(57)【要約】  新たに見出された神経伸長メカニズムに基づく神経伸長及び皮膚感覚過敏を有効に抑制できる神経伸長抑制剤、皮膚感覚過敏抑制剤等を提供する。  （１）特定のフラボノイド、（２）タンニン、（３）クロロゲン酸、（４）特定のスチルベノイド、及び以上の（１）〜（４）の配糖体又は薬学的に許容される塩、あるいは（５）特定の生薬エキス、（６）クルミポリフェノールから選ばれる１種以上である神経伸長抑制剤あるいは皮膚感覚過敏抑制剤。
2014065194.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）〜（６）から選ばれる１種以上であることを特徴とする神経伸長抑制剤。
（１）フラボノイドに属するアピゲニン、ルテオリン、ジオスメチン、ゲンクワニン、ポンシリン、エリオジクチオール、ステルビン、プルネチン、あるいはそれらの配糖体又は薬学的に許容される誘導体。
（２）タンニンあるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。
（３）クロロゲン酸あるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。
（４）少なくともレスベラトロールを包含するスチルベノイドあるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。
（５）生薬エキスであるオウヒエキス、オンジエキス、ブクリョウエキス、セキセツソウエキス、又はソウジュツエキス。
（６）クルミポリフェノール。
【請求項２】
請求項１に記載の神経伸長抑制剤を含有することを特徴とする神経伸長抑制剤組成物。
【請求項３】
前記神経伸長抑制剤組成物が医薬品、医薬部外品又は化粧品であることを特徴とする請求項２に記載の神経伸長抑制剤組成物。
【請求項４】
前記神経伸長抑制剤組成物が皮膚外用剤であることを特徴とする請求項２又は請求項３に記載の神経伸長抑制剤組成物。
【請求項５】
下記の（１）〜（６）から選ばれる１種以上であることを特徴とする皮膚感覚過敏抑制剤。
（１）フラボノイドに属するアピゲニン、ルテオリン、ジオスメチン、ゲンクワニン、ポンシリン、エリオジクチオール、ステルビン、プルネチン、あるいはそれらの配糖体又は薬学的に許容される誘導体。
（２）タンニンあるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。
（３）クロロゲン酸あるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。
（４）少なくともレスベラトロールを包含するスチルベノイドあるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。
（５）生薬エキスであるオウヒエキス、オンジエキス、ブクリョウエキス、セキセツソウエキス、又はソウジュツエキス。
（６）クルミポリフェノール。
【請求項６】
請求項５に記載の皮膚感覚過敏抑制剤を含有することを特徴とする皮膚感覚過敏抑制剤組成物。
【請求項７】
前記皮膚感覚過敏抑制剤組成物が医薬品、医薬部外品又は化粧品であることを特徴とする請求項６に記載の皮膚感覚過敏抑制剤組成物。
【請求項８】
前記皮膚感覚過敏抑制剤組成物が皮膚外用剤であることを特徴とする請求項６又は請求項７に記載の皮膚感覚過敏抑制剤組成物。
【請求項９】
皮膚ケラチノサイト試料中の活性型ＨＤＣ及び不活性型ＨＤＣの少なくとも一方であることを特徴とする皮膚感覚過敏検出用マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経伸長抑制剤、皮膚感覚過敏抑制剤及び皮膚感覚過敏検出用マーカーに関する。更に詳しくは本発明は、皮膚の自由神経終末（以下、単に「神経」とも呼ぶ）についての新規に解明した伸長メカニズムに基づいて当該神経伸長を抑制する神経伸長抑制剤と、神経伸長抑制の結果として皮膚感覚過敏を抑制する皮膚感覚過敏抑制剤と、これらの抑制剤を含有する組成物と、上記の神経伸長メカニズムに基づいて皮膚感覚過敏を検出又は予測するための皮膚感覚過敏検出用マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトや哺乳動物体の皮膚は表皮、真皮及び皮下組織からなる。末梢知覚神経である自由神経終末は、通常、真皮と表皮との境界部近傍まで伸びているが、表皮内までは達していない。ところが、いわゆる敏感肌、乾燥肌、荒れ肌のような、皮膚感覚が過敏になっている皮膚では、神経の終末が表皮内まで伸長していることが知られている。このような敏感肌等に対しては、表皮内まで伸長した神経に対する外部刺激の作用をブロックする意味で保湿剤等も使用されているが、十分な効果を得るに至っていない。【０００３】
例えば下記の非特許文献１等で報告されたように、上記の神経伸長が痒み等の不快な皮膚感覚過敏の原因となっている点を考慮すると、むしろ、神経の表皮内への伸長そのものを抑制したり、表皮内へ伸長した神経を正常な状態まで縮退させたりすることが、皮膚感覚過敏への根本的かつ有効な対策であると考えられる。【０００４】
このような神経伸長に関し、神経伸長因子（NGF：Nerve Growth Factor）や神経伸長抑制因子（Sema3A：Semaphorin 3A）が知られており、従来、これらの因子の産生に影響する物質を利用した神経伸長抑制剤や皮膚感覚過敏抑制剤が提案されている。例えば下記の特許文献１では、ヒスタミンが表皮のケラチノサイトに作用し、ケラチノサイトでの神経伸長因子の産生を亢進させる結果、神経が表皮内まで伸長するとの考え方を示したもとで、一定の生薬を含有する神経伸長抑制剤及び痒み治療剤を提案している。【０００５】
上記の非特許文献１や特許文献１等の公知文献における考え方、即ち、神経伸長が皮膚感覚過敏の原因である点、神経伸長がケラチノサイトでの神経伸長因子の産生によって起こる点、ケラチノサイトでの神経伸長因子の産生がヒスタミンの作用を契機として起こる点等は、多くの専門家によってほぼ容認されている。【０００６】
しかし、上記の神経伸長を引き起こすヒスタミンに関しては、例えば下記の特許文献２〜５において直接的又は間接的に示唆されているように、「皮膚の真皮に存在する肥満細胞にはＬ−ヒスチジン脱炭酸酵素（ＨＤＣ）により生成されたヒスタミンが貯溜されており、このヒスタミンが肥満細胞の脱顆粒によって細胞外へ放出されて上記のようにケラチノサイトに作用する」とする見解が支配的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tobin D., Nabaro G. de la Faille, H.B. van Vloten, W.A., van derPutte, S.C.J., Schuurman, H.-J., 1992 “Increased number of immunoreactive nerve fibers in atopic dermatitis” J. Allergy Clin. Immunol. 90, 613-622
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−１２６４号公報
【特許文献２】特開平８−２１７６７４号公報
【特許文献３】特開平９−１１０８５７号公報
【特許文献４】特開平１０−０５９９５６号公報
【特許文献５】特開２００６−１７６４８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上のように、従来の神経伸長抑制剤では、神経伸長を引き起こす契機となるヒスタミンが皮膚の真皮に存在する肥満細胞に由来することを前提としている。【００１０】
しかし、本願発明者の研究によれば、肥満細胞を欠損させたモデルマウスでも神経伸長が起こり得ることを示唆する、従来の技術常識からは予測困難な結果が得られた。この結果は、神経伸長が未知の新たな由来に係るヒスタミンによって引き起こされる可能性を示唆する。この示唆に基づいて推測すれば、真皮の肥満細胞に由来するヒスタミンに焦点を合わせた従来の神経伸長抑制剤ないしは皮膚感覚過敏抑制剤では、未知の新たな由来に係るヒスタミンが引き起こす神経伸長を有効に抑制できないと言う可能性が考えられる。【００１１】
一方、ＨＤＣによってＬ-ヒスチジンから生成されるヒスタミンが皮膚の痒みに関連していること、真皮の肥満細胞内には活性型ＨＤＣが存在し、ヒスタミンが貯溜されていることは周知である。そして従来、肥満細胞の脱顆粒により細胞外へ放出されたヒスタミンが、前記のように「ケラチノサイトに作用して神経伸長因子の産生を亢進させる」とする見解と共に、このヒスタミンが「知覚神経上に存在するヒスタミン受容体に結合して痒みシグナルを中枢に伝達する」とする見解も支配的である。【００１２】
しかし、本願発明者の研究により、上記の痒みに関しても、肥満細胞からの脱顆粒によって放出されたヒスタミンに基づいて痒みが発生するという機序では説明できない新たな痒みの存在が判明した。その点は本願の出願人が既に出願した特願２０１１−２６５７６０号（先願１）において詳しく説明しているが、ここではその概要を述べる。即ち、「皮膚表皮のケラチノサイトには不活性型ＨＤＣ（ＨＤＣ前駆体）が存在しており、刺激性物質の作用によって、この不活性型ＨＤＣの活性化が誘導される。その結果、ケラチノサイト内でヒスタミンが生成及び細胞外放出されて、これが皮膚に痒みを生じる」と言う新規な痒み発生機序による痒みである。【００１３】
更に本願の出願人は既に特願２０１２−０７４７３３号（先願２）を出願しており、この先願２では、先願１の知見に基づいて見出された新規かつ有効なＨＤＣ活性化阻害剤を具体的に開示している。この「ＨＤＣ活性化阻害剤」とは、ケラチノサイトに存在する不活性型ＨＤＣが刺激性物質の作用により活性化誘導されることを阻害し、その結果、ケラチノサイト内でのヒスタミンの生成を防止する物質である。【００１４】
本願発明者は、「肥満細胞欠損マウスでも神経伸長が起こり得る」と言う新規な知見と、「ケラチノサイトに存在する不活性型ＨＤＣが刺激性物質の作用により活性化誘導されると、ケラチノサイト内でヒスタミンが生成する」と言う新規な知見との関連を考慮した結果、前記の「未知の新たな由来に係るヒスタミン」が、「不活性型ＨＤＣの活性化誘導に基づいてケラチノサイト内で生成するヒスタミン」であるという仮説に想到した。【００１５】
このような仮説が事実であれば、神経伸長に関わるヒスタミンは肥満細胞由来のヒスタミンとは考えられない。つまり、従来のように「肥満細胞の脱顆粒を抑制する」ことで表皮内への神経伸長を抑制しようとしても、十分な抑制効果は期待できない。即ち、従来の考え方に基づく神経伸長抑制剤では、新たに見出されたヒスタミンの発生源である「ケラチノサイト内でのＨＤＣの活性化誘導」自体は抑制できないことになり、神経伸長に対して十分な効果を発揮できないと考えられる。【００１６】
そこで本発明は、未知の新たな由来に係るヒスタミンが引き起こす神経伸長をその根源から有効に抑制できる神経伸長抑制剤、皮膚感覚過敏抑制剤を提供し、又、このような神経伸長メカニズムに基づいて皮膚感覚過敏を検出又は予知するための皮膚感覚過敏検出用マーカーを提供することを、解決すべき技術的課題とする。【００１７】
本願発明者は、上記の先願２で具体的に開示したＨＤＣ活性化阻害剤を用いて更に実験を重ねた結果、「未知の新たな由来に係るヒスタミン」が「不活性型ＨＤＣの活性化誘導に基づいてケラチノサイト内で生成するヒスタミン」であるという上記の仮説が事実であることを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための第１発明の構成は、下記の（１）〜（６）から選ばれる１種以上である、神経伸長抑制剤である。【００１９】
（１）フラボノイドに属するアピゲニン、ルテオリン、ジオスメチン、ゲンクワニン、ポンシリン、エリオジクチオール、ステルビン、プルネチン、あるいはそれらの配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００２０】
（２）タンニンあるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００２１】
（３）クロロゲン酸あるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００２２】
（４）少なくともレスベラトロールを包含するスチルベノイドあるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００２３】
（５）生薬エキスであるオウヒエキス、オンジエキス、ブクリョウエキス、セキセツソウエキス、又はソウジュツエキス。【００２４】
（６）クルミポリフェノール。【００２５】
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための第２発明の構成は、第１発明に記載した神経伸長抑制剤を含有する、神経伸長抑制剤組成物である。【００２６】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための第３発明の構成は、前記第２発明に係る神経伸長抑制剤組成物が医薬品、医薬部外品又は化粧品である、神経伸長抑制剤組成物である。【００２７】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための第４発明の構成は、前記第２発明又は第３発明に係る神経伸長抑制剤組成物が皮膚外用剤である、神経伸長抑制剤組成物である。【００２８】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための第５発明の構成は、下記の（１）〜（６）から選ばれる１種以上である、皮膚感覚過敏抑制剤である。【００２９】
（１）フラボノイドに属するアピゲニン、ルテオリン、ジオスメチン、ゲンクワニン、ポンシリン、エリオジクチオール、ステルビン、プルネチン、あるいはそれらの配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００３０】
（２）タンニンあるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００３１】
（３）クロロゲン酸あるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００３２】
（４）少なくともレスベラトロールを包含するスチルベノイドあるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００３３】
（５）生薬エキスであるオウヒエキス、オンジエキス、ブクリョウエキス、セキセツソウエキス、又はソウジュツエキス。【００３４】
（６）クルミポリフェノール。【００３５】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための第６発明の構成は、第５発明に記載した皮膚感覚過敏抑制剤を含有する、皮膚感覚過敏抑制剤組成物である。【００３６】
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための第７発明の構成は、前記第６発明に係る皮膚感覚過敏抑制剤組成物が医薬品、医薬部外品又は化粧品である、皮膚感覚過敏抑制剤組成物である。【００３７】
（第８発明の構成）
上記課題を解決するための第８発明の構成は、前記第６発明又は第７発明に係る皮膚感覚過敏抑制剤組成物が皮膚外用剤である、皮膚感覚過敏抑制剤組成物である。【００３８】
（第９発明の構成）
上記課題を解決するための第８発明の構成は、皮膚ケラチノサイト試料中の活性型ＨＤＣ及び不活性型ＨＤＣの少なくとも一方である、皮膚感覚過敏検出用マーカーである。
【発明の効果】
【００３９】
第１発明において（１）〜（６）として列挙された神経伸長抑制剤は、動物、特にヒト及び非ヒト哺乳動物を包含する哺乳動物において、いわゆる敏感肌、乾燥肌、荒れ肌のように皮膚の末梢知覚神経である自由神経終末が表皮内まで伸長する状態を有効に予防し、あるいは抑制する。その理由は、これらの神経伸長抑制剤が、ケラチノサイト内での不活性型ＨＤＣの活性化誘導に基づくヒスタミンの生成を抑制し、その結果、自由神経終末が表皮内まで伸長することを防止し、あるいは既に表皮内まで伸長した自由神経終末を真皮まで縮退させるためであると考えられる。【００４０】
第５発明において（１）〜（６）として列挙された皮膚感覚過敏抑制剤は、第１発明の場合と同様の理由により自由神経終末が表皮内まで伸長する状態を有効に予防し、あるいは抑制する結果、いわゆる敏感肌、乾燥肌、荒れ肌のような皮膚感覚過敏を有効に抑制し、あるいは予防する。【００４１】
第２発明の神経伸長抑制剤組成物は、第１発明に記載した神経伸長抑制剤を含有するため、本願発明者が見出した新たな神経伸長メカニズムを有効に抑制できる神経伸長抑制剤組成物が提供される。又、第６発明の皮膚感覚過敏抑制剤組成物は、第５発明に記載した皮膚感覚過敏抑制剤を含有するため、本願発明者が見出した新たな神経伸長メカニズムに基づく敏感肌、乾燥肌、荒れ肌のような皮膚感覚過敏を有効に抑制できる皮膚感覚過敏抑制剤組成物が提供される。【００４２】
第３発明又は第７発明のように、神経伸長抑制剤組成物又は皮膚感覚過敏抑制剤組成物は医薬品、医薬部外品又は化粧品として用いることができる。【００４３】
第４発明又は第８発明のように、神経伸長抑制剤組成物又は皮膚感覚過敏抑制剤組成物は、特に好ましくは、敏感肌、乾燥肌、荒れ肌等を抑えるための皮膚外用剤として用いることができる。【００４４】
前記したように、皮膚表皮のケラチノサイトに存在する不活性型ＨＤＣ（ＨＤＣ前駆体）が刺激性物質の作用によって活性化誘導される結果、ケラチノサイト内でヒスタミンが生成及び細胞外放出されて、これが皮膚感覚過敏をもたらす神経伸長を引き起こす。従って第９発明のように、皮膚ケラチノサイト試料中の活性型ＨＤＣ及び不活性型ＨＤＣの少なくとも一方を、皮膚感覚過敏の検出用マーカーとして利用できる。即ち、皮膚表皮のケラチノサイトに存在する不活性型ＨＤＣの標準的な量との対比において、特定の皮膚ケラチノサイト試料中の不活性型ＨＤＣの測定量（Ａ）に基づき皮膚感覚過敏の予知又は診断を行うことができる。又、活性型ＨＤＣの測定量（Ｂ）に基づいても、あるいは（Ａ）と（Ｂ）の両者の比率に基づいても、同様に皮膚感覚過敏の予知又は診断を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】参考実験例１−１に係る検討結果を示す。
【図２】参考実験例１−２に係る検討結果を示す。
【図３】参考実験例１−３に係る検討結果を示す。
【図４】１０％ラウリン酸ナトリウム（ＳＬ）水溶液の単回局所塗布による掻破行動の経時的変化を肥満細胞欠損マウス及びその野生型マウスを用いて検討した結果を示す。各グラフは平均値±標準誤差（n＝7）で示す。
【図５】１０％ＳＬ水溶液の単回局所塗布後の表皮中のヒスタミン含有量及びＨＤＣ発現量を検討した結果を示す。各グラフは平均値±標準誤差（n＝3）で示す。なお、図５（ｂ）は表皮中のＨＤＣ発現量を検討したウエスタンブロットの結果であり、図５（ｃ）は図５（ｂ）のウエスタンブロットで得られた結果からＨＤＣ発現量／β−actin発現量の値を示す。
【図６】１０％ＳＬ水溶液の単回局所塗布２時間後の真皮中のヒスタミン含有量及びＨＤＣ発現量を検討した結果を示す。各グラフは平均値±標準誤差（n＝3）で示す。なお、図６（ｂ）は真皮中のＨＤＣ発現量を検討したウエスタンブロットの結果を示す。図６（ｃ）は図６（ｂ）のウエスタンブロットで得られた結果からＨＤＣ発現量／β−actin発現量の値を示す。
【図７】皮膚標本の蛍光位相差顕微鏡による切片画像の１例を示す。
【図８】画像解析ソフトによる実施例のシグナル強度をグラフにより示す。
【図９】画像解析ソフトによる実施例のシグナル強度をグラフにより示す。
【図１０】画像解析ソフトによる実施例のシグナル強度をグラフにより示す。
【図１１】画像解析ソフトによる実施例のシグナル強度をグラフにより示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
次に本発明の実施形態を、その最良の形態を含めて説明する。【００４７】
〔神経伸長抑制剤、皮膚感覚過敏抑制剤〕
神経伸長抑制剤又は皮膚感覚過敏抑制剤は、広義には、下記の（１）〜（６）から選ばれる１種以上からなるものである。【００４８】
（１）フラボノイドあるいはそれらの配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００４９】
（２）タンニンあるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００５０】
（３）クロロゲン酸あるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００５１】
（４）スチルベノイドあるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００５２】
（５）生薬エキス。【００５３】
（６）クルミポリフェノール。【００５４】
（フラボノイド）
上記フラボノイドはポリフェノール類の１種であって、一般的にはクマル酸CoAとマロニルCoAが重合してできるカルコンから派生する植物２次代謝物の総称である。フラボノイドには、アントシアニン、フラバン、フラバノン、フラボン、フラボノール、ジヒドロフラボノール、カルコン、オーロン、イソフラボノイド、ネオフラボノイドが包含される。これらの物質を含む植物エキスとしては、ヤーバサンタ葉エキス等が挙げられる。【００５５】
本発明に係る神経伸長抑制剤又は皮膚感覚過敏抑制剤は、より具体的には、下記の（１）〜（６）から選ばれる１種以上からなるものである。これらについては、本発明に係る神経伸長抑制剤又は皮膚感覚過敏抑制剤としての報告はもちろんのことであるが、従来の神経伸長抑制剤又は皮膚感覚過敏抑制剤としての報告も見聞していない。【００５６】
（１）フラボノイドに属するアピゲニン、ルテオリン、ジオスメチン、ゲンクワニン、ポンシリン、エリオジクチオール、ステルビン、プルネチン、あるいはそれらの配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００５７】
（２）タンニンあるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００５８】
（３）クロロゲン酸あるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００５９】
（４）少なくともレスベラトロールを包含するスチルベノイドあるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００６０】
（５）生薬エキスであるオウヒエキス、オンジエキス、ブクリョウエキス、セキセツソウエキス、又はソウジュツエキス。【００６１】
（６）クルミポリフェノール。【００６２】
以上において、「配糖体」とは、神経伸長抑制効果又は皮膚感覚過敏抑制効果を阻害しない限りにおいて、上記（１）〜（４）の化合物における水酸基やカルボキシル基等の官能基にグルコース、ガラクトース等の糖単位が単数又は複数に結合したものをいう。【００６３】
又、「薬学的に許容される誘導体」とは、薬学的に許容される限りにおいて、上記（１）〜（４）の化合物における水酸基やカルボキシル基等の官能基に他の任意の化合物が結合したもの、あるいはその環構造を構成する特定の炭素原子において他の任意の化合物が置換したものを言う。薬学的に許容される誘導体として、例えば各種の塩、溶媒和物、エステル化物等が挙げられる。【００６４】
塩としては、無機酸塩（例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩）、有機酸塩（例えばカルボン酸塩、オキシカルボン酸塩、有機スルホン酸塩）、有機塩基（例えば、メチルアミン、トリエチルアミン、トリエタノールアミン）との塩、無機塩基との塩（例えばアンモニウム塩、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩）等を例示できる。溶媒和物としては、水和物、エタノール溶媒和物、メタノール溶媒和物、アセトニトリル溶媒和物等を例示できる。エステル化物としては、カルボン酸エステル、リン酸エステル、炭酸エステル、硫酸エステル、硝酸エステル、チオエステル等を例示できる。【００６５】
誘導体としては、いわゆるプロドラッグも包含される。プロドラッグとは、生理学的条件下において、本発明の化合物に変換し得る代謝前駆体を意味する。【００６６】
（タンニン）
本発明においてタンニンとは、柿渋や栗の渋等の渋み成分であり、その他、多様な植物の葉などにも含まれるポリフェノール化合物の総称である。代表的なタンニンとして、五倍子又は没食子から得られた植物タンニン、柿タンニン、栗皮タンニン、タマリンドタンニン、ミモザタンニン等や、それらに含まれるタンニンが例示される。その他にも、いわゆる加水分解性のタンニン（ピロガロールタンニン）や縮合型のタンニン（カテコールタンニン）も含まれる。タンニンの具体例としては、タンニン酸、チョウジ等に含まれる加水分解型タンニン、より好ましくはタンニン酸が挙げられる。【００６７】
（クロロゲン酸）
クロロゲン酸は、5-カフェオイルキナ酸とも呼ばれ、コーヒー酸のカルボキシル基がキナ酸の５位のヒドロキシ基と脱水縮合した構造を持つ。コーヒー豆や、その他の多くの双子葉植物の種子や葉から得られる。又、例えば、双子葉植物としてサクラの葉などに含まれる。【００６８】
（スチルベノイド）
スチルベノイドとは、p-ヒドロキシケイヒ酸CoAに３単位のマロニルCoAが結合して閉環した構造を持つ化合物である。スチルベノイドとしては、レスベラトロール、ラポンチシンを包含する各種のスチルベンの他、フィロズルチン、オリゴスチルベン、ポリスチルベン等が例示され、レスベラトロール二量体であるε-ビニフェリン、グネチンＣあるいはレスベラトロール二量体の配糖体であるグネモノシドＡ、グネモノシドＣ及び、グネモノシドＤあるいはレスベラトロール三量体であるα-ビニフェリンあるいはレスベラトロール四量体であるバチカノールＣなどのようなレスベラトロールのオリゴマーも例示される。レスベラトロールは、系統名が3,5,4’-トリヒドロキシ-trans-スチルベンであるものが好ましい。【００６９】
（クルミポリフェノール）
クルミポリフェノールとは、クルミの種皮（薄皮）に含まれる成分で、加水分解型のポリフェノールである。
（生薬エキス）
オウヒエキス、オンジエキス、ブクリョウエキス、セキセツソウエキス、ソウジュツエキスは、それぞれ、生薬であるオウヒ、オンジ、ブクリョウ、セキセツソウ、ソウジュツを抽出して得られた生薬エキスである【００７０】
〔神経伸長抑制剤組成物、皮膚感覚過敏抑制剤組成物〕
（有効成分及び用途、剤型など）
本発明に係る神経伸長抑制剤組成物又は皮膚感覚過敏抑制剤組成物は、有効成分として上記した神経伸長抑制剤を含有し、又は上記した皮膚感覚過敏抑制剤を含有する。神経伸長抑制剤組成物における神経伸長抑制剤の含有量、又は皮膚感覚過敏抑制剤組成物における皮膚感覚過敏抑制剤の含有量は限定されないが、例えば、これらの含有量の下限値をそれぞれ０．１質量％とすることができる。含有量が０．１質量％未満であると十分に満足できる効果を得られない可能性がある。又、これらの含有量の上限値は、効果とコストとのバランスを考慮すれば、２〜５質量％程度、多くても１０質量％程度にとどめることができる。但し、必要に応じて含有量を５０質量％程度まで増量させることもできる。含有量が５０質量％を超えると溶解度等の問題が生じる可能性がある。【００７１】
本発明の神経伸長抑制剤組成物又は皮膚感覚過敏抑制剤組成物は、各種の用途を有する医薬品、医薬部外品又は化粧品として、皮膚感覚の過敏あるいは皮膚の痒みを伴う様々な症状の治療・予防のために用いることができる。特に好ましいものの１例としては皮膚外用剤が挙げられるが、その他にも、内服薬、注射剤等として好ましく用いられる。【００７２】
皮膚外用剤の用途としては、皮膚感覚過敏症、乾燥性皮膚掻痒症、脂漏性皮膚掻痒症、敏感肌、炎症を伴う皮膚掻痒症などの治療、症状軽減や悪化防止の為の用途、予防を目的とする医薬品、医薬部外品、化粧品が例示される。代表的な皮膚疾患としては、乾皮症やアトピー性皮膚炎、乾癬、接触皮膚炎などが例示される。【００７３】
本発明の神経伸長抑制剤組成物又は皮膚感覚過敏抑制剤組成物は、種々の剤型に調製することができる。例えば、スティック状を含む固形剤、軟膏剤、ローション状や乳液状あるいはエアゾール状を含む液剤、泡剤、ゲル剤、クリーム剤、パック状を含む貼付剤等とすることができる。特に軟膏剤、液剤、ゲル剤、クリーム剤が好ましい。【００７４】
以上の各種剤型に調製する方法は特に制限されず、各種成分を適宜選択、配合して、常法により調製することができる。又、本発明の神経伸長抑制剤組成物又は皮膚感覚過敏抑制剤組成物の適用量や用法は特に制限されず、通常は、一日数回、適量を用いることができる。【００７５】
（その他の成分）
本発明の神経伸長抑制剤組成物又は皮膚感覚過敏抑制剤組成物においては、本発明の効果を阻害しない限りにおいて、公知の鎮痒剤、神経伸長抑制剤あるいは皮膚感覚過敏抑制剤の１種以上を併せ含有することができる。【００７６】
このような公知の鎮痒剤等として、例えば、クロルフェニラミン、ジフェンヒドラミン、リドカイン、ジブカイン、アミノ安息香酸エチル、シプロヘプタジン、ジフェニルピラリン、トリプロリジン、プロメタジン、ホモクロルシクリジン、アンモニア、カプサイシン、ノニル酸ワニリルアミド、サリチル酸、サリチル酸メチル、サリチル酸グリコール、アリメマジン、クレマスチン、メキタジン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、吉草酸酢酸デキサメタゾン、吉草酸酢酸プレドニゾロン、酪酸ヒドロコルチゾン、酢酸プレドニゾロン、プレドニゾロン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、酪酸クロベタゾン、トリアムシノロンアセトニド、クロタミトン、チモール、オイゲノール、メントール、カンフル、ヒノキチオール、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、コンフリーエキス、シソエキス、セージエキス、ボタンピエキス、ボダイジュエキス等が挙げられ、これらの薬理学的に（製薬上）又は生理学的に許容される塩も挙げられる。【００７７】
更に、本発明の神経伸長抑制剤組成物又は皮膚感覚過敏抑制剤組成物は、本発明の効果を阻害しない限りにおいて、医薬品、医薬部外品又は化粧品分野において配合されることがある各種成分の１種または２種以上を、任意に含有することができる。このような成分としては、下記（ａ）〜（ｇ）に列挙するものが例示される。【００７８】
（ａ）抗炎症剤：グリチルリチン酸、グリチルリチン酸二カリウム、グリチルリチン酸モノアンモニウム等のグリチルリチン酸誘導体、グリチルレチン酸又はその誘導体、アラントイン又はその誘導体、インドメタシン、イブプロフェン、イブプロフェンピコノール、ブフェキサマク、フルフェナム酸ブチル、ベンダザック、ピロキシカム、ケトプロフェン、フェルビナク、サリチル酸メチル又はサリチル酸グリコール等のサリチル酸誘導体など。【００７９】
（ｂ）ビタミン剤：レチノールなどのビタミンＡ類、β−カロチンやリコピンなどのプロビタミンＡ類、トコフェロールなどのビタミンＥ類、リボフラビンやフラビンモノヌクレオチドなどのビタミンＢ２類、アスコルビン酸やデヒドロアスコルビン酸などのビタミンＣ類、エルゴカルシフェロールやコレカルシフェロールなどのビタミンＤ類、フィロキノンなどのビタミンＫ類、γ−オリザノールやチアミンなどのビタミンＢ１類、ピリドキシンやピリドキサールなどのビタミンＢ６類、シアノコバラミンなどのビタミンＢ１２類、葉酸やプテロイルグルタミン酸などの葉酸類、ニコチン酸やニコチン酸アミドなどのビタミンＢ３類、パントテン酸や補酵素Ａなどのパントテン酸類。【００８０】
（ｃ）抗菌剤：イソプロピルメチルフェノール、塩酸クロルヘキシジン、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、ポリヘキサメチレンビグアニド、トリクロサン、トリクロロカルバニリド、クレゾール、ピロクトンオラミンなど。【００８１】
（ｄ）抗真菌剤：イトラコナゾール、塩酸アモロルフィン、塩酸クロコナゾール、塩酸テルビナフィン、塩酸ネチコナゾール、塩酸ブテナフィン、クロトリマゾール、ケトコナゾール、シクロピロクスオラミン、硝酸イソコナゾール、硝酸エコナゾール、硝酸オキシコナゾール、硝酸スルコナゾール、ビホナゾール、ピマリシン、フルコナゾール、フルシトシン、ミコナゾール、ラノコナゾールなど。【００８２】
（ｅ）保湿剤：グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ジグリセリントレハロース、ヘパリン類似物質、コンドロイチン硫酸ナトリウム、コラーゲン、エラスチン、キチン、キトサン、グリシン、アスパラギン酸、乳酸ナトリウム、尿素、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、セラミド、コレステロール、リン脂質、カミツレエキス、アロエエキス、ハマメリスエキス、ローズマリーエキス、タイムエキス、チャエキス、シソエキスなど。【００８３】
（ｆ）美白剤：前記したビタミンＡ類、ビタミンＣ類又はビタミンＥ類、パントテン酸類等のビタミン類の他に、プラセンタ、アルブチン、コウジ酸、システイン、フィチン酸、イリス（アイリス）、アーモンド、アロエ、イチョウ、ウーロン茶、エイジツ、オウゴン、オウレン、オトギリソウ、オドリコソウ、海藻、カッコン、クチナシ、クジン、コムギ、コメハイガ、コメヌカ、シソ、シャクヤク、センキュウ、ソウハクヒ、ダイズ、茶、トウキ、ベニバナ、ボタンピ、ヨクイニン、エノキなど。【００８４】
（ｇ）以上の他にも、各種の収斂剤（クエン酸、硫酸亜鉛、海藻エキスなど）、抗酸化剤（ジブチルヒドロキシトルエン、エデト酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど）、抗シワ剤（アシル化グルコサミン、カイネチン、ヒアルロン酸）が例示される。【００８５】
（製剤上の成分）
本発明の神経伸長抑制剤組成物又は皮膚感覚過敏抑制剤組成物は、製剤上の必要に応じて、かつ、本発明の効果を阻害しない限りにおいて、更に、基剤、界面活性剤、増粘剤、保存剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、刺激軽減剤、防腐剤、着色剤、分散剤、香料等を含有することができる。【００８６】
基剤としては、流動パラフィン、パラフィン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス、タルク、ミリスチン酸、ラウリルアルコール、セチルアルコール、オクタン酸セチル、パルミチン酸イソプロピル、ジペンタエリスリトール脂肪酸エステル、トリミリスチン酸グリセリン、メチルポリシロキサン、架橋型ポリエーテル変性シリコーン、架橋型アルキル変性シリコーンなどが例示される。【００８７】
界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル類、グリセリン脂肪酸類、ポリグリセリン脂肪酸類、プロピレングリコール脂肪酸エステル類、硬化ヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、グリセリンアルキルエーテルなどが例示される。【００８８】
増粘剤としては、グアーガム、カラギーナン、キサンタンガム、デキストラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ベントナイト、デキストリン脂肪酸エステルなどが例示される。【００８９】
保存剤としては、安息香酸、安息香酸ナトリウム、デヒドロ酢酸、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ベンジル、パラオキシ安息香酸メチル、フェノキシエタノールなどが例示される。【００９０】
ｐＨ調整剤としては、無機酸（塩酸、硫酸、リン酸、ポリリン酸、ホウ酸など）、有機酸（乳酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、シュウ酸など）、グルコノラクトン、酢酸アンモニウム、無機塩基（炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムなど）、有機塩基（モノエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、リジンなど）が例示される。【００９１】
〔皮膚感覚過敏の治療方法又は予防方法〕
本発明の神経伸長抑制剤又は皮膚感覚過敏抑制剤、あるいは神経伸長抑制剤組成物又は皮膚感覚過敏抑制剤組成物を用いて、皮膚感覚過敏の治療方法又は予防方法を行うことができる。【００９２】
（皮膚感覚過敏の治療・予防方法）
下記の（１）〜（６）から選ばれる１種以上である神経伸長抑制剤又は皮膚感覚過敏抑制剤、あるいは、当該神経伸長抑制剤を含有する神経伸長抑制剤組成物又は当該皮膚感覚過敏抑制剤を含有する皮膚感覚過敏抑制剤組成物を治療・予防剤として用い、皮膚感覚過敏症状の治療又は予防を行うことを特徴とする皮膚感覚過敏の治療・予防方法。【００９３】
（１）フラボノイドに属するアピゲニン、ルテオリン、ジオスメチン、ゲンクワニン、ポンシリン、エリオジクチオール、ステルビン、プルネチン、あるいはそれらの配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００９４】
（２）タンニンあるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００９５】
（３）クロロゲン酸あるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００９６】
（４）少なくともレスベラトロールを包含するスチルベノイドあるいはその配糖体又は薬学的に許容される誘導体。【００９７】
（５）生薬エキスであるオウヒエキス、オンジエキス、ブクリョウエキス、セキセツソウエキス、又はソウジュツエキス。【００９８】
（６）クルミポリフェノール。【００９９】
（皮膚感覚過敏の治療・予防方法の実施形態）
本発明に係る皮膚感覚過敏の治療・予防方法に用いる治療・予防剤の内、神経伸長抑制剤組成物、皮膚感覚過敏抑制剤組成物とは、前記した「神経伸長抑制剤組成物、皮膚感覚過敏抑制剤組成物」の項で述べた通りのものである。【０１００】
治療・予防剤の適用形態としては、好ましくは皮膚外用剤が例示されるが、内服薬、注射剤等としても好ましく用いられる。治療・予防剤の適用量や用法は皮膚感覚過敏の症状に応じて適宜に選択されるものであり特に制限されないが、通常は、一日数回、適量を用いることができる。治療・予防剤の適用対象はヒトに限定されず、動物、特に哺乳動物も好適な適用対象となる。【０１０１】
〔皮膚感覚過敏検出用マーカー、皮膚感覚過敏の診断方法〕
（皮膚感覚過敏検出用マーカー）
第９発明の効果として述べたように、皮膚ケラチノサイト試料中の活性型ＨＤＣ及び不活性型ＨＤＣの少なくとも一方を皮膚感覚過敏の検出用マーカーとして利用することができる。即ち、特定の皮膚ケラチノサイト試料中の不活性型ＨＤＣの測定量（Ａ）、活性型ＨＤＣの測定量（Ｂ）、又はこれらの（Ａ）と（Ｂ）の比率が分かれば、皮膚ケラチノサイト中のＨＤＣ発現量または不活性型ＨＤＣの活性化誘導率、ひいては表皮への神経伸長の状況を把握することができる。従って、皮膚感覚過敏症状が発現していること、あるいは発現しつつあることを検出できる。【０１０２】
ヒトの皮膚ケラチノサイト試料は、例えば被験者から皮膚生検などにより採取できる。採取した皮膚ケラチノサイト試料中の不活性型ＨＤＣ量、又は活性型ＨＤＣ量はWestern blottingなどを用いて測定できる。【０１０３】
（皮膚感覚過敏の診断方法）
患者から採取した皮膚ケラチノサイト試料中の皮膚感覚過敏検出用マーカーの量を測定することにより、皮膚感覚過敏症状が発現していることを診断し、又は皮膚感覚過敏症状が発現しつつあることを予測することができる。
【実施例】
【０１０４】
次に本発明の実施例を説明する。本発明の技術的範囲は以下の実施例によって限定されない。【０１０５】
〔参考実験例１：マウスの掻破行動とマウス皮膚中のヒスタミン量〕
（参考実験例１−１）
本参考実験例ではＩＣＲマウスを使用し、刺激性物質としてアニオン性界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて、マウスの掻破行動を評価した。又、ＳＤＳを用いた後に抗ヒスタミン薬であるテルフェナジン（ＴＲＦ）を投与し、掻破行動に対する影響を見た。【０１０６】
実験動物：
日本SLC社より購入した、雄性で７〜８週齢のＩＣＲマウスを用いた。これらは温度２２±２℃、湿度５５±１０％の恒温恒湿環境下にて、自由給水下に固形飼料を摂取させ、７日以上の予備飼育を経てから試験に使用した。又、使用マウスの吻側背部を刈毛・除毛した後、少なくとも３日以上経ってから試験に用いた。【０１０７】
刺激性物質：
皮膚に対する刺激性物質として、ＳＤＳを蒸留水に溶かした１０％水溶液を、上記のように刈毛・除毛したマウス吻側背部に５０μＬ、１回塗布した。塗布する際に界面活性剤水溶液が固まっていた場合は３７℃の湯浴で温めて溶かしてから使用した。溶媒対照群（Vehicle）には蒸留水を塗布した。【０１０８】
掻破行動の観察：
マウスの掻破行動はKuraishiらの報告を参考に実施した。即ち、４つに仕切ったアクリル製の箱（１３×９×３５cm）にそれぞれ1匹ずつマウスを入れ、少なくとも１時間は順化させ、無人環境下で、上記１０％ＳＤＳ水溶液の塗布の当日（Ｄａｙ０）から塗布後４日経過した日（Ｄａｙ４）までにわたり、毎日少なくとも１時間のビデオ撮影を行って行動を記録した。その後、ビデオ観察によって後肢による吻側背部の掻破行動を計数した。一連の掻き行動（後肢で塗布部位である吻側背部を引っ掻き、後肢を下ろすまでの行動を示す）を1カウントとして、６０分間の掻破回数を目視にて計数した。【０１０９】
統計処理：
データは平均±標準誤差（ＳＥＭ）で示した。統計はDunnett's multiple comparisons もしくはStudent's t-testを用いた。危険率（p）が５％未満を有意差ありとした。統計解析に使用したソフトはStatLight（Yukms Co. Ltd., Tokyo, Japan）である。【０１１０】
マウスの掻破行動：
上記した掻破行動の観察の結果を図１(a)に示す。図１(a)において、縦軸には６０分間の掻破回数を示す。□で示すICR(NT)のプロットは無処置群（吻側背部を刈毛・除毛したが何も塗布しなかった群）を示し、■で示すICR(VE)のプロットは溶媒対照群（Vehicle）を示し、○で示すICR(SDS)のプロットは１０％ＳＤＳ水溶液塗布群を示す。図１(a)の結果から分かるように、マウスの掻破行動は無処置群及び溶媒対照群では増加しないが、１０％ＳＤＳ水溶液塗布群では経時的に顕著に増加した。【０１１１】
一方、上記した１０％ＳＤＳ水溶液塗布群のＩＣＲマウスについて、Ｄａｙ３の時点で一旦観察室から出して給水・給餌環境下で３時間休ませた後、観察室へ移し１時間順化させた。その後、後述の掻破行動の観察のためのビデオ録画の３０分前にＴＲＦを投与した。ＴＲＦは０．５％カルボキシルメチルセルロース（CMC-Na）に溶かし、体重１０ｇあたり０．０５ｍＬ（３０ｍｇ／ｋｇ）の割合で経口投与した。そして、このようなＴＲＦの経口投与後３０分を経過したＩＣＲマウスの掻破行動を前記「掻破行動の観察」の通りにビデオ撮影を行って記録した。「観察前に、３時間休憩」させた理由は、連続した行動観察ではマウスの行動量が減ることが予想されるため、一旦マウスを給水・給餌環境下で休ませるためである。この掻破行動の観察結果を図１(b)における「After」の棒グラフに示す。図１(b)において、縦軸には６０分間の掻破回数を示す。図１(b)における「Before」の棒グラフはＴＲＦの経口投与の直前の６０分間におけるマウスの掻破回数を示し、これは、図１(a)における１０％ＳＤＳ水溶液塗布群でのＤａｙ３の時点での掻破回数と同様である。「After」と「Before」との対比から、マウスの掻破行動がＴＲＦの投与によって抑制されたことが分かる。【０１１２】
本参考実験例の評価は後述の「考察」の項で述べる。【０１１３】
（参考実験例１−２）
本参考実験例では肥満細胞欠損マウスとその対照正常マウスを使用し、刺激性物質としてＳＤＳを用いてマウスの掻破行動を評価した。又、ＳＤＳを用いた後にマウス皮膚中のヒスタミン量を評価した。【０１１４】
実験動物：
日本SLC社より購入した雄性で７〜８週齢の肥満細胞欠損マウス（WBB6F1−W/WVマウス）と、その対照正常マウスとしての雄性で７〜８週齢の野生型マウス（WBB6F1−+/+マウス）を用いた。これらは温度２２±２℃、湿度５５±１０％の恒温恒湿環境下にて、自由給水下に固形飼料を摂取させ、７日以上の予備飼育を経てから試験に使用した。又、使用マウスの吻側背部を刈毛・除毛した後、少なくとも３日以上経ってから試験に用いた。【０１１５】
刺激性物質：
皮膚に対する刺激性物質として、ＳＤＳを蒸留水に溶かした１０％水溶液を、上記のように刈毛・除毛したマウス吻側背部に５０μＬ、１回塗布した。塗布する際に界面活性剤水溶液が固まっていた場合は３７℃の湯浴で温めて溶かしてから使用した。溶媒対照群（Vehicle）には蒸留水を塗布した。【０１１６】
掻破行動の観察：
マウスの掻破行動の観察及び統計処理は、参考実験例１−１における「掻破行動の観察」及び「統計処理」の場合と全く同様にして行った。【０１１７】
マウスの掻破行動：
上記した掻破行動の観察の結果を図２(a)に示す。図２(a)において、縦軸には６０分間の掻破回数を示す。□で示すW/Wv(VE)のプロットは肥満細胞欠損マウスにおける溶媒対照群（Vehicle）を示し、■で示す+/+(VE)のプロットは対照正常マウスにおける溶媒対照群（Vehicle）を示し、○で示すW/Wv(SDS)のプロットは肥満細胞欠損マウスにおける１０％ＳＤＳ水溶液塗布群を示し、●で示す+/+(SDS)のプロットは対照正常マウスにおける１０％ＳＤＳ水溶液塗布群を示す。図２(a)の結果から分かるように、１０％ＳＤＳ水溶液塗布群では、肥満細胞欠損マウス、対照正常マウスともにマウスの掻破行動が経時的に顕著に増加したが、両者の掻破行動の増加傾向は同程度であって、有意な差が認められなかった。【０１１８】
マウス皮膚中のヒスタミン量：
一方、上記した１０％ＳＤＳ水溶液塗布群の肥満細胞欠損マウス及び対照正常マウスについて、Ｄａｙ４の時点で、マウスは麻酔下で、心血液循環系を利用して、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で灌流後に皮膚を採取した（直径18mmの円状の生体パンチでくり抜いた）。そして採取した皮膚中のヒスタミン量を測定した。【０１１９】
即ち、回収した皮膚を６０℃のＰＢＳに３０秒間浸した後、表皮と真皮に分けた。その後、表皮中・真皮中のヒスタミン量を測定キット（histamine enzyme immunoassay kit (Immunotech, Marseilles, France)）を用いて測定した。ヒスタミン量の測定においては、表皮、真皮ともに組織を粉砕した組織懸濁液を作成し、遠心分離をした後、上清を採取し、その上清中のヒスタミン量を測定した。【０１２０】
（１）マウス表皮中のヒスタミン量：
ＳＤＳ処置によってマウス表皮中のヒスタミンレベルが上昇しているか否かを検討した。その結果を図２（ｂ）の左側のグラフに示す。図２（ｂ）の左側のグラフにおいて、縦軸はマウス表皮中のヒスタミン量を示す。又横軸における「W/Wv」は肥満細胞欠損マウスについての結果であることを示し、「+/+」は対照正常マウスについての結果であることを示す。そして白抜きの棒グラフ（左側）はＳＤＳ塗布群であることを示し、グレーで塗りつぶした棒グラフ（右側）は溶媒対照群（Vehicle）であることを示す。このグラフから分かるように、肥満細胞欠損マウス、対照正常マウスともに、ＳＤＳ塗布群の表皮中のヒスタミンは溶媒対照群に比較して顕著に増加している。【０１２１】
（２）マウス真皮中のヒスタミン量：
ＳＤＳ処置によってマウス真皮中のヒスタミンレベルが上昇しているか否かを検討した。その結果を図２（ｂ）の右側のグラフに示す。図２（ｂ）の右側のグラフにおいて、縦軸はマウス表皮中のヒスタミン量を示す。又横軸における「W/Wv」、「+/+」の表示、白抜きの棒グラフ（左側）、グレーで塗りつぶした棒グラフ（右側）はそれぞれ、図２（ｂ）の左側のグラフの場合と同じ意味である。このグラフから分かるように、肥満細胞欠損マウス、対照正常マウスともに、ＳＤＳ塗布群の真皮中のヒスタミンは溶媒対照群に比較してほとんど増加していない。【０１２２】
本参考実験例の評価は後述の「考察」の項で述べる。【０１２３】
（参考実験例１−３）
本参考実験例ではＩＣＲマウスを使用し、刺激性物質としてＳＤＳを用いてから、マウス皮膚中のヒスタミン量を評価し、マウス皮膚中のＨＤＣ発現量も評価した。【０１２４】
実験動物：
参考実験例１−１で用いたものと同じＩＣＲマウスを用いた。ＩＣＲマウスについての予備飼育、吻側背部の刈毛・除毛等の処置も、参考実験例１−１の場合と同様に行った。【０１２５】
刺激性物質：
皮膚に対する刺激性物質として、ＳＤＳを蒸留水に溶かした１０％水溶液を、参考実験例１−１の場合と同様に用いてマウス吻側背部に塗布した。溶媒対照群（Vehicle）には蒸留水を塗布した。【０１２６】
マウス皮膚中のヒスタミン量：
上記１０％ＳＤＳ水溶液塗布群及び溶媒対照群のＩＣＲマウスについて、それらの塗布後４日経過した日（Ｄａｙ４）の時点で、参考実験例１−２中の「マウス皮膚中のヒスタミン量」で述べた操作と同様にしてマウスの皮膚を採取し、採取した皮膚を表皮と真皮に分けて、それらの中のヒスタミン量を測定した。【０１２７】
（１）マウス表皮中のヒスタミン量：
マウス表皮中のヒスタミン量の測定結果を図３(a)の左側のグラフに示す。このグラフにおいて、縦軸はマウス表皮中のヒスタミン量を示す。又、横軸の「Vehicle」は溶媒対照群の表皮中のヒスタミン量を、「SDS」は１０％ＳＤＳ水溶液塗布群の表皮中のヒスタミン量を、それぞれ示す。溶媒対照群に比較して、１０％ＳＤＳ水溶液塗布群の表皮中のヒスタミン量が顕著に増加していることが分かる。【０１２８】
（２）マウス真皮中のヒスタミン量：
マウス真皮中のヒスタミン量の測定結果を図３(a)の右側のグラフに示す。このグラフにおいて縦軸はマウス真皮中のヒスタミン量を示す。横軸の「Vehicle」、「SDS」の表記の意味は、図３(a)の左側のグラフの場合と同様である。１０％ＳＤＳ水溶液塗布群の真皮中のヒスタミン量が溶媒対照群に比較して、有意差がないことが分かる。【０１２９】
マウス表皮、真皮中のＨＤＣ発現量：
上記「マウス皮膚中のヒスタミン量」の項に記載した方法で得られた表皮と真皮について、表皮中のＨＤＣ及び真皮中のＨＤＣをウエスタンブロット法により定量した。表皮、真皮のタンパクはMammalian cell lysis kit（Sigma、tokyo、japan）を用いて抽出した。【０１３０】
このタンパク抽出液を遠心分離し上清をタンパク溶液とした。このタンパク溶液中のタンパク量を、タンパク定量キットであるＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製の2-D Quant Kitを用いて定量後、一定量のタンパクを還元剤である２−メルカプトエタノールを含むサンプルバッファーを加えて９５℃で反応にかけることで、タンパク構造中のジスルフィド結合を切断した。これによって分子量を反映した電気泳動が可能となる。【０１３１】
これらの処置を施したタンパク溶液をウエスタンブロッティングに供した。即ち、下記の電気泳動条件で電気泳動を行った。その結果、分子量に応じてタンパクが分離された。次に、分離したタンパクを、下記の転写条件でメンブレンに転写した。【０１３２】
[電気泳動条件]
使用ゲル：  Nupage 4％-12％ Bis-tris gels (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)
泳動緩衝液：  3-モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液
電流・泳動時間：  ２００V、１００分
[転写条件]
使用メンブレン：  Polyvinylidene Fluoride (PVDF) membrane
泳動緩衝液：  NuPAGE 転写用緩衝液 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)
電流・泳動時間：  ３０V、６０分
転写後、約５０kDaでメンブレンを切断した。その後、１％スキムミルク水溶液でブロッキングを行った。ブロッキング後、高分子サイズ側のメンブレンに１次抗体としてRabbit polyclonal anti-L-histidine decarboxylase (HDC) antibody (Progen Biotechnik GmbH, Heidelberg, Germany) をCan Get Signal 1 (Toyobo Co. Ltd., Osaka, Japan)に１０００倍希釈した溶液を反応させ、低分子サイズ側のメンブレンに１次抗体としてRabbit polyclonal anti-β-actin antibody (Abcam, Tokyo, Japan) をCan Get Signal 1 (Toyobo Co. Ltd., Osaka, Japan)に１０００倍希釈した溶液を４℃、オーバーナイトで反応させた。１次抗体処理後に各メンブレンをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳに０．１％Tween20を加えた溶液）で洗浄後、各メンブレンに２次抗体としてfluorophore-labeled donkey anti-rabbit IgG (H+L) antibody (Invitrogen Co. Carlsbad, CA) をCan Get Signal 2 (Toyobo Co. Ltd., Osaka, Japan)
に１０００倍希釈した溶液を反応させた。２次抗体処理後に各メンブレンをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳに０．１％Tween20を加えた溶液）で洗浄後、蛍光スキャナーでバンドの検出を行った。その後、検出されたバンドを画像解析ソフトScion Image(Scion. Corp., Frederick,  MD, USA)を用いて定量した。Scion Imageは、数値化したいタンパク質のバンドを選択し、バンドの面積及び色調の濃さを読み取り、これに基づき当該タンパクの発現量に相当する数値を検出するソフトである。【０１３３】
以上の処理によりＨＤＣとβ−actin（細胞骨格の構成成分）が検出される。ＨＤＣとしては活性型ＨＤＣ（53kDa）と不活性型ＨＤＣ（74kDa）が検出される。【０１３４】
ＨＤＣ発現量の評価結果を図３(b)及び図３(c)に示す。図３(b)の左側の図は表皮についての、右側の図は真皮についての、それぞれウェスタンブロットの結果を示す。図３(c)は、図３(b)のバンドをそれぞれ数値化してグラフに表したものである。これらの図中、「Vehicle」は溶媒対照群を、「SDS」は１０％ＳＤＳ水溶液塗布群を示す。図３(c)における１０％ＳＤＳ水溶液塗布群の数値は、溶媒対照群の数値を１とした場合の相対的な数値で表している。図３(c)では四つのグラフが並列しているが、左端のグラフは表皮についての活性型ＨＤＣ（53kDa）の測定結果、左から二番目のグラフは表皮についての不活性型ＨＤＣ（74kDa）の測定結果、左から三番目のグラフは真皮についての活性型ＨＤＣ（53kDa）の測定結果、右端のグラフは真皮についての不活性型ＨＤＣ（74kDa）の測定結果である。【０１３５】
本参考実験例の評価は後述の「考察」の項で述べる。【０１３６】
〔参考実験例２：マウスの掻破行動〕
この参考実験例は、上記した参考実験例１における主として「マウスの掻破行動」の実験部分を異なる条件下で行ったものである。【０１３７】
実験動物：
日本SLC社より購入した雄性で７〜８週齢の肥満細胞欠損マウス（WBB6F1−W/WVマウス）と、その対照正常マウスとしての雄性で７〜８週齢の野生型マウス（WBB6F1−+/+マウス）を用いた。これらは温度２２±２℃、湿度５５±１０％の恒温恒湿環境下にて、自由給水下に固形飼料を摂取させ、７日以上の予備飼育を経てから試験に使用した。又、使用マウスの吻側背部を刈毛・除毛した後、少なくとも３日以上経ってから試験に用いた。【０１３８】
刺激性物質：
皮膚に対する刺激性物質として、アニオン性界面活性剤であるラウリン酸ナトリウム（ＳＬ）を蒸留水に溶かした１０％水溶液を、上記のように刈毛・除毛したマウス吻側背部に５０μＬ、１回塗布した。塗布する際に界面活性剤水溶液が固まっていた場合は３７℃の湯浴で温めて溶かしてから使用した。溶媒対照群には蒸留水を塗布した。【０１３９】
掻破行動の観察：
マウスの掻破行動はKuraishiらの報告を参考に実施した。即ち、４つに仕切ったアクリル製の箱（１３×９×３５cm）に４匹のマウスを入れ、少なくとも１時間は順化させ、無人環境下でビデオ撮影を行って行動を記録した。その後、ビデオ観察によって後肢による吻側背部の掻破行動を計数した。一連の掻き行動（後肢で塗布部位である吻側背部を引っ掻き、後肢を下ろすまでの行動を示す）を1カウントとして、６０分間の掻破回数を目視にて計数した。【０１４０】
統計処理：
データは平均±標準誤差（ＳＥＭ）で示した。統計はDunnett's multiple comparisons もしくはStudent's t-testを用いた。危険率（p）が５％未満を有意差ありとした。統計解析に使用したソフトはStatLight（Yukms Co. Ltd., Tokyo, Japan）である。【０１４１】
マウスの掻破行動：
肥満細胞欠損マウス及び対照正常マウスとしての野生型マウスにおいてＳＬ水溶液塗布を行うと、図４（ａ）に示すように、両マウスとも塗布２時間後（塗布した時点を０時間とした）に掻破行動が明らかに増加した。又、図４（ｂ）に示すように、掻破回数は肥満細胞欠損マウスおよびその対照正常マウスにおいて同程度であった。【０１４２】
本参考実験例の評価は後述の「考察」の項で述べる。【０１４３】
〔参考実験例３：マウス皮膚中のヒスタミン量〕
この参考実験例は、上記した参考実験例１における主として「マウス皮膚中のヒスタミン量」の実験部分を異なる条件下で行ったものである。【０１４４】
実験動物：
日本SLC社より購入した、雄性で７〜８週齢のＩＣＲマウスを用いた。これらは温度２２±２℃、湿度５５±１０％の恒温恒湿環境下にて、自由給水下に固形飼料を摂取させ、７日以上の予備飼育を経てから試験に使用した。又、使用マウスの吻側背部を刈毛・除毛した後、少なくとも３日以上経ってから試験に用いた。【０１４５】
刺激性物質：
皮膚に対する刺激性物質として、ＳＬを蒸留水に溶かした１０％水溶液を、上記のように刈毛・除毛したマウス吻側背部に５０μL塗布した。溶媒対照群（Vehicle）には蒸留水を塗布した。なお、後述の図５、図６に関し、上記のＳＬ水溶液又は蒸留水の塗布を行わなかったマウスを「ＮＴ（無処置）」と呼ぶ。【０１４６】
マウス皮膚中のヒスタミン量：
界面活性剤塗布前、塗布２時間後、２４時間後（塗布した時点を０時間とした）の皮膚中のヒスタミン量を測定した。マウスは麻酔下で、心血液循環系を利用して、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で灌流後に皮膚を採取した（直径18mmの円状の生体パンチでくり抜いた）。そして採取した皮膚中のヒスタミン量を測定した。【０１４７】
回収した皮膚を６０℃のＰＢＳに３０秒間浸した後、表皮と真皮に分けた。その後、表皮中・真皮中のヒスタミン量を測定キットを用いて測定した。ヒスタミン量の測定においては、表皮、真皮ともに組織を粉砕した組織懸濁液を作成し、遠心分離をした後、上清を採取し、その上清中のヒスタミン量を測定した。【０１４８】
ＩＣＲマウス表皮、真皮中のヒスタミン量：
（１）ＳＬ処置によってマウス表皮中のヒスタミンレベルが上昇しているか否か、ＨＤＣの活性化が生じているか否かを検討した。その結果、図５（ｂ）、（ｃ）に示すように、マウス表皮においてＨＤＣの活性型（５３ｋＤa）がＳＬ水溶液塗布２時間後に有意に上昇し、塗布２４時間後には塗布前のレベルにまで戻っていた。更に、図５（ａ）に示すように、表皮中のヒスタミンレベルも同様に塗布２時間後に増加し、塗布２４時間後には塗布前のレベルに戻っていた。【０１４９】
（２）一方、表皮の場合と同様にして検討した真皮のヒスタミンレベルは、図６（ａ）〜（ｃ）に示すように、塗布前、塗布２時間後、２４時間後のどのタイミングでも測定誤差の範囲内であって、実質的に変化はなかった。【０１５０】
本参考実験例の評価は後述の「考察」の項で述べる。【０１５１】
〔実施例１：表皮内への神経伸長の測定〕
試験動物として７〜８週齢の雄性ＩＣＲマウスを用いた。試験を実施する少なくとも３日前にマウスの吻側背部の６ｃｍ２（２×３ｃｍ）を剃毛した。【０１５２】
被験物質として、タンニン酸、レスベラトロール、アピゲニン、ルテオニン、ステルビン、クロロゲン酸、ジオスメチン、ポンシリン、エリオジクチオール、プルネチン、クルミポリフェノール、オウヒエキス、オンジエキス、ブクリョウエキス、セキセツソウエキス及びソウジュツエキスをそれぞれ用いて、以下の実施例を行った。
マウスを被験物質塗布群（ｎ＝３〜４）と溶媒対照群（ｎ＝３〜４）とに分け、刺激性物質であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の１０％水溶液をそれぞれ吻側背部に５０μl塗布を1回／日、５日間連続塗布し、表皮内への神経伸長を誘発した。ＳＤＳ水溶液の塗布３時間後に、２．０質量％になるように５０％エタノールにて調製した被験物質の溶液を、溶媒対照群には５０％エタノールを、それぞれ吻側背部に５０μl塗布し、被験物質の神経伸長抑制効果を評価した。【０１５３】
試験５日目にリン酸緩衝液（0.1 M phosphate-buffered saline；ＰＢＳ）で灌流後、マウスの皮膚を切除した。切除した皮膚を４％パラホルムアルデヒド溶液で２４時間浸漬固定した。その後、３０％スクロース水溶液に置換後、凍結用包埋剤（OTC compound; Tissue Tek; Sakura, Tokyo, Japan）を用いて皮膚標本を凍結させたブロックを作製した。この凍結させたブロックをクリオスタットにて薄切した切片（切片厚、４０μｍ）を作成した。その後、皮膚切片に１次抗体としてrabbit polyclonal anti-protein gene product 9.5 (PGP9.5) antibody (Ultraclone, Isle of Wight, UK) を１．５％ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳに０．１％Tween20を加えた溶液）で１０００倍希釈したものを、4℃、オーバーナイトで反応させた。その後、２次抗体としてfluorophore-labeled donkey anti-rabbit IgG (Ｈ＋Ｌ) antibody(Invitrogen Co.) を１．５％ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳに０．１％Tween20を加えた溶液）で１０００倍希釈したものを２時間、室温で反応させた。免疫染色を行った皮膚標本を蛍光位相差顕微鏡にて観察した。【０１５４】
得られた切片画像は、図７に示すような、マウス皮膚内の神経を免疫染色した画像であって、図中の表皮及び真皮における白い部分が神経を示す。但し、図示上の便宜から、図７においては、表皮の表面部、及び表皮と真皮の境界部に、人為的に白色の実線を書き込んでいる。このような切片画像を画像解析ソフト（Image J software (NIH, Bethesda, MD, USA）を用いて評価した。【０１５５】
本実施例の評価は後述の「考察」の項で述べる。【０１５６】
〔実施例２：データ解析〕
上記の画像解析ソフトを用いた評価は、具体的には、表皮内の神経のシグナル強度（蛍光強度）を数値化し、得られた数値をグラフ化して行った。即ち、図７のような皮膚切片画像における表皮部分を選択する。その後、表皮内の各シグナルを、設定した閾値以上の部分（神経を示す白い点や線）と、設定した閾値未満の部分（灰色〜黒色）に分けた。設定した閾値以上の部分のシグナル強度を画像解析ソフトで数値に変換した。そのようにして各群についてシグナル強度の数値を求めた。【０１５７】
なお、被験物質塗布群および溶媒対照群とは別に、水塗布群（ｎ＝３〜４）も設定した。この群は、実施例１における前記ＳＤＳの１０％水溶液の塗布を水の塗布に代え、かつ、その後の被験物質塗布群における被験物質の５０％エタノール溶液の塗布や溶媒対照群における５０％エタノールの塗布に相当する操作は行わず、それ以外の点は実施例１と全く同様に行った群である。【０１５８】
そして、水塗布群から得られた切片画像における上記画像解析ソフトによるシグナル強度を基準値「１」として、被験物質塗布群及び溶媒対照群のシグナル強度の相対値を算出した。その結果を、前記した各被験物質について、図８〜図１１のグラフに示す。【０１５９】
図８〜図１１において、「水」と表記したグラフは水塗布群を示し、「SDS＋溶媒」と表記したグラフは溶媒対照群を示し、例えば「SDS＋タンニン酸」と被験物質名を伴って表記したグラフは当該被験物質を用いた被験物質塗布群を示す。図１０及び図１１において、「クルミ」とはクルミポリフェノールを意味し、「オウヒ」、「オンジ」、「ブクリョウ」、「セキセツソウ」及び「ソウジュツ」とは、それぞれオウヒエキス、オンジエキス、ブクリョウエキス、セキセツソウエキス及びソウジュツエキスを意味する。各棒グラフに付記した数値は、棒グラフの高さ、即ちシグナル強度の相対値である。【０１６０】
本実施例の評価は次の「考察」の項で述べる。【０１６１】
〔参考実験例及び実施例の考察〕
（１）参考実験例１−１によれば、図１(a)、(b)に示すように、ＳＤＳ水溶液塗布によってマウスの掻破行動が顕著に増加し、かつ当該掻破行動が抗ヒスタミン薬であるＴＲＦの経口投与によって有効に抑制されるので、これらはヒスタミン依存的な反応であると考えられる。そして前記したように、一般的には、このヒスタミンは肥満細胞からの脱顆粒によって放出されると考えられている。そこで、参考実験例１−２において、このような考え方の当否を肥満細胞欠損マウスを用いて検討した。【０１６２】
参考実験例１−２によれば、図２(a)、(b)に示すように、肥満細胞欠損マウス、対照正常マウスともにＳＤＳ水溶液塗布によってマウスの掻破行動が顕著に増加し、かつ、表皮中のヒスタミン量が溶媒対照群に比較して顕著に増加する一方、真皮中のヒスタミン量は溶媒対照群に比較して増加しない。更に、肥満細胞欠損マウスの真皮中のヒスタミン量は明らかに対照正常マウスと比較して少なかった。つまり、ＳＤＳによって誘発される掻破行動への真皮中のヒスタミンの関与は少ないと思われる。【０１６３】
まとめると、ＳＤＳ水溶液塗布によって誘発されるマウスの掻破行動（痒み関連行動）に対して、肥満細胞由来のヒスタミンは影響しておらず、表皮のケラチノサイト由来のヒスタミンが反応を支配している、と考えられる。【０１６４】
参考実験例１−３によれば、図３(a)に示すように、ＳＤＳ塗布によって表皮中のヒスタミン量が有意に増加したのに対し、真皮中のヒスタミン量は変化がほとんどなかった。【０１６５】
又、図３(b)及び図３(c)に示すように、ＳＤＳ塗布によって表皮中の５３ｋＤａ-ＨＤＣ発現量および７４ｋＤａ-ＨＤＣ発現量が増加した。一方、真皮中では７４ｋＤａ-ＨＤＣ発現量は有意に増加したのに対し５３ｋＤａ-ＨＤＣ発現量は変化がなかった。以上のことから、ＳＤＳ水溶液塗布によって表皮内でＨＤＣ（特に５３ｋＤａ-ＨＤＣ）発現量が増加し、その結果ヒスタミン量が増加したのではないかと思われる。この表皮内ヒスタミン量が掻破行動を誘発していると思われる。【０１６６】
（２）参考実験例２によれば、図４から分かるように、皮膚への刺激性物質の塗布により、肥満細胞欠損マウスと、その対照である正常な野生型マウスとが同等の掻破行動を示した。即ち、肥満細胞欠損マウスで、正常マウスと同様の痒みを生じている。一方、実施例１、２によれば、正常なＩＣＲマウスの皮膚への類似した刺激性物質の塗布により、表皮内への神経伸長が誘発されている。従って、肥満細胞を欠損させたモデルマウスでも表皮内への神経伸長が起こり得ることが示唆される。【０１６７】
（３）参考実験例３によれば、図５、６から分かるように、ＩＣＲマウスの皮膚への刺激性物質の塗布により、表皮において活性型ＨＤＣが増大するが、真皮においては増大しない。そしてこの活性型ＨＤＣは、表皮のケラチノサイトにおいて不活性型ＨＤＣが刺激性物質の作用により活性化誘導されたものと考えられる。従って、皮膚ケラチノサイト試料中の活性型ＨＤＣ及び不活性型ＨＤＣの少なくとも一方を、皮膚感覚過敏検出用マーカーとして有効に利用できる。【０１６８】
（４）実施例１、２によれば、図８〜図１１から分かるように、ＩＣＲマウスの皮膚への刺激性物質の塗布に基づく表皮内への神経伸長が、溶媒対照群との比較において、本発明に係る神経伸長抑制剤あるいは皮膚感覚過敏抑制剤である上記の各被験物質ではかなりの程度まで抑制されている。なお、上記の参考実験例１及び参考実験例２から、このような表皮内への神経伸長が、表皮ケラチノサイトでのＨＤＣ活性化誘導に由来するヒスタミンに起因することが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
本発明により、新たに見出された神経伸長メカニズムに基づく神経伸長及び皮膚感覚過敏を有効に抑制できる神経伸長抑制剤、皮膚感覚過敏抑制剤等が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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