(57)【要約】  試料中の検出対象抗原を、前記抗原に対する抗原認識部位を含む抗体断片（以下、「抗原に対する抗原認識部位を含む抗体断片」を単に「抗原に対するフラグメント抗体」という）との抗原抗体反応により検出する方法であって、フラグメント抗体に起因する非特異的反応が抑制された検出方法を提供することを課題とする。  試料中の検出対象抗原を、前記抗原に対するフラグメント抗体との抗原抗体反応により検出する方法であって、ａ）試料と、前記フラグメント抗体の変性体とを接触させる工程と、ｂ）ａ）の工程の後に、試料と、不溶性担体に担持した前記フラグメント抗体とを接触させる工程と、を含むことにより非特異的反応を抑制した検出方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の検出対象抗原を、前記抗原に対する抗原認識部位を含む抗体断片（以下、「検出対象抗原に対する抗原認識部位を含む抗体断片」を単に「フラグメント抗体」という）との抗原抗体反応により検出する方法であって、
ａ）試料と、前記フラグメント抗体の変性体とを接触させる工程と、
ｂ）ａ）の工程と同時またはａ）の工程の後に、前記試料と、不溶性担体に担持した前記フラグメント抗体とを接触させる工程と、
を含む前記検出方法。
【請求項２】
フラグメント抗体の変性体は、不溶性担体に担持したフラグメント抗体と認識エピトープが同一または異なる請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
ｂ）の不溶性担体に担持したフラグメント抗体が、認識部位の異なる少なくとも２種類のフラグメント抗体をそれぞれ不溶性担体に担持したものである、請求項１または２に記載の検出方法。
【請求項４】
試料中の検出対象抗原を、前記フラグメント抗体との抗原抗体反応により検出する方法における非特異的反応抑制方法であって、
ａ）試料と前記フラグメント抗体の変性体とを接触させる工程と、
ｂ）ａ）の工程と同時またはａ）の工程の後に、前記試料と不溶性担体に担持した前記フラグメント抗体を接触させる工程と、
を含む非特異的反応抑制方法。
【請求項５】
フラグメント抗体の変性体は、不溶性担体に担持したフラグメント抗体と認識エピトープが同一または異なる請求項４記載の非特異的反応抑制方法。
【請求項６】
ｂ）の不溶性担体に担持したフラグメント抗体が、認識部位の異なる少なくとも２種類のフラグメント抗体をそれぞれ不溶性担体に担持したものである、請求項４または５に記載の非特異的反応抑制方法。
【請求項７】
非特異的反応が、測定に使用するフラグメント抗体に起因する反応である、請求項４〜６のいずれかに記載の非特異的反応抑制方法。
【請求項８】
非特異的反応が、全長の抗体を含む非特異的反応抑制剤では抑制できない反応である、請求項４〜７のいずれかに記載の非特異的反応抑制方法。
【請求項９】
全長の抗体が、全長の抗ヒトＩｇＧ抗体または抗ヒトＩｇＭ抗体または抗ヒトＩｇＡ抗体である請求項８に記載の非特異的反応抑制方法。
【請求項１０】
全長の抗体が、ハイブリドーマＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３４が産生するモノクローナル抗体である請求項９に記載の非特異的反応抑制方法。
【請求項１１】
全長の抗体を含む非特異的反応抑制剤が、ＨＢＲ（ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ社）である請求項９に記載の非特異的反応抑制方法。
【請求項１２】
試料中の検出対象抗原を抗原抗体反応により検出するための試薬であって、
１）検出対象抗原に対するフラグメント抗体を担持した不溶性担体
２）検出対象抗原に対するフラグメント抗体の変性体
を含む前記試薬。
【請求項１３】
フラグメント抗体の変性体は、不溶性担体に担持したフラグメント抗体と認識エピトープが同一または異なる、請求項１２に記載の試薬。
【請求項１４】
１）の不溶性担体に担持したフラグメント抗体が、認識部位の異なる少なくとも２種類のフラグメント抗体をそれぞれ不溶性担体に担持したものである、請求項１２または１３に記載の試薬。
【請求項１５】
さらに、３）全長の抗体を含む非特異的反応抑制剤を含む請求項１２または１３に記載の試薬。
【請求項１６】
試料中の検出対象抗原を、フラグメント抗体との抗原抗体反応により検出する方法における非特異的反応抑制剤であって、
前記フラグメント抗体の変性体を有効成分として含む前記非特異的反応抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は非特異的反応の抑制方法、抑制剤およびこれを用いた免疫学的測定方法に関し、より詳細には検出対象抗原に対するフラグメント抗体を担持した不溶性担体を用いる免疫学的測定法に特徴的な非特異的反応の抑制方法、抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
体外診断薬の分野で汎用される被験試料中の検出対象物質の検出方法として、予め検出対象物質（抗原）を免疫原として作成された抗体を用い、被験試料中に存在する検出対象抗原を検出する免疫学的測定法が挙げられる。とりわけ抗体を担持した不溶性担体を利用する免疫凝集法や免疫クロマトグラフ法は、測定感度や操作性に優れることから、さまざまな臨床検査における診断項目に適用される汎用性の高い測定方法である。
近年の測定精度の向上に伴ない、免疫学的測定方法における非特異的反応の抑制が体外診断薬開発の課題となっている。非特異的反応とは被験試料中の何らかの因子が、免疫学的測定方法を原理とする体外診断薬の構成成分である抗体と反応することにより、誤ったシグナルを発生する現象で、正確な測定を妨害する原因となる。非特異的反応の原因因子として異好性抗体やリウマチ因子（ＲＦ）の存在が明らかとなっている。
異好性抗体とは、免疫学的測定方法を構成する主成分である動物由来抗体に対して反応性を示すヒト抗体の総称であり、ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス免疫グロブリン抗体）が代表的なものとして知られている。その成因については、食事や動物との接触、生物学的製剤の投与といった無自覚下における抗原感作によって産生される場合に加え、抗原未感作のヒト試料中の抗体が異好性を示す可能性も指摘されているため、詳細あるいは統一した解明がなされていないのが実状である。一方、リウマチ因子は関節リウマチ患者に出現し、その結合部位は免疫グロブリン（抗体）のＦｃ部位と特定されていることから、異好性抗体とは別の概念として捉えられているが、動物由来抗体に対して反応性を示すという性質を有する点では共通しており、非特許文献1に記載されたようにその実体はいずれもヒトのＩｇＧやＩｇＭ（いわゆる自己抗体）であることが知られている
これまで体外診断薬に使用する抗体として、Ｆｃ部分を除去し、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２に断片化したフラグメント抗体（定義後記）を使用することで、非特異的反応を低減する方法が知られており、特にリウマチ因子の影響抑制に効果的である。さらにＦａｂに結合する異好性抗体による非特異的反応を抑制する添加剤として非特許文献２、３記載の抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体を成分とする異好性阻止試薬ＨＢＲがＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ社より製品化されている。さらにまた測定に用いる抗体と同種動物から調製したＩｇＭ型自然抗体に対するポリクローナル抗体を添加する特許文献１の方法や、リウマチ因子の反応部位に対する各種動物抗体を添加する特許文献２記載の方法、１種類でヒトＩｇＭを凝集できる抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体を利用する特許文献３記載の非特異的反応抑制方法が考案されている。
しかしながら従来の対策法だけでは非特異的反応を充分抑制できず、対策法そのものが非特異的反応の原因となっている検体が見出されるようになってきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−２８７８０１号公報
【特許文献２】特開平０７−０１２８１８号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１０／０２６７５８号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】臨床化学 ;第23巻補冊175a-1〜175a-10 (1994）
【非特許文献２】異好性阻止試薬HBRに関わる宣伝資料（長瀬産業1993）
【非特許文献３】CLIN.CHEM. 45/7,942-956 （1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は非特異的反応の抑制方法、抑制剤およびこれを用いた免疫学的測定方法に関し、より詳細にはフラグメント抗体を担持した不溶性担体を用いる免疫学的測定法に特徴的な非特異的反応の抑制方法、抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは前記課題を解決するために鋭意検討をおこなったところ、フラグメント抗体を担持した不溶性担体を利用した測定方法において、断片化されていない全長の抗体（以下、インタクト抗体ということがある）を利用した従来の対策方法では抑制できない非特異的反応を示す試料に対して、フラグメント抗体を担持した不溶性担体と接触させる前あるいは同時に、変性させたフラグメント抗体を接触させることで非特異的反応を抑制できることを見出し本発明の完成に至った。したがって本発明の目的は、変性させたフラグメント抗体による非特異的反応の抑制方法に関する。
また、本発明者らは、驚くべきことに前記変性させたフラグメント抗体が、不溶性担体に担持したフラグメント抗体と同一の全長の抗体に由来するものでなくても、検出対象抗原に対する抗体であれば本発明の目的とする非特異的反応の抑制効果を示すことを見出した。したがって本発明の別の目的は、変性させたフラグメント抗体を含む非特異的反応の抑制剤に関し、さらに別の目的は前記抑制剤を利用した免疫学的測定法および免疫学的測定試薬に関する。
具体的には本発明は以下の構成を有する。
〔１〕試料中の検出対象抗原を、前記抗原に対する抗原認識部位を含む抗体断片（以下、「検出対象抗原に対する抗原認識部位を含む抗体断片」を単に「フラグメント抗体」という）との抗原抗体反応により検出する方法であって、
ａ）試料と、前記フラグメント抗体の変性体とを接触させる工程と、
ｂ）ａ）の工程と同時またはａ）の工程の後に、前記試料と、不溶性担体に担持した前記フラグメント抗体とを接触させる工程と、
を含む前記検出方法。
〔２〕フラグメント抗体の変性体は、不溶性担体に担持したフラグメント抗体と認識エピトープが同一または異なる〔１〕記載の検出方法。
〔３〕ｂ）の不溶性担体に担持したフラグメント抗体が、認識部位の異なる少なくとも２種類のフラグメント抗体をそれぞれ不溶性担体に担持したものである、〔１〕または〔２〕に記載の検出方法。
〔４〕試料中の検出対象抗原を、前記フラグメント抗体との抗原抗体反応により検出する方法における非特異的反応抑制方法であって、
ａ）試料と前記フラグメント抗体の変性体とを接触させる工程と、
ｂ）ａ）の工程と同時またはａ）の工程の後に、前記試料と不溶性担体に担持した前記フラグメント抗体を接触させる工程と、
を含む非特異的反応抑制方法。
〔５〕フラグメント抗体の変性体は、不溶性担体に担持したフラグメント抗体と認識エピトープが同一または異なる〔４〕記載の非特異的反応抑制方法。
〔６〕ｂ）の不溶性担体に担持したフラグメント抗体が、認識部位の異なる少なくとも２種類のフラグメント抗体をそれぞれ不溶性担体に担持したものである、〔４〕または〔５〕に記載の非特異的反応抑制方法。
〔７〕非特異的反応が、測定に使用するフラグメント抗体に起因する反応である、〔４〕〜〔６〕のいずれかに記載の非特異的反応抑制方法。
〔８〕非特異的反応が、全長の抗体を含む非特異的反応抑制剤では抑制できない反応である、〔４〕〜〔７〕のいずれかに記載の非特異的反応抑制方法。
〔９〕全長の抗体が、全長の抗ヒトＩｇＧ抗体または抗ヒトＩｇＭ抗体または抗ヒトＩｇＡ抗体である〔８〕に記載の非特異的反応抑制方法。
〔１０〕全長の抗体が、ハイブリドーマＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３４が産生するモノクローナル抗体である〔９〕に記載の非特異的反応抑制方法。
〔１１〕全長の抗体を含む非特異的反応抑制剤が、ＨＢＲ（ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ社）である〔９〕に記載の非特異的反応抑制方法。
〔１２〕試料中の検出対象抗原を抗原抗体反応により検出するための試薬であって、
１）検出対象抗原に対するフラグメント抗体を担持した不溶性担体
２）検出対象抗原に対するフラグメント抗体の変性体
を含む前記試薬。
〔１３〕フラグメント抗体の変性体は、不溶性担体に担持したフラグメント抗体と認識エピトープが同一または異なる、〔１２〕に記載の試薬。
〔１４〕１）の不溶性担体に担持したフラグメント抗体が、認識部位の異なる少なくとも２種類のフラグメント抗体をそれぞれ不溶性担体に担持したものである、〔１２〕または〔１３〕に記載の試薬。
〔１５〕さらに、３）全長の抗体を含む非特異的反応抑制剤を含む〔１２〕または〔１３〕に記載の試薬。
〔１６〕試料中の検出対象抗原を、フラグメント抗体との抗原抗体反応により検出する方法における非特異的反応抑制剤であって、
前記フラグメント抗体の変性体を有効成分として含む前記非特異的反応抑制剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の非特異的反応回避方法により、インタクト抗体を利用する従来の方法では抑制できない非特異的反応を抑制することが可能になった。
また本発明の非特異的反応の抑制剤を含む、免疫学的測定法や免疫学的測定試薬では、既知の抑制剤では回避できなかった非特異的反応が抑制されるため、従来よりも正確な測定値を与えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】各試薬の検量線を示す図である。（実施例２）
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（フラグメント抗体）
フラグメント抗体とは抗原認識部位であるＦａｂ構造を含む、抗体由来の断片であって、ＦａｂやＦ（ａｂ'）２が繁用される。フラグメント抗体は一般的に、インタクト抗体（断片化されていない全長の抗体を）を常法に従いペプシンやパパインなどで酵素処理して、Ｆｃ部分を除去することで作成されるが、遺伝子組み換えによって合成、改変されたものであっても特に制限はない。
【００１０】
（不溶性担体）
不溶性担体としては、特に限定されないが、合成高分子からなるラテックス、金属コロイド、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、セラミックスまたは磁性体の材質よりなる不溶性担体粒子から選ばれるものが好ましい。前記合成高分子としては、ポリスチレン、スチレン‐スルホン酸共重合体、スチレン‐メタクリル酸共重合体、アクリロニトリル‐ブタジエン‐スチレン共重合体、塩化ビニル‐アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル‐アクリル酸エステル共重合体から選ばれる１種以上であることが好ましい。また、メンブレンを利用し、標識抗体、抗原、および検出用抗体の３元複合体をメンブレン上の検出ラインで検出するようなイムノクロマトグラフ法においては、標識抗体の標識部分も検出ライン部分のメンブレンも本発明でいうフラグメント抗体が固定化された不溶性担体に含めることができる。
【００１１】
（フラグメント抗体の担体への担持）
フラグメント抗体を不溶性担体に担持する方法としては特に限定はなく、繁用される物理的な結合法、化学的な結合法いずれも利用することができる。
ここで、免疫凝集法を利用する検出の場合は、不溶性担体に担持させる抗体は、抗原が多価抗原でない場合には抗原に対する認識部位の異なる少なくとも２種以上の抗体が必要であり、本発明においてはフラグメント抗体が１種以上使用されていればよく、すべてがフラグメント抗体であってもよく、後述する実施例では２種のフラグメント抗体をそれぞれ不溶性担体に担持させたものが例示されている。
【００１２】
（非特異的反応）
本発明の非特異的反応抑制方法は、インタクト抗体を担持した不溶性担体からなる免疫学的測定法では発生せず、同抗体をフラグメント抗体化して担持した不溶性担体において顕在化し、インタクト抗体を利用した従来の方法では抑制できない非特異的反応を効果的に抑制できる。インタクト抗体を利用した従来の非特異的反応抑制剤の例としては、ＨＡＭＡ、異好性抗体、リウマチ因子（ＲＦ）に由来する非特異的反応を抑制する剤が挙げられ、例えば、全長の抗ヒトＩｇＧ抗体や抗ヒトＩｇＭ抗体を成分とする抑制剤が挙げられ、より具体的には、異好性阻止試薬ＨＢＲ（ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ社）やハイブリドーマＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３４が産生するモノクローナル抗体を有効成分とする抑制剤が挙げられる。
【００１３】
（フラグメント抗体の変性体）
フラグメント抗体の変性方法には特に制限はなく、通常タンパク質の変性に一般的に用いられる加熱、酸、アルカリ、還元剤、カオトロピック塩などが適用できるが、なかでも不可逆的な変性効果を示す処理方法が好適である。また、フラグメント化と変性化の順序は、全長抗体をフラグメント化した後に変性してもよく、あるいは全長抗体を変性した後にフラグメント化してもよい。本明細書中、「フラグメント抗体の変性体」を「変性させたフラグメント抗体」あるいは「変性フラグメント抗体」ということがあるが、特にその意味を断らない限り同義で用いるものとする。
フラグメント抗体の変性の程度としては、抗原認識部位の反応性が失活、あるいは担体に担持したフラグメント抗体よりも反応性が低下していて、抗原測定のための主反応を実用レベル以下に抑制しなければ良い。変性操作の際には、変性の程度を調整するためにＢＳＡ、セリシン、ブロッキングペプチドフラグメント（東洋紡績株式会社）のようなタンパク質成分やグリセロールを共存させることができる。
【００１４】
（用途）
本発明の非特異的反応抑制剤は、フラグメント抗体を担持した不溶性担体を用いる免疫学的測定法であればいずれにも適用でき、その用途としては検体の前処理用剤として、あるいは免疫学的測定方法／試薬の構成成分の一部として好適に利用できる。免疫学測定法として具体的には、汎用される粒子増強免疫凝集法、簡易検査法である免疫クロマトグラフ法、専用機器を利用した化学発光法や蛍光酵素法などが挙げられる。
【００１５】
（添加剤）
本発明の非特異的反応抑制剤ならびにそれを含む免疫学的測定試薬においてはその非特異的反応抑制効果を妨げない範囲でバッファー、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、脂質、リン脂質、糖類、無機塩、界面活性剤、防腐剤等を含有させてもよい。
【００１６】
（測定対象物質または検出対象抗原）
本発明の非特異的反応抑制法は、測定対象物質を抗原とするフラグメント抗体を作成できるような物質であればいずれの物質にも適用できる。測定対象物質としてはタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、核酸、ハプテンなどが挙げられるが、理論的に測定可能な分子であれば特に制限はない。例としてＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、Ｌｐ（ａ）、ＭＭＰ−３（マトリクスメタロプロテイナーゼ３）、抗ＣＣＰ（環状シトルリン化ペプチド）抗体、抗リン脂質抗体、ＲＰＲ、ＩＶ型コラーゲン、ＰＳＡ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、インスリン、マイクロアルブミン、シスタチンＣ、ＲＦ（リウマチ因子）、ＣＡ―ＲＦ、ＫＬ−６、ＰＩＶＫＡ―ＩＩ、ＦＤＰ、Ｄダイマー、ＳＦ（可溶性フィブリン）、ＴＡＴ（トロンビン-アンチトロンビンＩＩＩ複合体）、ＰＩＣ、ＰＡＩ、ＸＩＩＩ因子、ペプシノーゲンＩ・ＩＩや、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、バルプロ酸、テオフィリンなどが挙げられる。
本発明において、非特異的反応を抑制できる測定対象抗原の濃度は、各抗原の種類、抗体の種類その他の条件により異なるが、例えば、血清中の正常濃度を含む範囲で特にその効果を発揮することがより望ましく、測定対象がＰＳＡの場合には、後述する実施例のように２〜５ｎｇ/ｍＬと臨床的なカットオフ値とされている４ｎｇ/ｍＬ付近の濃度レベルでその抑制効果を示すことがより望ましい。
【００１７】
本発明の検出には、試料中の検出対象抗原の存在の有無を調べる定性的な検出のほか、試料中の検出対象抗原の存在量を定量的に調べるような定量的な検出（すなわち測定）の意味も含まれる。したがって、本明細書において、「検出」、「定量」、「測定」という用語は、特に断りのない限り、検出対象である抗原の存在の証明および／または定量も含めて広義に解釈するものとする。
【実施例】
【００１８】
以下、変性させたフラグメント抗体による非特異的反応の抑制方法、変性させたフラグメント抗体を含む非特異的反応の抑制剤を利用した免疫学的測定法、免疫学的測定試薬の例を挙げて本発明の一部を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００１９】
実施例1 非特異的反応を呈する検体の分析と本発明による非特異的反応の抑制
（１）フラグメント抗体の調製
抗ＰＳＡ（前立腺特異抗原）モノクローナル抗体６３２７９（ハイブリドーマ寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４５４が産生するモノクローナル抗体）ＩｇＧより、常法にしたがってフラグメント抗体を精製した。
詳細には６３２７９ ＩｇＧ溶液を０．２Ｍクエン酸液（ｐＨ３．５）と等量混和し、ＩｇＧの１／１３０量（ｗ/ｗ）のペプシンを添加して３７℃、４時間インキュベートした後、２Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液を１／１０容量添加して中和した。最終溶液をゲル濾過法に供し精製６３２７９Ｆ（ａｂ'）2を得た。【００２０】
（２）抗体結合ラテックス液の調製
２０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０）を用いてそれぞれの濃度に希釈した０．４％ラテックス溶液（平均粒子径約３００ｎｍ）と波長２８０ｎｍにおける吸光度が０．４Ａｂｓ/ｍＬとなるように調製した６３２７９Ｆ（ａｂ'）2を等量（１容+１容）混和して約１時間撹拌後、１０％ＢＳＡを０．１容添加し約１時間撹拌した。遠心分離にて上清を除去した後、沈殿を５ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）にて再懸濁ならびに、波長６００ｎｍにおける吸光度が１．５Ａｂｓ/ｍＬとなるよう調整して６３２７９Ｆ（ａｂ'）2結合ラテックス液を得た。対照として６３２７９Ｆ（ａｂ'）2に代わって６３２７９ ＩｇＧ（断片化を行っていない全長の抗体）を用いた６３２７９ ＩｇＧ結合ラテックス液を調製した。【００２１】
（３）インタクト抗体からなる非特異的反応抑制物質を含む処理液の調製
塩化カリウム、ＢＳＡ、ＰＶＰ−Ｋ９０を含むＨＥＰＥＳ緩衝液に最終濃度１００μｇ/ｍＬとなるように非特異的反応抑制物質であるＨＢＲ（ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ社）および抗ＩｇＭモノクローナル抗体７３２２４（ハイブリドーマ寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３４が産生するモノクローナル抗体）を添加し処理液を調製した。これら非特異的反応抑制物質はいずれも全長ＩｇＧすなわちインタクト抗体である。【００２２】
（４）変性フラグメント抗体の調製
６３２７９Ｆ（ａｂ'）2を波長２８０ｎｍにおける吸光度で４．０ Ａｂｓ/ｍＬ含むＰＢＳ溶液を６５℃で３０分間加熱し、変性６３２７９Ｆ（ａｂ'）2溶液を得た。【００２３】
（５）分析方法
試料として、ＰＳＡ陽性反応を示す血清（ＳＬＲ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、Ｌｏｔ．１０１４０９、表示ＰＳＡ濃度２．３６ｎｇ／ｍＬ：以下、表示値ということがある）を用いて、試料に前記（３）で調整した処理液および（２）で調整した抗体結合ラテックス液を添加し、吸光度の変化から非特異的反応の発生を確認した。ここで、ＰＳＡは同一のエピトープ分子内に複数有する多価抗原ではないため、１種類の抗体結合ラテックスのみでは、試料中のＰＳＡと抗体結合ラテックスが反応しても凝集を形成することはできないため、通常吸光度は変化しない。したがって、本分析方法で生じる吸光度変化は、非特異的凝集に起因するものと考えることができる。分析条件を以下に示す。
（分析条件）
分析装置：日立７１８０型自動分析装置
Ｓ/Ｒ比：試料−処理液−抗体結合ラテックス液＝９．６−６０−６０（単位：μＬ）
測定波長：８００／５７０ｎｍ（副波長／主波長）
分析法：２ポイントエンド法（測光ポイント１９−３４）【００２４】
（６）本発明の変性フラグメント抗体による効果の確認
前記（５）の分析により吸光度上昇を示し非特異的反応が認められた血清検体Ｌｏｔ．１０１４０９について、変性６３２７９Ｆ（ａｂ'）2を含むＰＢＳ溶液または変性６３２７９Ｆ（ａｂ'）2を含まないＰＢＳ溶液で適宜希釈し、それぞれ被検試料、対照試料として測定に供した。
測定結果を表１に示す。
本結果によれば、吸光度上昇を示す検体Ｌｏｔ．１０１４０９は、６３２７９Ｆ（ａｂ'）2結合ラテックスとの間で、非特異的反応の発生が確認された。この非特異的反応は対照とした６３２７９ ＩｇＧ結合ラテックスとの間では認められず、またインタクト抗体からなる非特異的反応抑制物質（ＨＢＲまたは抗ＩｇＭモノクローナル抗体）によっても抑制できなかった（データ示さず）ことから、フラグメント抗体に起因する非特異的反応と推察された。
また、検体Ｌｏｔ．１０１４０９を波長２８０ｎｍにおける吸光度が０．４Ａｂｓ/ｍＬの変性６３２７９Ｆ（ａｂ'） 2を含むＰＢＳ溶液で２倍に希釈して分析に供したところ、吸光度変化はほぼゼロとなり、非特異的反応が抑制されることが確認された。なお、変性６３２７９Ｆ（ａｂ'） 2を含まないＰＢＳ溶液で２倍希釈した場合には、希釈に伴う吸光度自体の低下は認められたが、非特異的反応は抑制されなかった。【００２５】
【表１】
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【００２６】
実施例２  本発明の非特異的反応抑制剤を含む免疫学的測定試薬
（１）非特異的反応抑制効果を示す変性フラグメント抗体の探索
実施例１にしたがい、各種抗ＰＳＡモノクローナル抗体の変性Ｆ（ａｂ'）2を調製して非特異的反応の抑制効果を示すフラグメント抗体を探索し、変性６３２８４Ｆ（ａｂ'）2を得た。６３２８４抗体は、実施例１で使用した６３２７９抗体と組み合わせてサンドイッチＥＬＩＳＡ測定が可能であることから６３２７９抗体とは認識するエピトープが異なる。【００２７】
（２）第１試液の調製
実施例１記載の処理液に波長２８０ｎｍにおける吸光度で０．０００３Ａbs/ｍＬの変性６３２７９Ｆ（ａｂ'）2または変性６３２８４Ｆ（ａｂ'）2を添加し第一試液とした。変性フラグメント抗体を含まない処理液を対照の第一試液とした。【００２８】
（３）第２試液の調製
実施例１で調製した６３２７９Ｆ（ａｂ'）2結合ラテックス液と、同様の方法で調製した６３２９１（ハイブリドーマ寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４５５が産生するモノクローナル抗体）Ｆ（ａｂ'）2結合ラテックス液を、それぞれ波長６００ｎｍにおける吸光度が１．５Ａｂｓ/ｍＬとなるよう５ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で調整し、等量混和して第２試液とした。認識するエピトープが異なる２種類のフラグメント抗体結合ラテックスを組み合わせることによって試料中のＰＳＡと凝集を形成でき、ＰＳＡ濃度を算出することができる。【００２９】
（４）測定方法
２種類の第１試液（変性６３２７９Ｆ（ａｂ'）2または変性６３２８４Ｆ（ａｂ'）2を含有）と第２試液を組みあわせて測定用試薬とし、下記条件にて予めＰＳＡキャリブレーター（積水メディカル株式会社）を用いて検量線を作成し、検体Ｌｏｔ．１０１４０９のＰＳＡ濃度を測定した。分析条件を以下に示す。
(分析条件)
分析装置：日立７１８０形自動分析装置
Ｓ/Ｒ比：試料−第１試液−第２試液＝８−７６−７６  （単位：μＬ）
測定波長：８００／５７０ｎｍ（副波長／主波長）
分析法：２ポイントエンド法（測光ポイント１９−３４）
キャリブレーター濃度：０、３．９、９．９（ｎｇ/ｍＬ）
演算式：スプライン
検体Ｌｏｔ．１０１４０９のＰＳＡ濃度は表示値を参照した。【００３０】
（５）結果
図1に各試薬の検量線を示す。
変性フラグメント抗体を含まない対照試薬と比較して、変性６３２７９Ｆ（ａｂ'）2を含む試薬では吸光度が半分程度まで低下した。これは変性６３２７９Ｆ（ａｂ'）2にＰＳＡとの反応性が残存しているために、６３２７９Ｆ（ａｂ'）2結合ラテックスと競合し、凝集を阻害するためと推測された。一方で測定系を構成するフラグメント抗体（６３２７９Ｆ（ａｂ'）2および６３２９１Ｆ（ａｂ'）2）と認識エピトープが異なる変性６３２８４Ｆ（ａｂ'）2を含む第一試液を使用した場合の感度低下は１０％程度であった。
表２に各試薬による検体Ｌｏｔ．１０１４０９の測定値を示す。
表示値に対し対照試薬では３０％以上高値となるのに対し、変性フラグメント抗体を含む本発明の試薬ではいずれも非特異的反応の影響が抑制されることが確認できた。ＰＳＡの正常濃度は４ｎｇ/ｍＬ以下であり、この濃度付近の測定値の正確性を担保することは臨床上重要である。
特に本発明の非特異的反応抑制剤として、変性６３２８４Ｆ（ａｂ'）2のように免疫学的測定試薬の主成分のフラグメント抗体と認識エピトープの異なるフラグメント抗体が利用できる場合、試薬感度への影響が小さく好適である。【００３１】
【表２】
2014051144.tif 000003
【００３２】
実施例３  非特異的反応検体の分析と本発明による非特異的反応の抑制２
（１）フラグメント抗体結合ラテックス液の調製
抗ＭＭＰ−３モノクローナル抗体８２２０８（ハイブリドーマ寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５１７が産生するモノクローナル抗体）ＩｇＧより、実施例１の方法に従ってフラグメント抗体を精製し、波長６００ｎｍにおける吸光度が３．０Ａｂｓ/ｍＬとなるよう５ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で調整し、８２２０８Ｆ（ａｂ'）2結合ラテックス液を得た。【００３３】
（２）インタクト抗体からなる非特異的反応抑制物質を含む処理液の調製
塩化ナトリウム、ＢＳＡを含むＴｒｉｓ緩衝液に最終濃度１００μｇ/ｍＬとなるように非特異的反応抑制物質であるＨＢＲ（ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ社）および抗ＩｇＭモノクローナル抗体７３２２４を添加し処理液を調製した。【００３４】
（３）変性フラグメント抗体の調製
実施例１記載の方法に従い変性８２２０８Ｆ（ａｂ'）2溶液を得た。【００３５】
（４）試料と変性フラグメント抗体処理
ＲＦ陽性血清（ＴＲＩＮＡ社）の中から、８２２０８Ｆ（ａｂ'）2結合ラテックスと非特異的反応を生じる血清を選択し、波長２８０ｎｍにおける吸光度で６．０Ａｂｓ/ｍＬの変性８２２０８Ｆ（ａｂ'） 2を含むＰＢＳ溶液またはＰＢＳで１０倍に希釈し、それぞれ被検試料、対照試料として測定に供した。【００３６】
（５）分析方法
（４）で調整した被検試料または対照試料に、（２）で調整した処理液、および（１）で調整したフラグメント抗体結合ラテックス液を添加し、吸光度の変化から非特異的反応の発生と本発明の抑制効果を確認した。本分析で生じる吸光度変化は、実施例１同様に非特異的凝集に起因するものと考えられる。分析条件を以下に示す。
(分析条件)
分析装置：日立７１８０形自動分析装置
Ｓ/Ｒ比：試料−処理液−抗体結合ラテックス液＝２．０−１００−３３（単位：μＬ）
測定波長：８００／５７０ｎｍ（副波長／主波長）
分析法：２ポイントエンド法（測光ポイント１９−３４）【００３７】
（６）結果
結果を表３に示す。
対照試料で非特異的反応による感度上昇が認められるのに対し、被検試料では吸光度変化はほぼゼロとなり、非特異的反応が抑制されていることが確認された。【００３８】
【表３】
2014051144.tif 000004
【００３９】
実施例１〜実施例３の結果より、本発明の非特異的反応の抑制法は、検出対象抗原（アナライト）の種類やフラグメント抗体の種類に関わらず広範に適用できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の非特異的反応抑制方法により、インタクト抗体を利用する従来の方法では抑制できなかった、フラグメント抗体に起因する非特異的反応を抑制することが可能になった。
【受託番号】
【００４１】
[寄託生物材料への言及]
（１）６３２７９抗体を産生するハイブリドーマ６３２７９
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２２年２月１９日（２０１０年２月１９日）（原寄託日）
平成２４年１月３１日（２０１２年１月３１日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４５４
（２）６３２９１抗体を産生するハイブリドーマ６３２９１
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２２年２月１９日（２０１０年２月１９日）（原寄託日）
平成２４年１月３１日（２０１２年１月３１日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４５５
（３）８２２０８抗体を産生するハイブリドーマ８２２０８
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２４年１月２７日（２０１２年１月２７日）（原寄託日）
平成２４年１１月２２日（２０１２年１１月２２日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５１７
（４）抗ＩｇＭ抗体を産生するハイブリドーマ７３２２４
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２０年９月１９日（２００８年９月１９日）（原寄託日）
平成２１年６月９日（２００９年６月９日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１３４
【図１】
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【国際調査報告】
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2014051144.tif 000007
2014051144.tif 000008
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