(57)【要約】  耐糖能異常の診断に有用な、最終糖化産物を始めとする糖化タンパク質分解物誘導体の誘導体化されたアミノ酸誘導体およびペプチド等のアミノ化合物、ならびにその迅速、高感度かつ高精度な定量が可能な質量分析方法およびそれを用いたバイオマーカーのアッセイ方法を提供すること。  本発明は、特に、質量分析に好適な誘導体化された新規な糖化タンパク質分解物誘導体を提供する。また、本発明に係るアミノ酸誘導体およびペプチド等のアミノ化合物の高感度質量分析方法は、アミノ酸誘導体またはペプチドのＮ末端アミノ基とトリニトロフェニル化剤またはその他の誘導体化剤とを反応させ、前記Ｎ末端アミノ基を誘導体化する工程と、Ｎ末端アミノ基が誘導体化されたアミノ酸誘導体またはペプチドを質量分析する工程を有する。さらに、本発明は、得られた質量スペクトルの強度データを用いて、生体試料中のバイオマーカー濃度の定量を行う工程を有するバイオマーカーのアッセイ方法を提供する。
2014010700.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式［Ｉ］で表されることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
【化１】
2014010700.tif 000047
（式中、Ｒはアミノ置換基を意味し、Ｚはニトロフェニル基を意味する。）
【請求項２】
請求項１に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記アミノ置換基がアミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基または複数の該アミノ酸残基ならびに／もしくは置換アミノ酸残基がペプチド結合したペプチド残基であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
【請求項３】
請求項２に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
前記アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンまたはそれらの置換体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
【請求項４】
請求項２または３に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
前記アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アルギニン、リジン、バリン、チロシン、メチオニン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸もしくはトリプトファンまたはそれらの置換体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
【請求項５】
請求項２ないし４のいずれか１項に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
前記置換アミノ酸残基が、最終糖化産物（ＡＧＥ）の残基であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
【請求項６】
請求項５に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記最終糖化産物（ＡＧＥ）が、アルギニン誘導体またはリジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
【請求項７】
請求項２に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
前記ペプチド残基のペプチドが、２個ないし１０個のアミノ酸がペプチド結合していることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記ニトロフェニル基が、一般式［IIIb］で表されることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
【化２】
2014010700.tif 000048
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。）
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記アミノ化合物が、一般式［Ia］で表されることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
【化３】
2014010700.tif 000049
（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。）
【請求項１０】
請求項９に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記アミノ化合物が、一般式［Ii］で表されることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
【化４】
2014010700.tif 000050
（式中、Ｒは前記と同じ意味を有する。）
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記アミノ化合物が、一般式［Ib］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または一般式［Ic］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
【化５】
2014010700.tif 000051
【化６】
2014010700.tif 000052
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。）
【請求項１２】
請求項１１に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記アミノ化合物が、構造式［Iii］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または構造式［Iiii］で表されるトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
【化７】
2014010700.tif 000053
【化８】
2014010700.tif 000054
【請求項１３】
一般式［Ｉ］で表されるアミノ化合物またはその塩を質量分析で測定することを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【化９】
2014010700.tif 000055
（式中、Ｒはアミノ置換基を意味し、Ｚはニトロフェニル基を意味する。）
【請求項１４】
請求項１３に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、
前記アミノ置換基が、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、
前記アミノ化合物が、一般式［Ia］で表されることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【化１０】
2014010700.tif 000056
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味し、Ｒは前記と同じ意味を有する。）
【請求項１６】
請求項１３ないし１５のいずれか１項に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ化合物が、一般式［Ib］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または一般式［Ic］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【化１１】
2014010700.tif 000057
【化１２】
2014010700.tif 000058
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。）
【請求項１７】
請求項１３ないし１６のいずれか１項に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ化合物が、
構造式［Iii］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または構造式［Iiii］で表されるトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【化１３】
2014010700.tif 000059
【化１４】
2014010700.tif 000060
【請求項１８】
一般式［II］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩と、一般式［III］で表されるニトロベンゼン化合物を反応させて一般式［I］で表されるアミノ化合物またはその塩を得る工程と、
上記工程で得られたアミノ化合物またはその塩を質量分析する工程を有することを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【化１５】
2014010700.tif 000061
（式中、Ｒはアミノ置換基を意味する。）
【化１６】
2014010700.tif 000062
（式中、Ｘはアミノ基反応性官能基を意味し、Ｚはニトロフェニル基を意味する。）
【化１７】
2014010700.tif 000063
（式中、ＲおよびＺは、前記と同じ意味を有する。）
【請求項１９】
前記一般式［II］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩と、一般式［III］で表されるニトロベンゼン化合物の反応を、アルカリ性水溶液または水と有機溶媒の混合溶液であり、かつ前記溶液のｐＨが８〜１０でおこなうことを特徴とする請求項１８に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、
前記アミノ置換基がアミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【請求項２１】
請求項１８ないし２０のいずれか１項に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記反応が試料中で行われることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【請求項２２】
請求項１８ないし２１のいずれか１項に記載の質量分析方法であって、
前記アミノ酸誘導体またはその塩がバイオマーカーであることを特徴とするアミノ化合物の質量分析方法。
【請求項２３】
一般式［I'］で表されるアミノ化合物またはその塩を質量分析することを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【化１８】
2014010700.tif 000064
（式中、Ｒ’は、置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味し、Ｚ’は誘導体化残基を意味する。）
【請求項２４】
請求項２３に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、
前記誘導体化残基の誘導体化剤が、
１−ピレンスルホニルクロライド（ＰＳＣ）、ダンシルクロライド（ＤＮＳ−Ｃｌ）等のスルホニル化合物；
９−フルオレニルメチルクロロホルメート（ＦＭＯＣ）、４−ジメチルアミノスルホニル−７−フルオロベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ−Ｆ）、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ−Ｆ）、２、３−ナフタレンジアルデヒド（ＮＤＡ）；
３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）等のカルバメート化合物；
３−クロロカルボニル−６、７−ジメトキシ−１−メチル−２−キノキサリノン（ＤＭＥＱ−ＣＯＣｌ）；
３−ニトロフェニルイソチオシアネート、３−ピリジルイソチオシアネート、４−（ジメチルアミノ）フェニルイソチオシアネート、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等のイソチオシアネート化合物；
ジエチルエトキシメチレンマロネート等のマロネート化合物；
（５−サクシニミドキシ−５−オキソペンチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（ＳＰＴＰＰ）等のホスホニウム化合物；
または２−クロロ−１−メチルピリジニウム塩等のピリジニウム化合物から選択された少なくとも１以上の誘導体化剤であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【請求項２５】
請求項１３ないし２４のいずれか１項に記載のアミノ化合物の質量分析方法により得られる質量スペクトルの強度データを用いて、生体試料中のバイオマーカー濃度の定量を行うことを特徴とするバイオマーカーのアッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ化合物およびその高感度質量分析方法ならびにバイオマーカーのアッセイ方法に関する。更に詳しくは、最終糖化産物を始めとするアミノ酸誘導体とニトロベンゼン系化合物との誘導体化で得られるアミノ化合物およびその塩、ならびにこのアミノ化合物を迅速に高感度かつ高精度で定量が可能な質量分析方法、およびそれを用いたバイオマーカーのアッセイ方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、血糖値が病的に高い状態をいうが、血糖値の異常に起因する急性症状以外に、高血糖状態が長期間継続することに伴い、種々の臓器が障害を受け、糖尿病慢性期合併症を発症すると、治療が非常に困難になるため、早期に発症を診断し、生活習慣の改善、経口血糖降下薬の投与、インスリン注射等の処置を開始することが重要である。【０００３】
しかし、生活習慣病を主因とする糖尿病患者数は年々増加の一途を辿っており、厚生労働省の推計では９００万人を超えるのはもはや時間の問題と言われている。その糖尿病患者数に加えて、いわゆる糖尿病予備軍が１０００万人以上いると推定されることから、糖尿病疾患患者数は近い将来激増することは想像に難くない。しかしながら、実際に糖尿病の治療を受けている患者はわずか３００万人足らずであり、また十分な診断を受けずに放置して治療が遅れたために腎症に至る患者が、毎年１万人ずつ増加し続けているのが現状である。その上、糖尿病の患者の約半数は心筋梗塞や脳梗塞等の虚血性疾患で死亡していることを考え合わせると、糖尿病とその合併症、ならびにいわゆる隠れ糖尿病（糖尿病前症）に対する対策は、医療経済からしても極めて重要である。とりわけ、健康診断の血糖値測定のみでは判定が極めて困難な潜在的糖尿病予備軍である糖尿病前症に対する対策、つまり早期診断方法と治療システムの確立は急務である。【０００４】
しかも、近年、糖尿病前症の中でも、空腹時血糖値（ＦＰＧ）は正常であるのに、耐糖能障害（ＩＧＴ）のために食後血糖値が極端に高くなり、これにより心血管障害を引き起こす患者が増加していることが指摘されている。このため、米国糖尿病学会や世界保健機構は、糖尿病前症をれっきとした疾患と定め、生活習慣の質的改善と薬物治療による糖尿病前症のＩＧＴ改善の重要性を唱えている。前述したように、このような糖尿病前症といわれる患者は、日本でも、推定１０００万人を超えていると考えられるところから、糖尿病前症に対する予防ならびに治療対策は極めて重要である。【０００５】
日本糖尿病学会では、糖尿病前症や糖尿病の診断基準として、一次健康診断では空腹時血糖値（ＦＰＧ）、また二次健康診断では経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）の実施を指導してきた。糖尿病前症患者の耐糖能障害は、一次健康診断のＦＰＧ検査やグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）検査だけでは正確に診断することが困難であるところから、一次健康診断で糖尿病前症が疑われる被検者に対しては、ＯＧＴＴの二次健康診断の受診を勧められている。しかしながら、このＯＧＴＴは、被験者の長い拘束時間や簡便性に欠けている上に、糖（グルコース）負荷という身体的負担を課するとともに急激な血糖値上昇等の危険が伴う等の問題があり、一般の健康診断での血液検査による血糖値検査法のように普及していないのが実情である。その結果、潜在的な糖尿病前症の多くが、ＯＧＴＴの二次健康診断の受診を怠ってしまい、糖尿病やその合併症を自覚することなく未治療のまま真性の糖尿病に進行し、さらに重篤な合併症を発症するか、または腎透析を余儀なくされるに至っている。【０００６】
一次健康診断では、通常、空腹時血糖（ＦＰＧ）、随時血糖あるいはグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を判定指標とした検査が実施されていて、ＦＰＧ値が１００ｍｇ／ｄＬ以上、またはＨｂＡ１ｃ値が５．２％以上であれば、インスリン抵抗性もしくはそれによるＩＧＴの疑いありと診断されている。しかし、インスリン抵抗性によるＩＧＴは、食後高血糖が主たる初期変化として現れてくることから、従来の一次健康診断で使用されているいずれの指標も精度の点で不十分と言わざるを得ず、従来の一次健康診断法は、糖尿病前症の早期診断としては利用することができない。【０００７】
そこで、現実的には、一次健康診断において、これらの指標を用いてインスリン抵抗性あるいはＩＧＴが疑われる被検者に対して、二次健康診断あるいはそれ以降の健康診断で７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験（７５ｇ ＯＧＴＴ）、血中インスリン、ＨＯＭＡ−Ｒ等の検査により、インスリン抵抗性もしくはＩＧＴが陽性であるかどうかを検査して、糖尿病前症の確定診断がなされている。これらの検査は、当然のことながら費用も手間もかかることになる。【０００８】
そこで、もし一次健康診断で用いた同じ血糖測定用採血サンプルでＯＧＴＴと同等の精度で糖尿病前症の診断を確定できる方法があれば、糖尿病前症患者の検出率は飛躍的に向上するとともに、二次健康診断でのＯＧＴＴ検査は不要となり、世界保健機構等が提唱する糖尿病前症の早期診断ならびに治療による糖尿病化阻止戦略を強力に推し進めることが可能となる。【０００９】
他方、近年、糖尿病慢性期合併症のリスクファクターとして、種々の最終糖化産物が注目を集めている。最終糖化産物（ＡＧＥ類）は、糖化タンパク質、メイラード反応産物等とも呼ばれ、グルコース等の還元糖とタンパク質のアミノ基との非酵素的な反応により生成する種々の構造を有するタンパク質誘導体である。ＡＧＥ類は、細胞外マトリックスタンパク質、膜タンパク質および細胞内タンパク質の糖化修飾に起因するこれらのタンパク質の機能及びそれに依存する細胞機能の破綻、あるいはＡＧＥ類をリガンドとするレセプターが引き起こす細胞応答の結果として、種々の病変の発症及び増悪に関与している。例えば、ＡＧＥ類レセプターの１つであるＲＡＧＥ類によってＡＧＥ類が認識されると、細胞内ＮＡＤＰＨオキシダーゼによる細胞内酸化ストレス物質の産生が亢進し、これが上皮細胞における遺伝子発現を変化させることにより、種々の糖尿病性血管障害が発症すると考えられている（非特許文献１参照）。【００１０】
ＡＧＥ類の中でも、解糖系の中間体または副産物として産生されるグリセルアルデヒドやメチルグリオキサール（ＭＧ）に由来するものは、糖尿病および耐糖能異常の発症および予後予測等に関する診断マーカーとして期待を集めている（非特許文献２、３、４、５）。【００１１】
非特許文献２には、２型糖尿病患者の血清について、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾールのポリクロナール抗体を用いたＥＬＩＳＡ系で測定した結果、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾールの血清レベルが同齢健常人に比較して増加しているとの報告がなされている。同非特許文献２は、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾールの血清レベルと、ＡＧＥ類の１種であるＮε−（カルボニルメチル）リジンの血清レベルとの間には、同様に有意な相関関係があるが、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾールの血清レベルは、空腹時血糖の血漿レベルやヘモグロビンレベルとは関連性はなかったと報告している。【００１２】
非特許文献３は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて１型糖尿病患者の血漿を測定した結果、タンパク質の糖化または酸化による付加生成物の濃度ならびにその遊離残基（free adduct）の濃度が増加していることを示している。例えば、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロンやグリオキサール由来ヒドロイミダゾロンあるいはその他のＡＧＥ類であるＮε−（カルボニルメチル）リジン、Ｎε−（カルボニルエチル）リジン、ならびにこれらの遊離付加物（ｆｒｅｅ  ａｄｄｕｃｔ）が増加していることが報告されている。【００１３】
非特許文献４は、１型糖尿病患者の血漿をタンデム質量分析した結果、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン遊離付加物が糖尿病患者のマーカーとして優れていることを示唆している。【００１４】
非特許文献５は、１型糖尿病患者の血漿ならびに尿サンプルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定した結果、糖負荷後の血糖値とインスリン値の上昇に加えて、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾール遊離付加物を初めとして、Ｎε−（カルボニルメチル）リジン、Ｎε−（カルボニルエチル）リジン、グリオキサール由来ヒドロイミダゾロン、Ｎδ−［５−（２，３，４−トリヒドロキシブチル）−５−ヒドロ４−イミダゾロン２−イル］−オルニチン（３ＤＧ−Ｈ１）等のｆｒｅｅ  ａｄｄｕｃｔも増加することを報告している。即ち、この論文は、食後には高血糖になるだけでなく、高カルボニルストレス状態も誘発されることを示している。さらに、この文献には、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン遊離付加物の他、アルグピリミジンを含む多くのＡＧＥ類、ならびにアミノ酸（アルギニン、リジン、メチオニン、チロシンおよびトリプトファン）についてのタンデム質量分析結果が記載されている。【００１５】
上述したように、これらのＡＧＥ類をタンデム質量（ＭＳ／ＭＳ）分析する手法が報告されている。しかしながら、これらのＡＧＥ類についての測定は、ＥＬＩＳＡ法等の免疫化学的手法を用いた総量評価以外に有効な手法が存在しないのが現状であり（特許文献１）、個別のＡＧＥ類およびその分解産物について確立した測定法は殆ど存在しておらず、ましてや臨床に応用可能な測定法は存在してないと言わざるを得ない。これらの個別のＡＧＥ類の定量は、糖尿病および耐糖能異常の診断のみならず、メタボローム解析等においても有用であることから、ＡＧＥ類についてより迅速に高感度かつ高精度に個別の化合物を測定できるアッセイ法が強く望まれている。【００１６】
ＡＧＥ類分析の他に、アミノ酸分析も、臨床分野、例えば先天的な代謝障害のアッセイにとって非常に重要であり、また診断のバイオマーカー検索に使用できる可能性を持っている。アミノ酸分析は、例えば、先天性アミノ酸症の診断や、肝臓機能障害の重症度や治療の指針等として使用されている。また、最近の報告では、アミノ酸のプロファイルが、慢性Ｃ型肝炎患者の進行型線維症等の診断に応用されている。さらに、アミノ酸のプロファイルを指標として用いて、生物の健康度合いの分析の可能性までも報告されている（非特許文献６）。【００１７】
上述したようなアミノ酸分析のために、アミノ酸自動分析装置が開発された。この装置はニンヒドリン試薬を用いたアミノ酸の比色を測定するものであり、分析には非常に時間を要するものである。【００１８】
上記のような比色測定方法の他に、プレカラム誘導体化法が開発され、このプレカラム誘導体化法に使用する誘導体化剤も様々なものが開発されている（非特許文献６）。しかし、この誘導体化法は複雑で時間を要する技術である。さらに、この誘導体化法と質量分析方法を組み合わせた自動アミノ酸分析方法も開発されているが、この方法にしても更なる改良が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】特開２００８−２２４４５３号公報
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Marie-Paule Wautier他著、「Activation of NADPH oxidase by AGE links oxidant stress to altered gene expression via RAGE」、American Journal of Physiology -Endocrinology and Metabolism、（米国）、アメリカ生理学会（American Physiological Society）、２００１年５月、第２８０巻、Ｅ６８５−Ｅ６９４
【非特許文献２】Kilhovd, B.K., et al. Metabolism, Vol 52, No 2 (February), 2003: pp. 163-167
【非特許文献３】Rabbani, N., and Thornalley, P.J. Amino Acids DOI 10.1007/s00726-010-0783-0
【非特許文献４】Ahmed, N., et al. Diabetologia (2005) 48: 1590-1603
【非特許文献５】Ahmed, N., et al. Diabetes Care, Vol. 28, No. 10, October  2005, pp. 2465-2471
【非特許文献６】Shimbo, K., et al. Biomed. Chromatogr. 2010; 24: 683-691.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
そこで、本発明者らは、かかる事情に鑑みて鋭意検討を重ねた結果、ＡＧＥ類のメチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ−Ｈ１）ならびにアルグピリミジン（ＡＰ）の末端アミノ基をニトロベンゼン系化合物で誘導体化することによって、質量分析における感度が大幅に向上する上に、ＡＧＥ類に加えて、その他のアミノ酸誘導体またはペプチド等のアミノ化合物にも応用できることを見いだして、本発明を完成するに至った。【００２２】
したがって、本発明は、特に最終糖化産物を始めとするアミノ酸誘導体とニトロベンゼン系化合物との誘導体化で得られるアミノ化合物およびその塩、ならびにこのアミノ化合物を迅速に高感度かつ高精度で定量が可能な質量分析方法、およびそれを用いたバイオマーカーのアッセイ方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
上記目的を達成するために、本発明は、一般式［Ｉ］で表されるアミノ化合物またはその塩を提供する。【００２４】
【化１】
2014010700.tif 000003
【００２５】
式［Ｉ］において、Ｒはアミノ置換基を意味し、Ｚはニトロフェニル基を意味する。【００２６】
本発明は、その好ましい態様として、上記アミノ置換基が、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基または該アミノ酸残基ならびに／もしくは置換アミノ酸残基がペプチド結合したペプチド残基であるアミノ化合物またはその塩を提供する。【００２７】
本発明は、その好ましい態様として、上記アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンまたはそれらの置換体、好ましくはアルギニン、リジン、バリン、チロシン、メチオニン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸もしくはトリプトファンまたはそれらの置換体であるアミノ化合物またはその塩を提供する。【００２８】
本発明は、その好ましい別の態様として、上記置換アミノ酸残基が、最終糖化産物（ＡＧＥ）、好ましくはアルギニン誘導体またはリジン誘導体の残基であるアミノ化合物またはその塩を提供する。【００２９】
本発明は、その好ましい別の態様として、上記ペプチド残基のペプチドが、２個ないし１０個のアミノ酸がペプチド結合しているアミノ化合物またはその塩を提供する。【００３０】
本発明は、その好ましい別の態様として、上記ニトロフェニル基が、一般式［IIIb］で表されるアミノ化合物またはその塩を提供する。【００３１】
【化２】
2014010700.tif 000004
【００３２】
式［IIIb］において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。【００３３】
本発明は、そのより好ましい態様として、上記アミノ化合物が、一般式［Ia］で表されるアミノ化合物またはその塩を提供する。【００３４】
【化３】
2014010700.tif 000005
【００３５】
式［Ia］において、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ前記と同じ意味を有する。【００３６】
本発明は、そのより好ましい別の態様として、上記アミノ化合物が、一般式［Ii］で表されるアミノ化合物またはその塩を提供する。【００３７】
【化４】
2014010700.tif 000006
【００３８】
式［Ii］において、Ｒは前記と同じ意味を有する。【００３９】
本発明は、そのより好ましい態様として、上記アミノ化合物が、一般式［Ib］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または一般式［Ic］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であるアミノ化合物またはその塩を提供する。【００４０】
【化５】
2014010700.tif 000007
【００４１】
【化６】
2014010700.tif 000008
【００４２】
式［Ib］及び［Ic］において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。【００４３】
本発明は、そのより好ましい態様として、上記アミノ化合物が、構造式［Iii］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または構造式［Iiii］で表されるトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であるアミノ化合物またはその塩を提供する。【００４４】
【化７】
2014010700.tif 000009
【００４５】
【化８】
2014010700.tif 000010
【００４６】
本発明は、その別の形態として、一般式［Ｉ］で表されるアミノ化合物またはその塩を質量分析で測定するアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。【００４７】
【化９】
2014010700.tif 000011
【００４８】
式［Ｉ］において、Ｒはアミノ置換基、例えば、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味し、Ｚはニトロフェニル基を意味する。【００４９】
本発明は、その好ましい態様として、上記アミノ化合物が、一般式［Ia］で表されるアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。【００５０】
【化１０】
2014010700.tif 000012
【００５１】
式［Ia］において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味し、Ｒは前記と同じ意味を有する。【００５２】
本発明は、そのより好ましい態様として、上記アミノ化合物が、一般式［Ib］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または一般式［Ic］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であるアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。【００５３】
【化１１】
2014010700.tif 000013
【００５４】
【化１２】
2014010700.tif 000014
【００５５】
式［Ib］及び［Ic］において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。【００５６】
本発明は、そのより好ましい態様として、上記アミノ化合物が、構造式［Iii］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または構造式［Iiii］で表されるアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。【００５７】
【化１３】
2014010700.tif 000015
【００５８】
【化１４】
2014010700.tif 000016
【００５９】
本発明は、その別の形態として、一般式［II］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩と、一般式［III］で表されるニトロベンゼン化合物を反応させて一般式［Ｉ］で表されるアミノ化合物またはその塩を得る工程と、
上記工程で得られたアミノ化合物またはその塩を質量分析する工程を有するアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。【００６０】
【化１５】
2014010700.tif 000017
【００６１】
式［II］において、Ｒは、アミノ置換基、例えば、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味する。【００６２】
【化１６】
2014010700.tif 000018
【００６３】
式［III］において、Ｘはアミノ基反応性官能基を意味し、Ｚはニトロフェニル基を意味する。【００６４】
【化１７】
2014010700.tif 000019
【００６５】
式［Ｉ］において、ＲおよびＺは、前記と同じ意味を有する。【００６６】
本発明は、そのより好ましい態様として、前記一般式［II］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩と、一般式［III］で表されるニトロベンゼン化合物の反応を、アルカリ性水溶液または水と有機溶媒の混合溶液であり、かつ前記溶液のｐＨが８〜１０でおこなうことを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。【００６７】
本発明は、その好ましい態様として、上記反応が試料中で行われるアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。【００６８】
本発明は、そのより好ましい態様として、上記アミノ酸誘導体またはその塩がバイオマーカーであるアミノ化合物の質量分析方法を提供する。【００６９】
本発明は、さらに別の形態として、一般式［I'］で表されるアミノ化合物またはその塩を質量分析するアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、上記誘導体化残基の誘導体化剤が、１−ピレンスルホニルクロライド（ＰＳＣ）、ダンシルクロライド（ＤＮＳ−Ｃｌ）等のスルホニル化合物；９−フルオレニルメチルクロロホルメート（ＦＭＯＣ）、４−ジメチルアミノスルホニル−７−フルオロベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ−Ｆ）、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ−Ｆ）、２、３−ナフタレンジアルデヒド（ＮＤＡ）；３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）等のカルバメート化合物；３−クロロカルボニル−６、７−ジメトキシ−１−メチル−２−キノキサリノン（ＤＭＥＱ−ＣＯＣｌ）、３−ニトロフェニルイソチオシアネート、３−ピリジルイソチオシアネート、４−（ジメチルアミノ）フェニルイソチオシアネート、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等のイソチオシアネート化合物；ジエチルエトキシメチレンマロネート等のマロネート化合物、（５−サクシニミドキシ−５−オキソペンチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（ＳＰＴＰＰ）等のホスホニウム化合物；または２−クロロ−１−メチルピリジニウム塩等のピリジニウム化合物であるアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。【００７０】
【化１８】
2014010700.tif 000020
【００７１】
式［I'］において、Ｒ’は、前記Ｒと同じ意味を有する置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味し、Ｚ’は誘導体化残基を意味する。【００７２】
本発明は、さらに別の形態として、上記のアミノ化合物の質量分析方法により得られる質量スペクトルの強度データを用いて、生体試料中のバイオマーカー濃度の定量を行うバイオマーカーのアッセイ方法を提供する。
【発明の効果】
【００７３】
本発明によって、アミノ酸誘導体のＮ末端アミノ基を誘導体化することにより、質量分析におけるイオン化効率が向上し、試料中に少量しか存在しない最終糖化産物等の分子バイオマーカーやペプチドホルモンについても、質量分析方法を用いて迅速、高感度かつ高精度な定量分析が可能になる。したがって、本発明は、アミノ酸誘導体とニトロベンゼン化合物等の誘導体化剤との誘導体化生成物である新規なアミノ化合物、好ましくはタンパク質の解糖等の反応中間産物である糖化タンパク質分解物がニトロベンゼン化合物等の誘導体化剤で誘導体化された、耐糖能異常の診断に有用な新規な糖化タンパク質分解物誘導体を提供する。また、本発明は、そのアミノ化合物についての迅速、高感度かつ高精度な定量が可能な質量分析方法およびそれを用いたバイオマーカーのアッセイ方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ−Ｈ１）の質量スペクトル（ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ）である。
【図２】ＭＧ−Ｈ１の２，４，６−トリニトロフェニル誘導体（ＭＧ−Ｈ１-ＴＮＰ）の質量スペクトル（ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ）である。
【図３】アルグピリミジン（ＡＰ）の質量スペクトル（ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ）である。
【図４】ＡＰの２，４，６−トリニトロフェニル誘導体（ＡＰ-ＴＮＰ）の質量スペクトル（ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ）である。
【図５】質量スペクトルより予測されるＭＧ−Ｈ１の２，４，６−トリニトロフェニル誘導体（ＭＧ−Ｈ１-ＴＮＰ）のフラグメンテーションパターンを示す図である。
【図６】質量スペクトルより予測されるＡＰの２，４，６−トリニトロフェニル誘導体（ＡＰ-ＴＮＰ）のフラグメンテーションパターンを示す図である。
【図７】（Ａ）はＭＧ−Ｈ１の、（Ｂ）はＭＧ−Ｈ１の２，４，６−トリニトロフェニル誘導体（ＭＧ−Ｈ１-ＴＮＰ）のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示すマスクロマトグラムである。
【図８】（Ａ）はＡＰの、（Ｂ）はＡＰの２，４，６−トリニトロフェニル誘導体（ＡＰ-ＴＮＰ）のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示すマスクロマトグラムである。
【図９】ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰの濃度と質量スペクトルのピーク強度について、内部標準法を用いて作製した検量線である。
【図１０】ＡＰ−Ｈ１−ＴＮＰの濃度と質量スペクトルのピーク強度について、内部標準法を用いて作製した検量線である。
【図１１】ＭＧ−Ｈ１の２，４，６−トリニトロフェニル化に及ぼすｐＨの影響を示すグラフである。
【図１２】ＡＰの２，４，６−トリニトロフェニル化に及ぼすｐＨの影響を示すグラフである。
【図１３】ラット血漿の前処理のプロトコールを示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
以下、本発明の実施形態について説明する。ただし、本発明は、下記の実施形態に限定されるものではなく、下記の実施形態は、本発明を具体的に詳細に説明するために例示的に記載するものである。したがって、下記の実施形態から想到される形態もまた、本発明の範囲に包含されるものと理解されるべきである。
【００７６】
なお、本明細書においては、説明を簡潔にするために、誘導体化剤としてはニトロベンゼン化合物を例に挙げて説明するが、本発明においては、誘導体化剤はニトロベンゼン化合物に一切限定されるものではなく、その他の誘導体化剤も本発明の範囲に当然包含されるものとして理解されるべきである。したがって、本明細書においては、誘導体化剤でアミノ酸誘導体の末端アミノ基を誘導体化した残基についても、ニトロベンゼン化合物の残基であるニトロフェニル基について説明するが、これについても一切限定されるものではなく、その他の誘導体化剤の残基も同様に包含されるものと理解されるべきである。
【００７７】
本発明に係るアミノ化合物は、一般式［Ｉ］で表すことができる。
【００７８】
【化１９】
2014010700.tif 000021
【００７９】
式［Ｉ］において、Ｒはアミノ置換基を意味し、Ｚはニトロフェニル基を意味する。
【００８０】
上記一般式において、用語「アミノ置換基」は、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味する。
ここで、用語「アミノ酸残基」とは、非置換アミノ酸からアミノ基を除外した残基を意味している。例えば、アラニンの場合には、２−アミノプロパン酸と別称されるので、２−アミノプロパン酸からアミノ基を除外したアミノ酸残基は、カルボキシルエチル基である。同様に、リジンの場合のアミノ酸残基は１−カルボキシル−５−アミノペンチル基である。
【００８１】
また、上記一般式において、用語「置換アミノ酸残基」とは、上記アミノ酸からアミノ基を除外したアミノ酸残基であって、該アミノ酸を構成するカルボキシル基以外の残基、つまり原子団が置換基で置換されて形成された原子団、つまり置換部分（moiety）を有するアミノ酸残基を意味している。置換アミノ酸残基の例としては、上記リジン残基の５−アミノ基にカルボキシルメチル基が置換した１−カルボキシル−５−（カルボキシルメチル）アミノペンチル基が挙げられる。また別の例として、例えば、アルギニン残基のアミノ−イミノメチル基が２−ピリミジニル基に変換した置換アミノ酸残基等も挙げることができる。
【００８２】
さらに、上記一般式において、用語「ペプチド残基」とは、上記アミノ酸および／または置換アミノ酸がペプチド結合して形成されたペプチドの末端アミノ酸から末端アミノ基が除外された残基を意味している。例えば、ペプチドＶａｌ−Ｔｙｒの場合、ペプチド残基とは、末端アミノ酸のバリンからアミノ基が除外された残基を意味する。
【００８３】
本発明において、用語「アミノ酸誘導体」とは、特段の定めがない限り、非置換アミノ酸誘導体、もしくはＮ末端アミノ基以外のアミノ酸部分が置換基等で修飾されている置換アミノ酸誘導体、またはペプチドを意味している。
【００８４】
したがって、本発明において使用する用語「アミノ化合物」は、特段の定めがない限り、アミノ酸誘導体［II］またはその塩のN末端アミノ基が、ニトロベンゼン化合物［III］によりニトロフェニル化されたニトロフェニル化アミノ化合物を意味している。
【００８５】
本発明において、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基のアミノ酸、またはペプチド残基のペプチド構成アミノ酸のアミノ酸は、広義には、アミノ基とカルボキシ基の両方の官能基を有する化合物であれば、特に限定されるものではないが、狭義には、例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンおよびチロシン、好ましくはアルギニンおよびリジン等のタンパク質の構成成分であるアミノ酸およびそれらを構成するカルボキシル基以外の残基が置換基で置換されて形成された置換部分を有する置換アミノ酸残基が挙げられる。
【００８６】
好ましいアミノ酸としては、例えば、好ましくはアルギニン、リジン、バリン、チロシン、メチオニン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸またはトリプトファンが挙げられる。
【００８７】
また、本発明において使用する用語「置換アミノ酸残基」は、上記アミノ酸の末端アミノ基以外の残基に任意の置換基が結合して形成された別の原子団を有する置換アミノ酸誘導体の残基を意味している。かかるアミノ酸誘導体としては、本発明の目的を逸脱しない限り、特に限定されるものではなく、例えば、アミノ酸等の生体成分の分解生成物や中間生成物、または代謝産物等が挙げられ、例えば、タンパク質の糖化反応によって生成される各種最終糖化産物（ＡＧＥ類）、アルギニンの分解生成物であるオルニチン、筋肉へのエネルギー供給源のクレアチニンリン酸の代謝産物であるクレアチニン、肝臓中のグルタチオン欠乏を示すバイオマーカーであるオフタルミン酸生合成の中間体のα−アミノ酪酸（ＡＡＢＡ）、主に神経伝達物質として作用するγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）等の他、各種疾患の診断および予後予測等に用いられる分子バイオマーカーや、馬尿酸等も挙げられる。これらアミノ酸のうち、上記ＡＧＥ類等が好ましい。より好ましいのは、例えば、アルギニンの側鎖のグアノシル基とメチルグリオキサール、またはリジンのアミノ基とグリオキサールもしくはメチルグリオキサール等の脂質過酸化、メイラード反応、解糖等の反応中間産物との反応により生成されるＡＧＥ類等が挙げられる。かかるＡＧＥ類等のうち、好ましいものとしては、置換アルギニン誘導体や置換リジン誘導体等が挙げられる。
【００８８】
置換アルギニン誘導体としては、例えば、アルギニンのグアニジノ基がカルボキシルメチル基、カルボキシルエチル基等の置換基で修飾されたアルキル置換アルギニン誘導体、イミダゾロン類、ピリミジン類、イミダゾピリジン類等のグアニジノ基が環状構造になっている環状アルギニン誘導体等が挙げられる。
【００８９】
更に具体的には、アルキル置換アルギニン誘導体としては、例えば、カルボキシルメチルアルギニン（ＣＭＡ）等が挙げられる。また、環状アルギニン誘導体のイミダゾロン類としては、例えば、イミダゾロン、グリオキサールヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ）、メチルグリオキサールヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ）、Ｎδ−［５−（２，３，４−トリヒドロキシブチル）−５−ヒドロ４−イミダゾロン２−イル］−オルニチン（３−ＤＧ−Ｈ）等が挙げられる。ピリミジン類としては、例えば、アルグピリミジン、テトラヒドロピリミジン等が挙げられる。イミダゾピリジン類としては、例えば、ペントシジン等が挙げられる。
【００９０】
これら置換アルギニン誘導体のうち、特に好ましいのは、例えば、構造式［IIa］で表されるメチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ−Ｈ１：Ｎδ−（５−ヒドロ−５−メチル−４−イミダゾロン２−イル）−オルニチン）、または構造式［IIb］で表されるアルグピリミジン（ＡＰ）が挙げられる。
【００９１】
【化２０】
2014010700.tif 000022
【００９２】
【化２１】
2014010700.tif 000023
【００９３】
更に具体的には、上記アミノ酸誘導体は、立体構造を有し、構造式［IIc］または構造式［IId］でそれぞれ表すことができる。
【００９４】
【化２２】
2014010700.tif 000024
【００９５】
【化２３】
2014010700.tif 000025
【００９６】
また、上記ＡＧＥ類のうち、置換リジン誘導体としては、例えば、リジンのアミノ基がカルボキシルメチル基、カルボキシルエチル基等の置換基で修飾されたアルキル置換リジン誘導体、リジンのアミノ基が環状構造を有している環状リジン誘導体等が挙げられる。
【００９７】
アルキル置換リジン誘導体としては、例えば、カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）、カルボキシエチルリジン（ＣＭＬ）等が挙げられる。また、環状リジン誘導体としては、例えば、ビラリン、ＦＴＰ（Ｆｏｒｍｙｌ  Ｔｈｅｒｏｓｙｌ  Ｐｙｒｒｏｌｅ）等のピロール誘導体、ＧＯＬＤ（グリオキサール由来リジン二量体）、ＭＯＬＤ（メチルグリオキサール由来リジン二量体）、ＤＯＬＤ（３−デオキシグルコソン由来リジン二量体）等のイミダゾール誘導体、ＧＬＡＰ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ）、ＧＡ−ピリジン（ｇｌｙｃｏｌａｌｄｅｈｙｄｅ−ピリジン）等のピリジン誘導体、ペントシジン等のイミダゾピリジン誘導体等が挙げられる。
【００９８】
さらに、上記一般式［Ｉ］において、置換基Ｒで表されるペプチド残基のペプチドとしては、そのペプチドを構成する上記アミノ酸の数は特に限定されないが、上記アミノ酸が２個〜１０個、好ましくは２個〜６個、より好ましくは２個〜４個ペプチド結合して構成されているペプチドであるのがよい。かかるペプチドとしては、例えば、バリルチロシン、リシルチロシン、メチオニルチロシン、グリシルチロシン、ヒスチジルチロシン、グルタミルチロシン、トリプトファニルチロシン、ヒスチジニルトリプトファン、カルノシン、アンセリン等のジペプチド、グルタチオン等のトリペプチド等が挙げられる。その他に、エンケファリン、カキシトシン、バソプレッシン等を挙げることができる。これらペプチドのうち、バリルチロシン、リシルチロシン、メチオニルチロシン、グリシルチロシン、ヒスチジルチロシン、グルタミルチロシン、トリプトファニルチロシンならびにヒスチジニルトリプトファン等のジペプチドが好ましい。また、ペプチドは、タンパク質の消化物、最終糖化産物等の代謝産物、ペプチドホルモン等の生理活性ペプチドのいずれであってもよく、各種疾患の診断および予後予測等に用いられる分子バイオマーカーであってもよい。
【００９９】
一方、上記一般式［I］において、置換基 Z は、アミノ酸誘導体［II］の末端アミノ基をニトロフェニル化したニトロベンゼン化合物の残基であって、一般式［IIIb］ で表すことができる。
【０１００】
【化２４】
2014010700.tif 000026
【０１０１】
式［IIIb］において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも、同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。
【０１０２】
ここで、ニトロフェニル基としては、例えば、モノ−、ジ−またはトリ−ニトロフェニル基、好ましくはトリ−ニトロフェニル基、特に好ましくは２、４、６−ニトロフェニル基が挙げられる。ニトロ置換基の位置にしても、特に限定はないが、１個の場合は２−位、２個の場合は２−位と４−位、３個の場合に２−位、４−位ならびに６−位であるのがよい。
【０１０３】
したがって、本発明に係るアミノ化合物は、一般的には、一般式［Ｉ］で表され、より具体的には、一般式［Ia］で表すことができる。
【０１０４】
【化２５】
2014010700.tif 000027
【０１０５】
【化２６】
2014010700.tif 000028
【０１０６】
式［Ia］において、Ｒ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。
【０１０７】
本発明において、構造式［Ia］で表されるアミノ化合物の好ましい例としては、例えば、構造式［Ib］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体、または構造式［Ic］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体が挙げられる。
【０１０８】
【化２７】
2014010700.tif 000029
【０１０９】
【化２８】
2014010700.tif 000030
【０１１０】
式［Ib］および［Ic］において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。
【０１１１】
さらに好ましいアミノ化合物は、例えば、一般式［Ii］で表すことができる。
【０１１２】
【化２９】
2014010700.tif 000031
【０１１３】
式［Ii］において、Ｒは前記と同じ意味を有する。
【０１１４】
したがって、アミノ化合物としては、例えば、構造式［Iii］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体、または一般式［Iiii］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体がさらに好ましい。
【０１１５】
【化３０】
2014010700.tif 000032
【０１１６】
【化３１】
2014010700.tif 000033
【０１１７】
上記のトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体およびトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体の立体構造式（［Iiv］および［Iv］）はそれぞれ次のように表すことができる。
【０１１８】
【化３２】
2014010700.tif 000034
【０１１９】
【化３３】
2014010700.tif 000035
【０１２０】
本発明に係るアミノ化合物［Ｉ］は、一般式［II］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩を、一般式［III］で表されるニトロベンゼン化合物で誘導体化反応することにより得ることができる。
【０１２１】
【化３４】
2014010700.tif 000036
【０１２２】
式［II］において、Ｒは前記と同じ意味を有する。
【０１２３】
【化３５】
2014010700.tif 000037
【０１２４】
式［III］において、Ｘはアミノ基反応性官能基を意味し、Ｚは上記と同じ意味を有する。
【０１２５】
より具体的には、本発明のアミノ化合物［Ia］は、アミノ酸誘導体［II］またはその塩と、一般式［IIIa］ で表されるニトロベンゼン化合物との誘導体化反応により得ることができる。
【０１２６】
【化３６】
2014010700.tif 000038
【０１２７】
式［IIIa］において、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。
【０１２８】
更に具体的には、本発明のアミノ化合物［Ii］は、アミノ酸誘導体［II］またはその塩と、一般式［IIIc］で表されるトリニトロベンゼン化合物との誘導体化反応により得ることができる。
【０１２９】
【化３７】
2014010700.tif 000039
【０１３０】
式［IIIc］において、Ｘは前記と同じ意味を有する。
【０１３１】
ここで、Ｘで表されるアミノ基反応性官能基としては、アミノ酸または置換アミノ酸（［II］）をニトロフェニル誘導体化する反応性官能基であれば特に限定されないが、例えば、塩素原子、フッ素原子、臭素原子もしくはヨウ素原子から選ばれるハロゲン原子、またはスルホン酸またはスルホン酸塩、アルキルスルホン酸エステル基、アリールスルホン酸エステル基、パーフルオロアルキルスルホン酸エステル基等の、ニトロベンゼン誘導体の芳香族求核置換反応において脱離基となり得る任意の官能基が挙げられる。
【０１３２】
そこで、好ましいニトロベンゼン化合物としては、例えば、２，４，６−トリニトロフルオロベンゼン、２，４，６−トリニトロクロロベンゼン、２，４，６−トリニトロブロモベンゼン、２，４，６−トリニトロヨードベンゼンおよび２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸またはその塩等が挙げられ、これらのうち特に好ましいのは、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸またはその塩である。塩としては、例えば、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩、カリウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
【０１３３】
本発明において、上記アミノ酸誘導体のＮ末端アミノ基をニトロベンゼン化合物で誘導体化するには、上記アミノ酸誘導体とニトロベンゼン化合物とを、アルカリ性の水溶液または、水と有機溶媒の混合溶液中にて室温で数十分間混合することにより行うことができる。好ましくはアルカリ性水溶液中で行われる。また、水と有機溶媒との混合溶液を用いる場合、有機溶媒としてはエタノール等の水との親和性が高い有機溶媒が好ましく用いられる。これらの溶液のｐＨは８〜１０であることが好ましく、より好ましくは８．５〜９．５であるのがよい。溶液のｐＨが高すぎると、分析対象のアミノ酸誘導体またはこの化合物が分解する可能性が増大し、低すぎるとニトロフェニル化反応が迅速に進行しなくなる。ここでｐＨとは、ｐＨメータにより直接測定される値である。なお、室温とは１５℃から４０℃程度の温度であり、３０℃前後で反応を行うことが好ましい。また、混合はいかなる方法であってもよく、１分以上１時間以下、好ましくは５分から４０分間の混合が行われる。通常は３０分間の混合で十分である。
【０１３４】
本発明の特徴の一つは、かかる温和な条件下で、ニトロフェニル化反応を行うことができることである。試料中の分析対象となる物質を単離してニトロフェニル化を行ってもよいが、夾雑物等を含むような試料中でそのままニトロフェニル化を行ってもよい。本発明はこのような試料中でそのままニトロフェニル化を行うことができるため、単離によるロス等を低減することができ、分析対象となる物質が少量しか含まれないような場合であっても測定することができるという優れた方法である。また、複雑な操作を行う必要が無く、簡便に測定することができる。特に対象試料が生体試料等の場合は、分析対象となる物質が少なく、かつ、夾雑物が多い状態であることが多いため有効である。
【０１３５】
また、例えば、試料中のアミノ酸誘導体を測定するに当たっては、生体試料に、ニトロベンゼン化合物を添加することにより、試料中のバイオマーカーとしてのアミノ酸誘導体をニトロベンゼン化合物で誘導体化することも可能であるとともに、かかる誘導体化したアミノ酸誘導体をバイオマーカーとして測定できることは当然のことである。
本発明において試料となるものは、測定対象となる最終糖化産物等の、本発明によってアミノ酸誘導体とニトロベンゼン系化合物との誘導体化で得られるアミノ化合物となるものを含有するものであればよい。また、生体由来の試料を生体試料とよぶ。
【０１３６】
さらに、アミノ酸誘導体の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、リチウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等を使用することができる。
【０１３７】
本発明においては、誘導体化剤として、上記ニトロベンゼン化合物の他に、その他のアミノ基を誘導体化する誘導体化剤も使用できることは当然のことである。かかる誘導体化剤としては、例えば、ニトロベンゼンスルホン酸化合物、フルオロ−ニトロベンゼン等のニトロベンゼン化合物の他に、１−ピレンスルホニルクロライド（ＰＳＣ）、ダンシルクロライド（ＤＮＳ−Ｃｌ）等のスルホニル化合物、９−フルオレニルメチルクロロホルメート（ＦＭＯＣ）、４−ジメチルアミノスルホニル−７−フルオロベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ−Ｆ）、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ−Ｆ）、２、３−ナフタレンジアルデヒド（ＮＤＡ）、３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）等のカルバメート化合物、３−クロロカルボニル−６、７−ジメトキシ−１−メチル−２−キノキサリノン（ＤＭＥＱ−ＣＯＣｌ）、３−ニトロフェニルイソチオシアネート、３−ピリジルイソチオシアネート、４−（ジメチルアミノ）フェニルイソチオシアネート、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等のイソチオシアネート化合物、ジエチルエトキシメチレンマロネート等のマロネート化合物、（５−サクシニミドキシ−５−オキソペンチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（ＳＰＴＰＰ）等のホスホニウム化合物、または２−クロロ−１−メチルピリジニウム塩等のピリジニウム化合物等を挙げることができる。これらの誘導体化剤も、上記ニトロベンゼン化合物と実質的に同様に使用することができる。
【０１３８】
つまり、本発明において、上記誘導体化剤を使用する場合は、本発明に係るアミノ化合物は、一般式［Ｉ'］で表される。
【０１３９】
【化３８】
2014010700.tif 000040
【０１４０】
式［I'］において、Ｒ’は上記Ｒと同じ意味を有するアミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味し、Ｚ’は誘導体化残基を意味する。
【０１４１】
ここで、誘導体化残基は、上記誘導体化剤が、置換アミノ酸誘導体（Ｒ’−ＮＨ２）のアミノ基を誘導体化した残基を意味している。例えば、誘導体化剤としてダンシルクロライドを使用した場合、置換アミノ酸誘導体（Ｒ’−ＮＨ２）のアミノ基がダンシル化、つまり、ジメチルアミノナフタレンスルホニル化されるので、このダンシル基が誘導体化残基ということができる。
【０１４２】
したがって、この場合も、本明細書において、ニトロベンゼンスルホン酸を誘導体化剤として用いた場合についての記載を実質的に同様に適用することができる。
【０１４３】
本発明において、質量分析に用いられる試料のイオン化法については、特に制限はないが、生体分子の検出および定量に広く用いられているＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法、ＡＰＣＩ法等用いられるのが好ましい。分離技術と組み合わせたＬＣ／ＭＳやＧＣ／ＭＳ等においては、試料のイオン化法としてはＥＳＩ法やＡＰＣＩ法を用いられるのがよい。分析には、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ３等のタンデム質量分析方法を用いることができる。この場合、プロダクトイオンの検出には、例えば、夾雑物の影響を排除し高感度な検出が可能な多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いるのが好ましい。
【０１４４】
次に、本発明に係る質量分析方法を用いたバイオマーカーのアッセイ方法について説明する。
本発明は、分析対象としてバイオマーカーを選択することにより、バイオマーカーを、迅速に、高感度かつ高精度に検出および定量できるアッセイ方法を提供することができる。すなわち、本発明のバイオマーカーのアッセイ方法は、アミノ酸誘導体であるバイオマーカーのＮ末端アミノ基とニトロベンゼン化合物等の誘導体化剤とを反応させ、Ｎ末端アミノ基をニトロフェニル化等の誘導体化する工程と、Ｎ末端アミノ基がニトロフェニル化等の誘導体化されたアミノ酸誘導体またはその塩を質量分析する工程と、質量分析方法を用いて得られた質量スペクトルの強度データを用いて、生体試料中のバイオマーカー濃度の定量を行う工程を有している。
【０１４５】
本発明において、バイオマーカーとしては、アミノ基を有するアミン化合物である限り、特に制限はないが、本発明のアッセイ方法が特に好ましく適用できるものとしては、例えば、アミノ酸誘導体と糖の代謝産物との反応により生成される最終糖化産物（ＡＧＥ類）等や、生体アミンであるカテコールアミン(ドパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン)、インドールアミン(セロトニン、メラトニン)、イミダゾールアミン(ヒスタミン)、アセチルコリン、ポリアミン(プトレシン、スペルミジン、スペルミン)等が挙げられる。
【０１４６】
本発明のアッセイ方法による分析対象のバイオマーカーとして特に好ましいＡＧＥ類としては、例えば、構造式［Iii］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ−Ｈ１）、および構造式［Iiii］で表されるトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体（ＡＰ）を挙げることができる。
【０１４７】
【化３９】
2014010700.tif 000041
【０１４８】
【化４０】
2014010700.tif 000042
【０１４９】
これらはそれぞれ、ＭＧ−Ｈ１およびＡＰのＮ−２，４，６−トリニトロフェニル誘導体であり、質量分析方法により高感度で検出および定量が可能なＡＧＥであり、耐糖能異常の診断指標として有用である。
【０１５０】
本発明において、アッセイ対象となるアミノ酸誘導体またはペプチドの濃度をマススペクトルの面積強度から定量するためには、例えば、検量線法または同位体希釈法が用いられる。質量分析において、分析対象物質を定量分析する手法の一つに検量線法が挙げられる。検量線法は、既知量の標準物質を含み、濃度の異なるいくつかの標準試料と、これらの標準試料から得られる信号強度との関係（検量線）が理論的には線形関係になることを利用し、未知試料から得られた信号強度からその試料の濃度を定量する方法である。標準とする試料の調製法により、検量線法は、外部標準法、内部標準法、標準添加法に大別されるが、本アッセイ方法ではいずれの方法を用いてもよい。同位体希釈法は、測定対象化合物を構成する特定の元素の同位体比に着目し、同位体比が既知のスパイクを一定量添加して測定対象化合物の同位体組成を平衡に到達させた後、スパイク添加前後の試料の同位体比を測定し、同位体組成の変化から試料の元素濃度を求める方法であり、検出限界が１ｐｇ程度と低いことが利点として挙げられる。
【０１５１】
上記の様にして得られたバイオマーカーの定量データは、疾患の発症、進行度、予後等の予測や診断に用いることができる。すなわち、本発明の一実施形態としては、アミノ酸誘導体またはペプチドであるバイオマーカーのＮ末端アミノ基とトリニトロフェニル化剤等の誘導体化剤とを反応させ、Ｎ末端アミノ基をトリニトロフェニル化等の誘導体化する工程と、Ｎ末端アミノ基がトリニトロフェニル化等の誘導体化されたアミノ酸誘導体またはペプチドを質量分析する工程と、質量分析方法を用いて得られた質量スペクトルの強度データを用いて、生体試料中のバイオマーカー濃度の定量を行う工程と、このようにして得られるバイオマーカーの濃度データを元に、疾患の発症、進行度、予後等に関する診断を行う工程を有する疾患の診断方法に関するものである。
【０１５２】
本発明の診断方法は、複数種のＡＧＥ類を同時に測定、定量できることからも有用である。すなわち、本発明は、試料中でニトロフェニル化を行うことができる方法であり、また質量分析により分析するものであるから、質量数が異なる対象物質を測定する場合、質量分析法と組み合わせることで同時に測定（定量）することができる優れた方法を提供するものである。本発明により、従来の早期診断法に比べて、費用および手間を大幅に削減することができる。
【実施例】
【０１５３】
以下、本発明の実施例に基づいて、本発明の特徴、作用効果についてより具体的に説明する。これらの実施例はあくまでも例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１５４】
トリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰ）［Iii］を次のようにして製造した。
メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ−Ｈ１）［IIa］を０．１Ｍホウ酸溶液（ｐＨ９．３）に溶解させ、３０ｍＭ  ２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩（ＴＮＢＳ）−０．１Ｍホウ酸溶液（ｐＨ９．３）を１０μＬ添加後、十分に混和した。得られた混合物を３０℃にて２０分間インキュベー卜して、誘導体化を行った。誘導体化したＭＧ−Ｈ１（ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰ）を、それぞれ、１００％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ギ酸（３ｍＬ）及び０．１％ギ酸（３ｍＬ）で平衡化したＳｅｐ−Ｐａｋ Ｐｌｕｓ Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）に負荷し、０．１％ＦＡ（３ｍＬ）で洗浄後、１００％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ギ酸（３ｍＬ）にて溶出した画分を遠心エバポレータで乾固した。画分乾固物は脱イオン水１．５ｍＬで再溶解し、凍結乾燥後、−４０℃で保存した。【０１５５】
【化４１】
2014010700.tif 000043
【実施例２】
【０１５６】
トリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体（ＡＰ−ＴＮＰ）［Iiii］を次のようにして製造した。
アルグピリミジン［IIb］を、実施例１と実質的に同様に処理してトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体（ＡＰ−ＴＮＰ）［Iiii］を得た。【０１５７】
【化４２】
2014010700.tif 000044
【実施例３】
【０１５８】
質量スペクトルの測定
ＭＧ−Ｈ１およびＡＰ、ならびに上記の様にして調製したＭＧ−Ｈ１およびＡＰのＮ−２，４，６−トリニトロフェニル誘導体（それぞれ「ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰ」および「ＡＰ−ＴＮＰ」）を０．１％ギ酸に溶解させ、質量スペクトルの測定を行った。測定条件は下記のとおりである。
・イオン化モード  ＥＳＩ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ
・スキャン範囲  １００〜５００ｍ／ｚ
・ドライガス  ３３０℃、８．０Ｌ／分
・ネブライザーガス  ２７６ｋＰａ
・キャピラリー電圧  −２７５０Ｖ
・スキマー電圧  ４０Ｖ
・キャピラリー出口電圧  １２４Ｖ【０１５９】
ＭＧ−Ｈ１、ＡＰ、ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰおよびＡＰ−ＴＮＰの質量スペクトル（ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ）を、それぞれ、図１、２、３、４に示す。なお、図２、４において、ＭＧ−Ｈ１およびＡＰのＮ−２，４，６−トリニトロフェニル誘導体は、それぞれ、「ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰ」、「ＡＰ−ＴＮＰ」と表記されている。ＭＳ／ＭＳの測定に用いたプリカーサーイオンは、ぞれぞれの化合物についての［Ｍ＋Ｈ］＋イオンである。得られた質量スペクトルのうち、ピーク強度の最も大きなものを、後述するＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ／ＭＳ分析においてモニターの対象となるイオンピークとして選択した。【０１６０】
また、図３、図４に示すＭＳスペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルより予測されるＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰおよびＡＰ−ＴＮＰのフラグメンテーションパターンを、それぞれ図５および図６に示す。
【実施例４】
【０１６１】
ＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ／ＭＳ分析
下記の条件下で、ＭＧ−Ｈ１、ＡＰ、ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰおよびＡＰ−ＴＮＰのＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。サンプル濃度はいずれも１０ｎｍｏｌ／Ｌとし、いずれも０．１％ギ酸水溶液に溶解させた。
＜ＨＰＬＣ条件＞
・移動相  ＭｅＯＨ−０．１％ギ酸水溶液
・流速  ０．２０ｍＬ／分
・グラジエント  ０〜１００％（２５分）
・固定相  Ｗａｔｅｒｓ  Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３（φ２．１×１００ｍｍ）
・カラムオーブン温度  ４０℃【０１６２】
＜ＭＳ条件＞
・イオン化モード  ＥＳＩ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ
・スキャン範囲  １００〜５００ｍ／ｚ
・ドライガス  ３３０℃、８．０Ｌ／分
・ネブライザーガス  ２７６ｋＰａ
・キャピラリー電圧  −２７５０Ｖ
・スキマー電圧  ４０Ｖ
・キャピラリー出口電圧  １２４Ｖ
・インジェクション体積  ２５μＬ【０１６３】
ＭＧ−Ｈ１、ＡＰ、ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰおよびＡＰ−ＴＮＰのマスクロマトグラムを、それぞれ、図７、８に示す。図７の結果より、ＭＧ−Ｈ１のＮ末端アミノ基を２，４，６−トリニトロフェニル化することにより、ピーク強度が１５００倍程度に増大することが確認された。
【実施例５】
【０１６４】
検量線の作製ならびに検出限界および定量限界の決定
内部標準としてＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰの重水素化体（ＭＧ−Ｈ１−ｄ３−ＴＮＰ）を用いて、ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰおよびＡＰ−ＴＮＰの検量線を作製した。酸による分解の影響を避けるために、インジェクション直前に０．１％ギ酸水溶液を添加する手順（表１参照）で希釈を行い、高濃度側から測定を行った。まず、原液として、ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰおよびＡＰ−ＴＮＰの１μｍｏｌ／ｍＬ水溶液を調製し、終濃度が４００、２００、４０、２０、４、２ｐｍｏｌ／ｍＬとなるように水で希釈した。各濃度について、これらの等モル混合物２５μＬに、ＭＧ−Ｈ１−ｄ３−ＴＮＰの４００ｐｍｏｌ／ｍＬ水溶液２５μＬを加え、０．２％ギ酸水溶液５０μＬを加えて十分混和し、うち２５μＬをＬＣ−ＭＳ分析に用いた。【０１６５】
【表１】
2014010700.tif 000045
【０１６６】
得られた質量スペクトルにおけるＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰまたはＡＰ−ＴＮＰと、ＭＧ−Ｈ１−ｄ３−ＴＮＰとのピーク強度比をＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰまたはＡＰ−ＴＮＰの濃度に対しプロットすることにより、図９および１０に示す検量線が得られた。これらより、ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰについて、検出限界２．０５ｐｍｏｌ／ｍＬ、定量限界６．２０ｐｍｏｌ／ｍＬ、ＡＰ−ＴＮＰについて、検出限界０．１１ｐｍｏｌ／ｍＬ、定量限界０．３３ｐｍｏｌ／ｍＬという結果が得られた。同様にＣＭＬ−ＴＮＰについて検量線を作製し濃度換算すると、検出限界５．３ｎｍｏｌ／Ｌ、定量限界１６ｎｍｏｌ／Ｌであった。また、ＣＥＬ−ＴＮＰについては、検出限界２．７ｎｍｏｌ／Ｌ、定量限界８．０ｎｍｏｌ／Ｌであった。検量線については、相関係数０．９９６以上の良好な直線性が得られると共に、それぞれについてｐｍｏｌレベル（濃度としてｎＭ／Ｌレベル）での定量分析が可能であることが確認された。これらの数値は、従来より用いられている誘導体化剤であるダンシルクロリドやＮＤＡ（２，３−ナフタレンジアルデヒド）における検出限界の１／１００〜１／２００であり、２，４，６−トリニトロフェニル化により大幅な感度向上が可能であることを示している。
【実施例６】
【０１６７】
２，４，６−トリニトロフェニル化におけるｐＨの影響
実施例１および２においてＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰおよびＡＰ−ＴＮＰのそれぞれの調製において、反応液のｐＨを７．５、８．０、８．５にした場合における誘導体化率を、ＬＣ−ＭＳ分析を用いて算出した。遠心エバポレータ処理により得られた乾固物を０．２％ギ酸水溶液１００μＬに溶解し、内部標準としてＭＧ−Ｈ１−ｄ３−ＴＮＰの２００ｐｍｏｌ／ｍＬ水溶液５０μＬを加え、十分に混和した後、２５μＬをＬＣ−ＭＳ分析に供し、検量線法により２，４，６−トリニトロフェニル体の濃度を決定した。結果は、図１１、１２に示すとおりであり、ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰまたはＡＰ−ＴＮＰのいずれの場合についても、ｐＨ８．５〜９．３で、定量的に誘導体化が可能であることが確認された。
【実施例７】
【０１６８】
ラット血漿スパイク試験
ＳＤラットのコントロール血漿に対し、ＭＧ−Ｈ１、ＡＰおよび内部標準であるＭＧ−Ｈ１−ｄ３をスパイクし、回収後、２，４，６−トリニトロフェニル化を行った。血漿に対する前処理は、図１３に示すプロトコール（E.M.N. Nakashima et al., Anal. Biochem., 414, 109-116（2011）参照）に準拠して行い、スパイクしたＭＧ−Ｈ１、ＡＰおよびＭＧ−Ｈ１−ｄ３の同時検出を試みた。標準添加法により作製した検量線を用いたＬＣ−ＭＳ分析により、ＭＧ−Ｈ１およびＡＰについて、血漿中濃度の定量が可能であることが確認された。
【実施例８】
【０１６９】
Ｖａｌ−Ｔｙｒを用いた検討
ＡＧＥ類であるＭＧ−Ｈ１およびＡＰの代わりにジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを用いて、上記と同様の手順により、２，４，６−トリニトロフェニル化による検出感度の変化を検討した結果、ＭＧ−Ｈ１の場合と同様、２，４，６−トリニトロフェニル化によりピーク強度が約５０倍に増大することが確認された（表２）。
【実施例９】
【０１７０】
ジペプチドを用いた検討
実施例８と実質的に同様にして下記ジペプチドを調製し、検出感度の変化を検討した。その結果を表２に示す。【０１７１】
【表２】
2014010700.tif 000046
【産業上の利用可能性】
【０１７２】
この発明は、例えば、生体内成分であるタンパク質が代謝過程で糖化等された最終糖化産物や中間産物等の代謝産物を始めとするアミノ酸誘導体をニトロベンゼン化合物等の誘導体化剤により誘導体化したアミノ化合物であって、特に耐糖能異常の診断に有用な化合物であるところから、これらのあの化合物を迅速、高感度かつ高精度に定量することが可能である質量分析方法である。したがって、これらのアミノ化合物をバイオマーカーとしてアッセイすることにより様々な疾患の予防や診断に役立ち、これによりその疾患の予防薬や治療薬の開発に役に立つことが期待できる。
【図１】
2014010700.tif 000065
【図２】
2014010700.tif 000066
【図３】
2014010700.tif 000067
【図４】
2014010700.tif 000068
【図５】
2014010700.tif 000069
【図６】
2014010700.tif 000070
【図７】
2014010700.tif 000071
【図８】
2014010700.tif 000072
【図９】
2014010700.tif 000073
【図１０】
2014010700.tif 000074
【図１１】
2014010700.tif 000075
【図１２】
2014010700.tif 000076
【図１３】
2014010700.tif 000077
【手続補正書】
【提出日】平成26年3月20日(2014.3.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
（削除）
【請求項２０】
（削除）
【請求項２１】
（削除）
【請求項２２】
（削除）
【請求項２３】
（削除）
【請求項２４】
（削除）
【請求項２５】
（削除）
【請求項２６】
一般式［Ｉａ］で表されるアミノ化合物またはその塩を質量分析で測定するアミノ化合物またはその塩の質量分析方法において、
【化１】
2014010700.tif 000078
（式中、Ｒはアミノ置換基を意味し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。）
式［Ｉａ］で表されるアミノ化合物またはその塩におけるアミノ置換基が、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基であり、
前記アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンまたはそれらの置換体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アルギニン、リジン、バリン、チロシン、メチオニン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸もしくはトリプトファンまたはそれらの置換体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ化合物が、一般式［Ｉｉ］で表されることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【化２】
2014010700.tif 000079
（式中、Ｒは前記と同じ意味を有する。）
【請求項２９】
請求項２６に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ化合物が、一般式［Ｉｂ］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または一般式［Ｉｃ］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【化３】
2014010700.tif 000080
【化４】
2014010700.tif 000081
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。）
【請求項３０】
請求項２６に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ化合物が、
構造式［Ｉｉｉ］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または構造式［Ｉｉｉｉ］で表されるトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【化５】
2014010700.tif 000082
【化６】
2014010700.tif 000083
【請求項３１】
一般式［ＩＩ］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩において、アミノ置換基がアミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基であり、
前記アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンまたはそれらの置換体であるアミノ酸誘導体またはその塩と、
一般式［ＩＩＩａ］で表されるニトロベンゼン化合物と、を反応させて一般式［Ｉａ］で表されるアミノ化合物またはその塩を得る工程と、
上記工程で得られたアミノ化合物またはその塩を質量分析する工程を有することを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【化７】
2014010700.tif 000084
（式中、Ｒはアミノ置換基を意味する。）
【化８】
2014010700.tif 000085
（式中、Ｘはアミノ基反応性官能基を意味し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。）
【化９】
2014010700.tif 000086
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味し、Ｒは前記と同じ意味を有する。）
【請求項３２】
前記一般式［ＩＩ］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩と、一般式［ＩＩＩａ］で表されるニトロベンゼン化合物の反応を、アルカリ性水溶液または水と有機溶媒の混合溶液であり、かつ前記溶液のｐＨが８〜１０でおこなうことを特徴とする請求項３１に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記反応が試料中で行われることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【請求項３４】
請求項３１に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ酸誘導体またはその塩がバイオマーカーであることを特徴とするアミノ化合物の質量分析方法。
【請求項３５】
請求項２６または３１に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法により得られる質量スペクトルの強度データを用いて、生体試料中のバイオマーカー濃度の定量を行うことを特徴とするバイオマーカーのアッセイ方法。
【請求項３６】
一般式［Ｉａ］で表されるアミノ化合物またはその塩であって、
式［Ｉａ］におけるアミノ置換基が、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基であり、
前記アミノ酸残基もしくは前記置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンまたはそれらの置換体である質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
【化１０】
2014010700.tif 000087
（式中、Ｒはアミノ置換基を意味し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。）
【請求項３７】
請求項３６に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
前記アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アルギニン、リジン、バリン、チロシン、メチオニン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸もしくはトリプトファンまたはそれらの置換体であることを特徴とする質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
【請求項３８】
請求項３６に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
前記置換アミノ酸残基が、最終糖化産物（ＡＧＥ）の残基であることを特徴とする質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
【請求項３９】
請求項３８に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
前記最終糖化産物（ＡＧＥ）が、アルギニン誘導体またはリジン誘導体であることを特徴とする質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
【請求項４０】
請求項３６に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
前記ペプチド残基のペプチドが、２個ないし１０個のアミノ酸がペプチド結合していることを特徴とする質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
【請求項４１】
請求項３６に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
前記アミノ化合物が、一般式［Ｉｉ］で表されることを特徴とする質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
【化１１】
2014010700.tif 000088
（式中、Ｒは前記と同じ意味を有する。）
【請求項４２】
一般式［Ｉｂ］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または一般式［Ｉｃ］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
【化１２】
2014010700.tif 000089
【化１３】
2014010700.tif 000090
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。）
【請求項４３】
請求項４２に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
前記アミノ化合物が、構造式［Ｉｉｉ］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または構造式［Ｉｉｉｉ］で表されるトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
【化１４】
2014010700.tif 000091
【化１５】
2014010700.tif 000092
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
［００７１］
式［Ｉ’］において、Ｒ’は、前記Ｒと同じ意味を有する置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味し、Ｚ’は誘導体化残基を意味する。
［００７２］
本発明は、さらに別の形態として、上記のアミノ化合物の質量分析方法により得られる質量スペクトルの強度データを用いて、生体試料中のバイオマーカー濃度の定量を行うバイオマーカーのアッセイ方法を提供する。式［Ｉ’］において、Ｒ’は、前記Ｒと同じ意味を有する置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味し、Ｚ’は誘導体化残基を意味する。
［００７２−１］
本発明は、下記のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法およびバイオマーカーのアッセイ方法、ならびにアミノ化合物またはその塩を提供する。
［１］  一般式［Ｉａ］で表されるアミノ化合物またはその塩を質量分析で測定するアミノ化合物またはその塩の質量分析方法において、
［化１８−１］
2014010700.tif 000093
式中、Ｒはアミノ置換基を意味し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。
前記一般式［Ｉａ］で表されるアミノ化合物またはその塩のアミノ置換基が、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基であり、
前記アミノ酸残基もしくは前記置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンまたはそれらの置換体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
［２］  前記［１］に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アルギニン、リジン、バリン、チロシン、メチオニン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸もしくはトリプトファンまたはそれらの置換体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
［３］  前記［１］または［２］に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ化合物が、一般式［Ｉｉ］で表されることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
［化１８−２］
2014010700.tif 000094
式中、Ｒは前記と同じ意味を有する。
［４］  前記［１］〜［３］のいずれかに記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ化合物が、一般式［Ｉｂ］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または一般式［Ｉｃ］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
［化１８−３］
2014010700.tif 000095
［化１８−４］
2014010700.tif 000096
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。
［５］  前記［１］〜［４］のいずれかに記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ化合物が、構造式［Ｉｉｉ］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または構造式［Ｉｉｉｉ］で表されるトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
［化１８−５］
2014010700.tif 000097
［化１８−６］
2014010700.tif 000098
［００７２−２］
［６］  一般式［ＩＩ］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩において、アミノ置換基がアミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基であり、前記アミノ酸残基もしくは前記置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンまたはそれらの置換体であるアミノ酸誘導体またはその塩と、一般式［ＩＩＩａ］で表されるニトロベンゼン化合物を反応させて一般式［Ｉａ］で表されるアミノ化合物またはその塩を得る工程と、
上記工程で得られたアミノ化合物またはその塩を質量分析する工程を有することを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
［化１８−７］
2014010700.tif 000099
式中、Ｒはアミノ置換基を意味する。
［化１８−８］
2014010700.tif 000100
式中、Ｘはアミノ基反応性官能基を意味し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。
［化１８−９］
2014010700.tif 000101
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味し、Ｒは前記と同じ意味を有する。
［７］  前記一般式［ＩＩ］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩と、一般式［ＩＩＩａ］で表されるニトロベンゼン化合物の反応を、アルカリ性水溶液または水と有機溶媒の混合溶液であり、かつ前記溶液のｐＨが８〜１０でおこなうことを特徴とする前記［６］に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
［８］  前記［６］または［７］に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記反応が試料中で行われることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
［９］  前記［６］〜［８］のいずれかに記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ酸誘導体またはその塩がバイオマーカーであることを特徴とするアミノ化合物の質量分析方法。
［００７２−３］
［１０］  前記［１］〜［９］のいずれかに記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法により得られる質量スペクトルの強度データを用いて、生体試料中のバイオマーカー濃度の定量を行うことを特徴とするバイオマーカーのアッセイ方法。
［００７２−４］
［１１］  一般式［Ｉａ］で表されるアミノ化合物またはその塩であって、式［Ｉａ］におけるアミノ置換基が、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基であり、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンもしくはテロシンまたはそれらの置換体である質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
［化１８−１０］
2014010700.tif 000102
式中、Ｒはアミノ置換基を意味し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。
［１２］  前記［１１］に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アルギニン、リジン、バリン、チロシン、メチオニン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸もしくはトリプトファンまたはそれらの置換体であることを特徴とする質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
［１３］  前記［１１］または［１２］に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記置換アミノ酸残基が、最終糖化産物（ＡＧＥ）の残基であることを特徴とする質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
［１４］  前記［１３］に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記最終糖化産物（ＡＧＥ）が、アルギニン誘導体またはリジン誘導体であることを特徴とする質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
［１５］  前記［１１］または［１２］に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記ペプチド残基のペプチドが、２個ないし１０個のアミノ酸がペプチド結合していることを特徴とする質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
［１６］  前記［１１］〜［１５］のいずれかに記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記アミノ化合物が、一般式［Ｉｉ］で表されることを特徴とする質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
［化１８−１１］
2014010700.tif 000103
式中、Ｒは前記と同じ意味を有する。
［００７２−５］
［１７］  一般式［Ｉｂ］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または一般式［Ｉｃ］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
［化１８−１２］
2014010700.tif 000104
［化１８−１３］
2014010700.tif 000105
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。
［１８］  前記［１７］に記載のアミノ化合物またはその塩であって、前記アミノ化合物が、構造式［Ｉｉｉ］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または構造式［Ｉｉｉｉ］で表されるトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
［化１８−１４］
2014010700.tif 000106
［化１８−１５］
2014010700.tif 000107
発明の効果
［００７３］
本発明によって、アミノ酸誘導体のＮ末端アミノ基を誘導体化することにより、質量分析におけるイオン化効率が向上し、試料中に少量しか存在しない最終糖化産物等の分子バイオマーカーやペプチドホルモンについても、質量分析方法を用いて迅速、高感度かつ高精度な定量分析が可能になる。したがって、本発明は、アミノ酸誘導体とニトロベンゼン化合物等の誘導体化剤との誘導体化生成物である新規なアミノ化合物、好ましくはタンパク質の解糖等の反応中間産物である糖化タンパク質分解物がニトロベンゼン化合物等の誘導体化剤で誘導体化された、耐糖能異常の診断に有用な新規な糖化タンパク質分解物誘導体を提供する。また、本発明は、そのアミノ化合物についての迅速、高感度かつ高精度な定量が可能な質量分析方法およびそれを用いたバイオマーカーのアッセイ方法を提供する。
図面の簡単な説明
［００７４］
［図１］メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ−Ｈ１）の質量スペクトル（ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ）である。
［図２］ＭＧ−Ｈ１の２，４，６−トリニトロフェニル誘導体（ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰ）の質量スペクトル（ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ）である。
［図３］アルグピリミジン（ＡＰ）の質量スペクトル（ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ）である。
［図４］ＡＰの２，４，６−トリニトロフェニル誘導体（ＡＰ−ＴＮＰ）の質量スペクトル（ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ）である。
［図５］質量スペクトルより予測されるＭＧ−Ｈ１の２，４，６−トリニトロフェニル誘導体（ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰ）のフラグメンテーションパターンを示す
【手続補正書】
【提出日】平成27年1月13日(2015.1.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式［Ia］で表されるアミノ化合物またはその塩を質量分析で測定するアミノ化合物またはその塩の質量分析方法において、
【化１】
2014010700.tif 000108
（式中、Ｒはアミノ置換基を意味し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。）
式［Ia］で表されるアミノ化合物またはその塩におけるアミノ置換基が、置換アミノ酸残基またはペプチド残基であり、
前記置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンまたはそれらの置換体であり、
かつ、前記置換アミノ酸残基が、最終糖化産物（ＡＧＥ）の残基である、または前記ペプチド残基のペプチドが、２個ないし１０個のアミノ酸がペプチド結合しているペプチドであることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【請求項２】
請求項１に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、
前記最終糖化産物（ＡＧＥ）が、置換アルギニン誘導体または置換リジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【請求項３】
請求項１に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、
前記最終糖化産物（ＡＧＥ）が、グリオキサールヒドロイミダゾロン、メチルグリオキサールヒドロイミダゾロン、アルグピリミジン、カルボキシメチルリジン、カルボキシエチルリジンからなる群から選択されるいずれかの最終糖化産物（ＡＧＥ）であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【請求項４】
請求項１に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、
前記置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アルギニン、リジン、バリン、チロシン、メチオニン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸もしくはトリプトファンまたはそれらの置換体であることを特徴とする質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ化合物が、一般式［Ii］で表されることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【化２】
2014010700.tif 000109
（式中、Ｒは前記と同じ意味を有する。）
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ化合物が、一般式［Ib］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または一般式［Ic］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【化３】
2014010700.tif 000110
【化４】
2014010700.tif 000111
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。）
【請求項７】
請求項６に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ化合物が、
構造式［Iii］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または構造式［Iiii］で表されるトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【化５】
2014010700.tif 000112
【化６】
2014010700.tif 000113
【請求項８】
一般式［II］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩において、アミノ置換基が置換アミノ酸残基またはペプチド残基であり、
前記置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンまたはそれらの置換体であり、
かつ、前記置換アミノ酸残基が、最終糖化産物（ＡＧＥ）の残基である、または前記ペプチド残基のペプチドが、２個ないし１０個のアミノ酸がペプチド結合しているペプチドであるアミノ酸誘導体またはその塩と、
一般式［IIIa］で表されるニトロベンゼン化合物と、を反応させて一般式［Ia］で表されるアミノ化合物またはその塩を得る工程と、
上記工程で得られたアミノ化合物またはその塩を質量分析する工程を有することを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【化７】
2014010700.tif 000114
（式中、Ｒはアミノ置換基を意味する。）
【化８】
2014010700.tif 000115
（式中、Ｘはアミノ基反応性官能基を意味し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。）
【化９】
2014010700.tif 000116
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味し、Ｒは前記と同じ意味を有する。）
【請求項９】
前記一般式［II］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩と、一般式［IIIa］で表されるニトロベンゼン化合物の反応を、アルカリ性水溶液または水と有機溶媒の混合溶液であり、かつ前記溶液のｐＨが８〜１０でおこなうことを特徴とする請求項８に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記反応が試料中で行われることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれかに記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ酸誘導体またはその塩がバイオマーカーであることを特徴とするアミノ化合物の質量分析方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法により得られる質量スペクトルの強度データを用いて、生体試料中のバイオマーカー濃度の定量を行うことを特徴とするバイオマーカーのアッセイ方法。
【請求項１３】
一般式［Ia］で表されるアミノ化合物またはその塩であって、
式［Ia］におけるアミノ置換基が、置換アミノ酸残基またはペプチド残基であり、
前記置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンまたはそれらの置換体であり、
かつ、前記置換アミノ酸残基が、最終糖化産物（ＡＧＥ）の残基である、または前記ペプチド残基のペプチドが、２個ないし１０個のアミノ酸がペプチド結合しているペプチドである質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
【化１０】
2014010700.tif 000117
（式中、Ｒはアミノ置換基を意味し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。）
【請求項１４】
請求項１３に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
前記最終糖化産物（ＡＧＥ）が、置換アルギニン誘導体または置換リジン誘導体であることを特徴とする質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
【請求項１５】
請求項１３に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
前記置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アルギニン、リジン、バリン、チロシン、メチオニン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸もしくはトリプトファンまたはそれらの置換体であることを特徴とする質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれかに記載のアミノ化合物またはその塩であって、
前記アミノ化合物が、一般式［Ii］で表されることを特徴とする質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
【化１１】
2014010700.tif 000118
（式中、Ｒは前記と同じ意味を有する。）
【請求項１７】
一般式［Ib］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または一般式［Ic］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
【化１２】
2014010700.tif 000119
【化１３】
2014010700.tif 000120
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。）
【請求項１８】
請求項１７に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
前記アミノ化合物が、構造式［Iii］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または構造式［Iiii］で表されるトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
【化１４】
2014010700.tif 000121
【化１５】
2014010700.tif 000122
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ化合物およびその高感度質量分析方法ならびにバイオマーカーのアッセイ方法に関する。更に詳しくは、最終糖化産物を始めとするアミノ酸誘導体とニトロベンゼン系化合物との誘導体化で得られるアミノ化合物およびその塩、ならびにこのアミノ化合物を迅速に高感度かつ高精度で定量が可能な質量分析方法、およびそれを用いたバイオマーカーのアッセイ方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、血糖値が病的に高い状態をいうが、血糖値の異常に起因する急性症状以外に、高血糖状態が長期間継続することに伴い、種々の臓器が障害を受け、糖尿病慢性期合併症を発症すると、治療が非常に困難になるため、早期に発症を診断し、生活習慣の改善、経口血糖降下薬の投与、インスリン注射等の処置を開始することが重要である。
【０００３】
しかし、生活習慣病を主因とする糖尿病患者数は年々増加の一途を辿っており、厚生労働省の推計では９００万人を超えるのはもはや時間の問題と言われている。その糖尿病患者数に加えて、いわゆる糖尿病予備軍が１０００万人以上いると推定されることから、糖尿病疾患患者数は近い将来激増することは想像に難くない。しかしながら、実際に糖尿病の治療を受けている患者はわずか３００万人足らずであり、また十分な診断を受けずに放置して治療が遅れたために腎症に至る患者が、毎年１万人ずつ増加し続けているのが現状である。その上、糖尿病の患者の約半数は心筋梗塞や脳梗塞等の虚血性疾患で死亡していることを考え合わせると、糖尿病とその合併症、ならびにいわゆる隠れ糖尿病（糖尿病前症）に対する対策は、医療経済からしても極めて重要である。とりわけ、健康診断の血糖値測定のみでは判定が極めて困難な潜在的糖尿病予備軍である糖尿病前症に対する対策、つまり早期診断方法と治療システムの確立は急務である。
【０００４】
しかも、近年、糖尿病前症の中でも、空腹時血糖値（ＦＰＧ）は正常であるのに、耐糖能障害（ＩＧＴ）のために食後血糖値が極端に高くなり、これにより心血管障害を引き起こす患者が増加していることが指摘されている。このため、米国糖尿病学会や世界保健機構は、糖尿病前症をれっきとした疾患と定め、生活習慣の質的改善と薬物治療による糖尿病前症のＩＧＴ改善の重要性を唱えている。前述したように、このような糖尿病前症といわれる患者は、日本でも、推定１０００万人を超えていると考えられるところから、糖尿病前症に対する予防ならびに治療対策は極めて重要である。
【０００５】
日本糖尿病学会では、糖尿病前症や糖尿病の診断基準として、一次健康診断では空腹時血糖値（ＦＰＧ）、また二次健康診断では経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）の実施を指導してきた。糖尿病前症患者の耐糖能障害は、一次健康診断のＦＰＧ検査やグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）検査だけでは正確に診断することが困難であるところから、一次健康診断で糖尿病前症が疑われる被検者に対しては、ＯＧＴＴの二次健康診断の受診を勧められている。しかしながら、このＯＧＴＴは、被験者の長い拘束時間や簡便性に欠けている上に、糖（グルコース）負荷という身体的負担を課するとともに急激な血糖値上昇等の危険が伴う等の問題があり、一般の健康診断での血液検査による血糖値検査法のように普及していないのが実情である。その結果、潜在的な糖尿病前症の多くが、ＯＧＴＴの二次健康診断の受診を怠ってしまい、糖尿病やその合併症を自覚することなく未治療のまま真性の糖尿病に進行し、さらに重篤な合併症を発症するか、または腎透析を余儀なくされるに至っている。
【０００６】
一次健康診断では、通常、空腹時血糖（ＦＰＧ）、随時血糖あるいはグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を判定指標とした検査が実施されていて、ＦＰＧ値が１００ｍｇ／ｄＬ以上、またはＨｂＡ１ｃ値が５．２％以上であれば、インスリン抵抗性もしくはそれによるＩＧＴの疑いありと診断されている。しかし、インスリン抵抗性によるＩＧＴは、食後高血糖が主たる初期変化として現れてくることから、従来の一次健康診断で使用されているいずれの指標も精度の点で不十分と言わざるを得ず、従来の一次健康診断法は、糖尿病前症の早期診断としては利用することができない。
【０００７】
そこで、現実的には、一次健康診断において、これらの指標を用いてインスリン抵抗性あるいはＩＧＴが疑われる被検者に対して、二次健康診断あるいはそれ以降の健康診断で７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験（７５ｇ ＯＧＴＴ）、血中インスリン、ＨＯＭＡ−Ｒ等の検査により、インスリン抵抗性もしくはＩＧＴが陽性であるかどうかを検査して、糖尿病前症の確定診断がなされている。これらの検査は、当然のことながら費用も手間もかかることになる。
【０００８】
そこで、もし一次健康診断で用いた同じ血糖測定用採血サンプルでＯＧＴＴと同等の精度で糖尿病前症の診断を確定できる方法があれば、糖尿病前症患者の検出率は飛躍的に向上するとともに、二次健康診断でのＯＧＴＴ検査は不要となり、世界保健機構等が提唱する糖尿病前症の早期診断ならびに治療による糖尿病化阻止戦略を強力に推し進めることが可能となる。
【０００９】
他方、近年、糖尿病慢性期合併症のリスクファクターとして、種々の最終糖化産物が注目を集めている。最終糖化産物（ＡＧＥ類）は、糖化タンパク質、メイラード反応産物等とも呼ばれ、グルコース等の還元糖とタンパク質のアミノ基との非酵素的な反応により生成する種々の構造を有するタンパク質誘導体である。ＡＧＥ類は、細胞外マトリックスタンパク質、膜タンパク質および細胞内タンパク質の糖化修飾に起因するこれらのタンパク質の機能及びそれに依存する細胞機能の破綻、あるいはＡＧＥ類をリガンドとするレセプターが引き起こす細胞応答の結果として、種々の病変の発症及び増悪に関与している。例えば、ＡＧＥ類レセプターの１つであるＲＡＧＥ類によってＡＧＥ類が認識されると、細胞内ＮＡＤＰＨオキシダーゼによる細胞内酸化ストレス物質の産生が亢進し、これが上皮細胞における遺伝子発現を変化させることにより、種々の糖尿病性血管障害が発症すると考えられている（非特許文献１参照）。
【００１０】
ＡＧＥ類の中でも、解糖系の中間体または副産物として産生されるグリセルアルデヒドやメチルグリオキサール（ＭＧ）に由来するものは、糖尿病および耐糖能異常の発症および予後予測等に関する診断マーカーとして期待を集めている（非特許文献２、３、４、５）。
【００１１】
非特許文献２には、２型糖尿病患者の血清について、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾールのポリクロナール抗体を用いたＥＬＩＳＡ系で測定した結果、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾールの血清レベルが同齢健常人に比較して増加しているとの報告がなされている。同非特許文献２は、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾールの血清レベルと、ＡＧＥ類の１種であるＮε−（カルボニルメチル）リジンの血清レベルとの間には、同様に有意な相関関係があるが、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾールの血清レベルは、空腹時血糖の血漿レベルやヘモグロビンレベルとは関連性はなかったと報告している。
【００１２】
非特許文献３は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて１型糖尿病患者の血漿を測定した結果、タンパク質の糖化または酸化による付加生成物の濃度ならびにその遊離残基（free adduct）の濃度が増加していることを示している。例えば、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロンやグリオキサール由来ヒドロイミダゾロンあるいはその他のＡＧＥ類であるＮε−（カルボニルメチル）リジン、Ｎε−（カルボニルエチル）リジン、ならびにこれらの遊離付加物（ｆｒｅｅ  ａｄｄｕｃｔ）が増加していることが報告されている。
【００１３】
非特許文献４は、１型糖尿病患者の血漿をタンデム質量分析した結果、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン遊離付加物が糖尿病患者のマーカーとして優れていることを示唆している。
【００１４】
非特許文献５は、１型糖尿病患者の血漿ならびに尿サンプルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定した結果、糖負荷後の血糖値とインスリン値の上昇に加えて、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾール遊離付加物を初めとして、Ｎε−（カルボニルメチル）リジン、Ｎε−（カルボニルエチル）リジン、グリオキサール由来ヒドロイミダゾロン、Ｎδ−［５−（２，３，４−トリヒドロキシブチル）−５−ヒドロ４−イミダゾロン２−イル］−オルニチン（３ＤＧ−Ｈ１）等のｆｒｅｅ  ａｄｄｕｃｔも増加することを報告している。即ち、この論文は、食後には高血糖になるだけでなく、高カルボニルストレス状態も誘発されることを示している。さらに、この文献には、メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン遊離付加物の他、アルグピリミジンを含む多くのＡＧＥ類、ならびにアミノ酸（アルギニン、リジン、メチオニン、チロシンおよびトリプトファン）についてのタンデム質量分析結果が記載されている。
【００１５】
上述したように、これらのＡＧＥ類をタンデム質量（ＭＳ／ＭＳ）分析する手法が報告されている。しかしながら、これらのＡＧＥ類についての測定は、ＥＬＩＳＡ法等の免疫化学的手法を用いた総量評価以外に有効な手法が存在しないのが現状であり（特許文献１）、個別のＡＧＥ類およびその分解産物について確立した測定法は殆ど存在しておらず、ましてや臨床に応用可能な測定法は存在してないと言わざるを得ない。これらの個別のＡＧＥ類の定量は、糖尿病および耐糖能異常の診断のみならず、メタボローム解析等においても有用であることから、ＡＧＥ類についてより迅速に高感度かつ高精度に個別の化合物を測定できるアッセイ法が強く望まれている。
【００１６】
ＡＧＥ類分析の他に、アミノ酸分析も、臨床分野、例えば先天的な代謝障害のアッセイにとって非常に重要であり、また診断のバイオマーカー検索に使用できる可能性を持っている。アミノ酸分析は、例えば、先天性アミノ酸症の診断や、肝臓機能障害の重症度や治療の指針等として使用されている。また、最近の報告では、アミノ酸のプロファイルが、慢性Ｃ型肝炎患者の進行型線維症等の診断に応用されている。さらに、アミノ酸のプロファイルを指標として用いて、生物の健康度合いの分析の可能性までも報告されている（非特許文献６）。
【００１７】
上述したようなアミノ酸分析のために、アミノ酸自動分析装置が開発された。この装置はニンヒドリン試薬を用いたアミノ酸の比色を測定するものであり、分析には非常に時間を要するものである。
【００１８】
上記のような比色測定方法の他に、プレカラム誘導体化法が開発され、このプレカラム誘導体化法に使用する誘導体化剤も様々なものが開発されている（非特許文献６）。しかし、この誘導体化法は複雑で時間を要する技術である。さらに、この誘導体化法と質量分析方法を組み合わせた自動アミノ酸分析方法も開発されているが、この方法にしても更なる改良が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】特開２００８−２２４４５３号公報
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Marie-Paule Wautier他著、「Activation of NADPH oxidase by AGE links oxidant stress to altered gene expression via RAGE」、American Journal of Physiology -Endocrinology and Metabolism、（米国）、アメリカ生理学会（American Physiological Society）、２００１年５月、第２８０巻、Ｅ６８５−Ｅ６９４
【非特許文献２】Kilhovd, B.K., et al. Metabolism, Vol 52, No 2 (February), 2003: pp. 163-167
【非特許文献３】Rabbani, N., and Thornalley, P.J. Amino Acids DOI 10.1007/s00726-010-0783-0
【非特許文献４】Ahmed, N., et al. Diabetologia (2005) 48: 1590-1603
【非特許文献５】Ahmed, N., et al. Diabetes Care, Vol. 28, No. 10, October  2005, pp. 2465-2471
【非特許文献６】Shimbo, K., et al. Biomed. Chromatogr. 2010; 24: 683-691.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
そこで、本発明者らは、かかる事情に鑑みて鋭意検討を重ねた結果、ＡＧＥ類のメチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ−Ｈ１）ならびにアルグピリミジン（ＡＰ）の末端アミノ基をニトロベンゼン系化合物で誘導体化することによって、質量分析における感度が大幅に向上する上に、ＡＧＥ類に加えて、その他のアミノ酸誘導体またはペプチド等のアミノ化合物にも応用できることを見いだして、本発明を完成するに至った。
【００２２】
したがって、本発明は、特に最終糖化産物を始めとするアミノ酸誘導体とニトロベンゼン系化合物との誘導体化で得られるアミノ化合物およびその塩、ならびにこのアミノ化合物を迅速に高感度かつ高精度で定量が可能な質量分析方法、およびそれを用いたバイオマーカーのアッセイ方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
上記目的を達成するために、本発明は、一般式［Ｉ］で表されるアミノ化合物またはその塩を提供する。
【００２４】
【化１】
2014010700.tif 000123
【００２５】
式［Ｉ］において、Ｒはアミノ置換基を意味し、Ｚはニトロフェニル基を意味する。
【００２６】
本発明は、その好ましい態様として、上記アミノ置換基が、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基または該アミノ酸残基ならびに／もしくは置換アミノ酸残基がペプチド結合したペプチド残基であるアミノ化合物またはその塩を提供する。
【００２７】
本発明は、その好ましい態様として、上記アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンまたはそれらの置換体、好ましくはアルギニン、リジン、バリン、チロシン、メチオニン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸もしくはトリプトファンまたはそれらの置換体であるアミノ化合物またはその塩を提供する。
【００２８】
本発明は、その好ましい別の態様として、上記置換アミノ酸残基が、最終糖化産物（ＡＧＥ）、好ましくはアルギニン誘導体またはリジン誘導体の残基であるアミノ化合物またはその塩を提供する。
【００２９】
本発明は、その好ましい別の態様として、上記ペプチド残基のペプチドが、２個ないし１０個のアミノ酸がペプチド結合しているアミノ化合物またはその塩を提供する。
【００３０】
本発明は、その好ましい別の態様として、上記ニトロフェニル基が、一般式［IIIb］で表されるアミノ化合物またはその塩を提供する。
【００３１】
【化２】
2014010700.tif 000124
【００３２】
式［IIIb］において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。
【００３３】
本発明は、そのより好ましい態様として、上記アミノ化合物が、一般式［Ia］で表されるアミノ化合物またはその塩を提供する。
【００３４】
【化３】
2014010700.tif 000125
【００３５】
式［Ia］において、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ前記と同じ意味を有する。
【００３６】
本発明は、そのより好ましい別の態様として、上記アミノ化合物が、一般式［Ii］で表されるアミノ化合物またはその塩を提供する。
【００３７】
【化４】
2014010700.tif 000126
【００３８】
式［Ii］において、Ｒは前記と同じ意味を有する。
【００３９】
本発明は、そのより好ましい態様として、上記アミノ化合物が、一般式［Ib］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または一般式［Ic］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であるアミノ化合物またはその塩を提供する。
【００４０】
【化５】
2014010700.tif 000127
【００４１】
【化６】
2014010700.tif 000128
【００４２】
式［Ib］及び［Ic］において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。
【００４３】
本発明は、そのより好ましい態様として、上記アミノ化合物が、構造式［Iii］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または構造式［Iiii］で表されるトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であるアミノ化合物またはその塩を提供する。
【００４４】
【化７】
2014010700.tif 000129
【００４５】
【化８】
2014010700.tif 000130
【００４６】
本発明は、その別の形態として、一般式［Ｉ］で表されるアミノ化合物またはその塩を質量分析で測定するアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。
【００４７】
【化９】
2014010700.tif 000131
【００４８】
式［Ｉ］において、Ｒはアミノ置換基、例えば、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味し、Ｚはニトロフェニル基を意味する。
【００４９】
本発明は、その好ましい態様として、上記アミノ化合物が、一般式［Ia］で表されるアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。
【００５０】
【化１０】
2014010700.tif 000132
【００５１】
式［Ia］において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味し、Ｒは前記と同じ意味を有する。
【００５２】
本発明は、そのより好ましい態様として、上記アミノ化合物が、一般式［Ib］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または一般式［Ic］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であるアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。
【００５３】
【化１１】
2014010700.tif 000133
【００５４】
【化１２】
2014010700.tif 000134
【００５５】
式［Ib］及び［Ic］において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。
【００５６】
本発明は、そのより好ましい態様として、上記アミノ化合物が、構造式［Iii］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または構造式［Iiii］で表されるアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。
【００５７】
【化１３】
2014010700.tif 000135
【００５８】
【化１４】
2014010700.tif 000136
【００５９】
本発明は、その別の形態として、一般式［II］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩と、一般式［III］で表されるニトロベンゼン化合物を反応させて一般式［Ｉ］で表されるアミノ化合物またはその塩を得る工程と、
上記工程で得られたアミノ化合物またはその塩を質量分析する工程を有するアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。
【００６０】
【化１５】
2014010700.tif 000137
【００６１】
式［II］において、Ｒは、アミノ置換基、例えば、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味する。
【００６２】
【化１６】
2014010700.tif 000138
【００６３】
式［III］において、Ｘはアミノ基反応性官能基を意味し、Ｚはニトロフェニル基を意味する。
【００６４】
【化１７】
2014010700.tif 000139
【００６５】
式［Ｉ］において、ＲおよびＺは、前記と同じ意味を有する。
【００６６】
本発明は、そのより好ましい態様として、前記一般式［II］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩と、一般式［III］で表されるニトロベンゼン化合物の反応を、アルカリ性水溶液または水と有機溶媒の混合溶液であり、かつ前記溶液のｐＨが８〜１０でおこなうことを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。
【００６７】
本発明は、その好ましい態様として、上記反応が試料中で行われるアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。
【００６８】
本発明は、そのより好ましい態様として、上記アミノ酸誘導体またはその塩がバイオマーカーであるアミノ化合物の質量分析方法を提供する。
【００６９】
本発明は、さらに別の形態として、一般式［I'］で表されるアミノ化合物またはその塩を質量分析するアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、上記誘導体化残基の誘導体化剤が、１−ピレンスルホニルクロライド（ＰＳＣ）、ダンシルクロライド（ＤＮＳ−Ｃｌ）等のスルホニル化合物；９−フルオレニルメチルクロロホルメート（ＦＭＯＣ）、４−ジメチルアミノスルホニル−７−フルオロベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ−Ｆ）、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ−Ｆ）、２、３−ナフタレンジアルデヒド（ＮＤＡ）；３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）等のカルバメート化合物；３−クロロカルボニル−６、７−ジメトキシ−１−メチル−２−キノキサリノン（ＤＭＥＱ−ＣＯＣｌ）、３−ニトロフェニルイソチオシアネート、３−ピリジルイソチオシアネート、４−（ジメチルアミノ）フェニルイソチオシアネート、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等のイソチオシアネート化合物；ジエチルエトキシメチレンマロネート等のマロネート化合物、（５−サクシニミドキシ−５−オキソペンチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（ＳＰＴＰＰ）等のホスホニウム化合物；または２−クロロ−１−メチルピリジニウム塩等のピリジニウム化合物であるアミノ化合物またはその塩の質量分析方法を提供する。
【００７０】
【化１８】
2014010700.tif 000140
【００７１】
式［I'］において、Ｒ’は、前記Ｒと同じ意味を有する置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味し、Ｚ’は誘導体化残基を意味する。
【００７２】
本発明は、さらに別の形態として、上記のアミノ化合物の質量分析方法により得られる質量スペクトルの強度データを用いて、生体試料中のバイオマーカー濃度の定量を行うバイオマーカーのアッセイ方法を提供する。
【００７３】
すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
［１］  一般式［Ia］で表されるアミノ化合物またはその塩を質量分析で測定するアミノ化合物またはその塩の質量分析方法において、
【化１８−１】
2014010700.tif 000141
（式中、Ｒはアミノ置換基を意味し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。）
式［Ia］で表されるアミノ化合物またはその塩におけるアミノ置換基が、置換アミノ酸残基またはペプチド残基であり、
前記置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンまたはそれらの置換体であり、
かつ、前記置換アミノ酸残基が、最終糖化産物（ＡＧＥ）の残基である、または前記ペプチド残基のペプチドが、２個ないし１０個のアミノ酸がペプチド結合しているペプチドであることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
［２］  前記［１］に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、
前記最終糖化産物（ＡＧＥ）が、置換アルギニン誘導体または置換リジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
［３］  前記［１］に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、
前記最終糖化産物（ＡＧＥ）が、グリオキサールヒドロイミダゾロン、メチルグリオキサールヒドロイミダゾロン、アルグピリミジン、カルボキシメチルリジン、カルボキシエチルリジンからなる群から選択されるいずれかの最終糖化産物（ＡＧＥ）であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
［４］  前記［１］に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、
前記置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アルギニン、リジン、バリン、チロシン、メチオニン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸もしくはトリプトファンまたはそれらの置換体であることを特徴とする質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
［５］  前記［１］〜［４］のいずれかに記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ化合物が、一般式［Ii］で表されることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【化１８−２】
2014010700.tif 000142
（式中、Ｒは前記と同じ意味を有する。）
［６］  前記［１］〜［５］のいずれかに記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ化合物が、一般式［Ib］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または一般式［Ic］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【化１８−３】
2014010700.tif 000143
【化１８−４】
2014010700.tif 000144
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。）
［７］  前記［１］〜［６］のいずれかに記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ化合物が、
構造式［Iii］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または構造式［Iiii］で表されるトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【化１８−５】
2014010700.tif 000145
【化１８−６】
2014010700.tif 000146
【００７４】
［８］  一般式［II］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩において、アミノ置換基が置換アミノ酸残基またはペプチド残基であり、
前記置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンまたはそれらの置換体であり、
かつ、前記置換アミノ酸残基が、最終糖化産物（ＡＧＥ）の残基である、または前記ペプチド残基のペプチドが、２個ないし１０個のアミノ酸がペプチド結合しているペプチドであるアミノ酸誘導体またはその塩と、
一般式［IIIa］で表されるニトロベンゼン化合物と、を反応させて一般式［Ia］で表されるアミノ化合物またはその塩を得る工程と、
上記工程で得られたアミノ化合物またはその塩を質量分析する工程を有することを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
【化１８−７】
2014010700.tif 000147
（式中、Ｒはアミノ置換基を意味する。）
【化１８−８】
2014010700.tif 000148
（式中、Ｘはアミノ基反応性官能基を意味し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。）
【化１８−９】
2014010700.tif 000149
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味し、Ｒは前記と同じ意味を有する。）
［９］  前記一般式［II］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩と、一般式［IIIa］で表されるニトロベンゼン化合物の反応を、アルカリ性水溶液または水と有機溶媒の混合溶液であり、かつ前記溶液のｐＨが８〜１０でおこなうことを特徴とする前記［８］に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
［１０］  前記［８］または［９］に記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記反応が試料中で行われることを特徴とするアミノ化合物またはその塩の質量分析方法。
［１１］  前記［８］〜［１０］のいずれかに記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法であって、前記アミノ酸誘導体またはその塩がバイオマーカーであることを特徴とするアミノ化合物の質量分析方法。
【００７５】
［１２］  前記［１］〜［１１］のいずれかに記載のアミノ化合物またはその塩の質量分析方法により得られる質量スペクトルの強度データを用いて、生体試料中のバイオマーカー濃度の定量を行うことを特徴とするバイオマーカーのアッセイ方法。
【００７６】
［１３］  一般式［Ia］で表されるアミノ化合物またはその塩であって、
式［Ia］におけるアミノ置換基が、置換アミノ酸残基またはペプチド残基であり、
前記置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンまたはそれらの置換体であり、
かつ、前記置換アミノ酸残基が、最終糖化産物（ＡＧＥ）の残基である、または前記ペプチド残基のペプチドが、２個ないし１０個のアミノ酸がペプチド結合しているペプチドである質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
【化１８−１０】
2014010700.tif 000150
（式中、Ｒはアミノ置換基を意味し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。）
［１４］  前記［１３］に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
前記最終糖化産物（ＡＧＥ）が、置換アルギニン誘導体または置換リジン誘導体であることを特徴とする質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
［１５］  前記［１３］に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
前記置換アミノ酸残基のアミノ酸または前記ペプチド残基の構成アミノ酸が、アルギニン、リジン、バリン、チロシン、メチオニン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸もしくはトリプトファンまたはそれらの置換体であることを特徴とする質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
［１６］  前記［１３］〜［１５］のいずれかに記載のアミノ化合物またはその塩であって、
前記アミノ化合物が、一般式［Ii］で表されることを特徴とする質量分析用のアミノ化合物またはその塩。
【化１８−１１】
2014010700.tif 000151
（式中、Ｒは前記と同じ意味を有する。）
【００７７】
［１７］  一般式［Ib］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または一般式［Ic］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
【化１８−１２】
2014010700.tif 000152
【化１８−１３】
2014010700.tif 000153
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。）
［１８］  前記［１７］に記載のアミノ化合物またはその塩であって、
前記アミノ化合物が、構造式［Iii］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体または構造式［Iiii］で表されるトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体であることを特徴とするアミノ化合物またはその塩。
【化１８−１４】
2014010700.tif 000154
【化１８−１５】
2014010700.tif 000155
【発明の効果】
【００７８】
本発明によって、アミノ酸誘導体のＮ末端アミノ基を誘導体化することにより、質量分析におけるイオン化効率が向上し、試料中に少量しか存在しない最終糖化産物等の分子バイオマーカーやペプチドホルモンについても、質量分析方法を用いて迅速、高感度かつ高精度な定量分析が可能になる。したがって、本発明は、アミノ酸誘導体とニトロベンゼン化合物等の誘導体化剤との誘導体化生成物である新規なアミノ化合物、好ましくはタンパク質の解糖等の反応中間産物である糖化タンパク質分解物がニトロベンゼン化合物等の誘導体化剤で誘導体化された、耐糖能異常の診断に有用な新規な糖化タンパク質分解物誘導体を提供する。また、本発明は、そのアミノ化合物についての迅速、高感度かつ高精度な定量が可能な質量分析方法およびそれを用いたバイオマーカーのアッセイ方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ−Ｈ１）の質量スペクトル（ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ）である。
【図２】ＭＧ−Ｈ１の２，４，６−トリニトロフェニル誘導体（ＭＧ−Ｈ１-ＴＮＰ）の質量スペクトル（ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ）である。
【図３】アルグピリミジン（ＡＰ）の質量スペクトル（ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ）である。
【図４】ＡＰの２，４，６−トリニトロフェニル誘導体（ＡＰ-ＴＮＰ）の質量スペクトル（ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ）である。
【図５】質量スペクトルより予測されるＭＧ−Ｈ１の２，４，６−トリニトロフェニル誘導体（ＭＧ−Ｈ１-ＴＮＰ）のフラグメンテーションパターンを示す図である。
【図６】質量スペクトルより予測されるＡＰの２，４，６−トリニトロフェニル誘導体（ＡＰ-ＴＮＰ）のフラグメンテーションパターンを示す図である。
【図７】（Ａ）はＭＧ−Ｈ１の、（Ｂ）はＭＧ−Ｈ１の２，４，６−トリニトロフェニル誘導体（ＭＧ−Ｈ１-ＴＮＰ）のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示すマスクロマトグラムである。
【図８】（Ａ）はＡＰの、（Ｂ）はＡＰの２，４，６−トリニトロフェニル誘導体（ＡＰ-ＴＮＰ）のＬＣ−ＭＳ分析の結果を示すマスクロマトグラムである。
【図９】ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰの濃度と質量スペクトルのピーク強度について、内部標準法を用いて作製した検量線である。
【図１０】ＡＰ−Ｈ１−ＴＮＰの濃度と質量スペクトルのピーク強度について、内部標準法を用いて作製した検量線である。
【図１１】ＭＧ−Ｈ１の２，４，６−トリニトロフェニル化に及ぼすｐＨの影響を示すグラフである。
【図１２】ＡＰの２，４，６−トリニトロフェニル化に及ぼすｐＨの影響を示すグラフである。
【図１３】ラット血漿の前処理のプロトコールを示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
以下、本発明の実施形態について説明する。ただし、本発明は、下記の実施形態に限定されるものではなく、下記の実施形態は、本発明を具体的に詳細に説明するために例示的に記載するものである。したがって、下記の実施形態から想到される形態もまた、本発明の範囲に包含されるものと理解されるべきである。
【００８１】
なお、本明細書においては、説明を簡潔にするために、誘導体化剤としてはニトロベンゼン化合物を例に挙げて説明するが、本発明においては、誘導体化剤はニトロベンゼン化合物に一切限定されるものではなく、その他の誘導体化剤も本発明の範囲に当然包含されるものとして理解されるべきである。したがって、本明細書においては、誘導体化剤でアミノ酸誘導体の末端アミノ基を誘導体化した残基についても、ニトロベンゼン化合物の残基であるニトロフェニル基について説明するが、これについても一切限定されるものではなく、その他の誘導体化剤の残基も同様に包含されるものと理解されるべきである。
【００８２】
本発明に係るアミノ化合物は、一般式［Ｉ］で表すことができる。
【００８３】
【化１９】
2014010700.tif 000156
【００８４】
式［Ｉ］において、Ｒはアミノ置換基を意味し、Ｚはニトロフェニル基を意味する。
【００８５】
上記一般式において、用語「アミノ置換基」は、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味する。
ここで、用語「アミノ酸残基」とは、非置換アミノ酸からアミノ基を除外した残基を意味している。例えば、アラニンの場合には、２−アミノプロパン酸と別称されるので、２−アミノプロパン酸からアミノ基を除外したアミノ酸残基は、カルボキシルエチル基である。同様に、リジンの場合のアミノ酸残基は１−カルボキシル−５−アミノペンチル基である。
【００８６】
また、上記一般式において、用語「置換アミノ酸残基」とは、上記アミノ酸からアミノ基を除外したアミノ酸残基であって、該アミノ酸を構成するカルボキシル基以外の残基、つまり原子団が置換基で置換されて形成された原子団、つまり置換部分（moiety）を有するアミノ酸残基を意味している。置換アミノ酸残基の例としては、上記リジン残基の５−アミノ基にカルボキシルメチル基が置換した１−カルボキシル−５−（カルボキシルメチル）アミノペンチル基が挙げられる。また別の例として、例えば、アルギニン残基のアミノ−イミノメチル基が２−ピリミジニル基に変換した置換アミノ酸残基等も挙げることができる。
【００８７】
さらに、上記一般式において、用語「ペプチド残基」とは、上記アミノ酸および／または置換アミノ酸がペプチド結合して形成されたペプチドの末端アミノ酸から末端アミノ基が除外された残基を意味している。例えば、ペプチドＶａｌ−Ｔｙｒの場合、ペプチド残基とは、末端アミノ酸のバリンからアミノ基が除外された残基を意味する。
【００８８】
本発明において、用語「アミノ酸誘導体」とは、特段の定めがない限り、非置換アミノ酸誘導体、もしくはＮ末端アミノ基以外のアミノ酸部分が置換基等で修飾されている置換アミノ酸誘導体、またはペプチドを意味している。
【００８９】
したがって、本発明において使用する用語「アミノ化合物」は、特段の定めがない限り、アミノ酸誘導体［II］またはその塩のN末端アミノ基が、ニトロベンゼン化合物［III］によりニトロフェニル化されたニトロフェニル化アミノ化合物を意味している。
【００９０】
本発明において、アミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基のアミノ酸、またはペプチド残基のペプチド構成アミノ酸のアミノ酸は、広義には、アミノ基とカルボキシ基の両方の官能基を有する化合物であれば、特に限定されるものではないが、狭義には、例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンおよびチロシン、好ましくはアルギニンおよびリジン等のタンパク質の構成成分であるアミノ酸およびそれらを構成するカルボキシル基以外の残基が置換基で置換されて形成された置換部分を有する置換アミノ酸残基が挙げられる。
【００９１】
好ましいアミノ酸としては、例えば、好ましくはアルギニン、リジン、バリン、チロシン、メチオニン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸またはトリプトファンが挙げられる。
【００９２】
また、本発明において使用する用語「置換アミノ酸残基」は、上記アミノ酸の末端アミノ基以外の残基に任意の置換基が結合して形成された別の原子団を有する置換アミノ酸誘導体の残基を意味している。かかるアミノ酸誘導体としては、本発明の目的を逸脱しない限り、特に限定されるものではなく、例えば、アミノ酸等の生体成分の分解生成物や中間生成物、または代謝産物等が挙げられ、例えば、タンパク質の糖化反応によって生成される各種最終糖化産物（ＡＧＥ類）、アルギニンの分解生成物であるオルニチン、筋肉へのエネルギー供給源のクレアチニンリン酸の代謝産物であるクレアチニン、肝臓中のグルタチオン欠乏を示すバイオマーカーであるオフタルミン酸生合成の中間体のα−アミノ酪酸（ＡＡＢＡ）、主に神経伝達物質として作用するγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）等の他、各種疾患の診断および予後予測等に用いられる分子バイオマーカーや、馬尿酸等も挙げられる。これらアミノ酸のうち、上記ＡＧＥ類等が好ましい。より好ましいのは、例えば、アルギニンの側鎖のグアノシル基とメチルグリオキサール、またはリジンのアミノ基とグリオキサールもしくはメチルグリオキサール等の脂質過酸化、メイラード反応、解糖等の反応中間産物との反応により生成されるＡＧＥ類等が挙げられる。かかるＡＧＥ類等のうち、好ましいものとしては、置換アルギニン誘導体や置換リジン誘導体等が挙げられる。
【００９３】
置換アルギニン誘導体としては、例えば、アルギニンのグアニジノ基がカルボキシルメチル基、カルボキシルエチル基等の置換基で修飾されたアルキル置換アルギニン誘導体、イミダゾロン類、ピリミジン類、イミダゾピリジン類等のグアニジノ基が環状構造になっている環状アルギニン誘導体等が挙げられる。
【００９４】
更に具体的には、アルキル置換アルギニン誘導体としては、例えば、カルボキシルメチルアルギニン（ＣＭＡ）等が挙げられる。また、環状アルギニン誘導体のイミダゾロン類としては、例えば、イミダゾロン、グリオキサールヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ）、メチルグリオキサールヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ）、Ｎδ−［５−（２，３，４−トリヒドロキシブチル）−５−ヒドロ４−イミダゾロン２−イル］−オルニチン（３−ＤＧ−Ｈ）等が挙げられる。ピリミジン類としては、例えば、アルグピリミジン、テトラヒドロピリミジン等が挙げられる。イミダゾピリジン類としては、例えば、ペントシジン等が挙げられる。
【００９５】
これら置換アルギニン誘導体のうち、特に好ましいのは、例えば、構造式［IIa］で表されるメチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ−Ｈ１：Ｎδ−（５−ヒドロ−５−メチル−４−イミダゾロン２−イル）−オルニチン）、または構造式［IIb］で表されるアルグピリミジン（ＡＰ）が挙げられる。
【００９６】
【化２０】
2014010700.tif 000157
【００９７】
【化２１】
2014010700.tif 000158
【００９８】
更に具体的には、上記アミノ酸誘導体は、立体構造を有し、構造式［IIc］または構造式［IId］でそれぞれ表すことができる。
【００９９】
【化２２】
2014010700.tif 000159
【０１００】
【化２３】
2014010700.tif 000160
【０１０１】
また、上記ＡＧＥ類のうち、置換リジン誘導体としては、例えば、リジンのアミノ基がカルボキシルメチル基、カルボキシルエチル基等の置換基で修飾されたアルキル置換リジン誘導体、リジンのアミノ基が環状構造を有している環状リジン誘導体等が挙げられる。
【０１０２】
アルキル置換リジン誘導体としては、例えば、カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）、カルボキシエチルリジン（ＣＭＬ）等が挙げられる。また、環状リジン誘導体としては、例えば、ビラリン、ＦＴＰ（Ｆｏｒｍｙｌ  Ｔｈｅｒｏｓｙｌ  Ｐｙｒｒｏｌｅ）等のピロール誘導体、ＧＯＬＤ（グリオキサール由来リジン二量体）、ＭＯＬＤ（メチルグリオキサール由来リジン二量体）、ＤＯＬＤ（３−デオキシグルコソン由来リジン二量体）等のイミダゾール誘導体、ＧＬＡＰ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ）、ＧＡ−ピリジン（ｇｌｙｃｏｌａｌｄｅｈｙｄｅ−ピリジン）等のピリジン誘導体、ペントシジン等のイミダゾピリジン誘導体等が挙げられる。
【０１０３】
さらに、上記一般式［Ｉ］において、置換基Ｒで表されるペプチド残基のペプチドとしては、そのペプチドを構成する上記アミノ酸の数は特に限定されないが、上記アミノ酸が２個〜１０個、好ましくは２個〜６個、より好ましくは２個〜４個ペプチド結合して構成されているペプチドであるのがよい。かかるペプチドとしては、例えば、バリルチロシン、リシルチロシン、メチオニルチロシン、グリシルチロシン、ヒスチジルチロシン、グルタミルチロシン、トリプトファニルチロシン、ヒスチジニルトリプトファン、カルノシン、アンセリン等のジペプチド、グルタチオン等のトリペプチド等が挙げられる。その他に、エンケファリン、カキシトシン、バソプレッシン等を挙げることができる。これらペプチドのうち、バリルチロシン、リシルチロシン、メチオニルチロシン、グリシルチロシン、ヒスチジルチロシン、グルタミルチロシン、トリプトファニルチロシンならびにヒスチジニルトリプトファン等のジペプチドが好ましい。また、ペプチドは、タンパク質の消化物、最終糖化産物等の代謝産物、ペプチドホルモン等の生理活性ペプチドのいずれであってもよく、各種疾患の診断および予後予測等に用いられる分子バイオマーカーであってもよい。
【０１０４】
一方、上記一般式［I］において、置換基 Z は、アミノ酸誘導体［II］の末端アミノ基をニトロフェニル化したニトロベンゼン化合物の残基であって、一般式［IIIb］ で表すことができる。
【０１０５】
【化２４】
2014010700.tif 000161
【０１０６】
式［IIIb］において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも、同じであってもまたは異なっていてもよく、水素原子またはニトロ基を意味する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも１個はニトロ基を意味する。
【０１０７】
ここで、ニトロフェニル基としては、例えば、モノ−、ジ−またはトリ−ニトロフェニル基、好ましくはトリ−ニトロフェニル基、特に好ましくは２、４、６−ニトロフェニル基が挙げられる。ニトロ置換基の位置にしても、特に限定はないが、１個の場合は２−位、２個の場合は２−位と４−位、３個の場合に２−位、４−位ならびに６−位であるのがよい。
【０１０８】
したがって、本発明に係るアミノ化合物は、一般的には、一般式［Ｉ］で表され、より具体的には、一般式［Ia］で表すことができる。
【０１０９】
【化２５】
2014010700.tif 000162
【０１１０】
【化２６】
2014010700.tif 000163
【０１１１】
式［Ia］において、Ｒ、Ｚ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。
【０１１２】
本発明において、構造式［Ia］で表されるアミノ化合物の好ましい例としては、例えば、構造式［Ib］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体、または構造式［Ic］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体が挙げられる。
【０１１３】
【化２７】
2014010700.tif 000164
【０１１４】
【化２８】
2014010700.tif 000165
【０１１５】
式［Ib］および［Ic］において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。
【０１１６】
さらに好ましいアミノ化合物は、例えば、一般式［Ii］で表すことができる。
【０１１７】
【化２９】
2014010700.tif 000166
【０１１８】
式［Ii］において、Ｒは前記と同じ意味を有する。
【０１１９】
したがって、アミノ化合物としては、例えば、構造式［Iii］で表されるニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体、または一般式［Iiii］で表されるニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体がさらに好ましい。
【０１２０】
【化３０】
2014010700.tif 000167
【０１２１】
【化３１】
2014010700.tif 000168
【０１２２】
上記のトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体およびトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体の立体構造式（［Iiv］および［Iv］）はそれぞれ次のように表すことができる。
【０１２３】
【化３２】
2014010700.tif 000169
【０１２４】
【化３３】
2014010700.tif 000170
【０１２５】
本発明に係るアミノ化合物［Ｉ］は、一般式［II］で表されるアミノ酸誘導体またはその塩を、一般式［III］で表されるニトロベンゼン化合物で誘導体化反応することにより得ることができる。
【０１２６】
【化３４】
2014010700.tif 000171
【０１２７】
式［II］において、Ｒは前記と同じ意味を有する。
【０１２８】
【化３５】
2014010700.tif 000172
【０１２９】
式［III］において、Ｘはアミノ基反応性官能基を意味し、Ｚは上記と同じ意味を有する。
【０１３０】
より具体的には、本発明のアミノ化合物［Ia］は、アミノ酸誘導体［II］またはその塩と、一般式［IIIa］ で表されるニトロベンゼン化合物との誘導体化反応により得ることができる。
【０１３１】
【化３６】
2014010700.tif 000173
【０１３２】
式［IIIa］において、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも前記と同じ意味を有する。
【０１３３】
更に具体的には、本発明のアミノ化合物［Ii］は、アミノ酸誘導体［II］またはその塩と、一般式［IIIc］で表されるトリニトロベンゼン化合物との誘導体化反応により得ることができる。
【０１３４】
【化３７】
2014010700.tif 000174
【０１３５】
式［IIIc］において、Ｘは前記と同じ意味を有する。
【０１３６】
ここで、Ｘで表されるアミノ基反応性官能基としては、アミノ酸または置換アミノ酸（［II］）をニトロフェニル誘導体化する反応性官能基であれば特に限定されないが、例えば、塩素原子、フッ素原子、臭素原子もしくはヨウ素原子から選ばれるハロゲン原子、またはスルホン酸またはスルホン酸塩、アルキルスルホン酸エステル基、アリールスルホン酸エステル基、パーフルオロアルキルスルホン酸エステル基等の、ニトロベンゼン誘導体の芳香族求核置換反応において脱離基となり得る任意の官能基が挙げられる。
【０１３７】
そこで、好ましいニトロベンゼン化合物としては、例えば、２，４，６−トリニトロフルオロベンゼン、２，４，６−トリニトロクロロベンゼン、２，４，６−トリニトロブロモベンゼン、２，４，６−トリニトロヨードベンゼンおよび２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸またはその塩等が挙げられ、これらのうち特に好ましいのは、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸またはその塩である。塩としては、例えば、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩、カリウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
【０１３８】
本発明において、上記アミノ酸誘導体のＮ末端アミノ基をニトロベンゼン化合物で誘導体化するには、上記アミノ酸誘導体とニトロベンゼン化合物とを、アルカリ性の水溶液または、水と有機溶媒の混合溶液中にて室温で数十分間混合することにより行うことができる。好ましくはアルカリ性水溶液中で行われる。また、水と有機溶媒との混合溶液を用いる場合、有機溶媒としてはエタノール等の水との親和性が高い有機溶媒が好ましく用いられる。これらの溶液のｐＨは８〜１０であることが好ましく、より好ましくは８．５〜９．５であるのがよい。溶液のｐＨが高すぎると、分析対象のアミノ酸誘導体またはこの化合物が分解する可能性が増大し、低すぎるとニトロフェニル化反応が迅速に進行しなくなる。ここでｐＨとは、ｐＨメータにより直接測定される値である。  なお、室温とは１５℃から４０℃程度の温度であり、３０℃前後で反応を行うことが好ましい。また、混合はいかなる方法であってもよく、１分以上１時間以下、好ましくは５分から４０分間の混合が行われる。通常は３０分間の混合で十分である。
【０１３９】
本発明の特徴の一つは、かかる温和な条件下で、ニトロフェニル化反応を行うことができることである。試料中の分析対象となる物質を単離してニトロフェニル化を行ってもよいが、夾雑物等を含むような試料中でそのままニトロフェニル化を行ってもよい。本発明はこのような試料中でそのままニトロフェニル化を行うことができるため、単離によるロス等を低減することができ、分析対象となる物質が少量しか含まれないような場合であっても測定することができるという優れた方法である。また、複雑な操作を行う必要が無く、簡便に測定することができる。特に対象試料が生体試料等の場合は、分析対象となる物質が少なく、かつ、夾雑物が多い状態であることが多いため有効である。
【０１４０】
また、例えば、試料中のアミノ酸誘導体を測定するに当たっては、生体試料に、ニトロベンゼン化合物を添加することにより、試料中のバイオマーカーとしてのアミノ酸誘導体をニトロベンゼン化合物で誘導体化することも可能であるとともに、かかる誘導体化したアミノ酸誘導体をバイオマーカーとして測定できることは当然のことである。
本発明において試料となるものは、測定対象となる最終糖化産物等の、本発明によってアミノ酸誘導体とニトロベンゼン系化合物との誘導体化で得られるアミノ化合物となるものを含有するものであればよい。また、生体由来の試料を生体試料とよぶ。
【０１４１】
さらに、アミノ酸誘導体の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、リチウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等を使用することができる。
【０１４２】
本発明においては、誘導体化剤として、上記ニトロベンゼン化合物の他に、その他のアミノ基を誘導体化する誘導体化剤も使用できることは当然のことである。かかる誘導体化剤としては、例えば、ニトロベンゼンスルホン酸化合物、フルオロ−ニトロベンゼン等のニトロベンゼン化合物の他に、１−ピレンスルホニルクロライド（ＰＳＣ）、ダンシルクロライド（ＤＮＳ−Ｃｌ）等のスルホニル化合物、９−フルオレニルメチルクロロホルメート（ＦＭＯＣ）、４−ジメチルアミノスルホニル−７−フルオロベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ−Ｆ）、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ−Ｆ）、２、３−ナフタレンジアルデヒド（ＮＤＡ）、３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）等のカルバメート化合物、３−クロロカルボニル−６、７−ジメトキシ−１−メチル−２−キノキサリノン（ＤＭＥＱ−ＣＯＣｌ）、３−ニトロフェニルイソチオシアネート、３−ピリジルイソチオシアネート、４−（ジメチルアミノ）フェニルイソチオシアネート、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等のイソチオシアネート化合物、ジエチルエトキシメチレンマロネート等のマロネート化合物、（５−サクシニミドキシ−５−オキソペンチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（ＳＰＴＰＰ）等のホスホニウム化合物、または２−クロロ−１−メチルピリジニウム塩等のピリジニウム化合物等を挙げることができる。これらの誘導体化剤も、上記ニトロベンゼン化合物と実質的に同様に使用することができる。
【０１４３】
つまり、本発明において、上記誘導体化剤を使用する場合は、本発明に係るアミノ化合物は、一般式［Ｉ'］で表される。
【０１４４】
【化３８】
2014010700.tif 000175
【０１４５】
式［I'］において、Ｒ’は上記Ｒと同じ意味を有するアミノ酸残基もしくは置換アミノ酸残基またはペプチド残基を意味し、Ｚ’は誘導体化残基を意味する。
【０１４６】
ここで、誘導体化残基は、上記誘導体化剤が、置換アミノ酸誘導体（Ｒ’−ＮＨ２）のアミノ基を誘導体化した残基を意味している。例えば、誘導体化剤としてダンシルクロライドを使用した場合、置換アミノ酸誘導体（Ｒ’−ＮＨ２）のアミノ基がダンシル化、つまり、ジメチルアミノナフタレンスルホニル化されるので、このダンシル基が誘導体化残基ということができる。
【０１４７】
したがって、この場合も、本明細書において、ニトロベンゼンスルホン酸を誘導体化剤として用いた場合についての記載を実質的に同様に適用することができる。
【０１４８】
本発明において、質量分析に用いられる試料のイオン化法については、特に制限はないが、生体分子の検出および定量に広く用いられているＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法、ＡＰＣＩ法等用いられるのが好ましい。分離技術と組み合わせたＬＣ／ＭＳやＧＣ／ＭＳ等においては、試料のイオン化法としてはＥＳＩ法やＡＰＣＩ法を用いられるのがよい。分析には、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ３等のタンデム質量分析方法を用いることができる。この場合、プロダクトイオンの検出には、例えば、夾雑物の影響を排除し高感度な検出が可能な多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いるのが好ましい。
【０１４９】
次に、本発明に係る質量分析方法を用いたバイオマーカーのアッセイ方法について説明する。
本発明は、分析対象としてバイオマーカーを選択することにより、バイオマーカーを、迅速に、高感度かつ高精度に検出および定量できるアッセイ方法を提供することができる。すなわち、本発明のバイオマーカーのアッセイ方法は、アミノ酸誘導体であるバイオマーカーのＮ末端アミノ基とニトロベンゼン化合物等の誘導体化剤とを反応させ、Ｎ末端アミノ基をニトロフェニル化等の誘導体化する工程と、Ｎ末端アミノ基がニトロフェニル化等の誘導体化されたアミノ酸誘導体またはその塩を質量分析する工程と、質量分析方法を用いて得られた質量スペクトルの強度データを用いて、生体試料中のバイオマーカー濃度の定量を行う工程を有している。
【０１５０】
本発明において、バイオマーカーとしては、アミノ基を有するアミン化合物である限り、特に制限はないが、本発明のアッセイ方法が特に好ましく適用できるものとしては、例えば、アミノ酸誘導体と糖の代謝産物との反応により生成される最終糖化産物（ＡＧＥ類）等や、生体アミンであるカテコールアミン(ドパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン)、インドールアミン(セロトニン、メラトニン)、イミダゾールアミン(ヒスタミン)、アセチルコリン、ポリアミン(プトレシン、スペルミジン、スペルミン)等が挙げられる。
【０１５１】
本発明のアッセイ方法による分析対象のバイオマーカーとして特に好ましいＡＧＥ類としては、例えば、構造式［Iii］で表されるトリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ−Ｈ１）、および構造式［Iiii］で表されるトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体（ＡＰ）を挙げることができる。
【０１５２】
【化３９】
2014010700.tif 000176
【０１５３】
【化４０】
2014010700.tif 000177
【０１５４】
これらはそれぞれ、ＭＧ−Ｈ１およびＡＰのＮ−２，４，６−トリニトロフェニル誘導体であり、質量分析方法により高感度で検出および定量が可能なＡＧＥであり、耐糖能異常の診断指標として有用である。
【０１５５】
本発明において、アッセイ対象となるアミノ酸誘導体またはペプチドの濃度をマススペクトルの面積強度から定量するためには、例えば、検量線法または同位体希釈法が用いられる。質量分析において、分析対象物質を定量分析する手法の一つに検量線法が挙げられる。検量線法は、既知量の標準物質を含み、濃度の異なるいくつかの標準試料と、これらの標準試料から得られる信号強度との関係（検量線）が理論的には線形関係になることを利用し、未知試料から得られた信号強度からその試料の濃度を定量する方法である。標準とする試料の調製法により、検量線法は、外部標準法、内部標準法、標準添加法に大別されるが、本アッセイ方法ではいずれの方法を用いてもよい。同位体希釈法は、測定対象化合物を構成する特定の元素の同位体比に着目し、同位体比が既知のスパイクを一定量添加して測定対象化合物の同位体組成を平衡に到達させた後、スパイク添加前後の試料の同位体比を測定し、同位体組成の変化から試料の元素濃度を求める方法であり、検出限界が１ｐｇ程度と低いことが利点として挙げられる。
【０１５６】
上記の様にして得られたバイオマーカーの定量データは、疾患の発症、進行度、予後等の予測や診断に用いることができる。すなわち、本発明の一実施形態としては、アミノ酸誘導体またはペプチドであるバイオマーカーのＮ末端アミノ基とトリニトロフェニル化剤等の誘導体化剤とを反応させ、Ｎ末端アミノ基をトリニトロフェニル化等の誘導体化する工程と、Ｎ末端アミノ基がトリニトロフェニル化等の誘導体化されたアミノ酸誘導体またはペプチドを質量分析する工程と、質量分析方法を用いて得られた質量スペクトルの強度データを用いて、生体試料中のバイオマーカー濃度の定量を行う工程と、このようにして得られるバイオマーカーの濃度データを元に、疾患の発症、進行度、予後等に関する診断を行う工程を有する疾患の診断方法に関するものである。
【０１５７】
本発明の診断方法は、複数種のＡＧＥ類を同時に測定、定量できることからも有用である。すなわち、本発明は、試料中でニトロフェニル化を行うことができる方法であり、また質量分析により分析するものであるから、質量数が異なる対象物質を測定する場合、質量分析法と組み合わせることで同時に測定（定量）することができる優れた方法を提供するものである。本発明により、従来の早期診断法に比べて、費用および手間を大幅に削減することができる。
【実施例】
【０１５８】
以下、本発明の実施例に基づいて、本発明の特徴、作用効果についてより具体的に説明する。これらの実施例はあくまでも例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１５９】
トリニトロフェニル化メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰ）［Iii］を次のようにして製造した。
メチルグリオキサール由来ヒドロイミダゾロン誘導体（ＭＧ−Ｈ１）［IIa］を０．１Ｍホウ酸溶液（ｐＨ９．３）に溶解させ、３０ｍＭ  ２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩（ＴＮＢＳ）−０．１Ｍホウ酸溶液（ｐＨ９．３）を１０μＬ添加後、十分に混和した。得られた混合物を３０℃にて２０分間インキュベー卜して、誘導体化を行った。誘導体化したＭＧ−Ｈ１（ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰ）を、それぞれ、１００％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ギ酸（３ｍＬ）及び０．１％ギ酸（３ｍＬ）で平衡化したＳｅｐ−Ｐａｋ Ｐｌｕｓ Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）に負荷し、０．１％ＦＡ（３ｍＬ）で洗浄後、１００％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ギ酸（３ｍＬ）にて溶出した画分を遠心エバポレータで乾固した。画分乾固物は脱イオン水１．５ｍＬで再溶解し、凍結乾燥後、−４０℃で保存した。
【０１６０】
【化４１】
2014010700.tif 000178
【実施例２】
【０１６１】
トリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体（ＡＰ−ＴＮＰ）［Iiii］を次のようにして製造した。
アルグピリミジン［IIb］を、実施例１と実質的に同様に処理してトリニトロフェニル化アルグピリミジン誘導体（ＡＰ−ＴＮＰ）［Iiii］を得た。
【０１６２】
【化４２】
2014010700.tif 000179
【実施例３】
【０１６３】
質量スペクトルの測定
ＭＧ−Ｈ１およびＡＰ、ならびに上記の様にして調製したＭＧ−Ｈ１およびＡＰのＮ−２，４，６−トリニトロフェニル誘導体（それぞれ「ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰ」および「ＡＰ−ＴＮＰ」）を０．１％ギ酸に溶解させ、質量スペクトルの測定を行った。測定条件は下記のとおりである。
・イオン化モード  ＥＳＩ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ
・スキャン範囲  １００〜５００ｍ／ｚ
・ドライガス  ３３０℃、８．０Ｌ／分
・ネブライザーガス  ２７６ｋＰａ
・キャピラリー電圧  −２７５０Ｖ
・スキマー電圧  ４０Ｖ
・キャピラリー出口電圧  １２４Ｖ
【０１６４】
ＭＧ−Ｈ１、ＡＰ、ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰおよびＡＰ−ＴＮＰの質量スペクトル（ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ）を、それぞれ、図１、２、３、４に示す。なお、図２、４において、ＭＧ−Ｈ１およびＡＰのＮ−２，４，６−トリニトロフェニル誘導体は、それぞれ、「ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰ」、「ＡＰ−ＴＮＰ」と表記されている。ＭＳ／ＭＳの測定に用いたプリカーサーイオンは、ぞれぞれの化合物についての［Ｍ＋Ｈ］＋イオンである。得られた質量スペクトルのうち、ピーク強度の最も大きなものを、後述するＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ／ＭＳ分析においてモニターの対象となるイオンピークとして選択した。
【０１６５】
また、図３、図４に示すＭＳスペクトルおよびＭＳ／ＭＳスペクトルより予測されるＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰおよびＡＰ−ＴＮＰのフラグメンテーションパターンを、それぞれ図５および図６に示す。
【実施例４】
【０１６６】
ＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ／ＭＳ分析
下記の条件下で、ＭＧ−Ｈ１、ＡＰ、ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰおよびＡＰ−ＴＮＰのＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。サンプル濃度はいずれも１０ｎｍｏｌ／Ｌとし、いずれも０．１％ギ酸水溶液に溶解させた。
＜ＨＰＬＣ条件＞
・移動相  ＭｅＯＨ−０．１％ギ酸水溶液
・流速  ０．２０ｍＬ／分
・グラジエント  ０〜１００％（２５分）
・固定相  Ｗａｔｅｒｓ  Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３（φ２．１×１００ｍｍ）
・カラムオーブン温度  ４０℃
【０１６７】
＜ＭＳ条件＞
・イオン化モード  ＥＳＩ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ
・スキャン範囲  １００〜５００ｍ／ｚ
・ドライガス  ３３０℃、８．０Ｌ／分
・ネブライザーガス  ２７６ｋＰａ
・キャピラリー電圧  −２７５０Ｖ
・スキマー電圧  ４０Ｖ
・キャピラリー出口電圧  １２４Ｖ
・インジェクション体積  ２５μＬ
【０１６８】
ＭＧ−Ｈ１、ＡＰ、ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰおよびＡＰ−ＴＮＰのマスクロマトグラムを、それぞれ、図７、８に示す。図７の結果より、ＭＧ−Ｈ１のＮ末端アミノ基を２，４，６−トリニトロフェニル化することにより、ピーク強度が１５００倍程度に増大することが確認された。
【実施例５】
【０１６９】
検量線の作製ならびに検出限界および定量限界の決定
内部標準としてＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰの重水素化体（ＭＧ−Ｈ１−ｄ３−ＴＮＰ）を用いて、ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰおよびＡＰ−ＴＮＰの検量線を作製した。酸による分解の影響を避けるために、インジェクション直前に０．１％ギ酸水溶液を添加する手順（表１参照）で希釈を行い、高濃度側から測定を行った。まず、原液として、ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰおよびＡＰ−ＴＮＰの１μｍｏｌ／ｍＬ水溶液を調製し、終濃度が４００、２００、４０、２０、４、２ｐｍｏｌ／ｍＬとなるように水で希釈した。各濃度について、これらの等モル混合物２５μＬに、ＭＧ−Ｈ１−ｄ３−ＴＮＰの４００ｐｍｏｌ／ｍＬ水溶液２５μＬを加え、０．２％ギ酸水溶液５０μＬを加えて十分混和し、うち２５μＬをＬＣ−ＭＳ分析に用いた。
【０１７０】
【表１】
2014010700.tif 000180
【０１７１】
得られた質量スペクトルにおけるＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰまたはＡＰ−ＴＮＰと、ＭＧ−Ｈ１−ｄ３−ＴＮＰとのピーク強度比をＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰまたはＡＰ−ＴＮＰの濃度に対しプロットすることにより、図９および１０に示す検量線が得られた。これらより、ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰについて、検出限界２．０５ｐｍｏｌ／ｍＬ、定量限界６．２０ｐｍｏｌ／ｍＬ、ＡＰ−ＴＮＰについて、検出限界０．１１ｐｍｏｌ／ｍＬ、定量限界０．３３ｐｍｏｌ／ｍＬという結果が得られた。同様にＣＭＬ−ＴＮＰについて検量線を作製し濃度換算すると、検出限界５．３ｎｍｏｌ／Ｌ、定量限界１６ｎｍｏｌ／Ｌであった。また、ＣＥＬ−ＴＮＰについては、検出限界２．７ｎｍｏｌ／Ｌ、定量限界８．０ｎｍｏｌ／Ｌであった。検量線については、相関係数０．９９６以上の良好な直線性が得られると共に、それぞれについてｐｍｏｌレベル（濃度としてｎＭ／Ｌレベル）での定量分析が可能であることが確認された。これらの数値は、従来より用いられている誘導体化剤であるダンシルクロリドやＮＤＡ（２，３−ナフタレンジアルデヒド）における検出限界の１／１００〜１／２００であり、２，４，６−トリニトロフェニル化により大幅な感度向上が可能であることを示している。
【実施例６】
【０１７２】
２，４，６−トリニトロフェニル化におけるｐＨの影響
実施例１および２においてＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰおよびＡＰ−ＴＮＰのそれぞれの調製において、反応液のｐＨを７．５、８．０、８．５にした場合における誘導体化率を、ＬＣ−ＭＳ分析を用いて算出した。遠心エバポレータ処理により得られた乾固物を０．２％ギ酸水溶液１００μＬに溶解し、内部標準としてＭＧ−Ｈ１−ｄ３−ＴＮＰの２００ｐｍｏｌ／ｍＬ水溶液５０μＬを加え、十分に混和した後、２５μＬをＬＣ−ＭＳ分析に供し、検量線法により２，４，６−トリニトロフェニル体の濃度を決定した。結果は、図１１、１２に示すとおりであり、ＭＧ−Ｈ１−ＴＮＰまたはＡＰ−ＴＮＰのいずれの場合についても、ｐＨ８．５〜９．３で、定量的に誘導体化が可能であることが確認された。
【実施例７】
【０１７３】
ラット血漿スパイク試験
ＳＤラットのコントロール血漿に対し、ＭＧ−Ｈ１、ＡＰおよび内部標準であるＭＧ−Ｈ１−ｄ３をスパイクし、回収後、２，４，６−トリニトロフェニル化を行った。血漿に対する前処理は、図１３に示すプロトコール（E.M.N. Nakashima et al., Anal. Biochem., 414, 109-116（2011）参照）に準拠して行い、スパイクしたＭＧ−Ｈ１、ＡＰおよびＭＧ−Ｈ１−ｄ３の同時検出を試みた。標準添加法により作製した検量線を用いたＬＣ−ＭＳ分析により、ＭＧ−Ｈ１およびＡＰについて、血漿中濃度の定量が可能であることが確認された。
【実施例８】
【０１７４】
Ｖａｌ−Ｔｙｒを用いた検討
ＡＧＥ類であるＭＧ−Ｈ１およびＡＰの代わりにジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを用いて、上記と同様の手順により、２，４，６−トリニトロフェニル化による検出感度の変化を検討した結果、ＭＧ−Ｈ１の場合と同様、２，４，６−トリニトロフェニル化によりピーク強度が約５０倍に増大することが確認された（表２）。
【実施例９】
【０１７５】
ジペプチドを用いた検討
実施例８と実質的に同様にして下記ジペプチドを調製し、検出感度の変化を検討した。その結果を表２に示す。
【０１７６】
【表２】
2014010700.tif 000181
【産業上の利用可能性】
【０１７７】
この発明は、例えば、生体内成分であるタンパク質が代謝過程で糖化等された最終糖化産物や中間産物等の代謝産物を始めとするアミノ酸誘導体をニトロベンゼン化合物等の誘導体化剤により誘導体化したアミノ化合物であって、特に耐糖能異常の診断に有用な化合物であるところから、これらのあの化合物を迅速、高感度かつ高精度に定量することが可能である質量分析方法である。したがって、これらのアミノ化合物をバイオマーカーとしてアッセイすることにより様々な疾患の予防や診断に役立ち、これによりその疾患の予防薬や治療薬の開発に役に立つことが期待できる。
【国際調査報告】
2014010700.tif 000182
2014010700.tif 000183
2014010700.tif 000184
2014010700.tif 000185
2014010700.tif 000186
2014010700.tif 000187
2014010700.tif 000188
2014010700.tif 000189
2014010700.tif 000190
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