(57)【要約】樹状細胞を含む人工皮膚モデルを製造可能な新たな方法を提供する。細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成することを含み、前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が樹状細胞を含む、人工皮膚モデルの製造方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外マトリックス成分と積層された細胞とを含む真皮組織層と、
前記真皮組織層上に形成されたＩＶ型コラーゲンを含む基底層と、
前記基底層上に形成された表皮層とを有し、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚組織。
【請求項２】
細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、
前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び
前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成すること、を含み、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚組織の製造方法。
【請求項３】
前記真皮組織層の形成は、前記被覆細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された樹状細胞とを培養することを含む、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
前記表皮層の形成は、前記基底層上に、表皮細胞と樹状細胞とを配置することを含む、請求項２又は３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記基底層の形成は、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲン層とラミニン層とが交互に形成されるように、前記真皮組織層にＩＶ型コラーゲン又はラミニンを接触させることを含む、請求項２から４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記被覆細胞は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された線維芽細胞を含む、請求項２から５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
請求項２から６のいずれかに記載の製造方法により製造される人工皮膚組織。
【請求項８】
細胞外マトリックス成分と前記細胞外マトリックス成分を介して積層された細胞とを含む真皮組織層と、
前記真皮組織層上に形成されたＩＶ型コラーゲンを含む基底層と、
前記基底層上に形成された表皮層とを有し、
前記真皮組織層が、樹状細胞とリンパ管とを含む、人工皮膚組織。
【請求項９】
前記真皮組織層における樹状細胞と真皮組織層を形成する樹状細胞以外の細胞との比が１：９９〜５０：５０である、請求項８記載の人工皮膚組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、人工皮膚組織、人工皮膚モデル及びそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化粧品、医薬品及び医薬部外品等といったヒトに直接適用される物質の研究開発において、薬効試験、薬理試験及び安全性試験等といった物質の評価試験は重要である。これらの試験は、従来、マウスやラット等の動物を用いて行われているが、近年、動物愛護の観点から動物実験の見直しが求められている。このため、生体外で細胞の三次元組織を製造するために様々な方法が提案されている（例えば、特許文献１）。【０００３】
また、動物実験に代わる実験方法の１つとして、培養皮膚モデルを用いたin vitro試験等がある。そのため、様々な培養皮膚等の研究が行われている（例えば、特許文献2及び３等）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−１１５２５４号公報
【特許文献２】特許２７７３０５８号
【特許文献３】ＷＯ２００５／０８７２８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
皮膚免疫では、例えば、表皮層に位置するランゲルハンス細胞等の樹状細胞が中心的な役割を担うことが知られている。このため、皮膚における免疫応答を評価するには、評価に用いる人工皮膚モデルがランゲルハンス細胞等の樹状細胞を含むことが重要となる。しかしながら、例えば、特許文献２及び３の培養皮膚にはランゲルハンス細胞等の樹状細胞が含まれておらず、これらの培養皮膚では皮膚における免疫応答を十分に評価できるとはいえない。このため、樹状細胞を含む人工皮膚モデルが求められている。【０００６】
そこで、本発明は、樹状細胞を含む人工皮膚組織及び人工皮膚モデル、及びそれらを製造可能な新たな方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、一又は複数の実施形態として、細胞外マトリックス成分と積層された細胞とを含む真皮組織層と、
前記真皮組織層上に形成されたＩＶ型コラーゲンを含む基底層と、
前記基底層上に形成された表皮層とを有し、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚組織に関する。【０００８】
本開示は、一又は複数の実施形態として、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、
前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び
前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成すること、を含み、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚組織の製造方法に関する。【０００９】
本開示は、一又は複数の実施形態として、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成すること、を含み、前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚モデルの製造方法に関する。【００１０】
本開示は、一又は複数の実施形態として、細胞外マトリックス成分と積層された細胞とを含む真皮組織層と、前記真皮組織層上に形成されたＩＶ型コラーゲンを含む基底層と、前記基底層上に形成された表皮層とを有し、前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含み、本開示の製造方法により製造される人工皮膚モデルに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本開示によれば、例えば、樹状細胞を含む人工皮膚組織、及びそれを製造可能な新たな方法を提供できる。本開示によれば、例えば、樹状細胞を含む人工皮膚モデルを製造可能な新たな方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａ及びＢは、実施例１の人工皮膚モデルの共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）画像の一例である。
【図２】図２Ａ〜Ｄは、実施例２の人工皮膚モデルの共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）画像の一例である。
【図３】図３は、LPSの添加量と、真皮組織層からのIL-6の産生量との関係を示すグラフの一例である。
【図４】図４は、LPSの添加量と、真皮組織層からのIL-6の産生量との関係を示すグラフの一例である。
【図５】図５は、LPS添加30時間後の共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）画像の一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養して形成した真皮組織層と表皮層との間に、ＩＶ型コラーゲン（以下、「コラーゲンＩＶ」ともいう）を含む基底層を形成することによって、真皮組織層の積層構造の長期安定性が優れ、樹状細胞が導入された人工皮膚モデルを作製できるという知見に基く。
【００１４】
本明細書において「人工皮膚組織」とは、ヒトの皮膚の構造、特に表皮層と真皮組織層とを含む構造及びその環境を再現又は模倣したものをいう。本開示の人工皮膚組織は、一又は複数の実施形態において、細胞外マトリックス成分と積層された細胞とを含む真皮組織層と、真皮組織層上に形成されたコラーゲンＩＶを含む基底層と、基底層上に形成された表皮層とを有し、真皮組織層及び表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含むものをいう。本開示の人工皮膚組織は、一又は複数の実施形態において、好ましくは被検物質の皮膚に対する薬効試験、薬理試験及び安全性試験等といった薬剤評価のために利用可能な実験又は試験ツールや、皮膚移植用材料となりうるものを含みうる。
【００１５】
本明細書において「人工皮膚モデル」とは、ヒトの皮膚の構造、特に表皮層と真皮組織層とを含む構造及びその環境を再現又は模倣したものをいう。本開示の人工皮膚モデルは、一又は複数の実施形態において、細胞外マトリックス成分と積層された細胞とを含む真皮組織層と、真皮組織層上に形成されたコラーゲンＩＶを含む基底層と、基底層上に形成された表皮層とを有し、真皮組織層及び表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含むものをいう。また、人工皮膚モデルは、一又は複数の実施形態において、好ましくは被検物質の皮膚に対する薬効試験、薬理試験及び安全性試験等といった薬剤評価のために利用可能な実験又は試験ツールとなりうるものを含み、より好ましくは本開示の製造方法により製造された人工皮膚モデルを含む。なお、本明細書の以下の記載において、特に言及しない限りは、「人工皮膚組織」及び「人工皮膚モデル」をまとめて「人工皮膚モデル」という。
【００１６】
本明細書において「樹状細胞」としては、一又は複数の実施形態において、真皮樹状細胞、及びランゲルハンス細胞等が挙げられ、これらの前駆細胞をも含みうる。
【００１７】
本開示の人工皮膚モデルは、一又は複数の実施形態において、樹状細胞以外に、皮膚に含まれる組織付属器官及び又はそれを構成する細胞等を含んでいてもよい。組織付属器官としては、例えば、血管、リンパ管、脂腺、汗腺、毛、及び毛嚢等が挙げられる。組織付属器官を構成する細胞としては、例えば、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、樹状細胞以外の免疫細胞、メラニン細胞、毛胞細胞、毛乳頭細胞、皮脂腺細胞、及び脂肪細胞等が挙げられる。また、本開示の人工皮膚モデルは、一又は複数の実施形態において、上記以外のその他の細胞を含んでいてもよい。その他の細胞としては、例えば、癌細胞、癌周辺に存在する又は存在しうる細胞等が挙げられる。
【００１８】
本明細書において「被覆細胞」とは、細胞外マトリックス成分を含む被膜と細胞とを含み、その細胞表面が該被膜によって被覆されている細胞をいう。被覆される細胞としては、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態として、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、及び免疫細胞等の接着性細胞が挙げられる。細胞は、ヒト由来の細胞であってもよいし、ヒト以外の由来の細胞であってもよい。細胞は、一種類でもよいし、二種類以上を用いてもよい。被覆細胞は、一又は複数の実施形態において、特開２０１２−１１５２５４号公報に開示された方法により作製できる。
【００１９】
本明細書において「真皮組織層」とは、細胞と細胞外マトリックス成分との集合体で構成されるものであって、細胞が三次元に積層されたものをいい、好ましくは皮膚の真皮の形態及び又は環境に類似及び又は模したものをいう。真皮組織層は、上記の組織付属器官及び又はそれを構成する細胞を含んでいてもよい。
【００２０】
［人工皮膚モデルの製造方法］
本開示の人工皮膚モデルの製造方法は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成することを含む。
【００２１】
本開示の人工皮膚モデルの製造方法によれば、経皮電気抵抗（ＴＥＲ）を測定可能な、真皮組織層と表皮層とを含む人工皮膚モデルを製造することができる。このため、本発明の人工皮膚モデルによれば、例えば、in vivoにより近い状態で皮膚（表皮層）のバリア機能の評価を行うことができる。本発明の製造方法により製造される人工皮膚モデルがＴＥＲを測定できるメカニズムは定かではないが、以下のように推測される。すなわち、被覆細胞を培養することにより形成された真皮組織層上で、表皮細胞の分化誘導を行うことにより、表皮層における緻密性が向上し、隣接する表皮細胞同士が密着し、かつそれらの間にタイトジャンクションが形成されるものと考えられる。但し、本発明はこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
【００２２】
皮膚では、表皮層の細胞間に形成されたタイトジャンクションが物質の移動を制限する物理的バリアとして機能するとともに、ランゲルハンス細胞がセンサのような免疫学的バリアとして機能すること等によって、外部からの病原菌や刺激物等といった異物の侵入を制御する機能を果たしている。本開示の人工皮膚モデルの製造方法により製造される人工皮膚モデルは、一又は複数の実施形態において、表皮層の細胞間に対とジャンクションが形成され、かつ表皮層及び又は真皮組織層に樹状細胞を含むことから、実際の皮膚により近い状態で薬剤評価及び又は免疫応答評価が可能な人工皮膚モデルを提供できる。
【００２３】
［真皮組織層］
真皮組織層は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養することにより形成される。細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された被覆細胞を培養することにより、被覆細胞が集積され、さらには細胞外マトリックス成分を含む被膜を介して隣接する被覆細胞同士が接着することにより、被覆細胞が三次元に積層された真皮組織層を形成することができる。
【００２４】
被覆細胞は、細胞と、細胞を覆う細胞外マトリックス成分を含む被膜とを含む。本明細書において「細胞外マトリックス成分」とは、生体内で細胞の外の空間を充填し、骨格的役割、足場を提供する役割、及び又は生体因子を保持する役割等の機能を果たす生体内物質をいう。また、細胞外マトリックス成分は、さらに、in vitro細胞培養において骨格的役割、足場を提供する役割及び又は生体因子を保持する役割等の機能を果たしうる物質を含んでいてもよい。
【００２５】
細胞外マトリックス成分を含む被膜は、物質Ａを含む膜と、前記物質Ａと相互作用する物質Ｂを含む膜とを含むことが好ましい。物質Ａと物質Ｂとの組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子（以下、「ＲＧＤ配列を有する物質」ともいう）と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子（以下、「相互作用を有する物質」ともいう）との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子（以下、「正の電荷を有する物質」ともいう）と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子（以下、「負の電荷を有する物質」ともいう）との組み合わせである。
【００２６】
細胞外マトリックス成分を含む被膜の厚みは、一又は複数の実施形態において、１ｎｍ〜１×１０3ｎｍ、又は２ｎｍ〜１×１０2ｎｍが好ましく、被覆細胞がより密に積層された真皮組織層が得られるという理由から、３ｎｍ〜１×１０2ｎｍがより好ましい。細胞外マトリックス成分を含む被膜の厚みは、例えば、被膜を構成する膜の数によって適宜制御することができる。細胞外マトリックス成分を含む被膜は、特に制限されず、１層であってもよいし、例えば、３、５、７、９、１１、１３、１５層又はそれ以上の多層であってもよい。なお、被膜の厚みは、実施例に記載の方法により求めることができる。
【００２７】
被覆細胞の培養は、例えば、基材上に被覆細胞を播種し、一定時間インキュベーションすることにより行う。このインキュベーションにより、細胞外マトリックス成分を含む被膜を介して隣接する被覆細胞が互いに接着し、被覆細胞が三次元に積層されるとともに、隣接する被覆細胞同士の間隔が密になり、緻密な構造の真皮組織層が形成される。インキュベーションの条件は、特に制限されず、細胞に応じて適宜決定できる。インキュベーション温度は、一又は複数の実施形態において、４〜６０℃、２０〜４０℃、又は３０〜３７℃である。インキュベーション時間は、一又は複数の実施形態において、１時間〜１６８時間、３時間〜２４時間、又は３時間〜１２時間である。培地は、特に制限されず、細胞に応じて適宜決定でき、例えば、Eagle's MEM培地、Dulbecco's Modified Eagle培地(DMEM)、Modified Eagle培地(MEM)、Minimum Essential培地、RDMI、GlutaMax培地、又は無血清培地等が挙げられる。
【００２８】
播種時の被覆細胞の密度は、例えば、形成する真皮組織層に含まれる細胞層数等に応じて適宜決定でき、一又は複数の実施形態において、１×１０2個／ｃｍ3〜１×１０9個／ｃｍ3、１×１０4個／ｃｍ3〜１×１０8個／ｃｍ3、又は１×１０5個／ｃｍ3〜１×１０7個／ｃｍ3である。
【００２９】
被覆細胞の培養は、表皮細胞の分化誘導のための気液培養の準備や取扱が容易となるという理由から、メンブレンフィルタ上で行うことが好ましく、より好ましくはメンブレンフィルタを備える培養プレート、さらに好ましくはハウジング部と基底部とを備え、基底部がメンブレンフィルタである培養プレートを用いて行う。ハウジング部は、透明であることが好ましい。該培養プレートは、市販品を使用してもよい。市販品としては、例えば、トランスウェル（登録商標）、セルカルチャーインサート（商品名）等が挙げられる。
【００３０】
メンブレンフィルタの孔径は、培養した細胞がメンブレンフィルタ上に保持可能な範囲であれば特に制限されず、一又は複数の実施形態において、０．１μｍ〜２μｍ、また他派０．４μｍ〜１．０μｍである。また、メンブレンの材質は、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、又はポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）等が挙げられる。
【００３１】
このようにして形成された真皮組織層は、例えば、真皮組織層の形成後、例えば、２週間以上、好ましくは３週間以上、より好ましくは４週間以上、さらに好ましくは５週間以上、さらにより好ましくは６週間以上保存した場合であっても細胞の積層構造が保持でき、長期安定性に優れうる。真皮組織層の形成は、１回であってもよいし、複数回繰り返し行ってもよい。複数回繰り返し行うことにより、より多くの細胞が積層された多層の真皮組織層を形成することができる。
【００３２】
真皮組織層の厚み及び真皮組織層において積層される細胞の数（層数）は特に制限されない。真皮組織層において積層される細胞の数（層数）は、一又は複数の実施形態において、ヒト等の生体組織とより同等の性質及び又は機能を発揮させる観点から、３層以上、５層以上、６層以上、１０層以上、又は１５層以上が好ましい。積層される細胞数の上限は特に制限されないが、一又は複数の実施形態において、１００層以下、５０層以下、４０層以下、３０層以下、又は２０層以下である。
【００３３】
本開示の人工皮膚モデルの製造方法において、真皮組織層の形成は、一又は複数の実施形態において、被覆細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された樹状細胞とを培養することを含んでいてもよい。
【００３４】
［基底層］
基底層は、真皮組織層にコラーゲンＩＶを接触させることにより作製することができる。コラーゲンＩＶとの接触は、一又は複数の実施形態において、コラーゲンＩＶ含有液を基底層に塗布、浸漬、滴下、又は噴霧すること等により行うことができる。
【００３５】
コラーゲンＩＶ含有液は、コラーゲンＩＶを含んでいればよく、一又は複数の実施形態において、コラーゲンＩＶと溶媒又は分散媒体（以下、「溶媒」ともいう）とを含む。コラーゲンＩＶ含有液における、コラーゲンＩＶの含有量は、一又は複数の実施形態において、０．０００１〜１質量％、０．０１〜０．５質量％、又は０．０２〜０．１質量％が好ましい。溶媒としては、一又は複数の実施形態において、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び緩衝液等の水性溶媒が挙げられる。緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、又はＧＴＡ緩衝液等が挙げられる。溶媒のｐＨは、特に制限されず、一又は複数の実施形態において、３〜１１、６〜８、又は７．２〜７．４が好ましい。
【００３６】
基底層は、コラーゲンＩＶに加えて、一又は複数の実施形態において、ラミニンを含んでいてもよい。基底層がコラーゲンＩＶとラミニンとを含む場合、一又は複数の実施形態において、真皮組織層にコラーゲンＩＶとラミニンとを交互に接触されることが好ましい。
【００３７】
［表皮層］
表皮層は、基底層上で表皮細胞を培養した後、気液培養して表皮細胞を分化誘導させることによって形成することができる。表皮細胞としては、例えば、表皮角化細胞が使用できる。
【００３８】
表皮細胞の培養は、例えば、真皮組織層上に表皮細胞を播種し、一定時間インキュベーションすることが好ましい。表皮細胞は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された表皮細胞を用いてもよいし、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆されていない表皮細胞を用いてもよい。操作が簡便になる点から、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆されていない表皮細胞を用いることが好ましい。この場合、表皮細胞を真皮組織層上に接着させるため、特開２０１２−１１５２５４号公報に開示された方法により真皮組織層上を先に細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆することが好ましい。インキュベーションの条件は、特に制限されず、細胞に応じて適宜決定できる。インキュベーション温度は、一又は複数の実施形態において、４〜６０℃、２０〜４０℃、又は３０〜３７℃である。インキュベーション時間は、一又は複数の実施形態において、１日〜３日、又は１日〜２日である。
【００３９】
培地は、特に制限されず、細胞に応じて適宜決定でき、表皮細胞の増殖に用いられる培地が好ましい。表皮細胞の増殖に用いられる培地としては、例えば、無血清培地が挙げられる。無血清培地としては、例えば、MCDB153培地、EpiLife（登録商標）培地、これらの培地のアミノ酸組成等が改変された培地、又はDulbecco's Modified Eagle培地(DMEM)とハムF-12培地とを所定の割合で混合した培地等が挙げられる。MCDB153培地のアミノ酸組成が改変された培地としては、MCDB153培地のアミノ酸比率を、Ｌ−アスパラギン酸（塩）を１．５〜４倍、Ｌ−イソロイシン（塩）を２２〜２６倍、Ｌ−グルタミン（塩）を１．５〜３倍、Ｌ−グルタミン酸（塩）を１．１〜２倍、Ｌ−チロシン（塩）を３〜６倍、Ｌ−トリプトファン（塩）を５〜７倍、Ｌ−バリン（塩）を０．４〜０．７倍、Ｌ−ヒスチジン（塩）を２〜４倍、Ｌ−プロリン（塩）を０．４〜０．７倍、Ｌ−フェニルアラニン（塩）を４〜７倍、Ｌ−メチオニン（塩）を４〜６倍、Ｌ−リジン（塩）１．１〜２倍になるようにし、総アミノ酸中のＬ−グルタミン（塩）の含有量を６５重量％以上にしたMCDB153改変培地等がある（例えば、特開2005-269923号公報）。なお、MCDB153培地のアミノ酸組成は表１の通りである。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
培地は、例えば、塩類、又はビタミン類等を含んでいてもよい。塩類としては、例えば、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、リン酸一水素二ナトリウム等が挙げられる。ビタミン類としては、例えば塩化コリン、シアノコバラミン、ニコチン酸アミド、Ｄ−パントテン酸又はその塩、塩酸ピリドキシン又は塩酸ピリドキサール、Ｄ−ビオチン、塩酸チアミン、リボフラビン、葉酸、ＤＬ−α−リポ酸、又はミオ−イノシトール等が挙げられる。
【００４２】
播種時の表皮細胞の密度は、一又は複数の実施形態において、１×１０2個／ｃｍ2〜１×１０9個／ｃｍ2、１×１０4個／ｃｍ2〜１×１０8個／ｃｍ2、又は１×１０5個／ｃｍ2〜１×１０7個／ｃｍ2である。
【００４３】
気液培養は、培地を角化培地に培地交換した後、表皮細胞の表面を空気に曝した状態でインキュベーションすることによって行う。インキュベーション温度は、例えば、４〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは３０〜３７℃である。インキュベーション時間は、例えば、１日〜４０日、好ましくは５日〜３０日、より好ましくは７日〜１０日である。角化培地（重層化培地）は、上記表皮細胞の増殖に用いた培地に、例えば、カルシウム、及び又はウシ胎仔血清を添加した培地等が使用できる。培地のカルシウム濃度は、例えば、約０．４ｍＭ〜２．０ｍＭとすることが好ましい。
【００４４】
［樹状細胞］
本開示の人工皮膚モデルの製造方法において、真皮組織層及び/又は表皮層は樹状細胞を含む。樹状細胞は、一又は複数の実施形態において、真皮組織層の形成において、真皮組織層を構成するための被覆細胞（例えば、線維芽細胞等）と混合させて培養したり、あるいは、真皮組織層を構成するための被覆細胞が積層された細胞層間に配置して培養してもよい。また、表皮層の形成において、表皮細胞と混合されて培養してもよいし、表皮細胞が積層された細胞層間に配置して培養してもよい。樹状細胞は、一又は複数の実施形態において、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆されていてもよい。
【００４５】
播種時の樹状細胞の密度は、例えば、真皮組織層及び／又は表皮層に含まれる細胞層数等に応じて適宜決定できる。真皮組織層に樹状細胞を配置する場合、樹状細胞の密度は、一又は複数の実施形態において、３個／ｃｍ2〜２０００００個／ｃｍ2、２００００個／ｃｍ2〜１０００００個／ｃｍ2、又は４００００個／ｃｍ2〜８００００個／ｃｍ2である。真皮組織層を構成するための被覆細胞と混合して配置する場合、樹状細胞と被覆細胞との比率（樹状細胞：被覆細胞）は、一又は複数の実施形態において、１：９９〜９９：１、１０：９０〜９０：１０、又は１０：９０〜５０：５０である。樹状細胞を、真皮組織層を構成するための被覆細胞と混合して配置する場合、その培養条件は真皮組織層の形成と同様の条件で行うことができる。表皮層に樹状細胞を配置する場合、樹状細胞の密度は、一又は複数の実施形態において、３個／ｃｍ2〜２０００００個／ｃｍ2、２００００個／ｃｍ2〜１０００００個／ｃｍ2、又は４００００個／ｃｍ2〜８００００個／ｃｍ2である。である。表皮細胞と混合して配置する場合、樹状細胞と表皮細胞との比率（樹状細胞：表皮細胞）は、一又は複数の実施形態において、１：９９〜９９：１、１０：９０〜９０：１０、又は１０：９０〜５０：５０である。
【００４６】
本開示の人工皮膚モデルの製造方法は、一又は複数の実施形態において、真皮組織層内に組織付属器官を形成することを含んでいてもよい。組織付属器官の形成は、例えば、真皮組織層の形成において、組織付属器官を構成する細胞を、真皮組織層を構成するための被覆細胞（例えば、線維芽細胞等）と混合させて培養すること、あるいは、組織付属器官を構成する細胞を、真皮組織層を構成するための被覆細胞が積層された細胞層間に配置して培養すること等により行うことができる。細胞層間への組織付属器官を構成する細胞の配置は、例えば、被覆細胞が積層された細胞層上に組織付属器官を構成する細胞を配置し、必要に応じて所定の期間培養した後、その上に被覆細胞を配置すること等により行うことができる。このため、本開示の人工皮膚モデルの製造方法は、真皮組織層の形成において、被覆細胞を培養して被覆細胞が積層された細胞層を形成すること、細胞層上に組織付属器官を構成する細胞を配置すること、及び組織付属器官を構成する細胞が配置された細胞層上に被覆細胞を配置し、培養して被覆細胞が積層された細胞層を形成することを含んでいてもよい。
【００４７】
組織付属器官として血管及びリンパ管といった網の目のように組織内に形成される器官を形成する場合、組織付属器官の形成は、組織付属器官を構成する細胞を被覆細胞が積層された細胞層で挟んだ状態で培養することにより行うことが好ましい。このように、細胞層間に挟まれた状態で組織付属器官を構成する細胞を培養することにより、ヒトの生体内により近い緻密な血管網又はリンパ管網が形成されうる。組織付属器官として血管を形成する場合、組織付属器官を構成する細胞は血管内皮細胞を使用すればよく、組織付属器官としてリンパ管を形成する場合は、組織付属器官を構成する細胞はリンパ管内皮細胞を使用すればよい。
【００４８】
組織付属器官を構成する細胞は、上記のとおりである。また、組織付属器官を構成する細胞に加えて又は替えて、組織付属器官を構成する細胞の幹細胞及び又は前駆細胞を使用してもよい。組織付属器官を構成する細胞は、真皮組織層の形成に用いる被覆細胞と同様に、細胞表面に細胞外マトリックス成分を含む被膜を形成したものを使用してもよいし、表皮層の形成と同様に、被膜を形成することなくそのまま使用してもよい。作業効率の向上の観点からは、細胞表面に細胞外マトリックス成分を含む被膜が形成された細胞が好ましい。播種する細胞の数、及び培養条件等は、組織付属器官を構成する細胞等に応じて適宜決定できる。細胞外マトリックス成分を含む被膜の形成は、上記の被覆細胞と同様に行うことができる。
【００４９】
本開示の人工皮膚モデルの製造方法は、被覆細胞を作製することを含んでいてもよい。被覆細胞は、細胞を、細胞外マトリックス成分に接触させることにより調製でき、真皮組織層において隣接する被覆細胞間の接着性が向上され、被覆細胞がより密に積層された真皮組織層が得られるという理由から、一又は複数の実施形態において、物質Ａと物質Ｂとに交互に接触させて調製することが好ましい。物質Ａと物質Ｂとの組み合わせとしては、上記の通り、ＲＧＤ配列を有する物質ともいう、相互作用を有する物質との組み合わせ、又は、正の電荷を有する物質と負の電荷を有する物質との組み合わせが挙げられる。
【００５０】
（ＲＧＤ配列を有する物質）
ＲＧＤ配列を有する物質とは、細胞接着活性を担うアミノ酸配列である「Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ」（ＲＧＤ）配列をするタンパク質又は高分子をいう。本明細書において「ＲＧＤ配列を有する」とは、元来ＲＧＤ配列を有するものでもよいし、ＲＧＤ配列が化学的に結合されたものでもよい。ＲＧＤ配列を有する物質は、生分解性であることが好ましい。
【００５１】
ＲＧＤ配列を有するタンパク質としては、例えば、従来公知の接着性タンパク質、又はＲＧＤ配列を有する水溶性タンパク質等が挙げられる。接着性タンパク質としては、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、又はコラーゲン等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する水溶性タンパク質としては、例えば、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、グロブリン、プロテオグリカン、酵素、又は抗体等が挙げられる。
【００５２】
ＲＧＤ配列を有する高分子としては、例えば、天然由来高分子、又は合成高分子が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、α−ポリリジン又はε−ポリリジン等のポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のＲＧＤ配列を有するポリマー又は共重合体が挙げられる。ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ポリアクリル酸）、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε−カプロラクタム、ポリアクリルアミド、又はポリ（メタクリル酸メチル−γ−ポリメタクリル酸オキシエチレン）等が挙げられる。
【００５３】
ＲＧＤ配列を有する物質は、これらの中でも、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、ポリリジン、エラスチン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ＲＧＤ配列を結合させたゼラチン、キチン、又はキトサンが好ましく、より好ましくはフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、又はＲＧＤ配列を結合させたゼラチンである。
【００５４】
（相互作用する物質）
相互作用する物質とは、ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用するタンパク質若しくは高分子をいう。本明細書において「相互作用する」とは、例えば、静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、電荷移動相互作用、共有結合形成、タンパク質間の特異的相互作用、及び又はファンデルワールス力等により、化学的及び又は物理的にＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する物質とが結合、接着、吸着又は電子の授受が可能な程度に近接することを意味する。相互作用する物質は、生分解性であることが好ましい。
【００５５】
ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用するタンパク質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、インテグリン、酵素、又は抗体等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する高分子としては、例えば、天然由来高分子、又は合成高分子が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、エラスチン、ヘパリン、ヘパラン硫酸又はデキストラン硫酸等の糖、及びヒアルロン酸等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、例えば、α−ポリリジン又はε−ポリリジン等のポリリジン、ポリグルタミン酸、又はポリアスパラギン酸等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のＲＧＤ配列を有するポリマー又は共重合体が挙げられる。ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチレングリコール−グラフト−ポリアクリル酸、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ポリアクリル酸）、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε−カプロラクタム、ポリアクリルアミド、ポリ（メタクリル酸メチル−γ−ポリメタクリル酸オキシエチレン）等が挙げられる。
【００５６】
相互作用する物質は、これらの中でも、ゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、グロブリン、アルブミン、ポリグルタミン酸、コラーゲン、又はエラスチンが好ましく、より好ましくはゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、又はコラーゲン、さらに好ましくはゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、又はヒアルロン酸である。
【００５７】
ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する物質との組み合わせは、特に制限されず、相互作用する異なる物質の組み合わせであればよく、いずれか一方がＲＧＤ配列を含む高分子又はタンパク質であり、他方がこれと相互作用する高分子またはタンパク質であればよい。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用を有する物質との組み合わせとしては、例えば、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、フィブロネクチンとコラーゲン、ラミニンとゼラチン、ラミニンとコラーゲン、ポリリジンとエラスチン、ビトロネクチンとコラーゲン、ＲＧＤ結合コラーゲン又はＲＧＤ結合ゼラチンとコラーゲン又はゼラチン等が挙げられる。中でも、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、又はラミニンとゼラチンが好ましく、より好ましくはフィブロネクチンとゼラチンである。なお、ＲＧＤ配列を有する物質及び相互作用を有する物質は、それぞれ一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。
【００５８】
（正の電荷を有する物質）
正の電荷を有する物質とは、正の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。正の電荷を有するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、例えば、塩基性コラーゲン、塩基性ゼラチン、リゾチーム、シトクロムｃ、ペルオキシダーゼ、又はミオグロビン等が挙げられる。正の電荷を有する高分子としては、例えば、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、ポリ（α−リジン）、ポリ（ε−リジン）等のポリリジン、ポリアルギニン、又はポリヒスチジン等が挙げられる。合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（ＰＤＤＡ）、ポリアリルアミンハイドロクロライド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
【００５９】
（負の電荷を有する物質）
負の電荷を有する物質とは、負の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。負の電荷を有するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、例えば、酸性コラーゲン、酸性ゼラチン、アルブミン、グロブリン、カタラーゼ、β−ラクトグロブリン、チログロブリン、α−ラクトアルブミン、又は卵白アルブミン等が挙げられる。負の電荷を有する高分子としては、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリ（βリジン）等のポリアミノ酸、又はデキストラン硫酸等が挙げられる。合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、及びこれらの共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、末端カルボキシ化ポリエチレングリコール、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ポリアリルアミン塩、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
【００６０】
正の電荷を有する物質と負の電荷を有する物質との組み合わせとしては、例えば、ε−ポリリジン塩とポリスルホン酸塩、ε−ポリリジンとポリスルホン酸塩、キトサンとデキストラン硫酸、ポリアリルアミンハイドロクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、又はポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩等が挙げられ、好ましくはε−ポリリジン塩とポリスルホン酸塩、又はポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩である。ポリスルホン酸塩としては、例えば、ポリスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）等が挙げられる。なお、正の電荷を有する物質及び負の電荷を有する物質は、それぞれ、一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。
【００６１】
以下に、細胞に、まずＲＧＤ配列を有する物質を含有する溶液Ａと接触させた後、ＲＧＤ配列を有する物質に相互作用を有する物質を含有する溶液Ｂと接触させ、例にとり、被覆細胞の調製方法を説明する。
【００６２】
まず、細胞を溶液Ａと接触させる。これにより、細胞表面にＲＧＤ配列を有する物質を含む膜が形成され、細胞表面がＲＧＤ配列を有する物質を含む膜によって被覆される。細胞と溶液Ａとの接触は、例えば、溶液Ａを細胞に塗布又は添加すること、溶液Ａに細胞を浸漬させること、溶液Ａを細胞に滴下又は噴霧すること等により行うことができる。中でも、操作が容易であるという理由から、溶液Ａに細胞を浸漬させることにより、細胞と接触させることが好ましい。
【００６３】
接触条件は、一又は複数の実施形態において、接触方法、ＲＧＤ配列を有する物質及び又は細胞の種類、及び含有液の濃度等に応じて適宜決定できる。接触時間は、一又は複数の実施形態において、３０秒〜２４時間、１分〜６０分、１分〜１５分、１分〜１０分、又は１分〜５分が好ましい。接触時の雰囲気温度及び又は含有液の温度は、一又は複数の実施形態において、４〜６０℃、２０〜４０℃、又は３０〜３７℃が好ましい。
【００６４】
溶液Ａは、ＲＧＤ配列を有する物質を含んでいればよく、好ましくはＲＧＤ配列を有する物質と溶媒又は分散媒体（以下、「溶媒」ともいう）とを含む。溶液Ａにおける、ＲＧＤ配列を有する物質の含有量は、一又は複数の実施形態において、０．０００１〜１質量％、０．０１〜０．５質量％、又は０．０２〜０．１質量％が好ましい。溶媒としては、一又は複数の実施形態において、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び緩衝液等の水性溶媒が挙げられる。緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、又はＧＴＡ緩衝液等が挙げられる。溶媒のｐＨは、特に制限されず、一又は複数の実施形態において、３〜１１、６〜８、又は７．２〜７．４が好ましい。
【００６５】
溶液Ａは、一又は複数の実施形態において、塩、細胞成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、生理活性ペプチド、又は医薬組成物等をさらに含有してもよい。医薬組成部としては、例えば、疾患の治療剤、予防剤、抑制剤、抗菌剤、又は抗炎症剤等が挙げられる。塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、コハク酸ナトリウム等が挙げられる。塩は、一種類でもよいし二種類以上含有していてもよい。溶液Ａ及び溶液Ｂの双方が塩を含有していてもよいし、いずれか一方が塩を含有していてもよい。溶液Ａ中の塩濃度は、特に制限されないが、例えば、１×１０-6Ｍ〜２Ｍであり、好ましくは１×１０-4Ｍ〜１Ｍ、より好ましくは１×１０-4Ｍ〜０．０５Ｍである。
【００６６】
ついで、ＲＧＤ配列を有する物質を含む膜の形成に使用されなかった物質を除去する。除去は、例えば、遠心分離又は濾過等により行うことができる。遠心分離による除去は、例えば、溶液Ａに細胞を分散させた状態で遠心分離し、ついで上澄みを除去することにより行うことができる。遠心分離条件は、細胞の種類、細胞の濃度、及び溶液Ａに含まれる含有物の組成によって適宜決定できる。
【００６７】
上記除去に加えて、洗浄操作を行うことが好ましい。洗浄は、例えば、遠心分離又は濾過等により行うことができる。遠心分離による洗浄は、例えば、上澄みを除去された細胞に溶媒を添加し、遠心分離及び上澄みの除去をすることにより行うことができる。洗浄に用いる溶媒は、溶液Ａの溶媒と同じであることが好ましい。
【００６８】
ついで、ＲＧＤ配列を有する物質を含む膜で被覆された細胞を溶液Ｂと接触させる。これにより、ＲＧＤ配列を有する物を含む膜表面に相互作用をする物質を含む膜が形成され、ＲＧＤ配列を有する物を含む膜で被覆された細胞表面が相互作用をする物質を含む膜によって被覆される。溶液Ｂとの接触は、ＲＧＤ配列を有する物質に代えて相互作用する物質を使用する以外は、溶液Ａとの接触と同様に行うことができる。
【００６９】
溶液Ａ又は溶液Ｂと細胞との接触とを交互に繰り返し行うことにより、細胞表面全体に、ＧＤ配列を有する物質を含む膜と相互作用をする物質を含む膜とが交互に積層された細胞外マトリックス成分を含む被膜を形成することができる。溶液Ａ又は溶液Ｂと細胞との接触を行う回数は、例えば、形成する細胞外マトリックス成分を含む被膜の厚み等に応じて適宜決定できる。
【００７０】
［人工皮膚モデル］
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の製造方法により製造される人工皮膚モデルに関する。本開示の人工皮膚モデルは、細胞外マトリックス成分と積層された細胞とを含む真皮組織層と、前記真皮組織層上に形成されたＩＶ型コラーゲンを含む基底層と、前記基底層上に形成された表皮層とを有し、前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む。本開示の人工皮膚モデルによれば、例えば、実際の皮膚に近い環境で、被検物質の薬効試験、免疫応答、薬理試験及び安全性試験等の評価を行うことができる。また、本開示の人工皮膚モデルは、例えば、火傷や創傷の治療のための被覆材として用いることもできる。
【００７１】
表皮層において、例えば、隣接する表皮細胞間にタイトジャンクションが形成されていることが好ましい。表皮層においてタイトジャンクションが形成されていることにより、例えば、ＴＥＲを測定することによる表皮層のバリア機能等を評価することができる。
【００７２】
本開示の人工皮膚モデルは、真皮組織層に形成された組織付属器官を含むことが好ましい。これにより、実際の皮膚により近い環境、被検物質の薬効試験、薬理試験及び又は安全性試験等の評価を行うことができる。
【００７３】
真皮組織層において積層される細胞の数は、特に制限されず、ヒト等の皮膚とより同等の性質・機能を発揮させる観点から、３層以上、５層以上、６層以上、又は１０層以上である。積層される細胞数の上限は特に制限されないが、例えば、１００層以下、５０層以下、４０層以下、３０層以下、又は２０層以下等である。
【００７４】
［評価方法］
本発明は、さらにその他の態様として、本開示の人工皮膚モデルを用いた被検物質の皮膚に対する刺激性を評価する方法に関する。本開示の評価方法によれば、例えば、従来の方法と比較して実際の皮膚に近い環境で被検物質の評価を行うことができるという効果を奏しうる。また、本開示の評価方法は、例えば、新薬の創出（スクリーニング）等における各種分子量の薬物の動態評価、化粧品や医薬部外品等の開発における評価において極めて有用なツールとなりうる。
【００７５】
本開示の評価方法は、例えば、被検物質を前記人工皮膚モデルと接触させること、及び、被検物質の接触による免疫応答を測定することにより行うことができる。応答の測定は、例えば、ＴＥＲを測定すること等によって行うことができる。被検物質は、評価対象となる物質のことをいい、例えば、無機化合物及有機化合物等が挙げられる。
【００７６】
［評価キット］
本発明は、さらにその他の態様として、被検物質の刺激性の評価キットに関する。本開示の評価キットは、本開示の人工皮膚モデルを含む。本開示の評価キットによれば、例えば、本開示の評価方法をより簡便に行うことができる。
【００７７】
評価キットは、所定の検査に用いる試薬、材料、用具、及び装置、並びに、その評価についての説明書（取扱説明書）の少なくとも１つを含む製品をさらに含んでいてもよい。
【００７８】
［人工皮膚モデル製造キット］
本発明は、さらにその他の態様として、人工皮膚モデル製造用キットに関する。本開示の人工皮膚モデル製造用キットは、例えば、細胞外マトリックス成分を含む被膜の形成に用いる試薬、及び本開示の人工皮膚モデルの製造方法が記載された説明書を含むことが好ましい。本開示の人工皮膚モデル製造用キットによれば、より簡便に本開示の人工皮膚モデルを製造することができる。
【００７９】
本開示の人工皮膚モデル製造用キットは、さらに、真皮組織層が形成された基材を含んでいてもよい。これにより、真皮組織層が形成された基材を含むことにより、例えば、より簡便に短時間で本開示の人工皮膚モデルを製造することができ、さらには組織付属器官を形成するまでの時間を短縮できる。
【００８０】
本開示は、以下の一又は複数の実施形態に関する。
〔Ａ１〕細胞外マトリックス成分と積層された細胞とを含む真皮組織層と、
前記真皮組織層上に形成されたＩＶ型コラーゲンを含む基底層と、
前記基底層上に形成された表皮層とを有し、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚組織。
〔Ａ２〕細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、
前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び
前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成すること、を含み、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚組織の製造方法。
〔Ａ３〕前記真皮組織層の形成は、前記被覆細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された樹状細胞とを培養することを含む、〔Ａ２〕記載の製造方法。
〔Ａ４〕前記表皮層の形成は、前記基底層上に、表皮細胞と樹状細胞とを配置することを含む、〔Ａ２〕又は〔Ａ３〕に記載の製造方法。
〔Ａ５〕前記基底層の形成は、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲン層とラミニン層とが交互に形成されるように、前記真皮組織層にＩＶ型コラーゲン又はラミニンを接触させることを含む、〔Ａ２〕から〔Ａ４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔Ａ６〕前記被覆細胞は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された線維芽細胞を含む、〔Ａ２〕から〔Ａ５〕のいずれかに記載の製造方法。
〔Ａ７〕〔Ａ２〕から〔Ａ６〕のいずれかに記載の製造方法により製造される人工皮膚組織。
〔Ａ８〕細胞外マトリックス成分と前記細胞外マトリックス成分を介して積層された細胞とを含む真皮組織層と、
前記真皮組織層上に形成されたＩＶ型コラーゲンを含む基底層と、
前記基底層上に形成された表皮層とを有し、
前記真皮組織層が、樹状細胞とリンパ管とを含む、人工皮膚組織。
〔Ａ９〕前記真皮組織層における樹状細胞と真皮組織層を形成する樹状細胞以外の細胞との比が１：９９〜５０：５０である、〔Ａ８〕記載の人工皮膚組織。
〔Ｂ１〕細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、
前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び
前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成すること、を含み、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚モデルの製造方法。
〔Ｂ２〕前記真皮組織層の形成は、前記被覆細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された樹状細胞とを培養することを含む、〔Ｂ１〕記載の製造方法。
〔Ｂ３〕前記表皮層の形成は、前記基底層上に、表皮細胞と樹状細胞とを配置することを含む、〔Ｂ１〕又は〔Ｂ２〕に記載の製造方法。
〔Ｂ４〕前記基底層の形成は、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲン層とラミニン層とが交互に形成されるように、前記真皮組織層にＩＶ型コラーゲン又はラミニンを接触させることを含む、〔Ｂ１〕から〔Ｂ３〕のいずれかに記載の製造方法。
〔Ｂ５〕前記被覆細胞は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された線維芽細胞である、〔Ｂ１〕から〔Ｂ４〕のいずれかに記載の製造方法。
【００８１】
以下に、実施例を用いて本開示をさらに説明する。但し、本開示は以下の実施例に限定して解釈されない。
【実施例】
【００８２】
［被膜の厚みの測定方法］
細胞表面に形成された被膜の厚みは、別途、基材上に被膜の形成を行い、水晶発振子マイクロバランス（QCM）測定法を用い、行った処理（ステップ）数と形成される厚みとを測定し、その結果から細胞表面への被膜形成時に行ったステップの回数に応じて算出した。QCM測定法を用いた測定は以下のように行った。QCM水晶センサをピランハ溶液で１分間洗浄してから、0.2 mg/mlフィブロネクチン（以下、「FN」ともいう）のTris-HCl(pH=7.4)溶液に３７℃で１分間浸漬し、Tris-HCl(pH=7.4)溶液で洗浄して風乾した後、振動数シフトを測定した（ステップ１）。ついで0.2 mg/mlゼラチン（以下、「Ｇ」ともいう）のTris-HCl(pH=7.4)溶液に３７℃で１分間浸漬し、Tris-HCl(pH=7.4)溶液で洗浄して風乾した後、振動数シフトを測定した（ステップ２）。このステップ１及び２を交互に繰り返すことによりQCM水晶センサに被膜を形成すると共に、振動数シフトの測定を行った。得られた振動数シフトに基づき、ステップの回数とそれにより形成される被膜の厚みとを得た。【００８３】
（実施例１）
［被覆細胞の作製］
ヒト線維芽細胞（正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）、Cambrex社製）を1×106cell/mlの濃度で0.2mg/mlのフィブロネクチンを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液に分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行った（FN浸漬操作）。ついで、上澄みを除き、50 mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液を加え、細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行った（洗浄操作）。上澄みを除き、0.2mg/mlのゼラチンを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液に細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら、1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行い（G浸漬操作）、ついで洗浄操作を行った。そして、FN浸漬操作、洗浄操作、Ｇ浸漬操作、及び洗浄操作をこの順番で行った。FN浸漬操作及びＧ浸漬操作は洗浄操作とそれぞれセットで１ステップとし、最終的に、FN浸漬操作を５回、Ｇ浸漬操作を４回、計９ステップ行うことによってNHDF被覆細胞を作製した（コーティング層の厚み：6nm）。【００８４】
NHDFに代えてヒト末梢血単球由来樹状細胞（以下、「MoDC」ともいう）を用いた以外は、NHDF被覆細胞の作製と同様にFN浸漬操作を５回、Ｇ浸漬操作を４回、計９ステップ行うことによってMoDC被覆細胞を作製した（コーティング層の厚み：6nm）。【００８５】
［皮膚モデルの作製］
まず、２４ウェル培養プレートに配置したトランスウェル（コーニング社製；ポアサイズ：0.4μm、表面積：0.33cm2）のメンブレンフィルタ上に、5×105個のNHDF被覆細胞と5×104個のMoDC被覆細胞を混合して播種し、10重量％ウシ胎仔血清を含むEagle's MEM培地を添加して37℃で1日培養した。これにより樹状細胞を含み、NHDFが6層積層された真皮組織層（厚み：30μm）が得られた。【００８６】
得られた真皮組織層の表面に、0.2mg/mLのコラーゲンIVのトリス溶液を添加し、１時間インキュベートすることにより、真皮組織層の上にコラーゲンIVを含む基底層を形成した（厚み：2.4nm）。ついで、基底層の表面にケラチノサイト（以下、「KC」ともいう）を1.8×105個播種し、37℃で２日間培養した。ついで、培地を角化培地（重層化培地）に交換し、セルカルチャーインサートのメンブレンフィルタが角化培地の気液界面に位置するようにセルカルチャーインサートを配置した。その状態で37℃で７日間気液培養することにより分化誘導を行い、人工皮膚モデルを作製した。【００８７】
なお、上記人工皮膚モデルの作製において、MoDC被覆細胞は緑色蛍光色素（商品名：Cell TrackerTM Green Fluorescent Probe、製品コード：PA-3011）で着色したものを、NHDF被覆細胞は赤色蛍光色素（商品名：Cell TrackerTM Orange Fluorescent Probe、製品コード：PA-3012）で着色したものを、KCは青色蛍光色素（商品名：Cell TrackerTM Blue）で着色したものをそれぞれ使用した。【００８８】
得られた人工皮膚モデル（ＫＣ分化誘導4日後）及び分化誘導前（KC播種２日後）の三次元培養体の共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）画像の一例を図１に示す。図１Ａは人工皮膚モデルのCLSM画像であり、図１Bは分化誘導前の三次元培養体のCLSM画像である。図１Ａ及びＢにおいて赤で染色された細胞がNHDFであり、青で染色されたのがＫＣであり、緑で染色されたのがMoDCである。【００８９】
図１Ａに示すように、本開示の方法によって真皮層に樹状細胞が導入された人工皮膚モデルを作成することができた。樹状細胞が接着している様子も観察され、真皮層内で生存していることが示唆された。【００９０】
（実施例２）
第１の三次元培養層上に、MoDC被覆細胞5×104個とHUVEC被覆細胞5×104個とをそれぞれ播種した以外は、実施例1と同様にして人工皮膚モデルを作製した。すなわち、まず2.5×105個のNHDF被覆細胞を播種し、20%FBS含有DMEMを添加して1日培養して第１の三次元培養層（NHDF：3層）を形成後、その上にMoDC被覆細胞5×104個とHUVEC被覆細胞5×104個と播種し、20%FBS含有DMEMを添加して1日培養後、2.5×105個のNHDF被覆細胞を播種することによって真皮組織層を作製し、上記と同様の手順で基底層及び表皮層を形成した。なお、HUVEC被覆細胞は、NHDFに変えてヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を用いた以外は、実施例１の被覆細胞の作製と同様の手順で作製した。  【００９１】
得られた人工皮膚モデルの共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）画像の一例を図２に示す。図２ＡはKC分化誘導1日後の画像であり、図２ＢはKC分化誘導２日後の画像であり、図２CはKC分化誘導５日後の画像であり、図２DはKC分化誘導６日後の画像である。図２Ａ〜Ｄにおいて赤で染色された細胞がNHDFであり、青で染色されたのがHUVECであり、緑で染色されたのがMoDCである。【００９２】
図２に示すように、本開示の方法によって真皮層に樹状細胞と毛細血管網とが導入された人工皮膚モデルを作成することができた。毛細血管網の共存下においても樹状細胞が生存していることが示唆された。【００９３】
（参考例１）
［免疫応答評価］
実施例１と同様に樹状細胞を含む真皮組織層を作製した。作製した真皮組織層の培地を10％FBS含有DMEMに変更した(インサート内：30μl、インサート外：1ml)。インサート内にはリポ多糖(LPS、sigma製)を添加し、24時間インキュベート後、インサート外の培地を全て回収し、Enzyme-Linked ImmunoAorbent Assay(ELISA (R&D,D6056))によってインターロイキン(IL)-6を定量した。リポ多糖の濃度は、0、1、10、100又は1000ng/mとした。その結果を図３に示す。【００９４】
「NHDF被覆細胞とMoDC被覆細胞との混合物」に代えて「NHDF被覆細胞のみ」を使用した以外は、実施例１と同様にして真皮組織層（樹状細胞なし）を作製した。得られた真皮組織層を用いて上述と同様の免疫応答評価を行った。【００９５】
図３は、LPSの添加量と、真皮組織層からのIL-6の産生量との関係を示すグラフの一例である。図３に示すように、樹状細胞を含む真皮組織層及び樹状細胞を含まない真皮組織層のいずれも、LPSの添加量の増加に伴ってIL-6の産生量が増加した。また、樹状細胞を含む真皮組織層は、樹状細胞を含まない真皮組織層と比較してIL-6の産生量が大幅に向上した。【００９６】
（実施例４）
［皮膚モデルの作製］
まず、実施例１と同様にして作製した真皮組織層を、コラーゲンIV/５０mM Tris HCｌ溶液(pH7.4)に20分間浸漬し、真皮組織層にコラーゲンIVをコートした。KCを1.8×105個播種し接着培地で２日間培養後、角化培地（重層化培地）で７日間気液界面にさらすことにより分化誘導を行い、人工皮膚モデルを作製した。【００９７】
作製した人工皮膚モデルを用いて、上記参考例と同様にして免疫応答評価を行った。その結果を図４に示す。図４は、LPSの添加量と、真皮組織層からのIL-6の産生量との関係を示すグラフの一例である。図４に示すように、表皮層を有する人工皮膚モデルは、LPSの添加量によってIL-6の産生量に変化は見られなかった。実施例４の人工皮膚モデルは、表皮層の細胞間に形成されたタイトジャンクションによって物理的なバリア機能が発揮し、LPSが透過しなかったことが予測される。【００９８】
（参考例２）
NHDF被覆細胞を播種し培養してNHDFを４層積層した後、その上にヒト皮膚微小血管内皮細胞(NHDMEC)被覆細胞を播種し培養してNHDMECを1層積層した。ついでその上にNHDF被覆細胞を播種し培養してNHDFを４層積層し、2.3mlの10%FBS含有DMEMで3日間培養した後、MoDCを5.0×104個播種し、2.3mlの10%FBS含有DMEMで1日間培養した。これにより、真皮組織層を形成した。得られた真皮組織層が配置されたインサート内にLPSを1μg/ml添加し、共焦点レーザー顕微鏡で30時間観察を行った。【００９９】
その結果を図５に示す。図５は、LPS添加30時間後の共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）画像の一例である。図５に示すように、LPS添加後、樹状細胞がNHDMECと重なっている様子が観察された。詳細は不明ではあるが、生体内において、樹状細胞は抗原によって活性化させることによってリンパ管に移行することが知られている。このため、参考例２の真皮組織層においても生体内と同様の機構が起こっていることが示唆された。また、生体内では、活性化した樹状細胞においてCCケモカインレセプター７が発現し、一方リンパ管ではそのリガンドであるＣＣケモカインリガンド21,19を産生することが報告されている。したがって、参考例２の真皮組織層においても、リンパ管が産生するこれらのサイトカインによって、樹状細胞がNHDMECへと誘導されたと考える。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本開示によれば、被検物質の透過性や、それに伴う微小応答等が評価可能な人工皮膚モデルを提供できる。本開示は、例えば、化粧品、医薬、製薬等の分野において有用である。
【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年7月7日(2014.7.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外マトリックス成分と積層された細胞とを含む真皮組織層と、
前記真皮組織層上に形成されたＩＶ型コラーゲンを含む基底層と、
前記基底層上に形成された表皮層とを有し、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚組織。
【請求項２】
細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、
前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び
前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成すること、を含み、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚組織の製造方法。
【請求項３】
前記真皮組織層の形成は、前記被覆細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された樹状細胞とを培養することを含む、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
前記表皮層の形成は、前記基底層上に、表皮細胞と樹状細胞とを配置することを含む、請求項２又は３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記基底層の形成は、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲン層とラミニン層とが交互に形成されるように、前記真皮組織層にＩＶ型コラーゲン又はラミニンを接触させることを含む、請求項２から４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記被覆細胞は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された線維芽細胞を含む、請求項２から５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
請求項２から６のいずれかに記載の製造方法により製造される人工皮膚組織。
【請求項８】
細胞外マトリックス成分と前記細胞外マトリックス成分を介して積層された細胞とを含む真皮組織層と、
前記真皮組織層上に形成されたＩＶ型コラーゲンを含む基底層と、
前記基底層上に形成された表皮層とを有し、
前記真皮組織層が、樹状細胞とリンパ管とを含む、人工皮膚組織。
【請求項９】
前記真皮組織層における樹状細胞と真皮組織層を形成する樹状細胞以外の細胞との比が１：９９〜５０：５０である、請求項８記載の人工皮膚組織。
【請求項１０】
細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された線維芽細胞と、樹状細胞とを混合して播種した後、培養することによって真皮組織層を形成すること、
前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び
前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成すること、を含む、人工皮膚組織の製造方法。
【請求項１１】
前記真皮組織層の形成において、前記細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆された線維芽細胞と、前記樹状細胞と、血管内皮細胞及び／又はリンパ管内皮細胞を混合すること、及び混合した細胞を播種して培養することを含む、請求項１０記載の製造方法
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の製造方法により製造される人工皮膚組織であって、
細胞外マトリックス成分と、積層された線維芽細胞と、樹状細胞とを含む真皮組織層と、
前記真皮組織層上に形成されたＩＶ型コラーゲンを含む基底層と、
前記基底層上に形成された表皮層とを有し、
前記表皮層において、隣接する表皮細胞間にタイトジャンクションが形成されている、人工皮膚組織。
【国際調査報告】
2014038599.tif 000009
2014038599.tif 000010
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