(57)【要約】  酸化還元酵素の反応の制御に有用な技術を提供することを課題とする。また、二酸化炭素からギ酸への効率的な変換を可能にする反応系及びそれを取り入れた効率的なメタノール生産系を提供することも課題とする。酸化還元酵素を触媒とした反応を、人工電子伝達体を用いて行うことで酸化還元反応の逆反応を選択的に進行させる。当該反応系をメタノールの生産に適用する。
2013187485.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化還元酵素を触媒とした反応を、人工電子伝達体を用いて行うことを特徴とする、酸化還元反応の逆反応を選択的に進行させる方法。
【請求項２】
酸化還元酵素を触媒とした反応を、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体を電子伝達体として用いて行うことを特徴とする、酸化還元反応の逆反応を選択的に進行させる方法。
【請求項３】
酸化還元酵素がNAD依存型酵素である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
NAD依存型酵素が、ギ酸脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、乳酸脱水素酵素及びグルタミン酸脱水素酵素からなる群より選択される酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記電子伝達体が式（１）〜式（９）のいずれかの化学式で表される化合物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【化１】
2013187485.tif 000023
（１）
但し、式中のR1及びR2は、それぞれ独立に、置換又は無置換アルキル基、置換又は無置換アリール基、置換又は無置換アリールアルキル基であり、置換又は無置換アルキル基の場合のアルキル基部分の炭素数は１〜１２であり、置換又は無置換アリール基の場合のアリール基部分の炭素数は６〜２０であり、置換又は無置換アリールアルキル基の場合のアリールアルキル基の炭素数は７〜２０である；
【化２】
2013187485.tif 000024
（２）
但し、式中のR3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立に、置換又は無置換アルキル基、置換又は無置換アリール基、置換又は無置換アリールアルキル基であり、置換又は無置換アルキル基の場合のアルキル基部分の炭素数は１〜１２であり、置換又は無置換アリール基の場合のアリール基部分の炭素数は６〜２０であり、置換又は無置換アリールアルキル基の場合のアリールアルキル基の炭素数は７〜２０である； 
【化３】
2013187485.tif 000025
（３）
但し、式中のｎは０〜１０の整数であり、R7は水素原子、メチル基、置換又は無置換のアミノ基、カルボキシル基、t-ブチル基又はベンジル基である；
【化４】
2013187485.tif 000026
（４）
但し、式中のｎは１〜１０の整数であり、R8はメチル基、置換又は無置換のアミノ基、カルボキシル基、t-ブチル基又はベンジル基である；
【化５】
2013187485.tif 000027
（５）
【化６】
2013187485.tif 000028
（６）
【化７】
2013187485.tif 000029
（７）
【化８】
2013187485.tif 000030
（８）
【化９】
2013187485.tif 000031
（９）
【請求項６】
以下のステップ（１）及び（２）を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法：
（１）前記電子伝達体を還元し、還元型電子伝達体を生成するステップ；
（２）生成した還元型電子伝達体の存在下、前記逆反応における基質に前記酸化還元酵素を作用させるステップ。
【請求項７】
ステップ（１）が、前記電子伝達体に還元剤を作用させるステップ、又は前記電子伝達体、電子供与体及び光増感剤の共存下で光を照射するステップ、からなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
二酸化炭素の存在下、ギ酸脱水素酵素を触媒とした酵素反応を、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体を電子伝達体として用いて行うことを特徴とする、二酸化炭素をギ酸に変換する方法。
【請求項９】
ギ酸脱水素酵素、還元型の前記電子伝達体及び二酸化炭素が溶液中に共存する状態を形成し、二酸化炭素に対してギ酸脱水素酵素を作用させるステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記還元型の電子伝達体が、前記電子伝達体に還元剤を作用させること、又は前記電子伝達体、電子供与体及び光増感剤の共存下で光を照射することによって生成する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項５に定義した化合物を電子伝達体として用いることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、二酸化炭素からメタノールを生産する方法：
（ｉ）ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体を電子伝達体として用い、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法によって生成したギ酸にアルデヒド脱水素酵素を作用させることにより、ギ酸をホルムアルデヒドに変換するステップ；
（ｉｉ）ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体を電子伝達体として用い、ステップ（ｉ）によって生成したホルムアルデヒドにアルコール脱水素酵素を作用させることにより、ホルムアルデヒドをメタノールに変換するステップ。
【請求項１３】
請求項５に定義した化合物をステップ（ｉ）の電子伝達体及びステップ（ｉｉ）の電子伝達体として用いることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
以下のステップ（１）及び（２）を含む、二酸化炭素からメタノールを生産する方法：
（１）ギ酸脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体、電子供与体、光増感剤、及び二酸化炭素が溶液中に共存する状態を形成するステップ、
（２）前記溶液に光を照射するステップ、
【請求項１５】
ステップ（１）が以下のステップ（１−１）及び（１−２）、或いは（１−３）〜（１−５）からなる、請求項１４に記載の方法：
（１−１）溶媒にギ酸脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体、電子供与体、及び光増感剤を添加するステップ；
（１−２）ステップ（１−１）で得られた溶液に二酸化炭素を供給するステップ；
（１−３）溶媒にアルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体、電子供与体、及び光増感剤を添加するステップ；
（１−４）ステップ（１−３）で得られた溶液に二酸化炭素を供給するステップ；
（１−５）ステップ（１−４）後の前記溶液にギ酸脱水素酵素を添加するステップ。
【請求項１６】
不溶性支持体と、
前記不溶性支持体に固定化されたヒドロゲナーゼ、人工電子伝達体及び光増感剤
を含む、水素生産反応ユニット。
【請求項１７】
前記不溶性支持体が樹脂、金属、半導体、セラミック、及びガラスからなる群より選択される不溶性支持体である、請求項１６に記載の水素生産反応ユニット。
【請求項１８】
前記光増感剤がポルフィリン誘導体、ルテニウムビピリジン錯体誘導体、ピレン誘導体、及びクロロフィル誘導体からなる群より選択される光増感剤である、請求項１６又は１７に記載の水素生産反応ユニット。
【請求項１９】
前記光増感剤がテトラキス（4-メチルピリジル）ポルフィリン亜鉛（ZnTMPyP）、テトラフェニルポルフィリンテトラスルフォネート（TPPS）、テトラフェニルポルフィリンテトラスルフォネート亜鉛（ZnTPPS）、ルテニウムトリスビピリジン、及びクロロフィルからなる群より選択される光増感剤である、請求項１６又は１７に記載の水素生産反応ユニット。
【請求項２０】
前記人工電子伝達体が、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体である、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の水素生産反応ユニット。
【請求項２１】
前記ビオローゲン化合物が式（１０）で表される化合物である、請求項２０に記載の水素生産反応ユニット。
【化１０】
2013187485.tif 000032
（１０）
【請求項２２】
前記ヒドロゲナーゼが、ラルストニア属微生物、クロストリジウム属微生物、水素細菌、硫酸還元菌、シアノバクテリア、及び藻類からなる群より選択される由来のヒドロゲナーゼである、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の水素生産反応ユニット。
【請求項２３】
前記ヒドロゲナーゼが、ラルストニア属微生物由来のヒドロゲナーゼである、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の水素生産反応ユニット。
【請求項２４】
前記水素生産反応ユニットと、
前記水素生産反応ユニットの前記不溶性支持体における、ヒドロゲナーゼ、人工電子伝達体及び光増感剤の固定化領域の上に、電子供与体を含有する液体を保持する、液相保持部材を含む、水素生産リアクター。
【請求項２５】
請求項１６〜２３のいずれか一項に記載された水素生産反応ユニットに、電子供与体が供給される条件下、光を照射するステップを含む、水素生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酸化還元酵素を触媒とした反応系の改良及び応用に関する。詳しくは、特定の電子伝達体を用いることによって酸化還元反応の逆反応を選択的に進行させる方法及びその応用としてのメタノールの生産方法等に関する。本出願は、２０１２年６月１６日に出願された日本国特許出願第２０１２−１３６４５２号及び２０１２年６月２１日に出願された日本国特許出願第２０１２−１３９８８７号に基づく優先権を主張するものであり、これらの特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
酸化還元酵素は代謝やエネルギー生産に関与するなど、生体において重要な役割を果たす。また、酸化還元酵素は産業上も極めて有用であり、分析や診断目的での測定や検定等に利用が図られている。近年、バイオエネルギー分野においても酸化還元酵素が利用されている。例えば、特許文献１、２には、メタノールを原料とした燃料電池にギ酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼを適用した例が示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００６／０５７３８７号パンフレット
【特許文献２】特表２００６−５０８５１９号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Chemistry Letters Vol. 33, No. 12, 1544-1545
【非特許文献２】D. Mandler, I. Willner, J. Chem. Soc., Perkin Trans., 2, 997 (1988).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
酸化還元酵素の反応は一般に可逆反応であることから、酸化還元酵素の利用を図る上で特に重要なことは、反応の制御、即ち、正反応と逆反応の内、必要な反応を選択的且つ効率的に進行させることである。例えば、タンパク質工学による酵素の改変や反応条件の調節（例えば、基質の添加量や反応生成物の存在量の調節、或いは温度条件の調節）などによって反応の制御が行われる。しかしながら、このような従来の手法が十分に奏功しない酸化還元酵素もある。例えば、本発明者らの研究グループが報告した光駆動型二酸化炭素−メタノール変換系（非特許文献１）では、３種類の脱水素酵素（ギ酸脱水素酵素（FDH）、アルデヒド脱水素酵素（AldDH）、アルコール脱水素酵素（ADH））による還元反応を連続的に進行させることによって、二酸化炭素がギ酸に、ギ酸がホルムアルデヒドに、そしてホルムアルデヒドがメタノールに順次変換されることになるが、反応系の効率化に最も重要といえる一段階目の反応（二酸化炭素をギ酸に変換する反応）は、ギ酸脱水素酵素による逆反応であり、その選択性を高めることが難しい。【０００６】
以上の事情に鑑み、本発明は、酸化還元酵素の反応の制御に有用な技術を提供することを課題とする。また、そのような技術の応用として、二酸化炭素からギ酸への効率的な変換を可能にする反応系及びそれを取り入れた効率的なメタノール生産系を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題の解決策を模索する中、本発明者らは天然の補酵素（例えばNAD+）に代えて人工補酵素（電子伝達体、メディエータ）を使用するという新たな視点に立ち、ギ酸脱水素酵素の反応系に焦点を絞った研究を進めた。ギ酸脱水素酵素の反応系としてメチルビオローゲンを人工補酵素として使用するものが過去に報告されているが（非特許文献２）、逆反応がどの程度進行するのか、或いは逆反応を選択的に進行させることができるのか等、不明な点が多い。そこで、メチルビオローゲンを人工補酵素としたギ酸脱水素酵素反応系の特徴を詳細に確認することにした。その結果、驚くべきことに、メチルビオローゲンを使用すると正反応は実質的に進行せず、逆反応が極めて選択的に進行することが明らかとなった。当該知見を得た後、更なる反応の効率化を目指し、4,4’-ビピリジン（BP）に様々なイオン性置換基を導入した人工補酵素を合成し、それらの有効性を比較した。詳細な検討の結果、人工補酵素の化学構造と酵素活性の間の法則性について重要且つ興味深い知見を得るに至った。【０００８】
以上の検討から、酸化還元酵素の反応の制御に人工補酵素の利用が有効であることが判明するとともに、効率的な反応に有効な人工補酵素が見出された。酸化還元酵素の反応を一方向化するためにはタンパク質工学を利用した酵素自体の改変や反応条件等の調節という、煩雑でしかも効果が限定的ともいえる手段に頼らざるをえない現状において、本発明者らによって明らかになった上記知見は、補酵素（メディエータ）を改良するという、斬新且つ飛躍的な効率化を期待できる解決手段を提供するものであり、その意義は大きく、新たな酵素反応改変手段として広範な分野での利用が期待される。以下に示す本願発明は、主として上記知見に基づく。【０００９】
［１］酸化還元酵素を触媒とした反応を、人工電子伝達体を用いて行うことを特徴とする、酸化還元反応の逆反応を選択的に進行させる方法。
［２］酸化還元酵素を触媒とした反応を、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体を電子伝達体として用いて行うことを特徴とする、酸化還元反応の逆反応を選択的に進行させる方法。
［３］酸化還元酵素がNAD依存型酵素である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］NAD依存型酵素が、ギ酸脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、乳酸脱水素酵素及びグルタミン酸脱水素酵素からなる群より選択される酵素である、［３］に記載の方法。
［５］前記電子伝達体が式（１）〜式（９）のいずれかの化学式で表される化合物である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の方法。
【化１】
2013187485.tif 000003
（１）
但し、式中のR1及びR2は、それぞれ独立に、置換又は無置換アルキル基、置換又は無置換アリール基、置換又は無置換アリールアルキル基であり、置換又は無置換アルキル基の場合のアルキル基部分の炭素数は１〜１２であり、置換又は無置換アリール基の場合のアリール基部分の炭素数は６〜２０であり、置換又は無置換アリールアルキル基の場合のアリールアルキル基の炭素数は７〜２０である；
【化２】
2013187485.tif 000004
（２）
但し、式中のR3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立に、置換又は無置換アルキル基、置換又は無置換アリール基、置換又は無置換アリールアルキル基であり、置換又は無置換アルキル基の場合のアルキル基部分の炭素数は１〜１２であり、置換又は無置換アリール基の場合のアリール基部分の炭素数は６〜２０であり、置換又は無置換アリールアルキル基の場合のアリールアルキル基の炭素数は７〜２０である； 
【化３】
2013187485.tif 000005
（３）
但し、式中のｎは０〜１０の整数であり、R7は水素原子、メチル基、置換又は無置換のアミノ基、カルボキシル基、t-ブチル基又はベンジル基である；
【化４】
2013187485.tif 000006
（４）
但し、式中のｎは１〜１０の整数であり、R8はメチル基、置換又は無置換のアミノ基、カルボキシル基、t-ブチル基又はベンジル基である；
【化５】
2013187485.tif 000007
（５）
【化６】
2013187485.tif 000008
（６）
【化７】
2013187485.tif 000009
（７）
【化８】
2013187485.tif 000010
（８）
【化９】
2013187485.tif 000011
（９）
［６］以下のステップ（１）及び（２）を含む、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法：
（１）前記電子伝達体を還元し、還元型電子伝達体を生成するステップ；
（２）生成した還元型電子伝達体の存在下、前記逆反応における基質に前記酸化還元酵素を作用させるステップ。
［７］ステップ（１）が、前記電子伝達体に還元剤を作用させるステップ、又は前記電子伝達体、電子供与体及び光増感剤の共存下で光を照射するステップ、からなる、［６］に記載の方法。
［８］二酸化炭素の存在下、ギ酸脱水素酵素を触媒とした酵素反応を、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体を電子伝達体として用いて行うことを特徴とする、二酸化炭素をギ酸に変換する方法。
［９］ギ酸脱水素酵素、還元型の前記電子伝達体及び二酸化炭素が溶液中に共存する状態を形成し、二酸化炭素に対してギ酸脱水素酵素を作用させるステップを含む、［８］に記載の方法。
［１０］前記還元型の電子伝達体が、前記電子伝達体に還元剤を作用させること、又は前記電子伝達体、電子供与体及び光増感剤の共存下で光を照射することによって生成する、［９］に記載の方法。
［１１］［５］に定義した化合物を電子伝達体として用いることを特徴とする、［８］〜［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、二酸化炭素からメタノールを生産する方法：
（ｉ）ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体を電子伝達体として用い、［８］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法によって生成したギ酸にアルデヒド脱水素酵素を作用させることにより、ギ酸をホルムアルデヒドに変換するステップ；
（ｉｉ）ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体を電子伝達体として用い、ステップ（ｉ）によって生成したホルムアルデヒドにアルコール脱水素酵素を作用させることにより、ホルムアルデヒドをメタノールに変換するステップ。
［１３］［５］に定義した化合物をステップ（ｉ）の電子伝達体及びステップ（ｉｉ）の電子伝達体として用いることを特徴とする、［１２］に記載の方法。
［１４］以下のステップ（１）及び（２）を含む、二酸化炭素からメタノールを生産する方法：
（１）ギ酸脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体、電子供与体、光増感剤、及び二酸化炭素が溶液中に共存する状態を形成するステップ、
（２）前記溶液に光を照射するステップ、
［１５］ステップ（１）が以下のステップ（１−１）及び（１−２）、或いは（１−３）〜（１−５）からなる、［１４］に記載の方法：
（１−１）溶媒にギ酸脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体、電子供与体、及び光増感剤を添加するステップ；
（１−２）ステップ（１−１）で得られた溶液に二酸化炭素を供給するステップ；
（１−３）溶媒にアルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体、電子供与体、及び光増感剤を添加するステップ；
（１−４）ステップ（１−３）で得られた溶液に二酸化炭素を供給するステップ；
（１−５）ステップ（１−４）後の前記溶液にギ酸脱水素酵素を添加するステップ。
［１６］不溶性支持体と、
前記不溶性支持体に固定化されたヒドロゲナーゼ、人工電子伝達体及び光増感剤
を含む、水素生産反応ユニット。
［１７］前記不溶性支持体が樹脂、金属、半導体、セラミック、及びガラスからなる群より選択される不溶性支持体である、［１６］に記載の水素生産反応ユニット。
［１８］前記光増感剤がポルフィリン誘導体、ルテニウムビピリジン錯体誘導体、ピレン誘導体、及びクロロフィル誘導体からなる群より選択される光増感剤である、［１６］又は［１７］に記載の水素生産反応ユニット。
［１９］前記光増感剤がテトラキス（4-メチルピリジル）ポルフィリン亜鉛（ZnTMPyP）、テトラフェニルポルフィリンテトラスルフォネート（TPPS）、テトラフェニルポルフィリンテトラスルフォネート亜鉛（ZnTPPS）、ルテニウムトリスビピリジン、及びクロロフィルからなる群より選択される光増感剤である、［１６］又は［１７］に記載の水素生産反応ユニット。
［２０］前記人工電子伝達体が、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体である、［１６］〜［１９］のいずれか一項に記載の水素生産反応ユニット。
［２１］前記ビオローゲン化合物が式（１０）で表される化合物である、［２０］に記載の水素生産反応ユニット。
【化１０】
2013187485.tif 000012
（１０）
［２２］前記ヒドロゲナーゼが、ラルストニア属微生物、クロストリジウム属微生物、水素細菌、硫酸還元菌、シアノバクテリア、及び藻類からなる群より選択される由来のヒドロゲナーゼである、［１６］〜［２１］のいずれか一項に記載の水素生産反応ユニット。
［２３］前記ヒドロゲナーゼが、ラルストニア属微生物由来のヒドロゲナーゼである、［１６］〜［２１］のいずれか一項に記載の水素生産反応ユニット。
［２４］前記水素生産反応ユニットと、前記水素生産反応ユニットの前記不溶性支持体における、ヒドロゲナーゼ、人工電子伝達体及び光増感剤の固定化領域の上に、電子供与体を含有する液体を保持する、液相保持部材を含む、水素生産リアクター。
［２５］［１６］〜［２３］のいずれか一項に記載された水素生産反応ユニットに、電子供与体が供給される条件下、光を照射するステップを含む、水素生産方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ギ酸脱水素酵素（FDH）が触媒する反応（上段）と、NADH及びギ酸生成濃度の時間変化（下段）。2.2mMギ酸、2.2mM NAD+及び5.0ユニットFDHの条件でインキュベートし、NADHを検出した（下段左）。一方、2.2mM CO2、2.2mM NADH及び5.0ユニットFDHの条件でインキュベートし、ギ酸を検出した（下段右）。
【図２】ビピリジン骨格を有する人工補酵素を用いた反応（上段）と、NADH及びギ酸生成濃度の時間変化（下段）。2.2mMギ酸、4.4mM メチルビオローゲン（MV2+）を使用）、及び5.0ユニットFDHの条件でインキュベートし、NADHを検出した（下段左）。一方、2.2mM CO2、ジチオン酸ナトリウムで化学的に還元したMV2+（4.4mM）及び5.0ユニットFDHの条件でインキュベートし、ギ酸を検出した（下段右）。
【図３】光駆動型二酸化炭素−メタノール変換系の概要。３種類の脱水素酵素（FDH、AldDH、ADH）による還元反応を連続的に進行させることによって、二酸化炭素がギ酸に、ギ酸がホルムアルデヒドに、そしてホルムアルデヒドがメタノールに順次変換される。この例ではメチルビオローゲン（MV2+）を電子伝達体として利用している。
【図４】人工補酵素の構造改変の例。メチルビオローゲンよりも陰イオン性を高める改変と陽イオン性を高める改変を試みた。
【図５】各種人工補酵素の構造。
【図６】実験方法の概要。サイクリックボルタンメトリーで還元電位を測定した（上）。一方、イオンクロマトグラフィーを利用してギ酸の反応速度を評価した（下）。
【図７】各人工補酵素の還元電位。
【図８】各人工補酵素のギ酸生成量。
【図９】実験結果のまとめ。人工補酵素の構造と、正電荷、還元電位、ギ酸生成量を比較した。
【図１０】テトラフェニルポルフィリンテトラスルフォネート（TPPS）の化学構造。
【図１１】ビオローゲン化合物の化学構造。
【図１２】カルボキシドデカンチオールの化学構造。
【図１３】TPPS、ビオローゲン化合物の含浸前後の吸光度。
【図１４】TPPS、ビオローゲン化合物の吸着量。
【図１５】ソーラー水素生産反応用リアクターの構造の例。
【図１６】可視光照射前（上）と1時間後（下）の基板表面の状態。
【図１７】TPPS-ピオローゲン化合物-ヒドロゲナーゼ固定基板を用いた光水素発生反応の経時変化。
【図１８】水素生産反応のスキーム。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の第１の局面は酸化還元酵素を用いた反応方法に関する。本発明の反応方法は、「酸化還元酵素を触媒とした反応を、人工電子伝達体を用いて行う」点で特徴付けられる。本発明によれば、酸化還元反応の逆反応を選択的に進行させることができる。即ち、酸化還元反応の制御が可能になる。本明細書において「逆反応」とは、酸化還元酵素の主たる反応（正反応）の逆の反応であり、例えば、脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）に区分される酵素においては、補酵素から水素イオンを奪い、奪った水素イオンを基質に渡す反応が逆反応に相当する。本発明は、例えば、ギ酸やメタノールの生産等に利用可能である。
【００１２】
「酸化還元酵素」とは、酸化還元反応を触媒する酵素の総称である。酸化還元酵素はその作用機構や反応生成物などに因んで脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）、酸化酵素（オキシダーゼ、還元酵素（レダクターゼ）などに分類される。
【００１３】
本発明では、好ましくは、NAD（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）依存型の酸化還元酵素が用いられる。NAD依存型とは、NADを補因子（補酵素）とする酵素の種類のことである。天然状態では、NAD依存型酵素の活性の発現にNADが必須となる。NAD依存型酸化還元酵素の例はギ酸脱水素酵素（FDH）、アルデヒド脱水素酵素（AldDH）、アルコール脱水素酵素（ADH）、乳酸脱水素酵素（LDH）、グルタミン酸脱水素酵素等である。
【００１４】
反応条件は、使用する酵素に一般的な反応条件を採用することができる。反応条件の例を示すと、ギ酸脱水素酵素の場合、温度20℃〜65℃、pH5〜10、アルデヒド脱水素酵素の場合、温度20℃〜70℃、pH4〜10、アルコール脱水素酵素の場合、温度0℃〜95℃、pH2〜12である。好ましい反応条件を示すと、温度20℃〜40℃、pH7.0〜8.5である。
【００１５】
使用する酵素に適切な反応条件は、過去の報告や成書（例えば天尾 豊 光化学，42, 107(2011).）を参考にして決定することができる。また、当業者であれば、予備実験を通して、最適な反応条件を容易に見出すことが可能である。
【００１６】
本発明の一態様では、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体を電子伝達体として用いることにより、酸化還元反応の逆反応を選択的に進行させる。即ち、本来の補酵素（補因子）ではなく、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体を人工の補酵素として使用する点に本発明の最大の特徴がある。ビオローゲン化合物は、4,4'-ビピリジンの二つのピリジン環窒素原子に置換基を導入したN,N'-二置換-4,4'-ビピリジニウムの慣用名である。置換基の導入により環窒素原子が正に帯電し、電子伝達体として機能する。好ましいビピリジニウム塩誘導体として、２つの塩化物イオンあるいは臭化物イオンを対イオンにもつものを用いることができる。
【００１７】
ビオローゲン化合物として、以下の式（１）で表される化合物を用いることができる。
【化１】
2013187485.tif 000013
（１）
但し、式中のR1及びR2は、それぞれ独立に、置換又は無置換アルキル基、置換又は無置換アリール基、置換又は無置換アリールアルキル基であり、置換又は無置換アルキル基の場合のアルキル基部分の炭素数は１〜１２であり、置換又は無置換アリール基の場合のアリール基部分の炭素数は６〜２０であり、置換又は無置換アリールアルキル基の場合のアリールアルキル基の炭素数は７〜２０である。
【００１８】
一方、ビピリジニウム塩誘導体として以下の式（２）で表される化合物を用いることができる。
【化２】
2013187485.tif 000014
（２）
但し、式中のR3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立に、置換又は無置換アルキル基、置換又は無置換アリール基、置換又は無置換アリールアルキル基であり、置換又は無置換アルキル基の場合のアルキル基部分の炭素数は１〜１２であり、置換又は無置換アリール基の場合のアリール基部分の炭素数は６〜２０であり、置換又は無置換アリールアルキル基の場合のアリールアルキル基の炭素数は７〜２０である。
【００１９】
上記式１の化合物又は式２の化合物において、アルキル基、アリール基又はアリールアルキル基における置換基は、例えば、置換又は無置換のアミノ基、カルボキシル基、t-ブチル基、ベンジル基である。置換アミノ基としては、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、ジ−ｎ−プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ｎ−ブチルアミノ基、ジ−ｎ−ブチルアミノ基、ｓｅｃ−ブチルアミノ基、ジ−ｓｅｃ−ブチルアミノ基、ｔｅｒｔ−ブチルアミノ基、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルアミノ基、ｎ−ペンチルアミノ基、２，２−ジメチルプロピルアミノ基、ｎ−ヘキシルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基、ｎ−ヘプチルアミノ基、ｎ−オクチルアミノ基、ｎ−ノニルアミノ基、ｎ−デシルアミノ基、ｎ−ウンデシルアミノ基、ｎ−ドデシルアミノ基、ｎ−トリデシルアミノ基、ｎ−テトラデシルアミノ基、ｎ−ペンタデシルアミノ基、ｎ−ヘキサデシルアミノ基、ｎ−ヘプタデシルアミノ基、ｎ−オクタデシルアミノ基、ｎ−ノナデシルアミノ基、ｎ−イコシルアミノ基、ピロリル基、ピロリジニル基、ピペリジニル基、カルバゾリル基、ジヒドロインドリル基及びジヒドロイソインドリル基等が挙げられる。
【００２０】
好ましい一態様では、ビオローゲン化合物として、以下の式（３）で表される化合物を用いる。
【化３】
2013187485.tif 000015
（３）
但し、式中のｎは０〜１０の整数であり、R7は水素原子、メチル基、置換又は無置換のアミノ基、アミノメチレン基、カルボキシル基、t-ブチル基又はベンジル基である。
【００２１】
好ましい他の一態様では、ビピリジニウム塩誘導体として、以下の式（４）で表される化合物を用いる。
【化４】
2013187485.tif 000016
（４）
但し、式中のｎは１〜１０の整数であり、R8はメチル基、置換又は無置換のアミノ基、カルボキシル基、t-ブチル基又はベンジル基である。
【００２２】
本発明で用いられるビオローゲン化合物の具体例を式（５）〜（９）に示す。
【化５】
2013187485.tif 000017
（５）（1,1'-ジメチル-4,4'-ビピリジニウム、別名：メチルビオローゲン）
【００２３】
【化６】
2013187485.tif 000018
（６）（1-メチル-1’-カルボキシルメチル-4,4’-ビピリジン）
【００２４】
【化７】
2013187485.tif 000019
（７）（1,1’-ジカルボキシメチル-4,4’-ビピリジン）
【００２５】
【化８】
2013187485.tif 000020
（８）（1-メチル-1'-アミノエチル-4,4’-ビピリジン）
【００２６】
【化９】
2013187485.tif 000021
（９）（1,1’-ジアミノエチル-4,4’-ビピリジン）
【００２７】
後述の実施例に示す通り、陽イオン性の化学構造を有する式（８）の化合物及び式（９）の化合物は酵素に対する親和性が高く（換言すれば、酵素と相互作用し易い）、特に有効な化合物である。従って、好ましくは、これらの化合物を採用する。上記の化合物（式（５）〜（９））の他、ビオローゲン化合物の具体例として、1,1'-ジベンジル-4,4'-ビピリジニウム、1,1’-ジヘキシル-4,4’-ビピリジニウム、1,1'-ジヘプチル-4,4'-ビピリジニウム、1,1’-ジノニル-4,4’-ビピリジニウム、1,1’-ジデシル-4,4’-ビピリジニウム、1,1'-ビス(2,4-ジニトロフェニル)-4,4'-ビピリジニウムジクロリド、1,1'-ジベンジル-4,4'-ビピリジニウムジクロリド水和物（ベンジルビオローゲン）、1,1'-ジヘプチル-4,4'-ビピリジニウムジブロミド、1,1'-ジメチル-4,4'-ビピリジニウムジクロリド（メチルビオローゲン）、1,1'-ジ-n-オクチル-4,4'-ビピリジニウムジブロミド及び1,1'-ジフェニル-4,4'-ビピリジニウムジクロリドを挙げることができる。尚、２種類以上の化合物を併用することにしてもよい。
【００２８】
本発明の反応方法は、典型的には、以下のステップ（１）及び（２）を含む。
（１）前記電子伝達体を還元し、還元型電子伝達体を生成するステップ
（２）生成した還元型電子伝達体の存在下、前記逆反応における基質に前記酸化還元酵素を作用させるステップ
【００２９】
ステップ（１）では電子伝達体（ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体）が還元され、還元型電子伝達体が生成する。電子伝達体を還元するためには電子伝達体に還元剤を作用させればよい。具体的には、例えば、反応の場となる溶液中で電子伝達体と還元剤が共存した状態を形成させる。各種還元剤を使用可能である。還元剤の例を挙げれば、ジチオン酸ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ヒドラジンであり、好ましくは、ジチオン酸ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、ヒドラジンである。より好ましくは、ジチオン酸ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウムであり、最も好ましくはジチオン酸ナトリウムである。
【００３０】
一方、電子供与体及び光増感剤の共存下で光を照射することによって電子伝達体を還元することにしてもよい。このように光エネルギーを利用した方法は、特に、循環型の反応系の構築に有効である。その組合せによって電子伝達体を還元可能である限りにおいて、任意の電子伝達体及び光増感剤を採用可能である。電子供与体（ドナー）には、電子供与基を持つ様々な化合物を用いることができる。電子供与体の例として、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸塩、エチレンジアミン塩酸塩、トリエチルアミン、メルカプトエタノールなどを挙げることができる。光増感剤の例として、ポルフィリン誘導体、ルテニウムビピリジン錯体誘導体、ピレン誘導体、クロロフィル誘導体などを挙げることができ、例えば、テトラキス（4-メチルピリジル）ポルフィリン亜鉛（ZnTMPyP）、テトラフェニルポルフィリンテトラスルフォネート亜鉛（ZnTPPS）、ルテニウムトリスビピリジン、クロロフィルを挙げることができる。
【００３１】
ステップ（２）では、ステップ（１）で生成した還元型電子伝達体の存在下、酸化還元酵素の逆反応における基質に酸化還元酵素を作用させる。このステップを行うためには、例えば、反応の場である溶液中に、生成した還元型電子伝達体、酸化還元酵素及び基質が共存する状態を形成した後、酵素反応に適した条件でインキュベートすればよい。反応時間は、目的に合わせて適宜設定すればよいが、例えば１〜４８時間である。
【００３２】
本発明の反応方法は、例えば、ギ酸脱水素酵素を触媒とした酵素反応（以下、「本発明のギ酸生成方法」）として実施することができる。即ち、本発明の反応方法の具体的態様の一つは、二酸化炭素の存在下、ギ酸脱水素酵素を触媒とした酵素反応を、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体を電子伝達体として用いて行うことを特徴とする、二酸化炭素をギ酸に変換する方法である。当該方法では、上記ステップ（２）として、例えば、ギ酸脱水素酵素、還元型の電子伝達体（ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体を）及び二酸化炭素が溶液中に共存する状態を形成し、二酸化炭素に対してギ酸脱水素酵素を作用させることになる。ギ酸脱水素酵素の由来は特に問わない。例えば、発現する事が知られている微生物Achromobacter parvulus、Ancylobacter aquaticus、Arthrobacter sp. Candida methanolica、Candida methylica、Clostridium acidurici、Cupriavidus necator、Cupriavidus oxalaticus、Cupriavidus oxalaticus、Desulfovibrio desulfuricans、Escherichia coli、Gelatoporia subvermispora、Glycine max、Hyphomicrobium sp.、Kloeckera sp.、Lotus japonicus、Methylophilus methylotrophus、Methylosinus trichosporium、Methylococcus capsulatus、Methylobacterium organophilum、Methylobacterium extorquens、Moraxella sp.、Mycobacterium vaccae、Ogataea pini、Paracoccus denitrificans、Paracoccus sp.、Pichia angusta、Pichia pastoris、Pisum sativum、Pseudomonas methylica、Rhodopseudomonas palustris、Saccharomyces cerevisiae、Thiobacillus sp.、Torulopsis candidaVigna radiata var. radiata由来のギ酸脱水素酵素等が使用できる。好ましくは、Candida boidinii由来のギ酸脱水素酵素（例えばロシュアプライドサイエンス及びシグマアルドリッチにより市販される）を用いることができる。野生型酵素の他、組換え型（リコンビナント）酵素を用いることもできる。
【００３３】
本発明の第２の局面は、上記第１の局面の応用であり、二酸化炭素からメタノールを生産する方法（以下、「本発明のメタノール生産方法」）に関する。本発明のメタノール生産方法の一態様は、以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含む。
（ｉ）ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体を電子伝達体として用い、本発明のギ酸生成方法によって生成したギ酸にアルデヒド脱水素酵素を作用させることにより、ギ酸をホルムアルデヒドに変換するステップ
（ｉｉ）ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体を電子伝達体として用い、ステップ（ｉ）によって生成したホルムアルデヒドにアルコール脱水素酵素を作用させることにより、ホルムアルデヒドをメタノールに変換するステップ。
【００３４】
本発明のステップ（ｉ）では、上記ギ酸生成方法によって生成したギ酸を基質としてホルムアルデヒドを得る。そのために本発明では、天然の補酵素に代えてビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体を人工の補酵素（電子伝達体）として用い、アルデヒド脱水素酵素による酵素反応（逆反応）を行う。電子伝達体の詳細については上記第１の局面と同様であるが、ギ酸の生成に利用した電子伝達体とステップ（ｉ）における電子伝達体は同一でなくてもよい。即ち、ギ酸の生成に第１の電子伝達体を用い、ステップ（ｉ）では第１の電子伝達体と異なる第２の電子伝達体を用いることにしてもよい。ここでの第２の電子伝達体は好ましくは、メチルビオローゲン、上記式（８）の化合物又は上記式（９）の化合物である。
【００３５】
好ましくは、ギ酸の生成に利用した電子伝達体と同一の化合物をステップ（ｉ）での電子伝達体に採用する。この態様によれば、より簡素な反応系を構築できることはもとより、同一反応溶液中で一連の反応（二酸化炭素からギ酸の生成、及びそれに続くギ酸からホルムアルデヒドの生成）を実施することが可能となる。同一反応液中で一連の反応を実施する場合は、反応溶液中にギ酸脱水素酵素とアルデヒド脱水素酵素が共存した状態でギ酸脱水素酵素による反応を開始させる場合と、反応溶液中にアルデヒド脱水素酵素が存在しない状態でギ酸脱水素酵素による反応を開始させた後、所定時間（例えば３０分〜２４時間）経過した後に、アルデヒド脱水素酵素を添加する場合の二つに大別される。前者では途中でアルデヒド脱水素酵素を投入する操作が不要であり（但し、不足する酵素を補給する目的などの下、アルデヒド脱水素酵素を後の段階で投入することにしてもよい）、操作が簡便となる。他方、後者では、アルデヒド脱水素酵素による反応の開始点を制御可能となる。
【００３６】
ステップ（ｉ）に続くステップ（ｉｉ）では、ステップ（ｉ）によって生成したホルムアルデヒドを基質としてメタノールを得る。そのために本発明では、ステップ（ｉ）と同様に、天然の補酵素に代えてビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体を人工の補酵素（電子伝達体）として用い、アルコール脱水素酵素による酵素反応（逆反応）を行う。電子伝達体の詳細については上記第１の局面と同様であるが、ギ酸の生成に利用した電子伝達体又はステップ（ｉ）に使用する電子伝達体とステップ（ｉｉ）における電子伝達体は同一でなくてもよい。例えば、ギ酸の生成に第１の電子伝達体を用い、ステップ（ｉ）に第２の電子伝達体を使用し、ステップ（ｉｉ）では、これら二つの電子伝達体とは異なる第３の電子伝達体を用いることにしてもよい。或いは、ギ酸の生成とステップ（ｉ）に同一の電子伝達体を使用し、ステップ（ｉｉ）のみ異なる電子伝達体を使用することにしてもよい。ステップ（ｉｉ）においても、好ましくは、メチルビオローゲン、上記式（８）の化合物又は上記式（９）の化合物を電子伝達体として採用する。
【００３７】
好ましくは、ギ酸の生成、ステップ（ｉ）及びステップ（ｉｉ）に同一の電子伝達体を使用する。この態様によれば、より簡素な反応系を構築できることはもとより、同一反応溶液中で一連の反応（二酸化炭素からギ酸の生成、ギ酸からホルムアルデヒドの生成、及びホルムアルデヒドからのメタノールの生成）を実施することが可能となる。尚、ステップ（ｉ）、ステップ（ｉｉ）のいずれについても、ギ酸の生成の場合と同様に、２種類以上の電子伝達体を併用してもよい。
【００３８】
操作の簡便化の観点からは、３種類全ての酵素が共存した状態でギ酸脱水素酵素による反応を開始させることが好ましいが、アルデヒド脱水素酵素及びアルコール脱水素酵素を後の段階で投入したり、或いはアルコール脱水素酵素のみを後の段階で投入したりすることも可能である。
【００３９】
本発明の他の一態様では、以下のステップ（１）及び（２）を行い、二酸化炭素からメタノールを生産する。
（１）ギ酸脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体、電子供与体、光増感剤、及び二酸化炭素が溶液中に共存する状態を形成するステップ
（２）前記溶液に光を照射するステップ
【００４０】
この態様は光駆動型二酸化炭素−メタノール変換反応系であり、光エネルギーを利用して還元した電子伝達体を人工補酵素として、ギ酸脱水素酵素による反応（二酸化炭素からギ酸の生成）、アルデヒド脱水素酵素による反応（ギ酸からホルムアルデヒドの生成）、及びアルコール脱水素酵素による反応（ホルムアルデヒドからのメタノールの生成）が順に進行する。その結果、最終産物としてメタノールが生成する。ギ酸脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素及び電子伝達体（ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体）に関しては、既に説明した通りであるため、その詳細な説明は省略する。
【００４１】
電子供与体（ドナー）には、電子供与基を持つ様々な化合物を用いることができる。電子供与体の例として、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸塩、エチレンジアミン塩酸塩、トリエチルアミン、メルカプトエタノールを挙げることができる。
【００４２】
光増感剤も特に限定されず、例えば、ポルフィリン誘導体、ルテニウムビピリジン錯体誘導体、ピエン誘導体などを挙げることができ、例えば、テトラキス（4-メチルピリジル）ポルフィリン亜鉛（ZnTMPyP）、テトラフェニルポルフィリンテトラスルフォネート亜鉛（ZnTPPS）、ルテニウムトリスビピリジン、クロロフィルなどを用いることができる。
【００４３】
各酵素、電子伝達体、電子供与体、光増感剤及び二酸化炭素の共存状態は、光を照射するステップを実施する段階に形成されていればよい。従って、各要素の添加順序や添加方法等は特に限定されない。例えば、一態様では、ステップ（１）として、以下のステップ（１−１）と（１−２）を行う。
（１−１）溶媒にギ酸脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体、電子供与体、及び光増感剤を添加するステップ；
（１−２）ステップ（１−１）で得られた溶液に二酸化炭素を供給するステップ；
【００４４】
ステップ（１−１）における溶媒は、各酵素反応が進行するものであれば特に限定されない。例えば、ピロリン酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液を用いることができる。反応溶液のpHは例えば5〜10、好ましくは7.0〜8.5にするとよい。
ステップ（１−２）の二酸化炭素の供給は、例えば、エアレーション、溶液中へのバブリング、気相置換、炭酸塩の添加等によって行う。ステップ（１−２）をステップ（２）と並行して実施することにしてもよい。即ち、二酸化炭素を供給しつつ光を照射することにしてもよい。また、光照射後も引き続き二酸化炭素を供給することにしてもよい。供給様式としては、単回の供給、複数回（間欠的）の供給及び連続的な供給、或いは後２者の組合せのいずれを採用してもよい。
【００４５】
別の態様では、ステップ（１）として、以下のステップ（１−３）〜（１−５）を行う。
（１−３）溶媒にアルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体、電子供与体、及び光増感剤を添加するステップ；
（１−４）ステップ（１−３）で得られた溶液に二酸化炭素を供給するステップ；
（１−５）ステップ（１−４）後の前記溶液にギ酸脱水素酵素を添加するステップ。
【００４６】
この態様の特徴は最初の反応を担うギ酸脱水素酵素の添加を最後に行う点にある。この特徴によって反応開始時を制御し易くなる。ステップ（１−３）の各要素、二酸化炭素の供給方法（ステップ（１−４））、ギ酸脱水素酵素については、上記態様と同様であるため、その詳細な説明は省略する。尚、反応開始後（即ちステップステップ（１−５）に続くステップ（２）の後）に二酸化炭素を再度、供給することにしてもよい。
【００４７】
ステップ（１）に続くステップ（２）では、必要な成分が共存する状態にある溶液（即ち、ギ酸脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体、電子供与体、光増感剤、及び二酸化炭素を含む溶液）に光を照射する。光増感剤を励起可能である限り、光源の種類は特に限定されない。様々な光源を利用可能である。光源の例を挙げれば、冷陰極管、蛍光灯、水銀ランプ、ハロゲンランプ、紫外線ランプ、LEDランプ、LEDレーザー、EL（エレクトロルミネセンス）ライト等である。
【００４８】
本発明の更なる局面は水素生産反応ユニット及びその用途に関する。「水素生産反応ユニット」とは、水素を生産する一連の反応を行うための構造体であり、不溶性支持体、ヒドロゲナーゼ、人工電子伝達体及び光増感剤を含む。
【００４９】
ヒドロゲナーゼ、人工電子伝達体及び光増感剤は不溶性支持体に固定化されている。一連の電子の授受（伝達）が生ずるように、ヒドロゲナーゼ、人工電子伝達体及び光増感剤は、不溶性支持体において同一の領域に固定化される。典型的には、不溶性支持体の一部の領域が反応領域として利用され、当該領域にヒドロゲナーゼ、人工電子伝達体及び光増感剤を固定化する。但し、不溶性支持体の表面の全体を固定化領域に利用することにしてもよい。
【００５０】
不溶性支持体としては、例えばポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等の樹脂、金属、半導体、セラミック、ガラス等、水に不溶性の物質が用いられ、その材質は特に限定されない。不溶性支持体の形状も特に問わない。例えば、板状、球状、棒状などに成型した不溶性支持体を用いることができる。
【００５１】
固定化方法は特に限定されない。例えば、吸着、化学的結合等によって各要素（ヒドロゲナーゼ、人工電子伝達体及び光増感剤）を不溶性支持体に固定化する。後述の実施例に示したように、ゲル材料などによる包埋ないしコートによって固定化することもできる。
【００５２】
ヒドロゲナーゼは、水素酸化反応とプロトン還元反応を触媒する酵素である。本願発明では、水素（H2）が生成する反応、即ち、プロトン還元反応を利用する。ヒドロゲナーゼとしては、例えば、ラルストニア（Ralstonia）属微生物由来のもの（例えば、Van der Linden, E., T. Burgdorf, A. L. de Lacey, T. Buhrke, M. Scholte, V. M. Fernandez, B. Friedrich, and S. P. Albracht. 2006. An improved purification procedure for the soluble [NiFe]-hydrogenase of Ralstonia eutropha: new insights into its (in)stability and spectroscopic properties. J Biol Inorg Chem. 11:247-60を参照）、水素細菌由来のもの（例えば特開２０００−３５０５８５）、硫酸還元菌由来のもの（例えば、J Biosci Bioeng. 2013 Apr;115(4):366-71.を参照）、シアノバクテリア由来のもの（例えば、J Biol Chem. 2009 Dec 25;284(52):36462-72.を参照）、藻類由来のもの（例えば、Plant Physiol. 1984 Jul;75(3):705-9.を参照）、クロストリジウム（Clostridium）属微生物由来のもの（例えば、Methods Enzymol. 1978;53:286-96を参照）が挙げられる。好ましい一態様では、ラルストニア属微生物由来のヒドロゲナーゼが用いられる。当該ヒドロゲナーゼは上掲の文献（Van der Linden, E.らの文献）及びSchneider, K.らの文献（Schneider, K., and H. G. Schlegel. 1976. Purification and properties of the soluble hydrogenase from Alcaligenes eutrophus H16.Biochim. Biophys. Acta 452:66-80.）を参考にして調製することができる。調製方法の一例を示せば、培養後の菌体を破砕し、上清を回収した後、DEAE-セファロースカラム及びPhenyl-セファロースカラムで精製することにより、精製酵素を取得する。
【００５３】
人工電子伝達体にはビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体を用いることができる。ビオローゲン化合物又はビピリジニウム塩誘導体の詳細は上記の通りであるため、重複する説明を省略する。但し、この局面の好ましい一態様では人工電子伝達体として、以下の式（１０）で表されるビオローゲン化合物を用いる。
【化１０】
2013187485.tif 000022
【００５４】
光増感剤には、ポルフィリン誘導体、ルテニウムビピリジン錯体誘導体、ピレン誘導体、クロロフィル誘導体などを用いることができる。具体例を示せば、テトラキス（4-メチルピリジル）ポルフィリン亜鉛（ZnTMPyP）、テトラフェニルポルフィリンテトラスルフォネート（TPPS）、テトラフェニルポルフィリンテトラスルフォネート亜鉛（ZnTPPS）、ルテニウムトリスビピリジン、クロロフィルである。
【００５５】
本発明の水素生産反応ユニットを利用して水素を生産する場合、電子供与体が供給される条件下、光を照射することになる。電子供与体を供給するためには、電子供与体を含有する液体が用いられる。当該液体を、水素生産反応ユニットを構成する不溶性支持体における、ヒドロゲナーゼ、人工電子伝達体及び光増感剤の固定化領域に接触させることによって、電子供与体が供給されることになる。使用可能な電子供与は上記局面と同様であるため、対応する説明を援用することにし、重複する説明を省略する。一方、光源の種類は特に限定されない。様々な光源を利用可能である。典型的には、太陽光を利用する。但し、冷陰極管、蛍光灯、水銀ランプ、ハロゲンランプ、紫外線ランプ、LEDランプ、LEDレーザー、EL（エレクトロルミネセンス）ライト等、人工の光源を利用することにしてもよい。
【００５６】
電子供与体の共存下で光を照射することによって、光増感剤が励起され、励起された光増感剤から電子伝達体へと電子が移動し、電子を受け取った電子伝達体は還元され、還元型電子伝達体が生成する。還元型電子伝達体はヒドロゲナーゼに電子を供給する。これによって酵素反応が進行し、プロトンが還元され水素が発生する（図１８を参照）。
【００５７】
本発明の水素生産反応ユニットを利用して水素生産リアクターを構築することも可能である。水素生産リアクターの使用は、例えば、効率的及び／又は大規模な水素の生産に適する。水素生産リアクターには水素生産反応ユニットと、水素生産反応ユニットの不溶性支持体における、ヒドロゲナーゼ、人工電子伝達体及び光増感剤の固定化領域の上に、電子供与体を含有する液体を保持する液相保持部材が備えられる。液相保持部材は仕切り板、流路等によって構成することができる。筐体、液相を供給する手段（ポンプ、流路など）、生成した水素を回収する手段（流路、加圧器など）、生成した水素を一時的に保有しておくための空間等を備えることにしてもよい。また、光源（太陽光以外を使用する場合）を更に備えることにしてもよい。
【実施例】
【００５８】
１．ギ酸脱水素酵素（FDH）の反応特性の検討
ギ酸を二酸化炭素に変換する反応を触媒する酵素「ギ酸脱水素酵素（FDH）」は二酸化炭素をギ酸に変換する反応も触媒する。注目すべきは、二酸化炭素からギ酸への変換反応（逆反応）の速度はギ酸を二酸化炭素に変換する反応（正反応）の約6分の1である（図１）。当該酵素を利用して二酸化炭素からギ酸を生成しようとすれば、正反応をいかにして抑え込むかが重要となる。FDHの本来の補酵素はNAD+であるが、メチルビオローゲンを人工補酵素（メディエータ）として利用することもできる（非特許文献２）。しかしながら、過去の報告では、電気化学的な手法によりFDHとメチルビオローゲンとの間の相互作用のみが測定されているにすぎず、本質的な相互作用に関する知見は得られていない。そこで、メチルビオローゲンを人工の補酵素としたFAD反応系の特徴を詳細に調べることにした。その結果、驚くべきことに、ギ酸を二酸化炭素に変換する反応が全く進行せず、ギ酸を二酸化炭素に変換する反応だけが進行した（図２）。即ち、メチルビオローゲンを使用すれば、逆反応が極めて選択的に進行することが判明した。メチルビオローゲンは光増感分子を用いて容易に光還元することができるという利点も有する。対照的に、本来の補酵素であるNAD+の光還元は容易ではない。【００５９】
２．反応効率の向上を目指した検討
本発明者らの研究グループは、３種類の脱水素酵素（FDH、AldDH、ADH）を利用した光駆動型二酸化炭素−メタノール変換系を報告している（非特許文献１。図３を参照）。メチルビオローゲンはFDHのメディエータ（電子伝達体）として有用であるが（上記参照）、AldDH及びADHのメディエータとしても利用できる。メチルビオローゲンをメディエータとした光駆動型二酸化炭素−メタノール変換系では、光エネルギーによってメチルビオローゲンを光還元し、３種類の脱水素酵素の反応によって、二酸化炭素がギ酸、ホルムアルデヒドを経由してメタノールに変換される。これらの酵素は還元型メチルビオローゲンのみを基質として認識するため、天然の補酵素NAD＋を用いたときに見られる可逆反応の必要な反応（即ち逆反応）のみを取りだすことができる。従って、選択的且つ効率的な反応を実現できる。【００６０】
メタノールの生成効率を上げるためには、二酸化炭素をギ酸に変換する効率を上げることが最も重要且つ効果的である。そこで、メタノール生成の最重要段階である二酸化炭素からギ酸への変換反応の効率向上を目的として、ビピリジニウム塩に様々なイオン性置換基を導入した人工補酵素を合成し（図４、図５）、FDHを用いた二酸化炭素−ギ酸変換反応における、人工補酵素の化学構造と機能の相間について調べた。【００６１】
（１）材料・方法
（１−１）人工補酵素の合成と電気化学的特性
合成した、4,4’-ビピリジン(BP)を基本骨格とした人工補酵素の化学構造を図５に示す。以下、メチルビオローゲンをMV2+、1-メチル-1’-カルボキシルメチル-4,4’-ビピリジンを人工補酵素A、1,1’-ジカルボキシメチル-4,4’-ビピリジンを人工補酵素B、1-メチル-1’-アミノエチル-4,4’-ビピリジンを人工補酵素C、1,1’-ジアミノエチル-4,4’-ビピリジンを人工補酵素Dとそれぞれ定義する（図５）。合成した人工補酵素の還元電位をサイクリックボルタンメトリー（作用極：グラッシーカーボン電極、参照極：塩化銀電極、対極：白金ワイヤー電極）を用いて測定した（図６）。【００６２】
（１−２）FDHを用いた二酸化炭素−ギ酸の変換反応
二酸化炭素−ギ酸の変換反応の条件は以下の通りである。十分に真空脱気し、気相を窒素に置換した人工補酵素（2 mM）1.5 ml、FDH（10ユニット/ml）0.1mlを含むpH 7.4ピロリン酸ナトリウム緩衝液（50 mM）2.0mlを、CO2ガスを導入しながら石英セル内でジチオン酸ナトリウム(5.7mmol)と混合し、反応温度30.5℃でインキュベートした。反応開始から1分後のギ酸生成濃度をイオンクロマトグラフにより定量した（図６）。【００６３】
（２）結果
（２−１）人工補酵素の合成と電気化学的特性
合成した人工補酵素のサイクリックボルタモグラムから求めた還元電位を図７に示す。今回合成した人工補酵素の場合、還元電位は-0.60〜-0.67Vであり、MV2+とほぼ同じ値になった。このことから4,4’-ビピリジンに置換基を導入しても酸化還元電位には大きな影響を与えないことが分かった。【００６４】
（２−２）人工補酵素とFDHを用いた二酸化炭素−ギ酸変換反応
次に人工補酵素とFDHを用いた二酸化炭素−ギ酸変換反応を調べた。反応開始1分後のギ酸生成濃度を比較した結果を図８に示す。MV2+を基準にして考えるとギ酸生成量は陽イオン性のアミノ基を付加することで正電荷が多い人工補酵素C及びDを用いたときに増加した。これに対して陰イオン性のカルボキシ基を付加した人工補酵素A及びBを用いたときにはギ酸生成量は減少した。それぞれの人工補酵素の酸化還元電位に差がないことを考慮に入れると、本反応系でのギ酸生成量は人工補酵素の化学構造に依存しており、人工補酵素がより陽イオン性の化学構造を持つことによってFDHとの相互作用が強くなり、二酸化炭素−ギ酸反応を加速させたと考えられる。尚、各人工補酵素の構造、正電荷、還元電位及びギ酸生成量の関係を図９にまとめた。【００６５】
（３）考察
これまで、酵素の構造を改変して酵素活性を向上させる研究は進められてきたが、人工補酵素の化学構造と酵素活性、さらには反応抑制等に関する研究はほとんどない。本検討によって得られた知見は、今後の酵素利用技術の新しい展開につながると期待される。【００６６】
３．水素生産反応系の構築
近年、二酸化炭素の場加などの地球環境問題は悪化の一途をたどっている。そのため、二酸化炭素の増加の一因となる石油や石炭などの化石燃料に代わるエネルギーの早急な開発が必要である。そこで現在、水を分解し水素を獲得する系が注目されている。本発明者らの研究グループでは、電子供与体、光増感剤、電子伝達体及び触媒からなる光水素生産反応系を構築してきた。以下では、水素生産効率向上を目的として、光増感剤、電子伝達体及び触媒としてのヒドログナーゼを固定化した基板を利用した、新たな水素生産反応系を検討した。【００６７】
３−１．TPPS-ビオローゲン化合物-ヒドロゲナーゼ固定基板の作製
TPPS-ビオローゲン化合物-ヒドロゲナーゼ固定基板の作製を以下のように行った。【００６８】
（１）試薬
テトラフェニルポルフィリンテトラスルフォネート（C44H30N4O12S4=934.99)は東京化成株式会社から購入した。ビオローゲン化合物（C21H30O2IBr=520.8)を合成し、使用した。10-カルボキシ-1-デカンチオール(C11H22O2S=218.36)はDOJINDOで購入した。酵素ヒドロゲナーゼはラルストニア属微生物由来のものを使用した。pH6.86の中性リン酸塩緩衝液、ポリリジン、ポリグルタミン酸は和光純薬株式会社から購入したものを使用した。TPPS、ビオローゲン化合物、カルボキシデカンチオールの構造を図１０〜図１２に示す。【００６９】
（２）反応溶液の調製
TPPS、ビオローゲン化合物、カルボキシデカンチオールをそれぞれメタノールに溶かし、40μM、50μM、50μMになるように調製した。【００７０】
（３）TPPS-ビオローゲン化合物固定基板の作製
大きさ2.8×1.4cmのTLCプレート（シリカゲルプレート）を用意し、0.01Mの塩酸水溶液に30分間含浸して、両面をRO水で洗浄後、乾燥させた。塩酸処理したTLCプレートを、段落００６９で示した条件で調製したTPPS、ビオローゲン化合物、カルボキシデカンチオールの溶液1.7mlに、それぞれ30℃の恒温槽内にて1時間含浸させた。含浸後、カセットチューブポンプを用いてメタノール15mlを15分間かけて循環させた後、乾燥させた。【００７１】
（４）吸着量の測定
TLCプレート上でのTPPS、ビオローゲン化合物の吸着量を、TLCプレートを含浸させる前後のTPPS、ビオローゲン化合物溶液の吸光度を測定することで計算した。測定には、UV-VISIBLE SPECTROPHOTOMETER S-3150を使用した。【００７２】
TLCプレートを含浸させる前後のTPPS、ビオローゲン化合物溶液の紫外・可視吸収スペクトルを図１３に示す。またTPPS、ビオローゲン化合物のTLCプレートへの吸着量を図１４に示す。TPPS、ビオローゲン化合物の吸収はそれぞれ650nmおよび260nmに存在する。【００７３】
図１３及び図１４よりTPPS、ビオローゲン化合物ともに溶液に含有されていた量の約20%吸着できたと考えられた。溶液濃度はTPPSで40μM、ビオローゲン化合物で50μMのときがより吸着量が多いことから、以降の検討には当該濃度を使用した。【００７４】
（５）ヒドロゲナーゼの吸着
段落００７３に示した条件で、上述の通り作製したTPPS-ビオローゲン化合物固定基板上にヒドロゲナーゼを添加し乾燥させた。その後、基板上に中性リン酸緩衝溶液に溶かしたポリリジンとポリグルタミン酸をそれぞれ添加、乾燥し、ポリイオンコンプレックス薄膜を形成させることで、ヒドロゲナーゼの固定化を行った。【００７５】
３−２．ソーラー水素生産反応用リアクターの開発
可視光照射による光水素発生反応をするために、ソーラー水素生産用リアクターを作製した。以下、ソーラー水素生産用リアクターの作製方法について述べる。【００７６】
（１）材料
シリコンゴム（厚さ0.3cm)、ガラス板、両面テープ、クリップを使用した。【００７７】
（２）ソーラー水素生産反応用リアクターの作製
容積がそれぞれ1.4cm3および3.0cm3となるシリコンゴム性セパレーターを2つ用意し、それらを重ねてガラス板ではさんだ。下層部のガラス板には段落００７４で作製したTPPS-ビオローゲン化合物-ヒドロゲナーゼ吸着基板を両面テープで固定したものを使用した。完成図を図１５に示す。【００７８】
作製したリアクターは窒素ガスで十分に脱気し、光水素発生反応で必要な還元型ビオローゲン化合物の酸素による酸化を防いだ。十分な脱気後、作製したソーラー水素生産反応用リアクターの下層部に、電子供与体であるトリエタノールアミンを含有する反応溶液を満たした。その後、ソーラーシミュレーターを用いた可視光照射における光水素発生反応を検討した。【００７９】
３−３．可視光照射によるビオローゲン化合物の還元
ソーラー水素生産反応用リアクターを用いて水素発生反応を行うためには、基板上のビオローゲン化合物が可視光照射によって光還元される必要がある。そこで、TPPS-ビオローゲン化合物固定基板上のビオローゲン化合物が可視光照射によって光還元されることを確認した。【００８０】
（１）試薬
トリエタノールアミン(N(CH2CH2OH)3=149.19)は市販品を使用した。pH6.86の中性リン酸塩緩衝液は上記のものを使用した。【００８１】
（２）反応溶液の調製
トリエタノールアミン14.96gを量り取り、中性リン酸塩緩衝液に溶かし、塩酸水溶液を用いてpH7.4になるよう調整した。その後、中性リン酸塩緩衝液を加え、全量が100ml、終濃度1Mになるよう調製した。【００８２】
（３）可視光照射によるビオローゲン化合物の還元
ヒドロゲナーゼを吸着させていないTPPS-ビオローゲン化合物吸着基板を固定したソーラー水素生産反応用リアクターの下層部の液相に、段落００８１で述べた反応溶液を満たし、窒素ガスを用いて十分に脱気した。その後、上部からソーラーシミュレーター(100mWcm-2）を用いて1時間可視光を照射した。【００８３】
（４）画像解析
基板上のビオローゲン化合物が可視光照射によって光還元されたことを確認するために、ビオローゲン化合物部位の光還元に基づく基板表面での色変化を確認した。可視光照射前と1時間後の基板表面をそれぞれRGB解析により、任意の点100か所の積算を行った。測定には画像解析(Adobe Photoshop（登録商標）)を用いた。【００８４】
可視光照射前と1時間後の基板表面の様子を図１６に示す。可視光照射前と1時間後では、基板表面の色が明確に変化した。またRGB解析の結果、輝度値における緑の割合が0.34から0.40へ変化した。これは可視光照射によって励起されたTPPSからビオローゲン化合物へ電子移動が起こり、ビオローゲン化合物が光還元したことを示している。【００８５】
以上の結果より、TPPS-ビオローゲン化合物固定基板上のビオローゲン化合物部位は可視光照射によって光還元されることが確認された。【００８６】
３−４．ソーラー水素生産反応用リアクターを用いた光水素発生反応
上記の通り、固定化基板上のビオローゲン化合物を可視光照射によって光還元することができた。次に、TPPS-ビオローゲン化合物-ヒドロゲナーゼ固定化基板を用い、ソーラー水素発生反応用リアクターを使用した光水素発生反応を実施した。【００８７】
（１）試薬
トリエタノールアミン、中性リン酸塩緩衝液は上記のものを使用した。【００８８】
（２）反応溶液の調製
段落００８１で述べた反応溶液を使用した。【００８９】
（３）ソーラー水素生産反応用リアクターを用いた光照射による光水素発生反応
段落００７４で作製したTPPS-ビオローゲン化合物-ヒドロゲナーゼ吸着基板を固定したソーラー水素生産反応用リアクターの下層部の液相に、段落００８１で述べた反応溶液を満たし、窒素ガスを用いて十分に脱気を実施した。その後、上部からソーラーシミュレーター(100mWcm-2)を用いて可視光を照射した。可視光照射開始から一定時間ごとに気相を採取し、生成した水素をガスクロマトグラフィー(キャリアーガス：アルゴンガス、検出器:：TCD)を用いて定量した。【００９０】
水素発生の経時変化を図１７に示す。横軸が光照射時間を、縦軸が水素の生成量を示す。可視光照射によって、水素発生量が経時的に上昇していることが確認できた。光照射時間5時間時点での水素発生量は4.0nmolであった。【００９１】
以上の通り、TPPS、ビオローゲン化合物、ヒドロゲナーゼを同一基板に固定することにより、光水素発生用のデバイスが構築できた。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明の反応系では、人工の補酵素（メディエータ）としてビオローゲン化合物等を用いることにより、酸化還元反応の逆反応を選択的に進行させることができる。タンパク質工学を利用した酵素自体の改変や反応条件等の調節という従来の手段とは異なる、新たな酵素反応改変手段として、広範な分野（例えば、バイオエネルギー分野やバイオリファイナリー分野）で本発明の利用が期待できる。特に、二酸化炭素からメタノールを効率的に生産する手段として本発明は有用である。【００９３】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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