(57)【要約】  ヒトミッドカインの６９位、７９位、８１位及び１０２位のアミノ酸のうち少なくとも２つのアミノ酸を認識するモノクローナル抗体が、ヒトミッドカインに対して優れた反応性と中和活性を有することを見出した。また、優れた中和活性を有する抗体には、腫瘍の増殖抑制活性が認められた。本発明の抗体を用いれば、効果的に癌の治療を行うことが可能であり、また、効率的にミッドカインの検出や精製を行うことも可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトミッドカインの６９位、７９位、８１位及び１０２位のアミノ酸のうち少なくとも２つのアミノ酸を認識し、ヒトミッドカインに対して中和活性を有するモノクローナル抗体。
【請求項２】
ヒトミッドカインの６９位、７９位、８１位及び１０２位のアミノ酸の全てのアミノ酸を認識する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
腫瘍の増殖を抑制する活性を有する、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の特徴を有する、モノクローナル抗体
（ａ）  配列番号：１から３に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４から６に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）  配列番号：７に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｃ）  配列番号：９に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｄ）  配列番号：１０に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｅ）  配列番号：１１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
【請求項５】
軽鎖可変領域における相補性決定領域のＣＤＲ１の４位のアミノ酸がイソロイシンである、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
下記（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の特徴を有する、モノクローナル抗体
（ａ）  配列番号：１３から１５に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１６から１８に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）  配列番号：２１から２３に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２４から２６に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｃ）  配列番号：２９から３１に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３２から３４に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｄ）  配列番号：３７から３９に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４０から４２に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｅ）  配列番号：４５から４７に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４８から５０に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｆ）  配列番号：５３から５５に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：５６から５８に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｇ）  配列番号：６１から６３に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：６４から６６に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｈ）  配列番号：６９から７１に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：７２から７４に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｉ）  配列番号：７７から７９に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：８０から８２に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｊ）配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｋ）  配列番号：２７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｌ）  配列番号：３５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｍ）  配列番号：４３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｎ）  配列番号：５１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：５２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｏ）  配列番号：５９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：６０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｐ）  配列番号：６７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：６８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｑ）  配列番号：７５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：７６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｒ）  配列番号：８３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：８４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生する、又は、請求項７に記載のＤＮＡを含む、細胞又は生物。
【請求項９】
ヒトミッドカインの６９位、７９位、８１位及び１０２位のアミノ酸のうち少なくとも２つのアミノ酸を認識するモノクローナル抗体。
【請求項１０】
請求項１から６のいずれかに記載のモノクローナル抗体を有効成分とする抗癌剤。
【請求項１１】
請求項１から６のいずれかに記載のモノクローナル抗体を患者に投与する工程を含む、癌の治療又は予防の方法。
【請求項１２】
請求項１から６のいずれかに記載のモノクローナル抗体を有効成分とする、ミッドカインの検出又は精製のための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトミッドカインに対するモノクローナル抗体、該抗体を含む抗癌剤、及び該抗体を含むミッドカインを検出又は精製するための薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミッドカイン（ｍｉｄｋｉｎｅ、ＭＫ）は、レチノイン酸による胚性腫瘍細胞の分化誘導過程において一過性に発現する遺伝子の産物として、門松らにより１９８８年に発見された、塩基性アミノ酸とシステインに富む、約１３ｋＤａのヘパリン結合性成長因子である（非特許文献１、２）。【０００３】
ミッドカインは脊椎動物に広く存在しており、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ニワトリ、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ等で報告されている。保存性は高く、例えばヒトとマウスのミッドカインは分子全体で８７％のアミノ酸同一性を持つ（非特許文献３）。【０００４】
ヘパリン結合能、神経突起伸長、神経細胞の移動等の活性は、Ｃドメインを含むＣ末端側の１／２分子に担われている（非特許文献４）。ヒトミッドカインとマウスミッドカインのＣドメインは９３％（４０／４３）のアミノ酸同一性を持つ。【０００５】
ミッドカインは、プレイオトロフィン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ、ＰＴＮ）を唯一の構成因子とする独立のファミリーを形成する。プレイオトロフィンは約１８ｋＤａのポリペプチドであり、ミッドカインと約４５％のアミノ酸同一性を有し、神経突起の伸長と成長促進、細胞の形質転換、血管新生を促進する。【０００６】
ミッドカインは、胎生期に上皮―間質間相互作用の起こる組織の上皮側で発現する特長がある（非特許文献５）。その発現は胎生期中期にピークに達し、その後漸減し、出生時には少なく、成体ではほとんどない。ただし、発がん、炎症、修復の過程で強い発現が誘導される。【０００７】
ミッドカインは、様々な生物学的機能を有することが知られている。大きく、癌、炎症、神経の３つの分野において重要である。【０００８】
ミッドカインはがん細胞の生存と移動を促進し、血管新生を促し、がんの進展を助けると考えられている。ヒト癌でのミッドカイン発現様式の特徴は、癌の種類によらず７０％を超える高い頻度で発現亢進していることである。これは、食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、神経芽腫（ニューロブラストーマ）、神経膠芽腫（グリオブラストーマ）、子宮癌、卵巣癌、ウイルムス腫瘍といった多様な癌で確認されている（例えば非特許文献６〜１０）。【０００９】
神経芽腫は神経内分泌腫瘍の一つである。小児期において最も発生頻度の高い頭蓋外固形がんであり、白血病、中枢神経系腫瘍、そしてリンパ腫に続いて４番目に多い小児期の悪性腫瘍である。神経芽腫は、小児におけるがん死の３大原因のひとつであり、乳児におけるがん死の最大原因である。アメリカ合衆国においては、１年あたり約６５０の神経芽腫の新規症例が発生する。神経芽腫の症例のうちおよそ５０％が、２歳未満の小児に生じる。予後不良な神経芽腫の特性として、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子が増幅することが知られている（非特許文献１１〜１３）。【００１０】
Ｎ−ｍｙｃ遺伝子増幅等の神経芽腫予後因子と血中ミッドカイン濃度は相関しており（非特許文献１４）、さらに、血中ミッドカインは単独で神経芽腫の予後因子になりうる（非特許文献１５）。【００１１】
ミッドカインは、炎症を促進させる機能を持つ。これは、主にミッドカインノックアウトマウス（Ｍｄｋ−／−）の解析から得られた知見に基づいている。例えば、ノックアウトマウスでは、血管に傷害時の新生内膜の形成と虚血傷害時の腎炎の発症が軽減される。また、リウマチモデルや手術後の癒着も、ノックアウトマウスでは大きく軽減される。更に、ミッドカインはマクロファージや好中球といった炎症性細胞の移動（遊走）を促進することや、破骨細胞の分化を引き起こすことが知られている。このような知見から、ミッドカインは、関節炎、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎（慢性関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ））、多発性硬化症、手術後の癒着、炎症性大腸炎、乾癬、狼瘡、喘息、好中球機能異常等の炎症性疾患に関与することが考えられる（特許文献１、２、３）。【００１２】
さらに、ミッドカインは血管内膜肥厚作用を有することから、血管再建術後再狭窄、心臓冠動脈血管閉塞性疾患、脳血管閉塞性疾患、腎血管閉塞性疾患、末梢血管閉塞性疾患、動脈硬化、脳梗塞等の血管閉塞性疾患に関与する（特許文献１）。【００１３】
神経におけるミッドカインの機能としては、神経細胞の生存や神経突起の伸長を促すことがあげられる（非特許文献１６、１７）。例えば、培養皿に格子状にミッドカインをコートしておくと、神経細胞はミッドカインに沿って格子状に生存し、神経突起を伸ばす。また、ミッドカインは脳虚血に際して病巣周囲に一過性に誘導され（非特許文献１８）、ラット脊髄損傷モデルでも損傷後に最も発現が誘導されるサイトカインの一つである。このようにして誘導されたミッドカインが神経細胞死を防ぐと考えられる。【００１４】
梗塞の際のミッドカインの組織保護作用は心臓でも同様である。急性心筋梗塞に際してミッドカインは梗塞巣の周りに発現誘導される。ミッドカイン欠損マウスでは野生型マウスと比較して梗塞巣の拡大が認められ、逆に梗塞に際してミッドカインタンパク質を心筋に直接注入すると優位に梗塞巣を小さくし、心機能を改善させる（非特許文献１９）。このような保護効果はミッドカインの抗アポトーシス活性に負うところが大きいと考えられる。【００１５】
ミッドカインは、１〜５２位のアミノ酸よりなるＮ末端側のフラグメント（以下、「Ｎ−フラグメント」）、６２〜１２１位のアミノ酸よりなるＣ末端側のフラグメント（以下、「Ｃ−フラグメント」）及びそれらを結合するループ領域（５３〜６１位のアミノ酸）から構成されており、その立体構造がＮＭＲにより解析されている（非特許文献１６）。Ｎ−フラグメント及びＣ−フラグメントはそれぞれ、主に３本の逆βシート構造から成る立体構造を持つ部分（以下、「ドメイン」）と、ドメインの外側に位置し、特定の立体構造をとらない部分（以下、「テイル」）から構成されている。Ｎ−フラグメントは、１５〜５２位のアミノ酸からなるＮ−ドメイン及び１〜１４位のアミノ酸からなるＮ−テイルによって構成され、Ｃ−フラグメントは、６２〜１０４位のアミノ酸からなるＣ−ドメイン及び１０５〜１２１位のアミノ酸からなるＣ−テイルによって構成される。さらに、Ｃ−ドメインの表面には、塩基性アミノ酸が２つのクラスターを形成している。７９位のリシン、８１位のアルギニン、１０２位のリシンからなるクラスター（クラスターＩ）と、８６位のリシン、８７位のリシン、８９位のアルギニンからなるクラスター（クラスターII）である（非特許文献２０）。これらのクラスターは、ミッドカインのヘパリン結合能に関与する（非特許文献２０、２１）。【００１６】
ミッドカイン阻害剤を含有する医薬品は、複数の特許公報に開示されている（特許文献４、５、６、７）。しかし、医薬品として上市されたミッドカイン阻害剤は存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第２０００／１０６０８号公報
【特許文献２】国際公開第２００４／０７８２１０号公報
【特許文献３】国際公開第２００４／０８５６４２号公報
【特許文献４】国際公開第９９／０３４９３号公報
【特許文献５】特開２００２−８５０８５号公報
【特許文献６】特開２００７−２９７２８２号公報
【特許文献７】特開２００７−１３７７７１号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５１，１３１２−１３１８．［ＰＭＩＤ：３３５５５５７］
【非特許文献２】Ｔｏｍｏｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６５，１０７６５−１０７７０．［ＰＭＩＤ：  ２３５５０２１］
【非特許文献３】Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３，１２８１−１２８５．［ＰＭＩＤ：８３８３００７］
【非特許文献４】Ｍｉｃｈｉｋａｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，３５，５３０−５３９．［ＰＭＩＤ：８３７７２２４］
【非特許文献５】Ｋａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１０，６０７−６１６．［ＰＭＩＤ：１６８９７３０］
【非特許文献６】Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３，１２８１−１２８５．［ＰＭＩＤ：  ８３８３００７］
【非特許文献７】Ｇａｒｖｅｒ，Ｒ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９，４６３−４６６．［ＰＭＩＤ：８２１７１８６］
【非特許文献８】Ａｒｉｄｏｍｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊａｐ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８６，６５５−６６１．［ＰＭＩＤ：７５５９０８３］
【非特許文献９】Ｏ'Ｂｒｉｅｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６，２５１５−２５１８．［ＰＭＩＤ：  ８６５３６８８］
【非特許文献１０】Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  Ｔ．（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３２，（３）：３５９−３７１．
【非特許文献１１】Ｋｏｈｌ  ＮＥ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３５，３５９−６７．
【非特許文献１２】Ｂｒｏｄｅｕｒ  ＧＭ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）２２４，１１２１−４．
【非特許文献１３】Ｓｅｅｇｅｒ  ＲＣ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３１３，１１１１−６．
【非特許文献１４】Ｉｋｅｍａｔｓｕ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８８，１５２２−１５２６．  ［ＰＭＩＤ：  １２７７１９１６］
【非特許文献１５】Ｉｋｅｍａｔｓｕ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９９（１０），２０７０−２０７４．
【非特許文献１６】Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５９，３９２−４０２．［ＰＭＩＤ：８４０５６６６］
【非特許文献１７】Ｋａｎｅｄａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１９（６）：１１５０−１１５６．
【非特許文献１８】Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８５，２５−３０．［ＰＭＩＤ：７７８１１６４］
【非特許文献１９】Ｈｏｒｉｂａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１１４，１７１３−１７２０．［ＰＭＩＤ：１７０１５７８９］
【非特許文献２０】Ｉｗａｓａｋｉ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６，６９３６−６９４６．［ＰＭＩＤ：  ９３８４５７３］
【非特許文献２１】Ａｓａｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０６，４６８−４７３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、上記状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヒトミッドカインに対して優れた反応性と中和活性を有するモノクローナル抗体を提供することにある。また、本発明は、このような抗体を有効成分とする抗癌剤を提供することを目的とする。さらに本発明は、このような抗体を有効成分とするミッドカインの検出や精製のための薬剤を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、上記課題を達成すべく、まず、ヒトミッドカインに対する多数のモノクローナル抗体（マウス抗体）を作製し、それらのヒトミッドカインに対する中和活性を評価し、優れた中和活性を有する抗体を選抜した。そして、ヒトミッドカインの特定のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異ペプチドとの反応性を指標として、選抜した抗体のヒトミッドカイン上の認識部位の同定を行った。その結果、優れた中和活性を有する抗体が、共通して、ヒトミッドカインの６９位、７９位、８１位及び１０２位のアミノ酸のうち少なくとも２つのアミノ酸を認識することを見出した。その中でも特に高い中和活性を示したのは、ヒトミッドカインの６９位、７９位、８１位及び１０２位の全てのアミノ酸を認識する抗体であった。【００２１】
また、本発明者らは、最も高い中和活性が認められた抗体であるＦＢ５４の遺伝子を単離し、それを基にキメラ化抗体及びヒト型化抗体を作製した。そして、これら抗体のヒトミッドカインに対する反応性を評価した結果、これら抗体が元のマウス抗体と同等の反応性を有していることを見出した。さらに、ヒト型化抗体について、マウスゼノグラフトを用いて抗腫瘍活性を評価した結果、当該抗体が腫瘍の増殖を有意に阻害することを見出した。また、抗体を投与しないコントロール群では、約９０日後に全個体が死亡したのに対し、ヒト型化抗体の投与群では、１００日後でも３０％もの個体が生存しており、当該抗体の延命効果も確認された。【００２２】
さらに、本発明者らは、ＦＢ５４のマウス抗体又はヒト型化抗体の可変領域に変異を導入したＦａｂ抗体群を作製し、それらのヒトミッドカイン及びマウスミッドカインに対する反応性を評価した。その結果、元のマウス抗体よりもこれらミッドカインに対する反応性が向上した複数のＦａｂ抗体を取得することに成功した。さらに、取得したＦａｂ抗体をＩｇＧ化して、ヒトミッドカイン及びマウスミッドカインに対する反応性及び中和活性をさらに高めることにも成功した。【００２３】
本発明者らは、ミッドカインに対する優れた反応性、中和活性、腫瘍の増殖抑制活性といった、取得した抗体の特性を利用することにより、効果的に癌の治療が可能であり、また、効率的にミッドカインの検出や精製を行うことも可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。【００２４】
すなわち、本発明は、ヒトミッドカインの６９位、７９位、８１位及び１０２位のアミノ酸のうち少なくとも２つのアミノ酸を認識し、ヒトミッドカインに対して中和活性を有するモノクローナル抗体、当該抗体を有効成分とする抗癌剤、及び当該抗体を有効成分とするミッドカインの検出又は精製のための薬剤に関するものであり、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
［１］  ヒトミッドカインの６９位、７９位、８１位及び１０２位のアミノ酸のうち少なくとも２つのアミノ酸を認識し、ヒトミッドカインに対して中和活性を有するモノクローナル抗体。
［２］  ヒトミッドカインの６９位、７９位、８１位及び１０２位のアミノ酸の全てのアミノ酸を認識する、［１］に記載の抗体。
［３］  腫瘍の増殖を抑制する活性を有する、［１］又は［２］に記載の抗体。
［４］  下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の特徴を有する、モノクローナル抗体
（ａ）  配列番号：１から３に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４から６に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）  配列番号：７に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｃ）  配列番号：９に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｄ）  配列番号：１０に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｅ）  配列番号：１１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
［５］  軽鎖可変領域における相補性決定領域のＣＤＲ１の４位のアミノ酸がイソロイシンである、［４］に記載の抗体。
［６］  下記（ａ）から（ｒ）のいずれかに記載の特徴を有する、モノクローナル抗体
（ａ）  配列番号：１３から１５に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１６から１８に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）  配列番号：２１から２３に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２４から２６に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｃ）  配列番号：２９から３１に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３２から３４に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｄ）  配列番号：３７から３９に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４０から４２に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｅ）  配列番号：４５から４７に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４８から５０に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｆ）  配列番号：５３から５５に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：５６から５８に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｇ）  配列番号：６１から６３に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：６４から６６に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｈ）  配列番号：６９から７１に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：７２から７４に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｉ）  配列番号：７７から７９に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：８０から８２に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｊ）配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｋ）  配列番号：２７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｌ）  配列番号：３５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｍ）  配列番号：４３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｎ）  配列番号：５１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：５２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｏ）  配列番号：５９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：６０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｐ）  配列番号：６７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：６８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｑ）  配列番号：７５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：７６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｒ）  配列番号：８３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：８４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
［７］  ［１］から［６］のいずれかに記載のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ。
［８］  ［１］から［６］のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生する、又は、［７］に記載のＤＮＡを含む、細胞又は生物。
［９］  ヒトミッドカインの６９位、７９位、８１位及び１０２位のアミノ酸のうち少なくとも２つのアミノ酸を認識するモノクローナル抗体。
［１０］  ［１］から［６］のいずれかに記載のモノクローナル抗体を有効成分とする抗癌剤。
［１１］  ［１］から［６］のいずれかに記載のモノクローナル抗体を患者に投与する工程を含む、癌の治療又は予防の方法。
［１２］  ［１］から［６］のいずれかに記載のモノクローナル抗体を有効成分とする、ミッドカインの検出又は精製のための薬剤。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、ヒトミッドカインの６９位、７９位、８１位及び１０２位のアミノ酸のうち少なくとも２つのアミノ酸を認識し、ヒトミッドカインに対して優れた反応性と中和活性を有するモノクローナル抗体が提供された。特にヒトミッドカインの６９位、７９位、８１位及び１０２位の全てのアミノ酸を認識する抗体は、最も高い中和活性を有していた。また、優れた中和活性を有する抗体には、腫瘍の増殖抑制活性が認められた。したがって、本発明の抗体を用いれば、効果的な癌の治療が可能となる。また、本発明の抗体は、そのミッドカインへの反応性の高さから、ミッドカインの検出や精製のための薬剤としての応用も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】取得した抗ミッドカインモノクローナル抗体の、リコンビナントヒトミッドカインに対する反応性について、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示すグラフである。
【図２】取得した抗ミッドカインモノクローナル抗体の、リコンビナントヒトミッドカインに対する反応性について、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示すグラフである。
【図３】取得した抗ミッドカインモノクローナル抗体の、リコンビナントヒトミッドカインに対する反応性について、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示すグラフである。
【図４】取得した抗ミッドカインモノクローナル抗体の、リコンビナントヒトミッドカインに対する反応性について、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示すグラフである。
【図５】取得した抗ミッドカインモノクローナル抗体の、ヒトミッドカインにおける認識部位について、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示すグラフである。「ＭＫ−ｆｕｌｌ」は、ヒトミッドカイン全長に対する各抗体の反応性を示し、「ＭＫ−Ｃ」は、ヒトミッドカインＣ末側（６０〜１２０位のアミノ酸からなるポリペプチド）に対する各抗体の反応性を示す。
【図６】取得した抗ミッドカインモノクローナル抗体（ＦＢ５３、ＦＢ５４及びＦＢ７２）の中和活性について、アルカリフォスファタ―ゼ（ＡＰ）標識ミッドカイン（ＡＰ−ＭＫ）と細胞表面の受容体との結合の阻害の程度を評価することにより解析した結果を示すグラフである。「ＡＰ」は、ＡＰのみを添加した細胞の抽出液における相対的なＡＰ活性値（％）を示し、「ＡＰ−ＭＫ＋ｍＡｂ」は、ＡＰ−ＭＫ及び抗ミッドカインモノクローナル抗体を添加した細胞の抽出液における相対的なＡＰ活性値（％）を示す。また、（ｎｏｎｅ）は、ＡＰ−ＭＫのみを添加した細胞の抽出液における相対的なＡＰ活性値（％）を示す。
【図７】取得した抗ミッドカインモノクローナル抗体（ＦＢ５３、ＦＢ５４、ＦＢ７２、ＢＦ１０６及びＦＢ７４）の、変異体ミッドカインリコンビナントタンパク質（ＭＫ−Ｗ６９Ａ、ＭＫ−Ｋ７９Ｑ、ＭＫ−Ｒ８１Ｑ及びＭＫ−Ｋ１０２Ｑ）に対する反応性について、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示すグラフである。図中「ＭＫ」は野生型ミッドカインリコンビナントタンパク質に対する各抗体の反応性を示す。
【図８】抗ヒトミッドカインマウスモノクローナル抗体（ｍＦＢ５４）及び、そのキメラ化抗体（ｃｈＦＢ５４）の、リコンビナントヒトミッドカインに対する反応性について、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示すグラフである。
【図９】ＦＢ５４のキメラ化抗体（重鎖可変領域がＦＢ５４−ｃｈＨであり、軽鎖可変領域がＦＢ５４−ｃｈＫである抗体）並びにＦＢ５４のヒト型化抗体（重鎖可変領域がＦＢ５４−ｒＨａであり、軽鎖可変領域がＦＢ５４−ｒＫａである抗体、重鎖可変領域がＦＢ５４−ｒＨａであり、軽鎖可変領域がＦＢ５４−ｒＫｂである抗体、及び、重鎖可変領域がＦＢ５４−ｒＨａであり、軽鎖可変領域がＦＢ５４−ｒＫｃである抗体）の、リコンビナントヒトミッドカインに対する反応性について、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示すグラフである。
【図１０】精製キメラ化ＦＢ５４抗体（ｃｈＦＢ５４）及び精製ヒト型化ＦＢ５４抗体（ｈＦＢ５４）の、リコンビナントヒトミッドカインに対する反応性について、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示すグラフである。
【図１１】ヒト神経芽腫瘍を移植したマウスゼノグラフトを用い、ｈＦＢ５４の抗腫瘍活性を評価した結果を示すグラフである。
【図１２】ｈＦＢ５４の抗体可変領域にランダムな変異を導入したＦａｂ抗体群（ｈＦＢ５４ｍａｔｕ００１〜０４７）の、リコンビナントヒトミッドカイン（ＭＫｖｅｒ１０）に対する反応性について、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示すグラフである。「ｏｒｉｇｉｎａｌ」は、ｈＦＢ５４のリコンビナントヒトミッドカインに対する反応性を示す。
【図１３】ｈＦＢ５４の抗体可変領域にランダムな変異を導入したＦａｂ抗体群（ｈＦＢ５４ｍａｔｕ０４８〜０９４）の、リコンビナントヒトミッドカイン（ＭＫｖｅｒ１０）に対する反応性について、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示すグラフである。「ｏｒｉｇｉｎａｌ」は、ｈＦＢ５４のリコンビナントヒトミッドカインに対する反応性を示す。
【図１４】ｍＦＢ５４の抗体可変領域にランダムな変異を導入したＦａｂ抗体群（ｍＦＢ５４ｍａｔｕ００１〜０４７）の、マウスミッドカイン（ｍＭＫ）に対する反応性について、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示すグラフである。「ｏｒｉｇｉｎａｌ」は、ｍＦＢ５４のマウスミッドカインに対する反応性を示す。
【図１５】ｍＦＢ５４の抗体可変領域にランダムな変異を導入したＦａｂ抗体群（ｍＦＢ５４ｍａｔｕ０４８〜０９４）の、マウスミッドカイン（ｍＭＫ）に対する反応性について、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示すグラフである。「ｏｒｉｇｉｎａｌ」は、ｍＦＢ５４のマウスミッドカインに対する反応性を示す。
【図１６】ｈＦＢ５４及び、その親和性向上抗体（ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０１４、ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０２０、ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０２４、ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０３９、ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０５４、ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０６２、ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０７２）の、リコンビナントヒトミッドカイン（ＭＫｖｅｒ１０）に対する反応性について、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示すグラフである。
【図１７】ｍＦＢ５４及び、その親和性向上抗体（ｍＦＢ５４−ｍａｔｕ００２、ｍＦＢ５４−ｍａｔｕ０８９）の、マウスミッドカイン（ｍＭＫ）に対する反応性について、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示すグラフである。
【図１８】ｍＦＢ５４及びｍＦＢ５４の親和性向上抗体（ｍａｔｕ００２、ｍａｔｕ０８９）間において、またｈＦＢ５４及びｈＦＢ５４の親和性向上抗体（ｍａｔｕ０１４、ｍａｔｕ０２０、ｍａｔｕ０２４、ｍａｔｕ０３９、ｍａｔｕ０５４、ｍａｔｕ０６２、ｍａｔｕ０７２）間において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。
【図１９】ｍＦＢ５４、ｍＦＢ５４の親和性向上抗体、ｈＦＢ５４及びｈＦＢ５４の親和性向上抗体の、リコンビナントヒトミッドカイン（ＭＫｖｅｒ１０）に対する反応性について、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示すグラフである。
【図２０】ｍＦＢ５４、ｍＦＢ５４の親和性向上抗体、ｈＦＢ５４及びｈＦＢ５４の親和性向上抗体の、マウスミッドカイン（ｍＭＫ）に対する反応性について、ＥＬＩＳＡにより解析した結果を示すグラフである。
【図２１】ｍＦＢ５４の親和性向上抗体、ｈＦＢ５４、ｈＦＢ５４の親和性向上抗体及びｃｈＦＢ５４の中和活性について、ＡＰ−ＭＫと細胞表面の受容体との結合の阻害の程度を評価することにより解析した結果を示すグラフである。「ＡＰ」は、ＡＰのみを添加した細胞の抽出液における相対的なＡＰ活性値（％）を示し、「ＡＰ−ＭＫ＋ｍＡｂ」は、ＡＰ−ＭＫ及び抗ミッドカインモノクローナル抗体を添加した細胞の抽出液における相対的なＡＰ活性値（％）を示す。また、「（ｎｏｎｅ）」は、ＡＰ−ＭＫのみを添加した細胞の抽出液における相対的なＡＰ活性値（％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、ヒトミッドカインの６９位、７９位、８１位及び１０２位のアミノ酸のうち少なくとも２つのアミノ酸を認識し、ヒトミッドカインに対して中和活性を有するモノクローナル抗体を提供する。
【００２８】
本発明における「ミッドカイン」は、軸索成長促進因子２（ＮＥＧＦ２）とも称される、塩基性アミノ酸及びシステインに富む分子量約１３ＫＤａのタンパク質である。ミッドカインは、細胞の生存や移動を促進し、癌の進行、炎症性疾患の発症、傷害を受けた組織の保存・修復に関与していることが明らかになっている。本発明の抗体が結合する「ヒトミッドカイン」とは、ヒトに由来するミッドカインを意味し、典型的には、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００１０１２３３３で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００１０１２３３３で特定されるＤＮＡがコードするタンパク質）の２３位のリジンから１４３位のアスパラギン酸からなるタンパク質である。なお、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００１０１２３３３で特定されるタンパク質は、シグナルペプチドを含む前駆体であり、前記「２３位のリジンから１４３位のアスパラギン酸からなるタンパク質」は、該シグナルペプチドが除去され、成熟した分泌型のヒトミッドカインである。通常、ヒトミッドカインにおいては、当該２３位のリジンを１位のアミノ酸とするので、本明細書においても、そのように規定する。すなわち、本発明における「ヒトミッドカインの６９位、７９位、８１位及び１０２位のアミノ酸」は、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００１０１２３３３で特定されるタンパク質（前駆体）においては、各々、９１位のトリプトファン、１０１位のリジン、１０３位のアルギニン及び１２４位のリジンに相当する。
【００２９】
本発明の抗体は、ヒトミッドカインの６９位、７９位、８１位及び１０２位のアミノ酸のうち少なくとも２つのアミノ酸を認識し、ヒトミッドカインに対して中和活性を有する。例えば、本実施例に記載のＦＢ５３は、ヒトミッドカインの６９位、及び８１位の２つのアミノ酸を認識し、ＦＢ５４及びＦＢ７２は、ヒトミッドカインの６９位、７９位、８１位及び１０２位のアミノ酸の全てを認識する（図７）。そして、抗体における、このような認識特異性が、ヒトミッドカインに対する中和活性と相関していることが見出された。特に、ヒトミッドカインの６９位、７９位、８１位及び１０２位のアミノ酸の全てを認識するＦＢ５４とＦＢ７２、及びＦＢ５４のアミノ酸配列変異体（ミッドカインに対する反応性を向上させた抗体）は、優れた中和活性を有していた（図６、２１）。したがって、本発明の抗体の一つの好ましい態様は、ヒトミッドカインの６９位、７９位、８１位及び１０２位のアミノ酸の全てを認識する抗体である。
【００３０】
なお、抗体におけるヒトミッドカイン上の特定のアミノ酸の認識は、例えば、実施例１５に記載のように、当該特定のアミノ酸を変異させたペプチドに対する反応性の低下を指標に評価することができる。また、抗体における「ヒトミッドカインに対する中和活性」は、例えば、実施例１２及び２４に記載のように、ミッドカイン受容体に対する標識したミッドカインの結合を被検抗体が阻害する活性として評価することが可能である。本発明の抗体は、コントロール（抗体なし）と比較して、ミッドカインの結合を、好ましくは８０％以下、より好ましくは７０％以下、より好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、最も好ましくは２０％以下に低下させる抗体である。
【００３１】
本発明の抗体の他の好ましい態様は、腫瘍の増殖抑制活性を有する抗体である。抗体における「腫瘍の増殖抑制活性」は、例えば、実施例２１に記載のように、マウスゼノグラフトを用いた実験において、被検抗体投与後の腫瘍体積を測定することにより評価することが可能である。本発明の抗体は、腫瘍細胞移植後２９日目以降（例えば、２９日目、３３日目、３６日目、又は４１日目）における腫瘍体積を、コントロール（抗体なし）と比較して、好ましくは８０％以下、より好ましくは７５％以下、より好ましくは７０％以下、より好ましくは６５％以下、より好ましくは６０％以下、より好ましくは５５％以下に低下させる抗体である。例えば、本実施例に記載のＦＢ５４は、優れた腫瘍の増殖抑制活性を有していた（図１１）。本発明の抗体は、この腫瘍の増殖抑制活性により、個体の延命効果を発揮することもできる。
【００３２】
本発明の抗体は、上記の活性を複数併せ持つ抗体であることが特に好ましい。
【００３３】
本発明の抗体の他の好ましい態様は、本実施例に記載のＦＢ５４の軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を保持する抗体、あるいはそれらのアミノ酸配列変異体である。すなわち、配列番号：１から３に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４から６に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域を保持する抗体である。
【００３４】
ＦＢ５４のアミノ酸配列変異体としては、その軽鎖のＣＤＲ１の４位のアミノ酸が「Ｔ」から「Ｉ」に変異している抗体、すなわち、軽鎖可変領域における相補性決定領域のＣＤＲ１の４位のアミノ酸がイソロイシンである上記抗体であることが好ましい。このような抗体は共通して、ヒトミッドカイン及びマウスミッドカインに対して優れた反応性を有する（図１８）。このような抗体の具体例としては、下記（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載の特徴を有する抗体が挙げられる。
【００３５】
＜ｍａｔｕ００２＞
（ａ）配列番号：１３から１５に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１６から１８に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域を保持する
＜ｍａｔｕ０８９＞
（ｂ）  配列番号：２１から２３に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２４から２６に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域を保持する
＜ｍａｔｕ０１４＞
（ｃ）  配列番号：２９から３１に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３２から３４に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域を保持する
＜ｍａｔｕ０２０＞
（ｄ）  配列番号：３７から３９に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４０から４２に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域を保持する
＜ｍａｔｕ０２４＞
（ｅ）  配列番号：４５から４７に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４８から５０に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域を保持する
＜ｍａｔｕ０３９＞
（ｆ）  配列番号：５３から５５に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：５６から５８に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域を保持する
＜ｍａｔｕ０５４＞
（ｇ）  配列番号：６１から６３に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：６４から６６に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域を保持する
＜ｍａｔｕ０６２＞
（ｈ）  配列番号：６９から７１に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：７２から７４に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域を保持する
＜ｍａｔｕ０７２＞
（ｉ）  配列番号：７７から７９に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号：８０から８２に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域を含む重鎖可変領域を保持する
【００３６】
本発明の抗体の他の好ましい態様は、ＦＢ５４（マウス抗体）の軽鎖可変領域と重鎖可変領域を保持する抗体、あるいはそのアミノ酸配列変異体である。すなわち、配列番号：７に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する抗体である。
【００３７】
本発明の抗体の他の好ましい態様は、ＦＢ５４（ヒト型化抗体）、あるいはそのアミノ酸配列変異体である。すなわち、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の軽鎖可変領域と、
（ａ）配列番号：９に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
（ｂ）配列番号：１０に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
（ｃ）配列番号：１１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
配列番号：１２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と
を保持するモノクローナル抗体である。
【００３８】
ＦＢ５４（マウス抗体、及びヒト型化抗体）のアミノ酸配列変異体としては、その軽鎖のＣＤＲ１の４位のアミノ酸が「Ｔ」から「Ｉ」に変異している抗体、すなわち、軽鎖可変領域における相補性決定領域のＣＤＲ１の４位のアミノ酸がイソロイシンである上記抗体であることが好ましい。このような抗体の具体例としては、下記（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載の特徴を有する抗体が挙げられる。
【００３９】
＜ｍａｔｕ００２＞
（ａ）配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する
＜ｍａｔｕ０８９＞
（ｂ）  配列番号：２７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する
＜ｍａｔｕ０１４＞
（ｃ）  配列番号：３５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する
＜ｍａｔｕ０２０＞
（ｄ）  配列番号：４３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する
＜ｍａｔｕ０２４＞
（ｅ）  配列番号：５１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：５２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する
＜ｍａｔｕ０３９＞
（ｆ）  配列番号：５９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：６０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する
＜ｍａｔｕ０５４＞
（ｇ）  配列番号：６７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：６８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する
＜ｍａｔｕ０６２＞
（ｈ）  配列番号：７５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：７６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する
＜ｍａｔｕ０７２＞
（ｉ）  配列番号：８３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：８４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を保持する
【００４０】
本発明における「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味する。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を認識するものである。本発明の抗体は、自然環境の成分から分離され、及び／又は回収された（即ち、単離された）抗体である。
【００４１】
本発明の抗体には、キメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト抗体、及び、これら抗体の機能的断片が含まれる。本発明の抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体、ヒト型化抗体、あるいはヒト抗体が望ましい。
【００４２】
本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免役し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平７−１９４３８４号公報、特許３２３８０４９号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。また、本発明において「ヒト型化抗体」とは、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、公知である（例えば、特許２９１２６１８号、特許２８２８３４０号公報、特許３０６８５０７号公報、欧州特許２３９４００号公報、欧州特許１２５０２３号公報、国際公開９０／０７８６１号公報、国際公開９６／０２５７６号公報参照）。本発明において、「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。ヒト抗体の作製においては、免疫することで、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用することが可能である。ヒト抗体の作製手法は、公知である（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９２）、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３：６５−９３（１９９５）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７２７（２０００）、特開平１０−１４６１９４号公報、特開平１０−１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１−２０６３８７号公報、特表平８−５０９６１２号公報、特表平１１−５０５１０７号公報）。本実施例においては、ＦＢ５４遺伝子を基に、ミッドカインに対して優れた反応性と中和活性を有するキメラ抗体及びヒト型化抗体を作製することに成功している（図８〜１０、１９〜２１）。
【００４３】
本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、ヒトミッドカインを認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、及びこれらの重合体等が挙げられる。
【００４４】
ここで「Ｆａｂ」とは、１つの軽鎖及び重鎖の一部からなる免疫グロブリンの一価の抗原結合断片を意味する。抗体のパパイン消化によって、また、組換え方法によって得ることができる。本実施例においては、ＦＢ５４遺伝子を基に、ミッドカインに対して優れた反応性を有するＦａｂを作製することに成功している（図１２〜１７）。「Ｆａｂ’」は、抗体のヒンジ領域の１つ又はそれより多いシステインを含めて、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのわずかの残基の付加によって、Ｆａｂとは異なる。「Ｆ（ａｂ’）２」とは、両方の軽鎖と両方の重鎖の部分からなる免疫グロブリンの二価の抗原結合断片を意味する。
【００４５】
「可変領域断片（Ｆｖ）」は、完全な抗原認識及び結合部位を有する最少の抗体断片である。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである。「一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）」は、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在する。「ｓｃ（Ｆｖ）２」は、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域をリンカー等で結合して一本鎖にしたものである。
【００４６】
本発明の抗体には、望ましい活性（例えば、ヒトミッドカイン及びマウスミッドカインに対する反応性、ヒトミッドカインに対する中和活性、腫瘍の増殖抑制活性）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。本発明の抗体のアミノ酸配列変異体は、本発明の抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、又はペプチド合成によって作製することができる。そのような修飾には、例えば、本発明の抗体のアミノ酸配列内の残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を含む。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖又は軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域及びＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５−３５１（２００８））。改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。実際、本実施例において、ＦＢ５４の可変領域（フレームワーク領域及びＣＤＲ）に変異が導入され、ヒトミッドカイン及びマウスミッドカインに対する優れた反応性とヒトミッドカインに対する優れた中和活性を有する多数のアミノ酸配列変異体の作製に成功している（実施例２２〜２４、図１８）。
【００４７】
また、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。
【００４８】
本発明の抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原（ヒトミッドカイン、その部分ペプチド、又はこれらを発現する細胞等）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等である。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、ヒトミッドカインに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。ヒトミッドカインに対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
【００４９】
組換えＤＮＡ法は、上記本発明の抗体又はペプチドをコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ  Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７−７７５（１９９０））。本発明の抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（国際公開９４／１１５２３号公報参照）。本発明の抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタ等）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
【００５０】
本発明は、上記本発明の抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクターを提供するものである。また、上記本発明の抗体を産生する、又は、前記本発明のＤＮＡを含む細胞又は生物を提供するものである。さらに、本発明は、前記細胞を培養し、又は前記生物を飼育し、抗体を回収することを含む抗体の生産方法をも提供するものである。なお、本発明の抗体を産生する、又は、本発明のＤＮＡを含む細胞としては、例えば、前述のハイブリドーマ、前述の宿主細胞が挙げられる。また、本発明の抗体を産生する、又は、本発明のＤＮＡを含む生物としては、例えば、前述のトランスジェニック動物、前述の抗原等で免疫された動物が挙げられる。
【００５１】
本発明の抗体は、ヒトミッドカインに対して中和活性を有することから、ミッドカイン関連疾患の治療薬及び予防薬として使用することができる。ミッドカイン関連疾患としては、例えば、癌（神経芽細胞腫、神経膠芽腫、食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、ウイルムス腫瘍）、子宮内膜症等の細胞増殖又は血管新生に起因する疾患、関節炎、自己免疫疾患（臓器特異的自己免疫疾患等）、リウマチ性関節炎（慢性関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ））、多発性硬化症（再発寛解型多発性硬化症等）、炎症性腸炎（クローン病等）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、シェーグレン症候群、多発性筋炎（ＰＭ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、結節性動脈周囲炎（ＰＮ）、甲状腺疾患（バセドウ病等）、ギラン・バレー症候群、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、突発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血、重症筋無力症（ＥＡＭＧ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、１型糖尿病、移植時の拒絶反応、手術後の癒着、子宮内膜症、乾癬、狼瘡、アレルギー、喘息、好中球機能異常等の炎症性疾患又は細胞遊走に起因する疾患、血管再建術後再狭窄、心臓冠動脈血管閉塞性疾患、脳血管閉塞性疾患、腎血管閉塞性疾患、末梢血管閉塞性疾患、動脈硬化、脳梗塞等の血管閉塞性疾患又は血管内膜肥厚に起因する疾患を挙げることができる。したがって、本発明は、本発明の抗体を有効成分とするミッドカイン関連疾患の治療又は予防のための薬剤、及び、有効量の本発明の抗体を、ヒトを含む哺乳類に投与する工程を含んでなる、ミッドカイン関連疾患の治療又は予防の方法をも提供するものである。
【００５２】
本発明の抗体は、本実施例に示すとおり、優れた腫瘍の増殖抑制活性を有することから、抗癌剤として好適である。したがって、本発明は、その好ましい態様において、本発明の抗体を有効成分とする抗癌剤、及び、有効量の本発明の抗体を患者（例えば、ヒトを含む哺乳類）に投与する工程を含む、癌の治療又は予防の方法をも提供するものである。
【００５３】
本発明の抗体を有効成分とする抗癌剤は、本発明の抗体と任意の成分、例えば生理食塩水、葡萄糖水溶液又は燐酸塩緩衝液等を含有する組成物の形態で使用することができる。本発明の医薬組成物は、必要に応じて液体又は凍結乾燥した形態で製形化しても良く、任意に薬学的に許容される担体又は媒体、例えば、安定化剤、防腐剤、等張化剤等を含有させることもできる。
【００５４】
薬学的に許容される担体としては、凍結乾燥した製剤の場合、マンニトール、ラクトース、サッカロース、ヒトアルブミン等を例として挙げることができ、液状製剤の場合には、生理食塩水、注射用水、燐酸塩緩衝液、水酸化アルミニウム等を例として挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５５】
本発明の抗癌剤の投与方法は、投与対象の年齢、体重、性別、健康状態等により異なるが、経口投与、非経口投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。好ましい投与方法は、非経口投与である。本発明の抗癌剤の投与量は、患者の年齢、体重、性別、健康状態、癌の進行の程度及び投与する抗癌剤の成分により変動しうるが、一般的に、静脈内投与の場合、成人には体重１ｋｇ当たり１日０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇである。
【００５６】
本発明の抗体は、ヒトミッドカインやマウスミッドカインに対して優れた反応性を有するため、これらミッドカインの検出（例えば、実験や診断における検出）やミッドカインの精製のための薬剤としての応用も考えられる。本発明の抗体をミッドカインの検出に用いる場合、本発明の抗体は、標識したものであってもよい。標識としては、例えば、放射性物質、蛍光色素、化学発光物質、酵素、補酵素を用いることが可能であり、具体的には、ラジオアイソトープ、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、リゾチーム、ビオチン／アビジン等が挙げられる。本発明の抗体を薬剤として調剤するには、合目的な任意の手段を採用して任意の剤型でこれを得ることができる。例えば、精製した抗体についてその抗体価を測定し、適当にＰＢＳ（生理食塩を含むリン酸緩衝液）等で希釈した後、０．１％アジ化ナトリウム等を防腐剤として加えることができる。また、例えば、ラテックス等に本発明の抗体を吸着させたものについて抗体価を求め、適当に希釈し、防腐剤を添加して用いることもできる。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００５８】
（実施例１）ＭＫのｃＤＮＡ取得
ヒトＭＫのｃＤＮＡ配列（ＮＭ＿００１０１２３３３）に基づき、５’ＵＴＲ領域と３’ＵＴＲ領域に下記のプライマーを設計した。ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３から抽出したｔｏｔａｌＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔIII  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを作製した。これを鋳型として、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  Ｖｅｒ．２（東洋紡）を用いたｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲによってＭＫのタンパク質コード領域全長を含むｃＤＮＡを増幅した。１ｓｔ  ＰＣＲは［９８℃  ２０秒、５７℃  ２０秒、６８℃  ４５秒］を２５サイクル、２ｎｄ  ＰＣＲは［９８℃  １５秒、５８℃  １５秒、６８℃  ４５秒］を３０サイクルの条件で増幅した。２ｎｄ  ＰＣＲの増幅産物をクローニングベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、塩基配列を確認した。塩基配列の確認は、オートシークエンサー（アプライドバイオシステム）を用いた。クローニングしたｃＤＮＡはヒトＭＫの配列と一致していたため、ｈＭＫ−ｐＴ７と名づけた。
１ｓｔ  ＰＣＲ
５’プライマー：５’−ＧＡＧＴＣＧＣＣＴＣＴＴＡＧＣＧＧＡＴＧＣ−３’（配列番号：８５）
３’プライマー：５’−ＧＣＴＣＣＴＴＧＧＣＡＴＣＣＡＧＧＣＴＴＧ−３’（配列番号：８６）
２ｎｄ  ＰＣＲ
５’プライマー：５’−ＣＧＧＡＴＧＣＡＧＣＡＣＣＧＡＧＧＣＴＴＣ−３’（配列番号：８７）
３’プライマー：５’−ＧＧＣＴＴＧＧＣＧＴＣＴＡＧＴＣＣＴＴＴＣＣ−３’（配列番号：８８）【００５９】
同様に、マウスＭＫのタンパク質コード領域全長を含むｃＤＮＡを増幅した。鋳型にはマウス胎児内臓組織由来ｃＤＮＡを用いた。プライマーはマウスＭＫのｃＤＮＡ配列（ＮＭ＿００１０１２３３６）に基づいて設計した。クローニングしたｃＤＮＡはマウスＭＫの配列と一致していたため、ｍＭＫ−ｐＴ７と名づけた。
１ｓｔ  ＰＣＲ
５’プライマー：５’−ＡＡＧＣＡＴＣＧＡＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＡＴＧ−３’（配列番号：８９）
３’プライマー：５’−ＡＡＣＡＡＧＴＡＴＣＡＧＧＧＴＧＧＧＧＡＧＡＡＣ−３’（配列番号：９０）
２ｎｄ  ＰＣＲ
５’プライマー：５’−ＧＡＴＧＣＡＧＣＡＣＣＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣ−３’（配列番号：９１）
３’プライマー：５’−ＴＡＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＣＡＧ−３’（配列番号：９２）【００６０】
（実施例２）ＭＫを分泌発現する細胞の作製
ヒトＭＫのａａ１−ａａ１２１（ＭＫｖｅｒ１０）若しくはａａ５７−ａａ１２１（ＭＫｖｅｒ５０）部分、又はマウスＭＫのａａ１−ａａ１１９（ｍＭＫ）を発現する動物細胞は、以下のように作製した。【００６１】
ｈＭＫ−ｐＴ７又はｍＭＫ−ｐＴ７を鋳型として、下記のプライマーによりＰＣＲで増幅させたＭＫ部分長断片の末端をＮｏｔＩとＢａｍＨＩで切断し、動物細胞用発現ベクターのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入した。動物細胞用の発現ベクターには、ＣＭＶプロモーターで制御され、ＩＲＥＳ配列により目的遺伝子とＰｕｒｏｍｙｃｉｎ−ＥＧＦＰ融合タンパク質が同時に発現されるｐＱＣｘｍｈＩＰＧを用いた。ＰＱＣｘｍｈＩＰＧは、発明者らが「ＢＤ  Ｒｅｔｒｏ−Ｘ  Ｑ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のｐＱＣＸＩＰ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒを改変したベクターである。作製したベクターは、ＭＫｖｅｒ１０−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧ、ＭＫｖｅｒ５０−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧ、ｍＭＫ−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧと名付けた。
ＭＫｖｅｒ１０
５’プライマー：５’−ａａｔａＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＣＡＣＣＧＡＧＧＣＴＴＣＣＴＣ−３’）（配列番号：９３、下線部はＮｏｔＩ認識配列）
３’プライマー：５’−ｃｇＧＧＡＴＣＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＣＴＴＧ−３’）（配列番号：９４、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）
ＭＫｖｅｒ５０
５’プライマー：５’−ａａｔａＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＴＴＴＧＧＡＧＣＣＧＡＣＴＧＣ−３’）（配列番号：９５、下線部はＮｏｔＩ認識配列）
３’プライマー：５’−ｃｇＧＧＡＴＣＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＣＴＴＧ−３’）（配列番号：９６、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）
ｍＭＫ
５’プライマー：５’−ａａｔａＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＣＡＣＣＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣ−３’）（配列番号：９７、下線部はＮｏｔＩ認識配列）
３’プライマー：５’−ｃｇＧＧＡＴＣＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧＧＣ−３’）（配列番号：９８、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）【００６２】
ＭＫ分泌発現細胞株を、Ｐａｎｔｒｏｐｉｃ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：Ｋ１０６３−１）を用いて作製した。Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｃｏａｔｅｄ  １００ｍｍ  ｄｉｓｈに８０〜９０％コンフルエント状態のＧＰ２−２９３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：Ｋ１０６３−１）を準備し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、上で構築した発現ベクター（ＭＫｖｅｒ１０−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧ、ＭＫｖｅｒ５０−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧ、ｍＭＫ−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧ）とｐＶＳＶ−Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：Ｋ１０６３−１）を１１．２ｕｇずつ共導入した。４８時間後、ウイルス粒子を含む上清を回収し、超遠心（１８，０００ｒｐｍ、１．５時間、４℃）によってウイルス粒子を沈殿させ、その沈殿物を３０ｕＬのＴＮＥ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ＝７．８］、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で懸濁し、レトロウイルスベクター濃縮液を調製した。レトロウイルスベクター濃縮液５ｕＬを、８ｕｇ／ｍＬのＨｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ：Ｈ−９２６８）を含んだ１５０ｕＬのＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ；Ｄ５７９６）−１０％ＦＢＳで希釈し、ウイルス粒子含有培地を調製した。９６穴のマイクロプレートに約４０％コンフルエントの状態になるように準備した２９３Ｔの培地を、調整したウイルス粒子入りの培地に交換することにより、目的遺伝子を導入した。導入後、５ｕｇ／ｍＬのＰｕｒｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ：Ｐ−８８３３）を含むＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ：Ｄ５７９６）−１０％ＦＢＳで拡大培養し、抗原発現株（ＭＫｖｅｒ１０／ｓｔ２９３Ｔ、ＭＫｖｅｒ５０／ｓｔ２９３Ｔ、ｍＭＫ／ｓｔ２９３Ｔ）を樹立した。【００６３】
（実施例３）ＭＫ精製タンパク質の調製（動物細胞由来リコンビナントタンパク質）
以上のように樹立した発現細胞株（ＭＫｖｅｒ１０／ｓｔ２９３Ｔ、ＭＫｖｅｒ５０／ｓｔ２９３Ｔ、ｍＭＫ／ｓｔ２９３Ｔ）を、ＣＤ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）それぞれ１Ｌで培養した。培養上清を回収し、そこからＴＡＬＯＮ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：Ｋ１２５３−１）を用いてリコンビナントタンパク質（（ＭＫｖｅｒ１０、ＭＫｖｅｒ５０、ｍＭＫ）を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにて精製タンパク質を確認した。プロテインアッセイキットII（ＢｉｏＲａｄ：５００−０００２ＪＡ）を用いてタンパク質濃度を決定した。【００６４】
（実施例４）ＭＫを発現する大腸菌の作製
ヒトＭＫのａａ２３−ａａ１２１（ＭＫｖｅｒ６０）及びａａ５７−ａａ１２１（ＭＫｖｅｒ８０）部分の大腸菌リコンビナントタンパク質は、以下のように作製した。ｈＭＫ−ｐＴ７を鋳型として、下記のプライマーによりＰＣＲで増幅させたＭＫ部分長断片の末端を、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断し、ｐＥＴ２８ａのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入した大腸菌用発現ベクターを構築した。これを用いてＢＬ２１を形質転換し、ＭＫｖｅｒ６０／ＢＬ２１及びＭＫｖｅｒ８０／ＢＬ２１と名付けた。
ＭＫｖｅｒ６０
５’プライマー：５’−ｃｇＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧ−３’）（配列番号：９９、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）
３’プライマー：５’−ｃｃｇＣＴＣＧＡＧＧＴＣＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＣＴＴＧ−３’）（配列番号：１００、下線部はＸｈｏＩ認識配列）
ＭＫｖｅｒ８０
５’プライマー：５’−ｃｇＧＧＡＴＣＣＧＡＧＴＴＴＧＧＡＧＣＣＧＡＣＴＧＣＡＡＧ−３’）（配列番号：１０１、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）
３’プライマー：５’−ｃｃｇＣＴＣＧＡＧＧＴＣＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＣＴＴＧ−３’）（配列番号：１０２、下線部はＸｈｏＩ認識配列）【００６５】
（実施例５）ＭＫ精製タンパク質の調製（大腸菌由来リコンビナントタンパク質）
以上のように樹立した大腸菌株ＭＫｖｅｒ６０／ＢＬ２１及びＭＫｖｅｒ８０／ＢＬ２１を、それぞれ１Ｌのカナマイシン添加ＬＢ培地で培養し、１ｍＭのＩＰＴＧで発現誘導を行った。リコンビナントタンパク質は、ＰＢＳ可溶性画分からＴＡＬＯＮ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｋ１２５３−１）を用いて精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにて精製タンパク質を確認した。プロテインアッセイキットII（ＢｉｏＲａｄ：５００−０００２ＪＡ）を用いてタンパク質濃度を決定した。【００６６】
（実施例６）抗原免疫
ＭＫｖｅｒ１０、ＭＫｖｅｒ５０、ＭＫｖｅｒ６０又はＭＫｖｅｒ８０は同量のコンプリートアジュバント（ＳＩＧＭＡ：Ｆ５８８１）と混合してエマルジョンにし、４〜５週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（日本エスエルシー）に１匹当たり５〜２０ｕｇ、３〜７日おきに６回免疫した。最終免疫の３日後にマウスからリンパ球細胞を摘出し、マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）と融合させた。【００６７】
（実施例７）細胞融合
細胞融合は次に示す一般的な方法を基本として行った。全ての培地中のＦＢＳは、５６℃で３０分間保温する処理によって非働化したものを使用した。Ｐ３Ｕ１は、ＲＰＭＩ１６４０−１０％ＦＢＳ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ含有）で培養して準備した。摘出したマウスリンパ球細胞とＰ３Ｕ１を１０：１〜２：１の割合で混合し、遠心した。沈殿した細胞に５０％ポリエチレングリコール４０００（Ｍｅｒｃｋ：１．０９７２７．０１００）を徐々に加えながら穏やかに混合後、遠心した。沈殿した融合細胞を、１５％ＦＢＳを含むＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＨＡＴ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：１１０６７−０３０）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で適宜希釈し、９６穴のマイクロプレートに２００ｕＬ／ウェルで播種した。融合細胞をＣＯ２インキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）中で培養し、コロニーが形成されたところで培養上清をサンプリングし、下記のようにスクリーニングを行った。【００６８】
（実施例８）抗ＭＫモノクローナル抗体産生細胞の選択
抗ＭＫ抗体を産生するハイブリドーマは、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって選定した。アッセイには先述のリコンビナントヒトＭＫ（ＭＫｖｅｒ１０）を９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（ｎｕｎｃ）に０．５ｕｇ／ｍＬ、５０ｕＬ／ウェルで分注し、室温２時間又は４℃一晩静置して吸着させたものを用いた。溶液を除去後、１％  ＢＳＡ（ナカライ：０１８６３−３５）−５％  Ｓｕｃｒｏｓｅ（ＷＡＫＯ）−ＰＢＳを１５０ｕＬ／ウェル加え、室温で２時間静置し、残存する活性基をブロックした。静置後、溶液を除去し、一次抗体としてハイブリドーマ培養上清を５０ｕＬ／ウェル分注し、１時間静置した。該プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで洗浄後、二次抗体として１００００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＭＢＬ：３３０）を５０ｕＬ／ウェル加えて室温で１時間静置した。該プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで洗浄後、発色液（５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．８ｍＭ  ３．３’．５．５’テトラメチルベンチジン−２ＨＣｌ、１０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、０．６２５％ポリエチレングリコール４０００、５ｍＭクエン酸一水和物、５ｍＭ  Ｈ２Ｏ２）を５０ｕＬ／ウェル添加し室温２０分静置して発色させ、１Ｍリン酸を５０ｕＬ／ウェル添加して発色を停止させたのち、４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて測定した。【００６９】
ここで選択した細胞は、１５％ＦＢＳを含むＨＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＨＴ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：２１０６０−０１７）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で拡大培養した後、限界希釈法によって単クローン化した。【００７０】
このようにして、抗ＭＫ抗体を産生するハイブリドーマを計４８取得した（ＭＫｖｅｒ１０を免疫原として５クローン、ｖｅｒ５０を免疫原として４クローン、ｖｅｒ６０を免疫原として３１クローン、ｖｅｒ８０を免疫原として８クローン）。【００７１】
（実施例９）取得抗体のＭＫに対する反応性
各ハイブリドーマクローンの培養上清から、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた一般的なアフィニティー精製法により抗体を精製した。これら抗体のヒトＭＫに対する反応性は、前記したのと同様に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって確認した。一次抗体として、抗ＭＫ抗体を５ｕｇ／ｍＬを最大濃度としてＰＢＳで段階希釈したものを用いた。結果、すべての抗体が濃度依存的にリコンビナントヒトＭＫに反応することを確認した（図１〜４）。【００７２】
さらに、ペプチド合成によって作製されたＭＫ（ペプチド研究所：４２９８−ｖ）に反応することも、同様のＥＬＩＳＡによって確認した。これにより、得た抗体はリコンビナントタンパク質のタグ部分やリンカー部分ではなくＭＫを認識するものであることを確認した。さらに、ＭＫのＣ末側精製ペプチド（ａａ６０−ａａ１２１）（ペプチド研究所：４２９９−ｓ）への反応性もＥＬＩＳＡによって評価した。これらのアッセイには、ＭＫの全長又はＣ末側の精製ペプチド（ペプチド研究所：４２９８−ｖ又は４２９９−ｓ）をＥＬＩＳＡプレート（ｎｕｎｃ）に０．５ｕｇ／ｍＬ、５０ｕＬ／ウェルで分注し、４℃一晩静置して吸着させたものを用いた。一次抗体として抗ＭＫ抗体をＰＢＳで５ｕｇ／ｍＬに調製したものを用いた。その結果、取得抗体のうち２５抗体は全長とＣ末側に同程度の反応性を示したためＣ末側部位を認識する抗体であり、他の２３抗体はＭＫのＮ末側部位を認識する抗体であると判断した（図５）。なお、図の左から、Ｋ４０からＫ９８までの５クローン、ＦＢ５３からＦＢ７４までの４クローン、５Ｆ２０からＢＦ２−４６１までの３１クローン、ＦＢ２９からＦｂ６−１３までの８クローンが、ＭＫｖｅｒ１０、ｖｅｒ５０、ｖｅｒ６０、ｖｅｒ８０を免疫原として取得した抗体である。【００７３】
一方、ＭＫと同じファミリーに属する唯一の因子であるＰｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎに対する反応性を、同様のＥＬＩＳＡによって評価した。これには、Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎの全長精製ペプチド（ペプチド研究所：４３３５−ｖ）を用いた。取得抗体はすべて反応性を示さなかったため、ＭＫを特異的に認識すると判断した。【００７４】
（実施例１０）ＡＰ標識ＭＫを発現する発現ベクターの作製
取得した抗ＭＫ抗体がＭＫ中和活性を有するか否かを、ＭＫが細胞表面の受容体に結合するのを阻害させることで評価した（ＡＰ−ＭＫ結合阻害アッセイ）。ＭＫのａａ２３−１２１のＮ末端にアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）を融合させた組み換えタンパク質（ＡＰ−ＭＫ）は以下のように作製した。【００７５】
下記のプライマーによりＰＣＲで増幅させたＭＫ  ｃＤＮＡの末端を、ＸｈｏＩとＸｂａＩで切断し、ｐＡＰｔａｇ−５  ｖｅｃｔｏｒ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ、ＱＶ５）のＸｈｏＩ−ＸｂａＩサイトに挿入した発現ベクターを構築した。これをＭＫ−ＡＰｔａｇ５と名付けた。
ｆｏｒｗａｒｄプライマー：５'−ＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＧＴＧ−３'  （配列番号：１０３、下線部はＸｈｏＩ認識配列）
ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：５'−ＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＣＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＣＣ−３'  （配列番号：１０４、下線部はＸｂａＩ認識配列）【００７６】
（実施例１１）ＡＰ標識ＭＫとＡＰの作製
Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉでコートした１００ｍｍ  ｄｉｓｈに、２９３Ｔを２．０ｘ１０６細胞播種した。２４時間後に、培地を１％  Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ−Ａ（ＧＩＢＣＯ：５１３００−０４４）を１％の濃度に添加した  ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（ＧＩＢＣＯ：３１９８５）１０ｍｌに交換した。エッペンチューブにＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ  ６００ｕＬとＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ：１８１５０９１）１５ｕＬを入れて混和し、室温で５分静置したのち、発現ベクター（ＭＫ−ＡＰｔａｇ５又はｐＡＰｔａｇ−５）を７．５ｕｇ加えて混和し、さらに１５分静置した。これを２９３Ｔ細胞の培地に加え、３７℃で５日間培養した。培地をタンパク低結合性のプロテオセーブＳＳ（住友ベークライト：ＭＳ−５２１５０）に回収し、１５００ｒｐｍで５分遠心したのち、上清を０．２２ｕｍのフィルターに通した。回収した溶液中のＡＰ−ＭＫ又はＡＰの活性は、以下のように測定した。【００７７】
培養上清２ｕＬにＭｉｌｌｉＱ水４８ｕＬとＡＰ  ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ａ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ：Ｑ５０１）を５０ｕＬ加え、３７℃で１０分静置して発色させた。０．５Ｎ  ＮａＯＨを１００ｕＬ加えて発色を停止し、ＭｉｌｌｉＱ水を８００ｕＬ加えたのち、４０５ｎｍの吸光度をＳｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ  １６０  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。測定した吸光度からＡＰ活性を算出した。これには次の公式を使用した。
ＡＰ活性［Ｕ／ｍｌ］＝（ＯＤ４０５ｘ５４）／（反応時間［分］ｘ液量［ｕｌ］）。【００７８】
（実施例１２）ＡＰ−ＭＫ結合阻害アッセイ
Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉでコートした６ｗｅｌｌプレートに、ＴＮＢ１細胞を１．０ｘ１０５細胞播種した。２４時間後に培地を除去し、ＨＢＨＡ（０．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ−２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）−ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ：１４１７５））で１回洗浄し、ＯＰＴＩ−ＭＥＭで０．６Ｕ／ｍｌとなるように希釈したＡＰ−ＭＫ又はＡＰを１ウェルあたり１ｍＬ添加し、室温で９０分静置した。このとき、ＡＰ−ＭＫ結合阻害活性を評価する抗ＭＫ抗体又はコントロール抗体を９０ｕｇ／ｍＬになるように添加した。【００７９】
ＨＢＨＡで５回洗浄した後、Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ：Ｑ５０４）を１ウェルあたり２００ｕＬ添加して細胞を溶解し、細胞抽出液として回収した。これを遠心（４℃、１５０００ｒｐｍ、２分）して分離した上清を６５℃で１０分間処理した後、５０ｕＬを分取し、ＡＰ  ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ａ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ：Ｑ５０１）を５０ｕＬ加え、３７℃で３０分静置して発色させた。０．５Ｎ  ＮａＯＨを１００ｕＬ加えて発色を停止し、ＭｉｌｌｉＱ水を８００ｕＬ加えたのち、４０５ｎｍの吸光度をＳｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ  １６０  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。測定した吸光度から、上記した計算式を用いてＡＰ活性を算出した。さらに、ＡＰ−ＭＫのみを添加したウェルでのＡＰ活性を１００％として、各ウェルにおけるＡＰ活性を相対値で表示した。【００８０】
結果の一部を図６に示す。各アッセイは３ウェルずつ行い、その平均値とエラーバーを示している。ＡＰ−ＭＫのみを添加したウェルと比較して、ＦＢ５３、ＦＢ５４、ＦＢ７２を添加したウェルでは、ＡＰ活性が７５．５％、２９．５％、６１．４％にそれぞれ低下していた。ＦＢ５３、ＦＢ５４、ＦＢ７２以外の抗ＭＫ抗体及びコントロール抗体を添加したウェルでは、ＡＰ活性の低下がみられなかった。したがって、取得した抗ＭＫ抗体のうち、ＦＢ５３、ＦＢ５４、ＦＢ７２の３抗体が、ＡＰ−ＭＫが受容体に結合するのを阻害する活性を有することがわかった。また、図６に示すように、これら３抗体のうち、ＦＢ５４が最も強くＡＰ−ＭＫが受容体に結合するのを阻害する活性を有することが明らかになった。【００８１】
（実施例１３）変異体ＭＫを分泌発現する細胞の作製
変異体ＭＫ（ＭＫ−Ｗ６９Ａ、−Ｋ７９Ｑ、−Ｒ８１Ｑ、−Ｋ１０２Ｑ）を発現する動物細胞は、以下のように作製した。【００８２】
ＭＫｖｅｒ１０−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧを鋳型として、下記のプライマーペアによりそれぞれ５’断片と３’断片をＰＣＲで増幅させた。各増幅産物を等量程度混合し、５’断片と３’断片の融合用プライマーペアを用いたＰＣＲによって融合した。増幅断片の末端をＮｏｔＩとＢａｍＨＩで切断し、動物細胞用発現ベクターのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入した。動物細胞用の発現ベクターには、上記したｐＱＣｘｍｈＩＰＧを用いた。作製したベクターは、ＭＫ−Ｗ６９Ａ−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧ、ＭＫ−Ｋ７９Ｑ−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧ、ＭＫ−Ｒ８１Ｑ−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧ、ＭＫ−Ｋ１０２Ｑ−ｐＱＣｘｍｈＩＰＧと名付けた。【００８３】
Ｗ６９Ａ
５’断片用：
５’−ＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧ−３’（配列番号：１０５）
及び５’−ＣＡＣＧＣＡＣＣＣＧＣＧＴＴＣＴＣＡＡＡＣ−３’（配列番号：１０６）
３’断片用：
５’−ＧＴＴＴＧＡＧＡＡＣＧＣＧＧＧＴＧＣＧＴＧ−３’（配列番号：１０７）
及び５’−ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧ−３’（配列番号：１０８）
Ｋ７９Ｑ
５’断片用：
５’−ＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧ−３’（配列番号：１０５）
及び５’−ＣＴＴＧＧＣＧＧＡＣＴＴＧＧＧＴＧＣＣＴＧ−３’（配列番号：１０９）
３’断片用：
５’−ＣＡＧＧＣＡＣＣＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧ−３’（配列番号：１１０）
及び５’−ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧ−３’（配列番号：１０８）
Ｒ８１Ｑ
５’断片用：
５’−ＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧ−３’（配列番号：１０５）
及び５’−ＧＧＴＧＣＣＴＴＧＣＴＧＧＡＣＴＴＴＧＧＴＧ−３’（配列番号：１１１）
３’断片用：
５’−ＣＡＣＣＡＡＡＧＴＣＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＣＣ−３’（配列番号：１１２）
及び５’−ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧ−３’（配列番号：１０８）
Ｋ１０２Ｑ
５’断片用：
５’−ＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧ−３’（配列番号：１０５）
及び５’−ＣＡＧＧＧＣＴＧＧＧＴＧＡＣＧＣＧＧＡＴＧ−３’（配列番号：１１３）
３’断片用：
５’−ＣＡＴＣＣＧＣＧＴＣＡＣＣＣＡＧＣＣＣＴＧ−３’（配列番号：１１４）
及び５’−ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧ−３’（配列番号：１０８）
５’断片と３’断片の融合
５’−ＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧ−３’（配列番号：１０５）及び５’−ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧ−３’（配列番号：１０８）
下線を付した塩基によって、アミノ酸を置換した。また５’−ＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧ−３’（配列番号：１０５）及び５’−ＧＡＧＧＧＧＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧ−３’（配列番号：１０８）は、発現ベクターのＭＫコード領域外に相当する配列である。【００８４】
このように作製した発現ベクターを用いて、上記方法と同様の方法で、各変異体ＭＫを分泌発現する細胞株を樹立した（ＭＫ−Ｗ６９Ａ／ｓｔ２９３Ｔ、ＭＫ−Ｋ７９Ｑ／ｓｔ２９３Ｔ、ＭＫ−Ｒ８１Ｑ／ｓｔ２９３Ｔ、ＭＫ−Ｋ１０２Ｑ／ｓｔ２９３Ｔ）。【００８５】
（実施例１４）変異体ＭＫ精製タンパク質の調製
樹立した発現細胞株を、ＣＤ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）それぞれ５００ｍＬで培養した。培養上清を回収し、上記したのと同様の方法で変異体ＭＫリコンビナントタンパク質（ＭＫ−Ｗ６９Ａ、ＭＫ−Ｋ７９Ｑ、ＭＫ−Ｒ８１Ｑ及びＭＫ−Ｋ１０２Ｑ）を精製した。【００８６】
（実施例１５）取得抗体の変異体ＭＫに対する反応性
以上のように得た抗体の変異体ＭＫに対する反応性は、前記と同様の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって確認した。アッセイには野生型ヒトＭＫ（ＭＫｖｅｒ１０）又は上で記載した変異体ＭＫ（ＭＫ−Ｗ６９Ａ、ＭＫ−Ｋ７９Ｑ、ＭＫ−Ｒ８１Ｑ及びＭＫ−Ｋ１０２Ｑ）を吸着させたプレートを用いた。一次抗体として抗ＭＫ抗体を５ｕｇ／ｍＬを最大濃度としてＰＢＳで段階希釈したものを用いた。また、ミッドカインのＮ末側、Ｃ末側を認識する抗体で中和活性を示さなかった抗体の例として、それぞれ、ＢＦ１０６とＦＢ７４とについても同様に評価した。【００８７】
結果の一部を図７に示す。中和活性を示したＦＢ５３、ＦＢ５４、ＦＢ７２の３抗体は、変異体ＭＫに対する反応性が野生型のＭＫに対する反応性より低下した。中和活性を示さなかった他の抗ＭＫ抗体では、変異体ＭＫに対して、野生型のＭＫと同様に反応した。【００８８】
（実施例１６）ＦＢ５４抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の単離、並びにＣＤＲの同定
ハイブリドーマを培養し、一般的な方法によりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。次に、ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた５’−ＲＡＣＥ法により、ｃＤＮＡを取得した。このｃＤＮＡを鋳型とし、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ５’Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３’（配列番号：１１５））とＣＨ１（ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１  ｃｏｎｓｔａｎｔ領域１）３’Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＡＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧ−３’（配列番号：１１６））を用いてＰｌｕｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＰＣＲ（サイクル［９４℃  ３０秒、５７℃  ３０秒、７２℃  ５０秒］を３５サイクル）を実施し、抗体重鎖可変領域の遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅した。一方、抗体軽鎖についても同様にＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ５’ＰｒｉｍｅｒとＣｋ（κｃｏｎｓｔａｎｔ領域）３’Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴ−３’（配列番号：１１７））を用いてＰＣＲを実施して、遺伝子（ｃＤＮＡ）を増幅した。増幅した重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の遺伝子断片をそれぞれｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、オートシークエンサー（アプライドバイオシステム）を用いて配列を解析した。その結果得られた塩基配列がコードするアミノ酸、及び各ＣＤＲの配列を決定した。得られた結果は以下の通りである。【００８９】
＜ＦＢ５４重鎖可変領域＞
ＥＶＭＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＦＣＡＲＨＮＹＲＹＤＥＹＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号：８）
ＦＢ５４重鎖可変領域のＣＤＲ１
ＳＹＡＭＳ（配列番号：４）
ＦＢ５４重鎖可変領域のＣＤＲ２
ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号：５）
ＦＢ５４重鎖可変領域のＣＤＲ３
ＨＮＹＲＹＤＥＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号：６）
＜ＦＢ５４軽鎖可変領域＞
ＥＴＴＶＴＱＳＰＴＳＬＳＭＡＩＧＥＫＶＴＩＲＣＩＴＳＴＤＩＤＤＥＭＮＷＹＱＱＫＰＧＥＰＰＫＬＬＩＳＥＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＹＧＴＤＦＶＦＴＩＥＮＭＬＳＥＤＶＡＤＹＹＣＬＱＳＤＮＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：７）
ＦＢ５４軽鎖可変領域のＣＤＲ１
ＩＴＳＴＤＩＤＤＥＭＮ（配列番号：１）
ＦＢ５４軽鎖可変領域のＣＤＲ２
ＥＧＮＴＬＲＰ（配列番号：２）
ＦＢ５４軽鎖可変領域のＣＤＲ３
ＬＱＳＤＮＬＰＹＴ（配列番号：３）【００９０】
（実施例１７）ＦＢ５４キメラ化抗体の作製
決定した遺伝子配列をもとに以下に示すＰＣＲ増幅用プライマーを設計し、２ラウンドのＰＣＲによって抗体可変領域を増幅した。この際、分泌シグナル配列はロンザ社推奨の配列に変換し、また増幅断片の末端に制限酵素認識配列を付加した（重鎖可変領域はＨｉｎｄIII認識配列及びＢａｍＨＩ認識配列、軽鎖可変領域はＨｉｎｄIII及びＢｓｉＷＩ認識配列を付加）。
重鎖用１ｓｔ  ＰＣＲ
ＨＣ−ｓｉｇｎａｌ−１：５’−ＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＣＣＧＴＧＡＣＣＡＣＡＧＧＣＧＴＧＣＡＴＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧ−３’（配列番号：１１８）
ＨＣ−ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ａｔａｔａＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧ−３’（配列番号：１１９、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）
重鎖用２ｎｄ  ＰＣＲ
ＨＣ−ｓｉｇｎａｌ−２：５’−ａｔａｔａＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＣＣＧＴＧＡＣＣＡＣＡＧＧＣＧＴＧＣ−３’（配列番号：１２０、下線部はＨｉｎｄIII認識配列）
ＨＣ−ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ａｔａｔａＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧ−３’（配列番号：１１９、下線部はＢａｍＨＩ認識配列）
軽鎖用１ｓｔ  ＰＣＲ
ＬＣ−ｓｉｇｎａｌ−１：５’−ＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＧＣＣＣＧＣＴＧＴＧＡＡＡＣＡＡＣＴＧＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’（配列番号：１２１）
ＬＣ−ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ａｔａｔａＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣ−３’（配列番号：１２２、下線部はＢｓｉＷＩ認識配列）
軽鎖用２ｎｄ  ＰＣＲ
ＬＣ−ｓｉｇｎａｌ−２：５’−ａｔａｔａＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＡＣＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＧＣＣ−３’（配列番号：１２３、下線部はＨｉｎｄIII認識配列）
ＬＣ−ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ａｔａｔａＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣ−３’（配列番号：１２２、下線部はＢｓｉＷＩ認識配列）。【００９１】
得られたＰＣＲ産物を上記の制限酵素で切断し、常法により、ヒトＩｇＧ１の定常領域を組み込んだロンザ社のヒトＩｇＧ１抗体産生用ベクターに挿入した（ＦＢ５４−ｃｈＨとＦＢ５４−ｃｈＫ）。ロンザ社推奨プロトコルに基づいてキメラ抗体産生細胞株を樹立し、その培養上清からＰｒｏｔｅｉｎＡを用いてキメラ化ＦＢ５４抗体を精製した。以下ｃｈＦＢ５４と記載する。【００９２】
（実施例１８）ＦＢ５４キメラ化抗体の反応性評価
ｃｈＦＢ５４のヒトＭＫに対する反応性は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって確認した。アッセイは前述と同様に行った。一次抗体として、ｃｈＦＢ５４又はコントロールとしてマウスＦＢ５４抗体を、５ｕｇ／ｍＬを最大濃度としてＰＢＳで段階希釈したものを用いた。二次抗体として、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＭＢＬ：２０６）又はＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＭＢＬ：３３０）を用いた。その結果、ｃｈＦＢ５４はもとのマウス抗体ＦＢ５４と同等の結合活性を示した（図８）。【００９３】
（実施例１９）ＦＢ５４ヒト型化抗体の作製
ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ法に従い、ヒトフレームワーク（以下、ＦＲ１からＦＲ４領域、全体合わせてＦＲ領域）を選択し、マウスモノクローナル抗体ＦＢ５４のＣＤＲに置き換えた。具体的には重鎖ＦＲ領域、軽鎖ＦＲ領域に分けてホモロジー検索を行った結果、ＦＢ５４重鎖はヒト抗体のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ４７１４９３のＦＲ領域と高い相同性を持つことが分かった。ＦＲ領域の相同性は７３／８７＝８３．９％であった。このＡＦ４７１４９３のＦＲ領域に適切にＦＢ５４重鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３が移植されるように、ヒト型化抗体重鎖可変領域を設計した。以下、このヒト型化抗体重鎖をＦＢ５４−ｒＨａと表記する。同様に、ＦＢ５４抗体軽鎖はヒト抗体のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ７０４６３のＦＲ領域と高い相同性を持つことが分かった。ＦＲ領域の相同性は５５／８０＝６８．８％であった。このＸ７０４６３のＦＲ領域に適切にＦＢ５４軽鎖のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３が移植されるように、ヒト型化抗体軽鎖可変領域を設計した。以下、このヒト型化抗体軽鎖をＦＢ５４−ｒＫａとも表記する。【００９４】
軽鎖については、さらに、ＦＲ領域のＶＣＩ部位をマウス生殖系列で使用されているアミノ酸に変換したもの、加えてＣＤＲから５Å以内の距離にあるアミノ酸もマウス生殖系列で使用されているアミノ酸に変換したものをそれぞれ設計した。以下、これらをＦＢ５４−ｒＫｂ、ＦＢ５４−ｒＫｃとも表記する。【００９５】
＜ＡＦ４７１４９３＞
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＹＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＬＨＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＹＩＴＧＳＳＮＴＩＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＴＤＤＤＴＡＶＹＦＣＡＲＧＰＩＳＡＡＮＴＦＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１２４）
ＡＦ４７１４９３のＦＲ１
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＹＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号：１２５）
ＡＦ４７１４９３のＦＲ２
ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡ（配列番号：１２６）
ＡＦ４７１４９３のＦＲ３
ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＴＤＤＤＴＡＶＹＦＣＡＲ（配列番号：１２７）
ＡＦ４７１４９３のＦＲ４
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１２８）
＜ＦＢ５４−ｒＨａ（ヒト型化抗体重鎖可変領域  ａ  ｖｅｒｓｉｏｎ）＞
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＹＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＴＤＤＤＴＡＶＹＦＣＡＲＨＮＹＲＹＤＥＹＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１２）
＜Ｘ７０４６３＞
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＧＳＦＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＧＰＫＬＬＩＳＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＦＳＴＬＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：１２９）
Ｘ７０４６３のＦＲ１
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号：１３０）
Ｘ７０４６３のＦＲ２
ＷＹＱＱＫＰＧＫＧＰＫＬＬＩＳ（配列番号：１３１）
Ｘ７０４６３のＦＲ３
ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号：１３２）
Ｘ７０４６３のＦＲ４
ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：１３３）
＜ＦＢ５４−ｒＫａ（ヒト型化抗体軽鎖可変領域  ａ  ｖｅｒｓｉｏｎ）＞
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＩＴＳＴＤＩＤＤＥＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＧＰＫＬＬＩＳＥＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＳＤＮＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：９）
＜ＦＢ５４−ｒＫｂ（ヒト型化抗体軽鎖可変領域  ｂ  ｖｅｒｓｉｏｎ）＞
ＤＴＱＶＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＩＴＳＴＤＩＤＤＥＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＧＰＫＬＬＩＳＥＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＳＤＮＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：１０）
＜ＦＢ５４−ｒＫｃ（ヒト型化抗体軽鎖可変領域  ｃ  ｖｅｒｓｉｏｎ）＞
ＥＴＴＶＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＲＣＩＴＳＴＤＩＤＤＥＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＧＰＫＬＬＩＳＥＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＳＤＮＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：１１）【００９６】
ヒト型化抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子は、オリゴＤＮＡ合成によって作製した。この際、分泌シグナル配列はロンザ社推奨の配列になるようにし、また末端に制限酵素認識配列を付加した（重鎖はＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩの認識配列、軽鎖はＨｉｎｄIII及びＢｓｉＷＩの認識配列を付加）。制限酵素で切断したのち、ヒトＩｇＧ１定常領域がクローニングされたｐＥＥ６．４ベクター（Ｌｏｎｚａ）又はヒトκ鎖定常領域がクローニングされたｐＥＥ１４．４ベクター（Ｌｏｎｚａ）へそれぞれ導入した。【００９７】
構築した重鎖及び軽鎖の発現ベクターを、ＦＢ５４−ｒＨａとＦＢ５４−ｒＫａ、ＦＢ５４−ｒＨａとＦＢ５４−ｒＫｂ、及びＦＢ５４−ｒＨａとＦＢ５４−ｒＫｃの組み合わせで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した常法により２９３Ｔ細胞に共導入した。コントロールとして、上で作製したキメラ抗体の発現ベクター（ＦＢ５４−ｃｈＨとＦＢ５４−ｃｈＫ）も導入した。【００９８】
遺伝子導入の４８時間後に培養上清を回収し、ＩｇＧ濃度を、Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，  Ｆｃγ  ｆｒａｇｍｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｓｔｒａｔｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＧｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｓｉｇｍａ）を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡによって市販の精製ヒトＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ）の検量線から算出した。【００９９】
これらの培養上清を用いて、ヒトＭＫに対する反応性を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって確認した。アッセイは前述と同様に行った。上記の培養上清をヒトＩｇＧ濃度が１０ｕｇ／ｍＬになるように調整し、これを一次抗体として用いた。二次抗体にはＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＭＢＬ：２０６）を用いた。その結果、キメラ抗体（ＦＢ５４−ｃｈＨ／ＦＢ５４−ｃｈＫ）とヒト型化抗体（ＦＢ５４−ｒＨａ／ＦＢ５４−ｒＫｃ）で同等の活性を確認でき、ヒト型化ＦＢ５４抗体の設計が成功した（図９）。以下、ヒト型化抗体（ＦＢ５４−ｒＨａ／ＦＢ５４−ｒＫｃ）については、ｈＦＢ５４とも記載する。【０１００】
（実施例２０）ＦＢ５４ヒト型化抗体の反応性評価
次に、ＦＢ５４−ｒＨａ、ＦＢ５４−ｒＫｃそれぞれの発現ベクターをロンザ社のプロトコルに基づいて結合させ、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞に導入した。ｈＦＢ５４を高産生するＣＨＯＫ１ＳＶ単クローン細胞株を樹立し、その培養上清からＰｒｏｔｅｉｎＡを用いて抗体を精製した。【０１０１】
そして、得られたヒト型化抗体のヒトＭＫに対する反応性は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって確認した。アッセイは前述と同様に行った。一次抗体として、ｈＦＢ５４又はコントロールとしてｃｈＦＢ５４抗体を、５ｕｇ／ｍＬを最大濃度としてＰＢＳで段階希釈したものを用いた。二次抗体として、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＭＢＬ：２０６）を用いた。その結果、ｈＦＢ５４はｃｈＦＢ５４と同等の結合活性を示した（図１０）。【０１０２】
（実施例２１）マウスゼノグラフトを用いた抗腫瘍活性評価
ｈＦＢ５４の抗腫瘍活性を判定するため、マウスゼノグラフトを用いて評価を行った。ヒト神経芽腫細胞株ＴＮＢ１（理研ＢＲＣ：ＲＣＢ０４８１）を、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｔｙｐｅ  Ｉ（ＧＩＢＣＯ：１７１００−０１７）を２ｍｇ／ｍＬとなるようにＣｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒｅｅ  ＰＢＳ−ｂａｓｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：１３１５１−０１４）に添加した溶液で、剥離した。洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）で５ｘ１０７  ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように縣濁した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ：３５４２３０）を等量加えて縣濁したのち、６週齢メスのヌードマウス（日本エスエルシー：ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕ）の右腹側部に２００ｕＬずつ皮下移植した。同日から、１ｍｇ／ｍＬとなるように０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで希釈した抗体溶液又は０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳを３００ｕＬずつ腹腔投与した（１群８匹）。投与は移植当日と８日目から１週間に２回、計７回行い、腫瘍が観察された時点からノギスで腫瘍径を測定した。腫瘍体積は以下の式により算出した。【０１０３】
腫瘍体積（ｍｍ３）＝長径×短径２×０．５
得られた結果を図１１に示す。ｈＦＢ５４投与群の腫瘍体積は、コントロール群と比較して、移植後２９日で５４％、３３日で５１％、３６日で５０％、４１日で５４％であった。このように、抗ＭＫ抗体ｈＦＢ５４は、腫瘍増大を有意に阻害した（Ｐ＜０．０５）。なお、生存率に関しては、コントロール群では、約９０日後に全個体が死亡したのに対し、ｈＦＢ５４投与群では、１００日後でも３０％もの個体が生存しており、当該抗体の延命効果も確認された。したがって、抗ＭＫ抗体ｈＦＢ５４は、初期癌モデルにおいて抗腫瘍効果を有することが明らかになった。【０１０４】
（実施例２２）ＦＢ５４のｉｎ  ｖｉｔｒｏアフィニティーマチュレーション（親和性向上）
（１）  ＩｇＧ抗体のＦａｂ抗体への変換
ｈＦＢ５４及びｍＦＢ５４のＩｇＧ抗体発現ベクターを鋳型として、それぞれ重鎖と軽鎖の可変領域を、ＰＣＲによって増幅した。増幅産物をＦａｂ型抗体発現用ファージミドベクターにクローニングした。Ｆａｂ抗体のＭＫへの反応性は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって確認した。【０１０５】
（２）  抗体可変領域にランダムな変異を導入したＦａｂ抗体群（変異導入ライブラリー）の作製
Ｅｒｒｏｒ−Ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲによって重鎖と軽鎖の可変領域に変異を導入し、上記と同様にＦａｂ型抗体発現用ファージミドベクターにクローニングした。これにより、抗体可変領域のみに様々な変異が導入された変異導入Ｆａｂ抗体ファージ・ライブラリーを作製した。【０１０６】
（３）  親和性が向上したクローンの濃縮（パニング）
（ｉ）抗原（ｈＦＢ５４にはＭＫｖｅｒ１０、ｍＦＢ５４にはｍＭＫ）をイムノチューブ（ｎｕｎｃ）に固相化した。
（ii）変異導入Ｆａｂ抗体ファージライブラリーを添加し、抗原に結合させた。
（iii）洗浄操作を行った後、抗原に結合している抗体ファージを回収し、大腸菌に感染させた（５０ｍｌ培養液、３７℃  １ｈｒ振とう培養）。
（iv）ファージミドを保持した大腸菌を薬剤選択した（アンピシリン１００ｕｇ／ｍｌを添加した培養液６００ｍｌに（iii）の溶液を加え、３０℃  １６ｈｒ振とう培養）。
（ｖ）ヘルパーファージを感染させ、抗体ファージを産生させた。
（vi）抗体ファージを分離・濃縮した。
（vii）分離・濃縮された抗体ファージライブラリーを用いて、計３回（ｉ）〜（vi）の工程を繰り返した。ｈＦＢ５４パニング及びｍＦＢ５４パニングの条件は表１及び２に各々示す。【０１０７】
【表１】
2014021339.tif 000002
【０１０８】
【表２】
2014021339.tif 000003
【０１０９】
（４）  親和性向上クローンの親和性評価（大腸菌培養上清を用いたＥＬＩＳＡ）
パニングを３回繰り返した後のライブラリー（ｈＦＢ５４：３．７５×１０７クローン、ｍＦＢ５４：１．７５×１０７クローン）から、Ｆａｂ抗体ファージ感染大腸菌をそれぞれ９４クローン単離した。それらの大腸菌クローンが培養液中に分泌したＦａｂ抗体のＭＫへの反応性を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって確認した。【０１１０】
アッセイにはリコンビナントヒトＭＫ（ＭＫｖｅｒ１０）又はマウスＭＫ（ｍＭＫ）を９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（ｎｕｎｃ）に５ｕｇ／ｍＬ、１００ｕＬ／ウェルで分注し、４℃一晩静置して吸着させたものを用いた。溶液を除去後、１％  ＢＳＡ−５％  ｓｕｃｒｏｓｅ−０．０５％  ＮａＮ３−ＰＢＳを２００ｕＬ／ウェル加え、４℃で一晩静置し、残存する活性基をブロックした。溶液を除去し、該プレートに一次抗体として大腸菌培養上清を１００ｕＬ／ウェル分注し、３７℃２時間静置した。該プレートをＰＢＳで洗浄後、二次抗体として２０００倍希釈したウサギ抗ｃｐ３抗体（ＭＢＬ）を１００ｕＬ／ウェル加えて３７℃１時間静置した。該プレートをＰＢＳで洗浄後、三次抗体として２５００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ抗体（ＭＢＬ：４５８）を１００ｕＬ／ウェル加えて３７℃１時間静置した。該プレートをＰＢＳで洗浄後、ＯＰＤ発色液を加えて発色させ、４９２ｎｍの吸光度をプレートリーダーを用いて測定した。【０１１１】
その結果、複数のクローンで、オリジナルのＦａｂ化抗体より強い反応性を確認した。ｈＦＢ５４由来のクローンについては吸光度が高いものから９クローン（ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０１４，０２０，０２４，０３４，０３９，０５４，０６２，０７２，０８６）、ｍＦＢ５４由来のクローンについては同様に４クローン（ｍＦＢ５４−ｍａｔｕ００２，０２４，０２５，０８９）を選択した（図１２〜１５）。【０１１２】
（５）  親和性向上クローンの親和性評価（精製Ｆａｂ抗体を用いたＥＬＩＳＡ）
前ステップで選択した計１３クローン（ｈＦＢ５４由来９クローン、ｍＦＢ５４由来４クローン）及びオリジナル（ｈＦＢ５４、ｍＦＢ５４）のＦａｂ抗体を精製した。次いで、これらＦａｂ抗体のＭＫに対する反応性を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。アッセイは上記と同様に行った。ただし、抗原の固相には、抗原を２ｕｇ／ｍＬに調整したものを用いた。Ｆａｂ抗体は５ｕｇ／ｍＬを最大濃度としてＰＢＳで段階希釈したものを用いた。【０１１３】
その結果、ｈＦＢ５４由来９クローンについては、７クローンについて、ＭＫｖｅｒ１０に対する反応性の向上を確認した（図１６）。ｍＦＢ５４由来４クローンについては、２クローンについて、ｍＭＫに対する反応性の向上を確認した（図１７）。【０１１４】
以上より、ヒト型化ＦＢ５４のＦａｂ化抗体をもとに、ヒトＭＫに対する反応性が向上したＦａｂ抗体を７クローン、マウスＦＢ５４のＦａｂ化抗体をもとに、マウスＭＫに対する反応性が向上したＦａｂ抗体を２クローン、得ることに成功した。【０１１５】
（６）  親和性向上クローンの配列解析
前項で選択した計９クローンの抗体重鎖及び軽鎖の可変領域の配列を、オートシークエンサーを用いて解析した。得られた結果を図１８及び以下にて示す。図１８において、オリジナル抗体と同じアミノ酸残基は「−」で、異なる残基は置換されたアミノ酸で表示した。囲みはＣＤＲ領域であることを表す。【０１１６】
また、図１８に示した結果から明らかなように、前記９クローンについてＣＤＲの配列を確認したところ、全てのクローンについて、軽鎖可変領域ＣＤＲ１の４位のアミノ酸がイソロイシンとなっていた。したがって、この部位のアミノ酸がイソロイシンに置換されていることが、前述の親和性向上等において重要であることが示唆された。【０１１７】
＜ｍａｔｕ００２重鎖可変領域＞
ＥＶＭＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＦＣＡＲＨＮＹＲＹＤＥＹＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号：２０）
ｍａｔｕ００２重鎖可変領域のＣＤＲ１
ＳＹＡＭＳ（配列番号：１６）
ｍａｔｕ００２重鎖可変領域のＣＤＲ２
ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号：１７）
ｍａｔｕ００２重鎖可変領域のＣＤＲ３
ＨＮＹＲＹＤＥＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号：１８）
＜ｍａｔｕ００２軽鎖可変領域＞
ＥＴＴＶＴＱＳＰＴＳＬＳＭＡＩＧＥＫＶＴＩＲＣＴＴＳＩＤＩＤＤＥＭＮＷＹＱＱＭＰＧＥＰＰＫＬＬＩＳＥＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＹＧＴＤＦＶＦＴＩＥＮＭＬＳＥＤＶＡＤＹＹＣＬＱＳＤＮＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：１９）
ｍａｔｕ００２軽鎖可変領域のＣＤＲ１
ＴＴＳＩＤＩＤＤＥＭＮ（配列番号：１３）
ｍａｔｕ００２軽鎖可変領域のＣＤＲ２
ＥＧＮＴＬＲＰ（配列番号：１４）
ｍａｔｕ００２軽鎖可変領域のＣＤＲ３
ＬＱＳＤＮＬＰＹＴ（配列番号：１５）
＜ｍａｔｕ０８９重鎖可変領域＞
ＥＶＭＬＶＥＳＧＧＧＬＶＥＰＧＧＳＬＫＬＳＣＴＶＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＦＣＡＲＨＮＹＲＹＤＥＹＹＹＡＭＤＹＷＧＨＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号：２８）
ｍａｔｕ０８９重鎖可変領域のＣＤＲ１
ＳＹＡＭＳ（配列番号：２４）
ｍａｔｕ０８９重鎖可変領域のＣＤＲ２
ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号：２５）
ｍａｔｕ０８９重鎖可変領域のＣＤＲ３
ＨＮＹＲＹＤＥＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号：２６）
＜ｍａｔｕ０８９軽鎖可変領域＞
ＥＴＴＶＴＱＳＰＴＳＬＳＭＡＩＧＥＫＶＴＩＲＣＩＴＳＩＤＩＤＤＥＭＮＷＹＱＱＫＰＧＥＰＰＫＬＬＩＳＥＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＹＧＴＤＦＶＦＴＩＥＮＶＬＳＥＤＶＡＤＹＹＣＬＱＳ  ＤＮＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：２７）
ｍａｔｕ０８９軽鎖可変領域のＣＤＲ１
ＩＴＳＩＤＩＤＤＥＭＮ（配列番号：２１）
ｍａｔｕ０８９軽鎖可変領域のＣＤＲ２
ＥＧＮＴＬＲＰ（配列番号：２２）
ｍａｔｕ０８９軽鎖可変領域のＣＤＲ３
ＬＱＳＤＮＬＰＹＴ（配列番号：２３）
＜ｍａｔｕ０１４重鎖可変領域＞
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＹＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＶＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＴＤＤＤＴＡＶＹＦＣＡＲＨＮＹＲＹＤＥＹＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：３６）
ｍａｔｕ０１４重鎖可変領域のＣＤＲ１
ＳＹＡＭＳ（配列番号：３２）
ｍａｔｕ０１４重鎖可変領域のＣＤＲ２
ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号：３３）
ｍａｔｕ０１４重鎖可変領域のＣＤＲ３
ＨＮＹＲＹＤＥＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号：３４）
＜ｍａｔｕ０１４軽鎖可変領域＞
ＥＴＴＶＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＲＣＩＴＮＩＤＩＤＤＥＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＧＰＫＬＬＩＳＥＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＳＤＮＬＰＹＴＦＧＲＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：３５）
ｍａｔｕ０１４軽鎖可変領域のＣＤＲ１
ＩＴＮＩＤＩＤＤＥＭＮ（配列番号：２９）
ｍａｔｕ０１４軽鎖可変領域のＣＤＲ２
ＥＧＮＴＬＲＰ（配列番号：３０）
ｍａｔｕ０１４軽鎖可変領域のＣＤＲ３
ＬＱＳＤＮＬＰＹＴ（配列番号：３１）
＜ｍａｔｕ０２０重鎖可変領域＞
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＹＱＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＮＬＴＤＤＤＴＡＶＹＦＣＡＲＨＮＹＲＹＤＥＹＹＨＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：４４）
ｍａｔｕ０２０重鎖可変領域のＣＤＲ１
ＳＹＡＭＳ（配列番号：４０）
ｍａｔｕ０２０重鎖可変領域のＣＤＲ２
ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号：４１）
ｍａｔｕ０２０重鎖可変領域のＣＤＲ３
ＨＮＹＲＹＤＥＹＹＨＡＭＤＹ（配列番号：４２）
＜ｍａｔｕ０２０軽鎖可変領域＞
ＥＴＴＶＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＲＣＩＴＳＩＤＩＤＤＥＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＧＰＫＬＬＩＳＥＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＳＤＮＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：４３）
ｍａｔｕ０２０軽鎖可変領域のＣＤＲ１
ＩＴＳＩＤＩＤＤＥＭＮ（配列番号：３７）
ｍａｔｕ０２０軽鎖可変領域のＣＤＲ２
ＥＧＮＴＬＲＰ（配列番号：３８）
ｍａｔｕ０２０軽鎖可変領域のＣＤＲ３
ＬＱＳＤＮＬＰＹＴ（配列番号：３９）
＜ｍａｔｕ０２４重鎖可変領域＞
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＹＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＴＤＤＤＴＡＶＹＦＣＡＲＨＮＹＲＹＧＥＹＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：５２）
ｍａｔｕ０２４重鎖可変領域のＣＤＲ１
ＳＹＡＭＳ（配列番号：４８）
ｍａｔｕ０２４重鎖可変領域のＣＤＲ２
ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号：４９）
ｍａｔｕ０２４重鎖可変領域のＣＤＲ３
ＨＮＹＲＹＧＥＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号：５０）
＜ｍａｔｕ０２４軽鎖可変領域＞
ＥＴＴＶＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＲＣＩＴＳＩＤＩＤＤＥＭＮＷＹＱＱＫＳＧＫＧＰＫＬＬＩＳＥＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＳＤＮＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：５１）
ｍａｔｕ０２４軽鎖可変領域のＣＤＲ１
ＩＴＳＩＤＩＤＤＥＭＮ（配列番号：４５）
ｍａｔｕ０２４軽鎖可変領域のＣＤＲ２
ＥＧＮＴＬＲＰ（配列番号：４６）
ｍａｔｕ０２４軽鎖可変領域のＣＤＲ３
ＬＱＳＤＮＬＰＹＴ（配列番号：４７）
＜ｍａｔｕ０３９重鎖可変領域＞
ＥＶＲＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＹＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＥＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＴＤＤＤＴＡＶＹＦＣＡＲＨＮＹＲＹＤＥＹＹＹＧＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：６０）
ｍａｔｕ０３９重鎖可変領域のＣＤＲ１
ＳＹＡＭＳ（配列番号：５６）
ｍａｔｕ０３９重鎖可変領域のＣＤＲ２
ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＥ（配列番号：５７）
ｍａｔｕ０３９重鎖可変領域のＣＤＲ３
ＨＮＹＲＹＤＥＹＹＹＧＭＤＹ（配列番号：５８）
＜ｍａｔｕ０３９軽鎖可変領域＞
ＥＴＴＶＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＲＣＫＴＳＩＤＩＤＤＥＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＧＰＫＬＬＩＳＥＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＳＤＮＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＧＩＫ（配列番号：５９）
ｍａｔｕ０３９軽鎖可変領域のＣＤＲ１
ＫＴＳＩＤＩＤＤＥＭＮ（配列番号：５３）
ｍａｔｕ０３９軽鎖可変領域のＣＤＲ２
ＥＧＮＴＬＲＰ（配列番号：５４）
ｍａｔｕ０３９軽鎖可変領域のＣＤＲ３
ＬＱＳＤＮＬＰＹＴ（配列番号：５５）
＜ｍａｔｕ０５４重鎖可変領域＞
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＹＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＴＤＤＤＴＡＶＹＦＣＡＲＨＮＹＲＹＤＥＹＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：６８）
ｍａｔｕ０５４重鎖可変領域のＣＤＲ１
ＳＹＡＭＳ（配列番号：６４）
ｍａｔｕ０５４重鎖可変領域のＣＤＲ２
ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号：６５）
ｍａｔｕ０５４重鎖可変領域のＣＤＲ３
ＨＮＹＲＹＤＥＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号：６６）
＜ｍａｔｕ０５４軽鎖可変領域＞
ＥＴＴＶＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＲＣＩＴＳＩＤＩＥＤＥＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＧＰＫＬＬＩＳＥＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＳＤＮＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：６７）
ｍａｔｕ０５４軽鎖可変領域のＣＤＲ１
ＩＴＳＩＤＩＥＤＥＭＮ（配列番号：６１）
ｍａｔｕ０５４軽鎖可変領域のＣＤＲ２
ＥＧＮＴＬＲＰ（配列番号：６２）
ｍａｔｕ０５４軽鎖可変領域のＣＤＲ３
ＬＱＳＤＮＬＰＹＴ（配列番号：６３）
＜ｍａｔｕ０６２重鎖可変領域＞
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＹＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＥＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＴＮＤＤＴＡＶＹＦＣＡＲＨＮＹＲＹＤＥＹＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：７６）
ｍａｔｕ０６２重鎖可変領域のＣＤＲ１
ＳＹＡＭＳ（配列番号：７２）
ｍａｔｕ０６２重鎖可変領域のＣＤＲ２
ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号：７３）
ｍａｔｕ０６２重鎖可変領域のＣＤＲ３
ＨＮＹＲＹＤＥＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号：７４）
＜ｍａｔｕ０６２軽鎖可変領域＞
ＥＴＴＶＴＱＳＰＳＳＬＳＡＦＶＧＧＲＶＡＩＲＣＩＴＮＩＤＩＤＤＥＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＧＰＫＬＬＩＳＥＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＭＱＳＤＮＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：７５）
ｍａｔｕ０６２軽鎖可変領域のＣＤＲ１
ＩＴＮＩＤＩＤＤＥＭＮ（配列番号：６９）
ｍａｔｕ０６２軽鎖可変領域のＣＤＲ２
ＥＧＮＴＬＲＰ（配列番号：７０）
ｍａｔｕ０６２軽鎖可変領域のＣＤＲ３
ＭＱＳＤＮＬＰＹＴ（配列番号：７１）
＜ｍａｔｕ０７２重鎖可変領域＞
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＹＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＮＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＴＤＤＤＴＡＶＹＦＣＡＲＨＮＹＲＹＤＥＹＹＨＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：８４）
ｍａｔｕ０７２重鎖可変領域のＣＤＲ１
ＳＹＡＭＳ（配列番号：８０）
ｍａｔｕ０７２重鎖可変領域のＣＤＲ２
ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＮＶＫＧ（配列番号：８１）
ｍａｔｕ０７２重鎖可変領域のＣＤＲ３
ＨＮＹＲＹＤＥＹＹＨＡＭＤＹ（配列番号：８２）
＜ｍａｔｕ０７２軽鎖可変領域＞
ＥＴＴＶＴＱＳＰＳＳＬＦＡＳＶＧＤＫＶＴＩＲＣＩＴＳＩＤＩＤＤＥＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＧＰＫＬＬＩＳＥＧＮＴＬＲＰＧＶＰＳＲＦＳＳＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＳＤＮＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：８３）
ｍａｔｕ０７２軽鎖可変領域のＣＤＲ１
ＩＴＳＩＤＩＤＤＥＭＮ（配列番号：７７）
ｍａｔｕ０７２軽鎖可変領域のＣＤＲ２
ＥＧＮＴＬＲＰ（配列番号：７８）
ｍａｔｕ０７２軽鎖可変領域のＣＤＲ３
ＬＱＳＤＮＬＰＹＴ（配列番号：７９）。【０１１８】
（７）  Ｆａｂ抗体のＩｇＧ抗体化
前項の計９クローンの親和性向上抗体（Ｆａｂ）を、下記のようにしてヒトＩｇＧ１あるいはマウスＩｇＧ１に変換した。【０１１９】
Ｆａｂ抗体発現ベクターを鋳型として、下記のプライマーを用いたＰＣＲによって抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を増幅した。重鎖、軽鎖とも、シグナルペプチド部分と可変領域部分を別々に増幅したあと、増幅産物を混合し、ＰＣＲによって連結させた。【０１２０】
前述のキメラ抗体・ヒト型化抗体の作製と同様に、制限酵素で切断した後、ヒトＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ１定常領域がクローニングされたｐＥＥ６．４ベクター（Ｌｏｎｚａ）、ヒトκ鎖又はマウスκ鎖の定常領域がクローニングされたｐＥＥ１４．４ベクター（Ｌｏｎｚａ）へそれぞれ導入した。【０１２１】
重鎖、軽鎖それぞれの発現ベクターはロンザ社のプロトコルに基づいて結合させ、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞に導入した。目的の抗体を高産生するＣＨＯＫ１ＳＶ単クローン細胞株を樹立し、その培養上清からＰｒｏｔｅｉｎＡを用いて抗体を精製した。【０１２２】
ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０１４，０２０，０２４，０５４，０６２，０７２重鎖シグナルペプチド部分
ＶＨ＿ｓｉｇｎａｌ＿Ｆ＿ＨｉｎｄIII：５’−ａｔａｔａＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧ−３’（配列番号：１３４、下線部はＨｉｎｄIII認識配列）
ｈＦＢ５４ＶＨ＿ｓｉｇｎａｌ＿Ｒ：５’−ＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＴＣＡＧＡＡＴＧＣＡＣＧＣＣＴＧＴＧＧＴＣ−３’（配列番号：１３５）
ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０３９重鎖シグナルペプチド部分
ＶＨ＿ｓｉｇｎａｌ＿Ｆ＿ＨｉｎｄIII：５’−ａｔａｔａＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧ−３’（配列番号：１３４、下線部はＨｉｎｄIII認識配列）
ｈＦＢ５４ＶＨ０３９＿ｓｉｇｎａｌ＿Ｒ：５’−ＣＣＡＧＣｃＧＣＡＣＣＴＣＡＧＡＡＴＧＣＡＣＧＣＣＴＧＴＧＧＴＣ−３’（配列番号：１３６）
ｍＦＢ５４−ｍａｔｕ００２，０８９重鎖シグナルペプチド部分
ＶＨ＿ｓｉｇｎａｌ＿Ｆ＿ＨｉｎｄIII：５’−ａｔａｔａＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧ−３’（配列番号：１３４、下線部はＨｉｎｄIII認識配列）
ｍＦＢ５４ＶＨ＿ｓｉｇｎａｌ＿Ｒ：５’−ＣＣＡＧＣＡＴＣＡＣＴＴＣＡＧＡＡＴＧＣＡＣＧＣＣＴＧＴＧＧＴＣ−３’（配列番号：１３７）
ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０１４，０２０，０２４，０５４，０６２，０７２重鎖可変領域部分
ｈＦＢ５４ＶＨ＿Ｆ：５’−ＣＧＴＧＣＡＴＴＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＧ−３’（配列番号：１３８）
ｈＦＢ５４ＶＨ＿Ｒ＿ＸｈｏＩ：５’−ａｔａｔａＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧ−３’（配列番号：１３９、下線部はＸｈｏＩ認識配列）
ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０３９重鎖可変領域部分
ｈＦＢ５４ＶＨ０３９＿Ｆ：５’−ＣＧＴＧＣＡＴＴＣＴＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＧ−３’（配列番号：１４０）
ｈＦＢ５４ＶＨ＿Ｒ＿ＸｈｏＩ：５’−ａｔａｔａＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧ−３’（配列番号：１３９、下線部はＸｈｏＩ認識配列）
ｍＦＢ５４−ｍａｔｕ００２，０８９重鎖可変領域部分
ｍＦＢ５４ＶＨ＿Ｆ：５’−ＣＧＴＧＣＡＴＴＣＴＧＡＡＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧ−３’（配列番号：１４１）
ＨＣ−ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ａｔａｔａＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧ−３’（配列番号：１４２、下線部はＸｈｏＩ認識配列）
ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０１４，０２０，０２４，０３９，０５４，０６２，０７２重鎖シグナルペプチド部分と可変領域部分の連結
ＶＨ＿ｓｉｇｎａｌ＿Ｆ＿ＨｉｎｄIII：５’−ａｔａｔａＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧ−３’（配列番号：１３４、下線部はＨｉｎｄIII認識配列）
ｈＦＢ５４ＶＨ＿Ｒ＿ＸｈｏＩ：５’−ａｔａｔａＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧ−３’（配列番号：１３９、下線部はＸｈｏＩ認識配列）
ｍＦＢ５４−ｍａｔｕ００２，０８９重鎖シグナルペプチド部分と可変領域部分の連結
ＶＨ＿ｓｉｇｎａｌ＿Ｆ＿ＨｉｎｄIII：５’−ａｔａｔａＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧ−３’（配列番号：１３４、下線部はＨｉｎｄIII認識配列）
ＨＣ−ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ａｔａｔａＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧ−３’（配列番号：１４２、下線部はＸｈｏＩ認識配列）
ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０１４，０２０，０２４，０３９，０５４，０６２，０７２、ｍＦＢ５４−ｍａｔｕ００２，０８９軽鎖シグナルペプチド部分
ＶＫ＿ｓｉｇｎａｌ＿Ｆ＿ＨｉｎｄIII：５’−ａｔａｔａＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＡＣＣＣＡＧＧ−３’（配列番号：１３４、下線部はＨｉｎｄIII認識配列）
ｍｈＦＢ５４ＶＫ＿ｓｉｇｎａｌ＿Ｒ：５’−ＣＡＧＴＴＧＴＴＴＣＡＣＡＧＣＧＧＧＣＧＴＣＴＧＴＣＡＧＣＣ−３’（配列番号：１４３）
ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０１４，０２０，０２４，０５４，０６２，０７２、ｍＦＢ５４−ｍａｔｕ００２，０８９軽鎖可変領域部分
ｍｈＦＢ５４ＶＫ＿Ｆ：５’−ＡＣＧＣＣＣＧＣＴＧＴＧＡＡＡＣＡＡＣＴＧＴＧＡＣＣＣ−３’（配列番号：１４４）
ＬＣ−ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ａｔａｔａＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣ−３’（配列番号：１２２、下線部はＢｓｉＷＩ認識配列）
ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０３９軽鎖可変領域部分
ｍｈＦＢ５４ＶＫ＿Ｆ：５’−ＡＣＧＣＣＣＧＣＴＧＴＧＡＡＡＣＡＡＣＴＧＴＧＡＣＣＣ−３’（配列番号：１４３）
ｈＦＢ５４ＶＫ０３９＿Ｒ＿ＢｓｉＷＩ：５’−ａｔａｔａＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＣＣＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＴＣＣ−３’（配列番号：１４５、下線部はＢｓｉＷＩ認識配列）
ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０１４，０２０，０２４，０５４，０６２，０７２、ｍＦＢ５４−ｍａｔｕ００２，０８９軽鎖シグナルペプチド部分と可変領域部分の連結
ＶＫ＿ｓｉｇｎａｌ＿Ｆ＿ＨｉｎｄIII：５’−ａｔａｔａＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＡＣＣＣＡＧＧ−３’（配列番号：１３４、下線部はＨｉｎｄIII認識配列）
ＬＣ−ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ａｔａｔａＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣ−３’（配列番号：１２２、下線部はＢｓｉＷＩ認識配列）
ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０３９軽鎖シグナルペプチド部分と可変領域部分の連結
ＶＫ＿ｓｉｇｎａｌ＿Ｆ＿ＨｉｎｄIII：５’−ａｔａｔａＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＡＣＣＣＡＧＧ−３’（配列番号：１３４、下線部はＨｉｎｄIII認識配列）
ｈＦＢ５４ＶＫ０３９＿Ｒ＿ＢｓｉＷＩ：５’−ａｔａｔａＣＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＣＣＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＴＣＣ−３’（配列番号：１４５、下線部はＢｓｉＷＩ認識配列）【０１２３】
（実施例２３）ＦＢ５４親和性向上抗体の反応性評価
取得した親和性向上抗体のＭＫに対する反応性は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって確認した。アッセイは前述と同様に行った。一次抗体として、親和性向上抗体（ｈＦＢ５４−ｍａｔｕ０１４，０２０，０２４，０３９，０５４，０６２，０７２、ｍＦＢ５４−ｍａｔｕ００２，０８９）、コントロールとしてｈＦＢ５４又はマウスＦＢ５４抗体を５ｕｇ／ｍＬを最大濃度としてＰＢＳで段階希釈したものを用いた。二次抗体としては、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＭＢＬ：２０６）又はＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＭＢＬ：３３０）を用いた。【０１２４】
その結果、親和性向上抗体すべてにおいて、ヒトＭＫとマウスＭＫの双方に対して反応性が向上していることを確認した（図１９、２０）。【０１２５】
（実施例２４）ＡＰ−ＭＫ結合阻害アッセイ（ＦＢ５４親和性向上抗体）
取得したＦＢ５４由来親和性向上抗体のＭＫ中和活性を、前記アッセイと同様のＡＰ−ＭＫ結合阻害アッセイで評価した。ただし、各抗体は１０ｕｇ／ｍＬとなるように添加した。得られた結果を図２１に示す。【０１２６】
図２１に示す通り、ＡＰ−ＭＫのみを添加したウェルと比較して、ヒト型化ＦＢ５４（ｈＦＢ５４）を添加したウェルでは、ＡＰの活性が８１．８％に低下していた。ＦＢ５４の親和性向上抗体を添加したウェルでは、ｍＦＢ５４−００２、ｍＦＢ５４−０８９、ｈＦＢ５４−０１４、ｈＦＢ５４−０２０、ｈＦＢ５４−０２４、ｈＦＢ５４−０３９、ｈＦＢ５４−０５４、ｈＦＢ５４−０６２、ｈＦＢ５４−０７２で、それぞれＡＰの活性が１８．９％、２０．０％、２５．６％、２６．８％、２２．７％、３０．１％、３３．５％、２８．３％、３３．０％に低下していた。コントロール抗体を添加したウェルでは、ＡＰ活性の低下がみられなかった。このことより、親和性向上抗体がオリジナルの抗体よりさらに強力な中和活性を有することが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明の抗体は、ミッドカインに対する中和活性を有し、腫瘍の増殖抑制活性も認められることから、癌の治療に用いることができる。また、本発明の抗体は、そのミッドカインへの反応性の高さから、ミッドカインの検出や精製のための薬剤としての応用も可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２８】
配列番号：１
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ１（ＦＢ５４）
配列番号：２
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ２（ＦＢ５４）
配列番号：３
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ３（ＦＢ５４）
配列番号：４
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ１（ＦＢ５４）
配列番号：５
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ２（ＦＢ５４）
配列番号：６
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ３（ＦＢ５４）
配列番号：７
＜２２３＞  軽鎖可変領域（ＦＢ５４）
配列番号：８
＜２２３＞  重鎖可変領域（ＦＢ５４）
配列番号：９
＜２２３＞  人工的にヒト型化された軽鎖可変領域
＜２２３＞  軽鎖可変領域（ＦＢ５４−ｒＫａ）
配列番号：１０
＜２２３＞  人工的にヒト型化された軽鎖可変領域
＜２２３＞  軽鎖可変領域（ＦＢ５４−ｒＫｂ）
配列番号：１１
＜２２３＞  人工的にヒト型化された軽鎖可変領域
＜２２３＞  軽鎖可変領域（ＦＢ５４−ｒＫｃ）
配列番号：１２
＜２２３＞  人工的にヒト型化された重鎖可変領域
＜２２３＞  重鎖可変領域（ＦＢ５４−ｒＨａ）
配列番号：１３
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域  ＣＤＲ１
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ１（ｍａｔｕ００２）
配列番号：１４
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ２（ｍａｔｕ００２）
配列番号：１５
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ３（ｍａｔｕ００２）
配列番号：１６
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ１（ｍａｔｕ００２）
配列番号：１７
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ２（ｍａｔｕ００２）
配列番号：１８
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ３（ｍａｔｕ００２）
配列番号：１９
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域
＜２２３＞  軽鎖可変領域（ｍａｔｕ００２）
配列番号：２０
＜２２３＞  重鎖可変領域（ｍａｔｕ００２）
配列番号：２１
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域  ＣＤＲ１
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ１（ｍａｔｕ０８９）
配列番号：２２
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ２（ｍａｔｕ０８９）
配列番号：２３
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ３（ｍａｔｕ０８９）
配列番号：２４
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ１（ｍａｔｕ０８９）
配列番号：２５
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ２（ｍａｔｕ０８９）
配列番号：２６
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ３（ｍａｔｕ０８９）
配列番号：２７
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域
＜２２３＞  軽鎖可変領域（ｍａｔｕ０８９）
配列番号：２８
＜２２３＞  人工的に変異が導入された重鎖可変領域
＜２２３＞  重鎖可変領域（ｍａｔｕ０８９）
配列番号：２９
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域  ＣＤＲ１
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ１（ｍａｔｕ０１４）
配列番号：３０
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ２（ｍａｔｕ０１４）
配列番号：３１
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ３（ｍａｔｕ０１４）
配列番号：３２
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ１（ｍａｔｕ０１４）
配列番号：３３
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ２（ｍａｔｕ０１４）
配列番号：３４
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ３（ｍａｔｕ０１４）
配列番号：３５
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域
＜２２３＞  軽鎖可変領域（ｍａｔｕ０１４）
配列番号：３６
＜２２３＞  人工的に変異が導入された重鎖可変領域
＜２２３＞  重鎖可変領域（ｍａｔｕ０１４）
配列番号：３７
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域  ＣＤＲ１
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ１（ｍａｔｕ０２０）
配列番号：３８
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ２（ｍａｔｕ０２０）
配列番号：３９
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ３（ｍａｔｕ０２０）
配列番号：４０
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ１（ｍａｔｕ０２０）
配列番号：４１
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ２（ｍａｔｕ０２０）
配列番号：４２
＜２２３＞  人工的に変異が導入された重鎖可変領域  ＣＤＲ３
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ３（ｍａｔｕ０２０）
配列番号：４３
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域
＜２２３＞  軽鎖可変領域（ｍａｔｕ０２０）
配列番号：４４
＜２２３＞  人工的に変異が導入された重鎖可変領域
＜２２３＞  重鎖可変領域（ｍａｔｕ０２０）
配列番号：４５
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域  ＣＤＲ１
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ１（ｍａｔｕ０２４）
配列番号：４６
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ２（ｍａｔｕ０２４）
配列番号：４７
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ３（ｍａｔｕ０２４）
配列番号：４８
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ１（ｍａｔｕ０２４）
配列番号：４９
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ２（ｍａｔｕ０２４）
配列番号：５０
＜２２３＞  人工的に変異が導入された重鎖可変領域  ＣＤＲ３
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ３（ｍａｔｕ０２４）
配列番号：５１
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域
＜２２３＞  軽鎖可変領域（ｍａｔｕ０２４）
配列番号：５２
＜２２３＞  人工的に変異が導入された重鎖可変領域
＜２２３＞  重鎖可変領域（ｍａｔｕ０２４）
配列番号：５３
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域  ＣＤＲ１
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ１（ｍａｔｕ０３９）
配列番号：５４
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ２（ｍａｔｕ０３９）
配列番号：５５
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ３（ｍａｔｕ０３９）
配列番号：５６
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ１（ｍａｔｕ０３９）
配列番号：５７
＜２２３＞  人工的に変異が導入された重鎖可変領域  ＣＤＲ２
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ２（ｍａｔｕ０３９）
配列番号：５８
＜２２３＞  人工的に変異が導入された重鎖可変領域  ＣＤＲ３
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ３（ｍａｔｕ０３９）
配列番号：５９
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域
＜２２３＞  軽鎖可変領域（ｍａｔｕ０３９）
配列番号：６０
＜２２３＞  人工的に変異が導入された重鎖可変領域
＜２２３＞  重鎖可変領域（ｍａｔｕ０３９）
配列番号：６１
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域  ＣＤＲ１
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ１（ｍａｔｕ０５４）
配列番号：６２
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ２（ｍａｔｕ０５４）
配列番号：６３
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ３（ｍａｔｕ０５４）
配列番号：６４
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ１（ｍａｔｕ０５４）
配列番号：６５
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ２（ｍａｔｕ０５４）
配列番号：６６
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ３（ｍａｔｕ０５４）
配列番号：６７
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域
＜２２３＞  軽鎖可変領域（ｍａｔｕ０５４）
配列番号：６８
＜２２３＞  人工的に変異が導入された重鎖可変領域
＜２２３＞  重鎖可変領域（ｍａｔｕ０５４）
配列番号：６９
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域  ＣＤＲ１
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ１（ｍａｔｕ０６２）
配列番号：７０
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ２（ｍａｔｕ０６２）
配列番号：７１
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域  ＣＤＲ３
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ３（ｍａｔｕ０６２）
配列番号：７２
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ１（ｍａｔｕ０６２）
配列番号：７３
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ２（ｍａｔｕ０６２）
配列番号：７４
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ３（ｍａｔｕ０６２）
配列番号：７５
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域
＜２２３＞  軽鎖可変領域（ｍａｔｕ０６２）
配列番号：７６
＜２２３＞  人工的に変異が導入された重鎖可変領域
＜２２３＞  重鎖可変領域（ｍａｔｕ０６２）
配列番号：７７
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域  ＣＤＲ１
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ１（ｍａｔｕ０７２）
配列番号：７８
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ２（ｍａｔｕ０７２）
配列番号：７９
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域  ＣＤＲ３
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＣＤＲ３（ｍａｔｕ０７２）
配列番号：８０
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ１（ｍａｔｕ０７２）
配列番号：８１
＜２２３＞  人工的に変異が導入された重鎖可変領域  ＣＤＲ２
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ２（ｍａｔｕ０７２）
配列番号：８２
＜２２３＞  人工的に変異が導入された重鎖可変領域  ＣＤＲ３
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＣＤＲ３（ｍａｔｕ０７２）
配列番号：８３
＜２２３＞  人工的に変異が導入された軽鎖可変領域
＜２２３＞  軽鎖可変領域（ｍａｔｕ０７２）
配列番号：８４
＜２２３＞  人工的に変異が導入された重鎖可変領域
＜２２３＞  重鎖可変領域（ｍａｔｕ０７２）
配列番号：８５〜１２３及び１３４〜１４５
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号：１２４
＜２２３＞  重鎖可変領域（ＡＦ４７１４９３）
配列番号：１２５
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＦＲ１（ＡＦ４７１４９３）
配列番号：１２６
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＦＲ２（ＡＦ４７１４９３）
配列番号：１２７
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＦＲ３（ＡＦ４７１４９３）
配列番号：１２８
＜２２３＞  重鎖可変領域  ＦＲ４（ＡＦ４７１４９３）
配列番号：１２９
＜２２３＞  軽鎖可変領域（Ｘ７０４６３）
配列番号：１３０
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＦＲ１（Ｘ７０４６３）
配列番号：１３１
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＦＲ２（Ｘ７０４６３）
配列番号：１３２
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＦＲ３（Ｘ７０４６３）
配列番号：１３３
＜２２３＞  軽鎖可変領域  ＦＲ４（Ｘ７０４６３）
【図５】
2014021339.tif 000004
【図６】
2014021339.tif 000005
【図８】
2014021339.tif 000006
【図９】
2014021339.tif 000007
【図１０】
2014021339.tif 000008
【図１１】
2014021339.tif 000009
【図１２】
2014021339.tif 000010
【図１３】
2014021339.tif 000011
【図１４】
2014021339.tif 000012
【図１５】
2014021339.tif 000013
【図１６】
2014021339.tif 000014
【図１７】
2014021339.tif 000015
【図１９】
2014021339.tif 000016
【図２０】
2014021339.tif 000017
【図２１】
2014021339.tif 000018
【図１】
2014021339.tif 000019
【図２】
2014021339.tif 000020
【図３】
2014021339.tif 000021
【図４】
2014021339.tif 000022
【図７】
2014021339.tif 000023
【図１８】
2014021339.tif 000024
【配列表】
2014021339000001.app
【国際調査報告】
2014021339.tif 000025
2014021339.tif 000026
2014021339.tif 000027
2014021339.tif 000028
2014021339.tif 000029
2014021339.tif 000030
2014021339.tif 000031
2014021339.tif 000032