(57)【要約】蛋白質および該蛋白質を含有する脂肪族ポリエステルを含む、放射線滅菌された滅菌組成物。この滅菌組成物では、蛋白質の構造や機能（活性）が維持される。
2013172468.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質および該蛋白質を含有する脂肪族ポリエステルを含む、放射線滅菌された滅菌組成物。
【請求項２】
蛋白質がそのまままたは薬学的に許容しうる添加物との混合物として脂肪族ポリエステル中に粒子として分散している請求項１記載の滅菌組成物。
【請求項３】
蛋白質が止血性蛋白質、酵素、輸送蛋白質、筋肉蛋白質、防御蛋白質、毒素蛋白質、蛋白質ホルモン、貯蔵蛋白質、構造蛋白質、成長因子、およびそれらの混合物からなる群から選択される請求項１または２に記載の滅菌組成物。
【請求項４】
蛋白質が止血性蛋白質である請求項１または２に記載の滅菌組成物。
【請求項５】
脂肪族ポリエステルがポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、それらの共重合体、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される請求項１から４のいずれかに記載の滅菌組成物。
【請求項６】
繊維形状にある請求項１から５のいずれかに記載の滅菌組成物。
【請求項７】
エレクトロスピニング法で製造された請求項６に記載の滅菌組成物。
【請求項８】
フィルム形状にある請求項１から５のいずれかに記載の滅菌組成物。
【請求項９】
流延法で製造された請求項８に記載の滅菌組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪族ポリエステルに包含されることにより機能が保持された蛋白質の滅菌組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、天然および合成蛋白質は薬剤としてその重要性が増大している。また、医療用途に使用する場合、製品が滅菌されていることが必須である。滅菌方法として、オートクレーブでの加熱滅菌、γ線や電子線による電離放射線滅菌、エチレンオキサイドガスでのガス滅菌、過酸化水素によるプラズマ滅菌、グルタルアルデヒド製剤を使用した化学滅菌剤およびフィルターを使用した分離滅菌等が知られている。しかし、生理活性蛋白質などの蛋白質は、熱や放射線による滅菌により活性が低下する。エチレンオキサイドによる滅菌は、化学反応により副生成物が生成する可能性があるばかりか、毒性が強く、残留ガスが人体等に悪影響を及ぼす可能性がある。化学滅菌剤による滅菌は、蛋白質の滅菌剤に対する耐性、ｐＨの変化、イオン強度の変化または温度の変化を考慮する必要があるといった問題があった。そこで、蛋白質を含有・固定した医薬品・医療品を製造する場合は、製造プロセスをすべて無菌状態にして製造しなければならず、莫大な製造コストが必要となっているのが現状である。
また、蛋白質を含む溶液はフィルターにより分離滅菌しているが、大きい粒子を含む組成物、または固体もしくは半固体組成物には適用が困難であった。
ＥＰ０４３７０９５号にはヘパリンまたはヘパリンフラグメントと複合する中和酸化セルロース生成物（ｎＯＲＣ）をガンマ線照射で滅菌できることが示されている。しかし、この文献には蛋白質が結合しているＯＲＣまたはｎ−ＯＲＣを滅菌することは示されていない。
ＥＰ０５６２８６４号にはコラーゲンスポンジマトリックス、第二の生体吸収性ポリマー例えば酸化再生セルロース（ＯＲＣ）の分散繊維、および活性剤例えばペプチドを含む複合傷手当物質が示されている。活性剤はマトリックス、生体吸収性ポリマー、またはそれらの両方に含むことができ、該複合スポンジ物質をパッケージして滅菌できることが記載されている。
ＵＳ５７３０９３３号には生物学的に活性なペプチドをその生物学的活性を消失することなくガンマ線または電子ビーム照射で滅菌する方法が示されている。この方法は、生物学的に活性なペプチドとゼラチン等の外来蛋白質を含む混合物を形成し、この混合物を凍結または凍結乾燥し、次にこの混合物を照射する工程を含む技術であり、外来蛋白質の存在がペプチドを安定化してペプチドの活性低下を防ぐと記載されている。
国際公開ＷＯ２０００／０３３８９３号には治療ペプチドと、酸化再生セルロース、中和酸化再生セルロース、およびこれらの混合物からなる群から選択されるポリサッカライドとの複合体が記載されている。そして電離放射線で滅菌する前にペプチドを有効量のポリサッカライドと共に製剤することにより、電離放射線で滅菌してもペプチド治療剤の生物学的活性は消失しないで安定化すると記載されている。
しかし、これらの文献は、電離放射線で滅菌する際に起る、蛋白質の凝集等の構造変化や失活を脂肪族ポリエステルが抑制できることは示唆していない。
一方、特開２０１１−４７０８９号公報には酵素活性に優れる酵素含有ナノファイバーの製造方法が記載されている。この方法は、酵素と非水溶媒に溶解したポリマーとを含有する紡糸液を、静電紡糸法により紡糸して酵素前駆ナノファイバーを形成後、水を付与し乾燥するものである。しかし、この文献には酵素含有ナノファイバーを滅菌することに関する記述はない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は、蛋白質の構造や機能が維持された滅菌組成物を提供することである。
本発明の発明者らは前記課題を解決するために鋭意研究した結果、驚くべきことに蛋白質を脂肪族ポリエステルに含有させることにより、放射線滅菌による蛋白質の構造変化や機能低下、および放射線滅菌後の保存に伴うこれら変化や低下のうち、いずれかまたは両方を抑制できることを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、蛋白質および該蛋白質を含有する脂肪族ポリエステルを含む、放射線滅菌された滅菌組成物である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、実施例１および２で得られた本発明のトロンビン含有シート状繊維成形体、実施例３で得られた本発明のトロンビン含有フィルム、比較例１のトロンビン含有粒子ならびに比較例２で得られた比較トロンビン含有シート状繊維成形体のそれぞれについて測定したトロンビン活性を、滅菌前の初期値に対する滅菌後の値および滅菌後１ヶ月保存後の値の保持割合（保持率、％）として示したものである。
図２は、実施例４で得られた本発明のフィブリノゲン含有シート状繊維成形体および比較例３のフィブリノゲン含有粒子のそれぞれについて測定したフィブリノゲン凝集体量（％）を、未照射、滅菌後（ＯＭ）および滅菌後１ヶ月保存後（１Ｍ）について、示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明は、蛋白質および該蛋白質を含有する脂肪族ポリエステルを含む、放射線滅菌された滅菌組成物である。
本発明に用いられる蛋白質は特に限定されない。好ましいものとしては、例えばフィブリノゲンやトロンビンに代表される止血性蛋白質、アスパラギナーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシドデスムターゼ、リパーゼに代表される酵素、ヘモグロビン、血清アルブミン、低密度リポ蛋白質に代表される輸送蛋白質、アクチン、ミオシンに代表される筋肉蛋白質、抗体、補体に代表される防御蛋白質、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、ヘビ毒に代表される毒素蛋白質、インスリン、増殖因子、サイトカインに代表される蛋白質ホルモン、卵アルブミン、フェリチンに代表される貯蔵蛋白質、コラーゲン、ケラチンに代表される構造蛋白質、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＥＰＯ）、トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＴＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦまたはＦＧＦ２）、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）に代表される成長因子が挙げられる。なかでも好ましいのは、酵素、輸送蛋白質、筋肉蛋白質、防御蛋白質、毒素蛋白質、蛋白質ホルモン、貯蔵蛋白質、構造蛋白質、および成長因子である。
本発明において使用される蛋白質は、動物由来のものでも遺伝子組換え技術により製造したものでもよい。動物由来であればヒト由来が好ましい。また、遺伝子組み換え技術により作製された蛋白質は、本質的な生物活性が同様であればアミノ酸配列を別のアミノ酸配列に置換した改変体でもよい。また、これらの蛋白質を修飾したもの、およびこれらの混合物を用いることもできる。
また、本発明で用いられる蛋白質には、薬学的に許容しうる添加剤を加えてもよい。そのような添加剤の好ましい例としては、血液凝固第ＸＩＩＩ因子、アルブミン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、界面活性剤、塩化ナトリウム、糖アルコール（グリセロール、マンニトール等）、トレハロース、クエン酸ナトリウム、アプロチニンおよび塩化カルシウムからなる群から選択される一種以上が挙げられる。
本発明で用いられる蛋白質又は蛋白質と添加剤との混合物は、脂肪族ポリエステル中に、それぞれ分子として分散して存在してもよいが、それぞれ分子が集まった粒子（以下添加剤との混合粒子を含めて「蛋白質粒子」と記載する場合がある。）として分散して存在することが好ましい。
本発明において使用される脂肪族ポリエステルは、生体吸収性または生分解性ポリマーであることが好ましい。生体吸収性ポリマーの具体例としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸−ポリカプロラクトン共重合体、ポリグリセロールセバシン酸、ポリヒドロキシアルカン酸、ポリブチレンサクシネート、およびこれらの誘導体が例示できる。
これらの中でも、好ましくはポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、およびそれらの共重合体、ならびにそれらの混合物からなる群から選択され、最も好ましいのはポリ乳酸、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体である。例えばポリＬ乳酸とポリＤ乳酸のステレオコンプレックスを用いてもよい。
また、本発明で用いる脂肪族ポリエステルの分子量は１×１０３〜５×１０６であり、好ましくは１×１０４〜１×１０６、より好ましくは５×１０４〜５×１０５である。また、ポリマーの末端構造やポリマーを重合する触媒は任意に選択できる。
本発明の滅菌組成物においては、その目的を損なわない範囲で、他のポリマーや他の化合物を併用してもよい。例えば、ポリマー共重合、ポリマーブレンド、化合物混合である。
本発明で用いる脂肪族ポリエステルは高純度であることが好ましく、とりわけ脂肪族ポリエステル中に含まれる添加剤や可塑剤、残存触媒、残存モノマー、成形加工や後加工に用いた残留溶媒などの残留物は少ない方が好ましい。特に、医療に用いる場合は、安全性の基準値未満に抑える必要がある。
本発明において「蛋白質を含有する」とは、蛋白質の少なくとも一部分が脂肪族ポリエステル内部に入り込んでいる状態をいう。蛋白質が組成物表面や組成物の空隙に存在する凍結乾燥による複合体と区別される状態である。
本発明の滅菌組成物の形状は特に限定されるものではなく、例えば繊維、フィルム、シート、板状体、管状体、線状体、棒状体、クッション材、発泡体、多孔質体等が挙げられる。成形品を製造する際の成形方法は、蛋白質の構造変化や活性低下が抑制される方法であれば特に制限されず、例えば押出成形、射出成形、カレンダー成形、圧縮成形、ブロー成形、真空成形、粉末成形、流延成形、注型などの適当な成形方法を採用することができる。その中でも、本発明の滅菌組成物は繊維およびフィルム形状が適しており、それらの製造に当たってはプラスチック繊維またはフィルムの製造に従来から採用されているいずれの方法も採用でき、例えばインフレーション押出成形法、Ｔダイ押出成形法などの押出成形法、カレンダー法、流延法（キャスト法）などを挙げることができる。前記成形は、溶融成形によって行っても、または溶液成形によって行ってもよいが、蛋白質の機能低下を防ぐべく蛋白質を容易に分散させるためには溶液成形が好ましい。
ここで繊維形状とは、得られた一本または複数本の繊維が積層され、織り、編まれ、もしくはその他の手法により形成された３次元の成形体をいう。具体的な繊維の形態としては、例えば不織布が挙げられる。さらに、それをもとに加工したチューブ、メッシュなども繊維形状に含まれる。
本発明の繊維形状を有する滅菌組成物の平均繊維径は、例えば０．０１〜５０μｍであるが、当業者であれば使用目的に応じて適宜定めることができる。
また、本発明の繊維形状を有する滅菌組成物は長繊維よりなるものであってもよい。長繊維とは、具体的には紡糸から繊維成形体への加工に至る工程の中で、繊維を切断する工程を加えずに形成される繊維をいい、エレクトロスピニング法、スパンボンド法、メルトブロー法などで形成することができる。これらのうち、エレクトロスピニング法が好ましく用いられる。
エレクトロスピニング法は、ポリマーが溶解している液に高電圧を印加することで、電極上に繊維成形体を得る方法である。工程としては、ポリマーが溶解している紡糸液を製造する工程と、該溶液に高電圧を印加する工程と、該溶液を噴出させる工程と、噴出させた溶液から溶媒を蒸発させて繊維成形体を形成させる工程と、任意に実施しうる工程として形成された繊維成形体の電荷を消失させる工程と、電荷消失によって繊維成形体を累積させる工程を含む。
以下、エレクトロスピニング法を例にとり、本発明のうち、繊維形状または不織布形状を有する滅菌組成物の製造法を説明する。
エレクトロスピニング法における、紡糸液を製造する段階について説明する。本発明における紡糸液は、特に限定されるものではなく、例えば脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質の水溶液からなるエマルション、脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質粒子からなる懸濁液、脂肪族ポリエステルと蛋白質が溶解した有機溶媒溶液を使用することができるが、脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質粒子からなる懸濁液を使用することが好ましい。
脂肪族ポリエステル溶液における脂肪族ポリエステルの濃度は１〜３０重量％であることが好ましい。脂肪族ポリエステルの濃度が１重量％より低いと繊維成形体を形成することが困難となり好ましくない。また、３０重量％より高いと得られる繊維成形体の繊維径が大きくなり好ましくない。より好ましい有機溶媒溶液中の脂肪族ポリエステルの濃度は２〜２０重量％である。
脂肪族ポリエステルの溶媒は、脂肪族ポリエステルを溶解可能で、紡糸する段階で蒸発し、繊維を形成可能なものであれば特に限定されず、一種を単独で用いても複数の溶媒を組み合わせてもよい。例えばクロロホルム、２−プロパノール、トルエン、ベンゼン、ベンジルアルコール、ジクロロメタン、四塩化炭素、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、トリクロロエタン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、およびこれらの混合溶媒が挙げられる。また、エマルションを形成する範囲内においてアセトン、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、１−プロパノール、フェノール、ピリジン、酢酸、蟻酸、ヘキサフルオロ−２−プロパノール、ヘキサフルオロアセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド、１，３−ジオキソラン等の溶媒を含んでいてもよい。これらの中でも、取り扱い性や物性から、ジクロロメタン、エタノールを用いることが好ましい。
本発明における蛋白質は、脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液に固体、液体、または溶液のいずれの状態で添加、混合してもよい。
本発明において、脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質の水溶液からなるエマルションを紡糸液として使用する場合、蛋白質の水性溶媒は、蛋白質を溶解可能で、かつ脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液とエマルションを形成し、紡糸する段階で蒸発し、繊維を形成可能なものであれば特に限定されない。例えば、生理食塩水や各種緩衝液を使用することができる。さらには、蛋白質の安定剤や添加剤を加えてもよい。なかでもリン酸緩衝液、生理食塩水を用いることが好ましい。
本発明で用いられる蛋白質の水溶液における蛋白質の濃度は特に限定されず、蛋白質の特性に応じて適宜定められるが、例えば０．５〜５０重量％である。
脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質の水溶液からエマルションを調製する場合、両者の混合割合としては、安定なエマルションさえ形成しさえすれば特に限定されるものではないが、例えば（蛋白質の水溶液）／（脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液）（体積比）が１／１００〜１／２である。この値が１／２より大きいとエマルションが不安定となり好ましくない。
脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質の水溶液を混合し、エマルションを調製する方法としては、特に限定されないが、超音波や各種攪拌方法を用いることができる。攪拌方法としては、ホモジナイザーのような高速攪拌やアトライター、ボールミル等の攪拌方法も使用することができる。なかでも超音波処理による分散方法が好ましい。
また、有機溶媒と蛋白質の水溶液とでエマルションを形成した後、脂肪族ポリエステルを添加して紡糸液を調製することも可能である。
本発明において、脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質からなる懸濁液を紡糸液として使用する場合、蛋白質粒子のサイズは特に限定されるものではないが、０．０１〜１００μｍの範囲にあることが好ましい。０．０１μｍよりも小さい蛋白質粒子を作製することは技術的に困難であり、１００μｍよりも大きいと分散性が悪く、滅菌組成物が脆弱となり好ましくない。
脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質粒子を混合し、懸濁液を調製する方法としては、特に限定されないが、超音波や各種攪拌方法を用いることができる。攪拌方法としては、ホモジナイザーのような高速攪拌やアトライター、ボールミル等の攪拌方法も使用することができる。なかでも超音波処理による分散方法が好ましい。
また、有機溶媒と蛋白質粒子とで懸濁液を形成した後、脂肪族ポリエステルを添加して紡糸液を調製することも可能である。
また、懸濁液を調製する前に蛋白質粒子を微細処理することができる。微細処理としては、乾式粉砕と湿式粉砕とがあり、本発明においては、いずれの方式も採用することができ、両者を組み合わせることもできる。
乾式粉砕処理としては、例えばボールミルを用いた処理、遊星ミルや振動ミルを用いた処理、乳鉢を用い乳棒によりすり潰す処理、媒体攪拌型粉砕機、ジェットミル、石臼を用いてすりつぶす処理等が挙げられる。
一方、湿式粉砕処理としては、適当な分散媒に蛋白質粒子を分散させた状態で、高い剪断力の攪拌装置、混練装置等により攪拌する処理や、媒体中に分散した状態でのボールミル、ビーズミル処理等が挙げられる。さらには、スプレードライヤーにより作製した蛋白質粒子を使用することもできる。
本発明で用いる滅菌方法は、放射線滅菌である。用いられる放射線としては、例えばアルファ線、ベータ線、ガンマ線、中性子線、電子線、およびエックス線が挙げられる。なかでもガンマ線あるいは電子線が好ましく、最も好ましいのは電子線である。これらの滅菌方法は、特に限定されるものではないが、放射線の照射量としては１０〜８０ｋＧｙ、好ましくは２０〜３０ｋＧｙである。温度条件としては、特に限定されるものではないが−８０〜４０℃、好ましくは−８０〜３０℃である。
アルファ線、陽電子線、ガンマ線、中性子線、電子線、エックス線などの放射線は、物質に当たると物質を構成する分子・原子から電子をはぎ取る。この際に分子結合が切断され、反応性の高いラジカル等が生じ、周辺物質と２次的に化学反応する。
蛋白質は放射線照射により機能（活性）を失いやすいことがよく知られている。これは照射により分子結合が切れ、機能発現の根源である「高次構造」が壊されることによるものと考えられる。さらに、本願明細書の比較例に示されているように、蛋白質は放射線照射後の保存によっても構造破壊や失活が起こる。しかしながら、本発明における脂肪族ポリエステルに含有された蛋白質は放射線照射しても構造破壊や機能低下が抑制され、照射後の保存によるさらなる構造破壊や機能低下も抑制されている。これは本組成物中では、性蛋白質の高次構造が保持されていることを意味し、これは蛋白質の種類によらず共通の効果である。この効果は透過する脂肪族ポリエステルの厚みから考えて遮蔽によるものとは考えられず、抑制機構は定かではない。
本発明における放射線滅菌前の蛋白質を含有する脂肪族ポリエステルは、さらに電子・イオン捕捉剤、エネルギー移動剤、ラジカル捕捉剤、酸化防止剤、可塑剤を含んでもよい。電子・イオン捕捉剤としては、例えばＮ，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン、ジフェニレンジアミン、ピレン、キノン等が挙げられる。エネルギー移動剤としては、例えばアセナフテン等が挙げられる。ラジカル捕捉剤としては、例えばメルカプタン、オクタヒドロフェナントレン、モノアルキルジフェニルエーテル、トコフェロール、クエン酸、ブチル化ヒドロキシアンソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ｔ−ブチルヒドロキノン、没食子酸プロピル、アスコルビン酸誘導体等が挙げられる。酸化防止剤としては、ＢＨＴ、亜リン酸トリエステル、フェノール系老化防止剤、有機チオ酸塩類等が挙げられる。なかでも食品や医薬品に使用するのに安全であると一般に認められている添加剤が好ましい。添加剤の量は特に限定されるものではないが、例えば滅菌組成物における脂肪族ポリエステルに対して０．０１〜１０重量％の添加剤を含むことができる。
滅菌工程における蛋白質を含有する脂肪族ポリエステルは、水分を含んでいないことが好ましい。水分率は１０重量％以下が好ましく、より好ましくは４重量％以下、さらに好ましくは実質的に無水のものである。
また、蛋白質を含有する脂肪族ポリエステルは、包装材に包装して放射線滅菌してもよい。かかる包装材料としては、アルミニウムのようなガスバリア性の高い材料を使用することが好ましい。また、脱酸素剤や乾燥剤と共に密封包装しても、脱気後に不活性ガスを充填した状態で包装しても、これら両方を行ってもよい。かかる脱酸素剤および乾燥剤は、人体に害がなく、放射線照射時に失活しないものが好ましい。
本発明の滅菌組成物は、例えば蛋白質の機能および滅菌性が求められる医療用材料として使用できる。
【実施例】
【０００６】
以下、実施例により本発明の実施の形態を説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
１．トロンビン活性測定
ファルコン社製２００８チューブに試料２０μＬと５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．５）＋５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファー６０μＬ、０．１％  ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８を２０μＬ加え、３７℃で３分インキュベーションした。標準品としてヒトプラズマ由来精製α―トロンビン（ヘマトロジックテクノロジー社から購入：ＨＣＴ−００２０）を同バッファーで５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５Ｕ／ｍＬに希釈したものを用いた。その反応液にテストチーム発色基質Ｓ−２２３８（１ｍＭ：第一化学薬品工業）を１００μＬ添加して攪拌混合し、３７℃で５分間の反応後、０．１Ｍクエン酸溶液を８００μＬ加えて反応を停止した。反応液２００μＬを９６ウェルプレートに移し、ＯＤ４０５／６５０を測定した。
なお、実施例５〜７及び比較例４以外においては以下の方法で測定した。ＢＤ社製ポリスチレンチューブに試料２０μＬと活性測定用希釈溶液（０．０１％  Ｆ−６８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４）８０μＬ加え、３７℃で３分インキュベーションした。標準品として組換トロンビン（ＪＰＵ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ４００Ｕ／ｍＬまたはＷＨＯ／ＵＳ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、１１０ＩＵ／ｍＬ）を同バッファーでＪＰＵの場合、４、２、１、０．５、０．２５Ｕ／ｍＬ、ＩＵの場合、６、３、１．５、０．７５、０．３７５ＩＵ／ｍＬに希釈したものを用いた。その反応液にテストチーム発色基質Ｓ−２２３８（１ｍＭ：第一化学薬品工業）を１００μＬ添加して攪拌混合し、３７℃で７分間の反応後、０．１Ｍクエン酸溶液を８００μＬ加えて反応を停止した。反応液２００μＬを９６ウェルプレートに移し、ＯＤ４０５／６５０を測定した。
２．フィブリノゲン凝集体量測定
シートをΦ１ｃｍに切り出した後、希釈液によりフィブリノゲンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーでその凝集体量を測定した。
＜試験条件＞
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２８０ｍ）
カラム：Ｂｉｏ  Ｓｅｐ−ＳＥＣ−ｓ４０００（７．８×３００ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）
カラム温度：２５℃
サンプラー温度：６℃
移動相：０．５ｍｏｌ／Ｌ  Ａｒｇ−ＨＣｌ／５０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸バッファー
流量：１ｍＬ／ｍｉｎ
分析時間：２０ｍｉｎ
３．厚さ
成形体を高精度デジタル測長機（株式会社ミツトヨ：商品名「ライトマチックＶＬ−５０」）を用いて測定力０．０１Ｎによりｎ＝１５にて成形体の膜厚を測定した平均値を算出し成形体の厚さとした。なお、本測定においては測定機器が使用可能な最小の測定力で測定を行った。
４．目付
成形体を、５０ｍｍ×１００ｍｍにカットしその重量を測定し換算することで成形体の目付を算出した。
５．嵩密度
上記測定した厚さと目付の値から成形体の嵩密度を算出した。
６．トロンビンＥＬＩＳＡ測定
ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ  ４６８６６７）に抗ヒトトロンビン抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、Ｎｏ．ＳＡＨＴ−ＡＰ）を５μｇ／ｍＬで固定化した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル  ＵＫ−Ｂ８０）を各ウェルに添加し、マスキングを行った。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、検体を添加した。標準品としてヒトトロンビン（ヘマトロジックテクノロジー社：ＨＣＴ−００２０）を用い、検量線を作成した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒトトロンビン抗体（（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、Ｎｏ．ＳＡＨＴ−ＨＲＰ）を０．１μｇ／ｍＬで添加した。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、ＴＭＢ試薬（ＤａＫｏ  Ｓ１５９９）を添加し、１０分間静置して発色させた。１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加え、発色を停止し、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０−６５０ｎｍを測定した。
７．リパーゼ及びβ―グルコシダーゼの酵素活性測定
（１）抽出率測定
成形体を２ｃｍ×２ｃｍに切り出し、１ｍＬの生理食塩水に３分間若しくは３時間浸漬して、固定化した酵素を溶出させた。ｎ＝３にて前後の重量変化を測定し、以下の式により算出した抽出率の平均値を求めた。固定化酵素理論重量は、組成物の重量、仕込み酵素粉末重量％から算出した。
抽出割合＝重量減少（ｍｇ）／固定化酵素理論重量（ｍｇ）
（２）酵素活性測定
リパーゼの活性測定にはＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｌｉｐａｓｅ  Ｔｅｓｔキット（ＰＲＯＧＥＮ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＫ  ＧＭＢＨ製）を使用した。以下の式により活性回収率を算出した。活性酵素量は、活性値から濃度換算して算出した。単位面積当たり固定化酵素理論重量は、仕込み酵素粉末重量％と組成物の目付けから算出した。
活性回収率（％）＝｛活性酵素量（ｍｇ／ｃｍ２）／（単位面積当たり固定化酵素理論重量（ｍｇ／ｃｍ２）×抽出割合）｝×１００
β‐グルコシダーゼの活性測定にはＴｏｋｙｏｇｒｅｅｎ（登録商標、以下同じ。）−βＧｌｕ（積水メディカル株式会社）を用いた蛍光測定により行った。以下の式により活性回収率を算出した。固定化酵素理論重量は、仕込み酵素粉末重量％と組成物の重量から算出した。
活性回収率（％）＝｛活性酵素量（ｍｇ）／（固定化酵素理論重量（ｍｇ）×抽出割合）｝×１００
以下の式により活性保持率を算出した。
活性保持率（％）＝｛滅菌後の活性回収率（％）／滅菌前の活性回収率（％）｝×１００
実施例１
エタノールにトロンビン含有粒子（リコンビナントトロンビン１ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトール含有ｐＨ７の水溶液を凍結乾燥したもの）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０重量％になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＤＬＧ５０１０、Ｐｕｒａｃ社製）を溶解し、トロンビン含有粒子／ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体＝１００（トロンビンとして１．６９）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られた繊維成形体の厚さは１３１μｍ、目付けは１．４４ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度１１１ｍｇ／ｃｍ３であった。得られたシートを直径１ｃｍに切り出し、２００μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性測定を実施した。その結果、活性測定値は２６．７Ｕ／ｃｍ２であった。得られたシートは、２０ｋＧｙの電子線を照射し滅菌後、４０℃／７５％ＲＨで保存し、１ヶ月後のトロンビン活性を測定した。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を１００％とした時、７９％の保持率であった。１ヵ月後の活性保持率は７８％であり、保存中のトロンビン活性の低下は見られなかった。
実施例２
エタノールにトロンビン含有粒子（リコンビナントトロンビン１ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトール含有ｐＨ７の水溶液を凍結乾燥したもの）とキニザリングリーンＳＳ（東京化成）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０重量％になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＤＬＧ５０１０、Ｐｕｒａｃ社製）を溶解し、トロンビン含有粒子／ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体＝１００（トロンビンとして１．６９）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られた繊維成形体（平均厚み：１２９μｍ、目付：１．４９ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度：１２４ｍｇ／ｃｍ３）を含むシートを直径１ｃｍに切り出し、２００μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してトロンビン活性測定を実施した。その結果、活性測定値は４０．２ＩＵ／ｃｍ２であった。得られたシートは、３０ｋＧｙの電子線を照射し滅菌後、４０℃／７５％ＲＨで保存し、１ヶ月後のトロンビン活性を測定した。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を１００％とした時、７０％の保持率であった。１ヵ月後の活性保持率は７４％であり、保存中のトロンビン活性の低下は見られなかった。
実施例３
エタノールにトロンビン含有粒子（リコンビナントトロンビン１ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトールを含有するｐＨ７の水溶液を凍結乾燥したもの）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０重量％になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＤＬＧ５０１０、Ｐｕｒａｃ社製）を溶解し、トロンビン含有粒子／ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体＝１００（トロンビンとして１．６９）／１００（ｗ／ｗ）のドープ液を調製した。得られたドープ液を用い、流延法によりフィルムを作製した。塗工間隔は１２７μｍで、塗工速度は３０．１ｍｍ／ｓｅｃであった。得られたシートの厚さは５８μｍ、目付２．９ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度５０４ｍｇ／ｃｍ３であった。得られたシートを直径１ｃｍに切り出し、２００μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してトロンビン活性測定を実施した。その結果、活性測定値は７１．１ＩＵ／ｃｍ２であった。得られたシートは、３０ｋＧｙの電子線を照射し滅菌後、４０℃／７５％ＲＨで保存し、１ヶ月後のトロンビン活性を測定した。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を１００％とした時、７５．７％の保持率であった。１ヵ月後の活性保持率は８２％であり、保存中のトロンビン活性の低下は見られなかった。
実施例４
エタノールにフィブリノゲン含有粒子（リコンビナントフィブリノゲン１０ｍｇ／ｍＬ、アルギニン、塩化ナトリウム及びマンニトールを含有するｐＨ８．５の水溶液を凍結乾燥したもの）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０重量％になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＤＬＧ５０１０、Ｐｕｒａｃ社製）を溶解し、フィブリノゲン含有粒子／ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体＝１００（フィブリノゲンとして５０．８５）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られた繊維成形体の厚さは１３１μｍ、目付けは１．４４ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度１１０ｍｇ／ｃｍ３であった。得られたシートを直径１ｃｍに切り出し、希釈液にてフィブリノゲンを抽出して高速クロマトグラフィーにより凝集体量を測定した。その結果、凝集体量は９．７９％であった。得られたシートは、３０ｋＧｙの電子線を照射し滅菌後、４０℃／７５％ＲＨで保存し、１ヶ月後の凝集体量を測定した。電子線照射直後の凝集体量は、１８．８１％であった。１ヵ月後は２４．１４％であった。
比較例１
トロンビン含有粒子（リコンビナントトロンビン１ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトールを含有するｐＨ７の水溶液を凍結乾燥したもの）に３０ｋＧｙの電子線を照射し滅菌後、４０℃／７５％ＲＨで保存し、１ヶ月後のトロンビン活性を測定した。照射前のトロンビン活性は、４０４．７３Ｕ／バイアルであった。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を１００％とした時、５１．８％の保持率であった。１ヵ月後の活性保持率は１７．９％であり、保存中のトロンビン活性の低下が見られた。
比較例２
２−プロパノールにトロンビン含有粒子（リコンビナントトロンビン１ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトールを含有するｐＨ７の水溶液を凍結乾燥したもの）を分散させた後、１３重量％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（２．０−２．９ｍＰａ・ｓ  日本曹逹製）を溶解し、トロンビン含有粒子／ヒドロキシプロピルセルロース＝１００／１００（ｗ／ｗ）のドープ液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られた繊維成形体の厚さは２０４μｍ、目付けは２．０８ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度１０１ｍｇ／ｃｍ３であった。得られたシートを直径１ｃｍに切り出し、２００μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性測定を実施した。その結果、活性測定値は１１０．３ＩＵ／ｃｍ２であった。得られたシートは、３０ｋＧｙの電子線を照射し滅菌後、４０℃／７５％ＲＨで保存し、１ヶ月後のトロンビン活性を測定した。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を１００％とした時、６８．４％の保持率であった。１ヵ月後の活性保持率は５４．９％であり、保存中のトロンビン活性の低下が見られた。
比較例３
フィブリノゲン含有粒子（リコンビナントフィブリノゲン１０ｍｇ／ｍＬ、アルギニン、塩化ナトリウム及びマンニトールを含有するｐＨ８．５の水溶液を凍結乾燥したもの）に３０ｋＧｙの電子線を照射し滅菌後、４０℃／７５％ＲＨで保存し、１ヶ月後のフィブリノゲンの凝集体量を測定した。照射前の凝集体量は、６．９７％であった。電子線照射直後の凝集体量は、１８．５１％であった。１ヵ月後は５４．７２％であった。
実施例１〜３、比較例１〜２の結果（滅菌後及び滅菌後保存後の、滅菌前に対するトロンビン（Ｔｈ）活性保持率）を図１に示す。
蛋白質を脂肪族ポリエステルに含有させることにより、蛋白含有粒子のみの場合（比較例１）に対し、放射線滅菌による蛋白質の構造変化や機能低下が抑制され、さらには放射線滅菌後の保存に伴うこれら変化や低下が、脂肪族ポリエステルでなくセルロース類（ヒドロキシプロピルセルロース）である場合（比較例２）に対し、それぞれ抑制されていることがわかる。
実施例４および比較例３の結果（滅菌後及び滅菌後保存後の、フィブリノゲンの凝集体量）を図２に示す。
蛋白質を脂肪族ポリエステルに含有（実施例４）させることにより、蛋白含有粒子のみの場合（比較例３）に対し、放射線滅菌後の保存に伴う蛋白質の構造変化が抑制されていることがわかる。
実施例５
エタノールにトロンビン含有粒子（ボルヒール（登録商標、以下同じ）組織接着用：バイアル３）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０ｗｔ％になるようにポリ乳酸（ＰＬ１８  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、トロンビン含有粒子／ポリ乳酸＝４０（トロンビンとして０．４５）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られたシートを２０ｋＧｙで電子線滅菌した。得られたシートを２ｃｍ×２ｃｍに切断し、１ｍＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性およびＥＬＩＳＡ測定を実施した。その結果、活性測定値は５．０Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は３．４μｇ／ｃｍ２であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性およびＥＬＩＳＡ測定を実施した結果、活性測定値は７．５Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は４．３５μｇ／ｃｍ２であった。すなわち、未滅菌シートに対しての滅菌シートの活性保持率は７３％であった。
実施例６
エタノールにトロンビン含有粒子（ボルヒール組織接着用：バイアル３）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０ｗｔ％になるようにポリ乳酸（ＰＬ１８  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、トロンビン含有粒子／ポリ乳酸＝７０（トロンビンとして０．７８）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られたシートを２０ｋＧｙで電子線滅菌した。得られたシートを２ｃｍ×２ｃｍに切断し、１ｍＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性およびＥＬＩＳＡ測定を実施した。その結果、活性測定値は９．５７５Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は、７．０μｇ／ｃｍ２であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性およびＥＬＩＳＡ測定を実施した結果、活性測定値は１１．１５Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は７．２μｇ／ｃｍ２であった。すなわち、未滅菌シートに対しての滅菌シートの活性保持率は８６％であった。
実施例７
エタノールにトロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０ｗｔ％になるようにポリ乳酸（ＰＬ１８  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、トロンビン凍結乾燥粉末／ポリ乳酸＝１００（トロンビンとして１．１）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、紡糸液流量は３．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。得られたシートを２０ｋＧｙで電子線滅菌した。得られたシートを２ｃｍ×２ｃｍに切断して、１ｍＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性およびＥＬＩＳＡ測定を実施した。その結果、活性測定値は１５Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は１１μｇ／ｃｍ２であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性およびＥＬＩＳＡ測定を実施した結果、活性測定値は２３Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は１６μｇ／ｃｍ２であった。すなわち、未滅菌シートに対しての滅菌シートの活性保持率は６４％であった。
比較例４
トロンビン含有粒子（ボルヒール）を２０ｋＧｙで電子線滅菌した。１ｍＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性およびＥＬＩＳＡ測定を実施した。その結果、活性測定値は２２．５Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は１１．５μｇ／ｃｍ２であった。一方で、滅菌処理していないトロンビン含有粒子についても同様に活性およびＥＬＩＳＡ測定を実施した結果、活性測定値は６８．５Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は４１．５μｇ／ｃｍ２であった。すなわち、未滅菌シートに対しての滅菌シートの活性保持率は３２％であった。
実施例８
エタノールにリパーゼ粉末（ブタ膵臓由来、和光純薬製、以下同じ）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０ｗｔ％になるようにポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＤＬＧ５０１０  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、リパーゼ粉末／ポリ乳酸−グリコール酸共重合体＝５０／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２７℃、湿度２５％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．９ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、紡糸液流量は４．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。得られたシートのリパーゼ抽出率は７９％であった。得られたシートを２０ｋＧｙで電子線滅菌した。得られた滅菌シートを１ｃｍ×１ｃｍに切断し、キットに含まれるＬｉｐａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  １ｍＬでリパーゼを抽出して活性測定を実施した。その結果、活性回収率は１００％であった。
実施例９
リパーゼ粉末にジクロロメタンを加え、１０ｗｔ％になるようにポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＤＬＧ５０１０  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、リパーゼ粉末／ポリ乳酸＝５０／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２６℃、湿度２５％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、紡糸液流量は４．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。得られたシートのリパーゼ抽出率は６３％であった。得られたシートを２０ｋＧｙで電子線滅菌した。得られた滅菌シートを１ｃｍ×１ｃｍに切断し、キットに含まれるＬｉｐａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  １ｍＬでリパーゼを抽出して活性測定を実施した。その結果、活性回収率は９２％であった。
実施例１０
エタノールにβ‐グルコシダーゼ粉末（アーモンド由来、オリエンタル酵母工業製、以下同じ）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０ｗｔ％になるようにポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＤＬＧ５０１０  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、β‐グルコシダーゼ粉末／ポリ乳酸−グリコール酸共重合体＝３８／６２（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２７℃、湿度２５％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．９ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、紡糸液流量は４．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。得られたシートを２ｃｍ×２ｃｍに切断後、２０ｋＧｙで電子線滅菌した。生理食塩水１ｍＬでβ‐グルコシダーゼを抽出してＴｏｋｙｏｇｒｅｅｎ−βＧｌｕで活性測定を実施した。その結果、活性回収率は９２％であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性測定を実施した結果、活性回収率は９４％であった。以上のことから、未滅菌繊維成形体に対しての滅菌繊維成形体の活性保持率は９８％であり、電子線滅菌により失活していないことがわかった。
実施例１１
エタノールにβ‐グルコシダーゼ粉末を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０ｗｔ％になるようにポリ乳酸−カプロラクトン共重合体（ＰＬＣＡ８８１２多木化学製）を溶解し、β‐グルコシダーゼ粉末／ポリ乳酸−カプロラクトン共重合体＝３８／６２（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２７℃、湿度２５％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．９ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、紡糸液流量は３．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。得られたシートを２ｃｍ×２ｃｍに切断後、２０ｋＧｙで電子線滅菌した。生理食塩水１ｍＬでβ‐グルコシダーゼを抽出してＴｏｋｙｏｇｒｅｅｎ−βＧｌｕで活性測定を実施した。その結果、活性回収率は８１％であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性測定を実施した結果、活性回収率は８０％であった。以上のことから、未滅菌繊維成形体に対しての滅菌繊維成形体の活性保持率は１０１％であり、電子線滅菌により失活していないことがわかった。
実施例１２
エタノールにβ‐グルコシダーゼ粉末を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１１ｗｔ％になるようにポリ乳酸（ＰＬ１８  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、β‐グルコシダーゼ粉末／ポリ乳酸＝３８／６２（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２７℃、湿度２５％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．９ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、紡糸液流量は３．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。得られたシートを２ｃｍ×２ｃｍに切断後、２０ｋＧｙで電子線滅菌した。生理食塩水１ｍＬでβ‐グルコシダーゼを抽出してＴｏｋｙｏｇｒｅｅｎ−βＧｌｕで活性測定を実施した。その結果、活性回収率は６２％であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性測定を実施した結果、活性回収率は７１％であった。以上のことから、未滅菌繊維成形体に対しての滅菌繊維成形体の活性保持率は８７％であり、電子線滅菌により失活していないことがわかった。
比較例５
リパーゼ粉末を２０ｋＧｙで電子線滅菌した。粉末１ｍｇに１ｍＬのＬｉｐａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒを添加して活性測定を実施した。その結果、活性回収率は７４％であった。
比較例６
β‐グルコシダーゼ粉末を２０ｋＧｙで電子線滅菌した。粉末２ｍｇを１ｍＬの生理食塩水に溶解させ、Ｔｏｋｙｏｇｒｅｅｎ−βＧｌｕで活性測定を実施した。その結果、活性保持率は８１％であった。
発明の効果
本発明の滅菌組成物は、滅菌されているにもかかわらず蛋白質の構造や機能が保持されている。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明の滅菌組成物は、例えば蛋白質の機能および滅菌性が求められる医療品の製造業で利用される。
【図１】
2013172468.tif 000003
【図２】
2013172468.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月19日(2015.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪族ポリエステルに包含されることにより機能が保持された蛋白質の滅菌組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、天然および合成蛋白質は薬剤としてその重要性が増大している。また、医療用途に使用する場合、製品が滅菌されていることが必須である。滅菌方法として、オートクレーブでの加熱滅菌、γ線や電子線による電離放射線滅菌、エチレンオキサイドガスでのガス滅菌、過酸化水素によるプラズマ滅菌、グルタルアルデヒド製剤を使用した化学滅菌剤およびフィルターを使用した分離滅菌等が知られている。しかし、生理活性蛋白質などの蛋白質は、熱や放射線による滅菌により活性が低下する。エチレンオキサイドによる滅菌は、化学反応により副生成物が生成する可能性があるばかりか、毒性が強く、残留ガスが人体等に悪影響を及ぼす可能性がある。化学滅菌剤による滅菌は、蛋白質の滅菌剤に対する耐性、ｐＨの変化、イオン強度の変化または温度の変化を考慮する必要があるといった問題があった。そこで、蛋白質を含有・固定した医薬品・医療品を製造する場合は、製造プロセスをすべて無菌状態にして製造しなければならず、莫大な製造コストが必要となっているのが現状である。
また、蛋白質を含む溶液はフィルターにより分離滅菌しているが、大きい粒子を含む組成物、または固体もしくは半固体組成物には適用が困難であった。
【０００３】
特許文献１にはヘパリンまたはヘパリンフラグメントと複合する中和酸化セルロース生成物（ｎＯＲＣ）をガンマ線照射で滅菌できることが示されている。しかし、この文献には蛋白質が結合しているＯＲＣまたはｎ−ＯＲＣを滅菌することは示されていない。
特許文献２にはコラーゲンスポンジマトリックス、第二の生体吸収性ポリマー例えば酸化再生セルロース（ＯＲＣ）の分散繊維、および活性剤例えばペプチドを含む複合傷手当物質が示されている。活性剤はマトリックス、生体吸収性ポリマー、またはそれらの両方に含むことができ、該複合スポンジ物質をパッケージして滅菌できることが記載されている。
特許文献３には生物学的に活性なペプチドをその生物学的活性を消失することなくガンマ線または電子ビーム照射で滅菌する方法が示されている。この方法は、生物学的に活性なペプチドとゼラチン等の外来蛋白質を含む混合物を形成し、この混合物を凍結または凍結乾燥し、次にこの混合物を照射する工程を含む技術であり、外来蛋白質の存在がペプチドを安定化してペプチドの活性低下を防ぐと記載されている。
特許文献４には治療ペプチドと、酸化再生セルロース、中和酸化再生セルロース、およびこれらの混合物からなる群から選択されるポリサッカライドとの複合体が記載されている。そして電離放射線で滅菌する前にペプチドを有効量のポリサッカライドと共に製剤することにより、電離放射線で滅菌してもペプチド治療剤の生物学的活性は消失しないで安定化すると記載されている。
【０００４】
しかし、これらの文献は、電離放射線で滅菌する際に起る、蛋白質の凝集等の構造変化や失活を脂肪族ポリエステルが抑制できることは示唆していない。
一方、特許文献５には酵素活性に優れる酵素含有ナノファイバーの製造方法が記載されている。この方法は、酵素と非水溶媒に溶解したポリマーとを含有する紡糸液を、静電紡糸法により紡糸して酵素前駆ナノファイバーを形成後、水を付与し乾燥するものである。しかし、この文献には酵素含有ナノファイバーを滅菌することに関する記述はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＥＰ０４３７０９５号
【特許文献２】ＥＰ０５６２８６４号
【特許文献３】ＵＳ５７３０９３３号
【特許文献４】国際公開ＷＯ２０００／０３３８９３号
【特許文献５】特開２０１１−４７０８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、蛋白質の構造や機能が維持された滅菌組成物を提供することである。
本発明の発明者らは前記課題を解決するために鋭意研究した結果、驚くべきことに蛋白質を脂肪族ポリエステルに含有させることにより、放射線滅菌による蛋白質の構造変化や機能低下、および放射線滅菌後の保存に伴うこれら変化や低下のうち、いずれかまたは両方を抑制できることを見出し、本発明に到達した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、蛋白質の少なくとも一部分が脂肪族ポリエステル内部に入り込んでいる状態で、蛋白質および脂肪族ポリエステルを含む、放射線滅菌された滅菌組成物（但し、１８０μｍのふるいを通過する微粒子の形態にあるものを除く）である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の滅菌組成物は、滅菌されているにもかかわらず蛋白質の構造や機能が保持されている。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１および２で得られた本発明のトロンビン含有シート状繊維成形体、実施例３で得られた本発明のトロンビン含有フィルム、比較例１のトロンビン含有粒子ならびに比較例２で得られた比較トロンビン含有シート状繊維成形体のそれぞれについて測定したトロンビン活性を、滅菌前の初期値に対する滅菌後の値および滅菌後１ヶ月保存後の値の保持割合（保持率、％）として示したものである。
【図２】実施例４で得られた本発明のフィブリノゲン含有シート状繊維成形体および比較例３のフィブリノゲン含有粒子のそれぞれについて測定したフィブリノゲン凝集体量（％）を、未照射、滅菌後（ＯＭ）および滅菌後１ヶ月保存後（１Ｍ）について、示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、蛋白質および該蛋白質を上記状態で含有する脂肪族ポリエステルを含む、放射線滅菌された滅菌組成物である。
本発明に用いられる蛋白質は特に限定されない。好ましいものとしては、例えばフィブリノゲンやトロンビンに代表される止血性蛋白質、アスパラギナーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシドデスムターゼ、リパーゼに代表される酵素、ヘモグロビン、血清アルブミン、低密度リポ蛋白質に代表される輸送蛋白質、アクチン、ミオシンに代表される筋肉蛋白質、抗体、補体に代表される防御蛋白質、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、ヘビ毒に代表される毒素蛋白質、インスリン、増殖因子、サイトカインに代表される蛋白質ホルモン、卵アルブミン、フェリチンに代表される貯蔵蛋白質、コラーゲン、ケラチンに代表される構造蛋白質、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＥＰＯ）、トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＴＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦまたはＦＧＦ２）、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）に代表される成長因子が挙げられる。なかでも好ましいのは、酵素、輸送蛋白質、筋肉蛋白質、防御蛋白質、毒素蛋白質、蛋白質ホルモン、貯蔵蛋白質、構造蛋白質、および成長因子である。
【００１１】
本発明において使用される蛋白質は、動物由来のものでも遺伝子組換え技術により製造したものでもよい。動物由来であればヒト由来が好ましい。また、遺伝子組み換え技術により作製された蛋白質は、本質的な生物活性が同様であればアミノ酸配列を別のアミノ酸配列に置換した改変体でもよい。また、これらの蛋白質を修飾したもの、およびこれらの混合物を用いることもできる。
また、本発明で用いられる蛋白質には、薬学的に許容しうる添加剤を加えてもよい。そのような添加剤の好ましい例としては、血液凝固第ＸＩＩＩ因子、アルブミン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、界面活性剤、塩化ナトリウム、糖アルコール（グリセロール、マンニトール等）、トレハロース、クエン酸ナトリウム、アプロチニンおよび塩化カルシウムからなる群から選択される一種以上が挙げられる。
本発明で用いられる蛋白質又は蛋白質と添加剤との混合物は、脂肪族ポリエステル中に、それぞれ分子として分散して存在してもよいが、それぞれ分子が集まった粒子（以下添加剤との混合粒子を含めて「蛋白質粒子」と記載する場合がある。）として分散して存在することが好ましい。
【００１２】
本発明において使用される脂肪族ポリエステルは、生体吸収性または生分解性ポリマーであることが好ましい。生体吸収性ポリマーの具体例としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸−ポリカプロラクトン共重合体、ポリグリセロールセバシン酸、ポリヒドロキシアルカン酸、ポリブチレンサクシネート、およびこれらの誘導体が例示できる。
これらの中でも、好ましくはポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、およびそれらの共重合体、ならびにそれらの混合物からなる群から選択され、最も好ましいのはポリ乳酸、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体である。例えばポリＬ乳酸とポリＤ乳酸のステレオコンプレックスを用いてもよい。
また、本発明で用いる脂肪族ポリエステルの分子量は１×１０３〜５×１０６であり、好ましくは１×１０４〜１×１０６、より好ましくは５×１０４〜５×１０５である。また、ポリマーの末端構造やポリマーを重合する触媒は任意に選択できる。
本発明の滅菌組成物においては、その目的を損なわない範囲で、他のポリマーや他の化合物を併用してもよい。例えば、ポリマー共重合、ポリマーブレンド、化合物混合である。
【００１３】
本発明で用いる脂肪族ポリエステルは高純度であることが好ましく、とりわけ脂肪族ポリエステル中に含まれる添加剤や可塑剤、残存触媒、残存モノマー、成形加工や後加工に用いた残留溶媒などの残留物は少ない方が好ましい。特に、医療に用いる場合は、安全性の基準値未満に抑える必要がある。
本発明において「蛋白質を含有する」とは、蛋白質の少なくとも一部分が脂肪族ポリエステル内部に入り込んでいる状態をいう。蛋白質が組成物表面や組成物の空隙に存在する凍結乾燥による複合体と区別される状態である。
【００１４】
本発明の滅菌組成物の形状は特に限定されるものではなく、例えば繊維、フィルム、シート、板状体、管状体、線状体、棒状体、クッション材、発泡体、多孔質体等が挙げられる。成形品を製造する際の成形方法は、蛋白質の構造変化や活性低下が抑制される方法であれば特に制限されず、例えば押出成形、射出成形、カレンダー成形、圧縮成形、ブロー成形、真空成形、粉末成形、流延成形、注型などの適当な成形方法を採用することができる。その中でも、本発明の滅菌組成物は繊維およびフィルム形状が適しており、それらの製造に当たってはプラスチック繊維またはフィルムの製造に従来から採用されているいずれの方法も採用でき、例えばインフレーション押出成形法、Ｔダイ押出成形法などの押出成形法、カレンダー法、流延法（キャスト法）などを挙げることができる。前記成形は、溶融成形によって行っても、または溶液成形によって行ってもよいが、蛋白質の機能低下を防ぐべく蛋白質を容易に分散させるためには溶液成形が好ましい。
【００１５】
ここで繊維形状とは、得られた一本または複数本の繊維が積層され、織り、編まれ、もしくはその他の手法により形成された３次元の成形体をいう。具体的な繊維の形態としては、例えば不織布が挙げられる。さらに、それをもとに加工したチューブ、メッシュなども繊維形状に含まれる。
本発明の繊維形状を有する滅菌組成物の平均繊維径は、例えば０．０１〜５０μｍであるが、当業者であれば使用目的に応じて適宜定めることができる。
【００１６】
また、本発明の繊維形状を有する滅菌組成物は長繊維よりなるものであってもよい。長繊維とは、具体的には紡糸から繊維成形体への加工に至る工程の中で、繊維を切断する工程を加えずに形成される繊維をいい、エレクトロスピニング法、スパンボンド法、メルトブロー法などで形成することができる。これらのうち、エレクトロスピニング法が好ましく用いられる。
エレクトロスピニング法は、ポリマーが溶解している液に高電圧を印加することで、電極上に繊維成形体を得る方法である。工程としては、ポリマーが溶解している紡糸液を製造する工程と、該溶液に高電圧を印加する工程と、該溶液を噴出させる工程と、噴出させた溶液から溶媒を蒸発させて繊維成形体を形成させる工程と、任意に実施しうる工程として形成された繊維成形体の電荷を消失させる工程と、電荷消失によって繊維成形体を累積させる工程を含む。
以下、エレクトロスピニング法を例にとり、本発明のうち、繊維形状または不織布形状を有する滅菌組成物の製造法を説明する。
【００１７】
エレクトロスピニング法における、紡糸液を製造する段階について説明する。本発明における紡糸液は、特に限定されるものではなく、例えば脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質の水溶液からなるエマルション、脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質粒子からなる懸濁液、脂肪族ポリエステルと蛋白質が溶解した有機溶媒溶液を使用することができるが、脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質粒子からなる懸濁液を使用することが好ましい。
脂肪族ポリエステル溶液における脂肪族ポリエステルの濃度は１〜３０重量％であることが好ましい。脂肪族ポリエステルの濃度が１重量％より低いと繊維成形体を形成することが困難となり好ましくない。また、３０重量％より高いと得られる繊維成形体の繊維径が大きくなり好ましくない。より好ましい有機溶媒溶液中の脂肪族ポリエステルの濃度は２〜２０重量％である。
【００１８】
脂肪族ポリエステルの溶媒は、脂肪族ポリエステルを溶解可能で、紡糸する段階で蒸発し、繊維を形成可能なものであれば特に限定されず、一種を単独で用いても複数の溶媒を組み合わせてもよい。例えばクロロホルム、２−プロパノール、トルエン、ベンゼン、ベンジルアルコール、ジクロロメタン、四塩化炭素、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、トリクロロエタン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、およびこれらの混合溶媒が挙げられる。また、エマルションを形成する範囲内においてアセトン、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、１−プロパノール、フェノール、ピリジン、酢酸、蟻酸、ヘキサフルオロ−２−プロパノール、ヘキサフルオロアセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド、１，３−ジオキソラン等の溶媒を含んでいてもよい。これらの中でも、取り扱い性や物性から、ジクロロメタン、エタノールを用いることが好ましい。
本発明における蛋白質は、脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液に固体、液体、または溶液のいずれの状態で添加、混合してもよい。
【００１９】
本発明において、脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質の水溶液からなるエマルションを紡糸液として使用する場合、蛋白質の水性溶媒は、蛋白質を溶解可能で、かつ脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液とエマルションを形成し、紡糸する段階で蒸発し、繊維を形成可能なものであれば特に限定されない。例えば、生理食塩水や各種緩衝液を使用することができる。さらには、蛋白質の安定剤や添加剤を加えてもよい。なかでもリン酸緩衝液、生理食塩水を用いることが好ましい。
本発明で用いられる蛋白質の水溶液における蛋白質の濃度は特に限定されず、蛋白質の特性に応じて適宜定められるが、例えば０．５〜５０重量％である。
脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質の水溶液からエマルションを調製する場合、両者の混合割合としては、安定なエマルションさえ形成しさえすれば特に限定されるものではないが、例えば（蛋白質の水溶液）／（脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液）（体積比）が１／１００〜１／２である。この値が１／２より大きいとエマルションが不安定となり好ましくない。
脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質の水溶液を混合し、エマルションを調製する方法としては、特に限定されないが、超音波や各種攪拌方法を用いることができる。攪拌方法としては、ホモジナイザーのような高速攪拌やアトライター、ボールミル等の攪拌方法も使用することができる。なかでも超音波処理による分散方法が好ましい。
また、有機溶媒と蛋白質の水溶液とでエマルションを形成した後、脂肪族ポリエステルを添加して紡糸液を調製することも可能である。
【００２０】
本発明において、脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質からなる懸濁液を紡糸液として使用する場合、蛋白質粒子のサイズは特に限定されるものではないが、０．０１〜１００μｍの範囲にあることが好ましい。０．０１μｍよりも小さい蛋白質粒子を作製することは技術的に困難であり、１００μｍよりも大きいと分散性が悪く、滅菌組成物が脆弱となり好ましくない。
脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質粒子を混合し、懸濁液を調製する方法としては、特に限定されないが、超音波や各種攪拌方法を用いることができる。攪拌方法としては、ホモジナイザーのような高速攪拌やアトライター、ボールミル等の攪拌方法も使用することができる。なかでも超音波処理による分散方法が好ましい。
また、有機溶媒と蛋白質粒子とで懸濁液を形成した後、脂肪族ポリエステルを添加して紡糸液を調製することも可能である。
また、懸濁液を調製する前に蛋白質粒子を微細処理することができる。微細処理としては、乾式粉砕と湿式粉砕とがあり、本発明においては、いずれの方式も採用することができ、両者を組み合わせることもできる。
【００２１】
乾式粉砕処理としては、例えばボールミルを用いた処理、遊星ミルや振動ミルを用いた処理、乳鉢を用い乳棒によりすり潰す処理、媒体攪拌型粉砕機、ジェットミル、石臼を用いてすりつぶす処理等が挙げられる。
一方、湿式粉砕処理としては、適当な分散媒に蛋白質粒子を分散させた状態で、高い剪断力の攪拌装置、混練装置等により攪拌する処理や、媒体中に分散した状態でのボールミル、ビーズミル処理等が挙げられる。さらには、スプレードライヤーにより作製した蛋白質粒子を使用することもできる。
【００２２】
本発明で用いる滅菌方法は、放射線滅菌である。用いられる放射線としては、例えばアルファ線、ベータ線、ガンマ線、中性子線、電子線、およびエックス線が挙げられる。なかでもガンマ線あるいは電子線が好ましく、最も好ましいのは電子線である。これらの滅菌方法は、特に限定されるものではないが、放射線の照射量としては１０〜８０ｋＧｙ、好ましくは２０〜３０ｋＧｙである。温度条件としては、特に限定されるものではないが−８０〜４０℃、好ましくは−８０〜３０℃である。
アルファ線、陽電子線、ガンマ線、中性子線、電子線、エックス線などの放射線は、物質に当たると物質を構成する分子・原子から電子をはぎ取る。この際に分子結合が切断され、反応性の高いラジカル等が生じ、周辺物質と２次的に化学反応する。
【００２３】
蛋白質は放射線照射により機能（活性）を失いやすいことがよく知られている。これは照射により分子結合が切れ、機能発現の根源である「高次構造」が壊されることによるものと考えられる。さらに、本願明細書の比較例に示されているように、蛋白質は放射線照射後の保存によっても構造破壊や失活が起こる。しかしながら、本発明における脂肪族ポリエステルに含有された蛋白質は放射線照射しても構造破壊や機能低下が抑制され、照射後の保存によるさらなる構造破壊や機能低下も抑制されている。これは本組成物中では、性蛋白質の高次構造が保持されていることを意味し、これは蛋白質の種類によらず共通の効果である。この効果は透過する脂肪族ポリエステルの厚みから考えて遮蔽によるものとは考えられず、抑制機構は定かではない。
【００２４】
本発明における放射線滅菌前の蛋白質を含有する脂肪族ポリエステルは、さらに電子・イオン捕捉剤、エネルギー移動剤、ラジカル捕捉剤、酸化防止剤、可塑剤を含んでもよい。電子・イオン捕捉剤としては、例えばＮ，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン、ジフェニレンジアミン、ピレン、キノン等が挙げられる。エネルギー移動剤としては、例えばアセナフテン等が挙げられる。ラジカル捕捉剤としては、例えばメルカプタン、オクタヒドロフェナントレン、モノアルキルジフェニルエーテル、トコフェロール、クエン酸、ブチル化ヒドロキシアンソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ｔ−ブチルヒドロキノン、没食子酸プロピル、アスコルビン酸誘導体等が挙げられる。酸化防止剤としては、ＢＨＴ、亜リン酸トリエステル、フェノール系老化防止剤、有機チオ酸塩類等が挙げられる。なかでも食品や医薬品に使用するのに安全であると一般に認められている添加剤が好ましい。添加剤の量は特に限定されるものではないが、例えば滅菌組成物における脂肪族ポリエステルに対して０．０１〜１０重量％の添加剤を含むことができる。
滅菌工程における蛋白質を含有する脂肪族ポリエステルは、水分を含んでいないことが好ましい。水分率は１０重量％以下が好ましく、より好ましくは４重量％以下、さらに好ましくは実質的に無水のものである。
【００２５】
また、蛋白質を含有する脂肪族ポリエステルは、包装材に包装して放射線滅菌してもよい。かかる包装材料としては、アルミニウムのようなガスバリア性の高い材料を使用することが好ましい。また、脱酸素剤や乾燥剤と共に密封包装しても、脱気後に不活性ガスを充填した状態で包装しても、これら両方を行ってもよい。かかる脱酸素剤および乾燥剤は、人体に害がなく、放射線照射時に失活しないものが好ましい。
本発明の滅菌組成物は、例えば蛋白質の機能および滅菌性が求められる医療用材料として使用できる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例により本発明の実施の形態を説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００２７】
１．トロンビン活性測定
ファルコン社製２００８チューブに試料２０μＬと５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．５）＋５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファー６０μＬ、０．１％  ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８を２０μＬ加え、３７℃で３分インキュベーションした。標準品としてヒトプラズマ由来精製α―トロンビン（ヘマトロジックテクノロジー社から購入：ＨＣＴ−００２０）を同バッファーで５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５Ｕ／ｍＬに希釈したものを用いた。その反応液にテストチーム発色基質Ｓ−２２３８（１ｍＭ：第一化学薬品工業）を１００μＬ添加して攪拌混合し、３７℃で５分間の反応後、０．１Ｍクエン酸溶液を８００μＬ加えて反応を停止した。反応液２００μＬを９６ウェルプレートに移し、ＯＤ４０５／６５０を測定した。
なお、実施例５〜７及び比較例４以外においては以下の方法で測定した。BD社製ポリスチレンチューブに試料２０μＬと活性測定用希釈溶液（０．０１％  Ｆ−６８、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４）８０μＬ加え、３７℃で３分インキュベーションした。標準品として組換トロンビン（ＪＰＵ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ４００Ｕ／ｍＬまたはＷＨＯ／ＵＳ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、１１０ＩＵ／ｍＬ）を同バッファーでＪＰＵの場合、４、２、１、０．５、０．２５Ｕ／ｍＬ、ＩＵの場合、６、３、１．５、０．７５、０．３７５ＩＵ／ｍＬに希釈したものを用いた。その反応液にテストチーム発色基質Ｓ−２２３８（１ｍＭ：第一化学薬品工業）を１００μＬ添加して攪拌混合し、３７℃で７分間の反応後、０．１Ｍクエン酸溶液を８００μＬ加えて反応を停止した。反応液２００μＬを９６ウェルプレートに移し、ＯＤ４０５／６５０を測定した。
【００２８】
２．フィブリノゲン凝集体量測定
シートをΦ１ｃｍに切り出した後、希釈液によりフィブリノゲンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーでその凝集体量を測定した。
【００２９】
＜試験条件＞
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２８０ｍ）
カラム：Ｂｉｏ  Ｓｅｐ−ＳＥＣ−ｓ４０００（７．８×３００ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）
カラム温度：２５℃
サンプラー温度：６℃
移動相：０．５ｍｏｌ／Ｌ  Ａｒｇ−ＨＣｌ／５０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸バッファー
流量：１ｍＬ／ｍｉｎ
分析時間：２０ｍｉｎ
【００３０】
３．厚さ
成形体を高精度デジタル測長機（株式会社ミツトヨ：商品名「ライトマチックＶＬ−５０」）を用いて測定力０．０１Ｎによりｎ＝１５にて成形体の膜厚を測定した平均値を算出し成形体の厚さとした。なお、本測定においては測定機器が使用可能な最小の測定力で測定を行った。
【００３１】
４．目付
成形体を、５０ｍｍ×１００ｍｍにカットしその重量を測定し換算することで成形体の目付を算出した。
【００３２】
５．嵩密度
上記測定した厚さと目付の値から成形体の嵩密度を算出した。
【００３３】
６．トロンビンＥＬＩＳＡ測定
ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ  ４６８６６７）に抗ヒトトロンビン抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、Ｎｏ．ＳＡＨＴ−ＡＰ）を５μｇ／ｍＬで固定化した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル  ＵＫ−Ｂ８０）を各ウェルに添加し、マスキングを行った。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、検体を添加した。標準品としてヒトトロンビン（ヘマトロジックテクノロジー社：ＨＣＴ−００２０）を用い、検量線を作成した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒトトロンビン抗体（（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、Ｎｏ．ＳＡＨＴ−ＨＲＰ）を０．１μｇ／ｍＬで添加した。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、ＴＭＢ試薬（ＤａＫｏ  Ｓ１５９９）を添加し、１０分間静置して発色させた。１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加え、発色を停止し、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０−６５０ｎｍを測定した。
【００３４】
（１）抽出率測定
成形体を２ｃｍ×２ｃｍに切り出し、１ｍＬの生理食塩水に３分間若しくは３時間浸漬して、固定化した酵素を溶出させた。ｎ＝３にて前後の重量変化を測定し、以下の式により算出した抽出率の平均値を求めた。固定化酵素理論重量は、組成物の重量、仕込み酵素粉末重量％から算出した。
抽出割合＝重量減少（ｍｇ）／固定化酵素理論重量（ｍｇ）
【００３５】
（２）酵素活性測定
リパーゼの活性測定にはＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｌｉｐａｓｅ  Ｔｅｓｔキット（ＰＲＯＧＥＮ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＫ  ＧＭＢＨ製）を使用した。以下の式により活性回収率を算出した。活性酵素量は、活性値から濃度換算して算出した。単位面積当たり固定化酵素理論重量は、仕込み酵素粉末重量％と組成物の目付けから算出した。
活性回収率（％）＝｛活性酵素量（ｍｇ／ｃｍ２）／（単位面積当たり固定化酵素理論重量（ｍｇ／ｃｍ２）×抽出割合）｝×１００
β‐グルコシダーゼの活性測定にはＴｏｋｙｏｇｒｅｅｎ（登録商標、以下同じ。）−βＧｌｕ（積水メディカル株式会社）を用いた蛍光測定により行った。以下の式により活性回収率を算出した。固定化酵素理論重量は、仕込み酵素粉末重量％と組成物の重量から算出した。
活性回収率（％）＝｛活性酵素量（ｍｇ）／（固定化酵素理論重量（ｍｇ）×抽出割合）｝×１００
以下の式により活性保持率を算出した。
活性保持率（％）＝｛滅菌後の活性回収率（％）／滅菌前の活性回収率（％）｝×１００
【００３６】
実施例１
エタノールにトロンビン含有粒子（リコンビナントトロンビン１ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトール含有ｐＨ７の水溶液を凍結乾燥したもの）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０重量％になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＤＬＧ５０１０、Ｐｕｒａｃ社製）を溶解し、トロンビン含有粒子／ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体＝１００（トロンビンとして１．６９）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られた繊維成形体の厚さは１３１μｍ、目付けは１．４４ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度１１１ｍｇ／ｃｍ３であった。得られたシートを直径１ｃｍに切り出し、２００μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性測定を実施した。その結果、活性測定値は２６．７Ｕ／ｃｍ２であった。得られたシートは、２０ｋＧｙの電子線を照射し滅菌後、４０℃／７５％ＲＨで保存し、１ヶ月後のトロンビン活性を測定した。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を１００％とした時、７９％の保持率であった。１ヵ月後の活性保持率は７８％であり、保存中のトロンビン活性の低下は見られなかった。
【００３７】
実施例２
エタノールにトロンビン含有粒子（リコンビナントトロンビン１ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトール含有ｐＨ７の水溶液を凍結乾燥したもの）とキニザリングリーンＳＳ（東京化成）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０重量％になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＤＬＧ５０１０、Ｐｕｒａｃ社製）を溶解し、トロンビン含有粒子／ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体＝１００（トロンビンとして１．６９）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られた繊維成形体（平均厚み：１２９μｍ、目付：１．４９ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度：１２４ｍｇ／ｃｍ３）を含むシートを直径１ｃｍに切り出し、２００μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してトロンビン活性測定を実施した。その結果、活性測定値は４０．２ＩＵ／ｃｍ２であった。得られたシートは、３０ｋＧｙの電子線を照射し滅菌後、４０℃／７５％ＲＨで保存し、１ヶ月後のトロンビン活性を測定した。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を１００％とした時、７０％の保持率であった。１ヵ月後の活性保持率は７４％であり、保存中のトロンビン活性の低下は見られなかった。
【００３８】
実施例３
エタノールにトロンビン含有粒子（リコンビナントトロンビン１ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトールを含有するｐＨ７の水溶液を凍結乾燥したもの）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０重量％になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＤＬＧ５０１０、Ｐｕｒａｃ社製）を溶解し、トロンビン含有粒子／ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体＝１００（トロンビンとして１．６９）／１００（ｗ／ｗ）のドープ液を調製した。得られたドープ液を用い、流延法によりフィルムを作製した。塗工間隔は１２７μｍで、塗工速度は３０．１ｍｍ／ｓｅｃであった。得られたシートの厚さは５８μｍ、目付２．９ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度５０４ｍｇ／ｃｍ３であった。得られたシートを直径１ｃｍに切り出し、２００μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出してトロンビン活性測定を実施した。その結果、活性測定値は７１．１ＩＵ／ｃｍ２であった。得られたシートは、３０ｋＧｙの電子線を照射し滅菌後、４０℃／７５％ＲＨで保存し、１ヶ月後のトロンビン活性を測定した。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を１００％とした時、７５．７％の保持率であった。１ヵ月後の活性保持率は８２％であり、保存中のトロンビン活性の低下は見られなかった。
【００３９】
実施例４
エタノールにフィブリノゲン含有粒子（リコンビナントフィブリノゲン１０ｍｇ／ｍＬ、アルギニン、塩化ナトリウム及びマンニトールを含有するｐＨ８．５の水溶液を凍結乾燥したもの）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０重量％になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体（Ｐｕｒａｓｏｒｂ  ＰＤＬＧ５０１０、Ｐｕｒａｃ社製）を溶解し、フィブリノゲン含有粒子／ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体＝１００（フィブリノゲンとして５０．８５）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られた繊維成形体の厚さは１３１μｍ、目付けは１．４４ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度１１０ｍｇ／ｃｍ３であった。得られたシートを直径１ｃｍに切り出し、希釈液にてフィブリノゲンを抽出して高速クロマトグラフィーにより凝集体量を測定した。その結果、凝集体量は９．７９％であった。得られたシートは、３０ｋＧｙの電子線を照射し滅菌後、４０℃／７５％ＲＨで保存し、１ヶ月後の凝集体量を測定した。電子線照射直後の凝集体量は、１８．８１％であった。１ヵ月後は２４．１４％であった。
【００４０】
比較例１  トロンビン含有粒子（リコンビナントトロンビン１ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトールを含有するｐＨ７の水溶液を凍結乾燥したもの）に３０ｋＧｙの電子線を照射し滅菌後、４０℃／７５％ＲＨで保存し、１ヶ月後のトロンビン活性を測定した。照射前のトロンビン活性は、４０４．７３Ｕ／バイアルであった。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を１００％とした時、５１．８％の保持率であった。１ヵ月後の活性保持率は１７．９％であり、保存中のトロンビン活性の低下が見られた。
【００４１】
比較例２
２−プロパノールにトロンビン含有粒子（リコンビナントトロンビン１ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトールを含有するｐＨ７の水溶液を凍結乾燥したもの）を分散させた後、１３重量％になるようにヒドロキシプロピルセルロース（２．０−２．９ｍＰａ・ｓ  日本曹逹製）を溶解し、トロンビン含有粒子／ヒドロキシプロピルセルロース＝１００／１００（ｗ／ｗ）のドープ液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られた繊維成形体の厚さは２０４μｍ、目付けは２．０８ｍｇ／ｃｍ２、嵩密度１０１ｍｇ／ｃｍ３であった。得られたシートを直径１ｃｍに切り出し、２００μＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性測定を実施した。その結果、活性測定値は１１０．３ＩＵ／ｃｍ２であった。得られたシートは、３０ｋＧｙの電子線を照射し滅菌後、４０℃／７５％ＲＨで保存し、１ヶ月後のトロンビン活性を測定した。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を１００％とした時、６８．４％の保持率であった。１ヵ月後の活性保持率は５４．９％であり、保存中のトロンビン活性の低下が見られた。
【００４２】
比較例３
フィブリノゲン含有粒子（リコンビナントフィブリノゲン１０ｍｇ／ｍＬ、アルギニン、塩化ナトリウム及びマンニトールを含有するｐＨ８．５の水溶液を凍結乾燥したもの）に３０ｋＧｙの電子線を照射し滅菌後、４０℃／７５％ＲＨで保存し、１ヶ月後のフィブリノゲンの凝集体量を測定した。照射前の凝集体量は、６．９７％であった。電子線照射直後の凝集体量は、１８．５１％であった。１ヵ月後は５４．７２％であった。
実施例１〜３、比較例１〜２の結果（滅菌後及び滅菌後保存後の、滅菌前に対するトロンビン（Ｔｈ）活性保持率）を図１に示す。
蛋白質を脂肪族ポリエステルに含有させることにより、蛋白含有粒子のみの場合（比較例１）に対し、放射線滅菌による蛋白質の構造変化や機能低下が抑制され、さらには放射線滅菌後の保存に伴うこれら変化や低下が、脂肪族ポリエステルでなくセルロース類（ヒドロキシプロピルセルロース）である場合（比較例２）に対し、それぞれ抑制されていることがわかる。
実施例４および比較例３の結果（滅菌後及び滅菌後保存後の、フィブリノゲンの凝集体量）を図２に示す。
蛋白質を脂肪族ポリエステルに含有（実施例４）させることにより、蛋白含有粒子のみの場合（比較例３）に対し、放射線滅菌後の保存に伴う蛋白質の構造変化が抑制されていることがわかる。
【００４３】
実施例５
エタノールにトロンビン含有粒子（ボルヒール（登録商標、以下同じ）組織接着用：バイアル３）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０ｗｔ％になるようにポリ乳酸（ＰＬ１８  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、トロンビン含有粒子／ポリ乳酸＝４０（トロンビンとして０．４５）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られたシートを２０ｋＧｙで電子線滅菌した。得られたシートを２ｃｍ×２ｃｍに切断し、１ｍＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性およびＥＬＩＳＡ測定を実施した。その結果、活性測定値は５．０Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は３．４μｇ／ｃｍ２であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性およびＥＬＩＳＡ測定を実施した結果、活性測定値は７．５Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は４．３５μｇ／ｃｍ２であった。すなわち、未滅菌シートに対しての滅菌シートの活性保持率は７３％であった。
【００４４】
実施例６
エタノールにトロンビン含有粒子（ボルヒール組織接着用：バイアル３）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０ｗｔ％になるようにポリ乳酸（ＰＬ１８  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、トロンビン含有粒子／ポリ乳酸＝７０（トロンビンとして０．７８）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られたシートを２０ｋＧｙで電子線滅菌した。得られたシートを２ｃｍ×２ｃｍに切断し、１ｍＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性およびＥＬＩＳＡ測定を実施した。その結果、活性測定値は９．５７５Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は、７．０μｇ／ｃｍ２であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性およびＥＬＩＳＡ測定を実施した結果、活性測定値は１１．１５Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は７．２μｇ／ｃｍ２であった。すなわち、未滅菌シートに対しての滅菌シートの活性保持率は８６％であった。
【００４５】
実施例７
エタノールにトロンビン凍結乾燥粉末（ボルヒール組織接着用：バイアル３）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０ｗｔ％になるようにポリ乳酸（ＰＬ１８  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、トロンビン凍結乾燥粉末／ポリ乳酸＝１００（トロンビンとして１．１）／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２２℃、湿度２６％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、紡糸液流量は３．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。得られたシートを２０ｋＧｙで電子線滅菌した。得られたシートを２ｃｍ×２ｃｍに切断して、１ｍＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性およびＥＬＩＳＡ測定を実施した。その結果、活性測定値は１５Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は１１μｇ／ｃｍ２であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性およびＥＬＩＳＡ測定を実施した結果、活性測定値は２３Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は１６μｇ／ｃｍ２であった。すなわち、未滅菌シートに対しての滅菌シートの活性保持率は６４％であった。
【００４６】
比較例４
トロンビン含有粒子（ボルヒール）を２０ｋＧｙで電子線滅菌した。１ｍＬの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性およびＥＬＩＳＡ測定を実施した。その結果、活性測定値は２２．５Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は１１．５μｇ／ｃｍ２であった。一方で、滅菌処理していないトロンビン含有粒子についても同様に活性およびＥＬＩＳＡ測定を実施した結果、活性測定値は６８．５Ｕ／ｃｍ２、ＥＬＩＳＡ測定値は４１．５μｇ／ｃｍ２であった。すなわち、未滅菌シートに対しての滅菌シートの活性保持率は３２％であった。
【００４７】
実施例８
エタノールにリパーゼ粉末（ブタ膵臓由来、和光純薬製、以下同じ）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０ｗｔ％になるようにポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＤＬＧ５０１０  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、リパーゼ粉末／ポリ乳酸−グリコール酸共重合体＝５０／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２７℃、湿度２５％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．９ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、紡糸液流量は４．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。得られたシートのリパーゼ抽出率は７９％であった。得られたシートを２０ｋＧｙで電子線滅菌した。得られた滅菌シートを１ｃｍ×１ｃｍに切断し、キットに含まれるＬｉｐａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  １ｍＬでリパーゼを抽出して活性測定を実施した。その結果、活性回収率は１００％であった。
【００４８】
実施例９
リパーゼ粉末にジクロロメタンを加え、１０ｗｔ％になるようにポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＤＬＧ５０１０  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、リパーゼ粉末／ポリ乳酸＝５０／１００（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２６℃、湿度２５％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、紡糸液流量は４．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。得られたシートのリパーゼ抽出率は６３％であった。得られたシートを２０ｋＧｙで電子線滅菌した。得られた滅菌シートを１ｃｍ×１ｃｍに切断し、キットに含まれるＬｉｐａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  １ｍＬでリパーゼを抽出して活性測定を実施した。その結果、活性回収率は９２％であった。
【００４９】
実施例１０
エタノールにβ‐グルコシダーゼ粉末（アーモンド由来、オリエンタル酵母工業製、以下同じ）を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０ｗｔ％になるようにポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＤＬＧ５０１０  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、β‐グルコシダーゼ粉末／ポリ乳酸−グリコール酸共重合体＝３８／６２（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２７℃、湿度２５％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．９ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、紡糸液流量は４．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。得られたシートを２ｃｍ×２ｃｍに切断後、２０ｋＧｙで電子線滅菌した。生理食塩水１ｍＬでβ‐グルコシダーゼを抽出してＴｏｋｙｏｇｒｅｅｎ−βＧｌｕで活性測定を実施した。その結果、活性回収率は９２％であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性測定を実施した結果、活性回収率は９４％であった。以上のことから、未滅菌繊維成形体に対しての滅菌繊維成形体の活性保持率は９８％であり、電子線滅菌により失活していないことがわかった。
【００５０】
実施例１１
エタノールにβ‐グルコシダーゼ粉末を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１０ｗｔ％になるようにポリ乳酸−カプロラクトン共重合体（ＰＬＣＡ８８１２ 多木化学製）を溶解し、β‐グルコシダーゼ粉末／ポリ乳酸−カプロラクトン共重合体＝３８／６２（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２７℃、湿度２５％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．９ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、紡糸液流量は３．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。得られたシートを２ｃｍ×２ｃｍに切断後、２０ｋＧｙで電子線滅菌した。生理食塩水１ｍＬでβ‐グルコシダーゼを抽出してＴｏｋｙｏｇｒｅｅｎ−βＧｌｕで活性測定を実施した。その結果、活性回収率は８１％であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性測定を実施した結果、活性回収率は８０％であった。以上のことから、未滅菌繊維成形体に対しての滅菌繊維成形体の活性保持率は１０１％であり、電子線滅菌により失活していないことがわかった。
【００５１】
実施例１２
エタノールにβ‐グルコシダーゼ粉末を分散させた後、ジクロロメタンを加え、１１ｗｔ％になるようにポリ乳酸（ＰＬ１８  Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ製）を溶解し、β‐グルコシダーゼ粉末／ポリ乳酸＝３８／６２（ｗ／ｗ）の紡糸液を調製した。温度２７℃、湿度２５％以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は０．９ｍｍ、電圧は１５ｋＶ、紡糸液流量は３．０ｍＬ／ｈ、噴出ノズルから平板までの距離は２５ｃｍであった。得られたシートを２ｃｍ×２ｃｍに切断後、２０ｋＧｙで電子線滅菌した。生理食塩水１ｍＬでβ‐グルコシダーゼを抽出してＴｏｋｙｏｇｒｅｅｎ−βＧｌｕで活性測定を実施した。その結果、活性回収率は６２％であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性測定を実施した結果、活性回収率は７１％であった。以上のことから、未滅菌繊維成形体に対しての滅菌繊維成形体の活性保持率は８７％であり、電子線滅菌により失活していないことがわかった。
【００５２】
比較例５
リパーゼ粉末を２０ｋＧｙで電子線滅菌した。粉末１ｍｇに１ｍＬのＬｉｐａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒを添加して活性測定を実施した。その結果、活性回収率は７４％であった。      
【００５３】
比較例６
β‐グルコシダーゼ粉末を２０ｋＧｙで電子線滅菌した。粉末２ｍｇを１ｍＬの生理食塩水に溶解させ、Ｔｏｋｙｏｇｒｅｅｎ−βＧｌｕで活性測定を実施した。その結果、活性保持率は８１％であった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の滅菌組成物は、例えば蛋白質の機能および滅菌性が求められる医療品の製造業で利用される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質の少なくとも一部分が脂肪族ポリエステル内部に入り込んでいる状態で、蛋白質および脂肪族ポリエステルを含む、放射線滅菌された滅菌組成物（但し、１８０μｍのふるいを通過する微粒子の形態にあるものを除く）。
【請求項２】
蛋白質がそのまままたは薬学的に許容しうる添加物との混合物として脂肪族ポリエステル中に粒子として分散している請求項１記載の滅菌組成物。
【請求項３】
蛋白質が止血性蛋白質、酵素、輸送蛋白質、筋肉蛋白質、防御蛋白質、毒素蛋白質、蛋白質ホルモン、貯蔵蛋白質、構造蛋白質、成長因子、およびそれらの混合物からなる群から選択される請求項１または２に記載の滅菌組成物。
【請求項４】
蛋白質が止血性蛋白質である請求項１または２に記載の滅菌組成物。
【請求項５】
脂肪族ポリエステルがポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、それらの共重合体、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される請求項１から４のいずれかに記載の滅菌組成物。
【請求項６】
繊維形状にある請求項１から５のいずれかに記載の滅菌組成物。
【請求項７】
エレクトロスピニング法で製造された請求項６に記載の滅菌組成物。
【請求項８】
フィルム形状にある請求項１から５のいずれかに記載の滅菌組成物。
【請求項９】
流延法で製造された請求項８に記載の滅菌組成物。 
【国際調査報告】
2013172468.tif 000005
2013172468.tif 000006
2013172468.tif 000007
2013172468.tif 000008