(57)【要約】  糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを膵臓癌を検出するためのマーカーとして用いると、膵臓癌を慢性膵炎患者や健常者とを区別して特異的に判定することができる。また、手術後の膵臓癌患者の予後の状況をモニターすることができる。更には、他の膵臓癌マーカー、例えば、ＣＡ１９−９などと組み合わせて用いることにより、慢性膵炎患者や健常者とを区別してより特異的に判定することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲからなる、膵臓癌を検出するためのマーカー。
【請求項２】
慢性膵炎又は健常者と区別して膵臓癌を検出するための請求項１記載のマーカー。
【請求項３】
検体中の糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに基づいて膵臓癌を検出するために、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定する方法。
【請求項４】
検体中の糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの測定を免疫測定法、電気泳動法、質量分析法または液体クロマトグラフィー法により行う、請求項３記載の方法。
【請求項５】
検体中の糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定し、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの量を膵臓癌の検出に相関させることを含む、膵臓癌を検出するための方法。
【請求項６】
Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに加えてＣＡ１９−９の量を膵臓癌の検出に相関させることを含む、請求項５記載の膵臓癌を検出するための方法。
【請求項７】
糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの、膵臓癌を検出するためのマーカーとしての使用。
【請求項８】
慢性膵炎又は健常者と区別して膵臓癌を検出するためのマーカーである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定するための試薬を含む、膵臓癌検出用試薬キット。
【請求項１０】
糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに対する抗体を含む、請求項９記載の膵臓癌検出用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓癌を検出するためのマーカーに関する。更に詳細には、本発明は、慢性膵炎又は健常者と区別して膵臓癌を検出するためのマーカー、膵臓癌を検出するために特定の糖蛋白質を測定する方法、膵臓癌を検出するための方法、特定の糖蛋白質の膵臓癌検出マーカーとしての使用、膵臓癌検出用試薬キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝胆膵領域の悪性腫瘍、特に膵臓癌は消化器癌の中で最も予後不良の癌として知られ、その主な理由は、周囲臓器への浸潤・転移しやすいため診断されたとき既に進行癌となり切除率が低く、さらに有効な補助療法が確立されていないことがあげられる。したがって、唯一根治が期待できる外科切除の効率を向上されるためにも、膵臓癌の特異的診断マーカーを同定することが急務であり、その蛋白質を標的とした分子標的治療薬を開発すること、さらにより高い治療効果を得るために個別化治療を行うことで治療成績の向上を図ることが重要である。
膵臓癌マーカーとしては、ＣＡ１９−９が知られている（非特許文献１）。また、ヒトハプトグロビンのフコシル化糖鎖を膵臓癌マーカーとして用いることも提案されている（特許文献１）。しかしながら、これらのマーカーは感度や特異性の点で十分なものとは必ずしも言えず、さらに、新たな膵臓癌マーカーの開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−１６８４７０号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５３巻，１９７−２０２頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような環境下にあって、本発明は、膵臓癌を検出するためのマーカー、特に、慢性膵炎又は健常者と区別して膵臓癌を検出するためのマーカーを提供することを目的とする。更に、本発明は、膵臓癌を検出するために特定の蛋白質を測定する方法、および膵臓癌を検出するための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、感度や特異性の点で優れた新たな膵臓癌マーカーの開発を目的として、現在までに肝胆膵領域におけるいくつかの癌特異的蛋白質の同定をプロテオミクスの手法を用いて行ってきた。そして、低侵襲かつ汎用性の高い検体である血清をサンプルとし、糖蛋白質抽出とＴＭＴ試薬（ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｔａｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）を用いることによって膵臓癌に対する血清中の特異的糖蛋白質の同定を定量的に行ない、慢性膵炎又は健常者と区別して膵臓癌を検出するための新たなマーカーを見出し、本発明を完成させた。【０００７】
したがって、本発明は、
［１］．糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲからなる、膵臓癌を検出するためのマーカー；
［２］．慢性膵炎又は健常者と区別して膵臓癌を検出するための上記［１］記載のマーカー；
［３］．検体中の糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに基づいて膵臓癌を検出するために、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定する方法；
［４］．検体中の糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの測定を免疫測定法、電気泳動法、質量分析法または液体クロマトグラフィー法により行う、上記［３］記載の方法；
［５］．検体中の糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定し、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの量を膵臓癌の検出に相関させることを含む、膵臓癌を検出するための方法；
［６］．Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに加えてＣＡ１９−９の量を膵臓癌の検出に相関させることを含む、上記［５］記載の膵臓癌を検出するための方法；
［７］．糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの、膵臓癌を検出するためのマーカーとしての使用；
［８］．慢性膵炎又は健常者と区別して膵臓癌を検出するためのマーカーである、上記［７］に記載の使用；
［９］．糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定するための試薬を含む、膵臓癌検出用試薬キット；および
［１０］．糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに対する抗体を含む、上記［９］記載の膵臓癌検出用試薬キット
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の膵臓癌を検出するためのマーカーとして、糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡ、ＰＩＧＲを用いると膵臓癌の可能性を、慢性膵炎患者や健常者とを区別して特異的に判定することができる。また、手術後の膵臓癌患者の予後の状況をモニターすることができる。更には、他の膵臓癌マーカー、例えば、ＣＡ１９−９などと組み合わせて用いることにより、慢性膵炎患者や健常者とを区別してより特異的に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】各種血清検体からの蛋白質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる検査結果を示す。
【図２】各種血清検体についてのＥＬＩＳＡ法によるＣ４ＢＰＡの測定結果を示す。
【図３】各種血清検体についてのＥＬＩＳＡ法によるＰＩＧＲの測定結果を示す。
【図４】膵臓癌の診断におけるＣ４ＢＰＡ、ＰＩＧＲおよびＣＡ１９−９のＲＯＣ曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に、本発明を更に詳細に説明する。
本発明により、健常者、慢性膵炎患者および膵臓癌患者（手術前および手術後）から採取した血清検体について、糖蛋白質抽出とＴＭＴ試薬を用いることによって膵臓癌に対する血清中の特異的糖蛋白質の同定を定量的に行った結果、健常者、慢性膵炎患者および膵臓癌患者（手術後）からの血清に比べて、膵臓癌患者（手術前）からの血清に、高レベルで、糖蛋白質であるＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲが存在することが明らかとなり、したがって、Ｃ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲが膵臓癌マーカーとなり得ることが見出された。
【００１１】
本発明の膵臓癌を検出するためのマーカーは、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲからなる。Ｃ４ＢＰＡすなわちＣ４ｂ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ  ｃｈａｉｎは、ＵｎｉＰｒｏｔのアクセション番号がＰ０４００３で表される糖蛋白質である（http://www.uniprot.org/uniprot/P04003）。Ｃ４ＢＰＡは、補体活性化の古典経路を制御している。Ｃ４ＢＰＡはＣ３ｂＩＮＡの補因子であり、補体断片Ｃ４ｂを加水分解する。さらに、Ｃ４ｂＣ２ａ複合体、補体断片Ｃ２ａの分解を促進する機能を有する（Barbosa et al., Infection and Immunity, Mr. 2009, p.1137-1143; Dahlback et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.80, pp.3461-3465, June 1983）。
一方、ＰＩＧＲすなわちＰｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒは、ＵｎｉＰｒｏｔのアクセション番号がＰ０１８３３で表される糖蛋白質である（http://www.uniprot.org/uniprot/P01833）。ＰＩＧＲは、上皮細胞の基底外側表面で重合体のＩｇＡおよびＩｇＭと結合する。結合した複合体はその切断の過程で膜貫通領域から細胞外に輸送される(Deitcher et al., The Journal of Cell Biology, Volume 102, March 1986, 911-919; Asano et al., Journal of Oral Science, Vol.53, No.2, 147-156, 2011)。
【００１２】
本発明の膵臓癌を検出するためのマーカーは、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲからなる。特に、本発明のマーカーは、慢性膵炎又は健常者と区別して膵臓癌を検出することができる。
本発明の測定する方法においては、検体中のＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに基づいて膵臓癌を検出するために、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定する。
本発明においては、検体中のＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定し、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの量を膵臓癌の検出に相関させることにより、膵臓癌を検出することができる。検体中のＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを実際に測定するに際しては、糖蛋白質としてのＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定してもよく、また、例えば、検体処理などで糖蛋白質から糖鎖が除去された、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲのアミノ酸配列部分を測定してもよい。
本発明においては、例えば、膵臓癌が疑われる患者や膵臓癌の術後患者から採取された検体中のＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲのレベルを測定して、膵臓癌の罹患可能性や予後の状況を判断することができる。この場合、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲのレベルが健常者のレベルに比べて高い場合には、膵臓癌を検出した可能性が高いとすることができ、また、術後の膵臓癌患者の検体中においてＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲのレベルが低下した場合には、膵臓癌の予後が良好とすることができる。
本発明では、他の膵臓癌マーカー、例えば、ＣＡ１９−９などと組み合わせて用いることにより、慢性膵炎患者や健常者とを区別してより特異的に膵臓癌を検出することができる。
【００１３】
本発明で用いることができる検体としては、膵臓癌が疑われる患者や膵臓癌の術後患者から採取された血清、血漿、血液、尿などが挙げられる。
【００１４】
Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定するためには現在既知のあらゆる方法を採用することができる。例えば、免疫測定法、電気泳動法、質量分析法、液体クロマトグラフィー法などが挙げられる。
【００１５】
免疫測定法としては、例えば、免疫比濁測定法、酵素免疫測定法などが挙げられる。免疫測定法は、従来知られている蛋白質を抗原として測定する免疫測定法において、抗体として抗Ｃ４ＢＰＡ抗体または抗ＰＩＧＲ抗体であるポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いることにより実施することができる。抗Ｃ４ＢＰＡ抗体または抗ＰＩＧＲ抗体としては、市販品の抗体を用いることができ、また、周知の方法により、製造することもできる。これらの抗体としては、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲのアミノ酸配列の構造を特異的に認識するものでもよく、糖鎖を含む全体構造を特異的に認識するものでもよい。
免疫比濁測定法においては、検体中のＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲと、抗Ｃ４ＢＰＡ抗体または抗ＰＩＧＲ抗体とを反応させて抗原抗体反応させ、その結果、発生する濁りの度合いからＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの濃度を測定するものであれば、とくに限定されない。そのような方法として、ＴＩＡ 法、ラテックス免疫比濁法、ネフェロメトリー法を例示することができる。ＴＩＡ法は、免疫比濁測定法において濁りの度合いを、例えば、３４０ｎｍから８００ｎｍの吸光度で測定する方法である。また、ラテックス免疫比濁法は、免疫比濁測定法において、抗体として抗Ｃ４ＢＰＡ抗体または抗ＰＩＧＲ抗体をラテックス粒子に結合させたものを用いて測定する方法である。さらに、ネフェロメトリー法は、免疫比濁測定法において濁りの度合いを、一定角度以上の大きさに散乱した光を集めて散乱光として測定する方法である。
酵素免疫測定法としては、プレートを支持体としたＥＩＡ法を挙げることが出来る。以下に具体的に記述する。はじめにポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ナイロン、ポリメタクリレートなどのそれ自体公知である固相に直接または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーを利用して抗Ｃ４ＢＰＡ抗体と抗ＰＩＧＲ抗体を一次抗体として結合させる。感作抗体量は、例えば、通常、１ｎｇから１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００１６】
Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを酵素免疫測定法で測定する場合には、例えば、物理結合や化学結合、アフィニティーなどによって固相に結合した一次抗体に、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定するための検体を加えて反応させる。一定時間、反応させた後、固相を洗浄し二次標識抗体を加えて二次反応させる。固相を再度洗浄し、固相に結合した標識部分を測定する。
【００１７】
以上に説明した免疫測定法においては、抗Ｃ４ＢＰＡ抗体または抗ＰＩＧＲ抗体の代わりに、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの糖鎖を特異的に認識しそれらと結合・架橋する蛋白質、すなわち特異的結合パートナーであるレクチンを用いることができる。レクチンとしては、フコースを特異的に認識するレクチンが好ましく、例えば、Ｌ−フコースを持つ糖鎖と結合するヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）などが挙げられる。この場合、例えば、レクチンと抗Ｃ４ＢＰＡ抗体または抗ＰＩＧＲ抗体とを用い、それぞれ、固相に結合した特異的結合パートナーおよび標識された特異的結合パートナーのいずれかとして組み合わせ、サンドウイッチ法で測定することも可能である。
【００１８】
これらの抗体やレクチンなどの特異的パートナーを用いる免疫測定法において、標識物質には西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）アルカリホスファターゼなどの酵素を用いることができる。例えば、ＨＲＰ標識抗体を利用した場合には基質に既知のＤＡＢ、ＴＭＢ、ＯＰＤなどを用いることができる。また、標識物質には、ＨＲＰのような酵素だけではなく、金コロイド、ユーロピウムなどの標識金属やＦＩＴＣ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ、ＧＦＰ  などの化学的、生物的各種蛍光物質、３２Ｐ、５１Ｃｒ  などの放射性物質など標識可能なあらゆる物質が挙げられる。また、本発明で標識物質を用いる場合、アビジン−ビオチン系またはストレプトアビジン−ビオチン系を用いることもできる。
【００１９】
電気泳動法としては、一般的にはＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を挙げることができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法はポリアクリルアミドで出来たゲル中に蛋白質を泳動させることで、一定時間での移動度と蛋白質を構成するアミノ酸の数、すなわち、分子量が比例することから、蛋白質を分類する方法である。そのほかにもセルロース・アセテートを支持体としたものなどがある。蛋白質の染色にはクマシー・ブリリアント・ブルー、ポンソーＳ染色、アミドブラック染色、直接酵素活性を利用する方法などがある。例えば一定量の検体と一般的なサンプルバッファーを一定の割合で１：１で混合し、加熱処理する。一般的には沸騰水中で５分程度処理される。その後、サンプルをゲルにアプライする。ポリアクリルアミド電気泳動は低電流で流すことがよい結果につながる。一般的には、５〜１００ｍＡ程度である。電気泳動後に上記試薬にて染色を行い酢酸、メタノール、水混合液よりなる脱色液にて処理するとＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲのバンドが確認できる。そのバンドの強弱により、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲのレベルを測定できる。
【００２０】
また、ウエスタンブロッティング法による検出も有効である。すなわち、電気泳動をしたゲルをニトロセルロース膜やＰＶＤＦ膜等に転写し、次いで、一次抗体である抗Ｃ４ＢＰＡ抗体または抗ＰＩＧＲ抗体、さらに、二次標識抗体であるＨＲＰ標識抗ＩｇＧを反応させ、次いで、ＨＲＰ発色試薬（Ｗａｋｏ）で発色させ、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに相当するバンドの発色度合いにより、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定することができる。
【００２１】
質量分析法としては、最近開発が急に進んでいる質量分析器を使用した分析方法を挙げることができる。例えば、表面増強レーザー脱離イオン化（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法）、マトリックス支援レーザーイオン化（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法）、ＥＳＩ法（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を用いる方法を例示できる。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法は、チップ表面の官能基に目的物質を均一に捕捉したまま不純物を除去し、レーザー光でイオン化するため、再現性のあるＳ／Ｎ比の高いイオンスペクトルが得られるので好ましい。
【００２２】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法の場合、通常、検体を前処理した後、チップに吸着させて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ質量計に付す。検体が血清の場合、アルブミンの吸着剤を用いるか、イオン交換チップでアルブミンが電荷をもたなくなるまでバッファーで洗浄してアルブミンを系から除去することが好ましい。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法に使用する蛋白質を結合させるチップとしては、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの蛋白質を吸着できるチップであれば特に種類を限定されない。疎水性やイオン交換などの蛋白質に親和性を持つ官能基が修飾されているチップ（ケミカルチップともいう）、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに対する抗体を固定化したチップ（バイオケミカルチップ）等を例示できる。
【００２３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法は、検体にレーザー光を吸収する化合物を混合し，数ナノ秒という短時間のレーザー光を照射することで検体中の蛋白質をイオン化して、測定するものである。蛋白質を結合させるチップとしては、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法に使用するチップと同様のものを用いることができる。ＥＳＩ法等の場合は、プロテアーゼ処理等の前処理した検体を、高速液体クロマトグラフィー等の分離手段と直結した質量分析計に付することが好ましい。
【００２４】
好ましい実施形態では、別々に検出可能な同位体標識Ｃ４ＢＰＡまたは同位体標識ＰＩＧＲが内部標準物質として試料に添加される。これらの実施形態では、試料中に存在する内因性Ｃ４ＢＰＡや内因性ＰＩＧＲと内部標準物質の両方の全部または一部は、イオン化され質量分析計において検出可能な複数のイオンを生成し、それぞれから生成された１つ以上のイオンが質量分析法によって検出される。関連実施形態では、同位体標識Ｃ４ＢＰＡや同位体標識ＰＩＧＲは、13Ｃおよび15Ｎ同位体標識バリン、アルギニン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニン、プロリンサブユニット、またはそれらの組み合わせを含んでいてもよい。さらに好ましい実施形態では、同位体標識Ｃ４ＢＰＡまたは同位体標識ＰＩＧＲは、炭素原子が13Ｃ同位体と置換され、または窒素原子が15Ｎ同位体と置換されており、内因性Ｃ４ＢＰＡや内因性ＰＩＧＲは、天然のＣ４ＢＰＡやＰＩＧＲと比較して質量の増加をもたらす。好ましい関連実施形態では、同位体標識は、炭素原子の一部または全部が13Ｃ同位体と置換され、窒素原子の一部または全部が15Ｎ同位体と置換されているアミノ酸サブユニットを有する。この同位体標識Ｃ４ＢＰＡまたは同位体標識ＰＩＧＲの質量は、通常、天然のものより高い。
【００２５】
好ましい実施形態では、Ｃ４ＢＰＡイオンまたはＰＩＧＲイオンの有無および／または量は、内部標準物質との比較によって、検体中の量と関連付けられる。
液体クロマトグラフィー法は、当業者にとって周知の方法であり、本発明では、これら周知の方法を採用することができる。例えば、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの糖鎖を特異的に認識しそれらと結合・架橋する蛋白質であるレクチン、例えば、Ｌ−フコースを持つ糖鎖と結合するヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）を支持体とするアフィニティカラムを用いた液体クロマトグラフィー法などが挙げられる。
【００２６】
本発明では、以上に説明した各種の測定法を行うための、糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定するための試薬を含む膵臓癌検出用試薬キットも提供される。これらのキットには、測定法に応じて、各種の試薬を構成成分として含有させることができる。例えば、免疫測定法を行うために、糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲに対する抗体を含有させることができる。これらの抗体としては、市販品の抗体を用いることもでき、また、周知の方法により、製造することもできる。これらの抗体としては、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲのアミノ酸配列の構造を特異的に認識するものでもよく、また、糖鎖を含む全体構造を特異的に認識するものでもよい。キットには、更に、標識物質の発色系試薬など、実施する測定法に応じて、周知の試薬を含有させることができる。
【実施例】
【００２７】
以下に好ましい実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例等により何ら限定されるものではない。
実施例１
膵臓癌マーカーの同定
健常者４５名、慢性膵炎患者２５名、膵臓癌患者５７名から採取した血清検体を用いて、膵臓癌マーカーの探索し、さらに同定を行った。【００２８】
Ａ．方法
１．対象の血清
健常者４５名、慢性膵炎患者２５名、膵臓癌患者５７名から採取した血清検体を、膵臓癌マーカーの探索および同定のための血清に用いた。【００２９】
２．各プール血清からの糖蛋白質の抽出
３種のプール血清として、健常者、慢性膵炎患者、膵臓癌患者（手術前・手術後）の血清を、それぞれ、ランダムに各５名ずつ抽出しプールして得た。
フコース特異的レクチンで、Ｌ−フコースを持つ糖鎖と結合するヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）を用いた糖蛋白質の検索キットであるＶＥＣＴＲＥＸ  ＡＡＬ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用して、各プール血清から糖蛋白質の抽出を行った。
ＡＡＬビーズ２０μＬにプール血清２０μＬを入れ、１時間インキュベーションした後、１２０００ｘｇで１分間遠心し、上清を捨てた。残りに、ＴＥＮＴ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０；１０ｍＭ  ＥＤＴＡ；１．５Ｍ  ＮａＣｌ；１．０％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０）８０μLを入れ混合した後、１２０００ｘｇで１分間遠心し、上清を捨てた。残りにＥｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（１．２５ＭＬ−ｆｕｃｏｓｅ；ＴＥＮＴ  ｂｕｆｆｅｒ）２０μＬを入れ混合した後、室温で１時間インキュベーションし、１２０００ｘｇで１分間遠心後、上清を回収し、各プール血清から糖蛋白質を抽出し、３種類のラベル化用サンプルを得た。【００３０】
３．糖蛋白質のラベル化
ラベル化用サンプルのラベル化は、ＴＭＴ  Ｍａｓｓ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｋｉｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を使用した。
ＴＭＴ（Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｔａｇ）試薬を用いた、この方法では、各プール血清中の特定の糖蛋白質を、物理的性質は同じで分子量が異なるようにタグをつけることができる。その結果、この方法により、複数のラベル化サンプルを混合することにより各サンプルの特定の糖蛋白質の存在比を定量することができる。具体的な糖蛋白質のラベル化の実施を以下に示す。
上記２で得たラベル化用サンプル２０μＬ（血清  ２０μＬ相当）をＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ  Ｌｅｃｔｉｎ）ビーズ処理し、次いで  ５０ｍＭ  ＴＥＡＢ（Ｔｒｉｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）６０μＬ、２％  ＳＤＳ５μＬと２００ｍＭ  ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）５μＬを入れて５５℃で１時間インキュベーションし、さらに３７５ｍＭ  ヨードアセトアミド５μＬを加えて室温で３０分間、静置した。その後、得られる各サンプルに１００％アセトニトリル４２μＬで可溶化した各質量のＴＭＴ試薬４０μＬを加え、室温で１時間インキュベーションし、さらに５％  Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ８μＬを加えて、室温で１５分静置して反応を停止した。その後、各サンプルを冷アセトンにて洗浄し、再び凍結乾燥をして糖蛋白質のラベル化済みサンプルを得た。【００３１】
４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の同定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとして、１０−２０％のグラディエントゲル（ＤＲＣ社）を使用した。レーン１は、健常者プール血清、慢性膵炎患者プール血清、膵臓癌患者プール血清を前処理したラベル化済み糖蛋白質を混合したサンプルを流し、レーン２は、健常者プール血清、膵臓癌患者（手術前）、膵臓癌患者（手術後）プール血清を前処理したラベル化済み糖タンパク質を混合したサンプルを流した。なお、レーン１では、健常者、慢性膵炎患者、膵臓癌患者（手術前）由来のサンプルに対し、マス・レポーターとして、それぞれＴＭＴ−１２６、ＴＭＴ−１２７、ＴＭＴ−１２８のタグを用いた。また、レーン２では、健常者プール血清、膵臓癌患者（手術前）、膵臓癌患者（手術後）由来のサンプルでは、それぞれＴＭＴ−１２６、ＴＭＴ−１２７、ＴＭＴ−１２８のタグを用いた。
電気泳動後のゲルは、クーマシー染色を行い、タンパク質バンドを検出した（図１）。各レーンを１８分割にゲルから切り出し、トリプシンを用いてゲル内消化を行った。得られた消化断片はＨＰＬＣを用いて分離し、ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）でＭＳ／ＭＳ測定した。測定データはＭａｓｃｏｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｅｎｇｉｎｅ  （Ｍａｔｒｉｘ  ｓｃｉｅｎｃｅ社）にてデータベース検索を行い、タンパク質を同定した。各プール血清の蛋白質の定量比較はＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）で行った。【００３２】
Ｂ．結果
質量分析装置にて検体中のタンパク質存在量を定量比較した結果を表１に示す。【００３３】
【表１】
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【００３４】
表１に示した結果から、膵臓癌患者プール血清（手術前）と健常者プール血清の比率が１．５以上、膵臓癌患者プール血清（手術後）と健常者プール血清の比率が１．５以下であり、かつ、慢性膵炎患者プール血清と健常者プール血清の比率が１．５以下であり、膵臓癌患者プール血清と健常者プール血清の比率が１．５以上であるタンパク質をスクリーニングして、Ｃ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲを同定した。
Ｃ４ＢＰＡ、ＰＩＧＲが、膵臓癌マーカーとして膵臓癌（手術前）患者を健常者や慢性膵炎患者や膵臓癌（手術後）患者と区別するという点、また、手術後の膵臓癌患者と健常者のデータの差が小さい点、さらに手術前の膵臓癌患者と健常者のデータの差が大きい点で、従って膵臓癌患者の手術前後でデータの差が大きい点で特に良好な結果が得られ、これらの結果から、Ｃ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲが、膵臓癌マーカーとして好適であることが明らかとなった。
他方、Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９、Ｉｎｔｅｒ−ａｌｐｈａ−ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  Ｈ３については、健常者と膵臓癌患者のデータに差が見られたものの、上記基準によるスクリーニングでは手術前後にてデータの差が見られず、マーカー候補から除外した。【００３５】
実施例３
Ｃ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲの膵臓癌マーカーとしての有用性
Ｃ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲの膵臓癌マーカーとしての有用性を、抗Ｃ４ＢＰＡ抗体または抗ＰＩＧＲ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により検体中のＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの測定を行って検証した。また、診断用テストやスクリーニングテストの精度評価や従来法との比較のために通常よく行われているＲＯＣ曲線による評価によっても、Ｃ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲの膵臓癌マーカーとしての有用性を検証した。【００３６】
１．ＥＬＩＳＡによるＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの測定
（１）方法
特に膵臓癌マーカーとしてのデータが良好だったＣ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲについて、種々の検体に対しＥＬＩＳＡ測定を行った。Ｃ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲは、それぞれ、Ｃ４  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  α  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｕｓｃｎｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｕｓｃｎｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて測定した。
ＥＬＩＳＡキットによる測定は、メーカーのプロトコルに従い実施した。詳細には、抗Ｃ４ＢＰＡ抗体、もしくは抗ＰＩＧＲ抗体をマイクロタイタープレートに一次抗体として固相化させ、その抗体に希釈検体を添加してインキュベーションを行なった。次いで、そのプレートを洗浄した後、ＨＲＰ標識した抗Ｃ４ＢＰＡ抗体または抗ＰＩＧＲ抗体を加えて反応させ、インキュベーションを行なった。さらにプレート洗浄後、ＴＭＢを添加して発色反応を行い、反応停止液を添加後にｉＭａｒｋＴＭ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて４５０ｎｍで測定を行った。そのデータを、あらかじめ作成しておいた検量線と比較し、検体中のＣ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを測定した。統計処理には、ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １８  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＳＰＳＳ社）を使用した。２標本検定はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔを用いて評価し、ｐ＜０．０５で有意な違いがあると判断した。【００３７】
（２）結果
Ｃ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲの結果を、それぞれ図２および図３に示す。
図２に示す結果から、Ｃ４ＢＰＡでは、健常者（ＨＶ）、慢性膵炎患者（ＰＴ）、膵臓癌患者（手術前）（ＰａＣａ）で、それぞれ３０８．２±８９．３μｇ／ｍＬ、３０３．３±７８．３μｇ／ｍＬ、４４５．２±１２４．６μｇ／ｍＬ、であり、健常者、慢性膵炎患者に対して膵臓癌患者で、ｐ＜０．００１と有意な違いがみられた。従って、Ｃ４ＢＰＡが、膵臓癌（手術前）患者を、健常者や慢性膵炎患者と区別するという点で、膵臓癌マーカーとして有用であることが示された。
図３に示す結果から、ＰＩＧＲでは、健常者（ＨＶ）、慢性膵炎患者（ＰＴ）、膵臓癌患者（ＰａＣａ）で、それぞれ３．９±０．９μｇ／ｍＬ、５．４±２．３μｇ／ｍＬ、６．５±３．２μｇ／ｍＬであり、健常者に対して膵臓癌患者で、ｐ＜０．００１と有意な違いがみられた。従って、ＰＩＧＲが、膵臓癌マーカーとして膵臓癌（手術前）患者を、健常者と区別するという点で、有用であることが示された。【００３８】
２．ＲＯＣ曲線によるＣ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲの膵臓癌マーカーとしての評価
膵臓癌の診断におけるＣ４ＢＰＡおよびＰＩＧＲのＲＯＣ曲線を、従来膵臓癌の診断に用いられているＣＡ１９−９のＲＯＣ曲線と共に、図４に示した。ＲＯＣ曲線はそれぞれのマーカーについて健常者濃度の２ＳＤよりカットオフ値を算出し、統計解析ソフトＳＰＳＳ  ｖｅｒ.１８を用いて求めた。ＲＯＣ曲線から求めたＡＵＲＯＣ（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｃｕｒｖｅｓ）はＣＡ１９−９が０．８４３、Ｃ４ＢＰＡが０．８５９、ＰＩＧＲが０．７２８であった。また、ＣＡ１９−９＋Ｃ４ＢＰＡ＋ＰＩＧＲを組み合わせた際のＡＵＲＯＣは０．９３９であった。さらに、ＣＡ１９−９＋Ｃ４ＢＰＡを組み合わせた際のＡＵＲＯＣは０．９２９であった（図面省略）。したがって、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの測定結果は、膵臓癌の診断に有用であること、更には、Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲの測定結果に加えて、ＣＡ１９−９の測定結果を組み合わせて判定することが、更に膵臓癌の診断に有用であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
以上に詳細に説明したように、膵臓癌を検出するためのマーカーとして、糖蛋白質Ｃ４ＢＰＡまたはＰＩＧＲを用いると膵臓癌の可能性を、慢性膵炎患者や健常者とを区別して特異的に判定することができる。また、手術後の膵臓癌患者の予後の状況をモニターすることができる。更には、他の膵臓癌マーカー、例えば、ＣＡ１９−９などと組み合わせて用いることにより、慢性膵炎患者や健常者とを区別してより特異的に判定することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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