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　特願２０１６−　５９６２０「細胞の再プログラミングのための方法とその用途」拒絶査定不服審判事件〔平成２８年　８月１８日出願公開、特開２０１６−１４６８４１〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯
　本願は、平成２２年１１月１日（パリ条約による優先権主張　２００９年１０月３１日　米国）を国際出願日とする特願２０１２−５３５５６５号の一部を新たな特許出願として平成２８年３月２４日に出願されたものであって、平成３０年２月６日付けで拒絶査定がなされ、これに対して、平成３０年７月４日に拒絶査定不服審判請求がなされた。その後の当審における手続の経緯は以下のとおりである。
　平成３０年　７月３１日　　　手続補正書（対象は、審判請求書）の提出
　平成３０年１０月１０日付け　拒絶理由通知書
　平成３１年　４月１６日　　　意見書、手続補正書の提出
第２　本願発明
　本願の請求項１に係る発明は、平成３１年４月１６日に提出された手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項１に記載された事項により特定される、次のとおりのものである。
　「【請求項１】　繊維芽細胞、角化細胞、血液細胞、および骨髄細胞から選択される第１の型の細胞を、多能性または単分化能性である神経系細胞へと再プログラミングする方法であって、
（１）前記第１の型の細胞のクロマチン及び／又はＤＮＡを再構築するために、前記細胞にヒストンアセチル化剤、ヒストン脱アセチル化の阻害剤、ＤＮＡ脱メチル化剤、及び／又は、ＤＮＡメチル化の化学的阻害剤を導入し、
（２）前記第１の型の細胞に対して、少なくとも１種の再プログラミング剤を一過的に適用し、ここで前記再プログラミング剤が、少なくとも１種の遺伝子調節因子の内因性発現を直接又は間接的に増加させる物質であり、ここで前記少なくとも１種の遺伝子調節因子の内因性発現は前記多能性または単分化能性である神経系細胞の存在に必要であり、ここで前記再プログラミング剤は、ＣＡＬＢ１、ＤＬＬ１、ＤＬＸ１イソ型１、ＤＬＸ１イソ型２、ＤＬＸ２、ＦＯＸＤ３、ＧＪＤ２、ＨＥＳ１、ＨＥＳ３、ＨＥＳ５、ＨＯＸＢ１、ＭＮＸ１イソ型１、ＭＮＸ１イソ型２、ＭＳＩ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＥＵＲＯＧ２（ＮＧＮ２）、ＮＫＸ６．１、ＳＦＲＰ２、ＳＩＸ３、及びＳＯＸ１からなる群より選択されるポリペプチド、又は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、
（３）前記細胞を、神経系多能性又は単分化能性細胞への転換を支持する培養条件下に、再プログラミング剤の不在下で転換遺伝子調節因子の安定な発現を生じさせるのに十分な期間に亘って保持し、
（４）前記細胞を、神経系多能性又は単分化能性細胞への転換を支持する培養条件下に、１種又は２種以上の第２の遺伝子を安定して発現させるのに十分な期間に亘って維持し、ここで前記１種又は２種以上の第２の遺伝子は、ネスチン、Ｓｏｘ２、ＧＦＡＰ、Ｍｓｉ１、Ｓｏｃ１、及びＣＤ１３３から選択され、ここで前記１種又は２種以上の第２の遺伝子の安定な発現は前記遺伝子調節因子が安定に発現した結果であり、ここで
　（ｉ）前記１種又は２種以上の第２の遺伝子の安定な発現は、前記多能性または単分化能性である神経系細胞の表現型的及び／又は機能的特性の特徴であり、かつ
　（ii）前記１種又は２種以上の第２の遺伝子のうちの少なくとも１種の安定な発現は、胚幹細胞の表現型的及び機能的特性の特徴ではないことを含み、
　ここで、前記期間の終了時に、前記第１の型の細胞は、神経系多能性又は単分化能性細胞に転換され、
　ここで、前記少なくとも１種の遺伝子調節因子がそれぞれ、Ｍｕｓａｓｈｉ１（Ｍｓｉ１）、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）、ＤＬＬ１、ＦＯＸＤ３、ＨＥＳ５、ＮＥＵＲＯＤ１、ＳＦＲＰ２、及びＳＯＸ１から選択される、方法。」（以下、「本願発明」という。）
第３　当審で通知した拒絶の理由
　平成３０年１０月１０日付けで当審が通知した拒絶理由は、次の理由を含むものである。
理由２（サポート要件）、理由３（実施可能要件）
請求項１−１０　（１）エ
　本願発明における「再プログラミング剤」について、明細書【００７１】、【００７５】の記載によれば、表Ａに記載されたポリヌクレオチド又はポリペプチドが含まれ得るが、本願明細書において実際に再プログラミング剤として機能したことが確認されたのはＭｓｉ１又はＮｇｎ２をコードする核酸ベクターのみであるところ、上記表Ａに記載されたものを使用する再プログラミング方法については明細書に裏付けられていないし、当業者にとり実施可能であるともいえないから、本願は特許法第３６条第６項第１号及び同条第４項第１号に規定する要件を満たしていない。
第４　当審の判断
１　本願の発明の詳細な説明及び図面の記載事項
　本願の発明の詳細な説明及び図面には、次のとおりの事項が記載されている。なお、下線は当審で付した。
（１）技術分野
　「【０００２】
  技術分野
  本発明は、真核細胞再プログラミングの分野に関し、特に細胞退行分化に関する。本発明はまた、ヒト体細胞（及び他の細胞）からの安定な神経幹様細胞（ＮＳＬＣｓ）を発生させる方法と、そのように発生された細胞のヒトの治療における用途に関する。」
（２）背景技術
　「【００１１】
  神経幹細胞は、神経変性疾患の細胞交換治療のための有望な治療的可能性を提供する（Ｍｉｍｅａｕｌｔら，２００７年）。現時点まで、ドナ-物質源としてヒト胎児組織の種々の型を開発するために、多数の治療的移植が実行されてきた。しかしながら、倫理上及び実用上の考慮並びに入手不能性が、移植治療のための細胞源としての利用可能性を制限している（Ｎｉｎｏｍｉｙ  Ｍら，２００６年）。
【００１２】
  患者に特異的な細胞の誘導への障壁及び制限を克服するために、皮膚細胞を用いて、神経幹細胞及び／又はニュ-ロンへの分化形質転換を誘導する１つのアプロ-チがあった（Ｌｅｖｅｓｑｕｅら，２０００年）。・・・他には、細胞骨格、アセチル化及びメチル化阻害物質の存在下での体細胞の培養によって、体細胞を神経細胞へと分化形質転換させたＰａｇｅら著（米国特許第２００３／００５９９３９号）などがあるが、プライミング剤の取り出し後、ニュ-ロン形態及び確立されたシナプスが、インヴィトロにおいて数週間までも続かず、
神経プロジェニタ-又は神経幹細胞の完全に機能的型及び安定型への完全な変換は、全く示されていない
　「【００１４】
  米国特許第６，０８７，１６８号（Ｌｅｖｅｓｑｕｅら著）は、皮膚基底細胞を生存可能なニュ-ロンへと変換または分化形質転換するための方法を記載している。・・・この技法は、２６％のニュ-ロン細胞を産出するが、これらの細胞の機能性及び安定性のいずれも確立されなかった。更に、
この方法によると、神経幹細胞又は神経プロジェニタ-細胞も産生されない
【００１５】
  後のプロセス（Ｌｅｖｅｓｑｕｅら著，２００５年，米国特許第６９４９３８０号）では、皮膚基底細胞を骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の拮抗物質に曝すことによって、更にＭＳＸ  １遺伝子及び／又はＨＥＳ１遺伝子のセグメントを含む少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド存在下で細胞を増殖させることによって、皮膚基底細胞の神経プロジェニタ-細胞、ニュ-ロン細胞、又はグリア細胞への変換を記載している。しかし、
本方法で、神経プロジェニタ-細胞又はグリア細胞のいずれかが生産された証拠又は例はない
【００１６】
  上記記載を鑑みて、安定で、効果的で、並びに好ましくは自家性である神経幹細胞、神経プロジェニタ-細胞、ニュ-ロン及びグリア細胞、並びに他の細胞型、幹細胞及びプロジェニタ-細胞への要望がある。真の細胞退行分化及び細胞再プログラミングをもたらし得る方法への要望も更にある。」
（３）発明の概要
　「【００１９】
  本発明は、幹様細胞及びプロジェニタ-様細胞、並びにこれら幹様細胞及びプロジェニタ-様細胞から誘導又は分化された細胞に関する。本発明は、細胞退行分化及び細胞再プログラミングのための方法に更に関する。本発明は、再プログラミングのために有用な組成物及び方法、並びに関連する治療用組成物及び方法を更に特徴とする。
【００２０】
  １つの特別な態様は、体細胞又は非ニュ-ロン細胞を、ニュ-ロン系統及びグリア系統に沿った分化を実行する能力を有する神経幹細胞の１つまたはそれ以上の形態学的、生理学的、免疫学的特徴を有する細胞へと再プログラムするための技術の開発に関する。いくつかの実施形態によると、本発明は、特に、ヒト体細胞、ヒトプロジェニタ-細胞及び／又はヒト幹細胞、並びにこのような方法を用いることから得られた細胞、細胞系及び組織からの安定な神経幹様細胞（ＮＳＬＣｓ）の発生の方法に関する。」
（４）発明を実施するための形態
　「【００７１】
  本明細書で使用するとき、「再プログラミング剤」は、異なる型の所望の細胞の形態的及び／又は機能的特性の発現を直接的又は間接的に誘導が可能である化合物を指す。好適な化合物は、第１の型の細胞の異なる型の所望の細胞への直接的又は間接的な形質転換を操作可能であるような化合物である。好適な実施形態では、再プログラミング剤は、本明細書に記載されたように、少なくとも１つの遺伝子調節因子の内因性発現を直接的又は間接的に誘導するために選択される。本発明による再プログラミングで有益であり得る多くの化合物があり、これら化合物は、単独又は組み合わされて使用され得る。
種々の実施形態では、再プログラミング剤は、表Ａに従って選択されたポリヌクレオチド又はポリペプチドである
（５）実施例
実施例Ｉ　ヒト繊維芽細胞の調製
　「【０１６４】
  ヒト包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ）から購入し、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、及び１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏの変法Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた細胞培養フラスコ中、３７℃、５％ＣＯ２で増殖された。・・・」
　「構築されたベクタ-を使用するリポフェクタミンによるＨＦＦの一過性トランスフェクション
【０１６７】
  培養２日後、製造業者のプロトコルに従って、リポフェクタミン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２（２μｇ）（ＤＮＡ脱メチル化剤）で、細胞がトランスフェクトされた。ＤＮＡ-脂質複合体が細胞に添加され、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベ-トされた。ＤＮＡ脱メチル化剤を使用してのトランスフェクションから２４時間後に、培地が交換され、
細胞が、ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｍｕｓａｓｈｉ１（２μｇ、Ｏｒｉｇｅｎｅ）又はｐＣＭＶ６-ＸＬ４-Ｎｇｎ２（２μｇ、Ｏｒｉｇｅｎｅ）で２４時間トランスフェクトされた
　「【０１７３】
  星状細胞、ニュ-ロン、及び希突起膠細胞の遺伝子発現の定量的比較は、再プログラムされた細胞中で示差的に発現される大多数の遺伝子の同定を可能にする。トランスフェクトされていない細胞に比べて再プログラムされた細胞中で富化されることが再現的に見出された遺伝子を同定するための有意性解析アルゴリズムを用いて、表１のデ-タが解析された。ＭＢＤ２の存在中でのＭｓｉ１又はＮｇｎ２でのトランスフェクション後、ＮＫｘ２．２、ｏｌｉｇ２、及びＭＡＧ並びに星状細胞のための２つのマ-カ-（ＧＦＡＰとＡＱＰ４）のような希突起膠細胞プロジェニタ-は、非常に増加した。更に、初期ニュ-ロン細胞の数種のマ-カ-もまた、ＨＦＦのトランスフェクション後に増強された。」
　「【０１７７】
  本研究は、ＤＮＡ脱メチル化剤の存在を伴う神経原性転写因子を使用してのニュ-ロン遺伝子並びに神経幹細胞及びニュ-ロン細胞に特異的な蛋白質を発現する細胞に向かうＨＦＦを再プログラムする可能性を示した。これらの再プログラムされた細胞は、少なくとも２週間、培養中で安定であった。」
実施例ＩＩ　３つの異なる神経原性遺伝子の再プログラミング効率の比較
　「【０１７８】
  ＨＦＦ細胞を、実施例Ｉのように培養し、ＣＤＭ  Ｉ培地にプレ-トした。細胞を、ＡＭＡＸＡ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）装置（Ｌｏｎｚａ）を使用してトランスフェクトした。・・・」
　「【０１８１】
  Ａｖｅｒａｇｅ  ｏｆ  ３  Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅの代わりにＡｖｅｒａｇｅ  ｏｆ  ２  Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ（ＧＡＰＤＨ＆ＰＰＩＡ）が標準化のために使用されたことを除外すれば、実施例Ｉに記載されたように相対的発現値が計算された。
Ｍｓｉ１、Ｎｇｎ２、及びＰａｘ６を含有する３つの異なるベクタ-によるトランスフェクションに続いて、ニュ-ロン系統遺伝子の同定が検討された
【０１８２】
  表２に示したように、トランスフェクションに続いて１４日後に、ニュ-ロン系統のｍＲＮＡの相対的発現が、トランスフェクトされていない細胞（ＨＦＦ）で検出不能であったが、一方
ＭＢＤ２の存在下、Ｍｓｉ１とＮｇｎ２でトランスフェクトされた細胞は、神経幹細胞マ-カ-（ネスチン及びＳｏｘ２）を発現し、しかしながら、Ｓｏｘ２の発現はＮｇｎ２又はＭｓｉ１によるトランスフェクト後のネスチンの発現よりも非常に高度に発現された
三分化能関連遺伝子βＩＩＩ-チュ-ブリン、ＭＡＰ２ｂ、アセチルコリン、及びＧＦＡＰのｍＲＮＡｓレベルは、Ｐａｘ６でトランスフェクトされた細胞中では検出不能であり、このことは、Ｐａｘ６単独では、ニュ-ロン系統へと向かう再プログラミング過程で関与することがないことを示唆している
実施例ＩＩＩ　ベクタ-の種々の組み合わせによるＨＦＦのトランスフェクション及び細胞骨格の崩壊
　「【０１８４】
  後成的改変のための神経原性調節因子とサイトカインの種々の組み合わせが、それらの再プログラミング効率へ及ぼす影響を確認するために試験された。・・・
ヌクレオフェクチンによる１つの神経原性転写因子を含有する１つ又は２つのベクタ-で、実施例ＩＩに記載されたように、細胞が一過性トランスフェクトされた
　「遺伝子発現解析
【０１８５】
  幹細胞に特異的なマ-カ-（Ｓｏｘ２、ネスチン、ＧＦＡＰ）及び繊維芽細胞に特異的なマ-カ-（Ｃｏｌ５Ａ２）に関する遺伝子発現解析が、先に実施例Ｉで記載されたように、ＲＴ-ＰＣＲによって実施された。ＲＴ-ＰＣＲ解析は、Ｓｏｘ２、ネスチン及びＧＦＡＰの相対的発現が、神経原性転写因子によって細胞をトランスフェクトした後に増加されたことを示した。表３に示したように、
Ｇａｄｄ４５ｂの存在中で、１つの転写因子Ｍｓｉ１によって細胞をトランスフェクトすることは、Ｓｏｘ２（２２．３±５．２６）とＧＦＡＰ（１０．１４±０．１５）の相対的発現のアップレギュレ-ションと関連性があって、Ｎｇｎ２によって細胞がトランスフェクトされた場合、それぞれ２０倍まで及び１０倍まで、これら遺伝子の発現は非常に増強された。２つの神経原性因子（Ｍｓｉ１とＮｇｎ２）をＧａｄｄ４５ｂと組み合わせることは、Ｓｏｘ２とＧＦＡＰの発現を更に増強させた
実施例ＩＶ　接着及び浮遊条件中のＮＳＬＣへのＨＦＦの再プログラミングにおけるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ  ＤｅｖｉｃｅとＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ９６-ｗｅｌｌ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  Ｄｅｖｉｃｅの比較
　「【０１９６】
  ＨＦＦ細胞を、実施例Ｉに記載されたように培養し、実施例ＩＩに記載されたようなＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、或いはＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ９６-ｗｅｌｌ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｌｏｎｚａ）を用いてトランスフェクトされた。・・・Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ  Ｄｅｖｉｃｅに関しては、細胞懸濁液の各１００μｌを、プラスミドＤＮＡの２つの異なる混合物と混合された（
サンプル１は、ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｍｓｉ１の２μｇとｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２の２μｇとに混合され、並びにサンプル２は、Ｍｓｉ１／Ｎｇｎ２の２μｇとｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２の２μｇと混合された
　「【０１９８】
  表１は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ  ＤｅｖｉｃｅとＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ９６-ｗｅｌｌ  Ｓｈｕｔｔｌｅ  Ｄｅｖｉｃｅの双方を使用した、典型的な真剣肝細胞の形態を備えたＳｏｘ陽性細胞のパ-センテ-ジを示している。後者は、より少量の出発物質（より少量の細胞及びより少量のＤＮＡ）でよいという利点を有し、更により多数のＳｏｘ２陽性細胞を生じる。更には、ＤＮＡ脱メチル化剤ＭＢＤ２の存在中でのただ１つの神経原性転写因子（Ｍｓｉ）によるトランスフェクションの際でも、Ｓｏｘ２陽性細胞の非常に小さい群がＳｈｕｔｔｌｅ  Ｄｅｖｉｃｅによって観測される。」
実施例Ｖ　神経形成アッセイ及び細胞分化アッセイ
　「０１９９】
  より大きく比例する再プログラミングが、２つの神経原性遺伝子をトランスフェクトすることによって達成されることを示す先の研究に基づいて、２つの神経原性転写因子（Msi1及びNgn2）を含有するベクタ-Ｍｓｉ１／Ｎｇｎ２を用いての再プログラミング細胞の数、並びに再プログラミング過程におけるＤＮＡ脱メチル化剤又はＤＮＡメチル化阻害剤（５-アザシチジン）及びヒストン脱アセチル化素材外の役割を評価するために、本研究がデザインされた。」
　「【０２００】
  実施例ＩＩＩに記載されたように、ＨＦＦｓが培養され、サイトカラシンＢで処理され、同時にＶＰＡ（１ｍＭ）と５-アザシチジン（０．５μＭ）で処理された。処理の２日後に、
構築されたベクタ-Ｍｓｄｉ１／Ｎｇｎ２を使用して、実施例ＩＩに記載されたようにＮｅｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎによって、細胞がトランスフェクトされた
実施例ＶＩ　ＨＦＦｓの再プログラミングにおけるＢＭＰ信号伝達経路の意味
　「【０２２０】
  本研究は、ＨＦＦｓのＮＳＬＣｓへと向かう退行分化の過程におけるノギンの役割を評価するためにデザインされた。ＨＦＦｓは、実施例ＩＩＩに記載されたように、培養され、サイトカラシンＢで処理された。２日後に、実施例ＩＩに記載されたように、
細胞が、構築されたベクタ-Ｍｓｉ１／Ｎｇｎ２を使用して、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎによってトランスフェクトされた
実施例ＩＸ　ＮＳＬＣｓに向かう異なる細胞型の再プログラミング
　「【０２２７】
  本研究は、角化細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ヒト脂肪細胞由来幹細胞（ＡＤＳＣｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びヒト造血幹細胞（ＣＤ３４＋、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が神経幹様細胞へと向かう能力について検討するために実施された。」
　「【０２３１】
  トランスフェクションに先立って、細胞がトリプシンで処理されて、Ｓｈｕｔｔｌｅを用いる実施例ＩＶ中で先に記載されたように、
ｐＣＭＶ-Ｍｓｉ１-Ｎｇｎ２及びｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２で一過性コトランスフェクトされて
　「【０２３２】
  再プログラムされた細胞の更なる解析及び定量化は、ＮＳＬＣｓの群が角化細胞とＣＤ３４＋細胞から引き起こされたことを示した。ＲＴ-ＰＣＲ解析は、Ｍｓｉ１及びＮｇｎ２による角化細胞とＣＤ３４＋細胞のトランスフェクション後に、Ｓｏｘ２、ネスチン、ＧＦＡＰ、及びβＩＩＩ-チュ-ブリンなどのような神経幹細胞マ-カ-の相対的発現の増加を確認した。」
実施例Ｘ　３Ｄ細胞外マトリックス（ＣＤＭ）の組立て
　「【０２３８】
　・・・この完全に化学的に限定された培地中で繊維芽細胞を超集密的密度にて培養することによって、増殖速度が低減された高合成期へとそれら細胞が移行することを引き起こし繊維芽細胞それ自体によって完全に合成される新生３Ｄ細胞外マトリックス（ＣＤＭ）内の繊維芽細胞の多重層からなる生きた組織等価物（ＬＴＥ）の生産へと誘導する。」
　「【０２４２】
  次いで、上記のように、ＶＰＡ（４ｍＭ）、５-Ａｚａ（５μＭ）及びサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ）で、ＣＤＭが処理された。化学的処理から２日後に、ＣＤＭ内の繊維芽細胞が、リポフェクタミン剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者の取扱説明書に従って、ＤＮＡでトランスフェクトされた。
細胞をトランスフェクトするために、真核細胞ＤＮＡ発現ベクタ-ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｐａｘ６、ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｍｓｉ１及びｐＣＭＶ６-ＸＬ４-Ｎｇｎ２（Ｏｒｉｇｅｎｅ）が使用された
Ｐａｘ６でトランスフェクトされた細胞は、ニュ-ロン系統に特異的な遺伝子を発現しなかった
Ｍｓｉ１によるトランスフェクション後には、ネスチン及びＡＣＨＥのレベルは、それぞれ４倍及び８倍まで増加され、並びにこの発現は１２日間を超えて維持された
同様に、Ｎｇｎ２でトランスフェクトされた細胞においても、同じパタ-ンが観察された
実施例ＸＩ　ＣＤＭ内の再プログラムされた細胞遺伝子発現解析
　「【０２４６】
  本研究は、再プログラミング過程で、ＭＢＤ２の存在中で、Ｍｓｉ１及びＮｇｎ２によって細胞をトランスフェクトすることの効果を試験するようにデザインされた。実施例Ｘに記載されたように、サイトカラシンＢによる前処理の２日後に、リポフェクタミン剤を用いて、細胞がＤＮＡ発現ベクタ-によってトランスフェクトされた。
真核細胞ＤＮＡ発現ベクタ-ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｍｕｓａｓｈｉ１又はｐＣＭＶ６-ＸＬ４-Ｎｇｎ２、及びｐＣＭＶ６-ＸＬ５-ＭＢＤ２（Ｏｒｉｇｅｎｅ）が、細胞をコトランスフェクトするために用いられた
実施例ＸＩＩ　リポフェクタミン及びヌクレオフェクチンによるＣＤＭ内の細胞の再プログラミング
　「【０２４９】
  本研究は、リポフェクタミンとヌクレオフェクチンを組み合わせることによる、並びに2つのベクタ-ｐＣＭＶ６-ＸＬ５-Ｍｓｉ１とｐＣＭＶ６-ＸＬ４-Ｎｇｎ２を個別に又は組み合わせて使用するＣＤＭのトランスフェクションを改善するためにデザインされた。サイトカラシンＢでの前処理後２日後又は前処理されず、
４日目のＣＤＭ内の細胞を、ＭＳｉ１／ＭＢＤ２、Ｎｇｎ２／ＭＢＤ２又はＭｓｉ／Ｎｇｎ２／ＭＢＤ２によって、６時間、脂質トランスフェクトした
実施例ＸＶＩ　一過性トランスフェクションからのＮＳＬＣｓ中におけるプラスミドＤＮＡの非ゲノム組込み
　「【０２５８】
  ＭＢＤ２（サンプル１に関して）又は５-Ａｚａ及びＶＰＡ（サンプル２に関して）を伴う
ＮＳＬＣｓの発生のための一過性トランスフェクションで、ＤＮＡプラスミドＭｓｉ１／Ｎｇｎ２（社内でデザインされ構築された）が使用された
２　判断
　発明の詳細な説明の記載によれば、本願発明が解決しようとする課題は、神経変性疾患の治療等のための、安定で、効果的で、自家性である神経幹細胞（請求項１の「多能性または単分化能性である神経系細胞」に相当すると認められる。発明の詳細な説明においては、「神経幹細胞」、「神経幹様細胞」、「神経プロジェニター」、「神経プロジェニター細胞」、「ＮＳＬＣ」が請求項１の「多能性または単分化能性である神経系細胞」と同義で使用されていると認められる。）を提供することにあると認められ（段落【０００２】、【００１６】）、請求項１には、「繊維芽細胞、角化細胞、血液細胞、および骨髄細胞から選択される第１の型の細胞」に対して（１）、（２）、（３）及び（４）のステップを施すことにより、「多能性または単分化能性である神経系細胞へと再プログラミングする方法」が記載されている。このうち、ステップ（２）は、「前記第１の細胞」すなわち、ステップ（１）で「ヒストンアセチル化剤、ヒストン脱アセチル化の阻害剤、ＤＮＡ脱メチル化剤、及び／又は、ＤＮＡメチル化の化学的阻害剤」を導入して「クロマチン及び／又はＤＮＡを再構築」した第１の細胞に対して、「少なくとも１種の再プログラミング剤を一過的に適用」するステップであって、「再プログラミング剤は、ＣＡＬＢ１、ＤＬＬ１、ＤＬＸ１イソ型１、ＤＬＸ１イソ型２、ＤＬＸ２、ＦＯＸＤ３、ＧＪＤ２、ＨＥＳ１、ＨＥＳ３、ＨＥＳ５、ＨＯＸＢ１、ＭＮＸ１イソ型１、ＭＮＸ１イソ型２、ＭＳＩ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＥＵＲＯＧ２（ＮＧＮ２）、ＮＫＸ６．１、ＳＦＲＰ２、ＳＩＸ３、及びＳＯＸ１からなる群より選択されるポリペプチド、又は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり」と記載されている。したがって、本願がサポート要件を満たすには、発明の詳細な説明において、請求項１に列挙された上記２１種類の再プログラミング剤のいずれを用いた場合にも上記課題が解決できることを当業者が認識できるように記載されている必要がある。
　この点について検討するに、発明の詳細な説明には、再プログラミング剤について、異なる型の所望の細胞の形態的及び／又は機能的特性の発現を直接的又は間接的に誘導が可能である化合物である旨記載され、実施形態として表Ａのポリヌクレオチド又はポリペプチドが挙げられている（段落【００７１】）。表Ａには、所望の第２の細胞型が神経幹様細胞（請求項１の「多能性または単分化能性である神経系細胞」に相当すると認められる。）である場合の再プログラミング剤として、請求項１に記載された２１種類に、ＮＡＮＯＧ、ＰＡＸ６イソ型ａ＊、ＰＡＸ６イソ型ａ、ＰＡＸ６イソ型ｂ及びＳＯＸ２の５種類を加えた合計２６種類が記載されているが、発明の詳細な説明にはそれらを神経幹様細胞用の再プログラミング剤として使用できることの根拠（作用機序等）についての記載はない。
　一方、実施例において、第１の型の細胞を「多能性又は単分化能性である神経系細胞」へと再プログラミングできたことが具体的に示されているのは、Ｍｕｓａｓｈｉ１（Ｍｓｉ１）及びＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）（表Ａでは「ＮＥＵＲＯＧ２」と記載されている。）のみである。すなわち、再プログラミング剤を用いた請求項１のステップ（２）を含む実施例は、上記１（５）に摘記した１１個であるところ、実施例Ｉには、Ｍｕｓａｓｈｉ１（Ｍｓｉ１）及びＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）をそれぞれ単独で用いた場合にヒト包皮線維芽細胞を神経幹細胞に再プログラミングできたことが、実施例ＩＩには、Ｍｕｓａｓｈｉ１（Ｍｓｉ１）、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）及びＰＡＸ６の３種類の再プログラミング効率を比較したところ、Ｍｕｓａｓｈｉ１（Ｍｓｉ１）及びＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）では神経幹細胞への再プログラミングが認められたのに対して、ＰＡＸ６ではニューロン系統すなわち神経系統への再プログラミングが認められなかったことが記載されている。そして、それ以降は、一貫してＭｕｓａｓｈｉ１（Ｍｓｉ１）及び／又はＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）を用いて、サイトカインとの組み合わせの検討（実施例ＩＩＩ）、トランスフェクトに用いるデバイスの比較（実施例ＩＶ）、ステップ（１）で用いる剤の検討（実施例Ｖ）、ノギンの役割の検討（実施例ＶＩ）、線維芽細胞以外の種類の細胞型の再プログラミング（実施例ＩＸ）、３Ｄ細胞外マトリックスを用いた再プログラミング（実施例Ｘ）、３Ｄ細胞外マトリックスを用いた場合の遺伝子発現（実施例ＸＩ）、トランスフェクションに用いる試薬の検討（実施例ＸＩＩ）、及びベクターの検討（実施例ＸＶＩ）に関する実験結果が示されている。
　発明の詳細な説明の背景技術の項にも記載されているとおり、本願出願日当時、自家性の神経幹細胞（多能性または単分化能性である神経系細胞）を提供するために皮膚細胞等の体細胞を分化形質転換する試みがなされていたものの、成功例は未だ報告されていないという技術水準にあったこと（段落【００１１】〜【００１６】）、表Ａに再プログラミング剤の実施形態として挙げられた２６種類について再プログラミング剤として使用できることの根拠（作用機序等）について何ら説明がないこと、及びＰＡＸ６は表Ａに再プログラミング剤として表Ａに記載されているにもかかわらず実施例ＩＩＩにおいて神経幹細胞への再プログラミング作用が認められなかったことに鑑みると、請求項１に（表Ａにも）記載された２１種類のうちＭｕｓａｓｈｉ１（Ｍｓｉ１）及びＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）以外のものについては、Ｍｕｓａｓｈｉ１（Ｍｓｉ１）及びＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）と同様に再プログラミング作用を有するのか、それともＰＡＸ６のように再プログラミング作用を発揮できないのかは、実験的に確認をしてみなくてはわからないというべきである。すなわち、発明の詳細な説明において、実験的な確認がなされていないものについては、当業者がＭｕｓａｓｈｉ１（Ｍｓｉ１）やＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）と同様の再プログラミング作用を有すると認識することはできないというべきである。
　したがって、発明の詳細な説明には、請求項１に列挙された上記２１種類の再プログラミング剤のいずれを用いた場合にも上記課題が解決できることを当業者が認識できるように記載されているとは認めることができないから、本願は、特許法第３６条第６項第１号に規定する要件を満たしていない。
　また、発明の詳細な説明に、請求項１に列挙された上記２１種類の再プログラミング剤のうちＭｕｓａｓｈｉ１（Ｍｓｉ１）及びＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）以外のものを用いる場合について本願発明に係る方法を実施することができる程度に明確かつ十分に記載したものとは認められないから、本願は特許法第３６条第４項第１号に規定する要件を満たしていない。
３　請求人の主張に対して
　平成３１年４月１６日付け意見書において、請求人は、次のとおりの主張をする。
　「請求項１を補正し、再プログラミング剤の選択肢を、当初明細書［００７１］の表Ａにおいて神経幹様細胞の再プログラミング剤として挙げられているものに限定することにより対処いたしました。表Ａは遺伝子調節に関する出願人の知識を具体的に反映したものであり、当業者が本願発明を実施する上で重要な情報であると言えます。斯かる当初明細書の記載に、出願当時の技術常識を考え合わせれば、当業者であれば補正後請求項１に記載の再プログラミング剤を用い、補正後請求項１に係る再プログラミング方法を実施することは十分に可能であります。」
　しかしながら、表Ａはポリヌクレオチド又はポリペプチドの名称とＲｅｆＳｅｑ／ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＵｎｉＧｅｎｅにおけるアクセッション番号を開示するだけであるから、遺伝子調節に関する知識を具体的に示すものとは認められないし、本願出願当時、実験的な確認なしに再プログラミング剤として作用し得ることを認めるに足りる技術常識があったとは認められないことは上述のとおりであるから、請求人の上記主張を採用することはできない。
第５　むすび
　以上のとおり、本願は、特許法第３６条第６項第１号及び同条第４項第１号に規定する要件を満たしていないから、拒絶すべきものである。
　よって、結論のとおり審決する。