(57)【要約】  本発明により、式（Ｉ）または式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される二糖単位を含む、ヒアルロン酸誘導体、および当該ヒアルロン酸誘導体と薬物により形成される複合体が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2014038641.tif 000066
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミル、およびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｒ５は、水素原子、ホルミル、またはＣ１−６アルキルカルボニルであり；
Ｘ１は、ヒドロキシ、−Ｏ−Ｑ＋、Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲ７Ｒ８、または−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２であり；
Ｑ＋は、カウンターカチオンを表し；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｒａは、水素原子、またはＣ１−６アルキルであり、ここで該アルキルは、独立に、ヒドロキシ、カルボキシ、カルバモイル、Ｃ１−６アルキルチオ、アリール、およびヘテロアリールから選択される１以上の基で置換されていてもよく、ここで該アリールは１以上のヒドロキシで置換されていてもよく；
Ｚ１は、Ｃ２−３０アルキレン、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ここで、該アルキレンは、独立に、−Ｏ−、−ＮＲｇ−および−Ｓ−Ｓ−から選択される１〜５の基が挿入されていてもよく、ｍは、１〜１００から選択される整数であり；
Ｚ２は、以下の式：
−ＮＲｂ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−Ｓ−Ｚ３、
−ＣＯ−Ｚａ−Ｓ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、および
−Ｓ−Ｓ−Ｚ３、
により表される基から選択され；
ＲｂおよびＲｃは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルおよびヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、ここで当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＲｆ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｒｆは、独立に、水素原子、Ｃ１−１２アルキル、アミノＣ２−１２アルキルおよびヒドロキシＣ２−１２アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜２個の基が挿入されていてもよく；
Ｒｇは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルまたはヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｚ３は、ステリル基であり；
Ｚａは、Ｃ１−５アルキレンであり；
Ｚｂは、Ｃ２−８アルキレンまたはＣ２−８アルケニレンである］
で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体であって、Ｘ１が−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２である式（Ｉ）で表される繰り返し単位が含まれない場合、さらに式（ＩＩ）： 
【化２】
2014038641.tif 000067
［式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａおよびＲ４ａは、独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミル、およびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｒ５ａは、水素原子、ホルミル、またはＣ１−６アルキルカルボニルであり；
Ｘ２は、−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２であり、ここで、Ｒ９、Ｚ１、およびＺ２は既に定義したとおりである］；
で表される繰り返し単位を含む、ヒアルロン酸誘導体。
【請求項２】
式（ＩＩｂ）
【化３】
2014038641.tif 000068
［式中、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｒ５ｂは、水素原子、ホルミルおよびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｘｂは、ヒドロキシおよび−Ｏ−Ｑ＋から選択され、ここでＱ＋は、カウンターカチオンを表す］
で表わされる繰り返し単位をさらに含む、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項３】
式（Ｉ）においてＸ１が−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２である、請求項１または２に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項４】
存在する二糖の繰り返し単位における、式（Ｉ）で表わされる二糖単位の割合が、７０〜１００％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項５】
存在する二糖の繰り返し単位における、基−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２を含む二糖単位の割合が、３〜５０％である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項６】
Ｘ１が−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２である式（Ｉ）で表される繰り返し単位が含まれない、請求項１または２に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項７】
存在する二糖の繰り返し単位における、（Ｉ）で表わされる繰り返し単位の割合、および式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位の割合の和が、７０〜１００％である、請求項１、２および６のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項８】
Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、およびＲ４ｂの全てを水素原子とし、Ｒ５ｂをアセチルとし、かつ、Ｘｂを−Ｏ−Ｎａ＋とした場合の重量平均分子量が３キロダルトン〜１５００キロダルトンとなる、請求項２に定義した式（ＩＩｂ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸を用いて製造される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項９】
Ｚ１が、Ｃ２−１０アルキレンであり、Ｚ２が、−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｚ３であり、Ｚ３が、コレステリル基である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項１０】
式（ＩＩｂ）で表わされる繰り返し単位および式（Ｉａ）
【化４】
2014038641.tif 000069
［式中、Ｘａは、ヒドロキシ、−Ｏ−Ｑ＋、Ｃ１−６アルコキシおよび−ＮＲ７Ｒ８から選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｑ＋、およびＲａは、請求項１に定義した通りである］
で表わされる繰り返し単位をそれぞれ含むヒアルロン酸誘導体を、以下の式
ＨＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２
［式中、Ｒ９、Ｚ１、およびＺ２は、請求項１に定義した通りである］
で表わされる化合物と反応させることにより得られる、請求項１〜９のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体と薬物を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
薬物がヒアルロン酸誘導体と複合体を形成することにより担持される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸により修飾され、さらにステリル基を導入したヒアルロン酸誘導体、該ヒアルロン酸誘導体と薬物との複合体、および該ヒアルロン酸誘導体および薬物を含む医薬品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、組み換え遺伝子技術や化学合成技術の発展により、タンパク質およびペプチドを活性成分とする製剤が実用化されており、その数は年々増え続けている。しかし、タンパク質やペプチドは消化管あるいは粘膜などからは吸収されにくく、また、体内では不安定で血中半減期が短い。そのため、タンパク質製剤およびペプチド製剤は注射による頻回投与が必要となっており、患者にも医療関係者にも負担が大きくなっている。薬理活性を損なうことなくタンパク質やペプチドをカプセル化するための徐放性もしくはターゲティング機能を有するＤＤＳ（薬物送達システム）基材が望まれている。また、投与の効率の観点から、基材に対してできるだけ多量のタンパク質、ペプチドが封入できることが望ましい。【０００３】
タンパク質やペプチドの薬理活性はそれらの高次構造に起因するところが大きく、有機溶媒や空気界面との接触、圧力や温度、ｐＨといった外部環境に起因する変性および凝集によりタンパク質やペプチドの薬理活性が損なわれることが知られている。また、変性や凝集したタンパク質を体内に投与することにより抗原性などのリスクが高まることも知られている。タンパク質またはペプチドを活性成分とする徐放性製剤においては、製剤化工程から、製剤の貯蔵期間を経て、投与後に生体内で当該活性成分が放出されるまで、タンパク質やペプチドの安定性を確保することが求められる。【０００４】
低分子薬物においては、薬物の安定性に関する課題はタンパク質・ペプチドと比較すると大きくはないが、依然として、難溶性薬物の溶解性向上機能や、徐放性もしくはターゲティング機能を有するＤＤＳ基材に対するニーズは大きい。【０００５】
また、安全性の面から、製剤に用いる基材は、非抗原性、非変異原性、無毒性、生分解性を併せ持つものでなければならない。【０００６】
近年、多糖を薬物担体の基材として用いるという報告がある。その中でも、ヒアルロン酸（ＨＡ）は、１９３４年、Ｋ．Ｍｅｙｅｒによって牛の眼の硝子体から単離された生体材料（多糖）であり、細胞外マトリックスの主成分として古くから知られている。ＨＡは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとがβ（１→３）グリコシド結合により連結された二糖単位から成るグリコサミノグリカンの一種である。ＨＡは、化学的、物理的構造に種差が無く、ヒトもその代謝系を有しており、免疫性および毒性といった面でも最も安全な医用生体材料（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ）の一つである。【０００７】
上述の安全性という特性に加え、近年、細胞の接着、増殖、移動の誘導に関するヒアルロン酸の生理活性物質としての側面も注目されている。更に製造の観点からも、微生物による高分子量のヒアルロン酸の大量生産が可能となっており、ＤＤＳ研究が盛んに行われている。薬物をヒアルロン酸とコンジュゲートすることで、薬物の癌組織へのターゲティング（特許文献１）、肝臓へのターゲティング（特許文献２）、抗原性の低減等（特許文献３）が達成できるという報告がなされている。また、生体内にはＣＤ４４やＲＨＡＭＭ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ）、ＬＹＶＥ−１（Ｌｙｍｐｈｅ  Ｖｅｓｓｅｌ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ＨＡ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）、ＨＡＲＥ（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）などのＨＡレセプターが存在することが報告されている（非特許文献７および非特許文献８）。特にＣＤ４４やＲＨＡＭＭは多くの癌細胞において過剰発現しており、それゆえＨＡを癌ターゲティングキャリアの基材として用いる試みがなされている。その例として、パクリタキセル−ＨＡコンジュゲート（非特許文献９〜１１および特許文献１２）、カンプトテシン−ＨＡコンジュゲート（特許文献１３）、ドキソルビシン−ＨＰＭＡ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］−ＨＡコンジュゲート（非特許文献１２）、酪酸−ＨＡコンジュゲート（非特許文献１３）、ドキソルビシン封入ＨＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡナノパーティクル（非特許文献１４）、ｓｉＲＮＡ封入ＨＡゲル（非特許文献１５）、ドキソルビシン封入ＨＡ被覆リポソーム（非特許文献１６）などが挙げられる。さらに非特許文献１７には、アミド結合により導入したエチレンジアミンリンカーを介してコール酸をコンジュゲートしたＨＡ誘導体について報告されている。これらＨＡを基材としたキャリアは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＣＤ４４高発現細胞において効率良く取り込まれることが報告されている（例えば非特許文献９）。しかし、ＨＡは全身投与した場合、肝臓などの類洞内皮に存在するＨＡＲＥレセプターにより瞬時に取り込まれ、代謝されることが知られており、急速に血中から消失する（非特許文献１８〜２０）。このようにヒアルロン酸を滞留性延長やターゲティング用ＤＤＳ基材として用いる場合、その血中滞留性の短さが欠点となる。ヒアルロン酸の連続する６糖がレセプターの認識部位であると考えられており、カルボキシを修飾することで血中滞留時間の延長（特許文献４、５および６）を行う試みがなされている。【０００８】
ヒアルロン酸のグルクロン酸部分のカルボキシを高度に修飾することにより、血中滞留性の長期化を実現させたヒアルロン酸誘導体が開発され、その有用性が示されてきた（特許文献７）。一般にグルクロン酸部分のカルボキシの修飾率を高めることによりヒアルロン酸誘導体の血中滞留性も長期化する。しかし、両者は直線的に相関するわけではなく、ある閾値を境に急激に変化することが明らかになっている。【０００９】
ヒアルロン酸中のカルボキシをアミノ酸で修飾した事例としては、例えば、Ｎ−メチルモルホリンの存在下、２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジンを用いることにより生成する４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン）−４−メチルモルホリウム（以下、ＤＭＴ−ＭＭとも称す）を縮合剤として用いた、グリシンのエチルエステルによる修飾が挙げられるが、修飾率は、最大でも２０％となっている（非特許文献１）。また、トリアジン系化合物を縮合剤として利用した事例としてはアラニンを導入したヒアルロン酸が、酵素分解に対する耐性が増強し、粘性のサプリメントとしての利用が期待できることが報告されており（非特許文献２）、同様の手法で、他のアミノ酸に関しても、修飾が報告されている（非特許文献３、特許文献９）。また、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣとも称す）を縮合剤として用いて、ロイシンのメチルエステル塩酸塩、バリンのメチルエステル塩酸塩、イソロイシンのメチルエステル塩酸塩、プロリンのメチルエステル塩酸塩、フェニルアラニンのメチルエステル塩酸塩、アルギニンのメチルエステル塩酸塩およびヒスチジンのメチルエステル塩酸塩により修飾し、脱保護せずにゲル化させて、非水溶性の生体適合性フィルムを調製した事例もあるが、修飾率は不明である（特許文献８）。さらに、本願優先日以降に公開された特許文献１５には、ヒアルロン酸のカルボキシを、特定のアミノ−カルボン酸またはそのアミドで修飾することにより得られたヒアルロン酸誘導体が、生分解性と血中滞留性の両方に特性を有すること、また、エンドソームから細胞質内への薬物の放出に有効であることが報告されている。【００１０】
その他、多糖由来の薬物担体として、コレステリル基などを導入したプルラン誘導体が、水溶液中においてナノサイズの微粒子を形成し、疎水性低分子、ペプチド、タンパク質などと複合化するホスト分子として機能することが報告されている（非特許文献４）。タンパク質取り込み後の当該プルラン誘導体についての熱力学的評価により、取り込まれたタンパク質が、プルランのヒドロキシ基との水素結合により安定化されることが示されている（非特許文献５）。【００１１】
また、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（特許文献１０）およびリノレイン酸を導入したキトサン（非特許文献６）をタンパク質との複合体形成の材料として利用する報告もある。さらに、特許文献１１には、架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体、および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を含む組成物であって、架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体が、親水性多糖類誘導体の存在下、ヒアルロン酸または架橋形成が可能な基を有するその誘導体の架橋形成反応により調製される組成物が報告されており、特許文献１４には、疎水性基としてコレステリル基を有する基をヒアルロン酸に導入したヒアルロン酸誘導体が、水中で会合により微粒子を形成し、薬物と複合体を形成することが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開ＷＯ９２／０６７１４号パンフレット
【特許文献２】特開２００１−８１１０３号公報
【特許文献３】特開平２−２７３１７６号公報
【特許文献４】特開平５−８５９４２号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ０１／０５４３４号パンフレット
【特許文献６】国際公開ＷＯ０１／６０４１２号パンフレット
【特許文献７】国際公開ＷＯ２００６／０２８１１０号パンフレット
【特許文献８】国際公開ＷＯ９２／２０３４９号パンフレット
【特許文献９】国際公開ＷＯ２０１１／１４８１１６号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第ＷＯ２００２／０２２１５４号
【特許文献１１】国際公開第ＷＯ２００８／１３６５３６号
【特許文献１２】国際公開第ＷＯ２００４／０３５６２９号
【特許文献１３】国際公開第ＷＯ２００９／０７４６７８号
【特許文献１４】国際公開第２０１０／０５３１４０号
【特許文献１５】国際公開第２０１２／１１８１８９号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Biomacromolecules 第8巻、第2190-2195頁、2007年
【非特許文献２】CARBOHYDRATE Polymers 第86巻、第747- 752頁、2011年
【非特許文献３】CARBOHYDRATE Polymers 第87巻、第2211-2216頁、2012年
【非特許文献４】Macromolecules 第26巻、第3062-3068頁、1993年
【非特許文献５】Colloids and Surfaces 第112巻、第91-95頁、1996年
【非特許文献６】Carbohydrate Polymers 第62巻、第293-298頁、2005年
【非特許文献７】MOLECULAR PHARMACEUTICS. 第5巻、第474-486頁、2008年
【非特許文献８】Journal of Drug Targeting. 第16巻、第91-107頁、2008年
【非特許文献９】Bioconjugate Chem.第10巻、第755-763頁、1999年
【非特許文献１０】Clinical Cancer Research. 第14巻、第3598-3606頁、2008年
【非特許文献１１】Bioconjugate Chem.第19巻、第1319-1325頁、2008年
【非特許文献１２】Pharmaceutical Research. 第19巻、第396-402頁、2002年
【非特許文献１３】Clinical Cancer Research. 第10巻、第4822-4830頁、2004年
【非特許文献１４】Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 第3巻、第246-257頁、2007年
【非特許文献１５】Journal of Controlled Release、第119巻、第245-252頁、2007年
【非特許文献１６】Neoplasia、第6巻、第343-353頁、2004年
【非特許文献１７】Journal of Materials Chemistry.第19巻、第4102-4107頁、2009年
【非特許文献１８】Cell and Tissue Research.第243巻、第505-510頁、1985年
【非特許文献１９】THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY、第275巻、第37733-37741頁、2000年
【非特許文献２０】The Biochemical Journal、第200巻、第415-424頁、1981年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ヒアルロン酸誘導体の血中滞留性は、グルクロン酸部分のカルボキシの修飾率と相関するものの、ある閾値を境に急激に変化することも明らかになっており、ヒアルロン酸誘導体の血中滞留性を、カルボキシの修飾率を制御することのみによって望ましい範囲内にコントロールすることは困難である。よって、より簡便かつ確実な方法で血中滞留性をコントロールする方法が望まれている。また、ヒアルロン酸のレセプターによる認識が低下すると、生体内での代謝を受けにくくなり、ヒアルロン酸が元来もつ特徴である生分解性が低下することも予想される。したがって、生分解性（安全性）および血中滞留性の両方の特徴を兼ね備えた新規基材が求められている。【００１５】
発明が解決しようとする課題は、生分解性と血中滞留性の両方の特徴を兼ね備えたヒアルロン酸誘導体を提供することである。また発明が解決しようとするさらなる課題は、該ヒアルロン酸誘導体と薬物との複合体および該ヒアルロン酸誘導体を含む医薬品組成物、特に、該ヒアルロン酸誘導体と薬物との複合体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、かかる課題を解決する為に鋭意研究を進めたところ、ヒアルロン酸またはその塩のグルクロン酸部分のカルボキシを、特定のアミノ酸またはアミノ酸アミドと反応させてアミドに変換することにより得られた中間体の、グルクロン酸部分のカルボキシおよび／またはアミノ酸部分のカルボキシに、さらにステリル基を導入することにより得られたヒアルロン酸誘導体が、生分解性と血中滞留性の両方の特性を有すること、および該ヒアルロン酸誘導体と薬物との複合体が医薬組成物として良好な特性を有することを見出し、本発明を完成させた。また、鋭意研究を進めた過程で、チロシンアミド、トリプトファンアミドといった一部のアミノ酸アミド（後述するＲａが、アリールまたはヘテロアリールで置換されているＣ１−６アルキルであり、該アリールは１以上のヒドロキシで置換されている場合）を用いると、ステリル基を導入しない場合に比べ、ステリル基を導入した場合の方が、ステリル基の有する疎水性にも係わらず、純水中でより分散することを見出し、本発明を完成させた。さらに、フェニルアラニンアミド（後述するＲａが、アリールで置換されているＣ１−６アルキルであり、該アリールは無置換である場合）を用いた上で更に６％以下の導入率でステリル基を導入した場合、フェニルアラニンアミドを用いずに６％以下の導入率でステリル基を導入した場合と比較して、純水中では、いずれの場合も分散するが、生理食塩水中では、後者の場合は分散するのに対し、前者の場合は凝集して沈殿を形成し、前者の場合が、例えば持続性の皮下投与用注射製剤の基材として非常に優れていることも見出し、本発明を完成させた。【００１７】
すなわち本発明は、生分解性と血中滞留性とを併せ持つヒアルロン酸誘導体、および、ステリル基を導入することで水中でより分散するヒアルロン酸誘導体、ならびに、これらのヒアルロン酸誘導体および薬理活性を有する化合物を含有する複合体に関する。さらに本発明は、これらのヒアルロン酸誘導体の製造方法、ならびに薬物およびこれらのヒアルロン酸誘導体を含む医薬品組成物およびその製造方法に関する。【００１８】
本発明の１つの側面において、以下の（１）〜（１０）のヒアルロン酸誘導体が提供される。
（１）式（Ｉ）【００１９】
【化１】
2014038641.tif 000002
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミル、およびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｒ５は、水素原子、ホルミル、またはＣ１−６アルキルカルボニルであり；
Ｘ１は、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、−Ｏ−Ｑ＋、−ＮＲ７Ｒ８、または−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２であり；
Ｑ＋は、カウンターカチオンを表し；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｒａは、水素原子、またはＣ１−６アルキルであり、ここで該アルキルは、独立に、ヒドロキシ、カルボキシ、カルバモイル、Ｃ１−６アルキルチオ、アリール、およびヘテロアリールから選択される１以上の基で置換されていてもよく、ここで該アリールは１以上のヒドロキシで置換されていてもよく；
Ｚ１は、Ｃ２−３０アルキレン、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ここで該アルキレンは、独立に、−Ｏ−、−ＮＲｇ−および−Ｓ−Ｓ−から選択される１〜５の基が挿入されていてもよく、ｍは、１〜１００から選択される整数であり；
Ｚ２は、以下の式：
−ＮＲｂ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−Ｓ−Ｚ３、
−ＣＯ−Ｚａ−Ｓ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、
−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、および
−Ｓ−Ｓ−Ｚ３、
により表される基から選択され；
ＲｂおよびＲｃは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルおよびヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、ここで当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＲｆ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｒｆは、独立に、水素原子、Ｃ１−１２アルキル、アミノＣ２−１２アルキル、およびヒドロキシＣ２−１２アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜２個の基が挿入されていてもよく；
Ｒｇは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルまたはヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｚ３は、ステリル基であり；
Ｚａは、Ｃ１−５アルキレンであり；
Ｚｂは、Ｃ２−８アルキレンまたはＣ２−８アルケニレンである］
で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体であって、Ｘ１が−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２である式（Ｉ）で表される繰り返し単位が含まれない場合、さらに式（ＩＩ）： 【００２０】
【化２】
2014038641.tif 000003
［式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａおよびＲ４ａは、独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミル、およびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｒ５ａは、水素原子、ホルミル、またはＣ１−６アルキルカルボニルであり；
Ｘ２は、−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２であり、ここで、Ｒ９、Ｚ１、およびＺ２は既に定義したとおりである］；
で表される繰り返し単位を含む、ヒアルロン酸誘導体。
（２）式（ＩＩｂ）【００２１】
【化３】
2014038641.tif 000004
［式中、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、およびＲ４ｂは、独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミル、およびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｒ５ｂは、水素原子、ホルミル、およびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｘｂは、ヒドロキシ、および−Ｏ−Ｑ＋から選択され、ここでＱ＋は、カウンターカチオンを表す］
で表わされる繰り返し単位をさらに含む、上記（１）に記載のヒアルロン酸誘導体。
（３）式（Ｉ）においてＸ１が−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２である、上記（１）または（２）に記載のヒアルロン酸誘導体。
（４）存在する二糖の繰り返し単位における、式（Ｉ）で表わされる二糖単位の割合が、７０〜１００％である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（５）存在する二糖の繰り返し単位における、基−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２を含む二糖単位の割合が、３〜５０％である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（６）Ｘ１が−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２である式（Ｉ）で表される繰り返し単位が含まれない、上記（１）または（２）に記載のヒアルロン酸誘導体。
（７）存在する二糖の繰り返し単位における、（Ｉ）で表わされる繰り返し単位の割合、および式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位の割合の和が、７０〜１００％である、（１）、（２）、および（６）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（８）Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、およびＲ４ｂの全てを水素原子とし、Ｒ５ｂをアセチルとし、かつ、Ｘｂを−Ｏ−Ｎａ＋とした場合の重量平均分子量が３キロダルトン〜１５００キロダルトンとなる、上記（２）に定義した式（ＩＩｂ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸を用いて製造される、上記（１）〜（７）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（９）Ｚ１が、Ｃ２−１０アルキレンであり、Ｚ２が、−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｚ３であり、Ｚ３が、コレステリル基である、（１）〜（８）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
（１０）式（ＩＩｂ）で表わされる繰り返し単位および式（Ｉａ）【００２２】
【化４】
2014038641.tif 000005
［式中、Ｘａは、ヒドロキシ、−Ｏ−Ｑ＋、Ｃ１−６アルコキシ、および−ＮＲ７Ｒ８から選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｑ＋、およびＲａは、上記（１）に定義した通りである］
で表わされる繰り返し単位をそれぞれ含むヒアルロン酸誘導体を、以下の式
ＨＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２
［式中、Ｒ９、Ｚ１、およびＺ２は、上記（１）に定義した通りである］
で表わされる化合物と反応させることにより得られる、上記（１）〜（９）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。【００２３】
本発明の別の側面において、以下の（１１）および（１２）の医薬組成物が提供される。
（１１）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体と薬物を含む、医薬組成物。
（１２）薬物がヒアルロン酸誘導体と複合体を形成することにより担持される、上記（１１）に記載の医薬組成物。【００２４】
本発明のさらに別の側面において、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体に薬物が担持された、ヒアルロン酸誘導体−薬物複合体が提供される。好ましくは、ヒアルロン酸誘導体が水中で会合により微粒子を形成して薬物を担持する、ヒアルロン酸誘導体−薬物複合体が提供される。【００２５】
さらに本発明の別の側面において、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体を含む、生分解性の薬物担体が提供される。【００２６】
さらに本発明の別の側面において、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体と共に治療有効量の薬物を対象に投与することを含む、薬物の投与方法が提供される。【００２７】
なお、Ｘ１が、ヒドロキシ、−Ｏ−Ｑ＋、または−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２である時、Ｒａ中のアリール（１以上のヒドロキシで置換されていてもよい）は、無置換であるのが好ましい。
【発明の効果】
【００２８】
本発明のヒアルロン酸誘導体を用いることで、薬物、特に低分子化合物や薬効を有するタンパク質やペプチドをその生物活性を維持したまま多量に封入した徐放性製剤を提供することが可能となる。また、ヒアルロン酸誘導体は安全性の面においても優れており、薬物の血中滞留性と生分解性の双方において、医薬製剤の担体として、また、持続性の皮下投与用注射製剤の基材として特に優れた特性を有している。また、本発明のヒアルロン酸誘導体のカルボキシの修飾の程度、すなわち、導入する基−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２および／またはアミノ酸（アミノ酸アミドを含む）の割合を調節することにより、当該誘導体を用いて製造する製剤の体内動態を制御することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１−１】実施例１−１で調製したコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメート（Ｃｈｏｌ−Ｃ６）の塩酸塩の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図１−２】実施例１−３で調製した９９ｋＤａのＨＡ−Ｎａを出発原料とするヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ−ＴＢＡ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（溶媒：Ｄ２Ｏ）の一例である。
【図１−３】実施例１−４で調製した９９ｋＤａのＨＡ−Ｎａを出発原料とするＨＡ−Ａｌａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図１−４】実施例１−４で調製した９９ｋＤａのＨＡ−Ｎａを出発原料とするＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：７％）である。
【図１−５】実施例１−５で調製した９９ｋＤａのＨＡ−Ｎａを出発原料とするＨＡ−ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図１−６】実施例１−６で調製したＨＡ−Ｓｅｒ−ＯＥｔの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図１−７】実施例１−６で調製したＨＡ−Ｓｅｒの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図１−８】実施例１−６で調製したＨＡ−Ｓｅｒ−Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図１−９】実施例１−７で調製したＨＡ−Ｇｌｙ−ＯＥｔの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図１−１０】実施例１−７で調製したＨＡ−Ｇｌｙの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図１−１１】実施例１−７で調製したＨＡ−Ｇｌｙ−Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図１−１２】実施例１−８で調製したＨＡ−Ｔｈｒの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図１−１３】実施例１−８で調製したＨＡ−Ｔｈｒ−Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図１−１４】実施例１−９で調製したＨＡ−Ａｓｎの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図１−１５】実施例１−９で調製したＨＡ−Ａｓｎ−Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：７％）である。
【図１−１６】実施例１−１０で調製したＨＡ−Ａｓｐの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図１−１７】実施例１−１０で調製したＨＡ−Ａｓｐ−Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図１−１８】実施例１−１１で調製したＨＡ−Ｉｌｅの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図１−１９】実施例１−１１で調製したＨＡ−Ｉｌｅ−Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図１−２０】実施例１−１２で調製したＨＡ−Ｌｅｕの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図１−２１】実施例１−１２で調製したＨＡ−Ｌｅｕ−Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図１−２２】実施例１−１３で調製したＨＡ−Ｖａｌの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図１−２３】実施例１−１３で調製したＨＡ−Ｖａｌ−Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図１−２４】実施例１−１４で調製したＨＡ−Ｐｈｅの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図１−２５】実施例１−１４で調製したＨＡ−Ｐｈｅ−Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図１−２６】実施例１−１５で調製したＨＡ−ＳｅｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（溶媒：０．０２Ｎ  ＤＣｌ  ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液）の一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図１−２７】実施例１−１５で調製したＨＡ−ＳｅｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（溶媒：Ｄ２Ｏ）の一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図１−２８】実施例１−１６で調製したＨＡ−ＧｌｙＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（溶媒：０．０２Ｎ  ＤＣｌ  ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液）の一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図１−２９】実施例１−１６で調製したＨＡ−ＧｌｙＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（溶媒：Ｄ２Ｏ）の一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図１−３０】実施例１−１７で調製したＨＡ−ＬｅｕＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図１−３１】実施例１−１８で調製したＨＡ−ＶａｌＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図１−３２】実施例１−１９で調製したＨＡ−Ａｌａ／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図１−３３】実施例１−２０で調製したＨＡ−Ｓｅｒ−ＯＥｔ／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図１−３４】実施例１−２０で調製したＨＡ−Ｓｅｒ／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図１−３５】比較例１−１で調製したＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図１−３６】比較例１−２で調製したＨＡ−ＥＤＯＢＥＡの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図１−３７】比較例１−２で調製したＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−Ａｃ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図１−３８】比較例１−３で調製したＨＡ−Ｔｙｒの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図１−３９】比較例１−３で調製したＨＡ−Ｔｙｒ−Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。
【図２−１−１】９９ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−７％／ＦＬ（表９：サンプル２−１）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−２】９９ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−２４％／ＦＬ（表９：サンプル２−２）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―２４％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−２）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−３】９９ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−３０％／ＦＬ（表９：サンプル２−３）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―２５％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−３）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−４】５０ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−４）と５０ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−４）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−５】５０ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−２２％／ＦＬ（表９：サンプル２−５）と５０ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―２０％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−５）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−６】５０ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−２６％／ＦＬ（表９：サンプル２−６）と５０ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―２７％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−６）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−７】１０ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−１６％／ＦＬ（表９：サンプル２−７）と１０ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―１５％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−７）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−８】９９ｋ  ＨＡ−ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：サンプル２−８）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−９】９９ｋ  ＨＡ−ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ―２４％／ＦＬ（表９：サンプル２−９）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―２４％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−２）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−１０】９９ｋ  ＨＡ−ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ―３１％／ＦＬ（表９：サンプル２−１０）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―２５％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−３）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−１１】９９ｋ  ＨＡ−Ｓｅｒ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１１）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−１２】９９ｋ  ＨＡ−Ｇｌｙ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１２）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−１３】９９ｋ  ＨＡ−Ｔｈｒ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１３）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−１４】９９ｋ  ＨＡ−Ａｓｎ−Ｃｈｏｌ−７％／ＦＬ（表９：サンプル２−１４）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−１５】９９ｋ  ＨＡ−Ａｓｐ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１５）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−１６】９９ｋ  ＨＡ−Ｉｌｅ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１６）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−１７】９９ｋ  ＨＡ−Ｌｅｕ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１７）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−１８】９９ｋ  ＨＡ−Ｖａｌ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１８）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−１９】９９ｋ  ＨＡ−Ｐｈｅ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１９）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−２０】９９ｋ  ＨＡ−ＶａｌＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−２０）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−２１】９９ｋ  ＨＡ−ＳｅｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−２１）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−２２】９９ｋ  ＨＡ−ＬｅｕＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−２２）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−２３】９９ｋ  ＨＡ−ＧｌｙＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−２３）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−２４】９９ｋ  ＨＡ−Ａｌａ／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−２４）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−２５】９９ｋ  ＨＡ−Ｓｅｒ／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−２５）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−１−２６】９９ｋ  ＨＡ−Ｔｙｒ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−８）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２−２）。
【図２−２−１】９９ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−７％／ＦＬ（表９：サンプル２−１）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−２】９９ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−２４％／ＦＬ（表９：サンプル２−２）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−３】９９ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−３０％／ＦＬ（表９：サンプル２−３）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−４】５０ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−４）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−５】５０ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−２２％／ＦＬ（表９：サンプル２−５）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−６】５０ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−２６％／ＦＬ（表９：サンプル２−６）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−７】１０ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−１６％／ＦＬ（表９：サンプル２−７）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−８】９９ｋ  ＨＡ−ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−８）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−９】９９ｋ  ＨＡ−ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ−２４％／ＦＬ（表９：サンプル２−９）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−１０】９９ｋ  ＨＡ−ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ−３１％／ＦＬ（表９：サンプル２−１０）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−１１】９９ｋ  ＨＡ−Ｓｅｒ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１１）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−１２】９９ｋ  ＨＡ−Ｇｌｙ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１２）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−１３】９９ｋ  ＨＡ−Ｔｈｒ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１３）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−１４】９９ｋ  ＨＡ−Ａｓｎ−Ｃｈｏｌ−７％／ＦＬ（表９：サンプル２−１４）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−１５】９９ｋ  ＨＡ−Ａｓｐ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１５）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−１６】９９ｋ  ＨＡ−Ｉｌｅ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１６）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−１７】９９ｋ  ＨＡ−Ｌｅｕ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１７）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−１８】９９ｋ  ＨＡ−Ｖａｌ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１８）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−１９】９９ｋ  ＨＡ−Ｐｈｅ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１９）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−２０】９９ｋ  ＨＡ−ＶａｌＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−２０）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−２１】９９ｋ  ＨＡ−ＳｅｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−２１）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−２２】９９ｋ  ＨＡ−ＬｅｕＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−２２）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−２３】９９ｋ  ＨＡ−ＧｌｙＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−２３）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−２４】９９ｋ  ＨＡ−Ａｌａ／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−２４）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−２５】９９ｋ  ＨＡ−Ｓｅｒ／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−２５）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−２６】９９ｋ  ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−Ａｃ／ＦＬ（比較例１−２）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルが何ら代謝を受けていないことが確認されている（実施例２−３）。
【図２−２−２７】９９ｋ  ＨＡ−Ｔｙｒ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−８）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２−３）。
【図２−３−１】９９ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−７％／ＦＬ（表９：サンプル２−１）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−２】９９ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−２４％／ＦＬ（表９：サンプル２−２）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−３】９９ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−３０％／ＦＬ（表９：サンプル２−３）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−４】５０ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−４）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−５】５０ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−２２％／ＦＬ（表９：サンプル２−５）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−６】５０ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−２６％／ＦＬ（表９：サンプル２−６）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−７】１０ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−１６％／ＦＬ（表９：サンプル２−７）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−８】９９ｋ  ＨＡ−ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−８）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−９】９９ｋ  ＨＡ−ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ−２４％／ＦＬ（表９：サンプル２−９）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−１０】９９ｋ  ＨＡ−ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ−３１％／ＦＬ（表９：サンプル２−１０）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−１１】９９ｋ  ＨＡ−Ｓｅｒ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１１）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−１２】９９ｋ  ＨＡ−Ｇｌｙ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１２）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−１３】９９ｋ  ＨＡ−Ｔｈｒ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１３）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−１４】９９ｋ  ＨＡ−Ａｓｎ−Ｃｈｏｌ−７％／ＦＬ（表９：サンプル２−１４）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−１５】９９ｋ  ＨＡ−Ａｓｐ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１５）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−１６】９９ｋ  ＨＡ−Ｉｌｅ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１６）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−１７】９９ｋ  ＨＡ−Ｌｅｕ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１７）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−１８】９９ｋ  ＨＡ−Ｖａｌ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１８）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−１９】９９ｋ  ＨＡ−Ｐｈｅ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−１９）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−２０】９９ｋ  ＨＡ−ＶａｌＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−２０）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−２１】９９ｋ  ＨＡ−ＳｅｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−２１）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−２２】９９ｋ  ＨＡ−ＬｅｕＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−２２）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−２３】９９ｋ  ＨＡ−ＧｌｙＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−２３）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−２４】９９ｋ  ＨＡ−Ａｌａ／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−２４）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−２５】９９ｋ  ＨＡ−Ｓｅｒ／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：サンプル２−２５）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−２６】９９ｋ  ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−Ａｃ／ＦＬ（比較例１−２）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図２−３−２７】９９ｋ  ＨＡ−Ｔｙｒ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−８）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２−４）。
【図３−１】実施例３−１で調製したＨＡ−ＧｌｎのＮＭＲスペクトルの一例である。
【図３−２】実施例３−１で調製したＨＡ−Ｇｌｎ−Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。
【図３−３】実施例３−２で調製したＨＡ−ＭｅｔのＮＭＲスペクトルの一例である。
【図３−４】実施例３−２で調製したＨＡ−Ｍｅｔ−Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。
【図３−５】実施例３−３で調製したＨＡ−ＡｌａＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。
【図３−６】実施例３−４で調製したＨＡ−ＡｓｎＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。
【図３−７】実施例３−４で調製したＨＡ−ＡｓｎＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。
【図３−８】実施例３−５で調製したＨＡ−ＩｌｅＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。
【図３−９】実施例３−６で調製したＨＡ−ＧｌｎＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。
【図３−１０】実施例３−７で調製したＨＡ−ＭｅｔＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。
【図３−１１】比較例３−１で調製したＨＡ−ＧｌｕのＮＭＲスペクトルの一例である。
【図３−１２】比較例３−１で調製したＨＡ−Ｇｌｕ−Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。
【図３−１３】比較例３−２で調製したＨＡ−ＴｒｐのＮＭＲスペクトルの一例である。
【図３−１４】比較例３−２で調製したＨＡ−Ｔｒｐ−Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。
【図４−１−１】９９ｋ  ＨＡ−Ｇｌｎ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表１５：サンプル４−１）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４−２）。
【図４−１−２】９９ｋ  ＨＡ−Ｍｅｔ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表１５：サンプル４−２）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４−２）。
【図４−１−３】９９ｋ  ＨＡ−ＡｌａＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表１５：サンプル４−３）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４−２）。
【図４−１−４】９９ｋ  ＨＡ−ＡｓｎＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表１５：サンプル４−４）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４−２）。
【図４−１−５】９９ｋ  ＨＡ−ＩｌｅＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表１５：サンプル４−５）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４−２）。
【図４−１−６】９９ｋ  ＨＡ−ＧｌｎＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表１５：サンプル４−６）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４−２）。
【図４−１−７】９９ｋ  ＨＡ−ＭｅｔＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表１５：サンプル４−７）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４−２）。
【図４−１−８】９９ｋ  ＨＡ−Ｇｌｕ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表１５：比較サンプル４−１）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４−２）。
【図４−１−９】９９ｋ  ＨＡ−Ｔｒｐ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表１５：比較サンプル４−２）と９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４−２）。
【図４−１−１０】１０ｋ  ＨＡ−Ｔｙｒ−Ｃｈｏｌ−７％／ＦＬ（表１５：比較サンプル４−３）と１０ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ―１５％／ＦＬ（表９：比較サンプル２−７）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４−２）。
【図４−２−１】９９ｋ  ＨＡ−Ｇｌｎ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表１５：サンプル４−１）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４−３）。
【図４−２−２】９９ｋ  ＨＡ−Ｍｅｔ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表１５：サンプル４−２）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４−３）。
【図４−２−３】９９ｋ  ＨＡ−ＡｌａＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表１５：サンプル４−３）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４−３）。
【図４−２−４】９９ｋ  ＨＡ−ＡｓｎＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表１５：サンプル４−４）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４−３）。
【図４−２−５】９９ｋ  ＨＡ−ＩｌｅＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表１５：サンプル４−５）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４−３）。
【図４−２−６】９９ｋ  ＨＡ−ＧｌｎＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表１５：サンプル４−６）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４−３）。
【図４−２−７】９９ｋ  ＨＡ−ＭｅｔＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表１５：サンプル４−７）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４−３）。
【図４−２−８】９９ｋ  ＨＡ−Ｇｌｕ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表１５：比較サンプル４−１）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４−３）。
【図４−２−９】９９ｋ  ＨＡ−Ｔｒｐ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（表１５：比較サンプル４−２）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４−３）。
【図４−２−１０】１０ｋ  ＨＡ−Ｔｙｒ−Ｃｈｏｌ−７％／ＦＬ（表１５：比較サンプル４−３）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４−３）。
【図５−１】実施例５−１で調製したＨＡ−ＴｙｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。
【図５−２】実施例５−２で調製したＨＡ−ＴｒｐＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。
【図５−３】実施例５−３で調製したＨＡ−ＰｈｅＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。
【図６−１−１】実施例６−１における、本発明のヒアルロン酸誘導体への、難溶性薬物であるパクリタキセルの封入（本発明のヒアルロン酸誘導体とパクリタキセルとの複合化）の結果を示すグラフであり、縦軸は、本発明のヒアルロン酸誘導体を共存させることにより向上する、上清中のパクリタキセル濃度（溶解度）を示す。縦軸の値が大きいほど、封入効果が高いことを指す。
【図６−１−２】実施例６−１における、本発明のヒアルロン酸誘導体への、難溶性薬物であるパクリタキセルの封入（本発明のヒアルロン酸誘導体とパクリタキセルとの複合化）の結果を示すグラフであり、縦軸は、本発明のヒアルロン酸誘導体を共存させることにより向上する、上清中のパクリタキセル濃度（溶解度）を示す。縦軸の値が大きいほど、封入効果が高いことを指す。
【図６−１−３】実施例６−１における、本発明のヒアルロン酸誘導体への、難溶性薬物であるパクリタキセルの封入（本発明のヒアルロン酸誘導体とパクリタキセルとの複合化）の結果を示すグラフであり、縦軸は、本発明のヒアルロン酸誘導体を共存させることにより向上する、上清中のパクリタキセル濃度（溶解度）を示す。縦軸の値が大きいほど、封入効果が高いことを指す。
【図６−１−４】実施例６−１における、本発明のヒアルロン酸誘導体への、難溶性薬物であるパクリタキセルの封入（本発明のヒアルロン酸誘導体とパクリタキセルとの複合化）の結果を示すグラフであり、縦軸は、本発明のヒアルロン酸誘導体を共存させることにより向上する、上清中のパクリタキセル濃度（溶解度）を示す。縦軸の値が大きいほど、封入効果が高いことを指す。
【図６−２−１】実施例６−２における、本発明のヒアルロン酸誘導体への、難溶性薬物であるシクロスポリンの封入（本発明のヒアルロン酸誘導体とシクロスポリンとの複合化）の結果を示すグラフであり、縦軸は、本発明のヒアルロン酸誘導体を共存させることにより向上する、上清中のシクロスポリン濃度（溶解度）を示す。縦軸の値が大きいほど、封入効果が高いことを指す。
【図６−２−２】実施例６−２における、本発明のヒアルロン酸誘導体への、難溶性薬物であるシクロスポリンの封入（本発明のヒアルロン酸誘導体とシクロスポリンとの複合化）の結果を示すグラフであり、縦軸は、本発明のヒアルロン酸誘導体を共存させることにより向上する、上清中のシクロスポリン濃度（溶解度）を示す。縦軸の値が大きいほど、封入効果が高いことを指す。
【図６−２−３】実施例６−２における、本発明のヒアルロン酸誘導体への、難溶性薬物であるシクロスポリンの封入（本発明のヒアルロン酸誘導体とシクロスポリンとの複合化）の結果を示すグラフであり、縦軸は、本発明のヒアルロン酸誘導体を共存させることにより向上する、上清中のシクロスポリン濃度（溶解度）を示す。縦軸の値が大きいほど、封入効果が高いことを指す。
【図６−２−４】実施例６−２における、本発明のヒアルロン酸誘導体への、難溶性薬物であるシクロスポリンの封入（本発明のヒアルロン酸誘導体とシクロスポリンとの複合化）の結果を示すグラフであり、縦軸は、本発明のヒアルロン酸誘導体を共存させることにより向上する、上清中のシクロスポリン濃度（溶解度）を示す。縦軸の値が大きいほど、封入効果が高いことを指す。
【図７−１】実施例７−１における、ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−４１％からのパクリタキセルの放出結果を示すグラフであり、横軸は、時間（Ｈｏｕｒ）、縦軸は、放出されずにＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−４１％中に封入されたまま（ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−４１％と複合化したまま）のパクリタキセルの量を、それぞれ示す。
【図７−２】実施例７−２における、ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−４１％からのシクロスポリンの放出結果を示すグラフであり、横軸は、時間（Ｈｏｕｒ）、縦軸は、放出されずにＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−４１％中に封入されたまま（ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−４１％と複合化したまま）のシクロスポリンの量を、それぞれ示す。
【図８−１】実施例８で調製したＨＡ−Ａｌａ−Ｃ２−ＣｈｏｌのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。
【図８−２】実施例８で調製したＨＡ−Ａｌａ−Ｃ２−ＣｈｏｌのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：７％）。
【図８−３】実施例８で調製したＨＡ−Ａｌａ−Ｃ１２−ＣｈｏｌのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：７％）。
【図８−４】実施例８で調製したＨＡ−Ａｌａ−Ｃ１２−ＣｈｏｌのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：７％）。
【図８−５】実施例８で調製したＨＡ−Ａｌａ−ＥＯ２−ＣｈｏｌのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：５％）。
【図８−６】実施例８で調製したＨＡ−Ａｌａ−ＥＯ２−ＣｈｏｌのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。
【図９】実施例９−２で調製したＨＡ−Ａｌａ−ＣＡのＮＭＲスペクトルの一例である（コラノイル基の導入率：１３％）。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明のヒアルロン酸誘導体は、式（Ｉ）で表される１以上の二糖単位（繰り返し単位でもある）を含むヒアルロン酸誘導体である。
【００３１】
本発明の一態様において、ヒアルロン酸誘導体は、（ａ）上記式（Ｉ）、（ｂ）上記式（Ｉ）および（ＩＩ）、（ｃ）上記式（Ｉ）および式（ＩＩｂ）、または（ｄ）上記式（Ｉ）および式（ＩＩ）および式（ＩＩｂ）の繰り返し単位から実質的に構成される。当該ヒアルロン酸誘導体は、当該誘導体に含まれるＤ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとから成る二糖の繰り返し単位のうちの、例えば８０％以上が、好ましくは９０％以上が、より好ましくは９５％以上が式（Ｉ）、（ＩＩ）または式（ＩＩｂ）の繰り返し単位である。本発明の１つの態様において、ヒアルロン酸誘導体は、（ａ）上記式（Ｉ）、（ｂ）上記式（Ｉ）および式（ＩＩ）、（ｃ）上記式（Ｉ）および式（ＩＩｂ）、または（ｄ）上記式（Ｉ）および式（ＩＩ）および式（ＩＩｂ）で表される繰り返し単位のみから構成される。
【００３２】
本発明のヒアルロン酸誘導体に存在する二糖の繰り返し単位に対する特定の二糖単位の割合は、二糖単位を繰り返し単位とする多糖類である本発明のヒアルロン酸誘導体の一定量に含まれる全ての二糖単位に対する特定の二糖単位の割合を意味する。
【００３３】
本発明のヒアルロン酸誘導体に含まれる二糖単位を表す式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、全て水素原子であるのが好ましい。Ｒ５は、水素原子またはＣ１−６アルキルカルボニルであるのが好ましく、水素原子またはアセチルであるのが更に好ましく、アセチルであるのが更に好ましい。また、本発明のヒアルロン酸誘導体に含まれる二糖単位を表す式（ＩＩ）および（ＩＩｂ）において、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａおよびＲ４ａ、並びにＲ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂは、全て水素原子であるのが好ましい。Ｒ５ａおよびＲ５ｂは、水素原子またはＣ１−６アルキルカルボニルであるのが好ましく、水素原子またはアセチルであるのが更に好ましく、いずれもアセチルであるのが更に好ましい。
【００３４】
式（Ｉ）におけるＲａの具体例としては、水素原子、メチル、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、カルバモイルメチル、カルボキシメチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、イソプロピル、２−カルボキシエチル、２−メチルチオエチル、２−カルバモイルエチル、フェニルメチル、（４−ヒドロキシフェニル）メチル、およびインドール−３−イルメチルなどが挙げられる。
【００３５】
基−ＣＨＲａ−が不斉中心となる場合は、それぞれの光学活性体およびそれらの混合物も含まれるが、Ｈ２Ｎ−ＣＨＲａ−ＣＯＯＨ（アミノ酸）として記載した時、Ｌ型（天然型）となるのが好ましい。
【００３６】
式（Ｉ）において、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、例えば、独立に、水素原子またはメチルであり、好ましくは全て水素原子である。
【００３７】
式（Ｉ）における基−ＣＨＲａ−ＣＯ−Ｘ１の態様として、例えば、基−ＣＨＲａ−ＣＯＯＨが挙げられる。該基の具体例として以下の基が挙げられる。
【００３８】
【化５】
2014038641.tif 000006
ここで、「＊」は、−ＮＲ６−との結合位置を表す（以下同じ）。
【００３９】
基−ＣＨＲａ−ＣＯＯＨの好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【００４０】
【化６】
2014038641.tif 000007
【００４１】
基−ＣＨＲａ−ＣＯＯＨの好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【００４２】
【化７】
2014038641.tif 000008
【００４３】
基−ＣＨＲａ−ＣＯＯＨの好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【００４４】
【化８】
2014038641.tif 000009
【００４５】
基−ＣＨＲａ−ＣＯＯＨの好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【００４６】
【化９】
2014038641.tif 000010
【００４７】
基−ＣＨＲａ−ＣＯＯＨの好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【００４８】
【化１０】
2014038641.tif 000011
【００４９】
上述した基−ＣＨＲａ−ＣＯＯＨは、いずれも、その一部または全部が、基−ＣＨＲａ−ＣＯＮＨ−Ｚ１−Ｚ２に変換されていてもよい。基−Ｚ１−Ｚ２の例は、後述の通りである。
【００５０】
式（Ｉ）における基−ＣＨＲａ−ＣＯ−Ｘ１の別の態様として、例えば、基−ＣＨＲａ−ＣＯＮＨ２が挙げられる。該基の具体例として以下の基が挙げられる。
【００５１】
【化１１】
2014038641.tif 000012
【００５２】
基−ＣＨＲａ−ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【００５３】
【化１２】
2014038641.tif 000013
【００５４】
基−ＣＨＲａ−ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【００５５】
【化１３】
2014038641.tif 000014
【００５６】
基−ＣＨＲａ−ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【００５７】
【化１４】
2014038641.tif 000015
【００５８】
基−ＣＨＲａ−ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【００５９】
【化１５】
2014038641.tif 000016
【００６０】
これらの基は、生分解性と血中滞留性の両方の特性を有する観点で、好ましい基でもある。
【００６１】
生分解性と血中滞留性の両方の特性を有する観点では、基−ＣＨＲａ−ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基も挙げられる。
【００６２】
【化１６】
2014038641.tif 000017
【００６３】
生分解性と血中滞留性の両方の特性を有する観点で、基−ＣＨＲａ−ＣＯＮＨ２のさらに好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【００６４】
【化１７】
2014038641.tif 000018
【００６５】
純水中でのより好適な分散性の観点で、基−ＣＨＲａ−ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【００６６】
【化１８】
2014038641.tif 000019
【００６７】
これら２つの基は、持続性の皮下投与用注射製剤の基材としての観点でも好ましい例である。
【００６８】
持続性の皮下投与用注射製剤の基材としての観点で、基−ＣＨＲａ−ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【００６９】
【化１９】
2014038641.tif 000020
【００７０】
Ｒ７としては、水素原子およびメチルがさらに好ましく、水素原子がさらに好ましい。
【００７１】
式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩｂ）において定義されるカルボキシは式−ＣＯＯ−Ｑ＋で表される塩を形成していてもよい。ここで、Ｑ＋はカルボキシと水中で塩を形成するカウンターカチオンであれば特に限定されず、２価以上の場合は価数に応じて複数のカルボキシと塩を形成する。カウンターカチオンの例としては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどの金属イオン；式：Ｎ＋ＲｊＲｋＲｌＲｍ（式中、Ｒｊ、Ｒｋ、ＲｌおよびＲｍは、それぞれ独立に、水素原子およびＣ１−６アルキルから選択される）で表されるアンモニウムイオンなどが挙げられ、好ましくは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、テトラアルキルアンモニウムイオン（例えば、テトラｎ−ブチルアンモニウムイオンなど）が挙げられる。Ｒｊ、Ｒｋ、ＲｌおよびＲｍは、Ｃ１−６アルキルから選択される同一の基であるのが好ましく、ｎ−ブチルであるのが好ましい。
【００７２】
式（Ｉ）における基−ＣＨＲａ−ＣＯ−Ｘ１の別の態様として、例えば、基−ＣＨＲａ−ＣＯＮＨ−Ｚ１−Ｚ２が挙げられる。該基の具体例として以下の基が挙げられる。
【００７３】
【化２０】
2014038641.tif 000021
【００７４】
該基の別の具体例として以下の基が挙げられる。
【００７５】
【化２１】
2014038641.tif 000022
【００７６】
基−ＣＨＲａ−ＣＯＮＨ−Ｚ１−Ｚ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【００７７】
【化２２】
2014038641.tif 000023
【００７８】
基−ＣＨＲａ−ＣＯＮＨ−Ｚ１−Ｚ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【００７９】
【化２３】
2014038641.tif 000024
【００８０】
基−ＣＨＲａ−ＣＯＮＨ−Ｚ１−Ｚ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【００８１】
【化２４】
2014038641.tif 000025
【００８２】
生分解性と血中滞留性の両方の特性を有する観点で、基−ＣＨＲａ−ＣＯＮＨ−Ｚ１−Ｚ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【００８３】
【化２５】
2014038641.tif 000026
【００８４】
基−Ｚ１−Ｚ２の例としては、基−（Ｃ２−１０アルキレン）−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｚ３が挙げられる。また、基−（Ｃ２−１２アルキレン）−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｚ３も挙げられる。ここでＣ２−１２アルキレンの例として、好ましくは、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）６−、−（ＣＨ２）８−、−（ＣＨ２）１０−および−（ＣＨ２）１２−が挙げられ、さらに好ましくは−（ＣＨ２）２−および−（ＣＨ２）６−が挙げられる。さらに、基−Ｚ１−Ｚ２の例としては、基−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−Ｚ３が挙げられる。ここでｍは、１〜２０が好ましく、１〜１０がさらに好ましく、１〜３がさらに好ましい。好ましいｍの具体例として、２が挙げられる。基−Ｚ１−Ｚ２の例として、好ましくは基−（ヘキサン−１，６−ジイル）−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｚ３、基−（エタンン−１，２−ジイル）−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｚ３および基−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−Ｚ３が挙げられ、さらに好ましくは基−（ヘキサン−１，６−ジイル）−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリル、基−（エタン−１，２−ジイル）−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリルおよび基−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−コラノイルが挙げられ、さらに好ましくは基−（ヘキサン−１，６−ジイル）−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリルが挙げられる。Ｚ１、Ｚ２、基−Ｚ１−Ｚ２の例としては、国際公開第２０１０／０５３１４０号の、Ｙ、Ｘ１、基−Ｙ−Ｘ１に相当するものを、それぞれ挙げることもできる。基−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３および基−Ｏ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｚ３の例としては、Ｒｃが水素原子である基を、それぞれ挙げることができる。
【００８５】
本発明のヒアルロン酸誘導体において、式（ＩＩ）の繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体も好ましい。さらに好ましい態様において、式（Ｉ）のＸ１と式（ＩＩ）のＸ２は同一である。本発明の一つの側面において、Ｘ１が−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２である式（Ｉ）で表される繰り返し単位、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位および式（ＩＩｂ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体が提供される。
【００８６】
本明細書で言及する用語「ステリル基」とは、ステロイド骨格を有する基であれば特に制限されない。ここでステロイドとしては、具体的には、コレステロール、デヒドロコレステロール、コプロステノール、コプロステロール、コレスタノール、カンペスタノール、エルゴスタノール、スチグマスタノール、コプロスタノール、スチグマステロール、シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール、シミアレノール、胆汁酸（コラン酸、リトコール酸、ヒオデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、アポコール酸、コール酸、デヒドロコール酸、グリココール酸、タウロコール酸）、テストステロン、エストラジオール、プロゲストロン、コルチゾール、コルチゾン、アルドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチステロンなどが挙げられる。ステリル基としては、コレステリル基、スチグマステリル基、ラノステリル基、エルゴステリル基、コラノイル基、コロイル基などが挙げられ、好ましくはコレステリル基（特に、下式で示されるコレスタ−５−エン−３β−イル基）、コラノイル基（特に、下式で示される５β−コラン−２４−オイル基）が挙げられる。
【００８７】
【化２６】
2014038641.tif 000027
ここで、「＊＊」は、隣の基との結合位置を表す。
【００８８】
本明細書で言及する用語「Ｃ１−２０アルキル」とは、炭素数１〜２０の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチルなどの「Ｃ１−４アルキル」が含まれ、さらに、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、２−メチルブチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３−エチルブチル、および２−エチルブチルなどが含まれる。Ｃ１−２０アルキルには、炭素数が１〜１２の「Ｃ１−１２アルキル」、炭素数が１〜６の「Ｃ１−６アルキル」も含まれる。
【００８９】
本明細書で言及する用語「Ｃ１−６アルキル」とは、炭素数１〜６の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチルなどの「Ｃ１−４アルキル」が含まれる。
【００９０】
本明細書で言及する用語「Ｃ１−６アルコキシ」とは、炭素数１〜６の直鎖状、分岐鎖状のアルキルオキシ基を意味し、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｔ−ブトキシなどの「Ｃ１−４アルコキシ」が含まれる。
【００９１】
本明細書で言及する用語「Ｃ１−６アルキルカルボニル」とは、アルキル部分が既に言及したＣ１−６アルキルであるアルキルカルボニル基を意味し、例えば、アセチル、プロピオニル、ｎ−プロピルカルボニル、ｉ−プロピルカルボニル、ｎ−ブチルカルボニル、ｓ−ブチルカルボニル、ｉ−ブチルカルボニル、ｔ−ブチルカルボニルなどの「Ｃ１−４アルキルカルボニル」が含まれる。
【００９２】
本明細書で言及する用語「Ｃ１−６アルコキシ」とは、アルキル部分が既に言及したＣ１−６アルキルであるアルキルオキシ基を意味し、例えば、メトキシ（Ｈ３Ｃ−Ｏ−）、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｔ−ブトキシなどが含まれる。
【００９３】
本明細書で言及する用語「Ｃ１−６アルキルチオ」とは、アルキル部分が既に言及したＣ１−６アルキルであるアルキルチオ基を意味し、例えば、メチルチオ（Ｈ３Ｃ−Ｓ−）、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、ｉ−プロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、ｓ−ブチルチオ、ｉ−ブチルチオ、ｔ−ブチルチオなどが含まれ、好ましくはメチルチオが挙げられる。
【００９４】
本明細書で言及する用語「アミノＣ２−２０アルキル」は、置換基としてアミノを有する炭素数２〜２０の直鎖状、分岐鎖状のアルキルを意味し、例えば、アミノはアルキルの末端の炭素原子上に位置していてもよい。アミノＣ２−２０アルキルには、炭素数が２〜１２の「アミノＣ２−１２アルキル」も含まれる。
【００９５】
本明細書で言及する用語「ヒドロキシＣ２−２０アルキル」は、置換基としてヒドロキシを有する炭素数２〜２０の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、ヒドロキシはアルキルの末端の炭素原子上に位置していてもよい。ヒドロキシＣ２−２０アルキルには、炭素数が２〜１２の「ヒドロキシＣ２−１２アルキル」も含まれる。
【００９６】
本明細書で言及する用語「Ｃ２−３０アルキレン」とは、炭素数２〜３０の直鎖状または分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン、プロピレンなどを含み、Ｃ２−２０アルキレン、Ｃ２−８アルキレン、基−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎは２〜３０、好ましくは２〜２０、さらに好ましくは２〜１５）を含む。
【００９７】
本明細書で言及する用語「Ｃ１−５アルキレン」とは、炭素数１〜５の直鎖状または分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン（エタン−１，２−ジイル、エタン−１，１−ジイル）、プロピレン（プロパン−１，１−ジイル、プロパン−１，２−ジイル、プロパン−１，３−ジイル）、ブタン−１，４−ジイル、およびペンタン−１，５−ジイルなどを含む。
【００９８】
本明細書で言及する用語「Ｃ２−１０アルキレン」とは、炭素数２〜１０の直鎖状または分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン（エタン−１，２−ジイル、エタン−１，１−ジイル）、プロピレン（プロパン−１，１−ジイル、プロパン−１，２−ジイル、プロパン−１，３−ジイル）、ブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，５−ジイル、ヘキサン−１，６−ジイル、ヘプタン−１，７−ジイル、オクタン−１，８−ジイルなどを含む。「Ｃ２−１０アルキレン」は、炭素数２〜８の「Ｃ２−８アルキレン」および炭素数２〜６の「Ｃ２−６アルキレン」を含む。
【００９９】
本明細書で言及する用語「Ｃ２−８アルキレン」とは、炭素数２〜８の直鎖状または分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン（エタン−１，２−ジイル、エタン−１，１−ジイル）、プロピレン（プロパン−１，１−ジイル、プロパン−１，２−ジイル、プロパン−１，３−ジイル）、ブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，５−ジイル、ヘキサン−１，６−ジイル、ヘプタン−１，７−ジイル、オクタン−１，８−ジイルなどを含む。
【０１００】
本明細書で言及する用語「Ｃ２−８アルケニレン」とは、炭素数２〜８の直鎖状または分岐鎖状の、１以上の二重結合を含む、２価の炭化水素基を意味し、例えば、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ−、２−ブテン−１，４−ジイル、ヘプタ−２，４−ジエン−１，６−ジイルおよびオクタ−２，４，６−トリエン−１，８−ジイルなどを含む。幾何異性が存在する場合は、それぞれの異性体およびそれらの混合物も含まれる。
【０１０１】
本発明において「アリール」とは、芳香族炭素環基、例えば炭素数が６〜１４の芳香族炭素環基を意味し、アリールの例としてはフェニル、ナフチル（１−ナフチル、および２−ナフチル）などが挙げられる。１以上のヒドロキシで置換されたアリールの例としては、４−ヒドロキシフェニルが挙げられる。
【０１０２】
本発明において「ヘテロアリール」とは、環を構成する原子中に、１または複数個の、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選択されるヘテロ原子を含有する芳香族性の環の基を意味し、部分的に飽和されていてもよい。環は単環、またはベンゼン環または単環へテロアリール環と縮合した２環式ヘテロアリールであってもよい。環を構成する原子の数は、例えば４〜１５であり、好ましくは、５〜１４、さらに好ましくは、６〜１０である。ヘテロアリールの例としては、たとえば、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジルなどが挙げられ、好ましくはインドール−２−イルが挙げられる。
【０１０３】
本発明のヒアルロン酸誘導体は薬物担体として使用することができ、当該薬物担体は生分解性である。ここで生分解性であるとは、ラットおよび／またはヒトに静脈内投与後、１５日後までの間に、肝臓中において検出される薬物担体が低分子化を起こしていることを意味する。「低分子化を起こしていること」は、肝臓中に存在する薬物担体の大きさを、サイズ排除カラムクロマトグラフィーに付して測定することで判定できる（本願明細書実施例２−３を参照）。この時、肝臓由来の薬物担体のピークトップが、投与前の薬物担体のピークトップと比較して低分子側に移行している（すなわち、カラムクロマトグラムにおける保持時間が長くなる）ならば、薬物担体が生分解性であると判定される。なお、生分解性の薬物担体は、尿、糞等の経路にて体外へ排泄されるため、尿中において低分子化を起こしていることが検出できるケースもあるが、疎水性基を有する本発明のヒアルロン酸誘導体はその疎水性により尿への排泄が抑制されやすいため、煩雑さや検出回数の制限の問題はあるものの、ヒアルロン酸の主な代謝臓器である肝臓における低分子化を検出することが、薬物担体の生分解性を直接的に判定する上で、より好ましい。
【０１０４】
本発明のさらに別の側面によれば、本明細書に定義したヒアルロン酸誘導体であって、当該誘導体に存在する二糖の繰り返し単位に対する基−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２（以下疎水性基とも称する）を有する式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）の繰り返し単位の割合（疎水性基の導入率）が３〜５０％である、前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。
【０１０５】
ここで、疎水性基の導入率は、以下の式：
【０１０６】
【数１】
2014038641.tif 000028
により算出される。ここで、「当該誘導体に存在する二糖の繰り返し単位」には、式（Ｉ）および式（ＩＩ）の繰り返し単位、ならびに式（ＩＩｂ）の繰り返し単位が含まれる。当該導入率は、反応条件、例えば試薬の比率により制御することができ、例えば、ＮＭＲ測定などにより決定することができる。
【０１０７】
疎水性基の導入率は、３〜５０％であり、好ましくは５〜４０％であり、より好ましくは５〜３５％であり、さらに好ましくは５〜２５％であり、より好ましくは５〜２０％であり、さらに好ましくは５〜１０％である。
【０１０８】
本発明の１つの態様において、後述する実施例１−４に例示されるように、ヒアルロン酸誘導体は、式（Ｉ）においてＸ１が−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２である。この場合、本発明のヒアルロン酸誘導体中に存在する二糖の繰り返し単位に対する式（Ｉ）の二糖単位の割合は、生分解性及び血中滞留性の両方の特性を有する観点で、例えば７０％以上、好ましくは７５％以上、更に好ましくは９０％以上である。上限は１００％以下であればよい。当該割合の範囲は、例えば、７０〜１００％、好ましくは７５〜１００％、更に好ましくは９０〜１００％である。なお、ヒアルロン酸誘導体は、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位をさらに含んでいてもよい。
【０１０９】
本発明の１つの態様において、ヒアルロン酸誘導体は、後述する実施例１−５に例示されるように、Ｘ１が−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２である式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含まない。この場合、存在する二糖の繰り返し単位における、（Ｉ）で表わされる繰り返し単位の割合、および式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位の割合の和は、７０〜１００％、好ましくは８０〜１００％、より好ましくは９０〜１００％である。
【０１１０】
ここで、存在する二糖の繰り返し単位における式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位の割合は、好ましくは３〜５０％、さらに好ましくは５〜４０％、さらに好ましくは５〜３５％、さらに好ましくは５〜２５％、さらに好ましくは５〜２０％、さらに好ましくは５〜１０％である。また、存在する二糖の繰り返し単位における（Ｉ）で表わされる繰り返し単位の割合は、好ましくは２０〜９７％、さらに好ましくは３０〜９５％、さらに好ましくは３５〜９５％、さらに好ましくは４５〜９５％、さらに好ましくは５０〜９５％、さらに好ましくは６０〜９５％である。
【０１１１】
存在する二糖の繰り返し単位における式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位の割合が５〜１０％の時、（Ｉ）で表わされる繰り返し単位の割合は、好ましくは６０〜９５％、さらに好ましくは７０〜９５％、さらに好ましくは７５〜９５％である。
【０１１２】
存在する二糖の繰り返し単位における式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位の割合が２０〜４０％、好ましくは２０〜３５％の時、（Ｉ）で表わされる繰り返し単位の割合は、好ましくは３０〜８０％、さらに好ましくは４５〜８０％、さらに好ましくは６０〜８０％である。
【０１１３】
存在する二糖の繰り返し単位における式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位の割合が１０〜２０％の時、式（Ｉ）で表わされる繰り返し単位の割合は、好ましくは５０〜９０％、さらに好ましくは６０〜９０％、さらに好ましくは７０〜９０％である。
【０１１４】
本発明のヒアルロン酸誘導体を製造するための原料としては、ヒアルロン酸またはその塩を使用することができる。ヒアルロン酸塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩を挙げることができ、特に好ましい塩は、医薬品として繁用されているナトリウム塩である。ＨＡまたはその薬学的に許容される塩は、鶏冠や豚皮下等の生物由来のものを抽出する方法や生物発酵法等の各種公知の方法を用いて製造することができ、あるいは市販のものを購入して（例えば、電気化学工業株式会社、株式会社資生堂、生化学工業株式会社、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社等から）入手することも可能である。
【０１１５】
原料として用いられる、式（ＩＩｂ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸（塩を含む）の重量平均分子量は、１ｋＤａ〜２，０００ｋＤａが好ましく、３ｋＤａ〜１，５００ｋＤａがさらに好ましく、５ｋＤａ〜１０００ｋＤａがさらに好ましい。さらに好ましくは１０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、さらに好ましくは１０ｋＤａ〜２００ｋＤａ、さらに好ましくは４５ｋＤａ〜２００ｋＤａ、さらに好ましくは５０ｋＤａ〜９９ｋＤａである。粒子径や粘度を小さくする、または溶解性を高める場合には、該重量平均分子量は、１ｋＤａ〜１００ｋＤａが好ましく、２ｋＤａ〜７０ｋＤａがさらに好ましく、３ｋＤａ〜５０ｋＤａがさらに好ましく、５ｋＤａ〜３０ｋＤａがさらに好ましい。粘度を大きくする、または皮下や関節腔内での滞留性を高める場合には、該重量平均分子量は、４５ｋＤａ〜２０００ｋＤａが好ましく、５０ｋＤａ〜２０００ｋＤａがさらに好ましく、１００ｋＤａ〜１０００ｋＤａがさらに好ましく、２００ｋＤａ〜１０００ｋＤａがさらに好ましい。持続性の皮下投与用注射製剤の基材としての観点では、該重量平均分子量は、５ｋＤａ〜２００ｋＤａが好ましい。重量平均分子量の具体例としては、例えば、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、５０ｋＤａ、９９ｋＤａ、２３０ｋＤａおよび１０５８ｋＤａが挙げられる。「ｋＤａ」は「キロダルトン」の略号である。
【０１１６】
なお、式（ＩＩｂ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸（塩を含む）の重量平均分子量とは、本発明のヒアルロン酸誘導体の主鎖構造を保持したまま、式（ＩＩｂ）における、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、およびＲ４ｂの全てを水素原子とし、Ｒ５ｂをアセチルとし、かつ、Ｘｂを−Ｏ−Ｎａ＋として換算した場合の重量平均分子量を意味する。従って、例えば、実際に用いる原料における一部又は全ての二糖単位においてＸｂが−Ｏ−（テトラｎ−ブチルアンモニウムイオン）であり、その重量平均分子量を上記に従って換算して４５ｋＤａ〜２００ｋＤａと算出される場合は、本発明の好ましい１態様に含まれることになる。
【０１１７】
なお、一般的に、ヒアルロン酸（塩を含む）は単一品として得ることが難しいため、その分子量は、数平均分子量または重量平均分子量として算出する。本発明においては、重量平均分子量として算出している。重量平均分子量の測定方法については、例えば、中浜精一他著「エッセンシャル高分子科学」（講談社発行、ＩＳＢＮ４−０６−１５３３１０−Ｘ）に記載された、光散乱法、浸透圧法、粘度法等、各種の公知の方法を利用することができ、本明細書において示される粘度平均分子量もウベローデ粘度計を使用するなど、本発明が属する技術分野において通常用いられる方法により測定することができる。従って、原料として用いられるヒアルロン酸（塩を含む）や本発明のヒアルロン酸誘導体の分子量も、重量平均分子量として算出されることになる。分子量を明示して市販されているヒアルロン酸（塩を含む）を使用する場合は、その明示された数値を分子量とすることもできる。
【０１１８】
本発明のヒアルロン酸誘導体の分子量は特に限定はされないが、局所投与における拡散遅延由来の徐放機能を期待する場合には粘度および分子量の高いヒアルロン酸が好ましく、最終剤形が溶液製剤の場合、スムーズな投与のため粘度および分子量の低いヒアルロン酸が好ましい。
【０１１９】
式（Ｉ）で表される二糖単位を含む本発明のヒアルロン酸誘導体は、グルクロン酸部分のカルボキシをアミドに変換することにより製造することができる。例えば、原料のヒアルロン酸（塩などを含む）、好ましくは、式（ＩＩｂ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と式：ＨＮＲ６−ＣＨＲａ−ＣＯＯＲｚ（式中、Ｒｚは、カルボキシを保護するためのエステル形成基であり、Ｒ６、およびＲａは本明細書に既に定義されたとおりである）または式：ＨＮＲ６−ＣＨＲａ−ＣＯＮＲ７Ｒ８（式中、Ｒ７、およびＲ８は本明細書に既に定義されたとおりである）で表される化合物とを反応させ、保護基が存在する場合は脱保護をおこなう方法が挙げられる(工程１)。ここでエステル形成基は特に限定されず、カルボキシの保護に通常用いられる基であれば特に限定されない。エステル形成基の例としては、Ｃ１−６アルキル、ベンジル、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル、およびベンジルオキシＣ１−６アルキルなどが挙げられる。
【０１２０】
式（Ｉ）における基：−ＮＲ６−ＣＨＲａ−ＣＯＯＲｚおよび−ＮＲ６−ＣＨＲａ−ＣＯＮＲ７Ｒ８は、複数存在する二糖単位の各々において同一であっても異なっていてもよい。例えば、異なる種類の式：ＨＮＲ６−ＣＨＲａ−ＣＯＯＲｚおよび／またはＨＮＲ６−ＣＨＲａ−ＣＯＮＲ７Ｒ８で表される化合物を用いて上記反応を行ってもよい。
【０１２１】
上記の反応において使用することができる縮合剤は特に限定されず、例えば、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン）−４−メチルモルホリウム（ＤＭＴ−ＭＭ）、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、２−ベンゾトリアゾール−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール−１−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などを挙げることができる。
【０１２２】
特に、限定はされないが、ＤＭＴ−ＭＭは水および有機溶媒の混合溶媒中でも反応が高効率に進む点において好ましい。また、ＤＭＴ−ＭＭを縮合剤として使用することにより、多数のヒドロキシが共存する系において、エステル結合形成を抑えつつ、高選択的にアミノとカルボキシによるアミド結合形成を行うことができる。この縮合剤の使用により、例えば、溶媒であるアルコールがヒアルロン酸部分のカルボキシと反応することや、ヒアルロン酸部分に同時に存在するカルボキシとヒドロキシとが、分子内もしくは分子間で結合して、望まない架橋を形成してしまうことを防ぐことができる。
【０１２３】
上記反応において用いる溶媒としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、スルホラン（ＳＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジオキサン（例えば１，４−ジオキサン）、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、およびこれらの混合溶媒を挙げることができる。出発物質、修飾物および生成物の溶解性と、縮合剤の反応性の観点からは、ＤＭＳＯ単独もしくは水／ＤＭＳＯ混合溶媒を使用するのが好ましい。修飾物であるアミノ−カルボン酸の種類によっては、それをメタノール溶液やジオキサン溶液として反応に用いてもよい。
【０１２４】
式：ＨＮＲ６−ＣＨＲａ−ＣＯＯＲｚで表される化合物として、例えば、アラニンエステル、セリンエステル、グリシンエステル、スレオニンエステル、アスパラギンエステル、アスパラギン酸ジエステル、バリンエステル、ロイシンエステル、イソロイシンエステル、グルタミン酸ジエステル、メチオニンエステル、グルタミンエステル、フェニルアラニンエステル、チロシンエステル、およびトリプトファンエステルなどが挙げられる。ここで、上記のエステルは、例えばＣ１−６アルキルエステル、アリールエステル、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキルエステル、アリールＣ１−６アルキルエステルなどであり、好ましくは、メチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステルなどである。
【０１２５】
式：ＨＮＲ６−ＣＨＲａ−ＣＯＮＲ７Ｒ８で表される化合物として、例えば、アラニンアミド、セリンアミド、グリシンアミド、スレオニンアミド、アスパラギンアミド、アスパラギン酸ジアミド、バリンアミド、ロイシンアミド、イソロイシンアミド、グルタミン酸ジアミド、メチオニンアミド、グルタミンアミド、フェニルアラニンアミド、チロシンアミド、およびトリプトファンアミドなどが挙げられる。
【０１２６】
疎水性基は、グルクロン酸のカルボキシまたは式（Ｉ）の基−ＮＲ６−ＣＨＲａ−ＣＯＯＨをアミドに変換して導入することができる（工程２）。例えば、原料のヒアルロン酸またはその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と式：ＨＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２（式中、Ｒ９、Ｚ１、およびＺ２は本明細書で既に定義したとおりである）で表される疎水性基を導入したアミンとを反応させる方法が挙げられる。
【０１２７】
上記の反応において使用することができる縮合剤は特に限定されず、例えば、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン）−４−メチルモルホリウム（ＤＭＴ−ＭＭ）、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、２−ベンゾトリアゾール−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール−１−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などを挙げることができる。
【０１２８】
疎水性基導入反応において用いる溶媒としては、水、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、およびこれらの混合溶媒を挙げることができる。
【０１２９】
あるいは、グルクロン酸のカルボキシまたは式（Ｉ）の基−ＮＲ６−ＣＨＲａ−ＣＯＯＨのカルボキシを、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩とスペーサー部分を反応させ（この際、必要に応じて保護及び脱保護反応を行ってもよい）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）を変換し、その後に適当な試薬と反応させてもよい。カルボキシから変換される基と、反応試薬の組み合わせの例を以下に示す。
【０１３０】
−ＣＯＮＲ９−Ｚ１−ＮＲｂＨ  ＋  Ｈａｌ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ９−Ｚ１−ＮＲｂＨ  ＋  Ｈａｌ−ＣＯＯＺ３、
−ＣＯＮＲ９−Ｚ１−ＮＲｂＨ  ＋  ＨＯＣＯ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ９−Ｚ１−ＮＲｂＨ  ＋  Ｈａｌ−ＣＯ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ９−Ｚ１−ＣＯＯＨ  ＋  ＨＯ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ９−Ｚ１−ＯＨ  ＋  Ｈａｌ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ９−Ｚ１−ＣＯＯＨ  ＋  ＮＲｃ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ９−Ｚ１−ＯＣＯ−Ｈａｌ  ＋  ＮＲｃ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ９−Ｚ１−ＯＣＯＯＨ  ＋  ＨＯ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ９−Ｚ１−ＯＣＯＯＨ  ＋  Ｈａｌ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ９−Ｚ１−ＯＣＯ−Ｈａｌ  ＋  ＨＯ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ９−Ｚ１−ＳＨ  ＋  Ｈａｌ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ９−Ｚ１−Ｈａｌ  ＋  ＨＳ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ９−Ｚ１−ＣＯ−Ｙａ−Ｈａｌ  ＋  ＨＳ−Ｚ３
−ＣＯＮＲ９−Ｚ１−ＣＯ−Ｙａ−ＳＨ  ＋  Ｈａｌ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ９−Ｚ１−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ２  ＋  ＨＳ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ９−Ｚ１−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２  ＋  ＨＳ−Ｚ３、
−ＣＯＮＲ９−Ｚ１−ＳＨ  ＋  ＨＳ−Ｒ、
（式中、Ｒ９、Ｚ１、Ｒｂ、ＲｃおよびＺ３は本明細書で既に定義したとおりであり、Ｈａｌは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素から選択されるハロゲン原子を表す）。
【０１３１】
反応様式としては、脱ハロゲン化水素反応、縮合反応、脱水反応、マイケル付加等の求核付加反応、酸化的なジスルフィド形成反応等が挙げられ、これらは周知な反応であり、当業者が適宜選択し、好ましい反応条件を見出して行うことができる。変換体または反応物がカルボキシを有する場合は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（以下、「ＮＨＳ」とも称す）エステルとし、反応させてもよい。
【０１３２】
また、グルクロン酸のカルボキシまたは式（Ｉ）の基−ＮＲ６−ＣＨＲａ−ＣＯＯＨのカルボキシに、２−アミノエチル  ２−ピリジル  ジスルフィドを反応させて、末端に脱離基で修飾されたメルカプトを有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体を調製し、これにチオコレステロールを求核置換反応させてジスルフィド結合を形成する方法を挙げることもできる。
【０１３３】
さらに、グルクロン酸のカルボキシまたは式（Ｉ）の基−ＮＲ６−ＣＨＲａ−ＣＯＯＨのカルボキシにスペーサーの一部を導入したものと、ステリル基にスペーサーの一部を導入したものを調製し、これらを反応させる方法を挙げることもできる。具体例の一部は上述したが、さらに、Ｙに−Ｓ−Ｓ−が挿入されている場合は、グルクロン酸のカルボキシまたは式（Ｉ）の基−ＮＲ６−ＣＨＲａ−ＣＯＯＨのカルボキシに、末端にメルカプトを有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体と、末端にメルカプトを有するスペーサーが導入されたステリル基をそれぞれ調製し、これらを酸化的に反応させてジスルフィド結合を形成させる方法を挙げることもできる。このとき、一方のメルカプトを２−メルカプトピリジンと反応させてジスルフィドとした後に、他方のメルカプトと置換させることもできる。
【０１３４】
工程１と工程２の順番は問われない。例えば、原料のヒアルロン酸（塩などを含む）、好ましくは、式（ＩＩｂ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と式：ＨＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２（式中、Ｒ９、Ｚ１、およびＺ２は本明細書で既に定義したとおりである）で表される疎水性基を導入したアミンとを反応させ、次いで、適当な縮合剤存在下、溶媒中で、当該反応物と式：ＨＮＲ６−ＣＨＲａ−ＣＯＯＲｚ（式中、Ｒｚは、カルボキシを保護するためのエステル形成基であり、Ｒ６、およびＲａは本明細書に既に定義されたとおりである）または式：ＨＮＲ６−ＣＨＲａ−ＣＯＮＲ７Ｒ８（式中、Ｒ７、およびＲ８は本明細書に既に定義されたとおりである）で表される化合物とを反応させてもよい。
【０１３５】
本発明の１つの態様において、ヒアルロン酸誘導体は、式（ＩＩｂ）で表わされる繰り返し単位および式（Ｉａ）
【０１３６】
【化２７】
2014038641.tif 000029
［式中、Ｘａは、ヒドロキシ、−Ｏ−Ｑ＋、Ｃ１−６アルコキシおよび−ＮＲ７Ｒ８から選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｑ＋、およびＲａは、本明細書で既に定義されたとおりである］
で表わされる繰り返し単位をそれぞれ含むヒアルロン酸誘導体を、以下の式
ＨＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２
［式中、Ｒ９、Ｚ１、およびＺ２は、本明細書で既に定義されたとおりである］
で表わされる化合物と反応させることにより得られる。
【０１３７】
反応は、カルボキシ（塩を含む）とアミノとを縮合させ、カルボキシをアミドに変換することにより行われ、工程２と同様の方法を用いることができる。
【０１３８】
本発明は、以下の式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位を含んでいてもよい。従って、本発明の１つの態様において、（ａ）式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）、（ｂ）式（Ｉ）および式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）、（ｃ）式（Ｉ）および式（ＩＩｂ）および式（ＩＩＩ）、または（ｄ）式（Ｉ）および式（ＩＩ）および式（ＩＩｂ）および式（ＩＩＩ）で表される１以上の二糖単位をそれぞれ含むヒアルロン酸誘導体が提供される。
【０１３９】
式（ＩＩＩ）：
【０１４０】
【化２８】
2014038641.tif 000030
［式中、Ｒ１ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃ、およびＲ４ｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｒ５ｃは、水素原子、ホルミルまたはＣ１−６アルキルカルボニルであり；
Ｒｅは、水素原子またはＣ１−６アルキルであり；
Ｒｄは、水素原子、Ｃ１−６アルキル、−ＣＯ−Ｃ（Ｒ１０）＝ＣＨ２、または−ＣＯ−Ｇ４−Ｘｃであり； 
Ｒ１０は、水素原子またはメチルであり；
Ｇ４は、フェニレン、Ｃ３−８シクロアルキレン、または−Ｇ５−（Ｃ１−１０アルキレン）−Ｇ６−から選択され、ここでＣ１−１０アルキレン部分は、１〜３のフェニレンまたはＣ３−８シクロアルキレンが挿入されていてもよく；
Ｇ５およびＧ６は、それぞれ独立に、直接結合、フェニレン、またはＣ３−８シクロアルキレンから選択され；
Ｘｃは、メルカプト、ハロゲン原子または式：
【０１４１】
【化２９】
2014038641.tif 000031
で表される基であり；
Ｙｂは、−ＣＨ２−（ＣＨＲ１５）ｌ−２−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−（ＣＨＲ１６）ｐ−２−ＣＨ２−Ｏ−、−（ＣＨ２）ｊ−Ｓ−または−（ＣＨ２）ａ−（Ｙ１−（ＣＨ２）ｂ）ｃ−Ｇ−であり；
ｌ、ｐ、およびｊは、それぞれ独立に２〜１０から選択される整数であり、Ｒ１５およびＲ１６は、それぞれ独立に、水素原子またはヒドロキシであり；
ａは、２〜１０から選択される整数であり；
ｂは、それぞれ独立に２〜１０から選択される整数であり；
ｃは、１〜２００から選択される整数であり；
Ｙ１は、酸素原子または−ＮＲｎ−であり；
Ｇは、酸素原子、硫黄原子または−ＮＨ−であり；
Ｒｎは、水素原子、Ｃ１−６アルキル、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｄ−Ｒｏ、−（ＣＨ２）ｅ−Ｒｐまたは−（ＣＨ２）ｆ−（Ｙ２−（ＣＨ２）ｇ）ｈ−Ｒｑであり；
ｇは、それぞれ独立に、２〜１０から選択される整数であり；
ｄ、ｅ、ｆおよびｈは、それぞれ独立に、２〜１０から選択される整数であり；
Ｒｏ，ＲｐおよびＲｑは、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシ、カルボキシまたは−ＮＨＲｒであり；
Ｙ２は、酸素原子または−ＮＨ−であり；
Ｒｒは、水素原子、ホルミルまたはＣ１−６アルキルカルボニルである］
で表される二糖単位。
【０１４２】
式（ＩＩＩ）で表される二糖単位を含む本発明のヒアルロン酸誘導体を製造する方法としては、例えば、上記のヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩と、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と式：ＨＮＲｅ−Ｙｂ−Ｒｗ（式中、Ｒｗは、水素原子、Ｃ１−６アルキル、−ＣＯ−Ｃ（Ｒ１０）＝ＣＨ２、−ＣＯ−Ｇ４−Ｘｃ、ヒドロキシの保護基、アミノの保護基、またはメルカプトの保護基であり、Ｒｅ、Ｙｂ、Ｒ１０、Ｇ４、およびＸｃは本明細書に既に定義されたとおりである）で表される化合物とを反応させ、保護基が存在する場合は脱保護をおこなう方法が挙げられる。上記反応では本明細書に既に記載した縮合剤および溶媒を使用することができる。
【０１４３】
−ＣＯ−Ｇ４−Ｘｃの具体例としては、以下の式で表される基が挙げられる：
【０１４４】
【化３０】
2014038641.tif 000032
【０１４５】
上記反応において用いられる保護基の具体例は、例えばＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９に記載されている。
【０１４６】
ヒドロキシの保護基の例としては、Ｃ１−６アルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、アリールＣ１−６アルキル、ヘテロアリールＣ１−６アルキル、アリールＣ１−６アルキルアミノカルボニル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、（（アミノＣ１−６アルキル）カルボニルオキシ）Ｃ１−６アルキル、不飽和ヘテロ環カルボニルオキシＣ１−６アルキル、アリールジ（Ｃ１−６アルキル）シリル、トリ（Ｃ１−６アルキル）シリルなどが挙げられる。好ましいヒドロキシの保護基としては、アセチルなどが挙げられる。
【０１４７】
−ＮＨ−またはアミノの保護基の例には、Ｃ１−６アルキルカルボニル、アリールＣ１−６アルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、アリールＣ１−６アルキル、ヘテロアリールＣ１−６アルキル、（アリールＣ１−６アルキル）アミノカルボニルなどが含まれる。好ましいアミノの保護基としては、アセチル、ｔ−ブトキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニルなどが挙げられる。また、アミノは保護されることにより、フタル酸イミド、コハク酸イミド、グルタル酸イミド、１−ピロリルなどの飽和または不飽和へテロ環基を形成していてもよい。
【０１４８】
メルカプトの保護基としては、例えば、エチルチオおよびｔ−ブチルチオ等のＣ１−６アルキルチオ、２−ニトロフェニルチオおよび２−カルボキシフェニルチオ等の置換フェニルチオ、並びに２−ピリジルチオ等のヘテロアリールチオが挙げられる。好ましい例は、２−ピリジルチオである。
【０１４９】
上記式（ＩＩＩ）の−ＮＲｅ−Ｙｂ−Ｒｄで表される基の例としては、式：
−ＮＨ−ＣＨ２−（ＣＨＲ１５）ｌ−２−ＣＨ２−ＮＨ２；
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｙ１−ＣＨ２−ＣＨ２）ｃ−ＮＨ２；
−ＮＨ−ＣＨ２−（ＣＨＲ１６）ｐ−２−ＣＨ２−ＯＨ；
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｙ１−ＣＨ２−ＣＨ２）ｃ−ＯＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｊ−ＳＨ；
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｙ１−ＣＨ２−ＣＨ２）ｃ−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ１０）＝ＣＨ２；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｌ−ＮＨＣＯ−Ｃ（Ｒ１０）＝ＣＨ２；
−ＮＨ−ＣＨ２−（ＣＨＲ１５）ｌ−２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＳＨ；
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｙ１−ＣＨ２−ＣＨ２）ｃ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｕ−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｌ−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｕ−ＳＨ；
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｙ１−ＣＨ２−ＣＨ２）ｃ−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ；
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｙ１−ＣＨ２−ＣＨ２）ｃ−ＮＨＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ；
−ＮＨ−ＣＨ２−（ＣＨＲ１５）ｌ−２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｂｒ；
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｙ１−ＣＨ２−ＣＨ２）ｃ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｉ；
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｙ１−ＣＨ２−ＣＨ２）ｃ−ＮＨＣＯ−Ｃ（Ｒ１０）＝ＣＨ２；または
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｙ１−ＣＨ２−ＣＨ２）ｃ−Ｏ−ＣＯ−Ｃ（Ｒ１０）＝ＣＨ２
［式中、Ｒ１０、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｙ１、ｃ、ｊ、ｌ、およびｐは、本明細書で定義されるとおりであり、ｕは、１〜３の整数である］
で表される基が挙げられる。
【０１５０】
ここで、ヒアルロン酸誘導体の分子中に含まれる、Ｒ１５およびＲ１６がヒドロキシであるＣＨＲ１５およびＣＨＲ１６の個数は、それぞれ０〜８であるが、好ましくは０〜３、さらに好ましくは０および１である。Ｒ１５およびＲ１６がヒドロキシであるＣＨＲ１５およびＣＨＲ１６の個数を調節することで、本発明のヒアルロン酸誘導体の、水に対する溶解度を調節することができる。Ｒ１５がすべて水素原子の場合、ｌとしては２〜６が好ましく、その具体例として２および６が挙げられる。Ｒ１５の１つがヒドロキシである場合、ｌの具体例としては３が挙げられる。Ｙ１が酸素原子の場合、ｃの具体例としては２が挙げられる。Ｙ１が−ＮＨ−の場合、ｃの具体例としては１〜３が挙げられる。ｌおよびｐの具体例としては３が挙げられる。
【０１５１】
−（ＣＨ２）ａ−（Ｙ１−（ＣＨ２）ｂ）ｃ−Ｇ−の具体例としては、例えば、−（ＣＨ２）２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｃ−Ｏ−、−（ＣＨ２）２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｃ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２）ｃ−Ｏ−、−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２）ｃ−ＮＨ−、−（ＣＨ２）２−ＮＲｎ−（ＣＨ２）２−Ｏ−、−（ＣＨ２）２−ＮＲｎ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−、−（ＣＨ２）３−ＮＲｎ−（ＣＨ２）４−Ｏ−、−（ＣＨ２）３−ＮＲｎ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−、−（ＣＨ２）６−ＮＲｎ−（ＣＨ２）６−Ｏ−、−（ＣＨ２）６−ＮＲｎ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−、−（ＣＨ２）３−ＮＲｎ−（ＣＨ２）２−ＮＲｎ−（ＣＨ２）３−Ｏ−、−（ＣＨ２）３−ＮＲｎ−（ＣＨ２）２−ＮＲｎ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−、−（ＣＨ２）３−ＮＲｎ−（ＣＨ２）４−ＮＲｎ−（ＣＨ２）３−Ｏ−、−（ＣＨ２）３−ＮＲｎ−（ＣＨ２）４−ＮＲｎ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（スペルミン型）、−（ＣＨ２）２−ＮＲｎ−（ＣＨ２）２−ＮＲｎ−（ＣＨ２）２−ＮＲｎ−（ＣＨ２）２−Ｏ−、−（ＣＨ２）２−ＮＲｎ−（ＣＨ２）２−ＮＲｎ−（ＣＨ２）２−ＮＲｎ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−、−（ＣＨ２）２−ＮＲｎ−（ＣＨ２）２−ＮＲｎ−（ＣＨ２）２−ＮＲｎ−（ＣＨ２）２−ＮＲｎ−（ＣＨ２）２−Ｏ−、−（ＣＨ２）２−ＮＲｎ−（ＣＨ２）２−ＮＲｎ−（ＣＨ２）２−ＮＲｎ−（ＣＨ２）２−ＮＲｎ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−、が挙げられる。ここで、Ｒｎとしては、全てが水素原子であるのが好ましい。
【０１５２】
これら−（ＣＨ２）ａ−（Ｙ１−（ＣＨ２）ｂ）ｃ−Ｇ−に結合するＲｄの具体例としては、例えば、水素原子、−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＯ−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｃｌ、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｂｒ、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｉ、−ＣＯ−ＣＨ２−ＳＨ、−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ等が挙げられる。
【０１５３】
また、−ＮＲｅ−Ｙｂ−Ｒｄで表される基の具体例として、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ（−（ＣＨ２）４−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨＣＯＣＨ３）−（ＣＨ２）２−ＳＨ、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨＣＯＣＨ３）−（ＣＨ２）３−ＳＨおよび−ＮＨ−（ＣＨ２）５−Ｎ（−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣＯＣＨ３）−（ＣＨ２）２−ＳＨが挙げられる。
【０１５４】
さらにまた、−ＮＲｅ−Ｙｂ−Ｒｄで表される基の具体例として、以下の基も挙げられる：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ１７）−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−（ＣＨ２）３−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ１７）−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）２−ＳＨ；
−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−（ＣＨ２）３−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ１７）−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−（ＣＨ２）３−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ１７）−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２−ＳＨ；
−ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）２−ＳＨ；
−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−（ＣＨ２）−ＳＨ；
−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−（ＣＨ２）２−ＳＨ；および
−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）−（ＣＨ２）２−ＣＯＮＨ−ＣＨ（ＣＯＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）−ＣＨ２−ＳＨ
（ここで、Ｒ１７は、水素原子またはＣ１−６アルキルであり、ｐ１は２〜１０の整数、ｑは１〜２００の整数を、それぞれ表す。）
【０１５５】
存在する二糖の繰り返し単位における、式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位の割合は、例えば０．１〜９９．５％であり、好ましくは１〜３０％である。
【０１５６】
式（ＩＩＩ）で表される二糖単位を含む本発明のヒアルロン酸誘導体を製造する方法として、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分のカルボキシ（−ＣＯＯＨ）を、式：Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−（ＣＨＲ１５）ｌ−２−ＣＨ２−ＮＨ２で表されるジアミンと反応させて式：−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−（ＣＨＲ１５）ｌ−２−ＣＨ２−ＮＨ２で表されるアミドに変換し、さらに末端のアミノを修飾して基：−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−（ＣＨＲ１５）ｌ−２−ＣＨ２−ＮＨＲｄで表されるアミドに変換する方法（工程３ａ）が挙げられる。
【０１５７】
上記ジアミンの具体例としては、例えば、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）５−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）６−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）７−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）８−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）９−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）１０−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−（ＣＨＯＨ）２−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−（ＣＨＯＨ）２−（ＣＨ２）２−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２−ＣＨＯＨ）２−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−（ＣＨＯＨ）３−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−（ＣＨＯＨ）２−（ＣＨ２）３−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−（ＣＨＯＨ）２−（ＣＨ２）２−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−（ＣＨＯＨ）３−（ＣＨ２）２−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−（ＣＨＯＨ）２−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ２、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ２およびＨ２Ｎ−（ＣＨ２）５−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ２が挙げられる。
【０１５８】
式（ＩＩＩ）で表される二糖単位を含む本発明のヒアルロン酸誘導体を製造する方法として、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分のカルボキシ（−ＣＯＯＨ）を、式：Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−（ＣＨＲ１６）ｐ−２−ＣＨ２−ＯＨで表されるヒドロキシアミンと反応させて式：−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−（ＣＨＲ１６）ｐ−２−ＣＨ２−ＯＨで表されるアミドに変換し、さらに末端のアミノを修飾して基：−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−（ＣＨＲ１６）ｐ−２−ＣＨ２−ＯＲｄで表されるアミドに変換する方法（工程３ｂ）が挙げられる。工程３ａと工程３ｂとを併せて工程３と称する。
【０１５９】
上記ヒドロキシアミンの具体例としては、例えば、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）５−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）６−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）７−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）８−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）９−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）１０−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）２−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−（ＣＨＯＨ）２−ＣＨ２−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）３−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）２−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−（ＣＨＯＨ）２−（ＣＨ２）２−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２−ＣＨＯＨ）２−ＣＨ２−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−（ＣＨＯＨ）３−ＣＨ２−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）４−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）３−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−（ＣＨＯＨ）２−（ＣＨ２）３−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）２−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−（ＣＨＯＨ）２−（ＣＨ２）２−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−（ＣＨＯＨ）３−（ＣＨ２）２−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−（ＣＨＯＨ）２−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）４−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）４−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）６−ＯＨおよびＨ２Ｎ−（ＣＨ２）５−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）４−ＯＨが挙げられる。
【０１６０】
なお、これらの化合物は例えばシグマ−アルドリッチ社などから市販されており、適宜購入して利用することができる。また、文献記載の方法に従い、もしくは文献記載の方法を参考にして合成してもよい。
【０１６１】
式（ＩＩＩ）における基：−ＮＲｅ−Ｙｂ−Ｒｄは、複数存在する二糖単位の各々において同一であっても異なっていてもよい。例えば、異なる種類の式：ＨＮＲｅ−Ｙｂ−Ｒｄで表される化合物を用いて上記反応を行ってもよい。
【０１６２】
式（Ｉ）におけるＸ１がヒドロキシ、−Ｏ−Ｑ＋またはＣ１−６アルコキシである場合、基−ＮＲｅ−Ｙｂ−Ｒｄは、式（ＩＩＩ）で表される二糖単位中に示した位置に存在するばかりでなく、その一部又は全部が、式（Ｉ）におけるＸ１と置換して、Ｘ１が、−ＮＲｅ−Ｙｂ−Ｒｄとなってもよい。
【０１６３】
工程１、工程２及び工程３の順番は問われない。好ましい順番としては、工程１、工程２、そして工程３の順番、工程２、工程１、そして工程３の順番、及び、工程１、工程３、そして工程２の順番が挙げられる。
【０１６４】
式（ＩＩＩ）で表される二糖単位において反応性の炭素−炭素二重結合を含むヒアルロン酸誘導体は、２以上のメルカプトを有する架橋剤（例えば、ジチオスレイトール：ＤＴＴ、ブタンジチオール、ポリエチレングリコールジチオール）との架橋反応に供することができる。また、式（ＩＩＩ）で表される二糖単位においてメルカプトを含むヒアルロン酸誘導体は、２以上のメルカプトを有する架橋剤（例えば、ジチオスレイトール：ＤＴＴ、ブタンジチオール、ポリエチレングリコールジチオール）とのジスルフィド形成による架橋反応、または反応性の炭素−炭素二重結合を２以上含む架橋剤（例えばジビニルスルホン）を使用する架橋反応に供することができる。架橋反応を行うことで、本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化することができる。
【０１６５】
架橋反応の他の事例としては、アミノにより修飾したヒアルロン酸誘導体と、Ｃ２−２０アルキレンの両端にスクシンイミジルエステルやその他のイミドエステルを有する架橋剤（例えば、ビス［スルフォスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ３）、エチレングリコール−ビス［スルフォスクシンイミジル］スクシネート（Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ）、ジメチルアジピミデート塩酸塩（ＤＭＡ）など）とので縮合反応による架橋；アミノにより修飾したヒアルロン酸誘導体と、Ｃ２−２０アルキレンの両端にホルミルを有する架橋剤（例えば、グルタルアルデヒドなど）との架橋；メルカプトにより修飾したヒアルロン酸誘導体の酸化条件下（例えば、テトラチオネートナトリウム（ＳＴＴ）存在下など）での酸化反応による架橋；メルカプトにより修飾したヒアルロン酸誘導体と、Ｃ２−２０アルキレンの両端にマレイミド（ＭＡＬ）やメタクリロイルなどの不飽和結合を有する架橋剤（例えば、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、ジメタクリル酸エチレン（ＥＤＭＡ）など）とのマイケル付加反応による架橋；アルクロイルおよびメタクリロイルなどの不飽和結合により修飾したヒアルロン酸誘導体と各種重合開始剤（例えば、ペルオキソ二硫酸カリウム（ＫＰＳ）／Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９など）とのラジカル重合による架橋；ジアミン化合物（例えば、ＥＤＡ、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチレンジアミン）など）共存下、縮合剤（例えば、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン）−４−メチルモルホリウムクロライド（ＤＭＴ-ＭＭ）、２−ベンゾトリアゾール−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール−１−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）など）による架橋が挙げられる。上記の架橋形成は、ヒアルロン酸誘導体の分子内であっても、複数のヒアルロン酸誘導体の分子間であってもよい。
【０１６６】
本発明のヒアルロン酸誘導体を、化学架橋によりゲル化させる工程は、適宜その条件を選択してもよい。架橋の条件とは、架橋方法、ポリマー濃度、架橋剤濃度、溶媒、溶媒ｐＨ、塩濃度、温度、時間などがある。
【０１６７】
本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程において、架橋形成の反応条件の中で、例えば化学架橋時のポリマー濃度および架橋形成が可能な基の導入率を高くすることで、生成するゲルの架橋密度を高くすることが可能である。
【０１６８】
本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程における、ヒアルロン酸誘導体に対する架橋剤の比は、両端に架橋形成が可能な基を有するものを使用する場合、当該基が過不足なく速やかに架橋反応に関与できるような比（例えばモル比）で添加することが好ましい。例えば、メタクリロイル（ＭＡ基）を導入したポリマーをＤＴＴを用いてマイケル付加反応により架橋する場合のモル比は、ＭＡ基：ＳＨ基＝３：１〜１：３が好ましく、２：１〜１：２が特に好ましい。
【０１６９】
本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程における溶媒は、ポリマーおよび架橋剤を充分に溶解することができるものが好ましく、特に限定されないが、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）およびこれらから選択される混合溶媒を用いることが好ましい。また、これらの溶媒に混和する有機溶媒を混合して使用することも可能である。特に限定されないが、混和する有機溶媒としては例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、アセトニトリルなどが挙げられる。
【０１７０】
本発明のヒアルロン酸誘導体のゲルが有する化学架橋構造は生体内で分解する構造を含んでいてもよい。特に限定されないが、例えば架橋反応に供する基として、エステル結合およびメタクリロイルを有する基を用いてもよい。また、架橋剤として、Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳやＥＤＭＡなど、エステル結合を有する化合物、または生体内の酵素によって分解されるペプチドスペーサーを有する化合物を用いてもよい。また、メルカプトの酸化によって形成するジスルフィド結合によって架橋したゲルは、ジスルフィド交換反応や還元反応によって、生体で分解される。分解性の化学架橋構造を有することで、本発明のヒアルロン酸誘導体のゲルの生体内での分解速度を制御することができ、これによって薬物の放出速度も制御することが可能である。
【０１７１】
本発明のヒアルロン酸誘導体は、水溶液中においてナノ微粒子を形成するため、希薄な条件化において架橋することにより、ナノサイズの微粒子ゲルを形成することができ、血中除放キャリア、ターゲティングキャリアとして用いることができる。希薄な条件とは１０ｍｇ／ｍＬ以下であり、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以下である。一方、高濃度な条件下において架橋することにより、微粒子同士が架橋した、バルク状のゲルを形成することができる。これは皮下徐放型のキャリアとして有用である。高濃度な条件とは５ｍｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは４０ｍｇ／ｍＬである。
【０１７２】
本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程は、バルクで行ってもよく、エマルション中や噴霧液滴中などの不連続相中で行ってもよい。例えば、Ｗ／Ｏエマルション中で行う場合は、ポリマーや架橋剤などを溶解させた水相を、水に混和しない溶媒中に乳化し、ゲル化反応を行えばよい。水に混和しない溶媒とは、特に限定されないが、例えばヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）、流動パラフィン、大豆油などが挙げられる。乳化を安定化するための界面活性剤を添加してもよい。また、例えば、超臨界二酸化炭素中やＰＥＧ中など脱溶媒が可能な溶媒中で行ってもよい。この場合は、ポリマーや架橋剤などを溶解させた水相や有機溶媒相を、前例の溶媒中に乳化、分散することで、脱溶媒（溶媒拡散）に伴うポリマーの濃縮が成されることから、より高い架橋密度のゲルを得ることが可能になる。
【０１７３】
本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程、およびその後に、架橋反応を停止する操作および残存した架橋性官能基を失活もしくは洗浄する操作を行ってもよい。反応に関与しなかった架橋性官能基、架橋剤の片端のみが結合した基、残存した架橋剤などは、安全性の観点、保存中安定性の観点、封入される薬物との副反応などの観点から除去した方が好ましい。特に限定されないが、例えば、未反応の架橋剤が残存している場合は、過剰の水などで洗浄することで除去してもよい。また、例えばポリマーに置換したメタクリロイルが残存する場合は、過剰のメルカプトエタノールなどを添加し、メタクリロイルを失活させた後、過剰の水などで余剰のメルカプトエタノールを洗浄することで除去してもよい。さらには、例えばメルカプトが残存する場合は、過剰の３−マレイミドプロピオン酸、ヨード酢酸などを添加し、メルカプトを失活させた後、過剰の水などで余剰の３−マレイミドプロピオン酸、ヨード酢酸を洗浄することで除去してもよい。
【０１７４】
本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程の後に、粉砕工程を行ってもよい。粉砕方法としては、乳棒と乳鉢を用いる粉砕やミルを用いる粉砕が挙げられるが、ミルを用いる粉砕が好ましい。ミル粉砕装置としては、遠心式粉砕機（日本精機製作所）およびインパクトミル（株式会社ダルトン）等の回転円板型の粉砕装置、アトマイザー（東京アトマイザー製造株式会社）、サンプルミル（東京アトマイザー製造株式会社）、バンタムミル（東京アトマイザー製造株式会社）、およびＳＫミル（トッケン）等のスクリーンミルの粉砕装置、超微少量ラボジェットミル（Ａ−Ｏジェットミル、セイシン企業）等のジェット粉砕装置、並びに、超低温での粉砕が可能なリンレックスミル（リキッドガス株式会社）等が挙げられるが、ＳＫミルおよびリンレックスミルが好ましい。
【０１７５】
本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程の後に、乾燥工程を行ってもよい。乾燥方法としては、例えば通風乾燥、恒温槽中での乾燥、減圧乾燥、熱風循環式乾燥などが挙げられる。風速、乾燥時間、温度、圧力などは本発明のゲルが分解や変質を生じない範囲で適宜選択される。
【０１７６】
本発明のヒアルロン酸誘導体のゲルに薬物を封入することで医薬組成物とすることができる。本発明の１つの側面において、（ａ）式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）、（ｂ）式（Ｉ）および式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）、（ｃ）式（Ｉ）および式（ＩＩｂ）および式（ＩＩＩ）、または（ｄ）式（Ｉ）および式（ＩＩ）および式（ＩＩｂ）および式（ＩＩＩ）で表される１以上の二糖単位をそれぞれ含むヒアルロン酸誘導体を、架橋剤を用いて架橋し、ゲル化して、薬物（低分子化合物、タンパク質、ペプチド、または核酸）を封入するための担体として使用することができる。薬物封入方法として、あらかじめ架橋されたヒアルロン酸誘導体ゲルに薬物溶液を添加する方法が挙げられる。当該方法では、まず、膨潤したゲル内部へ拡散によって薬物が吸収され、吸収された薬物は、ヒアルロン酸誘導体ゲルの疎水性相互作用による物理架橋ドメインに保持されることによって薬物が封入される。特に限定されないが、溶媒、塩濃度、ｐＨ、温度、時間、変性剤の添加などの条件は、薬物が安定でかつ高収率で封入されるように適宜選択してよい。例えば、薬物封入時の塩濃度やｐＨによって、ヒアルロン酸誘導体ゲルの膨潤度や密度が変化し、薬物の電離状態なども変わるため、その組み合わせによって適宜、適した条件を使用すればよい。薬物の封入を低塩濃度下で行うことで、ヒアルロン酸誘導体のカルボキシ同士の静電反発を利用し、ゲル密度を減少させ、薬物封入量を増加させることや、より高分子量の薬物を封入することができる。薬物封入後、塩濃度を上昇させることにより静電反発を弱め、ゲル密度を上昇させ、ゲル網目を薬物サイズより小さくすることにより、強固に薬物を保持し、放出を遅らせることが可能となる。この際、塩濃度を生理塩濃度とすることもできる。
【０１７７】
また、薬物封入方法として、本発明のヒアルロン酸誘導体に薬物を複合化させた後、架橋することでゲル化させる方法が挙げられる。特に限定されないが、複合化の際の溶媒、塩濃度、ｐＨ、温度、時間、変性剤の添加、前記親水性多糖類誘導体濃度、薬物濃度、ＨＰと薬物の比率などの条件は、薬物が安定でかつ高収率でナノゲルと複合化されるように適宜選択してもよい。複合化されなかったフリーの薬物は、透析法やサイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ）法などで分離、除去すればよい。架橋の際は、封入された薬物が変性しない架橋条件を用いることが好ましい。
【０１７８】
本発明のヒアルロン酸誘導体のゲルに封入された薬物は、薬物のゲル中における単純拡散、ヒアルロン酸誘導体のゲルの分解、および生体成分と薬物の置換によって放出される。薬物の拡散によって薬物放出がなされる場合には、ゲルの架橋密度、および架橋ドメインの量やその疎水性の強さによってその速度を制御することが可能である。ゲルの分解とは、例えば、化学架橋ドメインの分解、ヒアルロン酸誘導体の骨格の分解などがある。これらの分解により、架橋密度の低下（膨潤率の増大）が生じる。架橋密度が低下すると、ゲル中の薬物の拡散速度が加速されるため放出が促進され、また結合が切れることによっても放出が促進される。このため、化学架橋ドメインの分解性、ポリマー骨格の分解性、スペーサーの分解性などを制御することによって、薬物放出速度を制御することが可能である。
【０１７９】
生体成分との置換とは、例えば、ゲルを皮下や血中などの生体内に投与した場合、アルブミンなどの血漿タンパク質や脂質などが存在し、これらがゲル中に浸潤、封入されている薬物と置換されることにより薬物が放出される場合を意味する。本発明のヒアルロン酸誘導体のゲルは、疎水性基同士による物理的な架橋だけでなく、前記の化学架橋により、生体成分の浸潤に伴う薬物との置換を抑制することが可能である。生体成分の浸潤は、ゲルの架橋密度、ゲル中の電荷などによってその速度を制御することが可能である。なお、前記の架橋によるゲルの形成後に薬物溶液を添加して薬物封入をする場合は、封入時に薬物はゲル中に吸収されやすく、生体内では生体成分の浸潤が抑制されるように、その封入条件を適宜選択することができる。特に限定されないが、例えば、タンパク質を封入する場合、その等電点付近で封入工程行うことで、ヒアルロン酸誘導体と薬物の静電反発を抑制することができる。また、ヒアルロン酸に含まれるグルクロン酸由来のカルボン酸のｐＫａ（およそ４．０）以下で封入工程を行うことで、ゲルが持つ負電荷を弱めることができるので、その条件で負電荷に帯電しているタンパク質との静電反発が抑制され、封入効率の向上が可能となる。また、例えば生体内よりも低い塩濃度において封入工程を行うことで、生体内よりもゲルの膨潤率が高くなるため、封入が容易となる。
【０１８０】
さらに、本発明の疎水性基と架橋性官能基を同時に導入したヒアルロン酸誘導体の化学架橋によるゲル化を、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体の共存下で、行うことができる。具体的には、疎水性基および不飽和結合を有する官能基を導入した本発明のヒアルロン酸誘導体と、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を混合し、架橋することにより、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を物理的に封入した、ヒアルロン酸誘導体ゲルが調製できる。
【０１８１】
疎水性基を有する親水性多糖類誘導体とは、親水性多糖類およびその誘導体に、多糖１分子あたり少なくとも１分子以上の疎水性基を導入して得ることができる親水性多糖類である。親水性多糖類としては特に限定されないが、好ましくはプルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、マンナン、レバン、イヌリン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、デキストリンであり、これらは市販されているか、文献記載の方法に従い、種々の平均分子量を有するものを入手することもできる。親水性多糖類として特に好ましいものは、プルラン、ヒアルロン酸、デキストリンである。デキストリンとしてはクラスターデキストリン（登録商標）が好ましい。クラスターデキストリン（登録商標）は、江崎グリコ株式会社から販売されているものを購入して使用することができる。疎水性基としては特に限定されないが、好ましくはＣ８−５０の炭化水素基、ステリル基、ポリ乳酸（ＰＬＡ）基、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）基などの基またはこれらの基を含む基であり、特に好ましくはコレステリル基を含む基、Ｃ８−３０の直鎖または分岐アルキルまたは当該基を含む基である。疎水性基はスペーサーを介して導入されていてもよい。
【０１８２】
疎水性基を有する親水性多糖類誘導体には、本発明のヒアルロン酸誘導体も含まれる。すなわち、本発明のヒアルロン酸誘導体からなる微粒子を適当なゲルに封入しても良い。
【０１８３】
疎水性基を有する親水性多糖類誘導体は各種公知の方法により製造することができる。また、親水性多糖類としてプルランのヒドロキシに、疎水性基としてＮ−［６−（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキシル］カルバモイルを導入した水親水性多糖類誘導体（以下、「コレステロールプルラン」、「ＣＨＰ」とも称する）は、市販のものを購入して（例えば、日本油脂株式会社）入手することも可能である。疎水性基を有する親水性多糖類誘導体は、水溶液中において疎水性相互作用により数分子が自発的に会合することでナノサイズ（１〜１，０００ｎｍ）のゲル構造を有する微粒子（ナノゲル）を形成することなどにより、疎水性薬物や薬効を有するタンパク質やペプチドと複合化することがきるものである。
【０１８４】
本発明に用いられる疎水性基を有する親水性多糖類誘導体の分子量は、特に限定されないが、好ましくは１ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、さらに好ましくは１０ｋＤａ〜３００ｋＤａである。また前記親水性多糖類誘導体は、薬学的に許容される塩であってもよい。
【０１８５】
さらに、例えば、本発明のヒアルロン酸誘導体および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体に含まれるヒドロキシもまた架橋形成が可能な基として利用することができる。すなわち、本発明のヒアルロン酸誘導体および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体のヒドロキシを、特定の架橋剤、例えば、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、カルボジイミド、またはＣ２−２０アルキレンの両端にグリシジルエーテルを有する架橋剤などによって架橋することができる。
【０１８６】
ヒアルロン酸のカルボキシに導入される置換基の種類が複数のときは、それらの置換基は、同時導入しても、順次に導入してもよい。
【０１８７】
本発明のさらに別の側面によれば、本明細書に定義したヒアルロン酸誘導体であって、水中で会合により微粒子を形成することを特徴とする前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。特に限定はされないが、導入された基−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２の疎水性相互作用により水中において自発的会合が起こり、ナノスケールの微粒子を形成するという特性を有する。望まれるドラッグデリバリーシステムの構築のために、本発明のヒアルロン酸誘導体により形成されるナノ微粒子は非常に有力な手段の一つであり、内部に形成される疎水ドメインに活性成分であるタンパク質、ペプチド、低分子化合物を保持したまま目的の部位に送達するカプセルとして使用することができる。また、薬物をコンジュゲートすることにより目的の部位に薬物を送達することができる。
【０１８８】
ナノスケールの微粒子は、全身投与、特に静脈内投与が可能であり、封入（複合化）した薬物を血中で徐放する血中薬物徐放、また、標的臓器および細胞へ薬物を選択的にデリバリーさせる、ターゲティング用の担体として使用できる。ターゲティング用の担体として使用する場合、ターゲット素子をくわえることにより各臓器ならびに細胞へターゲティングすることもできる。ターゲット素子としては、例えば、標的組織特異的なペプチド、抗体、断片化抗体、アプタマー、がん細胞に対するＲＧＤペプチド、葉酸、アニサミド、トランスフェリン、肝臓に対するガラクトース、トコフェロールなどがある。血中での薬物の保持を強固にするために、さらにヒアルロン酸誘導体を化学架橋させることもできる。
【０１８９】
また、ヒアルロン酸と同様直鎖状のポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、分子量４０ｋＤａ以下で腎排泄を受けることが報告されている（Europian Journal of Cancer. 第31巻、第766-770頁、1995年）など、ある一定の大きさ以下の分子は、腎排泄を受けることが知られている。よって、同程度以下の分子量のヒアルロン酸ならびにヒアルロン酸誘導体も腎排泄され、瞬時に血中から消失する懸念がある。しかし、本発明の疎水性基を導入したＨＡ誘導体は、ＰＥＧが腎排泄を受ける分子量以下であっても、会合化することにより血中薬物徐放およびターゲティング用の担体として用いることができる。
【０１９０】
ヒアルロン酸誘導体による微粒子は、水溶液中で自己会合により形成するので、固体のヒアルロン酸誘導体をから水または塩水溶液に溶解することによって形成することができる。また、別の方法では、他の溶媒（例えばＤＭＳＯ）に溶解させたあと、水、または塩水溶液に置換することによっても微粒子を形成することができる。形成した微粒子のサイズを均一化するために超音波処理を行ってもよい。
【０１９１】
ヒアルロン酸誘導体の疎水性基導入率が高くなるに従って、水への溶解性が減少する。そのため水溶液中で分散性の微粒子を形成させるためには、共有結合により導入する疎水性基は８０％以下、このましくは６０％以下になるように調製されたヒアルロン酸誘導体を用いることがこのましい。
【０１９２】
ヒアルロン酸は解離基であるカルボキシを有するため、系中のイオン強度が高いほど、溶解性が低くなる。したがって、導入率をコントロールすることにより、低塩濃度下あるいは無塩条件下では溶解し、生理食塩濃度にて凝集・沈殿するヒアルロン酸誘導体の調製が可能であり、これは、皮下での徐放製剤の基材となり得る。また、生理塩濃度下においても安定な微粒子を形成する程度の疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体は、全身投与型の薬物担体となり得る。
【０１９３】
形成される微粒子の粒子径は特に限定されないが、注射による投与の際にニードルを詰まらせずに通過できるようにするため２００μｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以下であることが更に好ましい。また、静脈投与の場合は、抹消血管を閉塞させないために粒子径５００ｎｍ以下であることが好ましく、２００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。また、細網内皮系への取り込みを回避し、血中滞留性を向上させるために１００ｎｍ以下であることが好ましく、さらにより好ましくは５０ｎｍ以下である。
【０１９４】
本発明のヒアルロン酸誘導体は、医薬製剤における薬物担体として使用することができ、本発明ヒアルロン酸誘導体と薬物とを含む、医薬組成物を提供することができる。本発明のヒアルロン酸誘導体は、水溶液中で自発的に薬物と複合体を形成できるため、特別な操作を必要とせず、当該ヒアルロン酸誘導体と薬物を水溶液中で混合し、インキュベートすることにより、担体−薬物の複合体を容易に形成させ、薬物を担持できる。複合体形成の駆動力は、主にヒアルロン酸誘導体の疎水性基と薬物との疎水性相互作用であるが、薬物が塩基性の場合、ヒアルロン酸誘導体のカルボン酸との静電的相互作用が寄与する場合がある。生体塩濃度では、静電的相互作用は弱く、疎水性相互作用は強くなるため、主に疎水性相互作用により複合体が形成すると考えられる。
【０１９５】
上記式（Ｉ）および（ＩＩ）において、Ｚ１がアルキレンの場合、アルキレンの炭素鎖が長いほど、当該基の疎水性が高くなり、強い疎水性相互作用により強固な微粒子を形成することができる。また、アルキレンが長いほど分子間での絡み合いが大きくなり、粘度を上昇させることができる。さらに、アルキレンの長さを変更することで、微粒子のサイズを制御することもできる。
【０１９６】
疎水性基中のリンカー（スペーサー）部分がエステルまたはカーボネートである場合（例えば、Ｘ１またはＸ２に、−ＣＯＯ−Ｚ３または−Ｏ−ＣＯＯ−Ｚ３が含まれる場合）、生体内においてエステルまたはカーボネートが分解し、ヒアルロン酸誘導体の疎水性が低下することによってさらに生分解性が高まり、安全性の面から好ましい。また、腫瘍組織周辺ではｐＨが低下していることが知られており、このようなスペーサーを有している場合、目的薬物を担持した本発明のヒアルロン酸誘導体の会合体は腫瘍周辺にて崩壊し、薬物を腫瘍周辺で放出することができる。
【０１９７】
特に、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−のようなβチオカルボン酸エステル構造を有するリンカーの場合、わずかなｐＨの低下（ｐＨ６程度）においても分解が促進される。このため、通常のエステルよりもｐＨ応答がシャープである。また、細胞内への薬物の送達を目指す場合、エンドソームにおけるｐＨ低下にも応答し、細胞に取り込まれた後にのみ薬物を放出させることができる。
【０１９８】
リンカー（スペーサー）部分がジスルフィド結合を有する場合（例えば、Ｘ１またはＸ２に、−Ｓ−Ｓ−Ｚ３が含まれる場合）、還元状況下においてリンカーが分解し、ヒアルロン酸誘導体の疎水性が低下することによって本発明のヒアルロン酸誘導体の会合体が崩壊する。細胞質は還元環境であることが知られているため、このリンカーを用いたヒアルロン酸誘導体に薬物を封入し、投与することによって、血中では薬物を放出せず、細胞質内でのみ薬物を放出させることができる。
【０１９９】
担体−薬物複合体を形成するときの、溶媒、塩濃度、ｐＨ、温度、時間、変性剤の添加などの条件は、用いる薬物により適宜変更することができる。例えば、薬物封入時の塩濃度やｐＨによって、ヒアルロン酸誘導体は密度が変わるとともに、薬物もその電離状態などが変動する。使用する変性剤の例としては、尿素、塩酸グアニジン、ドデシル硫酸ナトリウムなどが挙げられる。変性剤を添加した場合は、複合体形成後に、過剰の水などで洗浄することにより余剰の変性剤を除去することができる。
【０２００】
特に限定されないが、例えば、本発明のヒアルロン酸誘導体とタンパク質の複合体を形成する場合、その等電点付近で複合体形成を行うことにより、ヒアルロン酸誘導体とタンパク質の静電反発を抑制することが可能なため、複合体に含まれるタンパク質の量を増加させることができる。また、グルクロン酸部分のカルボキシのｐＫａ（およそ４．０）以下の条件で複合体形成工程を行うことにより、ヒアルロン酸誘導体が有する負電荷を弱めることができるので、タンパク質が当該条件下で負電荷に帯電している場合には静電反発を抑制することが可能であり、複合体に含まれるタンパク質の量を増加させることができる。さらに、例えば生体内よりも低い塩濃度において複合体形成工程を行うことにより、水溶液中で形成されるヒアルロン酸誘導体の微粒子の密度が低下するため、複合体に含まれるタンパク質の量を増加させることができる。また、その状態で塩濃度を上げることにより微粒子の密度を向上させ、強固にタンパク質を封入することができる。
【０２０１】
ヒアルロン酸誘導体とタンパク質との複合体形成は、タンパク質の分子量にも影響され得る。一般に、タンパク質が低分子量であるほど、当該タンパク質のヒアルロン酸誘導体の微粒子内部へ移行速度は高い。また、疎水性基の導入率に依存する微粒子の密度も、タンパク質との複合体形成の速度、および複合体に含まれるタンパク質の量に影響を与えうる。
【０２０２】
ヒアルロン酸誘導体と薬物の複合体からの生体内における薬物放出は、複合体からの薬物の拡散に加えて、生体成分が薬物と置換することにより促進される。微粒子の密度を増減させて、この拡散や置換を制御することにより、薬物の徐放性を制御することが可能となる。
【０２０３】
生体内には血漿タンパク質や脂質などの生体成分が存在し、ヒアルロン酸誘導体と薬物の複合体を皮下や血中などの生体内に投与した場合、この生体成分が複合体内の薬物と置換することにより薬物が放出される場合がある。当該置換を生じさせる主な生体内タンパク質としてアルブミンが想定される。本発明のヒアルロン酸誘導体の疎水性基の導入率を低くすることにより、グルクロン酸部分のカルボキシの負電荷を高くすることができ、負電荷を有するアルブミン（ｐＩ＝４．６）との置換を抑制することができる。
【０２０４】
本発明のヒアルロン酸誘導体を薬物担体として使用する方法としては、前述の水溶性液中で自発的に薬物と複合体を形成させる方法の他、薬物と本発明のヒアルロン酸誘導体とを結合させたコンジュゲートにする方法を挙げることもできる。すなわち、本発明の別の側面において、式（Ｉ）で表される二糖単位を含むヒアルロン酸誘導体に、上記薬物の１以上が結合した、ヒアルロン酸誘導体−薬物結合体が提供される。この側面の１つの態様において、ヒアルロン酸誘導体として、（ａ）式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）、（ｂ）式（Ｉ）および式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）、（ｃ）式（Ｉ）および式（ＩＩｂ）および式（ＩＩＩ）、または（ｄ）式（Ｉ）および式（ＩＩ）および式（ＩＩｂ）および式（ＩＩＩ）で表される１以上の二糖単位をそれぞれ含むヒアルロン酸誘導体を用いることができる。例えば、式（ＩＩＩ）の基−ＮＲｅ−Ｙｂ−Ｒｄに含まれるヒドロキシ、アミノ、メルカプト、ハロゲン原子（ブロモ、ヨードなど）または反応性の炭素−炭素二重結合（メタクリロイル、アクリロイルなど）と薬物を結合させることにより、上記のヒアルロン酸誘導体−薬物結合体を調製することができる。
【０２０５】
なお、基−ＮＲｅ−Ｙｂ−Ｒｄと薬物との間に、更に、式−Ｇ１−Ｇ２−Ｇ３−Ｊ−＊＊＊
（式中、＊＊＊は、薬物との結合部位を表し、
Ｇ１は、直接結合、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＲｓ−および−Ｓ−から選択され、
Ｇ２は、−（ＣＨ２）ｉ−および−（ＣＨ２）ｑａ−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｋ−から選択され、
Ｇ３は、直接結合、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲｔ−（ＣＨ２）ｒ−および−ＮＲｕ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｍａ−から選択され、
Ｊは、以下の式で表される基を表し、
【０２０６】
【化３１】
2014038641.tif 000033
【０２０７】
Ｒｓ、ＲｔおよびＲｕは、独立して、水素原子およびＣ１−６アルキルから選択され、ｉは、１〜１０から選択される整数であり、ｑａは、２〜１０から選択される整数であり、ｋは、１〜１００から選択される整数であり、ｒおよびｍａは、独立して、１〜１０から選択される整数である）
で表されるスペーサーが挿入されていてもよい。
【０２０８】
式−Ｇ１−Ｇ２−Ｇ３−Ｊ−＊＊＊の具体例としては、例えば、以下の式が挙げられる：
【０２０９】
【化３２】
2014038641.tif 000034
【０２１０】
本発明のヒアルロン酸誘導体の主鎖の末端に存在するグルクロン酸４位およびアセチルグルコサミン１位のヒドロキシは、別の基に変換されていてもよく、例えば、Ｃ１−６アルコキシ、ホルミルオキシおよびＣ１−６アルキルカルボニルオキシなどであってもよい。
【０２１１】
本発明のヒアルロン酸誘導体と薬物とからなるコンジュゲートの調製方法は、既知のポリマーと薬物とのコンジュゲートの調製で使用されている方法を用いることができ、例えば、以下の反応を利用することができる。
【０２１２】
ヒアルロン酸誘導体のグルクロン酸部分のカルボキシと、薬物のアミノ、ヒドロキシ、ヨード、ブロモまたは、薬物に導入したアミノ、ヒドロキシ、ブロモ、ヨードとの反応；
ヒアルロン酸誘導体のＮ−アセチルグルコサミン部分の６位のヒドロキシと、薬物のカルボキシまたは薬物に導入したカルボキシとの反応；
ヒアルロン酸誘導体に導入したアミノと、薬物のカルボキシまたは薬物に導入したカルボキシとの反応； 
ヒアルロン酸誘導体に導入したアミノと、修飾によりイソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステルおよびエポキシドなどに変換された薬物との反応；
薬物のアミノまたは薬物に導入したアミノと、修飾によりイソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、カルボニル、ＮＨＳエステルおよびエポキシドに変換されたヒアルロン酸誘導体との反応；
ヒアルロン酸誘導体のアミノと、カルボニルを有するまたは導入された薬物（アルデヒドおよびケトンなど）とのシッフ塩基形成ならびに還元的アミノ化反応；
薬物のアミノまたは薬物に導入したアミノと、修飾によりカルボニルが導入されたヒアルロン酸誘導体とのシッフ塩基形成ならびに還元アミノ化反応；
ヒアルロン酸誘導体に導入したメルカプトと、不飽和結合を有する化合物（マレイミド、アクリルエステル、アクリルアミド、メタクリルエステル、メタクリルアミド、アリル化物、ビニルスルホンなど）、ハロゲン化物（クロロ酢酸エステル、ブロモ酢酸エステル、ヨード酢酸エステル、クロロ酢酸アミド、ブロモ酢酸アミド、ヨード酢酸アミドなど）またはチオールである薬物または修飾により当該化合物に変換された薬物との反応；および
薬物に導入したメルカプトと、修飾により、不飽和結合を有する化合物（マレイミド、アクリルエステル、アクリルアミド、メタクリルエステル、メタクリルアミド、アリル化物、ビニルスルホンなど）、ハロゲン化物（クロロ酢酸エステル、ブロモ酢酸エステル、ヨード酢酸エステル、クロロ酢酸アミド、ブロモ酢酸アミド、ヨード酢酸アミドなど）またはチオールに変換されたヒアルロン酸誘導体との反応。
【０２１３】
さらに、前述の疎水性基をＨＡ誘導体に導入する際に用いたエステルまたはカーボネート、βチオエステル、ジスルフィド、特定の部位で切断するペプチドを含むリンカー（スペーサー）を、薬物とのコンジュゲート用のリンカーとして使用することもできる。これらのリンカーは前述の通り、標的部位において切断され、薬物が放出される。
【０２１４】
コンジュゲートの調製のためにヒアルロン酸誘導体または薬物の修飾に使用する試薬は、コンジュゲートの調製において不都合な反応を生じさせないものであれば、特に限定されない。該化合物は試薬として入手可能であるか、または文献公知の方法を参考にして合成してもよい。
【０２１５】
具体的には、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、さらにアミノを有する薬物またはアミノを導入した薬物をＤＭＴ−ＭＭなどの縮合剤を用いて反応させ、アミド結合により薬物をコンジュゲートすることができる。この際、薬物をコレステリル  ６−アミノへキシルカーバメート塩酸塩などと一緒に加えて、疎水性基を同時に導入してもよい。また、薬物の後もしくは前に当該化合物を加えてもよい。また、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成・精製後に薬物を反応させても、薬物を導入したヒアルロン酸誘導体を合成・精製後に疎水性基誘導体を導入してもよい。
【０２１６】
また、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、さらにヒドロキシを有する薬物またはヒドロキシを導入した薬物をＤＭＴ−ＭＭ、１，３−ジクロロヘキシルカルボジイミト゛（ＤＣＣ）などの縮合剤を用いて反応させ、エステル結合によりヒアルロン酸誘導体に薬物をコンジュゲートすることができる。この際、薬物をコレステリル  ６−アミノへキシルカーバメート塩酸塩などと一緒に加えて、疎水性基を同時に導入してもよい。また、薬物の後もしくは前に当該化合物を加えてもよい。しかし、エステルの加水分解を回避するためには、疎水性基を導入後、薬物をコンジュゲートすることが望ましい。上記の方法は、例えば、パクリタキセルがＨＡにエステルで導入された報告（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  第１９巻、第１３１９−１３２５項、２００８年）などを参考にして行うことができる。
【０２１７】
また、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、さらに臭化物もしくはヨウ化物である薬物または、修飾により臭化物もしくはヨウ化物に変換された薬物を反応させ、グルクロン酸部分のカルボキシをエステルに変換することにより薬物をコンジュゲートすることができる。エステルの加水分解を回避するためには、疎水性基を導入後、薬物をコンジュゲートすることが望ましい。
【０２１８】
本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、さらにカルボキシを有する薬物またはカルボキシを導入した薬物をＮＨＳエステルとし、Ｎ−アセチルグルコサミン部分の６位のヒドロキシと反応させ、エステル結合により薬物をコンジュゲートすることができる。この際、コレステリル６−アミノへキシルカーバメート塩酸塩などにより疎水性基をＨＡに導入した後に薬物を加えても、導入の前に加えてもよい。また、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成・精製後に薬物を反応させても、薬物を導入したヒアルロン酸誘導体を合成・精製後に疎水性基誘導体を導入してもよい。エステル結合の加水分解を回避するためには、疎水性基誘導体を導入後、薬物をコンジュゲートすることが望ましい。上記の方法は、例えば、カンプトテシンがＨＡにエステルで導入された報告（国際公開第ＷＯ２００９／０７４６７８号）などを参考にして行うことができる。
【０２１９】
１つの態様において、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成後、グルクロン酸部分のカルボキシをエチレンジアミンなどのジアミンと脱水縮合させ、アミノを導入することができる。さらに、Ｎ−スクシンイミジル  ヨードアセテート（ＰＩＥＲＣＥ社）やＮ−スクシンイミジル  ［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート（ＰＩＥＲＣＥ社）をアミノに反応させ、ヨードアセチルが導入されたヒアルロン酸誘導体を合成することができる。このヒアルロン酸誘導体に対して、メルカプトを有する薬物を、コンジュゲートすることができる。この方法はタンパク質、ペプチド、核酸などのアミノなどの反応性基を多く含む高分子薬物においてもメルカプト選択的にコンジュゲートできるため特に有効である。この際、薬物の導入は疎水基誘導体をＨＡに導入する前でも後でもよい。
【０２２０】
Ｘ１が−ＮＨ２−ＣＯＯ−Ｒである、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、ここで、グルクロン酸部分のカルボキシの一部を２−アミノエチル  ２−ピリジル  ジスルフィド塩酸塩と反応させる。このヒアルロン酸誘導体に対してメルカプトを有する薬物ならびにメルカプトを導入した薬物をジスルフィド結合交換反応、すなわち置換反応により導入することが可能である。
【０２２１】
ここで、当該コンジュゲートの生物活性を有効に保つために、薬物とヒアルロン酸誘導体間のリンカーの長さを調節することもできる。また、生体内の特定部位にて酵素等で切断されるペプチドリンカーを導入することもできる。例えば、メトトレキセートがＨＡにペプチドを含むリンカーを介して導入された報告（国際公開第ＷＯ２００５／０９５４６４号）、ドキソルビシンがＨＰＭＡ（N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide）およびペプチドを含むリンカーを介して導入された報告（国際公開第ＷＯ２００２／０９０２０９号）などを参考にして行うことができる。
【０２２２】
また、抗体に低分子化合物をコンジュゲートさせたＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に関する報告（国際公開第ＷＯ２００９／０２６２７４号；Expert Opinion. 第15巻、第1087-1103頁、2005年；Bioconjugate Chem. 第19巻、第1960-1963頁、2008年；Bioconjugate Chem.  in press、Bernhard Stumpら、Antibody-Drug Conjugates: Linking Cytotoxic Payloads to Monoclonal Antibodies）が多数あり、これらを参考にして、ヒアルロン酸誘導体と低分子化合物とのコンジュゲートを調製することもできる。
【０２２３】
本発明のヒアルロン酸誘導体と１以上の薬物とを含む医薬組成物および本発明のヒアルロン酸誘導体と１以上の薬物とが結合したコンジュゲートは、ナノ微粒子、ミクロ微粒子、溶液、エマルジョン、懸濁液、ゲル、ミセル、インプラント、粉末、またはフィルムの形態にあってよい。粉末は、凍結乾燥または噴霧乾燥により得た固体を粉砕して製造してもよく、沈殿物を乾燥したものから製造してもよい。
【０２２４】
本発明の医薬組成物およびコンジュゲートは、経口、腸管外、鼻腔内、膣内、眼内、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、関節腔内、脳内または口腔内の経路を経て投与されてよい。
【０２２５】
本発明の医薬組成物およびコンジュゲートは、特に局所における徐放を目的とした場合、ニードルを詰まらせずに通過できるようにするため２００μｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以下であることが更に好ましい。
【０２２６】
本発明の医薬組成物およびコンジュゲートは、特にＣＤ４４をはじめとするヒアルロン酸レセプターへのターゲティングを目的とした場合、そのサイズは５μｍ以下であることが好ましい。
【０２２７】
本発明の医薬組成物およびコンジュゲートは、特に血中滞留性延長、ならびに腫瘍組織または炎症組織への集積性を目的とする場合、そのサイズは５００ｎｍ以下であることが好ましく、さらに好ましくは２００ｎｍ以下である。また、細網内皮系への取り込みを回避し、血中滞留性を向上させるためには１００ｎｍ以下であることが好ましい。
【０２２８】
本発明の医薬組成物およびコンジュゲートは、粘膜付着性を持ち非侵襲投与用途を目的とした場合、そのサイズは２００μｍ以下であることが好ましい。粘膜付着性の観点からは、用いるヒアルロン酸誘導体の疎水性基導入率は低い方が好ましい。
【０２２９】
本発明のヒアルロン酸誘導体と複合体を形成する薬物は、担持可能な薬物であれば特に限定されない。また、本発明のヒアルロン酸誘導体と結合させる薬物は、コンジュゲートが調製可能であれば特に限定されない。当該薬物の例としては、タンパク質および／またはペプチド、多糖類、核酸類、低分子化合物が挙げられ、好ましくは、タンパク質および／またはペプチドが挙げられる。
【０２３０】
低分子化合物の例としては、例えば、制癌剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、パクリタキセル等のアルカロイドなど）、シクロスポリンなどの免疫抑制剤、抗炎症剤（ステロイド剤、非ステロイド剤系抗炎症剤など）、抗リウマチ剤、抗菌剤（β−ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、サルファ剤など）などを挙げることができる。
【０２３１】
タンパク質およびペプチドの例としては、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、グラニュロサイトコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α、β、γ、（ＩＮＦ−α、β、γ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、シリアリーニュートロフィクファクター（ＣＮＴＦ）、チューマーネクローシスファクター（ＴＮＦ）、チューマーネクローシスファクター結合タンパク質（ＴＮＦｂｐ）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、ＦＭＳ類似チロシンカイネース（Ｆｌｔ−３）、成長ホルモン（ＧＨ）、インシュリン、インシュリン類似成長因子−１（ＩＧＦ−１）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ブレイン由来ニューロトロフィクファクター（ＢＤＮＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、メガカリオサイト成長分化因子（ＭＧＤＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、レプチン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、塩基性フィブロブラスト成長因子（ｂ−ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、抗体、ダイアボディー、ミニボディー、断片化抗体などを挙げることができる。
【０２３２】
核酸類の例としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス、デコイ、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーなどを挙げることができる。
【０２３３】
本発明のヒアルロン酸誘導体のゲル中に、薬物を封入して、あるいは、本発明のヒアルロン酸誘導体−薬物結合体は、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含む医薬組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。
【０２３４】
本発明により、従来の徐放性製剤では得られない、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物といった薬物を長期間徐放でき、および／または、適切な生分解性を有する安全性の高い徐放性製剤および医薬組成物を提供することが可能である。
【実施例】
【０２３５】
以下、本発明の好適な具体的態様を実施例として説明する。【０２３６】
また、以下の記載中のＨＡユニットとは、ヒアルロン酸中のＮ−アセチルグルコサミン−グルクロン酸の繰り返し単位（１ユニット）を意味する。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定には、日本電子株式会社製ＪＮＭ−ＥＣＡ５００を用いた。透析には再生セルロース製透析膜（分子量５０ｋＤａおよび９９ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム塩を出発原料とする時はスペクトラポア４：分画分子量１２ｋ〜１４ｋＤａ、分子量１０ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム塩を出発原料とする時はスペクトラポア７：分画分子量１ｋＤａもしくは２ｋＤａ）を用いた。【０２３７】
〔実施例１〕ヒアルロン酸誘導体の合成
（実施例１−１）コレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメート塩酸塩の調製
コレステリル  クロロホルメート（３．３７ｇ、７．５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）の溶液に、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン（ＴＥＡ、１．０５ｍＬ）を加えて撹拌した。氷冷下で、６−（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ−１−アミノヘキサン（１．１２ｍＬ、５ｍｍｏｌ）を滴下して加え、そのまま氷冷下で３０分間攪拌後、室温まで昇温し、当該混合物を一晩撹拌した。反応混合物を、超純水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：４)で精製し、目的物のフラクションを合わせて溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を酢酸エチル（４０ｍＬ）に溶解し、４Ｎ塩酸／酢酸エチル溶液（４０ｍＬ）を加えて室温で一晩撹拌した。生じた沈殿物を遠心分離により回収した。得られた固体を酢酸エチルにて４回洗浄後、減圧下で乾燥し、コレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメート（Ｃｈｏｌ−Ｃ６）の塩酸塩（１．２ｇ）を得た。生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＥｔＯＨ−ｄ６）を図１−１に示す。【０２３８】
（実施例１−２）カチオン交換樹脂のテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩化
ＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ＷＸ−８−４００（シグマ−アルドリッチ社製）を超純水に懸濁させ、デカンテーションにより樹脂を超純水で３回程度洗浄した。４０重量％テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液（ＴＢＡ−ＯＨ）（シグマ−アルドリッチ社製）を樹脂のカチオン交換能に対し約１．５モル等量を加え、３０分間攪拌した。余剰のＴＢＡ−ＯＨ溶液をデカンテーションにより除去した後、さらに過剰の超純水で洗浄を繰り返し、最後に０．４５μｍのフィルターを用いて濾過することによりＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂を得た。【０２３９】
（実施例１−３）ＨＡのＴＢＡ塩の調製
分子量１０ｋＤａ、５０ｋＤａおよび９９ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ−Ｎａ、資生堂株式会社製）をそれぞれ１５ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解させた。実施例１−２でＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂の懸濁液をＨＡユニット（ユニット分子量４０１．３）のモル数に対し樹脂のイオン交換能換算で５モル等量添加した。１５分間撹拌した後、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過を行い、濾液を凍結乾燥し、ヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ−ＴＢＡ）を白色固体として得た。【０２４０】
代表例として９９ｋＤａのＨＡ−Ｎａを出発原料とする生成物のＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−２に示す。ＨＡのグルコサミンのアセチル由来のシグナル（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＴＢＡの４つのエチレン由来のシグナル（Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）４、１．４、１．７ｐｐｍ；１６Ｈ）の積分値より、ＨＡユニットに対するＴＢＡの量比を算出し、この比からＨＡ−ＴＢＡのユニット平均分子量を算出した。例えば、９９ｋＤａのＨＡ−Ｎａを出発原料とするＨＡ−ＴＢＡのユニット平均分子量は７５２．６であった。【０２４１】
（実施例１−４）Ｌ−アラニン（Ａｌａ）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
実施例１−３で合成した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋＤａ、５０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩（アルドリッチ社製）をＨＡユニットに対して５モル等量添加し、次に４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）をＨＡユニットに対して６モル等量添加し、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ  ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析した。得られた透析液に２Ｎ  ＮａＯＨを添加しｐＨ１２．５以上として、１時間攪拌してエチルエステルを加水分解し、カルボキシの脱保護を行った。その後、２Ｎ  ＨＣｌを用いて中和を行い、さらに透析を行った後、凍結乾燥してＨＡ−Ａｌａを白色固体として得た。実施例１−３に記載と同じ条件で測定したＨＡ−Ａｌａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（９９ｋＤａのＨＡを出発原料として用いた生成物）を図１−３に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、アラニン中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、１．４ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるアラニンの導入率（Ａｌａ導入率）を算出した（表１）。【０２４２】
【数２】
2014038641.tif 000035
【０２４３】
ＨＡ−Ａｌａ水溶液に対し、実施例１−２でＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂の懸濁液を約５モル等量添加し、１５分間撹拌した後、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過を行い、濾液を凍結乾燥し、ＨＡ−ＡｌａのＴＢＡ塩（ＨＡ−Ａｌａ−ＴＢＡ）を白色固体として得た。実施例１−３に記載と同じ条件で測定したＨＡ−Ａｌａ−ＴＢＡの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから、実施例１−３に記載と同じ方法にてＨＡユニットに対するＴＢＡの量比を算出し、グルコサミンのアセチル由来のピークの積分値と、内部標準として用いた３−（トリメチルシリル）プロピオン酸ナトリウム−ｄ４（ＴＳＰ−ｄ４）のメチル由来のピーク（−Ｓｉ（ＣＨ３）３，０．０ｐｐｍ；９Ｈ）の積分値から重量あたりのＨＡユニット含量を定量した。【０２４４】
ＨＡ−Ａｌａ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製し、その後、実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩をＨＡ−Ａｌａ−ＴＢＡユニットに対して以下の表１に示す比率で各溶液に添加した。次に、ＤＭＴ−ＭＭをＨＡ−Ａｌａ−ＴＢＡに対して以下の表１に示す比率で加え、さらに５−アミノメチルフルオレセイン（ＦＬ、インビトロジェン社製）塩酸塩、ＤＭＴ−ＭＭをＨＡ−Ａｌａ−ＴＢＡユニットに対してそれぞれ０．０４モル等量、０．０７モル等量添加し、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ  酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。【０２４５】
測定溶媒として０．０２Ｎ  ＤＣｌ  ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ  ＤＣｌ  Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（９９ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が７％の生成物）を図１−４に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、コレステリル基中のメチル由来のピーク（ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１）。なおグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．６〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．６〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基メチル由来のピーク（０．７ｐｐｍ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．６〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。【０２４６】
【数３】
2014038641.tif 000036
【０２４７】
【表１】
2014038641.tif 000037
【０２４８】
なお、ここでは、Ｃｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩のアミノが反応可能な基としては、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分のカルボキシとＡｌａのカルボキシの両方が挙げられる。このように２種類の反応点に疎水性基が導入可能な場合には、目的物の略称において「−Ｃｈｏｌ」のように、ハイフンを用いて表す。【０２４９】
（実施例１−５）Ｌ−スレオニンアミド（ＴｈｒＮＨ２）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
実施例１−３で調製した、ＨＡ−Ｎａ（９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩をＨＡユニットに対して以下の表２に示す比率で各溶液に添加した。次にＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表２に示す比率で加え、さらに５−アミノメチルフルオレセイン（ＦＬ、インビトロジェン社製）塩酸塩、ＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対してそれぞれ０．０４モル等量、０．０７モル等量添加し、室温で７時間撹拌した。その後、Ｌ−スレオニンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）をＨＡユニットに対して３モル等量添加し、次にＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して５モル等量を添加し、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ  酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。【０２５０】
測定溶媒として０．０２Ｎ  ＤＣｌ  ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ  ＤＣｌ  Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（９９ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が６％の生成物）を図１−５に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、コレステリル基中のメチル由来のピーク（ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表２）。なおグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．６〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．６〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基メチル由来のピーク（０．７ｐｐｍ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．６〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。【０２５１】
【数４】
2014038641.tif 000038
【０２５２】
また、グルコサミンのアセチル由来のピークの積分値と、スレオニンアミドのメチル由来のピーク（−ＣＨ３、１．２ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、ＨＡユニットにおけるスレオニンアミドの導入率を算出した（表２）。【０２５３】
【数５】
2014038641.tif 000039
【０２５４】
【表２】
2014038641.tif 000040
【０２５５】
なお、ここでは、Ｃｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩のアミノは、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分のカルボキシとのみ反応し、導入されたＴｈｒＮＨ２に更に疎水性基が導入されることはない。このように、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分のカルボキシにのみ疎水性基を導入できる場合を、目的物の略称において「／Ｃｈｏｌ」のように、スラッシュを用いて表す。【０２５６】
（実施例１−６）Ｌ−セリン（Ｓｅｒ）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｓｅｒ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ−セリンエチルエステル塩酸塩（アルドリッチ社製）を用いたこと以外は、実施例１−４と同様の方法で行い、ＨＡ−Ｓｅｒを白色固体として得た。また、カルボキシを脱保護する前の透析溶液の一部を採り凍結乾燥して導入率算出用サンプルとした（ＨＡ−Ｓｅｒ−ＯＥｔ）。実施例１−３の記載と同じ条件で測定した導入率算出用サンプルの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−６に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．９ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、セリンのエチルエステル中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、１．２ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるセリンの導入率を算出した（表３）。また、脱保護したサンプルを実施例１−３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−７に示す。さらに実施例１−４の記載と同じ条件でＨＡ−ＳｅｒのＴＢＡ塩（ＨＡ−Ｓｅｒ−ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１−４と同様の方法でＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ−Ｓｅｒ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１−４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−８に示す。実施例１−４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表３）。【０２５７】
（実施例１−７）Ｌ−グリシン（Ｇｌｙ）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｇｌｙ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにグリシンエチルエステル塩酸塩（和光純薬株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−４と同様の方法で行い、ＨＡ−Ｇｌｙを白色固体として得た。また、カルボキシを脱保護する前の透析溶液の一部を採り凍結乾燥して導入率算出用サンプルとした（ＨＡ−Ｇｌｙ−ＯＥｔ）。実施例１−３の記載と同じ条件で測定した導入率算出用サンプルの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−９に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、グリシンのエチルエステル中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、１．３ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるグリシンの導入率を算出した（表３）。また、脱保護したサンプルを実施例１−３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−１０に示す。さらに実施例１−４の記載と同じ条件でＨＡ−ＧｌｙのＴＢＡ塩（ＨＡ−Ｇｌｙ−ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１−４と同様の方法でＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ−Ｇｌｙ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１−４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−１１に示す。実施例１−４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表３）。【０２５８】
（実施例１−８）Ｌ−スレオニン（Ｔｈｒ）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｔｈｒ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ−スレオニンメチルエステルの塩酸塩（Ｂａｃｈｅｍ社製）を用いたこと以外は、実施例１−４と同様の方法で行い、ＨＡ−Ｔｈｒを白色固体として得た。実施例１−３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−１２に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、スレオニン中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、１．２ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるスレオニンの導入率を算出した（表３）。さらに実施例１−４の記載と同じ条件でＨＡ−ＴｈｒのＴＢＡ塩（ＨＡ−Ｔｈｒ−ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１−４と同様の方法でＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ−Ｔｈｒ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１−４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−１３に示す。実施例１−４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表３）。【０２５９】
（実施例１−９）Ｌ−アスパラギン（Ａｓｎ）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ａｓｎ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ−アスパラギンメチルエステル塩酸塩（Ｂａｃｈｅｍ社製）を用いたこと以外は、実施例１−４と同様の方法で行い、ＨＡ−Ａｓｎを白色固体として得た。実施例１−３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−１４に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、アスパラギンのメチレン由来のピーク（−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、２．７、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるアスパラギンの導入率を算出した（表３）。さらに実施例１−４の記載と同じ条件でＨＡ−ＡｓｎのＴＢＡ塩（ＨＡ−Ａｓｎ−ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１−４と同様の方法でＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ−Ａｓｎ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１−４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−１５に示す。実施例１−４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表３）。【０２６０】
（実施例１−１０）Ｌ−アスパラギン酸（Ａｓｐ）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ａｓｐ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ−アスパラギン酸ジエチルエステル塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−４と同様の方法で行い、ＨＡ−Ａｓｐを白色固体として得た。実施例１−３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−１６に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、アスパラギン酸中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ２ＣＯＯＨ、２．７、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるアスパラギン酸の導入率を算出した（表３）。さらに実施例１−４の記載と同じ条件でＨＡ−ＡｓｐのＴＢＡ塩（ＨＡ−Ａｓｐ−ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１−４と同様の方法でＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ−Ａｓｐ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１−４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−１７に示す。実施例１−４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表３）。【０２６１】
（実施例１−１１）Ｌ−イソロイシン（Ｉｌｅ）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｉｌｅ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ−イソロイシンメチルエステル塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−４と同様の方法で行い、ＨＡ−Ｉｌｅを白色固体として得た。実施例１−３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−１８に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、イソロイシン中の２つのメチル由来のピーク（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、０．９ｐｐｍ；６Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるイソロイシンの導入率を算出した（表３）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、イソロイシンの３位の水素のピーク（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、１．９ｐｐｍ；１Ｈ）が重なっているため、１．８〜２．２ｐｐｍのピークの積分値から０．９ｐｐｍのピークの積分値に１／６を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、導入率の算出に使用した。さらに実施例１−４の記載と同じ条件でＨＡ−ＩｌｅのＴＢＡ塩（ＨＡ−Ｉｌｅ−ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１−４と同様の方法でＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ−Ｉｌｅ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１−４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−１９に示す。実施例１−４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表３）。【０２６２】
（実施例１−１２）Ｌ−ロイシン（Ｌｅｕ）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｌｅｕ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ−ロイシンエチルエステル塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−４と同様の方法で行い、ＨＡ−Ｌｅｕを白色固体として得た。実施例１−３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−２０に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ロイシン中の２つのメチル由来のピーク（−ＣＨ（ＣＨ３）２、０．９ｐｐｍ；６Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるロイシンの導入率を算出した（表３）。さらに実施例１−４の記載と同じ条件でＨＡ−ＬｅｕのＴＢＡ塩（ＨＡ−Ｌｅｕ−ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１−４と同様の方法でＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ−Ｌｅｕ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１−４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−２１に示す。実施例１−４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表３）。【０２６３】
（実施例１−１３）Ｌ−バリン（Ｖａｌ）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｖａｌ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ−バリンエチルエステル塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−４と同様の方法で行い、ＨＡ−Ｖａｌを白色固体として得た。実施例１−３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−２２に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、バリン中の２つのメチル由来のピーク（−ＣＨ（ＣＨ３）２、０．９ｐｐｍ；６Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるバリンの導入率を算出した（表３）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、バリンの３位の水素のピーク（−ＣＨ（ＣＨ３）２、２．１ｐｐｍ；１Ｈ）が重なっているため、１．８〜２．２ｐｐｍのピークの積分値から０．９ｐｐｍのピークの積分値に１／６を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、導入率の算出に使用した。さらに実施例１−４の記載と同じ条件でＨＡ−ＶａｌのＴＢＡ塩（ＨＡ−Ｖａｌ−ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１−４と同様の方法でＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ−Ｖａｌ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１−４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−２３に示す。実施例１−４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表３）。【０２６４】
（実施例１−１４）Ｌ−フェニルアラニン（Ｐｈｅ）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｐｈｅ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ−フェニルアラニンエチルエステル塩酸塩（アルドリッチ社製）を用いたこと以外は、実施例１−４と同様の方法で行い、ＨＡ−Ｐｈｅを白色固体として得た。実施例１−３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−２４に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、フェニルアラニン中のフェニル由来のピーク（−Ｃ６Ｈ５、７．２〜７．４ｐｐｍ；５Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるフェニルアラニンの導入率を算出した（表３）。さらに実施例１−４の記載と同じ条件でＨＡ−ＰｈｅのＴＢＡ塩（ＨＡ−Ｐｈｅ−ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１−４と同様の方法でＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ−Ｐｈｅ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１−４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−２５に示す。実施例１−４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表３）。【０２６５】
【表３】
2014038641.tif 000041
【０２６６】
（実施例１−１５）Ｌ−セリンアミド（ＳｅｒＮＨ２）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−ＳｅｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ−セリンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−５と同様の方法で行い、ＨＡ−ＳｅｒＮＨ２−Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。実施例１−５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−２６に示す。実施例１−５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表４）。また、実施例１−３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−２７に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、セリンアミドのメチレン由来のピーク（−ＣＨ２−、３．９ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１−５と同様にしてＨＡユニットにおけるセリンアミドの導入率を算出した（表４）。なお、セリンアミドのメチレン由来のピークには、グルクロン酸の２〜５位のピーク（４Ｈ）、グルコサミンの２〜６位のピーク（６Ｈ）が重なっているため、３．２〜４．２ｐｐｍのピークの積分値から、２．０ｐｐｍのピークの積分値に１０／３を乗じた値を差し引いた値をセリンアミドのメチレン由来のピークとして、導入率の算出に使用した。【０２６７】
（実施例１−１６）Ｌ−グリシンアミド（ＧｌｙＮＨ２）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−ＧｌｙＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−スレオニンアミド塩酸塩の代わりにグリシンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−５と同様の方法で行い、ＨＡ−ＧｌｙＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。【０２６８】
実施例１−５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−２８に示す。実施例１−５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表４）。また、実施例１−３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−２９に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、グリシンアミドのメチレン由来のピーク（−ＣＨ２−；２Ｈ）の積分値より、実施例１−５と同様にしてＨＡユニットにおけるグリシンアミドの導入率を算出した（表４）。なお、グリシンアミドのメチレン由来のピークには、グルクロン酸の２〜５位のピーク（４Ｈ）、グルコサミンの２〜６位のピーク（６Ｈ）が重なっているため、実施例１−１５と同様の方法でセリンアミドのメチレン由来のピークの積分値を算出した。【０２６９】
（実施例１−１７）Ｌ−ロイシンアミド（ＬｅｕＮＨ２）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−ＬｅｕＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ−ロイシンアミド塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−５と同様の方法で行い、ＨＡ−ＬｅｕＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。【０２７０】
実施例１−５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−３０に示す。実施例１−５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表４）。また、グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．９ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ロイシンアミドの２つのメチル由来のピーク（−ＣＨ（ＣＨ３）２、０．９ｐｐｍ；６Ｈ）の積分値より、実施例１−５と同様にしてＨＡユニットにおけるロイシンアミドの導入率を算出した（表４）。【０２７１】
（実施例１−１８）Ｌ−バリンアミド（ＶａｌＮＨ２）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−ＶａｌＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ−バリンアミド塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−５と同様の方法で行い、ＨＡ−ＶａｌＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。【０２７２】
実施例１−５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−３１に示す。実施例１−５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表４）。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．９ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、バリンアミドの２つのメチル由来のピーク（−ＣＨ（ＣＨ３）２、１．０ｐｐｍ；６Ｈ）の積分値より、実施例１−５と同様にしてＨＡユニットにおけるバリンアミドの導入率を算出した（表４）。【０２７３】
【表４】
2014038641.tif 000042
【０２７４】
（実施例１−１９）Ｌ−アラニン（Ａｌａ）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ａｌａ／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ−アラニンエチルエステル塩酸塩（アルドリッチ社製）を用い、超純水透析中に透析液を一度取り出して２Ｎ  ＮａＯＨにてカルボキシの脱保護を行った以外は、実施例１−５と同様の方法で行い、ＨＡ−Ａｌａ／Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。実施例１−５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−３２に示す。実施例１−５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表５）。また、グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．９ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、アラニン中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、１．３ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるアラニンの導入率を算出した（表５）。なお、アラニンのメチル由来のピークにはコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメート由来のピーク（０．８〜１．６ｐｐｍ、４１Ｈ）が重なっているため、０．８〜１．６ｐｐｍのピークの積分値から０．７ｐｐｍのピークの積分値に４１／３を乗じた値を差し引いた値をアラニンのメチル由来のピークとして、導入率の算出に使用した。【０２７５】
（実施例１−２０）Ｌ−セリン（Ｓｅｒ）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｓｅｒ／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ−セリンエチルエステル塩酸塩（アルドリッチ社製）を用い、超純水透析中に透析液を一度取り出して２Ｎ  ＮａＯＨにてカルボキシの脱保護を行った以外は、実施例１−５と同様の方法で行い、ＨＡ−Ｓｅｒ／Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。また、カルボキシを脱保護する前の透析溶液の一部を採り凍結乾燥して導入率算出用サンプルとした（ＨＡ−Ｓｅｒ−ＯＥｔ／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）。実施例１−３の記載と同じ条件で測定した導入率算出用サンプルの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−３３に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．３ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、セリンのエチルエステル中のメチル由来のピーク（−ＣＨ３、１．６ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１−６と同様にしてＨＡユニットにおけるセリンの導入率を算出した（表５）。また、脱保護したサンプルを実施例１−５の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−３４に示す。実施例１−５に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表５）【０２７６】
【表５】
2014038641.tif 000043
【０２７７】
（実施例１−２１）蛍光標識されていないヒアルロン酸誘導体の合成
５−アミノメチルフルオレセインを加えていないこと以外は実施例１−４（Ａｌａ）、実施例１−５（ＴｈｒＮＨ２）、実施例１−１５（ＳｅｒＮＨ２）、実施例１−１８（ＶａｌＮＨ２）に記載の方法によりＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ、ＨＡ−ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ、ＨＡ−ＳｅｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ、ＨＡ−ＶａｌＮＨ２／Ｃｈｏｌを白色固体として得た。対応する実施例の記載と同じ方法によりコレステリル基の導入率ならびにアミノ酸およびアミノ酸アミドの導入率を算出した（表６）。【０２７８】
【表６−１】
2014038641.tif 000044
【０２７９】
【表６−２】
2014038641.tif 000045
【０２８０】
（比較例１−１）コレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
実施例１−３で調製した、ＨＡ−Ｎａ（１０ｋ、５０ｋ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの、無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、実施例１−１で調製したＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩をＨＡユニットに対して以下の表７に示す比率で各溶液に添加した。次にＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表７に示す比率で加え、さらに５−アミノメチルフルオレセイン（ＦＬ、インビトロジェン社製）塩酸塩、ＤＭＴ−ＭＭをＨＡユニットに対してそれぞれ０．０４モル等量、０．０７モル等量添加し、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ  酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。【０２８１】
測定溶媒として０．０２Ｎ  ＤＣｌ  ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ  ＤＣｌ  Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ−ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（９９ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が６％の生成物）を図１−３５に示す。ＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率は実施例１−４に記載の方法で算出した（表７）。【０２８２】
【表７】
2014038641.tif 000046
【０２８３】
（比較例１−２）ＥＤＯＢＥＡにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−Ａｃ／ＦＬ）の合成
実施例１−３で合成した、ＨＡ−Ｎａ（９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、ＨＡユニット／ＢＯＰ（和光純薬株株式会社製）／２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（ＥＤＯＢＥＡ、シグマ−アルドリッチ社製）＝１／２．５／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の等量比でＥＤＯＢＥＡ、ＢＯＰの順で添加し、室温で一晩攪拌した。反応溶液は、０．３Ｍ  ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析した後、凍結乾燥して高導入率のＨＡ−ＥＤＯＢＥＡを得た。【０２８４】
実施例１−３の記載と同じ条件で測定した高導入率のＨＡ−ＥＤＯＢＥＡの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−３６に示す。なお測定に際し、ＮａＯＤを０．００４６Ｎとなるように加え、溶液がアルカリ性となるようにした。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＥＤＯＢＥＡ末端のメチレン由来のピーク（−ＣＨ２ＮＨ２、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるＥＤＯＢＥＡの導入率を算出したところ、８２％であった。【０２８５】
次に、得られた高導入率のＨＡ−ＥＤＯＢＥＡを超純水で１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させた後、１００ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）で２倍希釈して５ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。この溶液にＨＡユニットに対して０．０４モル等量のＮＨＳ−フルオレセインをＤＭＳＯ溶液として加えて室温で１時間攪拌した後、ＨＡユニットに対して４０モル等量の無水酢酸（和光純薬株式会社製）を添加してさらに１時間攪拌することにより、余分なＥＤＯＢＥＡの末端アミノをアセチル化した。反応溶液は、０．３Ｍ  ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で遮光下で透析を行った後、凍結乾燥してＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−Ａｃ／ＦＬを黄色固体として得た。実施例１−３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−３７に示す。【０２８６】
（比較例１−３）Ｌ−チロシン（Ｔｙｒ）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｔｙｒ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ−チロシンエチルエステル塩酸塩（和光純薬株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−４と同様の方法で行い、ＨＡ−Ｔｙｒを白色固体として得た。実施例１−３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−３８に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、チロシン中のヒドロキシフェニル由来のピーク（−Ｃ６Ｈ４ＯＨ、６．８、７．２ｐｐｍ；４Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるチロシンの導入率を算出した（表８）。さらに実施例１−４の記載と同じ条件でＨＡ−ＴｙｒのＴＢＡ塩（ＨＡ−Ｔｙｒ−ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１−４と同様の方法でＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩、ＦＬを反応させ、目的物（ＨＡ−Ｔｙｒ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１−４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１−３９に示す。実施例１−４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表８）【０２８７】
【表８】
2014038641.tif 000047
【０２８８】
〔実施例２〕ｉｎ  ｖｉｖｏでの血中滞留性および生分解性の確認
（実施例２−１）ＨＡ誘導体を投与したラットからの生体サンプル採取
実施例１−４〜１−２０および比較例１−１および１−３で得られた化合物を１０ｍｇ／ｋｇの用量でラット静脈内に単回投与し、投与後５分、２、７、２４、４８、７２、１６８、２４０および３３６時間でヘパリンナトリウム処理したシリンジを用いて頸静脈採血し、遠心分離により血漿を得た。比較例のサンプルの中には投与後９６時間においても採血したものもある。この血漿サンプルは測定まで−２０℃以下で凍結保存した。また、投与後０〜２４時間、２４〜４８時間、４８〜７２時間、７２〜９６時間、１６８〜１９２時間、２４０〜２６４時間、および３３６〜３６０時間で代謝ケージを用いて採尿し、測定まで−２０℃以下で凍結保存した。さらに、投与１５日後に肝臓を摘出し、測定まで−２０℃以下で凍結保存した。比較例１−２で得られた化合物は２０ｍｇ／ｋｇの用量でラット静脈内に単回投与し、採尿ならびに肝臓摘出を行った。【０２８９】
（実施例２−２）ＨＡ誘導体を投与したラットの血漿の分析
血漿サンプルを融解後、ＨＰ−β−ＣＤ（１００ｍＭ）／トリス緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）溶液にて２倍希釈し、３７℃にて１時間インキュベート後、９６穴プレートリーダー（ＡＲＶＯ）にて蛍光標識ＨＡ誘導体濃度を測定した（定量限界：０．４μｇ／ｍＬ）。蛍光標識ＨＡ誘導体の血漿中濃度推移を図２−１−１〜図２−１−２６に示した。また、薬物動態パラメーター（血漿中濃度−時間曲線下面積外挿値（ＡＵＣ∞））をＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｖｅｒ．６．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）によって解析し、その値を表９に示した。また、以下の式により算出される、同程度にコレステロールが導入された比較サンプルに対するＡＵＣ∞の比率を表１０に示した。【０２９０】
【数６】
2014038641.tif 000048
【０２９１】
【表９】
2014038641.tif 000049
【０２９２】
【表１０】
2014038641.tif 000050
【０２９３】
カルボキシにアミノ酸またはアミノ酸アミドを導入し、さらにコレステリル基を導入したＨＡ誘導体（サンプル２−１〜２−２５）は、カルボキシにコレステリル基のみを導入したＨＡ誘導体（比較サンプル２−１〜２−７）と比較して、優位に血漿中濃度を維持することが明らかとなった。【０２９４】
（実施例２−３）ＨＡ誘導体を投与したラットの肝臓の分析
約１ｇの肝臓サンプルにトリスバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ９．０）を添加し、ビーズを用いてホモジネートした。４ｍｇ／ｍＬプロナーゼ溶液を添加し、３７℃にて一晩インキュベートした。遠心分離後、ＨＰ−β−ＣＤ（１００ｍＭ）／トリス緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）溶液にて２倍希釈し、さらに３７℃にて１時間インキュベート後、フィルターろ過し、以下の条件にてサイズ排除クロマトグラフィー分析を行った。なお、サンプル非投与ラットの肝臓も同様の処理を行い、投与前サンプルと混合したものを、スタンダードとして同様に分析を行った。【０２９５】
サイズ排除クロマトグラフィー分析条件
分析カラム：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー株式会社）
カラム温度：２５℃
移動相：ＨＰ−β−ＣＤ（１０ｍＭ）／トリス緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：Ｅｘ  ４９４ｎｍ／Ｅｍ  ５１５ｎｍ
注入量：５０μＬ【０２９６】
結果を図２−２−１〜図２−２−２７に示す。クロマトグラムはそれぞれの最強ピークでノーマライズされている。比較例１−２のＨＡ誘導体（ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−Ａｃ／ＦＬ、図２−２−２６）では、肝臓中において全く低分子化が観察されなかったのに対し、実施例のＨＡ誘導体は、いずれも低分子化した投与化合物が検出された。これは、本発明のＨＡ誘導体が生分解性を有することを示している。また、体内にて分解後、尿または糞にて体外へ排泄されると考えられる。【０２９７】
（実施例２−４）ＨＡ誘導体投与ラット尿の分析
尿サンプルを０．２２μｍのフィルターでろ過し、ＨＰ−β−ＣＤ（１００ｍＭ）／トリス緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）溶液にて２倍希釈した。３７℃にて１時間インキュベート後、フィルターろ過し、実施例２−３に記載の条件にてサイズ排除クロマトグラフィー分析を行った。なお、サンプル非投与ラットの尿サンプルも同様の処理を行い、投与前サンプルと混合したものを、スタンダードとして同様に分析を行った。【０２９８】
結果を図２−３−１〜図２−３−２７に示す。左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す。投与後０〜２４時間、２４〜４８時間、４８〜７２時間、７２〜９６時間、１６８〜１９２時間、２４０〜２６４時間、および３３６〜３６０時間で採尿したサンプルをそれぞれ０−１ｄ、１−２ｄ、２−３ｄ、３−４ｄ、７−８ｄ、１０−１１ｄ、および１４−１５ｄとして、またそれぞれのスタンダードをＳＴＤとして図中に示す。【０２９９】
比較例１−２のＨＡ誘導体（ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−Ａｃ／ＦＬ）では、低分子化した投与化合物が尿中に観察されなかったのに対し、実施例のＨＡ誘導体には、低分子化した投与化合物が尿中に検出されたものもあった。これは、本発明のＨＡ誘導体の生分解性を、尿を調べることで簡便に評価できる場合があることを示している。【０３００】
〔実施例３〕ヒアルロン酸誘導体の合成
（実施例３−１）Ｌ−グルタミン（Ｇｌｎ）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｇｌｎ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ−グルタミンメチルエステル塩酸塩（和光純薬株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−４と同様の方法で行い、ＨＡ−Ｇｌｎを白色固体として得た。実施例１−３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３−１に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、グルタミンのメチレン由来のピーク（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、２．３、２．４ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるグルタミンの導入率を算出した（表１１）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、グルタミンの別のメチレンのピーク（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、２．１ｐｐｍ；２Ｈ）が重なっているため、１．８〜２．２ｐｐｍのピークの積分値から２．３、２．４ｐｐｍのピークの積分値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、修飾率の算出に使用した。さらに実施例１−４の記載と同じ条件でＨＡ−ＧｌｎのＴＢＡ塩（ＨＡ−Ｇｌｎ−ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１−４と同様の方法でＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ−Ｇｌｎ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１−４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３−２に示す。実施例１−４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表１１）。【０３０１】
（実施例３−２）Ｌ−メチオニン（Ｍｅｔ）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｍｅｔ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ−メチオニンエチルエステル塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−４と同様の方法で行い、ＨＡ−Ｍｅｔを白色固体として得た。実施例１−３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３−３に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、メチオニンのメチレン由来のピーク（−ＣＨ２ＳＣＨ３、２．６ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるメチオニンの導入率を算出した（表１１）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、メチオニンの別のメチレンとメチル由来のピーク（−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、２．１ｐｐｍ；５Ｈ）が重なっているため、１．８〜２．２ｐｐｍのピークの積分値から２．６ｐｐｍのピークの積分値に５／２を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、導入率の算出に使用した。【０３０２】
さらに実施例１−４の記載と同じ条件でＨＡ−ＭｅｔのＴＢＡ塩（ＨＡ−Ｍｅｔ−ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１−４と同様の方法でＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ−Ｍｅｔ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１−４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３−４に示す。実施例１−４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表１１）。【０３０３】
【表１１】
2014038641.tif 000051
【０３０４】
（実施例３−３）Ｌ−アラニンアミド（ＡｌａＮＨ２）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−ＡｌａＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ−アラニンアミド塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−５と同様の方法で行い、ＨＡ−ＡｌａＮＨ２−Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。実施例１−５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３−５に示す。実施例１−５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１２）。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．８ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、アラニンアミドのメチル由来のピーク（−ＣＨ２−、１．３ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１−５と同様にしてＨＡユニットにおけるアラニンアミドの導入率を算出した（表１２）。なお、アラニンアミドのメチル由来のピークには、コレステリル由来のピーク（４１Ｈ）が重なっているため、０．８〜１．６ｐｐｍのピークの積分値から、０．７ｐｐｍのピークの積分値に４１／３を乗じた値を差し引いた値をアラニンアミドのメチレン由来のピークとして、導入率の算出に使用した。【０３０５】
（実施例３−４）Ｌ−アスパラギンアミド（ＡｓｎＮＨ２）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−ＡｓｎＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ−アスパラギンアミド塩酸塩（国産化学株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−５と同様の方法で行い、ＨＡ−ＡｓｎＮＨ２−Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。実施例１−５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３−６に示す。実施例１−５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１２）。また、実施例１−３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３−７に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、アスパラギンアミドのメチレン由来のピーク（−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、２．７、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるアスパラギンアミドの導入率を算出した（表１２）【０３０６】
（実施例３−５）Ｌ−イソロイシンアミド（ＩｌｅＮＨ２）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−ＩｌｅＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ−イソロイシンアミド塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−５と同様の方法で行い、ＨＡ−ＩｌｅＮＨ２−Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。実施例１−５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３−８に示す。実施例１−５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１２）。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．８ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、イソロイシンアミド中のメチレンならびに２つのメチル由来のピーク（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、０．９ｐｐｍ；８Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるイソロイシンアミドの導入率を算出した（表３）。なお、イソロイシンアミドのメチル由来のピークには、コレステリル由来のピーク（４１Ｈ）が重なっているため、０．８〜１．６ｐｐｍのピークの積分値から、０．７ｐｐｍのピークの積分値に４１／３を乗じた値を差し引いた値をイソロイシンアミドのメチレン由来のピークとして、導入率の算出に使用した。また、グルコサミンのアセチル由来のピークには、イソロイシンの３位の水素のピーク（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、１．９ｐｐｍ；１Ｈ）が重なっているため、１．８〜２．２ｐｐｍのピークの積分値から０．８〜１．６ｐｐｍのピークの積分値に１／８を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、導入率の算出に使用した。【０３０７】
（実施例３−６）Ｌ−グルタミンアミド（ＧｌｎＮＨ２）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−ＧｌｎＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ−グルタミンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−５と同様の方法で行い、ＨＡ−ＧｌｎＮＨ２−Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。実施例１−５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３−９に示す。実施例１−５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１２）。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．８ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、グルタミンアミド中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、２．１ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるグルタミンアミドの導入率を算出した（表１２）。なお、グルタミンアミドのメチル由来のピークには、コレステリル由来のピーク（２Ｈ）が重なっているため、０．７ｐｐｍのピークの積分値に２／３を乗じた値を差し引いた値をグルタミンアミドのメチレン由来のピークとして、導入率の算出に使用した。また、グルコサミンのアセチル由来のピークには、グルタミンアミド中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、１．９ｐｐｍ；２Ｈ）が重なっているため、１．８〜２．０ｐｐｍのピークの積分値から２．１ｐｐｍのピークの積分値に２／２を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、導入率の算出に使用した。【０３０８】
（実施例３−７）Ｌ−メチオニンアミド（ＭｅｔＮＨ２）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−ＭｅｔＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ−メチオニンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−５と同様の方法で行い、ＨＡ−ＭｅｔＮＨ２−Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。実施例１−５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３−１０に示す。実施例１−５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１２）。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．８ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、メチオニンアミド中のメチル由来のピーク（−ＳＣＨ３、２．１ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるメチオニンアミドの導入率を算出した（表１２）。グルコサミンのアセチル由来のピークには、メチオニンアミド中のメチレン由来のピーク（−ＣＨ２ＳＣＨ３、１．９ｐｐｍ；２Ｈ）が重なっているため、１．８〜２．０ｐｐｍのピークの積分値から２．１ｐｐｍのピークの積分値に２／３を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、導入率の算出に使用した。【０３０９】
【表１２】
2014038641.tif 000052
【０３１０】
（比較例３−１）Ｌ−グルタミン酸（Ｇｌｕ）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｇｌｕ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ−グルタミン酸ジエチルエステル塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−４と同様の方法で行い、ＨＡ−Ｇｌｕを白色固体として得た。実施例１−３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３−１１に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、グルタミン酸のメチレン由来のピーク（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、２．４ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるグルタミン酸の導入率を算出した（表１３）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、グルタミン酸の別のメチレン由来のピーク（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、２．１ｐｐｍ；２Ｈ）が重なっているため、１．８〜２．２ｐｐｍのピークの積分値から２．４ｐｐｍのピークの積分値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、修飾率の算出に使用した。さらに実施例１−４の記載と同じ条件でＨＡ−ＧｌｕのＴＢＡ塩（ＨＡ−Ｇｌｕ−ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１−４と同様の方法でＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ−Ｇｌｕ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１−４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３−１２に示す。実施例１−４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表１３）。【０３１１】
（比較例３−２）Ｌ−トリプトファン（Ｔｒｐ）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｔｒｐ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ−トリプトファンエチルエステル塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−４と同様の方法で行い、ＨＡ−Ｔｒｐを白色固体として得た。実施例１−３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３−１３に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、トリプトファンのインドール環由来のピーク（−Ｃ８Ｈ６Ｎ、７．８ｐｐｍ；１Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるトリプトファンの導入率を算出した（表１３）。さらに実施例１−４の記載と同じ条件でＨＡ−ＴｒｐのＴＢＡ塩（ＨＡ−Ｔｒｐ−ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１−４と同様の方法でＣｈｏｌ−Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ−Ｔｒｐ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１−４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図３−１４に示す。実施例１−４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表１３）。【０３１２】
（比較例３−３）Ｌ−チロシン（Ｔｙｒ）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−Ｔｙｒ−Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
１０ｋＤａのＨＡ−Ｎａを出発原料とするＨＡ−ＴＢＡを用いたこと以外は、比較例１−３と同様の方法で行い、１０ｋのＨＡ−Ｔｙｒ−Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。チロシンならびにコレステリル基の導入率も比較例１−３と同様の方法で算出した（表１３）。【０３１３】
【表１３】
2014038641.tif 000053
【０３１４】
（実施例３−８）蛍光標識されていないヒアルロン酸誘導体の合成
５−アミノメチルフルオレセインを加えていないこと、ならびに出発原料として用いたＨＡ−Ｎａの分子量が異なること以外は実施例１−４〜実施例１−１８ならびに実施例３−１〜実施例３−７ならびに比較例３−１〜比較例３−３に記載の方法により各種ヒアルロン酸誘導体を白色固体として得た。対応する実施例の記載と同じ方法によりコレステリル基の導入率ならびにアミノ酸およびアミノ酸アミドの導入率を算出した（表１４−１、表１４−２）。原料のヒアルロン酸は、５ｋＤａのみＲ＆Ｄシステム社製を用い、それ以外は資生堂社製のものを用いた。【０３１５】
【表１４−１】
2014038641.tif 000054
【０３１６】
【表１４−２】
2014038641.tif 000055
【０３１７】
〔実施例４〕ｉｎ  ｖｉｖｏでの血中滞留性および生分解性の確認
（実施例４−１）ＨＡ誘導体を投与したラットからの生体サンプル採取
実施例３−１〜３−７および比較例３−１〜３−３で得られた化合物を１０ｍｇ／ｋｇの用量でラット静脈内に単回投与し、投与後５分、２、７、２４、４８、７２および１６８時間でヘパリンナトリウム処理したシリンジを用いて頸静脈採血し、遠心分離により血漿を得た。比較例のサンプルの中には投与後９６時間においても採血したものもある。この血漿サンプルは測定まで−２０℃以下で凍結保存した。また、投与７日後に肝臓を摘出し、測定まで−２０℃以下で凍結保存した。【０３１８】
（実施例４−２）ＨＡ誘導体を投与したラットの血漿の分析
血漿サンプルを融解後、ＨＰ−β−ＣＤ（１００ｍＭ）／トリス緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）溶液にて２倍希釈し、３７℃にて１時間インキュベート後、９６穴プレートリーダー（ＡＲＶＯ）にて蛍光標識ＨＡ誘導体濃度を測定した（定量限界：０．４μｇ／ｍＬ）。蛍光標識ＨＡ誘導体の血漿中濃度推移を図４−１−１〜図４−１−１０に示した。また、薬物動態パラメーター（血漿中濃度−時間曲線下面積外挿値（ＡＵＣ∞））をＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｖｅｒ．６．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）によって解析し、その値を表１５に示した。また、以下の式により算出される、同程度にコレステロールが導入された比較サンプルに対するＡＵＣ∞の比率を表１６に示した。【０３１９】
【数７】
2014038641.tif 000056
【０３２０】
【表１５】
2014038641.tif 000057
【０３２１】
【表１６】
2014038641.tif 000058
【０３２２】
カルボキシにアミノ酸またはアミノ酸アミドを導入し、さらにコレステリル基を導入したＨＡ誘導体（サンプル４−１〜４−７）は、カルボキシにコレステリル基のみを導入したＨＡ誘導体（比較サンプル２−１）と比較して、優位に血漿中濃度を維持することが明らかとなった。なお、１０ｋ  ＨＡ−Ｔｙｒ−Ｃｈｏｌ−７％／ＦＬ（比較サンプル４−３）は９９ｋ  ＨＡ−Ｔｙｒ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（比較サンプル２−８）と同じくカルボキシにコレステリル基のみを導入したＨＡ誘導体と比較して血中滞留性が低下した。一方で、９９ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−７％／ＦＬ（サンプル２−１）、１０ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−１６％／ＦＬ（サンプル２−７）はいずれもカルボキシにコレステリル基のみを導入したＨＡ誘導体と比較して優位にもしくは同等に血漿中濃度を維持した。このことから、カルボキシに導入するアミノ酸の違いによるＨＡ誘導体の血中滞留性の優劣は、原料ヒアルロン酸の分子量には影響されない（依存しない）ことが示唆される。【０３２３】
（実施例４−３）ＨＡ誘導体を投与したラットの肝臓の分析
約１ｇの肝臓サンプルにトリスバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ９．０）を添加し、ビーズを用いてホモジネートした。４ｍｇ／ｍＬプロナーゼ溶液を添加し、３７℃にて一晩インキュベートした。遠心分離後、ＨＰ−β−ＣＤ（１００ｍＭ）／トリス緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）溶液にて２倍希釈し、さらに３７℃にて１時間インキュベート後、フィルターろ過し、以下の条件にてサイズ排除クロマトグラフィー分析を行った。なお、サンプル非投与ラットの肝臓も同様の処理を行い、投与前サンプルと混合したものを、スタンダードとして同様に分析を行った。【０３２４】
サイズ排除クロマトグラフィー分析条件
分析カラム：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー株式会社）
カラム温度：２５℃
移動相：ＨＰ−β−ＣＤ（１０ｍＭ）／トリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．０）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：Ｅｘ  ４９４ｎｍ／Ｅｍ  ５１５ｎｍ
注入量：５０μＬ【０３２５】
結果を図４−２−１〜図４−２−１０に示す。クロマトグラムはそれぞれの最強ピークでノーマライズされている。比較例１−２のＨＡ誘導体（ＨＡ−ＥＤＯＢＥＡ−Ａｃ／ＦＬ、図２−２−２６）では、肝臓中において全く低分子化が観察されなかったのに対し、実施例のＨＡ誘導体は、いずれも低分子化した投与化合物が検出された。  これらのことから、本発明のＨＡ誘導体は生分解性を有しており、体内にて分解後、尿または糞にて体外へ排泄されると考えられる。【０３２６】
〔実施例５〕塩濃度応答型沈殿徐放製剤
（実施例５−１）Ｌ−チロシンアミド（ＴｙｒＮＨ２）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−ＴｙｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ−チロシンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−５と同様の方法で行い、ＨＡ−ＴｙｒＮＨ２−Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色水溶液として得た。凍結乾燥品を実施例１−５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図５−１に示す。実施例１−５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１７）。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．８ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、チロシン中のヒドロキシフェニル由来のピーク（−Ｃ６Ｈ４ＯＨ、６．８、７．２ｐｐｍ；４Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるチロシンアミドの導入率を算出した（表１７）【０３２７】
（実施例５−２）Ｌ−トリプトファンアミド（ＴｒｐＮＨ２）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−ＴｒｐＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ−トリプトファンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−５と同様の方法で行い、ＨＡ−ＴｒｐＮＨ２−Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色水溶液として得た。凍結乾燥品を実施例１−５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図５−２に示す。実施例１−５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１７）。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．８ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、トリプトファンアミド中のインドール環由来のピーク（−Ｃ８Ｈ６Ｎ、７．６ｐｐｍ；１Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるトリプトファンアミドの導入率を算出した（表１７）。【０３２８】
（実施例５−３）Ｌ−フェニルアラニンアミド（ＰｈｅＮＨ２）ならびにコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ−ＰｈｅＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
Ｌ−スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ−フェニルアラニンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１−５と同様の方法で行い、ＨＡ−ＰｈｅＮＨ２−Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色水溶液として得た。凍結乾燥品を実施例１−５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図５−３に示す。実施例１−５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１７）。グルコサミンのアセチル由来のピーク（−ＣＯＣＨ３、１．８ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、フェニルアラニン中のフェニル由来のピーク（−Ｃ６Ｈ５、７．２〜７．４ｐｐｍ；５Ｈ）の積分値より、実施例１−４と同様にしてＨＡユニットにおけるフェニルアラニンアミドの導入率を算出した（表１７）【０３２９】
【表１７】
2014038641.tif 000059
【０３３０】
（比較例５−１）Ｌ−チロシンアミド（ＴｙｒＮＨ２）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−ＴｙｒＮＨ２）の合成
実施例１−３で合成した、ＨＡ−Ｎａを出発原料とするＨＡ−ＴＢＡ（９９ｋＤａ）の無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。その後、Ｌ−チロシンアミド塩酸塩（渡辺化学株式会社製）をＨＡユニットに対して５モル等量添加し、次に４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）をＨＡユニットに対して３モル等量添加し、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析した。透析中に沈殿が生じ、目的物を水溶液として回収できなかった。【０３３１】
（比較例５−２）Ｌ−トリプトファンアミド（ＴｒｐＮＨ２）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−ＴｒｐＮＨ２）の合成
Ｌ−チロシンアミド塩酸塩の代わりにＬ−トリプトファンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、比較例５−１と同様の方法でおこなった。透析中に沈殿が生じ、目的物を水溶液として回収できなかった。【０３３２】
（比較例５−３）Ｌ−フェニルアラニンアミド（ＰｈｅＮＨ２）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ−ＰｈｅＮＨ２）の合成
Ｌ−チロシンアミド塩酸塩の代わりにＬ−フェニルアラニンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、比較例５−１と同様の方法でおこなった。ＨＡ−ＰｈｅＮＨ２を白色固体として得た。【０３３３】
（実施例５−４）
実施例５−１、実施例５−２、比較例５−１、比較例５−２で合成したＨＡ誘導体の水への透析後の溶解性状を表１８に示す。【０３３４】
【表１８】
2014038641.tif 000060
【０３３５】
サンプル５−１ならびにサンプル５−２はステリル基を導入しない比較サンプル５−１ならびに比較サンプル５−２に比べ、ステリル基を導入した場合の方が、ステリル基の有する疎水性にも係わらず、水中でより分散することが明らかとなった。【０３３６】
（実施例５−５）塩濃度依存的沈殿性能評価
実施例５−１、実施例５−２、実施例５−３、実施例３−３で得られたＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−ＴｙｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ、９９ｋ  ＨＡ−ＴｒｐＮＨ２／Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ、９９ｋ  ＨＡ−ＰｈｅＮＨ２／Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ、９９ｋ  ＨＡ−ＡｌａＮＨ２／Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ）の水溶液（超純水）に対し、最終緩衝液組成が１０ｍＭ  ＰＢ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌとなるように濃縮緩衝液を加え、ＨＡ誘導体濃度を４．５ｍｇ／ｍＬとした。３７℃にて２０分間インキュベート後、２０００Ｇにて１分間遠心し、上澄みを９６穴プレートリーダー（ＡＲＶＯ）にて蛍光強度を測定した。スタンダードを用いて蛍光標識ＨＡ誘導体濃度を算出し、当初使用量に対する残存率を算出した（表１９）。同様の操作を比較例１−１で得られた９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（比較サンプル５−３）に対しても行った。比較サンプル５−１、５−２の結果はＷＯ２０１０／０５３１４０に記載の結果である。【０３３７】
【表１９】
2014038641.tif 000061
【０３３８】
５０ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（比較サンプル５−１）は塩の濃度が低い条件（超純水）でも生理塩濃度（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）のいずれにおいても溶液状態であることがＷＯ２０１０／０５３１４０に示されている。また、９９ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（比較サンプル５−３）も同様の挙動を示すことが本実験により示された。一方、９９ｋ  ＨＡ−ＰｈｅＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（サンプル５−３）は塩の濃度が低い条件（超純水）では溶解し、生理塩濃度（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）では析出するという塩濃度依存的な挙動を示すことが確認された。この結果は、糖などにより等張化した低塩濃度溶液を調製することにより投与後皮下で沈殿する製剤において本発明のＨＡ誘導体が担体として使用されうる可能性を示唆する。また、その沈殿性能（残存量：１％以下）はこれまでＨＡ誘導体で報告されている値（比較サンプル５−２：５０ｋ  ＨＡ−Ｃｈｏｌ−７％／ＦＬ：２２．６％）と比較して優位に高いものであった。【０３３９】
９９ｋ  ＨＡ−ＴｙｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（サンプル５−１）、９９ｋ  ＨＡ−ＴｒｐＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（サンプル５−２）も９９ｋ  ＨＡ−ＴｒｐＮＨ２／Ｃｈｏｌ−６％／ＦＬ（サンプル５−３）同様に塩濃度依存的な沈殿挙動を示し、塩濃度依存的沈殿製剤として有用であることが示された。【０３４０】
（実施例５−６）ラット皮下における沈殿性評価
実施例５−１、実施例５−２、実施例５−３で得られた蛍光標識ＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−ＴｙｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ、９９ｋ  ＨＡ−ＴｒｐＮＨ２／Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ、９９ｋ  ＨＡ−ＰｈｅＮＨ２／Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ）で得られた化合物を１０ｍｇ／ｋｇの用量（スクロース溶液）でラット皮下に単回投与した。投与７日後、投与部位を確認したところ、確かに蛍光標識ＨＡ誘導体が沈殿し、存在していることが確認された。【０３４１】
（実施例５−７）蛍光標識されていないヒアルロン酸誘導体の合成
５−アミノメチルフルオレセインを加えていないこと、ならびに出発原料として用いたＨＡ−Ｎａの分子量が異なること以外は実施例５−１〜実施例５−３に記載の方法により各種ヒアルロン酸誘導体を白色固体として得た。対応する実施例の記載と同じ方法によりコレステリル基の導入率ならびにアミノ酸およびアミノ酸アミドの導入率を算出した（表２０）。【０３４２】
【表２０】
2014038641.tif 000062
【０３４３】
〔実施例６〕薬物封入能評価
（実施例６−１）パクリタキセル（ＰＴＸ）の封入
実施例１−４ならびに実施例１−２１ならびに実施例３−８ならびに実施例５−７で得られたＨＡ誘導体の水溶液（超純水）に対し、パクリタキセル（１０ｍｇ／ｍｌ、メタノール溶液）を加え、最終パクリタキセル濃度を１００μｇ／ｍＬ、ＨＡ誘導体濃度を１．０ｍｇ／ｍＬとした。４℃にて一晩静置後、４７００Ｇにて１０分間遠心し、上澄み１００μＬに対し、５０％アセトニトリル１００μＬ、１００ｍＭ  ＨＰ−β−ＣＤ  ５０μＬを加え、以下の条件にて逆相クロマトグラフィー分析を行った。【０３４４】
逆相クロマトグラフィー分析条件
分析カラム：ＰＬＲＰ−Ｓ  １０００Å（Ａｇｉｌｅｎｔ社）  カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液
グラジエント：Ｂ５％→Ｂ９５％（３．４分）
流速：２ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
注入量：３０μＬ【０３４５】
スタンダードを用いて算出した上清中パクリタキセル濃度を図６−１−１〜図６−１−４に示す。ＨＡ誘導体が存在しない場合のパクリタキセルの溶解度は０．６μｇ／ｍＬであるのに対し、ＨＡ誘導体の存在下において優位にパクリタキセルの溶解度の向上が確認された。これは、パクリタキセルなどの難溶性低分子化合物がＨＡ誘導体に封入されることを示唆している。【０３４６】
（実施例６−２）シクロスポリン（シクロスポリンＡ：ＣｙＡ）の封入
実施例１−４ならびに実施例１−２１ならびに実施例３−８ならびに実施例５−７で得られたＨＡ誘導体の水溶液（超純水）に対し、シクロスポリン（１０ｍｇ／ｍｌ、メタノール溶液）を加え、最終シクロスポリン濃度を３００μｇ／ｍＬ、ＨＡ誘導体濃度を１．０ｍｇ／ｍＬとした。４℃にて一晩静置後、４７００Ｇにて３０分間遠心し、上澄み１００μＬに対し、５０％アセトニトリル１００μＬ、１００ｍＭ  ＨＰ−β−ＣＤ  ５０μＬを加え、実施例６−１に記載の条件にて逆相クロマトグラフィー分析を行った。検出はＵＶ２１０ｎｍを用いた。スタンダードを用いて算出した上清中シクロスポリン濃度を図６−２−１〜図６−２−４に示す。ＨＡ誘導体が存在しない場合のシクロスポリンの溶解度は２８μｇ／ｍＬであるのに対し、ＨＡ誘導体の存在下において優位にシクロスポリンの溶解度の向上が確認された。これは、シクロスポリンなどの難溶性ペプチドがＨＡ誘導体に封入されることを示唆している。【０３４７】
〔実施例７〕 ｉｎ  ｖｉｔｒｏリリース試験
（実施例７−１）パクリタキセルリリース試験
実施例１−２１で得られた１０ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ−４１％の水溶液（超純水）に対し、パクリタキセル（１０ｍｇ／ｍｌ、メタノール溶液）を加え、最終パクリタキセル濃度を１００μｇ／ｍＬ、ＨＡ誘導体濃度を１．０ｍｇ／ｍＬとした。４℃にて一晩静置後、フリーのパクリタキセルを透析膜（３，０００ＭＷＣＯ）にて４℃にて精製した。得られたＨＡ誘導体／パクリタキセル複合体を透析膜（３，０００ＭＷＣＯ）に入れ、ＰＢＳに対して、３７℃にてインキュベートした。経時的に透析膜内のパクリタキセル濃度を逆相クロマトグラフィー分析にて定量し、リリースを確認した。透析膜内のパクリタキセルの残存量を図７−１に示す。この結果はＨＡ誘導体が徐放担体として使用し得ることを示している。【０３４８】
（実施例７−２）シクロスポリンリリース試験
パクリタキセルの代わりにシクロスポリンＡを用いたこと以外は実施例７−１に記載の方法で実施し、シクロスポリンのリリースを確認した。透析膜内のシクロスポリンの残存量を図７−２に示す。この結果はＨＡ誘導体が徐放担体として使用し得ることを示している。【０３４９】
〔実施例８〕 リンカーの異なるＨＡ−ＡＡ−Ｃｈｏｌの合成
コレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメート（Ｃｈｏｌ−Ｃ６）の代わりにコレステリル  ２−アミノエチルカーバメート（Ｃｈｏｌ−Ｃ２）、コレステリル  １２−ドデシルアミノヘキシルカーバメート（Ｃｈｏｌ−Ｃ１２）、コレステリル  ８−アミノ−３，６−ジオキサオクチルカーバメート（Ｃｈｏｌ−ＥＯ２）を用いたこと以外は実施例１−４と同様の方法で行い、リンカーの異なるＨＡ−ＡＡ−Ｃｈｏｌを固体として得た（表２０）。コレステリル  ２−アミノエチルカーバメート、コレステリル  １２−ドデシルアミノヘキシルカーバメート、コレステリル  ８−アミノ−３，６−ジオキサオクチルカーバメートはＷＯ２０１０／０５３１４０に記載の方法にて合成した。実施例１−５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図８−１〜図８−６に示す。実施例１−５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表２１）。【０３５０】
【表２１】
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【０３５１】
〔実施例９〕 ＨＡ−Ａｌａ−コラン酸の合成
（実施例９−１）Ｎ−（２−アミノエチル）５βコラン酸アミド（Ｎ−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）５β−ｃｈｏｌａｎｏａｍｉｄｅ）の合成
５βコラン酸メチルエステル（ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ社、１００μｇ）をエチレンジアミン（６ｍＬ）に溶解し、１３０℃、４時間、還流した。減圧留去後、ジクロロメタンに溶解し、超純水にて洗浄した。減圧下で溶媒を留去し、アミノエチル５βコラン酸アミドを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．６４（３Ｈ、ｓ、ＣＨ３）、０．９１（３Ｈ、ｓ、ＣＨ３）、０．９２（３Ｈ、ｄ、ＣＨ３）２．０−２．３（２Ｈ、ｍ、ＣＯＣＨ２）、２．８（２Ｈ、ｍ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯ）、３．３（２Ｈ、ｍ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯ）、５．９（１Ｈ、ｂｒ、ＮＨＣＯ）。【０３５２】
（実施例９−２）ＨＡ−Ａｌａ−コラン酸の合成
実施例１−４と同様の方法で合成されたＨＡ−Ａｌａ−ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製し、その後、実施例９−１で調製したアミノエチル５βコラン酸アミドをＨＡ−Ａｌａ−ＴＢＡユニットに対して以下の表２２に示す比率で各溶液に添加した。次に、ＤＭＴ−ＭＭをＨＡ−Ａｌａ−ＴＢＡに対して以下の表２２に示す比率で加えた。反応溶液は、メタノール／水  １／１混液、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ−Ａｌａ−ＣＡ）を白色固体として得た。【０３５３】
測定溶媒としてＤＭＳＯ−ｄ６を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの代表例（９９ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コラン酸の導入率が１３％の生成物）を図９に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６〜２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、コラノイル基中のメチル由来のピーク（ＣＨ３、０．６ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコラン酸の導入率を算出した（表２２）。なおグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．６〜２．０ｐｐｍ付近のピークにはコラン酸基由来のピーク（７Ｈ）が重なっているため、１．６〜２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコラン酸基メチル由来のピーク（０．６ｐｐｍ）の積分値を７／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．６〜２．０ｐｐｍ）−積分値（０．６ｐｐｍ）×７／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。【０３５４】
【数８】
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【０３５５】
【表２２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図１−２１】
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【図１−２２】
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【図１−２３】
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【図１−２４】
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【図１−２５】
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【図１−２６】
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【図１−２７】
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【図１−２８】
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【図１−２９】
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【図１−３０】
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【図１−３１】
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【図１−３２】
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【図１−３３】
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【図１−３４】
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【図１−３５】
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【図１−３６】
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【図１−３７】
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【図１−３８】
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【図１−３９】
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【図２−１−１】
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【図２−１−２】
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【図２−１−３】
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【図２−１−４】
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【図２−１−５】
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【図２−１−６】
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【図２−１−７】
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【図２−１−８】
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【図２−１−９】
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【図２−１−１０】
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【図２−１−１１】
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【図２−１−１２】
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【図２−１−１３】
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【図２−１−１４】
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【図２−１−１５】
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【図２−１−１６】
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【図２−１−１７】
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【図２−１−１８】
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【図２−１−１９】
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【図２−１−２０】
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【図２−１−２１】
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【図２−１−２２】
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【図２−１−２３】
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【図２−１−２４】
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【図２−１−２５】
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【図２−１−２６】
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【図２−２−１】
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【図２−２−２】
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【図２−２−３】
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【図２−２−４】
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【図２−２−５】
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【図２−２−６】
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【図２−２−７】
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【図２−２−８】
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【図２−２−９】
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【図２−２−１０】
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【図２−２−１１】
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【図２−２−１２】
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【図２−２−１３】
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【図２−２−１４】
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【図２−２−１５】
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【図２−２−１６】
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【図２−２−１７】
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【図２−２−１８】
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【図２−２−１９】
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【図２−２−２０】
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【図２−２−２１】
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【図２−２−２２】
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【図２−２−２３】
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【図２−２−２４】
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【図２−２−２５】
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【図２−２−２６】
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【図２−２−２７】
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【図２−３−１】
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【図２−３−２】
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【図２−３−３】
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【図２−３−４】
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【図２−３−５】
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【図２−３−６】
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【図２−３−７】
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【図２−３−８】
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【図２−３−９】
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【図２−３−１０】
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【図２−３−１１】
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【図２−３−１２】
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【図２−３−１３】
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【図２−３−１４】
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【図２−３−１５】
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【図２−３−１６】
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【図２−３−１７】
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【図２−３−１８】
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【図２−３−１９】
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【図２−３−２０】
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【図２−３−２１】
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【図２−３−２２】
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【図２−３−２３】
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【図２−３−２４】
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【図２−３−２５】
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【図２−３−２６】
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【図２−３−２７】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図３−１０】
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【図３−１１】
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【図３−１２】
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【図３−１３】
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【図３−１４】
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【図４−１−１】
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【図４−１−２】
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【図４−１−３】
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【図４−１−４】
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【図４−１−５】
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【図４−１−６】
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【図４−１−７】
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【図４−１−８】
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【図４−１−９】
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【図４−１−１０】
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【図４−２−１】
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【図４−２−２】
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【図４−２−３】
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【図４−２−４】
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【図４−２−５】
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【図４−２−６】
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【図４−２−７】
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【図４−２−８】
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【図４−２−９】
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【図４−２−１０】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１−１】
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【図６−１−２】
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【図６−１−３】
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【図６−１−４】
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【図６−２−１】
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【図６−２−２】
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【図６−２−３】
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【図６−２−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
2014038641.tif 000236
【図８−２】
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【図８−３】
2014038641.tif 000238
【図８−４】
2014038641.tif 000239
【図８−５】
2014038641.tif 000240
【図８−６】
2014038641.tif 000241
【図９】
2014038641.tif 000242
【国際調査報告】
2014038641.tif 000243
2014038641.tif 000244
2014038641.tif 000245
2014038641.tif 000246