(57)【要約】  本発明は、微生物活性調節物質及び運搬媒体を含む、生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物用活性調節剤を提供する。
2014017233.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物活性調節物質及び運搬媒体を含む、生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物用活性調節剤。
【請求項２】
前記微生物活性調節物質は、細胞間情報伝達物質、原核生物の活性に影響を与える核酸及び原核生物の活性に影響を与えるタンパク質からなる群より選択される１種以上の物質である、請求項１に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項３】
前記微生物活性調節物質がＮ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトンである、請求項１又は２に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項４】
前記運搬媒体は、ベシクル、リポソーム、ミセル、エマルション、ペプチド、タンパク質、金属ナノ粒子、カーボンナノチューブ、フラーレン及び第１のポリマーからなる群より選択される１種以上の物質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項５】
前記第１のポリマーは、ハイドロゲル、ナノスフェア、マイクロスフェア又はデンドリマーである、請求項４に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項６】
前記運搬媒体が、糖鎖、抗体又は第２のポリマーで修飾されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項７】
前記第２のポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミンである、請求項６に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項８】
前記運搬媒体は、リポソームである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項９】
前記リポソームは、卵黄レシチン又は水素添加大豆ホスファチジルコリンを含む、請求項８に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項１０】
前記リポソームは、コレステロールをさらに含む、請求項９に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項１１】
前記リポソームはステアリン酸をさらに含む、請求項９又は１０に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項１２】
前記微生物活性調節物質の微生物活性は、硝化活性である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項１３】
生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物の活性を調節する方法であって、生物学的排水処理設備の反応槽に、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の微生物用活性調節剤を添加する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物用活性調節剤及び微生物の活性を調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物は細胞間情報伝達物質（以下、「シグナル物質」という。）を介して情報伝達を行い、微生物の密度に依存して病原性物質の分泌やバイオフィルムの生産を制御していることが知られている。このような情報伝達機構のことをクオラムセンシングという（例えば、非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，１５，４９５−５０２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、シグナル物質を含む微生物活性調節物質には、水に不溶性のものが多く存在する。このような微生物活性調節物質を水に溶解するためには、有機溶媒等を用いる必要があるなど、操作性が悪い場合がある。そこで、本発明は、操作性が改善された微生物活性調節物質を提供することを目的とする。本発明はまた、微生物の活性を調節する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、微生物活性調節物質及び運搬媒体を含む、生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物用活性調節剤を提供する。また、本発明は、微生物活性調節物質及び運搬媒体を含む組成物の生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物の活性調節のための使用を提供する。【０００６】
本発明の微生物用活性調節剤又は使用によれば、上記微生物活性調節物質が親水性であるか否かにかかわらず、容易に水系に添加して微生物の存在する環境中に微生物活性調節物質を拡散させ、微生物に送達することができ、効率よく微生物の活性を調節することができる。このため、微生物活性調節物質の操作性を改善することができ、生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物、特に排水処理に関わる微生物の活性調節に適している。【０００７】
上記微生物活性調節物質は、シグナル物質、原核生物の活性に影響を与える核酸及び原核生物の活性に影響を与えるタンパク質からなる群より選択される１種以上の物質であってよい。【０００８】
このような微生物活性調節物質を微生物に送達することにより、微生物の活性を調節することができる。【０００９】
上記微生物活性調節物質は、Ｎ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトンであってよい。上記微生物活性調節物質がＮ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトンであれば、多くの種類のグラム陰性菌の微生物活性を調節することができる。【００１０】
上記の運搬媒体は、ベシクル、リポソーム、ミセル、エマルション、ペプチド、タンパク質、金属ナノ粒子、カーボンナノチューブ、フラーレン及び第１のポリマーからなる群より選択される１種以上の物質であってよい。また、運搬媒体としての第１のポリマーは、ハイドロゲル、ナノスフェア、マイクロスフェア又はデンドリマーの形状であってもよい。【００１１】
本発明の微生物用活性調節剤又は使用は、このような運搬媒体を含むことにより、微生物活性調節物質の操作性をより改善することができる。また、微生物活性調節物質の分解を抑制し、生物学的排水処理設備の反応槽全体により容易に拡散することができ、微生物活性の調節をより確実に行うことができる。【００１２】
上記の運搬媒体は、糖鎖、抗体又は第２のポリマーで修飾されていてもよい。運搬媒体を修飾する第２のポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミンであってもよい。【００１３】
運搬媒体がこれらの物質で修飾されていることにより、上記の微生物用活性調節剤を選択的に特定の抗原を有する微生物に送達したり、微生物用活性調節剤の残存性（残存時間）を調節することが可能になる。【００１４】
上記運搬媒体はリポソームであってもよい。上記リポソームは、卵黄レシチン又は水素添加大豆ホスファチジルコリンを含んでいることが好ましい。上記リポソームは、コレステロールをさらに含んでいてもよい。【００１５】
上記リポソームがコレステロールを含むことにより、リポソームの流動性を調節することができ、リポソームの膜をより安定に存在させることができる。【００１６】
上記リポソームは、ステアリン酸をさらに含んでいてもよい。【００１７】
上記リポソームがステアリン酸を含むことにより、リポソームは負の電荷を帯び、膜の安定性が低下し、微生物活性調節物質をより放出しやすい傾向にある。【００１８】
上記微生物活性は、硝化活性であることが好ましい。【００１９】
微生物活性が硝化活性であると、排水中のアンモニアの除去効率が向上する。【００２０】
本発明はまた、生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物の活性を調節する方法であって、生物学的排水処理設備の反応槽に、上記の微生物用活性調節剤を添加する工程を含む方法を提供する。【００２１】
上記本発明の方法によれば、容易に効率よく生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物の活性を調節することができる。このため、反応槽で行われる排水処理を促進させ、又は、必要に応じて抑制することができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、操作性が改善された微生物活性調節物質を提供することができる。また、微生物の活性を調節する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、硝化反応の促進の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、硝化反応の促進の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、パラコッカスＡＳ６株の簡易分子系統解析の結果を示す分子系統樹である。
【図４】図４は、リポソームを用いたときの３ｏｘｏＣ１２−ＨＳＬの作用を示すグラフである。
【図５】図５は、リポソームの組成を変化させたときの３ｏｘｏＣ１２−ＨＳＬの作用を示すグラフである。
【図６】図６は、微生物用活性調節物質がベシクルにより運搬される状態を示す模式図である。
【図７】図７は、微生物用活性調節物質がミセルにより運搬される状態を示す模式図である。
【図８】図８は、微生物用活性調節物質がタンパク質により運搬される状態を示す模式図である。
【図９】図９は、微生物用活性調節物質が金属ナノ粒子により運搬される状態を示す模式図である。
【図１０】図１０は、微生物用活性調節物質がカーボンナノチューブにより運搬される状態を示す模式図である。
【図１１】図１１は、微生物用活性調節物質がフラーレンにより運搬される状態を示す模式図である。
【図１２】図１２は、微生物用活性調節物質が第１のポリマーにより運搬される状態を示す模式図である。
【図１３】図１３は、微生物用活性調節物質がハイドロゲルにより運搬される状態を示す模式図である。
【図１４】図１４は、微生物用活性調節物質がナノスフェアにより運搬される状態を示す模式図である。
【図１５】図１５は、微生物用活性調節物質がデンドリマーにより運搬される状態を示す模式図である。
【図１６】図１６は、本発明の一実施形態に係る運搬媒体の模式図である。
【図１７】図１７は、本発明の他の実施形態に係る運搬媒体の模式図である。
【図１８】図１８は、本発明のさらに他の実施形態に係る運搬媒体の模式図である。
【図１９】図１９は、本発明の一実施形態に係る生物学的排水処理装置を説明する概略構成図である。
【図２０】図２０は、本発明の他の実施形態に係る生物学的排水処理装置を説明する概略構成図である。
【図２１】図２１は、本発明のさらに他の実施形態に係る生物学的排水処理装置を説明する概略構成図である。
【図２２】図２２は、本発明のさらに他の実施形態に係る生物学的排水処理装置を説明する概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（微生物活性調節物質）
本発明の微生物用活性調節剤は、微生物活性調節物質及び運搬媒体を含む。微生物活性調節物質としては、細胞間情報伝達物質（シグナル物質）、原核生物の活性に影響を与える核酸、原核生物の活性に影響を与えるタンパク質等が挙げられる。これらは１種類を単独で又は複数種類を組み合わせて使用することができる。微生物活性調節物質は、微生物の活性を向上させる物質であっても、微生物の活性を低下させる物質であってもよい。
【００２５】
シグナル物質としては、Ｎ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトン（ＡＩ１：オートインデューサー１）；４，５−ジヒドロキシ−２，３−ペンタンジオン（ＡＩ２：オートインデューサー２）；ＨＨＱ（２−アルキル−４−キノロン）、ＰＱＳ（２−アルキル−３−ヒドロキシ−４−キノロン）等のキノロン・キノリン類；インドール類；ペプチド；環状ジペプチド；ジケトピペラジン等が挙げられる。Ｎ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトンとしては、例えば、Ｎ−ブタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソブタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシブタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ペンタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソペンタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシペンタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘプタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソヘプタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシヘプタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−オクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソオクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシオクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ノナノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソノナノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシノナノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−デカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ウンデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソウンデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシウンデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−トリデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソトリデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシトリデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−テトラデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソテトラデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシテトラデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ペンタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソペンタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシペンタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘキサデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソヘキサデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシヘキサデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン等のアシル基の炭素数が４〜１６であるＮ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
シグナル物質は、化学合成により調製してもよく、シグナル物質産生菌が培地中に分泌したシグナル物質を精製して調製してもよい。また、シグナル物質産生菌の培養物を、精製することなくシグナル物質として使用してもよい。シグナル物質産生菌としては、パラコッカス属、バークホルデリア属、シュードモナス属、ビブリオ属、アエロモナス属、バチルス属、ストレプトマイセス属、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属などの菌が例示できる。
【００２７】
原核生物の活性に影響を与える核酸としては、タンパク質の合成や合成抑制に関わる酵素やＡＴＰ合成酵素の発現をコードするＤＮＡやＲＮＡ等が挙げられる。これらのＤＮＡは、プロモーターの下流に発現可能に連結されていることが好ましい。
【００２８】
原核生物の活性に影響を与える核酸は、大腸菌、バチルス属等の原核生物のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって取得することができる。原核生物の活性に影響を与える核酸は、ｐＧＥＭ（プロメガ社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社）、ｐＵＣ（タカラバイオ株式会社）等のベクターにクローニングし、例えば大腸菌に導入して大腸菌の菌体内でプラスミドの形態で維持することができる。また、必要に応じて上記大腸菌から大量に調製することができる。
【００２９】
原核生物の活性に影響を与えるタンパク質としてはポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ等が挙げられる。
【００３０】
原核生物の活性に影響を与えるタンパク質は、例えば、当該タンパク質を生産する微生物から精製して調製してもよい。あるいは、原核生物の活性に影響を与えるタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを用いて、大腸菌等の体内で大量発現させ、これを精製して調製してもよい。
【００３１】
（運搬媒体）
微生物用活性調節剤は、微生物活性調節物質及び運搬媒体を含む。運搬媒体は、微生物活性調節物質を内包するものであってもよく、微生物活性調節物質と共有結合又は非共有結合により複合体を形成するものであってもよい。運搬媒体は微生物活性調節物質と複合体を形成できるものであれば、特に制限はなく、具体例としては、ベシクル、リポソーム、ミセル、エマルション、ペプチド、タンパク質、金属ナノ粒子、カーボンナノチューブ、フラーレン、第１のポリマー等が挙げられる。これらは１種類を単独で又は複数種類を組み合わせて使用することができる。また、ホスト−ゲスト化学の分野で一般的に用いられるシクロデキストリン、シクロファン、カリックスアレーン等を用いてもよい。
【００３２】
ベシクルとは、一般的に脂質二重膜で形成された小胞であり、小胞の内側と外側が親水性を示し、脂質二重膜の内部が疎水性を示す。特に、リン脂質を主成分とする脂質二重膜からなる小胞は、リポソームと呼ばれる。リン脂質としては、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、卵黄レシチン、水素添加大豆ホスファチジルコリン等を使用することができる。疎水性の物質を取り込んだリポソームは、容易に水に添加して拡散させることができる。また、ベシクルは微生物が分泌するものであってもよく、化学的に合成したものであってもよい。
【００３３】
運搬媒体としてリポソームを用いる場合、リポソームは電荷を有しないものを用いてもよく、電荷を有したものを用いてもよい。電荷を有したリポソームとしては、カチオン性リポソームとアニオン性リポソームが挙げられる。
【００３４】
カチオン性リポソームとは、リン脂質を主成分とする脂質二重層からなる小胞であって、外界と接する表面が正電荷を帯びているものをいう。リン脂質として、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン等を使用することができる。脂質二重膜を構成する他の成分として、コレステロール等のリン脂質以外の脂質、糖、タンパク質等を使用することができる。
【００３５】
カチオン性リポソームは、リポソームの膜が正電荷を帯びており、負電荷を帯びている微生物の細胞膜との静電的相互作用により、取り込まれやすい点で好ましい。汚泥に付着したカチオン性リポソームは、汚泥中の微生物を引き寄せて凝集体を形成する。凝集体が形成されることで、カチオン性リポソームと微生物との物理的距離が近づき、カチオン性リポソームが微生物の細胞膜と融合又は生分解されて壊れる確率が高まり、微生物活性調節物質が微生物に送達される効率が向上する。
【００３６】
カチオン性リポソームは、例えば、遺伝子導入ベクターとして用いられているものを利用することが可能である。リポソームにカチオン性脂質、カチオン性多糖類等を脂質二重層の構成要素として含ませることで、カチオン性リポソームとすることができる。
【００３７】
カチオン性リポソームは、例えば、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン又は第四級アンモニウムカチオンが結合した脂質；カチオン性多糖類を含むことができる。このような脂質の具体例として、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム硫酸メチル（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、ステアリルアミン等が挙げられる。カチオン性多糖類の具体例として、キトサン等が挙げられる。
【００３８】
アニオン性リポソーム（以下、負荷電リポソームともいう。）とは、リン脂質を主成分とする脂質二重層からなる小胞であって、外界と接する表面が負電荷を帯びているものをいう。リン脂質として、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン等を使用することができる。脂質二重膜を構成する他の成分として、コレステロール等のリン脂質以外の脂質、糖、タンパク質等を使用することができる。
【００３９】
アニオン性リポソームは、例えば、アニオン性脂質又はアニオン性多糖類を含むことができる。アニオン性脂質としては、例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸等の脂肪酸；ドデシル硫酸、ヘキサデシル硫酸等のアルキル硫酸が挙げられる。アニオン性多糖類としては、例えば、カラギーナン、デキストラン硫酸等が挙げられる。
【００４０】
また、流動性を調節するために、リポソームにコレステロール等のリン脂質以外の脂質を含有してもよい。リン脂質以外の脂質を含有することにより、リポソームの脂質二重膜の流動性を調節することができる。リン脂質以外の脂質の含有量は、リポソームの膜の安定性を調節できる観点から、リポソーム全体の質量を基準として、５０質量％以下であることが好ましく、３０質量％以下であることがより好ましく、５〜２０質量％であることが好ましい。
【００４１】
運搬媒体として用いられるリポソームは、複数の層構造を有していてもよい。図１６に示す運搬媒体１６００は、最外層１６０１及び内層リポソーム１６０２の二層から形成されている。内層リポソーム１６０２は、微生物活性調節物質１６０３を内包する。運搬媒体１６００は三層以上の層構造を有していてもよく、その場合、例えば、内層リポソーム１６０２内に、微生物活性調節物質を内包するリポソーム層が形成され得る。
【００４２】
微生物活性調節物質１６０３としては、細胞間情報伝達物質（シグナル物質）、原核生物の活性に影響を与える核酸、原核生物の活性に影響を与えるタンパク質等が挙げられる。これらは１種類を単独で又は複数種類を組み合わせて使用することができる。微生物活性調節物質は、微生物の活性を向上させる物質であっても、微生物の活性を低下させる物質であってもよい。
【００４３】
上記運搬媒体１６００は最外層１６０１がリポソームで形成されているため、水環境中でも容易に拡散して微生物まで送達する。上記運搬媒体１６００の最外層１６０１が壊れて内容物が放出しても、微生物活性調節物質１６０３は内層リポソーム１６０２に内包されている。そのため、微生物活性調節物質が微生物の分解作用を直接受けることを避けられる。その結果、微生物活性調節物質の送達効率が向上する。
【００４４】
図１７に、本発明の別の実施形態に係る運搬媒体１７００の模式図を示す。図１７に示した運搬媒体１７００は、最外層１７０１が微生物活性調節物質１７０４を内包する点以外は、図１６に示した運搬媒体と同じである。微生物活性調節物質１７０３及び微生物活性調節物質１７０４は同一物質であってもよく異なる物質であってもよい。
【００４５】
最外層１７０１が微生物活性調節物質１７０４を内包することにより、内層リポソーム１７０２に内包される微生物活性調節物質１７０３の放出のタイミングをずらすことが可能となる。最外層１７０１が壊れることにより又は微生物の細胞膜と融合することにより、微生物活性調節物質１７０４及び内層リポソーム１７０２が放出される。その後、内層リポソーム１７０２が壊れることにより又は微生物の細胞膜と融合することにより、微生物活性調節物質１７０３が放出される。最外層１７０１及び内層リポソーム１７０２が壊れるタイミングが異なることから、それぞれが内包する微生物活性調節物質１７０４及び微生物活性調節物質１７０３の放出のタイミングも異なってくる。
【００４６】
微生物活性調節物質１７０３及び微生物活性調節物質１７０４を同一物質とすることで、微生物に同一物質を長時間作用させることが可能である。また、運搬媒体当たりの微生物活性調節物質の量を増加させることができ、微生物により多くの量の微生物活性調節物質を送達することが可能である。微生物活性調節物質１７０３及び微生物活性調節物質１７０４を異なる物質とすることで、微生物の異なる部位に異なる物質をそれぞれ作用させることが可能である。
【００４７】
図１８に、本発明のさらに別の実施形態に係る運搬媒体１８００の模式図を示す。図１８に示した運搬媒体１８００は、最外層１８０１であるリポソームの脂質二重層内部に微生物活性調節物質１８０４を内包し、内層リポソーム１８０２の脂質二重層内部に微生物活性調節物質１８０３を内包する。微生物活性調節物質１８０３及び微生物活性調節物質１８０４は同一物質であってもよく異なる物質であってもよい。
【００４８】
微生物活性調節物質１８０３及び１８０４の水溶性が高い場合には、図１６及び１７のようにリポソームの小胞内に取り込まれ、微生物活性調節物質１８０３及び１８０４の水溶性が低い（疎水性が高い）場合には、図１８のようにリポソームの脂質二重層内部に取り込まれる。このように、本発明の運搬媒体は、水溶性微生物活性調節物質及び疎水性微生物活性調節物質のいずれであっても、微生物に効率よく運搬することが可能である。
【００４９】
微生物活性調節物質１８０３を内包する内層リポソーム１８０２は、公知のリポソームの作成方法と同様であり、例えばバンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）法を利用することができる。具体的には、リン脂質等のリポソームの構成要素、及び微生物用活性調節剤１８０３をクロロホルム等の有機溶媒に溶解し、有機溶媒を留去し脂質薄膜を得る。そこに水を加えて、超音波処理又はボルテックスミキサーを用いて水和分散させることで、微生物活性調節物質１８０３を内包する内層リポソーム１８０２が得られる。リポソームの別の作成方法である、逆相蒸発法、エタノール注入法、エーテル蒸発法等を利用してもよい。
【００５０】
このようにして得た内層リポソーム１８０２を、公知の方法で最外層１８０１であるリポソーム又は生分解性ポリマーに取り込むことで、運搬媒体１８００を製造することが可能である。
【００５１】
最外層１８０１がリポソームである場合、リポソームの製造条件を制御することにより、微生物活性調節物質１８０３を内包する内層リポソーム１８０２を包含するリポソームである運搬媒体１８００を製造することが可能である。
【００５２】
ミセルとは、両親媒性化合物が球状に集合したものである。ミセルにおいて、両親媒性化合物の親油性部分は球の中心部を向き、親水性部分は球の外側を向いて集合している。このため、ミセルは、疎水性の物質を取り込んで水に溶解させることができる。両親媒性化合物としては、親水性ポリマー（ポリエチレングリコール等）と疎水性ポリマー（ポリアミノ酸等）との共重合体等が挙げられる。
【００５３】
エマルションとは、混じり合わない二つの液体のうち、一方が微細な液滴となって他方の相の中に分散したものである。疎水性の物質を溶解した油相をエマルション化することで、微細な液滴として容易に水に拡散させることができる。油相としては、シクロヘキサン、ドデカン、酢酸エチル等が挙げられる。
【００５４】
運搬媒体として使用可能なペプチド及びタンパク質としては、アルブミン、α１−酸性糖タンパク質、エラスチン等が挙げられる。タンパク質やペプチドは、特定の部位に対する親和性が高く、生物に取り込まれやすいため、運搬媒体として使用できる。
【００５５】
運搬媒体として使用可能な金属ナノ粒子としては、金、銀、白金、銅、ニッケル、酸化鉄等が挙げられる。例えば、金ナノ粒子には、チオール基を介してポリエチレングリコール等の様々な化合物を結合させることができるため、様々な物質を付着させて運搬媒体として使用することができる。金属ナノ粒子は、市販のものを使用することができる。また、ナトリウムおよびカリウム、カルシウムのようなアルカリ金属、アルカリ土類金属に、ポリエチレングリコール等で化学修飾したクラウンエーテル、アザクラウンエーテル（例えば、サイクレン）またはポルフィリン等を用いてもよい。
【００５６】
運搬媒体として使用可能なカーボンナノチューブとしては、単層カーボンナノチューブ、多層カーボンナノチューブ等が挙げられる。カーボンナノチューブの有する疎水的性質や、内部に空間を有することを利用して、物質を付着させて運搬媒体として使用することができる。カーボンナノチューブは、市販のものを使用することができる。
【００５７】
フラーレンは、多数の炭素原子で構成される球状の物質である。運搬媒体として使用可能なフラーレンとしては、炭素数が６０のＣ６０フラーレン及び炭素数が７０、７４等の高次フラーレンが挙げられる。フラーレンに共有結合等で様々な物質を付着させて、運搬媒体として使用することができる。
【００５８】
運搬媒体として使用可能な第１のポリマーとしては、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン、ポリエチレングリコール等が挙げられる。これらのポリマーは、物質との相互作用により、内部に物質を安定して保持することができるため、運搬媒体として使用することができる。また、微生物の存在する環境内で安定して維持できることも特徴である。
【００５９】
上記第１のポリマーは、ハイドロゲル、ナノスフェア、マイクロスフェア又はデンドリマーの形状であってもよい。これらのポリマーは、立体的な構造を形成するため、運搬媒体として適している。
【００６０】
第１のポリマーとしては、生分解性ポリマーを用いることができる。図１６に示すリポソームの例と同様に二層構造とする場合、生分解性ポリマーを運搬媒体の運搬媒体の最外層として利用することによって、微生物が存在する水環境中に微生物活性調節物質を拡散させることができる。運搬媒体の最外層が生分解性ポリマーで形成されているため、水環境中でも容易に拡散して微生物まで送達することができる。また、運搬媒体の最外層が壊れて内容物が放出しても、微生物活性調節物質は内層リポソームに内包されている。そのため、微生物活性調節物質が微生物の分解作用を直接受けることを避けられる。その結果、微生物活性調節物質の送達効率が向上する。
【００６１】
生分解性ポリマーとして、デンプン、アルギン酸、セルロース、キチン、キトサン、ゼラチン、コラーゲン等が利用できる。生分解性ポリマーはそのまま利用することができ、硬化剤を用いてマイクロスフェア又はゲルの形態で利用することもできる。また、生分解性ポリマーを用いて図１６〜１８に示すような複数の層構造を形成させて用いてもよい。最外層を生分解性ポリマーとすることで、微生物活性調節物質の放出タイミングを調節しやすい傾向がある。
【００６２】
ハイドロゲルとは、ポリマーが架橋して３次元の網目構造が形成されたものであり、内部に多量の水を取り込んでいる。したがって、内部の水の中に物質を内包させることができる。具体的なハイドロゲルとしては、例えば、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、コラーゲン、アルギン酸、アクリルアミド、ポリビニルアルコールが挙げられる。
【００６３】
ポリマーで構成される球状の物質で、直径が１μｍ以下のものをナノスフェアといい、直径が数μｍのものをマイクロスフェアという。ポリマーと物質との相互作用によりナノスフェア・マイクロスフェアに物質を内包させることができる。具体的なナノスフェア・マイクロスフェアとしては、例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、乳酸グリコール酸共重合体が挙げられる。
【００６４】
デンドリマーは、規則的に分岐した構造の粒径数ｎｍ程度の球状ポリマーである。疎水性相互作用またはイオン相互作用により内部の空間に物質を保持し、運搬することができる。構造が分子レベルで制御でき、表面に多くの官能基が存在しているため、機能化に有利である。具体的なデンドリマーとしては、例えば、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリプロピレンイミンデンドリマー、ポリリシンデンドリマー、ポリフェニルエーテルデンドリマーが挙げられる。
【００６５】
（微生物用活性調節剤の調製方法）
微生物用活性調節剤は、微生物活性調節物質及び運搬媒体を含む。運搬媒体としてリポソームを用いる場合、微生物用活性調節剤は、例えば次のようにして調製することができる。まず、有機溶媒に溶解したリン脂質を微生物活性調節物質の溶解液と混合する。続いて、有機溶媒を除去した後、精製水を加え、リン脂質の相転移温度以上の温度となるように加温する。これにより、リポソームを作製することができる。この時、微生物活性調節物質が脂溶性物質の場合は、図６（ａ）のように脂質二重膜の内部に疎水性相互作用により取り込まれ、水溶性物質の場合は、図６（ｂ）のように脂質二重膜の内側に形成される内水相に取り込まれる。
【００６６】
運搬媒体としてベシクルを用いる場合、微生物用活性調節剤は、例えば微生物を利用して調製することもできる。目的の微生物活性調節物質をベシクルの形態で分泌する微生物を培地中で培養すると、培養物中に微生物活性調節物質を内包したベシクルが分泌される。このベシクルを微生物用活性調節剤として用いることができる。微生物活性調節物質を内包したベシクルは、上記の培養物から精製して用いてもよいし、上記の培養物を、精製することなく微生物用活性調節剤として使用してもよい。微生物活性調節物質をベシクルの形態で分泌する微生物としては、パラコッカス、シュードモナス等が挙げられる。
【００６７】
微生物活性調節物質を内包するカチオン性リポソームの作成方法は、公知のリポソームの作成方法と同様であり、例えばバンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）法を利用することができる。具体的には、リン脂質等のカチオン性リポソームの構成要素をクロロホルム等の有機溶媒に溶解し、有機溶媒を留去し脂質薄膜を得る。そこに微生物用活性調節剤及び水を加えて、超音波処理又はボルテックスミキサーを用いて水和分散させることで、微生物活性調節物質を内包するカチオン性リポソームが得られる。リポソームの別の作成方法である、逆相蒸発法、エタノール注入法、エーテル蒸発法等を利用してもよい。
【００６８】
運搬媒体としてミセルを用いる場合、例えば、両親媒性化合物と微生物活性調節物質との疎水性相互作用や静電相互作用によってミセルを形成させることにより、微生物用活性調節剤を調製することができる。このとき、図７に示すように、ミセルは、疎水性物質である微生物活性調節物質７０３を中心として、疎水性基７０２を内側、親水性基７０１を外側に向けて球状のミセルを形成し、水に溶解させることができる。
【００６９】
運搬媒体としてエマルションを用いる場合、例えば、微生物活性調節物質を溶解した油相に界面活性剤を添加して水中に分散させることで調製することができる。
【００７０】
運搬媒体としてペプチドやタンパク質を用いる場合、例えば、ペプチドやタンパク質と微生物活性調節物質とを疎水性相互作用またはイオン性相互作用等によって結合させることにより、微生物用活性調節剤を調製することができる。微生物活性調節物質が酸性または中性物質である場合はアルブミンを、塩基性物質である場合はα１−酸性糖タンパク質を用いることが好ましい。また、微生物活性調節物質は図８のように、タンパク質に取り込まれて運搬される。微生物活性調節物質８０２がペプチド又はタンパク質に取り込まれる態様は、タンパク質の３次元構造８０１の複数のヘリックス構造又はループ構造に包まれる態様でもよく、３次元構造の表面、特に凹部に付着する態様でもよい。
【００７１】
運搬媒体として金属ナノ粒子を用いる場合、例えば、図９に示すように金属粒子９０１に修飾基９０２のチオール基等を介して結合させた金属ナノ粒子と微生物活性調節物質９０３とを物理吸着させることにより、微生物用活性調節剤を調製することができる。
【００７２】
運搬媒体としてカーボンナノチューブを用いる場合、例えば、図１０（ａ）に示すように、微生物活性調節物質１００２を、カーボンナノチューブ１００１の表面や内部に、疎水性相互作用、吸着作用等により付着させることにより、微生物用活性調節剤を調製することができる。また、微生物活性調節物質１００２が親水性物質である場合には、図１０（ｂ）に示すようにカーボンナノチューブ１００１の表面に外側に向けてポリエチレングリコールなどの鎖状の修飾基１００３を共有結合させたカーボンナノチューブを用いて、調製することができる。
【００７３】
運搬媒体としてフラーレンを用いる場合、微生物活性調節物質１１０２が疎水性物質であれば、図１１（ａ）に示すようにフラーレン１１０１の側面に疎水性相互作用等によって付着させることができ、またフラーレンに内包させることもできる。また、微生物調節物質１１０２が親水性物質であれば、図１１（ｂ）に示すように、フラーレンの３次元構造の表面から外側に向けてポリエチレングリコールなどの鎖状の修飾基１１０２を共有結合させたフラーレン１１０１を用いて、調製することができる。
【００７４】
運搬媒体として第１のポリマーを用いる場合、図１２に示すように、例えば、第１のポリマー１２０１と微生物活性調節物質１２０２とを、疎水的相互作用等によって結合させることにより、微生物用活性調節剤を調製することができる。
【００７５】
第１のポリマーがハイドロゲルである場合には、微生物活性調節物質を溶解又は分散させた溶媒中でハイドロゲルを膨潤させることにより、図１３に示すように、第１のポリマー１３０１の網目構造中に溶媒１３０３を保持させ、溶媒１３０３に微生物活性調節物質１３０２を溶解させて、微生物用活性調節剤を調製することができる。
【００７６】
第１のポリマーがナノスフェア・マイクロスフェアである場合には、以下のようにして微生物用活性調節剤を調製することができる。溶媒中で微生物活性調節物質とナノスフェア・マイクロスフェアを混合することにより、図１４に示すように、ナノスフェア・マイクロスフェア１４０１と微生物活性調節物質１４０２との相互作用により、微生物活性調節物質をナノスフェア・マイクロスフェアに内包させることができる。
【００７７】
第１のポリマーがデンドリマーである場合には、図１５に示すように、溶媒中で微生物活性調節物質１５０２とデンドリマー１５０１を混合することにより、デンドリマーと微生物活性調節物質との疎水性相互作用、イオン相互作用によりデンドリマーの内部の空間に微生物活性調節物質を保持することができる。また、微生物活性調節物質は、デンドリマーに化学結合させたものでもよい。デンドリマーに化学結合された微生物活性調節物質は、デンドリマーの分解等に伴って放出される。
【００７８】
（運搬媒体の修飾）
上記運搬媒体は、糖鎖、抗体又は第２のポリマーで修飾されていてもよい。運搬媒体がこれらの物質で修飾されていることにより、上記の微生物用活性調節剤を選択的に特定の抗原を有する微生物に送達したり、微生物用活性調節剤の残存性を調節することが可能になる。運搬媒体を修飾する糖鎖としては、オリゴ糖、ガラクトース、フコース等が挙げられる。また、運搬媒体を修飾する抗体としては、リポ多糖、鞭毛、莢膜、線毛等を抗原とするものが挙げられる。また、運搬媒体を修飾する第２のポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン等が挙げられる。運搬媒体を修飾する第２のポリマーは、ハイドロゲル、ナノスフェア、マイクロスフェア又はデンドリマーの形状であってもよい。
【００７９】
（運搬媒体の修飾方法）
運搬媒体を糖鎖、抗体又は第２のポリマーで修飾する方法としては、例えば、化学架橋剤を用いて、運搬媒体を構成する分子に、糖鎖、抗体又は第２のポリマーを結合させる方法が挙げられる。化学架橋剤としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）等が挙げられる。
【００８０】
（微生物の活性を調節する方法）
上記の微生物用活性調節剤を微生物に投与することにより、微生物の活性を調節することができる。ここで、微生物活性とは、微生物が特定の物質（汚濁物質）を分解する活性をいう。微生物活性の向上とは、単位量の微生物が特定の汚濁物質を分解する能力が向上することをいう。また、微生物活性の低下とは、単位量の微生物が特定の汚濁物質を分解する能力が低下することをいう。汚濁物質としては、グルコース、マルトースなどの糖；メタノールなどのアルコール；ホルムアルデヒドなどのアルデヒド；厨芥などの有機性固形物；でんぷん、タンパク質、アンモニア、硝酸塩、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が挙げられる。特に、アンモニアを硝酸塩に分解する微生物活性を硝化活性といい、硝酸塩を窒素に分解する微生物活性を脱窒活性という。
【００８１】
上記の微生物用活性調節剤が有効に作用する微生物としては、ビブリオ、アエロモナス、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、アクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、ハロモナス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、スフィンゴバクテリウム属（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）アシドバクテリウム属（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アエロバクター属（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、スピリラム属（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ズーグレア属（Ｚｏｏｇｌｏｅａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、デハロコッカス属（Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）、アミノモナス属（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、デサルホモナス属（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ）、デサルフォビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、シントロフォバクター属（Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メサノスピリラム属（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、メサノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノリネア属（Ｍｅｔｈａｎｏｌｉｎｅａ）メタノブレビバクター属（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）、メタノサエタ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ）等が挙げられる。
【００８２】
上記の微生物の活性を調節する方法は、海洋構造物、パイプラインなど、バイオフィルム形成が影響する様々な対象に適用できる。例えば、微生物電池においてはアノード及びカソードに緻密なバイオフィルムを形成させる技術に応用できる。また、海洋構造物の大型生物付着防止のためにバイオフィルムを形成させる技術に応用できる。
【００８３】
（生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物の活性を調節する方法）
一実施形態において、上記の微生物用活性調節剤は、生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物用である。生物学的排水処理設備の反応槽に、上記の微生物用活性調節剤を添加することにより、反応槽中に存在する微生物の活性を向上又は低下させることができる。これにより、反応槽で行われる排水処理を促進させ、又は、必要に応じて抑制することができる。
【００８４】
以下、生物学的排水処理設備について、図１９〜２２を参照して、詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。
【００８５】
（生物学的排水処理設備１）
図１９は、生物学的排水処理設備１に係る活性汚泥処理装置を示す概略構成図である。図１９に示すように、活性汚泥処理装置１９００は、調整槽１９０１、曝気槽１９０２、及び固液分離手段１９０３を備える。
【００８６】
有機性排水は、有機性排水導入ラインＬ１を介してまず調整槽１９０１に投入され、浮遊物等を取り除いた後に、ラインＬ２を介して曝気槽１９０２に投入される。有機性排水を曝気槽１９０２に導入し曝気処理することで活性汚泥（好気性微生物）により有機物を分解し、水、炭酸ガス、硫酸塩、硝酸塩等の安定物質を生成すると共に汚泥を増殖させる。曝気槽１９０２において曝気処理された後の汚泥を含む処理水はラインＬ３を介して固液分離手段１９０３に導入される。固液分離手段１９０３では、汚泥と処理水とが固液分離され、分離処理水は処理水排出ラインＬ４から系外に排出されると共に、分離汚泥は返送汚泥として曝気槽１９０２に戻すべく汚泥返送ラインＬ５を介して返送し、分離汚泥の一部は余剰汚泥として汚泥排出ラインＬ６から外部に排出するように構成されている。固液分離手段１９０３は、ここでは、沈殿槽とされ、分離処理水を上澄みとし、分離汚泥を沈降汚泥としているが、固液分離できれば、例えば、膜分離装置や遠心分離装置等であっても良い。
【００８７】
ここで、生物学的排水処理設備１に係る活性汚泥処理装置１９００では、曝気槽１９０２に対して細胞間情報伝達物質（シグナル物質）を投入するシグナル物質添加手段１９０４（添加手段）を備える。
【００８８】
シグナル物質添加手段１９０４によって添加されるシグナル物質は、例えば、運搬媒体によって内包された状態や、運搬媒体と結合して複合体を形成した状態であってもよい。シグナル物質を運搬する運搬媒体としては、例えば、ベシクル、リポソーム、ミセル、エマルション、ペプチド、タンパク質、金属ナノ粒子、カーボンナノチューブ、ポリマー等が挙げられる。これらは１種類を単独で又は複数種類を組み合わせて使用することができる。
【００８９】
生物学的排水処理設備１に係る活性汚泥処理装置１９００では、曝気槽１９０２に対して、シグナル物質添加手段１９０４によってシグナル物質を添加する際に、活性汚泥処理装置１９００のうち少なくとも曝気槽１９０２の運転を停止させて、曝気槽１９０２内の活性汚泥が槽内下部に沈降した状態で、シグナル物質を活性汚泥に対して添加してもよい。
【００９０】
曝気槽１９０２内の下部に沈降した状態の活性汚泥は、曝気処理運転中の曝気槽１９０２内における活性汚泥の濃度よりもその濃度が高い。このように、通常運転中の曝気槽１９０２内の活性汚泥の濃度よりも濃度が高い状態にある活性汚泥に対してシグナル物質を添加する構成とすることで、より濃縮された活性汚泥に対してシグナル物質を添加することができる。これによって、シグナル物質を活性汚泥中の微生物に対して効果的に到達させることができるため、シグナル物質による微生物の活性の調節をより効率的に行うことができる。
【００９１】
この点について、例えば、容積が１０００ｍ３である曝気槽１９０２に対してシグナル物質を添加する場合について考える。ここでは、運転中の曝気槽１９０２においてシグナル物質を添加する場合には微生物の活性の調節を好適に行うためには、分子量が５００ＭＷであるシグナル物質を１０μｍｏｌ／Ｌ投与する必要があるとする。この場合、５ｋｇのシグナル物質を曝気槽１９０２に添加する必要がある。これに対して、曝気槽１９０２の運転を停止して活性汚泥を自然沈降させることで、活性汚泥の体積が運転中に比べて３０％となるまで小さくなったとする。この場合、沈降濃縮した活性汚泥に対して、シグナル物質を濃度が１μｍｏｌ／Ｌとなるように投与すると仮定すると、シグナル物質は１．５ｋｇで十分となり、より少ないシグナル物質によって、曝気槽１９０２で活動する微生物の活性の調節を行うことができる。
【００９２】
なお、生物学的排水処理設備１では、曝気槽１９０２における曝気処理を停止してシグナル物質を添加する構成についても説明したが、曝気処理を完全に止めずに、例えば運転動力を低下させることで通常運転時に比べて活性汚泥が槽内下方に貯留するような状態とし、貯留した活性汚泥に対してシグナル物質を添加する構成とすることもできる。この場合であっても、シグナル物質をより効果的に微生物に作用させて活性を調節するという効果を得ることができる。
【００９３】
なお、本発明では曝気槽にシグナル物質を添加する添加工程を備えることを特徴としているが、添加工程をどのように行うかについては、上記生物学的排水処理設備１の態様に限定されない。以下、生物学的排水処理設備２〜４を用いて、添加工程に係る他の態様について説明する。
【００９４】
（生物学的排水処理設備２）
図２０は、生物学的排水処理設備２に係る活性汚泥処理装置を示す概略構成図である。活性汚泥処理装置２０００が生物学的排水処理設備１に係る活性汚泥処理装置１９００と相違する点は以下の点である。すなわち、シグナル物質添加手段１９０４に代えて、シグナル物質添加手段２００４，２０１４が設けられている点である。
【００９５】
シグナル物質添加手段２００４は、固液分離手段１９０３によって固液分離された後の活性汚泥に対してシグナル物質を添加する構成を示している。固液分離後の活性汚泥は、曝気運転中の槽内の活性汚泥と比較して、濃縮されている。このような固液分離後の濃縮された活性汚泥は、返送ラインＬ５を経て曝気槽１９０２に返送されるので、固液分離手段１９０３において分離された活性汚泥に対してシグナル物質を添加することで、曝気処理運転中の曝気槽１９０２に対してシグナル物質を添加する構成と比較して、シグナル物質による微生物の活性の調節をより効率的に行うことができる。
【００９６】
また、シグナル物質添加手段２０１４は、固液分離手段１９０３によって固液分離された活性汚泥を曝気槽１９０２に返送するための返送ラインＬ５内を移動する活性汚泥に対してシグナル物質を添加する構成を示している。返送ラインＬ５内を移動する活性汚泥は、曝気運転中の槽内の活性汚泥と比較して、濃縮されている。返送ラインＬ５を経て曝気槽１９０２に返送される活性汚泥に対してシグナル物質を添加することで、曝気処理運転中の曝気槽１９０２に対してシグナル物質を添加する構成と比較して、シグナル物質による微生物の活性の調節をより効率的に行うことができる。
【００９７】
なお、活性汚泥処理装置２０００では、２つのシグナル物質添加手段２００４，２０１４が設けられた構成を示しているが、シグナル物質添加手段２００４，２０１４のうち一方のみを備えていればよい。そして、活性汚泥処理方法においてシグナル物質添加手段によりシグナル物質を添加する工程を備える態様とすることで、シグナル物質による微生物の活性の調節をより効率的に行うことができる。
【００９８】
（生物学的排水処理設備３）
図２１は、生物学的排水処理設備３に係る活性汚泥処理装置を示す概略構成図である。活性汚泥処理装置２１００が生物学的排水処理設備１に係る活性汚泥処理装置１９００と相違する点は以下の点である。すなわち、シグナル物質添加手段１９０４に代えて、返送ラインＬ５に沿って互いに異なる位置に複数のシグナル物質添加手段２１０４〜２１２４が設けられている点である。
【００９９】
また、シグナル物質添加手段２１０４〜２１２４は、返送ラインＬ５に沿って、互いに異なる位置に設けられて、固液分離手段１９０３によって固液分離された活性汚泥を曝気槽１９０２に返送するための返送ラインＬ５内を移動する活性汚泥に対してシグナル物質を添加する機能を有する。また、シグナル物質添加手段２１０４〜２１２４によるシグナル物質の添加量は互いに異なる構成とされている。図３では、その一例として、シグナル物質添加手段２１０４，２１１４，２１２４の順に添加量が増えていく構成を、矢印の大きさで示している。
【０１００】
このように、返送ラインＬ５に沿って互いに異なる位置に複数のシグナル物質添加手段２１０４〜２１２４を設けることで、返送ラインＬ５内を移動する曝気槽１９０２内の運転中における濃度よりも高濃度の活性汚泥に対してシグナル物質を添加することによるシグナル物質による微生物の活性の調節効果の向上に加えて、シグナル物質を活性汚泥に対してより均一に添加することができるため、シグナル物質による微生物の活性をより効率的に調節することができる。
【０１０１】
さらに、複数のシグナル物質添加手段２１０４〜２１２４におけるシグナル物質の添加量を互いに異ならせる構成とすることで、例えば、返送ラインＬ５内での活性汚泥の流れ方等活性汚泥の状況に応じてシグナル物質の添加量を調整することもでき、シグナル物質を活性汚泥に対してより均一に添加することが可能となり、シグナル物質による微生物の活性をより効率的に調節することができる。
【０１０２】
なお、複数のシグナル物質添加手段２１０４〜２１２４から添加するシグナル物質の種類を互いに異ならせる構成としてもよい。
【０１０３】
（生物学的排水処理設備４）
図２２は、生物学的排水処理設備４に係る活性汚泥処理装置を示す概略構成図である。活性汚泥処理装置２２００が生物学的排水処理設備１に係る活性汚泥処理装置１９００と相違する点は以下の点である。すなわち、シグナル物質添加手段１９０４に代えて、返送ラインＬ５に汚泥量検出手段２２０５が設けられ、シグナル物質添加手段２２０４が汚泥量検出手段２２０５により検出された結果に基づいてシグナル物質を添加する構成とされている点である。
【０１０４】
汚泥量検出手段２２０５は、返送ラインＬ５を経て曝気槽１９０２に返送される返送汚泥（活性汚泥）の量を計測する手段であり、例えば、返送ラインＬ５内を流れる汚泥の流量を計測する流量計や、汚泥の濃度を検出する濃度計を適用することができる。また、流量計と濃度計との両方を用いてもよい。
【０１０５】
また、シグナル物質添加手段２２０４は、返送ラインＬ５において汚泥量検出手段２２０５よりも下流側に設けられ、汚泥量検出手段２２０５によって検出された汚泥の量（流量及び／又は濃度）に基づいて、シグナル物質の添加量を調節して添加する機能を有する。
【０１０６】
上記の活性汚泥処理装置２２００による活性汚泥処理方法では、シグナル物質の添加工程において、汚泥量検出手段２２０５によって検出された活性汚泥の流量及び／又は濃度に基づいてシグナル物質添加手段２２０４からシグナル物質が添加される。このように、活性汚泥の流量及び／又は濃度に基づいてシグナル物質の添加量を変化させる構成とすることで、活性汚泥の返送量に応じてシグナル物質の添加量を適切に制御することができ、シグナル物質による微生物の活性をより効率的に調節することができる。
【０１０７】
以上、生物学的排水処理設備について説明してきたが、本発明は必ずしも上述した生物学的排水処理設備に限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で様々な変更が可能である。
【０１０８】
例えば、上記生物学的排水処理設備においては、返送汚泥を曝気槽１９０２より上流のラインＬ２に返送するようにしているが、曝気槽１９０２に直接返送するようにしてもよい。
【実施例】
【０１０９】
（ＭＬＳＳ）
以下の実験において、活性汚泥の量は、ＭＬＳＳ（Ｍｉｘｅｄ  ｌｉｑｕｏｒ  ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  ｓｏｌｉｄｓ：活性汚泥浮遊物質）に基づいて測定した。ＭＬＳＳの測定は、以下の方法により行なった。まず、活性汚泥サンプルを遠心管にとり、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行なった後、上清を捨てた。次に、得られた沈殿物に水を加えてよく混合した後、再び上記と同様に遠心分離して上清を捨てた。得られた沈殿物を、予め秤量された蒸発皿に入れ、乾燥機中で１０５〜１１０℃で半日乾燥した。続いて、デシケーター中で放冷後、秤量した。測定された質量から、空の蒸発皿の質量を除いた質量をＭＬＳＳとした。【０１１０】
（ベシクルに内包されたＮ−ヘキサデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトンの調製）
Ｎ−ヘキサデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン（以下、「Ｃ１６−ＨＳＬ」という場合がある。）をベシクル（メンブレンベシクル）の形態で分泌する、パラコッカスＡＳ６株を培地中で培養し、その培養物をベシクルに内包されたＣ１６−ＨＳＬとして使用した。パラコッカスＡＳ６株については後述する。Ｃ１６−ＨＳＬの濃度は質量分析法により測定した。【０１１１】
（硝化反応の促進の検討）
試験管に、アンモニア態窒素（ＮＨ４＋）が５０ｍＭとなるように調製した無機塩培地を入れた。続いて、上記の試験管に、活性汚泥をＭＬＳＳが５０００ｍｇ／Ｌとなるように添加した。さらに、上記の試験管に、ベシクルに内包されたＣ１６−ＨＳＬを１０μＭの終濃度となるように添加した。ベシクルに内包されたＣ１６−ＨＳＬは、Ｃ１６−ＨＳＬが疎水性の物質であるにもかかわらず、容易に培地中に拡散させることができた。陰性対照としては、上記の無機塩培地に活性汚泥のみを添加したものを用いた。実験開始時、２４時間培養後及び４８時間培養後に、培地中のアンモニア態窒素濃度をイオン電極法により測定した。結果を図１に示す。ベシクルに内包されたＣ１６−ＨＳＬを添加した系では、陰性対照と比較して、アンモニア態窒素の減少速度が速くなり、硝化反応が促進されたことが示された。【０１１２】
（Ｎ−３−オキソドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトンを含む微生物用活性調節剤の調製）
Ｎ−３−オキソドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン（以下、「３ｏｘｏＣ１２−ＨＳＬ」という場合がある。）をリポソームに内包させ、微生物用活性調節剤を調製した。リポソームの組成は水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）２９ｇ／Ｌ、コレステロール１３ｇ／Ｌであった。リポソームはバンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）法として知られる次の手順により作製した。【０１１３】
まず、クロロホルム１０ｍＬにＨＳＰＣ、コレステロール及び３ｏｘｏＣ１２−ＨＳＬ（１ｍＭ）を溶解した。続いて、エバポレーターを用いてクロロホルムを除去し、ナス型フラスコの底に脂質フィルムを形成させた。続いて脂質フィルムを形成させたナス型フラスコにリン酸バッファを添加し、ボルテックスミキサーを使用して撹拌しながら、６０℃で水和及び分散させた。以上の操作により、３ｏｘｏＣ１２−ＨＳＬを含む微生物用活性調節剤を得た。【０１１４】
（硝化反応の促進の検討）
試験管に、アンモニア態窒素（ＮＨ４＋）が１４ｍＭとなるように調製した無機塩培地を入れた。続いて、上記の試験管に、活性汚泥をＭＬＳＳが５０００ｍｇ／Ｌとなるように添加した。さらに、上記の試験管に、微生物用活性調節剤（３ｏｘｏＣ１２−ＨＳＬを内包したリポソーム溶液）を培地と同容量添加した。１０μＭの終濃度となるように添加した。上記の微生物用活性調節剤は、３ｏｘｏＣ１２−ＨＳＬが疎水性の物質であるにもかかわらず、容易に培地中に拡散させることができた。陰性対照としては、上記の無機塩培地に活性汚泥を添加した後、３ｏｘｏＣ１２−ＨＳＬを含まない点以外は上記の微生物用活性調節剤と同様にして調製した、リポソームを水和したリン酸バッファを、培地と同容量添加したものを用いた。実験開始時、２４時間、４８時間及び７２時間培養後に、培地中のアンモニア態窒素濃度をイオンクロマトグラフィーにより分析した。結果を図２に示す。３ｏｘｏＣ１２−ＨＳＬを含む微生物用活性調節剤を添加した系では、陰性対照と比較して、アンモニア態窒素の減少速度が速くなり、硝化反応が促進されたことが示された。【０１１５】
（パラコッカスＡＳ６株）
（ホモセリンラクトン高生産菌のスクリーニング）
培地中にホモセリンラクトンが存在すると紫色の色素であるビオラセインを生産するレポーター株を利用して、活性汚泥からホモセリンラクトン高生産菌をスクリーニングした。より具体的には、アシル基の炭素数が４〜８のＮ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトン（Ｃ４〜Ｃ８−ＨＳＬ）に応答するクロモバクテリウム・ビオラセウムＣＶ０２６株及びアシル基の炭素数が１０〜１６のＮ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトン（Ｃ１０〜Ｃ１６−ＨＳＬ）に応答するクロモバクテリウム・ビオラセウム  ＶＩＲ０７株を使用した。ここで、ＣＶ０２６株が応答するＮ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトンとしては、Ｎ−ブタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソブタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシブタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ペンタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソペンタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシペンタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘプタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソヘプタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシヘプタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−オクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソオクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシオクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン等が挙げられる。また、ＶＩＲ０７株が応答するホモセリンラクトンとしては、Ｎ−デカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ウンデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソウンデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシウンデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−トリデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソトリデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシトリデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−テトラデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソテトラデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシテトラデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ペンタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソペンタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシペンタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘキサデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソヘキサデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシヘキサデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン等が挙げられる。【０１１６】
活性汚泥を希釈して寒天培地に塗布し、単離株を得た。寒天培地上の近接する位置に、活性汚泥から得られた単離株及びレポーター株を塗布した。数日培養後、レポーター株が紫色の色素（ビオラセイン）を分泌したものについて、単離株をホモセリンラクトン生産菌と判断した。結果を表１に示す。表中、「＋」の数が多い程ビオラセインの生産量が多かったことを示す。この方法により、ホモセリンラクトン高生産菌である、ＡＳ６株を得た。ＡＳ６株は、２０１２年５月１８日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３６３として寄託した。【０１１７】
【表１】
2014017233.tif 000003
【０１１８】
（ＡＳ６株が生産しているシグナル物質の解析）
ＡＳ６株をＬＢ培地で培養し、培養液を６，０００×ｇ、１５分間遠心分離した。続いて、遠心上清をポアサイズ０．２μｍの酢酸セルロースフィルターで濾過した後、１５０００００×ｇ、３時間、４℃で超遠心した。上清を捨てた後、ペレットをＨＥＰＥＳ−ＮａＣｌ溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−０．８５（ｗ／ｖ）％ＮａＣｌ）で洗浄した。次に、ＨＥＰＥＳ−ＮａＣｌ溶液中にＯｐｔｉｐｒｅｐ（商品名、アクシスシールド社）を４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０（ｖ／ｖ）％混合したものを、濃度が高いものが下に来るように遠心管内に重層してグラジエント層を作成し、一番上に４０（ｖ／ｖ）％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ−ＨＥＰＥＳ−ＮａＣｌ溶液に溶解したペレットを添加した。続いて、このグラジエントを１００００００×ｇ、３時間超遠心した。超遠心分離後、それぞれの層を回収し、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．１９７６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８−２５４．）によりタンパク質濃度を、スチュワート法（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．１９８０．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４，１０−１４．）によりリン脂質濃度を分析した。タンパク質の濃度及びリン脂質の濃度が高い層をベシクルが抽出された層とした。【０１１９】
（ベシクルの確認）
上記のベシクルが抽出された層のサンプルを、ネガティブ染色を用いた透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察により観察した。その結果、ベシクルが存在することが確認された。【０１２０】
（シグナル物質の同定）
質量分析により、上記のベシクルが抽出された層のサンプルを解析し、シグナル物質の標準品との比較により、物質の同定及び濃度測定を行った。その結果、ＡＳ６株は、培養液中に１．０μＭ程度のＣ１６−ＨＳＬを分泌しており、また、その中の少なくとも半分量がベシクルに内包された状態で存在することが明らかとなった。Ｃ１６−ＨＳＬのような疎水性の物質は、細胞膜に留まりやすいと考えられている。このため、ＡＳ６株は、ベシクルにＣ１６−ＨＳＬを内包して細胞外に排出することにより大量のＣ１６−ＨＳＬを分泌していると考えられた。【０１２１】
以上の結果から、発明者らは、ＡＳ６株が生産するＣ１６−ＨＳＬが、ベシクルの形態で分泌されることを発見した。疎水性のシグナル物質を化学合成した場合、水に溶解するために有機溶媒等を用いる必要があるなど、操作性が悪い場合がある。これに対し、ＡＳ６株が生産したＣ１６−ＨＳＬは、ベシクルの形態で分泌されているため親水性であり、そのまま水系に添加して用いることができることが明らかとなった。【０１２２】
（ＡＳ６株の同定）
１６Ｓ  ｒＤＮＡ（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子）の塩基配列解析、形態観察及び生理・生化学試験により、ＡＳ６株の帰属分類群を推定した。【０１２３】
（１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列解析）
ＡＳ６株を寒天培地上で３０℃、２４時間培養し、ＤＮＡを抽出した。例えば、「中川恭好、川崎浩子、遺伝子解析法  １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定法、日本放線菌学会編、『放線菌の分類と同定』、Ｐ．８８−１１７、日本学会事務センター（２００１）」に記載された、一般的な方法に基づいて、１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を決定し、データベースとの相同性検索及び簡易分子系統解析を行った。簡易分子系統解析は、アポロンＤＢ−ＢＡデータベース  Ｖｅｒ．７．０（商品名、テクノスルガ・ラボ社、２０１１年３月版、検索日２０１２年５月２日）に基づいて作成した。【０１２４】
図３に簡易分子系統解析の結果を示す。図３において、左下の線はスケールバーを表し、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を表す。また、株名の末尾のＴはその種の基準株であることを示す。相同性検索の結果、ＡＳ６株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列は、パラコッカス属のｒＤＮＡの塩基配列に対して高い相同性を示した。また、簡易分子系統解析の結果、ＡＳ６株は、パラコッカス属の種で形成されるクラスター内に含まれ、パラコッカス・ベルスタス（Ｐ．ｖｅｒｓｕｔｕｓ）及びパラコッカス・ベンガレンシス（Ｐ．ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ）に近縁であることが示された。しかしながら、ＡＳ６株がパラコッカス・ベルスタス又はパラコッカス・ベンガレンシスに帰属する可能性及びこれらとは異なる種である可能性が考えられ、種名の同定には至らなかった。【０１２５】
（形態観察及び生理・生化学試験）
光学顕微鏡による形態観察、及び、例えば「ＢＡＲＲＯＷ及びＦＥＬＴＨＡＭ、Ｃｏｗａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｌ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉａ．  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．  １９９３、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ」に記載された、一般的な方法に基づいて、カタラーゼ反応、アオキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス発生、ブドウ糖の酸化／発酵について試験を行った。また、ＡＰＩ２０ＮＥキット（商品名、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製）を用いて、硝酸塩還元、インドール産生、ブドウ糖酸性化、アルギニンジヒドロラーゼ、ウレアーゼ、エスクリン加水分解、ゼラチン加水分解、β−ガラクトシダーゼ及びチトクロームオキシダーゼについての生化学試験、並びに、ブドウ糖、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、マルトース、グルコン酸カリウム、ｎ−カプリン酸、アジピン酸、ｄｌ−リンゴ酸、クエン酸ナトリウム、酢酸フェニルについての資化性試験を行った。さらに、嫌気条件下での生育の有無及び２０℃での生育の有無についての試験、並びに、グリセロール、サッカロース、Ｄ−フルクトース、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム及び乳酸ナトリウムについての資化性試験を行った。【０１２６】
結果を表２〜４に示す。ＡＳ６株は、運動性を有しないグラム陰性桿菌であり、グルコースを酸化せず、カタラーゼ反応及びオキシダーゼ反応は共に陽性を示した。ＡＰＩ２０ＮＥキットを用いた試験の結果、ＡＳ６株は硝酸塩を還元せず、グルコース、Ｌ−アラビノース及びＤ−マンノース等を資化し、ｎ−カプリン酸及びクエン酸ナトリウムを資化しなかった。これらの性状はパラコッカス・ベルスタス及びパラコッカス・ベンガレンシスの性状と類似していたが完全には一致しなかった。特に、Ｄ−マンノースを資化する点ではパラコッカス・ベンガレンシスの性状と異なり、ラクトースを資化する点ではパラコッカス・ベルスタスの性状と異なり、硝酸塩を還元しない点はパラコッカス・ベルスタス及びパラコッカス・ベンガレンシスのいずれとも異なっていた。【０１２７】
【表２】
2014017233.tif 000004
【０１２８】
【表３】
2014017233.tif 000005
＋：陽性、−：陰性【０１２９】
【表４】
2014017233.tif 000006
【０１３０】
以上の結果から、ＡＳ６株は、パラコッカス・ベルスタス及びパラコッカス・ベンガレンシスに近縁なパラコッカス属細菌であると推定された。【０１３１】
（レポーターアッセイ）
３ｏｘｏＣ１２−ＨＳＬに応答して蛍光を発するレポーター株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１  δｌａｓＩ  ｐＭＥ  ＰｌａｓＩ  ＧＦＰを用いて評価を行った。上記レポーター株は、プラスミドにＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質：Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ、イクオリン）発現遺伝子を挿入し、さらに３ｏｘｏＣ１２−ＨＳＬによって誘導されるｌａｓＩのプロモーターをＧＦＰ発現遺伝子の上流に挿入したものを、ｌａｓＩ破壊株の緑膿菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１に取り込ませている。上記レポーター株は、自らの３ｏｘｏＣ１２−ＨＳＬの生産能力は破壊されているが、環境中の３ｏｘｏＣ１２−ＨＳＬに応答してＧＦＰを発現し、蛍光を示す。リポソームはバンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）法により作製した。【０１３２】
実験方法
１）ＬＢ液体培地にレポーター株を投入した系を複数準備し、３ｏｘｏＣ１２−ＨＳＬ（５０ｎＭ）をＤＭＳＯに溶解、あるいは表５，６に示す組成のリポソームに内包する形で添加した。
２）３７℃で１２時間静置培養した。
３）蛍光光度計を用い、培養液に紫外線を照射してＧＦＰの蛍光発色度合いを分析した。【０１３３】
【表５】
2014017233.tif 000007
【０１３４】
図４に示すように、３ｏｘｏＣ１２−ＨＳＬ含有リポソームを用いた場合、３ｏｘｏ−Ｃ１２−ＨＳＬのみを添加した場合と比較して、蛍光強度が１５倍程度まで増強した。また、荷電していないリポソームと負荷電リポソームとでは、ほぼ同程度の蛍光強度を示した。【０１３５】
【表６】
2014017233.tif 000008
【０１３６】
図５に示すように、リポソームにコレステロールを添加し、脂質二重膜の流動性を調節したリポソームＡ、ＢおよびＣでは、リポソームＢが最も蛍光強度が高かった。
【符号の説明】
【０１３７】
６００，７００，８００，９００，１０００，１１００，１２００，１３００，１４００，１５００…微生物用活性調節剤、６０１，７０１…親水性基、６０２，７０２…疎水性基、８０１，９０１，１００１，１１０１，１２０１，１３０１，１４０１，１５０１…運搬媒体、６０３，７０３，８０２，９０３，１００２，１１０２，１２０２，１３０２，１４０２，１５０２…微生物活性調節物質、９０２，１００３，１１０３…修飾基、１３０３…溶媒、１６００，１７００，１８００…運搬媒体、１６０１，１７０１，１８０１…最外層、１６０２，１７０２，１８０２…内層リポソーム、１６０３，１７０３，１７０４，１８０３，１８０４…微生物活性調節物質、１９０１…調整槽、１９０２…曝気槽、１９０３…固液分離槽、１９０４，２００４，２０１４，２１０４，２１１４，２１２４，２２０４…シグナル物質添加手段、２２０５…汚泥量検出手段、１９００，２０００，２１００，２２００…活性汚泥処理装置。
【図１】
2014017233.tif 000009
【図２】
2014017233.tif 000010
【図３】
2014017233.tif 000011
【図４】
2014017233.tif 000012
【図５】
2014017233.tif 000013
【図７】
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【図８】
2014017233.tif 000015
【図９】
2014017233.tif 000016
【図１０】
2014017233.tif 000017
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2014017233.tif 000021
【図１５】
2014017233.tif 000022
【図１６】
2014017233.tif 000023
【図１７】
2014017233.tif 000024
【図１８】
2014017233.tif 000025
【図１９】
2014017233.tif 000026
【図２０】
2014017233.tif 000027
【図２１】
2014017233.tif 000028
【図２２】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年1月15日(2016.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物活性調節物質及び運搬媒体を含み、
前記微生物活性調節物質が、細胞間情報伝達物質、原核生物の活性に影響を与える核酸及び原核生物の活性に影響を与えるタンパク質からなる群より選択される１種以上の物質であり、
前記原核生物の活性に影響を与える核酸が、タンパク質の合成もしくは合成抑制に関わる酵素又はＡＴＰ合成酵素の発現をコードするＤＮＡあるいはＲＮＡであり、
前記原核生物の活性に影響を与えるタンパク質が、ポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ又はプロテアーゼである、
生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物用活性調節剤。
【請求項２】
前記微生物活性調節物質がＮ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトンである、請求項１に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項３】
前記運搬媒体は、ベシクル、リポソーム、ミセル、エマルション、ペプチド、タンパク質、金属ナノ粒子、カーボンナノチューブ、フラーレン及び第１のポリマーからなる群より選択される１種以上の物質である、請求項１又は２に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項４】
前記第１のポリマーは、ハイドロゲル、ナノスフェア、マイクロスフェア又はデンドリマーである、請求項３に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項５】
前記運搬媒体が、糖鎖、抗体又は第２のポリマーで修飾されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項６】
前記第２のポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミンである、請求項５に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項７】
前記運搬媒体は、リポソームである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項８】
前記リポソームは、卵黄レシチン又は水素添加大豆ホスファチジルコリンを含む、請求項７に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項９】
前記リポソームは、コレステロールをさらに含む、請求項７に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項１０】
前記リポソームはステアリン酸をさらに含む、請求項８又は９に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項１１】
前記微生物活性調節物質の微生物活性は、硝化活性である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の微生物用活性調節剤。
【請求項１２】
生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物の活性を調節する方法であって、生物学的排水処理設備の反応槽に、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の微生物用活性調節剤を添加する工程を含む、方法。
【国際調査報告】
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