(57)【要約】  多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞へと高効率に分化誘導することが可能な膵臓ホルモン産生細胞の生産方法（分化誘導方法）及び生産された膵臓ホルモン産生細胞、並びにその生産方法に用いられる分化誘導促進剤を提供する。  本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞の生産方法は、多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で、特定の分化誘導促進剤を培地中に添加することを特徴とする。分化誘導促進剤としては、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドやその改変体、あるいは配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、又はこのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを外来遺伝子として組み込んだ細胞の培養上清が用いられる。
2013176249.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞を生産する膵臓ホルモン産生細胞の生産方法であって、
多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で、下記（１）〜（３）から選ばれる少なくとも１種の分化誘導促進剤を培地中に添加することを特徴とする膵臓ホルモン産生細胞の生産方法、
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つポリペプチド、
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、又はこのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを外来遺伝子として組み込んだ細胞の培養上清。
【請求項２】
（Ａ１）ＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子β）スーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で多能性幹細胞を培養する工程、
（Ｂ１）前記工程（Ａ１）で得られた細胞をＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）の存在下で培養する工程、
（Ｃ１）前記工程（Ｂ１）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程、
（Ｄ１）前記工程（Ｃ１）で得られた細胞をγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程、及び
（Ｅ１）前記工程（Ｄ１）で得られた細胞を、エキセンジン−４、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＩＧＦ−１（インスリン様増殖因子−１）、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも１種の因子の存在下で培養する工程、を含み、
前記工程（Ａ１）〜（Ｅ１）の少なくとも１つの工程で前記分化誘導促進剤を培地中に添加する請求項１記載の膵臓ホルモン産生細胞の生産方法。
【請求項３】
（Ａ２）ＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子β）スーパーファミリーに属する増殖因子と、Ｗｎｔ（ウィングレス型ＭＭＴＶ組み込み部位）ファミリーに属する増殖因子及びＧＳＫ−３（グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３）阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の因子との存在下で多能性幹細胞を培養する工程、
（Ｂ２）前記工程（Ａ２）で得られた細胞をＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する工程、
（Ｃ２）前記工程（Ｂ２）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程、
（Ｄ２）前記工程（Ｃ２）で得られた細胞を、ｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）増加剤、デキサメタゾン、ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも１種の因子の存在下で培養する工程、を含み、
前記工程（Ａ２）〜（Ｄ２）の少なくとも１つの工程で前記分化誘導促進剤を培地中に添加する請求項１記載の膵臓ホルモン産生細胞の生産方法。
【請求項４】
（Ａ３）ＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子β）スーパーファミリーに属する増殖因子、レチノイド、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）、及びニコチンアミドの非存在下で膵臓組織幹／前駆細胞を培養する工程、
（Ｂ３）前記工程（Ａ３）で得られた細胞をＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する工程、
（Ｃ３）前記工程（Ｂ３）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程、
（Ｄ３）前記工程（Ｃ３）で得られた細胞をＦＧＦの存在下で培養する工程、及び
（Ｅ３）前記工程（Ｄ３）で得られた細胞をニコチンアミドの存在下で培養する工程
を含み、
前記工程（Ａ３）〜（Ｅ３）の少なくとも１つの工程で前記分化誘導促進剤を培地中に添加する請求項１記載の膵臓ホルモン産生細胞の生産方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の膵臓ホルモン産生細胞の生産方法によって人工的に生産された膵臓ホルモン産生細胞。
【請求項６】
次の（１）〜（３）の少なくとも１種を含み、多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導する分化誘導促進剤；
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つポリペプチド、
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、又はこのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを外来遺伝子として組み込んだ細胞の培養上清。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘導多能性幹細胞（以下、「ｉＰＳ細胞」ともいう。）や胚性幹細胞（以下、「ＥＳ細胞」ともいう。）等の多能性幹細胞、あるいは膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞を生産する膵臓ホルモン産生細胞の生産方法及び生産された膵臓ホルモン産生細胞、並びにその生産方法に用いられる分化誘導促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓は内分泌細胞と外分泌細胞とを有し、内分泌及び外分泌の両方で重要な役割を担っている器官である。内分泌細胞は膵臓ホルモンを産生・分泌する役割を果たし、α細胞からはグルカゴンが、β細胞からはインスリンが、δ細胞からはソマトスタチンが、ＰＰ細胞からは膵ポリペプチドがそれぞれ分泌されることが知られている。特にインスリンは血糖値低下作用を有し、血糖を正しい濃度に保つ重要な役割を果たす。【０００３】
近年、多能性幹細胞や膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞へと分化誘導する方法が数多く報告されている（非特許文献１〜４、特許文献１〜６等を参照）。このような分化誘導方法によって効率的に膵臓ホルモン産生細胞を得ることができれば、膵島移植の代替となる糖尿病の治療方法に繋がると期待される。さらに、患者本人由来の多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞を得ることにより、拒絶反応の問題も解消し得ると考えられる。【０００４】
しかし、これまで報告されている分化誘導方法は、いずれも膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導効率が十分ではなかった。例えば、非特許文献１におけるインスリン産生細胞への分化誘導効率は１２％程度である。このため、多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞へと高効率に分化誘導することが可能な分化誘導方法が望まれている。また、非特許文献３では、マウスＥＳ細胞にｐｄｘ１遺伝子を導入して培養することによってインスリン産生細胞へと分化誘導しているが、安全性の観点からは、遺伝子導入を伴わない分化誘導方法であることが好ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００７／１０３２８２号
【特許文献２】国際公開第２００５／０６３９７１号
【特許文献３】国際公開第２００９／０４８６７５号
【特許文献４】国際公開第２００７／０５１０３８号
【特許文献５】国際公開第２００６／１０８３６１号
【特許文献６】国際公開第２００８／０６６１９９号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｄ’Ａｍｏｕｒ，Ｋ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２４，  ｐｐ．１３９２−１４０１（２００６）
【非特許文献２】Ｗｅｉ  Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １７，  ｐｐ．３３３−３４４（２００７）
【非特許文献３】Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ５３，  ｐｐ．１０３０−１０３７（２００４）
【非特許文献４】Ｙｕｙａ  Ｋｕｎｉｓａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ８，  ｐｐ．２７４−２８４（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、このような従来の実情に鑑みてなされたものであり、多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞へと高効率に分化誘導することが可能な膵臓ホルモン産生細胞の生産方法（分化誘導方法）及び生産された膵臓ホルモン産生細胞、並びにその生産方法に用いられる分化誘導促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、ヒトＴＭ４ＳＦ２０として公知のポリペプチド、あるいはヒトＴＭ４ＳＦ２０をコードするＤＮＡを外来遺伝子として組み込んだ細胞の培養上清を培地に添加することにより、多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞へと高効率に分化誘導することが可能になることを見出した。本発明は、このような知見に基づいて完成されたものであり、より具体的には以下のとおりである。【０００９】
［１］
多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞を生産する膵臓ホルモン産生細胞の生産方法であって、
多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で、下記（１）〜（３）から選ばれる少なくとも１種の分化誘導促進剤を培地中に添加することを特徴とする膵臓ホルモン産生細胞の生産方法、
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つポリペプチド、
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、又はこのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを外来遺伝子として組み込んだ細胞の培養上清。【００１０】
［２］
（Ａ１）ＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子β）スーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で多能性幹細胞を培養する工程、
（Ｂ１）上記工程（Ａ１）で得られた細胞をＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）の存在下で培養する工程、
（Ｃ１）上記工程（Ｂ１）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程、
（Ｄ１）上記工程（Ｃ１）で得られた細胞をγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程、及び
（Ｅ１）上記工程（Ｄ１）で得られた細胞を、エキセンジン−４、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＩＧＦ−１（インスリン様増殖因子−１）、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも１種の因子の存在下で培養する工程、を含み、
上記工程（Ａ１）〜（Ｅ１）の少なくとも１つの工程で上記分化誘導促進剤を培地中に添加する上記［１］記載の膵臓ホルモン産生細胞の生産方法。【００１１】
［３］
（Ａ２）ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子と、Ｗｎｔ（ウィングレス型ＭＭＴＶ組み込み部位）ファミリーに属する増殖因子及びＧＳＫ−３（グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３）阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の因子との存在下で多能性幹細胞を培養する工程、
（Ｂ２）上記工程（Ａ２）で得られた細胞をＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する工程、
（Ｃ２）上記工程（Ｂ２）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程、
（Ｄ２）上記工程（Ｃ２）で得られた細胞を、ｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）増加剤、デキサメタゾン、ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも１種の因子の存在下で培養する工程、を含み、
上記工程（Ａ２）〜（Ｄ２）の少なくとも１つの工程で上記分化誘導促進剤を培地中に添加する上記［１］記載の膵臓ホルモン産生細胞の生産方法。【００１２】
［４］
（Ａ３）ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子、レチノイド、ＦＧＦ、及びニコチンアミドの非存在下で膵臓組織幹／前駆細胞を培養する工程、
（Ｂ３）上記工程（Ａ３）で得られた細胞をＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する工程、
（Ｃ３）上記工程（Ｂ３）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程、
（Ｄ３）上記工程（Ｃ３）で得られた細胞をＦＧＦの存在下で培養する工程、及び
（Ｅ３）上記工程（Ｄ３）で得られた細胞をニコチンアミドの存在下で培養する工程
を含み、
上記工程（Ａ３）〜（Ｅ３）の少なくとも１つの工程で上記分化誘導促進剤を培地中に添加する上記［１］記載の膵臓ホルモン産生細胞の生産方法。【００１３】
［５］
上記［１］〜［４］のいずれか１項記載の膵臓ホルモン産生細胞の生産方法によって人工的に生産された膵臓ホルモン産生細胞。【００１４】
［６］
次の（１）〜（３）の少なくとも１種を含み、多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導する分化誘導促進剤；
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つポリペプチド、
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、又はこのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを外来遺伝子として組み込んだ細胞の培養上清。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞へと高効率に分化誘導することが可能な膵臓ホルモン産生細胞の生産方法（分化誘導方法）及び生産された膵臓ホルモン産生細胞、並びにその生産方法に用いられる分化誘導促進剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるポリペプチド（ＩＢＣＡＰ）の発現ベクターをトランスフェクトした細胞の培養上清を、ヒトｉＰＳ細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程の最終段階（工程（Ｄ１）、（Ｅ１））で添加した場合の、グルカゴン（ＧＣＧ）及びソマトスタチン（ＳＳＴ）の発現量を示す図である。
【図２】配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるポリペプチド（ＩＢＣＡＰ）の発現ベクターをトランスフェクトした細胞の培養上清を、ヒトｉＰＳ細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程の初期段階（工程（Ａ１−１）、（Ａ１−１））又は中間段階（工程（Ｂ１）、（Ｃ１））で添加した場合の、グルカゴン（ＧＣＧ）及びソマトスタチン（ＳＳＴ）の発現量を示す図である。
【図３】配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるポリペプチド（ＩＢＣＡＰ）の発現ベクターをトランスフェクトした細胞の培養上清を、マウス膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程の最終段階（工程（Ｅ３））で添加した場合の、マウスインスリン−１（Ｉｎｓ１）の発現量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞の生産方法は、多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で、特定の分化誘導促進剤を培地中に添加することを特徴とする。以下ではまず、多能性幹細胞、膵臓組織幹／前駆細胞、分化誘導促進剤について順に説明し、次いで、具体的な膵臓ホルモン産生細胞の生産方法（分化誘導方法）について説明する。
【００１８】
＜多能性幹細胞＞
多能性幹細胞とは、少なくとも一種類ずつの三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に属する分化細胞に分化する能力（多分化能）のある自己複製可能な幹細胞のことをいい、例えば、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（ＥＣ細胞）、成体多能性幹細胞（ＡＰＳ細胞）等が包含される。本発明に係る生産方法では、その中でも、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いることが好ましい。
【００１９】
ｉＰＳ細胞とは、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。ｉＰＳ細胞の作製は、京都大学のＤｒ．Ｙａｍａｎａｋａらのグループ、マサチューセッツ工科大学のＤｒ．Ｊａｅｎｉｓｃｈらのグループ、ウィスコンシン大学のＤｒ．Ｔｈｏｍｓｏｎらのグループ、ハーバード大学のＤｒ．Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒらのグループ等を含む複数のグループが成功している。
【００２０】
ｉＰＳ細胞の作製に用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。すなわち、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を用いることができ、分化した体細胞であってもよく、未分化の幹細胞であってもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類のいずれでもよく特に限定されないが、哺乳動物が好ましく、ヒト又はマウスが特に好ましい。ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児、成人のいずれの体細胞を用いてもよい。
【００２１】
体細胞からｉＰＳ細胞を作製するには、少なくとも１種類の初期化遺伝子を体細胞に導入し、初期化する必要がある。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してｉＰＳ細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。ヒトｉＰＳ細胞を作製する場合の初期化遺伝子の組み合わせとしては、例えば以下の（ｉ）〜（ｉｖ）を挙げることができるが、これらの例に限定されるものではない。
（ｉ）ＯＣＴ遺伝子、ＫＬＦ遺伝子、ＳＯＸ遺伝子、ＭＹＣ遺伝子
（ｉｉ）ＯＣＴ遺伝子、ＳＯＸ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子
（ｉｉｉ）ＯＣＴ遺伝子、ＫＬＦ遺伝子、ＳＯＸ遺伝子、ＭＹＣ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ遺伝子
（ｉｖ）ＯＣＴ遺伝子、ＫＬＦ遺伝子、ＳＯＸ遺伝子
【００２２】
一方、ＥＳ細胞とは、動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚の一部に属する内部細胞塊から作製された、多分化能、自己複製能を有する幹細胞である。ＥＳ細胞の由来は、特に限定されないが、哺乳動物が好ましく、ヒト又はマウスが特に好ましい。ＥＳ細胞としては、その分化の程度の確認を容易とするために、例えばＰＤＸ１遺伝子付近にレポーター遺伝子を導入した細胞を用いることもできる。
【００２３】
＜膵臓組織幹／前駆細胞＞
膵臓組織幹／前駆細胞とは、動物の膵臓に存在する、多分化能、自己複製能を有する組織幹／前駆細胞である。膵臓組織幹／前駆細胞の由来は、特に限定されないが、哺乳動物が好ましく、ヒト又はマウスが特に好ましい。膵臓から組織幹／前駆細胞を分離する方法としては、従来公知の方法を任意に採用することができ、特に限定されない。例えば、胎児膵臓では、ＰＤＸ１が膵臓組織幹／前駆細胞のマーカー分子として既知である（Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３７１，  ｐｐ．６０６−６０９（１９９４）；Ｏｆｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ２２，  ｐｐ．９８３−９９５（１９９６））。胎児のＰＤＸ１発現細胞は、内分泌細胞、外分泌細胞、及び膵管細胞に分化し、成体膵に存在するあらゆる種類の細胞を生じる。そこで、ＰＤＸ１をマーカー分子として、膵臓組織幹／前駆細胞を分離することができる。
なお、この膵臓組織幹／前駆細胞は、株化されていないものであってもよく、株化されたものであってもよい。
【００２４】
＜分化誘導促進剤＞
本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞の生産方法で用いられる分化誘導促進剤は、下記（１）〜（３）から選ばれる少なくとも１種である。
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つポリペプチド。
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、又はこのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを外来遺伝子として組み込んだ細胞の培養上清。
【００２５】
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡは、ヒトＴＭ４ＳＦ２０をコードするＤＮＡとして公知の全長２３０８ｂｐのものである（ＮＣＢＩ：ＬＯＣＵＳ  ＮＭ  ０２４７９５）。このＤＮＡのＣＤＳは３８．．７２７であり、配列番号３に記載の２２９個のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている（配列番号２を参照）。本発明に係る生産方法では、このポリペプチドを分化誘導促進剤として用いることができる。
【００２６】
また、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞の生産方法では、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用が維持されている限り、上述のポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、「改変ポリペプチド」ともいう。）を分化誘導促進剤として用いることもできる。あるアミノ酸配列に対する１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加により修飾されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが、その生物学的活性を維持することは既に知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１，  ｐｐ．５６６２−５６６６（１９８４）；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １０，  ｐｐ．６４８７−６５００（１９８２）；Ｗａｎｇ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２４，  ｐｐ．１４３１−１４３３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７９，  ｐｐ．６４０９−６４１３（１９８２）等を参照）。
【００２７】
ここで、上述のポリペプチドのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換する場合には、置換前後でアミノ酸側鎖の性質が保存されていることが望ましい。アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）が挙げられる（括弧内のアルファベットはいずれもアミノ酸を一文字表記したものである）。
【００２８】
１若しくは数個のアミノ酸を置換、欠失、及び／又は付加する場合、その数は例えば１〜２０個であってもよく、１〜１５個であってもよく、１〜１０個であってもよく、１〜５個であってもよい。
また、改変ポリペプチドと元のポリペプチドとの相同性は、８０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。
【００２９】
なお、配列番号３の１〜１６３番目、１７９〜２２９番目のアミノ酸は、異なる生物種間で高度に保存された部分である。このため、その部分のアミノ酸は、改変前後で保存されていることが好ましい。
【００３０】
上述のポリペプチドや改変ポリペプチドは、化学合成してもよいが、遺伝子工学的に取得することもできる。例えば、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、又はこのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを外来遺伝子として、培養可能な宿主細胞に組み込み、その宿主細胞を培養して遺伝子発現させることで、その培養上清から上述のポリペプチドや改変ポリペプチドを得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等の公知の細胞を適宜使用することができる。動物細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＯＳ細胞等が挙げられる。
【００３１】
ここで「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、特定のＤＮＡ（配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ）をプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を採用することにより取得できるＤＮＡを意味する。例えば、コロニーやプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを使用し、０．７〜１．０Ｍ塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を使用し、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等が挙げられる（必要であれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．，  １９８９．等を参照のこと）。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列の、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列との相同性は、８０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。
【００３２】
これらのポリペプチドや改変ポリペプチドの分離・精製は、例えば、イオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の、ペプチド化学において通常使用される方法によって行うことができる。
【００３３】
また、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞の生産方法では、上述のポリペプチドや改変ポリペプチドを含む培養上清を分化誘導促進剤として用いることもできる。培養上清を分化誘導促進剤として用いる場合、限外濾過等により培養上清を濃縮することが好ましい。さらに、必要に応じて透析を行い、不要な化学物質等を除いてもよい。
【００３４】
＜多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導方法（膵臓ホルモン産生細胞の生産方法）＞
本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞の生産方法では、多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で、上述した分化誘導促進剤を培地中に添加する。多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導方法としては、従来公知の方法を任意に採用することができ、特に限定されない。分化誘導促進剤としてポリペプチド又は改変ポリペプチドを添加する場合、その濃度は、１０〜２００ｎｇ／ｍＬが好ましく、５０〜１８０ｎｇ／ｍＬがより好ましく、６０〜１５０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。また、分化誘導促進剤として培養上清を添加する場合、その濃度は、０．５〜２０％（ｖ／ｖ）が好ましく、１〜１０％（ｖ／ｖ）がより好ましく、１．５〜５％（ｖ／ｖ）がさらに好ましい。
【００３５】
以下、多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導方法（膵臓ホルモン産生細胞の生産方法）の例として２種類の方法について説明するが、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞の生産方法はこの例に限定されるものではない。
【００３６】
［第１の分化誘導方法］
第１の分化誘導方法は、非特許文献１に記載の方法に準じたものである。この文献は参照により本願に援用する。
第１の分化誘導方法は、下記の工程（Ａ１）〜（Ｅ１）を含む。このうち少なくとも１つの工程で、上述した分化誘導促進剤が培地中に添加される。分化誘導促進剤を添加する工程は、工程（Ａ１）〜（Ｃ１）の少なくとも１つの工程であることが好ましく、工程（Ｂ１）〜（Ｃ１）の少なくとも１つの工程であることがより好ましい。なお、ある工程に分化誘導促進剤を添加する場合、その工程の最初から添加してもよく、工程の途中から添加してもよい。
（Ａ１）ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で多能性幹細胞を培養する工程。
（Ｂ１）上記工程（Ａ１）で得られた細胞をＦＧＦの存在下で培養する工程。
（Ｃ１）上記工程（Ｂ１）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程。
（Ｄ１）上記工程（Ｃ１）で得られた細胞をγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程。
（Ｅ１）上記工程（Ｄ１）で得られた細胞を、エキセンジン−４、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも１種の因子の存在下で培養する工程。
【００３７】
（工程（Ａ１））
工程（Ａ１）では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で多能性幹細胞を培養する。
【００３８】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子としては、アクチビン、ノーダル、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）等が挙げられ、その中でもアクチビンが好ましい。このようなＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子は、多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞への分化を促進することが知られている（非特許文献１、特許文献１〜３等を参照）。アクチビンとしては、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ等が挙げられ、その中でもアクチビンＡが好ましい。
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、５〜２５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜２００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、５０〜１５０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【００３９】
また、工程（Ａ１）では、Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子を培地中に添加することが好ましい。ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子とともにＷｎｔファミリーに属する増殖因子を添加することにより、胚体内胚葉細胞への分化効率を高めることができる。
Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子としては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ７ａ等が挙げられ、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａが好ましく、Ｗｎｔ３ａがより好ましい。
Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子の濃度は、１〜１０００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、１０〜５０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【００４０】
なお、工程（Ａ１）では、Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子の代わりに、ＧＳＫ−３阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ）を添加してもよい。ＧＳＫ−３阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ）は、Ｗｎｔシグナル経路を活性化させることが知られている（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７（３４），ｐｐ．３０９９８−３１００４（２００２））。
【００４１】
また、工程（Ａ１）では、胚体内胚葉細胞への分化効率を高め得る追加の因子を培地中に添加してもよい。追加の因子としては、例えば、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）、ＫＧＦ（ケラチノサイト増殖因子）、ＨＧＦ、ＮＧＦ（神経増殖因子）、ＧＤＦ（増殖分化因子）、ＧＬＰ（グルカゴン様ペプチド）、ニコチンアミド、エキセンジン−４、レチノイン酸、エタノールアミン、副甲状腺ホルモン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、ガストリン、ステロイドアルカロイド、銅キレーター（トリエチレンペンタミン等）、フォルスコリン、酪酸ナトリウム、ノギン、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ヘッジホッグ経路阻害剤等が挙げられる。
【００４２】
培養に用いる容器としては、分化誘導能、機能発現能、生存能等の観点から、生体適合材料を用いたスキャフォールドでコートされた培養プレートが好ましい。スキャフォールドとしては、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ゼラチン、エンタクチン、ポリオルニチン等が挙げられる。市販品としては、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製のＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ、増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ等が入手可能である。特に、ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭでコートされた培養プレートを用いることが好ましい。
【００４３】
培養に用いる培地は、動物細胞の培養に用いることのできる基本培地に、細胞の維持増殖に必要な各種栄養源やその他の成分を添加して作製される。
【００４４】
基本培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ハムＦ１２培地、イーグルＭＥＭ培地、グラスゴーＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、ウィリアムＥ培地、フィッシャー培地、マッコイ培地、ＢＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＢＧＪｂ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、あるいはこれらの混合培地等が挙げられる。
【００４５】
栄養源としては、グリセロール、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、デンプン、デキストリン等の炭素源；脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール等の炭化水素類；硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム等の窒素源；ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、リン酸塩等の無機塩類；各種ビタミン類；各種アミノ酸類；等が挙げられる。
【００４６】
その他の成分としては、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質；コレラトキシン；インスリン；トランスフェリン；亜セレン酸；アルブミン；２−メルカプトエタノール；血清又は血清代替物；等が挙げられる。インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＩＴＳ−Ｘ、ＩＴＳ−Ａ、ＩＴＳ−Ｇ等が市販品として入手可能である。また、血清代替物としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＢ−２７ＴＭサプリメント、Ｎ−２サプリメント、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ血清代替物等が市販品として入手可能である。
【００４７】
ここで、工程（Ａ１）における分化効率を高めるためには、培地中のインスリン、ＩＧＦ等の含有量を十分に低くすることが重要であることが知られている（国際公開第２００６／０２０９１９号を参照）。このため、工程（Ａ１）では、無血清培地又は低血清培地を用いることが好ましい（非特許文献１、特許文献１〜３等を参照）。血清濃度は、０〜２％（ｖ／ｖ）が好ましく、０〜１％（ｖ／ｖ）がより好ましく、０〜０．５％（ｖ／ｖ）がさらに好ましい。
【００４８】
好適な実施形態では、アクチビンＡ、Ｗｎｔ３ａ、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質、Ｌ−グルタミン又はＬ−グルタミンを含むジペプチドを添加した、無血清又は低血清のＲＰＭＩ１６４０培地が用いられる。
【００４９】
工程（Ａ１）の培養期間は例えば１〜６日であり、２〜４日が好ましい。
胚体内胚葉細胞への分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞への分化が進行するに従って、幹細胞のマーカー遺伝子であるＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＥＣＡＤ等の発現が減少し、胚体内胚葉細胞のマーカー遺伝子であるＳＯＸ１７、ＣＥＲ、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４等の発現が亢進する。
【００５０】
なお、胚体内胚葉細胞への分化効率を高めるためには、培地中の血清濃度を低めることが必要であるが、細胞の生存率を高めるためには、培地中の血清濃度を高める方が好ましい。
そこで、工程（Ａ１）を、無血清の第１の培地で培養する工程（Ａ１−１）と、低血清の第２の培地で培養する工程（Ａ１−２）とに分けることが好ましい。
【００５１】
工程（Ａ１−１）で用いられる第１の培地は、無血清であるほかは上記と同様でよい。すなわち、第１の培地は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子を含有し、その他に、Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子を含有していてもよい。この第１の培地は、Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子を含有する方が好ましい。
【００５２】
工程（Ａ１−１）の培養期間は例えば１〜３日であり、１〜２日が好ましい。この培養により、多能性幹細胞から中内胚葉細胞への分化が進行する。
中内胚葉細胞への分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。多能性幹細胞から中内胚葉細胞への分化が進行するに従って、幹細胞のマーカー遺伝子であるＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＥＣＡＤ等の発現が減少し、中内胚葉細胞のマーカー遺伝子であるＢＲＡ、ＦＧＦ４、ＷＮＴ３、ＮＣＡＤ等の発現が亢進する。
【００５３】
工程（Ａ１−２）で用いられる第２の培地は、低血清であるほかは上記と同様でよい。すなわち、第２の培地は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子を含有し、その他に、Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子を含有していてもよい。血清濃度は、０．０５〜２％（ｖ／ｖ）が好ましく、０．０５〜１％（ｖ／ｖ）がより好ましく、０．１〜０．５％（ｖ／ｖ）がさらに好ましい。
【００５４】
工程（Ａ１−２）の培養期間は例えば１〜３日であり、１〜２日が好ましい。この培養により、中内胚葉細胞から胚体内胚葉細胞への分化が進行する。
上述したとおり、胚体内胚葉細胞への分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。
【００５５】
なお、得られた細胞は、次の工程（Ｂ１）に進む前に、公知の方法で濃縮、単離、及び／又は精製してもよい。
【００５６】
（工程（Ｂ１））
工程（Ｂ１）では、工程（Ａ１）で得られた細胞をＦＧＦの存在下で培養する。
【００５７】
ＦＧＦとしては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−２３等が挙げられ、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０が好ましい。
ＦＧＦの濃度は、５〜１５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、２０〜８０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【００５８】
また、工程（Ｂ１）では、ヘッジホッグ経路阻害剤を培地中に添加することが好ましい。ＦＧＦとともにヘッジホッグ経路阻害剤を添加することにより、分化効率を高めることができる。
ヘッジホッグ経路阻害剤としては、ＫＡＡＤ−シクロパミン（２８−［２−［［６−［（３−フェニルプロパノイル）アミノ］ヘキサノイル］アミノ］エチル］−１７β，２３β−エポキシベラトラマン−３−オン）、ＫＡＡＤ−シクロパミンの類似体、ジェルビン（１７，２３β−エポキシ−３β−ヒドロキシベラトラマン−１１−オン）、ジェルビンの類似体、ヘッジホッグ経路遮断抗体等が挙げられ、その中でもＫＡＡＤ−シクロパミンが好ましい。
ヘッジホッグ経路阻害剤の濃度は、０．０１〜５μＭが好ましく、０．０２〜２μＭがより好ましく、０．１〜０．５μｍがさらに好ましい。
【００５９】
培養に用いる容器は、工程（Ａ１）と同様でよい。培地は、上述した各因子や培地の血清濃度を除き、工程（Ａ１）と同様でよい。培地の血清濃度は、０．１〜５％（ｖ／ｖ）が好ましく、０．５〜５％（ｖ／ｖ）がより好ましく、１〜５％（ｖ／ｖ）がさらに好ましい。
なお、工程（Ａ１）で低血清培地が用いられる場合、工程（Ｂ１）では、工程（Ａ１）よりも高い血清濃度の培地を用いることが好ましい。
【００６０】
好適な実施形態では、ＦＧＦ−１０、ＫＡＡＤ−シクロパミン、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質、Ｌ−グルタミン又はＬ−グルタミンを含むジペプチドを添加した、低血清のＲＰＭＩ１６４０培地が用いられる。
【００６１】
工程（Ｂ１）の培養期間は例えば１〜６日であり、２〜４日が好ましい。
分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。分化が進行するに従って、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ４Ａ等の遺伝子の発現が亢進する。
【００６２】
なお、得られた細胞は、次の工程（Ｃ１）に進む前に、公知の方法で濃縮、単離、及び／又は精製してもよい。
【００６３】
（工程（Ｃ１））
工程（Ｃ１）では、工程（Ｂ１）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する。
【００６４】
レチノイドとしては、レチノール、レチナール、レチノイン酸等が挙げられ、その中でもレチノイン酸が好ましい。
レチノイドの濃度は、０．２〜１０μＭが好ましく、０．４〜８μＭがより好ましく、１〜４μＭがさらに好ましい。
【００６５】
また、工程（Ｃ１）では、ヘッジホッグ経路阻害剤を培地中に添加することが好ましい。レチノイドとともにヘッジホッグ経路阻害剤を添加することにより、分化効率を高めることができる。
ヘッジホッグ経路阻害剤としては、ＫＡＡＤ−シクロパミン、ＫＡＡＤ−シクロパミンの類似体、ジェルビン、ジェルビンの類似体、ヘッジホッグ経路遮断抗体等が挙げられ、その中でもＫＡＡＤ−シクロパミンが好ましい。
ヘッジホッグ経路阻害剤の濃度は、０．０１〜５μＭが好ましく、０．０２〜２μＭがより好ましく、０．１〜０．５μＭがさらに好ましい。
【００６６】
また、工程（Ｃ１）では、ＦＧＦを培地中に添加することが好ましい。レチノイドとともにＦＧＦを添加することにより、分化効率を高めることができる。
ＦＧＦとしては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−２３等が挙げられ、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０が好ましい。
ＦＧＦの濃度は、０．５〜５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１〜２５ｎｇ／ｍＬがより好ましく、２〜１０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【００６７】
また、工程（Ｃ１）では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子を培地中に添加してもよい。
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、５〜２５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜２００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、２０〜１５０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【００６８】
培養に用いる容器は、工程（Ｂ１）と同様でよい。培地は、上述した各因子を除き、基本的に工程（Ｂ１）と同様でよい。ただし、培地には、血清の代わりに血清代替物を添加することが好ましい。血清代替物の市販品としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＢ−２７ＴＭサプリメント、Ｎ−２サプリメント、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ血清代替物等が入手可能であり、その中でもＢ−２７ＴＭサプリメントが好ましい。
Ｂ−２７ＴＭサプリメントの濃度は、０．１〜１０％（ｖ／ｖ）が好ましく、０．２〜５％（ｖ／ｖ）がより好ましく、０．４〜２．５％（ｖ／ｖ）がさらに好ましい。なお、このＢ−２７ＴＭサプリメントは、５０倍ストック溶液として市販されているため、Ｂ−２７ＴＭサプリメントの濃度を０．１〜１０％（ｖ／ｖ）とするには、５〜５００倍希釈されるように培地中に添加すればよい。
【００６９】
好適な実施形態では、レチノイン酸、ＫＡＡＤ−シクロパミン、ＦＧＦ−１０、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質、Ｂ−２７ＴＭサプリメントを添加した、無血清のＤＭＥＭ／ハムＦ１２培地が用いられる。
【００７０】
工程（Ｃ１）の培養期間は例えば１〜６日であり、２〜４日が好ましい。
分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。分化が進行するに従って、ＰＤＸ１、ＨＮＦ６、ＨＬＸＢ９等の遺伝子の発現が亢進する。
【００７１】
なお、得られた細胞は、次の工程（Ｄ１）に進む前に、公知の方法で濃縮、単離、及び／又は精製してもよい。
【００７２】
［工程（Ｄ１）］
工程（Ｄ１）では、工程（Ｃ１）で得られた細胞をγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で培養する。
【００７３】
γ−セクレターゼ阻害剤としては、ＤＡＰＴ（Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシン−ｔｅｒｔ−ブチルエステル）、Ｌ−６８５４５８（［１Ｓ−ベンジル−４Ｒ−［１−（１Ｓ−カルバモイル−２−フェネチルカルバモイル）−１Ｓ−３−メチルブチルカルバモイル］−２Ｒ−ヒドロキシ−５−フェネチルペンチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル）等が挙げられ、その中でもＤＡＰＴが好ましい。
γ−セクレターゼ阻害剤の濃度は、１〜５０μＭが好ましく、２〜４０μＭがより好ましく、５〜２０μＭがさらに好ましい。
【００７４】
また、工程（Ｄ１）では、エキセンジン−４を培地中に添加することが好ましい。γ−セクレターゼ阻害剤とともにエキセンジン−４を添加することにより、分化効率を高めることができる。
エキセンジン−４の濃度は、５〜１５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、２０〜８０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【００７５】
培養に用いる容器や培地は、工程（Ｃ１）と同様でよい。すなわち、培地には血清代替物を添加することが好ましい。
【００７６】
好適な実施形態では、ＤＡＰＴ、エキセンジン−４、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質、Ｂ−２７ＴＭサプリメントを添加した、無血清のＤＭＥＭ／ハムＦ１２培地が用いられる。
【００７７】
工程（Ｄ１）の培養期間は例えば１〜６日であり、２〜３日が好ましい。
分化誘導の進行は、形態学的観察によるほか、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。分化が進行するに従って、ＮＫＸ６−１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＮＫＸ２−２等の遺伝子の発現が亢進する。
【００７８】
なお、得られた細胞は、次の工程（Ｅ１）に進む前に、公知の方法で濃縮、単離、及び／又は精製してもよい。
【００７９】
（工程（Ｅ１））
工程（Ｅ１）では、工程（Ｄ１）で得られた細胞を、エキセンジン−４、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも１種の因子の存在下で培養する。
【００８０】
エキセンジン−４、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、及びニコチンアミドとしては、そのうちの２種以上を添加することが好ましく、３種以上を添加することがより好ましい。
エキセンジン−４の濃度は、５〜１５０ｎＭが好ましく、１０〜１００ｎＭがより好ましく、２０〜８０ｎＭがさらに好ましい。
ＨＧＦの濃度は、５〜１５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、２０〜８０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
ＩＧＦ−１の濃度は、５〜１５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、２０〜８０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
ニコチンアミドの濃度は、１〜３０ｍＭが好ましく、３〜２０ｍＭがより好ましく、５〜１５ｍＭがさらに好ましい。
【００８１】
培養に用いる容器や培地は、工程（Ｄ１）と同様でよい。すなわち、培地には血清代替物を添加することが好ましい。
【００８２】
好適な実施形態では、エキセンジン−４、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、Ｂ−２７ＴＭサプリメントを添加した、無血清のＣＭＲＬ１０６６培地が用いられる。
【００８３】
工程（Ｅ１）の培養期間は例えば３〜２０日であり、３〜１０日が好ましい。
この工程（Ｅ１）により、膵臓ホルモン産生細胞が得られる。
膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導の進行は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン等の膵臓ホルモンの産生を確認するほか、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。分化が進行するに従って、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰＹ等のうち、少なくとも１つの遺伝子の発現が亢進する。
【００８４】
［第２の分化誘導方法］
第２の分化誘導方法は、非特許文献４に記載の方法に準じたものである。この文献は参照により本願に援用する。
第２の分化誘導方法は、下記の工程（Ａ２）〜（Ｄ２）を含む。このうち少なくとも１つの工程で、上述した分化誘導促進剤が培地中に添加される。分化誘導促進剤を添加する工程は、工程（Ｃ２）〜（Ｄ２）の少なくとも１つの工程であることが好ましく、工程（Ｄ２）であることが特に好ましい。なお、ある工程に分化誘導促進剤を添加する場合、その工程の最初から添加してもよく、工程の途中から添加してもよい。
（Ａ２）ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子と、Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子及びＧＳＫ−３阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の因子との存在下で多能性幹細胞を培養する工程。
（Ｂ２）上記工程（Ａ２）で得られた細胞をＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する工程。
（Ｃ２）上記工程（Ｂ２）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程。
（Ｄ２）上記工程（Ｃ２）で得られた細胞を、ｃＡＭＰ増加剤、デキサメタゾン、ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも１種の因子の存在下で培養する工程。
【００８５】
（工程（Ａ２））
工程（Ａ２）では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子と、Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子及びＧＳＫ−３阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の因子との存在下で多能性幹細胞を培養する。
【００８６】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子としては、アクチビン、ノーダル、ＢＭＰ等が挙げられ、その中でもアクチビンが好ましい。アクチビンとしては、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ等が挙げられ、その中でもアクチビンＡが好ましい。
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、５〜２５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜２００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、５０〜１５０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【００８７】
Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子としては、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ７ａ等が挙げられ、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａが好ましく、Ｗｎｔ３ａがより好ましい。
Ｗｎｔファミリーに属する増殖因子の濃度は、１〜１０００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、１０〜５０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【００８８】
ＧＳＫ−３阻害剤としては、ＧＳＫ−３α阻害剤及びＧＳＫ−３β阻害剤のいずれを用いてもよいが、ＧＳＫ−３β阻害剤を用いることが好ましい。具体例としては、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル）、ＳＢ４１５２８６（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、インジルビン−３’−モノオキシム（３−［（３Ｅ）−３−（ヒドロキシイミノ）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−２−イリデン］−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−２−オン）、ケンパウロン（７，８−ジヒドロ−９−ブロモインドロ［３，２−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（５Ｈ）−オン）等が挙げられ、その中でもＣＨＩＲ９９０２１が好ましい。
ＧＳＫ−３阻害剤の濃度は、０．０１〜２０μＭが好ましく、０．１〜２０μＭがより好ましく、１〜５μＭがさらに好ましい。
【００８９】
また、工程（Ａ２）では、分化効率を高め得る追加の因子を培地中に添加してもよい。追加の因子としては、例えば、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＧＤＦ、ＧＬＰ、ニコチンアミド、エキセンジン−４、レチノイン酸、エタノールアミン、副甲状腺ホルモン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、ガストリン、ステロイドアルカロイド、銅キレーター（トリエチレンペンタミン等）、フォルスコリン、酪酸ナトリウム、ノギン、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ヘッジホッグ経路阻害剤等が挙げられる。
【００９０】
培養に用いる容器としては、分化誘導能、機能発現能、生存能等の観点から、生体適合材料を用いたスキャフォールドでコートされた培養プレートが好ましい。スキャフォールドとしては、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ゼラチン、エンタクチン、ポリオルニチン等が挙げられる。市販品としては、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製のＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ、増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ等が入手可能である。特に、ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭでコートされた培養プレートを用いることが好ましい。
【００９１】
培養に用いる培地は、動物細胞の培養に用いることのできる基本培地に、細胞の維持増殖に必要な各種栄養源やその他の成分を添加して作製される。
【００９２】
基本培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ハムＦ１２培地、イーグルＭＥＭ培地、グラスゴーＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、ウィリアムＥ培地、フィッシャー培地、マッコイ培地、ＢＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＢＧＪｂ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、あるいはこれらの混合培地等が挙げられる。
【００９３】
栄養源としては、グリセロール、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、デンプン、デキストリン等の炭素源；脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール等の炭化水素類；硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム等の窒素源；ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、リン酸塩等の無機塩類；各種ビタミン類；各種アミノ酸類；等が挙げられる。
【００９４】
その他の成分としては、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質；コレラトキシン；インスリン；トランスフェリン；亜セレン酸；アルブミン；２−メルカプトエタノール；血清又は血清代替物；等が挙げられる。インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＩＴＳ−Ｘ、ＩＴＳ−Ａ、ＩＴＳ−Ｇ等が市販品として入手可能である。また、血清代替物としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＢ−２７ＴＭサプリメント、Ｎ−２サプリメント、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ血清代替物等が市販品として入手可能である。
【００９５】
ここで、工程（Ａ２）における分化効率を高めるためには、培地中のインスリン、ＩＧＦ等の含有量を十分に低くすることが重要であることが知られている。このため、工程（Ａ２）では、無血清培地又は低血清培地を用いることが好ましい。血清濃度は、０〜３％（ｖ／ｖ）が好ましく、０〜２％（ｖ／ｖ）がより好ましい。
【００９６】
好適な実施形態では、アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１を添加した低血清のＲＰＭＩ１６４０培地が用いられる。
工程（Ａ２）の培養期間は例えば１〜３日であり、１〜２日が好ましい。
【００９７】
（工程（Ｂ２））
工程（Ｂ２）では、工程（Ａ２）で得られた細胞をＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する。
【００９８】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子としては、アクチビン、ノーダル、ＢＭＰ等が挙げられ、その中でもアクチビンが好ましい。アクチビンとしては、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ等が挙げられ、その中でもアクチビンＡが好ましい。
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、５〜２５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜２００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、５０〜１５０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【００９９】
培養に用いる容器や培地は、工程（Ａ２）と同様でよい。すなわち、好適な実施形態では、アクチビンＡを添加した低血清のＲＰＭＩ１６４０培地が用いられる。
工程（Ｂ２）の培養期間は例えば１〜４日であり、１〜３日が好ましい。
【０１００】
（工程（Ｃ２））
工程（Ｃ２）では、工程（Ｂ２）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する。
【０１０１】
レチノイドとしては、レチノール、レチナール、レチノイン酸等が挙げられ、その中でもレチノイン酸が好ましい。
レチノイドの濃度は、０．２〜１０μＭが好ましく、０．４〜８μＭがより好ましく、１〜４μＭがさらに好ましい。
【０１０２】
また、工程（Ｃ２）では、ＢＭＰ受容体阻害剤を培地中に添加することが好ましい。
ＢＭＰ受容体阻害剤としては、ドルソモルフィン（６−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−３−（４−ピリジル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）、ＬＤＮ−１９３１８９（４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン）等が挙げられ、その中でもドルソモルフィンが好ましい。
ＢＭＰ受容体阻害剤の濃度は、０．２〜５μＭが好ましく、０．３〜３μＭがより好ましく、０．５〜２μＭがさらに好ましい。
【０１０３】
また、工程（Ｃ２）では、ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤を培地中に添加することが好ましい。
ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤としては、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソル−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）、ＳＢ５２５３３４（６−［２−（１，１−ジメチルエチル）−５−（６−メチル−１，２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］キノキサリン）、ＬＹ３６４９４７（４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］キノリン）等が挙げられ、その中でもＳＢ４３１５４２が好ましい。また、ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤としては、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製のＡｌｋ５インヒビターＩＩを用いることも可能である。
ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤の濃度は、１〜５０μＭが好ましく、２〜３０μＭがより好ましく、５〜２０μＭがさらに好ましい。
【０１０４】
培養に用いる容器は、工程（Ｂ２）と同様でよい。培地は、上述した各因子を除き、基本的に工程（Ｂ２）と同様でよい。ただし、培地には、血清の代わりに血清代替物を添加することが好ましい。血清代替物の市販品としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＢ−２７ＴＭサプリメント、Ｎ−２サプリメント、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ血清代替物等が入手可能であり、その中でもＢ−２７ＴＭサプリメントが好ましい。
Ｂ−２７ＴＭサプリメントの濃度は、０．１〜１０％（ｖ／ｖ）が好ましく、０．２〜５％（ｖ／ｖ）がより好ましく、０．４〜２．５％（ｖ／ｖ）がさらに好ましい。なお、このＢ−２７ＴＭサプリメントは、５０倍ストック溶液として市販されているため、Ｂ−２７ＴＭサプリメントの濃度を０．１〜１０％（ｖ／ｖ）とするには、５〜５００倍希釈されるように培地中に添加すればよい。
【０１０５】
好適な実施形態では、レチノイン酸、ドルソモルフィン、ＳＢ４３１５４２、Ｂ−２７ＴＭサプリメントを添加した、無血清のＩＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地が用いられる。
工程（Ｃ２）の培養期間は例えば５〜９日であり、６〜８日が好ましい。
【０１０６】
（工程（Ｄ２））
工程（Ｄ２）では、工程（Ｃ２）で得られた細胞を、ｃＡＭＰ増加剤、デキサメタゾン、ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも１種の因子の存在下で培養する。
【０１０７】
ｃＡＭＰ増加剤、デキサメタゾン、ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤、及びニコチンアミドとしては、そのうちの２種以上を添加することが好ましく、３種以上を添加することがより好ましい。
【０１０８】
ｃＡＭＰ増加剤としては、フォルスコリン等のアデニル酸シクラーゼ活性化剤；３−イソブチル−１−メチルキサンチン等のホスホジエステラーゼ阻害剤；ジブチリルｃＡＭＰ等のｃＡＭＰアナログ；等が挙げられ、その中でもフォルスコリンが好ましい。
ｃＡＭＰ増加剤の濃度は、１〜５０μＭが好ましく、２〜３０μＭがより好ましく、５〜２０μＭがさらに好ましい。
【０１０９】
デキサメタゾンの濃度は、１〜５０μＭが好ましく、２〜３０μＭがより好ましく、５〜２０μＭがさらに好ましい。
【０１１０】
ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤としては、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５２５３３４、ＬＹ３６４９４７等が挙げられ、その中でもＳＢ４３１５４２が好ましい。また、ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤としては、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製のＡｌｋ５インヒビターＩＩを用いることも可能である。
ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤の濃度は、１〜５０μＭが好ましく、２〜３０μＭがより好ましく、５〜２０μＭがさらに好ましい。
【０１１１】
ニコチンアミドの濃度は、１〜３０ｍＭが好ましく、３〜２０ｍＭがより好ましく、５〜１５ｍＭがさらに好ましい。
【０１１２】
培養に用いる容器や培地は、工程（Ｃ２）と同様でよい。すなわち、培地には血清代替物を添加することが好ましい。
【０１１３】
好適な実施形態では、フォルスコリン、デキサメタゾン、Ａｌｋ５インヒビターＩＩ、ニコチンアミド、Ｂ−２７ＴＭサプリメントを添加した、無血清のＩＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地が用いられる。
工程（Ｄ２）の培養期間は例えば９〜１３日であり、１０〜１２日が好ましい。
【０１１４】
この工程（Ｄ２）により、膵臓ホルモン産生細胞が得られる。
膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導の進行は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン等の膵臓ホルモンの産生を確認するほか、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。多能性幹細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化が進行するに従って、膵臓ホルモン産生細胞のマーカー遺伝子であるＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰＹ等のうち、少なくとも１つの遺伝子の発現が亢進する。
【０１１５】
＜膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導方法（膵臓ホルモン産生細胞の生産方法）＞
本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞の生産方法では、膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で、上述した分化誘導促進剤を培地中に添加する。膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導方法としては、従来公知の方法を任意に採用することができ、特に限定されない。分化誘導促進剤としてポリペプチド又は改変ポリペプチドを添加する場合、その濃度は、１０〜２００ｎｇ／ｍＬが好ましく、５０〜１５０ｎｇ／ｍＬがより好ましく、６０〜１２０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。また、分化誘導促進剤として培養上清を添加する場合、その濃度は、０．５〜２０％（ｖ／ｖ）が好ましく、１〜１０％（ｖ／ｖ）がより好ましく、１．５〜５％（ｖ／ｖ）がさらに好ましい。
【０１１６】
以下、膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導方法（膵臓ホルモン産生細胞の生産方法）の一例について説明するが、本発明に係る膵臓ホルモン産生細胞の生産方法はこの例に限定されるものではない。
【０１１７】
以下の分化誘導方法は、非特許文献２に記載の方法に準じたものである。この文献は参照により本願に援用する。
この分化誘導方法は、下記の工程（Ａ３）〜（Ｅ３）を含む。このうち少なくとも１つの工程で、上述した分化誘導促進剤が培地中に添加される。分化誘導促進剤を添加する工程は、工程（Ｄ３）〜（Ｅ３）の少なくとも１つの工程であることが好ましく、工程（Ｅ３）であることが特に好ましい。なお、ある工程に分化誘導促進剤を添加する場合、その工程の最初から添加してもよく、工程の途中から添加してもよい。
（Ａ３）ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子、レチノイド、ＦＧＦ、及びニコチンアミドの非存在下で膵臓組織幹／前駆細胞を培養する工程。
（Ｂ３）上記工程（Ａ３）で得られた細胞をＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する工程。
（Ｃ３）上記工程（Ｂ３）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程。
（Ｄ３）上記工程（Ｃ３）で得られた細胞をＦＧＦの存在下で培養する工程。
（Ｅ３）上記工程（Ｄ３）で得られた細胞をニコチンアミドの存在下で培養する工程。
【０１１８】
（工程（Ａ３））
工程（Ａ３）では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子、レチノイド、ＦＧＦ、ニコチンアミドの非存在下で膵臓組織幹／前駆細胞を培養する。
【０１１９】
培養に用いる容器としては、分化誘導能、機能発現能、生存能等の観点から、生体適合材料を用いたスキャフォールドでコートされた培養プレートが好ましい。スキャフォールドとしては、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ゼラチン、エンタクチン、ポリオルニチン等が挙げられる。市販品としては、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製のＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ、増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ等が入手可能である。特に、ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭでコートされた培養プレートを用いることが好ましい。
【０１２０】
培養に用いる培地は、動物細胞の培養に用いることのできる基本培地に、細胞の維持増殖に必要な各種栄養源やその他の成分を添加して作製される。
【０１２１】
基本培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ハムＦ１２培地、イーグルＭＥＭ培地、グラスゴーＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、ウィリアムＥ培地、フィッシャー培地、マッコイ培地、ＢＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＢＧＪｂ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、あるいはこれらの混合培地等が挙げられる。
【０１２２】
栄養源としては、グリセロール、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、デンプン、デキストリン等の炭素源；脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール等の炭化水素類；硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム等の窒素源；ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、リン酸塩等の無機塩類；各種ビタミン類；各種アミノ酸類；等が挙げられる。
【０１２３】
その他の成分としては、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質；コレラトキシン；インスリン；トランスフェリン；亜セレン酸；２−メルカプトエタノール；アルブミン；血清又は血清代替物；等が挙げられる。インスリン、トランスフェリン、及び亜セレン酸としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＩＴＳ−Ｘ、ＩＴＳ−Ａ、ＩＴＳ−Ｇ等が市販品として入手可能である。また、血清代替物としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＢ−２７ＴＭサプリメント、Ｎ−２サプリメント、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ血清代替物等が市販品として入手可能である。
【０１２４】
好適な実施形態では、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、２−メルカプトエタノール、アルブミンを添加した、無血清のＤＭＥＭ／ハムＦ１２が用いられる。
インスリンの濃度は、２〜３０μｇ／ｍＬが好ましく、５〜２０μｇ／ｍＬがより好ましい。トランスフェリンの濃度は、１〜２０μｇ／ｍＬが好ましく、３〜１０μｇ／ｍＬがより好ましい。亜セレン酸の濃度は、１〜２０ｎｇ／ｍＬが好ましく、５〜２０ｎｇ／ｍＬがより好ましい。２−メルカプトエタノールの濃度は、５０〜２００μＭが好ましく、５０〜１００μＭがより好ましい。アルブミンの濃度は、１〜１０ｎｇ／ｍＬが好ましく、２〜５ｎｇ／ｍＬがより好ましい。
工程（Ａ３）の培養期間は例えば１〜３日であり、１〜２日が好ましい。
【０１２５】
（工程（Ｂ３））
工程（Ｂ３）では、工程（Ａ３）で得られた細胞をＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する。
【０１２６】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子としては、アクチビン、ノーダル、ＢＭＰ等が挙げられ、その中でもアクチビンが好ましい。アクチビンとしては、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ等が挙げられ、その中でもアクチビンＡが好ましい。
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の濃度は、５〜２５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０〜２００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、５０〜１５０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【０１２７】
培養に用いる容器は、工程（Ａ３）と同様でよい。培地は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子を添加することを除き、工程（Ａ３）と同様でよい。すなわち、好適な実施形態では、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、２−メルカプトエタノール、アルブミンを添加した、無血清のＤＭＥＭ／ハムＦ１２が用いられる。
工程（Ｂ３）の培養期間は例えば２〜６日であり、３〜５日が好ましい。
【０１２８】
（工程（Ｃ３））
工程（Ｃ３）では、工程（Ｂ３）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する。
【０１２９】
レチノイドとしては、レチノール、レチナール、レチノイン酸等が挙げられ、その中でも全トランス型レチノイン酸が好ましい。
レチノイドの濃度は、０．２〜１０μＭが好ましく、０．４〜８μＭがより好ましく、１〜４μＭがさらに好ましい。
【０１３０】
培養に用いる容器は、工程（Ａ３）と同様でよい。培地は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子を添加することを除き、工程（Ａ３）と同様でよい。
好適な実施形態では、全トランス型レチノイン酸、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、２−メルカプトエタノール、アルブミンを添加した、無血清のＤＭＥＭ／ハムＦ１２が用いられる。
工程（Ｃ３）の培養期間は例えば２〜６日であり、３〜５日が好ましい。
【０１３１】
（工程（Ｄ３））
工程（Ｄ３）では、工程（Ｃ３）で得られた細胞をＦＧＦの存在下で培養する。
【０１３２】
ＦＧＦとしては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−２３等が挙げられ、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０が好ましい。
ＦＧＦの濃度は、１〜３０ｎｇ／ｍＬが好ましく、２〜２０ｎｇ／ｍＬがより好ましく、５〜１５ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【０１３３】
培養に用いる容器は、工程（Ａ３）と同様でよい。培地は、ＦＧＦを添加することを除き、基本的に工程（Ｃ３）と同様でよい。
好適な実施形態では、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、アルブミンを添加した、無血清のＤＭＥＭ／ハムＦ１２が用いられる。
工程（Ｄ３）の培養期間は例えば１〜５日であり、２〜４日が好ましい。
【０１３４】
（工程（Ｅ３））
工程（Ｅ３）では、工程（Ｄ３）で得られた細胞をニコチンアミドの存在下で培養する。
ニコチンアミドの濃度は、１〜３０ｍＭが好ましく、３〜２０ｍＭがより好ましく、５〜１５ｍＭがさらに好ましい。
【０１３５】
また、工程（Ｅ３）では、ＦＧＦを培地中に添加することが好ましい。
ＦＧＦとしては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２、ＦＧＦ−２３等が挙げられ、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０が好ましい。
ＦＧＦの濃度は、１〜３０ｎｇ／ｍＬが好ましく、２〜２０ｎｇ／ｍＬがより好ましく、５〜１５ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【０１３６】
培養に用いる容器は、工程（Ａ３）と同様でよい。培地は、ニコチンアミドを添加することを除き、基本的に工程（Ｄ３）と同様でよい。
好適な実施形態では、ニコチンアミド、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、アルブミンを添加した、無血清のＤＭＥＭ／ハムＦ１２が用いられる。
工程（Ｅ３）の培養期間は例えば３〜２０日であり、３〜１０日が好ましい。
【０１３７】
この工程（Ｅ３）により、膵臓ホルモン産生細胞が得られる。
膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導の進行は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン等の膵臓ホルモンの産生を確認するほか、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現を確認することによっても評価することができる。膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化が進行するに従って、膵臓ホルモン産生細胞のマーカー遺伝子であるＩＮＳ、ＧＣＧ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、ＰＰＹ等のうち、少なくとも１つの遺伝子の発現が亢進する。
【０１３８】
＜膵臓ホルモン産生細胞の応用例＞
上述のようにして得られた膵臓ホルモン産生細胞は、糖尿病等の治療薬に応用することができる。例えば、膵臓ホルモン産生細胞がインスリンを産生・分泌する場合には、そのインスリン産生細胞をそのまま、あるいはフィルター濾過により濃縮したペレット等の細胞塊を糖尿病治療薬として用いることができる。この糖尿病治療薬は、ＤＭＳＯ等の保護剤を加え、凍結保存することもできる。なお、より安全に利用するためには、加熱処理、放射線処理、マイトマイシンＣ処理など、糖尿病治療薬としての機能を残しつつ、病原体のタンパク質が変性する程度の条件下で処理をすることが好ましい。
【０１３９】
インスリン産生細胞を用いた糖尿病治療薬のヒトへの投与形態（移植方法）としては、例えば、ヒト患者の右下腹部に小切開を置き、腸間膜の細い血管を露出して直視下にカテーテルを挿入して細胞を移植する方法、エコーにて肝臓の門脈を同定して、カテーテルを穿刺して細胞を移植する方法、あるいは腹部エコーガイド下に脾臓を直接穿刺することにより脾臓に移植する方法が挙げられる。投与量（移植量）は、１×１０８〜１×１０１０細胞／個体が好ましく、５×１０８〜１×１０１０細胞／個体がより好ましい。なお、投与量（移植量）は、投与される患者の年齢、体重、症状等によって適宜変更することができる。
【０１４０】
また、上述のようにして得られた膵臓ホルモン産生細胞を研究試薬として用いることもできる。例えば、膵臓ホルモン産生細胞を培養している培養容器や、膵臓ホルモン産生細胞を封じ込めたバイオリアクター内に新薬を添加することにより、新薬のスクリーニングを行うことができる。
【０１４１】
さらに、上述のようにして得られた膵臓ホルモン産生細胞を用いて、バイオ人工膵臓を製造することも可能である。バイオ人工膵臓としては、中空糸型のバイオリアクター（デバイス）と膵臓ホルモン産生細胞とを組み合わせたハイブリッド型の人工膵臓が挙げられる。バイオ人工膵臓には、体外に装着して血管に接続するもの、体内に留置して血管に接続するもの、血管に接続せずに腹腔内に留置するもの、血管に接続せずに皮下に留置するもの等があり、いずれの形態のバイオ人工膵臓にも適用可能である。
【実施例】
【０１４２】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。【０１４３】
＜実施例１＞
（１）分化誘導促進剤の調製
分化誘導促進剤は以下のようにして調製した。１０％  ＦＢＳ（ウシ胎児血清）（ニチレイ、１７１０１２）、１％  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ、１５１４０−１２２）を添加したハムＦ１２培地（Ｓｉｇｍａ、Ｎ６６５８）で継代培養したＣＨＯ−Ｋ１細胞を１０ｃｍディッシュに５×１０５個プレーティングした。その翌日、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるポリペプチド（以下、「ＩＢＣＡＰ」という。）の発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ＩＢＣＡＰ）をＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトし、ＩＢＣＡＰを強制発現させた。その４８時間後に細胞を１／２０濃度に希釈し、１０ｃｍディッシュに再度プレーティングした。その翌日、最終濃度４００μｇ／ｍＬのＧ４１８（ナカライテスク、０９３８０−４４）を添加し、以後、３〜５日おきに培地交換を行い、コロニー形成させた。限界希釈法でクローン化したコロニーを単離し、増殖後、サザンブロット法及びノザンブロット法で遺伝子発現を確認し、安定型ＩＢＣＡＰ発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞株（以下、「ＩＢＣＡＰ発現Ｓｔａｂｌｅ  ＣＨＯ細胞」という。）を作製した。【０１４４】
その後、このＩＢＣＡＰ発現Ｓｔａｂｌｅ  ＣＨＯ細胞を、１％  ＧＬＵＴＡＭＡＸ  Ｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ、３５０５０−０６１）及び１％  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ、１５１４０−１２２）を添加したＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ、１２６８１−０１１）に馴化させた。さらに、馴化させたＩＢＣＡＰ発現Ｓｔａｂｌｅ  ＣＨＯ細胞を、強制通気式ＣＯ２インキュベーター（タイテック、ＣＯ２−ＢＲ−４３ＦＬ、温度：３７℃、振とう速度：１２０ｒｐｍ、ガス条件：５％  ＣＯ２、２０ｍＬ／ｍｉｎ／フラスコ）にて振とう培養を行い、以後、この細胞を用いて培養上清を作製した。【０１４５】
培養上清は、生存率が９０％以上あることを確認し、細胞数が５×１０５個／ｍＬとなるよう継代し（培養液量：１５０ｍＬ培養液／５００ｍＬフラスコ）、５日後に回収した（細胞数は約４〜５×１０５個／ｍＬ）。回収した培養上清はその後、セントリプレップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、４３０２、ＹＭ−３）を用いて約１０倍に濃縮し（３００ｍＬを約３０ｍＬに濃縮し）、さらに２Ｌの３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）に対して３回透析した。そして、透析後の培養上清（以下、「ＩＢＣＡＰ培養上清」という。）を分化誘導促進剤として準備した。【０１４６】
また、Ｍｏｃｋコントロールとして、空ベクター（ｐＣＡＧＧＳ）をＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトし、上記と同様にして透析後の培養上清（以下、「Ｍｏｃｋ培養上清」という。）を準備した。【０１４７】
（２）ヒトｉＰＳ細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導
ヒトｉＰＳ細胞としては、埼玉医科大学のＤｒ．Ｍｉｔａｎｉから供与されたＴＩＧ３／ＫＯＳＭ細胞を用いた。この細胞は、センダイウイルスを用いてＴＩＧ−３細胞に４因子（ＯＣＴ遺伝子、ＫＬＦ遺伝子、ＳＯＸ遺伝子、ＭＹＣ遺伝子）を導入することにより、産業技術総合研究所にて樹立されたものである（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２８６，  ｐｐ．４７６０−４７７１（２０１１））。ＴＩＧ３／ＫＯＳＭ細胞は、１％（ｖ／ｖ）  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２０％（ｖ／ｖ）  ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ血清代替物（Ｇｉｂｃｏ）、１％  （ｖ／ｖ）  非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、２．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、５ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５ｍＭ  塩化ナトリウムを添加したＤＭＥＭ／ハムＦ１２培地中で維持した。【０１４８】
分化誘導を開始する前日、１０ｃｍディッシュに増やしたＴＩＧ３／ＫＯＳＭ細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でコートされた６ウェルプレートに１×１０９個／ウェルの細胞密度でプレーティングし、ＳＴＯフィーダー細胞による馴化培地中で一晩培養した。そして、培地を取り除き、ＣＴＫ（０．２５％  トリプシン、１ｍｇ／ｍＬ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＶ、２０％  ＫＳＲ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｉｎ  ＰＢＳ）１ｍＬを添加し、３７℃で５分間処理をし、ＳＴＯフィーダー細胞を取り除いた後に、ピペッティングにより懸濁してＴＩＧ３／ＫＯＳＭ細胞を剥がした。その後、剥がしたＴＩＧ３／ＫＯＳＭ細胞を１５ｍＬチューブにとり、１０００ｒｐｍ（１５０×ｇ）で５分間遠心後、上清を取り除き、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭでコートされた６ウェルプレートに１×１０９個／ウェルの細胞密度でプレーティングした。【０１４９】
なお、上記の馴化培地は、以下のようにして調製したものである。すなわち、マイトマイシン処理済みＳＴＯ細胞を１５ｃｍディッシュに７．５×１０６個プレーティングし、翌日、ヒトｉＰＳ培地（ＦＧＦ−２なし）に培地交換し、１〜３時間処理後、再度ヒトｉＰＳ培地に交換して２４時間培養した。その翌日、上清を回収し、１５００ｒｐｍ（３３０×ｇ）で１０分間遠心することによって細胞を取り除き、−２０〜−３０℃にてストックした。【０１５０】
分化誘導の開始初日に、１％（ｖ／ｖ）  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１００ｎｇ／ｍＬ  アクチビンＡ（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ）、２５ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａ（ナカライテスク）を添加したＡｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に培地交換し、１日間培養した（工程（Ａ１−１））。次いで、１％（ｖ／ｖ）  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、０．２％（ｖ／ｖ）  ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１００ｎｇ／ｍＬ  アクチビンＡ（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＡｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に培地交換し、２日間培養した（工程（Ａ１−２））。【０１５１】
次いで、１％（ｖ／ｖ）  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２％（ｖ／ｖ）  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−１０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、０．２５μＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン（ナカライテスク）を添加したＡｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に培地交換し、２日間培養した（工程（Ｂ１））。【０１５２】
次いで、１％（ｖ／ｖ）  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２％（ｖ／ｖ）  Ｂ−２７ＴＭサプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、２μＭ  レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）、０．２５μＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン（ナカライテスク）、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−１０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加したＤＭＥＭ／ハムＦ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）に培地交換し、４日間培養した（工程（Ｃ１））。【０１５３】
次いで、１％（ｖ／ｖ）  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２％（ｖ／ｖ）  Ｂ−２７ＴＭサプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、１０μＭ  ＤＡＰＴ（Ｓｉｇｍａ）、５５ｎＭ  エキセンジン−４（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を添加し、さらに２％（ｖ／ｖ）  ＩＢＣＡＰ培養上清又はＭｏｃｋ培養上清を添加したＤＭＥＭ／ハムＦ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）に培地交換し、３日間培養した（工程（Ｄ１））。【０１５４】
最後に、１％（ｖ／ｖ）  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２％（ｖ／ｖ）  Ｂ−２７ＴＭサプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、５５ｎＭ  エキセンジン−４（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、５０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ）、５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−１（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ）を添加し、さらに２％（ｖ／ｖ）  ＩＢＣＡＰ培養上清又はＭｏｃｋ培養上清を添加したＣＭＲＬ１０６６培地（Ｇｉｂｃｏ）に培地交換し、６日間培養した（工程（Ｅ１））。【０１５５】
（３）定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
分化誘導前のＴＩＧ３／ＫＯＳＭ細胞、及び工程（Ｅ１）を経て得られた細胞について、グルカゴン（ＧＣＧ）及びソマトスタチン（ＳＳＴ）の遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで確認した。具体的には、まず、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＴＭ  ＲＮＡ  ＩＩ（タカラバイオ）を用いて細胞からＲＮＡを抽出し、Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲＴＭ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。プライマー配列を以下に示す。
ＨｓＧＣＧ＿２６４Ｆ：ＧＣＡＴＴＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＣＴＧＧＡ（配列番号４）
ＨｓＧＣＧ＿３６８Ｒ：ＣＣＴＧＧＧＡＡＧＣＴＧＡＧＡＡＴＧＡＴ（配列番号５）
ＨｓＳＳＴ＿２０６Ｆ：ＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＣＡＧＴＴＴＣ（配列番号６）
ＨｓＳＳＴ＿３１３Ｒ：ＴＣＣＧＴＣＴＧＧＴＴＧＧＧＴＴＣＡＧ（配列番号７）【０１５６】
ＰＣＲ産物は３％アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド、ＢｉｏＤｏｃ−Ｉｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＭｂｉｏ）により可視化した。【０１５７】
工程（Ｅ１）を経て得られた細胞におけるグルカゴン（ＧＣＧ）及びソマトスタチン（ＳＳＴ）の発現量をそれぞれ図１（ａ）、（ｂ）に示す。この図１（ａ）、（ｂ）は、分化誘導前のＴＩＧ３／ＫＯＳＭ細胞におけるグルカゴン（ＧＣＧ）及びソマトスタチン（ＳＳＴ）の発現量を１とした相対値（誘導倍率）で示したものである。【０１５８】
図１（ａ）に示すように、無添加の場合にはグルカゴン（ＧＣＧ）の誘導倍率が約２２．６倍であったのに対し、工程（Ｄ１）、（Ｅ１）でＭｏｃｋ培養上清を添加した場合には約１２．８倍であり、ＩＢＣＡＰ培養上清を添加した場合には約３６．８倍であった。
また、図１（ｂ）に示すように、無添加の場合にはソマトスタチン（ＳＳＴ）の誘導倍率がほぼ０倍であったのに対し、工程（Ｄ１）、（Ｅ１）でＭｏｃｋ培養上清を添加した場合には約０．４倍であり、ＩＢＣＡＰ培養上清を添加した場合には約９．５倍であった。
この結果から、工程（Ｄ１）、（Ｅ１）でＩＢＣＡＰ培養上清を添加することにより、ヒトｉＰＳ細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導効率が向上することが分かる。【０１５９】
＜実施例２＞
ＩＢＣＡＰ培養上清又はＭｏｃｋ培養上清を工程（Ａ１−１）、（Ａ１−１）、あるいは工程（Ｂ１）、（Ｃ１）で添加するとともに、工程（Ｅ１）の培養期間を３日間とするほかは、実施例１と同様にしてＴＩＧ３／ＫＯＳＭ細胞を培養し、グルカゴン（ＧＣＧ）及びソマトスタチン（ＳＳＴ）の遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで確認した。【０１６０】
工程（Ｅ１）を経て得られた細胞におけるグルカゴン（ＧＣＧ）及びソマトスタチン（ＳＳＴ）の発現量をそれぞれ図２（ａ）、（ｂ）に示す。この図２（ａ）、（ｂ）は、分化誘導前のＴＩＧ３／ＫＯＳＭ細胞におけるグルカゴン（ＧＣＧ）及びソマトスタチン（ＳＳＴ）の発現量を１とした相対値で示したものである。【０１６１】
図２（ａ）に示すように、無添加の場合にはグルカゴン（ＧＣＧ）の誘導倍率が約１２０．１倍であったのに対し、工程（Ａ１−１）、（Ａ１−２）でＭｏｃｋ培養上清を添加した場合には約１００．７倍であり、ＩＢＣＡＰ培養上清を添加した場合には約１９３．８倍であった。また、工程（Ｂ１）、（Ｃ１）でＭｏｃｋ培養上清を添加した場合には約３１．２倍であり、ＩＢＣＡＰ培養上清を添加した場合には約２１８．５倍であった。
また、図２（ｂ）に示すように、無添加の場合にはソマトスタチン（ＳＳＴ）の誘導倍率が約１１７．６倍であったのに対し、工程（Ａ１−１）、（Ａ１−２）でＭｏｃｋ培養上清を添加した場合には約１６．６倍であり、工程（Ａ１−１）、（Ａ１−２）でＩＢＣＡＰ培養上清を添加した場合には約６５．２倍であった。また、工程（Ｂ１）、（Ｃ１）でＭｏｃｋ培養上清を添加した場合には約８．８倍であり、ＩＢＣＡＰ培養上清を添加した場合には約１６４．１倍であった。
この結果から、工程（Ａ１−１）、（Ａ１−２）でＩＢＣＡＰ培養上清を添加する場合と、工程（Ｂ１）、（Ｃ１）でＩＢＣＡＰ培養上清を添加する場合とのいずれも、ヒトｉＰＳ細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導効率が向上することが分かる。【０１６２】
＜実施例３＞
（１）マウス膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導
マウス膵臓組織幹／前駆細胞としては、埼玉医科大学のＤｒ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏから供与されたＴｅｃ３ＤＲ細胞を用いた。この細胞は、マウス胎児期の膵臓から分離された組織幹／前駆細胞をクローン化することにより樹立されたものである。Ｔｅｃ３ＤＲ細胞は、１％（ｖ／ｖ）  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、１５％（ｖ／ｖ）  ＦＢＳ、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤＭＥＭ培地中で維持した。【０１６３】
分化誘導の開始初日に、２４ウェルプレートにＴｅｃ３ＤＲ細胞を１×１０５個／ウェルの細胞密度でプレーティングし、１％（ｖ／ｖ）  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％（ｖ／ｖ）  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）  ＩＴＳ−Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）、５５μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤＭＥＭ／ハムＦ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）で２日間培養した（工程（Ａ３））。【０１６４】
次いで、１％（ｖ／ｖ）  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％（ｖ／ｖ）  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）  ＩＴＳ−Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）、５５μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、５０ｎｇ／ｍＬ  アクチビンＡ（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ）を添加したＤＭＥＭ／ハムＦ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）に培地交換し、４日間培養した（工程（Ｂ３））。【０１６５】
次いで、１％（ｖ／ｖ）  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％（ｖ／ｖ）  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）  ＩＴＳ−Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）、５５μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１μＭ  レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）を添加したＤＭＥＭ／ハムＦ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）に培地交換し、４日間培養した（工程（Ｃ３））。【０１６６】
次いで、トリプシン−ＥＤＴＡで処理することにより培養中の細胞を回収し、２４ウェルプレートに１×１０５個／ウェルの細胞密度でプレーティングし、１％（ｖ／ｖ）  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）  ＩＴＳ−Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−２（ナカライテスク）を添加したＤＭＥＭ／ハムＦ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）で３日間培養した（工程（Ｄ３））。【０１６７】
最後に、１％（ｖ／ｖ）  ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）  ＩＴＳ−Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−２（ナカライテスク）、１０ｍＭ  ニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ）を添加したＤＭＥＭ／ハムＦ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）に培地交換し、５日間培養した。その途中、２〜３日経過後に新しい培地に交換した。その後、培地中に２％（ｖ／ｖ）  ＩＢＣＡＰ培養上清又はＭｏｃｋ培養上清を添加し、さらに６日間培養した（工程（Ｅ３））。【０１６８】
（２）定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
分化誘導前のＴｅｃ３ＤＲ細胞、及び工程（Ｅ３）を経て得られた細胞について、マウスインスリン−１（Ｉｎｓ１）の遺伝子発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲで確認した。具体的には、まず、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＴＭ  ＲＮＡ  ＩＩ（タカラバイオ）を用いて細胞からＲＮＡを抽出し、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲＴＭ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。プライマー配列を以下に示す。
ＭｎＩｎｓ１＿ｑＰＣＲ＿Ｆｗ：ＣＡＣＴＴＣＣＴＡＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧ（配列番号８）
ＭｎＩｎｓ１＿ｑＰＣＲ＿Ｒｖ：ＡＣＧＣＣＡＡＧＧＴＣＴＧＡＡＧＧＴＣ（配列番号９）【０１６９】
ＰＣＲ産物は３％アガロースゲル電気泳動により分離し、エチブジウムブロマイドで染色し、ＢｉｏＤｏｃ−Ｉｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＭｂｉｏ）により可視化した。【０１７０】
工程（Ｅ３）を経て得られた細胞におけるインスリン−１（Ｉｎｓ１）の発現量を図３に示す。この図３は、分化誘導前のＴｅｃ３ＤＲ細胞におけるインスリン−１（Ｉｎｓ１）の発現量を１とした相対値で示したものである。【０１７１】
図３に示すように、工程（Ｅ３）でＭｏｃｋ培養上清を添加した場合には約０．３倍であり、ＩＢＣＡＰ培養上清を添加した場合には約１７．０倍であった。
この結果から、工程（Ｅ３）でＩＢＣＡＰ培養上清を添加することにより、マウス膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導効率が向上することが分かる。
【図１】
2013176249.tif 000003
【図２】
2013176249.tif 000004
【図３】
2013176249.tif 000005
【配列表】
2013176249000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年10月10日(2014.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞を生産する膵臓ホルモン産生細胞の生産方法であって、
多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導過程で、下記（１）〜（３）から選ばれる少なくとも１種の分化誘導促進剤を培地中に添加することを特徴とする膵臓ホルモン産生細胞の生産方法、
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つポリペプチド、
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、又はこのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを外来遺伝子として組み込んだ細胞の培養上清。
【請求項２】
（Ａ１）ＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子β）スーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で多能性幹細胞を培養する工程、
（Ｂ１）前記工程（Ａ１）で得られた細胞をＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）の存在下で培養する工程、
（Ｃ１）前記工程（Ｂ１）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程、
（Ｄ１）前記工程（Ｃ１）で得られた細胞をγ−セクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程、及び
（Ｅ１）前記工程（Ｄ１）で得られた細胞を、エキセンジン−４、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＩＧＦ−１（インスリン様増殖因子−１）、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも１種の因子の存在下で培養する工程、を含み、
前記工程（Ａ１）〜（Ｅ１）の少なくとも１つの工程で前記分化誘導促進剤を培地中に添加する請求項１記載の膵臓ホルモン産生細胞の生産方法。
【請求項３】
（Ａ２）ＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子β）スーパーファミリーに属する増殖因子と、Ｗｎｔ（ウィングレス型ＭＭＴＶ組み込み部位）ファミリーに属する増殖因子及びＧＳＫ−３（グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３）阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の因子との存在下で多能性幹細胞を培養する工程、
（Ｂ２）前記工程（Ａ２）で得られた細胞をＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する工程、
（Ｃ２）前記工程（Ｂ２）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程、
（Ｄ２）前記工程（Ｃ２）で得られた細胞を、ｃＡＭＰ（環状アデノシン一リン酸）増加剤、デキサメタゾン、ＴＧＦ−β１型受容体阻害剤、及びニコチンアミドからなる群から選択される少なくとも１種の因子の存在下で培養する工程、を含み、
前記工程（Ａ２）〜（Ｄ２）の少なくとも１つの工程で前記分化誘導促進剤を培地中に添加する請求項１記載の膵臓ホルモン産生細胞の生産方法。
【請求項４】
（Ａ３）ＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子β）スーパーファミリーに属する増殖因子、レチノイド、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）、及びニコチンアミドの非存在下で膵臓組織幹／前駆細胞を培養する工程、
（Ｂ３）前記工程（Ａ３）で得られた細胞をＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する増殖因子の存在下で培養する工程、
（Ｃ３）前記工程（Ｂ３）で得られた細胞をレチノイドの存在下で培養する工程、
（Ｄ３）前記工程（Ｃ３）で得られた細胞をＦＧＦの存在下で培養する工程、及び
（Ｅ３）前記工程（Ｄ３）で得られた細胞をニコチンアミドの存在下で培養する工程
を含み、
前記工程（Ａ３）〜（Ｅ３）の少なくとも１つの工程で前記分化誘導促進剤を培地中に添加する請求項１記載の膵臓ホルモン産生細胞の生産方法。
【請求項５】
次の（１）〜（３）の少なくとも１種を含み、多能性幹細胞又は膵臓組織幹／前駆細胞から膵臓ホルモン産生細胞への分化を誘導する分化誘導促進剤；
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓ホルモン産生細胞への分化誘導促進作用を持つポリペプチド、
（３）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、又はこのＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを外来遺伝子として組み込んだ細胞の培養上清。
【国際調査報告】
2013176249.tif 000006
2013176249.tif 000007
2013176249.tif 000008
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