(57)【要約】ヒアルロン酸製剤中の生物由来の生理活性物質の検出または濃度の測定において、より高い測定精度を得ることが可能な技術を提供する。ヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬とを混和させ、ヒアルロン酸製剤中の生物由来の生理活性物質とＡＬとを反応させることで、ヒアルロン酸製剤中の生物由来の生理活性物質を検出しまたはその濃度を測定する測定法に関する。そして、ヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬との混和液を、電解質水溶液で希釈するとともに、ヒアルロン酸よりも生物由来の生理活性物質との親和性の高い所定の蛋白質を含有させる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸製剤中に存在する生物由来の生理活性物質とカブトガニの血球抽出物であるＡＬとを反応させることで、ヒアルロン酸製剤中の前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記ＡＬを含むＡＬ試薬と前記ヒアルロン酸製剤との混和液に、希釈用の電解質水溶液及び、前記ヒアルロン酸よりも前記生物由来の生理活性物質との親和性の高い所定の蛋白質を含有させることを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項２】
前記所定の蛋白質はアルブミンであることを特徴とする請求項１に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項３】
前記希釈用の電解質水溶液はリン酸緩衝生理食塩水であることを特徴とする請求項１または２に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項４】
前記ＡＬ試薬と前記ヒアルロン酸製剤との混和液の、前記希釈用の電解質水溶液を含有させた状態におけるｐＨが５．５以上であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項５】
前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンであることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなど、ＡＬとの反応によってゲル化する特性を有する生物由来の生理活性物質を含有する試料中の該生理活性物質を検出しまたはその濃度を測定するための測定方法であって、特にヒアルロン酸製剤中の生物由来の生理活性物質を検出しまたはその濃度を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在するリポ多糖であり、最も代表的な発熱性物質である。このエンドトキシンに汚染された輸液、注射薬剤、透析液、血液などが人体に入ると、発熱やショックなどの重篤な副作用を惹起するおそれがある。このため、上記の薬剤などは、エンドトキシンにより汚染されることが無いように管理することが義務付けられている。【０００３】
ところで、カブトガニの血球抽出物(以下、「ＡＬ : Amoebocyte lysate」ともいう。)の中には、エンドトキシンによって活性化されるセリンプロテアーゼが存在する。そして、ＡＬとエンドトキシンとが反応すると、エンドトキシンの量に応じて活性化されたセリンプロテアーゼによる酵素カスケードによって、ＡＬ中に存在するコアギュロゲンがコアギュリンへと加水分解されて会合し、不溶性のゲルが生成される。このようなＡＬの特性を用いれば、エンドトキシンを高感度に検出することが可能である。【０００４】
また、β−Ｄ−グルカンは真菌に特徴的な細胞膜を構成しているポリサッカライド（多糖体）である。β−Ｄ−グルカンを測定することによりカンジダやアスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌の存在も検出することができ、真菌感染症の広範囲なスクリーニングが可能になる。【０００５】
この場合にも、カブトガニの血球抽出成分ＡＬがβ−Ｄ−グルカンによって凝固（ゲル凝固）する特性を利用して、β−Ｄ−グルカンを高感度に検出することが可能である。【０００６】
カブトガニの血球抽出成分ＡＬによって、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの生物由来の生理活性物質（以下、所定生理活性物質ともいう）の検出または濃度測定を行う場合の具体的な方法としては、以下のものが例示できる。まず、所定生理活性物質の検出または濃度測定（以下、単純に「所定生理活性物質の測定」ともいう。）をすべき試料とＡＬとを混和した混和液を静置し、一定時間後に容器を転倒させて、混和液の垂れ落ちの有無によりゲル化が生じたかどうかを判定し、試料に一定濃度以上の所定生理活性物質が含まれるか否かを調べる半定量的なゲル化転倒法がある。また、ＡＬと所定生理活性物質との反応によるゲルの生成に伴う試料の濁りを経時的に計測して解析する比濁法や、酵素カスケードにより加水分解されて発色する合成基質を用いて試料の色の変化を測定する比色法などがある。【０００７】
上記の比濁法によって所定生理活性物質の測定を行う場合には、乾熱滅菌処理されたガラス製測定セル内に測定試料とＡＬとの混和液を生成させる。そして、混和液のゲル化を外部から光を照射し、ゲル化によって生じる混和液の透過率変化を光学的に測定する。これに対し、より短時間での所定生理活性物質の測定が可能な方法として、測定試料とＡＬとの混和液を例えば磁性攪拌子を用いて攪拌することにより、ゲル粒子を生成せしめ、ゲル粒子により散乱されるレーザー光のピーク数を検出する光散乱法（レーザー光散乱粒子計測法）が提案されている。同様に、測定試料とＡＬとの混和液を攪拌することにより生成したゲル粒子による試料の濁りを、混和液を透過する光の強度により検出する攪拌比濁法が提案されている。【０００８】
試料中のエンドトキシンを測定する際の問題点の一つに、試料による測定への干渉（阻害と促進）の影響がある。すなわち、測定しようとする試料自体の影響によって、エンドトキシンの測定値が実際の測定値より低くなる場合（阻害）や、逆に高くなる場合（促進）がある。これは、試料の特性などによって、ＡＬの反応活性やエンドトキシンの物性、あるいは主反応以外の測定系が影響され、試料とＡＬを混和した際に起こるリムルス反応が効率よく進行しなかったり、過剰に反応が進むことが原因で起こることが多いとされている。したがって、試料中のエンドトキシンを高い精度で測定するためには、試料中のエンドトキシンを安定させる技術が必要となる。これに関し、例えば血液透析用透析液等の水溶液中のエンドトキシンの濃度測定において、水溶液中のエンドトキシンを安定化させるためにアルブミンを共存させる技術が知られている（例えば、特許文献１参照）。【０００９】
ところで、白内障手術、眼内レンズ挿入手術などにおいては、手術中の眼球の前房部の張りを維持するために、ヒアルロン酸製剤を前房部に注入することが知られている。このヒアルロン酸製剤がエンドトキシンに汚染されていた場合には手術後に前房部が炎症を起こすＴＡＳＳ（Toxic Anterior Segment Syndrome）と呼ばれる事態を招く場合があった。【００１０】
これに対し、ＩＳＯ及びＦＤＡにおいて、ヒアルロン酸製剤中のエンドトキシンの混入許容値を０．１ＥＵ／ｍＬとする規制が提案されているため、ヒアルロン酸製剤に含まれるエンドトキシンの濃度を精密に測定する必要がある。しかしながら、特に粘度が高いこと及び/又は、リムルス反応が阻害されることにより、ヒアルロン酸製剤中のエンドトキシンを高精度に測定することが困難な場合があった。【００１１】
これに関し、３０℃以上４０℃以下の希釈用水で同温度帯のヒアルロン酸製剤を希釈してエンドトキシン濃度測定を行う技術が知られている（例えば、特許文献２参照）。しかしながら、ヒアルロン酸製剤といっても分子量の高いものから低いものまでさまざまなものがあり、Ｖｉｓｃｏａｔ（登録商標）（分子量５００）のようなものであれば上記の技術で十分安定した測定が可能であるが、Ｈｅａｌｏｎ（登録商標）（分子量１９００〜３９００）やＨｅａｌｏｎ Ｖ（分子量４０００）のような粘性の高いものに含まれるエンドトキシン濃度の安定測定は依然、困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許第２８１７６０６号公報
【特許文献２】国際公開第２０１２／０２９１７１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は上述の問題点に鑑みて案出されたものであり、その目的とするところは、ヒアルロン酸製剤中の生物由来の生理活性物質の検出または濃度の測定において、ヒアルロン酸の阻害作用を抑制せしめ、より高い測定精度を得ることが可能な技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、ヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬とを混和させ、ヒアルロン酸製剤中の生物由来の生理活性物質とＡＬとを反応させることで、ヒアルロン酸製剤中の生物由来の生理活性物質を検出しまたはその濃度を測定する測定法に関する。そして、ヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬との混和液を、電解質水溶液で希釈するとともに、ヒアルロン酸よりも生物由来の生理活性物質との親和性の高い所定の蛋白質を含有させることによって、ヒアルロン酸の阻害作用を抑制することを最大の特徴とする。【００１５】
より詳しくは、ヒアルロン酸製剤中に存在する生物由来の生理活性物質とカブトガニの血球抽出物であるＡＬとを反応させることで、ヒアルロン酸製剤中の前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記ＡＬを含むＡＬ試薬と前記ヒアルロン酸製剤との混和液に、希釈用の電解質水溶液及び、前記ヒアルロン酸よりも前記生物由来の生理活性物質との親和性の高い所定の蛋白質を含有させることを特徴とする。【００１６】
ここで、ヒアルロン酸製剤中の生物由来の生理活性物質とＡＬ試薬におけるＡＬとの反応において、ヒアルロン酸自体に、生物由来の生理活性物質とＡＬとの反応を阻害する働きがあることが分かってきた。また、ヒアルロン酸自体が、生物由来の生理活性物質とＡＬとの反応によるコアギュリンの凝集を阻害することが分かってきた。これは、ヒアルロン酸の分子に生物由来の生理活性物質が取り込まれることで生物由来の生理活性物質とＡＬとが反応しづらい状態になること及び、結合しようとするコアギュリンの間に電荷を帯びたヒアルロン酸分子が入り込みコアギュリンどうしの電気結合を阻害することによると考えられている。【００１７】
これに対し、本発明においては、まず、ヒアルロン酸製剤を電解質水溶液を用いて希釈することとした。これにより電荷を帯びたヒアルロン酸分子による、コアギュリンどうしの電気結合の阻害を抑制することができる。また、本発明においては、ヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬の混和液中に、ヒアルロン酸よりも前記生物由来の生理活性物質との親和性の高い所定の蛋白質を含有させることとした。これにより、ヒアルロン酸の分子に取り込まれた生物由来の生理活性物質を引き出すことができ、生物由来の生理活性物質とＡＬとが反応し易い状態を形成させることができる。【００１８】
その結果、ヒアルロン酸製剤中の生物由来の生理活性物質とＡＬとの反応を促進すること及び、当該反応に起因するコアギュリンのゲル化を促進することが可能となり、ヒアルロン酸製剤中の生物由来の生理活性物質の測定感度を増大させることができ、測定精度を向上させることができる。【００１９】
また、本発明においては、前記所定の蛋白質はアルブミンであってもよい。ここで、アルブミンの、周囲のｐＨに対する挙動が詳しく分かってきた。従って、所定の蛋白質としてアルブミンを用い、さらにヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬の混和液のｐＨを制御することで、ヒアルロン酸製剤中の生物由来の生理活性物質とＡＬとの反応をより容易に制御することが可能となる。【００２０】
また、本発明においては、前記希釈用の電解質水溶液としてリン酸緩衝生理食塩水を用いても良い。このリン酸緩衝生理食塩水には、より潤沢にマイナス電荷が含まれているので、リン酸希釈用の電解質水溶液としてリン酸緩衝生理食塩水を用いることで、より確実に、電荷を帯びたヒアルロン酸分子による、コアギュリンどうしの電気結合の阻害を抑制することができる。また、ヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬の混和液のｐＨをより安定させることができ、ヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬との混和液における前記所定の蛋白質の特性をより容易に制御することが可能となる。【００２１】
また、本発明においては、前記ＡＬ試薬と前記ヒアルロン酸製剤との混和液の、前記希釈用の電解質水溶液を含有させた状態におけるｐＨを５．５以上となるようにしてもよい。ここで、アルブミンは周囲のｐＨが、アルブミンの等電点より高い場合には、鎖状の切片を形成し、アルブミンに吸着した生物由来の生理活性物質とＡＬとが反応し易い状態を形成できることが分かってきた。一方、周囲のｐＨがアルブミンの等電点より低い場合には、アルブミンは凝集してしまい、生物由来の生理活性物質を取り込み、生物由来の生理活性物質とＡＬとが反応しづらい状態となることが分かってきた。また、アルブミンの等電点は４．４〜５．３程度であることが分かっている。【００２２】
従って、前記ＡＬ試薬と前記ヒアルロン酸製剤との混和液の、前記希釈用の電解質水溶液を含有させた状態におけるｐＨを５．５以上とすることで、より確実に混和液のｐＨがアルブミンの等電点より高い状態を維持することができる。その結果、生物由来の生理活性物質とＡＬとが反応し易い状態を維持することが可能となり、より精度よく、生物由来の生理活性物質の検出または濃度の測定を行うことが可能となる。【００２３】
また、本発明においては、前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−Ｄ−グルカンであってもよい。【００２４】
そうすれば、最も代表的な発熱性物質であるエンドトキシンの検出または濃度測定がより正確に行なえ、エンドトキシンに汚染された輸液、注射薬剤、透析液、血液などが人体に入り、副作用が惹起されることを抑制できる。同様に、β−Ｄ−グルカンの検出または濃度測定がより正確に行なえ、カンジダやアスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングをより正確に行なうことが可能となる。【００２５】
なお、上記した本発明の課題を解決する手段については、可能なかぎり組み合わせて用いることができる。また、本発明において前記所定の蛋白質としては、アルブミンの他、グロブリン、リゾチウムなどを例示することができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明にあっては、ヒアルロン酸製剤中の生物由来の生理活性物質の検出または濃度の測定において、より高い測定精度を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬の混和液におけるｐＨによる、アルブミン分子の挙動の相違について説明するための図である。
【図２】ヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬の混和液にアルブミンを添加した場合の、混和液のｐＨと、レーザー光散乱粒子計測法による測定結果との関係を示すグラフである。
【図３】ヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬の混和液にアルブミンを添加した場合の、混和液のｐＨと、エンドトキシンの回収率との関係を示すグラフである。
【図４】ヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬の混和液にアルブミンを添加した場合の、混和液のｐＨの変化と、エンドトキシンの回収率の変化との関係を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例におけるレーザー光散乱粒子計測装置の概略構成を示す図である。
【図６】エンドトキシンまたはβ―Ｄ−グルカンにより、ＡＬがゲル化する過程及び、その検出方法について説明するための概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明を実施するための最良の形態を、図面を参照して詳細に説明する。なお、以下の実施例では、生物由来の生理活性物質として主にエンドトキシンを例にとって説明するが、本発明は他の生物由来の生理活性物質、例えばβ−Ｄ−グルカンなどにも適用可能であることは当然である。
【００２９】
〔実施例１〕  ＡＬとエンドトキシンとが反応してゲルが生成される過程はよく調べられている。すなわち、図６に示すように、エンドトキシンがＡＬ中のセリンプロテアーゼであるＣ因子に結合すると、Ｃ因子は活性化して活性型Ｃ因子となる、活性型Ｃ因子はＡＬ中の別のセリンプロテアーゼであるＢ因子を加水分解して活性化させ活性化Ｂ因子とする。この活性化Ｂ因子は直ちにＡＬ中の凝固酵素の前駆体を加水分解して凝固酵素とし、さらに、この凝固酵素がＡＬ中のコアギュロゲンを加水分解してコアギュリンを生成する。そして、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成し、ＡＬ全体がこれに巻き込まれてゲル化すると考えられている。
【００３０】
また、同様にβ−Ｄ−グルカンがＡＬ中のＧ因子に結合すると、Ｇ因子は活性化して活性型Ｇ因子となる、活性型Ｇ因子はＡＬ中の凝固酵素の前駆体を加水分解して凝固酵素とする。その結果、エンドトキシンとＡＬとの反応と同様、コアギュリンが生成され、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成する。
【００３１】
この一連の反応は哺乳動物に見られるクリスマス因子やトロンビンなどのセリンプロテアーゼを介したフィブリンゲルの生成過程に類似している。このような酵素カスケード反応はごく少量の活性化因子であっても、その後のカスケードを連鎖して活性化していくために非常に強い増幅作用を有する。従って、ＡＬを用いた所定生理活性物質の測定法によれば、サブピコグラム／ｍＬオーダーのきわめて微量の所定生理活性物質を検出することが可能になっている。
【００３２】
所定生理活性物質を定量することが可能な測定法としては前述のように比濁法、ならびに、レーザー光散乱粒子計測法が挙げられる。図６に示すように、これらの測定法はこのＡＬの酵素カスケード反応によって生成されるコアギュリンの会合物を前者は試料の濁りとして、後者は系内に生成されるゲルの微粒子として検出することで、高感度な測定を可能にしている。
【００３３】
特にレーザー光散乱粒子計測法では、系内に生成されたゲルの微粒子を直接測定するため、比濁法よりも高感度であり、且つ、一般的にＡＬと検体からなる試料を強制的に攪拌するので、比濁法と比較して短時間でゲルの生成を検出できる。
【００３４】
次に、エンドトキシンによる人体への影響に関する具体例について説明する。白内障手術、眼内レンズ挿入手術など眼球の前房水の除去を前提とする手術においては、手術中の眼球の前房部の張りを維持するために、ヒアルロン酸製剤を前房部に注入することが知られている。このヒアルロン酸製剤がエンドトキシンに汚染されていた場合には、ＴＡＳＳ（Toxic Anterior Segment Syndrome）を発症し、手術後に前房部が炎症を起こすなどの事態を招く場合があった。
【００３５】
これに対し、ＩＳＯ及びＦＤＡによって、ヒアルロン酸製剤中のエンドトキシンの混入許容値を０．１ＥＵ／ｍＬとする規制が提案されているため、ヒアルロン酸製剤に含まれるエンドトキシンの濃度を精密に測定する必要が生じている。しかしながら、ヒアルロン酸の粘度は非常に高く、ＡＬを用いてエンドトキシンの濃度を測定しようとしても、ＡＬ試薬とヒアルロン酸製剤とを均一に混合することが困難となり、ヒアルロン酸製剤中のエンドトキシンを高精度に測定することが困難な場合があった。
【００３６】
ヒアルロン酸製剤の分子量は表１に示すようにばらついており、特に分子量の大きなヒアルロン酸においてはより粘度が高い状態となり、ヒアルロン酸製剤中のエンドトキシンを高精度に測定することがより困難な場合があった。
【表１】
2013168695.tif 000003
【００３７】
また、表２には、ヒアルロン酸の希釈率とエンドトキシンの測定における回収率との関係を示す。ここで、回収率とはエンドトキシンフリーのヒアルロン酸製剤に添加したエンドトキシン量に対する、検出されたエンドトキシン量の比率を示しており、１００％であれば、非常に精度のよい測定ができたことになる。
【表２】
2013168695.tif 000004
【００３８】
表２から分かるように、希釈水を用いてヒアルロン酸を希釈した場合には、１００倍程度に希釈しない限り、充分な回収率が得られない。しかしながら、ヒアルロン酸製剤を単に希釈水で１００倍にも希釈すると、測定系におけるエンドトキシンの含有率自体が低下してしまい、エンドトキシンの測定精度の大幅な向上は期待できないのが現状であった。
【００３９】
さらに、発明者らの鋭意研究により、ヒアルロン酸製剤におけるエンドトキシンの測定が困難な原因には、上記のような粘性の影響の他、ヒアルロン酸自体の、エンドトキシンとＡＬとの反応を阻害する作用と、ヒアルロン酸自体の、コアギュリンのゲル化を阻害する作用とが関連していることが分かってきた。この作用については以下のように考えられている。
【００４０】
ここで、ヒアルロン酸製剤中のエンドトキシンの測定においては、まず混和液中で反応可能に存在するエンドトキシンとＡＬとが接近して反応に到る。そして、エンドトキシンとＡＬの反応によってコアギュロゲンが加水分解されてコアギュリンが生成され、このコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成する過程においては、まず、コアギュリンが鎖状に結合する。そして、この鎖状に結合したコアギュリンどうしが疎水結合または電気的結合によりさらに結合してゲルを形成していく。
【００４１】
この過程において、ヒアルロン酸自体の、エンドトキシンとＡＬとの反応を阻害する作用は、ヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬の混和液におけるエンドトキシンが、ヒアルロン酸の分子内に取り込まれた状態となり、エンドトキシンとＡＬとが接近する機会が奪われることでエンドトキシンとＡＬとの間の反応が阻害されることであると考えられている。また、ヒアルロン酸自体の、コアギュリンのゲル化を阻害する作用は、電荷を帯びたヒアルロン酸が、結合しようとするコアギュリンの間に存在することで、コアギュリンどうしの電気的結合を阻害することであると考えられる。
【００４２】
これに対し、本実施例では、まず、ヒアルロン酸製剤を希釈する際に、希釈液として電解質水溶液を使用することで、ヒアルロン酸の分子を電気的に安定させ（あるいは、コアギュリンどうしの結合における疎水結合と電気的結合のバランスを変え、）、電荷を帯びたヒアルロン酸の分子が、鎖状に結合したコアギュリンどうしの電気的結合を阻害することを抑制することとした。これにより、ヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬の混和液において、エンドトキシンとＡＬとが反応した際の、コアギュリンどうしの会合およびゲル化を促進することが可能となる。
【００４３】
表３には、ヒアルロン酸製剤の希釈液として水（大塚蒸留水：大塚製薬工場製、本実施例において同じ）を用いた場合と、ＮａＣｌ溶液（０．１Ｍ：和光純薬工業製、本実施例において同じ）、リン酸緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline：以下、ＰＢＳともいう）（０．０１Ｍ  ｐＨ７．４：ナカライテスク製、本実施例において同じ）を用いた場合におけるエンドトキシンの回収率の相違を示す。
【表３】
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【００４４】
表３から分かるように、ＮａＣｌ溶液やＰＢＳなどの電解質水溶液を用いてヒアルロン酸製剤を希釈することにより、電荷を帯びたヒアルロン酸分子がコアギュリンのゲル化を阻害することを抑制できるので、（表では希釈率４０倍、１００倍において）エンドトキシンの回収率を向上させることができる。なお、ＰＢＳには、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４などが含まれ、多くのマイナス電荷を有しているため、本実施例の目的にはより好適と言える。
【００４５】
また、本実施例においては、ヒアルロン酸製剤に含まれるエンドトキシンを測定する際には、ヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬（リムルスＥＳ−ＩＩシングルテストワコー（和光純薬工業製）：本実施例において同じ）の混和液にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ：以下、単にアルブミンともいう。）を添加することとした。この理由は以下のとおりである。ヒアルロン酸製剤中のエンドトキシンは、前述のようにヒアルロン酸の分子内に取り込まれた状態となっており、エンドトキシンとＡＬとの接近機会が奪われることで反応が阻害されている。しかしながら、この状態でアルブミンが添加されると、アルブミンはヒアルロン酸と比較してエンドトキシンとの親和性が高いためにヒアルロン酸に取り込まれたエンドトキシンを引き離してＡＬと反応し易い状態にできると考えられる。
【００４６】
表４には、ヒアルロン酸製剤を水または電解質水溶液を使用して希釈し、さらにアルブミンを添加した場合におけるエンドトキシンの回収率を示す。
【表４】
2013168695.tif 000006
【００４７】
表４からも分かるように、ヒアルロン酸製剤をＮａＣｌやリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの電解質水溶液で希釈し、さらにアルブミンを添加することで、希釈率が２０倍〜４０倍の場合でも高い回収率を得ることができる。
【００４８】
ここで、上記のようにヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬の混和液にアルブミンを添加する場合の効果は、混和液を希釈した状態におけるｐＨの影響を大きく受けることが発明者らの鋭意研究によって明らかになってきた。また、これは、アルブミンの周囲のｐＨに応じたアルブミンの挙動の変化と密接な関係があることが分かってきた。
【００４９】
図１は、周囲のｐＨの値に応じたアルブミンの挙動の変化について説明するための図である。図１において２１はアルブミンの分子である。アルブミン２１の等電点（以下、ＩＥＰともいう）は、概略４．４〜５．３の間の値となる。そして、周囲のｐＨがアルブミン２１の等電点より低い場合には、アルブミン２１は自ら団子状にランダムに凝集することが分かっている。そして、この状態でエンドトキシン２３が存在したとしても、エンドトキシン２３はアルブミン２１の凝集の中に取り込まれた状態となり、ＡＬとも反応しづらい状態となる。
【００５０】
一方、周囲のｐＨの値が等電点より高い場合にはアルブミン２１はランダムに凝集せずに鎖状の切片２２を形成し、線上に整列して存在することが分かっている。そして、この状態でエンドトキシン２３が存在した場合には、エンドトキシン２３はアルブミンの鎖状の切片２２には取り込まれず、外部に対してむき出しの状態を維持できる。そうすると、エンドトキシン２３が、ＡＬのＣ因子と会合することが妨げられず、ＡＬと反応し易い状態を形成することが可能となる。その結果、エンドトキシン２３とＡＬとの反応によりコアギュリンゲル２４が生成され易い状態となる。
【００５１】
従って、ヒアルロン酸製剤を電界質水溶液で希釈し、ＡＬ試薬と混和させ、さらにアルブミンを添加した状態におけるｐＨが、アルブミンの等電点より低い場合には、ヒアルロン酸製剤中にエンドトキシンとＡＬ試薬中のＡＬとの反応は阻害され、反応開始時間は遅くなり、エンドトキシンの回収率も低下する。一方、上記状態におけるｐＨが、アルブミンの等電点より高い場合には、ヒアルロン酸製剤中のエンドトキシンとＡＬ試薬中のＡＬとの反応は促進され、反応開始時間は早くなり、エンドトキシンの回収率も向上する。
【００５２】
図２には、ヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬との混和液で電界質水溶液で希釈した状態のｐＨが３．３７でありアルブミンの等電点より低くなるものと、ｐＨが７．４でありアルブミンの等電点より高くなるものとを準備し、レーザー光散乱粒子計測法（興和製ＥＸ−３００使用：本実施例において同じ）によって双方の混和液において生成されたゲル粒子の数を測定した結果を示す。ｐＨが７．４である混和液においては、ｐＨが３．３７である混和液と比較してゲル粒子数の増加が早期に生じていることが分かる。
【００５３】
また、図３には、混和液のｐＨが３．３７の場合と、混和液のｐＨが７．４の場合におけるエンドトキシンの回収率を示す。これによれば、２回の測定において２回とも、ｐＨ７．４の混和液の方は略１００％の回収率を達成しているのに対し、ｐＨ３．３７の混和液の方は略４０％未満の回収率しか得られていない。よって、ｐＨがアルブミンの等電点より高い混和液を使用することにより、エンドトキシンの測定精度を向上できることが理解できる。
【００５４】
さらに、図４には、ヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬との混和液におけるｐＨを増加させていった場合に、いずれの段階でエンドトキシンの回収率が向上するかを検証したグラフを示す。図４におけるアルブミン添加の項目を見ると、ｐＨが５．５〜６を超えると回収率が８０％以上と改善されている。前述したようにアルブミンの等電点は４．４〜５．３程度であるので、上記した現象がより厳密に証明されたと言える。
【００５５】
上記の結果から、本実施例においてヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬との混和液にアルブミンを添加する場合には、混和液のｐＨを５．５以上とすることで、混和液のｐＨをアルブミンの等電点より高く維持することが可能となり、エンドトキシンの測定精度を向上させることが可能となる。また、混和液のｐＨを６．２２以上とすることで、混和液のｐＨをアルブミンの等電点より高く維持することがより確実に可能となり、エンドトキシンの測定精度をより確実に向上させることが可能となる。
【００５６】
図５には、本実施例におけるエンドトキシンの測定装置としての光散乱粒子計測装置１の概略構成を示す。光散乱粒子計測装置１に使用される光源２にはレーザー光源が用いられているが、他に、超高輝度ＬＥＤなどを用いてもよい。光源２から照射された光は、入射光学系３で絞られ、試料セル４に入射する。この試料セル４にはエンドトキシンの測定をすべきヒアルロン酸製剤とＡＬ試薬の混和液が保持されている。試料セル４に入射した光は、混和液中の粒子（コアギュリンモノマー、ならびに、コアギュリンオリゴマーなどの測定対象）で散乱される。
【００５７】
試料セル４の、入射光軸の側方には出射光学系５が配置されている。また、出射光学系５の光軸の延長上には、試料セル４内の混和液中の粒子で散乱され出射光学系５で絞られた散乱光を受光し電気信号に変換する受光素子６が配置されている。受光素子６には、受光素子６で光電変換された電気信号を増幅する増幅回路７、増幅回路７によって増幅された電気信号からノイズを除去するためのフィルタ８、ノイズが除去された後の電気信号のピーク数からゲル粒子数を演算し、さらにゲル化検出時間を判定してエンドトキシンの濃度を導出する演算装置９及び、結果を表示する表示器１０が電気的に接続されている。
【００５８】
また、試料セル４には、外部から電磁力を及ぼすことで回転し、試料としての混和液を攪拌する攪拌子１１が備えられており、試料セル４の外部には、攪拌器１２が備えられている。これらにより、攪拌の有無及び攪拌速度の調整が可能となっている。
【００５９】
上記の光散乱粒子計測装置１においては、リムルス反応の最終段階であるコアギュリンゲル粒子の出現時間（ゲル化検出時間＝ゲル化時間）を測定し、エンドトキシン濃度とゲル化検出時間の間に成立する検量関係を用いて検体中のエンドトキシン濃度を算出する。
【００６０】
上記の実施例においては、本発明を、光散乱粒子計測装置１を用いたレーザー光散乱粒子計測法によってエンドトキシン濃度を測定する場合に適用した例について説明したが、本発明が適用されるのは、レーザー光散乱粒子計測法による場合だけでないことはもちろんである。例えば、比濁法、攪拌比濁法、比色法などによってヒアルロン酸製剤のエンドトキシンを測定する場合に適用してもよい。
【００６１】
なお、上記の実施例において記述された電解質水溶液、ヒアルロン酸、ＡＬ試薬、アルブミンなどの物質は、上記において使用された製品、製造元のものに限られるものでなく、同等の働きを有するものであれば代替可能であることは当然である。
【符号の説明】
【００６２】
１・・・光散乱粒子計測装置
２・・・光源
３・・・入射光学系
４・・・試料セル
５・・・出射光学系
６・・・受光素子
７・・・増幅回路
８・・・ノイズ除去フィルタ
９・・・演算装置
１０・・・表示器
１１・・・攪拌子
１２・・・攪拌器
２１・・・アルブミン分子
２２・・・アルブミンによる鎖状の切片
２３・・・エンドトキシン
２４・・・コアギュリンゲル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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