(57)【要約】  本発明は、優れたイソプレンモノマー生産系の確立に有用な手段を提供する。具体的には、本発明は、以下（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドなどを提供する：（ａ）（ｉ）配列番号１で表される塩基配列、もしくは（ｉｉ）配列番号１で表される塩基配列中の１３３〜１７８５番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列を含むポリヌクレオチド；（ｂ）前記（ｉ）もしくは（ｉｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；または（ｃ）前記（ｉ）もしくは（ｉｉ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド：
（ａ）（ｉ）配列番号１で表される塩基配列、もしくは（ｉｉ）配列番号１で表される塩基配列中の１３３〜１７８５番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ｉ）もしくは（ｉｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；または
（ｃ）前記（ｉ）もしくは（ｉｉ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドがムクナに由来する、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
以下（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のタンパク質：
（Ａ）（ｉ’）配列番号２で表される全長アミノ酸配列、もしくは（ｉｉ’）配列番号２で表されるアミノ酸配列中の４５〜５９４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）前記（ｉ’）もしくは（ｉｉ’）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ）前記（ｉ’）もしくは（ｉｉ’）のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項１もしくは２記載のポリヌクレオチド、または請求項３記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４記載の発現ベクターが宿主に導入されることにより作製された形質転換体。
【請求項６】
前記宿主が、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
前記宿主が大腸菌である、請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
前記形質転換体が、メバロン酸経路およびメチルエリスリトールリン酸経路の双方によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、請求項５〜７のいずれか一項記載の形質転換体。
【請求項９】
宿主が、コリネバクテリウム属、パントエア属、エンテロバクター属、またはサッカロミセス属に属する微生物である、請求項５記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれか一項記載の形質転換体を用いて、請求項３記載のタンパク質を生成することを含む、タンパク質の製造方法。
【請求項１１】
請求項３記載のタンパク質の存在下において、ジメチルアリル二リン酸からイソプレンモノマーを生成することを含む、イソプレンモノマーの製造方法。
【請求項１２】
請求項５〜９のいずれか一項記載の形質転換体の培養によりイソプレンモノマーが生成される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記形質転換体の培養により培地中の炭素源からジメチルアリル二リン酸が供給される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む、イソプレンポリマーの製造方法：
（Ｉ）請求項１１〜１３のいずれか一項記載の方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソプレンシンターゼおよびそれをコードするポリヌクレオチドなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
タイヤ業界及びゴム工業界において、天然ゴムは非常に重要な原材料である。新興国を中心とするモータリゼーションで今後需要が拡大していく中で、森林伐採規制やパームとの競合で農園拡大は容易でないことから天然ゴムの収量増加は見込みにくく、需給バランスはタイトになっていくことが予想される。天然ゴムに代わる材料として、合成ポリイソプレンがあるが、原料モノマー（イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン））は、主にナフサのクラッキング解により得られたＣ５留分から抽出することで得られる。しかし近年、クラッカーのフィードのライト化に伴い、イソプレンの生産量は減少傾向にあり、供給が懸念されている。また、近年では石油価格の変動の影響も強く受けることから、イソプレンモノマーの安定した確保のために、非石油資源由来でイソプレンを安価に生産する系の確立が要望されている。【０００３】
このような要望に対して、単離された葛又はポプラ由来のイソプレンシンターゼ遺伝子及びこれらの変異体を発酵生産用の菌に組み込むことにより得られる形質転換体を用いて、イソプレンモノマーを生産する方法が開示されている（特許文献１および２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１１−５０５８４１号公報
【特許文献２】特表２０１１−５１８５６４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋｅｓｓｅｌｍｅｉｅｒ  Ｊ．らＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３３巻、第２３−８８頁、１９９９
【非特許文献２】Ｍｏｎｓｏｎ  Ｒ．Ｋ．らＰｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第９８巻、第１１７５〜１１８０頁、１９９２年
【非特許文献３】Ｋｕｚｍａ  Ｊ．らＰｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第１０１巻、第４３５〜４４０頁、１９９３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１および２に記載のイソプレンシンターゼの有する酵素活性は、低く、これらのイソプレンシンターゼ遺伝子を用いても、生産性の高いイソプレンモノマーを生産するという点では未だ改良の余地があった。【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、優れたイソプレンモノマー生産系の確立に有用な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ムクナ（Ｍｕｃｕｎａ  ｐｒｕｒｉｅｎｓ）由来のイソプレンシンターゼが、イソプレンモノマー生産能に優れることを見出し、本願発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本願発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド：
（ａ）（ｉ）配列番号１で表される塩基配列、もしくは（ｉｉ）配列番号１で表される塩基配列中の１３３〜１７８５番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ｉ）もしくは（ｉｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；または
（ｃ）前記（ｉ）もしくは（ｉｉ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔２〕前記ポリヌクレオチドがムクナに由来する、〔１〕のポリヌクレオチド。
〔３〕以下（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のタンパク質：
（Ａ）（ｉ’）配列番号２で表される全長アミノ酸配列、もしくは（ｉｉ’）配列番号２で表されるアミノ酸配列中の４５〜５９４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）前記（ｉ’）もしくは（ｉｉ’）のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ）前記（ｉ’）もしくは（ｉｉ’）のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されているアミノ酸配列を含み、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質。
〔４〕〔１〕もしくは〔２〕のポリヌクレオチド、または〔３〕のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔５〕〔４〕の発現ベクターが宿主に導入されることにより作製された形質転換体。
〔６〕前記宿主が、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、〔５〕の形質転換体。
〔７〕前記宿主が大腸菌である、〔６〕の形質転換体。
〔８〕前記形質転換体が、メバロン酸経路およびメチルエリスリトールリン酸経路の双方によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、〔５〕〜〔７〕のいずれかの形質転換体。
〔９〕宿主が、コリネバクテリウム属、パントエア属、エンテロバクター属、またはサッカロミセス属に属する微生物である、〔５〕の形質転換体。
〔１０〕〔５〕〜〔９〕のいずれかの形質転換体を用いて、〔３〕のタンパク質を生成することを含む、〔３〕のタンパク質の製造方法。
〔１１〕〔３〕のタンパク質の存在下において、ジメチルアリル二リン酸からイソプレンモノマーを生成することを含む、イソプレンモノマーの製造方法。
〔１２〕〔５〕〜〔９〕のいずれかの形質転換体の培養によりイソプレンモノマーが生成される、〔１１〕の方法。
〔１３〕前記形質転換体の培養により培地中の炭素源からジメチルアリル二リン酸が供給される、〔１２〕の方法。
〔１４〕以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む、イソプレンポリマーの製造方法：
（Ｉ）〔１１〕〜〔１３〕のいずれかの方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、優れたイソプレンモノマー生産系を確立することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、種々の植物の葉乾燥物の単位重量あたりのイソプレン発生量を示す図である。
【図２】図２は、種々の植物の葉から抽出された総タンパク質量あたりのイソプレン発生量を示す図である。
【図３】図３は、染色体固定したメバロン酸経路下流とその周辺領域の概要を示す図である。
【図４】図４は、染色体におけるｔａｃプロモーターで支配されたメバロン酸経路下流とその周辺領域の概要を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜イソプレンシンターゼをコードするポリヌクレオチド＞
本発明は、イソプレンシンターゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
イソプレンシンターゼは、ジメチルアリルジホスフェートをイソプレンに転換する酵素である。本発明者らは、まず、同一の高温条件下での、種々の植物におけるイソプレン生産能を評価した。この結果、ムクナのイソプレン生産能が、特許文献１および２において報告されている葛及びポプラのイソプレン生産能よりも、数倍から数十倍高いことが見出された。しかしながら、この高イソプレン生産能が当該植物の高いジメチルアリルジホスフェート生産能によるのか、当該植物がイソプレンシンターゼを高生産することによるのか、あるいは当該植物が保有するイソプレンシンターゼの酵素比活性が高いことによるのかは明らかになっていなかった。特にムクナについては、非特許文献２および３でＭｏｎｓｏｎらおよびＫｕｚｍａらにより硫安分画により部分精製された酵素を用いて、イソプレンシンターゼ活性のｐＨ依存性などが調べられていたが、ムクナ比活性が葛及びポプラと比べて高いかどうかは明らかになっていなかった。そこで、本発明者らは、ムクナおよび葛の葉から硫安分画によりイソプレンシンターゼを部分精製し、粗抽出液の比活性を調べた。この結果、ムクナのイソプレンシンターゼ比活性が葛のイソプレンシンターゼ比活性よりも、数倍から数十倍高いことが見出された。測定されたムクナのイソプレンシンターゼ比活性は特許文献１および２において報告されているポプラ粗酵素のイソプレンシンターゼ比活性値よりも、数倍から数十倍高いことも明らかとなった。以上のことから、ムクナが高機能イソプレンシンターゼを有している可能性が示唆された。
【００１３】
次いで、ムクナにおけるイソプレンシンターゼ遺伝子の塩基配列を解析した。解析方法の一例を以下に説明する。
植物において、イソプレンシンターゼは葉のみで発現していること、並びに、強光下及び高温下でその発現量は上昇することが知られている。そのため、先ず、光照射下且つ４０℃の温度下で、イソプレンシンターゼのｍＲＮＡを転写誘導したムクナの葉からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡについて、分解していないこと、又はゲノムＤＮＡが混入していないことを確認した。次いで、このＴｏｔａｌ  ＲＮＡを二本鎖化後断片化し、３’末端にｐｏｌｙＡ配列を有する断片の塩基配列のみを高速シークエンサーを用いて解析した。得られた断片配列において、重複する配列を連結し、複数のコンティグ配列を得た。これらコンティグ配列に対して、ＢＬＡＳＴ検索を行ったところ、登録されている既知の葛及びポプラのイソプレンシンターゼ遺伝子配列と相同性（塩基配列の同一性）を有するコンティグ配列が抽出され、ムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子の部分配列が得られた。この部分配列に基づき、定法により５’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）を行い、配列番号１で表されるムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子の完全長の塩基配列を解析した。
このムクナ由来イソプレンシンターゼのｃＤＮＡは、例えば、解析されたムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子の塩基配列情報に基づいて設計したプライマーと、上述した方法を用いて得られたＴｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲにより得られる。
【００１４】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、（ｉ）配列番号１で表される塩基配列、もしくは（ｉｉ）配列番号１で表される塩基配列中の１３３〜１７８５番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列を含むポリヌクレオチドである。配列番号１で表される塩基配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードし、１〜１３２番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列は、推定上の葉緑体移行シグナルをコードし、１３３〜１７８５番目のヌクレオチド残基からなる塩基配列は、成熟イソプレンシンターゼのアミノ酸配列をコードし得る。
【００１５】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、上記（ｉ）もしくは（ｉｉ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。塩基配列との同一性％は、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であってもよい。イソプレンシンターゼ活性とは、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からイソプレンを生成する活性をいう（以下同様）。
【００１６】
塩基配列の同一性％および後述するようなアミノ酸配列の同一性％は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、塩基配列およびアミノ酸配列の同一性％を計算してもよい。また、アミノ酸配列の相同性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。塩基配列およびアミノ酸配列の同一性％として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
【００１７】
さらに別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、上記（ｉ）もしくは（ｉｉ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００１８】
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このような条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、高い同一性を有する実質的に同一のポリヌクレオチド同士、例えば上述した同一性％を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体的には、このような条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、ムクナに由来し得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、後述する本発明のタンパク質をコードするものであってもよい。
【００２０】
＜イソプレンシンターゼ＞
本発明はまた、イソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質を提供する。イソプレンシンターゼ活性は、上述したとおりである。
【００２１】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、（ｉ’）配列番号２で表される全長アミノ酸配列、もしくは（ｉｉ’）配列番号２で表されるアミノ酸配列中の４５〜５９４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むタンパク質である。配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１〜４４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、推定上の葉緑体移行シグナルをコードし、４５〜５９４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、成熟イソプレンシンターゼをコードし得る。
【００２２】
別の実施形態では、本発明のタンパク質は、上記（ｉ’）もしくは（ｉｉ’）のいずれか一つのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質である。アミノ酸配列との同一性％は、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であってもよい。
【００２３】
さらに別の実施形態では、本発明のタンパク質は、上記（ｉ’）もしくは（ｉｉ’）のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が変異しているアミノ酸配列を含み、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質である。アミノ酸残基の変異としては、例えば、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入が挙げられる。１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１個もしくは数個」は、タンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲を示すものである。タンパク質の場合における用語「１もしくは数個」が示す数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個である。本発明のタンパク質は、ヒスチジンタグ等の精製用タグを有していてもよい。
【００２４】
本発明のタンパク質のイソプレンシンターゼ活性は、同一条件で測定された場合、上記（ｉ’）もしくは（ｉｉ’）のいずれか一つのアミノ酸配列を含むタンパク質のイソプレンシンターゼ活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。また、本発明のタンパク質は、安定性の観点から、所定の緩衝液〔例、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液〕中で４℃にて４８時間保存した場合に、残存活性が３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上または６５％以上であることが好ましい。
【００２５】
本発明のタンパク質は、目的活性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、および触媒ドメイン以外の部位に変異が導入されていてもよい。目的活性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に自明である。具体的には、当業者は、１）同種の活性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号２により表されるアミノ酸配列、および他のイソプレンシンターゼのアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、イソプレンシンターゼのアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。
【００２６】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００２７】
＜発現ベクター＞
本発明は、発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００２８】
本発明の発現ベクターとしては、例えば、宿主においてタンパク質を発現させる細胞系ベクター、およびタンパク質翻訳系を利用する無細胞系ベクターが挙げられる。発現ベクターはまた、プラスミド、または組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。
細胞系ベクターとしては、宿主に適した公知の発現ベクターが用いられる。例えば、大腸菌においてはｐＢＲ３２２誘導体に代表されるＣｏｌＥ系プラスミド、ｐ１５Ａオリジンを持つｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＳＣ系プラスミド、Ｂａｃ系等のＦ因子由来ミニＦプラスミドが挙げられる。その他、ｔｒｃやｔａｃ等のトリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等を有する発現ベクターも挙げられる。
無細胞系ベクターとしては、細胞系ベクターにおいて挙げられたＴ７プロモーターを有する発現ベクターやＴ３プロモーターを有する発現ベクター；ＳＰ６プロモーター又はＴ７プロモーターを有するｐＥＵ系プラスミド等の小麦無細胞タンパク質合成用ベクター等が挙げられる。
【００２９】
無細胞系ベクターを用いたタンパク質合成においては、先ず、転写系を用いて、目的タンパク質のｃＤＮＡを転写して、ｍＲＮＡを合成する。係る転写系としては、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させる従来公知のものが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
次いで、翻訳系である無細胞タンパク質合成系を用いて、ｍＲＮＡを翻訳し、タンパク質を合成する。この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。
更に、上記翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。
尚、細胞系ベクターを用いたタンパク質合成については、＜形質転換体＞において後述する。
細胞系ベクター又は無細胞系ベクターを用いて合成されたタンパク質を精製してもよい。精製方法としては、塩析法や各種クロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる。発現ベクターが目的タンパク質のＮ末端又はＣ末端にヒスチジンタグ等のタグ配列を発現するように設計されている場合には、ニッケルやコバルト等、このタグに親和性を有する物質を用いたアフィニティーカラムによる精製方法が挙げられる。その他、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等、適宜組み合わせて精製することにより、本発明のタンパク質の純度を高めることができる。
【００３０】
＜形質転換体＞
本発明は、本発明の発現ベクターを含む形質転換体を提供する。本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターが宿主に導入されたものである。本発明に用いられる宿主としては、細菌又は真菌が好ましい。細菌としては、グラム陽性菌であってもグラム陰性菌であってもよい。
【００３１】
グラム陽性細菌としては、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属細菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌等が挙げられ、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌が好ましい。
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）等が挙げられ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がより好ましい。
コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｌｌｕｎａｅ）等が挙げられ、コリネバクテリウム・グルタミカムがより好ましい。
【００３２】
グラム陰性細菌としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属細菌、ビブリオ（Ｖｉｖｒｉｏ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌等が挙げられ、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌が好ましい。
エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が好ましい。
パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌としては、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・スチューアルティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）等が挙げられ、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）が好ましい。また、パントエア属細菌としては、欧州特許出願公開０９５２２２１号に例示された株を使用してもよい。パントエア属細菌の代表的な株としては、例えば、欧州特許出願公開０９５２２２１号に開示されるパントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４）およびパントエア・アナナティスＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１５）が挙げられる。
エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられ、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｇｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）が好ましい。また、エンテロバクター属細菌としては、欧州特許出願公開０９５２２２１号に例示された菌株を使用してもよい。エンテロバクター属細菌の代表的な株としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランスＡＴＣＣ１２２８７株、エンテロバクター・アエロゲネスＡＴＣＣ１３０４８株、エンテロバクター・アエロゲネスＮＢＲＣ１２０１０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００７  Ｍａｒ  ２７；９８（２）：３４０−３４８）、エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５５）株等が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７株は、２００７年８月２２日付で独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４８として寄託され、２００８年３月１３日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５５の受領番号が付与されている。
【００３３】
真菌としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物等が挙げられ、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物が好ましい。
サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。
シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）が好ましい。
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の微生物としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が好ましい。
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物としては、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｔｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギフラキアム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）が挙げられ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）が好ましい。
その他、本発明に用いられる宿主としては、イソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸の合成に関与するメバロン酸（ＭＶＡ）経路および／またはメチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路によるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の合成能を備えていれば特に限定されず、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等であってもよい。
【００３４】
本発明の形質転換体は、さらにイソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を合成する経路が強化されていてもよい。このような強化のため、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）への変換能を有するイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼの発現ベクターが、本発明の形質転換体に導入されてもよい。また、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰの生成に関連するメバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の発現ベクターが、本発明の形質転換体に導入されてもよい。このような酵素の発現ベクターは、プラスミド、または組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。このような酵素の発現ベクターはまた、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。このような酵素の発現ベクターはさらに、メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する複数の酵素（例、１種、２種、３種または４種以上）を発現するものであってもよく、例えば、ポリシストロニックｍＲＮＡの発現ベクターであってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の由来は、宿主に対して同種であってもよいし、異種であってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素の由来が宿主に対して異種である場合、例えば、宿主が上述したような細菌（例、大腸菌）であり、かつ、メバロン酸経路に関与する酵素が真菌（例、サッカロミセス・セレビシエ）に由来するものであってもよい。また、宿主が、メチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素を固有に産生するものである場合、宿主に導入される発現ベクターは、メバロン酸経路に関与する酵素を発現するものであってもよい。
【００３５】
イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ（ＥＣ:５．３．３．２）としては、例えば、Ｉｄｉ１ｐ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１５２０８）、ＡＴ３Ｇ０２７８０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８６９２７）、ＡＴ５Ｇ１６４４０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９７１４８）、およびＩｄｉ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７３６５）が挙げられる。
【００３６】
メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関与する酵素としては、例えば、メバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．１．３６；例１、Ｅｒｇ１２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３９３５；例２、ＡＴ５Ｇ２７４５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１９０４１１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．４．２；例１、Ｅｒｇ８ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３９４７；例２、ＡＴ１Ｇ３１９１０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１８５１２４）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３３；例１、Ｍｖｄ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１４４４１；例２、ＡＴ２Ｇ３８７００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８１４０４；例３、ＡＴ３Ｇ５４２５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６６９９５）、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．９；例１、Ｅｒｇ１０ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１５２９７；例２、ＡＴ５Ｇ４７７２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１０３２０２８；例３、ＡＴ５Ｇ４８２３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６８６９４）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ：２．３．３．１０；例１、Ｅｒｇ１３ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３５８０；例２、ＡＴ４Ｇ１１８２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９２９１９；例３、ＭｖａＳ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＡＡＧ０２４３８）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：１．１．１．３４；例１、Ｈｍｇ２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３５５５；例２、Ｈｍｇ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３６３６；例３、ＡＴ１Ｇ７６４９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１７７７７５；例４、ＡＴ２Ｇ１７３７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１７９３２９、ＥＣ：１．１．１．８８、例、ＭｖａＡ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  Ｐ１３７０２）、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：２．３．１．９／１．１．１．３４、例、ＭｖａＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＡＡＧ０２４３９）が挙げられる。
【００３７】
メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に関与する酵素としては、例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．２．１．７、例１、Ｄｘｓ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４９５４；例２、ＡＴ３Ｇ２１５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６６６８６；例３、ＡＴ４Ｇ１５５６０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９３２９１；例４、ＡＴ５Ｇ１１３８０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１０７８５７０）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼ（ＥＣ：１．１．１．２６７；例１、Ｄｘｒ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４７１５；例２、ＡＴ５Ｇ６２７９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１９０６００）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＥＣ：２．７．７．６０；例１、ＩｓｐＤ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７２２７；例２、ＡＴ２Ｇ０２５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６５２８６）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＥＣ：２．７．１．１４８；例１、ＩｓｐＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１５７２６；例２、ＡＴ２Ｇ２６９３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８０２６１）、２−Ｃ−メチル―Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロニリン酸シンターゼ（ＥＣ：４．６．１．１２；例１、ＩｓｐＦ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７２２６；例２、ＡＴ１Ｇ６３９７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６４８１９）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−ニリン酸シンターゼ（ＥＣ：１．１７．７．１；例１、ＩｓｐＧ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７０１０；例２、ＡＴ５Ｇ６０６００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１１９４６７）、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２；例１、ＩｓｐＨ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４５７０；例２、ＡＴ４Ｇ３４３５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６７９６５）が挙げられる。
【００３８】
遺伝子が組込まれた発現ベクターの宿主への導入（形質転換）は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。
【００３９】
更に、本発明の形質転換体において、イソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸を合成するメバロン酸経路又はメチルエリスリトールリン酸経路の酵素をコードする遺伝子が導入されていてもよい。
係る酵素としては、ピルビン酸塩とＤ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェートを１−デオキシ−Ｄ−キシロース−５−ホスフェートに転換する１−デオキシ−Ｄ−キシロース−５−ホスフェートシンターゼ；イソペンテニル二リン酸をジメチルアリル二リン酸に転換するイソペンチルジホスフェートイソメラーゼ等が挙げられる。
【００４０】
本発明の形質転換体から本発明のタンパク質を抽出・精製して用いてもよく、本発明のタンパク質を発現する形質転換体を培養してイソプレンを生産してもよい。
【００４１】
＜イソプレンモノマーおよびイソプレンポリマーの製造方法＞
本発明は、イソプレンモノマーの製造方法を提供する。本発明のイソプレンモノマーの製造方法は、本発明のタンパク質の存在下において、ジメチルアリル二リン酸からイソプレンモノマーを生成することを含む。
【００４２】
本発明のイソプレンモノマーの製造方法は、本発明のタンパク質の存在下で行われる限り特に限定されず、例えば、本発明のタンパク質自体（例、精製タンパク質）を用いる酵素反応系を利用して、または本発明のタンパク質を産生する本発明の形質転換体の培養により行うことができる。好ましくは、本発明の形質転換体の培養により行われる。本発明のイソプレンモノマーの製造方法において本発明の形質転換体を用いる場合、イソプレンモノマーの原料となるジメチルアリル二リン酸は、本発明の形質転換体により、培地中の炭素源から効率的に供給される。本発明の形質転換体は、培地中の炭素源から、イソプレンモノマーを主にアウトガスとして生産するため、形質転換体から発生するガスを採取することにより、イソプレンモノマーが回収される。イソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸は、培地中の炭素源を素に、宿主内のメバロン酸経路又はメチルエリスリトールリン酸経路で合成される。
本発明の形質転換体を培養する培地としては、イソプレンに転換されるための炭素源を含むことが好ましい。炭素源としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類等の炭水化物；ショ糖を加水分解した転化糖；グリセロール；メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、一酸化炭素、二酸化炭素等の炭素数が１の化合物（以下、Ｃ１化合物という。）；コーン油、パーム油、大豆油等のオイル；アセテート；動物油脂；動物オイル；飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂肪酸；脂質；リン脂質；グリセロ脂質；モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド等のグリセリン脂肪酸エステル；微生物性タンパク質、植物性タンパク質等のポリペプチド；加水分解されたバイオマス炭素源等の再生可能な炭素源；酵母エキス；又はこれらを組み合わせたものが挙げられる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００４３】
単糖類としては、ケトトリオース（ジヒドロキシアセトン）、アルドトリオース（グリセルアルデヒド）等のトリオース；ケトテトロース（エリトルロース）、アルドテトロース（エリトロース、トレオース）等のテトロース；ケトペントース（リブロース、キシルロース）、アルドペントース（リボース、アラビノース、キシロース、リキソース）、デオキシ糖（デオキシリボース）等のペントース；ケトヘキソース（プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース）、アルドヘキソース（アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース）、デオキシ糖（フコース、フクロース、ラムノース）等のヘキソース；セドヘプツロース等のヘプトースが挙げられ、フルクトース、マンノース、ガラクトース、グルコース等のＣ６糖；キシロース、アラビノース等のＣ５糖の炭水化物が好ましい。
二糖類としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等が挙げられ、スクロース、ラクトースが好ましい。
オリゴ糖類としては、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類；アカルボース、スタキオース等の四糖類；フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナンオリゴ糖（ＭＯＳ）等のその他のオリゴ糖類が挙げられる。
多糖類としては、グリコーゲン、デンプン（アミロース、アミロペクチン）、セルロース、デキストリン、グルカン（β１，３−グルカン）が挙げられ、デンプン、セルロースが好ましい。
【００４４】
微生物性タンパク質としては、酵母または細菌由来のポリペプチドが挙げられる。
植物性タンパク質としては、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁由来のポリペプチドが挙げられる。
【００４５】
脂質としては、Ｃ４以上の飽和、不飽和脂肪酸を１以上含む物質が挙げられる。
【００４６】
オイルとしては、Ｃ４以上の飽和、不飽和脂肪酸が１以上含み、室温で液体の脂質が好ましく、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁、油性微生物細胞、ナンキンハゼ、又はこれらの２以上の組み合わせからなるものが挙げられる。
【００４７】
脂肪酸としては、式ＲＣＯＯＨ（「Ｒ」は炭化水素基を表す。）で表される化合物が挙げられる。
不飽和脂肪酸は、「Ｒ」に少なくとも１の炭素−炭素二重結合を有する化合物であり、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミテライジン酸、アラキドン酸等が挙げられる。
飽和脂肪酸は、「Ｒ」が飽和脂肪族基である化合物であり、ドコサン酸、イコサン酸、オクタデカン酸、ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、ドデカン酸等が挙げられる。
中でも、脂肪酸としては、１以上のＣ２からＣ２２の脂肪酸が含まれるものが好ましく、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸が含まれるものがより好ましい。
また、炭素源としては、これら脂肪酸の塩、誘導体、誘導体の塩も挙げられる。塩としては、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩等が挙げられる。
【００４８】
また、炭素源としては、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、グリセリン脂肪酸エステルとグルコース等の炭水化物との組み合わせが挙げられる。
【００４９】
再生可能な炭素源としては、加水分解されたバイオマス炭素源が挙げられる。
バイオマス炭素源としては、木、紙、及びパルプの廃材、葉状植物、果肉等のセルロース系基質；柄、穀粒、根、塊茎等の植物の一部分が挙げられる。
バイオマス炭素源として用いられる植物としては、コーン、小麦、ライ麦、ソルガム、トリティケイト、コメ、アワ、大麦、キャッサバ、エンドウマメ等のマメ科植物、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビ、タピオカ等が挙げられる。
【００５０】
バイオマス等の再生可能な炭素源を細胞培地に添加する際には、前処理することが好ましい。前処理としては、酵素的前処理、化学的前処理、酵素的前処理と化学的前処理の組み合わせが挙げられる。
再生可能な炭素源を細胞培地に添加する前に、その全部または一部を加水分解することが好ましい。
【００５１】
また、炭素源としては、酵母エキス、または酵母エキスと、グルコース等の他の炭素源との組み合わせが挙げられ、酵母エキスと、二酸化炭素やメタノール等のＣ１化合物との組み合わせが好ましい。
【００５２】
本発明において、形質転換体の培養方法としては、細胞を生理食塩水と栄養源を含む標準的培地で培養することが好ましい。
培養培地としては、特に限定されず、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス、Ｙｅａｓｔ  ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）ブロス等の一般的に市販されている既成の培地が挙げられる。特定の宿主の培養に適した培地を適宜選択して用いることができる。
【００５３】
細胞培地には適切な炭素源の他に、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、及び培養に適していること、またはイソプレン産出を促進することが当業者にとって公知の成分が含まれていることが望ましい。
本発明の形質転換体において、本発明のタンパク質の発現を維持するために、糖、金属塩、抗菌物質等を培地に添加しておくことが好ましい。
【００５４】
本発明の形質転換体の培養条件としては、本発明のタンパク質の発現が可能な条件であれば、特に限定されず、標準的な細胞培養条件を用いることができる。
培養温度としては、２０℃〜３７℃が好ましく、ガス組成としては、ＣＯ２濃度が約６％〜約８４％であることが好ましく、ｐＨが、約５〜約９であることが好ましい。
また、宿主の性質に応じて好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で培養を行うことが好ましい。
【００５５】
培養方法としては、形質転換体をバッチ培養法、流加培養法、連続培養法等の公知の発酵方法を用いて培養する方法が挙げられる。
バッチ培養法は、発酵開始時に培地組成物に仕込み、宿主を培地に植菌し、ｐＨや酸素濃度等の制御を行いながら形質転換体の培養を行う方法である。
バッチ培養法による形質転換体の培養において、形質転換体は、穏やかな誘導期から対数増殖期を経て最終的に成長速度が減少または停止する定常期に至る。イソプレンは、対数増殖期や定常期の形質転換体によって産出される。
【００５６】
流加培養法は、上述したバッチ法に加えて、発酵プロセスが進行するに従い徐々に炭素源を添加する方法である。流加培養法は、カタボライト抑制により形質転換体の代謝が抑制される傾向があり、培地中の炭素源の量を制限することが好ましいときに有効である。流加培養法は、制限された量または過剰な量のグルコース等の炭素源を用いて行うことができる。
【００５７】
連続培養法は、一定の速度でバイオリアクターに所定量の培地を連続的に供給しながら、同時に同量の培養液を抜き取る培養法である。連続培養法では培養物を一定の高密度に保つことができ、培養液中の形質転換体は主に対数増殖期にある。
適宜、培地の一部または全部を入れ換えることにより、栄養素の補給を行うことができ、形質転換体の生育に悪影響を及ぼす可能性のある代謝副産物、及び死細胞の蓄積を防ぐことができる。
【００５８】
本発明の発現ベクターが有するプロモーターとしては、構成的プロモーターや誘導的プロモーターが挙げられる。本発明の発現ベクターがｌａｃプロモーター等の誘導的プロモーターを有している場合には、培養液中に、例えばＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を添加して、本発明のタンパク質の発現を誘導してもよい。
【００５９】
本発明の形質転換体を培養することにより得られるイソプレンモノマーの生産量の評価方法としては、ヘッドスペース法により気相を採取し、この気相をガスクロマトグラフィー法で分析する方法が挙げられる。
詳細には、密封したバイアル中で形質転換体を含む培養液を振蕩しながら培養したときのヘッドスペース中のイソプレンモノマーを、標準的なガスクロマトグラフィーを用いて分析する。次いで、検量線を用いて、ガスクロマトグラフィー測定カーブから得られる面積を、形質転換体のイソプレンモノマー生産量に換算する。
【００６０】
本発明の形質転換体を培養することにより得られるイソプレンモノマーの回収方法としては、ガスストリッピング、分留、或いは、固相に吸着させたイソプレンモノマーの熱若しくは真空による固相からの脱着、又は溶媒による抽出等が挙げられる。
ガスストリッピングでは、アウトガスから連続的にイソプレンガスを除去する。このようなイソプレンガスの除去は種々の方法で行うことができ、固相への吸着、液相への分離、又はイソプレンガスを直接凝縮させる方法が挙げられる。
【００６１】
イソプレンモノマーの回収は一段階又は多段階で行うことができる。イソプレンモノマーを一段階で回収する場合には、アウトガスからのイソプレンモノマーの分離と、イソプレンモノマーの液相への変換を同時に行う。イソプレンモノマーをアウトガスから直接凝縮させて液相にすることもできる。イソプレンモノマーを多段階で回収する場合には、オフガスからのイソプレンモノマーの分離と、イソプレンモノマーの液相への変換とを順次行う。例えば、イソプレンモノマーを固相に吸着させ、溶媒で固相から抽出する方法が挙げられる。
【００６２】
更に、イソプレンモノマーの回収方法は、イソプレンモノマーを精製する工程が含まれていてもよい。精製工程としては、液相抽出物からの蒸留による分離や各種クロマトグラフィーが挙げられる。
【００６３】
本発明のタンパク質は、従来のイソプレンシンターゼと比較してイソプレン生産能に優れるため、本発明のタンパク質を発現する形質転換体を用いて、イソプレンモノマーを効率よく生産することができる。
【００６４】
本発明はまた、イソプレンポリマーの製造方法を提供する。本発明のイソプレンポリマーの製造方法は、以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む：
（Ｉ）本発明の方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
【００６５】
工程（Ｉ）は、上述した本発明のイソプレンモノマーの製造方法と同様にして行うことができる。工程（ＩＩ）におけるイソプレンモノマーの重合は、当該分野で公知の任意の方法により行うことができる。
【実施例】
【００６６】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６７】
実施例１：植物におけるイソプレン生産能の検討
１−１）葉乾燥物の単位重量あたりのイソプレン発生量の測定
先ず、植物におけるイソプレン生産能を検討するため、植物における葉乾燥重量１ｇあたりのイソプレン発生量を測定した。植物としては、ムクナ、ヤナギ（シダレヤナギ）、モミジバフウ、ギンコウバイ、葛を用いた。
イソプレン発生量測定には、ガス交換式デシケーター（商品名：真空デシケーター、アズワン社製）を、インキュベーター（商品名：グロースチェンバーＭＬＲ−３５１ＨＳＡＮＹＯ社製製）内に収容し、ガス交換式デシケーター内に設置した気体攪拌用ファンを作動させガス交換式デシケーターの空間内の雰囲気を攪拌させつつ、インキュベーターを高温誘導条件（照度１００μｍｏｌＥ／ｍ２／ｓで４０℃）に設定した。ガス交換式デシケーター内の雰囲気の温度が４０℃になった後、プランターに植えられたムクナ植物体を収容し、ガス交換式デシケーターを密閉した状態で３時間保持した。次いで、吸引ポンプにより、シリコンチューブ、吸着管および気体採取管を介して、ガス交換式デシケーター内の空間から、ムクナが放出したガス成分を吸引した。これにより、吸着管において、ムクナが放出したガス成分に含まれる水蒸気（水分）を吸着、分離するとともに、水蒸気が分離されたガス成分を気体採取管に導き、気体採取管において、そのガス成分を採取した。次いで、ガスクロマトグラフ（商品名：ＧＣ−ＦＩＤ６８９０、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて、気体採取管に採取されたガス成分に含まれるイソプレンを定量分析した。
植物の葉乾燥重量は、新鮮個葉の葉面積と、８０℃の乾熱器によって新鮮個葉を８時間乾燥させたときの乾燥重には非常に良い正の相関関係が成り立つので、葉面積からの乾燥重換算式を導いておき、イソプレン発生量測定に用いたムクナ植物体の全葉面積から乾燥重を推定した。
植物における葉乾燥重量１ｇあたりのイソプレン発生量はムクナ植物体全体からのイソプレン発生量を植物体全体の葉の乾燥重量推定値で割ることにより求めた。
その結果、ムクナが葉乾燥物の単位重量あたりのイソプレン発生量に優れることが明らかとなった（図１）。【００６８】
１−２）総タンパク質量あたりのイソプレン発生量の測定
次いで、種々の植物の葉から抽出された総タンパク質量あたりのイソプレン発生量を測定した。植物としては、ムクナ（サンプル１、２）、ヤナギ（シダレヤナギ）、モミジバフウ、ギンコウバイ、クズを用いた。
タンパク質抽出には、バッファー液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ２０ｍＭ  ＭｇＣｌ，  ５％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，  ０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，  ｐＨ８．０）を作成し、使用直前にＰｏｌｙｃｌａｒ  ＡＴ  １０％、ＤＴＴ  ２０ｍＭ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｔａｂｌｅｔ  （１ｔａｂｌｅｔ／５０ｍｌ）Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ  １ｍＭ（それぞれ終濃度）となるように加え蛋白抽出バッファーとして用いた。５ｇサンプルに対してタンパク抽出バッファー５０ｍｌ加えて、氷上で冷やしておいた乳鉢でよく摩砕した後、２重に重ねたＭｉｒａｃｌｏｔｈで摩砕液を濾過し、濾液を１２０００Ｇで２０分、４００００Ｇで４０分遠心分離した上清を取得し粗抽出液とした。
次いで、この粗抽出液について硫安分画を行った。硫安の終濃度４０％から５５％の範囲で析出する蛋白を４００００Ｇで４０分遠心分離し、得られた沈殿を蛋白抽出バッファーに再溶解させて硫安画分を得た。
総（硫安画分）タンパク質量は、ブラッドフォード法で硫安画分を測定することで求めた。標準蛋白Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎについて、ブラッドフォード試薬を反応させ分光光度計で測定した波長５９５ｎｍの吸光度に対する蛋白量の検量線を作成した。５０倍希釈した硫安画分液について同様に波長５９５ｎｍの吸光度を測定し、標準蛋白の検量線から総（硫安画分）蛋白量を推定した。
イソプレン発生量は、４ｍｌガラスバイアルに粗抽出液ないしは１００℃で煮沸処理した粗酵素液を１００μｌ入れ、次いで０．５Ｍ  ＭｇＣｌ２溶液を２μｌ、０．２Ｍ  ＤＭＡＰＰ溶液を５μｌ加え、セプタム付きスクリューキャップをしっかり締めたあと、ゆるやかに振とう撹拌し４０℃恒温漕にセットした。０．５時間、１時間、２時間後に、ガスタイトシリンジでＨｅａｄｓｐａｃｅ気層を０．５〜２ｍｌサンプリングしガスクロマトグラフ（商品名：ＧＣ−ＦＩＤ６８９０、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いてイソプレン発生量を測定した。粗酵素での０．５時間、１時間、２時間後の発生量は、それぞれの測定値から１００℃で煮沸処理した粗酵素液の測定値を引いて求めた。１時間あたりのイソプレン発生量からＴｏｔａｌ蛋白１ｍｇあたりの酵素活性（比活性）を求めた。なお、イソプレン発生量の測定は、イソプレンシンターゼの基質であるＤＭＡＰＰの量を一定にして行った。
その結果、ムクナが総タンパク質量あたりのイソプレン発生量に優れることが明らかとなった（図２、表１）。以上より、ムクナがイソプレン生産能に優れることが示された。【００６９】
【表１】
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【００７０】
実施例２：ムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子のクローニング
２−１）サンプリング時間の検討
４０℃の温度下で１，２，３，５時間光照射したムクナの葉が放出するイソプレンガスをサンプリングし、後述するガスクロマトグラフィーにてイソプレン生産量を定量したところ、それぞれ４，８，１２，１０μｇ  ｉｓｏｐｒｅｎｅ／ｇ  ＤＷ  ｌｅａｆのイソプレンの生産が確認され、最適な光照射時間は、３時間であることが確認された。【００７１】
２−２）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ溶解液の抽出
以下の手順でムクナの葉からＴｏｔａｌ  ＲＮＡ溶解液を抽出した。
（１）４０℃の温度下で３時間光照射したムクナの葉をサンプリングした。
（２）葉組織１００ｍｇを液体窒素ですばやく凍結しながら乳鉢で粉砕した後、ＲＮａｓｅフリーの２ｍｌエッペンドルフチューブに液体窒素ごと分注し、液体窒素を気化させた。
（３）このエッペンドルフチューブに、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）に備え付けの溶解バッファーＲＬＴ（２−メルカプトエタノール含有）を４５０μｌ添加し、ボルッテックスで激しく混和し、葉組織溶解物を得た。
（４）この葉組織溶解物をＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔに備え付けのＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムにかけ、１５０００ｒｐｍ、２分間、遠心分離を行った。
（５）カラム濾液の上清のみを、ＲＮａｓｅフリーの新たな２ｍｌエッペンドルフチューブに分注した後、このカラム濾液上清の１／２容量の特級エタノールを添加し、ピペッティングにより混和し、約６５０μｌの溶液を得た。
（６）この溶液をＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔに備え付けのＲＮｅａｓｙスピンカラムにかけ、１００００ｒｐｍ、１５秒間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（７）このＲＮｅａｓｙスピンカラムに、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔに備え付けのＲＷ１バッファー７００μｌを添加し、１００００ｒｐｍ、１５秒間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（８）このＲＮｅａｓｙスピンカラムに、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔに備え付けのＢＰＥバッファー５００μｌを添加し、１００００ｒｐｍ、１５秒間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（９）このＲＮｅａｓｙスピンカラムに、再度、ＢＰＥバッファー５００μｌを添加し、１００００ｒｐｍ、２分間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（１０）このＲＮｅａｓｙスピンカラムを、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔに備え付けの２ｍｌ回収用チューブにセットし、１５０００ｒｐｍ、１分間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（１１）このＲＮｅａｓｙスピンカラムを、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔに備え付けの１．５ｍｌ回収用チューブにセットした。
（１２）ピペットマンを用いて、このＲＮｅａｓｙスピンカラムに、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔに備え付けのＲＮａｓｅフリーの蒸留水を、ＲＮｅａｓｙスピンカラムの膜に直接添加し、１００００ｒｐｍ、１分間、遠心分離を行い、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収した。このステップを２回繰り返し、約１００μｌのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。【００７２】
２−３）ムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子の塩基配列の解析
抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡ溶解液について、バイオアナライザ（アジレント・テクノロジー社）のＲＮＡ用ｎａｎｏチップを用いて、ＲＮＡの品質チェックを行い、溶解液中にゲノムＤＮＡの混入がなく、溶解液中のＲＮＡが分解していないことを確認した。
このＴｏｔａｌ  ＲＮＡを、逆転写酵素を用いて二本鎖化した後、ネブライザーを用いて断片化した。３’末端にｐｏｌｙＡ配列を有する１９８１７９個の断片の塩基配列を、４５４  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ＦＬＸ高速シークエンサー（ロッシュアプライドサイエンス社製）を用いて解析した。得られた断片配列において、重複する配列を連結し、１３４８５個のコンティグ配列を得た。これらコンティグ配列に対して、ＢＬＡＳＴ検索を行ったところ、登録されている既知の葛及びポプラのイソプレンシンターゼ遺伝子配列と相同性（塩基配列の同一性）を有する６個のコンティグ配列が抽出された。更に配列を詳細に解析したところ、この６個のコンティグ配列のうち３個は、同一の遺伝子由来のものであることが分かり、ムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子の部分配列が得られた。この部分配列に基づき、５’ＲＡＣＥを行い、配列番号１で表されるムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子の完全長の塩基配列を得た。【００７３】
実施例３：各植物種由来イソプレンシンターゼの発現プラスミドの調製
３−１）Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ  ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ（葛）由来イソプレンシンターゼの化学合成
Ｐ．ｍｏｎｔａｎａ  ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ由来、イソプレンシンターゼの塩基配列、及びアミノ酸配列は既に知られている（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：  ＡＡＱ８４１７０：Ｐ．ｍｏｎｔａｎａ  ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ（葛）  ｉｓｏｐｒｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＩｓｐＳ））。Ｐ．ｍｏｎｔａｎａ由来ＩｓｐＳタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号３、及び配列番号４にそれぞれ示す。ＩｓｐＳ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉで効率的に発現させる為にＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化し、更に葉緑体移行シグナルが切断されたＩｓｐＳ遺伝子を設計し、これをＩｓｐＳＫと名付けた。ＩｓｐＳＫの塩基配列を配列番号５に示す。ＩｓｐＳＫ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＫと名付けた。【００７４】
３−２）Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ  ｘ  Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ（ポプラ）由来イソプレンシンターゼの化学合成
Ｐ．ａｌｂａ  ｘ  Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａ由来、イソプレンシンターゼの塩基配列、及びアミノ酸配列は既に知られている（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：  ＣＡＣ３５６９６：Ｐ．ａｌｂａ  ｘ  Ｐ．  ｔｒｅｍｕｌａ  （ポプラ）ｉｓｏｐｒｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）。Ｐ．ａｌｂａ  ｘ  Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａ由来ＩｓｐＳタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号６、及び配列番号７にそれぞれ示す。この塩基配列を基に、前記と同様に、Ｅ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化し、更に葉緑体移行シグナルが切断されたＩｓｐＳ遺伝子を設計し、これをＩｓｐＳＰと名付けた。ＩｓｐＳＰの塩基配列を配列番号８に示す。ＩｓｐＳＰ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＰと名付けた。【００７５】
３−３）Ｍｕｃｕｎａ  ｐｕｒｕｒｉｅｎｓ（ムクナ）由来イソプレンシンターゼの化学合成
Ｍ．ｐｕｒｕｒｉｅｎｓ由来イソプレンシンターゼの塩基配列を基に、前記と同様に、Ｅ．  ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化されたＩｓｐＳ遺伝子を設計し、葉緑体移行シグナルが付与されたものをＩｓｐＳＭ（Ｌ）と名付け、葉緑体移行シグナルを切断したものをＩｓｐＳＭと名付けた。ＩｓｐＳＭ（Ｌ）の塩基配列を配列番号９に、ＩｓｐＳＭの塩基配列を配列番号１０に示す。ＩｓｐＳＭ遺伝子とＩｓｐＳＭ（Ｌ）遺伝子は、それぞれ化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭとｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）と名付けた。【００７６】
３−４）発現用プラスミドｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐの構築
Ｅ．ｃｏｌｉで各植物種由来ＩｓｐＳを発現させる為の発現用プラスミドｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを構築した。始めに、ｔａｃプロモーター（同意語：Ｐｔａｃ）領域（ｄｅＢｏｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，２１−２５）及びＥ．ｃｏｌｉ由来トリプトファンオペロンのターミネーター（同意語Ｔｔｒｐ）領域（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５，５４４２−５４４６）を含み、５’末端にＫｐｎＩサイト、３’末端にＢａｍＨＩサイトを有するＤＮＡ断片（Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ）を化学合成した（Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐの塩基配列を配列番号１１に示す）。得られたＰｔａｃ−ＴｔｒｐのＤＮＡ断片をＫｐｎＩ、及びＢａｍＨＩにて消化処理し、同様にＫｐｎＩ、及びＢａｍＨＩで消化処理したｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）とをＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅによるライゲーション反応によって連結した。得られたプラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐと名付けた（塩基配列を配列番号１２に示す）。本プラスミドは、Ｐｔａｃ下流にＩｓｐＳ遺伝子をクローニングすることで、ＩｓｐＳ遺伝子の発現増幅が可能となる。【００７７】
３−５）各植物種由来ＩｓｐＳ遺伝子発現用プラスミドの構築
Ｅ．ｃｏｌｉでＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＰ遺伝子、ＩｓｐＳＭ遺伝子、及びＩｓｐＳＭ（L）遺伝子を発現させる為のプラスミドは次の手順で構築した。ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＫを鋳型として、配列番号１３と配列番号１４の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＰを鋳型として、配列番号１５と配列番号１６の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭを鋳型として、配列番号１７と配列番号１８の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、更にはｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭ（L）を鋳型として、配列番号１９と配列番号２０の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて１２０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＰ遺伝子、ＩｓｐＳＭ遺伝子、及びＩｓｐＳＭ（Ｌ）遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを、配列番号２１と配列番号２２の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて２１０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＰ遺伝子、ＩｓｐＳＭ遺伝子、及びＩｓｐＳＭ（Ｌ）遺伝子遺伝子断片と、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＴｔｒｐのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＩｓｐＳＫ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ、ＩｓｐＳＰ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ、ＩｓｐＳＭ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ、ＩｓｐＳＭ（Ｌ）遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（L）と命名した。【００７８】
【表２】
2013179722.tif 000003
【００７９】
実施例４：Ｅ．ｃｏｌｉ由来粗酵素抽出液を用いた各植物種由来イソプレンシンターゼの酵素活性測定
４−１）イソプレン生産能を有するＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株の構築
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ７００９２６）のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーション法によりｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ、更にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）を導入し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。その後、得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐが導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫが導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰが導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭが導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、更にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）が導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）株と命名した。【００８０】
４−２）粗酵素抽出液の調製方法
ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、及びＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１／６プレート分の菌体を６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢ２０ｍｌを張り込んだ坂口フラスコに接種し、３７℃にて６時間培養した。培養液より菌体を５０００ｒｐｍ、４℃、５分の条件で遠心分離し、氷冷したイソプレンシンターゼバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）・２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２・５％グリセロール）にて２回洗浄した。洗浄菌体を同バッファー１．８ｍｌに懸濁した。２ｍｌ容のマルチビーズショッカー専用チューブに約０．９ｍｌの破砕用ビーズ（ＹＢＧ０１，直径０．１ｍｍ）と菌体懸濁液０．９ｍｌを入れ、安井器械製マルチビーズショッカー（ＭＢ７０１（Ｓ）型）にて２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒ＯＮ・３０秒ＯＦＦを３サイクルの条件で菌体を破砕した。破砕後チューブを２００００ｇ、４℃、２０分の条件で遠心し、上清を粗酵素抽出液とした。【００８１】
４−３）イソプレンシンターゼ活性の測定
ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）株の粗酵素抽出液（総タンパク量として２ｍｇを含む量）とイソプレンバッファーを合わせて０．５ｍｌをヘッドスペースバイアル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  ２２ｍＬ  ＣＬＥＡＲ  ＣＲＩＭＰ  ＴＯＰ  ＶＩＡＬ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６）に入れ、０．５Ｍ  ＭｇＣｌ２溶液０．０２５ｍｌと０．２Ｍ  ＤＭＡＰＰ（ｃａｙｍａｎ製，Ｃａｔｌｏｇ  Ｎｏ．６３１８０）溶液０．０１ｍｌを加えて軽く攪拌した後、すぐにヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）にて密栓、３７℃にて２時間保温した。
反応終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。以下にガスクロマトグラフィーの分析条件を記載する。【００８２】
Ｈｅａｄｓｐａｃｅ  Ｓａｍｐｌｅｒ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  Ｔｕｒｂｏ  Ｍａｔｒｉｘ  ４０）
バイアル保温温度  ４０℃
バイアル保温時間  ３０ｍｉｎ
加圧時間  ３．０ｍｉｎ
注入時間  ０．０２ｍｉｎ
ニードル温度  ７０℃
トランスファー温度  ８０℃
キャリアガス圧力（高純度ヘリウム）  １２４ｋＰａ【００８３】
ガスクロマトグラフィー（島津社製  ＧＣ−２０１０  Ｐｌｕｓ  ＡＦ）
カラム（Ｒｘｉ（登録商標）−１ｍｓ：  長さ３０ｍ、内径０．５３ｍｍ、液相膜厚１．５μｍ  ｃａｔ♯１３３７０）
カラム温度  ３７℃
圧力  ２４．８ｋＰａ
カラム流量  ５ｍＬ／ｍｉｎ
流入方法  スプリット  １：０（実測１：１８）
トランスファー流量  ９０ｍＬ
ＧＣ注入量  １．８ｍＬ（トランスファー流量×注入時間）
カラムへの試料注入量  ０．１ｍＬ
注入口温度  ２５０℃
検出機  ＦＩＤ（水素  ４０ｍＬ／ｍｉｎ、空気  ４００ｍＬ／ｍｉｎ、メイクアップガス  ヘリウム  ３０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出器温度  ２５０℃【００８４】
イソプレン標準試料の調整
試薬イソプレン（比重０．６８１）を冷却したメタノールで１０、１００、１０００、１００００、１０００００倍希釈し、添加用標準溶液を調整した。その後、水１ｍＬを入れたヘッドスペースバイアルに各添加用標準溶液を、それぞれ１μＬ添加し、標準試料とした。【００８５】
表３に各菌株の反応２時間後のイソプレン生成量を記載した。【００８６】
【表３】
2013179722.tif 000004
【００８７】
表３の結果から、イソプレン生成量は高い順に、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株となり、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株とＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株はほぼ同等の値となった。上記の結果から、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株の粗酵素抽出液が最も高いイソプレン生成活性を示した。【００８８】
実施例５：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
実施例４の粗酵素活性の結果から、葉緑体移行シグナルを欠失したムクナ由来のイソプレンシンターゼで最も高い活性が確認された。その為、葉緑体移行シグナルを欠失した全てのイソプレンシンターゼ導入株について、グルコースからのイソプレン生産能を比較した。ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、及びＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を、ヘッドスペースバイアル中のＭ９グルコース培地１ｍＬに接種し、ヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）で密栓後、往復振とう培養装置（１２０ｒｐｍ）で、３０℃にて２４時間培養を行った。Ｍ９グルコース培地の組成は表４に記載のとおりである。【００８９】
【表４】
2013179722.tif 000005
【００９０】
培養終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。また、ＯＤ値は分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２９００）によって６００ｎｍで測定した。表５に各菌株の培養終了時のイソプレン濃度とＯＤ値を記載した。【００９１】
【表５】
2013179722.tif 000006
【００９２】
表５の結果から、イソプレン生産量は高い順に、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、そしてＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株となった。上記の結果から、野生株では、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株が最も高いイソプレン生産能を示した。【００９３】
実施例６：ＭＥＰ（メチルエリスリトール）経路を強化したＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
６−１）ｄｘｓ遺伝子発現用プラスミド（ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ）の構築
イソプレンシンターゼを導入したＥ．ｃｏｌｉでＭＥＰ経路を構成するｄｘｓ遺伝子（１−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｘｙｌｕｌｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現強化を行うと、イソプレン生成量が向上する事が既に報告されている（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２０１１）９０，１９１５−１９２２）。そこで、ｄｘｓ遺伝子の発現を強化した株においても、イソプレンシンターゼの由来の違いで、イソプレン生産能に相違が生じるかを確認した。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株のゲノムの全塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ０００９６）は既に明らかにされている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９７）２７７，１４５３−１４７４）。遺伝子増幅を行うためにｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社製）を用いた。本プラスミドは、マルチクローニングサイトに目的遺伝子を導入する事で、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加時に目的遺伝子の発現量を増加させる事が出来る。Ｅ．ｃｏｌｉのゲノム配列のｄｘｓ遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４５０６０  Ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ  ｂ０４２０）に基づいて、配列番号２３と配列番号２４の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを合成した。その後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株のゲノムを鋳型として、配列番号２３と配列番号２４の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて１２０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ｄｘｓ遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＭＷ２１９を鋳型として、配列番号２５と配列番号２６の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて２４０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ｐＭＷ２１９を含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたｄｘｓ遺伝子断片と、ｐＭＷ２１９のＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたｄｘｓ遺伝子発現用プラスミドをｐＭＷ２１９−ｄｘｓと命名した。【００９４】
【表６】
2013179722.tif 000007
【００９５】
６−２）イソプレン生産能を有するＥ.ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株へのｐＭＷ２１９−ｄｘｓの導入
ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、更にＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーション法によりｐＭＷ２１９−ｄｘｓを導入し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールと５０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシン塩酸塩を含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコールとカナマイシンに耐性を示す形質転換体を取得した。ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、更にＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株にｐＭＷ２１９−ｄｘｓがそれぞれ導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ、更にＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓと命名した。【００９６】
６−３）ＤＸＳの発現を強化したＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、更にＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールと５０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシン塩酸塩を含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。その後、実施例５に記載したヘッドスペースバイアルでの培養評価を実施した。培養終了時のイソプレン生産量（μｇ/L）とＯＤ値を表７に記載した。【００９７】
【表７】
2013179722.tif 000008
【００９８】
表７の結果から、イソプレン生産量は高い順に、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、そしてＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株となった。上記の結果から、ＭＥＰ経路強化株においても、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株が最も高いイソプレン生産能を示した。【００９９】
実施例７：ＭＶＡ（メバロン酸）経路を導入したＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
７−１）酵母由来のメバロン酸経路下流遺伝子のクローニング
メバロン酸経路の下流領域はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅより取得した（ＷＯ２００９０７６６７６，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／＃    Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｊａｎ  ２０１２；４０：Ｄ７００−Ｄ７０５）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型とし、メバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ１２遺伝子、ホスホメバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ８遺伝子、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＥＲＧ１９遺伝子、イソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼをコードするＩＤＩ１遺伝子を次に示すプライマーを用いたＰＣＲ反応により増幅した（表８）。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭＡＸ  Ｐｒｅｍｉｘを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５５℃、５秒、７２℃、５秒／ｋｂ）×３０サイクルの条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐベクター（配列番号１２）にｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、クローニングと発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換を行い、各遺伝子の想定配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。これら増幅した遺伝子の塩基配列、およびその遺伝子がコードする酵素のアミノ酸配列はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／＃にて取得可能である。【０１００】
【表８】
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【０１０１】
７−２）メバロン酸経路下流の人工オペロンの構築
メバロン酸キナーゼとホスホメバロン酸キナーゼを直鎖状に並べた配列の構築を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて行った。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型とし、メバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ１２遺伝子、ホスホメバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ８遺伝子を表９に示すプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ酵素には東洋紡より販売されているＫＯＤ  ｐｌｕｓを利用し、９４℃、２分、（９４℃、１５秒、４５℃、３０秒、６８℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、６８℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＵＣ１１８ベクターにｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、クローニングと発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に形質転換を行い、各遺伝子の想定配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。作成したプラスミドをｐＵＣ−ｍｖｋ−ｐｍｋと名付けた。ｐＵＣ−ｍｖｋ−ｐｍｋの塩基配列を配列番号３５に示す。【０１０２】
【表９】
2013179722.tif 000010
【０１０３】
ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼを直鎖状に並べた配列の構築を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて行った。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＥＲＧ１９遺伝子、イソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼをコードするＩＤＩ１遺伝子を表１０に示すプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ酵素には東洋紡より販売されているＫＯＤ  ｐｌｕｓを利用し、９４℃、２分、（９４℃、１５秒、４５℃、３０秒、６８℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、６８℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＴＷＶ２２８ベクターにｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、クローニングと発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換を行い、各遺伝子の想定配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。作成したプラスミドをｐＴＷＶ−ｄｍｄ−ｙｉｄｉと名付けた。ｐＴＷＶ−ｄｍｄ−ｙｉｄｉの塩基配列を配列番号４０に示す。【０１０４】
【表１０】
2013179722.tif 000011
【０１０５】
メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼを直鎖状に並べた配列の構築を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて行った。ｐＵＣ−ｍｖｋ−ｐｍｋを鋳型とし表１１に示すプライマーを用いてメバロン酸キナーゼとホスホメバロン酸キナーゼ配列をＰＣＲ法により増幅し、ｐＴＷＶ−ｄｍｄ−ｙｉｄｉを鋳型とし表１１に示すプライマーを用いてジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼをＰＣＲ法により増幅した後、ｐＴｒｃＨｉｓ２ＢベクターにＩｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にてクローニングを行うことで４種の酵素遺伝子を直鎖状に並べた発現プラスミドの構築を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は、制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩで処理したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクターにｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に形質転換を行い、目的配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。構築した発現ベクターをｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（β）と名付けた。ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（β）の塩基配列を配列番号４５に示す。【０１０６】
【表１１】
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【０１０７】
７−３）メバロン酸経路下流の染色体固定
メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼを直鎖状に並べた配列を染色体上で発現させる事とした。遺伝子の発現にはグルコースイソメラーゼプロモーターを利用し、転写終結にはＥ．ｃｏｌｉのａｓｐＡ遺伝子の転写終結領域を利用した（ＷＯ２０１００３１０６２）。染色体固定部位としてＴｎ７の転移部位を用いた（Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．１９８１；１８３（２）：３８０−７）。染色体固定後の薬剤マーカーとしてはｃａｔ遺伝子を利用した。表１２に示すプライマーを利用して、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムを鋳型としたＰＣＲにより染色体固定領域の内、Ｔｎ７下流領域の増幅を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。表１２に示すプライマーを利用して、ｐＭＷ１１８−ａｔｔＬ−Ｃｍ−ａｔｔＲプラスミドを鋳型としたＰＣＲによりλファージアッタチメント部位を含むｃａｔ遺伝子領域の増幅を行った（ＷＯ２０１０−０２７０２２）。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９５℃、３分、（９５℃、１分、３４℃、３０秒、７２℃、４０秒）×２サイクル、（９５℃、３０秒、５０℃、３０秒、７２℃、４０秒）×２５サイクル、７２℃、５分の条件で反応を行った。表１２に示すプライマーを利用して、ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（β）を鋳型としたＰＣＲによりプロモータと転写終結領域を付与したメバロン酸経路下流配列（以下ＫＫＤｙＩと略す）の増幅を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。これらのＰＣＲ産物と、制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＭＷ２１９を用い、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法によりベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に形質転換を行い、目的配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。得られたプラスミドをｐＭＷ２１９−ＫＫＤｙＩ−ＴａｓｐＡと名づけた。ｐＭＷ２１９−ＫＫＤｙＩ−ＴａｓｐＡの塩基配列を配列番号５０に示す。【０１０８】
次に、表１３に示すプライマーを利用して、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムを鋳型としたＰＣＲにより染色体固定領域の内、Ｔｎ７上流領域の増幅を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ産物と、制限酵素ＳａｌＩで処理したｐＭＷ２１９−ＫＫＤｙＩ−ＴａｓｐＡを用い、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法によりベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に形質転換を行い、目的配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。得られたプラスミドをｐＭＷ−Ｔｎ７−Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩ−ＴａｓｐＡ−Ｔｎ７と名づけた。構築したプラスミドの配列を配列番号５１に示す。【０１０９】
続いて、λ−Ｒｅｄ法を用いてクロラムフェニコール耐性遺伝子、グルコースイソメラーゼプロモーター、メバロン酸経路下流オペロン、ａｓｐＡ遺伝子転写終結領域を含む領域の染色体固定を行った。染色体固定用の断片は、プラスミドｐＭＷ−Ｔｎ７−Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩ−ＴａｓｐＡ−Ｔｎ７を抽出後、制限酵素ＰｖｕＩとＳａｌＩで処理した後、精製することで調整した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５に温度感受性の複製能を有するプラスミドｐＫＤ４６を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５（以下ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６と表記する）をエレクトロポレーションするために用いた。プラスミドｐＫＤ４６［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，ｐ６６４０−６６４５］は、アラビノース誘導性ＰａｒａＢプロモーターに制御されるλＲｅｄシステムの遺伝子（λ、β、ｅｘｏ遺伝子）を含むλファージの合計２１５４塩基のＤＮＡフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  アクセッション番号  Ｊ０２４５９，第３１０８８番目〜３３２４１番目）を含む。エレクトロポレーションの後、クロラムフェニコール耐性を獲得したコロニーを取得した。続いてゲノムＤＮＡを抽出し、表１４に示すプライマーを用いたＰＣＲにより目的領域が染色体に固定されていることを確認した。更に、ＰＣＲ断片の配列を確認することで目的領域の配列を確認した。染色体固定したメバロン酸経路下流とその周辺領域の塩基配列を配列番号５２に、構築概要を図３に示す。得られた変異体をＭＧ１６５５  ｃａｔ−Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩと名づけた。【０１１０】
ＭＧ１６５５  ｃａｔ−Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩの薬剤マーカーを以下の手順で除去した。ＭＧ１６５５  ｃａｔ−Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩのコンピテントセルを作成後ｐＭＷ−ｉｎｔ−ｘｉｓを導入した。ｐＭＷ−ｉｎｔ−ｘｉｓは、λファージのインテグラーゼ（Ｉｎｔ）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ（Ｘｉｓ）をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである（ＷＯ２００７／０３７４６０、特開２００５−０５８８２７）。【０１１１】
ｐＭＷ−ｉｎｔ−ｘｉｓの導入により、λファージのアタッチメントサイトであるａｔｔＬ及びａｔｔＲで挟まれた領域にあるクロラムフェニコール耐性遺伝子が染色体から脱落する。その結果として、宿主はクロラムフェニコール耐性を失うことが知られている。そこで、得られたコロニーからクロラムフェニコール感受性株を取得した。この後、４２度、ＬＢ培地で６時間培養の後、ＬＢプレート培地に塗布し、コロニーを出現させた。この中からアンピシリン耐性を失ったクローンを選抜することで、薬剤耐性を除去した。このようにして取得した変異体をＭＧ１６５５  Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩと名づけた。【０１１２】
【表１２】
2013179722.tif 000013
【０１１３】
【表１３】
2013179722.tif 000014
【０１１４】
【表１４】
2013179722.tif 000015
【０１１５】
７−４）染色体上メバロン酸経路下流のプロモーター置換
染色体上のメバロン酸経路下流オペロンのプロモーターをλ−ｒｅｄ法により置換した。ＰＣＲの鋳型として、ａｔｔＬ−Ｔｅｔ−ａｔｔＲ−Ｐｔａｃを有するゲノム断片を使用した。これは、ｔａｃプロモーターとテトラサイクリン耐性薬剤マーカー及びλファージのアタッチメントサイトであるａｔｔＬ及びａｔｔＲが並ぶものである。これらの配列を配列番号６３に示す。表１５に示すプロモーターを用いてＰＣＲ断片を調整した。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼを利用し、９２℃、１分、（９２℃、１０秒、５０℃、２０秒、７２℃、１分／ｋｂ）×４０サイクル、７２℃、７分の条件で反応を行った。ＰＣＲ産物を精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドｐＫＤ４６を含むＭＧ１６５５  Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩ（以下ＭＧ１６５５  Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩ／ｐＫＤ４６と表記する）をエレクトロポレーションするために用いた。プラスミドｐＫＤ４６［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，ｐ６６４０−６６４５］は、アラビノース誘導性ＰａｒａＢプロモーターに制御されるλＲｅｄシステムの遺伝子（λ、β、ｅｘｏ遺伝子）を含むλファージの合計２１５４塩基のＤＮＡフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  アクセッション番号  Ｊ０２４５９，第３１０８８番目〜３３２４１番目）を含む。プラスミドｐＫＤ４６はＰＣＲ産物をＭＧ１６５５  Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩに組み込むために必要である。【０１１６】
エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含んだＬＢ培地中で３０℃、一晩培養したＭＧ１６５５  Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩ／ｐＫＤ４６を、アンピシリンとＬ−アラビノース（１ｍＭ）を含んだ５ｍＬのＬＢ培地で１００倍希釈した。得られた希釈物を３０℃で通気しながらＯＤ６００が約０．６になるまで生育させた後、氷冷した１０％  グリセロール溶液で３回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。エレクトロポレーションは５０μＬのコンピテントセルと約１００ｎｇのＰＣＲ産物を用いて行った。エレクトロポレーション後のセルは１ｍＬのＳＯＣ培地［モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）］を加えて３７℃で１時間培養した後、ＬＢ寒天培地上、３７℃で平板培養し、クロラムフェニコール耐性組換え体を選択した。次に、ｐＫＤ４６プラスミドを除去するために、テトラサイクリン入りのＬＢ寒天培地上、３７℃で継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性を試験し、ｐＫＤ４６が脱落しているアンピシリン感受性株を取得した。テトラサイクリン耐性遺伝子によって識別できるｔａｃプロモーター置換を含む変異体を取得した。得られた変異体をＭＧ１６５５  ｔｅｔ−Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩと名づけた。【０１１７】
薬剤マーカーを以下の手順で除去した。ＭＧ１６５５  ｔｅｔ−Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩのコンピテントセルを作成後ｐＭＷ−ｉｎｔ−ｘｉｓを導入した。ｐＭＷ−ｉｎｔ−ｘｉｓは、λファージのインテグラーゼ（Ｉｎｔ）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ（Ｘｉｓ）をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである（ＷＯ２００７／０３７４６０、特開２００５−０５８８２７）。ｐＭＷ−ｉｎｔ−ｘｉｓの導入により、λファージのアタッチメントサイトであるａｔｔＬ及びａｔｔＲで挟まれた領域にあるテトラサイクリン耐性遺伝子が染色体から脱落する。その結果として、宿主はテトラサイクリン耐性を失うことが知られている。そこで、得られたコロニーからテトラサイクリン感受性株を取得した。この後、４２℃、ＬＢ培地で６時間培養の後、ＬＢプレート培地に塗布し、コロニーを出現させた。この中からアンピシリン耐性を失ったクローンを選抜することで、薬剤耐性を除去した。得られた変異体をＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩと名づけた。染色体上にてｔａｃプロモーターで支配されたメバロン酸経路下流およびその周辺領域の塩基配列を配列番号６４に、概要を図４に示す。【０１１８】
【表１５】
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【０１１９】
７−５）ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株への各植物種由来イソプレンシンターゼの導入
ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーション法によりｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ、更にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰを導入し、６０  （ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐが導入された株をＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫが導入された株をＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭが導入された株をＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰが導入された株をＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株と命名した。【０１２０】
７−６）ＭＶＡ経路を強化したＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、更にＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を、ヘッドスペースバイアル中（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  ２２  ｍＬ  ＣＬＥＡＲ  ＣＲＩＭＰ  ＴＯＰ  ＶＩＡＬ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６）のＭ９グルコース（メバロン酸含有）培地１ｍＬに接種し、その後、実施例２に記載した方法に従って、培養評価を実施した。Ｍ９グルコース（メバロン酸含有）培地の組成を表１６に記載した。培養終了時のイソプレン生産量とＯＤ値を表１７に記載した。【０１２１】
【表１６】
2013179722.tif 000017
【０１２２】
【表１７】
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【０１２３】
表１７の結果から、イソプレン生産量は高い順に、ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、そしてＭＧ１６５５  Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株となった。上記の結果から、ＭＶＡ経路導入株においても、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株が最も高いイソプレン生産能を示した。【０１２４】
実施例８：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来粗酵素抽出液を用いた各植物種由来イソプレンシンターゼの酵素活性測定
１）各植物種由来ＩｓｐＳ遺伝子発現用プラスミドの構築
コリネ型細菌としてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ２２５６株（ＡＴＣＣ１３８６９）を利用した（Ｏｋｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９６２，Ｓａｎｔａｍａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｔｓｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＰ遺伝子、及びＩｓｐＳＭ遺伝子を発現させる為のプラスミドは次の手順で構築した。ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＫを鋳型として、配列番号６７と配列番号６８に示す合成オリゴヌクレオチド、ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＰを鋳型として、配列番号６９と配列番号７０に示す合成オリゴヌクレオチド、更にはｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭを鋳型として、配列番号７１と配列番号７２に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調製し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１２０秒の反応を３０サイクル行った。その結果、ＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＰ遺伝子、及びＩｓｐＳＭ遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。次にＥｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｔｕのプロモーター配列（以下、Ｐ０４８０）を取得する目的でＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ２２５６株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行った。ＩｓｐＳＫ遺伝子とＰ０４８０を組み合わせる目的で、ＰＣＲのプライマーとして配列番号７３と配列番号７４に示す合成ヌクレオチドを利用した。また、ＩｓｐＳＰ遺伝子とＰ０４８０を組み合わせる目的で、ＰＣＲのプライマーとして配列番号７３と配列番号７５に示す合成ヌクレオチドを利用した。また、ＩｓｐＳＭ遺伝子とＰ０４８０を組み合わせる目的で、ＰＣＲのプライマーとして配列番号７３と配列番号７６に示す合成オリゴヌクレオチドを利用した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いた。反応溶液はキットに添付された組成に従って調製し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて３０秒の反応を３０サイクル行った。その結果、Ｐ０４８０を含むＰＣＲ産物を取得した。Ｐ０４８０の配列情報を配列番号７７に示す。続いてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍとＥ．ｃｏｌｉのシャトルベクター・ｐＶＫ９を制限酵素ＸｂａＩ（タカラバイオ社製）にて消化した（Ｍｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）。ｐＶＫ９の配列情報を配列番号７８に示す。精製したＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＰ遺伝子、及びＩｓｐＳＭ遺伝子遺伝子断片と、Ｐ０４８０のＰＣＲ産物、ＸｂａＩにて消化後精製したｐＶＫ９を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＩｓｐＳＫ遺伝子発現用プラスミドをｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＫ、ＩｓｐＳＰ遺伝子発現用プラスミドをｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＰ、ＩｓｐＳＭ遺伝子発現用プラスミドをｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＭと命名し、これらの配列情報をそれぞれ配列番号７９、８０、８１に示した。【０１２５】
２）イソプレン生産能を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ２２５６株の構築
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ２２５６株をＣＭ−Ｄｅｘ培地４ｍｌを容れた試験管に植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍにて対数増殖期まで培養した。この菌体を集菌し、氷冷した１０％グリセロールにて２〜３回洗浄後、１００〜２００倍程度に濃縮したものをコンピテントセルとした。コンピテントセルとｐＶＫ９、ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＫ、ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＰ、ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＭの各プラスミドＤＮＡとを良く混合し、パルス印加を行った。バルス印加は、ＢＩＯＲＡＤ社・ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＸＣｅｌｌを使用し、１．８ｋＶ、２５μＦ、２００Ωの条件で実施した。バルス印加後、ＣＭ−Ｄｅｘ培地にて約１〜２時間回復培養を行い、その後、Ｋｍ５０μｇ／ｍｌを含むＣＭ−Ｄｅｘプレート培地に塗布し、３０℃にて１８〜２４時間培養した。培養後のプレートから、カナマイシン耐性を示す形質転換体を取得した。ＣＭ−Ｄｅｘ培地の組成を表１８に示す。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ２２５６株にｐＶＫ９が導入された株を２２５６／ｐＶＫ９株、ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＫが導入された株を２２５６／ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＫ株、ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＰが導入された株を２２５６／ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＰ株、ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＭが導入された株を２２５６／ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＭ株と命名した。【０１２６】
【表１８】
2013179722.tif 000019
必要に応じてカナマイシンが終濃度50  (mg/L)になるように添加した。
プレートの場合、寒天20g/Lを添加した。【０１２７】
３）粗酵素抽出液の調製方法
２２５６／ｐＶＫ９株、２２５６／ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＫ株、２２５６／ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＰ株、及び２２５６／ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＭ株を、５０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシンを含むＣＭ−Ｄｅｘプレートに均一に塗布し、３０℃にて１８時間培養した。培養後のプレートから、１／６プレート分の菌体を５０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシンを含むＣＭ−Ｄｅｘ培地２０ｍｌを張り込んだ坂口フラスコに接種し、３０℃にて６時間培養した。培養液より菌体を５０００ｒｐｍ、５分の条件で遠心操作により分離し、イソプレンシンターゼバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）・２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２・５％グリセロール）にて２回洗浄した。洗浄後の菌体を同バッファー１．８ｍｌに懸濁した。２ｍｌ容積のマルチビーズショッカー専用チューブに約０．９ｍｌの破砕用ビーズ（ＹＢＧ０１，直径０．１ｍｍ）と菌体懸濁液０．９ｍｌを入れ、安井器械製マルチビーズショッカー（ＭＢ７０１（Ｓ）型）にて２５００ｒｐｍ、６０秒ＯＮ・６０秒ＯＦＦを６サイクルの条件で菌体を破砕した。菌体破砕操作後、チューブを２００００ｇ、２０分の条件の遠心操作により上清画分を得て、これを粗酵素抽出液とした。【０１２８】
４）イソプレンシンターゼ活性の測定
２２５６／ｐＶＫ９株、２２５６／ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＫ株、２２５６／ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＰ株、及び２２５６／ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＭ株の粗酵素抽出液のタンパク質濃度をビシンコニン酸法（ＢＣＡ法）により測定した。測定試薬として、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック社、Ｃａｔ．＃２３２２７）を用いた。総タンパク量として２ｍｇの粗酵素抽出液とイソプレンバッファーを合わせて０．５ｍｌとなるよう調製し、これをヘッドスペースバイアルに入れ、その後、０．５Ｍ  ＭｇＣｌ２溶液０．０２５ｍｌと０．２Ｍ  ＤＭＡＰＰ（ｃａｙｍａｎ製，Ｃａｔｌｏｇ  Ｎｏ．６３１８０）溶液０．０１ｍｌを加えて軽く攪拌した後、すぐに密栓し３７℃、２時間の条件で反応を行った。反応後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。ヘッドスペースバイアルとして、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  ２２ｍＬ  ＣＬＥＡＲ  ＣＲＩＭＰ  ＴＯＰ  ＶＩＡＬ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６を、密栓用のキャップとして、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０を利用した。
表１９に各菌株の反応２時間後のイソプレン生成量を記載した。【０１２９】
【表１９】
2013179722.tif 000020
【０１３０】
表１９の結果から、イソプレン生成量は高い順に、２２５６／ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＭ株、２２５６／ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＫ株となり、２２５６／ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＰ株と２２５６／ｐＶＫ９株は同等となった。上記の結果から、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株の粗酵素抽出液が最も高いイソプレン生成活性を示した。【０１３１】
実施例９：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ２２５６株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
１）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ２２５６株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
２２５６／ｐＶＫ９株、２２５６／ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＫ株、２２５６／ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＰ株、及び２２５６／ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＭ株を、５０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシンを含むＣＭ−Ｄｅｘプレートに均一に塗布し、３０℃にて１８〜２４時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を、ヘッドスペースバイアル内のＭＭ−グルコース培地１ｍＬに接種し、密栓後、往復振とう培養装置で、３０℃にて１２０ｒｐｍ、２４時間の培養を行った。ヘッドスペースバイアルとしてＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  ２２ｍＬ  ＣＬＥＡＲ  ＣＲＩＭＰ  ＴＯＰ  ＶＩＡＬ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６を、密栓用のキャップとしてＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０を利用した。
ＭＭ−グルコース培地の組成は表２０に記載のとおりである。【０１３２】
【表２０】
2013179722.tif 000021
必要に応じてカナマイシンが終濃度50  (mg/L)になるように添加した。
1Lに調製後、濾過滅菌を行った。【０１３３】
培養終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。また、ＯＤ値は分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２９００）によって６６０ｎｍで測定した。
表２１に各菌株の培養終了時のイソプレン濃度を記載した。【０１３４】
【表２１】
2013179722.tif 000022
【０１３５】
表２１の結果から、イソプレン生産量は高い順に、２２５６／ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＭ株、２２５６／ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＫ株となった。２２５６／ｐＶＫ９株、２２５６／ｐＶＫ９−Ｐ０４８０−ＩｓｐＳＰ株からイソプレンは未検出となった。上記の結果から、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ２２５６の野生株において、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株が最も高いイソプレン生産能を示した。【０１３６】
実施例１０：Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ由来粗酵素抽出液を用いた各植物種由来イソプレンシンターゼの酵素活性測定
１）イソプレン生産能を有するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５株の構築
Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５株のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーション法によりｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ、更にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭを導入し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３０℃にて１８時間培養した。その後、得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５株にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐが導入された株をＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫが導入された株をＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰが導入された株をＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭが導入された株をＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株と命名した。【０１３７】
２）粗酵素抽出液の調製方法
実施例４に記載してある方法に順じて、粗酵素活性を測定した。ＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、及びＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３０℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１／６プレート分の菌体を６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢ２０ｍｌを張り込んだ坂口フラスコに接種し、３４℃にて６時間培養した。培養液より菌体を６０００ｒｐｍ、４℃、５分の条件で遠心分離し、氷冷したイソプレンシンターゼバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）・２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２・５％グリセロール）にて２回洗浄した。洗浄菌体を同バッファー１．８ｍｌに懸濁した。２ｍｌ容のマルチビーズショッカー専用チューブに約０．９ｍｌの破砕用ビーズ（ＹＢＧ０１，直径０．１ｍｍ）と菌体懸濁液０．９ｍｌを入れ、安井器械製マルチビーズショッカー（ＭＢ７０１（Ｓ）型）にて２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒ＯＮ・３０秒ＯＦＦを３サイクルの条件で菌体を破砕した。破砕後チューブを２００００ｇ、４℃、２０分の条件で遠心し、上清を粗酵素抽出液とした。【０１３８】
３）イソプレンシンターゼ活性の測定
ＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、及びＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株の粗酵素抽出液（ブラッドフォード法にて総タンパク量として２ｍｇになるように定量した）とイソプレンバッファーを合わせて０．５ｍｌをヘッドスペースバイアル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  ２２ｍＬ  ＣＬＥＡＲ  ＣＲＩＭＰ  ＴＯＰ  ＶＩＡＬ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６）に入れ、０．５Ｍ  ＭｇＣｌ２溶液０．０２５ｍｌと０．２Ｍ  ＤＭＡＰＰ（ｃａｙｍａｎ製，Ｃａｔｌｏｇ  Ｎｏ．６３１８０）溶液０．０１ｍｌを加えて軽く攪拌した後、すぐにヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）にて密栓、３７℃にて２時間保温した。
反応終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。【０１３９】
【表２２】
2013179722.tif 000023
【０１４０】
表２２の結果から、イソプレン生成量は高い順に、ＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、ＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株となり、ＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、ＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株となった。上記の結果から、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株の粗酵素抽出液が最も高いイソプレン生成活性を示した。【０１４１】
実施例１１：Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５株においても、葉緑体移行シグナルを欠失した全てのイソプレンシンターゼ導入株について、グルコースからのイソプレン生産能を比較した。ＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、及びＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３０℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を、ヘッドスペースバイアル中のＭ９グルコース培地１ｍＬに接種し、ヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）で密栓後、往復振とう培養装置（１２０ｒｐｍ）で、３０℃にて２４時間培養を行った。培養終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定し、ＯＤ値は分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２９００）によって６００ｎｍで測定した。表２３に各菌株の培養終了時のイソプレン濃度とＯＤ値を記載した。【０１４２】
【表２３】
2013179722.tif 000024
【０１４３】
表２３の結果から、イソプレン生産量は高い順に、ＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、ＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、そしてＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株となった。上記の結果から、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５株においても、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株が最も高いイソプレン生産能を示した。【０１４４】
実施例１２：Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＡＪ１１０６３７由来粗酵素抽出液を用いた各植物種由来イソプレンシンターゼの酵素活性測定
１）イソプレン生産能を有するＥ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＡＪ１１０６３７株の構築
Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＡＪ１１０６３７株のコンピテントセルを調製後、エレクトロポレーション法によりｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ、更にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭを導入し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。その後、得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＡＪ１１０６３７株にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐが導入された株をＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫが導入された株をＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰが導入された株をＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭが導入された株をＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株と命名した。【０１４５】
２）粗酵素抽出液の調製方法
実施例４に記載してある方法に順じて、粗酵素活性を測定した。ＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、及びＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１／６プレート分の菌体を６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢ２０ｍｌを張り込んだ坂口フラスコに接種し、３７℃にて４時間培養した。培養液より菌体を８０００ｒｐｍ、４℃、１０分の条件で遠心分離し、氷冷したイソプレンシンターゼバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）・２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２・５％グリセロール）にて２回洗浄した。洗浄菌体を同バッファー１．８ｍｌに懸濁した。２ｍｌ容のマルチビーズショッカー専用チューブに約０．９ｍｌの破砕用ビーズ（ＹＢＧ０１，直径０．１ｍｍ）と菌体懸濁液０．９ｍｌを入れ、安井器械製マルチビーズショッカー（ＭＢ７０１（Ｓ）型）にて２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒ＯＮ・３０秒ＯＦＦを３サイクルの条件で菌体を破砕した。破砕後チューブを２００００ｇ、４℃、２０分の条件で遠心し、上清を粗酵素抽出液とした。【０１４６】
３）イソプレンシンターゼ活性の測定
ＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、及びＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株の粗酵素抽出液（ブラッドフォード法にて総タンパク量として２ｍｇになるように定量した）とイソプレンバッファーを合わせて０．５ｍｌをヘッドスペースバイアル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  ２２ｍＬ  ＣＬＥＡＲ  ＣＲＩＭＰ  ＴＯＰ    ＩＡＬ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６）に入れ、０．５Ｍ  ＭｇＣｌ２溶液０．０２５ｍｌと０．２Ｍ  ＤＭＡＰＰ（ｃａｙｍａｎ製，Ｃａｔｌｏｇ  Ｎｏ．６３１８０）溶液０．０１ｍｌを加えて軽く攪拌した後、すぐにヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）にて密栓、３７℃にて２時間保温した。
反応終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィー
により測定した。
表２４に各菌株の反応２時間後のイソプレン生成量を記載した。【０１４７】
【表２４】
2013179722.tif 000025
【０１４８】
表２４の結果から、イソプレン生成量は高い順に、ＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、ＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、そしてＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株となった。上記の結果から、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株の粗酵素抽出液が最も高いイソプレン生成活性を示した。【０１４９】
実施例１３：Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＡＪ１１０６３７株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＡＪ１１０６３７株においても、葉緑体移行シグナルを欠失した全てのイソプレンシンターゼ導入株について、グルコースからのイソプレン生産能を比較した。ＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、及びＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３０℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を、ヘッドスペースバイアル中のＭ９グルコース培地１ｍＬに接種し、ヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）で密栓後、往復振とう培養装置（１２０ｒｐｍ）で、３０℃にて２４時間培養を行った。培養終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定し、ＯＤ値は分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２９００）によって６００ｎｍで測定した。表２５に各菌株の培養終了時のイソプレン濃度とＯＤ値を記載した。【０１５０】
【表２５】
2013179722.tif 000026
【０１５１】
表２５の結果から、イソプレン生産量は高い順に、ＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、ＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、そしてＡＪ１１０６３７／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株となった。上記の結果から、Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＡＪ１１０６３７株においても、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株が最も高いイソプレン生産能を示した。【０１５２】
実施例１４：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来粗酵素抽出液を用いた各植物種由来イソプレンシンターゼの酵素活性測定
１）各植物種由来ＩｓｐＳ遺伝子発現用プラスミドの構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＰ遺伝子、及びＩｓｐＳＭ遺伝子を発現させる為のプラスミドは次の手順で構築した。ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＫを鋳型として、配列番号８２と配列番号８３に示す合成オリゴヌクレオチド、ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＰを鋳型として、配列番号８４と配列番号８５に示す合成オリゴヌクレオチド、更にはｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭを鋳型として、配列番号８６と配列番号８７に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調製し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１２０秒の反応を３０サイクル行った。その結果、ＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＰ遺伝子、及びＩｓｐＳＭ遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。一方、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとＥ．ｃｏｌｉのシャトルベクター・ｐＹＥＳ２（インビトロジェン社Ｃａｔ．ｎｏ．Ｖ８２５−２０）を制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）にて消化した。その後、精製されたＩｓｐＳＫ遺伝子を含むＰＣＲ断片とＫｐｎＩにて消化後精製したｐＹＥＳ２を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＩｓｐＳＫ遺伝子発現用プラスミドをｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＫと命名した。同様に、精製されたＩｓｐＳＰ遺伝子を含むＰＣＲ断片とＫｐｎＩにて消化後精製したｐＹＥＳ２を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＩｓｐＳＰ遺伝子発現用プラスミドをｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＰと命名した。同様に、精製されたＩｓｐＳＭ遺伝子を含むＰＣＲ断片とＫｐｎＩにて消化後精製したｐＹＥＳ２を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＩｓｐＳＭ遺伝子発現用プラスミドをｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＭと命名した。【０１５３】
２）イソプレン生産能を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株の構築
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株のコンピテントセルをＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＫｉｔＩＩ（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社，Ｃａｔ．ｎｏ．Ｔ２００１）を用いて調製した。同キットのプロトコールに従って、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＫ、ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＰ、更にｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＭをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株のコンピテントセルに導入し、ＳＤ−Ｕｒａプレートに均一に塗布し、３０℃にて２日間培養した。その後、得られたプレートから、Ｕｒａ要求性が消失した形質転換体を取得した。ＳＤ−Ｕｒａ培地の組成は表２６に記載のとおりである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株にｐＹＥＳ２が導入された株をＳ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２株、ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＫが導入された株をＳ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＫ株、ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＰが導入された株をＳ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＰ株、ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＭが導入された株をＳ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＭ株と命名した。【０１５４】
【表２６】
2013179722.tif 000027
【０１５５】
３）粗酵素抽出液の調製方法
Ｓ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２株、Ｓ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＫ株、Ｓ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＰ株、及びＳ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＭ株を、ＳＤ−Ｕｒａプレートに均一に塗布し、３０℃にて２４時間培養した。得られたプレートから、１／４プレート分の菌体をＳＤ−Ｕｒａ  Ｇａｌａｃｔｏｓｅ（ＳＤ−Ｕｒａ培地のＧｌｕｃｏｓｅをＧａｌａｃｔｏｓｅに換えた培地）培地５０ｍｌを張り込んだ坂口フラスコに接種し、３０℃にて１６時間培養した。ＳＤ−Ｕｒａ  Ｇａｌａｃｔｏｓｅ培地の組成を表２７に示す。培養液より菌体を３０００ｒｐｍ、５分の条件で遠心分離し、イソプレンシンターゼバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）・２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２・５％グリセロール）にて２回洗浄した。洗浄菌体を同バッファー１．８ｍｌに懸濁した。２ｍｌ容のマルチビーズショッカー専用チューブに約０．９ｍｌの破砕用ビーズ（ＹＢＧ０５，直径０．５ｍｍ）と菌体懸濁液０．９ｍｌを入れ、安井器械製マルチビーズショッカー（ＭＢ７０１（Ｓ）型）にて２５００ｒｐｍ、６０秒ＯＮ・６０秒ＯＦＦを１２サイクルの条件で菌体を破砕した。破砕後チューブを２００００ｇ、２０分の条件で遠心し、上清を粗酵素抽出液とした。【０１５６】
【表２７】
2013179722.tif 000028
【０１５７】
４）イソプレンシンターゼ活性の測定
Ｓ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２株、Ｓ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＫ株、Ｓ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＰ株、及びＳ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＭ株の粗酵素抽出液の粗酵素抽出液のタンパク質濃度をビシンコニン酸法（ＢＣＡ法）により測定した。測定試薬として、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック社、Ｃａｔ．＃２３２２７）を用いた。総タンパク量として０．４ｍｇの粗酵素抽出液とイソプレンバッファーを合わせて０．２５ｍｌとなるよう調製し、これをヘッドスペースバイアルに入れ、０．５Ｍ  ＭｇＣｌ２溶液０．０１２５ｍｌと０．２Ｍ  ＤＭＡＰＰ（ｃａｙｍａｎ製，Ｃａｔｌｏｇ  Ｎｏ．６３１８０）溶液０．００５ｍｌを加えて軽く攪拌した後、すぐにヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）にて密栓、３７℃にて２時間の条件で反応を行った。反応後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。ヘッドスペースバイアルとして、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  ２２ｍＬ  ＣＬＥＡＲ  ＣＲＩＭＰ  ＴＯＰ  ＶＩＡＬ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６を、密栓用のキャップとして、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０を利用した。
表２８に各菌株の反応２時間後のイソプレン生成量を記載した。【０１５８】
【表２８】
2013179722.tif 000029
【０１５９】
表２８の結果から、イソプレン生成量は高い順に、Ｓ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２  −ＩｓｐＳＭ株、Ｓ２８８Ｃ  ／ｐＹＥＳ２  −ＩｓｐＳＫ株となり、Ｓ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＰ株とＳ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２株は同等となった。上記の結果から、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株の粗酵素抽出液が最も高いイソプレン生成活性を示した。【０１６０】
実施例１５：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
１）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃにおける、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
Ｓ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２株、Ｓ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＫ株、Ｓ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＰ株、及びＳ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＭ株を、ＹＰＤプレートに均一に塗布し、３０℃にて１８〜２４時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を、ヘッドスペースバイアル中（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製  ２２ｍＬ  ＣＬＥＡＲ  ＣＲＩＭＰ  ＴＯＰ  ＶＩＡＬ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６）のＳＤ−Ｕｒａ２培地（グルコース，ガラクトース各１ｇ／Ｌを含む）１  ｍＬに接種し、ヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ  ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）で密栓後、往復振とう培養装置にて、３０℃１２０ｒｐｍの条件で２４時間培養を行った。ＹＰＤ培地の組成を表２９に、ＳＤ−Ｕｒａ２培地の組成は表３０に記す。【０１６１】
【表２９】
2013179722.tif 000030
【０１６２】
【表３０】
2013179722.tif 000031
【０１６３】
培養終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。
また、ＯＤ値は分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−２９００）によって６００ｎｍで測定した。表３１に各菌株の培養終了時のイソプレン濃度を記載した。【０１６４】
【表３１】
2013179722.tif 000032
【０１６５】
表３１の結果から、イソプレン生産量は高い順に、Ｓ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＭ株、Ｓ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＫ株となった。Ｓ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２株、Ｓ２８８Ｃ／ｐＹＥＳ２−ＩｓｐＳＰ株からイソプレンは未検出となった。上記の結果から、野生株では、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株が最も高いイソプレン生産能を示した。【０１６６】
実施例１６：イソプレンシンターゼの安定性比較
１）発現用プラスミドの構築
ムクナ由来イソプレンシンターゼの大量発現用プラスミドの構築を次の手順で行った。ベクター部分について、ｐＣｏｌｄ−ＴＦ（ＴａＫａＲａ社製、＃３３６５、配列情報はＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤ  ＡＢ２１３６５４）を鋳型とし、配列番号８８と配列番号８９に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲを行った。インサートについてはｐＵＣ５７−ｉｓｐＳＭを鋳型とし、配列番号９０と配列番号９１に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲを行った。ＰＣＲ法のポリメラーゼはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ（ＴａＫａＲａ社製）を利用し、反応溶液はキットに添付された組成に従って調製し、反応条件は９５℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて６分間を一連のサイクルとし、３０回繰り返した。得られたこれらのＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。構築したプラスミドをｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＩｓｐＳＭと名付けた。ｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＩｓｐＳＭの塩基配列を配列番号９２に示す。
ポプラ由来イソプレンシンターゼの大量発現用プラスミドの構築を次の手順で行った。ベクター部分について、ｐＣｏｌｄ−ＴＦを鋳型とし、配列番号８８と配列番号８９に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲを行った。インサートについてはｐＵＣ５７−ｉｓｐＳＰを鋳型とし、配列番号９３と配列番号９４に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲを行った。ＰＣＲ法のポリメラーゼはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ（ＴａＫａＲａ社製）を利用し、反応溶液はキットに添付された組成に従って調製し、反応条件は９５℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて６分間を一連のサイクルとし、３０回繰り返した。得られたこれらのＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。構築したプラスミドをｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＩｓｐＳＰと名付けた。ｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＩｓｐＳＰの塩基配列を配列番号９５に示す。
クズ由来イソプレンシンターゼの大量発現用プラスミドの構築を次の手順で行った。ベクター部分について、ｐＣｏｌｄ−ＴＦを鋳型とし、配列番号８８と配列番号８９に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲを行った。インサートについてはｐＵＣ５７−ｉｓｐＳＫを鋳型とし、配列番号９６と配列番号９７に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲを行った。ＰＣＲ法のポリメラーゼはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ（ＴａＫａＲａ社製）を利用し、反応溶液はキットに添付された組成に従って調製し、反応条件は９５℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて６分間を一連のサイクルとし、３０回繰り返した。得られたこれらのＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。構築したプラスミドをｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＩｓｐＳＫと名付けた。ｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＩｓｐＳＫの塩基配列を配列番号９８に示す。
これらの発現ベクターの構築においてイソプレンシンターゼはｔｒｉｇｇｅｒ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＦ）をＮ末端に融合した蛋白質として発現するよう設計した。ＴＦとイソプレンシンターゼの融合タンパク質をＴＦ−ＩｓｐＳと命名した。ムクナ由来イソプレンシンターゼの融合タンパク質をＴＦ−ＩｓｐＳＭ、ポプラ由来イソプレンシンターゼの融合タンパク質をＴＦ−ＩｓｐＳＰ、葛由来イソプレンシンターゼの融合タンパク質をＴＦ−ＩｓｐＳＫと名付けた。
ｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＩｓｐＳＭ，ｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＩｓｐＳＰ，ｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＩｓｐＳＫそれぞれをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）のコンピテントセル（ｏｎｅ  ｓｈｏｔ  ＢＬ  ２１（ＤＥ３）、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にヒートショック法により形質転換を行った。４２℃、３０秒のヒートショックの後、ＳＯＣ培地を用いた回復培養を３７℃、１時間、１２０ｒｐｍの条件で実施した。その後、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢプレートに全量播種し、３７℃、１４時間静置培養した。【０１６７】
２）イソプレンシンターゼの大量調製のための培養
形成されたコロニーをピックし、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含む５ｍＬ  ＬＢ培地に植菌した後、ＯＤ６００＝１．０になるまで３７℃、２００ｒｐｍで培養した。当該ＯＤ値に到達したことを確認した後、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地１００ｍｌを張り込んだ５００ｍＬ容量の坂口フラスコに全量を植菌し、ＯＤ６００＝１．０に到達するまで３７℃、１２０ｒｐｍで培養した。その後、１Ｍイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭになるよう添加し、１５℃、１００ｒｐｍで終夜培養した。培養終了後、８０００×ｇ、１０分で遠心分離して菌体を回収し、精製操作を行うまで−２０℃にて保存した。【０１６８】
３）イソプレンシンターゼの精製
イソプレンシンターゼの精製はＨｉｓ−ｔａｇカラムを利用して行った。培養終了後のブロス１００ｍＬより得られた菌体を５０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ８）、５００ｍＭ  ＮａＣｌからなる破砕バッファー２４０ｍＬに懸濁し、超音波破砕機（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０、Ｂａｒａｎｓａｎ社製）を用いて、ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ  ５０％、ｏｕｔｐｕｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ６の条件にて、８分間、氷上にて超音波破砕を実施した。超音波破砕後、１４０００×ｇ、２０分の遠心分離操作により破砕上清を得た。以下の精製操作は全て４℃にて実施した。ｐｏｌｙｐｒｅｐ  ｃｏｌｕｍｎ（ＢｉｏＲａｄ社製）にＨｉｓ−ｓｅｌｅｃｔ  Ｎｉｃｋｅｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ社製）を、ベッドボリューム２ｍＬ相当をアプライし、重力法により充填した。次に破砕バッファー１０ｍＬをアプライし、重力法で平衡化を実施した。このカラムに対し超音波破砕後の破砕上清を全量アプライし、ＴＦ−ＩｓｐＳをカラムに吸着させた。
アプライした破砕上清の全量がカラムを通過したことを確認した後、破砕バッファー１０ｍＬでカラムを洗浄した。更に、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２からなる活性測定用バッファー１０ｍＬでカラムを追加洗浄した。その後、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅからなる洗浄液をカラムに４ｍＬアプライし、通過液を廃棄した。最後に、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅからなる溶出液を４ｍＬカラムにアプライし、ＴＦ−ＩｓｐＳの溶出を行った。溶出後のＴＦ−ＩｓｐＳをゲル濾過カラム（ａｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ  ＭＷＣＯ１００ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社））で濃縮した。
続いて、ＴＦ−ＩｓｐＳ融合タンパク質の融合部分を切断した。切断には、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を利用した。反応バッファーは、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２からなり、２６Ｕ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａを添加し、４℃にて、１４時間反応を行った。反応終了後の反応液を、Ｈｉｓ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｎｉｃｋｅｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌに通過させることにより、ＴＦのみがＨｉｓ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｎｉｃｋｅｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌに吸着する事を利用して、反応液中からＴＦを除去した。続いてゲル濾過カラム（ａｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ  ＭＷＣＯ５０ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてＩｓｐＳを濃縮した。得られた濃縮液をＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｌｏｇｉｅｓ社製）で展開し、純度検定を実施した。展開したゲルをＣＢＢ染色した結果、ＩｓｐＳ以外の不純物由来のバンドが観測されなかったことから、純度は９９％程度と推定した。
このようにして得られたＩｓｐＳＭ溶液とＩｓｐＳＫ溶液は、活性測定用バッファーに対して終濃度５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌを添加して活性測定に供するまで−８０℃冷凍庫で保存した。また、ＩｓｐＳＰ溶液は終濃度５％  ＰＥＧ６００を添加して、活性測定に供するまで−８０℃冷凍庫で保存した。【０１６９】
４）イソプレンシンターゼの活性測定
ＩｓｐＳＭ、ＩｓｐＳＫ、ＩｓｐＳＰを氷上で解凍し、バッファー交換によりｇｌｙｃｅｒｏｌやＰＥＧ６００を除去した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の比色定量によりタンパク質濃度を統一した。イソプレン反応液５０μＬは、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，４ｍＭ  ＤＭＡＰＰ，１μｇ  ＩｓｐＳから構成される。このイソプレン反応液５０μｌを０．２ｍｌ容積のＰＣＲ  ｔｕｂｅ（日本ジェネティクス社製）に入れ、蓋に穴を穿った。次に、このチューブを４５０μＬの純水を張り込んだ２２ｍＬ  バイアル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）に入れ、直ちにヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で密栓した。イソプレン生成反応は４０℃にて２３８時間行った。発生したイソプレンの定量は、４−２）および４−３）に記載の方法に従った。結果を表３２に示す。結果に示す通り、ムクナ由来イソプレンシンターゼはクズ由来イソプレンシンターゼと比較し１０倍程度高いイソプレン生産能を有することが明らかとなった。【０１７０】
【表３２】
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【０１７１】
５）イソプレンシンターゼの安定性の比較
上記の方法で精製した各ＩｓｐＳを、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液中にて、４℃、４８時間保存した。上で述べた方法に従って、保存前後の各種イソプレンシンターゼが酵素反応により産出するイソプレン生産量をガスクロマトグラフィーにて解析した。保存前のイソプレン生産量で、保存後の生産量を割り返して比較した。その結果、ムクナ由来イソプレンシンターゼは、葛由来イソプレンシンターゼ、ポプラ由来イソプレンシンターゼと比べ、優れた安定性を持つことが明らかになった。【０１７２】
【表３３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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