(57)【要約】  本発明は、次式（Ｉ）：2014017659.tif 000089（式中、Ａｒ１及びＡｒ２はアリール又はヘテロアリール；ＬはＯ、Ｓ、ＮＨ、ＮＨＣＯ又はＣＯＮＨ；ＸはＣＨ又はＮ；ＹはＣ１−３−アルキレン；Ｚ１は水素、Ｃ１−６−アルキル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−アルキルアミノ−Ｃ１−６−アルキル、ジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−アルコキシ−Ｃ１−６−アルキル、カルボキシ−Ｃ１−６−アルキル；Ｚ２はＣ１−６−アルキル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−アルキルアミノ−Ｃ１−６−アルキル、ジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル、ヒドロキシ−Ｃ１−６−アルキル、Ｃ１−６−アルコキシ−Ｃ１−６−アルキル、カルボキシ−Ｃ１−６−アルキル；Ｚ１及びＺ２は、隣接する窒素と共同して、Ｚ１及びＺ２に隣接する前記窒素以外に１つ以上のヘテロ原子を環員に含む複素環基を形成してもよい。）で示される化合物又はその塩を含有する急性骨髄性白血病の治療又は再発抑制剤、及び白血病幹細胞増殖抑制剤に関する。
2014017659.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）：
【化１】
2014017659.tif 000088
（式中、Ａｒ１は、置換又は非置換のアリーレン基又はヘテロアリーレン基であり；
Ａｒ２は、置換又は非置換のアリール基又はヘテロアリール基であり；
Ｌは、酸素原子、イオウ原子、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−又は−ＣＯＮＨ−であり；
Ｘ１は、ＣＨ又は窒素原子であり；
Ｘ2及びＸ3は、ＣＨ又は窒素原子であり（ただし、Ｘ2及びＸ3は同一ではない。）；
Ｙは、Ｃ１−３−アルキレン基であり；
Ｙ及びＸ２を含む環上の基であるＷ１は、独立して、Ｃ１−６−アルキル基であり；
ｍは、０〜３の整数であり；
Ｚ１及びＺ２は、独立して、水素原子、Ｃ１−６−アルキル基、アミノ−Ｃ１−６−アルキル基、Ｃ１−６−アルキルアミノ−Ｃ１−６−アルキル基、ジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル基、ヒドロキシ−Ｃ１−６−アルキル基、Ｃ１−６−アルコキシ−Ｃ１−６−アルキル基、Ｃ２−７−脂肪族アシル基、カルボキシ−Ｃ１−６−アルキル基、カルバモイル−Ｃ１−６−アルキル基、置換又は非置換の飽和複素環基、置換又は非置換のアリール−Ｃ１−６−アルキル基、置換又は非置換のヘテロアリール−Ｃ１−６−アルキル基、置換又は非置換のアリールカルボニル基又は置換又は非置換のヘテロアリールカルボニル基（ただし、Ｚ１及びＺ２が共に水素原子の場合を除く。）であり；
Ｘ2がＣＨでありＸ3が窒素原子のとき、Ｚ１及びＺ２はＸ３を含み、酸素原子、イオウ原子又は窒素原子よりなる群から選択される２個以上のヘテロ原子を環員に含む置換又は非置換の単環もしくは多環の複素環基を形成してもよく、
Ｘ2が窒素原子でありＸ3がＣＨのとき、Ｚ１及びＺ２はＸ３を含み、置換又は非置換の酸素原子、イオウ原子又は窒素原子から選択されるヘテロ原子を有する単環もしくは多環の複素環基を形成してもよい。）
で示される化合物、その塩又はそれらのプロドラッグ。
【請求項２】
Ａｒ１が置換又は非置換のアリーレン基、Ａｒ２が置換又は非置換のアリール基、Ｌが酸素原子である、請求項１記載の化合物、その塩又はそれらのプロドラッグ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の化合物、その塩又はそれらのプロドラッグを含有する、白血病幹細胞を殺傷するための医薬組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の化合物、その塩又はそれらのプロドラッグを含有する、急性骨髄性白血病の治療用又は再発抑制用の医薬組成物。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の化合物、その塩又はそれらのプロドラッグを含有する、再発した急性骨髄性白血病治療用の医薬組成物。
【請求項６】
Ｆｌｔ３／ＩＴＤ変異を有する白血病幹細胞に対して作用させる、請求項２記載の化合物、その塩又はそれらのプロドラッグを含有する医薬組成物。
【請求項７】
Ｆｌｔ３／ＩＴＤ変異を有する白血病幹細胞を体内に持つ急性骨髄性白血病患者に投与するための請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
Ｘ２がＣＨ、Ｘ３が窒素原子であり、Ｚ１及びＺ２がＸ３を含み、酸素原子、イオウ原子又は窒素原子よりなる群から選択される２個以上のヘテロ原子を環員に含む置換又は非置換の単環もしくは多環の複素環基である請求項３から７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記化合物が７−［ｔｒａｎｓ−４−（４−メチル−１−ピペラジニル）シクロヘキシル］−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミンであり、再発した急性骨髄性白血病治療用である請求項８記載の医薬組成物、
【請求項１０】
Ｚ１が水素原子であり、Ｚ２が置換又は非置換の飽和複素環基、置換又は非置換のヘテロアリール−Ｃ１−６−アルキル基又は置換又は非置換のヘテロアリールカルボニル基である、請求項３から７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
Ｘ２が窒素原子、Ｘ３がＣＨであり、Ｚ１及びＺ２がＸ３を含み、置換又は非置換の酸素原子、イオウ原子又は窒素原子から選択されるヘテロ原子を有する単環もしくは多環の複素環基である請求項３から７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
Ａｒ１が置換又は非置換のアリーレン基、Ａｒ２が置換又は非置換のヘテロアリール基、Ｌが−ＮＨＣＯ−である請求項４記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＦＬＴ３の阻害効果を有する薬剤をさらに含む、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記薬剤がCrenolanib、Lestautirinib、PKC412、Tandutinib、Sunitinib、Sorafenib、Linifanib、Dovitinib、KW-2449、Quizartinib、Dovitinib Dilactic acid、Tandutinib、Cabozanitib、TG101209、Amuvatinib及びENMD-2076から選択される少なくとも一つの剤である、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＨＣＫ遺伝子発現を阻害する核酸と、Ｆｌｔ３遺伝子発現を阻害する核酸を含む、白血病幹細胞を殺傷させる医薬組成物。
【請求項１６】
前記遺伝子発現を阻害する核酸がｓｉＲＮＡである、請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記白血病幹細胞が、Ｆｌｔ３／ＩＴＤ変異を有する白血病幹細胞である請求項１５又は１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
請求項３から１７のいずれか１項に記載の医薬組成物を、白血病幹細胞を有する個体に投与する工程を含む、白血病幹細胞を殺傷するための方法。
【請求項１９】
白血病幹細胞を有する個体が急性骨髄性白血病を再発した個体である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記白血病幹細胞がＦｌｔ３／ＩＴＤ変異を有する白血病幹細胞である、請求項１８又は１９記載の方法。
【請求項２１】
Ｆｌｔ３／ＩＴＤ変異を有する白血病幹細胞の殺傷能を指標として、ＨＣＫ活性の阻害効果とＦｌｔ３の阻害効果を合わせ持つ化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２２】
以下の工程を含む、急性骨髄性白血病と診断された個体であってＦｌｔ３／ＩＴＤ変異を有する白血病幹細胞を有する個体における請求項３から１７のいずれか１項に記載の医薬組成物による治療の薬理有効性の可能性の増大を決定するための方法。
個体の急性骨髄性白血病の腫瘍細胞サンプルから核酸を得る工程；及び
該核酸中のＦｌｔ３遺伝子のＩＴＤ変異を検出する工程であって、当該ＩＴＤ変異の存在は、個体における請求項３から１７のいずれか１項に記載の医薬組成物による治療の薬理有効性の可能性が増大することを示す工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性骨髄性白血病の治療又は再発抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性骨髄性白血病（以下「ＡＭＬ」ともいう。）は、成人に多い予後不良な悪性の血液疾患で、５年生存率は２０％と推定されている。現在のＡＭＬ治療では、一旦ＡＭＬ細胞数を検出限界以下に減少させることはできる。この状態を「完全寛解」という。しかしながら、その後再発することがかなり多く、再発患者の多くは死に至る。このため再発を防ぎ、根治できるＡＭＬ治療法の確立が急務となっている。【０００３】
従来の化学療法剤はＡＭＬを一時的に寛解し得るものの、後になって再発することが問題となっていた。特に、再発した場合の生存率が極めて低いことは喫緊の課題である。【０００４】
本発明者らは、これまでＡＭＬの根治には白血病幹細胞（以下「ＬＳＣ」ともいう。）の排除が重要であり、当該ＬＳＣが通常は骨髄ニッチ内で細胞周期の静止期にあること（特許文献１、非特許文献４、５）、またＬＳＣと正常造血幹細胞（以下「ＨＳＣ」ともいう。）との遺伝子発現の比較からＬＳＣ特異的な遺伝子群を明らかにしてきた（特許文献２、非特許文献６）。【０００５】
一方、特許文献３には、無数の化合物を包含する一般式で特定された５，７−二置換−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミンが、様々なキナーゼの機能を阻害し、白血病を含む多数の疾患の治療に有効であることが報告されている。【０００６】
また、特許文献４にも、キナーゼ阻害活性を有する５，７−二置換−７Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミンが報告されている。【０００７】
しかしながら、特許文献３及び特許文献４には、いずれの化合物についてもキナーゼ阻害作用又は薬理作用を裏付ける具体的データは示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／１０１２５７
【特許文献２】ＷＯ２０１０／１１０３４６
【特許文献３】ＷＯ００／１７２０３
【特許文献４】ＷＯ０１／１９８２９
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 Suppl 1, 11842-11849 (2003).
【非特許文献２】Nat. Immunol., 5, 738-743 (2004).
【非特許文献３】Oncogene, 23, 7178-7187 (2004).
【非特許文献４】Nature Biotechnology, 25, 1315-1321 (2007).
【非特許文献５】Nature Biotechnology, 28, 275-280 (2010).
【非特許文献６】Science Translational Medicine, 2, 17ra9 (2010).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、白血病幹細胞増殖抑制効果を有し、急性骨髄性白血病の治療又は再発抑制に有効な医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ＬＳＣ特異的な遺伝子群のうち、細胞内シグナル因子であるＨＣＫ（hemopoietic cell kinase）に着目して、特許文献３に記載の５，７−二置換−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン及び特許文献４に記載の５，７−二置換−７Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミンに含まれる化合物によるＬＳＣの傷害活性、急性骨髄性白血病（以下「ＡＭＬ」ともいう。）のモデルマウス等を用いて鋭意検討した。その結果、前記５，７−二置換−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミンに含まれる一部の化合物がＬＳＣに対する顕著な殺傷能を示してＡＭＬ治療効果を有する一方、当該化合物と構造が酷似するにもかかわらず、ＡＭＬ治療効果を有しない化合物が存在することを見出した。また、ＨＣＫに対する酵素阻害効果に加えてＦＬＴ３（fms-related tyrosine kinase 3）に対する酵素阻害効果を合わせ持つ物質により、ＬＳＣに対する顕著な殺傷能を有することを見出した。【００１２】
さらに、本発明者らは、当該化合物において膜貫通部直下をコードする膜近傍領域に縦列重複変異が入った変異型ＦＬＴ３遺伝子（Ｆｌｔ３／ＩＴＤ変異；Ｆｌｔ３−ＩＴＤ＋、ＩＴＤ：
ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔａｎｄｅｍ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に対する酵素阻害効果を持つことにより、ＦＬＴ３／ＩＴＤ変異を有する白血病幹細胞に対して、前記化合物の一部が顕著な殺傷能力を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１３】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。【００１４】
（１）次式（Ｉ）：
【化１】
2014017659.tif 000003
【００１５】
（式中、Ａｒ１は、置換又は非置換のアリーレン基又はヘテロアリーレン基であり；
Ａｒ２は、置換又は非置換のアリール基又はヘテロアリール基であり；
Ｌは、酸素原子、イオウ原子、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−又は−ＣＯＮＨ−であり；
Ｘ１は、ＣＨ又は窒素原子であり；
Ｘ2及びＸ3は、ＣＨ又は窒素原子であり（ただし、Ｘ2及びＸ3は同一ではない。）；
Ｙは、Ｃ１−３−アルキレン基であり；
Ｙ及びＸ２を含む環上の基であるＷ１は、独立して、Ｃ１−６−アルキル基であり；
ｍは、０〜３の整数であり；
Ｚ１及びＺ２は、独立して、水素原子、Ｃ１−６−アルキル基、アミノ−Ｃ１−６−アルキル基、Ｃ１−６−アルキルアミノ−Ｃ１−６−アルキル基、ジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル基、ヒドロキシ−Ｃ１−６−アルキル基、Ｃ１−６−アルコキシ−Ｃ１−６−アルキル基、Ｃ２−７−脂肪族アシル基、カルボキシ−Ｃ１−６−アルキル基、カルバモイル−Ｃ１−６−アルキル基、置換又は非置換の飽和複素環基、置換又は非置換のアリール−Ｃ１−６−アルキル基、置換又は非置換のヘテロアリール−Ｃ１−６−アルキル基、置換又は非置換のアリールカルボニル基又は置換又は非置換のヘテロアリールカルボニル基（ただし、Ｚ１及びＺ２が共に水素原子の場合を除く。）であり；
Ｘ2がＣＨでありＸ3が窒素原子のとき、Ｚ１及びＺ２はＸ３を含み、酸素原子、イオウ原子又は窒素原子よりなる群から選択される２個以上のヘテロ原子を環員に含む置換又は非置換の単環もしくは多環の複素環基を形成してもよく、
Ｘ2が窒素原子でありＸ3がＣＨのとき、Ｚ１及びＺ２はＸ３を含み、置換又は非置換の酸素原子、イオウ原子又は窒素原子から選択されるヘテロ原子を有する単環もしくは多環の複素環基を形成してもよい。）
で示される化合物、その塩又はそれらのプロドラッグ、【００１６】
（２）Ａｒ１が置換又は非置換のアリーレン基、Ａｒ２が置換又は非置換のアリール基、Ｌが酸素原子である、前記（１）記載の化合物、その塩又はそれらのプロドラッグ、【００１７】
（３）前記（１）又は（２）に記載の化合物、その塩又はそれらのプロドラッグを含有する、白血病幹細胞を殺傷するための医薬組成物、【００１８】
（４）前記（１）又は（２）に記載の化合物、その塩又はそれらのプロドラッグを含有する、急性骨髄性白血病の治療用又は再発抑制用の医薬組成物、【００１９】
（５）前記（１）又は（２）に記載の化合物、その塩又はそれらのプロドラッグを含有する、再発した急性骨髄性白血病治療用の医薬組成物、【００２０】
（６）Ｆｌｔ３／ＩＴＤ変異を有する白血病幹細胞に対して作用させる、前記（２）記載の化合物、その塩又はそれらのプロドラッグを含有する医薬組成物、【００２１】
（７）Ｆｌｔ３／ＩＴＤ変異を有する白血病幹細胞を体内に持つ急性骨髄性白血病患者に投与するための前記（６）記載の医薬組成物、【００２２】
（８）Ｘ２がＣＨ、Ｘ３が窒素原子であり、Ｚ１及びＺ２がＸ３を含み、酸素原子、イオウ原子又は窒素原子よりなる群から選択される２個以上のヘテロ原子を環員に含む置換又は非置換の単環もしくは多環の複素環基である前記（３）から（７）のいずれかに記載の医薬組成物、【００２３】
（９）前記（２）化合物が７−［ｔｒａｎｓ−４−（４−メチル−１−ピペラジニル）シクロヘキシル］−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミンであり、再発した急性骨髄性白血病治療用である前記（８）に記載の医薬組成物、【００２４】
（１０）Ｚ１が水素原子であり、Ｚ２が置換又は非置換の飽和複素環基、置換又は非置換のヘテロアリール−Ｃ１−６−アルキル基又は置換又は非置換のヘテロアリールカルボニル基である、前記（３）から（７）のいずれかに記載の医薬組成物、【００２５】
（１１）Ｘ２が窒素原子、Ｘ３がＣＨであり、Ｚ１及びＺ２がＸ３を含み、置換又は非置換の酸素原子、イオウ原子又は窒素原子から選択されるヘテロ原子を有する単環もしくは多環の複素環基である前記（３）から（７）のいずれかに記載の医薬組成物、【００２６】
（１２）Ａｒ１が置換又は非置換のアリーレン基、Ａｒ２が置換又は非置換のヘテロアリール基、Ｌが−ＮＨＣＯ−である前記（４）記載の医薬組成物、【００２７】
（１３）ＦＬＴ３の阻害効果を有する薬剤をさらに含む、前記（１２）記載の医薬組成物、【００２８】
（１４）前記薬剤がCrenolanib、Lestautirinib、PKC412/CGP41251、Tandutinib、Sunitinib、Sorafenib、Linifanib、Dovitinib、KW-2449、Quizartinib、 Dovitinib Dilactic acid、Tandutinib、Cabozanitib、TG101209、Amuvatinib及びENMD-2076から選択される少なくとも一つの剤である、前記（１３）記載の医薬組成物、【００２９】
（１５）ＨＣＫ遺伝子発現を阻害する核酸と、Ｆｌｔ３遺伝子発現を阻害する核酸を含む、白血病幹細胞を殺傷させる医薬組成物、【００３０】
（１６）前記遺伝子発現を阻害する核酸がｓｉＲＮＡである、前記（１５）記載の医薬組成物、【００３１】
（１７）前記白血病幹細胞が、Ｆｌｔ３／ＩＴＤ変異を有する白血病幹細胞である前記（１５）又は（１６）記載の医薬組成物、【００３２】
（１８）前記（３）から（１７）のいずれかに記載の医薬組成物を、白血病幹細胞を有する個体に投与する工程を含む、白血病幹細胞を殺傷するための方法。【００３３】
（１９）白血病幹細胞を有する個体が急性骨髄性白血病を再発した個体である、前記（１８）記載の方法。【００３４】
（２０）前記白血病幹細胞がＦｌｔ３／ＩＴＤ変異を有する白血病幹細胞である、前記（１８）又は（１９）記載の方法。【００３５】
（２１）Ｆｌｔ３／ＩＴＤ変異を有する白血病幹細胞の殺傷能を指標として、ＨＣＫ活性の阻害効果とＦｌｔ３の阻害効果を合わせ持つ化合物をスクリーニングする方法。【００３６】
（２２）以下の工程を含む、急性骨髄性白血病と診断された個体であってＦｌｔ３／ＩＴＤ変異を有する白血病幹細胞を有する個体における前記（３）から（１７）のいずれかに記載の医薬組成物による治療の薬理有効性の可能性の増大を決定するための方法。
個体の急性骨髄性白血病の腫瘍細胞サンプルから核酸を得る工程；及び
該核酸中のＦｌｔ３遺伝子のＩＴＤ変異を検出する工程であって、当該ＩＴＤ変異の存在は、個体における前記（３）から（１７）のいずれかに記載の医薬組成物による治療の薬理有効性の可能性が増大することを示す工程
【発明の効果】
【００３７】
本発明によれば、白血病幹細胞増殖抑制効果、又は白血病幹細胞に対する殺傷能を有し、急性骨髄性白血病の治療又は再発抑制に有効な医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１はヒトＡＭＬ  ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の増殖に対する被験化合物の阻害効果の分析結果を示す。
【図２】図２はヒトＡＭＬ  ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の増殖に対する被験化合物の阻害効果の分析結果を示す。
【図３】図３はヒトＡＭＬ  ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の生存に対する被験化合物の阻害効果の分析結果を示す。
【図４】図４はin vivoでの処置研究において、ビヒクル単独（無治療）、実施例１の化合物（阻害剤）単独、ＡｒａＣ単独、又はＡｒａＣ、次いで実施例１の化合物（阻害剤）（３０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ  ｂｉｄ）の組み合わせを投与したときの結果を示す。
【図５】図５は化学療法抵抗性疾患の患者から得られたＡＭＬ細胞が生着したレシピエントのin vivoでの処置研究における実施例１の化合物（阻害剤）の効果を示す。写真中の星印は残存したＡＭＬ細胞の位置を示す。
【図６】図６はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）によるＨＣＫの発現低下の効果を示す。
【図７】図７はＦＬＴ３／ＩＴＤ変異を有するヒトＡＭＬに対してＨＣＫの阻害が有効であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４０】
本発明において、アリーレン基、ヘテロアリーレン基としては、例えば後述するアリール基、ヘテロアリール基から、環炭素原子の１個の水素原子を除去することにより生成される２価基が挙げられる。
【００４１】
アリール基としては、例えばフェニル基、ナフチル基が挙げられる。
【００４２】
ヘテロアリール基としては、例えばフリル基、チエニル基、ピロリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、キノリル基、イソキノリル基、インドリル基が挙げられる。
【００４３】
Ｃ１−３−アルキレン基としては、例えばメチレン基、エチレン基、メチルエチレン基、トリメチレン基が挙げられる。
【００４４】
Ｃ１−６−アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基等の鎖状アルキル基、及びシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等の環状アルキル基が挙げられる。
【００４５】
Ｃ２−７−脂肪族アシル基としては、例えばアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基が挙げられる。
【００４６】
飽和複素環基としては、例えばテトラヒドロピラニル基、ピペリジニル基、ピロリジニル基が挙げられる。
【００４７】
Ｚ１及びＺ２から形成される単環の複素環基としては、例えばピロリジニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基が挙げられ、多環の複素環基としては、例えばピラゾロピラジニル基、トリアゾロピラジニル基が挙げられる。
【００４８】
Ａｒ１又はＡｒ２の置換基としては、例えばＣ１−６−アルキル基；ビニル基、アリル基等のＣ２−６−アルケニル基；エチニル基、プロパルギル基等のＣ２−６−アルキニル基；Ｃ２−６−アルキレン基；アリール基；ヘテロアリール基；アセチル基、プロピオニル基等のＣ２−７−脂肪族アシル基；ベンゾイル基等の芳香族アシル基；水酸基；カルボニル基；カルボキシル基；シアノ基；ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）；メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロピルオキシ基等のＣ１−６−アルコキシ基；ベンジル基等のアラルキル基；ベンジルオキシ基等のアラルキルオキシ基；ニトロ基；アミノ基；Ｃ１−６−アルキルアミノ基；ジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ基等が挙げられ、Ａｒ１又はＡｒ２基は独立した複数の置換基で置換されていてもよい。
【００４９】
Ｚ１又はＺ２で表されるアリール−Ｃ１−６−アルキル基、ヘテロアリール−Ｃ１−６−アルキル基、アリールカルボニル基又はヘテロアリールカルボニル基の置換基としては、Ｃ１−６−アルキル基、Ｃ１−６−アルコキシ基、ハロゲン原子、カルボキシル基等が挙げられる。
【００５０】
Ｚ１又はＺ２で表される飽和複素環基の置換基としては、Ｃ１−３−アルキル基、Ｃ１−３−アルキレン基、カルボニル基（オキソ基）、カルボキシル基等が挙げられる。
【００５１】
Ｚ１、Ｚ２及びＸ２で形成される単環もしくは多環の複素環基の置換基としては、Ｃ１−６−アルキル基、Ｃ２−６−アルケニル基、Ｃ２−６−アルキニル基、Ｃ１−３−アルキレン基、アリール基、ヘテロアリール基、Ｃ２−７−脂肪族アシル基、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、Ｃ１−６−アルコキシ基、ヒドロキシ−Ｃ１−６−アルキル基、Ｃ１−６−アルコキシ−Ｃ１−６−アルキル基、アラルキル基、アラルキルオキシ基、ニトロ基、アミノ基、Ｃ１−６−アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ基等が挙げられ、複素環基は独立した複数の置換基で置換されていてもよい。
【００５２】
Ａｒ１としては、１，４−フェニレン基、２−メトキシ−１，４−フェニレン基、３−メトキシ−１，４−フェニレン基、２，５−ピリジレン基が好ましい。
【００５３】
Ａｒ２としては、フェニル基、フルオロフェニル基、ピリジル基、メチルインドリル基が好ましく、フェニル基、１−メチル−２−インドリル基がさらに好ましい。
【００５４】
Ｌとしては、酸素原子、−ＮＨＣＯ−又は−ＣＯＮＨ−が好ましく、酸素原子、−ＮＨＣＯ−がさらに好ましい。
【００５５】
Ｙとしては、メチレン基、エチレン基が好ましく、エチレン基がさらに好ましい。
【００５６】
Ｗ１としては、メチル基が好ましい。
【００５７】
ｍとしては、０が好ましい。
【００５８】
Ｚ１又はＺ２で表されるＣ１−６−アルキル基としては、鎖状アルキル基が好ましく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基がさらに好ましい。
【００５９】
Ｚ１又はＺ２で表されるアミノ−Ｃ１−６−アルキル基としては、２−アミノエチル基、３−アミノプロピル基、４−アミノブチル基が好ましい。
【００６０】
Ｚ１又はＺ２で表されるＣ１−６−アルキルアミノ−Ｃ１−６−アルキル基としては、２−（メチルアミノ）エチル基、２−（エチルアミノ）エチル基、３−（メチルアミノ）プロピル基、３−（エチルアミノ）プロピル基、４−（メチルアミノ）ブチル基が好ましい。
【００６１】
Ｚ１又はＺ２で表されるジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル基としては、２−（ジメチルアミノ）エチル基、２−（ジエチルアミノ）エチル基、３−（ジメチルアミノ）プロピル基、３−（ジエチルアミノ）プロピル基、４−（ジメチルアミノ）ブチル基が好ましい。
【００６２】
Ｚ１又はＺ２で表されるヒドロキシ−Ｃ１−６−アルキル基としては、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキブチル基が好ましい。
【００６３】
Ｚ１又はＺ２で表されるＣ１−６−アルコキシ−Ｃ１−６−アルキル基としては、２−メトキシエチル基、２−エトキシエチル基、３−メトキシプロピル基、３−エトキシプロピル基、４−メトキシブチル基が好ましい。
【００６４】
Ｚ１又はＺ２で表されるカルボキシ−Ｃ１−６−アルキル基としては、カルボキシメチル基、２−カルボキシエチル基、３−カルボキシプロピル基、４−カルボキシブチル基が好ましい。
【００６５】
Ｚ１又はＺ２で表されるカルバモイル−Ｃ１−６−アルキル基としては、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、３−カルバモイルプロピル基、４−カルバモイルブチル基が好ましい。
【００６６】
Ｚ１又はＺ２で表される飽和複素環基としては、４−ピペリジニル基、４−テトラヒドロピラニル基、３−ピロリジニル基が好ましい。
【００６７】
Ｚ１又はＺ２で表されるアリールカルボニル基としては、ベンゾイル基が好ましい。
【００６８】
Ｚ１又はＺ２で表されるヘテロアリールカルボニル基としては、ピリジルカルボニル基が好ましい。
【００６９】
Ｚ１又はＺ２で表されるアリール−Ｃ１−６−アルキル基としては、ベンジル基、フェニルエチル基が好ましい。
【００７０】
Ｚ１又はＺ２で表されるヘテロアリール−Ｃ１−６−アルキル基としては、ピリジルメチル基、ピリジルエチル基、ピラゾリルメチル基、ピラゾリルエチル基、イミダゾリルメチル基、イミダゾリルエチル基が好ましく、ピリジルメチル基、ピラゾリルメチル基がさらに好ましい。
【００７１】
Ｚ１又はＺ２で表されるアリール−Ｃ１−６−アルキル基、ヘテロアリール−Ｃ１−６−アルキル基、アリールカルボニル基又はヘテロアリールカルボニル基の置換基としては、Ｃ１−６−アルキル基、Ｃ１−６−アルコキシ基、ハロゲン原子が好ましい。
【００７２】
Ｚ１又はＺ２で表される飽和複素環基の置換基としては、Ｃ１−３−アルキル基、Ｃ１−３−アルキレン基、カルボニル基（オキソ基）が好ましい。
【００７３】
Ｚ１としては、水素原子又はＣ１−６−アルキル基が好ましく、水素原子がさらに好ましい。
【００７４】
Ｚ２としては、カルボキシ−Ｃ１−６−アルキル基、カルバモイル−Ｃ１−６−アルキル基、置換又は非置換のアリール−Ｃ１−６−アルキル基、ヘテロアリール−Ｃ１−６−アルキル基、アリールカルボニル基、ヘテロアリールカルボニル基又は飽和複素環基が好ましく、カルボキシメチル基、カルバモイルメチル基、ピラゾリルメチル基、メチルピラゾリルメチル基、ピリジルメチル基、ピリジルカルボニル基、テトラヒドロピラニル基、８−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル基又は２−オキソピロリジニル基がさらに好ましく、カルボキシメチル基、カルバモイルメチル基、ピラゾリルメチル基、ピリジルメチル基、ピリジルカルボニル基、４−テトラヒドロピラニル基、８−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル基又は２−オキソ−３−ピロリジニル基が最も好ましい。
【００７５】
Ｘ2がＣＨでありＸ3が窒素原子のとき、Ｚ１、Ｚ２及びＸ３で形成される複素環基としては、
次式（ａ）：
【化２】
2014017659.tif 000004
【００７６】
（式中、Ｒ１は、水素原子、Ｃ１−６−アルキル基、Ｃ２−７−脂肪族アシル基、ヒドロキシ−Ｃ１−６−アルキル基又はＣ１−６−アルコキシ−Ｃ１−６−アルキル基であり、Ｗ２はＣ１−６−アルキル基又はカルボニル基であり、ｎは０〜３の整数であり、Ｘ２は前記と同義である。複数のＷ２が共同してＣ１−３−アルキレン基を形成してもよい。）
で示されるピペラジニル基、次式（ｂ）：
【化３】
2014017659.tif 000005
【００７７】
（式中、Ｘ４及びＸ５は、独立して、ＣＲ２又は窒素原子であり、Ｘ２、Ｗ２及びｎは前記と同義である。Ｒ２は、水素原子、Ｃ１−６−アルキル基、Ｃ１−６−ハロゲン化アルキル基又はヒドロキシ−Ｃ１−６−アルキル基であり、複数のＲ２は異なっていてもよい。）
で示される縮合ピペラジニル基が好ましい。
【００７８】
式（ａ）で表されるピペラジニル基のＲ１としては、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が好ましい。
【００７９】
式（ａ）で表されるピペラジニル基としては、ピペラジノ基、４−メチル−１−ピペラジニル基、４−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ピペラジニル基、３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル基、８−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル基が好ましい。
【００８０】
式（ｂ）で表される縮合ピペラジニル基のＲ２としては、水素原子、メチル基、エチル基、トリフルオロメチル基が好ましく、水素原子、メチル基、トリフルオロメチル基がさらに好ましい。
【００８１】
式（ｂ）で表される縮合ピペラジニル基としては、イミダゾピラジニル基、メチルイミダゾピラジニル基、トリアゾロピラジニル基、メチルトリアゾロピラジニル基が好ましい。
【００８２】
Ｘ２が窒素原子でありＸ３がＣＨのとき、Ｚ１、Ｚ２及びＸ３で形成される複素環基としては、前記式（ａ）で表されるピペラジニル基又は式（ｂ）で表される縮合ピペラジニル基においてＸ２と結合する窒素原子をＣＨに置換した基が好ましく、ピペリジン−４−イル基、８−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル基が特に好ましい。
【００８３】
前記式（Ｉ）で示される化合物の塩としては、薬学的に許容される塩が好ましく、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、ピロ硫酸、メタリン酸等の無機酸、又はクエン酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、コハク酸、スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸）等の有機酸との塩が挙げられる。また、前記式（Ｉ）で示される化合物がフェノール性水酸基、カルボキシル基等の酸性置換基を有する場合には、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、リジン塩、アルギニン塩として用いることもできる。
【００８４】
本明細書において「プロドラッグ」とは、生物系に投与した場合に、自発的な化学反応の結果として、又は触媒する酵素若しくは代謝反応により、一般式（Ｉ）の化合物を生ずる全ての化合物を示す。水酸基又はアミノ基において使用されるプロドラッグを構成する基としては、例えば、Ｃ２−７−アシル基、Ｃ１−６−アルコキシ（Ｃ２−７アシル）基、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル（Ｃ２−７−アシル）基、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル基、Ｃ１−６−アルコキシ（Ｃ２−７−アルコキシカルボニル）基、（Ｃ２−７−アシルオキシ）メチル基、１−（Ｃ２−７−アシルオキシ）エチル基、（Ｃ２−７−アルコキシカルボニル）オキシメチル基、１−〔（Ｃ２−７−アルコキシカルボニル）オキシ〕エチル基等が挙げられ、Ｃ２−７−アシル基、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル基が好ましい。カルボキシル基において使用されるプロドラッグを構成する基としては、例えば、Ｃ１−６−アルキル基、Ｃ１−６−アルコキシ−Ｃ１−６−アルキル基、（Ｃ２−７−アシルオキシ）メチル基、１−（Ｃ２−７−アシルオキシ）エチル基、（Ｃ２−７−アルコキシカルボニル）オキシメチル基、１−〔（Ｃ２−７−アルコキシカルボニル）オキシ〕エチル基等が挙げられ、Ｃ１−６−アルキル基、Ｃ１−６−アルコキシ−Ｃ１−６−アルキル基が好ましい。
【００８５】
前記式（Ｉ）で示される化合物は、特許文献３又は特許文献４の記載に準じて製造することができ、例えば、以下のようにして製造することができる。なお、反応性置換基が存在するときは、反応の前後において、適宜、保護基の付加、脱離を施せばよい。
【００８６】
前記式（Ｉ）においてＸ１がＣＨである化合物は、次式（II）：
【化４】
2014017659.tif 000006
【００８７】
（式中、Ａｒ１、Ａｒ２、Ｌ、Ｗ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ、Ｚ１、Ｚ２及びｍは前記と同義である。）
で示される化合物を５０〜２５０℃で、必要であれば、例えば４−ジメチルアミノピリジンのような触媒の存在下、ホルムアミドと縮合することにより製造できる。
【００８８】
前記式（Ｉ）で示される化合物は、次式（III）：
【化５】
2014017659.tif 000007
【００８９】
（式中、Ｗ１、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ、Ｚ１及びＺ２は前記と同義であり、Ｒｘは臭素原子又はヨウ素原子である。）
で示される化合物を次式（IVａ）、（IVｂ）又は（IVｃ）：
Ａｒ２−Ｌ−Ａｒ１−Ｂ（ＯＨ）２              （IVａ）、
Ａｒ２−Ｌ−Ａｒ１−Ｓｎ（ＣＨ３）３          （IVｂ）、
【化６】
2014017659.tif 000008
【００９０】
（式中、Ａｒ１、Ａｒ２及びＬは前記と同義である。）
で示される化合物と、例えばパラジウム（Ｏ）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４のような触媒の存在下で反応させることにより製造することができる。
【００９１】
前記式（Ｉ）で示される化合物は、また次式（Ｖ）：
【化７】
2014017659.tif 000009
【００９２】
（式中、Ａｒ１、Ａｒ２、Ｌ及びＸ１は前記と同義である。）
で示される化合物を次式（VI）：
【化８】
2014017659.tif 000010
【００９３】
（式中、Ｗ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ、Ｚ１及びＺ２は前記と同義であり、ＲYは脱離基、例えばハロゲン原子、メシルオキシ基又はトシルオキシ基である。）
で示される化合物によってアルキル化するか、又は次式（VII）：
【化９】
2014017659.tif 000011
【００９４】
（式中、Ｗ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｙ、Ｚ１及びＺ２は前記と同義である。）
で示される化合物と光延（Mitsunobu）反応させることにより製造することができる。
【００９５】
前記式（Ｉ）においてＸ１及びＸ２がＣＨである化合物は、次式（VIII）：
【化１０】
2014017659.tif 000012
【００９６】
で示される化合物を次式（IX）：
【化１１】
2014017659.tif 000013
【００９７】
（式中、Ｙは前記と同義である。）
で示される化合物と光延（Mitsunobu）反応させ、生成した次式（Ｘ）：
【化１２】
2014017659.tif 000014
【００９８】
（式中、Ｗ１及びｍは前記と同義である。）
で示される化合物を前記式（IVａ）、（IVｂ）又は（IVｃ）で示される化合物と、例えばパラジウム（Ｏ）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４のような触媒の存在下で反応させ、生成した次式（XI）：
【化１３】
2014017659.tif 000015
【００９９】
（式中、Ａｒ１、Ａｒ２、Ｌ、Ｗ１、Ｙ及びｍは前記と同義である。）
で示される化合物の保護基を除去し、次式（XII）：
【化１４】
2014017659.tif 000016
【０１００】
（式中、Ａｒ１、Ａｒ２、Ｌ、Ｗ１、Ｙ及びｍは前記と同義である。）
で示される化合物とし、次いで次式（XIII）：
Ｚ１−ＮＨ−Ｚ２
（式中、Ｚ１及びＺ２は前記と同義である。）
で示される化合物と反応させることにより製造することができる。
【０１０１】
前記のようにして得られる生成物を精製するには、通常用いられる手法、例えばシリカゲル等を担体として用いたカラムクロマトグラフィーやメタノール、エタノール、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、水等を用いた再結晶法によればよい。カラムクロマトグラフィーの溶出溶媒としては、メタノール、エタノール、クロロホルム、アセトン、ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル、及びこれらの混合溶媒等が挙げられる。
【０１０２】
（医薬組成物）
前記式（Ｉ）で示される化合物、その塩又はそれらのプロドラッグ（以下「化合物（Ｉ）」という。）は、白血病幹細胞増殖抑制効果、又は白血病幹細胞の殺傷能を示す。従って、当該化合物、その塩又はそれらのプロドラッグは、急性骨髄性白血病の治療又は再発抑制のための医薬組成物に利用することができる。
【０１０３】
白血病幹細胞とは、次の要件のうち少なくとも一つを満たす細胞をいう。
１  生体内での白血病発症能を選択的かつ独占的に有する。
２  自身では白血病を発症することができない白血病非幹細胞分画を作り出すことができる。
３  生体に生着することができる。
４  自己複製能を有する。
【０１０４】
また、一態様において白血病幹細胞は表面抗原としてＣＤ３４＋ＣＤ３８−の特徴を示す細胞である。本明細書において、急性骨髄性白血病患者由来の白血病幹細胞は「ヒトＡＭＬ ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞」とも記述される。
【０１０５】
ここで、自己複製能とは、細胞分裂の結果生じる２個の細胞のうち、１つが自分自身、すなわち幹細胞となり、もう１つが分化の進んだ前駆細胞となるように、分裂し得る能力をいう。白血病幹細胞の概念は、本技術分野において既に確立しており、広く受け入れられている(D. Bonnet， J. E. Dick， Nat. Med. 3， 730 (1997), T. Lapidot et al., Nature, 367, 645 (1994))。
【０１０６】
本明細書において、白血病幹細胞は、あらゆるタイプの白血病細胞の幹細胞を包含するが、好ましくはＨＣＫ遺伝子を高発現している幹細胞であり、より好ましくは急性骨髄性白血病細胞の幹細胞をいう。
【０１０７】
本発明の対象となる白血病幹細胞は、通常哺乳動物由来である。哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブ夕、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類を挙げることができる。本発明の対象となる白血病幹細胞は、好ましくは霊長類（例えばヒト）又はげっ歯類（例えばマウス）由来である。
【０１０８】
本発明の白血病幹細胞を殺傷するための医薬組成物、及び急性骨髄性白血病の治療用又は再発抑制用の医薬組成物（以下「本発明の医薬組成物」という。）は、白血病幹細胞を殺傷する効果を有する。白血病幹細胞の殺傷効果は、白血病幹細胞の細胞集団全体における増殖抑制として効果を確認することもできる。
【０１０９】
白血病幹細胞は、白血病再発の原因と考えられているので、本発明の医薬組成物を用いることにより、白血病の再発を抑制し、予防することができる。すなわち、本発明の医薬組成物は白血病の抑制剤(好ましくは白血病の再発抑制剤)としても有用である。白血病の再発とは、治療により白血病の症状が完全に又は一部寛解した後に再び白血病細胞が増殖し、白血病の症状の再出又は悪化を意味する。本発明の医薬組成物を白血病の発症（又は再発）のリスクのある哺乳動物に投与することにより該哺乳動物における白血病の発症（又は再発）を抑制し、予防することができる。
【０１１０】
また、癌の化学療法剤として公知の薬剤、例えばアルキル化剤（例えばシクロホスファミド、イホスファミド等）、代謝拮抗剤（例えばシタラビン、５−フルオロウラシル、メソトレキセート等）、抗癌性抗生物質（例えばアドリアマイシン、マイトマイシン）、植物由来抗癌剤（例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド等を用いても、急性骨髄性白血病を完全寛解の状態にすることができるが、その後再発することがかなり多く、再発患者の多くは死に至る。
【０１１１】
本発明の医薬組成物を急性骨髄性白血病の完全寛解者に投与することにより、急性骨髄性白血病の再発を防止することができる。
【０１１２】
前記式（Ｉ）で示される化合物であって、Ａｒ１が置換又は非置換のアリーレン基、Ａｒ２が置換又は非置換のアリール基、Ｌが酸素原子である化合物は、ＨＣＫとＦＬＴ３に対して顕著な阻害効果を有し、ＦＬＴ３／ＩＴＤ変異に対しても高い阻害効果を持つ。このことより、当該化合物、その塩又はそれらのプロドラッグを含む本発明の医薬組成物は白血病幹細胞に対する高い殺傷能を持つ。当該化合物、その塩又はそれらのプロドラッグを含む本発明の医薬組成物は、特にＦＬＴ３／ＩＴＤ変異を有する白血病幹細胞に対して顕著な殺傷能を示す。従って、ＦＬＴ３／ＩＴＤ変異を獲得して悪性化した白血病幹細胞から再発した急性骨髄性白血病に対して、本発明の医薬組成物は特に高い治療効果を持つ。
【０１１３】
本発明の医薬組成物は、前記式（Ｉ）で示される化合物、その塩又はそれらのプロドラッグに加えて、さらにＦＬＴ３の阻害効果を有する薬剤を含有することができる。ＦＬＴ３の阻害効果を有する薬剤を含有することにより、特にＦｌｔ３／ＩＴＤ変異を有する白血病幹細胞に対する殺傷能を向上させることができる。
【０１１４】
本発明においてＦＬＴ３の阻害効果を有する薬剤としては、Crenolanib、Lestautirinib（CEP-701/KT5555）、PKC412（CGP41251）、Tandutinib（MLN518/CT53518）、Sunitinib（SU11248）、Sorafenib（BA43-9006）、Linifanib（ABT-869）、Dovitinib（CHIR-258/TKI-258）、KW-2449、Quizartinib（AC220）、Dovitinib Dilactic acid、Cabozanitib（XL-184）、R406、TG101209、Amuvatinib、ENMD-2076等が例示されるが、これらに限定されない。
【０１１５】
ＩＴＤ変異型のＦｌｔ３の検出・判別する方法としては、正常型との変異箇所の違いをＰＣＲ法、電気泳動法、配列のシークエンス、抗体による検出（ウェスタンブロッテイング、ＥＬＩＳＡ等）等を適宜選択して検出することで可能である。ＩＴＤ変異型ＦＬＴ３が検出された白血病幹細胞を有する個体において、正常型ＦＬＴ３が検出された白血病幹細胞を有する個体よりも薬理有効性の可能性が増大することを決定することができる。薬理有効性の可能性が増大すると判定された際に、当該個体に本発明の医薬組成物を投与することで急性骨髄性白血病の治療及び／又は再発防止を達成することができる。
【０１１６】
（ＨＣＫの発現又は機能を抑制する核酸）
ＨＣＫ及びＦＬＴ３のヌクレオチド配列やアミノ酸配列は公知である。ヒトのＨＣＫの代表的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えばＮＣＢＩに以下の通りに登録されている。
【０１１７】
ＨＣＫヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ配列）：アクセッション番号 NM_002110.3<<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_002110.3>>
ＨＣＫアミノ酸配列：アクセッション番号 NP_002101.2<<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_002101.2>>
ＦＬＴ３ヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ配列）：アクセッション番号 NM_004119.2<<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004119.2>>
ＦＬＴ３アミノ酸配列：アクセッション番号 NP_004110.2<<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_004110.2>>
ＨＣＫの発現又は機能を抑制する核酸としては、例えば、ＨＣＫの発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、これらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター、低分子化合物が挙げられる。好ましくは、ＨＣＫの発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、又はこれらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターが用いられる。
【０１１８】
本明細書中、「特異的な遺伝子発現の抑制」とは、標的とする遺伝子の発現を、それ以外の遺伝子の発現よりも強く抑制することを意味する。
【０１１９】
ＨＣＫの発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡとしては、例えば
（Ａ）ＨＣＫをコードするｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）のヌクレオチド配列又は１８塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む２本鎖のＲＮＡ、及び
（Ｂ）ＨＣＫをコードするｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）と治療対象動物（好ましくはヒト）の細胞内で特異的にハイブリダイズし得る１８塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズすることによりＨＣＫの転写を抑制する２本鎖のＲＮＡを挙げることができる。
【０１２０】
本明細書中、「特異的なハイブリダイゼーション」とは、核酸が、標的とするヌクレオチドに対して、それ以外のヌクレオチドよりも強くハイブリダイズすることを意味する。
【０１２１】
ＨＣＫをコードするヌクレオチド配列としては、例えば、前記ＮＣＢＩアクセッション番号 NM_002110.3で表されるヌクレオチド配列（ヒトＨＣＫ）を挙げることができる。
【０１２２】
短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、最近、この現象が動物細胞でも起こることが確認されたことから［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として注目されている。
【０１２３】
ｓｉＲＮＡは、代表的には、標的遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列又はその部分配列（以下、標的ヌクレオチド配列）と相補的な配列を有するＲＮＡとその相補鎖からなる２本鎖オリゴＲＮＡである。また、ヘアピンループ部分を介して、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列（第１の配列）と、その相補配列（第２の配列）とが連結された一本鎖ＲＮＡであって、ヘアピンループ型の構造をとることにより、第１の配列が第２の配列と２本鎖構造を形成するＲＮＡ（small hairpin RNA: ｓｈＲＮＡ）もｓｉＲＮＡの好ましい態様の１つである。
【０１２４】
ｓｉＲＮＡに含まれる、標的ヌクレオチド配列と相補的な部分の長さは、通常、約１８塩基以上、好ましくは約１９塩基以上、より好ましくは約２１塩基以上の長さであるが、標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されない。ｓｉＲＮＡが２３塩基よりも長い場合には、該ｓｉＲＮＡは細胞内で分解されて、約２０塩基前後のｓｉＲＮＡを生じ得るので、理論的には標的ヌクレオチド配列と相補的な部分の長さの上限は、標的遺伝子のｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡもしくは初期転写産物）のヌクレオチド配列の全長である。しかし、インターフェロン誘導の回避、合成の容易さ、抗原性の問題等を考慮すると、該相補部分の長さは、例えば約５０塩基以下、好ましくは約２５塩基以下、最も好ましくは約２３塩基以下である。即ち、該相補部分の長さは、通常、約１８〜約５０塩基、好ましくは約１９〜約２５塩基、より好ましくは約２１〜約２３塩基である。
【０１２５】
また、ｓｉＲＮＡを構成する各ＲＮＡ鎖の長さも、通常、約１８塩基以上、好ましくは約１９塩基以上、より好ましくは約２１塩基以上の長さであるが、標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されず、理論的には各ＲＮＡ鎖の長さの上限はない。しかし、インターフェロン誘導の回避、合成の容易さ、抗原性の問題等を考慮すると、siRNAの長さは、例えば約５０塩基以下、好ましくは約２５塩基以下、最も好ましくは約２３塩基以下である。即ち、各ＲＮＡ鎖の長さは、例えば通常、約１８〜約５０塩基、好ましくは約１９〜約２５塩基、より好ましくは約２１〜約２３塩基である。なお、ｓｈＲＮＡの長さは、２本鎖構造をとった場合の２本鎖部分の長さとして示すものとする。
【０１２６】
標的ヌクレオチド配列と、ｓｉＲＮＡに含まれるそれに相補的な配列とは、完全に相補的であることが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置についての塩基の変異（少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性の範囲内であり得る）については、完全にＲＮＡ干渉による切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存し得る。他方、ｓｉＲＮＡの中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下し得る。
【０１２７】
ｓｉＲＮＡは、５’及び／又は３’末端に塩基対を形成しない、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り特に限定されないが、通常５塩基以下、例えば２〜４塩基である。該付加的塩基は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡを用いるとｓｉＲＮＡの安定性を向上させることができる。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１２８】
ｓｈＲＮＡのヘアピンループのループ部分の長さは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されないが、通常、５〜２５塩基程度である。該ループ部分のヌクレオチド配列は、ループを形成することができ、且つ、ｓｈＲＮＡが標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されない。
【０１２９】
「アンチセンス核酸」とは、標的ｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該標的ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で該標的ｍＲＮＡにコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。
【０１３０】
ＨＣＫの発現を特異的に抑制し得るアンチセンス核酸としては、例えば
（Ａ）ＨＣＫをコードするｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）のヌクレオチド配列又は１２塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸、及び
（Ｂ）ＨＣＫをコードするｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）と治療対象動物（好ましくはヒト）の細胞内で特異的にハイブリダイズし得る１２塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態でＨＣＫポリペプチドへの翻訳を阻害し得る核酸
等を挙げることができる。
【０１３１】
アンチセンス核酸中の標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする部分の長さは、ＨＣＫの発現を特異的に抑制する限り特に制限はなく、通常、約１２塩基以上であり、長いものでｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）の全長配列と同一の長さである。ハイブリダイゼーションの特異性を考慮すると、該長さは好ましくは約１５塩基以上、より好ましくは約１８塩基以上である。また、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする部分の長さは、通常、約２００塩基以下、好ましくは約５０塩基以下、より好ましくは約３０塩基以下である。即ち、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする部分の長さは、例えば約１２〜約２００塩基、好ましくは約１５〜約５０塩基、より好ましくは約１８〜約３０塩基である。
【０１３２】
アンチセンス核酸の標的ヌクレオチド配列は、ＨＣＫの発現を特異的に抑制可能であれば特に制限はなく、ＨＣＫのｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ又は初期転写産物）の全長配列であっても部分配列（例えば約１２塩基以上、好ましくは約１５塩基以上、より好ましくは約１８塩基以上）であってもよいし、あるいは初期転写産物のイントロン部分であってもよいが、好ましくは、標的配列はＨＣＫのｍＲＮＡの５’末端からコード領域のＣ末端までに位置することが望ましい。
【０１３３】
アンチセンス核酸中の標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする部分のヌクレオチド配列は、標的配列の塩基組成によっても異なるが、生理的条件下でＨＣＫのｍＲＮＡとハイブリダイズし得るために、標的配列の相補配列に対して通常約９０％以上（好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％）の同一性を有するものである。
【０１３４】
アンチセンス核酸の大きさは、通常約１２塩基以上、好ましくは約１５塩基以上、より好ましくは約１８塩基以上である。該大きさは、合成の容易さや抗原性の問題等から、通常約２００塩基以下、好ましくは約５０塩基以下、より好ましくは約３０塩基以下である。
【０１３５】
さらに、アンチセンス核酸は、ＨＣＫのｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるＨＣＫ遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。
【０１３６】
天然型の核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、本発明において使用されるｓｉＲＮＡやアンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’−Ｏ−メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成することもできる。ｓｉＲＮＡやアンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服することができる。
【０１３７】
ＨＣＫの発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸は、ＨＣＫのヌクレオチド配列（例えば前記ＮＣＢＩアクセッション番号 NM_002110.3で表されるヌクレオチド配列）や染色体ＤＮＡ配列に基づいて標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的なヌクレオチド配列を合成することにより調製できる。ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製できる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い２本鎖ポリヌクレオチドを調製できる。
【０１３８】
本発明の医薬組成物は、ＨＣＫの発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ又はアンチセンス核酸を発現し得る（コードする）発現ベクターを有効成分とすることもできる。当該発現ベクターにおいては、上述のｓｉＲＮＡ又はアンチセンス核酸或いはそれをコードする核酸（好ましくはＤＮＡ）が、投与対象である哺乳動物（好ましくはヒト）の細胞（例えば、肉腫細胞）内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されている。
【０１３９】
使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物の細胞内で機能し得るものであれば特に制限はない。プロモーターとしては、ｐｏｌＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーター等を使用することができる。具体的には、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ等のウイルスプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター、並びにｔＲＮＡプロモーター等のＲＮＡプロモーター等が用いられる。
【０１４０】
ｓｉＲＮＡの発現を意図する場合には、プロモーターとしてｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを使用することが好ましい。ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターとしては、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター等を挙げることができる。
【０１４１】
前記発現ベクターは、好ましくは上述のポリヌクレオチド又はそれをコードする核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。
【０１４２】
ＦＬＴ３の発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸は、上述においてＨＣＫをＦＬＴ３に置き換えた態様である。
【０１４３】
本明細書においてＨＣＫの発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡは「ＨＣＫのｓｉＲＮＡ」とも記述され、ＦＬＴ３の発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡは「ＦＬＴ３のｓｉＲＮＡ」とも記述される。
【０１４４】
（化合物及び医薬組成物の投与量、製剤化）
以下、本発明の化合物（Ｉ）及び医薬組成物の投与量及び製剤化について説明する。
【０１４５】
化合物（Ｉ）はそのまま、あるいは慣用の製剤担体と共にヒト及び非ヒト動物に投与することができる。投与形態としては、特に限定がなく、必要に応じ適宜選択して使用され、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、徐放性製剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤等の経口剤、注射剤、坐剤、塗布剤、貼付剤等の非経口剤が挙げられる。
【０１４６】
経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。
【０１４７】
この種の製剤には、適宜前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を使用することができる。
【０１４８】
結合剤としては、例えばデンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴールが挙げられる。
【０１４９】
崩壊剤としては、例えばデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。
【０１５０】
界面活性剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０が挙げられる。
【０１５１】
滑沢剤としては、例えばタルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１５２】
流動性促進剤としては、例えば軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムが挙げられる。
【０１５３】
注射剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、オリーブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を用いることができる。更に必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、注射剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分を除去し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。更に、必要に応じて適宜、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤等を加えてもよい。
【０１５４】
その他の非経口剤としては、外用液剤、軟膏等の塗布剤、貼付剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、常法に従って製造される。
【０１５５】
本発明の製剤は、剤形、投与経路等により異なるが、１日１〜数回から１〜数回／週〜月の投与が可能である。
【０１５６】
経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人で化合物（Ｉ）の重量として１〜２００ｍｇを、１日数回に分けての服用が適当である。
【０１５７】
非経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人で化合物（Ｉ）の重量として１日１〜５０ｍｇの静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射が適当である。
【０１５８】
本発明の医薬組成物は、他の白血病の治療又は再発抑制剤、免疫賦活剤などと併用することができる。この場合には、必要に応じて、後述の投与量を適宜増減することができる。
【０１５９】
（スクリーニング法）
また本発明は、ＨＣＫ遺伝子の発現量もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を低下させ、かつＦＬＴ３遺伝子の発現量もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を低下させる化合物を選択することを特徴とする、急性骨髄性白血病の治療もしくは予防のための薬剤（候補化合物）のスクリーニング方法を提供する。
【０１６０】
本発明のスクリーニング方法の一態様は、白血病幹細胞のＨＣＫ遺伝子およびＦＬＴ３遺伝子の発現レベルを指標とする方法である。ＨＣＫ遺伝子およびＦＬＴ３遺伝子の発現レベルを低下させる化合物は、急性骨髄性白血病の治療もしくは予防のための薬剤となることが期待される。
【０１６１】
本発明の前記方法は、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、急性骨髄性白血病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法である。
（ａ）白血病幹細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該白血病幹細胞におけるＨＣＫ遺伝子およびＦＬＴ３遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【０１６２】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は、急性骨髄性白血病の治療もしくは予防のための薬剤となる。
【０１６３】
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、ＨＣＫ遺伝子およびＦＬＴ３遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、レポーター遺伝子の発現を指標として同定する方法である。
【０１６４】
本発明の前記方法は、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、急性骨髄性白血病の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法である。
（ａ）ＨＣＫ遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAと、ＦＬＴ３遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNA、を含む細胞と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【０１６５】
本方法においては、まず、ＨＣＫ遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAと、ＦＬＴ３遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNA、を含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。ここで「機能的に結合した」とは、ＨＣＫ遺伝子またはＦＬＴ３遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ＨＣＫ遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、ＨＣＫ遺伝子またはＦＬＴ３遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、前記「機能的に結合した」の意に含まれる。ＨＣＫ遺伝子およびＦＬＴ３遺伝子のcDNA塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に存在するＨＣＫ遺伝子およびＦＬＴ３遺伝子の転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。
【０１６６】
本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限はなく、例えば、CAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびGFP遺伝子等が挙げられる。「ＨＣＫ遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAと、ＦＬＴ３遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNA、を含む細胞」として、例えば、このような構造が挿入されたベクターを導入した細胞が挙げられる。各遺伝子に連結されたレポーター遺伝子は、異なるレポーター遺伝子であることが好ましい。このようなベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェクトアミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。「ＨＣＫ遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAと、ＦＬＴ３遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNA、を含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体へのDNA構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。
【０１６７】
「ＨＣＫ遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAと、ＦＬＴ３遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNA、を含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、ＨＣＫ遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAと、ＦＬＴ３遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNA、を添加したものを挙げることができる。
【０１６８】
本方法における「接触」は、「ＨＣＫ遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAと、ＦＬＴ３遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNA、を含む細胞」の培養液に被検化合物を添加する、または該DNAを含む前記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である。
【０１６９】
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。
【０１７０】
本方法においては、次いで、測定したレポーター遺伝子の発現レベルを、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、低下（抑制）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は、急性骨髄性白血病の治療もしくは予防のための薬剤となる。
【実施例】
【０１７１】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。【０１７２】
（実施例１）
７−［ｔｒａｎｓ−４−（４−メチル−１−ピペラジニル）シクロヘキシル］−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミンの合成
【化１５】
2014017659.tif 000017
【０１７３】
（１）４−クロロ−７−（１，４−ジオキサスピロ[４．５]デカン−８−イル）−５−ヨード−７Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジンの合成
トリフェニルホスフィン（６３．２８ｇ）のＴＨＦ（７００ｍＬ）溶液に、氷冷下にジイソプロピルアゾジカルボキシラート（４８．７３ｇ）を滴下ロートを用いて滴下した。滴下ロートはＴＨＦ（３０ｍＬ）で洗いこみをした。その後、混合物を室温にし、４−クロロ−５−ヨード−７Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン（３６．８４ｇ）及び１，４−ジオキサスピロ[４．５]デカン−８−オール（２９．４６ｇ）のＴＨＦ（３２０ｍＬ）溶液を５０分間かけて滴下した。滴下終了後、室温にて３時間攪拌し、それからエバポレーターにて溶媒の大部分を蒸発させた。残留物に酢酸エチル（４００ｍＬ）を加え、得られた固体を濾取、酢酸エチルにて洗浄（２５０ｍＬ＋１８０ｍＬ）、減圧下で乾燥し、４−クロロ−７−（１，４−ジオキサスピロ[４．５]デカン−８−イル）−５−ヨード−７Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン（３５．４６ｇ）を薄茶色の固体として得た。【０１７４】
（２）４−クロロ−５−（４−フェノキシフェニル）−７−（１，４−ジオキサスピロ［４．５］デカン−８−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンの合成
４−フェノキシフェニルボロン酸ピナコールエステル（８．４４ｇ）をエチレングリコールジメチルエーテル（３００ｍＬ）に溶解し、ここへ４−クロロ−７−（１，４−ジオキサスピロ[４．５]デカン−８−イル）−５−ヨード−７Ｈ−ピロロ[２，３−ｄ]ピリミジン（７．９７ｇ）、炭酸ナトリウム（６．０２ｇ）、水（２００ｍＬ）及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１．３２ｇ）を順次加え、混合物を８０℃にて３時間半攪拌した。放冷後、酢酸エチル（４００ｍＬ）を加え分液した。有機層を水（２５０ｍＬ）及び飽和食塩水（２５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた淡褐色油状物（１３．８ｇ）にヘキサン／酢酸エチル（５：１、４０ｍＬ）及びジクロロメタン（１５ｍＬ）を加え、析出した白色固体を濾取、乾燥し、４−クロロ−５−（４−フェノキシフェニル）−７−（１，４−ジオキサスピロ［４．５］デカン−８−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（５．２２ｇ）を得た。【０１７５】
（３）５−（４−フェノキシフェニル）−７−（１，４−ジオキサスピロ［４，５］デカン−８−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミンの合成
４−クロロ−５−（４−フェノキシフェニル）−７−（１，４−ジオキサスピロ［４．５］デカン−８−イル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（７．５８ｇ）、１，４−ジオキサン（１２０ｍｌ）及び濃アンモニア水溶液（１２０ｍｌ）の混合物を、圧力容器において１２０℃で１７時間加熱した。混合物を周囲温度まで冷却し、そして減圧下で溶媒を留去し、薄茶色の固体（８．３ｇ）を得た。このものは精製することなく、次の反応に使用した。【０１７６】
（４）４−［４−アミノ−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］シクロヘキサノンの合成
前の工程の生成物、ＴＨＦ（３０ｍＬ）、アセトン（１５０ｍｌ）及び６Ｍ塩酸（１０９ｍＬ）の混合物を４０℃で４時間撹拌した。混合物を氷冷し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（８２０ｍＬ）を加えｐＨ８とし、生成した薄茶色固体を濾取した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝５０／１→２０／１）にて精製し、４−［４−アミノ−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］シクロヘキサノン（４．８２ｇ）を得た。【０１７７】
（５）７−［ｃｉｓ−４−（４−メチル−１−ピペラジニル）シクロヘキシル］−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン及び７−［ｔｒａｎｓ−４−（４−メチル−１−ピペラジニル）シクロヘキシル］−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミンの合成
４−［４−アミノ−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］シクロヘキサノン（８．２３ｇ）を１，２−ジクロロエタン（３３０ｍＬ）に溶かし、酢酸（３．７３ｇ）、Ｎ−メチルピペラジン（６．２２ｇ）及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（６．５８ｇ）を加え、室温にて５時間半攪拌した。反応混合物に水（１００ｍＬ）及びクロロホルム（１００ｍＬ）を加えて、更に飽和重曹水（１００ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（１４０ｍＬ）にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後に溶媒を留去した。カラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム／メタノール＝２０／１）により精製して、７−［ｃｉｓ−４−（４−メチル−１−ピペラジニル）シクロヘキシル］−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン（１２．１ｇ）、及び７−［ｔｒａｎｓ−４−（４−メチル−１−ピペラジニル）シクロヘキシル］−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン（３．８ｇ）を得た。【０１７８】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.33 (s, 1H), 7.46-7.32 (m, 4H), 7.20-7.03 (m, 5H), 7.01 (s, 1H), 5.07 (s, 2H), 4.68 (m, 1H), 2.73-2.58 (m, 4H), 2.58-2.35 (m, 5H), 2.30 (s, 3H), 2.27-2.14 (m, 2H), 2.14-2.00 (m, 2H), 1.90-1.70 (m, 2H), 1.70-1.50 (m, 2H).
MS (m/z) = 483.50 [M+H]
HCK IC50 (nM); 1.1, FLT3-ITD IC50 (nM); 26.7 【０１７９】
（実施例２〜５９）
実施例２：ＲＫ−００２０６９０
７−（（１ｒ，４ｒ）−４−（８−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル）シクロヘキシル）−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化１６】
2014017659.tif 000018
【０１８０】
実施例1の合成方法に従い、第5工程において8-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタンをN-メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物(白色固体)として得た。【０１８１】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.33 (s, 1H), 7.44-7.35 (m, 4H), 7.17-7.00 (m, 5H), 7.00 (s, 1H), 5.04 (s, 2H), 4.66 (m, 1H), 3.08 (s, 2H), 2.57 (s, 4H), 2.30 (s, 3H), 2.19 (m, 2H), 2.15-1.75 (m, 8H), 1.25 (m, 2H).
MS (m/z) = 509.30 [M+H]
HCK IC50 (nM); 5.0, FLT3-ITD IC50 (nM); 18.0【０１８２】
実施例３：ＲＫ−００２０７２１
２−（（（ｔｒａｎｓ）−４−（４−アミノ−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）シクロヘキシル）アミノ）酢酸・三塩酸塩
【化１７】
2014017659.tif 000019
【０１８３】
(1)tert-ブチル 2-((trans)-4-(4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキシル)アミノ)アセタート
実施例1の合成方法に従い、第5工程においてグリシンtert-ブチル塩酸塩をN-メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物を合成した。【０１８４】
(2)2-((trans)-4-(4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキシル)アミノ) 酢酸・三塩酸塩
tert-ブチル 2-(((trans)-4-(4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキシル)アミノ)アセタート(93mg 0.18mmol)を4M塩酸(2mL)に溶解し、室温で3時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、IPEを加えて洗浄し表記化合物(白色固体、83mg)を得た。【０１８５】
1H NMR (270 MHz, CD3OD, δ): 8.34 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.52-7.46 (m, 2H), 7.43-7.36 (m, 2H), 7.19-7.10 (m, 3H), 7.05-7.10 (m, 2H), 4.95-4.75 (s, 1H), 4.00 (s, 2H), 3.43-3.30 (m, 1H), 2.42-2.32 (m, 2H), 2.28-2.18 (m, 2H), 2.18-2.06 (m, 2H), 1.83-1.68 (m, 2H).
MS (m/z) = 458.36[M+H].
HCK IC50 (nM); 4.2, FLT3-ITD IC50 (nM); 24.0【０１８６】
実施例４：ＲＫ−００２０７３０
Ｎ−（４−（４−アミノ−７−（（ｔｒａｎｓ）−４−（３−メチル−５，６−ジヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−７（８Ｈ）−イル）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−２−メトキシフェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化１８】
2014017659.tif 000020
【０１８７】
(1)tert-ブチル (4-(4-アミノ-7-(4-オキソシクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)-2-メトキシフェニル)カルバマート
tert-ブチル (2-メトキシ-4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル)カルバマート(0.6g, 1.74mmol)をエチレングリコールジメチルエーテル(74mL)、エタノール(20mL)に溶解し、ここへ4-(4-アミノ-5-ヨード-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキサノン(0.5g, 1.45mmol)、飽和炭酸ナトリウム溶液(8.6mL)及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(117mg, 0.10mmol)を順次加え、混合物を80℃にてアルゴン雰囲気下終夜攪拌した。放冷後、ジクロロメタンを加え抽出し、飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた淡褐色油状物(0.9g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン／メタノール＝95／5)にて精製しtert-ブチル(4-(4-アミノ-7-(4-オキソシクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)-2-メトキシフェニル)カルバマート(0.7g)を得た。【０１８８】
(2)4-(4-アミノ-5-(4-アミノ-3-メトキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキサノン
tert-ブチル (4-(4-アミノ-7-(4-オキソシクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)-2-メトキシフェニル)カルバマート(0.7g, 1.51mmol)をアセトン／メタノール(1／1, 10mL)に溶解し、5M塩酸(5mL)を加え2時間還流した。2M水酸化ナトリウムでpH9に調整し減圧濃縮後、酢酸エチルを加え抽出し、飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた淡褐色油状物(0.8g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン／メタノール＝10／1)にて精製し、4-(4-アミノ-5-(4-アミノ-3-メトキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキサノン(0.4g)を得た。【０１８９】
(3)N-(4-(4-アミノ-7-(4-オキソシクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド
ピリジン(1mL)をジクロロメタン(2mL)に溶解した4-(4-アミノ-5-(4-アミノ-3-メトキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキサノン(0.4g, 2.00mmol)に加え氷冷下5分間撹拌した。ジクロロメタン(5mL)に溶解した1-メチル-1H-インドール-2-カルボニルクロリド(0.2g, 1.10mmol)を滴下し、氷冷下30分撹拌した。水(10mL)加え反応停止後、ジクロロメタンを加え抽出し、飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた淡褐色油状物(0.6g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン／メタノール＝95／5)にて精製し、表記化合物(0.3g)を得た。【０１９０】
(4)N-(4-(4-アミノ-7-((cis)-4-(3-メチル-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)シクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド及びN-(4-(4-アミノ-7-((trans)-4-(3-メチル-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)シクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド
N-(4-(4-アミノ-7-(4-オキソシクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド(0.5g, 0.98mmol)を1,2-ジクロロエタン(20mL)に溶かし、酢酸(0.2g, 2.95mmol)、3-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン(0.2g, 1.48mmol)及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(0.3g, 1.48mmol)を加え、室温にて終夜攪拌した。反応混合物を減圧縮後、酢酸エチルにて抽出し水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去し、分取薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン／メタノール／28％  アンモニア水＝100／10／2)により精製を行った。N-(4-(4-アミノ-7-((cis)-4-(3-メチル-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)シクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド(38mg)及びN-(4-(4-アミノ-7-((trans)-4-(3-メチル-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)シクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド(紫色固体、98mg)を得た。【０１９１】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.62 (s, 1H), 8.56 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.34 (s, 1H), 7.70 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.38 (m, 2H), 7.22-7.04 (m, 4H), 5.27 (s, 2H), 4.75 (m, 1H), 4.14 (s, 3H), 4.01 (s, 3H), 4.99 (s, 2H), 3.87 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.01 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 2.76 (m, 1H), 2.30 (s, 3H), 2.26 (br, 2H), 2.10 (br, 2H), 1.94-1.55 (m, 4H).
MS (m/z) = 616.31 [M+H].
HCK IC50 (nM); 0.8, FLT3-ITD IC50 (nM); >2500, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 49%【０１９２】
実施例５：ＲＫ−００２０６９４
５−（４−フェノキシフェニル）−７−（（ｃｉｓ）−４−（（ピリジン−４−イルメチル）アミノ）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミンの合成
【化１９】
2014017659.tif 000021
【０１９３】
実施例1の合成方法に従い、第5工程において4-ピコリルアミンをN-メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物(白色固体)を得た。【０１９４】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.59-8.54 (m, 2H), 8.22 (s, 1H), 7.47-7.30 (m, 6H), 7.20-7.04 (m, 6H), 6.12 (br, 2H), 4.82-4.66 (m, 1H), 3.84 (s, 2H), 3.06-2.93 (m, 1H), 2.30-2.10 (m, 4H), 2.00-1.70 (m, 4H).
MS (m/z) = 491.58[M+H]. 
HCK IC50 (nM); 0.75, FLT3-ITD IC50 (nM); 6.6【０１９５】
実施例６：ＲＫ−００２０７０９
７−（［１，４’−ビピペリジン］−４−イル）−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化２０】
2014017659.tif 000022
【０１９６】
(1)tert-ブチル 4-(4-クロロ-5-ヨード-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)ピペリジン-1-カルボキシラート
トリフェニルホスフィン（1.4g, 5.37mmol）のTHF（60mL）溶液に、氷冷撹拌下でアゾジカルボン酸ジイソプロピル40%トルエン溶液1.9mol/L（2.8mL, 5.37mmol）を滴下した。混合物を室温に戻し、4-クロロ-5-ヨード-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン（1.0g, 3.58mmol）、及びtert-ブチル 4-ヒドロキシピペリジン-1-カルボキシラート（1.1g, 5.37mmol）のTHF（15mL）溶液を滴下した。滴下終了後、室温で3時間撹拌し溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル=3／1）で精製し、表記化合物（白色固体、0.7g）を得た。【０１９７】
(2)tert-ブチル 4-(4-クロロ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)ピペリジン-1-カルボキシラート
tert-ブチル 4-(4-クロロ-5-ヨード-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)ピペリジン-1-カルボキシラート(0.7g, 1.49mmol)、及び4,4,5,5-テトラメチル-2-(4-フェノキシフェニル)-1,3,2-ジオキサボロラン(0.5mg, 1.79mmol)をエチレングリコールジメチルエーテル（25mL）に溶解し、飽和炭酸ナトリウム水溶液(5mL)、及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0.1g, 0.10mmol）を順次加え、混合物を80℃で終夜撹拌した。放冷後、水を加え酢酸エチルで抽出し無水硫酸ナトリウムで乾燥減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル=3／1）で精製し、表題化合物（黄色固体、0.6g）を得た。【０１９８】
(3)5-(4-フェノキシフェニル)-7-(ピペリジン-4-イル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-アミン
tert-ブチル 4-(4-クロロ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)ピペリジン-1-カルボキシラート（0.2g, 0.44mmol）、1,4-ジオキサン（10mL）、及び28%アンモニア水（10mL）の混合物を、圧力容器において120℃で17時間加熱した。反応液を室温に戻し減圧下で溶媒を留去し、表記化合物（白色固体、0.2g）を得た。【０１９９】
（4）5-(4-フェノキシフェニル)-7-(ピペリジン-4-イル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-アミン
5-(4-フェノキシフェニル)-7-(ピペリジン-4-イル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-アミン(0.2g, 0.37mmol)、アセトン（5mL）、5M塩酸（1mL）、及びトリフルオロ酢酸（0.5mL）の混合物を80℃で2時間撹拌した。溶媒濃縮後、2M水酸化ナトリウムを加えpH8とし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去し表記化合物（白色固体、0.1g）を得た。【０２００】
(5)tert-ブチル4-(4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)-[1,4'-ビピペリジン]-1'-カルボキシラート
5-(4-フェノキシフェニル)-7-(ピペリジン-4-イル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-アミン(0.2g, 0.47mmol)、tert-ブチル 4-オキソピペリジン-1-カルボキシラート(0.3g, 1.41mmol)、酢酸(0.1mL)、及び1,2-ジクロロエタン(5mL)の混合物を室温で10分撹拌し、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(0.1g 0.70mmol)を加え一晩撹拌した。水を加え反応を停止し、ジクロロメタンで抽出後有機層を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン／メタノール＝10／1)で精製し表記化合物（白色固体、0.1g）を得た。【０２０１】
(6)7-([1,4'-ビピペリジン]-4-イル)-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-アミン
tert-ブチル4-(4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)-[1,4'-ビピペリジン]-1'-カルボキシラート(0.1g, 0.20mmol)、THF(5mL)及び5M塩酸(1mL)の混合物を50℃で1時間撹拌した。反応後室温にもどし、水酸化ナトリウムでpH11に調整後減圧下で溶媒を留去した。残渣にエタノールを加え濾過後、濾液を減圧濃縮し表記化合物(白色固体、73mg)を得た。【０２０２】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.28 (s, 1H), 7.47-7.33 (m, 4H), 7.20-7.00 (m, 6H), 5.42 (br, 2H), 4.90-4.60 (m, 2H), 3.50-3.30 (m, 2H), 3.20-2.98 (m, 2H), 2.90-2.66 (m, 3H), 2.66-2.35 (m, 3H), 2.20-1.70 (m, 8H).
MS (m/z) = 469.44 [M+H].
HCK IC50 (nM); 0.7, FLT3-ITD IC50 (nM); 43.0【０２０３】
実施例７：ＲＫ−００２０７８１
７−（１−（（ｔｒａｎｓ）−８−メチル−８−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル）ピペリジン−４−イル）−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化２１】
2014017659.tif 000023
【０２０４】
実施例6の合成方法に従い、第5工程においてトロピノンをtert-ブチル−４−オキソピペラジン-1-カルボキシラートの代わりに使うことにより表記化合物(黄色油状物)を得た。【０２０５】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.32 (s, 1H), 7.45-7.34 (m, 4H), 7.18-7.05 (m, 6H), 5.11 (s, 2H), 4.08 (m, 1H), 3.25 (br, 2H), 3.06 (br, 2H), 2.73 (m, 1H), 2.44 (br, 2H), 2.32 (s, 3H), 2.06-1.97 (m, 6H), 1.79 (br, 2H), 1.24 (m, 3H).
MS (m/z) = 509.30 [M+H].
HCK IC50 (nM); .59, FLT3-ITD IC50 (nM); 23.0【０２０６】
実施例８：ＲＫ−００２０８８８
１−（（１ｓ，４ｓ）−４−（（８−メチル−８−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル）アミノ）シクロヘキシル）−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化２２】
2014017659.tif 000024
【０２０７】
(1)3-ヨード-1-(1,4-ジオキサスピロ[4.5]デカン-8-イル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン
3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン(5.1g, 19.5mmol)、及び1,4-ジオキサスピロ[4.5]デカン-8-イル4-メチルベンゼンスルホナート(6.9g, 21.4mmol)を溶かしたDMF(36.8mL)溶液に炭酸カリウム(5.4g, 39.0mmol)、18-クラウンエーテル(0.5g, 2.0mmol)、ヨウ化カリウム(0.3g, 1.95mmol)を加え、この混合液を80℃で終夜撹拌した。沈殿物を濾取し、濾液を減圧濃縮した。酢酸エチルを加え抽出し、飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた褐色固体はそのまま精製されず次の反応に使用された。【０２０８】
(2)4-(4-アミノ-3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン
3-ヨード-1-(1,4-ジオキサスピロ[4.5]デカン-8-イル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジンをアセトン(50mL)に溶解し、5M塩酸を加え1時間還流した。減圧濃縮後、酢酸エチルを加え飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた淡褐色油状物(3.2g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン／メタノール＝95／5)にて精製し、表記化合物(1.5g)を得た。【０２０９】
(3)4-(4-アミノ-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン
4,4,5,5-テトラメチル-2-(4-フェノキシフェニル)-1,3,2-ジオキサボロラン(2.0g, 6.72mmol)をエチレングリコールジメチルエーテル(74mL)、エタノール(20mL)に溶解し、ここへ4-(4-アミノ-3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン(0.96g, 2.69mmol)、飽和炭酸ナトリウム溶液(23mL)及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0.2g, 0.19mmol)を順次加え、混合物を80℃にてアルゴン雰囲気下終夜半攪拌した。放冷後、ジクロロメタンを加え抽出し、飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた淡褐色油状物(2.0g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン／メタノール＝95／5)にて精製し、表記化合物(0.6g)を得た。【０２１０】
(4)1-(4-アミノシクロヘキシル)-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン
4-(4-アミノ-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン(1g, 2.5mmol)、酢酸アンモニウム(2.9g, 37.6mmol)、2-ピコリンボランコンプレックス(0.3g, 3.0mmol)をマイクロウェーブ用耐圧容器に秤取り、エタノール(15mL)を加えた。この混合液を130℃で、マイクロ波リアクター中にて2分間攪拌した。この反応液を減圧濃縮後シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン／メタノール＝10／1)にて精製し、表記化合物(0.34g)を得た。【０２１１】
(5)1-((1s,4s)-4-((8-メチル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-イル)アミノ)シクロヘキシル)-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン
1-(4-アミノシクロヘキシル)-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン(0.2g, 0.39mmol)を1,2-ジクロロエタン(6mL)に溶かし、酢酸(70mg, 1.16mmol)、トロピノン(81mg, 0.58mmol)及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(0.1g, 0.58mmol)を加え、室温にて終夜攪拌した。反応混合物を濾過し減圧縮後、分取薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン／メタノール／28％アンモニア水＝100／10／2)により単離、精製し1-((1s,4s)-4-((8-メチル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-イル)アミノ)シクロヘキシル)-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン(3.8mg)及び1-((1r,4r)-4-((8-メチル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-イル)アミノ)シクロヘキシル)-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン(12mg)を得た。【０２１２】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.36 (s, 1H), 7.67 (d, J = 1.9 Hz 2H), 7.41 (m, 2H), 7.19-7.06 (m, 5H), 5.64 (s, 2H), 4.77 (m, 1H), 3.07 (br, 2H), 2.98 (m, 2H), 2.31 (m, 1H), 2.26 (s, 3H), 2.07-1.52 (m, 14H).
MS (m/z) = 524.31 [M+H].
HCK IC50 (nM); 26, FLT3-ITD IC50 (nM); 16【０２１３】
実施例９：ＲＫ−００２０７１８
２−（（（ｃｉｓ）−４−（４−アミノ−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）シクロヘキシル）アミノ）酢酸・三塩酸塩
【化２３】
2014017659.tif 000025
【０２１４】
実施例1の合成方法に従い、第5工程においてグリシンtert-ブチル塩酸塩をN-メチルピペラジンの代わりに使うことによりtert-ブチル2-(((cis)-4-(4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキシル)アミノ)アセタート（108mg）を合成した。その後４M塩酸(2mL)に溶解し室温で3時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、IPEを加えて懸濁洗浄し表記化合物(白色固体、86mg)を得た。【０２１５】
1H NMR (270 MHz, CD3OD, δ): 8.34 (s, 1H), 7.73-7.68 (m, 1H), 7.53-7.49 (m, 2H), 7.43-7.37 (m, 2H), 7.19-7.11 (m, 3H), 7.11-7.00 (m, 2H), 5.03-4.92 (m, 1H), 4.00 (s, 2H), 3.62-3.55 (m, 1H), 2.40-2.15 (m, 4H), 2.15-2.03 (m, 4H).
MS (m/z) = 458.38 [M+H].
HCK IC50 (nM); 16, FLT3-ITD IC50 (nM); 23【０２１６】
実施例１０：ＲＫ−００２０７１９
２−（（（ｃｉｓ）−４−（４−アミノ−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）シクロヘキシル）アミノ）アセタミド
【化２４】
2014017659.tif 000026
【０２１７】
実施例1の合成方法に従い、第5工程において2-アミノアセトアミドをN-メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物(白色固体)を合成した。【０２１８】
1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 8.31 (s, 1H), 7.44 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.38 (m, 2H), 7.17-7.06 (m, 5H), 7.02 (s, 1H), 5.60 (s, 1H), 5.14 (s, 2H), 4.65 (m, 1H), 3.33 (s, 2H), 2.96 (br, 1H), 2.23 (m, 2H), 1.94-1.90 (m, 4H), 1.83-1.74 (m, 2H).
MS (m/z) = 457.31 [M+H].
HCK IC50 (nM); 6.5, FLT3-ITD IC50 (nM); 23【０２１９】
実施例１１：ＲＫ−００２０７２２
２−（（（ｔｒａｎｓ）−４−（４−アミノ−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）シクロヘキシル）アミノ）アセタミド
【化２５】
2014017659.tif 000027
【０２２０】
実施例1の合成方法に従い、第5工程において2-アミノアセトアミドをN-メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物(白色固体)を合成した。【０２２１】
1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 8.32 (s, 1H), 7.43 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.38 (m, 2H), 7.17-7.06 (m, 5H), 6.98 (s, 1H), 5.48 (s, 1H), 5.11 (s, 2H), 4.72 (m, 1H), 3.35 (s, 2H), 2.58 (m, 1H), 2.15 (m, 4H), 1.83 (m, 2H), 1.45-1.36 (m, 2H).
MS (m/z) = 457.31 [M+H].
HCK IC50 (nM); 7.6, FLT3-ITD IC50 (nM); 23【０２２２】
実施例１２：ＲＫ−００２０７５２
Ｎ−（（ｃｉｓ）−４−（４−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）シクロヘキシル）イソニコチンアミド
【化２６】
2014017659.tif 000028
【０２２３】
（1） 7-(4-アミノシクロヘキシル)-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-アミン
実施例1の合成方法に従い、第4工程生成物4-(4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキサノン（0.60g, 1.51mmol）、酢酸アンモニウム（1.7g, 22.6mmol）, 2-ピコリンボラン錯体（0.2g, 1.81mmol）をマイクロウェーブ用耐圧容器に秤取り、エタノール（11mL）を加えた。この混合液を130℃で、マイクロ波リアクター中にて2分間攪拌した。この反応液を減圧濃縮後シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝10／1→ジクロロメタン／メタノール／28%  アンモニア水＝100／10／2）にて精製し、表記化合物（0.3g）を得た。【０２２４】
（2） N-((cis)-4-(4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキシル)イソニコチンアミド及びN-((trans)-4-(4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキシル)イソニコチンアミド
7-(4-アミノシクロヘキシル)-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-アミン（100mg, 0.27mmol）、イソニコチン酸（42mg, 0.34mmol）、TBTU（88mg, 0.27mmol）をDMF（3mL）に溶解し、DIPEA (50mg, 0.39mmol)を滴下した。この溶液を室温にて1時間撹拌し減圧濃縮後、分取薄層クロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール／28%アンモニア水＝100／10／2）により精製しN-((cis)-4-(4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキシル)イソニコチンアミド（白色固体、16mg）及びN-((trans)-4-(4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキシル)イソニコチンアミド（白色固体、51mg）を得た。【０２２５】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.81 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.32 (s, 1H), 7.73 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 7.45-7.41 (m, 4H), 7.18-6.99 (m, 5H), 6.06 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 5.09 (s, 2H), 4.59 (m, 1H), 4.50 (m, 1H), 2.32 (m, 2H), 2.18 (m, 4H), 1.91 (m, 2H) .
MS (m/z) = 505.23 [M+H].
HCK IC50 (nM); 4.0, FLT3-ITD IC50 (nM); 44.0【０２２６】
実施例１３：ＲＫ−００２０９５２
７−（（ｔｒａｎｓ）−４−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）ピペラジン−１−イル）シクロヘキシル）−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化２７】
2014017659.tif 000029
【０２２７】
実施例1の合成方法に従い、第5工程において1-(tert-ブチル)ピペラジンをN-メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物(白色固体)を合成した。【０２２８】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.33 (s, 1H), 7.45-7.35 (m, 4H), 7.18-7.06 (m, 5H), 7.01 (s, 1H), 5.09 (s, 2H), 4.68 (m, 1H), 2.67 (br, 8H), 2.43 (m, 1H), 2.39-2.08 (m, 4H), 1.88-1.61 (m, 4H), 1.10 (s, 9H). 
MS (m/z) = 525.74 [M+H].
HCK IC50 (nM); 8.0, FLT3-ITD IC50 (nM); 17【０２２９】
実施例１４：ＲＫ−００２０６１８
Ｎ−（４−（４−アミノ−１−（（ｔｒａｎｓ）−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）シクロヘキシル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化２８】
2014017659.tif 000030
【０２３０】
（１）N-(4-(4-アミノ-1-(4-オキソシクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド
N-(2-メトキシ-4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-アミン（0.7g, 1.83mmol）をエチレングリコールジメチルエーテル（16mL）、エタノール（8.5mL）に溶解し、ここへ4-(4-アミノ-3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン（0.54g, 1.52mmol）、飽和炭酸ナトリウム溶液（3.4mL）及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（123mg, 0.11mmol）を順次加え、混合物を80゜Cでアルゴン雰囲気下終夜半攪拌した。放冷後、ジクロロメタンを加え抽出し飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた油状物をn-ヘキサンで洗浄しN-(4-(4-アミノ-1-(4-オキソシクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド（0.9g）を得た。【０２３１】
（2）N-(4-(4-アミノ-1-((cis)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド及びN-(4-(4-アミノ-1-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド
N-(4-(4-アミノ-1-(4-オキソシクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド（0.3g, 0.51mmol）を1,2-ジクロロエタン（14.6mL）に溶かし、酢酸（92mg, 1.53mmol）、N-メチルピペラジン（153mg, 1.53mmol）及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（0.2g, 0.76mmol）を加え、室温にて終夜攪拌した。反応混合物を減圧縮後、酢酸エチルで抽出し、水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去し、分取薄層クロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール／28％  アンモニア水＝100／10／2）により精製した。N-(4-(4-アミノ-1-((cis)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド（白色固体、36mg）及びN-(4-(4-アミノ-1-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド（黄色固体、48mg）を得た。【０２３２】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.67 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 7.94 (d, J = 7.8, 1H), 7.73-7.30 (m, 4H), 7.09 (s, 1H), 5.54 (s, 2H), 4.78 (m, 1H), 4.14 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 2.67 (br, 4H), 2.50 (br, 4H), 2.29 (s, 3H), 2.16 (br, 5H), 1.82 (br, 2H), 1.60 (br 2H).
MS (m/z) = 594.30 [M+H]HCK IC50 (nM); 0.77, FLT3-ITD IC50 (nM); 2747【０２３３】
実施例１５：ＲＫ−００２０７２５
１−（（１ｒ，４ｒ）−４−（８−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル）シクロヘキシル）−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化２９】
2014017659.tif 000031
【０２３４】
4-(4-アミノ-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン（150mg, 0.38mmol）、8-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン2塩酸塩(75mg, 0.38mmol)、エタノール(1.5mL)、及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム（30mg, 0.48mmol）の混合物をマイクロ波リアクター中にて130℃、2分間加熱した。減圧下で溶媒を留去し、2M水酸化ナトリウム水溶液でpH10に調整し、ジクロロメタンで抽出した。溶媒を減圧留去しシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン／メタノール／28％  アンモニア水＝100／10／2→6／4／1)にて精製した後、さらに分取薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン／メタノール＝10／1)で精製し表記化合物（白色固体、45mg）及び、1-((1s,4s)-4-(8-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-イル)シクロヘキシル)-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン（黄色固体、24mg）を得た。【０２３５】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.37 (s, 1H), 7.68-7.60 (m, 2H), 7.43-7.35 (m, 2H), 7.20-7.03 (m, 5H), 5.43 (s, 2H), 4.80-4.65 (m, 1H), 3.07 (s, 2H), 2.57 (d, J = 2.2 Hz, 4H), 2.47-2.32 (m, 1H), 2.26 (s, 3H), 2.20-1.69 (m, 10H), 1.60-1.40 (m, 2H).
MS (m/z) = 510.50 [M+H]
HCK IC50 (nM); 0.5, FLT3-ITD IC50 (nM); 87【０２３６】
実施例１６：ＲＫ−００２０７２９
Ｎ−（４−（４−アミノ−７−（（ｃｉｓ）−４−（３−メチル−５，６−ジヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−７（８Ｈ）−イル）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−２−メトキシフェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミドアミド
【化３０】
2014017659.tif 000032
【０２３７】
実施例4の合成法に従い、第4工程で得られたcis-体を単離、精製し表記化合物(白色固体)が得られた。【０２３８】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.61 (s, 1H), 8.54 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.70 (d, 2H, J = 7.8 Hz), 7.40 (m, 3H), 7.22-6.83 (m, 5H), 5.31 (s, 2H), 4.87 (m, 1H), 4.13 (s, 3H), 4.00 (s, 3H), 3.90 (br, 4H), 3.01 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.62 (m, 1H), 2.41 (s, 3H), 2.26-1.81 (m, 8H).
MS (m/z) = 616.31 [M+H].
HCK IC50 (nM); 4.9, FLT3-ITD IC50 (nM); 3999.9【０２３９】
実施例１７：ＲＫ−００２０７３２
Ｎ−（４−（４−アミノ−７−（（ｔｒａｎｓ）−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）フェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化３１】
2014017659.tif 000033
【０２４０】
（1）tert-ブチル (4-(4-アミノ-7-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)フェニル)カルバマート
tert-ブチル (4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル)カルバマート（4.6g, 10.45mmol）をエチレングリコールジメチルエーテル（50mL）、エタノール（30mL）に溶解し、そこへ5-ヨード-7-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-アミン（4.6g, 10.5mmol）、飽和炭酸ナトリウム溶液（20mL）及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0.8g, 73mmol）を順次加え、混合物を80℃にてアルゴン雰囲気下終夜攪拌した。放冷後、ジクロロメタンを加え飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール／28％アンモニア水＝100／10／2）にて精製し、表記化合物（4.4g）を得た。【０２４１】
（2）5-(4-アミノフェニル)-7-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-アミンの合成
tert-ブチル (4-(4-アミノ-7-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)フェニル)カルバマート（4.4g, 8.7mmol）をアセトン（20mL）に溶解し、5M塩酸（5mL）、TFA（1mL）を加え2時間還流した。2M水酸化ナトリウムでpH9に調整し減圧濃縮後、酢酸エチルを加え飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去し表記化合物（3.1g）を得た。このものは精製することなく、次の反応に使用した。【０２４２】
（3）N-(4-(4-アミノ-7-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)フェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド
5-(4-アミノフェニル)-7-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-アミン（0.1g, 0.25mmol）、1-メチル-1H-インドール-2-カルボン酸（45mg, 0.259mmol）、TBTU（83mg, 0.259mmol）をDMF（6mL）に溶解し、DIPEA （48mg, 0.37mmol）を滴下した。この溶液を室温にて一晩撹拌し減圧濃縮後、得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール／28％アンモニア水＝100／10／2）にて精製し、さらに分取薄層クロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝10／1）にて精製し、表記化合物（淡褐色固体、45mg）を得た。【０２４３】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.32 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.77-7.65 (m, 3H), 7.53-7.33 (m, 4H), 7.24-7.15 (m, 1H), 7.04 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.15 (s, 2H), 4.77-4.60 (m, 1H), 4.11 (s, 3H), 2.74-2.57 (m, 4H), 2.57-2.35 (m, 5H), 2.30 (s, 3H), 2.27-2.15 (m, 2H), 2.15-2.00 (m, 2H), 1.90-1.70 (m, 2H), 1.70-1.50 (m, 2H).
MS (m/z) = 563.60 [M+H].
HCK IC50 (nM); 2.55, FLT3-ITD IC50 (nM); 255【０２４４】
実施例１８：ＲＫ−００２０７４６
Ｎ−（（ｔｒａｎｓ）−４−（４−アミノ−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）シクロヘキシル）ピコリンアミド
【化３２】
2014017659.tif 000034
【０２４５】
実施例12の合成方法に従い、第2工程においてピリジン-2-カルボン酸をイソニコチン酸の代わりに使うことにより表記化合物(淡茶褐色油状)を合成した。【０２４６】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.59 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 8.43 (br, 1H), 8.35 (s, 1H), 8.23 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.87 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.38-7.35 (m, 5H), 7.18-7.06 (6H, m), 5.13 (s, 2H), 4.82 (m, 1H), 4.40 (m, 1H), 2.22-2.00 (m, 8H).
MS (m/z) = 505.23 [M+H].
HCK IC50 (nM); 4.55, FLT3-ITD IC50 (nM); 428【０２４７】
実施例１９：ＲＫ−００２０７５５
Ｎ−（（ｔｒａｎｓ）−４−（４−アミノ−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）シクロヘキシル）ニコチンアミド
【化３３】
2014017659.tif 000035
【０２４８】
実施例12の合成方法に従い、第2工程においてニコチン酸をイソニコチン酸の代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）を合成した。【０２４９】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 9.10 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 8.77 (dd, J = 1.6, 3.5 Hz, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.23 (dt, J = 1.6, 8.1 Hz, 1H), 7.46-7.35 (m, 5H), 7.18-7.12 (5H, m), 7.00 (s, 1H), 6.66 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.13 (s, 2H), 4.63 (m, 1H), 4.51 (m, 1H), 2.32-1.68 (m, 8H).
MS (m/z) = 505.23 [M+H].
HCK IC50 (nM); 11.85, FLT3-ITD IC50 (nM); 108【０２５０】
実施例２０：ＲＫ−００２０７６８
Ｎ−（（ｔｒａｎｓ）−４−（４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）シクロヘキシル）イソニコチンアミド
【化３４】
2014017659.tif 000036
【０２５１】
実施例12の合成方法に従い、第1工程において4-(4-アミノ-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノンを4-(4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキサノンの代わりに使うことにより表記化合物(白色固体)を合成した。【０２５２】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.76 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 8.39 (s, 1H), 7.69-7.61 (m, 4H), 7.43-7.37 (m, 2H), 7.20-7.07 (m, 5H), 6.03 (d, J = 8.1 Hz, 1H) 5.45 (s, 2H), 4.83 (m, 1H), 4.19 (m, 1H), 2.39-2.18 (m, 4H), 2.15 (m, 2H), 1.52 (m, 2H).
MS (m/z) = 506.22 [M+H].
HCK IC50 (nM); 7.9, FLT3-ITD IC50 (nM); 414【０２５３】
実施例２１：ＲＫ−００２０７７０
Ｎ−（４−（４−アミノ−１−（（１ｒ，４ｒ）−４−（８−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル）シクロヘキシル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）フェニル）ピコリンアミド
【化３５】
2014017659.tif 000037
【０２５４】
（１）N-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル)ピコリンアミド
4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)アニリン（3.00g, 13.7mmol）、2-ピコリン酸（1.70g, 13.7mmol）、TBTU（4.40g, 13.7mmol）をDMF（20mL）に溶解し、DIPEA （1.77g, 13.7mmol）を滴下した。この溶液を室温で3時間撹拌し、水を加え酢酸エチルで抽出した。さらに水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた固体をIPEで洗浄し表記化合物（白色固体、3.7g）を得た。【０２５５】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 10.11 (br, 1H), 8.65-8.59 (m, 1H), 8.33-8.27 (m, 1H), 7.91 (dt, J = 1.6, 7.5 Hz, 1H), 7.87-7.78 (m, 4H), 7.52-7.45 (m, 1H), 1.35 (s, 12H).
MS (m/z) = 325.30 [M+H].【０２５６】
（２）3-ヨード-1-((1r,4r)-4-(8-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-イル)シクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン
4-(4-アミノ-3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン(17.0g, 47.6mmol)、及び8-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン2塩酸塩(9.5g, 47.6mmol)にメタノール(115mL)、酢酸(11.5mL)を加え90℃で撹拌し、そこへ2-ピコリンボラン錯体(5.1g, 47.6mmol)を40分かけて加えた。メタノール(30mL)を加え室温で2時間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注ぎクロロホルム／メタノール（10／1）で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。アミノプロピルシリカゲルクロマトグラフィー(トルエン／酢酸エチル＝4／1)で精製し、表記化合物（白色固体、5.6g）を得た。【０２５７】
1H NMR (270 MHz, CD3OD, δ): 8.17 (s, 1H), 4.67-4.51 (m, 1H), 3.11 (s, 2H), 2.70-2.51 (m, 4H), 2.28-2.44 (m, 1H), 2.25 (s, 3H), 2.12-1.86 (m, 8H), 1.86-1.74 (m, 2H), 1.59-1.37 (m, 2H).
MS (m/z) = 510.50 [M+H].【０２５８】
（３） N-(4-(4-アミノ-1-((1r,4r)-4-(8-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1] オクタン-3-イル) シクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d] ピリミジン-3-イル) フェニル) ピコリンアミドの合成
3-ヨード-1-((1r,4r)-4-(8-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-イル)シクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン（0.5g, 1.1mmol）、N-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル)ピコリンアミド（0.4g, 1.2mmol）、飽和炭酸ナトリウム溶液（10mL）及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0.1g, 0.11mmol）を順次加え、混合物を80℃でアルゴン雰囲気下終夜攪拌した。放冷後ジクロロメタンを加え飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール／28％  アンモニア水＝100／10／2）で精製し、表記化合物（白色固体、278mg）を得た。【０２５９】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 10.19 (s, 1H), 8.67-8.63 (m, 1H), 8.37 (s, 1H), 8.36-8.30 (m, 1H), 8.00-7.90 (m, 3H), 7.76-7.69 (m, 2H), 7.56-7.49 (m, 1H), 5.50 (s, 2H), 4.81-4.65 (m, 1H), 3.08 (s, 2H), 2.57 (d, J = 1.9 Hz, 4H), 2.50-2.35 (m, 1H), 2.27 (s, 3H), 2.23-1.65 (m, 10H), 1.60-1.40 (m, 2H).
MS (m/z) = 538.29 [M+H].
HCK IC50 (nM); 4.7, FLT3-ITD IC50 (nM); 1176, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 48%【０２６０】
実施例２２：ＲＫ−００２０７７５
Ｎ−（（ｔｒａｎｓ）−４−（４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）シクロヘキシル）ニコチンアミド
【化３６】
2014017659.tif 000038
【０２６１】
実施例8の合成方法に従い、第4工程の生成物  1-(4-アミノシクロヘキシル)-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン（100mg）、ニコチン酸（43mg, 0.33mmol）、TBTU（84mg, 0.26mmol）をDMF（3mL）に溶解し、DIPEA (49mg, 0.38mmol)を滴下した。この溶液を室温にて1時間撹拌し減圧濃縮後、分取薄層クロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール／28％  アンモニア水＝100／10／2）により精製し、N-((trans)-4-(4-アミノ-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキシル)ニコチンアミド（白色固体、56mg）を得た。【０２６２】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.98 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.74 (dd, J = 1.6, 5.1 Hz, 1H),  8.39 (s, 1H), 8.13 (dt, J = 8.1, 1.8 Hz, 1H,), 7.68 (m, 2H), 7.40-7.36 (m, 3H), 7.22-7.07 (m, 5H), 6.00 (d, J = 8.1 Hz, 1H) 5.45 (s, 2H), 4.84 (m, 1H), 4.17 (m, 1H), 2.39 (m, 4H), 2.31 (m, 2H). 1.53 (m, 2H)
MS (m/z) = 506.22 [M+H]
HCK IC50 (nM); 20, FLT3-ITD IC50 (nM); 190, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 50%【０２６３】
実施例２３：ＲＫ−００２０７７７
Ｎ−（（ｔｒａｎｓ）−４−（４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）シクロヘキシル）ピコリンアミド
【化３７】
2014017659.tif 000039
【０２６４】
実施例22の合成方法に従い最終工程でピリジン-2-カルボン酸をニコチン酸の代わりに使うことにより表記化合物(白色固体)を合成した。【０２６５】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.58 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.21 (d, J = 8.1 Hz 1H), 7.88 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.67 (m, 2H), 7.46-7.37 (m, 3H), 7.22-7.08 (m, 5H), 5.41 (s, 2H), 4.91 (m, 1H), 4.40 (m, 1H), 2.42 (m, 2H), 2.22-2.01 (m, 6H).
MS (m/z) = 506.22 [M+H].
HCK IC50 (nM); 12, FLT3-ITD IC50 (nM); 548【０２６６】
実施例２４：ＲＫ−００２０７９１
Ｎ−（４−（４−アミノ−１−（（１ｒ，４ｒ）−４−（８−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル）シクロヘキシル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）フェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化３８】
2014017659.tif 000040
【０２６７】
実施例21の合成方法に従い、第3工程において1-メチル-N-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル)-1H-インドール-2-カルボキサミドをN-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル)ピコリンアミドの代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）を得た。【０２６８】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.37 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.85-7.77 (m, 2H), 7.77-7.65 (m, 3H), 7.48-7.33 (m, 2H), 7.25-7.16 (m, 1H), 7.07 (s, 1H), 5.52 (s, 2H), 4.82-4.65 (m, 1H), 4.12 (s, 3H), 3.07 (s, 2H), 2.57 (d, J = 1.9 Hz, 4H), 2.50-2.30 (m, 1H), 2.26 (s, 3H), 2.23-1.65 (m, 10H), 1.60-1.38 (m, 2H).
MS (m/z) = 590.44 [M+H].
HCK IC50 (nM); 9.73, FLT3-ITD IC50 (nM); 3330, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 64%【０２６９】
実施例２５：ＲＫ−００２０７９８
Ｎ−（４−（４−アミノ−１−（１−（８−メチル−８−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル）ピペリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）フェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化３９】
2014017659.tif 000041
【０２７０】
（１）tert-ブチル 4-(4-アミノ-3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)ピペリジン-1-カルボキシラート
トリフェニルホスフィン（7.5g, 28.7mmol）のＴＨＦ（70mL）溶液に、氷冷下でジイソプロピルアゾジカルボキシラート（5.8g, 28.7mmol）を滴下した。混合物を室温にし、3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン（5.0g, 19.2mmol）及びtert-ブチル- 4-ヒドロキシピペリジン-1-カルボキシラート（5.8g, 28.7mmol）加えた。室温にて終夜攪拌後、減圧濃縮させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝10／1）にて精製し表記化物（白色固体 3.8g）を得た。【０２７１】
（２）3-ヨード-1-(ピペリジン-4-イル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン
tert-ブチル 4-(4-アミノ-3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)ピペリジン-1-カルボキシラート（3.8g, 8.5mmol）をアセトン／メタノール（1／1, 30mL）に溶解し、5M塩酸（14mL）を加え5時間還流した。2M水酸化ナトリウムでpH12に調整し減圧濃縮後、水で洗浄し、3-ヨード-1-(ピペリジン-4-イル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン（3.0g）を得た。【０２７２】
（３）3-ヨード-1-(1-(8-メチル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-イル)ピペリジン-4-イル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン
トロピノン（1.1g, 7.67mmol）、3-ヨード-1-(ピペリジン-4-イル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン（0.9g, 2.56mmol）、及び2-ピコリンボラン錯体（0.5g, 3.84mmol）をマイクロウェーブ用耐圧容器に秤取り、10%酢酸/1,2-ジクロロエタン（10mL）を加えた。この混合液を110℃で、マイクロ波リアクター中にて7分間攪拌した。この反応液を減圧濃縮後シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール／28％  アンモニア水＝100／10／2）にて精製し、表記化合物（0.4g）を得た。【０２７３】
（４） N-(4-(4-アミノ-1-(1-(8-メチル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-イル)ピペリジン-4-イル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)フェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド
3-ヨード-1-(1-(8-メチル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-イル)ピペリジン-4-イル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン（0.2g, 0.39mmol）をエチレングリコールジメチルエーテル（4.2mL）、エタノール（2.3mL）へ溶解し、ここへ1-メチル-N-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル)-1H-インドール-2-カルボキサミド（0.2g, 0.46mmol）、飽和炭酸ナトリウム溶液（0.9mL）及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（31mg, 0.03mmol）を順次加え、混合物を80℃でアルゴン雰囲気下終夜半攪拌した。放冷後、酢酸エチルを加え抽出、飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた油状物を分取薄層クロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール／28％アンモニア水＝100／10／2）により単離、精製し表記化合物（白色固体、35mg）を得た。【０２７４】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.38 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.86-7.70 (m, 2H), 7.73-7.68 (m, 3H), 7.45-7.17 (m, 3H), 7.11 (s, 1H), 5.55 (s, 2H), 4.74 (m, 1H), 4.12 (s, 3H), 3.79 (s, 2H), 3.03 (br, 2H), 2.70 (s, 3H), 2.50-2.28 (m, 8H), 2.07-1.80 (m, 6H).
MS (m/z) = 590.33 [M+H].
HCK IC50 (nM); 2.05, FLT3-ITD IC50 (nM); 2780, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 42%【０２７５】
実施例２６：ＲＫ−００２０８１９
Ｎ−（４−（４−アミノ−７−（（ｃｉｓ）−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−２−メトキシフェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化４０】
2014017659.tif 000042
【０２７６】
実施例4の合成方法に従い、第4工程においてN-メチルピペラジンを3-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジンの代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）を得た。【０２７７】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.63 (s, 1H), 8.56 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.35 (s, 1H), 7.71 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.46-7.34 (m, 2H), 7.23-7.18 (m, 2H), 7.07 (s, 3H), 5.14 (s, 2H), 4.84 (m, 1H), 4.14 (s, 3H), 4.02 (s, 3H), 2.58 (br, 5H), 2.36 (s, 3H), 2.21 (m, 1H), 2.17-2.09 (m, 4H), 1.87-1.62 (m, 5H). 
MS (m/z) = 593.33 [M+H].
HCK IC50 (nM); 7.2, FLT3-ITD IC50 (nM); 1329【０２７８】
実施例２７：ＲＫ−００２０８２０
Ｎ−（４−（４−アミノ−７−（（ｔｒａｎｓ）−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−２−メトキシフェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化４１】
2014017659.tif 000043
【０２７９】
実施例4の合成方法に従い、第4工程においてN-メチルピペラジンを3-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジンの代わりに使うことにより表記化合物(白色固体)を合成した。【０２８０】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.62 (s, 1H), 8.55 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.34 (s, 1H), 7.71 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.43-7.37 (m, 2H), 7.25-7.04 (m, 5H), 5.18 (s, 2H), 4.70 (m, 1H), 4.14 (s, 3H), 4.00 (s, 3H), 2.67 (br, 3H), 2.50 (br, 3H), 2.32 (s, 3H), 2.25-2.08 (m, 4H), 1.87-1.58 (m, 6H). 
MS (m/z) = 593.33 [M+1].
HCK IC50 (nM); 1.6, FLT3-ITD IC50 (nM); 609, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 39.3%【０２８１】
実施例２８：ＲＫ−００２０８２４
Ｎ−（４−（４−アミノ−１−（（ｔｒａｎｓ）−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）シクロヘキシル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）フェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化４２】
2014017659.tif 000044
【０２８２】
（１）N-(4-(4-アミノ-1-(4-オキソシクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)フェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド
4-(4-アミノ-3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン（0.2g, 0.42mmol）、1-メチル-N-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル)-1H-インドール-2-アミン(0.2g, 0.51mmol)をエチレングリコールジメチルエーテル（4.9mL）、エタノール（2.7mL）に溶解し、ここへ飽和炭酸ナトリウム溶液（1.0mL）及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（34mg, 0.03mmol）を順次加え、混合物を80℃にてアルゴン雰囲気下終夜半攪拌した。放冷後酢酸エチルを加え抽出し、飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝95／5）にて精製しN-(4-(4-アミノ-1-(4-オキソシクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)フェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド（0.1g）が得られた。【０２８３】
（2）N-(4-(4-アミノ-1-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)フェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド
N-(4-(4-アミノ-1-(4-オキソシクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)フェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド（100mg）を1,2-ジクロロエタン（3mL）に溶かし、酢酸（35mg, 0.59mmol）、N-メチルピペラジン（59mg, 0.59mmol）及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（63mg, 0.3mmol）を加え、室温にて終夜攪拌した。反応混合物を減圧縮後、酢酸エチルに抽出し水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去し、分取薄層クロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール／28％アンモニア水＝100／10／2）により単離、精製を行った。N-(4-(4-アミノ-1-((cis)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)フェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド（白色固体、39mg）及び表記化合物N-(4-(4-アミノ-1-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)フェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド（白色固体、12mg）が得られた。【０２８４】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.38 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.92-7.65 (m, 4H), 7.46-7.36 (m, 2H), 7.23-7.18 (m, 1H), 7.08 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 4.76 (m, 1H), 4.13 (s, 3H), 2.92 (m, 1H), 2.94-2.52 (m, 8H), 2.29 (s, 3H), 2.14 (m, 6H), 1.55 (m, 2H).
MS (m/z) = 564.31 [M+H].
HCK IC50 (nM); 1.6, FLT3-ITD IC50 (nM); 1079【０２８５】
実施例２９：ＲＫ−００２０８２６
Ｎ−（４−（４−アミノ−１−（（ｔｒａｎｓ）−４−（３−メチル−５，６−ジヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−７（８Ｈ）−イル）シクロヘキシル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−２−メトキシフェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化４３】
2014017659.tif 000045
【０２８６】
実施例14の合成方法に従い、第2工程において3-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジンをN-メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物(白色固体)を合成した。【０２８７】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.68 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 8.64 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 7.71 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.46-7.29 (m, 4H), 7.23 (m, 1H), 7.10 (s, 1H), 5.61 (s, 2H), 4.86 (m, 1H), 4.14 (s, 3H), 4.05 (s, 3H), 3.99 (s, 2H), 3.85 (m, 2H), 3.04 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 2.43 (m, 1H), 2.41 (s, 3H), 2.31-2.11 (m, 6H), 1.63 (m, 2H).
HCK IC50 (nM); 1.8, FLT3-ITD IC50 (nM); 1343, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 17.1%【０２８８】
実施例３０：ＲＫ−００２０９０１
Ｎ−（４−（４−アミノ−７−（（ｔｒａｎｓ）−４−（３−（トリフルオロメチル）−５，６−ジヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−７（８Ｈ）−イル）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−２−メトキシフェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化４４】
2014017659.tif 000046
【０２８９】
実施例4の合成方法に従い、第4工程において3-(トリフルオロメチル)-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジンを3-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジンの代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）を合成した。【０２９０】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.62 (s, 1H), 8.57 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.35 (s, 1H), 7.70 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.43-7.38 (m, 2H), 7.20-7.12 (m, 2H), 7.07 (s, 1H), 7.05 (s, 1H), 5.54 (s, 2H), 4.74 (m, 1H), 4.18 (m, 2H), 4.16 (s, 3H), 4.14 (s, 2H), 4.01 (s, 3H), 3.08 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.79 (m, 1H), 2.32 (m, 2H), 2.15 (m,2H), 1.96 (m, 2H), 1.66 (m, 2H).
MS (m/z) = 685.29 [M+H].
HCK IC50 (nM); 7.7, FLT3-ITD IC50 (nM); 10999.9【０２９１】
実施例３１：ＲＫ−００２０９０８
Ｎ−（４−（４−アミノ−７−（（ｃｉｓ）−４−（３−エチル−５，６−ジヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−７（８Ｈ）−イル）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−２−メトキシフェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化４５】
2014017659.tif 000047
【０２９２】
実施例4の合成方法に従い、第4工程において3-エチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジンを3-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジンの代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）を合成した。【０２９３】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.61 (s, 1H), 8.54 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.70 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.42-7.37 (m, 2H), 7.22-7.06 (m, 2H), 7.04 (s, 1H), 7.04 (s, 1H), 5.25 (s, 2H), 4.86 (m, 1H), 4.13 (s, 3H), 4.00 (s, 3H), 3.92 (s, 2H), 3.89 (m, 2H), 3.00 (br, 2H), 2.77 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 2.71 (m, 1H), 2.21-2.09 (m,4H), 1.94-1.68 (m, 4H), 1.42 (m, 3H).
MS (m/z) = 645.33 [M+H].
HCK IC50 (nM); 11, FLT3-ITD IC50 (nM); 10999.9【０２９４】
実施例３２：ＲＫ−００２０９０９
Ｎ−（４−（４−アミノ−７−（（ｔｒａｎｓ）−４−（３−エチル−５，６−ジヒドロ［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−７（８Ｈ）−イル）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−２−メトキシフェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化４６】
2014017659.tif 000048
【０２９５】
実施例4の合成方法に従い、第4工程において3-エチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジンを3-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジンの代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）を合成した。【０２９６】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.62 (s, 1H), 8.56 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.34 (s, 1H), 7.70 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.46-7.34 (m, 2H), 7.22-7.07 (m, 2H), 7.05 (s, 1H), 7.04 (s, 1H), 5.26 (s, 2H), 4.69 (m, 1H), 4.14 (s, 3H), 4.00 (s, 5H), 3.88 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.02 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.72 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 2.30 (m, 2H), 2.15 (m, 2H), 1.93-1.62 (m,4H), 1.38 (m, 3H)
MS (m/z) = 645.33 [M+H].
HCK IC50 (nM); 14, FLT3-ITD IC50 (nM); 10999.9【０２９７】
実施例３３：ＲＫ−００２０９１８
Ｎ−（４−（４−アミノ−７−（（ｃｉｓ）−４−（３−イソプロピル−５，６−ジヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−７（８Ｈ）−イル）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−２−メトキシフェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化４７】
2014017659.tif 000049
【０２９８】
実施例4の合成方法に従い、第4工程において3-イソプロピル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジンを3-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジンの代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）を合成した。【０２９９】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.62 (s, 1H), 8.55 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.32 (s, 1H), 7.70 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.45-7.34 (m, 2H), 7.22-7.03 (m, 5H), 5.49 (s, 2H), 4.74 (m, 1H), 4.13 (s, 3H), 4.01 (s, 3H), 3.94 (br, 4H), 3.01 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.62 (m, 1H), 2.26-1.81 (m, 8H), 1.43 (s, 3H), 1.40 (s, 3H).
MS (m/z) = 659.35 [M+H].
HCK IC50 (nM); 7.7, FLT3-ITD IC50 (nM); 10999.9【０３００】
実施例３４：ＲＫ−００２０９１９
Ｎ−（４−（４−アミノ−７−（（ｔｒａｎｓ）−４−（３−イソプロピル−５，６−ジヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−７（８Ｈ）−イル）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−２−メトキシフェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化４８】
2014017659.tif 000050
【０３０１】
実施例4の合成方法に従い、第4工程において3-イソプロピル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジンを3-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジンの代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）を合成した。【０３０２】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.62 (s, 1H), 8.56 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.34 (s, 1H), 7.71 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.46-7.34 (m, 2H), 7.23-6.87 (m, 5H), 5.26 (s, 2H), 4.73 (m, 1H), 4.14 (s, 3H), 4.01 (s, 5H), 3.92 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.99 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.75 (m, 1H), 2.30-2.15 (m, 4H), 1.99-1.66 (m, 4H), 1.41 (s, 3H), 1.39 (s, 3H).
MS (m/z) = 659.35 [M+H].
HCK IC50 (nM); 7.7, FLT3-ITD IC50 (nM); 10999.9【０３０３】
実施例３５：ＲＫ−００２０９２０
Ｎ−（４−（４−アミノ−７−（（ｃｉｓ）−４−（３−メチル−５，６−ジヒドロイミダゾロ［１，５−ａ］ピラジン−７（８Ｈ）−イル）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−２−メトキシフェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化４９】
2014017659.tif 000051
【０３０４】
実施例4の合成方法に従い、第4工程において3-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロイミダゾロ[1,5-a]ピラジンを3-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジンの代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）を合成した。【０３０５】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.61 (s, 1H), 8.54 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.34 (s, 1H), 7.70 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.45-7.30 (m, 2H), 7.22-7.04 (m, 5H), 6.71 (s, 1H), 5.18 (s, 2H), 4.87 (m, 1H), 4.13 (s, 3H), 4.00 (s, 3H), 3.93 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.76 (s, 2H), 2.97 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.56 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 2.25-2.12 (m, 4H), 1.88-1.78 (m, 4H).
MS (m/z) = 630.32 [M+H].【０３０６】
実施例３６：ＲＫ−００２０９２１
Ｎ−（４−（４−アミノ−７−（（ｔｒａｎｓ）−４−（３−メチル−５，６−ジヒドロイミダゾロ［１，５−ａ］ピラジン−７（８Ｈ）−イル）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−２−メトキシフェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化５０】
2014017659.tif 000052
【０３０７】
実施例4の合成方法に従い、第4工程において3-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロイミダゾロ[1,5-a]ピラジンを3-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジンの代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）を合成した。【０３０８】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.62 (s, 1H), 8.46 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.35 (s, 1H), 7.70 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.46-7.35 (m, 2H), 7.23-7.04 (m, 5H), 6.66 (s, 1H), 5.16 (s, 2H), 4.73 (m, 1H), 4.14 (s, 3H), 4.00 (s, 3H), 3.87 (m, 2H), 3.83 (s, 2H), 3.00 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.69 (m, 1H), 2.32 (s, 3H), 2.25-2.13 (m, 4H), 1.96-1.65 (m, 4H).
MS (m/z) = 630.32 [M+H].
HCK IC50 (nM); 4, FLT3-ITD IC50 (nM); 409【０３０９】
実施例３７：ＲＫ−００２０９３０
Ｎ−（４−（４−アミノ−７−（（ｃｉｓ）−４−（２−メチル−６，７−ジヒドロピラゾロ［１，５−ａ］ピラジン−５（４Ｈ）−イル）シクロヘキシシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−２−メトキシフェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化５１】
2014017659.tif 000053
【０３１０】
実施例4の合成方法に従い、第4工程において2-メチル-4,5,6,7-テトラヒドロピラゾロ[1,5-a]ピラジンを3-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジンの代わりに使うことにより表記化合物（淡褐色固体）を合成した。【０３１１】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.62 (s, 1H), 8.44 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.70 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.45-7.37 (m, 2H), 7.22-7.03 (m, 5H), 5.81 (s, 1H), 5.33 (s, 2H), 4.86 (m, 1H), 4.17 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 4.13 (s, 3H), 4.01 (s, 3H), 3.74 (s, 2H), 2.99 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.62 (m, 1H), 2.27 (s, 3H), 2.20-2.09 (m, 4H), 1.92-1.25 (m, 4H).
MS (m/z) = 630.32 [M+H].
HCK IC50 (nM); 7.7, FLT3-ITD IC50 (nM); 3328【０３１２】
実施例３８：ＲＫ−００２０９３２
Ｎ−（４−（４−アミノ−７−（（ｃｉｓ）−４−（６，７−ジヒドロピラゾロ［１，５−ａ］ピラジン−５（４Ｈ）−イル）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−２−メトキシフェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化５２】
2014017659.tif 000054
【０３１３】
実施例4の合成方法に従い、第4工程において4,5,6,7-テトラヒドロピラゾロ[1,5-a]ピラジンを3-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジンの代わりに使うことにより表記化合物（淡褐色固体）を合成した。【０３１４】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.61 (s, 1H), 8.54 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.34 (s, 1H), 7.70 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.50-7.34 (m, 2H), 7.22-7.06 (m, 5H), 6.03 (s, 1H), 5.26 (s, 2H), 4.88 (m, 1H), 4.25 (t, J = 4.1 Hz, 2H), 4.14 (s, 3H), 4.13 (s, 3H), 4.00 (s, 2H), 3.04 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 2.59 (m, 1H), 2.28-2.13 (m, 4H), 1.93-1.25 (m, 4H)
MS (m/z) = 616.31 [M+H].
HCK IC50 (nM); 2.8, FLT3-ITD IC50 (nM); 6581【０３１５】
実施例３９：ＲＫ−００２０９４２
Ｎ−（４−（４−アミノ−７−（（ｔｒａｎｓ）−４−（３−メチル−５，６−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−７（８Ｈ）−イル）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）−２−メトキシフェニル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド
【化５３】
2014017659.tif 000055
【０３１６】
実施例4の合成方法に従い、第4工程において3-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロピラゾロ[1,2-a]ピラジンを、3-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジンの代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）を合成した。【０３１７】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.62 (s, 1H), 8.56 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.35 (s, 1H), 7.70 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.43-7.34 (m, 2H), 7.19-7.04 (m, 5H), 6.71 (s, 1H), 5.17 (s, 2H), 4.73 (m, 1H), 4.14 (s, 3H), 4.01 (s, 3H), 3.90 (s, 2H), 3.83 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 3.03 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.62 (m, 1H), 2.32 (m, 2H), 2.17 (s, 3H), 2.12 (m, 2H), 1.93-1.26 (m, 4H).
MS (m/z) = 630.32 [M+H].
HCK IC50 (nM); 4, FLT3-ITD IC50 (nM); 4623【０３１８】
実施例４０：ＲＫ−００２０６２７
７−（（ｔｒａｎｓ）−４−（４−（２−メトキシエチル）ピラジン−１−イル）シクロヘキシル）−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化５４】
2014017659.tif 000056
【０３１９】
実施例1の合成方法に従い、第5工程において1-(2-メトキシエチル)ピペラジンをN-メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物(白色固体)を得た。【０３２０】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.33 (s, 1H), 7.45-7.35 (m, 5H), 7.15-7.06 (m, 4H), 7.01 (s, 1H), 5.06 (s, 2H), 4.70 (m, 1H), 3.52 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.36 (s, 3H), 2.68 (br, 4H), 2.60 (m, 6H), 2.17 (m, 2H), 2.05 (m, 2H), 1.79-1.59 (m, 4H).
MS (m/z) = 527.31 [M+H].
HCK IC50 (nM); 4, FLT3-ITD IC50 (nM); 16, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 96%【０３２１】
実施例４１：ＲＫ−００２０６２９
２−（４−（（ｔｒａｎｓ）−４−（４−アミノ−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）シクロヘキシル）ピペラジン−１−イル）エタン−１−オール
【化５５】
2014017659.tif 000057
【０３２２】
実施例1の合成方法に従い、第5工程において2-(ピペラジン-1-イル)エタノールをN-メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物(白色固体)を得た。【０３２３】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.33 (s, 1H), 7.65-7.35 (m, 4H), 7.18-7.06 (m, 5H), 7.01 (s, 1H), 5.08 (s, 2H), 4.69 (m, 1H), 3.63 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.58 (br, 8H), 2.56 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.45 (m, 1H), 2.24 (m, 2H), 2.10 (m, 2H), 1.84 (m, 2H), 1.62 (m, 2H).
MS (m/z) = 513.29 [M+H].
HCK IC50 (nM); 3.5, FLT3-ITD IC50 (nM); 21, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 93%【０３２４】
実施例４２：ＲＫ−００２０６４０
７−（（ｔｒａｎｓ）−４−（４−イソプロピルピペラジン−１−イル）シクロヘキシル）−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化５６】
2014017659.tif 000058
【０３２５】
実施例1の合成方法に従い、第5工程において1-イソプロピルピペラジンをN-メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物(白色固体)を得た。【０３２６】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.33 (s, 1H), 7.65-7.31 (m, 4H), 7.18-7.01 (m, 5H), 6.87 (s, 1H), 5.06 (s, 2H), 4.68 (m, 1H), 2.62 (br, 8H), 2.45 (m, 1H), 2.24 (br, 2H), 2.19 (br, 2H), 1.83-1.58 (m, 4H), 1.09 (s, 3H), 1.07 (s, 3H).
MS (m/z) = 510.31 [M+H].
HCK IC50 (nM); 0.26, FLT3-ITD IC50 (nM); 22, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 88%【０３２７】
実施例４３：ＲＫ−００２０６５８
５−（４−フェノキシフェニル）−７−（（ｔｒａｎｓ）−４−（ピペラジン−１−イル）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化５７】
2014017659.tif 000059
【０３２８】
実施例1の合成方法に従い、第5工程においてtert-ブチル ピペラジン-1-カルボキシラートをN-メチルピペラジンの代わりに使いtert-ブチル 4-((trans)-4-(4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキシル)ピペラジン-1-カルボキシラートを合成した。その後4M塩酸-酢酸エチル(2mL)を加え室温にて1時間撹拌し、2M水酸化ナトリウムでpH9に調整した。有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後減圧下で有機溶媒を除去し表記化合物(白色固体)を得た。【０３２９】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.33 (s, 1H), 7.45-7.35 (m, 4H), 7.15-7.06 (m, 5H), 7.01 (s, 1H), 5.06 (s, 2H), 4.66 (m, 1H), 2.93 (m, 4H), 2.59 (m, 4H), 2.44 (m, 1H), 2.39 (br, 2H), 2.09 (br, 2H), 1.84-1.61 (m, 4H).
MS (m/z) = 469.26 [M+H].
HCK IC50 (nM); 2.8, FLT3-ITD IC50 (nM); 21.0【０３３０】
実施例４４：ＲＫ−００２０６９５
５−（４−フェノキシフェニル）−７−（（ｔｒａｎｓ）−４−（（ピリジン−４−イルメチル）アミノ）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミンの合成
【化５８】
2014017659.tif 000060
【０３３１】
実施例1の合成方法に従い、第5工程において4-ピコリルアミンをN-メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）を得た。【０３３２】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.59-8.54 (m, 2H), 8.25 (s, 1H), 7.45-7.27 (m, 6H), 7.20-7.04 (m, 5H), 6.99 (s, 1H), 5.79 (br, 2H), 4.80-4.65 (m, 1H), 3.90 (s, 2H), 2.69-2.54 (m, 1H), 2.25-2.07 (m, 4H), 1.90-1.70 (m, 2H), 1.57-1.36 (m, 2H).
MS (m/z) = 491.61 [M+H].
HCK IC50 (nM); 9, FLT3-ITD IC50 (nM); 15, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 93%【０３３３】
実施例４５：ＲＫ−００２０６９６
５−（４−フェノキシフェニル）−７−（（ｃｉｓ）−４−（（ピリジン−３−イルメチル）アミノ）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化５９】
2014017659.tif 000061
【０３３４】
実施例1の合成方法に従い、第5工程において3−ピコリルアミンをN−メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物(白色固体)を得た。【０３３５】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.63 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.52 (dd, J = 4.9, 1.6 Hz, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.80-7.68 (m, 1H), 7.57-7.25 (m, 6H), 7.20-7.03 (m, 5H), 6.10 (br, 2H), 4.81-4.72 (m, 1H), 3.83 (s, 2H), 3.02 (s, 1H), 2.30-1.70 (m, 8H).
MS (m/z) = 491.60 [M+H].
HCK IC50 (nM); 0.9, FLT3-ITD IC50 (nM); 8.8, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 99%【０３３６】
実施例４６：ＲＫ−００２０６９７
５−（４−フェノキシフェニル）−７−（（ｔｒａｎｓ）−４−（（ピリジン−４−イルメチル）アミノ）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化６０】
2014017659.tif 000062
【０３３７】
実施例1の合成方法に従い、第5工程において3−ピコリルアミンをN−メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物(白色固体)を得た。【０３３８】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.58 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.52 (dd, J = 4.9, 1.9 Hz, 1H), 8.32 (s, 1H), 7.68-7.75 (m, 1H), 7.47-7.33 (m, 4H), 7.33-7.25 (m, 1H), 7.20-7.04 (m, 5H), 6.99 (s, 1H), 5.19 (s, 2H), 4.81-4.65 (m, 1H), 3.88 (s, 2H), 2.70-2.55 (m, 1H), 2.25-2.10 (m, 4H), 1.94-1.70 (m, 2H), 1.56-1.35 (m, 2H).
MS (m/z) = 491.7 [M+H].
HCK IC50 (nM); 6.7, FLT3-ITD IC50 (nM); 11, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 92%【０３３９】
実施例４７：ＲＫ−００２０６９８
５−（４−フェノキシフェニル）−７−（（ｃｉｓ）−４−（（ピリジン−２−イルメチル）アミノ）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化６１】
2014017659.tif 000063
【０３４０】
実施例1の合成方法に従い、第5工程において2−ピコリルアミンをN−メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）を得た。【０３４１】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.62-8.54 (m, 1H), 8.29 (s, 1H), 7.66 (dt, J = 1.9, 7.6 Hz, 1H), 7.47-7.29 (m, 5H), 7.23-7.03 (m, 7H), 5.50 (br, 2H), 4.84-4.68 (m, 1H), 3.94 (s, 2H), 3.05-2.97 (m, 1H), 2.34-2.13 (m, 2H), 2.10-1.70 (m, 6H).
MS (m/z) = 491.41 [M+H].
HCK IC50 (nM); 6.5, FLT3-ITD IC50 (nM); 12, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 99%【０３４２】
実施例４８：ＲＫ−００２０７０３
５−（４−フェノキシフェニル）−７−（（ｃｉｓ）−４−（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化６２】
2014017659.tif 000064
【０３４３】
実施例1の合成方法に従い、第5工程においてテトラヒドロ-2H-ピラン-4-アミンをN-メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物（黄色油状物）を合成した。【０３４４】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.33 (s, 1H), 7.47-7.35 (m, 4H), 7.15-6.87 (m, 6H), 5.13 (s, 2H), 4.74 (m, 1H), 3.99 (d, J = 12.2 Hz, 2H), 3.41 (t, J = 11.6 Hz, 2H), 3.15 (s, 1H), 2.76 (m, 1H), 2.17-2.10 (m, 2H), 1.89-1.77 (m, 6H), 1.53-1.26 (m, 4H).
MS (m/z) = 484.26 [M+H].
HCK IC50 (nM); 8.2, FLT3-ITD IC50 (nM); 6.8, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 99%【０３４５】
実施例４９：ＲＫ−００２０７１０
７−（（ｃｉｓ）−４−（（（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）メチル）アミノ）シクロヘキシル）−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化６３】
2014017659.tif 000065
【０３４６】
実施例1の合成方法に従い、第5工程において (1-メチル-1H-ピラゾール-5-イル)メタンアミンをN-メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物(白色固体)を合成した。【０３４７】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.34 (s, 1H), 7.65-7.31 (m, 4H), 7.18-7.05 (m, 6H), 6.17 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 5.09 (s, 2H), 4.79 (m, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.80 (s, 2H), 3.02 (br, 1H), 2.14 (m, 2H), 1.91-1.79 (m, 7H).
MS (m/z) = 494.26 [M+H].
HCK IC50 (nM); 0.53, FLT3-ITD IC50 (nM); 23, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 99%【０３４８】
実施例５０：ＲＫ−００２０７１１
７−（（ｔｒａｎｓ）−４−（（（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）メチル）アミノ）クロヘキシル）−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化６４】
2014017659.tif 000066
【０３４９】
実施例1の合成方法に従い、第5工程において (1-メチル-1H-ピラゾール-5-イル)メタンアミンをN-メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）を合成した。【０３５０】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.33 (s, 1H), 7.65-7.31 (m, 4H), 7.19-7.06 (6H, m), 6.87 (s, 1H), 5.13 (s, 2H), 4.73 (m, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.88 (s, 2H), 2.62 (m, 1H), 2.16 (m, 4H), 1.84 (m, 2H), 1.47 (m, 2H) .
MS (m/z) = 494.26 [M+H].
HCK IC50 (nM); 9.6, FLT3-ITD IC50 (nM); 39, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 97%【０３５１】
実施例５１：ＲＫ−００２０７１２
７−（（ｃｉｓ）−４−（（（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）メチル）アミノ）シクロヘキシル）−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化６５】
2014017659.tif 000067
【０３５２】
実施例1の合成方法に従い、第5工程において、(1-メチル-1H-ピラゾール-3-イル)メタンアミンをN-メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）を得た。【０３５３】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.32 (s, 1H), 7.47-7.34 (m, 5H), 7.17-7.07 (6H, m), 6.19 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.11 (s, 2H), 4.77 (m, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.81 (s, 2H), 3.03 (br, 1H), 2.18 (m, 2H), 2.15-1.76 (m, 7H).
MS (m/z) = 494.26 [M+H].
HCK IC50 (nM); 8, FLT3-ITD IC50 (nM); 34, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 100%【０３５４】
実施例５２：ＲＫ−００２０７２４
１−（（１ｓ，４ｓ）−４−（８−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル）シクロヘキシル）−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化６６】
2014017659.tif 000068
【０３５５】
実施例15の合成法に従い、表記化合物（黄色固体）を得た。【０３５６】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.35 (s, 1H), 7.74-7.64 (m, 2H), 7.44-7.34 (m, 2H), 7.05-7.22 (m, 5H), 5.72 (br, 2H), 4.92-4.70 (m, 1H), 3.11 (s, 2H), 2.78 (dd, J = 2.7, 10.5 Hz, 2H), 2.60-2.40 (m, 2H), 2.30-2.20 (m, 7H), 2.16-2.05 (m, 2H), 2.00-1.86 (m, 3H), 1.83-1.70 (m, 2H), 1.62-1.42 (m, 2H).
MS (m/z) = 510.48 [M+H].
HCK IC50 (nM); 14.5, FLT3-ITD IC50 (nM); 27, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 99%【０３５７】
実施例５３：ＲＫ−００２０７３３
（Ｓ）−３−（（（ｃｉｓ）−４−（４−アミノ−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）シクロヘキシル）アミノ）ピロロリジン−２−オン
【化６７】
2014017659.tif 000069
【０３５８】
実施例１の合成方法に従い、第５工程において(S)-3-アミノピロリジン-2-オンをN−メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）を得た。【０３５９】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.31 (s, 1H), 7.48-7.32 (m, 4H), 7.18-7.03 (m, 6H), 6.21 (s, 1H), 5.23 (s, 2H), 4.84-4.68 (m, 1H), 3.50-3.25 (m, 3H), 3.06 (s, 1H), 2.54-2.40 (m, 1H), 2.27-1.70 (m, 9H).
MS (m/z) = 483.45 [M+H].
HCK IC50 (nM); 5.3, FLT3-ITD IC50 (nM); 30, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 97%【０３６０】
実施例５４：ＲＫ−００２０７３４
（Ｓ）−３−（（（ｔｒａｎｓ）−４−（４−アミノ−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）シクロヘキシル）アミノ）ピロロリジン−２−オン
【化６８】
2014017659.tif 000070
【０３６１】
実施例1の合成方法に従い、第5工程において(S)-3-アミノピロリジン-2-オンをN−メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）を得た。【０３６２】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.33 (s, 1H), 7.48-7.33 (m, 4H), 7.20-7.05 (m, 5H), 7.00 (s, 1H), 5.64 (s, 1H), 5.10 (s, 2H), 4.80-4.62 (m, 1H), 3.55-3.25 (m, 3H), 2.85-2.70 (m, 1H), 2.55-2.40 (m, 1H), 2.25-1.75 (m, 7H), 1.57-1.35 (m, 2H).
MS (m/z) = 483.44 [M+H].
HCK IC50 (nM); 13.5, FLT3-ITD IC50 (nM); 25【０３６３】
実施例５５：ＲＫ−００２０７５８
７−（（１ｓ，４ｓ）−４−（（８−メチル−８−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル）アミノ）シクロヘキシル）−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化６９】
2014017659.tif 000071
【０３６４】
実施例１の合成方法に従い、第５工程において8-メチル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-アミンをN−メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）として得た。【０３６５】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.33 (s, 1H), 7.49-7.33 (m, 4H), 7.18-7.04 (m, 5H), 7.00 (s, 1H), 5.09 (s, 1H), 4.80-4.62 (m, 1H), 3.16-2.85 (m, 3H), 2.65-2.50 (m, 1H), 2.26 (s, 3H), 2.25-1.65 (m, 14H), 1.65-1.45 (m, 2H), 1.38-1.15 (m, 1H).
MS (m/z) = 523.50 [M+H].
HCK IC50 (nM); 4.2, FLT3-ITD IC50 (nM); 35.2, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 92%【０３６６】
実施例５６：ＲＫ−００２０６８６
７−（（ｔｒａｎｓ）−４−（３−メチル−５，６−ジヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−７（８Ｈ）−イル）シクロヘキシル）−５−（４−フェノキシフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化７０】
2014017659.tif 000072
【０３６７】
実施例1の合成方法に従い、第5工程において1-(tert-ブチル)ピペラジンをN-メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物（白色固体）を合成した。【０３６８】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.33 (s, 1H), 7.45-7.36 (m, 4H), 7.18-7.06 (5H, m), 7.00 (s, 1H), 5.15 (s, 2H), 4.72 (m, 1H), .3.98 (s, 2H), 3.87 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.03 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 2.74 (m, 1H), 2.41 (s, 3H), 2.29 (br, 2H), 2.14 (br, 2H), 1.91-1.66 (m, 4H).
MS (m/z) = 521.27 [M+H].
HCK IC50 (nM); 90, FLT3-ITD IC50 (nM); 23【０３６９】
実施例５７：ＲＫ−００２０６９３
Ｎ−（４−（４−アミノ−７−（（ｔｒａｎｓ）−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）フェニル）−３−フェニルプロパンアミド
【化７１】
2014017659.tif 000073
【０３７０】
実施例17第2工程で得られた5-(4-アミノフェニル)-7-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-アミン（300mg, 0.74mmol）をピリジン（5mL）に溶解させ、室温で撹拌しながら3-フェニルプロピオン酸クロリド（125mg, 0.74mmol）を滴下した。室温で４時間反応後ジクロロメタン及び水を加え、そこへ2M水酸化ナトリウムを加えpH9としジクロロメタンで抽出後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール／28%アンモニア水＝100／10／2）にて精製し、さらに分取薄層クロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール／28%アンモニア水＝100／10／2）にて精製し表記化合物（白色固体、56mg）を得た。【０３７１】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.32 (s, 1H), 7.56-7.46 (m, 2H), 7.46-7.37 (m, 2H), 7.37-7.20 (m, 5H), 7.06 (s, 1H), 6.99 (s, 1H), 5.03 (s, 2H), 4.76-4.60 (m, 1H), 3.09 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.75-2.57 (m, 7H), 2.57-2.36 (m, 4H), 2.30 (m, 3H), 2.26-2.14 (m, 2H), 2.14-2.02 (m, 2H), 1.92-1.70 (m, 2H), 1.70-1.50 (m, 2H).
MS (m/z) = 538.70 [M+H].
HCK IC50 (nM); 32, FLT3-ITD IC50 (nM); 14, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 53%【０３７２】
実施例５８：ＲＫ−００２０８９８
５−（４−フェノキシフェニル）−７−（（ｔｒａｎｓ）−４−（３−（トリフルオロメチル）−５，６−ジヒドロ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−７（８Ｈ）−イル）シクロヘキシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化７２】
2014017659.tif 000074
【０３７３】
実施例1の合成方法に従い、第5工程において3-(トリフルオロメチル)-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾール[4,3-a]ピラジン塩酸塩をN−メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物を白色固体として得た。【０３７４】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.33 (s, 1H), 7.47-7.34 (m, 4H), 7.20-7.05 (m, 5H), 7.00 (s, 1H), 5.14 (s, 2H), 4.80-4.65 (m, 1H), 4.16 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 4.08 (s, 2H), 3.08 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.84-2.70 (m, 1H), 2.35-1.60 (m, 8H).
MS (m/z) = 575.50 [M+H].
HCK IC50 (nM); 23, FLT3-ITD IC50 (nM); 43【０３７５】
実施例５９：ＲＫ−００２０６２０
１−（（ｔｒａｎｓ）−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）シクロヘキシル）−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン
【化７３】
2014017659.tif 000075
【０３７６】
（１）4-(4-アミノ-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン
4,4,5,5-テトラメチル-2-(4-フェノキシフェニル)-1,3,2-ジオキサボロラン（1.0g, 3.38mmol）をエチレングリコールジメチルエーテル（38mL）、エタノール（11mL）に溶解し、ここへ4-(4-アミノ-3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン（0.5g, 1.35mmol）、飽和炭酸ナトリウム溶液（12mL）及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0.1g, 0.10mmol）を順次加え、混合物を80℃でアルゴン雰囲気下終夜半攪拌した。放冷後、ジクロロメタンを加え抽出し飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール＝10／1→ジクロロメタン／メタノール＝95／5）にて精製し、4-(4-アミノ-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン（0.7g）を得た。【０３７７】
（2）1-((cis)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン及び1-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン
4-(4-アミノ-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン（0.7g, 1.65mmol）を1,2−ジクロロエタン（20mL）に溶かし、酢酸（0.3g, 4.96mmol）、N-メチルピペラジン（0.5g, 4.96mmol）及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（0.5g, 2.48mmol）を加え、室温にて終夜攪拌した。反応混合物を減圧縮後、酢酸エチルで抽出し、水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去し、分取薄層クロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール／28％アンモニア水＝100／10／2）により単離、精製を行った。1-((cis)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン(黄色油状、194mg)及び1-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン（白色固体、73mg）を得た。【０３７８】
1H NMR (270 MHz, CDCl3, δ): 8.36 (s, 1H), 7.65 (d, J = 6.5, 1H), 7.41-7.27 (m, 2H), 7.19-7.06 (m, 5H), 5.54 (s, 2H), 4.74 (m, 1H), 2.67 (br, 4H), 2.53 (br, 5H), 2.32 (s, 3H), 2.27-2.07 (br, 6H), 1.82 (br, 2H).
MS (m/z) = 483.27 [M+1H]
HCK IC50 (nM); 3, FLT3-ITD IC50 (nM); 55【０３７９】
（実施例６０）
（材料及び方法）
（１）ヒト試料
すべての実験は、理化学研究所 免疫・アレルギー科学総合研究センター（ＲＣＡＩ）のInstitutional Review Board for Human Researchからの承認により実施した。すべてのヒト試料は、書面によるインフォームドコンセントを得て収集した。転写プロファイリングは、French-American-British（ＦＡＢ）分類システムのサブタイプＭ０（Ｎ＝１）、Ｍ１（Ｎ＝５）、Ｍ２（Ｎ＝９）、Ｍ４（Ｎ＝４）、Ｍ５（Ｎ＝１）及びＭＤＳ／ＡＭＬ（Ｎ＝２５）を有する患者４６名に由来する骨髄（ＢＭ）又は末梢血（ＰＢ）について実施した。ＨＣＫ阻害の評価は患者３２名に由来するＢＭ又はＰＢ試料について実施した。臍帯血（ＣＢ）試料は、東京臍帯血バンクが書面によるインフォームドコンセントを得て採取した。健常ドナー由来のＢＭ単核細胞（ＭＮＣ）はCambrex社（米国メリーランド州Walkerville）から入手した。ＡＭＬ患者由来のＢＭ  ＭＮＣ及びＣＢ  ＭＮＣは、密度勾配遠心分離を使用して単離した。【０３８０】
（２）動物
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtmlWjl/Sz (NOD/SCID/IL2rgnull, NSG)マウスは、Il2rg遺伝子座の完全ヌル変異をNOD. Cg-Prkdcscid (NOD/SCID)系統と戻し交雑することによって、The Jackson Laboratory（米国メーン州Bar Harbor）で開発された(Shultz，L. D. et al., Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immuno1. 154， 180-191 (1995))。マウスを、理研及びThe Jackson Laboratoryの動物施設で、各施設でInstitutional Animal Committeesによって確立されたガイドラインに従って、照射した食物及び酸性化した水を用いて飼育し、規定された細菌叢のもとで維持した。【０３８１】
（３）フローサイトメトリー及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）
ヒト細胞の生着及びマーカーの発現を評価するため、細胞を蛍光色素結合ラット抗マウスＣＤ４５、抗マウスＣＤ１１７、抗マウスＳｃａ−１、抗マウスＧｒ１、抗マウスＣＤ１１ｂ、抗マウスＴＥＲ１１９、マウス抗ヒトＣＤ４５、抗ヒトＣＤ３３、抗ヒトＣＤ３４、抗ヒトＣＤ３８、抗ヒトＣＤ３、抗ヒトＣＤ８、抗ヒトＣＤ１９モノクローナル抗体（BD Biosciences、米国カリフォルニア州San Jose）で標識した。解析はFACSAria及びFASCCanto II（BD Biosciences、米国カリフォルニア州San Jose）を用いて行った。マイクロアレイ解析及び異種移植用の細胞を得るため、ヒトＭＮＣを蛍光色素結合マウス抗ヒトＣＤ３、抗ヒトＣＤ４、抗ヒトＣＤ８、抗ヒトＣＤ３４及び抗ヒトＣＤ３８モノクローナル抗体（BD Biosciences、米国カリフォルニア州San Jose）で標識し、レシピエントのＢＭ  ＭＮＣ細胞を前述した蛍光色素結合マウス抗ヒトＣＤ４５、抗ヒトＣＤ３４及び抗ヒトＣＤ３８モノクローナル抗体で標識してFACSAria（BD Biosciences、米国カリフォルニア州San Jose）を用いて細胞をソートした。ソートされた細胞の純度は９８％よりも高かった。正確な細胞数を求めるため、AccuCount Beads（BD Biosciences、米国カリフォルニア州San Jose）を用いたフローサイトメトリーを実施した。【０３８２】
（４）異種移植
新生仔のNOD/SCID/IL2rgnullレシピエントに、１５０ｃＧｙの全身照射を与え、その後ソートされた細胞の静脈内注射を行った。F. Ishikawa et al., Nat. Biotechno1. 25， 1315 (2007)に記載したように、ＡＭＬ生着レシピエントを作製するために、レシピエントあたり１０３〜１０５個のソートした７ＡＡＤ−系（ｈＣＤ３／ｈＣＤ４／ｈＣＤ８）−ｈＣＤ３４＋ｈＣＤ３８−ＡＭＬ患者のＢＭ細胞を用いた。末梢血（ＰＢ）ヒト細胞の生着は後眼窩放血(retro-orbital phlebotomy)によって評価した。【０３８３】
（５）マイクロアレイ解析
ＬＳＣ試料７４個及び健常人ＢＭ由来ＨＳＣ試料８個をヒト遺伝子発現解析用マイクロアレイＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ（Affymetrix、米国）を用いて評価した。ソートされた細胞１０４個以上からＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen、米国）を用いて抽出された全ＲＮＡから、Ｔｗｏ−Ｃｙｃｌｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキット（Affymetrix、米国）を用いてビオチン化ｃＲＮＡを合成した。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージ（http://www.bioconductor.org/)を用いて、マイクロアレイデータを解析した。マイクロアレイプラットフォーム上のプローブセットのシグナル強度を、ＧＣ−ＲＭＡプログラム（http://www.bioconductor.org/)を用いて正規化した。各プラットフォームに対して、正規化したデータをＲａｎｋＰｒｏｄプログラム（Hong et al., Bioinformatics, 22, 2825-2827, 2006）により解析し、カットオフｐ値０．０１かつ擬陽性推定０．０５％として、ＬＳＣとＨＳＣとの間で示差的に発現した遺伝子を選択した。遺伝子アノテーションは、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ及びＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎのデータベース（http://www.ingenuity.com; http://www.ebi.ac.up/GOA/）から得た。【０３８４】
（６）定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）解析
全ＲＮＡを、ＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ  ＲＮＡ増幅システム（Nugen、米国）を用いるｃＤＮＡ増幅に供した。ＰＣＲ反応は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０（Roche Applied Science、スイス国）を使用して、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Invitrogen、米国）で行った。二重標識した蛍光プローブ及び遺伝子特異的プライマー（Sigma-Aldrich、米国）の配列は特許文献２（ＷＯ２０１０／１１０３４６）の表３に記載されている。各転写物の存在量は、標準曲線法（Giulietti, A. et al., Methods, 25, 386-401 2001）により計算した。Ｋａｌｅｉｄａ  Ｇｒａｐｈソフトウェアパッケージ（Synergy、米国）中のＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ又はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−検定のいずれかがＰ＜０．０５を示した場合、発現レベルが有意に異なるとみなした。【０３８５】
（７）免疫蛍光標識及びイメージング
大腿骨から、パラホルムアルデヒド固定し脱灰したパラフィン包埋切片を調製し、マウス抗ヒトＣＤ４５モノクローナル抗体（DAKO、デンマーク国）及びマウス抗ヒトＨＣＫモノクローナル抗体（Novus Biologicals、米国）を用いて標識した。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０（Carl Zeiss Microimaging, ドイツ国）を用いて、レーザースキャニング共焦点イメージングを得た。【０３８６】
（８）生存能力の評価
レンチウイルス形質導入及びＨＣＫ knock-down細胞株ＴＦ１ａ、ＨＬ−６０及びＫ５６２をＡＴＣＣから入手し、製造者の指示に従って維持した。ヒトＡＭＬ  ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞はＦＡＣＳで精製するか、ＡＭＬ患者のＢＭ、ＰＢ又はヒトＡＭＬ生着レシピエントのＢＭから直接得た。レンチウイルスでパッケージングされたＨＣＫ  ｓｈＲＮＡ及び対照ＧＦＰ  ｓｈＲＮＡはSigma社から入手した。細胞を１００のＭＯＩに３〜４日間感染させ、採取し、マウス抗ヒトＣＤ４５、抗ヒトＣＤ３４及び抗ヒトＣＤ３８モノクローナル抗体で標識し、ソートして、ＨＣＫ  ｓｈＲＮＡ又は対照ＧＦＰ  ｓｈＲＮＡが導入された（ＧＦＰ陽性）ｈＣＤ３４＋ｈＣＤ３８−細胞を得た。次いで、ソートされた細胞を、細胞株については、対応する培地で、又は、ヒトＡＭＬ細胞については、組換えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ，５０ｎｇ／ｍｌ）、組換えヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ，５０ｎｇ／ｍｌ）及び組換えヒトＦＬＴ３リガンド（ＦＬ，５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＨＰＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ、スイス国）で培養した。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００（Carl Zeiss Microimaging，ドイツ国）を用いて顕微鏡写真を撮った後、細胞を採取し、フローサイトメトリーによって生存能力を評価した。【０３８７】
（９）被験化合物
実施例の化合物、比較化合物Ａ（ＷＯ００／１７２０３（特許文献３）の式（Ｉ）に包含される化合物）、比較化合物Ｂ（ＷＯ００／１７２０３（特許文献３）の請求項７２の３番目の化合物）、比較化合物Ｃ（チロシンキナーゼ阻害剤ダサチニブ(Dasatinib)）、比較化合物Ｄ（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 271, No. 2, pp. 695-701 (1996)に記載のＰＰ２）、比較化合物Ｅ（Nature Chemical Biology, 4, 691-699 (2008)に記載のＰＰ１２１）、比較化合物Ｆ（Nature Chemical Biology, 4, 691-699 (2008)に記載のＰＰ２０）、比較化合物Ｇ（ＰＩ３Ｋ inhibitor；ＰＩ１０３）及び比較化合物Ｈ（ｍＴＯＲ inhibitor；rapamycin）を用いた。【０３８８】
比較化合物Ａは、in vitroでの分析において、用量依存的にヒトＡＭＬ  ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の増殖及び生存を有意に阻害したが（試験した１９例中９例において、ＩＣ５０＜１ｍＭ）、水溶解度がＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１μＭ未満と低く、代謝安定性が低い（ヒト及びマウスの肝ミクロゾームで１時間インキュベート後の残存率がそれぞれ１１％及び０％）という医薬用途としては好ましくないものであった。【０３８９】
実施例１の化合物は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の水溶解度が１７７．３μＭである比較化合物Ｃ（ダサチニブ(Dasatinib)）とほぼ同様の水溶解度（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１９４．３μＭ）を示し、ヒト及びマウスの肝ミクロゾームで１時間インキュベート後の残存率がそれぞれ５４％及び７５％と高い代謝安定性を示した。【０３９０】
（比較化合物Ａ；ＲＫ−２４４６６）
【化７４】
2014017659.tif 000076
【０３９１】
（比較化合物Ｂ）
【化７５】
2014017659.tif 000077
【０３９２】
（比較化合物Ｃ）
【化７６】
2014017659.tif 000078
【０３９３】
（比較化合物Ｄ）
【化７７】
2014017659.tif 000079
【０３９４】
（比較化合物Ｅ）
【化７８】
2014017659.tif 000080
【０３９５】
（比較化合物Ｆ）
【化７９】
2014017659.tif 000081
【０３９６】
（１０）in vitroでのキナーゼ阻害分析
ヒトＡＭＬ  ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞はＦＡＣＳで精製するか、患者ＢＭ／ＰＢ又はヒトＡＭＬ生着レシピエントＢＭから直接得た。ソートされた細胞を、９６ウェル組織培養プレートのウェル中、ＤＭＳＯ単独又は被験化合物の共存下で、組換えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ，５０ｎｇ／ｍｌ）、組換えヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ，５０ｎｇ／ｍｌ）及び組換えヒトＦＬＴ３リガンド（ＦＬ，５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＨＰＧＭ培地で培養した。３日後、ウェルから細胞を採取し、細胞数、表面表現型及び生存能力を前述したようにフローサイトメトリーによって評価した。【０３９７】
比較化合物Ａ、比較化合物Ｃ（チロシンキナーゼ阻害剤ダサチニブ(Dasatinib)）、比較化合物Ｄ（ＰＰ２）、並びにその他のＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ（ＳＦＫ）及びその下流キナーゼの阻害剤、比較化合物Ｅ（ＰＰ１２１）、比較化合物Ｆ（ＰＰ２０）、比較化合物Ｇ（ＰＩ３Ｋ inhibitor；ＰＩ１０３）及び比較化合物Ｈ（ｍＴＯＲ inhibitor；rapamycin）に比較して、実施例１の化合物は、ヒトＡＭＬ  ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の増殖及び生存に対する阻害効果が最も高かった（図１）。【０３９８】
更に、これら化合物で処理した細胞の生死をフローサイトメトリーによって前方散乱（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＳＣ）を測定することによって確認した（図２）。また、化合物で処理した細胞を７ＡＡＤ標識(AnnexinV-FITC Apoptosis Detection Kit, BD)し、フローサイトメトリーを行うことによってアポトーシス細胞を測定した。【０３９９】
分析の結果、実施例１記載の化合物において白血病幹細胞に対する増殖及び生存に対する阻害効果が高かった。【０４００】
処理濃度を０ｎＭ、１００ｎＭまたは１０００ｎＭとして比較化合物Ｃと比較化合物Ｄと比べた場合に、どちらの処理濃度においても実施例１記載の化合物が白血病幹細胞に対する増殖及び生存に対する高い阻害効果を有することが示された（表１）。表１は、ＤＭＳＯ単独処理の場合の細胞数を１００％として、各化合物での処理時の細胞数をパーセントで表したものである。
【表１】
2014017659.tif 000082
【０４０１】
（実施例６１）in vitroでのキナーゼ阻害分析２
実施例６０記載の材料及び方法に基づき、以下のキナーゼ阻害分析を行った。【０４０２】
下記表２−４に示す急性骨髄性白血病の患者（sample code; ＡからＡＢまで、計２８名）から得られた血液試料より、ＡＭＬ ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞をＦＡＣＳで精製するか、患者ＢＭ／ＰＢ又はヒトＡＭＬ生着レシピエントＢＭから直接得ることで細胞試料を調製した。ソートされた各細胞を、９６ウェル組織培養プレートのウェル中、ＤＭＳＯ単独、実施例１記載の化合物、比較化合物Ａ、又は比較化合物Ｄ（ＳＦＫ阻害剤、ＰＰ２）の各薬剤との化合物を添加した状態で、組換えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ，５０ｎｇ／ｍｌ）、組換えヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ，５０ｎｇ／ｍｌ）及び組換えヒトＦＬＴ３リガンド（ＦＬ，５０ｎｇ／ｍｌ）を含んだＨＰＧＭ培地で培養した。【０４０３】
３日後、ウェルから細胞を採取し、細胞数、表面表現型及び生存能力を前述したようにフローサイトメトリーによって評価した。ＤＭＳＯ単独処理の場合の細胞数を１００％として、各化合物での処理時の細胞数をパーセントで表した。【０４０４】
分析の結果、実施例６０と同様に実施例１記載の化合物において白血病幹細胞に対する増殖及び生存に対する阻害効果が高いことが示された。驚くべきことに、実施例１記載の化合物はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異を有する白血病幹細胞に対して顕著に増殖及び生存に対する阻害効果を有することが示された（表２〜４）。【０４０５】
表２に、実施例１の化合物の濃度を５００ｎＭ又は１μＭにして処理した結果を示す。【０４０６】
表３に、比較化合物Ａの濃度を５００ｎＭ又は１μＭにして処理した結果を示す。【０４０７】
表４に、比較化合物Ｄの濃度を５００ｎＭ又は１μＭにして処理した結果を示す。【０４０８】
“ＦＬＴ３  Ｔｙｐｅ”はＦＬＴ３遺伝子変異について示し、ＩＴＤはＦＬＴ３／ＩＴＤ変異を有する変異型ＦＬＴ３遺伝子を有する細胞試料、ＷＴは正常型ＦＬＴ３遺伝子を有する細胞試料を表す。“(average)”は各薬剤で処理した際の、ＩＴＤ変異型ＦＬＴ３遺伝子を有する細胞試料群、又は正常型ＦＬＴ３遺伝子を有する細胞試料群における平均値を表す。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【０４０９】
（実施例６２）
in vitroでのキナーゼ阻害分析３
実施例６０記載の材料及び方法に基づき、以下のキナーゼ阻害分析を行った。【０４１０】
ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を持つ急性骨髄性白血病の患者（＃１、＃２）から得られた血液試料より、ＡＭＬ ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞をＦＡＣＳで精製するか、患者ＢＭ／ＰＢ又はヒトＡＭＬ生着レシピエントＢＭから直接得ることで細胞試料を調製した。ソートされた各細胞を、９６ウェル組織培養プレートのウェル中、ＤＭＳＯ単独、またはＨＣＫ阻害効果とＦＬＴ３阻害効果を合わせ持つ化合物の例として実施例１、２、６、７、８、４３、４５、４８、５６又は５７記載の化合物を添加した状態で、組換えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ，５０ｎｇ／ｍｌ）、組換えヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ，５０ｎｇ／ｍｌ）及び組換えヒトＦＬＴ３リガンド（ＦＬ，５０ｎｇ／ｍｌ）を含んだＨＰＧＭ培地で培養した。【０４１１】
３日後、ウェルから細胞を採取し、細胞数、表面表現型及び生存能力を前述したようにフローサイトメトリーによって評価した。【０４１２】
分析の結果、ＤＭＳＯ単独での細胞数を１００％とした場合に、各化合物においても実施例１化合物と同様に白血病幹細胞に対して顕著に増殖及び生存に対する阻害効果を有することが示された（表５）。
【表５】
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【０４１３】
（実施例６３）
ＦＬＴ３阻害効果を有する薬剤を加えたキナーゼ阻害分析
Ｆｌｔ３／ＩＴＤを有するヒトＡＭＬ ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞をＦＡＣＳで精製するか、患者ＢＭ／ＰＢ又はヒトＡＭＬ生着レシピエントＢＭから直接得た。ソートされた細胞を、９６ウェル組織培養プレートのウェル中、実施例４記載の化合物とＣｒｅｎｏｌａｎｉｂそれぞれの濃度条件を変えて共存させ、組換えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ，５０ｎｇ／ｍｌ）、組換えヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ，５０ｎｇ／ｍｌ）及び組換えヒトＦＬＴ３リガンド（ＦＬ，５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＨＰＧＭ培地で培養した。３日後、ウェルから細胞を採取し、細胞数、表面表現型及び生存能力を前述したようにフローサイトメトリーによって評価した。【０４１４】
実施例４記載の化合物を０μＭ、Ｃｒｅｎｏｌａｎｉｂを０μＭの場合の細胞数を１００％として実施例４記載の化合物を加えた場合の細胞数、表面表現型及び生存能力を評価した。【０４１５】
その結果、Ｆｌｔ３活性とＨＣＫ活性の双方を阻害することにより顕著に増殖及び生存に対する阻害効果が高いことを示した（表６）。
【表６】
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【０４１６】
（実施例６４）
処置されたＡＭＬ  ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の白血病発症能力の評価
処置されたＡＭＬ  ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の白血病発症能力を試験するため、各ウェルから採取された細胞から７ＡＡＤ−ＣＤ４５＋細胞をソートし、前述したように新生仔ＮＳＧマウスに移植した。移植レシピエントは、後眼窩放血(retro-orbital phlebotomy)を移植後６週目に開始し、３週間ごとに受け、ＡＭＬ生着を評価した。生存率はKaplan-Meier法を用いて計算した。【０４１７】
また、特許文献３の請求項７２の３番目に記載の化合物である比較化合物Ｂについて、ヒトＡＭＬ  ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の増殖及び生存に対する効果を検証したが、阻害効果はほとんど認められなかった（図３）。【０４１８】
（実施例６５）
（１）in vivoでのキナーゼ阻害分析
短期のin vivoでの処置研究のため、患者７名（Ｕ５８＃１，ＳＨ３，ＫＨ，Ｕ６２，Ｕ１４２，ＡＫ，Ｕ１１５）由来のＡＭＬを生着させたNOD/SCID/IL2rgnull littermateにビヒクル単独又は被験化合物３０ｍｇ／ｋｇを１日２回（ｂｉｄ）、１８日間又はいずれかが瀕死状態になるまで腹腔内（ｉｐ）投与した。化学療法抵抗性疾患(AK, U115)の患者から得られたＡＭＬ細胞が生着したレシピエントのin vivoでの処置研究については、littermateに、ビヒクル単独、被験化合物単独（３０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ  ｂｉｄ）、ＡｒａＣ単独（４８０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ×１）、又はＡｒａＣ（４８０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ×１）、次いで被験化合物（３０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ  ｂｉｄ）の組み合わせを投与した。マウスが瀕死状態になったとき、又は処置６週間後にマウスを殺処分した。次いで、ＢＭ、脾臓及びＰＢにおけるヒトＡＭＬのキメラ率を解析した。ヒトＡＭＬのキメラ率は、フローサイトメトリーを用いhCD45で全体のヒト白血病細胞を、hCD45+hCD34+hCD38-でヒト白血病幹細胞を同定し、マウス白血球をmouseCD45, マウス赤血球をmouse Ter119で同定することで算出した。この結果、実施例１の化合物（阻害剤）単独投与、及びＡｒａＣと実施例１の化合物（阻害剤）との併用投与において顕著な効果が認められた（図４、図５）。【０４１９】
また、ＡｎｎｅｘｉｎＶ及び７ＡＡＤ標識(AnnexinV-FITC Apoptosis Detection Kit, BD)を用いたＢＭ及び脾臓におけるアポトーシスの測定結果も得た。【０４２０】
（２）統計的分析
数値データは、平均値±標準誤差で表した。差異は、両側t-検定を用いて解析した(GraphPad Prism, GraphPad, USA)。Ｐ＜０．０５を示した場合、有意差があるとみなした。生存数はKaplan-Meier法により推定し、曲線はLog-rank (Mantel-Cox)検定により比較した。【０４２１】
（実施例６６）
ＬＳＣにおけるＨＣＫの機能的役割を確認するために、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）によるＨＣＫの発現低下の効果を調べた。【０４２２】
ヒトＡＭＬの細胞株であるＴＦ１ａとヒト慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株であるＫ５６２にＨＣＫのｓｈＲＮＡと対照用のｓｈＲＮＡを導入した。発現低下の効果を細胞の増殖・生存で測定するため、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）陽性であるヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞を蛍光識別細胞分取（ＦＡＣＳ）で精製し、７日間インビトロの系で培養した。ＨＣＫの発現の低下によって、ＴＦ１ａ細胞（遺伝子導入前でＨＣＫ発現あり）の増殖・生存に顕著な阻害効果を引き起こしたが、Ｋ５６２（ＨＣＫ発現なし）では影響が見られなかった。ＨＣＫのｓｈＲＮＡは、ヒトＡＭＬ病理に関係していると報告されているＳＦＫファミリーのＬｙｎとＳｒｃの転写レベルに対しては影響していなかった。これらの結果ら、ＨＣＫ発現はヒトＡＭＬ細胞の増殖と生存に必須であり、ＨＣＫの薬理学的阻害によってヒトＡＭＬの白血病幹細胞を排除できることを示す（図６）。【０４２３】
次に、ＦＬＴ３の恒常的な活性化（ほとんどの頻度ではＦＬＴ３／ＩＴＤ変異のフォームである）が正常な核型のＡＭＬと関連することが一般的であるため、ＨＣＫのｓｈＲＮＡによるＦＬＴ３／ＩＴＤ変異を有するヒトＡＭＬにおけるＨＣＫ発現の重要性を調べた。二系統のＦＬＴ３／ＩＴＤ変異を有するヒトＡＭＬ細胞（MV-4-11及びMolm13）において、ｓｈＲＮＡによるＨＣＫの阻害のために生存細胞の数と生存率が減少した。このことから、ＦＬＴ３／ＩＴＤ変異を有するヒトＡＭＬに対してＨＣＫの阻害が有効であることが示された（図７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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