(57)【要約】  免疫異常、特に過剰な免疫応答を調節するための免疫調節剤の提供。発明者らは鋭意研究の結果マンゴスチンの果皮から極性溶媒で抽出したマンゴスチン果皮抽出物が免疫を調節する機能を有することを見出し、これを免疫調節剤として提供する。
2014013727.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンゴスチン果皮抽出物からなる免疫調節剤。
【請求項２】
細胞の増殖を抑制することを特徴とする請求項１に記載の免疫調節剤。
【請求項３】
ＩＦＮ−γの産生を抑制することを特徴とする請求項１から２のいずれかに記載の免疫調節剤。
【請求項４】
ＴＳＬＰの産生を抑制することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の免疫調節剤。
【請求項５】
細胞が、ケラチノサイト、肥満細胞及びＢ細胞からなる群から選ばれる１種類の細胞であることを特徴とする請求項２あるいは請求項２に係る請求項３または４のいずれかに記載の免疫調節剤。
【請求項６】
ＩＬ−４、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ）、ＣＣＬ２４（Ｅｏｔａｘｉｎ−２）、ＮＧＦ、ＡＱＰ３のいずれか少なくとも一種類の産生を抑制することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の免疫調節剤。
【請求項７】
α−マンゴスチンからなる免疫調節剤。
【請求項８】
細胞の増殖を抑制することを特徴とする請求項７に記載の免疫調節剤。
【請求項９】
ＩｇＥ、ＩＦＮ−γまたはＴＳＬＰのいずれか少なくとも一種類の産生を抑制することを特徴とする請求項７または８のいずれかに記載の免疫調節剤。
【請求項１０】
γ−マンゴスチンからなる免疫調節剤。
【請求項１１】
細胞の増殖を抑制することを特徴とする請求項１０に記載の免疫調節剤。
【請求項１２】
ＩｇＥまたはＩＦＮ−γのいずれか少なくとも一種類の産生を抑制することを特徴とする請求項１０または１１のいずれかに記載の免疫調節剤。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載の免疫調節剤を含む、免疫調節のための飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫調節剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高等動物は、細菌、ウイルス、毒物などの異物が侵入してきた際に体を防御する、免疫機能を備えている。免疫機能が低下すると、細菌などによる感染症にかかりやすくなる。一方、免疫機能が過剰に働くとアレルギーや自己免疫疾患といった疾病を招く。本発明では、免疫異常、特に過剰に働く免疫機能によって引き起こされる疾病を予防、治療、あるいは軽減する免疫調節剤の提供を目的とする。【０００３】
免疫応答には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、肥満細胞などの細胞が関与している。Ｔ細胞は、表面抗原により、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞に分けることができ、ヘルパーＴ細胞はさらにサイトカインの分泌のプロファイルによりＴｈ１細胞とＴｈ２細胞に分けられる。Ｔｈ１細胞が優勢な免疫応答はＴｈ１型応答といわれ細胞性免疫を誘導し、Ｔｈ２細胞が優勢な免疫応答はＴｈ２型応答といわれ液性免疫を誘導する。Ｔｈ１型免疫応答とＴｈ２型免疫応答は正常な状態ではバランスが保たれており、これがどちらかに大きく偏ると疾患を起こすといわれ、すなわち、Ｔｈ１型の免疫応答が亢進すれば、自己免疫疾患が誘導され、Ｔｈ２型の免疫応答が亢進すればアレルギーが誘導されるといわれる。【０００４】
ウイルス、寄生菌に感染すると、Ｔｈ０細胞のＴｈ１細胞への分化が促され、細胞性免疫が活発化される。Ｔｈ１細胞はインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）やインターロイキン（ＩＬ）−２等のサイトカインを産生し、Ｔ細胞、マクロファージなどを活発化し、ウイルス感染した細胞を攻撃する。Ｔｈ１型免疫応答が亢進すると自己応答型のＴ細胞を活性化し、関節リウマチや多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病等の慢性炎症や自己免疫疾患を誘導する場合がある。【０００５】
一方、外界からダニやハウスダストなどの環境抗原が体内に侵入するとＴｈ０細胞のＴｈ２細胞への分化が誘導され、液性免疫が活発化される。【０００６】
アレルギーの発症にはＴｈ２型応答が関わっている。ハウスダストなどの環境抗原が生体に侵入すると、表皮ケラチノサイトより胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ：ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）が産生される。ＴＳＬＰは樹状細胞を活性化し、Ｔｈ０細胞のＴｈ２細胞への分化を促す。活性化したＴｈ２細胞からＩＬ−４、ＩＬ−１３が産生され、これらがＢ細胞に作用し、抗原に対して特異性を有する抗体が産生され、液性免疫が誘導される。この際に、なんらかの機序によりＩｇＥ抗体が多量に誘導される場合がある。ＩｇＥは肥満細胞及び好塩基球上のＦｃεＲＩと結合し、再度侵入した抗原と架橋すると、ＦｃεＲＩの凝集が促進され、肥満細胞や好塩基球の活性化が引き起こされる。その際に、細胞質顆粒内に蓄えられたヒスタミン、トリプターゼ、プロテオグリカンといった化学伝達物質が放出され、即時性アレルギー反応が引き起こされる。更に、Ｔｈ２細胞より産生されるＩＬ−５により好酸球の病変部への浸潤が、また活性化樹状細胞より産生されるＣＣＬ２２やＣＣＬ２４といったケモカインによりＴｈ２細胞の病変部への浸潤が誘導され、炎症アレルギー反応が引き起こされる場合がある。【０００７】
近年、アレルギーには、皮膚のバリア機能の破綻も関与すると考えられはじめている。
皮膚は表皮、基底膜、真皮、皮下組織の４層からなり、表皮は更に角層、顆粒層、有棘層、基底層に分類される。表皮細胞層の大部分を占めるケラチノサイトの秩序だった細胞増殖・分化により、皮膚バリアが形成され、角層内水分が外界に逃げるのを防ぐとともに、外界からのハウスダストなどの環境抗原が体内に侵入するのを防ぐ。乾癬、光線性角化症、魚鱗癬、脂漏性皮膚炎等の皮膚疾患では、ケラチノサイトの細胞増殖制御が破綻をきたし、皮膚上皮細胞の異常増殖により皮膚の肥厚化が起こる。その結果、表皮バリア機能が低下することで、環境抗原が侵入しやすくなる。【０００８】
ケラチノサイトの細胞増殖を制御する因子として、アクアポリン３（ＡＱＰ３：Ａｑｕａｐｏｒｉｎ３）が報告されている。ＡＱＰ３は、細胞膜表面に存在する水及びグリセリンの輸送タンパク質であり、細胞の増殖・移動と水分の輸送を制御し、皮膚の生理的保湿や創傷治癒に関与することが報告されている。また、ケラチノサイトは種々の刺激により、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＴＳＬＰ、ＣＣＬ１７等の炎症性サイトカインやケモカインを放出し、免疫細胞を活性化させるなど免疫応答においても重要な役割を果たす。更に、ケラチノサイトは種々の刺激により、神経成長因子（ＮＧＦ：Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を放出し、末梢神経の増加・肥大を引き起こし、外界の刺激に対する感受性が増大することが報告されている。刺激に対する感受性が増大すると、掻爬行動が惹起され、すると、表皮バリアが破壊され、炎症性サイトカインの産生が誘導され、免疫応答がさらに亢進するという悪循環となる。【０００９】
免疫疾患の予防・治療には、免疫機能と表皮バリア機能を上手く制御する物質、即ちＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン、ＩｇＥ産生に加え、ケラチノサイトの異常増殖やケラチノサイトからの炎症性サイトカインやＮＧＦの産生を抑制する物質が見出されることが期待される。【００１０】
このような背景の下、免疫調節能を有する物の探索が行われており、米原料醸造物（特許文献１）・酢酸及びプロピオン酸（特許文献２）等が開示されている。しかしこれらは、いずれもＴｈ１／Ｔｈ２バランスに対する効果を有するのみで、表皮バリア改善も含む多面的効果を有することは開示されていない。【００１１】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決するためになされたもので、マンゴスチン果皮抽出物中からなる安全かつ免疫異常を調節する効果を有する免疫調節剤に関するものである。【００１２】
本発明で使用するマンゴスチン（Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍａｎｇｏｓｔａｎａ．  Ｌｎｎ）はオトギリソウ科フクギ属に含まれる。マンゴスチンは東南アジアに生息する食用果樹であり、その果皮は古くから民間伝承薬として下痢、赤痢、解熱剤や皮膚病に利用されてきた。マンゴスチンはフルーツの女王といわれ、知名度も高くイメージのよい素材である。したがってマンゴスチン果皮の抽出物からなる免疫調整剤は、イメージがよく、患者に受け入れられやすい。【００１３】
マンゴスチンの効能については、マンゴスチンの抽出物から精製されたα−マンゴスチン及びγ−マンゴスチンが、抗ヒスタミン効果あるいは抗セロトニン効果を有すること、また、α−マンゴスチン及びγ−マンゴスチンがヒト花粉症に対する抑制効果を示すことが知られている（特許文献３）。また、マンゴスチン抽出物、とりわけα−マンゴスチン、γ−マンゴスチンがＩκＢキナーゼに対する阻害効果を有することも知られている（特許文献４）。さらに、マンゴスチン抽出物がアトピー性皮膚炎を予防／治療する効果を有することも知られている（特許文献５）。【００１４】
また、非特許文献１はγ−マンゴスチンがＩκＢキナーゼ活性を抑制すること、プロスタグランジンＥの放出を抑制し、その結果シクロオキシゲナーゼ２遺伝子の発現を抑制することを開示する。非特許文献２は、ＩκＢキナーゼ活性阻害剤であるＩＭＤ―０３５４が免疫異常の一つであるアトピー性皮膚炎の治療に動物レベルで効果を有することを開示する。非特許文献３はα−マンゴスチンがリンパ性白血病Ｂ細胞に対して、抗増殖効果を有することを開示する。非特許文献４はα−マンゴスチン及びγ−マンゴスチンがヒト白血病細胞株ＨＬ６０に対し抗増殖効果を有することを開示する。【００１５】
非特許文献５はマンゴスチン果皮抽出物がヒト結腸直腸腺癌の細胞株ＣＯＬＯ２０５に対し抗増殖効果を有することを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２００８−１９５７１３
【特許文献２】特開２００９−２９２７８５
【特許文献３】特許第３９６８４０５
【特許文献４】特開２０１０−１９５８３１
【特許文献５】再表２００９−１４２３２０
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６６，ｐ６６７（２００４）
【非特許文献２】Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １２７，  Ｐ８５５（２００７）
【非特許文献３】Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．，７５、Ｐ２４３（２００９）
【非特許文献４】Ｊ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ．，６６，Ｐ１１２４（２００３）
【非特許文献５】ＡｐｐｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６２，Ｐ１０８０（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
免疫異常、特に過剰な免疫応答を調節するための免疫調節剤の提供。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明者らは鋭意研究の結果マンゴスチンの果皮から抽出したマンゴスチン果皮抽出物が免疫を調節する機能を有することを見出し、これを免疫調節剤として提供する。
【発明の効果】
【００２０】
マンゴスチン果皮抽出物からなる免疫調節剤は、細胞の増殖の抑制、ＩｇＥ、ＩＦＮ−γ、ＴＳＬＰ、ＩＬ−４、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２４、ＮＧＦ、ＡＱＰ３等の産生を抑制する。
マンゴスチンは、古くから食用されており、本発明の免疫調節剤は安全性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】細胞の増殖に対してマンゴスチン果皮抽出物が示す効果を調べた結果である。
【図２】ＩｇＥ産生に対してマンゴスチン果皮抽出物が示す効果を調べた結果である。
【図３】サイトカインの産生に対してマンゴスチン果皮抽出物が示す効果をｍＲＮＡレベルで調べた結果である。
【図４】サイトカインの産生に対してマンゴスチン果皮抽出物が示す効果をｍＲＮＡレベルで調べた結果である。
【図５】ＴＳＬＰの産生に対してマンゴスチン果皮抽出物が示す効果をｍＲＮＡレベルで調べた結果である。
【図６】サイトカイン、ケモカインなどの内因性タンパク質の産生に対してマンゴスチン果皮抽出物が示す効果をｍＲＮＡレベルで調べた結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、マンゴスチン果皮抽出物からなる免疫調節剤を提供する。マンゴスチン果皮抽出物からなる免疫調節剤は、細胞の増殖を抑制する。細胞の種類は限定されないが、細胞はケラチノサイト、肥満細胞及びＢ細胞を例としてあげることができる。また、マンゴスチン果皮抽出物からなる免疫調節剤は、ＩＦＮ−γの産生を抑制する。また、マンゴスチン果皮抽出物からなる免疫調節剤はＴＳＬＰの産生を抑制する。さらには、マンゴスチン果皮抽出物からなる免疫調節剤はＩＬ−４、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ）、ＣＣＬ２４（Ｅｏｔａｘｉｎ−２）、ＮＧＦ、ＡＱＰ３の産生を抑制する。
【００２３】
また、本発明は、α−マンゴスチンからなる免疫調節剤を提供する。α−マンゴスチンからなる免疫調節剤は細胞の増殖、また、ＩｇＥ、ＩＦＮ−γまたはＴＳＬＰの産生を抑制する。
【００２４】
また、本発明は、γ−マンゴスチンからなる免疫調節剤を提供する。γ−マンゴスチンからなる免疫調節剤は細胞の増殖、また、ＩｇＥ、またはＩＦＮ−γの産生を抑制する。
さらに本発明は上記に記載の免疫調節剤のいずれかを含む、免疫調節のための飲食品を提供する。
【００２５】
マンゴスチンはオトギリソウ科フクギ属に含まれる植物である。マンゴスチンの果皮は、マンゴスチン果実（生または乾燥品）から得られるものを使用することができる。
【００２６】
マンゴスチン果皮抽出物とは、マンゴスチン果皮から溶媒により抽出された抽出物をいう。抽出に用いられる溶媒は、特に限定されないが、好ましくは極性溶媒であり、好ましい例としてメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｎ―ブタノール、アセトン、酢酸エチル、および水からなる群から選択される極性溶媒あるいはそれらの混合溶媒を上げることができる。経口投与剤又は飲食品として用いることを考慮すると、抽出溶剤として、エタノール、又は水とエタノールとの組み合わせを用いることが安全性の点において好ましい。抽出の温度は特に規定はしないが、抽出効率の点で、室温から溶媒の沸点温度の範囲が好適である。抽出時間は溶媒の種類、果皮の状態（生または乾燥品、粉砕物または粉末など）および抽出温度により変化するが、０．５〜２４時間の範囲が好適である。
【００２７】
抽出物は必要によりエバポレーターなどにより抽出溶剤を濃縮し、あるいは除去してもよい。また、抽出物は、必要により溶媒分画やクロマトグラフィーにより精製して用いることもできる。
【００２８】
免疫調節剤とは、免疫応答を調節する調節剤を指し、本発明においてはより好ましくは、過剰な免疫応答を抑制する調節剤を指す。免疫調節の例としては、細胞の増殖の抑制、抗体、特に好ましくはＩｇＥの産生の抑制、サイトカイン、ケモカインといった、免疫応答に関連する内因性タンパク質、たとえば、ＩＦＮ−γ、ＴＳＬＰ、ＩＬ−４，ＣＣＬ２２，ＣＣＬ２４、ＮＧＦ、ＡＱＰ３の抑制を挙げることができる。
【００２９】
α−マンゴスチンとは、次の（１）の構造をもつ化合物であり、マンゴスチン果皮より抽出が可能である。
【化１】
2014013727.tif 000003
【００３０】
γ−マンゴスチンとは、次の（２）の構造をもつ化合物であり、マンゴスチン果皮より抽出が可能である。
【化２】
2014013727.tif 000004
【実施例１】
【００３１】
・マンゴスチン果皮抽出物の調製
マンゴスチンの未乾燥果皮１００ｇを粉砕し、１ｌの７０％エタノール中で１時間、８０℃で撹拌抽出した。これをろ過し、ろ液をエバポレーターで減圧乾燥し、２７．４ｇの抽出物を得た。これをマンゴスチン果皮抽出物とした。以下、本明細書中において、この抽出物をＭＥ７０と呼称することがある。【００３２】
・α−マンゴスチン、γ−マンゴスチンの調製
マンゴスチンの未乾燥果皮１ｋｇを１０Ｌのメタノールに浸漬し、２４時間室温下抽出した。濾過後、濾液をエバポレーターで減圧乾燥し、８０ｇの抽出物を得た。得られた抽出物８０ｇを３５０ｍｌの酢酸エチルに溶解後、２００ｍｌの水で２回洗浄した。酢酸エチル画分をエバポレーターで溶媒を溜去させ２０ｇの乾燥物を得た。この乾燥物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。溶出はヘキサン−酢酸エチル系で漸次、極性をあげるグラジエント溶出を行い、３つの画分を得た。最初に得られた画分（５ｇ）を再度、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、１０：９０→３０：７０→５０：５０）で精製し、黄色結晶状の試料としてα−マンゴスチン２ｇを得た。２つめの画分（２ｇ）を再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、３０：７０→５０：５０、続いて酢酸エチルのみ、最後に酢酸エチル−メタノール、５０：５０）で精製し、黄色非結晶状の試料としてγ−マンゴスチン５００ｍｇを得た。
【実施例２】
【００３３】
・試験法
ケラチノサイト細胞、肥満細胞、及びＢ細胞の細胞株の増殖に対してマンゴスチン果皮抽出物、α−マンゴスチン、γ−マンゴスチンが示す効果を調べた。
マウスケラチノサイト細胞株ＰＡＭ２１２はＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１２１００−０４６）培地（１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌ  Ｐ−Ｓ含有）で培養した。マウス肥満細胞株Ｐ８１５は  ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％  ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌ  Ｐ−Ｓ含有）で培養した。マウスＢ細胞株ＢＣＬ１は  ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％  ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌ  Ｐ−Ｓ含有）で培養した。
各細胞の懸濁液に様々な濃度の試料（マンゴスチン果皮抽出物（ＭＥ７０）、α−マンゴスチン、γ−マンゴスチン、ＩＭＤ−０３５４，ＦＫ５０６）を加え、９６ウェルプレートに播種した（１００μｌ／ｗｅｌｌ）。対照群として、試料を添加しない群を設けた。ＦＫ５０６は公知の免疫抑制剤である。
なお、ＰＡＭ２１２は２×１０４細胞／ｍｌの濃度で播種を行った。Ｐ８１５は５×１０４細胞／ｍｌの濃度で播種を行った。ＢＣＬ１は２×１０５細胞／ｍｌの濃度で播種を行った。
播種２４、４８、７２時間後にｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ  ｄｙｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｔｅｓｔにより生細胞数の測定を行った。【００３４】
・結果
結果を表１および図１に示す。マンゴスチン果皮抽出物、α−マンゴスチン、γ−マンゴスチンはマウスケラチノサイト細胞株ＰＡＭ２１２の増殖を抑制した。ＩＣ５０はそれぞれ５．９μｇ／ｍｌ、３．８μＭ、１．６μＭであった。
マンゴスチン果皮抽出物、α−マンゴスチン、γ−マンゴスチンはマウス肥満細胞株Ｐ８１５の増殖を抑制した。ＩＣ５０はそれぞれ７．７μｇ／ｍｌ、３．０μＭ、３．１μＭであった。
マンゴスチン果皮抽出物、α−マンゴスチン、γ−マンゴスチンはマウスＢ細胞株ＢＣＬ１の増殖を抑制した。ＩＣ５０はそれぞれ４．９μｇ／ｍｌ、２．２μＭ、１．０μＭであった。
また、本実験で使用したマンゴスチン果皮抽出物には、α―マンゴスチン、γ―マンゴスチンがそれぞれ１３．２％、１２．４％含まれ、分子量が、それぞれ４１０．４６６、３９６．４３９であることを考慮し、以下の式により求めた。
α−マンゴスチンの寄与率＝｛（マンゴスチン果皮抽出物のＩＣ５０）（μｇ／ｍｌ）×０．１３１÷４１０．４６６÷１０００×１０６｝÷（α−マンゴスチンのＩＣ５０）（μＭ）×１００
γ−マンゴスチンの寄与率＝｛（マンゴスチン果皮抽出物のＩＣ５０）（μｇ／ｍｌ）×０．０２４÷３９６．４３９÷１０００×１０６｝÷（γ−マンゴスチンのＩＣ５０）（μＭ）×１００【００３５】
【表１】
2014013727.tif 000005
【実施例３】
【００３６】
・試験法
ＳＰＦ環境下のＮＣ／Ｔｎｄマウス（７〜９週齢）から、脾臓を単離し、ＲＰＭＩ１６４０培地中でホモジェナイズ後、７０μｍメッシュフィルターにより、単一細胞懸濁液を作製した。遠心分離後（１２００ｒｐｍ、４℃、５分）、１×１０８細胞／ｍｌの濃度になるように、Ｒｏｂｏｓｅｐバッファー（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２０１０４）に再懸濁した。Ｍｏｕｓｅ  ＣＤ１９  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２００００）を用いて、ＲＯＢＯＳＥＰ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２０１０４）により、ＣＤ１９陽性の細胞を分離した。遠心分離後（１２００ｒｐｍ、４℃、５分）、５×１０５細胞／ｍｌになるようにＲＰＭＩ１６４０培地（１０％  ＦＣＳ、５０  Ｕ／ｍｌ  Ｐ−Ｓ、１×１０−４  Ｍ  ２−ＭＥ含有）に懸濁した。５００Ｕ／ｍｌ  ｒｍＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ，  Ｉｎｃ．，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＵＳＡ，  Ｃａｔ．Ｎｏ．４０４−ＭＬ−０１０）と１０μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＵＳＡ，  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｌ６１４３）とともに、各濃度の試料を添加し、９６ウェルプレートに播種した（２００μｌ／ｗｅｌｌ）。対照群として、試料を添加しない群を設けた。３７℃、５％  ＣＯ２条件下で９日間培養した後、培養液上清を回収し、ＥＬＩＳＡにより、ＩｇＥ濃度を測定した。【００３７】
・結果
マウス脾臓より単離したＢ細胞に対して、マンゴスチン果皮抽出物、α−マンゴスチン、γ−マンゴスチンはＩＬ−４とＬＰＳにより誘導されるＩｇＥの産生を抑制した。結果を表１及び図２に示す。ＩＣ５０はそれぞれ４．８μｇ／ｍｌ、２．５μＭ、１．６μＭであった。
【実施例４】
【００３８】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるサイトカイン産生に対する影響（メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルでの解析）
・試験法
コンベンショナル環境下で皮膚炎を発症したＮＣ／Ｔｎｄマウス（１２〜１７週齢）から、腋窩リンパ節を単離し、ＲＰＭＩ１６４０培地中でホモジェナイズ後、７０μｍメッシュのフィルターにより、単一細胞懸濁液を作製した。遠心分離後（１２００ｒｐｍ、４℃、５  ｍｉｎ）、２×１０６細胞／ｍｌの濃度になるように、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％  ＦＣＳ、５０Ｕ／ｍｌ  Ｐ−Ｓ、１×１０−４Ｍ  ２−ＭＥ含有）に懸濁した。１μｇ／ｍｌポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｌ６１４３）とともに、各濃度のサンプルを添加し、２４ウェルプレートに播種し（１ｍｌ／ｗｅｌｌ）、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。対照群として、ＰＷＭを添加しない群(図３、４では培地と示す)、また、ＰＷＭのみを添加してサンプルを添加しない群を設けた（図３、４ではPWMと示す）。その後、ＴＡＫＡＲＡ  ＦａｓｔＰｕｒｅ  ＲＮＡ  ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．，  Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．９１９０）により、トータルＲＮＡを単離し、ＴＡＫＡＲＡ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６１１０Ａ）を用いてｃＤＮＡの作製を行い、リアルタイムＰＣＲを行った。なお、内在性コントロールとしてβ−ａｃｔｉｎを使用し、比較ＣＴ法（ΔΔＣＴ法）による比較を行った。ΔΔＣＴ法は、１サイクルの検出の違いで、発現量に２倍量の差があるという理論をもとに、基準となる群と比較して、調べたい群が何サイクル早く、もしくは何サイクル遅くＴｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｌｉｎｅに達するかに注目して、発現量を相対定量する方法である。ΔΔＣＴ法においては、ＰＷＭを添加しない群（培地）を基準にした。【００３９】
・結果
結果を図３，４に示す。マウス腋下リンパ節より単離したリンパ球に対して、マンゴスチン果皮抽出物、α−マンゴスチン、γ−マンゴスチンはＰＷＭにより誘導されるＩＦＮ−γのｍＲＮＡの発現上昇を抑制した。ＩＣ５０はそれぞれ６．２μｇ／ｍｌ、３．６μＭ、３．６μＭであった。一方、ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−１３に対しては有意な抑制を示さなかった。
【実施例５】
【００４０】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴＳＬＰ産生に対する影響（ｍＲＮＡレベルでの解析）
・試験法
ＮＣ／Ｔｎｄマウス新生児（１−３日）を屠殺し、皮膚をハサミで切り取った。皮下脂肪を物理的に除去した後、６ｍｍパンチにより皮膚サンプルを得た。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液に皮膚サンプルを浮かせ、４℃で１時間培養した後、３７℃で３０分培養した。ピンセットを用いて皮膚サンプルより表皮を単離し、２４ウェルプレートにおいて培地に浮かせた。様々な濃度の試薬を添加し、３７℃で１時間、前培養した後、ＴＮＦ−α（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加し３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。対照として、試薬もＴＮＦ―α、ＩＬ−１βも加えない群（図５中最も左側）、ＴＮＦ―α、ＩＬ−１βのみを加えた群（図５中左から２番目）を設けた。２４時間後、Ｔａｋａｒａ  ＲＮＡ  Ｆａｓｔｐｕｒｅを用いてトータルＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲを行った。なお、内在性コントロールとしてβ−ａｃｔｉｎを使用し、ΔΔＣＴ法による比較を行った。ΔΔＣＴ法においては、試薬もＴＮＦ―α、ＩＬ−１βも加えない群を基準にした。【００４１】
・結果
結果を図５に示す。表皮組織培養系において、ＴＮＦ−αとＩＬ−１βの共添加により誘導されるＴＳＬＰのｍＲＮＡの発現上昇に対して、マンゴスチン果皮抽出物、α−マンゴスチンは発現抑制作用を示した。
【実施例６】
【００４２】
・試験法
コンベンショナル環境下で未だ皮膚炎を発症していないＮＣ／Ｔｎｄマウス（５−６週齢）を、対照飼料投与群、マンゴスチン果皮抽出物を含む混餌飼料の投与群であるマンゴスチン投与群との２群（各群ｎ＝７）に分けた。いずれの群も、コンベンショナル環境下で対照飼料を用いて１週間の予備飼育を行った後、それぞれの試験飼料を自由摂取させた。すなわち、マンゴスチン投与群には、マンゴスチン果皮抽出物を０．２５％含む混餌飼料を与え（マンゴスチン果皮抽出物の摂取量は、２５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとなる）、対照試料投与群には、ＣＲＦ−１（オリエンタル酵母社）を投与した。試験飼料を６週間投与した後、頸椎脱臼によりマウスを屠殺し、６ｍｍパンチにより、皮膚サンプルを得た。
得られた皮膚サンプルは、ＴＡＫＡＲＡ  ＦａｓｔＰｕｒｅ  ＲＮＡ  ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．，  Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．９１９０）を用いてトータルＲＮＡを単離し、ＴＡＫＡＲＡ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６１１０Ａ）を用いてｃＤＮＡの作製を行い、様々なサイトカインやケモカイン、神経線維の伸展調節に関わるＮＧＦやセマフォリン３ａ（Ｓｅｍａ３ａ）、細胞増殖制御因子であるＡＱＰ３のｍＲＮＡ発現量を解析するためリアルタイムＰＣＲを行った。なお、内在性コントロールとしてβ−ａｃｔｉｎを使用し、ΔΔＣＴ法による比較を行った。ΔΔＣＴ法においては、対照飼料群を基準にした。【００４３】
・結果
結果を図６に示す。図６において、縦軸は対照飼料群での値を１とした相対値である。マンゴスチン果皮抽出物投与群では、皮膚のＴＳＬＰ、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ）、ＣＣＬ２４（Ｅｏｔａｘｉｎ−２）、ＮＧＦ、ＡＱＰ３のｍＲＮＡの発現量が有意に低かった。【００４４】
この出願は２０１２年７月１９日に出願された日本国特許出願第２０１２−１６０４２９号からの優先権を主張するものであり、その内容を引用してこの出願の一部とするものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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