(57)【要約】  光応答性核酸類を含むプローブを使用した標的核酸との光連結が停滞してしまうという問題を克服し、光連結効率を向上させる光連結方法、及び光連結キットを提供する。  前記光連結方法は、核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブと、を反応溶液中でハイブリダイゼーションし、光照射することにより光連結させる方法であって、該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させることを特徴とする。前記光連結キットは、核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブ、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブと、を反応溶液中でハイブリダイゼーションし、光照射することにより光連結させる方法であって、該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させることを特徴とする、光連結方法。
【請求項２】
前記第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることにより、該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させることを特徴とする、請求項１に記載の光連結方法。
【請求項３】
前記高い相補性とは、前記第一のプローブと前記第二のプローブとが互いに相補的な関係にあり、所定の光連結条件下で該第一のプローブ中の該光応答性核酸類の自己内で光連結する塩基が、第二のプローブとハイブリダイゼーションしている、請求項１又は２に記載の光連結方法。
【請求項４】
前記光連結させる方法が、前記核酸サンプル中に存在する標的部位が有する標的核酸と、前記第一のプローブの光応答性核酸類との間で光連結させる、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の光連結方法。
【請求項５】
前記第二のプローブが光応答性核酸類を含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の光連結方法。
【請求項６】
前記第一のプローブ及び前記第二のプローブが光応答性核酸類を含み、該第一のプローブと該第二のプローブの非相補性領域において、該第一のプローブ及び／又は該第二のプローブ内に存在する光応答性核酸類が自己内で光連結できないように、該第一のプローブ及び／又は該第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを使用する、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の光連結方法。
【請求項７】
核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し光応答性核酸類を含む第一のプローブと、該標的部位に対して相補的な配列を有し標的核酸を含む第四のプローブと、を反応溶液中で隣接して配置するようにハイブリダイゼーションさせ、光照射によって該第四のプローブに存在する標的核酸と該第一のプローブ中の該光応答性核酸類との間で光連結する方法において、
該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることで、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させることを特徴とする、請求項１に記載の光連結方法。
【請求項８】
前記第一のプローブ内において光応答性核酸類と自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換した該第一のプローブを使用することを特徴とする、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の光連結方法。
【請求項９】
前記光応答性核酸類と光連結しない核酸がプリン塩基である、請求項８に記載の光連結方法。
【請求項１０】
前記光応答性核酸類と光連結しない核酸が、ピリミジン環を人工的に変換した合成塩基である、請求項８に記載の光連結方法。
【請求項１１】
反応溶液中にアニオン性物質が存在する、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の光連結方法。
【請求項１２】
少なくとも一種類の光連結プローブが、反応溶液中に０．１μｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で存在することを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の光連結方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の光連結方法を使用する遺伝子解析方法。
【請求項１４】
前記遺伝子解析方法が、遺伝子検出方法又は核酸増幅方法である、請求項１３の遺伝子解析方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸増幅方法が、変異型核酸の標的部位を含む増幅用ヌクレオチド配列を選択的に増幅させることで、該変異型核酸の有無を検出することを特徴とする、変異型核酸検出方法。
【請求項１６】
核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブ、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを含むことを特徴とする、光連結キット。
【請求項１７】
前記第一のプローブが、核酸サンプル中の標的部位の標的核酸と光連結するものである、請求項１６に記載の光連結キット。
【請求項１８】
更に、該第一のプローブの該光応答性核酸類と光連結する標的核酸を含む第四のプローブを含む、請求項１６に記載の光連結キット
【請求項１９】
前記第二のプローブが光応答性核酸類を含む、請求項１６乃至１８のいずれか一項に記載の光連結キット。
【請求項２０】
前記第一のプローブが、該プローブ内において光応答性核酸類と自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換したものである、請求項１６乃至１９のいずれか一項に記載の光連結キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光応答性核酸類を含むプローブを用いて光連結する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、個々の患者についてオーダーメイドの治療法である個別化医療を確立するために、該患者の特定の遺伝子多型と、薬剤感受性や薬剤応答性との関連を明らかにする研究が提案されている。【０００３】
特に、ゲノム科学の進歩により、薬物動態の解明、および薬物の反応性に関与する酵素、蛋白質等の遺伝子多型の解明が急速になされている。ヒトゲノム解析において、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ：ＳＮＰｓ）が、最も頻度の高い遺伝子多型マーカーとして注目されつつある。該ＳＮＰｓは、種々の疾患や薬剤応答との関連を明らかにする上で有用であることが既に知られている。また、複数のＳＮＰｓを用いたハプロタイプ解析が、疾患感受性を解析する上で有用であることも知られている。【０００４】
特に医療現場においては、ＳＮＰｓの検出結果を用いた病気罹患率の診断、効果的な投与薬剤の選択、副作用の予測などへの利用等が考えられ、治療効果の増大だけでなく患者のＱＯＬの向上にもつながるものとして期待されている。
このようなＳＮＰｓ部位の塩基を判別する、いわゆるタイピングについては多くの手法が報告されている。ＤＮＡの一塩基多型をタイピングする技術としては、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法やＩｎｖａｄｅｒ法などが、一塩基の置換を識別できるほどの高い配列選択性をもつ技術として知られている。【０００５】
しかし、悪性腫瘍のような後発変異の検出においては、検体材料の多くを占める正常細胞に由来する野生型の核酸分子がバックグラウンドとなることから、上記のような解析手法では一塩基置換等の変異を高感度に検出できない場合が多い。【０００６】
そのため、上記方法に代わる特に有効な解析手法として、光応答性核酸類の使用が開示されている。ハイブリダイゼーションした光応答性核酸類と標的核酸は、特定の波長の光照射を行うことによって、光連結を形成させることができる。この光連結は、人工塩基部分の光反応によって、光応答性核酸類分子と標的核酸分子との間に、分子間の共有結合が形成されて生じる。このように光連結された分子と分子は、単なる熱的な安定性のみで会合しているのではないので、相補的二重鎖が解離する条件におかれた場合でも、解離することなく結合している（特許文献１）。【０００７】
また、光応答性核酸類の性質として、光連結反応は１秒程度で極めて迅速に進行すること、完全にハイブリダイゼーションしないと光連結しないという知見に立脚して、光応答性核酸類を使用した変異型遺伝子を検出する解析手法が開示されている（特許文献２）。【０００８】
特許文献１および２では光応答性核酸類を使用したＳＮＰｓの特定について開示されているが、光応答性核酸類を含むプローブが、相補的な配列を持つ標的部位とハイブリダイゼーションしたときに光連結するという知見に基づいて、光応答性核酸類の使用が変異型遺伝子の選択的増幅に有用である例を開示しているのみである。【０００９】
従って、このような従来の技術常識を鑑みれば、光連結には光応答性核酸類を含むプローブとその相補的な配列をもつ標的部位とがハイブリダイゼーションする必要があり、更に、光連結は光応答性核酸類と標的部位又は標的部位近傍の標的核酸とが結合することによって形成されることから、光応答性核酸類は相補的な配列をもつ標的部位又は標的部位近傍の標的核酸配列としか結合しないと考えられていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００９−２５４２７９号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１２／０３３１９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、光応答性核酸類を含むプローブ（すなわち、光連結プローブ）が標的核酸に対して光連結する反応において、標的核酸の量に関係なく一定の割合までしか光連結できない、すなわち、光連結が停滞してしまうことを見出した。この事実を受け鋭意検討した結果、光連結が停滞してしまう要因として、光応答性核酸類を含むプローブが、標的核酸と光連結するための光照射によって、該プローブ自身が自己の配列内で光連結してしまう事を見出した。すなわち、プローブ内の光応答性核酸類と該光応答性核酸類と光連結する塩基が会合し光連結することから、標的部位とハイブリダイゼーション及び／又は標的核酸と光連結できないプローブが光照射の時間（エネルギー）依存的に蓄積され、その結果、標的核酸に対する光連結を停滞させているものと推察された。【００１２】
更に、従来の技術常識に基づいて考えると、野生型遺伝子を選択的に増幅抑制し、変異型遺伝子を選択的に増幅する場合において、特許文献２のような光応答性核酸類を使用した光連結方法の最大の優位性は、一度、光によって光連結した標的核酸はＰＣＲ反応工程における熱変性工程において開裂しない点、すなわち、一度、光によって光連結した標的核酸を非平衡系に持ち込むことができる点にあった。【００１３】
しかしながら、本発明者らは、光連結可能な波長（３６５ｎｍ）の光を照射した場合においても、標的核酸に対して光連結されるだけでなく、該標的核酸に対して光連結したプローブが、本来生じることの無い光開裂反応により一部、外れてしまうことを見出した。つまり、光連結する反応と光連結を開裂させる反応とが並行して起こる光平衡の状態が、標的核酸に対する光連結を停滞させている要因と考えられた。【００１４】
本発明の目的は、光応答性核酸類を含むプローブを使用した標的核酸との光連結が停滞してしまうという問題を克服し、光連結効率を向上させる方法、キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決する手段を鋭意検討した結果、光連結効率の停滞を回避するために、反応溶液中において、光応答性核酸類を含むプローブの自己配列内での光連結を抑制することにより、該プローブの有効濃度を保つこと、また、局所的に標的部位付近における光応答性核酸類を含むプローブの実質的な濃度を高めることでハイブリダイゼーションを促進し、光連結効率を向上させることができることを見出した。【００１６】
すなわち、本発明は以下の内容に関する。
［１］核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブと、を反応溶液中でハイブリダイゼーションし、光照射することにより光連結させる方法であって、該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させることを特徴とする、光連結方法。
［２］前記第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることにより、該第一のプローブ内の該光応答性核酸類に起因する自己会合を抑制させることを特徴とする、［１］の光連結方法。
［３］前記高い相補性とは、前記第一のプローブと前記第二のプローブとが互いに相補的な関係にあり、所定の光連結条件下で該第一のプローブ中の該光応答性核酸類の自己内で光連結する塩基が、第二のプローブとハイブリダイゼーションしている、［１］又は［２］の光連結方法。
［４］前記光連結させる方法が、前記核酸サンプル中に存在する標的部位が有する標的核酸と、前記第一のプローブの光応答性核酸類との間で光連結させる、［１］〜［３］のいずれかの光連結方法。
［５］前記第二のプローブが光応答性核酸類を含む、［１］〜［４］のいずれかの光連結方法。
［６］前記第一のプローブ及び前記第二のプローブが光応答性核酸類を含み、該第一のプローブと該第二のプローブの非相補性領域において、該第一のプローブ及び／又は該第二のプローブ内に存在する光応答性核酸類が自己内で光連結できないように、該第一のプローブ及び／又は該第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを使用する、［１］〜［５］のいずれかの光連結方法。
［７］核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し光応答性核酸類を含む第一のプローブと、該標的部位に対して相補的な配列を有し標的核酸を含む第四のプローブと、を反応溶液中で隣接して配置するようにハイブリダイゼーションさせ、光照射によって該第四のプローブに存在する標的核酸と該第一のプローブ中の該光応答性核酸類との間で光連結する方法において、
該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることで、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させることを特徴とする、［１］の光連結方法。
［８］前記第一のプローブ内において光応答性核酸類と自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換した該第一のプローブを使用することを特徴とする、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させることを特徴とする、［１］〜［７］のいずれかの光連結方法。
［９］前記光応答性核酸類と光連結しない核酸がプリン塩基である、［８］の光連結方法。
［１０］前記光応答性核酸類と光連結しない核酸が、ピリミジン環を人工的に変換した合成塩基である、［８］の光連結方法。
［１１］反応溶液中にアニオン性物質が存在する、［１］〜［１０］のいずれかの光連結方法。
［１２］少なくとも一種類の光連結プローブが、反応溶液中に０．１μｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で存在することを特徴とする、［１］〜［１１］のいずれかの光連結方法。
［１３］［１］〜［１２］のいずれかの光連結方法を使用する遺伝子解析方法。
［１４］前記遺伝子解析方法が、遺伝子検出方法又は核酸増幅方法である、［１３］の遺伝子解析方法。
［１５］［１４］の核酸増幅方法が、変異型核酸の標的部位を含む増幅用ヌクレオチド配列を選択的に増幅させることで、該変異型核酸の有無を検出することを特徴とする、変異型核酸検出方法。
［１６］核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブ、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを含むことを特徴とする、光連結キット。
［１７］前記第一のプローブが、核酸サンプル中の標的部位の標的核酸と光連結するものである、［１６］の光連結キット。
［１８］更に、該第一のプローブの該光応答性核酸類と光連結する標的核酸を含む第四のプローブを含む、［１６］の光連結キット
［１９］前記第二のプローブが光応答性核酸類を含む、［１６］〜［１８］のいずれかの光連結キット。
［２０］前記第一のプローブが、該プローブ内において光応答性核酸類と自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換したものである、［１６］〜［１９］のいずれかの光連結キット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、光応答性核酸類を使用した遺伝子の解析方法において、標的部位と光応答性核酸類を含むプローブ間の光連結効率を向上させることが可能である。すなわち、標的核酸に対して特異的かつ効率よく光連結できるため、高い感度と特異性を必要とする、対象とする遺伝子の解析方法において効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、光応答性核酸の一例である３−シアノビニルカルバゾール（ＣＮＶＫ）の構造式である。
【図２】図２は、ＥＧＦＲ遺伝子上のエクソン２１（ｅｘ．２１）領域の一部を光連結形成対象として、光応答性核酸であるＣＮＶＫの挿入位置を５’末端に近い位置に挿入して設計した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
【図３】図３は、ＥＧＦＲ遺伝子上のエクソン２１（ｅｘ．２１）領域の一部を光連結形成対象として、光応答性核酸であるＣＮＶＫの挿入位置を５’末端よりも中心に近い位置に挿入して設計した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
【図４】図４は、ＥＧＦＲ遺伝子上のエクソン２１（ｅｘ．２１）領域の一部を光連結形成対象として、光応答性核酸であるＣＮＶＫの挿入位置を３’末端よりも中心に近い位置に挿入して設計した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
【図５】図５は、ＥＧＦＲ遺伝子上のエクソン２１（ｅｘ．２１）領域の一部を光連結形成対象として、光応答性核酸であるＣＮＶＫの挿入位置を３’末端に近い位置に挿入して設計した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
【図６】図６は、ＣＮＶＫの標的核酸とならないアデニン（Ａ）のみで構成した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
【図７】図７は、ＣＮＶＫの標的核酸とならないグアニン（Ｇ）のみで構成した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
【図８】図８は、ＣＮＶＫの標的核酸とならないアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）のみで構成した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
【図９】図９は、ＥＧＦＲ遺伝子の３箇所の変異を目的部位として設計した光連結プローブである。具体的には、（１）は８６１番目のロイシン（Ｌ８６１）をコードする核酸配列を目的部位として、（２）は７９０番目のスレオニン（Ｔ７９０）に該当する核酸配列を目的部位として、（３）は８５８番目のロイシン（Ｌ８５８）に該当する核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して設計した光連結プローブとその相補性について示した図である。
【図１０】図１０は、ＥＧＦＲ遺伝子の８６１番目のロイシン（Ｌ８６１）をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して光連結プローブを設計した場合に、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
【図１１】図１１は、ＥＧＦＲ遺伝子の７９０番目のスレオニン（Ｔ７９０）をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して光連結プローブを設計した場合に、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
【図１２】図１２は、ＥＧＦＲ遺伝子の８５８番目のロイシン（Ｌ８５８）をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して光連結プローブを設計した場合に、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
【図１３】図１３は、ＥＧＦＲ遺伝子の７９０番目のスレオニン（Ｔ７９０）をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して光連結プローブを設計した場合に、ハイブリダイゼーション温度を変化させて光連結形成させた場合の光連結形成効率を表した図である。
【図１４】図１４は、ＥＧＦＲ遺伝子の７９０番目のスレオニン（Ｔ７９０）をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して光連結プローブを設計した場合に、ハイブリダイゼーション促進剤としてポリアクリル酸を添加して４℃でハイブリダイゼーションさせて光連結形成させた場合の光連結形成効率を表した図である。
【図１５】図１５は、ＥＧＦＲ遺伝子の７９０番目のスレオニン（Ｔ７９０）をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して光連結プローブを設計した場合に、ハイブリダイゼーション促進剤としてポリアクリル酸を添加して５０℃でハイブリダイゼーションさせて光連結形成させた場合の光連結形成効率を表した図である。
【図１６】図１６は、ＥＧＦＲ遺伝子の７９０番目のスレオニン（Ｔ７９０）をコードする核酸配列を目的部位として、遺伝子変異検出を行った際の定量ＰＣＲ測定結果を表した図である。
【図１７】図１７は、ＥＧＦＲ遺伝子上のエクソン２１（ｅｘ．２１）領域の一部を光連結形成対象として、光応答性核酸であるＣＮＶＫの挿入位置を５’末端に近い位置に挿入し、更にＣＮＶＫが光連結形成可能なピリミジン塩基をイノシンに置換した光連結プローブについて、光連結形成波長の光照射と光連結開裂波長の光照射を行ったサンプルを電気泳動にて確認した結果である。
【図１８】図１８は、ＥＧＦＲ遺伝子の実施例８−１．において設計した光連結プローブを光連結形成させた場合の光連結形成効率を表した図である。
【図１９】図１９は、ＥＧＦＲ遺伝子上のエクソン２１（ｅｘ．２１）領域の８６１番目のロイシン（Ｌ８６１）をコードする核酸配列を目的部位として、センス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して設計した光連結プローブとその相補性について示した図である。
【図２０】図２０は、ＥＧＦＲ遺伝子の実施例１０−１．において設計した光連結プローブを光連結形成させた場合の光連結形成効率を表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下において、本発明の実施形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明するが、利用方法やキットの態様についてはこれに限定されるものではない。
【００２０】
本発明において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子発現、コード、鋳型、プロモーター、プライマー、ＰＣＲ、配列等の用語の定義に関しては、現在、分子生物学、遺伝学、遺伝子工学等で広く一般的に使用されている用語と同じ意味である。
【００２１】
本発明において、核酸とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は、後述のヌクレオチドアナログであれば特に限定されるものではなく、天然のものであってもよく、合成されたものであってもよい。天然の核酸として、例えば、生物から回収されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等がある。また、合成された核酸として、β−シアノエチルホスフォロアミダイト法、ＤＮＡ固相合成法等の公知の化学的合成法により合成されたＤＮＡや、ＰＣＲ等の公知の核酸増幅法により合成された核酸、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等がある。
【００２２】
本発明において核酸サンプルとは、核酸を含有するサンプルであって、標的部位を含有する可能性のあるサンプルであれば、特に限定されるものではない。例えば、標的部位を含む野生型核酸又はその変異型核酸の少なくとも一方を含有する可能性のあるサンプル、好ましくは、その両方を含有する可能性のあるサンプルである。例えば、血液や組織等を試料として試料中の全細胞から得られるゲノムＤＮＡやＲＮＡが該当する。この核酸の抽出は、フェノール／クロロホルム法等の公知の手法により行うことができる。このとき、核酸サンプル中における変異型の存在率は問わない。例えば、１００％が野生型であってもよいし、５０％が野生型で残り５０％が変異型であってもよい。また、当該核酸サンプルは、細胞から得られるゲノムＤＮＡであってもよいし、細胞から調製されたｍＲＮＡであってもよいし、ｍＲＮＡを鋳型にして逆転写反応を行って得られるｃＤＮＡであってもよい。さらにはクローン化された多数の遺伝子を人工的に混合したものであってもよいし、核酸増幅反応によって人工的に増幅させた核酸、又はそれらの混合物であってもよい。
【００２３】
本発明において野生型核酸とは、変異を生じる前の核酸を意味するものとし、その典型的な例は、変異を生じておらず、本来の正常な機能を有する遺伝情報を含む核酸である。ここで言う遺伝情報とは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ等の情報をコードする転写領域だけでなく、プロモーター等の遺伝子発現上必要な調節領域を含むものとする。
【００２４】
本発明において変異型核酸とは、変異を生じた核酸である。変異とはＤＮＡやＲＮＡ等の核酸配列の変化であり、遺伝学等で使用される塩基置換、挿入、欠失、逆位、重複、転座等が該当する。当該変異型核酸において、変異の存在する領域は転写領域だけでなく、プロモーター等の遺伝子発現上必要な調節領域を含むものとする。なお、変異により変異型核酸が機能上の変化を有する必要はない。また、変異には、先天的なものも後天的なものも含まれる。
【００２５】
本発明において標的部位とは、核酸サンプル中に存在する核酸配列において、プローブがハイブリダイゼーションする部位である。ハイブリダイゼーションするプローブが光応答性核酸類を含むことは必要とせず、該核酸配列とプローブ間のハイブリダイゼーションはその配列の全部又は一部とハイブリダイゼーションすることを意味する。また、標的核酸とは光応答性核酸類が結合して、光連結する核酸配列を有する部位を意味する。ここで光連結とは、光応答性核酸類を含むプローブと標的核酸とが共有結合することを意味する。形成される共有結合の型は、光応答性核酸類の種類によって複数存在することが既に公知であるが、そのいずれをも含むものとし、特に、クロスリンク型の共有結合を形成する場合と、ライゲーション型の共有結合を形成する場合の両方が含まれる。
【００２６】
また光応答性核酸類としては、光に反応して他の核酸類と共有結合を形成して連結する性質を有すれば良く、例えば、後述する式Ｉ〜ＶＩＩによって示される核酸類を使用することができる。後述する式Ｉ〜ＶＩＩの光応答性核酸類はいずれもピリミジン塩基と共有結合する性質をもつが、該光応答性核酸類と共有結合するものであれば、特に限定されない。このような、炭素−炭素二重結合を形成する塩基としては、天然に存在するものである場合には、好ましくは、シトシン、チミン、ウラシルなどを含む配列が標的核酸となりうる。標的核酸は、標的部位中に存在していてもよいし、本発明において使用される光連結プローブ以外のプローブ中に存在するように設計されて使用してもよい。
【００２７】
また、本発明において目的部位とは、変異型核酸において変異が見られる塩基が存在する部位であり、野生型核酸を含め、本発明における遺伝子解析方法の対象となる部位である。例えば、塩基置換があった場合には野生型核酸、変異型核酸共に当該塩基置換した塩基が該当する。また挿入があった場合には変異型核酸においては挿入された塩基が該当し、野生型遺伝子においては変異型核酸で塩基が挿入された部位が該当する。また欠失があった場合には変異型核酸においては欠失によって塩基が失われた部位が該当し、野生型核酸においては変異型核酸で失われた塩基が該当する。また、当該目的部位は、本発明において最終的な解析対象ともなりうる。例えば、遺伝情報をコードする配列を有する鎖（以下、センス鎖とする）を示すものであってもよいし、センス鎖に対して相補的な配列を有する鎖（以下、アンチセンス鎖とする）を示すものであってもよい。また、遺伝情報に直接関与しない配列における核酸配列の変化も含まれるものとする。
【００２８】
当該光連結プローブの塩基配列及び光応答性核酸類の位置や数は標的部位の一部、又は全部と特異的にハイブリダイゼーションすることが可能であれば、特に限定はされない。
また、変異箇所や塩基の種類、光連結プローブの長さ等の状況に応じて、標的部位と目的部位とが一致するように光連結プローブを設計することもできるし、目的部位とは頃なる部位に標的部位を設定してプローブを設計することもできる。標的部位と目的部位とが一致する場合には、一部の部位のみを重複させることも可能であるし、全部を重複させて設計することも可能である。
【００２９】
本発明に使用できる光応答性核酸類としては、標的核酸と光照射により連結可能であれば良い。
例えば、ソラレン誘導体（Chang, E. et al. Biochemistry 1991, 30, 8283）やアミノプリン誘導体（特開２００１−２０６８９６）や４−チオウラシル等が使用できる。前記ソラレン誘導体は５’−ＡＴ−３’である塩基配列のチミン特異的に反応する性質があり、また、アミノプリン誘導体には配列依存性はないもののシチジン特異的であることから、適用範囲に一定の制約があるため、そのような制限のない下記の光応答性核酸類がより好ましい。
【００３０】
使用が好ましい第１の光応答性核酸類として、塩基部分として、式Ｉ：
【化１】
2014014106.tif 000002
（式中、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素である）
で表される基を有する核酸類（Org. Lett., Vol. 10, No. 15, 2008、特開２００９−２５４２７９号公報）を挙げることができる。結合される核酸がＤＮＡの場合、この式Ｉで表される置換カルバゾリル基は、式Ｉ（ａ）：
【化２】
2014014106.tif 000003
で示すように、２−デオキシリボースの１位の炭素原子（Ｃ）に、β位で結合している。具体的な例としては、３−シアノビニルカルバゾール−１’−β−デオキシリボシド〔３−ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ−１’−β−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｉｄｅ（ＣＮＶＫ）〕が挙げられる。
【００３１】
また、使用が好ましい第２の光応答性核酸類として、式ＩＩ：
【化３】
2014014106.tif 000004
（式中、Ｒは、−ＣＮ、−ＣＯＮＲ１Ｒ２、又は−ＣＯＯＲ３であって、かかるＲ１〜Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子又はアルキル基ＣｎＨ２ｎ＋１（ｎ≧１）である。ここでｎの上限は特に限定されるものではないが、例えば、ｎは１〜７、好ましくは１〜５であることができる）
で表される基を有する核酸類（Organic & Biomolecular Chemistry 2007, 5, 2583、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15 (2005), 1299-1301、特開２００５−３４８６４５）を挙げることができる。結合される核酸がＤＮＡの場合、この式ＩＩで表される置換フェノキシ基は、式ＩＩ（ａ）：
【化４】
2014014106.tif 000005
で示すように、２−デオキシリボースの１位の炭素原子（Ｃ）に、α位で結合している。Ｒが−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＭｅであるものが好ましく、特には、−ＣＯＯＨ又は−ＣＯＯＭｅであるものが好ましい。
【００３２】
これらの式Ｉや式ＩＩで表される基を有することで光連結性を備えた核酸類となる。この光連結性の付与はＤＮＡであってもＲＮＡであっても、さらにはヌクレオチドアナログであっても可能である。これらの光応答性核酸類は通常の核酸の製造方法に準じて製造することができる。
【００３３】
また、本発明の好ましい実施の態様において、光応答性核酸類は、塩基部分として次の式ＩＩＩ：
【化５】
2014014106.tif 000006
（ただし、式ＩＩＩにおいて、ＺはＯ又はＮＨを示し、Ｘ及びＹの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基及びシアノ基からなる群より選択された電子吸引性基を示し、Ｘ及びＹの残りの基は水素原子を示す）で表される基を有している。アルコキシカルボニル基におけるアルキル基としては、炭素数１から１０、好ましくは１から５の低級アルキル基が挙げられる。置換基Ｘ、Ｙは、両方が同時に同一又は異なる電子吸引基であってもよく、また置換基Ｘ、Ｙの一方だけが電子吸引基であり、他方が水素原子であってもよい。式ＩＩＩにおいて、ＺがＯで、Ｘが水素原子で、Ｙがカルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基又はシアノ基であることが好ましい。特に好ましい塩基部分として、５−ビニル−２’−デオキシウリジン、及び５−カルボキシビニル−２’−デオキシウリジンをあげることができる。特に５−カルボキシビニル−２’−デオキシウリジンが好ましい。
【００３４】
好ましい実施の別な態様において、光応答性核酸類は、塩基部分として次の式ＩＶ：
【化６】
2014014106.tif 000007
（ただし、式ＩＶにおいて、Ｒ１は、水素原子であり、Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ２及びＲ３の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）で表される基を有している。
【００３５】
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましく、カルボキシル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
【００３６】
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、低級アルコキシカルボニル基は好ましく、低級アルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数１〜１０、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３、さらに好ましくは１〜２、特に好ましくは炭素数１の低級アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、及びブトキシカルボニル基等を挙げることができ、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基が特に好ましい。低級アルコキシカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
【００３７】
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましく、低級アルケニル基としては、炭素数２〜１０、好ましくは炭素数２〜５、さらに好ましくは炭素数２〜３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
【００３８】
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましく、低級アルキニル基としては、炭素数２〜１０、好ましくは炭素数２〜５、さらに好ましくは炭素数２〜３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルキニル基と水素原子の組み合わせ、特にエチニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
【００３９】
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、置換アミドは好ましく、置換アミドとしては、１置換のＮ−置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、Ｎ−アルキルアミド、Ｎ−アミノアルキルアミドを挙げることができる。このようなＮ−アルキルアミド、Ｎ−アミノアルキルアミドとしては、炭素数１〜１０、好ましくは炭素数１〜５、さらに好ましくは炭素数１〜３、特に好ましくは炭素数３のものであり、Ｎ−アミノアルキルアミドが特に好ましい。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特にＮ−アミノ（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）アミドと水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
【００４０】
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、シアノ基は好ましく、シアノ基とシアノ基の組み合わせ、及びシアノ基と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
【００４１】
Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方として、水素原子は好ましく、水素原子を少なくとも１個含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、Ｒ２及びＲ３の組み合わせとして好ましい。
【００４２】
好ましい実施の別な態様において、光応答性核酸類は、塩基部分として次の式Ｖ：
【化７】
2014014106.tif 000008
（ただし、式Ｖにおいて、Ｒ４は、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ５及びＲ６の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）で表される基を有している。
【００４３】
Ｒ４としては、水素原子は特に好ましい。
Ｒ４としては、低級アルキル基は好ましく、低級アルキル基としては、炭素数１〜５、好ましくは炭素数１〜３、さらに好ましくは炭素数１〜２、特に好ましくは炭素数１のものである。このような低級アルキル基としては、メチル基、エチル基及びプロピル基等を挙げることができ、メチル基及びエチル基は好ましく、特にメチル基が好ましい。
【００４４】
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましく、カルボキシル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
【００４５】
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、低級アルコキシカルボニル基は好ましく、低級アルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数１〜１０、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３、さらに好ましくは１〜２、特に好ましくは炭素数１の低級アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、及びブトキシカルボニル基等を挙げることができ、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基が特に好ましい。低級アルコキシカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
【００４６】
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましく、低級アルケニル基としては、炭素数２〜１０、好ましくは炭素数２〜５、さらに好ましくは炭素数２〜３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
【００４７】
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましく、低級アルキニル基としては、炭素数２〜１０、好ましくは炭素数２〜５、さらに好ましくは炭素数２〜３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルキニル基と水素原子の組み合わせ、特にエチニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
【００４８】
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、置換アミドは好ましく、置換アミドとしては、１置換のＮ−置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、Ｎ−アルキルアミド、Ｎ−アミノアルキルアミドを挙げることができる。このようなＮ−アルキルアミド、Ｎ−アミノアルキルアミドとしては、炭素数１〜１０、好ましくは炭素数１〜５、さらに好ましくは炭素数１〜３、特に好ましくは炭素数３のものであり、Ｎ−アミノアルキルアミドが特に好ましい。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特にＮ−アミノ（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）アミドと水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
【００４９】
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
【００５０】
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、シアノ基は好ましく、シアノ基とシアノ基の組み合わせ、及びシアノ基と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
【００５１】
Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方として、水素原子は好ましく、水素原子を少なくとも１個含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、Ｒ５及びＲ６の組み合わせとして好ましい。
【００５２】
好ましい実施の別な態様において、光応答性核酸類は、塩基部分として次の式ＶＩ：
【化８】
2014014106.tif 000009
（ただし、式ＶＩにおいて、Ｒ７は、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ８及びＲ９の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）で表される基を有している。
【００５３】
Ｒ７としては、水素原子は特に好ましい。
Ｒ７としては、低級アルキル基は好ましく、低級アルキル基としては、炭素数１〜５、好ましくは炭素数１〜３、さらに好ましくは炭素数１〜２、特に好ましくは炭素数１のものである。このような低級アルキル基としては、メチル基、エチル基及びプロピル基等を挙げることができ、メチル基及びエチル基は好ましく、特にメチル基が好ましい。
【００５４】
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましく、カルボキシル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
【００５５】
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、低級アルコキシカルボニル基は好ましく、低級アルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数１〜１０、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３、さらに好ましくは１〜２、特に好ましくは炭素数１の低級アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、及びブトキシカルボニル基等を挙げることができ、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基が特に好ましい。低級アルコキシカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
【００５６】
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましく、低級アルケニル基としては、炭素数２〜１０、好ましくは炭素数２〜５、さらに好ましくは炭素数２〜３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
【００５７】
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましく、低級アルキニル基としては、炭素数２〜１０、好ましくは炭素数２〜５、さらに好ましくは炭素数２〜３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルキニル基と水素原子の組み合わせ、特にエチニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
【００５８】
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、置換アミドは好ましく、置換アミドとしては、１置換のＮ−置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、Ｎ−アルキルアミド、Ｎ−アミノアルキルアミドを挙げることができる。このようなＮ−アルキルアミド、Ｎ−アミノアルキルアミドとしては、炭素数１〜１０、好ましくは炭素数１〜５、さらに好ましくは炭素数１〜３、特に好ましくは炭素数３のものであり、Ｎ−アミノアルキルアミドが特に好ましい。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特にＮ−アミノ（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）アミドと水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
【００５９】
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
【００６０】
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、シアノ基は好ましく、シアノ基とシアノ基の組み合わせ、及びシアノ基と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
【００６１】
Ｒ８及びＲ９の少なくとも一方として、水素原子は好ましく、水素原子を少なくとも１個含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、Ｒ８及びＲ９の組み合わせとして好ましい。
【００６２】
好ましい実施の別な態様において、光応答性核酸類は、塩基部分として次の式ＶＩＩ：
【化９】
2014014106.tif 000010
（ただし、式ＶＩＩにおいて、Ｒ１０は、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、Ｒ１１及びＲ１２の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す）で表される基を有している。
【００６３】
Ｒ１０としては、水素原子は特に好ましい。
Ｒ１０としては、低級アルキル基は好ましく、低級アルキル基としては、炭素数１〜５、好ましくは炭素数１〜３、さらに好ましくは炭素数１〜２、特に好ましくは炭素数１のものである。このような低級アルキル基としては、メチル基、エチル基及びプロピル基等を挙げることができ、メチル基及びエチル基は好ましく、特にメチル基が好ましい。
【００６４】
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、カルボキシル基は好ましく、カルボキシル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
【００６５】
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、低級アルコキシカルボニル基は好ましく、低級アルコキシカルボニル基におけるアルキル部分としては、炭素数１〜１０、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３、さらに好ましくは１〜２、特に好ましくは炭素数１の低級アルキルが挙げられる。すなわち、好ましい低級アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、及びブトキシカルボニル基等を挙げることができ、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基及びプロポキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基がさらに好ましく、メトキシカルボニル基が特に好ましい。低級アルコキシカルボニル基と水素原子の組み合わせ、特にメトキシカルボニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
【００６６】
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、低級アルケニル基は好ましく、低級アルケニル基としては、炭素数２〜１０、好ましくは炭素数２〜５、さらに好ましくは炭素数２〜３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルケニル基と水素原子の組み合わせ、特にビニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
【００６７】
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、低級アルキニル基は好ましく、低級アルキニル基としては、炭素数２〜１０、好ましくは炭素数２〜５、さらに好ましくは炭素数２〜３、特に好ましくは炭素数２の低級アルケニル基が挙げられる。低級アルキニル基と水素原子の組み合わせ、特にエチニル基と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
【００６８】
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、置換アミドは好ましく、置換アミドとしては、１置換のＮ−置換アミドを挙げることができ、好ましい例として、Ｎ−アルキルアミド、Ｎ−アミノアルキルアミドを挙げることができる。このようなＮ−アルキルアミド、Ｎ−アミノアルキルアミドとしては、炭素数１〜１０、好ましくは炭素数１〜５、さらに好ましくは炭素数１〜３、特に好ましくは炭素数３のものであり、Ｎ−アミノアルキルアミドが特に好ましい。置換アミドと水素原子の組み合わせ、特にＮ−アミノ（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）アミドと水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
【００６９】
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、アミド基は好ましく、アミド基と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
【００７０】
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、シアノ基は好ましく、シアノ基とシアノ基の組み合わせ、及びシアノ基と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
【００７１】
Ｒ１１及びＲ１２の少なくとも一方として、水素原子は好ましく、水素原子を少なくとも１個含む組み合わせ、及び水素原子と水素原子の組み合わせは、Ｒ１１及びＲ１２の組み合わせとして好ましい。
【００７２】
このような塩基の好適な構造式を以下に例示する。本発明において使用可能な塩基は以下の例示に限定されるものではない。
【化１０】
2014014106.tif 000011
【００７３】
本発明においてプローブとは、公知の一緒に結合された二つ以上のヌクレオシドサブユニット又は核酸塩基サブユニットを有するポリマーを意味し、ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡ又はそのアナログを含む。
【００７４】
アナログとは、非天然のヌクレオチドであり、天然のヌクレオチドであるデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）やリボヌクレオチド（ＲＮＡ）と同様の機能を有するものをいう。すなわち、ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドと同様にリン酸ジエステル結合により鎖を形成することができ、かつ、ヌクレオチドアナログを用いて形成されたプライマーやプローブは、ヌクレオチドのみを用いて形成されたプライマーやプローブと同様に、ＰＣＲやハイブリダイゼーションに用いることができる。
【００７５】
このようなヌクレオチドアナログとして、例えば、ＰＮＡ（ポリアミドヌクレオチド誘導体）、ＬＮＡ（ＢＮＡ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、及びこれらの複合体等がある。ここで、ＰＮＡは、ＤＮＡやＲＮＡのリン酸と５炭糖からなる主鎖をポリアミド鎖に置換したものである。また、ＬＮＡ（ＢＮＡ）は、リボヌクレオシドの２’部位の酸素原子と４’部位の炭素原子がメチレンを介して結合している２つの環状構造を持つ化合物である。
【００７６】
上記のアナログに限定されず、そのプローブがハイブリダイゼーションアッセイ条件下で標的部位と相補的であり、安定にハイブリダイゼーションし得るものであればよい。ここで、相補的な配列とは、ハイブリダイゼーション条件下で安定な水素結合を形成し得る塩基配列を有することを意味し、各プローブの核酸間の完全な一致は必要とされない。
【００７７】
本発明の光応答性核酸類を含むプローブ（すなわち、光連結プローブ）とは、前記プローブにおいて、少なくとも一つの光応答性核酸類を含むプローブであり、該光応答性核酸類を含むプローブは、標的部位に対して相補的な配列をもつ。
【００７８】
本発明において第一のプローブ（以下、光連結プローブと称する場合がある）とは、標的部位対して相補的な配列を有し、かつ、前記光応答性核酸類を含む核酸類プローブをいう。当該光連結プローブは前記の式Ｉ〜ＶＩＩで表される基を有した光応答性核酸類を含んでいればよい。
【００７９】
本発明の光連結方法は、核酸サンプル中に存在する標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブと、を反応溶液中でハイブリダイゼーションさせ、光照射することにより光連結させる方法において、該第一のプローブが該光応答性核酸類に起因する自己会合（すなわち、自己内での光連結）を抑制させることを特徴とする、光連結方法である。
【００８０】
本発明の光連結方法の第一の態様としては、核酸サンプル中の標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブを反応溶液中でハイブリダイゼーションさせ、光照射することによって該標的部位中に存在する標的核酸と該第一のプローブ中の該光応答性核酸類との間で光連結するクロスリンク型の光連結方法において、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることで、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させる光連結方法が挙げられる。
【００８１】
これにより、該標的部位中に存在する標的核酸と該第一のプローブ間の光連結効率を向上させることができる。例えば、所定の光連結条件下で、標的部位とハイブリダイゼーションしなかった未反応の該第一のプローブに該第二のプローブをハイブリダイゼーションさせることで、該第一のプローブが自己会合して二次構造を形成することを防ぎ、光照射による該第一のプローブの自己内での光連結を抑制する。その結果、標的部位中に存在する標的核酸と光連結しなかった未反応の該第一のプローブは光連結能を維持しているため、長時間光照射を継続すること、又は変性やアニーリングの温調サイクルにおいて光照射を複数回繰り返すことで、光連結効率を向上させることができる。
【００８２】
前記の高い相補性とは、光応答性核酸類を含む該第一のプローブと該第二のプローブとが互いに相補的な関係にあり、所定の光連結条件下で該第一のプローブ中の該光応答性核酸類が自己内で光連結する塩基が、相補的な該第二のプローブとハイブリダイゼーションしている状態を意味する。該第二のプローブは完全相補な関係であってもよく、該第一のプローブに対して相補的であることが好ましいが、所定の光連結条件下において該第一のプローブとハイブリダイゼーションできれば完全な相補関係は必ずしも必要とはされない。例えば、該第一のプローブの配列の種類や長さ等の情報から、該第一のプローブを構成する核酸類塩基のうち、自己内の光連結に関与する箇所が特定される場合、該当箇所の塩基以外は必ずしも相補的である必要はない。
【００８３】
ここで、該第一のプローブ中の光応答性核酸類は標的部位中の標的核酸と光連結するものであるから、当然に該光応答性核酸類は該第二のプローブと光連結しないように設計することが必要である。よって、該光応答性核酸類の標的核酸との光連結を阻害しないように、該第二のプローブを設計することも好ましい。例えば、該第二のプローブがハイブリダイゼーションすることで該光応答性核酸類を含む第一のプローブの自己会合を抑制しつつ、光応答性核酸類の結合能を失わないように設計することが挙げられる。
【００８４】
光応答性核酸類が光連結することが可能な塩基は公知であるか、当業者であれば試行錯誤なく同定することができる。例えば、式Ｉ又はＩＩで示される光応答性核酸類はシトシン、チミンやウラシルといったピリミジン塩基と光連結することが公知であることから、該第二のプローブは該第一のプローブ内のピリミジン塩基と相補的な配列となるように設計して使用することができる。なお、第二のプローブは、該第一のプローブ中の該光応答性核酸類が自己内で光連結することが可能なすべての塩基と相補的である必要は無く、少なくとも、所定の光連結条件下で、該第一のプローブ中の該光応答性核酸類が自己内で光連結する塩基と相補的であれば良い。
【００８５】
但し、該第二のプローブが該第一のプローブに対してハイブリダイゼーションするためには、連続した塩基を必要とすることは公知であることから、該第二のプローブが必要に応じて、該第一のプローブ内の光応答性核酸類が自己内で光連結する核酸類の塩基以外とも相補性を必要とすることは自明である。
【００８６】
また、第二のプローブは、連続した単数の配列として前記第一のプローブの自己内の光連結を抑制することもできるし、第一のプローブ内に存在する光応答性核酸類が光連結可能な核酸と相補性を有する、非連続な複数の配列として使用することもできる。当業者であれば、公知の方法に従って、解析方法や光連結条件に応じて、ハイブリダーゼンション可能な塩基配列や鎖長などを考慮して、連続した単数の配列でも非連続な複数の配列でも、適宜、設計して使用することが可能である。
【００８７】
光応答性核酸類は前記光応答性核酸類を含むプローブの中央付近に配置することも可能であるが、該第一のプローブの末端側に配置することもできる。利用する解析系において、使用可能な該第一のプローブの鎖長が制限される場合（例えば、ハイブリダイゼーション可能な最小の鎖長など）、光応答性核酸類を該第一のプローブの末端側に配置することにより、該第一のプローブと安定的にハイブリダイゼーションするように前記第二のプローブを設計することができる。
【００８８】
なお、光応答性核酸類を末端に配置することによって、該光応答性核酸類の立体障害のため、ハイブリダイゼーションによって該末端塩基を光連結する核酸との距離を接近させることが不十分になり、標的部位と光連結できない可能性が考えられる場合には、該光応答性核酸類を、末端よりも内側に導入することがより好ましく、更には末端から２〜５塩基目に導入することがより好ましい。
【００８９】
従来の技術常識では、プローブは、標的部位以外とは相補的配列を有しないようにすること、及び、プローブが自己配列内において二次構造を形成することを防ぐためにプローブ内に相補的配列を有しないようにすることはもちろん、２つ以上のプローブを使用する場合、それらのプローブ間で相補的配列が少ないことがプローブ設計にあたり重要であるとされていた。
【００９０】
しかし本発明の光連結方法では、標的部位に相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブに対して、標的部位と競合関係にある、該第一のプローブと相補性が高い第二のプローブを利用することで、光連結効率を向上させることができたのは意外な効果である。
【００９１】
当業者であれば、前記光応答性核酸類を含む第一のプローブが自己内で光連結することが可能か否かについて、公知の方法を適宜選択して使用することができる。例えば、ソフトウェアを使用して塩基の隣接計算や所与の構造の遊離エネルギー計算から、前記光連結プローブの二次構造を予測し、自己内の光連結に関与する核酸を選定することも可能である。更に、後述する実施例のように、所定の光連結条件下において、自己内で光連結するか否か検討することもできる。
【００９２】
また、第二のプローブに光応答性核酸類を含めることもでき、第二のプローブとして自己会合を抑制する機能と、光応答性核酸類を含む第一のプローブ（光連結プローブ）として光連結する機能を有するように設計して使用することもできる。
【００９３】
光応答性核酸類を含むプローブは、光連結する作用を示す場合には第一のプローブとして、また、自己会合を抑制する作用を示す場合には第二のプローブとして称される場合がある。例えば、標的部位のセンス鎖プローブ、該標的部位のアンチセンス鎖プローブがともに光応答性核酸類を含む場合、該センス鎖プローブを第一のプローブとした場合には該アンチセンス鎖プローブは第二のプローブとなり、該アンチセンス鎖プローブが第一のプローブである場合には、該センス鎖プローブは第二のプローブとして機能する。
この場合、該第二のプローブは、該標的部位のアンチセンス鎖の標的核酸と、クロスリンク型の光連結をすることができる。
【００９４】
また、自己会合を抑制する方法であれば上記の方法に限定されることなく、多様な解析方法において本発明の光連結方法を適宜変更して使用することが可能である。
【００９５】
例えば、配列が一本鎖である場合（例えばｍＲＮＡ等）は、光応答性核酸類は少なくとも第一のプローブに含有されていれば良いが、標的部位が二本鎖である場合（例えばｄｓＤＮＡ等）は、光応答性核酸類は第一のプローブだけでなく、第二のプローブにも含有されていることが好ましい。例えば、野生型配列を光連結し、変異型配列を高感度に検出する場合であって、さらに核酸増幅反応を伴う遺伝子解析である場合は、野生型配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両鎖に光連結することで更に高感度に変異型配列を検出、同定することができる。
【００９６】
また、第一のプローブ及び第二のプローブが共に光応答性核酸類を有する（すなわち、光連結プローブとして機能する）場合、第一のプローブと第二のプローブの非相補性領域において、第一のプローブ及び／又は第二のプローブ内に存在する光応答性核酸類が自己内で光連結できないように、第一のプローブ及び／又は第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを使用することもできる。第三のプローブは、前記第二のプローブの態様と同様に設計し、使用することができる。
【００９７】
本発明の光連結方法の第二の態様としては、核酸サンプル中の標的部位と、該標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブと、該標的部位に対して相補的な配列を有し標的核酸を含む第四のプローブとを反応溶液中で隣接して配置するようにハイブリダイゼーションさせ、光照射することによって該第四のプローブに存在する標的核酸と該第一のプローブ中の該光応答性核酸類との間で光連結するライゲーション型の光連結方法において、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを共存させることで、該第一のプローブの自己内での光連結を抑制させる光連結方法が挙げられる。
【００９８】
該第一のプローブに相補的な配列をもつ、第二のプローブの使用によって、光応答性核酸類が挿入された末端とは反対側の末端に存在する塩基と結合して自己配列内での会合を抑制することも可能である。
【００９９】
該ライゲーション型の光連結方法としては、ＷＯ２００７／０５８３２６号公報に記載の方法を本願に取り込んで使用することができる。当業者であれば、光連結方法が該ライゲーション型であることを除いて、本発明の光連結方法の第一の態様を、適宜改変して、該第二の態様を容易に実施することができる。このようなライゲーション型の光応答性核酸類を使用した方法では、該第一のプローブはその３’末端又は５’末端に光応答性核酸類を有しており、標的部位に上記の該第一プローブ及び該第四プローブがハイブリダイゼーションした場合以外にも、該第一のプローブ内の光応答性核酸類とピリミジン塩基とが空間的配置により近接した場合に会合して光連結することを防ぐ使用方法も可能である。
【０１００】
以下にライゲーション型の光連結方法について詳述する。
光応答性核酸類を含む第一のプローブと標的核酸を含む第四のプローブは、所定の標的部位において、隣接してハイブリダイゼーションするように配置され、且つ、光照射によって光連結可能なように隣接して該光応答性核酸類と該標的核酸とが配置される。
【０１０１】
このとき、該光応答性核酸類は第一のプローブの末端に位置するように設計されることが好ましい。また、第四のプローブは第一のプローブと隣接する側の末端が光連結可能な標的核酸となるように設計することが好ましい。
【０１０２】
また、該第一のプローブと第四のプローブとが１塩基分の間隙も無く近接し、両プローブに光照射された際に光連結によって結合した連続した一本の核酸配列を構成しうることが好ましい。
【０１０３】
光応答性核酸類を含む該第一のプローブと標的核酸を含む該第四のプローブとが光照射によって連結されることによって、更に安定的な標的部位の塩基配列と相補的な塩基配列を生成する。
【０１０４】
例えば、光応答性核酸類として、５−カルボキシビニル−２’−デオキシウリジン（ＣＶＵと表記する）を有する第一のプローブを使用した場合、このＣＶＵは、標的核酸であるピリミジン塩基と光連結性を示し、チミンの塩基部分と炭素−炭素二重結合を形成する。
【０１０５】
標的部位である検出対象である核酸配列と、該ＣＶＵを含む該第一のプローブと、標的核酸を含む該第四のプローブと、を混合しハイブリダイゼーションさせる。すると、塩基配列の相補性に従って、標的部位に対して該第一のプローブと該第四のプローブとが光連結可能になるように隣接して整列する。この状態で光照射を行うと、光反応により光連結されて、ＣＶＵと標的核酸であるピリミジン塩基とが共有結合で１本に連結された状態となる。
【０１０６】
このようなライゲーション型の光連結方法には、上記のように第一のプローブと第四のプローブのそれぞれ末端側で光連結可能な光応答性核酸類を使用すれば良いが、例えば、該光応答性核酸類として式ＩＩＩ〜ＶＩＩで示される化合物が使用できる。
【０１０７】
前記第一の態様又は前記第二の態様はそれぞれ単独で実施することもできるが、該第二の態様は該第一の態様と組み合わせて実施することもできる。例えば、光応答性核酸類を含む第一のプローブがクロスリンク型の光連結を行い、光応答性核酸類を含む第二のプローブがライゲーション型の光連結を行う方法、又は、光応答性核酸類を含む第一のプローブがライゲーション型の光連結を行い、光応答性核酸類を含む第二のプローブがクロスリンク型の光連結を行う方法などが挙げられる。
【０１０８】
本発明の光連結方法の第三の態様としては、前記光連結プローブは、標的部位とハイブリダイゼーション可能な限り、所定の光連結条件下において、光連結プローブ内の光応答性核酸類が自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換した該光連結プローブを設計し、自己内の光連結を抑制させることも可能である。また、センス鎖プローブとアンチセンス鎖プローブとがプローブ間で光連結することを防ぐために該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換してプローブを設計し、プローブ間での光連結を抑制させることもできる。例えば、該光応答性核酸類がＣＮＶＫである場合はピリミジン塩基からアデニン、グアニンやイノシンのようなプリン塩基に置換して実施することも可能である。置換する塩基の数は、標的部位或いはプローブ内に存在するピリミジン塩基数に応じて適宜設定することができる。
【０１０９】
また、光応答性核酸類がＣＮＶＫである場合、光連結可能な塩基である、シトシンやチミンのピリミジン環を人工的に変換した合成塩基を使用することもできる。この場合、光照射による［２＋２］付加環化反応が起きないようにすることで、光連結プローブが自己配列内で光連結することを抑制することができる。この場合使用可能な合成塩基としては、例えば、ピリミジン環の５位もしくは６位の炭素を窒素に置換した５−アゾ−チミン、６−アゾ−チミン、５−アゾ−シトシン、６−アゾ−シトシン等の合成塩基等が挙げられる。
【０１１０】
該第三の態様は単独で実施することもできるが、前記第一の態様及び／又は前記第二の態様と組み合わせて実施することもできる。
当業者であれば、公知の情報から使用する光応答性核酸類がどの塩基を標的とするか、どのような化学反応機構により光連結を行うか等の性質を考慮し、標的となる塩基に対して置換もしくは修飾を実施して、合成塩基を適宜使用することが可能である。
【０１１１】
本発明の光連結方法は、緩衝作用のある塩を含む反応溶液中で行うことができる。緩衝作用のある塩としてはカコジル酸塩、リン酸塩、トリス塩をあげることができる。緩衝作用のある塩の濃度は、５〜２５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲にあることが好ましい。また、アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属の塩を含むことが好ましい。アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属として塩化ナトリウム、及び塩化マグネシウムをあげることができる。さらに反応溶液中にＤＭＳＯやホルムアミド等の有機溶剤を加えることで光応答性核酸類を含むプローブと標的部位との特異的な光結合反応を促すこともできる。但し、その後又は同時に行われる遺伝子解析方法を阻害するような物質の混入を避けることが好ましい。特に核酸増幅反応と同時に行う場合は核酸増幅反応に適した反応組成であることが好ましい。
【０１１２】
本発明の光連結方法における光照射は、一般に３５０〜３８０ｎｍの範囲、好ましくは３６５ｎｍの波長を含む光が好ましく、特に好ましくは３６５ｎｍの単波長のレーザー光である。好適な実施の様態において光照射による光反応は１秒〜数秒以内が好ましい。但し、容器および溶液の光透過性を考慮してさらに時間をかけて行うこともできる。
【０１１３】
また、前記光の照射は１回以上行えばよいが、複数繰り返すことにより、光連結効率を高めることができる。当業者であれば、利用する遺伝子解析方法に応じて、適宜、選択して実施することができる。例えば、ＰＣＲ法において増幅サイクル毎に光照射を繰り返すことによって、より確実に野生型核酸の増幅を抑制することができる。全増幅サイクルで光を照射してもよいし、任意の増幅サイクルから照射を開始又は終了してもよい。
【０１１４】
また、標的核酸に対して一度光連結した光連結プローブが、光照射による光平衡反応により開裂しないように、光照射時の波長の選択および出力の選択をすることも重要である。光照射時の波長の選択および出力の選択に関しては、当業者であれば過度の検討を実施せず選択可能である。
【０１１５】
また、別の好適な実施の態様によれば、局所的に前記プローブ濃度を高めることで前記プローブと前記標的部位との会合を効率的かつ迅速化することができ、その結果、光連結効率を向上させることができる。
【０１１６】
例えば、核酸は反応溶液中で負に帯電することから、アニオン性物質を共存させることにより、局所的に実質的な密度を高め、光連結効率を向上させることができる。アニオン性物質のように負に帯電した物質は、ポリエチレングリコールやデキストランのような帯電していない非イオン性ポリマーに比べて、ハイブリダイゼーションを促進し光連結効果をあげることが可能である。
【０１１７】
このようなハイブリダイゼーション促進剤としては、公知のアニオン性物質が使用可能であり、例えば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、又はその塩を使用することができる。アニオン性物質は光連結が行われる反応溶液中に存在していれば良く、核酸サンプル中の対象とする遺伝子を解析する遺伝子解析方法において、光連結以外の反応に影響を及ぼさないように、当業者であれば、適切な濃度範囲を適宜検討の上決定して使用することができる。例えば、ポリアクリル酸塩は、約０．２〜１０％（容量に対する重量百分率（ｗ／ｖ）で表す、以下同じ）の範囲が好ましく、０．５〜５％程度がより好ましい。ポリメタクリル酸塩では、約１．０〜５０％の範囲が好ましく、５〜２５％程度がより好ましい。
【０１１８】
これらのポリマーの分子量は、広い範囲にわたるが、約５，０００〜１００，０００ダルトンであることが好ましく、分子量約５，０００〜１０，０００ダルトンであることがより好ましい。本発明におけるハイブリダイゼーション促進を意図して、同等の種々のアクリル酸塩重合体を使用することも可能であり、アクリル酸塩の様々な単独重合体および共重合体であって、ハイブリダイゼーション促進特性を有することが予期される化合物を使用することができる。
【０１１９】
なお、上記のハイブリダイゼーション効率の向上方法は、光連結条件下における、標的部位と光応答性核酸類を含むプローブのハイブリダイゼーションだけではなく、あらゆるハイブリダイゼーションにおいて有用なことは、当業者であれば自明である。
【０１２０】
また、本発明の光連結において、前記光連結プローブと前記標的部位との会合を効率的かつ迅速化することで光連結効率を向上させることができる。
【０１２１】
例えば、核酸サンプル中の標的部位を含む核酸配列の存在量に関わらず、光応答性核酸類を含む光連結プローブの濃度を高くすることで、光連結効率を向上させることができる。その場合、光連結時におけるプローブ濃度は約０．１μｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、約１μｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましく、約１０μｍｏｌ／Ｌ以上であることが最も好ましい。
【０１２２】
このように光応答性核酸類を含む光連結プローブが、自己配列内で光連結することを抑制したり、局所的に光連結プローブの濃度を高めて標的部位と効果的にハイブリダイゼーションしたりすることで、光連結効率を向上させることが可能である。
【０１２３】
本発明における光連結方法は、公知の、核酸サンプル中の対象とする遺伝子を解析する遺伝子解析方法に使用することができる。これは、対象とする遺伝子の有無やその配列を同定するだけでなく、該遺伝子の精製や選択的回収も含まれることは、当業者であれば設計変更の範囲内である。
上記の精製や選択的回収の例としては、該遺伝子の精製や核酸サンプル中の標的核酸類を含む核酸を選択的に収集する前処理工程が挙げられる。これらの前処理工程における使用は、下記に述べる遺伝子解析方法において極めて有効である。従って、該前処理の後に続いて実施される遺伝子解析方法、遺伝子検出方法において高感度で正確な解析を達成することが可能となり、好ましい。
【０１２４】
また、本発明で使用可能な遺伝子解析方法としては、公知の遺伝子検出方法や核酸増幅方法等が使用できる。遺伝子検出方法や核酸増幅方法としては、様々な方法が知られているが、Invader法、Sniper法、TaqMan PCR法、Hybridization Probe法、SNPIT法、Pyrominisequencing法、Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC)法、MALDI−TOF／MS法、NanoChip法などが迅速且つハイスループットで解析する方法として挙げられる。また、本発明で使用可能な別の遺伝子解析方法としては、例えば、標的部位に未知の変異型核酸があると思われる場合に、検出領域の増幅産物について塩基配列を決定することで変異型核酸の有無を判定することができる。
【０１２５】
本発明の遺伝子検出方法の利用としては、標的部位に対して相補的で光応答性核酸類を含む光連結プローブを蛍光標識したものをハイブリダイゼーションさせ、光照射により該標的核酸と該光連結プローブ間で光連結させ、蛍光を検出することにより、該遺伝子を検出する方法が挙げられる。当業者であれば、本発明の光連結方法を、遺伝子解析の目的に応じて適宜変更して実施することができ、また、公知の遺伝子検出方法に容易に使用することができる。
【０１２６】
本発明において核酸増幅方法とは、公知のポリメラーゼ反応を利用した鋳型核酸の増幅反応をいい、例えば、ＷＯ２０１２／０３３１９０号公報に開示されている公知の核酸の増幅抑制方法において、本発明の光連結方法を利用することができる。
【０１２７】
核酸の増幅方法における本発明の光連結方法の利用としては、標的部位を含む検出対象である核酸配列（増幅用ヌクレオチド配列）を増幅可能なプライマーを用いて、公知の核酸増幅方法を実施する際に、検出対象である遺伝子の核酸の変異に基づいて、ある核酸配列（例えば、野生型核酸）の増幅を抑制する一方、それ以外の核酸配列（例えば、変異型核酸）のみを選択的に増幅させる方法における利用が挙げられる。
【０１２８】
野生型核酸又は変異型核酸のいずれを増幅抑制の対象とするかは、その目的に応じて適宜選択することができ、特に限定されるものではないが、例えば、核酸サンプル中の存在比に大きな偏りがある場合、大量に存在する核酸（例えば、野生型核酸）の増幅を抑制し、微量に存在する核酸（例えば、変異型核酸）のみを選択的に増幅することにより、微量に存在する核酸の有無を検出することができる。
【０１２９】
例えば、本発明の光連結方法により、増幅抑制対象である野生型核酸（標的部位を有する）に対して、該標的部位に相補的な配列を有し、光応答性核酸類を含む第一のプローブをハイブリダイゼーションさせ、光照射により該標的核酸と該第一のプローブとで光連結させることにより、該野生型核酸の増幅を抑制して、検出対象である変異型核酸のみを選択的に増幅する。
【０１３０】
また、ＴａｑＭａｎ法によって使用されるＴａｑＭａｎプローブのように、必要に応じて蛍光物質や消光物質で配列中の塩基を標識してもよい。変異型核酸に対するＴａｑＭａｎプローブ等の公知の検出用プローブを利用することにより、対象核酸の検出だけでなく定量を行うこともできる。
【０１３１】
また、本発明の光連結方法による特定の核酸の増幅抑制方法は、他の核酸増幅方法と同時に行うこともできるし、核酸増幅方法の前処理段階として実施することもできる。当業者であれば、本発明の光連結方法を、遺伝子解析の目的に応じて適宜変更して実施することができ、また、公知の遺伝子増幅方法に容易に使用することができる。
【０１３２】
前記選択的核酸増幅に用いるプライマーは、変異型核酸の増幅用ヌクレオチド配列を増幅することのできるプライマーであり、それは同時に、光応答性核酸類を有するプローブが光連結される前の野生型核酸において、野生型核酸の増幅用ヌクレオチド配列も増幅できるプライマーである。
【０１３３】
野生型配列を有する分子は光照射によって光応答性核酸類を有する光連結プローブと光連結しているため、架橋された塩基より３’末側への伸長反応が進まず増幅されない。一方、変異型配列を有する分子の大部分は光応答性核酸類を有する光連結プローブと光連結していないため、伸長反応が起こり、その結果、選択的な核酸増幅が成される。
【０１３４】
核酸増幅法に使用可能な増幅プライマーは、１又は２以上の標的部位を含む増幅用ヌクレオチド配列をＰＣＲにより増幅し得るプライマーであり、増幅用ヌクレオチド配列を挟む２種類のプライマーである。例えば、増幅用ヌクレオチド配列の上流端領域と相同的なヌクレオチド配列を有するフォワードプライマーと、増幅用ヌクレオチド配列の下流端領域と相補的なヌクレオチド配列を有するリバースプライマーとからなる２種類のプライマーであってもよい。なお、ＰＣＲにおいて用いられる該２種類のプライマーの各濃度は、ＰＣＲ産物として二本鎖核酸を得ることができる濃度比であれば特に限定されるものではないが、等濃度で用いることが好ましい。
【０１３５】
ＰＣＲに用いられるこれらのプライマーは増幅用ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の配列情報から常法により設計、合成することができる。ＰＣＲに用いられるこれらのプライマーは、ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログからなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものである。プライマーの長さは、プライマーのＴｍ値、増幅ヌクレオチド配列の種類等を考慮して適宜決定することができるが、１０〜１００分子連結したものであることが好ましい。
【０１３６】
ＰＣＲ反応に使用される試薬の種類、量、調製方法および反応条件等のプロトコルは常法に従って行うことができる。なお、ＰＣＲに用いられるＤＮＡポリメラーゼは、通常ＰＣＲにおいて用いられるＤＮＡポリメラーゼであれば特に限定されるものではないが、耐熱性ポリメラーゼであることが好ましい。
【０１３７】
光応答性核酸類を有するプローブは、光照射により標的部位との光連結によってポリメラーゼの伸長反応を阻害することから、光応答性核酸類を有するプローブ自体にヌクレアーゼ活性に対する抵抗性は必要としない。従って、ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの使用も可能である。但し、光応答性核酸類を有するプローブがプライマーとして機能し、ポリメラーゼの伸長反応が生じ得る場合は、ポリメラーゼによる伸長反応が起こる温度で標的分子から解離するようにＴｍ値を考慮するか、光応答性核酸類を有するプローブの３’末端に伸長反応を阻害する物質を修飾することによって増幅プライマーとして機能しないようにすることが好ましい。また、本発明の光連結方法のために第一のプローブ、第二のプローブ、第三のプローブ、第四のプローブを使用する場合、これらのプローブについても同様に、増幅プライマーとして機能しないようにＴｍ値の考慮ならびに３’末端に伸長反応を阻害するような物質を修飾することが好ましい。
【０１３８】
また、ＰＣＲ反応において、通常のＰＣＲ増幅反応に適した反応組成で実施できる。さらに選択的増幅反応を促すために反応液中にＤＭＳＯやホルムアミド等、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える物質を加えることも可能である。
【０１３９】
本発明の光連結キットは、本発明の光連結方法が実施できるように構成される。具体的には、前記本発明の光連結方法の第一の態様、前記第二の態様、前記第三の態様などが実施される。該光連結キットを構成する第一のプローブ、第二のプローブ、第三のプローブ、第四のプローブとは、本発明の光連結方法における第一のプローブ、第二のプローブ、第三のプローブ、第四のプローブと同じものを意味する。
【０１４０】
本発明の第一の光連結キットとしては、少なくとも、核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有し、該標的部位中の標的核酸と光連結する光応答性核酸類を含む第一のプローブ（光連結プローブ）と、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを含む。
また、光応答性核酸類を含む該第二のプローブを含むこともできる。この場合、前記第二のプローブは光連結プローブとしても機能する。
更に、光連結プローブとして機能する、前記第一のプローブ及び／又は前記第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを含むこともできる。
【０１４１】
本発明の第二の光連結キットとしては、少なくとも、核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブ（光連結プローブ）と、該第一のプローブの該光応答性核酸類と光連結する標的核酸を含む第四のプローブと、該第一のプローブに対して、高い相補性を有する第二のプローブを含む。
また、光応答性核酸類を含む該第二のプローブを含むこともできる。この場合、前記第二のプローブは光連結プローブとしても機能する。
更に、光連結プローブとして機能する、前記第一のプローブ及び／又は前記第二のプローブに相補的な配列を有する第三のプローブを含むこともできる。
【０１４２】
本発明の第三の光連結キットとしては、少なくとも、核酸サンプル中の標的部位に対して相補的な配列を有する光応答性核酸類を含む第一のプローブ（光連結プローブ）を含み、該光連結プローブは、該光連結プローブ内の光応答性核酸類が自己会合する核酸を、該光応答性核酸類と光連結しない核酸に置換して該光連結プローブの自己内の光連結を抑制されたものである。
【０１４３】
本発明の光連結キットには、利用する遺伝子解析方法に応じて、反応溶液、標識酵素、核酸増幅用のポリメラーゼ、核酸増幅用のプライマー等を含むこともできる。当業者であれば、公知のキットの構成に応じて、適宜、選択して設計することができる。
【実施例】
【０１４４】
以下では、光連結プローブの光応答性核酸類としてＣＮＶＫを使用し、上皮成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＥＧＦＲ）遺伝子配列の一部を標的部位とした場合を例に詳細な説明をするが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。本発明の精神から離れることなく、いかなる変更、改良又は改変を加えることができることは当業者には自明である。
また、本実施例中において、アミノ酸一文字表記と該アミノ酸の位置番号とで示された表記の場合には野生型を、元のアミノ酸位置文字表記と該アミノ酸位置番号に加えて、更に置換されたアミノ酸一文字表記を組合せて表記される場合には変異型をあらわすものとする。【０１４５】
［実施例１：光連結プローブの自己配列内での光連結確認］
実施例１−１．光連結プローブの調製
ＥＧＦＲ遺伝子上のエクソン２１（ｅｘ．２１）領域の一部と同配列の１００ｍｅｒからなるオリゴヌクレオチドを合成し（配列番号１）、光連結対象の鋳型とした。
［配列番号１］  １００ｍｅｒオリゴヌクレオチド：
５’−ＡＧＣＣＡＧＧＡＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡ−３’（配列番号１）【０１４６】
この合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能な１６ｍｅｒからなる光連結プローブは以下のように調製した。光連結プローブとして、光応答性プローブ（ｐｈｏｔｏ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｂｅ）を光応答性核酸類である３−シアノビニルカルバゾール−１’−β−デオキシリボシド（ＣＮＶＫ）の導入位置を変えて４種類設計した（配列番号２〜５）。これらＰＲＥＰの配列を表１に示す。なお、ＣＮＶＫのＰＲＥＰへの導入位置をｎとして示す。
ＣＮＶＫは特開２００９−２５４２７９号公報に記載の方法に従って調製し、プローブの合成はファスマック社に委託した。また、ＣＮＶＫの構造式を図１に示す。【０１４７】
【表１】
2014014106.tif 000012
【０１４８】
実施例１−２．光連結プローブへの光照射処理
実施例１−１．にて合成した各ＰＲＥＰをＴＥにて１００μｍｏｌ／Ｌに溶解し、各２００ｐｍｏｌを別々の０．２ｍＬチューブに分取した。それぞれのサンプルに対して以下の条件にて光照射を実施した。なお、光連結波長である３６５ｎｍの光照射はＵＶ−ＬＥＤ照射器（ＺＵＶ−Ｃ３０Ｈ：オムロン）を、開裂波長である３１２ｎｍの光照射はＵＶトランスイルミネーター（フナコシ）を使用した。【０１４９】
条件１：光未照射
各ＰＲＥＰに対して光照射を行わない。
条件２：光連結光照射
各ＰＲＥＰに３６５ｎｍの光を室温にて１分間照射する。
条件３：光連結光照射＋光連結開裂光照射
条件２の光照射を施した各ＰＲＥＰに、３１２ｎｍの光を室温にて５分間照射する。【０１５０】
実施例１−３．電気泳動による評価
光照射処理の影響を見るため、実施例１−２．の条件で処理した各々のＰＲＥＰを滅菌水で１０μｍｏｌ／Ｌに希釈後、ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所）を用いてマイクロチップ電気泳動を行った。そのゲルイメージを図２〜図５に示す。【０１５１】
４種類すべてのＰＲＥＰにおいて、光連結波長の光を照射することにより電気泳動のバンドが低分子側にシフトした。これは、明らかにＰＲＥＰのコンフォメーションが変化したことを示唆している。
また、光連結波長の光を照射した後に光連結開裂波長の光を照射すると、低分子側にシフトしたバンドが、光連結波長の光を照射する前（すなわち、光未照射）のバンドの位置に戻ることが確認された。これは、自己の配列内で形成していた光連結が開裂し元の状態に戻ったものと考えられる。
この現象は、４種類すべてのＰＲＥＰにおいて同様に確認されたことから、光連結部位であるＣＮＶＫの導入位置に関係なく起こると考えられた。【０１５２】
［実施例２：光照射処理をした光連結プローブの光連結効率の評価］
実施例２−１．光連結プローブの調製
評価対象の光連結プローブは、実施例１−２．で調製したＰＲＥＰａ．〜ＰＲＥＰｄ．を使用した。【０１５３】
実施例２−２．光連結プローブの光連結反応
０．２ｍＬチューブに、標的部位として１００ｐｍｏｌ／Ｌの合成オリゴヌクレオチド２μＬを分取し、１０μｍｏｌ／ＬのＰＲＥＰ（実施例１−２．記載の各条件で処理したもの）２μＬを加え、１×ＰＣＲバッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ，１．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２，０．００１％（Ｗ／Ｖ）  ｇｅｌａｔｉｎ）の終濃度で総量を２０μＬとした。
これを９５℃にて５分間加熱処理し、５０℃にて５秒間静置した後、５０℃でＵＶ−ＬＥＤにより３６５ｎｍの光を３０秒間照射した。なお、対照として光を照射しないサンプルを同時に用意した。【０１５４】
実施例２−３．定量ＰＣＲ反応溶液の調製と反応条件
実施例２−２．で調製したサンプル（対照サンプルを含む）の各調製液２０μＬに８０μＬの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、その内５μＬずつを鋳型としてプライマーＥＧＦＲ  Ｅｘ．２１ＦおよびＥｘ．２１Ｒによりライトサイクラー（Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ：ロッシュ）を使用して定量ＰＣＲ反応を実施した。【０１５５】
ＰＣＲ反応試薬にはＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（ロッシュ）を使用した。なお、プライマーの配列は以下の通りである。
ＥＧＦＲ  ｅｘ．２１Ｆ：５’−ＧＡＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号６）
ＥＧＦＲ  ｅｘ．２１Ｒ：５’−ＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣ−３’（配列番号７）【０１５６】
実施例２−４．光連結効率の評価
実施例２−２．で光連結処理を実施したサンプルと光連結処理を実施しなかった対照のサンプルを鋳型として、それぞれ実施例２−３．の条件にて定量ＰＣＲ反応を実施した。ＰＲＥＰが光連結した標的部位は、共有結合により架橋された箇所でポリメラーゼの伸長反応が止まるため、増幅反応の鋳型として機能しなくなる。従って、定量ＰＣＲ反応において、光連結処理を実施しなかった対照サンプルよりも通常遅いサイクルにて蛍光シグナルが立ち上がってくる。そのため、ＰＲＥＰにより光連結された標的部位の量を以下の式に従い算出し、光連結効率として表記することができる。
ΔＣｔ＝光連結処理後の標的部位のＣｔ値−光連結未処理の標的部位のＣｔ値
光連結効率（％）＝（１−２ΔＣｔ）×１００
このようにして、各ＰＲＥＰの標的部位への光連結効率を評価した結果を表２に示す。【０１５７】
【表２】
2014014106.tif 000013
【０１５８】
その結果、いずれのＰＲＥＰにおいても、光連結波長を１分間照射した後においては著しく光連結効率が低下していることが確認された。また、開裂波長を５分間照射することによって、一度失われた光連結効率が再び回復し、光連結可能な状態になっていることが確認された。
この結果から、ＰＲＥＰに対して光連結波長が照射されると、ＰＲＥＰの自己配列内で光連結され、その結果、ＰＲＥＰの光連結能が消失したことで、標的部位に対する光連結効率が大きく低下したと考えられる。
さらに、自己の配列内で光連結してしまったＰＲＥＰに対して光連結開裂波長である３１２ｎｍの光を照射することで、自己配列内で形成していた光連結が開裂し元の状態に戻ったために、低下していた光連結効率が回復したと考えられる。
また、いずれのＰＲＥＰにおいても光連結能の消失および回復が認められることからＰＲＥＰに対するＣＮＶＫの導入位置に関わらずＰＲＥＰの自己内での光連結および開裂が起こることが示唆された。
これらの結果は、実施例１において光連結反応後の電気泳動バンドがシフトし、光連結開裂波長の光を照射した後には電気泳動バンドが元の位置に戻った事実とも一致するものである。【０１５９】
［実施例３：プリン塩基のみで構成される光連結プローブにおける自己配列内での光連結確認］
光応答性核酸類であるＣＮＶＫとは光連結しない、プリン塩基のみで構成されたＰＲＥＰを合成し、合成した各ＰＲＥＰが光連結波長の光を照射しても自己配列内で光連結しないことを確認した。【０１６０】
実施例３−１．光連結プローブの調製
光連結プローブとして、プリン塩基であるアデニン（Ａ）もしくは、グアニン（Ｇ）のみで構成した以下の３種のＰＲＥＰを調製した。合成したＰＲＥＰの配列を表３に示す。その際、光応答性核酸類であるＣＮＶＫの導入位置（Ｘ）および鎖長（１６ｍｅｒ）は統一とした。
【表３】
2014014106.tif 000014
【０１６１】
実施例３−２．光連結プローブへの光照射処理
実施例３−１．にて合成した各ＰＲＥＰをＴＥにて１００μｍｏｌ／Ｌに溶解し、各２００ｐｍｏｌを別々の０．２ｍＬチューブに分取した。それぞれのサンプルに対して以下の条件にて光照射を実施した。
なお、光連結波長である３６５ｎｍの光照射はＵＶ−ＬＥＤ照射器を使用した。
条件１：光未照射
各ＰＲＥＰに対して光照射を行わない。
条件２：光連結光照射
各ＰＲＥＰに３６５ｎｍの光を４℃にて３分間照射する。【０１６２】
実施例３−３．電気泳動による評価
光照射処理の影響をみるために、実施例３−２．の条件で処理した各々のＰＲＥＰを滅菌水で１０μｍｏｌ／Ｌに希釈後、ＭｕｌｔｉＮＡを用いてマイクロチップ電気泳動を行った。そのゲルイメージを図６〜図８に示す。【０１６３】
３種類いずれのＰＲＥＰにおいても、光連結波長の光を照射する前後で、電気泳動のバンドに移動度の違いは見られなかった。このことから、プリン塩基のみで構成されたＰＲＥＰは、光応答性核酸類であるＣＮＶＫと結合可能な塩基がプローブの配列内に存在していないため、自己の配列内で光連結しなかったことが推察された。【０１６４】
［実施例４：相補配列を利用した光連結プローブの自己配列内での光連結抑制］
実施例４−１．光連結プローブの調製
野生型配列であるＥＧＦＲ遺伝子上の７９０番目のスレオニン（Ｔ７９０）、８５８番目のロイシン（Ｌ８５８）および８６１番目のロイシン（Ｌ８６１）に該当する核酸配列を標的部位として、ＥＧＦＲ遺伝子のコード鎖、すなわち、センス鎖にハイブリダイゼーションするアンチセンス鎖（ＡＳ鎖）の光連結プローブであるＰＲＥＰを設計し、同時にＥＧＦＲ遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイゼーションするセンス鎖（Ｓ鎖）の光連結プローブであるＰＲＥＰも設計した。その際に、センス鎖のＰＲＥＰとアンチセンス鎖のＰＲＥＰの相補性を以下の組み合わせのように変化させ、お互いの光連結プローブ同士が光連結しない位置に実施例１で記載したＣＮＶＫを配した。図９に光連結プローブとして実際に使用したＰＲＥＰの配列とその相補性についての模式図を示す。図中のＡＳ鎖は野生型ＥＧＦＲ遺伝子配列のセンス鎖と相補的であることを意味し、Ｓ鎖は野生型ＥＧＦＲ遺伝子配列のアンチセンス鎖と相補的であることを意味するものとする。【０１６５】
（１）Ｌ８６１：  相補性が低い組み合わせの例
Ｌ８６１  ＡＳ鎖：５’−ＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＣＣＣＡｎＣＡＧ−３’（配列番号１１）
Ｌ８６１  Ｓ鎖  ：５’−ＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡｎＣＴＧＣ−３’（配列番号１２）
（２）Ｔ７９０：  相補性が高い組み合わせの例
Ｔ７９０  ＡＳ鎖：５’−ＴＧＡｎＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＧ−３’（配列番号１３）
Ｔ７９０  Ｓ鎖  ：５’−ＣＡｎＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣ−３’（配列番号１４）
（３）Ｌ８５８：  相補性が（１）及び（３）の中間的な組み合わせの例
Ｌ８５８  ＡＳ鎖：５’−ＣＡｎＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣ−３’（配列番号１５）
Ｌ８５８  Ｓ鎖  ：５’−ＣＡｎＴＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡ−３’（配列番号１６）【０１６６】
実施例４−２．光連結プローブへの光照射処理
光連結プローブへの光照射処理は、以下の条件に従って実施した。
条件１：ＡＳ鎖、光未照射
実施例４−１．にて合成したＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖にハイブリダイゼーションするＡＳ鎖のＰＲＥＰを各々、ＴＥにより１０μｍｏｌ／Ｌに調製したものを条件１とした。
条件２：ＡＳ鎖、光照射
条件１と同様に調製した各々のＡＳ鎖のＰＲＥＰを、サーマルサイクラー（アプライド社製）にて４℃にした後、ＵＶ−ＬＥＤ照射器にて３６５ｎｍの光を３分間照射したものを条件２とした。
条件３：Ｓ鎖、光未照射
実施例１−１．にて合成したＥＧＦＲ遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイゼーションするＳ鎖のＰＲＥＰを各々、ＴＥにより１０μｍｏｌ／Ｌに調製したものを条件３とした。
条件４：Ｓ鎖、光照射
条件３と同様に調製した各々のＳ鎖のＰＲＥＰを、サーマルサイクラーにて４℃にした後、ＵＶ−ＬＥＤ照射器にて３６５ｎｍの光を３分間照射したものを条件４とした。
条件５：Ｓ鎖＋ＡＳ鎖光未照射
実施例４−１．にて合成したＥＧＦＲ遺伝子のセンス鎖にハイブリダイゼーションするＡＳ鎖のＰＲＥＰと、ＥＧＦＲ遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイゼーションするＳ鎖のＰＲＥＰを、それぞれが終濃度で１０μｍｏｌ／Ｌになるように混合したものを条件５とした。
条件６：Ｓ鎖＋ＡＳ鎖光照射
条件５と同様に混合した各ＰＲＥＰ溶液を、サーマルサイクラーにて４℃にした後、ＵＶ−ＬＥＤ照射器にて光を３分間照射したものを条件６とした。【０１６７】
実施例４−３．電気泳動による評価
実施例４−２．の条件にて調製したＰＲＥＰ試料を、ＭｕｌｔｉＮＡを用いてマイクロチップ電気泳動を行った。そのゲルイメージを、図１０〜図１２に示す。図１０は（１）Ｌ８６１を標的部位としたＰＲＥＰの組み合わせ、図１１は（２）Ｔ７９０、図１２は（３）Ｌ８５８の結果である。【０１６８】
（１）Ｌ８６１：相補性が低い組み合わせ
電気泳動の結果より、相補性が低い組み合わせでは、センス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合、アンチセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合のいずれも光照射処理後にバンドシフトが認められ、自己の配列内で光連結されていることが示唆された（図１０のレーン１〜４）。
また、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰを混合した条件５においては、条件１および条件３において見られた、センス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合及びアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合と同じ位置にバンドが認められたことから、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰとはハイブリダイゼーションしていないと考えられた。
さらに、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰを混合し光照射した条件６においても、センス鎖に対するＰＲＥＰに光照射処理した条件２とアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰに光照射処理した条件４のバンドと同じ位置にバンドが認められた。【０１６９】
（２）Ｔ７９０：相補性が高い組み合わせ
電気泳動の結果より、相補性が高い組み合わせにおいても、センス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合、アンチセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合のいずれも光照射処理後にバンドシフトが認められ、自己の配列内で光連結していることが示唆された（図１１のレーン１〜４）。
また、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰを混合した条件５においては、光照射を行っていない条件１のセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合と、光照射を行っていない条件３のアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合とは、異なる位置に一本のバンドが認められたことから、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰがハイブリダイゼーションしていることが推察された。
さらに、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰを混合したものに光照射を行った条件６においては、光照射する前と同じ位置にバンドが認められ、センス鎖に対するＰＲＥＰ、アンチセンス鎖に対するＰＲＥＰの光照射による自己の配列内で光連結した場合に検出される位置には、バンドが認められなかった。
このことから、光照射時にセンス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰがハイブリダイゼーションしていれば、自己の配列内で光連結は起こらないことが示唆された。【０１７０】
（３）Ｌ８５８：相補性が（１）及び（２）の中間的な組み合わせ
電気泳動の結果より、相補性が中間的な組み合わせにおいても、センス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合、アンチセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合のいずれも光照射後にバンドシフトが認められ自己の配列内で光連結していることが示唆された（図１２のレーン１〜４）。
また、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰを混合した条件５においては、光照射を行っていない条件１のセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合と、光照射を行っていない条件３のアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰの単独の場合とは、異なる位置にバンドが認められたことから、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰがハイブリダイゼーションしていることが推察された。【０１７１】
さらに、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰを混合したものに光照射を行った条件６においては、光照射する前とは異なる位置に２本のバンドが確認された。
低分子側のバンド（下のバンド）はセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合、又はアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合に光照射し自己の配列内で光連結された場合のバンドの位置と同じであることから、センス鎖に対するＰＲＥＰ又はアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰの自己会合に由来するバンドと考えられた。
また、高分子側のバンド（上のバンド）は、センス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合、アンチセンス鎖に対するＰＲＥＰ単独の場合の、自己会合由来のバンドとも異なる位置に認められた。このことから、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰとのハイブリダイゼーションは維持されているが、ハイブリダイゼーション出来ない塩基の部分にて光連結が行われ、バンドがシフトしたものと考えられた。【０１７２】
以上より、相補性が低いＰＲＥＰを混合して使用した場合においては、センス鎖に対するＰＲＥＰ又はアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰをそれぞれ単独で使用した場合にも、各々のＰＲＥＰを混合させて使用した場合にも、ＰＲＥＰが自己の配列内で光連結することが確認された。
また、センス鎖に対するＰＲＥＰとアンチセンス鎖に対するＰＲＥＰとが中程度の相補性がある場合でも、ハイブリダイゼーションしていない塩基中にＣＮＶＫと光連結可能なシトシン又はチミンのようなピリミジン塩基が存在していると、自己の配列内において光連結してしまうことが示唆された。
このことから、光連結プローブが自己の配列内で光連結することを抑制するためには、光連結プローブ間の相補性を高くすることが効果的であると考えられた。また、ＣＮＶＫと光連結可能なピリミジン塩基が相補鎖によって覆われ、ＣＮＶＫと結合可能な状態で存在しないようにすることが効果的であると考えられた。【０１７３】
［実施例５：相補性の高い光連結プローブを用いた光連結の確認］
実施例５−１．光連結プローブの調製
Ｔ７９０を標的部位とした、実施例４−１．（２）で調製した相補性の高い組合せであるＰＲＥＰを使用した。【０１７４】
実施例５−２．ＥＧＦＲエクソン２０（ｅｘ．２０）領域における野生型遺伝子断片の調製
健常者の末梢血から通常の方法によりヒトゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型としてプライマーセットＥＧＦＲ  ｅｘ．２０Ｆ及びＥＧＦＲ  ｅｘ．２０Ｒを使用してＴ７９０に該当する核酸配列を包むＥＧＦＲエクソン２０（ｅｘ．２０）の領域を通常のＰＣＲ反応条件により増幅した。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。
ＥＧＦＲ  ｅｘ．２０Ｆ：５’−ＣＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧ−３’（配列番号１７）
ＥＧＦＲ  ｅｘ．２０Ｒ：５’−ＡＣＣＴＴＴＧＣＧＡＴＣＴＧＣＡＣＡＣ−３’（配列番号１８）【０１７５】
得られたＰＣＲ増幅産物をｐＧＥＭＴ  ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ）内に、添付のプロトコルに従って挿入しクローニングした。
このプラスミドを鋳型として、前記プライマーセットＥＧＦＲ  ｅｘ．２０Ｆ及びＥＧＦＲ  ｅｘ．２０Ｒを使用して通常のＰＣＲ反応条件によって増幅を行い、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製することで、直鎖状のＥＧＦＲ  ｅｘ．２０の野生型遺伝子断片を得た（配列番号１９）。
ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製したＥＧＦＲ  ｅｘ．２０の野生型遺伝子断片の重量濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定し、増幅断片長を考慮して各遺伝子断片のコピー数を算出したものを、野生型核酸として以下の反応の検討鋳型として用いた。【０１７６】
［配列番号１９］  ＥＧＦＲ  ｅｘ．２０野生型断片
５’−ＣＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＴＧＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＧＣＡＧＡＴＣＧＣＡＡＡＧＧＴ−３’（配列番号：１９）【０１７７】
実施例５−３．光連結反応時の試薬組成
０．２ｍＬチューブに、実施例５−２．で調製した標的核酸（１×１０７コピー／μＬ）を２μＬと、１０μｍｏｌ／Ｌに調製した、実施例４−１．（２）に示すＴ７９０に該当する核酸塩基を標的とした、Ｔ７９０  ＡＳ鎖（配列番号３）及びＴ７９０  Ｓ鎖（配列番号４）のＰＲＥＰをそれぞれ２μＬずつ加え、１×ＰＣＲバッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ，１．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２，０．００１％（Ｗ／Ｖ）  ｇｅｌａｔｉｎ）の終濃度で総量を２０μＬとした。【０１７８】
実施例５−４．光連結反応時の条件
実施例５−３．で調製した核酸サンプル溶液に対して、２つの温度条件にて光連結波長である３６５ｎｍの光照射を実施した。なお、対照として光を照射しないサンプルを同時に用意した。
条件１：５０℃において光照射
９５℃にて３分間加熱処理後、５０℃にて３０秒間静置した後、５０℃で光を３０秒間照射した。
条件２：４℃において光照射
９５℃にて３分間加熱処理後、４℃にて１分間静置した後、４℃で３０秒間光照射した。【０１７９】
実施例５−５．定量ＰＣＲによる光連結量の確認
実施例５−４．で光連結反応を実施した各反応液２０μＬに８０μＬの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、その内５μＬずつを鋳型としてライトサイクラー（ＬＣ  ４８０  Ｖｅｒ２：ロッシュ）を使用して定量ＰＣＲ反応を実施した。
定量ＰＣＲ用反応液としては、以下の試薬を混合して調製し、１サンプルあたりの最終液量が２５μＬになるように滅菌水を加えて調製した。１２．５μＬの２×Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ）に、増幅プライマーとしてＥＧＦＲ  ｅｘ．２０Ｆ及びＥＧＦＲ  ｅｘ．２０Ｒをそれぞれ５ｐｍｏｌずつ添加した。
さらに末端蛍光標識した検出プローブを２．５ｐｍｏｌ添加した。この検出プローブの配列は以下の通りである。
Ｔｏｔａｌ  ＬＮＡプローブ：５’−Ｃｙ５／ＣＴＴ＋ＣＧＧＣ＋ＴＧＣ＋ＣＴＣ／ＢＨＱ２−３’（配列番号２０）
なお、配列中の＋はそれに続く塩基がＬＮＡであることを示し、Ｃｙ５はクエンチャーとなる蛍光色素を、ＢＨＱ２は蛍光抑制物質を、それぞれ示す。当該検出プローブの合成はＩＤＴ社に委託した。
また、定量ＰＣＲ反応は９５℃，１０秒＋（９５℃，３秒／５８℃，３０秒）×４５サイクルの条件で実施した。
各々の試料について、光連結効率は実施例２と同様に定量ＰＣＲで算出したΔＣｔ値から評価した。その結果を図１３に示す。【０１８０】
５０℃で光連結波長である３６５ｎｍの光照射をした場合、ΔＣｔが４程度で光を複数回照射してもほぼ一定であるのに対して（図１３における黒丸）、４℃で実施した場合には光を照射するたびにΔＣｔが上昇することが確認された（図１３における黒三角形）。この事は、５０℃においては、光を複数回照射しても光連結量が増加しないのに対して、４℃においては光を照射するたびに光連結量が増加していることを意味している。
従って、４℃においては、ＰＲＥＰ相補鎖間のハイブリダイゼーション形成が維持され、ＰＲＥＰの自己配列内での光連結が抑制されたため、光を複数回照射するたびに光連結量が増加したのに対し、５０℃においては、ＰＲＥＰ相補鎖間のハイブリダイゼーションが十分に維持されず、ＰＲＥＰが自己の配列内で光連結したことにより、ＰＲＥＰが鋳型に対して光連結できなくなったために、光を複数回照射しても光連結量が増加しないものと考えられた。
つまり、光連結プローブの自己の配列内での光連結を抑制するためには、光連結プローブの相補鎖の相補性を高めることと、相補的な光連結プローブ同士（又は光連結プローブと相補的な第二のプローブと）が十分にハイブリダイゼーションを形成できる温度条件で光を照射する必要がある。【０１８１】
［実施例６：ハイブリダイゼーション促進のための添加剤検討］
実施例５の結果から、５０℃にて光を照射した際には相補的な光連結プローブ同士のハイブリダイゼーションが維持できていないことが示唆された。そこで、光連結プローブ間のハイブリダイゼーションを促進可能な添加剤に関して検討を実施した。種々検討を実施したが、その中でも効果が高かった陰性荷電を持つ高分子（ポリアクリル酸：ｐＡＡｃ）に関しての結果を示す。【０１８２】
実施例６−１．光連結プローブの調製
Ｔ７９０に該当する核酸配列を標的とした、実施例４−１．（２）で調製した相補性の高い組合せであるＰＲＥＰを使用した。【０１８３】
実施例６−２．ＥＧＦＲエクソン２０（ｅｘ．２０）領域における野生型遺伝子断片の調製
健常者の末梢血を材料として、実施例５−２．と同じ方法でＥＧＦＲ  ｅｘ．２０領域における野生型遺伝子断片を調製した。【０１８４】
実施例６−３．光連結反応時の試薬組成
０．２ｍＬチューブに、実施例６−２．で調製したｅｘ．２０の野生型遺伝子断片（１×１０７コピー）を２μＬと、１０μｍｏｌ／Ｌに調製した、実施例４−１．（２）に示すＴ７９０に該当する核酸配列を標的とした、Ｔ７９０  ＡＳ鎖（配列番号３）及びＴ７９０  Ｓ鎖（配列番号４）の光連結プローブであるＰＲＥＰをそれぞれ２μＬと、１０％（ｗ／ｗ）ポリアクリル酸（ｐＡＡｃ）を２μＬ加え、１×ＰＣＲバッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ，１．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２，０．００１％（Ｗ／Ｖ）  ｇｅｌａｔｉｎ）の終濃度で総量を２０μＬとした。【０１８５】
実施例６−４．光連結反応時の条件
実施例５−３．で調製した核酸サンプル溶液に対して以下の条件で光照射を実施した。なお、対照として３６５ｎｍの光を照射しないサンプルを同時に用意した。
条件１：ポリアクリル酸（ｐＡＡｃ）添加した核酸サンプル溶液について、４℃で光照射した。
条件２：ポリアクリル酸（ｐＡＡｃ）未添加の核酸サンプル溶液について、４℃で光照射した。
条件３：ポリアクリル酸（ｐＡＡｃ）添加の核酸サンプル溶液について、５０℃で光照射した。
条件４：ポリアクリル酸（ｐＡＡｃ）未添加の核酸サンプル溶液について、５０℃で光照射した。【０１８６】
実施例６−５．定量ＰＣＲによる光連結量の確認
実施例５−４．で光照射により光連結させた試料について、定量ＰＣＲを行った。定量ＰＣＲの条件は実施例５と同一の条件で実施した。
各々の試料について、光連結効率は実施例２と同様に定量ＰＣＲで算出したΔＣｔ値から評価した。４℃で光照射した結果については図１４に、５０℃で光照射した結果については図１５に示す。【０１８７】
光連結波長である３６５ｎｍの光照射処理を４℃で行った場合には、ｐＡＡｃを添加することで光照射１サイクルでのΔＣｔが増加していた（図１４における黒三角形）。これは、ｐＡＡｃを添加したことで鋳型に対してＰＲＥＰがより効果的にハイブリダイゼーション可能になり、光照射１回あたりの光連結量を増加させたためである。つまり、ｐＡＡｃはＰＲＥＰと鋳型のハイブリダイゼーションを促進させている。【０１８８】
また、光連結波長である３６５ｎｍの光照射処理を５０℃で行った場合においても、ｐＡＡｃを添加することでΔＣｔが大きく増加していた（図１５における黒三角形）。これは、光連結波長である３６５ｎｍの光照射処理を４℃で行った場合の結果と同様に、ｐＡＡｃによって鋳型に対してＰＲＥＰがより効果的にハイブリダイゼーション可能になったことに加え、ＰＲＥＰ相補鎖間でのハイブリダイゼーションが促進されたため、ＰＲＥＰの相補鎖間で十分なハイブリダイゼーションの形成が可能となり、その結果、ＰＲＥＰの自己配列内での光連結が抑制されたものと考えられた。【０１８９】
このことからも、光連結波長である３６５ｎｍの光照射時に光連結プローブ相補鎖間のハイブリダイゼーションを維持し、光連結プローブの自己配列内での光連結を抑制し、光連結プローブを光連結可能な状態に維持することが光連結効率を向上させることに効果的であることが確認された。【０１９０】
［実施例７：遺伝子変異検出感度の確認］
これまでの実施例に示した通り、光連結プローブの自己配列内での光連結を抑制することで、標的部位との光連結効率を向上することが可能であることが分かった。この事を踏まえ、遺伝子変異検出感度への効果を検証するため、ＥＧＦＲ遺伝子のＴ７９０Ｍを標的として遺伝子変異検出を行った。【０１９１】
実施例７−１．変異型ＥＧＦＲ遺伝子断片の調製
実施例５−２．で調製した野生型プラスミドに、公知の方法に従い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてＴ７９０Ｍの変異を導入した。すなわち、当該方法により、ＥＧＦＲ遺伝子の２６３９番目の塩基をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）に変異させた。これを変異型プラスミドとした。
次に、このプラスミドを鋳型として、実施例４に記載のプライマーセットＥＧＦＲ  ｅｘ．２０Ｆ及びＥＧＦＲ  ｅｘ．２０Ｒを使用して通常のＰＣＲ反応条件によって増幅を行い、直鎖状のＥＧＦＲ変異型遺伝子断片を得た。得られた変異型遺伝子断片をＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した後、重量濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｔｏｍｅｔｅｒを用いて測定し、増幅断片長を考慮して各遺伝子断片のコピー数を算出したものを変異型核酸とし、以下の検討の鋳型として用いた（配列番号２１）。【０１９２】
ＥＧＦＲ  ｅｘ．２０  変異型断片
５’−ＣＡＧＡＡＧＣＣＴＡＣＧＴＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＴＧＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡＡＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＧＣＡＧＡＴＣＧＣＡＡＡＧＧＴ−３’（配列番号：２１）【０１９３】
実施例７−２．変異型混入サンプルの調製
実施例５−２．で調整した野生型核酸と実施例７−１．で調製した変異型核酸の混合比率を変えて３種類（変異１％、変異０．１％、変異０．０１％）調製し、変異型核酸検出用の試料として用いた。使用した野生型核酸と変異型核酸の混合比を表４に示す。また、変異型核酸を混合しない試料を変異０％の試料とした。また、混合型は１μＬあたりのコピー数を示す。
【表４】
2014014106.tif 000015
【０１９４】
実施例７−３．光連結プローブの調製
Ｔ７９０に該当する核酸配列を標的とした、実施例１−１．（２）で調製した相補性の高い組合せである光連結プローブを使用した。【０１９５】
実施例７−４．光連結反応時の試薬組成
０．２ｍＬチューブに、実施例７−２．で調製した実施例４−１．（２）に示すＴ７９０に該当する核酸配列を標的とした、Ｔ７９０  ＡＳ鎖（配列番号１３）及びＴ７９０  Ｓ鎖（配列番号１４）のＰＲＥＰをそれぞれ２μＬと、１０％（ｗ／ｗ）ポリアクリル酸（ｐＡＡｃ）を２μＬ加え、１×ＰＣＲバッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ，１．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２，０．００１％  （Ｗ／Ｖ）  ｇｅｌａｔｉｎ）の終濃度で総量を２０μＬとした。【０１９６】
実施例７−５．光連結反応時の条件
実施例７−４．で調製したサンプルに対して、ＵＶ−ＬＥＤにより光連結波長である３６５ｎｍの光照射を実施した。９５℃にて３分間加熱処理後、９５℃にて３０秒間維持し、５０℃にて５秒間静置した後、５０℃で光を３０秒間照射する工程を１サイクルとし、合計１０回繰り返した。【０１９７】
実施例７−６．定量ＰＣＲによる光連結量の確認
実施例７−５．の各調製液２０μＬに８０μＬの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、その内５μＬを取り４５μＬの滅菌水を加えた。この内５μＬずつを鋳型としてライトサイクラーを使用して定量ＰＣＲ反応を実施した。なお、定量ＰＣＲは実施例５及び実施例６と同一の条件で実施した。【０１９８】
その結果を図１６に示す。図１６において、ａは変異１％、ｂは変異０．１％、ｃは変異０．０１％、ｄは変異０％の結果を示す。グラフの縦軸は蛍光強度の対数表示値であり、横軸はＰＣＲサイクル数である。変異型０％（野生型のみ）に比して、変異が混入している場合は蛍光シグナルが高くなっている。その結果、変異１％から変異０．０１％まで濃度依存的に変異を検出していることが確認された。これは、ＰＲＥＰの自己配列内で光連結を抑制することで、野生型配列に対する光連結効率が向上したことに起因すると思われる。
光連結プローブの自己配列内での光連結を抑制することで、これまで非常に難しかった変異０．０１％の存在比においても変異型核酸を選択的かつ効果的に増幅することが可能となった。
以上より、本法は高感度かつ高精度に変異遺伝子を検出可能であることが示された。【０１９９】
［実施例８：イノシンを導入したＰＲＥＰの評価］
実施例８−１．光連結プローブ（ＰＲＥＰ）の調製
光連結対象の鋳型としては、実施例１−１．で調製した、ＥＧＦＲ遺伝子上のエクソン２１（ｅｘ．２１）領域の一部と同配列の１００ｍｅｒからなるオリゴヌクレオチドを使用した。
この合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション可能な１６ｍｅｒからなるＰＲＥＰをイノシンの導入位置を変えて３種類設計した（配列番号２３〜２５）。１つは、イノシンを導入しないＰＲＥＰを比較対象用のコントロールとして設計した（配列番号２２）。これらＰＲＥＰの配列を表５に示す。尚、光連結性核酸類であるＣＮＶＫのＰＲＥＰへの導入位置をｎとし、イノシンの導入位置をＩとして示す。
【表５】
2014014106.tif 000016
【０２００】
実施例８−２．ＰＲＥＰへの光照射処理
実施例８−１．にて合成した各ＰＲＥＰをＴＥにて１００μｍｏｌ／Ｌに溶解し、各２００ｐｍｏｌを別々の０．２ｍＬチューブに分取した。それぞれのサンプルに対して以下の条件にて光照射を実施した。尚、クランプ形成波長である３６５ｎｍの光照射はＵＶ−ＬＥＤ照射器（ＺＵＶ-Ｃ３０Ｈ：オムロン）を使用した。
条件１：光未照射
各ＰＲＥＰに対して光照射を行わない。
条件２：クランプ形成光照射
各ＰＲＥＰに３６５ｎｍの光を４℃にて３分間照射する。【０２０１】
実施例８−３．電気泳動による評価
光照射処理の影響を見るため、実施例８−２．の条件で処理した各々のＰＲＥＰを滅菌水で１０μｍｏｌ／Ｌに希釈後、ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所）を用いてマイクロチップ電気泳動を行った。そのゲルイメージを図１７に示す。
イノシンを導入していないＰＲＥＰ（ＰＲＥＰ  ｅ．）、イノシンを１箇所導入したＰＲＥＰ（ＰＲＥＰ  ｆ．）はＵＶ照射後のバンドが低分子側にシフトしているのに対して、イノシンを２個、３個導入したＰＲＥＰ（ＰＲＥＰ  ｇ．、ＰＲＥＰ  ｈ．）はＵＶ照射後のバンドシフトが見られなくなった。これは、イノシンを導入していないＰＲＥＰ、イノシンを１個しか導入していないＰＲＥＰは、ＵＶ照射により明らかなＰＲＥＰのコンフォメーション変化が生じているのに対して、イノシンを２個、３個導入することでＰＲＥＰのコンフォメーション変化を抑制したことを示している。
このことから、ＰＲＥＰ内のクロスリンクターゲットとなるピリミジン塩基をイノシンのようなクロスリンクターゲットとならない塩基に置き換えることで、ＰＲＥＰの自己配列内でのクランプ形成を抑制可能であることが示された。【０２０２】
［実施例９：光照射処理をしたＰＲＥＰのクランプ形成効率の評価］
実施例９−１．光連結プローブ（ＰＲＥＰ）の調製
評価対象のＰＲＥＰは、実施例８−１．で調製したＰＲＥＰ  ｅ．とＰＲＥＰ  ｈ．を使用した。【０２０３】
実施例９−２．ＰＲＥＰの光連結反応（クランプ形成反応）
０．２ｍＬチューブに、標的部位を有する核酸配列として１００ｐｍｏｌ／Ｌの合成オリゴヌクレオチド２μＬを分取し、１００μｍｏｌ／ＬのＰＲＥＰ（実施例８−２．記載の各条件で処理したもの）２μＬを加え、１×ＰＣＲバッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ，１．５  ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２，０．００１％（Ｗ／Ｖ）ｇｅｌａｔｉｎ）の終濃度で総量を２０μＬとした。
これを９５℃にて５分間加熱処理し、４５℃にて５秒間静置した後、４５℃でＵＶ−ＬＥＤにより３６５ｎｍの光を３０秒間照射した。尚、対照として光を照射しないサンプルを同時に用意した。【０２０４】
実施例９−３．定量ＰＣＲ反応溶液の調製と反応条件
実施例９−２．で調製したサンプル（対照サンプルを含む）の各調製液２０μＬに８０μＬの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、更にその内５μＬずつを４５μＬの滅菌水に混合した。混合したサンプルの内５μＬを鋳型としてライトサイクラー（ＬＣ  ４８０Ｖｅｒ２：ロッシュ社製）を使用して定量ＰＣＲ反応を実施した。
定量ＰＣＲ用反応液としては、以下の試薬を混合して調製し、１サンプルあたりの最終液量が２５μＬになるように滅菌水を加えて調製した。１２．５μＬの２×Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ社製）に、増幅プライマーとしてＥＧＦＲ  ｅｘ．２１Ｆ（配列番号：６）及びＥＧＦＲ  ｅｘ．２１Ｒ（配列番号：７）をそれぞれ５ｐｍｏｌずつ添加した。
さらに末端蛍光標識した検出プローブを２．５ｐｍｏｌ添加した。この検出プローブの配列は以下の通りである。
Ｔｏｔａｌ  ＬＮＡプローブ：５’−Ｃｙ５／ＣＡＧＣＡＴＧＴ＋ＣＡＡＧＡ＋ＴＣＡＣＡＧＡ／ＢＨＱ＿２−３’（配列番号２６）
尚、配列中の＋はそれに続く塩基がＬＮＡであることを示し、Ｃｙ５は蛍光色素を、ＢＨＱ２は蛍光抑制物質を、それぞれ示す。当該検出プローブの合成はＩＤＴ社に委託した。
また、定量ＰＣＲ反応は９５℃，１０秒＋（９５℃，３秒／５６℃，３０秒）×４５サイクルの条件で実施した。【０２０５】
各々の試料について、クランプ形成効率は実施例２と同様に定量ＰＣＲで算出したΔＣｔ値から評価した。その結果を図１８に示す。
尚、プライマーの配列は以下の通りである。
ＥＧＦＲ  ｅｘ．２１Ｆ：５’−ＧＡＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号６）
ＥＧＦＲ  ｅｘ．２１Ｒ：５’−ＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣ−３’（配列番号７）【０２０６】
イノシンを導入していないＰＲＥＰ  ｅ．を用いた場合、ΔＣｔが４程度でＵＶを複数回照射してもほぼ一定であるのに対して（図１８中三角印）、イノシンを導入したＰＲＥＰ  ｈ．を用いた場合、ＵＶの照射回数を増やすごとにΔＣｔが増加する（図１９の四角印）ことが分かる。
これは、イノシンを導入していないＰＲＥＰは、ＰＲＥＰの自己配列内でのクランプ形成が起き、光を複数回照射してもＰＲＥＰの鋳型に対するクランプ形成量が増加しなかったのに対し、イノシンを導入したＰＲＥＰは、ＰＲＥＰの自己配列内でのクランプ形成が抑制されたため、ＰＲＥＰが鋳型に対して十分にクランプ形成可能となったためＵＶ照射回数に応じてクランプ形成量が増加したものと考えられる。
つまり、ＰＲＥＰの自己の配列内でのクロスリンクターゲット塩基をイノシンのような光連結の標的核酸とならない塩基に置換することで、ＰＲＥＰの自己配列内での光連結を抑制でき、ＰＲＥＰのクランプ形成量を増加可能であることが示された。【０２０７】
［実施例１０：相補性の高いＰＲＥＰを用いたクランプ形成の確認］
実施例１０−１．光連結プローブ（ＰＲＥＰ）の調製
野生型配列であるＥＧＦＲ遺伝子上の８６１番目のロイシン（Ｌ８６１）に該当する核酸配列を標的部位として、実施例８−１．で設計したＰＲＥＰ  ｅ．の配列をＥＧＦＲ遺伝子のコード鎖、即ちセンス鎖にハイブリダイゼーションするアンチセンス鎖（ＡＳ鎖）のＰＲＥＰとし（配列番号２２）、同時にＥＧＦＲ遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリダイゼーションするセンス鎖（Ｓ鎖）のＰＲＥＰも設計した（配列番号２７）。ＣＮＶＫの導入位置をｎとして示す。
Ｌ８６１  ＡＳ鎖：５’−ＧＣＡｎＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧ−３’（配列番号２２）
Ｌ８６１  Ｓ鎖  ：５’−ＣＴＧｎＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番号２７）【０２０８】
また、センス鎖のＰＲＥＰとアンチセンス鎖のＰＲＥＰの相補性とが完全相補の関係であって、お互いのＰＲＥＰ同士が光連結しない位置にＣＮＶＫを配し、且つ、各ＰＲＥＰのＣＮＶＫが本来光連結できる標的核酸をイノシンに置換したＰＲＥＰを設計した。ＣＮＶＫの導入位置をｎとし、イノシンの導入位置をＩとして示す。
Ｌ８６１  ＡＳ鎖：５’−ＧＣＡｎＣＣＡＧＣＡＧＴＩＴＧＧ−３’（配列番号２８）
Ｌ８６１  Ｓ鎖  ：５’−ＣＣＡＡｎＣＴＧＣＴＧＧＧＩＧＣ−３’（配列番号２９）
図１９にクランププローブとして実際に使用したＰＲＥＰの配列とその相補性についての模式図を示す。【０２０９】
実施例１０−２．ＥＧＦＲエクソン２１（ｅｘ．２１）領域における野生型遺伝子断片の調製
健常者の末梢血から通常の方法によりヒトゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型としてプライマーセットＥＧＦＲ  ｅｘ．２１Ｆ及びＥＧＦＲ  ｅｘ．２１Ｒを使用してＬ８６１に該当する核酸配列を包むＥＧＦＲエクソン２１（ｅｘ．２１）の領域を通常のＰＣＲ反応条件により増幅した。ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。
ＥＧＦＲ  ｅｘ．２１Ｆ（ｏｕｔ）：５’−ＧＣＡＴＧＡＡＣＴＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣ−３’（配列番号３０）
ＥＧＦＲ  ｅｘ．２１Ｒ（ｏｕｔ）：５’−ＡＣＣＴＡＡＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＡＣ−３’（配列番号３１）
得られたＰＣＲ増幅産物をｐＧＥＭＴ  ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ）内に、添付のプロトコルに従って挿入しクローニングした。【０２１０】
このプラスミドを鋳型として、前記プライマーセットＥＧＦＲ  ｅｘ．２１Ｆ及びＥＧＦＲ  ｅｘ．２１Ｒを使用して通常のＰＣＲ反応条件によって増幅を行い、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製することで、直鎖状のＥＧＦＲ  ｅｘ．２１の野生型遺伝子断片を得た（配列番号３２）。
ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製したＥＧＦＲ  ｅｘ．２１の野生型遺伝子断片の重量濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定し、増幅断片長を考慮して各遺伝子断片のコピー数を算出したものを、野生型核酸として以下の反応の検討鋳型として用いた。【０２１１】
［配列番号３２］  ＥＧＦＲ  ｅｘ．２１野生型断片
５’−ＧＣＡＴＧＡＡＣＴＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＣＧＴＣＧＣＴＴＧＧＴＧＣＡＣＣＧＣＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＴＴＧＧＴ−３’（配列番号３２）【０２１２】
実施例１０−３．光連結反応時の試薬組成
０．２ｍＬチューブに、実施例５−２．で調製した標的核酸（１×１０７コピー／μＬ）を２μＬと、１００μｍｏｌ／Ｌに調製した、実施例１０−１．に示すＬ８６１に該当する核酸塩基を標的とした、Ｌ８６１  ＡＳ鎖（配列番号２８）及びＬ８６１  Ｓ鎖（配列番号２９）のＰＲＥＰをそれぞれ２μＬずつ加え、１×ＰＣＲバッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ，１．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２，０．００１％（Ｗ／Ｖ）ｇｅｌａｔｉｎ）の終濃度で総量を２０μＬとした。【０２１３】
実施例１０−４．光連結反応時の条件
実施例１０−３．で調製した核酸サンプル溶液に対して、９５℃にて５分間加熱処理し、４５℃にて５秒間静置した後、４５℃でＵＶ−ＬＥＤにより３６５ｎｍの光を３０秒間照射した。尚、対照として光を照射しないサンプルを同時に用意した。【０２１４】
実施例１０−５．定量ＰＣＲによるクランプ量の確認
実施例１０−４．で光連結反応を実施した各反応液２０μＬに８０μＬの滅菌水をそれぞれ加えよく混合した後、更にその内５μＬずつを４５μLの滅菌水に混合した。混合したサンプルの内５μＬを鋳型としてライトサイクラー（ＬＣ  ４８０Ｖｅｒ２：ロッシュ社製）を使用して定量ＰＣＲ反応を実施した。
定量ＰＣＲ用反応液としては、以下の試薬を混合して調製し、１サンプルあたりの最終液量が２５μＬになるように滅菌水を加えて調製した。１２．５μＬの２×Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ社製）に、増幅プライマーとしてＥＧＦＲ  ｅｘ．２１Ｆ及びＥＧＦＲ  ｅｘ．２１Ｒをそれぞれ５ｐｍｏｌずつ添加した。さらに末端蛍光標識した検出プローブを２．５ｐｍｏｌ添加した。検出プローブには、実施例９に記載のプローブ（配列番号２６）と同じものを使用し、定量ＰＣＲ反応は実施例９−２．と同じ条件で行った。【０２１５】
各々の試料について、クランプ形成効率は実施例２と同様に定量ＰＣＲで算出したΔＣｔ値から評価した。その結果を図２０に示す。
既存の設計手法により設計したＰＲＥＰ（三角印）は、ＵＶを複数回照射してもΔＣｔがある一定のところで飽和してしまうが、イノシンを導入し完全相補で設計したＰＲＥＰを用いることでＵＶ複数回照射するごとにΔＣｔを増加させることができることが分かる。
これは、ＰＲＥＰ内にイノシンを導入し、かつＰＲＥＰの相補性を高めたことでＰＲＥＰの自己配列内でのクランプ形成を抑制出来たためと考えられる。このことからもクランプ形成波長である３６５ｎｍの光照射時にＰＲＥＰ相補鎖間のハイブリダイゼーションを維持し、ＰＲＥＰの自己配列内でのクランプ形成を抑制し、ＰＲＥＰをクランプ形成可能な状態に維持することがクランプ形成効率を向上させることに効果的であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０２１６】
本発明は、光応答性核酸類を含むプローブを用いた、光連結効率を向上させる方法に関するものであり、高感度かつ高精度に遺伝子を解析することができる。例えば、大量に存在する野生型遺伝子に混在する微量に存在する変異型遺伝子を選択的に検出する際に使用できる。また、従来の評価方法では検出が困難であった標的とする核酸が微量にしか存在しない核酸サンプルからの遺伝子検出も可能にするものである。
また、以上のような解析が可能になることは、手術により摘出された組織や生検材料のような侵襲性の高い検査材料に限定されず、例えば血液試料のような標的とする核酸が微量にしか存在しない試料をも材料として扱えるため、困難であった治療効果の確認やモニタリング検査を可能にする。これらは、癌の早期発見や、個々の患者について薬剤感受性や薬剤応答性をはじめとした薬効評価等に適用することで、個別化医療の実現を可能とするものである。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【０２１７】
配列表の配列番号２〜５の各塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、それぞれ、ＰＲＥＰａ．（６番目のｎはＣＮＶＫ）、ＰＲＥＰｂ．（８番目のｎはＣＮＶＫ）、ＰＲＥＰｃ．（１０番目のｎはＣＮＶＫ）、ＰＲＥＰｄ．（１２番目のｎはＣＮＶＫ）である。配列番号８〜１０の各塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、それぞれ、ＰＲＥＰ−Ａ（３番目のｎはＣＮＶＫ）、ＰＲＥＰ−Ｇ（３番目のｎはＣＮＶＫ）、ＰＲＥＰ−ＡＧ（３番目のｎはＣＮＶＫ）である。配列番号１１〜１６の各塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、それぞれ、プローブＬ８６１  ＡＳ（１５番目のｎはＣＮＶＫ）、プローブＬ８６１  Ｓ（１４番目のｎはＣＮＶＫ）、プローブＴ７９０  ＡＳ（４番目のｎはＣＮＶＫ）、プローブＴ７９０  Ｓ（３番目のｎはＣＮＶＫ）、プローブＬ８５８  ＡＳ（３番目のｎはＣＮＶＫ）、プローブＬ８５８  Ｓ（３番目のｎはＣＮＶＫ）である。配列番号２０の塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、Ｔｏｔａｌ  ＬＮＡプローブ（４番目のＣ、８番目のＴ、１１番目のＣはＬＮＡ）である。配列番号２２〜２５の各塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、それぞれ、ＰＲＥＰｅ．（４番目のｎはＣＮＶＫ）、ＰＲＥＰｆ．（４番目のｎはＣＮＶＫ、１４番目のｎはイノシン）、ＰＲＥＰｇ．（４番目のｎはＣＮＶＫ、１３〜１４番目のｎはイノシン）、ＰＲＥＰｈ．（４番目のｎはＣＮＶＫ、１２〜１４番目のｎはイノシン）である。配列番号２６の塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、Ｔｏｔａｌ  ＬＮＡプローブ（９番目のＣ、１４番目のＴはＬＮＡ）である。配列番号２７〜２９の各塩基配列は、人工的に合成したプローブ配列であり、それぞれ、プローブＬ８６１  Ｓ（４番目のｎはＣＮＶＫ）、プローブＴ８６１  ＡＳ（４番目のｎはＣＮＶＫ、１３番目のｎはイノシン）、プローブＴ８６１  Ｓ（５番目のｎはＣＮＶＫ、１４番目のｎはイノシン）である。
【図１】
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【図９】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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