(57)【要約】  本発明は、哺乳動物の精子の活性化剤および当該活性化剤を用いた精子の活性化方法に関する。詳しくは、体外受精や人工授精に使用する哺乳動物の精子の運動能を亢進させる、エンド−β−ガラクトシダーゼおよび／またはＦＧＦを含む精子活性化剤、ならびにエンド−β−ガラクトシダーゼおよび／またはＦＧＦを添加することを特徴とする精子活性化方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンド−β−ガラクトシダーゼおよび／またはＦＧＦを含む、精子活性化剤。
【請求項２】
ＦＧＦがｂＦＧＦである、請求項１に記載の精子活性化剤。
【請求項３】
単離された精子にエンド−β−ガラクトシダーゼおよび／またはＦＧＦを添加するステップを含む、精子活性化方法。
【請求項４】
ＦＧＦがｂＦＧＦである、請求項３に記載の精子活性化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の精子の活性化剤および当該活性化剤を用いた精子の活性化方法に関する。詳しくは、体外受精や人工授精に使用する哺乳動物の精子の運動能を亢進させる、エンド−β−ガラクトシダーゼおよび／またはＦＧＦを含む精子活性化剤、ならびにエンド−β−ガラクトシダーゼおよび／またはＦＧＦを添加することを特徴とする精子活性化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の精子は、射精の後、運動能獲得および受精能獲得のために活性化される。この活性化のプロセスは、先体反応前あるいは精子が卵に出会う前に起こる反応であり、精液中に含まれる受精能獲得抑制因子（decapacitation factor, DF）に依存した可逆的反応である。【０００３】
精子の運動能獲得は、精子の先体反応を可能とするのに必要な現象である。また、運動能獲得と受精能獲得は並行して生じ、これら２種類の精子活性化現象はいずれも受精に必須である。受精能獲得は、受精能獲得抑制因子の除去によって生じる一連の生化学的反応により定義されている。これら２種類の現象が生じるためには、カルシウムとグルコースが必要であると考えられている。【０００４】
また、ケトン体が精子を活発な運動状態へ誘導することや精子運動の維持にも重要な役割を果たしていることが見出されている（特許文献１）ほか、抗酸化剤等が精子の活性化に与える影響に注目した報告も多数存在する（特許文献２等）。【０００５】
過剰な活性酸素により精子の活力が阻害されることから、精子活性化剤として、抗酸化物質が注目を集めている。例えば、現在、グルタチオンやＳＯＤ、タウリンなどの活性酸素除去物質が添加されたり、活性酸素の抑制及び金属イオンの除去を目的としてＥＤＴＡが添加されたり、抗酸化剤としてコエンザイムＱ１０やカテキン等が用いられている。【０００６】
しかしながら、これらの精子活性化剤はその作用機序や臨床効果が不明であり、臨床の現場では、未だに受精率向上に有効な方法が存在しないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２５５６７６
【特許文献２】特開２００５−２１３１４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、受精率の向上に有効な、新規な精子活性化剤および精子活性化方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明者らはヒト精子の構造および運動能について鋭意検討を行った結果、ヒト精子尾部を覆っている多量のグリカン（多糖類）が精子尾部表面への物質のアクセスを妨げていること、係るグリカンが多くの硫酸基とフコースを含んだ特殊な構造のポリラクトサミン糖鎖であること、係る糖鎖は精巣上体の上皮細胞によって合成されて精液へ分泌されること、精子をエンド−β−ガラクトシダーゼを用いて処理すると精子の運動能が増強されること、係る作用はｃＡＭＰレベルの増加とカルシウム流入に伴って生じること、および精子尾部にＦＧＦＲ２が存在し、ＦＧＦを精子に添加すると精子の運動能が増強されること、を見出した。本発明者らは、これらの知見、特に、精子にエンド−β−ガラクトシダーゼ若しくはＦＧＦを単独で、またはそれらを組み合わせて添加することにより、精子の運動能が亢進されるという知見に基づいて、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［４］を提供する。
［１］エンド−β−ガラクトシダーゼおよび／またはＦＧＦを含む、精子活性化剤。
［２］ＦＧＦがｂＦＧＦである、［１］に記載の精子活性化剤。
［３］単離された精子にエンド−β−ガラクトシダーゼおよび／またはＦＧＦを添加するステップを含む、精子活性化方法。
［４］ＦＧＦがｂＦＧＦである、［３］に記載の精子活性化方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、全く新しい作用機序に基づく精子活性化剤および精子活性化方法が提供される。本発明の精子活性化剤を使用すると、精子の運動能が増強されるので、結果、受精を促進することができる。本発明の活性化剤および活性化方法はヒトを含む哺乳動物の体外受精および胚移植（ＩＶＦ−ＥＴ）に活用することができる。また、本発明により、精子運動能不全に起因する不妊症患者のための人工授精（ＡＩＨ）の効率を飛躍的に向上させることができると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、精子運動能のＣＡＳＡ分析の結果を示す。１９人のボランティアより得た精子を、分析前に３７℃で１５分間エンド−β−ガラクトシダーゼで処置した（＋）、または処置しなかった（−）。Ａ  全運動能；Ｂ  進行性の前方への運動能；Ｃ  非進行性の運動能。使用した統計分析は、ペア両側ｔ検定（ｎ＝１９）。
【図２】図２は、ヒト精子へのエンド−β−ガラクトシダーゼ処置の効果を示すグラフである。Ａ  エンド−β−ガラクトシダーゼで処置した（赤）または処置しなかった（青）ヒト精子中のＡＴＰレベル；Ｂ  エンド−β−ガラクトシダーゼで処置した（赤）または処置しなかった（青）ヒト精子中のカルシウムレベル；Ｃ  エンド−β−ガラクトシダーゼで処置したまたは処置しなかったヒト精子中のｃＡＭＰレベル。
【図３】図３は、精子関連粘液グリカンのＭＡＬＤＩ−ＭＳのスペクトルを示す。
【図４】図４は、抗ルイスＹ抗体を用いた、組織切片および精液スメアの免疫組織化学を示す図である。Ａ  精巣；Ｂ  精巣上皮管；Ｃ  精巣輸出管；Ｄ  ヒト精液；Ｅ  ＰＢＳ洗浄精子。組織切片および精液または精子スメアのスライドは、エンド−β−ガラクトシダーゼで処理し（右）または処理せず（左）、抗ルイスＹ抗体により免疫染色した。精巣中の精原細胞（Ａ中の矢印）は染色されなかったが、一方、精巣上皮管の上皮細胞（Ｂ中の短い矢印）と精巣輸出管中の粘液（Ｃ中の長い矢印）は、該抗体により陽性に染色されたことに留意。スケールバー：１００μｍ（Ａ、ＢおよびＣ）、５０μｍ（ＤおよびＥ）。
【図５】図５は、ヒト精子細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する精液由来のポリラクトサミンの効果を示す図である。
【図６】図６は、精子運動能のポリラクトサミン依存性の抑制について、想定されるメカニズムを示す図である。
【図７】図７は、ヒト精子糖ペプチドのＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０によるゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す。各分画は、アントロン呈色反応によって、ヘキソースに関して測定された。
【図８】図８は、精液ポリラクトサミンを外因的に添加したまたはしない場合のヒト精子のＣＡＳＡ分析の結果を示す。
【図９】図９は、ＦＧＦで処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＦＧＦＲ２のチロシンリン酸化の経時変化を調べた実験結果である。
【図１０】図１０は、アクロビーズテストを用いてヒト精子受精能を評価した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．定義
エンド−β−ガラクトシダーゼ（ＥＢＧ）は、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖中の内側にあるβ−ガラクトシド結合を加水分解する酵素である。本発明において使用し得るエンド−β−ガラクトシダーゼは、エンド−β−ガラクトシダーゼ活性を有する限り、特に限定されない。
【００１４】
ここで「エンド−β−ガラクトシダーゼ活性」とは、Ｒ−ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（またはＧｌｃ）（Ｒ−Ｎ−アセチルグルコサミンβ１−３ガラクトースβ１−４Ｎ−アセチルグルコサミン（またはグルコース））に含まれるＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（またはＧｌｃ）に含まれるＧａｌβ１と４ＧｌｃＮＡｃ（またはＧｌｃ）との間の結合を加水分解して、Ｒ−ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌとＧｌｃＮＡｃ（またはＧｌｃ）を生ずる活性をいう。例えば、本発明においては、エンド−β−ガラクトシダーゼとして、遺伝子工学的に製造されたもの、市販されているもの、またはそれらのアミノ酸配列において一部のアミノ酸が置換、欠失、または付加されているがエンド−β−ガラクトシダーゼ活性を有するものを使用することができる。具体的には、例えば、Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．Ｎ．（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６，３９００−３９０５に従って得られるエンド−β−ガラクトシダーゼを使用することができる。
【００１５】
繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、血管新生、創傷治癒、および胚発生に関連する成長因子のファミリーであり、中胚葉由来のほとんどすべての細胞および組織の増殖と分化のプロセスにおいて重要な役割を果たすことが知られている。ＦＧＦは、その等電点に基づいて塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）と酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）に大別される。ｂＦＧＦは、ＦＧＦ２としても知られ、繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）に結合する。本発明においては、ｂＦＧＦが好ましく使用される。例えば、本発明においては、ｂＦＧＦとして、哺乳動物の臓器より抽出されたもの、遺伝子工学的に製造されたもの、市販されているもの、またはそれらのアミノ酸配列において一部のアミノ酸が置換、欠失、または付加されているがＦＧＦＲへの結合活性を有するものを使用することができる。
【００１６】
本明細書において、「精子活性化」とは精子の運動能が亢進されることを意味し、「精子活性化剤」は、精子の運動能を亢進することによってその受精能を向上させるための薬剤である。
【００１７】
本発明を適用できる哺乳動物としては、限定するものではないが、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの家畜、マウス、ラット、ウサギ等の実験動物、イヌ、ネコなどの愛玩動物、およびヒトが挙げられる。
【００１８】
２．精子活性化剤
本発明は、エンド−β−ガラクトシダーゼおよび／またはＦＧＦを含む、哺乳動物の精子活性化剤を提供する。よって、本発明の精子活性化剤は、精子無力症等に起因する不妊症治療剤、受精促進剤、および体外受精促進剤として使用し得る。
【００１９】
本発明の精子活性化剤は、有効成分として、エンド−β−ガラクトシダーゼ若しくはＦＧＦを単独で、またはエンド−β−ガラクトシダーゼとＦＧＦとを組み合わせて含有するものである。ＦＧＦとしては、ｂＦＧＦが好ましく使用される。また、本発明の精子活性化剤は、哺乳動物の精子の活性化を妨げない限り、さらに他の成分を含んでもよい。他の成分としては、例えば、精子運動のエネルギー源となるピルビン酸、グルコース、ヒドロキシ酪酸等が挙げられる。
【００２０】
本発明の精子活性化剤は、哺乳動物より単離された精子に対して添加して使用される。精子は、採取後すぐのもの、採取後に常温保存されたもの、または凍結保存された後に融解されたものでもよい。また、本発明の精子活性化剤は、精子培養用の培地成分として使用することができ、精子培養用の培地にあらかじめ添加して使用してもよいし、精子培養中に添加して使用してもよい。
【００２１】
本発明の精子活性化剤は、精子を活性化するのに有効量のエンド−β−ガラクトシダーゼおよび／またはＦＧＦを含む。具体的には、本発明の精子活性化剤は、エンド−β−ガラクトシダーゼを、使用時の濃度が、０．１〜５ｍＵ／ｍｌとなるように含有する。また、本発明の精子活性化剤は、ＦＧＦを、使用時の濃度が、１〜１００ｎｇ／ｍｌとなるように含有する。本発明の精子活性化剤がエンド−β−ガラクトシダーゼとＦＧＦとを組み合わせて含有する場合には、それぞれ単独で含有する場合よりも含有量を少なくしてもよい。
【００２２】
３．精子活性化方法
本発明は、単離された精子に、エンド−β−ガラクトシダーゼおよび／またはＦＧＦを添加することにより、哺乳動物の精子を活性化する方法を提供する。
【００２３】
本発明の精子活性化方法は、哺乳動物より単離された精子に対して適用することができ、精子は、採取後すぐのもの、採取後に常温保存されたもの、または凍結保存された後に融解されたものでもよい。また、本発明の一態様では、精子を含有する精液および培養液に精子活性化剤を添加してもよい。
【００２４】
精子の濃度は、対象とする哺乳動物の種類や精子の保存状況等に応じて、適宜設定される。例えばヒトの精子に対して本発明の方法を実施する場合、精子の濃度は１×１０5〜１×１０7細胞／ｍｌに設定される。
【００２５】
本発明の精子活性化方法においては、精子に対し、エンド−β−ガラクトシダーゼ若しくはＦＧＦを単独で、またはエンド−β−ガラクトシダーゼおよびＦＧＦを組み合わせて添加する。エンド−β−ガラクトシダーゼおよびＦＧＦを組み合わせて添加する場合には、それぞれを順に添加してもよいし、同時に添加してもよい。順に添加する場合には、第１の成分と第２の成分を連続して添加してもよいし、第１の成分を添加して一定時間経過した後に第２の成分を添加してもよい。また、順に添加する場合には、どちらを先に添加してもよいが、エンド−β−ガラクトシダーゼを先に添加する方が好ましい。また、哺乳動物の精子の活性化を妨げない限り、さらに他の成分を添加してもよい。他の成分としては、例えば、精子運動のエネルギー源となるピルビン酸、グルコース、ヒドロキシ酪酸等が挙げられる。
【００２６】
本発明の精子活性化方法においては、精子を活性化するのに有効量のエンド−β−ガラクトシダーゼおよび／またはＦＧＦを添加する。具体的には、エンド−β−ガラクトシダーゼの濃度が０．１〜５ｍＵ／ｍｌとなるように、ＦＧＦの濃度が１〜１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加する。本発明の一態様において、エンド−β−ガラクトシダーゼとＦＧＦの両者を添加する場合には、それぞれ単独で添加する場合よりも濃度を低くしてもよい。
【００２７】
本発明の精子活性化方法においては、精子に対してエンド−β−ガラクトシダーゼおよび／またはＦＧＦを添加した後、一定時間（例えば、５分、１５分、３０分、６０分）、精子の培養を行ってもよい。培地は精子の培養に適した培地であれば特に限定されず、例えば、ＢＯ液、ＫＲＢ、ＫＲＰ、ＴＹＨ、ＴＣＭ１９９、ＳＯＦ等、公知の体外受精用培地を使用することができる。なお、培地は、動物血清を含まない「無血清培地」であることが好ましいが、血清代替物、ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）等は添加してもよい。培地のｐＨは５．５〜９．０、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５の範囲である。培養は、室温〜３８℃、好ましくは室温〜３７．５℃で、１％〜２５％  Ｏ2、１％〜１５％  ＣＯ2の条件下で適宜培地を交換しながら行う。
【００２８】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て参照として本明細書に組み込まれる。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願2012-206711号（2012年9月20日出願）の明細書および図面に記載の内容は全て参照として本明細書に組み込まれる。
【００２９】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００３０】
１．実験方法
（１）酵素、抗体、および発現ベクター
エンド−β−ガラクトシダーゼは生化学工業（東京）から取得し、Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．Ｎ．（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６，３９００−３９０５に記載のようにＥ．ｆｒｅｕｎｄｉｉの培養液からも精製した。抗ルイスＹモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−Ｌｅｗｉｓ  Ｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（クローンＡＨ６、マウスＩｇＭ）は、ワシントン大学のＤｒ．Ｓ．Ｈａｋｏｍｏｒｉより提供されたものである。【００３１】
（２）ＣＡＳＡ分析
１９人の健康なボランティアより取得され、凍結保存されていたヒト精子を、ｓｐｅｒｍ  ｗａｓｈｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を用いて洗浄し、同じ溶液に懸濁させた。エンド−β−ガラクトシダーゼを１ｍＵ／ｍｌで水に溶解した。１００ｍｌのヒト精子溶液（２ｘ１０＾６細胞）に対して５ｍｌのエンド−β−ガラクトシダーゼを添加し、室温で１５分間インキュベートした。精子運動能は、コンピュータ補助精液分析器（ＣＡＳＡ、ｓｐｅｒｍ  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎａｌｙｚｅｒ−ｖ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｓ、ＣＡ）を用いて解析した。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ  ｐｒｏｇｒａｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗｅａｒ）を用いて、スチューデントｔ−検定により行った。【００３２】
（３）ＡＴＰ、カルシウム流入、およびｃＡＭＰの測定
ヒト精子におけるＡＴＰレベルを、蛍光に基づくＡＴＰアッセイＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。つまり、ヒト精子を上記のとおりエンド−β−ガラクトシダーゼと一緒にインキュベートし、等量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬と混合した。四つ組で（ｉｎ  ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）アッセイするサンプルを、白色３８４ウェルプレートのウェル内に入れ、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＴＸ８１０  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒを用いて１分毎に９０分まで化学発光をモニターした。精子細胞へのカルシウム流入は、Ｆｌｕｏ−４  ＮＷ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて測定した。エンド−β−ガラクトシダーゼで処理したまたは処理していない精子細胞は、三つ組で（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）９６ウェルプレート中でアッセイした。４８５ｎｍの励起波長での蛍光および５３６ｎｍでの蛍光を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ  ＩＩ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、３０秒ごとに１８０分まで測定した。サイクリックＡＭＰは、ｃＡＭＰ用の競合免疫アッセイキットおよびＧＭＰ  ＸＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて測定した。つまり、精子細胞を、２．５Ｕ／ｍｌのエンド−β−ガラクトシダーゼを用いてまたは用いずに、０、１５、および６０分間処理した。免疫アッセイは、製品のプロトコールに従って、三つ組で行った。エンド−β−ガラクトシダーゼ処理サンプルから得られた化学発光の値より、対照サンプルから得られた値を引いた。【００３３】
（４）精子関連グリカンの調製および質量分析解析
２０人のボランティアより得たヒト精子を凍結保存した。解凍後、精子細胞を遠心分離により回収し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、２０μｌのプロテイナーゼＫ（１４−２２ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ）を用いて４５℃にて２０時間消化した。遠心により不溶物を除去した後、上清を１Ｍ  ＮａＢＨ4を含有する０．５Ｍ  ＮａＯＨで、３７℃にて２０時間処理した。サンプルを、水で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５に通し、ボイドボリュームにて溶解している物質をプールし、０．２Ｍ  ＮａＣｌで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０  ｓｕｐｅｒ  ｆｉｎｅ  ｃｏｌｕｍｎに適用した。中性糖をアントロン呈色反応（Ａｎｔｈｒｏｎｅ  ｃｏｌｏｒ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によりモニターし、質量分析解析のために大きなグリカンまたはポリラクトサミンを有する糖ペプチドを回収した。サンプルはまず、５０ｍＭ酢酸アンモニウム中５ｍＭエンド−β−ガラクトシダーゼ（Ｅ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来、生化学工業）によって、ｐＨ５．８、３７℃で４８時間消化された。その後、０．１％ＴＦＡ中２５〜５０％のアセトニトリルによってＳｕｐｅｌｃｌｅａｎ  ＥＮＶＩ−Ｃａｒｂ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）から流出させて完全メチル化した（ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）。サンプルの他のロットは、非硫酸化および硫酸化グリカンの両方を回復するために、上記の条件を用いてＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ解析用に直接完全メチル化した。【００３４】
（５）精液ポリラクトサミンの調製
ヒト精液を３倍量のクロロホルム：メタノール（２：１、ｖ／ｖ）と混合し、脂質を抽出した。遠心分離後、ペレットを、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．０に懸濁し、プロテアーゼＫにより４５℃で２０時間消化された。遠心分離後、水溶物を水で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を通過させ、ボイドボリュームにて抽出される物質を、上記のようにＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０  ｓｕｐｅｒ  ｆｉｎｅ  ｃｏｌｕｍｎに適用した。ポリラクトサミンは回収され、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムにより脱塩し、凍結乾燥された。【００３５】
（６）免疫組織化学
ヒト精巣、精巣輸出管（ｄｕｃｔｕｌｉ  ｅｆｆｅｒｅｎｔｅｓ  ｔｅｓｔｉｓ）および精巣上皮管（ｄｕｃｔｕｌｉ  ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｃｓ）のパラフィン組織切片を、Ｆｏｌｉｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。脱パラフィン、水和、およびペルオキシド処理した後、組織の各ペアの一スライドを、３７℃で３０分間、エンド−β−ガラクトシダーゼ処理に供した。組織標本を抗ルイスＹ（クローン  ＡＨ６）抗体によって、続いてビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）およびペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンによって染色した。ペルオキシダーゼ呈色反応は、ＤＡＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅまたはＡＥＣ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行われ、ヘマトキシリンを用いて対比染色を行った。洗浄していないおよびＰＢＳで洗浄したヒト精子細胞は、スライドグラス上になすりつけ、風乾し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定した。次に、組織を、エンド−β−ガラクトシダーゼを用いてまたは用いずに処理し、上記のとおり、組織切片のための免疫染色を行った。【００３６】
（７）ＦＧＦ結合アッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、〜７５％の集密度まで培養した。培地は、３０分毎に、１０％ウシ胎児血清および１ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4を含む新しい培地に完全に交換した。上記方法で精製したポリラクトサミンを、１ｍｇ／ｍｌでモノレイヤーに添加し、１０分間インキュベートした。次いで組換えｂ−ＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ）を最終濃度２５ｎｇ／ｍｌまで添加し、５分間インキュベートした。次に、細胞をＴＢＳで３回洗浄した。ｂ−ＦＧＦ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中にある溶解バッファーを用いて、細胞可溶化液を調製し、遠心分離した。１００ｍｇのタンパク質を含有する各可溶化液を、ＥＬＩＳＡ阻害アッセイに供し、ポリラクトサミンの存在下または非存在下における、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合しているＦＧＦの量を決定した。【００３７】
（８）免疫沈降および免疫ブロット
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充した培地中で培養した。Ｎａ3ＶＯ4を、最終濃度１ｍＭになるように添加し、３０分間インキュベートした。ポリラクトサミン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、最終濃度２５ｎｇ／ｍｌとなるようにＦＧＦを添加し、５分間インキュベートした。次に細胞をラバーポリスマンを用いて回収し、１ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4を含有する冷ＴＢＳで洗浄し、ＴＢＳ中１％ＮＰ−４０で可溶化した。各可溶化液は、２０μｌプロテインＡ／Ｇアガロースビーズを用いて、４℃で２０時間、前もってきれいにした（pre-cleared）。プロテインＡ／Ｇビーズ（２０μｌ）は、５００μｌＴＢＳＴ中、抗ＦＧＦＲ２抗体（２μｇ、ウサギポリクローナル、ＧｅｎＴｅｘ）で、４℃で２０時間コートされた。前もってきれいにした可溶化液を、４℃で２０時間、抗ＦＧＦＲ２抗体コートプロテインＡ／Ｇビーズと反応させた。ビーズはＴＢＳＴで３回洗浄し、ビーズ結合物質をＳＤＳバッファー中で３分間煮ることにより抽出した。タンパク質は、４〜１２％の密度勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離され、ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にトランスファーされた。Ｏｄｙｓｓｅｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてブロッキングした後、フィルターを、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するブロッキングバッファー中で、６０分間、希釈した（１：５００）抗チロシンリン酸抗体（４Ｇ１０、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）と反応させた。続いて、希釈した（１：５０００）ＩＲＤｙｅ−結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と一緒に４５分間インキュベーションした。ＴＢＳＴで洗浄後、フィルターをＯｄｙｓｓｅｙ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍでスキャンし、バンドを検出した。【００３８】
（９）アクロビーズテスト
５人のボランティアより得たヒト精子をアクロビーズテスト（MH61抗体結合ビーズ、扶桑薬品工業株式会社）に供し、エンド−β−ガラクトシダーゼを添加した場合と添加しない場合のヒト精子の受精能の変化を評価した。受精能の測定および評価は、アクロビーズテストの添付文書に従って行った。具体的には、新鮮なまたは凍結されたヒト精子を、精子洗浄溶液（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）で洗浄し、エンド-β−ガラクトシダーゼ（２．５ｍＵ）を用いてまたは用いずに、室温にて１５分間処理した。５×１０６細胞／ｍｌの精子細胞を、連続的に１：１、１：２、１：４、および１：８に希釈して、アクロビーズを入れた平底マイクロタイタープレートに添加し、ＣＯ２(5%)存在下、３７℃の加湿インキュベーターにて２４時間、撹拌せずにインキュベートした。各ウェルの５つの領域を倒立顕微鏡下で観察し、結果を、すべての精子細胞がビーズに結合していた場合を陽性、全くまたはいくつかしか精子細胞がビーズに結合していない場合を陰性と判断した。１：８希釈まで陽性の場合をスコア４、１：４希釈まで陽性の場合をスコア３、１：２希釈まで陽性の場合をスコア２、１：１希釈まで陽性の場合をスコア１とした（表１参照）。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ  ｐｒｏｇｒａｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗｅａｒ）を用いてペア両側ｔ−検定（paired two-tailed t-test）によって行った。【００３９】
【表１】
2014045582.tif 000002
【００４０】
２．結果
（１）エンド−β−ガラクトシダーゼ処理はヒト精子の運動性を亢進させる
本発明者らの研究成果も含む従来の研究は、成熟ヒト精子細胞は糖鎖によって濃密にカバーされていることを示唆している（Ｔｏｌｌｎｅｒ，  Ｔ．  Ｌ．，  Ｖｅｎｎｅｒｓ，  Ｓ．  Ａ．，  Ｈｏｌｌｏｘ，  Ｅ．  Ｊ．，  Ｙｕｄｉｎ，  Ａ．  Ｉ．，  Ｌｉｕ，  Ｘ．，  Ｔａｎｇ，  Ｇ．，  Ｘｉｎｇ，  Ｈ．，  Ｋａｙｓ，  Ｒ．  Ｊ．，  Ｌａｕ，  Ｔ．，  Ｏｖｅｒｓｔｒｅｅｔ，  Ｊ．  Ｗ．，  Ｘｕ，  Ｘ．，  Ｂｅｖｉｎｓ，  Ｃ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｒ，  Ｇ．  Ｎ．  （２０１１）  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ３，  ９２ｒａ６５、Ｈａｔａｋｅｙａｍａ，  Ｓ．，  Ｓｕｇｉｈａｒａ，  Ｋ．，  Ｌｅｅ，  Ｓ．  Ｈ．，  Ｎａｄａｎｏ，  Ｄ．，  Ｎａｋａｙａｍａ，  Ｊ．，  Ｏｈｙａｍａ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｆｕｋｕｄａ，  Ｍ．  Ｎ．  （２００８）  Ｊ  Ｕｒｏｌ  １８０，  ７６７−７７１、Ｐａｎｇ，  Ｐ．  Ｃ．，  Ｔｉｓｓｏｔ，  Ｂ．，  Ｄｒｏｂｎｉｓ，  Ｅ．  Ｚ．，  Ｓｕｔｏｖｓｋｙ，  Ｐ．，  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｈ．  Ｒ．，  Ｃｌａｒｋ，  Ｇ．  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｄｅｌｌ，  Ａ．  （２００７）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２，  ３６５９３−３６６０２）。これらの多糖類が、精子尾部の運動に機能するかどうか判定するため、本発明者らは、ヒト精子をエンド−β−ガラクトシダーゼ（ポリ−Ｎ−アセチル−ラクトサミンを加水分解する酵素）で処理した。視覚的検査により、エンド-β−ガラクトシダーゼ処理された精子は処理されていない精子に比べて、より活発に移動することが明らかになった（データ開示無し）。エンド−β−ガラクトシダーゼ処理によって亢進された動作のタイプを決定するため、精子細胞を、コンピューター補助精液分析（ＣＡＳＡ）に供した。分析により、進行性の、もしくは前方への運動能が、酵素処理によって亢進され、ランダムなまたは非進行性の運動能は亢進されなかった（図１）。【００４１】
本発明者らは、ヒト精子をエンド−β−ガラクトシダーゼ（ＥＢＧ）で処理した場合の受精能の変化を、アクロビーズテストによって評価した。その結果、ＥＢＧ添加により受精能が亢進されることが示唆された（図１０）。【００４２】
精子尾部運動能は、ＡＴＰａｓｅおよびイオンチャネルの活性を必要とするという報告がある。これらのパラメーターを分析するために、本発明者らは、精子中のＡＴＰレベルを測定したが、対照群とエンド−β−ガラクトシダーゼ処理群間で差が見られなかった（図２Ａ）。対照的に、カルシウムレベルは、酵素処理した精子細胞において著しく増加していた（図２Ｂ）。精子へのカルシウム流入は、サイクリックヌクレオチド感受性チャネル（ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌｓ）によって調節されるので、本発明者らはｃＡＭＰレベルを調べたところ、エンド−β−ガラクトシダーゼ処理した精子において確かに増強されることがわかった（図２Ｃ）。これらの結果は、精子尾部に付着したポリラクトサミンが、ｃＡＭＰおよびカルシウムチャンネル依存的なメカニズムによって、精子運動能を調節することを強く示唆する。【００４３】
図２は、ヒト精子へのエンド−β−ガラクトシダーゼ処置の効果を示すグラフである。Ａ  エンド−β−ガラクトシダーゼで処置した（赤）または処置しなかった（青）ヒト精子中のＡＴＰレベル。各点は四つ組分析の平均を表す。；Ｂ  エンド−β−ガラクトシダーゼで処置した（赤）または処置しなかった（青）ヒト精子中のカルシウムレベル。三つ組のデータポイントの平均値を表す。；Ｃ  エンド−β−ガラクトシダーゼで処置したまたは処置しなかったヒト精子中のｃＡＭＰレベル。精子細胞は、プロテインキナーゼＣに基づくｃＡＭＰ測定に供された。蛍光の値は、エンド−β−ガラクトシダーゼ処理細胞由来の値から、テスト期間中バッファーで処理された対照由来の値を引いた値である。各点は、１０回の読み取りの平均を表す。【００４４】
（２）ヒト精子細胞から単離されたポリラクトサミンの構造
どのような種類の糖鎖構造が精子運動能の調節に関与するかを決定するために、本発明者らはヒト精子細胞からポリラクトサミンを単離した。ヒト精子グリカンに関する以前の研究では、ポリラクトサミンは検出されなかったので、本発明者らは、ポリラクトサミンはヒト精子の固有成分ではなく、むしろ尾部に関係している、と推測した。精子に関連するポリラクトサミンを特徴づけるために、本発明者らはＰＢＳで２度洗った後に精液から精子細胞を単離した。精子細胞はその後プロテアーゼＫで消化処理され、水溶性物質をゲル濾過によって分画した。この分析により、おそらくポリラクトサミンであろう、大きな糖鎖の存在を明らかにした（図７）。エンド−β−ガラクトシダーゼ処理すると、この分画のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析は、０−２  ＦｕｃのＬａｃＮＡｃ−Ｇａｌグリカンのフラグメントのシリーズを検出した。これらは、酵素消化により放出された末端配列を表しており、高度にフコシル化された１−３  Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃユニットを有することに一致している（図３Ａ）。これらは、恐らく、消化処理に強かったポリラクトサミンの末端に由来する。非還元末端配列のより完全なプロフィールは、先にエンド−β−ガラクトシダーゼ処理をしない、直接的に、完全メチル化されたサンプルのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析によって得た。これは、ポジティブイオンモードにおいて、酵素により放出されたＬａｃＮＡｃ−Ｇａｌシリーズがないことを除いて、極めて類似のプロフィールを与えた（図３Ｂ）だけではなく、ネガティブイオン・モードにおいて、硫酸化、シアリル化、フコシル化されたＨｅｘ−ＨｅｘＮＡｃユニットがさらに存在することを明らかにした（図３Ｃ）。とりわけ、Ｈ、ＬｅＸおよびＬｅＹエピトープの存在は、構成および追加のＭＳ／ＭＳ分析の両方から明白だった（図示せず）。特に、インソースフラグメンテーションによりｍ／ｚ  ６３８および８１２でオキソニウムイオンが生じ、これはそれぞれ１および２  Ｆｕｃを持つＬａｃＮＡｃに一致している。さらに、３  ＬａｃＮＡｃおよび４  Ｆｕｃのような構成の多糖類（グリカン）フラグメントは、硫酸塩の有無により検出できた。したがって、精子に関連するポリラクトサミンは、シアリル化と硫酸化に加えて、血液グループのＨ、ＬｅＸおよびＬｅＹ抗原を含んでいるＦｕｃで高度に置換されている。【００４５】
図３は、精子関連粘液グリカンのＭＡＬＤＩ−ＭＳのスペクトルを示す。Ａ  ポジティブイオンモードにおける、エンド−β−ガラクトシダーゼ処理サンプルにより提供された完全メチル化グリカンフラグメントであり、ｉ）末端Ｆｕｃ0-2ＬａｃＮＡｃ−Ｇａｌ（ｍ／ｚ  ７２２、８９６および１０７０）およびｉｉ）様々な程度にフコシル化され、シアリル化されているまたはされていない［Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ］1-3のシリーズに対応している。後半のシリーズはエンド−β−ガラクトシダーゼ消化に由来するのではなく、完全メチル化中、大きな糖ペプチドおよび／または抵抗性ポリラクトサミンの直接的な化学的切断を介したものでありうる。Ｂ  それぞれ［Ｍ＋Ｎａ］+と［Ｍ−Ｈ］-で示されるポジティブイオンモードおよびネガティブイオンモードにて検出された、エンド−β−ガラクトシダーゼで消化していない同じサンプルの完全メチル化により提供された非硫酸化（上パネル）および硫酸化（下パネル）グリカンフラグメント。種々にフコシル化された［Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ］1-3グリカンフラグメントの同じシリーズに加え、末端Ｈ／ＬｅＸ（ｍ／ｚ  ６３８）、ＬｅＹ（ｍ／ｚ  ８１２）、およびシアリルＬａｃＮＡｃ（ｍ／ｚ  ８２５）が検出された。ネガティブイオンモードにおいて、シアリル化されているまたはされていない硫酸化およびフコシル化［Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ］1-4フラグメントを、一連のシグナルと一緒に同定することができ、これは、グリコサミノグリカンの繰返し単位と類似の硫酸化［ヘキスロン酸−ＨｅｘＮＡｃ］2-4として暫定的に帰属させることができた。すべての主要なピークは、図に示した記号を用いて標識され、注解された。ＵＡはヘキスロン酸を示す。【００４６】
（３）精子形成において機能する臓器中の、エンド−β−ガラクトシダーゼ感受性ＬｅＹ抗原の局在
精子に関連するグリカンとして見つけたＬｅＹ抗原のポリラクトサミンの起源を明確にするため、本発明者らは精子形成において機能する器官由来のヒト組織の免疫組織化学を行なった。ヒト精巣はＬｅＹ抗原に対して陰性だった（図４Ａ）。対照的に、ＬｅＹ抗原は、精巣から新たに放出された精子を含む精巣上皮管由来組織（図４Ｂ）および完全に成熟した精子を含む精巣輸出管由来組織（図４Ｃ）の上皮細胞で見られた。精子と精液の混合物を含む精液スメアは、ＬｅＹ抗原に陽性であった（図４Ｄ）。ＬｅＹ陽性組織のエンド−β−ガラクトシダーゼ処理は、ＬｅＹ陽性を消失させた（図４Ａ〜Ｅ  右パネル）。これらの結果は、成熟精子細胞に付着したフコシル化ポリラクトサミンは、精巣上体の上皮細胞に由来し、この細胞層から精液へ分泌されることを強く示唆する。【００４７】
（４）ポリラクトサミン受容体の候補として、ＦＧＦＲ２の同定
精液から精製した精液ポリラクトサミンをヒト精子へ加えると、精子運動能は抑制されたことから（図５Ａ、図８）、精子尾部に、精子運動能を抑制するポリラクトサミン受容体が存在することが示唆される。ポリラクトサミン依存性の精子運動能の基礎となるメカニズムを理解し、かつ潜在的なポリラクトサミン受容体を同定するために、本発明者らはヒト精子尾部タンパク質のプロテオミクス・データベースを調べた（表２）。【００４８】
【表２】
2014045582.tif 000003
【００４９】
精子尾部表面に見られたこと（図５Ｂ）、および、ＰＬＣγ／Ｃａ2+／ＰＫＣ経路を通じてｃＡＭＰレベルを増加する報告があったことから、本発明者らは、いくつかの候補のうちＦＧＦＲ２に注目した。【００５０】
ＦＧＦＲ２は、受容体チロシン・キナーゼである。ＦＧＦがＦＧＦＲ２の細胞外ドメインに結合すると、ＦＧＦＲ２の細胞質ドメインはチロシンリン酸化される。ヒト精子細胞を抗チロシンリン酸化抗体によって染色すると、頭部ではなく、尾部が強く染色された（図５Ｃ）。これらの染色の強度および頻度は、ＦＧＦおよびポリラクトサミンの存在下または非存在下で変化しなかったこと（データは示していない）から、ヒト精子を用いてポリラクトサミンおよびＦＧＦの効果を決定するのが困難であることが示唆される。したがって、本発明者らは、内因性のＦＧＦＲ２を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養液にＦＧＦを加えると、ＦＧＦＲ２は、チロシンリン酸化され、それは、５分でピークに達した（図９）。さらに、ポリラクトサミンの存在下で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＦＧＦの結合をアッセイすると、ポリラクトサミン非存在下よりも結合が低かった（図５Ｄ）。このことは、ポリラクトサミンが、受容体へのＦＧＦの結合をブロックすることを示唆している。最後に、本発明者らは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＦＧＦ依存性のＦＧＦＲ２チロシンリン酸化が、ポリラクトサミンによって阻害されたことを観察した（図５Ｅ）。最後に、エンド−β−ガラクトシダーゼおよび／またはＦＧＦで処理したヒト精子の運動能を比較すると、最も高い運動能は、エンド−β−ガラクトシダーゼおよびＦＧＦで処理した精子において観察された（図５Ｆ）。これらの結果は、精液ポリラクトサミンが、受容体へのＦＧＦの結合を阻害することによって、ＦＧＦＲ２活性化を障害できることを示唆する。【００５１】
図５に、ヒト精子細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する精液由来のポリラクトサミンの効果を示す。Ａ  ＣＡＳＡにより分析された、ヒト精子運動能に対する精液ポリラクトサミンの効果。運動能は、分析に使用した精子の総数に対する運動性の精子の相対数により表す。追加のデータは図８に示す。Ｂ  ＦＧＦＲ２について染色したヒト精子細胞の免疫染色。左  抗ＦＧＦＲ２抗体により染色されたヒト精子細胞の代表的な像。右  一次抗体を用いずに染色されたヒト精子細胞の代表的な像。Ｃ  チロシンリン酸化について染色されたヒト精子の免疫蛍光顕微鏡写真。ヒト精子細胞は、抗チロシンリン酸化抗体、次いでアレクサ５６４結合抗マウスＩｇＧ抗体により染色された。核染色にはジアミジノ−２−フェニルインドールを使用した。Ｄ  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＦＧＦの結合に対するポリラクトサミンの効果。ポリラクトサミン存在下または非存在下での結合を、ＦＧＦ−ＥＬＩＳＡ阻害アッセイによって測定した。Ｅ  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＦＧＦＲ２のチロシンリン酸化に対するポリラクトサミンの効果。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ポリラクトサミンの存在下または非存在下でＦＧＦで処理され、可溶化液をＦＧＦＲ２に対する抗体を用いて免疫沈降し、リン酸化チロシンについて免疫ブロットを行った（下パネル）。Ｆ  エンド−β−ガラクトシダーゼ処理したヒト精子の運動能に対するＦＧＦの効果。【００５２】
図６は、精子運動能のポリラクトサミン依存性の抑制について、想定されるメカニズムを示す。精子尾部は、ＦＧＦＲ２（受容体チロシンキナーゼ）およびＣＡＴＳＰＥＲ１（ｃＡＭＰ依存性のカルシウムチャネル）を発現し、ｃＡＭＰを用いる経路を介して関連づけられ得る。精液ポリラクトサミン（ｐｏｌｙＬａｃ）がＦＧＦＲ２細胞外ドメインに結合すると、ＦＧＦの受容体への結合を妨げて精子運動能を抑制する可能性がある（左）。ポリラクトサミンがエンド−β−ガラクトシダーゼ消化によって除去されるとすぐ、ＦＧＦはＦＧＦＲ２に結合することができ、受容体はチロシンリン酸化を受けるだろう。次に、ＦＧＦＲ２活性化はＰＬＣγおよびＰＫＣシグナル伝達を引き起こし、精子運動能を亢進する、サイクリックヌクレオチド感受性チャネルによるカルシウム流入を促進するだろう（右）。【００５３】
図９は、ＦＧＦで処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＦＧＦＲ２のチロシンリン酸化の経時変化を調べた結果である。２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを用いて、示した時間処理した細胞を、抗ＦＧＦＲ２抗体による免疫沈降に供し、続いて抗チロシンリン酸化（１０Ｅ４）抗体による免疫ブロットを行った（左）。抗体を取り除いた後、抗ＦＧＦＲ２抗体による免疫ブロットと同じフィルターに供した。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明により、全く新しい作用機序に基づく精子活性化剤および精子活性化方法が提供される。本発明の活性化剤および活性化方法はヒトを含む哺乳動物の体外受精および胚移植（ＩＶＦ−ＥＴ）に活用することができる。また、本発明により、精子運動能不全に起因する不妊症患者のための人工授精の効率を飛躍的に向上させることができると考えられる。
【図１】
2014045582.tif 000004
【図２】
2014045582.tif 000005
【図３】
2014045582.tif 000006
【図４】
2014045582.tif 000007
【図５】
2014045582.tif 000008
【図６】
2014045582.tif 000009
【図７】
2014045582.tif 000010
【図８】
2014045582.tif 000011
【図９】
2014045582.tif 000012
【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年3月18日(2016.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンド−β−ガラクトシダーゼを含む、精子活性化剤。
【請求項２】
ｂＦＧＦをさらに含む、請求項１に記載の精子活性化剤。
【請求項３】
エンド−β−ガラクトシダーゼとｂＦＧＦとの組合せであって、精子を活性化することに用いる組合せ。
【請求項４】
単離された精子にエンド−β−ガラクトシダーゼを添加するステップを含む、精子活性化方法。
【請求項５】
ｂＦＧＦを添加するステップをさらに含む、請求項４に記載の精子活性化方法。
【請求項６】
単離した精子にエンド−β−ガラクトシダーゼを添加するステップが、ｂＦＧＦを添加するステップよりも前に行われる、請求項５に記載の方法。
【国際調査報告】
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