(57)【要約】  本発明は、脂肪酸結合タンパク質７型遺伝子のノックアウト動物を作製することによって、難聴が生じにくいモデル動物を提供する。
2014042262.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
難聴が生じにくいモデル動物であって、
脂肪酸結合タンパク質７型遺伝子のノックアウト動物であることを特徴とするモデル動物。
【請求項２】
前記難聴が加齢性難聴であって、
加齢性難聴の発症または進行が遅延する、請求項１に記載のモデル動物。
【請求項３】
前記難聴が騒音性難聴であって、
騒音性難聴が低減する、請求項１に記載のモデル動物。
【請求項４】
請求項１に記載のモデル動物において、加齢に従って聴力を測定する方法。
【請求項５】
請求項１に記載のモデル動物において、音響暴露後に聴力を測定する方法。
【請求項６】
加齢性難聴に関与する遺伝子のスクリーニング方法であって、
請求項１に記載のモデル動物において、正常な加齢性難聴を生じる動物と異なる発現を示す遺伝子を検索する工程を含む方法。
【請求項７】
騒音性難聴に関与する遺伝子のスクリーニング方法であって、
請求項１に記載のモデル動物において、正常な騒音性難聴を生じる動物と異なる発現を示す遺伝子を検索する工程を含む方法。
【請求項８】
転写レベルでの発現、又はタンパク質レベルでの発現を指標に検索することを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
加齢性難聴のマーカーとなる物質のスクリーニング方法であって、
請求項１に記載のモデル動物において、正常な加齢性難聴を生じる動物と異なる量または濃度を示す化合物を検索する工程を含む方法。
【請求項１０】
騒音性難聴のマーカーとなる物質のスクリーニング方法であって、
請求項１に記載のモデル動物において、正常な騒音性難聴を生じる動物と異なる量または濃度を示す化合物を検索する工程を含む方法。
【請求項１１】
加齢性難聴の発症または進行が遅延するモデル動物の作製方法であって、
動物個体において、脂肪酸結合タンパク質７型遺伝子の発現を抑制することを特徴とする作製方法。
【請求項１２】
騒音性難聴が低減するモデル動物の作製方法であって、
動物個体において、脂肪酸結合タンパク質７型遺伝子の発現を抑制することを特徴とする作製方法。
【請求項１３】
ヒト以外の脊椎動物において、加齢性難聴の発症または進行を遅延させる方法であって、
前記脊椎動物において、脂肪酸結合タンパク質７型遺伝子の発現を抑制することを特徴とする方法。
【請求項１４】
ヒト以外の脊椎動物において、騒音性難聴を低減させる方法であって、
前記脊椎動物において、脂肪酸結合タンパク質７型遺伝子の発現を抑制することを特徴とする方法。
【請求項１５】
加齢性難聴の発症または進行を遅延させる化合物のスクリーニング方法であって、
候補となる化合物が脂肪酸結合タンパク質７型の発現を阻害するかどうかを検出する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項１６】
騒音性難聴を低減させる化合物のスクリーニング方法であって、
候補となる化合物が脂肪酸結合タンパク質７型の発現を阻害するかどうかを検出する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項１７】
加齢性難聴のマーカーである、脂肪酸結合タンパク質７型遺伝子であるマーカー。
【請求項１８】
騒音性難聴のマーカーである、脂肪酸結合タンパク質７型遺伝子であるマーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、難聴が生じにくいモデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸結合タンパク質７型（fatty acid binding protein7：Fabp7）は、DHAなどの不飽和脂肪酸に結合し、脂肪酸の細胞内輸送を行う脂肪酸結合タンパク質の一つである（Nature reviews Drug discovery. 2008;7(6):489-503.）。Fabp7は、脳で高レベルに発現し、神経幹細胞の増殖や維持に関与しているとされる（Stem Cells. 2012；30(7)：1532-43.）。また、内耳の蝸牛（cochlea）では、蝸牛神経節（spiral ganglion）における衛星細胞（satellite cell）、コルチ器（organ of Corti）における支持細胞（supporting cell）、らせん板縁（spiral limbus）やらせん靭帯（spiral ligament）における線維細胞（fibrocytes）で発現が検出されているが、これらの組織におけるFabp7の機能は明らかではない（Annals of anatomy. 2010;192(4):210-4.）。【０００３】
一方、これまで、加齢性難聴の遺伝学的研究においては、特定の遺伝子の欠損により先天性の難聴をきたす、または加齢性難聴の進行が加速するという表現型を示す報告は数多く存在している。一方、ある特定の遺伝子を欠損させたノックアウトマウスで加齢性難聴の発症や進行が遅れたという報告は非常に珍しく、アポトーシス促進タンパクの一種であるBak遺伝子のノックアウトマウスで加齢性難聴の発症が有意に予防された（Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Nov 17;106(46):19432-7.）という報告など少数である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、難聴が生じにくいモデル動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、Fabp7遺伝子のノックアウトマウスの表現型を解析している時、このマウスでは、加齢性難聴の発症及び進行が遅延することを見出した。組織学的には、老化に伴う蝸牛の変性が軽度な状態に留まり、神経細胞や線維細胞、有毛細胞の脱落が抑制されていた。その上、このノックアウトマウスは、音響暴露にも耐性があり、野生型マウスで生じるような音響暴露後の一過的な聴力閾値の上昇が低減していた。このようにして、本発明者らは、以下の発明を完成させた。【０００６】
本発明の一実施態様は、難聴が生じにくいモデル動物であって、脂肪酸結合タンパク質７型遺伝子のノックアウト動物である。前記難聴が加齢性難聴であって、加齢性難聴の発症または進行が遅延するモデル動物であってもよい。あるいは、前記難聴が騒音性難聴であって、騒音性難聴が低減するモデル動物であってもよい。【０００７】
本発明の他の一実施態様は、上記モデル動物において、加齢に従って聴力を測定する方法である。さらなる一実施態様は、上記モデル動物において、音響暴露後に聴力を測定する方法である。【０００８】
本発明のさらなる一実施態様は、加齢性難聴に関与する遺伝子のスクリーニング方法であって、上記モデル動物において、正常な加齢性難聴を生じる動物と異なる発現を示す遺伝子を検索する工程を含む方法である。さらなる一実施態様は、騒音性難聴に関与する遺伝子のスクリーニング方法であって、上記モデル動物において、正常な音響暴露による難聴を生じる動物と異なる発現を示す遺伝子を検索する工程を含む方法である。これらの方法において、転写レベルでの発現、又はタンパク質レベルでの発現を指標に検索してもよい。【０００９】
本発明のさらなる一実施態様は、加齢性難聴のマーカーとなる物質のスクリーニング方法であって、上記モデル動物において、正常な加齢性難聴を生じる動物と異なる量または濃度を示す化合物を検索する工程を含むスクリーニング方法である。さらなる一実施態様は、騒音性難聴のマーカーとなる物質のスクリーニング方法であって、上記モデル動物において、正常な騒音性難聴を生じる動物と異なる量または濃度を示す化合物を検索する工程を含むスクリーニング方法である。【００１０】
本発明のさらなる一実施態様は、加齢性難聴の発症または進行が遅延するモデル動物の作製方法であって、動物個体において、脂肪酸結合タンパク質７型遺伝子の発現を抑制することを特徴とする作製方法である。さらなる一実施態様は、騒音性難聴が低減するモデル動物の作製方法であって、動物個体において、脂肪酸結合タンパク質７型遺伝子の発現を抑制することを特徴とする作製方法である。【００１１】
本発明のさらなる一実施態様は、ヒト以外の脊椎動物において、加齢性難聴の発症または進行を遅延させる方法であって、前記脊椎動物において、脂肪酸結合タンパク質７型遺伝子の発現を抑制することを特徴とする方法である。さらなる一実施態様は、ヒト以外の脊椎動物において、騒音性難聴を低減させる方法であって、前記脊椎動物において、脂肪酸結合タンパク質７型遺伝子の発現を抑制することを特徴とする方法である。【００１２】
本発明のさらなる一実施態様は、加齢性難聴の発症または進行を遅延させる化合物のスクリーニング方法であって、候補となる化合物が脂肪酸結合タンパク質７型の発現を阻害するかどうかを検出する工程を含む。さらなる一実施態様は、騒音性難聴を低減させる化合物のスクリーニング方法であって、候補となる化合物が脂肪酸結合タンパク質７型の発現を阻害するかどうかを検出する工程を含む。【００１３】
本発明のさらなる一実施態様は、加齢性難聴または騒音性難聴のマーカーであって、脂肪酸結合タンパク質７型遺伝子であるマーカーである。【００１４】
＝＝関連文献とのクロスリファレンス＝＝
本出願は、２０１２年９月１３日付で出願した日本国特許出願２０１２−２０２０２７に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施例において、（Ａ）生後２ヶ月の若年野生型マウス（Fabp7 (+/+)）、（Ｂ）Fabp7ヘテロノックアウトマウス（Fabp7 (+/-)）、（Ｃ）Fabp7ノックアウトマウス（Fabp7 (-/-)）における、Fabp7タンパク質の蝸牛における発現を調べた結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、（Ａ）生後１２ヶ月の老齢野生型マウス（Fabp7 (+/+)）、（Ｂ）Fabp7ノックアウトマウス（Fabp7 (-/-)）における、Fabp7タンパク質の蝸牛における発現を調べた結果を示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、生後１２か月の（Ａ〜Ｇ）老齢野生型マウス（Fabp7 (+/+)）、（Ｈ〜Ｎ）Fabp7ノックアウトマウス（Fabp7 (-/-)）についての蝸牛の組織学的解析結果、ならびに（Ｏ〜Ｐ）生後１２か月および（Ｑ〜Ｒ）生後１５−２０ヶ月のFabp7 (+/+)マウス及びFabp7 (-/-)マウスにおける細胞の脱落レベルを示した図である。
【図４】本発明の一実施例において、生後１２ヶ月の（Ａ）野生型マウス（Fabp7 (+/+)）、（Ｂ）Fabp7ノックアウトマウス（Fabp7 (-/-)）について、頂回転におけるコルチ器の外有毛細胞（outer hair cell：OHC）数の解析結果、ならびに（Ｃ）生後７ヶ月および生後１２か月のFabp7 (+/+)マウスおよびFabp7 (-/-)マウスについて、細胞の脱落レベル（％）を示した図である。
【図５】本発明の一実施例において、生後７ヶ月（Ａ）、１２ヶ月（Ｂ）、１５−２０ヶ月（Ｃ）の野生型マウス（Fabp7 (+/+)）、Fabp7ヘテロノックアウトマウス（Fabp7 (+/-)）、Fabp7ノックアウトマウス（Fabp7 (-/-)）について、聴性脳幹反応（auditory brain-stem response：ABR）を用いて聴力閾値（Hearing threshold）を測定することによって、Fabp7ノックアウトマウスにおける加齢性難聴の発症および／または進行の遅延を示した図である。
【図６】本発明の一実施例において、生後２ヶ月の野生型マウス（Fabp7 (+/+)）、Fabp7ヘテロノックアウトマウス（Fabp7 (+/-)）、Fabp7ノックアウトマウス（Fabp7 (-/-)）について、音響曝露を行って一過性の難聴を引き起こした後、聴性脳幹反応（auditory brain-stem response：ABR）を用いて聴力閾値（Hearing threshold）を測定した結果を示した図である。Aは実験の模式図（ABRの後のアルファベットは、本図の対応するグラフを示す。）、Bは一過性閾値上昇（TTS）実験における音響暴露前の聴力閾値、CはTTS実験における音響曝露４時間後の聴力閾値変化、DはTTS実験における音響曝露７日後の聴力閾値変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１７】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１８】
＝＝加齢性難聴の発症および／または進行が遅延するモデル動物＝＝
本発明における難聴が生じにくいモデル動物は、脂肪酸結合タンパク質７型（fatty acid binding protein7：Fabp7）遺伝子のノックアウト動物である。ここで、難聴の原因は、特に限定されず、加齢による加齢性難聴であっても、騒音暴露による一過的・長期的・永久的難聴（本明細書では、総じて騒音性難聴と呼ぶ）であってもかまわない。なお、難聴とは、ある周波数の音に対し、有意に聴力が低下することを意味する。
【００１９】
この動物においては、加齢性難聴の発症および／または進行が遅れるという表現型が観察されることから、加齢性難聴の発症および／または進行が遅延するモデル動物として用いることができる。なお、加齢性難聴（ヒトでは老人性難聴）とは、老化に伴い進行する両側性の感音難聴のことである。
【００２０】
また、音響暴露による聴力閾値の一過的上昇が低減するという表現型が観察されることから、騒音性難聴が低減するモデル動物として用いることができる。
【００２１】
＜作製方法＞
このモデル動物は、動物個体において、Fabp7タンパク質の発現を抑制することによって作製することができる。  
ここで、動物の種類は、内耳の蝸牛を有するものであれば、特に限定されず、マウス、ラット、マーモセット、サルなどの実験動物を代表とする脊椎動物などが例示できる。  
Fabp7タンパク質の発現を抑制する方法は特に限定されず、内在性遺伝子を破壊するノックアウト法や、siRNAなどを利用したノックダウン法等が例示できる。いずれの方法でも、ほぼ完全に発現を抑制することが好ましい。  
Fabp7タンパク質の発現を抑制する組織は、体全体でもよいが、内耳の蝸牛においてのみ、発現を抑制してもかまわない。
【００２２】
＜利用方法＞
このモデル動物を用い、聴覚を司る内耳の蝸牛を解析することにより、加齢性難聴や騒音性難聴などの難聴の発症メカニズムを解明することが期待できる。例えば、マイクロアレイ法によって、正常な加齢性難聴や騒音性難聴などの難聴を生じる動物と異なる発現を示す遺伝子の候補を探索し、実際に、転写レベル、又はタンパク質レベルでの発現を詳細に調べてFabp7の下流の遺伝子を同定することによって、難聴を生じる遺伝子ネットワーク、とくに、加齢性難聴や騒音性難聴などの難聴の発症および／または進行における遺伝子ネットワークを明らかにすることができる。
【００２３】
また、このモデル動物を用い、メタボロミクス解析によって、加齢性難聴や騒音性難聴などの難聴のマーカーとなる物質（特に脂質代謝産物）をスクリーニングすることができる。例えば、このモデル動物において、CE/MS（キャピラリー電気泳動質量分析）法、LC/MS（液体クロマトグラフ質量分析）法、GC/MS（ガスクロマトグラフ質量分析）法などによって、正常な加齢性難聴を生じる動物と異なる量または濃度を示す化合物を探索し、特定された各化合物について、その血清中の濃度などと加齢性難聴や騒音性難聴などの難聴との相関を調べることによって、加齢性難聴や騒音性難聴などの難聴のマーカーを同定することができる。得られた化合物は、加齢性難聴や騒音性難聴などの難聴の発症や進行を促進または抑制する物質の候補にもなり得るため、加齢性難聴や騒音性難聴などの難聴の発症や進行を促進または抑制することを確かめることによって、そのような物質をスクリーニングすることができる。
【００２４】
このように、加齢性難聴や騒音性難聴などの難聴の発症メカニズムを解明することができれば、そのメカニズムに基づいて、更に、加齢性難聴や騒音性難聴などの難聴の発症予防薬および／または進行遅延薬の開発も期待できる。
【００２５】
＝＝加齢性難聴を遅延させる方法＝＝
Fabp7遺伝子のノックアウト動物においては、難聴が生じにくい、特に加齢性難聴の発症ならびにその進行が遅れる、音響暴露による聴力閾値の一過的上昇が低減するという表現型が観察される。従って、ヒトまたはヒト以外の動物において、Fabp7タンパク質の発現や機能を抑制することによって、難聴を生じにくくすること、特に加齢性難聴の発症および／または進行を遅延させることや、音響暴露による聴力閾値の一過的上昇を低減させることができる。ここで、脂肪酸結合タンパク質７型タンパク質の発現を抑制する方法は特に限定されず、siRNAなどを利用したノックダウン法等が例示できる。また、機能を抑制するには、Fabp7タンパク質の活性部位に結合する阻害抗体や低分子化合物などが考えられる。
【００２６】
そして、脂肪酸結合タンパク質７型タンパク質の発現を抑制する発現抑制剤や、機能を抑制する機能抑制剤は、難聴特に加齢性難聴や騒音性難聴などの発症予防剤および／または進行遅延剤、として利用できる。具体的には、アンチセンス核酸、siRNA、miRNA、shRNA、アプタマー、機能阻害抗体などが例示できる。そして、加齢性難聴や騒音性難聴などの難聴が生じる前から投与することで、加齢性難聴や騒音性難聴などの難聴の発症を予防することができ、加齢性難聴や騒音性難聴などの難聴が起こっても、その時点から投与することで、加齢性難聴や騒音性難聴などの難聴の進行を遅延させることができる。
【００２７】
投与方法は、その予防剤や遅延剤の有効成分によって異なり、核酸製剤の場合は、注射などによる直接投与が好ましく、低分子化合物の場合は、経口投与などによる間接投与が好ましいが、適宜、投与者が適切な投与方法を選べばよい。
【００２８】
＝＝難聴の発症を予防および／または進行を遅延させる化合物のスクリーニング方法＝＝
上述したような加齢性難聴や騒音性難聴などの難聴の発症予防剤および／または進行遅延剤は、Fabp7タンパク質の機能や発現を阻害する化合物をスクリーニングすることによって得られる。候補の化合物が、Fabp7タンパク質の機能または発現を阻害するかどうかを検出するためには、例えば、Fabp7タンパク質を発現している培養細胞に候補の化合物を投与し、Fabp7タンパク質の発現が低下することを検出すればよい。ここで、化合物としては、低分子化合物でもよく、核酸などの高分子化合物でもよい。
【００２９】
＝＝加齢性難聴のマーカー＝＝
本発明にかかる加齢性難聴のマーカーは、Fabp7遺伝子である。すなわち、Fabp7遺伝子の発現量またはFabp7タンパク質の発現量を調べることによって、加齢性難聴の発症および／または進行が、正常より早く進むか、遅延するか、あるいは、どの程度、正常より早く進むか、遅延するか、が予測可能になる。また、本発明にかかる騒音性難聴のマーカーは、Fabp7遺伝子である。すなわち、Fabp7遺伝子の発現量またはFabp7タンパク質の発現量を調べることによって、騒音性難聴が、どの程度生じるか、が予測可能になる。
【００３０】
その発現量を調べるサンプルは、Fabp7遺伝子またはFabp7タンパク質が発現していれば特に問題なく、蝸牛であっても良いが、非侵襲性からは血液や尿であることが好ましい。
【実施例】
【００３１】
（１）Fabp7タンパクの蝸牛における発現
生後２ヶ月（図１）ならびに生後１２か月（図２）のFabp7ノックアウトマウス（Fabp7 (-/-)）、Fabp7ヘテロノックアウトマウス（Fabp7 (+/-)）及び野生型マウス（Fabp7 (+/+)）を４％パラホルムアルデヒドで灌流固定し、蝸牛を摘出した。同固定液で浸漬固定し、10％EDTAで脱灰の後、OTCコンパウンドに包埋し凍結切片を作成した。その後、抗Fabp7抗体（Kurtz et al., Development vol.120, p.2637-2649, 1994 ）を用いて免疫染色を行った。【００３２】
過去の報告と同様に、Fabp7タンパク質は、蝸牛神経節（spiral ganglion：SG）における衛星細胞（satellite cells）、らせん板縁（spiral limbus：SLim）における線維細胞（fibrocytes）、コルチ器（organ of Corti：OC）における支持細胞（inner phalangeal cell：IPC、outer border cell of Hensen：OBCH）で発現が検出された。【００３３】
図１のＡ、Ｂ、Ｃは同一条件で染色・撮影したものであり、図１に示すように、Fabp7 (+/+)で認めたFabp7タンパクの発現が、Fabp7 (+/-)では半分程度に減弱し、Fabp7 (-/-)では消失していることが確認された。また、図２に示すように、老齢Fabp7 (+/+)の蝸牛では、若年マウスと同様にFabp7タンパク質が発現していたが、やはりFabp7 (-/-)ではその発現が消失していた。【００３４】
（２）Fabp7ノックアウトマウスにおける線維細胞及び神経細胞の残存
生後１２ヶ月ならびに生後１５か月のFabp7ノックアウトマウス（Fabp7 (-/-)）及び野生型マウス（Fabp7 (+/+)）を４％パラホルムアルデヒド（生後１２か月）またはブアン固定液（生後１５か月）で灌流固定し、蝸牛を摘出した。同固定液で浸漬固定し、１０％ＥＤＴＡで脱灰の後、ＯＴＣコンパウンドに包埋し凍結切片を作成した。その後ＨＥ染色を行い、内耳形態を評価した。図３Ａ〜Ｎに、生後１２ヶ月のマウスにおける全体像、及び、頂回転（apical turn）、中回転（middle turn）、基底回転（basal turn）の各拡大像を示す。【００３５】
生後１２ヶ月のFabp7 (+/+)の蝸牛（図３Ａ〜Ｇ）においては、らせん板縁（spiral limbus：SLim）の線維細胞（fibrocyte）や蝸牛神経節（spiral ganglion：SG）の神経細胞（Neuron）の脱落を認めたが、Fabp7 (-/-)の蝸牛（図３Ｈ〜Ｎ）では軽度であった。【００３６】
次に、ラセン板縁（SLim）における線維細胞及び蝸牛神経節（SG）における神経細胞の細胞数を計測した（図１Ｏ〜Ｒ）。細胞数は、各回転につき１個体あたり３切片を計測し、単位面積（1mm2）当たりの細胞数としてその平均を算出した。ラセン板縁においては、生後１２か月の頂回転と生後１５か月の基底回転において、Fabp7 (-/-)の線維細胞の細胞数が、Fabp7 (+/+)の細胞数より有意に多く残存していた。蝸牛神経節においては、生後１２か月の基底回転と生後１５か月の頂回転・中回転で、Fabp7 (-/-)の神経細胞の細胞数が、Fabp7 (+/+)の細胞数より有意に多く残存していた。このように、Fabp7 (-/-)では、老化に伴う蝸牛の変性が軽度な状態にとどまり、神経細胞や線維細胞の脱落が抑制されていた。【００３７】
（３）Fabp7ノックアウトマウスにおける有毛細胞の残存
生後７ヶ月ならびに生後１２か月のFabp7ノックアウトマウス（Fabp7 (-/-)）及び野生型マウス（Fabp7 (+/+)）を４％パラホルムアルデヒドで灌流固定し、蝸牛を摘出した。同固定液で浸漬固定し、１０％ＥＤＴＡで脱灰した。ファロイジン・ローダミンにて有毛細胞を染色した後にコルチ器を摘出し、スライドガラス上にマウントした（surface preparation法）。頂回転における外有毛細胞（outer hair cell）数を測定し、予測される外有毛細胞数（内有毛細胞１個あたり、外有毛細胞は３個存在すると予測される）に対する欠損率を測定した。外有毛細胞10個×3列を一視野とし、３視野以上観察しその平均を算出した。図４Ａに、生後１２か月のFabp7 (+/+)、図４Ｂに生後１２か月のFabp7 (-/-)マウスの外有毛細胞形態を示す。そして、図４Ｃに外有毛細胞の欠損率（OHC loss）を示す。【００３８】
Fabp7 (+/+)マウスでは、ランダムに生じる細胞死による細胞の欠損のため、外有毛細胞形態が崩れており（図４Ａ）、Fabp7 (-/-)マウスでは、外有毛細胞形態が整然と並んでいる（図４Ｂ）ことが確認された。また、図４Ｃで示したように、定量的にも、生後７か月、１２か月ともに、Fabp7 (-/-)の外有毛細胞の欠損率は、Fabp7 (+/+)の外有毛細胞の欠損率よりも少なかった。このように、Fabp7 (-/-)では、老化に伴う有毛細胞の脱落が抑制された。【００３９】
（４）Fabp7ノックアウトマウスにおける加齢性難聴の発症および／または進行の遅延
生後７ヶ月、12ヶ月、15−20ヶ月のFabp7ノックアウトマウス（Fabp7 (-/-)）、Fabp7ヘテロノックアウトマウス（Fabp7 (+/-)）及び野生型マウス（Fabp7 (+/+)）に対し、聴性脳幹反応（auditory brain-stem response：ABR）を用いて聴力閾値を測定した（図５A〜C）。キシラジン・ケタミンにて麻酔を施行したのち、tone burstの刺激音を用いて、4, 8, 12, 16, 32kHzの５周波数で聴力閾値を測定した。【００４０】
生後７ヶ月では、図５Aに示すように、Fabp7 (+/+)では、32kHzという高音域の聴力閾値が上昇していたが、Fabp7 (-/-)では、聴力閾値の上昇は見られなかった。生後12ヶ月では、図５Bに示すように、Fabp7 (+/+)では、音の全域に渡って聴力閾値が上昇していたが、Fabp7 (-/-)では、聴力閾値の上昇は見られず、Fabp7 (+/-)では、野生型個体とホモノックアウト個体の中間レベルで聴力閾値が上昇していた。生後15-20か月では、図５Cに示すように、Fabp7 (-/-)の聴力閾値はFabp7 (+/+)の聴力閾値に比較し全体に低値であったが、特に16、32kHzでは有意に低値に保たれていた。【００４１】
生後12ヶ月の解析結果（図５B）と、Fabp7 (+/-)ではFabp7タンパク質の発現が半分程度に減弱していたという結果（図１A-C）をふまえ、正常なFabp7遺伝子座の数に比例して、聴力の低下を生じることがわかる。従って、Fabp7タンパク質は、加齢性難聴の発症および／または進行のレベルを示す量的マーカーになり得る。【００４２】
（５）Fabp7ノックアウトマウスにおける一過性聴力閾値上昇の低減
本実施例では、生後２ヶ月齢（９−１２週齢）のFabp7ノックアウトマウス（Fabp7 (-/-)）、及び野生型マウス（Fabp7 (+/+)）に対し、音響曝露を行った後、聴性脳幹反応（auditory brain-stem response：ABR）を用いて聴力閾値を測定し、一過性閾値上昇（TTS）を調べた。具体的には、以下の通りである。【００４３】
まず、音響曝露については、無麻酔のマウスを防音箱（特注品、KAWAI）内に設置した金網ケージにいれ、騒音発生装置 (SF-06, RION)、周波数フィルター (3611, NF)、パワーアンプ (D-75A, Crown) およびスピーカー(2446H, JBL)で作成した過大音響を、8−10 kHzのバンドノイズを89 dB SPLの音圧で２時間曝露（A-D）するという条件で曝露した。【００４４】
ABRは、音響曝露前後にキシラジン・ケタミンにてマウスに麻酔したのち、tone burstの刺激音を用いて、4, 8, 12, 16, 32kHzの５周波数で測定した。一過性閾値上昇（TTS）を調べるため、ABRを音響曝露前（B）、曝露４時間後、曝露７日後に測定し、曝露前後の聴力閾値の変化を計算した（C, D）。【００４５】
図６Ｂに示すように、音響曝露前の状態では、生後２ヶ月齢（９−１２週齢）の段階で、すでにFabp7 (+/+)で32kHzの聴力閾値が上昇していたが、Fabp7 (-/-)では、聴力閾値の上昇は見られなかった。その他の周波数では、聴力閾値の差を認めなかった。【００４６】
曝露４時間後においてFabp7 (+/+)の聴力閾値が全音域にわたって上昇していたが、Fabp7 (-/-)では、聴力閾値の上昇が8、12、16、32 kHzで有意に軽度であった（図６Ｃ）。曝露7日後においては、Fabp7 (-/-)では全音域にわたって聴力閾値が曝露前同等に改善していたが、Fabp7 (+/+)の32kHzでは聴力閾値の改善が乏しい傾向があった（図６Ｄ）。【００４７】
このように、Fabp7の欠損により音響暴露による一過性閾値上昇が低減する。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明によって、難聴が生じにくいモデル動物を提供できるようになった。
【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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