(57)【要約】  本発明は、食品、飼料、化粧品、医薬品、生体試料などに含まれるγ−オリザノールを簡便かつ高精度で定量する方法を提供することを課題とし、以下の（１）〜（３）の工程を含む方法によって試料中のγ−オリザノールを定量するための回帰式を得、得られた回帰式と、当該回帰式の作成に使用した波長領域における試料の近赤外光スペクトルデータとを用いて試料中のγ−オリザノールを定量する。（１）試料の近赤外光スペクトルを測定する工程（２）当該試料のγ−オリザノール含量を定量する工程（３）近赤外光スペクトルを測定した波長範囲の全部または一部の波長領域で得られたスペクトルデータと、定量したγ−オリザノール含量とを多変量解析法により解析し、γ−オリザノール含量と関係する因子を決定する工程【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のγ−オリザノールを定量するための回帰式を得る方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする方法。
（１）試料の近赤外光スペクトルを測定する工程
（２）当該試料のγ−オリザノール含量を定量する工程
（３）近赤外光スペクトルを測定した波長範囲の全部または一部の波長領域で得られたスペクトルデータと、定量したγ−オリザノール含量とを多変量解析法により解析し、γ−オリザノール含量と関係する因子を決定する工程
【請求項２】
試料が、γ−オリザノールを含む食品、飼料、化粧品もしくは医薬品またはこれらの原料もしくは素材であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料が、穀物またはその一部であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
穀物が、玄米であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
試料が、油脂またはその加工品またはこれらの原料もしくは素材であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
油脂が、米油または米油を含有するものであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
試料が、生体由来であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（１）の前に、試料中のγ−オリザノールを溶媒で抽出する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
溶媒が、ヘキサンまたはクロロホルムであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
近赤外光スペクトルが、拡散反射光または透過光のスペクトルであることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記（３）の工程における波長領域が、８００〜２５００ｎｍまたはその一部であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記（３）の工程における波長領域が、１４４０±１０ｎｍ、１９３８±１０ｎｍ、２０３０±１０ｎｍ、２１０５±１０ｎｍの少なくとも１つの領域を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法により得られた回帰式と、当該回帰式の作成に使用した波長領域における被験試料の近赤外光スペクトルデータとを用いることを特徴とするγ−オリザノールの定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、近赤外光分光法を用いたγ−オリザノールの定量方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
米糠から抽出して得られる米油（米糠油）は、栄養・生理機能に富み、味質、食感にも優れた食用油として注目され、利用が拡大している。米油に含まれる主要な生理機能成分としては、γ−オリザノール、ビタミンＥ、植物ステロールなどがあるが、中でもγ−オリザノールは、米油に特異的に存在し、様々な保健機能を持つことから注目を集めている。γ−オリザノール（γ−Ｏｒｙｚａｎｏｌ）は１９５４年に米油から初めて単離された化合物であり、フェルラ酸とトリテルペンアルコールもしくは植物ステロールのエステルの総称である。米油が他の植物油と比較して保存安定性に優れるのは、このγ−オリザノールが豊富に含まれていることが一因である。γ−オリザノールは、コーン、大麦などにも存在することが知られているが、米に比べればその含量は僅かである。【０００３】
γ−オリザノールは抗酸化作用や紫外線保護効果を有することから、抗酸化剤や紫外線吸収剤として利用されている。さらに、高脂血症、更年期障害、過敏性腸症候群、心身症における身体症候ならびに不安、緊張、抑鬱等の改善を目的とした医薬品あるいはその原料として用いられている。また、抗酸化剤として食品添加物に認可されている。【０００４】
γ−オリザノールは体内で消化されて加水分解されるため、その生理機能の多くはその構成成分であるフェルラ酸、トリテルペンアルコール、植物ステロールの機能であると考えられている。しかし最近では、γ−オリザノールとしての形態で転写因子ＮＦ−κＢの活性化阻害作用を介した抗炎症作用、糖尿病や潰瘍性大腸炎などの予防・改善効果、ＩｇＥ捕捉作用によるＩ型アレルギーの低減作用、酸化ストレスの低減作用によるエタノール性肝炎予防・改善作用、アルツハイマー病治療効果を持つインスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）の増加作用などの保健機能食品としての有用な機能が続々と報告されている。これらの点から、γ−オリザノールの含量を正確に定量することは、玄米、米糠、米油やこれらを含む関連製品の品質を評価する上で極めて重要な技術である。【０００５】
γ−オリザノールの定量法としては、γ−オリザノールが波長３２０ｎｍ付近に強い吸収極大を持つことから、試料油脂をｎ−ヘプタン等の溶媒に溶解させ、分光光度計により定量を行うのが一般的である。本法は迅速性に優れ、非常に簡便な手法であるが、ＵＶ検出には化合物の選択性が低いため、試料組成によっては正確な定量ができないという欠点がある。γ−オリザノールのより精密な分析法としては高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法が知られており、中でも逆相クロマトグラフィーを用いた例が多く報告されている（非特許文献１、２）。しかし、これらのＨＰＬＣ法は、試料毎の条件検討が必要であり、操作が煩雑で迅速性に欠けるという欠点がある。【０００６】
近赤外分光法は、物質分子による近赤外光（一般的に波長域８００〜２５００ｎｍを指す）の吸収に基づく分光法であり、食品の分野では果実、野菜、魚類等の成分測定や加工食品の品質管理などに用いられている。近赤外分光法の利点は特に、試料を損傷しないことであり、あるがままの状態で分析ができるため、非常に迅速に多成分の同時定量が可能であるということがある。近赤外分光法は、特に青果物の分析方法として一般的なものである。青果物の非破壊分析法としては糖類の定量方法（例えば特許文献１）、水分の定量方法（例えば特許文献２）、硝酸イオン定量方法（例えば特許文献３）などが報告されている。近赤外分光法は穀類の分析でも実用化が進んでおり、米の澱粉、タンパク質、水分、灰分、アミノ酸、食味値を同時分析した例が報告されている（非特許文献３）。また、著者らは近赤外分光法を用いた玄米の水分と油分（トリアシルグリセロール）の非破壊分析法を開発し特許出願している（特願２０１１−２１１４５５）。近赤外分光法は臨床試験用途でも使用されており、血液中のコレステロール、血糖値、トリアシルグリセロール、アディポネクチンなどを同時分析した例が報告されている（特許文献４）。しかし、γ−オリザノールを非破壊分析法により定量したことはこれまでに報告されておらず、近赤外分光法を用いた分析例も報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−０９８０３３号公報
【特許文献２】特開２００４−０２０４７０号公報
【特許文献３】特開２０１０−２１０３５５号公報
【特許文献４】特開２００７−２８５９２２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Azrina, A. et al., Extraction and Determination of Oryzanol in Rice Bran of Mixed Herbarium UKMB; AZ 6807:MR 185, AZ 6808: MR 211, AZ6809: MR 29, ASEAN Food Journal, 15（1）, 89-96（2008）
【非特許文献２】A.G. Gopala Krishna et al., Effect of Refining of Crude Rice Bran Oil on the Retention of Oryzanol in the Refined Oil, JAOCS, 78(2),127-131 (2001)
【非特許文献３】近藤みゆき、「近赤外分光法による食品の化学分析」名古屋文理大学紀要、２００７、第７号、ｐ２３−２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、食品、飼料、化粧品、医薬品、生体試料などに含まれるγ−オリザノールを簡便かつ高精度で定量する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］試料中のγ−オリザノールを定量するための回帰式を得る方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする方法。
（１）試料の近赤外光スペクトルを測定する工程
（２）当該試料のγ−オリザノール含量を定量する工程
（３）近赤外光スペクトルを測定した波長範囲の全部または一部の波長領域で得られたスペクトルデータと、定量したγ−オリザノール含量とを多変量解析法により解析し、γ−オリザノール含量と関係する因子を決定する工程
［２］試料が、γ−オリザノールを含む食品、飼料、化粧品もしくは医薬品またはこれらの原料もしくは素材であることを特徴とする前記［１］に記載の方法。
［３］試料が、穀物またはその一部であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の方法。
［４］穀物が、玄米であることを特徴とする前記［３］に記載の方法。
［５］試料が、油脂またはその加工品またはこれらの原料もしくは素材であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の方法。
［６］油脂が米油または米油を含有するものであることを特徴とする前記［５］に記載の方法。
［７］試料が、生体由来であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の方法。
［８］前記工程（１）の前に、試料中のγ−オリザノールを溶媒で抽出する工程をさらに含むことを特徴とする前記［１］に記載の方法。
［９］溶媒が、ヘキサンまたはクロロホルムであることを特徴とする前記［８］に記載の方法。
［１０］近赤外光スペクトルが、拡散反射光または透過光のスペクトルであることを特徴とする前記［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］前記（３）の工程における波長領域が、８００〜２５００ｎｍまたはその一部であることを特徴とする前記［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］前記（３）の工程における波長領域が、１４４０±１０ｎｍ、１９３８±１０ｎｍ、２０３０±１０ｎｍ、２１０５±１０ｎｍの少なくとも１つの領域を含むことを特徴とする前記［１１］に記載の方法。
［１３］前記［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法により得られた回帰式と、当該回帰式の作成に使用した波長領域における被験試料の近赤外光スペクトルデータとを用いることを特徴とするγ−オリザノールの定量方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、食品、飼料、化粧品、医薬品、生体試料などに含まれるγ−オリザノールを簡便かつ高精度で定量する方法を提供することができる。特に本発明は、油脂中のγ−オリザノール含量や玄米一粒中のγ−オリザノール含量を非破壊的かつ迅速に定量できる点で、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヘキサン溶液中のγ−オリザノール含量について、ＮＩＲ予測値（定量値）と化学分析値（実測値）の相関を示す図である。
【図２】米油中のγ−オリザノール含量について、ＮＩＲ予測値（定量値）と化学分析値（実測値）の相関を示す図である。
【図３】γ−オリザノール標品（９８％、築野食品）をＨＰＬＣで分析し、紫外可視分光検出器（３２０ｎｍ）で検出して得られたＵＶクロマトグラムを示す図である。
【図４】玄米一粒中のγ−オリザノール含量について、ＮＩＲ予測値（定量値）と化学分析値（実測値）の相関を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
〔試料中のγ−オリザノールを定量するための回帰式を得る方法〕
本発明は、試料中のγ−オリザノールを定量するための回帰式を得る方法（以下、「本発明の回帰式を得る方法」という。）を提供する。本発明の回帰式を得る方法は、以下の（１）〜（３）の工程を含むものであればよい。
（１）回帰式を得るための試料の近赤外光（以下「ＮＩＲ」と記す。）スペクトルを測定する工程
（２）回帰式を得るための試料のγ−オリザノール含量を定量する工程
（３）ＮＩＲスペクトルを測定した波長範囲の全部または一部の波長領域で得られたスペクトルデータと、γ−オリザノール含量の実測値とを多変量解析法により解析し、γ−オリザノール含量と関係する因子を決定する工程
本発明の回帰式を得る方法は、（１）〜（３）以外の工程を含んでいてもよく、その内容は問わない。
【００１４】
工程（１）では、試料のＮＩＲスペクトルを測定する。ＮＩＲスペクトルの測定方法は特に限定されないが、拡散反射法または透過法が好ましく、これらを試料によって使い分けることがより好ましい。試料が固体であれば主に拡散反射法を用い、試料が液体であれば主に透過法を用いて測定することが好ましが、液体の場合でも着色が強く、光を透過しにくい試料の場合は拡散反射光を測定することが好ましい。試料が溶液の場合は、適宜濃度を調整して透過光を測定することが好ましい。測定セルは特に限定されないが、測定試料、測定法に応じて使い分けることが好ましい。ＮＩＲスペクトルの測定は、オフライン（off line）分析だけではなく、アットライン（at line）、オンライン（on line）、インライン（in line）、無侵襲（non-invasive）分析などの形で実施してもよい。ＮＩＲスペクトルの測定は、試料を採取し分析室の近赤外分析計で測定することもできるが、生産現場や倉庫に近赤外分析計を持ち込みその場で測定することもできる。また製造ラインに近赤外分析計を組み込むことにより連続的に試料のＮＩＲスペクトルを測定することも可能である。
【００１５】
ＮＩＲスペクトルの測定には、市販の近赤外分光分析計を用いることができるが、透過光と拡散反射光を測定できるものが好ましい。また、試料に応じて固体測定モジュール、液体測定モジュール、光ファイバーモジュール、固体透過測定モジュールを備えたものが利用できる。また、測定セルの温度調節機能を備えたものがより好ましい。具体的にはＭＰＡ（ブルカー・オプティクス）、ＴＡＮＧＯ（ブルカー・オプティクス）、ＮＩＲＦｌｅｘ Ｎ−５００（ビュッヒ）、ＮＩＲＦｌｅｘ Ｎ−４００（ビュッヒ）、ＮＩＲＬａｂ Ｎ−２００（ビュッヒ）、ＮＩＲＭａｓｔｅｒ（ビュッヒ）、ＮＩＲＳ６５００（ニレコ）、ＸＤＳ・ＮＩＲシリーズ（ニレコ）、ＳｐｅｃｔｒａＳｔａｒ Ｓｅｒｉｅｓ（ＢＬＴＥＣ）、光品質チェッカーＨＯＳ−Ｆシリーズ（ＳＡＩＫＡ）、光品質チェッカーポータブルＨＱＣ−Ｆ３０（ＳＡＩＫＡ）、ＩＲＡｆｆｉｎｉｔｙ−１（島津製作所）、ＬＡＭＢＤＡ７５０／９５０／１０５０およびＦｒｏｎｔｉｅｒ ＮＩＲ（パーキンエルマー）、ＦＴ−ＩＲ４０００シリーズおよびＦＴ−ＩＲ６０００シリーズ（日本分光）、ＦＴ−ＮＩＲ ＭＢ３６００（ＡＢＢ ＢＯＭＥＭ）などが挙げられ、なかでもＭＰＡ、ＴＡＮＧＯが好ましく、ＭＰＡが特に好ましい。得られるスペクトルは、フーリエ変換スペクトルであることが好ましい。
【００１６】
本発明で定量するγ−オリザノールは、フェルラ酸とトリテルペンアルコールのエステル体またはフェルラ酸と植物ステロールのエステル体を指す。トリテルペンアルコールとしてはシクロアルテノール、２４−メチレンシクロアルタノール、シクロブラノール、シクロアルタノール、シクロサドール、シクロラウデノール、ブチロスペリモール、パルケオール、イソシクロサドール等が挙げられる。植物ステロールとしてはα−シトステロール、β−シトステロール、スティグマステロール、カンペステロール、α−シトスタノール、β−シトスタノール、スティグマスタノール、カンペスタノール、ブラシカステロール、フコステロール、イソフコステロール、スピナステロール、アベナステロール等が挙げられる。γ−オリザノールの分子種組成については特に限定されず、フェルラ酸と上記のトリテルペンアルコールまたは植物ステロールのエステル体がどのような比率で存在していてもかまわない。
【００１７】
試料は特に限定されないが、γ−オリザノールを含有している可能性のあるものが好ましい。具体的には、例えば、食品、飼料、化粧品、医薬品、生体試料などが挙げられる。なかでも、原料や素材としてγ−オリザノールを含有する植物またはその一部が使用されているもの、または食品添加物や抗酸化剤としてγ−オリザノールが添加されているものがより好ましい。γ−オリザノールを含有する植物としては、例えば、イネ、大麦、トウモロコシなどが挙げられる。植物の一部としては、これらの種子、すなわち穀物が挙げられる。穀物は、種子そのもの、種子の一部、またはこれらを粉砕した粉など、どのような形態でもよい。植物としてはイネが好ましく、イネの種子としては籾殻を除去した玄米、玄米から得られた米糠、精白途中の玄米、精白後の白米、加工糠、脱脂糠、米糠の搾油残渣、脱脂途中の米糠、およびこれらの粉砕物などが挙げられる。
【００１８】
γ−オリザノールを含有する植物またはその一部を原料や素材として含む食品としては、例えば、菓子類（米菓、蒸菓子、ロックケーキ、クレープ、餅、ホットケーキ、ゼリー、ガム、キャンディー、グミ、マフィン、蒸しまんじゅう、カップケーキ、焼き菓子、鯛焼き、団子、クッキー、カステラ、マドレーヌ、ワッフルなど）、パン類（パン、スコーン、ナンなど）、麺類（うどん、ラーメン、そば、パスタ、マカロニなど）、練り製品（かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、ソーセージなど）、料理全般（白飯、おにぎり、おかゆ、豆腐、シリアル、ニョッキスープ、お好み焼き、カレー、シチュー、グラタン、天ぷら衣、パスタスープ、だんご汁、ピザ、ハンバーグ、チャーハン、スープの素など）、粉類（米粉、玄米粉、コーンスターチ、パン粉、片栗粉、天ぷら粉など）、ドリンク類（茶、コーヒー、ココア、清涼飲料、果実飲料、乳性飲料、酒類、栄養ドリンクなど）、調味料（醤油、ソース、料理酒、みりん、だし類、味噌など）、錠菓、サプリメント類などが挙げられる。
【００１９】
植物に比べるとγ−オリザノール含量は低いが、動物由来の原料または素材を使用した食品等も試料として好ましい。特にγ−オリザノールを含む飼料で飼育された家畜、養殖魚などを原料または素材として使用した食品、食品添加物や抗酸化剤としてγ-オリザノールを添加された食品などが好適である。動物由来の原料または素材を使用した食品等としては、例えば、牛肉、牛脂、牛乳、豚肉、ラード、馬肉、羊肉、鶏肉、鶏卵、レバー、魚肉、魚油、魚卵、魚粉およびこれらの加工品（例えば、卵黄、卵白、とき卵、ゆで卵、卵焼き、メレンゲ、粉ミルク、脱脂粉乳、プリン、ヨーグルトなど）が挙げられる。
【００２０】
このような原料や素材を含む飼料としては、例えば、ウシ、ウマ、ブタ等の家畜用飼料、ニワトリ等の家禽用飼料、イヌ、ネコ等のペット用飼料、養殖魚用飼料などが挙げられる。
このような原料や素材を含む化粧品としては、例えば、イネ、大麦、トウモロコシなどのγ−オリザノールを含有する植物のエキスを配合したクリーム、ローション、ジェル、ミスト、マスク、パック、シャンプー、リンス、入浴剤等が挙げられる。
このような原料や素材を含む医薬品としては、例えば、イネ、大麦、トウモロコシなどのγ−オリザノールを含有する植物由来の成分を含む賦形剤を用いた錠剤、粉薬、カプセル剤等が挙げられる。また、γ−オリザノールを有効成分として含有するあらゆる剤形の医薬品、例えば高脂血症治療剤、更年期障害治療剤、皮膚外用剤、育毛剤、歯磨き剤、口中薬、点眼薬、点鼻薬などが挙げられる。
【００２１】
試料が食品、飼料、化粧品、医薬品、生体試料などまたはこれらの原料や素材であって、非破壊分析を目的とする場合、試料をそのまま工程（１）のＮＩＲスペクトル測定に供してもよいが、測定精度を向上させるために試料の調製を行うことが好ましい。例えば、試料が固体の場合、異物が除去されていることが好ましい。また、支障が無ければ乾燥処理を行って水分を除くことが好ましい。乾燥処理法は特に限定されないが、試料の損壊や変質を避けるため、凍結乾燥法や真空乾燥法などを用いることが好ましい。固体試料はこれらの前処理を行った上でさらにその大きさや形状によって適正な測定セルを使い分けることが好ましい。例えば玄米を試料とする場合には穀物用のセルなどに数粒の玄米を詰め込んで測定してもよいが、一粒で測定する場合は一粒用のセルを用いることが好ましい。
【００２２】
非破壊分析を目的としない場合には、試料の均質化のために粉砕処理を施すことが好ましく、さらに乾燥処理を行って水分を除去することが好ましい。この場合の乾燥処理法は特に限定されないが、凍結乾燥法、真空乾燥法など試料の変性を避けられる方法が好ましい。粉砕処理法は特に限定されないが、例えば試料が固体の場合で試料が大きすぎてそのまま破砕できない場合は、適切な大きさに切断、破断してから粉砕処理を施すのがよく、試料が軟質の場合はまず凍結乾燥処理や真空乾燥処理を行ってから破砕するのがよい。例えば、試料が液体の場合、沈殿や異物が除去されていることが好ましい。非破壊分析を目的としない場合や、非破壊分析を目的とする場合でも特に支障が無い場合は、攪拌処理による均質化や乾燥処理による水分除去を行うことが好ましい。乾燥処理方法は特に限定されず、凍結乾燥法や真空乾燥法などを用いることができる。
【００２３】
試料が固体、液体に関わらず主成分がタンパク質である場合で非破壊分析を目的としない場合には、タンパク質の除去処理を行うことが好ましい。除タンパク処理の方法は特に限定されず、酸や有機溶媒の添加による沈殿法、限外濾過法、透析法、カラム法などが挙げられる。試料が固体の場合は試料を破断・粉砕した上で適当な溶媒に懸濁し、除タンパク処理を行うことが好ましい。試料中のγ−オリザノール濃度は、少なくとも１０ｐｐｍ以上であることが好ましい。一例として玄米を直接分析する際には、５０ｐｐｍ以上が好ましく、１００ｐｐｍ以上がさらに好ましい。
【００２４】
また、油脂またはその加工品も試料として好適に用いることができる。油脂またはその加工品の原料、組成、製法等については特に限定されないが、γ−オリザノールを含むものが好ましい。γ−オリザノールを含む油脂としては、例えば、米油、米胚芽油、γ−オリザノール高含有油、コーン油、大麦油などが挙げられる。また、これらと他の油脂とのブレンド油もγ−オリザノールを含む油脂として好適である。他の油脂としては、例えば、ごま油、サフラワー油、大豆油、菜種油、ひまわり油、オリーブ油、グレープシードオイル、ヤシ油、パーム油、パーム核油、綿実油、ヤシ油、アマニ油、ひまし油、ハトムギ油、小麦胚芽油、シソ油、エゴマ油、サチャインチ油、クルミ油、キウイ種子油、サルビア種子油、マカデミアナッツ油、ヘーゼルナッツ油、カボチャ種子油、椿油、茶実油、ボラージ油、カカオ脂、サル脂、シア脂、藻油などの植物油脂、または牛脂、ラード、魚油などの動物油、あるいはそれらのエステル交換油、水素添加油、分別油等の油脂類などが挙げられる。これらの中でも、米油または米油を含む油脂が好ましい。油脂の純度は特に限定されず、精製された油脂、精製前の原油、精製途中の油脂のいずれであってもよい。精製された油脂は使用前のものでもよく、使用後のもの（廃油）でもよい。また、精油過程で生じた脱臭スカム、ソープストック、遊離脂肪酸、ワックス（ロウ）、ガム質などの副産物も試料として好適に用いることができる。
【００２５】
油脂の加工品としては、例えば、天ぷら、天かす、唐揚げ、フライ、マーガリン、バター、チーズ、フライドポテト、油揚げ、厚揚げ、生クリーム、コーヒーミルク（粉）、ホイップクリーム、ドレッシング、マヨネーズ、タルタルソース、オイスターソース、ホワイトソース、ポテトチップス、チョコレート、ビスケット、コーンスナック、ポップコーン、クラッカー、揚げせんべい、米菓、ショートケーキ、エクレア、シュークリーム、ウエハース、ババロア、ドーナッツ、かりんとう、アイスクリームなどの食品が挙げられる。また、例えば、石鹸、洗剤、ファンデーション、クレンジングオイル、アロマオイル、リップクリーム、マニキュアなどの油脂を主体とする化粧品などが挙げられる。
【００２６】
油脂または主成分が油脂である油脂加工品の場合、試料をそのまま工程（１）のＮＩＲスペクトル測定に供してもよいが、測定精度を向上させるために試料の調製を行うことが好ましい。例えば試料が固体の油脂または油脂加工品の場合、異物が除去されており、均質な状態であることが好ましい。固体のまま拡散反射法によりＮＩＲスペクトルを測定しても構わないが、加温による溶解が可能であれば加温して液体状態とし、透過法によりＮＩＲスペクトルを測定することが好ましい。例えば試料が液体の油脂または油脂加工品の場合、攪拌処理を行って均質化することが好ましく、沈殿や異物は除去されていることが好ましい。試料の粘度が高い場合には試料を入れた測定セルを加温して試料粘度を下げることが好ましい。試料が不透明な場合であって加温により透明化できる場合には測定セルを加温して透明化した状態で測定することが好ましい。これらの油脂に含まれるγ−オリザノール濃度は１０ｐｐｍ以上が好ましく、１００ｐｐｍ以上であることがより好ましく、１０００ｐｐｍ以上であることがさらに好ましい。主成分が油脂以外の油脂加工品の場合については、上述の食品、飼料、化粧品、医薬品などまたはこれらの原料や素材である場合と同様である。
【００２７】
本発明により得られる回帰式は、臨床試験やγ−オリザノールの代謝研究などを目的とした生体由来の試料中のγ−オリザノールの定量にも利用することができる。生体由来の試料は特に限定されないが、例えば、動物の生体構成成分が好適である。動物由来の試料としては、例えばヒトや実験動物、家畜、養殖魚などの血液、血清、血漿、組織液、リンパ液、脳脊髄液、母乳、膿、粘液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水、精液等の体液類、皮膚、粘膜、各種臓器、骨等の組織、毛髪、体毛などを挙げることができる。
【００２８】
試料が生体由来の試料であって、非破壊分析を目的とする場合は、試料をそのまま工程（１）のＮＩＲスペクトル測定に供してもよいが、測定精度を向上させるために試料の調製を行うことが好ましい。試料が固体の場合、異物を取り除くことが好ましく、試料が液体の場合、異物や沈殿を除き攪拌処理を行って均質化することが好ましい。
非破壊分析を目的としない場合は、粉砕や攪拌による均一化や除タンパク処理を行うことが好ましい。しかし試料中に含まれるγ−オリザノールは非常に低濃度であることが予測されるため、直接分析では十分な測定感度が得られない可能性もある。よって、安定した回収率が得られることが条件であるが、試料を直接分析するよりも試料を濃縮したり、溶媒を用いて抽出した粗脂質を測定試料として調製するのがより好ましい。抽出法については特に限定されないが、抽出効率の向上のため、除タンパク処理を先に行うことが好ましい。除タンパク処理の方法は特に限定されず、上述の食品、飼料、化粧品、医薬品などまたはこれらの原料や素材である場合と同様である。試料を直接分析する場合、測定試料中のγ−オリザノール濃度については、１０ｐｐｍ以上が好ましい。
【００２９】
試料中のγ−オリザノールを溶媒で抽出し、得られた抽出物を工程（１）または工程（２）に供してもよい。このような抽出物を測定に供する場合には、本発明の回帰式を得る方法の工程（１）の前に、試料中のγ−オリザノールを溶媒で抽出する工程を有することが好ましい。抽出に用いる溶媒は、γ−オリザノールが溶解可能な溶媒であることが好ましい。γ−オリザノールが溶解可能な溶媒としては、例えば、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、メチルエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、２-メトキシエタノール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などのエーテル類、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール（２−プロパノール）、ブタノール、t-ブタノール、グリセリン、エチレングリコールなどの炭素数３〜１１のアルコール類、ペンタン、ヘキサンなどの炭素数５〜１７のアルカン類、ペンテン、ヘキセンなどの炭素数５〜２０のアルケン類、アセトン、アセトニトリル、クロロホルム、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、酢酸エチル、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリフルオロ酢酸、ベンゼン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、石油エーテル、トルエン、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、四塩化炭素、ｔ−ブチルアセトアセタートなどが挙げられる。これらの溶媒は単独で用いてもよいし、均質に混合できるならば任意の割合で混合したものを用いてもよい。抽出法は特に限定されず、公知の脂質抽出法を用いることができる。例えば、ソックスレー抽出法、クロロホルム−メタノール抽出法、酸分解法などが挙げられ、中でもソックスレー抽出法が抽出効率の点で好ましい。試料をそのまま溶媒抽出しても構わないが、試料が固体の場合は異物を除去することが好ましく、また、試料の均質化と抽出効率の向上のために粉砕処理を行うことが好ましい。試料が液体の場合は異物や沈殿物を除去することが好ましく、攪拌処理を行って均質化することが好ましい。水分を除去する場合は、凍結乾燥法や真空乾燥法などを用いることが好ましい。
【００３０】
抽出物は溶媒が除去された粗脂質の状態でも、溶媒に溶けた抽出液の状態のどちらでも構わないが、前者の場合には油脂試料と同様の方法で試料を調製することが好ましい。後者の場合には溶媒の除去処理を行って油脂試料と同様の調製を行ってもよいし、抽出液をそのまま、あるいは必要に応じて溶媒交換、希釈等を行った後にＮＩＲスペクトル測定に供してもよい。抽出液の場合、その溶解溶媒は上述の抽出溶媒と同様のものを用いることができるが、精度の高い測定のためにはヘキサンまたはクロロホルムを用いることが好ましく、ヘキサンを用いることがより好ましい。抽出溶媒がこれらの溶媒でない場合にはヘキサンまたはクロロホルムに溶媒交換を行うことが好ましい。溶媒の除去方法は特に限定されないが、測定試料の変性を避けるために低温・真空条件下で行うことが好ましい。具体的には上述の乾燥（水分除去）法と同様の方法を好適に用いることができる。測定試料中のγ−オリザノール濃度は、試料が粗脂質である場合は上述の油脂試料と同様であるが、溶液である場合は１０ｐｐｍ以上が好ましく、５０ｐｐｍ以上がより好ましい。
【００３１】
回帰式を得るための試料は、γ−オリザノール含量の定量に供する被験試料と類似の形態であって、γ−オリザノール含量の異なるものを用意することが好ましい。こうした試料の調製法は特に限定されないが、例えば試料が玄米などの穀物である場合、回帰式を得るための試料はγ−オリザノール含量の異なる種々の品種・系統を用いる手法が挙げられる。試料が食品や油脂加工品などの固体である場合、原料や素材としてγ−オリザノールを含有する植物またはその一部を混ぜ込み濃度の調節を行う手法が考えられる。試料が油脂などの均質な液体である場合、回帰式を得るための試料はγ−オリザノール含量の高いものと低いものを任意の割合で混合して濃度を調節してもよい。試料が溶液である場合、そのまま試料とすることができる。また、溶媒に溶かすこともできるが溶媒に溶かす前の形態については特に限定されない。回帰式を得るための試料は、γ−オリザノールの標品を溶媒に溶かした溶液を用いてもよいが、被験試料に近い組成を持つ溶液を調製して用いることがより好ましい。また、回帰式を得るための溶液試料は、γ−オリザノール濃度が既知の溶液が１つあれば、この溶液にγ−オリザノールを添加する、またはこの溶液を溶媒で希釈することによって、γ−オリザノール濃度を必要に応じて調製することができる。回帰式を得るための試料は、γ−オリザノールの最小濃度と最大濃度の試料の間に被験試料が全て入るように調製することが好ましい。回帰式を得るための試料数は多いほどよく、特に玄米などの固体試料の場合、十分な予測精度を得るためには３０試料以上が好ましく、５０試料以上であることがより好ましい。
【００３２】
工程（２）では、工程（１）でＮＩＲスペクトルを測定した試料のγ−オリザノール含量を測定する。工程（１）に供した試料単位でγ−オリザノール含量を測定すればよい。試料中のγ−オリザノール含量の定量方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、分光光度計を用いた吸光度法やポリフェノール類の検出法であるＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法により、γ−オリザノールを簡便に定量することができる。また、より高い分析精度を求める場合はガスクロマトグラフィー（ＧＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などを用いた精密測定を行うことができる。検量線の予測精度を高めるためには精密測定を行うことが好ましく、精度の点でＨＰＬＣを用いるのがより好ましい。試料が固体の場合には、例えば公知の方法で粗脂質を抽出し、必要に応じて溶媒置換、濃縮、希釈、精製等を行って得られた溶液を定量に供することができる。試料が液体の場合には、そのまま定量に供してもよく、必要に応じて溶媒置換、濃縮、希釈、精製等を行ってもよい。
【００３３】
ＨＰＬＣを用いる場合、その手法は特に限定されないが、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィーなどが好ましく、逆相クロマトグラフィーがより好ましい。逆相クロマトグラフィーで用いられる移動相は、γ−オリザノールを溶解でき、かつ逆相クロマトグラフィーに適した溶媒が好ましい。好適な溶媒として、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノールなど等の低級アルコール類、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などのエーテル類、アセトニトリル、酢酸、ギ酸、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサン、酢酸エチル、ジオキサン、アセトン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、水、トリフルオロ酢酸、これらの均質な混合液などが挙げられる。移動相に用いる有機溶媒は、ＨＰＬＣグレード以上であることが好ましい。逆相クロマトグラフィーに用いられるカラムについては、ポリマーベース、シリカベース、ハイブリッドのカラムが挙げられ、この内シリカベースのカラムが好ましい。逆相カラムとしては固定相の異なるＣ３０、Ｃ１８（ＯＤＳ）、Ｃ８、Ｃ４、ＴＭＳ、Ｐｈ、ＰＦＰ、ＣＮカラムなどが挙げられ、この内Ｃ１８（ＯＤＳ）カラムが特に好ましい。カラムの形状は特に限定されない。カラム充填剤の粒径は特に限定されないが、平均粒子径が５μｍ以下であることが好ましく、３μｍ以下であることがより好ましい。カラム温度は、通常約１０〜６０℃の範囲で用いられ、約２０〜５０℃の範囲が好ましく、約３０〜５０℃の範囲がより好ましい。流速はカラムの性能上問題ない範囲であれば特に限定されない。検出器はγ−オリザノールを検出できるものであれば特に限定されない。具体的には、蛍光（ＦＬ）検出器、紫外可視分光（ＵＶ-Ｖｉｓ）検出器、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器、蒸発光散乱（ＥＬＳＤ）検出器、質量（ＭＳ）検出器、電気化学（ＥＣ）検出器、示差屈折率（ＲＩ）検出器、電気電導度（ＣＤ）検出器、コロナＣＡＤ検出器などが挙げられる。中でもγ−オリザノールの特異性の点で、紫外可視分光検出器、フォトダイオードアレイ検出器、質量検出器、蛍光検出器を用いることが好ましい。
【００３４】
γ−オリザノールは複数の分子種から構成されている。γ−オリザノールのピークは分離条件によっては一本になることもあれば、複数のピークに分かれることもある。この分離条件は特に限定されないが、分子種ごとにピークが分離している条件が、同定が容易である点で好ましい。γ−オリザノールの定量方法は分子種ごとの標品が入手可能であれば分子種ごとに定量し、その定量値を合計してγ−オリザノール総量としてもよいが、分子種ごとの標品が入手できない場合、混合物を標品として主要なピークの面積値または高さの合計を用いて定量してもよい。定量にはピークの高さを用いても面積を用いてもよいが、分子種ごとのピーク分離が得られない場合はピーク面積を用いた方がよい。標品はγ−オリザノールとしての純度が明らかであればその組成は特に限定されず、分子種の混合物でも単一の分子種でも構わない。γ−オリザノール（混合物）標品としては「ＴＳＵＮＯ γ−オリザノール」（築野食品）、「γ−オリザノール」（オリザ油化）等が挙げられ、単一分子種の標品としては「フェルラ酸シクロアルテニル」（和光純薬）等が挙げられる。
【００３５】
工程（３）では、ＮＩＲスペクトルを測定した波長範囲の全部または一部の波長領域で得られたスペクトルデータと、定量したγ−オリザノール含量とを多変量解析法により解析し、γ−オリザノール含量と関係する因子を決定する。ＮＩＲスペクトルを測定した波長範囲の一部とはＮＩＲスペクトルを測定した波長範囲に含まれる任意の部分領域である。ＮＩＲスペクトルを測定した波長範囲の一部は特に限定されないが、８００〜２５００ｎｍまたはその一部であることが好ましく、１３３３〜２１７５ｎｍまたはその一部であることがより好ましい。また、γ−オリザノールに関連する１４４０±１０ｎｍ、１９３８±１０ｎｍ、２０３０±１０ｎｍ、２１０５±１０ｎｍの好ましくは１つ以上、より好ましくは２つ以上の領域を含むものが好ましい。また、この１つの波長領域は最大波長と最小波長の差が２０ｎｍ以上の連続した領域であることが好ましく、１００ｎｍ以上の連続した領域であることがより好ましく、２００ｎｍ以上の連続した領域であることがさらに好ましい。この波長領域は１つのみを設定してもよく、複数設定してもよい。ただし、拡散反射光を用いる場合は解析に用いる波長領域の最大波長と最小波長の差の合計（解析に用いる波長領域が１つの場合は単独で）が２５０ｎｍ以上であることが好ましく、５００ｎｍ以上であることがより好ましい。
【００３６】
工程（３）で用いられる多変量解析法には、ＰＬＳ（ｐａｒｔｉａｌ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ）回帰分析法、多重線形回帰分析（ＭＬＲ、ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）法、主成分回帰分析（ＰＣＲ、ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｒｅｇｒｅｅｓｉｏｎ）法、ＣＬＳ（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ）回帰分析法などがあるが、この内ＰＬＳ回帰分析法を用いるのが好ましい。ＰＬＳ回帰分析は市販のソフトウェアを使用して行うことができる。使用するソフトウェアは、例えば、Ｔｈｅ Ｕｎｓｃｒａｍｂｌｅｒ（株式会社カモソフトウェアジャパン)、ＯＰＵＳ（ブルカー・オプティクス社）、ＮＩＲＣａｌ（日本ビュッヒ社）、Ｐｉｒｏｕｅｔｔｅ（ジーエルサイエンス社）などが例示できる。これらのソフトウェアを利用して、ＮＩＲ拡散反射光スペクトルを解析し、その結果を本発明の定量法で用いる。使用するスペクトルデータまたはフーリエ変換スペクトルデータは、原スペクトルデータでもよいが、原スペクトルデータを加工したものを使用することが好ましい。データ加工の方法としては、例えば、一次微分、二次微分、三次微分などの多次微分（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、平滑化（Ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ）、スペクトルの減算（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）、正規化（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）、ＭＳＣ補正（ＭｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｖｅＳｃａｔｔｅｒ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）、ＳＮＶ補正（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｎｏｒｍａｌ Ｖａｒｉａｔｅ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）などが挙げられる。
【００３７】
解析に用いる波長領域のスペクトルデータと定量したγ−オリザノール含量（γ−オリザノールの実測値）とをＰＬＳ回帰分析に供することにより、γ−オリザノール含量と関係する因子を決定して回帰式を得ることができる。γ−オリザノール含量と関係する因子とは、スペクトルデータの中に内在するγ−オリザノール含量の変化と相関の高い仮想的な変量を指す。この因子の回帰係数を用いてスペクトルデータからγ−オリザノール含量を予測する回帰式を作成する。近赤外分光法では、通常回帰式作成後、回帰式を得るための試料以外の試料（評価用試料）を用いて、作成された回帰式の測定精度を評価する。回帰式の測定精度は評価用試料の実測値と作成した回帰式によって算出された予測値による分析値との残差（測定誤差）の標準偏差や平均値によって評価する。この予測値（定量値）と実測値の散布図が図１、２、４である。検量線回帰式はこの実測値と予測値（定量値）の相関が最大となるように導出された回帰式である。
【００３８】
〔ＮＩＲ分光法を利用したγ−オリザノールの定量方法〕
本発明のＮＩＲ分光法を利用したγ−オリザノールの定量方法（以下、「本発明の定量方法」という。）は、上記本発明の回帰式を得る方法により得られた回帰式と、当該回帰式の作成に使用した波長領域における被験試料のＮＩＲスペクトルデータとを用いる定量方法である。具体的には、まず、被験試料のＮＩＲスペクトルを測定する。ＮＩＲスペクトルを測定する波長範囲は、回帰式の作成に使用した波長領域を含むものであればよく、８００〜２５００ｎｍであることが好ましい。
【００３９】
被験試料のＮＩＲスペクトルデータは、上記本発明の回帰式を得る方法においてＮＩＲスペクトルデータを測定する場合と同様にして測定することができるが、ＮＩＲスペクトルの測定装置、測定法、解析方法は回帰式を得るための試料と同じものを使用することが好ましい。すなわち、市販の近赤外分光分析計を用いてＮＩＲスペクトルを測定しスペクトルデータ、好ましくはフーリエ変換スペクトルデータを測定する。スペクトルデータまたはフーリエ変換スペクトルデータは、原スペクトルデータでもよいが、原スペクトルデータを加工したものを使用することが好ましい。データ加工の方法としては、例えば、一次微分、二次微分、三次微分などの多次微分（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、平滑化（Ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ）、スペクトルの減算（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）、正規化（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）、ＭＳＣ補正（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｖｅ Ｓｃａｔｔｅｒ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）、ＳＮＶ補正（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｎｏｒｍａｌ Ｖａｒｉａｔｅ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）などが挙げられる。
【００４０】
被験試料のＮＩＲスペクトルデータ（好ましくは上記の加工を施されたもの）を解析して、先に得られた回帰式を適用することにより、被験試料のγ−オリザノール含量の予測値を算出する。この予測値がＮＩＲによる被験試料のγ−オリザノールの定量値となる。ここでのスペクトルデータの解析と予測値（定量値）の算出は市販のソフトウェアを使用して行うことができる。使用するソフトウェアは例えばＴｈｅ Ｕｎｓｃｒａｍｂｌｅｒ(株式会社カモソフトウェアジャパン)、ＯＰＵＳ（ブルカー・オプティクス社）、ＮＩＲＣａｌ（日本ビュッヒ社）、Ｐｉｒｏｕｅｔｔｅ（ジーエルサイエンス社）などが例示できる。
【００４１】
なお本発明の定量方法においては、被験試料に水分が多く含まれる場合が想定され、その場合には乾物量あたりで定量することが考えられる。そうしたケースでは測定試料に水分除去処理を行ってからＮＩＲスペクトルデータを取得し定量するか、何らかの方法で水分含量を定量し、予測値（定量値）を補正する必要がある。水分含量の定量法としては試料の一部を採取して乾燥減量法、カールフィッシャー法にて計測する方法が挙げられる。また、非破壊分析を目的とする場合には、ＮＩＲスペクトルデータを用いて水分含量を予測する方法を好適に用いることができる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４３】
〔実施例１：γ−オリザノール試料の検量線回帰式〕
１−１  ヘキサン溶媒の検討
(1) 市販のパーム油１ｇを１００ｍＬのヘキサンに溶解して１％（ｗ／ｖ）溶液とし、γ−オリザノール（９８％、築野食品製）を添加してγ−オリザノール含量５〜２８０ｐｐｍの溶液試料を調製した。各試料中のγ−オリザノール含量はγ−オリザノール／ヘキサン溶液を標品として、３２０ｎｍの吸光度に基づき分光光度計Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ２０００ｃ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて定量した。
(2) (1)で調製した試料のＮＩＲ透過光を、ＦＴ型近赤外分析計ＭＰＡ（ブルカー・オプティクス社）を用いて８００ｎｍから２５００ｎｍ（１２５００〜４０００ｃｍ−１）の範囲で測定した。
(3) 得られた原スペクトルの前処理（２次微分処理）を行い、前処理スペクトル（１３３３〜１４７０ｎｍ、１８３５〜２１７５ｎｍ）の波長データを説明変数とし、γ−オリザノール含量を目的変数とするＰＬＳ回帰分析により、ヘキサン溶媒試料の検量モデルを作成した。ＮＩＲ予測値（定量値）と化学分析値（実測値）の相関を図１に示した。ここでのＮＩＲ予測値（ｐｐｍ、定量値）はγ−オリザノール含量の検量線回帰式とＮＩＲスペクトルのデータから測定装置によって導出される計算値である。ＰＬＳ回帰分析結果から、γ−オリザノール含量に関連する重要な波長データとして１４４０±１０ｎｍ、１９３８±１０ｎｍ、２０３０±１０ｎｍ、２１０５±１０ｎｍの４つの領域がリストアップされた。【００４４】
１−２  クロロホルム溶媒の検討
実施例１においてヘキサンをクロロホルムに変更し、同様に検量線回帰式を作成した。
１−３  メタノール溶媒の検討
実施例１においてヘキサンをメタノールに変更し、同様に検量線回帰式を作成した。
１−４  ｔ−ブタノール溶媒の検討
実施例１においてヘキサンをｔ−ブタノールに変更し、同様に検量線回帰式を作成した。【００４５】
表１に異なる溶媒でのγ−オリザノールのＮＩＲ予測値（ｐｐｍ、定量値）と実測値の相関係数を示した。ヘキサンおよびクロロホルムにおいて非常に高い相関係数が得られたが、ｔ−ブタノールやメタノールの場合、十分な相関が得られなかった。【００４６】
【表１】
2014034668.tif 000002
【００４７】
〔実施例２：ヘキサン溶媒試料の至適波長範囲の検討〕
実施例１のヘキサン溶媒試料について、前処理スペクトルの波長データの波長範囲を様々に変えてγ−オリザノール検量モデルを作成した。得られた検量モデルの全条件の決定係数Ｒ２を表２に示した。波長は用いた波長範囲を示しており、最小波長と最大波長で区切られた１区間（条件Ｎｏ．７〜１５）ないし２区間（条件Ｎｏ．１〜６）のデータを用いて解析を行った。表２からわかるように条件Ｎｏ．１〜１５でＮＩＲ予測値（定量値）と化学分析値（実測値）には高い相関関係が見られた。これらの相関の高い条件には実施例１で示されたγ−オリザノールに関連する波長領域である１４４０±１０ｎｍ、１９３８±１０ｎｍ、２０３０±１０ｎｍ、２１０５±１０ｎｍの領域を１つ以上含むという共通点があった。【００４８】
【表２】
2014034668.tif 000003
【００４９】
〔実施例３：油脂試料の検量線回帰式〕
(1) 市販の米油１ｇにγ−オリザノール高含有米油である「胚芽油ガンマ」（γ−オリザノール含量約３０％、築野食品）、または米胚芽油（γ−オリザノール含量約５％、築野食品）を任意の割合で添加し、γ−オリザノール含量０．３〜１５重量％の油脂試料を調製した。γ−オリザノール５〜１５％の試料は米油と胚芽油ガンマの混合、γ−オリザノール０．３〜５％の試料は米油と米胚芽油の混合にて調製した。各試料中のγ−オリザノール含量は、γ−オリザノール（９８％、築野食品）／ヘキサン溶液を標品として、３２０ｎｍの吸光度に基づき分光光度計Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ２０００ｃ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて定量した。
(2) (1)で調製した試料のＮＩＲ透過光を、ＦＴ型近赤外分析計ＭＰＡ（ブルカー・オプティクス社）を用いて８００ｎｍから２５００ｎｍ（１２５００〜４０００ｃｍ−１）の範囲で測定した。なお、油脂試料を均質化させるため、測定セルを７５℃に加熱して温度の安定を確認してからＮＩＲスペクトルを取得した。
(3) 得られた原スペクトルの前処理（２次微分処理）を行い、前処理スペクトル（１３３３〜１４７０ｎｍ、１８３５〜２１７５ｎｍ）の波長データを説明変数とし、γ−オリザノール含量を目的変数とするＰＬＳ回帰分析により、油脂試料の検量モデルを作成した。ＮＩＲ予測値（定量値）と化学分析値（実測値）の相関を図２に示した。ここでのＮＩＲ予測値（重量％、定量値）はγ−オリザノール含量の検量線回帰式とＮＩＲスペクトルのデータから測定装置によって導出される計算値である。定量値と実測値は非常に高い相関（Ｒ２＝０．９９）を示し、実施例１のヘキサン溶液と同様に高い予測精度を持つことが明らかとなった。【００５０】
〔実施例４：玄米試料の検量線回帰式〕
４−１  粗脂質の抽出
(1) 玄米一粒を秤量した後、凍結乾燥処理し、ろ紙に包んで薬さじにて押しつぶした。
(2) 押しつぶした試料をろ紙ごと抽出用円筒ガラスフィルターに入れ、セミ・ミクロ脂肪抽出器セットにて、エーテル２５ｍＬを用いて、加温機を１００℃に設定し、６時間ソックスレー抽出を行った。
(3) 抽出液をナシ型フラスコに移し、ロータリーエバポレーターにより乾固した。
(4) ナシ型フラスコの粗脂質をクロロホルム１．２ｍＬに溶解し、脂質のクロロホルム溶液を２ｍＬバイアル瓶に移し、遠心エバポレーターにより濃縮乾固することで玄米一粒の粗脂質を得た。【００５１】
４−２  γ-オリザノール含量の測定
(1) 上記４−１(4)で得られた粗脂質にエタノールを加えて１ｍｇ／ｍＬの溶液とした。
(2) 試料注入量１０μＬ（粗脂質１０μｇ相当）としてＨＰＬＣ法によりγ−オリザノール含量の測定を行った。ＨＰＬＣ装置には、ＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅＨＰＬＣシステム（ＬＣ−２０ＡＤ、島津製作所）を用いた。検出器には、紫外可視吸光度検出器（波長３２０ｎｍ、島津製作所）を、カラムには、信和化工製「ＳＴＲ−ＯＤＳＩＩ」（２．０×１５０ｍｍ、粒子径５μｍ）を用いた。移動相は、メタノール：アセトニトリル＝１：１（ｖ／ｖ）とし、カラム温度４０℃、流速０．２０ｍＬ／分とした。
(3) γ−オリザノール標品（９８％、築野食品）を上記(2)と同一条件で分析し、上記(2)で得られたＵＶクロマトグラムからγ−オリザノールのピーク４種（フェルラ酸シクロアルテニル、フェルラ酸２４−メチレンシクロアルタニル、フェルラ酸カンペステリル、フェルラ酸β−シトステリル）を同定した。γ−オリザノール標品のＵＶクロマトグラムを図３に示す。
(4) フェルラ酸シクロアルテニル（９９％、和光純薬）を標品とし、それぞれのγ−オリザノールの分子種の定量値をフェルラ酸シクロアルテニル換算で算出した。【００５２】
４−３  γ−オリザノールの含量検量線回帰式の作成
(1) １２品種のイネの玄米を各３粒用意した。
(2) 分析装置としてＦＴ型近赤外分析計ＭＰＡ（ブルカー・オプティクス社）を用い、玄米のＮＩＲ拡散反射光を８００ｎｍから２５００ｎｍ（１２５００〜４０００ｃｍ−１）の範囲で測定した。
(3) スペクトルを取得した玄米について、上記４−１および４−２の方法で粗脂質を抽出し、各玄米１粒中のγ−オリザノール含量を定量した。
(4) 得られた原スペクトルの前処理（２次微分処理）を行い、前処理スペクトル（１３３３〜２３５５ｎｍ）の波長データを説明変数とし、測定したγ−オリザノール含量を目的変数とするＰＬＳ回帰分析により、玄米１粒のγ−オリザノール検量モデルを作成した。ＮＩＲ予測値（定量値）と化学分析値（実測値）の相関を図４に示した。ここでのＮＩＲ予測値（ｐｐｍ、定量値）はγ−オリザノール含量の検量線回帰式とＮＩＲスペクトルのデータから測定装置によって導出される計算値である。【００５３】
図４に見られるように、ＮＩＲ予測値（定量値）と化学分析値（実測値）には高い相関が見られており、予測精度は油脂やその溶液を試料とした場合には及ばないものの、玄米を試料とした場合にも本法が適用できることが示された。【００５４】
〔実施例５：玄米試料の至適波長範囲の検討〕
玄米試料について、前処理スペクトルの波長データの波長範囲を様々に変えてγ−オリザノール検量モデルを作成した。得られた検量モデルの全条件の決定係数Ｒ２を表３に示した。波長は用いた波長範囲を示しており、最小波長と最大波長で区切られた１区間（条件Ｎｏ．２、５以外）ないし２区間（条件Ｎｏ．２、５）のデータを用いて解析を行った。表３からわかるように条件Ｎｏ．１〜１０でＮＩＲ予測値（定量値）と化学分析値（実測値）に高い相関関係が見られた。これらの相関の高い条件には、実施例１で示されたγ−オリザノールと関連する波長領域である１４４０±１０ｎｍ、１９３８±１０ｎｍ、２０３０±１０ｎｍ、２１０５±１０ｎｍの領域を１つ以上含み、最小波長と最大波長で区切られた１区間（条件Ｎｏ．２、５以外）または２区間（条件Ｎｏ．２、５）の波長領域の合計が５００ｎｍ以上であるという共通点があった。【００５５】
【表３】
2014034668.tif 000004
【００５６】
〔試験例１：米胚芽油および米原油に含まれるγ−オリザノールの定量〕
米胚芽油および米原油に対して、以下の１〜４の各方法でγ−オリザノールの定量を行いその結果を比較した。それぞれの方法で３回ずつの測定を行い、平均値を算出した。【００５７】
１：ＮＩＲスペクトルによる定量
(1) ＦＴ型近赤外分析計ＭＰＡ（ブルカー・オプティクス社）を用いて、米胚芽油または米原油を直接７５℃に加温した測定セルに入れ、温度の安定を待ってＮＩＲ透過光を８００ｎｍから２５００ｎｍ（１２５００〜４０００ｃｍ−１）の範囲で測定した。
(2) 実施例３で作成したγ−オリザノール検量モデルに(1)で測定したＮＩＲスペクトルデータを当てはめて、γ−オリザノール含量を予測した。【００５８】
２：ヘキサン溶液のＮＩＲスペクトルによる定量
(1) 米胚芽油または米原油の１ｇを１００ｍＬのヘキサンに溶解して１％（ｗ／ｖ）溶液を調製し、試料とした。
(2) (1)で調製した試料のＮＩＲ透過光を、ＦＴ型近赤外分析計ＭＰＡ（ブルカー・オプティクス社）を用いて８００ｎｍから２５００ｎｍ（１２５００〜４０００ｃｍ−１）の範囲で測定した。
(3) 実施例１で作成したγ−オリザノール検量モデルに(1)で測定したＮＩＲスペクトルデータを当てはめて、γ−オリザノール含量を定量した。【００５９】
３：化学分析（吸光度法）
上記２の米胚芽油または米原油のヘキサン溶液を、γ−オリザノール（９８％、築野食品工業）のヘキサン溶液を標品として３２０ｎｍの吸光度に基づき分光光度計Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ２０００ｃ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて定量した。【００６０】
４：化学分析（ＨＰＬＣ法）
実施例４の４−２において玄米粗脂質中のγ−オリザノール含量を測定した方法と同じ方法を用いて、米胚芽油または米原油中のγ−オリザノール含量を定量した。【００６１】
表４に１〜４の方法で予測または定量した米胚芽油および米原油中のγ−オリザノールの予測値または定量値を示した。表４からわかるように、米胚芽油においてはＮＩＲによる予測値と化学分析による定量値はほぼ一致しており、ＮＩＲ法の妥当性が示された。一方、米原油においては２つのＮＩＲ法の予測値およびＨＰＬＣ法の定量値はほぼ一致しているが、吸光度法の定量値は若干高めになった。これは米原油には米胚芽油に比べて不純物が多く、γ−オリザノール以外にも３２０ｎｍに吸収極大を持つ物質が存在しているためと推定され、ＮＩＲ法が吸光度法よりも汎用性が高い（不純物の多い試料に対してもＨＰＬＣ法に近い正確な予測が可能）であることが示された。【００６２】
【表４】
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【００６３】
〔試験例２：種々の食用油を用いたモデル試料の定量〕
（１）市販のパーム油、菜種油、大豆油、魚油にγ−オリザノール（９８％、築野食品）を添加して加熱溶解し、γ−オリザノール含量が約０．５重量％となるモデル試料を調製した。
（２）（１）のモデル試料に対して、試験例１と同様に４種類の方法で予測ないし定量したγ−オリザノール含量の予測値および定量値を算出した。それぞれの方法で３回ずつの測定を行い、算出した平均値を表５に示した。表５から明らかなように、それぞれのモデル試料でＮＩＲによる予測値と化学分析による定量値はほぼ一致した。よって米油以外の油脂にも、本法が適用できることが判明した。【００６４】
【表５】
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【００６５】
〔試験例３：米糠中のγ−オリザノールの定量〕
（１）品種の異なる稲Ａ、ＢおよびＣの米糠各約１０ｇずつにジエチルエーテル１００ｍＬを加えて、以下実施例４と同様にソックスレー抽出を行い、溶媒を除去して粗脂質を得た。
（２）（１）の粗脂質に対して試験例１と同様の方法でＮＩＲ予測値および定量値を導出し、これを米糠あたりの含量（重量％）に換算した。それぞれの方法で３回ずつの測定を行って得られた平均値を表６に示した。表６から明らかなように、それぞれの米糠でＮＩＲによる予測値と化学分析による定量値はほぼ一致したが、吸光度法の定量値は若干高めになる傾向があり、これについては試験例１と同様の考察が可能である。【００６６】
【表６】
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【００６７】
〔試験例４：飼料の分析〕
試験例３の米糠を、玄米粉を配合した鶏用飼料に変えて同様の試験を行った。飼料は抽出の前にすり鉢ですりつぶし、均質化した後に粗脂質を抽出した。その結果、ＮＩＲ予測値と化学分析値はほぼ一致し、本法の妥当性が示された。【００６８】
〔試験例５：石鹸の分析〕
試験例３の米糠を米油とパーム油の混合油を原料とする石鹸に変えて同様の試験を行った。石鹸は１ｇ程度を切り出して粗脂質を抽出した。その結果、ＮＩＲ予測値と化学分析値はほぼ一致し、本法の妥当性が示された。【００６９】
〔試験例６：γ−オリザノール配合薬品の分析〕
試験例３の米糠を、γ−オリザノールを２０％程度配合した細粒剤に変えて同様の試験を行った。その結果、ＮＩＲ予測値と化学分析値はほぼ一致し、本法の妥当性が示された。【００７０】
〔試験例７：血液の分析〕
試験例３の米糠を、米胚芽油（γ−オリザノール含量約１．０％）を１０％程度含有した飼料で３週間飼育した４週齢のウィスター系雄ラット６匹（日本クレア（株））の血清に変えて同様の試験を行った。血清は飼育最終日にエーテル麻酔後、開腹し、腹部下大動脈採血により血液を採取した。採取した血液は常法に従い血清を分離した。分離した血清は限外濾過処理およびエタノールの添加により除タンパク処理を行った後、ヘキサンによりγ−オリザノールを含む脂質を抽出し、分析試料とした。その結果、ＮＩＲ予測値と化学分析値の平均値はほぼ一致し、本法の妥当性が示された。【００７１】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年9月29日(2015.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする方法により得られた回帰式と、当該回帰式の作成に使用した波長領域における被験試料の近赤外光スペクトルデータとを用いることを特徴とするγ−オリザノールの非破壊的定量方法。
（１）試料の近赤外光スペクトルを測定する工程
（２）当該試料のγ−オリザノール含量を定量する工程
（３）近赤外光スペクトルを測定した波長範囲の全部または一部の波長領域で得られたスペクトルデータと、定量したγ−オリザノール含量とを多変量解析法により解析し、γ−オリザノール含量と関係する因子を決定する工程
【請求項２】
試料が、γ−オリザノールを含む食品、飼料、化粧品もしくは医薬品またはこれらの原料もしくは素材であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料が、穀物またはその一部であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
穀物が、玄米であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
試料が、油脂またはその加工品またはこれらの原料もしくは素材であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
油脂が、米油または米油を含有するものであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
試料が、生体由来であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（１）の前に、試料中のγ−オリザノールを溶媒で抽出する工程をさらに含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
溶媒が、ヘキサンまたはクロロホルムであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
近赤外光スペクトルが、拡散反射光または透過光のスペクトルであることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記（３）の工程における波長領域が、８００〜２５００ｎｍまたはその一部であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記（３）の工程における波長領域が、１４４０±１０ｎｍ、１９３８±１０ｎｍ、２０３０±１０ｎｍ、２１０５±１０ｎｍの少なくとも１つの領域を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
試料が（ａ）米油、米胚芽油もしくは米原油もしくはそれらの溶液、または、（ｂ）γオリザノールを含む（イ）パーム油、（ロ）菜種油、（ハ）大豆油、もしくは（ニ）魚油もしくはそれらの溶液、または、（ｃ）米糠もしくはその抽出物、または、（ｄ）玄米もしくはその抽出物である請求項１及び８〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
試料中のγ−オリザノールを定量するための回帰式を得るための方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする方法。
（１）試料の近赤外光スペクトルを測定する工程
（２）当該試料のγ−オリザノール含量を定量する工程
（３）近赤外光スペクトルを測定した波長範囲の全部または一部の波長領域で得られたスペクトルデータと、定量したγ−オリザノール含量とを多変量解析法により解析し、γ−オリザノール含量と関係する因子を決定する工程
【国際調査報告】
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