(57)【要約】  本発明は、疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果、及び成長促進効果から選ばれる少なくとも１種以上の効果を有し、安全性が高い乳酸菌を提供することを課題とする。さらには、疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果、及び成長促進効果から選ばれる少なくとも１種以上の効果を有する乳酸菌、又は該乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣を有効成分とする製剤を提供することを課題とする。  本発明によれば、特定の菌学的性質を有し、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上であるエンテロコッカス・フェシウムに属する新規乳酸菌、当該乳酸菌を含有する組成物、当該組成物を有効成分とする疲労改善剤、血流改善剤、便臭改善剤、又は成長促進剤のいずれかの剤、及び当該組成物の食品等への使用が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の菌学的性質を有し、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上であるエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌：
形態学的性質
１）グラム染色：陽性
２）胞子形成能：なし
３）運動性：なし
生理学的性質
１）カタラーゼ：陰性
２）ピルピン酸ナトリウムの分解：陽性
３）エスクリンの分解：陽性
４）ピロリドニル−２−ナフチルアミドの分解：陽性
５）２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの分解：陽性
６）Ｌ−ロイシン−２−ナフチルアミドの分解：陽性
７）Ｌ−アルギン酸の分解：陽性
８）各種炭水化物の分解性
Ｄ−リボース：＋
Ｄ−マンニトール：＋
乳糖：＋
Ｄ−ソルビトール：−
Ｄ−トレハロース：−
Ｄ−ラフィノース：−
【請求項２】
以下の化学分類学的性質を有することを特徴とする請求項１に記載のエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌：
化学分類学的性質
配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１と９０％以上の配列同一性を示す塩基配列を有する。
【請求項３】
エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３６２）、エンテロコッカス・フェシウムＲ２８株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３６１）、又は前記菌株がＤＮＡ変異処理された変異体である、請求項１又は２に記載のエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の乳酸菌、又は該乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣を含有する組成物。
【請求項５】
さらに保護剤を含むことを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
保護剤の含量が乾燥菌体重量に対して１重量％以上であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
保護剤が、ショ糖、トレハロース、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン、リンゴ酸の群から選択される１種以上であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれかに記載の組成物を有効成分とする疲労改善剤。
【請求項９】
請求項４〜７のいずれかに記載の組成物を有効成分とする血流改善剤。
【請求項１０】
請求項４〜７のいずれかに記載の組成物を有効成分とする便臭改善剤。
【請求項１１】
請求項４〜７のいずれかに記載の組成物を有効成分とする成長促進剤。
【請求項１２】
請求項４〜７のいずれかに記載の組成物を含有する食品。
【請求項１３】
請求項４〜７のいずれかに記載の組成物を含有する飼料または動物用医薬品。
【請求項１４】
請求項４〜７のいずれかに記載の組成物を含有する医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）菌種に属する新規乳酸菌、当該乳酸菌を含有する組成物、当該組成物を有効成分とする疲労改善剤、血流改善剤、便臭改善剤、又は成長促進剤のいずれかの剤、及び当該組成物の食品等への使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代人は、過度のストレス、偏った食生活、睡眠不足などの不規則な生活習慣により腸内環境が悪化していると言われている。腸内環境は、健康状態と密接に関係しており、疲労の蓄積、血流障害による冷え性、肩こり、肌荒れ、腰痛といった身近な症状も腸内環境の悪化が原因の一つと捉えられている。これらの症状は不規則な生活習慣を変えることなどで腸内環境が正常な状態に戻れば、改善する可能性があるが、忙しい現代人において生活習慣を変えることは容易ではない。そこで、このような症状を緩和し、安全で日常的、継続的に摂取可能な食品、機能性食品、医薬品が求められている。【０００３】
また、畜産分野においては、生産性の向上を目的とした多頭飼育やワクチンなどの薬剤投与によるストレスが家畜などの腸内環境の悪化を引き起こし、発育の抑制、便臭の悪化、肉質や卵質の低下などの問題が発生している。これらの問題を回避するため、抗生物質などが使用されているが、抗生物質は低濃度ながら長期にわたり投与されることから、抗生物質に対する耐性菌の出現や残留した抗生物質がヒトに与える影響が懸念されている。このような背景から、畜産分野では、上記した問題を回避できる安全で日常的、継続的に使用可能な飼料や飼料添加物が求められている。【０００４】
一方、近年の健康志向などを背景に、ヒトや動物に有益な生理活性を発揮させる成分（いわゆる機能性成分）として、乳酸菌が注目されている。これまでに、ヒトや動物への経口投与によって、整腸作用、抗アレルギー作用、コレステロール低減作用、血圧降下作用など、菌株により様々な生理活性を発揮することが知られている（非特許文献１）。また、最近では、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  Ｌａ１株（ＬＣ１乳酸菌）が脳内ヒスタミン神経系や体内時計の存在する視床下部視交叉上核を介して自律神経制御を行い、血圧や体温などに影響をあたえることが報告されており（非特許文献２）、新規な生理活性を有する乳酸菌株の研究が進められている。【０００５】
以上のように様々な乳酸菌がヒトや動物に有益な生理活性を有することが知られているものの、疲労や血流障害を改善する乳酸菌に関しては有効な効果を示す乳酸菌がないのが現状である。また、疲労や血流障害を改善する乳酸菌を家畜などに与えた際の効果、特に便臭改善や成長促進効果は検討されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆｕｌｌｅｒ，Ｒ．Ｊ  Ａｐｐｌ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９８９；６６：３６５
【非特許文献２】谷田  守他著、「ＬＣ１乳酸菌の自律神経を介する血圧低下作用」肥満研究  Ｖｏｌ．１２  Ｎｏ．３  ２００６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果、及び成長促進効果から選ばれる少なくとも１種以上の効果を有し、安全性が高い乳酸菌を提供することを課題とする。さらには、疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果、及び成長促進効果から選ばれる少なくとも１種以上の効果を有する乳酸菌を有効成分とする製剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに特定の菌学的性質を有し、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上であるエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌が、優れた疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果、及び成長促進効果から選ばれる少なくとも１種以上の効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。【００１０】
[１] 以下の菌学的性質を有し、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上であるエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌：
形態学的性質
１）グラム染色：陽性
２）胞子形成能：なし
３）運動性：なし
生理学的性質
１）カタラーゼ：陰性
２）ピルピン酸ナトリウムの分解：陽性
３）エスクリンの分解：陽性
４）ピロリドニル−２−ナフチルアミドの分解：陽性
５）２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの分解：陽性
６）Ｌ−ロイシン−２−ナフチルアミドの分解：陽性
７）Ｌ−アルギン酸の分解：陽性
８）各種炭水化物の分解性
Ｄ−リボース：＋
Ｄ−マンニトール：＋
乳糖：＋
Ｄ−ソルビトール：−
Ｄ−トレハロース：−
Ｄ−ラフィノース：−【００１１】
[２] 以下の化学分類学的性質を有することを特徴とする[１]に記載のエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌：
化学分類学的性質
配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１と９０％以上の配列同一性を示す塩基配列を有する。【００１２】
[３] エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３６２）、エンテロコッカス・フェシウムＲ２８株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３６１）、又は前記菌株がＤＮＡ変異処理された変異体である、[１]又は[２]に記載のエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌。【００１３】
[４] [１]〜[３]のいずれかに記載の乳酸菌、又は該乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣を含有する組成物。【００１４】
[５] さらに保護剤を含むことを特徴とする[４]に記載の組成物。【００１５】
[６] 保護剤の含量が乾燥菌体重量に対して１重量％以上であることを特徴とする[５]に記載の組成物。【００１６】
[７] 保護剤が、ショ糖、トレハロース、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン、リンゴ酸の群から選択される１種以上であることを特徴とする[５]に記載の組成物。【００１７】
[８] [４]〜[７]のいずれかに記載の組成物を有効成分とする疲労改善剤。【００１８】
[９] [４]〜[７]のいずれかに記載の組成物を有効成分とする血流改善剤。【００１９】
[１０] [４]〜[７]のいずれかに記載の組成物を有効成分とする便臭改善剤。【００２０】
[１１] [４]〜[７]のいずれかに記載の組成物を有効成分とする成長促進剤。【００２１】
[１２] [４]〜[７]のいずれかに記載の組成物を含有する食品。【００２２】
[１３] [４]〜[７]のいずれかに記載の組成物を含有する飼料または動物用医薬品。【００２３】
[１４] [４]〜[７]のいずれかに記載の組成物を含有する医薬品。【００２４】
[１５] 疲労、血流障害、便臭、及び成長不良から選ばれる少なくとも１種以上の状態の改善または緩和に使用するための、[４]〜[７]のいずれかに記載の組成物。【００２５】
[１６] [４]〜[７]のいずれかに記載の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、疲労または血流障害を改善する方法。【００２６】
[１７] [４]〜[７]のいずれかに記載の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、便臭を改善する方法。【００２７】
[１８] [４]〜[７]のいずれかに記載の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、成長促進方法。【００２８】
本発明は、２０１２年７月３１日に出願された日本国特許出願２０１２−１７０１３６号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の特定の菌学的性質を有するエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌は、疲労や血流障害を改善することが認められたことから、本発明の乳酸菌、又は当該乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣を含有する組成物は、安全性が高く、且つ疲労や血流障害の改善作用を有する食品、医薬品に用いることができる。さらに、当該乳酸菌は、便臭改善効果や成長促進効果が認められたことから、本発明の乳酸菌、又は当該乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣を含有する組成物は、畜産分野等において、抗生物質などの薬剤の代替として、安全性が高く、且つ便臭改善効果や成長促進効果を有する飼料、飼料添加物に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明について詳述する。
【００３１】
１．本発明の乳酸菌
本発明の乳酸菌は、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上、好ましくは分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が９０％以上、より好ましくは分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が９５％以上であるエンテロカッコス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）に属する乳酸菌である。
【００３２】
分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％未満、又は４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％未満であると、疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果、及び成長促進効果から選ばれる少なくとも１種以上の効果を有する乳酸菌が得られないため、好ましくない。
【００３３】
本発明の「分散媒非存在下で凍結乾燥を行う」とは、常法により培養した培養液中の菌体を遠心分離器などを用いて集菌し、集菌した菌体に分散媒を添加しないで、水中で菌体を分散させ、凍結乾燥することである。「分散媒」とは、集菌した菌体を均一に分散できる物質であって、生理食塩水、リン酸生理食塩水、保護剤を含有した溶液などが挙げられる。前記「保護剤」とは、凍結や乾燥などが菌体へ与えるダメージを軽減できる物質であって、トレハロース、ウシ血清アルブミン、脱脂粉乳、グルタミン酸ナトリウム、L-アスコルビン酸、ヒスチジン、リンゴ酸、ホエー、グルコース、アスパラギン酸、メチオニン、デンプン、デキストリン、ショ糖、乳糖、塩化ナトリウム、リン酸塩などが挙げられる。
【００３４】
本発明の乳酸菌は、以下に示すスクリーニング方法により得ることができる。
【００３５】
（１）１次スクリーニング（分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率の算出）
乳酸菌が生育可能な培地を用いてスクリーニング株を３７℃で２４時間培養し、遠心分離により培養液と菌体を分離させ、培養液を除去し菌体を回収する。前記回収した菌体に、分散媒を添加しないで、適量の水を加え、分散させた菌体濃縮液を得る。当該菌体濃縮液中の総生菌数をコロニーカウント法などの常法により求める。次いで菌体濃縮液を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥菌体中の総生菌数をコロニーカウント法などの常法により求める。そして、前記菌体濃縮液中の総生菌数と前記凍結乾燥菌体中の総生菌数により、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率を算出し、前記生残率が４０％以上である乳酸菌を選抜する。
【００３６】
（２）２次スクリーニング（４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率の測定）
１次スクリーニングにおいて分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であった乳酸菌を３７℃で２４時間培養し、遠心分離により培養液と菌体を分離させ、培養液を除去し湿菌体を得る。前記湿菌体に分散媒を添加した後、凍結乾燥し凍結乾燥菌体を得る。得られた凍結乾燥菌体を生菌数が１．０×１０１０ｃｆｕ／ｇになるよう賦形剤を添加し生菌製剤を調製する。調製した生菌製剤を４０℃のインキュベータ内で４ヶ月間保存した後、生菌製剤１ｇ当たりの生菌数をコロニーカウントなどの常法により求める。そして、保存前の生菌製剤中の生菌数（１．０×１０１０ｃｆｕ／ｇ）と４０℃で４ヶ月保存した生菌製剤１ｇ当たりの生菌数により、４０℃で４ヶ月保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率を算出し、前記生残率が８０％以上である乳酸菌を選抜する。
【００３７】
上記スクリーニングにより得られた本発明の乳酸菌の例である、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）Ｒ３０株（以下、Ｒ３０株ともいう）及びＲ２８株（以下、Ｒ２８株ともいう）は２０１２年５月１６日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒292-0818  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３６２、ＮＩＴＥ  Ｐ−１３６１として寄託され、２０１３年４月２４日付でブタベスト条約の規定下で受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３６２、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３６１としてそれぞれ国際寄託に移管されている。
【００３８】
前記エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株及びＲ２８株は、以下に示す菌学的性質を有している。
形態学的性質
１）グラム染色：陽性
２）胞子形成能：なし
３）運動性：なし
生理学的性質
１）カタラーゼ：陰性
２）ピルピン酸ナトリウムの分解：陽性
３）エスクリンの分解：陽性
４）ピロリドニル−２−ナフチルアミドの分解：陽性
５）２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの分解：陽性
６）Ｌ−ロイシン−２−ナフチルアミドの分解：陽性
７）Ｌ−アルギン酸の分解：陽性
８）各種炭水化物の分解性
Ｄ−リボース：＋
Ｄ−マンニトール：＋
乳糖：＋
Ｄ−ソルビトール：−
Ｄ−トレハロース：−
Ｄ−ラフィノース：−
【００３９】
以上の菌学的性質をＡＰＩ２０ストレップ（シスメックス・ビオメリュー株式会社製）等を用いて解析した結果、エンテロコッカス・フェシムと同一の菌学的性質を示した。また、１６ＳｒＤＮＡの全塩基配列解析の結果から、Ｒ３０株が配列同一性９９．８％、Ｒ２８株が配列同一性９９．９％でエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ＤＳＭ２０４７７株と一致した。但し、分散媒非存在下で凍結乾燥した時の生菌の生残率、及び４０℃で４ヶ月保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率に関しては、明らかにＤＳＭ２０４７７株とは異なっている。
【００４０】
本発明のエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌は、さらに以下の化学分類学的性質を有することを特徴とする。
【００４１】
化学分類学的性質
配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１と９０％以上の配列同一性を示す塩基配列を有する。
【００４２】
本発明のエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌は、ＤＳＭ２０４７７の１６ＳｒＤＮＡの配列番号１に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有すればよく、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、最も好ましくは９９．５％以上、９９．８％以上、１００％であると、優れた疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果、及び成長促進効果から選ばれる少なくとも１種以上の効果を有する乳酸菌を得ることができる点で好ましい。配列同一性が９０％未満であると、優れた疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果、及び成長促進効果から選ばれる少なくとも１種以上の効果を有する乳酸菌が得られない。
【００４３】
また本発明においては、上記Ｒ３０株またはＲ２８株だけでなく、それらの変異体も同等の効果を有する限り、本発明の技術範囲に属し、前記Ｒ３０株またはＲ２８株の代わりに本発明の組成物に含有させることができる。「変異体」とは、ＤＮＡ変異処理された乳酸菌を示し、「ＤＮＡ変異処理」とは、放射線や突然変異誘導物質などの公知の手段によって人為的に突然変異を誘導させる処理をいい、また、ＤＮＡ変異には自然突然変異によるものも含まれる。
【００４４】
本発明の乳酸菌の培養については、それらが生育可能な培地であればいかなる培地を使用してもよく、培養方法については、試験管培養、フラスコ培養、発酵槽による培養などにより培養することができ、特に制限されるものではないが、例えば、乳酸菌培養に一般的に使用されているＭＲＳ培地を用い、一般的な条件で通常の乳酸菌培養を行えばよい。
【００４５】
２．本発明の組成物及び各種製剤
本発明の組成物は、前記の本発明の乳酸菌若しくはその変異体を含有する。また、本発明の組成物に含まれる乳酸菌若しくはその変異体は、菌体そのものであってもよく、当該乳酸菌若しくはその変異体の処理物若しくは抽出残渣であってもよい。
【００４６】
本発明の組成物に含まれる菌体としては、生菌でも死菌（死滅菌）でもよい。ここで生菌とは、生きたままの乳酸菌であり、死菌（死滅菌）とは、加熱、加圧、薬物処理などにより殺菌処理を施した菌体のことである。
【００４７】
本発明でいう「処理物」としては、乳酸菌の磨砕や破砕、抽出などによる液状化物、濃縮、ペースト化、乾燥（スプレードライ、凍結乾燥、真空乾燥、ドラム乾燥など）、希釈から選ばれる少なくとも一つの処理を施した処理物が挙げられ、「抽出残渣」としては、例えば、菌体を煮沸水または熱水で処理し、菌体からエキスを抽出した後の残渣を遠心分離により回収した沈降物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
本発明の乳酸菌の生菌を含有した組成物は、例えば、常法で培養した培養液中の菌体を集菌し、集菌した菌体に保護剤を溶解した溶液を添加し、乾燥した後、適当な賦形剤と混合することで得ることができる。
【００４９】
上記保護剤とは、トレハロース、ウシ血清アルブミン、脱脂粉乳、グルタミン酸ナトリウム、L-アスコルビン酸、ヒスチジン、リンゴ酸、ホエー、グルコース、アスパラギン酸、メチオニン、デンプン、デキストリン、ショ糖、乳糖、塩化ナトリウム、リン酸塩など、凍結や乾燥などが菌体へ与えるダメージを軽減できる物質であればよい。これらの保護剤は、単独または組み合わせて使用することができる。例えば、定法により培養した培養液中の菌体を遠心分離して集菌し、集菌した菌体に、トレハロース、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン、リンゴ酸、ショ糖等の保護剤を溶解した溶液を添加することができる。各保護剤の配合割合は限定されないが、保護剤総量の下限は、乾燥菌体重量に対して１重量％以上、好ましくは１０重量％以上、さらに好ましくは１００重量％以上である。保護剤の最終濃度が乾燥菌体重量に対して１重量％未満であると、凍結や乾燥などが菌体へ与えるダメージを十分に軽減できず、好ましくない。
【００５０】
本発明の乳酸菌の死菌を含有した組成物は、例えば、常法で培養した培養液中の菌体を集菌し、集菌した菌体を殺菌処理し、乾燥した後、適当な賦形剤と混合することで得ることができる。
【００５１】
上記殺菌処理とは、加熱、加圧、薬物処理等により菌を死滅させることであり、例えば、乾熱殺菌、蒸気殺菌、高圧蒸気殺菌、化学的殺菌、超音波殺菌、電磁波殺菌、紫外線殺菌等を挙げることができる。また、殺菌処理は、集菌した菌体を乾燥した後行ってもよい。
【００５２】
本発明の組成物は、優れた疲労改善効果を有することから、疲労改善剤として使用できる。本発明の疲労改善剤は、過度のストレス、偏った食生活、睡眠不足などの不規則な生活習慣などによる疲労感の予防または改善、運動能力向上、持久力向上などの作用を有する。
【００５３】
さらに本発明の組成物は、優れた血流改善効果を有することから、血流改善剤として使用できる。本発明の血流改善剤は、過度のストレス、偏った食生活、睡眠不足などの不規則な生活習慣などによる冷え性、肩こり、肌荒れ、腰痛などの病態を予防または改善する作用を有する。
【００５４】
さらに本発明の組成物は、優れた便臭改善効果を有することから、便臭改善剤として使用できる。本発明の便臭改善剤は、腸内環境のバランスが乱れやすい乳幼児、高齢者、体力が低下したヒトの便臭を改善する作用を有する。また、多頭飼育やワクチンなどの薬剤投与によるストレスで腸内環境が悪化している家畜の便臭を改善する作用を有する。
【００５５】
さらに本発明の組成物は、優れた成長促進効果を有することから、成長促進剤として使用できる。本発明の成長促進剤は、乳幼児などの成長を促進したり、老人、病人などの体重減少を抑制したりする作用を有する。また、多頭飼育やワクチンなどの薬剤投与によるストレスで腸内環境が悪化している家畜の成長を促進する作用を有する。
【００５６】
本発明において、疲労改善効果は、例えば後述する実施例のように、トレッドミル装置を用いて、ラットを１０ｍ／ｍｉｎの速度で走行させ、３分毎に５ｍ／ｍｉｎずつ段階的に速度を上げていき、ラットが走行不能となるまでの時間（最大走行時間）を測定することで評価できる。被検物質投与前のラットの最大走行時間と比べ、被検物質投与後のラットの最大走行時間が延長していれば、当該被検物質は疲労改善効果を有すると評価する。
【００５７】
本発明において、血流改善効果は、例えば後述する実施例のように、ボランティアに左手を１５℃の冷水に１０秒間浸水してもらい、冷水負荷直前、冷水負荷後１０分の時点での皮膚温度をサーモグラフィーを用いて測定することで評価できる。被検者の冷水負荷直後と冷水負荷後１０分の皮膚温度の差を比べ、被検物質摂取により、被検者の皮膚温度の差が大きくなれば、当該被検物質は血流改善効果を有すると評価する。
【００５８】
本発明において、便臭改善効果は、例えば後述する実施例のように、鶏ひなの便臭を測定することで評価できる。被検物質投与前の便臭と、被検物質投与後の便臭とから、便臭の低減率を求め、便臭の低減率が大きければ、当該被検物質は便臭改善効果を有すると評価する。便臭は、官能評価で評価しても良いし、糞便中の酢酸ガス濃度などを測定することでも評価できる。
【００５９】
本発明において、成長促進効果は、例えば後述する実施例のように、マウスの体重を測定することで評価できる。被検物質を投与していないマウスと比べ、被検物質を投与したマウスの体重が大きれば、当該被検物質は成長促進効果を有すると評価する。
【００６０】
３．本発明の組成物の使用
本発明の組成物は、食品、機能性食品またはサプリメント、飼料（ペットフードを含む）、動物用医薬品、または医薬品として使用できる。
【００６１】
本発明の組成物は、食品として日常的に摂取する場合、本発明の組成物を含有する食品の形態は、特には限定されず、例えば、食用油脂組成物、調理油類、スプレー油類、バター類、マーガリン類、ショートニング類、ホイップクリーム類、濃縮乳類、ホワイトナー類、ドレッシング類、ピックル液類、パン類、ケーキ類、パイ類、クッキー類、和菓子類、スナック菓子類、油菓子類、チョコレート及びチョコレート菓子類、米菓類、ルウ類、ソース類、たれ類、トッピング類、氷菓類、麺類、ベーカリーミックス類、フライ食品類、加工肉製品類、豆腐・こんにゃくなどその他加工品、水産練り製品類、冷凍アントレ類、畜産冷凍食品、農産冷凍食品などの冷凍食品類、米飯類、ジャム類、チーズ、チーズフード、チーズ様食品、ガム類、キャンディー類、発酵乳類、缶詰類、飲料類などの一般食品形態が挙げられる。尚、本発明の乳酸菌およびＤＮＡ変異処理された変異体を用いて一般食品を発酵した発酵物であってもよい。
【００６２】
本発明の組成物を食品とする場合の乳酸菌又は乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣の含有量は特に限定されないが、例えば食品中の含有量の下限は、０．００００１重量％以上、好ましくは、０．００１重量％以上、さらに好ましくは０．１重量％以上、食品中の含有量の上限は、１００重量％以下、好ましくは５０重量％以下、さらに好ましくは３０重量％以下の割合となるように含有させることが出来る。
【００６３】
本発明の組成物はまた、カプセル剤や錠剤などのサプリメント形態で、特定保健用食品、栄養機能食品などの保健機能食品や、健康食品、栄養補助食品などの機能性食品とすることができ、疲労状態の予防や改善、運動能力、持久力向上、及び／又は冷え性、肩こり、肌荒れ、腰痛の予防や改善、及び／又は便臭の軽減又は緩和、及び／又は成長促進のために用いるものであるとの表示をすることもできる。その場合は、本発明の組成物の投与量としては、乳酸菌又は乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣として、成人一日あたりの下限は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ体重以上、成人一日あたりの上限は、１０００ｍｇ／ｋｇ体重以下、好ましくは３００ｍｇ／ｋｇ体重以下を摂取できるように１回ないし数回に分けて投与する。
【００６４】
本発明の組成物を機能性食品またはサプリメントとして用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えばカプセル剤、シロップ剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、ドリンク剤、注射剤、輸液、点鼻剤、点眼剤、座薬、貼付剤、噴霧剤などが挙げられる。製剤化においては、薬剤学的に許容されるほかの製剤、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。
【００６５】
また、本発明の組成物を、飼料（ペットフードを含む）または動物用医薬品として用いる場合は、上記の乳酸菌又は乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣を主原料として用いるが、通常の配合飼料に使用される原料を動物の種類、発育ステージ、地域などの飼育環境に応じて適宜配合してもよい。かかる原料としては、例えば穀物類または加工穀物類（とうもろこし、マイロ、大麦、小麦、ライ麦、燕麦、キビ、小麦粉、小麦胚芽粉等）、糟糠類（ふすま、米糠、コーングルテンフィード等）、植物性油粕類（大豆油粕、ごま油粕、綿実油粕、落花生粕、ヒマワリ粕、サフラワー粕等）、動物性原料（脱脂粉乳、魚粉、肉骨粉等）、ミネラル類（炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、食塩、無水ケイ酸等）、ビタミン類（ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６ 、ビタミンＢ１２、パントテン酸カルシウム、ニコチン酸アミド、葉酸等）、アミノ酸（グリシン、メチオニン等）、ビール酵母などの酵母類、無機物質の微粉末（結晶性セルロース、タルク、シリカ、白雲母、ゼオライト等）などが挙げられる。
【００６６】
本発明の飼料は、上記の飼料原料に、配合飼料に通常使用される賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料等の飼料用添加剤、所望によりその他の成分（抗生物質や殺菌剤、駆虫剤、防腐剤等）を配合してもよい。
【００６７】
本発明の飼料の形態は特に限定されるものではなく、例えば、粉末状、顆粒状、ペースト状、ペレット状、カプセル剤（ハードカプセル，ソフトカプセル）、錠剤等が挙げられる。本発明の飼料の給与対象となる動物は、特に限定されるものではないが、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等の家畜類、ニワトリ（ブロイラー、採卵鶏の両方を含む）、七面鳥、合鴨等の家禽類、マウス、ラット、モルモット等の実験動物、イヌ、ネコなどのペットなどが挙げられる。
【００６８】
これらの場合、本発明の組成物は、乳酸菌又は乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣として、動物の種類に関わらず、一日あたりの摂取量の下限は、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ体重以上、さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重以上、一日あたりの摂取量の上限は、１０００ｍｇ／ｋｇ体重以下、好ましくは５００ｍｇ／ｋｇ体重以下、が摂取できるよう１回ないし数回に分けて与える。
【００６９】
本発明の組成物を、医薬品として用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えばカプセル剤、シロップ剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、ドリンク剤、注射剤、輸液、点鼻剤、点眼剤、座薬、貼付剤、噴霧剤などが挙げられる。製剤化においては、薬剤学的に許容されるほかの製剤、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。
【００７０】
医薬品として用いる場合の本発明の組成物の投与量としては、前記の機能性食品またはサプリメントの投与量に準じればよい。
【実施例】
【００７１】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。なお、実施例においては、以下に示す１次スクリーニング法、２次スクリーニング法で乳酸菌の選抜を行い、疲労改善効果の評価法、血流改善効果の評価法、便臭改善効果の評価法、成長促進効果の評価法により、生理活性を評価した。【００７２】
＜１次スクリーニング法＞
乳酸菌を１０ｍＬのＭＲＳ液体培地（ＭＲＳブイヨン、関東化学株式会社製０．５２ｇを１０ｍＬの水に溶解し１２１℃、１５分オートクレーブ滅菌したもの）で、３７℃、２４時間培養し前培養液を得た。前培養液１ｍＬを１００ｍＬのＭＲＳ液体培地に加え、３７℃、２４時間培養した。培養終了後、８０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、培養液と菌体を分離させた。菌体を１００ｍＬの滅菌水で洗浄後、再度遠心分離により、滅菌水と菌体を分離し、菌体に滅菌水２ｍＬを加え、菌体濃縮液を得た。前記菌体濃縮液０．１ｍＬを０．９ｍＬの生理食塩水に懸濁し、さらに生理食塩水で１０６倍希釈した希釈液０．１ｍＬをＭＲＳ寒天培地（ＭＲＳ寒天培地、関東化学株式会社製１．２４ｇを２０ｍＬの水に溶解し１２１℃、１５分オートクレーブ滅菌したものを、９０φ×２０の滅菌シャーレに加え、固まらせたもの）に塗抹し、３７℃、２日間培養し出現するコロニー数をカウントし、菌体濃縮液中の総生菌数を求めた。また、前記菌体濃縮液を、凍結乾燥（凍結乾燥機  ＶｉｒＴｉｓ社製  ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｐｌｕｓ、凍結条件；  −３０℃、１２時間、乾燥条件；  １０×１０−１ｔｏｒｒ、棚温２０℃、４８時間）し、凍結乾燥菌体を得た。前記凍結乾燥菌体２０ｍｇを、１ｍＬの生理食塩水に分散した菌体懸濁液を生理食塩水で１０６倍希釈した希釈液０．１ｍＬをＭＲＳ寒天培地に塗抹し、３７℃、２日間培養し出現するコロニー数をカウントし、凍結乾燥菌体中の総生菌数を求め、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率を次式より算出し、生残率が４０％以上の乳酸菌を選抜した。
分散媒非存在下で凍結乾燥した際の生菌の生残率（％）＝（乾燥菌体中の総生菌数／菌体濃縮液の総生菌数）×１００【００７３】
＜２次スクリーニング法＞
１次スクリーニング法で選抜した乳酸菌を１０ｍＬのＭＲＳ液体培地で３７℃、２４時間培養し前培養液を得た。前培養液１０ｍＬを１ＬのＭＲＳ液体培地に加え、３７℃、２４時間培養した。培養終了後、８０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、培養液と菌体を分離させた。菌体を１Ｌの滅菌水で洗浄後、再度遠心分離により、滅菌水と菌体を分離し、菌体を滅菌水で２０ｍＬにメスアップし、菌体濃縮液を得た。該菌体濃縮液にショ糖が０．４重量％、トレハロースが０．２重量％、グルタミン酸ナトリウムが０．２重量％、ヒスチジンが０．２重量％、リンゴ酸が０．２重量％からなる保護剤を溶解した溶液２ｍＬ加えて、上記と同条件で凍結乾燥し、凍結乾燥菌体を得た。該凍結乾燥菌体を生菌数が１．０×１０１０ｃｆｕ／ｇになるようにデキストリンに混合し、生菌製剤を得た。生菌製剤を１０ｇずつチャック付きポリエチレン袋（ユニパック  Ｂ−８、株式会社セイニチ社製）に分注したものを、シリカゲル１ｇ（富士シリシア化学株式会社製）を入れたアルミパウチ（ラミジップ、株式会社セイニチ社製）に梱包し、ヒートシールにより密閉したものを保存サンプルとした。保存サンプルを４０℃のインキュベーターで４ヶ月間保存した後、生菌製剤１００ｍｇを１ｍＬの生理食塩水に分散した菌体懸濁液を生理食塩水で１０７倍希釈した希釈液０．１ｍＬをＭＲＳ寒天培地に塗抹し、３７℃、２日間培養し出現するコロニー数をカウントし、４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率を次式より算出した。そして前記生残率が８０％以上である乳酸菌を選抜した。
４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率（％）＝（４０℃で４ヶ月間保存後の生菌製剤１ｇあたりの生菌数／１．０×１０１０）×１００【００７４】
＜疲労改善効果の評価法＞
疲労改善効果は、トレッドミル装置（５連式形式  ＭＫ−６８０Ｓ−０２Ａ、室町機会社製）を用いて、７〜１０週齢のＳＤ系雄性ラット（１群；ｎ＝１０）を１０ｍ／ｍｉｎの速度で走行させ、３分ごとに５ｍ／ｍｉｎずつ段階的に速度を上げていき、ラットが走行不能となるまでの時間（最大走行時間）を測定することで評価した。被検物質投与前の最大走行時間と被検物質投与後２時間の最大走行時間を測定し、被検物質投与後２時間の最大走行時間から被検物質投与前の最大走行時間を引いた値（被検物質投与前後における最大走行時間の差）を算出し、被検物質投与により、被検物質投与前後における最大走行時間の差が増加しているか否かで評価した。【００７５】
＜血流改善効果の評価法＞
血流改善効果は、２０〜５０歳の健常男性（１群；ｎ＝５）を対象に、被検物質を１週間摂取後に冷水負荷試験を実施することで評価した。冷水負荷試験は、被検者の左手を１５℃の冷水に１０秒間浸し、冷水負荷直後及び冷水負荷後１０分の皮膚温度をサーモグラフィー（ＴＶＳ  ６００、日本アビオニクス社製）を用い測定した。被検物質摂取により、冷水負荷後１０分の平均皮膚温度から、冷水負荷直後の平均皮膚温度を引いた値（平均皮膚温度の差）が有意に増加しているか否かで評価した。平均皮膚温度は手背部の中指の指先、中指基節骨の中間点及び第３中指手骨の中間点の３ポイントの皮膚温度の平均値とした。【００７６】
＜便臭改善効果の評価法＞
便臭改善効果は、８日齢の雄の鶏ひな（１群；ｎ＝１０）に試験飼料を６日間与え、試験開始前及び試験終了時に回収した糞便の便臭を測定し、試験前後の便臭の低減率を算出することで評価した。被検物質を混合していない試験飼料（標準飼料）を与えた群の便臭の低減率と比べ、被検物質を混合した試験飼料（被検物質混合飼料）を与えた群の便臭の低減率が大きいか否かで評価した。便臭は、糞便の臭気指数、硫化水素ガス濃度、酢酸ガス濃度で評価し、試験前後の臭気指数、硫化水素ガス濃度、酢酸ガス濃度の低減率を算出した。臭気指数は、糞便１ｇを１００ｍＬの無臭蒸留水に懸濁し２５℃３０分間静置後、さらに１０倍希釈したものを試験水とし、３点比較式フラスコ法にて求めた。また、硫化水素ガス濃度及び酢酸ガス濃度は、糞便１００ｇをガラスシャーレに乗せ１０Ｌのポリスチレン製袋に入れ、袋内の空気を全て排出した後、活性炭を通し精製した無臭空気を袋内に充満させ密閉し、約２２℃の室温で１時間静置した後、袋内の硫化水素ガス及び酢酸ガス濃度をガス検知管で測定することで求めた。尚、回収した糞便は測定時まで密閉し、−８０℃で保管した。【００７７】
＜成長促進効果の評価法＞
成長促進効果は、５週齢のＩＣＲ雄性マウス（１群；ｎ＝１０）に試験飼料を１ヶ月間与え、試験終了時の体重を測定することで評価した。被検物質を混合していない試験飼料（標準飼料）を与えた群と比べ、被検物質を混合した試験飼料（被検物質混合飼料）を与えた群の体重が大きいか否かで評価した。試験期間中の各マウスの摂餌量を測定するため、マウスは個別飼育とし、試験飼料はローデンカフェ（オリエンタル酵母社製）付き粉末給餌器を用いて自由摂取させた。【００７８】
下記の実施例では、エンテロコッカス・フェシウムの基準株であるエンテロコッカス・フェシウム  ＤＳＭ２０４７７株を基準株と称する。尚、基準株の分散媒非存在下で凍結乾燥をした際の生菌の生残率は２５％であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率は４０％である。【００７９】
（実施例１）＜Ｒ３０株のスクリーニング＞
食品素材等から分離した乳酸菌１２５株（分離株１−分離株１２５）を対象に、上記１次スクリーニング法により、各分離株の分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率を求めた。【００８０】
１２５株中、分離株１７及び分離株８２の２株が分散媒非存在下で凍結乾燥をした際の生菌の生残率が４０％以上であった。【００８１】
次いで分離株１７及び分離株８２について、上記２次スクリーニング法により４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率を求めた。その結果を表１に示す。【００８２】
【表１】
2014021205.tif 000002
【００８３】
２株中、分離株８２が４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上であった。【００８４】
得られた分離株８２の菌学的性質をＡＰＩ２０ストレップ（シスメックス・ビオメリュー株式会社製）を用いて調べた結果、エンテロコッカス・フェシウムと同一の菌学的性質を示した。さらに分離株８２の１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列の配列番号１との配列同一性を調べた結果、９９．８％の配列同一性であることが明らかとなり、分離株８２はエンテロコッカス・フェシウム属であることがわかった。以下実施例において、分離株８２はＲ３０株と称す。【００８５】
（実施例２）＜Ｒ３０株の疲労改善効果の測定＞
２次スクリーニング法に記載の方法に準じてＲ３０株及び基準株の凍結乾燥菌体を調製し、各々の凍結乾燥菌体を生菌数が５．０×１０１０ｃｆｕ／ｇになるようにデキストリンに混合した生菌製剤を得た。Ｒ３０株の生菌製剤を１ｇ／ｋｇ投与するＲ３０株投与群、基準株の生菌製剤を１ｇ／ｋｇ投与する基準株投与群、及びデキストリンを１ｇ／ｋｇ投与するデキストリン投与群について上記疲労改善効果の評価法を実施した。その結果を表２に示す。【００８６】
【表２】
2014021205.tif 000003
【００８７】
表２より、Ｒ３０株投与群は、デキストリン投与群及び基準株投与群と比較して被検物質投与前後における最大走行時間の差が有意に増加した。したがって、Ｒ３０株は、疲労改善効果を有することが明らかとなった。【００８８】
（実施例３）＜Ｒ３０株の血流改善効果の測定＞
実施例２で調製したＲ３０株の生菌製剤を１ｇ／日摂取するＲ３０株摂取群、実施例２で調製した基準株の生菌製剤を１ｇ／日摂取する基準株摂取群及びデキストリンを１ｇ／日摂取するデキストリン摂取群について、上記血流改善効果の評価法を実施した。その結果を表３に示す。【００８９】
【表３】
2014021205.tif 000004
【００９０】
表３より、Ｒ３０株摂取群はデキストリン摂取群及び基準株摂取群と比較して、被検物質を１週間摂取後の平均皮膚温度の差が有意に増加した。したがって、Ｒ３０株は、血流改善効果を有することが明らかとなった。【００９１】
（実施例４）＜Ｒ３０株の便臭改善効果の測定＞
２次スクリーニング法に記載の方法に準じてＲ３０株の凍結乾燥菌体を調製し、該凍結乾燥菌体を生菌数が１．０×１０１０ｃｆｕ／ｇになるようにデキストリンに混合した生菌製剤を得た。当該Ｒ３０株の生菌製剤が０．３重量％になるように標準飼料（ブロイラー肥育前期用標準飼料；日本配合飼料株式会社製）に混合した試験飼料（Ｒ３０株混合飼料）を調製し、上記便臭改善効果の評価法を実施した。その結果を表４に示す。【００９２】
【表４】
2014021205.tif 000005
【００９３】
表４より、Ｒ３０株混合飼料群は、標準飼料群と比べ、臭気指数、硫化水素ガス濃度、酢酸ガス濃度の低減率が大きかった。したがって、Ｒ３０株は便臭改善効果を有することが明らかとなった。【００９４】
（実施例５）＜Ｒ３０株の成長促進効果の測定＞
被検物質として実施例４で調製したＲ３０株の生菌製剤が０．１重量％となるように標準飼料（ＣＥ−２粉末飼料；日本クレア社製）に混合した試験飼料（Ｒ３０株混合飼料）を調製し、上記成長促進効果の評価法を実施した。試験終了時の標準飼料を与えた群の体重を１００％とした時のＲ３０株混合飼料を与えた群の体重の割合を算出した。その結果を表５に示す。【００９５】
【表５】
2014021205.tif 000006
【００９６】
表５より、Ｒ３０株混合飼料を与えた群の体重の割合が１０７％と有意に高くなり、Ｒ３０株が成長促進効果を有することが明らかとなった。また、標準飼料を与えた群及びＲ３０株混合飼料を与えた群の試験期間中の総摂餌量の平均値は、各々２００ｇ、１９９ｇと差を認めないことから、Ｒ３０株は飼料効率向上効果を有することが明らかとなった。【００９７】
上記表２から表５の結果より、Ｒ３０株が疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果及び成長促進効果を有することが明らかとなったため、本発明者らはさらにＲ３０株と同一の菌学的性質を有し、且つ分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、４０℃で４カ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上であるエンテロコッカス・フェシウム属である乳酸菌をスクリーニングすることにした。【００９８】
（実施例６）＜Ｒ２８株のスクリーニング＞
食品素材等から分離した乳酸菌を、ＡＰＩ２０ストレップ（シスメックス・ビオメリュー株式会社製）を用いてエンテロコッカス・フェシウム属と同一の菌学的性質を示した１０株（エンテロコッカス・フェシウム株１〜１０）を選抜した。各株に対して上記１次スクリーニング法を実施し、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であった３株（エンテロコッカス・フェシウム株１、エンテロコッカス・フェシウム株２、エンテロコッカス・フェシウム株３）について２次スクリーニングを実施し、４０℃で４カ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率を求めた。その結果を表６に示す。【００９９】
【表６】
2014021205.tif 000007
【０１００】
表６の結果より、エンテロコッカス・フェシウム株１が分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４カ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上であった。また、エンテロコッカス・フェシウム株１について、１６ＳｒＤＮＡの全塩基配列解析の結果、配列番号１と配列同一性が９９．９％であった。以下実施例において、エンテロコッカス・フェシウム株１をＲ２８株と称する。【０１０１】
（実施例７）＜Ｒ２８株の疲労改善効果及び血流改善効果の測定＞
実施例６により得られたＲ２８株の疲労改善効果及び血流改善効果について、実施例２及び実施例３と同様に調べた。尚、エンテロコッカス・フェシウム株２及びエンテロコッカス・フェシウム株４はＲ２８株の比較対象とした。その結果を表７に示す。【０１０２】
【表７】
2014021205.tif 000008
【０１０３】
表７より、Ｒ２８株はエンテロコッカス・フェシウム株２及びエンテロコッカス・フェシウム株４と比較して、有意な疲労改善効果及び血流改善効果を有していることが明らかとなり、結果として特定の菌学的性質を有し、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上であるエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌が優れた効果を持つことが明らかとなった。【０１０４】
（実施例８）＜Ｒ２８株の便臭改善効果及び成長促進効果の測定＞
Ｒ２８株の便臭改善効果及び成長促進効果について、実施例４及び実施例５と同様に調べた。その結果を表８に示す。【０１０５】
【表８】
2014021205.tif 000009
【０１０６】
表８より、標準飼料のみを与えた群と比べＲ２８株混合飼料を与えた群は顕著な便臭改善効果、並びに、有意な成長促進効果を有することが明らかとなった。また、Ｒ２８株の成長促進効果の測定の結果、試験期間中の総摂餌量の平均値は標準飼料群、Ｒ２８混合飼料群共に２００ｇとなり、Ｒ２８株は、飼料効率向上効果を有することが明らかとなった。【０１０７】
（実施例９）＜Ｒ３０株、Ｒ２８株を用いた生菌製剤の製造方法＞
Ｒ３０株を１ＬのＭＲＳ液体培地で３７℃、２４時間培養した。培養終了後、遠心分離した菌体を１Ｌの滅菌水で洗浄後、再度遠心分離することにより、菌体と滅菌水を分離させた。菌体を滅菌水で２０ｍＬにメスアップした菌体濃縮液に対して、ショ糖、トレハロース、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン、リンゴ酸からなる保護剤が菌体濃縮液中の乾燥菌体重量に対して、０、１、３、１０、１００、１０００、１００００重量％になるよう保護剤を溶解した溶液を添加し、凍結乾燥した。該凍結乾燥菌体を生菌数が１．０×１０１０ｃｆｕ／ｇになるようにデキストリンに混合し、生菌製剤を調整し、４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率を求めた。また、Ｒ２８株についても同様の実験を行った。その結果を表９に示す。【０１０８】
【表９】
2014021205.tif 000010
【０１０９】
表９の結果より、保護剤を乾燥菌体重量に対して１重量％以上添加することで、４０℃で４ヶ月間保存した際の生菌製剤の生菌の生残率が向上した。また、乾燥菌体重量に対して保護剤の量を、３重量％、１０重量％、１００重量％と増やすことで、４０℃で４ヶ月間保存した際の生菌製剤中の生菌の生残率は向上した。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明は、乳酸菌を利用する機能性食品やサプリメントなどの食品、飼料、医薬品の製造分野において利用できる。【０１１１】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【配列表】
2014021205000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年9月30日(2014.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の菌学的性質を有し、分散媒非存在下で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上であり、且つ４０℃で４ヶ月間保存した際における生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上であるエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌：
形態学的性質
１）グラム染色：陽性
２）胞子形成能：なし
３）運動性：なし
生理学的性質
１）カタラーゼ：陰性
２）ピルピン酸ナトリウムの分解：陽性
３）エスクリンの分解：陽性
４）ピロリドニル−２−ナフチルアミドの分解：陽性
５）２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの分解：陽性
６）Ｌ−ロイシン−２−ナフチルアミドの分解：陽性
７）Ｌ−アルギン酸の分解：陽性
８）各種炭水化物の分解性
Ｄ−リボース：＋
Ｄ−マンニトール：＋
乳糖：＋
Ｄ−ソルビトール：−
Ｄ−トレハロース：−
Ｄ−ラフィノース：−
【請求項２】
以下の化学分類学的性質を有することを特徴とする請求項１に記載のエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌：
化学分類学的性質
配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１と９０％以上の配列同一性を示す塩基配列を有する。
【請求項３】
エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３６２）、エンテロコッカス・フェシウムＲ２８株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３６１）、又は前記菌株がＤＮＡ変異処理された変異体、又は前記菌株の子孫株である、請求項１又は２に記載のエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の乳酸菌、又は該乳酸菌の処理物若しくは抽出残渣を含有する組成物。
【請求項５】
さらに保護剤を含むことを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
保護剤の含量が乾燥菌体重量に対して１重量％以上であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
保護剤が、ショ糖、トレハロース、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン、リンゴ酸の群から選択される１種以上であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれかに記載の組成物を有効成分とする疲労改善剤。
【請求項９】
請求項４〜７のいずれかに記載の組成物を有効成分とする血流改善剤。
【請求項１０】
請求項４〜７のいずれかに記載の組成物を有効成分とする便臭改善剤。
【請求項１１】
請求項４〜７のいずれかに記載の組成物を有効成分とする成長促進剤。
【請求項１２】
請求項４〜７のいずれかに記載の組成物を含有する食品。
【請求項１３】
請求項４〜７のいずれかに記載の組成物を含有する飼料または動物用医薬品。
【請求項１４】
請求項４〜７のいずれかに記載の組成物を含有する医薬品。
【請求項１５】
以下の工程を含む、疲労改善効果、血流改善効果、便臭改善効果、及び成長促進効果から選ばれる少なくとも１種以上の効果を有する乳酸菌のスクリーニング方法。
(1) 被検乳酸菌の菌体濃縮液を分散媒非存在下で凍結乾燥する工程
(2) 工程(1)で凍結乾燥を行った際の生菌の生残率が４０％以上である乳酸菌を選抜する工程
(3) 工程(2)で選抜した乳酸菌に分散媒を添加した後、凍結乾燥して得られる凍結乾燥菌体を含む生菌製剤を調製する工程
(4) 工程(3)で調製した生菌製剤を４０℃で４ヶ月間保存し、該生菌製剤中の生菌の生残率が８０％以上である乳酸菌を選抜する工程
【国際調査報告】
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