(57)【要約】  メラミンを検出するための新たなセンサを提供する。  本発明のメラミン分析用核酸センサは、触媒機能を生起する触媒核酸分子（Ｄ）およびメラミンに結合する結合核酸分子（Ａ）を有する下記（ｘ１）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。前記（ｘ１）のポリヌクレオチドは、配列番号１〜１４のいずれか一つの塩基配列からなり、ｎおよびｍは、正の整数である。前記核酸センサは、メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、メラミン存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起されるため、触媒機能の検出により、メラニンを分析できる。
2014017471.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
触媒機能を生起する触媒核酸分子（Ｄ）およびメラミンに結合する結合核酸分子（Ａ）を有する下記（ｘ１）、（ｘ２）、（ｘ３）または（ｘ４）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、メラミン分析用核酸センサ。
（ｘ１）配列番号１〜１４のいずれか一つの塩基配列からなり、ｎおよびｍは、正の整数であるポリヌクレオチド
（ｘ２）前記（ｘ１）の前記塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
（ｘ３）前記（ｘ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
（ｘ４）前記（ｘ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
【請求項２】
配列番号１〜１４のいずれか一つの塩基配列において、（T）nのｎが、６〜４８であり、（T）mのｍが、２〜３１である、請求項１記載の核酸センサ。
【請求項３】
前記触媒核酸分子（Ｄ）と前記結合核酸分子（Ａ）とを連結するリンカー配列を有する、請求項１または２記載の核酸センサ。
【請求項４】
前記（ｘ１）、（ｘ２）、（ｘ３）または（ｘ４）のポリヌクレオチドの５’末端に連結した５’末端付加配列を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸センサ。
【請求項５】
前記５’末端付加配列が、０〜２２塩基長である、請求項４記載の核酸センサ。
【請求項６】
さらに、前記（ｘ１）、（ｘ２）、（ｘ３）または（ｘ４）のポリヌクレオチドの３’末端に連結した３’末端付加配列を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸センサ。
【請求項７】
前記３’末端付加配列が、７〜１８塩基長である、請求項６記載の核酸センサ。
【請求項８】
前記核酸センサが、下記（Ｘ１）、（Ｘ２）、（Ｘ３）または（Ｘ４）のポリヌクレオチドを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸センサ。
（Ｘ１）配列番号１５〜５６のいずれか一つの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｘ２）前記（Ｘ１）の前記塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
（Ｘ３）前記（Ｘ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
（Ｘ４）前記（Ｘ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
【請求項９】
基材、核酸センサおよび検出部を含み、
前記基材に、前記核酸センサおよび前記検出部が配置され、
前記核酸センサは、請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸センサであり、
前記検出部は、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出する検出部であることを特徴とするメラミンの分析用デバイス。
【請求項１０】
前記核酸センサが、リンカーを介して、前記基材に連結されている、請求項９記載の分析用デバイス。
【請求項１１】
前記核酸センサが、前記検出部に配置されている、請求項９または１０記載の分析用デバイス。
【請求項１２】
前記検出部は、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能により生成されるシグナルを検出する検出部である、請求項９から１１のいずれか一項に記載の分析用デバイス。
【請求項１３】
前記シグナルが、光学的シグナルまたは電気化学的シグナルである、請求項１２記載の分析用デバイス。
【請求項１４】
さらに、試薬部を有し、
前記試薬部が、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能に対する基質を含む、請求項９から１３のいずれか一項に記載の分析用デバイス。
【請求項１５】
請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸センサを含むことを特徴とするメラミンの分析用試薬。
【請求項１６】
さらに、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能に対する基質を含む、請求項１５記載の分析用試薬。
【請求項１７】
請求項１から８のいずれか一項に記載のメラミンの分析用核酸センサに試料を接触させる接触工程、および、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のメラミンを検出する検出工程を含むことを特徴とする、メラミンの分析方法。
【請求項１８】
前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能に対する基質の存在下、前記検出工程を行う、請求項１７記載の分析方法。
【請求項１９】
請求項９から１４のいずれか一項に記載の分析用デバイスに試料を接触させる接触工程、および、前記分析用デバイスの前記検出部において、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のメラミンを検出する検出工程を含むことを特徴とするメラミンの分析方法。
【請求項２０】
前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能に対する基質の存在下、前記検出工程を行う、請求項１９記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラミンの分析用核酸センサ、分析用デバイスおよび分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラミンは、窒素含有量の高い有機窒素化合物である。近年、見かけのタンパク質量を増加させるために、牛乳や粉ミルク等の加工品にメラミンが混入され、これが原因で、乳幼児に腎不全が多発するという問題が生じている。このような、メラミンが混入された食品の摂取ならびに流通を防止するために、食品中のメラミンの分析は、極めて重要視されている。日本の厚生労働省におけるメラニン濃度の基準値は、０．５ｐｐｍであるが、人体への影響等の点から、実質的には、５００ｐｐｍ程度のメラニン濃度が検出できればよいとされている。【０００３】
現在、メラミンの分析には、フーリエ変換赤外分光分析法（ＦＴＩＲ）が使用されている。しかしながら、ＦＴＩＲ用の分析装置は、極めて高額な大型装置であるため、例えば、食品の輸入業者、販売会社、小売業者、消費者等が、容易に使用することができず、前記分析装置を有している検査機関に依頼せざるを得ないという問題がある。【０００４】
そこで、新たな検出方法として、メラミンに結合する核酸分子（いわゆるアプタマー）を使用する方法の構築が試みられている（非特許文献１）。具体的には、前記核酸分子を固定化したナノゴールドコロイド粒子を使用し、触媒的共鳴散乱スペクトルを分析する方法が提案されている。この方法によれば、前記コロイド粒子に固定化された前記核酸分子間でメラミンが結合すると、前記コロイド粒子の触媒能が失活する。このため、前記触媒的共鳴散乱スペクトルにより、触媒能を有無や減少を分析することで、試料中のメラミンの有無および量を分析できると考えられている。しかしながら、この方法によっても、特殊な装置が必要であり、簡便な分析とは言い難い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】A  Highly  Sensitive  Aptamer-Nanogold  Catalytic  Resonance  Scattering  Spectral  Assay  for  Melamine.  Aihui  Liang,  J  Fluoresc  (2011)  21：1907−1912
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、メラミンを分析するための新たなセンサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の分析用核酸センサは、メラミンの分析用核酸センサであり、触媒機能を生起する触媒核酸分子（Ｄ）およびメラミンに結合する結合核酸分子（Ａ）を有する下記（ｘ１）、（ｘ２）、（ｘ３）または（ｘ４）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ｘ１）配列番号１〜１４のいずれか一つの塩基配列からなり、ｎおよびｍは、正の整数であるポリヌクレオチド
（ｘ２）前記（ｘ１）の前記塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
（ｘ３）前記（ｘ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
（ｘ４）前記（ｘ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド【０００８】
本発明の分析用デバイスは、メラミンの分析用デバイスであり、基材、核酸センサおよび検出部を含み、前記基材に、前記核酸センサおよび前記検出部が配置され、前記核酸センサが、前記本発明の核酸センサであり、前記検出部は、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出する検出部であることを特徴とする。【０００９】
本発明の分析用キットは、容器および核酸センサを含み、前記核酸センサは、前記本発明の核酸センサであることを特徴とする。【００１０】
本発明の分析方法は、メラミンの分析方法であり、前記本発明のメラミンの分析用核酸センサに試料を接触させる工程、および、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のメラミンを検出する工程を含むことを特徴とする。【００１１】
本発明の分析方法は、メラミンの分析方法であり、前記本発明の分析用デバイスに試料を接触させる工程、および、前記分析用デバイスの前記検出部において、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のメラミンを検出する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の核酸センサによれば、前記結合核酸分子（Ａ）とメラミンとが結合したか否かによって、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能のＯＮ−ＯＦＦをスイッチできる。このため、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することで、メラミンの有無または量を、容易に検出可能である。また、本発明の分析用デバイスは、前述のように、前記核酸センサを使用することから、例えば、デバイスの小型化およびチップ化等も可能であり、多数の検体でも簡便な分析が可能となる。このため、本発明は、例えば、メラミンの分析において極めて有用な技術といえる。本発明において、「分析」は、例えば、定量分析、半定量分析、定性分析を含む概念である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の実施例１における核酸センサの構造を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の実施例１における吸光度測定の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例２における核酸センサの構造を示す模式図である。
【図４】図４は、本発明の実施例２における吸光度測定の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例３におけるＲＬＵ測定の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例４における核酸センサの構造を示す模式図である。
【図７】図７は、本発明の実施例４におけるＲＬＵ測定の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例５における核酸センサの構造を示す模式図である。
【図９】図９は、本発明の実施例５におけるＲＬＵ測定の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例６における核酸センサの構造を示す模式図である。
【図１１】図１１は、本発明の実施例６におけるＲＬＵ測定の結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の実施例７における核酸センサの構造を示す模式図である。
【図１３】図１３は、本発明の実施例７におけるＲＬＵ測定の結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、本発明の実施例８における核酸センサの構造を示す模式図である。
【図１５】図１５は、本発明の実施例８におけるＲＬＵ測定の結果を示すグラフである。
【図１６】図１６は、本発明の実施例９における比色定量の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（核酸センサおよびそれを用いた分析方法）
本発明のメラミンの分析用核酸センサは、前述のように、触媒機能を生起する触媒核酸分子（Ｄ）およびメラミンに結合する結合核酸分子（Ａ）を有する下記（ｘ１）、（ｘ２）、（ｘ３）または（ｘ４）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ｘ１）配列番号１〜１４のいずれか一つの塩基配列からなり、ｎおよびｍは、正の整数であるポリヌクレオチド
（ｘ２）前記（ｘ１）の前記塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
（ｘ３）前記（ｘ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
（ｘ４）前記（ｘ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、
メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
メラミン存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起されるポリヌクレオチド
【００１５】
配列番号１    GGGTGGGAGGGTCGGGccctCGC（T)nGCG
配列番号２    GGGTGGGAGGGTCGGGccctcCGC（T)nGCG
配列番号３    GGGTGGGAGGGTCGGGccctttCGC（T)nGCG
配列番号４    GGGTGGGAGGGTCGGGcaccctCGC（T)nGCG
配列番号５    GGGTGGGAGGGTCGGGccctccCGC（T)nGCG
配列番号６    GGGTGGGAGGGTCGGGccctccCGC（T)nGCGg
配列番号７    GGGTGGGAGGGTCGGGcccGCGCG（T)nCGCGC
配列番号８    GGGTGGGAGGGTCGGGacccGCGCG（T)nCGCGC
配列番号９    GGGTGGGAGGGTCGGGcacccGCGCG（T)nCGCGC
配列番号１０  GCGCG（T)nCGCGCcgcgcGGGTGGGAGGGTCGGG
配列番号１１  GCGCG（T)nCGCGCacgcgcGGGTGGGAGGGTCGGG
配列番号１２  GGGTGGGAGGGTCGGGccctcCGC（T)mGGC（T)nGCC（T)mGCG
配列番号１３  GGGTGGGAGGGTCGGGccctcCGC（T)mAGGC（T)nGCC（T)mGCG
配列番号１４  AGGGACGGGAAGAACGC（T)nGCGAAAATGTGGAGGGT
【００１６】
前記配列番号１〜１３の塩基配列において、下線部が、前記結合核酸分子（Ａ）および前記触媒核酸分子（Ｄ）を示す。具体的に、配列番号１〜９、１２および１３の塩基配列において、例えば、５’側の下線が、前記触媒核酸分子（Ｄ）であり、３’側の下線が、前記結合核酸分子（Ａ）である。配列番号１０および１１において、例えば、５’側の下線が、前記結合核酸分子（Ａ）であり、３’側の下線が、前記触媒核酸分子（Ｄ）である。配列番号１４の塩基配列において、下線部が、前記結合核酸分子（Ａ）であり、その両端の配列が、二本鎖型の前記触媒核酸分子（Ｄ）である。
【００１７】
本発明の核酸センサは、例えば、さらに、前記結合核酸分子（Ａ）と前記触媒核酸分子（Ｄ）とを連結するリンカー配列（Ｌ）を有してもよい。前記リンカー配列（Ｌ）は、例えば、０〜１４塩基長であり、より好ましくは０〜１０塩基長であり、さらに好ましくは０〜７塩基長である。前記配列番号１〜１３の塩基配列は、例えば、下線領域の間が前記リンカー配列（Ｌ）であり、さらなるリンカー配列（Ｌ）を有してもよい。
【００１８】
前記結合核酸分子（Ａ）は、メラミンに結合する核酸分子であればよく、その分子内でメラミンに結合することが好ましい。前記結合核酸分子（Ａ）は、以下、メラミンアプタマーともいう。前記結合核酸分子（Ａ）は、例えば、ステム形成領域ＳＡとループ領域とステム形成領域ＳＡ’とから構成される。前記ステム形成領域ＳＡと前記ステム形成領域ＳＡ’とは、互いに相補性を示す配列からなり、例えば、メラミン存在下で、自己アニーリングによりステムを形成する。
【００１９】
前記ステム形成領域ＳＡと前記ステム形成領域ＳＡ’は、それぞれ、例えば、１〜１０塩基長であり、より好ましくは２〜７塩基長であり、さらに好ましくは３〜５塩基長である。前記ステム形成領域ＳＡと前記ステム形成領域ＳＡ’は、例えば、同じ塩基長でも、異なる塩基長でもよく、好ましくは前者であり、両者が完全に相補な配列であることが、より好ましい。
【００２０】
前記ループ領域は、例えば、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のポリヌクレオチド（以下、ポリｄＴ）であり、（Ｔ）ｎで表わすことができる。ｎは、正の整数である。ｎは、例えば、３〜１００であり、好ましくは６〜７０であり、より好ましくは６〜６０または１０〜６０であり、さらに好ましくは６〜４８または１２〜４８である。
【００２１】
前記結合核酸分子（Ａ）は、例えば、ポリｄＴからなるループ領域の他に、さらに、ポリｄＴからなるインターナルループ領域を有してもよい。このような結合核酸分子（Ａ）を、例えば、タンデム型ともいう。
【００２２】
前記結合核酸分子（Ａ）の長さは、特に制限されないが、例えば、９〜１２０塩基長であり、より好ましくは２０〜７０塩基長であり、さらに好ましくは１８〜５４塩基長である。
【００２３】
前記結合核酸分子（Ａ）は、具体例として、例えば、以下の配列があげられる。
CGC（T)ｎGCG  （配列番号５７）
Mel01  ｎ＝７
Mel02  ｎ＝８
Mel03  ｎ＝９
Mel04  ｎ＝１０
Mel05  ｎ＝１１
Mel06  ｎ＝１２
GCGCG（T)ｎCGCGCG（配列番号５８）
Mel07  ｎ＝７
Mel08  ｎ＝８
Mel09  ｎ＝９
Mel10  ｎ＝１０
Mel11  ｎ＝１１
Mel12  ｎ＝１２
【００２４】
前記触媒核酸分子（Ｄ）は、触媒機能を生起する核酸分子であればよい。前記触媒機能は、例えば、酸化還元反応の触媒機能である。前記酸化還元反応は、例えば、基質から生成物が生成される過程において、二つの基質の間に電子の授受を生じる反応であればよい。前記酸化還元反応の種類は、特に制限されない。前記酸化還元反応の触媒機能は、例えば、酵素と同様の活性があげられ、具体的には、例えば、ペルオキシダーゼと同様の活性（以下、「ペルオキシダーゼ様活性」という）等があげられる。前記ペルオキシダーゼ活性は、例えば、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）活性があげられる。前記触媒核酸分子（Ｄ）は、後述するようなＤＮＡの場合、ＤＮＡエンザイムまたはＤＮＡｚｙｍｅと呼ぶことができ、また、後述するようなＲＮＡの場合、ＲＮＡエンザイムまたはＲＮＡｚｙｍｅと呼ぶことができる。
【００２５】
前記触媒核酸分子（Ｄ）は、Ｇ−カルテット（またはＧ−ｔｅｔｒａｄという）の構造を形成する核酸が好ましく、より好ましくはグアニン四重鎖（またはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘという）の構造を形成する核酸である。前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄは、例えば、グアニンが四量体となった面の構造であり、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘは、例えば、前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄが複数面重なった構造をいう。前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄおよび前記Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘは、例えば、反復してＧリッチの構造モチーフを有する核酸において、形成される。前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄは、例えば、パラレル型およびアンチパラレル型があげられるが、パラレル型が好ましい。
【００２６】
前記触媒核酸分子（Ｄ）は、ポルフィリンと結合可能な核酸が好ましく、具体的には、前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄを形成し且つ前記ポルフィリンと結合可能な核酸が好ましい。前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄを有する核酸は、例えば、前記ポルフィリンと結合して複合体を形成することによって、前述のような酸化還元反応の触媒機能を生起することが知られている。前記核酸センサにおいて、前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、前記結合核酸分子（Ａ）にメラミンが結合していない状態で、前記リンカー配列（Ｌ）または前記結合核酸分子（Ａ）との間でステムを形成することにより、前記ポルフィリンとの結合が阻害され、前記結合核酸分子（Ａ）にメラミンが結合することにより、前記ステム形成が解除され、前記ポルフィリンと結合することが好ましい。具体的には、前記核酸センサにおいて、前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、前記結合核酸分子（Ａ）にメラミンが結合していない状態で、前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄの形成が阻害され且つこれにより前記ポルフィリンとの結合が阻害され、前記結合核酸分子（Ａ）にメラミンが結合することにより、前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄを形成し且つ前記ポルフィリンと結合することが好ましい。
【００２７】
前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、無置換体のポルフィリン、その誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、置換体のポルフィリンおよび金属元素と錯体を形成した金属ポルフィリン等があげられる。前記置換体のポルフィリンは、例えば、Ｎ−メチルメソポルフィリン等があげられる。前記金属ポルフィリンは、例えば、三価鉄錯体であるヘミン等があげられる。前記ポルフィリンは、例えば、前記金属ポルフィリンが好ましく、より好ましくはヘミンである。
【００２８】
前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。前記核酸センサにおいて、前記触媒核酸分子（Ｄ）が一本鎖の場合、例えば、前記結合核酸分子（Ａ）にメラミンが結合していない状態で、前記触媒核酸分子（Ｄ）は、前記リンカー配列（Ｌ）または前記結合核酸分子（Ａ）との間でステムを形成することにより、前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄの形成が阻害され、前記結合核酸分子（Ａ）にメラミンが結合することにより、前記ステム形成が解除され、前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄを形成する。また、前記核酸センサにおいて、前記触媒核酸分子（Ｄ）が二本鎖の場合、例えば、前記結合核酸分子（Ａ）にメラミンが結合していない状態では、前記結合核酸分子（Ａ）の構造が揺らいでいるため、前記触媒核酸分子（Ｄ）の前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄの形成が阻害され、前記結合核酸分子（Ａ）にメラミンが結合することにより、前記Ｇ−ｔｅｔｒａｄを形成する。前記触媒核酸分子（Ｄ）は、一本鎖の場合、例えば、１５〜３０塩基長であり、より好ましくは１５〜２４塩基長であり、さらに好ましくは１５〜１８塩基長である。二本鎖の場合、それぞれの鎖が、例えば、７〜２１塩基長であり、より好ましくは７〜１７塩基長であり、さらに好ましくは７〜１４塩基長である。
【００２９】
前記二本鎖の触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、以下の配列の組合せがあげられる。
5’-AGGGACGGGAAGAA-3’  （配列番号５９）
3’-TGGGAGGTGTAAAA-5’  （配列番号６０）
【００３０】
前記一本鎖の触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、以下の配列があげられる。
ｎｅｃｏ０５８４（配列番号６１）
5’-GGGTGGGAGGGTCGGG-3’
【００３１】
前記触媒核酸分子（Ｄ）は、前述のように、例えば、メラミン非存在下において、前記結合核酸分子（Ａ）にメラミンが結合していない状態で、前記リンカー配列（Ｌ）との間でステムを形成することにより、触媒機能が阻害され、前記結合核酸分子（Ａ）にメラミンが結合することにより、前記ステム形成が解除され、前記触媒機能が生起されることが好ましい。このため、前述のように、前記核酸センサは、さらに、前記触媒核酸分子（Ｄ）と前記結合核酸分子（Ａ）との間に、これらを連結する前記リンカー配列（Ｌ）を有することが好ましい。前記リンカー配列（Ｌ）の塩基配列は、例えば、前記触媒核酸分子の配列に応じて設定できる。
【００３２】
本発明の核酸センサは、前述のように、前記触媒核酸分子（Ｄ）および前記結合核酸分子（Ａ）を有する前記（ｘ１）、（ｘ２）、（ｘ３）または（ｘ４）のポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、例えば、メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、メラミン存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起されるポリヌクレオチドである。
【００３３】
前記（ｘ１）のポリヌクレオチドは、配列番号１〜１４のいずれか一つの塩基配列からなり、ｎおよびｍは、正の整数である。前記ｎは、例えば、前述の数値があげられ、６〜４８が好ましい。配列番号１２および１３のヌクレオチドは、２つの前記（Ｔ）ｍが、内部ループを形成することから、それぞれのｍは、例えば、２〜３１であり、好ましくは２〜２４であり、より好ましくは３〜１７であり、さらに好ましくは４〜１０である。
【００３４】
前記（ｘ２）のポリヌクレオチドは、前記（ｘ１）の前記塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列からなる。前記（ｘ２）において、「１または複数」は、特に制限されない。前記置換された塩基の数は、前記塩基配列（ｘ１）において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個または２個、特に好ましくは１個である。前記付加または挿入された塩基の数は、前記塩基配列（ｘ１）において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個または２個、特に好ましくは１個である。前記欠失された塩基の数は、前記塩基配列（ｘ１）において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは２個または１個、特に好ましくは１個である。
【００３５】
前記（ｘ３）のポリヌクレオチドは、前記（ｘ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる。前記（ｘ３）において、前記同一性は、前記塩基配列（ｘ１）に対して、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。
【００３６】
前記（ｘ４）のポリヌクレオチドは、前記（ｘ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなる。前記（ｘ４）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」は、例えば、０．７〜１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより塩基配列を同定できる条件をいう。１×ＳＳＣは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウムからなる。
【００３７】
前記核酸センサは、例えば、前記（ｘ１）〜（ｘ４）のいずれかのポリヌクレオチドからなるセンサでもよいし、前記ポリヌクレオチドを含むセンサでもよい。後者の場合、例えば、さらに、前記ポリヌクレオチドの５’末端に連結した５’末端付加配列を有してもよく、また、前記ポリヌクレオチドの３’末端に連結した３’末端付加配列を有してもよく、前記５’末端付加配列および前記３’末端付加配列の両方を有してもよい。前記５’末端付加配列は、例えば、０〜２２塩基長であり、より好ましくは０〜１８塩基長であり、さらに好ましくは０〜１４塩基長であり、前記３’末端付加配列は、例えば、０〜１８塩基長であり、より好ましくは０〜１０塩基長であり、さらに好ましくは０〜７塩基長である。後述するように、前記核酸センサを固定化した使用する場合、例えば、固定化用のリンカー配列として、前記５’末端付加配列または前記３’末端付加配列を有してもよい。前記固定化用のリンカー配列は、例えば、ポリｄＴ等があげられる。前記固定化用のリンカー配列の長さは、特に制限されず、例えば、０〜１２０塩基長であり、より好ましくは６〜８０塩基長である。
【００３８】
前記核酸センサの具体例としては、例えば、（Ｘ１）、（Ｘ２）、（Ｘ３）または（Ｘ４）のポリヌクレオチドを含むセンサがあげられる。これらのポリヌクレオチドは、例えば、メラミン非存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、メラミン存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起されるポリヌクレオチドである。
【００３９】
前記（Ｘ１）のポリヌクレオチドは、前記（ｘ１）の塩基配列を含む、配列番号１５〜５６のいずれか一つの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。これらの配列を、下記表１〜４に示す。
【００４０】
【表１】
2014017471.tif 000003
【００４１】
前記表１の各（Ｘ１）ポリヌクレオチドは、配列番号１または２の塩基配列を含むポリヌクレオチドであり、前記配列番号１または２の塩基配列の５’末端に０〜５塩基（０、１、５塩基）の付加配列、３’末端に０〜１２塩基（０、６、１２、１６塩基）の付加配列を有している。
【００４２】
【表２】
2014017471.tif 000004
【００４３】
前記表２の（Ｘ１）ポリヌクレオチドは、配列番号３、４、５、７、８または９の塩基配列を含むポリヌクレオチドであり、前記配列番号３、４、５、７、８または９の塩基配列の５’末端に０〜３塩基（０、１、３塩基）の付加配列、３’末端に０〜６（０、６塩基）の付加配列を有している。
【００４４】
【表３】
2014017471.tif 000005
【００４５】
前記表３の（Ｘ１）ポリヌクレオチドは、配列番号１０または１１の塩基配列を含むポリヌクレオチドであり、前記配列番号１０または１１の塩基配列の５’末端に５または６塩基の付加配列を有している。
【００４６】
【表４】
2014017471.tif 000006
【００４７】
前記表４の（Ｘ１）ポリヌクレオチドのうち、配列番号４８または４７の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号１２または１３の塩基配列を含むポリヌクレオチドであり、前記配列番号１２または１３の塩基配列の５’末端に１塩基の付加配列を有している。前記表４の（Ｘ１）ポリヌクレオチドのうち、配列番号４０、４９、５０および５１の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、前記配列番号１４の塩基からなるポリヌクレオチドである。
【００４８】
前記（Ｘ２）のポリヌクレオチドは、前記（Ｘ１）の前記塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列からなる。前記（Ｘ２）において、「１または複数」は、特に制限されず、例えば、前記（ｘ２）の例示を援用できる。具体例として、前記表１において、前記配列番号３９の塩基からなるポリヌクレオチドは、前記配列番号２の塩基配列における５’末端のＣをＴに置換した配列を含み、具体的には、配列番号３８の塩基配列における３’側下線部の５’末端のＣがＴに置換した配列からなる。
【００４９】
前記（Ｘ３）のポリヌクレオチドは、前記（Ｘ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる。前記同一性は、例えば、前記（ｘ３）の例示を援用できる。
【００５０】
前記（Ｘ４）のポリヌクレオチドは、前記（Ｘ１）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなる。前記「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」は、例えば、前記（ｘ４）の例示を援用できる。
【００５１】
本発明の核酸センサの大きさは、特に制限されず、例えば、１５〜１３０塩基長であり、より好ましくは２０〜１１０塩基長であり、さらに好ましくは３０〜９０塩基長である。
【００５２】
本発明の核酸センサの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、前記核酸センサは、例えば、前記ヌクレオチド残基を含む分子であり、前記ヌクレオチド残基のみからなる分子でもよいし、前記ヌクレオチド残基を含む分子でもよい。前記ヌクレオチドは、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの誘導体である。前記核酸センサは、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの誘導体のいずれか一種類のみを含んでもよいし、二種類以上を含んでもよいし、全てを含んでもよい。具体的に、前記核酸センサは、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはその誘導体を含むＤＮＡでもよいし、リボヌクレオチドおよび／またはその誘導体を含むＲＮＡでもよいし、前者と後者とを含むキメラ（ＤＮＡ／ＲＮＡ）でもよい。前記核酸センサは、好ましくはＤＮＡであり、例えば、ＤＮＡセンサということもできる。
【００５３】
前記ヌクレオチドは、塩基として、例えば、天然塩基（非人工塩基）および非天然塩基（人工塩基）のいずれを含んでもよい。前記天然塩基は、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕおよびこれらの修飾塩基があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記非天然塩基は、例えば、２’−フルオロピリミジン、２’−Ｏ−メチルピリミジン等があげられ、具体例としては、２’−フルオロウラシル、２’−アミノウラシル、２’−Ｏ−メチルウラシル、２’−チオウラシル等があげられる。前記ヌクレオチドは、例えば、修飾されたヌクレオチドでもよく、前記修飾ヌクレオチドは、例えば、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。前記結合核酸分子（Ａ）は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等の非ヌクレオチドを含んでもよい。
【００５４】
本発明の核酸センサは、例えば、メラミンの非存在において、前記触媒核酸分子（Ｄ）が部分的に前記リンカー配列とステムを形成し、これによって、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害される。前記触媒機能の阻害は、例えば、このステム形成で、前記触媒核酸分子（Ｄ）がケージ化されて起こる。つまり、ステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、触媒機能を生起する構造をとれないことで、触媒機能が阻害される。他方、メラミンの存在下、前記メラミンと前記結合核酸分子（Ａ）との結合により、前記ステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される。前記触媒機能の生起は、例えば、ステム形成が解除され、前記触媒核酸分子のケージ化が解除されて起こる。つまり、ステム形成の解除により、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、触媒機能を生起する本来の構造をとることで、触媒機能が生起される。前記核酸センサは、このように、メラミンが非存在の場合、例えば、前記ステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され（スイッチＯＦＦ）、メラミンが存在の場合、前記ステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される（スイッチＯＮ）。なお、本発明は、これらのメカニズムには制限されない。
【００５５】
本発明の核酸センサは、例えば、遊離状態で使用してもよいし、固定化した状態で使用してもよい。後者の場合、例えば、前記核酸センサを前記基材に固定化し、デバイスとして使用できる。前記基材は、例えば、プレート、シート、フィルム、スワブ等の基板；ウェルプレート、チューブ等の容器；ビーズ、粒子、フィルター等があげられる。前記核酸センサは、例えば、５’末端および３’末端のいずれを固定化してもよい。
【００５６】
前記固定化方法は、特に制限されず、例えば、化学的結合による連結が例示できる。具体例としては、例えば、前記担体および前記核酸センサのいずれか一方に、ストレプトアビジンまたはアビジンを結合させ、他方に、ビオチンを結合させ、前者と後者との結合を利用して固定化する方法があげられる。
【００５７】
前記固定化方法は、例えば、この他に、公知の核酸固定化方法が採用できる。前記方法は、例えば、フォトリソグラフィーを利用する方法があげられ、具体例として、米国特許５，４２４，１８６号明細書等を参照できる。また、前記固定化方法は、例えば、前記基材上で前記核酸センサを合成する方法があげられる。この方法は、例えば、いわゆるスポット法があげられ、具体例として、米国特許５，８０７，５２２号明細書、特表平１０−５０３８４１号公報等を参照できる。
【００５８】
前記核酸センサは、例えば、前記基材に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。前者の場合、例えば、前記核酸センサの末端において、前記核酸センサを前記基材に固定化することが好ましい。後者の場合、例えば、前記核酸センサを、固定化用のリンカー配列を介して、前記基材に固定化してもよい。前記核酸センサの前記基材への配置は、例えば、後述する本発明の分析用デバイスを参照できる。
【００５９】
本発明の核酸センサの使用方法は、特に制限されず、以下のように、本発明のメラミンの分析方法に使用できる。
【００６０】
本発明の分析方法は、前述のように、メラミンの分析方法であり、前記本発明の核酸センサに、試料を接触させる接触工程、および、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のメラミンを検出する検出工程を含むことを特徴とする。
【００６１】
前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、メラミンを含む試料、およびメラミンを含有するか否かが不明な試料のいずれでもよい。前記試料は、例えば、液体試料が好ましい。被検体が、例えば、液体の場合、前記被検体をそのまま試料として使用してもよいし、溶媒に混合した希釈液を試料として使用してもよい。被検体が、例えば、固体、粉末等の場合は、溶媒に混合した混合液、または、溶媒に懸濁した懸濁液等を、試料として使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等があげられる。前記被検体の具体例は、例えば、原乳、加工乳、粉ミルク等があげられる。
【００６２】
本発明の核酸センサを遊離状態で使用する際は、例えば、前記容器内で、前記核酸センサと前記試料とを接触させることが好ましい。また、本発明の核酸センサを前記基材に固定化した状態で使用する際は、例えば、前記基材上の前記核酸センサに、前記試料を接触させることができる。
【００６３】
前記検出工程は、例えば、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能により生成されるシグナルを検出することが好ましい。前記シグナルは、例えば、光学的シグナルおよび電気化学的シグナル等があげられる。前記光学的シグナルは、例えば、発色シグナル、発光シグナル、蛍光シグナル等があげられる。
【００６４】
前記シグナルは、例えば、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能により、基質から生成されることが好ましい。そこで、前記検出工程は、例えば、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能に応じた基質の存在下で、行うことが好ましい。
【００６５】
前記基質は、例えば、前記触媒機能によって、発色、発光もしくは蛍光の生成物を生成する基質、前記触媒機能によって、発色、発光もしくは蛍光が消失する生成物を生成する基質、また、前記触媒機能によって、異なる発色、発光もしくは蛍光の生成物を生成する基質等があげられる。このような基質によれば、例えば、発色、発光もしくは蛍光の有無、または、発色、発光もしくは蛍光の変化や強度等をシグナルとして、目視で確認することにより、前記触媒機能を検出できる。また、例えば、吸光度、反射率、蛍光強度等をシグナルとして、光学的な手法で測定することにより、前記触媒機能を検出することもできる。前記触媒機能は、例えば、前述のような酸化還元反応の触媒機能があげられる。
【００６６】
また、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、前記酸化還元反応の触媒機能を有する場合、例えば、電子の授受が可能な基質があげられる。この場合、前記触媒核酸分子（Ｄ）により、例えば、前記基質から生成物が生成され、その過程において、電子の授受が生じる。この電子授受は、例えば、電極への印加により、電気シグナルとして、電気化学的に検出できる。前記電気シグナルの検出は、例えば、電流等のような、前記電気シグナルの強度を測定することにより行える。
【００６７】
前記基質は、特に制限されず、例えば、過酸化水素、3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine（ＴＭＢ）、1,2-Phenylenediamine（ＯＰＤ）、2,2’-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic  Acid  Ammonium  Salt（ＡＢＴＳ）、3,3’-Diaminobenzidine（ＤＡＢ）、3,3’-Diaminobenzidine  Tetrahydrochloride  Hydrate（ＤＡＢ４ＨＣｌ）、3-Amino-9-ethylcarbazole（ＡＥＣ）、4-Chloro-1-naphthol（４Ｃ１Ｎ）、2,4,6-Tribromo-3-hydroxybenzoic  Acid、2,4-Dichlorophenol、4-Aminoantipyrine、4-Aminoantipyrine  Hydrochloride、ルミノール等があげられる。
【００６８】
前記検出工程において、前記基質は、例えば、前記核酸センサに前記試料を接触させる前に、予め、前記核酸センサに供給してもよいし、前記試料の接触と同時または前記試料を接触させた後、前記核酸センサに供給してもよい。前記基質は、例えば、液体に混合した基質液として、前記核酸センサに供給することが好ましい。前記基質を混合する液体は、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液が好ましい。前記基質液における前記基質の濃度は、特に制限されず、例えば、０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．５〜２ｍｍｏｌ／Ｌである。また、前記基質液のｐＨは、例えば、６〜９であり、好ましくは６．８〜９である。
【００６９】
前記検出工程において、前記触媒核酸分子（Ｄ）による反応条件は、特に制限されない。温度は、例えば、１５〜３７℃であり、時間は、例えば、１０〜９００秒である。
【００７０】
また、前記検出工程において、前記基質の他に、例えば、ポルフィリンを共存させてもよい。公知のＤＮＡｚｙｍｅには、例えば、ポルフィリンと複合体を形成することによって、さらに高い酸化還元活性を示すものがある。そこで、本発明においても、例えば、ポルフィリンを共存させて、前記触媒核酸分子（Ｄ）とポルフィリンとの複合体として、酸化還元活性を検出してもよい。前記ポルフィリンの供給は、特に制限されず、前記基質と同様に行うことができる。
【００７１】
前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、無置換体のポルフィリン、その誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、置換体のポルフィリンおよび金属元素と錯体を形成した金属ポルフィリン等があげられる。前記置換体のポルフィリンは、例えば、Ｎ−メチルメソポルフィリン等があげられる。前記金属ポルフィリンは、例えば、三価鉄錯体であるヘミン等があげられる。前記ポルフィリンは、例えば、前記金属ポルフィリンが好ましく、より好ましくはヘミンである。
【００７２】
本発明の分析方法において、前記接触工程と前記検出工程との間に、さらに、洗浄工程を有してもよい。前記洗浄工程は、例えば、前記核酸センサと前記試料とを接触させた後、前記核酸センサを洗浄液で洗浄する工程である。前記洗浄工程によって、例えば、前記試料中に含まれる夾雑物を除去でき、さらに精度に優れる分析が可能となる。前記洗浄液は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等の水性溶媒があげられる。前記核酸センサは、例えば、前記洗浄工程が容易に行えることから、前述のような基材に固定化されていることが好ましい。
【００７３】
（分析用デバイスおよびそれを用いた分析方法）
本発明の分析用デバイスは、メラミンの分析用デバイスであり、基材、核酸センサおよび検出部を含み、前記基材に、前記核酸センサおよび前記検出部が配置され、前記核酸センサは、前記本発明の核酸センサであり、前記検出部は、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出する検出部であることを特徴とする。
【００７４】
本発明の分析用デバイスは、前記本発明の核酸センサを使用することが特徴であって、その他の構成に関しては何ら制限されない。特に説明しない限り、本発明の分析用デバイスは、例えば、前記本発明の核酸センサの説明を援用できる。
【００７５】
本発明の分析用デバイスにおいて、前記核酸センサの配置方法は、特に制限されない。前記分析用デバイスにおいて、前記核酸センサは、例えば、前記基材に固定化されてもよいし、固定化されていなくてもよい。前記核酸センサの配置に関しては、例えば、前記本発明の核酸センサの説明を援用できる。
【００７６】
前記基材における前記核酸センサの配置部位は、特に制限されず、例えば、前記検出部に配置されている形態があげられる。
【００７７】
本発明の分析用デバイスは、例えば、さらに、試薬部を有してもよい。前記試薬部は、例えば、前記検出部に配置してもよい。前記試薬部は、例えば、予め試薬が配置されてもよいし、使用時に試薬を供給してもよい。前記試薬としては、例えば、前述のような基質、前記ポルフィリン等があげられる。
【００７８】
本発明の分析用デバイスにおいて、前記検出部は、前述のように、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出する検出部である。前記検出部は、例えば、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能により生成されるシグナルを検出する検出部であることが好ましい。前記シグナルは、前述のように、例えば、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能による、基質からのシグナルがあげられる。前記シグナルは、例えば、前述のような、光学的シグナルまたは電気化学的シグナルがあげられる。前記検出部は、例えば、外部から前記検出部において発生するシグナルが検出されることから、被検出部ということもできる。
【００７９】
前記シグナルが光学的シグナルの場合、前記検出部は、例えば、光学的シグナルの検出部であり、吸光度、反射率、蛍光強度等の検出部が例示できる。
【００８０】
前記シグナルが前記電気化学的シグナルの場合、前記検出部は、例えば、電極系を有する。この場合、前記検出部は、例えば、前記基材の表面に、前記電極系を配置することによって形成できる。前記電極の配置方法は、特に制限されず、例えば、公知の方法が採用でき、具体例は、蒸着法、スパッタリング法、スクリーン印刷法、メッキ法等の薄膜形成方法があげられる。前記電極は、例えば、前記基材に、直接配置してもよいし、間接的に配置してもよい。間接的な配置は、例えば、他の部材を介した配置があげられる。
【００８１】
前記電極系は、例えば、作用極および対極を含んでもよいし、作用極、対極および参照極を含んでもよい。前記電極の材料は、特に制限されず、例えば、白金、銀、金、カーボン等があげられる。前記作用極および前記対極は、例えば、白金電極、銀電極、金電極、カーボン電極等があげられ、前記参照極は、例えば、銀／塩化銀の電極があげられる。前記銀／塩化銀の電極は、例えば、銀電極への塩化銀電極の積層により形成できる。
【００８２】
本発明の分析用デバイスが、前記電極系を有する場合、前記核酸センサは、例えば、前記電極系に配置すること好ましく、前記電極の中でも前記作用極に配置することが好ましい。本発明の分析用デバイスが、前記電極系と前記試薬部とを有する場合、例えば、前記電極系の上に、前記試薬部を配置することが好ましい。
【００８３】
本発明の分析用デバイスは、例えば、複数の検出部を備えてもよい。この場合、前記分析用デバイスは、例えば、前記基材の表面をマトリックスに分画し、各分画領域に、前述のような検出部を備えることが好ましい。本発明の分析用デバイスにおいて、１つの検出部に配置する核酸センサの数は、特に制限されない。
【００８４】
前記基材は、特に制限されない。前記基材は、例えば、表面が絶縁性の基板が好ましい。前記基材は、例えば、絶縁材料からなる基板でもよいし、表面に絶縁材料からなる絶縁層を有する基材でもよい。前記絶縁材料は、特に制限されず、例えば、ガラス、セラミック、絶縁性プラスチック、紙等の公知の材料があげられる。前記絶縁性プラスチックは、特に制限されず、例えば、シリコーン樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂、フッ素樹脂等があげられる。
【００８５】
本発明の分析方法は、前述のように、メラミンの分析方法であり、前記本発明の分析用デバイスに試料を接触させる接触工程、および、前記分析用デバイスの前記検出部において、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のメラミンを検出する検出工程を含むことを特徴とする。
【００８６】
本発明の分析方法は、前記本発明の核酸センサを備える前記分析用デバイスを使用することが特徴であって、その他の条件は、何ら制限されない。本発明の分析方法は、例えば、前記本発明の核酸センサにおける分析方法の説明を援用できる。
【００８７】
（分析用試薬）
本発明の分析用試薬は、前記本発明の分析用核酸センサを含むことを特徴とする。本発明の分析用試薬は、前記核酸センサを含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。
【００８８】
本発明の分析用試薬は、前記核酸センサの他に、例えば、前記基質、前記ポルフィリン、前記緩衝液、および／または前記基材等の構成成分を含んでもよい。
【００８９】
本発明の分析用試薬は、例えば、分析用キットでもよい。この場合、例えば、前記核酸センサと、前述したその他の構成成分とを含み、それぞれ別個に収容されてもよい。前記核酸センサは、例えば、前記基材に固定化されてもよいし、固定化されていなくてもよい。前記分析用キットは、例えば、さらに、使用説明書を含んでもよい。
【実施例】
【００９０】
（実施例１）
核酸センサについて、固定化用の付加配列の長さの影響を確認した。具体的には、遊離状態の核酸センサを用い、固定化用の付加配列の長さを変化させ、遊離状態におけるメラミンの検出能を確認した。下記配列は、左側が５’末端であり、右側が３’末端とした（以下、同様）。【００９１】
（１）核酸センサ
結合核酸分子（Ａ）として、メラミンアプタマーであるMel06（配列番号５７、ｎ＝１２）を有し、触媒核酸分子（Ｄ）として、ＤＮＡｚｙｍｅであるneco0584（配列番号６１)を有する、下記表５の核酸センサを作製した。前記表５の配列において、３’末端側のポリｄＴ配列は、固定化用の付加配列である。前記配列において、５’側の下線部がＤＮＡｚｙｍｅであり、３’側の下線部がメラミンアプタマーである。これらの核酸センサの二次構造を、図１に示す。図１は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。【００９２】
【表５】
2014017471.tif 000007
【００９３】
（２）比色分析
マイクロウェルプレートのウェル内に、下記組成となるように、各種成分を添加した。
（ウェル内の組成）
１μｍｏｌ／Ｌ  核酸センサ
３μｍｏｌ／Ｌ  ヘミン
５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ
０．０５％（ｗ／ｖ）  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００【００９４】
つぎに、前記ウェルに５μｍｏｌ／Ｌとなるようにメラミンを添加し、さらに、基質として、２０ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＡＢＴＳ（2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic  Acid  Ammonium  Salt)および０．５ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＨ２Ｏ２を添加した。この反応液を、２５℃で６０秒反応させ、吸光度の測定（波長４１５ｎｍ）を行った。測定は、測定装置（商品名TECAN  infinite  F200  plate  reader、TECAN社）を使用した。【００９５】
ポジティブコントロール（ＰＣ）として、前記核酸センサに代えて、前記ＤＮＡｚｙｍｅであるneco0584（配列番号６１）を使用し、同様に測定した。また、ネガティブコントロール（ＮＣ）として、前記核酸センサを除いた反応液（ｗｉｔｈｏｕｔ  ｏｌｉｇｏ）についても、同様に測定した。【００９６】
これらの結果を図２に示す。図２は、前記反応液の吸光度を示すグラフである。図２に示すように、前記固定化用の付加配列の長さを変化させても、メラミンを検出可能であることが確認された。また、３’側に付加配列を有する核酸センサは、付加配列を有さない核酸センサよりも、優れたＳ／Ｎ比を示した。【００９７】
（実施例２）
遊離状態の核酸センサについて、メラミンの検出能を確認した。【００９８】
（１）核酸センサ
結合核酸分子（Ａ）として、メラミンアプタマーであるMel04（配列番号５７、ｎ＝１０）、Mel05（配列番号５７、ｎ＝１１）、Mel06（配列番号５７、ｎ＝１２）、Mel11（配列番号５８、ｎ＝１１）、Mel12（配列番号５８、ｎ＝１２）を有し、触媒核酸分子（Ｄ）として、ＤＮＡｚｙｍｅであるneco0584（配列番号６１)を有する、下記表６の核酸センサを作製した。前記表６の配列において、３’末端側のポリｄＴ配列は、固定化用の付加配列である。前記配列において、５’側の下線部がＤＮＡｚｙｍｅであり、３’側の下線部がメラミンアプタマーである。これらの核酸センサの二次構造を、図３に示す。図３は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。【００９９】
【表６】
2014017471.tif 000008
【０１００】
（２）比色分析
前記実施例１と同様にして、各核酸センサについて、吸光度の測定を行った。これらの結果を図４に示す。図４は、前記反応液の吸光度を示すグラフである。図４に示すように、実施例の全ての核酸センサについて、ノンパラメトリックの両側Ｔ検定で、メラミンを含む反応液は、メラミン未添加の反応液に対して、その吸光度が有意差を示した。中でも、N1Mel06_I1_A0_D5_T06は、ターゲット添加の場合、ターゲット未添加に対して、２．８倍の高い吸光度を示した。この結果から、実施例の核酸センサによれば、吸光度測定によって、メラミンの有無および濃度を測定可能であり、具体的には、５ｍｍｏｌ／Ｌのメラミンであっても検出可能であることが確認された。【０１０１】
（実施例３）
遊離状態の核酸センサについて、メラミンの検出能を確認した。【０１０２】
（１）核酸センサ
結合核酸分子（Ａ）として、メラミンアプタマーであるMel07（配列番号５８、ｎ＝７）、Mel08（配列番号５８、ｎ＝８）、Mel09（配列番号５８、ｎ＝９）、およびMel10（配列番号５８、ｎ＝１０）を有し、触媒核酸分子（Ｄ）として、ＤＮＡｚｙｍｅであるneco0584(配列番号６１)を有する、核酸センサを作製した。下記配列において、５’側の下線部がメラミンアプタマーであり、３’側の下線部がＤＮＡｚｙｍｅである。【０１０３】
【表７】
2014017471.tif 000009
【０１０４】
（２）化学発光分析
エッペンドルフチューブに、下記試薬１、試薬２および試薬３をこの順序で添加し、２５℃で６０秒反応させた後、前記反応液について、相対化学発光強度（ＲＬＵ）を測定した。下記組成における濃度は、前記反応液における終濃度とした（以下、同様）。測定は、測定装置（商品名TECAN  infinite、TECAN社）を使用した。基質は、ルミノール誘導体であるＬ−０１２（和光純薬社)を使用した。【０１０５】
（試薬１）
４００ｎｍｏｌ／Ｌ  核酸センサ
２００ｎｍｏｌ／Ｌ  ヘミン
５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ
０．０５％（ｗ／ｖ）  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
（試薬２）
５ｍｍｏｌ／Ｌ  メラミン
（試薬３）
２５μｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−０１２
２５μｍｏｌ／Ｌ  Ｈ２Ｏ２【０１０６】
ポジティブコントロール（ＰＣ）として、前記核酸センサに代えて、前記ＤＮＡｚｙｍｅであるneco0584（配列番号６１）を使用し、同様に測定した。また、ネガティブコントロール（ＮＣ）として、前記核酸センサを除いた反応液についても、同様に測定した。ＰＣおよびＮＣは、以下の実施例でも同様とした。【０１０７】
これらの結果を図５に示す。図５は、前記反応液の発光強度（ＲＬＵ）を示すグラフである。図５に示すように、実施例の核酸センサを使用した結果、メラミンを含む反応液は、メラミン未添加の反応液に対して、その発光強度が有意差を示した。この結果から、実施例の核酸センサによれば、発光強度測定によって、メラミンの有無および濃度を測定可能であることがわかった。【０１０８】
下記実施例４から実施例９における核酸センサを、表８に示す。【０１０９】
【表８】
2014017471.tif 000010
【０１１０】
（実施例４）
前記実施例１の核酸センサN1Mel06_I1_A0_D3_T00（配列番号１５）について、推定二次構造を、図６（Ａ）に示す。図６（Ａ）において、左図は、メラミン非存在下での非活性型の推定二次構造であり、右図は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。【０１１１】
このN1Mel06_I1_A0_D3_T00に対して、内部ループの２１番目のｄＴ（Ｔ２１）と２２番目のｄＣ（Ｃ２２）との間に、さらに、ｄＣを挿入したN1Mel06_I1_A0_D3_T00_C（配列番号３８）を作製した。N1Mel06_I1_A0_D3_T00_Cについて、推定二次構造を、図６（Ｂ）に示す。図６（Ｂ）において、左図は、メラミン非存在下での非活性型の推定二次構造であり、右図は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。また、ｄＣに代えてｄＴを挿入したN1Mel06_I1_A0_D3_T00_T（配列番号３９）も作製した。N1Mel06_I1_A0_D3_T00_Tについて、推定二次構造を、図６（Ｃ）に示す。図６（Ｃ）は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。【０１１２】
前記核酸センサについて、前記実施例３と同様にして、相対化学発光強度（ＲＬＵ）を測定した。これらの結果を図７に示す。図７は、前記反応液の発光強度（ＲＬＵ）を示すグラフである。図７に示すように、いずれのセンサもメラミンを検出できた。なかでも、さらにｄＣを挿入したN1Mel06_I1_A0_D3_T00_C（配列番号３８）は、メラミン添加の発光強度とメラミン未添加の発光強度との比（Ｓ／Ｎ）が、より一層向上した。具体的には、N1Mel06_I1_A0_D3_T00（配列番号１５）のＳ／Ｎが、３．２であるに対して、N1Mel06_I1_A0_D3_T00_C（配列番号３８）のＳ／Ｎは、さらに６．５にまで向上した。【０１１３】
（実施例５）
前記実施例４の核酸センサN1Mel06_I1_A0_D3_T00_C（配列番号３８）の改変センサを作製した。具体的には、図６（Ｂ）のN1Mel06_I1_A0_D3_T00_Cの推定二次構造において、５’末端のｄＴを削除したN1Mel06_I1_A0_D3C_1（配列番号４１）、２１番目のｄＴ（Ｔ２１）と２２番目のｄＣ（Ｃ２２）の間にｄＣを挿入したN1Mel06_I1_A0_D3C_C（配列番号４２）を作製した。これらの推定二次構造を、図８（Ａ）、（Ｂ）にそれぞれ示す。図８（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、メラミン非存在下での非活性型推定二次構造である。【０１１４】
また、図８（Ｂ）のN1Mel06_I1_A0_D3C_Cの３’末端に、ｄＧを付加したN1Mel06_I1_A0_D3C_CG（配列番号４３）を作製した。この推定二次構造を、図８（Ｃ）に示す。図８（Ｃ）は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。【０１１５】
また、結合核酸分子（Ａ）として、メラミンアプタマーであるMel06（配列番号５７、ｎ＝１２）を有し、触媒核酸分子（Ｄ）として、下記二本鎖ＤＮＡｚｙｍｅ（ｄｓＧ）を有する、核酸センサMel06_dsG（配列番号４０）を作製した。下記配列において、下線部がｄｓＧに該当する。この核酸センサの推定二次構造を、図８（Ｄ）に示す。図８（Ｄ）は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。【０１１６】
ｄｓＧ
5’-AGGGACGGGAAGAA-3’  （配列番号５９）
3’-TGGGAGGTATAAAA-5’  （配列番号６０）
Mel06_dsG  （配列番号４０）
AGGGACGGGAAGAACGCTTTTTTTTTTTTGCGAAAATGTGGAGGGT【０１１７】
前記核酸センサについて、前記実施例３と同様にして、相対化学発光強度（ＲＬＵ）を測定した。これらの結果を図９に示す。図９は、前記反応液の発光強度（ＲＬＵ）を示すグラフである。また、図９の結果から、メラミン添加の発光強度とメラミン未添加の発光強度との比（Ｓ／Ｎ）を求めた。これらの結果を下記表９に示す。図９および表９に示すように、いずれのセンサもメラミンを検出できた。中でも、５’末端にｄＧを付加したセンサN1Mel06_I1_A0_D3C_CGは、優れたＳ／Ｎを示した。【０１１８】
【表９】
2014017471.tif 000011
【０１１９】
（実施例６）
前記実施例４の核酸センサN1Mel06_I1_A0_D3_T00_C（配列番号３８）の改変センサを作製した。具体的には、図６（Ｂ）の左図に示す、活性型のN1Mel06_I1_A0_D3_T00_Cの推定二次構造において、１２塩基長のポリｄＴを、２４塩基長に変更したN1Mel06_I1_A0_D3C_H24（配列番号４４）、３０塩基長に変更したN1Mel06_I1_A0_D3C_H30（配列番号５２）、３６塩基長に変更したN1Mel06_I1_A0_D3C_H36（配列番号５３）、４２塩基長に変更したN1Mel06_I1_A0_D3C_H42（配列番号５４）、４８塩基長に変更したN1Mel06_I1_A0_D3C_H48（配列番号４６）を作製した。これらの推定二次構造を、図１０にそれぞれ示す。図１０は、それぞれ、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。【０１２０】
前記核酸センサについて、前記実施例４と同様にして、相対化学発光強度（ＲＬＵ）を測定した。これらの結果を図１１に示す。図１１は、前記反応液の発光強度（ＲＬＵ）を示すグラフである。また、図１１の結果から、メラミン添加の発光強度とメラミン未添加の発光強度との比（Ｓ／Ｎ）を求めた。これらの結果を下記表１０に示す。このように、メラミンアプタマーにおけるポリｄＴの塩基長を２０塩基長以上に増加させることで、さらに感度が向上することがわかった。また、N1Mel06_I1_A0_D3_T00_C（配列番号３８）について、メラミンの終濃度を３００μｍｏｌ／Ｌに低減させて同様に測定を行ったところ、Ｓ／Ｎが１．４であった。この結果から、低濃度のメラミンであっても、検出可能であることがわかった。【０１２１】
【表１０】
2014017471.tif 000012
【０１２２】
（実施例７）
前記実施例５のセンサMel06_dsG（配列番号４０）およびN1Mel06_I1_A0_D3C_CG（配列番号４３）の改変センサを作製した。具体的には、図１１に示す、Mel06_dsGおよびN1Mel06_I1_A0_D3C_CGの活性型の推定二次構造において、１２塩基長のポリｄＴを、３０塩基長、３６塩基長、４２塩基長に変更した下記センサを作製した。これらの推定二次構造を、図１２にそれぞれ示す。図１２は、それぞれ、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。
Mel06_dsG_H30  （配列番号４９）
Mel06_dsG_H36  （配列番号５０）
Mel06_dsG_H42  （配列番号５１）
N1Mel06_I1_A0_D3C_CG_H30  （配列番号５２）
N1Mel06_I1_A0_D3C_CG_H36  （配列番号５３）
N1Mel06_I1_A0_D3C_CG_H42  （配列番号５４）【０１２３】
前記核酸センサについて、前記実施例３と同様にして、相対化学発光強度（ＲＬＵ）を測定した。これらの結果を図１３に示す。図１３は、前記反応液の発光強度（ＲＬＵ）を示すグラフである。また、図１３の結果から、メラミン添加の発光強度とメラミン未添加の発光強度との比（Ｓ／Ｎ）を求めた。これらの結果を下記表１１に示す。このように、メラミンアプタマーにおけるポリｄＴの塩基長を３０塩基長以上に増加させることで、さらに感度が向上することがわかった。【０１２４】
【表１１】
2014017471.tif 000013
【０１２５】
（実施例８）
前記実施例４の核酸センサN1Mel06_I1_A0_D3_T00_Cの改変センサを作製した。具体的には、図６（Ｂ）の左図に示す、活性型のN1Mel06_I1_A0_D3_T00_Cの推定二次構造において、メラニンアプタマーとＤＮＡｚｙｍｅとの間に、さらに、ポリｄＴの内部ループを追加して、ポリｄＴを含むメラニンアプタマーがタンデムとなるセンサN1Mel06_I1_A0_D3C_sAT（配列番号４７）およびN1Mel06_I1_A0_D3C_sGC（配列番号４８）を作製した。これらの推定二次構造を、図１４に示す。図１４は、メラミン存在下での活性型の推定二次構造である。【０１２６】
前記核酸センサについて、前記実施例３と同様にして、相対化学発光強度（ＲＬＵ）を測定した。これらの結果を図１５に示す。図１５は、前記反応液の発光強度（ＲＬＵ）を示すグラフである。また、図１５の結果から、メラミン添加の発光強度とメラミン未添加の発光強度との比（Ｓ／Ｎ）を求めた。これらの結果を下記表１２に示す。このように、センサにおいてメラミンアプタマーをタンデムとすることによっても、メラニン検出が可能であることがわかった。【０１２７】
【表１２】
2014017471.tif 000014
【０１２８】
（実施例９）
前記実施例４の核酸センサN1Mel06_I1_A0_D3_T00_Cを使用して、メラミンの比色分析および化学発光分析を行った。【０１２９】
（１）比色分析
エッペンドルフチューブに、下記試薬１、試薬２および試薬３をこの順序で添加し、２５℃で５分間反応させた後、前記反応液の着色を目視観察した。下記組成における濃度は、前記反応液における終濃度とした。前記反応液におけるメラミンの終濃度は、０、１２．５、３７．５、１２５、３７５、６２５ｐｐｍ（０、１００μｍｏｌ／Ｌ、３００μｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、３ｍｍｏｌ／Ｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ）とした。基質は、ＡＢＴＳを使用した。【０１３０】
（試薬１）
１μｍｏｌ／Ｌ  核酸センサ
３μｍｏｌ／Ｌ  ヘミン
５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ
０．０５％（ｗ／ｖ）  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
（試薬２）
所定濃度  メラミン
（試薬３）
１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＢＴＳ
０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｈ２Ｏ２【０１３１】
ネガティブコントロール（ＮＣ）として、前記核酸センサを未添加とした前記試薬１を使用し、同様にして目視観察を行った。【０１３２】
これらの結果を図１６に示す。図１６は、前記反応液の発色を示す結果である。図１６は、反応液の着色を示す写真であって、色が黒い程、青色への発色が強いことを示す。図１６に示すように、３７５ｐｐｍ以上のメラミン濃度の反応液において、強い発色が確認できた。前述のように、メラミンは５００ｐｐｍが検出できればよいことから、実施例の核酸センサによれば、目視観察のみでメラミンを検出できることがわかった。【０１３３】
（２）化学発光分析
反応容器内において、下記試薬１、試薬２および試薬３をこの順序で添加し、その反応液１００μＬについて、２５℃の条件下、経時的な相対化学発光強度（ＲＬＵ）を測定した。前記測定は、ルミノメーター（商品名ルミテスターＰＤ−２０、キッコーマン）を使用した。下記組成における濃度は、前記反応液における終濃度とした。前記反応液におけるメラミンの終濃度は、０、１２５、６２５ｐｐｍ（０、１ｍｍｏｌ／Ｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ）とした。【０１３４】
（試薬１）
５００ｎｍｏｌ／Ｌ  核酸センサ
２５０ｎｍｏｌ／Ｌ  ヘミン
５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ
０．０５％（ｗ／ｖ）  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
（試薬２）
所定濃度  メラミン
（試薬３）
２５μｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−０１２
２５μｍｏｌ／Ｌ  Ｈ２Ｏ２【０１３５】
反応開始から３０秒後における前記反応液の発光強度（ＲＬＵ）を、下記表１３に示す。表１３に示すように、実施例の核酸センサを使用した結果、メラミン濃度１２５ｐｐｍの反応液についても、メラミン濃度０ｐｐｍの反応液に対して有意差を示した。この結果から、実施例の核酸センサによれば、発光強度測定によって、１２５ｐｐｍのメラミン濃度であっても検出可能であることがわかった。【０１３６】
【表１３】
2014017471.tif 000015
【０１３７】
以上、実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。【０１３８】
この出願は、２０１２年７月２７日に出願された日本出願特願２０１２−１６７７６６を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
本発明の核酸センサによれば、前記結合核酸分子（Ａ）とメラミンとが結合したか否かによって、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能のＯＮ−ＯＦＦをスイッチできる。このため、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することで、メラミンの有無または量を、容易に検出可能である。また、本発明の分析用デバイスは、前述のように、前記核酸センサを使用することから、例えば、デバイスの小型化およびチップ化等も可能であり、多数の検体でも簡便な分析が可能となる。このため、本発明は、例えば、メラミンの分析において極めて有用な技術といえる。
【図１】
2014017471.tif 000016
【図２】
2014017471.tif 000017
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014017471.tif 000022
【図８】
2014017471.tif 000023
【図９】
2014017471.tif 000024
【図１０】
2014017471.tif 000025
【図１１】
2014017471.tif 000026
【図１２】
2014017471.tif 000027
【図１３】
2014017471.tif 000028
【図１４】
2014017471.tif 000029
【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
2014017471000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年1月27日(2016.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
触媒機能を生起する触媒核酸分子（Ｄ）およびメラミンに結合する結合核酸分子（Ａ）を有する下記（ｘ１）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、メラミン分析用核酸センサ。
（ｘ１）配列番号１〜１３のいずれか一つの塩基配列からなり、ｎおよびｍは、正の整数であるポリヌクレオチド
【請求項２】
配列番号１〜１３のいずれか一つの塩基配列において、（T）nのｎが、６〜４８であり、（T）mのｍが、２〜３１である、請求項１記載の核酸センサ。
【請求項３】
前記（ｘ１）のポリヌクレオチドの５’末端に連結した５’末端付加配列を有する、請求項１または２記載の核酸センサ。
【請求項４】
前記５’末端付加配列が、０〜２２塩基長である、請求項３記載の核酸センサ。
【請求項５】
さらに、前記（ｘ１）のポリヌクレオチドの３’末端に連結した３’末端付加配列を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸センサ。
【請求項６】
前記３’末端付加配列が、７〜１８塩基長である、請求項５記載の核酸センサ。
【請求項７】
前記核酸センサが、下記（Ｘ１）のポリヌクレオチドを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸センサ。
（Ｘ１）配列番号１５〜３９、４１〜４８および５２〜５６のいずれか一つの塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項８】
基材、核酸センサおよび検出部を含み、
前記基材に、前記核酸センサおよび前記検出部が配置され、
前記核酸センサは、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸センサであり、
前記検出部は、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出する検出部であることを特徴とするメラミンの分析用デバイス。
【請求項９】
前記核酸センサが、リンカーを介して、前記基材に連結されている、請求項８記載の分析用デバイス。
【請求項１０】
前記核酸センサが、前記検出部に配置されている、請求項８または９記載の分析用デバイス。
【請求項１１】
前記検出部は、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能により生成されるシグナルを検出する検出部である、請求項８から１０のいずれか一項に記載の分析用デバイス。
【請求項１２】
前記シグナルが、光学的シグナルまたは電気化学的シグナルである、請求項１１記載の分析用デバイス。
【請求項１３】
さらに、試薬部を有し、
前記試薬部が、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能に対する基質を含む、請求項８から１２のいずれか一項に記載の分析用デバイス。
【請求項１４】
請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸センサを含むことを特徴とするメラミンの分析用試薬。
【請求項１５】
さらに、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能に対する基質を含む、請求項１４記載の分析用試薬。
【請求項１６】
請求項１から７のいずれか一項に記載のメラミンの分析用核酸センサに試料を接触させる接触工程、および、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のメラミンを検出する検出工程を含むことを特徴とする、メラミンの分析方法。
【請求項１７】
前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能に対する基質の存在下、前記検出工程を行う、請求項１６記載の分析方法。
【請求項１８】
請求項８から１３のいずれか一項に記載の分析用デバイスに試料を接触させる接触工程、および、前記分析用デバイスの前記検出部において、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のメラミンを検出する検出工程を含むことを特徴とするメラミンの分析方法。
【請求項１９】
前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能に対する基質の存在下、前記検出工程を行う、請求項１８記載の分析方法。
【国際調査報告】
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