(57)【要約】  ２’位と３’位の炭素−炭素結合が開裂し、かつ、４’位に置換ヒドロキシメチル基を有する開環型ヌクレオシドを修飾核酸モノマー化合物として用いて、該修飾核酸モノマー化合物を構成ユニットの少なくとも一つとして含むオリゴ核酸類縁体を、例えばsiＲＮＡとして用いた場合に、生物学的安定性や、標的遺伝子発現抑制活性に優れたsiＲＮＡが得られ、そして、このようなオリゴ核酸類縁体は、アンチセンス法、リボザイム法、デコイ法などにも適用でき、更には、核酸アプタマーなどとしても使用でき、加えて、核酸プローブやモレキュラービーコンなどとして用いて遺伝子診断などにも適用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
2014069520.tif 000038
［式中、
Ｂは、置換されていてもよい複素環基を示し；
Ｔ１は、水酸基の保護基または水素原子を示し；
Ｔ２は、リン官能基、水酸基の保護基または水素原子を示し；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、−Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２））−、−Ｎ（Ｅ３）−または−Ｃ（＝ＮＥ３）−を示し；
Ｅ１およびＥ２は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、置換されてもよい水酸基、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；
Ｅ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基または置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基を示し；
Ｒ１は、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；
Ｒ２は、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基またはハロゲン原子を示し；
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基またはハロゲン原子を示す。］
で表される化合物またはその塩。
【請求項２】
下記式（ＩＩ）
【化２】
2014069520.tif 000039
［式中、
Ｂは、置換されていてもよい複素環基を示し；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、−Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２））−、−Ｎ（Ｅ３）−または−Ｃ（＝ＮＥ３）−を示し；
Ｅ１およびＥ２は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；
Ｅ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基または置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基を示し；
Ｒ１は、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；
Ｒ２は、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基またはハロゲン原子を示し；
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基またはハロゲン原子を示す。］
で表される部分構造を１以上含有するオリゴ核酸類縁体またはその塩（ただし、上記部分構造を２以上含有する場合は、当該部分構造間でＢ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ同一であっても、異なってもよい。）。
【請求項３】
下記式（ＩＩＩ）
【化３】
2014069520.tif 000040
［式中、
Ｂは、置換されていてもよい複素環基を示し；
Ｔ１は、水酸基の保護基または水素原子を示し；
Ｔ２は、リン官能基、水酸基の保護基または水素原子を示し；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、−Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２））−、−Ｎ（Ｅ３）−または−Ｃ（＝ＮＥ３）−を示し；
Ｅ１およびＥ２は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、置換されてもよい水酸基、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；
Ｅ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基または置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基を示し；
Ｒ１は、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；
Ｒ２は、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基またはハロゲン原子を示し；
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基またはハロゲン原子を示す。］
で表される化合物またはその塩。
【請求項４】
下記式（ＩＶ）
【化４】
2014069520.tif 000041
［式中、
Ｂは、置換されていてもよい複素環基を示し；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、−Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２））−、−Ｎ（Ｅ３）−または−Ｃ（＝ＮＥ３）−を示し；
Ｅ１およびＥ２は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；
Ｅ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基または置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基を示し；
Ｒ１は、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；
Ｒ２は、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基またはハロゲン原子を示し；
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基またはハロゲン原子を示す。］
で表される部分構造を１以上含有するオリゴ核酸類縁体またはその塩（ただし、上記部分構造を２以上含有する場合は、当該部分構造間でＢ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ同一であっても、異なってもよい。）。
【請求項５】
Ｂが、アデニン由来の基またはグアニン由来の基である、請求項１または３記載の化合物またはその塩。
【請求項６】
Ｒ１が、Ｃ１−６アルキル基である、請求項１または３記載の化合物またはその塩。
【請求項７】
Ｂが、アデニン由来の基またはグアニン由来の基である、請求項２または４記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩。
【請求項８】
Ｒ１が、Ｃ１−６アルキル基である、請求項２または４記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、開環型修飾核酸モノマー化合物および該モノマー化合物を含むオリゴ核酸類縁体に関する。更に詳細には、本発明は、ヌクレオシドの２’位と３’位の炭素−炭素結合が開裂し、かつ、４’位に置換ヒドロキシメチル基を有する開環型修飾核酸モノマー化合物および該モノマー化合物を構成ユニットの少なくとも一つとして含むオリゴ核酸類縁体に関する。
[発明の背景]【０００２】
本明細書中で示される核酸モノマー糖部の原子付番に関しては、天然型のリボヌクレオシド (アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジンなど)を基準にして慣用的に用いられる原子付番に従うものとする（下記化学構造式参照)。また、天然型核酸塩基の原子付番に関しても、ピリミジン塩基（チミン、ウラシル、シトシン）およびプリン塩基(アデニン、グアニン、ヒポキサンチン)それぞれ、慣用的に用いられる原子付番にしたがうものとする(下記化学構造式参照)。また、これら由来の置換体に関しても同様であるが、これらを由来としない複素環に関しては、一般的に用いられている原子付番に従う。
【化１】
2014069520.tif 000002
【０００３】
ゲノム創薬や遺伝子診断、遺伝子治療などの最先端バイオ関連研究の急速な進歩、発展に伴い、近年、ＤＮＡやＲＮＡなどの各種のオリゴ核酸の治療、診断等への利用が益々高まっている。
オリゴ核酸の治療への利用としては、疾患に関連する標的遺伝子発現の阻害や標的タンパク質の機能を阻害するものがある。例えば、標的ｍＲＮＡに対して相補性の一本鎖ＤＮＡやＲＮＡをワトソン−クリック型の水素結合により二本鎖ＤＮＡ/ｍＲＮＡやＲＮＡ/ｍＲＮＡを形成させてｍＲＮＡから標的タンパク質への翻訳過程を阻害するアンチセンス法、標的遺伝子の本体である二本鎖ＤＮＡに対して人工核酸を用いて三本鎖を形成させて標的遺伝子発現を転写レベルで抑制するアンチジーン法、染色体上の特定の二本鎖ＤＮＡの配列を認識して遺伝子の発現を調節するタンパク質である転写因子に対して、転写因子が認識する遺伝子と共通の配列を有する二本鎖ＤＮＡをデザインしてそれを細胞内に投与することにより、転写因子の標的遺伝子への結合を阻害して転写を抑制するデコイ法、核酸の三次元構造に基づいて、標的タンパク質分子に特異的に結合してタンパク質の機能を阻害する核酸アプタマー、ＲＮＡやＤＮＡの核酸酵素によるｍＲＮＡの加水分解により標的タンパク質への翻訳を阻害するリボザイム法などが治療法として期待されている。
オリゴ核酸の診断への利用としては、疾患に関連した標的遺伝子に特異的に結合する配列を有する人工核酸を構築してプローブとして用いて病気を診断する方法などがあり、また、ステム・ループ構造を持ち、蛍光物質と蛍光発色阻害物質（クエンチャー）をその構造内に含み、標的ＲＮＡに結合した時に蛍光発色するモレキュラービーコンをＤＮＡプローブとして用いる方法もある。【０００４】
元来ＲＮＡ干渉（RNA interference: RNAi）という現象は、機能阻害したい標的遺伝子の特定領域と相同な１００塩基対程度の二本鎖ＲＮＡを細胞内へ導入させることにより、細胞質内でＤｉｃｅｒの働きにより２０から２５塩基対程度の二本鎖ＲＮＡへと分解され、その後複数のタンパク質とＲＮＡ/タンパク質複合体（RISC:RNA-induced silencing complex）を形成し、標的遺伝子から産出されたｍＲＮＡの相同部位と結合し強力に標的遺伝子発現を抑制するというものである（非特許文献１）。最近、人工的に合成された２０〜２４塩基の短い二本鎖ＲＮＡ（small interfering RNA: siRNA）を用いても同様の現象が起こることが明らかになり、ｓiＲＮＡを用いた標的遺伝子発現抑制法として、有用な研究手法のみならず、医薬用途の応用にも注目されている。このＲＮＡi法では、例えば、アンチセンス法と比較して、極めて低濃度で遺伝子発現抑制の効果があるとされており、これまで治癒が困難と考えられてきた各種のウイルスを原因とする疾患および遺伝子疾患に対する有力な治療方法として期待されている。【０００５】
上記したアンチセンス法、ＲＮＡi法において天然型のＤＮＡオリゴマーやＲＮＡオリゴマーを用いる場合には、血中の各種のヌクレアーゼによる加水分解を速やかに受け、生物学的に極めて不安定であるという問題がある。このような問題を解決するために、核酸内のリン酸結合部位をメチルホスホネート結合とする修飾核酸、リン酸結合部位をホスホロチオエート結合とする修飾核酸などがよく知られている。
また、２’位と３’位の炭素−炭素結合が開裂した開環型修飾核酸として、下記式
【化２】
2014069520.tif 000003
[式中、Ｂは核酸の塩基を表わす]
で示されるＵＮＡ（unlocked nucleic acid: 2',3'-seco-RNA）モノマーを、siＲＮＡに導入することにより、ｓｉＲＮＡの血中安定性が増し、標的遺伝子分解活性が亢進されて、オフ−ターゲッテング（off-targeting）効果を抑制しうることが報告されている（非特許文献２）。また、特許文献１には、下記式
【化３】
2014069520.tif 000004
[式中、Ｚは、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ３、Ｃ２−２２アルキル鎖を表わす]
で示されるＵＮＡモノマーをsiＲＮＡに導入することが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１１/１３９７１０号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Fire et al., Nature, 391, 806-811 (1998)
【非特許文献２】Pasternak et al., Org. Biomol. Chem., 9, 3591-3597, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
今までに、生物学的安定性を改善し、標的遺伝子発現抑制活性を増強させるために、多くの修飾核酸が提案されている。しかしながら、十分に満足し得るものは未だに見出されていないのが現状である。
したがって、本発明の課題は、生物学的安定性（例えば、血中安定性）や、標的遺伝子発現抑制活性に優れたオリゴ核酸類縁体を得ることを可能にする開環型修飾核酸モノマー化合物および該モノマー化合物を構成ユニットとして含むオリゴ核酸類縁体を提供することに在る。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このような課題を解決するために本発明者らは鋭意研究した結果、２’位と３’位の炭素−炭素結合が開裂し、かつ、４’位に置換ヒドロキシメチル基を有する開環型ヌクレオシドを修飾核酸モノマー化合物として用いて、該修飾核酸モノマー化合物を構成ユニットの少なくとも一つとして含むオリゴ核酸類縁体を、例えばsiＲＮＡとして用いた場合に、生物学的安定性を改善され、標的遺伝子発現抑制活性が増強したsiＲＮＡが得られ、そして、このようなオリゴ核酸類縁体は、アンチセンス法、リボザイム法、デコイ法などに適用でき得ること、更には、核酸アプタマーなどとしても使用出来得ること、加えて、核酸プローブやモレキュラービーコンなどとして用いて遺伝子診断などにも適用出来得ることを見出し、本発明を完成させたものである。【００１０】
したがって、本発明は、
［１］．下記式（Ｉ）
【化４】
2014069520.tif 000005
［式中、
Ｂは、置換されていてもよい複素環基を示し；
Ｔ１は、水酸基の保護基または水素原子を示し；
Ｔ２は、リン官能基、水酸基の保護基または水素原子を示し；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、−Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２））−、−Ｎ（Ｅ３）−または−Ｃ（＝ＮＥ３）−を示し；
Ｅ１およびＥ２は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、置換されてもよい水酸基、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；
Ｅ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基または置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基を示し；
Ｒ１は、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；
Ｒ２は、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基またはハロゲン原子を示し；
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基またはハロゲン原子を示す。］
で表される化合物またはその塩；
［２］．下記式（ＩＩ）
【化５】
2014069520.tif 000006
［式中、
Ｂは、置換されていてもよい複素環基を示し；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、−Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２））−、−Ｎ（Ｅ３）−または−Ｃ（＝ＮＥ３）−を示し；
Ｅ１およびＥ２は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；
Ｅ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基または置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基を示し；
Ｒ１は、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；
Ｒ２は、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基またはハロゲン原子を示し；
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基またはハロゲン原子を示す。］
で表される部分構造を１以上含有するオリゴ核酸類縁体またはその塩（ただし、上記部分構造を２以上含有する場合は、当該部分構造間でＢ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ同一であっても、異なってもよい。）；
［３］．下記式（ＩＩＩ）
【化６】
2014069520.tif 000007
［式中、
Ｂは、置換されていてもよい複素環基を示し；
Ｔ１は、水酸基の保護基または水素原子を示し；
Ｔ２は、リン官能基、水酸基の保護基または水素原子を示し；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、−Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２））−、−Ｎ（Ｅ３）−または−Ｃ（＝ＮＥ３）−を示し；
Ｅ１およびＥ２は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、置換されてもよい水酸基、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；
Ｅ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基または置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基を示し；
Ｒ１は、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；
Ｒ２は、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基またはハロゲン原子を示し；
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基またはハロゲン原子を示す。］
で表される化合物またはその塩；
［４］．下記式（ＩＶ）
【化７】
2014069520.tif 000008
［式中、
Ｂは、置換されていてもよい複素環基を示し；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、−Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２））−、−Ｎ（Ｅ３）−または−Ｃ（＝ＮＥ３）−を示し；
Ｅ１およびＥ２は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；
Ｅ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基または置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基を示し；
Ｒ１は、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；
Ｒ２は、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基またはハロゲン原子を示し；
Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基またはハロゲン原子を示す。］
で表される部分構造を１以上含有するオリゴ核酸類縁体またはその塩（ただし、上記部分構造を２以上含有する場合は、当該部分構造間でＢ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ同一であっても、異なってもよい。）
［５］．Ｂが、アデニン由来の基またはグアニン由来の基である、上記[１]または[３]記載の化合物またはその塩；
［６］．Ｒ１が、Ｃ１−６アルキル基である、上記[１]または[３]記載の化合物またはその塩；
［７］．Ｂが、アデニン由来の基またはグアニン由来の基である、上記[２]または[４]記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩；および
［８］．Ｒ１が、Ｃ１−６アルキル基である、上記[２]または[４]記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩
に関するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の開環型修飾核酸モノマー化合物を少なくとも構成ユニットの一つとして含むオリゴ核酸類縁体を、例えばsiＲＮＡとして用いた場合には、生物学的安定性（例えば、血中安定性）や、標的遺伝子発現抑制活性に優れたsiＲＮＡが得られる。また、このようなオリゴ核酸類縁体は、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、デコイ核酸、核酸アプタマー、リボザイムなどとしても使用出来るものである。更には、ＲＮＡプローブ、ＤＮＡプローブ、モレキュラービーコンなどの遺伝子解析ツールとしても利用出来得るものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本明細書において記載する用語等の意義を説明し、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本明細書において、ハロゲン原子は、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を示す。
Ｃ１−６アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、１−メチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、１−メチル−２−エチルプロピル、１−エチル−２−メチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２−エチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチルを示す。なかでもメチルが好ましい。
【００１４】
Ｃ２−６アルケニル基は、例えば、ビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテン−１−イル、１−ブテン−２−イル、１−ブテン−３−イル、２−ブテン−１−イル、２−ブテン−２−イルを示す。
Ｃ２−６アルキニル基は、例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニルを示す。
Ｃ１−６アルコキシ基は、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、イソペントキシ、ｓｅｃ−ペントキシ、ｔ−ペントキシ、ｎ−ヘキソキシ、イソヘキソキシ、１，２−ジメチルプロポキシ、２−エチルプロポキシ、１−メチル−２−エチルプロポキシ、１−エチル−２−メチルプロポキシ、１，１，２−トリメチルプロポキシ、１−ジメチルブトキシ、２，２−ジメチルブトキシ、２−エチルブトキシ、１，３−ジメチルブトキシ、２−メチルペントキシ、３−メチルペントキシ、ヘキシルオキシを示す。
【００１５】
Ｃ１−６アルキルチオ基は、例えば、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、イソブチルチオ、ｔ−ブチルチオ、ｎ−ペンチルチオ、イソペンチルチオ、ネオペンチルチオ、ｎ−ヘキシルチオ、１−メチルプロピルチオを示す。
Ｃ１−６アルキルスルホニル基は、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ−プロピルスルホニル、イソプロピルスルホニル、ｎ−ブチルスルホニル、イソブチルスルホニル、ｔ−ブチルスルホニル、ｎ−ペンチルスルホニル、イソペンチルスルホニル、ネオペンチルスルホニル、ｎ−ヘキシルスルホニル、１−メチルプロピルスルホニルを示す。
【００１６】
Ｃ１−６アルキル−カルボニル基は、アセチル、プロピオニル、ブチリルを示す。
Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル基は、例えば、フェニルオキシカルボニル、ナフチルオキシカルボニル、アンスリルオキシカルボニルを示す。
Ｃ６−１４アリール−カルボニル基は、例えば、ベンゾイル、ナフトイルを示す。なかでもベンゾイルが好ましい。
Ｃ６−１４アリールスルホニル基は、例えば、ベンゼンスルホニル、ナフチルスルホニルを示す。
【００１７】
モノＣ１−６アルキルアミノ基は、例えば、モノメチルアミノ、モノエチルアミノ、モノｎ−プロピルアミノ、モノイソプロピルアミノ、モノｎ−ブチルアミノ、モノイソブチルアミノ、モノｔ−ブチルアミノ、モノｎ−ペンチルアミノ、モノイソペンチルアミノ、モノネオペンチルアミノを示す。
ジＣ１−６アルキルアミノ基は、例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジｎ−プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジｎ−ブチルアミノ、ジイソブチルアミノ、ジｔ−ブチルアミノ、ジｎ−ペンチルアミノ、ジイソペンチルアミノ、ジネオペンチルアミノを示す。
【００１８】
本明細書中においては、化合物の化学構造式が異性体を表すことがあるが、本発明には化合物の構造上生ずる総ての幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体等の異性体及び異性体混合物を含み、化学構造式の記載に限定されるものではなく、いずれか一方の異性体でも混合物でもよい。したがって、分子内に不斉炭素原子を有し光学活性体およびラセミ体が存在することがあり得るが、本発明においてはそれらに限定されず、いずれもが含まれる。
【００１９】
以下、本発明の開環型修飾核酸モノマー化合物およびそれを少なくとも構成ユニットの一として含むオリゴ核酸類縁体について詳細に説明する。
【００２０】
１．開環型修飾核酸モノマー化合物
本発明の開環型修飾核酸モノマー化合物は、下記式（Ｉ）または下記式（ＩＩＩ）
【化８】
2014069520.tif 000009
で表わされる。式（Ｉ）の開環型修飾核酸モノマー化合物は、その３’位の−Ｏ−Ｔ２と５’位の−Ｏ−Ｔ１とが、オリゴ核酸類縁体を構成するヌクレオチドとの結合に関与して、３’位と５’位結合型のオリゴ核酸誘導体を製造するのに用いることができ、式（ＩＩＩ）の開環型修飾核酸モノマー化合物は、その２’位の−Ｏ−Ｔ２と５’位の−Ｏ−Ｔ１とが、オリゴ核酸類縁体を構成するヌクレオチドとの結合に関与して、２’位と５’位結合型のオリゴ核酸誘導体を製造するのに用いることができる。式（Ｉ）の開環型修飾核酸モノマー化合物および式（ＩＩＩ）の開環型修飾核酸モノマー化合物は、いずれも、２’位と３’位の炭素−炭素結合が開裂し、かつ、４’位に置換ヒドロキシメチル基を有するという共通の特徴を有する。
【００２１】
式（Ｉ）および（ＩＩＩ）において、Ｂは置換されていてもよい複素環基を示す。上記置換されていてもよい複素環基における複素環基には、（１）天然型のヌクレオシドの塩基(例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシル)（本明細書中、「天然型塩基」と称することがある）、（２）天然型塩基とは別異の塩基および（３）その他の複素環基が含まれる。
【００２２】
上記（２）天然型塩基とは別異の塩基としては、例えば、（i）ネブラリン、イソグアノシン、イソシチジンおよびツベルシジンのそれぞれに付加している塩基や（ii）天然型塩基と同一の構造を有するが、糖との結合（置換）位置が異なる塩基（例、シュードウリジン）が挙げられる。
上記（３）その他の複素環基としては、例えば、ピペリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、フリル、チエニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾフリル、ベンゾピラニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、インドリニル、イソインドリニル、クロマニル、イソクロマニル、１，３−ジオキサインダニル、１，４−ジオキサテトラリニルなどのＣ５−１０複素環基や、化学的に合成された核酸塩基が挙げられる。化学的に合成された核酸塩基としては、広義にユニバーサル塩基と総称されるものでもよい。これらの核酸塩基については、Loakes, Nucleic Acids Research, Vol.29, pp.2437-2447, 2001；Englisch and Gauss, Angew. Chem. Int. Ed., Vol. 30, pp. 613-722, 1991などの文献を参照することができる。
【００２３】
前記置換されていてもよい複素環基の置換基としては、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ６−１４アリールスルホニル基、アミノ基、モノＣ１−６アルキルアミノ基、ジＣ１−６アルキルアミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、シアノ基、カルボキシ基から選ばれる１ないし３個の置換基が挙げられる。これらの置換基のうち、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ６−１４アリールスルホニル基などは、更に、ハロゲン原子、アミノ基、モノＣ１−６アルキルアミノ基、ジＣ１−６アルキルアミノ基から選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよい。
【００２４】
前記複素環基が置換されていてもよい置換基は保護基であってもよく、前記した置換基自体が保護基として機能し得るものであれば、それらは保護基として使用してもよい。上記保護基の例として、アミノ基の保護基、ヒドロキシ基の保護基、カルボキシ基の保護基が挙げられる。
アミノ基の保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、アリルオキシカルボニルなどのカーバメート系保護基；アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、フルオロアセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、２−ニトロベンゾイルなどのアシル系保護基；フタロイルなどのイミド系保護基；トシル、２−ニトロベンゼンスルホニルなどのスルホニル系保護基；４−メトキシフェニルなどのフェニル系保護基；ベンジル、４−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジルなどのベンジル系保護基等が挙げられる。
ヒドロキシ基の保護基としては、後述するＴ１の水酸基の保護基と同様の保護基を挙げることができる。
カルボキシ基の保護基としては、メチルエステル、エチルエステル、ｔ−ブチルエステル、ベンジルエステルなどのエステル系保護基等を挙げることができる。
【００２５】
式（Ｉ）および（ＩＩＩ）における、置換されていてもよい複素環基であるＢとしては、具体的には、例えば、アデニン、２−フロロアデニン、２−メチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−アミノアデニン、２−アミノメチルアデニン、２−アミノプロピルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ６−プロピルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザアデニン、８−アザ−７−デアザアデニン、８−ビニルアデニン、８−メチルアデニン、８−エチニルアデニン、８−フェニルアデニン、８−アミノアデニン、８−フロロアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、８−メトキシアデニン、８−メチルチオアデニン、８−メルカプトアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニンなどのアデニン由来の基；グアニン、２−メチルグアニン、２−プロピルグアニン、Ｏ６−メチルグアニン、Ｏ６−エチルグアニン、７−メチルグアニン、７−エチルグアニン、７−デアザグアニン、８−メチルグアニン、８−ビニルグアニン、８−エチニルグアニン、８−フェニルグアニン、８−アミノグアニン、８−フロログアニン、８−ヒドロキシルグアニン、８−メトキシグアニン、８−メチルチオグアニン、８−メルカプトグアニン、Ｎ２−メチルグアニンなどのグアニン由来の基；シトシン、２−チオシトシン、３−デアザ−５−アザシトシン、３−メチルシトシン、３−エチルシトシン、５−メチルシトシン、５−ビニルシトシン、５−エチニルシトシン、５−フロロシトシン、５−メチルシトシン、５−プロペニルシトシン、５−エチニルシトシン、５−トリフルオロメチルシトシン、６−アザシトシン、Ｎ４−アセチルシトシンなどのシトシン由来の基；ウラシル、３−（３−アミノ−カルボキシプロピル）ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチル−４−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−４−チオウラシル、５−メチル−２，４−ジチオウラシル、５−メチルアミノメチル−２，４−ジチオウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−グアニジノアルキルウラシル、５−（１，３−ジアゾ−１−イル−アルキル）ウラシル、５−シアノメチルウラシル、５−ジメチルアミノエチルウラシル、５−ジメチルアミノエチルウラシル、５−フロロウラシル、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルウラシル、５−エチニルウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、６−アザウラシル、５，６−ジヒドロウラシル、Ｎ３−メチルウラシル、ウラシル−５−イル（シュードウラシル）、２−チオシュードウラシル、４−チオシュードウラシル、２，４−ジチオシュードウラシル、１−メチルシュードウラシル、１−メチルシュードウラシル、１−メチル−２−チオシュードウラシル、１−メチル−４−チオシュードウラシル、１−メチル−２，４−ジチオシュードウラシル、１−エチル−２−チオシュードウラシル、１−エチル−４−チオシュードウラシル、１−エチル−２，４−ジチオシュードウラシル、１−アミノカルボニルエチレニル−２−チオシュードウラシル、１−アミノカルボニルエチレニル−４−チオシュードウラシル、１−アミノカルボニルエチレニル−２，４−ジチオシュードウラシルなどのウラシル由来の基；１，３−ジアザ−２−オキソフェノキサジン−１−イル、１−アザ−２−チオ−３−アザフェノキサジン−１−イル、７−アミノメチルヒドロキシ−１，３−ジアザ−２−チオ−フェノキサジン−１−イル、７−アミノメチルヒドロキシ−１，３−ジアザ−２−オキソフェノキサジン−１−イル、７−グアニジウムメチルヒドロキシ−１，３−ジアザ−２−オキソフェノキサジン−１−イル、７−グアニジウムメチルヒドロキシ−１，３−ジアザ−２−チオフェノキサジン−１−イルなどのフェノキサジン由来の基；１，３−ジアザ−２−オキソフェネチアジン−１−イル、１−アザー２−チオ−３−アザフェネチアジン−１−イル、７−アミノアルキルヒドロキシ−１，３−ジアザ−２−チオフェネチアジンなどのフェネチアジン由来の基；１，３，５−トリアザ−２，６−ジオキサナフタレンなどのナフタレン由来の基；キサンチン、ヒポキサンチンなどのキサンチン由来の基；イノシニル、２−アザイノシニル、７−デアザイノシニルなどのイノシニル類；ニトロイミダゾリル、ニトロベンズイミダゾリルなどのイミダゾリル由来の基；ニトロピラゾリルニトロインダゾリルなどのインダゾリル由来の基；アミノインドリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、４，６−ジメチルインドリルなどのインドリル由来の基；ピロロピリミジニル、９−メチル−イミジゾピリミジルなどのピリミジニル由来の基；ピロロピリジニルなどのピリジニル由来の基；３−メチルイソカルボスチリル、５−メチルイソカルボスチリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリル、イソカルボスチリル、７−プロピニルイソカルボスチリル、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、などのカルボスチリル由来の基；イミジゾピリジニルピロロピリジニルなどのピリジニル由来の基；プロピニル−７−アザインドリル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、プロピニル−７−アザインドリルなどのインドリル類；４−フルオロ−６−メチルベンズイミダゾリル、４−メチルベンズイミダゾリルなどのイミダゾリル由来の基；６−アゾチミンなどのチミン由来の基；２−ピリジノンなどのピリジノン由来の基；５−ニトロインドールなどのインドール由来の基；３−ニトロピロールなどのピロール由来の基；６−アザピリミジン、ピロロピリミジン−２−オン−３−イル、６−フェニル−ピロロピリミジン−２−オン−３−イル、ｐ−フロロ−６−フェニル−ピロロピリミジン−２−オン−３−イル、ｏ−フロロ−６−フェニル−ピロロピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−ｏ−フロロ−６−フェニル−ピロロピリミジン−２−オン−３−イル、ｐ−アミノアルキルヒドロキシ−６−フェニルーピロロピリミジン−２−オン−３−イル、ｏ−アミノアルキルヒドロキシ−６−フェニルーピロロピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−ｏ−ジ−アミノアルキルヒドロキシ−６−フェニルーピロロピリミジン−２−オン−３−イル、ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−７−アミノピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−ピリドピリミジン−３−イルなどのピリミジン由来の基；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリンなどのプリン由来の基が挙げられる。
式（Ｉ）および（ＩＩＩ）における、置換されていてもよい複素環基であるＢとしては天然型のヌクレオシドの塩基が好ましく、ウラシルがさらに好ましい。他の好ましい態様では、Ｂとしてはアデニン由来の基またはグアニン由来の基が好ましく、なかでもアデニン由来の基が好ましい。
【００２６】
式（Ｉ）および（ＩＩＩ）において、Ｔ１は、水酸基の保護基または水素原子を示す。水酸基の保護基としては、核酸の水酸基の保護基として通常使用されているものであればいずれの保護基も使用し得る。このような保護基としては、例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、イソプロピルジメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）、（トリフェニルメチル）ジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、メチルジイソプロピルシリル、メチルジ−ｔ−ブチルシリル、トリベンジルシリル、トリ−ｐ−キシリルシリル、トリイソプロピルシリル、トリフェニルシリルなどのシリル型保護基；トリチル、４−モノメトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、トリメトキシトリチルなどのトリチル型保護基；テトラヒドロピラニル、３−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニルなどの複素環型保護基；ベンジル、４−メトキシベンジル、２−ニトロベンジル、４−ニトロベンジル、４−シアノベンジルなどのベンジル型保護基；アセチル、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、フェノキシアセチル、ブチリル、プロピオニル、ピバロイル、レブリニル、ペンタノイル、バレリル、オクタノイルなど脂肪族アシル型保護基；ベンゾイル、２−フルオロベンゾイル、４−フェニルベンゾイル、２，６−ジクロロベンゾイル、２−トルオイル、４−メトキシベンゾイル、２，４，６−トリメチルベンゾイルなどの芳香族アシル型保護基；ブチル、ｔ−ブトキシメチル、メトキシメチル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、２−トリメチルシリルエチル、２−（シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）、シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）、２−ナフチルメチル、ジフェニルメチル、４−クロロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、などのエーテル型保護基；ジメチルカルバモイル、ジフェニルカルバモイルなどのカルバモイル型保護基；メシル、トシル、トリフルオロメタンスルホニルなどのスルホニル型保護基；９−フルオレニルメトキシカルボニルなどのアルコキシカルボニル型保護基；９−フェニルキサンチン−９−イル（ピキシル）、９−（４−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）などのキサンチン型保護基が挙げられる。
【００２７】
これらの水酸基の保護基については、Beaucage et al., Tetrahedron, Vol.48, pp.2223-2311, 1992; Greene and Wuts、Protecting Groups in Organic Synthesis, Chapter 2, 2nd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1991; Ekstein et al., Oligonucleotides And Analogures A Practical Approach, IRL Press, N.Y., 1991 などの文献を参照することができる。
式（Ｉ）および（ＩＩＩ）におけるＴ１としては水酸基の保護基が好ましく、ＤＭＴｒがさらに好ましい。
【００２８】
式（Ｉ）および（ＩＩＩ）において、Ｔ２は、リン官能基、水酸基の保護基または水素原子を示す。ここで、水酸基の保護基としては、前記したＴ１の水酸基の保護基を同様に挙げることができる。
リン官能基としては、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の開環型修飾核酸モノマー化合物を用いて、式（ＩＩ）または（ＩＶ）のオリゴ核酸類縁体を、核酸合成法として知られているトリエステル法、ホスホロアミダイト法、ジクロロホスフィン誘導体を用いる方法、Ｈ−ホスホネート法などにより製造する際のリン酸反応性基であるリン官能基を挙げることができる。
【００２９】
トリエステル法により製造する際のリン酸反応性基であるリン官能基としては、下記式（ａ）
【化９】
2014069520.tif 000010
[式中、Ｙ１はリン酸の保護基、Ｚ１は水素原子またはリン酸の保護基を示す]
で表されるリン官能基が挙げられる。Ｙ１のリン酸の保護基とＺ１のリン酸の保護基とは異なっているのが、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の開環型修飾核酸モノマー化合物を用いて式（ＩＩ）または（ＩＶ）のオリゴ核酸類縁体を合成する上で好ましい。ここで、リン酸の保護基としては、２−シアノエチル、２−（フェニルスルホニル）エチル、２−（４−ニトロフェニル）エチル、２，２，２−トリクロロエチル（ＴＣＥ）、２，２，２−トリブロモエチル、２，２，２−トリクロロー１，１−ジメチルエチルなどのβ脱離により除去できる保護基；２−トリメチルシリルエチル（ＴＭＳＥ）、２−（ジフェニルメチルシリル）エチル（ＤＰＳＥ）などのフッ化物イオン（フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）など）で除去できる保護基；４−［Ｎ−メチル−Ｎ−（トリフルオロアセチル）アミノ］ブチル（ＴＦＡＢ）、２−［（１−ナフチル）アルバモイルオキシ］エチル（ＮＣＥ）、４−オキソペンチルなどの環化反応により除去できる保護基；メチル、２，４−ジニトロベンジルなどの炭素原子上での求核置換反応により除去できる保護基；ベンジルなどの加水素化分解により除去できる保護基；アリルなどのパラジウム触媒による置換反応で除去できる保護基；フェニル、２−クロロフェニル、８−クロロキノリル、フェニルチオなどのオキシマートイオンによる除去できる保護基が挙げられる。
【００３０】
ホスホロアミダイト法により製造する際のリン酸反応性基であるリン官能基としては、下記式（ｂ）
【化１０】
2014069520.tif 000011
[式中、Ｙ２はリン酸の保護基を示し、Ｚ２およびＺ３は、同一または異なってＣ１−６アルキル基を示すか、またはＺ２およびＺ３が一緒になって、それらが結合する窒素原子と共に、更に複素原子を含んでいてもよい５ないし７員含窒素複素環を形成する。]
で表されるリン官能基が挙げられる。Ｙ２のリン酸の保護基としては、上記した
式（a）のＹ１およびＺ１のリン酸の保護基と同様のものを挙げることができる。なかでも、メチル、２−シアノエチル、２−トリメチルシリルエチルなどのホスホロアミダイト法で汎用されるリン酸の保護基が好ましく、２−シアノエチルが特に好ましい。式（ｂ）の−NＺ２Ｚ３としては、例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジｎ−プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジｎ−ブチルアミノ、ジイソブチルアミノ、ジｔ−ブチルアミノ、ジｎ−ペンチルアミノ、ジイソペンチルアミノ、ジネオペンチルアミノなどを挙げることができる。Ｚ２およびＺ３が一緒になって、それらが結合する窒素原子と共に形成する、更に複素原子を含んでいてもよい５ないし７員含窒素複素環としては、モルホリン−１−イル、ピペリジン−１−イルなどを挙げることができる。ここで、複素原子としては、窒素原子、酸素原子、硫黄原子などが挙げられる。これらのなかでも、ジイソプロピルアミノ、ジメチルアミノなどのホスホロアミダイト法で汎用されるものが好ましく、ジイソプロピルアミノが特に好ましい。
【００３１】
ジクロロホスフィン誘導体を用いる方法により製造する際のリン酸反応性基であるリン官能基としては、下記式（ｃ）
【化１１】
2014069520.tif 000012
[式中、Ｙ３は置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、置換されていてもよい
Ｃ６−１２アリールオキシ基またはアリルオキシ基を示し、Ｚ４はハロゲン原子を示す。]
で表されるリン官能基が挙げられる。ここで、置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基としては、例えば、メトキシ、トリクロロメトキシ、２，２，２−トリクロロ−１，１−ジメチルエチルオキシなどのハロゲン原子で置換されたＣ１−６アルコキシ基を挙げることができる。置換されていてもよいＣ６−１２アリールオキシ基としては、例えば、２−クロロフェニルオキシなどのハロゲン原子で置換されたＣ６−１２アリールオキシ基を挙げることができる。Ｚ４のハロゲン原子の好ましい例としては、塩素原子が挙げられる。
【００３２】
Ｈ−ホスホネート法により製造する際のリン酸反応性基であるリン官能基としては、下記式（ｄ）
【化１２】
2014069520.tif 000013
[式中、Ｚ＋はカチオンを示す]
で表されるリン官能基が挙げられる。Ｚ＋のカチオンとしては、例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、イソブチルアミノなどのモノＣ１−６アルキルアンモニウムイオン；ジメチルアンモニウムイオン、ジエチルアンモニウムイオン、ジイソブチルアンモニウムイオンなどのジＣ１−６アルキルアンモニウムイオン；カリウムイオン、リチウムイオンなどの金属イオンを挙げることができる。
式（Ｉ）および（ＩＩＩ）におけるＴ２としては、ホスホロアミダイト法により製造する際のリン酸反応性基が好ましく、ホスホロアミダイト基（式（ｂ）におけるＹ２が２−シアノエチルであり、かつ、式（ｂ）の−NＺ２Ｚ３がジイソプロピルアミノである基）がさらに好ましい。
【００３３】
式（Ｉ）および（ＩＩＩ）において、Ｘは、酸素原子、硫黄原子、−Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２））−、−Ｎ（Ｅ３）−または−Ｃ（＝ＮＥ３）−を示し；Ｅ１およびＥ２は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、置換されてもよい水酸基、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；Ｅ３は、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基または置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基を示す。
【００３４】
ここで、Ｅ１およびＥ２の置換されていてもよい水酸基の置換基としては、例えば、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ６−１４アリールスルホニル基が挙げられる。これらの置換基は、更に、ハロゲン原子、アミノ基、モノＣ１−６アルキルアミノ基、ジＣ１−６アルキルアミノ基などから選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよい。水酸基の置換基は、保護基であってもよく、前記した置換基自体が保護基として機能し得るものもあり、それらは保護基として使用してもよい。そのような保護基としては、前記したＴ１の水酸基の保護基を同様に挙げることができる。
【００３５】
Ｅ１およびＥ２の置換されていてもよいＣ１−６アルキル基および置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基の置換基としては、例えば、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ６−１４アリールスルホニル基、アミノ基、モノＣ１−６アルキルアミノ基、ジＣ１−６アルキルアミノ基、ニトロ基、ヒドロキシル基、シアノ基、カルボキシル基から選ばれる１ないし３個の置換基が挙げられる。これらの置換基のうち、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ６−１４アリールスルホニル基は、更に、ハロゲン原子、アミノ基、モノＣ１−６アルキルアミノ基、ジＣ１−６アルキルアミノ基から選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよい。
【００３６】
Ｅ１およびＥ２の置換されていてもよいアミノ基の置換基としては、例えば、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ６−１４アリールスルホニル基から選ばれる１または２個の置換基が挙げられる。これらの置換基は、更に、ハロゲン原子、アミノ基、モノＣ１−６アルキルアミノ基、ジＣ１−６アルキルアミノ基から選ばれる１ないし３個の置換基で置換されていてもよい。
【００３７】
Ｅ３の置換されていてもよいＣ１−６アルキル基および置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基の置換基としては、前記したＥ１およびＥ２の置換されていてもよいＣ１−６アルキル基および置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基の置換基と同様の置換基を挙げることができる。
式（Ｉ）および（ＩＩＩ）におけるＸとしては、酸素原子が好ましい。
【００３８】
式（Ｉ）および（ＩＩＩ）において、Ｒ１は、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示す。Ｒ１の置換されていてもよいＣ１−６アルキル基および置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基の置換基としては、前記したＥ１およびＥ２の置換されていてもよいＣ１−６アルキル基および置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基の置換基と同様の置換基を挙げることができる。また、Ｒ１の置換されていてもよいアミノ基の置換基としては、前記したＥ１およびＥ２の置換されていてもよいアミノ基の置換基と同様の置換基を同様に挙げることができる。
式（Ｉ）および（ＩＩＩ）におけるＲ１としてはＣ１−６アルキル基が好ましく、メチル基がさらに好ましい。
【００３９】
式（Ｉ）および（ＩＩＩ）において、Ｒ２は、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基またはハロゲン原子を示し、Ｒ３は、水素原子、置換されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアミノ基、水素原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル基またはハロゲン原子を示す。Ｒ２およびＲ３の置換されていてもよい水酸基の置換基としては、前記したＥ１およびＥ２の置換されていてもよい水酸基の置換基と同様の置換基を挙げることができる。Ｒ２およびＲ３の置換されていてもよいＣ１−６アルキル基および置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基の置換基としては、前記したＥ１およびＥ２の置換されていてもよいＣ１−６アルキル基および置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基の置換基と同様の置換基を挙げることができる。また、Ｒ２およびＲ３の置換されていてもよいアミノ基の置換基としては、前記したＥ１およびＥ２の置換されていてもよいアミノ基の置換基と同様の置換基を同様に挙げることができる。
式（Ｉ）および（ＩＩＩ）におけるＲ２およびＲ３の好適な例として、一方が水素原子であり、他方が置換されていてもよい水酸基である場合が挙げられる。Ｒ２およびＲ３の一方が水素原子であり、他方がＣ６−１４アリールカルボニル基で置換されていてもよい水酸基である場合がより好ましい。Ｒ２およびＲ３の一方が水素原子であり、他方がベンゾイルで置換されていてもよい水酸基である場合がより好ましい。Ｒ２およびＲ３の一方が水素原子であり、他方がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）で置換されていてもよい水酸基である場合がより好ましい。
また、Ｒ２およびＲ３の好適な例として、一方が水素原子であり、他方が置換されていてもよいアミノ基（好ましくは１ないし３個のハロゲンで置換されていてもよいＣ１−６アルキル−カルボニル基で置換されたアミノ基；さらに好ましくはトリフルオロアセチルアミノ基）である場合も挙げられる。
【００４０】
本発明の式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）の開環型修飾核酸モノマー化合物は、その塩の形態にあってもよい。そのような塩としては、例えば、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩などの無機酸塩；酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩などの有機カルボン酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩などの有機スルホン酸塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などのアミノ酸塩；四級アミン塩；ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩が挙げられる。
【００４１】
２．開環型修飾核酸モノマー化合物の製造
以下に、本発明の式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）の開環型修飾核酸モノマー化合物の製造法について説明する。
以下の反応における、原料または製造中間体は、それぞれ塩であってもよい。そのような塩としては、本発明の式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）の開環型修飾核酸モノマー化合物の塩として例示したものが挙げられる。
以下の反応において、生成物は反応液のままか、または粗生成物として次反応に用いてもよい。あるいは、自体公知の分離手段（例、再結晶、蒸留、クロマトグラフィー）を用いて、反応混合物から単離して、次反応に用いてもよい。
【００４２】
式（Ｉ）の化合物（以下、化合物（Ｉ）と言うこともある）および式（ＩＩＩ）の化合物（以下、化合物（ＩＩＩ）と言うこともある）は、例えば、以下の反応スキーム１に示す工程により製造することできる。
【化１３】
2014069520.tif 000014
[式中、Ｂ、Ｔ１、Ｔ２、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、前記の定義と同じである。]
【００４３】
工程１および２について：
工程１において、式（ｅ）で表される１，２−ジオール化合物（以下、化合物（ｅ）という）を、酸化的開裂反応により、式（ｆ）で表されるジアルデヒド化合物（以下、化合物（ｆ）という）を製造し、次いで、工程２において、還元反応により、式（ｇ）で表されるジオール化合物（以下、化合物（ｇ）という）を製造する。
【００４４】
化合物（ｅ）において、Ｔ１は水酸基の保護基であるのが好ましく、Ｘ、Ｒ１およびＢは、それらの基が水酸基、アミノ基、カルボキシ基などの反応性基を置換基として有する場合には、それらが前記したそれぞれの保護基で保護されているのが好ましい。Ｘが酸素原子である化合物（ｅ）は、本明細書中の実施例などに記載の方法により製造することができる。Ｘが硫黄原子である化合物（ｅ）は、ＷＯ２００３/０２６６７５（Gosselin, G.;Imbach, J.-L.;Sammadossi, J.-P.2003 PCT Int.Appl）もしくはＷＯ２００３/０２６５８９（Gosselin, G.;Imbach, J.-L.;Sammadossi, J.-P. 2003PCT Int.Appl）などに記載の方法を参考にして製造することができる。また、Ｘが−Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝Ｃ（Ｅ１）（Ｅ２））−または−Ｃ（＝ＮＥ３）−である化合物（ｅ）は、Kim, S.-A et al. Synlett 2007, (7) 1055-1058 などに記載の方法を参考にして製造することができ、Ｘが−Ｎ（Ｅ３）−である化合物（ｅ）は、Varaprasad, C. V. et al. Tetrahedron 1999, 55, 13345-13368 などに記載の方法を参考にして製造することができる。
【００４５】
工程１の酸化的開裂反応は、炭素−炭素結合が切断され、対応するジアルデヒド化合物を生成する反応であり、過ヨウ素酸ナトリウムなどの過ヨウ素酸塩を用いる過ヨウ素酸法（Bull. Soc. Chim. France [4] 43,683 (1928); J. Am. Soc. Chem. Soc., 59, 2049 (1937)）、四酢酸鉛ＩＶを用いるＣｒｅｉｇｒｅｅ法（Chem. Ber. 64, 260 (1931); Tetrahedron: Asymmetry. 8. 451 (1997)）などにより実施することができる。工程１は、例えば、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトン、クロロホルム、ジオキサン、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、ベンゼン、トルエンなどの反応を阻害しない有機溶媒中で、あるいはこれらの有機溶媒と水との混合溶媒中で、過ヨウ素酸塩または四酢酸鉛ＩＶの存在下、室温（１〜３０℃、以下、本明明細書で室温とは、同様に１〜３０℃を意味する）で５分間から２４時間攪拌することにより実施できる。
【００４６】
工程２における還元反応は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、ジボラン（Ｂ２Ｈ６）、水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ−Ｈ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）、水素化トリエチルホウ素リチウム（ＬｉＢＨ（Ｃ２Ｈ５）３）などの金属水素化物もしくはその他の水素化物またはそれらの錯化合物を還元剤として用いる方法により実施することができる。これらの方法は、例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、アセトン、ジクロロメタン、クロロホルム、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、ベンゼン、トルエンなどの反応を阻害しない有機溶媒中で、前記した還元剤の存在下、室温で５分間から２４時間攪拌することにより実施できる。
さらに工程２では、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロパノールなどの有機化合物を還元剤として用いることもできる。この場合は、前記した有機化合物系の還元剤を前記した水素化物系の還元剤と共に用いることもできる。前記した有機化合物系の還元剤と前記した水素化物系の還元剤との反応により得られる化合物を還元剤として用いることもできる。例えば、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）と水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）との反応により得られるＮａＢＨ（ＨＦＩＰ）３を還元剤として用いることもできる。これらの方法は、前記した反応を阻害しない有機溶媒中で、前記した還元剤の存在下、室温で、又は３０〜７０℃で、好ましくは４０〜６０℃で、より好ましくは４５〜５５℃で、さらに好ましくは５０℃で、５分間から２４時間攪拌することにより実施できる。この反応には、塩化リチウムなどの塩を加えることもできる。これらの方法は、水素化物系の還元剤を用いる還元方法では困難な核酸の合成に有効であり、特に、Ｂがアデニン由来の基またはグアニン由来の基である化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩＩ）の合成に有効である。
かくして得られる化合物（ｇ）は、Ｔ２が水素原子、Ｒ２およびＲ３のいずれかが水素原子で他方が水酸基である化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩＩ）に相当し、化合物（ｇ）は、本発明の式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）の開環型修飾核酸モノマー化合物でもある。
【００４７】
工程３および４について
工程３では、化合物（ｇ）から、３’位に−Ｏ−Ｔ２、２’位に−Ｒ２および−Ｒ３を有する化合物（Ｉ）を、工程４では、化合物（ｇ）から、２’位に−Ｏ−Ｔ２、３’位に−Ｒ２および−Ｒ３を有する化合物（ＩＩＩ）を製造する。以下に、これらの工程３および４について詳細に説明する。
例えば、下記反応スキーム２
【化１４】
2014069520.tif 000015
［式中、Ｘ、Ｔ１、ＢおよびＲ１は、前記の定義と同じである。保護基としては、Ｔ１で示される水酸基の保護基として例示したものが挙げられる。］
に示すように、先ず、化合物（ｇ）を水酸基の通常の保護反応に付し、通常の保護反応後に、カラムクロマトグラフィーなどの方法により分離精製して、２’位の−ＯＨのみが保護された化合物（ｇ−１）と、３’位の−ＯＨのみが保護された化合物（ｇ−２）とを製造する。この分離精製において、同時に得ることができる２’位および３’位の両者の−ＯＨが保護された化合物は、Ｔ２が水酸基の保護基、Ｒ２およびＲ３のいずれかが水素原子で他方が保護基で置換された水酸基である化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩＩ）に相当し、本発明の式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）の開環型修飾核酸モノマー化合物でもある。
【００４８】
次いで、下記の反応スキーム３および４
【化１５】
2014069520.tif 000016
［式中、Ｘ、Ｔ１、Ｔ２、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は前記の定義と同じである。保護基としては、Ｔ１で示される水酸基の保護基として例示したものが挙げられる。］
【００４９】
【化１６】
2014069520.tif 000017
［式中、Ｘ、Ｔ１、Ｔ２、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は前記の定義と同じである。保護基としては、Ｔ１で示される水酸基の保護基として例示したものが挙げられる。］
に示すように、化合物（ｇ−１）を、例えば、３’位の−ＯＨをリン官能基に変換する反応に付することにより、Ｔ２がリン官能基である化合物（Ｉ）を製造することができる。同様に、化合物（ｇ−２）を、２’位の−ＯＨをリン官能基に変換する反応に付することにより、Ｔ２がリン官能基である化合物（ＩＩＩ）を製造することができる。
【００５０】
リン官能基への変換反応は、Ｔ２のリン官能基として、前記した式（a）、式（ｂ）または式（ｃ）のリン官能基へ変換するには、例えば、それぞれに対応する下記式（ａ’）、下記式（ｂ’）または下記式（ｃ’）
【化１７】
2014069520.tif 000018
[各式中、Ｈａｌはハロゲン原子を示し、Ｙ１、Ｚ１、Ｙ２、Ｚ２、Ｚ３、Ｙ３およびＺ４は前記の定義と同じである]
で表わされるリン酸化試薬と、化合物（ｇ−１）または化合物（ｇ−２）とを反応させることにより製造することができる。これらの反応は、例えば、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトン、クロロホルム、ジオキサン、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、ベンゼン、トルエンなどの反応を阻害しない溶媒に溶解し、必要に応じて、例えば、トリエチルアミン、トリブチルミン、コリジン、２，６−ルチジン等の存在下、室温で５分間から２４時間攪拌することにより実施することができる。
【００５１】
Ｔ２のリン官能基として、前記した式（ｄ）のリン官能基へ変換するには、化合物（ｇ−１）または化合物（ｇ−２）と、ｐ−トルイル−Ｈ−ホスホネートのトリエチルアンモニウム塩などの塩とを、ピバロイルクロリドなどの促進剤の存在下で、ピリジン中で、低温で反応させることにより変換できる。また、化合物（ｇ−１）または化合物（ｇ−２）と、ジ（ｔ−ブチル）Ｎ，Ｎ−ジエチルホスホロアミダイト、ジ（トリベンジルメチル）Ｎ，Ｎ−ジエチルホスホロアミダイト、ジ（２−トリメチルシリル−１，１−ジメチルエチル）Ｎ，Ｎ−ジエチルホスホロアミダイトなどのホスフィチル化剤とを反応させて、ホスフィチル化し、次いで、トリエチルアミン、トリブチルアミンなどで処理することにより、変換できる。
【００５２】
前記の反応スキーム３および４に示すように、化合物（ｇ−１）を、例えば、３’位の−ＯＨを、アミノ基等への変換反応に付することにより、Ｒ２またはＲ３の一方が水素原子で他方が置換されていてもよいアミノ基である化合物（ＩＩＩ）を製造することができる。同様に、化合物（ｇ−２）を、２’位の−ＯＨをアミノ基等への変換反応に付することにより、Ｒ２またはＲ３の一方が水素原子で他方が置換されていてもよいアミノ基である化合物（Ｉ）を製造することができる。
【００５３】
アミノ基等への変換反応は、例えば、先ず、化合物（ｇ−１）の３’位の−ＯＨを塩化メシルなどでアルキルスルホニル化し、次いで、アジ化ナトリウムなどでアジ化し、更に含水溶媒中トリフェニルホスフィンなどで還元 (シュタウジンガー還元)することにより、Ｒ２またはＲ３の一方が水素原子で他方がアミノ基である化合物（ＩＩＩ）を製造することができる。これらの化合物を、更に、ヨウ化メチル、臭化エチルなどのハロゲン化アルキル化合物との反応に付し、もしくはホルムアルデヒドやアルキルアルデヒドなどと処理し、生じたシッフ塩基を水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、ジボラン（Ｂ２Ｈ６）、水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ−Ｈ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）、水素化トリエチルホウ素リチウム（ＬｉＢＨ（Ｃ２Ｈ５）３）などの金属水素化物もしくはその他の水素化物またはそれらの錯化合物を用いて還元することなどにより、Ｒ２またはＲ３の一方が水素原子で他方が置換されたアミノ基である化合物（ＩＩＩ）を製造することができる。同様に、化合物（ｇ−２）の２’位の−ＯＨを同様の反応に付すことにより、Ｒ２またはＲ３の一方が水素原子で他方がアミノ基である化合物（Ｉ）およびＲ２またはＲ３の一方が水素原子で他方が置換されたアミノ基である化合物（Ｉ）を製造することができる。前記したハロゲン化アルキル化合物との反応は、例えば、無水メタノール、無水エタノール、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトン、ジクロロメタン、クロロホルム、ジオキサン、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、ベンゼン、トルエンなどの反応を阻害しない溶媒中、例えば、水素化ナトリウム、１，８−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ−7-セン（ＤＢＵ）、トリエチルアミン、トリブチルミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン等の存在下、室温で１時間から３０時間攪拌することにより実施することができる。
【００５４】
また、前記の反応スキーム３および４に示すように、化合物（ｇ−１）の３’位の−ＯＨに対して、ハロゲン化試薬、ハロゲン化Ｃ１−６アルキル化合物、ハロゲン化Ｃ２−６アルケニル化合物、ハロゲン化Ｃ２−６アルキニル化合物などとの求核置換反応に付すことにより、Ｒ２またはＲ３の一方が水素原子で他方がハロゲン原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基である化合物（ＩＩＩ）を製造することができる。同様に、化合物（ｇ−２）を、２’位の−ＯＨを求核置換反応に付すことにより、Ｒ２またはＲ３の一方が水素原子で他方がハロゲン原子、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基である化合物（Ｉ）を製造することができる。
【００５５】
これらの求核置換反応は、塩化チオニル、三フッ化Ｎ，Ｎ-ジエチルアミノ硫黄などのハロゲン化試薬；ヨウ化メチル、臭化エチルなどのハロゲン化Ｃ１−６アルキル化合物；臭化エチニル、臭化ブテニルなどのハロゲン化Ｃ２−６アルケニル化合物；または臭化アセチレンなどのハロゲン化Ｃ２−６アルキニル化合物を用いて、例えば、無水メタノール、無水エタノール、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトン、クロロホルム、ジオキサン、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、ベンゼン、トルエンなどの反応を阻害しない溶媒に溶解し、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン等の存在下、室温で１時間から３０時間攪拌することにより実施することができる。
【００５６】
以上に説明した方法により、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩＩ）を製造することができる。他の化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩＩ）も、以上に説明した方法と同様の方法を、製造しようとする目的化合物に応じて、種々に組み合せ、必要に応じて公知の方法を更に組み合わせることにより、同様に製造することができる。
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩＩ）の単離および精製は、一般に用いられるカラムクロマトグラフィーによる分離や、再結晶法などを種々に組み合わせ、必要に応じて公知の方法を更に組み合わせることにより、同様に行うことができる。
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩＩ）は同位元素（例、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３５Ｓ、１２５Ｉ等）等で標識されていてもよく、このような同位元素等で標識された化合物も化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩＩ）に包含される。
さらに、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩＩ）において１Ｈは２Ｈ（Ｄ）に変換されていてもよく、このような変換をされた重水素変換体も化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩＩ）に包含される。
また、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩＩ）は、溶媒和物（例えば、水和物など）であっても、無溶媒和物であってもよく、いずれも化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩＩ）に包含される。
【００５７】
３．広範囲の開環型修飾核酸モノマー化合物
本発明では、より広範囲の開環型修飾核酸モノマー化合物として、式（Ｉ）の化合物を包含するより広範囲の化合物として、下記式（Ｉ’）
【化１８】
2014069520.tif 000019
[式中
Ｂ、Ｔ１、Ｔ２、Ｘ、Ｒ２およびＲ３は前記と同意義を示し；
Ｒ１’は、−ＣＨ２−Ｘ−Ｅ４、−Ｃ（Ｆ１）（Ｆ２）−Ｘ−Ｅ４または−Ｃ（＝Ｇ）−Ｘ−Ｅ４を示し；
Ｅ４は、ハロゲン原子、置換されてもよい水酸基、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；
Ｆ１およびＦ２は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、置換されてもよい水酸基、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示し；
ｌは、１または２を示し；
ｍは、０または１を示し；
ｎは、１または２を示す。]
で表わされる開環型核酸モノマー化合物またはその塩が提供される。式（Ｉ’）において、Ｅ４はハロゲン原子、置換されてもよい水酸基、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示す。また、式（I’）において、Ｆ１およびＦ２は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、置換されてもよい水酸基、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基または置換されていてもよいアミノ基を示す。Ｅ４、Ｆ１およびＦ２の置換されていてもよい水酸基の置換基としては、前記したＥ１およびＥ２の置換されていてもよい水酸基の置換基と同様の置換基を挙げることができる。Ｅ４、Ｆ１およびＦ２の置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基の置換基としては、前記したＥ１およびＥ２の置換されていてもよいＣ１−６アルキル基および置換されていてもよいＣ２−６アルケニル基の置換基と同様の置換基を挙げることができる。また、Ｅ４、Ｆ１およびＦ２の置換されていてもよいアミノ基の置換基としては、前記したＥ１およびＥ２の置換されていてもよいアミノ基の置換基と同様の置換基を同様に挙げることができる。
式（Ｉ’）の化合物も、式（Ｉ）の化合物と同様に、２’位と３’位の炭素−炭素結合が開裂し、かつ、４’位に置換ヒドロキシメチル基などの置換メチル基を有する。この化合物は、当業者に公知の化合物から、自体公知の方法を組み合わせて製造することができる。また、塩としては、式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）の開環型核酸モノマー化合物の塩と同様の塩が挙げられる。
【００５８】
４．オリゴ核酸類縁体
本発明のオリゴ核酸類縁体は、下記式（ＩＩ）または下記式（ＩＶ）
【化１９】
2014069520.tif 000020
で表される部分構造を１以上含有するオリゴ核酸類縁体またはその塩（ただし、上記部分構造を２以上含有する場合は、当該部分構造間でＢ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３がそれぞれ同一であっても、異なってもよい。）である。式（ＩＩ）および式（ＩＶ）と式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）とで、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は同意義を示す。本発明のオリゴ核酸類縁体は、式（Ｉ）または式（ＩＩＩ）の開環型修飾核酸モノマー化合物に対応する式（ＩＩ）または式（ＩＶ）の部分構造を１以上含有するオリゴ核酸類縁体である。
【００５９】
本発明のオリゴ核酸類縁体は、式（ＩＩ）または式（ＩＶ）の部分構造を１以上含有し、式（ＩＩ）または式（ＩＶ）以外のヌクレオシドサブユニットをさらに含有する。
式（ＩＩ）または式（ＩＶ）の部分構造以外のヌクレオシドサブユニットとしては、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシドのいずれでもよく、その塩基部分は、チミン、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルのいずれでもよく、また、それらの修飾体であってよい。塩基部分の修飾体としては、例えば、塩基部分が、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ６−１４アリールスルホニル基、アミノ基、モノＣ１−６アルキルアミノ基、ジＣ１−６アルキルアミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、シアノ基、カルボキシ基などで置換された当業者に公知の修飾体などが挙げられる。また、リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドの糖部分も、リボースまたはデオキシリボースの修飾体であってもよく、糖部分の修飾体としては、例えば、２’−アミノ体（Verheyden, J. P. H. et al. J. Org. Chem. 1971, 36, 250-254.; Wolfrom; Winkley, M. W. J. Org. Chem. 1967, 32, 1823; Smith, L. M.; Fung, S., US Patent/4849513, 1989年; Aurup, H. et al., Nucleic Acids Res. 1994, 22, 20-24）、２’−Ｏ−メトキシエチル体（Crook, P. D. et al. PCT Int. Appl. 1996, WO9627606）、２’−フルオロ体（Ikehara, M.; Miki, H., Chem. Pharm. Bull. 1978, 26, 2449-2453; Schmidt, S. et al., Biochim. Biophys. Acta 1992, 1130, 41-46; Kawasaki, A. M. et al., J. Med. Chem. 1993, 36, 831-841）、２’−Ｏ−メチル体（Inoue, H. et al., FEBS Lett. 1987, 215, 327-330; Inoue, H. et al., Nucleic Acids Res. 1987, 15, 6131-6148）などの当業者に公知の修飾体を挙げることができる。
本発明のオリゴ核酸類縁体を構成するヌクレオシドサブユニットの数としては、通常、４から１００個が好ましく、例えば、オリゴ核酸類縁体がＤＮＡである場合には、４から１００個が好ましく、４から３０個がより好ましく、ＲＮＡである場合には、４から５０個が好ましく、４から３０個がより好ましい。式（ＩＩ）または式（ＩＶ）の部分構造は、サブユニットとして、オリゴ核酸類縁体中に、好ましくは１から１５個、より好ましくは、１から１０個を含有される。また、その含有位置は、いずれでもよく、使用目的に応じて、任意に決めることができる。また、同一のオリゴ核酸類縁体において、式（ＩＩ）の部分構造と式（ＩＶ）の部分構造とが、共に１つ以上含有されていてもよい。
【００６０】
オリゴ核酸類縁体における各ヌクレオシドサブユニットは、それぞれホスホジエステル結合により結合しており、その結合様式としては、天然体の下記式（ｈ）で表される結合に加えて、下記式（ｈ１）から（ｈ９）
【化２０】
2014069520.tif 000021
[各式中、Ｎｕｃ１およびＮｕｃ２はヌクレオシドサブユニット、Ｓｕｂは、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基またはＣ６−１４アリール−カルボニル基を示す。式（ｈ４）における二つのＳｕｂは同じでも異なっていてもよい。]
で表わされる各種の結合様式が挙げられる。これらの結合様式は、同一のオリゴ核酸類縁体において、２種以上が組み合せて存在していてもよい。
【００６１】
本発明のオリゴ核酸類縁体は、その塩の形態にあってもよく、そのような塩としては、前記した本発明の式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）の開環型修飾核酸モノマー化合物の塩と同様の塩を挙げることができる。
【００６２】
本発明のオリゴ核酸類縁体は、より具体的には、例えば、下記式（Ｘ）
【化２１】
2014069520.tif 000022
[式中、ホスホジエステル結合は、前記式（ｈ）から（ｈ９）のいずれかの結合様式を、Ｂ１は置換されていてもよい複素環基を、Ｄは水素原子、水酸基、メトキシ基、ハロゲン原子またはアミノ基を、ｑは１以上の整数を示す。但し、ホスホジエステル結合、Ｂ１およびＤは各構成ユニットにおいてそれぞれ同じでも異なっていてもよい。]
で表わされるオリゴ核酸類縁体において、その任意の位置における構造ユニットの１つ以上と代わって、式（ＩＩ）および式（ＩＶ）から選ばれる部分構造を１つ以上含有するオリゴ核酸類縁体である。式（Ｘ）において、Ｂ１の置換されていてもよい複素環基としては、上記Ｂの置換されていてもよい複素環基と同様のものが挙げられる。ｑは、好ましくは３から１００、より好ましくは、４から４０もしくは５０の整数である。
【００６３】
本発明のオリゴ核酸類縁体は、前記したように、例えばsiＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、デコイ核酸、核酸アプタマー、リボザイムなどとして使用出来る。更には、ＲＮＡプローブ、ＤＮＡプローブ、モレキュラービーコンなどの遺伝子解析ツールとしても利用出来る。
したがって、本発明のオリゴ核酸類縁体は、これらの使用用途に応じて、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド等であってもよく、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ/ＲＮＡキメラ体、ＤＮＡ/ＲＮＡハイブリッド体であってもよい。
本発明のオリゴ核酸類縁体を、例えば、siＲＮＡとして使用する場合には、標的遺伝子のセンス鎖およびアンチセンス鎖あるいはそれらの改変体からなる二本鎖ＲＮＡが好ましく、本発明の式（ＩＩ）または式（ＩＶ）の部分構造は、センス鎖またはアンチセンス鎖あるいはそれらの改変体のいずれか一方に、または両者に含有させることができる。ここで改変体とは、前記したヌクレオシドの塩基部分の修飾体、糖部分の修飾体、天然体以外の各種ホスホジエステル結合を含むものが挙げられる。siＲＮＡは、そのセンス鎖とアンチセンス鎖とが、両３’末端の２から５程度のリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドあるいは公知の修飾ヌクレオチドからなるダングリングエンドを持つようにハイブリダイズして二本鎖を形成しているものであってもよい。
本発明のオリゴ核酸類縁体を、例えば、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡプローブ、ＤＮＡプローブなどに使用する場合には、標的遺伝子に対して相補性配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドが好ましい。デコイ核酸に使用する場合には、二本鎖ＤＮＡ、核酸アプタマーやリボザイムなどに使用する場合には、一本鎖オリゴヌクレオチドや二本鎖オリゴヌクレオチド、モレキュラービーコンに使用する場合には、ステム・ループ構造を持ち標的ＲＮＡに対して相補性配列を有するものなどが好ましい。
【００６４】
５．オリゴ核酸類縁体の製造
本発明のオリゴ核酸類縁体は、式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の開環型修飾核酸モノマー化合物を用いて、核酸合成法として自体公知のトリエステル法、ホスホロアミダイト法、ジクロロホスフィン誘導体を用いる方法、Ｈ−ホスホネート法などにより固相法または液相法で製造することができる。また、これらの製造は核酸自動合成機器によって行うこともできる。以下に、これらの製造法について、以下に説明する。例えば、最も一般的なホスホロアミダイト法による固相合成により合成されたオリゴヌクレオチドは、アンモニアやメチルアミンに代表される塩基処理により固相からの切り出しおよび脱保護される。さらに、ＲＮＡを含む場合など塩基処理で脱保護を受けない保護基（例えばｔｅｒｔ−ブチルヂメチルシリル基）がある場合には、三フッ化水素・トリエチルアミンなど公知のフッ素処理による脱保護を行う。粗オリゴヌクレオチド生成物は、逆相もしくはイオン交換クロマトグラフィーなど公知の方法によって、単離・精製が可能であり、脱保護および精製とも、必要に応じて公知の方法を更に組み合わせて同様に行うこともできる。
【００６５】
（１）トリエステル法によるオリゴ核酸類縁体の製造
トリエステル法によるオリゴ核酸類縁体の製造は、例えば、以下の反応スキーム５
【化２２】
2014069520.tif 000023
[式中、Ｚ１は水素原子、Ｙ１はリン酸の保護基、ｒは１以上の整数、好ましくは、１から４０もしくは５０の整数を示す。Ｂ１、Ｄ、Ｘ、Ｔ１、Ｔ２、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は前記の定義と同じである。但し、Ｂ１およびＤは各構成ユニットにおいてそれぞれ同じでも異なっていてもよい。保護基としては、Ｔ１で示される水酸基の保護基として例示したものが挙げられる。]
で表わされる方法、あるいはこれに準ずる方法により実施することができる。すなわち、化合物（Ｉ）または（ＩＩＩ）においてＴ２として前記した式（a）で表わされるリン官能基を有する式（Ｉ−１）または式（ＩＩＩ−１）のヌクレオチドユニットと、式（Ｖ）のオリゴヌクレオチドブロックとを、縮合剤の存在下で反応させることにより、両者を縮合させて、式（ＩＩ）または式（ＩＶ）の部分構造を、本発明のオリゴ核酸類縁体のサブユニットの１つとして組み込むことができる。同様の反応を繰り返すことによって、式（ＩＩ）または式（ＩＶ）の部分構造の２つ以上をオリゴ核酸類縁体のサブユニットとして組み込むことができる。更に、各種のヌクレオチドユニットもしくはオリゴヌクレオチドブロックを用いて、同様の縮合反応を繰り返すことにより、また、以下に説明する他のホスホロアミダイト法、ジクロロホスフィン誘導体を用いる方法、Ｈ−ホスホネート法など方法を必要に応じて、加えることにより、目的とする本発明のオリゴ核酸類縁体を製造することができる。
【００６６】
前記縮合反応は、通常、１−（２−メシチレンスルオニル）−３−ニトロ−１，２−４−トリアゾール、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホニルテトラゾール、１−（２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾールなどの縮合剤の存在下で、例えば、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトン、クロロホルム、ジオキサン、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、ベンゼン、トルエンなどの反応を阻害しない溶媒中で、室温で５分間から２４時間攪拌することにより実施することができる。
縮合反応後に、目的とするオリゴ核酸類縁体を得るために、また、例えば、各オリゴヌクレオチドブロックの製造後などに、必要に応じて、脱保護反応に付することができる。脱保護反応としては、通常の核酸合成に用いられる脱保護反応を採用することができる。例えば、濃アンモニア水、水酸化ナトリウム水溶液などのアルカリ水溶液と、メタノール、エタノールなどの有機溶媒を混合した溶液を用いる方法；メチルアミン、トリエチルアミン、N、N-ジイソプロピルアミンなどの有機塩基をメタノール、エタノールなどの有機溶媒に溶解した溶液を用いる方法；フッ化テトラブチルアンモニウム、フッ化テトラブチルアンモニウムー酢酸、トリエチルアミン・三フッ化水素、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸などを、ジクロロメタン、クロロホルムなどの有機溶媒に溶解した溶液を用いる方法等により脱保護反応を行うことができる。
なお、式（Ｖ）のオリゴヌクレオチドブロックとしては、市販品として入手可能なもの、および自体公知の方法により合成可能なものを用いることができる。
【００６７】
（２）ホスホロアミダイト法によるオリゴ核酸類縁体の製造
ホスホスホロアミダイト法によるオリゴ核酸類縁体の製造について、代表的な方法を例にとって以下に説明する。例えば、以下の反応スキーム６
【化２３】
2014069520.tif 000024
[式中、Ｙ２、Ｚ２、Ｚ３、Ｂ１、Ｄ、ｒ、Ｘ、Ｔ１、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は前記の定義と同じである。]
で表わされる方法、あるいはこれに準ずる方法により実施することができる。すなわち、化合物（Ｉ）または（ＩＩＩ）においてＴ２として前記した式（ｂ）で表わされるリン官能基を有する式（Ｉ−２）または式（ＩＩＩ−２）のヌクレオチドユニットと、固相担体に結合した式（Ｖ−１）のオリゴヌクレオチドブロックとを反応させることにより、両者を結合させて、式（ＶＩ−２）または式（ＶＩＩ−２）のオリゴヌクレオチドとし、次いで、酸化反応、脱保護反応に付すことによって、式（ＶＩ−３）または式（ＶＩＩ−３）のオリゴヌクレオチドへ変換して、式（ＩＩ）または式（ＩＶ）の部分構造を、本発明のオリゴ核酸類縁体のサブユニットの１つとして組み込むことができる。同様の反応を繰り返すことによって、式（ＩＩ）または式（ＩＶ）の部分構造の２つ以上をオリゴ核酸類縁体のサブユニットとして組み込むことができる。更に、各種のヌクレオチドユニットもしくはオリゴヌクレオチドブロックを用いて、同様の反応を繰り返すことにより、また、他のトリエステル法、ジクロロホスフィン誘導体を用いる方法、Ｈ−ホスホネート法など方法を必要に応じて、加えることにより、目的とする本発明のオリゴ核酸類縁体を製造することができる。
【００６８】
式（Ｖ−１）のオリゴヌクレオチドブロックが結合する固相担体としては、例えば、ＣＰＧ（controlled pore glass）、ＨＣＰ(highly cross-linked polystyrene)などの高分子担体が用いられる。また、固相担体として、上記高分子担体にリンカー（例、コハク酸エステルリンカー）が結合した担体を用いることもできる。式（Ｖ−１）のオリゴヌクレオチドブロックは、自体公知の方法により固相担体に結合される。ここで、式（Ｖ−１）のオリゴヌクレオチドブロックが上記リンカーが結合した担体と結合する場合には、上記リンカーを介してオリゴヌクレオチドブロックが担体と結合する。式（Ｉ−２）または式（ＩＩＩ−２）のヌクレオチドユニットと、固相担体に結合した式（Ｖ−１）のオリゴヌクレオチドブロックとの反応は、ホスホロアミダイト法において通常使用されている、例えば、１Ｈ−テトラゾール、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾール、５−ベンゾイルメルカプト−１Ｈ−テトラゾールなどのカップリング試薬を用いて、アセトニトリル、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等の適当な有機溶媒中で、０℃から室温で、１０分から２４時間反応させることにより実施することができる。その後の酸化反応は、核酸合成に通常使用されている、ヨウ素などのハロゲン単体；ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ビス（トリメチルシリル）ペルオキシドどのパーオキシド；ｍ−クロロ過安息香酸などの過酸化物等の酸化剤を用い、ピリジン、水、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、トルエンなどの単独溶媒もしくはこれらの任意の混合溶媒中で行うことができる。
また、酸化反応の代わりに、硫黄化反応に付して、前記した式（ｈ５）の結合様式であるホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸類縁体を得ることも出来る。硫黄化反応は、ホスホロチオエート結合を持つ修飾核酸の合成に通常使用されている硫黄化反応を採用することができる。例えば、硫黄の２，６−ルチジン懸濁液、硫黄の二硫化炭素溶液、テトラエチルチウラムジスルヒド（ＴＥＴＤ）（H. Vu et al., Tetrahedron Lett., 32, 3005-3008 (1991)、Ｂｅａｕｇｅ試薬（R.P. Lyer et al., J. Am. Chem. Soc., 112, 1253-1254 (1990）、ローソン試薬などを用いた硫黄化反応を用いることができる。
【００６９】
目的とするオリゴ核酸類縁体を得るために、また、例えば、各オリゴヌクレオチドブロックの製造後などに、必要に応じて、脱保護反応に付することができる。脱保護反応としては、前記した反応スキーム５における脱保護反応と同様の脱保護反応を採用することができる。また、最終的に製造されたオリゴ核酸類縁体を、例えば、脱保護反応と同様に、濃アンモニア水、水酸化ナトリウム水溶液などのアルカリ水溶液等で処理することによって固相担体から切り出すことができる。
【００７０】
（３）ジクロロホスフィン誘導体を用いる方法によるオリゴ核酸類縁体の製造
ジクロロホスフィン誘導体を用いる方法によるオリゴ核酸類縁体の製造は、例えば、以下の反応スキーム７
【化２４】
2014069520.tif 000025
[式中、Ｙ３、Ｚ４、Ｂ１、Ｄ、ｒ、Ｘ、Ｔ１、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は前記の定義と同じである。保護基としては、Ｔ１で示される水酸基の保護基として例示したものが挙げられる。]
で表わされる方法、あるいはこれに準ずる方法により実施することができる。すなわち、化合物（Ｉ）または（ＩＩＩ）においてＴ２として前記した式（ｃ）で表わされるリン官能基を有する式（Ｉ−３）または式（ＩＩＩ−３）のヌクレオチドユニットと、式（Ｖ）のオリゴヌクレオチドブロックとを反応させることにより、両者を結合させて、式（ＶＩ−４）または式（ＶＩＩ−４）のオリゴヌクレオチドとし、次いで、酸化反応、脱保護反応に付すことによって、式（ＶＩ−５）または式（ＶＩＩ−５）のオリゴヌクレオチドへ変換して、式（ＩＩ）または式（ＩＶ）の部分構造を、本発明のオリゴ核酸類縁体のサブユニットの１つとして組み込むことができる。同様の反応を繰り返すことによって、式（ＩＩ）または式（ＩＶ）の部分構造の２つ以上をオリゴ核酸類縁体のサブユニットとして組み込むことができる。更に、各種のヌクレオチドユニットもしくはオリゴヌクレオチドブロックを用いて、同様の反応を繰り返すことにより、また、他のトリエステル法、ジクロロホスフィン誘導体を用いる方法、Ｈ−ホスホネート法など方法を必要に応じて、加えることにより、目的とする本発明のオリゴ核酸類縁体を製造することができる。
【００７１】
式（Ｉ−３）または式（ＩＩＩ−３）のヌクレオチドユニットと、式（Ｖ）のオリゴヌクレオチドブロックとの反応は、通常、コリジン、２，６−ルチジンなどを反応促進剤として用いて、例えば、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトン、クロロホルム、ジオキサン、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、ベンゼン、トルエンなどの反応を阻害しない溶媒中で、−７８℃から０℃で５分間から７２時間攪拌することにより実施することができる。その後の酸化反応および脱保護反応は、前記したホスホロアミダイト法の場合と同様に実施できる。
【００７２】
また、前記した酸化反応の代わりに、ホスホロアミダイト法と同様に、硫黄化反応に付して、前記した式（ｈ５）の結合様式であるホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸類縁体を得ることも出来る。
【００７３】
（４）Ｈ−ホスホネート法によるオリゴ核酸類縁体の製造
Ｈ−ホスホネート法によるオリゴ核酸類縁体の製造は、例えば、以下の反応スキーム８
【化２５】
2014069520.tif 000026
[式中、Ｚ＋、Ｂ１、Ｄ、ｒ、Ｘ、Ｔ１、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は前記の定義と同じである。]
で表わされる方法、あるいはこれに準ずる方法により実施することができる。すなわち、化合物（Ｉ）または（ＩＩＩ）においてＴ２として前記した式（ｈ）で表わされるリン官能基を有する式（Ｉ−４）または式（ＩＩＩ−４）のヌクレオチドユニットと、前記と同様にして固相担体に結合した式（Ｖ−１）のオリゴヌクレオチドブロックとを反応させることにより、両者を結合させて、式（ＶＩ−６）または式（ＶＩＩ−６）のオリゴヌクレオチドとする。この反応は、Ｈ−ホスホネート法において通常使用されている、例えば、ピバロイルクロリド、２−（ベンゾイルトリアゾール１−イルオキシ）―１，３−ジメチル−２−ピロリジン−１−イルー１，３，２−ジアザホスホリジリニウム  ヘキサフルオレート（ＢＯＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−オキサゾリジニル）ホスホニッククロリド（ＢｏｐＣｌ）などのカップリング試薬を用いて、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ピリジンなどの適当な有機溶媒中で、０℃から室温で、１０分から２４時間反応させることにより、カップリング反応を実施することができる。
【００７４】
次いで、式（ＶＩ−６）または式（ＶＩＩ−６）のオリゴヌクレオチドにおけるホスホネート結合を、必要に応じて、前記した式（ｈ）から（ｈ９）で表わされる各種のホスホジエステル結合に変換することができる。これらの各種のホスホジエステル結合への変換法は、自体公知の反応を用いることによって実施できる。例えば、前記したと同様の硫黄化反応により、式（ｈ１）のホスホロチオエート結合へ変換でき、更に、ハロゲン化Ｃ１−６アルキル化合物、ハロゲン化Ｃ２−６アルケニル化合物、ハロゲン化Ｃ２−６アルキニル化合物、Ｃ１−６アルキル−カルボニルハライドまたはＣ６−１４アリール−カルボニルハライドとの反応により、式（ｈ２）の結合様式へ変換できる。また、モノＣ１−６アルキルアミン、モノＣ２−６アルケニルアミン、モノＣ２−６アルキニルアミン、Ｃ１−６アルキル−カルボニルアミドまたはＣ６−１４アリール−カルボニルアミドとの反応により、式（ｈ３）の結合様式へ、ジＣ１−６アルキルアミン、ジＣ２−６アルケニルアミンとの反応により、式（ｈ４）の結合様式へ変換できる。Ｃ１−６アルキルアルコール、Ｃ２−６アルケニルアルコールなどとの反応により、式（ｈ５）の結合様式へ変換できる。他にも、式（ｈ６）に示されるホスホロジチオエート構造の構築法としてはＭａｒｓｈａｌｌらの文献（Science 259: 1564-1570, 1993）やＣａｒｕｔｈｅｒｓおよびＮｉｅｌｓｅｎの文献（ＷＯ１９８９/０１１４８６）を参考にできる。また、式（ｈ７）に示されるホスホロセレノエート構造および式（ｈ８）に示されるホスホロジセレノエート構造に関しても、多くの文献に示されており、例えば、一般的には Peyman and Ulmann, Chemical Reviews 90:543-584(1990); Milligan et al., J. Med. Chem., 36:1923‐1937 (1993)；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉらの文献（ＷＯ１９９２/００５１８６）に概説されている。また、ボラン−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ボランピリジンなどとの反応により、式（ｈ９）の結合様式へ変換できる。
【００７５】
かくして、式（ＩＩ）または式（ＩＶ）の部分構造を、本発明のオリゴ核酸類縁体のサブユニットの１つとして組み込むことができる。同様の反応を繰り返すことによって、式（ＩＩ）または式（ＩＶ）の部分構造の２つ以上をオリゴ核酸類縁体のサブユニットとして組み込むことができる。更に、各種のヌクレオチドユニットもしくはオリゴヌクレオチドブロックを用いて、同様の反応を繰り返すことにより、また、他のトリエステル法、ホスホロアミダイト法、ジクロロホスフィン誘導体を用いる方法など方法を必要に応じて、加えることにより、目的とする本発明のオリゴ核酸類縁体を製造することができる。
【００７６】
目的とするオリゴ核酸類縁体を得るために、また、例えば、各オリゴヌクレオチドブロックの製造後などに、必要に応じて、脱保護反応に付することができる。脱保護反応としては、前記した反応スキーム５における脱保護反応と同様の脱保護反応を採用することができる。また、最終的に製造されたオリゴ核酸類縁体を、前記した反応スキーム５の場合と同様に、固相担体から切り出すことができる。
【００７７】
以上に説明した製造法により、式（ＩＩ）または式（ＩＶ）の部分構造を１つ以上含有する、本発明のオリゴ核酸類縁体を製造することができる。
かくして得られる一本鎖のオリゴ核酸類縁体を、更に二本鎖のオリゴ核酸類縁体とすることもできる。すなわち、例えば、先ず、得られた一本鎖のオリゴ核酸類縁体と相補的な配列を有する他の一本鎖オリゴ核酸類縁体を製造する。この他の一本鎖オリゴ核酸類縁体は、天然型のオリゴヌクレオチドであってもよく、本発明の式（ＩＩ）または式（ＩＶ）の部分構造を１つ以上含有するオリゴヌクレオチドであってもよく、また、各ヌクレオシドの塩基部分や糖部分が、それらの修飾体であるヌクレオシドを構成ユニットとして含むオリゴヌクレオチドであってもよい。例えば、これらの一本鎖オリゴ類縁体のそれぞれを、当業者に公知の通常のアニーリング用緩衝液に溶解させ、それらを混合して、加温処理後に、冷却させ、二本鎖のオリゴ核酸類縁体を製造することができる。
本発明の開環型修飾核酸モノマー化合物を少なくとも構成ユニットの一つとして含むオリゴ核酸類縁体は生物学的安定性（例えば、血中安定性、より具体的には、血清中のオリゴ核酸類縁体残存量など）や標的遺伝子発現抑制活性に優れている。したがって、上記オリゴ核酸類縁体を、例えばsiＲＮＡとして用いた場合には、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤をはじめとした、「遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する医薬品」としての有用性が期待される。また、上記オリゴ核酸類縁体は、siＲＮＡだけでなく、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、デコイ核酸、核酸アプタマー、リボザイムなどとしても使用出来るものである。更には、ＲＮＡプローブ、ＤＮＡプローブ、モレキュラービーコンなどの遺伝子解析ツールとしても利用出来得るものである。本発明の開環型修飾核酸モノマー化合物を少なくとも構成ユニットの一つとして含むオリゴ核酸類縁体は、例えば緩衝剤及び／又は安定剤等の慣用の助剤を配合して非経口投与用製剤とすることができる。また、局所用の製剤としては、慣用の医薬用担体を配合して軟膏、クリーム、液剤、又は膏薬等に調剤できる。
【００７８】
以下、実施例および参考例に基いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７９】
実施例および参考例においては、以下の略語または略号を用いる。
Ｂｎ：べンジル
Ｍｅ：メチル
Ａｃ：アセチル
ＤＭＴｒ：４，４’−ジメトキシトリチル
Ｂｚ：ベンゾイル
ＴＢＤＰＳ：ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル
ＴＢＳ：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
Ｍｓ：メタンスルホニル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン【００８０】
実施例１
2014069520.tif 000027
以下に示すＳｃｈｅｍｅ１の合成ルートに沿って、Ｘが酸素原子、Ｔ１が水酸基の保護基、Ｒ１がメチル基、Ｔ２がホスホロアミダイト基、Ｒ２が水素原子、Ｒ３がベンゾイルオキシ基、Ｂがウラシルである本発明の式（Ｉ）の開環型修飾核酸モノマー化合物を合成した。
【化２６】
2014069520.tif 000028
【００８１】
（１）化合物２の合成
化合物１（２０ｇ）のテトラヒドロフラン溶液（２００ｍｌ）に水素化ナトリウム（６０％オイル混合物：４ｇ）を加え、２０分間激しく攪拌した。反応液にヨウ化メタン（６．２ｍｌ）を加え、１０分間攪拌した。反応混合物に氷を加えることで、反応を停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和食塩水の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。乾燥剤を濾去後、減圧下濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル/ヘキサン）にて精製し、無色油状物質として標題化合物（２０ｇ）を得た。【００８２】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 1.34, 1.63 (each 3H, each s), 3.38 (3H, s), 3.52 (1H, d, J = 10.4 Hz), 3.64 (2H, m), 3.91 (1H, d, J = 10.8 Hz), 4.24 (1H, d, J = 5.3 Hz), 4.53 (4H, m), 4.72 (1H, d, J = 12.1 Hz), 5.76 (1H, d, J = 3.6 Hz), 7.30 (10H, m)【００８３】
（２）化合物４の合成
化合物２（２０ｇ）の酢酸溶液（１００ｍｌ）に無水酢酸（２５ｍｌ）と硫酸（５０μｌ）を加え、室温で２．５時間攪拌した。反応液に少量の水酸化ナトリウムを加え、反応溶媒および過剰の試薬を減圧下留去した。残渣を酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和重曹水、飽和食塩水の順に洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。乾燥剤を濾去後、減圧下濃縮して得られた粗化合物３は、トルエンで３回共沸後、次の反応にそのまま供した。粗化合物３のアセトニトリル溶液（２５０ｍｌ）にウラシル（８．４ｇ）およびＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（３７ｍｌ）を加え、反応液を３０分加熱還流した。反応液に、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（１０．９ｍｌ，６０ｍｍｏｌ）を加え、さらに４時間加熱還流した。反応液に飽和重曹水を加え反応を停止した後、酢酸エチルで希釈した。有機層を水、飽和重曹水、飽和食塩水の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。乾燥剤を濾去後、減圧下濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル/ヘキサン）にて精製し、白色泡状物質として標題化合物（２４．１ｇ）を得た。【００８４】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 2.06 (3H, s), 3.33 (3H, s), 3.60 (3H, m), 3.84 (1H, d, J = 10.2 Hz), 4.37 (1H, d, J = 5.5 Hz), 4.53 (4H, m), 5.34 (2H, m), 6.28 (1H, d, J = 6.4 Hz), 7.33 (10H, m), 7.71 (1H, d, J = 8.1 Hz), 8.71 (1H, br s, exchangeable with D2O)【００８５】
（３）化合物５の合成
化合物４（１１．２ｇ）のメタノール溶液（１１２ｍｌ）に、２５％アンモニア水溶液（５６ｍｌ）を加え、室温で４時間反応した。反応液を減圧下濃縮して得られた残渣に水を加え、酢酸エチルとテトラヒドロフランの混合溶媒で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。乾燥剤を濾去後、減圧下濃縮して得られた残渣を、酢酸エチル−ヘキサン（２／８，ｖ／ｖ）で懸濁させ、生じた固体を濾取することで、白色固体として標題化合物（９．８ｇ）を得た。【００８６】
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 3.42 (3H, s), 3.48 - 3.70 (4H, m), 3.73 - 3.82 (1H, m), 4.21 - 4.34 (2H, m), 4.42 - 4.53 (2H, m), 4.59 (1H, d, J = 11.4 Hz), 4.73 (1H, d, J = 11.4 Hz), 5.36 (1H, d, J = 8.1 Hz), 5.90 (1H, d, J = 3.9 Hz), 7.20-7.42 (10H, m), 7.57 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.95 (1H, br s)【００８７】
（４）化合物７の合成
化合物５（８．０ｇ）のエタノール溶液（２００ｍｌ）に水酸化パラジウム−炭素（１０ｇ，２０ｗｔ％）とシクロヘキセン（２００ｍｌ）を加え、１２時間加熱還流した。不溶物をセライトで濾去し、メタノールで洗浄した。濾液を減圧下濃縮し、得られた粗化合物６は無水ピリジンで２回共沸後、次の反応にそのまま供した。粗化合物６のピリジン溶液（１００ｍｌ）に４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（８．７ｇ）を加え、室温で１８時間攪拌した。反応液にメタノールを加えることで反応を停止させた後、溶媒を減圧下留去した。残渣を酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和食塩水の順で洗浄後、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。乾燥剤を濾去後、減圧下濃縮して得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル/ヘキサン）にて精製し、白色泡状物質として標題化合物（５．８ｇ）を得た。【００８８】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 3.13 (1H, d, J = 9.6 Hz), 3.19 (3H, s), 3.22 (1H, m), 3.45 (1H, d, J = 10.2 Hz), 3.55 (1H, d, J = 10.2 Hz), 3.74 (6H, s), 4.16 (2H, m), 5.26 (1H, br d, exchangeable with D2O), 5.39 (2H, m), 5.82 (1H, d, J = 6.2 Hz), 6.92 (4H, d, J = 8.9 Hz), 7.33 (10H, m), 11.34 (1H, br s, exchangeable with D2O)【００８９】
（５）化合物９の合成
化合物７（５．５ｇ）のテトラヒドロフラン／水混合溶液（１４０ｍｌ，１００／４０ｖ／ｖ）に過ヨウ素酸ナトリウム（２．４ｇ）を加え、室温で４時間激しく攪拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和食塩水の順で洗浄後、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。乾燥剤を濾去後、減圧下濃縮して得られた粗化合物８を、次の反応にそのまま供した。得られた粗化合物８をテトラヒドロフラン（１００ｍｌ）に溶解し、反応液にテトラヒドロホウ素ナトリウム（４２０ｍｇ）を加え、室温で４５分間攪拌した。反応液を氷水にあけ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水洗浄後、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。乾燥剤を濾去後、減圧下濃縮して得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル/ヘキサン）にて精製し、白色泡状物質として標題化合物（４．４ｇ）を得た。【００９０】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 2.95 (1H, s), 3.13 (4H, m), 3.49 (6H, H), 3.74 (6H, s), 4.66, 5.11 (each 1H, each br t, exchangeable with D2O), 5.52 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.07 (1H, m), 6.87 (d, 4H, J = 8.9 Hz), 7.27 (9H, m), 7.50 (1H, d, J = 8.1 Hz), 11.16 (1H, br s, exchangeable with D2O)【００９１】
（６）化合物１０の合成
化合物９（１２０ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（２ｍｌ）に、トリエチルアミン（４２μｌ，０．３０ｍｍｏｌ）および塩化ベンゾイル（２８μｌ，０．２４ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間攪拌した。反応液に氷を加えることで反応を停止し、酢酸エチルで希釈した。有機層を水、飽和食塩水の順に洗浄後、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。乾燥剤を濾去後、減圧下濃縮して得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル/ヘキサン）にて精製し、白色泡状物質として標題化合物（９０ｍｇ）を得た。【００９２】
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 3.26 (5H, m), 3.52 (2H, s), 3.80 (8H, m), 4.41 (2H, d, J = 5.5 Hz), 5.67 (1H, d, J = 8.1 Hz), 6.49 (1H, m), 6.81 (4H, m), 7.40 (13H, m), 7.94 (2H, m), 8.02 (1H, br s)【００９３】
（７）化合物１１の合成
化合物１０（１．８ｇ）のアセトニトリル溶液（９．０ｍｌ）に、室温にて3-(ビス(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノオキシ)プロパンニトリル（１．２３ｍｌ）、１Ｈ−イミダゾール−４，５−ジカルボニトリル（０．３４ｇ）を加え、室温にて２時間撹拌した。反応混合物を飽和重曹水に加え、酢酸エチルにて抽出した。有機層を食塩水にて洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、ろ過して減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル/ヘキサン、０．５％トリエチルアミン添加）およびシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジオールシリカゲル、アセトン/ヘキサン、０．５％トリエチルアミン添加）で精製した。得られた油状化合物を酢酸エチル（6.0ｍｌ）に溶解し、ヘキサン（２００ｍｌ）に滴下して、析出物を濾取し、標題化合物、すなわち、Ｘが酸素原子、Ｔ１が水酸基の保護基、Ｒ１がメチル基、Ｔ２がホスホロアミダイト基、Ｒ２が水素原子、Ｒ３がベンゾイルオキシ基、Ｂがウラシルである本発明の式（Ｉ）の開環型修飾核酸モノマー化合物（１．１８ｇ）を得た。【００９４】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 1.07 - 1.19 (12H, m), 2.52 - 2.59 (2H, m), 3.11 - 3.34 (5H, m), 3.43 - 3.60 (4H, m), 3.63 - 3.90 (4H, m), 3.78 (6H, s), 4.34 - 4.42 (2H, m), 5.66 (1H, dd, J = 8.1, 2.4 Hz), 6.49 - 6.62 (1H, m), 6.76 - 6.83 (4H, m), 7.15 - 7.60 (13H, m), 7.90 - 7.98 (3H, m).【００９５】
実施例２
実施例１で合成した化合物のジアステレオ異性体の合成
以下に示すＳｃｈｅｍｅ２の合成ルートに沿って、実施例１で合成した化合物のジアステレオ異性体を合成した。
【化２７】
2014069520.tif 000029
【００９６】
（１）化合物１３の合成
自体公知の方法で製造した化合物１２（５０ｇ）をＴＨＦ（６００ｍｌ）に溶解して得られた溶液に、０℃にて６０％水素化ナトリウム（５．９９ｇ）を少しずつ加えた後、室温にて３０分撹拌した。０℃にて反応混合物にヨウ化メチル（９．３７ｍｌ）を加え、室温にて２時間撹拌した。氷水中に反応混合物を加え、酢酸エチルにて抽出した。得られた有機層を、飽和塩化アンモニウム、食塩水にて洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、ろ過して減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル/ヘキサン）で精製して標題化合物（５０．１ｇ）を得た。【００９７】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 1.32 (3H, s), 1.50 (3H, s), 3.30 (3H, s), 3.39 (1H, d, J = 10.5 Hz), 3.63 (1H, d, J = 10.5 Hz), 3.76 (1H, d, J = 11.0 Hz), 3.98 (1H, d J = 11.0 Hz), 4.19 (1H, d, J = 5.1 Hz), 4.52 - 4.61 (3H, m), 4.66 (1H, d, J = 12.0 Hz), 4.75 (1H, d, J = 12.3 Hz), 5.76 (1H, d, J = 3.9 Hz), 7.20 - 7.38 (10H, m).【００９８】
（２）化合物１５の合成
化合物１３（５０ｇ）の酢酸溶液（２００ｍｌ）に、室温にて無水酢酸（６８．３ｍｌ）、硫酸（０．３２ｍｌ）を加え、室温にて２時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル／水の混合液に加え、炭酸水素ナトリウムにて中和し、酢酸エチルにて抽出した。有機層を、飽和重曹水、食塩水にて洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥した後、ろ過して減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製して化合物１４を油状化合物（４２．４ｇ）として得た。得られた油状化合物（１．０ｇ）のアセトニトリル溶液（１５ｍｌ）に、室温にてウラシル（０．３７ｇ）、Ｎ−（トリメチルシリル）アセトイミド酸トリメチルシリル（１．６０ｍｌ）を加え、窒素雰囲気下、７０℃にて１時間撹拌した。室温に冷却後、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（０．４７ｍｌ）を加え、窒素雰囲気下、４０℃にて２時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却後、飽和重曹水を加えて中和し、酢酸エチルにて抽出した。有機層を水、食塩水にて洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、ろ過して減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製して標題化合物（０．９９ｇ）を得た。【００９９】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 2.03 (3H, s), 3.40 (3H, s), 3.56 (1H, d, J = 10.2 Hz), 3.58 (1H, d, J = 10.0 Hz), 3.68 (1H, d, J = 10.2 Hz), 3.71 (1H, d J = 10.0 Hz), 4.32 (1H, d, J = 5.4 Hz), 4.44 - 4.62 (4H, m), 5.32 (1H, dd, J = 6.6, 5.4 Hz), 5.73 (1H, dd, J = 8.3, 2.3 Hz), 6.26 (1H, d, J = 6.6 Hz), 7.23 - 7.39 (10H, m), 7.76 (1H, d, J = 8.3 Hz), 8.08 (1H, s).【０１００】
（３）化合物１６の合成
化合物１５（２２．１ｇ）のメタノール溶液（２２０ｍｌ）に２５％アンモニア水溶液（１１０ｍｌ）を加えて、室温にて４時間撹拌した。反応混合物を減圧下約半分まで濃縮し、酢酸エチル／ＴＨＦにて抽出した。有機層を食塩水にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、ろ過して、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル/ヘキサン) で精製して標題化合物（１８．６ｇ）を得た。【０１０１】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 3.35 (3H, s), 3.50 - 3.53 (2H, m), 3.60 - 3.70 (2H, m), 3.87 (1H, d, J = 11.4 Hz), 4.22 (1H, d, J = 6.4 Hz), 4.31 - 4.43 (1H, m), 4.50 - 4.66 (3H, m), 4.73 (1H, d, J = 11.4 Hz), 5.69 (1H, d, J = 8.1 Hz), 5.81 (1H, d, J = 3.9 Hz), 7.25 - 7.42 (10H, m), 7.54 (1H, d, J = 8.1 Hz), 8.05 (1H, brs).【０１０２】
（４）化合物１８の合成
化合物１６（０．５ｇ）のエタノール溶液（１０ｍｌ）に、酢酸（１．０ｍｌ）、シクロヘキセン（９．０ｍｌ）、２０重量％水酸化パラジウム／炭素（０．７５ｇ）を加え、終夜加熱還流した。室温に冷却後、セライトにて不溶物を除去し、エタノール／ＴＨＦにて洗浄した。ろ液を減圧下濃縮し、ピリジンにて2回共沸した。得られた粗化合物１７のピリジン溶液（７．０ｍｌ）に４，４’−（クロロ（フェニル）メチレン）ビス（メトキシベンゼン）（０．５４ｇ）を加え、室温にて終夜撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、残渣に酢酸エチルと水を加え、酢酸エチルにて抽出した。有機層を食塩水にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、ろ過して減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル/ヘキサン）で精製して標題化合物（０．４１ｇ）を得た。【０１０３】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 3.16 (1H, brs), 3.28 - 3.39 (2H, m), 3.39 (3H, s), 3.41 - 3.56 (1H, m), 3.55 (1H, d, J = 10.2 Hz), 3.63 (1H, d, J = 10.0 Hz), 3.80 (6H, s), 4.32 (2H, brs), 5.75 (1H, d, J = 8.4 Hz), 5.94 (1H, d, J = 5.7 Hz), 6.86 (4H, d, J = 8.9 Hz), 7.18 - 7.46 (9H, m), 7.69 (1H, d, J = 8.4 Hz), 8.34 (1H, brs).【０１０４】
（５）化合物２０の合成
化合物１８（１．０ｇ）のＴＨＦ／水溶液（２０／７．０ｍｌ）に、室温にて過ヨウ素酸ナトリウム（０．４４ｇ）を加え、４時間撹拌した。水中に反応混合物を加え、酢酸エチル／ＴＨＦにて抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、ろ過して減圧下濃縮した。得られた粗化合物１９のＴＨＦ溶液（２０ｍｌ）に、室温にて水素化ホウ素ナトリウム（７７ｍｇ）を加え、室温にて４０分撹拌した。水中に反応混合物を加え、酢酸エチル／ＴＨＦにて抽出した。有機層を食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、ろ過して減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル/ヘキサン）で精製して標題化合物（０．４４ｇ）を得た。【０１０５】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 3.00 - 3.20 (2H, m), 3.14 (3H, s), 3.35 - 3.54 (6H, m), 3.74 (6H, s), 4.69 (1H, t, J = 5.4 Hz), 5.02 (1H, t, J = 5.9 Hz), 5.51 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.04 - 6.11 (1H, m), 6.87 (4H, d, J = 8.9 Hz), 7.17 - 7.41 (9H, m), 7.50 (1H, d, J = 8.0 Hz), 11.14 (1H, s).【０１０６】
（６）化合物２１ａおよび化合物２１ｂの合成
化合物２０（４．０ｇ）のＴＨＦ溶液（６０ｍｌ）に、０℃にてトリエチルアミン（１．４１ｍｌ）、塩化ベンゾイル（０．９４ｍｌ）を加え、室温にて２時間撹拌した。反応混合物にトリエチルアミン（１．４１ｍｌ）、塩化ベンゾイル（０．９４ｍｌ）を加え、さらに室温にて４時間撹拌した。氷水中に反応混合物を加え、酢酸エチルにて抽出した。有機層を食塩水にて洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、ろ過して減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル/ヘキサン）で精製して標題化合物２１ａ（１．１６ｇ）及び２１ｂ（１．０７ｇ）を得た。【０１０７】
化合物２１ａ
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 2.16 (1H, t, J = 6.6 Hz), 3.21 - 3.33 (2H, m), 3.27 (3H, s), 3.54 (1H, d, J = 10.5 Hz), 3.62 (1H, d, J = 10.5 Hz), 3.64 - 3.81 (2H, m), 3.78 (6H, s), 4.36 (2H, d, J = 5.4 Hz), 5.69 (1H, d, J = 8.3 Hz), 6.52 (1H, t, J = 5.4 Hz), 6.82 (4H, d, J = 9.0 Hz), 7.16 - 7.64 (13H, m), 7.81 - 7.99 (3H, m).【０１０８】
化合物２１ｂ
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 2.10 - 2.23 (1H, m), 3.21 - 3.38 (2H, m), 3.30 (3H, s), 3.52 (1H, d, J = 10.5 Hz), 3.61 - 3.81 (3H, m), 3.75 (6H, s), 4.38 - 4.45 (2H, m), 5.82 (1H, d, J = 8.3 Hz), 6.57 (1H, t, J = 5.7 Hz), 6.76 - 6.85 (4H, m), 7.15 - 7.43 (9H, m), 7.55 - 7.65 (3H, m), 7.81 - 7.98 (4H, m).【０１０９】
（７）化合物２２の合成
化合物２１ａ（１．０５ｇ）を２回トルエンにて共沸した。得られた残渣のアセトニトリル溶液（１０．５ｍｌ）に、室温にて３−（ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノオキシ）プロパンニトリル（０．７２ｍｌ）、１Ｈ−イミダゾール−４，５−ジカルボニトリル（０．２０ｇ）を加え、室温にて２時間撹拌した。反応混合物を飽和重曹水に加え、酢酸エチルにて抽出した。有機層を食塩水にて洗浄し、無水硫酸マグネシウムにて乾燥後、ろ過して減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン、０．５％トリエチルアミン添加）およびシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジオールシリカゲル、アセトン／ヘキサン、０．５％トリエチルアミン添加）で精製した。得られた油状化合物を酢酸エチル（６．０ｍｌ）に溶解し、ヘキサン（２００ｍｌ）に滴下して、析出物を濾取し、標題化合物、すなわち、実施例１で合成された化合物のジアステレオ異性体（７６３ｍｇ）を得た。【０１１０】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 1.02 - 1.18 (12H, m), 2.47 - 2.57 (2H, m), 3.20 - 3.37 (5H, m), 3.44 - 3.87 (8H, m), 3.77 (6H, s), 4.29 - 4.34 (1H, m), 5.66 (1H, d, J = 7.8 Hz), 6.56 (1H, t, J = 5.4 Hz), 6.81 (4H, d, J = 8.7 Hz), 7.15 - 7.32 (7H, m), 7.36 - 7.60 (6H, m), 7.84 - 8.00 (3H, m).【０１１１】
参考例１
2014069520.tif 000030
以下に示すＳｃｈｅｍｅ３の合成ルートに沿って、Ｘが酸素原子、Ｔ１が水酸基の保護基、Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチルクロロジフェニルシリル基、Ｔ２がホスホロアミダイト基、Ｒ２が水素原子、Ｒ３がベンゾイルオキシ基、Ｂがウラシルである式（Ｉ）の化合物の類似化合物を合成した。
【化２８】
2014069520.tif 000031
【０１１２】
（１）化合物２３の合成
化合物１（５０．０ｇ）の無水ＤＭＦ（２５０ｍｌ）溶液にイミダゾール（１２．８ｇ）およびｔｅｒｔ−ブチルクロロジフェニルシラン（４８．７ｍｌ）を加えた。反応混合物を室温で３日間撹拌した。反応混合物に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウム水溶液と食塩水で順に洗浄した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製して標題化合物（７６．７ｇ）を得た。【０１１３】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 1.03 (9H, s), 1.28 (3H, s), 1.29 (3H, s), 3.60-3.66 (1H, m), 3.70-3.76 (1H, m), 4.01-4.11 (2H, m), 4.20 (1H, d, J = 5.3 Hz), 4.42-4.70 (5H, m), 5.76 (1H, d, J = 3.9 Hz), 7.20-7.43 (16H, m), 7.62-7.72 (4H, m).【０１１４】
（２）化合物２４の合成
化合物２３（７６．７ｇ）の酢酸（２７７ｍｌ）溶液に無水酢酸（６９．８ｍｌ）および濃硫酸（０．１４１ｍｌ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。氷冷下で反応混合物に２規定水酸化ナトリウム水溶液（２ｍｌ）を加え、バス温２５度で溶媒を減圧下留去した。残渣に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウム水溶液と食塩水で順に洗浄した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製して標題化合物（７６．１ｇ）を得た。【０１１５】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 1.03 (9H, s), 1.80 (3H, s), 1.91 (3H, s), 3.64 (1H, d, J = 9.8 Hz), 3.82-3.90 (2H, m), 3.95-4.00 (1H, m), 4.38-4.63 (5H, m), 5.26 (1H, d, J = 4.9 Hz), 6.07 (1H, s), 7.13-7.43 (16H, m), 7.68 (4H, dd, J = 11.4, 7.5 Hz).【０１１６】
（３）化合物２５の合成
化合物２４（７６．１ｇ）の無水アセトニトリル（５００ｍｌ）溶液にウラシル（１５．０ｇ）およびＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（６８．１ｍｌ）を加えた。反応混合物を窒素雰囲気下、９０度で１時間撹拌した。反応混合物を６０度まで放冷したのち、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（２４．２ｍｌ）を加えた。反応混合物を窒素雰囲気下、９０度で６時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、酢酸エチルおよびヘキサンを加えた。反応混合物を炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製して標題化合物（３８．４ｇ）を得た。【０１１７】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 1.04 (9H, s), 1.93 (3H, s), 3.64-3.81 (3H, m), 3.92 (1H, d, J = 11.0 Hz), 4.35 (1H, d, J = 5.5 Hz), 4.46-4.59 (4H, m), 5.27-5.36 (2H, m), 6.08 (1H, d, J = 5.6 Hz), 7.17-7.47 (16H, m), 7.60 (4H, dd, J = 9.5, 7.5 Hz), 7.72 (1H, d, J = 8.2 Hz), 8.94 (1H, s).【０１１８】
（４）化合物２６の合成
化合物２５（１０．６ｇ）のメタノール（１０６ｍｌ）溶液に２８％アンモニア水（８４．９ｍｌ）を加え、室温で２４時間撹拌した。溶媒を減圧下留去し、残渣を酢酸エチルとＴＨＦの混合物で抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄し、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製して標題化合物（９．９７ｇ）を得た。【０１１９】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 1.06 (9H, s), 3.51-3.62 (2H, m), 3.72-3.83 (3H, m), 4.25-4.48 (4H, m), 4.58-4.66 (1H, m), 4.69-4.76 (1H, m), 5.38 (1H, d, J = 7.9 Hz), 5.94 (1H, d, J = 4.5 Hz), 7.14-7.47 (17H, m), 7.59-7.68 (4H, m), 8.92 (1H, brs).【０１２０】
（５）化合物２７の合成
化合物２６（９．９７ｇ）のエタノール（２８８ｍｌ）溶液に２０％水酸化パラジウム（５０％含水）（１０．１ｇ）を加えた。反応混合物を水素雰囲気下、室温で１６時間撹拌後、不溶物をセライトを用いてろ別した。ろ液を減圧下濃縮し、標題化合物（７．１９ｇ）を得た。【０１２１】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 0.97 (9H, s), 3.61-3.86 (4H, m), 4.09 (1H, d, J = 5.3 Hz), 4.22 (1H, dd, J = 7.6, 5.3 Hz), 5.71 (1H, dd, J = 7.9, 2.3 Hz), 5.88 (1H, d, J = 7.6 Hz), 7.36-7.49 (6H, m), 7.65-7.74 (4H, m), 7.90 (1H, d, J = 8.3 Hz), 11.35 (1H, d, J = 1.9 Hz).【０１２２】
（６）化合物２８の合成
化合物２７（７．１９ｇ）の無水ピリジン（９４ｍｌ）溶液に、塩化４，４’−ジメトキシトリチル（４．９９ｇ）を加えた。反応混合物を室温で１８時間撹拌後、溶媒を減圧下留去した。残渣に酢酸エチルを加え、１０％クエン酸水溶液と炭酸水素ナトリウム水溶液で順に洗浄した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製して標題化合物（８．６３ｇ）を得た。【０１２３】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 0.99 (9H, s), 3.18 (1H, d, J = 10.2 Hz), 3.51 (1H, d, J = 10.6 Hz), 3.55 (1H, d, J = 4.2 Hz), 3.68 (1H, d, J = 10.6 Hz), 3.77 (6H, s), 3.95 (2H, d, J = 10.6 Hz), 4.42-4.50 (1H, m), 4.50-4.56 (1H, m), 5.41 (1H, d, J = 8.3 Hz), 5.93 (1H, d, J = 5.7 Hz), 6.76-6.84 (4H, m), 7.17-7.62 (20H, m), 8.85 (1H, brs).【０１２４】
（７）化合物３０の合成
化合物２８（８．６３ｇ）のＴＨＦ（１７５ｍｌ）溶液に、水（１７．５ｍｌ）および過ヨウ素酸ナトリウム（２．７２ｇ）を加えた。反応混合物を室温で２４時間撹拌後、水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。得られた粗化合物２９の無水ＴＨＦ（１７５ｍｌ）溶液に水素化ホウ素ナトリウム（０．４８１ｇ）を加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌後、水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。抽出液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製して標題化合物（４．３５ｇ）を得た。【０１２５】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (9H, s), 3.15 (1H, d, J = 9.8 Hz), 3.28 (1H, d, J = 9.8 Hz), 3.42-3.52 (2H, m), 3.62-3.76 (10H, m), 4.71 (1H, t, J = 4.7 Hz), 5.03-5.09 (1H, m), 5.47 (1H, dd, J = 7.9, 1.9 Hz), 6.20 (1H, t, J = 5.1 Hz), 6.82 (4H, dd, J = 9.1, 1.9 Hz), 7.15-7.58 (20H, m), 11.15 (1H, d, J = 1.9 Hz).【０１２６】
（８）化合物３１の合成
化合物３０（３．５３ｇ）およびトリエチルアミン（０．６５６ｇ）の無水ＴＨＦ（４３．２ｍｌ）溶液に、塩化ベンゾイル（０．７２９ｇ）を０度で滴下した。反応混合物を０度で２時間、室温で１８時間撹拌した。反応混合物を氷水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄し、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製して標題化合物（２．０８ｇ）を得た。【０１２７】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (9H, s), 3.16-3.32 (2H, m), 3.61-3.81 (10H, m), 4.35 (2H, d, J = 5.7 Hz), 4.88 (1H, t, J = 4.5 Hz), 5.52 (1H, dd, J = 8.1, 2.1 Hz), 6.64 (1H, t, J = 5.5 Hz), 6.79 (4H, dd, J = 9.1, 1.1 Hz), 7.16-7.69 (23H, m), 7.82-7.89 (2H, m), 11.29 (1H, d, J = 1.9 Hz).【０１２８】
（９）化合物３２の合成
化合物３１（１．４３ｇ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３０１ｇ）の無水ＴＨＦ（１５．５ｍｌ）溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロ亜ホスホルアミド酸２−シアノエチル（０．３８６ｇ）を−７８度で加えた。反応混合物をゆっくり室温まで昇温し、室温で３時間撹拌した。反応混合物に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウム水溶液と食塩水で順に洗浄した。溶媒を減圧下留去し、残渣をアミノプロピルシラン結合シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製して標題化合物、すなわち、Ｘが酸素原子、Ｔ１が水酸基の保護基、Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチルクロロジフェニルシリル基、Ｔ２がホスホロアミダイト基、Ｒ２が水素原子、Ｒ３がベンゾイルオキシ基、Ｂがウラシルである式（Ｉ）の化合物の類似化合物（１．３０ｇ）を得た。【０１２９】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 0.97 (9H, d, J = 4.3 Hz), 1.07 (6H, dd, J = 6.7, 2.8 Hz), 1.14 (6H, d, J = 6.7 Hz), 2.43-2.55 (2H, m), 3.28-4.38 (18H, m), 5.56 (1H, dd, J = 8.1, 2.0 Hz), 6.55-6.69 (1H, m), 6.76 (4H, d, J = 8.7 Hz), 7.16-7.61 (23H, m), 7.88 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.99-8.15 (1H, m).【０１３０】
実施例３
2014069520.tif 000032
以下に示すＳｃｈｅｍｅ４の合成ルートに沿って、Ｘが酸素原子、Ｔ１が水酸基の保護基、Ｒ１がメチル基、Ｔ２がホスホロアミダイト基、Ｒ２が水素原子、Ｒ３がトリフルオロアセチルアミノ基、Ｂがウラシルである本発明の式（Ｉ）の開環型修飾核酸モノマー化合物を合成した。
【化２９】
2014069520.tif 000033
【０１３１】
（１）化合物３４の合成
化合物１０（３．００ｇ）の無水ピリジン（１５ｍｌ）溶液にｔｅｒｔ−ブチルクロロジメチルシラン（１．３０ｇ）を加えた。反応混合物を室温で２日間撹拌したのち、水（３ｍｌ）とメタノール（６０ｍｌ）を加えた。反応混合物（化合物３３を含有）に、８規定水酸化ナトリウム水溶液（２．６９ｍｌ）を０度で加え、０度で２．５時間撹拌した。反応混合物に飽和塩化ナトリウム水溶液（３０ｍｌ）を加え、室温で１０分間撹拌した。反応混合物を水（３００ｍｌ）に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。抽出液を１０％クエン酸水溶液（１００ｍｌ）および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で順に洗浄し、溶媒を減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製して標題化合物（３．００ｇ）を得た。【０１３２】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: -0.04 (3H, s), 0.00 (3H, s), 0.82 (9H, s), 2.93 (1H, dd, J = 9.3, 3.2 Hz), 3.17-3.30 (5H, m), 3.40-3.55 (2H, m), 3.58-3.82 (10H, m), 5.60 (1H, d, J = 7.9 Hz), 6.11 (1H, dd, J = 7.2, 3.8 Hz), 6.79-6.85 (4H, m), 7.18-7.39 (9H, m), 7.49 (1H, d, J = 7.9 Hz), 8.80 (1H, s).【０１３３】
（２）化合物３５の合成
化合物３４（３．００ｇ）の無水ピリジン（８５ｍｌ）溶液に塩化メタンスルホニル（０．６５７ｍｌ）を０度で滴下した。反応混合物を室温で２日間撹拌したのち、無水エタノール（３ｍｌ）を加え、室温で１０分間撹拌した。溶媒を減圧下濃縮し、残渣に酢酸エチルを加え、不溶物を濾去した。濾液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製して標題化合物（２．９３ｇ）を得た。【０１３４】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: -0.01 (3H, s), 0.01 (3H, s), 0.83 (9H, s), 2.92 (3H, s), 3.11-3.30 (5H, m), 3.53 (2H, s), 3.72 (2H, s), 3.80 (6H, s), 4.18-4.29 (2H, m), 5.67 (1H, dd, J = 7.9, 2.3 Hz), 6.42 (1H, t, J = 4.3 Hz), 6.79-6.87 (4H, m), 7.18-7.41 (9H, m), 7.50 (1H, d, J = 8.3 Hz), 8.46 (1H, d, J = 1.5 Hz).【０１３５】
（３）化合物３７の合成
化合物３５（２．９３ｇ）の無水ＤＭＦ（３７．３ｍｌ）溶液にアジ化ナトリウム（０．７２８ｇ）を加え８０度で１６時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、酢酸エチルを加え、食塩水で２度洗浄した。溶媒を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製して化合物３６（１．０３ｇ）、および標題化合物（０．３９ｇ）を得た。化合物３６（１．０３ｇ）のＴＨＦ（１４．１ｍｌ）溶液に１Ｍフッ化テトラブチルアンモニウム（４．２２ｍｌ）を加え、室温で１６時間撹拌した。溶媒を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製して標題化合物（０．８０ｇ）を得た。【０１３６】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 2.28 (1H, t, J = 6.2 Hz), 3.18-3.39 (6H, m), 3.51 (3H, d, J = 3.0 Hz), 3.69-3.87 (8H, m), 5.67 (1H, d, J = 8.3 Hz), 6.22 (1H, dd, J = 5.7, 4.2 Hz), 6.80-6.88 (4H, m), 7.20-7.33 (7H, m), 7.36-7.41 (2H, m), 7.50 (1H, d, J = 7.9 Hz), 8.37 (1H, brs).【０１３７】
（４）化合物３９の合成
化合物３７（０．８０ｇ）の無水ＴＨＦ（１３．０ｍｌ）溶液にトリフェニルホスフィン（０．４０８ｇ）を加え、室温で２時間攪拌した。反応混合物に水（０．２５７ｍｌ）を加え、室温で２４時間撹拌した。溶媒を減圧下濃縮し、得られた粗化合物３８に無水メタノール（１３．０ｍｌ）を加えた。反応混合物に４−ジメチルアミノピリジン（０．０７９ｇ）およびトリフルオロ酢酸エチル（０．４６２ｍｌ）を加え、室温で２日間撹拌した。溶媒を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製して標題化合物（０．７２ｇ）を得た。【０１３８】
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 3.21 (3H, s), 3.24 (2H, s), 3.31 (1H, dd, J = 13.4, 8.9 Hz), 3.44 (2H, s), 3.64 (1H, d, J = 12.8 Hz), 3.70-3.77 (1H, m), 3.80 (6H, s), 3.85-3.91 (1H, m), 5.68 (1H, d, J = 7.9 Hz), 6.17 (1H, dd, J = 8.9, 3.6 Hz), 6.80-6.87 (4H, m), 7.19-7.42 (11H, m), 8.16 (1H, brs).【０１３９】
（５）化合物４０の合成
化合物３９（１．０４ｇ）の無水ＴＨＦ（１５．１ｍｌ）溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３９５ｍｌ）を加え、−７８度に冷却した。反応混合物にＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロ亜ホスホルアミド酸２−シアノエチル（０．４３０ｇ）を加え、−７８度で２時間撹拌した。反応混合物をゆっくり室温まで昇温し、室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、さらにアミノプロピルシラン結合シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）で精製して標題化合物、すなわち、Ｘが酸素原子、Ｔ１が水酸基の保護基、Ｒ１がメチル基、Ｔ２がホスホロアミダイト基、Ｒ２が水素原子、Ｒ３がトリフルオロアセチルアミノ基、Ｂがウラシルである本発明の式（Ｉ）の開環型修飾核酸モノマー化合物（１．０２ｇ）を得た。【０１４０】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 1.03 (6H, dd, J = 6.6, 2.5 Hz), 1.11 (6H, d, J = 6.8 Hz), 2.67 (2H, t, J = 5.9 Hz), 3.01 (1H, dd, J = 9.1, 3.0 Hz), 3.13-3.22 (4H, m), 3.35-3.72 (10H, m), 3.74 (6H, s), 5.55 (1H, dd, J = 7.9, 2.6 Hz), 6.16 (1H, t, J = 4.7 Hz), 6.86 (4H, d, J = 8.7 Hz), 7.17-7.38 (9H, m), 7.45 (1H, dd, J = 7.9, 4.2 Hz), 9.55 (1H, q, J = 5.7 Hz), 11.24 (1H, s).
MS (ESI+): [M-H]+ 886.3.【０１４１】
実施例４
2014069520.tif 000034
以下に示すＳｃｈｅｍｅ５の合成ルートに沿って、Ｘが酸素原子、Ｔ１が水酸基の保護基、Ｒ１がメチル基、Ｔ２がホスホロアミダイト基、Ｒ２が水素原子、Ｒ３がｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ基、Ｂがアデニンである本発明の式（Ｉ）の開環型修飾核酸モノマー化合物を合成した。
【化３０】
2014069520.tif 000035
略語
ＢＳＡ：Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド
ＨＦＩＰ：１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロパノール
ＤＭＴｒ：４，４´−ジメトキシトリチル
ＴＢＳ：ｔ−ブチルジメチルシリル【０１４２】
（１）化合物２ａの合成
化合物１ａ（２４．０ｇ）、水素化ナトリウム（２．９ｇ、６０％ミネラルオイル混合物）およびヨウ化メチル（４．５ｍｌ）をテトラヒドロフラン（２００ｍｌ）中に混合し、反応液を室温で１７時間攪拌した。反応液に氷を加え、反応を停止後、混合物を酢酸エチルと水で分配した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤を濾去後、濃縮した。試薬由来ミネラルオイルを除くため、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）で簡易精製し、粗化合物２ａを油状化合物として得た。粗化合物２ａは更なる精製はせず、次反応に用いた。【０１４３】
（２）化合物３ａの合成
前述の粗化合物２ａ、無水酢酸（２０ｍｌ）および硫酸（４０μｌ）を酢酸（８０ｍｌ）中に混合し、反応液を室温で２時間攪拌した。溶媒および過剰の試薬を減圧下留去し、残渣を酢酸エチルで希釈した。有機層を飽和重曹水で２回、水で１回、飽和食塩水で１回洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤を濾去後、濃縮した。残渣をトルエンで２回共沸し、得られた粗化合物３ａは更なる精製はせず、次反応に用いた。【０１４４】
（３）化合物４ａの合成
前述の粗化合物３ａ、N６−ベンゾイルアデニン (１６．９ g)およびＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（３４．５ｍｌ）をアセトニトリル（２００ｍｌ）中混合し、反応液を２０分間還流した。反応液にトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（１６ｍｌ）を加え、さらに２時間還流した。反応を飽和重曹水で停止させた後、混合物を酢酸エチルと飽和重曹水で分配した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤を濾去後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）で精製し、化合物４ａ（２４ｇ）を泡状化合物として得た。【０１４５】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.24 (br s, 1H, exchangeable with D2O), 8.71, 8.58 (each s, each 1H), 8.04 (d, 2H, J = 7.0 Hz), 7.67-7.53 (m, 3H), 7.39-7.28 (m, 10H), 6.35 (d, 1H, J = 6.0 Hz), 6.11 (t, 1H, J = 5.7 Hz), 4.70 (d, 1H, J = 5.5 Hz), 4.64 (d, 1H, J = 11.5 Hz), 4.59 (d, 1H, J = 11.5 Hz), 4.53 (m, 2H), 3.70 (s, 2H), 3.65 (d, 1H, J = 10.4 Hz), 3.59 (d, 1H, J = 10.4 Hz), 3.28 (s, 3H), 2.02 (d, 3H).【０１４６】
（４）化合物５ａの合成
化合物４ａ（１３．０ｇ）を３３％メチルアミンのメタノール溶液（１２０ｍｌ）に溶解し、反応液を室温下１５時間静置した。溶媒および過剰のメチルアミンを減圧下留去した後、生じた固体を濾取した。濾液を濃縮し、得られた固体もさらに濾取した。固体を乾燥し、化合物５（９．０ｇ）を白色固体として得た。【０１４７】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.23, 8.12 (each s, each 1H), 7.42-7.27 (m, 10H), 5.97 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 5.62 (d, 1H, J = 6.6 Hz), 5.05 (m, 1H), 4.88 (d, 1H, J = 11.7 Hz), 4.50 (d, 1H, J = 10.9 Hz), 4.53 (s, 2H), 4.25 (d, 1H, J = 4.9 Hz), 3.66 (br s, 2H), 3.60 (d, 1H, J = 10.2 Hz), 3.55 (d, 1 H, J = 10.2 Hz), 3.28 (s, 1H), 3.25 (s, 3 H).【０１４８】
（５）化合物６ａの合成
化合物５ａ（２．４ｇ）、蟻酸（１０ｍｌ）および２０％水酸化パラジウム−炭素（５０％ｗｔ、１．２ｇ）をメタノール（１００ｍｌ）中に混合し、反応液を室温下２日間攪拌した。不溶物をセライト濾去し、濾液を濃縮した。残渣をエタノールとトルエンで共沸して残存した蟻酸を除いて、得られた粗化合物６ａは更なる精製はせず、次反応に用いた。【０１４９】
（６）化合物７ａの合成
粗化合物６ａ（１．８ｇ）および塩化ベンゾイル（５．４ｍｌ）を、氷冷下ピリジン（１００ｍｌ）に溶解し、反応液を５分間攪拌した。反応液を徐々に室温に戻し、さらに１８時間攪拌した。反応をメタノールで停止し、溶媒を減圧下留去した。残渣を酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和食塩水の順で洗浄した。あわせた水層から酢酸エチルで逆抽出し、全ての有機層をあわせて硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤を濾去後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）で精製し、化合物７ａ（４．３ｇ）を泡状化合物として得た。【０１５０】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.85, 8.44 (each s, each 1H), 7.99 (m, 4H), 7.82-7.40 (m, 21H), 6.82 (d, 1H, J = 5.5 Hz), 6.64 (t, 1H, J = 6.0 Hz), 6.38 (d, 1H, J = 6.4 Hz), 4.76 (d, 1H, J = 11.7 Hz), 4.67 (d, 1H, J = 11.7 Hz), 3.93 (s, 2H), 3.33 (s, 3H).【０１５１】
（７）化合物８ａの合成
化合物７ａ（４．３ｇ）をテトラヒドロフラン（４８ｍｌ）とメタノール（１６ｍｌ）の混合溶媒に溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（８ｍｌ）を加え、反応液を室温で３０分間攪拌した。反応をクエン酸水溶液で停止し、混合物を酢酸エチル−メタノール−水で分配した。有機層を分離し、水層から酢酸エチル−メタノール（３回）および酢酸エチル−テトラヒドロフラン（１回）で逆抽出し、全ての有機層をあわせて硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤を濾去後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル−メタノール）で精製し、化合物８ａ（２．０ｇ）を泡状化合物として得た。【０１５２】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.21 (br s, 1H), 8.76, 8.71 (each s, each 1H), 8.05 (d, 2H, J = 7.2 Hz), 7.65 (t, 1H, J = 7.6 Hz), 7.55 (t, 2H, J = 7.6 Hz), 6.05 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 5.45 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 5.25 (d, 1H, J = 4.5 Hz), 5.17 (m, 1H), 4.93 (m, 1H), 4.19 (m, 1H), 3.60 (m, 1H), 3.59 (d, 1H, J = 10.4 Hz), 3.26 (s, 3H), 2.76, 2.65 (each d, each 1H, J = 15.1 Hz).【０１５３】
（８）化合物９ａの合成
化合物８ａ（７００ｍｇ）および塩化４，４´−ジメトキシトリチル（８５０ｍｇ）をピリジン（１０ｍｌ）に溶解し、反応液を室温で１６時間攪拌した。反応を氷で停止し、混合物を酢酸エチルと水で分配した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、あわせた水層は酢酸エチルで逆抽出した。全ての有機層をあわせて硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤を濾去後、濃縮した。残渣をジオールシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）で精製し、化合物９ａ（６９０  ｍｇ）を泡状化合物として得た。【０１５４】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.18 (br s, 1H), 8.57, 8.46 (each s, each 1H), 8.04 (d, 2H, J = 7.2 Hz), 7.64 (m, 1H), 7.54 (m, 2H), 7.40 (m, 2H), 7.32-7.22 (m, 7H), 6.88 (m, 4H), 6.59 (d, 1H, J = 7.4 Hz), 5.46 (d, 1H, J = 7.0 Hz), 5.37 (d, 1H, J = 4.9 Hz), 4.95 (m, 1H), 4.29 (m, 1H), 3.74 (d, 1H, J = 10.4 Hz), 3.74 (s, 6H), 3.63 (d, 1H, J = 10.4 Hz), 3.29 (d, 1H, J = 9.4 Hz), 3.27 (s, 3H), 3.22 (d, 1H, J = 9.4 Hz).【０１５５】
（９）化合物１０ａの合成
化合物９ａ（５３０ｍｇ）と過ヨウ素酸ナトリウム（１７３ｍｇ）をテトラヒドロフラン（２２．５ｍｌ）と水（４．５ｍｌ）中で混合し、反応液を室温で１７時間攪拌した。反応液を酢酸エチルと水で分配し、有機層を飽和重曹水、飽和食塩水の順に洗浄した。あわせた水層を酢酸エチルで逆抽出し、全ての有機層をあわせて硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤を濾去後、濃縮した。得られた粗化合物１０ａは、アルデヒド水和物との平衡混合物であり、更なる精製はせず、次反応に用いた。【０１５６】
（１０）化合物１１ａの合成
水素化ホウ素ナトリウム（３７８ｍｇ）をテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）に懸濁し、アルゴン雰囲気下１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロパノール（６．２ｍｌ）を加え、室温で１５時間攪拌した。本液（１５．８ｍｌ）を別の容器に移し、前述の粗化合物１０ａ、塩化リチウム（６３ｍｇ）およびテトラヒドロフラン（７．４ｍｌ）を加え、反応液を５０℃で１８時間攪拌した。反応を飽和塩化アンモニウム水溶液で停止し、混合物を酢酸エチルと水で分配した。有機層を飽和重曹水、飽和食塩水の順で洗浄し、あわせた水層を酢酸エチルで逆抽出した。全ての有機層をあわせて硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤を濾去後、濃縮した。残渣をエタノールで共沸した後、アミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル−メタノール）で精製し、化合物１１ａ（４４４ｍｇ）を泡状化合物として得た。【０１５７】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.13 (br s, 1H, exchangeable with D2O), 8.66, 8.42 (each s, each 1H), 8.06 (d, 2H, J = 7.2 Hz), 7.67-7.53 (m, 3H), 7.33-7.14 (m, 9H), 6.85 (d, 4H, J = 8.7 Hz), 6.37 (dd, 1H, J = 5.5, 6.2 Hz), 5.19 (t, 1H, J = 5.7 Hz, exchangeable with D2O), 4.70 (t, 1H, J = 5.5 Hz, exchangeable with D2O), 3.80 (m, 2H), 3.73 (s, 6H), 3.61 (m, 1H), 3.50 (m, 1H), 3.41 (s, 2H), 3.09 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 2.89 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 2.85 (s, 3H).【０１５８】
（１１）化合物１２ａの合成
化合物１１ａ（１４０ｍｇ）をピリジン（２ｍｌ）に溶解し、氷冷下で塩化ｔ−ブチルジメチルシラン（８８ｍｇ）を加え、反応液を徐々に室温に戻しながら１５時間攪拌した。反応をメタノールで停止し、溶媒を減圧下留去した。残渣を酢酸エチルで希釈し、有機層を飽和重曹水、飽和食塩水の順で洗浄した。あわせた水層を酢酸エチルで逆抽出し、全ての有機層をあわせて硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤を濾去後、濃縮した。残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル−メタノール）で精製し、化合物１２ａ（６８ｍｇ）を泡状化合物として得た。【０１５９】
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.10 (br s, 1H, exchangeable with D2O), 8.67, 8.43 (each s, each 1H), 8.05 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.67-7.52 (m, 3H), 7.35-7.17 (m, 9H), 6.86 (d, 4H, J = 8.9 Hz), 6.43 (dd, 1H, J = 4.9, 6.3 Hz), 4.75 (t, 1H, J = 4.9 Hz, exchangeable with D2O), 3.96 (m, 2H), 3.73 (s, 6H), 3.61 (m, 1H), 3.50 (m, 1H), 3.42 (s, 2H), 3.13 (d, 1H, J = 9.1 Hz), 2.93 (d, 1H, J = 9.1 Hz), 2.89 (s, 3H), 0.63 (s, 9H), -0.11, -0.20 (each s, each 3H).【０１６０】
（１２）化合物１３ａの合成
化合物１２ａ（１６０ｍｇ）、２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（７９μｌ）および４，５−ジシアノ−１Ｈ−イミダゾール（２７ｍｇ）をアセトニトリル（２ｍｌ）に溶解し、反応液を室温で６時間攪拌した。反応を飽和重曹水で停止し、混合物を酢酸エチルと飽和重曹水で分配した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤を濾去後、濃縮した。残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）で精製し、化合物１３ａ（１０２ｍｇ、ジアステレオ混合物）を泡状化合物として得た。【０１６１】
31P NMR (121 MHz, DMSO-d6) δ 146.91, 146.78 (each s)【０１６２】
実施例５
2014069520.tif 000036
実施例１および２で合成した本発明の式（Ｉ）の開環型修飾核酸モノマー化合物である化合物１１および化合物２２をそれぞれ用いて、ホスホロアミダイト法により、Ｘが酸素原子、Ｒ１がメチル基、Ｒ２が水素原子、Ｒ３が水酸基、Ｂがウラシルである式（ＩＩ）の部分構造を有するｓｉＲＮＡを合成した。【０１６３】
（１）オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドの合成は、ＤＮＡ自動合成機（Ｈ−８型合成機）を用いた一般的な固相ホスホロアミダイト法で行った。ビルディングユニットとなる各ホスホロアミダイトブロックおよび固相担体は、実施例１および２で合成したそれぞれのアミダイトブロックである化合物１１および化合物２２を除き、市販のものを用いた。例えば、１マイクロモルスケールの合成後、固相担体に担持されたオリゴヌクレオチドにメチルアミン水溶液（０．５ｍｌ）を加え、５０〜６０℃で１．５時間加熱した。固相担体を濾去し、ジメチルスルホキシド（１．０ｍｌ）で洗浄し、あわせた濾液に三フッ化水素トリエチルアミン複合体（０．５ｍｌ）を加え、４０〜５０℃で１．５時間加熱した。反応液をゲルろ過もしくは塩析によって粗オリゴヌクレオチドを分離し、イオン交換カラムもしくは逆相カラムを用いて精製した。【０１６４】
（２）ｓｉＲＮＡの合成
ｓｉＲＮＡは、ＰＢＳ緩衝液中に各ストランドを等モル加え、９０℃で５分間加温した後、室温まで徐冷して合成した。具体的には、以下に示すセンス鎖（配列番号１）、および実施例１で合成した化合物１１から誘導される、Ｘが酸素原子、Ｒ１がメチル基、Ｒ２が水素原子、Ｒ３が水酸基、Ｂがウラシルである式（ＩＩ）の部分構造を１つ含有するアンチセンス鎖（配列番号２）からなるｓｉＲＮＡ（１）を合成した。【０１６５】
ｓｉＲＮＡ（１）：
センス鎖（５’から３’方向）：
C(M)U(M)U(M)AC(M)GC(M)U(M)GAGU(M)AC(M)U(M)U(M)C(M)GAtt（配列番号１）
アンチセンス鎖（５’から３’方向）：
UCGAAGU(K)ACUC(M)AGCGU(M)AAGtt（配列番号２）
ここで、大文字はＲＮＡ、小文字はＤＮＡを表し、Ｎ（Ｍ）は２’−ＯＭｅＲＮＡを表し、Ｕ（Ｋ）は、実施例１で合成された化合物１１から誘導される部分構造であるヌクレオチド単位をオリゴマー中に組み込んだものを表す。【０１６６】
同様にして、実施例２で合成した化合物２２から誘導される、以下に示す、Ｘが酸素原子、Ｒ１がメチル基、Ｒ２が水素原子、Ｒ３が水酸基、Ｂがウラシルである式（ＩＩ）の部分構造を１つ含有するアンチセンス鎖（配列番号３）およびセンス鎖（配列番号１）からなるｓｉＲＮＡ（２）を合成した。【０１６７】
ｓｉＲＮＡ（２）：
センス鎖（５’から３’方法）：
C(M)U(M)U(M)AC(M)GC(M)U(M)GAGU(M)AC(M)U(M)U(M)C(M)GAtt（配列番号１）
アンチセンス鎖（５’から３’方法）：
UCGAAGU(K2)ACUC(M)AGCGU(M)AAGtt（配列番号３）
ここで、大文字はＲＮＡ、小文字はＤＮＡを表し、Ｎ（Ｍ）は２’−ＯＭｅＲＮＡを表し、Ｕ（Ｋ２）は、実施例２で合成された化合物２２から誘導される部分構造であるヌクレオチド単位をオリゴマー中に組み込んだものを表す。【０１６８】
比較例
対照ｓｉＲＮＡとして、実施例１および２で合成した化合物１１および化合物２２を用いる代わりに、ウリジンを用いる以外は、ホスホロアミダイト法により、ほぼ同様にして、以下のセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる対照ｓｉＲＮＡを合成した。
対照ｓｉＲＮＡ
センス鎖（５’から３’方法）：
C(M)U(M)U(M)AC(M)GC(M)U(M)GAGU(M)AC(M)U(M)U(M)C(M)GAtst（配列番号４）
アンチセンス鎖（５’から３’方法）：
UCGAAGU(M)ACUC(M)AGCGU(M)AAGtst（配列番号５）
ここで、大文字はＲＮＡ、小文字はＤＮＡを表し、Ｎ（Ｍ）は２’−ＯＭｅＲＮＡを表し、小文字ｓはホスホロチオエート結合を表す。【０１６９】
試験例
以下のようにして、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃレポータ系を用いた各種ｓｉＲＮＡの評価を行った。
１）Ｄｕａｌ−Ｌｕｃレポータベクターの作製
ＧＬ３ルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（Elbashir SM et al., Nature, Vol.411, 24 May 2001,494-498）のアンチセンス鎖に相補的な配列１９塩基およびその５’側１０塩基と３’側１０塩基を含む配列に制限酵素配列を付加し正方向（配列Ａ）および逆方向（配列Ｂ）にそれぞれｐｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ部位に組み込み、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼを発現するベクター、それぞれＯＦＦ＃０８５およびＯＦＦ＃０８６を構築した。【０１７０】
配列Ａ
センス鎖：
5’-TCGAGGTGGACATCACTTACGCTGAGTACTTCGAAATGTCCGTTGCTAGCGC-3’
（配列番号６）
アンチセンス鎖：
5’-GGCCGCGCTAGCAACGGACATTTCGAAGTACTCAGCGTAAGTGATGTCCACC-3’
（配列番号７）【０１７１】
配列Ｂ
センス鎖：
5’-TCGAGAACGGACATTTCGAAGTACTCAGCGTAAGTGATGTCCACGCTAGCGC-3’
（配列番号８）
アンチセンス鎖：
5’-GGCCGCGCTAGCGTGGACATCACTTACGCTGAGTACTTCGAAATGTCCGTTC-3’
（配列番号９）【０１７２】
２）Ｄｕａｌ−Ｌｕｃレポータ系を用いた各種ｓｉＲＮＡの評価
ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ）を３×１０６個／１０ｍＬ／７５ｃｍ２フラスコに播種した。５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養後、前記１）で得たベクターＯＦＦ＃０８５およびＯＦＦ＃０８６をＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｓｃｈｅ社）を用いて導入しさらに一晩培養した。実施例５および比較例で合成された各種ｓｉＲＮＡをＰＢＳを用いて最終３．３ｎＭと０．００４３ｎＭの２段階または１０ｎＭから５６ｆＭまでの１２段階系列に希釈し、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて１．６×１０４個／１００μＬ／ｗｅｌｌでリバーストランスフェクションした。二晩培養後、Ｄｕａｌ−ＧｌｏＬｕｃＡｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて添付文書に従いホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。ＢＬＯＣＫ−ｉＴＴＭＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（Ｒ）ＲｅｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＯｌｉｇｏ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）を１０ｎＭでリバーストランスフェクションした細胞のルシフェラーゼ活性（ウミシイタケ／ホタル）を１００％として各種ｓｉＲＮＡ導入細胞のルシフェラーゼ活性を計算した。ＩＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ社のＰｒｉｓｍ５を用いて算出した。
得られた結果を表１に示した。【０１７３】
【表１】
2014069520.tif 000037
【０１７４】
表１の結果から明らかなように、本発明の式（Ｉ）の開環型修飾核酸モノマー化合物である実施例１で得られた化合物１１から誘導される部分構造を１つ含有するｓｉＲＮＡ（１）および実施例２で得られた化合物２２から誘導される部分構造を１つ含有するｓｉＲＮＡ（２）は、それらを含まない対照ＲＮＡに比べて、高いルシフェラーゼ発現抑制活性を発揮した。
【産業上の利用可能性】
【０１７５】
本発明の開環型修飾核酸モノマー化合物を少なくとも部分構成の１つとして含むオリゴ核酸類縁体を、例えばsiＲＮＡとして用いた場合には、生物学的安定性や、標的遺伝子発現抑制活性に優れたsiＲＮＡが得られる。また、このようなオリゴ核酸類縁体は、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、デコイ核酸、核酸アプタマー、リボザイムなどとしても使用出来るものである。更には、ＲＮＡプローブ、ＤＮＡプローブ、モレキュラービーコンなどの遺伝子解析ツールとしても利用出来得るものである。
【配列表フリーテキスト】
【０１７６】
配列番号１：実施例５で構築されたｓiＲＮＡ（１）およびｓiＲＮＡ（２）のセンス鎖ＲＮＡ；
配列番号２：実施例１で合成された化合物１１から誘導される部分構造を１つ有する、実施例５で構築されたｓiＲＮＡ（１）のアンチセンス鎖ＲＮＡ；
配列番号３：実施例１で合成された化合物２２から誘導される部分構造を１つ有する、実施例５で構築されたｓiＲＮＡ（２）のアンチセンス鎖ＲＮＡ；
配列番号４：比較例で構築された対照ｓiＲＮＡのセンス鎖ＲＮＡ；
配列番号５：比較例で構築された対照ｓiＲＮＡのアンチセンス鎖ＲＮＡ；
配列番号６：Ｄｕａｌ−ＬｕｃレポーターベクターＯＦＦ♯０８５に組み込んだセンス鎖ＤＮＡ；
配列番号７：Ｄｕａｌ−ＬｕｃレポーターベクターＯＦＦ♯０８５に組み込んだアンチセンス鎖ＤＮＡ；
配列番号８：Ｄｕａｌ−ＬｕｃレポーターベクターＯＦＦ♯０８６に組み込んだセンス鎖ＤＮＡ；
配列番号９：Ｄｕａｌ−ＬｕｃレポーターベクターＯＦＦ♯０８６に組み込んだアンチセンス鎖ＤＮＡ。
【配列表】
2014069520000001.app
【国際調査報告】
2014069520.tif 000042
2014069520.tif 000043