(57)【要約】  サーチュイン遺伝子活性増強剤ならびにそれを用いた医薬品、化粧品、および食品を開示する。本発明のサーチュイン遺伝子活性増強剤は、所定のポリフェノールおよび／またはテルペノイドを有効成分として含有する。ポリフェノールおよび／またはテルペノイドは、ザクロなどの植物または植物抽出物の形態で含有され得る。本発明のサーチュイン遺伝子活性増強剤は、身近な材料から得られるものであり、人体に対する副作用等の懸念も予め回避されている。このようなサーチュイン遺伝子活性増強剤は、医薬品、化粧品および食品分野における新規素材として有用である。
2014042261.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリフェノールを有効成分として含有するサーチュイン遺伝子活性増強剤であって、該ポリフェノールが、プニカリン、プニカラジン、ウロリチンＡ、オイゲニイン、テリマグランジンＩおよびそれらの類縁物質からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、サーチュイン遺伝子活性増強剤。
【請求項２】
テルペノイドを有効成分として含有するサーチュイン遺伝子活性増強剤であって、該テルペノイドが、カフェストール、カフェオール、グリチルリチンおよびそれらの類縁物質からなる群から選択される少なくとも１種の化合物である、サーチュイン遺伝子活性増強剤。
【請求項３】
前記ポリフェノールが、植物または植物抽出物の形態で含有される、請求項１に記載のサーチュイン遺伝子活性増強剤。
【請求項４】
前記植物または植物抽出物が、ザクロまたはザクロ抽出物である、請求項３に記載のサーチュイン遺伝子活性増強剤。
【請求項５】
前記テルペノイドが、植物または植物抽出物の形態で含有される、請求項２に記載のサーチュイン遺伝子活性増強剤。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のサーチュイン遺伝子活性増強剤を含有する、医薬組成物。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載のサーチュイン遺伝子活性増強剤を含有する、化粧料組成物。
【請求項８】
単離されたポリフェノールおよび／またはテルペノイドを含有する、食品組成物であって、
該ポリフェノールが、プニカリン、プニカラジン、ウロリチンＡ、オイゲニイン、テリマグランジンＩおよびそれらの類縁物質からなる群より選択される少なくとも１種の化合物であり、そして
該テルペノイドが、カフェストール、カフェオール、グリチルリチンおよびそれらの類縁物質からなる群から選択される少なくとも１種の化合物である、食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サーチュイン遺伝子活性増強剤ならびにそれを用いた医薬品、化粧品、および食品に関し、より詳細には、入手が容易でありかつ人体に対する副作用の懸念が少ない、サーチュイン遺伝子活性増強剤ならびにそれを用いた医薬品、化粧品、および食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
老化・寿命制御に関する研究の中で、NAD依存性脱アセチル化酵素活性を有するサーチュイン(Sirtuin)であるSir2の関与が注目されている。酵母Sir2の哺乳類ホモログとしてはSIRT1〜7が知られており、特にSIRT1は脂肪動員の増強、神経軸索変性の抑制、β細胞からのインスリン分泌、肝臓での糖新生等の制御に関わり、その制御を通じて延命を実現しているものと考えられている。【０００３】
このようなサーチュイン遺伝子の活性を増強させ、哺乳類の延命効果を期待する物質として、身近な材料から得ることができる物質の利用が注目されている。このような例としては、乳酸菌または乳酸菌由来成分が挙げられる（特許文献１）。【０００４】
しかし、こうしたサーチュイン遺伝子の活性増強能を有し、かつ身近な材料から得ることができる物質の種類自体は未だ少なく、ましてその中で優れた活性を有するものとなれば、到底充分な種類が存在するとは言い難い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−１９５６７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記問題の解決を課題とするものであり、その目的とするところは、身近な材料から得ることができ、かつ優れた増強活性を有する、サーチュイン遺伝子活性増強剤ならびにそれを用いた医薬品、化粧品、および食品を得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ポリフェノールを有効成分として含有するサーチュイン遺伝子活性増強剤を提供する。上記ポリフェノールは、プニカリン、プニカラジン、ウロリチンＡ、オイゲニイン、テリマグランジンＩおよびそれらの類縁物質からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である。【０００８】
本発明はまた、テルペノイドを有効成分として含有するサーチュイン遺伝子活性増強剤を提供する。上記テルペノイドは、カフェストール、カフェオール、グリチルリチンおよびそれらの類縁物質からなる群から選択される少なくとも１種の化合物である。【０００９】
１つの実施形態では、上記ポリフェノールは、植物または植物抽出物の形態で含有される。【００１０】
さらなる実施形態では、上記植物または植物抽出物は、ザクロまたはザクロ抽出物である。【００１１】
別の１つの実施形態では、上記テルペノイドは、植物または植物抽出物の形態で含有される。【００１２】
本発明はまた、上記サーチュイン遺伝子活性増強剤を含有する、医薬組成物である。【００１３】
本発明はまた、上記サーチュイン遺伝子活性増強剤を含有する、化粧料組成物である。【００１４】
本発明はまた、単離されたポリフェノールおよび／またはテルペノイドを含有する、食品組成物であって、該ポリフェノールが、プニカリン、プニカラジン、ウロリチンＡ、オイゲニイン、テリマグランジンＩおよびそれらの類縁物質からなる群より選択される少なくとも１種の化合物であり、そして該テルペノイドが、カフェストール、カフェオール、グリチルリチンおよびそれらの類縁物質からなる群から選択される少なくとも１種の化合物である、食品組成物である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、延命および抗老化に関与すると考えられるサーチュイン遺伝子の活性を高めた機能性材料を簡易かつ大量に提供することができる。本発明のサーチュイン遺伝子活性増強剤は、身近な材料から得られるものであり、人体に対する副作用等の懸念も予め回避されている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】種々のポリフェノールまたはテルペノイドについて、Caco-2-hSIRT1p-EGFP細胞に添加した際のhSIRT1のプロモーター活性への影響を示すグラフである。
【図２】種々のポリフェノールまたはテルペノイド添加後のCaco-2細胞におけるサーチュイン遺伝子hSIRT1の発現量を示すグラフである。
【図３】種々の植物または植物抽出物について、Caco-2-hSIRT1p-EGFP細胞に添加した際のhSIRT1のプロモーター活性への影響を示すグラフである。
【図４】種々のポリフェノールまたはテルペノイド添加後のHaCaT-hSIRT1p-EGFP細胞におけるEGFP蛍光強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について詳述する。
【００１８】
本発明のサーチュイン遺伝子活性増強剤は、植物および／または植物由来成分を有効成分として含有する。
【００１９】
ここで、本発明に用いられる用語「サーチュイン遺伝子」とは、例えば、酵母、線虫、ショウジョウバエの延命に寄与するとされるＮＡＤ依存性脱アセチル化活性酵素を有するSir2のホモログ、および哺乳類におけるSIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、およびSIRT7を包含して言う。「サーチュイン遺伝子活性増強剤」とは、当該サーチュイン遺伝子の活性をインビボおよび／またはインビトロにて増強し得る物質単独、および当該物質を含有する組成物を包含して言う。
【００２０】
本発明における当該植物の例としては、ザクロ、ニッケイ、大麦、ケール、人参、エルダーフラワー、茶、ローズマリー、バラ、サクラ、ショウガ、赤ショウガ、黒ショウガ、ユキノシタ、ユーカリ、月見草、コーヒー、カンゾウおよびマツヨイグサなどの草本、樹木等、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。使用され得る当該植物の部位は、特に限定されないが、例えば、全草、花、果実、葉、種子、根、茎、根茎、根皮および樹皮、ならびにこれらを任意に発酵させたものを包含する。上記植物の具体例と好ましい使用部位との関係については、例えば、ザクロの花、果実、葉および種子、ニッケイの根皮および樹皮、大麦若葉、発酵人参、発酵茶葉（例えば、烏龍茶）、ローズマリーの葉、バラの花、果実および種子、サクラの樹皮、花および葉、ショウガの根茎、赤ショウガの根茎、黒ショウガの根茎、ユキノシタの全草、ユーカリの葉および樹皮、月見草の葉、コーヒーの果実、カンゾウの根、ならびにマツヨイグサの全草が好適に使用される。
【００２１】
当該植物は、予め乾燥したもの、あるいは生の状態（未乾燥）のものをいずれであってもよい。サーチュイン遺伝子活性増強剤としての保存性に優れ、かつ当該増強剤において活性を示す成分含量を高めることができるという点から、予め乾燥したものを用いることが好ましい。
【００２２】
本発明における植物由来成分は、植物から得ることができる抽出物（抽出化合物単独、および液状物、ペースト状物、粉末などの抽出混合物の両方を包含する）、ならびに当該抽出化合物と同様の化学構造を有する任意の化合物（例えば、化学的に合成されたもの）を包含する。
【００２３】
このような植物由来成分の例としては、ポリフェノールおよびテルペノイド、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。さらに、ポリフェノールの例としては、プニカリン（punicalin）、プニカラジン（punicalagin）、ウロリチンＡ(urolithin A)、エノテインＢ(oenothein B)、ユーカルバニンＢ(eucalbanin B)、オイゲニイン(eugeniin)、テリマグランジンＩ(tellimagrandin I)およびそれらの類縁物質、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。テルペノイドの例としては、カフェストール(cafestol)、カフェオール(kahweol)、グリチルリチン(glycyrrhizin)およびそれらの類縁物質、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００２４】
本発明において、植物由来成分は、例えば、上記植物の所定部位から、当業者に公知の方法を用いて抽出することにより得ることができる。
【００２５】
抽出は、例えば、上記植物の部位を所定の抽出溶媒に浸漬することにより行われ得る。
【００２６】
この浸漬において、当該植物は、例えば、抽出効率を高めるために適切な長さに予め切断させているか、粉砕されていてもよい。
【００２７】
抽出溶媒としては、特に限定されないが、水（例えば、熱水）；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの低級アルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコールなどの多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類；酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどの鎖状および環状エーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素などのハロゲン化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテルなどの炭化水素類；ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類；ポリエチレングリコールなどのポリエーテル類；ピリジン類などが挙げられ、これらを単独または混合物として用いることができる。好ましくは、水、低級アルコール（メタノール、エタノール、ブタノールなど）、アセトン、酢酸エチル、またはこれらの２種以上の混合液である。
【００２８】
抽出の条件（溶媒の量、温度、時間など）は、特に制限されない。例えば、抽出溶媒の量は、好ましくは、浸漬する植物に対して１〜５０倍容量／乾燥質量である。抽出温度は、使用する溶媒の種類に応じて異なるが、通常は、室温〜溶媒の沸点以下の温度に設定される。抽出時間も、使用する溶媒の種類、量、および抽出温度によって変動し得る。例えば、室温で使用する場合、１時間〜６０時間であり得、溶媒の沸点付近で使用する場合は、１分〜３００分間程度であってもよい。さらに、１種類の抽出溶媒による単回抽出でもよく、あるいは、異なる種類の溶媒を用いて複数回抽出してもよい。
【００２９】
さらに上記浸漬の後、例えば、室温まで放冷され、濾過または遠心分離により植物が除去される。こうして粗抽出物を得ることができる。なお、得られた粗抽出物は、その後、不純物を除去するための任意の手段（例えば、カラムクロマトグラフィー）により精製および溶媒の除去が行われる。
【００３０】
このような操作を通じて、上記植物から所望の植物由来成分を得ることができる。
【００３１】
１つの実施形態では、本発明のサーチュイン遺伝子活性増強剤は、ポリフェノール（例えば、エラジタンニン）を有効成分として含有する。エラジタンニンの例としては、プニカリン、プニカラジン、ウロリチンＡ、エノテインＢ、ユーカルバニンＢ、オイゲニイン、テリマグランジンＩおよびそれらの類縁物質（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０の飽和脂肪酸エステル体または不飽和脂肪酸エステル体）、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。ポリフェノールは、植物または植物抽出物の形態で含有され得る。植物そのものを用いる場合、全草または上述の所定部位のいずれが用いられてもよく、生または乾燥物、あるいはこれらのペーストまたは粉末のいずれであってもよい。植物抽出物を用いる場合、例えば、上述したように調製された抽出物が用いられ得る。植物抽出物の形態は、このような植物または植物抽出物の例は、ザクロ（Punica granatum）またはザクロ抽出物である。ザクロまたはザクロ抽出物は、エラジタンニン（例えば、プニカリン、プニカラジン、ウロリチンＡ、エノテインＢ、ユーカルバニンＢおよびそれらの類縁物質）などのポリフェノールを含有し得る。エラジタンニン（例えば、プニカリン、プニカラジン、ウロリチンＡ、エノテインＢ、ユーカルバニンＢおよびそれらの類縁物質）などのポリフェノールは、ザクロまたはザクロ抽出物の形態で含有され得る。オイゲニインおよびそれらの類縁物質は、バラまたはその抽出物の形態で含有され得る。テリマグランジンＩおよびそれらの類縁物質は、ハマナスまたはその抽出物の形態で含有され得る。
【００３２】
１つの実施形態では、本発明のサーチュイン遺伝子活性増強剤は、テルペノイドを有効成分として含有する。テルペノイドの例としては、カフェストール、カフェオール、グリチルリチンおよびそれらの類縁物質（例えば、Ｃ１〜Ｃ２０の飽和脂肪酸エステル体または不飽和脂肪酸エステル体）、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。ポリフェノールは、植物または植物抽出）、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。テルペノイドは、植物または植物抽出物の形態で含有され得る。カフェストール、カフェオールおよびそれらの類縁物質は、コーヒーまたはコーヒー抽出物の形態で含有され得る。グリチルリチンおよびその類縁物質は、カンゾウまたはカンゾウ抽出物の形態で含有され得る。
【００３３】
本発明のサーチュイン遺伝子活性増強剤は、必ずしもインビボまたはインビトロのいずれかに限定されることなく、サーチュイン遺伝子の活性を増強させることを目的とする用途全般において広範に利用され得る。本発明のサーチュイン遺伝子活性増強剤は、例えば、医薬品、医薬部外品などの医薬組成物の構成成分として、そのままあるいは他の医薬組成物と組み合わせて使用されてもよく、化粧品などの化粧料組成物の構成成分として、そのままあるいは他の化粧品材料と組み合わせて使用されてもよく、あるいは健康食品などの食品組成物あるいは飲食物に添加される添加物の一種として使用されてもよく、家畜または養殖魚などの生産分野に利用される飼料組成物の構成成分として、そのままあるいは他の飼料用材料と組み合わせて使用してもよい。
【００３４】
本発明のサーチュイン遺伝子活性増強剤は、上記植物および／または植物由来成分単独、すなわち、上記植物および／または植物由来成分のみから構成されていてもよく、あるいは、上記植物および／または植物由来成分を有効成分して含有する限りは、上記医薬組成物、化粧料組成物、食品組成物または飼料組成物を構成する成分として、一般に使用され得る他の添加剤または他の成分を含有していてもよい。
【００３５】
本発明のサーチュイン遺伝子活性増強剤が、上記植物および／または植物由来成分と、上記他の添加剤を含有する場合、当該増強剤に占める植物および／または植物由来成分の割合は、必ずしも限定されないが、増強剤全体の質量を基準として、例えば、０．０１質量％〜９９．９９質量％、好ましくは１質量％〜９０質量％の範囲である。
【００３６】
本発明のサーチュイン遺伝子活性増強剤が医薬組成物の構成成分として使用される場合、上記他の添加剤には、従来より医薬品の調製に通常用いられる添加剤が用いられ得る。このような添加剤の例としては、特に限定されないが、薬学的に受容可能な賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香料、着色剤、コーティング剤などが挙げられる。
【００３７】
他の局面では、本発明はまた、上記サーチュイン遺伝子活性増強剤を含有する医薬組成物である。
【００３８】
本発明の医薬組成物の形態は、特に限定されないが、通常、日本薬局方の記載の種々の投与剤形に加工されたものである。経口投与を目的とする医薬組成物の場合、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、徐放剤、溶液剤、シロップ剤、乳剤などが挙げられる。非経口投与を目的とする医薬組成物の場合、注射剤、軟膏剤、ローション剤などが挙げられる。本発明の医薬組成物において、用量は、対象となる者の体重などの種々の条件によって変動するため、当業者によって適宜選択され得る。本発明の医薬組成物は、ポリフェノールまたはテルペノイド、およびそれらの組み合わせの有効成分の量を、経口または粘膜吸収により投与される場合は、例えば、０．１質量％〜５０質量％、非経口投与による場合は、例えば、０．１質量％〜３０質量％とし得る。
【００３９】
本発明のサーチュイン遺伝子活性増強剤が化粧料組成物の構成成分として使用される場合、上記他の添加剤には、従来より化粧料の調製に通常用いられる添加剤が用いられ得る。このような添加剤としては、例えば、油分、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、防腐剤、香料、着色料、薬剤などが挙げられる。これらの成分を必要に応じて１または２以上含むことができる。
【００４０】
他の局面では、本発明はまた、上記サーチュイン遺伝子活性増強剤を含有する化粧料組成物である。
【００４１】
本発明の化粧料組成物の形態は特に限定されず、ローション、乳液、クリーム、パウダーなどが挙げられる。
【００４２】
本発明のサーチュイン遺伝子活性増強剤が食品組成物の構成成分として使用される場合、上記他の成分には、従来より食品分野で通常使用される食品原料が用いられ得る。例えば、水；アルコール；食肉加工品；米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆、コンブ、ワカメ、テングサなどの一般食品材料およびそれらの粉末；デンプン、コーンスターチ、水飴、ラクトース、果糖、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトールなどの糖類；リンゴファイバー、大豆ファイバーなどの食物繊維；肉エキス；黒酢エキス；ゼラチン；蜂蜜；動植物油脂；香辛料；ビタミン類、保存料、デキストリン、着色剤、潤沢剤、乳化剤、懸濁化剤、酸化防止剤、防腐剤、増粘剤、甘味料、香味剤、ポリビニルピロリドン、および結晶性セルロースなどの食品添加物などの食品原料が挙げられる。さらに、必要に応じて他の生理活性成分や薬剤（漢方薬を包含する）を含んでいてもよい。このような他の成分および／または他の薬剤の含有量は、特に限定されず、当業者は、サーチュイン遺伝子活性を妨げることのない適切な成分および量を選択することができる。
【００４３】
他の局面では、本発明はまた、上記サーチュイン遺伝子活性増強剤を含有する食品組成物である。より好ましくは、本発明の食品組成物は、サーチュイン遺伝子活性増強剤として、上記植物から一旦単離されたポリフェノールおよび／またはテルペノイドを含有する。
【００４４】
ここで「単離された」とは、上記植物に含まれていた成分を上記抽出などの操作を通じて、当該植物から分離することを言う。このため本発明の食品組成物は、乾燥・未乾燥などを問わず、上記植物をそのまま構成成分として組成物中に含有させる場合を含まない。
【００４５】
このように本発明の食品組成物が、このような単離されたポリフェノールおよび／またはテルペノイドを含有することにより、上記植物をそのまま飲食品として用いることでは到底なし得なかった、より高濃度のポリフェノールおよび／またはテルペノイド（サーチュイン遺伝子活性増強剤）を当該食品組成物に含有させることができる。その結果、従来の飲食品とは全く異なる食品組成物を提供することができる。
【００４６】
本発明の食品組成物は、通常食用に供されるもの全般を指し、その形態はどのようなものであってもよい。当該食品組成物は、固形の食品に限定されず、飲料（例えば、液体飲料）であってもよい。
【００４７】
ここで、本明細書中で用いられる用語「食品組成物」とは、摂取にあたり咀嚼を要するものおよび要しないもののいずれをも包含する食品全般をいい、常温においてペースト状、固形状（タブレット、顆粒を包含する）、ゼリー状、液状などのいずれの形態をも包含する。食品組成物の具体的な例としては、キャンディ、グミ、クッキー、ビスケットなどの菓子類；シロップ類；乾燥果実、乾燥野菜などの果実または野菜加工品；沢庵、キムチなどの漬物類；ビーフジャーキー、ハンバーグ、ハム、ソーセージなどの畜肉または魚肉製品；ラーメン、うどん、蕎麦、パスタ、素麺などの麺類；食パン、フランスパン、あんぱん、惣菜パンなどのパン類；大福、草もちなどの餅類；フルーツ缶詰などの缶・ビン詰類；ゼリー；アイスクリーム；栄養補助食品などのサプリメント；果実飲料、茶飲料、コーヒー飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料などの飲料；が挙げられるが、特にこれらに限定されない。
【００４８】
本発明のサーチュイン遺伝子活性増強剤は、上記の通り、サーチュイン遺伝子の活性を高めることができる。このため、生体の延命または長寿効果を達成または期待させる材料として、広く利用することができる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００５０】
（参考例１）
サーチュイン遺伝子活性増強剤の探索に用いるために、サーチュイン遺伝子のプロモーターを導入した細胞を、以下に示すように調製した。【００５１】
TIG-1細胞（東北大学加齢医学研究所より入手）より抽出したヒトゲノムDNAを鋳型として、hSIRT1（ヒトSIRT1）プロモーター領域（−1593〜−1bp）をLA-PCR法により取得した。プライマーは、報告されているhSIRT1ゲノム配列の情報をもとに合成し、その両末端に、AseＩおよびNheＩの認識配列を付加したプライマー（hSIRT1p-AseＩ（配列番号１）、hSIRT1p-NheＩ（配列番号２））を合成した。PCRの反応条件は、94℃にて１分間の後、98℃にて20秒；68℃にて2分を34サイクル、72℃にて10分間の伸長反応を行った。また、TaqDNAポリメラーゼには、宝酒造のLA-Taqを使用し、プライマーの合成は、株式会社ニッポンイージーティーに委託した。【００５２】
LA-PCRによって得られたhSIRT1プロモーター断片をpGEM-T Easy vector（プロメガ株式会社製）へTAクローニングした。またシークエンシングにより塩基配列の確認を行った。pGEM-T Easy vectorに組み込まれたhSIRT1プロモーター断片を制限酵素AseIおよびNheI消化によって切り出し、同じくpEGFP-C3（タカラバイオ株式会社製）のCMVプロモーターをAseIとNheＩ消化で除き、この除いた部位に挿入し、phSIRT1p-EGFPを得た。【００５３】
トランスフェクションには、LIFE TECHNOLOGIES社製のLIPOFECT AMINE 2000 REAGENTを使用し、それに準ずるプロトコールで行った。トランスフェクションを行う前日に、Caco-2細胞（ヒト結腸癌由来細胞。理化学研究所バイオリソースセンターより入手）を1.0×106で10mLディッシュに播種した。トランスフェクションを行う当日にphSIRT1p-EGFP（10μg）を容量が750μLになるように無血清OPTI-MEM培地で希釈した後、15μLのLIPOFECT AMINE Reagentを無血清OPTI-MEM培地で1.5mLに希釈し、室温で5分間インキュベートした。LIPOFECT AMINE Reagentによるトランスフェクション法は、血清非存在下で行うため、この間に前日に播種しておいたCaco-2細胞の培養培地を除去し、5mLの無血清OPTI-MEM培地に置換した、30分後、DNA-LIPOFECT AMINE 2000混合液を各10mLディッシュに1.5mLずつ添加した。添加後、軽く震盪させDNA-LIPOFECT AMINEとOPTI-MEMとを混和した。3時間培養後、DNA-LIPOFECT AMINE混合溶液を除去し、血清を含む培養培地に置換した。その後、5%CO2/95%air、37℃環境下で21時間培養し、新しい培養培地に置換した。【００５４】
phSIRT1p-EGFPは薬剤G418に耐性があるので、トランスフェクションした細胞に薬剤G418を70μg/mLとなるように添加し、1週間薬剤選択にかけた。3日毎に新しい培養培地に置換し、その都度G418を同濃度で添加した。これにより、Caco-2-hSIRT1p-EGFP細胞が得られた。【００５５】
（実施例１：SIRT1増強ポリフェノールまたはテルペノイドの探索）
本実施例では、Caco-2-hSIRT1p-EGFP細胞を用いて、種々のポリフェノールまたはテルペノイドについて、サーチュイン遺伝子hSIRT1のプロモーターの増強効果を調べた。【００５６】
Caco-2-hSIRT1p-EGFP細胞を0.6×10４細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種した。翌日、各ウェルに10μMポリフェノールまたはテルペノイド、あるいはコントロール（PBS）を添加した。添加してから2日後、培養液をアスピレート後、4%パラホルムアルデヒド100μLを各ウェルに添加し、室温で10分間静置した。10分間静置後、4%パラホルムアルデヒドをアスピレートし、PBSで1/500希釈したCellstain（登録商標）−Hoechst 33342 solution（Dojindo）100μLを各ウェルに添加し、15分間室温暗所で静置した後アスピレートし、PBS100μLを各ウェルに添加し、IN Cell Analyzer 1000（GE Healthcare, Amersham Place, UK）にて蛍光強度を測定した。プロモーター活性は、コントロールの活性に対する相対的割合で表した。【００５７】
この結果を図１に示す。図１は、種々のポリフェノールまたはテルペノイドについて、Caco-2-hSIRT1p-EGFP細胞に添加した際のhSIRT1のプロモーター活性への影響を示すグラフである。縦軸は、相対hSIRT1プロモーター活性を表し、数値が高いほどプロモーター活性が強い。横軸に、用いたポリフェノールまたはテルペノイドを示す。プニカリン、プニカラジン、ウロリチンＡ、テリマグランジンＩ、オイゲニイン、カフェストール、カフェオール、およびフィセチンにおいて、特に強いhSIRT1プロモーター増強活性が確認された。【００５８】
（実施例２：SIRT1増強ポリフェノールまたはテルペノイドによる内在性SIRT1の発現量の確認）
本実施例では、プニカリン、プニカラジン、ウロリチンＡ、オイゲニイン、カフェストール、カフェオール、グリチルリチンおよびフィセチンについて、これらのポリフェノールまたはテルペノイド添加後のCaco-2細胞におけるサーチュイン遺伝子hSIRT1の発現量を調べた。この手順を以下に示す。【００５９】
Caco-2細胞を5mLディッシュに3.0×105細胞にて播種し、24時間後に各ポリフェノール10μMとなるように添加した。なお、ポリフェノールおよびテルペノイド無処理の場合をネガティブコントロールとし、そしてポジティブコントロールとしてレスベラトロール10μMを添加した。この処理を行ってから2日後にRNAを回収した。【００６０】
全RNAの調製にはロシュ社（Roche, Indianapolis, IN, USA）のHigh Pure RNA Isolation Kitを使用した。また全RNA調製から逆転写反応終了まで用いる試薬および器具はRNase Freeのものを使用した。細胞培養ディッシュ（Greiner bio-one, Monroe, NC, USA）にサブコンフルエントからコンフルエント状態の細胞を準備した。培地を完全に除去し、PBS 200μLおよびHigh Pure RNA Isolation Kitに含まれている細胞溶解液400μLを添加し、細胞溶解液をよくディッシュ全体にくぐらせて、細胞溶解液に粘性が無くなったら1.5mLサンプルチューブへ回収した。回収したサンプルは良く懸濁した。High Pure RNA Isolation Kitに含まれているフィルターチューブと回収用チューブとを組み立て、試料をフィルターチューブ上部のバッファー受けにピペットで加え、8,000×gで15秒間遠心分離した。回収用チューブに排出された液を捨て、再びフィルターチューブとこの回収用チューブを組み立てた。試料当たり90μLのDNaseインキュベーションバッファーを滅菌済み反応チューブにピペットで加え、このチューブにDNaseＩ10μLを加え混合した。この混合液をピペットでフィルターチューブ上部バッファー受けにのせ、フィルターチューブ内のグラスファイバーフリースに添加し、室温15分間インキュベートした。High Pure RNA Isolation Kitに含まれている洗浄バッファーＩ 500μLをフィルターチューブ上部バッファー受けに加え、8,000×gで15秒間遠心分離した。回収用チューブに排出された液を捨て、再びフィルターチューブとこの回収用チューブとを組み立てた。洗浄バッファーII 500μLをフィルターチューブ上部バッファー受けに加え、8,000×gで15秒間遠心分離した。回収用チューブに排出された液を捨て、再びフィルターチューブとこの回収用チューブとを組み立てた。洗浄バッファーII 200μLをフィルターチューブ上部バッファー受けに加え、13,000×gで2分間遠心分離し、フィルターチューブ内に残っている洗浄バッファーを取り除いた。回収用チューブを捨て、フィルターチューブを滅菌済み反応チューブに挿し込み、溶出バッファー50μLをフィルターチューブに加え、8,000×gで1分間遠心分離した。この操作による溶出液をRNA溶液とした。溶液中のRNA濃度は、NanoDrop 2000/2000c分光光度計（Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）を使用し、260nmでの吸光値を元に算出し、以後の実験に使用した。【００６１】
細胞から抽出した全RNA1.0μgに対して5pmolのoligo(dT)20プライマーを加え、総液量が13μLになるように滅菌水を加えた。サーマルサイクラー（Peltier Thermal Cycler PTC-200, MJ Research, Watertown, MA, USA）にて65℃で5分間熱処理反応を行い、直ちに氷中に移して急冷した。その間に逆転写酵素反応プログラムを42℃の段階へ進めておき一時停止にした。氷中にて5分間経過したサンプルへ１サンプル当たり逆転写酵素反応緩衝液4μL, 1mM dNTPs（Amershan Pharmacia Biotech., Buckinghamshire, UK）2μL, 逆転写酵素ReverTra Ace（TOYOBO, Osaka, Japan）0.5μLを混合した溶液を加え穏やかに混合した。その後42℃ 20分間、99℃ 5分間の反応にてcDNAを合成し、後に使うPCRの鋳型として用いた。【００６２】
hSIRT検出用のフォワードプライマー（配列番号３）およびリバースプライマー（配列番号４）を、そして検量線のためのプライマーとしてβ−アクチン検出用のフォワードプライマー（配列番号５）およびリバースプライマー（配列番号６）をそれぞれ設計した。プライマーの合成は、タカラバイオ株式会社（Shiga, Japan）に委託した。【００６３】
作製したcDNAを鋳型として用いた。cDNAを1/10に希釈し、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの双方を10pmol/μLに希釈した。これらの希釈液を、0.2mL PCRチューブにRNase Free水51.5μL、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの双方を3.5μLずつ、鋳型cDNA 7.0μL、KAPA SYBR FAST qPCR Kit（NIPPON Genetics, Tokyo, Japan）22μLを入れ、よく懸濁した。その後、96ウェルプレートに25μLずつ添加し、Thermal Cycle Dicer Real Time System (TaKaRa)を用いて、定量PCRを行った。PCR反応条件としては、95℃にて30秒間を1サイクル、95℃にて5秒間、60℃にて30秒間を40サイクル行った。hSIRTの相対遺伝子発現量は、測定した値をβ−アクチンの値で除し求めた。【００６４】
この結果を図２に示す。図２は、種々のポリフェノールまたはテルペノイド添加後のCaco-2細胞におけるサーチュイン遺伝子hSIRT1の発現量を示すグラフである。縦軸は、hSIRTの相対遺伝子発現量を示し、横軸に、用いたポリフェノールまたはテルペノイドを示す。プニカリン、プニカラジン、ウロリチンＡ、オイゲニイン、カフェストール、カフェオール、グリチルリチンおよびフィセチンの全てにおいてhSIRT1転写増強効果が観察された。【００６５】
（実施例３：SIRT1増強植物または植物抽出物の探索）
本実施例においては、種々のポリフェノールまたはテルペノイドの種々の植物または植物抽出物を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、サーチュイン遺伝子hSIRT1のプロモーターの増強効果を調べた。【００６６】
この結果を図３に示す。図３は、種々の植物または植物抽出物について、Caco-2-hSIRT1p-EGFP細胞に添加した際のhSIRT1のプロモーター活性への影響を示すグラフである。縦軸は、相対hSIRT1プロモーター活性を表し、数値が高いほどプロモーター活性が強い。横軸に、用いた植物または植物抽出物を示す。ザクロ果汁精製エキス、ニッケイ、ニッケイ黒皮（宮崎）、ニッケイ（和歌山）、エルダーフラワー、赤烏龍茶、ローズマリー、ニッケイ黒皮（阿久根）、ローズペダル、桜葉、ショウキョウ（生姜）、黒ショウガ、赤ショウガ、および雪の下において、hSIRT1プロモーター増強活性が確認された。【００６７】
（参考例２）
サーチュイン遺伝子活性増強剤のSIRT1発現増強効果をさらに検証するために、サーチュイン遺伝子のプロモーターを導入した細胞を、以下に示すように調製した。【００６８】
（１．細胞培養）
HaCaT細胞（ヒト表皮ケラチノサイト由来細胞株、国立成育医療センター・三浦巧博士より分与）は、10% FBS、100,000U/Lペニシリン（Meiji、東京）、100mg/Lストレプトマイシン（Meiji）、2.0g/L NaHCO3を含むDalbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）培地（日水製薬、東京）を用いて培養した。これらの細胞は、37℃、5% CO2存在下で継代培養した。【００６９】
（２．リポフェクションによる遺伝子導入）
以下のようにして、参考例１に記載のベクター（phSIRT1-EGFP）を組み込んだHaCaT細胞株（HaCaT-hSIRT1p-EGFP細胞）を作製した。【００７０】
（２−１．HaCaT細胞への遺伝子導入）
HaCaT細胞をφ60mmディッシュに9.0×105個播種し、10% FBS含有DMEM培地で培養した。コントロールとしての細胞も同様に用意した。24時間後、phSIRT1p-EGFP  ８μgをDMEM培地300μLに加えて混ぜ、そこにトランスフェクション試薬であるハイリーマックス（Hilymax、同仁化学）24μLを加えてさらに混ぜ、15分間室温でインキュベートした。その後、全量をHaCaT細胞へ添加した。3時間後、10% FBS含有DMEM培地に交換した。【００７１】
（２−２．薬剤選択）
遺伝子導入から24時間後、G418（和光純薬）を750μg/mL含む10% FBS含有DMEM培地に交換した。コントロールの無処理HaCaT細胞が全滅するのを顕微鏡下目視にて確認した後、G418を150μg/mLとした10% FBS含有DMEM培地にて継代培養を続けた。【００７２】
（２−３．フローサイトメトリーによるEGFP蛍光強度の測定）
上記継代培養後の細胞にきちんとphSIRT1p-EGFPベクターが入っているかをフローサイトメトリーにより確認した。上記の細胞とコントロールの無処理HaCaT細胞とをφ60mmディッシュに7.0×105個播種した。24時間後、細胞を剥がして5% FBS含有DMEM培地2mLでよく懸濁し、ナイロンメッシュ（共通理工、日本）にかけて、フローサイトメーター（EPICS, BeckmanCoulter）でEGFP蛍光強度の測定を行った。解析ソフトはFlowJo（Tree Star, Ashland OR）を用い、それぞれの細胞のEGFP蛍光強度をヒストグラム化した。【００７３】
（実施例４：SIRT1増強ポリフェノールまたはテルペノイドによるサーチュイン遺伝子hSIRT1のプロモーターの増強効果）
HaCaT-hSIRT1p-EGFP細胞をφ60mmディッシュに1.7×106細胞（フローサイトメトリーによる測定時）または96ウェルプレートに2.0×104細胞／ウェル（IN Cell Analyzer 1000による測定時）撒き、24時間後、DMSO（和光純薬）に溶解させた各種ポリフェノールまたはテルペノイド10μMを添加した。なお、ネガティブコントロールとしてポリフェノールおよびテルペノイド無処理の場合、DMSOを同量添加し、そしてポジティブコントロールとしてレスベラトロール10μMを添加した。各種ポリフェノールまたはテルペノイドまたはコントロール添加から２４時間後、フローサイトメトリーにより蛍光強度を測定した。【００７４】
この結果を図４に示す。図４は、種々のポリフェノールまたはテルペノイド添加後のHaCaT-hSIRT1p-EGFP細胞におけるEGFP蛍光強度を示すグラフである。縦軸は、EGFP蛍光強度を表し、数値が高いほどプロモーター活性が強い。横軸に、用いたポリフェノールまたはテルペノイドを示す。プニカリン、プニカラジン、ウロリチンＡ、テリマグランジン、フィセチン、カフェストール（誘導体）、カフェオールにおいて、肌表皮細胞においてもhSIRT1の発現効果が観察された。【００７５】
（調製例１：ザクロ抽出物の調製）
市販の乾燥ザクロ粉末（果実および種子、中国産）３００ｇに水７００ｍＬを加え、５０℃にて２４時間攪拌放置し、放冷後遠心分離して、抽出液９００ｍＬを得た。その抽出液をアンバーライトＸＡＤ４（オルガノ社製）１００ｇを充填したカラムに注入し、３０００ｍＬの水を流し、その後、エタノール：水＝８：１（ｖ：ｖ）混液を１５００ｍＬ流した。得られた画分を減圧下で濃縮した後、得られたエタノール−水画分濃縮物に凍結乾燥助剤としてセルロース（旭化成アビセル）５ｇを加え、凍結乾燥した。このようにして、粉末状ザクロ抽出物を調製した。【００７６】
（エラジタンニン量）
上記粉末状ザクロ抽出物のエラジタンニン量を、文献（J. Agric. Food Chem., 2009年, 57(16)、p.7395）に記載の下記条件に従い、ＨＰＬＣ（型番Inertsil ODS-3、ジーエルサイエンス株式会社製）で定量した。【００７７】
＜ＨＰＬＣの分析条件＞
検出器：紫外吸光光度計（380nm）
カラム：Inertsil ODS-3（5μm、4.6×250mm）（ジーエルサイエンス株式会社製）
カラム温度：４０℃
流量：1.0mL／分
注入量：25μL
移動相条件：０．５％リン酸（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）を、以下の条件でリニアグラジエントを行った：
Ａ      Ｂ
０分      ９５％    ５％
１０分      ８５％  １５％
３０分      ７５％  ２５％
３５分      ９５％    ５％【００７８】
得られた結果を以下に示す。
プニカリン          ２５％
プニカラジン        ３０％
エノテインＢ      ０．１％【００７９】
（実施例５：錠剤の作製）
調製例１の粉末状ザクロ抽出物１０ｍｇ、乳糖２５０ｇ、コーンスターチ４５ｇおよびカルボキシメチルセルロースカルシウム２０ｇを転動造粒機に入れ、予熱混合し、ヒドロキシプロピルセルロース１．７ｇを含む水溶液３４ｇをスプレーして、造粒末を得た。ここにカルボキシメチルセルロースカルシウム１００ｇおよびタルク４０ｇを加えて混合し、この混合末を打錠機により打錠し、裸錠を得た。【００８０】
（実施例６：飲料の作製）
下記処方に基づき、飲料を作成した。【００８１】
成分                            配合比（質量比）
グリセリン                        １０．０
調製例１の粉末状ザクロ抽出物        １．０
セルロース                          ０．１
クエン酸                            ０．３
香料                                ０．１
精製水                              残量
上記各成分を一緒に混合し、撹拌することにより飲料を作製した。【００８２】
（実施例７：化粧水の作製）
以下の成分を以下の割合で均一に混合して化粧水を得た。【００８３】
成分                        配合比（質量比）
グリセリン                        １０．０
１，３−ブチレングリコール          ６．０
調製例１の粉末状ザクロ抽出物        １．０
クエン酸                            ０．１
クエン酸ナトリウム                  ０．３
ポリオキシエチレン                  １．０
エチルアルコール                    ８．０
パラベン                            ０．１
香料                                ０．１
精製水                              残量
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明によれば、延命および抗老化に関与すると考えられるサーチュイン遺伝子の活性を高めた機能性材料を簡易かつ大量に提供することができる。本発明のサーチュイン遺伝子活性増強剤は、身近な材料から得られるものであり、人体に対する副作用等の懸念も予め回避されている。このようなサーチュイン遺伝子活性増強剤は、医薬品、化粧品および食品分野における新規素材として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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