(57)【要約】  免疫原として、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドをマウスに投与する工程と、前記マウスから抗体産生細胞を回収する工程と、前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、前記ハイブリドーマが産生する抗体と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドとを接触させ、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程と、前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程とを含む方法により得られるＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体等である。
2014042167.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原として、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドをマウスに投与する工程と、
前記マウスから抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
前記ハイブリドーマが産生する抗体と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドとを接触させ、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程と、
前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程とを含む方法により得られることを特徴とするＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体。
【請求項２】
エピトープが、配列番号１３に記載のアミノ酸配列内にあることを特徴とするＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１から２のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであって、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１４０６であることを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項４】
被検体由来の試料中におけるＥＢＡＧ９を請求項１から２のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を用いて測定する工程と、
前記測定結果を指標として、内分泌療法薬に耐性を有する乳癌か否かを評価する工程とを含むことを特徴とする内分泌療法薬耐性乳癌の予測方法。
【請求項５】
請求項１から２のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含むことを特徴とする内分泌療法薬耐性乳癌の予測用診断薬又はキット。
【請求項６】
請求項１から２のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含むことを特徴とする腫瘍増殖抑制剤。
【請求項７】
請求項１から２のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含むことを特徴とする癌転移抑制剤。
【請求項８】
請求項６に記載の腫瘍増殖抑制剤、及び請求項７に記載の癌転移抑制剤の少なくともいずれかを含むことを特徴とする医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を用いた内分泌療法薬耐性乳癌の予測方法、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む内分泌療法薬耐性乳癌の予測用診断薬又はキット、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む腫瘍増殖抑制剤、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む癌転移抑制剤、並びに、前記腫瘍増殖抑制剤及び前記癌転移抑制剤の少なくともいずれかを含む医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、４０歳以上の女性に多く、日本においても増加の傾向にある。前記乳癌は、エストロゲン受容体陽性のものが多く、抗エストロゲン剤等の内分泌療法薬を用いた内分泌療法が奏功することが知られている。しかしながら、乳癌の中には、治療過程において、内分泌療法薬に対する抵抗性（耐性）を獲得するものが多く、予後不良となるため問題となっている。そのため、内分泌療法薬に対する耐性を獲得する乳癌か否かを早期に診断することを可能とする技術が求められている。【０００３】
ＥＢＡＧ９（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ９）は、エストロゲン応答遺伝子として単離され、その後の研究で、癌細胞の糖鎖修飾に関与し、免疫系からの回避に関与することが明らかにされている。また、ＥＢＡＧ９は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、精巣腫瘍、脳腫瘍、子宮癌、甲状腺癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、大腸癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉咽頭癌、扁平上皮癌、悪性リンパ腫、悪性中皮腫、ページェット病での発現が報告されており、癌の進展、転移に関わると考えられている。【０００４】
これまでに、免疫原として、前記ＥＢＡＧ９の全長を用いて、ＥＢＡＧ９に対するポリクローナル抗体を作製し、前記ポリクローナル抗体と乳癌サンプルとを用いた免疫染色法による解析が行われている（例えば、非特許文献１参照）。前記解析では、ＥＢＡＧ９の免疫染色性は、エストロゲン受容体の免疫染色性と相関すること、並びに腫瘍組織内へのＣＤ３陽性Ｔ細胞の浸潤の減少と相関することが示されている。しかしながら、内分泌療法薬に対する耐性を獲得する乳癌か否か等の乳癌の予後との関係は、解明されていない。【０００５】
したがって、内分泌療法薬に対する耐性を獲得する乳癌か否かを早期に診断することを可能とする技術は未だ開発されておらず、その速やかな開発が強く求められている。【０００６】
また、上述のようにＥＢＡＧ９は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、精巣腫瘍、脳腫瘍、子宮癌、甲状腺癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、大腸癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉咽頭癌、扁平上皮癌、悪性リンパ腫、悪性中皮腫、ページェット病での発現が報告されており、ＥＢＡＧ９に対する抗体が癌の予防乃至治療に有効となり得ると考えられるものの、未だそのような抗体は提供されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＢＡＧ９／ＲＣＡＳ１  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：  ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−ｉｍｍｕｎｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００１  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；  ８５（１１）：１７３１−１７３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、内分泌療法薬に対する耐性を獲得する乳癌か否かの診断に用いることができ、また腫瘍の増殖や癌の転移を抑制することも可能なＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む内分泌療法薬耐性乳癌の予測用診断薬又はキット、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む腫瘍増殖抑制剤、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む癌転移抑制剤、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む癌転移抑制剤、並びに、前記腫瘍増殖抑制剤及び前記癌転移抑制剤の少なくともいずれかを含む医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、免疫原として、ＥＢＡＧ９の特定の部分を用いて作製したＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を用いることで、内分泌療法薬耐性乳癌を予測でき、また腫瘍の増殖を抑制したり、癌の転移を抑制したりすることも可能であることを知見し、本発明の完成に至った。【００１０】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  免疫原として、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドをマウスに投与する工程と、
前記マウスから抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
前記ハイブリドーマが産生する抗体と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドとを接触させ、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程と、
前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程とを含む方法により得られることを特徴とするＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体である。
＜２＞  エピトープが、配列番号１３に記載のアミノ酸配列内にあることを特徴とするＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体である。
＜３＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであって、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１４０６であることを特徴とするハイブリドーマである。
＜４＞  被検体由来の試料中におけるＥＢＡＧ９を前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を用いて測定する工程と、
前記測定結果を指標として、内分泌療法薬に耐性を有する乳癌か否かを評価する工程とを含むことを特徴とする内分泌療法薬耐性乳癌の予測方法である。
＜５＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含むことを特徴とする内分泌療法薬耐性乳癌の予測用診断薬又はキットである。
＜６＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含むことを特徴とする腫瘍増殖抑制剤である。
＜７＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含むことを特徴とする癌転移抑制剤である。
＜８＞  前記＜６＞に記載の腫瘍増殖抑制剤、及び前記＜７＞に記載の癌転移抑制剤の少なくともいずれかを含むことを特徴とする医薬である。
＜９＞  癌を予防乃至治療するための方法であって、個体に、前記＜６＞に記載の腫瘍増殖抑制剤、前記＜７＞に記載の癌転移抑制剤、及び前記＜８＞に記載の医薬の少なくともいずれかを投与することを特徴とする方法である。
＜１０＞  免疫原として、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドをマウスに投与する工程と、
前記マウスから抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
前記ハイブリドーマが産生する抗体と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドとを接触させ、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程と、
前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程とを含むことを特徴とするＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の製造方法である。
＜１１＞  ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの製造方法であって、
免疫原として、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドをマウスに投与する工程と、
前記マウスから抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
前記ハイブリドーマが産生する抗体と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドとを接触させ、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程とを含むことを特徴とするハイブリドーマの製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、内分泌療法薬に対する耐性を獲得する乳癌か否かの診断に用いることができ、また腫瘍の増殖や癌の転移を抑制することも可能なＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む内分泌療法薬耐性乳癌の予測用診断薬又はキット、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む腫瘍増殖抑制剤、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む癌転移抑制剤、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含む癌転移抑制剤、並びに、前記腫瘍増殖抑制剤及び前記癌転移抑制剤の少なくともいずれかを含む医薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ヒトＥＢＡＧ９タンパク質及び免疫原として用いた部分を模式的に示した図である。
【図２】図２は、製造例１における一次スクリーニングにより選択されたハイブリドーマが産生するＥＢＡＧ９モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図３】図３は、製造例１における単クローン化したハイブリドーマが産生するＥＢＡＧ９モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図４】図４は、試験例１におけるウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図５】図５は、試験例２における免疫組織化学的染色結果の一例を示す図である。
【図６】図６は、試験例２における免疫組織化学的染色結果の他の一例を示す図である。
【図７】図７は、試験例２におけるＥＢＡＧ９の免疫反応性に基づく乳癌患者の生存解析の結果を示す図である。
【図８】図８は、試験例３の「エピトープの同定−１」におけるウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図９】図９は、試験例３の「エピトープの同定−２」におけるウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、試験例４の１秒間当たりの発光量を測定した結果のグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、試験例４のインビボイメージング装置で撮影した写真の一例である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、試験例４における肺転移を調べた写真の一例である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、試験例４における転移巣の数を測定した結果のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（モノクローナル抗体及びその製造方法）
本発明のモノクローナル抗体は、ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体であって、以下のモノクローナル抗体の製造方法により製造することができる。
以下、モノクローナル抗体の製造方法の説明と併せて本発明のモノクローナル抗体を説明する。
【００１４】
＜モノクローナル抗体の製造方法＞
前記モノクローナル抗体の製造方法は、免疫原を投与する免疫原投与工程と、抗体産生細胞を回収する抗体産生細胞回収工程と、ハイブリドーマを調製するハイブリドーマ調製工程と、ハイブリドーマを選択するハイブリドーマ選択工程と、抗体を回収する抗体回収工程とを含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００１５】
＜＜免疫原投与工程＞＞
前記免疫原投与工程は、免疫原として、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドをマウスに投与する工程である。
【００１６】
−免疫原−
前記免疫原としては、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のみからなるポリペプチド、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）タンパク質を融合させたポリペプチド（融合タンパク質）等が挙げられる。これらの中でも、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）タンパク質を融合させたポリペプチドが、水溶性が高く、精製が容易な点で、好ましい。
【００１７】
前記配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ヒトＥＢＡＧ９タンパク質の４８番目から２１３番目のアミノ酸に相当する。前記ヒトＥＢＡＧ９タンパク質は、２つの機能ドメインとして、Ｎ末端側の膜貫通ドメインと、Ｃ末端側のコイルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ）ドメインとを有している。前記配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ヒトＥＢＡＧ９タンパク質の膜貫通ドメインは含まず、コイルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ）ドメイン含む１６６のアミノ酸配列からなる（図１参照）。
前記配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをプラスミドに組み込み、前記プラスミドを宿主細胞に導入し、発現させることにより調製する方法等が挙げられる。
前記配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成により調製する方法、ＥＢＡＧ９を発現している細胞からトータルＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成することにより調製する方法等が挙げられる。
前記プラスミドとしては、特に制限はなく、宿主細胞に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐＧＥＸベクター等が挙げられる。
前記宿主細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌等が挙げられる。前記宿主細胞の培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドの精製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜採用することができる。
【００１８】
前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にＧＳＴタンパク質を融合させたポリペプチドの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知のＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターに前記配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを組み込み、前記ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより調製する方法等が挙げられる。
前記配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製する方法は、上記と同様の方法が挙げられる。
前記ＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターとしては、特に制限はなく、宿主細胞に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐＧＥＸベクター等が挙げられる。
前記宿主細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大腸菌等が挙げられる。前記宿主細胞の培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にＧＳＴタンパク質を融合させたポリペプチドの精製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜採用することができ、例えば、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて精製する方法等が挙げられる。
【００１９】
−マウス−
前記マウスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス等が挙げられる。
【００２０】
−投与−
前記免疫原を投与する方法（マウスを免疫する方法）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、アジュバントとともに投与することが、前記マウスの免疫原への免疫応答性を高めることができる点で、好ましい。
前記アジュバントとしては、特に制限はなく、公知のアジュバントを適宜選択することができ、例えば、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２１】
前記免疫原の投与は、１回であってもよいし、複数回であってもよい。前記免疫原の投与を複数回行う場合に使用するアジュバントは、各回同一であってもよいし、異なっていてもよい。
前記免疫原の投与を複数回行う場合の投与間隔としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記免疫原の投与量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記アジュバントの投与量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記免疫原及びアジュバントの投与部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２２】
＜＜抗体産生細胞回収工程＞＞
前記抗体産生細胞回収工程は、前記マウスから抗体産生細胞を回収する工程である。
【００２３】
−抗体産生細胞回収−
前記抗体産生細胞を回収する時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、最後の免疫原の投与から３日間後とする等が挙げられる。
前記抗体産生細胞の回収方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マウスの両足から肥大したリンパ節を取り出し、細胞をたたき出し、遠心して回収する方法等が挙げられる。
【００２４】
＜＜ハイブリドーマ調製工程＞＞
前記ハイブリドーマ調製工程は、前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程である。
【００２５】
−ミエローマ−
前記ミエローマの由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、マウス由来のものが好ましい。
前記マウス由来のミエローマとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｐ３Ｕ１、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４等が挙げられる。
【００２６】
−細胞融合−
前記細胞融合の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ポリエチレングリコールを用いる方法（ＰＥＧ法）、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法等が挙げられる。
前記細胞融合された細胞の選択方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、選択培地として、ヒポキサン−アミノプテリン−チミジン培地（ＨＡＴ培地）を用いて細胞を培養する方法等が挙げられる。前記ＨＡＴ培地を用いることにより、親細胞株が死滅し、細胞融合された細胞のみが増殖する。
【００２７】
＜＜ハイブリドーマ選択工程＞＞
前記ハイブリドーマ選択工程は、前記ハイブリドーマが産生する抗体と、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＥＢＡＧ９タンパク質の全長のアミノ酸配列は含まないポリペプチドとを接触させる処理を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の処理を含む。前記ハイブリドーマ選択工程により、前記ＥＢＡＧ９に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【００２８】
−選択−
前記選択工程における処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥＬＩＳＡ法による処理、ウエスタンブロット法による処理等が挙げられる。これらは、単独で行なってもよいし、併用してもよいが、併用することが好ましい。
前記処理の回数としては、特に制限はなく、１回であってもよいし、複数回であってもよい。
【００２９】
前記ＥＬＩＳＡ法としては、例えば、前記免疫原として、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にＧＳＴタンパク質を融合させたポリペプチドを用いた場合には、例えば、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にＧＳＴタンパク質を融合させたポリペプチド、又はＧＳＴタンパク質を感作用プレートに固相化し、次いで、前記ハイブリドーマが産生する抗体が含まれる培養上清を加え反応させた後、酵素標識抗マウスＩｇＧを加えて反応させ、次いで、酵素基質（発色剤）を加え、発色させた後、波長４５０ｎｍの吸光度を測定する方法等が挙げられる。
ここで、前記ＧＳＴタンパク質を固相化したプレートに対する反応性が高いものを除き、かつ、前記配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端にＧＳＴタンパク質を融合させたポリペプチドを固相化したプレートに対する反応性が高いものを選択することで、よりＥＢＡＧ９に特異的な抗体を産生しているハイブリドーマを選択することができる。
【００３０】
前記ウエスタンブロット法としては、例えば、全長のヒトＥＢＡＧ９を発現する細胞の溶解液を調製し、前記溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離後、一次抗体として、前記ハイブリドーマが産生する抗体を用い、二次抗体として、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識された抗体を用い、発光シグナルを検出することにより行う方法等が挙げられる。
前記ＥＬＩＳＡ法と組み合わせることにより、よりＥＢＡＧ９に特異的な抗体を産生しているハイブリドーマを選択することができる。
【００３１】
前記選択したハイブリドーマを分離する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セルソーターを用いる方法等が挙げられる。
【００３２】
＜＜抗体回収工程＞＞
前記抗体回収工程は、前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程である。
【００３３】
−抗体回収−
前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ハイブリドーマの培養上清から回収する方法、ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から回収する方法等が挙げられる。
【００３４】
前記ハイブリドーマの培養上清から回収する方法における前記ハイブリドーマの培養方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、静置培養、高密度培養、スピナーフラスコによる培養等が挙げられる。前記各培養の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３５】
前記ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から回収する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、プリスタン等の免疫抑制作用を有する物質を投与したマウスの腹腔内へ前記ハイブリドーマを移植し、約１週間後から３週間後に腹水を採取する方法等が挙げられる。
【００３６】
＜＜その他の工程＞＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製工程等が挙げられる。
【００３７】
−精製工程−
前記精製工程は、前記回収工程により回収された抗体を精製する工程である。
前記精製の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＡを充填したカラムに培養上清をアプライし、精製する方法等が挙げられる。
【００３８】
＜モノクローナル抗体＞
本発明のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体は、後述する試験例３に示すように、エピトープが配列番号１３に記載のアミノ酸配列内にある。
本発明のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体は、ヒトＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体として好適に利用可能である。
また、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体は、後述する内分泌療法薬耐性乳癌の予測方法、内分泌療法薬耐性乳癌の予測用診断薬又はキットとして好適に利用可能である。
【００３９】
（ハイブリドーマ及びその製造方法）
本発明のハイブリドーマは、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであって、以下のハイブリドーマの製造方法により製造することができる。
以下、ハイブリドーマの製造方法の説明と併せて本発明のハイブリドーマを説明する。
【００４０】
＜ハイブリドーマの製造方法＞
前記ハイブリドーマの製造方法は、免疫原を投与する免疫原投与工程と、抗体産生細胞を回収する抗体産生細胞回収工程と、ハイブリドーマを調製するハイブリドーマ調製工程と、ハイブリドーマを選択するハイブリドーマ選択工程とを含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００４１】
＜＜免疫原投与工程＞＞
前記免疫原投与工程は、前記モノクローナル抗体の製造方法における免疫原投与工程と同様に行うことができる。
【００４２】
＜＜抗体産生細胞回収工程＞＞
前記抗体産生細胞回収工程は、前記モノクローナル抗体の製造方法における抗体産生細胞回収工程と同様に行うことができる。
【００４３】
＜＜ハイブリドーマ調製工程＞＞
前記ハイブリドーマ調製工程は、前記モノクローナル抗体の製造方法におけるハイブリドーマ調製工程と同様に行うことができる。
【００４４】
＜＜ハイブリドーマ選択工程＞＞
前記ハイブリドーマ選択工程は、前記モノクローナル抗体の製造方法におけるハイブリドーマ選択工程と同様に行うことができる。
【００４５】
＜＜その他の工程＞＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４６】
＜ハイブリドーマ＞
本発明のハイブリドーマＣ５７−８株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、寄託申請し、２０１２年８月１５日に国内寄託され、その後、２０１３年７月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託への移管請求がされ、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１４０６として国際寄託されている。
【００４７】
（内分泌療法薬耐性乳癌の予測方法）
本発明の内分泌療法薬耐性乳癌の予測方法は、ＥＢＡＧ９を測定する測定工程と、内分泌療法薬に耐性を有する乳癌か否かを評価する評価工程とを含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００４８】
＜測定工程＞
前記測定工程は、被検体由来の試料中におけるＥＢＡＧ９を前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を用いて測定する工程である。
【００４９】
＜＜被検体由来の試料＞＞
前記被検体由来の試料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳癌組織、子宮癌組織、前立腺癌組織、膀胱癌組織、腎癌組織、肺癌組織、肝癌組織、卵巣癌組織、大腸癌組織、胃癌組織、精巣腫瘍組織、脳腫瘍組織、甲状腺癌組織、胆嚢癌組織、胆管癌組織、膵癌組織、食道癌組織、喉咽頭癌組織、扁平上皮癌組織、悪性リンパ腫組織、悪性中皮腫組織、ページェット病組織等が挙げられる。前記被検体由来の試料の採取方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００５０】
＜＜測定＞＞
前記測定の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、免疫組織化学的染色による方法等が挙げられる。
前記免疫組織化学的染色の方法としては、例えば、Ｄａｋｏ社のＥｎＶｉｓｉｏｎ＋  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ等を用いて行うことができる。具体的には、乳癌組織切片を前処理した後、一次抗体として、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を用いて反応させ、次いで、二次抗体として、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ標識したＥｎｖｉｓｉｏｎ＋  ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒを用いて反応させ、抗原抗体複合体を形成する。前記抗原抗体複合体の可視化の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ社の３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  （ＤＡＢ）  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ等を用いて行うことができる。
以上のようにして染色された乳癌組織切片を顕微鏡下で観察し、視野内の全細胞における染色された陽性細胞の存在の有無や、割合を測定する。
なお、前記乳癌組織以外の組織の癌の場合も同様にして、免疫組織化学的染色を行うことができる。
【００５１】
＜評価工程＞
前記評価工程は、前記測定結果を指標として、内分泌療法薬に耐性を有する乳癌か否かを評価する工程である。
【００５２】
＜＜内分泌療法薬＞＞
前記内分泌療法薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抗エストロゲン剤、アロマターゼ阻害剤等が挙げられる。
前記抗エストロゲン剤としては、例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン等が挙げられる。
前記アロマターゼ阻害剤としては、例えば、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール等が挙げられる。
これらの中でも、本発明の予測方法では、タモキシフェンに対する耐性を獲得する乳癌か否かを好適に予測できる。
【００５３】
＜＜評価＞＞
前記評価では、前記測定結果を指標として、ＥＢＡＧ９陽性の乳癌であると判断された場合に、内分泌療法薬耐性乳癌であると評価することができる。
前記ＥＢＡＧ９陽性の乳癌であるか否かの判断方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、顕微鏡観察における視野内に、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体に対する陽性細胞が検出された場合や、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体陽性細胞の割合が５０％以上の場合にＥＢＡＧ９陽性の乳癌であると判断する方法等が挙げられる。これらの中でも、顕微鏡観察における視野内に前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体陽性細胞の割合が５０％以上の場合にＥＢＡＧ９陽性の乳癌であると判断する方法が好ましい。
前記顕微鏡としては、例えば、光学顕微鏡（ＤＭＬＢ  １００Ｓ、Ｌｅｉｃａ社製）等が挙げられる。前記評価は、病理学者が行うことが好ましい。
なお、前記乳癌組織以外の組織の癌の場合も同様にして、評価を行うことができる。
【００５４】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、被検体由来の試料を調製する試料調製工程等が挙げられる。
前記試料調製工程の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５５】
（内分泌療法薬耐性乳癌の予測用診断薬又はキット）
前記内分泌療法薬耐性乳癌の予測用診断薬又はキットは、前記した本発明のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
【００５６】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、公知の診断薬又は診断キットに用いられている構成を目的に応じて適宜選択することができ、例えば、標識、緩衝液、プレート、反応停止液等が挙げられる。前記標識の具体例としては、酵素とその発色基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、着色物質等が挙げられる。
【００５７】
（腫瘍増殖抑制剤）
前記腫瘍増殖抑制剤は、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００５８】
＜ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体＞
前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の詳細としては、前記した本発明のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の項目に記載したとおりである。
前記腫瘍増殖抑制剤中の前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記腫瘍増殖抑制剤は、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体そのものであってもよい。
【００５９】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体等が挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、剤形等に応じて適宜選択することができる。
前記腫瘍増殖抑制剤中の前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６０】
＜腫瘍＞
前記腫瘍増殖抑制剤の適用対象となる腫瘍としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、乳癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、肺癌、肝癌、卵巣癌、大腸癌、胃癌、精巣腫瘍、脳腫瘍、甲状腺癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、食道癌、喉咽頭癌、扁平上皮癌、悪性リンパ腫、悪性中皮腫、ページェット病が好ましく、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌がより好ましく、乳癌が特に好ましい。
【００６１】
前記腫瘍増殖抑制剤は、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含むので、腫瘍の増殖を効果的に抑制することができる。したがって、本発明は、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を腫瘍に作用させることを特徴とする、腫瘍の増殖抑制方法にも関する。
【００６２】
（癌転移抑制剤）
前記癌転移抑制剤は、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００６３】
＜ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体＞
前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の詳細としては、前記した本発明のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の項目に記載したとおりである。
前記癌転移抑制剤中の前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記癌転移抑制剤は、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体そのものであってもよい。
【００６４】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体等が挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、剤形等に応じて適宜選択することができる。
前記癌転移抑制剤中の前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６５】
＜癌＞
前記癌転移抑制剤の適用対象となる癌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、乳癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、肺癌、肝癌、卵巣癌、大腸癌、胃癌、精巣腫瘍、脳腫瘍、甲状腺癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、食道癌、喉咽頭癌、扁平上皮癌、悪性リンパ腫、悪性中皮腫、ページェット病が好ましく、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌がより好ましく、乳癌が特に好ましい。例えば、前記癌転移抑制剤は、癌の肺への転移を好適に抑制することができる。
【００６６】
前記癌転移抑制剤は、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含むので、癌の転移を効果的に抑制することができる。したがって、本発明は、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、癌の転移抑制方法にも関する。
【００６７】
（医薬）
前記医薬は、前記腫瘍増殖抑制剤及び前記癌転移抑制剤の少なくともいずれかを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００６８】
＜腫瘍増殖抑制剤、癌転移抑制剤＞
前記腫瘍増殖抑制剤の詳細としては、前記した本発明の腫瘍増殖抑制剤の項目に記載したとおりである。
前記癌転移抑制剤の詳細としては、前記した本発明の癌転移抑制剤の項目に記載したとおりである。
前記医薬中の前記腫瘍増殖抑制剤及び前記癌転移抑制剤の少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬は、前記腫瘍増殖抑制剤そのものであってもよいし、前記癌転移抑制剤そのものであってもよいし、前記腫瘍抑制剤及び前記癌転移抑制剤のみからなるものであってもよい。
【００６９】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体等が挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、剤形等に応じて適宜選択することができる。
前記医薬中の前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７０】
＜適用対象＞
前記医薬の適用対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、乳癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、肺癌、肝癌、卵巣癌、大腸癌、胃癌、精巣腫瘍、脳腫瘍、甲状腺癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、食道癌、喉咽頭癌、扁平上皮癌、悪性リンパ腫、悪性中皮腫、ページェット病が好ましく、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌がより好ましく、乳癌が特に好ましい。
【００７１】
＜剤形＞
前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬の剤形としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等が挙げられる。
【００７２】
前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等が挙げられる。
前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。
前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
【００７３】
前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００７４】
前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。
前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。
前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が挙げられる。
前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。
【００７５】
前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。
前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。
【００７６】
前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。
前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シート等が挙げられる。
【００７７】
＜投与＞
前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬の投与対象動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらの中でも、ヒトが特に好ましい。
【００７８】
前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記腫瘍増殖抑制剤、及び前記医薬の剤型、疾患の種類、患者の状態等に応じて、局所投与、全身投与のいずれかを選択することができる。
例えば、局所投与においては、前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬の有効成分（前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体）を、所望の部位（例えば、腫瘍部位）に直接注入することにより投与することができる。前記注入には、注射等の従来公知の手法を適宜利用することができる。
また、全身投与（例えば、経口投与、腹腔内投与、血液中への投与等）においては、前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬の有効成分（前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体）が所望の部位（例えば、腫瘍部位）まで安定に、かつ効率良く送達されるよう、従来公知の薬剤送達技術を適宜応用することが好ましい。
【００７９】
前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。
前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬の投与回数としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。
前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記疾患に対して、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。
【００８０】
（癌を予防乃至治療するための方法）
前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬は、前記ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含むので、癌を患う個体に投与することにより、腫瘍の増殖の抑制や、癌の転移を抑制することができ、癌を予防乃至治療することができる。したがって、本発明は、個体に、前記腫瘍増殖抑制剤、前記癌転移抑制剤、及び前記医薬の少なくともいずれかを投与することを特徴とする、癌の予防乃至治療方法にも関する。
前記癌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、乳癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、肺癌、肝癌、卵巣癌、大腸癌、胃癌、精巣腫瘍、脳腫瘍、甲状腺癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、食道癌、喉咽頭癌、扁平上皮癌、悪性リンパ腫、悪性中皮腫、ページェット病が好ましく、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌がより好ましく、乳癌が特に好ましい。
【実施例】
【００８１】
以下、製造例、試験例を挙げて、本発明を説明するが、本発明は、以下の製造例、試験例に何ら限定されるものではない。【００８２】
（製造例１：ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の製造）
＜プラスミド１の構築＞
配列番号１に記載のアミノ酸配列（ヒトＥＢＡＧ９タンパク質（全長：２１３アミノ酸）のＮ末端側の４８番目のアミノ酸から２１３番目のアミノ酸に相当（Ｎ末端の１番目から４７番目のアミノ酸を欠く））に相当するｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製し、ＧＳＴタンパク質とＥＢＡＧ９タンパク質の４８番目から２１３番目のアミノ酸との融合タンパク質を発現するプラスミド（ｐＧＥＸ−ｈＥＢＡＧ９（４８−２１３））を以下のようにして作製した。
ＥＢＡＧ９の全長ｃＤＮＡ（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １８（１）：４４２−４４９，  １９９８）を鋳型として、下記配列番号２及び３の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。
配列番号２：５’−ｃｃｇｇａａｔｔｃｔｔａｔｔｃａｔｃａｇｔｔｃｃｔａａｇｃａｇａｃ−３’
配列番号３：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔａｔｇａａａｇｔｔｔｃａｃａｃｃａａｔｔｔｔ−３’
前記ＰＣＲにより得られた増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化した後、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化したｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に挿入し、ＧＳＴタンパク質とＥＢＡＧ９タンパク質の４８番目から２１３番目のアミノ酸との融合タンパク質を発現するプラスミド（ｐＧＥＸ−ｈＥＢＡＧ９（４８−２１３））を作製した。なお、前記融合タンパク質は、前記ＥＢＡＧ９タンパク質の４８番目から２１３番目のアミノ酸のＮ末端側にＧＳＴタンパク質が融合されている。【００８３】
＜免疫原の調製＞
前記プラスミド１を大腸菌ＢＬ２１（タカラバイオ株式会社）に形質転換した。
前記形質転換した大腸菌を以下のようにして、培養、回収、精製し、配列番号４に記載のＧＳＴ融合ＥＢＡＧ９（４８−２１３）タンパク質を調製した。
２００ｍＬのＬ−Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ培地）２本に前記形質転換した大腸菌を入れ、３０℃で振盪培養し、６００ｎｍの吸光度が０．６〜０．８になるまで培養した。その後、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．１ｍＭになるように添加し、更に３０℃で２時間振盪培養した。
前記培養液を５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心した沈殿を５ｍＬの溶液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、８０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）、０．５ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）、０．５ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で懸濁し、ソニケート（３０秒間を４回）した。
次いで、１０，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間遠心した上清に、５００μＬのグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を加え、４℃で１時間混合して吸着させた後、遠心操作によってＰＢＳで３回洗浄した。最後の洗浄後、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）１ｍＬを入れて懸濁し、１０分間静置した後、５００×ｇ、４℃、５分間遠心してＧＳＴ融合ＥＢＡＧ９（４８−２１３）タンパク質が含まれる上清を回収した。この工程を３回繰り返し、２．５ｍｇのＧＳＴ融合ＥＢＡＧ９（４８−２１３）タンパク質を精製した。
このようにして得られたＧＳＴ融合ＥＢＡＧ９（４８−２１３）タンパク質を免疫原とした。【００８４】
＜免疫原投与工程＞
前記精製したＧＳＴ融合ＥＢＡＧ９（４８−２１３）タンパク質の１ｍｇ／ｍＬ溶液と、アジュバントとを等量混和し、エマルジョンとした。前記エマルジョンをマウス（日本エスエルシー株式会社製）の足裏に５０μＬ投与した。前記免疫原の投与は、１週間おきに３回行った。なお、前記アジュバントは、１回目の投与では、Ｓｉｇｍａ社製のＣａｔ  Ｎｏ  Ｆ５８８１  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅを用い、２回目以降の投与では、Ｓｉｇｍａ社製のＣａｔ  Ｎｏ  Ｆ５５０６  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅを使用した。【００８５】
＜抗体産生細胞回収工程＞
前記免疫原投与工程の最後の免疫原の投与から３日間後に免疫したマウスの両足から肥大したリンパ節を取り出し、細胞をたたき出し、１，４００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を回収した。【００８６】
＜ハイブリドーマ調製工程＞
ミエローマ細胞は、Ｐ３Ｕ１細胞を用い、培養フラスコで増殖させたもの（７５ｃｍ２フラスコ４本分）を回収した。
前記抗体産生細胞回収工程で回収した細胞（マウス２匹から回収）と、前記Ｐ３Ｕ１とを混和し、１，４００ｒｐｍで５分間遠心した。ペレットにＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液（ＲＰＭＩ培地で等量希釈）を加え、細胞融合を行った。
前記細胞融合を行った細胞を洗浄し、次いで、細胞を懸濁した後、９６穴プレートに播種した。コロニー形成が確認されたら、後述のハイブリドーマ選択工程における一次スクリーニングを行った。なお、９６穴プレートにおける培地は、ＨＡＴ培地（ＨＡＴ／１５％ＦＢＳ／ＰＳ／ＲＰＭＩ；アミノプテリン（ＳＩＧＭＡ社製  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ３４１１、ＨＴ（ＧＩＢＣＯ社製  Ｃａｔ．Ｎｏ  １１０６７−０３０））を用いた。【００８７】
＜ハイブリドーマ選択工程＞
−一次スクリーニング−
前記一次スクリーニングはＥＬＩＳＡにより行った。
まず、前記免疫原とした融合タンパク質、又はＧＳＴタンパク質をＰＢＳ（０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水）で希釈し、５μｇ／ｍＬに調製した後、感作用プレート（ＮＵＮＣ社製  Ｃａｔ  Ｎｏ  ４６８６６７）に５０μＬ／穴分注し、４℃で一晩静置した。その後、タンパク質溶液を除去し、ブロッキング  バッファー（株式会社医学生物学研究所製）を１００μＬ／穴分注し、４℃で一晩静置した。なお、前記ＧＳＴタンパク質は、前記免疫原とした融合タンパク質の調製において、プラスミド１をｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクター（ＥＢＡＧ９の部分配列が組み込まれていないベクター）に代えた以外は、前記免疫原とした融合タンパク質の調製と同様にして、調製した。
前記コロニー形成が確認された各培養上清を５０μＬ／穴加え、室温で６０分間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、ＰＯＤ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（＃３３０、株式会社医学生物学研究所製）を青バッファー（株式会社医学生物学研究所製希釈液）で１０，０００倍に希釈したものを５０μＬ／穴加え、室温で６０分間反応させた。３回洗浄後、発色基質（株式会社医学生物学研究所製）を加え１０分間から１５分間発色させた。その後、４５０ｎｍ及び６２０ｎｍで吸光度測定を行った。なお、前記６２０ｎｍはバックグラウンド測定用であり、４５０ｎｍでサンプルの評価を行った。【００８８】
前記一次スクリーニングを行い、最終的に、前記免疫原とした融合タンパク質のプレートに対する反応性が、吸光度測定の結果、ＯＤ値０．２以上であり、ＧＳＴタンパク質のプレートに対する反応性が、ＯＤ値０．２以下であるハイブリドーマ株が３２種得られた。表１−１に免疫原とした融合タンパク質のプレートに対する反応性の測定結果を示し、表１−２にＧＳＴタンパク質のプレートに対する反応性の測定結果を示し、表１−３にハイブリドーマのクローンリストを示す。表１−３中、カッコ書きは選択されなかったハイブリドーマ株を示し、それ以外は選択されたハイブリドーマ株を示す。【００８９】
【表１−１】
2014042167.tif 000003
【００９０】
【表１−２】
2014042167.tif 000004
【００９１】
【表１−３】
2014042167.tif 000005
【００９２】
−ウエスタンブロット解析−
−−細胞溶解液の調製−−
−−−プラスミド２の構築−−−
ヒトＥＢＡＧ９（ｈＥＢＡＧ９）タンパク質（全長、ただし１番目のメチオニンを除く）のＮ末端にＦｌａｇタグを付加した融合タンパク質に相当するＤＮＡ配列をｐｃＤＮＡ３プラスミドにサブクローニングし、発現プラスミド２（ｐＣＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＥＢＡＧ９）を以下のようにして構築した。
ＥＢＡＧ９の全長ｃＤＮＡ（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １８（１）：４４２−４４９，  １９９８）を鋳型として、下記配列番号５及び６の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。
配列番号５：５’−ｃｃｇｇａａｔｔｃｇｃｃａｔｃａｃｃｃａｇｔｔｔｃｇｇｔｔａｔｔｔ−３’
配列番号６：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔａｔｇａａａｇｔｔｔｃａｃａｃｃａａｔｔｔｔ−３’
前記ＰＣＲにより得られた増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化した後、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化したｐｃＤＮＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した。更に、Ｆｌａｇタグ配列をＢａｍＨＩ認識配列（５’側）とＥｃｏＲＩ認識配列（３’側）で挟んだ配列を有する合成ＤＮＡを作製し、前記ベクターのＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ部位に挿入して、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ−ｈＥＢＡＧ９を作製した。なお、前記融合タンパク質は、前記ＥＢＡＧ９タンパク質の２番目から２１３番目のアミノ酸のＮ末端側にＦｌａｇ配列が融合されている（配列番号７参照）。【００９３】
−−−細胞溶解液１の調製−−−
ヒト腎由来２９３Ｔ細胞にベクターｐｃＤＮＡ３のみ（コントロール）をトランスフェクションした。得られた細胞をＰＢＳで洗浄した後、スクレイプして培養ディッシュより剥がして集め、これを溶解バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．５％  ＮＰ−４０、１ｍＭ  Ｎａ３Ｖｏ４、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁して４℃、５０分間ゆるやかに振盪し、１４，０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心した上清を回収し、細胞溶解液１を調製した。【００９４】
−−−細胞溶解液２の調製−−−
細胞溶解液１の調製において、ベクターｐｃＤＮＡ３を用いていた点を、前記発現プラスミド２に代えた以外は、前記細胞溶解液１の調製と同様にして、細胞溶解液２を調製した。【００９５】
−−ウエスタンブロット−−
前記各細胞溶解液２０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離後、前記一次スクリーニングにより選択されたハイブリドーマＢ１５、Ｂ１６、Ｃ３３、Ｃ３５、Ｃ３６、Ｃ５７、Ｃ６３、Ｂ６５、Ｃ７６、Ｃ７７、Ｃ８０及びＣ９５が産生する抗体を一次抗体（１００倍希釈）として用い、以下の手順により、ウエスタンブロットを行った。なお、コントロールとして、一次抗体として、抗Ｆｌａｇ抗体（３，０００倍希釈）を用いたものも試験した。
前記ウエスタンブロットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）へブロッティングした膜を、前記一次抗体とともに室温で１時間、又は４℃で１２時間、ＴＢＳＴバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中で静置した後、二次抗体として、ＨＲＰ（西洋ワサビパーオキシダーゼ）標識された二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）とともに室温で１時間反応し、その後、発光シグナルをＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により検出した。【００９６】
結果を図２に示す。図２中、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｃ３３、Ｃ３５、Ｃ３６、Ｃ５７、Ｃ６３、Ｂ６５、Ｃ７６、Ｃ７７、Ｃ８０及びＣ９５は抗体を産生するハイブリドーマの株を示し、Ｆｌａｇ  Ａｂ．は抗Ｆｌａｇ抗体を用いたものを示し、「１」は、細胞溶解液１を示し、「２」は細胞溶解液２を示す。
図２から、ＥＬＩＳＡによって反応性が高かったものが、ウエスタンブロット解析においても強いシグナルが観察される傾向であった。その中でも、Ｃ５７が産生する抗体は、抗ＥＢＡＧ９抗体として抗体価及び特異性が最も高いものであった。【００９７】
−単クローン化−
前記図２の結果から、強いシグナルが観察されたＢ１６、Ｃ３５、及びＣ５７について９６穴プレートに１細胞／穴となるように希釈して培養し、複数の単クローン（Ｂ１６−１、Ｂ１６−２、Ｂ１６−６、Ｂ１６−７、Ｃ３５−１、Ｃ３５−５、Ｃ３５−６、Ｃ３５−７、Ｃ５７−２、Ｃ５７−４、Ｃ５７−６、Ｃ５７−８）を得た。
前記各単クローンについて、前記一次スクリーニングにおけるウエスタンブロット解析と同様にして、ウエスタンブロット解析を行った。なお、コントロールには、一次抗体として、ウサギポリクローナル抗マウスＥＢＡＧ９抗体（４，０００倍希釈、Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２８４（１）：２−１０，  ２００１）を用いた。
結果を図３に示す。図３中、Ｂ１６−１、Ｂ１６−２、Ｂ１６−６、Ｂ１６−７、Ｃ３５−１、Ｃ３５−５、Ｃ３５−６、Ｃ３５−７、Ｃ５７−２、Ｃ５７−４、Ｃ５７−６、Ｃ５７−８は抗体を産生するハイブリドーマの株を示し、Ｍｏｕｓｅ  ＥＢＡＧ９  Ａｂ．はウサギポリクローナル抗マウスＥＢＡＧ９抗体を用いたものを示し、「１」は、細胞溶解液１を示し、「２」は細胞溶解液２を示す。
図３から、Ｃ５７株に由来するＣ５７−８株が産生する抗体が、最も反応性に優れた抗体であることが明らかになった。【００９８】
前記ハイブリドーマＣ５７−８株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、寄託申請し、２０１２年８月１５日に国内寄託され、その後、２０１３年７月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託への移管請求がされ、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１４０６として国際寄託されている。【００９９】
＜抗体回収工程＞
得られたハイブリドーマＣ５７−８株のクローンの培養量を１０Ｌまで増やし、１．５ヶ月間培養した後、培養上清を回収し、抗体を回収した。【０１００】
＜精製工程＞
前記培養上清に含まれる抗体を以下のようにして精製した。まず、ＰｒｏｔｅｉｎＡを充填したカラムに、回収した培養上清をフィルターでろ過したものをアプライし、抗体を、ＰｒｏｔｅｉｎＡを充填したカラム吸着させた。前記カラムをＰＢＳで洗浄後、溶出バッファー（０．５Ｍ  アルギニン、ｐＨ４．１）を入れて、抗体をフラクションごとに回収した。
回収した抗体はすぐに、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により中和した。
得られたフラクションのうち、ＰＯＤ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧとの反応性において吸光度の高いフラクションをプールした。プールした精製抗体をＰＢＳに対して透析し、ＩｇＧ分画の精製されたＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体（「マウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体」と称することもある）を得た。【０１０１】
（試験例１：抗体の評価）
前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体について、ウエスタンブロット法により、既存の各種抗体と比較し、評価した。既存の各種抗体としては、以下の３種類を用意した。なお、ＲＣＡＳ１とは、ＥＢＡＧ９の別名である。
−既存の各種抗体−
（Ａ）  ウサギポリクローナル抗マウスＥＢＡＧ９抗体（Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２８４（１）：２−１０，  ２００１）
（Ｂ）  マウスモノクローナル抗ＲＣＡＳ１抗体（Ｃａｔ＃  ＡＭ７５−１００ＵＧ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）（以下、「ＲＣＡＳ１（１）抗体」と称することがある。）
（Ｃ）  マウスモノクローナル抗ＲＣＡＳ１抗体（Ｃａｔ  Ｄ０６０−３Ｈ、株式会社医学生物学研究所製）（以下、「ＲＣＡＳ１（２）抗体」と称することがある。）【０１０２】
＜ウエスタンブロット法＞
−抗体希釈溶液の調製−
前記マウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体、及び既存の各種抗体について、各抗体の濃度がほぼ同等となるようにＴＢＳＴバッファーで希釈し、希釈溶液を調製した。前記希釈は、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体及び前記（Ａ）のウサギ抗マウスＥＢＡＧ９抗体は、５，０００倍希釈、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のマウスモノクローナル抗ＲＣＡＳ１抗体は、２，０００倍希釈とした。【０１０３】
−細胞溶解液の調製−
前記製造例１のハイブリドーマ選択工程におけるウエスタンブロット解析と同様にして、プラスミド２、細胞溶解液１、及び細胞溶解液２を調製した。【０１０４】
−ウエスタンブロット−
前記抗体希釈溶液を用いた点以外は、前記製造例１のハイブリドーマ選択工程におけるウエスタンブロットと同様にして、ウエスタンブロットを行った。【０１０５】
結果を図４に示す。図４中、「１」は、細胞溶解液１を示し、「２」は細胞溶解液２を示す。
図４から、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体（Ｃ５７−８由来の精製モノクローナル抗ヒトＥＢＡＧ９抗体）は、外来性のタグ付きのＥＢＡＧ９タンパク質に加え、内在性のＥＢＡＧ９タンパク質をも検出し、しかも非特異的なバンドがほとんど見られなかった。一方、前記ウサギポリクローナル抗マウスＥＢＡＧ９抗体は、外来性のタグ付きのＥＢＡＧ９タンパク質及び内在性のＥＢＡＧ９タンパク質の両者のバンドを検出できるものの、非特異的なバンドも数多く検出した。前記ＲＣＡＳ１（１）抗体は、外来性のタグ付きのＥＢＡＧ９タンパク質を検出できるものの、同様の条件で内在性のＥＢＡＧ９タンパク質は検出できず感度が低かった。前記ＲＣＡＳ１（２）抗体については、同様の条件で外来性のタグ付きのＥＢＡＧ９タンパク質及び内在性のＥＢＡＧ９タンパク質ともに検出できず感度が低かった。
したがって、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体は、十分な感度を有することに加え、極めて特異性が高く、バックグラウンドが低いことが示された。【０１０６】
（試験例２：ＥＢＡＧ９免疫反応陽性と、乳癌患者の予後不良との相関）
前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体を用い、再発乳癌患者に対する内分泌療法効果についてのケース−コントロール  スタディを行った。【０１０７】
＜患者特性と組織選択＞
１００症例の乳癌患者を日本国内の３施設（国立がんセンター、国立四国がんセンター、東京都立駒込病院）より収集した。これらの患者は、１９８９年から１９９８年の間に乳癌と診断され、かつ術後タモキシフェン治療を実施後、再発情報が明らかであり、内分泌療法による予後を解析するために好適な症例群である。
本試験例２では、術後内分泌療法を行った後、５年のフォローアップ期間内で遠隔転移を認めた症例を再発群、認めなかった症例を無再発群と規定した。
サンプルとして、生検あるいは手術により摘出された乳癌組織をホルマリン固定・パラフィン包埋したサンプルを用いた。
なお、本試験は、参加施設並びに埼玉医科大学の倫理委員会の承認を受け、インフォームド  コンセントを得ている。患者の臨床病理学的特性を表２に示した。【０１０８】
【表２】
2014042167.tif 000006
表２中、「ＥＲα」は、エストロゲンレセプターαを示し、「ＰｇＲ」は、プロゲステロンレセプターを示す。【０１０９】
＜免疫組織化学的染色＞
乳癌組織におけるＥＢＡＧ９発現の免疫組織化学的解析は、Ｄａｋｏ社のＥｎＶｉｓｉｏｎ＋  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用い、以下のようにして行った。
厚み６μｍの乳癌組織切片を脱パラフィン処理、段階的エタノール系列による再親水処理を行った後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有トリス緩衝リン酸溶液（ＴＢＳＴ）により洗浄した。その後、抗原の賦活化処理として、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ  ６．０）に浸漬した切片スライドにオートクレーブ機器を用いた熱処理（１２１℃、５分間）を施した。その後、乳癌組織内の内在性ペルオキシダーゼ活性を阻害するため、切片を０．３％の過酸化水素水（Ｈ２Ｏ２）で３０分間処理したのち、非特異的抗原をマスクするため１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で３０分間処理した。次いで、一次抗体として、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体を２００倍希釈したマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体溶液を１５０μＬ添加し、４℃で一晩反応させた。ＴＢＳＴで洗浄後、二次抗体として、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ標識したＥｎｖｉｓｉｏｎ＋  ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒを１５０μＬ添加し、室温で１時間反応させた。抗原抗体複合体の可視化は、Ｖｅｃｔｏｒ社の３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  （ＤＡＢ）  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを用いた。なお、前記一次抗体の陰性コントロールとして、マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ  マウス血清由来、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いた。
前記染色結果の例を図５及び図６に示す。図５及び図６中、スケールバーは、１００μｍを表す。図５及び図６の結果から、ＥＢＡＧ９の免疫反応性は主に乳癌細胞の細胞質で観察された。一方、ほぼ全ての乳腺上皮細胞、筋上皮細胞、間質細胞におけるＥＢＡＧ９免疫反応性は乳癌細胞に比べ弱いかあるいは陰性であった。【０１１０】
＜免疫組織化学的染色結果の判定＞
前記染色した切片スライドを顕微鏡下で観察し、評価した。前記評価では、視野内全細胞における染色された陽性細胞の割合（以下、「免疫反応性スコア」と称することがある。）を評価した。前記評価は、２名が独立に行い、免疫反応性スコアを算定した。
なお、２名の評価者の間で免疫反応性スコアが異なった場合、第３の評価者が更に判定に加わり、３者の平均した結果を用いた。
乳癌組織におけるＥＢＡＧ９免疫反応性と、臨床病理学的パラメーターとの間の相関を明らかにするため、ＥＢＡＧ９陽性細胞の割合が５０％以上の乳癌患者をＥＢＡＧ９陽性とし、一方５０％未満の乳癌患者を陰性とした。【０１１１】
＜統計解析＞
前記免疫反応性スコアと、臨床病理学的パラメーターとの相関の解析は、カイ２乗検定により行った。Ｐ値が０．０５未満の場合、統計学的に有意であるとした。２群間の差異については、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより解析した。無再発生存期間及び全生存期間における予後曲線は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法により作成し、ｌｏｇ−ｒａｎｋ  （Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）  ｔｅｓｔにより評価した。
単変量解析及び多変量解析については、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社のソフトウェアＪＭＰ９．０を用いてロジスティック回帰分析により行った。Ｐ値が０．０５未満を統計学的有意と判定した。【０１１２】
統計学的解析の結果、細胞質におけるＥＢＡＧ９の免疫反応性は、再発群で有意に上昇していた（ｐ＝０．０１３）（表３参照）。同様に、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線解析の結果、ＥＢＡＧ９陽性患者は陰性患者に比べ、短い無再発生存期間を有していた（ｐ＝０．０２０５、５年間；ｐ＝０．００２４、全フォローアップ期間）（図７参照）。【０１１３】
【表３】
2014042167.tif 000007
【０１１４】
更に、この乳癌患者の集団において、様々な臨床病理学的パラメーターの予後に対する統計学的有意性を、ロジスティック回帰分析により検討を行った。結果を表４に示す。【０１１５】
【表４】
2014042167.tif 000008
【０１１６】
まず、単変量解析（ｕｎｉｖａｒｉａｔｅ）を行ったところ、腫瘍径（ｐＴ）、ＥＲα、ＰｇＲ、年齢の各因子との相関はみられなかったが、ＥＢＡＧ９陰性とリンパ節転移状態の２つの因子について、５年無再発生存との負の相関関係が有意に観察され、危険因子となることが判明した。
この結果を受けた多変量解析（Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ）においても、ＥＢＡＧ９陰性とリンパ節転移陰性のいずれも、より長期の無再発生存を予測しうる独立した予後予測因子であることが示唆された（ｏｄｄｓ  ｒａｔｉｏ，  ０．２２  ａｎｄ  ０．３７、ｐ−ｖａｌｕｅ，  ０．０３５  ａｎｄ  ０．０２５）。
これらの結果から、ＥＢＡＧ９の免疫反応性は術後内分泌療法を受けた乳癌患者の予後不良因子として機能しうることが初めて示された。【０１１７】
（試験例３：ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体のエピトープの同定）
前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体のエピトープを以下のようにして同定した。【０１１８】
＜エピトープの同定−１＞
−プラスミド−
プラスミドとして、前記製造例１で作製したプラスミド１と、以下のようにして構築したプラスミド３及び４を用意した。【０１１９】
−−プラスミド３の構築−−
ＧＳＴタンパク質とヒトＥＢＡＧ９タンパク質の４８番目から１３６番目のアミノ酸との融合タンパク質を発現するプラスミド（ｐＧＥＸ−ｈＥＢＡＧ９（４８−１３６））を以下のようにして作製した。
前記製造例１で作製したプラスミド１（ｐＧＥＸ−ｈＥＢＡＧ９（４８−２１３））を制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで切断することによって、ヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１３７番目のアミノ酸から２１３番目のアミノ酸に相当するｃＤＮＡを除き、次いで、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて平滑末端化した後、セルフライゲーションを行ってＧＳＴタンパク質とＥＢＡＧ９タンパク質の４８番目から１３６番目のアミノ酸との融合タンパク質を発現するプラスミド（ｐＧＥＸ−ｈＥＢＡＧ９（４８−１３６））を作製した。なお、前記融合タンパク質は、前記ＥＢＡＧ９タンパク質の４８番目から１３６番目のアミノ酸のＮ末端側にＧＳＴタンパク質が融合されている（配列番号８参照）。【０１２０】
−−プラスミド４の構築−−
ヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１２８番目から２１３番目のアミノ酸に相当するｃＤＮＡを調製し、ＧＳＴタンパク質とＥＢＡＧ９タンパク質の１２８番目から２１３番目のアミノ酸との融合タンパク質を発現するプラスミド（ｐＧＥＸ−ｈＥＢＡＧ９（１２８−２１３））を以下のようにして作製した。
ＥＢＡＧ９の全長ｃＤＮＡ（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １８（１）：４４２−４４９，  １９９８）を鋳型として、下記配列番号９及び１０の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行った。
配列番号９：５’−ｃｃｇｇａａｔｔｃｔｃｔａｇｔａｇａｔｔａｇｃａｇｃｔａｃａｃａａ−３’
配列番号１０：５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔａｔｇａａａｇｔｔｔｃａｃａｃｃａａｔｔｔｔ−３’
前記ＰＣＲにより得られた増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化した後、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化したｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に挿入し、ＧＳＴタンパク質とＥＢＡＧ９タンパク質の１２８番目から２１３番目のアミノ酸との融合タンパク質を発現するプラスミド（ｐＧＥＸ−ｈＥＢＡＧ９（１２８−２１３））を作製した。なお、前記融合タンパク質は、前記ＥＢＡＧ９タンパク質の１２８番目から２１３番目のアミノ酸のＮ末端側にＧＳＴタンパク質が融合されている（配列番号１１参照）。【０１２１】
−細胞抽出液の調製−
前記プラスミド１、３、及び４のそれぞれを用い、以下のようにして細胞抽出液を調製した。
大腸菌株ＤＨ５αに前記各プラスミドを導入し、ＬＢ培地で一晩培養した後、遠心分離によって大腸菌を回収し、サンプルバッファーで懸濁して細胞抽出液を作製した。【０１２２】
−ウエスタンブロット−
前記各細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）へブロッティングした膜を、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体とともに室温で１時間、又は４℃で１２時間、ＴＢＳＴバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中で静置した後、二次抗体として、ＨＲＰ（西洋ワサビパーオキシダーゼ）標識された二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）とともに室温で１時間反応し、その後、発光シグナルをＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により検出した。
なお、コントロールとして、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体の代わりにＧＳＴに対する抗体を用い、同様にしてウエスタンブロットを行った。【０１２３】
結果を図８に示す。図８中、左側はマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体（ＥＢＡＧ９モノクローナル抗体）を用いた場合の結果を示し、右側はＧＳＴに対する抗体（ＧＳＴ抗体）を用いた場合の結果を示す。
図８に示すように、ｐＧＥＸ−ｈＥＢＡＧ９（４８−２１３）とｐＧＥＸ−ｈＥＢＡＧ９（１２８−２１３）を導入した大腸菌の抽出液ではＧＳＴ−ＥＢＡＧ９融合タンパク質が検出されたが、ｐＧＥＸ−ｈＥＢＡＧ９（４８−１３６）を導入した大腸菌の抽出液ではＧＳＴ−ＥＢＡＧ９融合タンパク質が検出されなかった。したがって、まず、マウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体のエピトープは、ヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１２８番目から２１３番目のアミノ酸配列の間に存在することが示された。【０１２４】
＜エピトープの同定−２＞
−ペプチド−
以下の各ペプチドを化学合成により用意した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社製）。
（１）  ヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１２８番目から１５７番目のアミノ酸に相当する３０アミノ酸からなるペプチド（以下、「１２８−１５７」と称することがある）。
Ｎ末端−ＳＳＲＬＡＡＴＱＤＬＰＦＩＨＱＳＳＥＬＧＤＬＤＴＷＱＥＮＴＮ−Ｃ末端（配列番号１２参照）
（２）ヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１４８番目から１７７番目のアミノ酸に相当する３０アミノ酸からなるペプチド（以下、「１４８−１７７」と称することがある）。
Ｎ末端−ＤＬＤＴＷＱＥＮＴＮＡＷＥＥＥＥＤＡＡＷＱＡＥＥＶＬＲＱＱＫ−Ｃ末端（配列番号１３参照）
（３）ヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１６７番目から１９６番目のアミノ酸に相当する３０アミノ酸からなるペプチド（以下、「１６７−１９６」と称することがある）。
Ｎ末端−ＷＱＡＥＥＶＬＲＱＱＫＬＡＤＲＥＫＲＡＡＥＱＱＲＫＫＭＥＫＥ−Ｃ末端（配列番号１４参照）
（４）ヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１８７番目から２１３番目のアミノ酸に相当する２７アミノ酸からなるペプチド（以下、「１８７−２１３」と称することがある）。
Ｎ末端−ＥＱＱＲＫＫＭＥＫＥＡＱＲＬＭＫＫＥＱＮＫＩＧＶＫＬＳ−Ｃ末端（配列番号１５参照）【０１２５】
−細胞抽出物の調製−
前記プラスミド１、４、又はｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）のそれぞれを用い、以下のようにして細胞抽出液を調製した。
大腸菌株ＤＨ５αに前記各プラスミドを導入し、ＬＢ培地で一晩培養した後、遠心分離によって大腸菌を回収し、サンプルバッファーで懸濁して細胞抽出液を作製した。【０１２６】
−抗体の中和−
前記（１）〜（４）の各ペプチド  ８μｇと、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体とを４℃で一晩混合し、前記抗体を中和させた試料を用意した。なお、コントロールとして、前記ペプチドを含まない以外は同様の操作を行った試料（以下、「Ｎｏｎｅ」と称することがある）も用意した。【０１２７】
−ウエスタンブロット−
前記各細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）へブロッティングした膜を、前記「抗体の中和」で得られた各試料とともに室温で１時間、又は４℃で１２時間、ＴＢＳＴバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中で静置した後、二次抗体として、ＨＲＰ（西洋ワサビパーオキシダーゼ）標識された二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）とともに室温で１時間反応し、その後、発光シグナルをＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により検出した。【０１２８】
結果を図９に示す。図９に示すように、前記製造例１で得られた抗体をヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１４８番目から１７７番目のアミノ酸に相当する３０アミノ酸からなるペプチド（「１４８−１７７」）で中和した場合にのみ、シグナルが検出されなかった。したがって、マウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体のエピトープは、ヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１４８番目から１７７番目のアミノ酸配列に局限することが明らかになった。【０１２９】
前記ヒトＥＢＡＧ９タンパク質のＮ末端側の１４８番目から１７７番目のアミノ酸配列には、酸性アミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸）が多く含まれており、特徴的な構造に寄与すると考えられる。この領域内をエピトープとするモノクローナル抗体が作製されたことで、力価の高い抗体となっていることが示唆された。【０１３０】
（試験例４：ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の作用）
前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体について、腫瘍増殖抑制作用、及び癌転移抑制作用を以下のようにして調べた。【０１３１】
＜細胞培養＞
細胞として、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来乳癌細胞でルシフェラーゼを発現する４Ｔ１−Ｌｕｃ（Ｈｉｒａｇａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  １０６：９７３−９７９，  ２００３）を使用した。
前記細胞は、１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍと、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と、１００μｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＮＡＣＡＬＡＩ  ＴＥＳＱＵＥ社製）で、５％  ＣＯ２、３７℃にて培養した。【０１３２】
＜ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖抑制実験＞
８週齢、メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア社製）のｍａｍｍａｒｙ  ｆａｔ  ｐａｄに前記４Ｔ１−Ｌｕｃ細胞を移植した。移植する細胞は、５×１０５ｃｅｌｌｓ／匹とし、投与量は、１００μＬ／匹となるように調整した。
前記マウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体は、ＰＢＳに対して透析した後、腫瘍移植後２日目より、週に２回、０．２ｍｇ／匹の投与量で腹腔内に注入した（治療群）。なお、コントロールとして、正常マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を同様に調製して投与した。
腫瘍の増殖は、ルシフェリン（３ｍｇ／匹）を腹腔内投与した後の発光をインビボイメージング装置Ｐｈｏｔｏｎ  ＩＭＡＧＥＲ  （ＢＩＯＳＰＡＣＥ  ＬＡＢ社製）を用いて週１回計測し、１秒間当たりの発光量（Ｃｏｕｎｔｓ／ｓ）によって解析した。【０１３３】
結果を図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。図１０Ａ中、「○」は正常マウスＩｇＧを投与したコントロール（ｎ＝６）の結果を示し、「●」はマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体を投与した場合（ｎ＝８）の結果を示す。なお、図１０Ａは、平均±ＳＥ（ｂａｒ）で示しており、「＊」はＰ＜０．０５を示し、「＊＊」はＰ＜０．０１を示す。図１０Ｂは、腫瘍移植から３週間後に計測した際の典型的な例の写真であり、「ＩｇＧ（コントロール）」はコントロールの場合の典型例を示し、「ＥＢＡＧ９モノクローナル抗体」はマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体を投与した場合の典型例を示す。
図１０Ａ及び図１０Ｂから明らかなように、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体を投与した群では、コントロールに対して有意に腫瘍形成が抑制された。したがって、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体は、乳癌細胞の腫瘍増殖抑制効果を有することが明らかとなった。【０１３４】
＜癌転移抑制作用の検証＞
前記ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖抑制実験において、腫瘍移植から４週間後のマウスにおける乳癌細胞の肺への転移を調べた。
図１１Ａは、腫瘍移植から４週間後のマウスの肺の様子の一例を示す写真であり、「ＩｇＧ（コントロール）」はコントロールの場合のものであり、「ＥＢＡＧ９モノクローナル抗体」はマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体を投与した場合のものである。また、図１１Ｂは、乳癌細胞の転移巣の数を示したグラフであり、「ＩｇＧ（コントロール）」はコントロールの場合のものであり、「ＥＢＡＧ９モノクローナル抗体」はマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体を投与した場合のものである。なお、図１１Ｂ中、「＊」はＰ＜０．０５を示す。
図１１Ａから明らかなように、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体を投与した群では、乳癌細胞の肺への転移が抑えられており、また、図１１Ｂから明らかなように、前記製造例１で得られたマウスモノクローナル抗ＥＢＡＧ９抗体を投与した群では、転移巣の数がコントロールに対して有意に低値を示した。【０１３５】
ＥＢＡＧ９は、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、精巣腫瘍、脳腫瘍、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、大腸癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉咽頭癌、扁平上皮癌、悪性リンパ腫、悪性中皮腫、ページェット病などで高発現しており、予後不良と相関することが知られている。したがって、ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体は、乳癌をはじめとする癌の治療に応用できる可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体は、特異性が高く、内分泌療法薬耐性乳癌の予測方法、内分泌療法薬耐性乳癌の予測用診断薬又はキットに好適に用いることができ、また、腫瘍増殖抑制剤、癌転移抑制剤、及び医薬の有効成分として好適に利用可能である。また、本発明のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体は、癌細胞の免疫系からの回避に関するメカニズムや増殖・転移メカニズムを解き明かし、病態解明への応用にも利用可能である。
本発明のハイブリドーマは、本発明のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体の製造に好適に用いることができる。
本発明の内分泌療法薬耐性乳癌の予測方法、予測用診断薬又はキットによれば、内分泌療法薬に対する耐性を獲得する乳癌か否かを早期に診断することが可能となる。
本発明の腫瘍増殖抑制剤によれば、腫瘍の増殖を効果的に抑制することができる。
本発明の癌転移抑制剤によれば、癌の転移を効果的に抑制することができる。
本発明の医薬は、癌の予防乃至治療に好適に利用可能である。
【受託番号】
【０１３７】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１４０６
【図１】
2014042167.tif 000009
【図２】
2014042167.tif 000010
【図３】
2014042167.tif 000011
【図４】
2014042167.tif 000012
【図５】
2014042167.tif 000013
【図６】
2014042167.tif 000014
【図７】
2014042167.tif 000015
【図８】
2014042167.tif 000016
【図９】
2014042167.tif 000017
【図１０Ａ】
2014042167.tif 000018
【図１０Ｂ】
2014042167.tif 000019
【図１１Ａ】
2014042167.tif 000020
【図１１Ｂ】
2014042167.tif 000021
【配列表】
2014042167000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年3月26日(2014.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１４０６のハイブリドーマが産生するＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体であることを特徴とするＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体。
【請求項２】
エピトープが、配列番号１３に記載のアミノ酸配列内にある請求項１に記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体。
【請求項３】
ＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであって、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１４０６であることを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
請求項１から２のいずれかに記載のＥＢＡＧ９に対するモノクローナル抗体を含み、乳癌の肺への転移を抑制することを特徴とする癌転移抑制剤。
【請求項８】
請求項７に記載の癌転移抑制剤を含むことを特徴とする医薬。
【国際調査報告】
2014042167.tif 000022
2014042167.tif 000023
2014042167.tif 000024
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