(57)【要約】要約  生体内でのアセチルコリンの産生を促進する装置が開示されている。生体内アセチルコリン産生促進装置は、四肢のいずれかの部位と接触し、加圧されるとその部位における動脈を圧迫する動脈圧迫部材と、該動脈圧迫部材に接続され、使用時に該動脈圧迫部材を加圧して前記動脈を圧迫して阻血し、かつ、加圧を解除して前記動脈に血液を再灌流する加圧手段とを具備する。この装置を動物に適用して四肢の動脈の阻血−再灌流を繰り返すことにより、アセチルコリンの産生を促進することができ、生体内でのアセチルコリンの濃度を高めることができる。
2014021267.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
四肢のいずれかの部位と接触し、加圧されるとその部位における動脈を圧迫する動脈圧迫部材と、該動脈圧迫部材に接続され、使用時に該動脈圧迫部材を加圧して前記動脈を圧迫して阻血し、かつ、加圧を解除して前記動脈に血液を再灌流する加圧手段とを具備する、生体内アセチルコリン産生促進装置。
【請求項２】
前記加圧手段が、１〜１５分間の加圧と、該加圧後の解除から成るサイクルを１回以上繰り返すようにプログラムされている請求項１記載の装置。
【請求項３】
前記加圧手段が前記サイクルを２回〜１０回繰り返すようにプログラムされている請求項２記載の装置。
【請求項４】
前記動脈圧迫部材がカフである請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記加圧手段が、ポンプと、該ポンプと前記カフを連結し、該ポンプから前記カフに空気を送る送気管と、該送気管に設けられたバルブとを具備し、該ポンプを作動させて前記カフを加圧し、前記バルブを開いて加圧を解除する請求項４記載の装置。
【請求項６】
前記バルブが電動バルブであり、該電動バルブの電源と、前記ポンプの電源がプログラムリレーを介して該電動バルブ及び該ポンプにそれぞれ接続され、該プログラムリレーにおいて、該ポンプの駆動による加圧と、前記電動バルブの解放による加圧後の解除から成るサイクルを１回以上繰り返すようにプログラムされている請求項５記載の装置。
【請求項７】
前記送気管及び前記プログラムリレーに接続された圧力スイッチをさらに具備し、該圧力スイッチは、前記送気管内の圧力を検知し、検知した圧力が設定圧力未満か否かの信号を前記プログラムリレーに送り、設定圧力未満では前記ポンプの電源から前記ポンプに電力が供給されて該ポンプが駆動して前記カフを加圧し、設定圧力以上では、前記ポンプの電源から前記ポンプに電力が供給されずポンプが駆動しない請求項６記載の装置。
【請求項８】
前記サイクルが、１〜１５分間の加圧と、１分間〜３時間の加圧解除とから成り、該サイクルを２回〜１０回繰り返す請求項７記載の装置。
【請求項９】
加圧時間が１分間〜１５分間であり、加圧解除時間が１分間〜１５分間であり、前記サイクルを２回〜５回繰り返す請求項８記載の装置。
【請求項１０】
血糖値低下装置又は血糖値上昇抑制装置である請求項１〜９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
動物の動脈を圧迫して阻血し、次いで前記動脈に血液を再灌流するサイクルを１回以上繰り返すことを含む、生体内アセチルコリン産生促進方法。
【請求項１２】
血糖値低下方法又は血糖値上昇抑制方法である請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内でのアセチルコリンの産生を促進する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセチルコリンは、コリンの酢酸エステルであり、副交感神経や運動神経の末端から刺激に応じて遊離され、シナプス部および終板で興奮伝達物質(神経伝達物質)となる物質である。アセチルコリンは、血圧降下、心臓抑制（心拍数の低下）、腸管収縮、骨格筋収縮などの生理作用を示す。また、アセチルコリン受容体に結合したアセチルコリンはアセチルコリンエステラーゼやコリンエステラーゼによってコリンと酢酸に加水分解されて筋肉は弛緩する。【０００３】
生体内でのアセチルコリン濃度を高めるコリンエステラーゼ阻害剤を、老人性痴呆、脳血管性痴呆、注意欠陥多動障害、緑内障、重症筋無力症又は偏頭痛の予防、治療又は改善に用いることが知られている（特許文献１）。また、アセチルコリンは、副交感神経を刺激してリラックス状態を作り出し、血圧を下げ、心拍数を低下させる作用があるので、降圧や不眠症の解消、さらには、交感神経系亢進時における耐糖能異常を誘発することによる血糖値の上昇を抑制することにも有用であると考えられる。【０００４】
上記の通り、生体内でのアセチルコリンの濃度を増大させるコリンエステラーゼ阻害剤はよく研究され、種々の化合物が知られている。しかしながら、生体内でのアセチルコリンの産生を促進する装置は全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】再表03/082820
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、生体内でのアセチルコリンの産生を促進する装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、四肢の動脈を閉塞することにより阻血し、一定時間阻血後に動脈の閉塞を解放して再灌流することを繰り返すことにより、生体内でのアセチルコリンの産生が促進されることを見出した。従って、四肢の動脈の阻血−再灌流のサイクルを繰り返すことが可能な装置は、生体内でのアセチルコリンの産生を促進することができる。【０００８】
すなわち、本発明は、四肢のいずれかの部位と接触し、加圧されるとその部位における動脈を圧迫する動脈圧迫部材と、該動脈圧迫部材に接続され、使用時に該動脈圧迫部材を加圧して前記動脈を圧迫して阻血し、かつ、加圧を解除して前記動脈に血液を再灌流する加圧手段とを具備する、生体内アセチルコリン産生促進装置を提供する。また、本発明は、動物の動脈を圧迫して阻血し、次いで前記動脈に血液を再灌流するサイクルを１回以上繰り返すことを含む、生体内アセチルコリン産生促進方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の装置を動物に適用して四肢の動脈の阻血−再灌流を繰り返すことにより、アセチルコリンの産生を促進することができ、生体内でのアセチルコリンの濃度を高めることができる。従って、本発明の装置を適用することにより、これまでに知られているコリンエステラーゼ阻害剤の薬効である老人性痴呆、脳血管性痴呆、注意欠陥多動障害、緑内障、重症筋無力症又は偏頭痛の予防、治療又は改善や、血圧の低下、不眠症の解消、リラックス状態の作出、耐糖能異常による血糖値上昇の抑制等を達成できる。特に、血糖値に関しては、後述のマウスを用いた動物実験により明らかなとおり、本発明の装置により、血糖値の低下、又は血糖値の上昇抑制を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｃは、下記実施例１において行った、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)遺伝子欠損に関する実験結果を示す図である。ＣｈＡＴ遺伝子の欠損は、β−カテニン及びＣｘ４３を介して細胞間コミュニケーションに影響を及ぼす。（Ａ）ＣｈＡＴに特異的なｍｉＲ  ＲＮＡｉ発現ベクターを一過的に感染させることにより、ＣｈＡＴのノックダウンをヒト尿細管上皮細胞HEK293細胞において確認した。ＧＦＰのシグナル（緑色）を示す破線によって囲まれた形質転換細胞では、ＣｈＡＴの免疫応活性（赤色）が弱まったことが示された。
【図１Ｂ】（Ｂ）このHEK293細胞を用いて安定的に形質転換したＣｈＡＴ  ＫＯ（ノックダウン）細胞では、対照のＬａｃＺ  ＫＯ細胞と比較して、細胞間で観察されるβ−カテニンの免疫活性がより少なく、細胞は撹拌により容易に分散した。ＣｈＡＴ  ＫＯ細胞では、細胞膜で見られるＡＣｈの免疫活性シグナルがより少なかった。
【図１Ｃ】（Ｃ）免疫細胞化学及びウェスタンブロット解析から、ＣｈＡＴに特異的なｍｉＲ  ＲＮＡｉ発現ベクターで安定に形質転換したマウス心筋由来のＨＬ−１細胞であるＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＬ−１細胞では、対照のＬａｃＺ  ＫＯ  ＨＬ−１細胞と比較して、Ｃｘ４３の発現がより少ないことが分かった。ＬＹ色素を用いてその細胞間物質輸送を評価する方法においては、ＬＹ色素移動は、対照細胞と比較して、直線上に並べたＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＬ−１細胞で抑制された。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｅは、下記実施例１において行った、ＣｈＡＴの抑制に関する実験結果を示す図である。細胞のＣｈＡＴを抑制すると、より多くの酸素及びＡＴＰの消費を伴うエネルギー代謝が亢進する。（Ａ）ＡＣｈレベルが低い（対照を基準として、９．３±３．５％）ＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＥＫ細胞ではＭＴＴ活性が上昇し（対照を基準として、３８４．８±２０．８％、Ｐ＜０．０１）、これと並行してより多くの酸素が消費された（対照を基準として、−２３９．４±２６．４％、Ｐ＜０．０１）。
【図２Ｂ】（Ｂ）ＣｈＡＴ  ＫＯ細胞に含まれるＡＴＰは、対照よりも少なかった（対照対ＣｈＡＴ  ＫＯ：７６５．１±５６．９対４２５．７±１８．７ｍＭ／タンパク質１ｇ、Ｐ＜０．０１）。
【図２Ｃ】（Ｃ）２ｍＭのＣｏＣｌ２により化学的に誘導した低酸素条件では、対照よりも多いＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＥＫ細胞が死んだ（対照対ＣｈＡＴ  ＫＯ：１００．０±０．３５対２６．６±２．３３、Ｐ＜０．０１）。
【図２Ｄ】（Ｄ）同様にＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＬ−１細胞も対照よりも多いＡＴＰを消費した（対照対ＣｈＡＴ  ＫＯ：２７１．９±２８．２対８３．１±８．８ｍＭ／タンパク質１ｇ、Ｐ＜０．０１）。
【図２Ｅ】（Ｅ）ＣｈＡＴ阻害薬であるＢｒＡＣｈ（１０μＭ）及びヘミコリニウム−３（１０μＭ）もまた、ＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＥＫ細胞で見られたのと同様に、ラット心筋由来Ｈ９ｃ２細胞でのＭＴＴ活性を上昇させた。ヘミコリニウム−３はさらに、Ｈ９ｃ２細胞でのＡＴＰ含量を低下させた。
【図３】下記実施例１において行った、ＣｈＡＴノックダウン（ＫＯ）ＨＬ−１細胞に関する実験結果を示す図である。ＣｈＡＴノックダウン（ＫＯ）ＨＬ−１細胞は、ノルエピネフリン（ＮＥ）誘導性細胞死により感受性が高かった。対照細胞との比較により評価した、ＣｈＡＴ  ＫＯ細胞の生存率は、２ｍＭのＮＥで処理した対照細胞がほぼ100％であったのとは対照的に、ＮＥにより用量依存的に低下した。２ｍＭのＮＥを用いた場合、ＣｈＡＴ  ＫＯ細胞はより多くの活性酸素種を産生し、ＡＰＦによる赤色の蛍光を、対照よりも多く示した。これと一致して、ＣｈＡＴ  ＫＯ細胞では、基準条件（０時間）での活性型カスパーゼ−３の発現が高く、ＮＥを使用すると、カスパーゼ−３の活性化はＣｈＡＴ  ＫＯ細胞でさらに高まった。
【図４】下記実施例１において行った、マウスの後肢の阻血−再灌流に関する実験結果を示す図である。後肢阻血−再灌流はＣｈＡＴとＣＨＴ１の発現を、手技を加えた後肢だけでなく心臓でも増強する。左の後肢に阻血−再灌流を行ったことで、右の後肢（Ｒ）と比較して、１６時間以内のＣｈＡＴ及びＣＨＴ１のタンパク質発現が上昇した。これらの骨格筋での蛋白発現上昇に付随して、心臓でもまたＣｈＡＴ及びＣＨＴ１の両方の発現が、それぞれ同様な経時変化で増加した。
【図５】下記実施例１において行った、阻血−再灌流（ＩＲ）処置とＣｈＡＴ活性の関係に関する実験結果を示す図である。  阻血−再灌流（ＩＲ）処置は、ＣｈＡＴ活性を介して、心臓全体の虚血再灌流負荷における心筋梗塞から心臓をより多く保護する。ＩＲを行わなかった対照と比較して（０．６１±０．０３）、ＩＲ処置は、より心臓を保護し、そしてＴＴＣ染色で示される梗塞部を減少させた（０．２６±０．０３、Ｐ＜０．０１）。ヘミコリニウム−３を用いた前処理により、ＩＲによる心保護効果は完全に失われた（ＩＲを基準として、０．５６±０．０３、Ｐ＜０．０５）。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｄは、下記実施例１において行った、後肢阻血−再灌流と心臓ＡＴＰレベルとの関係に関する実験結果を示す図である。  後肢阻血−再灌流が心保護に及ぼす遠隔効果は、心臓ＡＴＰレベルを維持する、心臓での非神経性コリン作動系の活性化に寄与する。（Ａ）心臓でのＡＴＰレベルは、ＩＲにより、１６時間の間に徐々に増加した（ＩＲを基準として、２５６．４±１３．１％、４ｈ、Ｐ＜０．０１）。
【図６Ｂ】（Ｂ）ＩＲによって引き起こされる心臓ＡＴＰレベルの増加（ＩＲ：１１．５±０．９ｍＭ／タンパク質１ｇ対対照：５．９±０．５ｍＭ／タンパク質１ｇ、Ｐ＜０．０１）は、ヘミコリニウム（ＨＣ）−３を用いた前処理により抑制された（ＨＣ−３：６．４±１．０ｍＭ／タンパク質１ｇ、ＩＲを基準として、Ｐ＜０．０５。
【図６Ｃ】（Ｃ）これらの条件では、心臓ＡＣｈレベルもまたこれらの傾向に続き、ＡＴＰレベルと並行して、ＡＣｈレベルもＩＲによって増加し（ＩＲ：２．７８±０．１７ｎｍｏｌ／タンパク質１ｇ対対照：２．３２±０．１２ｎｍｏｌ／タンパク質１ｇ、Ｐ＜０．０５）、そしてＨＣ−３によって弱まった（ＨＣ−３：２．１４±０．０７、ＩＲを基準として、Ｐ＜０．０５）。
【図６Ｄ】（Ｄ）ｅＮＯＳ  ＫＯマウスでは、心臓でのＡＣｈ合成はＩＲによってはアップレギュレートされなかった（ＮＳ：有意差なし）。
【図７】本発明の装置の一具体例の構成を模式的に示す図である。
【図８】図７に示す装置においてプログラムした、加圧−解除のサイクルを示す図である。
【図９】図７に示す装置を複数の被検者に適用して阻血−再灌流サイクルを３回繰り返した場合の心拍数の経時変化を示す図である。対照として、阻血−再灌流サイクルを行わなかった被検者の心拍数の経時変化も併せて示す。
【図１０】図７に示す装置を複数の被検者に適用して阻血−再灌流サイクルを１回繰り返した場合の心拍数の経時変化を示す図である。対照として、阻血−再灌流サイクルを行わなかった被検者の心拍数の経時変化も併せて示す。
【図１１】下記実施例３の結果、すなわち、マウスに高脂肪食を与え、後脚に対するIR（3分虚血2分再灌流3回繰り返し）を毎日、11日間行い、IR未処理のマウスとBS(血糖値)を比較した結果を示す図である。
【図１２】下記実施例４の結果、すなわち、マウスに高脂肪食を与え、IR（3分虚血2分再灌流3回繰り返し）を隔日(0日目、2日目、4日目)で行い、IR未処理のマウスとBS(血糖値)を比較した結果を示す図である。
【図１３】下記実施例５の結果、すなわち、マウスに高脂肪食を与え、IR(2分虚血2分再灌流3回繰り返し)を実施例４とは異なり、毎日11日間行った時のBS（血糖値）を比較した結果の図である。
【図１４】下記実施例６の結果、すなわち、マウスに高脂肪食を7−11日間摂取させながら、IR（2分虚血2分再灌流3回繰り返し）を毎日行い、体重変化を比較した結果の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
下記実施例１において、動物実験に基づき具体的に記載するとおり、本願発明者らは、四肢の動脈を閉塞することにより阻血し、一定時間阻血後に動脈の閉塞を解放して再灌流することを繰り返すことにより、生体内でのアセチルコリンの産生が促進されることを見出した（ただし、ヒト被験者においては、直接的に心臓内AChの測定が不可能であることから、心拍数減少効果をもって、心臓への副交感神経系の亢進すなわち神経終末からのACh分泌亢進およびそれによる心筋内ACh産生増加とみなした）。本発明は、この新知見を基礎とする。すなわち、本発明の装置は、四肢の動脈の阻血と再灌流を行うものである。
【００１２】
本発明の生体内アセチルコリン産生促進装置は、四肢のいずれかの部位と接触し、加圧されるとその部位における動脈を圧迫する動脈圧迫部材を具備する。ここで、「四肢のいずれかの部位」は、腕でも脚でもよく、腕の場合、上腕部でも肘部でもよく、脚の場合、大腿部でも膝部でもよい。
【００１３】
動脈圧迫部材としては、カフを好ましく用いることができる。カフは、四肢に巻き付ける帯状の袋で、空気を送り込むことによって膨張し、その結果、四肢が締付けられて動脈が圧迫されるものである。カフは、血圧測定において常用されている周知のものであり、本発明においても周知のカフを用いることができる。カフ自体は周知であり、市販されているので、市販品を用いることも可能である。
【００１４】
動脈圧迫部材はカフに限定されるものではなく、動脈を圧迫して阻血可能なものであればどのような構成のものでもよい。例えば、帯状又は紐状の部材を四肢に巻き付け、空気を送ることなく直接モーターで締め付けるようにしたもの、剛性のある２つの部材でリング状部材を構成し、これらの部材をモーターでスライドさせてリング状部材の直径を小さくすることにより、リング状部材の中に挿入された四肢を締め付けるもの等でもよい。
【００１５】
本発明の装置はさらに、動脈圧迫部材に接続され、使用時に該動脈圧迫部材を加圧して前記動脈を圧迫して阻血し、かつ、加圧を解除して前記動脈に血液を再灌流する加圧手段とを具備する。加圧手段は、手動により駆動と停止を行うものでもよいが、自動的に駆動と停止を行うようにしておけば、使用者は、装置の使用中に他の作業をしたり、テレビを見たり、さらには寝ることもできるので便利で好ましい。自動的に駆動と停止を行う場合、加圧手段は、１〜１５分間の加圧と、該加圧後の解除から成るサイクルを１回以上、好ましくは２回〜１０回、さらに好ましくは２回〜５回繰り返すようにプログラムされていることが好ましい。
【００１６】
動脈圧迫部材がカフの場合には、好ましい例として、ポンプと、該ポンプと前記カフを連結し、該ポンプから前記カフに空気を送る送気管と、該送気管に設けられたバルブとを具備し、該ポンプを作動させて前記カフを加圧し、前記バルブを開いて加圧を解除するように構成されているものが挙げられる。この場合、前記バルブが電動バルブであり、該電動バルブの電源と、前記ポンプの電源がプログラムリレーを介して該電動バルブ及び該ポンプにそれぞれ接続され、該プログラムリレーにおいて、該ポンプの駆動による加圧と、前記電動バルブの解放による加圧後の解除から成るサイクルを１回以上繰り返すようにプログラムされているものが好ましい。さらに、前記送気管及び前記プログラムリレーに接続された圧力スイッチをさらに具備し、該圧力スイッチは、前記送気管内の圧力を検知し、検知した圧力が設定圧力未満か否かの信号を前記プログラムリレーに送り、設定圧力未満では前記ポンプの電源から前記ポンプに電力が供給されて該ポンプが駆動して前記カフを加圧し、設定圧力以上では、前記ポンプの電源から前記ポンプに電力が供給されずポンプが駆動しないように構成されているものが好ましい。この装置の場合、阻血−再灌流のサイクルが、１〜１５分間の加圧と、１分間〜３時間の加圧解除とから成り、該サイクルを２回〜１０回繰り返すようにプログラムリレーにおいてプログラムされていることが好ましく、特に、加圧時間が１分間〜１５分間であり、加圧解除時間が１分間〜１５分間であり、前記サイクルを２回〜５回繰り返すようにプログラムされているものが好ましい。なお、設定圧力は、四肢の組織をできるだけ損傷しないようにするために、阻血を達成できる（すなわち、動脈内を血液が流れないようにする）のに必要な圧力であって、できるだけ低い圧力が好ましく、従って、使用者の最大血圧よりも５〜10mmHg程度高い圧力が好ましい。
【００１７】
以下、図面に基づき、本発明の装置の好ましい具体例を説明する。
【００１８】
図７に、本発明の装置の一具体例の構成を模式的に示す。以下、この具体例について説明する。なお、具体例には、電源の電圧等、種々の数値が含まれるが、これらの数値は好ましい数値を例示的に示すものであり、支障が生じない限り他の数値を採用することも可能である。
【００１９】
図７中、１は、家庭用の交流電源(AC100V)に接続された電源スイッチ、２は、交流100V(AC100V)を直流24V(DC24V)に変換し、DC24Vを供給する直流電源、３は、AC100VをDC6Vに変換し、DC6Vを供給する直流電源、４は圧力スイッチ、５はプログラムリレー、６はポンプ、７は電動バルブ、８はポンプ６からカフ９に空気を送る送気管、９はカフである。これらの各部品は周知のものであり、市販品を利用可能である。また、阻血−再灌流サイクルの各時間や、繰り返し回数も適宜変更することができる。
【００２０】
電源スイッチ1を閉じると電源2及び電源3にAC100Vが供給され、電源2はDC24Vを、電源3はDC6Vを出力可能となる。電源2は、圧力スイッチ4及びプログラムリレー5に直接繋がっている（開閉スイッチを介さない）ので、電源スイッチ1閉で圧力スイッチ4とプログラムリレー5にはDC24Vが供給され起動状態となる。一方、電源3は、ポンプ6及びバルブ7にプログラムリレー5を介して繋がっているので、電源スイッチ1閉でもプログラムリレー5内のリレースイッチが閉じないとポンプ6やバルブ7にはDC6Vは供給されない。圧力スイッチ4、ポンプ6、バルブ7、カフ9は、送気管8を介して繋がっている。ポンプ6は、DC6Vが供給されると、ポンプ外の空気を吸い込んで管8内に空気を送り込みカフ9を加圧する。バルブ7は、0Vで開きDC6Vで閉じるので、0V時には管8及びカフ9内部は大気圧と同等となり、DC6V時には大気に対して閉じられる。圧力スイッチ4は、管8を介してカフ9内の圧力を検知し、大気圧差で+50〜250mmHgの任意の設定圧力未満と設定圧力以上でそれぞれ別の信号をプログラムリレーに送っている。プログラムリレー5は、圧力スイッチ4からの設定圧力未満の信号ではポンプ6及びバルブ7にDC6Vを供給し管8及びカフ9内を加圧する。設定圧力以上の信号でポンプ6へのDC6Vのみ供給を停止（バルブ7へはDC6V供給は続ける）する。このため、カフ9内圧は、圧力スイッチ4において設定した任意の圧力に保たれる。
【００２１】
プログラムリレー5は、ポンプ6及びバルブ7へのDC6Vの供給を同時に停止し、管8及びカフ9内圧を大気圧と同等にすることもできる。また、これらの動作、すなわち、カフ9の内圧を圧力スイッチ4で設定された圧力に保つ動作と大気圧と同等にする動作を任意の時間、任意のパターンで繰り返すことができる。
【００２２】
この具体例の装置のプログラムリレー5には、図８に示した制御プログラムが書き込まれている。阻血時には、カフ9内圧が圧力スイッチ4で設定された圧力となり、被検者の上腕部や大腿部を締付け阻血する。解除時には、カフ9内圧は大気圧とほぼ同等となり灌流する。
【００２３】
使用時に、電源スイッチ1閉で、1〜15分の任意の時間阻血後、1〜15分の任意の時間灌流し、これを任意の0〜5回繰り返した後、0〜3時間の任意の時間灌流し、この動作を0〜5回の任意の回数繰り返すようにプログラムされている。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００２５】
先ず、阻血−再灌流サイクルを繰り返すことにより生体内でのアセチルコリン(Ach)産生が促進されることを証明する動物実験を実施例１として記載する。【００２６】
実施例１
方法
１．ＣｈＡＴ遺伝子のノックダウン
BLOCK-iT（商標）Pol II miR RNAi発現ベクターであるpcDNA（商標）6.2-GW/ EmGFP-miR（Invitrogen Corporation、カールスバッド、カリフォルニア、米国）を用いて、ＣｈＡＴ遺伝子のノックダウンを行った。製造業者によるプロトコールに従って、商業上望ましく、かつ、予め設計されているヒト又はマウスＣｈＡＴに特異的なＲＮＡｉ配列を用いて二本鎖オリゴを調製し、これを発現ベクター中にサブクローニングした。ネガティブコントロールとしては、これもまた商業上望ましいとされている、ＬａｃＺに特異的なＲＮＡｉ配列をサブクローニングし、ネガティブコントロール発現ベクターを構築した。標的遺伝子であるＣｈＡＴの発現が抑制されたかを確認するために、Effectene transfection regent（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて一過的に形質転換したＨＥＫ２９３細胞を、免疫細胞化学的な実験により試験した。ＨＥＫ２９３細胞、ＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＥＫ細胞、並びにマウス心房心筋由来のＨＬ−１細胞、ＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＬ−１細胞に適した選択的抗生物質を用い、ＣｈＡＴノックダウン発現ベクターの安定な形質転換体を作出した。形質転換された細胞は、ＧＦＰの発現により容易に検出された。【００２７】
２．免疫細胞化学的試験
一次抗体として２００倍に希釈したヤギ抗ＣｈＡＴポリクローナル抗体（MILLIPORE、ビルリカ、マサチューセッツ、米国）、２００倍に希釈したウサギ抗−カテニンポリクローナル抗体（Cell Signaling TECHNOLOGY, Inc.、ダンヴァーズ、マサチューセッツ、米国）、５００倍に希釈したラット抗ＡＣｈポリクローナル抗体（MILLIPORE）、及びウサギ抗Ｃｘ４３ポリクローナル抗体（ZYMED Laboratories Inc.、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア、米国）を用い、免疫細胞化学的解析を行った。４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、それぞれに適した二次抗体に結合した免疫蛍光で処理し、その後レーザー共焦点顕微鏡（OLYMPUS、東京、日本）で観察した。【００２８】
３．ウェスタンブロット解析
本願発明者らによる研究で既に報告しているように、ウェスタンブロット解析を行った［２、３、７、１０、１１］。この試験では一次抗体として、５００倍に希釈したヤギ抗ＣｈＡＴポリクローナル抗体（MILLIPORE）、５００倍に希釈したウサギ抗ＣＨＴ１ポリクローナル抗体（Antagene, Inc.、リモネスト、フランス）、５００倍に希釈したウサギ抗切断型カスパーゼ−３モノクローナル抗体（Cell Signaling TECHNOLOGY, Inc.）を使用した。適したＨＲＰ結合二次抗体と反応させた後、１ＴＢＳＴで洗浄し、Luminata（商標）Forte Western HRP基質（MILLIPORE）を用いてシグナルを検出した。【００２９】
４．ＬＹ色素移動アッセイ
心筋細胞由来の細胞に及ぼす非神経性コリン作動系の効果を評価するために、恒久的にＣｈＡＴがノックダウンされているＨＬ−１細胞である、ＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＬ−ｌ細胞を得た。これらの細胞を、細胞が６０ｍの幅で直線状に並ぶように処理した、ガラス底のシャーレに播種した（Cyto Graph, Dai Nippon Printing Co., Ltd.、東京、日本）。直線状に並べた細胞は、それぞれが２００μｍ離れ、並行したパターンのバンドを形成した。培地を除去した後、直線状に並んだ細胞を２７ゲージの針で垂直に掻き取り、１％のルシファーイエロー色素を掻き取った領域の中央に乗せた。１分後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、その後、掻き取った領域から色素が移動した距離を免疫蛍光顕微鏡で評価した。【００３０】
５．細胞培養
ＨＥＫ２９３細胞と、ラット胚由来で自然に不死化した心筋芽細胞であるＨ９ｃ２細胞を、１０％ＦＢＳと抗生物質を添加したＤＭＥＭ（日本、大阪、日本）中で培養した。具体的には、ＨＥＫ２９３細胞をＩ型コラーゲン（Cellmatrix, Nitta Gelatin Inc.、大阪、日本）でコーティングした培養シャーレ上で培養した。心房筋細胞由来のＨＬ−１細胞を、１０％のＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのノルエピネフリン及び３ＭのＬ−アスコルビン酸を添加したＣｌａｙｃｏｍｂ培地（SAFC Biosciences, Inc.、レネクサ、カンザス、米国）を用い、０．０２％のゼラチンと２５ｇ／ｍＬのフィブロネクチンでコーティングした培養シャーレ上で培養した。【００３１】
６．細胞内ＡＣｈ濃度の測定
本願発明者らの最近の研究で既に報告しているように、ＨＰＬＣを用いて細胞内の又は心臓ＡＣｈ濃度を決定した[11]。細胞溶解物を調製するために、１０ｃｍの培養シャーレから掻き取った細胞をＰＢＳで洗浄し、０．１ｍＭフィソスチグミンと２×１０−８ＭのＩＰＨＣを内部対照として含む、１ｍＬのＰＢＳに懸濁した。その後、これらの試料を３回凍結融解した。マウスから摘出した心臓を十分に細かくし、０．１Ｍ過塩素酸、０．１ｍＭフィソスチグミン及び２×１０−８ＭのＩＰＨＣを含む１ｍＬの均一化溶液存在下でホモジナイズした。０℃、２×１０４Ｇで１５分間遠心分離した後、１Ｍの重炭酸カリウムでｐＨを調製し、Ultrafree MCカラム（MILLIPORE）でろ過し、そして溶出液をＡＣｈ濃度の定量に用いた。【００３２】
７．ＭＴＴ活性の測定
Cell Counting Kit-8（DOJINDO LABORATORIES、熊本、日本）を用い、製造業者によるプロトコールに従ってＭＴＴ活性を測定した。この活性が細胞の生死、すなわち完全な細胞の数に依存することが既に知られているが、この活性が細胞数だけでなく、細胞代謝によっても決定されることが報告された［１０、１２］。特に、ミトコンドリアの機能が正常でない細胞のＭＴＴ活性は、同等の細胞数であっても活性が低下する傾向を示した。【００３３】
８．細胞での酸素消費の測定
我々のこれまでの研究と同様に［１１］、Fibox 3（PreSense Precision Sensing、レーゲンスブルク、ドイツ）を用いて、培地中の酸素含量を決定した。特定の酸素感受性の感知装置を培養シャーレの底部に接着し、その培養シャーレ中で細胞をインキュベートした。酸素含量を連続して測定し、記録し、そして０時間での含量と比較した。【００３４】
９．細胞でのＡＴＰ含量の測定
XL-ATPキット（APRO Life Science Institute、徳島、日本）を用い、プロトコールに従って、細胞及び心臓のＡＴＰレベルを決定した。溶解物からのＡＴＰレベルはタンパク質濃度を基に修正した。【００３５】
１０．細胞での活性酸素種産生の評価
活性酸素種の指示物質であるアミノフェニルフルオレセイン（ＡＰＦ、SEKISUI MEDICAL CO., LTD.、東京、日本）を用い、それぞれの濃度（０．５、１．０、２．０ｍＭ）のノルエピネフリン存在下でのＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＬ−１細胞又は対照であるＨＬ−１細胞による産生レベルを評価した。ＡＰＦを最終濃度が１０μＭになるように培地に加えた。細胞をＡＰＦと共に１時間インキュベートし、その後レーザー共焦点顕微鏡により観察した。【００３６】
１１．ランゲンドルフ装置を用いた、マウス心臓の全虚血モデル
ネンブタールを腹腔内注入して麻酔した後、外科的ではなくて物理的な方法により、オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊの左後肢に阻血（５分）−再灌流（３分）を３回繰り返し行った。再灌流から１６時間後のＣｈＡＴ及びＣＨＴ１タンパク質の発現を評価するために、右と左の大腿四頭筋を摘出した。さらに、再灌流の４時間、８時間又は１６時間後に、タンパク質発現を評価するために心臓を摘出し、また別の心臓にはランゲンドルフ装置を接続し、５％二酸化炭素と９５％酸素で平衡化し、ろ過したクレブス−ヘンゼライト緩衝液を９０ｍｍＨｇで灌流した。安定した後、ランゲンドルフで灌流した心臓を、クレブス−ヘンゼライト緩衝液の灌流を３０分間停止することで全虚血にし、その後６０分間再灌流した。その後その心臓を１％のＴＴＣ染色液中に１０分間、３７℃で浸漬し、染色した心臓の中央部の横断切片を作成し、梗塞部を比較した。梗塞部の割合は、ＮＩＨ画像ソフトウェアを用いて梗塞部を全体から区別することによって決定した。【００３７】
１２．統計分析
データを平均±標準誤差として表した。２群間の比較を行うためのノンパラメトリック検定を、マン−ホイットニーＵ検定により行った。３群間でのノンパラメトリック多重比較検定を、クラスカル・ワリス検定と、それに続くフィッシャーのＰＬＳＤ検定により行った。Ｐ＜０．０５の場合に差が有意であると見なした。【００３８】
結果
１．非神経性コリン作動系は細胞間コミュニケーションを制御する。
非神経性コリン作動系の具体的な役割をインビトロで明らかにするために、ＣｈＡＴ特異的なｍｉＲＮＡ発現ベクターを用いてＣｈＡＴ遺伝子をノックダウンし、その効果を確認後ＨＥＫ２９３細胞とマウス心房心筋由来のＨＬ−１細胞を用いて恒久的なＣｈＡＴ  ＫＯ細胞を調製した。一過性に形質転換したＨＥＫ２９３細胞でのＣｈＡＴ遺伝子のノックダウンを免疫細胞化学的に確認した（図１Ａ）。形質転換された細胞は、ＧＦＰの発現（図１Ａの緑色部分）によって確認された。非形質転換体（赤色）で観察されるようなＣｈＡＴの免疫活性は、ＣｈＡＴ  ＫＯ細胞では完全に弱まっていた。【００３９】
恒久的なＣｈＡＴ  ＫＯ細胞は、ＬａｃＺ遺伝子ノックダウンベクター（対照細胞）で安定に形質転換した対照のＨＥＫ２９３細胞と比較して、成長が遅れることなく増殖した。しかしながら、ＣｈＡＴ  ＫＯ細胞を再度播種し、その後撹拌によって細胞を分離させると、細胞の特徴、すなわち、効率的な細胞間コミュニケーションが対照細胞と比較して損なわれたことが明らかになった（図１Ｂ）。撹拌後、ＣｈＡＴ  ＫＯ細胞は単一細胞として容易に分散するが、対照細胞は細胞間相互作用を維持して凝集体を形成する。対照細胞では、ＡＣｈ−陽性シグナルは細胞膜上で検出されたが、ＣｈＡＴ  ＫＯ細胞ではこのシグナルは弱くなっていた。同様に、免疫反応性β−カテニンのシグナルが対照細胞間では非常に強いこととは対照的に、ＣｈＡＴ  ＫＯ細胞間では、より減弱したたシグナルが検出された。【００４０】
ＬａｃＺ遺伝子をノックダウンさせた対照細胞（対照細胞）と同様に、ＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＬ−１細胞もまた調製した。ＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＬ−１細胞では、ウェスタンブロット及び免疫細胞化学的解析で確認したように（図１Ｃ）、Ｃｘ４３タンパク質の発現が抑制された。対照細胞間でははっきりと検出できるＣｘ４３陽性のシグナルは、ＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＬ−１細胞では顕著に弱まっており、このことは細胞間コミュニケーションが妨げられたことを示唆している。色素移動アッセイでもまた、ＬＹ色素がＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＬ−１細胞間を効率的に移動しなかったことが明らかになった。対照的に、対照細胞に乗せた色素は顕著に長い距離を移動し、このことは、非神経性コリン作動系がギャップ結合機能を制御したことを示唆している。【００４１】
総合すると、これらのデータは、非神経性コリン作動系が細胞間コミュニケーションで機能していることを示唆している。【００４２】
２．非神経性コリン作動系はエネルギー代謝の抑制に機能している
この系のさらなる機能を解析するために、対照細胞と比較して産生レベルが１０％未満のＡＣｈ合成能をもつＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＥＫ細胞（対照対ＣｈＡＴ  ＫＯ：１００±８．７対９．３±３．５％、Ｐ＜０．０１）の細胞のエネルギー代謝について評価した。それぞれについて同等の細胞数を使用した場合であっても、ＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＥＫ細胞におけるＭＴＴ活性は対照の活性よりも高かった（対照を基準として、３８４．８±２０．８％、Ｐ＜０．０１）。この結果と一致して、ＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＥＫ細胞は対照よりも多い酸素を消費した（対照を基準として、−２３９．４±２６．４％、Ｐ＜０．０１）（図２Ａ）。その結果、ＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＥＫ細胞のＡＴＰレベルは有意に低下した（対照対ＣｈＡＴ  ＫＯ：７６５．１±５６．９対４２５．７±１８．７ｍＭ／タンパク質１ｇ、Ｐ＜０．０１）（図２Ｂ）。これらの結果は、ＭＴＴ活性並びに酸素消費及びＡＴＰ含量の相互変化を示しており、これは、非神経性コリン作動系が細胞のエネルギー代謝を負に制御していること、そしてこの系が細胞のＡＴＰ含量を維持していることを示唆している。従って、化学的に擬似的な低酸素を生じる塩化コバルト（２ｍＭ）で酸素の使用を阻害した場合、塩化コバルトを投与しても対照細胞と比較して、ＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＥＫ細胞は細胞死を起こしやすい（対照対ＣｈＡＴ  ＫＯ：１００．０±０．３５対２６．６±２．３３％、Ｐ＜０．０１）（図２Ｃ）。  【００４３】
同様にＨＬ−１細胞では、非神経性コリン作動系は細胞のエネルギー代謝の制御に重要な役割を果たしている。ＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＬ−１細胞でのＡＴＰ含量は対照よりもずっと少ない（対照対ＣｈＡＴ  ＫＯ：２７１．９±２８．２対８３．１±８．８ｍＭ／タンパク質１ｇ、Ｐ＜０．０１）（図２Ｄ）。この結果は、ラット心筋由来のＨ９ｃ２細胞でもまた同様であった。ＣｈＡＴ遺伝子を欠損させる代わりに、２種類のＣｈＡＴ阻害薬、すなわち、ブロモアセチルコリン（ＢｒＡＣｈ）とヘミコリニウム−３を使用して、ＣｈＡＴ活性を阻害した。１０μＭの各阻害薬を使用した場合、Ｈ９ｃ２細胞はいかなる形態的な変化も示さなかった。各阻害剤はＨ９ｃ２細胞でのＭＴＴ活性を上昇させ、また、ヘミコリニウム−３は、ＣｈＡＴ遺伝子を欠損させた場合と同様に、ＡＴＰレベルを相互に減少させた（対照対ＣｈＡＴ  ＫＯ：９２．０±１．０対６１．０±１．１ｍＭ／タンパク質１ｇ、Ｐ＜０．０５）（図２Ｅ）。これらのデータもまた、細胞のＡＴＰを保存するために、非神経性コリン作動系はエネルギー代謝を負に制御し、かつ、酸素消費を抑制することを示唆している。【００４４】
３．非神経性コリン作動系は、ノルエピネフリンの毒性から細胞を保護する
ＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＬ−１細胞をノルエピネフリン（ＮＥ）で処理した（図３）。この実験では、細胞の生存能力の指標として、ＮＥ処理したＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＬ−１細胞と対照細胞との間の細胞の生存率を用いた。従って、１００％の割合は、ＮＥが存在する場合であっても、両方の細胞が同様に生存していることを示した。それにもかかわらず、図３ではっきりと示されたように、ＮＥはＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＬ−１細胞の細胞生存率を用量依存的に低下させた（対照を基準として：０．５ｍＭのＮＥで７３．６±１．４％、Ｐ＜０．０１；１．０ｍＭのＮＥで６２．０±１．０％、Ｐ＜０．０１）。２ｍＭのＮＥは、ＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＬ−１細胞でより多くの細胞死を引き起こし（対照を基準として：２９．４±２．４％、Ｐ＜０．０１）、これは対照よりも高いカスパーゼ−３活性を伴った。加えて、ＣｈＡＴ  ＫＯ  ＨＬ−１細胞はＮＥによるこの細胞死の間に、ＲＯＳの指示物質であるＡＰＦで評価される、より多くの活性酸素種を産生した。そのようなＲＯＳ産生の増加は、部分的には細胞死によるものだと推測された。これらの結果は、心筋における非神経性コリン作動系は、ＮＥの毒性から細胞を保護するのに必須であることをはっきりと示している。【００４５】
これらのインビトロでのデータを総合すると、非神経性コリン作動系は、細胞間コミュニケーションの維持、細胞のエネルギー代謝の負の制御、及び細胞死からの細胞の保護に関与している。【００４６】
４．骨格筋の非神経性コリン作動系のインビボでの促進
この系のインビボでの制御機構を解析するために、プレコンディショニングのプロトコールと同様に、阻血（５分）と再灌流（３分）を断続的に３回、左大腿動脈の流動性を手で弱めることによりマウスで一過的な後肢阻血−再灌流（ＩＲ）を行った（図４）。ＩＲから１６時間後、試験した左の大腿四頭筋では、反対側と比較して、ＣｈＡＴとＣＨＴ１のタンパク質発現が顕著に上昇した。このことは、ＩＲそれ自体が骨格非神経性コリン作動系を活性化させる引き金として機能することを示唆している。【００４７】
注目すべきことに、この処置の間、心臓でもまたこの系は活性化されており、このことは、ＩＲが心臓の非神経性コリン作動系を遠隔的に活性化させることを示唆している。ＣｈＡＴのタンパク質発現は２４時間の間に徐々に増加した。ＣＨＴ１タンパク質発現の経時変化には、同様のＣｈＡＴのパターンが続いた。これらのデータは、ＩＲが試験を行った器官だけでなく、離れた器官、例えば心臓の非神経性コリン作動系もまたアップレギュレートすることを示唆している。【００４８】
５．インビボでの後肢阻血再灌流は、心臓の非神経性コリン作動系を介して心臓全体を全虚血から救出する
ＩＲが全虚血から心臓を保護するかを確認するために、ＩＲの１６時間後に摘出し、ランゲンドルフ装置を用いて灌瘤した心臓に、全阻血−再灌流、すなわち３０分の阻血と６０分の再灌流を加えた（図５）。再灌流傷害においては、ＩＲを受けていない対照マウスでの梗塞部の割合は０．６１±０．０３であった。対照的に、ＩＲを加えたマウスから摘出した心臓での割合は０．２６±０．０３（対照を基準として、Ｐ＜０．０１）まで有意に低下し、このことから、マウスの心臓に及ぼすＩＰの遠隔的な保護効果が確認された。この現象は後期プレコンディショニングとして周知であるが、ＩＲ処理マウスをＩＲの前にＣｈＡＴ阻害薬であるヘミコリニウム−３で前処理すると、ＩＲによるこの心筋梗塞抑制効果が弱まり、かつ、割合が対照の０．５６±０．０３（ＩＲに対する、Ｐ＜０．０５）と同等のレベルまで回復した。これらの結果は、ヘミコリニウム−３がこの効果を打ち消すことから、心臓を保護する遠隔効果が心臓でのＣｈＡＴのアップレギュレーションにより仲介されたことを示唆している。【００４９】
６．遠隔効果による心保護の根底をなす機序
ＩＲ後、４時間、８時間及び１６時間でそれぞれ心臓を摘出し、心臓でのＡＴＰレベル含量を測定した。１６時間の心臓においてもより高いレベルのＡＴＰ含量が含まれていることが明らかとなり（ＩＲを基準として、２５６．４±１３．１％、４時間、Ｐ＜０．０１）、このことは、ＩＲが心臓でのＡＴＰレベルの上昇を引き起こすことを示唆している（図６Ａ）。  心臓でのＡＴＰレベルの上昇が、心臓の非神経性コリン作動系のアップレギュレーションによるものであるかどうかを調べるために、ＩＲの前にヘミコリニウム−３を投与した。図４及び６Ｃに示されたように、ＩＲは心臓でのＣｈＡＴタンパク質の発現をアップレギュレートし、心臓でのＡＣｈ（ＩＲ：２．７８±０．１７ｎｍｏｌ／タンパク質１ｇ対対照：２．３２±０．１２ｎｍｏｌ／タンパク質１ｇ、Ｐ＜０．０５）とＡＴＰレベル（ＩＲ：１１．５±０．９ｍＭ／タンパク質１ｇ対対照：５．９±０．５ｍＭ／タンパク質１ｇ、Ｐ＜０．０１）を増加させた。しかしながら、ＣｈＡＴ阻害薬であるヘミコリニウム−３は驚くことに、心臓ＡＴＰレベルの上昇を対照レベルまで弱めた（ＨＣ−３：６．４±１．０ｍＭ／タンパク質１ｇ、ＩＲを基準として、Ｐ＜０．０５）（図６Ｂ）。これは、心臓の非神経性コリン作動系が心臓のＡＴＰレベルの維持に確かに関与していることを示唆している。ＩＲに用いたマウスの心臓でのＡＣｈレベルの測定もまた、この課題を支持した。ヘミコリニウム−３での前処理は、心臓ＡＣｈレベルの上昇を完全に抑制した（ＨＣ−３：２．１４±０．０７、ＩＲを基準として、Ｐ＜０．０５）（図６Ｃ）。【００５０】
ｅＮＯＳ（血管内皮型一酸化窒素合成酵素）ＫＯマウスでは、心臓におけるＩＲ誘導性のＡＣｈ合成のアップレギュレーションが失われた。ＩＲの１６時間後でも、野生型マウスでは増加するはずの心臓ＡＣｈレベルが、ＩＲ前と同等であった。これは、ＩＲの遠隔効果によって誘導される心臓の非神経性コリン作動系のアップレギュレーションに、ＮＯが部分的に関与していることを示唆している。【００５１】
実施例２
図７及び図８を参照して具体的に説明した本発明の装置を作製した。この装置を用いて、ヒトにおいて右大腿部を5分阻血し3分再灌流させた。この阻血−再灌流サイクルを１回又は３回行った。この場合の心拍数の経時変化をそれぞれ図９及び図１０に示す。【００５２】
図９及び図１０中、「trained」は、本発明の装置により阻血−再灌流を行ったヒト、「untrained」は、阻血−再灌流を行わなかったヒト（対照）である。図９及び図１０に示す通り、阻血−再灌流サイクル直後より心拍数の低下（心臓におけるAChが増加していることおよび、中枢性に副交感神経系が活性化していることを示す）が認められ、これが約16時間持続した。なお、この効果は約24時間以内であれば持続が認められるが、それ以上間隔をあけると心拍数は再び元に戻り、再度改めて阻血再灌流をすると心拍数は低下した（データ示さず）。これは、全身の副交感神経系が亢進し、さらに心臓におけるアセチルコリン合成系が亢進したことを示唆している。【００５３】
実施例３
マウスに高脂肪食を与え、後脚に対するIR（3分虚血2分再灌流3回繰り返し）を毎日、11日間行い、IR未処理のマウスとBS(血糖値)を比較した。結果を図１１に示す。【００５４】
図１１に示されるとおり、IR未処理マウスでは血糖値が増加したが、IR処理マウスでは血糖値低下作用が認められた。【００５５】
実施例４
マウスに高脂肪食を与え、IR（3分虚血2分再灌流3回繰り返し）を隔日(0日目、2日目、4日目)で行い、IR未処理のマウスとBS(血糖値)を比較した。結果を図１２に示す。【００５６】
図１２に示されるとおり、IR未処理マウスでは血糖値が増加したが、IR処理マウスでは血糖値低下作用が認められた。この血糖低下作用は、１日おきの隔日でも明らかな効果が認められた。【００５７】
実施例５
マウスに高脂肪食を与え、IR（2分虚血2分再灌流3回繰り返し）を毎日、11日間行い、IR未処理のマウスとBS(血糖値)を比較した。結果を図１３に示す。【００５８】
図１３に示すように、IR処理マウスでは血糖値低下作用が認められた。この血糖値低下作用は、阻血時間を、侵襲の少ない短時間である２分間にしても１１日間持続した。【００５９】
実施例６
マウスに高脂肪食を7-11日間摂取させながらIRを毎日行った。IRは２分〜３分虚血・２分再灌流を３回繰り返した。この間の体重を測定した。結果を図１４に示す。【００６０】
図１４に示すように、対照群(control)と比較して、pc (IR)群では、有意に体重増加が認められなかった。共に、１日摂取量に差はなかった。一方１日おき（隔日）にIRを行った場合は、体重減少効果は見られなかった。しかし、図１２が示すように、血糖低下作用はまだ認められた。【００６１】
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【符号の説明】
【００６２】
１  電源スイッチ
２  直流電源
３  直流電源
４  圧力スイッチ
５  プログラムリレー
６  ポンプ
７  電動バルブ
８  送気管
９  カフ
【図２Ａ】
2014021267.tif 000003
【図２Ｂ】
2014021267.tif 000004
【図２Ｃ】
2014021267.tif 000005
【図２Ｄ】
2014021267.tif 000006
【図２Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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