(57)【要約】  本発明は、神経活動依存的に活性を生じ、かつ高感度でダイナミックレンジが大きい人工プロモータを提供し、かかるプロモータを利用して神経活動部位を同定する方法等を提供することを課題とする。  本発明は、神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAであって、Arc/Arg3.1遺伝子のプロモータ上のシナプス活動応答性エレメント（SARE）のうち、CREB結合部位、MEF2結合部位、及びSRF結合部位を含むフラグメントが、少なくとも2回タンデムに連結されたコンストラクトを含む、DNAを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAであって、
Arc/Arg3.1遺伝子のプロモータ上のシナプス活動応答性エレメント（SARE）のうち、CREB結合部位、MEF2結合部位、及びSRF結合部位を含むフラグメントが、少なくとも2回タンデムに連結されたコンストラクトを含む、DNA。
【請求項２】
前記SAREのうち、CREB結合部位、MEF2結合部位、及びSRF結合部位を含むフラグメントが、5回タンデムに連結されたコンストラクトを含む、請求項１に記載の神経活動依存的プロモータ活性を有するDNA。
【請求項３】
神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAであって、
以下の(i)〜(iv)のいずれかのDNAが、少なくとも2回タンデムに連結されたコンストラクトを含む、DNA：
(i)配列番号：２、３、又は４で表される塩基配列からなるDNA；
(ii)配列番号：２、３、又は４で表される塩基配列において1又は複数の塩基が欠失、付加又は置換されている配列からなるDNA；
(iii)配列番号：２、３、又は４で表される塩基配列と70％以上の同一性を有する配列からなるDNA；
(iv)配列番号：２、３、又は４で表される塩基配列と相補的な配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるDNA。
【請求項４】
上記(i)〜(iv)のいずれかのDNAが、5回タンデムに連結されたコンストラクトを含む、請求項３に記載の神経活動依存的プロモータ活性を有するDNA。
【請求項５】
前記コンストラクトは、タンデムに連結されたフラグメント又はDNAの間にスペーサを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の神経活動依存的プロモータ活性を有するDNA。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAと、該DNAの下流に連結されたレポーター遺伝子とを含むベクター。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか１項に記載の神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAと、該核酸の下流に連結されたレポーター遺伝子とを含むウイルスベクター。
【請求項８】
アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項７に記載のウイルスベクター。
【請求項９】
さらに、感染マーカー遺伝子の発現カセットを含む、請求項７又は８に記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
請求項６から９に記載のベクターを含む宿主細胞（但し、ヒト生体内の細胞を除く）。
【請求項１１】
請求項６から９に記載のベクターを含む非ヒト動物。
【請求項１２】
請求項６から９のいずれか１項に記載のベクターを神経細胞にトランスフェクトする工程と、
前記レポーター遺伝子の発現を測定して、活動した神経細胞を同定する工程と、
を含む神経細胞の活動検出方法。
【請求項１３】
幹細胞から神経細胞へのいずれかの分化段階で、請求項６から９のいずれか１項に記載のベクターを該細胞にトランスフェクトする工程と、
前記レポーター遺伝子の発現を測定して、神経活動の有無又は強弱を評価する工程と、
を含む神経細胞の分化評価方法。
【請求項１４】
幹細胞から神経細胞へのいずれかの分化段階で、請求項６から９のいずれか１項に記載のベクターを該細胞にトランスフェクトする工程と、
前記レポーター遺伝子の発現を測定して、神経活動の有無又は強弱を評価する工程と、
を含む神経細胞の可塑性の評価方法。
【請求項１５】
請求項６から９のいずれか１項に記載のベクターを含む、脳機能マーカー。
【請求項１６】
請求項６から９のいずれか１項に記載のベクターを神経細胞にトランスフェクトする工程と、
前記神経細胞に候補化合物を投与する工程と、
前記レポーター遺伝子の発現を測定して、神経活動の有無を評価する工程と、
を含む脳機能改善剤のスクリーニング方法。
【請求項１７】
配列番号：５で表される塩基配列を含む、プロモータ活性を有するDNA。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経活動依存的にプロモータ活性を生じるDNA、及びこれを含むベクター等に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳高次機能の本質である認知活動は脳の神経活動がその基礎となっている。このことから、特定の認知活動に伴う神経活動の部位を同定するという試みが電気生理学的手法や機能的核磁気共鳴画像法などによりなされてきたが、前者はシグナルの空間情報に乏しく、後者は血流変化をシグナルとしてとらえていることから、細胞レベルでの神経活動マッピングは不可能である。【０００３】
一方、c-fosまたはArc/Arg3.1などの様々な前初期遺伝子（immediate-early gene；IEG）の発現や、CREBのリン酸化などの転写因子の修飾を利用した神経活動マッピングも試みられてきた（非特許文献１−４参照）。c-fos遺伝子やArc/Arg3.1遺伝子に由来するIEGプロモータを使用して、レポータータンパク質を刺激応答性に発現させる試みもなされ、IEGプロモータによるイメージングが、脳内の高活動部位を標識する技術として使用できる可能性が示唆された（非特許文献２及び５−７参照）。【０００４】
しかしながら、これまでに開発された神経活動依存性レポーター遺伝子を用いて神経細胞のスパイク反応をin vivoで検出する方法では、単一細胞レベルの解析は難しいことがわかってきた。その理由としては、内因性の神経活動依存性プロモータの感度が限られていることや、神経活動依存性プロモータを駆動する様々なin vivoのメカニズムの複雑性などが挙げられる。また、感覚皮質におけるc-fosプロモータの活性化は、認知活動よりも神経細胞の自発的な活動に関連することも示されてきた（非特許文献８参照）。さらに、IEGの上方制御は、局所的なニューロトロフィンの分泌（非特許文献９参照）や神経調節反応（非特許文献１０参照）を反映していることも示唆されている。【０００５】
また、人工的なプロモータの構築も試みられたが、これまでは無作為のランダム変異に基づくアプローチが取られており、内因性プロモータに比較して多少増強されたものしか得られなかった（非特許文献１７、１８）。【０００６】
本発明者ら及び他の研究チームは、これまでに、記憶のエンコードの際、in vivoのArc/Arg3.1転写が、感覚皮質、海馬、へんとう体、及び前頭葉連合野における神経活動の増大に比例することを示した（非文献７及び１１−１６参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】S. M. Sagar, F. R. Sharp, and T. Curran, Science 240 (4857), 1328 (1988).
【非特許文献２】K. Schilling, D. Luk, J. I. Morgan et al., Proc Natl Acad Sci U S A 88 (13), 5665 (1991).
【非特許文献３】H. Bito, K. Deisseroth, and R. W. Tsien, Cell 87 (7), 1203 (1996).
【非特許文献４】J. F. Guzowski, B. L. McNaughton, C. A. Barnes et al., Nat Neurosci 2 (12), 1120 (1999).
【非特許文献５】A. L. Barth, R. C. Gerkin, and K. L. Dean, J Neurosci 24 (29), 6466 (2004).
【非特許文献６】V. Grinevich, A. Kolleker, M. Eliava et al., J Neurosci Methods 184 (1), 25 (2009).
【非特許文献７】T. Kawashima, H. Okuno, M. Nonaka et al., Proc Natl Acad Sci U S A 106 (1), 316 (2009).
【非特許文献８】L. Yassin, B. L. Benedetti, J. S. Jouhanneau et al., Neuron 68 (6), 1043.
【非特許文献９】E. Messaoudi, T. Kanhema, J. Soule et al., J Neurosci 27 (39), 10445 (2007).
【非特許文献１０】C. Cirelli and G. Tononi, Sleep 23 (4), 453 (2000).
【非特許文献１１】Y. Tagawa, P. O. Kanold, M. Majdan et al., Nat Neurosci 8 (3), 380 (2005).
【非特許文献１２】A. Vazdarjanova, V. Ramirez-Amaya, N. Insel et al., J Comp Neurol 498 (3), 317 (2006).
【非特許文献１３】H . Okuno, K . Akashi, Y . Ishii et al., Cell 149(4):886 (2012).
【非特許文献１４】Y. Zhang, H. Fukushima, and S. Kida, Mol Brain 4, 4.
【非特許文献１５】J. H. Han, S. A. Kushner, A. P. Yiu et al., Science 316 (5823), 457 (2007).
【非特許文献１６】D. Tse, T. Takeuchi, M. Kakeyama et al., Science 333 (6044), 891.
【非特許文献１７】A. Melnikov, A. Murugan, X. Zhang et al., Nat Biotechnol 30 (3), 271 (2012).
【非特許文献１８】R. P. Patwardhan, J. B. Hiatt, D. M. Witten et al., Nat Biotechnol 30 (3), 265 (2012).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、神経活動依存的に活性を生じ、かつ高感度でダイナミックレンジが大きい人工プロモータを提供し、かかるプロモータを利用して神経活動部位を同定する方法等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、脳の神経活動に伴って発現量が変化するArc/Arg3.1の発現制御領域を詳細に解析し、そのいくつかのフラグメントをタンデムに複数連結したプロモータを設計し、下流にレポーター遺伝子を連結した発現カセットを含むウイルスベクターを作製した。そして、このウイルスベクターを神経細胞に感染させたところ、従来の報告より10倍以上高い感度で認知活動に応答してレポーター遺伝子がプロモータに駆動されて発現し、皮質領域における神経活動を可視化できることを確認した。
本発明は、
〔１〕神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAであって、
Arc/Arg3.1遺伝子のプロモータ上のシナプス活動応答性エレメント（SARE）のうち、CREB結合部位、MEF2結合部位、及びSRF結合部位を含むフラグメントが、少なくとも2回タンデムに連結されたコンストラクトを含む、DNA；
〔２〕前記SAREのうち、CREB結合部位、MEF2結合部位、及びSRF結合部位を含むフラグメントが、5回タンデムに連結されたコンストラクトを含む、上記〔１〕に記載の神経活動依存的プロモータ活性を有するDNA；
〔３〕神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAであって、
以下の(i)〜(iv)のいずれかのDNAが、少なくとも2回タンデムに連結されたコンストラクトを含む、DNA：
(i)配列番号：２、３、又は４で表される塩基配列からなるDNA；
(ii)配列番号：２、３、又は４で表される塩基配列において1又は複数の塩基が欠失、付加又は置換されている配列からなるDNA；
(iii)配列番号：２、３、又は４で表される塩基配列と70％以上の同一性を有する配列からなるDNA；
(iv)配列番号：２、３、又は４で表される塩基配列と相補的な配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるDNA；
〔４〕上記(i)〜(iv)のいずれかのDNAが、5回タンデムに連結されたコンストラクトを含む、請求項３に記載の神経活動依存的プロモータ活性を有するDNA；
〔５〕前記コンストラクトは、タンデムに連結されたフラグメント又はDNAの間にスペーサを含む、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の神経活動依存的プロモータ活性を有するDNA；
〔６〕上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載の神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAと、該DNAの下流に連結されたレポーター遺伝子とを含むベクター；
〔７〕上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載の神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAと、該核酸の下流に連結されたレポーター遺伝子とを含むウイルスベクター；
〔８〕アデノ随伴ウイルスベクターである、上記〔７〕に記載のウイルスベクター；
〔９〕さらに、感染マーカー遺伝子の発現カセットを含む、上記〔７〕又は〔８〕に記載のウイルスベクター；
〔１０〕上記〔６〕から〔９〕に記載のベクターを含む宿主細胞（但し、ヒト生体内の細胞を除く）；
〔１１〕上記〔６〕から〔９〕に記載のベクターを含む非ヒト動物；
〔１２〕上記〔６〕から〔９〕のいずれか１項に記載のベクターを神経細胞にトランスフェクトする工程と、
前記レポーター遺伝子の発現を測定して、活動した神経細胞を同定する工程と、を含む神経細胞の活動検出方法；
〔１３〕幹細胞から神経細胞へのいずれかの分化段階で、上記〔６〕から〔９〕のいずれか１項に記載のベクターを該細胞にトランスフェクトする工程と、
前記レポーター遺伝子の発現を測定して、神経活動の有無又は強弱を評価する工程と、を含む神経細胞の分化評価方法；
〔１４〕幹細胞から神経細胞へのいずれかの分化段階で、上記〔６〕から〔９〕のいずれか１項に記載のベクターを該細胞にトランスフェクトする工程と、
前記レポーター遺伝子の発現を測定して、神経活動の有無又は強弱を評価する工程と、を含む神経細胞の可塑性の評価方法；
〔１５〕上記〔６〕から〔９〕のいずれか１項に記載のベクターを含む、脳機能マーカー；
〔１６〕上記〔６〕から〔９〕のいずれか１項に記載のベクターを神経細胞にトランスフェクトする工程と、
前記神経細胞に候補化合物を投与する工程と、
前記レポーター遺伝子の発現を測定して、神経活動の有無を評価する工程と、を含む脳機能改善剤のスクリーニング方法；及び
〔１７〕配列番号：５で表される塩基配列を含む、プロモータ活性を有するDNA、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係るプロモータを用いてレポーターアッセイを行えば、認知活動に伴って活動する神経細胞を可視化し、神経活動部位マッピングを簡単に行うことができる。
また、本発明に係るプロモータを用いてレポーターアッセイを行えば、特定の神経細胞の活動の有無や強弱を知ることができる。したがって、幹細胞が神経細胞に分化したか否かを確認するマーカーや、神経細胞の生死を示すマーカー、細胞レベルの神経可塑性のマーカーとして利用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａは、E-SAREの構築に用いられたゲノムのコンポーネントを示す。上段は、Arc/Arg3.1プロモータのマップである。SAREは左端のボックス、ArcMin（TATAを含む最小プロモータ）は、Arc/Arg3.1のボックスの左に隣接するボックスで示される。他のボックスは進化的に保存されたゲノムドメインを示す。下段は、3つの異なる種（マウス、ヒト、ウシ）のSAREエレメントの配列である。進化的に保存された配列は灰色で示される。転写因子結合部位は、それぞれ転写因子の名前で示した。E-SAREを構築するために使用したフラグメントを、3つの双方向矢印で示した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、E-SAREの設計と作用を示す。上段にプロモータのデザインを示す。図１Ａに示されたSAREのフラグメントを単一又は複数でArcMinに連結し、培養した神経細胞における転写活性をルシフェラーゼアッセイで測定した。下段には、細胞をサイレントにした場合（TTX、青）と刺激した場合（4AP＆BIC、赤）の各プロモータの転写活性を示す。もっとも発現レベルが高かったものをE-SAREと名づけた。右上は、TTX投与時のデータを拡大したものである。各アッセイにおいてN=3。
【図１Ｃ】図１Ｃは、E-SAREと他の神経活動依存性人工プロモータ（プロモータモジュール内の個々のエレメントを多重化したものを利用）の能力の比較を示す。5xCREは、CREB結合部位の5回繰り返し。5xMREは、MEF2結合部位の5回繰り返し。5xSREは、SRF結合部位の5回繰り返し。各アッセイでN=6。***は、E-SAREとの比較でP < 0.001を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、c-FosプロモータとE-SAREの比較である。ダイナミックレンジ（4AP&BICとTTXで解析）も示す。右上図は、TTX投与時のデータを拡大したものである。各アッセイでN=6。エラーバーは、標準誤差を示す。*はP < 0.05。***と###はP <0.001。NSはE-SAREとの比較において有意差なし。
【図１Ｅ】図１Ｅは、培養神経細胞において、E-SARE又はc-Fosプロモータで駆動されたd2EGFP蛍光の代表的な画像である。スケールバーは100μmを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、短時間の初期フェーズと長時間の後期フェーズからなるE-SAREによる転写の単純化モデルを示す。初期フェーズは、パルス様の強い発現（a1）を短時間（t1）示し、後期フェーズでは、ゆっくりと減衰する弱い発現（a2）を長時間（t2）にわたって示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、E-SARE及びArcプロモータによる転写動態パラメータの測定に用いられた実験のスケジュールを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、複数のタイムポイントにおけるルシフェラーゼアッセイの結果を示す。1xFrgAは、1xFragment A（図１Ａ参照）を示す。Arc7000は、ArcMinからSAREに及ぶ7-kbのプロモータの全長を示す（図１Ａ参照）。各アッセイでN=3。エラーバーは、標準誤差を示す。刺激から4時間後の値を用いて多重比較を行った。***はP < 0.001。
【図２Ｄ】図２Ｄは、図２Ｃのデータを標準化した結果を示す。それぞれのトレースは各プロモータのタイムコースを各トレースの平均で割って求めた。刺激後4時間又は24時間後の値を用いて多重比較を行った。結果は（4時間後の有意差，24時間後の有意差）で示した。**はP < 0.01。nsは有意差なし。
【図２Ｅ】図２Ｅは、最尤法を用いた試験モデルのパラメータ冗長性を示す。各パネルは、他のパラメータを最適値に固定して、上に記載した2つのパラメータの組み合わせの尤度をプロットしたパラメータ空間の二次元切片を示す。黒点は、最適値を示す。パラメータa1（100から400）とt1（0.5時間から1.5時間）の間に反比例するいくつかの冗長性が見られた。
【図２Ｆ】図２Ｆは、in silicoとin situで得られた転写動態パラメータの比較を示す。シミュレーションによる転写、mRNA発現及びタンパク質発現の動態は、測定データから得られたものとよく重複していた。
【図３Ａ】図３Ａは、E-SARE二重カセットAAVベクターの設計を示す。ITRはinverted terminal repeats；d2Venusは、不安定化YFP (Venus)；pAは、ポリアデニル化シグナル；cHS4はchick insulator HS4；E-PGKは、増強型PGKプロモータ；WPREは、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節因子をそれぞれ示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、E-SARE AAVのマウス一次視覚野への両側注射の方法を示す。単眼の視覚刺激により一方の脳半球のみ活性化した。Contraは、反対側；Ipsiは、同側を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、通常のPGKプロモータ、又は増強型PGKプロモータによる培養神経細胞でのルシフェラーゼ発現を示す。各アッセイでN=3。エラーバーは標準誤差、*はP < 0.05。
【図３Ｄ】図３Ｄは、E-SARE AAV感染皮質領域で、RFP蛍光を皮膚の上から検出した例を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、E-SARE AAV投与を受けた動物の脳の背面からの肉眼による観察例を示す。破線は脳の輪郭を、V1は一次視覚野を示す。スケールバーは1mm。
【図３Ｆ】図３Ｆは、神経活動依存性のレポーター発現を組織学的に確認するための脳の冠状断面の蛍光イメージである。左のローマ数字は皮質層を示す。RFP及びGFPの蛍光シグナルは、免疫組織学的増強なしで、ネイティブな蛍光シグナルで示されている。スケールバーは、100μm。
【図４Ａ】図４Ａは、E-SARE AAVを感染させた動物のS1バレル皮質から得られたイメージの3Dスタッキングを示す。表面から0−150μmを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、E-SARE AAVを感染させたマウスを3つの異なる条件で飼育した後、皮質のII/III層から得た2光子ライブセルイメージングの代表例を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、複数の動物から収集し、AAV感染神経細胞について標準化したGFP強度とGFP/RFP比の累積分布を示す。TR、HC、NEマウス群はそれぞれN=7、6、7。各マウスの1500から3000の神経細胞からデータを収集した。スケールバーは50μm。エラーバーは標準誤差を示し、***は、P < 0.001。
【図５Ａ】図５ＡはE-SAREレポーターの発現実験における刺激タイムコースを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ルシフェラーゼ活性絶対値を指標とした、種々のプロモータ発現タイムコースを示す。エラーバーは標準誤差を示し、***は、P < 0.001。
【図５Ｃ】図５Ｃは、図５Ｂのデータを各々のタイムコースの２４時間総平均値に対して正規化したタイムコースプロットを示す。エラーバーは標準誤差を示し、***は、P < 0.001。
【図６Ａ】E-SARE AAVの感染細胞（RFP）、E-SARE活性化細胞（d2EGFP）は神経細胞特異的マーカーNeuNと共染色する図を示す。
【図６Ｂ】E-SARE AAVの感染細胞（RFP）、E-SARE活性化細胞（d2EGFP）はグリア細胞特異的マーカーS100bと共染色しないという図を示す。
【図７】は、新環境に曝露されたマウスの海馬歯状回におけるE-SARE誘導性dGFP発現と、内因性Arcタンパク質の発現の重なりを調べた結果を示す。
【図８】図８は、新環境に曝露されたマウスの体性感覚皮質におけるE-SARE誘導性dGFP発現と、内因性Arcタンパク質（ａ）又はc-Fosタンパク質（ｂ）の発現の重なりを調べた結果を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、10分間の明刺激によるV1におけるE-SAREレポーターの誘導を調べた実験の手順を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９Ａの実験における、明刺激前後のV1神経細胞像（左）と、E-SAREレポーターdGFPと、内因性c-Fos及びArcの発現の重なりの定量（右）を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、図９Ａの実験における、E-SARE-dGFPと内因性Arc免疫活性の像（左）と、E-SARE-dGFPと内因性Arcの発現の重なりの定量（右）を示す。
【図９Ｄ】図９Ｄは、図９Ａの実験における、E-SARE-dGFPと内因性c-Fos免疫活性の像（左）と、E-SARE-dGFPと内因性c-Fosの発現の重なりの定量（右）を示す。
【図９Ｅ】図９Ｅは、図９Ａの実験における、E-SARE-dGFP、内因性Arcタンパク質、及び内因性c-Fosタンパク質の三重染色の像（上段）と、発現の重なりの定量（下段）を示す。
【図１０】図１０は、E-SAREとERT2CreERT2-PESTを組み合わせたAVVベクターの構造（左）と、標識した外側膝状体（LGN）の軸索がV1第４層に投射した再構成3D画像（右）を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、培養神経細胞を20μMのアニソマイシンで処理した後のERT2CreERT2、ERT2CreERT2-PESTタンパク質及びEGFPの分解の経過を示す
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ERT2CreERT2、ERT2CreERT2-PESTタンパク質及びEGFP分解の経時変化を定量的に調べた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
本発明に係る神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAの一態様は、Arc/Arg3.1遺伝子のプロモータ上のシナプス活動応答性エレメント（SARE）のうち、CREB結合部位、MEF2結合部位、及びSRF結合部位を含むフラグメントが、少なくとも2回タンデムに連結されたコンストラクトを含む。
【００１３】
本明細書において、「プロモータ活性を有する」とは、所定の条件下で、RNAポリメラーゼが認識し結合する配列を有することを意味する。その結果、RNAポリメラーゼによってDNA情報に基づくmRNAの合成（転写）が起こる。
本明細書において、「神経活動依存的プロモータ活性を有する」とは、神経細胞において、神経細胞が活動しているときにはプロモータ活性を示して下流に結合した構造遺伝子の発現を開始させる一方、神経細胞が活動していないときにはプロモータ活性を示さず、下流に結合した構造遺伝子の発現を開始させないことをいう。神経細胞とは、中枢神経（脳、脊髄）及び末梢神経（体性神経、自律神経）からなる神経系を構成する細胞である。ここで、「神経細胞が活動する」とは、神経細胞がシナプスを介して何らかの入力刺激を受け、あるいは自発発火を起し、シナプス電位が発生する、活動電位が発生する、興奮性が高まる、cAMPやCa2+等を介したシグナル伝達が活性化する状態のうち少なくとも１つが生じることを示す。
【００１４】
本明細書において、「Arc/Arg3.1遺伝子」は、activity-regulated cytoskeleton-associated proteinをコードする遺伝子を意味する。Arc/Arg3.1遺伝子は、前初期遺伝子（IEG）ファミリーの1つである。Arc/Arg3.1遺伝子については、これまでに多くのプロモータ及びエンハンサー領域が同定されており、SAREはその1つである。SARE領域は、図１Ａに示すとおり、転写開始部位の約7kb上流に位置し、cyclic AMP response element-binding protein（CREB）、myocyte enhancer factor 2（MEF2）、及びserum response factor（SRF）などの転写因子の結合部位を含む。
【００１５】
本発明に係る神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAの一態様は、これらの転写因子結合部位を含むSAREのフラグメントが、少なくとも2回タンデムに連結されたコンストラクトを含む。
本明細書において、「少なくとも2回タンデムに連結される」とは、同一のフラグメントが少なくとも2つ直列に連結されることを意味する。フラグメントは、コンストラクトにおいて、2回以上であれば何回連結されていてもよく、例えば、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、または10回とすることができる。フラグメントとフラグメントの間には、得られたコンストラクトがプロモータ活性を有する限りスペーサを挿入してもよい。スペーサとしては、例えば、1〜20塩基長、2〜15塩基長、3〜10塩基長程度の核酸が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において「コンストラクト」とは人工的に作製したDNA断片を意味する。
【００１６】
実施例に示すとおり、CREB結合部位、MEF2結合部位、及びSRF結合部位を含むSAREのフラグメントを複数タンデムに連結してプロモータとすると、その下流に連結したレポーター遺伝子が神経活動に依存して高レベルに発現することが確認された。図１Ａに示されるとおり、このフラグメントは哺乳類間で高く保存された領域であることから、本発明に係る神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAは、種々な哺乳類細胞において、同様の神経活動依存的なプロモータ活性を示すものと理解される。
3つの転写因子結合部位を含むSAREフラグメントの長さは、例えば、50bp〜200bpの間、具体的には、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、150bp、180bpとすることができるが、得られたプロモータが活性を有する限り、それより短くても長くてもよい。
【００１７】
本発明に係る神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAの一態様は、以下の(i)〜(iv)のいずれかのDNAが、少なくとも2回タンデムに連結されたコンストラクトを含む。
(i)配列番号：２、３、又は４で表される塩基配列からなるDNA；
(ii)配列番号：２、３、又は４で表される塩基配列において1又は複数の塩基が欠失、付加又は置換されている配列からなるDNA；
(iii)配列番号：２、３、又は４で表される塩基配列と70％以上の同一性を有する配列からなるDNA；
(iv)配列番号：２、３、又は４で表される塩基配列と相補的な配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるDNA。
配列番号：２、３、及び４で表される配列は、それぞれ図１Ａに示されるFragment A、B、及びCの塩基配列である。実施例に示されるとおり、Fragment A、B、及びCを、それぞれ複数タンデムに連結してプロモータとすると、その下流に連結したレポーター遺伝子が神経活動に依存して発現すること、及び、かかるレポーターシステムによって神経細胞の活動を高感度かつ広いダイナミックレンジで検出できることが確認された。
特に、Fragment Aを5つ連結したプロモータは、もっとも発現レベルが高く、ダイナミックレンジも大きいものであり、これをE-SARE（配列番号：１）と名づけた。
【００１８】
本発明に係る神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAは、配列番号：２、３、又は４で表される塩基配列において、1又は複数の塩基が欠失、付加又は置換されている配列からなるDNAを含むものであってもよい。欠失、付加又は置換される塩基の個数は、DNAがプロモータ活性を有する限り特に限定されないが、例えば、20塩基以下、15塩基以下、10塩基以下、5塩基以下とすることができる。
【００１９】
本発明に係る神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAは、配列番号：２、３、又は４で表される塩基配列と70％以上の同一性を有する配列からなるDNAを含むものであってもよい。同一性は、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上等としてもよい。配列同一性は公知の方法に従って求めることができる。
【００２０】
本発明に係る神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAは、配列番号：２、３、又は４で表される塩基配列と相補的な配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるDNAであってもよい。ストリンジェントな条件は、当業者が適宜選択することができるが、例えば、1×SSC、0.1％SDS、60℃といった条件とすることができる。ストリンジェンシーはSSCの濃度及び温度などでコントロールすることができ、高ストリンジェントな条件を選択すれば、より高い相補性を有する核酸を得ることができる。
【００２１】
本態様においても、タンデムに連結される(i)〜(iv)のDNAの間には、得られたコンストラクトがプロモータ活性を有する限りスペーサを挿入してもよい。スペーサとしては、例えば、1〜20塩基長、2〜15塩基長、3〜10塩基長程度の核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明は、上述した神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAと、該DNAの下流に連結されたレポーター遺伝子とを含むベクター（以下、単に「本発明に係るベクター」という。）も包含する。本発明に係るベクターを神経細胞にトランスフェクトすれば、レポーター遺伝子の発現を検出することにより、神経細胞の活動の有無や強弱を容易に評価することができる。レポーター遺伝子は、その発現を簡便に確認できるものであれば特に限定されないが、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、DsRed、DsRed2、HcRed、HcRed1、緑色蛍光タンパク質（GFP）、EGFP、赤色蛍光タンパク質（RFP）、Venus、FP635、FP602、β−グルクロニダーゼ（GUS）、β−ガラクトシダーゼ、ホタル又はウミシイタケルシフェラーゼ、青色蛍光タンパク質（BFP）、シアン色蛍光たんぱく質（CFP）、ECFP、黄色蛍光タンパク質（YFP）、EYFPをコードする遺伝子が挙げられる。神経細胞の活動を検出する場合、皮膚の上からもレポーター遺伝子の発現を確認できることが好ましく、その点でレポーター遺伝子は、各種蛍光タンパク質をコードする遺伝子を用いることが好ましい。
【００２３】
本発明に係るベクターは、公知の方法に従って作製することができる。例えば、必要な配列を予め含む市販のレポーターアッセイ用プラスミドに、当該DNAとレポーター遺伝子が機能的に結合するように、公知の方法で挿入すればよい。なお、本明細書において、「機能的に結合する」とは、神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAに転写因子が結合したときに、レポーター遺伝子が発現するように、該DNAとレポーター遺伝子とが結合していることを意味する。
本発明に係るベクターは、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、DEAE-デキストランやポリブレンなどのポリマーと複合体を形成させる方法などで宿主細胞に導入することができる。
【００２４】
本発明に係るベクターは、ウイルスベクターとしてもよい。ウイルスベクターを用いれば、標的細胞に感染させることにより、in vivo又はin vitroでベクターを標的細胞に効率よく導入することができる。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルス、パピローマウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどのウイルスを用いることができる。
中でもアデノ随伴ウイルスは、分裂しない細胞にもよく感染するため、神経細胞にもベクターを効率よく導入できる。また、非病原性で、内因性タンパク質の過剰発現や欠損を起こさず、ゲノムにも組み込まれないので、安全で汎用性の高いベクターとして本発明に好ましく用いられる。
【００２５】
ウイルスベクターを用いる場合、ベクターに感染マーカー遺伝子の発現カセットを挿入しておくことも好ましい。これにより、感染マーカー遺伝子の発現を確認して、ベクターが標的細胞に導入されたか否か評価することができる。感染マーカー遺伝子は、その発現を簡便に確認できるものであれば特に限定されず、上述したレポーター遺伝子のいずれかを用いてもよい。
感染マーカー遺伝子を発現させるためのプロモータとしては、神経細胞で活性が高く、かつ、神経活動に応答性のないものが好ましい。このようなプロモータとして、実施例に記載されるE-PGKプロモータ（配列番号：５）が挙げられる。E-PGKプロモータは、PGK-プロモータにイントロンフラグメントを融合したものである。
【００２６】
本発明に係るベクターに、神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAによって駆動されるレポーター遺伝子と、当該レポーター遺伝子産物と識別可能なマーカータンパク質を発現する感染マーカー遺伝子とを挿入しておくことにより、ベクターが神経細胞に導入されたことの確認と、その神経細胞の活動の有無とを、同時に単一細胞レベルで評価することが可能となる。
【００２７】
本発明は、本発明に係るベクターを含む宿主細胞（但し、ヒト生体内の細胞を除く）も包含する。宿主細胞は、あらゆる非ヒト動物の生体内の細胞と、ヒトを含む動物の培養細胞を含む。また、本発明は、本発明に係る神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAを挿入したベクターを含む非ヒト動物も含む。かかる動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ等とすることができ、各種の試験に用いることが可能である。
【００２８】
本発明に係るベクターは、例えば以下のような目的に用いることができる。
【００２９】
＜神経細胞の活動検出方法＞
本発明に係る神経細胞の活動検出方法は、
本発明に係るベクターを神経細胞にトランスフェクトする工程と、
レポーター遺伝子の発現を測定して、活動した神経細胞を同定する工程と、を含む。
神経細胞は、生体内にある細胞でも培養細胞でもよい。生体内の細胞は、非ヒト動物の細胞であることが好ましい。
上記トランスフェクトの後、神経細胞に刺激を与え、刺激に応答して活動した神経細胞を同定してもよいし、神経細胞の自発発火による活動を同定してもよい。神経細胞に刺激を与える工程は、公知の方法に従って行うことができ、例えば生体内にある細胞である場合は動物に外部から刺激を与えてもよいし、培養細胞に直接電気的または化学的刺激を与えてもよい。レポーター遺伝子の発現の測定は、レポーター遺伝子の種類によって公知の方法で行うことができ、それにより、神経細胞の活動の有無や強弱を簡便に評価することができる。
【００３０】
＜神経細胞の分化評価方法＞
近年、様々な幹細胞を神経細胞に分化させる研究が行われており、神経細胞に分化したか否かを評価する手段が求められている。分化させた細胞を神経細胞として使用するためには、シナプスが十分に形成され、シナプス活動応答性を有することが必要である。本発明に係る神経細胞の活動検出方法を応用すれば、神経細胞が刺激に応答して活動するか否かを評価することを通じて、分化の程度を評価することができる。
したがって、本発明に係る神経細胞の分化評価方法は、
幹細胞から神経細胞へのいずれかの分化段階で、本発明に係るベクターをその細胞にトランスフェクトする工程と、
レポーター遺伝子の発現を測定して、神経活動の有無又は強弱を評価する工程と、を含む。
幹細胞としては、神経幹細胞、iPS細胞、ES細胞等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３１】
＜神経可塑性の評価方法＞
本発明に係る神経細胞の活動検出方法を応用すれば、神経可塑性を細胞レベルで検出することができる。神経系の構造と機能は、必ずしも固定されたものではなく、活動状況によって変化する。この特性を神経可塑性という。神経可塑性による変化は、個々のシナプスレベル、細胞レベル、神経回路レベル、個体レベルと様々なレベルで生じ、学習、記憶、脳損傷からの回復などに寄与する。神経活動に依存して棘突起の形態が変化することや、シナプス自体の形成や消滅が神経可塑性のメカニズムの一つと考えられている。
本発明に係る神経細胞の活動検出方法を応用すれば、神経細胞が刺激に応答して活動するか否かを評価することを通じて、神経可塑性の程度を評価することができる。
したがって、本発明に係る神経細胞の分化評価方法は、
幹細胞から神経細胞へのいずれかの分化段階で、本発明に係るベクターをその細胞にトランスフェクトする工程と、
レポーター遺伝子の発現を測定して、神経活動の有無又は強弱を評価する工程と、を含む。
【００３２】
＜脳機能マーカー＞
本発明に係るプロモータはレポーター遺伝子を発現させる速度が速いことから、本発明に係るベクターは神経細胞の生死をリアルタイムで検出して脳機能の有無を評価することが可能である。
例えば、脳梗塞、外傷、血腫除去などの手術の際、本発明に係るベクターを脳機能マーカーとして神経細胞に導入し、レポーター遺伝子の発現を検出して細胞の生死を判別し、死んだ細胞のみ切除することも可能である。
【００３３】
＜医薬品候補化合物の評価＞
本発明に係るベクターを用いて、脳機能改善剤、神経保護剤などの医薬品候補化合物の薬効や安全性を評価することができる。
かかる方法は、
本発明に係るベクターを神経細胞にトランスフェクトする工程と、
神経細胞に候補化合物を投与する工程と、
レポーター遺伝子の発現を測定して、神経活動の有無を評価する工程と、を含む。
神経細胞は、生体内の細胞であっても培養細胞であってもよい。生体内の細胞の場合、非ヒト動物の細胞であることが好ましい。候補化合物及びその投与方法は、当業者が適宜選択することができる。医薬品候補化合物としては、低分子化合物、高分子化合物、核酸、タンパク質等を用いることができる。
例えば、医薬品候補化合物の投与により、レポーター遺伝子の発現が亢進する場合、当該化合物は脳機能を改善する可能性があると評価することができ、レポーター遺伝子の発現が低下する場合、神経細胞に毒性を示す可能性があると評価することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。【００３５】
［１］方法
プラスミド
使用した全てのルシフェラーゼレポータープラスミドは、pGL4.11-luc2Pホタルレシフェラーゼレポータープラスミド（Promega）上に構築した。E-SARE（5xSARE-ArcMin）プロモータは、SARE-ArcMin（非特許文献７）の104bpのSAREエンハンサーフラグメント（転写開始部位を+1としたときに-6793から-6690）を5つ連結して構築した。
E-PGKプロモータは、マウスPGKプロモータフラグメント（-280から+112）をヒト成長ホルモン（GH）のイントロンフラグメント（+69から+315）と融合させて構築した。マウスc-fosプロモータ（-622から+140）は、pGEM4-cFos-LacZ（非特許文献２；Dr. Tom Curranより提供を受けた。）から得た。
5xCRE-minCMVプロモータ（配列番号：６）、5xMRE-minCMVプロモータ（配列番号：７）、及び5xSRE-minCMVプロモータ（配列番号：８）は、それぞれ、5xCRE（CRB結合部位TGACGTCA（配列番号：１１）と7bpのスペーサの5回繰り返し）、5xMRE（MEF2結合部位CTATTTTTAG（配列番号：１２）と7bpのスペーサの5回繰り返し）、及び5xSRE（SRF及びElk-1結合部位AGGATxxCCATATTAGG（配列番号：１３）と6bpのスペーサの5回繰り返し）と、最小CMVプロモータフラグメント（-51から+6；配列番号：９））を融合させて構築した。  d2EGFPレポータープラスミドは、ルシフェラーゼプラスミドからpGL4.11-d2EGFP（T. Kawashima et al., Proc Natl Acad Sci U S A 106 (1), 316 (2009).）にプロモータフラグメントを移して構築した。
上記においてゲノム上の位置を示す数字は、NCBIゲノムデータベースに基づく。
E-SARE二重発現カセット（配列番号：１０）は、以下のエレメントから作製した：LVDPレンチウイルスプラスミド（J. Tian and S. T. Andreadis, Gene Ther 16 (7), 874 (2009).；Dr. Stelios Andreadisから提供を受けた。）のcHS4インシュレーターエレメント；CSIIレンチウイルスプラスミドのWPREエレメント（Dr. Hiroyuki Miyoshiから提供を受けた。）；pTurboFP635-C（Evrogen社）のTurboFP635；pCS2-Venus（T. Nagai et al., Nat Biotechnol 20 (1), 87 (2002).；Dr. Atsushi Miyawakiから提供を受けた。）のVenus；pGL4.11（Promega社）のSV40 polyA、及びpcDNA3（Invitrogen社）のウシGH  polyA。作製したカセットは、AAVプラスミド pFBGR（Dr. Robert Kotinの同意の下にDr. Beverly DavidsonとDr. Ilya Bezprozvannyから提供を受けた。）に挿入した。d2Venusは、Venusとpd2EGFP-1（Clontech社）のMODC PEST配列を融合させて作製した。また、免疫組織化学分析のための青色型のE-SARE二重発現カセットは、d2Venusをd2EGFPで、TurboFP635をTagRFP（Evrogen社）で置換して作製した。【００３６】
動物
すべての動物実験は、所定の機関のガイドラインに従い承認を受けて行った。
ルシフェラーゼとd2EGFPレポーターアッセイは、Sprague-Dawleyラットの胚から得た培養皮質神経細胞を用いて行った。ウイルス投与実験は、4〜10週齢の雄のC57BL/6Nマウスで行った。野生型マウスは、Japan SLC, Incから購入した。【００３７】
培養神経細胞におけるルシフェラーゼ及びd2EGFPアッセイ
培養皮質神経細胞のルシフェラーゼアッセイは、公知の方法（非特許文献７）に従って行った。簡単に説明すると、まずラットE18胚皮質にルシフェラーゼプラスミドとNucleofector（Lonza社）をトランスフェクトした。DIV（days in vitro；培養後日数）10で、1μMのテトロドトキシン（TTX）を用いて神経細胞をサイレントにした。DIV11で、100μMの4-AP、30 μMビククリン、100μMグリシン、及び1μMストリキニーネを含む培地（4AP&BIC培地）で神経細胞を4時間刺激した。細胞のライセートのルシフェラーゼ活性は、Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega社）で測定した。
d2EGFPレポーターアッセイのために、d2EGFPレポータープラスミド（3.6μg）とトランスフェクトマーカーのRFPプラスミド（0.9μg）を、3.75x106個の培養神経細胞に上述の方法でトランスフェクトした。神経細胞は上述の方法でサイレントにし、その後刺激してから、パラホルムアルデヒドで固定した。
複数タイムポイントのルシフェラーゼアッセイのために、ホタルレポータープラスミド（4.8μg）とpGL4.74ウミシイタケコントロールプラスミド（1.2μg）を1.0x107個の皮質神経細胞にエレクトロポレートし、細胞浮遊液を、24ウェルのポリDリジンコーティングプレートの8ウェルに均等に分注した。DIV10で、1μMのTTXで神経細胞をサイレントにし、DIV11で、4AP&BIC培地で10分間、又は、10μMグルタミン酸を含むMg2+フリーのTyrode液で2分間、神経細胞を刺激した。4AP&BIC刺激の場合、10分間の刺激の間に5分間隔で2回培地を交換し、残存TTXによる拮抗作用を除いた。刺激の後、1μMのTTX、20μMのNBQX、及び50μMのD-AP5を含む培地で、神経細胞を再度サイレントにした。細胞のライセートは、所定のタイムポイント（サイレント刺激後、0、2、4、6、8、12、16及び24時間）でそれぞれ1つのウェルから回収し、ルシフェラーゼ活性の測定まで-80℃で保管した。【００３８】
転写動態のモデリング
まず、転写、mRNA発現、及びタンパク質発現の単純な系を2つの微分方程式でモデリングした。転写（T）、mRNAレベル（R）、タンパク質レベル（P）は、以下の式で示される。【００３９】
【数１】
2014045674.tif 000002
パラメータD mRNA、D proteinは、それぞれmRNAとレポータータンパク質の減衰定数を示す。D mRNAは、イントロンなしのmRNAのmRNA減衰定数（H. F. Wang, L. Feng, and D. K. Niu, Biochem Biophys Res Commun 354 (1), 203 (2007).）と、類似のルシフェラーゼベクターのmRNA減衰定数（X. Fan, E. Roy, L. Zhu et al., J Biol Chem 278 (12), 10232 (2003).）の平均（0.421/h）に設定した。D proteinは、培養神経細胞で測定して（データ示さず）得られた値（0.641/h）に設定した。
最尤推定（MLE）によるシミュレーションに使用できる転写モデルを作るために、まず、測定した経時データを補間して数値微分し、転写応答の概形を得た。この形に基づいて、刺激に対する転写応答に2つのフェーズがあると仮定した。第1のフェーズは、1〜2時間（又はそれより短い時間）継続する矩形パルス様の転写であり、第2のフェーズは、ゼロに戻るまで数時間以上かかる、ゆっくりと減少する線形の転写である。第1のフェーズは、パルスの高さ（a1）と長さ（t1）で定義され、第2のフェーズは、最初の高さ（a2）とゼロに戻るまでの時間（t2）で定義した。
これらのパラメータの最尤値は、MLEで決定した。各パラメートの尤度は、以下の式で計算して求めた。【００４０】
【数２】
2014045674.tif 000003
式中、Gは、ガウスの確率密度、Miは、各タイムポイントのパラメータa1、a2、t1、t2に基づくシミュレーションデータ、Di及びσiは、タイムポイントiにおけるルシフェラーゼデータの測定値の平均と標準偏差、Nは、測定したタイムポイントの数である。これらのパラメータに基づくルシフェラーゼレポーター応答のシミュレーションは、上記の微分方程式をDormand-Price法で積分して求めた。計算は、特注のMatlabソフトウエアで行った。【００４１】
昆虫細胞における組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）の産生
血清型1のアデノ随伴ウイルスは、バキュロウイルス/Sf9発現システム（Beverly Davidsonのチームの援助により、Robert Kotinのチームで開発された）で、産生し精製した。
具体的には、まず、AAVプラスミドとRepCap1ヘルパープラスミド（M. Urabe, C. Ding, and R. M. Kotin, Hum Gene Ther 13 (16), 1935 (2002).）でDH10-Bac E. coli（Invitrogen社）を形質転換し、組換えバキュロウイルスバクミドを作製した。組換えはM13プライマー（M13-F：5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3（配列番号：１４）；M13-R：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3（配列番号：１５））を用いたPCRで確認した。第1代（P1）バキュロウイルスストックを作製するために、バクミドを精製し、Sf9細胞にトランスフェクトした後、当該細胞をCellfectin II reagent（Invitrogen社）を使用して6ウェルプレートで培養した。5日後、上清を回収してP1ストックとして保存した。P2バキュロウイルスストックを作るために、P1ストックをSf9細胞に感染させ、T-75cm2フラスコで培養した。5日後、上清を回収し、P2ストックとして保存した。P3バキュロウイルスストックを作るために、P2ストックをさらにSf9細胞に感染させ、100mlの浮遊培養を行った。5日後、上清を回収し、P3ストックとして保存した。バキュロウイルスの力価は、バクミド特異的プライマー（e56-F：5’-AATGATAGGCATTAACTTGC-3’（配列番号：１６）；e56-R：5’-GTGATTTAGTTGGCGACTTG-3’（配列番号：１７））を使用して定量PCRで測定した。
AAVは、次の方法で作製した。まず、AAVバキュロウイルスとRepCap1ヘルパーバキュロウイルスを、80mlの浮遊培養中、8.0x107個のSf9細胞にMOI=2.5〜5で共感染させた。2〜4日後、細胞を回収し、PGSで洗浄した後、低張性の溶解バッファー（1%Triton X-100、10 mM HEPES (pH 8.0)、3mM NaCl、及び0.5 mM MgCl2）で、室温で15分処理した。ライセートを60℃で15分インキュベートし、バキュロウイルスを不活化し、細胞性タンパク質を不溶化した。続いてライセートを遠心処理し、上清をAVBセファロース（GE Healthcare社）と混合し、室温に1時間置いた。この混合液をgravity-flow column（Bio-Rad社）に通した後、PBSで洗浄した。溶出バッファー（50 mM glycine (pH 3.0)）で溶出し、Amicon Ultra 100K Centrifugal concentrators（EMD Millipore社）を使って遠心し、さらに濃縮した。濃縮工程の途中でウイルスバッファーをPBSに交換した。定量PCRで測定したところ、結果物のウイルス力価は、通常0.5〜3.0x1013ゲノムコピー/ml（トータルボリューム200μl）であった。【００４２】
定位固定によるウイルス投与
マウスを定位固定し、引き伸ばしたガラスのマイクロピペットでウイルスを投与した。マウスは、2.5mg/kgの硫酸アトロピン（Tanabe Pharma社）で前処理し、440mg/kgの抱水クロラール（Tokyo Chemical Industry社）を腹腔内注射して麻酔した。ペトロラタムを両眼に適用して乾燥を防ぎ、頭皮を脱毛クリームで処理した。
マウスを、小動物用定位固定装置（David Kopf Instruments社）に固定した。頭皮を正中線に沿って切開し、3％過酸化水素と外科用メスで骨膜を除去した。頭蓋骨をドリルで薄くし、27ゲージ針で小さな穴を開けた。引き伸ばしたマイクロピペットをハミルトンシリンジ（Hamilton Company社）に接続したもので、ウイルスを注射投与した。ハミルトンシリンジは、シリンジポンプの接続した（World Precision Instruments社）。皮質投与の場合はマイクロピペットを45度に傾けた。
定位固定による投与は、以下の組織に対して、以下の座標に従って行った。
視覚野：bregmaからA/P -3.4 mm、M/L ±3.0 mm、軟膜表面からD/V -0.5 mm。
体性感覚野バレル皮質：bregmaからA/P -1.5 mm、M/L ±3.0 mm、軟膜表面からD/V -0.5 mm。
ウイルス液は、0.05〜0.1μl/minの速度で、1.0〜1.5μl注射投与し、投与後、ピペットはそのまま位置に10分間固定してから抜いた。マイクロピペットを抜いた後、切開した皮膚を縫合し、抗生物質クリームを塗って、術後痛を和らげるために鎮痛剤を皮下投与した。投与後の動物は、実験に使用するまで4週間から2ヶ月、通常通りに飼育した。【００４３】
視覚野におけるE-SARE誘導実験
E-SARE AAVを視覚野に投与したマウスは、単眼を摘出した後、暗環境に2日間置いた。実験当日、マウスを明環境に4時間曝露してから経心灌流で固定した。脳を摘出し、公知の方法（非特許文献７）に従って固定及び抗凍結処理した。脳の巨視的な蛍光イメージは、実体顕微鏡（Olympus社）に搭載したデジタルCMOSカメラ（Panasonic社）で撮影した。脳の冠状切片（厚さ50μm）は、cryostat microtome（Carl Zeiss社）で作製し、蛍光デジタル顕微鏡（KEYENCE社）で観察した。【００４４】
免疫組織化学
免疫組織化学分析のために、d2EGFPがE-SAREプロモータ下で発現し、TagRFPがE-PGKプロモータ下で発現する、変色型のE-SARE AAVを用いた。EGFPとTagRFPの蛍光スペクトルにより、細胞型特異的マーカーを染色するための追加の遠赤色チャネルの使用が可能となった。
免疫組織化学解析は、公知の方法（非特許文献７）に従って行った。すなわち、まず50μm厚の脳切片を0.3％ Triton X-100/PBSで5分処理して透過性にし、ブロッキング液（0.1% Triton X-100、1% bovine albumin、及び5% normal goat serum in PBS）で、室温で2時間処理した。続いて切片を、4℃で2時間、ブロッキング液で希釈した一次抗体と反応させた。一次抗体は、マウス抗Arcモノクローナル抗体（C-7、1:250；Santa Cruz社）、ウサギ抗RFPポリクローナル抗体（R10367、1:1000；Invitrogen社）、マウス抗GFAPモノクローナル抗体（clone G-A-5、1:1000；Sigma社）、マウス抗S100βモノクローナル抗体（clone 4C4.9、1:500；Abcam社）、及びマウス抗NeuNモノクローナル抗体（clone A60、1:1000；Chemicon社）を含んだ。次に、切片を二次抗体溶液（0.1%Triton X-100、及び5% normal goat serum in PBS）で希釈した二次抗体で、室温で2時間処理した。二次抗体は、Alexa647結合ヤギ抗マウスIgG抗体、及びAlexa555結合ヤギ抗ウサギIgG抗体（1:500、Invitrogen社）を含んだ。免疫染色した切片は、さらにHoechst 33342で染色し、組織ガラススライド上に載置した。蛍光イメージは、LSM510共焦点顕微鏡（Carl Zeiss社）、又はA1R共焦点顕微鏡（Nikon社）で得た。【００４５】
3Dスタッキングイメージの取得と、バレル皮質におけるE-SARE発現の解析
AAV投与マウスは、投与後3〜4週間で3つのグループに分けた。ひげをトリミングしたグループ（TRグループ）、通常のケージに入れたグループ（HCグループ）、及び新環境に置いたグループ（NEグループ）である。TRグループのマウスは、イメージングの2日前にひげをトリミングし、イメージングまで暗環境に置いた。HCグループのマウスは、イメージングまで通常通り飼育した。NEグループのマウスは、2日間暗環境に置いた後、様々な物体で構成された新たな環境に移し、6〜7時間後にイメージングを行った。
イメージング前の手術では、皮膚及び頭蓋骨を透過した感染マーカーRFPシグナルを、携帯用蛍光観察システム（RelyOn社）で検出して感染部位を確認した。その後、感染部位上の頭蓋骨をドリルで除き、公知の方法でガラスのカバースリップで覆った（K. Ohki, S. Chung, Y. H. Ch'ng et al., Nature 433 (7026), 597 (2005).）。
3Dスタッキングイメージ（XY幅：485μm、Z深さ：400μm、Z深さ間隔：3μm）は、LSM 7MP 2光子顕微鏡（Carl Zeiss社）とMai Tai DeepSee（Spectra-Physics社）のモードロックパルスTi:Sapphireレーザ（900nm）を組み合わせて使用して得た。3Dボリュームレンダリングは、Imaris software（Bitplange社）で行った。
E-SAREレポーター発現の解析は、特注のMatlab software（Mathworks社）をオフラインで使用して行った。感染した神経細胞は、特注アルゴリズムでマーカーRFP発現を用いて識別した。細胞認識精度は98％を超え、イメージスタックの80％を超える細胞を識別できた。通常、各マウスの単一のスタックのII/III層から1500〜2500の細胞が識別された。各細胞のGFP及びRFP蛍光は、細胞の中央部（4.5μmx4.5μm）の蛍光強度の平均から計算した。
異なる条件下でのE-SAREレポーター発現レベルの比較は、次のように行った。まず、各スタックが細胞群の10％以上が非応答性の細胞であると仮定した。これまでの研究で、一次視覚野は、感覚刺激に応答しないサイレントな細胞を含むことが示されており、サイレントな細胞は、全神経細胞の10％以上を示す（D. H. O'Connor, S. P. Peron, D. Huber et al., Neuron 67 (6), 1048.；K. Ohki et al.（2005））。したがって、細胞群全体のcell soma fluorescenceの分布は、非応答性細胞のcell soma fluorescenceの分布によって標準化できる（例えば、細胞群の下位10％等）。そして、マウスの各グループ間における標準化した分布における差を比較することができる。
各スタックは、まず厚さ30μmのZサブレイヤーに分けた。各サブレイヤーは通常100〜300の細胞を含んでいた。細胞のGFP及びGFP/RFP蛍光シグナルは、各サブレイヤーの下位10％の細胞に対して、各サブレイヤー内で標準化した。標準化された値をマウスごとに集めた後、さらに同条件のマウス同士で平均をとった。【００４６】
統計解析
得られたデータの統計解析は、Prism（GraphPad社）、Matlab（Mathworks社）を用いて行った。ルシフェラーゼ活性データは、one-way ANOVAと、Tukey’s post-hoc testを順に使用するか（図１Ｃ、Ｄ）、paired t-test（図３Ｃ）を使用して解析した。バレル皮質におけるE-SAREレポーター発現分布は、two-sample Kolmogorov-Smirnov testとBonferroni correction of P values for multiple comparisonsで比較した（図４Ｃ）。【００４７】
［２］結果
E-SAREの神経活動依存性プロモータ活性
SAREのフラグメントを5つ連結して作製したプロモータを挿入したルシフェラーゼレポータープラスミドを用い、TTX（Na＋チャネルブロッカー）投与時を培養神経細胞の遺伝子発現のベースラインとし、4AP&BIC（前者はK＋チャネルブロッカー、後者はGABAA受容体アンタゴニスト）投与時をシナプス刺激時として、レポーターアッセイによりルシフェラーゼの発現を測定した。
Fragment A、B、Cのいずれを用いた場合も、シナプス刺激に応答してルシフェラーゼが高レベルで発現し、フラグメントのリピート回数に応じて発現量が増大した。中でも、Fragment Aを5つ連結したものは、もっとも発現レベルが高く、これをE-SAREと名づけて以降の実験に用いた。
E-SAREは、SAREの個々の転写因子結合部位（CREB、MEF2、及びSRF）を5つ連結したプロモータを用いたレポータープラスミドと比較して、ルシフェラーゼの発現レベルが100以上高かった（図１Ｃ）。
また、E-SAREは、これまでに報告された最も活性の高いプロモータであるc-fosプロモータより、活動依存性の発現レベルが少なくとも30倍高く、ダイナミックレンジは20倍広くなった（図１Ｄ）。不安定化したEGFP（d2EGFP）をレポーターとして用いても、c-Fosプロモータを使用した場合と比較して、E-SAREは著しく強い蛍光を生じた（図１Ｅ）。【００４８】
E-SAREによるレポーターの転写活性の増加が、転写を減衰させる調節の変化によるものでないこと示すために、興奮性神経伝達物質のグルタミン酸を短時間適用した後のレポーター発現の経時変化を調べた（図５Ａ）。結果を図５Ｂ、Ｃに示す。E-SAREは、単一モジュールのSARE-ArcMin、Arc7000（全長のArc/Arg3.1プロモータ（非特許文献７））、及びc-fosプロモータと比較して、著しく大きなレポーター発現を引き起こした（図５Ｂ）。このデータを標準化すると、E-SAREを含む全てのプロモータの誘導と減衰の動態がよく一致していることがわかった（図５Ｃ）。但し、c-fosプロモータ活性は、いくらか遅く減衰する傾向があった。【００４９】
全長Arcプロモータ（Arc7000）とE-SAREプロモータの転写動態が類似していたことから、E-SAREの転写応答を単純化したモデル（図２Ａ；矩形パルス様の第1フェーズと、ゆっくりと減衰する第2フェーズで構成される）が、in vivoのArc遺伝子の発現にも合致するものか否かを調べるために、短時間のシナプス刺激（4AP＆BIC）後の培養皮質神経細胞の転写動態を測定し、測定値を最尤推定（MLE）法によって転写モデルに外挿した。転写モデル（図２Ａ）と、レポーターmRNAとたんぱく質の仮想減衰定数（それぞれ0.421/hourと0.641/hour）とから、最初の強い発現は約1時間継続すると計算された（図２Ｃ、Ｄ）。これは、in vivoのArc/Arg3.1 mRNA発現に関する報告と正確に合致し、矛盾しない。【００５０】
以上をまとめると、本発明者らのモデルに基づくシミュレーションと実際の測定値の正確な一致から、E-SAREプロモータが、内因性Arcプロモータがin vivoで遺伝子を誘導するメカニズムと同じメカニズムで遺伝子発現を誘導することが強く示唆された。E-SARE AAVベクターは、内因性タンパク質の過剰発現や欠損を起こさず、ゲノムにも組み込まれないので、安全で汎用性の高い細胞標識ツールである。E-SAREレポーターの発現の持続性は、ライブイメージングの後に解剖や電気生理学的手法で解析するためにも、応答性の高い細胞群をin vivo又はin vitroで多数イメージングするためにも、非常に有用である。【００５１】
活動している神経細胞を標識するためのE-SAREを利用したレポーターAAVの構築
in vivoの皮質神経細胞の反応を調べるために、E-SAREが不安定化した蛍光タンパク質の発現を駆動するアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いた（図３Ａ、Ｂ）。
このウイルスは、インシュレーター（J. Tian and S. T. Andreadis, Gene Ther 16 (7), 874 (2009).；図３ＡのcHS4）で隔てられた2つの発現カセットで構成される。1つめは、d2Venus（半減期2時間のGFP）がE-SAREに駆動される神経活動依存性レポーターカセットであり、もう1つは、TurboFP635（RFP）が神経活動に非感受性のE-PGKプロモータに駆動される感染マーカーカセットである。
ウイルス発現の正確なモニターと、感染した神経細胞の電気生理学的レコーディングのためには、感染マーカーも高い発現レベルを得ることが不可欠なため、イントロンフラグメントの融合により10倍改善された強力な神経活動非感受性のPGKプロモータ（E-PGK）を開発した（図３Ｃ）。その結果、RFP蛍光は、マウス皮質へのウイルス投与後、感染の程度を皮膚の上から評価できるくらい明るくなり、in vivoのAAVレポーターアッセイの成功率が飛躍的に上昇した（図３Ｂ、Ｄ）。
高レベルの刺激を受けた神経細胞の活動性集合体をin vivoで同定する目的でのE-SAREの有用性を確認するために、E-SARE AAVを注射したマウスに、既に確立されたArc誘導実験を適用した。マウスの両側の一次視覚野（V1）に、レポーターウイルスを注射し、1ヵ月後に片眼を摘出して暗所に2日間置いた後、明環境に4時間曝露した（図３Ｂ）。
摘出した脳を肉眼で観察したところ、開いている眼と同側の皮質に比較して、反対側の皮質におけるGFP蛍光が著しく増加していた。対照的に、RFP蛍光は、両方の皮質で同等であった（図３Ｅ）。V1切片の解析から、反対側の皮質内では、II/III層神経細胞において強いGFP発現が生じていたことがわかった（図３Ｆ）。これらの結果は、E-SAREが、感覚刺激に応答して極めて高い誘導比で強いレポーター発現を駆動したこと、及び、単一のAAVベクター内のE-SARE駆動レポーターが、生理的に刺激された神経細胞の活動性集合体をin vivoで同定し可視化するための強力な手段であることを示した。【００５２】
バレル皮質内の情報コード神経細胞のマーカーとしてのE-SARE駆動レポーター
独立に発火する様々な種類の神経細胞を含む領域として、体性感覚野のバレル皮質がよく知られている。バレル皮質は、ひげを有する動物で発達しており、ひげが物体に接触したときのたわみを情報に変換する皮質領域である。
これまでの研究（D. H. O'Connor, S. P. Peron, D. Huber et al., Neuron 67 (6), 1048.）により、ひげの活動に強く反応するのはバレル皮質のほんの一部の細胞群であることが示されている。したがって、ひげ刺激による神経細胞の活動の同定と電気生理学的レコーディングは非常に難しい。そこで、ダイナミックレンジが拡大したE-SAREが、高活動性神経細胞を選択的に可視化できるか、また、in vivoの電気的レコーディングの際、この複雑な電気回路の分析にE-SAREが役立つか調べた。2光子顕微鏡法によるE-SAREレポーター発現マウスのin vivoライブイメージングでは、バレル皮質の数千のII/III層神経細胞にレポーターウイルスをうまく感染させ、定量的に画像化することができた（図４Ａ）。
そして、ひげをトリミングしたマウス（TR）、慣れたケージに入れたひげを切っていないマウス（HC）、及び新しい環境に曝露したひげを切っていないマウス（NE）についてin vivoライブイメージングを行ったところ、ひげの使用量が大きい順（NE、HC、TR）に、GFPが発現した細胞の分布が広くなった（図４Ｂ、Ｃ）。
NEマウスで検出されたGFP発現の広い分布は、これらの神経細胞における神経活動のレンジが広いという報告に一致していた（D. H. O'Connor, S. P. Peron, D. Huber et al., Neuron 67 (6), 1048.）。ポストホックの解析により、GFPとRFPの発現はいずれも神経細胞に限定されていることが確認された（図６Ａ、Ｂ）。【００５３】
E-SAREによるdGFP（destabilized GFP）発現と内因性Arcタンパク質発現の重なりの解析
まず、新環境に曝露されたマウスの海馬歯状回におけるE-SARE誘導性dGFP発現と、内因性Arcタンパク質の発現の重なりを調べた。
結果を図７に示す。左側に、組織切片の代表的な像を示す。スケールバーは50μm。右側にdGFPとArcタンパク質の発現のかさなりを示す。2次元カイ二乗検定により、χ2=137.6、P=9.0×10-32。かっこ内の数字は4匹の動物で計測した細胞数を示す。【００５４】
次に、新環境に曝露されたマウスの体性感覚皮質におけるE-SARE誘導性dGFP発現と、内因性Arcタンパク質の発現の重なりを調べた。
結果を図８Ａ及び８Ｂに示す。図８Ａ及び８Ｂの上段には、組織切片の代表的な像を示す。スケールバーは50μm。矢印は、E-SARE-dGFPとArc/c-Fosがいずれも陽性であった神経細胞を示し、三角はいずれか一方のみ陽性であった神経細胞（dGFP像ではdGFPのみ発現した神経細胞であり、Arc/c-Fos像ではArc/c-Fosタンパク質のみ発現した神経細胞）を示す。図８Ａ及び８Ｂの下段には、E-SAREレポーターdGFPと、内因性Arc・c-Fosタンパク質の免疫活性の重なりを示す。2次元カイ二乗検定により、Arc/GFPはχ2=87.5、P=8.4×10-21、c-Fos/GFPはχ2=98.6、P=3.1×10-23であった。かっこ内の数字は2匹の動物で計測した細胞数を示す。
体性感覚皮質では、E-SAREレポーターdGFP蛍光と、Arc/c-Fosタンパク質の免疫活性が細胞レベルで有意に重なることが示された【００５５】
次に、10分間の明刺激によるV1におけるE-SAREレポーターの誘導を調べた。
図９Ａに実験の手順を示す。7-8週齢のマウスにE-SARE AAVを感染させ、3-4週間後に暗環境に2日間置き、10分間明環境曝露し、再び暗環境に置いて90分後に組織学的解析を行った。図９Ｂ左に、明刺激前後のV1神経細胞像を示す。図９Ｂ右に、E-SAREレポーターdGFPと、内因性c-Fos及びArcの免疫活性の定量を示す。エラーバーはそれぞれ4匹のマウスにおける標準誤差を示す。*はP < 0.01。***はP < 0.001（unpaired t-test）。各P値は、1.4×10-5（GFP）、4.8×10-3（c-Fos）、4.3×10-3（Arc）。
図９Ｃ及びＤに、E-SARE-dGFPと内因性Arc/c-Fosタンパク質の発現の重なりを示す。核図左に、E-SARE-dGFP、感染マーカーのRFP、内因性Arc/c-Fos免疫活性の像を示す。矢印はE-SARE-dGFPとArc/c-Fosがいずれも陽性であった細胞を示し、三角はE-SARE-dGFPとArc/c-Fosのいずれか一方のみが陽性であった細胞を示す。各図右に、重なりの定量を示す。2次元カイ二乗検定により、Arc/GFPはχ2=242.3、P=1.2×10-54、c-Fos/GFPはχ2=266.6、P=6.1×10-60であった。かっこ内の数字は4匹の動物で計測した細胞数を示す。
図９ＥにE-SARE-dGFP、内因性Arcタンパク質、及び内因性c-Fosタンパク質の三重染色を示す。上段にE-SARE-dGFPと、内因性Arcタンパク質及び内因性c-Fosタンパク質の免疫応答とを示す。矢印は、E-SARE-dGFP、内因性Arcタンパク質、及び内因性c-Fosタンパク質の3つとも陽性の神経細胞を示す。下段に、重なりの定量を示す。2次元カイ二乗検定により、Arc/GFPはχ2=2.6、P=1.2×10-216、c-Fos/GFPはχ2=637.4、P=1.2×10-140、Arc or c-Fos/GFPはχ2=1020、P=5.7×10-224であった。かっこ内の数字は4匹の動物で計測した細胞数を示す。【００５６】
E-SAREの神経活動依存的活性の確認
E-SAREの下流にERT2CreERT2-PESTを連結したAAVベクターを用いて、図３Ｂと同様の方法で実験を行った。
図１０左に本実験で用いたAAVベクターの構造を示す。Virus 1のE-SAREが機能してCreリコンビナーゼが発現すると、Virus 2のStop配列を切り出す結果、組織非特異的なCAGプロモータの下流のRFPが発現し赤色蛍光が観察される。
一方、GFPは、構成的に発現し、両眼網膜からの入力に応答する外側膝状態細胞をすべて染色するので、そこからV1への投射軸索がすべて緑色に観察される。
図１０右に、V1へのLGN軸索投射の再構成3D画像を示す（スケールバーは、上段20μm、下段5μm。）。Layer 4（深度-340μm。直線で示される平面）において、GFP陽性軸索の一部に、RFP標識された軸索が観察された。このことは、片眼刺激時に活性化された細胞でE-SARE誘導性Creリコンビナーゼが発現し、RFPが片眼刺激による入力に応答する細胞のみで発現し、ある特定の時期に活性化した細胞のみV1への投射軸索が染色されたことを示す。
すなわち、E-SAREが、その他の分子的特徴が全く同一の細胞集団の中で、特定の神経活動の履歴を持った細胞群でのみ、任意の遺伝子を発現することが示された。【００５７】
図１１に不安定化薬剤誘導性リコンビナーゼERT2CreERT2-PESTのタンパク質半減期を調べた結果を示す。
図１１Ａは、培養神経細胞を20μMのアニソマイシンで処理した後のERT2CreERT2とERT2CreERT2-PESTタンパク質の分解の経過を示す。ERT2CreERT2とERT2CreERT2-PESTタンパク質（矢印）のいずれも、アニソマイシン処理後、徐々に分解したが、同じサンプル中のEGFPタンパク質はほとんど分解しなかった。図１１Ｂは、分解の経時変化を定量的に調べた結果を示す。図１０で用いたERT2CreERT2-PESTの半減期は、2.9時間と計算された。エラーバーは3つの独立した実験における標準誤差を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００５８】
配列番号：１は、E-SAREプロモータの塩基配列を表す。
配列番号：２は、図１Ａに示すFragment Aの塩基配列を表す。
配列番号：３は、図１Ａに示すFragment Bの塩基配列を表す。
配列番号：４は、図１Ａに示すFragment Cの塩基配列を表す。
配列番号：５は、E-PGKプロモータの塩基配列を表す。
配列番号：６は、5xCRE-minCMVプロモータの塩基配列を表す。
配列番号：７は、5xMRE-minCMVプロモータの塩基配列を表す。
配列番号：８は、5xSRE-minCMVプロモータの塩基配列を表す。
配列番号：９は、最小CMVプロモータフラグメントminCMVの塩基配列を表す。
配列番号：１０は、E-SARE二重発現カセットの塩基配列を表す。
配列番号：１１は、5xCRE-minCMVプロモータに用いられたCRB結合部位の塩基配列を表す。
配列番号：１２は、5xMRE-minCMVプロモータに用いられたMEF2結合部位の塩基配列を表す。
配列番号：１３は、5xSRE-minCMVプロモータに用いられたSRF及びElk-1結合部位の塩基配列を表す。
配列番号：１４は、M13フォワードプライマーの塩基配列を表す。
配列番号：１５は、M13リバースプライマーの塩基配列を表す。
配列番号：１６は、e56フォワードプライマーの塩基配列を表す。
配列番号：１７は、e56リバースプライマーの塩基配列を表す。
【図３Ｃ】
2014045674.tif 000004
【図９Ａ】
2014045674.tif 000005
【図１Ａ】
2014045674.tif 000006
【図１Ｂ】
2014045674.tif 000007
【図１Ｃ】
2014045674.tif 000008
【図１Ｄ】
2014045674.tif 000009
【図１Ｅ】
2014045674.tif 000010
【図２Ａ】
2014045674.tif 000011
【図２Ｂ】
2014045674.tif 000012
【図２Ｃ】
2014045674.tif 000013
【図２Ｄ】
2014045674.tif 000014
【図２Ｅ】
2014045674.tif 000015
【図２Ｆ】
2014045674.tif 000016
【図３Ａ】
2014045674.tif 000017
【図３Ｂ】
2014045674.tif 000018
【図３Ｄ】
2014045674.tif 000019
【図３Ｅ】
2014045674.tif 000020
【図３Ｆ】
2014045674.tif 000021
【図４Ａ】
2014045674.tif 000022
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
2014045674.tif 000028
【図６Ｂ】
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【図７】
2014045674.tif 000030
【図８】
2014045674.tif 000031
【図９Ｂ】
2014045674.tif 000032
【図９Ｃ】
2014045674.tif 000033
【図９Ｄ】
2014045674.tif 000034
【図９Ｅ】
2014045674.tif 000035
【図１０】
2014045674.tif 000036
【図１１Ａ】
2014045674.tif 000037
【図１１Ｂ】
2014045674.tif 000038
【配列表】
2014045674000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年7月17日(2014.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経活動依存的プロモータ活性を有するＤＮＡであって、
Ａｒｃ／Ａｒｇ３．１遺伝子のプロモータ上のシナプス活動応答性エレメント（ＳＡＲＥ）のうち、ＣＲＥＢ結合部位、ＭＥＦ２結合部位、及びＳＲＦ結合部位を含むフラグメントが、スペーサを介して５回タンデムに連結されたコンストラクトを含む、ＤＮＡ。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
神経活動依存的プロモータ活性を有するＤＮＡであって、
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかのＤＮＡが、スペーサを介して５回タンデムに連結されたコンストラクトを含む、ＤＮＡ：
（ｉ）配列番号：２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｉｉ）配列番号：２で表される塩基配列において１又は複数の塩基が欠失、付加又は置換されている配列からなるＤＮＡ；
（ｉｉｉ）配列番号：２で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する配列からなるＤＮＡ；
（ｉｖ）配列番号：２で表される塩基配列と相補的な配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるＤＮＡ。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
前記神経活動依存的プロモータ活性を有するＤＮＡが、配列番号：１で表される塩基配列からなる、請求項１又は３記載の神経活動依存的プロモータ活性を有するＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１、３及び５のいずれか１項に記載の神経活動依存的プロモータ活性を有するＤＮＡと、該ＤＮＡの下流に連結されたレポーター遺伝子とを含むベクター。
【請求項７】
請求項１、３及び５のいずれか１項に記載の神経活動依存的プロモータ活性を有するＤＮＡと、該核酸の下流に連結されたレポーター遺伝子とを含むウイルスベクター。
【請求項８】
アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項７に記載のウイルスベクター。
【請求項９】
さらに、感染マーカー遺伝子の発現カセットを含む、請求項７又は８に記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
請求項６から９のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞（但し、ヒト生体内の細胞を除く）。
【請求項１１】
請求項６から９のいずれか１項に記載のベクターを含む非ヒト動物。
【請求項１２】
請求項６から９のいずれか１項に記載のベクターを神経細胞にトランスフェクトする工程と、
前記レポーター遺伝子の発現を測定して、活動した神経細胞を同定する工程と、
を含む神経細胞の活動検出方法。
【請求項１３】
幹細胞から神経細胞へのいずれかの分化段階で、請求項６から９のいずれか１項に記載のベクターを該細胞にトランスフェクトする工程と、
前記レポーター遺伝子の発現を測定して、神経活動の有無又は強弱を評価する工程と、
を含む神経細胞の分化評価方法。
【請求項１４】
幹細胞から神経細胞へのいずれかの分化段階で、請求項６から９のいずれか１項に記載のベクターを該細胞にトランスフェクトする工程と、
前記レポーター遺伝子の発現を測定して、神経活動の有無又は強弱を評価する工程と、
を含む神経細胞の可塑性の評価方法。
【請求項１５】
請求項６から９のいずれか１項に記載のベクターを含む、脳機能マーカー。
【請求項１６】
請求項６から９のいずれか１項に記載のベクターを神経細胞にトランスフェクトする工程と、
前記神経細胞に候補化合物を投与する工程と、
前記レポーター遺伝子の発現を測定して、神経活動の有無を評価する工程と、
を含む脳機能改善剤のスクリーニング方法。
【請求項１７】
配列番号：５で表される塩基配列を含む、プロモータ活性を有するＤＮＡ。
【手続補正書】
【提出日】平成28年2月15日(2016.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAであって、
Arc/Arg3.1遺伝子のプロモータ上のシナプス活動応答性エレメント（SARE）のうち、CREB結合部位、MEF2結合部位、及びSRF結合部位を含むフラグメントが、スペーサを介して5回タンデムに連結されたコンストラクトを含む、DNA。
【請求項２】
神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAであって、
以下の(i)〜(iii)のいずれかのDNAが、スペーサを介して5回タンデムに連結されたコンストラクトを含む、DNA：
(i)配列番号：２で表される塩基配列からなるDNA；
(ii)配列番号：２で表される塩基配列において1又は数個の塩基が欠失、付加又は置換されている配列からなるDNA；
(iii)配列番号：２で表される塩基配列と90％以上の同一性を有する配列からなるDNAであって、CREB結合部位、MEF2結合部位、及びSRF結合部位の塩基配列が、配列番号：２で表される塩基配列と同一である、DNA。
【請求項３】
前記神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAが、配列番号：１で表される塩基配列からなる、請求項１又は２記載の神経活動依存的プロモータ活性を有するDNA。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の神経活動依存的プロモータ活性を有するDNAと、該DNAの下流に連結されたレポーター遺伝子とを含むベクター。
【請求項５】
アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
ウイルスベクターであって、さらに、感染マーカー遺伝子の発現カセットを含む、請求項４又は５に記載のベクター。
【請求項７】
配列番号：５で表される塩基配列からなるDNAを含む、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項４から７のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞（但し、ヒト生体内の細胞を除く）。
【請求項９】
請求項４から７のいずれか１項に記載のベクターを含む非ヒト動物。
【請求項１０】
請求項４から７のいずれか１項に記載のベクターを神経細胞にトランスフェクトする工程と、
前記レポーター遺伝子の発現を測定して、活動した神経細胞を同定する工程と、
を含む神経細胞の活動検出方法であって、
前記トランスフェクト工程が、in vitroで実施される工程であるか、非ヒト動物の神経細胞を用いて実施される工程である、方法。
【請求項１１】
幹細胞から神経細胞へのいずれかの分化段階で、請求項４から７のいずれか１項に記載のベクターを該細胞にin vitroでトランスフェクトする工程と、
前記レポーター遺伝子の発現を測定して、神経活動の有無又は強弱を評価する工程と、
を含む神経細胞の評価方法であって、
前記神経細胞の評価が神経細胞の分化評価又は神経細胞の可塑性の評価である、方法。
【請求項１２】
請求項４から７のいずれか１項に記載のベクターを含む、脳機能マーカー。
【請求項１３】
請求項４から７のいずれか１項に記載のベクターを神経細胞にトランスフェクトする工程と、
前記神経細胞に候補化合物を投与する工程と、
前記レポーター遺伝子の発現を測定して、神経活動の有無を評価する工程と、
を含む脳機能改善剤のスクリーニング方法であって、
前記トランスフェクト工程及び投与工程のいずれもが、in vitroで実施される工程であるか、非ヒト動物の神経細胞を用いて実施される工程である、方法。
【請求項１４】
さらに配列番号：５で表される塩基配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の神経活動依存的プロモータ活性を有するDNA。
【国際調査報告】
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