(57)【要約】簡便な方法で、短時間に、細胞をロスすることなく、過分な細胞への負荷を与えず、細胞濃縮液（ただし、ヒト血液は除く）を製造する方法を提供する。細胞懸濁液入口、ろ液出口、細胞懸濁液出口、及び該細胞懸濁液入口と細胞懸濁液出口の間に配置された中空糸型分離膜を備え、内圧ろ過方式である細胞懸濁液処理器を用いる細胞濃縮液の製造方法であって、該中空糸型分離膜の総断面積が０．５ｃｍ２〜１．５ｃｍ２であり、該中空糸型分離膜の内側膜面積が０．２ｍ２以下であり、該中空糸型分離膜の内側を流れる線速度が５００ｃｍ/分〜１２００ｃｍ/分であり、ろ液出口より排出される初期ろ過流量を、細胞懸濁液入口への流量で除した値が０．４〜０．７であることを特徴とする、細胞濃縮液の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液入口、ろ液出口、細胞懸濁液出口、及び該細胞懸濁液入口と細胞懸濁液出口の間に配置された中空糸型分離膜を備え、内圧ろ過方式である細胞懸濁液処理器を用いる細胞濃縮液の製造方法であって、
該中空糸型分離膜の総断面積が０．５ｃｍ２〜１．５ｃｍ２であり、
該中空糸型分離膜の内側膜面積が０．２ｍ２以下であり、
該中空糸型分離膜の内側を流れる線速度が５００ｃｍ/分〜１２００ｃｍ/分であり、
ろ液出口より排出される初期ろ過流量を、細胞懸濁液入口への流量で除した値が０．４〜０．７である、
細胞濃縮液の製造方法。
【請求項２】
該中空糸型分離膜の内径が３００μｍ〜１０００μｍである、請求項１に記載の細胞濃縮液の製造方法。
【請求項３】
該中空糸型分離膜の平均孔径が０．１μｍ以上である、請求項１又は２に記載の細胞濃縮液の製造方法。
【請求項４】
該中空糸型分離膜がポリスルホン系、ポリオレフィン系又はセルロース系の材料からなる、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
【請求項５】
該中空糸型分離膜がポリエーテルスルホンからなる、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
【請求項６】
細胞懸濁液が免疫細胞の細胞懸濁液である、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法により得られた細胞濃縮液を、細胞を含まない液体を用いた希釈と濃縮との繰り返しにより洗浄する工程、及びさらに濃縮する工程を含むことを特徴とする細胞濃縮液の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法により得られた細胞濃縮液を、液体窒素を用いて凍結保存する工程を含む、細胞の凍結保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中空糸型分離膜を充填した細胞懸濁液処理器を用いて細胞濃縮液を製造する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞医療の分野では、生体から採取した細胞を直接、又は生体外で培養した後、患者に接種する方法が用いられている。これらの治療に用いる細胞は、治療に適した溶液に懸濁され、又は適切な濃度に調整され移植される。しかしながら、生体から細胞を採取した場合、治療に十分な細胞濃度でないことがあり、また、生体から採取した細胞を体外でさらに培養した場合、組織由来の夾雑物や培地などを含んでいることが多い。したがって、生体から採取又は培養した細胞を治療に用いるためには、夾雑物や培地を取り除き、治療に適した溶液などに懸濁された状態とし（洗浄）、治療に適した細胞濃度に濃縮される必要がある。【０００３】
前記目的を解決するため、遠心分離を用いた濃縮、洗浄操作が知られている。たとえば、ヒト組織から再生細胞を分離して濃縮するために遠心分離を用いる方法が開示されている（特許文献１）。しかし、このように遠心分離を用いる方法は、装置が大型になること、細胞に負荷がかかること、及びコストが増大することにより利用できる施設が限定されてしまうことが懸念される。さらに遠心分離により細胞を沈殿させた後の細胞懸濁液の上清を、細胞の洗浄のために取り除く際に、細胞が大気に開放される可能性があり、汚染等の問題が挙げられる。【０００４】
これに対して、コンパクトで簡便な装置である中空糸型分離膜を用いた細胞懸濁液の分離、濾過方法が提案されている（特許文献２）。中空糸型分離膜を用いて細胞医療用途の細胞懸濁液を濃縮する際には、細胞へのダメージを軽減するために短時間で濃縮処理を行うことが必要であり、さらに夾雑物や培地成分の分子量が大きいことから、中空糸型分離膜の孔径を大きくした方が良いと考えられる。しかし、中空糸型分離膜の孔径を大きくすると、細胞による目詰まり等が発生し、或いは細胞の中空糸型分離膜への付着性が増すことにより、濃縮液を調製する過程で細胞数が低下することが懸念される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００７−５２４３９６号公報
【特許文献２】特許第２９２８９１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、中空糸型分離膜を用いた細胞濃縮液の製造における上述の問題点を解決することである。具体的には、細胞懸濁液を濃縮するに際して、中空糸型分離膜の孔径が大きくとも、優れた細胞回収率を維持しつつ、短時間で細胞を濃縮できる細胞濃縮液の製造方法を提供する。さらに、懸濁液中に存在する蛋白質等の夾雑物を効率良く取り除くことができる細胞濃縮液の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、中空糸型分離膜の孔径が大きくとも、ろ過流量及び線速度をある特定の範囲に保った際に、優れた細胞回収率を維持しつつ短時間で細胞濃縮液を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、細胞懸濁液入口、ろ液出口、細胞懸濁液出口、及び該細胞懸濁液入口と細胞懸濁液出口の間に配置された中空糸型分離膜を備え、内圧ろ過方式である細胞懸濁液処理器を用いる細胞濃縮液の製造方法であって、該中空糸型分離膜の総断面積が０．５ｃｍ２〜１．５ｃｍ２であり、該中空糸型分離膜の内側膜面積が０．２ｍ２以下であり、該中空糸型分離膜の内側を流れる線速度が５００ｃｍ/分〜１２００ｃｍ/分であり、ろ液出口より排出される初期ろ過流量を、細胞懸濁液入口への流量で除した値が０．４〜０．７である、細胞濃縮液の製造方法に関する。【０００９】
該中空糸型分離膜の内径が３００μｍ〜１０００μｍであることが好ましい。【００１０】
該中空糸型分離膜の平均孔径が０．１μｍ以上であることが好ましい。【００１１】
該中空糸型分離膜がポリスルホン系、ポリオレフィン系又はセルロース系の材料からなることが好ましい。【００１２】
該中空糸型分離膜がポリエーテルスルホンからなることが好ましい。【００１３】
細胞懸濁液が免疫細胞の細胞懸濁液であることが好ましい。【００１４】
また、本発明は、前記製造方法により得られた細胞濃縮液を、細胞を含まない液体を用いた希釈と濃縮との繰り返しにより洗浄する工程、及びさらに濃縮する工程を含むことを特徴とする細胞濃縮液の製造方法に関する。【００１５】
また、本発明は、前記製造方法により得られた細胞濃縮液を、液体窒素を用いて凍結保存する工程を含む、細胞の凍結保存方法に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、細胞懸濁液を濃縮するに際して、中空糸型分離膜の孔径が大きくとも、高い細胞回収率を維持しつつ、短時間で細胞濃縮液を製造できる。さらに本発明は、懸濁液中に存在する蛋白質等の夾雑物を効率良く取り除くことができ、無菌的な閉鎖系で処理することが可能なので、本発明の方法で製造された細胞濃縮液は細胞治療用として提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例に用いた細胞懸濁液処理器を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、本発明について説明する。
【００１９】
本発明の細胞懸濁液処理器は、図１に例示されるが、これに限定されるものではない。筒状容器１はストレートな胴部２とその両側の頭部３、ヘッダー部９からなり、頭部３にはろ液出口４が備えられている。このろ液出口は一方に備えられていても、両端に備えられていてもよい。この例ではヘッダー部９に細胞懸濁液入口８ａ、細胞懸濁液出口８ｂが設けられている。該筒状容器１内部には、装填された中空糸型分離膜の束５と、ヘッダー部９の内部に設けられた中空糸型分離膜の束５を容器内部に固定するとともに中空糸型分離膜の開口端６を形成している樹脂層部７、さらに頭部３の内部に設けられたこれと同等の構造を有している。この樹脂層部７及び開口端６は、ヘッダー部９（或いは頭部３）に被冠された構造となっており、細胞懸濁液出入口８ａ、８ｂとろ液出口４が中空糸型分離膜を構成する壁材により隔てられ、連続しない構造となっている。
【００２０】
なお、図１に示した例では、各部分を筒状容器の胴部２、頭部３、ヘッダー部９というように区別しているが、これは便宜的なものである。設計上、ヘッダー部９が筒状容器の頭部３に一体化したものや、筒状容器の胴部２と頭部３が別々のパーツから形成されている場合でも、細胞懸濁液入口と細胞懸濁液出口が中空糸型分離膜を構成する壁材で隔てられることなく連続しており、さらに細胞懸濁液出入口とろ液出口が中空糸型分離膜を構成する壁材により隔てられている構造を備えていれば、各種構造をとることが可能である。
【００２１】
本発明の細胞懸濁液処理器には、中空糸型分離膜を数十から数千本程度束ねたものを筒状の容器内に充填していることが好ましい。尚、本発明において、中空糸型分離膜の配置は、直線状になっていても、撓んでいても、らせん状になっていてもよく、細胞懸濁液入口と細胞懸濁液出口の間に中空糸型分離膜の両端が保持されていれば特に形状は限定されない。
【００２２】
細胞懸濁液処理器の筒状容器の素材として、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、アクリロニトリル、ブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等を使用できる。特に耐滅菌性を有する素材、具体的にはポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン等が好ましい。
【００２３】
中空糸型分離膜を固定する樹脂層部の素材としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂、及びシリコン樹脂など一般的な接着材料が好ましく用いることができる。
【００２４】
本発明における内圧濾過方式とは、中空糸分離膜内側から外側に向けて、細胞を実質的に含まないろ液がろ別されることを意味する。なお、ここで細胞を実質的に含まないろ液とは、ろ液に含まれる細胞の数が、流入前の細胞懸濁液中の細胞の数の０．１％を上回らない範囲であることを意味する。例えば、細胞懸濁液入り口より流入した細胞懸濁液が、細胞懸濁液処理器内で束ねられた中空糸分離膜の内側に流入する際の水圧によりろ液がろ別されてもよいし、中空糸分離膜外側を陰圧にしてろ液を外側にろ別してもよい。
【００２５】
本発明における中空糸型分離膜の総断面積とは、細胞懸濁液処理器内に備えた中空糸型分離膜の内腔の断面積の合計面積であり、（総断面積）＝（糸本数）×π×（中空糸内径）×（中空糸内径）／４で求めることができる。本発明の中空糸型分離膜の総断面積は０．５ｃｍ２以上１．５ｃｍ２以下であり、０．６ｃｍ２以上１．５ｃｍ２以下であることが好ましく、０．７５ｃｍ２以上１．５ｃｍ２以下であることがより好ましく、０．７５ｃｍ２以上１．２５ｃｍ２以下であることがさらに好ましい。０．５ｃｍ２未満では、細胞懸濁液を処理するのに十分な量の内側膜面積を確保できないため、処理に時間がかかってしまうなどの傾向がある。また、１．５ｃｍ２を超えると、細胞懸濁液処理器内に流入した細胞懸濁液が分散して中空糸内に流入せず、濾過効率が低下する傾向がある。
【００２６】
本発明における中空糸型分離膜の内側膜面積とは、細胞懸濁液処理器内に備えた中空糸型分離膜の内側の面積の合計であり、（内側膜面積）＝（糸本数）×π×（中空糸内径）×（有効長）で求めることができる。ここで、有効長とは、細胞懸濁液処理器内の入口と出口の間に配置された中空糸型分離膜の全長のうち、液体が通過できる膜の長さである。本発明の中空糸型分離膜の内側膜面積は０．２ｍ２以下であり、０．１８ｍ２以下であることが好ましく、０．１５ｍ２以下であることがより好ましい。また、本発明の中空糸型分離膜の内側膜面積は０．０５ｍ２以上であることが好ましい。０．２ｍ２を超えると細胞懸濁液が中空糸型分離膜内に残存する液量が多くなり回収率が低下する傾向がある。一方、０．０５ｍ２未満では、ろ過流量が十分でなく短時間で処理ができなくなる傾向がある。
【００２７】
本発明において、細胞懸濁液入口に流入する細胞懸濁液の流量は、回収率や生存率の低下を引き起こす条件でなければ特に限定されないが、２００ｍＬ／分以上１０００ｍＬ／分以下であることが好ましく、３００ｍＬ／分以上８００ｍＬ／分以下であることがより好ましい。流量が２００ｍＬ／分未満であると、ろ過流量を大きく設定することができなくなり効率的な濃縮ができない傾向がある。また、１０００ｍＬ／分を超えると、ポンプにより大きな圧力を細胞懸濁液に加えて送液する必要があり、回路や中空糸内を流れる際に、細胞へ強いせん断や圧力が加わり損傷を与える可能性があり、結果として回収率の低下や生存率比の低下を引き起こす傾向がある。
【００２８】
本発明における線速度とは、単位時間当たりに中空糸分離膜内側に流入する液量を中空糸型分離膜の総断面積で除した値である。本発明において、中空糸型分離膜内側を流れる線速度は、５００ｃｍ／分以上１２００ｃｍ／分以下であり、５００ｃｍ／分以上１０００ｃｍ／分以下であることが好ましい。線速度が５００ｃｍ／分未満であると、細胞が中空糸膜表面に付着しやすくなってしまい回収率が低下する傾向がある。１２００ｃｍ／分を超えると、細胞に強いせん断応力が加わるため、細胞にダメージを与えてしまう傾向がある。
【００２９】
本発明における初期ろ過流量とは、処理を開始した最初の５００ｍＬをろ過するための、単位時間当たりのろ過流量を意味する。初期ろ過流量は、回収率や生存率の低下を引き起こす条件でなければ特に限定されないが、５０ｍＬ／分以上６００ｍＬ／分以下であることが好ましく、１００ｍＬ／分以上４００ｍＬ／分以下であることがより好ましい。流量が５０ｍＬ／分未満であると、濃縮処理に時間が必要になり効率的な濃縮ができない傾向がある。また、６００ｍＬ／分を超えると、細胞が膜表面に固着し細胞に損傷を与えるなどの傾向がある。
【００３０】
本発明において、初期ろ過流量を、細胞懸濁液入口への流量で除した値は０．４以上０．７以下であり、０．４以上０．６以下であることが好ましい。上記数値が０．４未満であると、細胞懸濁液の液流れが不規則になり細胞が中空糸膜に付着し、回収率が低下する傾向がある。一方、０．７を超えると、中空糸内で細胞懸濁液の細胞濃度が急激に大きくなりすぎてしまうために中空糸膜へ付着し、回収率が低下するなどの傾向がある。
【００３１】
本発明において、中空糸型分離膜の内径は３００μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましく、４００μｍ以上８００μｍ以下であることがより好ましい。３００μｍ未満であると、細胞に対して強いせん断応力が加わり、細胞が損傷する傾向がある。一方、１０００μｍを超えると細胞懸濁液が接触できる比表面積が小さくなり濾過を効率的に行えない傾向がある。
【００３２】
中空糸型分離膜の平均孔径は０．１μｍ以上であることが好ましく、０．２μｍ以上であることがより好ましい。また、中空糸型分離膜の内側の孔の平均孔径は１μｍ以下であることが好ましい。０．１μｍ未満であると、大きなろ過流量を得ることができない、又は不要な蛋白質などの夾雑物を効率的に除去できない傾向がある。一方、１μｍを超えると、細胞の大きさに近い孔径が中空糸型分離膜上に存在するため、孔へのつまりがひどくなり、細胞回収率が大きく低下してしまう傾向がある。
【００３３】
本発明に用いられる中空糸型分離膜の樹脂材料は、材料の安全性、安定性などの点から合成高分子材料からなることが好ましい。ポリスルホン系、ポリオレフィン系又はセルロース系の高分子材料がより好ましい。材料の安全性、安定性、入手のしやすさから、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、セルロースエステルが最も好ましい。
【００３４】
本発明の製造方法により濃縮し得る細胞としては、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系細胞、脂肪由来間質幹細胞、多能性成体幹細胞、骨髄ストローマ細胞、造血幹細胞等の多分化能を有する生体幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、キラーＴ細胞（細胞障害性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞などのリンパ球系の細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、顆粒球、赤血球、血小板など、神経細胞、筋細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞などの体細胞、又は遺伝子の導入や分化などの処理を行った細胞が例示される。
【００３５】
中でも顆粒球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、キラーＴ細胞（細胞障害性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞等の免疫細胞が好ましい。
【００３６】
また、本発明で用いる細胞懸濁液としては、細胞を含む懸濁液であれば特に限定されないが、例えば、脂肪、皮膚、血管、角膜、口腔、腎臓、肝臓、膵臓、心臓、神経、筋肉、前立腺、腸、羊膜、胎盤、臍帯などの生体組織を酵素処理や破砕処理や抽出処理や分解処理や超音波処理などをした後の懸濁液、血液や骨髄液を密度勾配遠心処理やろ過処理や酵素処理や分解処理や超音波処理などの前処理をして調製された細胞懸濁液等が挙げられる。また、上記に例示した細胞を生体外で培養液を用いて培養した後の細胞懸濁液が挙げられる。培養液としては、例えば、ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０や、サイトカイン、抗体やペプチドなどの刺激因子などを含む培養液が挙げられる。
【００３７】
本発明により製造した細胞濃縮液をさらに洗浄してもよい。洗浄とは、細胞が懸濁されている体液や培地などを、洗浄液に置換することである。これにより、濃縮液中の不要な夾雑物を取り除くことができ、細胞濃縮液をヒトや動物への移植に好適に使用することができる。細胞濃縮液の洗浄は、繰り返し行うことができる。
【００３８】
洗浄液は、細胞を含まない液体であり、例えば、生理食塩水、輸液、培地、蒸留水、無機塩、糖類、血清、蛋白質を含む液体、緩衝液、培地、血漿等が挙げられ、安全性の観点から生理食塩水や輸液が好ましい。
【００３９】
また、本発明の方法により製造された細胞濃縮液は、白血病治療、心筋再生や血管再生、幹細胞疲弊疾患、骨疾患、軟骨疾患、虚血性疾患、血管系疾患、神経病、やけど、慢性炎症、心疾患、免疫不全、クーロン病等の疾患、豊胸、しわとり、美容成形、組織陥没症等の組織増大などの再生医療、Ｔ細胞療法、ＮＫＴ細胞療法、樹状細胞移入療法などの免疫療法、遺伝子導入した細胞を用いる遺伝子療法などに用いることも可能であるが、これらの用途に限定されるものではない。また、濃縮された細胞をスキャフォールドなどの構造材料に播種して治療に用いることも可能である
【００４０】
本発明の方法により製造された細胞濃縮液をさらに培養してもよい。洗浄後の細胞濃縮液に含まれる液体を培地に置換して培養することで、細胞数の増加、細胞の分化、形質転換、遺伝子導入などを行うことができる。細胞の増殖に用いられる培地としては、ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０が挙げられ、サイトカイン、抗体やペプチドなどの刺激因子などを用いて培養してもよい。
【００４１】
本発明の方法により製造された細胞濃縮液から、医薬組成物を製造できる。医薬組成物は、濃縮された細胞を製薬的に許容される添加剤と混合することで製造できる。製薬的に許容される添加剤としては、例えば、抗凝固剤、ビタミン等の栄養源、抗生物質等が挙げられる。
【００４２】
本発明の方法により製造された細胞濃縮液をさらに凍結保存してもよい。細胞へのダメージを低減できる点から、液体窒素を用いて凍結保存することが好ましい。また、凍結保存した細胞を融解して、ヒトや動物への移植に使用することができ、研究に使用することができ、又は、再度培養することができる。本発明の方法により製造された細胞濃縮液に含まれる細胞は、濃縮操作によるダメージが少ないことから、凍結保存や融解後の使用などにも好適に用いることができる。
【００４３】
以下、本発明の細胞濃縮液の製造方法を例示するが、本発明はこれに限定されるものではなく、本発明の主旨に反しない範囲で各種変更をすることができる。
【００４４】
細胞懸濁液処理器を用いた細胞懸濁液からの細胞濃縮液の製造方法では、細胞懸濁液処理器内に備えられた中空糸型分離膜に流入した細胞懸濁液から、内圧ろ過により、細胞を実質的に含まないろ液が中空糸型分離膜の外側にろ別され、細胞成分が濃縮された細胞懸濁液が細胞懸濁液出口より流出する。なお、ここで細胞を実質的に含まないろ液とは、ろ液に含まれる細胞の数が、流入前の細胞懸濁液中の細胞の数の０．１％を上回らない範囲であることを意味する。
【００４５】
先ず、細胞懸濁液処理器の細胞懸濁液入口及び出口にチューブ等を取り付け（処理器内の中空糸に細胞懸濁液が流入及び流出する回路の一部となる）、さらに取り付けたチューブを細胞懸濁液が入った細胞バッグなどの容器に連結し、バッグなどの容器と細胞懸濁液処理器との間で細胞懸濁液が循環できるようにする。なお、液を循環させるために、ポンプなどの機械をこの回路に介在させることが考えられる。また、ろ液出口には廃液タンクなどに連絡されたチューブを連結しておくことが好ましい。このとき、回路の全体の取り付けは、無菌的な環境下で行われることが好ましい。また、この際に、細胞懸濁液出口側の流路を狭くするなどして、分離膜に圧力をかけることもできるし、ろ過側のチューブにポンプ等を用いて圧力をかけながらろ過を行ってもよく、一般的に中空糸型分離膜で用いられる各種ろ過方法を併用することができる。
【００４６】
一方、濃縮が進んだ後、バッファーなどの洗浄液を追加し、濃縮を繰り返すことで、細胞の洗浄や培地の交換を行うことができる。この際、洗浄液の投入は、循環回路のチューブに設けた流入口から行う。この際、無菌的に液を注入できる流入口を用いることが好ましい。
【００４７】
濃縮・洗浄された細胞懸濁液は、回収バッグなどに収集して、その後の治療などに用いることができる。この際、回収バッグは、循環回路のチューブに別途三方活栓などの流出口を設けて無菌的に行うことが好ましい。
【００４８】
なお、本発明における細胞懸濁液処理器は滅菌して用いてもよい。滅菌方法は、特に限定されず、γ線滅菌や電子線滅菌やＥＯＧ滅菌、高圧蒸気滅菌などの医療用具の滅菌に汎用されている滅菌方法を好適に用いることができる。
【実施例】
【００４９】
以下、実験結果を用いて本発明を説明する。なお、ここで細胞回収率とは、一定量まで濃縮した時点での細胞懸濁液中の細胞数を、処理をする前の細胞懸濁液中の細胞数で除した値で、値が高いほど回収効率に優れていることを示す。細胞濃度は、細胞懸濁液に含まれる白血球分画の細胞濃度を血球カウンター（シスメックス、Ｋ−４５００）により測定して本実施例での細胞濃度とした。細胞数は、細胞懸濁液量と細胞濃度より算出した。また、処理開始から培地を１０００ｍＬ濾過するのに必要な濾過時間（ｓ）を測定した。処理対象の細胞懸濁液は、培養したＪｕｒｋａｔ細胞の細胞懸濁液（１０％ＦＢＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地）１５００ｍＬとした。【００５０】
各実施例において、細胞懸濁液処理器の入り口と出口に塩ビチューブをつなげた。プラスチック容器に細胞懸濁液を貯留させて、懸濁液がモジュール及びチューブを循環できるように細胞懸濁液処理器の両端から延びる塩ビチューブの両端を懸濁液中に垂らした。塩ビチューブにはポンプを設置し、懸濁液の流れが適当な流速に設定できるようにした。細胞懸濁液処理器のろ液出口にもチューブを取り付け、こちらは廃液入れに注ぐように設置した。ポンプにより流速を調整し、回路に細胞懸濁液を循環させながらろ過を行った。一定量（１００ｍＬ〜１５０ｍＬ）まで濃縮した後、チューブや中空糸型分離膜内の細胞懸濁液をエアーで押し出し、ポンプを停止し、プラスチック容器中の細胞懸濁液の細胞数を測定し、回収率を算出した。【００５１】
（実施例１）
ポリエーテルスルホンの中空糸型分離膜〔中空糸内径５７０μｍ  孔径０．２μｍ〕を２５０本用いて、細胞懸濁液処理器を作製した。作成した処理器の内側膜面積は０．１ｍ２、中空糸型分離膜の総断面積０．６３７ｃｍ２であった。通液条件は、細胞懸濁液入口への流量が４６０ｍＬ／分（線速度７２２ｃｍ／分）、ろ液出口より排出される初期ろ過流量２８５ｍＬ／分とした。結果、細胞回収率は８８％、濾過時間は１９０ｓであった。【００５２】
（実施例２）
実施例１と同様の分離膜を用いた。用いた中空糸の本数は３００本とし、作成した処理器の内側膜面積は０．１２ｍ２、中空糸型分離膜の総断面積０．７６５ｃｍ２であった。通液条件は、細胞懸濁液入口への流量が４２０ｍＬ／分（線速度５４９ｃｍ／分）、ろ液出口より排出される初期ろ過流量２００ｍＬ／分とした。結果、細胞回収率は８４％、濾過時間は２９０ｓであった。【００５３】
（実施例３）
実施例２と同様の細胞懸濁液処理器を作製した。通液条件は、細胞懸濁液入口への流量が６４０ｍＬ／分（線速度８３７ｃｍ／分）、ろ液出口より排出される初期ろ過流量３０１ｍＬ／分とした。結果、細胞回収率は１００％、濾過時間は２１０ｓであった。【００５４】
（実施例４）  
実施例１と同様の分離膜を用いた。用いた中空糸の本数は４５０本とし、作成した処理器の内側膜面積は０．１９ｍ２、中空糸型分離膜の総断面積１．１４７ｃｍ２であった。通液条件は、細胞懸濁液入口への流量が６６０ｍＬ／分（線速度５７５ｃｍ／分）、ろ液出口より排出される初期ろ過流量２７３ｍＬ／分とした。結果、細胞回収率は９９％、濾過時間は２００ｓであった。【００５５】
（比較例１）
実施例４と同様の細胞懸濁液処理器を作製した。通液条件は、細胞懸濁液入口への流量が４２０ｍＬ／分（線速度３６６ｃｍ／分）、ろ液出口より排出される初期ろ過流量２０６ｍＬ／分とした。結果、細胞回収率は７２％、濾過時間は２８５ｓであった。【００５６】
（比較例２）
実施例１と同様の分離膜を用いた。用いた中空糸の本数は６００本とし、作成した処理器の内側膜面積は０．２５ｍ２、中空糸型分離膜の総断面積１．５３ｃｍ２であった。通液条件は、細胞懸濁液入口への流量が４２５ｍＬ／分（線速度２７８ｃｍ／分）、ろ液出口より排出される初期ろ過流量２７８ｍＬ／分とした。結果、細胞回収率は６４％、濾過時間は２８５ｓであった。【００５７】
（実施例５）
ポリエーテルスルホンの中空糸型分離膜モジュール〔型式：Ｍ２−Ｍ０２Ｅ−１００−Ｆ１Ｎ、内側膜面積０．１０５ｍ２、中空糸内径５００μｍ、孔径０．２μｍ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）〕を用いて細胞濃縮検討を行った。実測した中空糸の有効長より中空糸型分離膜の総断面積０．５８８ｃｍ２と算出した。通液条件は、細胞懸濁液入口への流量が４５０ｍＬ／分（線速度７６５ｃｍ／分）、ろ液出口より排出される初期ろ過流量２６９ｍＬ／分とした。結果、細胞回収率は８３％、濾過時間は２３５ｓであった。【００５８】
（実施例６）
実施例５と同様の中空糸モジュールを用いた。通液条件は、細胞懸濁液入口への流量が６３０ｍＬ／分（線速度１０７１ｃｍ／分）、ろ液出口より排出される初期ろ過流量２６９ｍＬ／分とした。結果、細胞回収率は８８％、濾過時間は２５０ｓであった。【００５９】
（比較例３）
実施例５と同様の中空糸モジュールを用いた。通液条件は、細胞懸濁液入口への流量が４５０ｍＬ／分（線速度７６５ｃｍ／分）、ろ液出口より排出される初期ろ過流量１２０ｍＬ／分とした。結果、細胞回収率は９２％、濾過時間は５００ｓであった。【００６０】
（比較例４）
ポリエーテルスルホンの中空糸型分離膜モジュール〔型式：Ｍ２−Ｍ０２Ｅ−３００−Ｆ１Ｎ、ろ過面積０．３１ｍ２、中空糸内径５００μｍ、孔径０．２μｍ、（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）〕を用いて細胞濃縮検討を行った。実測した中空糸の有効長より中空糸型分離膜の総断面積１．７３７ｃｍ２と算出した。通液条件は、細胞懸濁液入口への流量が５２０ｍＬ／分（線速度２９９ｃｍ／分）、ろ液出口より排出される初期ろ過流量２６５ｍＬ／分とした。結果、細胞回収率は５３％、濾過時間は２３０ｓであった。【００６１】
（比較例５）
比較例４と同様の中空糸モジュールを用いた。通液条件は、細胞懸濁液入口への流量が１０２０ｍＬ／分（線速度５８７ｃｍ／分）、ろ液出口より排出される初期ろ過流量５６６ｍＬ／分とした。結果、細胞回収率は７２％、濾過時間は１０６ｓであった。【００６２】
（実施例７）
セルロースエステルの中空糸型分離膜〔型式：Ｍ２２Ｍ−１００−０１Ｎ、内側膜面積０．０７９ｍ２、中空糸内径６００μｍ、孔径０．２μｍ、（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）〕を用いて細胞濃縮検討を行った。実測した中空糸の有効長より中空糸型分離膜の総断面積０．５３１ｃｍ２と算出した。通液条件は、細胞懸濁液入口への流量が４４０ｍＬ／分（線速度８２９ｃｍ／分）、ろ液出口より排出される初期ろ過流量１８８ｍＬ／分とした。結果、細胞回収率は９６％、濾過時間は３３０ｓであった。【００６３】
（比較例６）
セルロースエステルの中空糸型分離膜〔型式：Ｍ２２Ｍ−３００−０１Ｎ、内側膜面積０．２５ｍ２、中空糸内径６００μｍ、孔径０．２μｍ、（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）〕を用いて細胞濃縮検討を行った。実測した中空糸の有効長より中空糸型分離膜の総断面積１．６８１ｃｍ２と算出した。通液条件は、細胞懸濁液入口への流量が４２０ｍＬ／分（線速度２５０ｃｍ／分）、ろ液出口より排出される初期ろ過流量２２２ｍＬ／分とした。結果、細胞回収率は４５％、濾過時間は２７５ｓであった。【００６４】
（比較例７）
セルロースエステルの中空糸型分離膜〔型式：Ｍ２２Ｍ−３０１−０１Ｎ、内側膜面積０．２ｍ２、中空糸内径１０００μｍ、孔径０．２μｍ、（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）〕を用いて細胞濃縮検討を行った。実測した中空糸の有効長より中空糸型分離膜の総断面積２．２４ｃｍ２と算出した。通液条件は、細胞懸濁液入口への流量が４２０ｍＬ／分（線速度１８８ｃｍ／分）、ろ液出口より排出される初期ろ過流量２００ｍＬ／分とした。結果、細胞回収率は３６％、濾過時間は３００ｓであった。【００６５】
（実施例８）
ポリエチレンの中空糸型分離膜〔品名サルフラックスＦＰ０２、内側膜面積０．２ｍ２、中空糸内径３５０μｍ、孔径０．３μｍ、（カネカ社製）〕を用いて細胞濃縮検討を行った。実測した中空糸の有効長より中空糸型分離膜の総断面積１．２０６ｃｍ２と算出した。通液条件は、細胞懸濁液入口への流量が７１０ｍＬ／分（線速度５８９ｃｍ／分）、ろ液出口より排出される初期ろ過流量３３３ｍＬ／分とした。結果、細胞回収率は８１％、濾過時間は１９０ｓであった。【００６６】
（比較例８）
実施例８と同様の中空糸モジュールを用いた。通液条件は、細胞懸濁液入口への流量が４１５ｍＬ／分（線速度３４４ｃｍ／分）、ろ液出口より排出される初期ろ過流量２２２ｍＬ／分とした。結果、細胞回収率は５９％、濾過時間は２７５ｓであった。【００６７】
【表１】
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【００６８】
表１より、中空糸型分離膜の総断面積が０．５ｃｍ２〜１．５ｃｍ２であり、且つ該中空糸型分離膜の内側膜面積が０．２ｍ２以下である細胞懸濁液処理器を用い、該中空糸型分離膜内側を流れる線速度を５００ｃｍ／分〜１２００ｃｍ／分、且つろ液出口より排出される初期ろ過流量を、細胞懸濁液入口への流量で除した値が０．４〜０．７となるように細胞懸濁液を処理することで、高い細胞回収率で細胞濃縮液を製造できることは明らかである。【００６９】
以上のように、本発明の製造方法により、懸濁液中の細胞以外の蛋白質などの夾雑物を取り除きつつ、短時間で効率的に細胞を回収でき、中空糸における細胞の目詰まりを低減しながら細胞濃縮液を製造できる。さらに細胞の負荷となるような洗浄方法等を使用しないので、細胞へのダメージが少なくなる。【００７０】
本発明の製造方法により製造された細胞濃縮液を用いれば、無菌的な操作処理で目的細胞だけを短時間で効率的に濃縮でき、複数の中空糸を使用しないので材料の漏洩も防ぐことができ安全性が高いので、細胞治療用途の細胞も提供できる。
【符号の説明】
【００７１】
１．筒状容器
２．胴部
３．頭部
４．ろ液出口
５．中空糸型分離膜の束
６．開口端（点線部）
７．樹脂層部（斜線部）
８ａ．細胞懸濁液入口
８ｂ．細胞懸濁液出口
９．ヘッダー部
【図１】
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【国際調査報告】
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