(57)【要約】  本発明の課題は組換えタンパク質生産に使用される宿主細胞として有用な、導入遺伝子を安定的に高発現し、安定に増殖する細胞株を樹立することである。  本発明により、細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入することを含む、2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法が提供される。
2014058025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、該遺伝子を発現させることを含む、2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法。
【請求項２】
2つ以上の外来遺伝子が、同時に安定的に発現することが困難なタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１の方法。
【請求項３】
同時に安定的に発現することが困難なタンパク質がいずれも類似の機能を有するタンパク質に属することを特徴とする、請求項２の方法。
【請求項４】
類似の機能を有するタンパク質がトランスポーターまたは代謝酵素である請求項３の方法。
【請求項５】
細胞に２種以上のトランスポーターの遺伝子を導入することを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
細胞に２種以上の代謝酵素の遺伝子を導入することを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
細胞にTauT及び２種の代謝酵素の遺伝子を導入することを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を含むDNA構築物を導入し、該non-coding RNAを細胞内で発現させることを含む、倍加時間の早い細胞を構築する方法。
【請求項９】
細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、該遺伝子を発現させ、且つ、2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させた細胞。
【請求項１０】
NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAが、NfkBiaのmRNAの一部に塩基対形成により結合し得る１９〜２５塩基長の連続する配列を含む３０塩基長までの低分子RNAである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法、又は請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAが、NfkBiaのmRNAの一部に塩基対形成により結合し得る１９〜２５塩基長の連続する配列を含む５６１塩基長までのmRNA型ノンコーディングRNAである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法、又は請求項９に記載の細胞。
【請求項１２】
NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAが、NfkBiaのmRNAの一部に塩基対形成により結合し得る１９〜２５塩基長の連続する配列を含む５６１〜１５７９塩基長のmRNA型ノンコーディングRNAである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法、又は請求項９に記載の細胞。
【請求項１３】
１９〜２５塩基長の連続する配列が、配列番号２で示される塩基配列中の任意の部分配列又はその相補配列である、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項１４】
NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子が、配列番号１〜１６及び２９のいずれかの塩基配列を有する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法、又は請求項９に記載の細胞。
【請求項１５】
NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子が以下の塩基配列又はその相補配列を有するDNAである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法、又は請求項９に記載の細胞：
（ａ）配列番号１〜１６及び２９のいずれかの塩基配列に塩基対形成により結合しうる配列；
（ｂ）配列番号１〜１６及び２９のいずれかの塩基配列と１または数塩基を除き同一の塩基配列；
（ｃ）配列番号１〜１６及び２９のいずれかの塩基配列を含む、NfkBia遺伝子の 3’側 非翻訳領域の部分配列;
（ｄ）上記（ｃ）の配列と１または数塩基を除き同一の塩基配列からなる配列。
【請求項１６】
細胞に、更に所望のタンパク質の遺伝子が導入されている、請求項１〜８のいずれかに記載の方法、又は請求項９に記載の細胞。
【請求項１７】
所望のタンパク質が抗体である、請求項１６記載の方法又は細胞。
【請求項１８】
請求項１に記載の2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法であって、
細胞に、１番目の外来遺伝子およびNfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、これらの遺伝子を発現させること、および
細胞に、１番目の外来遺伝子と同時に安定的に発現することが困難な２番目の外来遺伝子を導入すること、を含み、
１番目と２番目の外来遺伝子はタンパク質をコードする遺伝子であり、
NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子、およびタンパク質をコードする１番目と２番目の外来遺伝子を発現する、組換えタンパク質生産のための細胞株が樹立される、前記方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法であって、
細胞に、１番目の外来遺伝子およびNfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、これらの遺伝子を発現させること、
細胞に、２番目の外来遺伝子を導入すること、および
細胞に、２番目の外来遺伝子と同時に安定的に発現することが困難な３番目の外来遺伝子を導入すること、を含み、
１番目、２番目、および３番目の外来遺伝子はタンパク質をコードする遺伝子であり、
NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子、およびタンパク質をコードする１番目、２番目、３番目の外来遺伝子を発現する、組換えタンパク質生産のための細胞株が樹立される、前記方法。
【請求項２０】
１番目の外来遺伝子がTAUT(taurine transporter)遺伝子である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞に、更に所望のタンパク質の遺伝子が導入されており、当該所望のタンパク質の生産のための宿主細胞株が樹立される、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養動物細胞を用いた組換えタンパク質の製造に関し、より詳細には、目的のタンパク質を効率良く製造できるような宿主細胞を樹立する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術を用いて、医薬として有用なタンパク質を生産する際に、動物細胞を用いると、原核細胞が行い得ないような複雑な翻訳後修飾やフォールディングが可能となるため、動物細胞は組換えタンパク質生産のための宿主細胞として多用されてきている。【０００３】
近年、抗体や生理活性タンパク質などの多くのバイオ医薬品が輩出されているが、組換えタンパク質を効率よく動物細胞に生産させる技術は、バイオ医薬品の低コスト化につながり、患者への安定な供給を約束するものである。【０００４】
従って、より生産効率の高いタンパク質の製造方法が望まれている。【０００５】
宿主細胞に、目的のタンパク質の遺伝子に加えて、他の構造遺伝子を導入して高い発現量で発現させることにより、目的のタンパク質の生産効率を向上させる技術が知られている。【０００６】
例えば、膜輸送タンパク質であるタウリントランスポーター（TauT）遺伝子を高発現し、且つ所望のタンパク質をコードするDNAが導入された細胞を培養することを含む、タンパク質の製造方法が開示されている（特許文献１：WO2007/119774、特許文献２：WO2009/051109）。【０００７】
また、タウリン合成経路の酵素であるシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（CSAD）遺伝子が導入された細胞を用いることによって所望のタンパク質の生産量が増加することが開示されている（特許文献３：WO2008/114673）。【０００８】
また、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT)遺伝子が導入された細胞を用いることによって所望のタンパク質の生産量が増加することが開示されている（特許文献４：WO2009/020144）。アラニンアミノトランスフェラーゼはアラニンからグルタミン酸を生成させる酵素であり、ヒト肝細胞に含まれる酵素GTP(グルタミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ）としても知られている。【０００９】
また、Bicarbonateトランスポーター機能を有するアニオンエクスチェンジャー（AE)の遺伝子が導入された細胞を用いることによって所望のタンパク質の生産量が増加することが開示されている（特許文献５：WO2009/054433）。【００１０】
さらに、CSADとTauTの共発現、ALTとTauTの共発現、BicarbonateトランスポーターとCSAD、又はBicarbonateトランスポーターとALTの共発現の結果、より一層所望のタンパク質の生産量が増加することも開示されている（特許文献３-５）。【００１１】
しかしながら、本発明者らは、今までの研究から、２種類の外来遺伝子を宿主細胞に導入する場合、其々単独で導入するとその遺伝子が安定的に発現した細胞株が樹立できる場合であっても、当該２種類の外来遺伝子を共に安定的に高発現させた細胞株が樹立できない場合があった。この場合、少なくとも一方の当該外来遺伝子と同じ遺伝子若しくはカウンターパート遺伝子の宿主細胞での発現量がqPCRで検出限界以下である場合、２種類の遺伝子を共に安定的に高発現させた細胞株が樹立できないことを経験した。特に、同じ機能を有する蛋白質の遺伝子若しくは同じ代謝系反応に関与する酵素の遺伝子、たとえば、２種類の膜輸送タンパク質を共に高発現させた宿主細胞や、２種類の酵素を共に高発現させた宿主細胞の樹立は不可能であった。また、GlycArt社の２種類の糖鎖関連酵素遺伝子は宿主細胞において発現しているが、さらに高発現させた宿主細胞由来の抗体産生細胞は、酵素遺伝子発現が不安定なため、抗体のアフコシル含量が期待される範囲を逸脱する事例がみられた。【００１２】
このように、異なる2種類以上の遺伝子を高発現させることには、困難が伴うことが多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】WO2007/119774
【特許文献２】WO2009/051109
【特許文献３】WO2008/114673
【特許文献４】WO2009/020144
【特許文献５】WO2009/054433
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、組換えタンパク質生産に使用される宿主細胞において、発現が困難な遺伝子を安定的に高発現させるための新規な技術を提供する。また、倍加時間が速く、安定に増殖する細胞株を樹立する技術も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らの研究グループは、以前、タンパク質をコードしない核酸配列であって、宿主細胞内でRNAとして発現することにより、NfkBia（nuclear factor κB inhibitor α、又はI-κＢ（inhibitor-κＢ））の発現を制御し、組換え抗体等のタンパク質の産生能を向上させる機能を有する特定の核酸配列を見出した（PCT/JP2012/058577（WO2012/137683））。本発明者らは、そのような機能を有するＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はそれらの配列を総称してAPES(Antibody Production Enhancing Sequence）（場合により、PPES (Polypeptide Production Enhancing Sequence)とも言う)と命名した。【００１６】
APESは、NfkBia（又はI-κＢ）の発現抑制を介してＮＦ-κ（kappa）Ｂを活性化する機能性核酸であると考えられた。また、この様な機能を有する核酸として、KSHV miRNA-K1なども知られている（Lei, Xiufen et al., Nat. Cell. Biol.,12(2), p193-199, 2010）。【００１７】
今回、本発明者らは、APESの新たな用途を見出した。【００１８】
すなわち、本発明者らは、APESが、（１）通常の細胞では発現が困難な特定の遺伝子を高発現させた細胞の構築や、（２）通常の細胞では樹立が困難な異なる２種以上の遺伝子を安定的に高発現させた細胞の構築を可能にするような、導入遺伝子を安定的に高発現させる機能を持つことを見出した。【００１９】
したがって、本願は、APES遺伝子を宿主細胞に導入することにより、発現困難な外来遺伝子若しくは発現が不安定な外来遺伝子を、当該細胞内で安定的に高発現させる方法を提供する。【００２０】
また、本願は、APES遺伝子を宿主細胞に導入することによる、倍加時間が速く、安定に増殖する細胞の樹立方法を提供する。【００２１】
APES遺伝子は、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNA（タンパク質に翻訳されないRNA）をコードするDNAである。【００２２】
本願発明の要旨は次のとおりである。
（１）細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、該遺伝子を発現させることを含む、2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法。
（２）2つ以上の外来遺伝子が、同時に安定的に発現することが困難なタンパク質をコードする、（１）の方法。
（３）同時に安定的に発現することが困難なタンパク質がいずれも類似の機能を有するタンパク質に属することを特徴とする、（２）の方法。
（４）類似の機能を有するタンパク質が、トランスポーターまたは代謝酵素である（３）の方法。
（５）細胞に２種以上のトランスポーター（TauTとAE1）の遺伝子が導入される、（１）〜（４）の方法。
（６）細胞に２種以上の代謝酵素（ピルビン酸代謝経路の酵素、ALT1とPC）の遺伝子が導入される、（１）〜（４）の方法。
（７）細胞にTauT及び２種の代謝酵素の遺伝子が導入される、（１）〜（４）の方法。
（８）細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を含むDNA構築物を導入し、該non-coding RNAを細胞内で発現させることを含む、倍加時間の早い細胞を構築する方法。
（９）細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、該遺伝子を発現させ、且つ、2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させた細胞。
（１０）NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAが、NfkBiaのmRNAの一部に塩基対形成により結合し得る１９〜２５塩基長の連続する配列を含む３０塩基長までの低分子RNAである、（１）〜（８）の方法、又は（９）の細胞。
（１１）NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAが、NfkBiaのmRNAの一部に塩基対形成により結合し得る１９〜２５塩基長の連続する配列を含む５６１塩基長までのmRNA型ノンコーディングRNAである、（１）〜（８）の方法、又は（９）の細胞。
（１２）NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAが、NfkBiaのmRNAの一部に塩基対形成により結合し得る１９〜２５塩基長の連続する配列を含む５６１〜１５７９塩基長のmRNA型ノンコーディングRNAである、（１）〜（８）の方法、又は（９）の細胞。
（１３）１９〜２５塩基長の連続する配列が、配列番号２で示される塩基配列中の任意の部分配列又はその相補配列である、（１０）から（１２）の方法又は細胞。
（１４）NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子が、配列番号１〜１６及び２９のいずれかの塩基配列を有する、（１）〜（８）の方法、又は（９）の細胞。
（１５）NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子が、以下の塩基配列又はその相補配列を有するDNAである、（１）〜（８）の方法、又は（９）の細胞：
（ａ）配列番号１〜１６及び２９のいずれかの塩基配列に塩基対形成により結合しうる配列；
（ｂ）配列番号１〜１６及び２９のいずれかの塩基配列と１または数塩基を除き同一の塩基配列；
（ｃ）配列番号１〜１６及び２９のいずれかの塩基配列を含む、NfkBia遺伝子の 3’側 非翻訳領域の部分配列;
（ｄ）上記（ｃ）の配列と１または数塩基を除き同一の塩基配列。
（１６）細胞に、更に所望のタンパク質の遺伝子が導入されている、（１）〜（８）の方法又は（９）の細胞。
（１７）所望のタンパク質が抗体である（１６）の方法又は細胞。
（１８）上記（１）に記載の2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法であって、
細胞に、１番目の外来遺伝子およびNfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、これらの遺伝子を発現させること、および
細胞に、１番目の外来遺伝子と同時に安定的に発現することが困難な２番目の外来遺伝子を導入すること、を含み、
１番目と２番目の外来遺伝子はタンパク質をコードする遺伝子であり、
NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子、およびタンパク質をコードする１番目と２番目の外来遺伝子を発現する、組換えタンパク質生産のための細胞株が樹立される、前記方法。
（１９）上記（１）に記載の2つ以上の外来遺伝子を安定的に発現させることができる組換えタンパク質生産のための細胞株を樹立する方法であって、
細胞に、１番目の外来遺伝子およびNfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を導入して、これらの遺伝子を発現させること、
細胞に、２番目の外来遺伝子を導入すること、および
細胞に、２番目の外来遺伝子と同時に安定的に発現することが困難な３番目の外来遺伝子を導入すること、を含み、
１番目、２番目、および３番目の外来遺伝子はタンパク質をコードする遺伝子であり、
NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子、およびタンパク質をコードする１番目、２番目、３番目の外来遺伝子を発現する、組換えタンパク質生産のための細胞株が樹立される、前記方法。
（２０）１番目の外来遺伝子がTAUT(taurine transporter)遺伝子である、（１８）または（１９）に記載の方法。
（２１）細胞に、更に所望のタンパク質の遺伝子が導入されており、当該所望のタンパク質の生産のための宿主細胞株が樹立される、（１８）〜（２０）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、宿主細胞中で各種の外来遺伝子を安定的に高発現させることができるようになった。したがって、本発明を利用して、通常の細胞では発現が困難なポリペプチドが医薬品として製造可能となる。また、発現が困難な抗原タンパク質の発現量を高めて、そのような抗原に対する抗体の開発が容易となる。また、本発明により、複数の遺伝子を安定的に高発現させた細胞が構築できることから、有用遺伝子を多数組み込んだ、組換えタンパク質を産生するための宿主細胞の作製が可能となる。【００２４】
また、本発明の別の態様により、倍加時間が速く、安定に増殖する細胞が樹立可能となった。したがって、培養動物細胞を用いた組換えタンパク質の生産において、そのような細胞を宿主として利用すれば、目的のタンパク質を効率良く生産可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、同定されたAI462015転写産物の配列およびマウスゲノムでの位置を示している。（参考例１）
【図２】図２は、CHO-DG44細胞にMab1(抗IL-6レセプター抗体)を高発現させた抗体産生細胞の継代培養３日目におけるAI462015転写産物の発現強度を示している。（参考例２）
【図３】図３は、CHO-DXB11s細胞にMab2(抗グリピカン３抗体)を高発現させた抗体産生細胞の継代培養３日目におけるAI462015転写産物の発現強度を示している。（参考例２）
【図４】図４は、Mab2(抗グリピカン３抗体)産生細胞の１Ｌジャー流加培養３日目におけるAI462015転写産物の発現強度を示している。（参考例２）
【図５】図５は、Mab2産生細胞の1Lジャーの流加培養後期１３日目におけるAI462015転写産物の発現強度の昂進を示している。（参考例２）
【図６】図６は、Mab1(抗IL-6レセプター抗体)産生ポテンシャルの低かった細胞の１Ｌジャー流加培養３日目におけるAI462015転写産物の発現強度を示している。（参考例２）
【図７】図７は、転写産物AI462015(437p)の一部配列434bpの発現プラスミドである。（参考例３）
【図８】図８は、転写産物AI462015(437p)の一部配列165bpの発現プラスミドである。（参考例３）
【図９】図９は、コントロールとしてハイグロマイシン耐性遺伝子のみを発現させたプラスミドである。（参考例３）
【図１０】図１０は、転写産物AI462015(437p)の一部配列の強発現によってMab1産生量が増加することを示している。（参考例３）
【図１１】図１１は、抗体高産生細胞での転写産物AI462015の強発現とNfkBia発現抑制を示している。（参考例４）
【図１２】図１２は、NfkBia発現定量に用いたプローブセットを示している。（参考例４）
【図１３】図１３は、抗体高産生細胞でのNfkBia発現抑制の定量結果を示している。（参考例４）
【図１４】図１４は、マウスMCMV IE2プロモーター上（配列番号23）の８つのNfkB結合部位（下線部）を示している。（参考例４）
【図１５】図１５は、microRNA発現の解析法の概略である。（参考例５）
【図１６】図１６は、抗体高産生細胞で高発現していたmicroRNA由来のPCR産物を示している。（参考例５）
【図１７】図１７は、pHyg-TAUT発現細胞に転写産物AI642048(437p)の一部配列165bpを共発現させたプラスミド pPur-APES165  および  ALT1を共発現させたpPur-ALT1である。（参考例６）
【図１８】図１８は、ＡＰＥＳ強発現による細胞高増殖、抗体高産生効果を示したシェーカー流加培養の結果である。（参考例６）
【図１９】図１９は、ＡＰＥＳ強発現による細胞高増殖、抗体高産生効果を示したL-Jar流加培養の結果である。（参考例６）
【図２０】図２０は、APES165強発現宿主候補細胞（９株）のＡＰＥＳ発現量と生細胞密度の相関を示している。（参考例６）
【図２１】図２１は、転写産物AI462015(437p)の一部配列APES165のさらに部分配列の強発現によってMab1産生量が増加することを示している。（参考例７）
【図２２】図２２は、図２１で抗体高産生効果のあったAPES165のさらに部分配列がNfkbia相補配列を含むことを示している。（参考例７）
【図２３】図２３は、AI462015がマウスNfkbia mRNAの相補鎖であることを示している。(参考例１）
【図２４】図２４は、AI462015の相同配列がＣＨＯ−Ｋ１細胞ゲノムに存在することを示している。（参考例１）
【図２５−１】図２５ａは、AI462015の一部配列（5′末端から7-91番目）が、種を超えて保存されていることを示している。（参考例１）図２５ｂは、AI462015の一部配列（5′末端から7-91番目）が、種を超えて保存されていることを示している。（参考例１）
【図２５−２】図２５ｃは、AI462015の一部配列（5′末端から7-91番目）が、種を超えて保存されていることを示している。（参考例１）図２５ｄは、AI462015の一部配列（5′末端から7-91番目）が、種を超えて保存されていることを示している。（参考例１）
【図２５−３】図２５ｅは、AI462015の一部配列（5′末端から7-91番目）が、種を超えて保存されていることを示している。（参考例１）
【図２６】DXB11/TAUT/APES (DTP)細胞の樹立。（実施例１）
【図２７】ハムスターTAUT、ヒトALT1、及びNfkbia のmRNA発現レベルを示す。（実施例１）
【図２８】DXB11/TAUT/APES/AE1 (DTPE) 細胞の樹立。（実施例１）
【図２９】DXB11/TAUT/APES/ALT1/PC (DTPLC)細胞の樹立。（実施例１）。
【図３０】DXB11/TAUT/ALT1 (DTL)細胞にヒトPC発現プラスミドpNeo-PCを導入したが、DXB11/TAUT/ ALT1/PC (DTLC)は樹立されなかった。（実施例１）
【図３１】DXB11(dhfr-)及びDT宿主の倍加時間。（実施例２）
【図３２】各種の遺伝子の強制発現による改変宿主の作製。（実施例２）
【図３３】改変宿主の倍加時間。（実施例２）
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
【００２７】
（１）APES(Antibody Production Enhancing Sequence）
APESは、ＮＦ-κＢの抑制タンパク質であるI-κＢを不活性化する核酸分子であり、より具体的には、I-κＢの制御サブユニットであるI-κＢα（NfkBia）の遺伝子発現を抑制する核酸分子である。そのような核酸分子の本体は、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAであるが、APESは、non-coding RNA自体、若しくはそのRNAをコードするDNA又はそれらの配列の総称である。
【００２８】
あるいは、APESは、ヒト、マウス、ラットまたはハムスター由来のNfkBiaの遺伝子であるDNAまたはmRNAに塩基対形成により結合し、NfkBiaの発現を抑制し得る塩基配列を含む核酸分子である。そのような核酸分子は、NfkBia遺伝子DNAまたはmRNAに結合してその発現を阻害することができると思われる。APESは、例えば、NfkBiaのmRNAにＲＮＡ干渉する分子である。
【００２９】
あるいは、APESは、ヒト、マウス、ラットまたはハムスター由来のNfkBiaの遺伝子DNAまたはmRNAに塩基対形成により結合し得る配列を含む、二本鎖RNA（dsRNA）、または短いdsRNAであるsiRNA、もしくは一本鎖に解離したsiRNA、またはshRNA、アンチセンスDNAもしくはRNA、microRNA（miRNA）またはmRNA型ノンコーディングRNAであってもよい。
【００３０】
あるいは、APESは、ヒト、マウス、ラットまたはハムスター由来のNfkBia遺伝子DNAまたはmRNAの相補配列からなる塩基配列、またはそのような相補配列を配列の一部に含む塩基配列であって、NfkBiaの発現を抑制し得る塩基配列を含む核酸分子である。
【００３１】
あるいは、APESは、ヒト、マウス、ラットまたはハムスター由来のNfkBia遺伝子DNAまたはmRNAの部分配列またはそのような部分配列の相補配列であって、NfkBiaの発現を抑制し得る塩基配列を含む核酸分子である。
【００３２】
たとえば、APESは、標的であるNfkBia mRNAの一部に相同または相補的な配列を含む配列からなるオリゴヌクレオチドであることができる。そのようなオリゴヌクレオチドの例としては、NfkBia mRNA相補鎖の１９〜２５塩基に相当する配列、又は当該配列と一塩基を除き同一配列を持ち、且つNfkBiaの発現を抑制する効果を有する低分子RNAが挙げられる。ここで、低分子RNAとは、Small non-coding RNA (snRNA)を意味しており、snRNAにはmiRNAが含まれる。
【００３３】
あるいは、APESは、長鎖のmRNA型ノンコーディングRNAであってもよく、例えばNfkBiaの遺伝子DNAまたはmRNAに塩基対形成により結合し得る配列を含む長さ５６１ヌクレオチド長(561 mer)までの配列からなり、且つNfkBiaの発現を抑制する効果を有するものであることができる。あるいは、APESは、さらに長鎖（数百〜数十万ヌクレオチド）のmRNA型ノンコーディングRNAであってもよい。例えば、APESは２００−１０万ヌクレオチド長、あるいは、３００〜３０万ヌクレオチド長の核酸分子または配列であることができる。APESは、NfkBiaのmRNAの一部に相補的な配列（例えば、上述のsnRNA配列）を含む、５６１〜１５７９塩基長、若しくは５００〜１０００塩基長のmRNA型ノンコーディングRNAであってもよい。
【００３４】
塩基対形成により結合し得る配列とは、完全に対合する（すなわち100％相補的である）ものに限られず、機能に支障のない範囲で不対合塩基の存在も許容される。あるいは、APESの形態によっては、部分的な相補性がむしろ好ましい。したがって、例えば、NfkBiaの非翻訳領域を含む遺伝子DNAまたはmRNAに少なくとも70％、より好ましくは80％、さらに好ましくは90％、最も好ましくは95％相同であるような配列またはその相補配列も、「塩基対形成により結合し得る配列」に含まれる。例えば、561 mer若しくは500 merのmRNA型ノンコーディングRNAについて少なくとも90％相同の配列には、塩基の挿入、欠失、または点突然変異による１〜５０個（若しくは561 merの場合は１〜５６個）のミスマッチ塩基を含む変異配列であって、その宿主細胞中での発現に伴い、抗体等の組換えポリペプチドの産生能が増大する、或いは、NfkBiaの発現を抑制する機能を有するものが包含される。よって、例えば70％以上の相同性のような、ある程度の配列類似性を有する、宿主細胞とは異なる生物種由来のNfkBiaオルソログ（異種間相同遺伝子)由来の配列もAPESとして利用可能であると思われる。
【００３５】
あるいは、塩基対形成により結合し得る配列とは、細胞内のような条件でNfkBiaのmRNAと結合し得る配列を包含する。そのような配列は、例えば、高度にストリンジェントな条件として当業者に公知の条件下でハイブリダイズし、且つ所望の機能を有する配列を含む。高度にストリンジェントな条件の一例は、ポリヌクレオチドとその他のポリヌクレオチドとを、６×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、５０％ホルムアミド、５×デンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの断片化した変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション緩衝液中で、４２℃のハイブリダイゼーション温度で１２〜１６時間インキュベートすること（ここで一方のポリヌクレオチドが、膜のような固体表面に付着させてあってもよい）それに続いて、１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液を用いて42℃以上の至適温度で数回洗浄することである。その他の具体的な条件については、Sambrook等「Molecular Cloning: A Laboratory Manual第３版」Cold Spring Harbor Laboratory Pr；および、Ausubel等「分子生物学実験プロトコール」丸善、など多数の当業者に周知の実験マニュアルを参照されたい。
【００３６】
APESの別の一態様は、ヒト、マウス、ラットまたはハムスター由来のNfkBiaのmRNA３’側非翻訳領域の部分配列に相同または相補的な配列であって、NfkBiaの発現を抑制し得る塩基配列を含む核酸分子である。
【００３７】
後述の参考例において説明するように、本発明者らは、培養ＣＨＯ細胞において抗体産生能と相関して発現量が高くなっているmRNA型ノンコーディングRNAを見出した。このRNAは、マウスゲノム中の437塩基からなる公知配列（図１、GenBank AccessionID:AI462015、配列番号１）の転写産物として同定された。AI462015の配列およびマウスゲノム上での位置が図１に示されている。AI462015の転写産物である437塩基はマウスNfkBia mRNA 3’側 非翻訳領域（513塩基）の相補鎖に相当する（図２３）。さらに、本発明者らは、AI462015由来の一部の配列を有する核酸分子を宿主細胞に導入して発現させることにより、所望のポリペプチドの生産量を増加させることができることを見出した。
【００３８】
上述のAI462015由来の配列またはその一部の配列は、マウス、ハムスター等のげっ歯類のみならず、ヒトにおいても保存されており、他の哺乳動物や、魚類、昆虫等の動物においても保存性が高い配列と考えられる。従って、AI462015由来の配列またはその一部の配列に対応する各種動物細胞の由来のNfkBia mRNA 3’側 非翻訳領域の部分配列若しくはその相補配列も本発明のAPESの配列として使用できる。
【００３９】
APESの一つの具体例は、マウスAI462015由来の一部の配列、あるいはそのような部分配列において１〜数個の塩基が置換、欠損又は付加された配列を有する。特に、5’側4番目のGから168番目までのCまでの塩基配列からなる１６５塩基のDNA配列（配列番号２、APES165）、もしくはその相補（アンチセンス）DNA配列またはこれらのDNAから転写されるRNA配列を含む配列、またはこの配列中の任意の長さの部分配列が挙げられる。あるいは、5’側4番目のGから3’末端のTまでの塩基配列からなる４３４塩基のDNA配列（配列番号３、APES434）、もしくはその相補（アンチセンス）DNA配列またはこれらのDNAから転写されるRNA配列を含む配列、またはこの配列に由来する任意の長さの部分配列が挙げられる。マウスAI462015の配列に対応するヒト、ハムスター、ラット等の哺乳類由来の配列を含む配列若しくはそれらの部分配列、あるいはそのような部分配列において１〜数個の塩基が置換、欠損又は付加された塩基配列も含まれる。
【００４０】
一態様において、APESは、AI462015中の5’側4番目から133番目までの塩基配列（配列番号４、APES130）またはこの配列由来の一部の配列を有する。例えば、5’側4番目から68番目まで（配列番号５、APES4-68）、または69番目から133番目まで（配列番号６、APES69-133）のDNA配列もしくはその相補DNA配列またはこれらのDNAから転写される配列が挙げられる。
【００４１】
一態様において、APESは、AI462015中の5’側40番目から91番目までの５２塩基（配列番号７）の配列、または該５２塩基が任意の位置で切断された一部配列に由来する配列を有する。例えば、前半部分（APES40-68の２９塩基、もしくはAPES40-63の２４塩基、もしくはAPES40-61の２２塩基）または後半部分（APES69-91の２３塩基）のDNA配列もしくはその相補DNA配列（それぞれ配列番号８〜１１に相当）またはこれらのDNAから転写される配列が挙げられる。
【００４２】
上述の５２塩基は、一塩基を除いてラットNfkBia遺伝子の3’側非翻訳領域の相補鎖と同一配列である。また、その5’側の24塩基(APES40-63、配列番号９)はヒトNfkBia遺伝子の3’側非翻訳領域と同一配列である。また、5’側の22塩基（APES40-61、配列番号１０：AAGTACCAAAATAATTACCAAC）はラット、アカゲザル、イヌ、ウマなど種を超えたNfkBia mRNAの3’側非翻訳領域の相補鎖と同一配列である。NfkBia遺伝子の3’側非翻訳領域に相補的な一部の配列を宿主細胞中で発現させることでRNAi効果が期待される。たとえば、上記52塩基中の19〜25塩基に相補的な配列を有するRNAが、microRNA（miRNA）としてNfkBiaのmRNAの非翻訳領域に作用することにより、翻訳が阻害される可能性がある。
【００４３】
あるいは、APESは、AI462015中の5’側７番目から91番目までの８５塩基（配列番号２９）の配列、または該８５塩基が任意の位置で切断された一部配列に由来する配列を有する。上記８５塩基中の19〜25塩基に相補的な配列を有するRNAが、microRNA（miRNA）としてNfkBiaのmRNAの非翻訳領域に作用することにより、翻訳が阻害される可能性がある。
【００４４】
一態様において、APESは21塩基のsiRNAサーチで見出される配列を有する。例えばAI462015中の８４番目から１０４番目（配列番号１２、APES84-104）、９９番目から１１９番目（配列番号１３、APES99-119）、１０１番目から１２１番目（配列番号１４、APES101-121）のDNA配列に相補的な配列を含むmiRNA配列である。上述のAPES 69-133中の７１番目から１１２番目の配列（配列番号１６）がGeneChip上で定量されており、実際に高発現している領域であることから、APES84-104がmiRNAとして機能する可能性が高いと思われる。
【００４５】
別の一態様において、APESはNfkBiaの発現を抑制する公知のnon-coding RNAであってもよい。そのような核酸分子の例として、KSHV（Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus) miRNA-K1が挙げられる。（配列情報はX Cai et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 April 12; 102(15): 5570-5575などを参照）
【００４６】
また、APESの構造的又は機能的な特徴に基づき、新たにAPESとしての活性を有する核酸分子を化学合成あるいは生物源から単離することが可能である。APESの構造的特徴は、標的であるNfkBia mRNAの一部に相補的な配列を含む核酸分子であることである。核酸分子の形態は、いかなる形態でもよく、DNA、DNAの転写産物、mRNA、cDNAであるか、exosome RNAであるか、化学合成一本鎖RNAであるか、化学合成二本鎖RNAであるかなどを問わない。機能的特徴は、その宿主細胞中での発現に伴い、抗体等の組換えポリペプチドの産生能が増大していること、或いは、NfkBiaの発現が抑制されていることである。
【００４７】
生物源からAPESを単離する場合には、如何なる生物由来でもよく特に限定されない。具体的には、ヒト、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類、ウシ、豚、ヤギ、などの家畜類、ニワトリなどの鳥類、ゼブラフィッシュなどの魚類、ハエ等の昆虫類、線虫類などの動物由来のAPESが挙げられ、ヒト、げっ歯類或いは宿主細胞と同じ種由来のAPESであることが好ましく、例えば、APESを強発現させる細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）である場合には、ヒト、マウス或いはハムスター由来のAPESであることが好ましい。
【００４８】
このような核酸分子は、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、抗体等の組換えポリペプチドを高産生している培養細胞より全RNAを調製し、本発明の核酸配列（例えば、配列番号２のAPES165）に基づいてオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして用いてPCR反応を行い、APESとしての特徴を有するcDNAを増幅させることにより調製すればよい。また、抗体等の組換えポリペプチドを高産生している培養細胞より低分子ＲＮＡを調製後にｃＤＮＡライブラリーを作製し、クローニングされたｃＤＮＡの塩基配列に基づき、NfkBia mRNAに相補的な部分配列を含む低分子ＲＮＡを得ることができる。cDNAライブラリーは、microRNA（miRNA）などの低分子ＲＮＡを調製後に、例えばSambrook, J. et al., Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載の方法により構築することも可能である。
【００４９】
また、得られたcDNAの塩基配列を決定することにより、得られたcDNAをプローブとしてゲノムDNA ライブラリーをスクリーニングすることにより、APESが発現されるゲノムDNAを単離することができる。
【００５０】
具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明のAPESを発現する可能性のある細胞、組織などから、全RNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299)、AGPC法 (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 等により全RNAを調製したのち、RNeasy Mini Kit (QIAGEN) 等を使用して全RNAをさらに精製する。
【００５１】
得られた全RNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。cDNAの合成は、 SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (Invitrogen)等を用いて行うこともできる。また、プライマー等を用いて、5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製)およびポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction ; PCR)を用いた5'-RACE法(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002 ; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) にしたがい、cDNAの合成および増幅を行うことができる。
【００５２】
得られたPCR産物から目的とするDNA断片を調製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
【００５３】
また、得られたDNAは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、site-directed mutagenesis 法による一塩基変異導入等が挙げられる。このようにして改変された配列も、APES活性を有するものである限り、本発明の範囲に包含される。ここで、「APES活性を有する」とは、宿主細胞内で発現することによってNfkBia（I-κＢα）の発現を抑制する機能を有することを言う。
【００５４】
本明細書中では、APES活性を有する核酸分子を本発明の核酸分子と呼ぶことがある。
【００５５】
（２）APESの宿主細胞への導入及び発現
本発明は、APES、すなわち、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNA、の遺伝子を宿主細胞に導入することを含み、さらに、APESを発現させること、好ましくはAPESを強発現させることを含む。
【００５６】
APESを強発現するとは、もとの細胞と比較してAPESの発現量が増加しているという意味である。もとの細胞は特に限定されないが、例えばCHO細胞など組換えタンパク質を製造する際に宿主として用いられている細胞を挙げることができる。具体例としては、後述の参考例に沿って説明するならば、AFFYMETRIX社のオリゴヌクレオチドアレイ（Affymetrix MOUSE430_2）を使ったGeneChip実験において、抗体遺伝子導入前のもとの細胞はAI462015のシグナル値が２０００以下のものであり、これと比較してAPESの発現量が増加しているとは、例えば、AI462015のシグナル値が２倍以上となることである。
【００５７】
APES遺伝子が導入され、APESを強発現する細胞は、内因性あるいは外来のAPESを細胞内に含む。APESを強発現する細胞として、例えば、APESが人為的に導入された細胞を挙げることができる。
【００５８】
APESが人為的に導入された細胞は当業者に公知の方法により作製することが可能であり、例えば、APESをコードするDNA配列をベクターに組込み、該ベクターを細胞に形質転換することにより作製することが可能である。
【００５９】
さらに、本明細書では遺伝子活性化技術（例えば、国際公開第WO94/12650号パンフレット参照）により内因性APESが活性化され、その結果、APESが強発現した細胞もAPESが人為的に導入された細胞に包含される。
【００６０】
内因性APESの典型的な例は、宿主細胞のゲノム上にコードされたDNA配列としてのAPESである。また、本発明においては、遺伝子活性化技術によらず、例えば、抗体遺伝子導入後に何らかの要因で内因性APESの転写が活性化して、強発現した細胞も利用可能である。
【００６１】
（３）発現ベクター
発現ベクターは、宿主細胞にAPESを強発現させるため、及びトランスポーターや代謝酵素等の外来のポリペプチドを発現させるために有用である。また、医薬品の有効成分や抗原として有用な外来のポリペプチドの発現にも、発現ベクターが使用される。
【００６２】
本発明において使用可能な発現ベクターとしては、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (Invitrogen社製）や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF 、pCDM8 ）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（GIBCO BRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIpneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（Invitrogen社製）、pNV11 、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）などが挙げられる。
【００６３】
外来のポリペプチドを発現させるための発現ベクターは、該ポリペプチドをコードするDNAおよび当該DNAの発現を推進可能な発現制御配列を含む。同様に、APESを発現させるための発現ベクターは、APESをコードするDNAおよび当該DNAの発現を推進可能な発現制御配列を含む。単一のベクターが、一種以上のポリペプチドおよびAPESを発現させるように構築されてもよい。遺伝子活性化技術を用いて、例えば宿主ゲノムの一部であるようなAPESまたはポリペプチド遺伝子を活性化する場合、そのような宿主細胞由来のDNAの発現を促進する発現制御配列が導入されてもよい。
【００６４】
発現制御配列の例としては、適当なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子における開始コドン（すなわちATG）を含むコザック配列、イントロンのためのスプライシングシグナル、ポリアデニル化部位、及びストップコドン等があり、ベクターの構築は当業者が適宜行うことができる。
【００６５】
発現制御配列は、使用する動物細胞において遺伝子の転写量を増大させることが可能なプロモーター／エンハンサー領域を含むことが好ましい。所望のポリペプチドをコードする遺伝子の発現に関与するプロモーター／エンハンサー領域は、NF-κB結合配列を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。
【００６６】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の哺乳動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが好ましい。また、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
【００６７】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【００６８】
（４）宿主細胞
本発明において用いる宿主細胞は、特に限定されることなく、動物細胞、植物細胞、酵母などの真核細胞、大腸菌、枯草菌などの原核細胞など如何なる細胞でもよく、好ましくは、昆虫、魚、両生類、爬虫類、哺乳類由来の動物細胞であり、特に哺乳動物細胞が好ましい。哺乳動物細胞の由来としては、ヒト、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスターなどのげっ歯類、その他が挙げられ、ヒト、げっ歯類であることが好ましい。さらに本発明の細胞としては、通常ポリペプチドの発現によく用いられる、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、３Ｔ３細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞などの哺乳動物培養細胞が好ましい。
【００６９】
医薬品や抗原として有用なポリペプチドの大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。CHO 細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO 細胞であるdhfr-CHO（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220 ）やCHO K-1 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275）を好適に使用することができる。
【００７０】
上記のCHO細胞としては特に、DG44株、DXB-11株、K-1、CHO-Sが好ましく、特にDG44株及びDXB-11株が好ましい。
【００７１】
宿主細胞は、例えば、医薬品や抗原のような所望のポリペプチドの製造のための産生系として使用することができる。そのような細胞は、所望のポリペプチドを産生できる天然の細胞であっても、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入した細胞であってもよいが、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入した形質転換細胞が好ましい。
【００７２】
所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入した形質転換細胞の一例は、少なくとも所望のポリペプチドをコードするDNAを含む発現ベクターがトランスフェクトされている宿主細胞である。
【００７３】
さらに、本発明において、「ＤＮＡ（あるいは遺伝子）を導入した」細胞とは、外来性ＤＮＡがトランスフェクトされた細胞の他、遺伝子活性化技術（例えば、国際公開第WO94/12650号パンフレット参照）により内因性ＤＮＡが活性化され、その結果、当該ＤＮＡに対応する蛋白質の発現もしくは当該ＤＮＡの転写が開始或いは増加した細胞も包含する。
【００７４】
APESが人為的に導入された細胞を用いて所望のポリペプチドを製造する場合、APESと所望のポリペプチドをコードする遺伝子の導入の順序は特に制限されず、APESを導入した後に所望のポリペプチドをコードする遺伝子を導入してもよいし、所望のポリペプチドをコードする遺伝子を導入した後にAPESを導入してもよい。又、APESと所望のポリペプチドをコードする遺伝子を同時に導入してもよい。
【００７５】
ベクターを用いる場合、APES及び所望のポリペプチドをコードする遺伝子の導入は単一のベクターにより同時に導入してもよいし、複数のベクターを用いて別々に導入してもよい。
【００７６】
（５）外来遺伝子
本発明では、宿主細胞にあらかじめAPESを導入して強発現させることにより、発現困難な外来遺伝子若しくは発現が不安定な外来遺伝子を、細胞内で安定的に高発現させることができる。
【００７７】
宿主細胞を所望のポリペプチドの製造のために使用する場合、製造の目的である所望のポリペプチドの遺伝子に加えて、それ以外の外来遺伝子を導入して、細胞内で安定的に高発現させることができる。
【００７８】
所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された形質転換細胞内で、外来遺伝子が発現することによって、所望のポリペプチドの生産量が増加することが好ましい。そのような外来遺伝子としては、タウリントランスポーター（TauT）、システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（CSAD）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT)、アニオンエクスチェンジャー（AE)、ピルビン酸カルボキシラーゼ（PC）、X-box binding protein (XBP-1)等をコードするDNAが挙げられる。
【００７９】
本発明では、宿主細胞にあらかじめAPESを導入して強発現させることにより、所望のタンパク質の遺伝子以外の複数の外来遺伝子を当該宿主細胞に導入して安定的に発現させることができる。宿主細胞中で、所望のポリペプチドの遺伝子に加えて、それ以外の特定の2つ以上の外来遺伝子が発現することによって、所望のポリペプチドの生産量が増加することが好ましい。その結果、組換えタンパク質生産に適した細胞株を樹立することが可能となる。
【００８０】
そのような2つ以上の外来遺伝子は、同時に安定的に発現することが困難なタンパク質をコードする遺伝子であることができる。つまり、宿主細胞にあらかじめAPESを導入して強発現させることにより、所望のポリペプチドの遺伝子以外の、同時に安定的に発現することが困難な2つ以上の外来遺伝子を同時に安定的に発現させることが可能となる。したがって、「同時に安定的に発現することが困難」とは、宿主細胞中にAPESが導入されていない状態では、同時に安定的に発現することがない、2つ以上のタンパク質をコードする外来遺伝子の組み合わせである。
【００８１】
ここで、「同時に安定的に発現することが困難な2つ以上の外来遺伝子」とは、APESを導入していない動物細胞、好ましくは所望のタンパク質の遺伝子を導入する前の宿主細胞に、其々単独で導入するとその外来遺伝子が安定的に発現する細胞株が樹立できるが、これらの外来遺伝子を2つ以上導入する処理を行った後、薬剤等による選抜処理を行っても、当該2つ以上のタンパク質をコードする外来遺伝子を同時に発現する細胞が得られないような遺伝子を言う。この場合、少なくとも一方の当該外来遺伝子と同じ遺伝子若しくはカウンターパート遺伝子の、当該外来遺伝子導入前の宿主細胞における発現量が、qPCRで検出限界以下であることが好ましい。
【００８２】
また、本発明の細胞が、2つ以上のタンパク質をコードする外来遺伝子を導入することができた、所望のタンパク質を産生するための宿主細胞であっても、所望のタンパク質の遺伝子を導入した後、少なくとも２回、MTX等の薬剤処理により所望のタンパク質の遺伝子増幅のための選抜処理を行う際に、当該選抜処理前の当該2つ以上のタンパク質をコードする外来遺伝子のうち少なくとも1つの遺伝子の発現量が50%未満、好ましくは30%以下、さらに好ましくは10％以下、最も好ましくは発現が消失してしまうとき、本発明においてこの様な遺伝子を「同時に安定的に発現することが困難な2つ以上の外来遺伝子」と言う。
【００８３】
また、別の側面としては「同時に安定的に発現することが困難な2つ以上の外来遺伝子」とは、2つ以上のタンパク質をコードする外来遺伝子を導入し、APESを導入していない細胞を選抜した時の、当該外来遺伝子の発現量に比して、当該細胞を少なくとも15世代継代培養を行った後、当該2つ以上のタンパク質をコードする外来遺伝子のうち少なくとも1つの遺伝子の発現量が50%未満、好ましくは30%以下、さらに好ましくは10％以下、最も好ましくは発現が消失してしまう遺伝子を言う。
【００８４】
「同時に安定的に発現する」とは、具体的には、本発明の細胞が所望のタンパク質を産生するための宿主細胞である場合、2つ以上のタンパク質をコードする外来遺伝子を導入した、APESを含む宿主細胞に、所望のタンパク質の遺伝子を導入した後、少なくとも２回、MTX等の薬剤処理により所望のタンパク質の遺伝子増幅のための選抜処理を行っても、当該選抜処理前の当該2つ以上のタンパク質をコードする外来遺伝子の発現量が其々50%以上、好ましくは70%以上の発現量が維持されている状態を言う。
【００８５】
また、別の側面としては「同時に安定的に発現する」とは、2つ以上の外来遺伝子を導入した細胞を選抜した時の、当該外来遺伝子の発現量に比して、当該細胞を少なくとも15世代継代培養を行った後においても、当該2つ以上のタンパク質をコードする外来遺伝子の発現量が其々50%以上、好ましくは70%以上、さらに好ましくは80％以上の発現量が維持されている状態を言う。
【００８６】
本発明において、上述の如く、２つ以上の外来遺伝子が「同時に安定的に発現している」状態が維持されている細胞株を、樹立された細胞株という。
【００８７】
本発明における「同時に安定的に発現することが困難なタンパク質」は、類似の機能を有するタンパク質に属することができる。同時に安定的に発現することが困難な、類似の機能を有するタンパク質の組み合わせの例としては、２種類以上の膜輸送タンパク質若しくはそれが機能するために必要なアクセサリープロテインや、２種類以上の酵素タンパク質、好ましくは同一の代謝経路に関与する代謝酵素や、２種類以上の転写因子の組み合わせが挙げられる。
【００８８】
あるいは、同時に安定的に発現することが困難なタンパク質の組み合わせは、２種類以上の膜輸送タンパク質と１若しくは２種類以上の酵素タンパク質の組み合わせであってもよい。あるいは、同時に安定的に発現することが困難なタンパク質の組み合わせは、１若しくは２種類以上の膜輸送タンパク質と２種類以上の酵素タンパク質の組み合わせであってもよい。
【００８９】
膜輸送タンパク質は、生体膜にあって、物質の輸送を仲介するタンパク質を指し、輸送体（トランスポーター）、担体（キャリヤー）、透過酵素（パーミアーゼ）等ともいわれる。細胞膜の重要な役割として各種イオンや栄養素等を選択的に透過させる機能が有り、その機能をつかさどる膜タンパク質である。膜輸送タンパク質には、糖やアミノ酸等の有機物質の輸送を仲介するタンパク質、並びにイオン輸送体であるイオンポンプ及びイオンチャンネルも含まれる。各種の糖若しくはアミノ酸の輸送体（トランスポーター、パーミアーゼ）及びイオン輸送体が精製されており、それらの遺伝子が公知である。
【００９０】
本発明において、例えば、類似の機能を有するタンパク質の遺伝子は、２種類以上のトランスポーター遺伝子の組み合わせであることができる。２種類のトランスポーターの例としては、TauTとAE1が挙げられる。
【００９１】
類似の機能を有する酵素タンパク質の代表例は、複数の代謝酵素の組み合わせである。例えば、類似の機能を有する酵素タンパク質の遺伝子は、同一経路の２種類以上の代謝酵素遺伝子であることができる。そのような代謝酵素は、同一経路内の連続した反応を促進する２種以上の酵素であってもよい。例えば、同一経路の代謝酵素は、アミノ酸の分解反応を触媒する酵素であることができる。また、例えば、代謝酵素は、ピルビン酸代謝経路の酵素であることができる。２種以上のピルビン酸代謝経路の酵素の例は、ALT1とPCであることができる。
【００９２】
あるいは、類似の機能を有する酵素タンパク質の例は、複数の糖転移酵素の組み合わせであってもよい。
【００９３】
また、１若しくは２種類以上の膜輸送タンパク質と２種類以上の酵素タンパク質の組み合わせの例は、TauT及び２種の代謝酵素であることができる。
【００９４】
上述したように、宿主細胞にAPESを人為的に発現させることは、細胞に、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNAの遺伝子を人為的に導入して、該遺伝子を発現させることより実現できる。2つ以上の外来遺伝子の発現も、同様に、細胞にそれらの外来遺伝子を人為的に導入して、該遺伝子を発現させることより実現できる。
【００９５】
宿主細胞への外来性DNA（ベクターに組み込まれていてもよい）の導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、Nucleofection法（amaxa社）、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
【００９６】
さらに、本発明において、「ＤＮＡ（あるいは遺伝子）を導入した」細胞とは、外来性DNAがトランスフェクトされた細胞の他、遺伝子活性化技術（例えば、国際公開第WO94/12650号パンフレット参照）により内因性ＤＮＡが活性化され、その結果、当該ＤＮＡに対応する蛋白質の発現もしくは当該ＤＮＡの転写が開始或いは増加した細胞も包含する。
【００９７】
同時に安定的に発現することが困難な2つ以上の外来タンパク質の遺伝子を宿主細胞に導入して安定的に発現させるには、２番目の外来遺伝子を導入するよりも前に、宿主細胞にあらかじめAPESを導入しておくことが好ましい。ベクターを用いる場合、APES及び２番目以降の外来遺伝子の導入は、複数のベクターを用いて別々に導入することが好ましい。
【００９８】
一方、1つ目の外来遺伝子とAPESの導入の順番には特に制限がなく、APESを導入した後に1つ目の外来遺伝子を導入してもよいし、1つ目の外来遺伝子を導入した後にAPESを導入してもよい。又、APESと1つ目の外来遺伝子を同時に導入してもよい。ベクターを用いる場合、APES及び1つ目の外来遺伝子の導入は単一のベクターにより同時に導入してもよいし、複数のベクターを用いて別々に導入してもよい。
【００９９】
（６）組換えタンパク質生産のための細胞株
本発明では、NfkBiaの発現を抑制するnon-coding RNA（APES）の遺伝子を導入して、該遺伝子を発現させることにより、継代培養を繰り返しても複数のタンパク質をコードする外来遺伝子が安定的に高発現する、組換えタンパク質生産のための細胞株を得ることができる。
【０１００】
また、APESの遺伝子を宿主細胞に導入することにより、倍加時間が速く、安定に増殖することができる、組換えタンパク質生産のための細胞株を得ることができる。そのような細胞は、APESに加えて、さらに別の外来遺伝子が導入されて安定的に高発現する細胞であってもよい。
【０１０１】
本発明で提供される細胞の例としては、後述の実施例では、先ずTauT高発現な細胞にAPES165（配列番号２： gtctgtaaaa atctgtttaa taaatataca tcttagaagt accaaaataa ttaccaacaa aatacaacat atacaacatt tacaagaagg cgacacagac cttagttggg ggcgactttt aagcacatgc cactgaacac ctggctctta catgggagga cacac）を導入した細胞を樹立し、次いで、当該細胞にさらに別のトランスポーター遺伝子を導入することにより、協調的に機能する２種のトランスポーターが共に安定的に高発現する細胞が樹立されている。また、先ずTauT高発現な細胞にAPES165を導入した細胞を樹立し、次いで、当該細胞にさらに２種のピルビン酸代謝経路の酵素の遺伝子を導入することにより、TauT並びにピルビン酸代謝経路の連続した反応を促進する２種の酵素が共に安定的に高発現する細胞が樹立されている。これらの細胞は、組換えタンパク質生産のために好ましい性質を有するので、医薬品や抗原として有用な所望のタンパク質を生産するための宿主細胞として好適である。これらの細胞を宿主として、所望のタンパク質の遺伝子を人為的に導入したものを培養し、所望のタンパク質を産生させ、産生したタンパク質を回収することにより、当該所望のタンパク質を製造することができる。
【実施例】
【０１０２】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。【０１０３】
実施例１：発現が困難な特定の遺伝子を高発現させた細胞の樹立
（１）膜タンパクのTauTとAE1は細胞表面上で塩素イオンの搬入・排出を通して協同的に機能する。これまで、TauT高発現細胞のTauT機能増強のために、AE1を同時に高発現させた宿主細胞の樹立を繰り返し試みたが、薬剤選抜過程で浮遊細胞の付着化がみられ、共発現細胞は樹立されなかった。この場合、宿主細胞における元々のAE1の発現量はqPCRで検出限界以下であった。
（２）酵素のALT1とPC（Pyruvate Carboxylase）は、アラニンからピルビン酸、ピルビン酸からオキサロ酢酸を生合成する。これまで、TCA回路へと続く代謝経路の反応を促進するために、ALT1高発現宿主細胞にPCを高発現させようとしたが、共発現細胞は樹立されなかった。この場合、宿主細胞における元々のALT1の発現量はqPCRで検出限界以下であった。【０１０４】
ところが、上記２例において、２番目の遺伝子導入の前にあらかじめAPESを高発現させておくと、APESを含めて３種類以上の遺伝子を高発現する細胞が樹立された。つまり、（１）ではTauT高発現細胞にAPESを高発現させたTAUT/APES細胞を構築したのち、AE1を導入することで、TauTとAE1を高発現する高増殖なTAUT/APES/AE1細胞が樹立された。（２）においても、（１）のTAUT/APES高発現細胞からALT1が高発現なTAUT/APES/ALT1細胞を構築した後、PCを導入することで、ALT1とPCを高発現する高増殖なTAUT/APES/ALT1/PC細胞が樹立された。一方、あらかじめAPESを高発現させていないTAUT/ALT1細胞からは、ALT1とPCを高発現するTAUT/ALT1/PC細胞は樹立されなかった。【０１０５】
なお、本実施例においては、宿主細胞としてCHO細胞DXB-11株を用いた。【０１０６】
〔実施例１−１〕DXB11/TAUT/APES細胞の樹立
ハムスターTAUT発現プラスミドpHyg-TAUTを宿主細胞のDXB11にエレクトロポレーション法で導入し、200μg/mLハイグロマイシン存在下で選抜すると、高増殖、且つハムスターTAUT(taurine transporter)高発現な細胞であるDXB11/TauT (DT)が樹立された（図２６）。さらに、APES発現プラスミドpPur-APES165をエレクトロポレーション法で導入し、6 μg/mLのピューロマイシン存在下で選抜すると、高増殖、且つAPESを強制発現させることでNfkbia mRNA発現が抑制された細胞であるDXB11/TAUT/APES (DTP)（図２６）が樹立された。DTP細胞において、ハムスターTAUT mRNA高発現、Nfkbia mRNA発現抑制が継代培養を繰り返しても安定に維持されることはTaqman法で確認された（図２７）。【０１０７】
〔実施例１−2〕DXB11/TAUT/APES/AE1細胞の樹立
２種のトランスポーターを共に安定に高発現させた宿主細胞の樹立には困難を伴う場合がある。たとえば、宿主細胞DXB11にTAUTとAE1(anion exchanger 1)を共に高発現させた安定株は樹立されなかった。しかし、図２６のハムスターTAUT高発現でAPESを強制発現させることでNfkbia mRNA発現が抑制された細胞であるDXB11/TauT/APES (DTP)にヒトAE1発現プラスミドpNeo-AE1をエレクトロポレーション法で導入し、200 μg/mLのG418存在下で選抜すると、高増殖、且つハムスターTAUTとヒトAE1を共に高発現している細胞であるDXB11/TAUT/APES/AE1 (DTPE) が樹立された（図２８）。【０１０８】
DTPE細胞において、ハムスターTAUT mRNA高発現、ヒトAE1 mRNA高発現、Nfkbia mRNA発現抑制が、継代培養を繰り返しても安定に維持されることはTaqman法で確認された（図２７、図２８）。【０１０９】
一方、APES導入前のDXB11/TAUT (DT)細胞にヒトAE1発現プラスミドpPur-AE1をエレクトロポレーション法で導入し、6 μg/mLのピューロマイシン存在下で選抜すると、DXB11/TAUT/AE1 (DTE)細胞は樹立されなかった。【０１１０】
以上より、TAUTによるCl-イオンの排出、AE1によるCl-イオンの取り込みを介して、協調的に機能する２種のトランスポーターを共に高発現させるためには、APES高発現によるNfkbia mRNAの発現抑制が必要であると考えられる。【０１１１】
〔実施例１−3〕DXB11/TAUT/APES/ALT1/PC細胞の樹立
２種の酵素を共に安定に高発現させた宿主細胞の樹立にも困難を伴う場合がある。たとえば、ALT1(alanine transferase)とPC(pyruvate carboxylase) を共に高発現させた安定株は樹立されなかった。しかし、図２６のDXB11/TauT/APES (DTP)にヒトALT1発現プラスミドpNeo-ALT1をエレクトロポレーション法で導入し、200 μg/mLのG418存在下で選抜すると、高増殖、且つ ヒトALT1高発現な細胞であるDXB11/TAUT/APES/ALT1 (DTPL) が樹立されたが、さらに、DTPL細胞にヒトPC発現プラスミドpZeo-PCをエレクトロポレーション法で導入し、200 μg/mLの Zeocin存在下で選抜することで高増殖、且つヒトPC高発現な細胞であるDXB11/TAUT/APES/ALT1/PC (DTPLC)が樹立された（図２９）。【０１１２】
DTPLC細胞において、ハムスターTAUT mRNA高発現, ヒトALT1 mRNA高発現、、 Nfkbia発現抑制、ヒトPC mRNA高発現が継代培養を繰り返しても安定に維持されることはTaqman法で確認された（図２７、図２９）。【０１１３】
一方、APES導入前のDXB11/TAUT (DT)細胞にヒトALT1発現プラスミドpPur-ALT1をエレクトロポレーション法で導入し、6μg/mLのピューロマイシン存在下で選抜すると、高増殖、且つ ヒトALT1高発現な細胞であるDXB11/TAUT/ALT1 (DTL) が樹立されたが、さらに、DTL細胞にヒトPC発現プラスミドpNeo-PCをエレクトロポレーション法で導入し、200 μg/mLの G418存在下で選抜すると、DXB11/TAUT/ ALT1/PC (DTLC)は樹立されなかった（図３０）。【０１１４】
以上より、ピルビン酸代謝経路の連続した反応を促進する酵素であるALT1とPCを共に高発現させるためには、APES高発現によるNfkbia mRNAの発現抑制が必要であると考えられる。【０１１５】
実施例２：倍加時間が速く、安定に増殖する細胞の樹立方法
〔実施例２−１〕倍加時間（概算値）の算出
倍加時間（概算値）は、125-mL Erlenmeyer Flaskによるシェーカー培養後、Roche Cedex Cell Counter and Analyzer system (Innovatis AG, Bielefeld, Germany) によって生細胞数を測定、算出した。Viabilityが90%以上に維持された状態の個々の細胞から継代培養を開始して、初発細胞密度2×105 cells/mLからの3日間培養、あるいは初発細胞密度1×105 cells/mLからの４日間培養などによって過増殖にならないように培養を繰り返しおこない、Viabilityを90%以上に維持しながら継代間の倍加時間を算出した。遺伝子を強制発現させた改変細胞の継代培地には各種遺伝子導入に用いたハイグロマイシン等の薬剤が含まれるが、薬剤以外はDXB11(dhfr-)と同一培地を使用した。【０１１６】
遺伝子導入による改変前のDXB11(dhfr-)の倍加時間（概算値）は、薬剤を含まない培地での継代培養（（Viabilityが99.5%の細胞から継代培養を7回（3日間培養を4回、4日間培養を3回））で算出したところ、27.5 ±1.7時間であった（図３１）。【０１１７】
〔実施例２−２〕各種の遺伝子強制発現宿主の樹立と倍加時間
図３２に示したように、各種の遺伝子の強制発現によって改変宿主を樹立した。まずはDXB11(dhfr-)にTAUT (Taurine Transporter) の発現プラスミド（pHyg-TAUT）をエレクトロポレーション法で導入、約2-3週間後に200 μg/mL ハイグロマイシン存在下で増殖良好であった細胞を２種類選抜した。さらに、継代培養時の遺伝子発現プロファイルをAFFYMETRIX社のオリゴヌクレオチドアレイ（Affymetrix MOUSE430_2）を用いたGeneChip実験で比較し、TAUT mRNAが高発現で、その他の発現プロファイルはDXB11(dhfr-)と類似していた選抜株をDT宿主とした。樹立されたDT宿主の倍加時間（概算値）は、薬剤（ハイグロマイシン）を含む培地での継代培養（（（Viabilityが90.0%以上の細胞から継代培養を１１回（3日間培養を4回、4日間培養を7回））で算出したところ、26.1 ±2.7時間であり、倍加時間はDXB11(dhfr-)に対してほぼ同等であった（図３１）。【０１１８】
次に、DT宿主をさらに改変するために抗体産生細胞において発現が異常に亢進されていたAPESの一部配列APES165（特願2011-082002）を強制発現させた。DT宿主にpPur-APES165をエレクトロポレーション法で導入、約2-3週間後に6 μg/mL ピューロマイシン存在下で増殖良好であった細胞を９株選抜すると、APES発現量と細胞増殖に相関 (R2=0.701)がみられた（図20）。【０１１９】
TAUTとAPESが共に高発現しており、倍加時間が20.8時間と最も速かった細胞株をDTP宿主とすると、DTP宿主はいままでにない形質を獲得していた。たとえば、TAUTと共に強制発現させた宿主細胞を樹立できなかったAE1(Anion Exchanger 1)の発現プラスミド(pNeo-AE1)をエレクトロポレーション法導入、約2-3週間後に200 μg/mL G418存在下で増殖良好であった細胞を選抜すると、TAUTとAE1が共に高発現な細胞が構築された。最もAE1発現量の高かった細胞をDTPE宿主とすると、長期間培養を繰り返しても安定であり、倍加時間はDTP宿主よりも速かった(図３３、57継代、19.9 ±4.3時間)。【０１２０】
次の例としては、TAUTと共に強制発現させた宿主細胞を樹立できたALT1 (Alanine Aminotransferase 1) の発現プラスミド(pNeo-ALT1)をエレクトロポレーション法で導入、約2-3週間後に200 μg/mL G418存在下で増殖良好であった細胞を選抜して、TAUTとAE1が共に高発現な細胞を構築した。ALT1発現量と細胞増殖には相関がみられるため、最もALT1発現量の高かった細胞をDTPL宿主とすると、こちらも長期間培養を繰り返しても安定であり、倍加時間はDTP宿主よりも速かった(図３３、57継代、19.8 ±4.3時間)。ALT1はAPESの強制発現に依存せずにTAUTと共に強制発現させた宿主細胞を樹立できるので、DT宿主にALT1の発現プラスミド（pPur-ALT1）をエレクトロポレーション法で導入、約2-3週間後に6 μg/mL ピューロマイシン存在下で増殖良好であった細胞を選抜し、最もALT1発現量の高かった細胞をDTL宿主とすると、長期間培養を繰り返しても安定であったが、DTPL宿主との比較では増殖にばらつきがみられ、倍加時間はDTPL宿主よりも遅かった( 図３３、57継代、21.9 ±7.3時間)。【０１２１】
以上の結果は、（１）APESを強制発現させることで倍加時間の速い宿主細胞を構築できること、（２）APES強発現宿主はさらに新しい遺伝子を導入することで、倍加時間のより速い細胞を構築できることを示している。このような機能をもつ核酸配列は知られていない。【０１２２】
参考例
本発明者らは、以前、高い組換え抗体産生能を有する培養細胞株（CHO細胞株）を材料として、当該細胞株で発現が顕著な遺伝子について検討を行い、一つのｍRNA型ノンコーディングRNAを同定した。この転写産物はNfkBiaのmRNAの非翻訳領域の相補鎖に相当した。さらに、この転写産物中の一部の配列からなる核酸分子を組換え培養細胞中で発現させることにより、当該培養細胞の抗体産生能を顕著に向上させることを見出した。また、本発明者らは当該ノンコーディングRNAの発現が昂進された抗体高産生細胞ではNfkBiaの発現が抑制されていること、高い抗体産生能を有する培養細胞が細胞内でNfkBiaの発現を抑制していること、培養細胞内のNfkBiaの発現を制御する転写産物を高発現させることにより、抗体の生産量が増加することを見出した。【０１２３】
これらの事項を、以下の参考例により説明する。【０１２４】
〔参考例１〕各種遺伝子導入CHO細胞のGeneChip解析実験
GeneChip実験は、AFFYMETRIX社のオリゴヌクレオチドアレイ（Affymetrix MOUSE430_2）を用いて通常の手順にしたがった。ただし、Hamster Arrayは商品化されていないためMouse Genome 430 2.0 Arrayを用いた。ハイブリダイゼーション条件の最適化によって、Test 3 array 上のMouse Gene１６種のプローブ中、８種のプローブでPresent Callが得られるようになり、Mouseとの塩基配列相同性が約９０%以上の場合は、Hamster転写産物の発現定量が可能になった。【０１２５】
各種遺伝子を強発現させた細胞から高純度total RNAを調製したのち、total RNAとT7プロモーター配列を含むオリゴdTプライマー(T7-(T)24)を用いてcDNAを合成した。つぎに、Bio-11 CTP, Bio-16 UTPとMegascript T7 Kit(Ambion)を用いた転写反応により、cDNAからビオチンラベルcRNAを合成した。cRNAはカラム精製後、電気泳動上で18sから28s rRNAに相当する分子量が確認された高品質cRNAを断片化し、均一なサイズをもつGeneChipサンプルとした。使用までのGeneChipサンプルは、ハイブリダイゼーションサンプル溶液を加えて−８０℃で凍結保存した。サンプル溶液は使用直前に熱処理、遠心、Mouse Genome 430 2.0 Arrayにアプライし、Arrayを回転させながら４５℃のハイブリダイゼーション専用オーブンで１６時間インキュベーションした。サンプルを回収、Arrayを繰り返し洗ってStreptavidin R-Phycoerythrinで染色後にスキャンした。【０１２６】
Array上の転写物（約45,000）のGeneChipシグナル値を比較することで、１Lジャー流加培養１０日目に９００ｍｇ/L以上のMAb1(抗IL-6R抗体；tocilizumab、商品名 アクテムラ)を産生するMAb1(抗IL-6R抗体)強発現 TAUT強発現 CSAD強発現DG44細胞の継代培養細胞において、発現強度が高く且つ発現昂進が著しい転写産物としてマウスゲノム上のｍRNA型ノンコーディングRNAUG_GENE=AI462015（Affymetrix MOUSE430_2, 1420088_AT）を同定した(図１：AI462015転写産物の配列)。【０１２７】
AI462015は437塩基のｍRNA型ノンコーディングRNAであるが、その配列はマウスゲノム１２のNfkBia mRNA ３’側の非翻訳領域近傍（56590831- 56590397）の相補鎖上に存在する。AI462015転写産物が直接にNfkBia mRNAの非翻訳領域に作用して翻訳を阻害する可能性、あるいは437塩基の一部の配列が低分子 RNAとして機能してNfkBia mRNAを分解する可能性が考えられた。【０１２８】
たとえば、AI462015配列中の５’側４０番目のAから９１番目のAを含む５２塩基の配列(AAGTACCAAAATAATTACCAACAAAATACAACATATACAACATTTACAAGAA：配列番号７)は、ラット NfkBia mRNA ３‘側の非翻訳領域(1478-1529, GENE ID: 25493 NfkBia) の相補鎖と一塩基（AI462015中の５’側６１番目のA）を除いて一致しており、さらにはAI462015の４０番目のAから６３番目のAを含む２４塩基の配列(AAGTACCAAAATAATTACCAACAA：配列番号９)は、ヒト NfkBia mRNA ３‘側の非翻訳領域の一部配列（TTGTTGGTAATTATTTTGGTACTT, 1490 - 1513：配列番号２４)の相補鎖でもあることから、５２塩基の一部である19-25塩基がmicroRNAとして、あるいは一部配列がアンチセンスRNAとしてCHO細胞のNfkBia mRNAに作用する可能性が予測された。【０１２９】
さらに、その後のGeneBankの情報更新によって、AI462015の転写産物である437塩基はマウスNfkBia 遺伝子の3’側 非翻訳領域（513塩基）の相補鎖に相当することが明らかになった（図２３）。図２４に示したように、CHO-K1細胞のゲノム配列上にAI462015の相同配列が存在すること(配列番号25：AI462015；配列番号26-27：CHO-K1ゲノム）、さらに、抗体高産生なCHO細胞においてNfkbia の発現抑制（参考例４）がみられたことから、CHO細胞ではAI462015の相同配列が高発現されて機能するものと考えられる。【０１３０】
たとえば、AI462015配列中の５’側７番目のTから９１番目のAを含む８５塩基の配列（図２３と２４の下線部、配列番号２９）(TGTAAAAATCTGTTTAATAAATATACATCTTAGAAGTACCAAAATAATTACCAACAAAATACAACATATACAACATTTACAAGAA)は、ラット NfkBia mRNA ３‘側の非翻訳領域(1478-1562, GENE ID: 25493 NfkBia、配列番号３１) の相補鎖と一塩基（AI462015中の５’側７０番目のA）を除いて一致しており(Matching = 84/85、図２５ｂ)、同様に、ヒト（Matching = 75/85、図２５ａ、配列番号３０）、チンパンジー（Matching = 75/85、図２５ｃ、配列番号３２）、アカゲザル（Matching = 74/85、図２５ｄ、配列番号３３）、ウシ（Matching = 76/85、図２５ｅ、配列番号３４）でも相同性が確認された。よって、この８５塩基（Conserved Sequence 7-91）の一部である19-25塩基がmicroRNAとして、あるいは一部配列がアンチセンスRNAとして種を超えて動物細胞、若しくは哺乳動物細胞に作用すると考えられる。従って、動物培養細胞、好ましくはCHO細胞のような哺乳動物細胞のNfkBia mRNAにも作用することが予測された。【０１３１】
〔参考例２〕抗体高産生細胞において発現昂進された転写産物の同定
参考例１で、MAb1(抗IL-6R抗体；tocilizumab、商品名 アクテムラ)高産生DG44細胞で転写産物AI462015の発現量が昂進されたが（図２）、異なる宿主細胞（CHO-DXB11s）に異なる抗体（MAb2：抗グリピカン３抗体；GC33（WO2006/006693参照））を高産生させた場合も同様にAI462015転写産物の発現昂進がみられた（図３）。【０１３２】
図２に示したように、CHO-DG44細胞にタウリントランスポーター (TauT)遺伝子を強発現させた場合、システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ(CSAD)遺伝子を強発現させた場合（data not shown）、TauTとCSADを共に強発現させた場合、いずれも転写産物AI462015の発現量は同程度であったが、TauTとCSADを共に強発現させた細胞にさらにMab1(抗IL-6レセプター抗体)を強発現させた場合は、AI462015の異常な昂進（宿主細胞の７倍）がみられ、発現量も異常に高いGeneChipシグナル値（10,000以上）を示した。コントロールのGAPDH発現強度は細胞間で同レベルであったことから、転写産物AI462015の発現昂進はMab1抗体高産生細胞に特異的であった。図３も同様であり、CHO-DXB11s細胞にMAb2(抗グリピカン３抗体)遺伝子を強発現させた場合、AI462015配列の発現昂進（TauT, CSAD, AE1強発現細胞の平均値の１３倍）はMAb2抗体高産生細胞に特異的であった。【０１３３】
以上の結果は、シェーカー継代培養３日目で安定増殖している抗体高産生細胞は、AI462015配列を異常に高発現していることを示している。【０１３４】
また、１Ｌジャー培養3日目の生産培養条件下においてもAI462015配列の異常な発現昂進がみられた。図４に示したように１Lジャー流加培養の１０日目に約１２００−１４００ｍｇ/LのMAb1(抗IL-6R抗体)を産生する2種の抗体高産生細胞は5,000以上の高いGeneChipシグナル値を示した。培養条件の違いから、１Lジャー流加培養３日目のシグナル値はシェーカー培養の５０％程度であったが、培養後期１３日目にAI462015配列の発現強度はシェーカー継代培養と同程度にまで昂進され、異常に高いシグナル値を示した（図５）。一方、抗体産生量の低いMAb1強発現DXB11s細胞（加水分解物無添加のシェーカー培養７日目で300mg/L以下、加水分解物添加でも500mg/L以下）は、高産生化に寄与する加水分解物（Hy-Fish、Procine Lysate）を添加した条件でも、１Ｌジャー培養3日目の AI462015配列の発現昂進はみられなかった（図６）。【０１３５】
図２で高いシグナル値を示したMAb1強発現TauT強発現CSAD強発現DG44細胞の抗体産生量が高かったこと（加水分解物無添加のシェーカー培養７日目で640mg/L）、図３で高いシグナル値を示したMAb2強発現DXB11s細胞の抗体産生量が高かったこと(加水分解物無添加のシェーカー培養７日目で640mg/L）、図６で抗体高産生化に寄与する加水分解物を加えた場合もシグナル値が昂進されなかった実験結果に基づいて、「AI462015配列の発現量が高い細胞は抗体産生ポテンシャルが高い」と考えられた。【０１３６】
〔参考例３〕APES強発現による抗体産生細胞の高産生化例
AI462015配列発現量の高さが抗体産生ポテンシャルの高さと相関することを示すため、図６で抗体産生ポテンシャルの低かったMAb1強発現DXB11s細胞にAI462015配列の一部を発現するプラスミドを導入し、強発現させて抗体産生ポテンシャルを比較した。【０１３７】
マウスゲノム由来の転写産物AI462015(図１、437塩基) 配列の一部（Affymetrix GeneChipのAI462015 Probe Sequenceを含む）5’側4番目のGから3’末端のTまでをAPES434、5’側4番目のGから168番目のCまでをAPES165と命名して、２種類の発現ユニットを作成した（APESとはAntibody Production Enhancing Sequenceの略称）。Kozak配列を加えた発現ユニットを合成することで、ＣＭＶプロモーター下で高発現するpHyg-APES434（図７）、 pHyg-APES165（図８）、pHyg-null（図９）を構築した。【０１３８】
Amaxa社（現、LONZA社） 遺伝子導入システムNucleofectorによって、図６の抗体低産生株の MAb1強発現DXB11s細胞に発現プラスミドを導入し、９６ウェルプレート上でHygromycin(200μg/ml) を含む選択培地存在下で高増殖だった全細胞株を選抜し、２４ウェルプレート拡大後に抗体産生量を比較した。選抜された株数はそれぞれpHyg-APES434（N＝38）, pHyg-APES165（N＝60）、pHyg-null（N＝11）であり、それらの株数はAPES強発現プラスミド導入によるポジティブ効果を期待させた。１mＬ継代培地を含む24ウェルプレートでの静置培養は、培養13日目に細胞増殖がみられなかったので、抗体産生量および細胞数を測定した。抗体産生量の平均値はpHyg-APES434（44.3 mg/L）、 pHyg-APES165（41.2 mg/L）、pHyg-null（21.9 mg/L）、細胞数（平均値）はpHyg-APES434（9.27x105cells/mL）、 pHyg-APES165（11.39x105 cells/mL）、pHyg-null（7.76x105cells/mL）であり、pHyg-APES434、 pHyg-APES165導入細胞は共にコントロールのpHyg-nullに対して統計的に優位であった（t検定  P< 0.001, 図１０）。【０１３９】
以上の結果は、AI462015転写産物の5’側165bpを含む核酸配列（例えば配列番号２のDNAの転写産物であるAPES165、又は配列番号３のDNAの転写産物であるAPES434）を強発現させると、細胞の抗体産生ポテンシャルが上がったことを示している。【０１４０】
〔参考例４〕抗体高産生ＣＨＯ細胞におけるNfkBiaの発現抑制
参考例１で述べたように、AI462015配列はマウスゲノム１２のNfkBia 遺伝子の３’側の非翻訳領域近傍（3’側78bp）の相補鎖上に存在すること、AI462015配列に含まれる２２塩基(AAGTACCAAAATAATTACCAAC：配列番号10)はヒトNfkBia 遺伝子の３’側非翻訳領域（1492-1513）の相補鎖と同一配列であり、さらにラット、アカゲザル、イヌ、ウマなど種を超えて保存されていることからmicroＲＮＡとしてＲＮＡ干渉してNfkBia mRNAを分解する可能性があること、あるいはAI462015発現を定量できるAFFYMETRIX社のオリゴヌクレオチドアレイ（Affymetrix MOUSE430_2）上の特異的プローブ配列領域（CATATACAACATTTACAAGAAGGCGACACAGACCTTAGTTGG：配列番号16）42bpの前半部分に相当する5’側71番目のCからの２１塩基（CATATACAACATTTACAAGAA：配列番号15）がラットNfkBia mRNAの1478から1498塩基目の相補配列であることから、AI462015配列由来の核酸分子がNfkBia mRNA にRNA干渉し、発現を抑制することで抗体高産生CHO細胞のホメオスタシスを維持する可能性が考えられた（ノックアウトマウスのlethality はpostnatal）。（注記：後に、AI462015の転写産物はマウスNfkBia 遺伝子の3’側513塩基の非翻訳領域の相補鎖に相当することが判明した。参考例８参照。また、マウスGeneChipで定量されたAI462015の71番目から112番目の配列(配列番号16)はＣＨＯ細胞での転写産物として確認された。）【０１４１】
そこで、抗体産生ポテンシャルが高かったAI462015高発現細胞でのNfkBia mRNA 発現量を定量し、その発現が抑制されていることを確認することにした。【０１４２】
CHO細胞のNfkBia mRNA配列は未知であったため、マウスとラットのアミノ酸コード領域（共に942塩基：314アミノ酸）で保存されている配列からプローブ（ 5’ACTTGGTGACTTTGGGTGCT、 5’GCCTCCAAACACACAGTCAT ）(配列番号17、18)を設計して３２５bpのPCR産物を得た。 PCRクローニングされた３２５bp は、その配列相同性からCHO細胞由来NfkBia mRNAの一部配列であると考えられる（図１１）。【０１４３】
Mouse Genome 430 2.0 Array（参考例１）では、そのプローブ配列がCHO細胞の種特異的配列に相当するためなのか、NfkBia mRNA発現を定量できなかったが、３２５bp PCR産物量を比較すると、抗体を産生させていない遺伝子強発現細胞（レーン１，２）に対して、AI462015配列の発現が昂進された抗体高産生細胞（レーン３，４）ではNfkBia mRNA発現が抑制されていた。さらに、３２５bp の一部の配列を定量可能なTaqMan Probe Set（図１２）を設計し、RT-PCR法で定量すると、抗体高産生細胞では、抗体を産生させていない細胞の約５０％にまでNfkBia mRNA発現が抑制されていた（図１３）。【０１４４】
以上から、抗体高産生細胞ではNfkBia mRNAの発現が抑制されており、その結果、抗体産生ポテンシャルが上がると考えられる。実際、われわれが抗体遺伝子発現に用いている発現プラスミドのプロモーター/エンハンサー領域には 複数個以上のNfkB結合部位が存在しており（図１４：マウスMCMV IE2プロモーター上のNfkB結合部位）、それらのエンハンサー領域は抗体遺伝子の高発現に必須の領域であることから、NfkBia発現抑制によって活性化されたNfkBが核内に移行し、プロモーター活性が増強されることが、抗体高産生の一因であると考えられる。【０１４５】
〔参考例５〕抗体高産生ＣＨＯ細胞で亢進されているmicroRNAの解析
microRNAを解析するために、図１５に示したようにMir-XTMmiRNA First-Strand Sythesis Kit (Clontech)を用いて、継代培養中のMAb1(抗IL-6R抗体)高産生DXB11s細胞とMAb1(抗IL-6R抗体)高産生TAUT強発現DXB11s細胞、さらに抗体遺伝子導入前のDXB11s宿主細胞から調製したsmall RNAの３’側にpoly(A)タグを付加したのち、オリゴｄTを３’側にPCRプライマー配列（ｍRQ  ３’Primer）を５’側にもつアダプターをプライミングして一次鎖ｃDNAを合成した。得られたｃDNAを鋳型にして、mRQ 3’ primer   と 予想されたAPES配列由来のmicroRNA-specific Primer（APES 40-61  5’ primer, あるいは APES 71-91  5’ primer）、さらに ポジティブコントロールのU6 snRNA    5’ primerを用いてｑPCR反応(95℃ 5sec, 60℃ 20sec, 30cycles)をおこなった。PCR反応液は、精製後、３％アガロースゲルで電気泳動した。図１６に示したように、APES 40-61  5’ primerとU6 snRNA 5’ primerによるPCR反応で目的の大きさのバンドがみられた。レーン1,2,3で示したように、APES 40-61(AAGTACCAAAATAATTACCAAC：配列番号10)２２塩基がMAb1（抗IL-6R抗体) 高産生細胞中で高発現していた。ポジティブコントロールのU6 snRNA（レーン4）の発現量はいずれの細胞においても同レベルであったこと、またAPES 71-91（CATATACAACATTTACAAGAA：配列番号１５）の存在は確認されなかったことから(data not shown)、種を超えて配列が保存されているAPES 40-61（２２塩基）がmicroRNAとして抗体高産生化に寄与すると考えられた。【０１４６】
〔参考例６〕APES強発現による抗体産生用宿主細胞の高増殖化例
抗体産生用宿主細胞DXB11/TAUTから、１Lジャー流加培養１４日目に３．９ｇ/LのMAb1(抗IL-6R抗体)を産生する抗体高産生細胞（DXB11/TAUT/MAb1）が得られ、ＴＡＵＴの生存率維持能によって培養３１日目に８．１ｇ/Lを産生したが、実生産を考慮して培養１４日目に高産生にするには、細胞最高到達密度（4.1 x10e6 cells/mL）を増加させる必要があった。APES強発現によるNfkbia mRNAの発現抑制（参考例４）がNfkbの活性化を促進するのであれば、増殖関連遺伝子の発現が亢進されるため、細胞最高到達密度は上がる可能性がある。APESと同様に抗体高産生化に寄与したALT1の共発現用プラスミドをそれぞれ(pPur-APES165, pPur-ALT1, 図１７)、上記抗体高産生細胞DXB11/TAUT/MAb1（親株）に導入して高増殖な上位３株ずつを選抜し、シェーカー流加培養をおこなうと、ＡＰＥＳ１６５強発現細胞の細胞最高到達密度の平均値は(11.5±1.7)x10e6 cells/mLであり、ＡＬＴ１強発現細胞の(8.9±1.8) x10e6 cells/mL以上に高増殖な細胞が得られた。さらにシェーカー流加培養１４日目の抗体産生量の平均値は、ＡＰＥＳ強発現細胞：４．４±0.6 g/L, ＡＬＴ１強発現細胞：４．０±0.6 g/Lと導入前のDXB11/TAUT/MAb1細胞：３.４g/L以上に高くなったことから、ＡＰＥＳ強発現効果はＴＡＵＴ強発現効果に独立してポジティブに作用することが示された（図１８）。APES強発現による正の効果は１L-Jar流加培養において顕著であり、それぞれシェーカー流加培養での高増殖細胞を比較すると、ＡＰＥＳ強発現株は最も高増殖で、培養１２日目で５．３g/Lと親株の３．２g/L, ＡＬＴ１強発現株４．４g/Lに対して短期間培養で高産生である長所が示された（図１９）。以上の結果に基づき、抗体産生用宿主細胞DXB11/TAUTをより高増殖な宿主細胞に改変することにし、ＡＰＥＳ１６５強発現宿主DXB11/TAUT/APESを作成した。DXB11/TAUT宿主にpPur-APES165をエレクトロポレーション法で遺伝子導入し、薬剤選抜後に生存率、増殖ともに良好であった宿主候補の９株について、継代培養時のAPES snRNA (small non-coding RNA)発現量を定量した。APES発現量の高かったDXB11/TAUT/APES宿主候補株は培養時の生細胞密度が高く、相関（Ｒ２＝０．７０）が示された(図２０)。【０１４７】
〔参考例７〕APES強発現による抗体産生細胞の高産生化例２
参考例３と同様に、MAb1強発現DXB11s細胞にAI462015転写産物の5’側の部分配列を発現するプラスミドを導入し、抗体産生ポテンシャルを比較した。【０１４８】
APES4-168（APES165）に加えて、さらにその一部配列からなるAPES4-68（配列番号５）およびAPES69-133（配列番号６）の発現ユニットを作成して、細胞の抗体産生ポテンシャルを検討した。空ベクター強発現(null)に対して APES 4-68は p<0.05, APES69-133は p<0.01の有意差で抗体高産生でとなった（t検定  P< 0.001、 図２１）。【０１４９】
参考例３および本参考例において同定された、APES活性を有する部分配列が、それぞれ、マウスAI462015転写産物のどの領域に相当するのかを図２２に示した。APES活性を示した部分配列はNfkbia相補配列を２３塩基以上含んでいる。【０１５０】
本発明は、あらゆる抗体等の組換えポリペプチド産生細胞へ応用可能である。【０１５１】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１（ａ）】
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【図２５−１（ｂ）】
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【図２５−２（ｃ）】
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【図２５−２（ｄ）】
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【図２５−３（ｅ）】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図１１】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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