(57)【要約】【課題】細胞毒性がほとんどない一酸化窒素産生阻害活性を備える組成物を提供すること。【解決手段】ドジョウおよびドジョウと棲息態様が同じ魚類の乾燥魚肉または前記乾燥魚肉の処理物を有効成分として含むことを特徴とする。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドジョウおよびドジョウと棲息態様が同じ魚類の乾燥魚肉または前記乾燥魚肉の処理物を有効成分として含むことを特徴とする一酸化窒素産生阻害活性を備える組成物。
【請求項２】
前記処理物は、前記乾燥魚肉から冷浸抽出した抽出物であることを特徴とする請求項１に記載の一酸化窒素産生阻害活性を備える組成物。
【請求項３】
前記抽出物は、アルコール類をもって冷浸抽出した抽出物であることを特徴とする請求項２に記載の一酸化窒素産生阻害活性を備える組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一酸化窒素産生阻害活性を備える組成物に係り、特に細胞毒性がほとんどない一酸化窒素産生阻害活性を備える組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、一酸化窒素（ＮＯ）はＬ−アルギニンから一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）によって産生される。皮膚において一酸化窒素は、感染、紫外線照射、抗原刺激などで産生され、感染防御、創傷治癒、炎症、疼痛増強など様々な作用を持つことが報告さられている。【０００３】
また、アトピー性皮膚炎などの慢性掻痒性皮膚疾患の痒みには、Ｈ１受容体拮抗薬が無効であることが多く、激しい痒みを伴うアトピー性皮膚炎や乾癬などの皮膚では、一酸化窒素が増加していることが報告されている。【０００４】
また、表皮ケラチノサイトが、痒みのメディエーターであるロイコトリエンＢ４、トロンボキサンＡ２、ノシセプチン、一酸化窒素、過酸化水素を産生、遊離し、それらのメディエーターの作用として、一酸化窒素以外のメディエーターは痒みを誘発させる因子、一酸化窒素は痒みを増強させる因子であることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１５５８２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように体内に産生された一酸化窒素は、例えば皮膚において感染防御、創傷治癒、炎症、疼痛増強など様々な症状の原因となるので、その体内における産生を抑える一酸化窒素産生阻害活性を備える組成物であって安全性の高いものが望まれている。【０００７】
本発明はこれらの点に鑑みてなされたものであり、細胞毒性がほとんどない一酸化窒素産生阻害活性を備える組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は鋭意研究し、体内に入っても安全なドジョウおよびドジョウと棲息態様が同じ魚類の乾燥魚肉や当該乾燥魚肉からの抽出物について一酸化窒素産生阻害活性を検証して、炎症マーカーである一酸化窒素産生阻害活性の存在を発見して本発明を完成させた。【０００９】
本発明の第１の態様である一酸化窒素産生阻害活性を備える組成物は、ドジョウおよびドジョウと棲息態様が同じ魚類の乾燥魚肉または前記乾燥魚肉の処理物を有効成分として含むことを特徴とする。【００１０】
本発明の第２の態様である一酸化窒素産生阻害活性を備える組成物は、第１の態様において、前記処理物が、前記乾燥魚肉から冷浸抽出した抽出物であることを特徴とする。【００１１】
本発明の第３の態様である一酸化窒素産生阻害活性を備える組成物は、第２の態様において、前記抽出物が、アルコール類をもって冷浸抽出した抽出物であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の一酸化窒素産生阻害活性を備える組成物は、ドジョウの乾燥魚肉を有効成分としているために、細胞毒性がなく一酸化窒素産生阻害活性を発揮することができるという優れた作用効果を発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ドジョウの魚肉粉末に対するヘキサン抽出物（Ｆｒ．Ａ）、クロロホルム抽出物（Ｆｒ．Ｂ）、メタノール抽出物（Ｆｒ．Ｃ）、水抽出物（Ｆｒ．Ｄ）に関する一酸化窒素産生阻害活性試験結果を示す線図
【図２】画分Ｆｒｓ．Ｃ−１〜Ｃ−４に関する一酸化窒素産生阻害活性試験結果を示す線図
【図３】画分Ｆｒｓ．Ｃ−１Ａ〜Ｃ−１Ｄに関する一酸化窒素産生阻害活性試験結果を示す線図
【図４】画分Ｆｒｓ．Ｃ−１ＣとＣ−１Ｄに関する容量依存ついての一酸化窒素産生阻害活性試験結果を示す線図
【図５】画分Ｆｒｓ．Ｃ−１Ｃ１Ａ〜Ｃ−１Ｃ１Ｃに関する一酸化窒素産生阻害活性試験結果（左）および細胞毒性試験結果（右）を示す線図
【図６】画分Ｆｒｓ．Ｃ−１Ｃ１ＢのＨＰＬＣクロマトグラム
【図７】画分Ｆｒｓ．Ｃ−１Ｃ１Ｂ１〜Ｃ−１Ｃ１Ｂ９に関する一酸化窒素産生阻害活性試験結果（上）および細胞毒性試験結果（下）を示す線図
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態を製造方法とともに説明する。
【００１５】
＜基本素材＞
基本素材としてドジョウの乾燥魚肉を用いた。
まず、ドジョウをざる等に取出して窒息死させ、その後１日間に亘って天日乾燥若しくは真空乾燥を施して乾燥魚肉からなる基本素材を得た。
この基本素材を粉末としたり、丸薬状としたり、カプセル内に詰めて傾向投与可能な状態とした。
また、本発明においては基本素材としてドジョウのほかにドジョウと棲息態様が同じ魚類、例えば、ウナギ、八目ウナギ、ナマズ、雷魚等を用いることができる。
【００１６】
＜基本素材からの抽出物＞
１）ドジョウの乾燥魚肉から抽出物の調製
ドジョウをヘキサン、クロロホルム、メタノールの順に冷浸抽出（各溶媒１週間冷浸抽出を３回）し、その後、熱水で温浸抽出（２時間温浸抽出を１回）した。
得られた各抽出液について減圧下濃縮あるいは凍結乾燥して、ヘキサン抽出物（Ｆｒ．Ａ）、クロロホルム抽出物（Ｆｒ．Ｂ）、メタノール抽出物（Ｆｒ．Ｃ）、水抽出物（Ｆｒ．Ｄ）を調製した。
【００１７】
２）一酸化窒素産生阻害活性試験および細胞毒性試験（１）
前記抽出物Ｆｒｓ．Ａ〜Ｄ（各濃度５０μｇ／ｍＬ）について、一酸化窒素産生阻害活性試験および細胞毒性試験を行った。
一酸化窒素産生は生細胞により行われるため、試料自体（ドジョウ抽出物あるいはその分離画分）に細胞への毒性（細胞死作用）があると、一酸化窒素酸性が低下し、一酸化窒素産生阻害活性試験において産生阻害活性を示してしまう。そこで、一酸化窒素産生阻害活性試験と併せて細胞毒性試験を実施して、一酸化窒素産生阻害活性が細胞毒性によるものなのか、あるいは細胞自体には影響はなく何らかのメカニズムによるものなのかを判断した。
【００１８】
２−１）ＮＯ産生阻害活性試験
（Ｇｒｉｅｓｓ法による一酸化窒素合成阻害率の測定方法）
マウスマクロファージ細胞株Ｊ７７４．１細胞を９６穴マイクロプレートに５×１０４個／２００μＬ／ウェル播種し、一晩培養した。次に、培養液を交換し、１００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ−γ、０．５μｇ／ｍＬ ＬＰＳ、となるように添加した。被検試料（ドジョウ抽出物あるいはその分離画分）は終濃度６．２５〜２００μＭになるようにＩＦＮ−γ、ＬＰＳと同じタイミングで添加した。
２４時間培養後に培養上清１００μＬを別のμプレートに移し、Ｇｒｉｅｓｓ試薬（０．１％N-(1-naphtyl)ethylenediamine dihydorochloride、  １％sulfanilamide、２％リ
ン酸、用時調製）１００μＬを添加し室温で１０分間静置した後マイクロプレートリーダー（バイオラッドラボラトリーズ株式会社、東京、Ｍｏｄｅｌ５５０）で波長５４０ｎｍの吸光度を測定した。１００μＭのＮａＮＯ２溶液を段階的に希釈し、同様に処理して検量線を作成し、ＮＯ２−濃度を求めた。
ＩＦＮ−γ、ＬＰＳを添加したときの一酸化窒素濃度に対する被検薬の作用を一酸化窒素合成阻害率（％）として求めた（培養上清中ＮＯ２−濃度を一酸化窒素生成量の指標とした）。
【００１９】
２−２）細胞毒性試験
（ＭＴＴ法による細動生存率の測定方法）
マウスマクロファージ細胞株Ｊ７７４．１細胞を９６穴マイクロプレートに１×１０４個２００μＬ／ウェル播種し、一晩培養した。その後、被検試料（ドジョウ抽出物あるいはその分離画分）を終濃度６．２５〜２００μＭになるように添加し、２４時間培養後に、５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ液を１０μＬ／ウェル加えて、３７℃で３時間インキュベートし、ホルマザンを生成させた。上清を除去し、dimethylsulfoxide（ＤＭＳＯ）を１００μＬ／ウェル加え振盪してホルマザンを溶解させ、波長５４０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定した。ＭＴＴはテトラゾリコム塩の一種で、細胞内に取り込まれると、生細胞においてのみ活性を示すミトコンドリアの吸収鎖のスクシネート−テトラゾリウム還元酵素システムによってホルマザンに分解される。従って、ホルマザン色素量は生細胞数に比例する。
何も添加してないときの生存率を１００％として、生存率に対する被検試料の影響を調べた。
【００２０】
２−３）結果
一酸化窒素産生阻害活性試験の結果を図１に示した。
細胞毒性活性は、ドジョウ抽出物のいずれの画分にも認められなかった。
これらの結果より、ドジョウの乾燥魚肉には一酸化窒素産生阻害活性を有する成分が存在することが明らかとなった。これらの画分の中で最も強い活性を認められたメタノール抽出物（Ｆｒ．Ｃ）について更に分離・精製を行うこととした。
なお、アルコールとしての機能を備えているエタノール等の他のアルコール類もメタノールと同様に抽出成分として用いることができる。
【００２１】
３）ドジョウ抽出物の分離（１）
メタノール抽出物Ｆｒ．Ｃについて、９０％メタノールに溶解し、ヘキサンで分配し、下層を減圧下濃縮後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー（５０ｍｍ  ｉ．ｄ．  ×３００ｍｍ、８０％メタノール）で４つの画分（Ｆｒｓ．Ｃ−１〜Ｃ−４）に分画した。
【００２２】
３−１）一酸化窒素産生阻害活性試験および細胞毒性試験（２）
前記画分Ｆｒｓ．Ｃ−１〜Ｃ−４（各濃度５０μ／ｍＬ）について、一酸化窒素産生阻害試験および細胞毒性試験を行った。
一酸化窒素産生阻害活性試験の結果を図２に示した。
細胞毒性活性は、いずれの画分にも認められなかった。
これらの結果から、次に一酸化窒素産生阻害活性が最も強い画分Ｆｒ．Ｃ−１について更に分離・精製を進めることとした。
【００２３】
４）ドジョウの抽出物の分離（２）
画分Ｆｒ．Ｃ−１を１０％メタノールにて懸濁させ、Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０カラムクロマトグラフィー（６０ｍｍ  ｉ．ｄ．×５０ｍｍ）に付し、１０％メタノール、５０％メタノール、メタノール、酢酸エチルで順次極性を下げながら溶出させ、１０％メタノール溶出画分（Ｆｒ．Ｃ−１Ａ）、５０％メタノール溶出画分（Ｆｒ．Ｃ−１Ｂ）、メタノール溶出画分（Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ）、酢酸エチル溶出画分（Ｆｒ．Ｃ−１Ｄ）の４つの画分に分画した。
【００２４】
４−１）一酸化窒素産生阻害活性試験および細胞毒性試験（３）
画分Ｆｒｓ．Ｃ−１Ａ〜Ｃ−１Ｄ（各濃度５００μｇ／ｍＬ）について、一酸化窒素産生阻害活性試験および細胞毒性試験を行った。
一酸化窒素産生阻害活性試験の結果を図３に示した。
更に、強い一酸化窒素産生阻害活性を示した画分Ｆｒ．Ｃ−１ＣとＦｒ．Ｃ−１Ｄについて、一酸化窒素産生阻害活性と用量との関係を検討した。その結果を図４に示した。どちらの画分も相関係数が１に近い値（０．９６４３）であったことから、一酸化窒素産生阻害活性の用量依存性が明らかになった。
【００２５】
５）ドジョウの抽出物の分離（３）
画分Ｆｒ．Ｃ−１Ｃを８０％メタノールで溶解し、Sep-P Plus Ｃ１８ environmental cartridges (WAT023635)  に通した溶出画分をＦｒ．Ｃ−１Ｃ１（８９８ｍｇ）とし、メタノールで回収した画分をＦｒ．Ｃ−１Ｃ２とした。
【００２６】
６）ドジョウの抽出物の分離（４）
画分Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１について、次の条件下、分取逆相ＨＰＬＣにより３つの画分（Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ａ〜Ｃ−１Ｃ１Ｃ）に分画した。
ＨＰＬＣ条件
Pump : Hitachi L-6250, Flow : 9.0mL/min
Detector : Hitachi L-4000, 210nm
Column : Senshu Pak DOCOSIL SP-100 (20mm i.d. × 250mm,Senshu)
Solvent : MeOH-H2O (4:1)
【００２７】
６−１）一酸化窒素産生阻害活性試験および細胞毒性試験（４）
画分Ｆｒｅ．Ｃ−１Ｃ１Ａ〜Ｃ−１Ｃ１Ｃ（各濃度２５μｇ／ｍＬ）について、一酸化窒素産生阻害活性試験および細胞毒性試験を行った。
その結果を図５に示す。
いずれの画分にも細胞毒性活性は認められず、Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ｂに６５％以上の強い一酸化窒素産生阻害活性が明らかになった。次に、画分Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ｂのについて更に分離・精製を進めることとした。
【００２８】
７）ドジョウ抽出物の分離（５）
画分Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ｂについて、以下の条件下、分取逆相ＨＰＬＣにより分離を行った。
ＨＰＬＣ条件
Pump : Hitachi L-6250, Flow : 2.0mL/min
Detector : Hitachi L-4000, 210nm
Column : Senshu Pak DOCOSIL SP-100 (10mm i.d. × 250mm,Senshu)
Solvent : MeOH-H2O (17:3)
分取逆相ＨＰＬＣによる分離により図６のクロマトグラムが得られ、点線で区切った保持時間で９つに分画した。ただし、ｉはメタノール回収分を含む。
その結果、９つの画分（Ｆｒｓ．Ｃ−１Ｃ１Ｂ１〜Ｃ−１Ｃ１Ｂ９）を以下に示す収量で得た。
ａ  →  Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ｂ１（２８．３ｍｇ）
ｂ  →  Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ｂ２（５．１ｍｇ）
ｃ  →  Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ｂ３（９．０ｍｇ）
ｄ  →  Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ｂ４（４．６ｍｇ）
ｅ  →  Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ｂ５（７．５ｍｇ）
ｆ  →  Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ｂ６（８．４ｍｇ）
ｇ  →  Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ｂ７（１３．４ｍｇ）
ｈ  →  Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ｂ８（２９．０ｍｇ）
ｉ  →  Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ｂ９（６１．１ｍｇ）
【００２９】
７−１）一酸化窒素産生阻害活性試験および細胞毒性試験（５）
画分Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ｂ１〜Ｃ−１Ｃ１Ｂ９（各濃度２５μｇ／ｍＬ）について、一酸化窒素産生阻害活性試験および細胞毒性試験を行った。
その結果を図７に示す。
画分Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ｂ３、Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ｂ５に強い一酸化窒素産生阻害活性が認められた。
画分Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ｂ２、Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ｂ７〜Ｆｒ．Ｃ−１Ｃ１Ｂ９に５０％程度の一酸化窒素産生阻害活性が得られた。
また、細胞製造率がほぼ１００％であり、細胞毒性活性がないことを確認した。
【００３０】
８）基本素材からの抽出物による効果
前記各画分の一酸化窒素産生阻害活性試験および細胞毒性試験の結果より、基本素材からの抽出物には細胞毒性のない一酸化窒素産生阻害活性が得られることが明確となった。
【００３１】
＜基本素材による効果＞
花粉症を発症している青森大学薬学部の２３〜２５歳の男子学生６名に対して、１日小さじ１杯分の基本素材の粉末を経口投与して経過観察したところ、全員７日経過すると花粉症の症状が軽減した。
この花粉症軽減により一酸化窒素の産生が低減されたことが明らかになった。
従って、本発明は基本素材および基本素材からの抽出物についてもそれぞれ細胞毒性のない一酸化窒素産生阻害活性が得られることが明確となった。
【００３２】
本発明は、前記実施形態のものに限らずに、必要に応じて変更することができる。具体的には、ドジョウに代えて、ヒトデ、ナマコ、ウニ等の棘皮動物を原料とした乾燥肉質又は当該乾燥肉質の処理物を有効成分として含有する組成物を用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図６】
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【国際調査報告】
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