(57)【要約】  アレルギー疾患（アトピー性皮膚炎、喘息等）に対する医薬品や、アレルギー疾患の病態解析に有用なツールを提供すること。ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質を含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するための活性調節剤を有効成分として含有する医薬品は、アレルギー疾患を治療または予防するために使用することができる。また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、アレルギー疾患を誘導させる物質を投与したときにアレルギー疾患を誘発しにくいモデルマウスとして、アレルギー疾患の病態解析を行うための、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングするために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質を含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するための活性調節剤を有効成分として含有することを特徴とする、アレルギー疾患を治療または予防するための医薬品。
【請求項２】
前記ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質がホスファチジルセリン結合性物質である、請求項１に記載の医薬品。
【請求項３】
前記ホスファチジルセリン結合性物質が、ＭＦＧ−Ｅ８、ＭＦＧ−Ｅ８変異体（Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８）、Ｔ細胞免疫グロブリン、可溶型ＴＩＭ−１、可溶型ＴＩＭ−４、可溶型スタビリンおよび可溶型インテグリンαｖβ３からなる群から選択される少なくとも１種類である、請求項２に記載の医薬品。
【請求項４】
前記ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質がＣＤ３００ａ結合性物質である、請求項１に記載の医薬品。
【請求項５】
前記ＣＤ３００ａ結合性物質が、配列番号３で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号４で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗ヒトＣＤ３００ａ抗体である、請求項４に記載の医薬品。
【請求項６】
前記ＣＤ３００ａ結合性物質が、配列番号１で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号２で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗マウスＣＤ３００ａ抗体である、請求項４に記載の医薬品。
【請求項７】
前記アレルギー疾患が、アトピー性皮膚炎または喘息である、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬品。
【請求項８】
アレルギー疾患について、病態解析を行うための、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングするための、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用であって、
前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを、アレルギー疾患を誘導させる物質を投与したときにアレルギー疾患を誘発しにくいモデルマウスとして使用することを特徴とする、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用。
【請求項９】
アレルギー疾患について、病態解析を行う際、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングする際の、比較解析用のツールとしての、
ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を亢進する物質を含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進するための活性調節剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー疾患に関連する、ＣＤ３００ａ発現細胞の活性調節剤を含有する医薬品、ならびにＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスおよびＣＤ３００ａ発現細胞の活性調節剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
宿主（人体または動物体内）に病原体（細菌、ウイルス、寄生虫等）が侵入したり、内因性の起炎物質が発生したりすると、病原体の侵入部位または起炎物質の発生部位にて細動脈が一時的に収縮した後、拡張・充血に至って、病原体の侵入部位または起炎物質の発生部位の血流が局所的に緩慢になるといった炎症反応が発生する。【０００３】
すると、白血球が血管壁に膠着し、さらに各種免疫系細胞から放出されるケミカルメディエーターの作用により、アメーバ様運動により血管壁を通過して遊走する。ケミカルメディエーターとしては、ヒスタミン、セロトニン、リンホカイン等が知られている。ヒスタミンやセロトニンを産生・放出するマスト細胞は、炎症反応において中心的な役割を果たしているリンパ球の一つである。また、マクロファージもマスト細胞と同様にＴＮＦ等のケミカルメディエーターを産生・放出する。【０００４】
炎症反応によって、遊走させられた白血球が病原体等に誘引されると、病原体に抗原抗体反応を伴う体液性免疫や細胞障害性Ｔ細胞等が関与する細胞性免疫によって、病原体が体内から除去され（クリアランス）、感染拡大が防止される。このように、炎症反応およびそれに基づく免疫反応は、生体の恒常性を維持するためには極めて重要である。【０００５】
一方で、炎症反応は、上述のような生体防御とともに、発赤、発熱、腫張、疼痛、機能障害といった不具合な徴候・症状を示してしまう。このような症状として、具体的には、アレルギー疾患、各種急性または慢性炎症が挙げられる。また、免疫学的寛容が適用されず、自己に対して免疫応等が生じてしまう自己免疫疾患が発生した場合も、炎症反応によって組織傷害が発生してしまう。【０００６】
すなわち、炎症反応を伴う疾患を予防するには、炎症反応を惹起させる病原体を各種抗生物質（抗菌剤）によって死滅させることや、生体内の免疫機能を向上させる薬剤を投与して、炎症反応が過剰に亢進する前に、病原体を除去することが重要である。【０００７】
一方、炎症反応を伴う疾患を改善・治療するには、たとえば、ケミカルメディエーターの放出を抑制するような、過剰に活性化した免疫機能を低下させる薬剤（抗炎症剤）を投与して、炎症の鎮静化を図ることが知られている。【０００８】
たとえば、特許文献１には、免疫活性剤として、抗原提示細胞として各種免疫系細胞の活性化を担う樹状細胞の機能賦活化剤が開示され、具体的には、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とすることを特徴とするものである。【０００９】
特許文献２には、抗炎症剤として、ＳＰＡＲＣ（Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒоｔｅｉｎ  ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ａｃｉｄｉｃ  ａｎｄ  ｒｉｃｈ  ｉｎ  ｃｙｓｔｅｉｎ）ペプチドおよび薬理学的担体を含む薬剤が開示されている。【００１０】
ところで、自然免疫系を担当するミエロイド系（骨髄系）細胞の細胞膜上には、ＭＡＩＲ（Myeloid Associated Ig like Receptors）と称されるレセプター分子群が発現していることが知られている（非特許文献１）。このうち、ＣＤ３００ａとしても知られている（その他「ＬＭＩＲ１」、「ＣＬＭ−８」と称されることもある）ＭＡＩＲ−Ｉは、マクロファージ、肥満細胞、顆粒球（好中球）、樹状細胞に発現しており、細胞内領域のＩＴＩＭ（Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif）配列を介して脱リン酸化酵素と会合し、抑制性シグナルを伝達する抑制性レセプターであることが知られている（非特許文献２）。しかしながら、当該受容体のリガンドは不明であり、いわゆるオーファンレセプターとなっていた。【００１１】
アトピー性皮膚炎は、アレルギー物質(抗原)が体内に入り、活性化した免疫細胞から分泌された物質（インターロイキン４，１３）が刺激となって作られたペリオスチンが、皮膚の角化細胞表面にある別のタンパク質「インテグリン」と結合することで炎症を起こすことが原因となっている。【００１２】
ペリオスチンがインテグリンと結合することによって新たな炎症誘発性物質が産生され、抗原がなくても症状が継続して慢性化する。マウスを使った実験で、ペリオスチンとインテグリンの結合を阻害剤により阻害すると、アトピー性皮膚炎は起きないことが示されている（非特許文献３）。【００１３】
アトピー性皮膚炎の主たる病因が明らかになったものの、アトピー性皮膚炎の病態のさらなる解明および他の炎症疾患との関連性の解析、上記阻害剤と併用可能なアトピー性皮膚炎用の医薬品等も望まれている。【００１４】
一方、気管支喘息（Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  Ａｓｔｈｍａ）とはアレルギー反応や細菌・ウイルス感染などが発端となった気管支の炎症が慢性化することで気道過敏性の亢進、可逆性の気道狭窄をおこし、発作的な喘鳴、咳などの症状をきたす呼吸器疾患である。また、気管支喘息は、気道過敏性、アレルギー体質、環境の組合せでおこるとされている。ぜん鳴、無呼吸、胸部緊張および咳などの再発性の症状の発現の形で、特に夜または早朝に現れる。【００１５】
多くの細胞および細胞成分、特に肥満細胞、好酸球、Ｔリンパ球、マクロファージ、好中球および上皮細胞は、気道の炎症に役割を演じている。炎症は、血漿の滲出、浮腫、平滑筋肥大、粘液填塞(mucus plugging)および上皮変化と関連している。また、炎症は、種々の刺激に対して存在する気管支過応答の関連する増大を引き起こす。【００１６】
気道の炎症は、気道平滑筋の萎縮、微小血管の破裂および気管支過応答を導く。気道の反応性が高いと、症状はより重く、持続的になり、肺機能の日中の変動の規模がより大きくなる。気道の炎症が気管支の反応性に関連しているメカニズムは不明であり、喘息の病態解明に有用なツールや、医薬品等が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特開２００７−２９７３７９号公報
【特許文献２】特開２０１１−５１６６０９号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Yotsumoto et al.. J Exp Med 198 (2), 223-233, 2003
【非特許文献２】Okoshi Y et al, Int Immunol., 17, 65-72, 2005.
【非特許文献３】Miho Masuoka et. al J Clin Invest. 2012; doi:10.1172/JC158978
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、アレルギー疾患に対する医薬品や、アレルギー疾患の病態解析に有用なツールなどを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者は、ＣＤ３００ａのリガンドおよびＣＤ３００ａの機能を解明すべく鋭意研究を重ねた結果、以下に示されるような知見を得た。
（ｉ）ＣＤ３００ａのリガンドは、ホスファチジルセリン（フォスファチジルセリン、ホスホファチジルセリン）（ＰＳ）である。
（ｉｉ）ＰＳがマスト細胞等のＣＤ３００ａへ結合すると、ＣＤ３００ａの抑制性シグナル伝達が亢進し、マスト細胞等の活性化も抑制される。
（ｉｉｉ）ホスファチジルセリン結合性物質またはＣＤ３００ａ結合性物質が共存することにより、マスト細胞等のＣＤ３００ａとＰＳとの結合が阻害されると、ＣＤ３００ａの抑制性シグナル伝達が抑制され、マスト細胞等の活性化も維持される。
（ｉｖ）上記の活性化の抑制または維持を通じて、アレルギー疾患などを治療できる。
（ｖ）ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、アレルギー疾患の病態解析や医薬品の有効成分のスクリーニングなどを行うためのツールとなり得る。【００２１】
これらの知見に基づいてなされた本発明により、たとえば、下記［１］〜［９］に示される各発明が提供される。
［１］  ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質を含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するための活性調節剤を有効成分として含有することを特徴とする、アレルギー疾患を治療または予防するための医薬品。【００２２】
［２］  前記ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質がホスファチジルセリン結合性物質である、［１］の医薬品。
［３］  前記ホスファチジルセリン結合性物質が、ＭＦＧ−Ｅ８、ＭＦＧ−Ｅ８変異体（Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８）、Ｔ細胞免疫グロブリン、可溶型ＴＩＭ−１、可溶型ＴＩＭ−４、可溶型スタビリンおよび可溶型インテグリンαｖβ３からなる群から選択される少なくとも１種類である、[２]に記載の医薬品。【００２３】
［４］  前記ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質がＣＤ３００ａ結合性物質である、［１］に記載の医薬品。
［５］  前記ＣＤ３００ａ結合性物質が、配列番号３で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号４で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗ヒトＣＤ３００ａ抗体である、［４］に記載の医薬品。【００２４】
［６］  前記ＣＤ３００ａ結合性物質が、配列番号１で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号２で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗マウスＣＤ３００ａ抗体である、［４］に記載の医薬品。【００２５】
［７］  前記アレルギー疾患が、アトピー性皮膚炎または喘息である、［１］〜［６］のいずれかに記載の医薬品。
［８］  アレルギー疾患について、病態解析を行うための、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングするための、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用であって、
前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを、アレルギー疾患を誘導させる物質を投与したときにアレルギー疾患を誘発しにくいモデルマウスとして使用することを特徴とする、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用。【００２６】
［９］  アレルギー疾患について、病態解析を行う際、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングする際の、比較解析用のツールとしての、
ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を亢進する物質を含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進するための活性調節剤の使用。【００２７】
また、上記発明の別の側面として、次の発明が提供される。
上記［１］に係る発明の別の側面として、ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害し、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制することを特徴とする、アレルギー疾患を治療または予防する方法が提供される。当該方法は、生体内（in vivo）、生体外（ex vivo, in vitro）を問わずに適用可能であり、また生体内で適用される場合、その生物種は、ヒトであるか、ヒト以外であるか（たとえばマウス等の哺乳類）であるかを問わない。【００２８】
上記［１］に係る発明のさらなる側面として、アレルギー疾患を治療または予防するための医薬品の製造における、ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害し、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制する活性調節剤の使用が提供される。
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、ＣＤ３００ａ発現細胞の抑制性シグナル伝達を阻害する活性調節剤を有効成分として含有する、アレルギー疾患を治療または予防するための医薬品の製造が可能となる。また、本発明により、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス等を、アレルギー疾患の病態解明や治療等に有用なモデルマウス等として使用することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、参考例１Ａで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、参考例１Ｂで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、参考例１Ｂで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、参考例１Ｃで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、参考例１Ｄで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、参考例１Ｄで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、参考例１Ｅで得られたイムノブロット分析の結果を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、野生型アレル中のＣＤ３００a遺伝子の構造、ＣＤ３００a欠損マウスを作成するために使用したターゲティングベクター、および標的化アレルを示すための模式図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、野生型アレルおよび変異型アレルのＰＣＲ産物を示す電気泳動写真である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、野生型マウスおよびＣＤ３００a欠損マウスを用いたウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＷＴマウスとＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスのフローサイトメトリ−分析結果を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、参考例２Ａで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、参考例２Ｃで得られた光学顕微鏡の分析結果を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、参考例２Ｃで得られたレーザー走査型共焦点顕微鏡の分析結果を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、参考例２Ｃで得られた、胸腺細胞を細胞質内に取り込んだＮＩＨ３Ｔ３または各形質転換体における細胞数の比率を示す結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、参考例２Ｂで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、参考例２Ｂで得られたＲＴ−ＰＣＲの分析の結果を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、参考例３Ａで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、参考例２Ａで得られたβ―ヘキサミニダーゼアッセイの分析結果を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、参考例３Ｂで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、参考例３Ｃで得られた、各種サイトカインおよびケモカインの放出量の増加率の結果を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、参考例３Ｅで得られた、各種サイトカインおよびケモカインの放出量の増加率の結果を示す図である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、参考例３Ｆで得られた、イムノブロッティング分析の結果を示す。
【図７Ｅ】図７Ｅは、参考例３Ｇで得られた、イムノブロッティング分析の結果を示す図である。
【図７Ｆ】図７Ｆは、参考例３Ｇで得られた、ＴＮＦ−αの増加率を示す図である。
【図８】図８は、参考例３Ｄで得られたフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、参考例４Ｂで得られたデンシトメトリー分析の結果を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、参考例４Ｂで得られたデンシトメトリー分析の結果を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、参考例４Ｃで得られた抗気性細菌のＣＦＵの算出結果を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＣＤ３００ａ好中球の誘導後、参考例４Ｃで得られた好中球およびマクロファージの細胞数を示す図である。
【図１１】図１１は、参考例４Ｃで得られた、大腸菌を貪食した各マクロファージの細胞数の比率を示す図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、参考例４Ｄで得られたフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、参考例４Ｄで得られた各マウスの生存率を示す図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、参考例４Ｄで各マウスの腸内の細菌クリアランスを細菌のＣＦＵで示した図である。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、参考例４Ｅで得られたフローサイトメトリー分析の結果等を示す図である。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、参考例４ＦでＴＸ４１を投与した後の各マウスの生存率を示す図である。
【図１２Ｆ】図１２Ｆは、参考例４Ｇで、ＴＸ４１を投与した後の腸内のクリアランスを示す図である。
【図１２Ｇ】図１２Ｇは、参考例４Ｇで、ＴＸ４１を投与した後の好中球の細胞数の変化を分析した結果を示す図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、鶏卵白アルブミンで喘息を誘導した際のプロトコールを示した図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、実施例１Ａについて、喘息誘導開始から25日目の各マウスの肺胞洗浄液中の総細胞数を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、実施例１Ｂについて、喘息誘導開始から25日目の各マウスの肺胞洗浄液中の好酸球の割合を示す。
【図１４】図１４は、実施例１Ｂについて、喘息誘導開始から１４日目の各マウスの血清ＩｇＥ値を示す。
【図１５】図１５は、ＯＶＡ感作をした各マウスの３０分毎の擦過行動数の経時変化（日別）を示す図である（実施例２Ａ）。
【図１６】図１６は、ＯＶＡ感作後、第３週末時点の各マウスの皮膚の切片を示す（実施例２Ｂ）。
【図１７】図１７は、ＯＶＡ感作後、第３週末時点の各マウスの皮膚サンプルについてトルイジンブルー染色した結果を示す図である（実施例２Ｃ）。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ＯＶＡ感作後、第３週末時点の各マウスの表皮内の細胞層数を示すグラフである（実施例２Ｄ）。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＯＶＡ感作後、第３週末時点の各マウスの各皮膚サンプルについて真皮内に浸潤した好酸球数とマスト細胞数を示す（実施例２Ｅ）。
【図１９】図１９は、ＯＶＡ感作後、第３週末時点の各マウスの各皮膚サンプルについてランゲリン免疫染色した結果を示す（実施例２Ｆ）。
【図２０】図２０は、図１９の各サンプルのカウンター染色を示す。
【図２１】図２１は、マスト細胞とランゲリン陽性皮膚細胞との相互作用している状態を示した図である（実施例２Ｈ）。
【図２２】図２２は、ＴＸ４１による治療の効果を確認する試験のスケジュールを示す図である。
【図２３】図２３は、ＴＸ７４またはＴＸ４１投与後の各ＷＴマウスについて、ＥＬＩＳＡ法により測定した血清総ＩｇＥ濃度を示す。
【図２４】図２４は、ＴＸ７４またはＴＸ４１投与後の各ＷＴマウスについて、擦過行動数を示した図である。
【図２５】図２５は、ＴＸ７４またはＴＸ４１投与後の各ＷＴマウスの皮膚切片について、Ｈ＆Ｅ染色を行った結果を示す図である。
【図２６】図２６は、ＴＸ７４またはＴＸ４１投与後の各ＷＴマウスの皮膚切片について、トルイジンブルー染色でカウンター染色をした状態を示す図である。
【図２７】図２７は、ＴＸ４１とＴＸ４９のＨ鎖とＬ鎖とをそれぞれ相同性解析を行った結果である。
【図２８】図２８は、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス及び野生型マウスを鶏卵白アルブミンで喘息を誘導した際のプロトコールを示した図である（実施例２Ｍ、２Ｎ）。
【図２９】図２９は、図２８で示すように喘息を誘導した際のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス及び野生型マウスの気道内圧を示す図である（実施例２Ｍ）。
【図３０】図３０は、図２８で示すように喘息を誘導した際のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス及び野生型マウスの気管支を洗浄した液の中の総細胞数、及び好酸球数を示す図である（実施例２Ｍ）。
【図３１】図３１は、図２８で示すように喘息を誘導した際のＩｇＥの量をＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス及び野生型マウスで比較した図である。
【図３２】図３２は、図２８で示すように喘息を誘導した際の鶏卵白アルブミンに特異的なＩｇＧ１の量をＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス及び野生型マウスで比較した図である（実施例２Ｎ）。
【図３３】図３３は、図２８で示すように喘息を誘導した際のＩｇＧ２ｃの量をＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス及び野生型マウスで比較した図である（実施例２Ｎ）。
【図３４】図３４は、図２８で示すように喘息を誘導した際のＩｇＧ２ｂの量をＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス及び野生型マウスで比較した図である（実施例２Ｎ）。
【図３５】図３５は、図２８で示すように喘息を誘導した際のＩｇＧ３の量をＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス及び野生型マウスで比較した図である（実施例２Ｎ）。
【図３６】図３６は、図２８で示すように喘息を誘導した３日後にＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス及び野生型マウスの縦隔リンパ節を採取し、撮影した写真である（実施例２Ｏ）。
【図３７】図３７は、図３６のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス及び野生型マウスの各縦隔リンパ節の細胞数を調べた結果を示す図である（実施例２Ｏ）。
【図３８】図３８は、図２８で示すように喘息を誘導した７日後にＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス及び野生型マウスの縦隔リンパ節を採取し、フローサイトメトリー法で制御性T（Ｔｒeｇ）細胞の転写因子ＦＯＸＰ３の発現量を調べた結果を示す図である（実施例２Ｐ）。
【図３９】図３９は、図２８で示すように喘息を誘導した７日後にＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス及び野生型マウスの縦隔リンパ節を採取し、フローサイトメトリー法でＴ細胞に特異的な転写因子ＧＡＴＡ３の発現量を調べた結果を示す図である（実施例２Ｐ）。
【図４０】図４０は、図２８で示すように喘息を誘導した７日後にＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス及び野生型マウスの縦隔リンパ節を採取し、フローサイトメトリー法で Ｔｈ１分化に関わる転写因子Ｔ−ｂｅｔの発現量を調べた結果を示す図である（実施例２Ｐ）。
【図４１】図４１は、ＣＤ３００ａを発現している脾臓細胞をフローサイトメトリー法で分析し、ゲーティングした結果を示す図である（実施例２Ｑ）。
【図４２】図４２は、ＣＤ３００ａを発現している脾臓細胞（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋）の量を示す図である（実施例２Ｑ）。
【図４３】図４３は、ＣＤ３００ａを発現している脾臓細胞（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ−）の量を示す図である（実施例２Ｑ）。
【図４４】図４４は、ＣＤ３００ａを発現している脾臓細胞（ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ−）の量を示す図である（実施例２Ｑ）。
【図４５】図４５は、ＣＤ３００ａを発現している縦隔リンパ節の細胞をフローサイトメトリー法で分析し、ゲーティングした結果を示す図である（実施例２Ｑ）。
【図４６】図４６は、ＣＤ３００ａを発現している縦隔リンパ節の細胞（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋）の量を示す図である（実施例２Ｑ）。
【図４７】図４７は、ＣＤ３００ａを発現している縦隔リンパ節の細胞（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ−）の量を示す図である（実施例２Ｑ）。
【図４８】図４８は、ＣＤ３００ａを発現している縦隔リンパ節の細胞（ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ＋）の量を示す図である（実施例２Ｑ）。
【図４９】図４９は、ＴＸ４１抗体投与による喘息病態への影響の確認する際のプロトコールを示す図である（実施例２Ｒ）。
【図５０】図５０は、喘息を誘導した野生型マウスに対してＴＸ４１抗体を投与した場合の全細胞数への影響を示す図である（実施例２Ｒ）。
【図５１】図５１は、喘息を誘導した野生型マウスに対してＴＸ４１抗体を投与した場合の好酸球数（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ｎｕｍｂｅｒ）への影響を示す図である（実施例２Ｒ）。
【図５２】図５２は、喘息を誘導した野生型マウスに対してＴＸ４１抗体を投与した場合の血清ＩｇＥ（Ｓｅｒｕｍ  ＩｇＥ）への影響を示す図である（実施例２Ｒ）。
【図５３】図５３は、Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８投与による縦隔リンパ節における制御性T細胞の増加の有無を確認した結果を示す図である（実施例２Ｓ）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明に係る活性調節剤、これを含有する医薬品、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用、抗ＣＤ３００ａ抗体について、以下詳細に説明する。免疫機構およびＣＤ３００ａ等に関する従来の知見や公知の試験方法に言及する際に用いる文献を実施例の末尾に列挙した。
【００３２】
［活性調節剤］
本発明における活性調節剤は、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を、抑制するためのものと、亢進するためのものを包含する。
【００３３】
ここで、「ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞」には、マスト細胞（肥満細胞）、マクロファージ、好中球、樹状細胞（ＣＤ１１ｂ＋樹状細胞等）などが含まれる。ＣＤ３００ａは、ヒト、マウス、その他の哺乳類に発現しているものを総称しており、生物種は特に限定されるものではない。
【００３４】
また、「抑制性シグナル伝達」とは、抑制性レセプターであるＣＤ３００ａが、細胞内領域のＩＴＩＭ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆ）配列を介して脱リン酸化酵素と会合することにより生じるシグナル伝達である。
【００３５】
＜第１の活性調節剤＞
本発明による第１の活性調節剤は、ＣＤ３００ａを介した抑制性シグナル伝達を抑制する作用を有する成分を含有する。本発明ではそのような成分として、ホスファチジルセリンとＣＤ３００ａとの結合を阻害する物質、すなわちホスファチジルセリン結合性物質およびＣＤ３００ａ結合性物質を用いることができる。第１の活性調節剤は、これらの何れか一方を含んでいてもよいし、これら両方を含んでいてもよい。
【００３６】
（ホスファチジルセリン結合性物質）
第１の活性調節剤の一つであるホスファチジルセリン結合性物質は、ＣＤ３００ａのリガンドであるホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合して、ホスファチジルセリンとミエロイド系細胞に発現したＣＤ３００ａとの相互作用（結合）を阻害するものである限り特に限定されない。
【００３７】
ホスファチジルセリン結合性物質の具体例としては、ＭＦＧ−Ｅ８（Ｍｉｌｋ  Ｆａｔ  Ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＥＧＦ−８）、Ｔ細胞免疫グロブリンや、可溶型ＴＩＭ−１、可溶型ＴＩＭ−４、可溶型スタビリンおよび可溶型インテグリンαｖβ３などの可溶型蛋白質が挙げられ、中でもＭＦＧ−Ｅ８が好ましい。
【００３８】
また、ホスファチジルセリン結合性蛋白質としては、ＭＦＧ−Ｅ８などのようなネイティブの蛋白質に限定されず、ホスファチジルセリンへの結合性を喪失しない限り、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するもの（変異体）であってもよい（たとえば、実施例における「Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８」等）。
【００３９】
これらの変異体は、部位特異的突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）やランダム突然変異法などの公知の方法によって作製される。
また、上記「可溶型蛋白質」とは、膜蛋白質など、後述するような希釈剤や体液に対して不溶性である、ネイティブの蛋白質において、公知の遺伝子組み換えの技術によって、疎水性ドメインを削除したり、親水性のペプチドを付加したりして、希釈剤や体液に対して可溶性になるように改変した蛋白質を指す。
【００４０】
（ＣＤ３００ａ結合性物質）
第１の活性調節剤の一つであるＣＤ３００ａ結合性物質は、ＣＤ３００ａに結合して、ミエロイド系細胞に発現したＣＤ３００ａとホスファチジルセリンとの相互作用（結合）を阻害するものである限り特に限定されない。
【００４１】
ＣＤ３００ａ結合性物質の具体例としては、ＣＤ３００ａに対する中和抗体が挙げられる。中和抗体は、特定の一種類のモノクローナル抗体であってもよいし、二種類以上のモノクローナル抗体の組み合わせ（ないしポリクローナル抗体）であってもよい。また、中和抗体は、完全長の抗体であってもよいし、断片化された抗体（Ｆａｂ断片もしくはＦ（ａｂ'）2等）であってもよい。
【００４２】
中和抗体は、公知の手法によって作製することができる。モノクローナル抗体であれば、一般的には、ＣＤ３００ａを用いた免疫、ハイブリドーマの作製、スクリーニング、培養、回収といった手順で、抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体を作製することができる。それらの中から、好ましいＣＤ３００ａとホスファチジルセリンとの結合阻害能（中和作用）を有し、本発明の作用効果を奏する適切なモノクローナル抗体を選択すればよい。
【００４３】
（ＴＸ４１、ＴＸ４９およびこれらに類する抗体）
ＴＸ４１は抗マウスＣＤ３００ａモノクローナル抗体（ラットＩｇＧ２ａ）であり、ＴＸ４９は抗ヒトＣＤ３００ａモノクローナル抗体（マウスＩｇＧ１）である。どちらも後記実施例において作成、使用されたモノクローナル抗体であり、ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンとの結合を阻害してシグナル伝達を抑制する機能に優れているため、本発明におけるＣＤ３００ａ結合性物質として好ましい。ただし、本発明に用いることのできる抗ＣＤ３００ａ抗体は、ＴＸ４１、ＴＸ４９およびこれらに類する（同等のアミノ酸配列からなる可変領域を有する）抗体に限定されるものではない。
【００４４】
ＴＸ４１のＨ鎖の可変領域は配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、ＴＸ４１のＬ鎖の可変領域は配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、ＴＸ４９のＨ鎖の可変領域は配列番号３で示されるアミノ酸配列を有し、ＴＸ４９のＬ鎖の可変領域は配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する。なお、これらの可変領域には、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域が含まれる。ＴＸ４１およびＴＸ４９の可変領域（Ｈ鎖およびＬ鎖それぞれ）のアミノ酸配列同士の相同性を解析した結果を図２７に示す。
【００４５】
マウスのＣＤ３００ａに対する結合性物質としては、ＴＸ４１に基づいて、Ｈ鎖の可変領域が配列番号１で表されるアミノ酸配列からなり、Ｌ鎖の可変領域が配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる抗体を用いることが好ましい。
【００４６】
ヒトのＣＤ３００ａに対する結合性物質としては、ＴＸ４９に基づいて、Ｈ鎖の可変領域が配列番号３で表されるアミノ酸配列からなり、Ｌ鎖の可変領域として配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる抗体を用いることが好ましい。
【００４７】
また、マウスのＣＤ３００ａに対する結合性物質としては、Ｈ鎖の可変領域が配列番号１で表されるアミノ酸配列に対し１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなる抗体、またはＬ鎖の可変領域が配列番号２で表されるアミノ酸配列に対し１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなる抗体を用いることもできる（Ｈ鎖およびＬ鎖の一方が上記の変異を有するものであってもよいし、それらの両方が上記の変異を有するものであってもよい）。
【００４８】
ヒトのＣＤ３００ａに対する結合性物質としては、Ｈ鎖の可変領域が配列番号３で表されるアミノ酸配列に対し１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を含むアミノ酸配列からなる抗体、またはＬ鎖の可変領域が配列番号４で表されるアミノ酸配列に対し１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなる抗体を用いることもできる（Ｈ鎖およびＬ鎖の一方が上記の変異を有するものであってもよいし、それらの両方が上記の変異を有するものであってもよい）。
【００４９】
このような変異を生じさせる部位は、可変領域のうちＣＤＲまたはその近傍の部位を避けることが好ましい。また、アミノ酸を置換する場合は、側鎖の構造および／または化学的な性質が類似するアミノ酸同士の間で行われる、保存的アミノ酸置換が好ましい。
【００５０】
抗ＣＤ３００ａ抗体の定常領域、すなわちＦａｂ領域のうちの上記のような可変領域以外の領域およびＦｃ領域の形態（アミノ酸配列、アミノ酸長）は、ＣＤ３００ａへの結合性、すなわち中和作用にほとんど影響しないため、本発明の作用効果を阻害しない範囲で適宜設計することができる。
【００５１】
すなわち、上記所定の可変領域のアミノ酸配列と、公知の各種の定常領域のアミノ酸配列からなる融合タンパク質として抗ＣＤ３００ａ抗体を作製することができる。
たとえば、ヒトの定常領域を利用することにより、ヒトキメラ抗体として抗ヒトＣＤ３００ａ抗体を作製することは、好ましい実施形態の一つである。このような抗ＣＤ３００ａ抗体は、公知の手法により作製することが可能である。
【００５２】
たとえば、上記所定の可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成し、定常領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよびその他の必要なＤＮＡ（転写因子等）と連結することにより、抗ＣＤ３００ａ抗体遺伝子の発現ベクターを構築することができる。このベクターを宿主細胞に導入して発現させるようにすれば、目的とする抗ＣＤ３００ａ抗体を産生することができる。
【００５３】
なお、上述したようなＴＸ４１、ＴＸ４９およびこれらに類する抗体は、本発明の作用効果に係る、ホスファチジルセリンとＣＤ３００ａとの結合により生じる抑制性シグナル伝達を阻害する目的以外にも使用できる可能性がある。
【００５４】
（ＣＤ３００ａ  ｓｉＲＮＡ）
また、ＣＤ３００ａの遺伝子配列（ＤＤＢＪ/ＥＭＢＬ/ＧｅｎＢａｎｋ＝ＩＮＳＤ等のＤＮＡデータベースから入手可能）を元に設計されたｓｉＲＮＡにより、罹患部位におけるミエロイド系細胞におけるＣＤ３００ａの発現を抑制することで、ＣＤ３００ａ遺伝子を欠損させた状態またはＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害した状態と同様に、上記の各種疾患に対する治療効果を得ることができる。換言すれば、ＣＤ３００ａ遺伝子に対するｓｉＲＮＡも、本発明におけるＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する物質の一種といえる。
【００５５】
（第１の活性調節剤の用途）
本発明における第１の活性調節剤は、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するために使用することができる。この際、ミエロイド系細胞は、生体内にあるものであっても、生体外に分離されたものまたは生体外で培養されたものであってもよい。
【００５６】
上記の作用により、ミエロイド系細胞のＣＤ３００ａの活性シグナリングを維持または向上させることで、当該ミエロイド系細胞から放出されるケミカルメディエーターを介する細胞間の情報伝達も維持または向上され、それに連なるさらなる細胞間の情報伝達によって引き起こされる炎症、アレルギー反応等に影響を及ぼすことができる。したがって、第１の活性調節剤は、後述する所定の医薬品の有効成分として使用することができる。また、実験動物のアレルギー疾患（喘息やアトピー性皮膚炎など）の病態を改善させて比較解析するための比較解析ツールとしての薬剤の有効成分としても使用することができる。例えば、第１の活性調節剤の一つであるＤ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８は、後記実施例で示すように炎症を抑制させる制御性Ｔ細胞の数を増加させる効果が得られるため、医薬品の有効成分や比較解析ツールとして有用である。
【００５７】
なお、ＣＤ３００ａ遺伝子を欠損させる（すなわちＣＤ３００ａとホスファチジルセリンとの結合を完全に生じさせない）ことで症状が緩和されることが確認されるアレルギー疾患に対しては、ＣＤ３００ａ結合性物質（ＴＸ４１、ＴＸ４９等の中和抗体）や、ホスファチジルセリン結合性物質（ＭＦＧ−Ｅ８、Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８等）が治療薬となりうることは、当業者にとって十分に推認可能である。
【００５８】
＜第２の活性調節剤＞
第２の活性調節剤は、ＣＤ３００ａを介した抑制性シグナル伝達を亢進する（つまり、ＣＤ３００ａの活性シグナリングを抑制する）作用を有する成分を含有する。本発明ではそのような成分として、ホスファチジルセリンとＣＤ３００ａとの結合を亢進する物質、特にＣＤ３００ａのリガンドであるホスファチジルセリンを用いることができる。
【００５９】
本発明では、第２の活性調節剤を、アレルギー疾患について、病態解析を行う際、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングする際の、比較解析用のツールとして使用することができる。
【００６０】
また、本発明の別の側面により提供されるＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを用いたスクリーニングにより、ホスファチジルセリンと同様の作用を有する、ＣＤ３００ａに対するアゴニスト（低分子化合物、抗体等）を発見できる可能性があり、それらもホスファチジルセリンとＣＤ３００ａとの結合を亢進する物質として用いることができる。
【００６１】
（ホスファチジルセリン）
ホスファチジルセリン（ＰＳ）は、ミエロイド系細胞に発現しているＣＤ３００ａのリガンドであり、ＰＳとＣＤ３００ａとの相互作用（結合）によって、ＣＤ３００ａ発現細胞の抑制性シグナリングが亢進する。たとえば、マスト細胞においては、この抑制性シグナリングを介して、ヒスタミンや、サイトカイン、ケモカインなどのケミカルメディエーターを放出するという、炎症反応に関連するマスト細胞の活性が抑制される。ＰＳは工業的に生産されており、容易に入手することができる。
【００６２】
なお、生体外にある（試験的な環境における）ＣＤ３００ａ発現細胞に対しては、ＰＳを提示した状態にあるアポトーシス細胞（ＰＳは、通常の細胞においては細胞の内側（脂質二重層のうち細胞質側の層）に存在するが、アポトーシスが起こると細胞の外側に提示されることが知られている）も第２の活性調節剤となり得る。また、外側にＰＳを含む脂質膜が形成されているリポソーム等も、第２の活性調節剤として用いることができる可能性がある。
【００６３】
（カルシウム塩）
ＰＳとマスト細胞におけるＣＤ３００ａとの相互作用は、カルシウムイオンを必要とすることから、第２の活性調節剤は、電離によってカルシウムイオンを発生するカルシウム塩（たとえば、塩化カルシウム等）を含有することが好ましい。
【００６４】
第２の活性調節剤中のカルシウム塩の含有量は、投与部位におけるカルシウムイオンの濃度や、第２の活性調節剤に含まれるＰＳの量等を考慮して、適宜決定することができる。
【００６５】
（第２の活性調節剤の用途）
本発明に係る第２の活性調節剤は、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を亢進するために使用することができる。この際、ミエロイド系細胞は、生体内にあるものであっても、生体外に分離されたものまたは生体外で培養により生産したものであってもよい。
【００６６】
上記の作用により、ミエロイド系細胞のＣＤ３００ａの活性シグナリングを抑制することで、当該ミエロイド系細胞から放出されるケミカルメディエーターを介する細胞間の情報伝達も抑制され、それに連なるさらなる細胞間の情報伝達によって引き起こされる炎症、アレルギー反応等に影響を及ぼすことができる。したがって、第２の活性調節剤は、たとえば、実験動物のアレルギー疾患（喘息やアトピー性皮膚炎）を増悪させて比較解析するための比較解析ツールとしての薬剤の有効成分として使用することができる。
【００６７】
［医薬品］
本発明に係る医薬品（医薬組成物）は、上述したような活性調節剤を有効成分として含有し、必要に応じて薬学的に許容される各種の添加剤（たとえば担体）をさらに含有していてもよい。
【００６８】
このような医薬品は、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達が関与する疾病または症状（特に炎症反応）を、治療または予防するためのものとして製剤化することができる。
【００６９】
より具体的には、前記第１の活性調節剤を有効成分として配合することにより、アレルギー疾患（喘息やアトピー性皮膚炎）を治療または予防するための医薬品などを調製することができる。
【００７０】
医薬品の投与部位は、適用対象とする疾病または病状に応じて、過剰な免疫機能（炎症反応）が生じている部位とすることができ、特に限定されるものではない。たとえば、腹腔内、気管内、皮下、皮内、泌尿生殖器内などの部位が挙げられる。
【００７１】
ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞は、通常、哺乳類の粘膜下組織や結合組織に存在するため、医薬品は、上記の部位の粘膜下組織や結合組織またはその付近に直接的に投与されることが好ましい。そのような投与は、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射等の注射投与によって行うことができる。たとえば、炎症性感染症（細菌性腹膜炎など）を治療または予防する場合は、腹腔内注射が好ましい。
【００７２】
医薬品（ないしそこに含まれる有効成分）の１回あたりの投与量および投与回数は、患者の年齢、性別、体重及び症状、必要とされる治療効果の程度、投与方法、処理時間、有効成分の種類などにより異なり、適宜調整されてもよい。投与回数は、たとえば、１日あたり１回〜数回である。
【００７３】
医薬品が第１の活性調節剤のうちホスファチジルセリン結合性物質を有効成分として含有する場合、当該医薬品は、投与されるヒトまたは動物１ｋｇあたり、ホスファチジルセリン結合性物質の１回あたりの投与量が通常３〜１５ｍｇ、好ましくは５〜１０ｍｇになるよう製剤化してもよい。
【００７４】
医薬品が第１の活性調節剤のうちＣＤ３００ａ結合性物質を有効成分として含有する場合、当該医薬品は、投与されるヒトまたは動物１ｋｇあたり、ＣＤ３００ａ結合性物質の１回あたりの投与量が通常５０〜１５０ｍｇ、好ましくは５０〜１００ｍｇになるよう製剤化してもよい。
【００７５】
（薬学的に許容され得る担体）
本発明に係る医薬品は、必要に応じて、薬学的に許容され得る担体を含んでいてもよい。
【００７６】
薬学的に許容され得る担体とは、医薬品の目的に反しないものである限り特に限定されず、たとえば、水性希釈剤や非水性希釈剤等の希釈剤、抗酸化剤（亜硫酸塩など）等の安定剤・保存剤、リン酸塩類等の緩衝剤、界面活性剤等の乳化剤、着色剤、粘稠剤、リドカインなどの局所麻酔剤、グリコール類などの溶解補助剤、塩化ナトリウムやグリセリン等の等張化剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。
【００７７】
たとえば、本発明に係る医薬品の剤形が注射剤である場合、所望の粘度や含有成分の濃度になるように希釈剤を配合することにより、有効成分を希釈剤に溶解または分散させることが好ましい。
【００７８】
このような希釈剤としては、生理食塩水または市販の注射用蒸留水等の水性希釈剤、ポリエチレングリコール、エタノール等のアルコール類等の非水性希釈剤が挙げられる。剤形が注射剤である医薬品は、常法に従って、フィルターによる濾過滅菌されてもよいし、殺菌剤の配合等により無菌化されてもよい。
【００７９】
また、本発明に係る医薬品を注射剤として投与する場合、用時調製の形態としてもよい。たとえば、凍結乾燥法などによって第１の活性調節剤を含む固体剤を調製し、使用前に希釈剤に溶解または分散させて注射剤を調製してから投与することができる。
【００８０】
＜喘息に対する医薬品＞
ＣＤ３００ａ発現細胞に対するホスファチジルセリンの結合を阻害すると、好酸球性気道炎症を抑制し、総血清ＩｇＥ濃度を低減することができる。したがって、第１の活性調節剤を有効成分として使用することにより、喘息に対する医薬品が得られる。
例えば、後記実施例に示すように、第１の活性調節剤の一つであるＴＸ４１の投与により、喘息患者における気道内圧と、気管支洗浄細胞の総細胞数およびこれに含まれる好酸球数を低下させて喘息の病態を軽減させることができるため、ＴＸ４１を有効成分として使用することにより、喘息に対して有用な医薬品が得られる。
また、Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８の投与により炎症を抑制する制御性Ｔ細胞数が増加し、喘息の病態を軽減させることができるため、Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８も喘息治療用の医薬品の有効成分として有用である。
さらに、ＣＤ３００ａは、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞に強く発現するため、ＣＤ３００ａとともにＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ１１ｃを標的とするドラッグデリバリーシステム、たとえばＴＸ４１（抗ＣＤ３００ａ抗体）と、抗ＣＤ１１ｂ抗体および／または抗ＣＤ１１ｃ抗体とが結合した親水性高分子（ＰＥＧ等）を表面に有するリポソーム製剤も医薬品の一実施形態として挙げられる。
【００８１】
＜アトピー性皮膚炎に対する医薬品＞
ＣＤ３００ａ発現細胞に対するホスファチジルセリンの結合を阻害すると、好酸球、マスト細胞（真皮内の皮膚ランゲリン陽性樹状細胞と相互作用し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化することが知られている）および単核球の細胞浸潤や、表皮（繊維芽細胞）の過形成を抑制し、総血清ＩｇＥ濃度を低減することができる。したがって、第１の活性調節剤を有効成分として使用することにより、アトピー性皮膚炎に対する医薬品が得られる。例えば、第１の活性調節剤の一つであるＤ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８を有効成分とすることで制御性Ｔ細胞数の増加による炎症抑制効果が高い医薬品が得られる。
現状、アトピー性皮膚炎の治療剤としてステロイド剤が広く用いられているが、抗かゆみ作用は不十分といわれており、また、タクロリムス等の免疫抑制剤も用いられているが、これら既存の薬剤の副作用も問題となっている。上記医薬品は、抗かゆみ作用を有し、副作用が少ない、喘息やアトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患の新たな治療薬として期待できる。
【００８２】
[ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用]
＜喘息に関する用途＞
本発明で得られた知見により、ＣＤ３００ａ欠損マウスに対して、喘息を誘導する物質（ダニ抗原、鶏卵白アルブミン等）を投与して喘息を誘導させた場合、野生のマウスよりも喘息の症状、病態が軽度である。
例えば、後記実施例に示すように、鶏卵白アルブミン（ＯＶＡ）で喘息を誘導した場合に、ＣＤ３００ａ欠損マウスでは、野生型マウスに比べて、気道抵抗および気管支洗浄細胞（特に好酸球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞）の数が減少するとともに、縦隔リンパ節の大きさ及び細胞数、免疫応答の抑制的制御（免疫寛容）を司る制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数、ＩｇＧ２ｂの量、およびＩｇＧ２ｃの量が有意に増加し、ＩｇＥと鶏卵白アルブミン（ＯＶＡ）特異的ＩｇＧ１が有意に減少する。そのようなＣＤ３００ａ欠損マウスに認められる、そのような喘息の症状の軽さを示す指標、あるいは喘息の症状の軽さとは一見関係性が不明な指標について、どのようなメカニズム（野生型マウスとの相違）によってもたらされているか、さらにそのようなメカニズムに関連している因子は何なのかといったことを解析することは有用である。
【００８３】
すなわち、前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを、喘息を誘導する物質を投与したときに喘息を発症しにくいモデルマウスとして利用でき、さらには喘息を起こした際のシグナル伝達経路の解明、病態解析等のためのツールとして使用することができる。
【００８４】
＜アトピー性皮膚炎に関する用途＞
本発明で得られた知見により、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに対して、アトピー性皮膚炎を誘導する物質（ダニ抗原、鶏卵白アルブミン等）を投与した場合、野生のマウスよりもアトピー性皮膚炎の症状が緩和される。
【００８５】
すなわち、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、アトピー性皮膚炎を発症しにくいモデルマウスとして使用することができる。さらには、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、ＩＬ−４、ＩＬ−１３産生との関係で、アトピー性皮膚炎に関わるシグナル伝達経路の解析、病態解析等に用いることができる。
【００８６】
（ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの作製方法）
本発明のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは、染色体上のＣＤ３００ａ遺伝子が不活性型ＣＤ３００ａ遺伝子に置換されたことにより、ＣＤ３００ａタンパク質の機能が欠損したマウスである。
【００８７】
「不活性型ＣＤ３００ａ遺伝子」とは、ＣＤ３００ａ遺伝子の一部の欠損、ＣＤ３００ａ遺伝子のコード領域への他の塩基配列の挿入、ＣＤ３００ａ遺伝子内の点突然変異、ＣＤ３００ａ遺伝子の発現調節領域内の変異などにより、正常なＣＤ３００ａタンパク質を発現できない遺伝子をいう。欠損型ＣＤ３００ａ遺伝子としては、たとえば、ＣＤ３００ａ遺伝子に含まれるエクソン1〜6の少なくとも一つが欠損した遺伝子などが挙げられるが、これには限定されない。
【００８８】
「ＣＤ３００ａタンパク質の機能が欠損した」とは、本発明が関与する抑制性シグナル伝達に係るＣＤ３００ａタンパク質の機能の少なくとも一部が失われたことをいい（たとえば、ヘテロノックアウトマウスのように片方のアレルのみ不活性型に置換されて、ＣＤ３００ａタンパク質の機能が一部失われたような場合が含まれる。）、好ましくは当該機能が完全に失われたことを意味する。
【００８９】
遺伝子カセットを用いてＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを得るための一般的な方法は次の通りである。ただし、本発明のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスはこの方法により得られるものに限定されない。
【００９０】
野生型アレル中のＣｄ３００ａ遺伝子のエクソンを抗生物質耐性遺伝子（マーカー遺伝子）カセットで置き換えた標的化アレル（変異型アレル）を有するターゲティングベクターを調製する。常法に従い、当該ターゲティングベクターとＥＳ細胞を用いてキメラマウスを得る。当該キメラマウスと野生型マウスとを交配させて、子マウス（ヘテロ接合体（＋／−））を得、さらに子マウス同士を交配させて、孫マウスを得る。
【００９１】
孫マウスからゲノムＤＮＡを抽出し、該ゲノムＤＮＡをＰＣＲ法によって、ゲノムＤＮＡ中の野生型アレルおよび変異型アレルの存在の有無を確認し、変異型アレルのみを有する孫マウス（ホモ接合体（−／−））を得る。さらにＣＤ３００ａが発現していないことを確認するために、当該マウス由来の細胞を抗ＣＤ３００ａ抗体を用いたウエスタンブロット分析で確認し、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスとする。
【実施例】
【００９２】
以下、実施例に則して、本発明をより具体的に説明するが、下記の実施例は、本発明を限定するものではない。
１．調製例
（１）ＣＤ３００ａ−Ｆｃ融合タンパク質、ＭＦＧ−Ｅ８およびＤ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８の調製
（１−１）  ヒトＩｇＧのＦｃ部位を有するＣＤ３００ａの融合タンパク質（ＣＤ３００ａ−Ｆｃ）を、下記文献２５に記載されているように、マウスまたはヒトＣＤ３００ａの細胞外ドメイン全体をコードする遺伝子のｃＤＮＡとヒトＩｇＧ１Ｆｃをコードする遺伝子のｃＤＮＡとを含むキメラｃＤＮＡから調製した。なお、上記融合タンパク質において、ＣＤ３００ａの細胞外ドメインが、マウス由来のものおよびヒト由来のものを、それぞれ「マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ」および「ヒトＣＤ３００ａ−Ｆｃ」と称する。【００９３】
（１−２）  ＭＦＧ−Ｅ８は、Ｍａｓａｔｏ  Ｔａｎａｋａ氏（ＲＣＡＩ、日本国横浜市）から提供されたものである。
（１−３）  Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８は、下記文献４に記載されているように、ＭＦＧ−Ｅ８のＲＧＤモチーフに部位特異的突然変異を導入して得られたＭＦＧ−Ｅ８の変異体である。【００９４】
得られたＤ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８は、Ｎ末端から８９番目のアミノ酸がアスパラギン酸からグルタミン酸に置換されている。また、ＭＦＧ−Ｅ８（ネイティブ）は、フォスファチジルセリン（ＰＳ）とαｖβ３インテグリンとの両方に結合して、アポトーシス細胞とαｖβ３インテグリンを発現する貪食細胞とを架橋する（下記文献４）のに対して、Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８は、フォスファチジルセリン（ＰＳ）に結合するものの、αｖβ３インテグリンに結合しない。【００９５】
（２）マウスおよび盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）
本実施例で使用されたノックアウトマウスは、以下のように作製あるいは提供されたものである。【００９６】
（ｉ）ＣＤ３００ａ遺伝子欠損（Ｃｄ３００ａ-/-）マウス
野生型アレル中のＣｄ３００ａ遺伝子のエクソン１〜６を、細菌人工染色体（ＢＡＣ）システムを用いて、ネオマイシン耐性遺伝子カセット（ＰＧＫ−ＧＢ２−ｎｅｏ）で置き換え、標的化アレル（変異型アレル）を調製した（図３Ａ）。次いで、常法に従い、キメラマウスを得、さらに該キメラマウスと野生型マウスとを交配させて、子マウス（ヘテロ接合体（＋／−））を得、さらに子マウス同士を交配させて、孫マウスを得た。【００９７】
孫マウスの中から、ＣＤ３００ａ欠損（Ｃｄ３００ａ-/-）マウスを選別するために、各孫マウスの尾部からゲノムＤＮＡを抽出し、該ゲノムＤＮＡをＰＣＲ法によって、ゲノムＤＮＡ中の、ＷＴアレルおよび変異型アレルの存在の有無を確認した。【００９８】
なお、図３Ｂに示されるように、ＷＴアレルを示すＰＣＲ産物、変異型アレルを示すＰＣＲ産物は、それぞれ、約５４０ｂｐ、約７００ｂｐのバンドとして検出される。
さらにＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに、ＣＤ３００ａが発現していないことを確認するために、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の細胞を抗ＣＤ３００ａ抗体を用いたウエスタンブロット分析に供した。図３Ｃに示されるように、野生型マウスでは、約５０ｋＤａにＣＤ３００ａに由来するバンドが示される一方で、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでは、このバンドは検出されなかった。【００９９】
（ｉｉ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｋｉｔW-sh/W-shマウス
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｋｉｔW-sh/W-shマウス（以下、「ｋｉｔW-sh/W-shマウス」または「マスト細胞欠損マウス」）は、理研バイオリソースセンター（日本国つくば市）から提供されたものである。なお、該マウスは、マスト細胞を欠損したマウスであること（下記文献２１）および、アポトーシス性のＤＮＡ断片化を経ずに、貪食細胞によってＤＮＡが取り込まれた後に、貪食細胞内でＤＮＡの分解が生じることが知られている（下記文献１２）。【０１００】
（ｉｉｉ）ＣＡＤ欠損マウス  ＣＡＤ（カスパーゼ活性型ＤＮＡ分解酵素（Ｃａｓｐａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＤＮａｓｅ））欠損マウスは、下記文献１２に記載されたものである。【０１０１】
（ｉｖ）マクロファージおよび好中球のｉｎ  ｖｉｖｏ除去
下記文献３０の記載に基づき、クロドン酸リポソームおよびコントロール用ＰＢＳリポソーム（Ｅｎｃａｐｓｕｌａ  ＮａｎｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を調製した。次いで、ＣＬＰ後２４時間目に、これらのリポソーム０．５ｍＬをマウス腹腔内に注入して、マクロファージを除去した。【０１０２】
また、ＣＬＰ後２４時間目に、抗Ｇｒ−１抗体を、マウス腹腔内に注入して、好中球を除去した。
なお、本実施例におけるマウスを用いた調製および評価試験の実施は何れも、筑波大学生命科学動物資源センター動物倫理員会作製のガイドラインを遵守したものである。【０１０３】
（３）各種抗体
各種抗体の購入先および調製方法を下記表１に示す。【０１０４】
【表１】
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【０１０５】
（４）各種細胞の調製
各種細胞は、以下のように調製されたものである。
（ｉ）骨髄由来マスト細胞（ＢＭＭＣ）
マウス骨髄細胞２×１０8個を、１０ｃｍｍディッシュにて、細胞増殖因子（ＳＣＦ）（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−３（４ｎｇ／ｍＬ）および仔牛血清（ＦＢＳ）（１０％）を含むコンプリートＲＰＭＩ１６４９メディウム中で５週間以上培養して骨髄由来マスト細胞（ＢＭＭＣ）を調製した。ＢＭＭＣは、毎週新しいメディウムで継代した。調製されたＢＭＭＣのうち、９５％超は、フローサイトメトリー分析によって、ｃ−Ｋｉｔ+ＦｃεＲＩ+細胞であることが示された。【０１０６】
（ｉｉ）骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭφ）
マウス骨髄細胞２×１０6細胞を、１０ｃｍｍディッシュにて、Ｍ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）および仔牛血清（ＦＢＳ）（１０％）を含むコンプリートＲＰＭＩ１６４９メディウム中で１週間培養して骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭφ）を調製した。【０１０７】
（ｉｉｉ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞形質転換体
常法に基づいて、Ｆｌａｇタグ付きＣＤ３００ａのｃＤＮＡまたはＦｌａｇタグ付きＣＤ３００ｄのｃＤＮＡを含むｐＭＸ−ｎｅｏレトロウイルスベクタープラスミドを調製した。【０１０８】
調製されたプラスミドをＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質導入（トランスフェクト）して、ＣＤ３００ａまたはＣＤ３００ｄを安定発現する形質転換体を得た。得られた、ＣＤ３００ａを安定発現する形質転換体およびＣＤ３００ｄを安定発現する形質転換体をそれぞれ、「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ａ）」および「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ｄ）」と称する。【０１０９】
また、ＴＩＭ−４を安定発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞形質転換体は、Ｔ．Ｋｉｔａｍｕｒａ氏（東京大学）から提供されたものである。なお、この形質転換体を、「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＴＩＭ−４）」と称する。【０１１０】
［評価方法］
以下に、評価方法の条件を記載する。なお、生存試験においては、カプラン・マイヤーログランク検定（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）を用い、その他の評価試験においては、アンペアード・スチューデントｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）を用いて統計学分析を行った。Ｐ＜０．０５を統計学的有意差とみなした。【０１１１】
（５）結合アッセイ等
（ｉ）結合アッセイ
細胞を、２％ＦＢＳを含むリン酸緩衝液中、１ｍＭＣａＣｌ2の存在下または非存在下でＣＤ３００ａまたはコントロール用ヒトＩｇＧを用いて３０分間染色し、同一の緩衝液で２回洗浄して、ＦＩＴＣ結合型のヤギ抗ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ'）2フラグメントとともにインキュベートした。次いで、アネキシンＶで染色するために、細胞を、１４０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２．５ｍＭＣａＣｌ2を含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液中で、アネキシンＶとともに１５分室温でインキュベートした。【０１１２】
（ｉｉ）結合阻止アッセイ
細胞を、マウスＣＤ３００ａに対するモノクローナル抗体（ＴＸ４１）、コントロール用アイソタイプの抗体またはＭＦＧ−Ｅ８とともに、３０分間プレインキュベートした後、上記結合アッセイのように、ＣＤ３００ａ−Ｆｃで染色した。また、ＣＤ３００ａ−Ｆｃがリン脂質へ結合したか否かを分析するために、ＰＩＰストリップアッセイ（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を製造元の取扱説明書に準拠して実施した。【０１１３】
（６）好気性細菌のＣＦＵ（コロニー形成単位）の測定
マウスの腹膜灌流液の段階希釈液をプレーティングして、該希釈液をブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天を含むプレート上で、３７℃、４８時間培養した。次いで、好気性細菌のＣＦＵを、下記文献２７に記載されているように、腹膜灌流液１ｍＬ中のコロニー数を計測して算出した。【０１１４】
［参考例１：ＣＤ３００ａのリガンドの同定］
［参考例１Ａ］
各種造血幹細胞系列細胞株または腫瘍細胞系列細胞株におけるマウスＣＤ３００ａリガンドの発現を確認するために、以下のような試験を行った。【０１１５】
「１．調製例」において得られた、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭφ）、骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）またはＩＬ−３依存性造血細胞株（ＢａＦ／３細胞）（各細胞数２Ｘ１０5個）を、ＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１μｇ）、および塩化カルシウム（１ｍＭ）を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で２０℃、３０分間インキュベートし、次いでＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧ抗体（０．１μｇ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１μｇ）を含む緩衝液を用いて染色した。【０１１６】
染色された各細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した。
また、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃの代わりにコントロール用ヒトＩｇＧ（１μｇ）を用いたこと以外は上記試験方法と同様にして、対照試験も実施した。【０１１７】
ＢＭＭφ、ＢＭＤＣおよびＢａＦ／３細胞を用いた場合のフローサイトメトリーの分析結果を、それぞれ図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃに示す（なお、対照試験は、「Ｃｔｒｌ  Ｉｇ」に示す。）。【０１１８】
図１Ａ〜図１Ｃに示されるように、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、塩化カルシウムを含む場合、ＰＩ-細胞（生細胞）に結合する一方、ＰＩ+細胞（死細胞）には結合しないことが分かった。つまり、マウスＣＤ３００ａリガンドは、死細胞において発現していることが示唆される。【０１１９】
［参考例１Ｂ］
マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃが、死細胞の一種であるアポトーシス細胞に結合するか否かを検証するために、以下のような試験を行った。【０１２０】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（野生型マウス）由来の胸腺細胞に、ＲＰＭＩメディウム中でデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）（１０μＭ）とともにインキュベートして、胸腺細胞のアポトーシス細胞を調製した。【０１２１】
得られたアポトーシス細胞（細胞数２Ｘ１０5）を、ＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１μｇ）、ＡＰＣ結合型アネキシンＶ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）（１μｌ）および塩化カルシウム（１ｍＭ）を含むメディウム（ＰＢＳ）中で２０℃、３０分間インキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧ抗体（０．１μｇ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１μｇ）を含む緩衝液を用いて染色した。【０１２２】
染色された各細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いて分析した（結果：図２Ａ）。
また、塩化カルシウムを含むメディウムの代わりに塩化カルシウムを含まないメディウムを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリーを用いた分析に供した（結果：図２Ｂ）。【０１２３】
図２Ａによると、塩化カルシウムの存在下では、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、アネキシンＶで染色されない（アネキシンＶ-）胸腺細胞に結合しないのに対して、アネキシンＶで染色される胸腺細胞に結合することが分かる。すなわち、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、アポトーシスした胸腺細胞に結合することが示される。【０１２４】
一方で、図２Ｂに示されるように、塩化カルシウムの非存在下では、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、アポトーシスした胸腺細胞へ結合しないことが分かる。
本試験結果から、マウスＣＤ３００ａは、カルシウムイオン依存的に、アポトーシス細胞に結合することが理解できる。【０１２５】
［参考例１Ｃ］
参考例１Ｂで得られたアポトーシス細胞（細胞数２Ｘ１０5）を、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１μｇ）、ＡＰＣ結合型アネキシンＶ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）（１μｌ）、コントロール用ヒトＩｇＧ１（１μｇ）および塩化カルシウム（１ｍＭ）を含むメディウム（ＰＢＳ）中で２０℃、３０分間インキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧ抗体（０．１μｇ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１μｇ）を含む緩衝液を用いて染色した。【０１２６】
染色された各細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図２Ｃ「ＨｕＩｇＧ１」）。【０１２７】
また、コントロール用ヒトＩｇＧ１の代わりに、モノクローナル抗体である「ＴＸ４１」またはマクロファージに発現する蛋白質「ＭＦＧ−Ｅ８」を用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリーを用いて分析した（結果：図２Ｃ「ＴＸ４１」および「ＭＦＧ−Ｅ８」）。【０１２８】
ここで使用された「ＴＸ４１」は、上述したように、抗マウスＣＤ３００ａモノクローナル抗体であり、マウスＣＤ３００ａとリガンドとの結合を阻止するものである。
また、「ＭＦＧ−Ｅ８」は、フォスファチジルセリン（ＰＳ）とαｖβ３インテグリンとの両方に結合し、アポトーシス細胞とαｖβ３インテグリンを発現する貪食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｅ）とを架橋することが知られている（下記文献４）。【０１２９】
図２Ｃの各フローサイトメトリーの結果を対比すると分かるように、ＴＸ４１またはＭＦＧ−Ｅ８の存在下では、マウスＣＤ３００ａは、アポトーシス細胞へ結合しないことが理解できる。
この点を鑑みると、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃは、ＰＳに対する結合性を有すること（ＣＤ３００ａのリガンドはＰＳであること）が示唆される。【０１３０】
［参考例１Ｄ］
ヒトＣＤ３００ａも、マウスＣＤ３００ａと同様に、アポトーシス細胞に結合するのか否かを検証すべく、以下の試験を行った。【０１３１】
まず、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞系列）を、ＲＰＭＩ１６４０メディウムに懸濁させ、該メディウムに紫外線を６０分間照射して、Ｊｕｒｋａｔ細胞のアポトーシス細胞を調製した。【０１３２】
アポトーシス細胞として、野生型マウス胸腺細胞由来のアポトーシス細胞の代わりに、上記「Ｊｕｒｋａｔ細胞由来のアポトーシス細胞」を用い、「マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ」の代わりに「ヒトＣＤ３００ａ−Ｆｃ」を用いたこと以外は、参考例１Ａの試験条件と同様にして、フローサイトメトリーを用いて分析した（結果：図２Ｄ）。【０１３３】
また、アポトーシス細胞として、野生型マウス胸腺細胞由来のアポトーシス細胞の代わりに、上記「Ｊｕｒｋａｔ細胞由来のアポトーシス細胞」を用い、「マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ」の代わりに「ヒトＣＤ３００ａ−Ｆｃ」を用い、さらに、「ＴＸ４１」の代わりに「ＴＸ４９」または「コントロール用ヒトＩｇＧ１」を用いたこと以外は、参考例１Ｂの試験条件と同様にして、フローサイトメトリーを用いて分析した（結果：図２Ｅ「ＴＸ４９」または「ＨｕＩｇＧ１」）。なお、「ＴＸ４９」とは、抗ヒトＣＤ３００ａ抗体（モノクローナル抗体）であり、ＣＤ３００ａとリガンドとの結合を阻止するものである。【０１３４】
図２Ｄ〜図２Ｅに示されるように、ヒトＣＤ３００ａ−Ｆｃも、アネキシンＶ+細胞に結合する一方で、抗ヒトＣＤ３００ａ抗体の存在下では結合しないことが分かる。すなわち、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃと同様に、ヒトＣＤ３００ａもアポトーシス細胞に結合することが示唆される。【０１３５】
［参考例１Ｅ］
メンブレン（ＰＩＰ−ｓｔｒｉｐ（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製））に、各種リン脂質（ＰＳ、ＰＣ、ＰＥ）（１００  ｐｍｏｌ）を含む液（試料液）をスポットして、該メンブレン上に各種リン脂質を吸着させた。【０１３６】
次いで、該メンブレンを、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１．５μｇ／ｍＬ）を含む塩化カルシウム（１ｍＭ）及びＢＳＡを加えたＴＢＳＴ緩衝液（ｐＨ  ８．０）中に２０℃で２時間浸漬した。【０１３７】
浸漬後、マウスＣＤ３００ａ−Ｆｃを含まないＴＢＳＴ緩衝液（ｐＨ８．０）で、３回洗浄して、メンブレン上の各リン脂質に未結合のＣＤ３００ａ−Ｆｃを除去した後、ＨＲＰ結合型抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎ社製）を含むＢＳＡを加えたＴＢＳＴ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて検出した（結果：図２Ｆ）【０１３８】
図２Ｆ中、「ＰＥ」、「ＰＣ」および「ＰＳ」は、それぞれホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルセリンがメンブレン上にスポットされた部分を指し、「Ｂｌａｎｋ」は、何れのリン脂質もメンブレン上にスポットされていない部分を指す。【０１３９】
図２Ｆによれば、ＣＤ３００ａは、ＰＥおよびＰＣの何れにも結合しない一方、ＰＳに特異的に結合したことを示している。参考例１Ａ〜１Ｅの結果から、ＣＤ３００ａは、カルシウムイオン依存的にホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合すること（ＣＤ３００ａのリガンドはＰＳであること）が理解できる。【０１４０】
［参考例２：ＣＤ３００ａの機能解析（２）］
一部のＰＳ結合性受容体は、貪食細胞において発現し、生理学的および病理的状況下で、アポトーシス細胞の除去に関与することが知られている（下記文献４〜９）。【０１４１】
また、ＰＳは、ＣＤ３００ａを発現する細胞である貪食細胞（マクロファージ等）において、いわゆる「ｅａｔ  ｍｅ」シグナルを介在することが知られている（下記文献１０〜１１）。この点を鑑みて、下記参考例２Ａ〜Ｃに記載の試験を行って、ＣＤ３００ａが、アポトーシス細胞の貪食作用に関与するか否かを検証した。【０１４２】
［参考例２Ａ］
ＣＡＤ欠損マウスに由来する胸腺細胞を、参考例１Ｂと同様にして、アポトーシス胸腺細胞を調製した。【０１４３】
次いで、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のマクロファージ（チオグリコレート誘発性腹腔マクロファージ）（２×１０5細胞）を、８穴Ｌａｂ−ＴｅＫＩＩチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ社製）内で、ＣＡＤ欠損マウスに由来するアポトーシス胸腺細胞とともに、１：５（マクロファージ：アポトーシス胸腺細胞（細胞数））の比率で、３７℃、１時間共培養した。【０１４４】
次いで、下記文献５または２６に記載されているように、共培養したマクロファージを冷ＰＢＳで洗浄し、パラホルムアルデヒド（１％）を含む固定液で固定した後、ＦＩＴＣ標識化ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含む緩衝液を用いたＴＵＮＥＬ染色に供した。【０１４５】
染色された５０細胞数以上のマクロファージをランダムにレーザー走査型共焦点顕微鏡（オリンパス社製、「ＦＶ１０ｉ」、型番：１Ｂ２２３５８）で分析し、マクロファージ１細胞に含まれるＴＵＮＥＬポジティブ細胞（アポトーシス細胞）の数を計測した。全マクロファージの個数を１００％として、０〜８個の各アポトーシス細胞を含むマクロファージの比率（貪食率）を算出した（結果：図４Ａ「Ｃｄ３００ａ-/-」）。【０１４６】
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のマクロファージの代わりに、野生型マウス由来のマクロファージを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、貪食率を計測した（結果：図４Ａ「ＷＴ」）。【０１４７】
図４Ａに示されるように、マクロファージがＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに由来する場合であっても、野生型マウスに由来する場合であっても、貪食率には明確な差異は見られなかった。【０１４８】
［参考例２Ｂ］
マスト細胞は、公知のＰＳ受容体（ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、スタビリン２、インテグリンαｖβ３）を発現するか否かを検証するために、以下の試験を行った。【０１４９】
骨髄由来マスト細胞（ＢＭＭＣ）（細胞数２Ｘ１０5個）と、ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）結合型抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体（０．１μｇ）、ＡＰＣ結合型抗ＴＩＭ−４モノクローナル抗体（０．１μｇ）およびＡｌｅｘａ結合型抗マウスＣＤ３００ａモノクローナル抗体（ＴＸ４１）（０．５μｇ）を含むメディウム（ＰＢＳ）中で２０℃、３０分間インキュベートした。【０１５０】
次いで、ＰＢＳを用いて、２回洗浄した後、染色された各細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図５Ａ「骨髄由来マスト細胞」）。【０１５１】
また、ＢＭＭＣのかわりに、腹腔マクロファージおよびＢＭ由来マクロファージを用いたこと以外は上記試験方法と同様にして、フローサイトメトリー分析も実施した（結果：図５Ａ「腹腔マクロファージ」および「骨髄由来マスト細胞」）。【０１５２】
さらに、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、腹腔マクロファージおよびＢＭＭＣからｃＤＮＡを調製し、調製された各ｃＤＮＡを用いて、スタビリン２、ＢＡｌ−１、αｖインテグリン、Ｃｄ３００ａおよびβアクチン（ローディングコントロール））の発現量を、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した（結果：図５Ｂ）。
図５Ａおよび図５Ｂを参照すると、マクロファージの場合とは異なって、マスト細胞は、ＣＤ３００ａおよびαｖβ３インテグリンを発現するものの、貪食作用に関与するＰＳ受容体であるＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４およびスタビリン２を低いレベルでしか発現していないことが分かる。【０１５３】
［参考例２Ｃ］
ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ａ）（細胞数６Ｘ１０4）を、ＦＩＴＣで標識化した細胞（アポトーシス胸腺細胞または胸腺細胞（生細胞））とともに、２時間共培養し、ＰＢＳで洗浄した後、光学顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製、ＢＺ−９０００）で分析した（結果：図４Ｂ）。【０１５４】
また、共培養および洗浄後の細胞を、パラフォルムアルデヒドを含む固定液Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）で固定して、レーザー走査型共焦点顕微鏡によって分析した（結果：図４Ｃ）。なお、図４Ｃにおいて、緑色部分（矢印で示す。）は、包摂された細胞（アポトーシス胸腺細胞または胸腺細胞（生細胞））を示す。【０１５５】
また、ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ａ）の代わりに、ＮＩＨ３Ｔ３未形質転換細胞（ネガティブコントロール）または「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＴＩＭ−４）」（ポジティブコントロール）を用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、光学顕微鏡およびレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて分析した。【０１５６】
図４Ｂおよび図４Ｃにおける「ＮＩＨ−３Ｔ３」および「ＮＩＨ−３Ｔ３／Ｔｉｍ４」は、それぞれ、「ＮＩＨ３Ｔ３」（未形質転換細胞）および「ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＴＩＭ−４）」を用いた光学顕微鏡およびレーザー走査型共焦点顕微鏡のイメージを示す。【０１５７】
また、レーザー走査型共焦点顕微鏡のイメージから、アポトーシス胸腺細胞を細胞質内に取り込んだ、未形質転換細胞または各形質転換体の細胞数の比率（共培養された未形質転換細胞または各形質転換体の細胞数を１００％とする。）を計測した（結果：図４Ｄ「ａｐｏｐｔｏｔｉｃ」）。【０１５８】
また、同様にして、胸腺細胞（生細胞）を細胞質内に取り込んだＮＩＨ３Ｔ３または各形質転換体の細胞数の比率（共培養された未形質転換細胞または各形質転換体の細胞数を１００％とする。）を計測した（結果：図４Ｄ「Ｌｉｖｅ」）。【０１５９】
図４Ｂに示されるように、ＮＩＨ３Ｔ３とは異なって、上記の形質変換体は、両方ともアポトーシス胸腺細胞に付着した。しかしながら、図４Ｃおよび図４Ｄから判断すると、ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＴＩＭ−４）のみがアポトーシス胸腺細胞を取り込み、貪食作用を発揮したことがわかる。【０１６０】
また、データを示さないが、ＮＩＨ３Ｔ３と同様に、ＮＩＨ３Ｔ３形質転換体（ＣＤ３００ａ）は、生細胞（胸腺細胞）を貪食しないことが観察された。
参考例２Ａ〜Ｃの結果から、ＣＤ３００ａは、マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食作用に関与しないことが理解できる。【０１６１】
［参考例３：ＣＤ３００ａの機能解析（２）］
図５に示すように、マスト細胞は、ＣＤ３００ａを発現するものの、マクロファージとは異なって、ＰＳ受容体であるＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、スタビリンを発現しない。【０１６２】
これらのＰＳ受容体には、ＰＳが直接的にまたは間接的に結合することが知られており、アポトーシス細胞の取り込みに寄与することが知られている（下記文献１３）。そこで、ＣＤ３００ａもこのような機能を有しているのか否か（アポトーシス細胞を取り込む機能的重複があるのか否か）を検証すべく、下記参考例３Ａ〜Ｃに示す試験を行った。【０１６３】
［参考例３Ａ］
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの骨髄細胞（ＢＭ細胞）２×１０8個を１０ｃｍｍディッシュにて、細胞増殖因子（ＳＣＦ）（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−３（４ｎｇ／ｍＬ）および仔牛血清（ＦＢＳ）（１０％）を含むコンプリートＲＰＭＩ１６４９メディウム中で４週間培養して、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの骨髄由来のマスト細胞（ＢＭＭＣ）を調製した。なお、ＢＭＭＣは、毎週新しいメディウムで継代した。【０１６４】
次いで、得られたＢＭＭＣを、ＦＩＴＣ結合型抗ＦｃεＲＩα抗体（０．１μｇ）およびＰＥ結合型抗ｃ−Ｋｉｔ抗体（０．１μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４９メディウム中で、４℃、３０分インキュベートし、フローサイトメトリーで分析した（結果：図６Ａ「ＣＤ３００ａ-/-」）。【０１６５】
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の骨髄細胞の代わりに野生型マウス由来の骨髄細胞を用いて、ＢＭＭＣを調製したこと以外は、上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリーで分析した（結果：図６Ａ「ＷＴ」）なお、図６Ａの数字は、ボックス中の細胞の比率を指し、各試験は独立して３回行った。【０１６６】
また、各ＢＭＭＣを用いてβ−ヘキソサミニダーゼ放出アッセイ（脱顆粒アッセイ）を以下のように実施した（詳細な条件は下記文献２９に記載されている）。
まず、対数増殖期における各ＢＭＭＣ１×１０5細胞〜２×１０5細胞を、ゼラチン（Ｓｉｇｍａ社製）でコートされた２４穴プレート中で３７℃、一昼夜培養し、ビオチン結合型マウス抗トリニトロフェノールＩｇＥ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を含み、サプリメントを含まないメディウム中において、３７℃、１時間インキュベートした。【０１６７】
次いで、上記メディウム中にストレプトアビジンを添加して、ビオチン結合型マウス抗トリニトロフェノールＩｇＥ同士をクロスリンクさせて、３７℃、４５分間培養した後、上清を採取した。【０１６８】
採取された上清に、ｐ−ニトロフェニルーＮ−アセチルーβーＤ−グルコサミド（Ｓｉｇｍａ社製）およびクエン酸（０．４Ｍ）およびリン酸ナトリウム（０．２Ｍ）を含む緩衝液（ｐＨ４．５）を加え、３７℃、３時間インキュベートして、放出されたβ−ヘキソサミニダーゼによってｐ−ニトロフェニルーＮ−アセチルーβーＤ−グルコサミドを加水分解反応させ、該反応を、０．２Ｍグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１０．７）を添加して、停止した後、ｐ−ニトロフェニルーＮ−アセチルーβーＤ−グルコサミドの加水分解によって生じる波長４１５ｎｍの吸光度を測定し、β−ヘキソサミニダーゼの放出量を定量した。さらに、上記処理をしていない各ＢＭＭＣに対する、β−ヘキソサミニダーゼの放出量の増加率（％）を図６Ｂに示した。【０１６９】
図６Ｂは、β−ヘキソサミニダーゼを放出したＢＭＭＣの比率を示す。図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、ＢＭＭＣがＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の場合と野生型マウス由来との場合とで、ＦｃεＲＩαやｃ−Ｋｉｔの発現（マスト細胞のマーカー蛋白質）や、β−ヘキソサミニダーゼの放出量の増加率には、有意な差異は見られなかった。
すなわち、骨髄細胞からの分化やＦｃｅＲＩ介在性の脱顆粒化には、ＣＤ３００ａは影響を与えるものではないことが分かる。【０１７０】
［参考例３Ｂ］
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣおよび、参考例１Ｂで得られたアポトーシス細胞（ＢＭＭＣ：アポトーシス細胞＝１０：１（細胞数比））を、塩化カルシウム（１ｍＭ）、ＡＰＣ結合型アネキシンＶ（１μｌ）、ＣＤ３００ａ−Ｆｃ（１μｇ／ｍＬ）およびＭＦＧ−Ｅ８（５μｇ）を含むＰＢＳ中で２０℃、３０分間インキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧ抗体（０．１μｇ／ｍＬ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１μｇ）を含む緩衝液を用いて染色した。【０１７１】
染色された細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図７Ａ「ＭＦＧ−Ｅ８」）。【０１７２】
また、ＭＦＧ−Ｅ８の代わりにコントロール用ＩｇＧを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリー分析を行った（結果：図７Ａ「Ｃｔｒｌ  Ｉｇ」）。【０１７３】
図７Ａに示される結果から、コントロール用ＩｇＧの存在下では、ＣＤ３００ａ−Ｆｃはアポトーシス細胞（アネキシンＶ+）に結合するのに対して、ＭＦＧ−Ｅ８（ＰＳ結合性物質）の存在下では、この結合が特異的に阻害されていることが分かる。【０１７４】
なお、この混合試料の上清において、サイトカインおよびケモカインの濃度は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６）およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製（ＭＩＰ−２、ＭＣＰ−１，ＩＬ−１３およびＭＩＰ−１α）のＥＬＩＳＡキットを用いてサイトカインやケモカインの定量を試みたところ、サイトカインやケモカインは検出されなかった。【０１７５】
［参考例３Ｃ］
ＢＭＭＣおよびアポトーシス細胞が共存する場合、ＬＰＳ（リポポリサッカリド）の刺激によって、各種サイトカインの放出量が変化するか否かを検証すべく、以下のような試験を行った。【０１７６】
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣおよびアポトーシス細胞（ＢＭＭＣ：アポトーシス細胞＝１０：１（細胞数比））を、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ中で４時間インキュベートした後、メディウムの上清を採取した。【０１７７】
次いで、サイトカインおよびケモカインの濃度を、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６）およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製（ＭＩＰ−２、ＭＣＰ−１，ＩＬ−１３およびＭＩＰ−１α）のＥＬＩＳＡキットを用いて３回測定し、上記のＬＰＳ処理が実施されていないＢＭＭＣの各サイトカインおよびケモカインの放出量の増加率を算出した（結果：図７Ｂ「Ｃｄ３００ａ-/-」）。【０１７８】
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、野生型マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は上記試験条件と同様にして、サイトカインおよびケモカインの増加率を算出した（結果：図７Ｂ「ＷＴ」）。【０１７９】
図７Ｂに示されるように、何れのＢＭＭＣにおいても、ＬＰＳによって、各種サイトカインの放出量が増加した。しかしながら、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣにおいては、野生型マウス由来のＢＭＭＣに比べてＴＮＦ−α、ＩＬ−１３、およびＭＣＰ−１が有意に増加した。【０１８０】
［参考例３Ｄ］
さらに、各ＢＭＭＣの細胞内中の各種サイトカインおよびケモカインの増加率を検証すべく、以下の試験を行った。【０１８１】
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣおよび、参考例１Ｂで得られたアポトーシス細胞（ＢＭＭＣ：アポトーシス細胞＝１０：１（細胞数比））を、ＬＰＳ（リポポリサッカリド）（１μｇ／ｍＬ）を含むメディウム（ＲＰＭＩ）中で４時間インキュベートした後、上記インキュベート後のＢＭＭＣおよびアポトーシス細胞を、各種サイトカインおよびケモカインに対する各種蛍光標識化抗体と、ホルムアルデヒドを含むメディウム（ＦＩＸ  ＆  ＰＥＲＭ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で４℃、２０分インキュベートし、染色された細胞を、フローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図８矢印（１））。また、各種サイトカインおよびケモカインに対する各種蛍光標識化抗体の代わりに、コントロール用抗体を用いたことは上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリー分析を行った（コントロール試験（結果：図８矢印（２）））。【０１８２】
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、野生型マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリー分析を行った（結果：図８矢印（３））。さらに、各種サイトカインおよびケモカインに対する各種蛍光標識化抗体の代わりに、コントロール用抗体を用いたことは上記試験条件と同様にして、フローサイトメトリー分析を行った（コントロール試験（結果：図８矢印（４）））。【０１８３】
また、図８のグラフは、各ＢＭＭＣにおける各サイトカイニンおよびケモカインに関するＭＦＩ値（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を測定し、ＬＰＳ未処理のＢＭＭＣに対するＭＦＩの増加量を示す。【０１８４】
図８によれば、何れのＢＭＭＣの細胞質中においても、ＬＰＳ未処理の場合に比べてサイトカイニンおよびケモカインの量が増加したことを示しているが、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの細胞質中では、野生型マウス由来のＢＭＭＣの細胞質中と比べても、ＴＮＦ−α等が有意に増加したことが分かる。【０１８５】
［参考例３Ｅ］
Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８は、ＲＧＤモチーフにおいて点変異（Ｄ８９Ｅ）を含むＭＦＧ−Ｅ８のバリアント（変異体）であり、ＰＳに結合するが、αｖβ３インテグリンに結合しないという結合特性を有する。【０１８６】
そこで、Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８の存在下において、各ＢＭＭＣのサイトカインおよびケモカインの放出量が変化するか否かを検証すべく、以下のような試験を行った。
ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣおよびアポトーシス細胞を含むメディウム中に、ＬＰＳとともにＤ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８（５μｇ／ｍＬ）を添加したこと以外は、参考例３Ｃと同様にして、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１３、ＭＣＰ−１およびＩＬ−６を定量した（結果：図７Ｃ「ＣＤ３００ａ-/-」）。【０１８７】
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、野生型マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は上記試験条件と同様にして、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１３、ＭＣＰ−１およびＩＬ−６を定量した（結果：図７Ｃ「ＷＴ」）。【０１８８】
図７Ｃに示されるように、Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８の存在下では、ＢＭＭＣがＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来の場合と野生型マウス由来との場合とで、各種サイトカインの濃度には、有意な差異が見られなかった。【０１８９】
［参考例３Ｆ］
ＣＤ３００ａは、細胞内部位において免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、抗ＣＤ３００ａ抗体で架橋されると、ＳＨＰ−１が誘導されることが知られている（下記文献１４）。【０１９０】
そこで、ＣＤ３００ａとＳＨＰ−１とが相互作用するのか否かを検証すべく、以下のような試験を実施した。試験例３Ｃのように、ＬＰＳの存在下でアポトーシス細胞と４時間共培養したＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスまたは野生型マウス由来のＢＭＭＣの細胞破砕物を、抗ＣＤ３００ａ抗体（ＴＸ４１）で免疫沈降させた。【０１９１】
得られた免疫沈降物を用いて、下記文献１４に記載されているように、抗ＳＨＰ−１抗体または抗ＣＤ３００ａ抗体によるイムノブロットを行った（結果：図７Ｄ）。
この結果からも分かるように、ＢＭＭＣがアポトーシス細胞と共培養された場合、ＬＰＳ刺激に応答して、ＳＨＰ−１を誘導（リクルート）することが分かる。しかしながら、Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８の存在下においては、ＣＤ３００ａはＳＨＰ−１をリクルートしなかった。
すなわち、ＬＰＳ刺激の応答に対するＣＤ３００ａによるＳＨＰ−１の誘導（リクルート）には、ＰＳがＣＤ３００ａへ結合することが必要であると考えられる。【０１９２】
［参考例３Ｇ］
ＳＨＰ−１が、ＣＤ３００ａ介在性のシグナリングに関与しているかどうかを調べるために、まず、野生型マウス由来のＢＭＭＣにおいて、ｓｉＲＮＡでＰｔｐｎ６（ＳＨＰ−１遺伝子）をノックアウトして、ＳＨＰ−１欠損（Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）野生型マウス由来のＢＭＭＣを以下の条件で作製した。また、同様にして、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来ＢＭＭＣからＳＨＰ−１欠損（Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣを作製した。【０１９３】
ＢＭＭＣ中のＳＨＰ−１遺伝子（Ｐｔｐｎ６遺伝子）をターゲットとしたｓｉＲＮＡ（ＳＨＰ−１  ｓｉＲＮＡ）（ｓｉＧＥＮＯＭＥ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｈａｒｍａｃｏｍ）０．５ｍＭを、Ｘ−ｔｒｅｍｅ  Ｇｅｎｅ  ｓｉＲＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）１ｍＬと混合し、下記文献２８に記載されているように、５×１０5細胞のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣに形質導入（トランスフェクト）して、ＳＨＰ−１がノックダウンされたＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣ（ＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ-/-・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ））を作製した。【０１９４】
また、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、野生型マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、ＳＨＰ−１がノックダウンされた野生型マウス由来のＢＭＭＣ（ＢＭＭＣ（ＷＴ・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ））を作製した。【０１９５】
ここで、ＳＨＰ−１  ｓｉＲＮＡが各ＢＭＭＣに形質導入され、ＳＨＰ−１の発現量が低減していることを確認するために、ＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ-/-・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）またはＢＭＭＣ（ＷＴ・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）のライセートを用いて、抗ＳＨＰ−１抗体、抗ＳＨＰ−２抗体および抗βアクチン抗体によるイムノブロッティング分析を行った（結果：図７Ｅ）。【０１９６】
図７Ｅに示されるように、ＳＨＰ−１  ｓｉＲＮＡを形質導入したＢＭＭＣでは、ＳＨＰ−１の発現量が低減されていることが確認できる。なお、「Ｃｔｒｌ」は、ＳＨＰ−１  ｓｉＲＮＡの代わりに、コントロール用ｓｉＲＮＡを形質導入したＢＭＭＣを用いたイムノブロッティング分析の結果を示す。【０１９７】
次に、ＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ-/-・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）またはＢＭＭＣ（ＷＴ・Ｐｔｐｎ６−ＫＤ）および参考例１Ｂで得られたアポトーシス細胞（ＢＭＭＣ：アポトーシス細胞＝１０：１（細胞数比））を、塩化カルシウム（１ｍＭ）およびＬＰＳ（リポポリサッカリド）（１μｇ／ｍＬ）含むＲＰＭＩ中で４時間インキュベートした後、参考例３Ｂと同様にして、ＴＮＦ−αの放出量を測定した（結果：図７Ｆ）。【０１９８】
図７Ｆ（左グラフ）に示されるように、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣは野生型マウス由来のＢＭＭＣよりも有意にＴＮＦ−αを産生した。一方で、図７Ｆ（右グラフ）に示されるように、野生マウスまたはＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣは、ＳＨＰ−１  ｓｉＲＮＡが形質導入された場合、野生由来ＢＭＭＣもＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来ＢＭＭＣも、ＴＮＦ−αの放出量は同程度であり、両者に有意な差異は見られなかった。【０１９９】
これらの結果は、ＰＳがＣＤ３００ａに結合すると、ＣＤ３００ａはＳＨＰ−１を誘導して、ＢＭＭＣの活性化抑制シグナルを介在し、結果として、ＴＮＦ−αの分泌の抑制をすることを示唆している。【０２００】
参考例３の結果から、ＰＳとＣＤ３００ａとの相互作用は、ＢＭＭＣから炎症誘発性の（ＬＰＳ誘導性の）サイトカインおよびケモカインの産生を阻害すること、およびこの相互作用はＳＨＰ−１をリクルートして、ＴＮＦ−αの分泌の抑制をすることが理解される。【０２０１】
［参考例４：ＣＤ３００ａの機能解析（３）］
マスト細胞が産生するＴＮＦ−α、ＩＬ−３およびＭＣＰ−１は、好中球の化学誘引物質であり、ＣＬＰ腹膜炎マウスにおいて、細菌クリアランスに重要な役割を果たすことが知られている（下記文献１５〜１９）。
そこで、ＣＤ３００ａが細菌クリアランス機能を有するか否かを検討するために、下記参考例４Ａ〜４Ｈを行った。【０２０２】
［参考例４Ａ］
野生型マウスの盲腸（腹側域）上において、１〜２ｃｍの正中線切開を実施し、その末端部を結紮した。次いで、結紮部位において、２７ゲージ針を用いて２回穿刺した後、該盲腸を腹部に戻し、無菌食塩水１ｍＬを皮下注射して補水した後、切開部を縫合して切開部分を閉じた。なお、上記のＣＬＰの詳細内容・条件は、下記文献１６に記載されている。【０２０３】
ＣＬＰの実施前またはＣＬＰの実施後４時間目において、腹膜灌流液を採取した。次いで、該腹膜灌流液にＡＰＣ結合型アネキシンＶ（１μｇ）およびＣＤ３００−Ｆｃ（１μｇ）を添加した後、ＦＩＴＣ結合型抗ヒトＩｇＧおよびＰＩ（ヨウ化プロピジウム）で染色し、フローサイトメトリーで分析した（結果：図１２Ａ）。【０２０４】
図１２Ａは、下記文献２０に記載されているように、腹膜炎部位は、多数の細胞がアポトーシスに至る部位であることを確認できる結果となっている。
すなわち、ＣＤ３００ａは、膜炎部位のマスト細胞の免疫制御に影響を与えることが示唆される。【０２０５】
［参考例４Ｂ］
ＣＤ３００ａとマスト細胞の免疫制御との関係を検証すべく、以下のようにプロテオーム解析を行った。【０２０６】
まず、野生型マウスおよびマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）に、参考例４Ａと同様にしてＣＬＰを実施した。
ＣＬＰ実施から４時間経過後、各マウスの腹膜灌流液を採取して、採取された腹膜灌流液を、製造元の説明書に準拠して、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ａｒｒａｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてサイトカインおよびケモカインのプロテオーム解析に供した。【０２０７】
図９Ａは、野生型マウスおよびマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）の腹膜灌流液を用いたデンシトメトリー分析（プロテオーム分析）の結果を示す（図９Ａ中「ＰＣ」はポジティブコントロールを示す。）。【０２０８】
また、図９Ｂは、図９Ａで示される各シグナルをデンシトメトリー像から得られた、各ケモカインやサイトカインのシグナルのピクセル密度を示す。
図９Ｂに示されるように、ＣＬＰ後４時間目において、腹腔内のケモカインの濃度は、野生型マウスよりもｋｉｔW-sh/W-shマウスにおいて高いことが分かる。なお、本試験は、２回実施しても同様の結果が得られた。【０２０９】
［参考例４Ｃ］
参考例４Ｂと同様にして、野生型マウスおよびマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）から腹膜灌流液を採取した（各ｎ＝３）。【０２１０】
次いで、各腹膜灌流液から段階希釈液系列を調製し、調製された腹膜灌流液の各段階希釈液をプレーティングし、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天を含むプレート上で、３７℃、４８時間培養した。次いで、好気性細菌のＣＦＵを、下記文献２７に記載されているように、腹膜灌流液１ｍＬ中のコロニー数を計測して好気性細菌のＣＦＵを算出した（結果：図１０Ａ）。【０２１１】
また、各腹膜灌流液中の好中球およびマクロファージの細胞数も計測し、結果をそれぞれ図１０Ｂの「ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ」および「ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ」に示す。
さらに、野生型マウスまたはマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）からＢＭ由来マクロファージを調製した。これらのマクロファージ（細胞数：１Ｘ１０6）を、フルオレセイン標識化大腸菌を含むメディウム中で、２４穴プレートで１時間共培養し、フローサイトメトリーで大腸菌を貪食した各マクロファージの細胞数を測定し、貪食しているマクロファージの比率を算出した（結果：図１１「ＢＭ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ」）。【０２１２】
野生型マウスまたはマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）由来のＢＭ由来マクロファージの代わりに、野生型マウスまたはマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）由来のＰＥＣマクロファージを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、貪食しているマクロファージの比率を算出した（結果：図１１「ＰＥＣ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ」）。【０２１３】
図１０Ａに示されるように、ＣＬＰ後４時間目のマスト細胞欠損マウス（ｋｉｔW-sh/W-shマウス）では、野生型マウスに比べて、腹腔内における細菌ＣＦＵが少なく、好中球の細胞数が多いことが分かる。対して、図１０Ｂおよび図１１に示されるように、マクロファージの細胞数および貪食作用は、両遺伝子型間で有意差が無いものであった。【０２１４】
［参考例４Ｄ］
ＣＤ３００ａが好中球の誘導（リクルート）に関与するか否かを検証するために、以下の実施例を行った。【０２１５】
マスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）に、野生型マウス由来のＢＭＭＣ（細胞数１Ｘ１０6）を含むＰＢＳ緩衝液を腹腔内注射で投与した（ｎ＝２０）。次いで、投与してから２８日間経過後、参考例４Ａと同様にしてＣＬＰを実施し、マウスの生存率を測定した（結果：図１２Ｂ「ＷＴ  ＢＭＭＣｓ→ＫｉｔW-sh/ＫｉｔW-sh」）。【０２１６】
また、野生型マウス由来のＢＭＭＣの代わりに、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣを用いたこと以外は、上記試験条件と同様にして、マウスの生存率を測定した（結果：図１２Ｂ「ＣＤ３００ａ-/-  ＢＭＭＣｓ→ＫｉｔW-sh/ＫｉｔW-sh」）。なお、図１２Ｂにおける「ＫｉｔW-sh/ＫｉｔW-sh」は、ＢＭＭＣを投与しないで、ＣＬＰを実施したマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）の生存率を示す。【０２１７】
図１２Ｂによれば、ＣＬＰ後であっても、野生型マウス由来のＢＭＭＣが供されたマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）では、ＢＭＭＣを投与されなかった場合と比べて、高い生存率が示された。【０２１８】
しかしながら、ＣＬＰの後において、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣが供されたマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）では、野生型マウス由来のＢＭＭＣやＢＭＭＣが投与されなかったマウスと比べて、ＣＬＰ後であっても生存率が有意に高かったことが分かる（図１２Ｂ）。【０２１９】
さらに、ＣＬＰ後４時間目の上記各マウスの腹膜灌流液を用いて、参考例４Ｃと同様にして細菌のＣＦＵを測定したところ、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣが供されたマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）では、他のマウスに比べて、細菌クリアランスも大きいことが示された（結果：図１２Ｃ）。【０２２０】
［参考例４Ｅ］
ＢＭＭＣをマスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）の腹腔内に投与することで、ＴＮＦ−αの放出量が増加するか否かを検証するために、以下の実施例を行った。【０２２１】
ＣＬＰの２４時間前において、マスト細胞欠損マウス（ＫｉｔW-sh/W-shマウス）の腹腔内に、ＣＦＳＥ標識化した混合ＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣ：野生マウス由来のＢＭＭＣ＝１：１（細胞数比））を腹腔内注射で投与した。【０２２２】
該混合ＢＭＭＣが注射されたマウスに参考例４Ａと同様にしてＣＬＰを実施し、ＣＬＰ後４時間目に、腹膜灌流液を採取した。該腹膜灌流液中に含まれる各ＢＭＭＣをフローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン社製、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、型番「Ｅ６１３３」）を用いた分析に供した（結果：図１２Ｄ）。【０２２３】
図１２Ｄに示されるように、ＣＬＰから４時間後において、ＣＤ３００Ｄ遺伝子欠損マウス由来のＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ-ＣＦＳＥ+細胞）は、野生型マウス由来のＢＭＭＣ（ＣＤ３００ａ+ＣＦＳＥ+細胞）よりも有意に大量のＴＮＦ−αを産生していることが分かる。【０２２４】
［参考例４Ｆ］
抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体（ＴＸ４１）を投与した場合、ＣＤ３００ａにおいてどのような影響があるのかを検証するために、以下のような実施例を行った。【０２２５】
まず、ＣＬＰの１時間前または１８時間前において、野生型マウスに、５００μｇの抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体（ＴＸ４１）（ｎ＝１３）を腹腔内注射したこと以外は、参考例４Ａと同様にしてＣＬＰを実施して、参考例４Ｄと同様にして、マウスの生存率を測定した（結果：図１２Ｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＣＤ３００ａ」）。【０２２６】
また、コントロールとして、ＴＸ４１（ｎ＝１３）の代わりに、アイソタイプコントロール用抗体（ｎ＝１１）を用いたこと以外は上記試験条件と同様にして、マウスの生存率を測定した（結果：図１２Ｅ「Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ」）。【０２２７】
図１２Ｅに示されるように、ＣＬＰ実施の１時間または１８時間前において野生型マウスに腹腔内注射によってＴＸ４１を投与した後にＣＬＰを実施した場合、コントロール用抗体を投与した場合と比べて、生存期間が長くなることが分かった。【０２２８】
［参考例４Ｇ］
参考例４Ｆにおける、ＣＬＰ後４時間目の各マウスから腹膜灌流液を採取した。得られた腹膜灌流液を用いて、参考例４Ｃと同様にして、細菌ＣＦＵおよび好中球の細胞数を測定した（コントロール用抗体：ｎ＝５および、抗ＣＤ３００ａモノクローナル抗体：ｎ＝５）（それぞれ図１２Ｆおよび図１２Ｇ）。【０２２９】
なお、ＴＸ４１が腹腔内注射で投与されても、各マウスのマスト細胞を含めたミエロイド系細胞が欠損することはなかった。
図１２Ｆおよび図１２Ｇに示されるように、ＣＬＰ実施の１時間または１８時間前において野生型マウスに腹腔内注射によってＴＸ４１を投与した場合、腹腔内において、有意に好中球の細胞数は増加し、細菌クリアランスも向上した。【０２３０】
参考例４の結果から、ＰＳとＣＤ３００ａとの相互作用を、たとえばＴＸ４１などで阻止することで、腹膜炎誘発性の敗血症を予防できることが理解される。
なお、生理的状況下においては、多くの細胞がアポトーシスに至っている。ここで、アポトーシス細胞の取り込みには、ＰＳ受容体は中心的な役割を果たし、自己免疫疾患の進展を防ぐのに必須なものである（下記文献２２）。【０２３１】
一方で、微生物感染のような病理的状況では、顕著にアポトーシスによる細胞死が増加し、病原関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）に対する受容体（たとえばＴｏｌｌ様受容体）を介し、マスト細胞による炎症反応を引き起こすことが知られている（下記文献１５，２３および２４）。また、マスト細胞は、病原体に対する免疫反応において重要な役割を果たすことも知られている。【０２３２】
以上から、上記実施例における結果は、ＰＳが、数種類のＰＳ受容体を介して貪食細胞へ取り込みシグナルを提供することのみならず、今回新たな知見として得られたように、ＣＤ３００ａを介したマスト細胞による炎症反応を有効に抑制する効果を有することが理解できる。【０２３３】
したがって、ホスファチジルセリン結合性物質（ＭＦＧ−Ｅ８等）やＣＤ３００ａ結合性物質（ＣＤ３００ａに対する中和抗体等）が、ＰＳとマスト細胞におけるＣＤ３００ａとの相互作用を阻止して、マスト細胞を活性化させるまたは該活性を維持させることが理解される。【０２３４】
すなわち、これらの物質は、たとえばＬＰＳ誘発性の各種炎症性感染症（さらにはそれによる敗血症）の予防に用いられる医薬品の有効成分として有用であることが理解できる。【０２３５】
＜喘息＞
(材料と方法)
(マウス)
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスはクレア日本社より購入した。ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス（ＣＤ３００ａ-/-マウス）は、当研究室で作成したＢａｌｂ／ｃのＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスと、購入したＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとを１２世代交配し、バッククロスを行うことにより得た。喘息の誘導開始時にはいずれも8-10週の雄または雌マウスを用いた。【０２３６】
（ＯＶＡ誘導喘息）
図１３Ａに、鶏卵白アルブミンで誘導喘息のプロトコールを示す。喘息誘導開始から０、７、１４日目に、１００μgの鶏卵白アルブミン(ＯＶＡ、鶏卵のアルブミン, シグマ社製)と１００μＬのアルミニウム水酸化物ゲル （ＡＬＵＭ、ＡＬｈｙｄｒｏｇｅｌ  ２％， インビトロジェン社製）を混和したものを各マウスに腹腔内注射した。【０２３７】
また、喘息誘導開始から２１，２２，２３日目に、ＰＢＳで１０%に希釈した鶏卵白アルブミンを超音波ネブライザー（ＮＥ−Ｕ１７，Ｏｍｕｒｏｎ）で各マウスに３０分間吸入させた。そして、喘息誘導開始から２５日目に各マウスの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）と、各マウスから血清の回収を行った。【０２３８】
［実施例１Ａ］（図１３Ａ、図１３Ｂ）
（気管支肺胞洗浄ＢＡＬ）
マウスの気管を切開し、１ｍＬの２％ＦＢＳ／ＰＢＳで３回洗浄し、洗浄液を回収し、細胞数を測定した。図１３ＡおよびＢに示すように、喘息誘導開始から２５日目の各マウスの肺胞洗浄液（ＢＡＬ液）中の細胞数は、総細胞数について、好酸球数についても、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの方がＷＴマウスよりも有意に少なかった。この結果は、ＣＤ３００ａが卵白アルブミン（ＯＶＡ）による好酸球性気道炎症を増悪させており、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは好酸球性気道炎症の症状が改善されることを示している。【０２３９】
［実施例１Ｂ］（肺胞洗浄液中の細胞の解析）（図１３Ｃ）
回収した気管支肺胞洗浄液から１×１０6個の細胞をＣＤ４５.２−ＦＩＴＣ、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｆ−ＰＥ、ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣＣｙ７、ＣＤ１１ｃ−ＰＥＣＣｙ７、Ｆ４／８０−Ａｌｅｘａ（いずれも購入，ＢＤ）で染色し、 ＣＤ４５＋ＳｉｇｌｅｃＦ−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ−Ｆ４／８０−を好酸球分画としてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）にて解析した。【０２４０】
喘息誘導開始から２５日目のマウスの肺胞洗浄液中の細胞をＦＡＣＳ解析したところ、ＣＤ４５陽性細胞中の好酸球の割合（ＣＤ４５＋ＳｉｇｌｅｃＦ−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ−Ｆ４／８０−）を示した。ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスはＷＴマウスに比べ、有意にＢＡＬ液中の好酸球の浸潤割合が低かった。【０２４１】
［実施例１Ｃ］（血清ＩｇＥ値の測定）（図１４）
血清ＩｇＥの測定はラット抗マウスＩｇＥ（ＢＤ）とビオチン化抗マウスＩｇＥ（ＢＤ）を用いて、ＥＬＩＳＡ法にて測定した。【０２４２】
図１４に示すように、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは鶏卵白アルブミンで誘導した喘息の感作の時期に、血清のＩｇＥ値を有意に低下させた。ＯＶＡで誘導した喘息モデルの１４病日目のＷＴマウスで、各マウスの血清ＩｇＥ値を比較すると、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでは、ＷＴマウスに比べ有意に、アレルギーの程度を示す指標の血清ＩｇＥ値が低かった。【０２４３】
ＣＤ３００ａのシグナル伝達を抑制する抗ＣＤ３００ａ抗体を投与することにより、鶏卵白アルブミンにより誘導した喘息において、血清ＩｇＥが有意に抑制されると考えられる。【０２４４】
＜アトピー性皮膚炎＞
ＣＤ３００ａがアトピー性皮膚にどのように関与しているのか、調べた。
以下、材料と方法、および各実施例を示す。【０２４５】
（実験動物）
Ｂａｌｂ／ｃマウスは、Ｃｌｅａ社から、購入し、承認された飼育舎条件下、発明者らの実験室で飼育した。本研究に用いたマウスのうち、８匹はＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）遺伝子欠損であり、他の８匹のマウスはＢａｌｂ／ｃ種の野生型（ＷＴ：Ｗｉｌｄ  Ｔｙｐｅ）のマウスであった。実験期間中、各マウスは餌および水を自由に与えられ、通常の実験室条件で維持された。【０２４６】
（経皮感作）
各マウスに対し、イソフルラン（マイラン制約株式会社、大阪、日本）により穏やかに麻酔を行った後、電気シェーバーで背部の剃毛を行った。各マウスにつき背面皮膚の一箇所（１ｃｍ2）に、粘着性セロファンテープを用いて、少なくとも１０回テープストリッピングを行った。【０２４７】
１００μＬのリン酸緩衝食塩水中１００μｇの鶏卵白アルブミン（ＯＶＡ）をバンドエイド（登録商標）テープのガーゼに配置し、テープストリッピングを行った各群のマウスのうち５匹の体に貼り付けた。残りの３匹のマウスには、ＰＢＳをテープで貼り付けた。テープは、２日目に一度更新され、１週間、テープで毎日、ＯＶＡ感作を行った。【０２４８】
各マウスは、第２週にはＯＶＡ感作から開放した。第３週に、再度、上記と同じＯＶＡ感作に供した。第３週の終わりに、各マウスを犠牲にして、組織学とＥＬＩＳＡのためのサンプルを採取した。【０２４９】
（擦過行動数）
擦過行動数は、第１〜３週の各週の終わりに各マウスを注意深く観察することにより、３０分間カウントすることにより計測した。【０２５０】
（組織学）
組織学的観察のために、各マウスのＯＶＡ感作部位の皮膚を採取した。採取した全ての皮膚のサンプルを小さな組織ブロックにカットし、４％のパラホルムアルデヒドに４℃で２４時間浸漬した。【０２５１】
この固定化に続いて、脱水工程を行なった。その後、全ての皮膚のサンプルをドライアイス入の容器内のアセトン中で急速冷凍した。各サンプルは使用するまで−３０℃で保存した。【０２５２】
その後、凍結切片作製装置であるＣｏｌｄｔｏｍｅＨＭ５６０Ｅ（カールツァイス社製、イエナ、ドイツ）を用いて、皮膚のサンプルを４μｍ厚の切片にカットし、ニューシランＩＩＩ（武藤化学株式会社、東京、日本）でプレコートしたスライドグラスにのせた。【０２５３】
組織切片に対して、ヘマトキシリン・エオシン（サクラファインインデックジャパン株式会社製）で染色、並びにトルイジンブルー（サンタクルーズバイオテクノロジー社）で染色を行った。
組織初見の評価は、表皮厚（細胞層）、好酸球、単核細胞およびマスト細胞の浸潤、繊維芽細胞の過形成のレベルについて行った。【０２５４】
［実施例２Ａ］擦過行動数（図１５）
図１５に各マウスの３０分毎の擦過行動数を示す。そう痒症（発疹がないのに、かゆみだけがある疾患）は、アトピー性皮膚炎の一般的な条件である。したがって、ＯＶＡ感作時に擦過行動数を慎重に３０分間、それぞれの動物を観察することによってカウントし、これに基づいて評価している。【０２５５】
図１５に示すように、ＯＶＡ感作をしたＷＴマウス（◆）では、ＯＶＡ感作後に重度の擦過行動の状態を示し、擦過行動数はＯＶＡ感作をしたＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス（▲）よりも高かった、最も多い擦過行動数は、第４のＯＶＡ感作の終了時に観察された。【０２５６】
ＯＶＡ感作の間、ＷＴマウスにおいて最も高い擦過行動の症状が観察された（図１５）。擦過行動の症状が高度に発現することは、アトピー性皮膚炎の最も一般的な病理特徴の一つである。したがって、このことから、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）陽性細胞がアトピー性皮膚炎において重要な役割に関わっていることが明らかになる可能性がある。【０２５７】
［実施例２Ｂ］観察（図１６参照）
ＯＶＡ感作をした各マウスの皮膚について観察した。
図１６（Ａ）にＷＴマウスでＯＶＡ感作をしなかったマウスの皮膚を示す。鶏卵白アルブミン感作を行わなかったＷＴマウス未処理では、真皮で細胞浸潤は見られず、薄い表皮が観察される。なお、図１６の下側のパネルは、上段の矩形領域の拡大図を示している。また、太いバーの長さは、１０μｍを示す。【０２５８】
一方、図１６（Ｂ）に示すように、ＯＶＡ感作を行ったＷＴマウスの皮膚では、表皮の過形成と線維芽細胞の過形成が観察された。ＷＴマウスで鶏卵白アルブミンの感作を行ったマウスの皮膚の真皮で、好酸球（白抜矢印参照）と単核細胞の浸潤が明確に見られた。【０２５９】
図１６（Ｃ）に示すように、ＯＶＡ感作を行わなかったＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの表皮では、細胞浸潤が観察されず、図１６（Ａ）と同様に、薄い皮膚が観察された。
図１６（Ｄ）に示すように、ＯＶＡ感作後のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの皮膚では、驚くべきことに、表皮の厚さは増加したが、表皮の過形成は観察されなかった。さらに、その真皮では、細胞浸潤や線維芽細胞の過形成が認められなかった。【０２６０】
［実施例２Ｃ］マスト細胞染色（図１７参照）
図１７に示すように、すべてのマウスの皮膚サンプルでトルイジンブルー染色を行った。トルイジンブルー染色は、マスト細胞の細胞内顆粒を好適に染色する染色法である。【０２６１】
図１７の（Ａ）にＯＶＡ感作をしなかったＷＴマウスの皮膚を示す。図１７の（Ｂ）にＯＶＡ感作を行ったＷＴマウスの皮膚を示す。図１７の（Ｃ）にＯＶＡ感作をしなかったＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの皮膚を示す。図１７の（Ｄ）にＯＶＡ感作を行ったＷＴマウスの皮膚を示す。なお、染色されたマスト細胞が白抜矢印で示されている。
図１７に示すように、ＯＶＡ感作後、ＷＴマウスの皮膚でマスト細胞の数の増加が観察され、表皮もＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスに比較してより厚くなった。【０２６２】
［実施例２Ｄ］細胞層数の計測（図１８Ａ）
すべてのマウスの皮膚サンプルで表皮内の細胞層数を計数した（図１８Ａ参照）。ＯＶＡ感作後、ＷＴマウスで最も多い細胞層数を示した。これに対して、ＯＶＡ感作を行ったＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでは、その半数以下であった。【０２６３】
［実施例２Ｅ］好酸球数とマスト細胞数の計測（図１８Ｂ）
図１８Ｂに示すように、全てのマウスの表皮サンプルで真皮内に浸潤したアトピー性皮膚炎の指標である好酸球数とマスト細胞数の計測を行った。鶏卵白アルブミン感作後のＷＴマウスの表皮で最も多い細胞数が観測された。【０２６４】
これに対して、ＯＶＡ感作をしたＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでは、好酸球数およびマスト細胞の増加がＷＴマウスのものより軽減された。ＯＶＡ感作の後、表皮過形成および過形成線維芽細胞が、ＷＴマウスにおいて最も高く発現した（図１６および図１８Ａ）。表皮および線維芽細胞の過形成は、いずれも、アトピー性皮膚炎のもう一つの主要な病理特徴である。【０２６５】
また、ＯＶＡ感作をしたＷＴマウスの皮膚では、好酸球，肥満細胞および単核細胞の浸潤が高く発現した（図１６〜図１８Ｂ）。浸潤した好酸球と過形成の繊維芽細胞との相互作用により、ＩＬ−３１が分泌される。このＩＬ−３１は、かゆみ惹起性サイトカインである（下記文献３４：Ｗｏｎｇ ＣＫら，２０１２）。
したがって、ＯＶＡ感作の後において、ＷＴマウスは、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスと比べて、アトピー性皮膚炎の特徴がより重度に表れる。【０２６６】
（免疫組織学）
連続皮膚切片上のＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）およびランゲリン抗原の検出を行うために、酵素免疫組織化学の１工程または２工程の方法を行った。まず、全ての切片を０．０５％Ｔｗｅｅｎ添加リン酸緩衝食塩水（ＴＰＢＳ，ｐＨ７．４）で３回すすいだ。その後、これらを冷無水メタノールおよび０．５％Ｈ2Ｏ2にそれぞれ３０分ずつ浸漬した。【０２６７】
ＴＰＢＳ中での洗浄の後、切片に対し、ブロッキング ワン Ｈｉｓｔｏ試薬（ナカライテスク株式会社，京都，日本）によるブロッキング処理を１０分間行い、ＴＰＢＳで洗浄した。皮膚切片を、抗ランゲリンヤギＩｇＧ（サンタクルーズバイオテクノロジー社，サンタクルーズ，カリフォルニア，米国）およびビオチン化抗ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）ラットＩｇＧ ２ａλ（発明者らの実験室で調製した。）の存在下で４℃にて１８時間培養し、ランゲリンの第２抗体としてビオチン化ロバ抗ヤギＩｇＧ存在下で室温にて１時間培養した。【０２６８】
最後に、これらを、ＤＡＢ／金属 濃縮物（サーモサイエンティフィック社，ウォルサム，マサチューセッツ，米国）の存在下で培養し、ヘマトキシリンで対比染色した。陰性対照切片については、第１抗血清に代えて、ＴＰＢＳまたはアイソタイプコントロール抗体の存在下で培養した。【０２６９】
［実施例２Ｆ］ランゲリン免疫染色（図１９）
各マウスの表皮について、免疫染色時の樹状細胞マーカーであるランゲリンについて、陽性であるか否かを調べた。ランゲリンは、ランゲルハンス細胞に発現するＣ型レクチンの１つであり，真皮樹状細胞の一部にも発現し、抗原認識と取り込み、細胞内の抗原輸送を担うバーベック顆粒（Ｂｉｒｂｅｃｋ  ｇｒａｎｕｌｅｓ）の形成に関与する。【０２７０】
（結果）
図１９（Ａ）は、未処理（ＯＶＡ感作なし）のＷＴマウスの表皮を示す。図１９（Ｂ）は、ＯＶＡ感作をしたＷＴマウスの表皮を示す。図１９（Ｃ）は、未処理のＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの表皮を示す。図１９（Ｄ）は、ＯＶＡ感作をしたＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの表皮を示す。なお、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、それぞれ上段の図面の矩形領域を拡大した図である。【０２７１】
ＯＶＡ感作後、ＷＴマウスの表皮で、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの表皮よりも有意により多くのランゲリン陽性細胞を示した。なお、矢印は、ランゲリン陽性細胞を示す。スケールバーは１０μｍを表す。【０２７２】
［実施例２Ｇ］ランゲリン免疫染色のカウンター染色（図２０）
ランゲリン抗体の免疫陽性をトルイジンブルーによるカウンター染色で評価した。ＷＴマウスの皮膚は、真皮内のランゲリン陽性細胞数の増加を示した。真皮では、いくつかのランゲリン陽性細胞はマスト細胞と相互作用していた。マスト細胞は紫色に染色されている。スケールバーは１０μｍを示す。【０２７３】
ランゲルハンス細胞および皮膚樹状細胞は、皮膚における主要な抗原提示細胞である。ランゲルハンス細胞はその細胞膜においてランゲリン抗原陽性であり、皮膚樹状細胞の中にも、ランゲリン抗原陽性のものが存在する（下記文献３５：Ｎａｋａｊｉｍａ Ｓ. ら，２０１２）。【０２７４】
皮膚ランゲリン陽性樹状細胞は、マスト細胞と相互作用し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化する（下記文献３６：Ｏｔｓｕｋａ Ａ. ら，２０１１）。ＯＶＡ感作モデルでは、皮膚中のマスト細胞（図１７および図１８Ｂ）およびランゲリン陽性細胞（図１９参照）の数は、ＯＶＡ感作の後のＷＴマウスの皮膚において大きく増加している（図１９白矢印対比参照）。ＯＶＡ感作の後のＷＴマウスの皮膚においては、マスト細胞とランゲリン陽性皮膚細胞との相互作用が確認された（図２０）。【０２７５】
（考察）
したがって、このことから、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの皮膚と比べてＷＴマウスの皮膚においてアトピー性皮膚炎が重度に発現することを導き出すことができる。これらの結果から、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）がアトピー性皮膚炎において重要な働きを有していることが示唆される。【０２７６】
ＷＴ皮膚の真皮において、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）陽性細胞は、ＯＶＡ感作の後に大きく増加している（図２０）。この結果によって、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）陽性細胞がアトピー性皮膚炎において重要な働きをしていることが更に確認される。【０２７７】
（アトピー性皮膚炎の治療）
（抗ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）抗体での処置）
本実験では、６匹の７週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用した。図２２に示したプロトコールに従い、６動物のうち３動物については、抗ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）ラットＩｇＧ ２ａλ（ＴＸ４１）を静注し、残りの３動物については、ラットＩｇＧ ２ａλコントロール抗体（ＴＸ７４）を静注した。これらの抗体は、両方とも、発明者らの実験室で調製しチェックした。「ＴＸ７４」は、TX41のアイソタイプコントロール抗体であり、以下に示すように中和作用を有さない抗体である。抗体の稀釈は滅菌ＰＢＳを用いて行い、抗体濃度１６００μｇ／ｍＬにて１５０μＬを一度に注射した。【０２７８】
＜ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）抗体の注射によるＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）抗原のブロック＞
図２２に、Ｂａｌｂ／ｃＷＴマウスでＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）抗原をブロックする手順を示す。太い線は、ＯＶＡ感作の期間を示す。矢印は、各抗体の注射の日程を示す。【０２７９】
血清総ＩｇＥは感作をした各週の終わりに評価した。組織学的試料は、連続した感作の後に回収した。抗ラットＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）抗体ＩｇＧ２ａλ（ＴＸ４１）とそのアイソタイプであるコントロール抗体（ＴＸ７４）を静脈内注射に使用した。【０２８０】
（ＥＬＩＳＡ）
末梢血を、プレーン（ｐｌａｉｎ）のガラス製ヘマトクリット管（ドラモンド サイエンティフック カンパニー，ブルームオール，ペンシルバニア，米国）を用いて後眼窩洞 （ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｃａｖｉｔｙ）から採取し、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。【０２８１】
管をカットすることにより血清を集め、血清全体を、ＥＬＩＳＡに用いる前にブロッキング血清で稀釈した。ＥＬＩＳＡ実験は、米国カリフォルニアのＢＤバイオサイエンス社による全ＩｇＥについての標準的なプロトコールに従って行った。【０２８２】
［実施例２Ｈ］抗ＣＤ３００ａ抗体の免疫反応（受容体の存在確認）（図２１）  抗ＣＤ３００ａ抗体の免疫陽性を、各マウスの皮膚サンプルで評価した。図２１の（A）は、ＷＴマウスの表皮で非処理のものを示し、（Ｂ）は、ＷＴマウスでＯＶＡ感作の表皮を示す。【０２８３】
ＷＴマウスの表皮はＯＶＡ感作後に有意に免疫陽性の細胞を示した。ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの表皮は免疫陽性反応を示さなかった。（Ｂ）の矢印は、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）陽性の細胞を示す。また、スケールバーは１０μmを示す。【０２８４】
［実施例２Ｉ］ＣＤ３００ａ抗体の投与による治療（図２３）
（ＥＬＩＳＡ）
図２２に示すようにＷＴマウスに対して、それぞれＴＸ４１とＴＸ７４を上述した手順に従って投与し、アトピー性皮膚炎の指標であるＩｇＥ濃度を測定した。
図２３に、ＥＬＩＳＡ法により測定した血清総ＩｇＥ濃度を示す。ＯＶＡ感作後のＩｇＥ値は、ＴＸ４１を注射したマウスより、ＴＸ７４を注射したマウスの方が高かった。【０２８５】
［実施例２Ｊ］抗ＣＤ３００ａ抗体の投与による治療（図２４）
図２４に示すように、ＯＶＡ感作後、ＴＸ７４を注射したＷＴマウスは、ＴＸ４１を注射したＷＴマウスより高い擦過行動の症状を示した。【０２８６】
［実施例２Ｋ］Ｈ＆Ｅ染色（図２５）
図２５に示すように、実施例２Ｉの各ＷＴマウスの皮膚切片でＨ＆Ｅ染色を行った。ＯＶＡ感作後、ＴＸ７４を注射されたＷＴマウスの皮膚は、ＴＸ４１を注射されたＷＴマウスの皮膚よりも表皮の過形成および単核細胞の浸潤を示した。なお、図２５の各写真右下のスケールバーは１０μｍを示す。【０２８７】
［実施例２Ｌ］トルイジンブルー染色（図２６）
図２６に示すように、各ＷＴマウスの皮膚について、トルイジンブルー染色を行った。ＯＶＡ感作後、ＴＸ４１を注射したＷＴマウスよりも、ＴＸ７１を注射したＷＴマウスの皮膚の方が、相対的に多くのマスト細胞が観測された。図２５と同様に、スケールバーは１０μmを示す。【０２８８】
（考察）
全ＩｇＥおよび擦過行動数は、ＴＸ４１を注射されたマウスよりもＴＸ７４を注射されたマウスの方が高かった（図２３および図２４参照）。表皮厚、浸潤細胞数、線維芽細胞数および肥満細胞数もまた、ＴＸ４１を注射されたマウスよりもＴＸ７４を注射されたマウスの方が高かった（図２５および図２６参照）。【０２８９】
これらの結果から、ＣＤ３００ａ（ＭＡＩＲ−Ｉ）がアトピー性皮膚炎において重要な働きを有していることがより一層確認され、抗ＣＤ３００ａ抗体であるＴＸ４１のアトピー性皮膚炎の治療薬としての効果が確認された。【０２９０】
［実施例２Ｍ］ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスにおける喘息病態の確認
方法：ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス及び野生型マウスにＯＶＡ１００μｇ／アルミニウムハイドロゲル（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ）１００μＬとしたものを０，７，１４日目に腹腔内投与し、２１，２２、２３日目に１０％ＯＶＡ／ＰＢＳとした噴霧液を鼻腔投与して喘息を誘導した（図２８）。２５日目にメサコリンを吸入させ、高性能呼吸機能解析システム（プライムテック株式会社製「ＦＬｅｘｉｖｅｎｔ（ＴＭ）」）にて気道内圧を測定した。また、ＰＢＳ  ３ｍＬにて気管支を洗浄し、洗浄液を回収した。気管支洗浄液は細胞を遠心分離し、フローサイトメトリー法にて表面マーカーから細胞集団を解析した。
結果：ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでは野生型マウスと比較して、メサコリンを吸入させた際の気道内圧が低下しており（図２９）、また、気管支洗浄液中の総細胞数、及び好酸球数が低下していた（図３０）。ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスは野生型マウスに比べて喘息の病態が軽減されていることが分かる。【０２９１】
［実施例２Ｎ］ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスのＩｇＥ値等
方法：実施例２Ｍと同様に喘息を誘導した（図２８）。２５日目に血清を回収し、血清中のＩｇＥ, ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１,ＩｇＧ２ｂ, ＩｇＧ２ｃ, ＩｇＧ３をＥＬＩＳＡ法にて測定した。
結果：ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでは野生型マウスと比較して、ＩｇＥ, ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１が低下しており、一方で、ＩｇＧ２ｂ, ＩｇＧ２ｃの増加が認められた（図３１〜図３５）。
Ｔｈ２細胞による免疫応答の指標であるＩｇＥおよびＯＶＡ特異的ＩｇＧ１が低下したことは、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスではＴｈ２細胞の誘導が減ってアレルギー反応が軽減されることを示している（図３１、図３２）。
また、Ｔｈ１細胞による免疫応答の指標であるＩｇＧ２ｃの血中濃度については、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの方がＷＴマウスよりも高く、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスではＴｈ１細胞の免疫反応がＷＴマウスよりも増強される結果となった。このＴｈ１細胞の免疫反応の増強は、Ｔｈ２細胞の免疫反応が相対的に低減されたことを示している（図３３）。【０２９２】
［実施例２Ｏ］ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス免疫後の縦隔リンパ節の確認
方法：ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス及び野生型マウスにＯＶＡ１００μｇ／アルミニウムヒドロゲル（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ）１００μＬとしたものを腹腔内投与して３日目に縦隔リンパ節を採取し、細胞を単離して細胞数を測定した。
結果：ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでは野生型マウスと比較して、縦隔リンパ節の腫大が認められ（図３６）、その細胞数も増加していた（図３７）。【０２９３】
［実施例２Ｐ］ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの粘膜固有層での制御性T細胞数の確認
方法：ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウス及び野生型マウスにＯＶＡ１００μｇ／アルミニウムハイドロゲル（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｌ)１００μＬとしたものを腹腔内投与して７日目に縦隔リンパ節を採取した。細胞を単離して染色し、細胞内転写因子の発現をフローサイトメトリー法にて解析した。
結果：ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスでは野生型マウスと比較して、縦隔リンパ節におけるＣＤ４陽性細胞中のＣＤ２５陽性ＦＯＸＰ３陽性細胞、つまりＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞が増加していた（図３８〜図４０）。各種の免疫抑制機能を有するＴｒｅｇ細胞が増加していることは、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスが野生型マウスより免疫機能が抑制された状態にあり、結果的に喘息の病態が軽減されることが示唆されている。【０２９４】
［実施例２Ｑ］ＣＤ１１ｂ＋樹状細胞におけるＣＤ３００ａの発現の確認
方法：脾臓、及び縦隔リンパ節におけるＣＤ３００ａの発現をフローサイトメトリー法にて解析した。
結果：ＣＤ３００ａは、野生型マウスの脾臓細胞および縦隔リンパ節細胞のいずれにおいても、ＣＤ１１ｂ陽性ＣＤ１１ｃ陽性細胞で強い発現が認められた(図４１〜図４８)。【０２９５】
［実施例２Ｒ］ＴＸ４１抗体投与による喘息病態への影響の確認
方法：野生型マウスにＯＶＡ１００μｇ／アルミニウムハイドロゲル（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ）  １００μＬとしたものを０日目、７日目、１４日目に腹腔内投与し、２１日目、２２日目、２３日目に１０％ＯＶＡ／ＰＢＳとした噴霧液を鼻腔投与して喘息を誘導した（図４９）。この際、０、３、７、１０日目にＴＸ４１抗体もしくはコントロールＩｇＧ抗体を３００μｇずつ腹腔内投与した。２５日目にメサコリンを吸入させ、高性能呼吸機能解析システム（プライムテック株式会社製「ＦＬｅｘｉｖｅｎｔ（ＴＭ）」）にて気道内圧を測定した。また、ＰＢＳ  ３ｍＬにて気管支を洗浄し、洗浄液を回収した。気管支洗浄液は細胞を遠心分離し、フローサイトメトリー法にて好酸球数を解析した。
結果：ＴＸ４１抗体を投与したマウスではコントロール抗体を投与したマウスと比較して、メサコリンを吸入させた際の気道内圧が低下しており、また、気管支洗浄液中の総細胞数、及び好酸球数が低下していた（図５０〜図５２）。ＴＸ４１抗体（抗ＣＤ３００ａ抗体）は喘息の病態を軽減する効果を有することが分かる。【０２９６】
［実施例２Ｓ］Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８投与による縦隔リンパ節における制御性T細胞の増加の有無の確認
方法：野生型マウスにＯＶＡ１００μｇ／アルミニウムハイドロゲル（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ）  １００μＬとしたものを腹腔内投与して7日目に縦隔リンパ節を採取した。この際、１、２日目にＤ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８もしくはコントロールタンパク質（ＥＰＴ  ＭＦＧ−Ｅ８）を１００μｇ腹腔内投与した。縦隔リンパ節の細胞を単離して染色し、細胞内転写因子の発現をフローサイトメトリー法にて解析した。
結果：Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８投与マウスではコントロールタンパク質(ＥＰＴ  ＭＦＧ−Ｅ８)投与マウスと比較して、縦隔リンパ節におけるＣＤ４陽性細胞中のＣＤ２５陽性ＦＯＸＰ３陽性細胞が増加していた（図５３）。Ｄ８９Ｅ  ＭＦＧ−Ｅ８は、各種の免疫抑制機能を有するＴｒｅｇ細胞を増加させることで、喘息の病態を軽減する効果を有することが示唆されている。【０２９７】
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【図１】
2014073529.tif 000003
【図２Ａ】
2014073529.tif 000004
【図２Ｂ】
2014073529.tif 000005
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2014073529.tif 000007
【図２Ｅ】
2014073529.tif 000008
【図２Ｆ】
2014073529.tif 000009
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2014073529.tif 000013
【図４Ａ】
2014073529.tif 000014
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年9月3日(2014.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３００ａとホスファチジルセリンの結合を阻害する下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選ばれる物質を含有する、ＣＤ３００ａを発現するミエロイド系細胞の抑制性シグナル伝達を抑制するための活性調節剤を有効成分として含有することを特徴とする、アレルギー疾患を治療または予防するための医薬品：
（ｉ）可溶型ＴＩＭ−１、可溶型ＴＩＭ−４および可溶型スタビリンからなる群から選択される少なくとも１種類；
（ｉｉ）配列番号３で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号４で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗ヒトＣＤ３００ａ抗体；
（ｉｉｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＨ鎖可変領域と、配列番号２で表されるアミノ酸配列または当該アミノ酸配列に対して１，２，３，４または５個のアミノ酸の置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列からなるＬ鎖可変領域とを有する、抗マウスＣＤ３００ａ抗体。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
前記アレルギー疾患が、アトピー性皮膚炎または喘息である、請求項１に記載の医薬品。
【請求項８】
アレルギー疾患について、病態解析を行うための、またはその治療薬もしくは予防薬の有効成分となりうる候補物質をスクリーニングするための、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用であって、
前記ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスを、アレルギー疾患を誘導させる物質を投与したときにアレルギー疾患を誘発しにくいモデルマウスとして使用することを特徴とする、ＣＤ３００ａ遺伝子欠損マウスの使用。
【国際調査報告】
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