(57)【要約】  補酵素の添加なしに２級アルコールの一方の鏡像体を選択的に不斉酸化し、且つ、酸素存在下水溶媒系にて不斉酸化活性を有する蛋白質複合体とその製造方法、及び該蛋白質複合体の高分子化合物コーティングに関わる製造方法を提供する。  動植物由来水溶性粗蛋白質をゲルに包括する処理、該ゲルを空気酸化する処理、該ゲルから蛋白質複合体を水溶液中に溶出させる処理を有する第１の工程と、前記蛋白質複合体水溶液に重力を掛けて蛋白質複合体を濃縮沈殿させる処理、該蛋白質複合体沈殿物を０．５ｍＭ程度のグリシン水酸化ナトリウム水溶液にて再溶解し高分子化合物と均一に共存させる処理、該共存水溶液を再沈殿させて脱水乾燥させて高分子化合物コーティング蛋白質複合体を得る第２の工程と、を含むことを特徴とする不斉酸化反応を有する蛋白質複合体の製造方法。
2014073673.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤ（Ｈ）及び／又はＮＡＤＰ（Ｈ）の不存在下においても過酸化水素との反応性を有する鉄含有蛋白質複合体を、動植物から製造する方法であって；以下の工程を含むことを特徴とする蛋白質複合体の製造方法。
動植物由来の蛋白質を酸素で酸化させる第１の工程と；
該第１の工程で得られた酸化生成物を固定化処理する第２の工程。
【請求項２】
前記第２の工程における固定化処理が、高分子化合物コーティング処理または化学修飾処理の少なくとも一方によって行われる請求項１に記載の蛋白質複合体の製造方法。
【請求項３】
前記第１の工程が、以下の（ａ１）〜（ａ３）の処理を含む、請求項１または２に記載の蛋白質複合体の製造方法。
（ａ１）動植物由来の蛋白質をゲルに包括する包括化処理、
（ａ２）該ゲルを酸素で酸化させる処理、
（ａ３）該酸化処理後のゲルから蛋白質複合体を溶出させる処理。
【請求項４】
前記第２の工程における固定化処理が高分子化合物コーティング処理であって；且つ該第２の工程が以下の（ｂ１）〜（ｂ３）の処理を含む、請求項２に記載の蛋白質複合体の製造方法。
（ｂ１）第１の工程で得られた酸化生成物の水溶液から、蛋白質複合体を沈殿させる処理、
（ｂ２）沈殿させた蛋白質複合体を、ｐＨ９〜１０の緩衝液中に溶解して、高分子化合物及びグルタルアルデヒドと共存させる処理、
（ｂ３）高分子化合物と共存させた水溶液を脱水乾燥処理して、高分子化合物コーティング蛋白質複合体を得る工程。
【請求項５】
前記（ｂ２）の処理において、０．５ｍＭグリシンＮａＯＨ（ｐＨ９〜１０）緩衝液に共存させる高分子化合物が、０．５％〜１．０％（ｖ／ｖ）、グルタルアルデヒドが１．０％〜３．０％である請求項４に記載の蛋白質複合体の製造方法。
【請求項６】
前記第２の工程における固定化処理が化学修飾処理であって；且つ該第２の工程が以下の（ｃ１）〜（ｃ３）の処理を含む、請求項２に記載の蛋白質複合体の製造方法。
（ｃ１）第１の工程で得られた酸化生成物の水溶液から、蛋白質複合体を沈殿させる処理、
（ｃ２）沈殿させた蛋白質複合体を水溶液中に溶解して、硫安と接触させる処理、
（ｃ３）硫安接触後の蛋白質複合体を化学修飾する処理
【請求項７】
前記グルタルアルデヒド添加が、鉄含有酵素本体への化学修飾化を目的とするものでなく、鉄含有酵素を含む蛋白質複合体（細胞膜を含む膜蛋白質断片）の一部を有機化学的に修飾するコーティングを目的とするものである請求項４または５に記載の蛋白質複合体の製造方法。
【請求項８】
前記第２の工程で得られた高分子化合物コーティング蛋白質複合体を紛体化処理する請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛋白質複合体の製造方法。
【請求項９】
動植物由来の鉄含有蛋白質複合体であって；且つ、ＮＡＤ（Ｈ）及び／又はＮＡＤＰ（Ｈ）の不存在下においても、過酸化水素との反応性を有することを特徴とする蛋白質複合体。
【請求項１０】
不斉酸化活性及び／又はカタラーゼ活性を有する細胞小器官に起因する機能を有する請求項９に記載の蛋白質複合体。
【請求項１１】
前記細胞小器官がミトコンドリアであり、前記機能が、膜蛋白質として内在するＰＱＱ−脱水素酵素とシトクロームｃオキシダーゼの鉄酸素依存的な電子移動的酸化活性に由来するものである請求項１０に記載の蛋白質複合体。
【請求項１２】
前記細胞小器官が葉緑体及び／又は小胞体であり、前記機能が、過酸化水素との反応性を示すカタラーゼ活性が局在する組織に由来するものである請求項１０に記載の蛋白質複合体。
【請求項１３】
前記細胞小器官が膜蛋白質として存在し、ＰＱＱ−脱水素酵素、シトクロームｃオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼの何れか２つ以上の酵素が含まれる請求項１０に記載の蛋白質複合体。
【請求項１４】
そのＦＴ−ＩＲスペクトルにおいて、１０８５±５０ｃｍ−１の領域に少なくとも１個のピークを有する請求項９〜１３のいずれか１項に記載の蛋白質複合体。
【請求項１５】
該領域が蛋白質内アミノ酸システインの空気酸化により生じる硫黄酸化物（Ｓ−Ｏ又はＳ＝Ｏ）由来のピークである請求項１４に記載の蛋白質複合体。
【請求項１６】
そのＮ末端から３３番目のアミノ酸までのアミノ酸配列として、以下の配列：
Ｓ＊ＳＩＳＹＳＴ＊ＹＡＴＮＴＶＡＱＹＬ＊ＤＷ＊ＡＹＦＧＤＬＮＨＲＥ
を含む成分であって；且つ、ＮＡＤ（Ｈ）及び／又はＮＡＤＰ（Ｈ）の不存在下においても、過酸化水素との反応性を有する成分を含む請求項９〜１５のいずれか１項に記載の蛋白質複合体。
【請求項１７】
前記配列より支持される鉄結合蛋白質が、ＰＱＱ−脱水素酵素、シトクロームｃオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼの酵素よりなる膜蛋白質ないし酵素群に由来する請求項１５に記載の蛋白質複合体。
【請求項１８】
前記酵素群には、ラセミ体アルコールのＲ体選択的不斉酸化反応のみならずＳ体選択的不斉酸化反応を触媒できる２種類が存在し、目的に応じて両鏡像体の使い分けが可能な請求項１７に記載の蛋白質複合体。
【請求項１９】
前記Ｓ体選択的不斉酸化反応には、卵白アルブミン由来の蛋白質複合体が利用可能な請求項１８に記載の蛋白質複合体。
【請求項２０】
前記蛋白質複合体が、高分子化合物コーティングされている請求項９〜１９のいずれか１項に記載の蛋白質複合体。
【請求項２１】
前記蛋白質複合体が、化学修飾処理されている請求項９〜１９のいずれか１項に記載の蛋白質複合体。
【請求項２２】
基質たるラセミ体アルコールに、請求項９〜２１のいずれか１項に記載の蛋白質複合体を作用させて、該ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に得ることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２３】
前記ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的にケトンへ不斉酸化することにより、反応に関わらない他方の鏡像体を選択的に得る、請求項２２に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２４】
請求項２０に記載の高分子化合物コーティングされた蛋白質複合体を用い、反応系における溶媒として水を用いる請求項２３に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２５】
請求項２１に記載の化学修飾処理された蛋白質複合体を用い、反応系における溶媒としてグリシンＮａＯＨ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ９．０）を用いる請求項２４に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２６】
請求項２０に記載の高分子化合物コーティングされた蛋白質複合体を用い、反応系における補助溶媒として、ＤＭＳＯ，ＩＰＡ，エタノール、水からなる群から選ばれる何れの溶媒を使用した場合でも、該蛋白質複合体が触媒活性を損なわない、請求項２２に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２７】
請求項２１に記載の化学修飾処理された蛋白質複合体を用い、反応系における補助溶媒として、ＤＭＳＯ（＜２％（ｖ／ｖ））を用いる請求項２４に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２８】
キャップフリー又は弱酸素供給の開封系の反応系において、触媒反応を行う請求項２２に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２９】
反応系における触媒ないし蛋白質複合体が、亜鉛とＮＡＤ（Ｐ）の電子移動系に伴う不斉酸化／還元反応ではなく、鉄と酸素の電子移動系に伴う不斉酸化反応を行う請求項２２に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項３０】
前記過酸化水素との反応性が、前記蛋白質複合体（粒径５０μｍ）の１５ｍｇを直径１８ｍｍφの試験管に入れ、これに５％過酸化水素水１．０ｍＬを加えた際に、酸素の発生に基づき、肉眼で視認可能な泡を生ずるレベルの反応性である請求項９に記載の蛋白質複合体。
【請求項３１】
前記蛋白質複合体（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間における平均速度により算出した比活性として、１０Unit  単位／ｇ（per  hour）以上の基質反応性を有する請求項９に記載の蛋白質複合体。
【請求項３２】
前記蛋白質複合体（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）、０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間において、ナプロキセン前駆体（ｓ−１）を与えるエナンチオ選択性が、９５ｅｅ％以上である請求項９に記載の蛋白質複合体。
【請求項３３】
前記高分子化合物が、分子量４０００以上であることを特徴とする請求項４に記載の蛋白質複合体の製造方法。
【請求項３４】
前記高分子化合物が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項３３に記載の蛋白質複合体の製造方法。
【請求項３５】
前記高分子化合物が、分子量の異なる高分子化合物の混合物であって、
該混合物は、分子量４０００以上の高分子量高分子化合物と分子量１０００以下の低分子量高分子化合物からなり、かつ、該低分子量高分子を３分の１以上含むことを特徴とする請求項４に記載の蛋白質複合体の製造方法。
【請求項３６】
前記高分子化合物が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項３５に記載の蛋白質複合体の製造方法。
【請求項３７】
前記高分子化合物が、分子量４０００以上であることを特徴とする請求項２０に記載の蛋白質複合体。
【請求項３８】
前記高分子化合物が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項３７に記載の蛋白質複合体。
【請求項３９】
前記高分子化合物が、分子量の異なる高分子化合物の混合物であって、
該混合物は、分子量４０００以上の高分子量高分子化合物と分子量１０００以下の低分子量高分子化合物からなり、かつ、該低分子量高分子を３分の１以上含むことを特徴とする請求項２０に記載の蛋白質複合体。
【請求項４０】
前記高分子化合物が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項３９に記載の蛋白質複合体。
【請求項４１】
前記高分子化合物が、分子量４０００以上であることを特徴とする請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項４２】
前記高分子化合物が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項４１に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項４３】
前記高分子化合物が、分子量の異なる高分子化合物の混合物であって、
該混合物は、分子量４０００以上の高分子量高分子化合物と分子量１０００以下の低分子量高分子化合物からなり、かつ、該低分子量高分子を３分の１以上含むことを特徴とする請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【請求項４４】
前記高分子化合物が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項４３に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも鉄、カルシウム、及び銅のいずれかを含み、且つ不斉酸化反応を触媒する活性を有する蛋白質複合体、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬、食品分野を始めとする種々の分野において、光学異性体を分離し、有用な一方の光学異性体を分取する技術の必要性が高まっている。例えば、光学異性体の一方を選択的に酸化還元又はデラセミ化する機能を有する不斉水素化（還元）酵素を用いて、医薬品や香料を生成させる方法について研究されている。【０００３】
生体内の化学変化は、通常は酵素で触媒される。このような酵素の作用・機構を有用物質生産や分析に利用するシステムの一つとして、バイオリアクターが挙げられる。【０００４】
バイオリアクターの中心となるのは、不溶性の担体に結合させた固定化酵素である。これによって、触媒となる酵素と生産物を容易に分離することができる。固定化酵素は、研究、医療、分析、産業に広く利用されている。化学反応を行わせるバイオリアクターの中枢部分は反応素子であり、原料を製品に変換したり化学変化を利用して分析に利用したりする目的で、精製した酵素、オルガネラあるいは細胞そのものが用いられている。反応素子はリアクター中に留まり、反復使用が可能なものでなければならないので、反応素子は種々の方法で固定化されている（このような酵素の活用の詳細に関しては、例えば、非特許文献１等を参照することが出来る）。【０００５】
しかしながら、酵素は精製する際には多額のコストがかかり、更には、精製された酵素は不安定なことが多いなど、多くの課題があるため、改善の余地がある。この理由から、精製酵素の代りに目的の酵素を含む微生物をそのまま固定化して用いる例がある。例えば、アスパルターゼを含む微生物を固定化してＬ−アスパラギン酸を製造する例や、次いで、このプラントでつくられるアスパラギン酸を原料として、連続的にＬ−アラニンを製造した例などである（非特許文献１、非特許文献２等を参照）。【０００６】
非特許文献３のように、工業的にみる酸化還元触媒は微生物や酵母、植物培養細胞など、細胞内に内在する不斉水素化酵素と補酵素の機能をそのまま活用する方法がコスト的に優位であり、生物固体から酸化還元酵素や補酵素の単離・精製を行う余分な経費負担は、酵素の安定化や、ケトン→アルコール反応と補酵素ＮＡＤＨ→ＮＡＤ+反応、又はその逆反応を共役させる操作コストにおいて見合わないとされている。【０００７】
中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素（ＭＤＲ：medium-chain dehydrogenase／reductases）タイプのアルコール脱水素酵素（ＡＤＳ： alcohol dehydrogenases）は、補酵素ＮＡＤ（Ｈ）を使って二級アルコールの酸化反応を触媒でき、非特許文献４の総説によれば、この脱水素酵素には、電子移動システムとして働く触媒亜鉛（Catalytic zinc）と構造維持に働く構造亜鉛（Structural zinc）と両方が存在し、そのアミノ酸配列にはシステイン、ヒスチジンなどの位置においての規則性がみられる。【０００８】
市販のアルコール脱水素（酸化）水素化（還元）酵素は、これら微生物により生産された補酵素（ＮＡＤＨ→ＮＡＤ＋）と内在亜鉛との電子トランスファー依存的であるため、補酵素添加により生じる反応である。例えば、２級アルコール脱水素酵素を耐熱性処理した酵素商品としては、(株)耐熱酵素研究所が販売している２級アルコール脱水素酵素（商品名：Secondary alcohol dehydrogenase A）がある。【０００９】
微生物より精製せずに不斉水素化酵素をそのまま使用する工程を要約すると、基質変換反応を誘導する１）微生物の探索と採取→２）培養（半年間）→３）微生物反応となる。この場合の課題としては、１）微生物の発見と実用化までの時間・経費負担、２）該微生物操作に精通した専門家の立会い必須、などがある。５０万〜１００万種類に及ぶ有機金属触媒（ＢＩＮＡＰなど）による不斉水素化（還元）反応の課題は、１）有機溶媒中水素加圧下反応系による経費負担、２）反応後の有害金属（ルテニウムなど）残留、３）立体選択性の低さ（８５~９５％ｅｅが殆ど）にある。【００１０】
不斉脱水素（酸化）触媒のメリットは、この従来不斉技術の補助役として活用できる点にある。例えば、該ＢＩＮＡＰで生産された不必要な鏡像体を選択的に不斉酸化して除去する目的で利用できる。この場合の不斉酸化触媒は、１）専門家立会いが不要、２）水溶媒、３）高立体選択的（１００％ｅｅ）で進む低コスト反応系が望ましい。【００１１】
電子移動が、亜鉛より幅広い鉄を持つ酸化還元反応に関わる脱水素酵素の報告がある。例えば、非特許文献５では、キノプロテインを補酵素として持つメタノールやエタノールといった１級アルコール特異的な脱水素酵素（以下「ＣＣ１」という場合がある）が報告されている。このＰＱＱ−脱水素酵素のもつ一般的な反応式は次のとおりであり、酸素供給が反応に関わっている。
【化１】
2014073673.tif 000003
しかしながら、非特許文献５には、ＰＱＱ依存の２級アルコールの不斉脱水素反応についての報告はない。【００１２】
また、非特許文献６によれば、鉄の電子移動が関わるシトクロームオキシダーゼ（以下「ＣＣ２」という場合がある）が報告されている。
【化２】
2014073673.tif 000004
この反応には酸素の関与はないが、ＰＱＱと同様、非特許文献６にも、２級アルコールの不斉脱水素反応についての報告はない。【００１３】
非特許文献７によれば、鉄の電子移動が関わるペルオキシダーゼ（以下「ＣＣ３」という場合がある）が報告されている。
【化３】
2014073673.tif 000005
この反応にも酸素の関与はなく、ＰＱＱとシトクロームオキシダーゼと同様、やはり非特許文献７にも、２級アルコールの不斉脱水素反応についての報告はない。鉄の電子移動が関わるカタラーゼ（以下「ＣＣ４」という場合がある）についても酸素の関与はなく同様である。
【化４】
2014073673.tif 000006
このように、鉄の電子移動に元づく基づく２級アルコールの不斉脱水素酵素に関わる報告は知られていない。【００１４】
該鉄電子移動と酸素依存的な２級アルコールの不斉脱水素反応を示す新しい不斉脱水素（酸化）触媒を発明することにより、該ＢＩＮＡＰで生産された不必要な鏡像体を選択的に不斉酸化して除去できる。更に、補酵素のＮＡＤ（Ｐ）依存でないので１）専門家立会いは不要、必要なのは酸素だけなので、２）水溶媒で３）高立体選択的（１００％ｅｅ）で進む低コスト反応系が実現可能となる。【００１５】
これらの鉄電子移動系と酸素（Ｏ２）依存、場合によって補酵素（ＮＡＤ（Ｐ）及び／又はＦＡＤ）依存については更に、シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ（Ｐ４５０）が注目されている。非特許文献１４によれば、還元鉄が酸素分子を酸化剤とし、立体選択的・位置選択的な水酸化、エポキシ化、脱ハロゲン化などの酸化反応を触媒し、生体内の異物代謝やステロイド、脂肪酸、テルぺノイド、フロボノイドなどの二次代謝産物の生合成に作用することが示されている。【００１６】
非特許文献１５によれば、Ｐ４５０はあらゆる生物で異なる分子を選んで作用する目的で形成され、細菌で約２０種類、動物で約６０種類、植物で数百種類が判名している。植物にこの種類が多い理由として、特定の環境で発達・進化・適応することで他の生物より貪欲に獲得してきた結果であることが、非特許文献１６に示されている。【００１７】
非特許文献１７によれば、ヘモフォアは鉄結合蛋白質に内在ずる鉄捕獲蛋白質のことであり、膜蛋白に局在するＰＱＱ−ＡＤＤ、シトクロームオキシダーゼ、Ｐ４５０、更には、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、ＡＢＣトランスポーターに広がって存在することが記載されている。【００１８】
１００％ｅｅ近くの光学純度で、動植物由来粗蛋白から光学活性アルコールを分割した例が特許文献１に示されており、穀類又は豆類から水溶性蛋白質を抽出する第１の工程と、前記蛋白質をアルギン酸カルシウムゲルにて包括化する第２の工程と、前記包括化された蛋白質を触媒として基質の不斉酸化変換反応を行う第３の工程とを組み合わせて、光学活性アルコール（１００％ｅｅ、収率５０％）を合成している。また、特許文献２では、卵白及び卵白から分離されたオボアルブミンから選択される水溶性蛋白質を抽出する第１の工程と、前記蛋白質をアルギン酸カルシウムにて包括化する第２の工程と、前記包括化された蛋白質を触媒として基質の不斉酸化変換反応を行う第３の工程とを組み合わせて、光学活性アルコール（１００％ｅｅ）を合成している。【００１９】
更には特許文献３には、穀類又は豆類から水溶性蛋白質をアルギン酸カルシウムゲルに包括して空気酸化後、温水中に溶出される蛋白質画分を硫安沈殿させて、グルタルアルデヒドで化学修飾させ紛体化させる製造法と、それを用いる光学活性アルコールの分割／合成されている。【００２０】
また、非特許文献８によれば、リパーゼをＰＥＧ（Poly（ethylene glycol））にてコーティング後、トルエン添加にてエマルジョンを形成後、２４時間の凍結乾燥処理を得て、ＰＥＧコーティング−リパーゼ複合体（白色紛体）を得ている。更に、イオン液体中（［Ｂｍｉｎ］［ＰＦ６］）にてアルコールの不斉アシル化反応が検討され、ＰＥＧでコーティングすることにより触媒活性の劇的な向上が観られるとの報告（ＩＬ１−ＰＳ：非特許文献１３）がある。【００２１】
化学工業における該リパーゼ加水分解酵素市場は、ＢＩＮＡＰ触媒及び微生物水素化に関わる不斉水素化市場に比べて小規模であり、１００分の１から１０００分の１程度と観られ、不斉酸化還元市場は大きい。従って、リパーゼでなく、ある不斉酸化酵素をＰＥＧコーティングする技術は市場的に興味深い。ＢＩＮＡＰ反応で生じた不要側の鏡像体を好適に取除く補助触媒として機能できる。しかし、既存のＰＥＧコーティング処理は、大量なるトルエン消費を要し、経費負担や環境負荷が懸念される。そこで、このような経費負担・環境負荷の懸念がある有機溶媒（トルエン等）を用いずに、コーティングする技術が強く望まれている。【００２２】
固定化酵素を作製する方法は、下記のような方法が代表的である。
１）該抽出・精製酵素を水不溶性の担体、例えば、セルロース、デキストラン、アガロース等の多糖類の誘導体、及びポリアクリルアミドゲル等に結合させる担体結合法、
２）該抽出・精製酵素を２個もしくはそれ以上の官能基を有する試薬を用いて該抽出・精製酵素間に化学修飾結合を形成させて固定する化学修飾法、
３）該抽出・精製酵素を、ゲル、例えば、アルギン酸塩、デンプン、コンニャク、ポリアクリルアミドゲル及びポリビニルアルコール等のゲルの細かい格子の中に取り入れる（格子型）か、半透明膜の皮膜によって被覆する（マイクロカプセル型）包括法【００２３】
これら固定化酵素の意義は、一般的に、反応後に好適に回収（より好ましくは、回収後に再利用）する点にある。この固定化技術を更に発展させて、固定化する生物材料に空気酸化を施して有益な材料に変化させる技術は、特許文献３の“アルギン酸カルシウムゲルに包括して空気酸化”処理にて新しいが、本処理の推定メカニズムが、蛋白質内システインの空気酸化に伴うジスルフィド結合の形成、及び／又は、ヘモフォア（鉄捕獲蛋白質）内鉄分子が還元されＰＣ自体を水溶性に変化が“滲み出し”効果と同時に“不斉酸化活性”効果が生む点については明確な根拠が観られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】特許第３２９４８６０号公報
【特許文献２】特許第３６８３１２９号公報
【特許文献３】国際特許公開ＷＯ２０１０／１３４６４２号公報
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】「化学増刊１１９  ハイブリッドプロセスによる有用物質生産」化学同人「バイオリアクター」福井三郎編、
【非特許文献２】バイオテクノロジーシリーズ、講談社「固定化酵素」千畑一郎編、講談社サイエンティフィック
【非特許文献３】“化学と工業”Vol．６２−１，January  ２００９、ｐｐ４４−４５
【非特許文献４】“Cell. Mol. Life. Sci. ６４ （２００８） ３９６１-３９７０”（The role of zinc foe alcohol dehydrogenase structure）「D.S.Auldら」
【非特許文献５】“Biochemistry ４０ （２００１） ９７９９-９８０９”（Site-directed mutagenesis and X-ray crystallogrally of the ＰＱＱ-containing quinoprotein methanol dehydrogenase and its electron acceptor, cytochrome cL）「Afolabi PRら」
【非特許文献６】“Biochem. Cell. Biol. ８４（２００６）８５９-８６９”（Defects in cytochrome oxidase assembly in humana: lessons from yeast.）「Zee JMら」
【非特許文献７】“Biochemistry  ４８（２００９）１-３”（Replacement of an electron transfer pathway in cytochrome c peroxidase with a surrogate peptide）「Hays  Putnam AMら」
【非特許文献８】“Org. Biomol.Chem.”No.２，ｐｐ１２３９-１２４４（２００４）（Poly（ethylene glycol）-lipase complex that are highly active and enantioselective in ionic liquid）「後藤ら；九州大学」
【非特許文献９】“食品と技術”  １２月号，ｐｐ１−９（２００８）（グルテンタンパク質のネットワーク形成における食塩の役割）「裏出令子；京都大学大学院農学研究科」
【非特許文献１０】「蛋白質  核酸  酵素」２００４年，１１月号，Ｖｏｌ．４９，Ｎｏ．１４  −ヘム酵素を中心とした金属酵素の分子設計−」（名古屋大学大学院理学研究科  渡辺芳人）
【非特許文献１１】「−Enantioselective synthesis of （S）-α-arylpropionic acid via Pd-catalyzed kinetic resolution of benzylic alcohols−」（Vinay V Thakur; from chemical engineering & process development division, national chemical laboratory, india）
【非特許文献１２】“Planta”２２６ （２） ｐｐ４６５-７４  （July ２００７）. “Nitrite-driven anaerobic ＡＴＰ synthesis in barley and rice root mitochondria”. “Stoimenova Mら.
【非特許文献１３】“Adv.Synth. Catal.”３５０ｐｐ１９５４−１９５８（２００８）．“Remarkable Activation of an Enzyme by (R)-Pyrrolidine-Substituted Imidazolium Alkyl PEG Sulfate”．”Yoshikazu Abeら”
【非特許文献１４】「化学と生物」Ｖｏｌ．５１，Ｎｏ．８、ｐｐ５２１−５２３（２０１３）。“リング状ヘテロ三量体タンパク質を利用した人工的な酵素複合体の構築、自己充足型シトクロムＰ４５０の構築”。“平川秀彦ら（東京大学大学院工学系研究科）”
【非特許文献１５】(d)“Chem. Res. Toxicol.” Ｖｏｌ．１４、ｐｐ６１１−６５０（２００１） “For more information on cytochrome p450 from a genomics perspective”。“ F. P. Guengerich。＊＊please check the Protein of the Month at the European Bioinformatics Institute.＊＊
【非特許文献１６】「化学と生物」Ｖｏｌ．５１，Ｎｏ．５、ｐｐ３１０−３１７（２０１３）。“植物が獲得した防御応答物質の生合成遺伝子クラスター、イネにおけるファイトアレキシン生産の制御機構”。“宮本皓司ら（東京大学生物生産工学研究センター）”
【非特許文献１７】“J. Bacteriol”１８２（１６）ｐｐ４４０１−４４０５（２０００）。“Functional Characterization of the HasAPF Hemophore and Its Truncated and Chimeric Variants: Determination of a Region Involved in Binding to the Hemophore Receptor”．”Sylvie Letoffeら”
【非特許文献１８】“ＰＮＡＳ”１０６（４）ｐｐ１０４５−１０５０（２００９）。“Heme uptake across the outer membrane as revealed by crystal structures of the receptor-hemophore complex”．“Stefanie Kriegら”
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明の目的は、本発明の目的は、上述した従来技術の欠点を解消しつつ、緩和（mild）な条件下で、不斉酸化反応を触媒する活性を有する蛋白質複合体を提供することにある。【００２７】
本発明の他の目的は、更に、環境的側面および安全性およびコスト性に優れた蛋白質複合体、及びその好適な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明者は鋭意研究の結果、不斉酸化反応を触媒する活性を有する蛋白質複合体を発見した。より詳しくは、本発明の蛋白質複合体を不斉酸化反応の触媒として使用する際に、少なくとも鉄の存在が、触媒活性に深く関与していることを見出し、更には従来技術で得られる蛋白質複合体よりも、鉄を多く含み、不純物が少なく、触媒活性の高い蛋白質複合体及びその製造方法を見出した。【００２９】
本発明は、例えば、以下の様態を含むことができる。【００３０】
［１］  ＮＡＤ（Ｈ）及び／又はＮＡＤＰ（Ｈ）の不存在下においても過酸化水素との反応性を有する鉄含有蛋白質複合体を、動植物から製造する方法であって；以下の工程を含むことを特徴とする蛋白質複合体の製造方法。
動植物由来の蛋白質を酸素で酸化させる第１の工程と；
該第１の工程で得られた酸化生成物を固定化処理する第２の工程。【００３１】
［２］  前記第２の工程における固定化処理が、高分子化合物コーティング処理または化学修飾処理の少なくとも一方によって行われる［１］に記載の蛋白質複合体の製造方法。【００３２】
［３］  前記第１の工程が、以下の（ａ１）〜（ａ３）の処理を含む、［１］または［２］に記載の蛋白質複合体の製造方法。
（ａ１）動植物由来の蛋白質をゲルに包括する包括化処理、
（ａ２）該ゲルを酸素で酸化させる処理、
（ａ３）該酸化処理後のゲルから蛋白質複合体を溶出させる処理。【００３３】
［４］  前記第２の工程における固定化処理が高分子化合物コーティング処理であって；且つ該第２の工程が以下の（ｂ１）〜（ｂ３）の処理を含む、［２］に記載の蛋白質複合体の製造方法。
（ｂ１）第１の工程で得られた酸化生成物の水溶液から、蛋白質複合体を沈殿させる処理、
（ｂ２）沈殿させた蛋白質複合体を、ｐＨ９〜１０の緩衝液中に溶解して、高分子化合物及びグルタルアルデヒドと共存させる処理、
（ｂ３）高分子化合物と共存させた水溶液を脱水乾燥処理して、高分子化合物コーティング蛋白質複合体を得る工程。【００３４】
［５］  前記（ｂ２）の処理において、０．５ｍＭグリシンＮａＯＨ（ｐＨ９〜１０）緩衝液に共存させる高分子化合物が、０．５％〜１．０％（ｖ／ｖ）、グルタルアルデヒドが１．０％〜３．０％である［４］に記載の蛋白質複合体の製造方法。【００３５】
［６］  前記第２の工程における固定化処理が化学修飾処理であって；且つ該第２の工程が以下の（ｃ１）〜（ｃ３）の処理を含む、［２］に記載の蛋白質複合体の製造方法。
（ｃ１）第１の工程で得られた酸化生成物の水溶液から、蛋白質複合体を沈殿させる処理、
（ｃ２）沈殿させた蛋白質複合体を水溶液中に溶解して、硫安と接触させる処理、
（ｃ３）硫安接触後の蛋白質複合体を化学修飾する処理
［７］  前記グルタルアルデヒド添加が、鉄含有酵素本体への化学修飾化を目的とするものでなく、鉄含有酵素を含む蛋白質複合体（細胞膜を含む膜蛋白質断片）の一部を有機化学的に修飾するコーティングを目的とするものである［４］または［５］に記載の蛋白質複合体の製造方法。【００３６】
［８］  前記第２の工程で得られた高分子化合物コーティング蛋白質複合体を紛体化処理する［１］〜［７］のいずれか１項に記載の蛋白質複合体の製造方法。【００３７】
［９］  動植物由来の鉄含有蛋白質複合体であって；且つ、ＮＡＤ（Ｈ）及び／又はＮＡＤＰ（Ｈ）の不存在下においても、過酸化水素との反応性を有することを特徴とする蛋白質複合体。【００３８】
［１０］  不斉酸化活性及び／又はカタラーゼ活性を有する細胞小器官に起因する機能を有する［９］に記載の蛋白質複合体。【００３９】
［１１］  前記細胞小器官がミトコンドリアであり、前記機能が、膜蛋白質として内在するＰＱＱ−脱水素酵素とシトクロームｃオキシダーゼの鉄酸素依存的な電子移動的酸化活性に由来するものである［１０］に記載の蛋白質複合体。【００４０】
［１２］  前記細胞小器官が葉緑体及び／又は小胞体であり、前記機能が、過酸化水素との反応性を示すカタラーゼ活性が局在する組織に由来するものである［１０］に記載の蛋白質複合体。【００４１】
［１３］  前記細胞小器官が膜蛋白質として存在し、ＰＱＱ−脱水素酵素、シトクロームｃオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼの何れか２つ以上の酵素が含まれる［１０］に記載の蛋白質複合体。【００４２】
［１４］  そのＦＴ−ＩＲスペクトルにおいて、１０８５±５０ｃｍ−１の領域に少なくとも１個のピークを有する［９］〜［１３］のいずれか１項に記載の蛋白質複合体。【００４３】
［１５］  該領域が蛋白質内アミノ酸システインの空気酸化により生じる硫黄酸化物（Ｓ−Ｏ又はＳ＝Ｏ）由来のピークである［１４］に記載の蛋白質複合体。【００４４】
［１６］  そのＮ末端から３３番目のアミノ酸までのアミノ酸配列として、以下の配列：
Ｓ＊ＳＩＳＹＳＴ＊ＹＡＴＮＴＶＡＱＹＬ＊ＤＷ＊ＡＹＦＧＤＬＮＨＲＥ
を含む成分であって；且つ、ＮＡＤ（Ｈ）及び／又はＮＡＤＰ（Ｈ）の不存在下においても、過酸化水素との反応性を有する成分を含む［９］〜［１５］のいずれか１項に記載の蛋白質複合体。【００４５】
［１７］  前記配列より支持される鉄結合蛋白質が、ＰＱＱ−脱水素酵素、シトクロームｃオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼの酵素よりなる膜蛋白質ないし酵素群に由来する［１５］に記載の蛋白質複合体。【００４６】
［１８］  前記酵素群には、ラセミ体アルコールのＲ体選択的不斉酸化反応のみならずＳ体選択的不斉酸化反応を触媒できる２種類が存在し、目的に応じて両鏡像体の使い分けが可能な［１７］に記載の蛋白質複合体。【００４７】
［１９］  前記Ｓ体選択的不斉酸化反応には、卵白アルブミン由来の蛋白質複合体が利用可能な［１８］に記載の蛋白質複合体。【００４８】
［２０］  前記蛋白質複合体が、高分子化合物コーティングされている［９〜１９］のいずれか１項に記載の蛋白質複合体。【００４９】
［２１］  前記蛋白質複合体が、化学修飾処理されている［９］〜［１９］のいずれか１項に記載の蛋白質複合体。【００５０】
［２２］  基質たるラセミ体アルコールに、［９］〜［２１］のいずれか１項に記載の蛋白質複合体を作用させて、該ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に得ることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。【００５１】
［２３］  前記ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的にケトンへ不斉酸化することにより、反応に関わらない他方の鏡像体を選択的に得る、［２２］に記載の光学活性アルコールの製造方法。【００５２】
［２４］  ［２０］に記載の高分子化合物コーティングされた蛋白質複合体を用い、反応系における溶媒として水を用いる［２３］に記載の光学活性アルコールの製造方法。【００５３】
［２５］  ［２１］に記載の化学修飾処理された蛋白質複合体を用い、反応系における溶媒としてグリシンＮａＯＨ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ９．０）を用いる［２４］に記載の光学活性アルコールの製造方法。【００５４】
［２６］  ［２０］に記載の高分子化合物コーティングされた蛋白質複合体を用い、反応系における補助溶媒として、ＤＭＳＯ，ＩＰＡ，エタノール、水からなる群から選ばれる何れの溶媒を使用した場合でも、該蛋白質複合体が触媒活性を損なわない、［２２］に記載の光学活性アルコールの製造方法。【００５５】
［２７］  ［２１］に記載の化学修飾処理された蛋白質複合体を用い、反応系における補助溶媒として、ＤＭＳＯ（＜２％（ｖ／ｖ））を用いる［２４］に記載の光学活性アルコールの製造方法。【００５６】
［２８］  キャップフリー又は弱酸素供給の開封系の反応系において、触媒反応を行う［２２］に記載の光学活性アルコールの製造方法。【００５７】
［２９］  反応系における触媒ないし蛋白質複合体が、亜鉛とＮＡＤ（Ｐ）の電子移動系に伴う不斉酸化／還元反応ではなく、鉄と酸素の電子移動系に伴う不斉酸化反応を行う［２２］に記載の光学活性アルコールの製造方法。【００５８】
［３０］  前記過酸化水素との反応性が、前記蛋白質複合体（粒径５０μｍ）の１５ｍｇを直径１８ｍｍφの試験管に入れ、これに５％過酸化水素水１．０ｍＬを加えた際に、酸素の発生に基づき、肉眼で視認可能な泡を生ずるレベルの反応性である［９］に記載の蛋白質複合体。【００５９】
［３１］  前記蛋白質複合体（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間における平均速度により算出した比活性として、１０Unit  単位／ｇ（per  hour）以上の基質反応性を有する［９］に記載の蛋白質複合体。【００６０】
［３２］  前記蛋白質複合体（粒径５０μｍ）の２０ｍｇを、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（Ｒａｃ−１）、０．８ｍＭの条件にて反応させた場合に、反応時間１５時間において、ナプロキセン前駆体（ｓ−１）を与えるエナンチオ選択性が、９５ｅｅ％以上である［９］に記載の蛋白質複合体。【００６１】
［３３］  前記高分子化合物が、分子量４０００以上であることを特徴とする［４］に記載の蛋白質複合体の製造方法。【００６２】
［３４］  前記高分子化合物が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする［３３］に記載の蛋白質複合体の製造方法。【００６３】
［３５］  前記高分子化合物が、分子量の異なる高分子化合物の混合物であって、
該混合物は、分子量４０００以上の高分子量高分子化合物と分子量１０００以下の低分子量高分子化合物からなり、かつ、該低分子量高分子を３分の１以上含むことを特徴とする［４］に記載の蛋白質複合体の製造方法。【００６４】
［３６］  前記高分子化合物が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする［３５］に記載の蛋白質複合体の製造方法。【００６５】
［３７］  前記高分子化合物が、分子量４０００以上であることを特徴とする［２０］に記載の蛋白質複合体。【００６６】
［３８］  前記高分子化合物が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする［３７］に記載の蛋白質複合体。【００６７】
［３９］  前記高分子化合物が、分子量の異なる高分子化合物の混合物であって、
該混合物は、分子量４０００以上の高分子量高分子化合物と分子量１０００以下の低分子量高分子化合物からなり、かつ、該低分子量高分子を３分の１以上含むことを特徴とする［２０］に記載の蛋白質複合体。【００６８】
［４０］  前記高分子化合物が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする［３９］に記載の蛋白質複合体。【００６９】
［４１］  前記高分子化合物が、分子量４０００以上であることを特徴とする［２２］〜［２４］のいずれか１項に記載の光学活性アルコールの製造方法。【００７０】
［４２］  前記高分子化合物が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする［４１］に記載の光学活性アルコールの製造方法。【００７１】
［４３］  前記高分子化合物が、分子量の異なる高分子化合物の混合物であって、
該混合物は、分子量４０００以上の高分子量高分子化合物と分子量１０００以下の低分子量高分子化合物からなり、かつ、該低分子量高分子を３分の１以上含むことを特徴とする［２２］〜［２４］のいずれか１項に記載の光学活性アルコールの製造方法。【００７２】
［４４］  前記高分子化合物が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする［４３］に記載の光学活性アルコールの製造方法。
【発明の効果】
【００７３】
本発明の特徴としては、例えば、以下の４点を挙げることができる。
（ａ）日本を含む１９３か国が加盟している１９９３年１２月２９日に発効した生物多様性条約（ＣＢＣ：Convention on Biological Diversity）、及び２０１０年１０月の生物遺伝資源の利用と利益配分（ＡＢＳ：Access and Benefit-Sharing）に関わる名古屋議定書に関連する、微生物遺伝資源には属さないこと。
（ｂ）高等植物／高等動物により作られた未使用生物資源（バイオマス）の有効利用であること。
（ｃ）遺伝的発展を成し遂げた、酸素の存在下、鉄電子移動システムを保持した蛋白質複合体であり、２級アルコールの不斉脱水素活性を有すること。
（ｄ）該蛋白質複合体が、カタラーゼを含む複数の鉄結合蛋白質（酵素）を保持する膜蛋白質であること。
従って、本発明によれば、微生物資源では補うことのできない機能、高等植物／高等動物でのみ作られる２級アルコールの不斉脱水素反応を有する蛋白質複合体が提供される。【００７４】
上述したように本発明によれば、実用的な不斉酸化反応を触媒する活性を付与した植物由来の蛋白質複合体、及び／又は動物由来の蛋白質複合体が提供される。
本発明によれば、更に、このような動植物由来の蛋白質複合体の紛体化に関わる好適な製造方法により、本発明の蛋白質複合体（以下、ＰＣと称す。）を、環境に優しく低コスト生産を実現する、高分子化合物コーティングされた蛋白質複合体として提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】高分子化合物コーティング蛋白質複合体（以下、ＨＰＣ−ＰＣと称す）の製造方法の一態様を表す概念図である。
【図２】化学修飾化蛋白質複合体（以下、ＣＬＰＣと称す。）の製造方法の一態様を表す概念図である。
【図３】ＰＣ加工品（ＣＬＰＣとＨＰＣ−ＰＣ）及びその原料の構成元素分析の結果を示すグラフ及び表の一例である。
【図４】ＰＣ加工品（ＣＬＰＣとＨＰＣ−ＰＣ）及びその原料のＦＴ−ＩＲの結果の一例を示すグラフである。
【図５】第１工程にて得られる蛋白質複合体（ＰＣ）水溶液を遠心分離して得られる上清み画分（Supernatant）の一態様の、（ａ）ゲル濾過クロマトグラフ分取と（ｂ）各分取フラクションの不斉酸化強度を示すHPLC結果グラフ及び写真の一例である。
【図６】第１工程にて得られるＰＣ水溶液を遠心分離して得られる各画分（A〜E）の一態様、及びゲル濾過クロマト分取フラクションＮｏ．３６（F）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果の一例を示す写真である。
【図７】基質ラセミ−６−メトキシ−１−（２−ナフチル）エタノール（以下、Ｒａｃ−１と称す）を用いるＨＰＣ−ＰＣの活性強度（Ｕｎｉｔ／ｇ  ｐｅｒ  ｈｏｕｒ）を導くグラフの一例である。
【図８】第１の工程で、豌豆蛋白質包括ゲルからPCが溶出される際のDOとｐＨの変化、更に、２４時間後に酸素供給した際のそれらの変化を示すグラフの一例である。
【図９】第１工程で得られる蛋白質複合体水溶液（PC suspension）の遠心分離後画分（上清み（Supernatant）、沈殿物（Precipitate））、及びＣＬＰＣとＨＰＣ−ＰＣの活性強度の違いの一例を示すグラフである。
【図１０】（ａ）第１工程にて得られるPC水溶液の各種硫安濃度での沈殿画分のＣＬＰＣの２４時間活性と４８時間活性の違い。（ｂ）豌豆蛋白質包括ゲルの空気酸化時間に及ぼすＣＬＰＣ収量と活性強度の関係の一例を示すグラフである。
【図１１】（ａ）と（ｂ）は、ＨＰＣ−ＰＣ作成時の高分子化合物量とその活性に及ぼす影響を示すグラフの一例である。（ｃ）連続基質ラセミ−１−（２−ナフチル）エタノール（以下、Ｒａｃ−２と称す）添加（３回：１０００ｐｐｍまで）の効果の一例を示すグラフの一例である。
【図１２】第１工程で得られるＰＣ水溶液の、基質Ｒａｃ−１に対する反応溶媒中の補酵素（ＮＡＤ（Ｐ）とＦＡＤ）の存在をＵＶ吸収から確認したグラフの一例である。
【図１３】各種補助溶媒のＣＬＰＣ活性強度に及ぼす影響を示したグラフの一例である。
【図１４】反応溶媒中ＤＭＳＯ濃度のＣＬＰＣ活性強度に及ぼす影響を示すグラフの一例である。
【図１５】（ａ）シトクロムＣオキシターゼ、及び（ｂ）ＰＱＱ−エタノール脱水素酵素中活性部位のジスルフィド結合；カルシウム；ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）のある位置を示す模式図の一例である。
【図１６】（ａ）空気酸化済生物材料包括ゲルより溶出されるＰＣより加工されるＨＰＣ−ＰＣが、各種２級アルコールを不斉酸化する様子を示す模式図の一例である。
【図１７】本発明の蛋白質複合体を用いるナプロキセン前駆体の合成と；更なるナプロキセン合成を示す模式図の一例、及び、従来のナプロキセン合成フローを示す模式図の一例である。
【図１８】ＰＣｓ−ｄｒｉｅｄ（コーティング無）と、ＣＬＰＣ（ＰＥＧ−ＭＷ：４０００）とＡＧＰＣ（ＰＥＧ−ＭＷ：４０００／１０００＝１／２）コーティング）による２．６％−Ｃａ２＋で覆われたＰＣ表面のマイクロスコープ画像である。
【図１９】ＣＬＰＣ（ＰＥＧ−ＭＷ：４０００）と、ＡＧＰＣ（ＰＥＧ−ＭＷ：４０００／１０００＝１／２）の比活性を求めた図である。
【図２０】ミトコンドリア中の酸化的リン酸化部位の電子移動連鎖を示す模式図の一例である。
【図２１】細胞膜のヘモフォア（鉄捕獲蛋白質）が鉄捕獲後にＨａｓＲ（受渡し蛋白質）に鉄受渡して再び定位置に戻る様子を示す模式図の一例である。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明を更に具体的に説明する。以下の記載において量比を表す「部」及び「％」は、特に断らない限り質量基準とする。
【００７７】
（高分子化合物コーティング蛋白質複合体（ＨＰＣ−ＰＣ）の製造方法）
以下、本発明の好ましい一態様における、高分子化合物コーティング蛋白質複合体の製造方法について述べる。
【００７８】
この態様において、高分子化合物コーティング蛋白質複合体（ＨＰＣ−ＰＣ）の製造方法は、動植物由来水溶性粗蛋白質をゲルに包括してゲルビーズを得る包括化処理、該ゲルビーズを空気酸化させる空気酸化処理、空気酸化された該ゲルビーズを水溶液に溶出させて蛋白質複合体（ＰＣ）水溶液を得る溶出処理を有する第１の工程と；前記蛋白質複合体水溶液に重力を掛けて蛋白質複合体を沈殿させる濃縮処理、該蛋白質複合体沈殿物を水溶液中にて高分子化合物と共存させ、引き続く凍結減圧乾燥（ＦＤ）処理して高分子化合物コーティング蛋白質複合体とする第２の工程と、を含むことが特徴である。
【００７９】
（第１の工程；包括化処理）
この態様において、包括化処理では、まず、動植物由来水溶性粗蛋白質をゲルに包括して疎水性の担体を得る。
【００８０】
ここで、動植物由来水溶性粗蛋白質（ＰＣ）とは、動物及び／又は植物から得られた粗蛋白質であり、市販のものを用いても、動物資源及び／又は植物資源から直接抽出して用いても良い。市販品としては、オルガノフードテック株式会社より販売されている豌豆蛋白（商品名「エンドウたん白ＰＰ−ＣＳ」）などが挙げられる。
【００８１】
このような「植物資源」としては、例えば、蕎麦、アマランサス、米、小麦、大麦、トウモロコシ、エンバク、ライ麦、粟、ヒエ、キビ、ハト麦、モロコシ等の穀類；小豆、インゲン豆、豌豆、リョクトウ、大豆等の豆類、更には一般的な草や雑草をも含めた、これらの種子、葉、茎、根、花、実の各植物組織も挙げられる。植物資源から粗蛋白質を抽出する方法は、特許文献１に開示されている方法などを適宜採用することが出来る。
【００８２】
更に、「動物資源」としては、卵白又はオボアルブミンとして、鶏卵由来のものが挙げられるが、鶏類、両生類、魚類の卵アルブミンも同様に用いることができ、鶏卵由来のものに限定するものではないし、由来の蛋白質を卵に限定するものでもない。動物資源から粗蛋白質を抽出する方法は、特許文献２に開示されている方法などを適宜採用することが出来る。
【００８３】
該生物材料包括ゲルを得る具体的な方法としては、例えば、アルギン酸塩、デンプン、コンニャク、ポリアクリルアミドゲル及びポリビニルアルコール等のゲルの細かい格子の中に取り入れる（格子型）か、半透膜性の皮膜によって被覆する（マイクロカプセル型）包括法があるが、蛋白質複合体を動植物資源より得る上では、アルギン酸のカルシウム塩を用いた包括化法が安価で環境に優しく、かつ、包括操作と回収操作が平易な点で最も好ましい
【００８４】
より具体的には、例えば、動植物由来水溶性粗蛋白質を蒸留水に溶かした後、アルギン酸ナトリウム水溶液を加えて均一になるまで撹拌し、得られた粗蛋白質―アルギン酸ナトリウム混合液に、塩化カルシウム水溶液中を滴下することで、包括化された粗蛋白質（ゲル）を得ることができる。ここで、塩化カルシウム水溶液の濃度は、５０ｍＭ以上であることが好ましい。
【００８５】
（第１の工程；空気酸化処理）
本発明の好ましい一態様において、空気酸化処理では、前記ゲルを空気に静置することで空気酸化させる。該空気酸化処理は、３０分以上、好ましくは３時間以上、より好ましくは５時間以上行うことで、最終的な本発明の蛋白質複合体をより高収率で得ることができる。この空気酸化処理が、粗蛋白質のアミノ酸成分の１つシステインが酸素と結合して形成される硫黄酸化物（Ｓ＝Ｏ及び／又はＳ−Ｏ）由来、及び／又は、ヘモフォア（鉄捕獲蛋白質）内鉄分子が還元されＰＣ自体を水溶性に変化する“水溶液中への「滲み出し」効果”、同時に、“不斉酸化反応を有する蛋白質複合体（例えばミトコンドリアなど）を溶出させる効果”を生んでいる。従って、空気酸化処理が本発明の蛋白質複合体の製造方法の鍵であり、必要不可欠となる。
【００８６】
該粗蛋白質包括ゲルの空気酸化過程では、３０℃以下が好ましく２０℃以下にて、細菌増殖を抑える点に注意して処理することがより好ましい。温水抽出まで速やかに処理を要するが、どうしても必要な場合は、１０℃以下４℃付近で該包括ゲルを冷蔵保存することもできる。しかしながら、その場合、活性強度の劣化を防ぐことの困難性が増大する。
【００８７】
（第１の工程；溶出処理）
本発明の好ましい一態様において、溶出処理は、空気酸化された該生物材料包括ゲルを水溶液にて蛋白質複合体を溶出させて得ることである。溶出させる手段としては、水中で該ゲルビーズを振とう／撹拌させることが好ましい。水は温水であることが好ましく、水温は３０〜５０℃であることが好ましい。振とうの回転数としては、該ゲルビーズが振れる範囲で適宜採用することが出来る。振とう時間としては、２０時間以上が好ましく、３０時間以上がより好ましい。振とう手段としては、恒温振とう培養器、撹拌調温タンクなどを用いることができる 。
【００８８】
該ゲルから蛋白質複合体（ＰＣ）の溶出が進むにつれて独特の硫黄臭が生じはじめ、３０℃〜４０℃での温水抽出の過程における細菌増殖も防げないが、硫黄臭が腐敗臭に変わる前までに、濃縮（遠心）操作とＦＤ乾燥操作をより速やかに行うことが好ましい。細菌増殖を腐敗臭産生まで放置すると、１）活性強度の低下、２）立体選択性の消失の原因を招く。腐敗臭産生を防ぐには、該ゲルを１０℃以下４℃付近で冷蔵保存することもできるが、その活性強度の低下は防げない。
【００８９】
（第２の工程；濃縮処理）
本発明の好ましい一態様において、濃縮処理では、前記第１の工程によって得られた蛋白質複合体水溶液に重力を掛けることによって、水溶液中に残った不純物を取り除き、該蛋白質複合体の濃縮沈殿物を得ることが目的である。手段としては、自然放置して地球重力沈む沈殿物を更に、遠心分離機により物理的に強い重力を掛けて、水溶液画分を除去して、濃縮した不斉酸化活性を有する蛋白質複合体（ＰＣ）を得る方法が挙げられる。速やかに該蛋白質複合体を濃縮できる方法であれば、この遠心分離法にこだわる必要はない。
【００９０】
この濃縮処理で得られた蛋白質複合体（ＰＣ）を、更に純度を高めて濃縮する目的として、沈殿物量に対して５倍等量の５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ9.0〜ｐＨ１０．０）を加えることでＰＣ機能を活性化でき、何度か遠心分離することで同時に洗浄することが出来る。洗浄処理は、濃縮処理で得られた蛋白質複合体の沈殿物に５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液を加えて再溶解後に、再度重力を掛けて、水溶液画分を除去することによって、水溶性の低分子化合物の不純物除去について行うことが出来る。一方、目的物の高分子蛋白質の濃縮については、フィールドフローフラクショネーション（FFF）法をつかって好適に行うことができる。
【００９１】
（第２の工程；高分子化合物コーティング処理）
本発明の好ましい一態様において、高分子化合物コーティング処理では、前記濃縮処理で得られた蛋白質複合体沈殿物に水溶液にて高分子化合物を共存させ、引き続く凍結減圧乾燥（ＦＤ）処理によって好適にコーティングすることができる。コーティングによって、該蛋白質複合体（ＰＣ）に対して、１）熱安定性向上の効果、２）立体選択性の保持効果、３）反応操作性の向上効果が賦与される。従って、コーティングしない場合、２級アルコールの両鏡像体が酸化される為に、光学活性アルコールの収率（最大５０％収率）が激減、又は、得られない結果となる。従って、蛋白質複合体の高分子化合物コーティング処理は本発明の製造方法として必要不可欠となる。
【００９２】
前記高分子化合物としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭ−セルロース）、α化デンプン、等があり、本願発明において用いることができる。この中でも、ＰＥＧは水溶性が高く、他の高分子化合物に比べて少量で該蛋白質複合体沈殿物をコーティングできることから、生産性に優れている。また、α化デンプンは他の高分子化合物に比べて蛋白質複合体を生産する為の原材全てが食用なので、経口投与できる栄養剤に利用することができる。
【００９３】
前記高分子化合物水溶液の濃度は、生産設備のスケールや、用いる高分子化合物の化学種によって適宜採用することができる。高分子化合物としてＰＥＧを用いる場合、前記濃縮処理で得られた蛋白質複合体の重量に対して０．２重量％程度、濃度にして０．５％〜１．０％のＰＥＧを用いることが好ましい。例えば、該蛋白質複合体沈殿物重量１００ｇ±１０ｇに対してＰＥＧ／５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０〜ｐＨ１０．０）水溶液：水量５００Ｌ当たりＰＥＧ（５．０±０．５ｇ）にて再溶解後、引き続いて凍結減圧乾燥（ＦＤ）させることにより、好適な活性強度を保持した蛋白質複合体に加工できる。
【００９４】
水溶液中の高分子化合物と蛋白質複合体の共存状態でも不斉酸化活性を有するが、細菌増殖にて進行する硫黄臭から腐敗臭への移行、これに伴う活性強度の低下が防げない為、溶液中から速やかに、保存性や流通性を高める粉末化処理を施す必要がある。
【００９５】
（第２の工程；紛体化処理）
本発明の好ましい一態様において、紛体化処理では、前記水溶液での高分子化合物と蛋白質複合体の共存状態から、引き続く乾燥脱水処理にて高分子化合物コーティング蛋白質複合体（紛体）を得る。粉末状に加工する手段としては、真空凍結乾燥、熱風乾燥、加圧乾燥、減圧乾燥、自然乾燥などの方法が挙げられる。このうち真空凍結乾燥は、水分を短時間で効果的に完全に除去できることから好ましい。真空凍結乾燥を行う場合、例えば、−５０℃程度で１時間以上、好ましくは完全に凍結させた後、系内を真空状態にし、温度を約５０℃まで昇温することで水分を昇華させる。尚、予め前記高分子コーティング蛋白質複合体の水溶液を凍結させた後、数日間保存後して減圧乾燥を行うこともできる。しかしながら、１週間以上の該共存水溶液の凍結保存は、活性強度を低下させる場合がある。
【００９６】
乾燥化した高分子化合物コーティング蛋白質複合体（ＨＰＣ−ＰＣ）は、更にボールミル粉砕などを行うことによって、常温保存できる粉末状の、且つ、不斉酸化反応を発現する触媒にできる。
【００９７】
（蛋白質複合体）
本発明の好ましい一態様において、本発明の蛋白質複合体（ＰＣ）は、少なくとも鉄を含有する蛋白質複合体であって、そのＦＴ−ＩＲスペクトルにおいて、１０８５±５０ｃｍ−１の領域に少なくとも１個のピークを有し、最も強い不斉酸化活性を有するフラクションにおいて、そのＮ末端から３３番目のアミノ酸までのアミノ酸配列が、以下の配列であり、
Ｓ＊ＳＩＳＹＳＴ＊ＹＡＴＮＴＶＡＱＹＬ＊ＤＷ＊ＡＹＦＧＤＬＮＨＲＥ、
且つ、過酸化水素との反応において顕著に泡立ち、酸素を放出することを特徴とする。
【００９８】
図３は、ＰＣ加工品（ＣＬＰＣとＰＥＧ−ＰＣ）の原料残存率を調べる目的（表１参照）にて、（ｉ）エンドウたん白粉末（ＰＰ）、（ｉｉ）化学修飾化蛋白質複合体（ＣＬＰＣ）、（ｉｉｉ）ＰＥＧコーティング蛋白質複合体（ＰＥＧ−ＰＣ）の無機系元素と有機系元素を分析した図である。無機系元素の分析は、ＩＣＰ発光分析、有機系元素の分析は、イオンクロマトグラフ法、元素分析装置などを適宜用いて分析した。本発明のＰＥＧ−ＰＣは、ＣＬＰＣに比べて、鉄濃度が４倍含有しており、カルシウム含量に至っては約２０倍に増加している。
【００９９】
図８は、第１の工程にて、空気酸化されたエンドウ蛋白質ゲルより蛋白質複合体が水溶液中にて溶け出す様子を示しているが、水溶液中ｐＨが次第にアルカリ側にシフトしている様子が読み取れる。この理由は、図３で示されたように、該蛋白質複合体が鉄イオン（酸化反応の電子移動として働く）を含むだけでなく、立体構造保持に働く多量のカルシウムも含まれることを意味し、これらのカチオン蛋白質（ＰＣ）が水溶液をアルカリ側にシフトさせるものと推察できる。
【０１００】
ＰＣは電子移動に関わる鉄と３次元的立体構造の保持に働く多くのカルシウムから成るカチオン性蛋白質である。従って、特許文献１と特許文献２で示されるように、図１の第１工程に示されるＰＣ溶液でさえも不斉酸化活性を保持している。特許文献３に示すＣＬＰＣの場合、グルタルアルデヒド化学修飾による化学的な３次元的保持（固定化）構造にある（なお、本発明では、図１の第２工程における「濃縮沈殿物を水で再溶解」とあるのは、「濃縮沈殿物をグリシン緩衝液（ｐＨ９〜１０）で再溶解」とすることが好ましい）。ＨＰＣ−ＰＣは、物理的な高分子化合物コーティング（固定）であり、該“アルカリ側水溶液へとシフト”及び“カルシウムの立体保持”の機能を合わせ持っている。表１０にて示される水溶媒系にて活性を有する理由は、これら２つの機能に起因するものと考えられる。
【０１０１】
図３と表１に示す通り、ＰＥＧ−ＰＣは、ＣＬＰＣに比べて、硫安含有量がない為、表１１に示す通り、不斉酸化活性とカタラーゼ活性が４倍に強くなる。ＣＬＰＣは、第２工程により硫安沈殿処理しており、この硫安１０％以上が化学修飾化・ＦＤ乾燥後にも残留して活性蛋白質の濃度が薄まる結果、活性が弱まると考えられる。
【０１０２】
図４（ａ）は、ＰＣ加工品（ＣＬＰＣとＰＥＧ−ＰＣ）の原料残存率（表１参照）を示している。（ｉ）エンドウ蛋白粉末（Pea protein）、（ｉｉ）ポリエチレングリコール（PEG）、（ｉｉｉ）ＰＥＧ−ＰＣ（Sanyo Catalyst １）、（ｉｖ）３０％硫安処理を施したＰＥＧ−ＰＣ（Sanyo Catalyst ２）、（ｖ）アルギン酸ナトリウム（Sodium alginate）を、ＦＴ−ＩＲにて解析した図である。図４（ｂ）は、同様の目的で、（ｉ）エンドウ蛋白粉末（Pea protein）、（ｉｉ）ＣＬＰＣ（SanyoCatalyst ８_６４_２０１１）、（ｉｉｉ）アルギン酸ナトリウム（Sodium alginate）を、ＦＴ−ＩＲにて解析した図を示している。
【０１０３】
図４（ａ）（ｂ）の結果から、アルギン酸Ｎａ＋残存量を示す１３００〜１５００ｃｍ−１のピークについて、ＰＥＧ−ＰＣ（Sanyo Catalyst １）は、ＰＥＧ−ＰＣ（Sanyo Catalyst ２）更にはＣＬＰＣ（SanyoCatalyst ８_６４_２０１１）に比べて、顕著に少なく又は検出されない。即ち、硫安を用いないＰＥＧ−ＰＣ（Sanyo Catalyst １）では、硫安だけでなく原料アルギン酸Ｎａ＋をも残留させない効果がある。
【０１０４】
以上から、表１に示す通り、ＨＰＣ−ＰＣ製造プロセスは、硫安と原料：アルギン酸Ｎａ＋の残留を未然に防く効果があり、従って、活性が４倍向上できた。エンドウ蛋白粉末（Pea protein）から好適に鉄結合蛋白を濃縮できるプロセスを見出し得た。
尚、１０８５±５０ｃｍ−１の領域に少なくとも有する１個のピークは、硫安やジスルフィド結合由来の硫黄酸化物（Ｓ＝Ｏ及び／又はＳ−Ｏ）を示すピークであり、この場合、アミノ酸システインの空気酸化により生じる“滲み出し効果”“不斉酸化反応を有する蛋白質複合体の溶出効果”を確認できるピークできる。
【０１０５】
図５（ａ）は、第１工程における遠心分離後上清い画分に含まれるＰＣについて、ゲル濾過クロマトグラフ分取の様子を示した図であり、図５（ｂ）は、分取された溶液（３ｍＬずつ）に基質ｒａｃ-２（０.８ｍＭ）を添加後、４８時間反応させた時のＨＰＬＣ結果をまとめた図である。No.３６に最も強い不斉酸化活性が認められている。
【０１０６】
図５（ａ）には、最上部：第１工程でのＰＣ溶液を遠心分離後得られる上清み画分、中間部：４％エンドウ蛋白粉末水溶液、最下部：分子量マーカー溶液である。各サンプルは限外濾過後、ゲル濾過クロマト装置に挿入した結果がまとられている。該上清み画分は、ゲル濾過クロマトにより６０本のバイヤルに３ｍＬずつ分取されたものである。
【０１０７】
図６には、強い活性が確認された該Ｎｏ．３６（Ｆ）とその他サンプルＡ〜ＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示している。サンプルＡ〜Ｅの詳細は、サンプルA：第１工程にて得られた蛋白質複合体（ＰＣ）水溶液、サンプルB：Aの遠心分離後の沈殿物を５倍等量分の５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ9.0〜ｐＨ１０．０）で再溶解したもの、サンプルC：その遠心分離後上清み画分、サンプルD：Aを３０％（w/v）硫安添加後に遠心分離された沈殿物の水再溶解溶液、サンプルE：Bを３０％（w/v）硫安添加後に遠心分離された沈殿物の水再溶解溶液である。その結果、強い不斉酸化活性が確認された該Ｎｏ．３６（Ｆ）の画分にて、分子量２０ｋＤａ付近に極めて濃い単一にバンドが表れている。
【０１０８】
更に、該濃い単一バンドの蛋白質同定する目的で、ゲルから切り離し、プロテインシーケンサーによるN末端シーケンス解析を実施した。その結果、バンド蛋白質の有するN末端からのアミノ酸配列が３３残基まで同定されている。得られたアミノ酸配列は、Ｓ＊ＳＩＳＹＳＴ＊ＹＡＴＮＴＶＡＱＹＬ＊ＤＷ＊ＡＹＦＧＤＬＮＨＲＥ、であり、そのアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ解析にて９３％相同性でヒットした「ＹＰ ２６２４４５.１」のヘモフォア（鉄捕獲蛋白質）の全てのアミノ酸シーケンスは、表３に示す通りである。
【０１０９】
図７（ａ）は、該鉄結合蛋白質を含むＰＥＧ−ＰＣ（５〜２０ｍｇ）について、水溶媒系（４ｍＬ）にて、室温４０℃、基質Ｒａｃ−１（１．２ｍＭ）の条件にて反応させ、縦軸には生成ケトン、横軸には反応追跡時間（２時間おき）の結果を示している。図７（ｂ）は、計算式｛生成ケトン量（ｍＭ）÷反応時間｝にて得られる活性強度（Unit/mg per hour）を縦軸、ＰＥＧ−ＰＣ量を横軸とした図である。
【０１１０】
図７（ｂ）の結果から、瞬間速度により算出した比活性が、１５〜３６Ｕｎｉｔ／ｇ（per  hour）であった。また、同様に、反応時間１２時間での、平均速度により算出した比活性が、１４Ｕｎｉｔ／ｇ（per  hour）であった。尚、本発明において、「ユニット」（Ｕｎｉｔ）とは、酵素活性の単位を示し、１ユニットは、１時間当たり１μモルの基質を変化させることができる酵素量（単位：μモル／ｈ）とする。また、「比活性」は、酵素の単位質量当たりの活性を示す。酵素１ｇあたりの比活性は、単位Ｕｎｉｔ／ｇで表した。
【０１１１】
ＰＥＧ−ＰＣは、不斉酸化活性に加えてカタラーゼ活性を有する。カタラーゼは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）と反応して酸素を放出する性質がある。粒径５０μｍの本発明のＰＥＧ−ＰＣを、直径１８ｍｍφの試験管に１５ｍｇ入れ、５％過酸化水素水１．０ｍＬを加えたとき、酸素の発生によって０．２ｃｍ〜３．５ｃｍ程度の泡を発生する。尚、この泡の高さは、表１１に示す通り、ＰＣ中の鉄濃度に比例し、ＣＬＰＣとの比較において、不斉酸化反応時間との比例した相関を確認できている。
【０１１２】
（光学活性アルコールの製造方法）
本発明の好ましい一態様において、光学活性アルコールの製造方法は、基質たるラセミ体アルコールに、ＨＰＣ−ＰＣを作用させて、該ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的に得ることが特徴である。
【０１１３】
また、ラセミ体アルコールの一方の鏡像体を選択的にケトンへ不斉酸化することにより、反応に関わらない他方の鏡像体を選択的に得ることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法もまた、本発明により提供される。
【０１１４】
（推定メカニズム）
本発明者の知見によれば、本発明の好ましい一態様において、好適な動植物由来の蛋白質複合体（ＰＣ）が提供されるのは、以下の理由によるものと推定される。
【０１１５】
安価な生物材料の動植物由来の粗蛋白質は、アルギン酸カルシウムゲルに包括されることで、カルシウム存在下、空気中で空気酸化できる環境を得ることができ、（ｉ）タンパク質内ジスフフィド結合の形成に導かれる形、及び／又は、ヘモフォア（鉄捕獲蛋白質）内鉄分子が還元されＰＣ自体を水溶性に変化する形で、ＰＣは水溶性へと性質変化を生じ、更に（ｉｉ）そのカチオン性を帯びた該ＰＣは水溶液をアルカリ側に変化させ、（ｉｉｉ）温水中で振るだけで好適に、不斉酸化反応を誘導するＰＣが溶出・精製されることとなる。
【０１１６】
温水中に溶出される溶存Ｃａ塩と酸素の存在は、例えば、エンドウ蛋白（ＰＰ）等の分子間のアミノ酸システインどうしのジスフフィド結合の形成、即ち、硫黄酸化物（Ｓ＝Ｏ及び／又はＳ−Ｏ）の生成に伴う水溶性への変化（ＰＰ→ＰＣ）を促し、温水中で容易に抽出できるよう助けている。ＰＣの触媒活性向上と収量向上と収量向上のポイントは、空気中で好適に該ゲルを空気酸化させる点と、温水中に溶け出す際の適度な溶存酸素量とＣａイオン濃度で「滲み出し」易くさせる点にある。
【０１１７】
本発明の製造方法においては、動植物蛋白質の有する空気酸化に伴うこれらの「滲み出し効果」とそれに伴う「不斉酸化反応を有するＰＣの溶出効果」の特性を生かして、好適にＰＣを得ることであり、アルギン酸カルシウムゲルによる固定目的ではなくて、好適に不斉酸化反応を有するＰＣを水溶性に変えて水で抽出する目的といった「逆転の発想」により、酵素様に作用するＰＣを低コストで、環境に優しく、効果的に抽出することに特徴がある。
【０１１８】
（推定メカニズムの関連文献）
上記した本発明の「推定メカニズム」のサポートに関しては、例えば、以下の文献を挙げることができる。
【０１１９】
非特許文献９では、食塩や塩化カルシウムには、グルテンタンパク質の相互作用を変化させてグリアジンやグルテニンを水に溶けるような性質に変化させる効果（水溶性効果）と、グルテン構成タンパク質間の相互作用を強めて分子間距離を短縮させる効果（凝集効果）が公知となっている。
【０１２０】
分子間距離を短縮させる効果（凝集効果）において、グルテン分子間距離は塩無添加では７．７Åであるが、塩添加の場合、分子間距離では６．４Å以内に短縮されることが示されている。ミオグロビンミュータントにみる活性ドメイン内のヒツチジン−鉄間の分子間距離は５．７Åであることから、塩添加による凝集効果は活性ドメインの機能性アミノ酸残基の適当な配置を設計する効果も期待できる。（非特許文献１０）
【０１２１】
更に、小麦粉生地の蛋白成分（グルテニンとグリアジン）は、食塩存在下で作製した場合には、この蛋白質分子間の相互作用を変化させ、純水では不溶性となり、食塩水では水溶性を示す性質に変化することにも報告がある。
【０１２２】
また、アミノ酸システインは、空気酸化に伴うジスルフィド結合形成の他にもＣａ、Ｆｅ、Ｚｎといった金属と結合し、酵素の立体構造維持に寄与している。アルギン酸Caゲルに包括させる意味は、この場合、動植物蛋白質に含まれるアミノ酸システインの空気酸化に伴う硫黄酸化物（Ｓ＝Ｏ及び／又はＳ−Ｏ）の形成、及び／又は、ヘモフォア（鉄捕獲蛋白質）内鉄分子が還元されＰＣ自体を水溶性に変化することによる「滲み出し効果」、更にはそれによる「不斉酸化反応を有するＰＣの溶出」を生かした「逆転の発想」によるもので、不斉酸化反応を有するＰＣを低コストで、環境に優しく、効果的に抽出することに特徴がある。
【０１２３】
（各種検討）
以下、本発明の好ましい一態様における、ＨＰＣ−ＰＣに関する種々の検討を記す。
【０１２４】
（各種検討；本発明の蛋白質複合体（ＣＬＰＣ、ＰＥＧ−ＰＣ）の構成元素分析）
図３と図４と表１と表１１から、ＰＣの紛体加工品ＣＬＰＣとＨＰＣ−ＰＣの構成成分に元づく詳細な情報を得ている。先ず、ＣＬＰＣ／ＰＥＧ−ＰＣの比較では、活性強度（４８時間／１３時間＝約４倍）、鉄含量（５９ｐｐｍ／２１５ｐｐｍ＝約４倍）となり、鉄結合蛋白質が本発明の不斉酸化活性の本丸に値すると示唆された。鉄電子移動系酵素には、例えば、非特許文献６に図１５（ａ）に示すシトクロームオキシダーゼ（cytochrome oxidase）があり、エタノールをアルデヒドに酸化する報告がある。シトクロームオキシダーゼは鉄イオンの電子移動のレギュレータ役として働いている（図１５（ａ））。
【０１２５】
更に、非特許文献５によれば、図１５（ｂ）に示すように鉄電子移動系には、ＰＱＱ-脱水素酵素（ＰＱＱ-containing quinoprotein methanol dehydrogenase）がある。しかし、これら鉄電子移動系には、それぞれ２級アルコール不斉酸化反応に関わる報告は無く、非特許文献４に示すCys（システイン）により保持された亜鉛とNAD（P）との電子移動（下記式）のみ、従来の酸化還元反応例として確認されていた。
【化５】
2014073673.tif 000007
従って、本発明の酸素依存的な鉄電子移動系による不斉脱水素反応は新規であり、補酵素添加を要しない新プロセスを提供するものである。
【０１２６】
（各種検討；本発明の蛋白質複合体（ＣＬＰＣとＨＰＣ−ＰＣ）のＦＴ−ＩＲ分析）
図４（ａ）と（ｂ）はＦＴ−ＩＲによる、ＰＥＧ−ＰＣ（SanyoCatalyst １：硫安添加無）、SanyoCatalyst ２：硫安添加有）とＣＬＰＣ（SanyoCatalyst８_６４_２０１１：硫安添加有）について、原材料のエンドウ蛋白質（ＰＰ）とアルギン酸Ｎａ＋のコンタミ具合を精査した結果である。その結果、表１のように、アルギン酸Ｎａ＋と硫安の残量は硫安を使用しないＰＥＧ−ＰＣ（SanyoCatalyst １）プロセスでほぼ除去できており、ＰＰから好適に目的の鉄結合蛋白質を濃縮できていることを確認した。
【０１２７】
表１１に示す通り、ＰＥＧ−ＰＣはＣＬＰＣに比べて、活性が４倍強く（４８時間→１３時間）、鉄含量が４倍に濃縮（５９ｐｐｍ→２１５ｐｐｍ）された。
【０１２８】
（各種検討；活性が強い画分の蛋白質同定）
ゲル濾過クロマト分取と該活性フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、引き続く該単一バンドのプロテインシーケンサーによるN末端シーケンス同定結果とそのＢＬＡＳＴ解析の結果から、ＰＣ活性に関わる酵素が、鉄結合蛋白質｛９３％の誤差範囲：HasAp gene product [Pseudomonas fluorescens Pf-５]｝と同定された。分子量の２０.８５３ Daであり、該活性フラクションNo３６のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果と一致した。
【０１２９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの特徴となる濃いバンドをMARDI-TOFとLC-MSMSにより蛋白質同定した結果を表４に示す。バンド３：コハク酸生産菌に関わる蛋白質について、バンド５のＡＴＰ-Binding Cassette （ABC） Transporter ファミリーの結果などから、ＰＣが、ミトコンドリアなど細胞内組織の膜蛋白質（カタラーゼを含む鉄結合酵素を含む）由来であり、その高分子量から好適に遠心分離にて濃縮できると推測した。図２０には、ミトコンドリア内複合体II（Complex II）を含むクエン酸回路と電子伝達系を紹介している。鉄電子移動系を有するＰＱＱ−脱水素酵素（非特許文献５；ＰＱＱ−ＡＤＨ；図１５（ｂ）に示す）とシトクロームオキシダーゼ（非特許文献６；ＣｙｔｃＯ；図１５（ａ）に示す）がここに存在している。図２１は、ミトコンドリア中の酸化的リン酸化部位の電子移動連鎖を示す模式図の一例である。
【０１３０】
（各種検討；ＣＬＰＣ不斉酸化反応の添加物添加による活性阻害試験）
不斉酸化反応を有するＰＣが、鉄電子移動系を有するＰＱＱ−脱水素酵素（非特許文献５）とシトクロームオキシダーゼ（非特許文献６）のような酵素であるためには、先ず、熱変性と化学変性されるか否かを確かめることが手っ取り早い。その結果、表６に示すとおり、酵素である根拠を得た。
【０１３１】
更に表７から、ＰＣが１ｍＭのキレート剤添加又はＺｎＣｌ２水溶液添加により活性を失う点から、鉄電子移動系（式（化１）又は（化２））に元づく酵素である根拠を得た。
以上より、鉄結合蛋白質であって、鉄電子移動（式（化１）及び／又は（化２））などを保有するＰＱＱ−脱水素酵素（非特許文献５）とシトクロームオキシダーゼ（非特許文献６）であると判定できた。
【０１３２】
該鉄結合蛋白質は、図１に示す第１工程のように、空気酸化後、カタラーゼを含む鉄結合酵素を含む膜蛋白質として温水中に溶出され、遠心分離により平易に濃縮沈殿できる。該沈殿物を、水溶液中にて高分子化合物と共存させ、ＦＤ処理することで保存性を高めた粉末のＨＰＣ−ＰＣに加工でき、２級アルコールを不斉酸化できる触媒となる。
【０１３３】
ＨＰＣ−ＰＣは、酸素と鉄依存の電子移動系であり、補因子のNAD（P）添加は要せず、緩衝液やpH条件の選定をも要しない。水溶媒中で、且つ、酸素存在下（キャップ無）の撹拌操作にて平易に、光学活性アルコールを得ることができる（実施例１３と表１０）。
【０１３４】
ＨＰＣ−ＰＣは、Ｒａｃ−１よりナプロキセン前駆体（S-１、＞９９％ｅｅ）を合成できる。非特許文献１１に従い、平易に医薬品“ナプロキセン”を合成できる。S-１からの有機合成プロセスは、（１）水酸基（-OH）のブロモ化（-Br）→（２）ニトリル化（-CN）→（３）カルボン酸（−COOH）の有機合成系（収率８３％、９２％ｅｅ）である。
【０１３５】
図１７（ｂ）には、ナプロキセン合成の従来方法によるフロー図を示している。ナプロキセンは、芳香族カルボン酸に分類される有機化合物で、鎮痛、解熱、抗炎症薬として用いられる非ステロイド性抗炎症薬 （NSAID） の一種である。
【０１３６】
本発明のＰＣは、［０１１２］に記述のとおり細胞小器官、特には、ミトコンドリア由来膜蛋白質と推察でき、図１５（ａ）に示すシトクロームＣオキシダーゼ反応式：式［化２］及び、（ｂ） に示すＰＱＱ-エタノール脱水素酵素の反応式：式［化１］に基づく鉄電子移動連鎖機能を有する膜蛋白と考えられる。
【０１３７】
図１６（ａ）は、工程１のフローを示す。空気酸化済のアルギン酸ゲル包括生物材料から好、ＰＱＱ-エタノール脱水素酵素とシトクロームＣオキシダーゼ機能を有するＰＣが溶出され、ＨＰＣ−ＰＣに固定化後、該鉄電子移動系（式［化６］）の作用より、各種２級アルコール分子の不斉酸化反応が生じる様子を表現している。
【０１３８】
図１６（ｂ）は、ＰＱＱ-エタノール脱水素酵素とシトクロームＣオキシダーゼが繋がって存在するクエン酸回路内ＡＴＰ合成酵素の働きが示され、エネルギー（ＡＴＰ）を生産の様子を示している。（非特許文献１２）
【化６】
2014073673.tif 000008
【０１３９】
アルギン酸Ｃａゲル包括動植物由来蛋白質は、空気酸化後、カルシウム塩と酸素の存在下、好適に空気酸化を誘発する。FT-IR測定にて得られる１０８５±５０ｃｍ−１の領域に少なくとも１個現れるピークは蛋白質内分子間ジスルフィド結合（硫黄酸化物：Ｓ＝Ｏ及び／又はＳ−Ｏ）の示すものであり、これが水溶性変化への要因となり、同時に、不斉酸化反応を有する蛋白質複合体（カタラーゼを含む鉄結合酵素を含む膜蛋白質）を温水中に溶出される効果を生んでいる。
【０１４０】
本発明で示す蛋白質複合体の構成は、（１）電子移動に関わる鉄結合蛋白質と（２）その酵素の立体構造を保持する多くのカルシウムを含んだ膜蛋白質であり、酸化機能としては、鉄電子移動系としてカタラーゼの他、シトクロームＣオキシダーゼとＰＱＱ-脱水素酵素の連鎖反応を有し、酸素存在下、２級アルコール脱水素反応することを特徴としている。従って、本発明は、従来の酸化還元酵素（式［化５］）とは明確に異なる反応系を提供している。
【０１４１】
更に、ＰＣにはＳ選択的酸化反応を持つものとＲ選択的酸化に働く２種類が存在する。表１２と表１３に示されるように、本発明で示されるＰＣは、第１工程での生物材料を使い分けることで、立体選択性の異なる２種類の鏡像異性体を生産している。従って、その２種類のＰＣの使い分けにより、両鏡像体（Ｓ体とＲ体）の合成を可能にできる。
【０１４２】
以上から、この発見は、従来の煩雑で煩わしい酵素の精製や単離の工程を含む、従来の亜鉛と補因子（ＮＡＤ（Ｐ）やＦＡＤ）電子移動系の２級アルコール脱水素酵素と比べて、不斉酸化反応が、１）補因子（ＮＡＤ（Ｐ）やＦＡＤ）添加を要しない点、２）酸素依存的な不斉酸化反応である点、３）ｐＨ依存的でなく、水溶媒系の極めて温和な反応系である点、４）更には、両鏡像体の使い分けが可能な点からコスト的にも操作的にも優位な、しかも高選択的なので効果的に光学活性アルコール（収率５０％、９９％ｅｅ以上）が得られる不斉有機合成試薬を提供している。
【０１４３】
（カタラーゼ活性の測定法−１）
上述したように、本発明の含鉄複合体は、不斉酸化活性に加えてカタラーゼ活性を有する。このカタラーゼ活性は、前述したように、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）と反応して酸素を放出する性質がある。粒径５０μｍの本発明のＰＥＧ−ＰＣを、直径１８ｍｍφの試験管に１５ｍｇ入れ、５％過酸化水素水１．０ｍＬを加えた際における、酸素発生に基づく「泡発生」レベルによって、好適に評価することができる（後述する表１１をも参照）。
【０１４４】
この「泡発生」レベルの確認においては、酸素発生に基づく「泡発生」が肉眼で視認可能であれば足りる。より具体的には、「泡発生」レベル（ないし泡発生の試験管内における「高さ」）が、２ｍｍ以上であることが好ましい。更には、該泡発生の「高さ」は、５ｍｍ以上（更には８ｍｍ以上、特許１０ｍｍ以上）であることが更に好ましい。
【０１４５】
（カタラーゼ活性の測定法−２）
他方、カタラーゼ活性は、上記反応における「過酸化水素」の消費量を測定することによっても、好適に評価することができる（後述する表１４および表１５をも参照）。
【０１４６】
より具体的には、後述する実施例に示すように、市販の「パックテスト」（（株）共立理化学研究所製）を用いて、反応後の「過酸化水素」の残存量を測定することができる。この測定方法は、例えば、候補物質の「スクリーニング」等に好適に使用可能である。
【０１４７】
（カタラーゼ活性の測定法−３）
更に、後述する実施例に示すように、市販の「デジタル式  過酸化水素濃度計」、反応後の「過酸化水素」の残存量を測定し、これに基づき、本発明における「ＰＥＧ−ＰＣ」または「ＣＬＰＣ」の過酸化水素分解反応に対する比活性を測定することができる。
【０１４８】
「デジタル式  過酸化水素濃度計」を用いた場合の、本発明の鉄含有蛋白質複合体の過酸化水素分解反応に対する比活性（基質２ｍＭ−過酸化水素（１ｍL）中5分間の反応において、１μＭ−Ｈ２Ｏ２を分解できるＰＥＧ−ＰＣ量）は、２００μｇであることが好ましく、更には１５０μｇ（特に１３０μｇ）であることが好ましい。この場合のユニットは、本発明の鉄含有蛋白質複合体が「ＰＥＧ−ＰＣ」である態様においては、その過酸化水素分解反応に対する比活性（１μＭ−Ｈ２Ｏ２を分解できるＰＥＧ−ＰＣ量）が、１００μｇであることが好ましく、更には８０μｇ（特に６０μｇ）であることが好ましい。
【０１４９】
（ＰＥＧ−ＰＣによる両鏡像体の選択的不斉酸化的合成）
最後に、図１の工程にて得られるＰＣ沈殿物は、低分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ分子量：１０００）でコーティングすることにより、ＰＣ活性中心の反転を促すことができる。表１７に示すように、ＣＬＰＣ（分子量４０００）とＡＧＰＣ（分子量４０００と分子量１０００のＰＥＧの混合物を使用）の比活性は、それぞれ０．６ｍＵと０．８ｍＵ（図１９参照）である。分子量１０００のように低分子コーティングを含むＰＣコーティングでは、酸化活性向上の効果がみられた。この図１９における数値は、以下の式により計算した。
計算式−初速度（ＩＶ，  ｍＭ／ｈ），活性（ＡＣ，ｍｍｏｌ／（４ｍＬ・ｍｉｎ）），比活性（ＳＡ，ｕｎｉｔ（ｍｍｏｌ／（４  ｍＬ・ｍｉｎ））の計算式）：
Δｋｅｔｏｎｅ（ｍＭ）÷ｔｉｍｅ（ｈ），
ＡＣ＝ＩＶ（ｍＭ／ｈ）×０．００４（４ｍＬ／Ｌ）×１０００（Ｍ／ｍＭ）÷６０（ｍｉｎ／ｈ），
ＳＡ＝ＡＣ（ｍｏｌ／（４ｍＬ・ｍｉｎ））÷ＣＬＰＸａ（ｏｒＡＧＰＸ）（ｍｇ）．
【０１５０】
本発明において、ＡＧＰＣとは、図１の第２の工程におけるＰＣ活性化処理「濃縮沈殿物に対し凡そ５倍等量の０．５ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０〜１０．０）にて再溶解」の際、その緩衝液量に対して０．５％〜１％ＰＥＧ（ｖ／ｖ）の濃度レベルにてＰＥＧ分子量１０００／４０００（比率として１／２）を添加して２０時間ほど静置した後、遠心分離して得られる活性化沈殿物を減圧凍結乾燥（ＦＤ）して粉砕したものである。
【０１５１】
本発明において、高分子化合物が異なる分子量の混合物である場合は、その表記を省略する場合がある。例えば、ＰＥＧ：分子量１０００／４０００＝２／１と表記した場合、分子量４０００と分子量１０００のポリエチレングリコールの混合物であって、その混合比が２：１であることを示す。
【０１５２】
実施例２２、図１９にその詳細データを示すが、ＰＥＧ分子量を４０００から１０００を含む物へ変えることにより、基質Ｒａｃ−１などに対し、Ｒ体選択的酸化反応からＳ体選択的に反転される点が重要である。更に、Ｓ体が（選択的に）酸化されて消費された後に、引き続きＲ体も酸化され全てがケトンに酸化される点も、また、重要である。ＰＥＧ分子量４０００使用のＰＥＧ−ＰＣやＣＬＰＣの有する酸化反応において、Ｓ体酸化は殆ど観られない。
【０１５３】
すなわち、本発明においては、図１の第２の工程におけるＰＣ活性化処理「濃縮沈殿物に対し凡そ５倍等量程度の０．５ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０〜１０．０）にて再溶解」の際、その緩衝液量に対して０．５％〜１％ＰＥＧ（ｖ／ｖ）の水溶液濃度レベルにてＰＥＧ分子量４０００（又は、それに分子量１０００を含むもの）共存環境を境界として、Ｒ体選択的酸化反応（又は、Ｓ体選択的酸化反応）とを選択することができる。いわゆる「動力学的」な選択酸化反応が可能となる。
【０１５４】
更に、本発明においては、Ｒ体またはＳ体が選択酸化反応により酸化されて消費された後に、引き続き他方の鏡像体（Ｓ体またはＲ体）をも得ることができるため、いわゆるone-pot反応により、効率的且つ簡便に、両方の鏡像体を選択的に得ることができる。
【０１５５】
本発明において、Ｒ体選択的酸化反応とするためには、高分子化合物として、高分子量高分子を用いることが好ましい。分子量としては、分子量４０００以上であることが好ましい。分子量の上限は特に限定されないが、ＰＥＧの場合、ポリエチレンオキシドと区別するために、分子量５００００以下のものを指す場合がある。
【０１５６】
本発明において、Ｓ体選択的酸化反応とするためには、高分子化合物として、低分子量高分子を含むもの（例えば、高分子量高分子と低分子量高分子の混合物）を用いることが好ましい。分子量としては１０００以下であることが好ましい。分子量が大きいと、前述のＲ体選択的酸化反応が生じる恐れがあるためである。分子量の下限は特に限定されないが、ＰＥＧの場合、低い分子量としては、分子量２００程度のものが市販されている。例えば、東邦化学工業株式会社より、分子量２００から分子量２００００のＰＥＧ及びそれらの混合物は購入できる。
【０１５７】
高分子量高分子と低分子量高分子の混合物としては、例えば、分子量４０００と分子量１０００のポリエチレングリコールの混合物が挙げられる。前記混合物としては、低分子量高分子を３分の１以上含むことが好ましい。３分の１未満である場合、前述のＲ体選択的酸化反応が生じる恐れがあるためである。
【実施例】
【０１５８】
次に、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、これは説明のためのものであって、これにより限定して解すべきではない。【０１５９】
尚、各実施例において、化学修飾化蛋白質複合体（ＣＬＰＣ）は、特許文献３の実施例１記載の方法により得た。【０１６０】
実施例１
豌豆蛋白粉（オルガノフードテック株式会社製、商品名「エンドウたん白ＰＰ−ＣＳ」）３００ｇに、蒸留水３０００ｍＬを加え、更に３％アルギン酸ナトリウム水溶液３０００ｍＬを加えて均一になるまで撹拌した。得られた粗蛋白質―アルギン酸ナトリウム混合液を撹拌しながら、分液漏斗を用いて４％塩化カルシウム水溶液中を滴下し、ゲルビーズを作成した。【０１６１】
次いで、溶液部分を捨て、前記ゲルビーズを回収し、空気中で５時間静置して空気酸化させた。【０１６２】
空気酸化させたゲルビーズに４０００ｍＬの蒸留水を添加し、恒温振とう培養器を用いて４０℃にて４８時間振とうし、該ゲルビーズ中のＰＣを溶出させることによってＰＣ水溶液を得た。【０１６３】
前記ＰＣ水溶液を、遠心分離機（日立工機株式会社製、ｈｉｍａｃ ＣＲ２０Ｇ）を用いて１０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、ＰＣ沈殿物（８０ｇ〜１２０ｇ）を得た。【０１６４】
このＰＣ沈殿物１００ｇをその５倍等量程度の０．５ｍＭグリシン水酸化ナトリウム水溶液（ｐＨ９．０−１０．０：５００ｍＬ）に均一混合後、１．０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ（ＭＷ：４０００）及び２．０％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド（ＧＡ）になるように加えてよく撹拌し、高分子化合物と共存のＰＣ水溶液を得た。【０１６５】
得られた高分子化合物と共存のＰＣ水溶液を、真空凍結乾燥機（日精株式会社製、ＲＬＥII２０３）を用いて、−５０℃にて凍結後、系内を真空状態にして、温度を５０℃まで昇温し、水分を昇華させた。その後、水分除去された高分子コーティングＰＣを、ボールミル粉砕により粉末体とし、本発明のＨＰＣ−ＰＣを得た。【０１６６】
実施例２
（本発明の蛋白質複合体（ＣＬＰＣ、ＰＥＧ−ＰＣ）の構成元素分析）
図３には、空気酸化した該生物材料包括ゲルより溶出されるＰＣ中の原料残存量を知る目的で、（ｉ）エンドウたん白粉末（ＰＰ）、（ｉｉ）ＣＬＰＣ、（ｉｉｉ）ＰＥＧ−ＰＣについて、ＩＣＰ発光分析装置（株式会社島津製作所製、ＩＣＰＳ−７５００）による無機物（Ｎａ、Ｍｇ、Ｐ、Ｓ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｃｕ）、元素分析装置（株式会社パーキンエルマージャパン、ＰＥ２４００ II）による構成元素（Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｓ）の分析を行った結果を示している。また、酸素含有量を、イオンクロマトグラフ装置（日本ダイオネクス株式会社、ＩＣＰ−９０）にてＳＯ４２−を定量し、モル比にて導いた。【０１６７】
表１のまとめの通り、ＰＥＧ−ＰＣは、ＣＬＰＣと比べて、無機物量はおよそ９倍に濃縮されていた。元素については、ＣＬＰＣでは硫黄（Ｓ）と窒素（Ｎ）が顕著に多い点で、原料の硫安（（ＮＨ４）２ＳＯ４）が１０％以上残留していることが分かった。ＰＥＧ−ＰＣについては好適にエンドウ蛋白質から鉄結合蛋白質を４倍程度、濃縮し得ていることが推察された。以上より、図１に示すＰＥＧ−ＰＣの濃縮プロセスは、図２に示すＣＬＰＣの濃縮プロセスに比べ、不純物を未然に残留させない優れた手法と判定できた。ＰＣを取り巻く２．６％Ｃａ２+の周りを更に１０％以上の硫安で塞ぐＣＬＰＣ構造は、基質がＰＣ表面を通りＰＣ活性中心へと到達する能力を著しく低下させる一方で、長い半減期を実現できていると考えられる。【０１６８】
実施例３
（本発明の蛋白質複合体（ＣＬＰＣ、ＰＥＧ−ＰＣ）のＦＴ−ＩＲ分析）
図４は、該ＨＰＣ−ＰＣとＣＬＰＣのアルギン酸Ｎａ残留物に関する検査を目的として、（ｉ）エンドウ蛋白粉末（Pea protein）、（ｉｉ）ポリエチレングリコール（PEG）、（ｉｉｉ）ＰＥＧ−ＰＣ（硫安不使用：Sanyo Catalyst １）、（ｉｖ）ＰＥＧ−ＰＣ（硫安使用：Sanyo Catalyst ２）、（ｖ）原料アルギン酸ナトリウム（Sodium alginate）について、ＦＴ−ＩＲ（株式会社エス・テイ・ジャパン、ポータブル ATR  装置  (A２ Technologes, ML version)、ＡＴＲ法）にて調べた結果である。ＰＥＧ−ＰＣ（硫安使用：Sanyo Catalyst ２）とは、第１の工程にて得られるＰＣ水溶液に３０％硫安を添加したものを遠心分離して、得られた沈殿物をＦＤ乾燥したものである。尚、表１は、実施例２（図３）と実施例３（図４）から得られたデータに元づき導いたＣＬＰＣとＰＥＧ−ＰＣの間での原料残存率比較を示す。【０１６９】
【表１】
2014073673.tif 000009
【０１７０】
図４（ａ）から、（ｉｉｉ）ＰＥＧ−ＰＣ（Sanyo Catalyst １）は、ＰＥＧ−ＰＣ（硫安使用：Sanyo Catalyst ２）とＣＬＰＣ（SanyoCatalyst ８_６４_２０１１）と同様、１０８５±５０ｃｍ−１の領域に少なくとも１個のピークを有しており、硫安とは異なる硫黄酸化物（Ｓ＝Ｏ）の存在、例えば、原料ＰＰ中の空気酸化によるシステイン−システインのジスルフィド結合による硫黄酸化物（Ｓ＝Ｏ及び／又はＳ−Ｏ）形成、及び／又は、ヘモフォア（鉄捕獲蛋白質）内鉄分子が還元されＰＣ自体を水溶性に変化することがその要因と考えられる。表１から、ＰＥＧ−ＰＣの鉄含量はＣＬＰＣの約４倍に濃縮される理由は、ＣＬＰＣ中に１０％以上残留する硫安とアルギン酸Ｎａがその濃縮の妨げとなっている理由と考えられる。【０１７１】
更に、ＡＴＲ装置付随スクリーニングソフトによるＰＥＧ−ＰＣスペクトルの化合物サーチを行った。ＰＥＧ−ＰＣ（Sanyo Catalyst １）を、化合物サーチソフトウェア（MicroLab with Ichem/Aldrich ATR Standerd Library （Vols １ & ２））を用いて検索し、その結果を表２に示した。【０１７２】
【表２】
2014073673.tif 000010
【０１７３】
表２から、ＰＥＧ−ＰＣは、プロタミン硫酸塩（protamine sulfate）と９３．７５％類似化合物として判定された。プロタミンはサケ科などの魚類の成熟した精巣から得ている強いカチオン性蛋白である。従って、ＰＣが鉄結合蛋白と同じカチオン性蛋白であることが示されている。また、プロタミン硫酸塩は、血液抗凝固作用をもつヘパリンの拮抗剤としての医薬品であり、ＰＥＧ−ＰＣの薬理効果についても期待できる。【０１７４】
実施例４
（第２の工程、豌豆蛋白・アルギン酸カルシウムゲルビーズの生化学的性質）
第１の工程において、豌豆蛋白・アルギン酸カルシウムゲルに蒸留水を加えて、密閉容器中でのジャーファメンタ中で撹拌し、溶存酸素濃度（ＤＯ）とｐＨの経時変化をモニターした。２４時間後に酸素供給を開始した。【０１７５】
図８の結果より、密閉容器中での、酸素供給が断たれたジャーファメンタ中における、溶存酸素量（ＤＯ）はほぼ数時間でゼロ近く落ち、ｐＨも酸性側にシフトする。酸素供給を開始すると、溶液は徐々に濁りだすと同時にＤＯは０．６ｍｇ／Ｌ付近で安定し、ｐＨはアルカリ側にシフトし始める。酸素供給におけるｐＨのカチオン性蛋白質（蛋白質複合体）の溶出する様子がモニタリングされている。【０１７６】
表１（鉄の４倍濃縮）と表３（カチオン性蛋白質の存在）から、酸化還元反応に関わる鉄電子移動保有の蛋白質（酵素）との関わりが示唆されている。従って、補酵素への依存性（式［化５］）又は酸素／鉄系（式［化６］）の機能確認により、蛋白質複合体（ＰＣ）の所在を明らかにできる。【０１７７】
実施例５
（ＰＣ水溶液の活性フラクションの決定）
第１工程で得られる（ｉ）ＰＣ水溶液（PC suspension：３ｍＬ）、及びその遠心分離（１００００rpm、１０min）後の画分（ｉｉ）沈殿物（Precipitate：１００ｍｇ+蒸留水３ｍＬ）、（ｉｉｉ）上清（Supernatant：３ｍＬ）、更に、（ｉｖ）ＣＭＣ−ＰＣ（CM-Cellulose coating PC：１５ｍｇ+蒸留水３ｍＬ）、（ｖ）ＣＬＰＣ（１５ｍｇ+蒸留水３ｍＬ）を１８ｍｍφスピッツ管中（キャップをせず）、撹拌７００rpm、４０℃、にて不斉酸化反応を調べた。その際、基質Ｒａｃ−１/ＤＭＳＯ溶液（２００００ppm、３０μＬ）は、基質濃度０.８ｍＭ水溶液になるように加えた。尚、ＣＭＣ−ＰＣは、沈殿物（１g）に対してＣＭ−セルロース（３０〜４０ｍｇ）でコーティングした。ＣＬＰＣは、該ＰＣ水溶液を３０％硫安とし、沈殿物をグルタルアルデヒド（０．２５％（ｖ／ｖ））で化学修飾、ＦＤ処理して得られた粉末である。【０１７８】
図９の結果より、活性の強さについては、ＣＭＣ−ＰＣ（CM-Cellulose coating PC：１３時間）、蛋白質複合体水溶液（PC-suspension：２４時間）、CLPC：４８時間、上清（Supernatant：７２時間）にて得られた。尚、コーティングなしの沈殿物（Precipitate）の反応では、立体選択性は崩れ基質の両鏡像体が全て酸化された。以上から、ＣＭＣ−ＰＣは最も高活性を示すが、高分子化合物コーティングしないＰＣでは立体選択性を保持できなかった。更に、ＰＣ不斉酸化反応では、補酵素（ＮＡＤ（Ｐ）、ＦＡＤ）添加を要せず、反応試験管キャップを外したまま（酸素の供給）で進行する。【０１７９】
実施例６
（エンドウ蛋白質・アルギン酸カルシウムゲルの空気酸化時間の検討）
実施例１の第１の工程において、（ａ）エンドウ蛋白質をアルギン酸カルシウムゲルにて包括して空気酸化を５時間させ、更に、温水中にて振とう培養（４８時間、４０℃）して得られた蛋白質複合体水溶液に対して、硫安濃度の違い（３０％、３０％〜５０％、５０％〜７０％、および＞７０％（ｗ／ｖ））で沈殿・遠心分離後、沈殿物をＦＤ処理してその活性強度を調べた。更に、（ｂ）空気酸化時間（０、０．５、１．０、３．０、５．０、および７．０ 時間）を変えて、その硫安沈殿（３０％（ｗ／ｖ））と遠心分離して得られる沈殿物のＦＤ処理後粉末量とその活性強度を調べた。【０１８０】
図１０（ａ）の結果より、得られた蛋白質複合体水溶液は、硫安濃度３０％にて、該蛋白質複合体を好適に回収できることが分かった。更に、図１０（ｂ）の結果より、空気酸化は３時間以上、好ましくは５時間程度行うのが好ましく、空気酸化時間によって、ＰＣ収量と活性強度に影響があった。空気酸化時間が短いとＰＣ収率が激減する、逆に空気酸化５時間では収率が２０％に向上し、活性は若干落ちる傾向を得た。【０１８１】
実施例７
（本発明の蛋白質複合体における活性が強い画分の決定）
図５（ａ）は、遠心分離機して得られる上清画分（supernatant：７２時間活性）のゲル濾過クロマトグラフによりフラクション分取した２８０ｎｍで描かれる３つのサンプルの示すスペクトルを表している。図５（ｂ）は、分取番目３３から３６で観られたＨＰＬＣのスペクトル結果を示している。更に、写真は分取番目３１から３９の４８時間反応後の様子である。【０１８２】
図５（ａ）の上段のクロマトグラフは、図１の第１の工程で得られるＰＣ溶液を遠心分離（１０、０００ｒｐｍ、１０分）して得られる上清み画分サンプル、中段のクロマトグラフは、５％のエンドウ蛋白質粉末（ＰＰ）水溶液サンプル、下段のクロマトグラフは、次の蛋白質を含む分子量マーカー溶液である: 
a, ferritin （４４０  ｋＤａ）; 
b, aldorase （１５８  ｋＤａ）; 
c, conalbumin （７５  ｋＤａ）; 
d, ovalbumin （４４  ｋＤａ）; 
e, carbonic anhydrase （２９  ｋＤａ）; 
f, ribonuclease A （１３．７  ｋＤａ）; 
g, aprotinin （６．５  ｋＤａ）。【０１８３】
限外濾過済の各サンプル溶液（１０ｍＬ）をゲル濾過クロマトグラフに投入した。装置は、ＧＥヘルスケアジャパン株式会社製AKTA explorer １０Sを用い、カラムは同社のhiload １６/６０ superdex ２００ pg columnを用いた。カラム内の温度は４℃、流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎとした。５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に塩濃度１５０ｍＭになるように加えたものを展開溶液とした。【０１８４】
図５（ｂ）は、６０本の画分（フラクション）に３ｍＬずつ分取されたそれぞれの画分に基質Ｒａｃ−２／ＤＭＳＯ溶液（２０，０００ｐｐｍ、３０μＬ）を加え、４０℃温室内で、１８ｍｍφの試験管を用い、７００ｒｐｍで撹拌をさせながら、それぞれ４８時間反応させたその時のＨＰＬＣ分析結果を示している。【０１８５】
図５（ｂ）の写真は、反応後の画分のうち、フラクションＮｏ．３０〜３９の結果を図５に示す。図５より、３６番目の画分（フラクション３６）に最も強い不斉酸化活性を確認した。【０１８６】
実施例８
（活性が強い画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
下記Ａ〜Ｆのサンプル各１０μＬ、及び分子量マーカーについて、テフコ(株)製プレキャストゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ mini）を用いて、分子量の決定を行った。染色には、ＣＢＢ染色液を用いた。尚、遠心分離は、日立工機株式会社製、ｈｉｍａｃ ＣＲ２０Ｇを用いて、１０，０００ｒｐｍ、１０分間にて行った。
Ａ）実施例１の第２の工程で得られる蛋白質複合体水溶液
Ｂ）該サンプルＡ１０ｍＬを遠心分離した後、得られた沈殿物を１０ｍＬの水に再溶解させた水溶解液
Ｃ）該サンプルＡ１０ｍＬを遠心分離した後の上清
Ｄ）該サンプルＣに硫安３０％を加え、得られた沈殿物を１０ｍＬの水に再溶解させた水溶解液
Ｅ）該サンプルＡに硫安３０％を加え、引き続き遠心分離をした後、得られた沈殿物を１０ｍＬの水に再溶解させた水溶解液
Ｆ）実施例４で得たフラクション３６【０１８７】
結果を図６に示す。図６より、前記フラクション３６は２０ｋＤａ付近に単一バンド（バンド７）として確認された。【０１８８】
実施例９
（活性が強い画分の蛋白質同定）
実施例５で得た、フラクション３６のＳＤＳバンド（図６で示す、サンプルＦのバンド７）を切り離し、プロテイシーケンサー（島津製作所製、ＰＰＳＱ−２１Ａ）にてアミノ酸配列解析を行った。結果を表３に示す。【０１８９】
【表３】
2014073673.tif 000011
【０１９０】
更に、表３のアミノ酸配列を、蛋白質の為の同定データベースにて解析（ＢＬＡＳＴ）を行った。このＢＬＡＳＴは、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ解析ページ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）中の「protein blast」から、テキストボックスに検索したいアミノ酸配列を入力することで得ることが出来る。ＢＬＡＳＴによる検索結果のうち、９３％以上の誤差範囲にてヒットしたものを表４に示す。【０１９１】
【表４】
2014073673.tif 000012
【０１９２】
表４より、フラクション３６とＳＤＳ−ＰＡＧＥで得られた活性バンドの成分は、鉄結合蛋白質であり、表１で示したＣＬＰＣ（Fe; ５９ ppm、活性：４８ｈ）とＰＥＧ−ＰＣ（Fe; ２１５ ppm、活性：１３ｈ）との鉄濃度に及ぼす不斉酸化活性の強度の違いについて相関が見出せた。表３に示すＨｉｓ−３２ (bearing loop), Ｔｙｒ−７５ (axial heme ligand)、そしてＨｉｓ−８３(hydrogen ligand)の各アミノ酸の鉄結合部位は、非特許文献１９より引用した図２１を持って分子レベルで確認できる点から、不斉酸化反応に関わる本発明の酵素は、酸素依存的な鉄電子移動系の鉄結合蛋白質（例えば、ＰＱＱ−ＡＤＤ、シトクロームオキシダーゼ、Ｐ４５０、更には、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、ＡＢＣトランスポーターをも含む）である根拠を得た。【０１９３】
実施例５の他のＳＤＳバンド（図６で示す、バンド１〜６）につき、LCMS-IT-TOF（SHIMAZU: mode; nanoESI+: MS range: MS１ （m/z ４００-１５００） MS２ （m/z ５０-１５００） data-dependent scan; flow rate: ３００ nL/min; flow solvent: A = ０.１％ formic acid/２％ acetonitrile, B = ０.１％ formic acid/８０％ acetonitrile; gradient: ５-４０％ B/０-３０  ｍｉｎ, ４０-１００％ B/３０-４０  ｍｉｎ, １００％ B/４０-６０  ｍｉｎ）とMASCOT解析による蛋白質同定を示した結果が表４（バンド５のみ）、表５のその他のバンドの蛋白質同定関してはPMF法（BIFLEX III （Bruker Daltonics: mode; positive/reflector: matrix; α-cyano-４-  hydroxy cinnamic acid （CHCA）; target plate; peptide calibration standards; angiotensin II （[M+H]+ = １０４６.５４２）, angiotensin I  （[M + H]+ = １２９６.６８５）, substance （[M + H]+ = １３４７.７３６）, bombesin （[M + H]+  = １６１９.８２３）, ACTH１-１７ （[M + H]+ = ２０９３.０８７）, ACTH１８-３９ （[M + H]+ = ２４６５.１９９））とMASCOT解析により判定した。【０１９４】
【表５】
2014073673.tif 000013
【０１９５】
表５のバンド３のコハク酸生産菌に関わる蛋白質は、ミトコンドリア内の複合体II（Complex II）を示し、溶出される蛋白質複合体（ＰＣ）の所在がミトコンドリアなどの膜蛋白質として示唆された。バンド５のＡＴＰ-Binding Cassette （ABC） Transporter ファミリーは、膜タンパク質での働きであり、蛋白質複合体（ＰＣ）は膜蛋白と推定された。以上から、蛋白質複合体が遠心分離で容易に沈殿濃縮されることから、該蛋白質複合体が、大きな高分子化合物であり、即ち、カタラーゼを含む複数の酵素を保持する膜蛋白質であると推定できる。更に、鉄電子移動系を保有のＰＱＱ−脱水素酵素とシトクロムオキシダーゼ（ＣｙｔｃＯ））が、図２０に示すようなミトコンドリア内に局在する点で、これら細胞小器官由来の膜蛋白質が効果的に沈殿濃縮した結果と推測できる。【０１９６】
表３で示されるヘモフォア（鉄獲得タンパク質：HasA: heme acquisition system A）は、表５中のＡＢＣトランスポーター（バンド５）に内在するとの報告もある一方、このヘモフォア自身又はこれを含む膜蛋白質：即ち、ＰＱＱ−ＡＤＤ、シトクロームオキシダーゼ、Ｐ４５０、更には、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、ＡＢＣトランスポーターなどの鉄結合蛋白質が本発明の本丸と判定できた。（非特許文献１７−１９より）【０１９７】
シトクロームｐ４５０は、あらゆる生物で見られる鉄結合蛋白質であり、各生物で何種類かを作りそれぞれが異なる分子を選んで作用する。通常、細菌は約２０種類の、動物は約６０種類のシトクロームｐ４５０を形成する。一方、エンドウ豆のような植物は、自分自身を守るための独特の色素や毒素を作る必要性などから、何百種類ものシトクロームｐ４５０酵素を作っていることが報告されている（非特許文献１８より）。従って、本発明の核心となるヘモフォア自身又はそれを含む膜蛋白質が、植物に限定的に備わる不斉酸化反応であり、ここに分子レベルにて確認できたことを意味する。【０１９８】
実施例１０
（ＣＬＰＣの熱変性と化学変性への検討）
不斉酸化反応に関わるＰＣが、鉄結合性蛋白質（酵素）であることを確認する目的で、ＣＬＰＣ（２０ｍｇ）をオートクレーブ熱変性処理（１２１℃、２０分）し、又は、DTTにて化学変性処理（ジスフィド結合切断）させた。その結果、表６に示すように、反応追跡は、基質Ｒａｃ−１（０．８ｍＭ）と基質Ｒａｃ−２（０．８ｍＭ）を添加後、４８時間後に行った。反応溶媒は５０ｍＭ−グリシンNaOH緩衝液（ｐＨ９．０、５．０ｍＬ）でＤＭＳＯ濃度２．０７％にて行った。【０１９９】
【表６】
2014073673.tif 000014
【０２００】
表６の結果から、ＰＣは該熱変性処理と該化学変性処理にて失活した。従って、不斉酸化反応を有する蛋白質複合体の活性の本体は、鉄電子移動系などを保有した鉄結合性の蛋白質である可能性が高まった。【０２０１】
実施例１１
（ＣＬＰＣ不斉酸化反応の各種添加物による活性阻害試験）
蛋白質複合体の本体が鉄結合蛋白質であることを確認する目的で、通常の反応環境に、表７に示す微量の阻害剤を添加し、その影響を調べた。１ｍＭ-金属塩溶液による競争阻害、１ｍＭ-キレート剤水溶液による金属電子移動阻害反応、オプションとして１ｍＭ-界面活性剤水溶液の添加物絵の効果を確認した。ＣＬＰＣ（２０ｍｇ）に対し、基質Ｒａｃ−２（０．８ｍＭ）、５０ｍＭグリシンNaOH緩衝液／ＤＭＳＯ（２．０７％ （v/v））（ｐＨ９．０、５．０ｍＬ）溶媒系において、表７に示す添加物の及ぼす４８時間後の阻害活性について調べた。【０２０２】
【表７】
2014073673.tif 000015
【０２０３】
表７から、金属１ｍM-ＺｎＣｌ２水溶液に阻害活性が認められ、更に、キレート剤（EDTAら）の添加により、完全に活性を失った。以上から、本発明の不斉酸化反応を有するＰＣは、鉄電子移動（式［化６］）に元づく金属蛋白質（酵素）であると判定できた。【０２０４】
実施例１２
（高分子化合物のコーティング量と連続基質添加による活性への影響に関する検討）
第２の工程における、（ａ）遠心沈殿部（Precipitate：ＦＤ後１g、wet状態５g目途）に対するＰＥＧ（分子量：４０００）又はＰＥＧ（分子量：１０００）によるコーティング量（４g、２g、１g、５００ｍｇ、２００ｍｇ、１００ｍｇ、２０ｍｇ、１０ｍｇ、２ｍｇ、添加せず（none）、沈殿部そのまま（non-ＰＥＧ／ＦＤ））粉末１５ｍｇでの、水溶媒系（３.０ｍＬ）での、１３時間後の反応結果を示している。（ｂ）該沈殿物（Precipitate：１g−粉末重量）に対するＣＭ−セルロースコーティング量（a: ２g、１g、５００ｍｇ、２００ｍｇ、１００ｍｇ）粉末１５ｍｇとα化デンプンコーティング量（b: ５００ｍｇ、２５０ｍｇ、１２５ｍｇ、５０ｍｇ、２５ｍｇ）粉末１５ｍｇにおける水溶媒（３.０ｍＬ）中での、１３時間後の反応結果を示している。更に、（ｃ）ＰＥＧ（４０００）コーティング−ＰＣ 、ＰＥＧ（１０００）コーティング−ＰＣ、ＣＭ−セルロース−ＰＣ、そしてα化デンプンコーティング−ＰＣの各１５ｍｇの水溶媒（５.０ｍＬ）中における、基質Ｒac-２（１.２ｍＭ）の連続基質添加（０時間後、１２時間後、２０時間後）で最終的に３０時間の間、反応させたときの得られる該S-isomer（＞９５％ｅｅ）を示している。【０２０５】
図１１（ａ）と図１１（ｂ）の結果より、コーティングする高分子化合物は、遠心分離後の沈殿部５ｇ（ＦＤ後：凡そ１ｇ）に対して２００ｍｇから５００ｍｇが最適量であり、不斉酸化反応の立体選択性と活性強度において好適に作用することが確認できた。更に、高分子化合物コーティングした蛋白質複合体１５ｍｇは、水溶媒（５．０ｍＬ）中において、３０時間を要して、１．８ｍＭの光学活性アルコール（およそ、１．０ｍｇ、＞９８％ｅｅ）を生産可能であることを図１１（ｃ）にて示した。コーティングする高分子化合物の濃度は、濃すぎると、不斉酸化活性を弱める（反応時間が伸びる）効果を導き、逆に、薄すぎる（又は、添加しないと）立体選択失われて両鏡像体が同時に酸化されることが分かった。ＦＤ乾燥後に占めるＰＥＧ等の高分子化合物含有量は、蛋白質複合体粉末含量の約２５％±１０％が好ましく、５０％以上のコーティング濃度では活性が弱まり、逆に、５％以下のコーティング処理濃度では、ＦＤ乾燥処理による熱安定性（熱変性）や立体選択性の保持力（選択性の崩壊）が失われる傾向が表れる。【０２０６】
実施例１３
（第１工程のＰＣ水溶液（PC suspension ３ｍＬ）反応系における補酵素（ＮＡＤ（Ｐ）とＦＡＤの存在確認）
第１の工程で得られるＰＣ水溶液（PC suspension：３ｍＬ）を用いて、１８ｍｍφスピッツ管中、撹拌７００rpm、４０℃にて反応させた。基質ｒａｃ−１溶液（２００００ppm、３０μＬ）/ＤＭＳＯ（＜０．６％（v/v））の濃度は０．８ｍＭとした。図１２（ａ）は、反応開始０時間後、２４時間後、４８時間後のＵＶ吸収の測定したものである。図１２（ｂ）は、反応生成物：２−アセトナフトン濃度（０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．８ｍＭ）のＵＶ吸収測定の結果を示したものである。図１２（ｃ）は、表８のcolormetric reaction mixtureの構成成分表にて調整した溶液の色の変化とＵＶ吸収（５１０ｎｍ）を調べたものである。尚、分光光度計は、ＧＥヘルスケアジャパン株式会社、パーソナルスペクトルモニター GeneQuant １３００を用いる。【０２０７】
【表８】
2014073673.tif 000016
【０２０８】
図１２（ａ）の反応時間２４時間と４８時間に観られる、３４０ｎｍ付近の吸収の確認から、基質０．８ｍＭを２４時間で完全に光学分割できるPC suspension 中のNAD（P）H関与が示唆された。しかし、２４時間と４８時間の吸収強度に顕著な差がない点、図１２（ｂ）の生成物２−アセトナフトンの示す吸収も３４０ｎｍと重なる点から、３４０ｎｍ付近の吸収はNAD（P）Hではなく、生成ケトンのものと判定した。更に、図１２（ｃ）のcolormetric reactionの結果、顕著な色の変化は見られなかった点、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を示すＵＶ５１０ｎｍにも顕著な変化は見られなかった点から、補因子（NAD（P）、FAD）の存在は否定された。【０２０９】
実施例１４
（ＣＬＰＣ反応における緩衝液（ｐＨ）の検討）
ＣＬＰＣ（２０ ｍｇ）の反応条件における、好適な緩衝液（ｐＨ）を調べた。反応条件は、５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ：７．０、８．０、 ９．０）、５０ｍＭ Tris-acetate（ｐＨ：７．０、８．０、 ９．０）、５０ｍＭ phosphate（ｐＨ：６．０、７．０、８．０）、５０ｍＭ Pipes-NaOH（ｐＨ：６．１、７．０、７．５）、５０ｍＭ Glycine-NaOH（ｐＨ：９．０、１０．０）の緩衝液５．０ ｍＬを用いて、基質ラセミ−１−（２−ナフチル）エタノール（ｒａｃ-２）／ＩＰＡ溶液（１,０００ppm、０.８ｍＬ）を加え、１８mmφ試験管内、４０℃、撹拌７００rpmにて、それぞれ４８時間反応させた。その結果を表９に示す。【０２１０】
【表９】
2014073673.tif 000017
【０２１１】
表９の結果から、５０ｍＭ Glycine-NaOH（ｐＨ９．０、１０．０）に高い活性が認められ、ＣＬＰＣ（２０ ｍｇ）の反応溶媒には、５０ｍＭ Glycine-NaOH（ｐＨ：９．０）が適当であることを導いた。【０２１２】
実施例１５
（ＣＬＰＣの補助溶媒の検討）
ＣＬＰＣ（２０ｍｇ）にて、基質Ｒａｃ−１を補助溶媒（DMSO、LogP =−１．４９）、ＩＰＡ（イソプロパノール：LogP =  ０．３８）、エタノール（LogP =０．０７）に溶解後、反応液５０ ｍＭ Glycine-NaOH （ｐＨ：９．０）５．０ｍL中に添加後の補所溶媒濃度２．０７％（v/v）、基質濃度（０．８ｍＭ、１．６ｍＭ、２．０ｍＭ）になるよう添加、２４時間後と４８時間後の不斉酸化反応後の光学純度を調べた。尚、分散係数（LogP）とは、物質の疎水性や移行性の指標となる。【０２１３】
図１３に示すように、補助溶媒（DMSO、LogP =−１．４９）は、基質濃度（１．６ｍＭ、２．０ｍＭ）においても好適に不斉酸化したが、ＩＰＡ（LogP =０．３８）とエタノール（LogP =０．０７）については、基質濃度（０．８ｍＭ）のみ、４８時間を要して反応した。このことから、ＣＬＰＣ反応に好適に作用する補助溶媒は、ＤＭＳＯであることが示された。【０２１４】
図１４のように、ＣＬＰＣ（２０ｍｇ）にて、反応液５０ ｍＭ Glycine-NaOH （ｐＨ：９．０、５．０ｍＬ）中、基質Ｒａｃ−１（０.８ｍＭ）、ＤＭＳＯ濃度（２．０％、４．０％、６．０％、８．０％（v/v））、４０℃、４８時間後の反応結果をまとめた。その結果、ＤＭＳＯ濃度が低ければ低いほど、該不斉酸化反応は好適に進行した。【０２１５】
実施例１６
（ＣＬＰＣ反応及びＨＰＣ−ＰＣ反応における補助溶媒／緩衝液・水溶媒系の検討）
表１０には、図４（ａ）で使用したＣＬＰＣ−１（２０ｍｇ：硫安使用無）、ＣＬＰＣ−２（２０ｍｇ：３０％硫安沈殿後遠心分離された沈殿物由来ＰＣ）、及びＨＰＣ−ＰＣ（１５ｍｇ）を触媒として、基質Ｒａｃ−１又は基質Ｒａｃ−２（１．２ｍＭ）、補所溶媒ＤＭＳＯとＩＰＡを用い、反応液５０ ｍＭ Glycine-NaOH （ｐＨ：９．０：４．０ｍL）又は蒸留水（Ｄ．Ｗ．４．０ｍL）中にて反応させた結果を示す。ＨＰＣ−ＰＣは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ（分子量１０００又は分子量４０００））、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、α化デンプン（ＰＧＳ）の３種類を使用した。【０２１６】
ＨＰＣ−ＰＣの作成は、ＰＣ沈殿物重量（１０００ｇ）に対して高分子化合物水溶液（水１５００Ｌに対してＰＥＧ／ＣＭＣ／ＰＧＳを各５０ｇ）のスケールで再溶解後、それぞれＦＤ乾燥後に粉末とした。反応は、２時間〜３時間おきにＨＰＬＣ追跡した結果である。ＣＬＰＣ−１のとＣＬＰＣ−２の調整上の違いは、図２の第３の工程後に、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を加えるか否かにあり、その後は同様の化学修飾化とＦＤ乾燥にて調整できる。【０２１７】
【表１０】
2014073673.tif 000018
【０２１８】
表１０の結果より、ＣＬＰＣ−１より、遠心分離工程を加えたＣＬＰＣ−２の方が５０ｍＭ−グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）／補助触媒ＤＭＤＯ系にて、反応時間にして２倍の向上が確認された。更に、ＣＬＰＣでは水溶媒系では反応が進まないのに対して、ＨＰＣ−ＰＣでは水溶媒系で反応が進むだけでなく、ＣＬＰＣ−２活性（４８ｈ）に比べ、ＨＰＣ−ＰＣ活性は反応時間１３ｈなど、約４倍ほど強い結果を得た。【０２１９】
（蛋白質複合体（ＰＣ、ＣＬＰＣ，ＨＰＣ−ＰＣ）の特徴のまとめ）
図３と図４と図８からの無機元素分析からのカチオン性蛋白質の好適な濃縮プロセスへの示唆、図５と図９と図１０と図１１と図１２と図１３からの該カチオン性蛋白質の反応特性：酸素依存的な２級アルコール脱水素反応の立証、図１５と図１６からの該蛋白質複合体が、カタラーゼを含む複数の酵素を保持する膜蛋白質であることの考察を踏まえ、３つの蛋白質複合体の特徴について表１１にまとめた。【０２２０】
また、カタラーゼ試験は、１８ｍｍφ試験管中に１５ｍｇの各サンプルを入れ、５％−Ｈ２Ｏ２水溶液（１ｍＬ）を加えてその泡立つ高さを比較したものである。ＨＰＣ−ＰＣのカタラーゼ活性は、ＣＬＰＣの４倍で泡立つことを確認した。この結果は、表１で示すＣＬＰＣ（５９ｐｐｍ）とＨＰＣ−ＰＣ（２１５ｐｐｍ）の鉄濃度との間で相関が得られた。更には、表１１に示す不斉酸化活性の中でもＣＬＰＣとＨＰＣ−ＰＣとで約４倍の活性強度の違いが認められた。更には、表１０で示すように、ＨＰＣ−ＰＣの反応溶媒では緩衝液によるｐＨ依存的な特性が認められず、水溶媒系で平易に不斉酸化反応する利点も認められた。【０２２１】
【表１１】
2014073673.tif 000019
【０２２２】
以上、表１と表１０と表１１のように、蛋白質複合体（ＰＣ、ＣＬＰＣ、ＨＰＣ−ＰＣ）が、カタラーゼを含む複数の鉄結合蛋白質（酵素）を保持する膜蛋白質であって、容易に生物原料から抽出／濃縮／高分子化合物と共存／ＦＤ脱水乾燥工程を経ることにより、平易に製造できることを立証した。その中でも本発明のＨＰＣ−ＰＣは、調整プロセスの中でも特別にコストパフォーマンスが優位にあり、しかも操作性が優れていることを示した。【０２２３】
実施例１７
（異なる生物材料由来蛋白質複合体（PC）水溶液による両鏡像体の使い分け検討）
第２の工程における生物材料の違い：ワカメ（WS）、ニンジン（C）、カボチャ（P）由来蛋白質複合体（表１２）及び卵白アルブミン（IOA）由来蛋白質複合体（表１３）による基質パラ位置換Ｒａｃ-１−フェニルエタノールとＲａｃ-２の基質特異性の検討を行った。反応条件は、実施例５の（ｉ）ＰＣ水溶液（PC suspension：３ｍＬ）を１８ｍｍφスピッツ管中（キャップをせず）、撹拌７００rpm、４０℃、にて不斉酸化反応を調べた系にて行い、基質Ｒａｃ−２/ＤＭＳＯ溶液（２００００ppm、３０μＬ）を、基質濃度０.８ｍＭ水溶液になるように加えた。その結果を表１２と表１３にまとめた。その他の異なる生物材料については特許文献１の中に、卵白アルブミン（IOA）については特許文献２の中に紹介してある。【０２２４】
【表１２】
2014073673.tif 000020
【０２２５】
【表１３】
2014073673.tif 000021
【０２２６】
表１２の結果から、ヨモギの葉（ＡＶＩ）、ワカメ（ＷＳ）、ニンジン（Ｃ）、カボチャ（Ｐ）由来の蛋白質複合体ゲルより好適に溶出され、同時に、基質であるパラ位置換臭素（Ｂｒ−／１ｐ）、塩素（Ｃｌ−／２ｐ）、メチル（Ｍｅ−／４ｐ）、メトキシ（ＭｅＯ−／５ｐ）のラセミ体のＲ体選択的な酸化により、Ｓ体アルコールが化学収率２０〜５０％、光学純度９９％e.e.以上で得られ、基質Ｒａｃ-２の場合は、Ｓ体選択的な酸化により、Ｒ体アルコールが化学収率５０％、光学純度９９％e.e.以上で得られた。【０２２７】
表１３の結果から、卵白アルブミン（IOA）由来の蛋白質複合体水溶液は、基質パラ位置換臭素（Ｂｒ−／１ｐ）、塩素（Ｃｌ−／２ｐ）、メトキシ（ＭｅＯ−／５ｐ）、Ｒａｃ-２（naphthyl／６）のラセミ体のＳ体選択的な酸化により、Ｒ体アルコールが化学収率２６％、光学純度８５〜９５％e.e.で得られた。【０２２８】
以上の結果から、動植物由来蛋白質複合体（PC）には、ラセミのＳ体のみを立体選択的に不斉酸化できる性質のものと、Ｒ体のみを立体選択的に不斉酸化できる性質の２種類存在していることを明らかにした。
従って、本発明のＨＰＣ−ＰＣは更に、Ｓ体選択的な不斉酸化を触媒する反応用とＲ体選択的な不斉酸化を触媒する反応用の両方を提供している。【０２２９】
実施例１８
（カタラーゼ活性の測定；「泡立ち」視認による測定）
上記の実施例３で得られたＰＥＧ−ＰＣ（１５ｍｇ）とＣＬＰＣ（１５ｍｇ）に対して、１８ｍｍφ試験管中それぞれ、５％−Ｈ２Ｏ２（１ｍＬ）を添加したところ、ＰＥＧ−ＰＣ溶液は、ＣＬＰＣ溶液に比べて顕著に激しく泡立ち、該溶液１．０ｍＬの嵩を泡容積により１．５〜３．５倍膨張させた。しかしながら、約５分後には、元の１．０ｍＬのＰＥＧ−ＰＣ溶液に落ち着いた。一方、ＣＬＰＣ反応系においては、該溶液表層部で静かに泡立ち酸素発生し、５分後には泡立ちは収まった。
以下の各実施例において、反応後のＨ２Ｏ２残存量とＨ２Ｏ２消費量を算出して、カタラーゼ活性の強度を調べた。【０２３０】
実施例１９
（カタラーゼ活性の測定；市販「パックテスト」による測定）
直径１８ｍｍφの試験管中に、ＰＣ触媒：１）ＰＥＧ−ＰＣ（１５ｍｇ）、２）ＣＬＰＣ（１５ｍｇ）、３）触媒無添加の各サンプルを入れ、更に、５％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）水溶液（１ｍＬ）添加して５分間、３５℃にて撹拌（７００ｒｐｍ）した。反応溶液（１０μＬ）のＨ２Ｏ２濃度は、水で１０万分の１に薄めてから、過酸化水素用「パックテスト」（（株）共立理化学研究所：ＷＡＫ−Ｈ２Ｏ２）に供した。
同時に、同条件にて、５％過酸化水素水（１ｍL）と純水（１ｍL）を入れ替えて測定を行い、得られたデータは、ＰＥＧ−ＰＣ（１５ｍｇ）／水（１ｍＬ）については「ブランク１」、ＣＬＰＣ（１５ｍｇ）／水（１ｍＬ）については「ブランク２」として表示した。
この「パックテスト」とは、ペルオキシダーゼとフェノール類と４−アミノアンチピリンの粉体物がパック内に含まれ、過酸化水素水と共存させ、（キノンイミン生成量に応じて）紫色に発色する濃さと標準色表に照らし合わせて、過酸化水素濃度を導く測定方法である。過酸化水素水（紫色濃さ）の範囲は０〜５ｐｐｍである。
上記測定により得られた結果を、表１４に示す。【０２３１】
【表１４】
2014073673.tif 000022
【０２３２】
表１４のパックテスト測定結果から、ＣＬＰＣを用いた際の測定値（７％）が「ブランク」の数値（５％）を超えていた。この測定結果は、過硫酸（Ｈ２Ｓ２Ｏ８）も本テストで過酸化水素様に働く知見がある理由から、ＣＬＰＣに含まれる硫安又はＰＣ由来硫黄酸化物（Ｓ−Ｏ、Ｓ＝Ｏ）などの酸素供与体（夾雑物）によって、キノンイミン合成を促す効果がみられるなど、本件（ＣＬＰＣの場合）のカタラーゼ活性テストとしては困難さが観られた。他方、ＰＥＧ−ＰＣの場合には、上記のような夾雑物は存在しないものと考えられるため、このような「パックテスト」を用いる測定は、定性的ないし半定量的な測定（スクリーニング等）には、ある程度の有用性を有するものと考えられる。【０２３３】
なお、上記の「パックテスト」の詳細、およびペルオキシダーゼ／フェノール類／４−アミノアンチピリンを用いる測定系の詳細に関しては、必要に応じて、以下の文献ないしＵＲＬを参照することができる。
（１）「パックテスト」：
http://kyoritsu-lab.co.jp/pack/packtest/manual2/wak_h2o2.pdf
（２）測定系：ペルオキシダーゼ, 過酸化水素および４-アミノアンチピリンを用いる水中フェノール類の吸光光度定量法（Absorptiometric Determination of Phenolic Compounds in Water using ４-Aminoantipyrine, Hydrogenperoxide and Peroxidase）』
（参考ＵＲＬ  http://ci.nii.ac.jp/naid/110003642714/ ）
衛生化学 ２４（４），１７５−１８１，１９７８−０８−３１，日本薬学会【０２３４】
実施例２０
（カタラーゼ活性の測定；過酸化水素濃度計による測定）
水中に含まれる過酸化水素の屈折率の強さから濃度を算出できるアタゴ社製の過酸化水素濃度計ＰＡＬ−３９Ｓ（デジタル表示）を用いて、ＰＣのカララーゼ活性を測定した。なお、ここで使用した過酸化水素濃度計の詳細に関しては、必要に応じて、下記のＵＲＬを参照することができる。
http://www.atago.net/japanese/products_pal_top.html【０２３５】
カタラーゼ活性の測定は、１８ｍｍφ試験管中に、各サンプル：１）ＰＥＧ−ＰＣ（１５ｍｇ）又は２）ＣＬＰＣ（１５ｍｇ）と５％過酸化水素水（１ｍL）を加え、３７℃で５分間、撹拌（７００ｒｐｍ）した。該反応液を遠心分離（３６００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して、その上清み０．３ｍＬを、過酸化水素濃度計ＰＡＬ−３９Ｓのプリズム面にたらして測定した。同時に、同条件にて、５％過酸化水素水（１ｍL）と純水（１ｍL）を入れ替えて測定を行い、ＰＥＧ−ＰＣ（１５ｍｇ）／水（１ｍＬ）については「ブランク１」、ＣＬＰＣ（１５ｍｇ）／水（１ｍＬ）については「ブランク２」とした。【０２３６】
以上から、ＰＥＧ−ＰＣを使用した場合の反応系におけるＨ２Ｏ２消費量と、ＣＬＰＣを使用した場合の反応系におけるＨ２Ｏ２消費量とは、以下のように計算することができる。表１４にはその結果を示す。
反応後のＨ２Ｏ２残存量（ＰＥＧ−ＰＣ）＝（実測値：８．０％）−（ブランク１値：２．２％）＝５．８％
反応後のＨ２Ｏ２残存量（ＣＬＰＣ）＝（実測値：１０.４％）−（ブランク２値：４．
０％）＝６．４％
Ｈ２Ｏ２消費量（ＰＥＧ−ＰＣ）＝（ＢＬＡＮＫ系におけるＨ２Ｏ２残存量：６．８％）−（ＰＥＧ−ＰＣ反応後のＨ２Ｏ２残存量：５．８％）＝１．０％（相対値で１４．７％消費）
Ｈ２Ｏ２消費量（ＣＬＰＣ）＝（ＢＬＡＮＫ系におけるＨ２Ｏ２残存量：６．８％）−（ＣＬＰＣ−ＰＣ反応後のＨ２Ｏ２残存量：６．４％）＝０．４％（相対値で５．９％消費）【０２３７】
【表１５】
2014073673.tif 000023
【０２３８】
表１５に示した過酸化水素濃度計ＰＡＬ−３９Ｓの結果から、実験において発生した「泡」の正体は酸素であって、過酸化水素を水と酸素に変えるカタラーゼ活性の酵素の関与が確定された。従って、ＰＥＧ−ＰＣ（１５ｍｇ）は、５％−過酸化水素水に対して、およそ１０，０００ｐｐｍ消費のカタラーゼ活性、ＣＬＰＣ（１５ｍｇ）についてはおよそ４０００ｐｐｍ消費のカタラーゼ活性を示した。【０２３９】
従って、１分間当りに１μモルの基質（Ｈ２Ｏ２：ＭＷ３４）を変化させることができるＰＥＧ−ＰＣ量又はＣＬＰＣ量を計算することで、各ＰＣ触媒の活性（ユニット）を、以下のように算出できる。
６．８％−Ｈ２Ｏ２ａｑ．＝６８ｍｇ／ｍＬ−Ｈ２Ｏ２＝２ｍＭ／ｍＬ−Ｈ２Ｏ２
このうち、各ＰＣ触媒の消費量は、上記の「表１４］の消費％を参考にすると、５分間当りでは、
＊ＰＥＧ−ＰＣ（１５ｍｇ）＝２ｍＭ／ｍＬ×０．１４７＝２９４μＭ／ｍＬ−Ｈ２Ｏ２
従って、ユニット＝１５０００÷２９４≒５０μｇ／μＭ。
＊ＣＬＰＣ（１５ｍｇ）＝２ｍＭ／ｍＬ×０．０５９＝１１８μＭ／ｍＬ−Ｈ２Ｏ２
従って、ユニット＝１５０００÷１１８≒１２７μｇ／μＭ。
以上の結果から、５分間当りに１μモルの基質（Ｈ２Ｏ２：ＭＷ３４）を変化させることができるＰＥＧ−ＰＣ量（５０μｇ）のもつカタラーゼ活性は、ＣＬＰＣ量（１２７μｇ）の２．３倍であることが明らかとなった。この結果は。表１１で示したＰＥＧ−ＰＣとＣＬＰＣの泡の観察結果とほぼ同等の結果であった。【０２４０】
以上の各実施例の結果、表１に示す鉄成分の濃縮（Ｆｅ：約９倍）と、表１１に示すカタラーゼ活性：２倍以上とＰＱＱ−脱水素酵素とシトクロームｃオキシダーゼ（不斉酸化活性：約２〜４倍：３６ｈ〜４８ｈ→１３ｈ〜１８ｈ）の相関を得た。即ち、含有鉄量とＰＱＱ−脱水素酵素／シトクロームｃオキシダーゼ量（不斉酸化活性）の平易な確認測定法の１つとして、直径１８ｍｍφの試験管中で、５％−Ｈ２Ｏ２添加後に泡立評価が採用できる。【０２４１】
実施例２１
（ＣＬＰＣ−２とＰＥＧ−ＰＣの連続再利用の有効性）
表１０で使用したＣＬＰＣ−２（２０ｍｇ：３０％硫安沈殿後遠心分離された沈殿物由来ＰＣ）とＰＥＧ−ＰＣ（２０ｍｇ）を５０ｍＭ−グリシンＮａＯＨ（ｐＨ９．０：４ｍＬ）／ＤＭＳＯ（＜１．０％（ｖ／ｖ））中、基質Ｒａｃ−２（２０，０００ｐｐｍ、３０μＬ）の添加にて、実施例１４の反応条件にて反応させた。反応終了後は、ヘキサン（４．０ｍＬ）を加え均一後に回収して、ヘキサン抽出液はＨＰＬＣの光学分割カラムを用い定量と光学純度を測定し、残った各ＰＣ触媒溶液は更に、基質Ｒａｃ−２（２０，０００ｐｐｍ、３０μＬ）加えることで、その連続再利用の有効性を確かめた。その連続再利用の結果を表１６に示す。【０２４２】
【表１６】
2014073673.tif 000024
【０２４３】
表１６の結果から、グルタルアルデヒドにより化学的に化学修飾されたＰＣでは、抽出溶媒ヘキサンによる変性は起こらず、最低３回までの連続再利用が光学純度と収率を損なうことなく可能であることが分かった。一方、物理的な高分子化合物（ＰＥＧ：ポリエチレングリコールなど）でコーティングされたＰＣでは、ヘキサンによる溶媒効果を受け変性してしまうため、２回目以降の活性は失われる。しかしながら、図１１（ｃ）で示されている通り、基質（２０，０００ｐｐｍ、３０μＬ）の反応開始０ｈ後、１２ｈ後、２０ｈ後の各３回の連続添加においても活性は失われず、基質濃度１０００ｐｐｍ程度では、３０ｈで光学分割できている。一方、ＣＬＰＣは、各３回の連続添加では反応が進行できない。【０２４４】
以上の結果、ＣＬＰＣとＨＰＣ−ＰＣのようなＰＣ固定化方法の違いにより、様々な用途による使い分けが可能となる。熱安定性は双方同等であるが、溶媒安定性を求める場合は化学的に結合された１）ＣＬＰＣ（連続再利用型）、食用や環境に配慮した一回きりの強い光学分割活性を得たい場合は２）ＨＰＣ−ＰＣである。
図１の第２の工程で得られるＰＣ濃縮物（遠心分離）を、化学的に固定化処理するのか、物理的に固定化処理するのか、本発明では、包括的なＰＣの活用方法を提案する目的で、そのさまざまな処理方法とその効果を明らかにしている。【０２４５】
実施例２２
（ＰＥＧ−ＰＣによる両鏡像体の選択的不斉酸化的合成）
図１の第２の工程において、濃縮ＰＣ沈殿物の５倍等量程度の０．５〜１．０％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＤ：分子量１０００／４０００＝２／１）を含む５０ｍＭグリシンＮａＯＨ緩衝液中に均一混合し、２０時間静置後、遠心沈殿させて得られる沈殿物を減圧凍結乾燥（ＦＤ）して粉砕した。この場合、ＣＬＰＣaはとＡＧＰＣに比べて、ＰＥＧ４０００がＰＣ表面に顕著に覆われていることを表１７中にて確認した。ＣＬＰＣとＡＧＰＣ比活性はそれぞれ、０．６ｍＵと０．８ｍＵ（詳細は、図１９を参照）とＰＥＧの分子量が１０００を含む場合の方が強い。【０２４６】
【表１７】
2014073673.tif 000025
【０２４７】
図３との比較から、２．６％Ca２+に覆われたＰＣ表面上に更にＰＥＧをコーティングすることにより様々なＰＣ活性、例えば、反応速度向上と立体選択性反転、に影響を及ぼすことが分かる。分子量４０００をコーティングしたＰＣでは、基質Ｒａｃ−２のＲ体の立体選択的酸化反応が生じる一方で、分子量１０００をコーティングしたＰＣではＳ体の立体選択的酸化反応を触媒する。希釈された水溶液中において、ＰＣコーティングされたＰＥＧは“基質のＰＣ表面の浸透を促し活性中心へと導く”補助剤として働くことが分かる。【０２４８】
表１７と図１９にその詳細データは示すが、ＰＥＧ分子量を４０００から１０００を含む物へ変えることで、基質Ｒａｃ−１などに対し、Ｒ体選択的酸化反応からＳ体選択的に反転される一方、Ｓ体が酸化された後に引き続き、Ｒ体も酸化され全てがケトンに酸化される点も見逃せない。ＰＥＧ分子量４０００使用のＰＥＧ−ＰＣやＣＬＰＣ（硫安による活性速度の低下が生じる傾向あり）については、Ｓ体選択的酸化反応は殆ど観られないといった興味深い現象もこららのデータから明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０２４９】
本発明の不斉酸化反応を有する蛋白質複合体、及びその製造方法は、医薬品や香料や食品等のファインケミカル分野における合成する光学活性アルコールなどの光学異性体を製造安価で、環境に優しく、平易に生産することができる新規な不斉酸化触媒を提供できる。
【図１】
2014073673.tif 000026
【図２】
2014073673.tif 000027
【図３】
2014073673.tif 000028
【図４】
2014073673.tif 000029
【図７】
2014073673.tif 000030
【図８】
2014073673.tif 000031
【図９】
2014073673.tif 000032
【図１０】
2014073673.tif 000033
【図１１】
2014073673.tif 000034
【図１２】
2014073673.tif 000035
【図１３】
2014073673.tif 000036
【図１４】
2014073673.tif 000037
【図１５】
2014073673.tif 000038
【図１６】
2014073673.tif 000039
【図１７】
2014073673.tif 000040
【図１９】
2014073673.tif 000041
【図２０】
2014073673.tif 000042
【図５】
2014073673.tif 000043
【図６】
2014073673.tif 000044
【図１８】
2014073673.tif 000045
【図２１】
2014073673.tif 000046
【国際調査報告】
2014073673.tif 000047
2014073673.tif 000048