(57)【要約】  Ｖｒｓ１遺伝子は、二条オオムギの不稔となる側列小穂の雌蕊で強く発現していることを見出し、ＶＲＳ１タンパク質は側列小穂の小花の稔実を抑制していることを明らかにした。さらに、Ｖｒｓ１遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡを二条オオムギに導入することにより、側列小穂の稔性を回復させ、着粒数を増加させることができることも明らかにした。また、コムギ由来のＶｒｓ１遺伝子を初めて単離し、該遺伝子の発現部位が、小穂において不稔となる上位小花に特異的であることを明らかにした。さらに、コムギＶｒｓ１遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡをコムギに導入することにより、１小穂あたりの小花数及び着粒数を増加させることができることも確認し、コムギの１小穂あたりの着粒数を増やすための方法及び薬剤を提供することを可能にした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の機能が人為的に抑制されており、コントロールコムギと比較して着粒数が増加したコムギ。
【請求項２】
二重鎖ＲＮＡ法、アンチセンス法又はリボザイム法により、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の機能が人為的に抑制されている、請求項１に記載のコムギ。
【請求項３】
内在性コムギＶｒｓ１遺伝子に１又は複数の変異が導入されることにより、該遺伝子の機能が人為的に抑制されている、請求項１に記載のコムギ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のコムギの繁殖材料。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のコムギの種子に由来する加工品。
【請求項６】
内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、コントロールコムギと比較して着粒数が増加したコムギの生産方法。
【請求項７】
請求項６に記載の生産方法で生産されたコムギの子孫又はクローンであるコムギであって、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の機能が人為的に抑制されており、コントロールコムギと比較して着粒数が増加したコムギ。
【請求項８】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されたベクターを有効成分として含む、コムギの着粒数を増加させるための薬剤
（ａ）コムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）コムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｃ）コムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、着粒数が増加したコムギ、及びその繁殖材料に関する。また本発明は、着粒数が増加したコムギの種子に由来する加工品に関する。さらに本発明は、着粒数が増加したの生産方法に関する。また本発明は、該方法によって生産されたコムギの子孫及びクローンに関する。さらに本発明は、コムギの着粒数を増加させるための薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９６０年代に世界の食糧危機が懸念された際には、短幹にして多肥に耐えうる多収コムギ等が育成され、かかる品種の速やかな普及により世界の食糧危機が回避された。いわゆる「緑の革命」である。しかし、膨大な量の化学肥料を用いた結果、土壌は劣化してしまい、さらには、多肥による雑草の増加を抑制するため、農薬を使用したことにより、土壌及び水が汚染されてしまった。故に、これ以上の多肥による収量増加は望めず、収穫量が頭打ちになっている等の問題点が生じてきている。【０００３】
これに対し、世界人口は爆発的に増え続ける一方で、環境汚染や地球温暖化・砂漠化による急激な耕地減少が起こっており、依然として、発展途上国を中心に慢性的な食糧不足が続いている。特に、コムギは、パン、うどん、中華麺、パスタ、シリアル及び菓子のみならず、ビール等の酒の原料、さらには家畜用飼料等と多岐に亘るため、その需要量が世界で最も多い穀物である。さらには、世界人口１位・２位の国である中国・インドにおいて、急激な経済成長に伴う食生活の変化が生じていることもあり、世界的に生産が需要に追いついておらず、コムギの期末在庫率は低下傾向にあり、国際的な取引価格は上昇傾向にある。したがって、短幹にして多肥に耐えうる多収コムギ等に依存しない、穀物等の収量を増大させるための新たな方法の開発が急務とされている。【０００４】
収穫期の植物１個体あたりの穀粒収量を決定する重要な構成要素は、花序の構造である。特に、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）及びトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）といったといった草本の花（小花）は、小穂と称される分化した短枝に生じるため、花序あたりの稔性小穂又はそれら小穂につけられる稔性小花の数は、穀粒収量に密接に関連している。【０００５】
また、かかる草本に関し、穀粒収量に関与する遺伝子の同定は精力的に進められており、イネにおいては、サイトカイニンオキシダーゼをコードするＧｒａｉｎ  ｎｕｍｂｅｒ  １ａ（Ｇｎ１ａ）、ＳＱＵＡＭＯＳＡ  ＰＲＯＭＯＴＥＲ  ＢＩＮＤＩＮＧ  ＰＲＯＴＥＩＮ−ＬＩＫＥ  １４（ＳＰＬ１４）をコードするＷＥＡＬＴＨＹ  ＦＡＲＭＥＲＳ  ＰＡＮＩＣＬＥ  １（ＷＦＰ１）といった、いくつかの主要な量的形質遺伝子座（ＱＴＬｓ）の原因遺伝子がクローニングされている。しかしながら、ムギ類においては、主要なＱＴＬｓ又は花序あたりの穀粒収量に関与する遺伝子は、オオムギ由来のＶｒｓ１（六条性（ｓｉｘ−ｒｏｗｅｄ  ｓｐｉｋｅ）１）及びｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ  ｓｐｉｋｅ−ｃ（ｉｎｔ−ｃ）を除き、未だクローニングされていない（特許文献１及び非特許文献１〜３）。【０００６】
オオムギは、イネ科オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）に分類される植物である。また、オオムギの花序は穂と称され、１穂節あたり三つの小穂（一つの主列小穂、二つの側列小穂）からなる。しかしながら、イネ科のコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）に属する植物は一つの小穂に複数の小花をつけるのに対し、オオムギ属に属する全３１種は、一つの小穂に一つの小花しかつけないというユニークな特徴を有している。【０００７】
さらに、オオムギは、その穂の形態から、二条性と六条性とに大きく分けられる。二条性の穂（二条穂）において、主列小穂のみが稔実し、穀粒をつける。一方、六条性の穂（六条穂）においては三小穂が稔実するため、六条性のオオムギは、二条性のオオムギに比べて、３倍量の穀粒をつけることになる。【０００８】
そして、このオオムギの条性を制御しているのは、２Ｈ染色体の長腕部に存在する前記Ｖｒｓ１遺伝子であり、さらには、野生型Ｖｒｓ１遺伝子は、ホメオドメインロイシンジッパー（ＨＤ−Ｚｉｐ）Ｉ転写因子をコードしており、Ｖｒｓ１遺伝子が側列小穂の小花原基にて発現することにより、側列小穂の発達を抑制され、オオムギの穂が二条になること等が本発明者らによって明らかになっている（特許文献１、並びに非特許文献１及び３）。【０００９】
しかしながら、オオムギにおいても、ＶＲＳ１タンパク質の分子機能や発現パターンは未だ十分に解明されておらず、また、二条穂におけるＶｒｓ１遺伝子の機能の喪失が側列小穂における稔性の回復をもたらすか否かは不明であった。さらに、オオムギとコムギとは前述の通り同じイネ科の植物であるものの、異なった属に属している。オオムギ及びコムギの小穂の形態は互いに大きく異なっており、当然のことながらコムギには六条性や二条性といった穂の形態はなく、コムギは側列小穂も有していないため、コムギにおいて、不稔になる小花に稔性を持たせることができるＤＮＡ等の存在は明らかにされていなかった。したがって、コムギにおける収穫量を増やす方法、特に、多肥に依存せず、コムギの１小穂あたりの稔実する小花数を増やすことで着粒数を増やす方法は、未だ開発がなされていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−１５９４７９号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋｏｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、２００７年、１０４巻、１４２４〜１４２９ページ
【非特許文献２】Ｒａｍｓａｙ，Ｌ．ら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２０１１年、４３巻、１６９〜１７２ページ
【非特許文献３】Ｇｏｔｔｗａｌｄ，Ｓ．ら、ＢＭＣ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｏｔｅｓ、２００９年、２巻、２５８−２７２ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、コムギの１小穂あたりの稔実する小花数を増やし、ひいては着粒数を増やすことを可能とする方法並びに薬剤等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、従前（特許文献１及び非特許文献１）にオオムギＶｒｓ１遺伝子の発現を確認していた護頴原基期付近よりも更に発達が進んだオオムギの小花原基器官において、Ｖｒｓ１遺伝子及びＶＲＳ１タンパク質の発現を検出した。その結果、白葯期の側列小穂の小花、特に雌蕊にて、Ｖｒｓ１遺伝子及びＶＲＳ１タンパク質が強く発現することを見出した。また、二条性オオムギにおいて野生型Ｖｒｓ１遺伝子の発現をＲＮＡｉによって抑制することによって、二条穂において不稔であった側列小穂の稔性が回復し、着粒数を増加できることを明らかにした。【００１４】
しかしながら、上記はオオムギにおいて見出されたＶｒｓ１遺伝子の機能である。オオムギとコムギとは同じイネ科の植物であるものの互いに異なった属に属している。オオムギは、コムギ属に属するコムギ等の植物とは異なり、一つの小穂に一つの小花にしか着けないというユニークな特徴を有している。一方、コムギ等においては、一つの小穂に複数の小花がつく。【００１５】
故に、オオムギとコムギとはイネ科の植物であるものの、小穂の形態は大きく異なっており、当然のことながらコムギには六条性や二条性といった穂の形態はなく、コムギは側列小穂も有していないため、コムギにおいて、小花における不稔とＶｒｓ１遺伝子との関連性については全く想定されていなかった（Ｓａｋｕｍａ，Ｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２０１１年、５２巻、７３８〜７４９ページ）。【００１６】
本発明者らは、コムギＶｒｓ１遺伝子（ＴｍＶｒｓ１遺伝子、ＴａＶｒｓ１−Ａ遺伝子、ＴａＶｒｓ１−Ｂ遺伝子及びＴａＶｒｓ１−Ｄ遺伝子）を単離した。その結果、コムギＶｒｓ１遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列がオオムギＶＲＳ１のアミノ酸配列と高い相同性を有しており、オオムギＶＲＳ１が有するホメオドメイン（ＨＤ）モチーフ及びロイシンジッパー（ＬＺ）モチーフがコムギＶＲＳ１においてよく保存されていることから、コムギＶＲＳ１がオオムギＶＲＳ１と同様の生物学的機能を有することを見出した。【００１７】
また、コムギの小花分化時期における該遺伝子の発現をＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法にて解析した結果、該遺伝子が、通常退化して不稔となる予定である上位小花に特異的に発現すること、すなわち、コムギにおいてＶｒｓ１遺伝子が上位小花の雌蕊特異的に発現することによって、上位小花の発達が阻害され上位小花が不稔となることを見い出した。したがって、コムギＶｒｓ１遺伝子の機能を抑制することにより、本来発達が阻害されるはずの上位小花に着粒させることができる。以上の結果から、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の機能を人為的に抑制することによりコムギの着粒数を増加させる方法を含む本発明を完成するに至った。さらに、発明者らは、コムギＶｒｓ１遺伝子の機能をＲＮＡｉによって抑制することによって、コムギ１小穂あたりの小花数及び着粒数を増やすことができることを確認した。【００１８】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
＜１＞  内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の機能が人為的に抑制されており、コントロールコムギと比較して着粒数が増加したコムギ。
＜２＞  二重鎖ＲＮＡ法、アンチセンス法又はリボザイム法により、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の機能が人為的に抑制されている、＜１＞に記載のコムギ。
＜３＞  内在性コムギＶｒｓ１遺伝子に１又は複数の変異が導入されることにより、該遺伝子の機能が人為的に抑制されている、＜１＞に記載のコムギ。
＜４＞  ＜１＞〜＜３＞のいずれか一に記載のコムギの繁殖材料。
＜５＞  ＜１＞〜＜３＞のいずれか一に記載のコムギの種子に由来する加工品。
＜６＞  内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、コントロールコムギと比較して着粒数が増加したコムギの生産方法。
＜７＞  ＜６＞に記載の生産方法で生産されたコムギの子孫又はクローンであるコムギであって、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の機能が人為的に抑制されており、コントロールコムギと比較して着粒数が増加したコムギ。
＜８＞  下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されたベクターを有効成分として含む、コムギの着粒数を増加させるための薬剤
（ａ）コムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）コムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｃ）コムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、コムギの１小穂あたりの稔実する小花数を増やし、ひいては着粒数及び収量を増やすことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】コムギＶｒｓ１遺伝子（ＴａＶｒｓ１−Ａ遺伝子のゲノムＤＮＡ）の構造を示す概略図である。図中、「ＡＴＧ」及び「ＴＧＡ」は各々開始コドン及び終止コドンの位置を示す。また「標的配列」は、ＴａＶｒｓ１−Ａ遺伝子、ＴａＶｒｓ１−Ｂ遺伝子及びＴａＶｒｓ１−Ｄの発現を抑制するために好適な、ｓｉＲＮＡの標的配列の位置を示す。
【図２】コムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡを発現させるのに好適なベクター（ｐＡＮＤＡ−βベクター）の構造を示す概略図である。
【図３】コムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡが挿入されたベクターをコムギ細胞（標的植物細胞）に導入するために好適な、パーティクルガン法の条件を示す図である。
【図４】ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、オオムギ未熟穂におけるオオムギＶｒｓ１  ｍＲＮＡの局在を検出した結果を示す顕微鏡写真である。Ａは、二条穂オオムギ  Ｂｏｎｕｓ栽培品種の三マウンド期における横断面を観察した結果を示す。Ｂは、護頴原基期における横断面を観察した結果を示す。Ｃは、白葯期における横断面を観察した結果を示す。Ｄは、Ｃにおいて四角で囲んだ側列小穂の部位を高倍率にて観察した結果を示す。Ｅは、白葯期における縦切断面を観察した結果を示す。Ｆは、Ｅにおいて四角で囲んだ側列小穂の部位を高倍率にて観察した結果を示す。Ｇは、白葯期における横断面にセンスＲＮＡをハイブリダイズさせ、観察した結果（陰性対照）を示す。Ｈは、Ｖｒｓ１遺伝子が完全に欠損している六条穂変異体を白葯期にて観察した結果を示す。また、図中、「ｃｓ」は主列小穂、「ｌｓ」は側列小穂、「ｌｅ」は外花穎、「ｐａ」は内花穎、「ｓｔ」は雄蕊、「ｐｉ」は雌蕊、「ｒａ」は穂軸を示す。スケールバーは、Ａ、Ｂ及びＥにおいて２００μｍ、Ｃ、Ｇ及びＨは５００μｍ、Ｄ及びＦにおいて１００μｍを示す。なお、オオムギの穂は、三マウンド期（ｔｒｉｐｌｅ−ｍｏｕｎｄ  ｓｔａｇｅ）、護頴原基期（ｇｌｕｍｅ  ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ  ｓｔａｇｅ）、外頴原基期（ｌｅｍｍａ  ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ  ｓｔａｇｅ）、雄蕊原基期（ｓｔａｍｅｎ  ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ  ｓｔａｇｅ）、芒原基期（ａｗｎ  ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ  ｓｔａｇｅ）、白葯期（ｗｈｉｔｅ  ａｎｔｈｅｒ  ｓｔａｇｅ）、緑葯期（ｇｒｅｅｎ  ａｎｔｈｅｒ  ｓｔａｇｅ）、黄葯期（ｙｅｌｌｏｗ  ａｎｔｈｅｒ  ｓｔａｇｅ）、止葉期（ｆｌａｇ−ｌｅａｆ  ｓｔａｇｅ）の各発達段階を踏んで成熟する。
【図５】オオムギＶｒｓ１遺伝子及びＨｖＨｏｘ２遺伝子のゲノムＤＮＡの構造を示す概略図である。図中、「ＡＴＧ」及び「ＴＧＡ」は各々開始コドン及び終止コドンの位置を示す。また「ＩＳＨ」は各遺伝子をＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出するのに用いたプローブの位置を示し、特に「Ｖｒｓ１−ＩＳＨ」はＶｒｓ１遺伝子に特異的な配列であることを示す。また、「ＨＤ」及び「ＬＺ］はホメオドメインモチーフ及びロイシンジッパーモチーフを各々示す。さらに、始端及び終端は、各遺伝子の転写開始点及びポリアデニル化部位を各々示す。
【図６】ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、ｈｅｘ−ｖ．３変異体（Ｖｒｓ１遺伝子ノックアウト変異体）のオオムギ未熟穂におけるＨｖＨｏｘ２ｍＲＮＡの局在を検出した結果を示す顕微鏡写真である。Ｂ、Ｄ及びＦは、白葯期にある未熟穂に対して、アンチセンスプローブをハイブリダイズさせて観察した結果を示す。Ｄ及びＦにおいて四角で囲んだ領域を高倍率にて観察した結果を、各々Ｅ及びＧに示す。Ｃは、白葯期にある未熟穂に対して、センスプローブをハイブリダイズさせて観察した結果を示す。また、Ｂにおける三角は、ＨｖＨｏｘ２ｍＲＮＡのシグナルを示す。「ｐｖ」は前形成層細胞、「ｔｒ」は仮道管を示す。Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＦにおいてはスケールバーは５００μｍを示し、Ｅ及びＧにおいては５０μｍを示す。
【図７】抗オオムギＶＲＳ１抗体を用いた、オオムギ未熟穂の免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。Ａ〜Ｄは、芒原基期にある二条性オオムギ栽培品種Ｂｏｎｕｓの未熟穂を観察した結果を示す。Ｂは、Ａの四角で囲まれた側列小穂の部位を高倍率にて観察した結果を示す。Ｃは、抗ＶＲＳ１抗体とＤＡＰＩとによる共染色の結果を示す。Ｄは、抗体及びＤＡＰＩにより染色しなかった結果（陰性対照）を示す。Ｅは、芒原基期にあるｈｅｘ−ｖ．３六条穂変異体（Ｖｒｓ１遺伝子ノックアウト）の未熟穂を観察した結果を示す。Ｆは、白葯期にあるｈｅｘ−ｖ．３六条穂変異体を観察した結果を示す。Ｇは、抗ＶＲＳ１抗体により標識し、さらにＤＡＰＩにより染色した、芒原基期にあるｈｅｘ−ｖ．３六条穂変異体を観察した結果を示す。Ｈは、抗体及びＤＡＰＩにより染色しなかった結果（陰性対照）を示す。「ｃｓ」は主列小穂を示し、「ｌｓ」は側列小穂を示し、「ｒａ」は穂軸を示す。Ａ及びＤ〜Ｈにおけるスケールバーは１００μｍを示し、Ｂ及びＣにおけるスケールバーは５０μｍを示す。
【図８】オオムギＶｒｓ１遺伝子及びＨｖＨｏｘ２遺伝子の器官特異的発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにて分析した結果を示すグラフである。各器官は、止葉期にあり、また穂は緑葯期にあるＧｏｌｄｅｎ  Ｐｒｏｍｉｓｅの植物体から単離した。図に示す値は、生物学的に３回反復して得られた値から、平均値±標準誤差を算出した値である（１反復あたり、５０ｍｇＦ．Ｗ．（生体組織重量）のバルクを使用）。また、定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいては、恒常的に発現しているＨｖＡｃｔｉｎ遺伝子を対照遺伝子として用いた。なお、定量的ＲＴ−ＰＣＲによる分析の結果、側列小穂における、Ｖｒｓ１遺伝子の発現量の平均値と、ＨｖＨｏｘ２遺伝子の発現量の平均値との間に、５％確率水準レベルでの有意な差は認められなかった。
【図９】発達段階の穂（二条性オオムギ栽培品種Ｂｏｎｕｓ（Ｖｒｓ１．ｂ３アレル））における、オオムギＶｒｓ１遺伝子及びＨｖＨｏｘ２遺伝子の転写レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲにて分析した結果を示すグラフである。定量的ＲＴ−ＰＣＲによる分析において、恒常的に発現しているＨｖＡｃｔｉｎ遺伝子を用いて、ＲＮＡレベルを正規化した。グラフ横軸の数字は、分析した下記発達段階を各々示す。１：三マウンド期、２：護頴原基期、３：外頴原基期、４：雄蕊原基期、５：芒原基期、６：白葯期、７：緑葯期、８：黄葯期。図に示す値は、生物学的に３回反復して得られた値から、平均値±標準誤差を算出した値である（１反復あたり、５０ｍｇＦ．Ｗ．（生体組織重量）のバルクを使用）。「＊＊」及び「＊」は、１％確率水準レベルでの有意差及び５％確率水準レベルでの有意差があることを各々示し、「ｎ．ｓ．」は有意差がないことを示す。
【図１０】発達段階の穂（二条性オオムギ栽培品種ＫＮＧ（Ｖｒｓ１．ｂ３アレル））における、オオムギＶｒｓ１遺伝子及びＨｖＨｏｘ２遺伝子の転写レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲにて分析した結果を示すグラフである。なお、図中の表記等については図９と同様である。
【図１１】発達段階の穂（六条性オオムギ栽培品種ＡＺ（Ｖｒｓ１．ａ１アレル））における、オオムギＶｒｓ１遺伝子及びＨｖＨｏｘ２遺伝子の転写レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲにて分析した結果を示すグラフである。なお、図中の表記等については図９と同様である。
【図１２】発達段階の穂（六条性オオムギ栽培品種ＨＫ２（Ｖｒｓ１．ｃ１アレル））における、オオムギＶｒｓ１遺伝子及びＨｖＨｏｘ２遺伝子の転写レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲにて分析した結果を示すグラフである。なお、図中の表記等については図９と同様である。
【図１３】ＲＮＡｉによってオオムギＶｒｓ１遺伝子がノックダウンされているトランスジェニックオオムギを解析した結果を示す写真である。Ａ及びＣは、野生型栽培品種Ｇｏｌｄｅｎ  Ｐｒｏｍｉｓｅにおいては、側列小穂の発達が抑制されていることを示す。一方、Ｂ及びＤにおいては、Ｖｒｓ１遺伝子に対するＲＮＡｉトランスジェニック植物体（ＢＧ８７／１Ｅ１８、Ｔ１世代）においては、側列小穂は発達しており、着粒していることを示す。Ａ及びＢにおいては、スケールバーは１０ｍｍであることを示す。Ｃ及びＤにおいては、スケールバーは５ｍｍであることを示す。
【図１４】オオムギＶｒｓ１遺伝子の発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した結果を示すグラフである。すなわち、トランスジェニック植物体及び非トランスジェニック植物体（Ｔ１世代）の白葯期にある未熟穂を解析した結果を示す。図に示す値は、生物学的に３回反復して得られた値から、平均値±標準誤差を算出した値である（１反復あたり、５０ｍｇＦ．Ｗ．（生体組織重量）のバルクを使用）。野生型植物体（図中「ＧＰ」）と、Ｔ１世代から分離した非トランスジェニック植物体（図中「Ｎｏ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ」）とは、対照植物体として用いた。また図中、白棒はＲＮＡｉが導入されていない植物個体の結果を示し、黒棒はＲＮＡｉが導入されている植物個体の結果を示す。
【図１５】オオムギＶｒｓ１遺伝子の発現が抑制されたトランスジェニック株におけるＨｖＨｏｘ２遺伝子の発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲにて解析した結果を示すグラフである。ＣａＭＶ  ３５Ｓ  （ｐ３５Ｓ）プロモーター又はイネアクチン１（ｐＡｃｔｉｎ）  プロモーターにて発現が制御されているＶｒｓ１遺伝子特異的ＲＮＡｉを保持する、トランスジェニック植物体及び非トランスジェニック植物体（Ｔ１世代）の白葯期にある未熟穂を解析した結果を示すグラフである。図に示す値は、生物学的に３回反復して得られた値から、平均値±標準誤差を算出した値である（１反復あたり、５０ｍｇＦ．Ｗ．（生体組織重量）のバルクを使用）。
【図１６】Ｖｒｓ１及びＨｖＨｏｘ２遺伝子領域におけるオオムギとヒトツブコムギ間のマイクロ−共線性を示す概略図である。
【図１７】コムギＶｒｓ１遺伝子（ＴａＶｒｓ１−Ａ遺伝子、ＴａＶｒｓ１−Ｂ遺伝子及びＴａＶｒｓ１−Ｄ遺伝子）のコムギ染色体上の位置を決定するための、ＰＣＲ解析結果を示す写真である。図中「ＣＳ」はチャイニーズスプリング（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｓｐｒｉｎｇ）を解析した結果を示し、「Ｎ  Ｔ  」は、第２同祖群の染色体を有するＣＳのナリテトラソミック系統（ｎｕｌｌｉ−ｔｅｔｒａｓｏｍｉｃ  ｌｉｎｅ）を解析した結果を示し、「ＤＴ  」は第２同祖群の染色体を有するＣＳのダイテロソミック系統（ｄｉｔｅｌｏｓｏｍｉｃ  ｌｉｎｅ）を解析した結果を示す。「２Ａ」、「２Ｂ」及び「２Ｄ」は各系統が有している第２同祖群の染色体の種類を示す。また「Ｓ」又は「Ｌ」は、各系統において各々「短腕部」又は「長腕部」を有している系統であることを示す。
【図１８】コムギＶｒｓ１遺伝子（ＴａＶｒｓ１−Ａ遺伝子、ＴａＶｒｓ１−Ｂ遺伝子及びＴａＶｒｓ１−Ｄ遺伝子）のコムギ染色体上の位置を決定するための、ＰＣＲ解析結果を示す写真である。図中「ＣＳ」はチャイニーズスプリングを解析した結果を示し、「ＣＳ以外」は第２同祖群の染色体を有するＣＳの欠失系統（ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｌｉｎｅ）を解析した結果を示す。「２ＡＬ−０４」等は染色体番号（各第２同祖群の染色体上の位置）を表わし、各系統においてこの位置から染色体が欠失していることを示すものである。なお、各染色体番号が示す第２同祖群の染色体上の位置については図２０参照のこと。
【図１９】オオムギＶｒｓ１遺伝子及びコムギＶｒｓ１遺伝子から予測されるアミノ酸配列を近接結合法によって解析した結果を示す、系統樹である。図中、ＶＲＳ１及びＨｖＨＯＸ２がオオムギ由来の遺伝子であり、ＴｍＶＲＳ１、ＴａＶＲＳ１−Ａ、ＴａＶＲＳ１−Ｂ、ＴａＶＲＳ１−Ｄ及びＴｍＨＯＸ２がコムギ由来の遺伝子であり、Ｂｒａｄｉ１ｇ２３４６０は、近接結合法においてアウトグループとして使用した遺伝子である。また、この近接結合法において、１０００個の複製データを作製し、得られたローカルブートストラップ値を分岐点近くに示す。
【図２０】コムギＶｒｓ１遺伝子（ＴａＶｒｓ１−Ａ遺伝子、ＴａＶｒｓ１−Ｂ遺伝子及びＴａＶｒｓ１−Ｄ遺伝子）のコムギ染色体上の位置を示す、概略図である。
【図２１】コムギＶＲＳ１タンパク質（ＴｍＶＲＳ１タンパク質）及びＨＯＸ２タンパク質（ＴｍＨＯＸ２タンパク質）、オオムギＶＲＳ１タンパク質（ＶＲＳ１タンパク質）及びＨＯＸ２タンパク質（ＨｖＨＯＸ２タンパク質）等におけるモチーフを、比較ゲノムデータベース（ＳＡＬＡＤ：Ｓｕｒｖｅｙｅｄ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｍｏｔｉｆ  ＡＬｉｇｎｍｅｎｔ  ｄｉａｇｒａｍ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  Ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ）にて分析し、比較した結果を示す概略図である。
【図２２】コムギの穂の各発達段階における、ＴｍＶｒｓ１ｍＲＮＡ及びＴｍＨｏｘ２ｍＲＮＡを定量的ＲＴ−ＰＣＲにて分析した結果を示すグラフである。図中、グレーの棒は、ＴｍＶｒｓ１ｍＲＮＡ量（平均値±標準誤差）を示し、白の棒は、ＴｍＨｏｘ２ｍＲＮＡ量（平均値±標準誤差）を示す。なお、頂端小穂形成期及び白葯期においては、ＴｍＶｒｓ１ｍＲＮＡ及びＴｍＨｏｘ２ｍＲＮＡ間で有意差（Ｐ値：１％）が認められ、また小花分化期においても、ＴｍＶｒｓ１ｍＲＮＡ及びＴｍＨｏｘ２ｍＲＮＡ間で有意差（Ｐ値：５％）が認められたが、その他の発達段階においては有意差が認められなかった。
【図２３】ＴｍＶｒｓ１ｍＲＮＡのコムギ小穂における局在を、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって分析した結果を示す写真（図中、Ｂ及びＣ）である。なお、Ａはコムギ小穂の外観を示す。
【図２４】小花分化期におけるＴｍＶｒｓ１ｍＲＮＡの局在をＲＮＡｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって解析した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、左側はアンチセンスプローブをハイブリダイズさせて観察した結果を示し、右側はセンスプローブをハイブリダイズさせて観察した結果を示す。「１ｓｔ  ｆｌｏｒｅｔ」は第１小花を示し、「ＳＭ」は小穂分裂組織を示す。またスケールバーは２００μｍを示す。
【図２５】頂端小穂形成期におけるＴｍＶｒｓ１ｍＲＮＡの局在をＲＮＡｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって解析した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、左側はアンチセンスプローブをハイブリダイズさせて観察した結果を示し、右側はセンスプローブをハイブリダイズさせて観察した結果を示す。「１ｓｔ  ｆｌｏｒｅｔ」は第１小花を示し、「２ｎｄ  ｆｌｏｒｅｔ」は第２小花を示し、「ＳＭ」は小穂分裂組織を示す。またスケールバーは２００μｍを示す。
【図２６】白葯期におけるＴｍＶｒｓ１ｍＲＮＡの局在をＲＮＡｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって解析した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、左側はアンチセンスプローブをハイブリダイズさせて観察した結果を示し、右側はセンスプローブをハイブリダイズさせて観察した結果を示す。「ＲＡ」は小軸を示し、「ＳＭ」は小穂分裂組織を示す。またスケールバーは２００μｍを示す。
【図２７】野生型コムギ（ＷＴ）及びＴ０  ＴａＶｒｓ１−Ａ  ＲＮＡｉトランスジェニックコムギ（ＲＮＡｉ）を穂の形態において比較した結果を示す写真である。スケールバーは１ｃｍを示す。
【図２８】野生型コムギ（ＷＴ）及びＴ０  ＴａＶｒｓ１−Ａ  ＲＮＡｉトランスジェニックコムギ（ＲＮＡｉ）を小穂の形態において比較した結果を示す写真である。スケールバーは１ｃｍを示す。
【図２９】野生型コムギ（トランスジーン（−））及びＴ０  ＴａＶｒｓ１−Ａ  ＲＮＡｉトランスジェニックコムギ（トランスジーン（＋））における、１小穂あたりの小花数を示すグラフである。図中、各コムギ３穂ずつ解析して得られた値を平均値±標準偏差にて示してある。また、統計的比較はスチューデント検定により行い、アスタリスク２個（＊＊）はＰ＜０．０１であることを示し、「ｎｓ」は有意差が認められなかったことを示す。
【図３０】野生型コムギ（トランスジーン（−））及びＴ０  ＴａＶｒｓ１−Ａ  ＲＮＡｉトランスジェニックコムギ（トランスジーン（＋））における、１小穂あたりの着粒数を示すグラフである。図中、各コムギ３穂ずつ解析して得られた値を平均値±標準偏差にて示してある。また、統計的比較はスチューデント検定により行い、アスタリスク２個（＊＊）はＰ＜０．０１であることを示し、「ｎｓ」は有意差が認められなかったことを示す。
【図３１】オオムギＶＲＳ１及びコムギＶＲＳ１（ＴｍＶＲＳ１、ＴａＶＲＳ１−Ａ、ＴａＶＲＳ１−Ｂ及びＴａＶＲＳ１−Ｄ）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。図中の「Ｂｏｎｕｓ」はオオムギＶＲＳ１のアミノ酸配列を、「ＴｍＶＲＳ１」はＴｍＶＲＳ１のアミノ酸配列を、「ＴａＶＲＳ１Ａ」はＴａＶＲＳ１−Ａのアミノ酸配列を、「ＴａＶＲＳ１Ｂ」はＴａＶＲＳ１−Ｂのアミノ酸配列を、「ＴａＶＲＳ１Ｄ」はＴａＶＲＳ１−Ｄのアミノ酸配列をそれぞれ示す。アミノ酸配列の左右にある数字は末端のアミノ酸残基の残基番号を示す。図中の「Ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ」及び「Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ」はタンパク質中のＨＤドメインモチーフ及びＬＺドメインモチーフの領域を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
後述の通り、オオムギの小花原基器官において、オオムギＶｒｓ１遺伝子及びタンパク質は、二条性オオムギの退化して不稔となる側列小穂の小花器官の雌蕊で強く発現していることを見出し、ＶＲＳ１タンパク質は側列小穂の小花の雌蕊の発達を抑制し、ひいては小花の稔実を抑制していることを明らかにした。さらに、Ｖｒｓ１遺伝子の転写産物と相補的なｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを二条性オオムギに導入することにより、側列小穂の稔性を回復させ、１小穂あたり（植物１個体あたり）の着粒数を増加させることができることも明らかにした。
【００２２】
一方、側列小穂を有さないコムギにおいては、オオムギＶｒｓ１遺伝子と相同なコムギ遺伝子の存在は明らかでなかった（Ｓａｋｕｍａ，Ｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２０１１年、５２巻、７３８〜７４９ページ）。しかし、本発明者らがオオムギＶｒｓ１遺伝子の相同遺伝子（コムギ由来のＶｒｓ１遺伝子（ＴｍＶｒｓ１遺伝子、ＴａＶｒｓ１−Ａ遺伝子、ＴａＶｒｓ１−Ｂ遺伝子及びＴａＶｒｓ１−Ｄ遺伝子））を初めて単離し、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子が、小穂において通常退化して不稔となる上位小花に特異的に発現することを明らかにした。したがって、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の機能を抑制することにより、本来発達が阻害されるはずの上位小花に着粒させることができる。以上の結果から、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の機能を人為的に抑制することによりコムギの着粒数を増加させる方法を含む本発明を完成するに至った。さらに、コムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物と相補的なｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡをコムギに導入することによりコムギ１小穂あたりの小花数及び着粒数が増加することを示した。
【００２３】
＜着粒数が増加したコムギ、及びその作出方法＞
したがって、本発明は、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の機能が人為的に抑制されており、コントロールコムギと比較して着粒数が増加したコムギ、及びコムギにおいて内在性Ｖｒｓ１遺伝子の機能を人為的に抑制する工程を含む、着粒数が増加したコムギの生産方法を提供する。
【００２４】
本発明において、「コムギ」とは、イネ科コムギ属に属する植物を意味する。「着粒数」とは、種子（いわゆる「穀粒」、「小麦粒」）の数のみならず、稔実することのできる小花の数も含む。「コントロールコムギ」とは、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の機能が人為的に抑制されていないコムギ（例えば、野生型コムギ）を意味する。また、本発明において、「コントロールコムギと比較して着粒数が増加した」とは、コントロールコムギと比較して、１小穂あたりの着粒数が増加していることを意味する。
【００２５】
また、「コムギＶｒｓ１遺伝子」は、２倍体コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ等）において、典型的には配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、かかるＤＮＡを「ＴｍＶｒｓ１遺伝子」とも称する）である。６倍体コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ等）において、典型的には、配列番号：５８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：５６に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、かかるＤＮＡを「ＴａＶｒｓ１−Ａ遺伝子」とも称する）、配列番号：６１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：５９に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、かかるＤＮＡを「ＴａＶｒｓ１−Ｂ遺伝子」とも称する）及び配列番号：６４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：６２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、かかるＤＮＡを「ＴａＶｒｓ１−Ｄ遺伝子」とも称する）である。また、これらの遺伝子の２つ以上を総称して「コムギＶｒｓ１遺伝子」と呼ぶ場合がある。
【００２６】
「コムギＶＲＳ１」又は「コムギＶＲＳ１タンパク質」は、上記コムギＶｒｓ１遺伝子のいずれかによりコードされているタンパク質である。それらタンパク質のアミノ酸配列は、典型的には、配列番号：３、配列番号：５８、配列番号：６１又は配列番号：６４に記載のアミノ酸配列である。また、これらタンパク質の２つ以上を総称して「コムギＶＲＳ１」又は「コムギＶＲＳ１タンパク質」と称する場合がある。さらに、ＴｍＶｒｓ１遺伝子、ＴａＶｒｓ１−Ａ遺伝子、ＴａＶｒｓ１―Ｂ遺伝子及びＴａＶｒｓ１−Ｄ遺伝子によってコードされるタンパク質をそれぞれ「ＴｍＶＲＳ１」、「ＴａＶＲＳ１−Ａ」、「ＴａＶＲＳ１−Ｂ」及び「ＴａＶＲＳ１−Ｄ」と称する場合がある。
【００２７】
なお、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡは、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍの実験系統ＫＴ−３−５より、配列番号：５８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号：６１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ及び配列番号：６４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡは、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ（品種名：Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｓｐｒｉｎｇ）より、本発明において初めて単離され、配列が決定されたものである。
【００２８】
また、自然界において塩基配列が変異することは起こり得ることであることから、本発明においてコムギＶｒｓ１遺伝子には、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号：５８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号：６１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ及び配列番号：６４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡのみならず、これらのタンパク質と同等の活性を有するコムギＶＲＳ１タンパク質をコードするアレル変異体も含まれる。配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ等と、そのアレル変異体との相同性は、アミノ酸配列レベルにて通常９５％以上であり、転写因子としての機能が保持されているという観点から、好ましくは９７％以上であり、より好ましくは９９％以上である。
【００２９】
配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）、ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチドレベル）、ＢＬＡＳＴＸ等のプログラムを利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４−２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＰ等によってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【００３０】
また、「内在性コムギＶｒｓ１遺伝子」とは、コムギ細胞のゲノム内にすでに存在しているコムギＶｒｓ１遺伝子のことをいう。
【００３１】
本発明の「内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の機能の人為的抑制」には、該機能の完全な抑制（阻害）及び部分的な抑制の双方が含まれる。また、内在性Ｖｒｓ１遺伝子の発現の人為的抑制の他、内在性Ｖｒｓ１遺伝子がコードするタンパク質の活性の人為的抑制が含まれる。かかる活性としては、ＨＯＸ２タンパク質による上位小花の発達を担う下流遺伝子の転写活性化能を抑制する活性が挙げられる（ＶＲＳ１タンパク質と、ＨＯＸ２タンパク質との関係については、後述の実施例を参照のこと）。
【００３２】
本発明のコムギにおける内在性Ｖｒｓ１遺伝子の機能を人為的に抑制するための方法の一態様としては、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ）をコードするＤＮＡを用いる方法が挙げられる（本発明において、この方法を「二重鎖ＲＮＡ法」と略称する）。標的遺伝子配列と同一又は類似した配列を有するｄｓＲＮＡを細胞内に導入することにより、導入した外来遺伝子及び標的内因性遺伝子の発現がいずれも抑制される、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）と呼ばれる現象を引き起こすことができる。細胞に約４０〜数百塩基対のｄｓＲＮＡが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅIII様のヌクレアーゼが、ＡＴＰ存在下で、ｄｓＲＮＡを３’末端から約２１〜２３塩基対ずつ切り出し、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）が生じる。このｓｉＲＮＡに、特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体はｓｉＲＮＡと同じ配列を認識して結合し、ＲＮａｓｅIII様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部で標的遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）を切断する。また、この経路とは別にｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｓＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成される。このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となって、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅する経路も考えられている。
【００３３】
本発明のｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的遺伝子、すなわちコムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）のいずれかの領域に対するアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスＤＮＡと、該ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードしたセンスＤＮＡを含み、該アンチセンスＤＮＡ及び該センスＤＮＡより、それぞれアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡを発現させることができる。また、これらのアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡよりｄｓＲＮＡを作製することができる。
【００３４】
本発明のｄｓＲＮＡの発現システムをベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡを発現させる場合がある。同一のベクターからアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスＤＮＡ及びセンスＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌIII系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットとセンスＲＮＡ発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入する構成である。
【００３５】
また、異なる鎖上に対向するように、アンチセンスＤＮＡとセンスＤＮＡとを逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスＲＮＡコード鎖とセンスＲＮＡコード鎖とが対となった一つの二本鎖ＤＮＡ（ｓｉＲＮＡコードＤＮＡ）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとを発現し得るようにプロモーターを対向して備える。この場合には、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスＲＮＡコード鎖、センスＲＮＡコード鎖）の３'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、Ａ（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモーターの種類は異なっていることが好ましい。
【００３６】
また、異なるベクターからアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスＤＮＡ及びセンスＤＮＡの上流にそれぞれプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットとセンスＲＮＡ発現カセットとをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させる構成である。また、これら異なるベクターにおいては、プロモーターの種類は同一であっても異なっていてもよい。
【００３７】
本発明に用いるｄｓＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡであってもよい。「ｓｉＲＮＡ」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡを意味する。
【００３８】
標的遺伝子の発現を抑制することができ、かつ、毒性を示さなければ、その鎖長に特に制限はない。ｄｓＲＮＡの鎖長は、例えば、１５〜４９塩基対であり、好適には１５〜３５塩基対であり、さらに好適には２１〜３０塩基対である。より好適には、２１〜２３塩基対である。
【００３９】
本発明のｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、標的配列のインバーテッドリピートの間に適当な配列（イントロン配列が望ましい）を挿入し、ヘアピン構造を持つダブルストランドＲＮＡ（ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ'ｈａｉｒｐｉｎ'  ＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ））を作るようなコンストラクト（Ｓｍｉｔｈ，Ｎ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４０７：３１９，２０００、Ｗｅｓｌｅｙ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２７：５８１，２００１、Ｐｉｃｃｉｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：Ｅ５５，２００１）を用いることもできる。
【００４０】
本発明のｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的遺伝子の塩基配列と完全に同一である必要はないが、標的遺伝子の全長又はその一部（通常１００塩基以上からなる領域、好ましくは２００塩基以上からなる領域、より好ましくは３００塩基以上からなる領域）の塩基配列に対して、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は上述した手法（ＢＬＡＳＴプログラム）により決定できる。
【００４１】
ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合した二重鎖ＲＮＡの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中に、バルジ及びミスマッチの両方が含まれていてもよい。
【００４２】
本発明のコムギにおけるＶｒｓ１遺伝子の機能を人為的に抑制するための方法の他の態様として、コムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ（アンチセンスＤＮＡ）を用いる方法が挙げられる（本発明においてこの方法を「アンチセンス法」と略称する）。アンチセンスＤＮＡが標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、及び核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等が挙げられる。これらは、転写、スプライシング、又は翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する（平島及び井上「新生化学実験講座２  核酸IV  遺伝子の複製と発現」、日本生化学会編，東京化学同人、ｐｐ．３１９−３４７、１９９３）。本発明で用いられるアンチセンスＤＮＡは、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、標的遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域又は３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明で利用されるアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。
【００４３】
アンチセンスＤＮＡは、コムギＶｒｓ１遺伝子（例えば、配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：５６に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：５７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：５９に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：６０に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：６２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：６３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）の配列情報を基にホスホロチオエート法（Ｓｔｅｉｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：３２０９−３２２１，１９８８）等により調製することが可能である。調製されたＤＮＡは、後述する公知の方法で、植物へ導入できる。アンチセンスＤＮＡの配列は、コムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の相補性を有する。効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスＤＮＡの長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
【００４４】
本発明のコムギにおけるＶｒｓ１遺伝子の機能を人為的に抑制するための方法の他の態様として、コムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ用いる方法が挙げられる（本発明においてこの方法を「リボザイム法」と略称する）。リボザイムには、グループIイントロン型や、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠及び大塚栄子、蛋白質核酸酵素，３５：２１９１，１９９０）。
【００４５】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５のＣ１５の３’側を切断するが、活性にはＵ１４が９位のＡと塩基対を形成することが重要とされ、１５位の塩基はＣの他にＡ又はＵでも切断されることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ．ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２８：２２５，１９８８）。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的になるように設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵ又はＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することが可能である（Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ．ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３９：２８５，１９８８、小泉誠及び大塚栄子，蛋白質核酸酵素，３５：２１９１，１９９０、Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７０５９，１９８９）。
【００４６】
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：３４９，１９８６）。このリボザイムも、標的特異的なＲＮＡ切断を起こすように設計できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｓａｓａｋｉ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：６７５１，１９９２、菊池洋，化学と生物  ３０：１１２，１９９２）。標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、コムギ細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター等のプロモーター及び転写終結配列に連結される。このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる（Ｙｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８６：１２７１，１９９２）。このようなリボザイムを用いて標的となるコムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる。
【００４７】
以上、本発明にかかる、二重鎖ＲＮＡ法、アンチセンス法及びリボザイム法について説明したが、本発明のコムギにおけるＶｒｓ１遺伝子の機能を人為的に抑制するための方法は上記Ｖｒｓ１遺伝子の転写産物を標的とする方法等に限定されるものではない。本発明のコムギにおけるＶｒｓ１遺伝子の機能を人為的に抑制するための方法の他の態様としては、該遺伝子のコード領域、非コード領域、転写制御領域（プロモーター領域）等に変異を導入する方法が挙げられる。
【００４８】
本発明において、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子に導入される変異としては、該遺伝子の機能を抑制する限り特に制限はないが、例えば、ナンセンス変異、フレームシフト変異、挿入変異またはスプライス部位変異等のヌル変異が好ましい。また、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子のいずれか１つに導入される変異の個数としても、該遺伝子の機能を抑制する限り特に制限はなく、１個でもよく、また複数個（例えば、２個、３個以下、５個以下、１０個以下）でもよい。
【００４９】
コムギＶｒｓ１遺伝子によってコードされるコムギＶＲＳ１タンパク質の活性は、活性が抑制されたオオムギＶＲＳ１をコードするＶｒｓ１遺伝子を有する多くの六条性オオムギ系統におけるＶｒｓ１遺伝子内の変異に関する知見をガイダンスとして、コムギゲノム上の内在性コムギＶｒｓ１遺伝子領域内、好ましくはコムギＶＲＳ１をコードする領域内に変異を導入することによって人為的に抑制することができる。
【００５０】
後に、実施例４等において述べるように、オオムギＶＲＳ１の活性は、小花原基の発達に必須な転写調節因子であるＨＯＸ２タンパク質による下流遺伝子の転写活性化を競争的に阻害する活性である。このＶＲＳ１による競争的阻害の結果、ＶＲＳ１が発現する側列小穂の小花原基は稔性を有する小花に分化することができない。
【００５１】
オオムギＶＲＳ１の活性が抑制され、その結果六条性となった数多くのオオムギ系統における内在性Ｖｒｓ１遺伝子内の変異の例が数多く報告されている（非特許文献１及び３）。
【００５２】
非特許文献１には、多くの六条性オオムギ系統が有する内在性オオムギＶｒｓ１遺伝子における変異を解析した結果、ＶＲＳ１タンパク質をコードする領域内における塩基置換に起因してＶＲＳ１タンパク質の活性が抑制された例のみならず、ＶＲＳ１タンパク質をコードする領域周辺のイントロン配列内の変異に起因してＶＲＳ１タンパク質の機能が抑制された例も開示されている。また、非特許文献３には、エチルメタンスルフォネートを用いて突然変異を誘導されたオオムギ集団からそれらが有する内在性Ｖｒｓ１遺伝子内に変異を有する系統をＴＩＬＬＩＮＧ法を用いて選抜した結果、六条性を示す系統が２つ（８４０８−１及び１１９１０−１）得られたこと、並びに８４０８−１系統のＶｒｓ１遺伝子内においては、ＶＲＳ１タンパク質の９５番目のアミノ酸をロイシンからグルタミンに変える塩基置換が見出され、１１９１０−１系統においては、Ｖｒｓ１遺伝子転写産物の正常なスプライシングを阻害する塩基置換が見出されたことが開示されている。
【００５３】
本発明において、コムギＶｒｓ１遺伝子がオオムギＶｒｓ１と同様の生物学的機能を有することが見出された。また、コムギＶＲＳ１タンパク質（ＴｍＶＲＳ１、ＴａＶＲＳ１−Ａ、ＴａＶＲＳ１−Ｂ、ＴａＶＲＳ１−Ｄ）のアミノ酸配列はオオムギＶＲＳ１タンパク質とタンパク質全体で約８６％の高い相同性を有する（図３１  参照）。特に、ＶＲＳ１タンパク質の機能にとって必須と考えられるＨＤドメインモチーフ及びＬＺモチーフは、コムギＶＲＳ１タンパク質にも保存されており、オオムギＶＲＳ１とそれぞれのコムギＶＲＳ１（ＴｍＶＲＳ１、ＴａＶＲＳ１−Ａ、ＴａＶＲＳ１−Ｂ及びＴａＶＲＳ１−Ｄ）は、ＨＤモチーフ内において約９３％の高いアミノ酸配列の相同性を示す。
【００５４】
したがって、六条性オオムギにおけるオオムギＶｒｓ１遺伝子内の変異に関する知見は、コムギＶｒｓ１遺伝子に変異を導入することにより、機能が抑制された内在性コムギＶｒｓ１遺伝子を有するコムギを作製するためのガイダンスとなるものである。
【００５５】
非特許文献１に、六条性オオムギ系統において、内在性オオムギＶｒｓ１遺伝子における変異の結果、当該遺伝子によってコードされるＶＲＳ１のＨＤドメインモチーフ内の１アミノ酸残基が置換されている例、及び、ＨＤドメインモチーフをコードするゲノム塩基配列内にナンセンス変異が存在する例が数多く報告されている。また、非特許文献３には、ＨＤドメインモチーフ内のアミノ酸残基である９５番目のロイシンがグルタミンに置換されたＶＲＳ１を有する六条性オオムギが開示されている。これらの知見は、オオムギＶＲＳ１の機能にとってＨＤドメインモチーフ内のアミノ酸配列が不変であること又はほぼ不変であることが必須であることを示している。
【００５６】
オオムギＶＲＳ１とコムギＶＲＳ１とのアミノ酸配列における高い相同性、及びそれらタンパク質の生物学的役割における近似性に基づき、コムギＶＲＳ１の場合にもそのＨＤドメインモチーフ内のアミノ酸配列が不変であること又はほぼ不変であることがその活性にとって必須であると高い蓋然性をもって推測することができる。
【００５７】
したがって、機能を抑制された内在性コムギＶｒｓ１遺伝子を得るためには、当該遺伝子がコードするＶＲＳ１タンパク質のＨＤドメインモチーフ内のアミノ酸配列の全部又は一部が失われるか変化するように当該遺伝子内に変異を導入することが好ましい。具体的には、コムギＶＲＳ１のＨＤドメインモチーフ内のアミノ酸配列（ＴｍＶＲＳ１については、配列番号：３に記載のアミノ酸配列の５４番目から１１３番目のアミノ酸、ＴａＶＲＳ１―Ａについては、配列番号：５８に記載のアミノ酸配列の５４番目から１１３番目のアミノ酸、ＴａＶＲＳ１―Ｂについては、配列番号：６１に記載のアミノ酸配列の５４番目から１１３番目のアミノ酸、ＴａＶＲＳ１―Ｄについては、配列番号：６４に記載のアミノ酸配列の５４番目から１１３番目のアミノ酸）にアミノ酸置換を生じさせる変異を導入することが好ましい。非特許文献３には、ＶＲＳ１タンパク質の９５番目のアミノ酸をロイシンからグルタミンに変える塩基置換を有するＶｒｓ１遺伝子を有する六条性オオムギ系統（８４０８−１系統）に加えて、ＶＲＳ１タンパク質の７５番目のアミノ酸残基をフェニルアラニンからイソロイシンに変える塩基置換を有するＶｒｓ１遺伝子を有する六条性オオムギ系統、ＶＲＳ１タンパク質の８９番目のアミノ酸残基をロイシンからグルタミンに変える塩基置換を有するＶｒｓ１遺伝子を有する六条性オオムギ系統、ＶＲＳ１タンパク質の９０番目のアミノ酸残基をアラニンからバリンに変える塩基置換を有するＶｒｓ１遺伝子を有する六条性オオムギ系統、ＶＲＳ１タンパク質の９３番目のアミノ酸残基をロイシンからヒスチジンに変える塩基置換を有するＶｒｓ１遺伝子を有する六条性オオムギ系統、ＶＲＳ１タンパク質の１０３番目のアミノ酸残基をトリプトファンからアルギニンに変える塩基置換を有するＶｒｓ１遺伝子を有する六条性オオムギ系統、及び、ＶＲＳ１タンパク質の１０７番目のアミノ酸残基をアルギニンからロイシンに代える塩基置換を有するＶｒｓ１遺伝子を有する六条性オオムギ系統が開示されている。これらの例は、これらの例において見出されたアミノ酸置換によってオオムギＶＲＳ１の活性が抑制されることを示している。これらの六条性オオムギ系統においてアミノ酸置換が認められたアミノ酸残基のすべてはコムギＶＲＳ１のアミノ酸配列において保存されている。したがって、機能を抑制された内在性コムギＶｒｓ１遺伝子を得るためには、六条性オオムギ系統においてアミノ酸置換が認められた上記アミノ酸残基に対応する位置のアミノ酸残基の置換がコムギＶＲＳ１のアミノ酸配列において生じるような塩基置換を内在性コムギＶｒｓ１遺伝子内に導入することがより好ましい。しかし、六条性オオムギ系統の中には、オオムギＶＲＳ１のＨＤドメインモチーフ以外の部分にアミノ酸置換が導入されたＶＲＳ１を有する系統も見出されている（非特許文献１）。従って、コムギＶＲＳ１のＨＤドメインモチーフ以外の部分にアミノ酸残基の置換を有するＶＲＳ１をコードするように内在性コムギＶｒｓ１遺伝子を改変することによっても内在性コムギＶｒｓ１の機能が抑制されたコムギを作製することが可能である。
【００５８】
または、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子内の、コムギＶＲＳ１のＨＤドメインモチーフ内のアミノ酸配列及びその配列よりアミノ末端側のアミノ酸配列をコードする塩基配列中に、ナンセンス変異又はフレームシフト変異を導入することがより好ましい。それにより当該遺伝子がコードするコムギＶＲＳ１からそのＨＤドメインモチーフの全部又は一部が失われるからである。また、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子において、タンパク質をコードする領域は第１エキソン内から始まり第３エキソン内で終わることから、当該遺伝子の転写産物から第１イントロン配列又は第２イントロン配列が正常にスプライスされない場合には活性を有するＶＲＳ１タンパク質が生産されない。したがって、機能を抑制された内在性Ｖｒｓ１遺伝子を得るためには、これらイントロン配列のドナーサイト配列（ＧＡ）又はアクセプター配列（ＡＧ）に変異を導入することがより好ましい。さらに、ドナーサイト配列及びアクセプターサイト配列以外にも、正常なスプライシングが起こるために必須なイントロン中の配列が存在することが当業者に知られていることから、上記第１及び第２イントロン中の上記正常なスプライシングが起こるために必須な配列を変化させるような変異を導入することもより好ましい。これらの変異を導入することによりコムギＶｒｓ１遺伝子のヌル変異体を作製することができる。
【００５９】
植物に速中性子線やガンマー線等を照射した場合には、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子全体を含む程度の長さ又はそれ以上の長さの欠失が起こることが知られている。内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の機能を抑制された又は喪失したコムギを得るためには内在性コムギＶｒｓ１遺伝子全体又はその大部分を欠失したコムギを作製し又は選抜することがより好ましい。このような変異を導入することによりコムギＶｒｓ１遺伝子のヌル変異体を作製することができる。
【００６０】
内在性コムギＶｒｓ１遺伝子への変異の導入は、化学的変異剤を用いる方法、物理的変異導入法、トランスポゾン等をゲノムＤＮＡに導入する方法、ジンクフィンガーヌクレアーゼやＴＡＬＥＮ等のＤＮＡ二重鎖切断酵素を用いる方法によって行うことができるが、これらに限定はされない。
【００６１】
化学的変異剤を用いる方法としては、例えば、化学変異剤によって種子等を処理する方法（Ｚｗａｒ及びＣｈａｎｄｌｅｒ、Ｐｌａｎｔａ、１９９５年、１９７巻、３９〜４８ページ等  参照）が挙げられる。化学変異剤としては特に制限はないが、エチルメタンスルホート（ＥＭＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＮＮＵ）、アジ化ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ヒドリキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、蟻酸及びヌクレオチド類似体が挙げられる。
【００６２】
物理的変異導入法としては、例えば、速中性子線照射、ガンマ線照射、重イオンビーム（ＨＩＢ）照射、紫外線照射が挙げられる（Ｈａｙａｓｈｉら、Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２００７年、第１８回国際会議、２３７〜２３９ページ、及び、Ｋａｚａｍａら、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００８年、２５巻、１１３〜１１７ページ参照のこと）。
【００６３】
トランスポゾン等をゲノムＤＮＡに導入する方法としては、例えば、ＴＯＳ１７等のトランスポゾン、Ｔ−ＤＮＡ等をコムギのゲノムＤＮＡに挿入する方法が挙げられる（Ｋｕｍａｒら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．、２００１年、６巻、３号、１２７〜１３４ページ、及び、Ｔａｍａｒａら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、４巻、３号、９０〜９６ページ  参照）。
【００６４】
ＤＮＡ二重鎖切断酵素を用いる方法とは、内因性の修復機序を刺激する、ＤＮＡ二本鎖切断酵素を利用する方法のことであり、例えば、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ（登録商標、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、トランスポザーゼ、部位特異的リコンビナーゼが挙げられる。ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術については、Ｌｅ  Ｐｒｏｖｏｓｔら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００９年、２８巻、３号。１３４〜１４１ページ、Ｄｕｒａｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５年、３３巻、１８号、５９７８〜５９９０ページ、及び、Ｌｉｕら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１０年、１０６巻、９７〜１０５ページ  参照のこと。また、ＴＡＬＥＮに関する技術は、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１１年、２９巻、２号、１４３〜１４８ページ、米国特許第８４４０４３１号明細書、米国特許第８４４０４３２号明細書、及び、米国特許第８４５０４７１号明細書  参照のこと。
【００６５】
特に、ＺＦＮやＴＡＬＥＮを用いてコムギゲノムＤＮＡに変異を導入する場合、それらのＤＮＡ二本鎖切断酵素によってゲノムＤＮＡが二重鎖切断を受けるゲノム塩基配列上の位置を適宜選択できることは当業者に知られている。また、これらＤＮＡ二本鎖切断酵素によってゲノムＤＮＡが二本鎖切断を受けた後にゲノムＤＮＡの再結合が生じるが、その際一定の確率で切断が起こった位置に塩基置換や１塩基から数十塩基の長さの塩基の欠失又は挿入が起こることも当業者に知られている。
【００６６】
したがって、例えば、前述のコムギＶＲＳ１のＨＤドメインモチーフ内のアミノ酸配列をコードするゲノム塩基配列中にＤＮＡ二本鎖切断を生じさせるように設計されたＤＮＡ二本鎖切断酵素をコムギ細胞に導入することによって、ＨＤドメインモチーフ内のアミノ酸配列が置換されたコムギＶＲＳ１変異体をコードするコムギＶｒｓ１遺伝子を有するコムギを作製することができる。また、コムギＶＲＳ１のＨＤドメインモチーフ内のアミノ酸配列及びその配列よりアミノ末端側のアミノ酸配列をコードするゲノム塩基配列中にＤＮＡ二本鎖切断を生じさせるように設計されたＤＮＡ二本鎖切断酵素をコムギ細胞に導入することによって、当該領域内にナンセンス変異又はフレームシフト変異を有するＶｒｓ１遺伝子を持ったコムギ細胞を作製することができる。さらに、当該コムギ細胞を再生することにより、Ｖｒｓ１遺伝子の機能が抑制されたコムギを作製することができる。また、このように作製された変異Ｖｒｓ１遺伝子はヌル変異体である。  以上の方法により変異が導入されたコムギについては、公知の方法により、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子に変異が導入されていることを確認することができる。かかる公知の方法としては、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ＰＣＲ法、ＤＮＡシークエンス法、マイクロアレイによる解析法が挙げられる。かかる方法によれば、Ｖｒｓ１遺伝子に変異が導入されているか否かを、変異導入前後の当該遺伝子の長さ又は配列を比較することによって判断することができる。また、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、マイクロアレイによる解析法等を利用することにより、転写制御領域等に変異が導入されたコムギにおいて、Ｖｒｓ１遺伝子の転写産物又は翻訳産物の発現量の低下が認められれば、該コムギはＶｒｓ１遺伝子に変異が導入されたコムギであると確認することもできる。また、Ｖｒｓ１遺伝子に変異が導入されていることを確認する他の方法として、ＴＩＬＬＩＮＧ（標的誘導型ゲノム特定位傷害、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）が挙げられる（Ｓｌａｄｅら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．、２００５年、１４巻、１０９〜１１５ページ、及び、Ｃｏｍａｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、２００４年、３７巻、７７８〜７８６ページ  参照）。
【００６７】
特に、前述の化学的変異剤や速中性子線等を用いてコムギゲノム中に非選択的変異を導入した場合には、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子ＤＮＡ又はその一部をＰＣＲで増幅した後に、該ＤＮＡ内に変異を有する個体を、前記ＴＩＬＬＩＮＧ等により選抜することができる。この場合にも、Ｖｒｓ１遺伝子のヌル変異体を有するコムギを得ることができる。さらに、このような方法により得られたコムギも内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の機能が抑制されたコムギに含まれる。
【００６８】
また、上述の方法により変異が導入されたコムギと野生型のコムギとを交配させ、戻し交配を行うことにより、Ｖｒｓ1遺伝子以外の遺伝子に導入された変異を除去することもできる。
【００６９】
本発明において、内在性コムギＶｒｓ１遺伝子機能の人為的な抑制は、上述の方法等に応じ、種々のコムギ植物体、コムギ種子又はコムギ細胞に対して行うことができる。コムギ細胞には、コムギ由来の培養細胞の他、コムギ植物体中の細胞も含まれる。さらに、種々の形態のコムギ由来の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、未熟胚、花粉等が含まれる。
【００７０】
また、上述の方法等により内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の機能が人為的に抑制されたコムギ細胞から植物体を再生することにより、着粒数が増加したコムギを得ることができる。かかる植物体の再生方法としては、例えば、「小川泰一、日本農薬学会誌、２０１０年、３５巻、２号、１６０〜１６４ページ」に記載の方法を挙げることができる。
【００７１】
内在性コムギＶｒｓ１遺伝子のいずれかに変異を導入することにより内在性コムギＶｒｓ１遺伝子の機能が抑制されたコムギが、当該変異が導入されたＶｒｓ１遺伝子のヘテロ接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）である場合がある。そのような場合、例えば、当該ヘテロ接合体コムギとコントロールコムギとを交配して得られるＦ１植物体同士を交配してＦ２植物体を得ることにより、当該Ｆ２植物体から当該変異が導入されたＶｒｓ１遺伝子を有するホモ接合体（ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ）を選抜することができる。内在性コムギＶｒｓ１遺伝子内の変異によるＶｒｓ１遺伝子の機能の抑制の効果がより安定的に維持されるためには、コムギが当該変異が導入されたＶｒｓ１遺伝子を有するホモ接合体であることが好ましい。この場合、「当該変異が導入されたＶｒｓ１遺伝子を有するホモ接合体であるコムギ」には、互いに同一である変異を有するＶｒｓ１対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）を２つ有するコムギだけでなく、第１の変異を有し活性が抑制されたＶＲＳ１タンパク質をコードする第１のＶｒｓ１対立遺伝子と、第２の変異を有し活性が抑制されたＶＲＳ１タンパク質をコードする第２のＶｒｓ１対立遺伝子とを有するコムギが含まれる。
【００７２】
また、６倍体コムギの場合、ＴａＶｒｓ１−Ａ遺伝子に変異を有するコムギであってＶｒｓ１遺伝子の機能が抑制されたコムギ、ＴａＶｒｓ１−Ｂ遺伝子に変異を有するコムギであってＶｒｓ１遺伝子の機能が抑制されたコムギ、若しくはＴａＶｒｓ１−Ｂ遺伝子に変異を有するコムギであってＶｒｓ１遺伝子の機能が抑制されたコムギ、又は、ＴａＶｒｓ１−Ａ遺伝子、ＴａＶｒｓ１−Ｂ遺伝子及びＴａＶｒｓ１−Ｄ遺伝子のうちの２つ以上において変異を有するコムギであってＶｒｓ１遺伝子の機能が抑制されたコムギを作製することができる。内在性コムギＶｒｓ１遺伝子内の変異によるＶｒｓ１遺伝子の機能の抑制の効果がより安定的に維持されるためには、上記遺伝子のうちの２つの遺伝子において変異を有するコムギを作製することがより好ましい。また、上記遺伝子すべてにおいて変異を有するコムギを作製することがさらにより好ましい。
【００７３】
また、本発明において、上述の、二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、リボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ、トランスポゾンをコードするＤＮＡ、ＤＮＡ二本鎖切断酵素をコードするＤＮＡ等を、ベクターに挿入した形態にてコムギ細胞に導入してもよい。Ｖｒｓ１遺伝子の機能を人為的に抑制するための前記ＤＮＡが挿入されるベクターとしては、コムギ細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はないが、前記ＤＮＡを恒常的又は誘導的に発現させるためのプロモーターを含有しうる。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーター等が挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布等の外因によって発現することが知られているプロモーター等が挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーターやタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター、低温によって誘導されるイネのｌｉｐ１９遺伝子のプロモーター、高温によって誘導されるイネのｈｓｐ８０遺伝子とｈｓｐ７２遺伝子のプロモーター、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター等が挙げられる。また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸等の特定の化合物によって、ｒａｂ１６は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。さらに、本発明にかかるＤＮＡとしてｓｉＲＮＡ等の短いＲＮＡをコードするＤＮＡを発現させるためのプロモーターとしては、ｐｏｌIII系のプロモーターが好適に用いられる。
【００７４】
コムギ細胞へ前記ＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されたベクター等を導入する方法としては、例えば、パーティクルガン法、アグロバクテリウムを介する方法（アグロバクテリウム法）、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）等当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
【００７５】
また、上述の方法等により、一旦、Ｖｒｓ１遺伝子の機能が人為的に抑制されているコムギの植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。さらに、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。したがって本発明には、前記着粒数が増加したコムギの子孫及びクローン、並びに、それらの繁殖材料が含まれる。さらに、本発明には、前記コムギの種子由来の加工品が含まれる。かかる加工品には、本発明のコムギの種子を原料として製造された、コムギ粉、スターチ、パン、うどん及びスパゲッティが含まれるが、それらに限定されない。
【００７６】
＜コムギの着粒数を増加させるための薬剤＞
前述の通り、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されたベクターは、コムギの着粒数を増加させるために好適に用いられる。
（ａ）コムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）コムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｃ）コムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【００７７】
したがって、本発明は、前記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されたベクターを有効成分として含む、コムギの着粒数を増加させるための薬剤を、一態様として提供する。
【００７８】
本発明の薬剤は、前記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一のＤＮＡや該ＤＮＡが挿入されたベクター自体であってもよく、他の成分が混合されているものであってもよい。このような他の成分としては特に制限はなく、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、保存剤、金粒子、多糖、ポリアミン類、塩類が挙げられる。また、前述のアグロバクテリウムを介する方法により本発明の形質転換細胞を調製する場合においては、前記ＤＮＡが導入されたアグロバクテリウムを含有するものであってもよい。
【００７９】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、以下に、「コムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡが挿入されたベクターをコムギ細胞に導入し、形質転換細胞を得る工程と、該形質転換細胞から植物体を再生する工程とを含む、着粒数が増加したコムギの作出方法」について、より好適かつ具体的な実施形態について説明する。
【００８０】
先ず、「コムギＶｒｓ１遺伝子の転写産物と相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡが挿入されたベクター」の構築について説明する。
【００８１】
本発明にかかるベクターの構築においては、先ず、クローニング用ベクター（例えば、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン株式会社製））に、該ベクターの添付の使用説明書の記載に沿って、コムギＶｒｓ１遺伝子の一部のＤＮＡをクローニングすることが好ましい。該ベクターにクローニングされるコムギＶｒｓ１遺伝子の一部、すなわち、二重鎖ＲＮＡの標的配列としては、コムギＶｒｓ１遺伝子の発現を極めて特異性高く抑制できるという観点から、着粒数を増加させるコムギが六倍体コムギ（例えば、Ｂｏｂｗｈｉｔｅ）である場合には、ＴａＶｒｓ１−Ａ遺伝子の第３エクソンのうち、３’−ＵＴＲを主とする３２３ｂｐの塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号：５６に記載の９９８〜１３２０位の塩基配列からなるＤＮＡ）が好ましい（図１  参照）。なお、該配列からなるＤＮＡは、例えば、配列番号：５４及び５５に記載の塩基配列からなるプライマーセット（表１２  参照）を用いるＰＣＲにより増幅し、前記クローニングに供することができる。また、配列番号：５６に記載の９９８〜１３２０位の塩基配列を、二重鎖ＲＮＡの標的配列とすることにより、ＴａＶｒｓ１−Ａ遺伝子の発現のみならず、ＴａＶｒｓ１−Ｂ遺伝子及びＴａＶｒｓ１−Ｄ遺伝子の発現も抑制することができる。
【００８２】
次に、このクローニング用ベクターから、前記コムギＶｒｓ１遺伝子の一部のＤＮＡと相補的な二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡを切り出し、ＲＮＡｉ用ベクターに挿入することが好ましい。ここで、ＲＮＡｉ用ベクターとして、例えば、ｐＡＮＤＡ−βベクター（図２  参照）を用いることにより、ゲートウェイシステム（Ｇａｔｅｗａｙ  ｓｙｓｔｅｍ）のＬＲ反応を利用して、簡便に前記クローニング用ベクターからＲＮＡｉ用ベクターに前記ＤＮＡを移し替えることができる。
【００８３】
次に、前記にて構築した本発明にかかるベクターをコムギ細胞に導入する方法について説明する。本発明にかかるベクターが導入されるコムギの栽培品種としては特に制限はないが、植物体再分化能及び形質転換効率が高いという観点から、Ｂｏｂｗｈｉｔｅが挙げられる。本発明にかかるベクターが導入されるコムギ細胞としても特に制限はないが、未熟胚（開花初めから１４〜１５日目に採取した未熟種子から胚の部分を摘出し、成長点部分を除去したもの（長辺：１〜２ｍｍ））が好適に用いられる。成長点部分の細胞は薬剤に比較的強く、形質転換細胞の選抜に不適当なため除去することが好ましい。
【００８４】
本発明にかかるベクターを導入する方法としては、前述の公知の手法が挙げられるが、コムギは形質転換が難しいため、比較的安定して形質転換体が作り易いという観点から、パーティクルガンを用いた方法が好ましい。また、パーティクルガンのパラメーターとしては、例えば、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（登録商標）ＰＤＳ−１０００／Ｈｅパーティクルデリバリーシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を用いる際には、図３に示す条件が挙げられる。
【００８５】
本発明にかかるベクターが導入された形質転換細胞を得るために用いられる選抜マーカー遺伝子及び選抜薬剤としては特に制限はないが、選抜マーカー遺伝子としてはｂａｒ遺伝子が好ましく、選抜薬剤としてはホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）又はビアラフォス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）が好ましい。また、ＨＰＴ遺伝子とハイグロマイシンＢとの組み合わせ、ＮＰＴII遺伝子とジェネティシン（Ｇ４１８）との組み合わせも、本発明の方法において用いることができる。
【００８６】
本発明にかかるベクターをコムギ細胞に導入する際の条件としては特に制限はないが、前述のコムギの未熟胚を用い、パーティクルガン等にて本発明にかかるベクターを導入する際には、胚盤側を上にしてＭＳＥ３Ｍ培地上に置床しておくことが望ましい（ＭＳＥ３Ｍ培地の組成は表１  参照）。
【００８７】
また、形質転換細胞から植物体を再生するための条件としては特に制限はないが、パーティクルガン等にて本発明にかかるＤＮＡを導入した翌日から１４日目はＭＳＥ３培地上にて培養し、１５日目以降はＭＳＲ＿Ｐ５培地（選択培地）にて培養することが好ましく、さらに、７０日目以降はＭＳ９＿Ｐ５培地（発根用培地）にて培養することが好ましい（ＭＳＥ３培地、ＭＳＲ＿Ｐ５培地及びＭＳ９＿Ｐ５培地の組成は各々表２、３及び４  参照）。次いで、本発明にかかるＤＮＡを導入した日から約１００日経過した後に土に移植することで、その移植後２〜３カ月後には開花状態に至り、さらには開花後２〜３カ月後には種子を採取することができる。
【００８８】
そして、かかる方法により、コムギにおいて、コムギＶｒｓ１遺伝子の発現が抑制され、その結果、野生型では退化する小花にも稔実し、一穂あたりの着粒数が増加することになる。
【００８９】
【表１】
2014007396.tif 000002
【００９０】
【表２】
2014007396.tif 000003
【００９１】
【表３】
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【００９２】
【表４】
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【００９３】
なお、ＭＳＥ３Ｍ培地、ＭＳＥ３培地、ＭＳＲ＿Ｐ５培地及びＭＳ９＿Ｐ５培地にて添加される「ＫＩ×１０００」、「０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＡ」、「ＭＳ−４」及び「ＭＳ−５」の組成については、各々表５、６、７及び８に示す。
【００９４】
【表５】
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【００９５】
【表６】
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【００９６】
【表７】
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【００９７】
【表８】
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【実施例】
【００９８】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、オオムギに関する実施例は、以下に示す材料及び方法にて行った。【００９９】
＜オオムギ＞
オオムギの栽培品種において、ゴールデンプロミス（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｐｒｏｍｉｓｅ（ＧＰ，ＪＰ１５９２３））、ハンナ（Ｈａｎｎａ（ＪＰ１５５９４））、ボーナス（Ｂｏｎｕｓ（ＪＰ１５９２９））、はるな二条（Ｈａｒｕｎａ  Ｎｉｊｏ（ＨＮ，ＪＰ６７５５６））、関東中生ゴール（Ｋａｎｔｏ  Ｎａｋａｔｅ  Ｇｏｌｄ（ＫＮＧ，ＪＰ１５４３６））を、二条性のオオムギ品種の代表例として用いた。モレックス（Ｍｏｒｅｘ（ＪＰ４６３１４））、アズマムギ（Ａｚｕｍａｍｕｇｉ（ＡＺ，ＪＰ１７２０９））、ハヤキソ−２（Ｈａｙａｋｉｓｏ−２（ＨＫ２，ＪＰ１８０９９））を、六条性のオオムギ品種の代表例として用いた。また、以上の品種は、農業生物資源（ＮＩＡＳ）ジーンバンク（日本）より得た。【０１００】
＜ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析＞
３’−ＵＴＲ（３００ｂｐ）の一部を含むＶｒｓ１遺伝子断片と、ＨｖＨｏｘ２遺伝子の全長ｃＤＮＡ（１０７２ｂｐ）とは、各遺伝子の配列特異的なプライマーを用いて、オオムギ未熟穂から単離したｃＤＮＡを鋳型として増幅した。用いたプライマーの配列は表９に示す。【０１０１】
【表９】
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【０１０２】
得られたＰＣＲ産物は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＫＳ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に挿入することにより、クローニングした。そして、挿入方向の異なる２クローンを、Ｖｒｓ１遺伝子に関してはＮｏｔ１にて切断し、ＨｖＨｏｘ２遺伝子に関してはＥｃｏＲIにて切断した。そして、これらを鋳型とし、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼにて、アンチセンスプローブ及びセンスプローブを作製した。ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、非特許文献１の記載に沿って行った。【０１０３】
＜免疫組織化学染色＞
抗オオムギＶＲＳ１抗体は、合成ペプチド（ＣＸＶＰＥＷＦＬＡ  配列番号：２７）をウサギに免疫することにより調製した。Ｃ（システイン残基）は、担体等とのジスルフィド結合のために導入したアミノ酸である。また、Ｘはアミノヘキサン酸を示し、「ＶＰＥＷＦＬＡ」は、ＶＲＳ１タンパク質の２１６〜２２２位のアミノ酸に由来する。【０１０４】
また、芒原基期にある未熟穂についての免疫組織化学染色は、Ｙａｍａｊｉ，Ｎ．及びＭａ，Ｊ．Ｆ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００７年、１４３巻、１３０６〜１３１３ページの記載に沿って行った。【０１０５】
＜ＲＮＡ抽出及び定量的リアルタイムＰＣＲ＞
Ｋｉｒｂｙ，Ｅ．Ｊ．Ｍ．及びＡｐｐｌｅｙａｒｄ，Ｍ．、「Ｃｅｒｅａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｇｕｉｄｅ」、１９８１年、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ：Ｃｅｒｅａｌ  Ｕｎｉｔの記載に沿って、未熟穂の発達過程を実体顕微鏡にて観察して分類し、各発達段階毎に約１０本ずつの未熟穂を採取した。そして、各発達段階毎のサンプルそれぞれ生重量５０ｍｇからトライゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、トータルＲＮＡを抽出した。なお、１サンプルにつき、独立したＲＮＡ抽出を３回行った（生物学的反復：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）。【０１０６】
また、ＲＮＡはナノドロップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて定量した。さらに、ＤＮＡのコンタミネーションを避けるため、ＲＮＡをＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製）にて、製造会社の使用説明書の記載に従って処理した。次いで、スーパースクリプトIII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ファーストストランドｃＤＮＡを合成し、２５ｎｇ  ＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として用いた。そして、ステップワンリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びサンダーバードサイバーｑＰＣＲミックスキット（ＴＯＹＯＢＯ社製）を、各々の製造会社の使用説明書の記載に沿って用い、各遺伝子の転写レベルを、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）法にて測定した。ｑＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは表９に示す。また、アンプリコンはアガロースゲルを用いた電気泳動にて分画し、エチジウムブロマイド染色にて可視化した。なお、各サンプルについて、少なくとも３回ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。【０１０７】
また、各遺伝子断片は、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）又はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII  ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に挿入し、クローニングした。そして、各遺伝子断片が挿入されたプラスミドＤＮＡを、絶対量を定量するために必要な検量線を作製するために用いた。【０１０８】
＜オオムギの形質転換＞
ＲＮＡｉコンストラクトを調製するため、特異的なプライマーを用いて、オオムギＶｒｓ１遺伝子断片（６２８ｂｐ）を増幅した（用いたプライマーは表９に示す）。得られたＰＣＲ産物については、順方向及び逆方向のものを、ｐＩＰＫｂ００８ベクター及びｐＩＰＫｂ００９ベクターに挿入し、クローニングした。なお、ｐＩＰＫｂ００８ベクター及びｐＩＰＫｂ００９ベクターにおいて、導入遺伝子の発現をイネアクチンプロモーター下及びＣａＭＶ３５Ｓプロモーター下にて各々制御することができる（Ｈｉｍｍｅｌｂａｃｈ，Ａ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００７年、１４５巻、１１９２〜１２００ページ  参照）。【０１０９】
そして、Ｈｅｎｓｅｌ，Ｇ．ら、Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００８年、１６５巻、７１〜８２ページの記載に沿って、アグロバクテリウム法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＡＧＬ−１を用いて、ＲＮＡｉコンストラクトをオオムギ未熟胚（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｐｒｏｍｉｓｅ栽培品種）に導入した。【０１１０】
（実施例１）
＜ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションによる、オオムギＶｒｓ１遺伝子及びＨｖＨｏｘ２遺伝子の発現についての解析＞
二条性オオムギ栽培品種（Ｂｏｎｕｓ、Ｋｉｒｂｙ，Ｅ．Ｊ．Ｍ．及びＡｐｐｌｅｙａｒｄ，Ｍ．、「Ｃｅｒｅａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｇｕｉｄｅ」、１９８１年、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ：Ｃｅｒｅａｌ  Ｕｎｉｔ  参照）の様々な発生段階にある未熟穂におけるＶｒｓ１遺伝子の発現を、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションにより検出した。得られた結果を図４に示す。【０１１１】
なお、このＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションに用いたプローブの配列は、オオムギＶｒｓ１特異的なプローブ（Ｖｒｓ１遺伝子の３’ＵＴＲの約３００ｂｐ、図５  参照）であり、その配列は、Ｖｒｓ１遺伝子の相同遺伝子であるＨｖＨｏｘ２遺伝子（Ｓａｋｕｍａ，Ｓ．ら、Ｆｕｎｃｔ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０１０年、１０巻、１２３〜１３３ページ  参照）及びＨｖＨｏｘ３遺伝子には存在していない。ＨｖＨｏｘ２遺伝子はＶｒｓ１遺伝子との相同性が最も高い遺伝子であり、ＨｖＨｏｘ３遺伝子は、ＨｖＨｏｘ２遺伝子に次いで、Ｖｒｓ１との相同性が２番目に高い遺伝子である（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｔ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２０１１年、１５６巻、２０〜２８ページ）。故に、このプローブによるＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕのシグナルは、Ｖｒｓ１ｍＲＮＡの発現のみを示すものである。実際、二条穂においてセンスプローブを用いたところ、シグナルは検出されなかった（図４のＧ  参照）。また、六条穂を有するオオムギＶｒｓ１遺伝子欠失体（ｎｕｌｌ）：ｈｅｘ−ｖ．３を陰性対照として用いた結果、オオムギＶｒｓ１特異的プローブによって、この変異体をハイブリダイズした場合には、シグナルは検出されなかった（図４のＨ  参照）。このように、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、Ｖｒｓ１プローブは、ＨｖＨｏｘ２  ｍＲＮＡ又は他の相同遺伝子の配列とクロスハイブリダイズすることなく、利用できることを確認している。【０１１２】
また、オオムギの穂は、三マウンド期、護頴原基期、外頴原基期、雄蕊原基期、芒原基期、白葯期、緑葯期、黄葯期、止葉期の各発達段階を踏んで成熟する。【０１１３】
図４に示した結果から明らかなように、オオムギＶｒｓ１ｍＲＮＡは、小穂原基が三つの異なる小穂分裂組織に分化する時期（三マウンド期及び護頴原基期）の未熟穂の側列小穂の分裂組織において検出された（穂の長さ１〜１．５ｍｍ，図４のＡ及びＢ  参照）。したがって、本発明者らが既に明らかにしているように（非特許文献１に記載の通り）、オオムギＶｒｓ１遺伝子が側列小穂の分裂組織に特異的に発現していることが確認された。【０１１４】
次に、花器の分化が完遂している白葯期（穂の長さ１０〜１５ｍｍ）において、Ｖｒｓ１遺伝子の発現を、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションにより検出した。得られた結果を図４のＤ及びＦに示す。【０１１５】
図４のＤ及びＦに示した結果から明らかなように、白葯期において、オオムギＶｒｓ１遺伝子の発現は、外花穎（ｌｅｍｍａ）、内花穎（ｐａｌｅａ）に局在しており、特に雌蕊（ｐｉｓｔｉｌ）において最も強く局在していた。また、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのシグナルは、葯組織においてはバックグラウンド程度であった。さらに、護頴においてはＶｒｓ１遺伝子の発現を検出することはできなかった。また、オオムギにおいて完全に抑制されている未発達の小花が付いている小軸においても、前記雌蕊と同程度のＶｒｓ１遺伝子の強い発現が検出された。したがって、オオムギＶｒｓ１遺伝子が花器特異的に発現することが明らかになった。【０１１６】
一方、三マウンド期及び護頴原基期にある主列小穂の分裂組織においては、Ｖｒｓ１遺伝子の発現は検出されなかった。また、白葯期にある主列小穂のいずれの組織においてもオオムギＶｒｓ１遺伝子の発現は検出されなかった。【０１１７】
次に、ＨｖＨｏｘ２遺伝子特異的プローブを用いたＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションを行った。得られた結果を図６に示す。【０１１８】
なお、ｈｅｘ−ｖ．３変異体においてはオオムギＶｒｓ１遺伝子のＤＮＡ配列が全て欠失しているため、ＨｖＨｏｘ２プローブによるＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションにおいて、Ｖｒｓ１遺伝子の相同配列を検出することはない（非特許文献１  参照）。この点を考慮し、この変異体の未熟穂を用い、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションによって、ＨｖＨｏｘ２の発現を調べた。また、ＨｖＨｏｘ２の遺伝子の発現レベルは相対的に低く、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションにより、ＨｖＨｏｘ２遺伝子の発現を容易には検出することはできない。そこで、ＨｖＨｏｘ２遺伝子のシグナルを増強するため、ＨｖＨｏｘ２ｃＤＮＡ全長を含むプロ―プを用いて、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションを行った（図５  参照）。【０１１９】
図６に示した結果から明らかなように、ＨｖＨｏｘ２特異的プローブを用いたＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、２つの側列小穂における小花柄の維管束組織（穂軸と小穂との間の結合部）においてシグナルが検出された（図６のＢ、Ｄ及びＦ  参照）。また、そのシグナルは、白葯期の前維管束細胞に局在していた（図６のＥ及びＧ  参照）。【０１２０】
一方、白葯期では、ＨｖＨｏｘ２の発現シグナルを検出することができたが、三マウンド期においては、ＨｖＨｏｘ２の発現は検出されなかった。主列小穂又は未熟穂の他の部位においても、ＨｖＨｏｘ２のシグナルは検出されなかった。また、センスプローブはどの構造においてもハイブリダイズすることはなかった（図６のＣ  参照）。【０１２１】
（実施例２）
＜免疫染色による、オオムギＶｒｓ１タンパク質のオオムギでの発現についての解析＞
オオムギＶＲＳ１タンパク質の組織特異的局在を調べるために、抗ＶＲＳ１抗体を用いた免疫染色を行った。その結果、オオムギＶＲＳ１タンパク質のシグナルは、芒原基期における二条穂（Ｂｏｎｕｓ）の側列小穂にて検出された（図７のＡ及びＢ  参照）。主列小穂においては、シグナルが検出されなかった。これらデータは、前述の側列小穂におけるオオムギＶｒｓ１  ｍＲＮＡの局在と一致しており、二条穂において、Ｖｒｓ１  ｍＲＮＡがＶＲＳ１タンパク質に翻訳されていることが示された。【０１２２】
ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ  データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ．ｏｒｇ／）解析により、ＶＲＳ１タンパク質及びＨｖＨＯＸ２タンパク質は各々「ＲＲＲＲＲＲＳＡＲ」（配列番号：２８）及び「ＲＰＲＡＲＲＲＲＲＲＡＡＲ」（配列番号：２９）という核局在シグナルを有していることが予測されているため、これら二つのタンパク質の標的は核に存在していることが想定される。そこで、ＶＲＳ１が核に局在していることを確認するため、ＤＮＡをラベルする色素であるＤＡＰＩとの共免疫染色を行った。オオムギＶＲＳ１は核に局在していた（図７のＣ  参照）。【０１２３】
一方、陰性対照においては、自家蛍光のシグナルのみ、穂軸の維管束組織にて検出された（図７のＤ  参照）。Ｖｒｓ１遺伝子を欠失しているｈｅｘ−ｖ．３変異体においては、穂軸と小穂との維管束において強い自家蛍光のみが検出された（図７のＥ及びＦ  参照）。しかし、ｈｅｘ−ｖ．３の主列小穂及び側列小穂、並びにそれらの核においては、抗オオムギＶＲＳ１抗体によって、オオムギＶＲＳ１タンパク質を検出することができなかった（図７のＧ  参照）。なお、図７のＧの穂軸において検出された強いシグナルは、抗オオムギＶＲＳ１抗体を用いなかった陰性対照においても確認されたため、自家蛍光である。【０１２４】
（実施例３）
＜ｑＲＴ−ＰＣＲによる、オオムギＶｒｓ１遺伝子及びＨｖＨｏｘ２遺伝子の発現についての解析１＞
オオムギＶｒｓ１遺伝子及びＨｖＨｏｘ２遺伝子のオオムギ各組織における発現レベルを分析するため、緑葯期にある二条栽培品種（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｐｒｏｍｉｓｅ  （ＧＰ））から、未熟穂を単離した。また、止葉期にあるこの品種から、芒組織、幹組織、葉組織も単離した。そして、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析を行った。得られた結果を図８に示す。【０１２５】
なお、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析においては、異なる発達段階での遺伝子発現レベルを比較するため、各遺伝子の３’ＵＴＲに特異的なＰＣＲプライマーを設計した。また、これらプライマーとＨｖＨｏｘ３遺伝子との間にて、相同性は認められないことを確認している。さらに、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析では、穂の発達段階において恒常的に発現しているＨｖＡｃｔｉｎ遺伝子の発現量を基準として、各サンプルにおけるＲＮＡの発現レベルを正規化した。【０１２６】
図８に示した結果から明らかなように、オオムギＶｒｓ１遺伝子は側列小穂のみにおいて発現していた。この結果は、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出されたオオムギＶｒｓ１の組織特異的発現パターンと一致している（図４  参照）。さらに、ＨｖＨｏｘ２遺伝子は、主列小穂、側列小穂、芒組織及び葉組織において発現が認められたが、側列小穂における転写レベルが最も高いことが明らかになった。また、オオムギＶｒｓ１とＨｖＨｏｘ２との転写レベルは、各々、トータルＲＮＡ１μｇあたり４．９×１０４コピー数及び３．４×１０４コピー数であり、緑葯期にある側列小穂においては同等であった。【０１２７】
＜ｑＲＴ−ＰＣＲによる、オオムギＶｒｓ１遺伝子及びＨｖＨｏｘ２遺伝子の発現についての解析２＞
次に、穂の様々な発達段階を通して、オオムギＶｒｓ１遺伝子の発現レベルと、ＨｖＨｏｘ２遺伝子の発現レベルとを比較すべく、２種の二条穂栽培品種及び２種の六条穂栽培品種を対象とし、絶対定量的逆転写ＰＣＲ（Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑＲＴ−ＰＣＲ）を行った。得られた結果を図９〜１２に示す。【０１２８】
図９に示した結果から明らかなように、Ｖｒｓ１．ｂ３アレルを保持する二条穂栽培品種  Ｂｏｎｕｓにおいて、外頴原基期（Ｐ＝０．０１０４）、雄蕊原基期（Ｐ＝０．００４０）、芒原基期（Ｐ＝０．００９６）及び白葯期（Ｐ＝０．０００６）におけるＨｖＨｏｘ２遺伝子の転写レベルよりも、Ｖｒｓ１遺伝子の転写レベルは有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。【０１２９】
すなわち、外頴原基期及び雄蕊原基期において、オオムギＶｒｓ１遺伝子の発現量（トータルＲＮＡ１μｇあたりのｍＲＮＡコピー数、外頴原基期においては５．１×１０５、雄蕊原基期においては、５．８×１０５）は、ＨｖＨｏｘ２遺伝子のそれら（外頴原基期においては２．４×１０４、雄蕊原基期においては、２．７×１０４）の２０倍以上であった。【０１３０】
また、芒原基期及び白葯期におけるＨｖＨｏｘ２遺伝子の発現量（芒原基期においては、２．０×１０５、白葯期においては、２．３×１０５）に対し、Ｖｒｓ１のそれら（芒原基期においては、７．５×１０５、白葯期においては、５．８×１０５）は３倍以上であった。【０１３１】
さらに、三マウンド期及び護頴原基期においては、転写レベルにおいて有意差（Ｐ＞０．０５）は認められなかったが、オオムギＶｒｓ１遺伝子の発現は、ＨｖＨｏｘ２遺伝子のそれらよりも高かった。しかし、緑葯期及び黄葯期においては、両遺伝子の発現は同等であった。【０１３２】
Ｂｏｎｕｓ同様に、Ｖｒｓ１．ｂ３アレルを保有している二条穂栽培品種である、Ｋａｎｔｏ  Ｎａｋａｔｅ  Ｇｏｌｄ（ＫＮＧ）においても、オオムギＶｒｓ１遺伝子及びＨｖＨｏｘ２遺伝子の発現パターンは同様であり、雌蕊への分化が開始される、芒原基期から白葯期にかけ、オオムギＶｒｓ１ｍＲＮＡの発現量は最も多かった（図１０  参照）。一方、ＨｖＨｏｘ２  ｍＲＮＡの発現量は、白葯期から黄葯期にかけ、最も多かった。【０１３３】
六条栽培品種であるアズマムギ（ＡＺ）において、オオムギＶｒｓ１遺伝子の転写レベルは、ＨｖＨｏｘ２遺伝子のそれよりも高かった。なお、ＡＺは、短縮型ＶＲＳ１タンパク質をコードしているｖｒｓ１．ａ１アレルを保有している（非特許文献１  参照）（図１１  参照）。【０１３４】
他の六条性栽培品種、Ｈａｙａｋｉｓｏ２（ＨＫ２）におけるオオムギＶｒｓ１遺伝子の発現は、Ｂｏｎｕｓにおけるそれの５分の１であり、ＡＺにおけるそれの３分の１であった（図１２  参照）。【０１３５】
ＨＫ２は、オオムギＶｒｓ１遺伝子によってコードされる推定アミノ酸配列が改変されていないｖｒｓ１．ｃアレルを保有している（Ｓａｉｓｈｏ，Ｄ．ら、Ｂｒｅｅｄ  Ｓｃｉ、２００９年、５９巻、６２１〜６２８ページ  参照）。したがって、ｖｒｓ１．ｃアレルは、Ｖｒｓ１遺伝子の発現制御領域が変異している可能性がある。【０１３６】
以上の結果から、ＨＫ２において見出されたオオムギＶｒｓ１発現量の低下（芒原基期における発現レベルは最大、１μｇあたり１．５×１０５コピー数）により、側列小穂の稔性を十分に抑制することができず、そして、完全な稔性を有する側列小穂が生じてしまうことが見出された。【０１３７】
また、ＡＺ及びＨＫ２間において、ＨｖＨｏｘ２遺伝子の発現レベルに関し、有意差は認められなかった。したがって、かかるデータから、ＨＫ２における六条穂の発生は、この栽培品種におけるＶｒｓ１遺伝子の転写レベルの低下に基づくことが明らかになった。【０１３８】
（実施例４）
＜オオムギＶｒｓ１遺伝子に対するＲＮＡ干渉＞
オオムギＶｒｓ１遺伝子特異的なヘアピンＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）コンストラクトを用いて、二条栽培品種  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｐｒｏｍｉｓｅの形質転換を行った。  イネＡｃｔｉｎ１プロモーターにて制御されるコンストラクトを用いて、５０の独立したＴ０植物体を作製した結果、３つのＴ０植物体（ＢＧ８７／１Ｅ１８、ＢＧ８７／１Ｅ３５及びＢＧ８７／２Ｅ４）には、穀粒を形成する稔性のある側列小穂が付いていることが観察された。また、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターにて制御されるコンストラクトを用いて、４７の独立したＴ０植物体を作製した結果、稔性の側列小穂が付いているＴ０トランスジェニック植物体は確認できなかった。【０１３９】
次に、イネＡｃｔｉｎ１プロモーター及びＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターによってｓｈＲＮＡの発現が制御されているＴ０植物体から、７系統のＴ１を作製した。そして、側列小穂の発達と導入遺伝子との共分離（ｃｏ−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）解析を行った。得られた結果を表１０及び図１３に示す。【０１４０】
【表１０】
2014007396.tif 000011
【０１４１】
表１０に示した結果のように、穀粒の形成は下記３系統のみにおいて観察された。稔実率は、全ての花を分母とし、種子がついた花を分子としたときの割合を％で示している。
ＢＧ８７／１Ｅ１８  （側列小穂における稔実率の幅：０〜３８％まで、個体差が大きい）
ＢＧ８７／１Ｅ３５  （側列小穂における稔実率の幅：０〜１４％）
ＢＧ８７／２Ｅ０４  （側列小穂における稔実率の幅：０〜５％）
したがって、側列小穂における穀粒形成能は、Ｔ１植物体に伝わっていることが示された（図１３  参照）。また、表１０に示す通り、Ｖｒｓ１遺伝子は側列小穂のみにおいて発現しており、側列小穂以外の器官においては、形態の変化は観察されなかった。【０１４２】
次に、Ｖｒｓ１ｍＲＮＡの発現レベルと、側列小穂の発達との相関を評価するため、白葯期にある未熟穂から単離されたＲＮＡを用いて、ｑＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた結果を図１４に示す。【０１４３】
図１４に示した結果から明らかなように、ＢＧ７８／３Ｅ０２、ＢＧ８７／１Ｅ１８、ＢＧ８７／１Ｅ３５及びＢＧ８７／２Ｅ０４系統由来のＴ１植物体におけるオオムギＶｒｓ１遺伝子の発現レベル（各々、２．０×１０５、１．６×１０５、２．１×１０５及び２．１×１０５コピー数／１μｇ  ＲＮＡ）は、野生型Ｇｏｌｄｅｎ  Ｐｒｏｍｉｓｅのそれ（３．５×１０５）又はＴ１ファミリーから分離した非トランスジェニック植物体におけるそれら（４．０×１０５及び３．９×１０５）の半分程度であった。【０１４４】
また、ＢＧ７８／１Ｅ０１、ＢＧ７８／１Ｅ０２及びＢＧ７８／２Ｅ０２系統由来のＴ１植物体並びに野生型の植物体におけるオオムギＶｒｓ１遺伝子の発現レベルは同等であった。さらに、ＨｖＨｏｘ２遺伝子の発現レベルに関し、野生型の植物体とトランスジェニック植物体とにおいて、有意差は認められなかった（図１５  参照）。【０１４５】
これら結果から、オオムギＶｒｓ遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを導入し、オオムギＶｒｓ１遺伝子の発現を抑制することによって、不稔になる側列小穂の小花に稔性を持たせ、１小穂あたりの着粒数を増加させることができることが明らかになった。【０１４６】
ＶＲＳ１タンパク質及び、その相同タンパク質であるＨｖＨＯＸ２タンパク質は、図５に示す通り、共にホメオドメイン（ＨＤ）モチーフ及びロイシンジッパーを有していることから、転写因子として機能することが想定されている。実際、実施例２においても明らかにした通り、オオムギＶＲＳ１タンパク質は核内に局在しているため、転写因子として機能することが強く示唆される。【０１４７】
また、ＨｖＨＯＸ２タンパク質のオーソログである、イネのＯｓＨＯＸ１４タンパク質やシロイナズナのＨＤ−ＺｉｐＩタンパク質の機能を考慮するに、ＨｖＨＯＸ２タンパク質は、側列小穂の生長を担う転写活性化因子として機能することが想定される。【０１４８】
一方、非特許文献１に記載されている通り、１８の独立した六条穂変異体において、ＶＲＳ１タンパク質の１アミノ酸置換が生じており、これら変異体から、野生型ＶＲＳ１タンパク質のＨＤはシス因子に結合し、側列小穂における花器官の発達に対して、負の制御因子として機能することが示唆されている。【０１４９】
また、オオムギＶＲＳ１タンパク質においては、ＨｖＨＯＸ２とオーソロガスなタンパク質にて高度に保存されている８アミノ酸長のＣ末モチーフが欠失していることから、ＨｖＨＯＸ２とオーソロガスなタンパク質で確認されているような下流遺伝子に対する転写活性化能が、オオムギＶＲＳ１タンパク質では喪失していることが想定されている（Ｓａｋｕｍａ，Ｓ．ら、Ｆｕｎｃｔ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０１０年、１０巻、１２３〜１３３ページ  参照）。【０１５０】
したがって、これらの知見並びに上記実施例において示した結果から、オオムギＶＲＳ１タンパク質とＨｖＨＯＸ２タンパク質とは、これらタンパク質のＨＤモチーフは高度に保存されているため、側列小穂の発達を担う下流遺伝子のシス因子への結合において、競合することが強く示唆される。【０１５１】
実際、実施例３において明らかにした通り、稔実する主列小穂においてはオオムギＶｒｓ１遺伝子が発現しておらず、ＨｖＨｏｘ２遺伝子は、葉や茎と同程度に低いものの発現はしている（図８  参照）。したがって、主列小穂においては、かかるＨｖＨｏｘ２遺伝子の相対的に低い発現によっても、競合因子であるオオムギＶＲＳ１タンパク質が発現していないため、主列小穂の発達を十分に促進でき、ひいては着粒できることが強く示唆される。【０１５２】
一方、ＨｖＨｏｘ２遺伝子及びオオムギＶｒｓ１遺伝子は共に側列小穂において発現しているが、穂の発達の早期段階において、オオムギＶｒｓ１遺伝子の発現量は、ＨｖＨｏｘ２遺伝子のそれよりも１０倍多い（図９〜１２  参照）。したがって、オオムギＶＲＳ１タンパク質のかかる高発現は、ＨｖＨＯＸ２タンパク質と、それが結合する部位（シス因子等）との結合を抑制することによって、側列小穂の形成を促進する発達遺伝子の発現を停止させ、ひいては側列小穂における着粒が阻害されることが強く示唆される。【０１５３】
また、ＨｖＨＯＸ２とオーソロガスなタンパク質であるＨＤ−Ｚｉｐタンパク質については、特異的なＤＮＡ配列に結合する前に、ロイシンジッパーを介して二量体を形成していることが予測されている（Ｓｅｓｓａ，Ｇ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ、１９９３年、１２巻、３５０７〜３５１７ページ  参照）。また、ＨＤ−ＺｉｐＩ及びＩＩタンパク質は、ホモ二量体又は同じクラスのタンパク質とヘテロ二量体を形成することも見出されている（Ｍｅｉｊｅｒ，Ａ．Ｈ．ら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ、２０００年、２６３巻、１２〜２１ページ  参照）。【０１５４】
したがって、ＨｖＨｏｘ２遺伝子とオオムギＶｒｓ１遺伝子とがほぼ同程度のレベルにて発現することにより、オオムギＶＲＳ１タンパク質とＨｖＨＯＸ２タンパク質とは、ロイシンジッパーを介してヘテロ二量体を形成することになる。そして、該ヘテロ二量体形成によってシス因子が占有され、側列小穂の核内における機能的なＨｖＨＯＸ２タンパク質ホモ二量体の量を低減し、ひいては側列小穂における着粒が阻害されることが強く示唆される。【０１５５】
しかしながら、上記はオオムギにおいて見出されたＶｒｓ１及びＨｖＨｏｘ２遺伝子の機能である。オオムギは、コムギ属に属するコムギ等の植物とは異なり、一つの小穂に一つの小花にしか着けないというユニークな特徴を有している。一方、コムギ等においては、一つの小穂に複数の小花がつく。【０１５６】
故に、オオムギとコムギとは同じイネ科の植物であるものの、小穂の形態は大きく異なっており、当然のことながらコムギには六条性や二条性といった穂の形態はなく、側列小穂も有していないため、コムギにおいて、小花における不稔とオオムギＶｒｓ１遺伝子と相同なコムギ遺伝子との関連性については全く想定されていなかった（Ｓａｋｕｍａ，Ｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２０１１年、５２巻、７３８〜７４９ページ）。【０１５７】
そこで、後述の実施例５〜９に示す方法にて、コムギにおいて、オオムギＶｒｓ１遺伝子及びＨｖＨｏｘ２遺伝子の相同遺伝子を各々単離し、それら遺伝子の染色体上の位置、それら遺伝子がコードするタンパク質のモチーフ、それら遺伝子の発現パターンについて解析を行った。さらに、コムギＶｒｓ１遺伝子の機能をＲＮＡｉにより抑制することにより、着粒数が増加するかどうかを調べた。なお、後述の実施例５〜９において用いたコムギは以下の通りである。【０１５８】
＜コムギ＞
ヒトツブコムギ  ＫＴ１−１（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ  Ｌ．  ｓｓｐ．ｂｏｅｏｔｉｃｕｍ）及びＫＴ３−５（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ  Ｌ．ｓｓｐ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ、２倍体コムギ）を、後述の遺伝子クローニング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いた。ＫＴ１−１とＫＴ３−５との交配種に由来する１１５のＦ１０組換え自殖系統（ＲＩＬｓ）集団を、後述の遺伝子マッピングに用いた。パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）品種  チャイニーズスプリング（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｓｐｒｉｎｇ；ＣＳ、６倍体コムギ）は、後述の遺伝子クローニング及びｑＲＴ−ＰＣＲに用いた。また、第２同祖群の染色体を有するＣＳの、ナリテトラソミック系統（ｎｕｌｌｉ−ｔｅｔｒａｓｏｍｉｃ  ｌｉｎｅｓ）、ダイテロソミック系統（ｄｉｔｅｌｏｓｏｍｉｃ  ｌｉｎｅｓ）及び欠失系統（ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｌｉｎｅｓ）は、Ｖｒｓ１遺伝子のコムギ染色体上の位置を決定するために用いた。【０１５９】
これら全てのコムギは、ナショナルバイオリソースプロジェクト（ＮＢＲＰ）−コムギより提供を受けた。また、パンコムギ  ボブホワイトは、ＣＩＭＭＹＴより提供を受け（アクセッション番号：ＳＨ  ９８  ２６、Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｅｓｃｈｉ  Ａ.ら、Ｇｅｎｏｍｅ、２００２年、４５巻、４２１〜４３０ページ  参照）、後述のコムギＶｒｓ１遺伝子に対するＲＮＡｉトランスジーンを導入する対象として用いた。【０１６０】
（実施例５）
＜コムギ由来のＶｒｓ１遺伝子等の単離及びマッピング＞
コムギＶｒｓ１遺伝子を単離すべく、２倍体コムギ（実験系統ＫＴ−３−５）からゲノムＤＮＡを、小松田ら、Ｇｅｎｏｍｅ、１９９８年、４１巻、６８０〜６８５ページに記載の方法に従って抽出した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲプライマーはオリゴ５ソフトウェア（Ｗ．Ｒｙｃｈｌｉｃｋ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ，ＵＳＡ）にて設計し、株式会社ＢＥＸに委託して、合成した。合成したプライマー配列を表１１に示す。【０１６１】
【表１１】
2014007396.tif 000012
【０１６２】
また、増幅反応は、１．２５Ｕ  ＥｘＴａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）、１ｘＥｘＴａｑポリメラーゼバッファー、０．３μＭの各々のプライマー、２００μＭ  ｄＮＴＰ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び１００ｎｇゲノムＤＮＡを含む５０μｌ反応系にて行った。さらに、各増幅反応は、９４℃にて５分間の変性ステップ、次いで、９４℃にて３０秒、５５℃にて３０秒及び７２℃にて６０秒を３０サイクル、最後に７２℃にて７分間のインキュベーションという条件にて行った。【０１６３】
そして、得られたＰＣＲ産物は、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製し、ビッグダイターミネーターキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いたサイクルシークエンシングに供した。すなわち、シークエンシング反応液は、アジェンコートクリーンＳＥＱ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）にて精製し、ＡＢＩプリズム３１３０ジェネティックアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて分析した。また、シークエンシングに用いたプライマーの配列を表１２に示す。【０１６４】
【表１２】
2014007396.tif 000013
【０１６５】
以上の解析によって、初めて明らかになった２倍体コムギのＶｒｓ１遺伝子（ＴｍＶｒｓ１遺伝子）のゲノムＤＮＡの配列を配列番号：１に、該ゲノムＤＮＡがコードするｃＤＮＡの配列を配列番号：２に、該ゲノムＤＮＡ及び該ｃＤＮＡがコードするタンパク質（ＴｍＶＲＳ１タンパク質）のアミノ酸配列を配列番号：３に記載する。さらに、コムギ由来のＨｏｘ２遺伝子（ＴｍＨｏｘ２遺伝子）のゲノムＤＮＡの配列を配列番号：４に、該ゲノムＤＮＡがコードするｃＤＮＡの配列を配列番号：５に、該ゲノムＤＮＡ及び該ｃＤＮＡがコードするタンパク質（ＴｍＨＯＸ２タンパク質）のアミノ酸配列を配列番号：６に記載する。【０１６６】
また、ＴｍＶｒｓ１遺伝子及びＴｍＨｏｘ２遺伝子のコムギ染色体上の位置を同定すべく、ヒトツブコムギ（Ｔ．ｂｏｅｏｔｉｃｕｍとＴ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍとの交配種）のＲＩＬｓについて、多型ＣＡＰＳ及びｄＣＡＰＳマーカーを用い、遺伝型を決定した。そして、マーカーのデータは統合し、Ｈｏｒｉら（Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００７年、５７巻、３９〜４５ページ）に記載の方法に沿って、遺伝地図（連鎖地図）を作製した。得られた結果を図１６に示す。【０１６７】
図１６に示した遺伝地図から、ＴｍＶｒｓ１遺伝子は染色体２Ａｍの長腕に位置し、ＴｍＨｏｘ２遺伝子は染色体２Ａｍの短腕に位置していることが明らかとなった。したがって、Ｖｒｓ１遺伝子及びＨｏｘ２遺伝子の順序は、オオムギ（染色体２Ｈ）及びコムギ（染色体２Ａｍ）間にて高度に保存されていることが明らかになった。【０１６８】
また、前記ＴｍＶｒｓ１遺伝子解析と同様の解析によって、パンコムギからＶｒｓ１相同性遺伝子（ＴａＶｒｓ１−Ａ、ＴａＶｒｓ１−Ｂ、ＴａＶｒｓ１−Ｄ）を単離した。すなわち、６倍体コムギ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｓｐｒｉｎｇ）のＢＡＣライブラリーを、ＴｍＶｒｓ１  ３'ＵＴＲ配列に基づき設計したプライマーを用いたＰＣＲによって、スクリーニングを行い、１４陽性クローンを同定した。そして、１４クローンの約２ｋｂＴａＶｒｓ１遺伝子領域について配列を決定した。【０１６９】
その結果、系統発生解析により３つのハプロタイプが存在していることが初めて明らかになった。これら６倍体コムギのＶｒｓ１遺伝子（ＴａＶｒｓ１−Ａ遺伝子、ＴａＶｒｓ１−Ｂ遺伝子及びＴａＶｒｓ１−Ｄ遺伝子）のゲノムＤＮＡの配列を配列番号：５６、５９及び６２に各々記載する。該ゲノムＤＮＡがコードするｃＤＮＡの配列を配列番号：５７、６０及び６３に各々記載する。該ゲノムＤＮＡ及び該ｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：５８、６１及び６４に各々記載する。【０１７０】
さらに、ＣＳナリテトラソミック系統、ＣＳダイテロソミック系統及びＣＳ欠失系統の異数性系統を、各相同遺伝子特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより分析することにより、前記３ハプロタイプ（ＴａＶｒｓ１−Ａ、ＴａＶｒｓ１−Ｂ及びＴａＶｒｓ１−Ｄ遺伝子）の染色体上の位置を決定した。得られた結果を図１７〜２０に示す。解析に用いたプライマーの配列を表１１に示す。【０１７１】
図１７〜２０に示す通り、前記１４クローンの内、１１クローン（ＴａＶｒｓ１−Ａ）は染色体２Ａの長腕に位置し、１クローン（ＴａＶｒｓ１−Ｂ）は染色体２Ｂの長腕に位置し、残り２クローンは染色体２Ｄ（ＴａＶｒｓ１−Ｄ）の長腕に位置していることが明らかになった。【０１７２】
（実施例６）
＜ＴｍＶｒｓ１遺伝子がコードするタンパク質ＴｍＶＲＳ１（ＴｍＨＯＸ１）と他のイネ科植物の相同タンパク質との比較＞
実施例５にて得られたＴｍＶＲＳ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：３）及びＴｍＨＯＸ２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：６）を、他のイネ科植物の相同タンパク質のそれらと比較した。すなわち、比較ゲノムデータベース（ＳＡＬＡＤ：Ｓｕｒｖｅｙｅｄ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｍｏｔｉｆ  ＡＬｉｇｎｍｅｎｔ  ｄｉａｇｒａｍ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  Ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ、ｈｔｔｐ：／／ｓａｌａｄ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｓａｌａｄ／ｅｎ／）を用いて、ペプチドのモチーフを解析した。得られた結果を図２１に示す。【０１７３】
ＴｍＶＲＳ１タンパク質は、前述のホメオドメインモチーフ及びロイシンジッパーモチーフを有しているため、オオムギ由来のＶＲＳ１タンパク質（ＶＲＳ１タンパク質）同様に転写因子であることが想定される。また、ＴｍＶＲＳ１タンパク質とＶＲＳ１タンパク質とのアミノ酸配列レベルでの相同性は８６％と極めて高かった。【０１７４】
また、図２１に示した結果から明らかなように、ＴｍＶＲＳ１タンパク質とＶＲＳ１タンパク質とはモチーフが一致していた。すなわち、オオムギ由来のＨＯＸ２タンパク質（ＨｖＨＯＸ２タンパク質）及びＴｍＨＯＸ２タンパク質とは異なり、中途終始コドンが生じているため、ＨＯＸ２タンパク質においてよく保存されているモチーフ８が、ＴｍＶＲＳ１タンパク質及びオオムギＶＲＳ１タンパク質において共に欠失していることが明らかになった。【０１７５】
（実施例７）
＜ＴｍＶｒｓ１遺伝子及びＴｍＨｏｘ２遺伝子の発現パターンについての解析＞
コムギの未熟穂の各発達段階における、ＴｍＶｒｓ１遺伝子及びＴｍＨｏｘ２遺伝子の発現レベルについて解析した。未熟穂の発達段階を、実体顕微鏡下にて観察・分別した（Ｋｉｒｂｙ，Ｅ．Ｊ．Ｍ．及びＡｐｐｌｅｙａｒｄ，Ｍ．、「Ｃｅｒｅａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｇｕｉｄｅ」、１９８１年、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ：Ｃｅｒｅａｌ  Ｕｎｉｔ）。そして、トータルＲＮＡ抽出のため、各発達段階にある未熟穂を、各々約１０本ずつ採取した。次いで、採取した各発達段階の未熟穂各５０ｍｇを１サンプルとし、トライゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、トータルＲＮＡを抽出した。なお、１サンプルにつき、独立したＲＮＡ抽出を３回行った（生物学的反復：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）。【０１７６】
抽出したＲＮＡはナノドロップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて定量した。また、ＤＮＡのコンタミネーションを避けるため、ＲＮＡをＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ（ＴａＫａＲａ）にて、製造会社の使用説明書の記載に従って、処理した。次いで、スーパースクリプトIII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ファーストストランドｃＤＮＡを合成した。そして、２５ｎｇのＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として用い、ステップワンリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びサンダーバードサイバーｑＰＣＲミックスキット（ＴＯＹＯＢＯ社製）を、各々の製造会社の使用説明書の記載に沿って用い、各遺伝子の転写レベルを、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）法にて測定した。得られた結果を図２２に示す。【０１７７】
なお、ｑＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは表１１に示す。アンプリコンはアガロースゲルを用いた電気泳動にて分画し、エチジウムブロマイド染色にて可視化した。各サンプルについて、少なくとも３回ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。また、各遺伝子断片は、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）又はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に挿入し、クローニングした。そして、絶対量を定量するために必要な検量線を作製するため、各遺伝子断片が挿入されたプラスミドＤＮＡを調製した。【０１７８】
図２２に示した結果から明らかなように、実施例３において明らかになったオオムギにおける発現パターン（図９〜１２  参照）同様に、小花分化期から白葯期の発達段階にある穂において、ＴｍＶｒｓ１の転写レベルは、他の段階と比べ相対的に高いものであった。特に、コムギの幼穂発達中期（頂端小穂形成期〜白葯期）において、ＴｍＶｒｓ１遺伝子は、ＴｍＨｏｘ２遺伝子の１０倍以上の量の発現を示した。【０１７９】
（実施例８）
＜ＴｍＶｒｓ１遺伝子のコムギ小穂における器官特異的な発現についての解析＞
前述の通り、オオムギとは異なり、コムギは１小穂の中に複数の小花を付ける（図２３のＡ  参照）。また、コムギの小穂においては、上位の小花が稔実しないことも知られている。そこで、ＴｍＶｒｓ１遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の小穂における局在を調べるべく、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。【０１８０】
すなわち、先ず、未成熟のコムギの穂から単離したｃＤＮＡを鋳型として、３’−ＵＴＲ部分を含むＴｍＶｒｓ１遺伝子に特異的なＤＮＡ断片（約３００ｂｐ）を、特異的プライマー（表１２  参照）にて増幅した。得られたＰＣＲ産物は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＫＳ  （＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入し、クローニングした。次いで、挿入方向の異なる２クローンをＮｏｔＩ又はＥｃｏＲＩにて切断することにより線状化した。そして、それらを鋳型とし、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼにて、アンチセンスプローブ及びセンスプローブを作製した。ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、非特許文献１に記載の方法に沿って行った。得られた結果を図２３〜２６に示す。【０１８１】
図２３に示した結果から明らかなように、ＴｍＶｒｓ１遺伝子は小穂の中の複数の小花のうち下位小花ではあまり発現が見られず、上位の小花ほど強い発現が見られた（図２３Ｂ及びＣ  参照）。【０１８２】
より詳しく説明すると、ＴｍＶｒｓ１遺伝子の発現は、小花分化期において小花の分裂組織に分化し得る穂の分裂組織に局在していた（図２４  参照）。頂端小穂形成期においては、第２及び第３の小花原基に分化した後、小穂の分裂組織及び第２小花においてＴｍＶｒｓ１遺伝子の発現は検出された（図２５  参照）。また、白葯期におけるＴｍＶｒｓ１の発現は、小穂の分裂組織に限局し続けていた。さらに、小花を有する小軸においてＴｍＶｒｓ１シグナルははっきりと検出された（図２６  参照）。【０１８３】
ヒトツブコムギにおいては、通常２つの小花が発達し、その内の１つが結実する。したがって、上述の結果から、ＴｍＶｒｓ１の機能は、上部小花（第３、第４、第５等の小花）の発達を阻害することであることが示された。【０１８４】
以上の実施例６〜８に記載の結果に基づき、オオムギとコムギとでは、ＶＲＳ１タンパク質及びＨＯＸ２タンパク質の配列及びモチーフは高度に保存されているため、それらの機能もよく保存されていることが強く示唆される。実際、実施例７に示す通り、オオムギ同様にコムギにおいても幼穂発達中期において、ＴｍＶｒｓ１遺伝子は、ＴｍＨｏｘ２遺伝子の１０倍以上発現していた。特に、実施例８においても示されている通り、オオムギの側列小穂にある小花同様、稔実しないコムギの頂端小穂（上位小花）において、ＴｍＶｒｓ１遺伝子は極めて高く発現していることが明らかになった。【０１８５】
したがって、コムギの上位小花においても、ＴｍＶＲＳ１タンパク質が発現することにより、ＴｍＨＯＸ２タンパク質が担う小花の発達及び着粒が競合的に阻害されていること、並びにＴｍＶｒｓ１遺伝子の機能を抑制することにより、コムギの着粒数を増加できることが明らかになった。【０１８６】
（実施例９）
＜コムギにおけるＶｒｓ１遺伝子に対するＲＮＡ干渉＞
コムギにおいて上位小花の発達をＴｍＶｒｓ１遺伝子が抑制していることを確認すべく、またＴｍＶｒｓ１遺伝子の機能を抑制することにより、コムギの着粒数を増加させることができることを確認すべく、ＲＮＡｉによってＴｍＶｒｓ１遺伝子（ＴａＶｒｓ１−Ａ遺伝子）の転写産物を抑制した。【０１８７】
すなわち、先ずＲＮＡｉコンストラクトを調製するため、ＴａＶｒｓ１−Ａ遺伝子断片（３２３ｂｐ）を特異的なプライマー（表１２  参照）を用いて増幅した。なお、表１２（配列番号：５４及び５５）に記載の塩基配列からなるプライマーセットを用いた前記ＰＣＲによって増幅される領域は、ＴａＶｒｓ１−Ａ遺伝子（配列番号：５６）の９９８〜１３２０位の塩基配列からなる領域であり、該領域を本ＲＮＡｉの標的配列とすることにより、ＴａＶｒｓ１−Ａ遺伝子の発現のみならず、ＴａＶｒｓ１−Ｂ遺伝子及びＴａＶｒｓ１−Ｄ遺伝子の発現も抑制することができる。【０１８８】
そして、このようにして得られた増幅断片をｐＥＮＴＲ  Ｄ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。次に、クローニングした断片を、ＬＲ再結合反応により、導入遺伝子の発現がトウモロコシユビキチンプロモーターにより制御されるｐＡＮＤＡ−ｂベクターに導入した（Ｍｉｋｉ  Ｄ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００４年、４５巻、４号、４９０〜４９５ページ  参照）。【０１８９】
そして、このベクターをパーティクル・ガン法（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ）によりコムギ未熟胚に導入し、トランスジェニックコムギ植物体を作製した（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｅｓｃｈｉ  Ａ.ら、Ｇｅｎｏｍｅ、２００２年、４５巻、４２１〜４３０ページ  参照）。なお、トランスジェニック植物は、日中の温度が２５℃であり、夜間の温度が２０℃となるよう制御されている温室にて育てた。また、導入された遺伝子（ＲＮＡｉトランスジーン）の存在は、ベクター特異的なプライマーを用いたＰＣＲ増幅により確認した（表１２  参照）。【０１９０】
そして、ＲＮＡｉトランスジーンを有する、独立したＴ０トランスジーン植物体をＰＣＲによって２２同定した。また、２２のトランスジェニック植物体の内１７の植物体において、止葉におけるトランスジーンの発現をｑＲＴ−ＰＣＲにより確認した。さらに、ＲＮＡｉトランスジェニック植物体において、最上部及び最下部にある小穂は十分に発達しなかったため、これら末端にある小穂を除き、１小穂あたりの小花の数を数えた。その結果、野生型植物体と比較して、小花の数は有意に増加していた（図２７〜２９  参照）。また、いくつかのＲＮＡｉトランスジェニック植物体において、１小穂あたりの着粒数も有意に増加していた（図３０  参照）。さらに、Ｔ０トランスジェニック植物体における、１小穂あたりの小花の最多個数は１２であり、１小穂あたりの最多着粒数は５であった。【０１９１】
以上の結果より、ＴｍＶｒｓ１遺伝子はコムギにおいて上位小花の発達を抑制し、１小穂あたりの小花数及び着粒数を制御していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１９２】
以上説明したように、本発明によれば、コムギＶｒｓ１遺伝子の機能を抑制することにより、不稔になる小花に稔性を持たせ、コムギの着粒数を増加させることが可能となる。したがって、本発明のコムギの着粒数を増加させるための方法及び薬剤等は、世界的に不足しているコムギの需要を満たす上で有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１９３】
配列番号：７〜２６、３０〜５５及び６５〜７７
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号：２７
＜２２３＞  人工的に合成されたポリペプチド抗原
＜２２３＞  Ｘはアミノヘキサン酸を示す
【図１】
2014007396.tif 000014
【図２】
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【図１９】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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