(57)【要約】【課題】新規な作用機序に基づく尿失禁の治療又は予防用医薬組成物、及び、当該医薬組成物に有効成分として含有される化合物のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】本発明は、メラトニン受容体活性化作用を有する化合物を有効成分として含有する、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防用医薬組成物に関する。当該有効成分として、メラトニン、ラメルテオン、アゴメラチン、タシメルテオン又はTIK-301等が挙げられる。また、メラトニン受容体の活性化を測定する工程、摘出尿道の収縮を測定する工程、尿道内圧を測定する工程などからなる腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防用医薬組成物に有効成分として含有される化合物のスクリーニング方法に関する。【選択図】図６
2014010603.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラトニン受容体活性化作用を評価することを含む腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁を治療又は予防するための化合物を選択する方法。
【請求項２】
腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁を治療又は予防するための化合物を選択する方法であって、
化合物をメラトニン受容体発現細胞に接触させる工程、
メラトニン受容体活性化を測定する工程、及び、
メラトニン受容体を活性化させた化合物を選択する工程を含む方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、選択した化合物が腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁に対する治療効果を有することを確認する工程をさらに含む方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法において、
選択された化合物を摘出尿道に接触させる工程、
該摘出尿道の収縮を測定する工程、及び、
該摘出尿道を収縮させた化合物を選択する工程をさらに含む方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法において、治療効果を有することを確認する工程が
選択された化合物を対象に投与する工程、
該対象の尿道内圧を測定する工程、及び、
該尿道内圧を上昇させた化合物を選択する工程である方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法において、治療効果を有することを確認する工程が、
選択された化合物を対象に投与する前及び投与した後において尿失禁のパラメーターを測定する工程である方法。
【請求項７】
メラトニン受容体がMT1受容体である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
メラトニン受容体ポリペプチド又はメラトニン受容体発現細胞を含む、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防するための化合物を選択する方法に用いられるスクリーニングツール。
【請求項９】
腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防するための化合物を選択する方法に用いられるスクリーニングツールを製造するためのメラトニン受容体ポリペプチド又はメラトニン受容体発現細胞の使用。
【請求項１０】
腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防するための化合物を選択する方法に用いられるスクリーニングツールとしてのメラトニン受容体ポリペプチド又はメラトニン受容体発現細胞の使用。
【請求項１１】
メラトニン受容体活性化作用を有する化合物を有効成分として含有する、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防用医薬組成物。
【請求項１２】
メラトニン受容体が、MT1受容体である請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
メラトニン受容体活性化作用を有する化合物が、メラトニン、ラメルテオン、アゴメラチン、タシメルテオン及びTIK-301並びにそれらの製薬学的に許容される塩からなる群より選択される化合物である請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
メラトニン受容体活性化作用を有する化合物の有効量を対象に投与することを含む、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁を治療又は予防する方法。
【請求項１５】
メラトニン受容体が、MT1受容体である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
メラトニン受容体活性化作用を有する化合物が、メラトニン、ラメルテオン、アゴメラチン、タシメルテオン及びTIK-301並びにそれらの製薬学的に許容される塩からなる群より選択される化合物である請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防用医薬組成物を製造するための、メラトニン受容体活性化作用を有する化合物の使用。
【請求項１８】
メラトニン受容体が、MT1受容体である請求項１７に記載の化合物の使用。
【請求項１９】
メラトニン受容体活性化作用を有する化合物が、メラトニン、ラメルテオン、アゴメラチン、タシメルテオン及びTIK-301並びにそれらの製薬学的に許容される塩からなる群より選択される請求項１７又は１８に記載の化合物の使用。
【請求項２０】
腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療のための、メラトニン受容体活性化作用を有する化合物の使用。
【請求項２１】
メラトニン受容体が、MT1受容体である請求項２０に記載の化合物の使用。
【請求項２２】
メラトニン受容体活性化作用を有する化合物が、メラトニン、ラメルテオン、アゴメラチン、タシメルテオン及びTIK-301並びにそれらの製薬学的に許容される塩からなる群より選択される化合物である請求項２０又は２１に記載の化合物の使用。
【請求項２３】
腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療のための、メラトニン受容体活性化作用を有する化合物。
【請求項２４】
メラトニン受容体が、MT1受容体である請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
メラトニン受容体活性化作用を有する化合物が、メラトニン、ラメルテオン、アゴメラチン、タシメルテオン及びTIK-301並びにそれらの製薬学的に許容される塩からなる群より選択される化合物である請求項２３又は２４に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第一に、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防用医薬組成物に含有される化合物のスクリーニング方法及びスクリーニングツールに関し、第二に、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防用医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
尿失禁とは、尿の不随意の漏れがあって、他覚的に認められ、社会的または衛生的にこれらが問題となる状態である（Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics, 25, 251-263 (2000)）。尿失禁の代表的なものとしては、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁、反射性尿失禁、溢流性尿失禁、真性尿失禁、及び、それらが混在している混合型尿失禁等が知られている。【０００３】
尿失禁の最も一般的なタイプは腹圧性尿失禁であり、尿失禁を発症している女性の50%が腹圧性尿失禁であることが報告されている（International Urogynecology Journal, 11(5), 301-319 (2000)）。腹圧性尿失禁とは、咳、くしゃみ、運動などの腹圧上昇時に、膀胱が収縮しないのにもかかわらず、不随意に尿が漏れ出てしまう疾患をいう。腹圧性尿失禁の原因は、大きく二つに分けられる。一つは、膀胱頸部・尿道の過可動性型であり、骨盤底筋弛緩に基づく膀胱頸部下垂により腹圧の尿道への伝導が不良となり、腹圧上昇時に膀胱内圧のみが上昇し尿が漏れるものである。他の一つは、内因性括約筋不全による括約筋機能の低下により、腹圧上昇時に尿が漏れるものである。腹圧性尿失禁の発症には、加齢や出産による骨盤底筋の脆弱化や尿道機能の低下が関与している可能性が高い。特に、妊娠や経膣出産による骨盤の外傷は持続的な腹圧性尿失禁発症の危険因子として知られ、初産後5年間での腹圧性尿失禁罹患率は約30％と報告されている（Neurourology and Urodynamics, 21(1), 2-29 (2002)）。【０００４】
切迫性尿失禁とは、急に起こる抑えられないような強い尿意で我慢することが困難な愁訴（尿意切迫感）の直後に不随意に尿が漏れるという疾患である。混合型尿失禁とは、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁、反射性尿失禁、溢流性尿失禁、真性尿失禁等の複数の尿失禁を併発している状態であり、多くは切迫性尿失禁と腹圧性尿失禁を発症している。【０００５】
尿失禁は、生活の質（ＱＯＬ：クオリティ・オブ・ライフ）に大きな影響を与える。その症状を気にすることにより患者の活動範囲を制限し、社会的な孤立や孤独感を感じさせることになる。【０００６】
腹圧性尿失禁治療薬として、セロトニン・ノルエピネフリン再取り込み阻害作用（SNRI）を有するデュロキセチン、選択的ノルエピネフリン再取り込み阻害作用(NRI)を有するニソキセチンなどが報告されている（International Urogynecology Journal, 14, 367-372 (2003)及びAmerican Journal of Physiology - Renal Physiology, 292(2), 639-646 (2007)）。ノルエピネフリン及びセロトニンは、咳、くしゃみ、運動時に認められるような急激な膀胱内圧の上昇による体性神経を介した反射において、尿道固有横紋筋を支配する体性神経の起始核であるオヌフ核を興奮させる。オヌフ核の興奮は、遠心性の体性神経である陰部神経を興奮させ、尿道固有横紋筋を収縮させる。【０００７】
デュロキセチンは、臨床試験で腹圧性尿失禁に対する有効性が報告されたが、吐き気、不眠、めまい及び自殺志願傾向等の副作用を有している。ニソキセチンは、尿道内圧を上昇させるとともに、くしゃみによって誘発される尿漏れを改善することが報告されている。【０００８】
蓄尿時における膀胱の伸展刺激による自律神経の神経反射において、α1アドレナリン受容体は尿道に存在して尿道収縮を惹起させることにより禁制を保つ役割を果たしている。これまでに、複数のα1アドレナリン受容体アゴニスト作用を有する薬剤が、強い尿道収縮作用を有することが報告され、また、臨床試験において、α1アドレナリン受容体アゴニスト作用を有する薬剤が腹圧性尿失禁に有効であることも示されてきた（Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics, 25, 251-263 (2000)、International Urogynecology Journal, 14, 367-372 (2003)、Urology, 62(Sup 4A), 31-38 (2003)、及びBJU International, 93, 162-170 (2004)）。しかしながら、α1アドレナリン受容体アゴニストは、血圧上昇等の心血管副作用を有することが報告されている。【０００９】
以上のように、腹圧性尿失禁に対する薬物治療として、蓄尿時に膀胱内圧が上昇した際に、禁制を維持するために尿道抵抗を上昇させることが有効と考えられ、いくつかの作用機序に基づく薬剤が検討されてきた。しかし、副作用等の問題から、新たな作用機序に基づく腹圧性尿失禁治療剤の開発が強く望まれていた。【００１０】
メラトニンは、生殖腺の機能や発育に対して抑制効果を示す、松果体から分泌されるホルモンである。メラトニンは、動物のサーカディアンリズムに影響し、生殖機能を環境の光周期に同調させる役割を演じている。【００１１】
メラトニンが夜間頻尿を改善することが報告されているが、作用機序は明らかにされていない(非特許文献１)。また、メラトニンが加齢等による膀胱収縮力の低下を改善することが報告されている（非特許文献２−６）。一方、メラトニンが膀胱収縮を抑制することや（特許文献１及び非特許文献７）、過活動膀胱を改善すること（非特許文献８）が報告されている。しかしながら、メラトニンが、腹圧性尿失禁を抑制すること、あるいは、メラトニンが尿道の収縮に関与することは一切報告されていない。さらに、メラトニンにより影響される可能性のある疾患として、下部尿路の疾患や障害（例えば排尿障害、尿失禁等）が例示されているものの、それを支持する具体的なデータの開示はない。（特許文献５）【００１２】
メラトニンの受容体は、MT1(Mel1a)、MT2(Mel1b)、MT3(Mel1c)の３つのサブタイプが知られている(非特許文献９及び１０)。MT1及びMT2は、Gi及びGqに共役するGタンパク質共役型受容体(GPCR)であるが、MT3はキノン還元酵素（QR2）がメラトニン結合部位を有しているものである。メラトニンのMT1及びMT2受容体に対する親和性は高いが、MT3受容体に対する親和性は低い(非特許文献１０)。【００１３】
ラメルテオン（TAK-375、(S)-N-[2-(1,6,7,8-テトラヒドロ-2H-インデノ[5,4-b]フラン-8-イル)エチル]プロピオンアミド）は、MT1及びMT2受容体アゴニストとして見出された化合物であり、入眠障害を特徴とする不眠症の治療に用いられている（非特許文献１１及び１２）。【００１４】
アゴメラチン（agomelatine、N-[2-(7-メトキシナフト-1-イル)エチル]アセトアミド）は、MT1及びMT2受容体アゴニスト活性並びに5-HT2C受容体アンタゴニスト活性を併せ持つ化合物で、うつ病の治療に用いられている（特許文献２）。【００１５】
タシメルテオン（tasimelteon、(-)-(trans)-N-{[2-(2,3-ジヒドロベンゾフラン-4-イル)シクロプロパン-1-イル]メチル}プロパンアミド）は、MT1及びMT2受容体に結合し、非24時間睡眠覚醒障害の治療を目的にして、現在フェーズIII試験が進行中である化合物である（特許文献３）。【００１６】
TIK-301 (N-[(2R)-2-(6-クロロ-5-メトキシ-1H-インドール-3-イル)プロピル]アセトアミド)は、、MT1及びMT2受容体アゴニスト活性を有し、不眠症の治療を目的とした臨床試験が行われている化合物である（特許文献４）。【００１７】
MT1及び/又はMT2受容体アゴニストは、上記の化合物以外にもいくつか報告されているが、いずれも睡眠障害やうつ病などの中枢疾患の治療を目的としたものであり、尿失禁をはじめとする泌尿器疾患の治療を目的としたものは報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】韓国公開特許１０−２０１１-０９０３７２号公報
【特許文献２】欧州特許出願公開４４７２８５号明細書
【特許文献３】国際公開９８／０２５６０６号公報
【特許文献４】欧州特許出願公開２８１２４２号明細書
【特許文献５】国際公開２００８／０６９３１１号パンフレット
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Journal of Urology, 171(3), 1199-1202 (2004)
【非特許文献２】Journal of Urology, 177(4), 1558-1561 (2007)
【非特許文献３】Journal of Pineal Research, 44(4), 416-425 (2008)
【非特許文献４】American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology, 293(2), R793-803 (2007)
【非特許文献５】Journal of Pharmacy and Pharmacology, 56(3), 359-366 (2004)
【非特許文献６】Curr. Med. Chem. 17(34), 4150-4165, (2010)
【非特許文献７】BJU International, 94(9), 1373-1376 (2004)
【非特許文献８】Acta. Medica., 54(2), 63-68 (2011)
【非特許文献９】Cell and Tissue Research, 309, 151-162 (2002)
【非特許文献１０】Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 91, 6133-6137 (1994)
【非特許文献１１】Neuropharmacology, 48, 301-310 (2005)
【非特許文献１２】Annals of Neurology, 54(suppl 7), S46 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の課題は、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防において、新たな作用機序に基づく薬剤、当該医薬組成物に有効成分として含有される化合物のスクリーニング方法及びスクリーニングツールを提供することにある。特に、メラトニン受容体活性化作用を有する化合物を有効成分として含有する、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防用医薬組成物を提供すること、及び、当該医薬組成物に有効成分として含有される化合物のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
発明者らは、新たな作用機序に基づく腹圧性尿失禁治療薬の探索を目的として、尿道を含む発現解析を実施した結果、メラトニン受容体のサブタイプのひとつであるMT1受容体の遺伝子が尿道に高発現していることを見出した。さらに、発明者らは、メラトニン受容体活性化作用を有する化合物が、尿道を収縮させることを見出した。また、発明者らは、この尿道収縮作用に、MT1受容体活性化作用が必要であることも見出した。加えて、発明者らは、メラトニン受容体活性化作用を指標に腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法を確立し、メラトニン受容体活性化作用を有する化合物を有効成分として含有する、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防用医薬組成物を見出した。【００２２】
すなわち、本発明は、以下に関する。
[1]メラトニン受容体活性化作用を評価することを含む腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁を治療又は予防するための化合物を選択する方法。
[2]腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁を治療又は予防するための化合物を選択する方法であって、
化合物をメラトニン受容体発現細胞に接触させる工程、
メラトニン受容体活性化を測定する工程、及び、
メラトニン受容体を活性化させた化合物を選択する工程を含む方法。
[3]上記[2]に記載の方法において、選択した化合物が腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁に対する治療効果を有することを確認する工程をさらに含む方法。
[4]上記[2]に記載の方法において、
選択された化合物を摘出尿道に接触させる工程、
該摘出尿道の収縮を測定する工程、及び、
該摘出尿道を収縮させた化合物を選択する工程をさらに含む方法。
[5]上記[3]に記載の方法において、治療効果を有することを確認する工程が
選択された化合物を対象に投与する工程、
該対象の尿道内圧を測定する工程、及び、
該尿道内圧を上昇させた化合物を選択する工程である方法。
[6]上記[3]に記載の方法において、治療効果を有することを確認する工程が、
選択された化合物を対象に投与する前及び投与した後において尿失禁のパラメーターを測定する工程である方法。
[7]メラトニン受容体がMT1受容体である、上記[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]メラトニン受容体ポリペプチド又はメラトニン受容体発現細胞を含む、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防するための化合物を選択する方法に用いられるスクリーニングツール。
[9]腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防するための化合物を選択する方法に用いられるスクリーニングツールを製造するためのメラトニン受容体ポリペプチド又はメラトニン受容体発現細胞の使用。
[10]腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防するための化合物を選択する方法に用いられるスクリーニングツールとしてのメラトニン受容体ポリペプチド又はメラトニン受容体発現細胞の使用。
[11]メラトニン受容体活性化作用を有する化合物を有効成分として含有する、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防用医薬組成物。
[12]メラトニン受容体が、MT1受容体である上記[11]に記載の医薬組成物。
[13]メラトニン受容体活性化作用を有する化合物が、メラトニン、ラメルテオン、アゴメラチン、タシメルテオン及びTIK-301並びにそれらの製薬学的に許容される塩からなる群より選択される化合物である上記[11]又は[12]に記載の医薬組成物。
[14]メラトニン受容体活性化作用を有する化合物の有効量を対象に投与することを含む、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁を治療又は予防する方法。
[15]メラトニン受容体が、MT1受容体である上記[14]に記載の方法。
[16]メラトニン受容体活性化作用を有する化合物が、メラトニン、ラメルテオン、アゴメラチン、タシメルテオン及びTIK-301並びにそれらの製薬学的に許容される塩からなる群より選択される化合物である上記[14]又は[15]に記載の方法。
[17]腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防用医薬組成物を製造するための、メラトニン受容体活性化作用を有する化合物の使用。
[18]メラトニン受容体が、MT1受容体である上記[17]に記載の化合物の使用。
[19]メラトニン受容体活性化作用を有する化合物が、メラトニン、ラメルテオン、アゴメラチン、タシメルテオン及びTIK-301並びにそれらの製薬学的に許容される塩からなる群より選択される上記[17]又は[18]に記載の化合物の使用。
[20]腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療のための、メラトニン受容体活性化作用を有する化合物の使用。
[21]メラトニン受容体が、MT1受容体である上記[20]に記載の化合物の使用。
[22]メラトニン受容体活性化作用を有する化合物が、メラトニン、ラメルテオン、アゴメラチン、タシメルテオン及びTIK-301並びにそれらの製薬学的に許容される塩からなる群より選択される化合物である上記[20]又は[21]に記載の化合物の使用。
[23]腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療のための、メラトニン受容体活性化作用を有する化合物。
[24]メラトニン受容体が、MT1受容体である上記[23]に記載の化合物。
[25]メラトニン受容体活性化作用を有する化合物が、メラトニン、ラメルテオン、アゴメラチン、タシメルテオン及びTIK-301並びにそれらの製薬学的に許容される塩からなる群より選択される化合物である上記[23]又は[24]に記載の化合物。【００２３】
また、本発明は、以下にも関する。
[25]デュロキセチンと併用することを特徴とする上記[11]〜[13]に記載の医薬組成物。
[26]デュロキセチンと併用することを特徴とする上記[14]〜[16]に記載の方法。
[27]デュロキセチンと併用することを特徴とする上記[17]〜[19]に記載の使用。【００２４】
なお、「対象」とは、その治療又は予防を必要とするヒト又はその他の動物であり、ある態様としては、その治療又は予防を必要とするヒトである。【００２５】
また、尿失禁のある態様としては、腹圧性尿失禁、切迫性尿失禁又は混合型尿失禁であり、別の態様としては、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁である。またさらに別の態様としては、腹圧性尿失禁であり、またさらに別の態様としては混合型尿失禁である。【００２６】
本明細書においては、腹圧性尿失禁とは、咳、くしゃみ、運動などの腹圧上昇時に、膀胱が収縮しないのにもかかわらず、不随意に尿が漏れ出てしまう疾患であり、切迫性尿失禁は、急に起こる抑えられないような強い尿意で我慢することが困難な愁訴（尿意切迫感）の直後に不随意に尿が漏れるという疾患であり、混合型尿失禁は、切迫性尿失禁、機能性尿失禁、反射性尿失禁、溢流性尿失禁及び真性尿失禁からなる群から選択される1以上の尿失禁と腹圧性尿失禁を併発している疾患を意味し、混合型尿失禁のある態様としては、切迫性尿失禁と腹圧性尿失禁を併発している疾患である。
【発明の効果】
【００２７】
本発明は、新規な作用機序に基づく、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防用医薬組成物、並びに当該医薬組成物に有効成分として含有される化合物のスクリーニング方法及びスクリーニングツールを提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ラット正常組織におけるMT1受容体発現量を示す図である。縦軸は反応溶液中に存在する遺伝子のコピー数を示す。図中、DRGはdorsal root ganglion（後根神経節）を示す。
【図２】メラトニン(Melatonin)及びラメルテオン(Ramelteon)のヒトMT1受容体発現細胞におけるメラトニン受容体活性化作用を示す図である。縦軸は、細胞内Ca2+濃度変化に伴う蛍光強度の変化を示す。
【図３】メラトニン及びラメルテオンのヒトMT2受容体発現細胞におけるメラトニン受容体活性化作用を示す図である。縦軸は、細胞内Ca2+濃度変化に伴う蛍光強度の変化を示す。
【図４】アゴメラチン(Agomelatin)、タシメルテオン(Tasimelteon)及びTIK-301のヒトMT1受容体発現細胞におけるメラトニン受容体活性化作用を示す図である。縦軸は、細胞内Ca2+濃度変化に伴う蛍光強度の変化を示す。
【図５】アゴメラチン、タシメルテオン及びTIK-301のヒトMT2受容体発現細胞におけるメラトニン受容体活性化作用を示す図である。縦軸は、細胞内Ca2+濃度変化に伴う蛍光強度の変化を示す。
【図６】メラトニン及びラメルテオンの摘出尿道における尿道収縮作用を示す図である。縦軸は、10-5Mのフェニレフリンによる収縮強度を100%とした場合の化合物の収縮強度を示す。
【図７】アゴメラチン、タシメルテオン及びTIK-301の摘出尿道における尿道収縮作用を示す図である。縦軸は、10-5Mのフェニレフリンによる収縮強度を100%とした場合の化合物の収縮強度を示す。
【図８】マイクロチップ法を用いて測定した、メラトニンのラットにおける尿道内圧上昇作用を示す図である。縦軸は、化合物添加前と添加後の尿道内圧の変化をΔ Elevation値として示す。
【図９】マイクロチップ法を用いて測定した、ラメルテオンのラットにおける尿道内圧上昇作用を示す図である。縦軸は、化合物添加前と添加後の尿道内圧の変化をΔ Elevation値として示す。
【図１０】潅流法を用いて測定した、メラトニンのラットにおける尿道内圧上昇作用を示す図である。縦軸は化合物添加前と添加後の尿道内圧の変化をΔ Elevation値として示す。
【図１１】潅流法を用いて測定した、ラメルテオンのラットにおける尿道内圧上昇作用を示す図である。縦軸は化合物添加前と添加後の尿道内圧の変化をΔ Elevation値として示す。
【図１２】潅流法を用いて測定した、アゴメラチンのラットにおける尿道内圧上昇作用を示す図である。縦軸は化合物添加前と添加後の尿道内圧の変化をΔ Elevation値として示す。
【図１３】潅流法を用いて測定した、タシメルテオンのラットにおける尿道内圧上昇作用を示す図である。縦軸は化合物添加前と添加後の尿道内圧の変化をΔ Elevation値として示す。
【図１４】潅流法を用いて測定した、TIK-301のラットにおける尿道内圧上昇作用を示す図である。縦軸は化合物添加前と添加後の尿道内圧の変化をΔ Elevation値として示す。
【図１５】ヒトMT1受容体発現細胞における、ラメルテオンのメラトニン受容体活性化作用に対するルジンドール(Luzindole)添加の効果を示す図である。縦軸は、10-6Mのラメルテオンの作用を100%とした場合の化合物存在時の細胞内Ca2+上昇作用の効果を示す。
【図１６】ヒトMT2受容体発現細胞における、ラメルテオンのメラトニン受容体活性化作用に対するルジンドール添加の効果を示す図である。縦軸は、10-6Mのラメルテオンの作用を100%とした場合の化合物存在時の細胞内Ca2+上昇作用の効果を示す。
【図１７】摘出尿道における、ラメルテオンの尿道収縮作用に対するルジンドール添加の効果を示す図である。縦軸は、10-6Mのラメルテオンの作用を100%とした場合の化合物存在時の収縮強度を示す。
【図１８】メラトニンによる摘出子宮(Uterus)収縮作用を示す図である。縦軸は、60mMのKClによる収縮を100%とした場合の、化合物の収縮強度を示す。
【図１９】ラメルテオンによる摘出膀胱(Bladder)収縮作用及び摘出子宮収縮作用を示す図である。縦軸は、摘出膀胱の場合は、10-6Mのカルバコールによる収縮を100%とした場合の化合物の収縮強度を、又、摘出子宮の場合は、60mMのKClによる収縮を100%とした場合の、化合物の収縮強度をそれぞれ示す。
【図２０】ラメルテオンによる摘出子宮の律動性収縮に対する影響を示す図である。縦軸は、化合物処置前を100%とした場合の子宮の律動性収縮の頻度を示す。
【図２１】メラトニンによるラット平均血圧(MBP)に対する影響を示す図である。縦軸には、平均血圧の変化率を示す。
【図２２】ラメルテオンによるラット平均血圧に対する影響を示す図である。縦軸には、平均血圧の変化率を示す。
【００２９】
なお、本明細書中において便宜上、濃度mol/LをMとして表す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下に、本発明を更に詳細に説明する。
１．スクリーニングツール
本発明を構成するスクリーニングツールとしては、例えば、ポリペプチド又は発現細胞が挙げられる。
【００３１】
本発明を構成するスクリーニングツールとして用いることのできるポリペプチドとしては、例えば、哺乳動物のMT1及び/又はMT2受容体と同一のアミノ酸配列からなるポリペプチド及びそれと機能的に等価なポリペプチドが挙げられる。
機能的に等価なポリペプチドとしては、MT1及び/又はMT2受容体アゴニストにより活性化され細胞内シグナル伝達系に活性を伝達できるものであれば特に限定はされないが、例えば、哺乳動物のMT1及び/又はMT2受容体と同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、哺乳動物のMT1及び/又はMT2受容体のアミノ酸配列において1-10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、並びに、哺乳動物のMT1及び/又はMT2受容体のアミノ酸配列と同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
なお、本明細書における前記「同一性」とは、NEEDLE program（J Mol Biol 1970; 48: 443-453）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Identityを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Gap penalty = 10
Extend penalty = 0.5
Matrix = EBLOSUM62
哺乳動物のMT1及び/又はMT2受容体のアミノ酸配列を含むポリペプチドとしては、例えば、哺乳動物のMT1及び/又はMT2受容体のアミノ酸配列からなるポリペプチドのN末端及び/又はC末端に適当なマーカー配列等を付加したポリペプチドも含まれる。本発明においてスクリーニングツールとして用いることのできる哺乳動物のMT1及び/又はMT2受容体のアミノ酸配列からなるポリペプチドとしては、例えば、ヒト、マウス、及びラット由来のMT1及び/又はMT2受容体（Neuron, 13(5), 1177-1185 (1994)、Endocrinology, 137(8), 3469-3477(1996)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92, 8734-8738 (1995)、Biochem. Biophys. Res. Commun., 262(3), 832-837 (1999)）が挙げられる。本発明では特に、ヒト由来のMT1及び/又はMT2受容体が好ましい。
【００３２】
本発明を構成するスクリーニングツールとして用いることのできるMT1及び/又はMT2受容体発現細胞は、前記スクリーニングツール用ポリペプチドを発現している限り、特に限定されるものではない。MT1及び/又はMT2受容体発現細胞は、外来遺伝子で形質転換することにより、人為的にMT1及び/又はMT2受容体ポリペプチドを発現させた形質転換細胞であってもよく、あるいはMT1及び/又はMT2受容体ポリペプチドを発現している天然の細胞又はその細胞株であることもできる。
【００３３】
なお、「MT1及び／又はMT2受容体」のある態様としては、MT1受容体及びMT2受容体であり、別の態様としては、MT1受容体であり、更に別の態様としては、MT2受容体である。
【００３４】
２．スクリーニングツールの製造方法
本発明のスクリーニングツールは、公知の方法（例えば、Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989）に従って製造することができる。
【００３５】
本発明のスクリーニングツールとして用いることができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適当なベクターに組み込んで、適当な宿主細胞を形質転換させることによって、本発明のスクリーニングツールとして用いることのできるMT1及び/又はMT2受容体発現細胞を得ることができる。また、培養した形質転換細胞から公知の方法（例えば、Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989）により分離生成することによって、本発明のスクリーニングツールとして用いることができるポリペプチドを得ることができる。
【００３６】
本発明のスクリーニングツールとして用いることができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの作製方法は、特に限定されるものではないが、ヒトMT1受容体遺伝子(GenBank登録番号：NM_005958.3)及びヒトMT2受容体遺伝子(GenBank登録番号：NM_005959.3)を、それぞれ目的配列を挟む一対のプライマーを用いたRT-PCR法、又は、化学的合成法などを用いて作製することができる。
【００３７】
形質転換細胞を作成するために使用することのできる宿主細胞は、メラトニン受容体が機能するように発現することができる限り、特に限定されるものではないが、例えば、ヒト胎児腎臓由来HEK293細胞（J. Gen. Virol., 36(1), 59-74 (1977)）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）細胞（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275-1281 (1968)）、サルの細胞であるCOS細胞（Cell, 23, 175-182 (1981)）等を挙げることができる。
【００３８】
形質転換細胞を作成するために使用することのできる発現ベクターはメラトニン受容体を発現することができる限り特に限定されるものではなく、使用する宿主細胞の種類に応じて、適宜選択することができる。発現ベクターは、発現しようとするポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーター、RNAスプライシング部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列を有するものを使用することができ、さらに必要により複製起点を有していることもできる。使用できる発現ベクターとして、例えばpCDNA3.1（Invitrogen社）等を挙げることができる。
【００３９】
発現ベクターを宿主細胞に取り込ませる方法としては、特に限定はされないが、例えば、DEAE-デキストラン法(Nucleic. Acids. Res., 11, 1295-1308 (1983)）、リン酸カルシウム−DNA共沈殿法(Virology, 52, 456-457 (1973))、市販のトランスフェクション試薬（例えば、Lipofectamine（登録商標）（Invitrogen社）、FUGENE（登録商標）（Roche Diagnostics社））を用いた方法等がある。
【００４０】
形質転換細胞は、常法に従って培養することができ、培地は採用した宿主細胞に応じて慣用される種々の培地を適宜選択することができる。例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（Invitrogen社）、MEMα（Invitrogen社）、RPMI-1640（Invitrogen社）等が用いられる。また、培地には必要に応じて牛胎仔血清（FBS）等の血清成分を添加することができる。さらに、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン等の薬剤を遺伝子選択のために、適宜加えることができる。
【００４１】
３．メラトニン受容体活性化を測定することを含むスクリーニング方法
「メラトニン受容体活性化」作用とは、メラトニン受容体のリガンド結合部位に化合物が直接的に結合し作用することにより、又は、間接的に作用することにより、リガンド結合受容体によって機能発現が引き起こされる初期段階の作用のすべてを意味する。例えば、メラトニン受容体に対するアゴニスト作用や部分アゴニスト作用、アロステリック効果によるメラトニン受容体活性化作用が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
「メラトニン受容体活性化を測定する」方法としては、例えば、メラトニン受容体発現細胞と化合物とを接触させて、メラトニン受容体の活性化を測定することが挙げられる。
【００４２】
「メラトニン受容体発現細胞」とは、MT1及び/又はMT2受容体のいずれかのタンパクをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換され、MT1及び/又はMT2受容体のいずれかを発現している形質転換細胞であってもよく、あるいはMT1及び/又はMT2受容体ポリペプチドを発現している天然の細胞又はその細胞株であることもできる。
形質転換細胞の作成方法としては、「２．スクリーニングツールの製造方法」で前述した方法が挙げられる。
【００４３】
メラトニン受容体発現細胞と化合物とを接触させる方法は、特に制限はないが、例えば、形質転換細胞を所望の細胞密度になるように培養プレートに播種し、所望の最終濃度になるように調整した化合物溶液を添加することができる。
【００４４】
メラトニン受容体の活性化の指標としては、Gi共役型GPCRの下流にあるcAMPなどの因子を測定することができる。指標とする因子は特に限定はされないが、共役するG蛋白として、G15、G16、又はGqとGiのキメラG蛋白等を用いることによって、例えば、細胞内におけるカルシウムイオン(Ca2+)、イノシトール-3-リン酸(IP3)、イノシトール-1-リン酸(IP1)などの濃度を測定することができる。別の態様としては、リガンド結合アッセイ法により算出される受容体親和性を指標とすることもできる。
【００４５】
細胞内におけるcAMP、Ca2+、IP3、IP1などの濃度は、標識剤を用いて測定することができる。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、[32P]などが用いられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが上げられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）などが挙げられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが挙げられる。
好ましい測定方法としては、細胞内Ca2+濃度又は細胞内IP1濃度を測定する方法が挙げられる。細胞内Ca2+濃度は、培養細胞にFluo4又はFluo4-AM（Dojindo社）などのCa2+感受性蛍光色素を取り込ませ、FLIPR（登録商標）システム（Molecular Device社）を用いて測定することができる。細胞内IP1濃度は、細胞溶解液にIP-One測定キット（Cisbio社）添付の試薬を加え、時間分解蛍光をプレートリーダーで測定することができる。
【００４６】
化合物の存在下において、化合物の非存在下と比較して、メラトニン受容体活性化の指標が変化すれば、前記化合物はメラトニン受容体を活性化させた化合物であると判定することができる。別の態様としては、メラトニン受容体活性化の指標の変化が化合物の濃度依存的に変化すれば、前記化合物はメラトニン受容体を活性化させた化合物であると判定することができる。具体的には、ある態様としては10μM未満のEC50値、別の態様としては1μM未満のEC50値、また別の態様としては100nM未満のEC50値、さらに別の態様としては10nM未満のEC50値を有する化合物をメラトニン受容体を活性化させた化合物として選択することが挙げられる。
【００４７】
本発明におけるメラトニン受容体活性化を測定する工程を含むスクリーニング方法で得られた化合物が腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁を治療又は予防に有効であることの確認は、当業者に公知の方法あるいはそれを改良した方法を用いることにより実施することができる。例えば、後述する「５．摘出尿道を用いたスクリーニング方法」、「６．尿道内圧を測定するスクリーニング方法」、「７．動物を用いた尿失禁のパラメータの測定方法」に記載した方法で行うことができる。より具体的には実施例3及び4に記載した方法が挙げられる。
【００４８】
４．メラトニン受容体活性化作用を有する化合物
本発明の方法により試験される化合物としては、例えば、医薬又は動物薬の候補化合物などが挙げられる。「メラトニン受容体活性化作用を有する化合物」は、メラトニン受容体発現細胞に化合物を接触させる工程を経てメラトニン受容体を活性化することを見出した化合物だけでなく、メラトニン受容体活性化作用を有することが知られている合成物又は天然物のすべてを包含する。化合物としては、合成物の場合、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Tetrahedron, 51, 8135-8137 (1995)）等によって合成された化合物群、又はファージ・ディスプレイ法（J. Mol. Biol., 222, 301-310 (1991)）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、天然物の場合、例えば、微生物、植物、海洋生物、又は動物由来の成分（例えば、培養上清、組織抽出物等）を用いることもできる。
【００４９】
メラトニン受容体は、MT1、MT2、及びMT3の３種類のサブタイプを有することが知られている。本発明における、メラトニン受容体活性化作用を有する化合物のある態様としては、MT1受容体アゴニスト、MT2受容体アゴニスト、並びにMT1及びMT2受容体アゴニスト作用を有する化合物である。
本発明における、メラトニン受容体活性化作用を有する化合物のある態様としては、メラトニン、ラメルテオン、アゴメラチン、タシメルテオン若しくはTIK-301又はそれらの製薬学的に許容される塩である。
【００５０】
メラトニン又はその製薬学的に許容される塩は、Sigma社からの購入等により入手が可能である。ラメルテオン又はその製薬学的に許容される塩は、国際公開第９７／３２８７１号パンフレットに記載された製法により、あるいはそれに準じた製法により入手が可能である。アゴメラチン又はその製薬学的に許容される塩は、欧州特許出願公開４４７２８５号明細書に記載された製法により、あるいはそれに準じた製法により入手が可能である。タシメルテオン又はその製薬学的に許容される塩は、国際公開第９８／２５６０６号パンフレットに記載された製法により、あるいはそれに準じた製法により入手が可能である。TIK-301又はその製薬学的に許容される塩は、欧州特許出願公開２８１２４２号明細書に記載された製法により、あるいはそれに準じた製法により入手が可能である。
【００５１】
しかしながら、本発明の方法により試験される化合物はこれらの化合物に限定されず、MT1受容体アゴニスト、MT2受容体アゴニスト並びにMT1及びMT2受容体アゴニスト作用を有する化合物を含むことができる。さらに、MT1受容体アゴニスト、MT2受容体アゴニスト並びにMT1及びMT2受容体アゴニスト作用を有する化合物は、メラトニン受容体発現細胞等を用いることにより、容易に得ることができる。
【００５２】
本発明の方法により試験される化合物には、置換基の種類によって、互変異性体や幾何異性体が存在しうる。本明細書中、被験化合物が異性体の一形態のみで記載されることがあるが、本発明の方法により試験される化合物は、それ以外の異性体も包含し、異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
【００５３】
また、本発明の方法により試験される化合物は、不斉炭素原子や軸不斉を有する場合があり、これに基づく光学異性体が存在しうる。本発明の方法により試験される化合物は、光学異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
【００５４】
本発明の方法により試験される化合物における、製薬学的に許容される塩は、置換基の種類によって、酸付加塩又は塩基との塩を形成する場合がある。具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、アスパラギン酸、又はグルタミン酸等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基や、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リシン、オルニチン等の有機塩基との塩、アセチルロイシン等の各種アミノ酸及びアミノ酸誘導体との塩やアンモニウム塩等が挙げられる。
【００５５】
本発明の方法により試験される化合物は、当該化合物の各種水和物や溶媒和物、及び結晶多形の物質も包含する。また、本発明の方法により試験される化合物は、種々の放射性又は非放射性同位体でラベルされた化合物も包含する。
【００５６】
本発明の医薬組成物は、当分野において通常用いられている薬剤用担体、賦形剤等を用いて通常使用されている方法によって調製することができる。投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、又は、関節内、静脈内、筋肉内等の注射剤、坐剤、点眼剤、眼軟膏、経皮用液剤、軟膏剤、経皮用貼付剤、経粘膜液剤、経粘膜貼付剤、吸入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
【００５７】
本発明による経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては、1種又は2種以上の有効成分を、少なくとも1種の不活性な賦形剤と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な添加剤、例えば滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよい。
【００５８】
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水又はエタノールを含む。当該液体組成物は不活性な希釈剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
【００５９】
非経口投与のための注射剤は、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤又は乳濁剤を含有する。水性の溶液剤又は懸濁剤としては、例えば注射用蒸留水又は生理食塩液が含まれる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤としては、例えばエタノールのようなアルコール類がある。このような組成物は、さらに等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、又は溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解又は懸濁して使用することもできる。
【００６０】
外用剤としては、軟膏剤、硬膏剤、クリーム剤、ゼリー剤、パップ剤、噴霧剤、ローション剤、点眼剤、眼軟膏等を包含する。一般に用いられる軟膏基剤、ローション基剤、水性又は非水性の液剤、懸濁剤、乳剤等を含有する。
【００６１】
吸入剤や経鼻剤等の経粘膜剤は固体、液体又は半固体状のものが用いられ、従来公知の方法に従って製造することができる。例えば公知の賦形剤や、更に、pH調整剤、防腐剤、界面活性剤、滑沢剤、安定剤や増粘剤等が適宜添加されていてもよい。投与は、適当な吸入又は吹送のためのデバイスを使用することができる。例えば、計量投与吸入デバイス等の公知のデバイスや噴霧器を使用して、化合物を単独で又は処方された混合物の粉末として、もしくは医薬的に許容し得る担体と組み合わせて溶液又は懸濁液として投与することができる。乾燥粉末吸入器等は、単回又は多数回の投与用のものであってもよく、乾燥粉末又は粉末含有カプセルを利用することができる。あるいは、適当な駆出剤、例えば、クロロフルオロアルカン、ヒドロフルオロアルカン又は二酸化炭素等の好適な気体を使用した加圧エアゾールスプレー等の形態であってもよい。
【００６２】
本発明に用いられる薬剤は腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁を有する患者に対し投与される。投与量は、投与方法、症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
【００６３】
また、化合物がメラトニン受容体活性化作用を有することが明らかでない場合であっても、当該化合物がメラトニン受容体活性化作用を有するか否かは、前述のメラトニン受容体を活性化させる化合物と判定する方法を用いることができる。
【００６４】
メラトニン受容体アンタゴニスト作用を有する化合物を用いることによって、化合物による摘出尿道を収縮させる作用がメラトニン受容体活性化作用に基づく作用であることを確認することができる。例えば、化合物の摘出尿道を収縮させる作用が、メラトニン受容体アンタゴニスト作用を有する化合物によって減弱されたときは、当該化合物は、メラトニン受容体活性化作用を有する化合物であるということができる。
【００６５】
メラトニン受容体アンタゴニスト作用を有する化合物は、公知の合成化合物や天然物を特に制限なく使用することができる。ここで、メラトニン受容体アンタゴニストは、MT1受容体アンタゴニスト、MT2受容体アンタゴニスト、又はMT1及びMT2受容体アンタゴニストのいずれであってもよい。好ましいメラトニン受容体アンタゴニストとして、例えばルジンドール（N-[2-[2-(フェニルメチル)-1H-インドール-3-イル]エチル]アセトアミド）（J. Pharmacol. Exp. Ther. 246, 902-910 (1988)）が挙げられる。ルジンドールは、Nelson Research社からの購入等により容易に入手が可能である。
【００６６】
メラトニン受容体アンタゴニスト作用を有する化合物を摘出尿道に接触させる方法としては、特に制限はないが例えば、所望の最終濃度となるように調整した化合物を摘出尿道を入れた緩衝液中に添加することができる。
メラトニン受容体アンタゴニスト作用を有する化合物は、化合物に対し、その作用を十分に発揮できるようなタイミングで、摘出尿道に接触させることが好ましい。接触のタイミングとしては特に制限はされないが、例えば、化合物を摘出尿道を入れた緩衝液中へ添加する一定時間前に、あるいは、化合物の添加と同時に、メラトニン受容体アンタゴニスト作用を有する化合物を添加することが挙げられる。
【００６７】
メラトニン受容体アンタゴニスト作用を有する化合物を動物に投与する方法は、標的組織(例えば、尿道、膀胱、子宮、血管など)に十分量の化合物が到達するように、化合物を該動物に投与するものであれば特に制限はない。投与形態は、化合物に適した方法であればいずれの投与方法を選択することもできる。
メラトニン受容体アンタゴニスト作用を有する化合物は、化合物に対し、その作用を十分に発揮できるようなタイミングで、動物に投与することが好ましい。投与のタイミングとしては特に制限はされないが、例えば、標的組織においてアンタゴニスト作用を発揮できる程度にメラトニン受容体アンタゴニスト作用を有する化合物の血中濃度が上昇してから、化合物の血中濃度が上昇するようなタイミングで投与することが挙げられる。具体的には、化合物を動物へ投与する一定時間前に、あるいは、化合物の投与と同時に、メラトニン受容体アンタゴニスト作用を有する化合物を投与することが挙げられる。
【００６８】
５．摘出尿道を用いたスクリーニング方法
「摘出尿道」とは、「６．尿道内圧を測定するスクリーニング方法」で後述する哺乳動物から、収縮能及び弛緩能を保った状態で体外に摘出された尿道組織を意味する。体外に摘出した尿道組織は、すみやかに緩衝液中に保存し、収縮能を測定する実験に用いる。摘出尿道の緩衝液は特に限定されないが、例えばクレブスヘンゼライト溶液が挙げられる。
化合物を摘出尿道に接触させる方法は、特に制限されないが例えば、所望の最終濃度となるように調整した化合物を摘出尿道の緩衝液中に添加することができる。
摘出尿道の収縮を測定する方法は、常法を用いることができる。具体的には、摘出尿道を縦切開後、短冊状標本とし、平衡化した一定温度の緩衝液中で懸垂し、化合物による収縮反応をひずみ圧アンプに接続したピックアップ圧トランスデューサーを用いて測定し、ペンレコーダーに記録する。標本は、輪走筋方向又は縦走筋方向のいずれに懸垂してもよい。好ましくは、輪走筋方向に懸垂する。尿道括約筋の関与を除いた作用を検討する場合は、短冊状標本から括約筋部分を切除し、尿道平滑筋標本を作製した後、懸垂することもできる。
【００６９】
本発明では、摘出尿道を特異的に収縮させた化合物を選択する工程をさらに含むことができる。ここで、「特異的に」収縮させたとは、化合物が摘出尿道を収縮させるのに対し、そのほかの組織、例えば、摘出膀胱、摘出子宮などを収縮させないこと、あるいは、摘出尿道の収縮に対して、その他の組織の収縮の程度が小さいことを意味する。
【００７０】
摘出膀胱又は摘出子宮とは、前述した哺乳動物から、収縮能及び弛緩能を保った状態で体外に摘出した膀胱組織又は子宮組織を意味する。摘出膀胱又は摘出子宮の収縮能を測定する実験は、前述の摘出尿道の収縮能を測定する実験に準じた方法を用いることができる。
【００７１】
摘出尿道を収縮させた化合物のある態様としては、後記実施例３に示す摘出尿道収縮作用が100％以上の作用を示す化合物である。
【００７２】
６．尿道内圧を測定するスクリーニング方法
化合物を投与される対象としては、哺乳動物が好ましい。哺乳動物のある態様としては、ヒト、サル、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ等である。別の態様としては、、ヒト、サル、イヌ、ラット、マウス、ウサギ等であり、さらに別の態様としては、ヒトである。またさらに別の態様としては、ラットであり、またさらに別の態様としては、マウスである。動物の性別、齢、体重等は特に限定されない。また、ラットの場合は、約1〜約２４月齢、体重約１００〜約７００ｇのものが好ましく用いられるが、これに限定されない。
哺乳動物がヒト以外である場合、遺伝学的および微生物学的に統御されている動物個体群を用いることが好ましい。例えば、遺伝学的には近交系、クローズドコロニーの動物を用いることが好ましく、ラットの場合、例えばSprague-Dawley（SD）、Wistar、LEW等の近交系ラットが挙げられ、マウスの場合、BALB/c、C57BL/6、C3H/He、DBA/2、SJL、CBA等の近交系マウスおよびDDY、ICR等のクローズドコロニーマウスが挙げられるが、これらに限定されない。また、微生物学的にはコンベンショナル動物であってもよいが、感染症の影響を排除する観点から、SPF（specific pathogen free）もしくはノトバイオートグレードのものを用いるのがより好ましい。
【００７３】
化合物を動物に投与する方法は、標的組織(例えば、尿道、膀胱、子宮、血管等)に十分量の化合物が到達するように、化合物を該動物に投与するものであれば特に制限はない。投与形態については、特に制限されないが例えば、化合物を固形、半固形、液状、エアロゾル等の形態で経口的もしくは非経口的（例：静脈内、筋肉内、腹腔内、動脈内、皮下、皮内、気道内等）に投与することができる。化合物の投与量は、化合物の種類、動物種、体重、投与形態などによって異なり、例えば、動物が生存し得る範囲で、標的組織が機能し得る最高濃度以下の化合物に一定時間以上曝露され得るのに必要な量などが挙げられる。臨床試験においては、前臨床試験で得られたデータに基づいて設定された範囲内で種々の投与量が選択される。
【００７４】
尿道内圧を測定する方法は、常法が用いられる。具体的にはSDまたはWistar系雌性ラットを用いた以下の方法が挙げられる。
(1)膀胱頂部にカテーテルを装着して、膀胱内の尿を排出させる。マイクロチップトランスデューサーカテーテル(Milar Instrume nts Inc.)を外尿道口より膀胱に向かって挿入し、トランスデューサー部分を尿道内圧が最大になる部位付近（外尿道口から10.0〜15.0 mm）に位置するように固定し、尿道内圧を測定する。
(2)膀胱頂部を切開し、ダブルルーメンカテーテル（PE160 & PE50）（J. Urology, 162, 204-212 (1999)）を膀胱から尿道に向かって挿入し、先端が近位尿道付近に位置するよう固定する。外側のカテーテルを介して尿道内へ所定の流速で生理食塩液を注入し、内側のカテーテルを介して圧トランスデューサーにより尿道内圧を測定する。
(3)膀胱頂部を切開し、先端に返しをつけたカテーテル（PE100）を膀胱から尿道に向かって挿入する。カテーテルの先端が近位尿道付近に位置するように膀胱頸部で結紮固定する。さらに外尿道口を結紮する。カテーテルを介して所定の尿道内圧となるように、尿道内に生理食塩水を注入する。また、カテーテルを介して圧トランスデューサーにより尿道内圧を測定する。
【００７５】
本発明では、尿道内圧を特異的に上昇させた化合物を選択する工程をさらに含むことができる。ここで、尿道内圧を特異的に上昇させたとは、化合物が尿道内圧を上昇させるのに対し、その他の器官の内圧、例えば、膀胱内圧、子宮内圧、血圧などを上昇させないこと、あるいは、尿道内圧の上昇に対して、その他の組織の内圧の上昇の程度が小さいことを意味する。
膀胱内圧、子宮内圧又は血圧の測定は、尿道内圧の測定に準じた方法を用いる。また、血圧は、カフを用いて測定することもできる。
【００７６】
７．動物を用いた尿失禁のパラメーターの測定方法
尿失禁のパラメーターの測定に用いる動物は、「６．尿道内圧を測定するスクリーニング方法」で前述した哺乳動物を用いることができる。哺乳動物は、正常動物だけでなく病態モデル動物を用いることができる。
【００７７】
腹圧性尿失禁のモデル動物の作成方法として、例えば、以下の(1)〜(4)の公知の方法により作成したものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
(1)ヒトの出産による禁制機構の脆弱化を表現するモデルとして、動物の膣内へ挿入したバルーンを進展させることにより骨盤底筋及びその周辺組織を破壊する方法(verginal distension法)。
(2)尿道括約筋を支配している陰部神経を化学的あるいは物理的に損傷することにより尿道括約筋の収縮を低下させる方法。
(3)骨盤底筋群を支配している神経、例えば腸骨尾骨筋や恥骨尾骨筋に向かう神経を物理的に損傷することにより尿道の収縮を低下させる方法。
(4)尿道をパラホルムアルデヒドで処置する方法。
【００７８】
哺乳動物を用いた尿失禁のパラメーターには、以下の(1)〜(3)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
(1)動物を垂直に固定させるとともに生理食塩水を膀胱内へ注入した際の、尿漏れが認められた時点での膀胱内圧(modified leak point pressure)。
(2)一過性に生理食塩水を膀胱内へ注入し、膀胱内圧を上昇させることによる尿道内圧の変化。
(3)腹壁を電気刺激、又はくしゃみを誘発させることにより、膀胱内圧を上昇させた際の、膀胱内圧上昇による尿道内圧上昇値又は尿漏れの量及び尿漏れの回数。
【００７９】
患者における、尿失禁のパラメーターとしては、以下の(1)〜(4)が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
(1)蓄尿時の尿道抵抗である漏出時圧(LPP、leak point pressure)。
(2)十分蓄尿された状態で患者に咳をしてもらった際の、外尿道口からの尿漏れの有無。
(3)尿漏れの量。
(4)24時間の排尿時刻と一回の排尿量。
【００８０】
哺乳動物を用いた尿失禁のパラメーターの測定方法には、以下の(1)〜(3)の公知の方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
(1)動物を垂直に固定させるとともに生理食塩水を膀胱内へ注入し、尿漏れが認められた時点での膀胱内圧(modified leak point pressure)を測定する方法。
(2)一過性に生理食塩水を膀胱内へ注入し、膀胱内圧を上昇させることによる尿道内圧の変化を測定する方法。
(3)腹壁を電気刺激、又はくしゃみを誘発させることにより、膀胱内圧を上昇させ、膀胱内圧上昇による尿道内圧上昇又は尿漏れの量及び尿漏れの回数を測定する方法。
【００８１】
患者において、尿失禁のパラメーターを測定する方法としては、以下の(1)〜(4)の公知の方法が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
(1)蓄尿時の尿道抵抗である漏出時圧(LPP、leak point pressure)を測定する方法。
(2)十分蓄尿された状態で患者に咳をしてもらい、外尿道口からの尿漏れの量及び尿漏れの回数を観察する方法（ストレステスト）。
(3)尿漏れの量を定量する方法（パットテスト）。
(4)24時間の排尿時刻と一回の排尿量の記録を行う方法。
ここで、パットテストには、500mLの水を飲ませた後に、おもに腹圧性尿失禁を誘発する動作（歩行，階段の昇降，咳など）を1時間行わせ、前後のパッド重量の差で失禁量を求める1時間パッドテスト、日常生活の中で24時間の失禁量を求める24時間パッドテスト等がある。
【００８２】
化合物の投与前及び投与後のそれぞれの尿失禁のパラメーターを測定し、それらを比較することにより、尿失禁を改善した化合物を腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁を治療又は予防するための化合物として選択することができる。メラトニン受容体活性化作用を有する化合物は、尿道を収縮させることから、腹圧性尿失禁のモデル動物やヒト患者において、上記測定による尿失禁のパラメータを改善するものと考えられる。
【００８３】
８．患者の治療効果を評価する方法
「７．動物を用いた尿失禁のパラメーターの測定方法」で前述した尿失禁のパラメーターを用いてメラトニン受容体活性化作用を有する化合物を投与されることによって腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療を受ける患者の治療効果を評価することができる。尿失禁のパラメーターとして尿漏れの量を測定することが好ましい。
例えば、メラトニン受容体活性化作用を有する化合物の投与前及び投与後において、患者から漏れ出た尿を試料として採取し、それぞれの尿漏れ量を定量して比較することができる。そして、尿漏れの量が減少したときに正の利用効果があったものと評価することができる。尿漏れの量の測定には、前述したパットテストを用いることができる。
「腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療効果」のある態様としては、化合物を対象に投与した際の尿道内圧上昇作用であり、別の態様としては、化合物を対象に投与した際の尿失禁のパラメーターの改善（例えば上述の正の利用効果）である。
なお、「尿道内圧を上昇させた化合物」のある態様としては、後記実施例４に示す方法で化合物を投与した際の尿道内圧上昇作用が5 mmHg以上の作用を示す化合物である。
ここで、後記実施例４（潅流法）と同様の方法を用いて、腹圧性尿失禁に対する臨床的効果が確認されているα1アドレナリン受容体アゴニストであるミドドリン（J. Urology, 118, 980-982 (1977)）の活性代謝物（ST-1059：CHEMIZON社より購入）を、臨床用量に相当すると推定される用量(0.01 mg/kg)をラットに投与した際、その尿道内圧上昇作用は4.9±1.1 mmHgであった。
【００８４】
９．本スクリーニング方法の用途
本発明のスクリーニング方法は、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防するための化合物のスクリーニングに有効であるのみならず、化合物の尿道収縮又は尿道内圧への影響を検討することによって、上記疾患以外の種々の薬剤をスクリーニングするのにも有効である。すなわち、尿道収縮を抑制し又は尿道内圧を低下させる化合物を除外すること、などの目的に有効に利用できる。
【００８５】
１０．腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防用医薬組成物に含有される化合物の使用方法
本発明では、本発明の医薬組成物に含有される化合物が有効性を示すと考えられる疾患の種々の治療又は予防用医薬組成物と併用することができる。当該併用においては、それぞれの医薬組成物を同時投与、あるいは別個に連続して、もしくは所望の時間間隔を置いて投与してもよい。同時投与製剤は、配合剤であっても別個に製剤化されていてもよい。
【００８６】
本発明の有効成分と他の医薬活性成分とを併用することにより、他の医薬活性成分を単独で投与する場合に比べて、その投与量を軽減できることも考えられる。例えば腹圧性尿失禁治療剤であるデュロキセチンと併用した場合、その投与量を軽減できるため、吐き気、不眠、めまい及び自殺志願傾向等の副作用の軽減を図ることができる。本発明の有効成分と作用機序が異なる他の医薬活性成分を併用することにより治療効果の持続や増大を図り、又は相乗効果を得ることができる。
【実施例】
【００８７】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明の範囲を何ら限定するものではない。【００８８】
実施例１
ラット正常組織を用いたMT1受容体の発現解析
実験方法
体重 100-500 gのSD系ラットから約0.1-0.5g程度の各正常組織を採取した後、RNeasy（登録商標） Mini Kit（QIAGEN社）を用いて、トータルRNAを取得した。取得したRNAの一部を用いて、SuperScript（登録商標） III RT（Invitrogen社）によってcDNAを合成した。合成したcDNAを鋳型として配列番号１及び２で表される塩基配列からなるMT1受容体遺伝子に対するプライマー、SYBR（登録商標） Green PCR Master Mix（Applied Biosystems社）とともにPCR反応を行い、Applied Biosystems（登録商標） 7900HT Fast リアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems社）にて解析した。遺伝子の発現量は、反応溶液中に含まれるMT1受容体遺伝子のコピー数を、スタンダードとして用いたラットゲノム由来DNAを元に算出した。【００８９】
結果
図１に示すように、MT1受容体が尿道（Mid-urethra）に高発現していることが確認された。【００９０】
実施例２
ヒトMT1及びMT2受容体発現細胞を用いた、化合物のヒトMT1及びMT2受容体の活性化を評価する試験
実験方法
（１）ヒト由来MT1及びMT2受容体の単離及び発現ベクターの構築
ヒトMT1受容体遺伝子(GenBank登録番号：NM_005958.3)及びヒトMT2受容体遺伝子(GenBank登録番号：NM_005959.3)を、それぞれ発現ベクターpCDNA3.1/Zeo（Invitrogen社）に導入した。
（２）ヒトMT1及びMT2受容体安定発現細胞の構築
ヒトMT1及びMT2受容体の発現ベクターを、それぞれGq/iキメラG蛋白発現ベクターとともに、HEK293細胞に導入した。導入には、Lipofectoamine（登録商標）2000試薬（Invitrogen社）を用いて、添付説明書に準じて行った。耐性薬剤として、ゼオシンおよびハイグロマイシンを用い、それぞれ0.02 mg/mL及び0.05 mg/mL存在下にて15日間細胞を培養し、薬剤耐性クローンを取得した。
（３）FLIPR（登録商標）による細胞内Ca2+濃度の測定
各安定発現細胞を、実験前日に40,000細胞／ウェルとなるように、96well、ポリ-D-リジン-コートプレート（Falcon社）に分注し、37℃、5% CO2にて、10% FBSを含むDMEM（Invitrogen社）培地にて一晩培養した。培地をローディングバッファー（4μMの Fluo-4AM（Dojindo社）を含む洗浄溶液（ハンクスバランス塩溶液（HBSS）、20mM HEPES-NaOH、2.5mMプロベネシド））に置き換え、37℃、5% CO2にて1時間培養した。その後、洗浄溶液をセットしたプレートウォッシャー（ELx405、BIO-TEK Instrument社）にて細胞を洗浄し、細胞内Ca濃度測定システム（FLIPR（登録商標）、Molecular Device社）にセットする。化合物（メラトニン、ラメルテオン、アゴメラチン、タシメルテオン及びTIK-301）をそれぞれ洗浄溶液であらかじめ溶解させ、最終濃度10-5〜10-12 Mとなるように希釈し、細胞とともに、FLIPR（登録商標）装置にセットし、装置内で細胞に添加し、その際の細胞内Ca2+濃度変化を測定した。【００９１】
結果
図２〜図５に示すように、メラトニン、ラメルテオン、アゴメラチン、タシメルテオン及びTIK-301はいずれもヒトMT1及びMT2受容体発現細胞の細胞内Ca2+濃度を濃度依存的に上昇させた。以上より、上記の化合物は、ヒトMT1及びMT2受容体を活性化することが明らかとなった。【００９２】
実施例３
摘出尿道を用いた、化合物の尿道収縮作用を評価する試験
実験方法
体重 100-500 gのSD系雌性ラットから尿道を摘出した。摘出尿道を縦切開後、幅約3 mmの短冊状標本とし、クレブスヘンゼライト溶液 (pH 7.4)で満たした10 mLの組織バス内に輪走筋方向に懸垂した。クレブスヘンゼライト溶液は95% O2、5% CO2で通気し、37℃に保温した。静止張力を0.5 gとし、等尺性収縮を記録した。静止張力が安定した後、10 μM フェニレフリン溶液添加により収縮を惹起した。尿道標本を洗浄し、安定化させた後、化合物（メラトニン、ラメルテオン、アゴメラチン、タシメルテオン及びTIK-301）を最終濃度10-5〜10-12 Mとなるようにそれぞれ累積的に添加し、収縮反応を測定した。【００９３】
結果
図６及び図７に示すように、メラトニン、ラメルテオン、アゴメラチン、タシメルテオン及びTIK-301はいずれも摘出尿道を収縮させた。以上より、上記の化合物は、尿道平滑筋及び/又は尿道括約筋を収縮させることが明らかとなった。【００９４】
実施例４
化合物の尿道内圧に及ぼす影響を評価する試験
実験方法（マイクロチップ法）
SD系雌性ラットをウレタンで麻酔し、開腹後、膀胱内の尿を排出させるため膀胱頂部にカテーテルを装着した。また、化合物投与のために大腿静脈に、後記実施例６に記載する血圧測定のために頸動脈にカテーテルをそれぞれ装着した。尿道内圧測定のため、マイクロチップトランスデューサーカテーテル(Milar Instruments社)を外尿道口より膀胱に向かって挿入し、トランスデューサー部分を尿道内圧が最大になる部位付近（外尿道口から10.0〜15.0 mm）に位置するように固定した。頸動脈に装着したカテーテルを圧トランスデューサーに接続し、血圧を測定した。尿道内圧および血圧が安定した後に、生理食塩水又は3%ジメチルスルホキシド（DMSO）及び2%クレモフォールを含む生理食塩水に溶解した化合物（メラトニン及びラメルテオン）を0.1、1、10、100、又は1000μg/kgで静脈内投与し、尿道内圧の変化を測定した。【００９５】
実験方法（潅流法）
SD系雌性ラットをウレタンで麻酔し、開腹後、膀胱頂部を切開し、先端に返しをつけたカテーテルを膀胱から尿道に向かって挿入し、カテーテルの先端が近位尿道付近に位置するように結紮固定した。カテーテルを介して尿道内へ所定の流速で生理食塩水を注入し、圧トランスデューサーにより尿道内圧を測定した。尿道内圧が安定した後に、生理食塩水又は5% N,N-ジメチルアセトアミド（DMA）及び0.5%クレモフォールを含む生理食塩水に溶解した化合物を1、 10、 100、 又は1000μg/kgで静脈内投与し、尿道内圧の変化を測定した。【００９６】
結果
図８及び図９に、メラトニン及びラメルテオンの尿道内圧上昇作用を上記マイクロチップ法で測定した結果を、図１０〜図１４に、メラトニン、ラメルテオン、アゴメラチン、タシメルテオン及びTIK-301の尿道内圧上昇作用を上記潅流法で測定した結果を示す。図８〜１４に示すように、メラトニン、ラメルテオン、アゴメラチン、タシメルテオン及びTIK-301は、尿道内圧を上昇させることが確認された。以上より、上記の化合物は、生体内においても尿道を収縮させて尿道内圧を上昇させて、禁制を保つ役割を果たすことが明らかとなった。【００９７】
実施例５
化合物の作用がMT1及び/又はMT2受容体を介する作用であることを評価する試験
実験方法
（1）FLIPR（登録商標）による細胞内Ca2+濃度の測定
各安定発現細胞を、実験前日に40,000細胞／ウェルとなるように、96well、ポリ-D-リジン-コートプレート（Falcon社）に分注し、37℃、5% CO2にて、10% FBSを含むDMEM（Invitrogen社）培地にて一晩培養した。培地をローディングバッファー（4μMのFluo-4AM（Dojindo社）を含む洗浄溶液（ハンクスバランス塩溶液（HBSS）、20mM HEPES-NaOH、2.5mMプロベネシド））に置き換え、37℃、5% CO2にて1時間培養した。その後、洗浄溶液をセットしたプレートウォッシャー（ELx405、BIO-TEK Instrument社）にて細胞を洗浄し、細胞内Ca濃度測定システム（FLIPR（登録商標）、Molecular Device社）にセットした。ルジンドールを洗浄溶液であらかじめ溶解させ、最終濃度10-5〜10-7 Mとなるように希釈して細胞に添加し、室温で5分間放置した。ラメルテオンを洗浄溶液であらかじめ溶解させ、最終濃度10-5〜10-11 Mとなるように希釈し、ルジンドール添加後に5分間放置した後の細胞とともに、FLIPR（登録商標）装置にセットし、装置内で細胞に添加し、その際の細胞内Ca2+濃度変化を測定した。
(2) 摘出尿道を用いた化合物の尿道収縮作用の測定
体重 100-500 gのSD系雌性ラットより尿道を摘出した。摘出尿道を縦切開後、幅約3 mmの短冊状標本とし、クレブスヘンゼライト溶液 (pH 7.4)で満たした10 mLの組織バス内に輪走筋方向または縦走筋方向に懸垂した。クレブスヘンゼライト溶液は95% O2、5% CO2で通気し、37℃に保温した。静止張力を0.5 gとし、等尺性収縮を記録した。静止張力が安定した後、10 μM フェニレフリン添加により収縮を惹起した。洗浄し、安定化させた後、化合物（ラメルテオン）を最終濃度が10-5〜10-12 Mとなるように累積的に添加し、収縮反応を測定した。洗浄し、安定化させた後、ルジンドールを添加し、20分後に再度ラメルテオンを累積的に添加し、収縮反応を測定した。1回目の1 μM ラメルテオンによる収縮を100%としたときの、２回目のラメルテオンによる収縮率を評価に用いた。【００９８】
結果
図１５及び図１６に示すように、MT1及びMT2受容体発現細胞におけるラメルテオンによる細胞内Ca2+濃度の上昇はルジンドール処理によりそれぞれ抑制された。図１５に示すように、MT1受容体発現細胞において、ルジンドール10-7 M添加時、ルジンドール10-6 M添加時、及び、ルジンドール10-5 M添加時におけるラメルテオン最終濃度10-5 M時の細胞内Ca2+濃度の上昇作用は、それぞれ100%、97%及び94%であった。一方、図１６に示すようにMT2受容体発現細胞において、ルジンドール10-7 M添加時、ルジンドール10-6 M添加時、及び、ルジンドール10-5 M添加時におけるラメルテオン最終濃度10-5M時の細胞内Ca2+濃度上昇作用は、それぞれ62%、60%及び52%であった。
なお、ルジンドールによる抑制作用は、MT1受容体発現細胞よりも、MT2受容体発現細胞でより強く認められたが、ルジンドールはMT1及びMT2受容体の阻害作用を有することが報告されており、その阻害作用はMT2受容体に対してより強いことが報告されている。
一方、図１７に示すように、ラメルテオンによる摘出尿道収縮作用はルジンドール処理により濃度依存的に抑制された。ルジンドール10-7 M添加時、ルジンドール10-6 M添加時、及び、ルジンドール10-5 M添加時におけるラメルテオン最終濃度10-5 M時の摘出尿道収縮作用はそれぞれ101%、94%及び78%であった。
ルジンドールはラメルテオン最終濃度10-5 M時において、MT1受容体に対してはほとんど阻害作用を示さなかったが、MT2受容体に対しては40-50％の阻害作用を示した。一方、摘出尿道収縮作用において、ルジンドールはラメルテオン最終濃度10-5 M時においてほとんど抑制作用を示さなかった。これらのことから、ラメルテオンによる尿道平滑筋及び/又は尿道括約筋収縮作用は、MT1受容体活性化作用に基づくものであることが示唆された。【００９９】
実施例６
化合物が摘出膀胱、摘出子宮及び血圧に及ぼす影響を評価する試験
実験方法
（１）体重 100-500 gのSD系雌性ラットより膀胱及び子宮を摘出した。摘出膀胱は、頭頂部及び三角部以下を切除して体部のみをリング状にし、さらにリング状組織の一辺を切断して帯状組織とした。帯状にした膀胱の正中軸方向に対して平行に切断し、長さ約10 mm、幅約3 mmの短冊状標本を作製した。標本はクレブスヘンゼライト溶液 (pH 7.4)で満たした10 mLの組織バス内に静止張力0.5 gで懸垂し、等尺性収縮を記録した。摘出子宮は、子宮角部分を切り出し、縦切開後、幅約6 mmの短冊状標本を作製した。標本はクレブスヘンゼライト溶液 (pH 7.4)で満たした10 mLの組織バス内に静止張力0.5 gで懸垂し、等尺性収縮を記録した。クレブスヘンゼライト溶液は95% O2, 5% CO2で通気し、37℃に保温した。膀胱標本については、静止張力が安定した後、60 mM KCl溶液又は10 μM カルバコール溶液添加により収縮を惹起した。標本を洗浄し、安定化させた後、化合物を累積的に投与した。子宮標本については、安定的な律動性収縮を確認した後、標本に化合物（メラトニン又はラメルテオン）を最終濃度10-5〜10-11 Mとなるように累積的に投与した。化合物の作用を検討した後 60 mM KCl溶液添加により収縮を惹起した。
（２）実施例４に記載した尿道内圧測定実験にて、同時に血圧測定を行った。尿道内圧及び血圧が安定した後に化合物を投与し、血圧の変化を測定した。【０１００】
結果
図１８〜図２０に示すように、メラトニン及びラメルテオンは摘出膀胱及び摘出子宮に対して収縮作用を示さなかった。さらに、ラメルテオンは摘出子宮の律動性収縮にも影響を与えなかった。また、図２１及び図２２に示すように、メラトニン及びラメルテオンは、尿道内圧を上昇させる用量において、血圧を上昇させなかった。以上より、メラトニン及びラメルテオンは、生体内においても尿道を特異的に収縮させて、尿道内圧を上昇させることにより、禁制を保つ役割を果たすことが明らかとなった。【０１０１】
以上のことから、メラトニン受容体活性化作用を有する化合物は、尿道を特異的に収縮させて禁制を保つ役割を果たすことが明らかとなった。さらに実施例5に示すように、ラメルテオンによる尿道収縮作用はMT1受容体活性化作用に基づく作用であることが示唆された。したがって、メラトニン受容体活性化作用を有する化合物は、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防用医薬組成物として有用であるとともに、本発明の方法及びスクリーニングツールは、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防するための化合物のスクリーニング方法として有用であることが示された。【０１０２】
製造例
（１）ラメルテオン              １．０ｇ
（２）乳糖                    ６０．０ｇ
（３）コーンスターチ          ３５．０ｇ
（４）ゼラチン                  ３．０ｇ
（５）ステアリン酸マグネシウム  ２．０ｇ
ラメルテオン１．０ｇと乳糖６０．０ｇ及びコーンスターチ３５．０ｇの混合物を１０重量％ゼラチン水溶液３０ｇ（ゼラチンとして３．０ｇ）を用い、１ｍｍメッシュの篩を通して顆粒化した後、４０℃で乾燥し再び篩過した。得られた顆粒をステアリン酸マグネシウム２．０ｇと混合し、圧縮した。得られた中心錠を、蔗糖、二酸化チタン、タルク及びアラビアゴムの水懸濁液による糖衣でコーティングした。コーティングが施された錠剤をミツロウで艶出して１０００錠のコート錠を得る。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
上述したとおり、本発明の化合物は、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防用医薬組成物として利用できる。また、本発明の方法及びスクリーニングツールは、腹圧性尿失禁又は混合型尿失禁の治療又は予防するための化合物をスクリーニングするために利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０４】
配列番号１：PCRプライマー（MT1受容体用）
配列番号２：PCRプライマー（MT1受容体用）
【図１】
2014010603.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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