(57)【要約】IgA腎症患者に見られるIgA凝集体の特徴的な構造に対して結合特異性を有するレクチンを用いた、新規なIgA腎症の検出方法を提供する。
2013172347.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
IgA凝集体の検出方法であって、IgAを含む試料に該IgA凝集体に特異的に反応するレクチンを接触させることを特徴とする該IgA凝集体の検出方法。
【請求項２】
上記IgA凝集体に対する上記レクチンの結合能を測定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記結合能の測定が、N-glycan上のβ 14  galactoseに対する上記レクチンの認識性に基づくことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記レクチンが、HHL, GNA, NPA、WFA, SBA, VVA, BPL, TJA-II、PHA-L、AOLレクチンからなる群から選択される、少なくとも１つ以上のレクチンである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
上記レクチンが、WFAレクチンである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
上記IgAを含む試料が、被検者の血清または尿である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法によってIgA凝集体を検出し、その検出結果に基づいてIgA腎症を検査することを特徴とする、IgA腎症の検査方法。
【請求項８】
上記IgA腎症が、mIgA-MIDDであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
IgA凝集体分子に特異的に反応するレクチンを結合させることによって該IgA凝集体分子を精製することを特徴とする、IgA凝集体分子の精製方法。
【請求項１０】
以下の手順を含むIgA腎症の検査方法：
１）被検体から採取された血清または尿中のIgAをWFAレクチンに接触させ；
２）WFAレクチンに結合したIgA量を健常人の場合と比較することによりIgA腎症を判定する。
【請求項１１】
IgA1モノクローナル抗体による抗体オーバーレイ法による解析を行うことによりWFAレクチンに結合したIgA量を測定する、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はIgA腎症患者の血清または尿中における、IgA凝集体を検出する簡便な方法を提供し、IgA腎症の早期診断を可能にするものである。
【背景技術】
【０００２】
IgA腎症（IgANとも称す）とは、主に免疫グロブリンの一種であるIgAが免疫複合体を形成し、腎糸球体メサンギウム領域に沈着することを特徴とする慢性糸球体腎炎であり、患者の約40%が20年以内に腎不全に移行する極めて予後不良な疾患である。
当疾患は、世界中で患者数が増加しているが特にアジア太平洋地域、ヨーロッパに多く、例えば日本では、末期腎不全により透析療法を受けている患者総数は２６万人を超えており、透析医療費として年間１兆４０００億（全医療費の３％）と多大な資金が費やされている。また、IgA腎症が原因となる新規透析導入患者数は年間４〜５０００人と非常に多いが、本腎症の発症メカニズムについて不明な点が多く、適正に治療する方法が確立していない。したがって、早期に本症を発見し、食事療法や薬物療法を施すことが必要である。
ところで、現在、IgA腎症の確定診断には侵襲性の高い腎生検が、臨床における唯一の方法として用いられている。しかし、腎生検は患者への負担が大きいにも関わらず、正確な予後診断ができず、また、短期間に複数回の検査を行えないことから、患者の病状の経過を正しく観察することができず、治療が適正に行われているかどうかを判定することが出来ない。このように、腎生検は臨床診断マーカーとしては整合性に欠け、腎生検の結果に基づいて患者に対する適正な治療を行なうことは困難である。
以上のことから、IgA腎症患者の早期診断や、透析前のIgA腎症患者において症状を簡便に定量的に判断することが可能な新規な血清マーカーの開発が急務とされている。【０００３】
ところで、IgA腎症は、糸球体メサンギウム領域へのIgA1を含む免疫複合体の沈着を特徴とするが、当患者血清中のIgA1上の糖鎖構造の変化が生じていることは報告されている（非特許文献1〜3）。特にIgA1上のO-glycan構造については数多くの研究報告があり、例えばIgAN患者の血清IgA1中にO-glycan上のガラクトース欠損した異常O-glycan構造が存在することが、Lectin-ELISA法や自己抗体検出方法を用いることによって示されている（非特許文献4〜6、特許文献1〜5）。しかしながら、異常O-glycan構造を有するこのような異常IgAを、血清中から実際に分離・精製や濃縮した報告はない。【０００４】
最近、モノクローナルIgA沈着症(mIgA-MIDD)患者と疾患コントロール（mIgA）および健常者のIgAについて比較検討した結果、mIgA-MIDD患者のIgAでは、IgAのN-glycan上のCore-fucoseやシアル酸の構造が変化していることが報告されている（非特許文献7）。しかし、このような糖鎖構造の変化が糸球体への沈着にどのように関わっているのかについては明らかでない。
このように、腎症患者のIgAでは、糖鎖構造の変化が生じていることは報告されているものの、糖鎖構造のこのような変化がどのようにIgA腎症の発症に関係しているのかは明らかではなく、またこの糖鎖構造の変化を簡便に検出する方法も見出されていないのが現状である。【０００５】
【非特許文献１】J Am Soc Nephrol. 1999 Apr;10(4):760-9.
【非特許文献２】Kidney Int. 2001 Sep;60(3):969-73.
【非特許文献３】Clin Exp Nephrol. 2008 Oct;12(5):332-8.
【非特許文献４】J Clin Invest. 2009 Jun;119(6):1668-77
【非特許文献５】Nephrol Dial Transplant. 2008 Jun;23(6):1931-9.
【非特許文献６】Nephrol Dial Transplant. 2002 Jan;17(1):50-6.
【非特許文献７】Clin Exp Nephrol. 2010 Aug;14(4):389-95
【０００６】
【特許文献１】特開2010-285419号公報
【特許文献２】特開2009-001512号公報
【特許文献３】特開2007-024661号公報
【特許文献４】特開2007-163151号公報
【特許文献５】特開平10-111291号公報
【発明の概要】
【０００７】
本発明の課題は、IgA腎症患者から採取した血清または尿などの試料を用いて、侵襲性がなく患者に負担の少ない、IgA腎症を簡便に診断または検出する方法を提供することである。
【０００８】
発明者らは、IgA腎症の発症原因となる腎糸球体に沈着する異常IgA分子に注目し、この異常分子が血中に多く存在すると考えられる、モノクローナルイムノグロブリン血症（MGUS）かつIgA腎症様の腎症を併発したmIgA-MIDD患者をモデルとし、この患者の血清中の異常IgA分子の精製および同定を行った。
その結果、本患者の血清中IgA1はN-glycanが異常に付加し、1分子あたりの糖鎖の本数が多い分子構造を有することを見出した。さらに当該IgA1は、通常のIgAでは見られない多量体を形成し、高度に糖鎖で被覆された凝集体の分子として存在していることを見出した。このように、これまで、腎症患者のIgAに関しては、正常（非疾患）IgAとの糖鎖構造の違いにのみ着目されていたが、本発明者らは糖鎖構造が異なるだけではなく糖鎖構造の付加数およびIgA凝集体の形成といった立体構造にも違いがあることを明らかにした。
さらに、発明者らはこのIgA凝集体（異常IgA）についてレクチンアレイ測定を行なったところIgA凝集体に対して特異的に反応する種々のレクチンを見出した。そして、このIgA凝集体に対して特異的に反応するレクチンを用いるIgA腎症を簡便に診断・検出する方法を見出した。
すなわち、本明細書では以下の発明を提供する。
【０００９】
（１）IgA凝集体の検出方法であって、IgAを含む試料に該IgA凝集体に特異的に反応するレクチンを接触させることを特徴とする該IgA凝集体の検出方法。
（２）上記IgA凝集体に対する上記レクチンのへの結合能（結合量）を測定することを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）上記結合能（結合量）の測定が、N-glycan上の非還元末端β14  galactoseに対する上記レクチンの認識性に基づくことを特徴とする、（１）または（２）に記載の方法。
（４）上記レクチンが、HHL, GNA, NPA、WFA, SBA, VVA, BPL, TJA-II、PHA-L、AOLレクチンからなる群から選択される、少なくとも１つ以上のレクチンである（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）上記レクチンが、WFAレクチンである（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（６）  上記IgAを含む試料が、被検者の血清または尿である（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の方法によってIgA凝集体を検出し、その検出結果に基づいてIgA腎症を検査することを特徴とする、IgA腎症の検査方法。
（８）上記IgA腎症が、mIgA-MIDDであることを特徴とする、（７）に記載の方法。
（９）上記IgA凝集体に特異的に反応するレクチンを結合させることによって、該IgA凝集体の分子を精製または濃縮する方法。
（１０）  以下の手順を含むIgA腎症の検査方法：
１）被検体から採取された血清または尿中のIgAをWFAレクチンに接触させ；
２）IgA1モノクローナル抗体による抗体オーバーレイ法による解析を行いWFAレクチンに結合したIgA量を測定し、WFAレクチンに結合したIgA量を健常人の場合と比較することによりIgA腎症を判定する。
（１１）IgA1モノクローナル抗体による抗体オーバーレイ法による解析を行うことによりWFAレクチンに結合したIgA量を測定する、（１０）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、侵襲性がなく患者に負担の少なく、IgA腎症を簡便に診断または検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】IgA1の構造が保存されているα鎖中のＦＣ領域におけるＮ-glycosylation site(Asn263,Asn459)及び、ヒンジ部のO-glycosylation siteを示す。
【図２】各種血清からの精製IgA1におけるSDS-PAGE（左：銀染色）および抗IgA1モノローナル抗体によるWestern blotting解析(右)の結果を示す（写真）。
【図３】各血清から精製したIgA1,40ngを用いたレクチンマイクロアレイ解析。解析に供した43全てのレクチンについての結果を示す。各レクチンシグナルは最もシグナルの高いレクチンTJA-1で割って補正した。
【図４】各血清から精製したIgA1,100ngを用いたレクチンマイクロアレイ解析。mIgA-MIDD患者に顕著に異なっていたレクチン12種類を抜粋して示す。各レクチンのシグナルは最もシグナルの高いレクチンTJA-1で割って補正した。
【図５】トリプシン消化物を用いたレクチンマイクロアレイ解析結果。
【図６】各種グリコシダーゼ消化IgA1に対するWFAレクチンの反応性。
【図７】mIgA-MIDD由来IgA1に対するWFAレクチンの反応性のPNGase消化処理による変化。
【図８】熱処理をしたIgA１のレクチンマイクロアレイ測定。
【図９】非還元条件下におけるmIgA-MIDD由来精製IgA1に対するWFAの反応性（写真）。
【図１０】PNGase F処理を利用したN-glycan付加数の検出（写真）。
【図１１】各検体由来精製IgA1における分子量の測定（写真）。
【図１２】WFAレクチンを用いたSandwichレクチンEILSAによる比較解析。
【図１３】WFAレクチンを用いたmIgA-MIDDの分離・精製１（写真）。
【図１４】WFAレクチンを用いたmIgA-MIDDの分離・精製２（写真）。
【図１５】WFAレクチンを用いたmIgA-MIDD精製条件の検討。
【図１６】抗IgA抗体オーバーレイ法を用いた血清に対するレクチンマイクロアレイ測定（写真）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の方法は、N-glycanが異常付加しかつ凝集して多量体を形成するIgA（異常IgA）を含むIgA凝集体を検出する方法及びこの方法によりIgA腎症を検査する方法である。
【００１３】
IgAはIgA1およびIgA2が含まれ得るが、血清または尿中に存在する単量体あるいは2量体IgA（血清型IgA）にはIgA1が約90％と圧倒的に多いため、IgA1のみを検出して本発明の方法を実施してもよい。
【００１４】
ここで、IgA腎症とは腎糸球体メサンギウム領域へのIgA沈着を特徴とする慢性糸球体腎炎であり、例えば、モノクローナルIgA沈着症(mIgA-MIDD)が含まれる。
【００１５】
例えば、健常者に比べてIgA１分子あたりに付加するN-glycanの数が４本以上多い場合などが例示される。N-glycanの異常付加は、通常の糖鎖分析法によって確認できるが、IgAの重鎖と軽鎖のバンドパターンを電気泳動などで調べてもよい。
【００１６】
N-glycanの異常付加によりIgA凝集体が形成され、これにより糸球体へのIgA沈着が促進されれば、最終的にIgA腎症が引き起こされる。したがって、N-glycanの異常付加が観察された場合、および／またはその量が健常者と比べて多いとき、被検者はIgA腎症と判定することが可能である。
【００１７】
本発明の方法においては、レクチンは上記IgA凝集体のN-glycan上のβ1,4  galactoseに接触させることが好ましい。
【００１８】
上記IgA凝集体（異常IgA）上に特異的に反応するレクチンとしては、HHL（Hippeastrum Hybrid由来レクチン）, GNA（Galanthus nivalis由来レクチン）, NPA（Narcissus pseudonarcissus由来レクチン）, WFA（Wisteria floribunda由来レクチン）, SBA（Glycine max由来レクチン）, VVA（Vicia villosa由来レクチン）, BPL（Bauhinia purpurea由来レクチン）, TJA-II（Trichosanthes japonica由来レクチン）, PHA-L（Phaseolus vulgaris由来レクチン）, AOL（Aspergillus oryzae由来レクチン）からなる群から選択される、少なくとも１つ以上のレクチンであることが好ましく、WFAがより好ましい。これらのレクチンはAnal Biochem. 1991 Dec;199(2):286-92、Biochim Biophys Acta. 1998 Apr 10;1380(2):268-74, Int J Cancer, 2003,Jul 1;105(4):533-41, Glycobiolog. Sep;16(9):777-85等に説明されており、例えば、データベースは「JCGGDB, Lectin Frontier DataBase」としてNCBIから、また、各レクチンはVector Laboratoriesから入手することができる。
【００１９】
レクチンを用いたIgAの検出は、例えば、レクチンを結合させた担体に血清や尿などの試料を混合し、これら試料中のIgAをレクチンに結合させたのち、標識した抗IgA抗体などで検出することができる。
例えば、被検体から採取された血清または尿中のIgAをプレート上に固定化されたWFAレクチンに接触させ；IgA1モノクローナル抗体（例えば、7303B）による抗体オーバーレイ法による解析を行いWFAレクチンに結合したIgA量を測定することができる。
そして、WFAレクチンに結合したIgA量を、健常人血清または尿を接触させたときのWFAレクチンに結合したIgA量と比較し、健常人の場合より多いときにIgA腎症と判定することができる。
【００２０】
なお、レクチンをビオチン化し、血清または尿中のIgAをビオチン化レクチンに結合させたのち、酵素または蛍光などで標識したアビジンによって検出することもできる。
WFAによって上記IgAを検出する場合、シアリダーゼ処理をすると検出感度が向上するのでより好ましい。
【００２１】
また、被検者から単離された血清や尿などの試料中のIgAに対するWFAレクチンの結合能を測定することによってもIgA腎症を判定することができる。結合能は、上記のレクチンと相互作用するIgAの量（結合量）を定量する、または、一般的に用いられる相互作用解析手法により解離定数を算出することによって求めることができる。
【００２２】
また、WFAなどのレクチンを用いてIgA腎症患者由来のIgA凝集体を精製したり濃縮したりすることもできる。
【実施例】
【００２３】
以下に本発明の実施例を説明するが、ここで挙げる実施例は単なる具体的例示に過ぎず、本発明の技術的範囲を何ら限定するものではない。【００２４】
＜実施例１＞IgA1のレクチン反応性の解析
（１）血清からのIgA1分離精製方法
血清サンプルにはmIgA-MIDD、良性疾患（MGUS患者）(mIgA)および健常者のものを用いた。500 μLの血清を0.01 M Tris-HCl bufferにて5 mLに希釈し、Cibacron Blue A agarose column (1 mL Column volume; Sigma Chemical Co)に供した。サンプルを供した後、0.01M Tris-HCl buffer, 6mLにて洗浄し、素通り画分と洗浄画分を回収した。続いて回収したサンプルは抗IgA1モノクローナル抗体(7393B)をSepharose 4Bに結合させ作成したカラム(500 μL column volume)に供した。20 mLのPBSによる洗浄後、0.1M Glycine/HCl(pH2.5)bufferを3mL用いて溶出し、直ちに1M Tris-HCl(pH8.0)を 400μL加えて中和を行った。さらに溶出画分にprotein G sepharose(Pierce)を100 μL加えて、4℃C、一晩反応させ、混在するIgGを除去した。上清を回収後、0.01M 重炭酸アンモニウムbufferにて透析を行い、凍結乾燥を行った。凍結乾燥後のサンプルはPBS bufferに溶かし、吸光度計を用いて濃度測定を行い1mg/mLの濃度に調整した。サンプルの精製度については次のSDS-PAGEおよびウエスタンブロットによって確認した。【００２５】
（２）SDS-PAGEおよびウエスタンブロット法による精製IgA1分析
精製したIgA1サンプルは2-メルカプトエタノール存在下で還元処理した後、10%ポリアクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEを行い、銀染色により精製度の確認を行った。さらに銀染色とは別に、SDS-PAGEを行ったゲルをPVDF膜に転写し、ウエスタンブロットを行った。転写したPVDF膜は3%BSA/0.1%Tween/PBS bufferにて室温、1 hブロッキングした後、1 μg/μLの抗IgA1モノクローナル抗体(7303B、特殊免疫研究所)を1000倍希釈した溶液にて4℃、一晩反応させた。0.1%Tween/PBS bufferにて5 minの洗浄を３回行ったのち、抗IgG-HRP抗体（GE healthcare）を5000倍希釈した溶液を用いて、室温、1 h反応させた。0.1%Tween/PBS bufferにて5 minの洗浄を３回行った後、基質としてWestern lightning CHemiluminescence Plus (Perkin-Elmer)を用い、high-perfomance chemiluminescence film(GE Healthcare)に現像し目的のIgA1バンドの検出を行った。図２に上記の結果を示す。【００２６】
（３）精製IgA1に対する抗体-オーバーレイ レクチンマイクロアレイ比較解析
10 ng、50 ng、100 ngの各精製IgA1を0.1%Triton x/PBS溶液(PBS-Tx)にて80 μLに希釈し、レクチンマイクロアレイスライドガラス（ Kuno et al. Nature Methods 2005
Uchiyama et al Methods in Enzymology 2006, Uchiyama et al Proteomics 2008に記載の方法で作成した）に供し、20℃、18h反応させた。1 μgのhuman serum polyclonal IgG(SIGMA)を供し、20℃、30 min反応させた後、80 μLのPBS-Txにて3回洗浄し、ビオチン化6.25 μg/mL濃度のビオチン化抗IgA1抗体（7303B）を80μL供し、20℃,1h反応させた。さらに80 μLPBS-Txにて3回洗浄した後、2.5 μg/mL濃度のstreptavidin-Cy3を80 μL供し、20℃,1h反応させた。80 μLPBS-Txにて3回洗浄した後80 μLのPBS-Txを供し、Glycostation(Moritex)を用いて測定した。Gain125〜100で測定した画像をArray Pro analyzer version 4.5を用いて各種レクチンのシグナルを数値化した後、患者および健常者間での比較解析を行った。【００２７】
図３に、各血清から精製したIgA1を用いたレクチンマイクロアレイ解析結果を示す。各血清から精製したIgA1,40ngを供して解析を行い、シグナルの観測されたレクチンについて各種数値化した。図３ではスライドガラス上にのせられている43のレクチンを示し、各レクチンのシグナルは最もシグナルの高いTJA-1レクチンの値で割って補正した。【００２８】
また、図４には各血清から精製したIgA1 100ngを用い、シグナルの観測されたレクチンについて各種数値化した。図３と同様に各レクチンのシグナルは最もシグナルの高いTJA-1レクチンの値で割って補正した。図４では、mIgA-MIDD患者に顕著に異なっていたレクチン12種類を抜粋して示している。
上記の検討から、（１）mIgA-MIDD> MGUSおよび健常者 の結合性を示すmIgA-MIDD患者のIgAに対して結合性の高いレクチン、（２）MGUSおよび健常者>mIgA-MIDDの結合性を示す mIgAおよび健常者のIgAに対して結合性の高いレクチンに分類しそれぞれ下記に列記した。また、これまで報告されている各レクチンの糖鎖の認識部位を矢印で示した。【００２９】
【表１】
2013172347.tif 000003
【００３０】
そこで、レクチンとIgA1との反応性を調べるため、IgA1のトリプシン消化物を用いて実験を行った。【００３１】
＜実施例2＞IgA1の構造的特徴の解析
（１）精製IgA1のトリプシン消化
精製したIgA1を500 μgを10mM dithiothreitol存在下0.1 M Tris-HCl(pH7.4)buffer中にて、37℃、45 min還元処理した後、50 mM Iodoacetoamideによって室温、遮光、90 minアルキル化処理を行った。還元アルキル化したサンプルについては2.5 Lの50 mM重炭酸アンモニウムbufferにて4℃、48 h透析した。透析したサンプルのうち100 μg相当のIgA1に対して1μgのトリプシンを用いて37℃、1 h反応させた。反応後のトリプシン消化物については逆相カラム Oasis HLB catridge (10 mg/mL ; Waters)を用いて脱塩処理を行った。逆相カラムの操作手順は、3 mLのMeOHおよび3 mLの純水の順序で平衡か操作を行ったカラムに対してトリプシン消化物溶液を供し、3 mLの純水による洗浄を行った。洗浄後、3 mLの80%アセトニトリル溶液にて溶出したサンプルについて凍結乾燥を行った。【００３２】
（２）IgA1トリプシン消化物のレクチンマイクロアレイ分析
凍結乾燥したトリプシン消化物をPBS溶液にて1 mg/ml濃度になるよう調整した。調整したサンプルのうち1 μg相当のトリプシン消化物溶液に対して10 μgのCy3-succimidyl ester (GE Healthcare)を用いて室温、1 h、遮光条件にてペプチドに対するラベル化処理を行った。未反応のCy3試薬を無効化するため、500 mM glycine/1%Triton X-100/TBS(probing buffer)を加えて室温、2 h、遮光条件にてブロッキング処理を行った。最終的にprobing bufferにて10 μg/mLに希釈したサンプル80 μLをレクチンマイクロアレイに供し、20℃、12 h反応させた。反応後probing bufferで3回洗浄した後、probing buffer 80 μLを加えてGlycostationを用いて測定を行った。シグナルの検出およびデータ処理方法等については前述のレクチンオーバーレイでの項と同様である。【００３３】
図５に示すように、トリプシン消化物ではO-glycanを認識するレクチンPNAがwhole sampleのデータと比べて上昇していたことから、トリプシン消化処理によってO-glycanとの反応が強くなることが示唆される。一方mIgA-MIDDに特異的に見られたWFAシグナルはトリプシン消化処理によって著しいシグナルの低下が見られた。
以上の結果から、WFAのmIgA-MIDDのIgA1分子への特異的な結合力は、O-glycanではなくて、N-glycanを認識するものであることが示された。
そこで、WFAレクチンがN-glycanのどのような構造部位を認識するかを調べるために、グリコシダーゼ消化処理をしたIgAに対して、GalNAcを認識するレクチンとしてHPA、VVA、WFA各種レクチン、またCore1（Gal-GalNAc）を認識するPNA レクチンを用いてSandwich レクチンELISAを行った。【００３４】
（３）各種グリコシダーゼを用いた糖鎖欠損IgA１の調製
mIgA-MIDD由来の精製IgA1,10 μgを200 mM酢酸ナトリウムbufferにて25 μLへ希釈し20 mUのシアリダーゼ（Nacalai Tesque）を用いて、37℃、一晩反応させた。さらに反応したサンプルを5 μLを分注したサンプルに対して溶液に1.1 mUのβガラクトシダーゼ、1 mUのβ1,3ガラクトシダーゼ、1.5 mUのβ1,4ガラクトシダーゼのいずれかを加えてさらに37℃, 一晩反応させた。最終的に未処理、シアリダーゼ(neuraminidase)、βガラクトシダーゼ、β1,3ガラクトシダーゼ、β1,4ガラクトシダーゼ、シアリダーゼ＋βガラクトシダーゼ、シアリダーゼ＋β1,3ガラクトシダーゼ、シアリダーゼ＋β1,4ガラクトシダーゼの合計8種類を調整した。次にそれぞれのサンプルについてHPA, PNA, VVA, WFA レクチンを用いてSandwich lectin ELISAにて比較した。
図６に示すように、HPA,VVAレクチンではシアリダーゼ+ガラクトシダーゼ処理した場合に最も強い反応を示した（白）。PNAについても予想どおり、シアリダーゼ処理したIgA、O-glycan上のcore1(Gal-GalNAc)が露出したと思われるIgAに強く反応した。一方、WFAレクチンではシアル酸消化した場合の方が強く反応した。一方でN-glycan上のβ1,4結合のガラクトースを消化するβ1,4ガラクトシダーゼで処理した場合、WFAのシグナルが顕著に消失した（黒）。
β1,4ガラクトシダーゼはN-glycan上のglcNAcにβ1,4で結合したGalを切断する酵素であることから、WFAレクチンはこれまでに報告のあったTnやLacdiNAcに対する既知の基質特異性ではなく、β1,4結合したGalに結合するという新規な基質特異性を有し、同様の基質特異性を有すると考えられていたGalNac認識レクチン、HPAおよびVVAとは異なる反応性を示すことが明らかになった。
以上の結果より、WFAレクチンのmIgA-MIDD由来のIgA1分子との強い結合性はWFAレクチンが、IgA1分子上のN-glycan、特にβ1,4ガラクトース構造を認識するためであることが判明した。
また、WFAレクチンは、健常者由来のIgA1よりも、mIgA-MIDD患者由来のIgA1に強く結合することから、mIgA-MIDD患者由来のIgA1はN-glycanに関連した構造的な特徴を有することが明らかとなった。【００３５】
（４）種々のレクチンを用いた酵素結合免疫測定（ELISA）
5 μg/mL濃度のポリクローナル抗IgA抗体（Jackson社製）50μLをMaxisorp 96-well immunoplate (Thermo Fisher Scientific社)に供し室温、2h静置した。上清廃棄後、1%BSA/PBS溶液100μLにて室温、1hブロッキングを行った。上清廃棄後、上記で調製した各種グリコシダーゼ消化処理IgA1を1%BSA/PBS溶液で5 μg/mLに希釈し、50 μLをプレートに供し、4℃、一晩反応させた。反応させたプレートは200 μLのPBS-Tにて３回洗浄した後、各種ビオチン化レクチンHPA5 μg/mL)、PNA(2 μg/mL)、VVA(5 μg/mL)、WFA(5 μg/mL)をそれぞれ50μL供し、室温、1 h反応させた。さらに200 μLのPBS-Tにて３回洗浄した後、いずれのサンプルについても1 μg/μLのstreptavidin-HRPを50μL供し、室温、1 h反応させた。200 μLのPBS-Tにて３回洗浄した後、基質として3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate solution (Thermo Fisher Scientific)を50μL供し、室温で1〜15 min反応させ、十分なシグナルが得られた後に50 μLの2 M H2SO4を加えて反応を終了させた。反応終了後、マイクロプレートリーダー(Wallac 1420ARVO sx Multilabel Counter,Perkin Elmer)を用いて450 nmの波長により検出を行った。【００３６】
（５）PNGase Fを用いた精製IgA１の脱Ｎグリコシル化反応
N-glycanをIgA1タンパク上から完全に切除する場合、10 μgの精製IgA1を0.5%SDS/0.2 M 2-mercaptoethanol/PBS(pH8.0)溶液20 μL中で98℃,5 min加熱した後、さらに20μLの5%Nonidet P-40、60 μLのPBS(8.0)および1 mUのPeptide N-glycosidase F(PNGase F ; takara)を加えて37℃、一晩反応させた。部分的な切断処理を行う場合、2.5 μgの精製IgA1を0.5%SDS/0.2 M 2-mercaptoethanol/PBS(pH8.0)溶液5 μL中で98℃,5 min加熱し、さらに5 μLの5%Nonidet P-40、15 μLのPBS(8.0)および0.1 mUのPNGase Fを加えて37℃で15,30,60,120minと経時的に反応させた。各酵素反応の停止は98℃、5 minの熱処理で行った。調整したde-N-glycosylated IgA1はSDS-PAGE（銀染色）およびレクチンアレイ測定を行った。【００３７】
（６）PNGase F処理サンプルを用いたSDS-PAGE解析（銀染色）
mIgA-MIDDおよびmIgA由来の精製IgA1について、上記方法にて調整したPNGase F処理および未処理サンプルを各400 ngずつ10%ポリアクリルアミドゲルSDS-PAGEによって分離し銀染色法によってバンドの検出を行った。【００３８】
（７）PNGase処理サンプルを用いたレクチンマイクロアレイ解析
mIgA-MIDD由来精製IgA1についてPNGase Fによって完全消化したものと未消化の物を上記方法により作製した。調製した1 μg相当のPNGase消化物および未消化物IgA1に対して10 μgのCy3-succimidyl ester (GE Healthcare)を用いて室温、1 h、遮光条件にてペプチドに対するラベル化処理を行った。未反応のCy3試薬を無効化するため、500 mM glycine/1%Triton X-100/TBS(probing buffer)を加えて室温、2 h、遮光条件にてブロッキング処理を行った。最終的にprobing bufferにて10 μg/mLに希釈したサンプル100 ng相当のIgA1をレクチンマイクロアレイに供し、20℃、一晩反応させた。反応後probing bufferで3回洗浄した後、probing buffer 80 μLを加えてGlycostationを用いて測定を行った。シグナルの検出およびデータ処理等については前述のトリプシン消化物を測定した項と同様の方法を用いた。【００３９】
図７に示すようにN-glycanを切断する酵素PNGaseF処理によってN-glycanを認識する多くのレクチン（UDAレクチンより下部）のシグナルが消失している。一方O-glycanを認識するレクチンのシグナル（BPLレクチンより上部）はPNGase処理によって変わらない、もしくは上昇している。したがって、WFAレクチンはPNGaseF処理によってシグナルが低下したことから、N-glycanを認識していることが、この実験によっても確認された。
さらに、予想外なことに、PNGase消化しないサンプルでもWFAシグナルの低下が見られた。この実験では立体構造を破壊する2-mercaptoethanolによる前処理を行っている。トリプシン消化も同様に立体構造を解消することから、結果としてWFAはIgAの立体構造を加味した変化を認識している可能性が示唆された。このようにWFAがmIgA-MIDD由来IgA1の立体構造を認識している可能性があることから、立体構造を解消させるような前処理を行うことで、WFAレクチンのシグナルがどのような挙動を示すか調べることとした。そこでSDS存在下で熱処理を行ったIgA1についてレクチンマイクロアレイ測定を行った。【００４０】
（８）精製IgA１の熱処理方法および熱処理サンプルにおけるレクチンマイクロアレイ測定
mIgA-MIDD由来精製IgA1の界面活性剤存在下での熱処理がレクチンマイクロアレイ上レクチンとの相互作用にどのような影響を与えるかを検討するために以下の実験を実施した。mIgA-MIDD由来精製IgA1へ終濃度0.2%になるようにSDSを加え、９５℃で５分間加熱した。対象サンプルとして0.2%SDS含有mIgA-MIDD由来精製IgA1溶液を調製した。これらを各レクチンアレイ反応槽に100ng, 50ng, 25ng添加し、２０℃で約１６時間保温した。反応後の相互作用検出は上述の抗体オーバーレイレクチンアレイ法により行った。
図８に示すように、mIgA-MIDD由来IgA1はSDS存在下での熱処理によってレクチンアレイにおける糖鎖プロファイルが異なった。特にWFAレクチンシグナルは熱処理によって著しく減少した。それに対して他のO-glycan認識レクチンについては熱処理によって大きな変動が見られなかった。【００４１】
（９）非還元条件下におけるmIgA-MIDD由来精製IgA1に対するWFAの反応性
WFAレクチンがIgAの立体構造変化を認識していることをさらに確認するため、還元または非還元条件でSDS-PAGEを行い、WFAレクチンブロットを行った。
mIgA-MIDD由来精製IgA1について還元および非還元条件下でSDS-PAGEを行った後、WFAレクチン、抗IgA1抗体、ConAレクチンを用いてウエスタンブロッティングを行った。図９に示すように、抗IgA抗体およびConAレクチンを用いた場合、非還元および還元条件に関係なく反応していた（B, C）。一方で、WFAレクチンでは還元条件におけるIgAに全く反応していないのに対して非還元条件におけるIgAにのみ反応していた。コントロールであるシアリダーゼ＋ガラクトシダーゼ処理したサンプル（O-glycanの構造がTn構造となっている）では還元条件でも反応する（A）。
この結果から、WFAは非還元状態のnativeのIgAと反応していることがわかった。さらに、nativeのIgAの中でも、特に高分子のIgA分子とだけ反応することが判明した。
また、WFAレクチンは、健常者由来のIgA1よりも、mIgA-MIDD患者由来のIgA1に強く結合することから、mIgA-MIDD患者由来のIgA1は、健常者由来のIgA1に比べて高分子であると考えられる。【００４２】
（１０）PNGase F処理を利用したN-glycan付加数の検出
糖鎖の付加数の違いについてPNGFase Fを用いて検討した。PNGase FをIgA1に経時的に反応させ、各時間におけるIgA1由来のバンドをSDS-PAGE（銀染色）にて検出した。PNGaseFを経時的に反応させた場合、N-glycanの付加数に依存したバンドが複数見られた（図１０）。
また、図１０Ｃに示すように良性疾患（mIgA）ではPNGaseF反応を途中で止めた場合、3本の重鎖由来、1本の軽鎖由来バンドが検出された（Ｂ、lane 8〜10）。一方mIgA-MIDDでPNGase F反応を途中で止めた場合、4本の重鎖由来、2本の軽鎖由来のバンドが検出された（Ａ、lane 2〜5）。
結果として、健常者では３本のバンドが見られたことから、２本のN-glycanが重鎖上に存在することがわかった。一方mIgA-MIDDでは合計４本のバンドが現れたことから、３本のN-glycanが重鎖上に存在することがわかった。さらに軽鎖にも１本のN-glycanが付加していることがわかった。mIgA-MIDDではN-glycanの本数が増えていることがわかり、健常者に比べてIgA分子１分子あたり合計４本も糖鎖が増加するという異常付加が認められた。【００４３】
（１１）各検体由来精製IgA1における分子量の測定
各検体由来の精製IgA1を非還元条件もしくは還元条件処理した後、10%ポリアクリルアミドゲルSDS-PAGE（銀染色）にて分離して分子量について比較したところ、顕著な違いを見出すことが出来なかった（A）。しかし、より高分子量の物を検出可能な2%アガロースゲルSDS-PAGE(抗IgA1抗体によるウエスタンブロット)にて分離して分子量について比較したところ、mIgA-MIDDにおいては、500kDa以上の高分子多量体IgAを形成していることがわかった（B、lane 3）。（図１１）
一般的にIgAはモノマー、ダイマー、ポリマーを形成することが知られており、健常者の血清中のIgAではモノマーがほとんどである。このような高分子量体は糖鎖の多価性が非常に強いと考えられる。
これまでは、腎症IgAと健常者IgAの糖鎖構造の違いにのみ着目されていたが、本症では糖鎖構造の違いではなく糖鎖構造の付加数および凝集IgAの形成といった立体構造上の異常も加味された異常性を見出した。【００４４】
＜実施例3＞WFAレクチン結合能の測定
（１）WFAレクチンを用いたSandwichレクチンEILSAによる比較解析
レクチンマイクロアレイ測定において、mIgA-MIDDのIgA1に対してWFAレクチンシグナルが顕著に高かったことから、良性疾患、健常者およびmIgA-MIDDの精製IgA1についてWFAレクチンを用いたSandwich lectin ELISAによってWFAへの反応性の差を調べた。mIgA-MIDD、mIgAおよび健常者由来の精製IgA1,10 μgを200 mM酢酸ナトリウムbufferにて50 μLへ希釈し20 mUのシアリダーゼを用いて、37℃、一晩反応させた。さらに反応後、溶液に1.1 mUのβガラクトシダーゼもしくは1.5 mUのβ1,4ガラクトシダーゼによって37℃, 一晩反応させた。次に酵素消化によって作製したサンプルをWFA レクチンを用いたSandwich lectin ELISAによって比較した。まず5 μg/mL濃度のポリクローナル抗IgA抗体（Jackson社製）50μLをMaxisorp 96-well immunoplate (Thermo Fisher Scientific社)に供し室温、2h静置した。上清廃棄後、1%BSA入りPBS溶液100μLを供し室温、1h静置した。上清廃棄後、上記で調製した酵素消化済みIgA1を1%BSA入りPBSにて200倍に希釈して50 μLをプレートに供し、4℃、一晩反応させた。反応させたプレートは200 μLのPBS-Tにて３回洗浄した後、WFA(5 μg/ml; Vector社製), VVA A(5 μg/ml; Vector社製), PNA (2 μg/μl; Vector社製), HPA(5 μg/ml; EY laboratories社製)の各種ビオチン化レクチンを50μL供し、室温、1 h反応させた。さらに200 μLのPBS-Tにて３回洗浄した後、1 μg/μLのstreptavidin-HRPを50μL供し、室温、1 h反応させた。200 μLのPBS-Tにて３回洗浄した後、基質として3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate solution (Thermo Fisher Scientific)を50μL供し、室温で1〜15 min反応させ、十分なシグナルが得られた後に50 μLの2 M H2SO4を加えて反応を終了させた。反応終了後、マイクロプレートリーダー(Wallac 1420ARVO sx Multilabel Counter,Perkin Elmer)を用いて450 nmの波長により検出を行った。検出結果を図１２に示すが、WFAはいずれの検体についてもシアリダーゼ消化したIgA1に強く反応したが、mIgA-MIDD IgA1については特に強く反応することがわかった。したがって、シアリダーゼ処理を行なったIgA1については、良性疾患および健常者とmIgA-MIDDでは顕著な反応性の差があることが見出された。【００４５】
＜実施例４＞WFAレクチンを用いたmIgA-MIDDの分離・精製（エンリッチ化）
（１）分離・精製法１
WFAレクチンがmIgA-MIDDに強く反応することから、WFAレクチンを用いてmIgA-MIDD由来IgAの分離・精製を行った。mIgA-MIDDおよび健常者のPBS buffer中の1μg/μLの精製IgA1 20μLに対して4μgのビオチン化WFAレクチンを加えて20℃、14000rpm、一晩反応させた。あらかじめ200 μL PBS-Tx bufferによて洗浄したDynabeads MyOne streptavidin T1 (Invitrogen) 20 μL(v/v)を添加して20℃、1 hインキュベートした。1 mLのPBS-Txで3回magnetic Beadsを洗浄した後、100 mM GalNAcもしくは100 mM Glycine-HCl(pH2.5)溶液20 μLで20℃、14000rpm、15 minの条件で溶出させた。後者の酸で溶出した場合は3 μL 1M Tris-HCl(pH8.0)で中和を行った。素通り画分および溶出画分についてはSDS-PAGE（銀染色）を用いてバンドの検出を行った（図１３）。
mIgA-MIDD IgA1については良好に精製することができた。【００４６】
（２）分離・精製法２
WFAレクチンを用いて健常者由来IgA中からmIgA-MIDD由来IgAの精製を行った。精製前のサンプルとして健常由来IgA1にmIgA-MIDD由来IgA1を一定比率で混ぜたサンプルを調整した。健常者IgA1を10μgに対してmIgA-MIDD由来IgA1の量を1 μg(10%)、100 ng(1%)、10ng(0.1%)の比率で混ぜサンプルを調整した。続いて、あらかじめ200 μL PBS-Tx bufferによって洗浄したDynabeads MyOne streptavidin T1 (Invitrogen) 50 μL(v/v)に8 μgのビオチン化WFAレクチンを50 μLのPBSに希釈し、20℃、14000rpm、1 hインキュベートした。上述のサンプルをそれぞれPBSで 40 μLに希釈し、1 mLのPBS-Txで3回洗浄したWFA結合magnetic Beadsに添加して20℃、14000rpm、一晩インキュベートした。1 mLのPBS-Txによる3回の洗浄後、40 μlの100 mM GalNAc/PBS溶液を加え、20℃、14000 rpm、15 minの条件で溶出した。素通り画分および溶出画分についてはSDS-PAGE（銀染色）を用いてバンドの検出を行った。
図１４に示すように、10μgの健常者由来精製IgA1に対して10%、１％および0.1%の比率のmIgA-MIDD IgA1（それぞれ、1 μg, 100 ng 10 ng）を混入し、WFAレクチンを用いてmIgA-MIDD IgA1を精製した。WFAレクチンを用いることによって1%のmIgA-MIDD IgA1を十分に分離することができた（緑枠）。また0.1%のmIgA-MIDD IgA1も分離可能であった。【００４７】
（３）WFAレクチンを用いたmIgA-MIDD精製条件の検討
WFAレクチンのmIgA-MIDD由来IgA1に対する結合能を検証するため、WFAアガロースカラムクロマトグラフィーを行った。mIgA-MIDD由来精製IgA1（600ng）を予めPBSTx緩衝液で平衡化したWFAアガロース(130μL)を充填したミニカラムに添加し、４℃で２時間静置反応した。反応後120μLのPBSTx緩衝液をカラムに添加し、非結合分子を滴下、回収した。これを非結合画分とした。レクチンアレイの前に、非結合画分のIgA量を見積もるため、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その結果、およそ７０％程度のIgA1がWFAカラムに結合していることが分かった。次いで、非結合画分を添加前のIgA１量で換算し、50ng, 25ng, 12.5ngをレクチンアレイに添加し、２０℃で１６時間反応した。結合反応の検出には上述の抗体オーバーレイレクチンアレイ法を用いた。対照実験として、mIgA-MIDD由来精製IgA1を同一量（12.5ng）レクチンアレイ解析に供した。その結果を図１５に示す。
非結合画分（Through）のレクチンシグナル強度は精製IgA1のそれに比べ明らかに減少している。特にWFAシグナルにおいては、非結合画分で顕著にシグナルが減少し、mIgA-MIDD由来精製IgA1は、WFAアガロースに吸着されたことが示された。したがってmIgA-MIDD由来IgA1はWFAアガロースによる吸着を行なうことで、エンリッチ化できることが判明した。【００４８】
＜実施例５＞抗IgA抗体オーバーレイ法を用いた血清に対するレクチンマイクロアレイ測定
mIgA-MIDD患者IgA1ではWFAレクチンと高い反応性が見られたことから、精製をせずに血清から直接、mIgA-MIDDと健常者を区別できるか調べるために、血清についてのレクチンマイクロアレイ測定を行った。測定法としては抗IgA1モノクローナル抗体（7303B）による抗体オーバーレイ法によって測定した。以下に実験方法を示す。
mIgA-MIDDおよび健常者の血清70nLを80μLのPBS-Txに希釈し、レクチンマイクロアレイスライドガラスに全量供し、20℃, 18 h反応させた。反応後、80 μLPBS-Txにて3回洗浄した後、6.25 μg/mL濃度のビオチン化抗IgA1抗体（7303B）を80μL供し、20℃,1h反応させた。さらに80 μLPBS-Txにて3回洗浄した後、2.5 μg/mL濃度のstreptavidin-Cy3を80μL供し、20℃,1h反応させた。80 μLPBS-Txにて3回洗浄した後80 μLのPBS-Txを供し、レクチンマイクロアレイにて測定した。Gain125〜110で測定を行った。結果はGain125のものを示す。
図１６に示すように、血清を直接用いた場合においても、mIgA-MIDDおよび健常者で顕著に異なる糖鎖プロファイルが得られた。血清の直接測定においても、WFAレクチンは健常者には反応しないのに対して、mIgA-MIDDのIgA1に強く反応することがわかった。
結果として、血清を直接用いた場合においても、mIgA-MIDDおよび健常者で顕著に異なる糖鎖プロファイルが得られた。血清の直接測定においても、WFAレクチンは健常者には反応しないのに対して、mIgA-MIDDのIgA1に強く反応することがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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