(57)【要約】  本発明は、多能性幹細胞の分化の度合いを判別する方法であって、培養された多能性幹細胞の平坦度を決定するステップを含み、平坦度は、一細胞の表面の平坦度又は細胞集団の表面の平坦度であり、平坦度が分化の度合いの指標となる、方法を提供する。
2014041935.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の分化の度合いを判別する方法であって、
培養された多能性幹細胞の平坦度を決定するステップを含み、
前記平坦度は、一細胞の表面の平坦度又は細胞集団の表面の平坦度であり、
前記平坦度が分化の度合いの指標となる、
方法。
【請求項２】
前記平坦度が、顕微鏡の視野単位における平坦度である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記平坦度が、顕微鏡の視野内の関心領域単位における平坦度である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記平坦度が、１つの細胞における平坦度である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記平坦度が、細胞表面又は細胞集団の表面の高さの標準偏差であり、
細胞表面の高さは、培養容器に接着している細胞底面から培養容器に接着していない細胞表面までの距離であり、
細胞集団の表面の高さは、培養容器に接着している細胞集団の底面から培養容器に接着していない細胞集団の表面までの距離である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記平坦度が、所定の水平方向距離における平均二乗高低差の値である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記平坦度が、所定の２点の水平方向距離におけるバリオグラムの傾きである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記平坦度が、細胞表面又は細胞集団の表面の高さの平均値で規格化されている、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記平坦度が、反射型定量位相顕微鏡を用いて決定される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞の分化の度合いを判別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞は、多種の細胞へ分化する多能性を有するため、例えば再生医療の分野において様々な組織修復又は再生への応用が考えられる。しかしながら、胎児由来の細胞を用いるため、細胞源が限られていること、倫理上の問題が議論されていること等の原因で、実際に医療に応用することは難しいとされている。そのような問題を解決するため、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、以下「ｉＰＳ細胞」ともいう。）が開発された。ｉＰＳ細胞は、自己複製能と多分化能を有する、成体細胞から人工的に誘導される多能性幹細胞である。ｉＰＳ細胞は成体細胞から誘導されるため、胚性幹細胞に比べて細胞源が比較的に豊富であり、更に倫理上の問題も少なく、再生医療等への応用に好適である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｍｉｔｓｕｉ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１１３，２００３年，ｐｐ．６３１−６４２
【非特許文献２】Ｘｕ，Ｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２，２００５年，ｐｐ．１８５−１９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ｉＰＳ細胞は株化された培養細胞とは異なり、培養を継続している間に、非特異的かつ容易に、より成熟な細胞に分化する傾向がある。分化したｉＰＳ細胞は、徐々に継続培養ができなくなり、更に、多分化能を失うため、再生医療等への応用に向かなくなるという問題点がある。したがって、ｉＰＳ細胞を培養するにあたり、分化の度合いを判別し、分化の度合いが非適切な細胞を取り除く細胞品質の管理が必要となる。【０００５】
従来、分化の度合いを判別するために、位相コントラスト顕微鏡画像に基づいて目視で判別する方法が知られているが、位相コントラスト顕微鏡は定量性を欠き、細胞の分化の度合いを正確に反映していない。【０００６】
また、より正確に細胞の分化の度合いを判別する方法として、一般的には、例えば、非特許文献１に開示されているように、細胞を抗体で染色する方法及びアルカリフォスファターゼ等で染色する方法が知られている。しかしながら、これらの方法では細胞を破壊する必要がある。また、細胞を生きたまま判別する方法として、特異的な細胞表面マーカーを蛍光ラベルで標識された抗体等で認識する方法、例えば、非特許文献２に開示されているように、未分化マーカーに対する抗体で細胞を認識させてＦＡＣＳで測定する方法が知られている。しかしながら、ｉＰＳ細胞等のような多能性幹細胞は、環境変化に敏感であり、蛍光試薬等の外部試薬は、多能性幹細胞の分化及び性質に影響を与える可能性がある。さらに、このような細胞を再生医療等に応用し、人体に移植する場合も、外部試薬等の混入及び操作の煩雑さによる汚染のリスクを避けるべきである。したがって、非染色かつ非侵襲的な分化の度合いの判別方法が必要となる。【０００７】
本発明は、上述の事情に鑑みて、細胞の分化の度合いを非染色、かつ非侵襲的に判別できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、培養された未分化の多能性幹細胞は、分化した細胞に比べて、表面が平坦であることを見出した。以上の知見に基づいて、本発明者らは、本発明の完成に至った。【０００９】
すなわち、本発明は、平坦度を指標とする、多能性幹細胞の分化の度合いを判別する方法に関する。上記判別方法は、培養された多能性幹細胞の平坦度を決定するステップを含む。上記判別方法において、平坦度が分化の度合いの指標となり、具体的には、細胞表面又は細胞集団の表面がより平坦であれば、細胞はより未分化であり、細胞表面又は細胞集団の表面がより平坦でなければ、細胞はより分化したものである。したがって、上記判別方法を用いることにより、未分化の多能性幹細胞と分化した多能性幹細胞を判別することができ、更に分化の度合いを判別することもできる。なお、本明細書において、平坦度は、一細胞の表面の平坦度又は細胞集団の表面の平坦度である。【００１０】
細胞集団の表面の平坦度は、具体的には、顕微鏡の視野単位における平坦度であってもよく、顕微鏡の視野内の関心領域（以下、「ＲＯＩ」ともいう。）単位における平坦度であっでもよい。【００１１】
顕微鏡の視野単位における平坦度を用いることよって、培養系全体の分化の度合いを判別できると共に、より簡便、かつ効率的に平坦度を決定することができ、より効率的に分化の度合いを判別することができる。【００１２】
顕微鏡の視野内の関心領域単位における平坦度を用いることによって、サンプル数を容易に増やすことができる。【００１３】
平坦度はまた、一細胞（一つの細胞）における平坦度であってもよい。顕微鏡の視野内の細胞について、一つの細胞を単位とした場合における平坦度を用いることによって、より正確な生理学的な本質に即した方法で平坦度を決定することができ、より正確な分化の度合いを判別することができる。【００１４】
平坦度は、細胞表面又は細胞集団の表面の高さの標準偏差であってもよい。これにより、平坦度を簡単に決定することができる。なお、細胞表面の高さとは、培養容器に接着している細胞底面から培養容器に接着していない細胞表面までの距離であり、細胞集団の表面の高さとは、培養容器に接着している細胞集団の底面から培養容器に接着していない細胞集団の表面までの距離である。【００１５】
平坦度はまた、所定の水平方向距離における平均二乗高低差（以下、「ＭＳＨＤ」ともいう。）の値であってもよい。これにより、対象物の空間の位置が反映された平坦度の値が得られ、より正確に多能性幹細胞の分化の度合いを判別することができる。【００１６】
さらに、平坦度は所定の２点の水平方向距離におけるバリオグラムの傾きであってもよい。これにより、より判別能が優れた多能性幹細胞の分化の度合いの判別方法を提供できる。【００１７】
平坦度は、細胞表面又は細胞集団の表面の高さの平均値で規格化されてもよい。これにより、細胞又は細胞集団間の細胞表面の平均的な高さの差による影響を補正することができる。【００１８】
平坦度は、反射型定量位相顕微鏡を用いて決定することができる。これにより、細胞の３次元的な形態を１ミクロン以下の分解能で得ることができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、細胞の分化の度合いを非染色、かつ非侵襲的に判別できる方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】未分化の多能性幹細胞（ａ）及び分化誘導された多能性幹細胞（ｂ−ｄ）の垂直断面の模式図である。
【図２】実施例１において、反射型定量位相顕微鏡を用いて６０μｍ×８０μｍ視野内の細胞の３次元画像を撮影し、３次元データの断層像から抽出した細胞の底面及び表面形状を示す図である。細胞は、ＭＣＦ７細胞、未分化のｉＰＳ細胞及びレチノイン酸を添加して培養したｉＰＳ細胞を用いた。
【図３】実施例１において、反射型定量位相顕微鏡を用いて６０μｍ×８０μｍ視野内の細胞の３次元画像を撮影し、数値化してプロットした図である。細胞は、未分化のｉＰＳ細胞及びレチノイン酸を添加して培養したｉＰＳ細胞を用いた。
【図４】実施例２における未分化のｉＰＳ細胞及びレチノイン酸を添加して培養したｉＰＳ細胞の平坦度を示す図である。平坦度は、顕微鏡の視野内のＲＯＩ単位における、細胞表面の高さの平均値で規格化した細胞表面の高さの標準偏差として算出した。
【図５】実施例３における未分化のｉＰＳ細胞及びレチノイン酸を添加して培養したｉＰＳ細胞の、細胞表面の高さの平均値で規格化したバリオグラムを示す図である。測定は、顕微鏡の視野内のＲＯＩ単位で行った。
【図６】実施例３における未分化のｉＰＳ細胞及びレチノイン酸を添加して培養したｉＰＳ細胞のバリオグラムを解析した結果を示す。平坦度は、水平方向距離（Δｒ）が１５μｍであるときの、細胞表面の高さの平均値で規格化したＭＳＨＤの値として算出した。
【図７】実施例３における未分化のｉＰＳ細胞及びレチノイン酸を添加して培養したｉＰＳ細胞（各々３コロニー）全体の細胞を母集団としたときの細胞表面の高さの平均値で規格化したバリオグラムを解析して得られたヒストグラムである。Δｒは１５μｍである。
【図８】実施例４における未分化のｉＰＳ細胞及びレチノイン酸を添加して培養したｉＰＳ細胞の平坦度を示す図である。平坦度は、細胞表面の高さの平均値で規格化したバリオグラムの、Δｒが５μｍ〜１５μｍの範囲の傾きとして算出した。測定は、顕微鏡の視野内のＲＯＩ単位で行った。
【図９】実施例５における未分化のｉＰＳ細胞及びＤＭＥＭ培地で培養したｉＰＳ細胞の各種方法によって算出した平坦度を示す図である。測定は、顕微鏡の視野内のＲＯＩ単位で行った。
【図１０】実施例６における平坦度を示す図である。測定は、顕微鏡の視野単位で行った。平坦度は、細胞表面の高さの平均値で規格化したＭＳＨＤの値として算出した。Δｒは５μｍである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２２】
本発明は、平坦度を指標とする、培養された多能性幹細胞の平坦度を決定するステップを含む、多能性幹細胞の分化の度合いを判別する方法を提供する。
【００２３】
本発明によれば、本発明者らが見出した、培養された未分化の多能性幹細胞が分化した細胞に比べて平坦である、との特徴を用いて、培養された多能性幹細胞の分化の度合いを判別することができる。
【００２４】
未分化の多能性幹細胞及び分化誘導された多能性幹細胞の平坦度について、垂直断面の模式図である図１を用いて説明する。未分化の多能性幹細胞は、図１ａで示したように、細胞表面又は細胞集団の表面は平坦である。一方、例えばレチノイン酸等の添加により分化が誘導された多能性幹細胞の表面は平坦ではなくなり、図１ｂで示されているように、個々の細胞においては細胞表面の平坦度が維持されているものの、１視野又は１コロニー内の細胞間が平坦ではなくなっていることがある。また、図１ｃで示されているように個々の細胞において表面が平坦ではなくなっていることもある。実際、本発明者らは、多能性幹細胞に分化を誘導することにより、図１ａの状態から図１ｂに向かう変化及び図１ｃに向かう変化が同時に起こり、細胞が図１ｄの状態になることを見出した。
【００２５】
本発明の判別方法を用いることにより、非染色かつ非侵襲的な方法で細胞の分化の度合いを判別することができる。分化した細胞は細胞単位、コロニー単位又はディッシュ単位で除去することができ、それにより、多能性幹細胞の細胞品質の管理を容易に行うことができる。
【００２６】
本明細書において、多能性幹細胞の種類は特に限定されず、幹細胞の性質、すなわち、培養において永久に分裂することができ、かつ、１つ以上の細胞種に分化する能力を持てばよい。このような細胞は、自然に存在する幹細胞であってもよく、人工的に誘導される多能性幹細胞であってもよい。また、上記多能性幹細胞は、胎児由来であってもよく、小腸上皮幹細胞、各細胞種の前駆細胞、及び成体細胞から誘導されるｉＰＳ細胞等のような成体組織由来の幹細胞であってもよい。細胞源及び倫理の観点から、多能性幹細胞は、胚性幹細胞以外の細胞が好ましく、人工的に誘導された多能性幹細胞であることがより好ましく、ｉＰＳ細胞であることが更に好ましい。
【００２７】
多能性幹細胞の分化能は特に限定されず、１つ以上の細胞種に分化する能力を持てばよい。すなわち、多能性幹細胞は、例えば全能性である胚性幹細胞、様々な臓器及び細胞種の幹細胞、並びに様々な細胞種の前駆細胞である。
【００２８】
ｉＰＳ細胞は、動物の成体細胞から誘導されることが好ましく、マウス、ラット、ヒト等の哺乳類動物の成体細胞から誘導されることがより好ましく、ヒトの成体細胞から誘導されることが更に好ましい。
【００２９】
ｉＰＳ細胞が由来する細胞種及び組織は特に限定されず、例えば線維芽細胞、皮膚上皮細胞及び造血前駆細胞が挙げられる。
【００３０】
ｉＰＳ細胞の作製方法は特に限定されず、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ−４及びＣ−ＭＹＣ遺伝子からなる遺伝子群、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ−４遺伝子からなる遺伝子群等のｉＰＳ細胞誘導因子を導入することにより誘導することができる。
【００３１】
本明細書における分化とは、それにより細胞が特化した機能を発揮するのに必要な生化学的及び形態学的性質を獲得する進行性の形質転換の過程のことである。本明細書における分化の度合いとは、全能性である胚性幹細胞から各成体における分化能を失った成体細胞、すなわち末端分化した細胞までの分化の進行程度を示すものである。かかる分化の度合いは各細胞及び各組織によって異なるが、その基準は、当業者が応用目的等によって適宜決めることができる。なお、未分化の細胞とは、分化の度合いがより低いもの、すなわち分化能がより高い細胞を示すものであり、分化した細胞とは、分化の度合いがより高いもの、すなわち分化能がより低い細胞を示すものである。
【００３２】
上記多能性幹細胞は、培養ディッシュ、カバーガラス等でインビトロ培養された多能性幹細胞であり、好ましくはガラス製の培養ティッシュで培養された多能性幹細胞である。また、培養ディッシュの表面は、反射防止コーティングでコーティングされることが好ましい。これにより、細胞を顕微鏡等で観察又は測定する際、ガラスからの光の反射の影響を抑制することができる。
【００３３】
平坦度は、１つの細胞における平坦度として決定することができる。この場合、平坦度は、１つの細胞内で少なくとも垂直方向に１μｍ間隔で断層画像を撮って断面層を作り、表面形状を抽出してデータ処理することによって決定することができる。視野内の細胞一個一個の単位で平坦度を決定することによって、細胞の生理学的な本質をより正確に判別することができる。
【００３４】
平坦度はまた、複数の細胞からなる細胞集団、例えば視野単位又は視野内のＲＯＩ単位における平坦度として決定することができる。この場合、平坦度は、１つの細胞集団内で少なくとも垂直方向に１μｍ間隔で断層画像を撮って断面層を作り、表面形状を抽出してデータ処理することによって決定することができる。
【００３５】
細胞集団を構成する細胞数の範囲は、多能性幹細胞の由来、培養条件、応用目的等により当業者が適宜決めることができる。多能性幹細胞がヒト成人線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞である場合、かかる細胞集団は、好ましくは少なくとも２０個の細胞、より好ましくは少なくとも５０個の細胞からなる細胞集団である。このような細胞集団を選択することによって、培養系における極端な状態の細胞に起因する偏りを避けることができる。
【００３６】
視野単位で平坦度を決定することによって、多数の細胞からの情報を容易に得ることができ、培養系全体の多能性幹細胞の分化の度合を簡単に判別することができる。この場合、信憑性を向上させるため、１つの細胞集団につき、好ましくは少なくとも４視野、より好ましくは少なくとも７視野について平坦度を決定する。
【００３７】
細胞集団内での被撮像視野の取り方としては、例えば中央付近をランダムにピックアップするランダムサンプリング方法と、一方向に順番に視野を移動していくシーケンシャルサンプリング方法が挙げられる。ランダムサンプリング方法を用いることにより、培養系全体の多能性幹細胞の分化の度合をより簡単に判別することができる。シーケンシャルサンプリング方法を用いることにより、細胞集団全体を形成する多能性幹細胞の分化の度合をより正確に判別することができる。
【００３８】
視野内のＲＯＩ単位で平坦度を決定することによって、より容易に多くの細胞集団からの情報を得ることができ、より正確に細胞の分化の度合を判別することができる。それによって、サンプリング検査を行うだけで、培養系全体の多能性幹細胞の分化の度合を判別することができる。また、視野を複数のＲＯＩに分割することにより、装置の仕様に関わらず取れるＲＯＩ単位で解析することができ、汎用性が高い。
【００３９】
視野内のＲＯＩ単位で平坦度を決定する場合、ＲＯＩの大きさ及び１視野の分割の数は、多能性幹細胞の由来、培養条件、応用目的等により当業者が適宜決めることができる。信憑性及び生理学的な意味の観点から、好ましくは、ＲＯＩの大きさは細胞の大きさの程度である。多能性幹細胞が線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞である場合、かかるＲＯＩの大きさは、１０μｍ×１０μｍ〜３０μｍ×３０μｍ程度であることが好ましく、２３μｍ×２３μｍであることが更に好ましい。また、１視野の大きさは、６つ以上のＲＯＩを含むことができる程度の広さを持つことが望ましく、８０μｍ×６０μｍ以上であることがより好ましい。
【００４０】
平坦度を指標に多能性幹細胞の分化の度合を判別する際、細胞表面又は細胞集団の表面がより平坦であれば、細胞はより未分化であり、細胞表面又は細胞集団の表面がより平坦でなければ、細胞はより分化したものであることを示す。平坦度は顕微鏡観察により確認してもよいが、客観的な評価をするためには算出して数値化することが好ましい。平坦度の算出方法は、未分化の多能性幹細胞と分化した細胞の平坦度とを区別できるものであればよく、特に限定されない。かかる方法は、例えば以下で説明する算出方法がある。なお、特に規定がない限り、細胞との記載は、細胞集団を含み、細胞表面との記載は、細胞集団の表面を含み、細胞底面との記載は、細胞集団の底面を含む。
【００４１】
平坦度は、細胞表面の高さの標準偏差として算出することができる。この場合、数値が小さいほど細胞が平坦であってより未分化であり、数値が大きいほど細胞が平坦ではなくなっていてより分化したものである。この方法を用いることにより、平坦度を容易に算出することができる。
【００４２】
平坦度はまた、所定の水平方向距離におけるＭＳＨＤの値であってもよい。表面形状Ｚ（ｘ，ｙ）が与えられ、Ｚ上で水平方向にΔｒだけ離れた２点、Ａ（ｘ１，ｙ１）、Ｂ（ｘ２，ｙ２）を取ったとき、かかるＭＳＨＤは、下記式（Ｉ）で表すことができる。
ＭＳＨＤ（Δｒ）＝＜（ｚ（ｘ１，ｙ１）−ｚ（ｘ２，ｙ２））２＞  （Ｉ）
式中、ｚ（ｘ１，ｙ１）はＡにおける細胞表面の高さであり、ｚ（ｘ２，ｙ２）はＢにおける細胞表面の高さであり、＜＞はアンサンブル平均である。また、（ｘ１，ｙ１）及び（ｘ２，ｙ２）は、下記式（ＩＩ）を満たす任意の組み合わせである。
Δｒ＝（（ｘ１−ｘ２）２＋（ｙ１−ｙ２）２））１／２    （ＩＩ）
【００４３】
平坦度を所定の水平方向距離におけるＭＳＨＤの値として算出することにより、対象物の空間の位置が反映された平坦度の値が得られ、より正確に多能性幹細胞の分化の度合を判別することができる。この場合、数値が小さいほど細胞が平坦であってより未分化であり、数値が大きいほど細胞が平坦ではなくなっていてより分化したものである。
【００４４】
ＭＳＨＤを水平方向距離の関数として表したものは、一般的にバリオグラムと呼ばれる。すなわち、表面形状Ｚ（ｘ，ｙ）が与えられ、Ｚ上で水平方向にΔｒだけ離れた２点、Ａ（ｘ１，ｙ１）、Ｂ（ｘ２，ｙ２）を取ったとき、点Ａと点Ｂの取り方は幾通りもあるが、そのようにして取ったときの高さの差の二乗をアンサンブル平均したものがバリオグラムとなる。バリオグラムは、例えばＧｌｅｎｎ，  Ｎら、Ｇｅｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ７３  （２００６）：１３１−１４８）が記載したように、表面形状の平坦度を数値化する指標として、地形やＳＥＭ画像の表面形状の解析、フラクタル解析等に使われているものである。
【００４５】
Δｒは、未分化多能性幹細胞と、分化した細胞との差が充分明確に判別できる点であればよく、特に限定されない。かかるΔｒは、多能性幹細胞の由来、応用目的等によって当業者が適宜に決めることができる。
【００４６】
平坦度はまた、所定の２点の水平方向距離におけるバリオグラムの傾きであってもよい。この場合、数値が小さいほど細胞が平坦であってより未分化であり、数値が大きいほど細胞が平坦ではなくなっていてより分化したものである。かかる所定の２点の水平方向距離は、未分化の多能性幹細胞と、分化した細胞との差が充分明確に判別できる点であればよく、特に限定されない。平均二乗高低差とバリオグラムの傾きとの関係は、下記式（ＩＩＩ）で表せる。
ＭＳＨＤ（Δｒ）∝ΔｒＳ    （ＩＩＩ）
式中、Ｓはバリオグラムを両対数表示したグラフにおける傾きである。なお、両対数グラフの性質より、横軸Δｒあるいは縦軸ＭＳＨＤを規格化することにより定数倍しても、グラフは平行移動するだけであり、傾きＳは横軸及び縦軸の定数倍に対して不変であることに注意されたい。また、前述のＧｌｅｎｎ，  Ｎらの文献にも示されている通り、バリオグラムを両対数グラフで表示し、その傾きＳによって表面形状の統計的性質を評価することは、既知の数学的手法である。
【００４７】
平坦度は例えば細胞表面の高さの平均値等で規格化されることが好ましい。それにより、細胞又は細胞集団間の細胞表面の高さの差による影響を補正することができ、より正確な分化の度合いを表せるだけではなく、複数の細胞又は細胞集団間の分化の度合いを比較して判別することもできる。
【００４８】
分化の度合いを判別する方法をより具体的に説明する。かかる方法は例えば、未分化の多能性幹細胞を陽性対照にし、判別対象となる細胞とを比較して判別することができる。この場合、判別対象となる細胞が、陽性対照の多能性幹細胞と同様、又はそれよりも平坦であると、判別対象となる細胞は未分化であると判別することができる。
【００４９】
また、分化した細胞を陰性対照にし、判別対象となる細胞とを比較する方法もある。この場合、判別対象となる細胞が陰性対照の細胞と同様、又はそれよりも平坦ではなくなると、判別対象となる細胞は分化したと判別することができる。
【００５０】
さらに、別の判別方法として、未分化の多能性幹細胞の陽性対照と、分化した細胞の陰性対照のそれぞれの平坦度を予め算出し、それに基づいて判別基準値を設定することができる。かかる判別基準値は、当業者が多能性幹細胞の由来、培養条件、応用目的等によって適宜決めることができる。
【００５１】
なお、上記陽性対照及び陰性対照となる細胞は、多能性幹細胞の応用目的等に応じて当業者が適宜決めることができるが、例えば、未分化の多能性幹細胞を陽性対照に、末端分化した多能性幹細胞を陰性対照にすることができる。好ましくは、これらの細胞は同じ細胞種に由来するものであり、より好ましくは同じ未分化の多能性幹細胞由来のものである。また、かかる判別方法及び判別基準値等も、応用目的等に応じて当業者が適宜決めることができる。
【００５２】
細胞の表面形状を抽出する方法は特に限定されないが、細胞の形態を正確に表すために３次元イメージング装置を用いた方法が好ましい。これにより、従来の位相コントラスト顕微鏡を用いるときに生じる細胞内物質による透過光を屈折させる問題を解決することができ、細胞表面を正確に測定することができる。
【００５３】
また、３次元イメージング装置は、非侵襲的な３次元イメージング装置であることがより好ましく、中でも、定量位相顕微鏡、低コヒーレンス干渉顕微鏡、トモグラフィック位相顕微鏡及び走査型プローブ顕微鏡が更に好ましく、反射型定量位相顕微鏡が特に好ましく、反射型低コヒーレンス定量位相顕微鏡が極めて好ましい。これらの装置を用いることにより、多能性幹細胞への影響及び汚染のリスクを最小限に抑えることができ、医療への応用の観点から優れる。
【００５４】
定量位相顕微鏡としては、例えば、特許第４０９０２４４号公報及び特開２０１０−４８６１９号公報に開示されるものが挙げられる。定量位相顕微鏡を用いることにより、位相シフト干渉法を用いて光場の強度及び位相を定量的に測定することができる。また、細胞表面を正確に測定する観点から、反射型定量位相顕微鏡であることが好ましい。反射型定量位相顕微鏡を用いることにより、細胞の３次元的な形態像を１ミクロン以下の分解能で得ることができる。
【００５５】
低コヒーレンス干渉顕微鏡を用いることにより、細胞内の特定のセクション平面をプローブすることができ、コヒーレンスゲートの縦位置を細胞膜に調整することにより、細胞内の構造に関係なく、細胞膜によって反射される光のみが干渉に関わるようにすることができる。
【００５６】
トモグラフィック位相顕微鏡を用いることにより、細胞の３次元形態を画像再構成することができる。
【００５７】
走査型プローブ顕微鏡を用いることにより、細胞底面と、細胞表面との距離を直接測定することができる。
【００５８】
反射型低コヒーレンス定量位相顕微鏡を用いることによって、細胞の表面形状を高精度で抽出することができる。反射型低コヒーレンス定量位相顕微鏡としては、例えばＹａｍａｕｃｈｉ  Ｔら、Ｐｒｏｃ．  ｏｆ  ＳＰＩＥ  Ｖｏｌ．  ８２２５：８２２５０Ｇ−１及びＹａｍａｕｃｈｉ  Ｔら、Ｐｒｏｃ．  ｏｆ  ＳＰＩＥ  Ｖｏｌ．  ８２２５：８２２５０Ａ−１で開示されるものが挙げられる。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００６０】
［実施例１］
反射防止コーティングされた直径３５ｍｍのガラスボトムディッシュに、ヒト成体線維芽細胞由来の２５３Ｇ１  ｉＰＳ細胞株を１０〜２０コロニー／ディッシュとなるよう播種し、最終濃度が４ｎｇ／ｍＬのヒトｂａｓｉｃ  ＦＧＦを含有するＰｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社製、商品名：ＲＣＨＥＭＤ００１）培地を用いてオンフィーダ培養した。１つのコロニーの大きさは２００μｍ程度であった。フィーダ細胞としてはマウス肺線維芽細胞を用いた。細胞は播種後３日目まで培養した。培地は１日１回交換した。【００６１】
ｉＰＳ細胞の分化用のサンプルは、播種後２日目に最終濃度が４ｎｇ／ｍＬのヒトｂａｓｉｃ  ＦＧＦ及び１２．５μＭのレチノイン酸を含有するＰｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｍｅｄｉｕｍ培地に交換し、更に４日間培養した。レチノイン酸は、一般的に分化を誘導する試薬として使用されている。また、分化した細胞の対照として、ヒト乳がん由来の上皮細胞であるＭＣＦ７細胞を用いた。ＭＣＦ７細胞は、細胞密度２０％となるよう播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて、ほぼコンフルエントになるまで３日間培養した。ＭＣＦ７細胞を除く各培養系において、培地は１日１回交換した。【００６２】
反射型定量位相顕微鏡を用いて細胞の形態を観察した。図１に、細胞の垂直断面の模式図を示した。レチノイン酸を添加して培養したｉＰＳ細胞は、細胞表面が平坦ではなくなり、図１ｂ−ｄに示した表面形状を有していた。これと対照的に、未分化のｉＰＳ細胞は、細胞表面が比較的平坦であり、図１ａに示した表面形状を有していた。【００６３】
以下の実施例においては、平坦度の指標として、細胞表面の高さの平均値で規格化した細胞表面の高さの標準偏差の値、細胞表面の高さの平均値で規格化したＭＳＨＤの値、細胞表面の高さの平均値で規格化したバリオグラム、及びバリオグラムの傾きの４つの指標を示す。これら４つの指標においては、前述した通り、値が小さいほど細胞及び細胞集団は平坦であることを示し、値が大きいほど細胞及び細胞集団が平坦ではないことを示す。【００６４】
細胞の底面及び表面形状は次のようにして抽出した。反射型定量位相顕微鏡を用いて６０μｍ×８０μｍ視野内の細胞について、水平方向に０．１２５μｍ間隔、及び垂直方向に０．３２μｍ間隔で３次元データを取得し、得られたデータから断層像を作成した。作成した断層像から、図２〜３に示したように、底面及び表面形状を抽出し、数値化した。この処理を視野全体において行うことで、視野全体の底面及び表面形状を得た。得られた底面及び表面形状から、細胞表面の高さを測定した。平坦度を細胞表面の高さの平均値で規格化された細胞表面の高さの標準偏差として算出し、統計処理をした。算出した各サンプルの平坦度を、表１に示した。レチノイン酸を添加して培養したｉＰＳ細胞の平坦度は、未分化のｉＰＳ細胞の平坦度より高く、ＭＣＦ７細胞の平坦度より低かった。【００６５】
【表１】
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【００６６】
［実施例２］
未分化のｉＰＳ細胞３コロニー、及びレチノイン酸を添加して培養したｉＰＳ細胞３コロニーについて、それぞれのコロニーの中央部付近で７〜１５視野を解析した。各視野内を６つのＲＯＩに分割し、各ＲＯＩ単位において実施例１と同じ条件で細胞の底面及び表面形状を抽出して細胞表面の高さを測定した。ＲＯＩの大きさは２３μｍ×２３μｍであった。平坦度を、細胞表面の高さの平均値で規格化された細胞表面の高さの標準偏差として算出し、統計処理をしてスチューデントｔ検定を行った。結果を表２及び図４に示した。レチノイン酸を添加して培養したｉＰＳ細胞の平坦度は、未分化のｉＰＳ細胞の平坦度より高く、その差は有意であった。【００６７】
【表２】
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【００６８】
［実施例３］
実施例２と同じ条件で、未分化のｉＰＳ細胞及びレチノイン酸を添加して培養したｉＰＳ細胞について、水平方向に０．１２５μｍ間隔、及び垂直方向に０．３２μｍ間隔の３次元データを取得し、得られたデータから断層像を作成した。作成した断層像から、細胞の底面及び表面形状を抽出し、バリオグラム解析を行った。具体的には、Δｒが０．２５μｍ〜１５μｍの範囲におけるＭＳＨＤの値を上述した式（Ｉ）で算出し、細胞表面の高さの平均値で規格化した。図５に示したように、レチノイン酸を添加して培養したｉＰＳ細胞の平坦度は、未分化のｉＰＳ細胞の平坦度より高かった。【００６９】
次に、Δｒが１５μｍにおけるＭＳＨＤの値を算出して細胞表面の高さの平均値で規格化し、平坦度を算出した。結果を対数グラフとして示す（図６）。統計解析においては、結果の常用対数を計算してスチューデントｔ検定を行った（表３）。レチノイン酸を添加して培養したｉＰＳ細胞の平坦度は、未分化のｉＰＳ細胞の平坦度に比べて顕著に高かった。また、各群コロニー１〜３全体（すなわち、Ｃｏｎｔ１〜Ｃｏｎｔ３全体、又はＲＡ−１〜ＲＡ−３全体）を母集団としてΔｒが１５μｍにおける平坦度と細胞の割合との関係をヒストグラムとして示した場合、明らかなシフトが確認された（図７）。【００７０】
【表３】
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【００７１】
［実施例４］
実施例３と同様に、細胞表面の高さの平均値で規格化したＭＳＨＤの値を用いてバリオグラム解析を行い、Δｒが５μｍ〜１５μｍの範囲におけるバリオグラムの傾きを、上述した式（ＩＩＩ）を用いて算出し、平坦度とした。次に、統計解析をしてスチューデントｔ検定を行った。その結果を表４及び図８に示した。レチノイン酸を添加して培養したｉＰＳ細胞の平坦度は、未分化のｉＰＳ細胞の平坦度に比べて顕著に高かった。【００７２】
【表４】
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【００７３】
［実施例５］
ｉＰＳ細胞の分化用のサンプルを、播種後４日目に培地を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に交換し、播種後７日目まで培地交換を行わずに培養したこと以外、実施例１と同様に細胞のサンプルを準備して、播種後７日目に測定を行った。【００７４】
平坦度を実施例２〜４と同様に、視野内のＲＯＩ単位において、細胞表面の高さの平均値で規格化した細胞表面の高さの標準偏差、細胞表面の高さの平均値で規格したΔｒが１５μｍにおけるＭＳＨＤの値、及びΔｒが５〜１５μｍにおけるバリオグラムの傾きとして算出した。統計解析をしてスチューデントｔ検定を行った。結果を表５及び図９に示した。なお、バリオグラムは、細胞表面の高さの平均値で規格化したΔｒが５μｍ〜１５μｍの範囲のＭＳＨＤの値を表す。【００７５】
【表５】
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【００７６】
［実施例６］
実施例２における各サンプルを用いて、未分化のｉＰＳ細胞について１コロニー（１５視野）、レチノイン酸を添加して培養したｉＰＳ細胞について２コロニー（それぞれ１１及び１３視野）の被撮像を用いて、視野単位における細胞表面の高さを実施例２と同じ条件で反射型定量位相顕微鏡を用いて測定した。Δｒが５μｍにおけるＭＳＨＤの値を算出して細胞表面の高さの平均値で規格化した後、常用対数を取り、平坦度を算出した。統計解析をしてスチューデントｔ検定を行った。結果を表６及び図１０に示した。レチノイン酸を添加して培養したｉＰＳ細胞の平坦度は、未分化ｉＰＳ細胞の平坦度に比べて顕著に高かった。【００７７】
【表６】
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【図１】
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【図４】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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