(57)【要約】  本発明は、より安価に免疫増強効果に優れたβグルカンを製造する方法を提供することを目的とし、乳酸生産菌の菌体及び／又はその派生物を栄養原として黒酵母（Aureobasidium pullulans）を培養して、当該黒酵母にβグルカンを生産させるようにした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸生産菌の菌体及び／又はその派生物を栄養原として黒酵母（Aureobasidium pullulans）を培養して、当該黒酵母にβグルカンを生産させる工程を有することを特徴とするβグルカンの製造方法。
【請求項２】
前記黒酵母は、乳酸生産菌の菌体及び／又はその派生物を唯一の窒素源として生育可能なものである請求項１記載のβグルカンの製造方法。
【請求項３】
前記黒酵母は、アウレオバシジウム・プルランス  ＭＲＢ００１（Aureobasidium pullulans MRB001）株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３８６）である請求項１記載のβグルカンの製造方法。
【請求項４】
前記乳酸生産菌は、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）である請求項１記載のβグルカンの製造方法。
【請求項５】
請求項１記載の製造方法により得られたβグルカンを含有することを特徴とするβグルカン含有組成物。
【請求項６】
アウレオバシジウム・プルランス  ＭＲＢ００１（Aureobasidium pullulans MRB001）株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３８６）である黒酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、免疫増強効果に優れたβグルカンの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
βグルカン（β−１，３−１，６−グルカン）は、近時、その免疫増強効果により注目されている物質である。すなわち、βグルカンには、体内の感染細胞やガン細胞等を攻撃するマクロファージや、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、キラーＴ細胞等を活性化させる働きがあり、免疫力・抵抗力を高めて、身体の中に侵入した細菌や異物を排除したり、発病を抑制したりする効果を有している。また、これらの効果が発現する結果、アレルギー抑制、ガン等の悪性腫瘍抑制、血糖値の降下、利尿効果、血圧調整、血中コレステロール値と中性脂肪値の低下等の作用があることも報告されている。【０００３】
このβグルカンの製造方法には、パン酵母やキノコ類からの抽出法と、黒酵母（Aureobasidium pullulans）を培養してその培地中に蓄積させる方法があるが、黒酵母に由来するβグルカンは他の生物に由来するものよりも水溶性が高く、また１．６鎖が高密度に分岐された分子構造に由来して効果も高いという利点があるといわれている。【０００４】
乳酸菌やバシラス属の乳酸生産菌の免疫増強効果についても既に公知となっており、報告例も多い。これらの乳酸を生産する菌は、細胞壁の構成成分としてＣｐＧモチーフと呼ばれる特有の塩基配列（ＤＮＡ断片）を比較的多く有することが知られている。このＣｐＧモチーフが直接哺乳類の免疫システムを刺激して、マクロファージや、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、キラーＴ細胞等を活性化させ、各種の感染に対する防衛機構を増強すると考えられている。【０００５】
なお、「乳酸菌」とは菌学的に定義された細菌名ではなく、その定義は、糖を発酵し、乳酸のみ、又は、乳酸・酢酸・アルコール・炭酸ガスを生産するグラム陽性の桿菌及び球菌に対してLactobacteriaceaeという科名を適用したことに由来する。【０００６】
また、バシラス属の乳酸生産菌は、有胞子性乳酸菌と呼ばれることもあるが、一般的な乳酸菌には分類されない。【０００７】
バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）の持つ生理活性効果についても既に広く知られており、プロバイオティクスに関する有用性も見出されている。また、一般の乳酸菌と同様、本菌株の安全性も広く認められている（非特許文献１、２）。【０００８】
また、βグルカンと乳酸菌を組み合わせて配合した製品も開発されており、特に、乳酸球菌であるエンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）を組み合わせた組成物がインフルエンザに対する免疫力を高め、重症化を防ぐ効果を持つと報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−２２００６５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety,2(3),101-110
【非特許文献２】Food Chem Toxicol, 47(6), 1231-1238 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来の黒酵母を用いたβグルカンの製法では、培地の栄養源として糖の他に米糠のような天然物質を用いる必要がある。しかし、米糠等は製品中に不純物として残存し、後工程で分離することは難しい。そして、このような不純物の存在は、食感、味質に影響する。【００１２】
また、βグルカンには毒性はないが、大量に摂取しすぎると下痢の症状を引き起こすこともある。このため、充分な免疫増強効果を得るためには、免疫賦活の作用機序が異なる乳酸菌等とβグルカンとを組み合わせて摂取するのが好ましいと考えられている。【００１３】
βグルカンと混合する乳酸菌としては、通常、グルコース等の糖源に酵母エキス等の栄養源と、無機塩、ビタミン等を添加した培地により菌体を培養し、これを高温高圧下に滅菌して、精密濾過、遠心分離等により培地と分離したものが用いられる。この製品は、粉末デキストリン等により希釈した粉末等の形態をとるが、非常に高価である。【００１４】
また、ラクトバシラス属、ラクトコッカス属等の一般的な乳酸菌や、スポロラクトバシラス属等のバシラス属の乳酸生産菌は、工業的に乳酸を製造する際に乳酸発酵により大量に生成することが知られている。これらの乳酸を生産する菌は、乳酸発酵の終了後に凝集剤や濾過助剤等を使って培地より分離され、大部分はそのまま廃棄されている。【００１５】
そこで本発明は、より安価に免疫増強効果に優れたβグルカンを製造する方法を提供すべく図ったものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、このような乳酸発酵の廃棄物である乳酸生産菌（一般の乳酸菌及びバシラス属の乳酸生産菌を包含する。）をβグルカン培養の栄養源として用いることができるならば、経済的にβグルカンと乳酸生産菌の効果を併せ持った製品を創製できると考えた。そして、本発明者は、乳酸発酵を終えた廃乳酸生産菌を唯一の窒素源として生育することができるβグルカン生産菌である黒酵母を適当な条件下で培養することにより、効率よくかつ不純物が少ないβグルカン培養液を生産できることを見出した。本発明は、当該知見に基づき完成に至ったものである。【００１７】
すなわち本発明に係るβグルカンの製造方法は、乳酸生産菌の菌体及び／又はその派生物を栄養原として黒酵母（Aureobasidium pullulans）を培養して、当該黒酵母にβグルカンを生産させる工程を有することを特徴とする。なお、本発明において、「乳酸生産菌」は、乳酸を生産することが可能な菌の総称として用いられ、バシラス属の乳酸生産菌だけではなく、一般的な乳酸菌及びバシラス属の乳酸生産菌を包含した広義の意味で用いられる。【００１８】
前記黒酵母は、乳酸生産菌の菌体及び／又はその派生物を唯一の窒素源として生育可能なものであることが好ましい。【００１９】
このような黒酵母のなかでも、特にアウレオバシジウム・プルランス  ＭＲＢ００１（Aureobasidium pullulans MRB001）株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３８６）が好適に用いられる。当該株は、平成２４年７月５日に独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されたものである。【００２０】
前記乳酸生産菌としては、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）を用いることができる。なお、バシラス・コアギュランスとβグルカンとを組み合わせて用いて免疫増強等の効果を上げることは、これまでに公知となった文献等には全く開示されていない。【００２１】
本発明に係る製造方法により得られたβグルカンを含有するβグルカン含有組成物もまた、本発明の一つである。本発明に係る製造方法により得られたβグルカンは、従来のβグルカンに比べて免疫増強効果に優れたものであるが、これは本発明に係る製造方法により得られたβグルカンには、乳酸生産菌の細胞壁に含まれるＣｐＧモチーフを含むＤＮＡ断片が混在しているためであると考えられる。【００２２】
更に、アウレオバシジウム・プルランス  ＭＲＢ００１（Aureobasidium pullulans MRB001）株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３８６）である黒酵母もまた、本発明の一つである。
【発明の効果】
【００２３】
このような構成を有する本発明によれば、細胞壁の成分としてＣｐＧモチーフが多く含まれ、免疫増強効果を持つ乳酸生産菌を原料として、同様に免疫増強等の効果を持つβグルカンを、夾雑物として残存する米糠等の他の窒素源を用いずに、安価に、かつ、大量に培養することができる。従って、本発明によれば、乳酸生産菌とβグルカンの免疫増強効果を相乗的に発揮しうる、純度の高い製品を得ることができる。【００２４】
また、本発明は、近年バイオプラスチックとして注目され、大量に生産が見込まれるポリ乳酸のモノマー製造のための乳酸発酵から大量に廃棄される乳酸生産菌の有効な利用法として活用できる。このため、現在は健康食品やペットフードの一部に使用されているβグルカン及び乳酸生産菌の利用範囲を、家畜飼料等にまで廉価に広げることができる。また、本発明は、鳥インフルエンザ等の予防にも有用であり、経済的波及効果も大きいと期待される。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下に本発明を詳述する。
【００２６】
本発明に係るβグルカンの製造方法は、乳酸生産菌の菌体及び／又はその派生物を栄養原として黒酵母（Aureobasidium pullulans）を培養して、当該黒酵母にβグルカンを生産させる工程を有するものである。
【００２７】
前記乳酸生産菌としては、乳酸を生産することが可能な菌であれば特に限定されず、例えば、一般的な乳酸菌やバシラス属の乳酸生産菌（以下、バシラス属乳酸生産菌ともいう。）等が用いられる。これらの乳酸生産菌は、細胞壁のＤＮＡ中にＣｐＧモチーフと呼ばれる特有の塩基配列を多く含有することが知られている。
【００２８】
一般的な乳酸菌は、菌体の増殖と連動して乳酸を培地中に蓄積する。乳酸菌には、乳酸のみを最終産物として生産するホモ乳酸菌と、アルコールや酢酸等の乳酸以外のものを同時に生産するヘテロ乳酸菌があり、通常の乳酸製造にはホモ乳酸菌が用いられる。また、菌の形状から、乳酸球菌と乳酸桿菌とがあるが、工業的には乳酸桿菌が多く使用されていると推測される。
【００２９】
代表的な乳酸菌としては、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、リューコノストック属（Leuconostoc）の６属が挙げられる。これらは全てグラム陽性の菌であり、いずれも発酵によって多量の乳酸を生産する。多くの乳酸菌はＬ乳酸を生産するが、ラクトバシラス属のなかには、Ｄ乳酸を生産する菌株もあり、また、Ｌ乳酸とＤ乳酸とを一定の割合で生産する菌株もある。
【００３０】
主にＤ乳酸を生産するバシラス属乳酸生産菌としては、バシラス・レボラクティカス（Bacillus laebolacticus）、スポロラクトバシラス属（Sporolactobacillus）が挙げられる。これらも一般的な乳酸菌と同様に扱い、Ｄ乳酸を生産するために用いることができる。
【００３１】
主にＬ乳酸を生産するバシラス属乳酸生産菌としては、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）が挙げられる。
【００３２】
これらの乳酸生産菌のうち、乳酸発酵の効率を考えると、一般的に乳酸発酵に用いられ入手容易な菌株としては、Ｌ乳酸を生産するラクトバシラス属やラクトコッカス属等の乳酸菌、Ｄ乳酸を生産するバシラス・レボラクティカスやスポロラクトバシラス属等のバシラス属乳酸生産菌、Ｌ乳酸を生産するバシラス・コアギュランス等が挙げられる。これらのなかでもバシラス・コアギュランスに属する菌株は、高温での乳酸発酵が可能なので雑菌汚染の可能性が低く、乳酸発酵培地からの分離も一般の乳酸菌と比較して容易である。また、バシラス・コアギュランスを栄養源とした場合、黒酵母によるβグルカンの生産性が高いことも確認された。
【００３３】
乳酸発酵は通常以下のようにして行われる。すなわち、一般的な乳酸菌を用いて乳酸発酵を行うには、デンプン、液化デンプン、糖化デンプン、粗糖、グルコース等の炭素源を主成分に、酵母エキス、ペプトン、大豆加水分解物、コーンスチープリカー、その他の窒素源となる栄養成分を少量添加し、必要であればリン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩、ビタミン等を添加してなる培地を用意し、これに乳酸菌のシード培養液を添加し、用いる乳酸菌に合わせた温度で、嫌気性の条件下において、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム等の中和剤を用いて発酵中のｐＨを適正値にコントロールして発酵を行う。
【００３４】
一方、バシラス・コアギュランス等のバシラス属乳酸生産菌を用いて乳酸発酵を行うには、まず、主成分のデンプン、液化デンプン、糖化デンプン、粗糖、グルコース等の糖濃度を比較的低くし、これに酵母エキス、ペプトン、大豆加水分解物、コーンスチープリカー、その他の栄養成分を少量添加し、必要であればリン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩、ビタミン等を添加した培地で好気的に培養する。次いで、主成分の炭素源を追加投入し、嫌気状態にして適温に保ち、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム等の中和剤を用いて発酵中のｐＨを適正値にコントロールして発酵を行う。このような発酵により培地中に乳酸を生産させることができる。また、好気培養が終了した時点で菌体と培地とを分離し、続いて、炭素源の濃度の高い培地にその他の栄養成分を少量追加してから、菌体を添加して嫌気的に保ち、同様に乳酸発酵を行ってもよい。バシラス・コアギュランスを培養する場合には、一般的に適温は５０℃以上、菌株によっては５５℃以上である。このため、培地が雑菌汚染されにくいので、特に菌体を目的物とする場合には好適である。
【００３５】
発酵終了後の培地から湿菌体を得るには、デスク型の遠心式セパレータによる分離や、１μｍ以下の孔径のフィルタによる加圧濾過、減圧濾過、クロスフロー濾過等により、容易に湿菌体を得ることができる。湿菌体の収量は、一般的に培地１Ｌに対して数〜数十グラムである。
【００３６】
前記黒酵母は、アウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）に属する菌株である。前記黒酵母は、土壌、植物表面等から簡単に分離できるカビの一種であり、一般的にプルランを生産するが、培養条件により細胞外に水溶性のβグルカン（β−１，３−１，６−グルカン）を生産することが知られている（生物工学会誌  第８８巻  第１２号  ６３４−６４１，２０１０参照）。
【００３７】
前記黒酵母の菌株としては特に限定されず、公知の菌株から適宜選択して用いてもよく、特開２００６−７５０７６号公報や、特開２００９−５６３９１号公報等に示されているような、メラミン色素を実質的に生産しないように変異処理を施した菌株であってもよい。なかでも、前記黒酵母としては、乳酸生産菌の菌体及び／又はその派生物を唯一の窒素源として生育可能なものが好ましく、更に、乳酸生産菌の菌体及び／又はその派生物を唯一の窒素源として生育させた場合に、高い生産性を示すように変異させた変異株がより好ましい。このような変異株を用いることにより、大量のβグルカンを安価にかつ効率的に生産することができる。
【００３８】
このような変異株は、親株である黒酵母に一般的な変異処理を施した後、乳酸生産菌の菌体及び／又はその派生物を唯一の窒素源として生育させて、生育が優良な菌株を選択することにより得ることができる。
【００３９】
より詳細には、黒酵母の優良株のスクリーニングは以下のようにして行うことができる。すなわち、スクロース等の炭素源や、窒素源としての乳酸生産菌の湿菌体、ｐＨ調整用のアスコルビン酸や、そのナトリウム塩等を含有する寒天培地上で、βグルカンを生産するアウレオバシジウム・プルランスの親株に対し変異処理を施し、生育の良い株を選択し、乳酸生産菌を唯一の窒素源とする液体培地に接種して振盪培養を行い、βグルカン生産能の高い菌株を選択する。
【００４０】
前記変異処理としては特に限定されず、例えば、紫外線照射処理や、変異原性誘発薬剤処理が挙げられる。
【００４１】
前記変異原性誘発薬剤としては特に限定されず、例えば、ニトロソグアニジン、エチディウムブロマイド、メタンスルホン酸エチル、亜硝酸ナトリウム等の一般的に用いられる変異処理剤を用いることができる。
【００４２】
変異処理を施す親株は、アウレオバシジウム・プルランスに属する菌体であれば特に限定されず、自然界より新たに分離されたものでもよく、従来βグルカンを生産することが知られている保存株でもよい。このような保存株としては、例えば、アウレオバシジウム・プルランスＡＴＣＣ  ９３４８株、ＡＴＣＣ  ３０９２株、ＡＴＣＣ  ４２０２３株、ＩＦＯ  ４４６４株、ＩＦＯ  ４４６６株、ＩＦＯ  ６３５３株、ＩＦＯ  ７７５７株等が挙げられる。
【００４３】
変異処理後は、その大きさに基づき寒天培地上のコロニーを選択する。コロニーの大きさに基づいて選択された菌株は、更に乳酸生産菌を唯一の窒素源とする液体培地を仕込んだフラスコ中で振盪培養し、βグルカンの生産を確認し、親株よりも生産性の高い菌株を選択するのが好ましい。
【００４４】
本発明者は、このようなスクリーニング方法により、アウレオバシジウム・プルランス  ＭＲＢ００１（Aureobasidium pullulans MRB001）株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３８６）を取得することに成功した。
【００４５】
選択された変異株は、スクロース、米糠、アスコルビン酸ナトリウム等を含み滅菌した液体培地に接種して２０〜３０℃で数日間振盪培養を行い、無菌的に小分けして凍結し保存しておくことにより、再現性よく種菌として用いることができる。
【００４６】
乳酸生産菌を窒素源として黒酵母を培養して、当該黒酵母にβグルカンを生産させるには、例えば、以下の方法を用いることができる。すなわち、スクロース等の炭素源に、窒素源としての乳酸生産菌を適当量と、少量のアスコルビン酸とを添加してなる液体培地に、黒酵母を植菌し、例えばフラスコを用いて振盪培養を行う。
【００４７】
各成分の濃度については、製品となる培養液の性状を考慮して適宜決定すればよいが、例えば、一般的には、スクロース１０〜２０ｇ／Ｌ、アスコルビン酸ナトリウム１〜３ｇ／Ｌ程度である。
【００４８】
前記液体培地へ添加する乳酸生産菌の形態としては特に限定されず、例えば、乳酸生産菌の菌株を適当な培地で培養して得られる培養物、培養物から分離した菌体、当該菌体の破砕物、溶解物、抽出物、これらを分画したもの等であってもよい。また、前記乳酸生産菌の菌体は、死菌体であっても、生菌体であってもよく、湿菌体であって、乾燥菌体であってもよい。
【００４９】
乳酸生産菌の適切な添加量は菌種やその形態により異なるので、実験により予め最適量を決めておくことが好ましい。乳酸生産菌の添加量が少なければ窒素源不足となり、多すぎてもβグルカンの生産量が減少する。
【００５０】
更に、必要があれば、味質、製品の規格等に影響のない範囲で、米糠等の栄養成分を少量添加してもよい。このように米糠を補助的に添加する場合、その添加量は１〜４ｇ／Ｌ程度である。しかし、培養に供する黒酵母として変異株を用いる場合は、米糠の添加は不要である。
【００５１】
前記液体培地のｐＨは、上記の組成であれば特にｐＨの調整を行わなくとも通常は４．５〜６となり、そのまま黒酵母の培養に用いることができるが、更に、アスコルビン酸等で黒酵母の培養に好適なｐＨに調整することが好ましい。なお、黒酵母の培養に好適なｐＨは５〜６である。培養温度は、通常２０〜３０℃であり、好ましくは２４〜２５℃である。
【００５２】
ジャーファーメンターを用いて培養する場合は、フラスコを用いた場合と同様の培地成分、温度で、通気量・回転数を調整して、ＤＯが植菌前の飽和濃度の１５％以上、好ましくは２０％以上を保つように調整する。培養開始後に徐々に培養液の粘度が上昇し、通常４〜６日で残糖がなくなり培養が終了する。培養終了時はＤＯの上昇により判断することができる。βグルカンの生産量は、フラスコを用いた振盪培養では２〜４ｇ／Ｌ程度であり、ジャーファーメンターを用いた場合は６ｇ／Ｌ以上である。
【００５３】
βグルカンを工業的に大量生産するためには、通気ができて培地をある程度撹拌できる形式の培養装置を用いればよい。このような培養装置としては、例えば、一般的な撹拌式のファーメンターや、エアリフトタイプのファーメンター等が用いられる。通気量はファーメンターの大きさ、形式に合わせて適宜調整すればよい。特に動力の少ないエアリフトタイプのファーメンターは、設備も比較的安価であり、経済上の利益を考慮すると好適である。
【００５４】
以上のようにして製造されたβグルカンを含有する黒酵母の培養液は、従来の米糠培地等で培養された黒酵母培養液と比較して、原料（シュークロース）からβグルカンへの転化率が高いことが判明した。更に米糠等の培地成分による味質への影響もなく、乳酸菌からの成分（特に細胞壁成分）が含まれるために、免疫増強効果も高いことが期待される。
【００５５】
乳酸菌成分による相乗効果については、乳酸生産菌の細胞壁に含まれるＣｐＧモチーフを含むＤＮＡ断片が、黒酵母により生産されたβグルカンの側鎖等に効果的に取り込まれ、それを摂取した哺乳類の細胞表面にβグルカンとともに吸着し、これによってより効果的に免疫系が刺激されるものと推測される。
【００５６】
このようにして製造された乳酸生産菌を窒素源とする黒酵母の培養液は、任意の方法により滅菌した後に、βグルカン含有組成物として、そのまま製品とすることができる。また、黒酵母の培養液に、乳酸発酵培地から分離された乳酸生産菌を、生菌体、死菌体に拘わらず、更に添加して製品としてもよい。製品の形態としては、培養液のままの液体状であってもよいが、経口摂取し易いように加工することが好ましく、例えばスプレードライ等の方法により粉末としてもよく、また、他の固体物又は液体物に混入してもよい。
【実施例】
【００５７】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。【００５８】
以下において、培地中の乳酸は、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定された。また、βグルカンの定量は、特開２００６−７５０７６号公報に記載の方法を参照して行った。更に、簡易定量法としてフェノール硫酸法（Anal Bichem., 339 (1), 69-72 (2005)）を用いたβグルカンの定量も行った。また、以下において、米糠としては、タイランドで入手した脱脂米糠を用いた。【００５９】
＜試験例１＞乳酸生産菌（Bacillus coagulans）の培養
下記表１に示す組成の培地１０００ｍＬを仕込んだ５０００ｍＬジャーファーメンターに、バシラス属乳酸生産菌であるBacillus coagulans IFO12714を植菌し、５０℃、通気量１．０ｖｖｍ、撹拌回転数４００ｒｐｍで８時間好気培養した。【００６０】
【表１】
2014013793.tif 000002
【００６１】
次いで、下記表２に示す組成の培地２０００ｍＬを同じジャーファーメンターに追加し、撹拌回転数５０ｒｐｍで嫌気的に２５時間培養して乳酸発酵を進めた。【００６２】
【表２】
2014013793.tif 000003
【００６３】
発酵終了時の乳酸濃度は１０８ｇ／Ｌであった。この培地を高速遠心分離（６０００Ｇ、１０分間）にかけ、沈殿したBacillus湿菌体８０．１ｇ（乾燥菌体重量は約２０％）を得た。【００６４】
＜試験例２＞黒酵母の分離と培養
土壌、食品工場、澱粉工場、植物表面等から採取した微生物サンプルをポテトデキストロース寒天培地に塗布し、得られた多くの微生物コロニーの中から目視により黒酵母に近いと思われる性状（粘性のある白色又はややピンク色のコロニーであり、放置すると茶色〜黒色に変化する）のものを選択し分離した。【００６５】
次に、これらの菌体を下記表３に示す組成の液体培地（米糠培地）に植菌して、２４℃で５日間培養し、その中で培地の粘度が高く明らかに増粘多糖類を生産していると思われる菌株を選択し、培地と等量のエタノールを添加することにより得られる沈殿物を簡易定量法により分析しβグルカンを定量した。この中で、最も多くβグルカンを生産した菌株は、５．２ｇ／Ｌのβグルカンを培地中に蓄積していた。以下の実験では、本菌株を用いた。【００６６】
【表３】
2014013793.tif 000004
【００６７】
次に、特開２００５−７５０７６号公報に記載の方法を参照して、得られた菌体をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁して１０００ＣＦＵ／ｍＬ程度の溶液とし、その０．２ｍＬを寒天培地のプレートに塗布して、紫外線ランプによる紫外線照射処理（照射時間は、２〜１０分間）を行い、そのまま寒天プレート上で２４℃、４日間培養した。明確なコロニーを形成したプレートを更に４℃で３日間培養して、厚膜胞子を形成させた。このようなコロニーの中から外観が白色のコロニーを選別し、メラニン色素が生成されない変異株を得た。【００６８】
この微生物を同定し、アウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）であることを確認し、Aureobasidium pullulans MR01と命名した。【００６９】
当該Aureobasidium pullulans MR01を、表３に示した培地１００ｍＬを仕込んだ３００ｍＬ三角フラスコに植菌し、２５℃で３日間、撹拌回転数１５０ｒｐｍで振盪培養した。これを以下のシードとして用いた。【００７０】
＜試験例３＞黒酵母の変異株の取得
試験例２で得られたアウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans MR01）菌体をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁して１０００ＣＦＵ／ｍＬ程度の溶液とし、その０．２ｍＬを下記表４に示す組成の寒天培地のプレートに塗布して、紫外線ランプによる紫外線照射処理を行った。照射時間は、２〜５分間とした。そのまま、寒天プレート上で２４℃、６日間培養したところ、米糠培地におけるより小さい白色のコロニーが形成されるのが観察された。このようなコロニーを大きいものから順に１００株選別した。【００７１】
【表４】
2014013793.tif 000005
【００７２】
次に、それぞれのコロニーから釣菌し、下記表５に示す組成の培地１００ｍＬを仕込んだ３００ｍＬ三角フラスコに植菌し、２４℃で４日間振盪培養を行い、βグルカンの蓄積量を簡易定量法により調べた。結果を下記表６に示す。【００７３】
【表５】
2014013793.tif 000006
【００７４】
【表６】
2014013793.tif 000007
【００７５】
これらの菌株うち、βグルカン生産量の最高値を示した株をＭＲＢ００１株と命名して、下記表７に示す組成の培地１００ｍＬを仕込んだ３００ｍＬ三角フラスコで２４℃、３日間振盪培養し、培養液を小分けして−８０℃で凍結保存した。【００７６】
【表７】
2014013793.tif 000008
【００７７】
ＭＲＢ００１株を、下記表８に示す組成の培地で２４℃、４日間振盪培養し、簡易定量法によりβグルカン生産量を調べ、湿菌体の最適添加量を決定した。得られた結果を下記表９に示す。【００７８】
【表８】
2014013793.tif 000009
【００７９】
【表９】
2014013793.tif 000010
【００８０】
表９に示す結果より、乳酸生産菌（バシラス属乳酸生産菌の湿菌体）の添加量には、最適値があることが分かる。【００８１】
＜試験例４＞
下記表１０に示す組成の培地１００ｍＬを３００ｍＬの三角フラスコに仕込み、ＭＲＢ００１株を植菌して、撹拌回転数１５０ｒｐｍで３日間、振盪培養を行い、前培養とした。【００８２】
【表１０】
2014013793.tif 000011
【００８３】
次に、下記表１１に示す組成の培地２７００ｍＬを５Ｌジャーファーメンターに仕込み、上記の前培養３００ｍＬを添加して２４℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌回転数４００ｒｐｍで培養を開始した。【００８４】
【表１１】
2014013793.tif 000012
【００８５】
培養の経時変化を下記表１２に示す。βグルカンの濃度は特開２００６−７５０７６号公報に記載のβグルカンの定量法により測定した。【００８６】
【表１２】
2014013793.tif 000013
【００８７】
表１２に示す結果より、バシラス属乳酸生産菌であるBacillus coagulansの、乳酸発酵後の死菌体（湿菌体）を唯一の窒素源として、黒酵母にβグルカンを生産させることが可能であることが明らかとなった。【００８８】
＜試験例５＞
下記表１３に示す組成の培地１００ｍＬを３００ｍＬの三角フラスコに仕込み、ＭＲＢ００１株を植菌して、撹拌回転数１５０ｒｐｍで３日間、振盪培養を行い、前培養とした。【００８９】
【表１３】
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【００９０】
次に、下記表１４に示す組成の培地３０００ｍＬを５Ｌジャーファーメンターに仕込み、上記の前培養３００ｍＬを添加して２４℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌回転数４００ｒｐｍで培養を開始した。【００９１】
【表１４】
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【００９２】
培養開始後、６日目のβグルカン濃度は、８．８ｇ／Ｌであった。βグルカンの濃度は特開２００６−７５０７６号公報に記載のβグルカンの定量法により測定した。この時、フェノール硫酸法により残糖を測定したところ、２．０ｇ／Ｌであった。【００９３】
＜試験例６＞
下記表１５に示す組成の培地１００ｍＬを３００ｍＬの三角フラスコに仕込み、ＭＲＢ００１株を植菌して、撹拌回転数１５０ｒｐｍで３日間、振盪培養を行い、前培養とした。【００９４】
【表１５】
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【００９５】
次に、下記表１６に示す組成の培地３０００ｍＬを５Ｌジャーファーメンターに仕込み、上記の前培養３００ｍＬを添加して２４℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌回転数４００ｒｐｍで培養を開始した。【００９６】
【表１６】
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【００９７】
培養開始後、５日目のβグルカン濃度は、７．４ｇ／Ｌであった。βグルカンの濃度は特開２００６−７５０７６号公報に記載のβグルカンの定量法により測定した。この時、フェノール硫酸法による残糖を測定したところ、１．８ｇ／Ｌであった。【００９８】
試験例５及び６の結果から、Bacillus湿菌体を窒素源として使用した培地では、米糠を用いた培地より、よりβグルカンの選択性の高い生産が可能であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明によれば、より安価に免疫増強効果に優れたβグルカンを製造することが可能となる。
【国際調査報告】
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