(57)【要約】【課題】  本発明は，安定性に優れた新規ＣｐＧオリゴヌクレオチドの立体異性体を提供すること，及びインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）産生能を有するＣｐＧオリゴヌクレオチドを目的とする。【解決手段】  本発明は，５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’（式（Ｉ））からなる配列を２〜４個含む１４〜３２ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに関する。式（Ｉ）において，ＣｐＧは，リン酸骨格修飾を有する非メチル化ＣｐＧを示す。Ｘ１Ｘ２は，ＡＡ，ＡＴ，ＧＡ又はＧＴのいずれかである。Ｘ３Ｘ４は，ＴＴ，ＡＴ，ＡＣ又はＣＧである。オリゴヌクレオチドは，ＣｐＧ以外の部位の少なくともひとつＳ型の立体異性体のリン酸骨格修飾を有する。【選択図】図１
2014010718.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’からなる配列を２〜４個含む１４〜３２ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであって，
前記ＣｐＧは，リン酸骨格修飾を有さない非メチル化ＣｐＧであり，
前記Ｘ１Ｘ２は，リン酸骨格修飾を有しても良いＡＡ，ＡＴ，ＧＡ又はＧＴのいずれかであり，
前記Ｘ３Ｘ４は，リン酸骨格修飾を有しても良いＴＴ，ＡＴ，ＡＣ，ＴＡ，ＴＣ又はＣＧであり，
前記オリゴヌクレオチドは，前記５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’以外の部位に少なくともひとつのリン酸骨格修飾を有する，
オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって，
前記Ｘ１Ｘ２は，リン酸骨格修飾を有しても良いＡＴ，ＧＡ又はＧＴのいずれかであり，
前記Ｘ３Ｘ４は，リン酸骨格修飾を有しても良いＴＴ，ＡＴ，ＡＣ，ＴＡ，ＴＣ又はＣＧである，
オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって，
前記Ｘ１Ｘ２は，リン酸骨格修飾を有さないＡＡ，ＡＴ，ＧＡ又はＧＴのいずれかであり，
前記Ｘ３Ｘ４は，リン酸骨格修飾を有さないＴＴ，ＡＴ，ＡＣ，ＴＣ又はＣＧであり，
オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって，
前記５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’以外の部位の少なくともひとつのリン酸骨格修飾を有する部位はＳ型の立体異性体である，
オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって，
以下の配列のいずれかを含む，
オリゴヌクレオチド。
2014010718.tif 000023
2014010718.tif 000024
2014010718.tif 000025
2014010718.tif 000026
上記式中*は，リン酸骨格修飾による立体異性体を示し，上記それぞれの式における少なくとも１つの*は，Ｓ型の立体異性体であり，
上記式中  ５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’に対応する部位のＣＧは，リン酸骨格修飾を有さない非メチル化ＣｐＧを意味する。
【請求項６】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって，
前記Ｘ１Ｘ２がＧＡであり，
前記Ｘ３Ｘ４がＴＴ又はＡＣである，
オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって，
前記５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’以外の部位の少なくともひとつのリン酸骨格修飾は，ホスホロチオエートを含む，
オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって，
前記５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’からなる配列部分をＣｐＧモチーフとしたときに，前記ＣｐＧモチーフより５’末端側又は３’末端側に−（Ｇ）ｍ−（ｍは，２以上１０以下の整数）からなる配列部分を有する，
オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって，
前記５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’からなる配列部分をＣｐＧモチーフとしたときに，前記ＣｐＧモチーフより３’末端側に−（Ｇ）ｍ−（ｍは，１以上６以下の整数）からなる配列部分を有する，
オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって，
前記５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’からなる配列部分をＣｐＧモチーフとしたときに，前記ＣｐＧモチーフより５’末端側にＴＣ，ＴＡ，ＴＧ，ＣＣ又はＣＣからなる配列部分を有する，
オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって，
前記５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’からなる配列部分をＣｐＧモチーフとしたときに，少なくとも第１のＣｐＧモチーフと第２のＣｐＧモチーフとを有し，
第１のＣｐＧモチーフと第２のＣｐＧモチーフとは直接結合しているか，又は
第１のＣｐＧモチーフと第２のＣｐＧモチーフとの間に−（Ｔ）ｎ−（ｎは，１以上３以下の整数），ＴＡ又はＴＣからなる配列部分を有する， 
オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって，
ｔＳｐｃＳｐｇａｃｇｔｔＳｐｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｔｔＳｐｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｇｇ（配列番号１３），
ｔＳｐｃＳｐｇａｃｇｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｇｇ（配列番号１８），及び
ｇＳｐｇＳｐｇａｃｇａｃｇｔｃｇｔｃｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇ（配列番号４４）
のいずれかの配列又はいずれかの配列から１，２又は３個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した配列からなり，
配列中「ｃｇ」は，リン酸骨格修飾を有する非メチル化ＣｐＧを示し，
「Ｓｐ」は，隣接するヌクレオチド間にＳ型のホスホロチオエート骨格修飾が導入されることを示す，
オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって，
ｔＳｐｃＳｐｇａｃｇｔｔＳｐｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｔｔＳｐｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｇｇ（配列番号１３），
ｔＳｐｃＳｐｇａｃｇｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｇｇ（配列番号１８），又は
ｇＳｐｇＳｐｇａｃｇａｃｇｔｃｇｔｃｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇ（配列番号４４）
からなり，
配列中「ｃｇ」は，リン酸骨格修飾を有する非メチル化ＣｐＧを示し，
「Ｓｐ」は，隣接するヌクレオチド間にＳ型のホスホロチオエート骨格修飾が導入されることを示す，オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含む組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含むワクチンアジュバンド。
【請求項１６】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含む樹状細胞からのインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）の産生誘導剤。
【請求項１７】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として有効量含む感染症，癌，呼吸器疾患，アレルギー疾患，自己免疫疾患，又は創傷治癒の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣｐＧオリゴヌクレオチド及びその用途に関する。より詳しく説明すると，本発明は，ＣｐＧオリゴヌクレオチドの立体異性体及びその立体異性体を用いた樹状細胞の活性化によって調節される免疫細胞が関連する疾患の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
特表２００２−５１３７６３号公報（特許文献１），特表２００２−５１４３９７号公報（特許文献２），特表２００２−５２１４８９号公報（特許文献３）には，ＣｐＧオリゴヌクレオチド及びその製造方法が開示されている。【０００３】
特表２０１０−５０４７５０号公報（特許文献４）には，ＣｐＧモチーフの外側に親油性置換ヌクレオチド類似体を有するオリゴヌクレオチドがインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）産生を惹起する点が開示されている。【０００４】
下記非特許文献１には，三量体のＣｐＧオリゴヌクレオチドのＳ型立体異性体がＭＡＰＫシグナルを促進する旨が開示されている。なお，本明細書は，文献を引用することによりその全体を明細書中に取り込むものである。【０００５】
下記非特許文献１には，全ての配列部分にホスホロチオエートが導入され，全ての配列部分がＳ型立体異性体であるＰＦ-３５１２６７６（配列番号１２８）が開示されている。天然のオリゴ核酸は生体内で容易に分解される。一方，オリゴ核酸のリン酸エステル結合（ＰＯ結合）をリン酸チオエステル結合（ＰＳ結合）に替えた，ＰＳ修飾体は，生体内で分解されにくいという特色を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００２−５１３７６３号公報
【特許文献２】特表２００２−５１４３９７号公報
【特許文献３】特表２００２−５２１４８９号公報
【特許文献４】特表２０１０−５０４７５０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｕｔｈｕｒ  Ｍ．  Ｋｒｉｅｇ  ｅｔ  ａｌ．  ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＲＯＴＩＤＥＳ  １３：  ｐｐ．４９１−４９９（２００３）
【非特許文献２】Ｃｌｉｎ ＣａｎｃｅｒＲｅｓ. ２００８ Ｊｕｌ １５;１４(１４):４５３２-４２.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
例えば，非特許文献２に開示されたＣｐＧオリゴヌクレオチドは，全ての配列にホスホロチオエートが導入される。このため非特許文献２に開示されたＣｐＧオリゴヌクレオチドは炎症を惹起する場合や，毒性反応を誘発する場合があるという問題があった。一方，非特許文献２に開示されたＣｐＧオリゴヌクレオチドのホスホロチオエート骨格修飾を除くと，ヌクレオチドの安定性が下がるという問題がある。【０００９】
そこで，本発明は，安定性に優れた新規ＣｐＧオリゴヌクレオチドの立体異性体を提供することを目的とする。【００１０】
本発明は，インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）産生能を有するＣｐＧオリゴヌクレオチドの立体異性体を提供することを目的とする。【００１１】
本発明は，ＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いた樹状細胞の活性化による特定疾患の治療剤を提供することを目的とする。【００１２】
本発明は，細胞毒性の少ないＣｐＧオリゴヌクレオチドの立体異性体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は，基本的には，オリゴ核酸の立体構造を制御することにより，オリゴ核酸の生体内での安定性を高め，これにより全ての配列にＰＳ結合を導入しなくても，生体内で安定なオリゴヌクレオチドを提供できるという知見に基づく。このオリゴヌクレオチドは，全ての配列にはＰＳ結合修飾がなされていないため，生体親和性に優れる。【００１４】
上記の課題のうち少なくともひとつは以下の発明により解決される。すなわち，本発明の第１の側面は，５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’（式（Ｉ））からなる配列を２〜４個含む１４〜３２ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに関する。【００１５】
式（Ｉ）において，ＣｐＧは，リン酸骨格修飾を有さない非メチル化ＣｐＧを示す。
Ｘ１Ｘ２は，リン酸骨格修飾を有しても良いＡＡ，ＡＴ，ＧＡ又はＧＴのいずれかである。リン酸骨格修飾を有しても良いＡＡ，ＡＴ，ＧＡ又はＧＴとは，ＡＡ，ＡＴ，ＧＡ，ＧＴのいずれにおいても１又は２つのリン酸骨格修飾を有しても良いことを意味する。以下同様である。
Ｘ３Ｘ４は，リン酸骨格修飾を有しても良いＴＴ，ＡＴ，ＡＣ，ＴＡ，ＴＣ又はＣＧである。
オリゴヌクレオチドは，５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’以外の部位にリン酸骨格修飾を有しても良い。すなわち，このオリゴヌクレオチドは，５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’からなるＣｐＧモチーフ以外の部分にリン酸骨格修飾を有しても良い。もっとも，オリゴヌクレオチドは，ＣｐＧモチーフ以外の部分以外の部分に少なくとも１ヶ所以上リン酸骨格修飾を有するものが好ましい。【００１６】
このオリゴヌクレオチドは，Ｘ１Ｘ２は，リン酸骨格修飾を有しても良いＡＴ，ＧＡ又はＧＴのいずれかであり，Ｘ３Ｘ４は，リン酸骨格修飾を有しても良いＴＴ，ＡＴ，ＡＣ，ＴＡ,ＴＣ又はＣＧであるものが好ましい。【００１７】
このオリゴヌクレオチドは，Ｘ１Ｘ２が，リン酸骨格修飾を有さないＡＡ，ＡＴ，ＧＡ又はＧＴのいずれかであり，Ｘ３Ｘ４が，リン酸骨格修飾を有さないＴＴ，ＡＴ，ＡＣ，ＴＣ又はＣＧであるものが好ましい。【００１８】
５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’以外の部位の少なくともひとつのリン酸骨格修飾を有する部位はＳ型の立体異性体であるものが好ましい。【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドは，以下の配列のいずれかを含むか，以下のいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【式１】
【００２０】
2014010718.tif 000003
【式２】
【００２１】
2014010718.tif 000004
【式３】
【００２２】
2014010718.tif 000005
【式４】
【００２３】
2014010718.tif 000006
【００２４】
上記式中*は，リン酸骨格修飾による立体異性体を示し，上記それぞれの式における少なくとも１つの*は，Ｓ型の立体異性体である。上記式中  ５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’に対応する部位のＣＧは，リン酸骨格修飾を有さない非メチル化ＣｐＧを意味する。
【００２５】
本発明のオリゴヌクレオチドは，Ｘ１Ｘ２がＧＡであり，Ｘ３Ｘ４がＴＴ又はＡＣであるオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００２６】
本発明のオリゴヌクレオチドは，５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’以外の部位の少なくともひとつのリン酸骨格修飾は，ホスホロチオエートを含むオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００２７】
式（Ｉ）で示される５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’からなる配列部分をＣｐＧモチーフとする。すると，本発明のオリゴヌクレオチドは，ＣｐＧモチーフより５’末端側又は３’末端側に−（Ｇ）ｍ−（ｍは，２以上１０以下の整数）からなる配列部分を有するオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００２８】
本発明のオリゴヌクレオチドは，ＣｐＧモチーフより３’末端側に−（Ｇ）ｍ−（ｍは，１以上６以下の整数）からなる配列部分を有するオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００２９】
本発明のオリゴヌクレオチドは，ＣｐＧモチーフより５’末端側にＴＣ，ＴＡ，ＴＧ，ＣＣ又はＣＣからなる配列部分を有するオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３０】
本発明のオリゴヌクレオチドは，少なくとも第１のＣｐＧモチーフと第２のＣｐＧモチーフとを有し，
第１のＣｐＧモチーフと第２のＣｐＧモチーフとは直接結合しているか，又は
第１のＣｐＧモチーフと第２のＣｐＧモチーフとの間に−（Ｔ）ｎ−（ｎは，１以上３以下の整数），ＴＡ又はＴＣからなる配列部分を有するものが好ましい。
【００３１】
本発明のオリゴヌクレオチドは，
ｔＳｐｃＳｐｇａｃｇｔｔＳｐｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｔｔＳｐｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｇｇ（配列番号１３），
ｔＳｐｃＳｐｇａｃｇｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｇｇ（配列番号１８），及び
ｇＳｐｇＳｐｇａｃｇａｃｇｔｃｇｔｃｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇ（配列番号４４）
のいずれかの配列又はいずれかの配列から１，２又は３個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した配列からなるものが好ましい。これらのオリゴヌクレオチドは，配列番号１３，配列番号１８，又は配列番号４４と同様の安定性又は活性を示すものが好ましい。ここで，配列中「ｃｇ」は，リン酸骨格修飾を有する非メチル化ＣｐＧを示す。
【００３２】
本発明のオリゴヌクレオチドは，
ｔＳｐｃＳｐｇａｃｇｔｔＳｐｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｔｔＳｐｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｇｇ（配列番号１３），
ｔＳｐｃＳｐｇａｃｇｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｇｇ（配列番号１８），又は
ｇＳｐｇＳｐｇａｃｇａｃｇｔｃｇｔｃｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇ（配列番号４４）からなるものが好ましい。ここで，配列中「ｃｇ」は，リン酸骨格修飾を有する非メチル化ＣｐＧを示す。
【００３３】
本発明は，上記したいずれかのオリゴヌクレオチドを含む組成物をも提供する。
【００３４】
本発明は，上記したいずれかのオリゴヌクレオチドを含むワクチンアジュバンドをも提供する。
【００３５】
本発明は，上記したいずれかのオリゴヌクレオチドを含む樹状細胞からのインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）の産生誘導剤をも提供する。
【００３６】
本発明は，上記したいずれかのオリゴヌクレオチドを有効成分として有効量含む感染症，癌，呼吸器疾患，アレルギー疾患，自己免疫疾患，又は創傷治癒の治療剤をも提供する。
【発明の効果】
【００３７】
本発明によれば，安定性に優れた新規ＣｐＧオリゴヌクレオチドを提供できる。【００３８】
本発明によれば，免疫調節能を有するＣｐＧオリゴヌクレオチドを提供できる。【００３９】
本発明によれば，ＣｐＧオリゴヌクレオチドを有功成分とした免疫調節因子を含む治療剤を提供できる。【００４０】
本発明によれば，細胞毒性の少ないＣｐＧオリゴヌクレオチドを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は，配列番号２６〜２８に関し，Ｓ型とＲ型のオリゴヌクレオチドの血清中安定性の評価を行うための図面に替わるゲル電気泳動写真である。
【図２】図２は，配列番号４３〜４５に関し，Ｓ型とＲ型のオリゴヌクレオチドの血清中安定性の評価を行うための図面に替わるゲル電気泳動写真である。
【図３】図３は，配列番号３３〜３５に関し，Ｓ型とＲ型のオリゴヌクレオチドの血清中安定性の評価を行うための図面に替わるゲル電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明の第１の側面は，５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’（式（Ｉ））からなる配列を２〜４個含む１４〜３２ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに関する。
【００４３】
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」は，複数のヌクレオチド（すなわち，ホスフェート基および置換可能な有機塩基（置換ピリミジン（例えば，シトシン（Ｃ），チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））あるいは置換プリン（例えば，アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のいずれかである）に結合した糖（例えば，リボースまたはデオキシリボース）を含む分子）を意味する。本明細書において用いられるように，用語「オリゴヌクレオチド」は，オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）およびオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）の両方を意味する。用語「オリゴヌクレオチド」はまた，オリゴヌクレオシド（すなわち，ホスフェートを含まないオリゴヌクレオチド）および任意の他の有機塩基含有ポリマーを包含する。オリゴヌクレオチドは，既存の核酸源（例えば，ゲノムまたはｃＤＮＡ）から得られ得るが，好ましくは合成である（例えば，オリゴヌクレオチド合成により産生される）。
【００４４】
式（Ｉ）において，ＣｐＧは，リン酸骨格修飾を有さない非メチル化ＣｐＧを示す。Ｃは２’−デオキシシチジンである。Ｇは２’−デオキシグアノシンである。ｐはホスホジエステルからなるヌクレオシド間結合である。
【００４５】
式（Ｉ）において，Ｘ１Ｘ２は，リン酸骨格修飾を有しても良いＡＡ，ＡＴ，ＧＡ又はＧＴのいずれかである。式（Ｉ）において，Ｘ３Ｘ４は，リン酸骨格修飾を有しても良いＴＴ，ＡＴ，ＡＣ，ＴＡ，ＴＣ又はＣＧである。本発明のオリゴヌクレオチドは，ＣｐＧ以外の部位にリン酸骨格修飾を有しても良い。このオリゴヌクレオチドは，５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’からなるＣｐＧモチーフ以外の部分にリン酸骨格修飾を有しても良い。一方，全てのヌクレオチド間のリン酸骨格がホスホロチオエート骨格修飾を有するものは先に説明した問題があるため，たとえば，リン酸骨格のうち２０％以上９５％以下において酸素原子が硫黄原子に置換されるものが好ましく，３０％以上９５％以下でも，２０％以上９０％以下でも，４０％以上９５％以下でも，４０％以上９０％以下でも，４０％以上８０％以下でも，５０％以上９５％以下でも，５０％以上９０％以下でも，５０％以上８０％以下でも，６０％以上９５％以下でもよい。
【００４６】
このオリゴヌクレオチドは，Ｘ１Ｘ２は，リン酸骨格修飾を有しても良いＡＴ，ＧＡ又はＧＴのいずれかであり，Ｘ３Ｘ４は，リン酸骨格修飾を有しても良いＴＴ，ＡＴ，ＡＣ，ＴＡ，ＴＣ又はＣＧであるものが好ましい。
【００４７】
このオリゴヌクレオチドは，Ｘ１Ｘ２が，リン酸骨格修飾を有さないＡＡ，ＡＴ，ＧＡ又はＧＴのいずれかであり，Ｘ３Ｘ４が，リン酸骨格修飾を有さないＴＴ，ＡＴ，ＡＣ，ＴＣ又はＣＧであるものが好ましい。
【００４８】
ＣｐＧモチーフ以外の部分のリン酸骨格修飾を有する部位が，ホスホロチオエートである場合，ＣｐＧモチーフ以外の部分の少なくともひとつリン酸骨格修飾を有する部位がＳ型の立体異性体であるものが好ましい。ＣｐＧモチーフ以外の部分の少なくともひとつリン酸骨格修飾が硫黄原子以外の原子又は基により置換される場合も，酸素原子が置換された部分が硫黄原子としたときにＳ型の立体配座となるものが好ましい。
【００４９】
本発明のオリゴヌクレオチドは，以下の，配列のいずれかを含むか，以下のいずれかの配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【式５】
【００５０】
2014010718.tif 000007
【式６】
【００５１】
2014010718.tif 000008
【式７】
【００５２】
2014010718.tif 000009
【式８】
【００５３】
2014010718.tif 000010
【００５４】
上記式中*は，リン酸骨格修飾による立体異性体を示す。上記式中  ５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’に対応する部位のＣＧは，リン酸骨格修飾を有さない非メチル化ＣｐＧを意味する。リン酸骨格修飾の例は，ホストチオエート骨格修飾，ホスホロジチオエート骨格修飾，又はホスホロアミデート骨格修飾である。これらの中では，ホストチオエート骨格修飾が好ましい。ホストチオエート骨格修飾は，隣接するヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合を構成するリン原子に結合している２個の非架橋酸素原子のうちの１個を硫黄原子に変換することを意味する。上記それぞれの式における少なくとも１つの*は，Ｓ型の立体異性体である。ここでＳ型とは，上記したとおり，酸素原子の替わりに導入された原子又は基を硫黄原子とした場合に，Ｓ型の立体配座を有するものを意味する。
【００５５】
本発明のオリゴヌクレオチドは，式（Ｉ）又は上記した配列からなるオリゴヌクレオチドのうち，Ｘ１Ｘ２がＧＡであり，Ｘ３Ｘ４がＴＴ又はＡＣであるオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００５６】
本発明のオリゴヌクレオチドは，上記したいずれかのものであって，ＣｐＧモチーフ以外の部分の少なくともひとつの部位に存在するリン酸骨格修飾は，ホスホロチオエートを含むオリゴヌクレオチドが好ましい。すなわち，先に説明したとおり，ＣｐＧ以外の部位においても，ホスホロチオエート骨格修飾を有するものが好ましい。この場合，先に説明したとおりＳ型の立体配座を有するものが好ましい。もっとも，本発明では，全ての配列間は，ホスホロチオエート骨格修飾されていないことが好ましい。
【００５７】
式（Ｉ）で示される５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’からなる配列部分をＣｐＧモチーフとする。すると，本発明のオリゴヌクレオチドは，ＣｐＧモチーフより５’末端側又は３’末端側に−（Ｇ）ｍ−（ｍは，２以上１０以下の整数）からなる配列部分を有するオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００５８】
本発明のオリゴヌクレオチドは，ＣｐＧモチーフより５’末端側にＴＣ，ＴＡ，ＴＧ，ＣＣ又はＣＣからなる配列部分を有するオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００５９】
本発明のオリゴヌクレオチドは，少なくとも第１のＣｐＧモチーフと第２のＣｐＧモチーフとを有し，
第１のＣｐＧモチーフと第２のＣｐＧモチーフとは直接結合しているか，又は
第１のＣｐＧモチーフと第２のＣｐＧモチーフとの間に−（Ｔ）ｎ−（ｎは，１以上３以下の整数），ＴＡ又はＴＣからなる配列部分を有するものが好ましい。
【００６０】
本発明のオリゴヌクレオチドは，
ｔＳｐｃＳｐｇａｃｇｔｔＳｐｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｔｔＳｐｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｇｇ（これを配列番号１３とよぶ），
ｔＳｐｃＳｐｇａｃｇｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｇｇ（これを配列番号１８とよぶ），及び
ｇＳｐｇＳｐｇａｃｇａｃｇｔｃｇｔｃｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇ（これを配列番号４４とよぶ）
のいずれかの配列又はいずれかの配列から１，２又は３個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した配列からなるものが好ましい。これらのオリゴヌクレオチドは，配列番号１３，配列番号１８，又は配列番号４４と同様の安定性又は活性を示すものが好ましい。ここで，配列中「ｃｇ」は，リン酸骨格修飾を有する非メチル化ＣｐＧを示す。「Ｓｐ」は，隣接するヌクレオチド間にＳ型のホスホロチオエート骨格修飾が導入されることを示す。
【００６１】
本発明のオリゴヌクレオチドは，
ｔＳｐｃＳｐｇａｃｇｔｔＳｐｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｔｔＳｐｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｇｇ（これを配列番号１３とよぶ），
ｔＳｐｃＳｐｇａｃｇｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｇｇ（これを配列番号１８とよぶ），又は
ｇＳｐｇＳｐｇａｃｇａｃｇｔｃｇｔｃｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇ（配列番号４４）からなるものが好ましい。ここで，配列中「ｃｇ」は，リン酸骨格修飾を有する非メチル化ＣｐＧを示す。「Ｓｐ」は，隣接するヌクレオチド間にＳ型のホスホロチオエート骨格修飾が導入されることを示す。
【００６２】
ヌクレオチドの合成方法
ヌクレオチドの合成方法は公知である。よって，本発明のヌクレオチドは公知の方法に従って製造できる。本発明のヌクレオチドは，例えば特許４５８０８７０号，又は国際公開２０１０／０６４１４６号パンフレットに開示された方法を採用できる。
【００６３】
ヌクレオチドの合成の上記とは別の例は，特許４９４２６４６号公報に開示される方法や，米国特許第５９１２３３２号明細書に開示されている方法である。後者は，固体支持体付着リンカーをパラレル合成に使用するか，又は制御細孔ガラス（controlled pore glass）支持体に付着させたリン酸塩などの，汎用的な固体支持体を使用する。
【００６４】
また，ヌクレオチドは，例えば，特許４３８３５３４号公報に開示された方法により製造できる。例えば，β−シアノエチルホスホロアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ
ＳＬおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２２：１８５９）；およびヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇら（１９８６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ ２７：４０５１−４；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら（１９８６）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １４：５３９９−４０７；Ｇａｒｅｇｇら（１９８６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ ２７：４０５５−８；Ｇａｆｆｎｅｙら（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２９：２６１９−２２）を使用して，新規に合成され得る。これらの化学物質は，市場において入手可能な種々の自動核酸合成機によって実施され得る。これらの核酸は，合成核酸と呼ばれる。あるいは，本発明の核酸を，プラスミド中にて大規模に生成することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
Ｔら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）。本発明の核酸は，そしてより小さい片へと分離され得るか，または全体として投与され得る。核酸は，公知技術（例えば，制限酵素，エキソヌクレアーゼ，またはエンドヌクレアーゼを使用する技術）を使用して，既存の核酸配列（例えば，ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列）から調製され得る。このようにして調製された核酸は，単離された核酸と呼ばれる。単離された核酸とは，一般的には，天然で通常関連している成分から分離された核酸を指す。例として，単離された核酸は，細胞から分離された核酸，核から分離された核酸，ミトコンドリアから分離された核酸，またはクロマチンから分離された核酸であり得る。本発明の組み合わせモチーフ核酸は，合成した組み合わせモチーフ核酸および単離された組み合わせモチーフ核酸の両方を包含する。
【００６５】
インビボでの用途の為に，この組み合わせモチーフオリゴヌクレオチドは，必要に応じて，分解に対して比較的耐性を有する（例えば，安定化されている）ものが好ましい。「安定化された核酸分子」とは，インビボでの分解（例えば，エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ）に対して比較的耐性である，核酸分子を意味する。核酸安定化は，リン酸骨格改変を介して達成され得る。本発明の好ましい安定化された核酸は，改変された骨格を有する。この核酸骨格の改変は，インビボで投与された場合のこの組み合わせモチーフオリゴヌクレオチドの活性の増加を提供する。いくつかの場合，ホスホロチオエート結合を有する組み合わせモチーフオリゴヌクレオチドは，最大の活性を提供し，そして細胞内エキソヌクレアーゼおよび細胞内エンドヌクレアーゼによる分解からその核酸を保護する。他の改変された核酸としては，改変されたホスホジエステル核酸，ホスホジエステル核酸とホスホロチオエート核酸の組み合わせ（すなわち，キメラ），メチルホスホネート，メチルホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，ｐ−エトキシ，およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００６６】
改変された骨格（例えば，ホスホロチオエート）は，ホスホロアミデート化学またはＨ−ホスホネート化学のいずれかを使用する自動技術を使用して，合成され得る。アリール−ホスホネートおよびアルキル−ホスホネートは，例えば，米国特許第米国特許４，４６９，８６３号に記載されるようにして，生成され得る；そしてアルキルホスホトリエステル（米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載されるように，荷電した酸素部分が，アルキル化されている）は，市販の試薬を使用して，自動固相合成によって調製され得る。他のＤＮＡ骨格の改変および置換を行うための方法は，記載されている（例えば，Ｕｈｌｍａｎｎ
Ｅ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ Ａ（１９９０）Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ ９０：５４４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ Ｊ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ １：１６５を参照）。
【００６７】
合成により得られたオリゴヌクレオチドは，公知の方法により精製すればよい。例えば，逆相ＨＰＬＣにより精製し，脱保護し，脱塩し，透析する。このようにして，本発明のオリゴヌクレオチドを単離精製できる。
【００６８】
本発明は，上記したいずれかのオリゴヌクレオチドを含む組成物をも提供する。この組成物は，医薬用組成物である。そして，この組成物は，上記したいずれかのオリゴヌクレオチドを有効量含むとともに，公知の担体を適宜含んでも良い。担体は，水，アルコールといった溶媒であってもよい。また，担体は，任意の賦形剤，希釈剤，充てん剤，塩，緩衝剤，安定剤，可溶化剤，脂質，または医薬組成物への使用のために当該技術分野でよく知られているその他の物質であってもよい。
【００６９】
本発明は，上記したいずれかのオリゴヌクレオチドを含むワクチンアジュバンドをも提供する。ワクチンアジュバンドは，必要に応じて，薬学的に許容される担体を含んでも良い。特許第４１２６２５２号は，オリゴヌクレオチドを含むワクチンアジュバンドを開示する。本発明のオリゴヌクレオチドを含むワクチンアジュバンドも，この公報に開示された要素を適宜含むことができる。
【００７０】
本発明は，上記したいずれかのオリゴヌクレオチドを含む樹状細胞からのインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）の産生誘導剤をも提供する。本発明は，上記したいずれかのオリゴヌクレオチドを有効成分として有効量含む感染症，癌，呼吸器疾患，アレルギー疾患，自己免疫疾患，又は創傷治癒の治療剤をも提供する。
【００７１】
本発明の感染症の治療剤における感染症の例は，真菌感染症，持続性真菌感染症，細菌感染症，カンジダ症，慢性皮膚粘膜カンジダ症（ＣＭＣ），アスペルギルス症，クリプトコックス症，ウイルス感染症，持続性ウイルス感染症，ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染，Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染，Ｃ型肝炎ウイルス感染，持続性細菌感染症，マイコバクテリア感染症，Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染，Ｍ．ｂｏｖｉｓ感染，およびＭ．ｌｅｐｒａｅ感染である。たとえば，特許４６８８８１５号公報には，インターフェロンアルファがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を含む感染症の治療に有効であることが示されている。例えば，特許４６０７４５２号公報には，インターフェロンアルファが感染症（例えば，ミコバクテリア症，マラリア，リーシュマニア症，トキソプラズマ症，住血吸虫症または肝吸虫症）の治療に有効であることが示されている。本発明の感染症の治療剤も，インターフェロンアルファを産生することにより，感染症の治療に有効である。
【００７２】
本発明の癌の治療剤における癌は，公知の癌及び腫瘍を含む。例えば，特許４６０７４５２号公報及び特表２０１１−５０３０３９号公報には，インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）が癌又は腫瘍の治療に有効であることが開示されている。このため，本発明の癌の治療剤も，インターフェロンアルファを産生することにより，癌又は腫瘍の治療に有効である。
【００７３】
本発明の呼吸器疾患の治療剤における呼吸器疾患の例は，感冒，喘息，アレルギー性鼻炎，気管支炎，肺炎，急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ），アレルギー性気管支肺アスペルギルス症である。例えば，特表２００４―５０５０４６号公報には，インターフェロンアルファがこれら呼吸器疾患の治療に有効であることが示されている。このため，本発明の呼吸器疾患の治療剤も，インターフェロンアルファを産生することにより，呼吸器疾患の治療に有効である。
【００７４】
本発明のアレルギー疾患の治療剤におけるアレルギー疾患は，全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ），アナフィラキシーあるいはアナフィラキシー様反応，アレルギー性血管炎，肝炎，腎炎，腎症，膵炎，鼻炎，関節炎，炎症性眼疾患（例えば，結膜炎等），炎症性腸疾患（例えば，潰瘍性大腸炎，クローン病，好酸球性胃腸症等），脳・循環器系疾患（例えば，動脈硬化症，血栓症，虚血／再還流障害，再狭窄，梗塞等），皮膚疾患（例えば，皮膚炎（例えば，アトピー性皮膚炎，乾癬，接触皮膚炎，湿疹，蕁麻疹，掻痒症等）等），自己免疫性疾患（例えば，多発性硬化症，慢性関節リウマチ，全身性エリテマトーデス，Ｉ型糖尿病，糸球体腎炎，シェーグレン症候群等），移植臓器拒絶反応である。例えば，特表２００４―５０５０４６号公報には，インターフェロンアルファがアレルギー性鼻炎の治療に有効であることが開示されている。このため，本発明のアレルギー疾患の治療剤も，インターフェロンアルファを産生することにより，アレルギー疾患の治療に有効である。
【００７５】
本発明の自己免疫疾患の治療剤における自己免疫疾患の例は，急性特発性血小板減少性紫斑病，慢性特発性血小板減少性紫斑病，シデナム舞踏病，重症筋無力症，全身性エリテマトーデス，ループス腎炎，リウマチ熱，多腺性症候群，水疱性類天疱瘡，糖尿病，ヘノッホ−シェーンライン紫斑病，ポストストレプトコッカス腎炎(post-streptococcalnephritis)，結節性紅斑，高安動脈炎，アジソン病，関節リウマチ，多発性硬化症，サルコイドーシス，潰瘍性大腸炎，多形紅斑，ＩｇＡネフロパシー，結節性多発動脈炎，強直性脊椎炎，グッドパスチャー症候群，閉塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans)，シェーグレン症候群，原発性胆汁性肝硬変症，橋本甲状腺炎，甲状腺中毒症，強皮症，慢性活動性肝炎，多発性筋炎／皮膚筋炎，多発性軟骨炎，尋常性天疱瘡(parnphigus vulgaris)，ヴェーゲナー肉芽腫症，膜性腎症，筋萎縮性側索硬化症，脊髄ロウ，巨細胞性動脈炎／多発筋痛，悪性貧血，急速進行性糸球体腎炎，乾癬，および繊維化性肺胞炎である。例えば，特表２００７−５２８２０９号公報には，インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）がこれらの自己免疫疾患の治療に有効であることが示されている。このため，本発明の自己免疫疾患の治療剤も，インターフェロンアルファを産生することにより，自己免疫疾患の治療に有効である。
【００７６】
本発明の創傷の治療剤における創傷は，皮膚障害，手術による創傷，肥厚性瘢痕，ケロイドを含む。例えば，特表２００３−５０３３１３号公報には，インターフェロンアルファが皮膚異常の治療に有効であることが開示されている。このため，本発明の創傷の治療剤も，インターフェロンアルファを産生することにより，創傷の治療に有効である。
【００７７】
インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）の産生誘導剤及びこれらの剤は，例えば，特許４３８３５３４号公報に開示された方法を用いることで製造できる。
【００７８】
本発明のオリゴヌクレオチドは，１型ＩＦＮ（すなわち，ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β）を誘導するために使用され得る。この方法は，１型ＩＦＮを発現可能な細胞を，その細胞による１型ＩＦＮの発現を誘導するために有効な量の本発明の組み合わせモチーフオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む。ヒトにおける主要なＩＦＮ−αプロデューサー細胞型は，プラスマ細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）であることが最近認識された。この細胞型は，ＰＢＭＣ中に非常に低頻度（０．２〜０．４％）で存在し，そしてこの細胞型は，直系ネガティブ（すなわち，ＣＤ３についても，ＣＤ１４についても，ＣＤ１９についても，ＣＤ５６についても染色しない）およびＣＤ１１ｃネガティブであり，ＣＤ４，ＣＤ１２３（ＩＬ−３Ｒα）およびクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣクラスＩＩ）についてポジティブである表現型によって特徴付けられる。１型ＩＦＮを測定する方法は，当業者に周知であり，そしてそのような方法としては，例えば，酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ），バイオアッセイ，および蛍光細胞分析（ＦＡＣＳ）が挙げられる。この種のアッセイは，容易に入手可能な市販の試薬およびキットを使用して，実施され得る。
【００７９】
このオリゴヌクレオチドはまた，全身免疫応答および／または粘膜性免疫応答を誘導するためのアジュバントとして有用である。本発明の組み合わせモチーフオリゴヌクレオチドは，抗原に対する免疫応答の増強を誘導するように，抗原に曝露された被験体に送達され得る。従って，例えば，組み合わせモチーフオリゴヌクレオチドは，ワクチンアジュバントとして有用である。アジュバンドが補助剤として機能する主剤の例は，各種のワクチンである。アジュバンドは，たとえば抗原が免疫細胞に取り込まれる効率を高めることができる。アジュバンドは，主剤の有効成分がもつ本来の作用を補助したり増強したり改良できるものが好ましい。対象となるワクチンの例はウィルス用ワクチン，Ｂ型肝炎，Ａ型肝炎，日本脳炎，小児用肺炎球菌，ジフテリア，百日せき，破傷風，はしか，風疹，おはふくかぜ，水疱瘡，結核(ＢＣＧワクチン）用のワクチンである。ウィルス用ワクチンの例は，インフルエンザワクチン，ポリオワクチン，ヒトパピローマウイルス用ワクチン，ロタウイルス用ワクチン，ヒプ用ワクチン，ポリオワクチン及びエイズワクチンである。本発明のオリゴヌクレオチドは極めて少量でアジュバンドとして機能する。このため本発明のオリゴヌクレオチドは，従来のアジュバンドに比べて細胞毒性が低く，副作用の怖れが極めて少ない。このことは多くの対象に投与されるワクチンにとっては極めて有益であるといえる。
【００８０】
このオリゴヌクレオチドは，非核酸アジュバントと組み合わせて投与され得る。非核酸アジュバントとは，体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を刺激し得る，本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチド以外の任意の分子または化合物である。非核酸アジュバントの例は，デポー（ｄｅｐｏｔ）効果を生じるアジュバント，免疫刺激アジュバント，およびデポー効果を生じかつ免疫系を刺激するアジュバントである。非核酸粘膜アジュバントは，本明細書中で使用される場合，抗原とともに粘膜表面に投与された場合に被験体において粘膜性免疫応答を誘導可能である，オリゴヌクレオチド以外のアジュバントである。
【００８１】
本発明のオリゴヌクレオチドは，薬学的に受容可能なキャリア中の薬学的組成物として処方され得る。このオリゴヌクレオチドは，被験体に直接投与され得るか，または核酸送達複合体と組み合わせて投与され得る。核酸送達複合体とは，標的化手段（例えば，標的細胞（例えば，Ｂ細胞表面）へのより高親和性の結合および／または標的細胞による細胞取り込みの増加を生じる分子）と会合（例えば，イオン性結合もしくは共有結合，またはその手段にカプセル化）された，核酸分子を意味する。核酸送達複合体の例は，ステロール（例えば，コレステロール）と会合した核酸，脂質（例えば，カチオン性脂質，ビロゾーム，またはリポソーム）と会合した核酸，または標的細胞特異的結合因子（例えば，標的細胞特異的レセプターにより認識されるリガンド）と会合した核酸である。好ましい複合体は，その標的細胞によるインターナリゼーションの前の有意な脱カップリングを防ぐために十分にインビボで安定であり得る。しかし，その複合体は，その核酸が機能的形態で放出されるように，その細胞中で適切な条件下で切断可能である。
【００８２】
このオリゴヌクレオチドおよび／または抗原および／または他の治療剤は，単独で（例えば，生理食塩水もしくは緩衝液中）で投与され得るか，または当該分野で公知の任意の送達ビヒクルを使用して投与され得る。
【００８３】
粘膜送達もしくは局所送達のための本明細書中に記載される化合物の被験体用量は，代表的には，約０．１μｇ／投与〜１０ｍｇ／投与の範囲であり，これは，その適用が毎日，毎週，または毎月投与，およびその間の他の任意の時間にされ得るかに依存する。より代表的には，粘膜用量または局所用量は，約１０μｇ／投与〜５ｍｇ／投与の範囲であり，最も代表的には，約１００μｇ／投与〜１ｍｇ／投与であり，２回の投与〜４回の投与が，数日間または数週間の間隔を空けられる。より代表的には，免疫刺激用量は，約１μｇ／投与〜１０ｍｇ／投与の範囲であり，最も代表的には，約１０μｇ／投与〜１ｍｇ／投与の範囲であり，毎日または毎週投与される。抗原特異的免疫応答を誘導するために非経口送達のための本明細書中に記載の化合物の被験体用量（この化合物は，抗原とともに送達されるが，別の治療剤とは送達されない）は，代表的には，ワクチンアジュバントまたは免疫刺激適用のための有効粘膜用量の５倍〜１０，０００倍多く，より代表的には１０倍〜１，０００倍多く，最も代表的には２０倍〜１００倍多い。このオリゴヌクレオチドが他の治療剤と組み合わせで，もしくは特殊な送達ビヒクル中で投与される場合に，先天免疫応答を誘導するためまたはＡＤＣＣを増加するためまたは抗原特異的免疫応答を誘導するための，非経口送達のための本明細書中に記載される化合物の用量は，代表的には，約０．１μｇ／投与〜１０ｍｇ／投与の範囲であり，これは，その適用が毎日，毎週，または毎月投与，およびその間の他の任意の時間にされ得るかに依存する。より代表的には，これらの目的のための非経口用量は，約１０μｇ／投与〜５ｍｇ／投与の範囲であり，最も代表的には，約１００μｇ／投与〜１ｍｇ／投与であり，２回の投与〜４回の投与が，数日間または数週間の間隔を空けられる。しかし，いくつかの実施形態において，これらの目的のための非経口用量は，上記の代表的用量よりも５倍〜１０，０００倍多い範囲で使用され得る。
【００８４】
本明細書中で使用される場合，「有効（な）量」とは，所望される生物学的効果を実現するために必要であるかまたは十分である量を指す。例えば，感染症を処置するために有効な量の免疫核酸は，その感染症を処置するのに必要な量である。本明細書中に提供される教示と組み合わせると，種々の活性化合物および重み付け因子（例えば，効力，相対的バイオアベイラビリティー，患者の体重，有害な副作用の重篤度，および好ましい投与様式）を選択することによって，実質的な毒性を引き起こさないが特定の被験体を処置するに完全に有効である，有効な予防処置レジメンもしくは有効な治療処置レジメンが計画され得る。任意の特定の適用のための有効量は，処置される疾患もしくは状態，投与される特定のオリゴヌクレオチド，抗原，被験体の大きさ，またはその疾患もしくは状態の重篤度のような要因に依存して，変化し得る。当業者は，特定のオリゴヌクレオチドおよび／または抗原および／または他の治療剤の有効量を，過度の実験を必要とすることなく経験的に決定し得る。
【００８５】
本明細書中に記載される任意の化合物について，その治療上有効な量は，動物モデルからまず決定され得る。治療上有効な用量はまた，ヒトにおいて試験された（ヒト臨床試験が開始された）ＣｐＧオリゴヌクレオチドについてのヒトデータから，および同様の薬理学的活性を示すことが公知である化合物（例えば，他の粘膜アジュバント（例えば，ＬＴおよびワクチン接種用の他の抗原））について粘膜投与もしくは局所投与についてのデータから，決定され得る。より高用量が，非経口投与のために必要である。適用される用量は，投与される化合物の相対的バイオアベイラビリティーおよび効力に基づいて，調整され得る。その用量を，上記の方法および他の方法に基づいて最大効力を達成するように調整することは，当該分野で周知であり，当業者の能力の範囲内に十分に存在する。
【００８６】
本発明の処方物は，薬学的に受容可能な溶液中で投与され，この溶液は，慣用的には，薬学的に受容可能な濃度の塩，緩衝化剤，保存剤，適合性キャリア，アジュバント，および必要に応じて他の治療成分を含み得る。
【００８７】
治療における使用のために，有効量のこのオリゴヌクレオチドが，所望される表面（例えば，粘膜表面，全身表面）にその核酸を送達する任意の様式によって，被験体に投与され得る。本発明の薬学的組成物を投与することは，当業者に公知の任意の手段によって達成され得る。好ましい投与経路としては，経口経路，非経口経路，筋肉内経路，鼻内経路，気管内経路，吸入経路，眼内経路，舌下経路，膣内経路，および直腸経路が挙げられるが，これらに限定されない。
【００８８】
経口投与のために，この化合物（すなわち，オリゴヌクレオチド，抗原，および他の治療剤）は，その活性化合物を，当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせることによって，容易に処方され得る。そのようなキャリアは，本発明の化合物が，標的とされる被験体による経口摂取のための錠剤，ピル，糖剤，カプセル剤，液剤，ゲル剤，シロップ剤，スラリー剤，懸濁剤などとして処方されることを可能にする。経口用途のための薬学的調製物は，必要に応じて，望まれる場合は適切な助剤を添加した後に，生じた混合物を粉砕し，その顆粒混合物を処理して錠剤コアまたは糖剤コアを得ることによって，固体賦形剤として入手され得る。適切な賦形剤は，特に，充填剤（例えば，糖（ラクトース，スクロース，マンニトール，もしくはソルビトールが挙げられる）；セルロース調製物（例えば，トウモロコシスターチ，コムギスターチ，イネスターチ，ジャガイモスターチ，ゼラチン，トラガカントゴム，メチルセルロース，ヒドロキシプロピルメチル−セルロース，カルボキシメチルセルロースナトリウム），および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ））である。望まれる場合，崩壊剤（例えば，架橋ポリビニルピロリドン，寒天，またはアルギン酸もしくはその塩（例えば，アルギン酸ナトリウム））が，添加され得る。必要に応じて，その経口処方物はまた，内部酸性状態を中和するための生理食塩水もしくは緩衝液中で処方され得るか，またはいかなるキャリアも含まずに投与され得る。
【００８９】
糖剤コアは，適切なコーティングを備える。この目的のために，濃縮糖溶液が，使用され得，これは，必要に応じて，アラビアゴム，タルク，ポリビニルピロリドン，カルボポールゲル，ポリエチレングリコール，および／または二酸化チタン，ラッカー溶液，および適切な有機溶媒もしくは溶媒混合物を含み得る。染料または色素が，異なる活性化合物用量の組み合わせを同定または特徴付けるために，錠剤または糖剤コーティングに添加され得る。
【００９０】
経口的に使用され得る薬学的調製物の例は，ゼラチンから作製された押込みばめカプセル，およびゼラチンと可塑剤（例えば，グリセロールまたはソルビトール）から作製された軟らかい密封カプセルである。この押込みばめカプセルは，充填剤（例えば，ラクトース），結合剤（例えば，スターチ），および／または滑沢剤（例えば，タルクまたはステアリン酸マグネシウム），および必要に応じて安定化剤と混合して，活性成分を含み得る。この軟らかいカプセルにおいて，活性化合物は，適切な液体（例えば，脂肪油，流動パラフィン，または液体ポリエチレングリコール）中に溶解または懸濁され得る。さらに，安定化剤が添加され得る。経口投与のために処方されたミクロスフェアもまた，使用され得る。このようなミクロスフェアは，当該分野で十分に規定されている。経口投与のためのすべての処方物は，このような投与に適切な投与量である。
【００９１】
経頬投与のために，この組成物は，従来の様式で処方された，錠剤またはロゼンジの形態を採り得る。
【００９２】
吸入による投与のために，本発明に従う使用のための化合物は，加圧パックまたは噴霧器からエアロゾル噴霧提示の形態で，適切な推進剤（例えば，ジクロロジフルオロメタン，トリクロロフルオロメタン，ジクロロテトラフルオロエタン，二酸化炭素または他の適切な気体）を使用して，従来のように送達され得る。加圧エアロゾルの場合，その投与単位は，計量した量を送達するための弁を提供することによって，決定され得る。吸入器または注入器において使用するための例えば，ゼラチンのカプセルおよびカートリッジが，その化合物と適切な粉末基剤（例えば，ラクトースまたはスターチ）との粉末混合物を含んで，処方され得る。
【００９３】
この化合物は，全身送達することが望ましい場合に，注入（例えば，ボーラス注入または連続注入）による非経口投与のために処方され得る。注入のための処方物は，単位投与形態で（例えば，アンプル中かまたは多用量容器にて），添加された保存剤とともに提示され得る。その組成物は，油状ビヒクルもしくは水性ビヒクル中の懸濁物，溶液，またはエマルジョンのような形態を採り得，そして処方剤（例えば，懸濁剤，安定化剤，および／もしくは分散剤）を含み得る。
【００９４】
非経口投与のための薬学的処方物としては，水溶性形態のその活性化合物の水性溶液が挙げられる。さらに，その活性化合物の懸濁物が，適切な油状注入懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒または親油性ビヒクルとしては，脂肪油（例えば，ゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えば，オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド），またはリポソームが挙げられる。水性注入懸濁物は，その懸濁物の粘度を増加する物質（例えば，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ソルビトール，またはデキストラン）を含み得る。必要に応じて，その懸濁物はまた，非常に濃縮された溶液の調製を可能にするために，適切な安定化剤またはその化合物の溶解度を増加する薬剤を含み得る。
【００９５】
あるいは，その活性化合物は，適切なビヒクル（例えば，発熱物質を含まない滅菌した水）を用いて使用前に構成するための，散剤形態であり得る。
【００９６】
この化合物はまた，直腸組成物または膣内組成物（例えば，（例えば，従来の坐剤基剤（例えば，ココアバターまたは他のグリセリド）を含む）坐剤または貯留浣腸）の状態で処方され得る。
【００９７】
上記の処方物に加えて，この化合物はまた，デポー（ｄｅｐｏｔ）調製物として処方され得る。そのような長期作用処方物は，適切なポリマー物質もしくは疎水性物質を用いて（例えば，受容可能な油中のエマルジョンとして）か，またはイオン交換樹脂を用いてか，または溶解性が乏しい誘導体（例えば，溶解性が乏しい塩）として，処方され得る。
【００９８】
この薬学的組成物はまた，適切な固相もしくはゲル相の，キャリアもしくは賦形剤を含み得る。そのようなキャリアまたは賦形剤の例としては，炭酸カルシウム，リン酸カルシウム，種々の糖，スターチ，セルロース誘導体，ゼラチン，およびポリマー（例えば，ポリエチレングリコール）が挙げられるが，これらに限定されない。
【００９９】
適切な液体薬学的調製物形態または固体薬学的調製物形態は，例えば，マイクロカプセル化されるか，キレート化されるか，微視的金粒子上にコーティングされるか，リポソーム中に含まれるか，噴霧されるエアロゾル中に含まれるか，皮膚への移植用のペレット中に含まれるか，または皮膚中を引っ掻く鋭い物体上に乾燥された，吸入用の水性溶液もしくは生理食塩水溶液である。この薬学的組成物はまた，活性化合物を長期放出する，顆粒，散剤，錠剤，コーティングした錠剤，（マイクロ）カプセル剤，坐剤，シロップ剤，エマルジョン，懸濁剤，クリーム，ドロップ，または調製物を含み，その調製物において，賦形剤および添加剤および／もしくは補助剤（例えば，崩壊剤，結合剤，コーティング剤，甘味剤，滑沢剤，矯味矯臭剤，甘味料，または可溶化剤）が，上記のように慣用的に使用される。この薬学的組成物は，種々の薬物送達系における使用のために適切である。薬物送達のための方法の簡単な概説について，Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４９：１５２７−３３（これは，本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０１００】
このオリゴヌクレオチドおよび必要に応じて他の治療剤および／または抗原は，それ自体が（そのまま）投与され得るか，または薬学的に受容可能な塩の形態で投与され得る。薬物中で使用される場合，その塩は，薬学的に受容可能であるべきであるが，薬学的に受容可能ではない塩が，その薬学的に受容可能な塩を調製するために簡便に使用され得る。そのような塩としては，以下の酸から調製された塩が挙げられるが，それらに限定されない：塩酸，臭化水素酸，硫酸，硝酸，リン酸，マレイン酸，酢酸，サリチル酸，ｐ−トルエンスルホン酸，酒石酸，クエン酸，メタンスルホン酸，ギ酸，マロン酸，コハク酸，ナフタレン−２−スルホン酸，およびベンゼンスルホン酸。また，そのような塩は，アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩（例えば，カルボン酸基のナトリウム塩，カリウム塩，もしくはカルシウム塩）として調製され得る。
【０１０１】
適切な緩衝化剤としては，酢酸および塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；およびリン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）が挙げられる。適切な保存剤としては，塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン類（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ），およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が挙げられる。
【０１０２】
本発明の薬学的組成物は，有効量のオリゴヌクレオチド，そして必要に応じて抗原および／または他の薬剤を，必要に応じて薬学的に受容可能なキャリア中に含んでもよい。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは，ヒトまたは他の脊椎動物への投与に適切な，１つ以上の適合性の，固体もしくは液体の，充填剤，希釈剤，もしくはカプセル化剤を意味する。用語「キャリア」とは，活性成分がその適用を容易にするために合わせられる，天然もしくは合成の，有機成分もしくは無機成分を示す。その薬学的組成物の成分はまた，相互作用が存在しない様式で，本発明の化合物と，および互いと，混合可能である。
【０１０３】
本発明の薬学的組成物は，被験体の処置のために，その化合物の活性，投与様式，その免疫の目的（すなわち，予防免疫または治療免疫），その障害の性質および重篤度，患者の年齢および体重に依存して，異なる用量が必要であり得る。所定の用量の投与は，個々の投与単位での単回投与によってか，またはより少量のいくつかの投与単位で，実行され得る。
【０１０４】
他の送達系としては，時間放出（ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅ）系，遅延放出（ｄｅｌａｙｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）系，または徐放（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）系が挙げられ得る。そのような系は，その化合物の反復投与を回避し得，被験体および医師に対する簡便性を増加し得る。多くの型の放出送達系が，利用可能であり，そして等業者にとって公知である。それらとしては，ポリマーベースの系（例えば，ポリ（ラクチド−グリコリド），コポリオキサレート，ポリカプロラクトン，ポリエステルアミド，ポリオルトエステル，ポリヒドロキシ酪酸，およびポリ無水物が挙げられる。薬物を含む上記ポリマーのマイクロカプセルが，例えば，米国特許第５，０７５，１０９号に記載される。送達系としてはまた，非ポリマー系も挙げられ，これは，脂質（ステロール（例えば，コレステロール，コレステロールエステル），および脂肪酸もしくは天然脂肪（例えば，モノグリセリド，ジグリセリド，およびトリグリセリド）が挙げられる）；ヒドロゲル放出系；シラスティック（ｓｉｌａｓｔｉｃ）系；ペプチドベースの系；ロウコーティング；従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤；部分融合した移植物などである。特定の例としては，（ａ）本発明の薬剤がマトリックス中にある形態で含まれる，侵食系（米国特許第４，４５２，７７５号，同第４，６７５，１８９号および同第５，７３６，１５２号に記載される系）；ならびに（ｂ）ポリマーから制御された速度で活性成分が浸透する，拡散系（米国特許第３，８５４，４８０号，同第５，１３３，９７４号および同第５，４０７，６８６号に記載される）が挙げられるが，これらに限定されない。さらに，ポンプベースのハードウェア送達系が使用され得，そのうちのいくつかは，移植のために適合される。
【０１０５】
本発明は，以下の実施例によってさらに例証される。以下の実施例は，いかようにも，さらなる限定として解釈されるべきではない。本明細書全体を通して引用された文献の全ての内容は本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【０１０６】
キラルＣｐＧオリゴ核酸の合成
ＣｐＧオリゴ核酸（ｍｉｘ体）
ホスホロアミダイト法を用いて合成し，ＨＰＬＣにて精製したオリゴ核酸（Ｍｉｘ体）をジーンデザイン社から購入した。【０１０７】
立体制御ＣｐＧオリゴ核酸の合成
核酸の鎖長延長を以下の（ｉ）〜(ｉｖ)のステップを繰返すことにより行なった。
(ｉ)  ３％  ＤＣＡ（ジクロロ酢酸）／ＣＨ２Ｃｌ２（１５秒），
（ｉｉ）  縮合（０．１Ｍ  モノマーのＭｅＣＮ溶液（下記参照）と１Ｍ  ＰｈＩＭＴ（１−フェニルイミダゾリウムトリフラート）のＭｅＣＮ溶液の１：１混合溶液，５分）
(ｉｉｉ)  キャップ化（０．５Ｍ  ＣＦ３ＣＯＩｍのＴＨＦ溶液と１Ｍ  ＤＭＡＮ（１,８−ビスジメチルアミノナフタレン）のＴＨＦ溶液の１：１混合液，３０秒），
(ｉｖ)  硫化（０．１Ｍ  ＤＤＴＴのＭｅＣＮ用液，９０秒）もしくは酸化（０．０２Ｍ  Ｉ２のＨ２Ｏ−ピリミジン（Ｐｙｒｉｄｉｎｅ）−ＴＨＦ溶液，１５秒）。【０１０８】
鎖長延長後，固相担体を１．５ｍＬマイクロチューブに回収し，濃アンモニア水（１．２ ｍＬ，５５℃，４８時間）で処理した。固相担体をろ別し，ろ液を減圧乾燥後，水（１．０
ｍＬ）に溶かし，逆相ＨＰＬＣにより分取・精製することでオリゴマーを得た。【０１０９】
０．１Ｍ モノマーのＭｅＣＮ溶液調整法（Ｒｐ−Ｔｈの場合）
チミジル酸Ｈ−ホスホネート（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）モノエステル（２５マイクロｍｏｌ）を脱水ピリジン，脱水トルエンで共沸乾燥後，ＭｅＣＮ−ＣＭＰ（Ｎ−シアノメチルピロリジン）混合液（９：１,ｖ/ｖ；２５０μＬ）に溶かした。溶液にＰｈ３ＰＣｌ２（６２．５マイクロｍｏｌ）を加え１０分間撹拌し，続いてＡＡ−Ｌ（３０マイクロｍｏｌ；Ｓｐ体の場合はＡＡ−Ｄ）を加えさらに１０分間撹拌することで，モノマー溶液を調整した。【０１１０】
上記の説明において，ＤＤＴＴ，ＡＡ−Ｌ及びＡＡ−Ｄは，それぞれ以下の化合物の略称である。得られたオリゴ核酸を表1に示す。【０１１１】
【化１】
2014010718.tif 000011
【０１１２】
【表１−１】
2014010718.tif 000012
【０１１３】
【表１−２】
2014010718.tif 000013
【０１１４】
表中，＊は，Ｓ型及びＲ型がランダムに導入されたホスホロチオエート骨格修飾を示す。表中，ｓは，Ｓ型のホスホロチオエート骨格修飾が導入されることを示す。表中，ｒは，Ｒ型のホスホロチオエート骨格修飾が導入されることを示す。
【実施例２】
【０１１５】
サル末梢血単核球（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮ−アルファ産生誘導
Ｂウイルス陰性カニクイザル血液（株式会社新日本科学株から購入）をハンクス平衡塩（Ｈａｎｋｓ‘Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で３倍希釈し，フィコール・パック・プラス（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ）比重液に重層後，遠心分離(２，６００  ｒｐｍ，３０  ｍｉｎ)を行い，末梢血単核球(ＰＢＭＣ)画分を採取した。ＰＢＭＣをＲＰＭＩ培地(＋１％  ペニシリン・ストレプトマイシン)で洗浄した後，ＲＰＭＩ培地(＋１０％ＦＢＳ，１％  ペニシリンストレプトマイシン)に細胞濃度が３×１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬとなるように調製した。その後，９６ウェルＵ底プレートに播種し，種々のオリゴ核酸(オリゴＤＮＡ：ＤＯＴＡＰ
１：３．２混合物)とともに５％ＣＯ２インキュベーターで１７〜２４時間培養した。培養終了後，遠心分離(５００ｒｐｍ,５ｍｉｎ)により，培養上清を回収した。培養上清中のＩＦＮ−アルファの濃度をエライザキット（ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ）(ＰＢＬ社)を用いて測定した。【０１１６】
測定結果を表２に示す。表２は，配列番号１〜４８に関し，サル末梢血単核球（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮ−アルファ産生誘導作用を示していている。【０１１７】
【表２】
2014010718.tif 000014
【実施例３】
【０１１８】
サル血清中安定性の評価
サンプル作製
Ｂウイルス陰性カニクイザル血液（新日本科学社から購入）を遠心分離(３０００ｒｐｍ, １５  ｍｉｎ)によりサル血清を得た。オリゴ核酸（１３．４ｎｇ/マイクロＬ）を５０％サル血清中で３７℃のウォーターバス内で反応させサンプリングした。回収したサンプルを０．３ ｍｇ/ｍＬプロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ存在下で４２℃，１．５時間反応させた後，サンプルと等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し，遠心分離され(１０，０００  ｒｐｍ,５  ｍｉｎ後，水層を回収しサンプルとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。【０１１９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの実施
上記の方法で得られたサンプル（１００．５ｎｇ）を２０％変性ポリアクリルアミドゲルに添加し，２０ｍＡ,１２０分間泳動した後，１０，０００倍希釈したＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄ溶液で４０分間染色した。オリゴ核酸をＵＶトランスイルミネーターで蛍光バンドとして可視化し，画像解析装置(ＩＭＡＧＥ  ＳＴＡＴＩＯＮ：Ｋｏｄａ社)で蛍光強度を測定した。【０１２０】
その結果を図１〜図３及び表３に示す。図１は，配列番号２７〜２８に関し，Ｓ型とＲ型のオリゴヌクレオチドの血清中安定性の評価を行うための図面に替わるゲル電気泳動写真である。図２は，配列番号４３〜４５に関し，Ｓ型とＲ型のオリゴヌクレオチドの血清中安定性の評価を行うための図面に替わるゲル電気泳動写真である。図３は，配列番号３３〜３５に関し，Ｓ型とＲ型のオリゴヌクレオチドの血清中安定性の評価を行うための図面に替わるゲル電気泳動写真である。【０１２１】
【表３】
2014010718.tif 000015
【実施例４】
【０１２２】
マウスにおける抗原特異的抗体産生誘導試験
被験物質の投与
免疫抗原としてＯＶＡ（和光純薬）及びオリゴ核酸を，生理食塩水を用いてそれぞれ０．２ｍｇ/ｍＬに調製したものを被験物質投与液とした。【０１２３】
モデル作成
８週齢のＢＡＬＢ/ｃＡｎＣｒｌＣｒｌｊマウスを用いて，全身麻酔装置によりイソフルラン（２．０％〜４．０％，フォーレン，アボットジャパン株式会社）で麻酔状態を維持し，動物の背部を剪毛し，ディスポーザブル注射筒及び注射針を用いて，被験物質投与液を５０  μＬ/ｂｏｄｙの用量で背部皮内に投与した。１度目の投与から２週間後に再度投与を行い一週間後に安楽死させ，脾臓及び全血を採取した。【０１２４】
抗体価測定
投与日の−５日目及び１６日目に採取した血液から分離した血漿をサンプルとして用いた。固相化溶液をＥＬＩＳＡ用プレートに０．１  ｍＬ/ｗｅｌｌ添加し，プレートをシールした後に一晩冷蔵で静置する．溶液を除去し，洗浄液を０．３  ｍＬ/ｗｅｌｌ添加し，洗浄液を除去した．同様の操作を２回繰り返し，計３回洗浄した．ブロッキング溶液を０．２  ｍＬ/ｗｅｌｌ添加し，プレートをシールした後に室温で１〜４時間静置した。溶液を除去し，上記と同様な方法で３回洗浄した。【０１２５】
測定試料（血漿）を希釈液で１００倍に希釈後，公比２で７段階（１００〜１２８００倍）以上希釈した試料をＥＬＩＳＡ用プレートに０．１  ｍＬ/ｗｅｌｌで１  ｗｅｌｌに入れた。ブランクとして希釈液を別の１  ｗｅｌｌに入れ，プレートをシールした後に３７度Ｃに設定したプレートインキュベーターで１時間反応させた.溶液を除去し，上記と同様な方法で３回洗浄した。検出抗体溶液を０．１  ｍＬ/ｗｅｌｌ添加し，プレートをシールした後に３７度Ｃに設定したプレートインキュベーターで１時間反応させた後，溶液を除去し，同様に４回洗浄した。【０１２６】
基質発色液を０．１  ｍＬ/ｗｅｌｌ添加し，室温で３０分間反応させた後，停止液を０．１  ｍＬ/ｗｅｌｌ添加し，反応を停止させた．マルチプレート用吸光測定装置（主波長４５０  ｎｍ，副波長６２０  ｎｍ）を用いて書くｗｅｌｌの吸光度を測定した。【０１２７】
その結果を表４に示す。表４は，配列番号２７及び２８のオリゴヌクレオチドの抗ＯＶＡ−ＩｇＧ抗体価測定を示している。表４から，Ｓ型のオリゴヌクレオチドはＲ型と比較して抗体価誘導に優れることがわかる。【０１２８】
【表４】
2014010718.tif 000016
【０１２９】
脾臓重量の測定
採取した脾臓を冷生理食塩液で洗浄した後，電子天秤（ＨＲ−２００，株式会社エー・アンド・デイ）を用いて脾臓重量を測定した。【０１３０】
その結果を表５に示す。表５は，配列番号２７及び２８のオリゴヌクレオチドの脾臓重量に対する影響を示している。表５から，Ｒ型のオリゴヌクレオチドを投与したものは，脾臓重量が増加した。これは，Ｒ型のオリゴヌクレオチドが毒性を有することを示す。一方，Ｓ型のオリゴヌクレオチドを投与したものは，脾臓重量が増加していない。これは，Ｓ型のオリゴヌクレオチドが毒性を有さないか，毒性が低いことを示す。【０１３１】
【表５】
2014010718.tif 000017
【実施例５】
【０１３２】
実施例１と同様の方法を用いて立体制御ＣｐＧオリゴ核酸を合成した。合成により得られたオリゴ核酸の塩基配列を以下の表６に示す。表中の表記は，実施例１におけるものと同様である。なお，参考までに，既に知られた核酸の配列を配列番号１１９として示す。【０１３３】
【表６−１】
2014010718.tif 000018
【０１３４】
【表６−２】
2014010718.tif 000019
【実施例６】
【０１３５】
実施例２と同様の方法を用いて，実施例５により合成されたオリゴ核酸のサル末梢血単核球（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮ−アルファ産生誘導を配列番号１２８で示される既に知られた核酸との相対値を用いて評価した。その結果を表７に示す。【０１３６】
【表７−１】
2014010718.tif 000020
【０１３７】
【表７−２】
2014010718.tif 000021
【０１３８】
配列１１９（従来のポリヌクレオチド）について実施例２と同様に測定したＩＦＮ−アルファの濃度値は表８に示すとおりであった。【０１３９】
【表８】
2014010718.tif 000022
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明は，製薬産業において利用されうる。【０１４１】
【図１】
2014010718.tif 000027
【図２】
2014010718.tif 000028
【図３】
2014010718.tif 000029
【配列表】
2014010718000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年5月7日(2014.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’からなる配列を２〜４個含む１４〜３２ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであって，
前記ＣｐＧは，リン酸骨格修飾を有さない非メチル化ＣｐＧであり，
前記Ｘ１Ｘ２は，リン酸骨格修飾を有しても良いＡＡ，ＡＴ，ＧＡ又はＧＴのいずれかであり，
前記Ｘ３Ｘ４は，リン酸骨格修飾を有しても良いＴＴ，ＡＴ，ＡＣ，ＴＡ，ＴＣ又はＣＧであり，
前記オリゴヌクレオチドは，前記５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’以外の部位に少なくともひとつのリン酸骨格修飾を有するオリゴヌクレオチドであって，
前記Ｘ１Ｘ２は，リン酸骨格修飾を有さないＡＡ，ＡＴ，ＧＡ又はＧＴのいずれかであり，
前記Ｘ３Ｘ４は，リン酸骨格修飾を有さないＴＴ，ＡＴ，ＡＣ，ＴＣ又はＣＧである，
オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドであって，
前記５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’以外の部位の少なくともひとつのリン酸骨格修飾を有する部位はＳ型の立体異性体である，
オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドであって，
以下の配列番号１〜７，１０〜１２，２１〜２４，２６，２９〜３３，３６，３９，４２，４３，４９〜５１，６０〜６２，６４〜７１，７５，７６，８１〜９０，９５〜９７，９９〜１０３，１０６，１０７，１０９〜１１３，及び１１８で示されるいずれかの配列を含む，
オリゴヌクレオチド。
2014010718.tif 000030
2014010718.tif 000031
2014010718.tif 000032
上記式中＊は，リン酸骨格修飾による立体異性体を示し，上記それぞれの式における少なくとも１つの＊は，Ｓ型の立体異性体であり，
上記式中  ５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’に対応する部位のＣＧは，リン酸骨格修飾を有さない非メチル化ＣｐＧを意味する。
【請求項６】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドであって，
前記Ｘ１Ｘ２がＧＡであり，
前記Ｘ３Ｘ４がＴＴ又はＡＣである，
オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドであって，
前記５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’以外の部位の少なくともひとつのリン酸骨格修飾は，ホスホロチオエートを含む，
オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドであって，
前記５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’からなる配列部分をＣｐＧモチーフとしたときに，前記ＣｐＧモチーフより５’末端側又は３’末端側に−（Ｇ）ｍ−（ｍは，２以上１０以下の整数）からなる配列部分を有する，
オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドであって，
前記５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’からなる配列部分をＣｐＧモチーフとしたときに，前記ＣｐＧモチーフより３’末端側に−（Ｇ）ｍ−（ｍは，１以上６以下の整数）からなる配列部分を有する，
オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドであって，
前記５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’からなる配列部分をＣｐＧモチーフとしたときに，前記ＣｐＧモチーフより５’末端側にＴＣ，ＴＡ，ＴＧ，ＣＣ又はＣＣからなる配列部分を有する，
オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドであって，
前記５’−Ｘ１Ｘ２ＣｐＧＸ３Ｘ４−３’からなる配列部分をＣｐＧモチーフとしたときに，少なくとも第１のＣｐＧモチーフと第２のＣｐＧモチーフとを有し，
第１のＣｐＧモチーフと第２のＣｐＧモチーフとは直接結合しているか，又は
第１のＣｐＧモチーフと第２のＣｐＧモチーフとの間に−（Ｔ）ｎ−（ｎは，１以上３以下の整数），ＴＡ又はＴＣからなる配列部分を有する，
オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドであって，
ｔＳｐｃＳｐｇａｃｇｔｔＳｐｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｔｔＳｐｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｇｇ（配列番号１３），
ｔＳｐｃＳｐｇａｃｇｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｇｇ（配列番号１８），及び
ｇＳｐｇＳｐｇａｃｇａｃｇｔｃｇｔｃｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇ（配列番号４４）
のいずれかの配列又はいずれかの配列から１，２又は３個の塩基が置換，挿入，欠失又は付加した配列からなり，
配列中「ｃｇ」は，リン酸骨格修飾を有さない非メチル化ＣｐＧを示し，
「Ｓｐ」は，隣接するヌクレオチド間にＳ型のホスホロチオエート骨格修飾が導入されることを示す，
オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドであって，
ｔＳｐｃＳｐｇａｃｇｔｔＳｐｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｔｔＳｐｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｇｇ（配列番号１３），
ｔＳｐｃＳｐｇａｃｇｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｔＳｐｔＳｐｇａｃｇｇｇ（配列番号１８），又は
ｇＳｐｇＳｐｇａｃｇａｃｇｔｃｇｔｃｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇＳｐｇ（配列番号４４）
からなり，
配列中「ｃｇ」は，リン酸骨格修飾を有さない非メチル化ＣｐＧを示し，
「Ｓｐ」は，隣接するヌクレオチド間にＳ型のホスホロチオエート骨格修飾が導入されることを示す，オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドを含む組成物。
【請求項１５】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドを含むワクチンアジュバンド。
【請求項１６】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドを含む樹状細胞からのインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）の産生誘導剤。
【請求項１７】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として有効量含む感染症，癌，呼吸器疾患，アレルギー疾患，自己免疫疾患，又は創傷治癒の治療剤。
【国際調査報告】
2014010718.tif 000033
2014010718.tif 000034
2014010718.tif 000035
2014010718.tif 000036