(57)【要約】  新規コラーゲンペプチド組成物の製造方法および前記コラーゲンペプチド組成物を含有するＤＰＰ−４阻害剤、血糖値上昇抑制剤を提供する。コラーゲンおよび／またはゼラチン溶液にショウガ根茎由来酵素を添加して分解し、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを含むペプチド組成物を生成する。このようにして得られるコラーゲンペプチド組成物は、ＤＰＰ−４阻害活性が高く、かつ血糖値上昇抑制効果に優れる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンおよび／またはゼラチン溶液にショウガ根茎由来酵素を添加して分解し、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを含むペプチド組成物を生成することを特徴とする、コラーゲンペプチド組成物の製造方法。
【請求項２】
ショウガ根茎の乾燥粉砕物を、前記ショウガ根茎由来酵素として使用することを特徴とする、請求項１記載のコラーゲンペプチド組成物の製造方法。
【請求項３】
前記ショウガ根茎由来酵素と共にグルタチオン含有酵母エキスを０．００５〜０．５w/v％の範囲で添加し、および／またはｐＨ４．０〜６．０の範囲に調整して反応させることを特徴とする、請求項１または２記載のコラーゲンペプチド組成物の製造方法。
【請求項４】
前記ペプチド組成物に含まれる前記式で示されるペプチドの含有量が、前記コラーゲンおよび／またはゼラチンの０．０１モル％以上であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲンペプチド組成物の製造方法。
【請求項５】
更に、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のコラーゲンペプチド組成物の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法で得られるコラーゲンペプチド組成物を含有するＤＰＰ−４阻害剤。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法で得られるコラーゲンペプチド組成物を含有する血糖値上昇抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲンペプチド組成物の製造方法、前記コラーゲンペプチド組成物を含有するジペプチジルペプチダーゼ４阻害剤（以下、単にＤＰＰ−４阻害剤と称する）および血糖値上昇抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、コラーゲンやゼラチンの加水分解物から多くの活性ペプチドが発見されている。活性ペプチドの用途として、Ｈｙｐ−Ｇｌｙを関節炎や褥瘡抑制剤に（特許文献１）、Ａｌａ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙをコラーゲン合成促進剤に（特許文献２）、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ−（Ｇｌｙ−Ｚ−Ｗ）で表されるペプチドを血糖値上昇抑制剤に（特許文献３）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＧｌｙをＤＰＰ−４阻害剤に（特許文献４）、Ｐｒｏ−Ｈｙｐの繊維芽細胞増殖促進作用を化粧品に（特許文献５）など多くの報告がある。また、コラーゲンやゼラチンを経口摂取した際の消化・吸収・代謝に関し、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙなどのジペプチドやトリペプチドが血中に存在すること（非特許文献１）、Ｈｙｐ−Ｇｌｙが血中に存在することが報告されている（非特許文献２）。これらのペプチドに生理活性があることから（特許文献１、特許文献２、特許文献５）、ジペプチドやトリペプチドの血中への移行がコラーゲンの経口摂取における効能メカニズムの１つと考えられている。コラーゲンやゼラチンを加水分解するタンパク質分解酵素は数多くあり、この中のいずれか、あるいはこれらの組み合わせによって生理活性ペプチドを効率的に生成するよう検討がなされ、タンパク質分解酵素の選択が重要な要素の一つとなっている。【０００３】
コラーゲンは、グリシンが３残基ごとに繰り返すいわゆるコラーゲン様配列と称される−（Ｇｌｙ−アミノ酸Ｘ−アミノ酸Ｙ）ｎ−で示される特徴的なアミノ酸配列を有しており、この単位ごとに分解するタンパク質分解酵素としてバクテリアコラゲナーゼがある。バクテリアコラゲナーゼを使って分解する方法はＧｌｙ−Ｘ−Ｙ型のペプチドを得るに優れた方法である。バクテリアコラゲナーゼによって生成したペプチドの生理活性に関する報告として、前記したＧｌｙ−Ｘ−Ｙ−（Ｇｌｙ−Ｚ−Ｗ）で表されるペプチドを使用する血糖値上昇抑制剤（特許文献３）やＧｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇなどのトリペプチドを使用するコラーゲン産生促進剤（特許文献６）などがある。【０００４】
一方、複数のタンパク質分解酵素を組み合わせて複数段に反応させて所望のペプチドを得る方法もある。例えば、Ｌ−プロリル−Ｌ−ヒドロキシプロリン含有組成物を製造するために、まずコラゲナーゼ活性を有するプロテアーゼで処理し、次いでエキソペプチダーゼを作用させる方法がある（特許文献７）。また、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを得るために、１次酵素処理にコラゲナーゼや黄色コウジカビ由来プロテアーゼを作用させ、次いで２次酵素処理としてＮ末端から２番目にプロリンまたはヒドロキシプロリン以外のアミノ酸が存在する場合にＮ末端からアミノ酸を遊離させるペプチダーゼを作用させ、１次酵素処理物に含まれていなかったペプチドを生成する方法もある（特許文献８）。【０００５】
一方、ショウガにジンジベインが含まれること（非特許文献３）、コラーゲンは、バクテリアコラゲナーゼなどのほかにジンジベインによっても分解されうること（非特許文献４）、およびショウガ根茎を極性溶媒中で粉砕してそのろ過残渣を乾燥してなる粉末から抽出した酵素のプロテアーゼ活性は、直接ショウガ根茎から抽出した酵素のプロテアーゼ活性よりも高いこと（非特許文献５）は公知である。【０００６】
更に、ジンジベインが、プロリン特異的システインプロテアーゼであり、Ｎ末端側から読んだときに、ＰｒｏのＣ末端側に隣接するアミノ酸残基とその次のアミノ酸残基との間のペプチド結合を切断することは知られている（特許文献９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−１０６００３号公報
【特許文献２】特開２０１０−２４２００号公報
【特許文献３】国際公開第２００８／６６０７０号
【特許文献４】国際公開第２０１３／６５８３２号
【特許文献５】特開２００７−１９８１号公報
【特許文献６】特開２００３−１３７８０７号公報
【特許文献７】特開２０１２−１３５２２２号公報
【特許文献８】国際公開第２０１２／１０２３０８号
【特許文献９】特表２００７−５２２８２２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ２００５  Ａｕｇ  １０；５３（１６）：６５３１−６５３６．
【非特許文献２】Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２９  １０１９−１０２４  ２０１１
【非特許文献３】ショウガたん白分解酵素の分離精製、栄養と食糧、１９７３年、２６巻６号、ｐ３７７−３８３
【非特許文献４】Ｐｌａｎｔ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ：ｕｎｉｑｕｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｇｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、２００７年、１７７０巻１２号、ｐ１６２７−１６３５
【非特許文献５】Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｉｃｈ  ｇｉｎｇｅｒ  ｐｏｗｄｅｒ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｔｅｎｄｅｒｉｚｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｓｐｅｎｔ−ｈｅｎ  ｍｕｓｃｌｅｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｆｏｏｄｓ、２００６年、１７巻２号、ｐ１７４−１８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
アミノ酸残基をＸで示した場合に、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるトリペプチドには、特有の生理活性を有するものが存在する。前記特許文献２では、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙにコラーゲン合成促進作用があるとし、生体コラーゲン合成促進用化粧品や皮膚治療薬などへ使用しうると記載する。また、前記特許文献８では、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−ＧｌｙなどにＤＰＰ−４阻害活性があるという。しかしながら、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるペプチドは、コラーゲンやゼラチンをバクテリアコラゲナーゼのみで分解して生成することはできない。バクテリアコラゲナーゼはＧｌｙのＮ末端側で切断するため、上記式のＨｙｐとＧｌｙとの間のペプチド結合を切断してしまうからである。このため、前記特許文献２では人工合成によってＡｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを生成し、前記特許文献８では複数の酵素を使用して２段階反応で生成している。しかしながら、工業的生産において、人工合成や複数の酵素を組み合わせることは工程数が多くなりコスト高の一因となる。従って、コラーゲンやゼラチンを効率的に分解し、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるトリペプチドを生成しうるコラーゲンペプチド組成物の製造方法の開発が望まれる。【００１０】
一般に、経口摂取されたタンパク質やペプチドは、消化管酵素によってアミノ酸、ジペプチド、トリペプチドに分解され、小腸上皮からアミノ酸トランスポーター、ペプチドトランスポーターによって血中に取り込まれる。前記したように、ジペプチドやトリペプチドには、血中で比較的安定に存在し、かつ生理活性を有するものが存在する。ジンジベインによれば、プロリン残基を含むペプチドを生成しうるがその種類は多く、これらの生理活性に関する研究は途上である。新たな薬効が見出されれば、簡便な方法で得たペプチドを有効に利用することができる。【００１１】
上記現状に鑑み、本発明は、コラーゲンおよび／またはゼラチンを原料として、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるトリペプチドを効率的に製造しうるコラーゲンペプチド組成物の製造方法を提供することを目的とする。【００１２】
また本発明は、上記コラーゲンペプチド組成物の生理活性に基づく、ＤＰＰ−４阻害剤および血糖値上昇抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、コラーゲンおよび／またはゼラチン溶液にショウガ根茎由来酵素を添加すると、Ｃ末端から２番目のアミノ酸残基がＨｙｐのコラーゲンペプチドを産生できること、得られるコラーゲンペプチド組成物には、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示されるペプチドが含まれ、さらに、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙで示されるペプチドなども同時に生成されること、得られるコラーゲンペプチド組成物はＤＰＰ−４阻害活性が高いこと、これを動物に経口投与すると、血糖値上昇抑制効果を有することなどを見出し、本発明を完成させた。【００１４】
すなわち本発明は、コラーゲンおよび／またはゼラチン溶液にショウガ根茎由来酵素を添加して分解し、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを含むペプチド組成物を生成することを特徴とする、コラーゲンペプチド組成物の製造方法を提供するものである。【００１５】
また本発明は、ショウガ根茎の乾燥粉砕物を、前記ショウガ根茎由来酵素として使用することを特徴とする、上記コラーゲンペプチド組成物の製造方法を提供するものである。【００１６】
また本発明は、前記ショウガ根茎由来酵素と共にグルタチオン含有酵母エキスを０．００５〜０．５w/v％の範囲で添加し、および／またはｐＨ４．０〜６．０の範囲に調整して反応させることを特徴とする、上記コラーゲンペプチド組成物の製造方法を提供するものである。【００１７】
また本発明は、前記ペプチド組成物に含まれる前記式で示されるペプチドの含有量が、前記コラーゲンおよび／またはゼラチンの０．０１モル％以上であることを特徴とする、上記コラーゲンペプチド組成物の製造方法を提供するものである。【００１８】
また本発明は、更に、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを含むことを特徴とする、コラーゲンペプチド組成物の製造方法を提供するものである。【００１９】
また本発明は、上記製造方法で得られるコラーゲンペプチド組成物を含有するＤＰＰ−４阻害剤を提供するものである。【００２０】
また本発明は、上記製造方法で得られるコラーゲンペプチド組成物を含有する血糖値上昇抑制剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、コラーゲンやゼラチン溶液にショウガ根茎由来酵素を添加することで、１段階の酵素反応でＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを含むコラーゲンペプチド組成物を製造することができる。【００２２】
本発明によれば、前記製造方法で得られるコラーゲンペプチド組成物を、ＤＰＰ−４阻害剤、および血糖値上昇抑制剤などに使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例４の結果を示す図であり、ウシ由来ゼラチンにショウガ由来のショウガ根茎有機溶媒乾燥粉砕物を添加して得たペプチド溶液のＤＰＰ−４阻害曲線を示す図である。
【図２】実施例４の結果を示す図であり、リコンビナントヒトゼラチンにショウガ由来のショウガ根茎有機溶媒乾燥粉砕物を添加して得たペプチド溶液のＤＰＰ−４阻害曲線を示す図である。
【図３】実施例５の結果を示す図であり、ウシ由来ゼラチンをショウガ由来のショウガ根茎有機溶媒乾燥粉砕物で分解してなるコラーゲンペプチド組成物を、マウスに投与した場合の血糖値降下作用を示す図である。コラーゲンペプチド組成物を添加しなかった陰性対照群、および予めジャヌビア錠を投与した陽性対照群の結果を併記する。
【図４】実施例５の結果を示す図であり、血糖測定時に同時に測定したインスリン濃度の結果を示す図である。
【図５】実施例６の結果を示す図であり、ウシ由来ゼラチンにショウガ由来のショウガ根茎有機溶媒乾燥粉砕物を添加して得たコラーゲンペプチド組成物を、健常者に所定量投与した場合の血糖値経時変化を示す図である。
【図６】実施例６の結果を示す図であり、血糖値の１２０分後までの積算値（ＡＵＣ）の値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の第一は、コラーゲンおよび／またはゼラチン溶液にショウガ根茎由来酵素を添加して分解し、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを含むペプチド組成物を生成することを特徴とする、コラーゲンペプチド組成物の製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
（１）コラーゲンおよび／またはゼラチン
本発明で使用するコラーゲンは、真皮、靱帯、腱、骨、軟骨などを構成するタンパク質のひとつである。本発明で使用するコラーゲンとしては、ウシ、ブタ、ニワトリ、魚類、その他、何れの動物種に由来するものであってもよい。従来から知られるＩ〜ＸＸＶＩＩＩ型のほか、新たに見出されるコラーゲンであってもよい。更に、コラーゲンの変異体であってもよい。このような変異体としては、コラーゲンを構成するヒドロキシプロリンに代えてプロリンが配列される非水酸化コラーゲンがある。すなわち、３重螺旋構造を形成するコラーゲン鎖の各１本は、−（Ｇｌｙ−アミノ酸Ｘ−アミノ酸Ｙ）ｎ−で示されるコラーゲン様配列を含む１次構造部分を有する。細胞内で前記１次構造からなるプロα鎖が合成され、次いでプロリンが水酸化され、糖付加を経た後に３本鎖のプロコラーゲンとして細胞外に分泌され、酵素処理を受けてコラーゲンとなる。コラーゲンの３重螺旋構造は、ヒドロキシプロリンの形成する水素結合により安定化されるため、プロリンの水酸化は必須の工程である。しかしながら、本発明で使用するコラーゲンとしては、例えば、プロα鎖に含まれるプロリンがヒドロキシプロリンへ水酸化されない条件で生成された非水酸化コラーゲンであってもよい。非水酸化コラーゲンであっても、コラーゲンと同様にショウガ根茎由来酵素によって分解されるからである。前記非水酸化コラーゲンとしては、３重螺旋を構成するいずれかのプロα鎖の遺伝子を組み込んで製造したリコンビナントコラーゲンであってもよい。非水酸化コラーゲンはプロリンの含有量が高いため、ショウガ根茎由来酵素による分解効率に優れる。
【００２６】
なお、ゼラチンとは、コラーゲンの分解物である。３重螺旋構造が加熱処理などによって変性して３本のα鎖となったものが主成分であり、α鎖の２量体（β成分）やα鎖の３量体（γ成分）も含有する。一方、処理工程中の熱履歴その他によって、分子間、分子内結合の一部がランダムに切断されるため分子量分布は数万〜数十万に亘るが、ゼラチンのペプチド結合の大半は未分解の状態である。従って、コラーゲンと同様にゼラチンも反応原料として使用しうる。
【００２７】
コラーゲンおよび／またはゼラチン溶液のコラーゲンおよび／またはゼラチンの濃度としては、０．１〜７５質量％が好ましく、より好ましくは１〜５０質量％、特に好ましくは５〜５０質量％である。
【００２８】
（２）ショウガ根茎由来酵素
本発明では、コラーゲンおよび／またはゼラチンを基質とし、ショウガ根茎由来酵素で分解することを特徴とする。ショウガにジンジベインが含まれることは公知であるが、本発明ではジンジベインを抽出、単離することなくショウガ根茎の乾燥粉砕物全体を使用し、分解反応を行うことができる。なお、従前からジンジベインがＮ末端側から読んだときに、ＰｒｏのＣ末端側に隣接するアミノ酸残基とその次のアミノ酸残基との間のペプチド結合を切断することは知られていたが、Ｈｙｐに対する効果は全く知られていなかった。本発明では、コラーゲンにショウガ根茎由来酵素を作用させると１段階の酵素反応でＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを生成することを見出した。バクテリアコラゲナーゼによれば、ＨｙｐとＧｌｙとの間のペプチド結合を切断するため、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを効率的に生成することはできない。
【００２９】
本発明で使用するショウガ根茎は、コラーゲン分解酵素活性を有するものであれば特に制限はない。市販のショウガ根茎を広く使用することができる。
【００３０】
ショウガ根茎由来酵素は、生ショウガ根茎から抽出した酵素であってもよく、乾燥ショウガ根茎から得た酵素であってもよい。何れであってもコラーゲンを分解してＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを生成しうるからである。
【００３１】
本発明では、ショウガ根茎由来酵素として、ショウガ根茎の乾燥粉砕物をそのまま使用することができる。コラーゲンおよび／またはゼラチン溶液に添加することで、酵素抽出、精製の工程を経ることなく、簡便に分解反応を行うことができる。更に、後記する実施例に示すように、乾燥粉砕物は、生ショウガ粉砕物をそのまま使用する場合よりも、コラーゲンの分解率に優れるからである。
【００３２】
乾燥ショウガ根茎は、凍結乾燥、通風乾燥、極性有機溶媒などによる脱水、およびこれらの組合せによって調製することができる。乾燥ショウガ根茎は、これを粉砕し、粉砕物をそのままショウガ根茎由来酵素として使用することができる。
【００３３】
また、生ショウガ根茎をエタノールなどの極性有機溶媒中で粉砕し、ろ過などにより有機溶媒と分離した残渣を乾燥したものも、ショウガ根茎由来酵素として使用することができる。本発明において、これらはいずれもショウガ根茎の乾燥粉砕物である。ショウガ根茎を極性有機溶媒中で粉砕する方法は、迅速に脱水することができ、かつショウガオール、ジンゲロールなどの酵素以外のショウガ根茎含有物を除去しうる点で優れる。なお、ショウガ根茎には多量の繊維が含まれているが、繊維を含んだまま粉砕した粉砕物であってもよい。粉砕は、乳鉢、スタンプミル、ボールミル、ホモジナイザーやカッティングミルなどで行うことができる。
【００３４】
（３）分解反応
本発明において、コラーゲンおよび／またはゼラチン溶液に添加するショウガ根茎由来酵素の量は、使用するショウガ根茎由来酵素の形状その他によって適宜選択することができ、例えばショウガ根茎の乾燥粉砕物の場合、コラーゲンおよび／またはゼラチンの１〜３０質量％、より好ましくは２〜２０質量％、特に好ましくは５〜１０質量％である。
【００３５】
分解反応により、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドが生成される。更に、Ｃ末端から２番目のアミノ酸残基がＰｒｏである、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）や、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドも生成される。なお、反応時間を調整することで、ＰｒｏやＨｙｐのＣ末端側に隣接するアミノ酸残基とその次のアミノ酸残基との間のペプチド結合の一部が切断されずに残存するペプチドも生成する。このため、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ以外のそれぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ以外のそれぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドなども生成される。これらが生成されるか否かは、反応液の一部を採取してペプチドの定量分析を行うことで簡便に確認することができる。
【００３６】
反応は、ｐＨ４．０〜７．０で行うことが好ましい。この範囲で、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドの生成率に優れるからである。より好ましくは、ｐＨ４．０〜５．６未満、特に好ましくはｐＨ４．０〜５．２である。反応液のｐＨと得られるコラーゲンペプチド組成物との関係を詳細に検討したところ、ｐＨ４．０〜５．６未満の範囲でＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドの生成率に優れることが判明した。同時に生成しうるＸ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドは、各ペプチドそれぞれの生成量が最大となるｐＨで判断するとｐＨ５．６〜６．０で生成率に優れるため、ペプチド種によって至適ｐＨが異なる。このことは、反応液のｐＨを調整することで得られるペプチド組成の異なるコラーゲンペプチド組成物を調製しうることを意味する。ｐＨ４．０〜５．６未満の範囲で反応を行うことで、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドの含有量の高いコラーゲンペプチド組成物を製造することができる。なお、反応をｐＨ４．０〜５．６の範囲で行うことで、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ以外のそれぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）やＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ以外のそれぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）の生成量も増加する。
【００３７】
反応には還元剤を添加してもよい。後記する実施例に示すように、コラーゲンおよび／またはゼラチン溶液に還元剤を添加して反応させると、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドの生成率に優れることが判明した。還元剤の濃度は、ショウガ根茎由来酵素の添加量に対応して適宜選択することができ、グルタチオン含有酵母エキスの場合、０．００１w/v％以上で添加の効果が発揮され、好ましい添加量は０．００５〜０．５w/v％である。特に、還元剤濃度が０．０２〜０．５w/v％の場合には、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドの生成量が大きく向上する。なお、還元剤の濃度が０．００５〜０．５w/v％であれば、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ以外のそれぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）やＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ以外のそれぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）の生成量も増加する。
【００３８】
還元剤としては、アスコルビン酸、α−トコフェロール、グルタチオンなどが存在するが、特に、ＳＨ基含有還元剤が好適である。ＳＨ基含有還元剤としては、ジチオトレイトール、システイン、グルタチオン、グルタチオン含有酵母エキスなどがある。ＳＨ基含有還元剤はＳＨ基の保護作用を有するため、ショウガ根茎由来酵素に含まれる酵素のＳＨ基に作用し、反応率を向上させると推定される。ＳＨ基含有還元剤として、トルラ酵母由来グルタチオン含有酵母エキスなどのグルタチオン含有酵母エキスを使用することもできる。
【００３９】
反応温度は、室温〜８０℃、より好ましくは４０〜６０℃である。反応時間に制限はなく、基質がコラーゲンであるかゼラチンであるかによっても相異する。ゼラチンを基質とする場合は、振盪、攪拌しながら８〜２４ｈ反応させる。これによりコラーゲンペプチド組成物が生成される。
【００４０】
反応の終了は、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドの生成量によって決定することができる。なお、同時に生成しうるペプチドには、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ以外のそれぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）やＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ以外のそれぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドなど、Ｐｒｏおよび／またはＨｙｐを２以上含有するペプチドがある。これらは、分解の進行に伴って複数のＰｒｏおよび／またはＨｙｐに基づく更なる分解を受ける可能性がある。従って、所望するペプチドの含有量の推移によって反応の終了時期を決定することが好ましい。
【００４１】
（４）コラーゲンペプチド組成物
本発明では、コラーゲンおよび／またはゼラチンを基質とする場合に、得られたコラーゲンペプチド組成物には、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ａｒｇ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙなどの、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドの少なくとも１種が含まれる。更に、アミノ酸数３〜６であり、Ｃ末端から２番目のアミノ酸残基がＰｒｏであるペプチドも混在する。本発明により製造されたコラーゲンペプチド組成物を定法に従って精製することで、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを単離することができる。この点で、本発明は、コラーゲンおよび／またはゼラチン溶液にショウガ根茎由来酵素を添加して分解することを特徴とする、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドの製造方法ということができる。同様に、コラーゲンおよび／またはゼラチン溶液にショウガ根茎由来酵素を添加して分解することを特徴とする、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ以外のアミノ酸残基を示す。）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ以外のそれぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）、またはＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ以外のそれぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドの製造方法ということもできる。
【００４２】
一方、非水酸化コラーゲンおよび／または非水酸化コラーゲン由来のゼラチンを基質とする場合には、Ｐｒｏの含有量が多いため、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを多く含むペプチド組成物が製造される。これらもコラーゲンペプチド組成物を精製することで、効率的にＸ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを単離することができる。本発明により製造されたコラーゲンペプチド組成物を定法に従って精製することで、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを単離することができるため、本発明は、非水酸化コラーゲンおよび／または非水酸化コラーゲン由来のゼラチン溶液にショウガ根茎由来酵素を添加して分解することを特徴とする、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドの製造方法ということができる。同様に、非水酸化コラーゲンおよび／または非水酸化コラーゲン由来のゼラチン溶液にショウガ根茎由来酵素を添加して分解することを特徴とする、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ以外のアミノ酸残基を示す。）、またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ以外のそれぞれ同一でも異なっていてもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドの製造方法ということもできる。
【００４３】
従来から、Ｎ末端から２番目がＰｒｏまたはＨｙｐであるペプチドがＤＰＰ−４阻害活性を有することは知られている。本発明の製造方法によって得られるコラーゲンペプチド組成物は、Ｎ末端から２番目がＰｒｏやＨｙｐであるペプチドも含み、後記する実施例に示すようにＤＰＰ−４阻害活性に優れることが判明した。
【００４４】
本発明の製造方法で得られるコラーゲンペプチド組成物は、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドが０．０１〜２５モル％、より好ましくは０．０５〜２０モル％、特に好ましくは０．１〜１０モル％含有される。なお、コラーゲンの１次配列に基づくＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドの理論的含有率は、コラーゲンによって相違するが約２０〜２５モル％である。本発明の製造方法によれば、ショウガ根茎由来酵素を使用して１段階の反応を行うことで、コラーゲンペプチド組成物中にＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを含むコラーゲンペプチド組成物を製造することができる。
【００４５】
本発明の第二は、前記製造方法で得られるコラーゲンペプチド組成物を含有するＤＰＰ−４阻害剤である。
本発明のコラーゲンペプチド組成物の製造方法によれば、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドが生成され、後記する実施例に示すようにＬｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙなど、ＤＰＰ−４阻害活性が高いペプチドが含まれる。本発明の製造方法で得られるコラーゲンペプチド組成物には、更に種々のペプチドが含まれる。これらの中には、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙなどのように、ＤＰＰ−４阻害活性が高いペプチドも存在する。このようなＤＰＰ−４阻害活性に優れるペプチドの含有量が高いコラーゲンペプチド組成物は、そのままＤＰＰ−４阻害剤として使用することができる。
【００４６】
本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、経口投与、経腸投与、経鼻投与によりＤＰＰ−４を阻害して血糖値の上昇を抑制する。経口投与の場合の剤型としては、コラーゲンペプチド組成物を溶液として使用し、またはペプチド組成物にふ形剤を配合して錠剤、細粒剤、丸剤、トローチなどに調製してもよく、カプセルに収納してカプセル剤としてもよい。投与量は、０．１〜５０ｇ／日が好ましく、治療や予防、健康維持などの目的、症状、体重、年齢などの条件を考慮して、適宜選択することができる。また、サプリメントとして摂取することもできる。
【００４７】
本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、上記コラーゲンペプチド組成物をそのまま使用しても良いが、前記コラーゲンペプチド組成物に含まれる特定ペプチドを分離し、これをＤＰＰ−４阻害剤として使用してもよい。
【００４８】
本発明の第三は、前記製造方法で得られるコラーゲンペプチド組成物を含有する血糖値上昇抑制剤である。
前記したように、本発明のコラーゲンペプチド組成物の製造方法で得られるコラーゲンペプチド組成物は、ＤＰＰ−４阻害活性に優れる。しかも、後記する実施例に示すように、上記コラーゲンペプチド組成物を健康なマウスに投与したところ、食後の最高血糖値を有意に低下しうることが判明した。インクレチンホルモンの１つであるＧＬＰ−１はインスリン分泌促進およびグルカゴンの分泌抑制により血糖値上昇を抑制するが、その作用は血中グルコース濃度に依存し、一定濃度以上のグルコース存在下のみで効果を発揮する。近年、ＤＰＰ−４阻害によってＧＬＰ−１の作用を増強し、血糖値を降下させる試みがなされており、ＤＰＰ−４阻害剤は糖尿病患者の高血糖値を低下させるのに有効であることが判っている。一方、空腹時血糖値が正常な場合に食後の血糖値上昇をどの程度抑制するかはＤＰＰ−４阻害剤の性質によって相違する。例えば、従来からＤＰＰ−４阻害剤として知られるジャヌビアは、半減期が９．６〜１１．６時間と長いため、過度に血糖値を低下させる場合がある。これに対し、上記コラーゲンペプチド組成物は、グルコース投与前の経口投与により対照群と比較して食後の最高血糖値を有意に低下させることができ、しかも、血糖の食後２時間値は対照群と略同じ数値であるから、食後の血中の糖濃度を穏やかに低減させている。このような血糖値の推移は、本発明の製造方法で得たコラーゲンペプチド組成物が、可食可能なコラーゲンおよび／またはゼラチンに由来するため、結果として正常人の血糖値上昇抑制として好適な半減期になったためと推定される。本発明のコラーゲンペプチド組成物の製造方法によれば、安全性に優れ、正常人の食後の血糖値の上昇を抑制しうるコラーゲンペプチド組成物を製造することができ、当該コラーゲンペプチド組成物は、メタボリックシンドロームなどの生活習慣病の予防や治療に有効である。本発明の血糖値上昇抑制剤は、上記コラーゲンペプチド組成物をそのまま使用しても良いが、前記コラーゲンペプチド組成物に含まれる特定ペプチドを分離し、これを血糖値上昇抑制剤として使用してもよい。
【００４９】
本発明の血糖値上昇抑制剤は、経口投与、経腸投与、経鼻投与により、健常者の食後の血糖値の上昇を抑制することができる。投与量は、０．１〜５０ｇ／日が好ましく、その１／３量を食前に摂取する。なお、投与量は、体重、年齢などの条件を考慮して、適宜選択することができる。また、サプリメントとして摂取することもできる。
【００５０】
本発明のＤＰＰ−４阻害剤や血糖値上昇抑制剤は、これを食品に配合して経口摂取することができる。このような本発明のＤＰＰ−４阻害剤等が配合された食品としては、野菜やフルーツ、乳酸菌などを含むジュースその他の飲料、ゼリー、ヨーグルト、プリン、アイスクリームなどの半流動性食品の他、他の食材に混練して固形食品に調製することができる。
【実施例】
【００５１】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。【００５２】
（製造例１）
ショウガ根茎を−３０℃で凍結した後、凍結ショウガに対して５倍量（容量／重量）の−３０℃の冷エタノールを添加し、カッティングミルで十分粉砕してスラリーを得た。前記スラリーをろ過してエタノールを除去し更にこの残渣を凍結乾燥し、ショウガ根茎有機溶媒乾燥粉砕物を得た。【００５３】
（製造例２）
生のショウガ根茎をカッティングミルで粉砕し、これをショウガ根茎生粉砕物とした。【００５４】
（製造例３）
ショウガ根茎をスライスし、温度２５〜５０℃、３時間、温風に通風して乾燥し、ショウガ根茎の乾燥物を得た。これをカッティングミルでパウダー状に粉砕し、これをショウガ根茎通風乾燥粉砕物とした。【００５５】
（実施例１）
ｐＨ４．８の０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファーでウシ由来ゼラチン５質量％溶液を調製した。この溶液に製造例１で調製したショウガ根茎有機溶媒乾燥粉砕物、製造例２で調製したショウガ根茎生粉砕物、製造例３で調製したショウガ根茎通風乾燥粉砕物を、ウシ由来ゼラチンに対して質量換算で１／２０倍量加え、グルタチオン含有酵母エキス（株式会社興人社製、ハイチオンエキスＹＨ−１５（グルタチオン含有率１５％以上））を０．０２w/v％となるように添加し、５０℃で振盪、攪拌しながら１６ｈ反応させた。反応終了後静置し、上清を回収してペプチド溶液を得た。なお、ショウガ根茎生粉砕物は、乾燥重量に換算して添加した。
得られたペプチド溶液を下記ＬＣ／ＭＳ測定条件で分離し、構成オリゴペプチドの一部の含有量を定量した。また、原料として使用したウシ由来ゼラチンについても上記と同様にしてオリゴペプチドの含有量を測定した。結果を表１に示す。【００５６】
表１に示すように、ショウガ根茎由来酵素は、ショウガ根茎生粉砕物、ショウガ根茎通風乾燥粉砕物およびショウガ根茎有機溶媒乾燥粉砕物のいずれを使用した場合でも、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを生成した。ショウガ根茎生粉砕物に比べ、ショウガ根茎通風乾燥粉砕物、ショウガ根茎有機溶媒乾燥粉砕物を使用した場合に、上記式で示すペプチドの含有量が著しく高くなった。【００５７】
（１）ＬＣ／ＭＳ測定条件
高速液体クロマトグラフ：1200Series(Agilent Technologies)、
質量分析装置：3200QTRAP(AB Sciex)、
分析カラム：Allure PFPP 5μm, 4.6mmi.d.×150mm(RESTEK)、
カラム温度：４０℃
移動相：Ａ液；０．１％ギ酸、Ｂ液；１００％アセトニトリル、
グラジエント条件：
０〜７．５分：Ａ液１００％、
７．５〜１７．５分：Ａ液１００〜７０％；Ｂ液０〜３０％、
１７．５〜２０分：Ａ液７０〜５０％；Ｂ液３０〜５０％、
２０〜３１分：Ａ液５０％；Ｂ液５０％、
３１．１〜３６分：Ａ液１％；Ｂ液９９％、
３６．１〜４５分：Ａ液１００％、
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
（２）質量分析条件：
イオン化：ＥＳＩ、ポジティブ、
分析モード：Multiple Reaction Monitoring(MRM)モード、
イオンスプレー電圧：３ｋＶ、
イオンソース温度：６００℃【００５８】
（実施例２）
ｐＨ４．８の０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファーでウシ由来ゼラチン５質量％溶液を調製した。このゼラチン溶液に、製造例１と同様にして新たに調製したショウガ根茎有機溶媒乾燥粉砕物を、ウシ由来ゼラチンに対して質量換算で１／２０倍量加え、更に、グルタチオン含有酵母エキスをそれぞれ０w/v％、０．００１w/v％、０．００５w/v％、０．０２w/v％、０．１w/v％、および０．５w/v％となるように添加し、５０℃で振盪、攪拌しながら１６ｈ反応させた。反応終了後静置し、上清を回収して各ペプチド溶液を得た。これらのペプチド溶液を実施例１と同様のＬＣ／ＭＳ測定条件で分離およびこれを構成するオリゴペプチドの含有量を定量した。オリゴペプチドの含有量を表２に示す。【００５９】
表２に示すように、ショウガ根茎有機溶媒乾燥粉砕物をゼラチンに対して１／２０倍量添加した場合には、グルタチオン含有酵母エキスを０．０２〜０．５w/v％となるように添加するとペプチドの生成率が大きく増加した。【００６０】
（実施例３）
酢酸ナトリウムバッファーまたはリン酸ナトリウムバッファーによってｐＨを４．０、４．４、４．８、５．２、５．６、６．０、６．４および６．８の溶液を調製し、これに実施例１で使用したウシ由来ゼラチンを溶解して５質量％ゼラチン溶液を調製した。このゼラチン溶液にそれぞれ実施例２で調製したショウガ根茎有機溶媒乾燥粉砕物をウシ由来ゼラチンに対して質量換算で１／２０倍量を加え、更にグルタチオン含有酵母エキス（グルタチオン含有率１５％以上）を０．０２w/v％となるように添加し、５０℃で振盪、攪拌しながら１６ｈ反応させた。反応終了後静置し、上清を回収してペプチド溶液を得た。これらのペプチド溶液を実施例１と同様のＬＣ／ＭＳ測定条件で分離およびこれを構成するオリゴペプチドの含有量を定量した。オリゴペプチドの含有量を表３に示す。【００６１】
表３に示すように、各ペプチドそれぞれの生成量が最大となるｐＨで判断すると、ｐＨ４．０〜５．２の範囲で、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドの生成率が増加した。一方、同時に生成しうるＸ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）は、ｐＨ５．６〜６．０の範囲で生成率に優れた。ショウガ根茎由来酵素で分解する場合には、反応液のｐＨを調整することで、得られるコラーゲンペプチド組成物に含まれるペプチド量を調整しうることが示唆された。【００６２】
（実施例４）
製造例１と同様にして新たに調製したショウガ根茎有機溶媒乾燥粉砕物を使用し、その添加量を、ウシ由来ゼラチンに対して質量換算で１／１０倍量に変更した以外は実施例１と同様に操作して、ペプチド溶液を得た。また、ウシ由来ゼラチンに代えて、リコンビナントヒトゼラチン（株式会社免疫生物研究所製、ネオシルク−ヒトコラーゲンＩ）を使用した以外は、上記と同様に操作してペプチド溶液を得た。
これらのペプチド溶液について、実施例１と同様のＬＣ／ＭＳ測定条件で分離し、ペプチド溶液に含まれるオリゴペプチドの一部の含有量を定量した。また、このペプチド溶液について、下記に従い、ＤＰＰ−４阻害率とＩＣ５０値とを測定した。測定したオリゴペプチドの含有量およびＩＣ５０値を表４に示す。ウシ由来ゼラチンから得たペプチド組成物のＤＰＰ−４阻害曲線を図１に、リコンビナントヒトゼラチンから得たペプチド組成物のＤＰＰ−４阻害曲線を図２に示す。【００６３】
表４のＩＣ５０値に示すように、リコンビナントヒトゼラチンから得たペプチド組成物は、ウシ由来ゼラチンから得たペプチド組成物と比較してＤＰＰ−４阻害活性に優れた。このことは、例えば、カイコによるリコンビナント蛋白質発現系で調製した「Ｈｙｐを含まないリコンビナントヒト型コラーゲン」を基質とすることで、「Ｈｙｐを含有する天然由来のコラーゲンやゼラチン」を基質とする場合よりもＤＰＰ−４阻害活性に優れるペプチド組成物を製造しうることを意味する。ＤＰＰ−４阻害活性の相異は、含まれる各ペプチドのＤＰＰ−４阻害活性に対するＩＣ５０値に由来する。前記したように、コラーゲンを構成するＨｙｐは、コラーゲンが生合成される際にＰｒｏがプロリン水酸化酵素によって水酸化されることで生成する。コラーゲン配列−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ−において、Ｘ位のＰｒｏはほとんど水酸化されないが、Ｙ位のＰｒｏの多くは水酸化される。オリゴペプチドのＤＰＰ−４阻害活性に対するＩＣ５０値を評価した表６に示すように、例えばＸ−Ｈｙｐ−ＧｌｙとＸ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙとを比較すると、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの方がＤＰＰ−４阻害活性が強い。ゆえに、リコンビナントヒトコラーゲンは、Ｙ位のＰｒｏの水酸化率が低く、得られるペプチド組成物のＤＰＰ−４阻害活性に対するＩＣ５０値が低くなり、ＤＰＰ−４阻害活性に優れる結果が得られたと推定される。【００６４】
測定方法
（１）ＤＰＰ−４阻害率の測定方法
５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に試料を溶解したサンプル液３５μｌと、５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解したＤＰＰ−４（シグマ社製、豚腎臓由来；８．６ｍＵ／ｍｌ）１５μｌとをマイクロプレートウェル（ＮＵＮＣ社製、商品名「２３７０１５」）中で混合し３７℃、１０分間インキュベートした。
これに、予め３７℃に保温しておいた基質溶液（グリシルプロリン−４−メチルクマリン−７−アミド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡ）を１０μＭとなるよう５０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解したもの）５０μｌを添加および混合し、３７℃で２０分間反応させた。
ＤＰＰ−４によって遊離される７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）の蛍光強度をマイクロプレートリーダー型蛍光検出器（コロナ電気社製、商品名「ＳＨ−９０００」）で経時的に測定した。なお、測定波長は励起波長３８０ｎｍ、測定波長４６０ｎｍで行った。なお、サンプルに代えて５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）を同量使用したものを対照として蛍光強度を測定した。
ＤＰＰ−４の活性は、反応時間中における蛍光強度変化量の平均勾配で表し、ＤＰＰ−４阻害率は、対照を１００％とし、サンプルの活性を前記対照から差し引いた分を阻害率（％）として算出した。【００６５】
（２）ＩＣ５０値の測定方法
上記したＤＰＰ−４阻害率の測定方法に準じて、サンプル濃度を変化させて得た阻害率から、反応系1ｍｌ換算におけるＤＰＰ−４活性の５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した。【００６６】
（実施例５）
ｐＨ４．８の０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファーでウシ由来ゼラチン５質量％溶液を調製し、この溶液に製造例１と同様にして新たに調製したショウガ根茎有機溶媒乾燥粉砕物を、ウシ由来ゼラチンに対して質量換算で１／１０倍量加え、グルタチオン含有酵母エキス（グルタチオン含有率１５％以上）を０．０２w/v％となるように添加し、５０℃で振盪、攪拌しながら１６ｈ反応させた。得られた反応液をろ過後、ろ液を回収してペプチド溶液を得た。この溶液を滅菌処理後、スプレードライヤーで乾燥してペプチド粉末を得た。【００６７】
得られたペプチド粉末を投与した場合の血糖値の変動を評価した。
（１）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  雄マウス８週齢（日本チャールスリバー）２５匹を一週間馴化飼育した。糖負荷試験前の7日間、各マウスに蒸留水０．２５ｍｌを与え、経口投与に馴化させた。
（２）糖負荷試験の前日の１６時より１８時間、水以外は絶食させた。空腹時血糖値を測定し、空腹時血糖値が等しくなる様に５群に（ｎ＝５）群分けをした。５群は、陽性対照群、コラーゲンペプチド組成物投与群（４００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、２０００ｍｇ／ｋｇ）、陰性対照群とからなる。
（ｉ）陽性対照群は、２０w/v％グルコース水溶液投与１時間前に、シタグリプチン（ＭＳＤ社製、ジャヌビア）を３ｍｇ／ｋｇとなるように経口投与した。
（ｉｉ）コラーゲンペプチド組成物投与群は、グルコース投与１５分前に、上記ペプチド粉末を、投与量が４００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、２０００ｍｇ／ｋｇとなるように蒸留水に溶解して経口投与した。
（ｉｉｉ）陰性対照群は、グルコース投与１５分前に、蒸留水を２０ｍｌ／ｋｇ経口投与した。
（３）グルコースを投与した。グルコース投与時には、２０w/v％グルコース水溶液を１０ｍｌ／ｋｇ投与した。
（４）グルコース投与後、１５、３０、６０、１２０分に尾から採血し、簡易血糖測定器（アークレイファクトリー社製、ＧＴ−１６４）で血糖値を測定した。結果を図３に示す。なお、群間の統計的有意差は、Aspin−Welchのｔ検定を用いた。図３において、＊は蒸留水投与群に対してＰ＜０．０５の、＊＊は蒸留水投与群に対してＰ＜０．０１の有意差を示す。
（５）血糖測定時にヘパリン採血管を用いて２５μｌの採血を行い、ＥＬＩＳＡキット（レビスインスリン−マウス−Ｕタイプ）を用いてインスリン濃度を測定した。結果を図４に示す。群間の統計的有意差は、Aspin−Welchのｔ検定を用いた。図４において、＊は蒸留水投与群に対してＰ＜０．０５の、＊＊は蒸留水投与群に対してＰ＜０．０１の有意差を示す。【００６８】
図３に示すように、注射用水を投与した陰性対照群では、グルコース投与前の血糖値６０ｍｇ／ｄＬからグルコース投与１５分後に４４０ｍｇ／ｄＬに上昇し、グルコース投与後３０分で３８０ｍｇ／ｄＬ、６０分後に２８０ｍｇ／ｄＬと漸次、減少した。これに対し、陽性対照群では、グルコース投与１５分後に２２０ｍｇ／ｄＬに上昇したが、投与後３０分〜１２０分で１２５〜１５０ｍｇ／ｄＬに半減し、その値を維持した。
これに対し、コラーゲンペプチド組成物投与群のうち、１０００ｍｇ／ｋｇ投与群および２０００ｍｇ／ｋｇ投与群は共に、グルコース投与１５分後に２５０ｍｇ／ｄＬであり、陰性対照群と有意に低い血糖値を示した。その後、投与後３０分で２２０〜２５０ｍｇ／ｄＬ、投与後１２０分で２５０〜２８０ｍｇ／ｄＬと血糖値の急激な変動が全く観察されなかった。ただし、４００ｍｇ／ｋｇ投与群は、陰性対照群とほぼ同じ血糖値の推移を示した。【００６９】
図４に示すように、コラーゲンペプチド組成物投与群では、陰性対象群に比べ、血中インシュリン濃度が上昇していた。このことから、血糖値上昇抑制効果の一部はインシュリンの分泌促進および分解抑制であることが推察された。一方で陽性対象群と比較するとその作用は温和で薬剤ほどの効果は得られなかった。【００７０】
（実施例６）
実施例５と同様にして新たに調製したペプチド粉末を健常者９人に投与して食後血糖値に対する作用を観察した。
（１）ペプチド粉末２５ｇを溶解した水１００ｍｌ、または対照として水１００ｍｌを飲用した。ペプチド粉末飲用後３０分経過後に、トレーランＧ液７５g（味の素製薬株式会社製、ブドウ糖７５ｇ含有）２２５ｍｌを飲用した。トレーランＧ液７５gを飲用した後、３０分後、６０分後、１２０分後の血糖値を測定した。１週間後に、ペプチド粉末と水とを入れ替えて同様の糖負荷試験を行った。結果を図５に示す。なお、群間の統計的有意差は、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  ｔｅｓｔを用いた。図５において、＊は水投与群に対してＰ＜０．０５の有意差を示す。
（２）上記（１）の血糖値の１２０分後までの積算値（ＡＵＣ）を算出した。結果を図６に示す。なお、群間の統計的有意差は、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  ｔｅｓｔを用いた。図６において、＊＊は水投与群に対してＰ＜０．０１の有意差を示す。【００７１】
図５に示すように、本発明の製造方法で得たコラーゲンペプチド組成物を健常者に経口摂取させると、ブドウ糖摂取後６０分における食後血糖値の上昇を統計学的に有意に抑制した。ブドウ糖摂取後１２０分の食後血糖値は更に低下しており、ブドウ糖摂取後の血糖値の急激な変動が抑制されることが示された。同様に、図６に示すように、血糖値の１２０分後までの積算値は、統計学的有意に対照群に比して低値を示した。【００７２】
（比較例）
２ｍＭ  塩化カルシウムを含むウシ由来ゼラチン５質量％溶液を調製し、１Ｍ  炭酸ナトリウムでｐＨ７．８に調整した。この溶液にクロストリジウム由来コラゲナーゼ（ロシュ社製、Ｌｉｂｅｒａｓｅ  Ｃ／Ｔ）を０．１w/v％となるように添加し、３０℃で振盪、攪拌しながら２０ｈ反応させ、沸騰水で５分加熱して酵素反応を停止し、ペプチド溶液を得た。このペプチド溶液を実施例１と同様のＬＣ／ＭＳ測定条件で分離およびこれを構成するオリゴペプチドの含有量を定量した。オリゴペプチドの含有量を表５に示す。また、得られたペプチド溶液を用いて実施例４と同様に操作してＩＣ５０値を測定したところ、ＩＣ５０値は０．２１ｍｇ／ｍｌであった。【００７３】
表５に示すように、クロストリジウム由来コラゲナーゼを使用した場合は、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドは生成されなかった。【００７４】
（参考例）
実施例１で得たペプチド溶液に含まれるオリゴペプチドの一部について、実施例４と同様にしてＩＣ５０値を測定した。結果を表６に示す。【００７５】
表６に示すように、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドは、ＤＰＰ−４阻害活性に対するＩＣ５０値が低いものが含まれていた。また、コラーゲンペプチド組成物に含まれるペプチドにも、ＤＰＰ−４阻害活性に対するＩＣ５０値が低いものが含まれていた。【００７６】
【表１】
2014017474.tif 000002
【００７７】
【表２】
2014017474.tif 000003
【００７８】
【表３】
2014017474.tif 000004
【００７９】
【表４】
2014017474.tif 000005
【００８０】
【表５】
2014017474.tif 000006
【００８１】
【表６】
2014017474.tif 000007
【００８２】
本発明は、上述した実施形態に限定されず、種々の変形及び応用が可能である。また、上述した実施形態の各構成要素を自由に組み合わせることも可能である。
本発明は２０１２年７月２５日に出願された日本国特許出願２０１２−１６４５２２号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１２−１６４５２２号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明の製造方法によれば、ＤＰＰ−４阻害活性に優れるＤＰＰ−４阻害剤や血糖値上昇抑制剤を提供することができ、有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年1月19日(2015.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンおよび／またはゼラチン溶液にショウガ根茎由来酵素を添加して分解し、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを含むペプチド組成物を生成することを特徴とする、コラーゲンペプチド組成物の製造方法。
【請求項２】
ショウガ根茎の乾燥粉砕物を、前記ショウガ根茎由来酵素として使用することを特徴とする、請求項１記載のコラーゲンペプチド組成物の製造方法。
【請求項３】
前記ショウガ根茎由来酵素と共にグルタチオン含有酵母エキスを０．００５〜０．５w/v％の範囲で添加し、および／またはｐＨ４．０〜６．０の範囲に調整して反応させることを特徴とする、請求項１または２記載のコラーゲンペプチド組成物の製造方法。
【請求項４】
前記ペプチド組成物に含まれる前記式で示されるペプチドの含有量が、前記コラーゲンおよび／またはゼラチンの０．０１モル％以上であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲンペプチド組成物の製造方法。
【請求項５】
更に、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のコラーゲンペプチド組成物の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の製造方法で得られるコラーゲンペプチド組成物を含有するＤＰＰ−４阻害剤。
【請求項７】
請求項５に記載の製造方法で得られるコラーゲンペプチド組成物を含有する血糖値上昇抑制剤。
【手続補正書】
【提出日】平成28年1月27日(2016.1.27)
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンおよび／またはゼラチン溶液にショウガ根茎由来酵素を添加して分解する分解工程を含むコラーゲンペプチド組成物の製造方法であって、
前記分解工程は、前記ショウガ根茎由来酵素と共にＳＨ基含有還元剤を添加して反応させるものであり、
前記ペプチド組成物は、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを含むことを特徴とする、コラーゲンペプチド組成物の製造方法。
【請求項２】
前記分解工程は、ｐＨ４．０〜６．０の範囲に調整して反応させるものである、請求項１記載のコラーゲンペプチド組成物の製造方法。
【請求項３】
前記ＳＨ基含有還元剤は、グルタチオン含有酵母エキスであり、その添加濃度は０．００５〜０．５w/v％であることを特徴とする、請求項１または２記載のコラーゲンペプチド組成物の製造方法。
【請求項４】
前記ＳＨ基含有還元剤は、添加濃度０．００５〜０．５w/v％のグルタチオン含有酵母エキスと同モルのグルタチオンであることを特徴とする、請求項１または２記載のコラーゲンペプチド組成物の製造方法。
【請求項５】
前記ペプチド組成物に含まれる前記式で示されるペプチドの含有量が、前記コラーゲンおよび／またはゼラチンの０．０１モル％以上であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のコラーゲンペプチド組成物の製造方法。
【請求項６】
更に、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のコラーゲンペプチド組成物の製造方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
すなわち本発明は、コラーゲンおよび／またはゼラチン溶液にショウガ根茎由来酵素を添加して分解する分解工程を含むコラーゲンペプチド組成物の製造方法であって、前記分解工程は、前記ショウガ根茎由来酵素と共にＳＨ基含有還元剤を添加して反応させるものであり、前記ペプチド組成物は、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを含むことを特徴とする、コラーゲンペプチド組成物の製造方法を提供するものである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
また本発明は、前記分解工程は、ｐＨ４．０〜６．０の範囲に調整して反応させるものである、上記コラーゲンペプチド組成物の製造方法を提供するものである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
また本発明は、前記ＳＨ基含有還元剤は、グルタチオン含有酵母エキスであり、その添加濃度は０．００５〜０．５w/v％であることを特徴とする、上記コラーゲンペプチド組成物の製造方法を提供するものである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
また本発明は、前記ＳＨ基含有還元剤は、添加濃度０．００５〜０．５w/v％のグルタチオン含有酵母エキスと同モルのグルタチオンであることを特徴とする、上記コラーゲンペプチド組成物の製造方法を提供するものである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
また本発明は、前記ペプチド組成物に含まれる前記式で示されるペプチドの含有量が、前記コラーゲンおよび／またはゼラチンの０．０１モル％以上であることを特徴とする、コラーゲンペプチド組成物の製造方法を提供するものである。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
また本発明は、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるペプチドを含むことを特徴とする、上記コラーゲンペプチド組成物の製造方法を提供するものである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【国際調査報告】
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