈＩＬ６Ｒは検出されなかった（図４）。ホモ型ノックインマウスでは、ヒトにおいて報告されている血中濃度と同等の濃度（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｎ．  ｅｔ.  ａｌ.  （２００８）  Ｂｌｏｏｄ．１１２：３９５９−３９６９）であった。【００７７】
−種特異的なリガンド反応性の確認−
ホモ型ノックインマウスおよび野生型マウスに、４μｇ／体重ｋｇとなるようマウスＩＬ６あるいはヒトＩＬ６を腹腔内投与し、その６時間後に採血して、血中の血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）濃度を、ＳＡＡ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて定量した。なお、投与用ＩＬ６の溶媒としては、マウス血漿が０．５％となるようにリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に添加した溶液を使用し、溶媒のみを投与する対照群を設けた。その結果、ホモ型ノックインマウスはヒトＩＬ６にのみ反応して血漿ＳＡＡレベルの上昇が認められたが、マウスＩＬ６に対する反応性は認められなかった（図５）。一方、野生型マウスはヒトＩＬ６にもマウスＩＬ６にも反応して血漿ＳＡＡレベルの上昇が認められた（図５）。マウスＩｌ６ｒａはマウスＩＬ６にもヒトＩＬ６にも結合する一方、ヒトＩＬ６ＲはヒトＩＬ６に結合するがマウスＩＬ６には結合しないことが知られており、本実験の結果は、この知見に合致するものである。従って、ホモ型ノックインマウスでは、設計通り、マウスＩｌ６ｒａが発現せず、代わりにヒトＩＬ６Ｒが発現し、かつ機能していることが明らかとなった。【００７８】
本発明におけるノックインアレルより転写されたｈＩＬ６Ｒ遺伝子のｍＲＮＡは、スプライスアウトされない構造であるため、ＮＭＤ機構によって分解を受けないが、その一方で、スプライスアウトされない遺伝子の発現量は低くなることが知られている。しかしながら、本発明のｈＩＬ６Ｒノックインマウスでは、血中の可溶型ｈＩＬ６Ｒ濃度が健常人における血中濃度と同等であり、さらに投与したヒトＩＬ６にも十分反応してＳＡＡを産生することが確認された。このことは、ポリＡ付加シグナルとともに挿入したｈｐ７が、スプライスアウトされない構造のために本来であれば低下するはずのｈＩＬ６Ｒ発現量の安定化に寄与したことを示す。【００７９】
[実施例２]  ヒト化キャッスルマン病モデルマウスの樹立と評価
（１）ヒト化キャッスルマン病モデルマウスの樹立
ｈＩＬ６Ｒノックインマウスを、Ｈ−２Ｌｄ  ヒトＩＬ６トランスジェニックマウス（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．  ２００２，Ｄｅｃ．  ２１；２０（６）：３０４−３１１）と交配することによりダブルトランスジェニックマウスを作出した。各個体の組織より抽出したゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ法により遺伝子型を解析し、ホモ型のｈＩＬ６Ｒノックインアレルを有し、かつｈＩＬ６トランスジーンを有する個体を選別した。ｈＩＬ６Ｒノックインアレルの検出には上述のＰＣＲ反応系を利用した。すなわち、ＰＣＲ反応液組成はサンプル１μｌ、２×ＧＣ緩衝液Ｉ  １２．５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）４μｌ、プライマー（各５０μＭ）各０．２５μｌ、ＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）０．２５μｌ、および蒸留水６．７５μｌ（全２５μｌ）とした。また、ＰＣＲ条件は、９４℃にて４分間の前加熱、９４℃にて３０秒間、６２℃にて３０秒間、７２℃にて３分間の増幅サイクル３５サイクル、並びに７２℃にて７分間の複加熱とした。プライマーはｍＲＬＩ６＿１０３５５（５’−ＴＣＴＧＣＡＧＴＡＧＣＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＣ−３’（配列番号：１０））およびｍＲＬＩ６＿１１１６６Ｒ（５’−ＡＡＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＣＡＣＡＴＴＣＣ−３’（配列番号：１１））を使用した。ＰＣＲ反応により、ノックインアレルは約２．７ｋｂのシグナル、野生型アレルは０．８ｋｂのシグナルとして検出された（図６）。さらに、ＰＣＲ法によりｈＩＬ６トランスジーンの検出を行なった。すなわち、ＰＣＲ反応液組成は、サンプル１μｌ、１０×Ｅｘ緩衝液２．５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）２μｌ、プライマー（各５０μＭ）各０．１μｌ、Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）０．２５μｌ、および蒸留水１９．０５μｌ（全２５μｌ）とした。ＰＣＲ条件は、９４℃にて４分間の前加熱、９４℃にて３０秒間、６５℃にて３０秒間、７２℃にて３０秒間の増幅サイクル３５サイクル、並びに７２℃にて７分間の複加熱とした。プライマーは、フォワードプライマーとして「５‘−ＡＣＣＴＣＴＴＣＡＧＡＡＣＧＡＡＴＴＧＡＣＡＡＡ−３’（配列番号：１２））」を、リバースプライマーとして「５‘−ＡＧＣＴＧＣＧＣＡＧＡＡＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＧＴ−３’（配列番号：１３）」を使用した。ｈＩＬ６トランスジーンは０．４５ｋｂの鎖長に検出された（図６）。ホモ型のｈＩＬ６Ｒノックインアレルを有し、かつｈＩＬ６トランスジーンを有するマウスでは、キャッスルマン病様の症状、すなわち全身のリンパ節の腫脹および脾臓の腫大が確認された。以上から、病態の原因がヒトＩＬ６の過剰産生であり、その受容体であるＩＬ６Ｒもヒト型化されているヒト型化キャッスルマン病モデルマウスが樹立できた。【００８０】
（２）ヒト型化キャッスルマン病モデルマウスへのｈＩＬ６Ｒ特異的中和抗体の投与による治療効果の検討
上述のヒト型化キャッスルマン病モデルマウスを用いてｈＩＬ６Ｒ中和抗体の薬効評価が可能かどうかの検討を実施した。ヒト化キャッスルマン病モデルマウスへ４週齢時に２ｍｇ／ｂｏｄｙのヒト型化抗ヒトＩＬ６Ｒモノクローナル抗体（トシリズマブ、以下ＴＣＺ）を尾静脈内投与し、その翌週より０．１、０．２５あるいは０．５ｍｇ／ｂｏｄｙのＴＣＺを２回／週の頻度にて４週間、皮下投与した。比較対照として、４週齢時に２ｍｇ／ｂｏｄｙのラット抗マウスＩｌ６ｒａモノクローナル抗体（ＭＲ１６−１）を尾静脈内投与し、その翌週より０．１ｍｇ／ｂｏｄｙのＭＲ１６−１を２回／週にて４週間皮下投与した。溶媒の生理食塩液を投与する群も設定した。さらにＩｌ６ｒａについて野生型、かつｈＩＬ６トランスジーンを有するマウスにも上記と同様の抗体投与を実施した。また、ｈＩＬ６ＲノックインマウスあるいはＩｌ６ｒａの野生型マウスで、ｈＩＬ６トランスジーンを有していないマウスを、病態を発症しない対照群として用い、同様のプロトコールにて生理食塩液の投与のみ実施した。なお、いずれの実験群も５匹の個体を使用した。最終投与の４日後にイソフルラン吸入麻酔下にて開腹し、全採血後に放血することによって安楽死処置し、脾臓を採取した。採取した血液はヘパリン血漿を分離し、−８０℃フリーザにて保存した。脾臓は重量測定し、一部をＲＮＡ調製用として−８０℃に凍結保存して、残りは１０％中性緩衝ホルマリン液に浸漬した。【００８１】
ｈＩＬ６トランスジーンを有していないｈＩＬ６Ｒノックインマウスあるいは野生型マウスの脾臓重量は、溶媒投与のみ行なった場合には、いずれも０．０８±０．０１ｇであり、ＩＬ６受容体がヒト化されたことによる脾臓重量には影響は認められなかった。次に、野生型ＩＬ６受容体を有するｈＩＬ６トランスジェニックマウスの場合、溶媒投与のみ行なった群では、脾臓重量は０．３４±０．０９ｇと脾臓の腫大が認められた。一方、ｈＩＬ６トランスジーンを有するｈＩＬ６Ｒノックインマウス（すなわちヒト型化キャッスルマン病モデルマウス）に溶媒投与のみ行なった場合には、脾臓重量は０．２６±０．０３ｇであり、ＩＬ６受容体をヒト型化しても、マウス型受容体を発現しているマウスと同様に脾臓の腫大が認められた。【００８２】
ＴＣＺ投与により、ヒト型化キャッスルマン病モデルマウスでは、脾臓の腫大が著明に抑制された（図７）。すなわち、０．１、０．２５および０．５ｍｇ／ｂｏｄｙのＴＣＺ投与群において、脾臓重量（平均値±標準偏差）はそれぞれ０．１４±０．０３ｇ、０．１４±０．０２ｇおよび０．１３±０．０３ｇであり、溶媒投与群の脾臓重量０．２６±０．０３ｇと比較して統計学的に有意な重量低下が認められた。一方、ＭＲ１６−１投与群の脾臓重量は０．３４ｍｇ±０．１１ｇであり、溶媒投与群と比較して有意差は認められなかった。また、野生型Ｉｌ６ｒａを有するｈＩＬ６トランスジェニックマウスでは、溶媒投与群で０．３４±０．０９ｇと脾臓腫大が認められるが、ＴＣＺ投与はいずれの投与用量においても脾臓腫大の抑制は認められず（０．４５±０．２６ｇ）、一方、ＭＲ１６−１投与群では０．１２±０．０１ｇまでの著明な重量低下が認められた。【００８３】
脾臓の病理組織学的な解析では、ヒト型化キャッスルマン病モデルマウスにおいて形質細胞の増加および白脾髄数の増加が認められたが、ＴＣＺ投与によっていずれの所見についても改善が認められた（図８、表１）。【００８４】
【表１】
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【００８５】
血漿中の可溶型ｈＩＬ６Ｒ濃度は、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６ｓＲ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＲ６００）を用いて測定した。血漿ｈＩＬ６濃度は、Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＫＨＣ００６２）を用いて測定した。その結果、ヒト型キャッスルマン病モデルマウスにおいて、ＴＣＺの投与によって、血漿可溶型ｈＩＬ６Ｒ濃度およびｈＩＬ６濃度のいずれにも著明な上昇が認められた（図９）。すなわち、血漿可溶型ｈＩＬ６Ｒ濃度は、溶媒投与群で２１±７ｎｇ／ｍｌであったのに対して、０．１、０．２５および０．５ｍｇ／ｂｏｄｙのＴＣＺ、２回／週の投与によって、７１３±３８７、１０６６±１２６および１１２０±１７１ｎｇ／ｍｌと著明な上昇が認められた。一方、ＭＲ１６−１の投与では血漿可溶型ｈＩＬ６Ｒ濃度２１±２ｎｇ／ｍｌであり、溶媒投与群と同様の濃度を呈した。血漿中ｈＩＬ６濃度は、溶媒投与群で１６３±１１２ｐｇ／ｍｌであったのに対し、０．１、０．２５および０．５ｍｇ／ｂｏｄｙのＴＣＺ、２回／週の投与によって、９３６±３５０、１１９４±３９４および１２０４±３２５ｐｇ／ｍｌと著明な上昇が認められた。一方、ＭＲ１６−１の投与では血漿ｈＩＬ６濃度は１６３±３６ｐｇ／ｍｌであり、溶媒投与群と同様の濃度を呈していた。【００８６】
キャッスルマン病患者や慢性関節リウマチ患者へのＴＣＺ投与によって、血中の可溶型ＩＬ６Ｒ濃度やＩＬ６濃度が上昇することは報告されている（Ｂｌｏｏｄ.  ２００８  １１２：３９５９−３９６９）。ＴＣＺが、血中の可溶型ＩＬ６Ｒと複合体を形成することによってクリアランスが延長することが可溶型ＩＬ６Ｒの血中濃度の上昇の原因であると考察されている。また、ＴＣＺと結合していないＩＬ６Ｒの存在比率が低下することによって、血中のＩＬ６濃度も上昇すると考えられている。本実験にてＴＣＺを投与したヒト型化キャッスルマン病モデルマウスにおいても同様の機構によって可溶型ｈＩＬ６ＲおよびｈＩＬ６の上昇が生じたと考察される。また、ｈＩＬ６Ｒノックインマウスおよびヒト型化キャッスルマン病モデルマウスの血漿中ｈＩＬ６Ｒ濃度は、キャッスルマン病患者や慢性関節リウマチ患者にて報告されているＴＣＺ投与前の血中濃度と同様であることから、ヒト患者における抗原の血中レベル変化を予測するための有効なモデルマウスとなることが期待される。特に、抗体投与後の、血中の可溶型ｈＩＬ６Ｒの推移をモニタリングすることによって、抗体による血中からｈＩＬ６Ｒを除去する機能を評価することが可能であると考えられる。しかも、マウスという小実験動物であるので、比較検討するための被験抗体の必要量も少量に抑えることができる。【００８７】
−血漿中抗ＴＣＺ抗体タイターの評価−
剖検の際に得られた血漿サンプルを用いて抗ＴＣＺ抗体タイターを測定した。すなわち、血漿サンプルをビオチン標識ＴＣＺ抗体およびＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識ＴＣＺ抗体と混合して一晩インキュベーションした後に、ＭＳＤ−ストレプトアビジンプレートに添加した。次いで、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）基質を添加して化学発光の強度を測定した。その結果、インターロイキン−６受容体が野生型のｈＩＬ６トランスジェニックマウスではＴＣＺ投与により、いずれの用量においても極めて高い抗ＴＣＺ抗体タイターを呈したのに対し、ヒト型化キャッスルマン病モデルマウスではＴＣＺのいずれの用量においても抗ＴＣＺ抗体の産生は極めて抑制されていた（図１０）。このことにより、ＴＣＺの作用によってインターロイキン−６からのシグナルを遮断することによって抗ＴＣＺ抗体の産生を抑制されることが明らかとなった。【００８８】
[実施例３]  マウスＰｏｕ５ｆ１遺伝子座へのネオマイシン耐性遺伝子のノックイン
（１）ノックインベクターの構築
マウスＰｏｕ５ｆ１遺伝子のエクソン１に存在する翻訳開始点とネオマイシン耐性（ｎｅｏ）遺伝子の翻訳開始点を一致させるようにネオマイシン耐性（ｎｅｏ）遺伝子を挿入し、かつマウスＰｏｕ５ｆ１遺伝子のエクソン１内部の翻訳開始点以降の塩基配列を１０７塩基対だけ欠損させたノックインベクターを構築した。その際、ｎｅｏ遺伝子の終止コドンの直下にｈｐ７配列、ポリＡ付加シグナルを接続したｈｐ７ｐＡベクターと、ｈｐ７配列、ポリＡ付加シグナルを接続せず、内因性のポリＡ付加シグナルを利用するコントロールベクターとを構築した。また、ノックインベクターの相同アームとして、Ｐｏｕ５ｆ１遺伝子の上述の翻訳開始点よりも１．７ｋｂ上流までのゲノムＤＮＡ、およびエクソン１の欠損領域以降の約５ｋｂのゲノムＤＮＡを接続した構造とし、ベクターｐＭＣ１ＤＴＡ（Ａ＋Ｔ／ｐａｕ）（Ｙａｇｉ  Ｔ．  ｅｔ．ａｌ．（１９９３）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１４：７７−８６）に挿入した。ノックインベクター上の相同アームの５‘端に制限酵素ＮｏｔＩ認識配列（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）を作製しているので、ＮｏｔＩにて線状化可能である。ベクターの構造を図１１Ａに示す。【００８９】
（２）ＥＳ細胞への導入
ＥＳ細胞（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス由来）に上記のノックインベクターをエレクトロポレーションにより導入し、Ｇ４１８による選択培養を行なった。ノックインベクターはＮｏｔＩで線状化し、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿させＰＢＳに溶解して用いた。なお、ＥＳ細胞２×１０７個に対して、２０μｇのノックインベクターが導入されるように濃度を調製してエレクトロポレーションを行なった。なお、それぞれのベクターについて、ＥＳ細胞へのエレクトロポレーションは、再現性を確認するために、各２回実施した。エレクトロポレーション後にＥＳ細胞を播種し、その２４時間後より、Ｇ４１８を３００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加して選択培養を行なった。【００９０】
（３）相同組換えクローンの検出のためのＰＣＲスクリーニング
ｈｐ７ｐＡベクターに由来するＥＳ細胞コロニーをピックアップして、相同組換えの効率を検討した。すなわち、ＥＳ細胞を９６穴プレートで培養し、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ溶液で２回洗浄後、以下の組成の細胞溶解緩衝液（１０×ＬＡ緩衝液ＩＩ（ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  Ｔａｑ用）５μｌ；５％  ＮＰ−４０  ５μｌ；プロティナーゼＫ（ＴＡＫＡＲＡ，２０ｍｇ／ｍｌ）４μｌ；蒸留水３６μｌ）を加えて５５℃２時間処理し、続いて９５℃にて１５分処理することで、プロティナーゼＫを失活させてＰＣＲサンプルとした。【００９１】
ＰＣＲ反応混合物は、サンプル１μｌ、１０×ＬＡ緩衝液ＩＩ  ２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２．５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）４μｌ、プライマー（各５０μＭ）各０．１μｌ、ＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）０．２５μｌ、および蒸留水１４．５５μｌ（全２５μｌ）とした。また、ＰＣＲ条件は、９４℃にて２分間の前加熱、９８℃にて１０秒間、６０℃にて１５秒、次いで６８℃にて３分間の増幅サイクル３５サイクル、並びに６８℃にて５分間の複加熱とした。【００９２】
使用したプライマーは以下の通りである。相同組換えを起こしたＥＳ細胞のサンプルでは、約２．２ｋｂのバンドが増幅される。プライマーは、Ｐｏｕ４１７５Ｆ２をノックインベクター上の相同アームよりも５‘上流側のマウスＰｏｕ５ｆ１ゲノム領域に配置し、ｎｅｏ８９１６Ｒをｎｅｏ遺伝子ｃＤＮＡ内に配置した（図１１Ｂを参照）。Ｐｏｕ４１７５Ｆ２（前方）５’−ＡＡＧＴＣＧＣＴＧＣＣＴＴＴＡＴＴＴＡＧＧＴＣＴＴＣＣＡＡＣＴＡＡＣＣ−３’（配列番号：１４）；ｎｅｏ０８９１Ｒ（後方）５’−ＴＴＣＡＧＴＧＡＣＡＡＣＧＴＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＧＣ−３’（配列番号：１５）。【００９３】
Ｐｏｕ５ｆ１遺伝子領域へのｎｅｏ遺伝子ノックインベクター導入後、Ｇ４１８耐性となったＥＳ細胞クローン数および相同組換えクローン数および効率を表２にまとめた。【００９４】
【表２】
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【００９５】
まず、コントロールベクターを導入した場合には、播種１０日後にＥＳ細胞コロニーの生育状況を観察したところ、正常に生育したＥＳ細胞コロニーは得られなかった。一方、ｈｐ７ｐＡベクターを導入した場合には、正常に生育したＥＳ細胞コロニーが観察された。【００９６】
両ノックインベクターの相同アームの鎖長は全く同一であるので、相同組換えによって標的の領域にｎｅｏ遺伝子が挿入される効率は同程度と考えられるが、コントロールベクターの場合には、たとえｎｅｏ遺伝子が期待通りの領域に挿入されたとしても、Ｇ４１８耐性を呈するには不十分な量のｎｅｏ遺伝子しか発現しなかったと考えられる。【００９７】
ｈｐ７ｐＡベクターを導入した場合には、２回のエレクトロポレーションに由来する１６７個のＧ４１８耐性クローンが得られた。それらのＧ４１８耐性クローンを上述のＰＣＲ系にて解析した結果、相同組換えによりｎｅｏ遺伝子がノックインされているクローンは１６７クローン中６４クローンであった（３８％）。ｈｐ７ｐＡベクターを導入した場合、相同組換えにて内因性Ｐｏｕ５ｆ１遺伝子の標的領域にｎｅｏ遺伝子が翻訳開始点を合わせた形で挿入されると、ＥＳ細胞で活性化されているＰｏｕ５ｆ１遺伝子のプロモータの制御によってｎｅｏが発現し、Ｇ４１８耐性となったと考えられる。また、ＰＣＲの結果、陰性であったクローンは、ｎｅｏ遺伝子が、標的領域ではなく、染色体上のランダムな位置に存在し、ＥＳ細胞で活性化されている何らかの遺伝子プロモータの下流に導入されたものと考えられる。すなわち、その挿入位置の近傍に存在するプロモータの活性によってｎｅｏが発現し、Ｇ４１８耐性を獲得したクローンであると判断された。これらの結果により、標的領域に挿入されたか、ランダムな位置に挿入されたかによらず、ｈｐ７配列およびポリＡ付加シグナルの存在によって十分なｎｅｏ遺伝子の発現量が得られたと推察された。【００９８】
本実験では、ｎｅｏ遺伝子を、Ｐｏｕ５ｆ１遺伝子の翻訳開始点を一致させて挿入し、かつ欠損させる標的遺伝子の領域を最小限にしたが、コントロールベクターにて改変した遺伝子アレルより転写されたｍＲＮＡは、Ｐｏｕ５ｆ１遺伝子の終止コドンの遥か上流に、挿入したｎｅｏ遺伝子の終止コドン（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎ,  ＰＴＣ）が存在し、かつ、このＰＴＣの下流にＰｏｕ５ｆ１遺伝子に由来するエキソン−エキソン結合部が存在するという構造となる。この構造が、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ機構）により認識されてｍＲＮＡが分解を受けるため、Ｇ４１８耐性を獲得するに十分なｎｅｏ遺伝子の発現量が得られなかったと考えられる。仮に、ｎｅｏ遺伝子の直下にポリＡ付加シグナルのみを付加すると、転写されるｍＲＮＡにおいて、ＰＴＣの下流に標的遺伝子由来のエキソン−エキソン結合部が生じない構造となるため、ＮＭＤは生じない。しかしながら、スプライスアウトされない構造であるため、ｍＲＮＡの発現量は低下する可能性が高いと考えられる（非特許文献２）。一方、強固なステムループを形成するｈｐ７配列をｎｅｏ遺伝子の直下に挿入する場合には、ＮＭＤが抑制される可能性は期待される（非特許文献４）が、非特許文献４の記述から予測されるｈｐ７配列単独でのＮＭＤ抑制効果は弱いものであり、遺伝子発現の安定化は期待できない。【００９９】
上記を勘案すると、今回の実験結果は、ノックインベクターにて外来遺伝子を標的遺伝子領域に導入する場合、外来遺伝子の直下にｈｐ７配列およびポリＡ付加シグナルの両方を挿入することにより、ノックインされた外来遺伝子の発現が安定化する可能性を強く示唆するものである。コントロールベクターとｈｐ７ｐＡベクターのいずれを用いたとしても、相同組換えにて標的領域にｎｅｏ遺伝子が挿入された場合には、５‘上流領域は全く同一なので、プロモータによる転写制御は両ベクターとも相違はないと考えられる。つまり、このｎｅｏ遺伝子の発現量の差の要因は、ｍＲＮＡの構造において終止コドンの下流に位置するｈｐ７およびポリＡ付加シグナルの両者を同時に挿入することによってｍＲＮＡが安定化されたためであることが強く示唆される。しかも、ポリＡ付加シグナルを挿入していることから、本ベクターの構造はＮＭＤを引き起こすものではないので、ｈｐ７配列の作用は既知のＮＭＤ抑制効果とは異なる新たに見出された機能によるものであると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明は、非ヒト動物の内因性の遺伝子（標的遺伝子）の発現を欠損させ、かつ生理的に妥当なレベルで外来遺伝子の発現することができる非ヒト動物を提供するとともに、該動物を用いた化合物の評価方法を提供するものである。従って、本発明は、特に、分子標的に対する特異性の高い治療薬の開発に利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０１】
配列番号１
＜223＞  hp7配列
配列番号3〜15
＜223＞  人工的に合成されたプライマーの配列
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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