(57)【要約】要約  検出プローブの使用量を減らしても、検出感度（Ｓ／Ｎ比）を低下させずに標的核酸を高感度に検出できる、標的核酸の検出方法が開示されている。標的核酸とハイブリダイズする検出プローブ及び支持体に固定された捕捉プローブとを用いるサンドイッチハイブリダイゼーション法による標的核酸の検出方法は、検出プローブ及び／又は捕捉プローブの核酸分子中の少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されており、標的核酸と検出プローブ及び／又は捕捉プローブとがハイブリダイズして形成された複合体に光照射して、光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させる工程を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸とハイブリダイズする検出プローブ及び支持体に固定された捕捉プローブとを用いるサンドイッチハイブリダイゼーション法による標的核酸の検出方法であって、
検出プローブ及び／又は捕捉プローブの核酸分子中の少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されており、
標的核酸と検出プローブ及び／又は捕捉プローブとがハイブリダイズして形成された複合体に光照射して、光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させる工程を有する、検出方法。
【請求項２】
検出プローブの核酸分子中の少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されている、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
捕捉プローブの核酸分子中の少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されている、請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
光反応性基が３−シアノビニルカルバゾール基、ｐ−カルバモイルビニルフェノール基、４，５’，８−トリメチルソラレン基及びＮ３−メチル−５−シアノビニルウラシル基から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンドイッチハイブリダイゼーション法による標的核酸の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種生物の遺伝情報解析の研究が始められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質及びこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能については、各種の方法で調べることができる。主なものとしては、核酸についてはノーザンブロッティング、あるいはサザンブロッティングのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質については、ウエスタンブロッティングに代表されるような、蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能及び発現について調べることができる。【０００３】
核酸検出方法の一つとしてサンドイッチハイブリダイゼーション法が知られている。サンドイッチハイブリダイゼーション法は、フィルター上に固定された捕捉プローブを用いる。捕捉プローブは、標的核酸の第１の部分に相補的である。一つの段階において、フィルターに結合した捕捉プローブを、標的核酸配列について調べるべき試料に曝露し、さらに、標的核酸の第２の部分に相補的な標識付けされた検出プローブに曝露するが、前述の第２の部分は、第１のプローブが相補的な標的の部分とは別（すなわち、それらと重複していない）である（特許文献１、２、非特許文献１）。この手法は、フィルター上に試料を固定化するのに要する手間を解消し、また第１のプローブを支持体に適合するように選択することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第４，４８６，５３９号
【特許文献２】特開平７−７５６００号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Sinikka Parkkinen et al., Journal of Medical Virology 20:279-288(1986)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来、捕捉プローブ固定化支持体上で、サンドイッチハイブリダイゼーション法を用いて標的核酸を検出する場合、検出感度を向上させるために、標的核酸量に対して過剰量の検出プローブの使用を必要としていた。例えば、文献（特開２００１−６９９９７号公報）によると、標的核酸量に対して、２５万倍当量の検出プローブを必要とされている。しかし、過剰量の検出プローブを使用すると、余剰の検出プローブが、別の標的核酸を捕捉するための捕捉プローブとクロスハイブリダイゼーション（非特異吸着）してしまい、その結果、検出感度（Ｓ／Ｎ比）が低下するといった課題があった。【０００７】
本発明の目的は、検出プローブの使用量を減らしても、検出感度（Ｓ／Ｎ比）を低下させずに標的核酸を高感度に検出できる、標的核酸の検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、サンドイッチハイブリダイゼーション法において、標的核酸と検出プローブ及び／又は捕捉プローブとがハイブリダイズして形成された複合体において、検出プローブ及び／又は捕捉プローブの核酸塩基に置換させた光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で光照射により共有結合を形成させることにより、過剰量の検出プローブを使用せずに標的核酸を高感度に検出することができることを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）標的核酸とハイブリダイズする検出プローブ及び支持体に固定された捕捉プローブとを用いるサンドイッチハイブリダイゼーション法による標的核酸の検出方法であって、検出プローブ及び／又は捕捉プローブの核酸分子中の少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されており、標的核酸と検出プローブ及び／又は捕捉プローブとがハイブリダイズして形成された複合体に光照射して、光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させる工程を有する、検出方法。
（２）前記検出プローブの核酸分子中の少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されている、（１）に記載の検出方法。
（３）捕捉プローブの核酸分子中の少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されている、（２）に記載の検出方法。 
（４）光反応性基が３−シアノビニルカルバゾール基、ｐ−カルバモイルビニルフェノール基、４，５’，８−トリメチルソラレン基及びＮ３−メチル−５−シアノビニルウラシル基から選択される少なくとも１種である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の検出方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、使用する検出プローブの量を低減することができ、そのため捕捉プローブとのクロスハイブリダイゼーション（非特異吸着）を抑制することができる。その結果、検出感度（Ｓ／Ｎ比）を向上させることができるので、微量の標的核酸を高感度に検出することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の検出方法に供せられる標的核酸としては、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの標的核酸を含む検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、ぬぐい液、各種組織液等の体液や、各種組織、パラフィン包埋検体（ＦＦＰＥ）及びその切片、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、被検物質となる標的核酸は、血液や細胞から常法により抽出した検体核酸であってもよく、検体から抽出したＤＮＡやＲＮＡなどを用いることができる。ＤＮＡとしては、染色体ＤＮＡ，ウイルスＤＮＡ，細菌、カビ等のＤＮＡ、ＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡ，それらの一部である断片などを用いることができるがこれらに限定されるものではない。ＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ，リボソームＲＮＡ，ｓｍａｌｌ  ＲＮＡやそれらの一部である断片などを用いることができるがこれらに限定されるものではない。また、化学的に合成したＤＮＡ、あるいはＲＮＡ等も標的核酸として用いることができる。
【００１２】
前記検体核酸には、測定の対象とする標的核酸以外の核酸成分（非標的核酸）も含まれていることがある。これら非標的核酸は、標的核酸との性状の差を考慮して除去してもかまわないし、除去せずに被検物質として用いてもよい。
【００１３】
標的核酸は、該標的核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよく、この場合、測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を標的核酸とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオシド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。
【００１４】
本発明の方法は、標的核酸の有無、ウイルスの遺伝子型、細菌の種及び株、カビの種及び株等を区別した検出、ＳＮＰ（一塩基多型）の検出、メッセンジャーＲＮＡの検出、ｍｉＲＮＡの検出、ＣＧＨ、コピー数変動、ゲノムＤＮＡ配列の欠落・重複・融合、あるいは転写産物の欠落・重複・融合の検出に用いることができる。また、検出プローブからの信号強度を測定することにより標的核酸の定量にも適用することができる。なお、標的核酸の定量を行えば、必然的に標的核酸の検出が行われることになるので、本発明の「検出方法」は定量を伴う場合も包含する。
【００１５】
本発明の方法には、標的核酸をそのまま適用することも可能であるし、標的核酸の断片化処理物を適用することも可能である。標的核酸の長さについて、捕捉プローブ、検出プローブがハイブリダイズすれば特に制限はないが、標的核酸が長い場合（１５００塩基以上、特に４０００塩基以上の場合）には、断片化処理により、後述するように適切な長さに断片化した断片化処理物を適用することが好ましい。断片化処理物は、生じた核酸断片から特定の核酸断片を選択する必要はなく、断片化処理物をそのまま本発明の方法に供することができ、それによって検出感度を高めることが可能である。
【００１６】
断片化のために標的核酸を切断する方法としては、超音波を照射して切断する方法、酵素で切断する方法、制限酵素で切断する方法、ネブライザーを用いる方法、酸やアルカリで切断する方法などを用いることができる。超音波で切断する方法の場合、標的核酸に照射する超音波の出力強度と照射時間を制御することにより、所望の長さに切断することが可能である。
【００１７】
支持体は、スライドガラス、メンブレン、ビーズ等を用いることができる。支持体の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマーなどを挙げることができる。複数の捕捉プローブを支持体に固定したマイクロアレイを用いることにより、複数種類の標的核酸を一斉に検出することができる。
【００１８】
本発明の標的核酸の検出方法は、サンドイッチハイブリダイゼーション法に好ましく適用される。サンドイッチハイブリダイゼーション法では、支持体に固定された捕捉プローブと、検出プローブとを用いる。捕捉プローブ、検出プローブは、通常それぞれ標的核酸の異なる一部分に相補的な塩基配列を有し、標的核酸とハイブリダイゼーションして選択的に結合し得る物質である。標的核酸と検出プローブ及び／又は捕捉プローブとがハイブリダイズして、複合体が形成される。この複合体中の検出プローブに結合させた標識体を検出（測定）することにより、標的核酸を検出することができる。
【００１９】
本発明において、捕捉プローブとしては、具体的にはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）などの核酸誘導体を用いることができる。ここで誘導体とは、核酸の場合、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド(例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど)を含む誘導体などの化学修飾誘導体を意味する。
【００２０】
特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう捕捉プローブに該当する。本発明に用いる捕捉プローブは、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。捕捉プローブとして、特に好ましいものは、核酸である。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが２００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能である。
【００２１】
捕捉プローブは、標的核酸配列と相補的な配列を含んでいれば良く、どの領域を選択しても良い。以下で述べる検出プローブの配列と重複しないことが好ましい。また、標的核酸の異なる領域とハイブリダイズする複数種類の捕捉プローブを用いることもできる。
【００２２】
標的核酸が、二本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＲＮＡである場合、センス鎖、アンチセンス鎖のいずれかの鎖に対して相補的な配列を捕捉プローブとして選択することができる。この場合、以下で述べる検出プローブと捕捉プローブは、同じ鎖の配列を選択することが好ましい。
【００２３】
検体核酸に含まれる、異なる標的核酸を区別して検出する場合は、例えば、患者に感染しているウイルスの型を区別して検出するなど、検体核酸に含まれうる核酸配列の中から、特異性が高い配列領域を選択することが好ましい。すなわち、捕捉プローブとして選択した配列が、検体核酸に含まれる全ての配列において、当該領域以外に相同性の高い配列がないことを意味する。
【００２４】
本発明で用いる検出プローブ、捕捉プローブは、そのいずれかの核酸分子中の少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されているか、あるいは検出プローブ、捕捉プローブの両方の核酸分子中のそれぞれ少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されている。
【００２５】
ここで、光反応性基とは、特定の波長の光が照射されることにより、有機合成反応における反応性が活性化される有機基（光反応性部位）である。プローブ中の核酸塩基が光反応性基に置換された後のプローブは、置換前の核酸塩基と同様に標的核酸とハイブリダイズして複合体を形成することが可能である。核酸塩基が光反応性基に置換されている捕捉プローブ及び／又は検出プローブと標的核酸とがハイブリダイズして形成された複合体に、当該光反応性基の光反応性部位を活性化し得る波長の光を照射すると、当該光反応性部位が活性化され、当該光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合が形成される。
【００２６】
このような光反応性基として、３−シアノビニルカルバゾール基及びその誘導体（WO2009/066447（EP2216338, US 2010-274000 A)、Yoshinaga Yoshimura et al., Organic Letters 10:3227-3230(2008))、ｐ−カルバモイルビニルフェノール基(Takehiro Ami et al., Organic & Biomolecular Chemistry 5:2583-2586(2007))、4,5',8-トリメチルソラレン基(Akio Kobori et al., Chemistry Letters 38:272-273(2009))並びにN3-メチル-5-シアノビニルウラシル基(Kenzo Fujimoto et al., Chemical Communications: 3177-3179(2005)等があげられる。これらの文献は、参照により本明細書に組み入れられたものとする。これらのうち、３−シアノビニルカルバゾール基及びその誘導体（WO2009/066447)が好ましく、特に３−シアノビニルカルバゾール基が好ましい。
【００２７】
ここで、３−シアノビニルカルバゾール基及びその誘導体は、WO2009/066447に記載されているとおり、下記式(I)で表される基である。
【００２８】
【化１】
2014034753.tif 000002
【００２９】
式(I)中、Rａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり;R1及びR2は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素である。Rａがシアノ基、R1及びR2が水素の場合が３−シアノビニルカルバゾール基である。なお、光反応性基として、３−シアノビニルカルバゾール基又はその誘導体を用いるときは、捕捉プローブ又は検出プローブ中の当該塩基の5'側にプリン塩基を隣接するように設計することが好ましい。
【００３０】
ｐ−カルバモイルビニルフェノール基は、下記式(II)で表される基である。
【００３１】
【化２】
2014034753.tif 000003
【００３２】
4,5',8-トリメチルソラレン基は、下記式(III)で表される基である。
【００３３】
【化３】
2014034753.tif 000004
【００３４】
N3-メチル-5-シアノビニルウラシル基は、下記式(IV)で表される基である。
【００３５】
【化４】
2014034753.tif 000005
【００３６】
これらの光反応性基は、核酸を構成するヌクレオチド中の塩基とそっくり置き換わるものであり、式(I)〜(IV)で示される各光反応性基中のフリーの結合手がヌクレオチド中の糖部分と直接結合する。例えば、式(I)で示される３−シアノビニルカルバゾール基（式(I)中、Rａがシアノ基、R1及びR2が水素のもの）は、デオキシリボースと次のように結合する。他の光反応性基も同様に糖と結合する。
【００３７】
【化５】
2014034753.tif 000006
【００３８】
上記した各光反応性基及びそれとデオキシリボース等の糖との結合物は、上記したそれぞれの文献に記載されている公知の方法により製造することができる。なお、これらの公知の方法は、有機化学合成の常識に従った通常の合成方法である。
【００３９】
例えば、一般式(V)中の３−シアノビニルカルバゾール基は、WO2009/066447の実施例では、３−ヨウ化カルバゾール(3.52mmol)とアクリロニトリル(7.04mmol)とを、ジオキサン中、トリフェニルホスフィン(0.53μmol)、パラジウムアセテート(0.18μmol)及びトリエチルアミン(4.23mmol)の存在下、７５℃、11.5時間加熱還流することにより製造されている。また、３−シアノビニルカルバゾールとデオキシリボースとの結合は、同実施例では、アセトニトリル中、３−シアノビニルカルバゾール(1.20mmol)と、Hoffer’s chlorosugar（デオキシリボースの１位のヒドロキシル基を塩素に、デオキシリボースの３位と６位のヒドロキシル基をｐ−トルオイルオキシ基に置き換えたもの）(1.24mmol)とをKOH(3.87mmol)とTDA-1(34μmol)の存在下で 室温で２０分間撹拌し、次いで、メタノール中、NaOMe(1.2mmol)を加えて室温で3.5時間撹拌してデオキシリボースの３位と６位のヒドロキシル基を脱保護することにより製造されている。ｐ−カルバモイルビニルフェノールとデオキシリボースとの結合物は、Takehiro Ami et al., Organic & Biomolecular Chemistry 5:2583-2586(2007)に記載の方法では、同様に、p-ヨードフェノールと、Hoffer’s chlorosugarとを反応させて結合させ、これにメチルメタクリレートを反応させることにより製造されている。4,5',8-トリメチルソラレン基とデオキシリボースとの結合物は、Akio Kobori et al., Chemistry Letters 38:272-273(2009)に記載の方法では、同様に、3-ヨウ化4,5',8-トリメチルソラレンとHoffer’s chlorosugarとを反応させて製造している。N3-メチル-5-シアノビニルウラシル基とデオキシリボースとの結合物は、Kenzo Fujimoto et al., Chemical Communications: 3177-3179(2005)に記載の方法では、同様に、2-ヨウ化N3-メチルウリジンとアクリロニトリルとを反応させて製造している。デオキシリボースが他の糖（例えばリボース等）の場合でも同様に光反応性基と糖との結合物を得ることができる。
【００４０】
光反応性基と糖との結合物が得られれば、これを含む核酸は、常法であるホスホロアミダイト法により容易に製造することができる。例えば、上記式(V)で示される３−シアノビニルカルバゾールとデオキシリボースとの結合物は、WO2009/066447の実施例では、ピリジン中、該結合物(0.29mmol)と4,4-ジメトキシトリチルクロリド(0.35mmol)と4-(ジメチルアミノ）ピリジンとを室温で１８時間反応させて、デオキシリボースの６位のヒドロキシル基を保護し、これ(0.17mmol)をアセトニトリル中、2-シアノエチル-N,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロアミダイト(0.17mmol)と室温で１時間撹拌することにより、所望のホスホロアミダイト化物を製造している。他の光反応性基とデオキシリボースとの結合物も同様にしてホスホロアミダイト化することが可能である。ホスホロアミダイト化は常法であり、そのための試薬も市販されているので容易に行うことができる。
【００４１】
光反応性基と糖との結合物のホスホロアミダイト化物が得られれば、市販のオリゴヌクレオチド合成機を用いて、所望の塩基配列を持つ核酸を合成することができる。
【００４２】
なお、光反応性基を有する核酸自体は、所望の遺伝子等の発現を阻害する試薬として用いられている周知のものであり、光反応性基を含み、所望の塩基配列を持つ核酸の合成は、商業サービスとして提供されており、この商業サービスを行っている会社に、所望の塩基配列を持つ核酸であって、所望の位置に所望の光反応性基を導入したものの合成を依頼することによっても該核酸を入手することが可能である。
【００４３】
本発明において、検出プローブとしては、具体的にはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡなどの核酸誘導体を用いることができる。ここで誘導体とは、核酸の場合、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド(例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど)を含む誘導体などの化学修飾誘導体を意味する。
【００４４】
特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう検出プローブに該当する。本発明に用いる検出プローブは、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。検出プローブとして、特に好ましいものは、核酸である。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが２００塩基までの核酸は、合成機で容易に合成が可能である。
【００４５】
標的核酸が二本鎖ＤＮＡである場合、センス鎖、アンチセンス鎖のいずれかの鎖に対して相補的な配列を検出プローブとして選択することができる。この場合、上述した捕捉プローブと検出プローブは、同じ鎖の配列を選択することが好ましい。
【００４６】
検出プローブは、標的核酸配列と相補的な配列を含んでいれば良く、どの領域を選択しても良い。ただし、上述した捕捉プローブの配列と重複しないことが好ましい。
【００４７】
検出プローブの配列は、捕捉プローブと塩基配列の相同性が低いことが望ましく、好ましくは２０％以下であり、より好ましくは１０％以下である。ここで、２つの塩基配列の相同性は、塩基ができるだけ多く一致するように２つの配列を整列させ（必要に応じギャップを入れる）、一致した塩基数を全塩基数（２つの塩基配列の塩基数が異なる場合には大きい方の塩基数）で除すことにより得られる数値であり、FASTAやBLAST等の市販のソフト（インターネットでも提供されている）により容易に算出可能である。
【００４８】
検体核酸に含まれる、複数種類の標的核酸を検出する場合、検出対象の標的核酸の間で相同性が１００％である配列を、共通検出プローブとして用いることができる。共通検出プローブは、検出対象の標的核酸の間で相同性が１００％でない場合、縮重配列を用いても良い。縮重配列については、「バイオ実験イラストレイテッド  本当にふえるＰＣＲ」、（１９９９年）、中山広樹編、（株）秀潤社発行、１２１頁〜１２５頁を参考にすることができる。
【００４９】
検出プローブには標識体を結合させることができる。検出プローブが核酸である場合、５'末端又は３'末端のいずれか、又は両方に標識体を結合させることができる。また、検出プローブ内部にも標識体を導入することが可能である。標識体の結合には化学反応、酵素反応などを用いることができる。好ましくは、化学反応を用いて反応させる。さらに好ましくは、検出プローブを化学合成する際に、末端に標識体を結合させる。検出プローブの内部にも標識体を結合させることができる。標識体の結合には化学反応を用いることができ、合成機でビオチン標識を挿入することができる。たとえば、グレンリサーチ社から入手可能な、ＢｉｏｔｉｎＴＥＧ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ, Ｂｉｏｔｉｎ−ｄＴなどを用いてビオチン標識を挿入することができる。
【００５０】
検出プローブは、一種類の標的核酸に対して、一種又は複数種の塩基配列を同時に使用することができる。複数種の検出プローブを使用する際、各々の検出プローブは塩基配列はもちろん、鎖長が異なっていてもかまわない。標的核酸の検出のＳ／Ｎ比を向上させるために、複数種の検出プローブを使用することが好ましい。
【００５１】
本発明において、使用できる標識体としては、タンパク質結合性物質、蛍光色素、りん光色素、放射線同位体など、標識に用いる公知の物質を用いることができる。好ましいのは、タンパク質結合性物質である。タンパク質結合性物質の例としてビオチンが挙げられる。ビオチンはアビジン又はストレプトアビジンと結合することができる。アビジン又はストレプトアビジンに蛍光色素が結合したもの、アルカリフォスファターゼやホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素が結合したものを用いることができる。アルカリフォスファターゼやホースラディッシュペルオキシダーゼを用いる場合には、それぞれの基質を添加し、基質と酵素が反応した結果、発光反応が生じる。発光反応は、プレートリーダーやＣＣＤカメラなどを用いて検出する。
【００５２】
標識体として、測定が簡便で、信号が検出しやすい蛍光色素を用いてもよい。具体的には、シアニン（シアニン２）、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン（シアニン３）、シアニン３．５、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン（シアニン５）、シアニン５．５、シアニン７、オイスター、ＢＯＤＩＰＹ系色素、フィコエリスリンなどの公知の蛍光色素が挙げられる。蛍光色素の検出は、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナーなどにより行うことができる。
【００５３】
また、標識体として発光性を有する半導体微粒子を用いてもよい。このような半導体微粒子としては、例えばカドミウムセレン（ＣｄＳｅ）、カドミウムテルル（ＣｄＴｅ）、インジウムガリウムリン（ＩｎＧａＰ）、カルコパイライト系微粒子、シリコン（Ｓｉ）、などが挙げられる。
【００５４】
検出されたシグナルは、周辺ノイズと比較される。具体的には、捕捉プローブが固定されている基板上の位置から得られたシグナル値と、捕捉プローブが固定されていない基板上の位置から得られたシグナル値（ノイズ値）を比較し、前者の数値とノイズ値の比をＳ／Ｎ比とする。
【００５５】
支持体に捕捉プローブを固定化する方法としては、支持体上面部でオリゴ核酸を合成する方法と、あらかじめ合成しておいたオリゴ核酸を支持体上面部へ滴下し固定する方法が知られており、いずれも適用できる。前者の方法には、Ｒｏｎａｌｄらの方法（米国特許第５７０５６１０号明細書）、Ｍｉｃｈｅｌらの方法（米国特許第６１４２２６６号明細書）、Ｆｒａｎｃｅｓｃｏらの方法（米国特許第７０３７６５９号明細書）がある。これらの方法ではＤＮＡ合成反応時に有機溶媒を用いるため、支持体は有機溶媒に耐性のある材質であることが望ましい。例えば、特表平１０−５０３８４１号公報に記載の方法を用いて作製した凹凸構造を有したガラス製支持体を用いることができる。特にＦｒａｎｃｅｓｃｏらの方法においては、支持体の裏面から光を照射し、ＤＮＡ合成を制御するため、支持体は透光性を有する材質であることが好ましい。後者の方法には、廣田らの方法（特許第３９２２４５４号）やガラスキャピラリーを用いる方法が挙げられる。ガラスキャピラリーの一例としては、自作したガラスキャピラリーやマイクロピペット（（株）マイクロサポート社製；ＭＰ−００５）などの市販製品を用いることができるが、これらの方法に限定されるものではない。
【００５６】
生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Ｂｌｉｎらの方法（ Ｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３： ２３０３ （１９７６））等により、また、ＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法［（Ｆａｖａｌｏｒｏ ｅｔ.ａｌ., Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５: ７１８ (１９８０）］等により行うことができる。固定化する核酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
【００５７】
本発明の検出方法は、サンドイッチハイブリダイゼーション法によるものである。サンドイッチハイブリダイゼーション法自体は周知であり、標的核酸中の異なる２つの領域を、それぞれ検出プローブと捕捉プローブとハイブリダイズさせて標的核酸を検出プローブと補足プローブでサンドイッチし、検出プローブを定量することにより標的核酸を定量するものである。本発明の方法は、標的核酸と検出プローブ及び／又は捕捉プローブとがハイブリダイズして形成された複合体に光照射して、検出プローブ及び／又は捕捉プローブ中の光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させる工程を有する。光照射は、使用した光反応性基に応じて、これが活性化される波長を含む光で行うことができる。例えば、光反応性基として３−シアノビニルカルバゾール基を用いるときは、波長３４０〜３８０ｎｍの光を用いることができる。上記した他の光反応性基をを用いるときも波長３４０〜３８０ｎｍの光を用いることができる。光照射させる装置としては、前記波長を含む光を照射することができる、トランスイルミネーター、ブラックライト、ＵＶ−ＬＥＤ、ＵＶレーザー等を使用することができる。
【００５８】
本発明においては、検出プローブ、捕捉プローブのいずれか、あるいは検出プローブ及び捕捉プローブの両方の核酸塩基が光反応性基に置換される。すなわち、本発明の方法は、（Ａ）検出プローブのみと標的核酸との間で共有結合を形成させる工程を含む方法、（Ｂ）補足プローブのみと標的核酸との間で共有結合を形成させる工程を含む方法、（Ｃ）検出プローブ及び補足プローブの両方と標的核酸との間で共有結合を形成させる各工程を含む方法、のいずれも採用することができる。
【００５９】
本発明の核酸の検出方法の例として、各プローブと標的核酸とのハイブリダーゼーションの順序と、光反応性基を導入するプローブの選択との組合せにより、例えば次の方法（１）〜（７）が挙げられる。
【００６０】
方法（１）：標的核酸と検出プローブとをハイブリダイズさせる。次いで、検出プローブとハイブリダイズした標的核酸と、支持体に固定された、少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されている捕捉プローブとをハイブリダイズさせる。こうして形成された複合体に光照射して、捕捉プローブ中の光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させる。
【００６１】
方法（２）：標的核酸と、少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されている検出プローブとをハイブリダイズさせる。ここで形成された複合体に光照射して、検出プローブ中の光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させる。この共有結合を形成させた複合体を、支持体に固定された捕捉プローブとハイブリダイズさせる。
【００６２】
方法（３）：標的核酸と、少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されている検出プローブとをハイブリダイズさせる。ここで形成された複合体に光照射して、検出プローブ中の光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させる。この共有結合を形成させた複合体を、支持体に固定された、少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されている捕捉プローブとハイブリダイズさせる。ここで形成された複合体に光照射して、捕捉プローブ中の光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させる。
【００６３】
方法（４）：標的核酸と、支持体に固定された捕捉プローブとをハイブリダイズさせる。形成された複合体と、少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されている検出プローブとをハイブリダイズさせる。ここで形成された複合体に光照射して、検出プローブ中の光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させる。
【００６４】
方法（５）：標的核酸と、支持体に固定された、少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されている捕捉プローブとをハイブリダイズさせる。ここで形成された複合体に光照射して、捕捉プローブ中の光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させる。この共有結合を形成させた複合体と、検出プローブとをハイブリダイズさせる。
【００６５】
方法（６）：標的核酸と、支持体に固定された、少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されている捕捉プローブとをハイブリダイズさせる。ここで形成された複合体に光照射して、捕捉プローブ中の光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させる。この共有結合を形成させた複合体と、少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されている検出プローブとをハイブリダイズさせる。ここで形成された複合体に光照射して、検出プローブ中の光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させる。
【００６６】
方法（７）：標的核酸と、少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されている検出プローブと、支持体に固定した、少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されている捕捉プローブとを同時に接触させて、検出プローブ及び捕捉プローブと標的核酸をハイブリダイズさせる。形成された複合体に光照射して、検出プローブ及び捕捉プローブ中の光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間でそれぞれ共有結合を形成させる。
【００６７】
これら方法のうち、方法（１）〜（３）が好ましく、方法（２）又は（３）がより好ましい。
【００６８】
標的核酸と捕捉プローブ及び／又は検出プローブとハイブリダイゼーションさせる工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、３０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。
【００６９】
各ハイブリダイゼーション工程における検出プローブの使用量は、検出プローブのクロスハイブリの低減を考慮すると、標的核酸に対して少ない方が好ましい。具体的には、標的核酸の１〜１００００当量（モル比）が好ましく、１〜１０００当量がより好ましく、１〜１００当量がさらに好ましい。
【実施例】
【００７０】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００７１】
核酸の調製
以下の実施例、比較例に用いた核酸を表１に示す。【００７２】
標的核酸としては、配列番号１で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡ「Ｔ−０１」及び配列番号２で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡ「Ｔ−０２」及びヒトゲノムＤＮＡを用いた。Ｔ−０１は、日本バイオサービス社にて合成した。Ｔ−０２は、日本バイオサービス社にて合成した。【００７３】
検出プローブ「Ｄ−０１」、「Ｄ−０２」、「Ｄ−０５」、「Ｄ−０６」、「Ｄ−０９」、「Ｄ−１０」、「Ｄ−１１」、「Ｄ−１２」は、５’末端及び３’末端をビオチン標識（ここで、３’末端は、ＢｉｏｔｉｎＴＥＧ標識）した合成ＤＮＡであり、つくばオリゴサービス社にて合成した。Ｄ−０１は、配列番号３で示される塩基配列の２３番目の塩基であるＣの代わりに、光反応性基として３−シアノビニルカルバゾール基を導入した合成ＤＮＡである。Ｄ−０２は、配列番号４で示される塩基配列の３番目の塩基であるＡの代わりに、光反応性基として３−シアノビニルカルバゾール基を導入した合成ＤＮＡである。Ｄ−０５は、配列番号５で示される塩基配列の１３番目の塩基であるＴの代わりに、光反応性基として３−シアノビニルカルバゾール基を導入した合成ＤＮＡである。Ｄ−０６は、配列番号６で示される塩基配列の１３番目の塩基であるＴの代わりに、光反応性基として３−シアノビニルカルバゾール基を導入した合成ＤＮＡである。Ｄ−０９は、配列番号７で示される塩基配列の２２番目の塩基であるＡの代わりに、光反応性基として３−シアノビニルカルバゾール基を導入した合成ＤＮＡである。Ｄ−１０は、配列番号８で示される塩基配列の２３番目の塩基であるＴの代わりに、光反応性基として３−シアノビニルカルバゾール基を導入した合成ＤＮＡである。Ｄ−１１は、配列番号９で示される塩基配列の１６番目の塩基であるＣの代わりに、光反応性基として３−シアノビニルカルバゾール基を導入した合成ＤＮＡである。Ｄ−１２は、配列番号１０で示される塩基配列の２１番目の塩基であるＴの代わりに、光反応性基として３−シアノビニルカルバゾール基を導入した合成ＤＮＡである。【００７４】
検出プローブ「Ｄ−０３」、「Ｄ−０４」、「Ｄ−０７」、「Ｄ−０８」、「Ｄ−１３」、「Ｄ−１４」、「Ｄ−１５」、「Ｄ−１６」は、それぞれ配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０で示される塩基配列を有し、５’末端及び３’末端をビオチン標識（ここで、３’末端は、ＢｉｏｔｉｎＴＥＧ標識）した合成ＤＮＡであり、オペロン社にて合成した。【００７５】
捕捉プローブ「Ｃ−０１」は、配列番号１１で示される塩基配列を有し、５’末端にアミノ基修飾をいれた合成ＤＮＡであり、オペロン社にて合成した。【００７６】
捕捉プローブ「Ｃ−０２」は、配列番号１２で示される塩基配列の１８番目の塩基であるＴの代わりに、光反応性基として３−シアノビニルカルバゾール基を導入し、５’末端をビオチン標識した合成ＤＮＡであり、つくばオリゴサービス社にて合成した。【００７７】
捕捉プローブ「Ｃ−０３」は、配列番号１２で示される塩基配列を有し、５’末端をビオチン標識した合成ＤＮＡであり、オペロン社にて合成した。【００７８】
捕捉プローブ「Ｃ−０４」は、Ｎ’末端に２分子のＯリンカー（−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＯ−）を介してビオチン標識、Ｃ’末端にリシン修飾したＰＮＡ（ペプチド核酸）であり、ＰＡＮＡＧＥＮＥ社にて合成した。【００７９】
捕捉プローブ「Ｃ−０５」は、配列番号１３で示される塩基配列の１９番目の塩基であるＡの代わりに、光反応性基として３−シアノビニルカルバゾール基を導入し、５’末端にアミノ基修飾をいれた合成ＤＮＡであり、つくばオリゴサービス社にて合成した。【００８０】
捕捉プローブ「Ｃ−０６」、「Ｃ−０７」、「Ｃ−０８」、「Ｃ−０９」、「Ｃ−１０」は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７で示される塩基配列を有し、５’末端にアミノ基修飾をいれた合成ＤＮＡであり、オペロン社にて合成した。【００８１】
【表１】
2014034753.tif 000007
【００８２】
表１において、塩基配列中の「Ｋ」は、光反応性基として、３−シアノビニルカルバゾール基を導入したものを示す。また、Ｃ−０４において、Ｎ’末端及びＣ’末端とは、それぞれＰＮＡのアミノ末端側、カルボキシル末端側を示す。【００８３】
実施例１
実施例１では、標的核酸Ｔ−０１と、光反応性基が導入された検出プローブＤ−０１及びＤ−０２とをハイブリダイズさせ、形成された複合体に光照射して検出プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させ、この複合体を捕捉プローブＣ−０１とハイブリダイズさせて、標的核酸を検出した。【００８４】
ＤＮＡチップの作製
東レ社製の「３Ｄ−Ｇｅｎｅ」（登録商標）の基板（２５６柱基板）に、捕捉プローブとしてＣ−０１を固定したものを用いた。【００８５】
ハイブリダイゼーションと検出
Ｔ−０１（１０μＭ）と、Ｄ−０１（１００μＭ）及びＤ−０２（１００μＭ）を、Ｔ−０１に対するＤ−０１、Ｄ−０２の各使用量が１モル当量となるように混合し、１０ｍＭリン酸バッファー（１００ｍＭ塩化ナトリウム含有）で希釈した。得られた溶液を０．１、１、１００ａｍｏｌの３通りのモル濃度になるよう調整（各々のトータル液量５μＬ）し、それぞれ以下の操作を行った。【００８６】
混合溶液をヒートブロックで９５℃、５分間保持し、その後ゆっくりと室温まで冷却したものを、ガラスチューブに移し、トランスイルミネーターで２０分間、３６５ｎｍ（１０μＷ／ｃｍ２）の光を照射した。これらの溶液に、１Ｘハイブリダイゼーション溶液（１重量％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ、１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、５０ｎｇ/ｍｌ サケ精子ＤＮＡの溶液、５重量％デキストラン硫酸ナトリウム、３０％フォルムアミド）を３５μＬ加え、ハイブリダイゼーション溶液とした。このハイブリダイゼーション溶液を全量ＤＮＡチップに注入し、３２℃で加温したインキュベータにセットした。ハイブリダイゼーションは、「３Ｄ−Ｇｅｎｅ」の標準プロトコールに従い、２５０ｒｐｍで旋回撹拌をしながら、３２℃で２時間行った。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡチップを３０℃に加温した洗浄液（０．５×ＳＳＣ、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム））で５分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥した。さらに、ストレプトアビジンフィコエリスリン（プロザイム社）を染色溶液（５０ｎｇ／μｌストレプトアビジンフィコエリスリン、１００ｍＭ  ＭＥＳ，１Ｍ  ＮａＣｌ，０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））に添加した溶液を用意し、ＤＮＡチップ上に滴下した。３５℃で５分間インキュベーションした。３０℃に加温した洗浄液（６ＸＳＳＰＥ、０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥した。染色済みのＤＮＡチップは、ＤＮＡチップスキャナー（東レ）を用いて蛍光シグナルを検出した。スキャナーの設定は、レーザー出力１００％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を７０％にした。【００８７】
標的核酸Ｔ−０１の検出結果を表２に示した。表２中の数字は、Ｓ／Ｎ比を示す。Ｓ／Ｎ比は、捕捉プローブが固定されている基板上の位置で検出されたシグナル値と、捕捉プローブが固定されていない基板上の位置で検出されたシグナル値の比として算出した。Ｓ／Ｎ比が１より大きくないときは、標的核酸を検出できていないことを意味する。【００８８】
光照射により標的核酸と検出プローブ間で共有結合を形成させたことにより、標的核酸に対する検出プローブの使用量が、従来より非常に少ない１モル当量であっても、０．１、１、１００ａｍｏｌの各濃度において標的核酸を検出できた。【００８９】
比較例１
実施例１において、検出プローブとしてＤ−０１の代わりにＤ−０３を使用し、Ｄ−０２の代わりにＤ−０４を使用し、またハイブリダイズさせて形成された複合体に光照射して検出プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させる工程を行わなかったこと以外は、実施例１と同様の操作を行い、標的核酸Ｔ−０１に対して１モル当量のＤ−０３及びＤ−０４を混合したものを調製し、標的核酸Ｔ−０１を検出した。【００９０】
また、同様にして、標的核酸Ｔ−０１に対して１０００モル当量のＤ−０３及びＤ−０４を混合したものを調製し、標的核酸Ｔ−０１を検出した。【００９１】
以上の結果を表２に示した。【００９２】
比較例１では、検出プローブを１モル当量用いたときは、実施例１と比べてＳ／Ｎ比は大きく低下し、１ａｍｏｌの濃度においてＴ−０１を検出することができなかった。また、検出プローブの使用量を増やして１０００モル当量とした場合も、実施例１と比べてＳ／Ｎ比は大きく低下し、０．１ａｍｏｌの濃度においてＴ−０１を検出できなかった。【００９３】
【表２】
2014034753.tif 000008
【００９４】
以上の実施例１及び比較例１の結果から、サンドイッチハイブリダイゼーションにおいて、標的核酸と光反応性基を導入した検出プローブとがハイブリダイズして形成される複合体に対して光照射して検出プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させることにより、使用する検出プローブ量を減らしても微量の標的核酸を検出することができるようになり、また高感度に標的核酸を検出することができることがわかった。【００９５】
実施例２
実施例２では、標的核酸Ｔ−０１と、検出プローブＤ−０３及びＤ−０４とをハイブリダイズさせて形成された複合体を、光反応性基が導入された捕捉プローブＣ−０２とハイブリダイズさせ、形成された複合体に光照射して補足プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させて、標的核酸を検出した。【００９６】
捕捉プローブ固定ビーズの作製
アビジンコートビーズ（サーモサイエンティフィック社製）に、捕捉プローブとしてＣ−０２を固定し、ビオチン水溶液でブロッキング処理したものを用いた。【００９７】
ハイブリダイゼーションと検出
Ｔ−０１（１０μＭ）と、検出プローブとしてＤ−０３（１００μＭ）及びＤ−０４（１００μＭ）を、Ｔ−０１に対するＤ−０３、Ｄ−０４の各使用量が１モル当量となるように混合し、１０ｍＭリン酸バッファー（１００ｍＭ塩化ナトリウム含有）で希釈し、トータル液量２００μＬ、Ｔ−０１の終濃度を０．２５μＭとした。この混合溶液をヒートブロックで９５℃、５分間保持し、その後ゆっくりと室温まで冷却した。「オムニフィット」（株式会社アイシスの登録商標）ガラスカラム（内径３ｍｍ、両末端に２μｍのステンレスフリッツのカラム栓）に、Ｃ−０２を固定したビーズを入れ、上記混合溶液（２００μＬ）を加えた後、５分間攪拌しながら、ブラックライトで３６５ｎｍの光を照射した。溶液をろ過後、上記ビーズを５０％ＤＭＳＯ水溶液で洗浄後、Ｃｙ３−ストレプトアビジンの水溶液（０．０１μＭ）を添加し染色した。溶液をろ過後、上記ビーズを５０％ＤＭＳＯ水溶液で洗浄した。染色済みのビーズは、ＣＣＤカメラを搭載した蛍光顕微鏡（オリンパス社製）を用いて検出した。その結果を表３に示した。【００９８】
実施例３
実施例３では、標的核酸Ｔ−０１と、光反応性基が導入された検出プローブＤ−０１及びＤ−０２とをハイブリダイズさせ、形成された複合体に光照射して検出プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させ、この複合体を捕捉プローブＣ−０３とハイブリダイズさせ、標的核酸を検出した。【００９９】
捕捉プローブ固定ビーズの作製
アビジンコートビーズ（サーモサイエンティフィック社製）に、Ｃ−０３を固定し、ビオチン水溶液でブロッキング処理したものを用いた。【０１００】
ハイブリダイゼーションと検出
Ｔ−０１（１０μＭ）と、Ｄ−０１（１００μＭ）及びＤ−０２（１００μＭ）を、Ｔ−０１に対するＤ−０１、Ｄ−０２の各使用量が１モル当量となるように混合し、１０ｍＭリン酸バッファー（１００ｍＭ塩化ナトリウム含有）で希釈し、トータル液量４００μＬ、Ｔ−０１の終濃度を０．２５μＭとした。この混合溶液をヒートブロックで９５℃、５分間保持し、その後ゆっくりと室温まで冷却したものを、ガラスチューブに移し、トランスイルミネーターで２０分間、３６５ｎｍ（１０μＷ／ｃｍ２）の光を照射した。「オムニフィット」ガラスカラム（内径３ｍｍ、両末端に２μｍのステンレスフリッツのカラム栓）に、Ｃ−０３を固定したビーズを入れ、上記混合溶液（２００μＬ）を加えた後、５分間攪拌した。溶液をろ過後、上記ビーズを５０％ＤＭＳＯ水溶液で洗浄後、Ｃｙ３−ストレプトアビジンの水溶液（０．０１μＭ）を添加し染色した。溶液をろ過後、上記ビーズを５０％ＤＭＳＯ水溶液で洗浄した。染色済みのビーズは、蛍光顕微鏡（オリンパス社製）を用いて検出した。その結果を表３に示した。【０１０１】
実施例４
実施例３において、捕捉プローブとしてＣ−０３の代わりにＣ−０４を用いたこと以外は、実施例３と同様の操作を行い、標的核酸Ｔ−０１を検出した。その結果を表３に示した。【０１０２】
実施例５
実施例５では、標的核酸Ｔ−０１と、光反応性基が導入された検出プローブＤ−０１及びＤ−０２とをハイブリダイズさせ、形成された複合体に光照射して検出プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させ、さらにこの複合体を光反応性基が導入された捕捉プローブＣ−０２とハイブリダイズさせ、形成された複合体に光照射して補足プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させて、標的核酸を検出した。【０１０３】
捕捉プローブ固定ビーズの作製
アビジンコートビーズ（サーモサイエンティフィック社製）に、捕捉プローブとしてＣ−０２を固定し、ビオチン水溶液でブロッキング処理したものを用いた。【０１０４】
ハイブリダイゼーションと検出
Ｔ−０１（１０μＭ）と、Ｄ−０１（１００μＭ）及びＤ−０２（１００μＭ）を、Ｔ−０１に対するＤ−０１、Ｄ−０２の各使用量が１モル当量となるように混合し、１０ｍＭリン酸バッファー（１００ｍＭ塩化ナトリウム含有）で希釈し、トータル液量２００μＬ、Ｔ−０１の終濃度を０．２５μＭとした。この混合溶液をヒートブロックで９５℃、５分間保持し、その後ゆっくりと室温まで冷却したものを、ガラスチューブに移し、トランスイルミネーターで２０分間、３６５ｎｍ（１０μＷ／ｃｍ２）の光を照射した。「オムニフィット」ガラスカラム（内径３ｍｍ、両末端に２μｍのステンレスフリッツのカラム栓）に、Ｃ−０２を固定したビーズを入れ、上記混合溶液（２００μＬ）を加えた後、５分間攪拌しながら、ブラックライトで３６５ｎｍの光を照射した。溶液をろ過後、上記ビーズを５０％ＤＭＳＯ水溶液で洗浄後、Ｃｙ３−ストレプトアビジンの水溶液（０．０１μＭ）を添加し染色した。溶液をろ過後、上記ビーズを５０％ＤＭＳＯ水溶液で洗浄した。染色済みのビーズは、蛍光顕微鏡（オリンパス社製）を用いて検出した。その結果を表３に示した。【０１０５】
比較例２
実施例２において、捕捉プローブとしてＣ−０２の代わりにＣ−０３を使用し、またハイブリダイズさせて形成された複合体に光照射して補足プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させる工程を行わなかったこと以外は、実施例２と同様の操作を行い、標的核酸Ｔ−０１に対して１モル当量のＤ−０３及びＤ−０４を混合したものを調製し、標的核酸Ｔ−０１を検出した。【０１０６】
また、同様にして、標的核酸Ｔ−０１に対して１００モル当量のＤ−０３及びＤ−０４を混合したものを調製し、標的核酸Ｔ−０１を検出した。以上の結果を表３に示した。【０１０７】
【表３】
2014034753.tif 000009
【０１０８】
実施例２〜５のいずれの場合も、検出プローブ及び／又は補足プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させることにより、標的核酸に対する検出プローブ量が１モル当量であっても、０．０５ｎｍｏｌの濃度の標的核酸を感度良く検出できた。また、検出プローブのみと標的核酸との間で共有結合を形成させた場合、補足プローブのみと標的核酸との間で共有結合を形成させた場合、検出プロープ及び補足プローブの両方と標的核酸との間で共有結合を形成させた場合のいずれの場合も、高感度で標的核酸を検出できることが分かった。特に、検出プロープ及び補足プローブの両方とで共有結合を形成させた場合に高感度で検出できた。さらに、プローブとしては、核酸だけでなく、ペプチド核酸も使用できることが分かった。【０１０９】
一方、比較例２では、検出プローブを１当量用いたときは、各実施例と比べて、Ｓ／Ｎ比は大きく低下した。また、検出プローブを１００当量用いたときも、Ｓ／Ｎ比は実施例と比べてかなり低く、検出プローブの使用量を増やしても、検出感度が改善されなかった。【０１１０】
以上のように、サンドイッチハイブリダイゼーションにおいて、標的核酸と、光反応性基を導入した検出プローブ及び／又は検出プローブとがハイブリダイズして形成される複合体に対して、光照射して検出プローブ及び／又は検出プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させることにより、使用する検出プローブ量を減らした場合であっても微量の標的核酸を高感度で検出できることがわかった。【０１１１】
実施例６
実施例１において、標的核酸としてＴ−０１の代わりにＴ−０２、検出プローブとしてＤ−０１及びＤ−０２の代わりにＤ−０５及びＤ−０６、捕捉プローブとしてＣ−０１の代わりにＣ−０５を用いたこと、及び、Ｔ−０２（１０μＭ）とＤ−０５（１００μＭ）及びＤ−０６（１００μＭ）をＴ−０２に対するＤ−０５、Ｄ−０６の各使用量が１モル当量となるように混合し、１０ｍＭリン酸バッファー（１００ｍＭ塩化ナトリウム含有）で希釈した溶液を０．１、０．０１ａｍｏｌの２通りのモル濃度になるよう調整し、ＤＮＡチップ上でのハイブリダイゼーション後、ＤＮＡチップをブラックライトで３６５ｎｍの光を５分間照射したこと以外は、実施例１と同様の操作を行い、標的核酸Ｔ−０２を検出した。その結果を表４に示した。【０１１２】
光照射により標的核酸と検出プローブ及び標的核酸と捕捉プローブ間で共有結合を形成させたことにより、標的核酸に対する検出プローブの使用量が、従来より非常に少ない１モル当量であっても、０．１、０．０１ａｍｏｌの各濃度において標的核酸を検出できた。【０１１３】
比較例３
実施例６において、検出プローブとしてＤ−０５及びＤ−０６の代わりにＤ−０７及びＤ−０８を使用し、捕捉プローブとしてＣ−０５の代わりにＣ−０６を使用し、ハイブリダイズさせて形成された複合体に光照射して検出プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させる工程を行わず、またＤＮＡチップ上でのハイブリダイゼーション後、ＤＮＡチップを光照射して捕捉プローブと標的核酸の間で共有結合を形成させる工程を行わなかったこと以外は、実施例６と同様の操作を行い、標的核酸Ｔ−０２を検出した。【０１１４】
また、同様にして、標的核酸Ｔ−０２に対して１０万モル当量のＤ−０７及びＤ−０８を混合したものを調製し、標的核酸Ｔ−０２を検出した。以上の結果を表４に示した。【０１１５】
比較例３では、検出プローブを１モル当量用いたときだけでなく、１０万モル当量用いたときであっても、実施例６と比べてＳ／Ｎ比は大きく低下し、Ｔ−０２を検出することができなかった。【０１１６】
【表４】
2014034753.tif 000010
【０１１７】
以上の実施例６及び比較例３の結果から、サンドイッチハイブリダイゼーションにおいて、標的核酸と光反応性基を導入した検出プローブとがハイブリダイズして形成される複合体に対して光照射して検出プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させ、かつ、ＤＮＡチップ上で標的核酸と光反応性基を導入した捕捉プローブとがハイブリダイズして形成される複合体に対して光照射して捕捉プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させることにより、使用する検出プローブ量を減らした場合であっても微量の標的核酸を高感度で検出できることがわかった。【０１１８】
実施例７
本発明の、ＳＮＰｓ（single nucleotide polymorphisms）検出への適用を検討した。本実施例ではヒトゲノムＤＮＡを用いるため、標的核酸は二本鎖核酸である。【０１１９】
ＤＮＡチップの作製
東レ社製の「３Ｄ−Ｇｅｎｅ」（登録商標）の基板（２５６柱基板）に、表１の捕捉プローブＣ−０７（野生型）、Ｃ−０８（Ｇｌｙ１２Ｓｅｒ変異型）、Ｃ−０９（Ｇｌｙ１２Ａｒｇ変異型）、Ｃ−１０（Ｇｌｙ１２Ｃｙｓ変異型）を固定したものを用いた。【０１２０】
検体ＤＮＡの調製
検体ＤＮＡとしてＡ５４９細胞から抽出したＤＮＡを用いた。Ａ５４９細胞は、肺がん組織由来の培養細胞であり、Ｇｌｙ１２Ｓｅｒ変異が生じていることが知られている。Ａ５４９細胞から抽出した５μｇのゲノムＤＮＡを超音波処理（コバリス、ｓ２２０）によって断片化し、断片化したゲノムＤＮＡのうち６００ｎｇを検出に用いた。断片化の処理条件は、メーカー推奨の方法に従った。断片の長さは、バイオアナライザー（アジレント社製）を用いて評価した。なお、ひとつの細胞には２ｐｇのＤＮＡが含まれていることが知られている。またＳＮＰｓ遺伝子は、１細胞あたり２コピー存在するため、ゲノムＤＮＡ ６００ｎｇには、ＳＮＰｓ遺伝子の配列が１ａｍｏｌ含まれていることになる。【０１２１】
ハイブリダイゼーションと検出
ゲノムＤＮＡ ６００ｎｇ（１ａｍｏｌ）に対して、検出プローブＤ−０９、Ｄ−１０、Ｄ−１１、Ｄ−１２の各使用量が１００モル当量（すなわち各検出プローブが１００ａｍｏｌ）となるよう検体ＤＮＡを調製（各々のトータル液量５μＬ）し、それぞれ以下の操作を行った。【０１２２】
混合溶液をヒートブロックで９５℃、５分間保持し、その後ゆっくりと室温まで冷却したものを、ガラスチューブに移し、トランスイルミネーターで２０分間、３６５ｎｍ（１０μＷ／ｃｍ２）の光を照射した。これらの溶液に、１Ｘハイブリダイゼーション溶液（１重量％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ、１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、５０ｎｇ/ｍｌ サケ精子ＤＮＡの溶液、５重量％デキストラン硫酸ナトリウム、３０％フォルムアミド）を３５μＬ加え、ハイブリダイゼーション溶液とした。このハイブリダイゼーション溶液を全量ＤＮＡチップに注入し、３２℃で加温したインキュベータにセットした。ハイブリダイゼーションは、「３Ｄ−Ｇｅｎｅ」の標準プロトコールに従い、２５０ｒｐｍで旋回撹拌をしながら、３２℃で２時間行った。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡチップを３０℃に加温した洗浄液（０．５×ＳＳＣ、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム））で５分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥した。さらに、ストレプトアビジンフィコエリスリン（プロザイム社）を染色溶液（５０ｎｇ／μＬストレプトアビジンフィコエリスリン、１００ｍＭ  ＭＥＳ，１Ｍ  ＮａＣｌ，０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ ２０、２ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））に添加した溶液を用意し、ＤＮＡチップ上に滴下した。３５℃で５分間インキュベーションした。３０℃に加温した洗浄液（６ＸＳＳＰＥ、０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間洗浄したのち、スピンドライヤー（和研薬）を用いて乾燥した。染色済みのＤＮＡチップは、ＤＮＡチップスキャナー（東レ）を用いて蛍光シグナルを検出した。スキャナーの設定は、レーザー出力１００％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を７０％にした。【０１２３】
標的核酸の検出結果を表５に示した。Ｇｌｙ１２Ｓｅｒ変異の捕捉プローブ「Ｃ−０８」のＳ／Ｎ比が最も高かった。Ａ５４９細胞は、Ｇｌｙ１２Ｓｅｒ変異が入っていることが知られており、本検出結果と一致した。【０１２４】
光照射により標的核酸と検出プローブ間で共有結合を形成させたことにより、標的核酸に対する検出プローブの使用量が、従来よりも少ない１００モル当量であっても、二本鎖核酸であるゲノムＤＮＡを検出でき、かつ、ＳＮＰｓを正しく検出することができた。【０１２５】
比較例４
実施例７において、検出プローブとしてＤ−０９、Ｄ−１０、Ｄ−１１、Ｄ−１２の代わりにＤ−１３、Ｄ−１４、Ｄ−１５、Ｄ−１６を使用し、ハイブリダイズさせて形成された複合体に光照射して検出プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させる工程を行わなかったこと以外は、実施例７と同様の操作を行い、標的核酸を検出した。【０１２６】
また、同様にして、従来の方法に従って標的核酸に対して１０万モル当量のＤ−１３、Ｄ−１４、Ｄ−１５、Ｄ−１６を混合したものを調製し、標的核酸を検出した。以上の結果を表５に示した。【０１２７】
比較例４では、検出プローブを１００モル当量用いたときは、野生型の捕捉プローブＣ−０７のＳ／Ｎ比が最も高く、Ｇｌｙ１２Ｓｅｒ変異はまったく検出できなかった。検出プローブを１０万モル当量用いたときであっても、実施例７と比べてＳ／Ｎ比は大きく低下し、Ｇｌｙ１２Ｓｅｒ変異を検出することができなかった。【０１２８】
【表５】
2014034753.tif 000011
【配列表フリーテキスト】
【０１２９】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ（５’末端及び３’末端ビオチン化）
配列番号４：合成ＤＮＡ（５’末端及び３’末端ビオチン化）
配列番号５：合成ＤＮＡ（５’末端及び３’末端ビオチン化）
配列番号６：合成ＤＮＡ（５’末端及び３’末端ビオチン化）
配列番号７：合成ＤＮＡ（５’末端及び３’末端ビオチン化）
配列番号８：合成ＤＮＡ（５’末端及び３’末端ビオチン化）
配列番号９：合成ＤＮＡ（５’末端及び３’末端ビオチン化）
配列番号１０：合成ＤＮＡ（５’末端及び３’末端ビオチン化）
配列番号１１：合成ＤＮＡ（５’末端アミノ化）
配列番号１２：合成ＤＮＡ（５’末端ビオチン化）
配列番号１３：合成ＤＮＡ（５’末端アミノ化）
配列番号１４：合成ＤＮＡ（５’末端アミノ化）
配列番号１５：合成ＤＮＡ（５’末端アミノ化）
配列番号１６：合成ＤＮＡ（５’末端アミノ化）
配列番号１７：合成ＤＮＡ（５’末端アミノ化）
【配列表】
2014034753000001.app
【国際調査報告】
2014034753.tif 000012
2014034753.tif 000013
2014034753.tif 000014
2014034753.tif 000015