(57)【要約】  本発明は、甘蔗から得られる多糖を有効成分として含有し、該多糖が、α−グルカンを主成分とし、ピーク分子量が７２０，０００〜１，０８０，０００の範囲内にあり、全構成糖に占めるグルコースの割合が８０％以上であり、かつ非還元末端グルコースの割合が２０〜３０％、及びα１−６結合グルコースの割合が１５〜２５％である、パイエル板活性剤を提供する。
2014054421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
甘蔗から得られる多糖を有効成分として含有し、
前記多糖が、α−グルカンを主成分とし、ピーク分子量が７２０，０００〜１，０８０，０００の範囲内にあり、全構成糖に占めるグルコースの割合が８０％以上であり、かつ非還元末端グルコースの割合が２０〜３０％、及びα１−６結合グルコースの割合が１５〜２５％である、パイエル板活性剤。
【請求項２】
前記多糖が、甘蔗抽出物又は甘蔗由来の糖蜜から選ばれる原料を、エタノール沈殿し、得られた沈殿から透析又は膜処理により低分子量の物質を除去して得られるエタノール沈殿画分から得られるものである、請求項１に記載のパイエル板活性剤。
【請求項３】
前記原料が、甘蔗由来のエキスであり、
前記エキスが、甘蔗抽出物又は甘蔗由来の糖蜜を、担体として陽イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、水を溶離液としたときの前記陽イオン交換樹脂と各成分との親和力の差により分画し、得た多数の画分のうち蔗糖、ブドウ糖及び果糖が除かれた、波長４２０ｎｍの光を吸収する画分である、請求項２に記載のパイエル板活性剤。
【請求項４】
前記多糖が、前記エタノール沈殿画分を、担体として陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、前記陰イオン交換樹脂に吸着された成分を低イオン強度の溶出溶媒で溶出して得られる溶出画分を、更にゲルろ過して得られる画分である、請求項２又は３に記載のパイエル板活性剤。
【請求項５】
前記多糖が、前記エタノール沈殿画分を、担体として水で平衡化した陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、前記陰イオン交換樹脂に吸着された成分を１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３で溶出して得られる溶出画分を、更に分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムに通液し、最初に流出する空隙容積に相当する量の画分である、請求項２〜４のいずれか一項に記載のパイエル板活性剤。
【請求項６】
甘蔗から得られる多糖を有効成分として含有し、
前記多糖が、ヘテログリカンを主成分とし、ピーク分子量が３８，４００〜５７，６００の範囲内、及び６６４，０００〜９９６，０００の範囲内にあり、全構成糖に占めるグルコースの割合が３０％〜５０％、及びアラビノースの割合が２０〜３０％であり、かつ非還元末端アラビノースの割合が２０〜３０％である、パイエル板活性剤。
【請求項７】
前記多糖が、甘蔗抽出物又は甘蔗由来の糖蜜から選ばれる原料を、エタノール沈殿し、得られた沈殿から透析又は膜処理により低分子量の物質を除去して得られるエタノール沈殿画分から得られるものである、請求項６に記載のパイエル板活性剤。
【請求項８】
前記原料が、甘蔗由来のエキスであり、
前記エキスが、甘蔗抽出物又は甘蔗由来の糖蜜を、担体として陽イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、水を溶離液としたときの前記陽イオン交換樹脂と各成分との親和力の差により分画し、得た多数の画分のうち蔗糖、ブドウ糖及び果糖が除かれた、波長４２０ｎｍの光を吸収する画分である、請求項７に記載のパイエル板活性剤。
【請求項９】
前記多糖が、前記エタノール沈殿画分を、担体として陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、前記陰イオン交換樹脂に吸着された成分を高イオン強度の溶出溶媒で溶出して得られる画分である、請求項７又は８に記載のパイエル板活性剤。
【請求項１０】
前記多糖が、
前記エタノール沈殿画分を、担体として水で平衡化した陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、前記陰イオン交換樹脂に吸着された成分を、１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３で溶出した後に、３００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３で溶出して得られる溶出画分を、更に分画分子量１×１０４〜１×１０６Ｄａのゲルろ過カラムに通液し、最初に流出する空隙容積に相当する量の画分以外の画分と、
前記エタノール沈殿画分を、担体として水で平衡化した陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、前記陰イオン交換樹脂に吸着された成分を、３００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３で溶出した後に、１．８Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３で溶出して得られる溶出画分を、更に分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムに通液し、最初に流出する空隙容積に相当する量の画分と、からなる、請求項７〜９のいずれか一項に記載のパイエル板活性剤。
【請求項１１】
甘蔗から得られる多糖を有効成分として含有し、
前記多糖が、甘蔗抽出物又は甘蔗由来の糖蜜から選ばれる原料を、エタノール沈殿し、得られた沈殿から透析又は膜処理により低分子量の物質を除去して得られるものである、パイエル板活性剤。
【請求項１２】
腸管免疫亢進剤である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のパイエル板活性剤。
【請求項１３】
マラリア原虫感染予防治療剤である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のパイエル板活性剤。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のパイエル板活性剤を含む食品。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のパイエル板活性剤を含む飼料。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のパイエル板活性剤を含む、マラリア原虫感染予防又は治療用医薬。
【請求項１７】
キニーネ、メフロキン、スルファドキシン、ピリメタミン、クロロキン、プリマキン、アルテスネート、アルテメーター及びルメファントリンからなる群より選択される１種又は２種以上の抗マラリア薬と併用されるように用いられる、請求項１６に記載のマラリア原虫感染予防又は治療用医薬。
【請求項１８】
前記抗マラリア薬が、アルテスネートである、請求項１７に記載のマラリア原虫感染予防又は治療用医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パイエル板活性剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
パイエル板は上部腸管に存在する高度に機能化されたリンパ濾胞組織であり、抗原特異的な分泌型ＩｇＡ産生及び免疫寛容発現のための重要な出発点である誘導組織の１つとなっている。パイエル板は、腸管免疫と呼ばれる生体防御に関わる免疫機構において重要な働きを担っていることが知られている。例えば、パイエル板のリンパ球は常時ホーミング現象により他の局所粘膜免疫系及び全身免疫系付属組織にリクルートされ、免疫情報を伝搬させる機能を有する。【０００３】
パイエル板免疫機能調節活性の一つとして、骨髄細胞増殖促進因子（例えば、サイトカイン）のパイエル板での産生が挙げられる。このような骨髄細胞増殖促進因子として、例えば、パイエル板で産生されるサイトカインであるＩＬ−６が知られている（非特許文献１）。【０００４】
一方、これまでに、キク科ホソバオケラ（Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ  ｌａｎｃｅａ  ＤＣ．）の根茎から得られた多糖、及びマメ科ナイモウオウギ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｓ  Ｂｕｎｇｅ．）の地上部から得られた多糖にパイエル板免疫機能調節活性があることが報告されている（非特許文献２）。【０００５】
また、イネ科植物である甘蔗由来のエキスを有効成分とする感染予防治療剤、ワクチンアジュバント剤及びコクシジウムによって引き起こされるヒト又は動物の病気に対する予防治療剤が知られている（例えば、特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−２９７０４６号公報
【特許文献２】特開２００３−６３９７５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔ．Ｈｏｎｇ，Ｔ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．Ｋｉｙｏｈａｒａ  ａｎｄ  Ｈ．Ｙａｍａｄａ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｅｙｅｒ’ｓ  ｐａｔｃｈｅｓ  ｂｙ  ｏｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋａｍｐｏ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｈｅｒｂａｌ）  ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，‘Ｊｕｚｅｎ−ｔａｉｈｏ−ｔｏ’，Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，５巻，３５３〜３６０頁（１９９８年）
【非特許文献２】Ｈｉｒｏａｋｉ  Ｋｉｙｏｈａｒａ，Ｔｏｓｈｉａｋｅ  Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｔｓｕｋａｓａ  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｔａｋａｙｕｋｉ  Ｎａｇａｉ，Ｈａｒｕｋｉ  Ｙａｍａｄａ：Ｙａｋｕｇａｋｕ  Ｚａｓｓｈｉ，１２８巻，５号，７０９〜７１９頁（２００８年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
パイエル板免疫機能調節を人為的に可能とすれば、腸管免疫を通じて生体防御に関わる免疫機構の調節が可能となり有益である。非特許文献２に開示されているように、パイエル板免疫機能調節活性を有する物質がこれまでにいくつか知られている。しかしながら、需要者の多様なニーズに応えるためには未だ充分なレパートリーがあるとは言えない。【０００９】
また、イネ科植物に由来する機能性成分はこれまでにいくつか知られているものの、パイエル板免疫機能調節活性を有する成分、例えば、骨髄細胞増殖促進活性を有するサイトカインのパイエル板での産生の亢進作用（以下、本作用を「パイエル板活性作用」ともいう。）を有する成分、はこれまで知られていない。【００１０】
本発明は、上記事情に鑑み、骨髄細胞増殖促進活性を有するサイトカインのパイエル板での産生の亢進作用を有する新規なパイエル板活性剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、サトウキビ（甘蔗）脱蔗糖エキスから精製された後述するα−グルカン画分及びヘテログリカン画分が、骨髄細胞増殖促進活性を有するサイトカインのパイエル板での産生の亢進作用を有することを見出し、本発明を完成させた。【００１２】
すなわち、本発明は、甘蔗から得られる多糖を有効成分として含有するパイエル板活性剤を提供する。【００１３】
本発明のパイエル板活性剤は、パイエル板での骨髄細胞増殖促進活性を有するサイトカイン（例えば、ＩＬ−６）産生の亢進作用を少なくとも有する。したがって、少なくともパイエル板での上記サイトカイン産生の調節により、パイエル板免疫機能調節活性を発揮することができる。また、甘蔗は古来より食品として使用されているものの一つであるため、より安全性の高いパイエル板活性剤の提供が可能となる。【００１４】
上記多糖は、α−グルカンを主成分とし、ピーク分子量が７２０，０００〜１，０８０，０００の範囲内にあり、全構成糖に占めるグルコースの割合が８０％以上であり、かつ非還元末端グルコースの割合が２０〜３０％、及びα１−６結合グルコースの割合が１５〜２５％であるもの（以下、「α−グルカン画分」ともいう。）であってもよい。これにより、より優れたパイエル板活性作用を奏することができる。なお、本明細書において、「α１−６結合グルコース」は、１位と６位の水酸基で他の構成単位と結合しているα−グルコース単位を意味し、「α−６結合グルコース」ともいう。【００１５】
本明細書において「分子量分布曲線」とは、被験試料（α−グルカン画分及びヘテログリカン画分）の分子量を、高速ゲルろ過クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）で分析したときに得られる分布曲線を意味する。分子量は、例えば、標準多糖（ｐｕｌｌｕｌａｎ  Ｐ−８００，４００，２００，１００，５０，２０，１０及び５，昭和電工）のＨＰＳＥＣでの保持時間より分子量対保持時間係数（Ｋａｖ）の検量線を作成し、被験試料の保持時間から算出する。また、ＨＰＳＥＣの条件は、例えば、以下のように設定することができる。
カラム；Ａｓａｈｉ−ｐａｋ  ＧＳ７１０及びＡｓａｈｉ−ｐａｋ  ＧＳ６２０（各０．７６ｉ．ｄ．×６０ｃｍ）（昭和電工）の連結カラム
送液装置；ＪＡＳＣＯ  ＰＶ−９８０（日本分光）
検出器；Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ  ＳＥ−６２（昭和電工）（感度：×２）
溶出液；０．２Ｍ  ＮａＣｌ（１．０ｍＬ／ｍｉｎ）【００１６】
本明細書において「ピーク分子量」とは、上述の「分子量分布曲線」におけるピークのピークトップに対応する分子量を意味する。【００１７】
また、上記α−グルカン画分は、甘蔗抽出物又は甘蔗由来の糖蜜から選ばれる原料を、エタノール沈殿し、得られた沈殿から透析又は膜処理により低分子量の物質を除去して得られる画分（「エタノール沈殿画分」ともいう。）から得られるものであることが好ましい。【００１８】
エタノール沈殿画分は、甘蔗抽出物又は甘蔗由来の糖蜜をそのまま用いて得られるものであってもよい。また、甘蔗抽出物又は甘蔗由来の糖蜜を、担体として陽イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、水を溶離液としたときの上記陽イオン交換樹脂と各成分との親和力の差により分画し、得た多数の画分のうち蔗糖、ブドウ糖及び果糖が除かれた、波長４２０ｎｍの光を吸収する画分（「甘蔗由来のエキス」ともいう。）を用いて得られるものが好ましい。甘蔗由来のエキスを用いることにより、エタノール沈殿画分をより効率的に得ることができる。【００１９】
上記α−グルカン画分は、上記エタノール沈殿画分を、担体として陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、上記陰イオン交換樹脂に吸着された成分を低イオン強度の溶出溶媒で溶出して得られる溶出画分を、更にゲルろ過して得られる画分であることが好ましい。【００２０】
上記α−グルカン画分は、上記エタノール沈殿画分を、担体として水で平衡化した陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、上記陰イオン交換樹脂に吸着された成分を１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３で溶出して得られる溶出画分を、更に分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムに通液し、最初に流出する空隙容積に相当する量の画分であることが好ましい。【００２１】
上記多糖は、ヘテログリカンを主成分とし、ピーク分子量が３８,４００〜５７，６００の範囲内、及び６６４，０００〜９９６，０００の範囲内にあり、全構成糖に占めるグルコースの割合が３０％〜５０％、及びアラビノースの割合が２０〜３０％であり、かつ非還元末端アラビノースの割合が２０〜３０％であるもの（以下、「ヘテログリカン画分」ともいう。）であってもよい。これにより、より優れたパイエル板活性作用を奏することができる。【００２２】
上記ヘテログリカン画分は、上記エタノール沈殿画分から得られるものであることが好ましい。この場合、上記エタノール沈殿画分は、上記甘蔗由来のエキスを用いて得られるものが好ましい。【００２３】
上記ヘテログリカン画分は、上記エタノール沈殿画分を、担体として陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、上記陰イオン交換樹脂に吸着された成分を高イオン強度の溶出溶媒で溶出して得られる画分であることが好ましい。【００２４】
上記ヘテログリカン画分は、
上記エタノール沈殿画分を、担体として水で平衡化した陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、上記陰イオン交換樹脂に吸着された成分を、１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３で溶出した後に、３００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３で溶出して得られる溶出画分を、更に分画分子量１×１０４〜１×１０６Ｄａのゲルろ過カラムに通液し、最初に流出する空隙容積に相当する量の画分以外の画分と、
上記エタノール沈殿画分を、担体として水で平衡化した陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、上記陰イオン交換樹脂に吸着された成分を、３００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３で溶出した後に、１．８Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３で溶出して得られる溶出画分を、更に分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムに通液し、最初に流出する空隙容積に相当する量の画分と、からなることが好ましい。【００２５】
上記多糖は、甘蔗抽出物又は甘蔗由来の糖蜜から選ばれる原料を、エタノール沈殿し、得られた沈殿から透析又は膜処理により低分子量の物質を除去して得られるもの（「エタノール沈殿画分」に相当する）であってもよい。【００２６】
本発明のパイエル板活性剤は、パイエル板活性作用を有することから、腸管免疫亢進剤として使用することもできる。また、腸管免疫亢進作用を通じて、例えば、マラリア原虫感染予防治療剤として使用することもできる。【００２７】
本発明のパイエル板活性剤は、食品、食品添加物、飼料、医薬品、医薬品添加物等に含ませて使用することもできる。【００２８】
本発明はまた、本発明のパイエル板活性剤を含む、マラリア原虫感染予防又は治療用医薬を提供する。【００２９】
上記マラリア原虫感染予防又は治療用医薬は、キニーネ、メフロキン、スルファドキシン、ピリメタミン、クロロキン、プリマキン、アルテスネート、アルテメーター及びルメファントリンからなる群より選択される１種又は２種以上の抗マラリア薬と併用されるように用いられてもよい。上記抗マラリア薬は、アルテスネートであることが好ましい。【００３０】
本発明は、上述した多糖のパイエル板を活性化するための使用（又は応用）ということもできる。本発明はまた、上述した多糖を対象に投与するステップを含む、パイエル板の活性化方法ということもできる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、新規なパイエル板活性剤が提供される。本発明によれば、甘蔗から得られる多糖を有効成分として含有する剤を動物に投与（例えば、経口投与）することにより、例えば、パイエル板でのサイトカイン（例えば、骨随細胞増殖促進因子としてのＩＬ−６）産生の亢進作用を奏することができる。これにより、例えば、腸管免疫亢進を通じて、生体防御に関わる免疫機構を亢進させることが可能である。【００３２】
また、本発明のパイエル板活性剤は、古来よりヒトが食してきた甘蔗に由来するものであるため、ヒト又はヒトが食用とする家畜若しくは家禽などの産業動物の健康を害することもなく、安全である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】試験例１におけるパイエル板活性作用試験の結果を示すグラフである。
【図２】製造例１における多糖画分の分離工程を示すスキームである。
【図３】実施例１におけるパイエル板活性作用試験の結果を示すグラフである。
【図４】実施例２におけるＩＬ−６産生誘導試験の結果を示すグラフである。
【図５】実施例３におけるネズミマラリア原虫（クロロキン感受性株）感染モデルでの多糖画分の経口投与試験の結果を示すグラフである。
【図６】製造例１で行ったカラムクロマトグラフィーにおける溶出パターンを示すグラフである。
【図７】試験例２におけるα−グルカン画分の分子量分布を示すＨＰＳＥＣチャートである。
【図８】試験例２におけるヘテログリカン画分の分子量分布を示すＨＰＳＥＣチャートである。
【図９】実施例４におけるネズミマラリア原虫（クロロキン耐性株）感染モデルでの多糖画分の経口投与試験の結果を示すグラフである。
【図１０】実施例５におけるネズミマラリア原虫（クロロキン耐性株）感染モデルでの多糖画分と抗マラリア薬の併用経口投与試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明の実施形態についてより詳細に説明する。
【００３５】
本発明のパイエル板活性剤は、甘蔗から得られる多糖を有効成分として含有する。
【００３６】
〔多糖〕
甘蔗から得られる多糖としては、
（ｉ）α−グルカンを主成分とし、ピーク分子量が７２０，０００〜１，０８０，０００の範囲内にあり、全構成糖に占めるグルコースの割合が８０％以上であり、かつ非還元末端グルコースの割合が２０〜３０％、及びα１−６結合グルコースの割合が１５〜２５％であるもの（α−グルカン画分）、
（ｉｉ）ヘテログリカンを主成分とし、ピーク分子量が３８，４００〜５７，６００の範囲内、及び６６４，０００〜９９６，０００の範囲内にあり、全構成糖に占めるグルコースの割合が３０％〜５０％、及びアラビノースの割合が２０〜３０％であり、かつ非還元末端アラビノースの割合が２０〜３０％であるもの（ヘテログリカン画分）、又は
（ｉｉｉ）甘蔗抽出物又は甘蔗由来の糖蜜から選ばれる原料を、エタノール沈殿し、得られた沈殿から透析又は膜処理により低分子量の物質を除去して得られるもの（エタノール沈殿画分）、とすることができる。
【００３７】
α−グルカン画分は更に、Ｇｌｃ換算での糖含有量が８０質量％〜９０質量％であることが好ましい。また、ＧａｌＡ換算でのウロン酸含有量が５質量％以下であることが好ましい。ウシ免疫グロブリン換算でのタンパク質含有量が１０質量％以下であることが好ましい。さらに、α−グルカン画分の全構成糖に占めるグルコースの割合は７５％〜９０％であることが好ましい。
【００３８】
α−グルカン画分は、ピーク分子量が７２０，０００〜１，０８０，０００の範囲内にあればよいが、８１０，０００〜９９０，０００の範囲内にあることが好ましく、８５５，０００〜９４５，０００の範囲内にあることがより好ましい。α−グルカン画分は、分子量分布曲線における分子量の分布範囲が、１６，０００〜（Ｖｏ容積に相当する分子量）であることが好ましく、１６，０００〜１，６６０，０００であることがより好ましい。
【００３９】
ヘテログリカン画分は更に、Ｇｌｃ換算での糖含有量が４５質量％〜５５質量％であることが好ましい。また、ＧａｌＡ換算でのウロン酸含有量が５質量％〜１０質量％であることが好ましい。ウシ免疫グロブリン換算でのタンパク質含有量が７．５質量％以下であることが好ましい。さらに、ヘテログリカン画分の全構成糖に占めるグルコースの割合は３０％〜４０％であることが好ましく、アラビノースの割合が２２．５％〜２７．５％であることが好ましい。
【００４０】
ヘテログリカン画分は、ピーク分子量が３８,４００〜５７，６００の範囲内、及び６６４，０００〜９９６，０００の範囲内の２ヶ所に存在する。分子量の小さい方のピーク分子量は、４３，２００〜５２，８００の範囲内にあることが好ましく、４５，６００〜５０，４００の範囲内にあることがより好ましい。分子量の大きい方のピーク分子量は７４７，０００〜９１３，０００の範囲内にあることが好ましく、７８８，５００〜８７１，５００の範囲内にあることがより好ましい。ヘテログリカン画分は分子量分布曲線において、少なくとも２つのピークを有する。ヘテログリカン画分の分子量分布曲線における分子量の分布範囲は、１０，０００〜（Ｖｏ容積に相当する分子量）であることが好ましく、１０，０００〜１，６６０，０００であることがより好ましい。
【００４１】
〔多糖の製造方法〕
＜エタノール沈殿画分＞
エタノール沈殿画分は、甘蔗抽出物又は甘蔗由来の糖蜜から選ばれる原料を、エタノール沈殿し、得られた沈殿から透析又は膜処理により低分子量の物質を除去することにより得ることができる。エタノール沈殿に用いる原料として、甘蔗抽出物又は甘蔗由来の糖蜜をそのまま用いてもよく、エタノール沈殿画分を効率的に得るために、甘蔗由来のエキスを用いることが好ましい。甘蔗由来のエキスは、甘蔗抽出物又は甘蔗由来の糖蜜より選ばれる原料を、担体として陽イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、溶離液として水を用い、陽イオン交換樹脂と原料に含まれる各成分との親和力の差により（溶出速度の差により）分離された多数の画分のうち蔗糖、ブドウ糖及び果糖等の低分子の糖類を除いた、波長４２０ｎｍの光を吸収する画分である。透析には、一般に脱塩に用いられる透析膜を用いることができる。また、膜処理には、脱塩及び単糖類除去などに用いられるＵＦ膜を用いることができる。
【００４２】
エタノール沈殿画分の収率は、例えばエキスを用いた場合、エキスに含まれる固形分を基準として通常約５質量％程度である。エタノール沈殿画分には、多糖に加え、ポリフェノール、塩類などの成分が含まれる。
【００４３】
＜エキス＞
以下、甘蔗由来のエキスの製造方法について説明する。
【００４４】
甘蔗汁、甘蔗の溶媒抽出液等の抽出物、又は甘蔗由来の糖蜜（以下、単に原料ということがある。）を、固定担体を充填したカラムに通液する。上記原料は、そのまま、又は水で任意の濃度に調整して、用いることができる。なお異物除去のために、カラムで処理する前に、原料をろ過することが望ましい。ろ過の手法は特に限定されず、食品工業で広く使用されているスクリーンろ過、ケイソウ土ろ過、精密ろ過、限外ろ過等の手段を好ましく使用できる。
【００４５】
固定担体としてイオン交換樹脂を用いる方法の好ましい態様は、以下の通りである。
【００４６】
イオン交換樹脂は、イオン交換の性質の観点から、陽イオン交換樹脂と陰イオン交換樹脂とに分類されるが、本発明では好ましくは陽イオン交換樹脂が使用できる。さらに好ましくは強酸性型、ナトリウムイオン型又はカリウムイオン型の陽イオン交換樹脂が使用できる。またイオン交換樹脂は、樹脂の形態の観点からは、ゲル型樹脂と、ポーラス型、マイクロポーラス型、ハイポーラス型などの多孔性樹脂とに分類されるが、本発明では好ましくはゲル型のイオン交換樹脂が使用できる。さらに好ましくは、強酸性型、ナトリウムイオン型又はカリウムイオン型であるゲル型の陽イオン交換樹脂が使用できる。そのようなイオン交換樹脂は市販されており、例えばダイヤイオン（商標）系としてＳＫ１Ｂ、ＳＫ１０４、ＳＫ１１０、ＳＫ１１２、ＳＫ１１６（いずれも商品名、三菱化学株式会社）、ＵＢＫ５３０、ＵＢＫ５５０（クロマト分離用、いずれも商品名、三菱化学株式会社）、アンバーライト（商標）系として、アンバーライトＩＲ１２０Ｂ、ＩＲ１２０ＢＮ、ＩＲ１２４、ＸＴ１００６、ＩＲ１１８、アンバーリスト３１、クロマトグラフ用アンバーライトＣＧ１２０、ＣＧ６０００（いずれも商品名、オルガノ株式会社）、ダウエックス（商標）系として、ＨＣＲ−Ｓ、ＨＣＲ−Ｗ２、ＨＧＲ−Ｗ２、モノスフィアー６５０Ｃ、マラソンＣ６００、５０Ｗ×２、５０Ｗ×４、５０Ｗ×８（いずれも商品名、ダウ・ケミカル日本株式会社）、ムロマック５０ＷＸ（商品名、室町化学工業株式会社）、ピュロライト（商標）系として、Ｃ−１００Ｅ、Ｃ−１００、Ｃ−１００×１０、Ｃ−１２０Ｅ、ＰＣＲ４３３、ＰＣＲ５６３Ｋ、ＰＣＲ８２２、ＰＣＲ８３３、ＰＣＲ８６６、ＰＣＲ８８３、ＰＣＲ８９２、ＰＣＲ９４５（いずれも商品名、エイエムピー・アイオネクス株式会社）等が挙げられる。中でも、ＵＢＫシリーズが特に好ましい。
【００４７】
固定担体の量は、カラムの大きさ、固定担体の種類などによって変化する。原料の固形分に対して、好ましくは２〜１０，０００倍、より好ましくは５〜５００倍湿潤体積量である。
【００４８】
原料を上記カラムに通し、次に溶離液として水を用いてクロマトグラフィー処理し、得た多数の画分のうち波長４２０ｎｍの光を吸収する画分を分取して目的とするエキスを得ることができる。この方法をイオンクロマト分離と言うことがある。イオンクロマト分離では、原料に含まれる各成分とイオン交換樹脂との親和力の差によるカラムの通過速度の違いにより、各成分を分離する。
【００４９】
通液条件は、原料の組成及び固定担体の種類などによって変化する。溶離液として脱気処理した水を用い、単塔式回分分離法の場合、流速はＳＶ＝０．３〜１．０ｈｒ−１、サンプルの供与量は樹脂の１〜２０％、温度は４０〜７０℃が好ましい。この分離法により得た画分の夫々について、波光４２０ｎｍでの吸収、電気伝導度（塩分の量の尺度）、蔗糖、ブドウ糖及び果糖の濃度を分析し、時系列的にグラフに表すと、波長４２０ｎｍでの光吸収のピーク、電気伝導度のピーク、蔗糖及び還元糖のピークの順にピークが現れる。
【００５０】
＜α−グルカン画分＞
次にα−グルカン画分の製造方法について説明する。
【００５１】
α−グルカン画分の精製（製造）には、上記エタノール沈殿画分を用いることが好ましい。以下、エタノール沈殿画分を用いる場合を例にとり、α−グルカン画分の精製方法を説明する。
【００５２】
まず、エタノール沈殿画分を、担体として陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、成分を吸着させる。陰イオン交換樹脂としては強イオン交換樹脂が好ましい。例えば、Ｑ（四級アンモニウム）基、又はＱＡＥ基を有する樹脂を用いることができる。このような担体を備えるカラムの具体例としては、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＦＦ）、ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ等を挙げることができる。これらの樹脂担体は、水で平衡化しておくことが好ましい。例えば、ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦの場合、２Ｍの炭酸水素アンモニウムに浸漬することによりＱＡＥ基を活性化させ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに共有結合させた４級アンモニウム基にカウンターイオンの炭酸水素イオンを結合させる、すなわちＨＣＯ３−型にする）、次いで水で洗浄することにより残存する炭酸水素アンモニウムを除去した後、水での懸濁状態（水で平衡化）にする。
【００５３】
次に、上記担体に吸着された成分を段階的にイオン強度が高くなるように溶出溶媒を通液し、溶出する。溶出溶媒としては、ＮＨ４ＨＣＯ３、ＨＣＯＯＮＨ４又はＮａＣｌなど、陰イオンの塩を溶解した水溶液を用いることが好ましい。
【００５４】
α−グルカン画分は、低イオン強度の溶出溶媒で溶出して得られる溶出画分（画分Ａ）から得ることができる。低イオン強度の溶出溶媒としては、例えば、陰イオンとしてＨＣＯ３−を用いた場合、当該陰イオン濃度が５０〜１５０ｍＭである溶出溶媒を用いることができ、好ましくは７５〜１２５ｍＭ、より好ましくは９０〜１１０ｍＭ、特に好ましくは１００ｍＭである。
【００５５】
得られた溶出画分（画分Ａ）は、透析膜（例えば、Ｖｉｓｋｉｎｇ  ｔｕｂｅ，ＭＷＣＯ１２，０００〜１４，０００）を用いて透析した後、透析内液を凍結乾燥してから次の工程に用いてもよい。
【００５６】
次に、上記溶出画分（画分Ａ）をゲルろ過カラムを用いて分子量により分画する。α−グルカン画分は、例えば、分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムを用いた場合、最初に流出する空隙容積に相当する量の画分（Ｖｏ画分）（画分Ａ１）から得ることができる。おおよその分画分子量が２×１０３〜４×１０５Ｄａ程度のゲルろ過カラムとしては、例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２等を用いることができる。α−グルカン画分は、ゲルろ過の際の溶出画分について、糖、ウロン酸及び２８０ｎｍでのＵＶ吸収に基づいて溶出パターンを作成し、上記Ｖｏ画分に相当する画分（画分Ａ１）を回収してもよい。得られた画分（画分Ａ１）は更に常法に従い透析した後、凍結乾燥してもよい。
【００５７】
＜ヘテログリカン画分＞
次にヘテログリカン画分の製造方法について説明する。
【００５８】
ヘテログリカン画分の精製（製造）には、上記エタノール沈殿画分を用いることが好ましい。以下、エタノール沈殿画分を用いる場合を例にとり、ヘテログリカン画分の精製方法を説明する。
【００５９】
まず、エタノール沈殿画分を、担体として陰イオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、成分を吸着させる。陰イオン交換樹脂としては強イオン交換樹脂が好ましい。例えば、Ｑ（四級アンモニウム）基又はＱＡＥ基を有する樹脂を用いることができる。このような担体を備えるカラムの具体例としては、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＦＦ）、ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ等を挙げることができる。これらの樹脂担体は、水で平衡化しておくことが好ましい。例えば、ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦの場合、２Ｍの炭酸水素アンモニウムに浸漬することによりＱＡＥ基を活性化させ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに共有結合させた４級アンモニウム基にカウンターイオンの炭酸水素イオンを結合させる、すなわちＨＣＯ３−型にする）、次いで水で洗浄することにより残存する炭酸水素アンモニウムを除去した後、水での懸濁状態に（水で平衡化）する。
【００６０】
次に、上記担体に吸着された成分を段階的にイオン強度が高くなるように溶出溶媒を通液し、溶出する。溶出溶媒としては、ＮＨ４ＨＣＯ３、ＨＣＯＯＮＨ４又はＮａＣｌなど、陰イオンの塩を溶解した溶液を用いることが好ましい。
【００６１】
ヘテログリカン画分は、高イオン強度の溶出溶媒で溶出して得られる溶出画分から得ることができる。高イオン強度の溶出溶媒としては、例えば、陰イオンとしてＨＣＯ３−を用いた場合、当該陰イオンの濃度が２００〜２０００ｍＭである溶出溶媒を用いることができる。ヘテログリカン画分は、２５０〜３５０ｍＭの溶出溶媒で溶出して得られる溶出画分（画分Ｂ）と、１６００〜２０００ｍＭの溶出溶媒で溶出して得られる溶出画分（画分Ｃ）と、に分けて精製した後、これらを組み合わせることが好ましい。
【００６２】
得られた溶出画分（画分Ｂ及び画分Ｃ）は、それぞれ透析膜（例えば、Ｖｉｓｋｉｎｇ  ｔｕｂｅ，ＭＷＣＯ１２，０００〜１４，０００）を用いて透析した後、透析内液を凍結乾燥してから次の工程に用いてもよい。
【００６３】
次に、上記溶出画分をゲルろ過カラムを用いて分子量により分画する。画分Ｂは、例えば、分画分子量１×１０４〜１×１０６Ｄａのゲルろ過カラムを用いた場合、最初に流出する空隙容積に相当する量の画分（Ｖｏ画分）以外の画分（画分Ｂ２）を回収する。画分Ｃは、例えば、分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムを用いた場合、最初に流出する空隙容積に相当する量の画分（Ｖｏ画分）（画分Ｃ１）を回収する。ゲルろ過の際の溶出画分について、糖、ウロン酸及び２８０ｎｍでのＵＶ吸収に基づいて溶出パターンを作成し、上記画分ＢのＶｏ画分以外の画分（画分Ｂ２）及び上記画分ＣのＶｏ画分に相当する画分（画分Ｃ１）を回収してもよい。
【００６４】
おおよその分画分子量１×１０４〜１×１０６Ｄａのゲルろ過カラムとしては、例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６等を用いることができる。また、おおよその分画分子量２×１０３〜４×１０５Ｄａのゲルろ過カラムとしては、例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２等を用いることができる。
【００６５】
画分Ｂ及び画分Ｃからゲルろ過することによりそれぞれ得られた画分（画分Ｂ２及び画分Ｃ１）を組み合わせることでヘテログリカン画分を得ることができる。得られたヘテログリカン画分は更に常法に従い透析した後、凍結乾燥してもよい。
【００６６】
〔パイエル板活性剤〕
本発明のパイエル板活性剤の形状は特に限定されないが、液状又は粉末状でもよく、又は通常用いられる製剤用担体を使用し固形製剤若しくは液体製剤としてもよい。これらの製剤化の方法は公知である。このようにして得られたパイエル板活性剤は、液状又は粉末状で保存することができる。保存は、特に液状の場合、冷蔵保存が好ましい。
【００６７】
本発明のパイエル板活性剤を固形製剤とする場合、例えば有効成分である上記多糖にデキストリン、コーンスターチ又は脱脂米糠を混和し調製してもよい。これらの製剤化の方法は公知である。
【００６８】
本発明のパイエル板活性剤の投与時期は、特に限定されない。本発明のパイエル板活性剤の投与量は、製剤形態、対象とするヒトや非ヒト動物の種類、健康状態、年齢や成長の度合いなどにより異なるため、特に限定されない。例えば、有効成分である上記多糖に換算して体重１ｋｇ当たり１日に１〜１，０００ｍｇを投与すればよい。
【００６９】
本発明のパイエル板活性剤の投与形態は特に限定されないが、例えば経口、経腸及び経鼻の方法で投与することができる。また、口腔内に貯留しやすい形状（チューインガムなども含む）にて投与することもできる。
【００７０】
本発明のパイエル板活性剤は、パイエル板活性作用を有することから、例えば、腸管免疫亢進剤、腸管免疫調節剤、腸管感染症改善剤、炎症改善剤、ウイルス感染症改善剤、細菌感染症改善剤等として使用することもできる。特に、腸管免疫亢進作用を通じて、例えば、マラリア原虫感染予防治療剤として使用することもできる。
【００７１】
〔マラリア原虫感染予防又は治療用医薬〕
本発明のパイエル板活性剤は、腸管免疫亢進作用を通じて、マラリア原虫感染予防又は治療が可能である。したがって、本発明は、上記パイエル板活性剤を有効成分として含む、マラリア原虫感染予防又は治療用医薬を提供できる。
【００７２】
上記マラリア原虫感染予防又は治療用医薬は、既存の抗マラリア薬と併用することで併用効果が得られる。したがって、既存の抗マラリア薬と併用されるように用いられてもよい。
【００７３】
抗マラリア薬としては、例えば、キニーネ（下記式（１）で表される化合物）、メフロキン（下記式（２）で表される化合物）、スルファドキシン（下記式（３）で表される化合物）、ピリメタミン（下記式（４）で表される化合物）、クロロキン（下記式（５）で表される化合物）、プリマキン（下記式（６）で表される化合物）、アルテスネート（下記式（７）で表される化合物）、アルテメーター（下記式（８）で表される化合物）及びルメファントリン（下記式（９）で表される化合物）が挙げられる。これらは、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００７４】
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【００７５】
抗マラリア薬としては、本発明のマラリア原虫感染予防又は治療用医薬との併用効果が高いことから、アルテスネートを含むことが好ましい。また、本発明のマラリア原虫感染予防又は治療用医薬は、アルテスネートと併用されるように用いられることがより好ましい。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００７７】
〔試験例１：甘蔗由来のエキスのエタノール沈殿画分によるパイエル板活性作用試験〕
＜甘蔗由来のエキスの製造＞
（イオン交換樹脂を用いた単塔式回分分離による２番蜜の分画）
原糖工場で得られた２番蜜処理液を原料として、ＦＰＬＣシステム（ファルマシア株式会社製）を用いた単塔式回分分離法によるイオン交換カラムクロマトグラフィーによる分画分離を行った。原料として使用した２番蜜処理液は、２番蜜を希釈後、炭酸ソーダによる清浄処理、ケイソウ土ろ過を行ったものである。この原料液の分析値は、ブリックス（Ｂｘ）４７．４、糖度（Ｐｏｌ．）２３．２、純糖率（Ｐｕｒｉｔｙ）４８．９、還元糖分３．２％であった。【００７８】
カラムにゲル型の強酸性陽イオン交換樹脂（商品名：ＵＢＫ５３０、ナトリウムイオン型、三菱化学株式会社）５００ｍｌを充填した。カラムは内径２６ｍｍ、高さ１０００ｍｍで、フローアダプター付きであった。通液条件は、溶出液として脱気した蒸留水を用い、流速ＳＶ＝０．５ｈｒ−１（４．１７ｍｌ／分）、温度６０℃にて行った。【００７９】
約２５ｍｌの原料を上記イオン交換カラムに供与した。分画条件は、原料供与３０分後から溶出液の回収を開始し、試験管１本当たり３．６分間回収し（約１５ｍｌ／本）、全部で３０本回収した。【００８０】
得られた３０画分（画分１〜３０）について、波長４２０ｎｍの吸光度、電気伝導度、及び糖（Ｓｕｃｒｏｓｅ、Ｇｌｃ、Ｆｒｕ）含量（各画分の固形分質量の合計を基準とした質量％）を測定し、図６に示した。ここで、吸光度測定は、０．５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）２ｍｌに各画分０．１ｍｌを加えたものを測定試料とした。電気伝導度測定は、各画分を蒸留水で０．５％に希釈したものを測定試料とした。糖含量はＨＰＬＣを用いた常法により測定した。【００８１】
得られた３０画分を以下のようにまとめてサンプル１〜８を得た。
サンプル１：画分３及び４。
サンプル２：画分５及び６。
サンプル３：画分７及び８。
サンプル４：画分９及び１０。
サンプル５：画分１１及び１２。
サンプル６：画分１３及び１４。
サンプル７：画分１５及び１６。
サンプル８：画分１７〜３０。
なお、画分１及び２は溶出される成分がほとんどなかったため、廃棄した。【００８２】
各サンプルを１晩凍結乾燥して、粉末とした。得られた凍結乾燥粉末０．２５ｇを０．５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解して、１００ｍｌとし、波長４２０ｎｍでの吸光度を測定し、下記表１に示した。サンプル８の吸光度は０．８６と比較的高かったが、これはテーリングした成分を集めたものだからである。他のサンプルは２画分ずつを一緒にしたものであるのに対し、サンプル８は１４画分を合わせたものである。したがって、４２０ｎｍの吸光度は高いが、この画分を回収するのは効率が悪い。【００８３】
各サンプルの分析結果を以下の表１に示した。表１中の電導度灰分は、電気伝導度と既知の硫酸灰分の関係の検量線から係数を求め、算出したものである。表１中、凍結乾燥固形分の分配比率は、全サンプルの固形分質量の合計に対する各サンプルの固形分質量の比（％）である。電導度灰分及び各糖（Ｓｕｃｒｏｓｅ、Ｇｌｃ、Ｆｒｕ）の含量は、各サンプルの固形分質量に対する比（質量％）である。各糖（Ｓｕｃｒｏｓｅ、Ｇｌｃ、Ｆｒｕ）の含量から、サンプル１〜３が非糖分画分に相当し、サンプル４〜８が糖分画分に相当することが判る。ここでいう糖分とは、単糖及び蔗糖を指す。【００８４】
【表１】
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【００８５】
（イオン交換樹脂を用いた擬似移動床式カラムクロマトグラフィーによる分離）
原糖工場において、結晶缶にて２回蔗糖結晶を回収し、遠心分離により結晶を除いた振蜜である２番蜜を原料として、陽イオン交換樹脂を充填した分離塔を用いた擬似移動床式連続分離法により、イオン交換カラムクロマト分離を行った。【００８６】
原料の調製からイオン交換クロマト分離までの工程は連続的に行われるため、各工程の液の固形分濃度や組成は時間と共に若干変動するが、以下の濃度や組成は定常運転における測定値である。【００８７】
２番蜜はブリックス（Ｂｘ．）が約８５であった。この濃度はカラムクロマト処理を行うには高いため、ブリックス約５０に希釈した。これに、消石灰、炭酸ソーダを添加し不純物を凝集させ、ケイソウ土ろ過を行った。得られたろ液は、ブリックス４７．３、糖度（Ｐｏｌ．）２３．６、純糖率（Ｐｕｒｉｔｙ）４９．９、還元糖分２．５％であった。濾液をイオン交換クロマトグラフィーの原料として用いた。【００８８】
陽イオン交換樹脂としてＵＢＫ５３０（三菱化学株式会社）を用いた擬似移動床式連続分離法によるイオン交換クロマトグラフィーを行った。樹脂を充填した分離塔は８分割されており、１塔当たりの樹脂量は６．５ｍ３である。原料液と溶離液（水）の供給、及び蔗糖画分と非蔗糖画分の抜き出し位置を一定時間毎に切り替えることにより、連続的に供給、抜き出しを行った。定常時の既定値は、供給流量３ｍ３／時間、溶離水流量１３．５ｍ３／時間、非蔗糖画分抜き出し流量１２．１３ｍ３／時間、蔗糖画分抜き出し流量４．３７ｍ３／時間、切り替え時間２６７秒であった。このクロマトグラフィー処理により、蔗糖画分と非蔗糖画分が分離された。これらはそれぞれ、図６における画分１０〜１７（蔗糖画分）、及び画分１〜９と画分１８〜３０（非蔗糖画分）とを合わせたものに相当する。蔗糖画分は蔗糖が固形分当たり約８７％（ＨＰＬＣ分析による）でブリックスは約３５であり、この画分は清浄汁と混合して本工程に戻され、再び蔗糖を回収する操作を行った。また、得られた非蔗糖画分は、蔗糖分が約０．３％（ＨＰＬＣ分析による）でブリックスが約８であった。この非蔗糖画分を濃縮缶により濃縮し、ブリックス４０．０、糖度（Ｐｏｌ．）２．３、純糖率（Ｐｕｒｉｔｙ）５．８、還元糖分５．４％とした。この非蔗糖画分を甘蔗由来のエキスとした。甘蔗由来のエキスは、後の試験に用いるため一晩、凍結乾燥処理に付した。得られた凍結乾燥粉末０．２５ｇを０．５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で１００ｍｌ溶液にし、波長４２０ｎｍでの吸光度を測定した。吸光度は、１．１１であった。【００８９】
＜エタノール沈殿画分の調製＞
甘蔗由来のエキス（凍結乾燥重量；４１８．５７９７４ｇ）に精製水を加えて総量５００ｍＬとし、４倍量のエタノールを撹拌しながら加え、室温にて一晩撹拌した。遠心分離（６，０００ｒｐｍ，４℃，３０分間）し、得られた沈殿を流水及び精製水にて透析し（７日間）、非透析性画分を凍結乾燥することによりエタノール沈殿画分（「ＳＣＥ−４」ともいう。）（収量：２０．１１ｇ，収率：４．８％）を得た。【００９０】
＜糖鎖分解ＳＣＥ−４の調製＞
エタノール沈殿画分（ＳＣＥ−４）（５０．４５ｍｇ）を５０ｍＭアセテートバッファー（ｐＨ４．５，３０ｍＬ）に溶解後、１００ｍＭ  ＮａＩＯ４を含む５０ｍＭアセテートバッファー（１０ｍＬ）を加え４℃、暗所で９６時間撹拌し過ヨウ素酸酸化を行った。反応溶液にエチレングリコール（１ｍＬ）を加えて室温で１時間撹拌し、過剰のＮａＩＯ４を分解させた。次いで、反応混合物について精製水を用いて２日間透析し、透析内液を減圧濃縮した。さらに、ＮａＢＨ４（１８０ｍｇ）を加えて室温で１２時間撹拌し、酢酸を滴下することで中和した。さらに精製水を用いて本反応液を３日間透析後、透析内液を凍結乾燥することにより過ヨウ素酸酸化物（糖鎖分解ＳＣＥ−４）を得た（収量：３１．９９ｍｇ、収率：６２．７６％）。【００９１】
＜脱リグニン化ＳＣＥ−４の調製＞
エタノール沈殿画分（ＳＣＥ−４）（５０．５９ｍｇ）を４％酢酸水溶液（５０ｍＬ）に溶解後、ＮａＣｌＯ２（２５０ｍｇ）を加えて、７０℃の水浴中で４０分間撹拌した。反応液を氷冷下３Ｍ  ＮａＯＨを用いて中和した。反応液を一晩流水にて透析後、精製水を用いて４日間透析し、透析内液を凍結乾燥することにより脱リグニン多糖画分（脱リグニン化ＳＣＥ−４）を得た（収量：２２．３９ｍｇ、収率：４４．１４％）。【００９２】
＜マウスパイエル板細胞の調製及び培養＞
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスをイソフルラン（エスカイン吸入麻酔薬、マイラン製薬）を用いて安楽死後、眼科用ハサミを用いて小腸よりパイエル板を切り出した。このパイエル板を氷冷した５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（２ｍＬ）を加えた滅菌シャーレにとり、ステンレスメッシュ（２００ｍｅｓｈ）上で５ｍＬのディスポーサブル注射器の内筒のゴムラバー部を用いて圧砕することでパイエル板細胞を遊離させた。本細胞懸濁液を５０ｍＬファルコンチューブに移し、ボルテックスミキサーで短時間撹拌した。本細胞懸濁液をステンレスメッシュ（１５０ｍｅｓｈ）によりろ過後、遠心分離（１，５００ｒｐｍ、４℃、７分間）し、培地をデカンテーションすることによりパイエル板細胞を得た。本細胞についてＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（１０ｍＬ）を用いて計４回同様の操作を繰り返すことにより細胞を洗浄後、ステンレスメッシュ（２００ｍｅｓｈ）によりろ過した。この細胞懸濁液（２０μＬ）を用いてセルカウンターで細胞数を計数後、ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて１〜２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのパイエル板細胞懸濁液を調製した。【００９３】
９６穴培養プレート（３０７２，ＦＡＬＣＯＮ）にパイエル板細胞懸濁液（１８０μＬ／ｗｅｌｌ）及び多糖試料溶液（２０μＬ／ｗｅｌｌ，多糖終濃度：１００μｇ／ｍＬ，５０μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬ）を添加し、５％ＣＯ２−９５％空気下、３７℃で２〜６日間培養した。培養上清を別の９６穴培養プレートに移し、−２０℃にて使用まで保存した。多糖溶液の代わりに注射用水（２０μＬ／ｗｅｌｌ）を加えて培養して得た培養上清を対照として用いた。【００９４】
＜マウス骨髄細胞の調製＞
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（７週齢、雌）はイソフルランを用いて安楽死後、大腿骨を摘出し、２３Ｇ注射針を装着した５ｍＬ注射器を用いてＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（５ｍＬ）により骨髄細胞を大腿骨から押しだすことにより採取した。本骨髄細胞をボルテックスミキサーにより分散後、ステンレスメッシュ（２００ｍｅｓｈ）でろ過、次いで遠心分離（１，２００ｒｐｍ、４℃、７分間）を行うことにより骨髄細胞を回収した。同様の操作を３回繰り返し細胞を洗浄後、骨髄細胞をＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（１０ｍＬ）に懸濁し、セルカウンターで細胞数を計数後、ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて骨髄細胞懸濁液（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を調製した。【００９５】
＜パイエル板活性作用試験＞
９６穴培養プレートにパイエル板細胞培養上清（５０μＬ／ｗｅｌｌ）、骨髄細胞懸濁液（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ，１００μＬ／ｗｅｌｌ）及びＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加えて、５％ＣＯ２−９５％空気下、３７℃にて６日間培養した。培養した骨髄細胞培養懸濁液にＡｌａｍｅｒ  Ｂｌｕｅ（２０μＬ／ｗｅｌｌ，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を添加し、５％ＣＯ２−９５％空気下、３７℃で６〜２４時間培養後、生じた蛍光物質量を蛍光プレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００，Ｔｅｃａｎ，励起波長；５４４ｎｍ，測定波長；５９０ｎｍ）にて測定し、得られた相対蛍光強度としての増殖骨髄細胞数を骨髄細胞増殖促進因子量とした。【００９６】
＜統計学的検定＞
実施例における全ての結果は平均値±Ｓ．Ｄ．で示した。対照及び被験試料間の統計学的有意差は、ＡＮＯＶＡの検定後、ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤにより検定した。【００９７】
＜結果＞
図１に、パイエル板活性作用試験結果を示す。骨髄細胞増殖促進因子量をパイエル板活性作用として示した。エタノール沈殿画分（ＳＣＥ−４）には、パイエル板活性作用が認められた。一方、ＳＣＥ−４の糖鎖を分解したもの（糖鎖分解ＳＣＥ−４）では対照と有意差がないレベルにまで活性が激減した。また、ＳＣＥ−４を脱リグニン化したもの（脱リグニン化ＳＣＥ−４）では活性が認められた。この結果、甘蔗由来エキス中のエタノール沈殿画分（ＳＣＥ−４）の多糖含有成分にパイエル板活性作用を示す物質が含まれることが示唆された。【００９８】
〔製造例１：α−グルカン画分及びヘテログリカン画分の調製〕
＜エタノール沈殿画分の調製＞
試験例１と同様にして甘蔗由来のエキスを得た。甘蔗由来のエキス（凍結乾燥重量；４１８．５７９７４ｇ）に精製水を加えて総量５００ｍＬとし、４倍量のエタノールを撹拌しながら加え、室温にて一晩撹拌した。遠心分離（６，０００ｒｐｍ，４℃，３０分間）し、得られた沈殿を流水及び精製水にて透析し（７日間）、非透析性画分を凍結乾燥することにより、茶褐色のエタノール沈殿画分（ＳＣＥ−４）（収量：２０．１１ｇ，収率：４．８％）を得た。【００９９】
＜α−グルカン画分及びヘテログリカン画分の調製＞
エタノール沈殿画分（ＳＣＥ−４）から図２に示すスキームに従ってα−グルカン画分（図２中「画分Ａ１」）及びヘテログリカン画分（図２中「画分Ｘ」）を調製した。【０１００】
ＳＣＥ−４（５．０ｇ）をＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（５．５ｉ．ｄ．×２６ｃｍ）に添加し通液した後、吸着した成分を順次１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（６Ｌ），３００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１０Ｌ）及び１．８Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１０Ｌ）を用いて段階的に溶出させた。分画画分を透析膜（Ｖｉｓｋｉｎｇ  ｔｕｂｅ，ＭＷＣＯ１２，０００〜１４，０００）を用いて透析後、透析内液を凍結乾燥し、分画画分（画分Ａ、画分Ｂ及び画分Ｃ）を得た。【０１０１】
画分Ａ（１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３溶出画分）：０．８６ｇ，１７．２％。
画分Ｂ（３００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３溶出画分）：０．６６ｇ，１３．２％。
画分Ｃ（１．８Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３溶出画分）：１．０４ｇ，２０．８％。【０１０２】
（α−グルカン画分）
画分Ａを０．２Ｍ  ＮａＣｌ溶液で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００（２．６ｉ．ｄ．×９０ｃｍ）に添加した後、０．２Ｍ  ＮａＣｌを用いて溶出させた。溶出画分について、常法により測定した相対糖含量、相対ウロン酸含量、２８０ｎｍのＵＶ吸収に基づき作成した溶出パターンに従い、分画画分を回収した。Ｖｏ溶出画分をα−グルカン画分（図２中「画分Ａ１」）として、白色の凍結乾燥粉末を得た（収量：０．２１６６ｇ，収率：４．３％）。【０１０３】
（ヘテログリカン画分）
画分Ｂを０．２Ｍ  ＮａＣｌ溶液で平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（２．６ｉ．ｄ．×９０ｃｍ）により分画し、ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ画分（図２中「画分Ｂ２」）（収量：０．０２１４１ｇ，収率：０．４１％）を得た。
一方、画分Ｃを０．２Ｍ  ＮａＣｌで平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００（２．６ｉ．ｄ．×９０ｃｍ）にて分画し、Ｖｏ溶出画分（図２中「画分Ｃ１」）（収量：０．１６３９５ｇ，収率：３．２８％）を得た。
画分Ｂ２及び画分Ｃ１を合わせてヘテログリカン画分として、白色の凍結乾燥粉末を得た（図２中「画分Ｘ」）（収量：０．１８４２ｇ，収率：３．６８％）。【０１０４】
〔試験例２：α−グルカン画分及びヘテログリカン画分の分析〕
＜分子量分布の測定＞
被験試料（α−グルカン画分及びヘテログリカン画分）の分子量分布を、Ａｓａｈｉｐａｋ  ＧＳ７１０及びＡｓａｈｉ−ｐａｋ  ＧＳ６２０（各０．７６ｉ．ｄ．×６０ｃｍ）（昭和電工）の連結カラムを用いた高速ゲルろ過クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）により分析した。分子量は、標準多糖（ｐｕｌｌｕｌａｎ  Ｐ−８００，４００，２００，１００，５０，２０，１０及び５，昭和電工）のＨＰＳＥＣでの保持時間より分子量対保持時間係数（Ｋａｖ）の検量線を作成し、被験試料の保持時間から算出した。
ＨＰＳＥＣの条件は以下の通りである。
送液装置；ＪＡＳＣＯ  ＰＶ−９８０（日本分光）
検出器；Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ  ＳＥ−６２（昭和電工）（感度：×２）
溶出液；０．２Ｍ  ＮａＣｌ（１．０ｍＬ／ｍｉｎ）【０１０５】
＜比色定量＞
全糖量はフェノール−Ｈ２ＳＯ４法、ウロン酸量はｍ−ヒドロキシビフェニル法、タンパク質量はブラッドフォード法を用いて測定した。標品としては、フェノール−Ｈ２ＳＯ４法にはＧｌｃを、ｍ−ヒドロキシビフェニル法にはＧａｌＡを、ブラッドフォード法はウシガンマグロブリン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。【０１０６】
＜構成糖分析＞
構成糖分析は、ＴＭＳメチルグリコシド法により行った。
単糖の標準品混合物（Ｇｌｃ，Ｇａｌ，ＧｌｃＡ，ＧａｌＡ，Ａｒａ，Ｆｕｃ，Ｘｙｌ，Ｍａｎ，Ｒｈａ、各５μｇ）及び被験試料（各５０〜１００μｇ）を１３ｍｍネジ口試験管に分取し、さらにｍｙｏ−イノシトール溶液（内部標準：２０μＬ，１ｍｇ／ｍＬ）を加えた後、溶媒を完全に減圧留去した。各試験管に１Ｍ  ＨＣｌ−ＭｅＯＨ溶液（１００〜３００μＬ，和光純薬）を加え、密封下メタノリシス（８０℃、１５時間）を行った。反応溶液にｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ（５μＬ）を加え窒素気流下（４０℃）で溶媒を留去した後、Ｔｒｉ−Ｓｉｌ試薬（１００μＬ，Ｐｉｅｒｃｅ）を加えて密封下反応（８０℃、２０分間）させた。試薬を窒素気流下（４０℃）で留去した後、反応生成物にヘキサン（２ｍＬ）を加え数秒間超音波処理することによりＴＭＳ誘導体を抽出した。抽出物中の不溶物を遠心分離（２，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により除去後、溶媒を窒素気流下（４０℃）で留去し、得られたＴＭＳ誘導体のヘキサン溶液をガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）により分析した。各単糖誘導体の同定は標準品の誘導体の保持時間との比較から行い、含有率比（ｍｏｌ．％）はピーク面積と各実験毎に得られる各単糖誘導体のＦＩＤ検出器に対する応答係数から算出した。
ＧＬＣの条件は以下の通りである。
機器；ＨＰ５８９０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）
カラム；ＤＢ−１  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｃｏｌｕｍｎ（０．２５ｍｍ  ｉ．ｄ．×３０ｍ、液膜厚０．２５μｍ、Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）
キャリアガス；Ｈｅ（総流量；８０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム入口圧；２１ｐｓｉ、ガス純度；９９．９９９９％）
注入口温度；２５０℃
検出器温度；２８０℃
オーブン温度プログラム；６０℃（１分間），６０℃→１７０℃（３０℃／ｍｉｎ），１７０℃→１９０℃（１℃／ｍｉｎ），１９０℃→３００℃（３０℃／ｍｉｎ）、３００℃（５分間）【０１０７】
＜メチル化分析＞
糖結合様式解析のためのメチル化分析は以下に示すように箱守法とＷａｅｇｈｅ等の方法を改変した方法に従って行った。【０１０８】
（メチルスルフィニルカルバニオンナトリウムを用いる多糖のメチル化）
被験試料（５００μｇ）をネジ口試験管（１５ｉ．ｄ．×１００ｍｍ）にとり、一晩デシケーター中で減圧乾燥させた後、無水ジメチルスルホキシド（ｄｒｙ  ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ）を加え、窒素気流下密封条件で１５分間超音波処理し、試料が完全に溶解するまで（数時間〜一昼夜）５０〜６０℃で加温した。試料溶液にメチルスルフィニルカルバニオンナトリウム（５００μＬ）を加え、窒素気流下１時間超音波処理を行った後、３時間室温で反応させた。反応後、少量の反応液（５〜１０μＬ）を用い、トリフェニルメタン試薬（和光純薬）により、過剰のメチルスルフィニルカルバニオンナトリウムの残存を確認した。メチルスルフィニルカルバニオンナトリウムが不十分の場合、さらにメチルスルフィニルカルバニオンナトリウムを追加し、上記操作をメチルスルフィニルカルバニオンナトリウムの過剰量が残存するまで繰り返した。反応混合液を凍結後に、ＣＨ３Ｉ（ヨードメタン、柳島製薬株式会社、特級、１ｍＬ）を加え、窒素気流下で密封条件にて１５分間超音波処理を行い、室温で４時間以上反応させた。反応終了後、反応液中のＣＨ３Ｉを減圧留去し、氷冷下凍結させ、使用したＤＭＳＯ及びメチルスルフィニルカルバニオンの総量と等量の精製水を加え、残存するメチルスルフィニルカルバニオンを分解し、反応を停止させた。さらに、反応液にその黄色が消えるまで飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（約２５０μＬ〜）を加えた。【０１０９】
（完全メチル化多糖の回収）
Ｓｅｐ−ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（１ｍＬ，Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅ  Ｉｎｃ．）を蒸留エタノール（１０ｍＬ×４）、次いで水（２ｍＬ×３）を用いて洗浄後、上記メチル化反応混合液を本カートリッジへ通過させ、メチル化多糖をカートリッジに吸着させた。カートリッジを５０％ＤＭＳＯ（２ｍＬ×５）、次いで水（２ｍＬ×５）により洗浄後、蒸留エタノール（２ｍＬ×３）を用いてメチル化多糖を溶出後、減圧乾固することにより完全メチル化多糖を得た。【０１１０】
（メチル化多糖中のウロン酸のカルボキシル基の還元）
完全メチル化多糖中のウロン酸残基のカルボキシル基は以下に示した方法により、重水素化一級アルコールに還元した。すなわち、完全メチル化多糖試料を９５％エタノール（０．２１ｍＬ）及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ，０．５１ｍＬ）で溶解後、重水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＤ４，１．８ｍｇ）を加えて混和した後１８時間以上室温で反応させ、さらに７０°Ｃで１時間加温させることによりカルボキシメチル基を還元した。反応液を酢酸を用いて中和し、さらに７〜８滴の酢酸を加えて反応を停止させた。反応溶液を減圧乾固後、生成したホウ酸を除去するため、反応生成物に蒸留メタノール（１ｍＬ）を加えて減圧乾固する操作を少なくとも４回繰り返した。本反応混合物の５０％ＤＭＳＯ溶液について、（完全メチル化多糖の回収）欄に記載した方法と同様にしてカルボキシル還元完全メチル化多糖を回収した。【０１１１】
（完全メチル化多糖から部分メチル化アルジトールアセテート体への誘導体化と分析）
得られたカルボキシル還元完全メチル化多糖をネジ口試験管（１５ｉ．ｄ．×１００ｍｍ）中、２Ｍ  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ，１ｍＬ）を用いて密封下１２１℃で１時間加熱することにより加水分解を行った。反応終了後、室温に冷却した反応溶液を減圧乾固し、さらにデシケーターで３０分間減圧乾燥することにより残存するＴＦＡを除去した。得られた加水分解物を９５％エタノール（蒸留、１ｍＬ）に溶解させ、２５％アンモニア水を７〜８滴添加しアンモニアアルカリ性にした後、過剰の水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を加え室温で４時間以上反応させた。反応液に酢酸溶液を滴加し、残存するＮａＢＨ４を分解した後、さらに７〜８滴加え、溶媒を減圧乾固により留去した。反応生成物にメタノール（１ｍＬ）を加え、減圧乾固する操作を４回繰り返すことにより生成したホウ酸を除去した。反応生成物をデシケーター中１時間減圧下乾燥後、無水酢酸を加え、密封下１２１℃、３時間加熱反応させることによりアセチル化を行った。反応溶液を室温になるまで放置した後、トルエン（１ｍＬ）を加えて混和し、４０℃で空気気流下、無水酢酸を除去した。反応生成物に水（１ｍＬ）及びＣＨＣｌ３（２ｍＬ）を加え液−液分配し、遠心分離（４℃、２，５００ｒｐｍ、５分）した後、上層の水層を吸引除去した。さらにＣＨＣｌ３層は水（１ｍＬ）を用いて４〜５回程洗浄後、ＣＨＣｌ３を減圧留去し、部分メチル化アルジトールアセテート誘導体を得た。本誘導体は以下に示す条件によりガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）及びガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＬＣ−ＭＳ）を用いて分析した。メチル化アルジトールアセテートの同定は標品のフラグメントイオンとの比較及び２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−ＯＭｅ−１，５−ｄｉ−ＯＡｃ−ｇａｌａｃｔｉｔｏｌに対する相対保持時間との比較により行った。メチル化糖の構成モル比（ｍｏｌ．％）はピーク面積とＦＩＤに対する応答係数により求めた。【０１１２】
ＧＬＣ：
装置；ＨＰ５８９０  ＳｅｒｉｅｓＩＩ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｇｈ（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）
キャピラリカラム；ＳＰ−２３８０  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｃｏｌｕｍｎ（０．２５ｍｍｉ．ｄ．×３０ｍ，液膜厚０．２５μｍ，ＳＰＥＬＣＯ／ＡＬＤＲＩＣＨ）
キャリアガス；Ｈｅ（総流量；８０ｍＬ／ｍｉｎ，カラム入口圧；１０ｐｓｉ，ガス純度；９９．９９９９％）
注入口温度；２５０℃
検出器；２５０℃
オーブン温度；６０℃（１ｍｉｎ），６０℃→１５０℃（３０℃／ｍｉｎ），１５０℃→２５０℃（１．５℃／ｍｉｎ），２５０℃（１ｍｉｎ）【０１１３】
ＭＳ：
Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ；ＨＰ５９７０Ｂ  Ｍａｓｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（７０ｅＶ，２８０℃）【０１１４】
＜結果＞
α−グルカン画分及びヘテログリカン画分の分析結果を表２及び表３に示す。また、α−グルカン画分及びヘテログリカン画分の分子量分布の測定結果を図７及び図８に示す。
【表２】
2014054421.tif 000013
【表３】
2014054421.tif 000014
【０１１５】
表２及び図７に示すように、α−グルカン画分は、ピーク分子量が９０万であり、分子量が１６，０００〜Ｖｏ容積に相当する分子量（約１，６６０，０００）の範囲に分布していた。α−グルカン画分は、構成糖に占めるグルコースの割合は約８４％であった。表２及び図８に示すように、ヘテログリカン画分は、ピーク分子量が２つあり、それぞれ４．８万、及び８３万であった。分子量は、１０，０００〜Ｖｏ容積に相当する分子量（約１，６６０，０００）の範囲に分布していた。ヘテログリカン画分は、構成糖に占めるグルコースの割合は約３２％、アラビノースは約２５％であった。α−グルカン画分及びヘテログリカン画分のいずれも糖を主成分として含有する多糖画分であった。【０１１６】
表３に示すように、α−グルカン画分は、非還元末端のグルコースを約２５％、α−６結合グルコース（６結合）を約２０％と多く含むという特徴があった。ヘテログリカン画分は、非還元末端のアラビノースを約２２％含むという特徴があった。【０１１７】
〔実施例１：パイエル板活性作用試験〕
試験例２で調製したα−グルカン画分（画分Ａ１）及びヘテログリカン画分（画分Ｘ）、並びに試験例１で調製した脱リグニン化ＳＣＥ−４及びエタノール沈殿画分（ＳＣＥ−４）を用い、試験例１と同様にパイエル板活性作用試験を行った。【０１１８】
図３に、パイエル板活性作用試験結果を示す。骨髄細胞増殖促進因子量をパイエル板活性作用として示した。α−グルカン画分（画分Ａ１）及びヘテログリカン画分（画分Ｘ）はいずれの添加量（２５μｇ／ｍＬ，５０μｇ／ｍＬ，１００μｇ／ｍＬ）においても脱リグニン化ＳＣＥ−４よりも有意にパイエル板活性作用が高く、エタノール沈殿画分（ＳＣＥ−４）に匹敵するパイエル板活性作用を示した。【０１１９】
原料である甘蔗由来のエキスは、塩類を多く含み、エタノール沈殿画分（ＳＣＥ−４）の収率は約５％である。また、エタノール沈殿画分（ＳＣＥ−４）は各種多糖が混合している画分であり、リグニン成分も含まれている。そのため、茶褐色であり、粉末化しにくいため、加工特性が悪く、渋味を有する。一方、本実施例により得られたα−グルカン画分及びヘテログリカン画分は白色の無味の粉末であるため、加工しやすい。【０１２０】
〔実施例２：パイエル板活性作用へのα−Ｄ−（１→６）−グルカン構造の関与〕
＜α−グルカン画分及びヘテログリカン画分の酵素消化＞
α−グルカン画分（１．５ｍｇ）又はヘテログリカン画分（１．５ｍｇ）の２５ｍＭ  アセテートバッファー（ｐＨ４．５，１ｍｇ／ｍＬ）溶液にｅｘｏ−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ（２０μＬ），ｅｘｏ−β−Ｄ−（１→３）−ｇａｌａｃｔａｎａｓｅ（２０μＬ）及びｅｎｄｏ−β−Ｄ−（１→４）−ｇａｌａｃｔａｎａｓｅ（５μＬ）を加え、３７℃，２日間の条件で酵素反応を行った。得られた消化物は、沸騰水浴中３０秒間加熱処理し、酵素を失活させた。この酵素反応液（図４中、「１，３／１，４−ガラクタナーゼ」と表示）の半量についてはさらにｄｅｘｔｒａｎａｓｅ（０．２５ｕｎｉｔ）を加えて２日間３７°Ｃにてインキュベーション後、上記と同様の条件で酵素を失活させ、酵素反応液を得た（図４中、「デキストラナーゼ」と表示）。これらの反応液は使用まで−２０℃にて保存した。【０１２１】
＜ＩＬ−６産生量の測定＞
マウスパイエル板細胞の調製及び培養は試験例１と同様に行った。【０１２２】
（酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ））
ＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）に５０ｍＭ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ−ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍＬに希釈した抗マウスＩＬ−６一次抗体（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を分注し、４℃で一昼夜インキュベーションした。本プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳＴ）（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄後、１％スキムミルク（ＳＭ）含有ＰＢＳＴ（ＳＭ−ＰＢＳＴ）（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を用いて３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴ（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で４回洗浄後、１％ＳＭ−ＰＢＳＴ（５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加えて１０分間室温にてプレインキュベーションし、次いで、パイエル板培養上清（５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加え、４℃で１晩インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴ（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄し、１％ＳＭ−ＰＢＳＴ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を用いて１０分間室温にてプレインキュベーションした。さらにプレートに１％ＳＭ−ＰＢＳＴで希釈したｂｉｏｔｉｎ標識抗ＩＬ−６二次抗体（１：１０００，５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加え３７℃で１時間インキュベーション後、ＰＢＳＴ（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄した。プレートを１％ＳＭ−ＰＢＳＴ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を用いて１０分間室温にてプレインキュベーション後、１％ＳＭ−ＰＢＳＴで希釈したａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ標識ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（１：１０００，１００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴ（３００μＬ／ｗｅｌｌ）で５回洗浄後、ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ［ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅの１０％ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．８）溶液（１ｍｇ／ｍＬ，１５０μＬ／ｗｅｌｌ）を加え、室温でインキュベーションした。発色した黄色をマイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＪＸ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）を用いて測定した（測定波長；４０５ｎｍ、ブランク波長；４９２ｎｍ）。【０１２３】
＜結果＞
パイエル板活性作用としての骨髄細胞増殖促進因子の一つとして、ＩＬ−６が関係することが明らかとなっている。図４に、ＩＬ−６産生誘導試験結果を示す。脱リグニン化ＳＣＥ−４では、対照と比較して有意にＩＬ−６産生量が増加していた（図４中、「脱リグニン化ＳＣＥ−４」）。α−グルカン画分（図４中、画分Ａ１）及びヘテログリカン画分（図４中、画分Ｘ）にもＩＬ−６産生亢進能が認められた（図４中、α−グルカン画分及びヘテログリカン画分の「未処理」）。また、１，３／１，４ガラクタナーゼ処理によっても、α−グルカン画分及びヘテログリカン画分のＩＬ−６産生亢進活性は低下しなかった。これは、活性発現に必要な構造がこれらのガラクタンではないことを示している。一方、ガラクタナーゼ処理をした後デキストラナーゼ処理を行なったところ、α−グルカン画分において、対照と同程度まで活性が低下した。また、ヘテログリカン画分においても５０μｇ／ｍｌの濃度で活性が低下した。デキストラナーゼは、α−１，６−結合の三糖以上のグルカン構造を認識して切断する活性を有する。したがって、このような糖鎖構造を持つ多糖が、α−グルカン画分及びヘテログリカン画分に含まれており、ＩＬ−６産生亢進活性に寄与していることが示唆された。なお、デキストランを単独で添加して試験した場合、ＩＬ−６産生量に変化は認められなかった（データは示さず）。【０１２４】
〔実施例３：ネズミマラリア原虫（クロロキン感受性株）感染モデルでの多糖画分の経口投与試験〕
製造例１で調製したα−グルカン画分及びヘテログリカン画分、並びにエタノール沈殿画分（ＳＣＥ−４）を多糖画分として用い、ネズミマラリア原虫感染モデルでの多糖画分の経口投与試験を行った。【０１２５】
＜Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ  Ｎ（クロロキン感受性株）感染モデル＞
ネズミマラリア原虫による感染実験は北里大学・北里生命科学研究所・熱帯病評価センター・実験動物センター分室にて行った。動物実験は、当該法律ならびに関係省庁からの通達などに従って規定された（学）北里研究所が定める実験動物取り扱い安全衛生管理規定に準じて行った。【０１２６】
ＩＣＲマウス（２０ｇ前半）は日本チャールズ・リバー社（株）より購入し、室温２３±２℃、湿度５５±１０％、照明時間９時間／日の一定条件下で１週間の予備飼育の後、実験に供した。【０１２７】
ネズミマラリア原虫の維持は凍結ネズミマラリア原虫Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ  Ｎ（クロロキン感受性株）をＩＣＲマウスへ腹腔内投与（２００μＬ／マウス）により感染させ、感染数日後に心臓採血、別マウス（４〜５匹）への尾静脈投与（２００μＬ／マウス）による感染を繰り返すことで行った。【０１２８】
原虫感染赤血球の調製は以下のように行った。すなわち、感染効率の良いマウスを選び、ネンブタール麻酔下で心臓採血を行い、血液塗抹標本を作製した。塗抹標本をＱｕｉｃｋＩＩＩ染色キット（ａｓｔｒａｄｉａｇｎｏｓｉｃｓ）もしくはヘマカラー（Ｍｅｒｃｋ）を用いた簡易ギムザ染色法により染色し、感染率（Ｐａｒａｓｉｔｅｍｉａ％）を算出した。採取した血液は注射用生理食塩水で希釈し、赤血球数を血球計算盤で数え、感染率を乗じて感染赤血球数を算出した。感染赤血球懸濁液として１×１０５又は１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように生理食塩水にて希釈後２００μＬ／ｍｏｕｓｅで尾静脈投与した。【０１２９】
マウスへのネズミマラリア原虫の感染実験は雄性ＩＣＲマウスに２×１０４ｃｅｌｌｓのＰ．ｂｅｒｇｈｅｉ  Ｎ感染赤血球を尾静脈から静注（０．２ｍｌ／マウス）することにより行った。【０１３０】
＜感染モデルマウスへの多糖の経口投与＞
ＩＣＲマウスへのα−グルカン画分（図５中、画分Ａ１）及びヘテログリカン画分（図５中、画分Ｘ）、並びにＳＣＥ−４の連日経口投与は経口ゾンデを用いて５００μＬ／ｍｏｕｓｅの用量で行った。エタノール沈殿画分（ＳＣＥ−４）の投与量は６００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙにて、また、α−グルカン画分及びヘテログリカン画分は各々２８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ及び２２ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとした。α−グルカン画分及びヘテログリカン画分の投与量は、それぞれ収率から計算したＳＣＥ−４の６００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙに相当する量である。また、対照として水のみを経口投与した。投与は原虫感染７日前より開始し、マラリア原虫感染後も投与を継続させた。【０１３１】
＜ネズミマラリア原虫の感染率の算出＞
感染３日後よりマウスの尾から血液を採取し血液塗抹標本の作製を行った。塗抹標本の染色はＱｕｉｃｋＩＩＩ染色キット（ａｓｔｒａｄｉａｇｎｏｓｉｃｓ）又はヘマカラー（Ｍｅｒｃｋ）を用いた簡易ギムザ染色により行った。塗抹標本は油浸オイルを滴下し、顕微鏡（ＯＲＩＭＰＵＳ  ＢＸ４０）下で、表４に示す基準で観察した。
【表４】
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また、赤血球の感染率（Ｐａｒａｓｉｔｅｍｉａ）は以下に示す式にあてはめて産出した。
【数１】
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【０１３２】
＜結果＞
図５に、ネズミマラリア原虫感染モデルでの多糖画分の経口投与試験結果を示す。エタノール沈殿画分（ＳＣＥ−４）を投与したマウスでは、４日目及び５日目に感染率が対照と比較して有意に低下していた。また、ＳＣＥ−４よりも約１／２０と明らかに投与量が少ないにも関わらず、α−グルカン画分（図５中、画分Ａ１）及びヘテログリカン画分（図５中、画分Ｘ）を投与したマウスでは、４日目及び５日目の感染率が対照と比較して有意に低下していた（図５には、ＦｉｓｈｅｒのＬＳＤ検定におけるｐ値を示してある）。さらにα−グルカン画分を投与した８匹中５匹のマウスでは６日目でも効果が継続していた。以上のことから、エタノール沈殿画分（ＳＣＥ−４）の示すマラリア感染に対する防御作用は、含有されるα−グルカン及びヘテログリカンにより発現されていることが確認された。また、本実施例における結果は、α−グルカン画分及びヘテログリカン画分は、投与量がＳＣＥ−４よりも少ない（約１／２０）にも関わらず、ＳＣＥ−４とほぼ同程度かやや上回る程度のマラリア感染に対する防御作用を有することを示している。したがって、α−グルカン画分及びヘテログリカン画分の投与量を増やすことにより、ＳＣＥ−４よりも顕著に高い当該防御作用を発現することができる。【０１３３】
〔実施例４：ネズミマラリア原虫（クロロキン耐性株）感染モデルでの多糖画分の経口投与試験２〕
製造例１で調製したエタノール沈殿画分（ＳＣＥ−４）を多糖画分として用い、ネズミマラリア原虫感染モデルでの多糖画分の経口投与試験を行った。【０１３４】
＜Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ＮＳ感染モデル＞
ネズミマラリア原虫はＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ＮＳ（クロロキン耐性株）を用い、尾静脈投与による原虫感染後すぐにクロロキン（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓａｌｔ水溶液）を６０ｍｇ／ｋｇ／ｍｏｕｓｅの用量でマウスに皮下投与し、耐性原虫を維持した。尾静脈から静注する感染赤血球数は２×１０６ｃｅｌｌｓとした。その他は実施例３の＜Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ  Ｎ感染モデル＞と同様にして行った。【０１３５】
＜感染モデルマウスへの多糖の経口投与＞
ＩＣＲマウスへのＳＣＥ−４の連日経口投与は経口ゾンデを用いて５００μＬ／ｍｏｕｓｅの用量で行った。ＳＣＥ−４の投与量は６００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとした。対照として水のみを経口投与した。投与は原虫感染７日前より開始し、マラリア原虫感染後も投与を継続させた。【０１３６】
＜ネズミマラリア原虫の感染率の算出＞
実施例３と同様にして行った。【０１３７】
＜結果＞
図９に、経口投与試験結果を示す。エタノール沈殿画分（ＳＣＥ−４）を投与したマウスでは、４日目及び７日目に感染率が対照と比較して有意に低下していた（ＦｉｓｈｅｒのＬＳＤ検定におけるｐ値は、いずれもｐ＜０．００１）。【０１３８】
〔実施例５：ネズミマラリア原虫（クロロキン耐性株）感染モデルでの多糖画分と抗マラリア薬の併用経口投与試験〕
製造例１で調製したエタノール沈殿画分（ＳＣＥ−４）を多糖画分として用い、抗マラリア薬アルテスネート（Ａｒｔｅｓｎａｔｅ，ＡＮと略記する。）との併用効果を、ネズミマラリア原虫感染モデルでの経口投与試験により試験した。【０１３９】
＜Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ＮＳ感染モデル＞
尾静脈から静注するＰ．ｙｏｅｌｉｉ  ＮＳ感染赤血球数を２×１０６ｃｅｌｌｓから２×１０４ｃｅｌｌｓに代えたこと以外は実施例４と同様にして行った。【０１４０】
＜感染モデルマウスへの多糖及びＡＮの経口投与＞
ＩＣＲマウスへのＳＣＥ−４及びＡＮの連日経口投与は経口ゾンデを用いて５００μＬ／ｍｏｕｓｅの用量で行った。ＳＣＥ−４の投与量は６００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、ＡＮは０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０含有１０％  ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）水溶液で溶解、投与し、その投与量は３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとした。ＳＣＥ−４の投与は原虫感染７日前より開始し、マラリア原虫感染後も投与を継続させた。ＡＮの投与は原虫感染２時間後から開始し、マラリア原虫感染後３日目まで（計４回）投与を継続させた。また、ＳＣＥ−４はＡＮ投与後、少なくとも３時間以上時間をおいて投与した。【０１４１】
対照群は水及び０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０含有１０％ＤＭＳＯ水溶液の経口投与、ＡＮ３群は水及びＡＮの０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０含有１０％ＤＭＳＯ水溶液の経口投与、ＳＣＥ−４＋ＡＮ３群はＳＣＥ−４水溶液の経口投与とＡＮの０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０含有１０％ＤＭＳＯ水溶液の経口投与を行った。【０１４２】
＜ネズミマラリア原虫の感染率の算出＞
実施例３と同様にして行った。【０１４３】
＜結果＞
図１０に、経口投与試験結果を示す。ＡＮを投与したＡＮ３群は、４日目及び５日目に感染率が対照群と比較して有意に低下していた（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定におけるｐ値は、それぞれｐ＜０．００１及びｐ＝０．００２４）。ＳＣＥ−４とＡＮを併用したＳＣＥ−４＋ＡＮ３群は、４日目及び５日目に感染率が対照群と比較して有意に低下しており（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定におけるｐ値は、それぞれｐ＜０．００１及びｐ＝０．０００２）、また６日目においてもその効果が持続していた（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定におけるｐ値は、ｐ＝０．００４７）。この結果から明らかな通り、ＳＣＥ−４とＡＮとを併用することでマラリア感染に対する防御作用が増強された。このことは、ＳＣＥ−４による作用が既存の抗マラリア薬（ＡＮ）による作用と競合しないことを示している。したがって、ＳＣＥ−４は耐性株が出現した抗マラリア薬の代替薬として用いること、又は既存の抗マラリア薬と併用して用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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