(57)【要約】  食肉や食肉加工品の色調の改善に有効な新たな手段を提供することを課題とする。食肉又は食肉加工品をイミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素で処理する。
2014013795.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
食肉又は食肉加工品をイミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素で処理する工程を含む、色調改善方法。
【請求項２】
食肉又は食肉加工品を、イミダゾール環含有化合物、メトミオグロビン還元酵素、及びミオグロビンのヘム基中の鉄を亜鉛に置換する作用を示す物質、で処理する工程を含む、色調改善方法。
【請求項３】
前記物質がフェロケラターゼである、請求項２に記載の色調改善方法。
【請求項４】
イミダゾール環含有化合物がヒスチジン又はイミダゾールペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の色調改善方法。
【請求項５】
イミダゾールペプチドがイミダゾールジペプチドである、請求項４に記載の色調改善方法。
【請求項６】
メトミオグロビン還元酵素がバチルス  ズブチリス、バチルス  アミロリケファシエンス、納豆菌、バチルス  スリンギエンシス又はバチルス  ミコイデス由来のメトミオグロビン還元酵素である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の色調改善方法。
【請求項７】
イミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素を組み合わせてなる色調改善剤。
【請求項８】
ミオグロビンのヘム基中の鉄を亜鉛に置換する作用を示す物質を更に組み合わせてなる、請求項７に記載の色調改善剤。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の色調改善方法によって、或いは請求項７又は８に記載の色調改善剤の使用によって色調が改善した食肉又は食肉加工品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は色調改善方法に関する。詳しくは、食肉や食肉加工品の色調を改善する方法及び色調改善剤に関する。本出願は、２０１２年７月１８日に出願された日本国特許出願第２０１２−１５９７３２号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
食肉の色は、消費者が肉質を評価するときの重要な因子である。鮮赤色であれば良質な食肉と判断され、褐色であれば古いと見なされるなど、肉色は消費者の食肉に対する購買意欲や評価に大きな影響を与える。【０００３】
食肉の褐色化を防止するため、ハム・ソーセージなど畜肉加工品では硝酸塩、亜硝酸塩の発色剤が一般的に用いられている。しかし、硝酸塩、亜硝酸塩はヒトにメトヘモグロビン血症を起こす急性毒性を有するので、残存亜硝酸根として70ppm以下になるように使用量が制限されている。また、亜硝酸が第二級アミンと反応して発ガン性物質であるニトロソアミンを形成する可能性が指摘されている。そのため、安全性の観点から、硝酸塩、亜硝酸塩の発色剤に代わる、発色効果のある物質や発色方法の探索が行われてきた。例えばラフィノースを添加することにより褐色化を防止する方法（特許文献１参照）、エノキタケ抽出物を添加することにより褐色化を防止する方法（特許文献２参照）、野菜類に含まれる成分を利用して発色させる方法（特許文献３参照）が見出されている。しかしながら、特許文献１の方法や特許文献２の方法では発色効果が十分でなく、また加熱によって発色効果が失われるという問題があり、特許文献３の方法では野菜類に含まれる硝酸塩を利用しており安全性に問題がある。【０００４】
一方、イミダゾール又はその関連化合物（例えばヒスチジン）を利用した食肉の発色方法が提案されている（特許文献４、５を参照）。しかしながら、当該方法による効果は限定的であり、特に、褐色化が生じた食肉の色調改善には有効ではない。【０００５】
尚、本出願人は先の特許出願において、食肉又は食肉加工品の色調改善に効果的な方法として、バチルス属微生物由来の酵素を利用した方法を提案した（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−１８９７６号公報
【特許文献２】特開２００８−２２８７０２号公報
【特許文献３】特開２００９−１６５４４５号公報
【特許文献４】英国特許第１，１７３，４４６号
【特許文献５】特開昭５８−２３７６６号公報
【特許文献６】国際公開第２０１１／１４２３００  Ａ１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来技術が内包する上記の如き問題点に鑑み、食肉や食肉加工品の色調の改善に有効な新たな手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、イミダゾールやヒスチジンによる食肉の発色効果が、ミオグロビンのヘム鉄(Fe2+)にイミダゾール環の窒素が配位することによるものであると推定される点に着目した。そして、アクセプターとなるヘム鉄を酵素（メトミオグロビン還元酵素）により供給して発色効果を高めるという戦略を立て、その有効性を検証した。その結果、予想を上回る優れた効果を認め、イミダゾール又はその関連化合物とメトミオグロビン還元酵素の併用が色調改善に極めて有効であることを明らかにした。この新たな手段によれば、イミダゾール又はその関連化合物単独での発色効果が不十分である点を補うことができ、高い発色効果が得られる。また、メトミオグロビン還元酵素の作用によって、褐色の原因となるメトミオグロビン量を低減することができることから、褐色化が生じた場合においても色調の改善が期待できる。更には、メトミオグロビン還元酵素単独で作用させた場合と異なり、発色効果を加熱処理後も維持できる。【０００９】
発色効果の更なる向上を目指して検討を進めた結果、イミダゾール又はその関連化合物とメトミオグロビン還元酵素に加え、ミオグロビンのヘム基中の鉄を亜鉛に置換する作用を示す物質であるフェロケラターゼを併用すると、一層高い発色効果が得られ、且つ長期間にわたって発色効果が持続することが明らかとなった。【００１０】
以下の発明は、上記の成果及び知見に基づくものである。
［１］食肉又は食肉加工品をイミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素で処理する工程を含む、色調改善方法。
［２］食肉又は食肉加工品を、イミダゾール環含有化合物、メトミオグロビン還元酵素、及びミオグロビンのヘム基中の鉄を亜鉛に置換する作用を示す物質、で処理する工程を含む、色調改善方法。
［３］前記物質がフェロケラターゼである、［２］に記載の色調改善方法。
［４］イミダゾール環含有化合物がヒスチジン又はイミダゾールペプチドである、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の色調改善方法。
［５］イミダゾールペプチドがイミダゾールジペプチドである、［４］に記載の色調改善方法。
［６］メトミオグロビン還元酵素がバチルス  ズブチリス、バチルス  アミロリケファシエンス、納豆菌、バチルス  スリンギエンシス又はバチルス  ミコイデス由来のメトミオグロビン還元酵素である、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の色調改善方法。
［７］イミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素を組み合わせてなる色調改善剤。
［８］ミオグロビンのヘム基中の鉄を亜鉛に置換する作用を示す物質を更に組み合わせてなる、［７］に記載の色調改善剤。
［９］［１］〜［６］のいずれか一項に記載の色調改善方法によって、或いは［７］又は［８］に記載の色調改善剤の使用によって色調が改善した食肉又は食肉加工品。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】加熱処理後の各サンプル（ソーセージサンプル）の外観（上段）と断面の状態（下段）。左から順にサンプル１（非添加）、サンプル２（亜硝酸Na(5mg)0.05%を添加）、サンプル３（L-ヒスチジン20mgを添加）、サンプル４（L-ヒスチジン20mgとバチルス  ズブチリス由来の精製メトミオグロビン還元酵素（精製YodC (Mbr)） 5mgを添加）、サンプル５（L-ヒスチジン50mgを添加）、サンプル６（L-ヒスチジン50mgと精製YodC (Mbr) 5mgを添加）、サンプル７（L-ヒスチジン100mgを添加）、サンプル８（L-ヒスチジン100mgと精製YodC (Mbr) 5mgを添加）。
【図２】加熱処理後の各サンプル（ソーセージサンプル）の断面の状態。左から順にサンプル１（非添加）、サンプル２（亜硝酸Na(5mg)0.05%を添加）、サンプル３（L-ヒスチジン50mgを添加）、サンプル４（カルノシン50mgを添加）、サンプル５（カルノシン50mgと精製YodC (Mbr) 5mgを添加）、サンプル６（イミダ４０（日本ハム株式会社）50mgを添加）。
【図３】熱処理当日の発色度とZnMb（ヘム基中の鉄が亜鉛に置換されたミオグロビン）量。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の第１の局面は、加工時又は流通時などに色の変化（典型的には褐色化）が問題となる、食肉や食肉加工品の色調を改善する方法を提供する。本発明の色調改善方法は発色作用、発色促進作用及び／又は退色防止作用により、処理対象の色調を改善する。即ち、本発明の色調改善方法は食肉又は食肉加工品の発色、色調維持又は退色防止に利用される。「食肉の発色」とは食肉又は食肉加工品に特有の赤い色調が発現することをいう。
【００１３】
ミオグロビンを含む食肉又は食肉加工品全般に本発明を適用可能である。具体的には、豚肉、牛肉、鶏肉等の畜肉又はこれらの加工品、その他の食肉（猪肉、鯨肉等）又はその加工品、或いはマグロ、カツオ、シャケ等の魚肉又はその加工品を処理対象にすることができる。但し、赤色を呈している食肉が好ましい処理対象といえる。処理対象の一つである食肉加工品は、食肉を原料として製造される食品であれば特に限定されない。食肉加工品として例えば生ハム、ベーコン、ソーセージ、ロースハム、サラミが挙げられる。魚肉加工品としては例えば魚肉ソーセージ、魚肉ハンバーグ、ネギトロが挙げられる。処理対象である食肉または食肉加工食品の形状についても特に制限はない。ブロック肉、ミンチ肉等、用途に合わせて適宜選択することができる。
【００１４】
本発明の色調改善方法では処理対象をイミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素で処理する工程を行う。理論に拘泥する訳ではないが、本発明の色調改善方法を適用すると、イミダゾール環含有化合物のイミダゾール環の窒素原子がミオグロビンのヘム鉄（Fe2+）と配位することで発色効果がもたらされる。一方、メトミオグロビン還元酵素の作用によって、アクセプターとなるヘム鉄（Fe2+）が供給され、イミダゾール環含有化合物の発色効果が高められる。また、メトミオグロビン還元酵素の作用によって、メトミオグロビンが還元され、還元型ミオグロビンが生成する。還元型ミオグロビンは酸素化によって鮮赤色の色調を示すオキシミオグロビンに変換される。従って、本発明の色調改善方法を適用すると、食肉又は食肉加工品中のメトミオグロビン量が低減し、併せてオキシミオグロビンが生成する結果、色調が改善する。また、還元型ミオグロビンまたはオキシミオグロビンの酸化が防止され、その結果として食肉の退色を防止できるという効果も期待できる。このように、発色のみならず色調維持、つまり退色防止の効果も発揮され得る。
【００１５】
上記の作用効果を発揮できる限りにおいてイミダゾール環含有化合物は特に限定されず、例えば、イミダゾール又はその誘導体、ヒスチジン、イミダゾールペプチドを用いることができる。イミダゾールペプチドの例はイミダゾールジペプチド（カルノシン（β-alanyl-L-histindine）、アンセリン（β-alanyl-1-dehydro-3-methyl-L-histindine）、バレニン(β-alanyl-1-methyl-L-histidine)等）である。二種類以上のイミダゾール環含有化合物を併用することにしてもよい。併用の一例として、ヒスチジンとイミダゾールジペプチドの併用を挙げることができる。
【００１６】
本明細書において「メトミオグロビン還元酵素」とは、ミオグロビン誘導体であるメトミオグロビンを還元する活性を示すタンパク質のことをいう。当該活性の強さ（程度）は特に限定されない。従って、他の酵素活性の方が優位であっても、メトミオグロビンに対する還元活性を示す限り、本明細書における「メトミオグロビン還元酵素」に該当する。メトミオグロビン還元酵素として、ニトロレダクターゼ（例えばバチルス  ズブチリス由来yodC遺伝子産物）、デヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ（例えばバチルス  ズブチリス由来pdhD遺伝子産物）、NADH−チトクロムb5還元酵素（例えばサッカロミセス  セレビジエ由来CBR1,MCR1遺伝子産物）、NADPH−フラビン還元酵素（例えばバチルス  ズブチリス由来nfrA1遺伝子産物）等を用いることができる。好ましいメトミオグロビン還元酵素の一例として、上掲の特許文献６に記載された、バチルス属が産生するヘム還元酵素を挙げることができる。当該酵素は、バチルス  ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス  アミロリケファシエンス（Bacillus amiloliquefaciens）、納豆菌（Bacillus natto）、バチルス  スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）又はバチルス  ミコイデス（Bacillus mycoides）によって産生される。これらの微生物は例えば公共の保存機関（NBRC（独立行政法人製品評価技術基盤機構  生物遺伝資源部門）、JCM（理化学研究所バイオリソースセンター）、ATCC（American Type Culture Collection）等）から入手することができる。納豆菌については市販されており、容易に入手可能である。また宮城野納豆菌製造所から入手することも可能である。尚、イミダゾール環含有化合物の場合と同様に、二種類以上のメトミオグロビン還元酵素を併用することにしてもよい。
【００１７】
本発明ではイミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素を同時に又は別々に処理対象に作用させる。好ましくは、操作の簡便性の点やミオグロビンの酸化への不安定性の点から、イミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素を同時に作用させる。イミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素を別々に作用させる場合の順序は任意であるが、作用機序の点からメトミオグロビン還元酵素を作用させた後、イミダゾール環含有化合物を作用させるとよい。本発明における処理条件は、原則、イミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素が良好に作用する条件（好ましくは至適条件）とすればよい。好ましい処理条件は、処理対象の食肉又は食肉加工品を用いた予備実験によって容易に特定ないし設定可能である。以下、処理方法の具体例を示す。まず、イミダゾール環含有化合物と酵素液（精製酵素の溶液、メトミオグロビン還元酵素を産生する微生物の菌体破砕液など）を用意する。これらを食肉又は食肉加工品に接触させる。イミダゾール環含有化合物の使用量は、これに限定されるものではないが、処理対象物1g当たり例えば0.1mg〜100mg、好ましくは1mg〜50mgである。また、メトミオグロビン還元酵素の使用量は、これに限定されるものではないが、処理対象物1g当たり例えば1 U〜100U、好ましくは10U〜50Uである。メトミオグロビン還元酵素の活性は以下の通り測定する。まず、酵素溶液を用意する（乾燥体の酵素の場合、例えば水で10mg/mLに溶解する）。続いて0.1Mリン酸バッファー（pH 5.5） 200μLに0.1％(w／v)ミオグロビン100μLと酵素溶液150μLを添加し、30℃、5分間プレインキュベートする。そして1mM NADH 50μLを添加して、波長406nmにおける吸光度の変化を5分間測定する。活性はユニット(U)で示される。本条件下で1分間に1μM相当のメトミオグロビンを還元させる酵素量を１Uとする。
【００１８】
接触方法としては、一般的に、ブロック肉では懸濁液を注射してタンブリングする或いは浸漬液に浸す、ミンチ肉では懸濁液を混合する等の方法がある。適した接触方法を行うことによって、懸濁液が食肉全体に浸透する。接触させる際の温度条件は例えば4℃〜40℃であり、好ましくは4℃〜30℃であり、より好ましくは4℃〜25℃であり、最も好ましくは4℃〜20℃である。また、接触時間は例えば1時間〜3日であり、好ましくは3時間〜2日であり、より好ましくは6時間〜2日である。但し、後の加工工程中においても接触状態が維持されるのであれば、注射や混合等の操作の後、直ちに次の加工工程に進むことにしてもよい。接触操作の後は、ケーシング、加熱処理、燻製、成形など、必要な加工処理を施す。
【００１９】
ところで、メトミオグロビン還元酵素のみを使用した場合、一般に、加熱により発色が低下する。これに対して、イミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素を併用した本願発明によれば、加熱処理による発色の低下が少なく、加熱処理後も発色を維持できる。従って、本願発明の色調改善方法は、製造工程中に加熱処理が行われる製品の色調改善に対して特に有効である。
【００２０】
ここで、後述の実施例に示す通り、メトミオグロビン還元酵素を併用した場合の効果には劣るものの、イミダゾール環含有化合物（実施例ではヒスチジン、カルノシン、チキン由来のイミダペプチドを使用）を単独で使用した場合においても比較的高い色調改善効果を認めた。この結果に基づき、本発明の変形例の一つとして、食肉又は食肉加工品をイミダゾール環含有化合物で処理する工程を含む、色調改善方法が提供される。好ましくは、イミダゾールジペプチドを用いる。
【００２１】
本発明の一態様では、イミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素に加え、ミオグロビンのヘム基中の鉄を亜鉛に置換する作用を示す物質（以下、「鉄・亜鉛置換物質」と呼ぶ）を使用する。即ち、この態様の色調改善方法では処理対象を、イミダゾール環含有化合物、メトミオグロビン還元酵素、及び鉄・亜鉛置換物質で処理する工程を行う。この態様によれば、イミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素による上記の作用効果に加え、鉄・亜鉛置換物質を併用したことによる複合的な効果により色調が一層改善される。特に、良好な色調の維持・退色防止の効果を期待できる。鉄・亜鉛置換物質として例えばフェロケラターゼを用いることができる（詳しくは特開２００６−６１０１６号公報を参照）。フェロケラターゼは動物組織（特に内蔵）、植物組織（キノコ類、モヤシ、エンドウ豆等）、酵母（パン酵母、ビール酵母、清酒酵母、ワイン酵母、焼酎酵母等）、細菌等に存在している。これらの天然物から抽出したフェロケラターゼを用いることができる。また、ミトコンドリア画分にはフェロケラターゼが多く含まれていることから、特にミトコンドリア画分を用いるとよい。鉄・亜鉛置換物質としてサッカロミセス属酵母（ビール酵母、パン酵母、清酒酵母、焼酎酵母など）を用いることもできる（詳しくは特開２００５−８７０５８号公報を参照）。
【００２２】
イミダゾール環含有化合物、メトミオグロビン還元酵素、及び鉄・亜鉛置換物質の処理対象への作用のさせ方は、イミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素を使用する態様に準ずる。即ち、これら３物質を同時に又は別々に処理対象に作用させる。好ましくは、操作の簡便性の点やミオグロビンの酸化への不安定性の点、及び相乗的な効果の点から、これら３物質を同時に作用させる。好ましい処理条件は、処理対象の食肉又は食肉加工品を用いた予備実験によって容易に特定ないし設定可能である。以下、処理方法の具体例を示す。まず、イミダゾール環含有化合物、メトミオグロビン還元酵素液、鉄・亜鉛置換物質溶液（例えば精製フェロケラターゼの溶液、ミトコンドリア画分溶液）を用意する。これらを食肉又は食肉加工品に接触させる。イミダゾール環含有化合物の使用量及びメトミオグロビン還元酵素の使用量は、上記態様に準ずる。一方、鉄・亜鉛置換物質の使用量は、フェロケラターゼを例にとれば、処理対象物1g当たり例えば0.1U〜100U、好ましくは1U〜20Uである。
【００２３】
本発明の第２の局面は、本発明の色調改善方法に使用される色調改善剤に関する。本発明の色調改善剤の特徴の一つは、イミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素を組み合わせて用いることである。本明細書において「イミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素を組み合わせて用いる」又は「イミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素を組み合わせてなる」とは、イミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素が併用されることをいう。典型的には、イミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素とを混合した配合剤として本発明の色調改善剤が提供されることになる。一方、例えば、イミダゾール環含有化合物を含有する第１剤（第１構成要素）と、メトミオグロビン還元酵素を含有する第２剤（第２構成要素）とからなるキットの形態で本発明の色調改善剤を提供することもできる。この場合、典型的には、これら二つの剤は同時に使用される。即ち、食肉又は食肉加工品の製造過程の一部として、これら二つの剤を同時に使用する処理工程が設けられる。これとは異なり、第１剤による処理工程と第２剤による処理工程を設けることにしてもよい。
【００２４】
一態様では、イミダゾール環含有化合物、メトミオグロビン還元酵素、及び鉄・亜鉛置換物質を組合せて用いる。即ち、イミダゾール環含有化合物、メトミオグロビン還元酵素、及び鉄・亜鉛置換物質を併用する。この態様では、典型的には、イミダゾール環含有化合物、メトミオグロビン還元酵素及び鉄・亜鉛置換物質を混合した配合剤として本発明の色調改善剤が提供されることになる。一方、例えば、イミダゾール環含有化合物を含有する第１剤（第１構成要素）と、メトミオグロビン還元酵素を含有する第２剤（第２構成要素）と、鉄・亜鉛置換物質を含有する第３剤（第３構成要素）からなるキットの形態で本発明の色調改善剤を提供することもできる。この場合、典型的には、これら三つの剤は同時に使用される。即ち、食肉又は食肉加工品の製造過程の一部として、これら三つの剤を同時に使用する処理工程が設けられる。これとは異なり、第１剤による処理工程、第２剤による処理工程、及び第３剤による処理工程を設けることにしてもよい。二つの剤を同時に作用させ、その後、残りの一つを作用させることにしてもよい。この場合において同時に作用させる二つの剤の組合せは特に問わない。
【００２５】
本発明の色調改善剤は、有効成分（イミダゾール環含有化合物とメトミオグロビン還元酵素、或いはイミダゾール環含有化合物、メトミオグロビン還元酵素及び鉄・亜鉛置換物質）の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、pH調整剤、保存剤、防腐剤、香料、増粘剤、油脂、光沢剤、結着剤、結着補強剤、乳化安定剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、D-グルコース、ソルビトール、D-マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。pH調製剤としてはイタコン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、アジピン酸、グルコン酸、ピロリン酸、酢酸、乳酸、α−ケトグルタル酸、フィチン酸等の有機酸又は有機酸塩；炭酸等の無機酸又は無機酸塩；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸；アルギニン、リジン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはエタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。香料としてはジャコウ、シベット、カストリウム、アンバーグリス等の動物性香料；アニス精油、アンゲリカ精油、イランイラン精油、イリス精油、ウイキョウ精油、オレンジ精油、カナンガ精油、カラウェー精油、カルダモン精油、グアヤクウッド精油、クミン精油、黒文字精油、ケイ皮精油、シナモン精油、ゲラニウム精油、コパイババルサム精油、コリアンデル精油、シソ精油、シダーウッド精油、シトロネラ精油、ジャスミン精油、ジンジャーグラス精油、杉精油、スペアミント精油、西洋ハッカ精油、大茴香精油、チュベローズ精油、丁字精油、橙花精油、冬緑精油、トルーバルサム精油、バチュリー精油、バラ精油、パルマローザ精油、桧精油、ヒバ精油、白檀精油、プチグレン精油、ベイ精油、ベチバ精油、ベルガモット精油、ペルーバルサム精油、ボアドローズ精油、芳樟精油、マンダリン精油、ユーカリ精油、ライム精油、ラベンダー精油、リナロエ精油、レモングラス精油、レモン精油、ローズマリー精油、和種ハッカ精油等の植物性香料；その他合成香料等を用いることができる。増粘剤としては、天然高分子またはデンプン系もしくはセルロース系天然高分子誘導体等を用いることができる。天然高分子としては、例えば、フコイダン、カラギーナン等の海藻抽出物、グァーガム等の種子粘出物、アラビアガム等の樹脂様粘着物、またはキサンタンガム等の微生物産生粘着物質等を挙げることができる。デンプン系もしくはセルロース系天然高分子誘導体としては、例えば、リン酸デンプン等のデンプン系またはメチルセルロースなどのセルロース系の天然高分子誘導体が挙げられる。油脂としては、例えば、アボガド油、アマニ油、アーモンド油、ウイキョウ油、エゴマ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、ココナッツ油、ゴマ油��コメ油、サフラワー油、シア脂、液状シア脂、大豆油、ツバキ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、ヒマワリ油、葡萄種子油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚脂等を用いることができる。また、これらの油脂に水素添加、分別、エステル交換等の処理をして改質された油脂も利用できる。光沢剤として、ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス、スクワレン、スクワラン、プリスタン等のロウ類（植物性、動物性を問わない。）；流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス等の鉱物油を用いることができる。結着剤としては大豆蛋白質、卵蛋白質、乳蛋白質、血液蛋白質、カゼイン、デンプン、トランスグルタミナーゼ等を用いることができる。結着補強剤としては重合リン酸塩等を用いることができる。乳化安定剤としてはカゼインナトリウム等を用いることができる。その他添加物として、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、1 2-ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸等の天然脂肪酸；イソノナン酸、カプロン酸、2-エチルブタン酸、イソペンタン酸、2-メチルペンタン酸、2-エチルヘキサン酸、イソペンタン酸等の合成脂肪酸等の脂肪酸を含有しても良い。
【実施例】
【００２６】
１．イミダゾール環含有化合物による食肉の発色効果
イミダゾールやヒスチジンによる食肉の発色効果は、ミオグロビンのヘム鉄(Fe2+)にイミダゾール環の窒素が配位することによるものであると推定される。当該発色効果を高めるため、アクセプターとなるヘム鉄をメトミオグロビン還元酵素により供給することで発色効果が高められるとの期待の下、イミダゾール環含有化合物としてヒスチジン（和光純薬工業株式会社）を用い、メトミオグロビン還元酵素としてバチルス  ズブチリス(Bacillus subtilis JCM1465株（＝ATCC6051株、IAM12118株、IFO13719株）)由来の精製酵素YodC（9.94U/mg。上掲の特許文献６を参照）を用い、以下の実験を行った。【００２７】
市販豚ミンチ肉10gに食塩150mg、L-アスコルビン酸10mg、0.5M リン酸カリウムバッファー（pH5.5） 180μL、40mg/mＬ ミオグロビン溶液 180μLを添加し、混合した。このように調製した溶液に対して、以下の表１の通り、各添加物を更に加え、混合した。混合後の豚ミンチ肉サンプル１〜８は氷上に静置した。
【表１】
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【００２８】
次に、各サンプルを天然羊腸にケーシングした後、37℃で2日間放置した。75℃40分間の加熱処理を行った後、急冷させ、各サンプルの断面の赤色度を画像解析した。画像解析にはImageJソフトウェア（オープンソース）を用いた。【００２９】
加熱処理後のサンプルの断面の色調を図１に示す。また、解析結果を以下の表２（加熱処理後の断面のL*a*b*値）に示す。尚、各数値は断面の平均値である。
【表２】
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【００３０】
発色度（赤味）を表すa*値に注目すると、ヒスチジン単独よりもヒスチジンとメトミオグロビン還元酵素を併用した方が高い発色度が得られている。また、ヒスチジンの使用量を増やすと発色度が高まり、本試験での最大使用量のサンプルでは亜硝酸Na（0.05%）を使用した場合と同等以上の発色効果を認めた。【００３１】
以上通り、ヒスチジンとメトミオグロビン還元酵素を併用すれば、優れた発色効果が得られることが明らかとなった。また、当該発色効果は加熱処理後も維持されることが確認された。尚、メトミオグロビン還元酵素を併用した場合の効果には劣るものの、ヒスチジン単独で使用した場合においても、比較的高い色調改善効果が認められた。特に、使用量の多いサンプル（20mg、50mg）では、ヒスチジンを使用しない場合（非添加）に比して格段に高いa*値を示し、高い発色効果が得られている。【００３２】
２．イミダゾールジペプチドによる食肉の発色効果
イミダゾール環含有化合物であるイミダゾールジペプチドによる食肉の発色効果を検討した。実験方法は、添加物を変更したこと以外、１．と同一とした。本実験での各サンプルの添加物を以下の表３に示す。尚、イミダ４０（日本ハム株式会社）はチキン由来のイミダゾールジペプチド（アンセリンとカルノシン）を含有する。
【表３】
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【００３３】
加熱処理後のサンプルの断面の色調を図２に示す。また、解析結果を以下の表４（加熱処理後の断面のL*a*b*値）に示す。尚、各数値は断面の平均値である。
【表４】
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【００３４】
a*値に注目すると、カルノシン単独（サンプル４）に比べ、カルノシンとメトミオグロビン還元酵素を併用した方（サンプル５）が高い発色度が得られている。この結果は、イミダゾールジペプチドを使用した場合においても、発色効果の増大にメトミオグロビン還元酵素の併用が有効であることを示す。一方、サンプル４、６の結果より、イミダゾールジペプチド単独の使用であっても色調改善効果が得られることが判明した。また、サンプル３の発色度とサンプル４の発色度を比較すれば、イミダゾールジペプチドの発色効果は高いと評価できる。尚、サンプル５の発色度に比べてサンプル６の発色度が低いのは、イミダ４０におけるイミダゾールジペプチドの含有量が少ないためと考察される。【００３５】
３．イミダゾール環含有化合物、メトミオグロビン還元酵素及び鉄・亜鉛置換物質の併用効果
ヒスチジンとメトミオグロビン還元酵素に加えて、ミオグロビンのヘム基中の鉄を亜鉛に置換する作用を示す物質であるフェロケラターゼを併用した場合の発色効果を検討した。【００３６】
市販豚ミンチ肉10gに食塩150mg、L-アスコルビン酸10mg、10mM NADH 180μL、100mg/mL グルコン酸Zn 50μL、0.5M リン酸カリウムバッファー（pH5.5） 180μL、40mg/mＬ ミオグロビン溶液 180μLを添加し、混合した。このように調製した溶液に対して、以下の表５の通り、各添加物を更に加え、混合した。混合後の豚ミンチ肉サンプル１〜６は氷上に静置した。
【表５】
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【００３７】
次に、各サンプルを天然羊腸にケーシングした後、37℃で2日間放置した。75℃40分間の加熱処理を行った後、急冷させ、各サンプルの断面の赤色度を画像解析した。また、酢酸エチル・酢酸処理によって得られたろ液中のZnMbを定量した。定量法は、蛍光光度計を利用し、Ex/Em=420nm/590nmの値から算出した。【００３８】
各サンプルの発色度（a*）赤色度の解析結果を以下の表６に示す。尚、各数値は断面の平均値である。
【表６】
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【００３９】
熱処理当日(0日）の発色度は、コントロールよりもHis（ヒスチジン）を使用した場合の方が高い。FeCH（フェロケラターゼ）単独、FeCHとHisの併用、或いはFeCHとHisとMbr(メトミオグロビン還元酵素)の併用では更に発色度が高い。また、FeCH単独よりもHis単独やHisとMbr併用の方が高い発色度を示した。但し、2日目にはHis単独の発色度は大きく後退した。9日目の発色度はHis単独よりもFeCH単独の方が高い（亜硝酸と同等）。FeCHとHisを併用すると発色度は更に高まり、FeCHとHisとMbrを併用した場合に最も高い発色度を示した。【００４０】
一方、ZnMb生成量は、亜硝酸、His単独、コントロール、FeCH単独、FeCHとHisの併用、FeCHとHisとMbrの併用の順で高くなる結果であった（図３）。亜硝酸、His単独、コントールでZnMb生成量が少ないことは予想通りであり、FeCHとHisとMbrの併用でFeCH単独よりもZnMb生成量が多いのは、Mbrの作用によってFe2+が増加したためと考えられる。【００４１】
以上の通り、FeCHとHisとMbrの併用によって高い発色効果及び安定した発色効果が得られることが明らかとなった。ZnMb生成量の測定結果から、フェロケラターゼの鉄・亜鉛置換作用が発色効果に寄与したことが裏付けられた。また、この結果を踏まえると、鉄・亜鉛置換作用を示す物質であれば、フェロケラターゼ以外でも同様の効果が得られるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の色調改善方法によれば、亜硝酸塩等の発色剤を使用することなく食肉を発色させることができることから、商品価値の高い食肉や食肉加工食品を提供することが可能となる。本発明の色調改善方法は、退色や褐色化などの色調の変化が問題となる様々な食肉製品に適用可能である。【００４３】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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