(57)【要約】  極微量の生体分子を定量するため磁気微粒子で生体分子を特異的に捕捉し生体分子には蛍光標識を行う。磁気微粒子の支持基板への高効率な固定反応と、磁気微粒子の凝集の解消が課題である。  磁気微粒子を支持基板に引き付けるために支持基板裏面にオン／オフを切り換えられる磁場発生装置を、支持基板表面には磁気微粒子を保持する接着層を設ける。はじめに支持基板表面の磁場をオフの状態で磁気微粒子の分散溶液を支持基板表面に置く。次に、磁場をオンにして液中の磁気微粒子を支持基板表面に引き付ける。支持基板に衝突した磁気微粒子を支持基板表面の接着層に固着させ、さらに磁場をオフにする。これにより磁気微粒子を保持したまま凝集を解消することができ、支持基板上の磁気微粒子層を一層にすることができる。
2014007034.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光色素を用いて生体関連分子を定量する分析装置であって、
支持基体と、この支持基体上に生体関連分子を捕捉した磁気微粒子を接着するために設けられた接着層と、蛍光色素を励起する励起手段と、蛍光を検出する検出手段と、前記支持基体に対して磁力のオン／オフ、あるいは磁力の強弱の切り替えが可能な磁場発生手段と、を備える分析装置。
【請求項２】
請求項１において、
支持基体を移動させる可動ステージを設けた分析装置。
【請求項３】
請求項１において、
支持基体上に流路を備え、該流路は送液ポンプを接続した取水口と排水口を備える分析装置。
【請求項４】
請求項１において、
前記蛍光色素として量子ドットを用いる分析装置。
【請求項５】
請求項１において、
前記接着層の材料として、アルキル鎖状分子、ビオチン分子のうちいずれかから選ばれる物質を用いた分析装置。
【請求項６】
請求項１において、
前記接着層の材料として、熱や光に応答して疎水性と親水性を可逆的に変化する物質を用いた分析装置。
【請求項７】
請求項１において、
前記磁場発生装置として、電磁石、可動式の永久磁石、可動式の磁場遮蔽物が組み合わさった電磁石、および可動式の磁場遮蔽物が組み合わさった永久磁石のうちいずれかを用いる分析装置。
【請求項８】
請求項１において、
前記検出手段として、落射型光学顕微鏡を用いた分析装置。
【請求項９】
請求項１において、２種類以上の蛍光色素を同時に識別する落射型光学顕微鏡を用いた分析装置。
【請求項１０】
請求項１において、
前記生体関連分子が抗原分子であり、前記磁気微粒子による捕捉が抗原抗体反応によって実施される分析装置。
【請求項１１】
請求項１において、
前記生体関連分子が核酸分子であり、前記磁気微粒子による捕捉がハイブリダイゼーションによって実施される分析装置。
【請求項１２】
請求項１において、
前記蛍光色素が、解析対象の生体分子の種類ごとに、配合割合が異なった複数種類の蛍光体を含むことを特徴とする分析装置。
【請求項１３】
請求項１において、
特定の生体関連分子以外の生体関連分子に対しては同一の蛍光色素を用い、前記生体関連分子ごとに蛍光輝点数を計数した上で、総輝点数に対する特定の生体関連分子ごとの輝点数の比を算出することで、前記特定の生体関連分子ごとの存在量を評価することを特徴とする分析装置。
【請求項１４】
蛍光色素を用いて生体関連分子を定量する分析方法であって、
生体関連分子を捕捉した磁気微粒子を接着するための接着層が設けられた支持基体上に磁気微粒子を配し、
磁力により、磁気微粒子を支持基体に衝突させ、
磁力をオフ又は弱くし、
蛍光色素を励起して、蛍光を検出することを特徴とする、分析方法。
【請求項１５】
前記請求項１〜1３のいずれかにおいて、
前記磁気微粒子を前記支持基板に固定するときに用いる磁場発生手段が、支持基板表面に対して平行な磁束を与えるように配置されていることを特徴とする生体分子分析装置。
【請求項１６】
前記請求項１〜1３のいずれかにおいて、
前記磁場発生装置が支持基板に与える表面磁束密度が0.1T以上であることを特徴とする生体分子分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁気微粒子を用いた生体分子分析方法及び生体分子分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌診断の分野では、早期に癌発症の徴候を知るため様々な癌マーカーが研究され、実用化も進んでいる。癌マーカーとは癌細胞由来の分泌型の生体因子であり、癌の進行とともに増加し血中や尿中に現れる。例えば、ホルモン、サイトカイン等のタンパク質、マイクロＲＮＡ等の核酸が知られている。早期の癌ではこれらの癌マーカーの量は少なく検出が難しく、元々発現量の少ない癌マーカーが存在する場合も同様である。現在、主流である高感度の癌マーカー検出方法は抗体を用いた免疫測定法で、ＥＬＩＳＡ法やナノ微粒子アッセイといった手法が知られている。最近では、研究段階であるが、さらなる高感度な免疫測定法として、単分子で検出可能なデジタルＥＬＩＳＡが開発されている（非特許文献１）。血液中の癌マーカーを検出する場合、患者から採取できる血液量は限られており、その中から極微量の癌マーカーをできるだけ多く捕捉して検出することが求められる。例えば、５０μｌの血漿中から検出する場合、早期の癌では癌マーカーは１０-16〜１０-12Ｍの濃度範囲であるため、５０μｌ中に３０００分子ある標的分子を定量する検出感度が必要になる。このように低濃度の癌マーカーを検出可能な超高感度の検出装置が要求されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Rissin DM et al, Nature Biotecnology, Jun 28(6); p595-599 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
極微量の生体分子を定量するため磁気微粒子で生体分子を特異的に捕捉し生体分子には蛍光標識を行う。磁気微粒子に捕捉された生体分子を支持基板に固定して検出を行う。液中に浮遊している生体分子を捕捉した磁気微粒子を磁場によって支持基板表面に引き付ける。磁場の存在下で磁気微粒子自体が帯磁するため、支持基板表面上において微粒子同士で引き合い、磁気微粒子は凝集する。磁気微粒子が凝集すると、支持基体上に板の表面とは垂直方向に磁気微粒子が重なり合ってしまう。また、凝集した微粒子が蛍光標識を内部に巻き込んでしまう。【０００５】
このように重なった磁気微粒子、または、内部に蛍光標識を巻き込んだ磁気微粒子は、蛍光観察時に精度良くカウントすることができないという問題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
磁気微粒子を支持基板に引き付けるために支持基板裏面にオン／オフを切り替えられる磁場発生装置を、支持基板表面には磁気微粒子を保持する接着層を設ける。はじめに支持基板表面の磁場をオフの状態で磁気微粒子の分散溶液を支持基板表面に置く。次に、磁場をオンにして液中の磁気微粒子を支持基板表面に引き付ける。支持基板に衝突した磁気微粒子を支持基板表面の接着層に固着させ、さらに磁場をオフにする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、液中の大部分の磁気微粒子を支持基体表面に引き付けることができ、接着層によって保持することができる。さらに磁場をオフの状態にすることによって、磁気微粒子同士の凝集を解消することができ、支持基板上の磁気微粒子層を一層にすることができる。磁気微粒子を一層にすることで支持基体上の蛍光色素に対する焦点合わせが容易にでき、磁気微粒子の凝集による蛍光色素の抱き込みを防ぐことで定量性が向上する。本発明を用いた生体分子分析により解析対象の生体分子捕獲率を大幅に向上できるため、従来技術より高感度な検出が可能になる。さらに複雑な構造を有するデバイスが不要なため従来技術に比べて非常に簡便であり、自動制御ユニットと組み合わせることで大幅なスループットの向上が得られる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本実施例の解析方法の一例を説明するための図。
【図２】本実施例の解析方法に用いるデバイスの構成の一例を説明するための図。
【図３】本実施例の解析方法に用いるデバイスの構成の一例を説明するための図。
【図４】本実施例の抗原分子の捕捉方法と抗原分子の蛍光標識する方法の一例を説明するための図。
【図５】本実施例の核酸断片の捕捉方法と核酸断片の蛍光標識する方法の一例を説明するための図。
【図６】本実施例の生体分子分析装置の構成の一例を説明するための図。
【図７】本実施例の磁石を用いた磁気微粒子固定方法の一例を説明するための図。
【図８】本実施例の磁石を用いて固定された磁気微粒子の顕微鏡観察画像。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の一実施例の核酸分析デバイスでは、解析対象の生体分子が磁気微粒子に捕捉されており、当該微粒子を二次元に提示するための平滑な支持基板を持ち、支持基板の表面には抗体付き磁気微粒子を固定するための接着層が存在する。支持基板としては磁力をよく透過する薄い石英ガラス基板やシリコン基板などがよく、接着層の種類に応じて金属薄膜を堆積させた石英ガラス基板やシリコン基板を使い分ける。タンパク質で修飾した磁気微粒子を固定するための接着面が疎水性の接着層、あるいはビオチンを導入した接着層であり、疎水性の接着剤としてアルキル基の自己組織膜を使用する。また、接着層の接着力の強弱を可逆的に切り替えられる接着剤として光応答性のアゾベンゼンを使用することを開示する。支持基板に固定するための官能基は、基板が石英または酸化処理したシリコン基板ならシラノール基、金堆積基板ならチオール基、酸化チタン堆積基板ならリン酸基を使用する。支持基板の直下には接着層に生体分子付き磁気微粒子を引き付けるための磁場発生装置が設置してあり、さらに磁場発生装置は磁場のオン／オフあるいは強弱を切り替える機能が付いている。磁場発生装置は電磁石、可動式の永久磁石、可動式の電磁石、支持基板と磁石の間に可動式の磁場遮断板が備わった永久磁石、または電磁石から選ばれる。本デバイスは撮像装置を固定した状態で支持基板全面をスキャンして蛍光観察できるように支持基板を可動ステージ上に設置して使用する。
【００１０】
観察手順について説明する。はじめに支持基板上に目的の生体分子を捕捉した磁気微粒子を含んだ反応液を配し、次に磁場発生装置をオンにして磁場を発生させ、反応液内のすべての磁気微粒子を支持基体上に引き付け、接着層に接した磁気微粒子を支持基板上に固定する。一度目で接着層に接しなかった磁気微粒子は、磁場のオン／オフ、あるいは強弱を繰り返すことで磁気微粒子の接着層に対する衝突機会を増やす。磁気微粒子を接着層に固定後、洗浄液を流すことで浮遊している未反応の蛍光標識抗体を洗い流す。支持基板上に固定した磁気微粒子とそれに結合した蛍光標識された抗原に励起光を照射して撮影する。観察された輝点数をカウントすることで目的の生体分子濃度を求める。
【００１１】
接着層の接着力を可逆的に変化させる機能を持ったデバイスを用いた観察手順について、磁気微粒子を固定する際はアゾベンゼンに紫外光を照射してシス型にしておき、磁場をオフにした状態で一定量の反応液を入れる。それから磁場を発生して、反応液中の磁気微粒子を支持基体上に引き付け、接着層に接した磁気微粒子は支持基板上に固定する。磁気微粒子を接着層に固定後、洗浄液を流すことで浮遊している未反応の蛍光標識抗体を洗い流す。支持基板上に固定した磁気微粒子とそれに結合した蛍光標識された抗原に励起光を照射して撮影し、観察された輝点数をカウントすることで目的の生体分子濃度を求める。観察終了後、支持基板に可視光あるいは熱を与えることで、アゾベンゼンが親水化して磁気微粒子を支持基板から剥がす。紫外光、可視光照射は検出系とは別に光源と波長分離フィルタを用意して、支持基板全面に照射できるようにする。熱を与える方法として、加熱した温水を流路に通す。洗浄が完了したら、再び紫外光を照射してシス型に戻し、新たな試料を入れて同様に固定、および観察を行う。二回目以降の試料の持ち込みを低減するには、繰り返し洗浄を実施する。あるいは測定の回次毎に標識に使用する蛍光色素の波長と検出フィルタを変えることでコンタミネーションを除去する。
【００１２】
実施例では、解析対象の生体分子がペプチド、タンパク質、核酸断片群であることを開示する。解析対象の抗原を用意し、抗原に対する抗体を結合した磁気微粒子と蛍光体標識された抗体に前記解析対象の抗原と結合させ、標識された蛍光体を検出することを特徴とする免疫学的分析方法を開示する。あるいは解析対象の核酸断片群を用意し、既知の塩基配列を有しかつ蛍光体標識された核酸分子を前記解析対象の核酸断片群とハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションした核酸分子に標識された蛍光体を検出することを特徴とする核酸分析方法を開示する。
【００１３】
また、実施例では、前記生体分子分析方法において、前記蛍光体標識が、解析対象の生体分子の種類ごとに、配合割合が異なった複数種類の蛍光体を含む微粒子であることを特徴とする核酸分析方法を開示する。また、実施例では、前記生体分子分析方法において、特定の分子種以外の分子種に対しては同一の蛍光体標識を用い、前記分子ごとに蛍光輝点数を計数した上で、総輝点数に対する特定の分子種ごとの輝点数の比を算出することで、前記特定の分子種ごとの存在量を評価することを特徴とする生体分子分析方法を開示する。また、実施例では、前記核酸分析方法において、解析対象の生体分子群に対して共通の蛍光体標識を施し、前記蛍光体とは蛍光波長あるいは蛍光強度が異なる蛍光体で標識された生体分子を特異的に結合反応させる工程を含み、前者と後者の蛍光体の輝点数の比を算出することで、前記解析対象の生体分子の種類ごとの存在量を評価することを特徴とする生体分子分析方法を開示する。
【００１４】
また、実施例では、解析対象の生体分子を二次元的に展開して固定するデバイスと、デバイスを搭載した生体分子分析装置、前記蛍光体の蛍光を測定するための手段を具備することを特徴とする生体分子分析装置を開示する。
【００１５】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
本実施例の解析方法およびデバイスの構成の一例を、図１を用いて説明する。はじめに検出したい生体分子を、事前に磁気微粒子で捕捉し、さらに蛍光標識でラベルする。これらの反応はすべて常温下、緩衝液中で行う磁気微粒子と生体分子の反応、蛍光標識と生体分子の反応はどちらが先でもよく、同時に行ってもよい。捕獲する磁気微粒子の作製法、蛍光標識の方法は実施例３と実施例４で詳細に記載する。【００１７】
本実施例では、検出したい生体分子が抗原１０１であり、抗体付き磁気微粒子１０２で抗原１０１を捕捉し、さらに蛍光標識抗体１０３でラベルする方法を例として、反応方法について図１を用いて説明する。はじめに、反応容器１１０内に抗体付き磁気微粒子１０２を入れ、よく撹拌しておく。この溶液に検出したい抗原１０１の入った溶液を入れてから、よく混合して数分間インキュベートする。このとき、反応容器を上下に回転させるか、振とうして撹拌することで反応が早まる。混合する比率は、抗体付き磁気微粒子１０２が抗原１０１に比べて過剰になるように混合する。さらに、この反応液に蛍光標識抗体１０３を入れて、さらに数分間インキュベートする。このように反応させた混合液中には、大量の未反応の磁気微粒子１０２と、蛍光標識抗体１０３が存在し、その中に磁気微粒子１０２と抗原１０１と蛍光標識抗体１０３の混合体が少量存在する。この混合液を以下、反応液Ａと呼称する。反応液Ａを支持基板に二次元に展開して、蛍光検出することによって抗原量を測定する。【００１８】
次に蛍光検出用のデバイスの構成に関して図１を用いて説明する。本デバイスは磁気微粒子１０２を二次元提示するための平滑な支持基板１０４を持ち、支持基板１０４の表面には磁気微粒子１０２を固定するための接着層１０５が存在する。支持基板１０４としては磁力をよく透過する薄い石英ガラス基板やシリコン基板などがよく、接着層１０５の種類に応じて金属薄膜を堆積させた石英ガラス基板やシリコン基板を使い分ける。タンパク質で修飾した磁気微粒子１０２は疎水性の層によく吸着することから、アルキル基を支持基板１０４の表面に固定することで接着層１０５を形成する。接着剤として、官能基付きのアルキル鎖を使用することができる。官能基は支持基板１０４の材質が石英または酸化処理したシリコン基板なら官能基はシラノール基、金堆積基板ならチオール基、酸化チタン堆積基板ならリン酸基を使用する。反応を行うと官能基は支持基板１０４に固定され、アルキル鎖はアルキル鎖疎水的相互作用で密集して支持基板１０４表面に自己集積膜（ＳＡＭ）を形成する。この方法によって支持基板１０４上に均一に疎水化することができる。支持基板１０４の直下には接着層１０５に磁気微粒子１０２を引き付けるための磁場発生装置１０６が設置してある。さらに磁場発生装置１０６は磁場のオン／オフあるいは強弱を切り替える機能が付いている。本デバイスは支持基板１０４全面をスキャンできるように可動ステージ１０７上に設置して使用する。【００１９】
以下、デバイスの役割と観察手順について説明する。はじめに支持基板１０４にピペット１０８で反応液Ａを載せる。支持基板１０４上の四方を囲う側壁を作ることで、支持基板面積当たりの溶液量を厳密に調整することができ、液滴をそのまま載せる方法に比べて液厚を均一にすることができる。つまり、磁気微粒子１０２の固定を均一にすることができる。磁場発生装置１０６をオンにした状態で、入れたところから磁気微粒子１０２が引き付けられるため、不均一に固定される。そのため、反応液Ａを入れるときはオフにし、入れてから磁場発生装置１０６をオンにして磁場を発生させ、反応液Ａ内のすべての磁気微粒子１０２を支持基体１０４上に引き付ける。接着層１０５に接した磁気微粒子１０２は支持基板１０４上に固定される。本検討で使用する抗体付き磁気微粒子１０２は常磁性体であるため、外部から磁場を与えることで磁性化する。しかし、各々の磁気微粒子１０２が磁性化すると、互いに引き合い数珠状に連なるように凝集する。そのため外部から磁場を与えた状態で観察を行うと、磁性微粒子１０２は支持基板１０４に対して垂直方向に向けて立体的な構造を持つため、観察の際に焦点が合わせ難くなり、あるいは蛍光標識抗体１０３を凝集体内部に巻き込むことで、励起光が不均一となり本来の定量性を損なう。そこで磁場をオフにして、磁気微粒子１０２同士の凝集を解消することで接着層１０５に固定された磁気微粒子１０２のみが支持基板１０４上に提示され、一層の磁気微粒子層が形成することができる。この場合、接着層１０５に接しなかった磁気微粒子は支持基板１０４上に提示されないことになるが、磁場のオン／オフ、あるいは強弱を繰り返すことで衝突機会を増やせば、ほとんどの磁気微粒子１０２が接着層１０５に固定される。磁気微粒子１０２を接着層１０５に固定後、洗浄液を流すことで浮遊している未反応の蛍光標識抗体１０３はすべて洗い流すことができる。ただし、未反応の蛍光標識抗体１０３は、事前に反応容器１１０内で行っておいてもよい。支持基板１０４上に一層に固定した磁気微粒子１０２とそれに結合した蛍光標識された抗原１０１に励起光を照射して撮影する。観察された輝点数をカウントすることで抗原濃度を求めることができる。
【実施例２】
【００２０】
次に流路と組み合わせた蛍光検出用のデバイスの構成に関して図２を用いて説明する。本デバイスは実施例１と同様に磁気微粒子２０１を二次元提示するための平滑な支持基板２０３を持ち、支持基板２０３の表面には磁気微粒子２０１を固定するための接着層２０４、支持基板２０３の直下には接着層２０４に磁気微粒子２０１を引き付けるための磁場のオン／オフあるいは強弱を切り替えが可能な磁場発生装置２０５が設置してある。さら支持基板２０３の四方に側壁２０６と、さらにその上に平滑で透明なカバー材２０７で蓋をする。例えば、側壁２０６の材料としてはＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、カバー材２０７の材料は石英を使用することができる。側壁の二か所に溶液を出し入れするためのチューブ２０８を取り付ける。チューブ２０８の材料としてはシリコンゴムが使用できる。支持基板２０３の直下には接着層２０４に磁気微粒子２０１を引き付けるための磁場発生装置２０５が設置してある。本デバイスは支持基板２０３全面をスキャンできるように可動ステージ２０９上に設置して使用する。あるいは、対物レンズ２１０側に可動機構を付加してスキャンする。【００２１】
以下、デバイスの役割と観察手順について説明する。はじめに磁場をオフにした状態で一定量の反応液Ａを入れる。それから磁場を発生して、反応液Ａ中の磁気微粒子２０１を支持基板２０３上に引き付ける。接着層２０４に接した磁気微粒子２０１は支持基板２０３上に固定される。本磁気微粒子２０１を接着層２０４に固定後、洗浄液２１１を流すことで浮遊している未反応の蛍光色素２０２はすべて洗い流すことができる。支持基板２０３上に一層に固定した磁気微粒子２０１とそれに結合した蛍光色素２０２に励起光を照射して撮影する。観察された輝点数をカウントすることで生体分子濃度を求めることができる。
【実施例３】
【００２２】
次に接着層３０４の接着力を可逆的に変化させる機能を持ったデバイスの構成に関して図３を用いて説明する。本デバイスは実施例２と同様に磁気微粒子３０２を二次元提示するための平滑な支持基板３０３を持ち、支持基板３０３の表面には磁気微粒子３０２を固定するための接着層３０４、支持基板３０３の直下には接着層３０４に磁気微粒子３０２を引き付けるための磁場のオン／オフあるいは強弱を切り替えが可能な磁場発生装置３０５が設置してある。さら支持基板３０３の四方に側壁３０６と、さらにその上を平滑なカバー材３０７で蓋をする。側壁３０６の二か所に溶液を出し入れするためのチューブを取り付ける。支持基板３０３の直下には接着層３０４に磁気微粒子３０２を引き付けるための磁場発生装置３０５が設置してある。さらに、接着層３０４の接着力を可逆的に変化する物質で形成する。例えば、温度や熱を利用して表面の水濡れ性を疎水性から親水性又は親水性から疎水性に変える物質を接着剤として用いる。接着層３０４の接着力を可逆的に変化することによって、観察後に磁気微粒子３０２を固定した支持基板３０３から磁気微粒子３０２を剥がして洗浄することができ、さらに吸着力を再び戻すことで新たな試料を観察することができる。つまり、支持基板３０３を何度も再利用することができる。再利用を実現する接着剤として、光応答性のアルキルアゾベンゼンを使用することができる。アゾベンゼンは二つのアゾ基に二つのベンゼン環が付いた構造をしており、紫外光３０８を照射するとシス体に、可視光３１０あるいは熱を与えることでより安定なトランス体に異性化する。例えば、アルキル鎖の一方の端にアゾベンゼン、もう一方の端に基板側と反応する官能基を結合させた官能基付きアルキルアゾベンゼンを用意する。基板が石英または酸化処理したシリコン基板なら官能基はシラノール基、金堆積基板ならチオール基、酸化チタン堆積基板ならリン酸基を使用する。反応を行うと官能基は基板に固定され、アルキル鎖はアルキル鎖疎水的相互作用で密集して基板表面に自己集積膜（ＳＡＭ）を形成する。この方法によって基板上に均一にアゾベンゼンを導入することができる。磁気微粒子３０２を固定する際はアゾベンゼンに紫外光３０８を５分間程度照射してシス型にしておく。【００２３】
以下、デバイスの役割と観察手順について説明する。はじめに磁場をオフにした状態で一定量の反応液Ａを入れる。それから磁場を発生して、反応液Ａ中の磁気微粒子３０２を支持基体上に引き付ける。接着層３０４に接した磁気微粒子３０２は支持基板３０３上に固定される。本磁気微粒子３０２を接着層３０４に固定後、洗浄液３０９を流すことで浮遊している未反応の蛍光標識抗体はすべて洗い流すことができる。支持基板３０３上に一層に固定した磁気微粒子３０２とそれに結合した蛍光標識された抗原に励起光を照射して撮影する。観察された輝点数をカウントすることで抗原濃度を求めることができる。【００２４】
観察が完了した磁気微粒子３０２が固定された支持基板３０３に可視光３１０あるいは熱を与えることで、アゾベンゼンが親水化して磁気微粒子３０２が支持基板３０３から剥がれる。可視光３１０照射は検出系とは別に光源と波長分離フィルタを用意して、支持基板３０３全面に照射できるようにする。熱を与えるには、３５℃以上に加熱した温水を流路に通す。いずれの親水化の方法でも、界面活性剤を含む水溶液を流しながら行うことでより高い磁気微粒子３０２の除去効果が得られる。洗浄が完了したら、再び紫外光３０８を五分間程度照射してシス型にしておき、新たな試料を入れて同様に固定、および観察を行う。【００２５】
このように繰り返し固定と除去を行う場合、前の回で固定した蛍光色素３０１が残留して、二回目以降の定量の際に加算されてしまう可能性がある。これを防ぐには事前に、磁気微粒子３０２を完全に、あるいは許容される量になるまで除去できる洗浄条件を求めておく。極微量の試料を定量する場合、数輝点の差が定量結果に大きく影響する場合がある。その時は、測定の回次毎に標識に使用する蛍光色素３０１の波長と検出フィルタを変えることでコンタミネーションを完全に除去することができる。
【実施例４】
【００２６】
本実施例の試料調整方法に関して、図４を用いて説明する。検出したい生体分子が抗原４０１である場合、事前に抗体４０２付き磁気微粒子４０３で捕捉し、さらに蛍光標識抗体４０５でラベルする。これらの反応はすべて常温下、反応用バッファ（トリスバッファ（ｐＨ８.０）、５０mM  ＮａＣｌ、０.１％  Ｔｗｅｅｎ２０）中で行う。抗体４０２付き微粒子と抗原４０１の反応と蛍光標識抗体４０５と抗原４０１の反応はどちらが先でもよく、同時に行ってもよい。抗原４０１はあらゆる種類のものが使用できるが、抗体４０２は抗原４０１に対して特異的の高いものを選択する方がよい。例えば、抗原４０１として前立腺がんの腫瘍マーカーであるＰＳＡ（前立腺特異抗原）を選択した場合、ＰＳＡ抗体が必要である。ＰＳＡ抗体は磁気微粒子側に結合するものと、蛍光色素標識のものをそれぞれ必要とする。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、抗原４０１の種類に合わせて適切なものを選択する。【００２７】
磁気微粒子４０３に抗体４０２を結合する場合、抗体４０２の活性を保ったまま結合できるプロテインＡ、またはプロテインＧ修飾の磁気微粒子４０３を用意する。これらの磁気微粒子４０３は市販されており、容易に入手することができる。例えば、常磁性微粒子であるアデムテック社のプロテインＡ修飾アデムビーズ（φ３００nm）を利用することができる。プロテインＡ修飾磁気微粒子４０３に対して約１０倍以上のＰＳＡ抗体を混合しインキュベートする。次に磁気微粒子４０３を磁石で捕捉してから溶液を除去し清浄なバッファで懸濁する。この操作を未反応の抗体４０２が除去できるまで繰り返す。磁気微粒子４０３としてストレプトアビジンの修飾磁気微粒子４０３を使用することができる。例えば、アデムテック社のストレプトアビジン修飾アデムビーズ（φ１００nm、φ２００nm、φ３００nm）を利用することができる。この磁気微粒子４０３を使用する場合は、ビオチン化した抗体４０２を使用して、磁気微粒子４０３表面に抗体４０２を結合させる。使用する磁気微粒子４０３の直径は励起波長よりも小さいものから選ばれることが望ましく、磁気微粒子４０３の散乱光によるバックグラウンドの増加を防ぐことができる。【００２８】
蛍光標識抗体４０５は様々な種類のものが市販されている。例えば、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ（登録商標）、ＣＹ５などがよく知られている。しかし、本検討では少なくとも一分子の抗原４０１の検出を可能にするため、輝度が高く、消光時間の長い蛍光色素を利用することが望ましい。このような蛍光色素として、例えば、数百分子の蛍光色素が一つの枝状の炭素鎖に結合したデンドリマー型蛍光色素や、量子ドット４０４を使用することができる。【００２９】
本実施例では量子ドット４０４を用いた抗体の蛍光標識方法について説明する。量子ドット４０４は直径数ナノ〜数十ナノの半導体微粒子である。従来の蛍光色素に比べて高寿命、高輝度で、粒径によって異なる波長の蛍光を発する。量子ドット４０４は複数のメーカーから市販されており、様々な官能基で修飾されているものもある。任意の蛍光標識抗体４０５を結合できる量子ドット４０４として、例えば、インビトロジェン社のＱｄｏｔ（登録商標）抗体標識キットが利用できる。本キットでは表面にチオール基を導入した量子ドット４０４と、ジスルフィド結合を還元した蛍光標識抗体４０５を混合し反応させることで、蛍光標識抗体４０５に量子ドット４０４を標識できる。【００３０】
以上のように作製した抗体４０２付き磁気微粒子４０３と蛍光標識抗体４０５を用いて抗原４０１の捕捉と検出を行う。はじめに、反応容器内に抗体４０２付き磁気微粒子４０３を入れ、よく撹拌しておく。この溶液に検出したい抗原４０１の入った溶液を入れてから、よく混合して１時間インキュベートする。このとき、反応容器を上下に回転させるか、振とうして撹拌することで抗原４０１と抗体４０２の反応が早まる。混合する比率は、抗体４０２付き磁気微粒子４０３が抗原４０１に比べて過剰になるように混合する。具体的には、想定される抗原量に対して１００から１００００倍量の抗体４０２付き磁気微粒子４０３を入れる。次いで、この反応液に蛍光標識抗体を入れて、さらに数分間インキュベートする。蛍光標識抗体４０５も同様に抗原量に対して過剰になるように１００から１００００倍量投入する。それぞれを過剰量入れることによって、抗原４０１との衝突頻度が上がり、抗原４０１の捕捉率と蛍光標識率が向上する。このように反応させた混合液を実施例３の反応液と同様に観察し、抗原４０１を定量する。
【実施例５】
【００３１】
本検討における試料調整方法について図５を用いて説明する。検出したい生体分子が核酸断片である場合、検出対象の試料核酸断片５０１を磁気微粒子５０７で捕捉し、さらに試料核酸断片５０１に対して相補的な配列を持つ蛍光色素５０６付き核酸断片５０５でラベルする。これらはハイブリダイゼーションによる特異的な反応であり、反応用バッファ（ＰＢＳバッファ（ｐＨ７.４）、５０mM〜１Ｍ  ＮａＣｌ、０.１％  Ｔｗｅｅｎ２０）中で行う。核酸付き磁気微粒子５０７と試料核酸断片５０１、蛍光色素５０６付き核酸断片５０５と試料核酸断片５０１の反応はどちらが先でもよく、同時に行ってもよい。核酸断片５０５は一本鎖のＤＮＡやＲＮＡが使用できる。具体的な解析対象としてマイクロＲＮＡを例に取り、詳細を説明する。【００３２】
マイクロＲＮＡは２０ｍｅｒ程度の一本鎖の核酸断片である。最も単純な検出方法は、試料核酸断片５０１に対して直接蛍光標識する方法である。この場合、試料核酸断片５０１の３‘末端側にビオチン化ｄＵＴＰを結合して、ビオチン化した試料核酸断片５０１を作製する。この試料核酸断片５０１に対してアビジン標識の量子ドットを反応させる。同様に試料核酸断片５０１の相補鎖を付けた磁気微粒子５０７を作製しておき、量子ドットと反応させた試料核酸断片５０１と反応させる。磁気微粒子５０７に捕獲された試料核酸断片５０１の量を蛍光色素５０４から測定する。【００３３】
全体のマイクロＲＮＡ総量のうち、特定のマイクロＲＮＡ量を測定したい時は、予め試料核酸断片５０１であるマイクロＲＮＡに共通配列５０３と捕捉配列５０８を含む核酸断片を末端にライゲーションで付加しておく。共通配列５０３とは、種類を問わずすべてのマイクロＲＮＡに蛍光標識するための配列を指し、捕捉配列とは、磁気微粒子５０７で捕捉するための配列を指す。共通配列および捕捉配列は、測定したい試料のＴｍ値に合わせて、ＧＣ含量と塩基長を任意に合成することができる。以下、共通配列と捕捉配列を含む核酸断片をタグ断片５０２と呼称する。はじめに、共通配列の相補鎖に蛍光色素５０４標識したものと、試料核酸断片５０１の相補鎖に蛍光色素５０６標識したものを用意する。これらをタグ分子５０２を付加した試料核酸断片５０１と混合しハイブリダイズさせる。このとき、試料核酸断片５０１が複数種類存在する場合は、種類ごとに試料核酸断片５０１の相補鎖を用意し、それぞれ異なる波長の蛍光標識をしておく。このように蛍光標識した試料核酸断片５０１を、捕捉配列付き磁気微粒子５０７で捕捉する。この反応もハイブリダイゼーションで行う。蛍光標識された試料核酸断片５０１を補足した磁気微粒子５０７を支持基板上の接着層に固定して実施例１、２と同様に輝点観察を行う。このとき、共通配列数側の蛍光輝点はマイクロＲＮＡの全数に相当し、試料側の蛍光輝点数は試料核酸断片５０１の分子数に相当する。両者の輝点数の比を、各種の核酸試料分子の存在比率と判断することも、特定の核酸分子だけの発現量を調べたい時には有効である。【００３４】
磁気微粒子５０７は市販されており、容易に入手することができる。例えば、常磁性微粒子であるアデムテック社のストレプトアビジンの修飾磁気微粒子を使用することができる。例えば、アデムテック社のストレプトアビジン修飾アデムビーズ（φ１００nm、φ２００nm、φ３００nm）を利用することができる。この磁気微粒子を使用する場合は、ビオチン化した核酸断片を使用して、磁気微粒子５０７表面のアビジン５０９に核酸を結合させる。使用する磁気微粒子５０７の直径は励起波長よりも小さいものから選ばれることが望ましく、磁気微粒子５０７の散乱光によるバックグラウンドの増加を防ぐことができる。蛍光色素は様々な種類のものが市販されている。例えば、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ（登録商標）、ＣＹ５などがよく知られている。しかし、本検討では少なくとも一分子の試料核酸断片５０１の検出を可能にするため、輝度が高く、消光時間の長い蛍光色素を利用することが望ましい。このような蛍光色素として、例えば、数百分子の蛍光色素が一つの枝状の炭素鎖に結合したデンドリマー型蛍光色素や、量子ドットを使用することができる。本実施例では量子ドットを用いた核酸断片の蛍光標識方法について説明する。例えば、インビトロジェン社のストレプトアビジン修飾Ｑｄｏｔ（登録商標）が利用できる。量子ドットと核酸断片との結合は混合して３０分間以上インキュベートすればよく、反応後に５０ｋＤａカットオフのスピンカラムで未反応の核酸断片を除去する。【００３５】
以上のように作製した捕捉配列片付き磁気微粒子５０７と蛍光色素標識核酸断片を用いて試料核酸断片５０１を捕捉する。はじめに、反応容器内に捕捉配列付き磁気微粒子５０７を入れ、よく撹拌しておく。この溶液に検出したい試料核酸断片５０１の入った溶液を入れてから、よく混合して６時間インキュベートする。このとき、反応容器を上下に回転させるか、振とうして撹拌することでハイブリダイゼーション反応が早まる。混合する比率は、磁気微粒子５０７が目的の核酸断片に比べて過剰になるように混合する。具体的には、想定される試料分子数に対して１００から１００００倍量の磁気微粒子５０７を入れる。以上のように処理した反応液を実施例１、２と同様に観察する。
【実施例６】
【００３６】
本実施例では、生体分子分析装置の好ましい構成の一例について図６を参照しながら説明する。本実施例の生体分子分析装置は、生体分子を二次元に展開するための支持基板６０１に対して、解析対象の生体分子溶液、洗浄液を供給する手段と、磁気微粒子を支持基板上に引き付けるための手段、磁気微粒子を支持基板上に保持するための手段、支持基板において洗浄液に加温するための温度調節する手段と、支持基板に光を照射する手段と、蛍光標識付き分子の蛍光体の蛍光を測定する発光検出手段、支持基板６０１をスキャンする手段、を備える。【００３７】
より具体的には、支持基板を６０１可動ステージ６０４上に置き、流路を設けた流路部材をその上に貼り合せることで反応チャンバ６０５を形成する。流路部材には、例えばＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を使用することができる。注入口６０６には送液ポンプ６０７が接続されており、解析対象の生体試料溶液槽６０２、洗浄液槽６０３から生体試料溶液と洗浄液が順次、支持基板６０１へ供給され、使用後、廃液槽６１２に捨てられる。生体試料溶液が反応チャンバ内に入ると、磁場発生装置６０８が磁場を発生させ、支持基板６０１表面に磁気微粒子を引き付ける。引き付けられた磁気微粒子は支持基板表面の接着層に接触し、固定される。送液ポンプ６０７から洗浄液を反応チャンバ６０５内に入れ洗浄を行う。洗浄後、蛍光検出を行う。励起光源６０９は、用いる蛍光体の種類によって適切なものを選択できる。例えば、蛍光標識用の蛍光色素として、量子ドットを用いる場合には、光源に５３２nm（ＹＡＧレーザ）、または水銀ランプで対応できる。励起光源６０９から発する励起フィルタ６１６と励起光をレンズ６１７を通し、ダイクロイックミラー６１０によって対物レンズ６１１に導き、支持基板６０１上に照射する。支持基体６０１上の蛍光標識付き分子から発せられる蛍光は、励起光と同軸光路を逆に進み、対物レンズ６１１で集められた後ダイクロイックミラー６１０を通過し、結像レンズに６１３より２次元ＣＣＤカメラ６１４の感光面上に結像される。励起光の散乱光は吸収フィルタ６１５によって除去される。定量性を高めるためには観察する輝点数を増やす必要がある。可動ステージ６０４を動作させ、支持基板６０１全面をスキャンすることによって輝点数を増やすことができる。上記のように、送液ポンプ６０７、注入口６０６、励起光源６０９及び蛍光検出ユニット、磁場発生装置６０８、可動ステージ６０４で生体分子分析装置を組み上げることにより、自動分析を行うことができ高速化が図れる。
【実施例７】
【００３８】
本実施例では、磁気微粒子７０１の固定に用いられる磁石と支持基板との配置に関して、実施例１〜５との組み合わせで用いることが望ましい構成の一つを、図７を参照しながら説明する。本発明で使用する装置は平滑な支持基板７０２の表面をスキャニングするため、面積あたりに固定される磁気微粒子７０１が多いほうがスループットの面で有利である。一方で面積あたりの磁気微粒子７０１が多すぎると多層化してしまい、対物レンズの焦点深度内に収まらない磁気微粒子７０１が増え検出数が低下する。したがって、効率的な検出を実現するためには磁気微粒子７０１は高密度で固定されつつ、薄い層を形成していることが望ましい。そこで、支持基板７０２に対して平行な磁力線７０４を持つ強力な磁石７０３を用いた磁気微粒子７０１の固定方法を考案した。【００３９】
配置方法は次のとおりである。図7に示すように、はじめに支持基板７０２の上に磁気微粒子701を載せ、次に支持基板７０２を磁場発生装置７０３上に配置した。予め磁石７０３の磁力線の向きと強さを調べておき、支持基板７０２表面の中央部分における磁力線７０４の方向が平行になるように支持基板702を配置した。さらに数秒間固定反応を行うことで図８のようにライン状に磁気微粒子７０１を固定することができた。以上の配置位置を鋭意検討した結果、支持基板７０２は磁石７０３の表面かつ両極間のできるだけ中央部分に配置すること、支持基板７０２よりも大きい磁石７０３を使用すること、さらに磁束密度の高い磁石７０３を用いることで、より均一で迅速に固定できること分かった。【００４０】
固定原理は次のとおりである。図７のように通常の磁石は両極間に弧を描くような磁力線７０４を形成する。そのとき、磁石７０３表面の中央部分では両極間を平行に結ぶ帯状の磁力線７０４が形成される。本実施例で使用する磁気微粒子７０１は常磁性を有することから外部から磁場を与えることで各々磁化し、平行な磁力線７０４に従って磁気微粒子７０１同士で数珠状の直鎖を形成した（図８）。この際、磁石７０３の中心に発生する平行な磁力は両極に生じる磁力に比べると非常に弱い。そのため、配置した磁気微粒子７０１が両極に引っ張られないように極から十分に距離を置くことが望ましい。つまり、両極の中央部分に配置することが望ましく、十分に距離をおくことで固定の偏りを低減することができる。ここで言う十分とは、例えば、４mm角の支持基板７０２の中心から各極までの距離を４０mmにすることで達成できる。また、磁石７０３の中心部に発生する平行磁場は支持基板７０２上に磁気微粒子７０１を固定するため磁石７０３に対して垂直な磁力成分を要する。そのため比較的強力な磁力を持つ磁石７０３を選ぶことで固定速度を上げることができる。これは磁気微粒子７０１を高密度に固定する点においても有利であり、具体的には０．１T以上の表面磁束密度が望ましい。本実施例ではφ８ｃｍで０．５Ｔのネオジム磁石と４ｍｍ角の支持基板７０２を使用した。磁石７０３の極付近で磁気微粒子を引き付けると、支持基板に対して垂直方向に磁気微粒子の鎖が伸びてしまう。実際、同体積内（４×４×０．１３ｍｍ）に等量（２０ｐＭ）の磁気微粒子７０１（φ３００ｎｍ）を導入し、支持基板７０２に対して平行な磁束と垂直な磁束をそれぞれ与えた場合、支持基板７０２表面の同一の焦点深度内に収まる磁気微粒子密度は平行な磁束の方が約８倍高かった。これにより平行な磁束が磁気微粒子の高密度固定に有効であることが確認できた。
【符号の説明】
【００４１】
１０１、４０１  抗原
１０２、２０１、３０２、４０３、５０７  磁気微粒子
１０３、４０５  蛍光標識抗体
１０４、２０３、３０３、４０６、６０１  支持基板
１０５、２０４、３０４、４０７、５１１  接着層
１０６、２０５、３０５、６０８  磁場発生装置
１０７、２０９、６０４  可動ステージ
１０８  ピペット
１０９、２１０、６１１  対物レンズ
１１０  反応容器
２０２、３０１、５０４、５０６  蛍光色素
２０６、３０６  側壁
２０７、３０７  カバー材
２０８  チューブ
２１１、３０９  洗浄液
３０８  紫外光
３１０  可視光
３１１  捕捉分子
４０２  抗体
４０４  量子ドット
５０１  試料核酸断片
５０２  タグ分子
５０３  共通配列
５０５  核酸断片
５０８  捕捉配列
５０９  アビジン
５１０  支持基体
６０２  生体試料溶液槽
６０３  洗浄液槽
６０５  反応チャンバ
６０６  注入口
６０７  送液ポンプ
６０９  励起光源
６１０  ダイクロイックミラー
６１２  廃液槽
６１３  結像レンズ
６１４  ２次元ＣＣＤカメラ
６１５  吸収フィルタ
６１６  励起フィルタ
６１７  レンズ
７０１  磁気微粒子
７０２  支持基板
７０３  磁石
７０４  磁力線（磁束）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2014007034.tif 000010
【国際調査報告】
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2014007034.tif 000012
2014007034.tif 000013
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