(57)【要約】本発明は、薬物代謝酵素遺伝子の発現制御領域の下流にレポーター遺伝子を接続したベクター、およびこれを導入した細胞を用いて、簡便な操作によって、従来よりも正確に被験物の薬物代謝酵素誘導を評価することを目的とする。本発明は、被験物の薬物代謝酵素誘導および細胞毒性を評価するための細胞を製造するためのベクターであって、胎児期特異的遺伝子の発現制御領域、第１のレポーター遺伝子、薬物代謝酵素遺伝子の発現制御領域、および第２のレポーター遺伝子を含み、ここで、第１のレポーター遺伝子が胎児期特異的遺伝子の発現制御領域の下流に位置し、第２のレポーター遺伝子が薬物代謝酵素遺伝子の発現制御領域の下流に位置する、ベクターを提供する。また、本発明は、これを含む細胞、およびこれを用いて被験物の薬物代謝酵素誘導および細胞毒性を評価する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物の薬物代謝酵素誘導および細胞毒性を評価するための細胞を製造するためのベクターであって、胎児期特異的遺伝子の発現制御領域、第１のレポーター遺伝子、薬物代謝酵素遺伝子の発現制御領域、および第２のレポーター遺伝子を含み、ここで、第１のレポーター遺伝子が胎児期特異的遺伝子の発現制御領域の下流に位置し、第２のレポーター遺伝子が薬物代謝酵素遺伝子の発現制御領域の下流に位置する、ベクター。
【請求項２】
薬物代謝酵素遺伝子が、チトクロムＰ４５０である、請求項１に記載のベクタ。
【請求項３】
胎児期特異的遺伝子が、ＣＹＰ３Ａ７である、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
レポーター遺伝子が、光シグナルによって検出されるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質をコードするものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項６】
被験物の薬物代謝酵素誘導および細胞毒性を評価するための細胞であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項７】
肝腫瘍細胞由来細胞株に由来する、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
成熟肝細胞に分化できる幹細胞の性質を有する、請求項６または７に記載の細胞。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の細胞であって、
（ア）請求項１〜５のいずれか１項に記載のベクターを含む細胞を培養する工程、および
（イ）工程（ア）における培養の際の前記細胞中の第１のレポーター遺伝子の発現量を指標として細胞を選択する工程
を含む方法によって選択された、細胞。
【請求項１０】
工程（ア）における培養が、請求項１〜５のいずれか１項に記載のベクターを含む細胞を肝細胞へ分化させるための培養である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のベクターを含む、非ヒト動物。
【請求項１２】
被験物の薬物代謝酵素誘導および細胞毒性を評価する方法であって、
（ａ）請求項６〜１０のいずれか１項に記載の細胞中の第１のレポーター遺伝子の発現を評価する工程、および
（ｂ）請求項６〜１０のいずれか１項に記載の細胞と被験物との接触の前後における、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の細胞中の第２のレポーター遺伝子の発現の変化を評価する工程
を含む、方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）における第２のレポーター遺伝子の発現の変化の評価が、第２のレポーター遺伝子の発現の継続的な測定結果に基づくものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
被験物の薬物代謝酵素誘導および細胞毒性を評価するためのキットであって、請求項１〜５のいずれか１項に記載のベクターを含む、キット。
【請求項１５】
さらに、成熟肝細胞に分化できる幹細胞の性質を有する細胞を含む、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、国等の委託研究の成果に係る出願（平成２２年度、文部科学省、イノベーションシステム整備事業「創薬及び食品機能性評価モデル動物等の開発に係わる染色体工学研究拠点形成」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願）である。【０００２】
本発明は、被験物における薬物代謝酵素誘導および細胞毒性を評価する方法、ならびにそのためのベクターおよび細胞に関する。
【背景技術】
【０００３】
薬物が有用であるための３大条件として、「効果があること」、「毒性が少ないこと」、および「体内に蓄積されないこと」が挙げられており、医薬品候補化合物については、一般的に吸収（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）、分布（Ｄｉｓｔｉｂｕｔｉｏｎ）、代謝（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、排泄（Ｅｓｃｒｅｓｉｏｎ）、および毒性（Ｔｏｘｉｔｙ）が検討される。【０００４】
薬物の代謝は、各種の薬物代謝酵素によって行われることが知られている。代表的な薬物代謝酵素であるシトクロームＰ４５０は、生体内での薬物代謝の８割に関与する酸化酵素である。ＣＹＰ３Ａ群は、シトクロームＰ４５０ファミリーに属する主要な遺伝子であり、市販の薬物の約５０％の代謝に関連するといわれる（非特許文献１）。【０００５】
薬物代謝酵素に関して、薬物代謝酵素誘導という現象が知られている。薬物代謝酵素誘導は、特定の薬物が薬物代謝酵素のプロモーターを活性化することなどによって、薬物代謝酵素の発現を向上させるという現象である。薬物代謝酵素誘導は有害な薬物間相互作用を引き起こす。たとえば、薬物代謝酵素の発現を向上させる第１の医薬と別の第２の医薬を同時に投与すると、第１の医薬によって発現が向上した薬物代謝酵素が第２の医薬の代謝を行って第２の薬物の薬効を低下させてしまう。したがって、有用な薬物を取得するにあたっては、医薬品候補化合物について薬物代謝酵素誘導を調べることが重要である。【０００６】
薬物代謝酵素誘導を調べる方法として、薬物代謝酵素遺伝子の発現制御領域の下流にレポーター遺伝子を接続させたベクターを導入した生体モデル細胞と薬物候補物質とを接触させて、接触前後の細胞におけるレポーター遺伝子の発現の変化を調べ、レポーター遺伝子の発現を向上させた薬物候補物質を薬物代謝酵素誘導性物質と評価する方法がある（特許文献１〜４参照）。これらの方法は、煩雑な操作が不要であり簡便に行うことができる。しかしながら、これらの方法によって薬物代謝酵素誘導を起こすと評価された薬物候補物質にも、実際の生体内などで薬物代謝酵素誘導を起こさないものがあり、また、逆に薬物代謝酵素誘導を起こさないと評価された薬物候補物質にも、生体内で薬物代謝酵素誘導を起こすものがあり、従来の評価方法は正確性が不十分であった。【０００７】
特許文献３には、ＣＹＰ３Ａ４の発現領域と蛍光タンパク質を有するベクターが記載されている。しかしながら、特許文献３には、薬物候補物質を接触させる細胞の性能を向上させることに関する記載はなく、また、胎児期特異的遺伝子に関する記載はない。【０００８】
特許文献４には、ＣＹＰ３Ａ４の調節核酸分子とレポーター核酸分子を用いることの記載があり、レポーター核酸分子としてβガラクトシダーゼを用いた実施例の記載がある。しかしながら、特許文献４には、蛍光タンパク質を用いた実施例の記載や、薬物候補物質を接触させる細胞の性能の向上に関する記載や、胎児期特異的遺伝子に関する記載はない。【０００９】
これらに類似する技術として、特許文献５は、レポーター遺伝子として蛍光タンパク質のＧＦＰを有し、胎児期特異的遺伝子であるＣＹＰ３Ａ７のプロモーター領域を含むベクターを用いて、薬物の毒性や生物学的利用能を評価する方法を開示する。しかしながら、特許文献５の技術は、薬物代謝酵素誘導の評価を目的とするものではない。また、特許文献５には、複数の遺伝子の発現領域を組み合わせたベクターの記載や、薬物候補物質を接触させる細胞の性能の向上に関する記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００８−５４６４１７号公報
【特許文献２】特開２００５−２２９９６７号公報
【特許文献３】特開２００３−３０４８９６号公報
【特許文献４】特開２０１０−１４８５０８号公報
【特許文献５】国際公開第０２／２４９１８号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｇ．Ｒ．（２００５）．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５２，２２１１−２２２１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明は、薬物代謝酵素遺伝子の発現制御領域の下流にレポーター遺伝子を接続したベクター、およびこれを導入した細胞を用いて、簡便な操作によって、従来よりも正確に被験物の薬物代謝酵素誘導を評価することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは鋭意検討したところ、従来の評価方法における不正確さの主要な原因は、評価に用いていた細胞集団が均一でなく、生体内と同様の薬物代謝酵素誘導を起こさない細胞を多く含むことにあることを見出した。また、細胞毒性を持つ被験物を用いた場合には評価用の細胞内でレポーター遺伝子の発現が充分に機能しなかったことも、不正確さの原因であることを見出した。さらに、従来の方法は、薬物接触後の特定の時点においてのみレポーター遺伝子の発現量を観察し、薬物代謝酵素誘導を評価していたが、本発明者らは、薬物代謝酵素誘導によるレポーター遺伝子の発現量は、一度上昇しても、その後、低下することがあり、低下後の発現量の結果をもとに薬物代謝酵素誘導を評価していたことも、従来の方法の不正確さの一因であることを見出した。また、本発明者らは、胎児期特異的遺伝子の発現は、細胞毒性を有する物質によって細胞に傷害が生じた際に一過的に増加し、被験物質の細胞毒性の指標となることを確認した。【００１４】
以上をもとにして、本発明者らは、さらに鋭意検討したところ、薬物代謝酵素遺伝子の発現制御領域および胎児期特異的遺伝子の発現制御領域を含むベクターを細胞に導入した後、胎児期特異的遺伝子の発現制御領域下のレポーター遺伝子の発現量が低い細胞を選択すれば、正確な薬物代謝酵素誘導試験に適した高い成熟度を示す細胞を選択することができることを見出した。また、このようなベクターを用いれば、細胞と被験物との接触前後における薬物代謝酵素遺伝子の発現制御領域下のレポーター遺伝子の発現量の変化を評価することによって薬物代謝酵素誘導を評価することができるだけでなく、細胞と被験物との接触前後における胎児期特異的遺伝子の発現制御領域下のレポーター遺伝子の発現量の変化を評価することによって細胞毒性を評価することができ、細胞毒性の評価を踏まえて、従来よりも正確に薬物代謝酵素誘導を評価することができることを見出した。上記のベクターを用いれば、薬物代謝酵素誘導試験に適した細胞の選択と、薬物代謝酵素誘導および細胞毒性の評価の試験とを、ワンステップで簡便な操作で行うことができ、細胞の発生段階や質を同時に評価することによって、取得データの信頼性を確認することができた。【００１５】
特に、それぞれの発現制御領域の下流に位置するレポーター遺伝子として、光シグナルによって検出されるものを用いる場合には、細胞の抽出物を解析することなく、レポーター遺伝子の発現量を簡便に継続的かつ定性的にライブイメージング評価することができた。このため、薬物酵素誘導によって発現が上昇した後に低下が起こった場合であっても、上昇した過程を見逃すことなく、簡便かつ正確に薬物酵素誘導試験を行うことができた。また、光シグナルによって検出されるレポーター遺伝子を含む本発明のベクターを用いれば、ルシフェラーゼやベータガラクトシダーゼ染色のように細胞の固定や破壊、基質の添加が不要であり、連続測定が可能であることから、経済的な優位性があった。【００１６】
さらに、ベクターを導入する細胞として、肝腫瘍細胞由来細胞株を用いる場合には、細胞の成熟度の違いによって、薬物代謝酵素の発現量の変化が極めて鮮明に観察されるため、試験に適した成熟度の高い細胞を、より確実かつ簡便に選択することができることを見出した。【００１７】
すなわち、本発明は、被験物の薬物代謝酵素誘導および細胞毒性を評価するための細胞を製造するためのベクターであって、胎児期特異的遺伝子の発現制御領域、第１のレポーター遺伝子、薬物代謝酵素遺伝子の発現制御領域、および第２のレポーター遺伝子を含み、ここで、第１のレポーター遺伝子が胎児期特異的遺伝子の発現制御領域の下流に位置し、第２のレポーター遺伝子が薬物代謝酵素遺伝子の発現制御領域の下流に位置する、ベクターを提供するものである。【００１８】
また、本発明は、薬物代謝酵素遺伝子が、チトクロムＰ４５０である、前記ベクターを提供するものである。【００１９】
また、本発明は、胎児期特異的遺伝子が、ＣＹＰ３Ａ７である、前記ベクターを提供するものである。【００２０】
また、本発明は、レポーター遺伝子が、光シグナルによって検出されるものである、前記ベクターを提供するものである。【００２１】
また、本発明は、レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質をコードするものである、前記ベクターを提供するものである。【００２２】
さらに、本発明は、被験物の薬物代謝酵素誘導および細胞毒性を評価するための細胞であって、前記のベクターを含む、細胞を提供するものである。【００２３】
また、本発明は、肝腫瘍細胞由来細胞株に由来する、前記細胞を提供するものである。【００２４】
また、本発明は、成熟肝細胞に分化できる幹細胞の性質を有する、前記細胞を提供するものである。【００２５】
また、本発明は、前記細胞であって、
（ア）前記ベクターを含む細胞を培養する工程、および
（イ）工程（ア）における培養の際の前記細胞中の第１のレポーター遺伝子の発現量を指標として細胞を選択する工程
を含む方法によって選択された、細胞を提供するものである。【００２６】
また、本発明は、工程（ア）における培養が、前記ベクターを含む細胞を肝細胞へ分化させるための培養である、前記細胞を提供するものである。【００２７】
さらに、本発明は、前記ベクターを含む、非ヒト動物を提供するものである。【００２８】
加えて、本発明は、被験物の薬物代謝酵素誘導および細胞毒性を評価する方法であって、
（ａ）前記の細胞中の第１のレポーター遺伝子の発現を評価する工程、および
（ｂ）前記の細胞と被験物との接触の前後における、前記の細胞中の第２のレポーター遺伝子の発現の変化を評価する工程
を含む、方法を提供するものである。【００２９】
また、本発明は、工程（ｂ）における第２のレポーター遺伝子の発現の変化の評価が、第２のレポーター遺伝子の発現の継続的な測定結果に基づくものである、前記方法を提供するものである。【００３０】
さらに、本発明は、被験物の薬物代謝酵素誘導および細胞毒性を評価するためのキットであって、前記ベクターを含むキットを提供するものである。【００３１】
また、本発明は、さらに、成熟肝細胞に分化できる幹細胞の性質を有する細胞を含む、前記キットを提供するものである。
【発明の効果】
【００３２】
本発明のベクターを用いれば、薬物代謝酵素誘導および細胞毒性を同時に正確に評価するための細胞集団を簡便に調製することができる。細胞集団の調製の際に、胎児期特異的遺伝子発現制御領域下の第１のレポーター遺伝子の発現を評価し、この発現が少ない細胞を選択すれば、より正確な評価に適した細胞集団を調製することができる。また、本発明のベクターは、薬物代謝酵素遺伝子の発現制御領域と胎児期特異的遺伝子発現制御領域とを共に含むため、これを用いれば両者が一定の比率で導入された細胞を調製することができる。このようにして調製された細胞について、薬物代謝酵素遺伝子の下流のレポーター遺伝子の発現量と胎児期特異的遺伝子の下流のレポーター遺伝子の発現量とを比較検討すれば、細胞毒性に対する影響と薬物代謝酵素に対する影響とを定量的に評価することができる。そして、レポーター遺伝子の非発現が被験物の細胞毒性に起因するかどうかの判断を踏まえて、被験物による薬物酵素誘導を一層正確に評価することができる。また、本発明のベクターを用いれば、細胞の発生段階や質を評価することができ、薬物代謝酵素誘導の試験に適した成熟度の高い細胞を、より確実に簡便に選択することができる。例えば、本発明のベクターを用いれば、肝臓の幹細胞およびそれに類する細胞株、ｉＰＳ細胞、ならびにＥＳ細胞などが機能的な肝臓細胞に分化する発生段階をモニターすることができ、分化した細胞を簡便に選別することができる。薬物代謝酵素誘導の評価に適した細胞が胎児期の肝臓細胞からそのまま分化して発生するのか、出生後に別の幹細胞から発生するのかは、不明であった。胎児期の肝細胞特異的遺伝子の発現制御領域の下流に位置する第１のレポーター遺伝子を発現する本発明の細胞が、時間経過に伴い薬物代謝酵素誘導評価に適した細胞に直接分化するのかどうかを、本発明のベクターにおける第２のレポーター遺伝子を用いて単一細胞で追跡することによって、この現象を明らかにすることができる。ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの幹細胞から薬物代謝酵素誘導性評価に適した細胞を作り出す細胞分化誘導法の開発が課題になっているが、代謝機能が高い肝細胞の発生過程を、本発明のベクターにおけるレポーター遺伝子の発現スイッチングにより明らかにすることによって、その分化誘導法の開発を加速化することができる。このように、本発明によれば、薬物代謝酵素誘導性、発現スイッチング、および肝毒性を評価できるベクター、ならびにこれらの評価が可能な生体モデル細胞に前記ベクターを導入した細胞が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ｌｏｘＰサイト導入ＨｅｐＧ２細胞におけるｌｏｘＰ挿入箇所を示す写真である。
【図２】図２は、ＣＨＯ細胞内のマウス人工染色体ベクター（ＭＡＣ）上に、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子全長とヒトＣＹＰ３Ａ７遺伝子の遺伝子発現制御領域下に赤色蛍光レポーター遺伝子（Ｒ：ＤｓＲｅｄ）を挿入したＢＡＣベクター｛ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＢＡＣ｝を搭載したことを確認する写真である。
【図３】図３−１および図３−２は、ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＢＡＣ搭載ＭＡＣ｛ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＭＡＣ｝導入マウスＥＳ細胞（ＴＴ２Ｆ）の核型（図３−１）とＭＡＣが移入されたことを確認したＦＩＳＨ解析像（図３−２）を示す写真である。
【図４】図４は、ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＭＡＣ導入マウスＥＳ細胞のコロニーを示す写真である。予めＭＡＣ上に搭載されていたＥＧＦＰ遺伝子発現を確認することができる。
【図５】図５は、ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＥＳ細胞を用いたキメラ産仔（一日目）における肝臓特異的なＤｓＲｅｄ発現を確認する写真である。
【図６】図６は、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ３Ａ７（ＣＹＰ３Ａ４／７）発現誘導性薬剤添加４８時間後、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子の遺伝子発現制御領域下に緑色蛍光レポーター遺伝子（Ｇ：ＥＧＦＰ）およびヒトＣＹＰ３Ａ７遺伝子の遺伝子発現制御領域下に赤色蛍光レポーター遺伝子（Ｒ：ＤｓＲｅｄ）を挿入したＢＡＣベクター｛ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ｝導入ＨｅｐＧ２細胞の発現誘導性を２色蛍光レポーター遺伝子発現で評価する蛍光顕微鏡写真である。
【図７】図７は、ＣＹＰ３Ａ４／７発現誘導性薬剤添加４８時間後のＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐＧ２細胞の発現誘導性を２色蛍光レポーター遺伝子発現で評価するＦＡＣＳ解析結果を示すグラフである。
【図８】図８は、ＣＹＰ３Ａ４／７発現誘導性薬剤（ＲＩＦ：リファンピシン）添加４８時間後のＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐＧ２細胞クローン（Ｃ８７）の発現誘導性を２色蛍光レポーター遺伝子発現で評価するため、エリア総蛍光量を蛍光顕微鏡で解析した結果を示すグラフである。対照群（ｌｏｘＰ）に対して、ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐＧ２細胞クローンは、ヒトＣＹＰ３Ａ４発現誘導性薬剤によりＥＧＦＰおよびＤｓＲｅｄ発現誘導されることを確認することができる。
【図９】図９は、ＣＹＰ３Ａ４／７発現誘導性薬剤（ＲＩＦ：リファンピシンおよびＤＥＸ：デキサメタゾン）添加２４時間後の代表的なＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐＧ２細胞クローン（Ｃ６、Ｃ５２、Ｃ８７）の内在性ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ７遺伝子発現変化を蛍光レポーター遺伝子ＥＧＦＰおよびＤｓＲｅｄの発現量変化で予測できるかを評価する定量性ＲＴ−ＰＣＲの解析結果を示すグラフである。特に、内在性ＣＹＰ３Ａ４に比べＥＧＦＰの遺伝子発現増加率（Ｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  非処理対象群＝１）が高く、薬剤の発現誘導性の有無を評価することが容易になることを示すグラフである。
【図１０】図１０左は、ｌｏｘＰサイトがヒト１５番染色体に導入されたｌｏｘＰ−１５  ＨｅｐａＲＧ細胞とヒト１６番染色体に導入されたｌｏｘＰ−１６  ＨｅｐａＲＧ細胞を示すＦＩＳＨマッピング写真である。同時に、ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ（赤色）が、ｌｏｘＰ挿入箇所（緑色）に挿入されていることを示す。図１０右は、代表的なＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞クローンの染色体構成を示すマルチカラーＦＩＳＨの解析結果を示す画像である。
【図１１】図１１は、ＨｅｐａＲＧ細胞の特性を確認する写真である。図１１左は、２週間（２Ｗ）の増殖専用培地による増殖培養（Ｇｒｏｗｉｎｇ）後に分化専用培地による分化培養（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）すると、小型の肝細胞様細胞集団が細胞集団上層に出現することを示す写真である。図１１右は、この肝細胞様細胞集団がＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ７を共に認識する抗体に対して強陽性となり、いずれかの発現が高いことを示す抗体染色写真である。
【図１２】図１２は、ＨｅｐａＲＧ細胞を分化した場合、内在性ＣＹＰ３Ａ４（左）とＣＹＰ３Ａ７（右）の遺伝子発現変化を定量性ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示すグラフである。１４日間の増殖専用培地による増殖培養後（Ｇ１４ｄ）、分化専用培地で分化培養１、２、３、７、１５日（Ｄ１ｄ、Ｄ２ｄ、Ｄ３ｄ、Ｄ７ｄ、Ｄ１５ｄ）経過したＨｅｐａＲＧ細胞での、細胞分化に伴うＣＹＰ３Ａ７発現の減少とＣＹＰ３Ａ４の増加を確認するグラフである。
【図１３】図１３は、代表的なＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞クローン（Ｃ３）の１４日間の増殖専用培地による増殖培養後（Ｇ１４ｄ）、分化専用培地による分化培養後５日目（Ｄ５ｄ）と１０日目（Ｄ１０ｄ）のＤｓＲｅｄ陽性細胞数の減少（上）およびＥＧＦＰ陽性細胞量の増加（下）を示す蛍光顕微鏡写真を示す。
【図１４】図１４は、ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞は当初全てＤｓＲｅｄ陽性であるが分化に伴ってＤｓＲｅｄ発現が消失し、その中から、一部の細胞がＥＧＦＰ陽性細胞となること示す顕微鏡写真である。図１４は、ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞が、ＣＹＰ３Ａ４陽性の代謝機能が高い肝細胞の発生過程を解析する材料となることを示す。
【図１５】図１５は、増殖専用培地による増殖培養７日目（Ｇ７ｄ）と１４日目（Ｇ１４ｄ）、専用分化培地による分化培養後１、３、５、７、１０、１２日目（Ｄ１ｄ、Ｄ３ｄ、Ｄ５ｄ、Ｄ７ｄ、Ｄ１０ｄ、Ｄ１２ｄ）でのＥＧＦＰ（左）およびＤｓＲｅｄ（右）のエリア総蛍光量の経日変化を蛍光顕微鏡で解析した結果を示すグラフである。ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞は、細胞分化に伴いＤｓＲｅｄ発現の減少とＥＧＦＰの増加を起こすことが分る。
【図１６】図１６は、代表的なＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞クローン（Ｃ３）に、１％ＤＭＳＯに溶解したＣＹＰ３Ａ４／７発現誘導性薬剤（ＲＩＦ：リファンピシン、ＤＥＸ：デキサメタゾン、ＣＬＯ：クロトリマゾール、ＮＩＦ：ニフェジピン、ＰＣＮ：ｐｒｅｇｎｅｎｏｌｏｎｅ  １６ａ−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）を添加し、４８時間後のＥＧＦＰおよびＤｓＲｅｄのエリア総蛍光量を蛍光顕微鏡で解析した結果を示すグラフである。ＥＧＦＰはＰＣＮ以外で、誘導性を示した。ＰＣＮはげっ歯類のＣＹＰ誘導剤として知られ、ヒトではＣＹＰ３Ａ４を誘導しないことから、ＰＣＮによる非誘導性はヒトでの反応をＥＧＦＰで予測できていることを示す例となる。また、ＨｅｐａＲＧ細胞に対して細胞障害度が高かったＣＬＯ、ＮＩＦ、ＰＣＮでのＤｓＲｅｄ蛍光量増加率（Ｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ，ＤＭＳＯ対象群＝１）から、ＣＹＰ３Ａ７発現増加が細胞毒性評価の目安となることを示すグラフである。
【図１７】図１７は、ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＢＡＣ搭載ＭＡＣ導入マウスＥＳ細胞を用いたキメラマウスを交配して得られたＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＭＡＣ導入マウスの生後１日目における肝臓でのＤｓＲｅｄ発現を確認する写真である（ｗｔ：対照群）。
【図１８】図１８は、ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＭＡＣ導入マウスがＤｓＲｅｄ発現増加によって肝障害を評価できるか検討するため、成体に肝障害物質である５％四塩化炭素を投与した後の肝臓の蛍光顕微鏡写真である。成体になって抑制されていた肝臓のＤｓＲｅｄ蛍光量が増加することが分る。ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＭＡＣ導入マウスでは、ＥＧＦＰは、細胞にＭＡＣが導入されていることを示すマーカーとしての機能をもつ。
【図１９】図１９は、ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＭＡＣ導入マウスがＤｓＲｅｄ発現増加によって肝障害を評価できるか検討するため、成体に肝障害物質である５％四塩化炭素を投与すると、成体になって抑制されていたＤｓＲｅｄ発現が増加することを示した定量性ＲＴ−ＰＣＲ解析結果のグラフである。ＤｓＲｅｄは、幼弱な肝芽細胞のマーカーであるαフェトプロテイン（Ａｆｐ）とともに肝毒性後の肝再生マーカーとして利用できることが分る。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、ベクターを提供する。ベクターとしては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクターなどが挙げられる。人工染色体ベクターとしては、酵母人工染色体ベクター（ＹＡＣ）、細菌人工染色体ベクター（ＢＡＣ）、Ｐ１人工染色体ベクター（ＰＡＣ）、マウス人工染色体ベクター（ＭＡＣ）、ヒト人工染色体ベクター（ＨＡＣ）が挙げられる。
【００３５】
本発明のベクターは、胎児期特異的遺伝子の発現制御領域を含む。
【００３６】
胎児期特異的遺伝子は、胎児期に特異的に発現が向上する遺伝子である。胎児期特異的遺伝子として各種の遺伝子が知られており、たとえば、ＣＹＰ３Ａ７、Ｃｙｐ３ａ１６、α−フェトプロテイン、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、ＧＳＴ−Ｐ、Ｍ２−ＰＫ、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＲＬ１６／７９、ＥｐＣＡＭなどが挙げられる。ＣＹＰ３Ａ７（チトクロムＰ４５０、ファミリー３、サブファミリーＡ、ポリペプチド７）は、ＮＣＢＩ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓにおいて、登録番号ＮＭ  ０００７６５として説明されている。ＣＹＰ３Ａ７の配列は、登録番号ＮＭ  ０００７６５．３に示される。ＣＹＰ３Ａ７は、胎児期特異的遺伝子であるとともに薬物代謝酵素遺伝子でもある。そのため、ＣＹＰ３Ａ７は、薬物代謝酵素誘導の評価の指標としても用いることができ、これにより一層正確な評価が可能となる。ＣＹＰ３Ａ７は、幼若な肝芽細胞のマーカーである。ＣＹＰ３Ａ７を用いることにより、肝細胞毒性後の肝再生を評価することができる。
【００３７】
発現制御領域は、下流に位置する遺伝子の発現を制御する領域である。発現制御領域としては、プロモーター、エンハンサーが挙げられる。プロモーターは、結合する遺伝子のコード領域の転写の開始に関わるＤＮＡ配列である。エンハンサーは、結合しているプロモーターの特異性を制御する。発現制御領域は、プロモーター、エンハンサーのそれぞれを単独で含んでもよいが、プロモーター、およびエンハンサーを共に含んでもよい。
【００３８】
胎児期特異的遺伝子の発現制御領域は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公知の情報をもとに周知技術によって取得することができる。たとえば、ＣＹＰ３Ａ７に関しては、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＡＦ１８１８６１．１が、ヒトチトクロムＰ−４５０ＩＩＡ７（ＣＹＰ３Ａ７）遺伝子、プロモーター領域、および部分配列として、１０１２ｂｐの塩基配列を開示している。この１０１２ｂｐの塩基配列を配列番号１として示す。また、ＧｅｎＢａｎｋは、登録番号ＡＣ０６９２９４．５として、ＣＹＰ３Ａ７の発現制御領域を含むＢＡＣクローンＲＰ１１−７５７Ａ１３の塩基配列を開示している。登録番号ＡＣ０６９２９４．５として開示された塩基配列を配列番号２として示す。さらに、ＣＹＰ３Ａ７の発現制御領域はＣＹＰ３Ａ４の発現制御領域と９０％以上の相同性を示すことから、ＣＹＰ３Ａ７のプロモーターおよびエンハンサー領域は、登録番号ＡＦ１８５５８９．１のＣＹＰ３Ａ４のプロモーターおよびエンハンサー領域との相対的な位置として公知である（Ｂｅｒｔｉｌｓｓｏｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＲＣ  ２８０，１３９−１４４，２００１；Ｓｕｅｙｏｓｈｉ，Ｔ  ａｎｄ  Ｎｅｉｓｈｉ，Ｍ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４１：１２３−４３，２００１）。ＣＹＰ３Ａ７の転写開始点から約−８０００ｂｐの配列は、ＣＹＰ３Ａ７の発現制御領域として用いることができる。登録番号ＡＦ１８５５８９．１の転写開始点から−７７３３〜−７７１９（ｄＮＲ１）、−７６８９〜−７６７２（ｄＮＲ２）、−７２８７〜−７２７３（ｄＮＲ３）、−１７１〜−１５４（ｐＮＲ）は、ＣＹＰ３Ａ４のエンハンサーであることが知られており、これらに対して相同性を有するＣＹＰ３Ａ７中の４箇所の相同領域もエンハンサーとして機能していることが知られている。この４箇所のエンハンサー配列を以下の表１に示す。ＣＹＰ３Ａ７の発現制御領域は以上の４箇所のエンハンサー領域を含むことが好ましく、転写開始点から約−８０００ｂｐまでの配列をＣＹＰ３Ａ７の発現制御領域として用いることによって、これらのエンハンサーを含めることができる。また、これらの配列と、９５％、９８％、または９９％以上の同一性を有する配列も、下流に位置する遺伝子の発現を制御する機能を有するかぎり、ＣＹＰ３Ａ７の発現制御領域として用いることができる。ここで、配列の同一性は、市販のまたは電気通信回線を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。具体的には、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３，１９９０）やＦＡＳＴＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−６９）等の解析ソフトを用いて計算することができる。
【表１】
2014061829.tif 000002
2014061829.tif 000003
【００３９】
本発明のベクターは、第１のレポーター遺伝子を含む。
【００４０】
レポーター遺伝子は、検出可能な標識を細胞に提示させる任意の核酸配列である。検出可能な標識としては、蛍光シグナル、リン光シグナル、アッセイにおいて検出可能なタンパク質、酵素活性、細胞上または細胞中で検出可能な抗原などが挙げられる。レポーター遺伝子がコードするタンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒト化ウミシイタケ緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、増強青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、増強シアン蛍光タンパク質（ｅＣＦＰ）、増強黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰまたはＤｓＲｅｄ）などの蛍光タンパク質が挙げられる。また、レポーター遺伝子がコードするタンパク質としては、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼなどの生物発光タンパク質が挙げられる。さらに、レポーター遺伝子がコードするタンパク質としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの化学発光基質を変換する酵素が挙げられる。本発明において、蛍光シグナル、リン光シグナルなどの光シグナルによって検出されるレポーター遺伝子を用いる場合、細胞を生存させた状態でレポーター遺伝子の発現量を観察することができ、評価用の細胞を生きたまま簡便に選択することができる。また、その場合、被験物を連続的に投与する実験に用いることもでき、発現量の経時的変化をリアルタイムで追跡することもできる。そのため、本発明のレポーター遺伝子としては、光シグナルを標識とするものを用いるのが好ましい。
【００４１】
本発明のベクターは、薬物代謝酵素遺伝子の発現制御領域を含む。
【００４２】
薬物代謝酵素遺伝子は、生体内で薬物の代謝を行う酵素をコードする遺伝子である。薬物代謝酵素遺伝子としては、各種の遺伝子が知られている。知られている薬物代謝酵素遺伝子の中には、薬物を化学的に改変または隔離する、細胞に結合しているもしくは細胞上に存在するタンパク質または核内タンパク質がある。薬物代謝酵素遺伝子は、生体内において薬物の排除またはその効果の実質的な変更をもたらす限り、化学的分解、別の化合物への変換、または別の細胞間もしくは細胞内空間への輸送などの具体的機能を問わない。薬理代謝酵素遺伝子としては、チトクロムＰ４５０、フラビン含有モノオキシゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、モノアミンオキシダーゼ、アルデヒド還元酵素、ケトン還元酵素、エステラーゼ、エポキシヒドロラーゼ、β−グルクロニダーゼ、スルファターゼ、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素、グルタチオンＳ−転移酵素、Ｎ−アセチル転移酵素、硫酸転移酵素、グリシン抱合酵素、メチル化酵素およびグルコース転移酵素などが挙げられる。チトクロムＰ４５０には、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７などを含むＣＹＰ３Ａ遺伝子群（単にＣＹＰ３Ａともいう）が含まれる。また、チトクロムＰ４５０には、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ５Ａ１、ＣＹＰ８Ａ１、ＣＹＰ２１などが含まれる。輸送を担う遺伝子としては、ＯＣＴ１、ＮＴＣＰ、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ＯＡＴＰ２Ｂ１、ＯＡＴ２、ＭＲＰ２、ＭＲＰ３、ＭＲＰ４、ＭＲＰ６、ＭＤＲ１、ＢＣＲＰ、ＢＳＥＰなどが含まれる。核内受容体としては、ＰＸＲ、ＣＡＲなどが含まれる。
【００４３】
薬物代謝酵素遺伝子の発現制御領域は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公知の情報をもとにして周知技術によって取得することができる。たとえば、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＡＦ１８５５８９．１には、ヒトチトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）遺伝子・プロモーター領域として、１１３７４ｂｐの配列が開示されており、転写開始点から約−８０００ｂｐの配列は、ＣＹＰ３Ａ４の発現制御領域として用いることができる。登録番号ＡＦ１８５５８９．１として開示された１１３７４ｂｐの配列を、配列番号３に示す。特に、登録番号ＡＦ１８５５８９．１の転写開始点から−７７３３〜−７７１９（ｄＮＲ１）、−７６８９〜−７６７２（ｄＮＲ２）、−７２８７〜−７２７３（ｄＮＲ３）、−１７１〜−１５４（ｐＮＲ）は、ＣＹＰ３Ａ４のエンハンサーであることが知られており（Ｂｅｒｔｉｌｓｓｏｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＲＣ  ２８０，１３９−１４４，２００１；Ｓｕｅｙｏｓｈｉ，Ｔ  ａｎｄ  Ｎｅｉｓｈｉ，Ｍ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４１：１２３−４３，２００１）、これらの配列をＣＹＰ３Ａ４の発現制御領域として用いてもよい。また、これらの配列と、９５％、９８％、または９９％以上の同一性を有する配列も、下流に位置する遺伝子の発現を制御する機能を有するかぎり、ＣＹＰ３Ａ４の発現制御領域として用いることができる。配列の同一性は、市販のまたは電気通信回線を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。具体的には、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３，１９９０）やＦＡＳＴＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−６９）等の解析ソフトを用いて計算することができる。ＣＹＰ３Ａ４の発現制御領域を用いる場合、下流にある第２のレポーター遺伝子の発現が高いことは、細胞が薬物代謝酵素誘導の評価に適していることの指標にもなるため、より正確な評価のための細胞を調製することが可能になる。
【００４４】
本発明のベクターは、第２のレポーター遺伝子を含む。第２のレポーター遺伝子は、第１のレポーター遺伝子と異なることが望ましい。
【００４５】
本発明のベクターにおいて、第１のレポーター遺伝子は、発生初期段階特異的遺伝子の発現制御領域の下流に位置し、第２のレポーター遺伝子は、薬物代謝酵素遺伝子の発現制御領域の下流に位置する。レポーター遺伝子が転写される方向を基準として、レポーター遺伝子が発現制御領域の後ろに位置する場合、レポーター遺伝子は発現制御領域の下流に位置するといってよい。また、発現制御領域がレポーター遺伝子に機能的に連結される場合にも、レポーター遺伝子は発現制御領域の下流に位置するといってよい。発現制御領域がコード領域の転写を駆動する実験結果が得られる場合には、発現制御領域はコード領域に機能的に結合しているといってよい。
【００４６】
本発明のベクターは、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムなどの、部位特異的組換え反応を利用した遺伝子組換え用の配列を含んでもよい。本発明のベクターがＣｒｅ−ｌｏｘＰシステム用の配列を含む場合、ベクターの全長をあらゆる細胞に１コピー導入することが可能になる。これにより、細胞間のレポーター遺伝子の発現のばらつきが減少するため、評価の正確性がさらに向上する。
【００４７】
本発明のベクターは、発現制御領域およびレポーター遺伝子などを含む核酸断片とベクターとを公知の方法によってライゲーションすることによって得てもよい。また、各遺伝子のゲノム上の周辺領域を含むベクターにおいて、その遺伝子のタンパク質翻訳領域（ＯＲＦ）をレポーター遺伝子と置換することによって得てもよい。
【００４８】
本発明のベクターにおいて、薬物代謝酵素遺伝子としてＣＹＰ３Ａ４を用い、かつ、胎児期特異的遺伝子としてＣＹＰ３Ａ７を用いる場合、両遺伝子の発現は発生段階特異的制御を受けているため、薬物代謝酵素誘導の評価に適さない細胞においては第１のレポーター遺伝子の発現の上昇と第２のレポーター遺伝子の発現の低下が観察される。他方、評価に適した細胞においては第１のレポーター遺伝子の発現の低下と第２のレポーター遺伝子の発現の上昇が観察される。このように、細胞が薬物代謝酵素誘導の評価に適しているかどうかを、レポーター遺伝子の発現上昇と発現低下の両方の側面から判断することができる。そのため、分化の成熟度が高く生体内における機能を充分に保持する機能的細胞を極めて効率よく取得することができる。したがって、本発明のベクターには、薬物代謝酵素遺伝子としてＣＹＰ３Ａ４を用い、かつ、胎児期特異的遺伝子としてＣＹＰ３Ａ７を用いることが好ましい。
【００４９】
本発明のベクターは、被験物の薬物代謝酵素誘導を評価するための細胞を製造するために用いることができる。
【００５０】
被験物の薬物代謝酵素誘導を評価するための細胞は、リポフェクション、微小核融合法などの公知の方法を用いて、本発明のベクターを細胞に導入することによって得ることができる。
【００５１】
本発明のベクターを導入する細胞としては、薬物代謝酵素誘導が生じる生体内の組織中の細胞が挙げられる。本発明のベクターを導入する細胞が由来する組織としては、肝臓、小腸などが挙げられる。本発明のベクターを導入する細胞が由来する生物は、薬物代謝酵素誘導を試験することを目的とする生物であることが望ましく、たとえば、ヒト、マウスなどの哺乳動物が挙げられる。また、本発明のベクターを導入する細胞としては、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｅｐａＲＧ細胞、Ｈｕ７細胞などの培養細胞であってもよい。ＨｅｐＧ２細胞は、ヒト肝ガン細胞であり、ヒト肝細胞モデル細胞として汎用されている。本発明のベクターを導入する細胞は、好ましくは、ＨｅｐａＲＧ（登録商標）などの肝腫瘍細胞由来細胞株である。また、本発明のベクターを導入する細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞であってもよい。胚性幹細胞、人工多能性幹細胞は、無限に増殖可能であり、機能的な細胞の大量供給源として有益である。本発明のベクターを導入する細胞は、好ましくは、成熟肝細胞に分化できる幹細胞の性質をもつ肝腫瘍細胞由来細胞株；肝腫瘍細胞由来細胞株または生体肝臓の幹細胞；ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞；など、成熟度の高い肝細胞に分化し得る能力をもつ未成熟な細胞である。
【００５２】
被験物の薬物代謝酵素誘導を評価するための細胞としては、本発明のベクターを導入した多能性幹細胞を好適な組織に分化誘導させて得られた細胞を用いてもよい。たとえば、機能的に成人の成熟肝細胞の特性を示す細胞は、ベクターを導入したｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞からＳＯＸ９陽性の膵・肝・小腸共通前駆細胞を取得し、さらに、ＡＦＰ／ＰＤＸ１共陽性の膵・肝臓共通前駆細胞を取得して増殖させる方法で肝細胞分化誘導を行い、ＣＹＰ３Ａ７／Ａｆｐ／ＥｐＣＡＭ共陽性の胎仔肝臓細胞を取得し、さらに成熟化を行ってＣＹＰ３Ａ４／ＡＬＢ共陽性の成体肝臓を取得することによって得てもよい。
【００５３】
また、被験物の薬物代謝酵素誘導を評価するための細胞としては、微小核融合法などによって人工染色体を導入した多能性幹細胞を用いてキメラ動物を作製し、作製したキメラ動物の肝臓等の組織から分取したものを用いてもよい。分取した細胞のうち、第１のレポーター遺伝子の発現が低いものを選択することによって、薬物代謝酵素誘導をより正確に評価することができる細胞を取得することができる。本発明のベクターを含む非ヒト動物において、非ヒト動物としては、たとえば、ウシ、ミニブタ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、サルなどの哺乳動物が挙げられる。
【００５４】
被験物の薬物代謝酵素誘導および細胞毒性を評価するための細胞を製造するための本発明のベクターを含み、本発明のベクターにおける胎児期特異的遺伝子の発現制御領域による遺伝子の発現量が低い細胞は、成熟度が高く、薬物代謝酵素誘導を評価する試験に適している。したがって、被験物の薬物代謝酵素誘導を評価するための細胞としては、（ア）本発明のベクターを含む細胞を培養する工程、および（イ）工程（ア）における培養の際の前記細胞中の第１のレポーター遺伝子の発現量を指標として細胞を選択する工程を含む方法によって選択された細胞が好ましい。より具体的には、工程（イ）においては、第１のレポーター遺伝子の発現量が低い細胞が選択される。上記細胞のうち、本発明のベクターにおける薬物代謝酵素遺伝子の発現制御領域による第２のレポーター遺伝子の発現量が高い細胞は、より成熟度が高く、より一層、薬物代謝酵素誘導を評価する試験に適している。したがって、より好ましくは、工程（イ）においては、細胞中の第２のレポーター遺伝子の発現量を指標とする細胞の選択が行われる。より具体的には、好ましくは、工程（イ）においては、第２のレポーター遺伝子の発現量が高い細胞が選択される。また、好ましくは、工程（ア）における培養は、本発明のベクターを含む細胞を肝細胞へ分化させるためのものである。肝細胞へ分化させるための培養は、たとえば、肝細胞への分化用培地において行うことができる。工程（ア）において培養される本発明のベクターを含む細胞は、第１のレポーター遺伝子の発現が認められることを指標に選択されたものであってもよい。また、工程（イ）における細胞の選択は、細胞集団上層に存在することを更なる指標として行ってもよい。
【００５５】
以上のようにして得られる細胞は、被験物の薬物代謝酵素誘導を評価するために用いることができる。被験物は、薬物代謝酵素誘導を起こすかどうかを検証することを目的とする物であり、たとえば、医薬品候補化合物が挙げられるが、医薬品、食品、化学物質、それらの代謝物などでよく、特に制限されない。
【００５６】
本発明が提供する評価方法は、前記のようにして得られる被験物の薬物代謝酵素誘導を評価するための細胞（以下、単に評価用細胞ともいう）中の第１のレポーター遺伝子の発現を評価する工程を含む。より具体的には、本発明の評価方法は、細胞中の第１のレポーター遺伝子の発現を評価して、高い発現が認められる細胞を、評価に用いる細胞から除去する工程を含んでよい。また、本発明の評価方法は、被験物質と評価用細胞とを接触させて、接触前後の第１のレポーター遺伝子の発現の変化を評価して、発現の向上が認められた場合、接触させた被験物が細胞毒性を有すると判断する工程を含んでよい。被験物質と評価用細胞との接触は、本発明のベクターを含む非ヒト動物に対して被験物質を投与することによって行ってもよい。
【００５７】
本発明が提供する評価方法は、評価用細胞と被験物との接触の前後における、評価用細胞中の第２のレポーター遺伝子の発現の変化を評価する工程を含む。より具体的には、本発明の評価方法は、被験物の接触によって第２のレポーター遺伝子の発現の向上が認められた場合に、接触させた被験物が薬物代謝酵素誘導能を有すると判断する工程を含んでよい。好ましくは、第２のレポーター遺伝子の発現の変化の評価は、第２のレポーター遺伝子の発現の継続的な測定結果に基づくものである。この場合、薬物酵素誘導によって、細胞内の第２のレポーター遺伝子の発現が一度上昇した後に低下する場合であっても、結果を見逃すことなく、簡便かつ正確に薬物酵素誘導を行うことができる点で好ましい。継続的な測定結果は、たとえば、被験物との接触の後、３日後まで行われる。継続的な測定は、たとえば、１〜２時間おきに、好ましくは、３０分〜１時間おきにレポーター遺伝子の発現量の結果を取得することによって行われる。
【００５８】
本発明が提供する評価方法は、９６ウェル、３８４ウェルなどの複数のウェルを用いて、複数の被験物と細胞との接触を同時に行い、レポーター遺伝子の評価を同時に行うハイコンテンツスクリーニング（ＨＣＳ）として行ってもよい。レポーター遺伝子として光シグナルを標識とするレポーター遺伝子を用いた場合には、レポーター遺伝子の発現を光シグナルとして一度に簡便に識別することができ、多数の被験物についての評価を迅速に行うことができる。
【００５９】
本発明が提供する評価方法は、キットによって行ってもよい。キットとしては、たとえば、被験物の薬物代謝酵素誘導および細胞毒性を評価するためのキットであって、本発明のベクターを含むキットが挙げられる。本発明のキットは、さらに、細胞；細胞株を培養して増殖させるための培地；肝細胞への分化を誘導するための誘導剤；被験物；細胞を培養するための容器；キットの少なくとも１つの構成要素を使用するための取扱説明書などを含んでもよい。キットに含める細胞は、好ましくは、成熟肝細胞に分化できる幹細胞の性質を有する細胞である。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を実施例によって説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００６１】
実施例１  細菌人工染色体（ＢＡＣ）の利用：
（１）ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ３Ａ７のタンパク質翻訳領域（ＯＲＦ）を含む細菌人工染色体の作製：
１１．６ｋｂのＢＡＣクローンベクターｐＢＡＣｅ３．６のＥｃｏＲＩサイトに、ＣＹＰ３Ａ４からＣＹＰ３Ａ７にいたる遺伝子発現制御領域の全長１２３，７７８ｂｐを挿入した、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ３Ａ７の遺伝子発現制御領域およびタンパク質翻訳領域を含む細菌人工染色体であるＲＰ１１−７５７Ａ１３ＢＡＣを以下の実験に用いた。ＢＡＣクローンＲＰ１１−７５７Ａ１３の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、登録番号ＡＣ０６９２９４．５として開示されている。【００６２】
（２）ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ３Ａ７のタンパク質翻訳領域をＤｓＲｅｄおよびＥＧＦＰへ置換：
ａ．ＤｓＲｅｄ置換用ベクターの作製：
ｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ−１ベクターを基本ベクターとし、ＤｓＲｅｄ遺伝子のＯＲＦ直前にあるＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ部位にｈＣＹＰ３Ａ７の５’領域（ｌｅｆｔ  ａｒｍ、ＬＡ）を挿入し、カナマイシン耐性遺伝子の直後のＢｓａＩ部位にＣＹＰ３Ａ７の３’領域（ｒｉｇｈｔ  ａｒｍ、ＲＡ）を挿入することで、ＤｓＲｅｄ置換用ベクターであるＬＡ−ＤｓＲｅｄ−ｐＡ−ＲＡ  ＣＹＰ３Ａ７ノックイン（以下、単にＫＩともいう）ベクターを構築した。【００６３】
ｂ．ＥＧＦＰ置換用ベクターの作製：
ｐＨｙｇＥＧＦＰベクターを基本ベクターとし、ｐＡとアンピシリン耐性遺伝子を含むＢｇｌＩＩ部位にＣＹＰ３Ａ４のＬＡおよびＲＡを挿入し、開鎖後にＥＧＦＰ遺伝子がＬＡとＲＡの間に位置するようにして、ＥＧＦＰ置換用ベクターであるＬＡ−ＥＧＦＰ−ｐＡ−ＲＡ−ＣＹＰ３Ａ４  ＫＩベクターを構築した。【００６４】
ｃ．ＤｓＲｅｄへの置換：
（ａ）相同組換え用の細胞への細菌人工染色体の導入：
ＤＹ３８０をＬＢプレートに線画し、３２℃で一晩加温した。コロニーをピックアップして振盪培養（３２℃、１８０−２００ｒｐｍ、１４時間）した液を、５０ｍｌのＬＢに移し振盪培養した（３２℃、１８０−２００ｒｐｍ、３〜４時間）。Ｏ．Ｄ．が０．４になったら振盪を止め、４２℃のウォーターバスの中で５分間撹拌し、５分間静止した。氷中に１０分静置した後、遠心機でＤＹ３８０を集めた（４℃、３５００ｒｐｍ、１０分）。ＭＱで２回洗浄したあと、前述の２００ｎｇのＲＢ１１−７５７Ａ１３  ＢＡＣ  ＤＮＡと混合し、Ｇｅｎｅ  Ｐｌｕｓｅｒでエレクトロポレーションした（１７５０Ｖ、２５ｕＦ、２００Ω、ｐｕｌｓｅ  ｎｏ．１）。３２℃で１．５時間回復振盪した後、ＬＢプレートに塗り、３２℃で一晩加温した。このようにして、細菌人工染色体ＲＢ１１−７５７Ａ１３を相同組換え用の細胞であるＤＹ３８０に導入し、ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ７を共に含む（ＣＹＰ３Ａ４＋／７＋）ＢＡＣクローンを得た。【００６５】
（ｂ）相同組換えによるＤｓＲｅｄへの置換：
前述のＤｓＲｅｄ置換用ベクターであるＬＡ−ＤｓＲｅｄ−ｐＡ−ＲＡ  ＣＹＰ３Ａ７  ＫＩベクターから必要なＤＮＡ断片を切り出し、その１００ｎｇのＤＮＡ断片をエレクトロポレーションにより前述のＣＹＰ３Ａ４＋／７＋  ＢＡＣクローンに導入し、薬剤添加ＬＢプレートに塗布した。得られたカナマイシン耐性クローンについて、相同組換えを確認するためのプライマーを用いてｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲを行った。用いたプライマーを表２に示す。すべてのＢＡＣクローンにおいて予想した長さのＰＣＲ産物が得られた。このようにして、ＣＹＰ３Ａ７のＯＲＦをＤｓＲｅｄに置換したクローンであるＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＢＡＣクローンを取得した。
【表２−１】
2014061829.tif 000004
2014061829.tif 000005
【表２−２】
2014061829.tif 000006
2014061829.tif 000007
【００６６】
ｄ．ＥＧＦＰへの置換：
前述したＬＡ−ＥＧＦＰ−ｐＡ−ＲＡ−ＣＹＰ３Ａ４  ＫＩベクターをＸｈｏＩで直鎖化し、得られた直鎖ＤＮＡをエレクトロポレーションによって、前述のようにして得たＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＢＡＣ上のＣＹＰ３Ａ４  ＯＲＦ領域にノックインし、ＥＧＦＰ遺伝子を挿入した。得られたアンピシリン耐性クローンにおいて相同組換えを確認するための９対のプライマーを用いて、ｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲを行ったところ、得られた全てのクローンにおいて予想した長さのＰＣＲ産物が確認された。このようにして、ＣＹＰ３Ａ７のＯＲＦがＤｓＲｅｄに置換されＣＹＰ３Ａ４のＯＲＦがＥＧＦＰに置換されたＢＡＣクローンであるＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣクローンを取得した。なお、ｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲに用いたプライマーを上の表２に示す。【００６７】
ｅ．ｌｏｘＰサイトの挿入：
Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムを介してＢＡＣ  ＤＮＡをＭＡＣ（マウス人工染色体）または予めｌｏｘＰ配列を挿入された任意の染色体上に搭載するため、公知の方法にしたがって、前述のようにして得たＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ上にｌｏｘＰ配列をノックインした（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  １９８１；  Ｈｏｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２；  Ｎａｇｙ，  ２０００）。【００６８】
実施例２  細菌人工染色体を導入した細胞の作製：
（１）ｌｏｘＰ  ｔｇ−ＨｅｐＧ２の作製：
ＨＰＲＴ  ｅｘｏｎ１−２、ｌｏｘＰおよび薬剤選択用マーカーとしてＨｙｇ耐性遺伝子を含むプラスミドベクター（ＶＨ２１−１２＃８−３）を制限酵素（ＮｏｔＩ）処理して直鎖化した。このベクターのＨｅｐＧ２への導入にはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ試薬を使用した。まず、５μｇＶＨ２１−１２＃８−３を２．５ｍｌＯｐｔｉ−ＭＥＭにて希釈し、１２．５μｇのＰＬＵＳ試薬を加え、室温で５分静置した。６８．７５μｌのＬＴＸ試薬を添加し、室温で２５分静置後、ＨｅｐＧ２（１０ｃｍディッシュ、約１×１０７）上に添加した。１０％ウシ胎仔血清入りＤ−ＭＥＭ５ｍｌにて１日培養したのち、ＨｅｐＧ２をトリプシン処理により培養皿から剥がし、１０ｃｍディッシュ５枚に播種した。ハイグロマイシン（４００μｇ／ｍｌ）を培地に添加し、３日おきに培地交換した。ハイグロマイシンの添加から１４日目にコロニーを単離して、１４番染色体長腕上に１箇所のｌｏｘＰサイトを持つトランスジェニックＨｅｐＧ２細胞株であるｌｏｘＰ  ｔｇ−ＨｅｐＧ２を取得した。遺伝子の導入は、ＨＰＲＴ  ｅｘｏｎ２末端からハイグロマイシン領域を増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲにより確認した。なお、作製にあたりＨｅｐＧ２を細胞培養する場合、培養にはＬ−グルタミン、フェノールレッド含有Ｄ−ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ−ｇｌｕｃｏｓｅ）にウシ胎仔血清を１０％添加したものを使用した。また、継代時は、０．０４％ＥＤＴＡ添加０．１％トリプシン溶液を用いて細胞を剥離した。【００６９】
（２）ｌｏｘＰ  ｔｇ−ＨｅｐＧ２へのＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣの導入：
前述のＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ−ＢＡＣをＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムにより前述のｌｏｘＰ  ＴＧ−ＨｅｐＧ２に挿入するため、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ試薬を用いてリポフェクションを行った。まず、５μｇのＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ−ＢＡＣと２μｇのｐＣＡＧ−Ｃｒｅを１．２５ｍｌＯｐｔｉ−ＭＥＭにて希釈し、６．２５μｌのＰＬＵＳ試薬を加え、室温で５分静置した。２５μｌのＬＴＸ試薬を添加し、室温で２５分静置後、ＨｅｐＧ２（６ｃｍディッシュ、約８０％コンフルエント）上に添加した。１日培養したのち、トリプシン処理によりディッシュから剥がし、１０ｃｍ培養皿３枚に播種した。ネオマイシン（８００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８）を培地に添加し、３日おきに培地交換し、添加から１０日目にコロニーを単離して、ｌｏｘＰ  ｔｇ−ＨｅｐＧ２にＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣが導入された細胞株であるＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐＧ２細胞を取得した。安定発現株取得の確認は、ＢＡＣベクターのＥＧＦＰおよびＤｓ−Ｒｅｄ領域を増幅する表２のプライマーセットを用いたＰＣＲおよびＦＩＳＨ解析により確認した（図１、ヒト１４番染色体長腕基部、矢印）。【００７０】
実施例３  ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ搭載およびＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ搭載マウス人工染色体の作製：
前述のＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ−ｌｏｘＰ  ＢＡＣを精製し、Ｃｒｅ酵素発現ベクターと共にリポフェクション法によって、ＭＡＣを保持するＣＨＯ細胞へトランスフェクションした。ＤｓＲｅｄ、ＥＧＦＰや、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ３Ａ７の制御領域をｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲによって確認した。さらにＦＩＳＨ解析を行い、ＣＨＯ細胞内のＭＡＣ、およびそのＭＡＣに搭載されたＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＢＡＣを確認できるクローンとして、ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＭＡＣを取得した（図２、赤色、ＭＡＣ；緑、ＢＡＣ）。同様に、ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ−ｌｏｘＰ  ＢＡＣをＣｒｅ酵素によってＭＡＣへ導入して、ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＭＡＣクローンを取得した。なお、ＭＡＣとして、ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ搭載には、ＥＧＦＰレポーターのないものを使用した。一方、ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＢＡＣ搭載には、ＥＧＦＰレポーターがｌｏｘＰサイト上流に挿入されているＭＡＣを使用した。【００７１】
実施例４  ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒマウス人工染色体を導入したＥＳ細胞の作製：
実施例３で取得したＣＨＯ細胞内のＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＭＡＣを微小核融合法によってマウスＥＳ細胞（ＴＴ２Ｆ）へ導入した。表２のプライマーを用いて、ＤｓＲｅｄ、ＥＧＦＰ、ＣＹＰ３Ａ４やＣＹＰ３Ａ７の制御領域をｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲによって確認した。さらにＦＩＳＨ解析を行い、ＴＴ２Ｆ細胞内のＭＡＣ上にＢＡＣ  ＤＮＡが搭載されたことを確認した（図３−２）。このようにしてＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＥＳ細胞を得た。このＣＹＰ３Ａ４＋／７ＲＥＳ細胞クローンは、ＴＴ２Ｆの核型（３９，Ｘ０）に準じて、マウス雌の正常核型３９、Ｘ０、＋ＭＡＣを示した（図３−１）。また、このＥＳ細胞は、ＭＡＣ上のＥＧＦＰ発現により、緑に光った（図４）。実施例３で取得したＣＨＯ細胞内のＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＭＡＣを導入したマウスＡ９細胞の作製も、同様の方法によって行った。Ａ９細胞は、ＣＨＯ細胞よりも微小核細胞融合法に適したＭＡＣベクター供与細胞として提供できる。【００７２】
実施例５  ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ搭載人工染色体をもつＥＳ細胞から作製したマウスの取得：
（１）ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＥＳ細胞からのキメラマウスの作製：
実施例４で得たＣＹＰ３Ａ４＋／７ＲマウスＥＳ細胞を用いて高キメラ産仔を得た。一日目のキメラ個体のあらゆる組織、例えば、肝臓、皮膚、脳、肺、小腸、脾臓、膵臓などがＭＡＣベクターに搭載されているＥＧＦＰ蛍光を示し、ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＥＳ細胞の組織発生への寄与を確認できた。一方、ＣＹＰ３Ａ７発現を反映するＤｓＲｅｄ蛍光は、肝臓および小腸で強く観察された（図５、肝臓）。薬物代謝酵素誘導性の試験に適した肝臓細胞はＤｓＲｅｄ蛍光を指標として効率的に選択することができた。
（２）  ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＭＡＣ導入マウスの作製：
実施例５（１）で作製したキメラマウスを交配してＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＭＡＣ導入マウス系統を得た。このＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒマウスの生後１日目の肝臓でのＤｓＲｅｄ発現を確認した（図１７）。【００７３】
実施例６  細菌人工染色体を導入したＨｅｐａＲＧ細胞の作製：
（１）ｌｏｘＰ  ｔｇ−ＨｅｐａＲＧの作製：
ＨＰＲＴ  ｅｘｏｎ１−２、ｌｏｘＰおよび薬剤選択用マーカーとしてＨｙｇ耐性遺伝子を含むプラスミドベクター（ＶＨ２１−１２＃８−３）を制限酵素（ＮｏｔＩ）処理して直鎖化した。このベクターのＨｅｐａＲＧへの導入やハイグロマイシン（４００μｇ／ｍｌ）耐性クローンの取得は、ｌｏｘＰ  ｔｇ−ＨｅｐＧ２の作製と同様に行った。なお、ＨｅｐａＲＧを増殖培養する場合、培養液はＢＩＯＰＲＥＤＩＣ社の増殖専用培地（７２０  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ：  ＭＩＬ７００基本培地にＡＤＤ７２０添加剤を加えたもの）のみを用いた。また、継代時は、０．０２％ＥＤＴＡ添加０．００５％トリプシン溶液を用いて細胞を剥離した。ＢＩＯＰＲＥＤＩＣ社の培養液の組成は非公開になっている。【００７４】
（２）ｌｏｘＰ  ｔｇ−ＨｅｐａＲＧへのＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣの導入：
前述のＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ−ＢＡＣをＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムにより前述のｌｏｘＰ  ＴＧ−ＨｅｐａＲＧに挿入するため、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ試薬を用いてリポフェクションを行った。このベクターのＨｅｐａＲＧへの導入やネオマイシン（８００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８）耐性クローンの取得は、ｌｏｘＰ  ｔｇ−ＨｅｐＧ２の作製と同様に行った。ｌｏｘＰ  ｔｇ−ＨｅｐａＲＧにＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣが導入された細胞株であるＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞を取得した。安定発現株取得の確認は、ＢＡＣベクターのＥＧＦＰおよびＤｓＲｅｄ領域を増幅する表２のプライマーセットを用いたＰＣＲおよびＦＩＳＨ解析により確認した（図１０、ヒト１５番染色体短腕、または、ヒト１６番染色体短腕）。【００７５】
試験例１  薬物代謝酵素誘導性の試験（顕微鏡観察）：
実施例２で取得したＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐＧ２細胞でＥＧＦＰの発現量が高くＤｓＲｅｄの発現量が低い細胞を、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ（新田ゼラチン）でコートした６ウェル培養皿（φ３５ｍｍ）の各ウェルに５×１０５細胞を播種し、翌日から４８時間に、ＣＹＰ誘導剤として、５０μＭ、１００μＭのデキサメタゾン（ＤＥＸ）またはリファンピシン（ＲＩＦ）を添加した。その結果、ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐＧ２細胞は、ＣＹＰ誘導剤非添加では、ＤｓＲｅｄもＥＧＦＰも発現が低いが、ＣＹＰ誘導剤添加後には、ＤｓＲｅｄもＥＧＦＰも共に発現量が増加する様子が観察された（図６）。このように、薬物代謝酵素誘導能をもつデキサメタゾンとリファンピシンの添加によってレポーター遺伝子の発現が観察されたことから、本発明のベクターを用いれば、薬物代謝酵素誘導能を正確に評価できることが分かる。また、胎児期特異的遺伝子の発現制御領域下のＤｓＲｅｄの発現量が低い細胞は薬物代謝酵素誘導の正確な評価に適していることが分かる。【００７６】
試験例２  薬物代謝酵素誘導性の試験（ＦＡＣＳ解析）：
試験例１と同様の培養条件で、４８時間、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭのＤＥＸまたはＲＩＦを添加した場合に、ＤｓＲｅｄ陽性およびＥＧＦＰ陽性を判定される細胞数の増加をＦＡＣＳ解析によって試験した。実施例２で作製したＢＡＣ挿入前のトランスジェニック細胞株であるｌｏｘＰ  ｔｇ−ＨｅｐＧ２をネガティブコントロールとして用い、その値を１としたときの相対値として結果を図７に示す。ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐＧ２細胞でのＥＧＦＰ蛍光量の増加は、ＤＥＸ添加の場合には、非処理の２−３倍の増加であり、ＲＩＦ添加の場合には非処理の１６倍の増加であった。このとき、ＤｓＲｅｄも同様に１５倍程度に増加していた。このように、薬物代謝酵素誘導能をもつデキサメタゾンとリファンピシンの添加によってレポーター遺伝子の発現が観察されたことから、本発明のベクターを用いれば、薬物代謝酵素誘導能を正確に評価できることが分かる。また、第２のレポーター遺伝子であるＤｓＲｅｄは、リファンピシンやデキサメタゾンの投与量が多くて細胞毒性が強い条件下において飛躍的に発現が向上しており、細胞毒性のマーカーとして有用であることが分かる。【００７７】
試験例３  細胞障害時におけるＣＹＰ３Ａ７の発現：
ヒトＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ３Ａ７が移入されたヒト型ＣＹＰ３Ａモデルマウスを用いた７０％生体部分肝切除後の肝再生の方法、同じマウスを用いたＣＹＰ誘導剤投与による肝障害の方法、および肝障害モデルマウスへのヒト凍結肝臓細胞移植の方法によって、肝臓細胞の障害時におけるＣＹＰ３Ａ７の発現を調べた。部分肝切除後の肝再生の方法では、７０％の肝臓を紐で結紮して切除後飼育したマウスを作製し、１日目から５日目に順に解剖し肝臓を取得し遺伝子発現を調べた。ＣＹＰ誘導剤投与による肝障害の方法では、ＰＣＮ投与群とコーンオイル投与コントロール群のマウスから肝臓を取得し遺伝子発現を調べた。マウス生体内でのヒト凍結肝臓細胞移植の方法では、ＰｈｅｎｉｘＢｉｏ社からヒト化マウス肝臓の一部を入手し遺伝子発現を調べた。その結果、肝障害後の肝細胞の再生時に、ＣＹＰ３Ａ７の発現が一過的に増加したことが確認された。【００７８】
試験例４  薬物代謝酵素誘導性の試験（蛍光顕微鏡によるエリア総計光量解析）：
試験例１と同様の培養条件で、４８時間、１μＭ、１０μＭ、２５μＭ、１００μＭのＲＩＦを添加し、ＤｓＲｅｄ陽性およびＥＧＦＰのエリア総蛍光量を蛍光顕微鏡で測定した。実施例２で作製したＢＡＣ挿入前のトランスジェニック細胞株であるｌｏｘＰ  ｔｇ−ＨｅｐＧ２をネガティブコントロールとして用い、その値を１としたときの相対値を図８に示す。ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐＧ２細胞でのＥＧＦＰ蛍光量の増加は、非処理の３５倍まで増加した。このとき、ＤｓＲｅｄも同様に１０倍程度に増加していた。このように、薬物代謝酵素誘導能をもつリファンピシンの添加によってレポーター遺伝子の発現誘導が観察されたことから、本発明のベクターを用いれば、細胞培養状態で薬物代謝酵素誘導能を評価できることが分かる。このことは、本発明の細胞を用いることでハイスループットスクリーニング型の薬物代謝酵素誘導評価系を構築できることを示す。【００７９】
試験例５  薬物代謝酵素誘導性の試験（定量性ＲＴ−ＰＣＲによる発現解析）：
試験例１と同様の培養条件で、４８時間、１００μＭのＤＥＸとＲＩＦを添加した場合に、ＤｓＲｅｄおよびＥＧＦＰの蛍光量変化と内在性のＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ３Ａ７の遺伝子発現量変化に相関がみられるか定量性ＲＴ−ＰＣＲで解析した。非処理群をネガティブコントロールとして用い、その値を１としたときの相対値として結果を図９に示す。ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐＧ２細胞でのＥＧＦＰ蛍光量の増加は、Ｃ８７クローンでＤＥＸ処理により非処理の１００倍まで増加した。このとき、Ｃ６ではＥＧＦＰに加えＤｓＲｅｄも同様に増加がみられた。また、内在性のＣＹＰ３Ａ７遺伝子発現は、ＤｓＲｅｄの発現量変化に極めて類似していた。一方、内在性ＣＹＰ３Ａ４に比べＥＧＦＰの遺伝子発現増加率は高く、誘導率は一致せず高感度であるが、被検物質が発現誘導性を有する可能性を評価することが容易になることが分る。【００８０】
試験例６  ＨｅｐａＲＧ細胞の分化過程のＣＹＰ３Ａ４／７（免疫染色と定量性ＲＴ−ＰＣＲによる発現解析）：
実施例６で取得したＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞を２週間（２Ｗ）の増殖培養（Ｇｒｏｗｉｎｇ）後に分化培養（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）した。なお、ＨｅｐａＲＧを増殖培養する場合、培養液はＢＩＯＰＲＥＤＩＣ社の増殖専用培地（７１０  Ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ：  ＭＩＬ７００基本培地にＡＤＤ７１０添加剤を加えたもの）のみを用いた。一方、分化培養する場合、培養液はＢＩＯＰＲＥＤＩＣ社の分化専用培地（７２０  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ：  ＭＩＬ７００基本培地にＡＤＤ７２０添加剤を加えたもの）のみを用いた。ＨｅｐａＲＧは分化すると小型の肝細胞様細胞となり細胞集団上層に出現する。図１１は、この肝細胞様細胞集団はＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ７を共に認識する抗体に対して強陽性であり、いずれかの発現が高いことを示す。ＨｅｐａＲＧ細胞の培養過程での内在性ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ７の遺伝子発現変化を定量性ＲＴ−ＰＣＲにより解析したところ、増殖培養１４日目、分化培養後１、２、３、７、１５日目のＨｅｐａＲＧ細胞では、細胞分化に伴うＣＹＰ３Ａ７発現の減少とＣＹＰ３Ａ４の増加が見られた（図１２）。よって、図１１で示された細胞集団上層に出現する小型のＣＹＰ３Ａ４／７抗体陽性肝細胞様細胞は、ＣＹＰ３Ａ４を発現する薬物代謝酵素誘導性評価に適した細胞であることが分かる。【００８１】
試験例７  ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞の分化（蛍光顕微鏡による観察）：
実施例６で取得したＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞クローン（Ｃ３）をＣｅｌｌｍａｔｒｉｘでコートした９６ウェル培養皿に播種し、１４日間増殖培養後（Ｇ１４ｄ）、１４日間分化培養した。図１３は、分化後５日目（Ｄ５ｄ）と１０日目（Ｄ１０ｄ）のＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞のＤｓＲｅｄ陽性細胞数の減少とＥＧＦＰ陽性細胞量の増加を示している。ＨｅｐａＲＧ細胞は増殖期には胎児期型肝細胞のレポーターであるＤｓＲｅｄを発現していることから、増殖中は薬物代謝酵素誘導の評価に適さない胎児期型の細胞である。しかし、ＢＩＯＰＲＥＤＩＣ社の分化用培地にて培養すると、ＣＹＰ３Ａ４に代表される薬物代謝酵素を充分に発現する肝臓細胞になることをＥＧＦＰレポーターの発現量を指標として可視化できる。このことから、本発明を用いて薬物代謝酵素誘導性評価に適した細胞を選択できることが分かる。【００８２】
試験例８  ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞の細胞分化過程：
試験例７で用いたＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞クローン（Ｃ３）の１４日間増殖培養後５日間分化培養した細胞（Ｄ５ｄ）の蛍光顕微鏡写真を詳細に解析した。胎児肝臓の肝実質細胞は、肝芽細胞でありＣＹＰ３Ａ７を発現し、ＣＹＰ３Ａ４を発現していない。生後、ＣＹＰ３Ａ７が検出されなくなり、ＣＹＰ３Ａ４が主要なＰ４５０薬物代謝酵素となる。この過程で、１つの細胞がＣＹＰ３Ａ７からＣＹＰ３Ａ４へ発現シフトを起こすのか、ＣＹＰ３Ａ７を発現していない別の幹細胞からＣＹＰ３Ａ４を発現する細胞が作りだされるのか未だ明らかになっていない。図１４で示すように、ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞は、当初全ての細胞がＤｓＲｅｄ陽性であるが、分化に伴ってＤｓＲｅｄ発現が消失し、ＤｓＲｅｄ陰性の細胞の一部からＥＧＦＰ陽性の細胞が出現することが分かる。ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞を用いて、ＣＹＰ３Ａ４陽性の代謝機能が高い肝細胞の発生過程が明らかになれば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの他の幹細胞から薬物代謝酵素誘導性評価に適した細胞を作り出す細胞分化誘導法に転用できる。【００８３】
試験例９  ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞の分化（蛍光顕微鏡によるエリア総蛍光量解析）：
試験例７で用いたＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞クローン（Ｃ３）の増殖培養７日目（Ｇ７ｄ）と１４日目（Ｇ１４ｄ）、分化培養後１、３、５、７、１０、１２日目（Ｄ１ｄ、Ｄ３ｄ、Ｄ５ｄ、Ｄ７ｄ、Ｄ１０ｄ、Ｄ１２ｄ）のＥＧＦＰおよびＤｓＲｅｄのエリア総蛍光量の経日変化を蛍光顕微鏡で解析した結果を図１５に示した。同日９６ウェル培養皿に播種した６ウェルのエリア総蛍光量を解析した結果、ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞は、極めて安定に細胞分化に伴うＤｓＲｅｄ発現の減少とＥＧＦＰの増加を示した。【００８４】
試験例１０  ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞の誘導性評価（定量性ＲＴ−ＰＣＲによる解析）：
試験例７で用いたＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞クローン（Ｃ３）の増殖培養１４日後、１２日間分化培養した細胞に、１％ＤＭＳＯに溶解したＣＹＰ３Ａ４発現誘導性薬剤（ＲＩＦ：リファンピシン、ＤＥＸ：デキサメタゾン、ＣＬＯ：クロトリマゾール、ＮＩＦ：ニフェジピン、ＰＣＮ：ｐｒｅｇｎｅｎｏｌｏｎｅ  １６ａ−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）を添加し、４８時間後（分化１４日目に相当）のＥＧＦＰおよびＤｓＲｅｄのエリア総蛍光量を蛍光顕微鏡で解析した（図１６）。ＥＧＦＰは、ＰＣＮ以外で、発現が誘導された。ＰＣＮはげっ歯類のＣＹＰ誘導剤として知られ、ヒトではＣＹＰ３Ａ４を誘導しないことから、ＰＣＮによる非誘導性はヒトでの反応をＥＧＦＰで予測できていることを示す例となる。また、細胞障害度が高いＣＬＯ、ＮＩＦ、ＰＣＮでＤｓＲｅｄ蛍光量の増加がみられ、ＣＹＰ３Ａ７発現増加が細胞毒性評価の目安となることが分る。このように、薬物代謝酵素誘導能をもつデキサメタゾンとリファンピシンの添加によって約２倍のレポーター遺伝子の発現が観察されたことから、実施例２で作製したＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐＧ２と同様に、ＣＹＰ３Ａ４Ｇ／７Ｒ  ＢＡＣ導入ＨｅｐａＲＧ細胞を用いれば、薬物代謝酵素誘導能を正確に評価できることが分かる。【００８５】
試験例１１  ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＭＡＣ導入マウスでの肝障害試験（蛍光顕微鏡による観察）：
実施例５で作製したＣＹＰ３Ａ４＋／７ＭＡＣ導入マウスは、生後数週はＤｓＲｅｄを強発現しているが、８週令になると肝臓でのＤｓＲｅｄ発現は極めて減少している。このマウスに、ＤＭＳＯに溶解した５％四塩化炭素を投与し、細胞障害時におけるＣＹＰ３Ａ７の発現を３日間観察した。結果、抑制されていた肝臓のＤｓＲｅｄ蛍光量が増加することが蛍光顕微鏡で可視化できることが分かる（図１８）。ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＭＡＣ導入マウスでは、ＥＧＦＰは、細胞にＭＡＣが導入されていることを示すマーカーとして機能する。【００８６】
試験例１２  ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＭＡＣ導入マウスでの肝障害試験（定量性ＲＴ−ＰＣＲによる解析）：
試験例１１で用いた５％四塩化炭素投与ＣＹＰ３Ａ４＋／７Ｒ  ＭＡＣ導入マウスおよび非投与（ｄａｙ  ０）マウスの肝臓から抽出したＲＮＡを用いて、投与後１日目、２日目、３日目のＤｓＲｅｄ発現増加を定量性ＲＴ−ＰＣＲによって解析した（図１９）。ＣＹＰ３Ａ７−ＤｓＲｅｄは、幼弱な肝芽細胞のマーカーであるαフェトプロテイン（Ａｆｐ）とともに肝毒性後の肝再生マーカーとして利用できることが分る。【００８７】
なお、ＣＹＰ３Ａ４／７ＢＡＣ導入細胞の遺伝子発現確認のためのＲＴ−ＰＣＲ用プライマーを、以下の表３に示す。
【表３】
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［配列表］
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【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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