(57)【要約】  液体中の個々の微生物等の粒子の蛍光スペクトルを連続的に取得し、微生物などの種類の特定を行うフロー式単粒子分光器を提供するもの。そこで本発明は、検査対象の粒子を含む検体液を保持する検体容器と、前記検査対象の粒子を光学的に検出するための流路である検知用流路と、前記検出用流路を流動した前記検体液を保管するための廃液容器と、前記検体液を前記検体容器、前記検知用流路、前記廃液容器の順に送液するための送液手段と、紫外域から近赤外域までの波長域をもつ白色光を発する白色光源と、前記白色光を波長毎に空間的に分散させる励起光用分光素子と、前記励起光用分光素子によって分光された光を前記検知用流路に集光するための励起光集光素子と、前記検査対象の粒子から発せられる蛍光及び側方散乱光を集光するための蛍光集光素子と、前記蛍光集光素子により集光された蛍光を波長毎に空間的に分散させる蛍光用分光素子と、前記蛍光用分光素子によって分光された蛍光を集光するための分光用集光素子と、前記分光用集光素子によって集光された光の強度を波長毎に検出可能なマルチチャネル型光検出器からなるフロー式単粒子分光器。
2014073064.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査対象の粒子を含む検体液を保持する検体容器と、前記検査対象の粒子を光学的に検出するための流路である検知用流路と、前記検出用流路を流動した前記検体液を保管するための廃液容器と、前記検体液を前記検体容器、前記検知用流路、前記廃液容器の順に送液するための送液手段と、
紫外域から近赤外域までの波長域をもつ白色光を発する白色光源と、前記白色光を波長毎に空間的に分散させる励起光用分光素子と、前記励起光用分光素子によって分光された光を前記検知用流路に集光するための励起光集光素子と、
前記検査対象の粒子から発せられる蛍光及び側方散乱光を集光するための蛍光集光素子と、前記蛍光集光素子により集光された蛍光を波長毎に空間的に分散させる蛍光用分光素子と、前記蛍光用分光素子によって分光された蛍光を集光するための分光用集光素子と、前記分光用集光素子によって集光された光の強度を波長毎に検出可能なマルチチャネル型光検出器からなるフロー式単粒子分光器。
【請求項２】
請求項１記載のフロー式単粒子分光器において、
前記マルチチャネル型光検出器は前記粒子から発せられる前方散乱光を集光するための散乱光用集光素子と、前記散乱光用集光素子によって集光された光の強度を検出するための散乱光用光検出器とを備えたフロー式単粒子分光器。
【請求項３】
検査対象の粒子を含む検体液を保持する検体容器と、前記検査対象の粒子を光学的に検出するための流路である検知用流路と、前記検出用流路を流動した前記検体液を保管するための廃液容器と、前記検体液を前記検体容器、前記検知用流路、前記廃液容器の順に送液するための送液手段と、
紫外域から近赤外域までの一部波長域の光を発する複数の単色光源と、前記複数の単色光源から発せられた光を前記検知用流路に重複しないように集光するための励起光集光素子と、
前記検査対象の粒子から発せられる蛍光及び側方散乱光を集光するための蛍光集光素子と、前記蛍光集光素子により集光された蛍光を波長毎に空間的に分散させる蛍光用分光素子と、前記蛍光用分光素子によって分光された蛍光を集光するための分光用集光素子と、前記分光用集光素子によって集光された光の強度を波長毎に検出可能なマルチチャネル型光検出器からなるフロー式単粒子分光器。
【請求項４】
請求項３記載のフロー式単粒子分光器において、
前記マルチチャネル型光検出器は前記粒子から発せられる前方散乱光を集光するための散乱光用集光素子と、前記散乱光用集光素子によって集光された光の強度を検出するための散乱光用光検出器とを備えたフロー式単粒子分光器。
【請求項５】
請求項１または３のいずれかに記載にフロー式単粒子分光器において、
前記マルチチャネル型光検出器で取得した光のスペクトルから、低波長側のピーク波長を励起光の波長と判断し、励起光の波長を変数とした二次元蛍光スペクトルを取得することができるフロー式単粒子分光器。
【請求項６】
請求項５記載のフロー式単粒子分光器において、
前記粒子の種類毎の前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、二次元蛍光スペクトルをデータベースとして備えて、前記単粒子分光器で測定した粒子の前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、二次元蛍光スペクトルとデータベースを比較することで粒子の種類を特定することができるフロー式単粒子分光器。
【請求項７】
検査対象の粒子を含む検体液を保持する検体容器と、前記検査対象の粒子と反応する試薬を保持すると共に前記検体液と前記試薬とを反応させる反応容器と、前記検査対象の粒子を流動させ光学的に検出するための検知用流路とを有する検査カートリッジと、
前記検査カートリッジと連結され、前記検体液、前記試薬とを前記検査カートリッジ内に搬送する圧力供給装置と、
前記検査カートリッジを保持すると共に、前記検査カートリッジを移動させるステージとを有し、
紫外域から近赤外域までの波長域をもつ白色光を発する白色光源と、前記白色光を波長毎に空間的に分散させる励起光用分光素子と、前記励起光用分光素子によって分光された光を前記検知用流路に集光するための励起光集光素子と、
前記粒子から発せられる前方散乱光を集光するための散乱光用集光素子と、前記散乱光用集光素子によって集光された光の強度を検出するための散乱光用光検出器と、
前記検査対象の粒子から発せられる蛍光及び側方散乱光を集光するための蛍光集光素子と、前記蛍光集光素子により集光された蛍光を波長毎に空間的に分散させる蛍光用分光素子と、前記蛍光用分光素子によって分光された蛍光を集光するための分光用集光素子と、前記分光用集光素子によって集光された光の強度を波長毎に検出可能なマルチチャネル型光検出器からなるフロー式単粒子分光器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体中の個々の微生物等の粒子の蛍光スペクトルを連続的に取得し、微生物などの種類の特定を行うフロー式単粒子分光器に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、飲料水などの液体中に含まれる特定微生物の計測手段として、培養法が一般的に用いられていた。この培養法は、液体検体の懸濁液を培地上に塗布し生きている微生物を培養させ、増殖した微生物が形成するコロニー数を計測することで生きている微生物の数を計測する手法である。この手法は、特定微生物のみ増殖可能な培地を使用することで特定微生物の計測・特定も可能である。【０００３】
しかし、この培養法は、微生物がコロニーを形成するまでに１日から数日を必要とするため、計測結果を得るまでに長時間の検査時間を必要とする。また、懸濁、希釈、塗布、コロニー計測などの検査工程を手作業で行うため、検査者は専門的知識および技量が必要になる。【０００４】
そこで迅速に微生物の種類を特定する手段として、微生物の蛍光スペクトルの違いを利用する方法がある。この方法は、微生物の種類によって保持する物質の種類や量が異なり、また蛍光色素に対する染色度合いも異なるため、種類によって蛍光スペクトルは異なることを利用するものである。蛍光スペクトルは励起光の波長によっても異なるため、励起光の波長をパラメータとした蛍光スペクトル（以下、二次元蛍光スペクトルという）を取得することで、より詳細に微生物の種類の判別が可能になる。【０００５】
微生物の蛍光スペクトルを取得する手段としては、蛍光分光器が一般的に用いられている。蛍光分光器は、専用の測定セルに入れた液体に特定波長の励起光を照射し、液体が発する蛍光スペクトルを取得することができる装置である。微生物などの粒子の蛍光スペクトルを取得するには、これらの粒子を超純水などの液体に懸濁することで測定することができる。【０００６】
蛍光分光器の励起光は、白色光源の光からグレーティング（回折格子）とスリットで特定波長のみ取り出した光であり、グレーティングの位置を変えることで励起光の波長を変えることができる。そのため励起光の波長をパラメータとした蛍光スペクトルである二次元蛍光スペクトルを取得することも容易である
しかし、蛍光分光器で取得可能な蛍光スペクトルは液体内の全て粒子が発する蛍光の平均値であるため、個々の粒子の蛍光スペクトルを取得することはできない。そこで近年単一の粒子の状態や種類を特定するために、単一の粒子の発する蛍光やラマン散乱光のスペクトルを取得する方法が報告されている。【０００７】
例えば、下記の特許文献１に記載されたラマン検出に基づくフローサイトメータは、流路を流れる測定対象の粒子にレーザー光を照射し、粒子から発せられるラマン散乱光をグレーティングなどの分光素子で分光したのち、マルチチャネル検出器により検出することでラマン散乱光のスペクトルを取得するものである。【０００８】
また、下記の非特許文献１に記載のハイスループット単一細胞蛍光分光器（原文名：High-Throughput Single-Cell Fluorescence Spectroscopy）では、流路を流れる測定対象の粒子に488 nm アルゴンイオンレーザーを照射し、粒子から発せられる蛍光をグレーティングによる分光したのちICCD（Intensified charge-coupling device）により検出することで蛍光スペクトルを取得するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００８−５２１００６号公報
【非特許文献１】Applied Spectroscopy、 Vol.59、 No.2、 pp221-226、 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
微生物の種類を迅速に特定するには、微生物の蛍光スペクトルの違いを利用することが有効である。しかし、上述した従来技術により知られるこれまでの方法及び装置では、液体中に含まれる微生物数、種類、液体の状態などの影響により、要求を十分に満たすことは難しかった。【００１１】
例えば蛍光分光器を使用する場合、液体検体中に十分な数の微生物（107個/ml〜）が存在しないと蛍光スペクトルを取得することは難しい。例えば、水道水中に存在する微生物数は約1個/ml以下であるため、検体液の培養及び濃縮を繰り返さないと蛍光スペクトルを取得することは困難である。また、液体検体中に複数の微生物が含まれている場合は、得られた蛍光スペクトルは存在する微生物全ての蛍光スペクトルの平均値となるため、種類の特定は困難である。【００１２】
次に、上記特許文献１や非特許文献１の装置では、一種類の励起光の波長に対する蛍光スペクトルもしくはラマン散乱光スペクトルを取得することは可能だが、二次元蛍光スペクトルを取得することは困難である。そのため、スペクトルの形状が似ている微生物の特定は困難である。【００１３】
また、上記特許文献１や非特許文献１の装置の検出器に、蛍光分光器を使用したとしても個々の微生物の二次元蛍光スペクトルを取得することは以下の理由により困難である。蛍光分光器では先述のようにグレーティングの位置を変更することで励起光の波長を決めるが、位置変更には数秒の時間を必要とする。一方、上記特許文献１や非特許文献１の装置のようなフローサイトメータでは、測定対象の粒子が検出領域を通過する時間（測定時間）は一般的に数マイクロ秒〜ミリ秒であるため、測定時間中に励起光の波長を変えることは困難である。【００１４】
そこで本発明は、液体中の個々の微生物等の粒子の蛍光スペクトルを連続的に取得し、微生物などの種類の特定を行うことができるフロー式単粒子分光器を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するために本発明は、検査対象の粒子を含む検体液を保持する検体容器と、前記検査対象の粒子を光学的に検出するための流路である検知用流路と、前記検出用流路を流動した前記検体液を保管するための廃液容器と、前記検体液を前記検体容器、前記検知用流路、前記廃液容器の順に送液するための送液手段と、紫外域から近赤外域までの波長域をもつ白色光を発する白色光源と、前記白色光を波長毎に空間的に分散させる励起光用分光素子と、前記励起光用分光素子によって分光された光を前記検知用流路に集光するための励起光集光素子と、前記検査対象の粒子から発せられる蛍光及び側方散乱光を集光するための蛍光集光素子と、前記蛍光集光素子により集光された蛍光を波長毎に空間的に分散させる蛍光用分光素子と、前記蛍光用分光素子によって分光された蛍光を集光するための分光用集光素子と、前記分光用集光素子によって集光された光の強度を波長毎に検出可能なマルチチャネル型光検出器とからなることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、液体中の個々の粒子の二次元蛍光スペクトルの取得が可能になることにより、二次元蛍光スペクトルの形状の差異を利用した粒子の種類の判別が可能になるという極めて優れた効果を発揮できるフロー式単粒子分光器を提供できる。【００１７】
上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の実施例１に係るフロー式単粒子分光器の全体概略構成図である。
【図２】実施例１に係るフロー式単粒子分光器を構成する光学系の位置関係を示す図である。
【図３】実施例１に係るフロー式単粒子分光器における粒子の位置と蛍光スペクトルを示す図である。
【図４】実施例１に係るフロー式単粒子分光器で取得した二次元蛍光スペクトルを示す図である。
【図５】実施例１に係るフロー式単粒子分光器で取得した二次元蛍光スペクトルを利用した粒子の種類の特定方法を示す図である。
【図６】実施例１に係るフロー式単粒子分光器の全体概略構成図である。
【図７】本発明の実施例２に係るフロー式単粒子分光器の全体概略構成図である。
【図８】実施例２に係るフロー式単粒子分光器を構成するカートリッジの構成図である。
【図９Ａ】実施例２に係るカートリッジにおける検知用流路を含む断面図である。
【図９Ｂ】実施例２に係るカートリッジにおける検知用流路を含む分解構造例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
既述したように、従来は液体中に存在する菌を特定する場合は培養法で数日かけて検査する必要があった。しかし、万一の菌の発生・混入などを考慮に入れた場合には、安全・衛生を高める検知から、液体中の菌の種類を短時間に特定することが求められる。
【００２０】
そこで、本願発明の発明者らは液体中の菌の種類を短時間に特定するための方法及び装置を種々検討した結果、本願発明に至った。以下その好ましい実施例について説明する。
【００２１】
なお、本明細書において、検出対象となる液体中に含まれる微生物とは、通常の微生物の概念より広く、ウイルス、細菌、酵母、原生動物、菌類、胞子、花粉の検査方法及び検査装置を意味する。また、本明細書では、表記を簡単にするため、一般的に定義されている微生物（細菌、酵母、原生動物、菌類）の他、ウイルス、胞子、花粉を含め単に「微生物」と表記した。
【００２２】
以下、図面を参照して、本発明の実施例を説明する。なお、後述する実施の形態は一例であって、各実施例同士の組み合わせ、公知又は周知の技術との組み合わせや置換による他の態様も可能であることは言うまでもない。
【実施例１】
【００２３】
図１は本発明の実施例１に係るフロー式単粒子分光器の全体概略構成図である。【００２４】
図２は実施例１に係るフロー式単粒子分光器を構成する光学系の位置関係を示す図である。【００２５】
図１において、フロー式単粒子分光器１（単微生物分光器ともいう）は、大別すると、検査対象（検体液）である液体を流動させるための流動部と液体中に含まれる微生物を光学的に検知するための光学検知部と図には記載がないが、流動部の制御と光学検知部からの信号を取り扱う制御システムからなる。【００２６】
流動部は、検体液を保持する検体容器１１０と、検体液を送液するための送液ポンプ１１１と、検体液中の微生物を流動させながら光学的に検知するための流路である検知用微細流路１１２と、検知用微細流路１１２を通過した検体液を保管するための廃液容器１１３からなる。検体容器１１０中の検体液は、送液ポンプ１１１により検体容器１１０から検知用微細流路１１２を経由し廃液容器１１３へと流動する。【００２７】
光学検知部は、白色光を発する白色光源１００と、白色光を分光するための分光素子である励起光分光素子１０１と、分光した光１２１を検知用微細流路１１２に集光するための光学素子である励起光集光素子１０２と、検知用微細流路１１２を流れる微生物１２０から発せられる蛍光１２２を集光するための光学素子である蛍光集光素子１０３と、蛍光集光素子１０３によって集光された蛍光を分光するための分光素子である蛍光分光素子１０４と、分光した蛍光をマルチチャネル型光検出器１０６に集光するための光学素子である分光集光素子１０５と、分光された蛍光の光量を一定の波長間隔毎に検出することで蛍光スペクトルを取得することができるマルチチャネル型光検出器１０６と、検知用微細流路１１２を流れる微生物１２０から発せられる前方散乱光を前方散乱光検出器１０７に集光するための光学素子である前方散乱光集光素子１０８で構成される。【００２８】
続いて、上述した各構成要素の詳細について説明する。【００２９】
まず、白色光源１００は紫外域から近赤外域までの広い波長域の白色光を放出する光源であり、集光や十分な光量を得ることが容易であることから白色レーザーが好ましいが、使用用途によってはハロゲンランプやキセノンランプのような光源でもよい。【００３０】
次に、励起光分光素子１０１や蛍光分光素子１０４は白色光源を波長毎に空間的に分散させるための光学素子であり、プリズムや回折格子を用いる。図１ではプリズムを使用しているが、透過型回折格子や反射型回折格子であってもよい。【００３１】
次に、励起光集光素子１０２、蛍光集光素子１０３、分光集光素子１０５、前方散乱光集光素子１０８は素子に入射する光を空間的に集光させるための光学素子であり、レンズや曲面鏡を用いる。【００３２】
次に、マルチチャネル型光検出器１０６は蛍光分光素子１０４によって波長毎に分散された光の光量を検出することが可能な光検出器であり、入射した光のスペクトルを取得することができる。複数のフォトダイオードやフォトマルチプライヤで構成されたものや、CCD（Charge Coupled Device）イメージセンサ、ICCD（Intensified charge Coupling Device）イメージセンサ、CMOS（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサのような複数の受光素子からなる光検出器を用いる。【００３３】
次に、前方散乱光検出器１０７は、フォトダイオードやフォトマルチプライヤのような光検出器であるが、一般的に前方散乱光の光量は蛍光や側方散乱光の光量よりもはるかに多いため、マルチチャネル型光検出器１０６よりは低感度の光検出器を用いる。【００３４】
次に、検知用微細流路１１２は、断面が矩形もしくは円形の流路であり、断面の一辺もしくは直径寸法は例えば１μｍ〜１ｍｍが好ましく、長さは例えば０．０１ｍｍ〜１０ｍｍが好ましい。検知用微細流路１１２の断面寸法は、大きいほど圧力損失は小さくなるが、微生物を一個ずつ流すためには小さいほうが良い。また検知用微細流路１１２の材質には光透過性の物質を使用し、好ましくは蛍光計測を行うため自家蛍光が低く、光透過性、面精度、屈折率などの光学特性に優れている必要がある。ガラス、石英、ポリメタクリル酸メチルエステル、ポリジメチルシロキサン、シクロオレフィンポリマー、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネイトなど光学特性に優れた材料を使用する。【００３５】
励起光分光素子１０１によって分光した光１２１は励起光集光素子１０２によって検知用微細流路１１２に照射される。このとき分光した光１２１の波長（紫外域から近赤外域）は検知用微細流路１０２の流れ方向にそって変化し、微生物１２０は検知用微細流路１１２を流れる際に紫外光から近赤外域までの波長の光を照射されることになる。【００３６】
次に送液ポンプ１１１は、検体液を検体容器１１０、検知用微細流路１１２、廃液容器１１３の順に送液するためのポンプであり、脈流が小さいほうが好ましい。また、検体液をシース液で包みこむように流すシースフローを利用してもよい。この場合はシース液を保管するためのシース液容器が必要になり、送液ポンプ１１１は検体液とシース液を同時に流動する。シースフローを利用することで、検体液を検知用微細流路１１２の中心を流すことが可能になり、また検体液中の微生物の向きを揃えることが可能になるため、微生物から発せられる蛍光や散乱光の強度が微生物の位置や向きによって変わらないため、より正確な解析が可能になる。【００３７】
図２において、白色光源１００から放出され励起用集光素子を通過した光の向き（図中ｘ方向）は、検知用微細流路１１２の向き（図中ｚ方向）と垂直の関係である。また、白色光源からの光の影響を最小にするため、蛍光集光素子１０３は検知用微細流路１１２から図中ｙ方向に配置する。【００３８】
次に、単微生物分光器１を利用した個々の微生物の二次元蛍光スペクトルを取得し、微生物の特定する手順について説明する。
（１）検体液の前処理
検査する検体液について適切な前処理を実施する。ここでの前処理とは、検体液から余計な物質を取り除き検査対象である微生物の純度を高くする作業である精製、検査対象である微生物の濃度を高くする作業である濃縮、検査対象である微生物に特定の蛍光物質を結合させる染色などの作業である。
（２）検体液の測定
前処理を終えた検体液を検体容器１１０に入れ、制御システムを介して単微生物分光器１を動作させる。単微生物分光器１は検体液を検知用微細流路１１２に送液する。検知用微細流路１１２に照射されている光は流路方向に沿って近赤外域から紫外域まで波長が変化するため、微生物１２０が分光した光１２１を通過する際には、微生物１２０は近赤外域から紫外域の波長の光を励起光とした蛍光を発する。【００３９】
図３は実施例１に係る単粒子分光器における粒子の位置と蛍光スペクトルを示す図である。本図では、検知用微細流路１１２を流れる微生物１２０が分光した光１２１を通過したときに取得することができる蛍光スペクトルを示す図である。【００４０】
図３において、図では微生物１２０は上から下方向に流れ、分光した光１２１の波長は上から下に向かうほど短波長になっているが、流れ方向や波長の順序は逆でも構わない。図中右側のグラフは、微生物１２０がその位置において発する光のスペクトルを示し、マルチチャネル型光検出器１０６で取得したものである。マルチチャネル型光検出器１０６に入射する光は微生物１２０から発せられる蛍光の他に微生物１２０からの側方散乱光（微生物１２０によって散乱された励起光のうち、光の入射方向に対し側方に分散した光）が含まれる。【００４１】
得られたスペクトルは蛍光スペクトルと側方散乱光のスペクトルを重ね合わせたものになるが、蛍光の波長は励起光よりも長波長であり、散乱光の波長は励起光と同じである。そのため、スペクトルの二つのピークのうち低波長側のピーク１２３が側方散乱光のスペクトルのピークとなり、長波長側のピーク１２４が蛍光のスペクトルのピークとなる。また微生物１２０が検知用微細流路１１２を上から下に流れると照射される励起光の波長も近赤外域から紫外域まで変化するため、得られるスペクトルも長波長側から短波長側に移動する。【００４２】
図４は実施例１に係る単粒子分光器で取得した二次元蛍光スペクトルを示す図である。本図は、得られたスペクトルを蛍光波長λfと励起波長λexの二次元スペクトルに変換したものである。【００４３】
図４において、励起光の波長λexの値は散乱光スペクトル１２３のピークの波長と等しいとして考える。
（３）微生物の特定
単微生物分光器１は、微生物１２０の前方散乱光の強度、微生物１２０の側方散乱光の強度、微生物１２０の二次元蛍光スペクトルを取得することができる。前方散乱光の強度は微生物１２０の大きさを示し、側方散乱光の強度は微生物１２０の内部構造の複雑さを示し、二次元スペクトルは微生物が保有する自家蛍光物質（NADH（Nicotinamide Adenine Dinucleotide）など）や前処理にて導入された蛍光物質に対する染まりやすさを示す。これらの性質は微生物の種類によって異なり、微生物毎にデータベース化することによって、取得した前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、二次元スペクトルの形状をデータベースと比較することにより微生物の種類の特定が可能になる（図５）。【００４４】
本装置で得ることのできるこれらのデータは、一個の微生物についてのデータであるため、蛍光を発する不純物やその他の微生物が混在したとしても、個々の微生物について特定が可能になる。【００４５】
図６は実施例１に係る単粒子分光器の全体概略構成図である。【００４６】
図６において、先の実施例では、白色光を励起光分光素子１０１で分光した光を利用したが、図６に示すように、異なる波長の光を放出する光源を複数並べた単色光源群１３０を利用してもよい。単色光源群１３０から放出された光を、互いに重ならないように検知用微細流路１１２に照射する。微生物１２０は単色光源群の光１２５の照射域を通過する際にそれぞれの励起波長に応じた蛍光を発するため、先の実施例と同様に二次元スペクトルを取得することができる。
【実施例２】
【００４７】
先の実施例では、検体液の前処理は検査者が手作業で行っていた。前処理は煩雑かつ専門的技量を必要とする作業であり、検査者の技量や作業時間の差異によって検査結果に違いが生じる。以下、前処理の工程も自動化することでこれらの課題を解決した実施例について説明する。【００４８】
図７は本発明の実施例２に係る単粒子分光器の全体概略構成図である。【００４９】
図７において、単微生物分光システム２は、検体液や試薬を内部に保持し、個々の微生物の蛍光スペクトルの取得に必要な工程を行うための機構を内部に備えた微生物検査カートリッジ１４０と、微生物計測に必要な工程を行うために、微生物検査カートリッジ１４０と連結したカートリッジ連結管１４２１〜１４２３を介して、微生物検査カートリッジ１４０内の検体液や試薬の搬送を制御するための送液制御部１４２と、微生物検査カートリッジ１４０を保持し、微生物検査カートリッジ１４０の位置を調整するカートリッジ保持台１４１と、微生物検査カートリッジ１４０内の微生物に分光した光を照射し、微生物から発せられる蛍光及び散乱光を検出する光学検出部で構成されている。【００５０】
単微生物分光システム２に連結したシステム装置１４８は、送液制御部１４２に対する制御信号の出力と、光学検出部から入力される電気信号に対する信号処理を実行する。なお、電気信号の処理により得られた計測結果は、システム装置１８に接続された出力装置１４９に表示される。【００５１】
送液制御部１４２は、ポンプ１４２４を有する。ポンプ１４２４と微生物検査カートリッジ１４０の各通気口１４５１〜１４５３（図８）は、カートリッジ連結管１４２１〜１４２３によって接続されている。カートリッジ連結管１４２１〜１４２３には、バルブ１４２５〜１４２７がそれぞれ設けられている。バルブ１４２５〜１４２７を開閉することにより、微生物検査カートリッジ１４０の容器に所定の圧力の気体を供給し、又は、微生物検査カートリッジ１４０の容器を大気開放する。この圧力の制御により、微生物検査カートリッジ１４０内における検体液や試薬の搬送を実現する。【００５２】
光学検出部は、先の実施例と同じく白色光を発する白色光源１００と、白色光を分光するための分光素子である励起光分光素子１０１と、分光した光１２１を検知用微細流路１１２に集光するための光学素子である励起光集光素子１０２と、検知用微細流路１１２を流れる微生物１２０から発せられる蛍光を集光するための光学素子である蛍光集光素子１０３と、蛍光集光素子１０３によって集光された蛍光を分光するための分光素子である蛍光分光素子１０４と、分光した蛍光をマルチチャネル型光検出器１０６に集光するための光学素子である分光集光素子１０５と、分光された蛍光の光量を一定の波長間隔毎に検出することで蛍光スペクトルを取得することができるマルチチャネル型光検出器１０６と、検知用微細流路１１２を流れる微生物１２０から発せられる前方散乱光を前方散乱光検出器１０７に集光するための光学素子である前方散乱光集光素子１０８で構成される。【００５３】
なお、励起光集光素子１０２、蛍光集光素子１０３及び散乱光集光素子１０８の焦点は、互いの焦点が重なるように配置され、測定時には検知用微細流路１４４を焦点の位置に調整できるように構成されている。【００５４】
図８は実施例２に係る単粒子分光器を構成するカートリッジの構成図である。【００５５】
図８において、微生物検査カートリッジ１４０は、検体液を保持するための検体容器１４６１と、検体液中の微生物の染色するための染色液（試薬液）を保持し、検体液と染色液を混合、反応させる染色液容器１４６２と、励起光を照射し、微生物を観測するための検知用微細流路１４４と、検知用微細流路１４４を通過した検体液と染色液の混合液を廃棄するための廃液容器１４７と、検体容器１４６１、染色液容器１４６２、検知用微細流路１４４を連結し、検体液や混合液が流動するための溶液用流路１４８１〜１４８２と、検体液や混合液を気圧により流動させるため送液制御部１４２と各容器を接続する通気用流路１４９１〜１４９３とで構成されている。本明細書においては、検体液の流れに沿って検体容器１４６１の側を上流側、検知用微細流路１４４の側を下流側と定義する。【００５６】
図９Ａ及び図９Ｂを用い、微生物検査カートリッジ１４０のうち検知用微細流路１４４の構造を説明する。【００５７】
図９Aは実施例２に係るカートリッジにおける検知用流路を含む断面図である。【００５８】
図９Bは実施例２に係るカートリッジにおける検知用流路を含む分解構造例を示す図である。【００５９】
図９Ａは、微生物検査カートリッジ１４０の本体１５１と検知用微細流路１４４の接合部であり、図９Ｂは、検知用微細流路１４４の分解斜視図を示す。【００６０】
なお、本体１５１と検知用微細流路１４４はそれぞれ別工程で作製され、それぞれを接合する。検知用微細流路１４４の製造方法を説明する。【００６１】
図９Ａ、図９Ｂにおいて、微生物検出部１７はカバー部材１７１と流路部材１７２からなり、両者は共に薄い平板からなる。流路部材１７２には溝１７３１が形成されており、この溝１７３１の両端には貫通孔１７４１、１７５１が形成されている。溝１７３１が形成された面が張り合わせ面となるように、カバー部材１７１と流路部材１７２を張り合わせる。この貼り合わせにより検知用微細流路１４４が形成される。流路部材１７２の貫通孔１７４１、１７５１によって、検知用微細流路入口１７４と検知用微細流路出口１７５が構成される。【００６２】
一方、本体１５１に形成された染色液容器−検知用微細流路間流路１５７４は、その下端にて流路方向を変更し、本体１５１の表面に開口を形成している。同様に、検知用微細流路−廃液容器間流路１５７６は、その上端にて流路方向を変更し、本体１５１の表面に開口を形成している。染色液容器−検知用微細流路間流路１５７４の開口は、検知用微細流路入口１７４に接続され、検知用微細流路−廃液容器間流路１５７６の開口は、検知用微細流路出口１７５に接続されている。【００６３】
本体１５には検知用窓枠部１６１が形成されている。検知用窓枠部１６１は、貫通孔、又は、貫通溝である。検知用窓枠部１６１は、染色液容器−検知用微細流路間流路１５７４の開口と検知用微細流路−廃液容器間流路１５７６の開口の間に形成されている。製造された検知用微細流路１４４は、前述したように、本体１５１に装着される。図９Ａに示すように、本体１５１の検知用窓枠部１６１の上に検知用微細流路１４４が配置されるようにする。【００６４】
形態例の場合、検知用微細流路１４４の背後に、本体１５１の貫通孔又は貫通溝である検知用窓枠部１６１が設けられる。従って、励起光１８０は、検知用微細流路１４４のみを照射し、本体１５１を照射しない。このため、背景光の増加の原因となる本体１５１からの反射光や自家蛍光は発生しない。検知用微細流路１４４を通過した励起光１８０が、本体１５１に照射されないためには、検知用窓枠部１６１を構成する貫通孔の断面は、励起光１８０の放射方向に沿って増加することが好ましい。【００６５】
カバー部材１７１の厚さは、例えば０．０１μm〜１ｍｍとする。流路部材１７２の厚さは、例えば０．０１μm〜１ｍｍとする。検知用微細流路１４４の断面形状は、例えば正方形、長方形、台形に形成する。微検知用微細流路１４４の断面寸法は、大きいほど圧力損失は小さくなるが、微生物を一個ずつ流すためには小さいほうが良い。検知用微細流路１４４の断面の一辺は、例えば１μｍ〜１ｍｍが好ましく、長さは例えば０．０１ｍｍ〜１０ｍｍが好ましい。検知用微細流路１４４に照射する励起光１８０の光軸は、検知用微細流路１４４の方向ベクトルに対して垂直になる。【００６６】
微生物検査カートリッジ１４０を用いた個々の菌種の特定は、図７に示すように、微生物検査カートリッジ１４０を単微生物分光システム２にセットした状態で開始される。この測定工程は、微生物検査カートリッジ１４０の位置合わせを行う位置合わせ工程と、検体液から夾雑物を取り除いて検体液中の微生物を染色する前処理工程と、微生物の二次元スペクトルを実際に測定する計測工程とで構成される。【００６７】
位置合わせ工程と前処理工程は独立した工程であるため並列して行い、両工程が終了した段階で計測工程を行う。続いて、各工程における各液体の移動について説明する。【００６８】
図８において、前処理工程では、まず、検体液が染色液容器１４６１に移動される。次に、通気口１４５１を介して検体容器１４６１に対して図７に示す送液制御部１４２の圧力を加える。これにより、検体容器１４６１内の気圧を上げる。同時に、染色液容器通気口１４９１を介して染色液容器１４６２の内圧を大気圧に開放する。気圧差により、検体液は、染色液容器１４６２に入り、微生物染色液と混合される。混合には、バブリングを使用する。検体液中の菌は、染色液（ここではシアニン系蛍光色素を使用する。）により染色される。【００６９】
二液の混合液の水位は、染色液容器１４６２と検知用微細流路１４４を連結する染色液容器−検知用微細流路１４８２の最高点を越えず、さらに染色液容器１４６２中に入っている空気は、染色液容器通気口１４９１を介して外部に放出される。染色液容器１４６２の気圧は大気圧と等しいため、二液の混合液は検知用微細流路１４４に押し出されず、混合液を反応に必要な時間中、染色液容器１４６２に保持することができる。【００７０】
なお、染色中は、微生物検査チップ１０の温度を一定に保つことにより、温度変化による染色の影響を小さくすることが望ましい。【００７１】
また、検体液が夾雑物除去部１６０を経て、染色液容器１４６２へ流動する際に、検体液中の夾雑物は、夾雑物除去部１６０により検体液から取り除かれる。【００７２】
以上で、前処理工程が終了する。また、この前処理工程と並行して、微生物検査カートリッジ１４０の位置合わせが実行される。【００７３】
以上の動作が終了すると、検体液と微生物染色液の混合液が検知用微細流路１４４に移動される。先の実施例と同様に、検知用微細流路１４４には分光した光が照射されているため、検知用微細流路１４４を流れる微生物が分光された光の照射域を通過する際に、それぞれの励起波長に応じた蛍光を発するため、先の実施例と同様に二次元スペクトルを取得することができる。【００７４】
以上のごとく本発明によれば、液体中の個々の粒子の種類を正確に特定する手段を提供する装置。白色光を分光した光を照射した検知用流路に測定対象の粒子を含む液体を送液し、測定対象の粒子から発せられる蛍光を分光することで蛍光スペクトルを取得することにより、二次元蛍光スペクトルを取得することが可能になり、取得した二次元蛍光スペクトルの形状から粒子の種類の特定を行うことが可能になったものである。【００７５】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されたものではない。またある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、またある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【符号の説明】
【００７６】
１…フロー式単粒子分光器、２…単微生物分光システム、１８…システム装置、１０…微生物検査チップ、１００…白色光源、１０１…励起光分光素子、１０２…励起用光集光素子、１０３…蛍光集光素子、１０４…蛍光分光素子、１０５…分光集光素子、１０６…マルチチャネル型光検出器、１０７…前方散乱光検出器、１０８…前方散乱光集光素子、１１０…検体容器、１１１…送液ポンプ、１１２…検知用微細流路、１１３…廃液容器、１２０…微生物、１２１…光、１２３…散乱光スペクトル、１２５…光、１３０…単色光源群、１４０…微生物検査カートリッジ、１４１…カートリッジ保持台、１４２…送液制御部、１４８…システム装置、１４４…検知用微細流路、１４７…廃液容器、１４９…出力装置、１５１…本体、１６０…夾雑物除去部、１６１…検知用窓枠部、１７１…カバー部材、１７２…流路部材、１７４…検知用微細流路入口、１７５…検知用微細流路出口、１８０…励起光、１４２１〜１４２３…カートリッジ連結管、１４２４…ポンプ、１４２５〜１４２７…バルブ、１４６１…検体容器、１４６２…染色液容器、１４８１〜１４８２…溶液用流路、１４９１〜１４９３…通気用流路、１７３１…溝、１７４１…通気孔、１７５１…通気孔、１５７４…染色液容器−検知用微細流路間流路、１５７６…検知用微細流路−廃液流路管流路。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年1月19日(2016.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査対象の粒子を含む検体液を保持する検体容器と、前記検査対象の粒子を光学的に検出するための流路である検知用流路と、前記検出用流路を流動した前記検体液を保管するための廃液容器と、前記検体液を前記検体容器、前記検知用流路、前記廃液容器の順に送液するための送液手段と、
紫外域から近赤外域までの波長域をもつ白色光を発する白色光源と、前記白色光を波長毎に空間的に分散させる励起光用分光素子と、前記励起光用分光素子によって分光された光を前記検知用流路に集光するための励起光集光素子と、
前記検査対象の粒子から発せられる蛍光及び側方散乱光を集光するための蛍光集光素子と、前記蛍光集光素子により集光された蛍光を波長毎に空間的に分散させる蛍光用分光素子と、前記蛍光用分光素子によって分光された蛍光を集光するための分光用集光素子と、前記分光用集光素子によって集光された光の強度を波長毎に検出可能なマルチチャネル型光検出器からなるフロー式単粒子分光器。
【請求項２】
請求項１記載のフロー式単粒子分光器において、
前記マルチチャネル型光検出器は前記粒子から発せられる前方散乱光を集光するための散乱光用集光素子と、前記散乱光用集光素子によって集光された光の強度を検出するための散乱光用光検出器とを備えたフロー式単粒子分光器。
【請求項３】
請求項１記載のフロー式単粒子分光器において、
前記マルチチャネル型光検出器で取得した光のスペクトルから、低波長側のピーク波長を励起光の波長と判断し、励起光の波長を変数とした二次元蛍光スペクトルを取得することができるフロー式単粒子分光器。
【請求項４】
請求項３記載のフロー式単粒子分光器において、
前記粒子の種類毎の前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、二次元蛍光スペクトルをデータベースとして備えて、前記単粒子分光器で測定した粒子の前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、二次元蛍光スペクトルとデータベースを比較することで粒子の種類を特定することができるフロー式単粒子分光器。
【請求項５】
検査対象の粒子を含む検体液を保持する検体容器と、前記検査対象の粒子と反応する試薬を保持すると共に前記検体液と前記試薬とを反応させる反応容器と、前記検査対象の粒子を流動させ光学的に検出するための検知用流路とを有する検査カートリッジと、
前記検査カートリッジと連結され、前記検体液、前記試薬とを前記検査カートリッジ内に搬送する圧力供給装置と、
前記検査カートリッジを保持すると共に、前記検査カートリッジを移動させるステージとを有し、
紫外域から近赤外域までの波長域をもつ白色光を発する白色光源と、前記白色光を波長毎に空間的に分散させる励起光用分光素子と、前記励起光用分光素子によって分光された光を前記検知用流路に集光するための励起光集光素子と、
前記粒子から発せられる前方散乱光を集光するための散乱光用集光素子と、前記散乱光用集光素子によって集光された光の強度を検出するための散乱光用光検出器と、
前記検査対象の粒子から発せられる蛍光及び側方散乱光を集光するための蛍光集光素子と、前記蛍光集光素子により集光された蛍光を波長毎に空間的に分散させる蛍光用分光素子と、前記蛍光用分光素子によって分光された蛍光を集光するための分光用集光素子と、前記分光用集光素子によって集光された光の強度を波長毎に検出可能なマルチチャネル型光検出器からなるフロー式単粒子分光器。
【国際調査報告】
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