(57)【要約】  検出標的核酸（例えば、変異型遺伝子）を高感度・高精度に検出でき、かつ簡便で低コストである検査手法を提供する。  核酸増幅反応において、下記一般式（Ｉ）： 2014051076.tif 000033（式中の記号は明細書中で定義される通りである。）等で表される各種ヌクレオシド類縁体の単位構造の１種以上を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩をクランプ核酸として用いて検査試料中の検出非標的核酸（例えば、野生型遺伝子）の増幅を阻害することにより、検出標的核酸を選択的に増幅させること、および増幅された核酸を検出することを含む方法。
2014051076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査試料において、対象核酸中の検出標的部位における塩基配列の相違を有する標的核酸を検出するための方法であって、該標的核酸は検出非標的核酸に対する塩基配列の相違を少なくとも１つ有する検出標的核酸であり、
検出非標的核酸における該検出標的部位の塩基配列に相補的な塩基配列を有するクランプ核酸を用いる核酸増幅法によって、検査試料中の検出標的核酸における該検出標的部位の少なくとも一部を含む領域を選択的に増幅させる工程、および
増幅された核酸を検出する工程
を含み、クランプ核酸が、下記一般式（Ｉ）：
【化１】
2014051076.tif 000025
（式中、
Ｂａｓｅは、置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基を示し、
Ｒ１は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、または機能性分子ユニット置換基を示し、
ｍは０〜２の整数であり、かつ
ｎ１は、１〜３の整数である。）、
または、下記一般式（ＩＩ）：
【化２】
2014051076.tif 000026
（式中、
Ｂａｓｅは上記と同義であり、
Ａは、直接結合、炭素数１〜４のアルキレン基、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−（ここで、酸素原子は４’位のメチレン基と結合しており、ｎ２は１〜３の整数を示す。）、または−Ｎ（Ｒ３）−（ＣＨ２）ｎ３−（ここで、窒素原子は４’位のメチレン基と結合しており、ｎ３は１〜３の整数を示す。）を示し、
Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アラルキル基、アリール基、アシル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、または、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、炭素数１〜６のシアノアルコキシ基、または、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基を示す。］を示す。）、または、下記一般式（ＩＩＩ）：
【化３】
2014051076.tif 000027
（式中、Ｂａｓｅは上記と同義である。）、
または、下記一般式（ＩＶ）：
【化４】
2014051076.tif 000028
（式中、Ｂａｓｅは上記と同義である。）
で表されるヌクレオシド類縁体の単位構造の１種以上を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体（但し、オリゴヌクレオチド類縁体中の各ヌクレオシド類縁体間の結合形態は、リン酸ジエステル結合以外にホスホロチオアート結合を１または２個以上含有していてもよく、また、前記の単位構造の1種以上を２個以上含有する場合は、当該構造間でＢａｓｅは同一または異なることができる。）またはその塩である、方法。
【請求項２】
クランプ核酸が、上記の一般式（Ｉ）において、
Ｂａｓｅが、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１〜５のアルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、アミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基、炭素数１〜５のアルキル基、およびハロゲン原子からなる群から選択される置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基であり、
Ｒ１が、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、ベンジル基、アセチル基、ベンゾイル基、メタンスルホニル基、またはｐ−トルエンスルホニル基であり、
ｍが０〜２の整数であり、かつ
ｎ１が、１〜３の整数である
ヌクレオシド類縁体の単位構造の１種以上を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
クランプ核酸が、上記の一般式（Ｉ）において、
Ｂａｓｅが、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１〜５のアルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、アミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基、炭素数１〜５のアルキル基、およびハロゲン原子からなる群から選択される置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基であり、
Ｒ１がメチル基であり、
ｍが０であり、かつ
ｎ１が１である
ヌクレオシド類縁体の単位構造の１種以上を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
クランプ核酸の長さが、５〜３０ｍｅｒである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
核酸増幅法がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＰＣＲ法がリアルタイムＰＣＲ法である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
リアルタイムＰＣＲ法が検出用プローブを用いて行われ、検出用プローブは、検出標的部位における塩基配列の相違を検出すべき領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸であり、かつ一方の末端が蛍光基で置換され、他方の末端が消光基で置換されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
検出用プローブが、上記の一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）（各一般式中の記号は上記と同義である。）のいずれか１つで表されるヌクレオシド類縁体の単位構造の１種以上を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
検出非標的核酸と検出標的核酸との間の塩基配列の相違が、置換、挿入、欠失、逆位、重複および転座からなる群から選択される１つ以上の変異またはそれらの組み合わせに起因するものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
増幅された核酸を検出する工程が、増幅産物の配列決定を行うことを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
対象核酸が遺伝子であって、かつ検出の対象とする該遺伝子の塩基配列の相違が、特定の疾患の発症および／または治療感受性に関連するものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
検査試料において、対象核酸中の検出標的部位における塩基配列の相違を有する標的核酸を検出するためのキットであって、該標的核酸は検出非標的核酸に対する塩基配列の相違を少なくとも１つ有する検出標的核酸であり、
（ａ）検出非標的核酸における該検出標的部位の塩基配列に相補的な塩基配列を有するクランプ核酸、および、
（ｂ）検査試料中の検出標的核酸における該検出標的部位の少なくとも一部を含む領域を選択的に増幅させるための試薬
を含み、クランプ核酸が、下記一般式（Ｉ）：
【化５】
2014051076.tif 000029
（式中、
Ｂａｓｅは、置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基を示し、
Ｒ１は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、または機能性分子ユニット置換基を示し、
ｍは０〜２の整数であり、かつ
ｎ１は、１〜３の整数である。）、
または、下記一般式（ＩＩ）：
【化６】
2014051076.tif 000030
（一般式（ＩＩ）中、
Ｂａｓｅは上記と同義であり、
Ａは、直接結合、炭素数１〜４のアルキレン基、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−（ここで、酸素原子は４’位のメチレン基と結合しており、ｎ２は１〜３の整数を示す。）、または−Ｎ（Ｒ３）−（ＣＨ２）ｎ３−（ここで、窒素原子は４’位のメチレン基と結合しており、ｎ３は１〜３の整数を示す。）を示し、
Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アラルキル基、アリール基、アシル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、または、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、炭素数１〜６のシアノアルコキシ基、または、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基を示す。］を示す。）、または、下記一般式（ＩＩＩ）：
【化７】
2014051076.tif 000031
（式中、Ｂａｓｅは上記と同義である。）、
または、下記一般式（ＩＶ）：
【化８】
2014051076.tif 000032
（式中、Ｂａｓｅは上記と同義である。）
で表されるヌクレオシド類縁体の単位構造の１種以上を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体（但し、オリゴヌクレオチド類縁体中の各ヌクレオシド類縁体間の結合形態は、リン酸ジエステル結合以外にホスホロチオアート結合を１または２個以上含有していてもよく、また、前記の単位構造の1種以上を２個以上含有する場合は、当該構造間でＢａｓｅは同一または異なることができる。）またはその塩である、キット。
【請求項１３】
クランプ核酸が、上記の一般式（Ｉ）において、
Ｂａｓｅが、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１〜５のアルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、アミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基、炭素数１〜５のアルキル基、およびハロゲン原子からなる群から選択される置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基であり、
Ｒ１が、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、ベンジル基、アセチル基、ベンゾイル基、メタンスルホニル基、またはｐ−トルエンスルホニル基であり、
ｍが０〜２の整数であり、かつ
ｎ１が、１〜３の整数である
ヌクレオシド類縁体の単位構造の１種以上を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩である、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
クランプ核酸が、上記の一般式（Ｉ）において、
Ｂａｓｅが、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１〜５のアルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、アミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基、炭素数１〜５のアルキル基、およびハロゲン原子からなる群から選択される置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基であり、
Ｒ１がメチル基であり、
ｍが０であり、かつ
ｎ１が１である
ヌクレオシド類縁体の単位構造の１種以上を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩である、請求項１２または１３に記載のキット。
【請求項１５】
クランプ核酸の長さが、５〜３０ｍｅｒである、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
前記（ｂ）の試薬が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用の増幅プライマーを含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７】
前記（ｂ）の試薬が、リアルタイムＰＣＲ用の試薬を更に含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
リアルタイムＰＣＲ法が検出用プローブを用いて行われ、検出用プローブは、検出標的核酸における塩基配列の相違を検出すべき領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸であり、かつ一方の末端が蛍光基で置換され、他方の末端が消光基で置換されている、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
検出用プローブが、上記の一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）（各一般式中の記号は上記と同義である。）のいずれか１つで表されるヌクレオシド類縁体の単位構造の１種以上を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
検出非標的核酸と検出標的核酸との間の塩基配列の相違が、置換、挿入、欠失、逆位、重複および転座からなる群から選択される１つ以上の変異またはそれらの組み合わせに起因するものである、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】
対象核酸が遺伝子であって、かつ検出の対象とする該遺伝子の塩基配列の相違が、特定の疾患の発症および／または治療感受性に関連するものである、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の塩基配列の相違の検出方法およびそのためのキットに関する。より具体的には、本発明は、核酸増幅技術においてクランプ核酸を用いる塩基配列の相違の検出方法およびそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生殖細胞における先天的な遺伝子変異とともに体細胞における遺伝子の後天的な変異は、ある種の病気の罹りやすさ、薬の治療効果、副作用の強弱などに大きく関与する場合がある。癌細胞では体細胞レベルでの様々な遺伝子の変異が生じ、その変異が癌の引き金になったり、分子標的薬の奏効率に大きな影響を与えたりする。例えば、非小細胞肺癌においてＥＧＦＲ遺伝子に変異があると分子標的薬の一種であるゲフィチニブ（商品名イレッサ）の奏効率が高く、変異がないと奏効率が低い。また、大腸癌においては、ＫＲＡＳ遺伝子に変異があると分子標的薬セツキシマブ（商品名アービタックス）の奏効率は低く、変異がないと奏効率が高い。そのため、これらの病気での分子標的薬治療をする際には、事前に当該遺伝子の変異の有無を検査することが求められるようになってきている。【０００３】
体細胞での検出標的核酸（変異型遺伝子）を検出する手法は大別して二つあり、その一つは、変異型遺伝子と検出非標的核酸（野生型遺伝子）を非選択的に増幅したのちに、変異型遺伝子を野生型遺伝子と区別して検出する方法である。この検出方法としては、電気泳動を利用する方法、ハイブリダイゼーションを利用する各種方法等がある（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、ほとんどの方法において、野生型遺伝子中に含まれるごく少量の変異型遺伝子を十分な感度や精度で検出することは困難である。例えば、変異型遺伝子検出の一般的な方法として、ジデオキシシークエンシング法がある。ジデオキシシークエンシング法は、単独で存在する変異型遺伝子を比較的高感度で検出することが可能であるものの、変異型遺伝子が野生型遺伝子中に微量混在する場合に、変異遺伝子の混在率は１０％程度でないと検出できない。また、パイロシークエンシング法では、ジデオキシシークエンシング法より優れているものの、その検出感度は５％程度と報告されている（例えば、非特許文献２参照）。さらに、変異型と野生型遺伝子の混合試料をＰＣＲにより増幅し、その増幅産物の二本鎖ＤＮＡの融解曲線を求め、変異型遺伝子と野生型遺伝子の融解曲線の違いから変異型遺伝子の割合を求める方法が開発されている。しかしながらこの方法でも、野生型遺伝子中に含まれる変異型遺伝子の検出感度は５％程度である（例えば、非特許文献３参照）。【０００４】
体細胞の変異型遺伝子を検出するもう一つの方法は、遺伝子増幅の段階で野生型遺伝子と変異型遺伝子を区別する方法であり、具体的には、変異型遺伝子のみを選択的に増幅する方法である。【０００５】
例えば、野生型遺伝子のみを制限酵素を用いて切断し、切断されていない変異型遺伝子のみを増幅する“ｍｕｔａｎｔ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ＰＣＲ”と呼ばれる方法がある（例えば、非特許文献４）。この方法では、変異型遺伝子を増幅する反応を繰り返すことにより、野生型遺伝子１０６分子中の１分子の変異型遺伝子を検出できるとされている（例えば、非特許文献５参照）。この方法はこのように高感度という点では優れているが、操作は非常に煩雑であり、一般の診断に適用できる方法ではない。【０００６】
また、ＰＣＲ等におけるプライマーの伸張反応において、一塩基の違いを区別して増幅する方法が開発されている。この方法は、“ＡＲＭＳ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）”（例えば、非特許文献６参照）、“ＡＳＰＣＲ（ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）”（例えば、非特許文献７参照）等と呼ばれている。この方法は、比較的高感度であり、更に一般的なＰＣＲの増幅反応以外の操作を必要とせず、反応の全てを閉鎖系で行うことができ、かつ非常に簡便であり、コンタミネーションのない優れた方法である。しかしながら、一度でも一塩基識別を誤って野生型遺伝子を増幅した場合、以後の増幅反応において、変異型遺伝子の増幅と同じように野生型遺伝子も増幅されてしまうため、偽陽性の危険が高い方法とも言える。この方法を用いる場合、反応条件、即ち反応温度や塩濃度等を厳密に制御する必要があり、また鋳型量も厳密に同じにする必要があり（例えば、非特許文献１参照）、不特定多数の検体を検査する臨床検査や、高い精度が要求される診断には不向きである。【０００７】
更に、ＰＣＲ等の核酸増幅技術において、塩基の相違を区別して増幅する方法の別法として、野生型遺伝子と完全相補構造の適当な種類と長さの人工的なオリゴヌクレオチドを用いて野生型遺伝子の増幅を阻害する技術、いわゆる「クランプ法」がある。クランプ核酸の素材としては、核酸増幅過程で（ｉ）野生型遺伝子と強くハイブリダイズする、（ｉｉ）変異型遺伝子とは強くハイブリダイズしない、（ｉｉｉ）核酸増幅過程で分解されにくい、ことが要求される。従って、天然素材のＤＮＡ、ＲＮＡはハイブリダイズ能および分解抵抗性の点で不向きであり、このクランプ技術のクランプ核酸の素材として、peptide nucleic acid (ＰＮＡ) やlocked nucleic acid (ＬＮＡ) の人工核酸が専ら用いられている（例えば、非特許文献８〜１１および特許文献１、２参照）。【０００８】
ＰＮＡは完全修飾型として通常利用する人工核酸で、相補構造のＤＮＡ鎖とのハイブリダイズ能が天然ＤＮＡよりも強く、１塩基ミスマッチ配列のＤＮＡ鎖とのハイブリダイズ能との差も良好で、しかも核酸分解酵素による分解を受けない、ことからクランプ核酸として望ましい特性を有している。それゆえ、様々な遺伝子の様々な変異を解析・検出するためのクランプ核酸に多用されている。一方、ＬＮＡは部分修飾型として利用する人工核酸で、１ユニット修飾するごとにハイブリダイズ能が飛躍的に強まるため、適当なハイブリダイズ能を獲得するために、長さと修飾モードとで調整できる。従って比較的短いＬＮＡオリゴヌクレオチドでクランプ効果を発揮させることが可能となる。【０００９】
しかしながら、上記のクランプ核酸にはそれぞれ難点がある。ＰＮＡは、「ハイブリダイズ能が天然ＤＮＡよりも高い」とはいえ、その程度は限られており、良好なハイブリダイズ能を獲得して十分なクランプ効果を発揮させるためには、クランプ核酸を長くする必要性がある。また、ＬＮＡは、ハイブリダイズ能においては全く問題ないものの、核酸分解酵素に対する抵抗力がさほど強くないため、増幅過程における化学的安定性に問題があり、総合的にはクランプ能に秀でているとは言い難い。【００１０】
本発明者らは、架橋構造型の新規人工核酸（第１世代ＢＮＡ）である2’,4’-BNA（ＬＮＡ）の開発(例えば、特許文献３)以降、3’-amino-2’,4’-BNA、5’-amino-2’,4’-BNA、2’,4’-BNACOC、2’,4’-BNANCなどの第２世代以降のＢＮＡ類（例えば、特許文献４〜７）を開発してきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許第４２１６２６６号公報
【特許文献２】特開２００６−３０４６１１号公報
【特許文献３】特許第３７５６３１３号公報
【特許文献４】特許第４７３１３２４号公報
【特許文献５】特許第４３８３１７８号公報
【特許文献６】特許第５０３０９９８号公報
【特許文献７】特許第４１５１７５１号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ノラウ（Nollau）ら、クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry）、１９９７年、第４３巻、第１１１４〜１１２８ページ
【非特許文献２】オギノ（Ogino）ら、ザ・ジャーナル・オブ・モレキュラー・ダイアグノスティックス（The Journal of Molecular Diagnostics）、２００５年、第７巻、第４１３〜４２１ページ
【非特許文献３】クリプィ（Krypuy）ら、ビーエムシー・キャンサー（BMC Cancer）、２００６年、第６巻、第２９５ページ
【非特許文献４】チェン（Chen）ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical biochemistry）、１９９１年、第１９５巻、第５１〜５６ページ
【非特許文献５】ジャコブソン（Jacobson）ら、オンコジーン（Oncogene）、１９９４年、第９巻、第５５３〜５６３ページ
【非特許文献６】ニュートン（Newton）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic acids research）、１９８９年、第１７巻、第２５０３〜２５１６ページ
【非特許文献７】ウ（Wu）ら、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、１９８９年、第８６巻、第２７５７〜２７６０ページ
【非特許文献８】セネカウ（Senescau）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー（Journal of Clinical Microbiology）、２００５年、第４３巻、第３３０４〜３３０８ページ
【非特許文献９】荒木（Araki）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・ダイアグノスチックス（Journal of Molecular Diagnostics）、２０１０年、第１２巻、第１１８〜１２４ページ
【非特許文献１０】チョウ（Chiou）ら、ネーチャー・プロトコル（Nature Protocol）、２００７年、第１巻、第２６０４〜２６１２ページ
【非特許文献１１】ノルジャード（Nordgard）ら、ダイアグノスチック・モレキュラー・パソロジー（Diagnostic Molecular Pathology）、２０１２年、第２１巻、第９〜１３ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上述した当該技術分野の現状を鑑みて為されたものであり、大部分が野生型遺伝子である中に変異型遺伝子が極微量しか含まれていない検査試料からでも変異型遺伝子の有無や変異様式を高感度、高精度に検出でき、かつ簡便で低コストである検査手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、各種の検査手法の中で特にクランプ法に着目した。本発明者らは更に、クランプ核酸として第２世代以降のＢＮＡ類を使用することを着想し、野生型遺伝子と変異型遺伝子を様々な既知の割合で含有するモデル検査試料を対象にして実験を行った。その結果、第２世代以降のＢＮＡ類をクランプ核酸として用いることで、検査試料において大量の野生型遺伝子中に変異型遺伝子がごく少量しか含まれていない場合であっても、変異型遺伝子を高選択的に増幅させることができ、具体的には変異型遺伝子が０．１〜１％程度しか存在しない場合であっても、その存在を容易に検出できることが分かった。更に、標的の変異型遺伝子増幅産物を選択的に捕捉する検出用プローブを併用することで、変異型遺伝子の検出感度の更なる向上（０．０１％程度の検出感度）が達成できることを本発明者らは見出した。本発明者らはこれらの知見に基づいて更に研究を行い、本発明を完成するに至った。【００１５】
本発明は即ち、以下を提供する。
［１］検査試料において、対象核酸中の検出標的部位における塩基配列の相違を有する標的核酸を検出するための方法であって、該標的核酸は検出非標的核酸に対する塩基配列の相違を少なくとも１つ有する検出標的核酸であり、
検出非標的核酸における該検出標的部位の塩基配列に相補的な塩基配列を有するクランプ核酸を用いる核酸増幅法によって、検査試料中の検出標的核酸における該検出標的部位の少なくとも一部を含む領域を選択的に増幅させる工程、および
増幅された核酸を検出する工程
を含み、クランプ核酸が、下記一般式（Ｉ）：【００１６】
【化１】
2014051076.tif 000003
【００１７】
（式中、
Ｂａｓｅは、置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基を示し、
Ｒ１は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、または機能性分子ユニット置換基を示し、
ｍは０〜２の整数であり、かつ
ｎ１は、１〜３の整数である。）、
または、下記一般式（ＩＩ）：【００１８】
【化２】
2014051076.tif 000004
【００１９】
（式中、
Ｂａｓｅは上記と同義であり、
Ａは、直接結合、炭素数１〜４のアルキレン基、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−（ここで、酸素原子は４’位のメチレン基と結合しており、ｎ２は１〜３の整数を示す。）、または−Ｎ（Ｒ３）−（ＣＨ２）ｎ３−（ここで、窒素原子は４’位のメチレン基と結合しており、ｎ３は１〜３の整数を示す。）を示し、
Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アラルキル基、アリール基、アシル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、または、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、炭素数１〜６のシアノアルコキシ基、または、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基を示す。］を示す。）、または、下記一般式（ＩＩＩ）：【００２０】
【化３】
2014051076.tif 000005
【００２１】
（式中、Ｂａｓｅは上記と同義である。）、
または、下記一般式（ＩＶ）：【００２２】
【化４】
2014051076.tif 000006
【００２３】
（式中、Ｂａｓｅは上記と同義である。）
で表されるヌクレオシド類縁体の単位構造の１種以上を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体（但し、オリゴヌクレオチド類縁体中の各ヌクレオシド類縁体間の結合形態は、リン酸ジエステル結合以外にホスホロチオアート結合を１または２個以上含有していてもよく、また、前記の単位構造の１種以上を２個以上含有する場合は、当該構造間でＢａｓｅは同一または異なることができる。）またはその塩である、方法。
［２］クランプ核酸が、上記の一般式（Ｉ）において、
Ｂａｓｅが、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１〜５のアルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、アミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基、炭素数１〜５のアルキル基、およびハロゲン原子からなる群から選択される置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基であり、
Ｒ１が、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、ベンジル基、アセチル基、ベンゾイル基、メタンスルホニル基、またはｐ−トルエンスルホニル基であり、
ｍが０〜２の整数であり、かつ
ｎ１が、１〜３の整数である
ヌクレオシド類縁体の単位構造の１種以上を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩である、上記［１］に記載の方法。
［３］クランプ核酸が、上記の一般式（Ｉ）において、
Ｂａｓｅが、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１〜５のアルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、アミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基、炭素数１〜５のアルキル基、およびハロゲン原子からなる群から選択される置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基であり、
Ｒ１がメチル基であり、
ｍが０であり、かつ
ｎ１が１である
ヌクレオシド類縁体の単位構造の１種以上を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩である、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］クランプ核酸の長さが、５〜２５ｍｅｒである、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］核酸増幅法がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法である、上記［１］〜［４］のいずれか１つに記載の方法。
［６］ＰＣＲ法がリアルタイムＰＣＲ法である、上記［５］に記載の方法。
［７］リアルタイムＰＣＲ法が検出用プローブを用いて行われ、検出用プローブは、検出標的部位における塩基配列の相違を検出すべき領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸であり、かつ一方の末端が蛍光基で置換され、他方の末端が消光基で置換されている、上記［６］に記載の方法。
［８］検出用プローブが、上記の一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）（各一般式中の記号は上記と同義である。）のいずれか１つで表されるヌクレオシド類縁体の単位構造の１種以上を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩である、上記［７］に記載の方法。
［９］検出非標的核酸と検出標的核酸との間の塩基配列の相違が、置換、挿入、欠失、逆位、重複および転座からなる群から選択される１つ以上の変異またはそれらの組み合わせに起因するものである、上記［１］〜［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１０］増幅された核酸を検出する工程が、増幅産物の配列決定を行うことを含む、上記［１］〜［９］のいずれか１つに記載の方法。
［１１］対象核酸が遺伝子であって、かつ検出の対象とする該遺伝子の塩基配列の相違が、特定の疾患の発症および／または治療感受性に関連するものである、上記［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］検査試料において、対象核酸中の検出標的部位における塩基配列の相違を有する標的核酸を検出するためのキットであって、該標的核酸は検出非標的核酸に対する塩基配列の相違を少なくとも１つ有する検出標的核酸であり、
（ａ）検出非標的核酸における該検出標的部位の塩基配列に相補的な塩基配列を有するクランプ核酸、および、
（ｂ）検査試料中の検出標的核酸における該検出標的部位の少なくとも一部を含む領域を選択的に増幅させるための試薬
を含み、クランプ核酸が、下記一般式（Ｉ）：【００２４】
【化５】
2014051076.tif 000007
【００２５】
（式中、
Ｂａｓｅは、置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基を示し、
Ｒ１は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、または機能性分子ユニット置換基を示し、
ｍは０〜２の整数であり、かつ
ｎ１は、１〜３の整数である。）、
または、下記一般式（ＩＩ）：【００２６】
【化６】
2014051076.tif 000008
【００２７】
（式中、
Ｂａｓｅは上記と同義であり、
Ａは、直接結合、炭素数１〜４のアルキレン基、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−（ここで、酸素原子は４’位のメチレン基と結合しており、ｎ２は１〜３の整数を示す。）、または−Ｎ（Ｒ３）−（ＣＨ２）ｎ３−（ここで、窒素原子は４’位のメチレン基と結合しており、ｎ３は１〜３の整数を示す。）を示し、
Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アラルキル基、アリール基、アシル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、または、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、炭素数１〜６のシアノアルコキシ基、または、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基を示す。］を示す。）、または、下記一般式（ＩＩＩ）：【００２８】
【化７】
2014051076.tif 000009
【００２９】
（式中、Ｂａｓｅは上記と同義である。）、
または、下記一般式（ＩＶ）：【００３０】
【化８】
2014051076.tif 000010
【００３１】
（式中、Ｂａｓｅは上記と同義である。）
で表されるヌクレオシド類縁体の単位構造の１種以上を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体（但し、オリゴヌクレオチド類縁体中の各ヌクレオシド類縁体間の結合形態は、リン酸ジエステル結合以外にホスホロチオアート結合を１または２個以上含有していてもよく、また、前記の単位構造の1種以上を２個以上含有する場合は、当該構造間でＢａｓｅは同一または異なることができる。）またはその塩である、キット。
［１３］クランプ核酸が、上記の一般式（Ｉ）において、
Ｂａｓｅが、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１〜５のアルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、アミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基、炭素数１〜５のアルキル基、およびハロゲン原子からなる群から選択される置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基であり、
Ｒ１が、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、ベンジル基、アセチル基、ベンゾイル基、メタンスルホニル基、またはｐ−トルエンスルホニル基であり、
ｍが０〜２の整数であり、かつ
ｎ１が、１〜３の整数である
ヌクレオシド類縁体の単位構造の１種以上を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩である、上記［１２］に記載のキット。
［１４］クランプ核酸が、上記の一般式（Ｉ）において、
Ｂａｓｅが、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１〜５のアルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、アミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基、炭素数１〜５のアルキル基、およびハロゲン原子からなる群から選択される置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基であり、
Ｒ１がメチル基であり、
ｍが０であり、かつ
ｎ１が１である
ヌクレオシド類縁体の単位構造の１種以上を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩である、上記［１２］または［１３］に記載のキット。
［１５］クランプ核酸の長さが、５〜３０ｍｅｒである、上記［１２］〜［１４］のいずれか１つに記載のキット。
［１６］前記（ｂ）の試薬が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用の増幅プライマーを含む、上記［１２］〜［１５］のいずれか１つに記載のキット。
［１７］前記（ｂ）の試薬が、リアルタイムＰＣＲ用の試薬を更に含む、上記［１６］に記載のキット。
［１８］リアルタイムＰＣＲ法が検出用プローブを用いて行われ、検出用プローブは、検出標的核酸における塩基配列の相違を検出すべき領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸であり、かつ一方の末端が蛍光基で置換され、他方の末端が消光基で置換されている、上記［１７］に記載のキット。
［１９］検出用プローブが、上記の一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）（各一般式中の記号は上記と同義である。）のいずれか１つで表されるヌクレオシド類縁体の単位構造の１種以上を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩である、上記［１８］に記載のキット。
［２０］検出非標的核酸と検出標的核酸との間の塩基配列の相違が、置換、挿入、欠失、逆位、重複および転座からなる群から選択される１つ以上の変異またはそれらの組み合わせに起因するものである、上記［１２］〜［１９］のいずれか１つに記載のキット。
［２１］対象核酸が遺伝子であって、かつ検出の対象とする該遺伝子の塩基配列の相違が、特定の疾患の発症および／または治療感受性に関連するものである、上記［１２］〜［２０］のいずれか１つに記載のキット。
【発明の効果】
【００３２】
本発明は、対象核酸の大部分が野生型遺伝子（検出非標的核酸）である中に変異型遺伝子（検出標的核酸）が極微量しか含まれていない検査試料からでも変異型遺伝子の有無や変異様式を高感度、高精度に検出でき、様々な遺伝子における点変異、欠失変異、挿入変異等の正確な検査を簡便かつ低コストで行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＫＲＡＳ遺伝子の第２エクソンの塩基配列と主な変異を示す。
【図２】実施例１で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異を標的としてオリゴ４を用いたＢＮＡクランプ法による各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１００％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲでの全核酸増幅確認用プローブ（以下、「核酸増幅用プローブ」とする）（オリゴ３）による核酸増幅曲線を示す。
【図３】実施例１で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異を標的としてオリゴ５を用いたＢＮＡクランプ法による各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１００％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲでの核酸増幅用プローブ（オリゴ３）による核酸増幅曲線を示す。
【図４】実施例１で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異を標的としてオリゴ６を用いたＢＮＡクランプ法による各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１００％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲでの核酸増幅用プローブ（オリゴ３）による核酸増幅曲線を示す。
【図５】実施例１で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異を標的としてオリゴ６を用いたＢＮＡクランプ法による各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１００％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲでの核酸増幅５５サイクル後の増幅産物のダイレクトシークエンス法によるコドン１２近傍の塩基配列解析図を示す。
【図６】実施例２で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異を標的とした各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１００％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲにおいてオリゴ５（ＢＮＡ）のクランプ効果を、オリゴ８（ＤＮＡ）、オリゴ９（ＬＮＡ）およびオリゴ１０（ＰＮＡ）のクランプ効果と比較した核酸増幅用プローブ（オリゴ３）による核酸増幅曲線を示す。
【図７】実施例２で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異を標的とした各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１００％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲにおいてオリゴ６（ＢＮＡ）のクランプ効果を、オリゴ１１（ＤＮＡ）、オリゴ１２（ＬＮＡ）およびオリゴ１３（ＰＮＡ）のクランプ効果と比較した核酸増幅用プローブ（オリゴ３）による核酸増幅曲線を示す。
【図８】実施例２で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異を標的とした各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１００％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲにおいてオリゴ５（ＢＮＡ）のクランプ効果を、オリゴ８（ＤＮＡ）、オリゴ９（ＬＮＡ）およびオリゴ１０（ＰＮＡ）のクランプ効果と比較した核酸増幅用プローブ（オリゴ３）による核酸増幅曲線から算出したΔＣｔ値のグラフを示す。
【図９】実施例２で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異を標的とした各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１００％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲにおいてオリゴ６（ＢＮＡ）のクランプ効果を、オリゴ１１（ＤＮＡ）、オリゴ１２（ＬＮＡ）およびオリゴ１３（ＰＮＡ）のクランプ効果と比較した核酸増幅用プローブ（オリゴ３）による核酸増幅曲線から算出したΔＣｔ値のグラフを示す。
【図１０】実施例３で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異を標的としてオリゴ６を用いたＢＮＡクランプ法による各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１００％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲでの核酸増幅用プローブ（オリゴ３−２）による核酸増幅曲線とＣｔ値を示す。
【図１１】実施例３で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異を標的としてオリゴ６を用いたＢＮＡクランプ法による各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１００％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲでのオリゴ１５の変異検出用プローブによる核酸増幅曲線とＣｔ値を示す。
【図１２】実施例３で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異を標的としてクランプ核酸（オリゴ６）を１ｐｍｏｌ用いた場合の１５ｍｅｒの変異型検出用ＤＮＡおよびＢＮＡプローブによる核酸増幅曲線とＣｔ値を示す。a)オリゴ１４でのモニター、b）オリゴ１５でのモニター。
【図１３】実施例３で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異を標的としてクランプ核酸（オリゴ６）を１ｐｍｏｌ用いた場合の１０ｍｅｒの変異型検出用ＤＮＡおよびＢＮＡプローブによる核酸増幅曲線とＣｔ値を示す。a)オリゴ１４−２でのモニター、b）オリゴ１５−２でのモニター。
【図１４】実施例４で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異を標的としてオリゴ６を用いたＢＮＡクランプ法による各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１０％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲでの各プローブ（a:オリゴ３−２およびb:オリゴ１４）による核酸増幅曲線を示す。
【図１５】実施例４で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｄ変異を標的としてオリゴ６を用いたＢＮＡクランプ法による各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１０％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲでの各プローブ（a:オリゴ３−２およびb:オリゴ１６）による核酸増幅曲線を示す。
【図１６】実施例４で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１３Ｄ変異を標的としてオリゴ６を用いたＢＮＡクランプ法による各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１０％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲでの各プローブ（a:オリゴ３−２およびb:オリゴ１７）による核酸増幅曲線を示す。
【図１７】実施例４で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ａ変異を標的としてオリゴ６を用いたＢＮＡクランプ法による各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１０％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲでの各プローブ（a:オリゴ３−２およびb:オリゴ１８）による核酸増幅曲線を示す。
【図１８】実施例４で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｃ変異を標的としてオリゴ６を用いたＢＮＡクランプ法による各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１０％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲでの各プローブ（a:オリゴ３−２およびb:オリゴ１９）による核酸増幅曲線を示す。
【図１９】実施例４で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｓ変異を標的としてオリゴ６を用いたＢＮＡクランプ法による各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１０％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲでの各プローブ（a:オリゴ３−２およびb:オリゴ２０）による核酸増幅曲線を示す。
【図２０】実施例４で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｒ変異を標的としてオリゴ６を用いたＢＮＡクランプ法による各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１０％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲでの各プローブ（a:オリゴ３−２およびb:オリゴ２１）による核酸増幅曲線を示す。
【図２１】実施例５で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異を標的としてオリゴ４−２を用いたＢＮＡクランプ法による各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲでの各プローブ（a:オリゴ３−２およびb:オリゴ１４）による核酸増幅曲線を示す。
【図２２】実施例５で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異を標的としてオリゴ５を用いたＢＮＡクランプ法による各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲでの各プローブ（a:オリゴ３−２およびb:オリゴ１４）による核酸増幅曲線を示す。
【図２３】実施例５で得られた、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異を標的としてオリゴ６を用いたＢＮＡクランプ法による各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲでの各プローブ（a:オリゴ３−２およびb:オリゴ１４）による核酸増幅曲線を示す。
【図２４】実施例６で得られた、ＥＧＦＲ遺伝子E746-A750 del (Type 1)変異を標的としてオリゴ２５を用いたＢＮＡクランプ法による各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１００％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲでの各プローブ（a:オリゴ２４およびb:オリゴ２６）による核酸増幅曲線を示す。
【図２５】実施例６でのＥＧＦＲ遺伝子E746-A750 del (Type 1)変異を標的とした各検査試料（変異型／（変異型＋野生型）（１００％〜０％）遺伝子混合試料）のリアルタイムＰＣＲにおいて、ＢＮＡクランプ（オリゴ２５）と他のクランプ（オリゴ２７〜２９）とのクランプ機能性を比較したグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（検出方法）
本発明は、検査試料において、対象核酸中の検出標的部位における塩基配列の相違を有する標的核酸を検出するための方法（以下、本発明の方法ともいう）を提供する。ここで、該標的核酸は検出非標的核酸に対する塩基配列の相違を少なくとも１つ有する検出標的核酸である。本発明の方法は、（１）検出非標的核酸における該検出標的部位の塩基配列に相補的な塩基配列を有するクランプ核酸を用いる核酸増幅法によって、検査試料中の検出標的核酸における該検出標的部位の少なくとも一部を含む領域を選択的に増幅させる工程、および、（２）増幅された核酸を検出する工程を含む。
【００３５】
本発明の方法の対象となる検査試料は、変異の検出が所望される核酸を含むと想定されるものであれば特に限定されない。検査試料は、典型的には、哺乳動物、好ましくはヒトから採取可能なものであり、血液、胸水、気管支洗浄液、骨髄液、リンパ液等の液体試料、リンパ節、血管、骨髄、脳、脾臓、皮膚等の固形試料が挙げられる。本発明の方法は非常に高い感度で核酸の変異を検出し得るため、例えば癌等の病変部位から試料を直接採取することなく、血液等の検査対象試料が微量しか含まれない液体試料を用いることが可能である。そのため、好ましい検査試料としては、血液等の液体試料である。
【００３６】
本発明の方法に係る「対象核酸」は、塩基配列の相違を検出する対象となる核酸であり、検出標的部位において検出非標的核酸に対する塩基配列の相違を少なくとも１つ有する検出標的核酸（例えば、変異型遺伝子）および検出非標的核酸（例えば、野生型遺伝子）のことである。核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、好ましくはＤＮＡであり、具体的には遺伝子である。好ましい遺伝子としては、その塩基配列の相違、即ち変異（好ましくは、後天的な変異）が、特定の疾患の発症および／または治療感受性に関連することが知られているものが挙げられる。なお、ここでいう「発症」は、疾患の実際の発症のみならず、発症リスク等も含み、また「治療感受性」は、薬物等による治療の奏効率のみならず、副作用の強弱等も含む。上記の疾患としては、以下に限定されないが、例えば癌、骨髄異形成症候群、ＨＩＶ−１感染症、血栓症、塞栓症、移植時拒絶反応、注意欠陥/多動性障害等が挙げられ、好ましくは癌である。
その変異が癌の発症および／または治療感受性に関連することが知られている遺伝子としては、例えば以下のもの（癌の種類を併記している）が挙げられ、これらの遺伝子は例示的な好ましい対象である：
ＡＢＬ／ＢＣＲ融合遺伝子（慢性骨髄性白血病）、ＨＥＲ２遺伝子（乳癌）、ＥＧＦＲ遺伝子（非小細胞肺癌）、ｃ−ＫＩＴ遺伝子（消化管間質腫瘍）、ＫＲＡＳ遺伝子（大腸癌、膵癌）、ＢＲＡＦ遺伝子（メラノーマ、大腸癌）、ＰＩ３ＫＣＡ遺伝子（肺癌、大腸癌）、ＦＬＴ３遺伝子（急性骨髄性白血病）、ＭＹＣ遺伝子（種々の癌）、ＭＹＣＮ遺伝子（神経芽細胞腫）、ＭＥＴ遺伝子（肺癌、胃癌、メラノーマ）、ＢＣＬ２遺伝子（濾胞性Ｂリンパ腫）、ＥＭＬ４／ＡＬＫ融合遺伝子（肺癌）。
上記遺伝子のうち、変異検出の対象となる患者数が多く、かつ癌との因果関係が比較的よく分かっているＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、およびＢＲＡＦ遺伝子が特に好ましい対象として挙げられる。
【００３７】
本発明の方法において検出の対象とされる「塩基配列の相違」は、基準となる塩基配列（即ち、検出非標的核酸の塩基配列）に対する任意の相違である。塩基配列の相違は例えば、置換、挿入、欠失、逆位、重複および転座等による１つ以上の変異またはそれらの組み合わせに起因するものであり得る。好ましくは、塩基配列の相違は、特定の疾患の発症および／または治療感受性に関連することが知られている、遺伝子の変異である。具体的には例えば、ＫＲＡＳ遺伝子の第２エクソンの１２番目のコドンまたは１３番目のコドンの変異は、分子標的薬セツキシマブの奏効率と関連することが知られており、当該変異としては例えば下記のものが挙げられる（ＫＲＡＳ遺伝子の第２エクソンの塩基配列（第２エクソンは、配列番号１に示される塩基配列の７〜１２８位に対応する。）を図１に示している。また、配列番号２は、第２エクソンによりコードされるアミノ酸配列を示している。）。
１２番目のコドンの変異：
ＧＧＴ（Ｇ）→ＴＧＴ（Ｃ）、ＧＴＴ（Ｖ）、ＡＧＴ（Ｓ）
ＧＡＴ（Ｄ）、ＣＧＴ（Ｒ）、ＧＣＴ（Ａ）
１３番目のコドンの変異：
ＧＧＣ（Ｇ）→ＧＡＣ（Ｄ）
また、ＥＧＦＲ遺伝子では、第１８エクソンから第２１エクソンにおいて複数の変異があり、分子標的薬ゲフィチニブの奏効率と関連することが知られている（例えば、特開２００６−２８８３５３号公報を参照）。当該変異としては例えば下記のものが挙げられる。
第１８エクソンの変異：
Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ａ
第１９エクソンの変異：
Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ （ｎｔ ２２３５−２２４９ｄｅｌ）、
Ｅ７４６−Ａ７５０ｄｅｌ （ｎｔ ２２３６−２２５０ｄｅｌ）、
Ｌ７４７−Ａ７５０ｄｅｌ Ｔ７５１Ｓ、
Ｌ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌ Ｐ７５３Ｓ、
Ｌ７４７−Ｅ７４９ｄｅｌ Ａ７５０Ｐ、
Ｌ７４７−Ｓ７５２ｄｅｌ Ｅ７４６Ｖ、
Ｓ７５２−Ｉ７５９ｄｅｌ
第２０エクソンの変異：
Ｔ７９０Ｍ、Ｓ７６８I 
第２１エクソンの変異：
Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８６１Ｑ
さらにＢＲＡＦ遺伝子では、第１５エクソンの６００番目のコドンの変異は、分子標的薬セツキシマブやパニツムマブの奏効率と関連することが知られており、当該変異としては例えば下記のものが挙げられる。
６００番目のコドンの変異：
ＧＴＧ（Ｖ）→ＧＡＧ（Ｅ）
【００３８】
以下、各工程について説明する。
【００３９】
（１）検出非標的核酸における該検出標的部位の塩基配列に相補的な塩基配列を有するクランプ核酸を用いる核酸増幅法によって、検査試料中の検出標的核酸における該検出標的部位の少なくとも一部を含む領域を選択的に増幅させる工程
【００４０】
本明細書において「検出標的部位」とは、塩基配列の相違の検出対象となる、対象核酸中の領域をいう。例えば、検出すべき相違が一塩基の相違（例えば、一塩基変異）である場合、検出標的部位は当該一塩基部分であってよいし、あるいは当該一塩基部分の近傍として捉えることもできる。
【００４１】
本明細書において「検出標的核酸」とは、対象核酸中の検出標的部位における塩基配列の相違を有する核酸であり、通常野生型遺伝子を基準として野生型遺伝子とは異なる塩基配列を有する核酸を意味するが、検査目的に応じて特定の塩基配列を選択し、当該特定の塩基配列を有する核酸であってもよい。
【００４２】
本明細書において「検出非標的核酸」とは、対象核酸中の検出標的部位における塩基配列の相違を有しない核酸であり、通常野生型遺伝子と同じ塩基配列を有する核酸を意味するが、検査目的に応じて基準となる塩基配列を選択し、当該基準塩基配列を有する核酸であってもよい。
【００４３】
本明細書において「クランプ核酸」とは、検出非標的核酸の検出標的部位にハイブリダイズできる核酸をいう。そのため、クランプ核酸は、検出非標的核酸の検出標的部位の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。本発明の方法においては、下記一般式（Ｉ）：
【００４４】
【化９】
2014051076.tif 000011
【００４５】
（式中、
Ｂａｓｅは、置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基を示し、
Ｒ１は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、または機能性分子ユニット置換基を示し、
ｍは０〜２の整数であり、かつ
ｎ１は、１〜３の整数である。）、
または、下記一般式（ＩＩ）：
【００４６】
【化１０】
2014051076.tif 000012
【００４７】
（式中、
Ｂａｓｅは上記と同義であり、
Ａは、直接結合、炭素数１〜４のアルキレン基、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ２−（ここで、酸素原子は４’位のメチレン基と結合しており、ｎ２は１〜３の整数を示す。）、または−Ｎ（Ｒ３）−（ＣＨ２）ｎ３−（ここで、窒素原子は４’位のメチレン基と結合しており、ｎ３は１〜３の整数を示す。）を示し、
Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アラルキル基、アリール基、アシル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、または、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、炭素数１〜６のシアノアルコキシ基、または、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基を示す。］を示す。）、または、下記一般式（ＩＩＩ）：
【００４８】
【化１１】
2014051076.tif 000013
【００４９】
（式中、Ｂａｓｅは上記と同義である。）、
または、下記一般式（ＩＶ）：
【００５０】
【化１２】
2014051076.tif 000014
【００５１】
（式中、Ｂａｓｅは上記と同義である。）
で表されるヌクレオシド類縁体の単位構造の１種以上を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体（但し、オリゴヌクレオチド類縁体中の各ヌクレオシド類縁体間の結合形態は、リン酸ジエステル結合以外にホスホロチオアート結合を１または２個以上含有していてもよく、また、前記の単位構造の1種以上を２個以上含有する場合は、当該構造間でＢａｓｅは同一または異なることができる。）またはその塩をクランプ核酸として用いる。なお、本発明の説明の文脈においては、そのようなオリゴヌクレオチド類縁体またはその塩を、「第２世代以降のＢＮＡ」または単に「ＢＮＡ」と称する。
【００５２】
一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）中、Ｂａｓｅのピリミジンもしくはプリン核酸塩基には、核酸の構成成分として一般に知られる塩基（例えば、グアニン、アデニン、シトシン、チミン、ウラシル）、およびその他これらに類する核酸成分の塩基として作用もしくは代用し得るあらゆる化学構造が含まれる。好適には、ピリミジンもしくはプリン核酸塩基、以下のα群から選択される置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基であり、具体的には、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、または下記α群から選択される置換基を有するプリン−９−イル基もしくは２−オキソ−ピリミジン−１−イル基が好適である。
【００５３】
α群：水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１〜５のアルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、アミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基、炭素数１〜５のアルキル基、および、ハロゲン原子。
【００５４】
ここで、「置換基を有していてもよいプリン核酸塩基」として好適な基は、６−アミノプリン−９−イル（即ち、アデニニル）、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された６−アミノプリン−９−イル、２，６−ジアミノプリン−９−イル、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル（即ち、グアニニル）、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル、２，６−ジメトキシプリン−９−イル、２，６−ジクロロプロリン−２−イルまたは６−メルカプトプリン−９−イル基であり、さらに好適には、６−ベンゾイルアミノプリン−９−イル、アデニニル、２−イソブチリルアミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イルまたはグアニニル基である。
【００５５】
また、「置換基を有していてもよいピリミジン核酸塩基」として好適な基は、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル（即ち、シトシニル）、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−アミノ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−オキソ−４−アミノ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル（即ち、ウラシニル）、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル（即ち、チミニル）または４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル（即ち、５−メチルシトシニル）基であり、さらに好適には、２−オキソ−４−ベンゾイルアミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、シトシニル、チミニル、ウラシニル、２−オキソ−４−ベンゾイルアミノ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、または５−メチルシトシニル基である。
【００５６】
「置換基を有していてもよいプリンもしくはピリミジン核酸塩基」の中で、さらに好適には、６−アミノプリン−９−イル（即ち、アデニニル）、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された６−アミノプリン−９−イル、２，６−ジアミノプリン−９−イル、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル（即ち、グアニニル）、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル、２，６−ジメトキシプリン−９−イル、２，６−ジクロロプリン−９−イル、６−メルカプトプリン−９−イル、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル（即ち、シトシニル）、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−アミノ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−オキソ−４−アミノ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル（即ち、ウラシニル）、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル（即ち、チミニル）、４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル（即ち、５−メチルシトシニル）、または、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イルである。
【００５７】
Ｒ２、Ｒ３の「核酸合成の水酸基の保護基」、Ｒ４、Ｒ５、およびα群の「核酸合成の保護基で保護された水酸基」の保護基とは、核酸合成の際に安定して水酸基を保護し得るものであれば、特に制限はないが、具体的には、酸性または中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解および光分解のような化学的方法により開裂し得る保護基のことをいい、そのような保護基としては、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、ピバロイル、バレリル、イソバレリル、オクタノイル、ノナノイル、デカノイル、３−メチルノナノイル、８−メチルノナノイル、３−エチルオクタノイル、３，７−ジメチルオクタノイル、ウンデカノイル、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル、１−メチルペンタデカノイル、１４−メチルペンタデカノイル、１３，１３−ジメチルテトラデカノイル、ヘプタデカノイル、１５−メチルヘキサデカノイル、オクタデカノイル、１−メチルヘプタデカノイル、ノナデカノイル、アイコサノイルおよびヘナイコサノイルのようなアルキルカルボニル基、スクシノイル、グルタロイル、アジポイルのようなカルボキシ化アルキルカルボニル基、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチルのようなハロゲノ低級アルキルカルボニル基、メトキシアセチルのような低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノイルのような不飽和アルキルカルボニル基のような「脂肪族アシル基」；メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、２−メチルブチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、２−エチルブチルのような「低級アルキル基」；エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、１−メチル−１−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、２−エチル−２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、１−メチル−２−ブテニル、１−メチル−１−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−エチル−２−ブテニル、３−ブテニル、１−メチル−３−ブテニル、２−メチル−３−ブテニル、１−エチル−３−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、１−メチル−２−ペンテニル、２−メチル−２−ペンテニル、３−ペンテニル、１−メチル−３−ペンテニル、２−メチル−３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−メチル−４−ペンテニル、２−メチル−４−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニルのような「低級アルケニル基」；ベンゾイル、α−ナフトイル、β−ナフトイルのようなアリールカルボニル基、２−ブロモベンゾイル、４−クロロベンゾイルのようなハロゲノアリールカルボニル基、２，４，６−トリメチルベンゾイル、４−トルオイルのような低級アルキル化アリールカルボニル基、４−アニソイルのような低級アルコキシ化アリールカルボニル基、２−カルボキシベンゾイル、３−カルボキシベンゾイル、４−カルボキシベンゾイルのようなカルボキシ化アリールカルボニル基、４−ニトロベンゾイル、２−ニトロベンゾイルのようなニトロ化アリールカルボニル基；２−（メトキシカルボニル）ベンゾイルのような低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基、４−フェニルベンゾイルのようなアリール化アリールカルボニル基のような「芳香族アシル基」；テトラヒドロピラン−２−イル、３−ブロモテトラヒドロピラン−２−イル、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル、テトラヒドロチオピラン−４−イル、４−メトキシテトラヒドロチオピラン−４−イルのような「テトラヒドロピラニルまたはテトラヒドロチオピラニル基」；テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロチオフラン−２−イルのような「テトラヒドロフラニルまたはテトラヒドロチオフラニル基」；トリメチルシリル、トリエチルシリル、イソプロピルジメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、メチルジイソプロピルシリル、メチルジ−ｔ−ブチルシリル、トリイソプロピルシリルのようなトリ低級アルキルシリル基、ジフェニルメチルシリル、ジフェニルブチルシリル、ジフェニルイソプロピルシリル、フェニルジイソプロピルシリルのような１〜２個のアリール基で置換されたトリ低級アルキルシリル基のような「シリル基」；メトキシメチル、１，１−ジメチル−１−メトキシメチル、エトキシメチル、プロポキシメチル、イソプロポキシメチル、ブトキシメチル、ｔ−ブトキシメチルのような「低級アルコキシメチル基」；２−メトキシエトキシメチルのような「低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基」；２，２，２−トリクロロエトキシメチル、ビス（２−クロロエトキシ）メチルのような「ハロゲノ低級アルコキシメチル基」；１−エトキシエチル、１−（イソプロポキシ）エチルのような「低級アルコキシ化エチル基」；２，２，２−トリクロロエチルのような「ハロゲン化エチル基」；ベンジル、α−ナフチルメチル、β−ナフチルメチル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、９−アンスリルメチルのような「１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」；４−メチルベンジル、２，４，６−トリメチルベンジル、３，４，５−トリメチルベンジル、４−メトキシベンジル、４−メトキシフェニルジフェニルメチル、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル、２−ニトロベンジル、４−ニトロベンジル、４−クロロベンジル、４−ブロモベンジル、４−シアノベンジルのような「低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、シアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」；メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニルのような「低級アルコキシカルボニル基」；４−クロロフェニル、２−フロロフェニル、４−メトキシフェニル、４−ニトロフェニル、２，４−ジニトロフェニルのような「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」；２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、２−トリメチルシリルエトキシカルボニルのような「ハロゲンまたはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」；ビニルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニルのような「アルケニルオキシカルボニル基」；ベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、４−ニトロベンジルオキシカルボニルのような１〜２個の「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」を挙げることができる。
【００５８】
Ｒ２およびＲ３の「核酸合成の水酸基の保護基」においては、好適には、「脂肪族アシル基」、「芳香族アシル基」、「１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」、「低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、シアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」または「シリル基」であり、さらに好適には、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンゾイル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基またはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基であり、Ｒ４、Ｒ５またはα群の「核酸合成の保護基で保護された水酸基」の保護基においては、好適には、「脂肪族アシル基」、「芳香族アシル基」、「１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、「低級アルキル基」または「低級アルケニル基」であり、さらに好適には、ベンゾイル基、ベンジル基、２−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基または２−プロペニル基である。
【００５９】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の「アルキル基」とは、炭素数１〜２０の直鎖または分岐鎖状のアルキル基を示し、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、２−メチルブチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、２−エチルブチルのような炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖状のアルキル基（本明細書においては、これらを低級アルキル基とも称す。）の他、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど炭素数７〜２０の直鎖または分岐鎖状のアルキル基が含まれ、好適には、上記の炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖状のアルキル基である。
【００６０】
Ａの「炭素数１〜４のアルキレン基」としては、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン基が挙げられ、好適には、メチレン基である。
【００６１】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の「アルケニル基」とは、炭素数２〜２０の直鎖または分岐鎖状のアルケニル基を示し、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、１−メチル−１−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、２−エチル−２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、１−メチル−２−ブテニル、１−メチル−１−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−エチル−２−ブテニル、３−ブテニル、１−メチル−３−ブテニル、２−メチル−３−ブテニル、１−エチル−３−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、１−メチル−２−ペンテニル、２−メチル−２−ペンテニル、３−ペンテニル、１−メチル−３−ペンテニル、２−メチル−３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−メチル−４−ペンテニル、２−メチル−４−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニルのような炭素数２〜６の直鎖または分岐鎖状のアルケニル基（本明細書においては、これらを低級アルケニル基とも称す。）の他、ゲラニル、ファルネシルなどが含まれ、好適には、上記の炭素数２〜６の直鎖または分岐鎖状のアルケニル基である。
【００６２】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の「シクロアルキル基」とは、炭素数３〜１０のシクロアルキル基を示し、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ノルボルニル、アダマンチルなどが挙げられ、好適には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどの炭素数３〜８のシクロアルキル基である。また、「シクロアルキル基」には、上記シクロアルキル基の環上の１つ以上のメチレンが酸素原子や硫黄原子、あるいはアルキル基で置換された窒素原子に置換された複素環基も含まれ、例えば、テトラヒドロピラニル基などが挙げられる。
【００６３】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の「アリール基」とは、芳香族炭化水素基から水素原子１個を除いた炭素数６〜１４の１価の置換基を意味し、例えば、フェニル、インデニル、ナフチル、フェナンスレニル、アントラセニルなどが挙げられる。また、アリール環が、ハロゲン原子、低級アルキル基、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミノ基、ニトロ基、トリフルオロメチル、フェニル基等の１種以上の基によって置換されていてもよく、そのような置換されていてもよいアリール基としては、例えば、２−メチルフェニル、２，６−ジメチルフェニル、２−クロロフェニル、４−クロロフェニル、２，４−ジクロロフェニル、２，５−ジクロロフェニル、２−ブロモフェニル、４−メトキシフェニル、４−クロロ−２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ビフェニルなどが挙げられる。好適には、ハロゲン原子、低級アルコキシ基、ニトロ基で置換されたフェニル基、フェニル基などが挙げられる。
【００６４】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の「アラルキル基」とは、アリール基で置換された炭素数１〜６のアルキル基を意味し、ベンジル、α−ナフチルメチル、β−ナフチルメチル、インデニルメチル、フェナンスレニルメチル、アントラセニルメチル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、９−アンスリルメチルのような「１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」や、４−メチルベンジル、２，４，６−トリメチルベンジル、３，４，５−トリメチルベンジル、４−メトキシベンジル、４−メトキシフェニルジフェニルメチル、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル、２−ニトロベンジル、４−ニトロベンジル、４−クロロベンジル、４−ブロモベンジル、４−シアノベンジルのような「低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、シアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」の他、１−フェネチル、２−フェネチル、１−ナフチルエチル、２−ナフチルエチル、１−フェニルプロピル、２−フェニルプロピル、３−フェニルプロピル、１−ナフチルプロピル、２−ナフチルプロピル、３−ナフチルプロピル、１−フェニルブチル、２−フェニルブチル、３−フェニルブチル、４−フェニルブチル、１−ナフチルブチル、２−ナフチルブチル、３−ナフチルブチル、４−ナフチルブチル、１−フェニルペンチル、２−フェニルペンチル、３−フェニルペンチル、４−フェニルペンチル、５−フェニルペンチル、１−ナフチルペンチル、２−ナフチルペンチル、３−ナフチルペンチル、４−ナフチルペンチル、５−ナフチルペンチル、１−フェニルヘキシル、２−フェニルヘキシル、３−フェニルヘキシル、４−フェニルヘキシル、５−フェニルヘキシル、６−フェニルヘキシル、１−ナフチルペンチル、２−ナフチルペンチル、３−ナフチルペンチル、４−ナフチルペンチル、５−ナフチルペンチル、６−ナフチルペンチル、などの「アリール基で置換された炭素数３〜６のアルキル基」などが含まれる。好適には、「１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」、「低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、シアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」であり、さらに好適には、４−メトキシフェニルジフェニルメチル、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルである。
【００６５】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の「アシル基」としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、ピバロイル、バレリル、イソバレリル、オクタノイル、ノナノイル、デカノイル、３−メチルノナノイル、８−メチルノナノイル、３−エチルオクタノイル、３，７−ジメチルオクタノイル、ウンデカノイル、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル、１−メチルペンタデカノイル、１４−メチルペンタデカノイル、１３，１３−ジメチルテトラデカノイル、ヘプタデカノイル、１５−メチルヘキサデカノイル、オクタデカノイル、１−メチルヘプタデカノイル、ノナデカノイル、アイコサノイルおよびヘナイコサノイルのようなアルキルカルボニル基、スクシノイル、グルタロイル、アジポイルのようなカルボキシ化アルキルカルボニル基、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチルのようなハロゲノ低級アルキルカルボニル基、メトキシアセチルのような低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基、フェノキシアセチル基のようなアリールオキシ低級アルキルカルボニル基、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノイルのような不飽和アルキルカルボニル基のような「脂肪族アシル基」、およびベンゾイル、α−ナフトイル、β−ナフトイルのようなアリールカルボニル基、２−ブロモベンゾイル、４−クロロベンゾイルのようなハロゲノアリールカルボニル基、２，４，６−トリメチルベンゾイル、４−トルオイルのような低級アルキル化アリールカルボニル基、４−アニソイルのような低級アルコキシ化アリールカルボニル基、２−カルボキシベンゾイル、３−カルボキシベンゾイル、４−カルボキシベンゾイルのようなカルボキシ化アリールカルボニル基、４−ニトロベンゾイル、２−ニトロベンゾイルのようなニトロ化アリールカルボニル基；２−（メトキシカルボニル）ベンゾイルのような低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基、４−フェニルベンゾイルのようなアリール化アリールカルボニル基のような「芳香族アシル基」が挙げられ、好適には、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、ピバロイル、ベンゾイル、フェノキシアセチル基である。
【００６６】
Ｒ１の「スルホニル基」としては、メタンスルホニル、エタンスルホニルのように炭素数が１〜６の直鎖あるいは分岐アルキル基が置換したスルホニル基のような「脂肪族スルホニル基」、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニルのような各種アリ−ル基が置換したスルホニル基のような「芳香族スルホニル基」が挙げられ、好適にはメタンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル基である。
【００６７】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の「シリル基」としては、トリメチルシリル、トリエチルシリル、イソプロピルジメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、メチルジイソプロピルシリル、メチルジ−ｔ−ブチルシリル、トリイソプロピルシリルのような「トリ低級アルキルシリル基」、ジフェニルメチルシリル、ブチルジフェニルブチルシリル、ジフェニルイソプロピルシリル、フェニルジイソプロピルシリルのような「１〜２個のアリール基で置換されたトリ低級アルキルシリル基」などが挙げられ、好適には、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリルであり、さらに好適にはトリメチルシリルである。
【００６８】
Ｒ２およびＲ３の「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」の「保護基」とは、核酸合成の際に安定してリン酸基を保護し得るものであれば、特に限定はないが、具体的には、酸性または中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解および光分解のような化学的方法により開裂し得る保護基のことをいい、そのような保護基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、２−メチルブチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、２−エチルブチルのような「低級アルキル基」；２−シアノエチル、２−シアノ−１，１−ジメチルエチルのような「シアノ化低級アルキル基」；２−メチルジフェニルシリルエチル、２−トリメチルシリルエチル、２−トリフェニルシリルエチルのような「シリル基で置換されたエチル基」；２，２，２−トリクロロエチル、２，２，２−トリブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、２，２，２−トリクロロ−１，１−ジメチルエチルのような「ハロゲン化低級アルキル基」；エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、１−メチル−１−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、２−エチル−２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、１−メチル−２−ブテニル、１−メチル−１−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−エチル−２−ブテニル、３−ブテニル、１−メチル−３−ブテニル、２−メチル−３−ブテニル、１−エチル−３−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、１−メチル−２−ペンテニル、２−メチル−２−ペンテニル、３−ペンテニル、１−メチル−３−ペンテニル、２−メチル−３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−メチル−４−ペンテニル、２−メチル−４−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニルのような「低級アルケニル基」；シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ノルボルニル、アダマンチルのような「シクロアルキル基」；２−シアノブテニルのような「シアノ化低級アルケニル基」；ベンジル、α−ナフチルメチル、β−ナフチルメチル、インデニルメチル、フェナンスレニルメチル、アントラセニルメチル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、１−フェネチル、２−フェネチル、１−ナフチルエチル、２−ナフチルエチル、１−フェニルプロピル、２−フェニルプロピル、３−フェニルプロピル、１−ナフチルプロピル、２−ナフチルプロピル、３−ナフチルプロピル、１−フェニルブチル、２−フェニルブチル、３−フェニルブチル、４−フェニルブチル、１−ナフチルブチル、２−ナフチルブチル、３−ナフチルブチル、４−ナフチルブチル、１−フェニルペンチル、２−フェニルペンチル、３−フェニルペンチル、４−フェニルペンチル、５−フェニルペンチル、１−��フチルペンチル、２−ナフチルペンチル、３−ナフチルペンチル、４−ナフチルペンチル、５−ナフチルペンチル、１−フェニルヘキシル、２−フェニルヘキシル、３−フェニルヘキシル、４−フェニルヘキシル、５−フェニルヘキシル、６−フェニルヘキシル、１−ナフチルペンチル、２−ナフチルペンチル、３−ナフチルペンチル、４−ナフチルペンチル、５−ナフチルペンチル、６−ナフチルペンチルのような「アラルキル基」；４−クロロベンジル、２−（４−ニトロフェニル）エチル、ｏ−ニトロベンジル、４−ニトロベンジル、２，４−ジニトロベンジル、４−クロロ−２−ニトロベンジルのような「ニトロ基、ハロゲン原子でアリール環が置換されたアラルキル基」；フェニル、インデニル、ナフチル、フェナンスレニル、アントラセニルのような「アリール基」；２−メチルフェニル、２，６−ジメチルフェニル、２−クロロフェニル、４−クロロフェニル、２，４−ジクロロフェニル、２，５−ジクロロフェニル、２−ブロモフェニル、４−ニトロフェニル、４−クロロ−２−ニトロフェニルのような「低級アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基で置換されたアリール基」を挙げることができ、好適には「低級アルキル基」、「シアノ基で置換された低級アルキル基」、「アラルキル基」、「ニトロ基、ハロゲン原子でアリール環が置換されたアラルキル基」または「低級アルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基で置換されたアリール基」であり、さらに好適には、２−シアノエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、ベンジル基、２−クロロフェニル基または４−クロロフェニル基である。
【００６９】
Ｒ１の「機能性分子ユニット置換基」とは、標識分子（例えば、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位元素を含む分子種等）等を含む。
【００７０】
Ｒ４、Ｒ５およびα群の「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の保護基としては、核酸合成の際に安定してメルカプト基を保護し得るものであれば、特に限定はないが、具体的には、酸性または中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解および光分解のような化学的方法により開裂し得る保護基をいい、例えば、上記水酸基の保護基として挙げたものの他、メチルチオ、エチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオのようなアルキルチオ基、ベンジルチオのようなアリールチオ基等の「ジスルフィドを形成する基」を挙げることができ、好適には、「脂肪族アシル基」または「芳香族アシル基」であり、さらに好適には、ベンゾイル基、ベンジル基である。
【００７１】
Ｒ４、Ｒ５およびα群の「炭素数１〜５のアルコキシ基」としては、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシを挙げることができ、好適には、メトキシまたはエトキシ基である。
【００７２】
Ｒ４、Ｒ５およびα群の「炭素数１〜５のアルキルチオ基」としては、例えば、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、イソブチルチオ、ｓ−ブチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、ｎ−ペンチルチオを挙げることができ、好適には、メチルチオまたはエチルチオ基である。
【００７３】
Ｒ４およびＲ５の「炭素数１〜６のシアノアルコキシ基」とは、上記「炭素数１〜５のアルコキシ基」のシアノ基が置換した基をいい、そのような基としては、例えば、シアノメトキシ、２−シアノエトキシ、３−シアノプロポキシ、４−シアノブトキシ、３−シアノ−２−メチルプロポキシ、または１−シアノメチル−１，１−ジメチルメトキシを挙げることができ、好適には、２−シアノエトキシ基である。
【００７４】
Ｒ４、Ｒ５およびα群の「炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基」としては、例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ブチルアミノ、イソブチルアミノ、ｓ−ブチルアミノ、ｔｅｒｔ−ブチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジブチルアミノ、ジイソブチルアミノ、ジ（ｓ−ブチル）アミノ、ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）アミノを挙げることができ、好適には、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノまたはジイソプロピルアミノ基である。
【００７５】
α群の「炭素数１〜５のアルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチルなどを挙げることができ、好適には、メチルまたはエチル基である。
【００７６】
α群の「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を挙げることができ、好適には、フッ素原子または塩素原子である。
【００７７】
α群の「核酸合成の保護基で保護されたアミノ基」の保護基としては、核酸合成の際に安定してアミノ基を保護し得るものであれば、特に限定はないが、具体的には、酸性または中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解および光分解のような化学的方法により開裂し得る保護基をいい、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、ピバロイル、バレリル、イソバレリル、オクタノイル、ノナノイル、デカノイル、３−メチルノナノイル、８−メチルノナノイル、３−エチルオクタノイル、３，７−ジメチルオクタノイル、ウンデカノイル、ドデカノイル、トリデカノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキサデカノイル、１−メチルペンタデカノイル、１４−メチルペンタデカノイル、１３，１３−ジメチルテトラデカノイル、ヘプタデカノイル、１５−メチルヘキサデカノイル、オクタデカノイル、１−メチルヘプタデカノイル、ノナデカノイル、ノナデカノイル、アイコサノイルおよびヘナイコサノイルのようなアルキルカルボニル基、スクシノイル、グルタロイル、アジポイルのようなカルボキシ化アルキルカルボニル基、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチルのようなハロゲノ低級アルキルカルボニル基、メトキシアセチルのような低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノイルのような不飽和アルキルカルボニル基等の「脂肪族アシル基」；ベンゾイル、α−ナフトイル、β−ナフトイルのようなアリールカルボニル基、２−ブロモベンゾイル、４−クロロベンゾイルのようなハロゲノアリールカルボニル基、２，４，６−トリメチルベンゾイル、４−トルオイルのような低級アルキル化アリールカルボニル基、４−アニソイルのような低級アルコキシ化アリールカルボニル基、２−カルボキシベンゾイル、３−カルボキシベンゾイル、４−カルボキシベンゾイルのようなカルボキシ化アリールカルボニル基、４−ニトロベンゾイル、２−ニトロベンゾイルのようなニトロ化アリールカルボニル基；２−（メトキシカルボニル）ベンゾイルのような低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基、４−フェニルベンゾイルのようなアリール化アリールカルボニル基等の「芳香族アシル基」；メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニルのような「低級アルコキシカルボニル基」；２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、２−トリメチルシリルエトキシカルボニルのような「ハロゲンまたはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」；ビニルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニルのような「アルケニルオキシカルボニル基」；ベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、４−ニトロベンジルオキシカルボニルのような１〜２個の「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」を挙げることができ、好適には、「脂肪族アシル基」または「芳香族アシル基」であり、さらに好適には、ベンゾイル基である。
【００７８】
「ヌクレオシド類縁体」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖が結合した「ヌクレオシド」のうち非天然型のもの、ならびに、プリンおよびピリミジン以外の芳香族複素環および芳香族炭化水素環でプリンまたはピリミジン塩基との代用が可能なものと糖が結合したものをいう。
【００７９】
「オリゴヌクレオチド類縁体」とは、同一または異なる「ヌクレオシド」または「ヌクレオシド類縁体」がリン酸ジエステル結合または場合により１以上のホスホロチオアート結合で２〜５０個結合した「オリゴヌクレオチド」の非天然型誘導体をいい、そのような類縁体としては、好適には、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル部分がチオアート化されたチオアート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体を挙げることができ、さらに好適には、糖部分が修飾された糖誘導体を挙げることができる。
【００８０】
「その塩」とは、上記のオリゴヌクレオチド類縁体は塩にすることができるので、その塩をいい、そのような塩としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。
【００８１】
クランプ核酸として用いられる、一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかで表されるヌクレオシド類縁体の単位構造を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体およびその塩のうち、好適なものとしては、一般式（Ｉ）で表されるヌクレオシド類縁体の単位構造を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体およびその塩、ならびに一般式（ＩＩ）で表されるヌクレオシド類縁体の単位構造を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体およびその塩が挙げられ、より好適なものとしては、一般式（Ｉ）で表されるヌクレオシド類縁体の単位構造を１または２個以上含有するオリゴヌクレオチド類縁体およびその塩が挙げられる。
【００８２】
一般式（Ｉ）で表されるヌクレオシド類縁体のうち、好適なものとしては、Ｂａｓｅが、上記のα群から選択される置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基であり、Ｒ１が、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、ベンジル基等のアラルキル基、アセチル基やベンゾイル基等の低級脂肪族あるいは芳香族アシル基、メタンスルホニル基やｐ−トルエンスルホニル基等の脂肪族あるいは芳香族スルホニル基であるものが挙げられる。当該ヌクレオシド類縁体において、Ｂａｓｅは、好ましくは下記のβ群およびγ群から選択され、より好ましくはγ群から選択される。
β群：６−アミノプリン−９−イル（即ち、アデニニル）、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された６−アミノプリン−９−イル、２，６−ジアミノプリン−９−イル、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル（即ち、グアニニル）、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル、２，６−ジメトキシプリン−９−イル、２，６−ジクロロプリン−９−イル、６−メルカプトプリン−９−イル、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル（即ち、シトシニル）、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−アミノ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された２−オキソ−４−アミノ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル（即ち、ウラシニル）、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル（即ち、チミニル）、４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル（即ち、５−メチルシトシニル）基、アミノ基が核酸合成の保護基で保護された４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル；
γ群：ベンゾイルアミノプリン−９−イル、アデニニル、２−イソブチリルアミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル、グアニニル、２−オキソ−４−ベンゾイルアミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、シトシニル、２−オキソ−５−メチル−４−ベンゾイルアミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、５−メチルシトシニル、ウラシニル、およびチミニル基。
【００８３】
一般式（Ｉ）で表されるヌクレオシド類縁体のうち、特に好適なものとしては、Ｂａｓｅが、上記のα群から選択される置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基であり、Ｒ１がメチル基であり、ｍが０であり、かつｎ１が１であるものが挙げられる。当該ヌクレオシド類縁体において、Ｂａｓｅは、好ましくは上記のβ群およびγ群から選択され、より好ましくはγ群から選択される。
【００８４】
一般式（ＩＩ）で表されるヌクレオシド類縁体のうち、好適なものとしては、Ｂａｓｅが、上記のα群から選択される置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基であり、Ａが直接結合または−Ｏ−ＣＨ２−（ここで酸素原子は４’位のメチレン基と結合している。）であり、かつＲ１が、水素原子、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、１〜３個のアリール基で置換されたメチル基、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲンもしくはシアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基、またはシリル基であるものが挙げられる。より好適なものとしては、Ｂａｓｅが、上記のα群から選択される置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基であり、Ａが直接結合または−Ｏ−ＣＨ２−（ここで酸素原子は４’位のメチレン基と結合している。）であり、かつＲ１が、水素原子、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基又はｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基であるものが挙げられる。これらのヌクレオシド類縁体において、Ｂａｓｅは、好ましくは上記のβ群およびγ群から選択され、より好ましくはγ群から選択される。
【００８５】
一般式（ＩＩ）で表されるヌクレオシド類縁体のうち、特に好適なものとしては、Ｂａｓｅが、上記のα群から選択される置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基であり、Ａが直接結合または−Ｏ−ＣＨ２−（ここで酸素原子は４’位のメチレン基と結合している。）であり、かつＲ１が、水素原子であるものが挙げられる。これらのヌクレオシド類縁体において、Ｂａｓｅは、好ましくは上記のβ群およびγ群から選択され、より好ましくはγ群から選択される。
【００８６】
一般式（ＩＩＩ）で表されるヌクレオシド類縁体のうち、好適なものとしては、Ｂａｓｅが、上記のα群から選択される置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基であるものが挙げられる。これらのヌクレオシド類縁体において、Ｂａｓｅは、好ましくは上記のβ群およびγ群から選択され、より好ましくはγ群から選択される。
【００８７】
一般式（ＩＶ）で表されるヌクレオシド類縁体のうち、好適なものとしては、Ｂａｓｅが、上記のα群から選択される置換基を１つ以上有していてもよいピリミジンもしくはプリン核酸塩基であるものが挙げられる。これらのヌクレオシド類縁体において、Ｂａｓｅは、好ましくは上記のβ群およびγ群から選択され、より好ましくはγ群から選択される。
【００８８】
クランプ核酸のオリゴヌクレオチド類縁体の長さとしては、通常５〜３０ｍｅｒ、好ましくは５〜２５ｍｅｒ、より好ましくは１０〜１８ｍｅｒである。一般に、クランプ核酸の長さを長くすれば野生型塩基配列への結合力は強くなるが、塩基認識力（即ち、野生型塩基配列への結合力と、１塩基ミスマッチ配列への結合力との差）は弱くなる傾向がある。そのため、高い感度や精度での検出を達成するために、クランプ核酸の長さを適切に設定することが重要である。
【００８９】
オリゴヌクレオチド類縁体中のヌクレオシド類縁体の個数は、１個以上であれば特に制限されないが、ヌクレオシド類縁体の導入により、野生型塩基配列への結合力および塩基認識力を増強することができるため、可能な限り多くすることが好ましい。また、検出すべき相違に対応するクランプ核酸上の部位をヌクレオシド類縁体とすることが特に好ましい。クランプ核酸中のヌクレオシド類縁体以外のヌクレオシドは、天然のヌクレオシドを用いる。天然のヌクレオシドとしては、アデノシン、デオキシアデノシン、グアノシン、デオキシグアノシン、５−メチルウリジン、チミジン、シチジン、デオキシシチジン、ウリジン、デオキシウリジン等である。クランプ核酸が１３ｍｅｒの場合、好適なヌクレオシド類縁体の数は、５〜１０個、より好ましくは７〜９個が例示されるが、これに限定されるものではない。
【００９０】
オリゴヌクレオチド類縁体中の各ヌクレオシドおよび／またはヌクレオシド類縁体間の結合形態は、リン酸ジエステル結合であってもよく、ヌクレアーゼ耐性効果を付与するためには、ホスホロチオアート結合を１または２個以上含有していてもよい。
【００９１】
クランプ核酸の５’末端を２’−ＯＭｅ−ＲＮＡまたは上記のヌクレオシド類縁体で置換修飾し、かつ／または３’末端をモノリン酸化する等、末端を適宜修飾してもよい。また、ＰＣＲで伸長反応をさせないために、３’末端にミスマッチ３塩基（例、ＧＧＧ）を付加してもよい。
【００９２】
クランプ核酸の配列や長さ、ヌクレオシド類縁体の個数は、クランプ核酸の検出標的部位に対する結合力、即ちＴｍ値を決定する因子である。本工程における核酸増幅反応において十分なクランプ効果を達成できるよう、核酸増幅のために用いる試薬等の特性も考慮して、クランプ核酸のＴｍ値を適切に設定することも重要である。
【００９３】
クランプ核酸の合成は、特開第２００１−８９４９６号公報、国際公開第２００３／０６８７９５号パンフレット、国際公開第２００５／０２１５７０号パンフレット等の文献に基づいて行うことができる。あるいは、クランプ核酸の合成は、ＢＮＡオリゴヌクレオチドの受託合成を行っている業者に委託してもよい。
【００９４】
本工程においては、上述したようなクランプ核酸と、検査試料中の核酸とを核酸増幅用反応液中に共存させ、核酸増幅反応を行う。
【００９５】
本工程で用いる核酸増幅法としては、検出標的部位を増幅でき、かつクランプ核酸の結合により該増幅を選択的に阻害できるものである限り制限されない。例えば、ＰＣＲ法［最も基本的な原理に基づくＰＣＲ法のみならず、それを基にして開発された、ホットスタートＰＣＲ法、マルチプレックスＰＣＲ法、ネステッドＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ法などの定量ＰＣＲ法等の様々なバリエーションを含む］、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法/特許第２６５０１５９号公報、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法/特許第３２４１７１７号公報、ＴＲＣ（Transcription Reverse Transcription Concerted Reaction）法/特開２０００−１４４００号公報、ＬＡＭＰ（Loop-mediated Isothermal Amplification）法/ＷО００/２８０８２、ＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法/特許第３４３３９２９号公報、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法/欧州特許出願番号３２０３２８号、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法/特公平７−１１４７１８号公報、等を用いることができる。ＰＣＲ法は最も広く用いられている核酸増幅法であることから当該方法に最適化された様々な試薬や機器が容易に入手できるだけでなく、上記の通り様々なバリエーションの方法があり、汎用性が極めて高いため、本工程のために好適な手法として挙げられる。ＰＣＲを含む核酸増幅反応の条件、操作等は、この分野で通常行われている常法に従えばよい。
【００９６】
上記の核酸増幅用反応液とは、前記核酸増幅反応を行う上で必要な試薬等を含有する溶液である。核酸増幅用反応液の組成は、使用する核酸増幅法によって多少異なるが、通常は基質としての４種のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ：以下まとめてｄＮＴＰとする）と、酵素としてのＤＮＡポリメラーゼと、前記酵素の補因子としてのマグネシウムイオンと、伸長用のプライマーとしての増幅プライマーと、をバッファー中に含むことを基本とする。また、詳細は後述するが、本工程と、増幅された核酸を検出する工程とを一括して行うことができるリアルタイムＰＣＲ法等の方法を核酸増幅法として用いる場合は、インターカレーター、蛍光標識プローブ、サイクリングプローブ等の適当な検出用試薬も核酸増幅用反応液中に共存させる。ｄＮＴＰの濃度は、４種の各終濃度が１００〜４００μＭの範囲で最適な濃度を検討すればよい。ＤＮＡポリメラーゼは、用いる核酸増幅法に適する性質を有したものを使用する。例えば、ＰＣＲ法であれば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、その他バイオサイエンス関連の各社により開発されたもの等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましく使用される。マグネシウムイオン濃度は、終濃度が１〜６ｍＭの範囲で最適な濃度を検討すればよい。
【００９７】
上記の増幅プライマーとは、前記核酸増幅法で検出領域を増幅するために用いられるプライマーである。増幅プライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、またはＬＮＡやＢＮＡ等の修飾核酸、またはそれらの組み合わせによって構成される。増幅プライマーの濃度は、終濃度が２０ｎＭから２μＭの範囲で最適な濃度を検討すればよい。増幅プライマーの数は、検出領域を前記核酸増幅法によって増幅可能であれば特に問わない。増幅プライマーの塩基数は、通常５〜４０塩基の範囲であり、好ましくは１５〜３０塩基であり、より好ましくは１８〜２５塩基である。増幅プライマー間の距離、即ち検出領域は通常５０〜５０００塩基の範囲であり、好ましくは１００〜２０００塩基である。増幅プライマーの配列は、検出標的部位の少なくとも一部、好ましくは塩基配列の相違を検出すべき特定の部位、を含む検出領域を前記核酸増幅法によって増幅可能であり、Ｔｍ値が通常５０℃から６５℃の範囲内であり、好ましくは５５℃から６０℃の範囲内であれば特に問わない。プライマーの配列中に検出標的部位を含んでいてもよい。増幅プライマーの配列のデザインは、マニュアルで行ってもよいし、適当なプライマーデザイン用のソフトウェアを用いてもよい。例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェア（http://frodo.wi.mit.edu）等を用いてもよい。
【００９８】
上記のバッファーは、前記ＤＮＡポリメラーゼの活性が得られる至適ｐＨ、および至適塩濃度を有する。使用する核酸増幅法によっては、更にリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）や逆転写酵素（ＲＴ）等を含んでいてもよい。また、核酸増幅用反応液は、各核酸増幅法の反応用として様々なタイプが市販されているが、そのような市販のキットに添付されたものを用いてもよい。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを酵素とする場合、当該遺伝子増幅用反応液の組成の基本的な一例を挙げれば、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）／５０ｍＭ  ＫＣｌ／２ｍＭ  ＭｇＣｌ２／２．５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。もちろん、この条件に限られるものではない。
【００９９】
反応液中のテンプレートとなる核酸の量としては、通常１０２〜１０６分子に相当する量があれば十分であり、例えばヒトの遺伝子では０．３ｎｇ〜３μｇ程度である。テンプレートの量が多すぎると非特異的増幅の頻度が増すので、反応液中に加える核酸の量は、１００μｌあたり０．５μｇ以下に抑えることが好ましい。
【０１００】
反応液中のクランプ核酸の量としては、検査試料中では通常、変異型核酸に対して野生型核酸が大多数であるため、やや過剰に加えておくことが好ましい。
【０１０１】
検査試料中の核酸とクランプ核酸とを含有する前記反応液中で、前記核酸増幅反応を行う。クランプ核酸は検出非標的核酸中に存在する相補的な配列に強く結合し、増幅反応の間のプライマーのアニーリングおよび／またはプライマーの伸長を阻害する。一方、本発明で用いられるクランプ核酸は高い塩基認識力を示し、一塩基でもミスマッチが存在すればテンプレートへの結合力は大幅に低下するため、検出標的核酸は通常の増幅反応に従って増幅される。その結果、検出標的核酸中の検出標的部位の少なくとも一部を含む検出領域が選択的に増幅される。
【０１０２】
（２）増幅された核酸を検出する工程
【０１０３】
本工程では、前記（１）の工程で増幅された核酸の検出領域の検出を行う。検出のために、検出標的核酸の検出領域の増幅が確認できるものであれば任意の方法を用いることができる。検出法は、増幅反応の最終産物に対して検出を行う方法と、増幅反応中に経時的に増幅を確認する方法とに大別される。いずれのグループについても、それぞれに適当なコントロールの結果と比較することで、より信頼性の高い結果を得ることができる。また、ダイレクトシークエンス法等により増幅産物における検出標的部位の塩基配列を確認することで、更に正確な結果を得ることができる。
【０１０４】
増幅反応の最終産物に対して検出を行う方法としては、例えば、増幅反応後の溶液をフェノール・クロロホルム（１：１）溶液で除タンパク処理後、水層を直接か、あるいはエタノール沈殿や適当な精製キットを用いて精製した後、波長２６０ｎｍの吸光度を吸光光度計を用いて測定する方法；増幅産物を電気泳動によりアガロースゲル、またはポリアクリルアミドゲルで展開した後、適当なプローブを用いてサザンハイブリダイゼーション法によって検出する方法；金ナノ粒子を用いたクロマトハイブリダイゼーション法によって検出する方法；増幅した核酸による溶液の濁度を測定する方法；増幅プライマーの５'末端を予め蛍光標識しておき、増幅反応後にアガロースゲル、またはポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、イメージングプレートに蛍光発光を取り込み、適当な検出装置を用いて検出する方法等が挙げられる。
【０１０５】
増幅反応中に経時的に増幅を確認する方法としては、増幅産物の増加を反映する蛍光強度の増加を経時的に検出する方法が挙げられる。具体的には、例えば、インターカレーター法（Higuchi et al., BioTechnology 10, 413-417 (1992)）、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ法（米国特許第5210015号、同第5538848号）、サイクリングプローブ法（Bekkaoui et al., Biotechniques 20, 240-248 (1996)）等のリアルタイムＰＣＲ法が挙げられ、検出の感度および精度に優れる点でＴａｑＭａｎＴＭプローブ法およびサイクリングプローブ法が好ましい。リアルタイムＰＣＲ法のためには、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した専用の装置が必要である。そのような装置としては例えば、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（ＡＢＩ社）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＮａｎｏ（Ｒｏｃｈｅ社）等が挙げられる。
【０１０６】
本工程で好ましく用いられ得る検出法としては、検出標的核酸において塩基配列の相違を検出すべき特定の部位を含む領域の塩基配列に完全に相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸である検出用プローブを用いるものが挙げられる。具体的には、例えばサザンハイブリダイゼーション法、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ法、サイクリングプローブ法等において、そのような塩基配列を有するように設計されたプローブを用いる方法である。
【０１０７】
インターカレーターは、二本鎖核酸の塩基対間に特異的に結合して蛍光を発する試薬であり、励起光を照射すると蛍光を発する。インターカレーターに由来する蛍光強度の検出に基づいて、プライマー伸長産物の量を知ることができる。本発明においては、通常この分野で用いられる任意のインターカレーターを用いることができるが、例えば、ＳＹＢＲＴＭ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）、エチジウムブロマイド、フルオレン等である。
【０１０８】
ＴａｑＭａｎＴＭプローブ法は、一方の末端（通常、５’末端）を蛍光基（レポーター)で、他方の末端（通常、３’末端）を消光基で標識した、対象核酸の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法により、目的の微量な核酸を高感度かつ定量的に検出できる方法である。該プローブは、通常の状態では消光基によってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブを検出領域に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。この蛍光強度をリアルタイムにモニタリングすることにより、鋳型となる核酸の初期量を正確に定量することができる。
【０１０９】
本発明において用いられるプローブは、リアルタイムＰＣＲを行った場合に増幅されると予測されるプライマー伸長産物の塩基配列を含む蛍光標識プローブである。一般に、プローブの長さを長くすることで相補的な配列への結合力は強くなるため、ある程度の長さが必要であるが、一方でプローブが長くなると塩基特異性が低くなる傾向があるため、長過ぎないことが必要である。具体的なプローブの長さとしては、通常５〜４０ｍｅｒ、好ましくは８〜３５ｍｅｒ、より好ましくは１０〜２５ｍｅｒである。また、該プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、またはＬＮＡやＢＮＡ等の修飾核酸、またはそれらの組み合わせによって構成される。上述の通り、ＢＮＡは相補的な配列への結合力、塩基認識力、および分解酵素耐性の点でＤＮＡやＲＮＡ等よりも優れているため、プローブは、ＢＮＡの単位構造を含むことが好ましい。プローブがＢＮＡの単位構造を含む場合の好ましい単位構造（即ち、ヌクレオシド類縁体）としては、クランプ核酸について上述したものが適用される。また、検出標的核酸において塩基配列の相違を検出すべき特定の部位を含む領域に完全に相補的な塩基配列を有するプローブを用いる場合は、当該部位に対応するプローブ中の箇所をＢＮＡの単位構造とすることが好ましい。
【０１１０】
上記のレポーター蛍光物質としては、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ)、へキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ)、テトラクロロフルオレセイン(ＴＥＴ)、Ｃｙ５(アマシャムバイオサイエンス株式会社)等が挙げられるが、中でもＦＡＭが好ましい。一方、クエンチャー色素としては、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）等の蛍光物質、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ色素（例えばＢＨＱ２)、４−（（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）ａｚｏ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＡＢＣＹＬ）等の非蛍光物質が挙げられるが、中でもＴＡＭＲＡが好ましい。
【０１１１】
当該プローブは、上記の米国特許第5210015号や同第5538848号、あるいはクランプ核酸の合成について上掲した文献等に基づいて行うことができる。あるいは、適当な業者による受託合成を利用してもよい。
【０１１２】
サイクリングプローブ法は、ＲＮＡとＤＮＡからなるキメラプローブとＲＮａｓｅ  Ｈの組み合わせによる高感度な検出方法である。該プローブは、ＲＮＡ部分を挟んで一方が蛍光物質（リポーター）で、もう一方が蛍光を消光する物質（クエンチャー）で標識されている。このプローブは、インタクトな状態ではクエンチングにより蛍光を発しないが、配列が相補的な増幅産物とハイブリッドを形成した後にＲＮａｓｅ  ＨによりＲＮＡ部分が切断されると、強い蛍光を発するようになる。この蛍光強度を測定することで、増幅産物の量をモニターすることができる。サイクリングプローブのＲＮＡ付近にミスマッチが存在すると、ＲＮａｓｅ  Ｈによる切断は起こらないため、一塩基の違いも認識できる非常に特異性の高い検出が可能である。
サイクリングプローブについても、適当な業者に設計・合成を委託する等して取得することができる。
【０１１３】
（変異検出用キット）
本発明はまた、本発明の方法を実施するために使用できるキット（以下、本発明のキットともいう）を提供する。本発明のキットは、（ａ）検出非標的核酸における該検出標的部位の塩基配列に相補的な塩基配列を有するクランプ核酸、および、（ｂ）検査試料中の検出標的核酸における該検出標的部位の少なくとも一部を含む領域を選択的に増幅させるための試薬を含む。
【０１１４】
上記（ａ）のクランプ核酸の好ましい態様および具体例は、本発明の方法において説明した通りである。
【０１１５】
上記（ｂ）の試薬は、本発明の方法において説明したような核酸増幅法を行うための試薬であるが、本発明のキットは、必ずしも当該増幅法を行うために必須となる全ての試薬を含まなくてもよい。
【０１１６】
本発明のキットは、好ましくは、（ｂ）の試薬として、前記の増幅プライマーを含む。増幅プライマーは、典型的には、ＰＣＲ用の増幅プライマーである。
【０１１７】
本発明のキットは更に、ヌクレオシド三リン酸、核酸合成酵素、増幅反応用緩衝液の１つ以上を含み得る。ヌクレオシド三リン酸は、核酸合成酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰ等）である。核酸合成酵素は、キットが対象とする核酸増幅法に応じた酵素であり、適当なＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等である。増幅反応用の緩衝液としては、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常の核酸増幅反応やハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられる緩衝液が挙げられ、そのｐＨも特に限定されないが、通常５〜９の範囲が好ましい。
【０１１８】
本発明のキットはまた、本発明の方法において説明したような検出法を行うための試薬を含み得る。好ましい試薬としては、上記のリアルタイムＰＣＲのために用いられる、インターカレーター、蛍光標識プローブ、サイクリングプローブ等が挙げられる。また、例えば安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害せず、核酸増幅反応やハイブリダイゼーション反応を阻害しないものが含まれていてもよい。これらの濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
【０１１９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【０１２０】
（材料および装置）
実施例で用いた各種のオリゴヌクレオチドを表１−１および１−２に示す。これらのオリゴヌクレオチドは、株式会社ジーンデザインおよび株式会社グライナー・ジャパン社、株式会社バイオロジカなどに合成を委託した。なお、用いたＢＮＡは、上記の一般式（Ｉ）においてＲ１がメチル基であり、ｍが０であり、かつｎ１が１であるヌクレオシド類縁体を単位構造とするものである。【０１２１】
【表１−１】
2014051076.tif 000015
【０１２２】
【表１−２】
2014051076.tif 000016
【０１２３】
［実施例１］モデル検査試料によるＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異の検出実験１（各種のＢＮＡオリゴヌクレオチドのクランプ効果）
（１）検査試料
ＫＲＡＳ遺伝子の野生型遺伝子試料として市販のＨｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを、またＧ１２Ｖ変異型遺伝子試料としてＳＷ４８０培養細胞から抽出したＤＮＡを用いた。各ＤＮＡ量は、各試料のＵＶスペクトルと、オリゴ１、２、３をｆｏｒｗａｒｄプライマー、ｒｅｖｅｒｓｅプライマー、核酸増幅用プローブとしたリアルタイムＰＣＲで得られたＣｔ値により求めた。そのＤＮＡ量に基づき、変異型が１００％、１０％、１．０％、０．１％、０．０１％および０％となるモデル検査試料を作製し、それぞれのモデル検査試料を実験あたり各５０ｎｇの量で用いた。
（２）核酸増幅装置および核酸増幅用試薬
ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（ＡＢＩ社製）をリアルタイムＰＣＲ装置に、ＴａｑＭａｎＴＭＦａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢＩ社製）を核酸増幅用試薬に用いた。本試薬の使用量は、添付マニュアルに準じた。
（３）プライマー、核酸増幅用プローブ、クランプ核酸
Ｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅプライマーとしてオリゴ１とオリゴ２を実験あたり各１０ｐｍｏｌ使用し、核酸増幅用プローブとしてオリゴ３を実験あたり２．５ｐｍｏｌ使用した。クランプ核酸としてオリゴ４〜６（ＢＮＡオリゴヌクレオチド）をそれぞれ実験あたり１０ｐｍｏｌ使用した。
（４）核酸増幅操作および結果
上記（１）〜（３）の検査試料、核酸増幅用試薬、プライマー、核酸増幅用プローブ、クランプ核酸の混合液を核酸増幅装置にて、（i）５０℃で２分間、（ii）９５℃で２０秒間、（iii）９５℃で１０秒間、（iv）５７℃で６０秒間、その後（v）（iii）〜（iv）の操作を５５回繰り返した。それぞれの検査試料、それぞれのクランプ核酸による核酸増幅用プローブでの核酸増幅過程（４５サイクルまで）をモニターした核酸増幅曲線を図２〜４に、Ｃｔ値データを表２に示す。表中、Ｍは変異型を、Ｗは野生型を示す。なお、Ｃｔ値とは、ＰＣＲ増幅産物がある一定量に達したときのサイクル数を意味しており、ΔＣｔ値とは、変異型が０％の試料と各検査試料との間のＣｔ値の差を意味している。【０１２４】
【表２】
2014051076.tif 000017
【０１２５】
１０〜１８ ｍｅｒ のＢＮＡオリゴヌクレオチド（オリゴ４〜６）のいずれにおいても、検査試料中の変異型遺伝子の割合（Ｍ／（Ｍ＋Ｗ））が１％と０％との間で核酸増幅曲線およびＣｔ値に大きな差が認められ、両者を区別できることが判明した。
（５）核酸増幅操作後のダイレクトシークエンス解析の結果
オリゴ６を用いた上記のＢＮＡクランプ法によるリアルタイムＰＣＲでの各検査試料（（Ｍ／（Ｍ＋Ｗ）の１００％〜０％遺伝子混合試料）の核酸増幅５５サイクル後の増幅産物をダイレクトシークエンス解析したコドン１２近傍の塩基配列解析図を図５に示す。本図より、ＢＮＡクランプ法による核酸増幅のダイレクトシークエンス解析によれば、Ｍ／（Ｍ＋Ｗ）＝０．１％の検査試料でも変異型遺伝子の存在が確認できる、即ち、変異型の検出感度が０．１％以下であることが判明した。【０１２６】
［実施例２］モデル検査試料によるＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異の検出実験２（ＢＮＡとＤＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡとのクランプ効果の比較）
（１）検査試料
ＫＲＡＳ遺伝子の野生型遺伝子試料として市販のＨｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを、またＧ１２Ｖ変異型遺伝子試料としてＳＷ４８０培養細胞から抽出したＤＮＡを用いた。各ＤＮＡ量は、各試料のＵＶスペクトルとオリゴ１、２、３をｆｏｒｗａｒｄプライマー、ｒｅｖｅｒｓｅプライマー、核酸増幅用プローブとしたリアルタイムＰＣＲで得られたＣｔ値により求めた。そのＤＮＡ量に基づき、変異型が１００％、１０％、１．０％、０．１％、０．０１％および０％となるモデル検査試料を作製し、それぞれのモデル検査試料を実験あたり各５０ｎｇの量で用いた。
（２）核酸増幅装置および核酸増幅用試薬
ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（ＡＢＩ社製）をリアルタイムＰＣＲ装置に、ＴａｑＭａｎＴＭＦａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢＩ社製）を核酸増幅用試薬に用いた。本試薬の使用量は、添付マニュアルに準じた。
（３）プライマー、核酸増幅用プローブ、クランプ核酸
Ｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅプライマーとしてオリゴ１とオリゴ２を実験あたり各１０ｐｍｏｌ使用し、核酸増幅用プローブとしてオリゴ３を実験あたり２．５ｐｍｏｌ使用した。クランプ効果を比較評価するため、オリゴ５、６（ＢＮＡ）、オリゴ８、１１（ＤＮＡ）、オリゴ９、１２（ＬＮＡ）およびオリゴ１０、１３(ＰＮＡ)をそれぞれ実験あたり１０ｐｍｏｌ用いた。
（４）核酸増幅操作および結果
上記（１）〜（３）の検査試料、核酸増幅用試薬、プライマー、核酸増幅用プローブ、クランプ核酸の混合液を核酸増幅装置にて、（ｉ）５０℃で２分間、（ii）９５℃で２０秒間、（iii）９５℃で１０秒間、（iv）５７℃で６０秒間、その後（v）（iii）〜（iv）の操作を５５回繰り返した。それぞれの検査試料、それぞれのクランプ核酸による核酸増幅用プローブでの核酸増幅過程（４５サイクルまで）をモニターした遺伝子増幅曲線を図６〜７に、Ｃｔ値データを表３〜４に、各Ｃｔ値の比較図を図８〜９に示す。【０１２７】
【表３】
2014051076.tif 000018
【０１２８】
【表４】
2014051076.tif 000019
【０１２９】
これらの結果から、ＢＮＡオリゴヌクレオチドが他のオリゴヌクレオチドよりもクランプ効果に優れていることが実証された。【０１３０】
［実施例３］モデル検査試料によるＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異の検出実験３（ＢＮＡクランプ核酸＋変異検出用プローブの検出効果）
（１）検査試料
ＫＲＡＳ遺伝子の野生型遺伝子試料として市販のＨｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを、またＧ１２Ｖ変異型遺伝子試料としてＳＷ４８０培養細胞から抽出したＤＮＡを用いた。各ＤＮＡ量は、各試料のＵＶスペクトルとオリゴ１、２、３をｆｏｒｗａｒｄプライマー、ｒｅｖｅｒｓｅプライマー、核酸増幅用プローブとしたリアルタイムＰＣＲで得られたＣｔ値により求めた。そのＤＮＡ量に基づき、変異型が１００％、１０％、１．０％、０．１％、０．０１％および０％となるモデル検査試料を作成した。それぞれのモデル検査試料を実験あたり各５０ｎｇの量で用いた。
（２）核酸増幅装置および核酸増幅用試薬
ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（ＡＢＩ社製）をリアルタイムＰＣＲ装置に、ＴａｑＭａｎＴＭＦａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢＩ社製）を核酸増幅用試薬に用いた。本試薬の使用量は、添付マニュアルに準じた。
（３）プライマー、核酸増幅用プローブ、クランプ核酸、変異検出用プローブ
Ｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅプライマーにオリゴ１とオリゴ２を実験あたり各１０ｐｍｏｌ使用し、核酸増幅用プローブにオリゴ３−２を実験あたり２．５ｐｍｏｌ使用した。クランプ核酸にオリゴ６（ＢＮＡ）を実験あたり１０〜１ｐｍｏｌ、変異検出用プローブにオリゴ１４、オリゴ１４−２、オリゴ１５およびオリゴ１５−２を実験あたり５ｐｍｏｌ使用した。
（４）核酸増幅操作および結果
上記（１）〜（３）の検査試料、核酸増幅用試薬、プライマー、核酸増幅用プローブ、クランプ核酸および変異検出用プローブの混合液を核酸増幅装置にて、（i）５０℃で２分間、（ii）９５℃で２０秒間、（iii）９５℃で１０秒間、（iv）５７℃で６０秒間、その後（v）（iii）〜（iv）の操作を５５回繰り返した。クランプ核酸（オリゴ６）を１０ｐｍｏｌ使用し、それぞれの検査試料による核酸増幅用プローブおよび変異検出用プローブ（オリゴ１５）での核酸増幅過程（４５サイクルまで）をモニターした核酸増幅曲線およびＣｔ値を図１０および図１１に示す。
また、クランプ核酸（オリゴ６）を１ｐｍｏｌ使用し、それぞれの検査試料による上記各４種の変異検出用プローブでの核酸増幅過程（５５サイクルまで）をモニターした核酸増幅曲線およびＣｔ値データを図１２および図１３に示す。これらの図およびＣｔ値データから明らかなように、本ＢＮＡクランプ技術と変異検出プローブを併用することで、ＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異型の存在割合（Ｍ／（Ｍ＋Ｗ））が０．０１％の検査試料と０％の検査試料との間でも、ΔＣｔ値（０％−Ｘ％）が大きな数値となり、野生型遺伝子中に０．０１％のＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異型が含まれているＤＮＡ検査試料から変異型の存在を明確に検出できることが実証された。
また、図１２および図１３からのΔＣｔ値比較より、ＢＮＡオリゴヌクレオチドは変異検出用プローブとしても秀でた機能性を有することが明らかとなった。すなわち、１５ｍｅｒ、１０ ｍｅｒのＢＮＡ変異検出用プローブの各試料濃度でのΔＣｔ値が相当するＤＮＡプローブでのΔＣｔ値よりも大きい。特に、単鎖（１０ ｍｅｒ）のプローブの場合にはΔＣｔ値差は非常に大きい。【０１３１】
［実施例４］モデル検査試料によるＫＲＡＳ遺伝子における主要７変異（Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ）を検出する実験（ＢＮＡクランプ法＋変異検出用プローブ）
（１）検査試料
ＫＲＡＳ遺伝子の野生型および各変異型の遺伝子試料として市販のそれぞれ該当するＨｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを用いた。各ＤＮＡ量は、各試料のＵＶスペクトルと、オリゴ１、２、３をｆｏｒｗａｒｄプライマー、ｒｅｖｅｒｓｅプライマー、核酸増幅用プローブとしたリアルタイムＰＣＲで得られたＣｔ値により求めた。そのＤＮＡ量に基づき、各変異型が１０％、１．０％、０．１％、０．０１％および０％となるモデル検査試料を作製し、それぞれのモデル検査試料を実験あたり各５０ｎｇの量で用いた。
（２）核酸増幅装置および核酸増幅用試薬
ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（ＡＢＩ社製）をリアルタイムＰＣＲ装置に、ＴａｑＭａｎＴＭＦａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢＩ社製）を核酸増幅用試薬に用いた。本試薬の使用量は、添付マニュアルに準じた。
（３）プライマー、核酸増幅用プローブ、クランプ核酸
Ｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅプライマーとしてオリゴ１とオリゴ２を実験あたり各１０ｐｍｏｌ使用し、核酸増幅用プローブとしてオリゴ３−２を実験あたり２．５ｐｍｏｌ使用した。クランプ核酸としてオリゴ６（ＢＮＡオリゴヌクレオチド）を実験あたり１０ｐｍｏｌ使用した。
また、各変異型を選択的に認識して検出するためのプローブには、それぞれの変異型に該当する変異検出用プローブ（オリゴ１４［Ｇ１２Ｖ用］、オリゴ１６［Ｇ１２Ｄ用］、オリゴ１７［Ｇ１３Ｄ用］、オリゴ１８［Ｇ１２Ａ用］、オリゴ１９［Ｇ１２Ｃ用］、オリゴ２０［Ｇ１２Ｓ用］、オリゴ２１［Ｇ１２Ｒ用］）を各実験あたり５ｐｍｏｌ使用した。
（４）核酸増幅操作および結果
上記（１）〜（３）の検査試料、核酸増幅用試薬、プライマー、各プローブ、クランプ核酸の混合液を核酸増幅装置にて、（i）５０℃で２分間、（ii）９５℃で２０秒間、（iii）９５℃で１０秒間、（iv）５７℃（対象がＧ１２Ｄの場合には、５４℃）で６０秒間、その後（v）（iii）〜（iv）の操作を５５回繰り返した。
ＫＲＡＳ遺伝子の各変異型検査試料での核酸増幅過程（４５〜５５サイクルまで）を核酸増幅用プローブならびに各変異検出用プローブで核酸増幅をモニターした核酸増幅曲線を図１４〜２０に、Ｃｔ値データを表５および表６に示す。これらのデータから、ＫＲＡＳ遺伝子の主要７変異のいずれの場合においても、本ＢＮＡクランプ法が、全核酸増幅をモニターする核酸増幅用プローブ単独での評価において、それぞれの変異の有無を高感度（ほぼ０．１％程度まで）で検出でき、各変異検出用プローブでの評価においては、それぞれの変異の有無ならびに変異様式をより高感度（＜０．１％）で検出できる技術であることを明らかにしている。【０１３２】
【表５】
2014051076.tif 000020
【０１３３】
【表６】
2014051076.tif 000021
【０１３４】
［実施例５］癌患者の組織ＦＦＰＥ由来のＤＮＡを検体試料としたＢＮＡクランプ法によるＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異の検出
（１）検査試料
市販のＦＦＰＥ臨床組織検体（ＫＲＡＳ野生型）から抽出したｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡとＫＲＡＳ遺伝子Ｇ１２Ｖ変異ｇｅｎｏｍｉc  ＤＮＡを用いた。各ＤＮＡ量は、各試料のＵＶスペクトルと、オリゴ１、２、３をｆｏｒｗａｒｄプライマー、ｒｅｖｅｒｓｅプライマー、核酸増幅用プローブとしたリアルタイムＰＣＲで得られたＣｔ値により求めた。そのＤＮＡ量に基づき、Ｇ１２Ｖ変異型が１．０％、０．５％、０．１％、０．０５％および０％となる混合検査試料を作製し、それぞれの検査試料を実験あたり各２０ｎｇの量で用いた。
（２）核酸増幅装置および核酸増幅用試薬
実施例４と同様の装置および試薬を用いた。
（３）プライマー、核酸増幅用プローブ、クランプ核酸、変異検出用プローブ
Ｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅプライマーとしてオリゴ１とオリゴ２を実験あたり各２０ｐｍｏｌ使用し、核酸増幅用プローブとしてオリゴ３−２を実験あたり５ｐｍｏｌ使用した。ＢＮＡクランプ核酸としてオリゴ４−２、オリゴ５、オリゴ６（ＢＮＡオリゴヌクレオチド）をそれぞれ実験あたり２０ｐｍｏｌ使用した。
Ｇ１２Ｖ変異型を選択的に検出するための変異検出用プローブにはオリゴ１４を実験あたり１０ｐｍｏｌ使用した。
（４）核酸増幅操作および結果
上記（１）〜（３）の検査試料、核酸増幅用試薬、プライマー、核酸増幅用プローブ、クランプ核酸、変異検出用プローブの混合液を核酸増幅装置にて、（i）５０℃で２分間、（ii）９５℃で２０秒間、（iii）９５℃で１０秒間、（iv）５７℃で６０秒間、その後（v）（iii）〜（iv）の操作を４５〜５５回繰り返した。それぞれの検査試料での核酸増幅過程（４５サイクルまで）を核酸増幅用プローブおよび各変異検出用プローブでモニターした核酸増幅曲線を図２１〜２３に示す。また、本実験でのＣｔ値データを表７にまとめた。
これらのデータから、患者組織ＦＦＰＥ由来のＤＮＡを検査試料とした場合でも、ＫＲＡＳ遺伝子の点変異を、本ＢＮＡクランプ法と変異検出用プローブとを組み合わせる核酸増幅手法は、その変異の有無ならびに変異様式を高感度（ほぼ０．１％程度）で検出解析できることが判明した。【０１３５】
【表７】
2014051076.tif 000022
【０１３６】
［実施例６］ＢＮＡクランプ法によるＥＧＦＲ遺伝子エクソン１９欠失変異の検出
（１）検体試料
ＥＧＦＲ遺伝子の野生型およびE746-A750 del (Type 1) 欠失変異型の遺伝子試料として市販のそれぞれ該当するＨｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを用いた。各ＤＮＡ量は、各試料のＵＶスペクトルと、オリゴ２２、２３、２４をｆｏｒｗａｒｄプライマー、ｒｅｖｅｒｓｅプライマー、核酸増幅用プローブとしたリアルタイムＰＣＲで得られたＣｔ値により求めた。そのＤＮＡ量に基づき、欠失変異型が１００％、１０％、１．０％、０．１％、０．０１％および０％となるモデル検査試料を作製し、それぞれのモデル検査試料を実験あたり各５０ｎｇの量で用いた。
（２）核酸増幅装置および核酸増幅用試薬
ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（ＡＢＩ社製）をリアルタイムＰＣＲ装置に、ＴａｑＭａｎＴＭＦａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢＩ社製）を核酸増幅用試薬に用いた。本試薬の使用量は、添付マニュアルに準じた。
（３）プライマー、核酸増幅用プローブ、クランプ核酸、変異検出用プローブ
Ｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅプライマーとしてオリゴ２２とオリゴ２３を実験あたり各１０ｐｍｏｌ使用し、核酸増幅用プローブとしてオリゴ２４を実験あたり２．５ｐｍｏｌ使用し、ＢＮＡクランプ核酸にはオリゴ２５を実験あたり１０ｐｍｏｌ使用し、欠失変異型を選択的に認識して検出するための変異検出用プローブにオリゴ２６を実験あたり５ｐｍｏｌ使用した。
（４）核酸増幅操作および結果
上記（１）〜（３）の検査試料、核酸増幅用試薬、プライマー、核酸増幅用プローブ、クランプ核酸、変異検出用プローブの混合液を核酸増幅装置にて、（i）５０℃で２分間、（ii）９５℃で２０秒間、（iii）９５℃で１０秒間、（iv）５３℃で６０秒間、その後（v）（iii）〜（iv）の操作を４５〜５５回繰り返した。それぞれの検査試料での核酸増幅過程（５５サイクルまで）を核酸増幅用プローブ（オリゴ２４）および変異検出用プローブ（オリゴ２６）でモニターした核酸増幅曲線を図２４に示す。また、本実験でのＣｔ値データを表８にまとめた。
また、ＢＮＡオリゴクランプの効果を比較するため、オリゴ２５の代わりにオリゴ２７（ＬＮＡ）、オリゴ２８（ＰＮＡ）、オリゴ２９（ＤＮＡ）をそれぞれクランプオリゴに用いて、同一条件下（ただし、変異検出用プローブのオリゴ２６は未使用）で実験し、オリゴ２４で核酸増幅過程をモニターした（図２５および表９）。
これらのデータから、ＥＧＦＲ遺伝子の欠失変変異を対象とした場合でも、本ＢＮＡクランプ法と変異検出用プローブとを組み合わせる核酸増幅手法は、その変異の有無ならびに変異様式を高感度（０．１％以上）で検出解析できることが判明した。また、クランプオリゴとしてのＢＮＡオリゴは、他のオリゴ素材（ＬＮＡ、ＰＮＡ等）よりも高機能性であることも明らかとなった。【０１３７】
【表８】
2014051076.tif 000023
【０１３８】
【表９】
2014051076.tif 000024
【０１３９】
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
ＢＮＡクランプ技術に関する本発明は、変異型遺伝子の存在割合が明らかである「モデル検査試料」での「特定遺伝子の特別な変異」を高感度高精度で検出するための技術に限定されず、（１）種々の検査試料の形態（生体組織、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片、体液等）から適切な単離操作によって得られる様々な遺伝子ＤＮＡサンプルを検査試料とすることができ、かつ（２）野生型遺伝子中に極微量含まれる様々な変異型遺伝子の存在の有無を高感度・高精度・簡便に検出できる検査手法を提供するものである。
また、ＢＮＡクランプ技術と変異検出用プローブを併用することで、検出感度精度がより一層向上させることが可能となり、変異型遺伝子の有無だけではなく、変異型の様式の特定・解析が可能で、産業上の多様なニーズに柔軟に対応できる基盤的技術である。【０１４１】
本願は、２０１２年９月２８日出願の日本国特許出願、特願２０１２-２１７６５７を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。
【図８】
2014051076.tif 000034
【図１】
2014051076.tif 000035
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2014051076.tif 000040
【図７】
2014051076.tif 000041
【図９】
2014051076.tif 000042
【図１０】
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【図１１】
2014051076.tif 000044
【図１２】
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【図１３】
2014051076.tif 000046
【図１４】
2014051076.tif 000047
【図１５】
2014051076.tif 000048
【図１６】
2014051076.tif 000049
【図１７】
2014051076.tif 000050
【図１８】
2014051076.tif 000051
【図１９】
2014051076.tif 000052
【図２０】
2014051076.tif 000053
【図２１】
2014051076.tif 000054
【図２２】
2014051076.tif 000055
【図２３】
2014051076.tif 000056
【図２４】
2014051076.tif 000057
【図２５】
2014051076.tif 000058
【配列表】
2014051076000001.app
【国際調査報告】
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