(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、従来の骨疾患の治療とは異なるタイプの、骨疾患の治療に有用な医薬組成物を提供することにある。【解決手段】  本発明は、骨疾患の治療に有用な組成物および当該組成物を用いた骨疾患の治療方法に関する。より具体的には、本発明は、骨疾患に罹患する患者を治療するための医薬組成物であって、下記ステップ、（１）骨分化誘導条件下で、幹細胞を含む細胞を培地中において培養するステップ、（２）前記培地から前記細胞を除去することにより、培養上清を取得するステップ、および、（３）前記培養上清に含まれる成分を含む医薬組成物を調製するステップ、によって、得られうる医薬組成物に関する。
2013187194.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨疾患に罹患する患者を治療するための医薬組成物であって、
下記ステップ
（１）骨分化誘導条件下で、幹細胞を含む細胞を培地中において培養するステップ、
（２）前記培地から前記細胞を除去することにより、培養上清を取得するステップ、および、
（３）前記培養上清に含まれる成分を含む医薬組成物を調製するステップ、
によって、得られうる医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬組成物であって、
前記骨疾患が、骨粗鬆症、骨形成不全症、くる病、骨異形成症、または、骨折である
ことを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項３】
請求項１または請求項２のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記ステップ（１）の前記幹細胞が、組織幹細胞またはｉＰＳ細胞である
ことを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の医薬組成物であって、
前記ステップ（１）の前記「幹細胞を含む細胞」が、当該患者由来である
ことを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の医薬組成物であって、
前記ステップ（１）の前記「幹細胞を含む細胞」が、当該患者の脂肪組織由来である
ことを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項６】
請求項４または請求項５のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記ステップ（１）の前記培地が当該患者から採取した血液の血清を含む
ことを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の医薬組成物であって、
前記ステップ（１）の前記骨分化誘導条件が、少なくとも、アスコルビン酸、β-グリセロフォスフェイト、および、デキサメサゾンを使用する骨分化誘導条件である
ことを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項８】
骨疾患に罹患する患者を治療するための医薬組成物であって、
下記ステップ
（１）骨分化誘導条件下で、幹細胞を含む細胞を培地中において培養するステップ、
（２）前記培地から前記細胞を除去することにより、培養上清を取得するステップ、および、
（３）前記培養上清に含まれる成分を含む医薬組成物を調製するステップ、
によって、得られた医薬組成物。
【請求項９】
骨疾患に罹患する患者を治療するための医薬組成物の調製方法であって、
（１）骨分化誘導条件下で、幹細胞を含む細胞を培地中において培養するステップ、
（２）前記培地から前記細胞を除去することにより、培養上清を取得するステップ、および、
（３）前記培養上清に含まれる成分を含む医薬組成物を調製するステップ、
を含む調製方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の調製方法であって、
前記ステップ（１）の前記「幹細胞を含む細胞」が、当該患者由来である
ことを特徴とする、
調製方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の調製方法であって、
前記ステップ（１）の前記「幹細胞を含む細胞」が、当該患者の脂肪組織由来である
ことを特徴とする、
調製方法。
【請求項１２】
請求項１０または請求項１１のいずれか１項に記載の調製方法であって、
前記ステップ（１）の前記培地が当該患者から採取した血液の血清を含む
ことを特徴とする、
調製方法。
【請求項１３】
骨疾患に罹患する患者の治療方法であって、
（１）骨分化誘導条件下で、幹細胞を含む細胞を培地中において培養するステップ、
（２）前記培地から前記細胞を除去することにより、培養上清を取得するステップ、
（３）前記培養上清に含まれる成分を含む医薬組成物を調製するステップ、および、
（４）治療上有効量の前記医薬組成物を当該患者に投与するステップ、
を含む治療方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の治療方法であって、
前記ステップ（１）の前記「幹細胞を含む細胞」が、当該患者由来である
ことを特徴とする、
治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨疾患の治療に有用な医薬組成物および当該医薬組成物を用いた骨疾患の治療方法に関する。【０００２】
より具体的には、本発明は、一態様において、骨疾患に罹患する患者を治療するための医薬組成物であって、下記ステップ、
（１）骨分化誘導条件下で、幹細胞を含む細胞を培地中において培養するステップ、
（２）前記培地から前記細胞を除去することにより、培養上清を取得するステップ、および、  （３）前記培養上清に含まれる成分を含む医薬組成物を調製するステップ、
によって、得られうる（または、実際に得られた）医薬組成物に関する。【０００３】
また、本発明は、一態様において、骨疾患に罹患する患者の治療方法であって、
（１）骨分化誘導条件下で、幹細胞を含む細胞を培地中において培養するステップ、
（２）前記培地から前記細胞を除去することにより、培養上清を取得するステップ、
（３）前記培養上清に含まれる成分を含む医薬組成物を調製するステップ、および、
（４）治療上有効量の前記医薬組成物を当該患者に投与するステップ、
を含む治療方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
骨粗鬆症とは、骨量または骨塩量の減少によって骨の微細構造が破綻し、骨強度が低下して骨折を起こしやすくなる疾患である。【０００５】
日本における骨粗鬆症の患者は約１１００万人と言われており、その８割は女性である。また、米国においては３０００万人以上に症状が現れていると推定されている。さらに、骨粗鬆症は中年以降に多く見られる疾患であるため、近年の先進国等における高齢化に伴い、今後患者数が増加すると推測される。【０００６】
骨粗鬆症の症状は、骨代謝における骨形成と骨吸収のバランスが崩れることにより引き起こされる骨の質の低下に起因するものと考えられている。特に閉経後、女性ホルモン分泌の低下に伴い、骨吸収に対する女性ホルモンの抑制効果が低下するため、骨粗鬆症が発症しやすい。【０００７】
骨粗鬆症の治療には、ビスホスフォネート、エストロゲン、カルシトニンなどの骨吸収抑制剤、ビタミンＫ２などの骨形成促進剤、カルシウム剤などの骨代謝調節剤のような、骨代謝を改善するための薬剤が使用されている。【０００８】
しかし、骨粗鬆症の症状は、これらの薬剤による現存する薬物療法によって、必ずしも、効果的に治療されているとはいえない。また、それらの薬剤には、人工的に合成された化学物質に起因する副作用を有する場合もある。【０００９】
したがって、効果的な骨粗鬆症の治療について、未だ対処されていない医療ニーズがある。【００１０】
また、骨粗鬆症に限らず、その他の骨疾患、例えば、骨形成不全症、くる病、骨異形成症、または、骨折についても、同様に、効果的な骨粗鬆症の治療について、未だ対処されていない医療ニーズがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、従来の骨疾患の治療とは異なるタイプの、骨疾患の治療に有用な医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述の課題を解決するために、本発明は以下の特徴を備える。【００１３】
<<医薬組成物>>
本発明の医薬組成物は、一態様において、骨疾患に罹患する患者を治療するための医薬組成物であって、下記ステップ、
（１）骨分化誘導条件下で、幹細胞を含む細胞を培地中において培養するステップ、
（２）前記培地から前記細胞を除去することにより、培養上清を取得するステップ、および、
（３）前記培養上清に含まれる成分を含む医薬組成物を調製するステップ、
によって、得られうる医薬組成物である。【００１４】
また、本発明の医薬組成物は、一態様において、骨疾患を治療するための医薬組成物であって、下記ステップ、
（１）骨分化誘導条件下で、幹細胞を含む細胞を培地中において培養するステップ、
（２）前記培地から前記細胞を除去することにより、培養上清を取得するステップ、および、
（３）前記培養上清に含まれる成分を含む医薬組成物を調製するステップ、
によって、（実際に）得られた医薬組成物である。【００１５】
<<調製方法>>
本発明の調製方法は、一態様において、骨疾患に罹患する患者を治療するための医薬組成物の調製方法であって、
（１）骨分化誘導条件下で、幹細胞を含む細胞を培地中において培養するステップ、
（２）前記培地から前記細胞を除去することにより、培養上清を取得するステップ、および、
（３）前記培養上清に含まれる成分を含む医薬組成物を調製するステップ、
を含む調製方法である。【００１６】
<<治療方法>>
本発明の治療方法は、一態様において、骨疾患に罹患する患者の治療方法であって、
（１）骨分化誘導条件下で、幹細胞を含む細胞を培地中において培養するステップ、
（２）前記培地から前記細胞を除去することにより、培養上清を取得するステップ、
（３）前記培養上清に含まれる成分を含む医薬組成物を調製するステップ、および、
（４）治療上有効量の前記医薬組成物を当該患者に投与するステップ、
を含む治療方法である。【００１７】
本発明における骨疾患は、骨に関連する疾患を広く意味する。例えば、本発明における骨疾患には、骨粗鬆症、骨形成不全症、くる病、骨異形成症、または、骨折が含まれる。【００１８】
本発明における骨分化誘導条件は、骨分化誘導を起こさせると、当業者に一般に理解されているいかなる骨分化誘導条件であってもよい。例えば、アスコルビン酸、β−グリセロフォスフェイト、および、デキサメサゾンを使用する骨分化誘導条件がよく知られている。【００１９】
本発明における「幹細胞を含む細胞」としては、患者由来のものであってもなくてもよい。【００２０】
本発明における「幹細胞を含む細胞」が患者由来のものである場合には、例えば、患者の脂肪組織由来のものであってもよいが、これに限定されない。なお、患者の脂肪組織は、例えば、皮下脂肪、頬脂肪、内臓脂肪などから取得することができる。【００２１】
本発明における「幹細胞を含む細胞」が患者由来のものである場合には、当該「幹細胞を含む細胞」を培養する培地は、当該患者から採取した血液の血清を含んでいてもよい。当該患者から採取した血液の血清を用いる利点としては、本発明の医薬組成物を当該患者に投与する場合の、感染の問題を著しく低減することができる。【００２２】
本発明における「幹細胞を含む細胞」が患者由来のものでない場合には、例えば、患者以外の人体に由来するものであっても、人体以外の動物に由来するものであっても、樹立された細胞株に由来するものであってもよいが、これらに限定されない。【００２３】
本発明における「幹細胞を含む細胞」における幹細胞としては、例えば、組織幹細胞またはｉＰＳ細胞を用いることができるが、これらに限定されない。ＥＳ細胞を用いることも、技術上は可能であるが、そのようなＥＳ細胞の利用が、好ましくない場合には、本発明における「幹細胞を含む細胞」から、ＥＳ細胞を除くこともできる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明においては、骨分化誘導条件下において、「幹細胞を含む細胞」を培地中において、培養する。「幹細胞を含む細胞」を、骨分化誘導条件下において、培地中において、培養するとき、当該「幹細胞を含む細胞」は、培地中に、骨疾患の治療に有用な成分（生理活性物質など）を放出する。当該培地から、細胞を除去することにより、培養上清を取得することができる。当該培養上清には、骨疾患の治療に有用な成分が含まれる。本発明は、こうして得られた当該有用な成分を含む、骨疾患の治療に用いるための医薬組成物を提供する。
【００２５】
本発明における骨疾患は、骨に関連する疾患を広く意味する。例えば、本発明における骨疾患には、骨粗鬆症、骨形成不全症、くる病、骨異形成症、または、骨折が含まれる。
【００２６】
本発明における「幹細胞を含む細胞」としては、患者由来のものであってもなくてもよい。感染の問題の観点からは、本発明における「幹細胞を含む細胞」としては、患者由来のものを用いることは好ましいといえる。
【００２７】
本発明における「幹細胞を含む細胞」が患者由来のものである場合には、例えば、患者の脂肪組織由来のものであってもよいが、これに限定されない。なお、患者の脂肪組織は、例えば、皮下脂肪、頬脂肪、内臓脂肪などから採取することができる。このような脂肪組織を構成する細胞群（本明細書において、脂肪組織構成細胞群ともいう。）には、脂肪細胞以外にも、幹細胞、繊維芽細胞、血管を構成する内皮細胞などが含まれる。
【００２８】
患者からの組織の採取方法としては、例えば、切開切除法や吸引法が挙げられる。また、採取した組織は、酵素を用いることにより、ばらばらの個々の細胞に分離することができる。そのような酵素としては、すでに周知のものが多く知られている。そのような酵素の例としては、リパーゼ、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼなどが知られている。これらの酵素は、適宜、１種の溶液としても、2種以上の混合溶液としても、用いることもできる。
【００２９】
本発明における「幹細胞を含む細胞」が患者由来のものである場合には、当該「幹細胞を含む細胞」を培養する培地は、当該患者から採取した血液の血清（本発明において、「自己血清」という。）を含んでいてもよい。当該患者から採取した血液の血清を用いる利点としては、本発明の医薬組成物を当該患者に投与する場合の、感染の問題を著しく低減することができる。
【００３０】
本発明における「幹細胞を含む細胞」が患者由来のものでない場合には、例えば、患者以外の人体に由来するものであっても、人体以外の動物に由来するものであっても、樹立された細胞株に由来するものであってもよいが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明における「幹細胞を含む細胞」における幹細胞としては、例えば、組織幹細胞またはｉＰＳ細胞を用いることができるが、これらに限定されない。ＥＳ細胞を用いることも、技術上は可能であるが、そのようなＥＳ細胞の利用が、好ましくない場合には、本発明における「幹細胞を含む細胞」から、ＥＳ細胞を除くこともできる。
【００３２】
本発明における骨分化誘導条件は、骨分化誘導を起こさせると当業者に一般に理解されているいかなる骨分化誘導条件であってもよい。例えば、少なくとも、アスコルビン酸、β-グリセロフォスフェイト、および、デキサメサゾンを使用する骨分化誘導条件がよく知られている。また、これらの３種に加え、ビタミンＤ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、および／または、ＦＧＦ−２などを用いることも知られている。
【００３３】
より具体的には、これら所定の物質が加えられた培地の中で、幹細胞を含む細胞を培養させることができるが、これらに限定されない。
例えば、以下の終濃度において、これらの物質が加えられた培地を用いることができる。
（１）アスコルビン酸（１００μＭ）、β−グリセロフォスフェイト（１０ｍＭ）、デキサメサゾン（１０ｎＭ）
（２）アスコルビン酸（５０μＭ）、β−グリセロフォスフェイト（１０ｍＭ）、デキサメサゾン（１００ｎＭ）
（３）アスコルビン酸（２００μＭ）、β−グリセロフォスフェイト（１０ｍＭ）、デキサメサゾン（１００ｎＭ）
（４）アスコルビン酸（２００μＭ）、β−グリセロフォスフェイト（１０ｍＭ）、デキサメサゾン（１００ｎＭ）、ビタミンＤ（１０ｎＭ）
【００３４】
本発明において、「幹細胞を含む細胞」を培養するための培地（実施例では、培養液とも呼ばれる。）としては、それが適している限り、公知の培地を広く用いることもできる。例えば、α−ＭＥＭ、Ｈａｍ  Ｆ１０、Ｈａｍ  Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
もっとも、本発明においては、上述のとおり、また、必要に応じて、当該培地には、骨分化誘導条件を満たす物質が含まれることになる。また、必要に応じて、当該培地には、「自己血清」が含まれてもよい。
【００３６】
「幹細胞を含む細胞」を、骨分化誘導条件下において、培地中において培養するとき、当該「幹細胞を含む細胞」は、培地中に、骨疾患の治療に有用な成分（生理活性物質など）を放出する。
【００３７】
当該培地から、細胞を除去することにより、培養上清を取得することができる。当該培養上清には、骨疾患の治療に有用な成分が含まれる。本発明は、こうして得られた当該有用な成分を含む、骨疾患の治療に用いるための医薬組成物を提供する。ここで、本発明の医薬組成物としては、当該培養上清をそのまま用いることもできるが、さらに、当該培養上清に基づき純化や精製などの所定の工程を経た上で用いることもできる。
【００３８】
本発明の医薬組成物の患者への投与の仕方に限定はない。例えば、当該有用な成分を含む溶液を生理食塩水やラクテックリンゲル液に希釈した上で、点滴により、患者に対して、静注投与することができる。また、そのような希釈をすることなく、患者に対して、投与することもできる。
【００３９】
本発明の医薬組成物の驚くべき顕著な効果は、「幹細胞を含む細胞」が骨分化誘導条件下において、培地中において培養されるときに、当該「幹細胞を含む細胞」が、培地中に放出する成分（生理活性物質など）が、骨疾患の治療に有用に働く結果であると推察される。
【００４０】
そのような成分は、幹細胞によって生成され、培地中に放出されたものであると考えることが推察されるが、同時に、幹細胞以外の細胞によって生成され、培地中に放出されたものである可能性もあろう。
【００４１】
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられる場合があるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
【００４２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００４３】
<実施例>【００４４】
（１）脂肪組織採取と試料調製
ある患者（８０歳・女性・骨粗鬆症の病歴あり）の大腿骨頚部の骨折についての手術の際に、大腿後部の手術創縁から約１ｇの脂肪塊を採取した。
採取した脂肪塊をシャーレに移し、細切した。
細切した脂肪塊を酵素の溶液（終濃度で０．８ｕｎｉｔ／ｍｌコラゲナーゼ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製  Ｃ２６７４）と、終濃度で０．１ｕｎｉｔ／ｍｌディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  １７１０５−０４１）との混合溶液）２０ｍＬに入れ、３７℃で３０分間、酵素によって処理した。その結果、脂肪塊は脂肪組織構成細胞群へと分離した。なお、このような脂肪組織構成細胞群に、通常、幹細胞が含まれることは、周知の手法（例えば、免疫不全動物に移植してテラトーマを作る方法やＰＣＲで幹細胞に発現する特異的な遺伝子を解析する方法、など）によって確認することができる。  このように酵素によって処理をすることによって得た脂肪組織構成細胞群を含む溶液を遠心管に入れ、遠心分離し（１５００ｒｐｍ、１０分間）、上層に浮遊した脂肪組織構成細胞群、脂肪分、および、上清を除去することにより、沈殿した脂肪組織構成細胞の沈殿を得た（なお、本実施例においては、上層に浮遊した脂肪組織構成細胞群を除去しているが、かかる上層に浮遊した脂肪組織構成細胞群からも、「幹細胞を含む細胞」を取得することもでき、これも、また、本発明の範囲内である。）。【００４５】
その沈殿した脂肪組織構成細胞群を、以下で説明される「通常培養液」３０ｍＬに再浮遊させ、懸濁液とした。
すなわち、本実施例において、「通常培養液」とは、「自己血清」（本実施例では、当該患者から採血した血液を、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）することによって得た血液の上清をいう。）を１０％添加した培養液（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）をいう。【００４６】
前記懸濁液を、２個の細胞培養用７５ｃｍ２フラスコ（コーニング社製４３０６４１）に移し、培養装置内で培養した（３７℃、５％炭酸ガス、１００％湿度）。【００４７】
<<骨分化誘導を伴う細胞培養>>
一方のフラスコについては、フラスコ内の細胞を「通常培養液」を用いて、４日間培養した。続いて、以下で説明される「誘導培養液」を用いて、３週間培養した（この間、「誘導培養液」は、４日間毎に、交換された。）。
すなわち、本実施例においては、「誘導培養液」とは、「通常培養液」に骨分化誘導試薬（アスコルビン酸（１００μＭ）、β−グリセロフォスフェイト（１０ｍＭ）、デキサメサゾン（１０ｎＭ）、ここで各濃度は、培養液中の終濃度を意味する。）を添加して得られる培養液をいう。
前記３週間培養の後、培養した細胞をＨａｎｋｓ液（Ｈａｎｋｓ’  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で洗浄しつつ、「誘導培養液」を除去した（なお、この洗浄するためには、Ｈａｎｋｓ液に限らず、それが適している限り、どのような溶液を用いてもよく、例えば、グルコースを含む塩類緩衝溶液が好適であり得る。）。
さらに、細胞を、「通常培養液」で４日間培養した。続いて、当該培養液から細胞を除去し、当該培養液の上清（培養上清）を得た。当該培養液からの細胞の除去は、具体的には、（１）当該培養液から、なるべく細胞（培養液の下方に存在する）が含まれないように、上方の培養液を取得し、（２）このようにして得た上方の培養液を遠心し（３０００ｒｐｍ、１０分間）、（３）遠心後の上清を、さらに、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過することによって行った。このようにして得た培養上清のことを、本実施例において、「分化誘導を伴う（ｗｉｔｈ）細胞培養上清」という。【００４８】
<<骨分化誘導を伴わない細胞培養>>
他方のフラスコについては、フラスコ内の細胞を「通常培養液」を用いて、４日間培養した。続いて、「通常培養液」を用いて、３週間培養した（この間、「通常培養液」は、４日間毎に、交換された。）。
前記３週間培養の後、培養した細胞をＨａｎｋｓ液（Ｈａｎｋｓ’  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で洗浄しつつ、「通常培養液」を除去した（なお、この洗浄するためには、Ｈａｎｋｓ液に限らず、それが適している限り、どのような溶液を用いてもよく、例えば、グルコースを含む塩類緩衝溶液が好適であり得る。）。
さらに、細胞を、「通常培養液」で４日間培養した。続いて、当該培養液から細胞を除去し、当該培養液の上清（培養上清）を得た。当該培養液からの細胞の除去は、具体的には、（１）当該培養液から、なるべく細胞（培養液の下方に存在する）が含まれないように、上方の培養液を取得し、（２）このようにして得た上方の培養液を遠心し（３０００ｒｐｍ、１０分間）、（３）遠心後の上清を、さらに、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過することによって行った。このようにして得た培養上清のことを、本実施例において、「分化誘導を伴わない（ｗｉｔｈｏｕｔ）細胞培養上清」という。【００４９】
（２）骨粗鬆症モデルラットの作成
９週齢の雌ラットの両側卵巣を摘出することにより、骨粗鬆症モデルラットを作成した。
当該骨粗鬆症モデルラットは、卵巣摘出によりエストロゲンが欠乏し、骨代謝回転が亢進することによって、長管骨の骨端部や椎体の海綿骨が顕著に減少していることを特徴とする疾患モデルラットである。【００５０】
（３）投与
卵巣を摘出して４０日経過後の骨粗鬆症モデルラットを用いて実験を行った。
当該ラットに対して、「分化誘導を伴う細胞培養上清」を、２日毎に１ｍｌ／ラットで腹腔内投与した。また、比較例として、当該ラットに対して、「分化誘導を伴わない細胞培養上清」を、２日毎に１ｍｌ／ラットで腹腔内投与した。【００５１】
（４）解析
投与開始から３０日後、実験に用いたラットを屠殺し、解析を行った。
各ラットの大腿骨の断面図は、Ｘ線ＣＴ装置ＥＬＥ−ＳＣＡＮ（（株）日鉄エレックス）を用いて解析した。
また、各ラットの大腿骨の骨密度等の数値は、実験動物用Ｘ線ＣＴ装置Ｌａｔｈｅｔａ  ＬＣＴ−２００（日立アロカメディカル（株））を用いて解析した。【００５２】
（５）結果
<<大腿骨の断面図の画像>>
各ラットの大腿骨の縦断面および横断面を、ＥＬＥ−ＳＣＡＮを用いて解析し、その結果を図１に示す。図１中、上方にあるのが、縦断面図であり、下方にあるのが、横断面図である。
図１中、横断面図Ａ、Ｂ、Ｃは、縦断面中の各点線Ａ、Ｂ、Ｃで示した部位における大腿骨の断面図を示す。
図１中、「Ｃｏｎ．」は、卵巣を摘出しておらず、いずれの培養上清（「分化誘導を伴う細胞培養上清」および「分化誘導を伴わない細胞培養上清」）の投与も行っていない正常のラットについての縦断面図および横断面図を示す。
図１中、「ＯＶＸ」は、いずれの培養上清の投与も行っていない骨粗鬆症モデルラット（上述のとおり、卵巣が摘出されている。）についての縦断面図および横断面図を示す。
図１中、「ＣＭ（ＳＣ）」は、「分化誘導を伴わない細胞培養上清」を投与した骨粗鬆症モデルラットについての縦断面図および横断面図を示す。
図１中、「ＣＭ（ＯＳ）」は、「分化誘導を伴う細胞培養上清」を投与した骨粗鬆症モデルラットについての縦断面図および横断面図を示す。【００５３】
図１に示されるように、卵巣を摘出していない正常ラット（Ｃｏｎ．）の大腿骨に比べて、いずれの培養上清の投与も行っていない骨粗鬆症モデルラット（ＯＶＸ）の大腿骨は、海綿骨の骨稜が顕著に減少し、骨粗鬆症を発症していることがわかった。
また、「分化誘導を伴わない細胞培養上清」を投与した骨粗鬆症モデルラット（ＣＭ（ＳＣ））の大腿骨では、いずれの培養上清の投与も行っていない骨粗鬆症モデルラット（ＯＶＸ）の大腿骨と同程度に骨稜が減少し、骨粗鬆症を発症していることがわかった。
ところが、「分化誘導を伴う細胞培養上清」を投与した骨粗鬆症モデルラット（ＣＭ（ＯＳ））の大腿骨では、「分化誘導を伴う細胞培養上清」を投与していない骨粗鬆症モデルラット（ＣＭ（ＳＣ））の大腿骨に比べて、骨稜が顕著に増加し、卵巣を摘出していない正常ラット（Ｃｏｎ．）の大腿骨と同程度の状態にまで海綿骨の骨稜が回復していることがわかった。【００５４】
<<骨密度等>>
また、上記の各ラットの大腿骨の骨密度等をＬａｔｈｅｔａ  ＬＣＴ−２００を用いて解析した。
皮質骨および海綿骨における骨密度および体積の数値と、これらの数値から算出した骨塩量の数値を、以下の表１に示した。なお、表１において、「骨塩量＝骨密度×骨体積」である。【００５５】
【表１】
2013187194.tif 000003
【００５６】
表１から、「分化誘導を伴う細胞培養上清」を投与した骨粗鬆症モデルラット（ＣＭ（ＯＳ））においては、いずれの培養上清の投与も行っていない骨粗鬆症モデルラット（ＯＶＸ）と比較して、骨密度等の各数値が回復していることがわかる。そして、その回復の程度は、卵巣を摘出していない正常ラット（Ｃｏｎ．）の骨密度等の各数値とほぼ同等の程度までの回復であることがわかった。
一方、「分化誘導を伴わない細胞培養上清」を投与した骨粗鬆症モデルラット（ＣＭ（ＳＣ））においては、いずれの培養上清の投与も行っていない骨粗鬆症モデルラット（ＯＶＸ）と比較して、ほとんど骨密度等の各数値が回復していないことがわかった。【００５７】
かかる結果から、驚くべきことに、「分化誘導を伴う細胞培養上清」の投与は、骨粗鬆症の治療に極めて有効な手段であることがわかった。すなわち、培養の過程において、分化誘導を起こさせえる条件を与えた場合には、驚くべきことに、「幹細胞を含む細胞」において、骨粗鬆症の治療に極めて有用な成分が生成され、培地に放出されていることがわかった。【００５８】
なお、表１から、皮質骨密度に関しては、卵巣を摘出していない正常ラット（Ｃｏｎ．）と比較して、いずれの培養上清の投与も行っていない骨粗鬆症モデルラット（ＯＶＸ）では、わずかしか数値が低下していないことがわかる。
一方、海綿骨密度に関しては、卵巣を摘出していない正常ラット（Ｃｏｎ．）と比較して、いずれの培養上清の投与も行っていない骨粗鬆症モデルラット（ＯＶＸ）では、顕著に数値が低下していることがわかる。
この結果から、骨粗鬆症モデルラット（ＯＶＸ）においては、皮質骨と比べて、海綿骨の密度の低下が著しいということがわかる。この現象は、ヒトの骨粗鬆症において見られる症状と同様である。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の医薬組成物は、既に述べたとおり、骨疾患の治療に有利に利用することができる。 
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】各ラットの大腿骨の縦断面図および横断面図
【図１】
2013187194.tif 000004
【国際調査報告】
2013187194.tif 000005
2013187194.tif 000006
2013187194.tif 000007
2013187194.tif 000008
2013187194.tif 000009
2013187194.tif 000010
2013187194.tif 000011
2013187194.tif 000012