(57)【要約】  本発明は、より高感度で対象物質の定量測定ができる新たな物質測定センサーを提供することを目的とする。本発明の物質測定センサーは、測定対象物質と特異的に反応する標識化粒子と、熱応答性高分子と、溶液中でプラスまたはマイナスのゼータ電位を示す帯電物質と、金属粒子とを含有し、金属粒子が、標識化粒子と帯電物質と熱応答性高分子との共重合体で被覆されている。
2014038585.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物質と特異的に反応する標識化粒子と、
熱応答性高分子と、
溶液中でプラスまたはマイナスのゼータ電位を示す帯電物質と、
金属粒子とを含有し、
前記金属粒子が、前記標識化粒子と前記帯電物質と前記熱応答性高分子との共重合体で被覆されている、物質測定センサー。
【請求項２】
前記金属粒子の平均粒径が１０〜５０ｎｍである、請求項１に記載の物質測定センサー。
【請求項３】
前記金属粒子が、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）およびパラジウム（Ｐｄ）のうちのいずれか１種である、請求項１または請求項２に記載の物質測定センサー。
【請求項４】
前記熱応答性高分子が、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）およびポリ（ビニルメチルエーテル）のうちの少なくとも一つである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の物質測定センサー。
【請求項５】
前記標識化粒子が、抗体、抗原、ペプチド、一本鎖のＤＮＡ、一本鎖のＲＮＡおよびこれらの誘導体のうちのいずれか１種である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の物質測定センサー。
【請求項６】
前記帯電物質が、溶液中でプラスのゼータ電位を示す、請求項１〜５のいずれか１項に記載の物質測定センサー。
【請求項７】
前記熱応答性高分子がアミノ基を有し、前記帯電物質がアミン系化合物である、請求項６に記載の物質測定センサー。
【請求項８】
前記標識化粒子を０．１〜０．４質量％含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の物質測定センサー。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の物質測定センサーを製造する方法であって、
熱応答性高分子を形成するためのモノマーを含む溶液に、測定対象物質と特異的に反応する標識化粒子と、溶液中でプラスまたはマイナスのゼータ電位を示す帯電物質とを添加し、重合させて三元共重合体を形成し、
得られた三元共重合体を含む溶液に金属粒子を含む溶液を添加した後、加熱冷却を行い該金属粒子を前記三元共重合体で被覆する
物質測定センサーの製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の物質測定センサーを製造する方法であって、
熱応答性高分子を形成するためのモノマーを含む溶液に、溶液中でプラスまたはマイナスのゼータ電位を示す帯電物質を添加し、重合させて共重合体を形成し、
得られた共重合体に金属粒子を添加して該金属粒子を前記共重合体で被覆し、
前記金属粒子を被覆した共重合体に測定対象物質と特異的に反応する標識化粒子を添加して複合化させる
物質測定センサーの製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の物質測定センサーに、
前記物質測定センサーの帯電物質がプラスのゼータ電位を示す場合は、溶液中でマイナスのゼータ電位を示すとともに測定対象物質と特異的に反応する標識化粒子を有する複合化化合物、あるいは、前記物質測定センサーの帯電物質がマイナスのゼータ電位を示す場合は、溶液中でプラスのゼータ電位を示すとともに測定対象物質と特異的に反応する標識化粒子を有する複合化化合物とを添加し、
前記物質測定センサーの熱応答性高分子が下限臨界溶液温度以上で不溶化し相分離を引き起こす熱応答性高分子の場合は、前記物質測定センサーの熱応答性高分子の相転移温度以上の温度における透過率を測定し、あるいは、前記物質測定センサーの熱応答性高分子が上限臨界溶液温度以下で不溶化し相分離を引き起こす熱応答性高分子の場合は、前記物質測定センサーの熱応答性高分子の相転移温度以下の温度における透過率を測定する、測定対象物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質測定センサーに関し、より詳しくは、免疫反応を利用した測定対象物質の定量に用いる物質測定センサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、環境中の微量物質等の検出方法や定量方法として、免疫反応を利用した免疫学的測定法（イムノアッセイ）が提案されている。このイムノアッセイの一般的な測定方法として、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）やイムノクロマト法などが知られている。【０００３】
これらの方法は、生物物質を蛍光物質等で標識化する作業が必要であることから、より簡易的に製造可能な物質測定センサーが検討されている。例えば、測定対象物質と特異的に反応する分子認識成分と、測定対象物質と分子認識成分との反応により体積が変化する刺激応答性高分子と、刺激応答性高分子の体積変化により局在表面プラズモン共鳴の強度が変化する平均粒径が０．２ｎｍ〜２００ｎｍの金属粒子とを含み、金属粒子と分子認識成分とが、刺激応答性高分子に固定されているバイオセンサーが提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】日本国特開２０１０−１９７０４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
免疫反応を利用した対象物質の定量測定において、実用化という点において検出感度が十分であり、取り扱いの容易な新たな物質測定センサーが望まれていた。
そこで、本発明は、熱応答性高分子を用いた物質測定センサーにおいて、より高感度で対象物質の定量測定ができる新たな物質測定センサーを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、金属粒子と、熱応答性高分子と、プラスまたはマイナスのゼータ電位を示す帯電物質と、測定対象物質と特異的に反応する標識化粒子とで複合体を構成することで、高感度なセンサーとすることができることを見出した。【０００７】
すなわち、本発明は下記の（１）〜（１１）により達成される。
（１）測定対象物質と特異的に反応する標識化粒子と、熱応答性高分子と、溶液中でプラスまたはマイナスのゼータ電位を示す帯電物質と、金属粒子とを含有し、
前記金属粒子が、前記標識化粒子と前記帯電物質と前記熱応答性高分子との共重合体で被覆されている、物質測定センサー。
（２）前記金属粒子の平均粒径が１０〜５０ｎｍである、前記（１）に記載の物質測定センサー。
（３）前記金属粒子が、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）およびパラジウム（Ｐｄ）のうちのいずれか１種である、前記（１）または（２）に記載の物質測定センサー。
（４）前記熱応答性高分子が、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）およびポリ（ビニルメチルエーテル）のうちの少なくとも一つである、前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の物質測定センサー。
（５）前記標識化粒子が、抗体、抗原、ペプチド、一本鎖のＤＮＡ、一本鎖のＲＮＡおよびこれらの誘導体のうちのいずれか１種である、前記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の物質測定センサー。
（６）前記帯電物質が、溶液中でプラスのゼータ電位を示す、前記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の物質測定センサー。
（７）前記熱応答性高分子がアミノ基を有し、前記帯電物質がアミン系化合物である、前記（６）に記載の物質測定センサー。
（８）前記標識化粒子を０．１〜０．４質量％含有する、前記（１）〜（７）のいずれか１つに記載の物質測定センサー。
（９）前記（１）〜（８）のいずれか１つに記載の物質測定センサーを製造する方法であって、
熱応答性高分子を形成するためのモノマーを含む溶液に、測定対象物質と特異的に反応する標識化粒子と、溶液中でプラスまたはマイナスのゼータ電位を示す帯電物質とを添加し、重合させて三元共重合体を形成し、
得られた三元共重合体を含む溶液に金属粒子を含む溶液を添加した後、加熱冷却を行い該金属粒子を前記三元共重合体で被覆する
物質測定センサーの製造方法。
（１０）前記（１）〜（８）のいずれか１つに記載の物質測定センサーを製造する方法であって、
熱応答性高分子を形成するためのモノマーを含む溶液に、溶液中でプラスまたはマイナスのゼータ電位を示す帯電物質を添加し、重合させて共重合体を形成し、
得られた共重合体に金属粒子を添加して該金属粒子を前記共重合体で被覆し、
前記金属粒子を被覆した共重合体に測定対象物質と特異的に反応する標識化粒子を添加して複合化させる
物質測定センサーの製造方法。
（１１）前記（１）〜（８）のいずれか１つに記載の物質測定センサーに、
前記物質測定センサーの帯電物質がプラスのゼータ電位を示す場合は、溶液中でマイナスのゼータ電位を示すとともに測定対象物質と特異的に反応する標識化粒子を有する複合化化合物、あるいは、前記物質測定センサーの帯電物質がマイナスのゼータ電位を示す場合は、溶液中でプラスのゼータ電位を示すとともに測定対象物質と特異的に反応する標識化粒子を有する複合化化合物とを添加し、
前記物質測定センサーの熱応答性高分子が下限臨界溶液温度以上で不溶化し相分離を引き起こす熱応答性高分子の場合は、前記物質測定センサーの熱応答性高分子の相転移温度以上の温度における透過率を測定し、あるいは、前記物質測定センサーの熱応答性高分子が上限臨界溶液温度以下で不溶化し相分離を引き起こす熱応答性高分子の場合は、前記物質測定センサーの熱応答性高分子の相転移温度以下の温度における透過率を測定する、測定対象物質の測定方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、トロンビン、レクチン、コンカナバリンＡ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）などの測定対象物質を高感度で簡単に計測することができる。したがって、特に免疫反応を用いた測定対象物質の検出に有効に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１（ａ）は本発明の物質測定センサーが測定対象物質に結合した状態を説明する図であり、図１（ｂ）は測定対象物質が存在しない場合の物質測定センサーの結合状態を説明する図である。
【図２】図２（ａ）は物質測定センサー１のアビジン濃度の変化における温度と透過率との関係を示すグラフであり、図２（ｂ）は物質測定センサー２のアビジン濃度の変化における温度と透過率との関係を示すグラフである。
【図３】図３（ａ）は物質測定センサー３のアビジン濃度の変化における温度と透過率との関係を示すグラフであり、図３（ｂ）は物質測定センサー４のアビジン濃度の変化における温度と透過率との関係を示すグラフであり、図３（ｃ）は物質測定センサー５のアビジン濃度の変化における温度と透過率との関係を示すグラフである。
【図４】図４（ａ）は物質測定センサー６のアビジン濃度の変化における温度と透過率との関係を示すグラフであり、図４（ｂ）は物質測定センサー７のアビジン濃度の変化における温度と透過率との関係を示すグラフであり、図４（ｃ）は物質測定センサー８のアビジン濃度の変化における温度と透過率との関係を示すグラフである。
【図５】図５は、３５℃におけるアビジン濃度と透過率の関係を示す図であり、図５（ａ）は物質測定センサー３〜５の結果を示すグラフ、図５（ｂ）は物質測定センサー６〜８の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、アビジンと熱応答性高分子の有無による物質測定センサーの温度と透過率との関係を示すグラフである。
【図７】図７は、牛血清マトリックス共存条件での物質測定センサー４のアビジンの濃度の変化における温度と透過率との関係を示すグラフである。
【図８】図８は、牛血清マトリックス共存下と非共存下での物質測定センサー４の３５℃におけるアビジン濃度と透過率の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（物質測定センサー）
本発明の物質測定センサーは、測定対象物質と特異的に反応する標識化粒子と、熱応答性高分子と、溶液中でプラスまたはマイナスのゼータ電位を示す帯電物質と、金属粒子とを含有する。
【００１１】
（熱応答性高分子）
熱応答性高分子は、熱刺激によって物性が変化するポリマーであり、温度変化によって水溶液への溶解性が変化する。熱応答性高分子には、低温では水に溶解しているが、下限臨界溶液温度（Lower Critical Solution Temperature：略号 ＬＣＳＴ）以上で不溶化し相分離を引き起こす熱応答性高分子と、温度が上昇して上限臨界溶液温度（Upper Critical Solution Temperature：略号 ＵＣＳＴ）を超えると水溶性を示す熱応答性高分子がある。
【００１２】
ＬＣＳＴ型の熱応答性高分子としては、例えば、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ポリ酢酸ビニルけん化物、ポリ（ビニルメチルエーテル）（略号 ＰＭＶＥ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（略号 ＰＮＩＰＡＭ）、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。ＵＣＳＴ型の温度応答性高分子としては、例えば、ポリ（アクリロイルグリシンアミド）、ポリ（アクリロイルアスパラギンアミド）、ポリ（アクリロイルグルタミンアミド）、アクリロイルグリシンアミドとアクリロイルアスパラギンアミドとの共重合体等が挙げられる。
【００１３】
ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３２℃付近にＬＣＳＴを持ち、相転移変化が極めて鋭敏である。このＬＣＳＴが比較的体温に近い温度であることとＬＣＳＴ以上で収縮する物性を示すことから、徐放性の薬剤の作成に役立ち、薬剤を内包できるナノサイズからマイクロサイズのヒドロゲルやミセルなどの形で利用されている。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は、水素結合部位をもっており、ＬＣＳＴ未満の温度では疎水性水和水を抱えて膨潤する。一方、ＬＣＳＴ以上の温度になると脱水和して疎水部分の疎水性相互作用によりグロビュール状に収縮し、不溶化する。この相転移挙動は可逆的であるため、ＬＣＳＴ未満の温度にすることで再び水に溶解するようになる。
【００１４】
本発明において、熱応答性高分子としては、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）およびポリ（ビニルメチルエーテル）のうちの少なくとも一つを用いることが好ましい。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）およびポリ（ビニルメチルエーテル）は、ラジカル共重合によって種々の官能基を有するモノマーを導入した共重合体を合成できる。これによって、ＬＣＳＴの制御や熱応答以外の機能付加が容易に導入できる。
【００１５】
熱応答性高分子の物質測定センサーにおける濃度は、０．０１〜０．０２質量％の範囲とすることが好ましく、０．０１５〜０．０２質量％の範囲がより好ましく、０．０１６〜０．０１７質量％の範囲が特に好ましい。濃度が０．０１質量％以上であると透過率の変化が明瞭になるため好ましく、０．０２質量％以下であると明瞭な透過率の変化が維持されるため好ましい。
【００１６】
（金属粒子）
本発明に係る金属粒子は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：略号 ＳＰＲ）による吸収を示す。表面プラズモンとは金属の表面を走るプラズモン（量子力学的な意味合いが付加されたプラズマ波）のことである。一般に、金属中の自由電子は光によって励起状態にならないため、エバネッセント波（evanescent wave、金属表面から遠ざかるにつれて減衰する電磁波をいう。）を用いて励起する必要がある。このエバネッセント波と表面プラズモン波の波数が一致したとき、共鳴が起こり、反射光が減衰する現象が生じる。
【００１７】
表面プラズモン共鳴による吸収を有する金属粒子は、金属の種類により異なるが、概ね金属粒子の粒径をｎｍオーダーにすることで得られる。本発明において、金属粒子の平均粒径は、１０〜５０ｎｍであることが好ましく、１０〜３０ｎｍがより好ましく、１０〜２０ｎｍが特に好ましい。金属粒子の平均粒径が１０ｎｍ以上であると、透過率の変化が明瞭となるため好ましく、５０ｎｍ以下であると、明瞭な透過率の変化が維持されるため好ましい。
【００１８】
金属の種類としては、特に限定はないが、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）等が好ましく用いられる。中でも、金は表面修飾による機能性付与が容易であるため、特に好ましい。
【００１９】
本発明に係る金属粒子は、平均アスペクト比が１〜５であることが好ましい。アスペクト比とは、粒子の長さ（長軸径）と直径（短軸径）との比（長軸径／短軸径）であり、平均アスペクト比とは２００個の粒子について個々のアスペクト比を求めて得られた算術平均の値である。平均アスペクト比が上記範囲であると、透過率の変化が明瞭となるため好ましい。
【００２０】
金属粒子の物質測定センサーにおける濃度は、０．０１〜０．０２ｇ／Ｌの範囲とすることが好ましく、０．０１５〜０．０２ｇ／Ｌの範囲がより好ましく、０．０１６〜０．０１７ｇ／Ｌの範囲が特に好ましい。濃度が０．０１ｇ／Ｌ以上であると透過率の変化が明瞭となるため好ましく、０．０２ｇ／Ｌ以下であると明瞭な透過率の変化が維持されるため好ましい。
【００２１】
（帯電物質）
本発明に係る帯電物質は、溶液中でプラスまたはマイナスのゼータ（ζ）電位を示す。ゼータ電位とは、溶液中の粒子の周囲に形成されるイオン固定層とイオン拡散層とよばれる電気二重層中の、液体流動が起こり始める「滑り面」の電位として定義される。粒子の表面特性により、このゼータ電位の絶対値は正（ポジ性）や負（ネガ性）の値を示す。
【００２２】
帯電物質としては、特に限定はないが、正または負に荷電する有機物質等が挙げられ、中でも効果的な静電相互作用の観点から正に荷電する有機物質を用いることが好ましい。
正に荷電する有機物質としては、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンエキサミンなどのアミン系化合物およびその誘導体が例示でき、特にトリエチレンテトラミンおよびその誘導体が好ましい。帯電物質がアミン系化合物およびその誘導体である場合、熱応答性高分子は正の電荷を持つアミノ基を有することになる。
また、負に荷電する有機物質としては、アクリル酸やメタクリル酸などのカルボン酸系化合物およびその誘導体が例示できる。帯電物質がカルボン酸系化合物およびその誘導体である場合、熱応答性高分子は負の電荷を持つカルボキシル基を有することになる。
【００２３】
（標識化粒子）
本発明に係る標識化粒子は、測定対象物質と特異的に反応するものである。標識化粒子としては、例えば、抗体、抗原、ペプチド、一本鎖のＤＮＡ、一本鎖のＲＮＡおよびこれらの誘導体を挙げることができる。標識化粒子（分子認識成分）と測定対象物質との特異的な反応としては、免疫反応が知られており、本発明の物質測定センサーは、免疫反応を用いた場合に、測定対象物質を検出することができる。
【００２４】
免疫反応とは、抗原がそれに対応する抗体と特異的に結合する反応のことであり、抗原抗体反応とも呼ばれる。抗体とは抗原である粒子状タンパク質と特異的に結合する血漿タンパクを意味する。それに対して、抗原という単語はより広義に適応免疫系において認識可能な物質を指す単語として用いられており、抗体と反応する分子は抗原、抗体生産を誘導する抗原は免疫源と呼ばれる。抗体の全体的な構造は、多くの抗体において共通しており、免疫グロブリン（Immunoglobulin：略号 Ｉｇ）と呼ばれる。Ｉｇ抗体の中でも最も多く存在しているものが免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体である。蛋白抗原の場合、抗原・抗体間に働く静電的相互作用、水素結合、ファンデルワールス力などが結合に関与しており、抗体分子は、その抗原が認識する抗体分子表面の相補的な領域と広範囲にわたって相互作用している。
【００２５】
免疫反応の例として、アビジン−ビオチン相互作用が挙げられる。アビジンとビオチン間には極めて強い親和性（Affinity）や差異性がある。
本発明の物質測定センサーにおいて、アビジン（分子量約６８ｋＤａ）はビオチン間を結合する接着剤の役割を果たす。アビジンと非常によく似た構造をもつ物質として、ストレプトマイセスという放射菌由来のストレプトアビジン（分子量約６０ｋＤａ）がある。ストレプトアビジンは等電点が６付近にあり、糖鎖を有していないが、アビジンは等電点が１０付近にあり、その上糖鎖を有している。このことから、ストレプトアビジンは生理条件においてアビジンよりも非特異的吸着が起こりにくく、変性にも強いため、好適に使用できる。
【００２６】
ビオチンはビタミンＢ群に分類される水溶性ビタミンの一種で、ビタミンＢ７とも呼ばれる。また、生体内で果たす役割から補酵素Ｒと呼ばれることもあり、ヒトにとって必須の栄養素であるため、摂取量によっては欠乏症を引き起こす可能性がある。物質測定センサーにおいてビオチンは検出対象であるタンパク質の標識化に用いられる。これによってタンパク質の生理活性を損なわずに抗体を標識化することが可能となる。また、タンパク質には複数のビオチンを共有結合させることができるため、ビオチンで標識化したタンパク質は複数のアビジンと相互作用することが可能である。
【００２７】
標識化粒子の物質測定センサーにおける濃度は、０．１〜０．４ｍｏｌ％の範囲とすることが好ましく、０．２〜０．４ｍｏｌ％の範囲がより好ましく、０．３〜０．４ｍｏｌ％の範囲が特に好ましい。濃度が０．１ｍｏｌ％以上であると低濃度からのアビジンに応答するため好ましく、０．４ｍｏｌ％以下であるとアビジンへの応答感度を保持するため好ましい。
【００２８】
（物質測定センサーの製造方法）
本発明の物質測定センサーは、金属粒子の表面を、測定対象物質と特異的に反応する標識化粒子と、帯電物質と、熱応答性高分子との共重合体で被覆できれば、その製造方法は特に限定されない。例えば、以下の１）〜３）の方法が挙げられるが、これらに限定されることはない。
１）標識化粒子と、帯電物質と、熱応答性高分子を形成するためのモノマーとを共重合させて三元共重合体（ターポリマー）を合成し、この三元共重合体を金属粒子に被覆する方法
２）熱応答性高分子を形成するためのモノマーと帯電物質とを共重合させて共重合体（コポリマー）を合成し、この共重合体を金属粒子に被覆した後に、標識化粒子を複合化させる方法
３）熱応答性高分子を形成するためのモノマーと帯電物質とを共重合させて共重合体（コポリマー）を合成し、この共重合体に標識化粒子を複合化させた後に、金属粒子を被覆する方法
【００２９】
（複合化化合物）
本発明の物質測定センサーは、溶液中の複合化化合物の存在により測定対象物質とともに三元系複合体を形成する。本発明に用いられる複合化化合物は、溶液中でプラスまたはマイナスのゼータ電位を示す物質（帯電物質）と、測定対象物質と特異的に反応する標識化粒子とからなる。測定対象物質の測定方法において、物質測定センサーの帯電物質がプラスのゼータ電位を示す場合は、溶液中でマイナスのゼータ電位を示す複合化化合物を用い、物質測定センサーの帯電物質がマイナスのゼータ電位を示す場合は、溶液中でプラスのゼータ電位を示す複合化化合物を用いる。複合化化合物に使用する溶液中でプラスまたはマイナスのゼータ電位を示す物質としては、特に限定されないが、例えば、ポリアクリル酸塩などが挙げられる。また、複合化化合物に使用する標識化粒子は、測定対象物質と結合できれば、特に限定されず、物質測定センサーに使用する標識化粒子と同じであっても、異なっていてもよい。
このように、本発明の物質測定センサーの帯電物質のゼータ電位と異なるゼータ電位を有する複合化化合物を用いることで、溶液中の三元系複合体では電荷の相殺が起こらず、親水性が保持される。したがって、加熱によって相転移を起こすことがない。よって溶液の透過率を測定することで測定対象物質を定量することができる。
【００３０】
（測定対象物質の測定）
次に、上記得られた物質測定センサーを用いた測定対象物質の測定方法について説明する。図１は、物質測定センサーの結合状態を説明する図であり、図１（ａ）は本発明の物質測定センサーが測定対象物質に結合した状態を説明する図であり、図１（ｂ）は測定対象物質が存在しない場合の物質測定センサーの結合状態を説明する図である。
【００３１】
本発明の物質測定センサー１は、溶液中に測定対象物質２と当該物質測定センサー１の標識化粒子１４と同じ標識化粒子１５を有する複合化化合物３とが存在する場合、図１（ａ）に示したように、物質測定センサー１の標識化粒子１４と複合化化合物３の標識化粒子１５がそれぞれ、測定対象物質２と相互作用して三元系複合体を形成する。測定対象物質２と標識化粒子１４，１５の相互作用により、物質測定センサー１を構成する帯電物質と複合化化合物３を構成する帯電物質との間には立体的な制約が生じるため、複合体内での電荷の相殺が完全には起こらない。このため、親水性が保持される。したがって、加熱しても明確な相転移を起こすことがなく、溶液の透過率は低下することがない。
これに対して、測定対象物質２が存在しない場合では、図１（ｂ）に示したように、静電相互作用により二元系複合体が形成される。二元系複合体が形成すると、効率的な電荷の相殺が起こる。これにより、親水性が低下する。この状態で、溶液を相転移温度以上に加熱すると、明確な相転移が生じ、溶液の透過率は低下する。
【００３２】
以上のメカニズムにより、相転移温度以上の条件では測定対象物質の濃度に応じて溶液の透過率が変化する。このように、溶液を相転移温度以上に加温し、その溶液の透過率を測定することにより、測定対象物質を定量することができる。
【００３３】
本発明の物質測定センサーによる測定対象物質の測定方法としては、物質測定センサーに測定対象物質および複合化化合物を添加し、用いた熱応答性高分子の上限臨界溶液温度以下または下限臨界溶液温度以上に溶液の温度を調整し、特定波長での吸光度を測定することにより検出することができる。
例えば、透過光を測定する場合、石英製のセルに物質測定センサーを入れ、次いで測定対象となる溶液と複合化化合物とを添加して、７５０〜９００ｎｍの波長における吸収ピークの強度変化を観察することにより、測定できる。
【実施例】
【００３４】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。なお、純水は、水道水をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製純水製造装置（型番 Ｆ９ＭＮ２５３３２Ｃ）にて精製した後、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製Ｍｉｌｌｉ−Ｑ超純水製造システムで精製したものを使用した。【００３５】
＜装置＞
本発明で用いた装置は、以下のとおりである。
・吸収スペクトル及び透過率の測定：日本分光株式会社製「Ｖ−６５０型紫外可視分光光度計」
・ＤＬＳ測定（粒子径の測定：測定値は、散乱光強度基準による調和平均粒子径（直径）である。）及びゼータ電位測定：Ｍａｌｖｅｒｎ社製「ゼータサイザーナノＺＳ」
・凍結乾燥：東京理化器械株式会社製「ＦＤ−５Ｎ型凍結乾燥機」
・限外濾過：ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製「ＵＨＰ−７６Ｋ型定容量連続濾過装置」
・透析：Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製「セルロースエステル透析膜（分画分子量：１００００）」【００３６】
＜試験例１：物質測定センサーの合成＞
測定対象物質をアビジン（Ｆｗ：６８０００）とし、金属粒子を金（Ａｕ）からなるものとし、熱応答性高分子としてＮ−イソプロピルアクリルアミド（略号 ＮＩＰＡＡｍ，Ｆｗ：１１３．１６）（和光純薬工業株式会社製のＮＩＰＡＡｍをヘキサン（Ｆｗ：８６．１８）を用いて再結晶したもの）を、測定対象物質と特異的に反応する標識化粒子としてビオチンモノマー（Ｆｗ：３６８、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−（メタ）アクロイルトリメチレンアミド）を、帯電物質としてトリエチレンテトラミン（略号 ＴＥＴＡ，Ｆｗ：１４６．２４）を用いて、以下の方法により物質測定センサーを製造した。【００３７】
（金属粒子溶液の調製）
金属粒子溶液の調製は、クエン酸還元法により行った。
５００ｍＬ丸底フラスコに１ｍＭテトラクロロ金酸塩水溶液２５０ｍＬを入れ、攪拌しながら沸騰直前まで加熱した。沸騰後、３８．８ｍＭクエン酸三ナトリウム水溶液２５ｍＬを添加し、溶液の色が淡黄色から深赤色へと変化することを確認した。さらに攪拌しながら１０分間加熱させた後、室温において１５分間攪拌し続けた。溶液を孔径１μｍメンブランフィルターを用いて、吸引ろ過し、金コロイド溶液をガラス試薬瓶に移し、冷暗所（４℃）に保存した（０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ 金コロイド溶液）。尚、上記の方法で調製した金属粒子である金コロイドの粒子径は約１３ｎｍであった。
また、還元剤及び分散剤としての役割を果たすクエン酸三ナトリウム水溶液の添加量を１１．６ｍＬにして粒子径が約３０ｎｍの金コロイド溶液を調製した。【００３８】
（熱応答性高分子、標識化粒子及び帯電物質からなる三元共重合体の合成）
（１）共重合体：ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／アクリロイルトリエチレンテトラミン）（略号 Ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ／ＴＥＴＡ））（以下、「ＮＩＰ−ＴＥＴＡ」ともいう。）の合成
重合に先立ち、反応中間体であるアクリロイルトリエチレンテトラミン（略号 ａｃＴＥＴＡ）を次の手順で合成した。氷浴に浸したＴＥＴＡ２９．２４ｇ（０．２ｍｏｌ）と１，４−ジオキサン２００ｍＬの混合溶液を攪拌しながら、塩化アクリロイル（略号 ＡＣ）１．７２ｍＬ（０．０２ｍｏｌ）と１，４−ジオキサン５０ｍＬの混合溶液を一滴ずつ滴下して反応させた。滴下終了後、白色の沈殿を濾別し、１，４−ジオキサンを用いて沈殿を洗浄することで未反応のＡＣを取り除いた。得られた沈殿を少量のメタノール（約５０ｍＬ）に溶解した。この溶液に水酸化カリウム−メタノール溶液（水酸化カリウム１．１８ｇ（０．０２ｍｏｌ））５０ｍＬを加えて攪拌した。沈殿（ＫＣｌ）を濾別し、ａｃＴＥＴＡを含む濾液をＮＩＰＡＡｍモノマーとの共重合に用いた。
５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコにモノマーの供給比（ＮＩＰの物質量：ＴＥＴＡの物質量）が９０．０：１０．０（ｍｏｌ比）となるようにＮＩＰＡＡｍ２０．３７ｇ（０．１８ｍｏｌ）を加え、重合促進剤として３−メルカプトプロピオン酸０．５ｍＬ及び重合開始剤としてα，α’−アゾビスイソブチロニトリル０．３２８４ｇ（０．００２ｍｏｌ）を添加して、オイルバスを用いて６０℃に加温、攪拌しながら、５ｗ／ｖ％ピロガロール−１０ｗ／ｖ％アルカリ溶液（アルカリ：ＮａＯＨ）１００ｍＬを用いた脱酸素ラインに通気した窒素雰囲気下で４時間重合を行った。重合終了後、冷ジエチルエーテルを用いて沈殿法によりポリマーの精製を２回行った。その後、得られたポリマーに総体積が３００ｍＬとなるように純水を加え、沈殿を溶解させた。この溶液を排除限界５０００の限外濾過膜を用いて１５０ｍＬまで限外濾過した。この操作を６回行い、ろ液に二硫化炭素と銀の標準溶液を少量添加し、溶液が黒褐色にならないことを確認した後に凍結乾燥を行い冷暗所に保存した。ＮＩＰ−ＴＥＴＡの構造式を下記式（１）に示す。【００３９】
【化１】
2014038585.tif 000003
【００４０】
（２）三元共重合体：ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／アクリロイルトリエチレンテトラミン／アクリロイルビオチン）（略号 Ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ／ＴＥＴＡ／Ｂｉｏ））（以下、「ＮＩＰ−ＴＥＴＡ−Ｂｉｏ」ともいう。）の合成
ａｃＴＥＴＡは上記（１）ＮＩＰ−ＴＥＴＡの合成の１／５倍のスケールにして同様に調製した。得られたａｃＴＥＴＡをＮＩＰモノマー及びビオチンモノマーとの共重合に用いた。
５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコにモノマーの供給比（ＮＩＰの物質量：ＴＥＴＡの物質量：Ｂｉｏの物質量）が８９．８７５：１０．０００：０．１２５（ｍｏｌ比）となるようにＮＩＰＡＡｍモノマー（略号 ＮＩＰ）４．０６８ｇ（０．０３５９５ｍｏｌ）、ビオチンモノマー０．０１８４ｇ（０．００００５ｍｏｌ）、重合促進剤として３−メルカプトプロピオン酸０．１ｍＬ及び重合開始剤としてα，α’−アゾビスイソブチロニトリル０．０６５７ｇ（０．０００４ｍｏｌ）を添加して、オイルバスを用いてフラスコを６０℃に加温、攪拌しながら、５ｗ／ｖ％ピロガロール−１０ｗ／ｖ％アルカリ溶液（アルカリ：ＮａＯＨ）１００ｍＬを用いた脱酸素ラインに通気した窒素雰囲気下で４時間重合を行った。重合終了後、冷ジエチルエーテルを用いて沈殿法によりポリマーの精製を２回行った。その後、得られたポリマーに総体積が１２０ｍＬとなるように純水を加え、沈殿を溶解させた。この溶液を排除限界５０００の限外濾過膜を用いて６０ｍＬまで限外濾過した。この操作を６回行い、ろ液に二硫化炭素と銀の標準溶液を少量添加し、溶液が黒褐色にならないことを確認した後に凍結乾燥を行い冷暗所に保存した。ＮＩＰ−ＴＥＴＡ−Ｂｉｏの構造式を下記式（２）に示す。【００４１】
【化２】
2014038585.tif 000004
【００４２】
（物質測定センサーの調製：物質測定センサー１）
５０ｍＬメスフラスコに２．０質量％ ＮＩＰ−ＴＥＴＡ−Ｂｉｏ溶液６．２５ｍＬ、０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金属粒子溶液（粒子径約１３ｎｍ）１５ｍＬを加えて、純水で希釈し、５０ｍＬに調整した。
ウォーターバスを用いて９０℃で３０分間加熱し、氷浴を用いて０℃で３０分間冷却し撹拌した。この操作を３回繰り返した。得られた溶液を分画分子量１００００のセロハンチューブに入れ、純水で満たした１Ｌビーカーにこのチューブを浸漬し、一日ごとに純水を入れ替えて５日間透析した。
物質測定センサー１の合成スキームを下記式（３）に示す。式中、ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ高分子中のＮＩＰ、ＴＥＴＡおよびＢｉｏのモル分率を表わす。【００４３】
【化３】
2014038585.tif 000005
【００４４】
（物質測定センサーの調製：物質測定センサー２）
１００ｍｍｏｌ／Ｌビオチン溶液は、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（以下、「ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ」ともいう。）（ＦＷ：３４１．３６、Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）６．８ｍｇを２００μＬの純水に溶解させることで調製した。
５０ｍＬメスフラスコに２．０質量％ＮＩＰ−ＴＥＴＡ溶液６．２５ｍＬ、０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金属粒子溶液（粒子径１３ｎｍ）１５ｍＬを加えて、純水で希釈し、５０ｍＬに調整した。
ウォーターバスを用いて９０℃で３０分間加熱し、氷浴を用いて０℃で３０分間冷却し撹拌した。この操作を３回繰り返すことでＮＩＰ−ＴＥＴＡ被覆金属粒子溶液（以下、「ＮＩＰ−ＴＥＴＡ−Ａｕ溶液」ともいう。）を得た。
２０ｍＬ三角フラスコに予め冷却しておいたＮＩＰ−ＴＥＴＡ−Ａｕ溶液９ｍＬに、前述と同様の方法で調製した１００ｍｍｏｌ／Ｌ ビオチン溶液を２００μＬ添加した。この溶液を攪拌しながら氷浴中で３時間インキュベートした。次いで、得られた溶液を分画分子量１００００のセロハンチューブに入れ、純水で満たした１Ｌビーカーにこのチューブを浸漬し、一日ごとに純水を入れ替えて５日間透析した。
物質測定センサー２の合成スキームを下記式（４）に示す。式中、ｘおよびｙはそれぞれ高分子中のＮＩＰおよびＴＥＴＡのモル分率を表わし、ｐはＴＥＴＡへのＢｉｏの導入割合を表わす。【００４５】
【化４】
2014038585.tif 000006
【００４６】
＜試験例２：物質測定センサー溶液の透過率に及ぼすアビジン濃度の検討＞
（リン酸緩衝生理食塩水の調製）
２００ｍＬビーカーに塩化ナトリウム０．８ｇ（０．０１４ｍｏｌ）、リン酸二水素ナトリウム１．１５ｇ（０．００８ｍｏｌ）、塩化カリウム０．２ｇ（０．００３ｍｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２ｇ（０．００２ｍｏｌ）を加え溶解した後、１００ｍＬメスフラスコを用い純水で希釈し、１００ｍＬに調整して、リン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」ともいう。）を調製した。【００４７】
（アビジン溶液の調製）
アビジン２．５ｍｇを０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム水溶液５００μＬに溶かして７．４μｍｏｌ／Ｌアビジン溶液を調製した。【００４８】
（透過率の測定）
上記調製した物質測定センサー溶液（物質測定センサー１、２）に、濃度７．４μｍｏｌ／Ｌアビジン溶液、複合化化合物としての４．４ｍｇ／ｍＬビオチン化ポリアクリル酸ナトリウム溶液及びＰＢＳを添加して、温度透過率測定を行った。
光路長１ｃｍの石英製セミミクロセルに物質測定センサー溶液３００μＬ、アビジン溶液１００μＬ、ビオチン化ポリアクリル酸ナトリウム溶液５０μＬを順次加えた。次いで、純水４５０μＬ、ＰＢＳ溶液１００μＬ加え、最終液量を１ｍＬとした。この溶液を手振りで軽く撹拌し、各試料溶液を均一にした後、金属粒子及び熱応答性高分子が吸収を持たない波長８５０ｎｍにおいて透過率を測定した。測定条件は以下の通りである。
〔測定条件〕
金属粒子の粒子径：１３ｎｍ
金属粒子溶液濃度：０．０２７ ｇ−Ａｕ／Ｌ
ポリマー濃度：０．０６２５質量％
測定温度：２０℃
波長：８５０ｎｍ
標準液：純水【００４９】
また、上記物質測定センサー溶液（物質測定センサー１、２）について、０〜７．４μｍｏｌの範囲でアビジン濃度を変化させた溶液を用いて、温度変化における透過率を測定した。測定条件は以下の通りである。アビジンの濃度変化による溶液の透過率の変化を図２（ａ）および図２（ｂ）に示す。
〔測定条件〕
金属粒子の粒子径：１３ｎｍ
金属粒子溶液濃度：０．０１６２ ｇ−Ａｕ／Ｌ
ポリマー濃度：０．０６２５質量％
ビオチン化ポリアクリル酸ナトリウム濃度：０．２２ｍｇ／ｍＬ
測定波長：８５０ｎｍ
標準液：純水【００５０】
図２（ａ）および図２（ｂ）の結果から、アビジンの有無による透過率曲線の差異が認められた。このことから、本発明の物質測定センサーがアビジンの検出に適していることがわかった。特に、物質測定センサー１はアビジンの透過率曲線の差異が大きいことから、物質測定センサーへの複合化効率が良好であることがわかった。【００５１】
＜試験例３：金属粒子の粒子径並びにビオチン導入割合＞
試験例１で作製した粒子径約１３ｎｍおよび約３０ｎｍの金属粒子と、ビオチン導入割合の異なる３種類の三元共重合体（ターポリマー）（ビオチン導入割合：０．１２５ｍｏｌ％、０．２５ｍｏｌ％、０．３７５ｍｏｌ％）を用いてそれぞれ複合化して、６種類の物質測定センサー３〜８を調製した。上記金属粒子溶液の調製の手順に従い調製した粒子径の異なる２種類の金属粒子（１３ｎｍ、３０ｎｍ）と、上記ＮＩＰ−ＴＥＴＡ−Ｂｉｏの合成手順に従い合成したビオチン導入割合の異なる３種類の三元共重合体ＮＩＰ−ＴＥＴＡ−Ｂｉｏ（ビオチン導入割合，０．１２５ｍｏｌ％、０．２５ｍｏｌ％、０．３７５ｍｏｌ％）を用いた。【００５２】
５０ｍＬメスフラスコに２．０質量％ＮＩＰ−ＴＥＴＡ−Ｂｉｏ溶液（ビオチン導入割合，０．１２５ｍｏｌ％、０．２５ｍｏｌ％、０．３７５ｍｏｌ％）６．２５ｍＬ、０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金属粒子溶液（粒子径約１３ｎｍ、３０ｎｍ）１５ｍＬを加えて、純水で希釈し、５０ｍＬに調整した。
ウォーターバスを用いて９０℃で３０分間加熱し、氷浴を用いて０℃で３０分間冷却し撹拌した。この操作を３回繰り返した。得られた溶液を分画分子量１００００のセロハンチューブに入れ、純水で満たした１Ｌビーカーにこのチューブを浸漬し、一日ごとに純水を入れ替えて５日間透析した。
物質測定センサー３〜８の金属粒子の粒子径とターポリマー中のビオチン導入割合を表１に示す。【００５３】
【表１】
2014038585.tif 000007
【００５４】
これらの物質測定センサー３〜８について、上記透過率の測定方法に従い、添加するアビジン濃度を０〜７．４μｍｏｌの範囲で変化させて、溶液の透過率を測定した。測定条件は以下のとおりである。アビジンの濃度変化による溶液の透過率の変化を図３（ａ）〜図３（ｃ）および図４（ａ）〜図４（ｃ）に示す。
また、各物質測定センサーにおいて３５℃でのアビジン濃度と透過率の関係を図５（ａ）および図５（ｂ）に示す。図５（ａ）は、１３ｎｍ金属粒子を用いた物質測定センサー３〜５の結果であり、図５（ｂ）は、３０ｎｍ金属粒子を用いた物質測定センサー６〜８の結果である。
〔測定条件〕
金属粒子溶液濃度：０．０１６２ ｇ−Ａｕ／Ｌ
ポリマー濃度：０．０６２５質量％
ビオチン化ポリアクリル酸ナトリウム濃度：０．２２ｍｇ／ｍＬ
測定波長：８５０ｎｍ
標準液：純水【００５５】
図３（ａ）〜図３（ｃ）、図４（ａ）〜図４（ｃ）、並びに図５（ａ）および図５（ｂ）の結果から、いずれの物質測定センサーを用いる場合においても物質測定センサーの相転移温度以上ではアビジン濃度に応じて透過率曲線のプロファイルが変化することがわかった。【００５６】
＜試験例４：物質測定センサー溶液の透過率＞
光路長１ｃｍの石英製セミミクロセルに物質測定センサー４を３００μＬ、７．４μｍｏｌ／Ｌアビジン溶液１００μＬ、及び８．０μｍｏｌ／Ｌビオチン化ポリアクリル酸ナトリウム溶液５０μＬを順次加え、純水４５０μＬ及びＰＢＳ１００μＬを加え最終体積を１ｍＬとした（実施例１）。
同様に、１）物質測定センサー溶液（物質測定センサー４）３００μＬ、２）物質測定センサー溶液（物質測定センサー４）３００μＬ及びビオチン化ポリアクリル酸ナトリウム溶液５０μＬ、３）物質測定センサー溶液（物質測定センサー４）３００μＬ及びアビジン溶液１００μＬの各溶液を用いて、最終体積を１ｍＬとした水溶液を作製した（比較例１，２、参考例１）。【００５７】
実施例１、比較例１、２および参考例１の測定溶液の構成を表２に示す。【００５８】
【表２】
2014038585.tif 000008
【００５９】
作製した測定溶液を手振りで軽く撹拌し、各試料溶液を均一にした後、波長８５０ｎｍにおいて温度変化における透過率を測定した。測定条件は以下のとおりである。結果を図６に示す。
〔測定条件〕
金属粒子の粒子径：１３ｎｍ
金属粒子溶液濃度：０．０１６２ｇ−Ａｕ／Ｌ
ポリマー濃度：０．０６２５質量％
ビオチン化ポリアクリル酸ナトリウム濃度：０．２２ｍｇ／ｍＬ
測定波長：８５０ｎｍ
標準液：純水【００６０】
図６の結果から、比較例１および比較例２では、溶液の相転移温度以上（ＬＣＳＴ以上）で透過率が低下した。これはアビジンが存在しないために、物質測定センサーを構成する熱応答性高分子が相転移に伴い疎水化したことによる溶解度の低下、そして物質測定センサーとビオチン化ポリアクリル酸ナトリウムの系では静電的な相互作用による電荷の相殺から引き起こされる溶解度の低下によるものと考えられる。一方、実施例１は参考例１と同様に、溶液の相転移温度以上（ＬＣＳＴ以上）でも透過率は高い値を示した。これはアビジンを介して物質測定センサー同士、または物質測定センサーとビオチン化ポリアクリル酸ナトリウムが相互作用するために、熱応答性高分子に重合した帯電物質（ＴＥＴＡ）とポリアクリル酸ナトリウムの荷電基（ポリアニオン）との間の立体規制によって系の親水性が保持されたためであると考えられる。【００６１】
＜試験例５：牛血清マトリックス共存条件での物質測定センサー溶液の透過率＞
物質測定センサー４において、１０ｖｏｌ％牛血清溶液（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、ＧＩＢＣＯ製）、濃度０〜７．４μｍｏｌ／Ｌアビジン溶液、４．４ｍｇ／ｍＬビオチン化ポリアクリル酸ナトリウム溶液及びＷｏｒｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを添加して、温度変化における透過率の測定を行った。
光路長１ｃｍの石英製セミミクロセルに物質測定センサー溶液３００μＬ、１０ｖｏｌ％牛血清溶液２５μＬ、アビジン溶液１００μＬ、ビオチン化ポリアクリル酸ナトリウム溶液５０μＬを順次加えた。次いで、純水４２５μＬ、Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ １００μＬを加え、最終液量を１ｍＬとした。この溶液を手振りで軽く撹拌し、各試料溶液を均一にした後、波長８５０ｎｍにおいて透過率を測定した。測定条件は以下のとおりである。アビジンの濃度変化による溶液の透過率の変化を図７に示す。【００６２】
＜Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒの組成＞
０．５ｗ／ｖ％牛アルブミン
０．５ｗ／ｖ％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ
ＮａＣｌ ０．０１４ｍｏｌ／Ｌ
ＫＣｌ ０．００３ｍｏｌ／Ｌ
ＮａＨ２ＰＯ４０．００８ｍｏｌ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４０．００２ｍｏｌ／Ｌ
〔測定条件〕
金属粒子の粒子径：１３ｎｍ
金属粒子溶液濃度：０．０１６２ ｇ−Ａｕ／Ｌ
ポリマー濃度：０．０６２５質量％
ビオチン化ポリアクリル酸ナトリウム濃度：０．２２ｍｇ／ｍＬ
牛血清濃度：０．２５ｖｏｌ％
測定波長：８５０ｎｍ
標準液：純水【００６３】
次に、牛血清マトリックスの共存下でアビジンの計測を行った。
物質測定センサー４において、濃度０〜７．４μｍｏｌ／Ｌアビジン溶液、４．４ｍｇ／ｍＬビオチン化ポリアクリル酸ナトリウム溶液及びＰＢＳを添加して、ＤＬＳ測定を行った。
ガラスセルに金ナノ複合体溶液６００μＬ、アビジン溶液２００μＬ、ビオチン化ポリアクリル酸ナトリウム溶液１００μＬを順次加えた。次いで、純水９００μＬ、ＰＢＳ溶液を２００μＬ加え、最終液量を２ｍＬとした。この溶液を手振りで軽く撹拌し、各試料溶液を均一にした後、金ナノ複合体溶液の相転移温度前後の３０℃及び４０℃でＤＬＳ測定を行った。測定は１試料に対して自動測定で３セット行った。測定条件は以下の通りである。牛血清共存下と非共存下での３５℃におけるアビジン濃度と透過率の関係を図８に示す。
〔測定条件〕
金属粒子の粒子径：１３ｎｍ
金属粒子溶液濃度：０．０１６２ｇ−Ａｕ／Ｌ
ポリマー濃度：０．０６２５質量％
ビオチン化ポリアクリル酸ナトリウム濃度：０．２２ｍｇ／ｍＬ
牛血清濃度：０．２５ｖｏｌ％
測定温度：３５℃
測定波長：８５０ｎｍ
標準液：純水【００６４】
図７および図８の結果から、牛血清が共存すると検出感度が若干低下するが、牛血清の有無に関わらず類似したＳ字状の相転移曲線を示すことが分かる。このことから、マトリックスマッチングを行うことでこの物質測定センサーを測定対象物質の計測に適用できる。【００６５】
本発明を詳細にまた特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。本出願は、２０１２年９月４日出願の日本特許出願（特願２０１２−１９４０８５）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【符号の説明】
【００６６】
１    物質測定センサー
２    測定対象物質
３    複合化化合物
１１  金属粒子
１２  熱応答性高分子
１３  帯電物質
１４，１５  標識化粒子
【図１】
2014038585.tif 000009
【図２】
2014038585.tif 000010
【図３】
2014038585.tif 000011
【図４】
2014038585.tif 000012
【図５】
2014038585.tif 000013
【図６】
2014038585.tif 000014
【図７】
2014038585.tif 000015
【図８】
2014038585.tif 000016
【国際調査報告】
2014038585.tif 000017
2014038585.tif 000018