(57)【要約】  被験者の血液に由来する試料中のhsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pからなる群より選択される１つ以上のmiRNAの濃度を測定するための、前記miRNAの増幅プライマーを主成分とする子宮内膜症診断薬が提供される。本発明はまた、被験者の血液に由来する試料中のhsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pからなる群より選択される１つ以上のmiRNAの濃度を測定する工程を含む子宮内膜症の検出方法も提供する。本発明の子宮内膜症診断薬およびこれを用いた診断方法は、簡便で、侵襲性が低く、かつ感度および特異度が高い。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の血液に由来する試料中のhsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pからなる群より選択される１つ以上のmiRNAの濃度を測定するための、前記miRNAの増幅プライマーを主成分とする子宮内膜症診断薬。
【請求項２】
請求項１記載の診断薬を含む子宮内膜症診断キット。
【請求項３】
miRNAが、hsa-miR-708である請求項１記載の子宮内膜症診断薬。
【請求項４】
miRNAが、hsa-miR-127-3pである請求項１記載の子宮内膜症診断薬。
【請求項５】
miRNAが、hsa-miR-518d-3pである請求項１記載の子宮内膜症診断薬。
【請求項６】
血液に由来する試料が、血漿である請求項１記載の子宮内膜症診断薬。
【請求項７】
被験者の血液に由来する試料中のhsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pからなる群より選択される１つ以上のmiRNAの濃度を測定する工程を含む子宮内膜症の検出方法。
【請求項８】
前記miRNAの濃度が正常対照における前記miRNAの濃度と比較して高値か否かを決定する工程を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記miRNAの濃度がカットオフ値以上か否かを決定する工程を含む、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
miRNAが、hsa-miR-708である請求項７記載の方法。
【請求項１１】
miRNAが、hsa-miR-127-3pである請求項７記載の方法。
【請求項１２】
miRNAが、hsa-miR-518d-3pである請求項７記載の方法。
【請求項１３】
血液に由来する試料が、血漿である請求項７記載の方法。
【請求項１４】
被験者の血液に由来する試料におけるhsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pからなる群より選択される１つ以上のmiRNAの濃度を測定する工程を含む被験者における子宮内膜症を診断する方法。
【請求項１５】
前記miRNAの濃度が正常対照における前記miRNAの濃度と比較して高値か否かを決定する工程を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記miRNAの濃度がカットオフ値以上か否かを決定する工程を含む、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連する出願】
【０００１】
本出願は，日本特許出願２０１２−１２４５９５（２０１２年５月３１日出願）に基づく優先権を主張しており，この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、新規な子宮内膜症診断マーカーおよびかかるマーカーを利用した子宮内膜症の診断に関する。
【発明の背景】
【０００３】
子宮内膜症は現在、経膣超音波造影および磁気共鳴造影法により診断されており、その確定診断は腹腔鏡検査によって行われている。また、子宮内膜症診断マーカーとしてCA125などの血中蛋白マーカーが知られている。
【０００４】
CA125に加えて、血清CA19-9の診断マーカーとしての有用性が検討されている（FERTILITY  AND  STERILITY  78(2002)733-739：非特許文献１）。また、各種炎症マーカーとCA-125(いずれも蛋白マーカー)を組合わせた診断方法も提案されている（FERTILITY  AND  STERILITY  89(2008)1073-1081：非特許文献２）。
【０００５】
また、子宮内膜症患者の子宮内膜におけるmiRNA発現解析が報告されている（Mol  Endocrinol  25(2011)821-832：非特許文献３）。この文献では、患者の子宮内膜組織において、10個のmiRNAが発現亢進、12個のmiRNAが発現減少していることが示されている。ただし、これらのmiRNAの血中における発現については何も述べられていない。
【０００６】
miRNA（マイクロRNA）とは、生体において内因性に存在する、19〜23塩基の1本鎖RNA分子である。これまでに700種類以上のヒトmiRNAが同定されており、標的遺伝子のmRNA(メッセンジャーRNA)に配列依存的に作用して遺伝子発現を制御する機能を有することが明らかになっているが、詳細な作用メカニズムやその生理学的役割はよく解明されていない。
【０００７】
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書に参照として取り込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】FERTILITY  AND  STERILITY  78(2002)733-739
【非特許文献２】FERTILITY  AND  STERILITY  89(2008)1073-1081
【非特許文献３】Mol  Endocrinol  25(2011)821-832
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、既存の方法よりも簡便で、侵襲性が低く、かつ感度および特異度が高い、血液に由来する試料における子宮内膜症診断マーカーを提供することである。また、本発明の目的は、複数のマーカーを組合わせて測定することが容易な、血液に由来する試料における子宮内膜症診断マーカー、ならびにこれを用いた診断方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、子宮内膜症患者の血液に由来する試料における約600種類のmiRNAの発現を調べたところ、hsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pの3種類のmiRNAの発現が亢進していることを見いだした。この知見に基づき、本発明者らは、さらに研究を重ね、本発明を完成した。【００１１】
すなわち本発明は、
［１］  被験者の血液に由来する試料中のhsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pからなる群より選択される１つ以上のmiRNAの濃度を測定するための、該miRNAの増幅プライマーを主成分とする子宮内膜症診断薬；
［２］  ［１］の診断薬を含む子宮内膜症診断キット；
［３］  miRNAが、hsa-miR-708である、［１］の子宮内膜症診断薬；
［４］  miRNAが、hsa-miR-127-3pである、［１］の子宮内膜症診断薬；
［５］  miRNAが、hsa-miR-518d-3pである、［１］の子宮内膜症診断薬；
［６］  血液に由来する試料が、血漿である、［１］および［３］ないし［５］のいずれかに記載の子宮内膜症診断薬；
［７］  被験者の血液に由来する試料中のhsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pからなる群より選択される１つ以上のmiRNAの濃度を測定する工程を含む子宮内膜症の検出方法；
［８］  前記miRNAの濃度が正常対照における前記miRNAの濃度と比較して高値か否かを決定する工程を含む、［７］の方法；
［９］  前記miRNAの濃度がカットオフ値以上か否かを決定する工程を含む、［７］または［８］のいずれかに記載の方法；
［１０］  miRNAが、hsa-miR-708である［７］ないし［９］のいずれかに記載の方法；
［１１］  miRNAが、hsa-miR-127-3pである［７］ないし［９］のいずれかに記載の方法；
［１２］  miRNAが、hsa-miR-518d-3pである［７］ないし［９］のいずれかに記載の方法；
［１３］  血液に由来する試料が、血漿である［７］ないし［１２］のいずれかに記載の方法；
［１４］  被験者の血液に由来する試料におけるhsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pからなる群より選択される１つ以上のmiRNAの濃度を測定する工程を含む被験者における子宮内膜症を診断する方法；
［１５］  前記miRNAの濃度が正常対照における前記miRNAの濃度と比較して高値か否かを決定する工程を含む、［１４］の方法；
［１６］  前記miRNAの濃度がカットオフ値以上か否かを決定する工程を含む、［１４］または［１５］に記載の方法、
を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の子宮内膜症診断薬および診断方法は、既存の方法（経膣超音波造影、磁気共鳴造影法、腹腔鏡、血中蛋白マーカー等）よりも簡便であり、侵襲性が低く、感度および特異度が高い。また、本発明の子宮内膜症診断薬および診断方法においては、複数のマーカーを組合わせて測定することが容易であり、複数のマーカーを組合わせることにより、子宮内膜症を感度良く、特異的に診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、患者および対照の2群間におけるhsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pの3種のmiRNAの発現分布を示す。
【図２】図２は、ROC解析による単独miRNAの子宮内膜症検出力の評価を示す。各縦軸は感度を示し、横軸は擬陽性率（1−Specificity(1−特異度)）を示す。
【図３】図３は、複数のmiRNAによる予測モデルを用いた際の検出力の評価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、被験者の血液に由来する試料中のhsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pからなる群より選択される１つ以上のmiRNA（本明細書中、「本発明のmiRNA」と称することがある）の濃度を測定するための、前記miRNAの増幅プライマーを主成分とする子宮内膜症診断薬（本明細書中、「本発明の診断薬」と称することがある）を提供する。
【００１５】
本明細書中、被験者とは、子宮内膜症に罹患しているかまたは罹患していると疑われるヒトをいう。被験者の血液に由来する試料には、全血、血清および血漿が含まれる。該試料は好ましくは血清または血漿であり、さらに好ましくは血漿である。なお、一般に、血清miRNA濃度と血漿miRNA濃度とは相関すると考えられている（例えば、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  105(2008)10513-10518を参照）。
【００１６】
本発明において、子宮内膜症患者の血液に由来する試料中で発現が亢進していることが見いだされたmiRNAは、hsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pの3種類である。これらのmiRNAの塩基配列は下記のとおりであり、miRBase  (http://www.mirbase.org/index.shtml）でも参照可能である。
hsa-miR-708  （aaggagcuuacaaucuagcuggg）  配列番号1
hsa-miR-127-3p  （ucggauccgucugagcuuggcu）  配列番号2
hsa-miR-518d-3p  （caaagcgcuucccuuuggagc）  配列番号3
【００１７】
本発明の子宮内膜症診断薬は、これらの3種類のmiRNAのうち1またはそれ以上のmiRNAを増幅しうるプライマー（本明細書中、「本発明の増幅プライマー」と称することがある。）を主成分とする。これらの増幅プライマーを用いて本発明のmiRNAをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)等で増幅することにより、血液に由来する試料中における本発明のmiRNAの濃度を測定することができ、子宮内膜症の簡便かつ迅速な検査が可能である。
【００１８】
本発明の増幅プライマーは、1本鎖のオリゴヌクレオチドであり、好ましくはDNAである。増幅プライマーにはフォワードプライマーとリバースプライマーとがあり、この2つを組み合わせて用いる。典型的には、フォワードプライマーは、miRNAの配列の中央の核酸よりも5’側の6〜10塩基と同一の配列（ただしプライマーがDNAである場合はUの代わりにTを有する）を有し、リバースプライマーはmiRNAの配列の中央の核酸よりも3’側の6〜10塩基の配列と相補的な配列を有する。
【００１９】
任意に、プライマーはその伸長方向と反対側に、増幅産物の識別、精製、サブクローニングなどに有用な付加的配列（例えばHis-tagをコードする配列や制限酵素認識部位）を有していてもよい。このような付加的配列は、好ましくは1〜15塩基の長さである。各増幅プライマーの配列は、各プライマーの特異性が高く、分子内に二次構造を形成せず、プライマーどうしがハイブリダイズしないよう選定する。各増幅プライマーの長さは、好ましくは12〜30ヌクレオチド、より好ましくは15〜25ヌクレオチドである。
【００２０】
さらに、PCR産物の定量を容易にするために、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの一方または両方が蛍光標識されていることが好ましい。蛍光標識としては、蛍光色素、消光物質、ドナー色素、アクセプター色素が挙げられる。
【００２１】
本発明の増幅プライマーは、汎用のDNA合成装置（例えば、Applied  Biosystems社製  Model  394）を用いて化学的に合成することができるが、当該技術分野においてよく知られる他の方法を用いて合成してもよい。
【００２２】
別の観点においては、本発明は子宮内膜症診断キットを提供する。キットは、本発明の診断薬に加えて、試料を前処理するための試薬、PCR用の試薬および酵素、緩衝液、容器、および使用の指針等を含むことができる。
【００２３】
さらに別の観点においては、本発明は被験者の血液に由来する試料中のhsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pからなる群より選択される１つ以上のmiRNAの濃度を測定する工程を含む、子宮内膜症の検出方法（本明細書において、「本発明の方法」と称することがある。）を提供する。
【００２４】
試料中のmiRNAの濃度を測定するためには、試料からRNAを抽出して鋳型cDNAを調製し、これをテンプレートとして本発明の増幅プライマーを用いてPCRを行うことにより、試料中に含まれるhsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pからなる群より選択される１つ以上のmiRNAを増幅させる。
【００２５】
試料からRNAを抽出する方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、グアニジン−イソチオシアネートおよびフェノール・クロロホルム抽出を用いることができる。あるいは市販のRNA抽出試薬を用いてもよい。次に、得られた総RNAをサイズ分画して、miRNAを得ることができる。例えば、Trizol  LS  reagent  (Life  Technologies  Inc.)を用いて試料からRNAを抽出し、mirVana  miRNA  isolation  kit  (Life  Technologies  Inc.)のフィルターカートリッジを使用して、RNA画分を分取することができる。
【００２６】
RNAを鋳型としてcDNAを合成する方法も当該技術分野においてよく知られている。プライマーとしては市販のランダムプライマーまたはStem-loop  reverse  transcription  primersを用い、dNTPsの存在下で、逆転写酵素を用いてcDNAを合成することができる。
【００２７】
次に、このようにして調製したDNAまたはcDNAをテンプレートとして、本発明の増幅プライマーを用いて、PCRを行う。好ましくは、リアルタイムPCR増幅法を用いて、miRNAを定量する。特に好ましい態様においては、TaqMan（商品名）プローブを用いる定量的RT-PCRにより、血液に由来する試料中のmiRNAの濃度を測定することができる。
【００２８】
miRNAの濃度の測定においては、測定値のばらつきを補正するために、適当な内部標準を含めることが好ましい。内部標準としては、例えば、発現量に変動がないことが知られているmiRNA、snRNAやmRNAが挙げられ、具体的にはβ−アクチン、グリセルアルデヒドβ−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びリボソームタンパク質P1が挙げられる。また多くの（例えば200以上）のmiRNAを同時に測定する場合はこれら全ての発現量の中央値を内部標準に用いることができる。
【００２９】
本発明のmiRNAの濃度は、hsa-miR-708、hsa-miR-127-3pまたはhsa-miR-518d-3pの一部と同一または相補的な配列を有するプローブを固定化したマイクロアレイを用いて、ハイブリダイゼーション法により測定してもよい。さらに、次世代シークエンス法（next-generation  sequencing）を用いて、miRNAの濃度を直接測定してもよい。
【００３０】
このようにして得られた被験者の血液に由来する試料における本発明のmiRNAの濃度を、正常対照における本発明のmiRNAの濃度と比較して高値か否かを決定する。被験者の上記試料における本発明のmiRNAの濃度が正常対照と比較して高値である場合、当該被験者は子宮内膜症に罹患しているかまたは子宮内膜症の疑いがあると判定される。「正常対照」とは、子宮内膜症に罹患していないと診断されたヒトの血液に由来する試料をいう。あらかじめ複数の正常対照における各miRNAの濃度を測定して、対照群平均発現量を求めておくことが好ましい。
【００３１】
好ましい態様においては、本発明の方法は、被験者の血液に由来する試料中のmiRNAの濃度を用いて構築した予測モデル関数がカットオフ値以上か否かを決定する工程を含む。カットオフ値とは、病気を判定、診断することを目的として設定する値で、本発明におけるカットオフ値とは、子宮内膜症の疑いがあるかどうか知るために設定された、被験者の血液に由来する試料における本発明のmiRNAの濃度を用いて構築した予測モデル関数の値である。被験者の上記試料における本発明のmiRNAの濃度がカットオフ値以上である場合、被験者は子宮内膜症に罹患しているかまたは子宮内膜症の疑いがあると判定される。「該カットオフ値の設定方法については特に規定されないが、ロジスティック回帰分析を用いて０から１の間の値を取る予測モデル関数を構築し、所定の被験者群と対照群の集団についてのROC曲線分析を行うことにより求めることができる。
【００３２】
特定の態様においては、カットオフ値として次の値を用いることができる：
前記試料中のmiRNAとしてhas-miR-708、has-miR-127-3p及びhas-miR-518d-3pの3つのmiRNAを用いる場合、そのカットオフ値として、0.1以上0.9以下、好ましくは0.31以上0.68以下、より好ましくは0.40以上0.59以下の値を使用することができる。
前記試料中のmiRNAとしてhas-miR-708及びhas-miR-518d-3pの2つのmiRNAを用いる場合、そのカットオフ値として、0.1以上0.9以下、好ましくは0.34以上0.66以下、より好ましくは0.38以上0.54以下の値を使用することができる。
前記試料中のmiRNAとしてhas-miR-708を用いる場合、そのカットオフ値として、0.1以上0.9以下、好ましくは0.42以上0.60以下、より好ましくは0.46以上0.58以下の値を使用することができる。
前記試料中のmiRNAとしてhas-miR-127-3ｐを用いる場合、そのカットオフ値として、0.1以上0.9以下、好ましくは0.44以上0.55以下、より好ましくは0.49以上0.55以下の値を使用することができる。
前記試料中のmiRNAとしてhas-miR-518d-3ｐを用いる場合、そのカットオフ値として、0.1以上0.9以下、好ましくは0.44以上0.56以下、より好ましくは0.47以上0.53以下の値を使用することができる。
【００３３】
また、本発明の方法は、１人の被験者からある時点において１回だけ分離された血液に由来する試料における本発明のmiRNAの濃度を測定することにより行うこともできるが、本発明のmiRNAの濃度が子宮内膜症発症からの時間の経過と共に増大するので、１人の被験者から経時的に採取された試料における本発明のmiRNAの濃度を測定することによっても行うことができる。この場合、正常対照のmiRNAの濃度と比較することなく子宮内膜症の検出が可能になるので好ましい。この場合、試料の採取は、例えば、初診から2週間ないし完治までの期間、１週間に１回程度の間隔で行われる。すなわち、本発明の診断方法には、疾患の進行のモニタリング方法ならびに治療経過のモニタリング方法も包含される。
【００３４】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。本明細書において用いる場合、「・・・を含む（comprising）」との表現により表される態様は、「本質的に・・・からなる（essentially  consisting  of）」との表現により表される態様、ならびに「・・・からなる（consisting  of）」との表現により表される態様を包含する。
【００３５】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
（患者ならびに対照被験者からの血清試料）
経膣子宮鏡により診断された子宮内膜症患者（20例）および患者群に年齢をマッチさせた対照被験者（20例（うち9例は子宮内膜症以外の良性婦人科疾患患者、11例は健常人））の血清試料をCureline  Inc.  (South  San  Francisco,  米国カリフォルニア州)より購入した。血清試料は使用時まで-80℃にて保管した。各被験者の臨床情報を表１に記す。【００３７】
【表１】
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【００３８】
（血清試料からのRNA抽出）
Trizol  LS  reagentとmirVana  miRNA  isolation  kit  (ともにLife  Technologies  Inc.)を用いて血清試料からRNAを抽出した。具体的な手順は以下に記す。血清1mLに1mL滅菌水を添加した後、さらに6mLのTrizol  LS  reagentを添加して、混合した。混合した溶液を室温にて5分間静置した後、1.6mLのクロロホルムを添加して、手で激しく攪拌した。攪拌後の溶液を室温にて10分間静置したのち、遠心操作（4℃、12,000  x  g、10分間）により有機溶媒層と水層を分離した。得られた水層から4mLを分取し、分取した水層に5mLの99.5%エタノールを添加して均一に攪拌した。攪拌後の溶液をmirVana  miRNA  isolation  kitのフィルターカートリッジに添加して、該kitに添付されたプロトコールに従ってRNA画分を分取した。分取したRNA画分を凍結乾燥した後、10μLの滅菌水で再懸濁してRNA濃縮溶液を得た。得られたRNA濃縮溶液に含まれるmiRNA濃度は、該RNA濃縮溶液に含まれる10〜40塩基長相当のRNA濃度として、Agilent  2100  bioanalyzerとSmall  RNA  kit（Agilent  Technologies）を用いて測定した。【００３９】
（miRNA定量解析）
上記RNA濃縮溶液からMegaplex  RT  primers  (pool  A  or  B  v.2.0)ならびにTaqManTM  MicroRNA  Reverse  Transcription  Kitを用いてcDNAを含む溶液を得た後、得られた溶液に含まれるcDNAをMegaplex  PreAmp  primers  (pool  A  or  B  v.2.0)ならびにTaqManTM  PreAmp  Master  Mixを用いて増幅した。増幅されたcDNAとTaqMan  Universal  PCR  Master  Mix  (No  AmpErase  UNG)を混合して得られた試料をTaqManTM  Human  MicroRNA  Array  v2.0に装填し、7900HT  Fast  Real-Time  PCRシステムを用いて定量的PCR解析を行った。なお、本項における各操作は、製品に添付されたプロトコールに従って行った。【００４０】
（データ解析）
データ解析にはRQ  Manager  1.2  software  (Life  Technologies)を用いた。増幅曲線からのCT  (Threshold  cycle)値算出は、Liangらにより報告された手法に従い  (Liang,  Y.  et  al.,  BMC  Genomics,  8,  166-,  2007)、閾値を0.2に設定した。全40検体のうち80%以上で増幅が見られなかったmiRNAについては以降の解析から除外した。残った全miRNAのCT  値の中央値を各検体毎に算出し、それぞれのCT  値から該中央値を差し引いた値（ΔCT  値）を算出して検体間の発現差を標準化した。患者群と対照群の間で有意に発現量の異なるmiRNAを同定するためにWelch’s  t-testを実施した。ロジスティック回帰解析を用いて同定された複数のmiRNAの組み合わせによる診断モデルの構築と評価を行った。またROC（Receiver  operating  characteristic）解析を用いてmiRNA個々のあるいは組み合わせによる診断力を評価した。これら解析にはMATLAB  software  (The  Mathworks  Inc.)を用いた。【００４１】
（結果）
図１に、患者および対照の2群間における３種のmiRNAの発現分布を示す。縦軸は各miRNAの相対的発現量を、底を２とする対数として表している。各被験者の発現量を青点で、各群の発現量の中央値を赤線で表示した。箱の上限と下限はそれぞれ25および75パーセンタイルを、ヒゲの両端は外れ値を除いた上限値と下限値を、赤十字は外れ値を表す。Welch’s  t-testの結果得られたP値と両群の発現量（底を２とする対数）の平均値の差を各図のmiRNA名の下に表示した。【００４２】
20例の子宮内膜症患者群と20例の対照被験者群の血清中のmiRNA発現プロファイルを比較解析した結果、hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-518d-3pの３種のmiRNAの発現量が患者群において有意に増加していることが明らかとなった（図１）。これにより、血清におけるこれら３つのmiRNAの発現量を測定することにより、患者群を良好に検出できることが明らかとなった。【００４３】
表２には、これらmiRNAの配列を示すとともに、両群の発現量（底を２とする対数）の平均値から算出された、患者群における対照群に比したこれらmiRNAの発現量増加倍率(Fold  Change)を記す。【００４４】
【表２】
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【００４５】
ROC解析により、これらの上方制御される３つのmiRNAを子宮内膜症の検出に用いた場合の検出力を評価した。【００４６】
まずhsa-miR-708、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-518d-3pの３種のmiRNAをそれぞれ単独で用いた際のROC曲線の曲線下面積（AUC）により検出力を比較した。さらにROC曲線上で両群を最も良く判別できる点を同定し、その点に対応するカットオフ値(threshold)を、対照群平均発現量からの上方制御の倍率(Fold  Change)として表した。次に、そのカットオフ値を用いた際の有病正診率（感度：Sensitivity）と無病正診率（特異度：Specificity)を算出した。これらを図２に図示する。【００４７】
さらに、ロジスティック回帰分析を用いて複数のmiRNAを組み合わせた予測モデルを構築し、上記と同様にROC解析によってモデルの検出力を評価した。図３に、hsa-miR-708とhsa-miR-518d-3p（左）またはhsa-miR-708、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-518d-3pの全て（右）から構築した予測モデルを用いた際のROC曲線を示す。その曲線下面積（AUC）により検出力を評価した。【００４８】
その結果、２つもしくは３つのmiRNAを組み合わせたモデルを利用した場合、１つの場合（図２）に比べ、ROC曲線の曲線下面積が大きくなっており、より高い精度で患者の検出が可能となることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は子宮内膜症の診断に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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