(57)【要約】  がんの治療等に有効な標的分子を見出し、当該分子に特異的に結合する抗体、並びに該抗体を有効成分とする抗がん剤等を提供することを目的とし、前立腺がん細胞株間（ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞とＬＮＣａＰ細胞との間）の比較をＳＳＴ−ＲＥＸにて行い、造腫瘍等に関与している分子としてＣＸＡＤＲを同定した。そして、ＣＸＡＤＲに対するモノクローナル抗体を作製し、抗がん活性、ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性等を検討した結果、ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位に存在するエピトープに結合する抗体が、前立腺がん細胞、膵臓がん細胞及び大腸がん細胞に対して抗がん活性を発揮することを見出した。さらに、かかる抗体はＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を有していることも明らかにした。また、かかる抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域の構造を決定することに成功した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位に存在するエピトープに結合する抗体。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｄ）に記載のいずれか一の特徴を有する請求項１に記載の抗体
（ａ）配列番号：１〜３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：６〜８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）配列番号：５に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｃ）配列番号：１１〜１３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｄ）配列番号：１５に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の抗体を有効成分とする、医薬組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の抗体を有効成分とする、ＣＸＡＤＲタンパク質に関連する疾患を検査するための薬剤。
【請求項５】
がん治療の有効性を判定する方法であって、
患者から単離した試料におけるＣＸＡＤＲタンパク質の存在又は非存在を検出する工程を含み、前記工程にてＣＸＡＤＲタンパク質の存在が検出されれば、前記患者において、請求項１又は２に記載の抗体を有効成分とするがんの治療剤によるがん治療の有効性が高いと判定される方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法により前記有効性が高いと判定された患者に投与される、請求項１又は２に記載の抗体を有効成分とするがんの治療剤。
【請求項７】
請求項５に記載の方法により前記有効性が高いと判定された患者に対して、請求項１又は２に記載の抗体を有効成分とするがんの治療剤を投与する、がんの治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＣＸＡＤＲ抗体に関し、より詳しくは、ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位に存在するエピトープに結合する抗体、並びに該抗体を有効成分とする医薬組成物及び検査薬に関する。また、本発明は、ＣＸＡＤＲタンパク質の存在又は非存在を指標とし、患者における前記抗体によるがん治療の有効性を判定する方法、該方法によって有効性が高いと判定された患者に前記抗体を投与する、がんの治療方法、並びに前記患者に投与される前記抗体を有効成分とするがんの治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、冠状動脈疾患と共に、先進国における主たる死因であり、その割合も年々増加の一途を辿っている。また、がんの中でも、肺がん、前立腺がん、膵臓がん、乳がん、結腸がん及び卵巣がんは、がんによる死因の代表である。世界的に見て、特に前立腺がんは、男性において４番目に蔓延しているがんであり、欧米においては約２割の男性にその発症が確認されている。さらに、前立腺がんは、日本におけるがん死亡患者の約３．５％を占め、その割合も近年急増傾向にある。【０００３】
また、前立腺がん等に対しては、外科的切除、放射線療法、ホルモン療法及び化学療法が、主たる治療方法として施されているが、これらの処置は、多くの人にとって効果が小さいため、がんに対して未だ有効な治療方法が確立されていないのが現状である。【０００４】
かかる現状から、近年、抗がん剤としての抗体の利用が注目され、種々の病態（がん型）の治療におけるアプローチとして、その重要性が認められつつある。例えば、腫瘍特異的な抗原を標的とした抗体であれば、投与した抗体は腫瘍に集積することが推定されるため、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性や抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性による、免疫システムを介したがん細胞への攻撃が期待できる。また、抗体に放射性核種や細胞毒性物質等の薬剤を結合しておくことにより、結合した薬剤を効率よく腫瘍部位に送達することが可能となる。これにより、他組織への薬剤到達量を減少させ、ひいては副作用の軽減を見込むことができる。腫瘍特異的抗原に細胞死を誘導する活性がある場合は、アゴニスティックな活性を持つ抗体を投与することで、また、腫瘍特異的抗原が細胞の増殖及び生存に関与する場合は、中和活性を持つ抗体を投与することで、腫瘍特異的な抗体の集積と抗体の活性によって、腫瘍の増殖停止または退縮が期待できる。このような特性から、抗体は抗がん剤としての適用に好適であると考えられている。【０００５】
これまでに上市された抗体医薬としては、白血病・リンパ腫を対象として、ＣＤ２０を標的としたリツキシマブ（商品名：Ｒｉｔｕｘａｎ）やイノツズマブ・オゾガミシン（商品名：Ｚｅｖａｉｌｎ）、ＣＤ３３を標的としたゲムツズマブ・オゾガマイシン（商品名：Ｍｙｌｏｔａｒｇ）等が開発されている。また、上皮性固形がんを対象としたものとしては、乳がんでは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕを標的としたトラスツズマブ（商品名：Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）やＶＥＧＦを標的としたベバシズマブ（商品名：Ａｖａｓｔｉｎ）等が開発されている。【０００６】
しかしながら、２００８年までに認可された抗体医薬は、米国でも２０種類程度、日本でも１０種類程度であり、特に固形がんに関してはまだ有効とされる抗体医薬は少ない。このため、さらなる有効な抗体医薬の開発が望まれており、特に抗体医薬の有効性に大きく影響する標的分子（抗原、エピトープ）の同定が強く望まれている。【０００７】
ところで、コクサッキーウィルス等の感染に関与するタンパク質として、コクサッキーウィルス・アデノウィルス受容体（ＣＯＸＳＡＣＫＩＥＶＩＲＵＳ  ＡＮＤ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ；ＣＸＡＤＲ）が知られている。また、このタンパク質については、卵巣がん及び皮膚細胞基底がんにおいて、発現が亢進していることが報告されている（特許文献１）。一方、胆管がんにおいて、ＣＸＡＤＲのホモ接合体欠失が確認されており、ＣＸＡＤＲはがん抑制遺伝子として機能していることが示唆されている（特許文献２）。【０００８】
このように、ＣＸＡＤＲとがんとの関連についての報告はあるものの、ＣＸＡＤＲは、がんの発症、悪性化等に寄与しているのか、それともがんに対して抑制的に作用するのか、定まっていないのが現状である。従って、ＣＸＡＤＲに対する抗体が抗がん活性を持ち得るのかについては、いまだ不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００９／１００１５９号
【特許文献２】特開２００５−３０４４９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、がんの治療等に有効な標的分子を見出し、当該分子に特異的に結合する抗体、ひいては該抗体を有効成分とする医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
アンドロゲン依存性のヒト前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰは免疫不全マウスでの造腫瘍性が低く、動物実験でのゼノグラフトへの応用が難しい。一方、本発明者らが樹立したＬＮＣａＰ細胞亜株：ＬＮＣａＰ−ＣＲは、免疫不全マウスでの造腫瘍性が極めて高く、アンドロゲン依存性のヒト前立腺がん細胞のゼノグラフトモデルとして有用である（「Ｋａｗａｄａ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．、２００６年、２４２巻、４６〜５２ページ」、「Ｋａｗａｄａ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．、２００７年、９８巻、３５０〜３５６ページ」参照）。【００１２】
そこで、本発明者らは、ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞に発現する膜タンパク質や分泌タンパク質と、親株であるＬＮＣａＰ細胞に発現するそれらとを比較することにより、がんの悪性化に関与する因子を見いだせるのではないかと考え、膜タンパク質及び分泌タンパク質を特異的に単離同定する技術であるシグナルシークエンストラップ（ＳＳＴ−ＲＥＸ）法を実施した。その結果、ＬＮＣａＰ細胞においては発現しておらず、ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞において発現しているタンパク質として、ＣＸＡＤＲを同定することに成功した。【００１３】
次いで、本発明者らは、このタンパク質に対するモノクローナル抗体を作製し、各種がん細胞株に対する結合性、インビトロ及びインビボにおける抗がん活性、ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を検討した。その結果、ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位に存在するエピトープに結合する抗体が、ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞を移植したマウス、特にＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞を同所である前立腺に移植したマウスにおいて優れた抗がん活性を有することを見出した。また、前記抗体は、前立腺がんのみならず、膵臓がん及び大腸がんに対しても抗がん活性を発揮することも見出した。さらに、かかるインビボでのがん抑制効果は、前記抗体がＣＸＡＤＲに結合することにより奏されること、すなわちＣＸＡＤＲタンパク質が発現しているがんに対して前記抗体はがん抑制効果を発揮できることを確認した。また、前記抗体はＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を有していることも明らかにした。さらに、本発明者らは、前記抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域の構造を決定することに成功し、本発明を完成するに至った。【００１４】
すなわち、本発明は、ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位に存在するエピトープに結合する抗体、並びに該抗体を有効成分とする医薬組成物等に関し、より詳しくは、以下を提供するものである。
（１）  ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位に存在するエピトープに結合する抗体。
（２）  下記（ａ）〜（ｄ）に記載のいずれか一の特徴を有する（１）に記載の抗体
（ａ）配列番号：１〜３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：６〜８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｂ）配列番号：５に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｃ）配列番号：１１〜１３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する
（ｄ）配列番号：１５に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持する。
（３）  （１）又は（２）に記載の抗体を有効成分とする、医薬組成物。
（４）  （１）又は（２）に記載の抗体を有効成分とする、ＣＸＡＤＲタンパク質に関連する疾患を検査するための薬剤。
（５）  がん治療の有効性を判定する方法であって、
患者から単離した試料におけるＣＸＡＤＲタンパク質の存在又は非存在を検出する工程を含み、前記工程にてＣＸＡＤＲタンパク質の存在が検出されれば、前記患者において、（１）又は（２）に記載の抗体を有効成分とするがんの治療剤によるがん治療の有効性が高いと判定される方法。
（６）  （５）に記載の方法により前記有効性が高いと判定された患者に投与される、（１）又は（２）に記載の抗体を有効成分とするがんの治療剤。
（７）  （５）に記載の方法により前記有効性が高いと判定された患者に対して、（１）又は（２）に記載の抗体を有効成分とするがんの治療剤を投与する、がんの治療方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質に結合し、インビボにおいて優れた抗がん活性等を有する抗体が提供された。本発明の抗体によれば、ＣＸＡＤＲタンパク質に関連する疾患の治療、予防及び検査が可能となる。特に、本発明の抗体は、がん（前立腺がん、膵臓がん、大腸がん等）に対して効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ハイブリドーマ（クローン名：１Ｇ１１Ｂ９Ｅ、７Ｆ８Ａ、６Ｇ１０Ａ、３Ｅ８Ｂ、６Ｃ３Ａ）から産生される抗ＣＸＡＤＲ抗体と、ＣＸＡＤＲ発現細胞との反応性を、フローサイトメーターにて分析した結果を示す図である。各フローサイトメーターデータの塗りつぶしヒストグラム部分は、各々ハイブリドーマから産生される抗ＣＸＡＤＲ抗体との反応を、白のヒストグラム部分は、陰性対照としたマウスＩｇＧ（アイソタイプコントロール抗体のミックス）との反応を示す（図２においても同様）。
【図２】ハイブリドーマ（クローン名：８Ｂ１１Ｂ、８Ｄ６、２Ａ８Ａ、２Ａ８Ｂ、８Ｆ１１）から産生される抗ＣＸＡＤＲ抗体と、ＣＸＡＤＲ発現細胞との反応性を、フローサイトメーターにて分析した結果を示す図である。なお、以下において、ハイブリドーマのクローン名「６Ｇ１０Ａ」、「７Ｆ８Ａ」等は各々ハイブリドーマのみならず、ハイブリドーマから産生される抗体自体の名称としても用いられる。
【図３】抗ＣＸＡＤＲ未精製抗体の細胞増殖への影響を分析した結果を示すグラフである。図中、縦軸は、ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞を各抗ＣＸＡＤＲ未精製抗体存在下で３日間培養した後、ＭＴＴ法にて測定した細胞数（５７０ｎｍの吸光度）を示す。また、図中の各バーが示す値は、２連の測定値の平均値を示し、標準誤差（ＳＥ）は１０％以下である。
【図４】抗ＣＸＡＤＲ未精製抗体のアンジオジェニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）産生への影響を分析した結果を示すグラフである。図中、縦軸は、ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞を各抗ＣＸＡＤＲ未精製抗体存在下で３日間培養した後、ＥＬＩＳＡ法にて測定した培養上清中のアンジオジェニン産生量（４５０−５４０ｎｍの吸光度）を示す。また、図中の各バーが示す値は、２連の測定値の平均値を示し、標準誤差（ＳＥ）は１０％以下である。
【図５】抗ＣＸＡＤＲ未精製抗体（６Ｇ１０Ａ又は７Ｆ８Ａ）のＬＮＣａＰ−ＣＲ腫瘍への影響を分析した結果を示すグラフである。ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝５）の皮下に接種し、翌日から１１日間、毎日未精製抗体１００μｌ又は陰性対照として生理食塩水１００μｌを尾静脈内投与した。そして、細胞接種２１日後のマウスから単離した腫瘍の重量を測定した。図中の各バーが示す重量の値は、１群５匹の平均値±標準偏差（ＳＤ）である。また、「＊」は「Ｐ＜０．０５」であることを示し、「＊＊」は「Ｐ＜０．０１」であることを示す。
【図６】抗ＣＸＡＤＲ精製抗体（６Ｇ１０Ａ又は７Ｆ８Ａ）のＬＮＣａＰ−ＣＲ腫瘍への影響を分析した結果を示すグラフである。ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝５）の皮下に接種し、接種１日後、７日後、１４日後に精製抗体２５０μｇ又は陰性対照として生理食塩水を尾静脈内投与した。そして、所定の期間後のマウスから単離した腫瘍の径を測定し、体積を算出した。図中の各折れ線が示す体積の値は、１群５匹の平均値±ＳＤである。また、「＊＊」は「Ｐ＜０．０１」であることを示す。
【図７】抗ＣＸＡＤＲ精製抗体（６Ｇ１０Ａ又は７Ｆ８Ａ）投与によるマウスへの影響を分析した結果を示すグラフである。ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝５）の皮下に接種し、接種１日後、７日後、１４日後に精製抗体２５０μｇ又は陰性対照として生理食塩水を尾静脈内投与した。そして、所定の期間後のマウスの体重を測定した。図中の各折れ線が示す体重の値は、１群５匹の平均値±ＳＤである。
【図８】抗ＣＸＡＤＲ精製抗体（６Ｇ１０Ａ又は７Ｆ８Ａ）のＬＮＣａＰ−ＣＲ腫瘍への影響を分析した結果を示すグラフ及び写真である。ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝５）の皮下に接種し、接種１日後、７日後、１４日後に精製抗体２５０μｇ又は陰性対照として生理食塩水を尾静脈内投与した。そして、細胞接種２１日後のマウスから単離した腫瘍を撮影し、これら腫瘍の重量を測定した。グラフの各バーが示す値は、１群５匹の平均値±ＳＤであり、「＊＊」は「Ｐ＜０．０１」であることを示す。また、写真中のスケールバーは１ｃｍを示す。
【図９】抗ＣＸＡＤＲ精製抗体６Ｇ１０ＡのＬＮＣａＰ−ＣＲ腫瘍への効果を分析した結果を示すグラフである。ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝５）の皮下に接種し、接種１日後、７日後、１４日後に精製抗体、６２．５、１２５、２５０μｇ又は陰性対照として生理食塩水（精製抗体  ０μｇ）を尾静脈内投与した。そして、所定の期間後のマウスから単離した腫瘍の径を測定し、体積を算出した。図中の各折れ線が示す体積の値は、１群５匹の平均値±ＳＤである。また、「＊」は「Ｐ＜０．０５」であることを示す。
【図１０】抗ＣＸＡＤＲ精製抗体６Ｇ１０Ａ投与によるマウスへの影響を分析した結果を示すグラフである。ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝５）の皮下に接種し、接種１日後、７日後、１４日後に精製抗体、６２．５、１２５、２５０μｇ又は陰性対照として生理食塩水（精製抗体  ０μｇ）を尾静脈内投与した。そして、所定の期間後のマウスの体重を測定した。図中の各折れ線が示す体重の値は、１群５匹の平均値±ＳＤである。
【図１１】抗ＣＸＡＤＲ精製抗体６Ｇ１０ＡのＬＮＣａＰ−ＣＲ腫瘍への効果を分析した結果を示すグラフである。ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝５）の皮下に移植し、接種１日後、７日後、１４日後に精製抗体、６２．５、１２５、２５０μｇ又は陰性対照として生理食塩水（精製抗体  ０μｇ）を尾静脈内投与した。そして、細胞接種２１日後にマウスを犠牲死させ腫瘍を切除し、重量を測定した。図中の各バーが示す値は、１群５匹の平均値±ＳＤであり、「＊」は「Ｐ＜０．０５」であることを示す。
【図１２】抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０ＡのＬＮＣａＰ−ＣＲ腫瘍への効果を分析した結果を示すグラフである。ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝５）の皮下に移植し、接種１日後、７日後、１４日後３回（早期投与）、６Ｇ１０Ａ若しくはアイソタイプコントロール抗体２５０μｇ、又は生理食塩水を尾静脈内投与した。細胞接種２１日後にマウスを犠牲死させ腫瘍を切除し、重量を測定した。図中の各バーが示す値は、１群５匹の平均値±ＳＤであり、「＊」は「Ｐ＜０．０５」であることを示す。
【図１３】抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０ＡのＬＮＣａＰ−ＣＲ腫瘍への効果を分析した結果を示すグラフである。ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝５）の皮下に移植し、接種１４日後、２１日後、２８日後３回（後期投与）、６Ｇ１０Ａ若しくはアイソタイプコントロール抗体２５０μｇを尾静脈内投与した。細胞接種３５日後にマウスを犠牲死させ腫瘍を切除し、重量を測定した。図中の各バーが示す値は、１群５匹の平均値±ＳＤであり、「＊」は「Ｐ＜０．０５」であることを示す。
【図１４】抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０ＡのＬＮＣａＰ−ＣＲ同所移植腫瘍への効果を分析した結果を示すグラフ及び写真である。ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝５）の前立腺に移植し、６Ｇ１０Ａ  ２５０μｇ又は生理食塩水を尾静脈内投与した。そして、細胞接種２１日後のマウスから単離した腫瘍を撮影し、これら腫瘍の重量を測定した。グラフの各バーが示す値は、１群５匹の平均値±ＳＤであり、「＊」は「Ｐ＜０．０５」であることを示す。また、写真中のスケールバーは１ｃｍを示す。
【図１５】ＬＮＣａＰ−ＣＲ同所移植腫瘍への抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０Ａの代表的な投与例（ＬＮＣａＰ−ＣＲ移植後２１日目）を示す写真である。図中、三角は「ＬＮＣａＰ−ＣＲ腫瘍」を示す。
【図１６】抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０ＡのＤＵ−１４５腫瘍への効果を分析した結果を示すグラフである。ＤＵ−１４５細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝３）の皮下に移植し、接種１日後、７日後、１４日後に６Ｇ１０Ａ又はアイソタイプコントロール抗体  ２５０μｇを尾静脈内投与した。そして、所定の期間後のマウスから単離した腫瘍の径を測定し、体積を算出した。図中の各折れ線が示す体積の値は、１群３匹の平均値±ＳＤである。また、「＊」は「Ｐ＜０．０５」であることを示す。
【図１７】抗ＣＸＡＤＲ精製抗体６Ｇ１０Ａ投与によるマウスへの影響を分析した結果を示すグラフである。ＤＵ−１４５細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝３）の皮下に接種し、接種１日後、７日後、１４日後に６Ｇ１０Ａ又はアイソタイプコントロール抗体  ２５０μｇを尾静脈内投与した。そして、所定の期間後のマウスの体重を測定した。図中の各折れ線が示す体重の値は、１群３匹の平均値±ＳＤである。
【図１８】抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０ＡのＤＵ−１４５腫瘍への効果を分析した結果を示すグラフである。ＤＵ−１４５細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝３）の皮下に移植し、接種１日後、７日後、１４日後に６Ｇ１０Ａ又はアイソタイプコントロール抗体  ２５０μｇを尾静脈内投与した。そして、細胞接種２１日後にマウスを犠牲死させ腫瘍を切除し、重量を測定した。図中の各バーが示す値は、１群３匹の平均値±ＳＤである。また、「＊」は「Ｐ＜０．０５」であることを示す。
【図１９】抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０ＡのＢｘＰＣ３腫瘍への効果を分析した結果を示すグラフである。ＢｘＰＣ３細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝４）の皮下に移植し、接種１日後、７日後、１４日後に６Ｇ１０Ａ又はアイソタイプコントロール抗体  ２５０μｇを尾静脈内投与した。そして、所定の期間後のマウスから単離した腫瘍の径を測定し、体積を算出した。図中の各折れ線が示す体積の値は、１群４匹の平均値±ＳＤである。また、「＊」は「Ｐ＜０．０５」であることを示す。
【図２０】抗ＣＸＡＤＲ精製抗体６Ｇ１０Ａ投与によるマウスへの影響を分析した結果を示すグラフである。ＢｘＰＣ３細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝４）の皮下に接種し、接種１日後、７日後、１４日後に６Ｇ１０Ａ又はアイソタイプコントロール抗体  ２５０μｇを尾静脈内投与した。そして、所定の期間後のマウスの体重を測定した。図中の各折れ線が示す体重の値は、１群４匹の平均値±ＳＤである。
【図２１】抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０ＡのＢｘＰＣ３腫瘍への効果を分析した結果を示すグラフである。ＢｘＰＣ３細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝４）の皮下に移植し、接種１日後、７日後、１４日後に６Ｇ１０Ａ又はアイソタイプコントロール抗体  ２５０μｇを尾静脈内投与した。そして、細胞接種２１日後にマウスを犠牲死させ腫瘍を切除し、重量を測定した。図中の各バーが示す値は、１群４匹の平均値±ＳＤである。また、「＊」は「Ｐ＜０．０５」であることを示す。
【図２２】抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０ＡのＤＬＤ−１腫瘍への効果を分析した結果を示すグラフである。ＤＬＤ−１細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝３）の皮下に移植し、接種１日後、７日後、１４日後に６Ｇ１０Ａ又はアイソタイプコントロール抗体  ２５０μｇを尾静脈内投与した。そして、所定の期間後のマウスから単離した腫瘍の径を測定し、体積を算出した。図中の各折れ線が示す体積の値は、１群３匹の平均値±ＳＤである。また、「＊＊」は「Ｐ＜０．００１」であることを示す。
【図２３】抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０ＡのＤＬＤ−１腫瘍への効果を分析した結果を示すグラフである。ＤＬＤ−１細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝３）の皮下に移植し、接種１日後、７日後、１４日後に６Ｇ１０Ａ又はアイソタイプコントロール抗体  ２５０μｇを尾静脈内投与した。そして、細胞接種２１日後にマウスを犠牲死させ腫瘍を切除し、重量を測定した。図中の各バーが示す値は、１群３匹の平均値±ＳＤである。また、「＊＊」は「Ｐ＜０．００１」であることを示す。
【図２４】抗ＣＸＡＤＲ精製抗体６Ｇ１０Ａ投与によるマウスへの影響を分析した結果を示すグラフである。ＤＬＤ−１細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝３）の皮下に接種し、接種１日後、７日後、１４日後に６Ｇ１０Ａ又はアイソタイプコントロール抗体  ２５０μｇを尾静脈内投与した。そして、所定の期間後のマウスの体重を測定した。図中の各折れ線が示す体重の値は、１群３匹の平均値±ＳＤである。
【図２５】ＤＵ−１４５細胞にｓｈ  ＲＮＡを導入することによって、ＣＸＡＤＲの発現が減少した細胞を作製したことを、ウエスタンブロットにより確認した結果を示す写真である。図中、「ｓｈ  ＣＸＡＤＲ」はＣＸＡＤＲに対するｓｈ  ＲＮＡを導入したＤＵ−１４５細胞におけるＣＸＡＤＲタンパク質の発現を検出した結果を示し、「コントロールベクター」はコントロールｓｈ  ＲＮＡを導入したＤＵ−１４５細胞におけるＣＸＡＤＲタンパク質の発現を検出した結果を示す。
【図２６】抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０ＡのＤＵ−１４５腫瘍への効果を分析した結果を示すグラフである。ＣＸＡＤＲに対するｓｈ  ＲＮＡ又はコントロールｓｈ  ＲＮＡを導入したＤＵ−１４５細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝３）の皮下に移植し、接種１日後、７日後、１４日後に６Ｇ１０Ａ又はアイソタイプコントロール抗体  ２５０μｇを尾静脈内投与した。そして、細胞接種２１日後にマウスを犠牲死させ腫瘍を切除し、重量を測定した。図中の各バーが示す値は、１群３匹の平均値±ＳＤである。また、「＊＊」は「Ｐ＜０．００１」であることを示す。また「ｓｈ  ＣＸＡＤＲ」はＣＸＡＤＲに対するｓｈ  ＲＮＡを導入したＤＵ−１４５細胞を接種したマウスの結果を示し、「コントロールベクター」はコントロールｓｈ  ＲＮＡを導入したＤＵ−１４５細胞を接種したマウスの結果を示す。
【図２７】抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０Ａの細胞増殖への影響を分析した結果を示すグラフである。図中、縦軸は、ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞を６Ｇ１０Ａ存在下で３日間培養した後、ＭＴＴ法にて測定した細胞数（５７０ｎｍの吸光度）を示す。また、図中の各バーが示す値は、２連の測定値の平均値を示し、標準誤差（ＳＥ）は１０％以下である。
【図２８】抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０Ａのアンジオジェニン産生への影響を分析した結果を示すグラフである。図中、縦軸は、ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞を６Ｇ１０Ａ存在下で３日間培養した後、ＥＬＩＳＡ法にて測定した培養上清中のアンジオジェニン産生量（４５０−５４０ｎｍの吸光度）を示す。また、図中の各バーが示す値は、２連の測定値の平均値を示し、標準誤差（ＳＥ）は１０％以下である。
【図２９】抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０Ａの細胞増殖への影響を分析した結果を示すグラフである。図中、縦軸は、ＤＵ−１４５細胞を６Ｇ１０Ａ存在下で３日間培養した後、ＭＴＴ法にて測定した細胞数（５７０ｎｍの吸光度）を示す。また、図中の各バーが示す値は、３連の測定値の平均値±ＳＤである。
【図３０】抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０ＡのＡＤＣＣ活性を分析した結果を示すグラフである。ＡＤＣＣ活性は、ヌードマウス（雄）の脾細胞（エフェクター細胞）と、カルセインＡＭにて標識したＤＵ−１４５細胞（標的細胞）とを、６Ｇ１０Ａ若しくはアイソタイプコントロール抗体１００μｇ／ｍｌ、又は生理食塩水存在下で４時間培養した。そして、培養上清中のカルセインＡＭの蛍光強度を測定し、ＤＵ−１４５細胞に対する細胞傷害活性（溶解活性）を算出した。図中の各折れ線が示す細胞傷害活性の値は、３連の測定値の平均値±ＳＤである。また「＊」は「Ｐ＜０．０５」であることを示し、「＊＊」は「Ｐ＜０．０１」であることを示す。
【図３１】抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０ＡのＣＤＣ活性を分析した結果を示すグラフである。ＣＤＣ活性は、カルセインＡＭにて標識したＤＵ−１４５細胞と、６Ｇ１０Ａ又はアイソタイプコントロール抗体とを、１０％補体存在下にて４時間培養した。そして、培養上清中のカルセインＡＭの蛍光強度を測定し、ＤＵ−１４５細胞に対する細胞傷害活性（溶解活性）を算出した。図中の各折れ線が示す細胞傷害活性の値は、３連の測定値の平均値±ＳＤであり、「＊＊」は「Ｐ＜０．０１」であることを示す。
【図３２】抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０Ａの抗がん活性への抗アシアロＧＭ１抗体の影響を分析した結果を示すグラフである。ＤＵ−１４５細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝５）の皮下に移植し、接種０日後、７日後、１４日後に６Ｇ１０Ａ又はアイソタイプコントロール抗体  ２５０μｇを尾静脈内投与した。抗アシアロＧＭ１抗体（抗ＧＭ１）は、細胞接種前日、６日後、１３日後に１００μｇ尾静脈内投与した。そして、所定の期間後のマウスから単離した腫瘍の径を測定し、体積を算出した。図中の各折れ線が示す体積の値は、１群５匹の平均値±ＳＤである。また、「＊＊」は「Ｐ＜０．０１」であることを示し、「＊＊＊」は「Ｐ＜０．００１」であることを示す。
【図３３】抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０Ａ及び抗アシアロＧＭ１投与によるマウスへの影響を分析した結果を示すグラフである。ＤＵ−１４５細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝５）の皮下に移植し、接種０日後、７日後、１４日後に６Ｇ１０Ａ又はアイソタイプコントロール抗体  ２５０μｇを尾静脈内投与した。抗アシアロＧＭ１抗体（抗ＧＭ１）は、細胞接種前日、６日後、１３日後に１００μｇ尾静脈内投与した。そして、所定の期間後のマウスの体重を測定した。図中の各折れ線が示す体重の値は、１群５匹の平均値±ＳＤである。
【図３４】抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０Ａの抗がん活性への抗アシアロＧＭ１抗体の影響を分析した結果を示すグラフである。ＤＵ−１４５細胞をヌードマウス（雄、ｎ＝５）の皮下に移植し、接種０日後、７日後、１４日後に６Ｇ１０Ａ又はアイソタイプコントロール抗体  ２５０μｇを尾静脈内投与した。抗アシアロＧＭ１抗体（抗ＧＭ１）は、細胞接種前日、６日後、１３日後に１００μｇ尾静脈内投与した。そして、細胞接種２１日後にマウスを犠牲死させ腫瘍を切除し、重量を測定した。図中の各バーが示す値は、１群５匹の平均値±ＳＤである。また、「＊＊」は「Ｐ＜０．０１」であることを示す。
【図３５】ハイブリドーマ（クローン名：６Ｇ１０Ａ）から産生される抗ＣＸＡＤＲ抗体の重鎖可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列を示す図である。図中、下線が引かれているアミノ酸配列は、予測されたシグナル配列及びＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を各々示す。
【図３６】ハイブリドーマ（クローン名：６Ｇ１０Ａ）から産生される抗ＣＸＡＤＲ抗体の軽鎖可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列を示す図である。図中、下線が引かれているアミノ酸配列は、予測されたシグナル配列及びＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を各々示す。
【図３７】ハイブリドーマ（クローン名：７Ｆ８Ａ）から産生される抗ＣＸＡＤＲ抗体の重鎖可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列を示す図である。図中、下線が引かれているアミノ酸配列は、予測されたシグナル配列及びＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を各々示す。
【図３８】ハイブリドーマ（クローン名：７Ｆ８Ａ）から産生される抗ＣＸＡＤＲ抗体の軽鎖可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列を示す図である。図中、下線が引かれているアミノ酸配列は、予測されたシグナル配列及びＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を各々示す。
【図３９】ハイブリドーマ（クローン名：１Ｇ１１Ｂ９Ｅ、７Ｆ８Ａ、６Ｇ１０Ａ、２Ａ８Ａ，２Ａ８Ｂ又は８Ｆ１１）から産生される抗ＣＸＡＤＲ抗体と、ＣＸＡＤＲの細胞外領域（Ｎ末端より８３アミノ酸、Ｎ末端より１３３アミノ酸、Ｎ末端より１８１アミノ酸、Ｎ末端より２３０アミノ酸又はＮ末端より２３７アミノ酸（ＣＸＡＤＲの細胞外領域の全長））との反応性を、フローサイトメーターにて分析した結果を示す図である。各フローサイトメーターデータの塗りつぶしヒストグラム部分は、各々ハイブリドーマから産生される抗ＣＸＡＤＲ抗体との反応を、白のヒストグラム部分は、陰性対照としたマウスＩｇＧ（アイソタイプコントロール抗体のミックス）との反応を示す。
【図４０】抗ＣＸＡＤＲ抗体  ６Ｇ１０Ａ又は７Ｆ８Ａと、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）との反応性を、フローサイトメーターにて分析した結果を示す図である。各フローサイトメーターデータの塗りつぶしヒストグラム部分は、抗ＣＸＡＤＲ抗体との反応を、白のヒストグラム部分は、陰性対照としたマウスＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ（アイソタイプコントロール抗体）との反応を示す。
【図４１】抗ＣＸＡＤＲ抗体  ６Ｇ１０Ａ又は７Ｆ８Ａと、ＨＵＶＥＣとの反応性を、細胞免疫染色にて分析した結果を示す顕微鏡写真である。
【図４２】抗ＣＸＡＤＲ抗体  ６Ｇ１０又は７Ｆ８Ａと、各種がん細胞（ＬＮＣａＰ−ＣＲ、ＤＵ−１４５又はＰＣ−３）との反応性を、フローサイトメーターにて分析した結果を示す図である。各フローサイトメーターデータの塗りつぶしヒストグラム部分は、抗ＣＸＡＤＲ抗体との反応を、白のヒストグラム部分は、陰性対照としたマウスＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ（アイソタイプコントロール抗体）との反応を示す。
【図４３】各種がん細胞（ＬＮＣａＰ−ＣＲ、ＬＮＣａＰ、ＤＵ−１４５又はＰＣ−３）におけるＣＸＡＤＲタンパク質の発現をウェスタンブロッティングにより分析した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
後述の実施例において示す通り、ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の特定部位（１８１〜２３０位）に結合する抗体は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性等を有し、優れた抗がん活性を発揮することが明らかになった。従って、本発明は、ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位に存在するエピトープに結合する抗体を提供する。
【００１８】
本発明における「抗体」は、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスを含む。「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が含まれ、また、抗体の機能的断片の形態も含む意である。「ポリクローナル抗体」は、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物である。また、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味する。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を認識するものである。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の抗体は、自然環境の成分から分離され、および／または回収された（即ち、単離された）抗体である。
【００１９】
本発明において「ＣＸＡＤＲ」は、「コクサッキーウィルス・アデノウィルス受容体（ＣＯＸＳＡＣＫＩＥＶＩＲＵＳ  ＡＮＤ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ）」、「ＣＡＲ」、「ＣＶＢ３結合タンパク質（ＣＶＢ３  ＢＩＮＤＩＮＧ  ＰＲＯＴＥＩＮ）」又は「コクサッキーウィルスＢ受容体（ＣＯＸＳＡＣＫＩＥＶＩＲＵＳ  Ｂ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ）」とも称されるタンパク質である。ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質は、典型的には、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００１３２９で特定されるタンパク質（ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＭ＿００１３３８で特定される塩基配列がコードするタンパク質）である。従って、「ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位」は、典型的には、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００１３２９で特定されるタンパク質の１８１位（セリン残基）〜２３０位（バリン残基）に記載のアミノ酸配列である。
【００２０】
また、「ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位」は、このような典型的なアミノ酸配列を有するもの以外に、天然においてアミノ酸が変異したものも存在しうる。従って、本発明にかかる「ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位」は、好ましくは、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００１３２９で特定されるタンパク質の１８１位〜２３０位に記載のアミノ酸配列であるが、それ以外に、ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ＿００１３２９で特定されるタンパク質の１８１位〜２３０位に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものも含まれる。アミノ酸配列の置換、欠失、挿入若しくは付加は、一般的には、１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
【００２１】
本発明において「エピトープ」とは、抗原中に存在する抗原決定基、すなわち抗体中の抗原結合ドメインが結合する抗原上の部位を意味する。従って、本発明におけるエピトープは、アミノ酸の一次配列中において連続する複数のアミノ酸からなるポリペプチド（線状エピトープ）であってもよく、アミノ酸の一次配列中において隣接していないアミノ酸が、ペプチド又はタンパク質の折り畳み等の三次元構造によって近傍にくることにより形成されるポリペプチド（不連続エピトープ、構造的エピトープ）であってもよい。また、かかるエピトープとしては、典型的には、少なくとも３つ、および最も普通には少なくとも５つ（例えば８〜１０個、６〜２０個）のアミノ酸からなる。
【００２２】
本発明において「抗がん活性」とは、がん細胞の増殖を抑制する活性、及び/又はがん細胞の死を誘導する活性を意味する。抗がん活性は、例えば、後述の実施例に記載の担がんモデル（がん細胞移植マウス等）を用いた分析により評価することができる。本発明の抗体の好ましい態様は、後述の実施例４又は５に記載の、アンドロゲン依存性ヒト前立腺がん細胞株：ＬＮＣａＰ−ＣＲを異所（皮下）移植したマウスを用いた分析により、がん細胞株移植２１日後において、摘出腫瘍重量を、対照と比較して、２０％以上（例えば、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上）減少させる抗体である。本発明の抗体の他の好ましい態様は、ＬＮＣａＰ−ＣＲを同所（前立腺内）移植したマウスを用いた分析により、がん細胞株移植２１日後において、摘出腫瘍重量を、対照と比較して、７０％以上（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上）減少させる抗体である。本発明の抗体の他の好ましい態様は、アンドロゲン非依存性ヒト前立腺がん細胞株：ＤＵ−１４５を異所（皮下）移植したマウスを用いた分析により、がん細胞株移植２１日後において、摘出腫瘍重量を、対照と比較して、２０％以上（例えば、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上）減少させる抗体である。本発明の抗体の他の好ましい態様は、膵臓がん細胞株：ＢｘＰＣ−３を異所（皮下）移植したマウスを用いた分析により、がん細胞株移植２１日後において、摘出腫瘍重量を、対照と比較して、１０％以上（例えば、１５％以上、２０％以上、２５％以上）減少させる抗体である。本発明の抗体の他の好ましい態様は、大腸がん細胞株：ＤＬＤ−１を異所（皮下）移植したマウスを用いた分析により、がん細胞株移植２１日後において、摘出腫瘍重量を、対照と比較して、１０％以上（例えば、１５％以上、２０％以上、２５％以上）減少させる抗体である。本発明の抗体の他の好ましい態様は、がん細胞に対してＡＤＣＣ活性及び／又はＣＤＣ活性を発揮する抗体である。
【００２３】
また、抗がん剤として用いる場合、これら抗体は、さらに、投与対象の体重を減少させないという特性を持つことが好ましい。また、静脈投与等の投与形態に対応すべく、これら抗体は、さらにまた、血管内皮細胞に対して結合しないという特性を持つことが好ましい。本発明の抗体は、上記の活性を複数併せ持つことが特に好ましい。
【００２４】
本発明の抗体の他の好ましい態様は、
軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３（配列番号：１〜３に記載のアミノ酸配列）を含む軽鎖可変領域と、重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３（配列番号：６〜８に記載のアミノ酸配列）を含む重鎖可変領域を保持する抗体、及び
軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３（配列番号：１１〜１３に記載のアミノ酸配列）を含む軽鎖可変領域と、重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３（配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列）を含む重鎖可変領域とを保持する抗体である。
【００２５】
例えば、軽鎖可変領域が配列番号：５に記載のアミノ酸配列（または該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列）からなり、重鎖可変領域が配列番号：１０に記載のアミノ酸配列（または該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列）からなる抗体、及び
軽鎖可変領域が配列番号：１５に記載のアミノ酸配列（または該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列）からなり、重鎖可変領域が配列番号：２０に記載のアミノ酸配列（または該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列）からなる抗体が挙げられる。
【００２６】
また、これらの中では、より高い抗がん活性を有し、血管内皮細胞に対して結合しないという特性を有するという観点から、軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３（配列番号：１〜３に記載のアミノ酸配列）を含む軽鎖可変領域と、重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３（配列番号：６〜８に記載のアミノ酸配列）を含む重鎖可変領域を保持する抗体が、本発明の抗体としてより好ましく、軽鎖可変領域が配列番号：５に記載のアミノ酸配列（または該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列）からなり、重鎖可変領域が配列番号：１０に記載のアミノ酸配列（または該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列）からなる抗体が、本発明の抗体として特に好ましい。
【００２７】
一旦、上記軽鎖可変領域と重鎖可変領域とからなる抗体が得られた場合、当業者であれば、その抗体が認識するヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位上のペプチド領域（エピトープ）を特定して、その領域に結合し、かつ、抗がん活性を示す種々の抗体を作製することができる。抗体のエピトープは、ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質のアミノ酸配列から得られたオーバーラップする合成オリゴペプチドへの結合を調べるなどの周知の方法によって決定することができる（例えば、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，、米国特許４７０８８７１号）。ファージディスプレイによるペプチドライブラリーをエピトープマッピングに用いることもできる。二つの抗体が同一または立体的に重なり合ったエピトープと結合するかどうかは、競合アッセイ法により決定することができる。
【００２８】
本発明の抗体には、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及び、これら抗体の機能的断片が含まれる。本発明の抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体が望ましい。
【００２９】
本発明において「キメラ抗体」とは、ある種の抗体の可変領域とそれとは異種の抗体の定常領域とを連結した抗体である。キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平８−２８０３８７号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。また、本発明において「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）した抗体であり、その作製方法は、公知である（例えば、ＥＰ２３９４００、ＥＰ１２５０２３、ＷＯ９０／０７８６１、ＷＯ９６／０２５７６参照）。本発明において、「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。ヒト抗体の作製においては、ヒトＢ細胞より活性のある抗体の産生をスクリーニングする方法、ファージディスプレイ法、免疫することで、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用すること等が可能である。ヒト抗体の作製手法は、公知である（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３：６５−９３（１９９５）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７２２−７２７（２０００）、特開平１０−１４６１９４号公報、特開平１０−１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１−２０６３８７号公報、特表平８−５０９６１２号公報、特表平１１−５０５１０７号公報）。
【００３０】
本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位に存在するエピトープを特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、及びこれらの重合体などが挙げられる。
【００３１】
ここで「Ｆａｂ」とは、１つの軽鎖及び重鎖の一部からなる免疫グロブリンの一価の抗原結合断片を意味する。抗体のパパイン消化によって、また、組換え方法によって得ることができる。「Ｆａｂ’」は、抗体のヒンジ領域の１つ又はそれより多いシステインを含めて、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのわずかの残基の付加によって、Ｆａｂとは異なる。「Ｆ（ａｂ’）２」とは、両方の軽鎖と両方の重鎖の部分からなる免疫グロブリンの二価の抗原結合断片を意味する。
【００３２】
「可変領域断片（Ｆｖ）」は、完全な抗原認識および結合部位を有する最少の抗体断片である。Ｆｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである。「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」は、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在する。「ｓｃ（Ｆｖ）２」は、２つの重鎖可変領域及び２つの軽鎖可変領域をリンカー等で結合して一本鎖にしたものである。「ダイアボディー」とは、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であり、この断片は、同一ポリペプチド鎖の中に軽鎖可変領域に結合した重鎖可変領域を含み、各領域は別の鎖の相補的領域とペアを形成している。「多特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。例えば、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現により調製することができる。
【００３３】
本発明においては、本発明において同定されたＣＤＲを含む抗体の軽鎖若しくは重鎖又はそれらの可変領域からなるペプチドを提供する。好ましいペプチドは、
配列番号：１〜３に記載のアミノ酸配列を含む本発明の抗体の軽鎖若しくはその可変領域からなるペプチド、
配列番号：１１〜１３に記載のアミノ酸配列を含む本発明の抗体の軽鎖若しくはその可変領域からなるペプチド、
配列番号：５に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列を含むペプチド、及び
配列番号：１５に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列を含むペプチドである。
【００３４】
他の好ましいペプチドは、配列番号：６〜８に記載のアミノ酸配列を含む本発明の抗体の重鎖若しくはその可変領域からなるペプチド、
配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列を含む本発明の抗体の重鎖若しくはその可変領域からなるペプチド、
配列番号：１０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列を含むペプチド、及び
配列番号：２０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列を含むペプチドである。
【００３５】
また、これらペプチドを、例えば、リンカー等により連結することで、機能的な抗体を作製することが可能である。
【００３６】
本発明の抗体には、望ましい活性（抗原への結合活性、抗がん活性、および／または他の生物学的特性）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。本発明の抗体のアミノ酸配列変異体は、本発明の抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。そのような修飾には、例えば、本発明の抗体のアミノ酸配列内の残基の置換、欠失、付加及び／又は挿入を含む。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域及びＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５−３５１（２００８））。また、現在では、統合計算化学システム等（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔ、カナダＣＣＧ社製）を利用することにより、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をモデリングすることもできる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｓｉ．ｃｏ．ｊｐ／ｋａｇａｋｕ／ｃｓ／ｃｃｇ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ／ｐｒｏｔｅｉｎ．ｈｔｍｌ  参照）。
【００３７】
改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。また、「同等の活性を有する」とは、抗原への結合活性または抗がん活性が対象抗体（代表的には、抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０Ａ、抗ＣＸＡＤＲ抗体７Ｆ８Ａ）と同等（例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）であることを意味する。抗原への結合活性は、例えば、抗原を発現するＢａ／Ｆ３細胞を作製し、抗体サンプルとの反応性をフローサイトメーターで解析することにより評価することができる（実施例２）。また、抗がん活性は、上記した通り、例えば、担がんモデルを用いた分析により評価することができる（実施例４等）。
【００３８】
また、本発明の抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数又は位置を変化させる等の抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。これにより、例えば、抗体のＡＤＣＣ活性を向上させることができる。抗体のグリコシル化とは、典型的には、Ｎ−結合又はＯ−結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入又は欠失等の公知の方法で行うことができる（特開２００８−１１３６６３号公報、米国特許第５０４７３３５号、米国特許第５５１０２６１号、米国特許第５２７８２９９号、国際公開第９９／５４３４２号）。さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。
【００３９】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位のアミノ酸配列からなるポリペプチド、その部分ペプチド、またはこれらを発現する細胞等）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィー等）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
【００４０】
ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラーおよびミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原（ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位のアミノ酸配列からなるポリペプチド、その部分ペプチド、またはこれらを発現する細胞等）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球などである。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
【００４１】
組換えＤＮＡ法は、上記本発明の抗体又はペプチドをコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ  Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７−７７５（１９９０））。本発明の抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（国際公開第９４／１１５２３号公報  参照）。本発明の抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
【００４２】
本発明は、上記本発明の抗体又はペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ＤＮＡを保持する宿主細胞、及び該宿主細胞を培養し、抗体を回収することを含む抗体の生産方法をも提供することができる。
【００４３】
本発明の抗体は、後述の実施例において示す通り、ＣＸＡＤＲタンパク質の機能を阻害することにより、抗がん活性等を発揮することから、ＣＸＡＤＲタンパク質に関連する疾患の治療又は予防に利用することができる。従って、本発明は、本発明の抗体を有効成分とする医薬組成物（例えば、本発明の抗体を有効成分とするがんの治療剤）、並びに本発明の抗体の治療上又は予防上の有効量を、ヒトを含む哺乳類に投与する工程を含んでなる、ＣＸＡＤＲタンパク質に関連する疾患（例えば、がん）の治療又は予防の方法をも提供するものである。本発明の治療又は予防の方法は、ヒト以外にも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ等を含各種哺乳動物に応用することが可能である。
【００４４】
本発明の抗体の標的とするＣＸＡＤＲタンパク質に関連する疾患は、ＣＸＡＤＲタンパク質が、その発症、症状の進行、悪化等に関与する疾患であればよく、例えば、がん、感染症（コクサッキーウィルス感染症、アデノウィルス感染症等）が挙げられるが、がんが望ましい。
【００４５】
また、本発明の抗体の標的とするがんとしては、本発明の抗体が抗がん活性を発揮しうるものである限り特に制限はないが、後述の実施例において示す通り、本発明の抗体は前立腺がん細胞、膵臓がん細胞、大腸がん細胞の増殖を強く抑制したことから、特に前立腺がん、膵臓がん、大腸がんが好ましい。
【００４６】
本発明の抗体を有効成分とする医薬組成物は、本発明の抗体と任意の成分、例えば生理食塩水、葡萄糖水溶液又はリン酸塩緩衝液等を含有する組成物の形態で使用することができる。本発明の医薬組成物は、必要に応じて液体又は凍結乾燥した形態で製形化しても良く、任意に薬学的に許容される担体若しくは媒体、例えば、安定化剤、防腐剤、等張化剤等を含有させることもできる。
【００４７】
薬学的に許容される担体としては、凍結乾燥した製剤の場合、マンニトール、ラクトース、サッカロース、ヒトアルブミン等を例として挙げることができ、液状製剤の場合には、生理食塩水、注射用水、リン酸塩緩衝液、水酸化アルミニウム等を例として挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
医薬組成物の投与方法は、投与対象の年齢、体重、性別、健康状態等により異なるが、非経口投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）、経口投与のいずれかの投与経路で投与することができる。好ましい投与方法は、非経口投与である。医薬組成物の投与量は、患者の年齢、体重、性別、健康状態、症状の進行の程度及び投与する医薬組成物の成分により変動しうるが、一般的に静脈内投与の場合、成人には体重１ｋｇ当たり１日０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇである。
【００４９】
本発明の抗体は、ＣＸＡＤＲタンパク質に関連する疾患の治療や予防のみならず、該疾患の検査への応用も考えられる。特に、本発明の抗体のエピトープが存在するヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位は、ＣＸＡＤＲタンパク質の細胞外領域であるため、細胞免疫染色やフローサイトメトリー等において、簡便かつ効率良く、ＣＸＡＤＲタンパク質を発現している細胞を検出することができる。特にがんに関して、遺伝子発現プロファイルデータベース（ＢｉｏＧＰＳ、http://biogps.org/#goto=welcome）においても示されているように、ＣＸＡＤＲ遺伝子の発現量は非がん細胞（非がん組織）において総じて低く、各種がん細胞株において高い。さらに、ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞とＬＮＣａＰ細胞との比較において、ＣＸＡＤＲタンパク質はがんの悪性化に関与している可能性があるため、本発明の抗体は、ＣＸＡＤＲタンパク質の発現を指標としたがんの悪性度の検査における利用も考えられる。従って、本発明は、上記本発明の抗体を有効成分とする、ＣＸＡＤＲタンパク質に関連する疾患（例えば、がん）を検査するための薬剤を提供する。
【００５０】
本発明の抗体をＣＸＡＤＲタンパク質に関連する疾患の検査に用いる場合あるいは該疾患の治療における疾患部位（例えば、がんの治療における腫瘍部位）の検出に用いる場合、本発明の抗体は、標識したものであってもよい。標識としては、例えば、放射性物質、蛍光色素、化学発光物質、酵素、補酵素を用いることが可能であり、具体的には、ラジオアイソトープ、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、リゾチーム、ビオチン／アビジンなどが挙げられる。本発明の抗体を検査薬として調剤するには、合目的な任意の手段を採用して任意の剤型でこれを得ることができる。例えば、精製した抗体についてその抗体価を測定し、適当にＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ，生理食塩を含むリン酸緩衝液）等で希釈した後、０．１％アジ化ナトリウム等を防腐剤として加えることができる。また、例えば、ラテックス等に本発明の抗体を吸着させたものについて抗体価を求め、適当に希釈し、防腐剤を添加して用いることもできる。
【００５１】
また、本発明において、ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位に存在するエピトープに結合する抗体が抗がん活性を有することが判明したことから、ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位のアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその部分ペプチドをがんワクチンとして、ヒトを含む哺乳動物に投与することも可能である（例えば、特開２００７−２７７２５１号公報、特開２００６−０５２２１６号公報を参照のこと）。本発明は、このようながんワクチン用途に用いられる、ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位のアミノ酸配列からなるポリペプチド又はその部分ペプチドを含むがんワクチン組成物をも提供するものである。製剤化する場合には、上記本発明の抗がん剤と同様に、薬学的に許容される担体若しくは媒体、例えば、安定化剤、防腐剤、等張化剤等を含有させることができる。
【００５２】
また、後述の実施例９及び１４に示す通り、本発明の抗ＣＸＡＤＲ抗体による抗がん活性は、該抗体がＣＸＡＤＲに結合することにより奏されること、すなわちＣＸＡＤＲタンパク質が発現しているがん細胞に対して本発明の抗体は抗がん活性を発揮できることが明らかになっている。さらに前述の通り、ＣＸＡＤＲ遺伝子の発現量は非がん細胞（非がん組織）において総じて低く、各種がん細胞株において高い。
【００５３】
従って、本発明は、がん治療の有効性を判定する方法であって、
患者から単離した試料におけるＣＸＡＤＲタンパク質の存在又は非存在を検出する工程を含み、前記工程にてＣＸＡＤＲタンパク質の存在が検出されれば、前記患者において、本発明の抗体を有効成分とするがんの治療剤によるがん治療の有効性が高いと判定される方法を提供する。
【００５４】
また、本発明は、前記方法によりがん治療の有効性が高いと判定された患者に投与される、本発明の抗体を有効成分とするがんの治療剤を提供する。
【００５５】
さらに、本発明は、前記方法によりがん治療の有効性が高いと判定された患者に対して、本発明の抗体を有効成分とするがんの治療剤を投与する、がんの治療方法。
【００５６】
本発明において「患者」とは、がんに罹患しているヒトのみならず、がんに罹患していると疑いのあるヒトであってもよい。また、このような患者から単離される「試料」は、生体試料（例えば、細胞、組織、臓器、体液（血液、リンパ液等）、消化液、喀痰、肺胞・気管支洗浄液、尿、便）のみならず、これらの生体試料から得られるタンパク質抽出物や核酸抽出物（ｍＲＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物から調製されたｃＤＮＡ調製物やｃＲＮＡ調製物等）も含まれる。また、前記試料は、ホルマリン固定処理、アルコール固定処理、凍結処理又はパラフィン包埋処理が施してあるものでもよい。また、タンパク質、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等は、当業者であれば、前記試料の種類及び状態等を考慮し、それに適した公知の手法を選択して調製することが可能である。
【００５７】
本発明における「ＣＸＡＤＲタンパク質の存在又は非存在の検出」において、ＣＸＡＤＲタンパク質を直接検出してもよく、また該タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等の検出を介して、間接的に検出するものであてもよい。
【００５８】
このような検出には、公知の手法を用いることができる。かかる公知の手法としては「ＣＸＡＤＲタンパク質」自体を対象とする場合においては、例えば、ＣＸＡＤＲタンパク質に対する抗体を用いた免疫学的手法（ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー、免疫組織化学的染色法、イメージングサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、抗体アレイを用いた解析法等）が挙げられる。「ＣＸＡＤＲタンパク質をコードするｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等」を対象とする場合においては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いた解析法が挙げられる。
【００５９】
本発明の方法により、患者から単離した試料において、ＣＸＡＤＲタンパク質の存在が検出された場合、当該患者は、本発明の抗体を有効成分とするがんの治療剤によるがん治療の有効性が高いと判定され、一方、当該タンパク質の存在が検出されなかった場合は、当該患者は、該治療剤によるがん治療の有効性が低いと判定される。
【００６０】
また、本発明の「がんの治療剤」並びに「がんの治療方法」に関し、本発明のがんの治療剤の前記有効性が高いと判定された患者への投与は、前述の通り、投与対象の年齢、体重、性別、健康状態等により異なるが、非経口投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）、経口投与のいずれかの投与形態を採用して行うことができる。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例及に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本実施例は下記細胞及び抗体等を用い、下記方法に沿って行った。【００６２】
＜細胞及び抗体等＞
ヒト前立腺がん細胞ＬＮＣａＰ、ヒト前立腺がん細胞ＤＵ−１４５、ヒト前立腺がん細胞ＰＣ―３、ヒト膵臓がん細胞ＢｘＰＣ−３、ヒト大腸がん細胞ＤＬＤ−１はＡＴＣＣから購入した。ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞は、本発明者らが樹立した。細胞は、ＤＭＥＭに１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）、ペニシリンＧ  １００ユニット／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加した培地にて、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。【００６３】
ラビット抗アシアロＧＭ１抗体は和光純薬株式会社から、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール抗体はＳｉｇｍａ社又はＣｅｌｌ  Ｌａｂ社から、マウスＩｇＧ２ｂアイソタイプコントロール抗体はＣｅｌｌ  Ｌａｂ社から、カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）ＡＭはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社から、Ｌｏｗ−Ｔｏｘ（登録商標）−Ｍウサギ補体はＣｅｄａｒｌａｎｅ社から購入した。【００６４】
＜ＳＳＴ−ＲＥＸ＞
前立腺がん株化細胞ＬＮＣａＰ細胞及びＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞、それぞれ２×１０７個をトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、＃１５５９６−０２６）１ｍｌに懸濁し５分放置後、クロロフォルムを２００μｌ添加して１５秒間懸濁した。その後１２０００ｇで１５分間遠心し、上清を得た。上清と５００μｌのイソプロパノールを混ぜ合わせた後、１２０００ｇで１０分間遠心を行った。得られたペレットを８０％エタノールで洗いＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２００μｇを得た。そのすべてを１００μｌの水で溶かし、ファストトラック２．０  ｍＲＮＡ分離キット（ＦａｓｔＴｒａｃｋ２．０  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、＃Ｋ１５９３−０２）を用いて能書にしたがって作業を行い、ｍＲＮＡ３μｇを得た。得られたｍＲＮＡすべてを利用して、スーパースクリプトチョイスシステム（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製、＃１８０９０−０１９）を用いて能書にしたがって作業を行い、ｃＤＮＡの作製を行った。得られたｃＤＮＡにＢｓｔＸＩアダプター（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製、＃Ｎ４０８−１８）９μｇを、ライゲーションハイ（ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ、ＴＯＹＯＢＯ社製、＃ＬＧＫ−２０１）を用いて１６時間かけて結合させた。その後、１．５％アガロースゲルにて電気泳動を行い、５００〜４０００ｂｐの部位の部分を切り出し、ウィザード（登録商標）ＳＶ  ゲル及びＰＣＲクリーンアップシステム（Ｗｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ、ｐｒｏｍｅｇａ社製、＃Ａ９２８２）を用いて能書にしたがって作業を行い精製した。ｐＭＸ−ＳＳＴベクターについてＢｓｔＸＩ酵素（Ｔａｋａｒａ社製、＃１０２７Ａ）を用いて処理し、１％  アガロースゲルにて電気泳動を行い、ベクターの部位を切り出し、ウィザード（登録商標）ＳＶ  ゲル及びＰＣＲクリーンアップシステムを用いて能書にしたがって作業を行い精製した。切り出し精製を行ったＢｓｔＸ  Ｉ  ＡｄａｐｔｅｒつきｃＤＮＡ半量と切り出し精製を行ったＢｓｔＸＩ処理を行ったｐＭＸ−ＳＳＴベクター５０ｎｇをＴ４  ＤＮＡライゲースを用いて３時間かけて結合させた。エタノール沈殿を行い精製して１０μｌに溶かしてそのうちの２μｌをコンピテントセル（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、＃１８９２０−０１５）２３μｌと混ぜ１．８ｋＶの条件でエレクトロポレーションを行いすぐに１ｍｌのＳＯＣに懸濁した。この作業を２回行った後、３７℃で９０分振とう培養を行った。その後、ＬＢ５００ｍｌにアンピシリンを添加し１６時間振とう培養を行った。集菌し、１０ヌクレオボンド（登録商標）ＡＸ５００カラム（１０  ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  ＡＸ  ５００  ｃｏｌｕｍｎｓ、日本ジェネティクス社製、＃７４０５７４）を用いてプラスミドを精製しｃＤＮＡライブラリを確立した。【００６５】
ウイルスを産生させるためにパッケイジング細胞Ｐｌａｔ−Ｅを６ｃｍディッシュに２×１０６個を４ｍｌのＤＭＥＭ（Ｗａｋｏ社製、＃０４４−２９７６５）に懸濁し、流し入れて３７℃、５％ＣＯ２の条件で２４時間培養した。１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製、＃３１９８５０７０）と９μｌのＦｕｇｅｎｅ（ｒｏｃｈｅ社製、＃１８１４４４３）を混ぜ、５分室温で放置後、３μｇのｃＤＮＡライブラリを添加、１５分室温で放置後、用意したＰｌａｔ−Ｅに滴下した。そして、２４時間後に上清を入れ替えた。さらに２４時間後の上清を０．４５μｍのフィルターを通してろ過した。ＲＰＭＩ−１６４０（コージンバイオ社製）９．５ｍｌに４×１０６個のＢａ／Ｆ３細胞を１０ｃｍディッシュに用意して取得したろ過上清０．５ｍｌを加えた。１０μｇのポリブレン（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製、＃ＴＲ−１００３−Ｇ）を添加し、さらにＩＬ−３を１０ｎｇ添加した。２４時間後、細胞を３回ＲＰＭＩ−１６４０で洗い、２００ｍｌに懸濁して９６ウェルプレート２０枚に均等分量になるようにまいた。１０日後から２０日後までに増殖してくる細胞を細胞がウェルいっぱいになるまで培養し、半分量は拡大培養して、ストックした。また、残り半分からゲノムを抽出した。ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製、＃ＲＲ００２）又はプライムスターマックスＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製、＃Ｒ０４５Ａ）を用いて能書にしたがってＰＣＲを行った。ＰＣＲプライマーは
ＳＳＴ３’−Ｔ７  ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＴＡＡＡＣＧＧＴＡＧ−３’（配列番号：２１）と
ＳＳＴ５’−Ｔ３  ５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡ−３’（配列番号：２２）と
を用いた。ＰＣＲ産物をウィザード（登録商標）ＳＶ  ゲル及びＰＣＲクリーンアップシステム等を用いて能書にしたがって作業を行い精製した。ビッグダイターミネーターｖ３．１サイクルシークエンシング（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＡＢＩ社製、＃４３３７４５６）を用いて能書に従って作業を行い、シークエンスを行った。シークエンスのプライマーはＳＳＴ５’−Ｔ３  ５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡ−３’（配列番号：２２）を用いた。シークエンスデータはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／とｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／とを用いて解析した。【００６６】
＜抗ＣＸＡＤＲ抗体の作製＞
免疫動物はマウスＢａｌｂ／ｃを使用した。免疫開始日の前日にタイターマックスゴールド（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、ＡＬＸ−５１０−００２−Ｌ０１０）と等量のＰＢＳとを混和して乳化したもの５０μｌを投与した。その後、マウスの腹腔にＣＸＡＤＲ遺伝子を有するＳＳＴ  ｃｌｏｎｅ細胞を５×１０６〜１×１０７細胞ずつ２日おきに４回注入して免疫した。免疫後に取り出した二次リンパ組織をほぐし、抗体産生細胞を含む細胞集団を得た。それらの細胞と融合パートナー細胞を混合し、ポリエチレングリコール（ＭＥＲＣＫ社製、１．０９７２７．０１００）を用いた細胞融合によりハイブリドーマを作製した。融合パートナー細胞は、マウスミエローマＰ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１）細胞を用いた。【００６７】
ハイブリドーマをＨＡＴ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｈ０２６２）、Ｔ−２４細胞の培養上清３０ｍｌを含む１５％ＦＢＳ、終濃度１００ユニット／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製、１５１４０−１２２）を含むＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｄ６０４６）選択培地で１０〜１４日間培養した。次に、フローサイトメトリーによりＣＸＡＤＲ発現細胞に反応し、ＣＸＡＤＲを発現しない陰性対象細胞に反応しないハイブリドーマを選択した。フローサイトメトリーは、各細胞５×１０４〜１×１０５細胞／サンプルに対して５０μｌの培養上清で染色を行い、２次抗体にＰＥ標識抗マウス抗体（ベックマンコールター社製、ＩＭ−０８５５）を用いて実施した。【００６８】
ＣＸＡＤＲ発現細胞に特異的に反応を示す培養上清を産生するハイブリドーマについて、限界希釈により単クローン化し、フローサイトメトリーにより反応を確認し、抗ＣＸＡＤＲ抗体を得た。【００６９】
単クローン化した抗ＣＸＡＤＲ抗体産生クローンを、終濃度１００ユニット／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製、１５１４０−１２２）を含む無血清培地（ハイブリドーマ−ＳＦＭ：ＧＩＢＣＯ社製、１２０４５−０７６）に馴化して拡大培養し、精製に用いる培養上清を得た。得られた培養上清中のＩｇＧをプロテインＡセファロース（ＧＥヘルスケア社製、１７−１２７９−０３）カラム、ＭＡＰＳ−ＩＩ結合バッファー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、１５３−６１６１）、ＭＡＰＳ−ＩＩ溶出バッファー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、１５３−６１６２）を用いて精製した。溶出されたＩｇＧをＰＢＳで透析し、精製抗体画分を得た。抗体のアイソタイプはアイソストリップキット（Ｒｏｃｈｅ社製、１４９３０２７）を用いて決定した
＜インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）細胞増殖＞
細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで５×１０４個／ｍｌに分散させ、９６ウェルプレートに０．１ｍｌ／ウェルずつ撒き、抗体を所定の濃度加えて、３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養した。細胞増殖はＭＴＴ法（３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；Ｓｉｇｍａ社製）にて測定した（Ｆｕｋａｚａｗａ，Ｈ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９５年、２２８巻、８３〜９０ページ  参照）。ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ）１０μｌを各ウェルに加え４時間培養し、産生されたフォルマザン産物を１０ｍＭ  ＨＣｌを含む２０％ＳＤＳ溶液１００μｌを各ウェルに添加して溶解し、５７０ｎｍの吸光度を測定した。【００７０】
＜ＣＸＡＤＲノックダウン細胞の作製＞
ヒトＣＸＡＤＲ遺伝子を標的としたｓｈＲＮＡの発現プラスミド又はコントロールｓｈＲＮＡの発現プラスミド（共に選択用マーカー遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子を持つＳｕｒｅＳｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｓｈＲＮＡ  Ｐｌａｓｍｉｄｓ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を、遺伝子導入試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、ＦｕＧｅｎｅＨＤ）を用い、ヒト前立腺癌ＤＵ−１４５細胞に導入した。そして、ピューロマイシンを最終濃度０．７５μｇ／ｍｌで含む１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで３週間培養し、ピューロマイシン耐性クローンを複数得た。得られたクローンについて細胞粗抽出液を作製し、抗ＣＸＡＤＲ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）によるウエスタンブロットを行い、ＣＸＡＤＲタンパク量を検討した。ＣＸＡＤＲタンパク量の低下が認められたクローンについてはＲＮｅａｓｙ  ｐｌｕｓ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて逆転写反応を行った。合成したｃＤＮＡを鋳型にＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（タカラバイオ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＣＸＡＤＲ  ｍＲＮＡ量の低下が確認できたクローンをＣＸＡＤＲ持続的ノックダウン細胞株とした。【００７１】
＜アンジオジェニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）産生＞
細胞を１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭで５×１０４個／ｍｌに分散させ、９６ウェルプレートに０．１ｍｌ／ウェルずつ撒き、抗体を所定の濃度加えて、３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養し、培養上清を回収した。培養上清中のアンジオジェニン量をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製のＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。【００７２】
＜インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）抗がん活性＞
ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ（雄、７週令）ヌードマウスはチャールズリバーから購入し、ＳＰＦ条件下にて微生物化学研究所のガイドラインに従って飼育した。培養した細胞をトリプシン処理し、培養ディッシュから剥がした細胞（８×１０６個）を０．３ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに分散し、０．５ｍｌの成長因子低減マトリゲル（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤバイオサイエンス社製）と混合した。この細胞液０．１ｍｌ（１×１０６個）をマウスの左鼠脛部に皮下接種した。翌日から抗体を静脈内に所定の期間投与し、皮下にできた腫瘍を切り出し、その重量を測定した。また腫瘍体積は次の式から算出した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長径×短径２）／２
（Ｋａｗａｄａ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００６年、６６巻、４４１９〜４４２５ページ  参照）。【００７３】
マウスの前立腺に同所移植する場合には、培養ディッシュから剥がした細胞（２０×１０６個）を０．１５ｍｌの１０％ＦＢＳ含むＤＭＥＭに分散し、０．２５ｍｌの成長因子低減マトリゲル）と混合した。ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ（雄、７週令）ヌードマウスマウスをソムノペンチル麻酔下にて腹部を切開し、細胞液２０μｌを３０Ｇ注射針でマウスの前立腺に接種し、腹部切開部を縫合した。所定の期間後、前立腺にできたがんを切り出し、重量を測定した。【００７４】
＜ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）活性＞
標的となるがん細胞をＲＰＭＩ１６４０で２×１０５個／ｍｌに分散し、カルセインＡＭを１０μｇ／ｍｌ加えて３７℃で３０分間標識した。標識した細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回遠心洗浄した後、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に再度分散し、３７℃で１時間置いた。再び１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を３回遠心洗浄した後、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０５個／ｍｌに再分散した細胞液を０．１ｍｌずつ９６ウェルプレートに撒いた。ここに所定の濃度で抗体を加えて３７℃で１時間培養した後、各ウェルに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で希釈した０．１ｍｌの補体溶液を所定の濃度加えて３７℃でさらに４時間培養した。９６ウェルプレートを遠心後、培養上清を０．１ｍｌ回収し、培養上清中にふくまれるカルセインＡＭの蛍光強度を４８５ｎｍの励起波長、５２８ｎｍの蛍光波長で測定した。ＣＤＣ細胞活性（細胞傷害活性）は次の式により算出した。
細胞傷害活性（％）＝（Ｅ−Ｓ）／（Ｍ−Ｓ）×１００
（Ｅは各実験条件での蛍光強度；Ｓは補体溶液の替わりに０．１ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を加えて自発的に得られた蛍光強度；Ｍは補体溶液の替わりに０．１  ｍｌの細胞溶解液（０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加えた時の最大蛍光強度）。【００７５】
＜ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性＞
脾臓をヌードマウスから摘出し、シリンジで脾細胞を分散させ、赤血球を氷冷水で１０秒処理することにより溶血させた。残った脾細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で遠心洗浄した後、１０％ＦＢＳ含むＲＰＭＩ１６４０で２．５×１０７個／ｍｌに調整した。標的となるがん細胞をＲＰＭＩ１６４０で５×１０５個／ｍｌに分散し、カルセインＡＭを１０μｇ／ｍｌ加えて３７℃で３０分間標識した。標識した細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回遠心洗浄した後、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に再度分散し、３７℃で１時間置いた。再び１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を３回遠心洗浄した後、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０５個／ｍｌに再分散した細胞液を０．１ｍｌずつ９６ウェルプレートに撒いた。ここに所定の比率になるように０．１ｍｌの脾細胞液を各ウェルに加え、３７℃で４時間培養した。９６ウェルプレートを遠心後、培養上清を０．１ｍｌ回収し、培養上清中にふくまれるカルセインＡＭの蛍光強度を４８５ｎｍの励起波長、５２８ｎｍの蛍光波長で測定した。ＮＫ細胞活性（細胞傷害活性）は次の式により算出した。
細胞傷害活性（％）＝（Ｅ−Ｓ）／（Ｍ−Ｓ）×１００（Ｅは各実験条件での蛍光強度；Ｓは脾細胞液の替わりに０．１ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を加えて自発的に得られた蛍光強度；Ｍは脾細胞液の替わりに０．１ｍｌの細胞溶解液（０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加えた時の最大蛍光強度）
（Ｋａｗａｄａ，Ｍ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２００３年、３巻、１７９〜１８８ページ  参照）。【００７６】
マウスのＮＫ細胞を除去する際には、１００μｇの抗アシアロＧＭ１抗体を尾静脈に所定の期間投与した（同文献  参照）。【００７７】
＜統計解析＞
全てのデータは同様な結果が得られた２又は３回の独立した実験の代表的なものである。統計解析はスチューデントのｔ検定を用いた。【００７８】
＜抗体可変領域の決定＞
抗体産生細胞２×１０６個をトリゾール１ｍｌに懸濁し５分放置後、クロロフォルムを２００μｌ添加して１５秒間懸濁した。その後１２０００×ｇで１５分間遠心し、上清を得た。上清と５００μｌのイソプロパノールとを混ぜ合わせた後、１２０００×ｇで１０分間遠心を行った。得られたペレットを８０％エタノールで洗いトータルＲＮＡ４０μｇを得た。そのすべてを２０μｌの水で溶かした。そのうち５μｇを使用して２本鎖ｃＤＮＡを作製した。作製方法はスーパースクリプトチョイスシステムを用いて能書にしたがった。エタノール沈殿後、ライゲーションハイを用いて１６時間かけて結合させた。そのうち１μｌをテンプレートとしてＰＣＲを行った。プライマーは重鎖及び軽鎖の定常領域に設計したそれぞれのものを使用して行った。プライマーの配列はそれぞれ
重鎖５’ｇｔｃｃａｃｇａｇｇｔｇｃｔｇｃａｃａａｔ（配列番号：２３）
重鎖３’ｇｔｃａｃｔｇｇｃｔｃａｇｇｇａａａｔａａｃｃ（配列番号：２４）
軽鎖５’ａａｇａｔｇｇａｔａｃａｇｔｔｇｇｔｇｃ（配列番号：２５）
軽鎖３’ｔｇｔｃａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇａ（配列番号：２６）を用いた。【００７９】
ＰＣＲ産物を１．５％ゲルに電気泳動を行ったあと切り出し精製を行った。精製したＤＮＡを用いてシークエンスを行った。軽鎖は精製したＤＮＡをクローニングした後、シークエンスを行った。【００８０】
＜エピトープの解析＞
ＡＣＴ１９６−５１４＿６Ｇ１０Ａ抗体のエピトープを特定するために、数種の鎖長のＣＸＡＤＲペプチドを発現するＢａ／Ｆ３細胞を作製し、抗体の反応性を評価した。細胞外領域８３ａａ（Ｎ末端より。以下、同様）、１３３ａａ、１８１ａａ、２３７ａａ（細胞外全長）を解析対象のペプチドとした。ＬＮＣａＰ−ＣＲのシグナルシーケンストラップ法を実施したｃＤＮＡライブラリを鋳型として下記配列のＤＮＡをプライマーとして使用し、プライムスターマックスＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製、＃Ｒ０４５Ａ）を能書に従って使用して実施した。なお、下記プライマーにおいて、フォワードプライマー（以下「Ｆ」という略称にて称す）は各遺伝子の増幅において共通して利用した。また、リバースプライマーの表記において、Ｒに付加した数値は、増幅産物がコードするペプチドの鎖長を意味する。
Ｆ：ｃｃｇｇａａｔｔｃｃｃａｃｇｇｃａｃｇｇｃａｇｃｃａｃｃａｔｇｇ（配列番号：２７）
Ｒ２３７：ｔｔｔｔｃｃｔｔｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｃｃａｇｃｔｔｔａｔｔｔｇａａｇｇａｇｇｇａｃ（配列番号：２８）
Ｒ２３０：ｔｔｔｔｃｃｔｔｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｇｇａｃａａｃｇｔｔｔａｇａｃｇｃａａｃａｇ（配列番号：２９）
Ｒ１８１：ｔｔｔｔｃｃｔｔｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｇａｇｔｃａｇａｃａａｔｔｔｔｔｇｃｃａｃｔｃ（配列番号：３０）
Ｒ１３４：ｔｔｔｔｃｃｔｔｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃａａｔｃｔｔｃｔｔａｔｔｔｇｃａａｃａｃｃａｇｇ（配列番号：３１）
Ｒ８３：ｔｔｔｔｃｃｔｔｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｇｔａｇｔｃａｔｃａｔａａａｔｔｔｔｇｔｃｔｃｃ（配列番号：３２）。【００８１】
ＰＣＲ産物を１％ゲルにて電気泳動を行った。切り出し精製を行い、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩとで制限酵素処理を行った。ｐＭＸ−ＳＳＴもＥｃｏＲＩＩとＮｏｔＩとで制限酵素処理を行い切り出し精製をした。それぞれをライゲ―ションハイで能書に従って処理をした。処理をしたものを全量ヒートショック法により大腸菌にトランスホーメーションを行った。アンピシリン含有ＬＢアガロースプレートにプレーティングを行って３７℃で１晩培養を行った。得られたコロニーからインサート部分を含有するようにＰＣＲを行い希望する配列を含んだｐＭＸ−ＳＳＴベクターであるかをシークエンスにて確認した。用いたＰＣＲプライマーは
ＳＳＴ３’−Ｔ７  ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＴＡＡＡＣＧＧＴＡＧ−３’（配列番号：２１）と
ＳＳＴ５’−Ｔ３  ５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡ−３’（配列番号：２２）と
を用いた。目的のインサートの挿入を確認したコロニーを培養して１０ヌクレオボンド（登録商標）ＡＸ５００カラムを用いてプラスミドを精製した。ウイルスを産生させるためにパッケイジング細胞Ｐｌａｔ−Ｅを６ｃｍディッシュに２×１０６個を４ｍｌのＤＭＥＭ（Ｗａｋｏ社製、＃０４４−２９７６５）に懸濁し、流し入れて３７℃５％ＣＯ２の条件で２４時間培養した。１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭと９μｌのＦｕｇｅｎｅを混ぜ、５分室温で放置後、３μｇの目的配列を持ったｐＭＸ−ＳＳＴベクターを添加、１５分室温で放置後、用意したＰｌａｔ−Ｅに滴下した。そして、２４時間後に上清を入れ替えた。さらに２４時間後の上清を０．４５μｍのフィルターを通してろ過した。ＲＰＭＩ−１６４０（コージンバイオ社製）９．５ｍｌに４×１０６個のＢａ／Ｆ３細胞を１０ｃｍディッシュに用意して取得したろ過上清０．５ｍｌを加えた。１０μｇのポリブレン（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製、＃ＴＲ−１００３−Ｇ）を添加し、さらにＩＬ−３を１０ｎｇ添加した。２４時間後、細胞を３回ＲＰＭＩ−１６４０で洗い１０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０に懸濁し１０ｃｍディッシュに添加し、１０日間３７℃５％ＣＯ２の条件で培養した。増殖してきた細胞からゲノムを抽出した。ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ又はプライムスターマックスＤＮＡポリメラーゼを用いて能書にしたがってＰＣＲを行った。ＰＣＲプライマーはＳＳＴ３’−Ｔ７  ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＴＡＡＡＣＧＧＴＡＧ−３’（配列番号：２１）と
ＳＳＴ５’−Ｔ３  ５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡ−３’（配列番号：２２）とを用いた。
ＰＣＲ産物をウィザード（登録商標）ＳＶ  ゲル及びＰＣＲクリーンアップシステム）等を用いて能書にしたがって作業を行い精製した。ビッグダイターミネーターｖ３．１サイクルシークエンシングを用いて能書に従って作業を行い、シークエンスを行った。シークエンスのプライマーはＳＳＴ５’−Ｔ３  ５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡ−３’（配列番号：２２）を用いた。シークエンスデータはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を用いて解析した。そして、このようにして得られた目的因子の領域が発現している細胞を、エピトープの解析に供した。【００８２】
＜ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ細胞）の染色試験＞
ヒト血管内皮細胞に対する抗体の反応性を検証する目的で、ＨＵＶＥＣに対する反応性を確認した。ＨＵＶＥＣ（５×１０３／ウェル）を黒色９６−ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製、３５３２１９）に播種し、２晩培養した。培養液は、ＥＧＭ−２ブレットキット培地（ＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ培地、Ｌｏｎｚａ社製）を使用した。培養後、培地を除去して、染色バッファー（０．５％  ＢＳＡ／ＰＢＳ）を用いて１回洗浄した後、１次抗体として６Ｇ１０Ａ及び７Ｆ８Ａ精製抗体１０μｇ／ｍＬ溶液５０μＬを添加し、室温で３０分間反応させた。陰性対象として、マウスＩｇＧ２ａ−ＵＮＬＢ（クローン：ＨＯＰＣ−１、Ｃｅｌｌ  Ｌａｂ社製、７３１５８９）、マウスＩｇＧ２ｂ−ＵＮＬＢ（ｃｌｏｎｅ：Ａ−１、Ｃｅｌｌ  Ｌａｂ社製、７３１５９７）を１０μｇ／ｍＬの濃度で染色バッファーに溶解させ、５０μｌ添加し、室温で３０分反応させた。反応後、一次反応溶液を除去し、染色バッファーで１回洗浄した。洗浄後、ヤギ抗マウスＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製、ＩＭ０８５５）を染色バッファーで２００倍希釈したものを４０μＬ添加して、室温遮光条件で２０分反応させた。さらに１０ｍｇ／ｍＬのヘキスト３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｈ１３９９）を２０００倍希釈したものを３０μｌ添加し、室温遮光条件でさらに２０分反応させた。その後染色バッファーで２回洗浄し、１００ｍＬの洗浄バッファーを添加した後、蛍光顕微鏡（オリンパス社製）を用いて細胞染色を観察した。【００８３】
＜ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ細胞）及びがん細胞のフローサイトメトリー試験＞
ヒト血管内皮細胞に対する抗体の反応性を検証する目的で、ＨＵＶＥＣに対する反応性を、フローサイトメトリー法を用いて確認した。ＨＵＶＥＣを、ＥＧＭ−２ブレットキット培地を用いて培養した。がん細胞は、非働化した１０％ＦＣＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ社製）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ＧＩＢＣＯ社製、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ、１５１４０１２２）を含む培地（ＲＰＭＩ１６４０：和光純薬社製又はＤＭＥＭ：ＳＩＧＭＡ社製）を用いて培養した。８０％コンフルエントになった時点で細胞解離バッファー（Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、ＧＩＢＣＯ社製、１３１５１−０１４）を用いて培養プレートから剥がして回収し、ＦＣＭバッファー（０．５％  ＢＳＡ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳ）で１回洗浄した。各細胞５×１０４／ウェルとなるよう９６−ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製、３５３９１１）に分注し、１次抗体として６Ｇ１０Ａ及び７Ｆ８Ａ精製抗体５μｇ／ｍＬ溶液５０μｌ／ウェルを添加し、室温で３０分間反応させた。陰性対象として、マウスＩｇＧ２ａ−ＵＮＬＢ（クローン：ＨＯＰＣ−１、Ｃｅｌｌ  Ｌａｂ社製、７３１５８９）、マウスＩｇＧ２ｂ−ＵＮＬＢ（ｃｌｏｎｅ：Ａ−１、Ｃｅｌｌ  Ｌａｂ社製、７３１５９７）を５μｇ／ｍＬの濃度でＦＣＭバッファーに溶解させ、５０μｌ添加し、室温で３０分反応させた。反応後７００ｘｇで２分間遠心を行なって一次反応溶液を除去し、ＦＣＭバッファーで１回洗浄した。洗浄後、ヤギ抗マウスＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製、ＩＭ０８５５）をＦＣＭバッファーで２００倍希釈したものを４０μｌ添加して、室温遮光条件で３０分反応させた。反応後７００ｘｇで２分間遠心を行なってＦＣＭバッファーで２回洗浄し、適当量のＦＣＭバッファーで細胞を懸濁し、フローサイトメーター（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製、ＦＣ５００ＭＰＬ）で解析した。【００８４】
（実施例１）
［ＳＳＴ−ＲＥＸ解析］
ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞をＳＳＴ−ＲＥＸにて２０７クローン解析した結果、６７因子を得た。また、ＬＮＣａＰ細胞をＳＳＴ−ＲＥＸで１５０クローン解析した結果、５０因子を得た。ＬＮＣａＰ−ＣＲの結果及びＬＮＣａＰ細胞の結果から、抗がん活性の標的としてＬＮＣａＰ−ＣＲのみに特異的に発現が認められた因子を１０種類選抜した。その中からＣＸＡＤＲ遺伝子を選択した。【００８５】
（実施例２）
［抗ＣＸＡＤＲ抗体の作製］
ＣＸＡＤＲタンパク質を発現するＢａ／Ｆ３細胞を免疫原としてマウスに免疫し、フローサイトメトリーでスクリーニングした結果、図１及び２に示す通り、ＣＸＡＤＲタンパク質を発現する細胞特異的に反応を示す１０クローンを得た。得られた１０クローンを用いて、機能試験スクリーニング等で候補抗体を選抜し、最終的に６Ｇ１０Ａ及び７Ｆ８Ａの有用な２クローンを得た。また、クラスチェックの結果、両者ともＩｇＧクラスを示し、サブクラスは、６Ｇ１０ＡがＩｇＧ２ａ／ｋ、７Ｆ８ＡがＩｇＧ２ｂ／ｋであった。【００８６】
（実施例３）
［未精製抗ＣＸＡＤＲ抗体によるインビトロでのがん抑制効果等］
ＣＸＡＤＲに対して作製した未精製抗体９クローンについて、インビトロでのＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞の増殖及び血管新生因子：アンジオジェニンの産生に与える影響を調べた。得られた結果を図３及び４に示す。【００８７】
図３及び４に示した結果から明らかなように、いずれの抗体クローンもインビトロでのＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞の増殖及びアンジオジェニンの産生に影響を及ぼさなかった。【００８８】
（実施例４）
［未精製抗ＣＸＡＤＲ抗体によるインビボでのがん抑制効果］
ヌードマウスの皮下にＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞を移植し、抗体クローンを１１日間連続して静脈内投与し、ＬＮＣａＰ−ＣＲ腫瘍の増殖に与える影響を調べた。得られた結果を図５に示す。【００８９】
図５に示した結果から明らかなように、腫瘍接種後２１日目に６Ｇ１０Ａクローンは約６０％、７Ｆ８Ａクローンは約３０％腫瘍の重量を抑制することが分かった。また、図には示さないか、他の抗体クローンにおいては顕著な抗がん活性は認められなかった。【００９０】
（実施例５）
［精製抗ＣＸＡＤＲ抗体によるインビボでのがん抑制効果１］
ヌードマウスの皮下にＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞を移植し、精製した抗体を２５０μｇ／マウスにて週１回、計３回投与し、該抗体の抗がん活性を調べた。得られた結果を図６〜８に示す。【００９１】
図６〜８に示す通り、２１日目のＬＮＣａＰ−ＣＲの腫瘍の重量を６Ｇ１０Ａクローンは約６０％、７Ｆ８Ａクローンは約４５％と有意に抑制することが明らかになった。また、この期間において、抗体クローンの投与によって体重減少等のマウスへの毒性は認められなかった（図７  参照）。さらに図９〜１１に示した結果から明らかなように、６Ｇ１０Ａクローンは投与量に依存して抗がん活性を示し、２５０μｇの投与量が最も有意に腫瘍の増殖を抑制した。【００９２】
また、効果の強かった６Ｇ１０Ａクローンについて大きくなった腫瘍に対しても抗がん活性が発揮されるのかを調べた。得られた結果を図１２及び１３に示す。【００９３】
図１２及び１３に示す通り、腫瘍接種後１４日経過した後から６Ｇ１０Ａクローンを投与しても腫瘍の増殖を抑制することが明らかになった。【００９４】
（実施例６）
［精製抗ＣＸＡＤＲ抗体によるインビボでのがん抑制効果２］
次に、ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞をマウスの前立腺に移植した同所移植モデルにおいて抗がん活性を検討した。得られた結果を図１４及び１５に示す。【００９５】
図１４及び１５に示す通り、２５０μｇ／マウスで週１回、計３回の静脈投与で、約９０％と有意にマウス前立腺でのＬＮＣａＰ−ＣＲ前立腺がんの増殖を抑制することが明らかになった。【００９６】
（実施例７）
［精製抗ＣＸＡＤＲ抗体によるインビボでのがん抑制効果３］
次に、アンドロゲン非依存性のヒト前立腺がんＤＵ−１４５細胞及びヒト膵臓がん細胞ＢｘＰＣ３に対する抗がん活性を調べた。得られた結果を図１６〜２１に示す。【００９７】
図１６〜２１に示す通り、マウスの皮下に移植したＤＵ−１４５細胞及びＢｘＰＣ３細胞の腫瘍増殖を６Ｇ１０Ａクローンは２５０μｇ／マウス、週１回、計３回の静脈内投与で、各々約６０％及び約２５％と有意に抑制した。【００９８】
（実施例８）
［精製抗ＣＸＡＤＲ抗体によるインビボでのがん抑制効果４］
ヌードマウスの皮下にヒト大腸がん細胞ＤＬＤ−１を移植し、精製した抗体を２５０μｇ／マウスにて週１回、計３回、静脈内投与し、該抗体の抗がん活性を調べた。得られた結果を図２２〜２４に示す。【００９９】
図２２に示す通り、マウスの皮下に移植したＤＬＤ−１細胞の腫瘍増殖を６Ｇ１０Ａクローンは２５０μｇ／マウス、週１回、計３回の静脈内投与で有意に抑制した。さらに、図２３に示す通り、２１日目のＤＬＤ−１の腫瘍の重量を６Ｇ１０Ａクローンは約７０％と有意に抑制できることが明らかになった。また、この期間において、抗体クローンの投与によって体重減少等のマウスへの毒性は認められなかった（図２４  参照）。【０１００】
（実施例９）
［抗ＣＸＡＤＲ抗体の抗がん作用機構の解析１］
ヒトＣＸＡＤＲ遺伝子を標的としたｓｈＲＮＡの発現するベクターを導入し、ＤＵ−１４５細胞のＣＸＡＤＲ発現が減少した細胞（ＣＸＡＤＲ  ｓｈＲＮＡ導入細胞）を作製した。また、コントロールベクターを導入したＤＵ−１４５細胞も作製した（図２５  参照）。そして、これら細胞を各々ヌードマウスに移植し、精製抗ＣＸＡＤＲ抗体（６Ｇ１０Ａクローン）を２５０μｇ／マウスにて週１回、計３回、静脈内投与し、該抗体の抗がん活性を調べた。得られた結果を図２６に示す。【０１０１】
図２６に示した結果から明らかなように、コントロールベクターを導入した細胞の腫瘍は６Ｇ１０Ａで約７０％減少と有意に阻害されたが、ＣＸＡＤＲ発現が減少した細胞に対して６Ｇ１０Ａは顕著な抗がん活性を示さなかった。【０１０２】
従って、実施例７等において明らかになった、本発明の抗ＣＸＡＤＲ抗体によるインビボでのがん抑制効果は、該抗体がＣＸＡＤＲに結合することにより奏されること、すなわちＣＸＡＤＲタンパク質が発現しているがんに対して本発明の抗体はがん抑制効果を発揮できることが確認された。【０１０３】
（実施例１０）
［抗ＣＸＡＤＲ抗体の抗がん作用機構の解析２］
マウスゼノグラフトモデルで抗がん活性の見られた精製抗体クローンのインビトロでのＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞の増殖及びアンジオジェニンの産生に与える影響を調べたが、全く変化はみられなかった（図２７及び２８  参照）。【０１０４】
抗体によるインビボでの抗がん活性は、一般的に、標的分子の中和や機能阻害、ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性によって発揮される。インビトロでの細胞増殖やタンパク質の産生等には効果を示さないことから、ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性について検討した。なお、図には示さないが、ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性の解析において、ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞は適さなかったため、アンドロゲン非依存性のヒト前立腺がん細胞：ＤＵ−１４５細胞を用いた。得られた結果を図３０及び３１に示す。【０１０５】
ＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞同様に、６Ｇ１０ＡはインビトロにおけるＤＵ−１４５細胞の増殖には全く影響を及ぼさなかった（図２９  参照）。しかし、図３０及び３１に示す通り、６Ｇ１０ＡはＤＵ−１４５細胞に対してＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を示すことが明らかになった。【０１０６】
そこで、インビボにおける抗がん活性にも、実際にＣＤＣ活性及びＡＤＣＣ活性が関与するのかを確かめる目的で、抗アシアロＧＭ１抗体を投与しＡＤＣＣ活性の実行中心であるＮＫ細胞を除去したマウスを用いて検討した。得られた結果を図３２〜３４に示す。【０１０７】
図３２〜３４に示す通り、抗アシアロＧＭ１抗体の投与によって、６Ｇ１０Ａの抗がん活性が有意に減弱することが明らかになった。ＮＫ細胞の除去によって完全に抗がん活性が失われないことから、６Ｇ１０ＡはＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性の両方の作用で抗がん活性を発揮すると考えられる。【０１０８】
（実施例１１）
［抗体可変領域の決定］
実施例１〜８にて抗がん活性等の機能を有していることが確認された６Ｇ１０Ａ及び７Ｆ８Ａ抗体について、重鎖及び軽鎖のシークエンスを確定し、可変領域及びＣＤＲを確定した。得られた結果を、６Ｇ１０Ａの配列については図３５及び３６に示し、７Ｆ８Ａの配列については図３７及び３８に示す。【０１０９】
また、抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０Ａの決定された軽鎖の可変領域の塩基配列を配列番号：４に、アミノ酸配列を配列番号：５に、重鎖の可変領域の塩基配列を配列番号：９に、アミノ酸配列を配列番号：１０に示す。さらに、抗ＣＸＡＤＲ抗体６Ｇ１０Ａの軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号：１〜３に、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号：６〜８に示す。【０１１０】
また、抗ＣＸＡＤＲ抗体７Ｆ８Ａの決定された軽鎖の可変領域の塩基配列を配列番号：１４に、アミノ酸配列を配列番号：１５に、重鎖の可変領域の塩基配列を配列番号：１９に、アミノ酸配列を配列番号：２０に示す。さらに、抗ＣＸＡＤＲ抗体７Ｆ８Ａの軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号：１１〜１３に、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号：１６〜１８に示す。【０１１１】
（実施例１２）
［エピトープの解析］
ＣＸＡＤＲタンパク質の細胞外領域をＮ末端側から８３アミノ酸、１３３アミノ酸、１８１アミノ酸、２３０アミノ酸、２３７アミノ酸（細胞外領域全長）のそれぞれの断片発現細胞を構築し、どの領域の欠損細胞で抗体（６Ｇ１０Ａ、７Ｆ８Ａ）との反応がなくなるかを検証することによってエピトープを確定した。得られた結果を図３９に示す。【０１１２】
図３９に示す通り、６Ｇ１０Ａ及び７Ｆ８Ａは、共に１８１アミノ酸から２３０アミノ酸までの領域をエピトープとして認識することが明らかになった。また、安定的に活性を有し、インビボ試験では機能を有さなかった別のクローン４種の抗体（１Ｇ１１Ｂ９Ｅ、２Ａ８Ａ、２Ａ８Ｂ及び８Ｆ１１）についても同様にエピトープを解析した。その結果、クローン１Ｇ１１Ｂ９Ｅは１３４アミノ酸から１８０アミノ酸までの領域をエピトープとして認識することが明らかになった。クローン２Ａ８Ａ、２Ａ８Ｂ及び８Ｆ１１は２３１アミノ酸から２３７アミノ酸の領域をエピトープとして認識することが明らかになった。従って、これらの結果から、６Ｇ１０Ａや７Ｆ８Ａが認識する１８１アミノ酸から２３０アミノ酸をエピトープとすることが抗がん作用を持つ重要な部位であることが明らかになった。【０１１３】
（実施例１３）
［ＨＵＶＥＣへの反応性］
静脈注射での抗体医薬品投与を想定し、ヒト血管内皮細胞への反応性をフローサイトメトリー法並びに細胞染色法にて調べた。ヒト血管内皮細胞として、ＨＵＶＥＣを用いた。得られた結果を図４０及び４１に示す。【０１１４】
図４０及び４１に示す通り、６Ｇ１０ＡはＨＵＶＥＣに反応を示さず、７Ｆ８ＡはＨＵＶＥＣに反応を示すことが明らかになった。ＨＵＶＥＣへの反応性から考えると、６Ｇ１０Ａの方がより抗体医薬シーズとして有用であると考えられる。【０１１５】
（実施例１４）
［本発明の抗ＣＸＡＤＲ抗体のがん細胞への反応性］
本発明の抗ＣＸＡＤＲ抗体の前立腺がん細胞への反応性をフローサイトメトリー法にて調べた。得られた結果を図４２に示す。なお、前立腺がん細胞におけるＣＸＡＤＲの発現は、抗ＣＸＡＤＲ抗体（Ｓｉｇｍａ社製、ＨＰＡ００３３４２）を用いたウェスタンブロッティング法により解析した。得られた結果を図４３に示す。【０１１６】
図４２及び４３に示す通り、前立腺がんにおいて、インビボにおいて抗がん活性が見出されたＬＮＣａＰ−ＣＲ細胞及びＤｕ１４５細胞に対し、本発明の抗ＣＸＡＤＲ抗体は反応することが明らかになった。一方、インビボにおいて抗がん活性が認められなかったＰＣ−３においてＣＸＡＤＲが発現していないこと、並びにＰＣ−３と本発明の抗ＣＸＡＤＲ抗体とは反応しないことも明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
以上説明したように、本発明の抗体は、ヒト由来のＣＸＡＤＲタンパク質の１８１〜２３０位に存在するエピトープに結合することにより、インビボにおいて優れた抗がん活性等を発揮することが可能となる。したがって、本発明の抗体は、ＣＸＡＤＲタンパク質が関連する疾患の治療、予防及び検査等、特にがんの治療、予防及び検査等において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１８】
配列番号１
＜２２３＞  ６Ｇ１０Ａ  軽鎖可変領域  ＣＤＲ１
配列番号２
＜２２３＞  ６Ｇ１０Ａ  軽鎖可変領域  ＣＤＲ２
配列番号３
＜２２３＞  ６Ｇ１０Ａ  軽鎖可変領域  ＣＤＲ３
配列番号４
＜２２３＞  ６Ｇ１０Ａ  軽鎖可変領域  ｃＤＮＡ
配列番号６
＜２２３＞  ６Ｇ１０Ａ  重鎖可変領域  ＣＤＲ１
配列番号７
＜２２３＞  ６Ｇ１０Ａ  重鎖可変領域  ＣＤＲ２
配列番号８
＜２２３＞  ６Ｇ１０Ａ  重鎖可変領域  ＣＤＲ３
配列番号９
＜２２３＞  ６Ｇ１０Ａ  重鎖可変領域  ｃＤＮＡ
配列番号１１
＜２２３＞  ７Ｆ８Ａ  軽鎖可変領域  ＣＤＲ１
配列番号１２
＜２２３＞  ７Ｆ８Ａ  軽鎖可変領域  ＣＤＲ２
配列番号１３
＜２２３＞  ７Ｆ８Ａ  軽鎖可変領域  ＣＤＲ３
配列番号１４
＜２２３＞  ７Ｆ８Ａ  軽鎖可変領域  ｃＤＮＡ
配列番号１６
＜２２３＞  ７Ｆ８Ａ  重鎖可変領域  ＣＤＲ１
配列番号１７
＜２２３＞  ７Ｆ８Ａ  重鎖可変領域  ＣＤＲ２
配列番号１８
＜２２３＞  ７Ｆ８Ａ  重鎖可変領域  ＣＤＲ３
配列番号１９
＜２２３＞  ７Ｆ８Ａ  重鎖可変領域  ｃＤＮＡ
配列番号２１〜３２
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
【図５】
2013168820.tif 000002
【図６】
2013168820.tif 000003
【図７】
2013168820.tif 000004
【図９】
2013168820.tif 000005
【図１０】
2013168820.tif 000006
【図１２】
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【図１３】
2013168820.tif 000008
【図１６】
2013168820.tif 000009
【図１７】
2013168820.tif 000010
【図１８】
2013168820.tif 000011
【図１９】
2013168820.tif 000012
【図２０】
2013168820.tif 000013
【図２１】
2013168820.tif 000014
【図２２】
2013168820.tif 000015
【図２３】
2013168820.tif 000016
【図２４】
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【図２６】
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【図３０】
2013168820.tif 000019
【図３１】
2013168820.tif 000020
【図３２】
2013168820.tif 000021
【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
2013168820.tif 000024
【図１】
2013168820.tif 000025
【図２】
2013168820.tif 000026
【図３】
2013168820.tif 000027
【図４】
2013168820.tif 000028
【図８】
2013168820.tif 000029
【図１１】
2013168820.tif 000030
【図１４】
2013168820.tif 000031
【図１５】
2013168820.tif 000032
【図２５】
2013168820.tif 000033
【図２７】
2013168820.tif 000034
【図２８】
2013168820.tif 000035
【図２９】
2013168820.tif 000036
【図３６】
2013168820.tif 000037
【図３７】
2013168820.tif 000038
【図３８】
2013168820.tif 000039
【図３９】
2013168820.tif 000040
【図４０】
2013168820.tif 000041
【図４１】
2013168820.tif 000042
【図４２】
2013168820.tif 000043
【図４３】
2013168820.tif 000044
【配列表】
2013168820000001.app
【国際調査報告】
2013168820.tif 000045
2013168820.tif 000046
2013168820.tif 000047
2013168820.tif 000048
2013168820.tif 000049
2013168820.tif 000050