(57)【要約】  本発明は、EGFRのT790M点突然変異配列に由来する抗原ペプチド、および前記ペプチドを含むがんを処置するための薬剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮成長因子受容体のT790M点突然変異配列に由来するペプチドであって、配列番号５のアミノ酸配列を含む１０〜３０アミノ酸残基、配列番号７のアミノ酸配列を含む１１〜３０アミノ酸残基、または配列番号１５のアミノ酸配列を含む９〜３０アミノ酸残基からなり、ペプチド特異的CTL誘導能を有するペプチド。
【請求項２】
配列番号５のアミノ酸配列を含む１０〜３０アミノ酸残基からなり、ペプチド特異的CTL誘導能を有するペプチドである、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号７のアミノ酸配列を含む１１〜３０アミノ酸残基からなり、ペプチド特異的CTL誘導能を有するペプチドである、請求項１記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号１５のアミノ酸配列を含む９〜３０アミノ酸残基からなり、ペプチド特異的CTL誘導能を有するペプチドである、請求項１記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号５、配列番号７、または配列番号１５のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５いずれかに記載のペプチドを含む、がんを処置するための薬剤。
【請求項７】
がんワクチンである、請求項６に記載の薬剤。
【請求項８】
CTL誘導剤である、請求項６に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮成長因子受容体のT790M点突然変異配列に由来する抗原ペプチド、および前記ペプチドを含むがんを処置するための薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
非小細胞肺がんは、国内での年間罹患患者数が約９万人（悪性腫瘍の中で第３位）、年間死亡者数が約６万５千人（悪性腫瘍の中で第１位）であり、海外での罹患患者数が米国２２万人、欧州３９万人と推定される、罹患患者数の極めて多いがんである。現在、非小細胞肺がんの治療には上皮成長因子受容体（EGFR）チロシンキナーゼ阻害薬が用いられているが、EGFRのT790M点突然変異を有する患者はEGFRチロシンキナーゼ阻害薬に対して耐性を示す。進行期の非小細胞肺がん患者の約２０％がT790M点突然変異を有することから、かかるEGFRチロシンキナーゼ阻害薬耐性の患者に対する有効な治療法が求められている。【０００３】
EGFRのアミノ酸配列に由来するHLA-A2拘束性抗原ペプチドとして、EGFR853-861が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、このペプチドは野生型の自己抗原であるEGFRのアミノ酸配列に由来するため、このペプチドに高い親和性を有するT細胞受容体を発現するT細胞は胸腺での選択によりすでに消失しており（免疫寛容）、高い免疫原性は期待できないと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Andrade, et al., Novel immunogenic HLA-A*0201-restricted epidermal growth factor receptor-specific T-cell epitope in head and neck cancer patiens. J Immunother. 2010, 83-91（前記文献は引用により本願明細書に含まれる。）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、EGFRのT790M点突然変異を有するがん患者の処置に有用な抗原ペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上皮成長因子受容体のT790M点突然変異配列に由来するペプチドであって、配列番号５のアミノ酸配列を含む１０〜３０アミノ酸残基、配列番号７のアミノ酸配列を含む１１〜３０アミノ酸残基、または配列番号１５のアミノ酸配列を含む９〜３０アミノ酸残基からなり、ペプチド特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）誘導能を有するペプチド、特に配列番号５、配列番号７、または配列番号１５のアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。【０００７】
本発明はまた、前記ペプチドを含む、がんを処置するための薬剤を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のペプチドは、がんの悪性化に関与する点突然変異を含むため、１）患者体内において非自己として認識され高い免疫原性が期待できる、２）がん細胞内でのワクチン抗原喪失による免疫監視機構からの逃避が起こりにくい、などの特徴を有する。本発明により、有効な治療法のないT790M点突然変異を有するがん患者に対して新たな治療法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】正常ドナー由来末梢血単核球（PBMC）におけるT790M-5ペプチドおよびT790M-7ペプチドの免疫原性。T790M-5ペプチドおよびT790M-7ペプチドの免疫原性を6人のHLA-A2+健常人由来のPBMCを用いて調べた。T790M-5ペプチドあるいはT790M-7ペプチド(10μg/ml)にてPBMCを3日または4日毎に5回刺激した。刺激したPBMC (3 X 104 細胞/ウェル) について、T790M-5ペプチドあるいはT790M-7ペプチドまたはコントロールのHIVペプチド (10μg/ml) をパルスしたT2細胞 (1 X 104 細胞/ウェル)に対する反応性を、IFN-γELISPOTアッセイにより調べた。
【図２】EGFR-T790M変異を有する非小細胞肺がん（NSCLC）細胞株に対するT790M-5刺激T細胞およびT790M-7刺激T細胞の反応性。HLA-A2+健常人由来のPBMCをT790M-5ペプチドあるいはT790M-7ペプチド(10μg/ml)にて3日または4日毎に5回刺激した。刺激したPBMCから抗CD8ビーズを用いて単離したCD8+ T細胞 (2 X 104細胞/ウェル)について、各種NSCLC細胞株（NCI-H1975 (HLA-A2- T790M+)、NCI-H1975-A2 (HLA-A2+ T790M+)、およびHCC827 (HLA-A2- T790M-)）に対する反応性を、IFN-γELISPOTアッセイにより調べた。
【図３】EGFR-T790M変異を有するNSCLC細胞株に対するT790M-5刺激T細胞およびT790M-7刺激T細胞の細胞傷害活性。HLA-A2+健常人由来のPBMCをT790M-5ペプチドあるいはT790M-7ペプチド(10μg/ml)にて3日または4日毎に5回刺激した。刺激したPBMCについて、NSCLC細胞株（NCI-H1975 (HLA-A2- T790M+)およびNCI-H1975-A2 (HLA-A2+ T790M+)）(2 X 103 細胞/ウェル)に対する細胞傷害活性を、示したエフェクター／ターゲット比で調べた。細胞傷害活性は、以下のとおり算出した：細胞傷害活性(%) = [(試験における放出-自然放出)/(最大放出-自然放出))] × 100。
【図４】EGFR-T790M変異を有するNSCLC細胞株に対するT790M-5刺激T細胞およびT790M-7刺激T細胞の反応性のMHCクラスI拘束性。HLA-A2+健常人由来のPBMCをT790M-5ペプチドあるいはT790M-7ペプチド(10μg/ml)にて3日または4日毎に5回刺激した。刺激したPBMCについて、NCI-H1975-A2 (HLA-A2+ T790M+)に対する反応性を、抗HLAクラスI抗体（W6/32）あるいは抗HLAクラスII抗体（L234）の存在下にIFN-γELISPOTアッセイにより調べた。
【図５】T790M-5刺激T細胞の野生型ペプチドに対する交差反応性。HLA-A2+健常人由来のPBMCをT790M-5ペプチド (10μg/ml)にて3日または4日毎に5回刺激した。刺激したPBMCについて、T790M-5ペプチドおよび野生型ペプチドに対する反応性をIFN-γ ELISPOTアッセイにより調べた。
【図６】EGFR-T790M由来ペプチドのHLA-A2結合能。選択ペプチドのHLA-A2分子に対する結合をHLA-A2を発現するTAP欠損株であるT2細胞を用いたHLAクラスI安定化試験にて評価した。
【図７】HLA-A2TgマウスにおけるEGFR-T790M由来候補ペプチドの免疫原性。候補ぺプチドがHLA-A2Tgマウスにおいて免疫原性を有するかを樹状細胞ワクチンにて評価した。T790M-Bの結果を示す。
【図８】健常人ドナー由来PBMCにおけるEGFR-T790M由来候補ペプチドの免疫原性。候補ペプチドの免疫原性の評価のため、HLA-A2陽性健常人由来のPBMCよりペプチド特異的CTLの誘導を行った。T790M-Aの結果を示す。
【図９】EGFR-T790M変異を有するNSCLC細胞株に対するT790M-A特異的CTLラインの反応性（１）。樹立したT790M-A特異的CTLラインのNSCLC細胞株(NCI-H1975（HLA-A2-、T790M+）、NCI-H1975-A2（HLA-A2+、T790M+）)に対する反応性をIFN-γELISPOTアッセイにて評価した。
【図１０】EGFR-T790M変異を有するNSCLC細胞株に対するT790M-A特異的CTLラインの反応性（２）。樹立したT790M-A特異的CTLラインのNSCLC細胞株(NCI-H1975（HLA-A2-、T790M+）、NCI-H1975-A2（HLA-A2+、T790M+）)に対する反応性をCD107aアッセイにて評価した。
【図１１】EGFR-T790M変異を有するNSCLC細胞株に対するT790M-A特異的CTLラインの反応性（３）。樹立したT790M-A特異的CTLラインのNSCLC細胞株(NCI-H1975（HLA-A2-、T790M+）、NCI-H1975-A2（HLA-A2+、T790M+）)に対する細胞傷害活性を評価した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のペプチドは、上皮成長因子受容体（EGFR）のT790M点突然変異配列（EGFR-T790M）に由来するペプチドであって、配列番号５、配列番号７または配列番号１５のアミノ酸配列を含み、ペプチド特異的CTL誘導能を有するペプチドである。EGFR-T790Mのアミノ酸配列を配列番号１１に示す。本発明のペプチドは、それ自体がHLA分子と結合しうるものであっても、細胞内で断片化されてHLA分子に結合する配列番号５、配列番号７、または配列番号１５のアミノ酸配列を含むペプチドを提供するものであってよく、そのアミノ酸残基数に特に制限はないが、好ましくは１０〜３０アミノ酸、１１〜３０アミノ酸、または９〜３０アミノ酸、より好ましくは１０〜１５アミノ酸、１１〜１５アミノ酸、または９〜１５アミノ酸である。
【００１１】
ペプチドがペプチド特異的CTL誘導能を有するか否かは、例えば、末梢血単核細胞（PBMC）をペプチドで刺激し、そのペプチド刺激PBMCが同じペプチドをパルスした抗原提示細胞に反応してサイトカイン（例えばIFN-γ）を産生するかをELISA法、ELISPOT法等により測定して調べることができる。また、51Cr放出測定法等により、誘導されたCTLの細胞傷害活性を確認することによっても調べることができる。
【００１２】
好ましい態様において、本発明のペプチドは、配列番号５、配列番号７、または配列番号１５のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００１３】
本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログであってよく、アミノ酸アナログとしては、アミノ酸のN-アシル化物、O-アシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等が挙げられる。本発明のペプチドは、機能を著しく損なわない限りにおいてその構成アミノ酸またはカルボキシル基などが修飾されていてもよい。修飾は、N末端や遊離のアミノ基にホルミル基、アセチル基、t-ブトキシカルボニル基等を結合するものや、C末端や遊離のカルボキシル基にメチル基、エチル基、t-ブチル基、ベンジル基等を結合するものが挙げられる。
【００１４】
本発明のペプチドは、通常のペプチド合成により製造することができる。そのような方法として、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York，1966；The Proteins, Vol2, Academic Press Inc., New York, 1976；ペプチド合成、丸善（株）、1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）、1985；医薬品の開発続 第十四巻・ペプチド合成、広川書店、1991（前記文献は引用により本願明細書に含まれる。）などに記載されている方法が挙げられる。
【００１５】
本発明のペプチドは、がん患者に投与すると、患者体内においてがん細胞上のがん抗原ペプチドとHLA分子との複合体を認識しその細胞を傷害するCTL（がん反応性CTL）を誘導し、抗腫瘍効果を発揮する。よって、本発明のペプチドは、がんを処置するための薬剤、例えばがんワクチンまたはCTL誘導剤として用いることができる。
【００１６】
本発明の薬剤は、EGFR-T790Mを発現するがんの処置に用いることができる。本発明は、特に非小細胞肺がんに好適である。
【００１７】
本発明において、がんの処置には、予防的処置と治療的処置の両方が含まれる。がんの処置には、例えば、腫瘍病変の縮小または増大抑制、新病変出現の抑制、生存期間の延長、腫瘍に関連する自他覚症状の改善または増悪の抑制、転移の抑制、再発の予防、などが含まれる。
【００１８】
本発明の薬剤は、例えば、皮内投与または皮下投与により患者に投与される。本発明の薬剤は、かかる投与に適するように医薬上許容される塩や担体などを含むことができる。塩としては、塩化ナトリウムや炭酸水素ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸水素塩が挙げられる。好ましくは、本発明の薬剤は血漿と等張となるように水等に溶解して投与される。担体としては、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が挙げられ、必要に応じて当該担体に本発明に用いるペプチドを結合させたものを用いることもできる。
【００１９】
本発明の薬剤は、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤などであってもよい。また、免疫応答が効果的に成立するように、従来からワクチン投与に用いられることが知られている不完全フロイントアジュバント（例えばISA-51等、SEPPIC社）やプルランなどの多糖類や、完全フロイントアジュバント、BCG、アラム、GM-CSF、IL-2、CpG等の免疫増強作用を有するものとともに投与することもできる。
【００２０】
本発明の薬剤の投与量は、疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により適宜調節されるが、通常１回の投与における薬剤中のペプチドの量は、０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ、より一層好ましくは０．１〜５ｍｇまたは０．５〜３ｍｇである。これを数日、数週、または数ヶ月に１回、反復投与することが好ましい。
【００２１】
本発明のペプチドは、インビトロでがん反応性CTLを誘導するために使用することもできる。即ち、本発明は、がん患者から採取されたPBMCを本発明のペプチドと接触させることを含む、がん反応性CTLの誘導方法を提供する。CTLの誘導は、例えば、がん患者から採取されたPBMCを、インビトロで本発明のペプチドの存在下培養することにより行う。前記CTL誘導方法は、PBMCを採取した患者の体内に誘導したCTLを戻してがん細胞を傷害する養子免疫療法に有用である。
【００２２】
本発明のペプチドは、がん患者においてがん反応性CTLを誘導する抗原提示細胞を調製するために使用することもできる。即ち、本発明は、がん患者から採取された抗原提示能を有する細胞を本発明のペプチドと接触させることを含む、抗原提示細胞の調製方法を提供する。抗原提示細胞の調製は、例えば、がん患者由来の抗原提示能を有する細胞を本発明のペプチドとともに培養し、ペプチドをHLA分子に結合および提示させることにより行う。あるいは、そのようなペプチドを発現可能なベクターを、がん患者由来の抗原提示能を有する細胞に導入し発現させてもよい。抗原提示能を有する細胞は、例えば樹状細胞である。患者由来の樹状細胞は、例えば、患者より採取したPBMCから培養プレート接着細胞を分離し、その細胞をIL-4およびGM-CSFの存在下で約１週間培養することで得られる。前記方法により調製された抗原提示細胞は、がん細胞の表面に提示されるペプチドとHLA分子との複合体を特異的に認識するCTLを誘導することができ、がん患者に投与されると患者体内でがん反応性CTLの誘導を促進することができる。よって、本発明の薬剤により調製された抗原提示細胞は、がんを処置するための薬剤として使用可能である。
【００２３】
本発明はまた、本発明のペプチドをコードする核酸分子および前記核酸分子を含むベクターを提供する。本発明の核酸分子を含むベクターは、抗原提示細胞に導入されると本発明のペプチドを発現し、それらをHLA分子との複合体として細胞表面に提示させる。この抗原提示細胞は、EGFR-T790M発現がん細胞を傷害するCTLを効率的に増殖させることができる。
【００２４】
本発明の核酸分子を組み込むベクターとしては、各種プラスミドおよびウィルスベクター、例えばアデノウィルス、アデノ関連ウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等が挙げられる（Liu M, Acres B, Balloul JM, Bizouarne N, Paul S, Slos P, Squiban P.  Gene-based vaccines and immunotherapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A 101 Suppl, 14567-71, 2004）（前記文献は引用により本願明細書に含まれる。）。ベクターの調製方法は当業界にて周知である（Molecular Cloning: A laboraroy manual, 2nd edn. New York, Cold Spring Harbor Laboratory）（前記文献は引用により本願明細書に含まれる。）。
【００２５】
本発明のベクターは、患者体内の抗原提示細胞において本発明のペプチドを発現させるため患者に投与することができる。あるいは、患者体外において例えば患者由来の樹状細胞に本発明のベクターを導入し、本発明のペプチドを発現させた細胞を患者に戻しても良い。これら方法は当業界において周知である（Hrouda D, Dalgleish AG. Gene therapy for prostate cancer. Gene Ther 3: 845-52, 1996）（前記文献は引用により本願明細書に含まれる。）。
【００２６】
本発明のベクターを患者に投与する場合、投与量は疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により変化するが、例えばDNA量として、0.1μg〜100mg、好ましくは1μg〜50mgである。投与方法には、静脈注射、皮下投与、皮内投与等が挙げられる。
【００２７】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれら実施例により制限されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
１．方法および材料
（１）ペプチドおよび細胞株
EGFRの790位の変異残基 (T790M)を含むペプチド、野生型ペプチド、並びにコントロールペプチドであるHLA-A2拘束性ペプチドのインフルエンザM158-66 (Flu-M1)（GILGFVFTL）（配列番号９）およびHIV由来ペプチド（SLYNTVATL）（配列番号１０）は、Thermo Fisher Scientific GmbH (Bremen, Germany)より得た（純度90％以上）。NSCLC細胞株であるNCI-H1975およびHCC827は、American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA)から入手した。NCI-H1975-A2細胞は、HLA-A2 cDNA (pCMV-HLA-A2)を含むプラスミドの安定なトランスフェクションにより樹立した。これらの細胞株は、RPMI 1640培地 (Invitrogen, Carlsbad, CA) （10% 熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、100μg/ml ストレプトマイシン、および100 IU/mlペニシリン含有）にて維持した。細胞表面のHLA-A2の発現は、抗HLA-A2 mAb (BB7.2; BD Biosciences, San Jose, CA)を用いたフローサイトメトリーにより調べた。【００２９】
（２）EGFR-T790M由来HLA-A2結合ペプチドの予測
NetMHC 3.2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC) およびBIMAS (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind)の２つのサーバーを使用して、EGFR-T790Mから9-merまたは10-merのHLA-A2結合ペプチドを予測した。11-merのHLA-A2結合ペプチドの予測には、NetMHC 3.2のみ使用した。これらの予測サーバーのいずれか一方または両方で良好なスコアを示したペプチドを選択してさらに評価した。【００３０】
（３）HLAクラスI安定化アッセイ
HLA-A2分子に対する予測ペプチドの実際の結合は、HLA-A2遺伝子を安定にトランスフェクトしたTAP2欠損RMA-S細胞(RMA-S/A2)を用いるMHCクラスI安定化アッセイにより評価した。説明すると、合成ペプチド（10μg/ml)およびβ2-ミクログロブリンの存在下、RMA-S/A2をRPMI 1640培地中で18時間26℃にて培養した。洗浄後、細胞を3時間37℃で培養し、そして抗HLA-A2 mAb (BB7.2)で染色し、フローサイトメトリーにより解析した。各ペプチドのHLA-A2分子に対する結合能は、以下のようにHLA-A2発現の平均蛍光強度(MFI)における増加により評価した：MFI増加 (%) = (ペプチド存在下のMFI-ペプチド非存在下のMFI)/( ペプチド非存在下のMFI) X 100。HLA-A2拘束性のM158-66 エピトープ (Flu-M1)をポジティブコントロールとして使用した。 【００３１】
（４）抗原特異的T細胞の作製
ペプチド特異的T細胞株は、既報の方法を改変して作製した。説明すると、久留米大学倫理委員会の許可のもと書面によるインフォームド・コンセントを得たHLA-A2+健常人あるいは肺がん患者から末梢血を得た。HLA-A2発現は、抗HLA-A2 mAbを用いたフローサイトメトリーにより確認した。Ficoll-Paque密度遠心法により精製したPBMC (1 × 105 細胞/ウェル) を、各ペプチド（10μg/ml）と96穴丸底プレート (Nunc, Roskilde, Denmark)にて200μlの培地（45% RPMI 1640、45% AIM-V培地 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)、10% FBS、20 IU/ml IL-2、および0.1 mM MEM 非必須アミノ酸溶液(Gibco BRL)）中で培養した。3日または4日毎に培地の半分を除去し、同じペプチド（10μg/ml）および20 IU/ml IL-2を含む培地と置き換えた。培養14日後、細胞をインターフェロン(IFN)-γELSPOTアッセイまたは細胞傷害活性アッセイに使用した。【００３２】
（５）免疫アッセイ
IFN-γ ELISPOTアッセイ (MBL, Nagoya, Japan)のため、ペプチド刺激PBMC (3 X 104 細胞/ウェル) を、コントロールペプチドまたは特異的ペプチド（10μg/ml）をロードしたT2細胞 (1 X 104 細胞/ウェル) と、抗ヒトIFN-γ mAbでコートした96穴ELISPOTプレート (MultiScreen HTS, Millipore) 中で18時間37℃にて培養した。洗浄後、製造元の説明にしたがい、ビオチン結合抗ヒトIFN-γ mAb、ストレプトアビジン-ALP、およびBCIP/NBT基質を用いてスポットを可視化した。スポット数は、ELISPOTリーダー (CTL Technologies)を用いて計測した。NCI-H1975 (HLA-A2- T790M+)、NCI-H1975-A2 (HLA-A2+ T790M+)、およびHCC827 (HLA-A2- T790M-)に対するペプチド刺激PBMCの反応性もまた、IFN-γ ELISPOTアッセイにより試験した。一部の実験では、CD8+ T細胞をCD8 Negative Isolation Kit (Miltenyi Biotec)によりペプチド刺激PBMCから単離した。抗HLAクラスI抗体（W6/32）および抗HLAクラスII抗体（L234）は、10μg/mlで添加した。なお、抗HLAクラスI抗体（W6/32）および抗HLAクラスII抗体（L234）は、いずれもATCCより購入したハイブリドーマ細胞から分泌された抗体を精製して使用した。【００３３】
ペプチド刺激PBMCのNCI-H1975またはNCI-H1975-A2に対する細胞傷害活性は、標準的6-h 51Cr放出アッセイにより試験した。各ウェルにつき2000個の51Cr標識細胞を、示したエフェクター/ターゲット（エフェクター細胞/標的細胞）比にて96穴丸底プレートにおいて培養した。自然放出と最大放出は、それぞれ1% Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)非存在下または存在下に培養した標的細胞により決定した。特異的溶解は、以下のとおり算出した：特異的溶解 (%) = [(試験における放出-自然放出)/(最大放出-自然放出)] × 100。【００３４】
２．結果
（１）EGFR-T790M由来HLA-A2結合ペプチドの予測
HLA-A2分子に結合する可能性の高いペプチド(9〜11-mer)を、NetMHC 3.2および／またはBIMASサーバーを用いて予測した。これらの予測サーバーのいずれか一方または両方で良好なスコアを示した8つのペプチドを選択し、HLA-A2分子に対する実際の結合を評価した（表１）。
【表１】
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【００３５】
（２）EGFR-T790M由来ペプチドのHLA-A2結合能
選択ペプチドのHLA-A2結合能は、HLA-A2を安定に発現するTAP欠損細胞株であるRMA-Sを用いた細胞表面HLAクラスI安定化アッセイにより確認した。表１に示すように、8つの選択ペプチドのうち３つがHLA-A2に対して実質的な結合を示した。HLA-A2に対する結合親和性は、T790M-5がT790M-7およびT790M-8よりもかなり強かった。【００３６】
（３）正常ドナー由来CD8+ T細胞におけるEGFR-T790M由来HLA-A2結合ペプチドの免疫原性
EGFR-T790M由来HLA-A2結合ペプチドの免疫原性を調べるため、6人のHLA-A2+ 健常人由来のPBMCを合成ペプチド（T790M-5、T790M-7、またはT790M-8）で繰り返し刺激した。図１に示すように、反復刺激後、6人の健常人中5人においてT790M-5に応答してIFN-γを放出するT細胞株を樹立することができた。また、反復刺激後、6人の健常人中3人においてT790M-7に応答してIFN-γを放出するT細胞株を樹立することができた。しかしながら、これら6人の健常人はいずれも、T790M-8に対して抗原特異的T細胞応答を示さなかった。【００３７】
（４）EGFR-T790M変異を有するNSCLC細胞に対するペプチド刺激T細胞の反応性
T790M-5あるいはT790M-7による反復刺激後のPBMCから精製したCD8+ T細胞の、NSCLC細胞株（NCI-H1975 (HLA-A2- T790M+)、NCI-H1975-A2 (HLA-A2+ T790M+)、およびHCC827 (HLA-A2- T790M-)）に対する反応性を、IFN-γ ELISPOTアッセイにより調べた。図２に示すように、T790M-5刺激CD8+ T細胞およびT790M-7刺激CD8+ T細胞は、NCI-H1975-A2に対して顕著なIFN-γ産生を示したが、HLA-A2陰性の親NCI-H1975細胞に対しては示さなかった。また、T790M-5刺激CD8+ T細胞およびT790M-7刺激CD8+ T細胞はEGFR/T790M陰性細胞株であるHCC827に対しては応答しなかった。さらに、T790M-5刺激PBMCおよびT790M-7刺激PBMCは、NCI-H1975-A2に対して実質的な細胞傷害活性を示したが、HLA-A2陰性NCI-H1975細胞に対しては示さなかった（図３）。さらに、T790M-5あるいはT790M-7による反復刺激後のPBMCのNCI-H1975-A2 (HLA-A2+ T790M+)に対する反応性を、抗HLAクラスI抗体（W6/32）あるいは抗HLAクラスII抗体（L234）の存在下にIFN-γ ELISPOTアッセイにより調べた。図４に示すように、T790M-5刺激PBMCおよびT790M-7刺激PBMCは、抗体非存在下あるいは抗HLAクラスII抗体（L234）存在下においてNCI-H1975-A2に反応して顕著なIFN-γ産生を示したが、抗HLAクラスI抗体（W6/32）の存在下においてはIFN-γ産生が低下した。これらの結果は、T790M-5エピトープおよびT790M-7エピトープがEGFR-T790M変異を有するNSCLC細胞の細胞表面にMHCクラスI拘束性に発現していることを示唆する。【００３８】
（５）T790M-5刺激T細胞の野生型ペプチドに対する交差反応性
T790M-5による反復刺激後のPBMCの野生型ペプチド(TQLMPFGCLL)（配列番号１２）に対する反応性を、IFN-γ ELISPOTアッセイにより調べた。図５に示すように、T790M-5刺激PBMCは、高濃度(1μg/ml)の野生型ペプチドには反応したが、低濃度(10 ng/ml)の野生型ペプチドには反応しなかった。一方、T790M-5刺激PBMCは、T790M-5ペプチドに対しては低濃度(10 ng/ml)においても反応した。このように、T790M-5刺激T細胞は野生型ペプチドへの反応性が低いことから、野生型ペプチドを発現する正常細胞への反応性も低いものと考えられた。これらの結果は、T790M-5をワクチン抗原として生体に投与した際に、野生型ペプチドを発現する正常細胞への反応、すなわち自己免疫反応が誘導される可能性が低いことを示唆する。【００３９】
（６）HLA-A2+肺がん患者の血液におけるT790M-5およびT790M-7の免疫原性
T790M-5およびT790M-7の肺がん患者における免疫原性を調べるため、HLA-A2+肺がん患者17人のPBMCをT790M-5あるいはT790M-7の存在下で繰り返し刺激したのち、ペプチド抗原特異的なＴ細胞が誘導できるかどうかをIFN-γ ELISPOTアッセイにより解析した。ゲファチニブ感受性の患者では6人中3人（50%）、ゲファチニブ耐性の患者では11人中2人（18%）において、ペプチド特異的なＴ細胞の誘導が可能であった（表２）。この結果から、ゲファチニブ耐性の患者では、T790M点突然変異に特異的なT細胞の消失により免疫監視機構が破綻し、T790M変異を有する癌細胞の出現が可能となった可能性が考えられる。したがって、ゲファチニブ治療中の肺がん患者に対してT790M-5またはT790M-7を用いた免疫療法を実施し、免疫監視機構を維持することができれば、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬耐性変異（T790M)の出現を予防できる可能性も期待できる。
【表２】
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【実施例２】
【００４０】
１．方法および材料
（１）マウス
HLA-A2トランスジェニック（Tg）マウス（HHD、H-2Db-/-β2m-/-）は埼玉医科大学  松井教授より提供を受け、国立がん研究センター東病院動物舎にて維持した。【００４１】
（２）ペプチドおよび細胞株
EGFRの790位の変異残基（T790M）を含むペプチドは、スクラム（Tokyo, Japan）より得た（純度＞95％）。コントロールペプチドであるHLA-A2拘束性HIV77-85ペプチド（SLYNTVATL）（配列番号１０）およびCMV495-503ペプチド（NLVPMVATV）（配列番号１３）はAmerican Peptide Co. (Sunnyvale, CA, US)より、H-2Kb 拘束性OVA257-264ペプチド（SIINFEKL）（配列番号１４）はAnaSpec（Fremont, CA, USA）より得た（純度＞95％）。NSCLC細胞株であるNCI-H1975は金沢大学  矢野教授より、NCI-H1975-A2細胞は久留米大学  笹田准教授より提供をうけた。人工抗原提示細胞（aAPC：K562/HLA-A2/CD80/CD83）はDana-Farber Cancer Institute. Dr.Hiranoより提供を受けた。RMA-S-HHDは埼玉医科大学  松井教授より提供をうけた。これらの細胞株は、RPMI1640培地（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA）（10％熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、100μg/mlストレプトマイシン、及び100 IU/mlペニシリン含有）にて維持した。【００４２】
（３）EGFR-T790M由来HLA-A2結合ペプチドの予測
BIMAS（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/）のサーバーを使用して、EGFR-T790Mから9merまたは、10merのHLA-A2結合ペプチドを予測した。予測サーバーで良好なスコアを示したペプチド及び改変ペプチドを選択して評価した。【００４３】
（４）HLAクラスI安定化アッセイ
HLA-A2分子に対する予測ペプチドの結合をTAP欠損株であるT2細胞（HLA-A2+）（RIKEN, Saitama, Japan）を用いるHLAクラスI安定化アッセイにて評価した。T2をRPMI1640培地中で一晩26℃にて培養後、合成ペプチドの存在下で3時間26℃で培養した。細胞を2.5時間37℃で培養し、抗HLA-A2抗体BB7.2（MBL, Nagoya, Japan）で染色し、フローサイトメトリーにより解析した。各ペプチドのHLA-A2分子に対する結合能は、HLA-A2発現の平均蛍光強度（MFI）の差をポジティブコントロール及びネガティブコントロールと比較することで評価した。ポジティブコントロールとして、HLA-A2拘束性HIVペプチドおよびCMVペプチド、ネガティブコントロールとしてH-2Kb 拘束性OVAペプチドを使用した。【００４４】
（５）マウス樹状細胞の作製
HLA-A2Tgマウスより、全骨髄細胞を採取し、溶血することにより、骨髄細胞を得た。得られた骨髄細胞4×106個をマウスGM-CSFおよび2ME存在下で1週間RPMI培養液で培養することによりマウス骨髄由来樹状細胞を得た。得られた樹状細胞は、抗I-Ab抗体、抗CD11c抗体、抗CD14抗体、抗CD40抗体、および抗CD86抗体（BioLegend, San Diego, CA, USA）で染色し、フローサイトメトリーにて樹状細胞への分化を確認した。【００４５】
（６）マウスでの免疫原性の評価
各ペプチドを10μg/mlでマウス樹状細胞にロードし、PBS 200μlに溶解した5×105個の樹状細胞を8-10週齢のHLA-A2Tgマウスに、0日目および7日目に腹腔内注射することにより免疫した。14日目にマウスより脾臓を採取し、マイクロビーズ (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)にてCD8+細胞を単離し、IFN-γ ELISPOTアッセイにて特異的CTLの誘導を評価した。【００４６】
（７）ヒト由来樹状細胞の作製
書面によるインフォームドコンセントのもと、HLA-A2+健常人より末梢血を得た。HLA-A2発現は三菱化学メディエンスにて遺伝子タイピングにて確認した。末梢血よりFicoll-Paque (General Electric Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden)密度遠心法によりPBMCを精製し、マイクロビーズにてCD14+細胞を単離した。CD14+細胞をGM-CSFおよびIL-4存在下でRPMI培養液で5日間培養し、TNF-αおよびPGE2にて成熟化樹状細胞に分化させ、7日目に使用した。成熟化樹状細胞は、抗HLA-DR抗体（Becton-Dickinson Co. ,Sunnyvale, CA, USA）、抗CD11c抗体、抗CD14抗体、抗CD40抗体、抗CD80抗体、抗CD83抗体、および抗CD86抗体（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）で分化を確認した。【００４７】
（８）抗原特異的T細胞の作製
HLA-A2+健常人より得られたPBMCよりマイクロビーズにてCD8+細胞を単離し、24穴プレート（Becton, Dickinson and Company）にて、CD8+細胞2×106個と、各ペプチドを10 μg/mlでロードし100 Gyにて放射線照射した樹状細胞とを、2mlの培地（RPMI、10% AB serum (SIGMA)）で共培養した。7および14日目に、各ペプチドを10μg/mlでロードし200 Gyにて放射線照射したaAPCを培養液に加え培養した。3、10、および17日目に、IL-2 (10 IU/ml)およびIL-15 (10 ng/ml)を培地に添加した。21日目に培養細胞を回収し、マイクロビーズにてCD8+を単離し、解析に使用した。【００４８】
（９）免疫アッセイ
IFN-γ ELISPOTアッセイにてペプチド特異的免疫反応を評価した。上記（６）のマウスCD8+細胞または上記（８）のヒトCD8+細胞（1×105個/ウェル）と、ペプチド（10μg/ml）をロードしたRMA-S-HHDまたはT2細胞（1×105個/ウェル）とを、抗IFN-γ抗体でコートした96穴ELISPOTプレート中で20時間37℃で培養した。洗浄後、ビオチン結合抗IFN-γmAb、ストレプトアビジンHRP、AEC基質を用いてスポットを可視化した。スポット数は、Eliphoto system (Minerva Tech, Tokyo, Japan)にて計測した。NCI-H1975およびNCI-H1975-A2に対するペプチド特異的CTLの評価も行った。実験によっては、細胞数およびペプチドパルス濃度を変更して行った。【００４９】
（１０）CD107aアッセイ及びペプチド特異的CTLラインの樹立
上記（８）のCD8+細胞と標的細胞（ペプチドをロードしたT2またはNCI-H1975-A2）を、抗CD107a抗体 (BD Biosciences)存在下でエフェクター細胞：標的細胞比2：1で3.5時間37℃で培養し、フローサイトメーターで評価した。CD8+CD107a+細胞をペプチド特異的CTLとして、セルソーターにて96穴プレートにソート（1〜100個/ウェル）した。ソートしたペプチド特異的CTLを、100 Gyにて放射線照射したアロのPBMC 8×104個をフィーダーとして14-21日間培養し（AIM-V (Gibco, Carlsbad, CA, USA)、10％ AB serum、IL-2 (200 U/mL)、フィトヘマグルチニン-P (PHA) (5μg/mL)）、ペプチド特異的CTLラインを樹立した。樹立したCTLラインのペプチド特異性は、IFN-γELISPOTアッセイにて確認した。【００５０】
（１１）細胞傷害性試験
ペプチド特異的CTLの細胞傷害活性は、カルセインラベルによるアッセイにて行った。標的細胞（NCI-H1975またはNCI-H1975-A2）をカルセインAM (Dojindo, Kumamoto, Japan)にて標識し、96穴ハーフプレート(Corning, NY, USA)に標的細胞1×104個と、下記のエフェクター細胞/ターゲット細胞比となるように4-6時間共培養し、Terascan VPC system (Minerva Tech)にて細胞傷害活性を評価した。エフェクター細胞/ターゲット細胞比を3：1及び10：1とし評価した。細胞傷害活性は右記にて算出した：細胞傷害活性（%）=(試験における放出―自然放出)/（最大放出―自然放出）×100。【００５１】
２．結果
（１）EGFR-T790M由来HLA-A2結合ペプチドの予測
HLA-A2に結合する可能性が高いEGFR-T790M由来ペプチド(9〜10mer)をBIMASサーバーにて予測した。良好なスコアがえられ、かつ、T790M変異の存在により野生型ペプチド配列よりスコアが上昇する3つのペプチド（T790M-A、T790M-B、T790M-C）を選択した。さらに、HLA分子との結合に重要なアンカー残基を変異させることでより結合の可能性を高めた1アミノ酸改変ペプチド2つ（T790M-D, T790M-E）を加え、計5つを候補ペプチドとした（表３）。
【表３】
2014024965.tif 000004
【００５２】
（２）EGFR-T790M由来ペプチドのHLA-A2結合能
選択ペプチドのHLA-A2結合能は、HLA-A2を発現するTAP欠損株であるT2細胞を用いた細胞表面HLAクラスI安定化試験にて確認した。図６に示すように、T790M-A、T790M-B、およびT-790-CについてHLA-A2との結合を確認した。改変ペプチドT790M-D、T790M-Eではより強い結合を認めた。【００５３】
（３）HLA-A2TgマウスにおけるEGFR-T790M由来候補ペプチドの免疫原性
候補ぺプチドがHLA-A2Tgマウスにおいて免疫原性を有するかを樹状細胞ワクチンにて評価した。HLA-A2Tgマウス骨髄より樹状細胞を誘導し、候補ペプチドをロードし、2回腹腔内に免疫した。免疫したマウスより脾細胞を採取し、IFN-γELISPOT アッセイにて評価した。図７に示すとおり、免疫したマウス5匹全てでT790M-B特異的CTLの誘導を確認した。他の4つのペプチドについては特異的CTLの誘導は認められなかった。【００５４】
（４）健常人ドナー由来PBMCにおけるEGFR-T790M由来候補ペプチドの免疫原性
EGFR-T790M由来候補ペプチドの免疫原性の評価のため、HLA-A2陽性健常人由来のPBMCよりペプチド特異的CTLの誘導を行った。CD8陽性T細胞を単離し、ペプチドをロードした樹状細胞およびaAPCによる刺激にて誘導した。誘導した4人全例でT790M-A特異的CTLが誘導された（図８）。同様に、4人中2人でT790M-B特異的CTLの誘導が確認された。他の3種については特異的CTLの誘導は得られなかった。また、得られたT790M-A特異的CTLを用いて、CD107aアッセイにてCD8+CD107a+細胞ソートし、T790M-A特異的CTLラインを樹立した。【００５５】
（５）EGFR-T790M変異を有するNSCLC細胞株に対するT790M-A特異的CTLラインの反応性
樹立したT790M-A特異的CTLラインのNSCLC細胞株(NCI-H1975（HLA-A2-、T790M+）、NCI-H1975-A2（HLA-A2+、T790M+）)に対する反応性をIFN-γELISPOTアッセイ及びCD107aアッセイにて評価した。HLA-A2陰性のNCI-H1975に比べ、NCI-H1975-A2でIFN-γ産生の上昇がみられた（図９）。また、CD107aアッセイにおいてもNCI-H1975-A2との共培養でCD107a陽性細胞が多数検出された（図１０）。さらに、T790M-A特異的CTLラインはNCI-H1975-A2に対し細胞傷害活性を示したが、HLA-A2陰性のNCI-H1975には細胞傷害活性を示さなかった（図１１）。これらの結果は、NCI-H1975-A2が内因性に提示する9merのT790M-AペプチドをCTLが認識し、傷害できることを示唆する。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列番号１：合成ペプチド
配列番号２：合成ペプチド
配列番号３：合成ペプチド
配列番号４：合成ペプチド
配列番号５：合成ペプチド
配列番号６：合成ペプチド
配列番号７：合成ペプチド
配列番号８：合成ペプチド
配列番号９：合成ペプチド
配列番号１０：合成ペプチド
配列番号１２：合成ペプチド
配列番号１３：合成ペプチド
配列番号１４：合成ペプチド
配列番号１５：合成ペプチド
配列番号１６：合成ペプチド
配列番号１７：合成ペプチド
【図１】
2014024965.tif 000005
【図３】
2014024965.tif 000006
【図４】
2014024965.tif 000007
【図５】
2014024965.tif 000008
【図６】
2014024965.tif 000009
【図７】
2014024965.tif 000010
【図８】
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【図９】
2014024965.tif 000012
【図１０】
2014024965.tif 000013
【図１１】
2014024965.tif 000014
【図２】
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【配列表】
2014024965000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年2月10日(2014.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５、配列番号７、または配列番号１５のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項３】
配列番号７のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項４】
配列番号１５のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
請求項１〜４いずれかに記載のペプチドを含む、がんを処置するための薬剤。
【請求項７】
がんワクチンである、請求項６に記載の薬剤。
【請求項８】
ＣＴＬ誘導剤である、請求項６に記載の薬剤。
【国際調査報告】
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