(57)【要約】 本発明は、血清または血清代替物を含む動物細胞用培地に、多糖類を添加し、所望のタンパク質の産生量を大きく増加させることを可能にしたタンパク質産生促進剤および該タンパク質産生促進剤を含有する培地を用いたタンパク質の製造方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖類を含む動物細胞用培地添加剤。
【請求項２】
培養する動物細胞による所望のタンパク質の産生を促進させる、請求項１に記載の添加剤。
【請求項３】
前記動物細胞の１細胞当たりのタンパク質の産生を促進させる、請求項２に記載の添加剤。
【請求項４】
前記多糖類が、アニオン性官能基を有する、請求項１に記載の添加剤。
【請求項５】
前記多糖類のアニオン性官能基が、カルボキシル基、スルホ基及びリン酸基からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項４に記載の添加剤。
【請求項６】
前記多糖類が、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、キサンタンガム、カラギーナン、ダイユータンガム、アルギン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項５に記載の添加剤。
【請求項７】
前記多糖類が、脱アシル化ジェランガムまたはその塩である、請求項６に記載の添加剤。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の添加剤を含有してなる動物細胞用培地。
【請求項９】
血清濃度が１％（ｗ/ｖ）以上、１５％（ｗ/ｖ）以下である、請求項８に記載の培地。
【請求項１０】
血漿タンパク質、ホルモン類、増殖因子及び塩類から選ばれる血清代替物の濃度が１％（ｗ/ｖ）以上、１５％（ｗ/ｖ）以下である、請求項８に記載の培地。
【請求項１１】
さらに、アミノ酸類、ビタミン類、エネルギー源、浸透圧調整剤、鉄源、及びｐＨ緩衝液の群から少なくとも１種が添加される請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１２】
動物細胞培養を用いたタンパク質の製造方法であって、
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の添加剤の存在下又は
請求項８乃至１１のいずれか１項に記載の培地中で、
該動物細胞を培養することを特徴とする、方法。
【請求項１３】
少なくとも（ａ）又は（ｂ）の期間において該動物細胞を培養することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
（ａ）培養する動物細胞が十分に増殖できる期間の一部或いは全部
（ｂ）該動物細胞が産生する所望のタンパク質が十分に産生できる期間の一部或いは全部
【請求項１４】
培養液中の動物細胞のタンパク質産生量を促進させる方法であって、
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の添加剤の存在下又は
請求項８乃至１１のいずれか１項に記載の培地中で、
該動物細胞を培養することを特徴とする、方法。
【請求項１５】
動物細胞の１細胞当たりのタンパク質産生量を促進することを特徴とする、
請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の培養に関し、特に動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）によるタンパク質の高産生化に適したタンパク質産生促進剤及びそれを含有する培地に関する。さらに本発明は該タンパク質産生促進剤及びそれを含有する培地を用いたタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生命科学の分野では、目的とする有用タンパク質を産生する動物細胞を大量培養することにより、有用タンパク質を工業的規模で産生することが非常に重要となってきている。該動物細胞または所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入した動物細胞の培養により、天然または組換えタンパク質等を製造する場合、塩類、糖類、アミノ酸類、およびビタミン類等の基礎栄養物の他に、該動物細胞の増殖のために動物細胞増殖因子が使用されている。動物細胞増殖因子としては、通常、ウシ胎児血清や子ウシ血清などのような血清成分が使用される。一般的には、ウシ胎児血清または子ウシ血清を使用する場合には、基礎培地に対して５〜２０容量％程度添加する必要がある。
しかしながら、ウシ胎児血清や子ウシ血清などのような血清は、その供給に制限があり、一般的に非常に高価である。これは、有用タンパク質の製造コストの上昇を招くこととなる。【０００３】
また、哺乳動物由来の増殖因子或いは血清については、狂牛病、ウシ海綿状脳症、感染性海綿状脳、更にはクロイツフェルト・ヤコブ病といったプリオン関連の疾患に関する問題点の他、哺乳動物由来の血清はオートクレーブ等で滅菌できないため、ウイルス又はマイコプラズマ汚染される可能性があり、安全性の点から動物細胞を血清の非存在下で培養する無血清培養法の開発が行われている。無血清培養法では、血清の効果を代替する物質（血清代替物）として、フェツイン、インスリン、トランスフェリン、増殖因子などの天然由来の純化されたタンパク質もしくは組換えタンパク質などが使用されているが、これらのタンパク質は一般的にウシ胎児血清や子ウシ血清以上に高価であり、その供給は制限される。【０００４】
このように、血清および血清代替物は高価であり、その供給が制限されることから、有用タンパク質をより一層効率的に製造するための技術の開発が望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、動物細胞を用いて所望のタンパク質を産生するためのタンパク質産生促進剤を提供することを課題とする。さらに本発明は、該タンパク質産生促進剤を含有する培地を用いたタンパク質の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記のような課題を達成すべく鋭意工夫を重ねた結果、血清または血清代替物を含む動物細胞用培地に、多糖類を添加したところ、所望のタンパク質の産生量が大きく増加することを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００７】
すなわち、本発明は下記［１］〜［１５］に関するものである。
［１］多糖類を含む動物細胞用培地添加剤。
［２］培養する動物細胞による所望のタンパク質の産生を促進させる、［１］に記載の添加剤。
［３］前記動物細胞の１細胞当たりのタンパク質の産生を促進させる、［２］に記載の添加剤。
［４］前記多糖類が、アニオン性官能基を有する、［１］に記載の添加剤。
［５］前記多糖類のアニオン性官能基が、カルボキシル基、スルホ基及びリン酸基からなる群から選択される少なくとも１種である、［４］に記載の添加剤。
［６］前記多糖類が、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、キサンタンガム、カラギーナン、ダイユータンガム、アルギン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種である、［５］に記載の添加剤。
［７］前記多糖類が、脱アシル化ジェランガムまたはその塩である、［６］に記載の添加剤。
［８］［１］乃至［７］のいずれか１項に記載の添加剤を含有してなる動物細胞用培地。
［９］血清濃度が１％（ｗ/ｖ）以上、１５％（ｗ/ｖ）以下である、［８］に記載の培地。
［１０］血漿タンパク質、ホルモン類、増殖因子及び塩類から選ばれる血清代替物の濃度が１％（ｗ/ｖ）以上、１５％（ｗ/ｖ）以下である、［８］に記載の培地。
［１１］さらに、アミノ酸類、ビタミン類、エネルギー源、浸透圧調整剤、鉄源、及びｐＨ緩衝液の群から少なくとも１種が添加される［８］乃至［１０］のいずれか１項に記載の培地。
［１２］動物細胞培養を用いたタンパク質の製造方法であって、
［１］乃至［７］のいずれか１項に記載の添加剤の存在下又は
［８］乃至［１１］のいずれか１項に記載の培地中で、
該動物細胞を培養することを特徴とする、方法。
［１３］少なくとも（ａ）又は（ｂ）の期間において該動物細胞を培養することを特徴とする、［１２］に記載の方法。
（ａ）培養する動物細胞が十分に増殖できる期間の一部或いは全部
（ｂ）該動物細胞が産生する所望のタンパク質が十分に産生できる期間の一部或いは全部
［１４］培養液中の動物細胞のタンパク質産生量を促進させる方法であって、
［１］乃至［７］のいずれか１項に記載の添加剤の存在下又は
［８］乃至［１１］のいずれか１項に記載の培地中で、
該動物細胞を培養することを特徴とする、方法。
［１５］動物細胞の１細胞当たりのタンパク質産生量を促進することを特徴とする［１４］に記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の動物細胞用培地添加剤は、該添加剤を動物細胞培養用培地に添加し、得られた培地を使用して、タンパク質を産生可能な動物細胞を培養し、該培地および／または該動物細胞から、産生されたタンパク質を採取した場合、所望のタンパク質の産生量を増大させることが可能である。特に１細胞当たりのタンパク質の産生量を増大させることができる。
また、本発明の動物細胞用培地添加剤は、培地に添加するだけで、所望のタンパク質の産生量を促進させることができるので、操作や取扱いの上からも有利である。
さらに、所望のタンパク質をより一層効率的に製造できることから、製造コストの点からも有利であり、例えば、抗体医薬等のバイオ医薬品などの大量供給に大きく貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ヒト骨髄腫由来細胞株ＳＣ−０１ＭＦＰを用いて、脱アシル化ジェランガムの存在下（０．０１５％）、非存在下（ｃｏｎｔｒｏｌ）で培養した場合の細胞数増加とλ鎖産生量の比較図を示す。
【図２】図１記載のＳＣ−０１ＭＦＰを用いた試験において、脱アシル化ジェランガム存在下（０．０１５％）、非存在下（ｃｏｎｔｒｏｌ）で比較した細胞数増加（左図）とλ鎖産生量比較図（右図）の両者のグラフ下面積を台形法にて算出し、得られた細胞数増加グラフ下面積を用いて、λ鎖産生量グラフ下面積を補正し（λ鎖産生量グラフ下面積／細胞数増加グラフ下面積）、さらにｃｏｎｔｒｏｌを１とした場合の脱アシル化ジェランガム０．０１５％存在下のそれとの比較図を示す。
【図３】チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１）にヒトインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）遺伝子を組み込んだＣＨＯ−Ｋ１を用いて、脱アシル化ジェランガムの存在下（０．０２５％）、非存在下（ｃｏｎｔｒｏｌ）で培養した場合の細胞数の増加とＩＦＮ−β産生量の比較図を示す。
【図４】図３記載のＣＨＯ−Ｋ１を用いた試験において、脱アシル化ジェランガム存在下（０．０２５％）、非存在下（ｃｏｎｔｒｏｌ）で比較した細胞数増加（左図）とＩＦＮ−β産生量比較図（右図）の両者のグラフ下面積を台形法にて算出し、細胞数増加グラフ下面積を用いて、λ鎖産生量グラフ下面積を補正し（ＩＦＮ−β産生量グラフ下面積／細胞数増加グラフ下面積）、さらにｃｏｎｔｒｏｌを１とした場合の脱アシル化ジェランガム０．０２５％存在下のそれとの比較図を示す。
【図５】ゲルに超音波処理を行い、かつ、培養培地に添加時に再懸濁を行った場合に、ゲルの微細化処理が細胞増殖に及ぼす影響を示す。
【図６】ゲルに超音波処理を行い、かつ、培養培地に添加時に再懸濁を行った場合に、ゲルの微細化処理がＩＦＮ−β産生に及ぼす影響を示す。
【図７】ローラーボトルの器材の違いが、ゲルの有する細胞増殖能に及ぼす影響を示す。
【図８】ローラーボトルの器材の違いが、ゲルの有するＩＦＮ−β産生に及ぼす影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．培地添加剤／タンパク質産生促進剤
本発明は、少なくとも部分的には、動物細胞を用いてタンパク質を製造する際に、少なくとも培養する細胞が十分に増殖できる期間あるいは産生する所望のタンパク質が十分に産生できる期間の一部或いは全部において、多糖類を培養液に加えることにより、目的タンパク質の高産生が可能となることを見出したのに基づく。従って、本発明は、当該多糖類を含有してなる動物細胞用培地添加剤、該動物細胞によるタンパク質産生の促進剤（以下、「本発明の培地添加剤／タンパク質産生促進剤」と略記する場合がある）を提供する。
【００１１】
本発明に用いる多糖類は、アニオン性官能基を有するものが好ましい。アニオン性の官能基としては、カルボキシル基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシル基またはその塩が好ましい。
本発明に用いる多糖類は、好ましくは単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が１０個以上重合した多糖類が挙げられ、より好ましくは、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。ここにいう酸性多糖類とは、その構造中にアニオン性の官能基を有すれば特に制限されないが、例えば、ウロン酸（例えば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸）を有する多糖類、構造中の一部に硫酸又はリン酸を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類であって、天然から得られる多糖類のみならず、微生物発酵により産生された多糖類、遺伝子工学的に産生された多糖類、或いは酵素を用いて人工的に合成された多糖類も含まれる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群より選ばれる１種又は２種以上から構成されるものが例示される。
ここでいう塩とは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩、カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩又はアルミニウム、亜鉛、銅、鉄、アンモニウム、有機塩基及びアミノ酸等の塩が挙げられる。好ましくは、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、銅などの２価金属塩であるが、これらに限定されるものではない。
これらの重量平均分子量は、好ましくは１０，０００乃至５０，０００，０００であり、より好ましくは１００，０００乃至２０，０００，０００、更に好ましくは１，０００，０００乃至１０，０００，０００である。本願発明における当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるプルラン換算値として定義される。
【００１２】
本発明に用いる多糖類のさらに好ましい具体例としては、脱アシル化ジェランガム、カラギーナン及びキサンタンガムが挙げられ、最も好ましい例としては脱アシル化ジェランガムが挙げられる。本発明における脱アシル化ジェランガムとは、１−３結合したグルコース、１−４結合したグルクロン酸、１−４結合したグルコース及び１―４結合したラムノースの４分子の糖を構成単位とする直鎖状の高分子多糖類であり、以下の一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２が共に水素原子であり、ｎは２以上の整数で表わされる多糖類である。ただし、Ｒ１はグリセリル基を、Ｒ２はアセチル基を含んでいてもよいが、アセチル基及びグリセリル基の含有量は、好ましくは１０％以下であり、より好ましくは１％以下である。
【００１３】
【化１】
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【００１４】
本発明における多糖類は、化学合成法でも得ることができるが、当該化合物が天然物である場合は、当該化合物を含有している各種植物、各種動物、各種微生物から慣用技術を用いて抽出及び分離精製することにより得るのが好適である。その抽出においては、水や超臨界ガスを用いると当該化合物を効率よく抽出することができる。例えば、ジェランガムの製造方法としては、発酵培地でジェランガム産生微生物を培養し、菌体外に産生された粘膜物を通常の精製方法にて回収し、乾燥、粉砕等の工程後、粉末状にすればよい。また、脱アシル化ジェランガムの場合は、前記粘膜物を回収する際にアルカリ処理を施し、１−３結合したグルコース残基に結合したグリセリル基とアセチル基を脱アシル化した後に回収すればよい。精製方法としては、例えば、液−液抽出、分別沈澱、結晶化、各種のイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０等を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル等による吸着クロマトグラフィーもしくは薄層クロマトグラフィーによる活性物質の吸脱着処理、あるいは逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、または反復して用いることにより、不純物を除き精製することができる。ジェランガムの産生微生物の例としては、これに限定されるものではないが、スフィンゴモナス・エロディア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｄｅａ）及び当該微生物の遺伝子を改変した微生物が挙げられる。さらに、脱アシル化ジェランガムの場合、市販品、例えば、三晶株式会社製「ＫＥＬＣＯＧＥＬ（シーピー・ケルコ社の登録商標）ＣＧ−ＬＡ」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）」等を使用することができる。
【００１５】
本発明の培地添加剤／タンパク質産生促進剤には、上記いずれかの多糖類に加えて、培地添加剤に通常配合され得る各種成分を含有させることができるが、該多糖類自体単独で、本発明の培地添加剤／タンパク質産生促進剤として用いてもよい。
【００１６】
本発明の培地添加剤は、タンパク質産生促進剤としての機能を発揮し得る限り、即ち、動物細胞が産生する目的タンパク質の産生量を、当該多糖類を添加しない場合に比べて有意に増大させ得る限り、該動物細胞の培養に好ましくない影響を及ぼさない範囲で適宜培地に添加することができる。例えば、上記多糖類の培地中での濃度が、０．００１％乃至１．０％（重量／容量、ｗ／ｖと略記する場合もある）、好ましくは０．００２％乃至０．４％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．２％（重量／容量）、さらに好ましくは０．００５％乃至０．０５％（重量／容量）となるように、本発明の培地添加剤を培地に添加すれば良い。例えば、多糖類として脱アシル化ジェランガムを用いる場合、脱アシル化ジェランガム濃度として０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００１％乃至０．５％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．０５％（重量／容量）となるように、培地添加剤を培地中に添加すれば良い。なお該濃度は、以下の式で算出できる。
濃度（％）＝特定化合物の重量（ｇ）／培地組成物の容量（ｍｌ）×１００
【００１７】
２．培地組成物
本発明の培地添加剤を用いることができる培地は、動物細胞用の培地であれば特に制限されず、例えば培地の組成による分類では、天然培地、半合成培地及び合成培地、また、形状による分類では、半固形培地、液体培地などが挙げられる。例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ  ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬工業株式会社製）、ＵｌｔｒａＣＨＯ（登録商標）培地（Ｌｏｎｚａ社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２培地（シグマ−アルドリッチ社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３２５−ＰＦ培地（シグマ−アルドリッチ社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＡＣＦ  ＣＨＯ培地（シグマ−アルドリッチ社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＨＯ  ＤＨＦＲ培地（シグマ−アルドリッチ社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ  ＣＨＯ培地（シグマ−アルドリッチ社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ  ＣＨＯ−２培地（シグマ−アルドリッチ社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ  ＣＨＯ−３培地（シグマ−アルドリッチ社製）、ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ（登録商標）培地（ライフテクノロジーズ社製）、ＣＤ  ＣＨＯ培地（ライフテクノロジーズ社製）、ＣＤ  ＣＨＯ  ＡＧＴ（登録商標）培地（ライフテクノロジーズ社製）、ＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ（登録商標）培地（ライフテクノロジーズ社製）、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ライフテクノロジーズ社製）、ＣＤ  ＤＧ４４培地（ライフテクノロジーズ社製）、ＨｙＣｌｏｎｅ  ＣＤＭ４ＣＨＯ培地（サーモサイエンティフィック社製）、ＨｙＣｌｏｎｅ  ＳＦＭ４ＣＨＯ培地（サーモサイエンティフィック社製）、ＣＤ−ＡＣＰ−ＣＨＯ（シグマ−アルドリッチ社製）、ＨｙＣｌｏｎｅ  ＳＦＭ４ＣＨＯ−Ｕｔｉｌｌｉｔｙ培地（サーモサイエンティフィック社製）、ＫＢＭ２７０培地（コージンバイオ株式会社製）、ＫＢＭ２４０培地（コージンバイオ株式会社製）、ＫＢＭ２３０培地（コージンバイオ株式会社製）、ＫＢＭ３０６培地（コージンバイオ株式会社製）、ＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＣＨＯ培地（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＣＨＯＭＡＣＳ  ＣＤ培地（ミルテニーバイオテク社製）、ＥＳＦ  ＳＦＭ培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ダイゴＴ培地（日本製薬株式会社製）、ＩＳ  ＣＨＯ−Ｖ培地（登録商標）（Ｉｒｖｉｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＩＳ  ＣＨＯ−Ｖ−ＧＳ培地（登録商標）（Ｉｒｖｉｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉ���ｉｃ社）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
上記培地には、各種アミノ酸、各種ビタミン、エネルギー源、浸透圧調整剤、鉄源、ｐＨ緩衝液、又は抗生物質等を一種類、又はそれ以上を組み合わせて、当業者は添加することができる。さらに、当業者は目的に応じてその他の化学成分あるいは生体成分を一種類以上組み合わせて添加することもできる。
【００１９】
各種アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等、各種ビタミンとしては、ビオチン、葉酸、リポ酸、ニコチンアミド、ニコチン酸、ｐ−アミノ安息香酸、パントテン酸カルシウム、塩酸ピリドキサール、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンＢ１２、アスコルビン酸等、エネルギー源としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース等、浸透圧調節剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム等、鉄源としては、ＥＤＴＡ鉄、クエン酸鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硝酸第二鉄等、ｐＨ緩衝剤としては、炭酸水素ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ等を使用することができる。添加する濃度は、培養する細胞の種類等に合わせて、当業者は適宜調整することができる。
【００２０】
培地に添加される抗生物質の例としては、サルファ製剤、ペニシリン、フェネチシリン、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、ナフシリン、アンピシリン、ペニシリン、アモキシシリン、シクラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メクズロシリン、メシリナム、アンジノシリン、セファロスポリン及びその誘導体、オキソリン酸、アミフロキサシン、テマフロキサシン、ナリジクス酸、ピロミド酸、シプロフロキサン、シノキサシン、ノルフロキサシン、パーフロキサシン、ロザキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ピペミド酸、スルバクタム、クラブリン酸、β−ブロモペニシラン酸、β−クロロペニシラン酸、６−アセチルメチレン−ペニシラン酸、セフォキサゾール、スルタンピシリン、アディノシリン、タゾバクタム、アズトレオナム、スルファゼチン、イソスルファゼチン、ノルカディシン、ｍ−カルボキシフェニル、フェニルアセトアミドホスホン酸メチル、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、並びにミノサイクリンが挙げられるが、これらに限定されない。添加する濃度は、培養する細胞の種類等に合わせて、当業者は適宜調整することができる。
【００２１】
本発明の培地添加剤を上記培地に添加する場合には、まず適切な溶媒にて培地添加剤を用時溶解した後、培地中での多糖類の濃度が、上記の範囲内となるように、該添加剤溶液を培地中に添加すれば良い。ここで、適切な溶媒の例としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール等の各種アルコールなどが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
【００２２】
上記培地添加剤溶液の調製法としては、まず培地添加剤を上記溶媒に添加し、多糖類を溶解できる温度（例えば、６０℃、８０℃、９０℃以上）で加熱しながら撹拌して溶解させる。溶解後、撹拌しながら放冷し、滅菌（例えば、１２１℃にて２０分でのオートクレーブ滅菌）を行い、室温に戻した後、培地に前記滅菌後の溶解液を添加し、培地と均一になるように混合する。例えば、脱アシル化ジェランガムを調製する場合、０．１％乃至２．０％（重量／容量）、０．２％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．２％乃至０．５％（重量／容量）、より好ましくは０．２％乃至０．４％（重量／容量）となるようにイオン交換水あるいは超純水に脱アシル化ジェランガムを添加する。そして、前記脱アシル化ジェランガムを溶解できる温度であれば何度でもよいが、６０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上に加熱しながら撹拌し、透明な状態になるまで溶解させる。溶解後、撹拌しながら放冷し、滅菌（例えば１２１℃にて２０分間オートクレーブ）を行い、室温に戻した後に培地と均一になるように混合させる。混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、マグネチックスターラーやメカニカルスターラー、ホモミキサー、ホモジナイザー等の機器を用いた混合が挙げられる。また、混合後に該培地混合液をフィルターろ過してもよい。
【００２３】
上記のようにして調製される、脱アシル化ジェランガムは、ゲル化した状態を微細化して細胞培養に使用することができる。微細化の手段としては、物理化学的な方法が挙げられる。例えば、後述の実施例に記載する、ＥＤＴＡ、シュウ酸カリウム等による化学的手段、紫外線、超音波処理等による物理的手段が挙げられる。これらの手段により微細化したゲルは、培養培地に添加時に再懸濁を行い使用することができる。
【００２４】
上記のようにして調製される、本発明の培地添加剤／タンパク質産生促進剤を含有してなる本発明の動物細胞用培地組成物における、血清または血清代替物の濃度を示す。
例えば、血清の場合、無血清培地かあるいは、血清濃度が１％〜１５％（重量／容量）、１％〜１０％（重量／容量）、５％〜１５％（重量／容量）、５％〜１０％（重量／容量）の血清培地が挙げられる。血清代替物の場合は、該代替物を含まないかあるいは、前記濃度範囲の血清の機能を代替する濃度（例えば、１％〜１５％（重量／容量）、１％〜１０％（重量／容量）、５％〜１５％（重量／容量）、５％〜１０％（重量／容量））で該代替物を含有する培地が挙げられる。
【００２５】
３．細胞培養方法
本発明においては、一般的な、細胞培養方法である、回分培養法（ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養法（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養法（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）のいずれの培養方法を用いてもよいが、好ましくは、流加培養法又は連続培養法が用いられ、特に好ましくは、流加培養法が用いられる。
【００２６】
回分培養法（ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）は、培地に少量の種培養液を加え、培養中に新たに培地を加えたり又は培養液を排出したりせずに、細胞を増殖させる培養方法である。本発明において回分培養法を用いる場合には、種培養液として、本発明の培地添加剤を含有する培養液を使用するができる。
【００２７】
連続培養法（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ）は、培養中に連続的に培養液を加え、かつ、連続的に排出させる培養方法である。なお、連続法には、灌流培養（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）も含まれる。
【００２８】
流加培養法（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）は回分培養法と連続培養法の中間にあたる為、半回分培養法（ｓｅｍｉ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）とも呼ばれ、培養中に連続的に又は逐次的に培地が加えられるが、連続培養法のような連続的な培養液の排出が行われない培養方法である。流加培養の際に加えられる培地（以下、流加培地という）は、既に培養に使用されている培養液（以下、初発培養液という）と同じ培養液である必要はなく、異なる培養液を添加してもよいし、特定の成分のみを添加してもよい。
【００２９】
本発明において初発培養液とは、通常、細胞培養の最初の段階で使用されている培養液のことをいう。但し、流加培養液を複数回に分けて添加する場合には、流加培養液をそれぞれ添加する前の培養液を初発培養液としてもよい。初発培養液に上記本発明の培地添加剤を含有する培養液を使用し細胞培養することができる。初発培養液への多糖類の添加濃度としては、目的タンパク質の産生量を増加できるだけの濃度であれば十分である。例えば、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００２％乃至０．４％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．２％（重量／容量）、さらに好ましくは０．００５％乃至０．０５％（重量／容量）となるように、多糖類を培養液に添加すれば良い。
【００３０】
本発明において、流加培養法又は連続培養法を用いる場合には、培養途中に添加する培養液として、上記本発明の培地添加剤を含有する培養液を使用することができる。流加培養で添加される培養液（流加培養液）は、培養体積を増大させないように高濃度培地としておくことが望ましい。具体的には例えば、流加培地の濃度において、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００２％乃至０．４％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．２％（重量／容量）、さらに好ましくは０．００５％乃至０．０５％（重量／容量）の多糖類を含むものを流加培養液として用いることができる。
【００３１】
本発明において前記流加培養液を培養液に添加する場合、初発培養液量の１％〜１５０％、好ましくは５％〜５０％、さらに好ましくは８％〜２０％を、培養期間を通して連続的に、又は一定期間、又は逐次的に添加する流加培養液量として用いることができる。
【００３２】
本発明の培養方法は特に限定されることなく種々の動物細胞の培養に使用できる。例えば、ヒト癌化細胞、抗体を産生するマウス−ヒト、マウス−マウス、マウス−ラット等のハイブリドーマに代表される融合細胞あるいは遺伝子工学的操作によって所望のタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞を培養することが可能である。
例えば、後述の実施例に記載のＳＣ−０１ＭＦＰ（独立行政法人産業技術総合研究所に寄託されている細胞株、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００７７）を培養して（国際公開第２００５／０８３０６０号）、該動物細胞が生来産生する天然型タンパク質を得ることができる。また、これに所望のタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターでトランスフェクトして得られる該タンパク質高産生細胞株を培養する場合にも利用できる。
【００３３】
本発明において特に好ましい動物細胞は、所望のタンパク質をコードする遺伝子が導入されたＣＨＯ細胞である。ＣＨＯの例としては、ＣＨＯ  Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１（商標））、ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＤＧ４４細胞等が挙げられるが、これらに制限されることはない。所望のタンパク質は特に限定されず、天然抗体、抗体断片、低分子化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などの抗体（例えば、抗ＩＬ−６レセプター抗体、抗グリピカン−３抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＬＡ４抗体など）や生理活性タンパク質（顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン、インターフェロン、ＩＬ−１やＩＬ−６等のインターロイキン、ｔ−ＰＡ、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固因子、など）、サイトカイン類を含む如何なるタンパク質でもよいが、特に医薬品として使用可能な抗体やサイトカイン類を含む免疫関連タンパク質、細胞増殖分化に関わるタンパク質、膜タンパク質などが好ましい。
【００３４】
培養条件は使用する細胞の種類によって異なるので、適宜好適な条件を決定することが可能である。例えばＣＨＯ細胞であれば通常、気相のＣＯ２濃度が０％〜４０％、好ましくは、２％〜１０％の雰囲気下、培養液のｐＨをｐＨ６．５〜７．２、好ましくはｐＨ６．７〜７．０、より好ましくはｐＨ６．８〜６．９の範囲とし、３０℃〜３９℃、好ましくは、３７℃程度で、１日〜５０日間培養、さらに好ましくは１日〜１４日間培養してもよい。
【００３５】
また、動物細胞培養用の各種の培養装置としては、例えば発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、カルチャーフラスコ型培養装置、スピンナーフラスコ型培養装置、マイクロキャリアー型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ローラーボトル型培養装置、充填槽型培養装置、バイオリアクター型培養装置等を用いて培養することができるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
本発明の培養方法を用いて細胞を培養する際には、細胞の培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養器材を用いて培養することが可能である。
これらの培養器材の材質は、例えば、ガラス、ポリ塩化ビニル、エチルセルロースやアセチルセルロース等のセルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブタジエン、ポリ（エチレン−ビニルアセテート）コポリマー、ポリ（ブタジエン−スチレン）コポリマー、ポリ（ブタジエン−アクリロニトリル）コポリマー、ポリ（エチレン−エチルアクリレート）コポリマー、ポリ（エチレン−メタアクリレート）コポリマー、ポリクロロプレン、スチロール樹脂、クロロスルフォン化ポリエチレン、エチレン酢酸ビニル、アクリル系ブロックコポリマー等のプラスチック等が挙げられる。後述の実施例に記載するように、ローラーボトルの器材により、本発明のゲルの有する細胞増殖等に影響を及ぼすため、ポリスチレンが好ましい。
【００３７】
４．タンパク質の製造方法
上述した細胞培養方法で動物細胞を培養することにより、タンパク質を高産生させることが可能となる。
【００３８】
一般的に、動物細胞のタンパク質の産生は、単にそれを培養するのみで良いものや、特殊な操作を必要とするものも存在するが、それらの操作又は条件等は培養する動物細胞により適宜決定すれば良い。タンパク質の種類は限定されないが、例えば遺伝子工学的操作によりマウス−ヒトキメラ抗体をコードする遺伝子を含むベクターでトランスフォームされたＣＨＯ細胞では、上述したような条件下で培養を実施することにより、１日〜５０日間、好ましくは５日〜２１日、さらに好ましくは７日〜１４日間程度で所望のタンパク質を培地中に得ることができる。これを常法（例えば、抗体工学入門、地人書館、（１９９４）、ｐ．１０２−１０４；Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ、ＧＥ  ヘルスケア（株）、（２００３）、ｐ．５６−６０など参照）に従い単離、精製することによって、所望のタンパク質を得ることができる。
【００３９】
本発明により、組換え抗体（天然抗体、抗体断片、低分子化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体など）、遺伝子組換えタンパク質（顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン、インターフェロン、ＩＬ−１やＩＬ−６等のインターロイキン、ｔ−ＰＡ、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固因子等）などを高い産生量で製造することができる。
【００４０】
本発明の製造方法で産生される抗体としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル等の動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体など人為的に改変した遺伝子組み換え型抗体も含まれる。また、抗体の免疫グロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭなどいずれのクラスでもよいが、医薬として用いる場合はＩｇＧ及びＩｇＭが好ましい。さらに本発明の抗体としてはｗｈｏｌｅの抗体だけでなく、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２などの抗体断片や、抗体の可変領域をペプチドリンカー等のリンカーで結合させた１価または２価以上の一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２等）の低分子化抗体なども含まれる。
【００４１】
以下、本発明を実施例及び参考例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例等は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００４２】
［試料］
本実施例で用いた細胞株は抗体λ軽鎖タンパク質の特徴的産生能を有する、ヒト骨髄腫由来細胞株ＳＣ−０１ＭＦＰである（国際公開第２００５／０８３０６０号）。【００４３】
［脱アシル化ジェランガム含有培地による培養評価系］
脱アシル化ジェランガム粉末（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を超純水（ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に対し３ｇ／Ｌとなる様に溶解させた。その後湯煎し、脱アシル化ジェランガム粉末の溶解を確認した後、オートクレーブによって滅菌を行った。滅菌を行った溶液を静置し室温まで冷却させ、１０％ウシ胎児血清含有Ｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬工業株式会社製）に対し、脱アシル化ジェランガム濃度が０．０１５％（ｗ／ｖ、以下脱アシル化ジェランガムの濃度について同様）となるように混合培地を作製した。コントロール群として、脱アシル化ジェランガムを含まない１０％ウシ胎児血清含有Ｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬工業株式会社製）を用いた。次に作製した脱アシル化ジェランガム含有培地に対し細胞を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように１００μＬずつ９６穴イムノプレートに播種した。２４時間ごとに、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ８（株式会社同仁化学研究所）を１０μＬ／ｗｅｌｌ添加し１．５時間インキュベートし、培養液１００μＬを別の９６穴プレートに移し吸光度を４５０−５９５ｎｍで計測した。その結果、図１左に示すように、ＳＣ−０１ＭＦＰ細胞は、培養開始後２日目以降で、コントロール群である脱アシル化ジェランガム無添加と比較して、脱アシル化ジェランガムを０．０１５％添加した培地での培養で、両者の細胞数の増加に顕著な差は見られなかった。【００４４】
［酵素抗体法によるλ鎖産生量の測定］
上記培養上清中のλ鎖産生量を酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）を用いて測定した。ヤギ抗ヒトλ鎖抗体（ＢＩＯＳＯＲＣＥ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２０００倍希釈し９６穴イムノプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌで分注してプレートコートした。３７℃で１時間静置した後、非特異的反応を防ぐために、ＰＢＳにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；ＩＣＮ）を０．５％に希釈した溶液（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を３００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、ブロッキングを行った。その後、３７℃で１時間静置し、定量するＩＦＮ−β抗体を含む培養上清を０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで１／１０、１／１００に希釈し５０μＬ／ｗｅｌｌで分注した。また、同様に１μｇ／ｍＬから１／３ずつ１５２ｎｇ／ｍＬまで段階希釈した標準溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、３７℃で１時間静置した。その後、西洋わさび由来ペルオキシターゼ標識ヒトλ鎖抗体（ＢＩＯＳＯＲＣＥ）を０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で、５，０００倍に希釈し、１００μＬ／ｗｅｌｌで分注して３７℃で１時間静置した。発色液として０．００６％Ｈ２Ｏ２−０．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）、６ｍｇ／ｍＬ  ＡＢＴＳ−（ＮＨ４）２（和光純薬）、超純水（ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）をそれぞれ１０：１：９の割合で混合した溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、３０分後に４１４ｎｍの波長により吸光度を測定した。各反応の間ではＰＢＳにポリエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０；和光純薬）を０．０５％濃度に希釈した溶液で３回洗浄した。図１右図は、ＳＣ−０１ＭＦＰ細胞のλ鎖産生量の結果を示すグラフである。培養開始後、３日目以降にλ鎖の産生量は対照実験と比較して、０．０１５％の濃度で脱アシル化ジェランガムを添加したものは、抗体産生量が顕著に増加していた。図２に図１左右図で得られたグラフの面積を台形法により算出し、細胞数のグラフから得られる面積で抗体産生量のグラフから得られる面積を除した値（抗体産生量のグラフから得られる面積／細胞数のグラフから得られる面積≒１細胞数当たりの抗体産生量相当量）を比較した図を記載した（コントロールを１とした場合の０．０１５％脱アシル化ジェランガム添加した場合の比率に換算して表示）。脱アシル化ジェランガムの添加により、１細胞数当たりのλ鎖産生量は約３倍に増加した。
【実施例２】
【００４５】
［試料］
本実施例で用いた宿主細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１（商標））である。物質産生性の評価のために、以下のようにしてヒトインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）遺伝子をＣＨＯ−Ｋ１に組み込み、培養上清中にＩＦＮ−βを産生する細胞株を作製した。
まず、ＩＦＮ−β生産細胞であるヒト皮膚由来正常二倍体線維芽細胞株ＴＩＧ−１０８からの、ＩＦＮ−β遺伝子の取得を行った。細胞数５×１０６ｃｅｌｌｓのＴＩＧ−１０８を４００×ｇで５分間遠心し、上清を除いた後、核酸抽出試薬ＩＳＯＧＥＮ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社）１ｍＬ、クロロホルム（和光純薬）０．２ｍＬを加えＤＮＡ、タンパク質を有機層に沈殿させた。１２０００×ｇで１５分遠心を行った後、水相（ＲＮＡ層）を取得し、これにイソプロパノール（和光純薬）０．５ｍＬを加え、１２０００×ｇで１５分遠心後、ＲＮＡを沈殿させた。沈殿させたＲＮＡを滅菌水に溶解した後、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ  Ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）とｐｄ（Ｎ）６Ｒａｎｄａｍ  Ｈｅｘａｍｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）１μＬを加え、室温で１分間静置後、３７℃で６０分間の逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
続いて、ＩＦＮ−β遺伝子のＰＣＲ増幅を試みた。まず、滅菌水  ３５．５μＬ、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  ４μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ（５’−ＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＴＣＴＣＣＴ−３’；配列番号１）１μＬ（１０  ｐｍｏｌｅｓ）、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ（５’−ＴＣＡＧＴＴＴＣＧＧＡＧＧＴＡＡＣＣＴＧ−３’；配列番号２）１μＬ（１０  Ｐｍｏｌｅｓ）、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．２５μＬ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）、ｃＤＮＡ  ３μＬ（５０ｎｇ）を０．２ｍＬチューブに混合した。このチューブをＰｒｏｇｒａｍ  Ｔｅｍｐ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＳＴＥＣ社）に入れ、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動で確認した後、Ｆｒｅｅｚｅ’ＮＳｑｕｅｅｓｅ  スピンカラム（ＢＩＯ  ＲＡＤ社）で精製した。精製されたＰＣＲ産物２μＬと、ｐＴＡＲＧＥＴベクター１μＬ（５０ｎｇ）を、ＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）３μＬと混合し、１６℃、３０分間のライゲーション反応を行った。続いて、ライゲーション後のｐＴＡＲＧＥＴベクターをヒートショック反応によりＪＭ１０９細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に導入し、ＬＢ培地プレートに播種した。生育したコロニーを取得し、ＬＢ培地１ｍＬ、３７℃で一晩、震盪培養を行った後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により、ｐＴＡＲＧＥＴベクターを抽出した。続いて、ＩＦＮ−β遺伝子配列上に認識配列が存在する制限酵素ＰｓｔＩ（ＴＯＹＯＢＯ社）でｐＴＡＲＧＥＴベクターを切断することで、ＩＦＮ−β遺伝子がｐＴＡＲＧＥＴベクターにクローニングされたことを確認した。
続いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株を１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ＦＢＳ、トレース社）含有−Ｅ−ＲＤＦ（１０％  ＦＢＳ−Ｅ−ＲＤＦ）培地で培養後、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、ＰＢＳに置き換えた。次に、ＩＦＮ−β遺伝子がｐＴＡＲＧＥＴベクターにクローニングされたことを確認した。
遺伝子を３μｇ添加し、０．７５ｋＶ／ｃｍ、３５０μＦの条件で電圧を印可した。１０％  ＦＢＳ−Ｅ−ＲＤＦ培地にて回復培養を行い、９６穴培養プレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に１００μＬ／ｗｅｌｌ分注した。２４時間インキュベートした後、Ｇ−４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を終濃度５００μｇ／ｍＬ添加した１０％ＦＢＳ−Ｅ−ＲＤＦ培地で遺伝子導入した細胞を選択培養した。その後、増殖が確認できた細胞については、ＩＦＮ−β遺伝子の発現確認を行うことにより、ＩＦＮ−β産生ＣＨＯ−Ｋ１細胞を作製した。【００４６】
［脱アシル化ジェランガム培養評価系］
脱アシル化ジェランガム粉末（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を超純水（ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に対し４ｇ／Ｌとなる様に溶解させた。その後湯煎し、脱アシル化ジェランガム粉末の溶解を確認した後、オートクレーブによって滅菌を行った。滅菌を行った脱アシル化ジェランガム水溶液を静置し室温まで冷却させ、無血清培地として、インスリン（ウシ由来、終濃度：５μｇ／ｍＬ）、トランスフェリン（ウシ由来、終濃度：２０μｇ／ｍＬ）、エタノールアミン（終濃度：２０μｍｏｌ）、亜セレン酸ナトリウム（終濃度：２５ｎｍｏｌ）を含むＥ−ＲＤＦ培地（極東製薬工業株式会社製）に対し、脱アシル化ジェランガム濃度が０．０２５％となるように混合培地を作製した。コントロール群として、脱アシル化ジェランガムを含まない上記無血清Ｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬工業株式会社製）を用いた。次に作製した培地に対し細胞を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように１００μＬずつ９６穴イムノプレートに播種した。２４時間ごとに、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ８（株式会社同仁化学研究所）を１０μＬ／ｗｅｌｌ添加し１．５時間インキュベートし、培養液１００μＬを別の９６穴プレートに移し吸光度を４５０−５９５ｎｍで計測した。その結果、図３左図に示すように、無血清Ｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬工業株式会社製）で脱アシル化ジェランガム添加培養系は、無添加の培養系と比較し、細胞増殖効果に影響を与えないことがわかった。【００４７】
［酵素抗体法によるＩＦＮ−β産生量の測定］
培養上清中のＩＦＮ−β産生量を酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）を用いて測定した。ヤギ抗ヒトＩＦＮ−β抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＮＣ．）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１μｇ／ｍＬとなるように希釈し９６穴イムノプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌで分注してプレートコートした。３７℃で１時間静置した後、非特異的反応を防ぐために、ＰＢＳにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；ＩＣＮ）を０．５％に希釈した溶液（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を３００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、ブロッキングを行った。その後、３７℃で１時間静置し、定量するＩＦＮ−β抗体を含む培養上清を０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで１／１０希釈し５０μＬ／ｗｅｌｌで分注した。また、同様に０．３３μｇ／ｍＬの標準溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌ分注し、３７℃で１時間静置した。その後、マウス抗ヒトＩＦＮ−β抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＮＣ．）を０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで１μｇ／ｍＬとなるように希釈し、１００μＬ／ｗｅｌｌで分注した後、３７℃で１時間静置した。その後、西洋わさび由来ペルオキシターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で、５，０００倍に希釈し、１００μＬ／ｗｅｌｌで分注して３７℃で１時間静置した。発色液として１０％  ３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液／０．００６％Ｈ２Ｏ２−０．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、３０分後に１Ｎ−Ｈ２ＳＯ４溶液で反応を停止後、４５０ｎｍの波長により吸光度を測定した。各反応の間ではＰＢＳにポリエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）（和光純薬）を０．０５％濃度に希釈した溶液で３回洗浄した。図３左図には細胞数の経時的変化を、右図は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞のＩＦＮ−β産生量の経時的変化を示すグラフである。図３右図に示すように、無血清培養において０．０２５％脱アシル化ジェランガム添加により、無添加のものよりもＩＦＮ−β産生量が増加することが分かった。図４に図３左右図で得られたグラフの面積を台形法により算出し、細胞数のグラフから得られるグラフ下面積でＩＦＮ−βのグラフから得られるグラフ下面積を除した値（ＩＦＮ−β産生量のグラフから得られる面積／細胞数のグラフから得られる面積≒１細胞数当たりのＩＦＮ−β産生量相当量）を比較した図を記載した（コントロールを１とした場合の０．０２５％脱アシル化ジェランガム添加した場合の比率に換算して表示）。脱アシル化ジェランガムの添加により、１細胞数当たりのＩＦＮ−β産生量は約４４％増加した。
【実施例３】
【００４８】
［試料］
本実施例で使用した細胞株は、実施例２で使用したヒトインターフェロンβ遺伝子を組み込み、かつ、培養上清中にヒトインターフェロンβを産生するＣＨＯ−Ｋ１細胞株である。
［ゲル組織の微細化手段］
脱アシル化ジェランガム粉末（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を超純水に対し１ｇ／１００ｍＬとなる様に溶解させた。続いて、オートクレーブによって滅菌、ゲルの溶解を行った。
次に、本ゲルをＥＤＴＡ、シュウ酸カリウム、紫外線、超音波の４種の処理をゲルに行い、物理化学的な微細化を図って、細胞増殖および細胞生産物の生産量への影響を検討した。
まず、ＥＤＴＡ（株式会社同仁化学研究所製）は０．１ｇを５００ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、オートクレーブ滅菌後、ゲルとＥＤＴＡ溶液を等量で混合して、１日室温に放置した。その後、４０００×ｇ、１０分間の遠心により、液体部分とゲル部分に分離して、ゲル部分を５％ウシ胎児血清含有ＥＲＤＦ培地（極東製薬工業株式会社製）に５％（ｗ／ｖ）で添加して培養した。
シュウ酸カリウム（和光純薬工業株式会社製）は、超純水で５％シュウ酸カリウム溶液を作製し、フィルター滅菌後、ゲルとシュウ酸カリウム溶液を等量で混合して、１日室温に放置した。その後、４０００×ｇ、１０分間の遠心により、液体部分とゲル部分に分離して、ゲル部分を５％ウシ胎児血清含有ＥＲＤＦ培地（極東製薬工業株式会社製）に５％（ｗ／ｖ）で添加して培養した。
続いて、紫外線は市販の１５Ｗ紫外線ランプから５５ｃｍの距離にゲル溶液を静置し、一晩照射を続けた試料を５％ウシ胎児血清含有ＥＲＤＦ培地（極東製薬工業株式会社製）に５％（ｗ／ｖ）で添加して培養した。
最後に、超音波は出力２０Ｗ、周波数２８ＫＨｚで５分間ゲル溶液に適用し、その後、５％ウシ胎児血清含有ＥＲＤＦ培地（極東製薬工業株式会社製）に５％（ｗ／ｖ）で添加して培養した。
なお、コントロール群として、ゲルを含まない５％ウシ胎児血清含有ＥＲＤＦ培地（極東製薬工業株式会社製）を用いた。
また、最終的に、ＥＤＴＡ、シュウ酸カリウム、紫外線、超音波処理した各ゲル試料を培養培地に添加する際に、ゲルの再凝集を防ぐ目的でピペットによる激しいピペッティングをした場合としない場合の２パターンも実施した。
細胞は、各処理後のゲルを調製した培養培地に、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように１ｍＬずつ２４穴培養プレートに播種した。培養時の細胞数は血球計算板での細胞数の計測を行った。その結果、図５に示すように、ゲルに超音波処理を行い、かつ、培養培地に添加時に再懸濁を行った場合に、培養７日目以降にコントロールやその他の試料の細胞増殖より明らかに高い増殖支持活性が認められた。【００４９】
［酵素抗体法によるＩＦＮ−β産生量の測定］
測定方法は実施例２と同一である。
図６に示すように、ゲルに超音波処理を行い、かつ、培養培地に添加時に再懸濁を行った場合に、培養６日目以降にコントロールやその他の試料のインターフェロンβ産生量より顕著に多く生産されることが分かった。
【実施例４】
【００５０】
［試料］
本実施例で使用した細胞株は、実施例２で使用したヒトインターフェロンβ遺伝子を組み込み、かつ、培養上清中にヒトインターフェロンβを産生するＣＨＯ−Ｋ１細胞株である。
［脱アシル化ジェランガム培養評価系］
脱アシル化ジェランガム粉末（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を超純水に対し１ｇ／１００ｍＬとなる様に溶解させた。その後、オートクレーブによって滅菌を行い、ゲルを溶解させた。このゲルを５％ウシ胎児血清含有ＥＲＤＦ培地（極東製薬工業株式会社製）に５％（ｗ／ｖ）で添加して、ガラス製ローラーボトル（ＷＨＥＡＴＯＮ社製）とポリスチレン製ローラーボトル（ＢＤ社製）にそれぞれ２００ｍＬずつ分注し、培養した。なお、どちらのローラーボトル培養器も表面積８５０ｃｍ２程度であった。
また、細胞の播種密度は１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように調整した。
なお、コントロールとして、ゲルを含まない５％ウシ胎児血清含有ＥＲＤＦ培地（極東製薬工業株式会社製）のみで培養したものとした。
ローラーの回転速度は１ｒｐｍに設定した。
ローラーボトルの培養開始後、７日目にそれぞれの細胞を１６００×ｇ、５分間の遠心分離で回収し、培養開始時と同じ培地で再懸濁して継代し、１４日目まで培養した。細胞数は血球計算板で計測した。図７は、培養７日目の継代の前と後で細胞数及び生存率の変化を示した。その結果、いずれも継代後に細胞数が増大したものの、生存率はガラスの方が若干低下していた。【００５１】
［酵素抗体法によるＩＦＮ−β産生量の測定］
培養上清中のＩＦＮ−β産生量を酵素抗体法は実施例２に記載と同一である。
図８にローラーボトルの素材の違い（ガラス製かポリスチレン製か）によるインターフェロンβ産生量を示した。培養後７日目の継代前では、ガラス製のローラーボトルにゲル添加した実験系が若干ＩＦＮ−β産生量が若干低いものの、その他の系ではＩＦＮ−β産生量に大きな違いはなかった。一方、培養開始７日目に継代した培養後は、ポリスチレン製のローラーボトルにゲルを添加したものが顕著にＩＦＮ−β産生量が向上し、その効果はゲルを添加しない系の約１．５倍に達した。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
以上詳述したように、本発明の動物細胞用培地添加剤を用いると、有用なタンパク質の産生量を促進することができる。
また、本発明のタンパク質の製造法は、さらに所望のタンパク質をより一層効率的に製造できることから、製造コストの点からも有利であり、例えば、抗体医薬等のバイオ医薬品などの大量供給に大きく貢献することができる。【００５３】
本出願は、日本国特許出願、特願2012-184508（出願日：2012年8月23日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。【００５４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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