(57)【要約】  既知のヒノキ花粉アレルゲンとは異なる新規なヒノキ花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープペプチドの提供。  配列番号３〜１６で示されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるペプチド、又は当該ペプチドにおいて１〜３個のアミノ酸が置換及び／又は１〜１０個のアミノ酸が欠失若しくは付加したペプチドであって、且つＴ細胞刺激活性を有するペプチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３〜１６で示されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるペプチド、又は当該ペプチドにおいて１〜３個のアミノ酸が置換及び／又は１〜１０個のアミノ酸が欠失若しくは付加したペプチドであって、且つＴ細胞刺激活性を有するペプチド。
【請求項２】
１〜１０個のアミノ酸が欠失したペプチドが、当該ペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側のアミノ酸が欠失したものである、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側のアミノ酸が欠失し、少なくとも「ＦＫＥＫＩＶＹＥＧＨＷ」を有するペプチド、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側のアミノ酸が欠失し、少なくとも「ＰＹＹＱＩＩＹＨＰＡＳ」を有するペプチド、又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側のアミノ酸が欠失し、少なくとも「ＦＫＶＩＴＴＮＫＱ」を有するペプチドである、請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載されたペプチドの１種又は２種以上を有効成分として含有する、ヒノキ花粉症のペプチド免疫療法剤。
【請求項５】
ヒノキ花粉症のペプチド免疫療法剤を製造するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載されたペプチドの１種又は２種以上の使用。
【請求項６】
ヒノキ花粉症のペプチド免疫療法に使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載されたペプチドの１種又は２種以上。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載されたペプチドの１種又は２種以上を投与するヒノキ花粉症のペプチド免疫療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒノキ花粉に由来する新規なアレルゲンタンパク質のＴ細胞エピトープペプチド、及び当該ペプチドを有効成分とする、ヒノキ花粉症に対するペプチド免疫療法用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒノキ花粉の飛散量は昭和４０年代にはわずかであったが、その後の２０年ほどの間に３倍以上に増えた。スギの植林は昭和２０年代に集中的に行われ、昭和４０年代後半には花粉を飛ばし始める壮年期を迎えた。ヒノキはスギ植林の後の昭和３０年代に集中的に植林され、スギに遅れて壮年期を迎えたところである。近年の比較では、ヒノキの植生数がスギの植生数に匹敵しつつあり、今後はヒノキ花粉症が増えてくるものと予想されることから、ヒノキ花粉特有の抗原を用いた免疫療法の必要性が指摘されている。【０００３】
免疫療法の大きな問題点はアナフィラキシー反応である。アナフィラキシー反応は抗原特異的ＩｇＥ抗体と抗原がマスト細胞上で結合することにより放出されるケミカルメディエーターによって引き起こされる。Ｔ細胞エピトープを用いたペプチド免疫療法は、ＩｇＥ抗体に結合する部分を含まず、免疫寛容に関わるＴ細胞エピトープを有効成分とする免疫療法であり、いままでにネコ、ダニ、スギ花粉、ブタクサ花粉などの抗原から同定されたＴ細胞エピトープを用いたペプチド免疫療法剤が臨床応用されてきた（非特許文献１及び２）。また、ヒノキ花粉に関しても、主要抗原であるＣｈａ  ｏ１とＣｈａ  ｏ２について、Ｔ細胞エピトープペプチドが同定されている（特許文献１、非特許文献３及び４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−１９５７１８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Valenta R. et al., Annu. Rev. Immunol., 2010:211-241, 2010
【非特許文献２】Casale T. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 127:8-15, 2011
【非特許文献３】Sone, T. et al., Clin. Exp. Allergy, 35:664-671, 2005
【非特許文献４】Sone, T. et al., Allergol. Int., 58:237-245, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、今後増加すると考えられるヒノキ花粉症に対する免疫療法の有効性向上に貢献すべく、既知のヒノキ花粉アレルゲンとは異なる新規なヒノキ花粉アレルゲンのＴ細胞エピトープペプチドを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ヒノキ花粉の中に多量に存在し、Ｃｈａ  ｏ１やＣｈａ  ｏ２と同等以上のアレルゲン活性を有する新規ヒノキ花粉アレルゲンを見出し、既に特許出願を行った（ＰＣＴ／ＪＰ２０１２／０５２１１０）。そして、更にスギ花粉症のヒノキ花粉感作症例より、当該ヒノキ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞ラインを個別に樹立し、その中から主要なＴ細胞エピトープを決定し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の１）〜４）に係るものである。
１）配列番号３〜１６で示されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるペプチド、又は当該ペプチドにおいて１〜３個のアミノ酸が置換及び／又は１〜１０個のアミノ酸が欠失若しくは付加したペプチドであって、且つＴ細胞刺激活性を有するペプチド。
２）１〜１０個のアミノ酸が欠失したペプチドが、当該ペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側のアミノ酸が欠失したものである、上記１）のペプチド。
３）配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側のアミノ酸が欠失し、少なくとも「ＦＫＥＫＩＶＹＥＧＨＷ」を有するペプチド、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側のアミノ酸が欠失し、少なくとも「ＰＹＹＱＩＩＹＨＰＡＳ」を有するペプチド、又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側のアミノ酸が欠失し、少なくとも「ＦＫＶＩＴＴＮＫＱ」を有するペプチドである、上記２）のペプチド。
４）上記１）〜３）のいずれかに記載されたペプチドの１種又は２種以上を有効成分として含有する、ヒノキ花粉症のペプチド免疫療法剤。
５）ヒノキ花粉症のペプチド免疫療法剤を製造するための、上記１〜３のペプチドの１種又は２種以上の使用。
６）ヒノキ花粉症のペプチド免疫療法に使用するための、上記１〜３のペプチドの１種又は２種以上。
７）上記１〜３のペプチドの１種又は２種以上を投与するヒノキ花粉症のペプチド免疫療法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のペプチド群は、単独で又は複数組み合わせることによりヒノキ花粉症に対する免疫療法剤として有用である。さらに、既知のヒノキ花粉アレルゲンであるＣｈａ  ｏ１やＣｈａ  ｏ２のＴ細胞エピトープペプチドと組み合わせることによって、スギ花粉エキスを用いた免疫療法で効果が不十分であったヒノキ花粉感作症例に対して、有用なペプチド免疫療法が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】各オーバーラップペプチドのＴ細胞刺激活性を示す。
【図２】本発明ペプチドのヒノキ花粉特異的ＩｇＥとの結合能を示す。
【図３】短縮ペプチド（ペプチド番号：＃５２）のＴ細胞刺激活性を示す。
【図４】短縮ペプチド（ペプチド番号：＃２４）のＴ細胞刺激活性を示す。
【図５】短縮ペプチド（ペプチド番号：＃３８）のＴ細胞刺激活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書中のアミノ酸配列は、１文字表記で記載している。
本発明の配列番号３〜１６で示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるヒノキ花粉アレルゲンタンパク質、又はそのアイソフォーム（配列番号１で示されるアミノ酸配列において、２番目のＰｒｏがＴｈｒに、２３０番目のＶａｌがＩｌｅに、２７１番目のＶａｌがＩｌｅにそれぞれ置換）である配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の一次構造よりシグナルペプチドであるＮ末端から２８アミノ酸を除いた、Ｎ末端ＬｅｕよりＣ末端Ｌｅｕに至る全５２８アミノ酸からなるタンパク質の、２０アミノ酸残基（一部１８アミノ酸残基）からなる部分ペプチドである。本発明の各ペプチドの配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列上の位置は、後記表１〜３に示すとおりであり、すなわち、配列番号３（ペプチド番号：＃１２）：配列番号１の１１１〜１３０番目、配列番号４（ペプチド番号：＃１３）：配列番号１の１２１〜１４０番目、配列番号５（ペプチド番号：＃２０）：配列番号１の１９１〜２１０番目、配列番号６（ペプチド番号：＃２１）：配列番号１の２０１〜２２０番目、配列番号７（ペプチド番号：＃２４）：配列番号１の２３１〜２５０番目、配列番号８（ペプチド番号：＃３１）：配列番号１の３０１〜３２０番目、配列番号９（ペプチド番号：＃３７）：配列番号１の３６１〜３８０番目、配列番号１０（ペプチド番号：＃３８）：配列番号１の３７１〜３９０番目、配列番号１１（ペプチド番号：＃３９）：配列番号１の３８１〜４００番目、配列番号１２（ペプチド番号：＃４１）：配列番号１の４０１〜４２０番目、配列番号１３（ペプチド番号：＃４２）：配列番号１の４１１〜４３０番目、配列番号１４（ペプチド番号：＃４９）：配列番号１の４８１〜５００番目、配列番号１５（ペプチド番号：＃５２）：配列番号１の５１１〜５２８番目、配列番号１６（ペプチド番号：＃５６）：配列番号２の２６１〜２８０番目である。
【００１１】
本発明の上記ペプチドは、スギ花粉症のヒノキ花粉感作症例より、当該配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるヒノキ花粉アレルゲンタンパク質に特異的なＴ細胞ラインを個別に樹立し、当該タンパク質又はそのアイソフォームの一次構造の全域をカバーする２０残基からなる５７種類のオーバーラップペプチドに対する増殖活性を評価することにより、Ｔ細胞エピトープとして同定されたものである（実施例２〜４参照）。したがって、本発明のペプチドには少なくとも一つのＴ細胞エピトープが存在し、本発明のペプチドはＴ細胞刺激活性を有するものである。
ここで、Ｔ細胞刺激活性とは、Ｔ細胞増殖又はリンホカイン分泌等のＴ細胞応答を誘導する活性をいい、ヒトや動物に投与することによってＴ細胞の免疫寛容を誘導し得る作用を意味する。ここで、Ｔ細胞刺激活性は、例えば、細胞内への［3Ｈ］チミジン取り込みを測定し、刺激係数を算出することにより決定できる。ここで用いるＴ細胞応答の刺激係数（Ｓ．Ｉ．値）は、ペプチド存在下で細胞内へ取り込まれた［3Ｈ］チミジンの放射能のｃｐｍを、ペプチド非存在下（対照）のｃｐｍで除したものとして計算する。本発明のペプチドは、平均Ｓ．Ｉ．値が２．０以上のものである。
このうち、あるペプチドの平均Ｓ．Ｉ．値に、当該ペプチドにＴ細胞応答を示す患者の出現頻度（％）を乗じた「重要度指数」が、少なくとも７０以上のものが好ましく、斯かるペプチドとしては、配列番号４（ペプチド番号：＃１３）、配列番号５（ペプチド番号：＃２０）、配列番号７（ペプチド番号：＃２４）、配列番号８（ペプチド番号：＃３１）、配列番号１０（ペプチド番号：＃３８）、配列番号１１（ペプチド番号：＃３９）、配列番号１２（ペプチド番号：＃４１）及び配列番号１５（ペプチド番号：＃５２）で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。斯かるペプチドは、スギ花粉やヒノキ花粉のアレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体に結合せずアナフィラキシーを引き起こすことがないことから、ヒノキ花粉アレルゲンに特異的なＴ細胞に対して免疫寛容を誘導することができる免疫療法剤として特に好適である。
【００１２】
また、本発明においては、上記配列番号３〜１６で示されるアミノ酸配列からなるペプチドの他に、当該ペプチドにおいて１〜３個のアミノ酸が置換及び／又は１〜１０個のアミノ酸が欠失若しくは付加したペプチドであって、且つＴ細胞刺激活性を有するペプチドが包含される。
ここで、１〜１０個のアミノ酸が欠失したペプチドとしては、例えばＮ末端側及び／又はＣ末端側のアミノ酸が欠失したペプチドが包含され、例えばＮ末端側のアミノ酸０〜１０残基、Ｃ末端側のアミノ酸０〜１０残基、合計で１〜１０個のアミノ酸を欠失したものが挙げられる。
具体的には、例えば、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（＃２４）の場合、Ｎ末端側のアミノ酸１〜３残基及び／又はＣ末端側のアミノ酸１〜６残基が欠失し、少なくとも「ＦＫＥＫＩＶＹＥＧＨＷ」を有するペプチド、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（＃３８）の場合、Ｎ末端側のアミノ酸６〜８残基及び／又はＣ末端側のアミノ酸１残基が欠失し、少なくとも「ＰＹＹＱＩＩＹＨＰＡＳ」を有するペプチド、配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（＃５２）の場合、Ｎ末端側のアミノ酸１〜２残基及び／又はＣ末端側のアミノ酸１〜７残基が欠失し、少なくとも「ＦＫＶＩＴＴＮＫＱ」を有するペプチドが挙げられる。
【００１３】
また、１〜１０個のアミノ酸が付加したペプチドとしては、Ｎ末端側及び／又はＣ末端側に１〜１０のアミノ酸が付加されたペプチドが包含され、この場合、付加されるアミノ酸残基としては、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列において、当該ペプチドに対応するアミノ酸配列のＮ末端側又はＣ末端側に隣接する１〜１０個のアミノ酸残基が挙げられる。
また、ここで「Ｔ細胞刺激活性を有する」とは、配列番号３〜１６で示されるアミノ酸配列からなるペプチドと同等以上のＴ細胞刺激活性を有することを意味する。尚、Ｔ細胞刺激活性の意味は上述したとおりである。
【００１４】
本発明のＴ細胞エピトープペプチドは、一般的なペプチドの合成に用いられている固相合成、液相合成、或いはこれらを組み合わせたペプチド合成法によって合成できる。また、本発明のＴ細胞エピトープペプチドを組換えＤＮＡ技術で合成する場合は、当該ペプチドをコードする配列を有する核酸で形質転換した宿主細胞をその細胞に適した培地で培養し、その培養上清から又は宿主細胞から当該ペプチドを当業者に公知の技術を用いて合成することができる。宿主としては、大腸菌、酵母、哺乳動物細胞等を用いることができる。
【００１５】
本発明のＴ細胞エピトープペプチドは、ヒトに投与したとき、好ましくはヒノキ花粉アレルゲンに感作されている個人に投与したとき、その個人のアレルゲンに対するアレルギー応答を調節することができるので、ペプチド免疫療法に有用である。さらに、他のヒノキ花粉アレルゲンであるＣｈａ  ｏ１やＣｈａ  ｏ２のＴ細胞エピトープペプチドに加え、スギ花粉アレルゲンであるＣｒｙ  ｊ１やＣｒｙ  ｊ２のＴ細胞エピトープペプチド（特開平７−１１８２９５号公報、特開平８−４７３９２号公報、Sone, T. et al., J. Immunol., 161:448-457, 1998）と組み合わせて用いることで、スギ・ヒノキに代表される春季樹木花粉症患者に対するペプチド免疫療法に有用である。
【００１６】
本発明のヒノキ花粉症のペプチド免疫療法剤は、注射（皮下、静脈注射等）、点眼、点鼻、経口、吸入、経皮など、通常の投与経路で投与することができ、投与形態に合わせて、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ、舌下錠、シロップ剤、注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤、鼻腔内噴霧剤、湿布剤、パップ剤、軟膏、ローション、クリーム等の各種剤形の製剤として調製され得る。
この場合、本発明のＴ細胞エピトープペプチドをそのまま、或いは乾燥して粉末状とし、希釈剤、添加剤等の担体、例えば安定剤、賦形剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、着色剤等を常法により添加した配合剤として調製されるのが好ましい。
【００１７】
本発明のヒノキ花粉症のペプチド免疫療法剤の投与量は、例えば、注射による場合、本発明のペプチドを１投与量単位当たり約１μg〜３０mg、好ましくは２０μg〜１０mgとすることができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００１８】
実施例１  ヒノキ花粉アレルゲンタンパク質の精製
ヒノキ花粉５０ｇ花粉に抽出緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０）１０００ｍｌを加え、１０分間攪拌後、１５分間超音波処理した。得られた懸濁液を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１５分）して上清を得、これをフィルトレーションすることで抽出液を得た。この抽出液を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化させたＤＥ５２陰イオン交換カラムに添加し、非吸着画分を集めた。続いて２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で平衡化させたＣＭ５２陽イオン交換カラムに吸着させ、ＮａＣｌ含１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．８）でグラジエント溶出したものをフラクションに分割して回収した。各フラクションの一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、分子量６６ｋＤａ付近のタンパク質を含むフラクションを合一した。【００１９】
実施例２  オーバーラップペプチドの合成
オーバーラップペプチドは、PepTrack Peptide Libraryサービス（JPT Peptide Technologies）にて委託合成した。実施例１で得られたヒノキ花粉アレルゲンタンパク質（以下、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｘ」と称する）（配列番号１）の一次構造を基にして、Ｎ末端１番目のＬｅｕから始まり、Ｃ末端のＬｅｕまで、１０残基のオーバーラップ部分を含む２０残基のオーバーラップペプチド（＃５２（配列番号５２）は１８残基）５２種類（＃１〜＃５２）を合成した（表１〜２）。なお、本タンパク質のアイソフォームとして、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、２番目のＰｒｏがＴｈｒに、２３０番目のＶａｌがＩｌｅに、２７１番目のＶａｌがＩｌｅに、それぞれ置換したタンパク質が存在し（配列番号２）、これらについても同様にオーバーラップペプチド５種類（＃５３〜＃５７）を作製した（表３）。【００２０】
【表１】
2014017599.tif 000002
【００２１】
【表２】
2014017599.tif 000003
【００２２】
【表３】
2014017599.tif 000004
【００２３】
実施例３  新規ヒノキ花粉特異的Ｔ細胞ラインの樹立
スギ花粉症でヒノキ花粉に感作されている患者２０名の末梢血からリンパ球を通常用いられているＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ比重遠心法で単離し、一部を液体窒素に保存した。末梢血リンパ球（１．２×１０7個）を、６ｍｌの自己血漿１０％を添加したＲＰＭＩ−１６４０に懸濁し、ヒノキ花粉から精製したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｘと共に２４穴培養プレート上で７〜８日間培養した。抗原刺激を受けて活性化されたＴ細胞が顕微鏡下で確認できた時点で２０  Ｕｎｉｔ／ｍｌのＩＬ−２を添加し、一晩培養した。翌日からは、２０  Ｕｎｉｔ／ｍｌのＩＬ−２、１０％自己血漿を添加したＲＰＭＩ−１６４０で毎日培養液を変えながら、１０−１２日間培養したものをＴ細胞エピトープの同定用のＴ細胞ラインとした。【００２４】
実施例４  Ｔ細胞エピトープを含むペプチドの同定
２０名の花粉症患者から樹立したＴ細胞ラインについて、それぞれ合成したオーバーラップペプチドとともに培養し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｘ特異的Ｔ細胞エピトープペプチドの同定を行った。すなわち、抗原提示細胞として、Ｔ細胞ラインと同一の患者から凍結ストックした末梢血単核球を融解後、Ｘ線照射（３６Ｇｙ）し、１０％自己血漿を添加したＲＰＭＩ−１６４０に懸濁した。この抗原提示細胞を９６穴平底プレートに播種（１×１０5  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｘ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）あるいは各ペプチド（最終濃度２μＭ）を各々のウェルに添加した。次いで、１０％自己血漿を添加したＲＰＭＩ−１６４０に懸濁したＴ細胞ライン（２×１０4  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を各ウェルに播種し、３７℃、５％  ＣＯ2条件で４８時間培養の後、１μＣｉ［3Ｈ］チミジンをウェルに添加し、さらに１６時間培養した。細胞をハーベスターを用いてガラスフィルター上に捕集し、乾燥してから、細胞内に取込まれた［3Ｈ］チミジンの放射活性（ｃｐｍ）をトップカウント（パーキンエルマー製）で測定した。増殖活性の指標として、ペプチド刺激によるＴ細胞ラインの放射活性を、ペプチド非添加の放射活性（対照）で割った値をＳ．Ｉ．値として算出し、Ｓ．Ｉ．値が２以上の値を示したペプチドを、Ｔ細胞エピトープペプチドとして同定した。図１は、全てのオーバーラップペプチドの「平均Ｓ．Ｉ．値」（２０名のＳ．Ｉ．値の平均値）と「出現頻度（％）」（２０名中のＳ．Ｉ．値が２以上であった割合）及び「重要度指数」（平均Ｓ．Ｉ．値と出現頻度を乗じた値）を示している。【００２５】
実施例５  ヒノキ花粉特異的ＩｇＥとの結合能の確認
５名のヒノキ花粉症患者血清を用いて、ヒノキ花粉特異的ＩｇＥとの結合能を確認した。本発明の好適なＴ細胞エピトープペプチド（重要度指数が１００以上）あるいはヒノキ花粉アレルゲンをＭａｘｉｓｏｒｐ  ９６穴プレート（ヌンク）に１μｇ／５０μＬ／ｗｅｌｌとなるように添加後、一晩４℃で静置することにより固相化した。翌日プレートを洗浄後、１％牛血清アルブミン含有ＰＢＳを添加、１時間室温静置することでブロッキングを実施した。プレート洗浄後、５倍希釈した患者血清又は陰性対照血清を添加し２時間室温静置させた。陰性対照にはｈｅａｌｔｈｙ  ｄｏｎｏｒ血清（ヒノキＲＡＳＴ  Ｓｃｏｒｅ＝０）を用いた。プレート洗浄後、１％牛血清アルブミン含有ＰＢＳで７０００倍希釈した２次抗体（ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体、  Ｎｏｖｕｓ）を添加して、４０分間室温静置した。プレートを洗浄後、ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｅｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にてＴＭＢ発色を室温静置、遮光状態で２０分間実施した。終了後、１Ｎ  硫酸を添加することで発色を停止させ、マイクロプレートリーダーにて波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図２に示す。尚、図２において、Ｖ０１２、Ｖ０１４、Ｖ０３１、Ｖ０４７、Ｖ０５１は、それぞれ５名のヒノキ花粉症患者ＩＤを示す。
本発明のＴ細胞エピトープペプチドは、ヒノキ花粉特異的ＩｇＥと結合しないことが確認された。【００２６】
実施例６  ２０ｍｅｒエピトープ特異的Ｔ細胞ラインの樹立
スギ花粉症でヒノキ花粉に感作されている患者末梢血からリンパ球を、通常用いられているＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ比重遠心法で単離し、一部を液体窒素に保存した。末梢血リンパ球を、自己血漿１０％を添加したＲＰＭＩ−１６４０に懸濁し、最終濃度１μＭの２０ｍｅｒエピトープペプチドと共に９６穴培養プレート上で（１．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）７〜８日間培養した。並行して培養６〜７日目には以下の通り継代に必要な抗原提示細胞を調製した。すなわち、同一の患者から凍結ストックした末梢血単核球を起眠し、１０％自己血漿を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁後、最終濃度１０μＭの２０ｍｅｒエピトープペプチドを添加し２４穴培養プレート上で一晩培養した。翌日それら細胞をＸ線照射（４５Ｇｙ）後、培地中の２０ｍｅｒエピトープペプチドを洗浄・除去したものを継代用抗原提示細胞とした。リンパ球培養７〜８日目に、９６穴培養プレートに播種されているリンパ球のうち各ウェル１／３ずつを、最終濃度１００  Ｕｎｉｔ／ｍｌのｈｕｍａｎ  ＩＬ−２、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌのｈｕｍａｎ  ＩＬ−４および１０％自己血漿を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁した継代用抗原提示細胞とともに９６穴培養プレート上で７日間培養した。残るリンパ球各ウェル２／３については、抗原特異性の評価に用いた。ＩＬ−２、ＩＬ−４および継代用抗原提示細胞とともに７日間培養したリンパ球のうち、２０ｍｅｒエピトープペプチド特異的Ｔ細胞陽性と判定したウェルのリンパ球を全て集め、最終濃度１００  Ｕｎｉｔ／ｍｌのｈｕｍａｎ  ＩＬ−２、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌのｈｕｍａｎ  ＩＬ−４および１０％自己血漿を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、前述の方法で調製した継代用抗原提示細胞とともに２４穴培養プレートにて７日間拡大培養した。以後、７日毎に継代用抗原提示細胞にて拡大培養を続け、２０ｍｅｒエピトープペプチド特異的な細胞増殖を示す細胞集団を２０ｍｅｒエピトープペプチド特異的Ｔ細胞ラインとした。【００２７】
実施例７  エピトープコア配列の推定
エピトープ２０ｍｅｒのＣ末端より１アミノ酸残基ずつアミノ酸が欠失したペプチド（＃５２−１〜＃５２−８、＃２４−１〜＃２４−８、＃３８−１〜＃２４−３）、Ｎ末端より１アミノ酸残基ずつアミノ酸が欠失したペプチド（＃５２−９〜＃５２−１３、＃２４−９〜＃２４−１３）、及びＮ末端より６〜９アミノ酸残基が欠失したペプチド（＃３８−４〜＃２４−７）を合成した。樹立した２０ｍｅｒエピトープペプチド特異的Ｔ細胞ラインについて、上記短縮ペプチドとともに培養することで、エピトープコア配列の推定を行った。すなわち、抗原提示細胞として、Ｔ細胞ラインと同一の患者から凍結ストックした末梢血単核球を融解後、Ｘ線照射（４５Ｇｙ）し、１０％自己血漿を添加したＲＰＭＩ−１６４０に懸濁した。この抗原提示細胞を９６穴平底プレートに播種（１×１０5  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）した後、２０ｍｅｒペプチドあるいは各短縮ペプチド（最終濃度２μＭ）を各々のウェルに添加した。次いで、１０％自己血漿を添加したＲＰＭＩ−１６４０に懸濁したＴ細胞ライン（２×１０4  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を各ウェルに播種し、３７℃、５％  ＣＯ2条件で４８時間培養の後、１μＣｉ［３Ｈ］チミジンをウェルに添加し、さらに１６時間培養した。細胞をハーベスターを用いてガラスフィルター上に捕集し、乾燥してから、細胞内に取込まれた［3Ｈ］チミジンの放射活性（ｃｐｍ）をトップカウント（パーキンエルマー製）で測定した。増殖活性の指標として、ペプチド刺激によるＴ細胞ラインの放射活性を、ペプチド非添加の放射活性（対照）で割った値をＳ．Ｉ．値として算出した。その結果の一例を図３〜図５に示す。
Ｎ末端ならびにＣ末端を欠失させた短縮ペプチドにてＴ細胞増殖活性を示した（Ｓ．Ｉ．値が２以上）最小の配列を元に両末端を決定したものをコア配列とした。上記手法により推定できた＃２４エピトープペプチド、＃３８エピトープペプチドおよび＃５２エピトープペプチドにおけるコア配列は、＃２４エピトープペプチド（配列番号７）では、４〜１４番目の「ＦＫＥＫＩＶＹＥＧＨＷ」であり、＃３８エピトープペプチド（配列番号１０）では、９〜１９番目の「ＰＹＹＱＩＩＹＨＰＡＳ」であり、＃５２エピトープペプチド（配列番号１５）では、３〜１１番目の「ＦＫＶＩＴＴＮＫＱ」である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年12月14日(2015.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３〜１６で示されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるペプチド、又は当該ペプチドにおいて１〜３個のアミノ酸が置換及び／又は１〜１０個のアミノ酸が付加したペプチドであって、且つＴ細胞刺激活性を有するペプチド。
【請求項２】
前記１〜３個のアミノ酸が置換及び／又は１〜１０個のアミノ酸が付加したペプチドが、１〜１０個のアミノ酸が付加したペプチドである請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１〜３個のアミノ酸が置換及び／又は１〜１０個のアミノ酸が欠失若しくは付加したペプチドであって、少なくとも「ＦＫＥＫＩＶＹＥＧＨＷ」若しくは１〜３個のアミノ酸が置換した「ＦＫＥＫＩＶＹＥＧＨＷ」を有し、且つＴ細胞刺激活性を有するペプチド、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１〜３個のアミノ酸が置換及び／又は１〜１０個のアミノ酸が欠失若しくは付加したペプチドであって、少なくとも「ＰＹＹＱＩＩＹＨＰＡＳ」若しくは１〜３個のアミノ酸が置換した「ＰＹＹＱＩＩＹＨＰＡＳ」を有し、且つＴ細胞刺激活性を有するペプチド、又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１〜３個のアミノ酸が置換及び／又は１〜１０個のアミノ酸が欠失若しくは付加したペプチドであって、少なくとも「ＦＫＶＩＴＴＮＫＱ」若しくは１〜３個のアミノ酸が置換した「ＦＫＶＩＴＴＮＫＱ」を有し、且つＴ細胞刺激活性を有するペプチド。
【請求項４】
前記「ＦＫＥＫＩＶＹＥＧＨＷ」若しくは１〜３個のアミノ酸が置換した「ＦＫＥＫＩＶＹＥＧＨＷ」が「ＦＫＥＫＩＶＹＥＧＨＷ」であり、「ＰＹＹＱＩＩＹＨＰＡＳ」若しくは１〜３個のアミノ酸が置換した「ＰＹＹＱＩＩＹＨＰＡＳ」が「ＰＹＹＱＩＩＹＨＰＡＳ」であり、「ＦＫＶＩＴＴＮＫＱ」若しくは１〜３個のアミノ酸が置換した「ＦＫＶＩＴＴＮＫＱ」が「ＦＫＶＩＴＴＮＫＱ」である、請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
１〜１０個のアミノ酸が欠失したペプチドが、当該ペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側のアミノ酸が欠失したものである、請求項３又は４記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側のアミノ酸が欠失し、少なくとも「ＦＫＥＫＩＶＹＥＧＨＷ」を有するペプチド、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側のアミノ酸が欠失し、少なくとも「ＰＹＹＱＩＩＹＨＰＡＳ」を有するペプチド、又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側のアミノ酸が欠失し、少なくとも「ＦＫＶＩＴＴＮＫＱ」を有するペプチドである、請求項５記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載されたペプチドの１種又は２種以上を有効成分として含有する、ヒノキ花粉症のペプチド免疫療法剤。
【請求項８】
ヒノキ花粉症のペプチド免疫療法剤を製造するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載されたペプチドの１種又は２種以上の使用。
【請求項９】
ヒノキ花粉症のペプチド免疫療法に使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載されたペプチドの１種又は２種以上。
【国際調査報告】
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