(57)【要約】  マイクロＲＮＡ及びメッセンジャーＲＮＡ等のＲＮＡを高感度且つ簡便に検出することができるＲＮＡの検出方法、検出用キット及び該方法に用いられるシグナル増幅用プローブを提供する。  （Ａ）ＲＮＡを、該ＲＮＡを捕捉するための捕捉物質により捕捉する捕捉工程と、（Ｂ）前記捕捉されたＲＮＡ及び自己集合可能なシグナル増幅用プローブを反応させ、前記ＲＮＡと、前記捕捉物質と、前記シグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーとを含む検出用複合体を形成する検出用複合体形成工程と、（Ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出することにより前記ＲＮＡを検出する検出工程とを含む標的ＲＮＡの検出方法であって、前記シグナル増幅用プローブの一つがポリＴ配列を含むようにした。
2013172305.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）ＲＮＡを、該ＲＮＡを捕捉するための捕捉物質により捕捉する捕捉工程と、
（Ｂ）前記捕捉されたＲＮＡ、第１のシグナル増幅用プローブ及び第２のシグナル増幅用プローブを反応させ、前記ＲＮＡと、前記捕捉物質と、前記第１のシグナル増幅用プローブ及び前記第２のシグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーと、を含む検出用複合体を形成する工程と、
（Ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出することにより、前記ＲＮＡを検出する工程と、
を含む、標的ＲＮＡを検出する方法であって、
前記第１のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及びポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、
前記第２のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであることを特徴とするＲＮＡの検出方法。
【請求項２】
前記第１のシグナル増幅用プローブのポリＴ配列の長さが１１〜２６塩基であることを特徴とする請求項１記載のＲＮＡの検出方法。
【請求項３】
前記第１のシグナル増幅用プローブの前記核酸領域Ｘの長さが１１〜２０塩基であり、前記核酸領域Ｙの長さが１１〜２０塩基であり、前記核酸領域Ｚの長さが１１〜２６塩基であることを特徴とする請求項１又は２記載のＲＮＡの検出方法。
【請求項４】
前記第１のシグナル増幅用プローブ及び／又は前記第２のシグナル増幅用プローブが標識物質で標識されてなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載のＲＮＡの検出方法。
【請求項５】
前記捕捉物質が、前記ＲＮＡに相補的な塩基配列を含み、且つ担体に固定されているか又は担体に固定可能な部分が導入されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載のＲＮＡの検出方法。
【請求項６】
前記標的ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載のＲＮＡの検出方法。
【請求項７】
前記標的ＲＮＡがマイクロＲＮＡであり、（Ｄ）該マイクロＲＮＡの３’末端にポリＡを付加するポリＡ付加工程を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載のＲＮＡの検出方法。
【請求項８】
標的ＲＮＡを捕捉するための捕捉物質、第１のシグナル増幅用プローブ及び第２のシグナル増幅用プローブを含むＲＮＡの検出用キットであって、
前記第１のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及びポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、
前記第２のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであることを特徴とするＲＮＡの検出用キット。
【請求項９】
第１のシグナル増幅用プローブ及び第２のシグナル増幅用プローブからなる一対のシグナル増幅用プローブであって、
前記第１のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及びポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、
前記第２のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであり、
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法に用いられることを特徴とする一対のシグナル増幅用プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロＲＮＡ（microRNA、miRNA）及びメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）等のＲＮＡの検出方法、検出用キット及び該方法に用いられるシグナル増幅用プローブに関し、特に、ＲＮＡを高感度且つ簡便に検出することができるＲＮＡの検出方法、検出用キット及びシグナル増幅用プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡはヒトを含む様々な真核生物で転写されている低分子ＲＮＡの一種である。ゲノム上の非遺伝子領域やイントロン部分から一次転写産物（pri-miRNA）として転写され、プロセッシングにより、ヘアピン構造のマイクロＲＮＡ前駆体（pre-miRNA）を生成した後、２２塩基程度の成熟型のマイクロＲＮＡ（mature-miRNA）となる（非特許文献１）。このマイクロＲＮＡは、転写されたｍＲＮＡからたんぱく質への翻訳過程における調節因子として働いていることが明らかにされた（非特許文献２）。現在、ヒトゲノム上には８００種以上のマイクロＲＮＡが存在すると予想されているが（非特許文献３）、その調節機能の対象となるメッセンジャー（ｍＲＮＡ）が同定されていないものも多い。【０００３】
しかしこれまでの研究から、多くのマイクロＲＮＡが多細胞生物の発生や分化、細胞増殖などに関与している遺伝子の発現調節を行っていることが明らかになっている（非特許文献４）。また、細胞のがん化やがん抑制機構において機能していると考えられるマイクロＲＮＡも報告され、それらはがん細胞内での発現量が正常細胞と比較して増加もしくは減少しているものも多い（非特許文献５）。そこで、将来的にはマイクロＲＮＡの発現量を調べることで、その細胞や組織のがん化についてのプロファイリングを行うことも可能になると考えられ、今後は細胞や組織でのマイクロＲＮＡの同定、定量を行うことが癌の診断にとって重要な項目のひとつとなると予期される。【０００４】
これまでにマイクロＲＮＡ検出方法として、ノーザン・ブロット法（非特許文献６）、プライマー伸長法（非特許文献７及び８）、インベーダー法（非特許文献９）、リボザイムのシグナル増幅法（非特許文献１０）、mirMASAビーズベースの技術（非特許文献１１）、ビーズベースのフロー・サイトメトリー（非特許文献１２）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（非特許文献１３及び１４）、マイクロアレイ（非特許文献１５）等が報告されており、金粒子を用いたラベル方法（非特許文献１６）が試みられている。また研究用試薬として、ＲＮアーゼプロテクションアッセイを用いたキットも発売されている（非特許文献１７）。【０００５】
しかしながら、上記の方法は、感度が充分でない（ノーザン・ブロット法）、標的となるマイクロＲＮＡ前駆体をＰＣＲによって増幅させる必要がある（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ等）、検出までに時間がかかり操作が煩雑である（ビーズベースのフロー・サイトメトリー、インベーダー法）、多種の標的核酸を同時に解析するのが難しい（プライマー伸長法、インベーダー法）等の問題点がある。【０００６】
一方、メッセンジャーＲＮＡは遺伝子発現の一端を担う核酸であり、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメーラーゼの働きにより合成される（転写）。その後メッセンジャーＲＮＡの持つ遺伝情報を用いてリボソームにより目的タンパク質が合成される（翻訳）。ＤＮＡからタンパク質を発現させるために、非常に重要な要素であるといえる。真核生物のメッセンジャーＲＮＡは他のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）やリボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）とは異なり、５’末端にＣＡＰ構造、３’末端にポリＡを有する。これらの構造はメッセンジャーＲＮＡ自身の分解を制御する働きも持つ。【０００７】
これまで診断の分野においては、主に生化学的なアプローチとして、タンパク質をバイオマーカーとして用いてきた。しかし、タンパク質を検出するための抗体作成が困難な場合もあり、感度や特異性の面で必ずしもタンパク質だけでは、バイオマーカーとして不十分である。そこで、タンパク質を生み出す元となるメッセンジャーＲＮＡの発現が疾病などに関連するバイオマーカーとして用いることができるかどうか研究がなされてきた。メッセンジャーアレイを用いた数千数万のメッセンジャーＲＮＡの発現を検討した結果、ある疾病に特異的なメッセンジャーＲＮＡの発現プロファイルの存在が明らかとなってきた。また、多くのメッセンジャーＲＮＡから得られる発現プロファイルだけでなく、たった一つのメッセンジャーＲＮＡもバイオマーカーとなることがわかっている。例えば、骨髄性白血病関連診断薬としてある遺伝子のメッセンジャーＲＮＡがバイオマーカーとなっており、実際に日本において体外診として保険収載されている。これらのことからもわかるとおり、タンパク質に代わる次世代のバイオマーカーとしてのメッセンジャーＲＮＡの有用性は今後も増してくると考えられる。【０００８】
これまでにメッセンジャーＲＮＡ検出方法として、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＴａｑＭａｎを含むリアルタイムＰＣＲ法、メッセンジャーアレイ、Ｂｒａｎｃｈｅｄ−ＤＮＡ法を用いた方法が報告されている。【０００９】
しかしながら、上記の方法は、標的となるメッセンジャーＲＮＡを逆転写によりＲＮＡからＤＮＡに変換する工程が必要であったり、ＰＣＲによって増幅させる必要がある（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ等）、また、検出までに１日以上かかり操作が煩雑である（メッセンジャーアレイ）、多種の標的核酸を同時に解析するのが難しい（リアルタイムＰＣＲ）等の問題点がある。【００１０】
他方、特許文献１及び２は、酵素を使用しない新規な等温でのシグナル増幅方法を開示している。この方法は、互いに相補的塩基配列領域を保持させた一対のオリゴヌクレオチド・プローブを自己集合反応させてプローブ同士の集合体（プローブポリマー）を形成させる方法であり、該ポリマーを定量することにより、試料中の標的核酸の検出に応用するものである。この方法は、例えば、標的核酸と相補的塩基配列、及びプローブポリマー形成に使用するプローブと相補的な配列の両方を有するプローブ（アシストプローブ）を用いるか、もしくは使用するプローブの相補的塩基配列領域の１箇所を標的核酸と相補的塩基配列とすることにより、該プローブと標的核酸とを直接又は間接的に結合させ、プローブのポリマーを形成させることにより標的核酸を有効に検出する方法であって、パルサー（ＰＡＬＳＡＲ）法と呼ばれている。【００１１】
また、特許文献３は、マイクロＲＮＡを含む低分子核酸を検出する方法を開示している。しかしながら、この方法は、マイクロＲＮＡの修飾を行わないなど利点があるが、感度が数百ａｍｏｌレベルであるため感度面や反応温度に制限があるという問題があった。【００１２】
またさらに、特許文献４では、ＰＡＬＳＡＲ法を用いたメッセンジャーＲＮＡの検出を行っているが、この方法では逆転写反応が必須であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特許第３２６７５７６号公報
【特許文献２】特許第３３１０６６２号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１０／０８７４０９号公報
【特許文献４】国際公開２００４／０７２３０２号
【特許文献５】国際公開０２／０３１１９２号
【特許文献６】特開２００２−３５５０８１号公報
【特許文献７】国際公開２００９／５４３２０号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Kim VN, Nam JW. Genomics of microRNA. Trends Genet. 2006 Mar; 22(3):165-73.
【非特許文献２】Sontheimer, E., J. Assembly and function of RNA silencing complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2005 Feb; 6 127-138
【非特許文献３】Bentwich I, Avniel A, Karov Y, Aharonov R, Gilad S, Barad O, Barzilai A, Einat P, Einav U, Meiri E, Sharon E, Spector Y, Bentwich Z. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 2005 Jul; 37(7):766-70
【非特許文献４】Alvarez-Garcia I, Miska EA. MicroRNA functions in animal development and human disease. Development. 2005 Nov; 132(21):4653-62.
【非特許文献５】Esquela-Kerscher A, Slack FJ. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nat Rev Cancer. 2006 Apr; 6(4):259-269
【非特許文献６】Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., and Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 2003 Feb; 9(2):175-179.
【非特許文献７】Zeng, Y. and Cullen, B.R. Sequence requirements for micro RNA processing and function in human cells. RNA. 2003 Jan; 9(1):112-123.
【非特許文献８】Raymond CK, Roberts BS, Garrett-Engele P, Lim LP, Johnson JM. Simple, quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA. 2005 Nov; 11:1737-1744
【非特許文献９】Allawi, H.T., Dahlberg, J.E., Olson, S., Lund, E., Olson, M., Ma, W.P., Takova, T., Neri, B.P., and Lyamichev, V.I. Quantitation of microRNAs using a modified Invader assay. RNA. 2004 Jul; 10(7):1153-1161.
【非特許文献１０】Hartig, J.S., Grune, I., Najafi-Shoushtari, S.H., and Famulok, M. Sequence-specific detection of MicroRNAs by signal-amplifying ribozymes. J. Am. Chem. Soc. 2004 Jan 28; 126(3): 722-723.
【非特許文献１１】Barad O, Meiri E, Avniel A, Aharonov R, Barzilai A, Bentwich I, Einav U, Gilad S, Hurban P, Karov Y, Lobenhofer EK, Sharon E, Shiboleth YM, Shtutman M, Bentwich Z, Einat P. MicroRNA expression detected by oligonucleotide microarrays: system establishment and expression profiling in human tissues. Genome Res. 2004 Dec; 14(12):2486-94.
【非特許文献１２】Lu J, Getz G, Miska EA, Alvarez-Saavedra E, Lamb J, Peck D, Sweet-Cordero A, Ebert BL, Mak RH, Ferrando AA, Downing JR, Jacks T, Horvitz HR, Golub TR. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 2005 Jun 9; 435(7043):834-8
【非特許文献１３】Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT, Barbisin M, Xu NL, Mahuvakar VR, Andersen MR, Lao KQ, Livak KJ, Guegler KJ. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2005 Nov 27; 33(20):e179.
【非特許文献１４】Tang F, Hajkova P, Barton SC, Lao K, Surani MA. MicroRNA expression profiling of single whole embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 2006 Jan 24; 34(2):e9.
【非特許文献１５】Liu CG, Calin GA, Meloon B, Gamliel N, Sevignani C, Ferracin M, Dumitru CD, Shimizu M, Zupo S, Dono M, Alder H, Bullrich F, Negrini M, Croce CM. An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jan 29; 101(26):9740-4.
【非特許文献１６】Liang RQ, Li W, Li Y, Tan CY, Li JX, Jin YX, Ruan KC. An oligonucleotide microarray for microRNA expression analysis based on labeling RNA with quantum dot and nanogold probe. Nucleic Acids Res. 2005 Jan 31; 33(2):e17.
【非特許文献１７】mirVana miRNA Detection kit (Ambion Inc.)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、マイクロＲＮＡ及びメッセンジャーＲＮＡ等のＲＮＡを高感度且つ簡便に検出することができる、ＲＮＡの検出方法、検出用キット及び該方法に用いられるシグナル増幅用プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を行った結果、驚くべきことに、パルサー法で用いられるハイブリダイゼーション反応のシグナル増幅用プローブにおいて、一つのシグナル増幅用プローブの１領域をチミン（Ｔ）が連続した核酸配列であるポリＴ配列を含む領域としたシグナル増幅用プローブを用い、必要に応じて標的ＲＮＡの３’末端にアデニン（Ａ）が連続した核酸配列であるポリＡを付加した後、捕捉用プローブで捕捉されたＲＮＡと該シグナル増幅用プローブを反応させ、プローブポリマーを含む検出用複合体を形成させ、該プローブポリマーを検出することにより、ＲＮＡを高感度で検出することができることを見出した。【００１７】
即ち、本発明のＲＮＡの検出方法は、（Ａ）３’末端にポリＡ配列を含み得るＲＮＡを、該ＲＮＡを捕捉するための捕捉物質により捕捉する捕捉工程、即ち、ＲＮＡを、該ＲＮＡを捕捉するための捕捉物質により捕捉する捕捉工程と、（Ｂ）前記捕捉されたＲＮＡ、及び自己集合可能な１種又は複数種のシグナル増幅用プローブを反応させ、前記ＲＮＡと、前記捕捉物質と、前記シグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーと、を含む検出用複合体を形成する検出用複合体形成工程と、（Ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出することにより、前記ＲＮＡを検出する検出工程と、を含む標的ＲＮＡを検出する方法であって、前記シグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブが、ポリＴ配列を有することを特徴とする。【００１８】
前記シグナル増幅用プローブのポリＴ配列の長さが１１〜２６塩基であることが好ましい。
前記ポリＴ配列を有するシグナル増幅用プローブが、３’末端に該ポリＴ配列を有することが好適である。【００１９】
前記シグナル増幅用プローブの少なくとも１つが標識物質で標識されてなることが好ましい。【００２０】
前記捕捉物質が、前記ＲＮＡに相補的な塩基配列を含み、且つ担体に固定されているか又は担体に固定可能な部分が導入されていることが好適である。【００２１】
本発明において、前記ハイブリダイゼーション反応としては、特に限定されないが、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有する複数種の核酸プローブを用いてハイブリダイゼーションさせることにより、核酸が自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を含むことがより好適である。【００２２】
即ち、本発明のＲＮＡの検出方法の第１の例としては、（Ａ）ＲＮＡを、該ＲＮＡを捕捉するための捕捉物質により捕捉する捕捉工程と、（Ｂ）前記捕捉されたＲＮＡ、第１のシグナル増幅用プローブ及び第２のシグナル増幅用プローブを反応させ、前記ＲＮＡと、前記捕捉物質と、前記第１のシグナル増幅用プローブ及び前記第２のシグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーと、を含む検出用複合体を形成する工程と、（Ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出することにより、前記ＲＮＡを検出する工程と、を含む、標的ＲＮＡを検出する方法であって、前記第１のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及びポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、前記第２のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであることを特徴とする。【００２３】
前記第１のシグナル増幅用プローブのポリＴ配列の長さが１１〜２６塩基であることが好ましい。
前記第１のシグナル増幅用プローブの前記核酸領域Ｘの長さが１１〜２０塩基であり、前記核酸領域Ｙの長さが１１〜２０塩基であり、前記核酸領域Ｚの長さが１１〜２６塩基であることが好適である。【００２４】
前記第１のシグナル増幅用プローブ及び／又は前記第２のシグナル増幅用プローブが標識物質で標識されてなることが好ましい。【００２５】
本発明において、標的ＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ等のアデニン（Ａ）が連続した核酸配列であるポリＡ配列を有するＲＮＡ、及びポリＡ配列を有しないＲＮＡのいずれも検出可能である。標的ＲＮＡとしてポリＡ配列を有するＲＮＡを検出する場合は、該標的ＲＮＡのポリＡ配列とシグナル増幅用プローブのポリＴ配列がハイブリダイズし、検出用複合体が形成され、該検出用複合体を検出することにより標的ＲＮＡを検出することができる。また、標的ＲＮＡとしてポリＡ配列を有しないＲＮＡ、例えば、ポリＡ配列を有しないマイクロＲＮＡを検出する場合は、前記工程（Ａ）の前後いずれか（好ましくは工程（Ａ）の前）において、（Ｄ）該マイクロＲＮＡの３’末端にポリＡを付加するポリＡ付加工程を行うことにより、ポリＡ付加された標的ＲＮＡのポリＡ配列とシグナル増幅用プローブのポリＴ配列がハイブリダイズし、検出用複合体が形成され、該検出用複合体を検出することにより標的ＲＮＡを検出することができる。【００２６】
本発明のＲＮＡの検出用キットは、標的ＲＮＡを捕捉するための捕捉物質、及び１種又は複数種のシグナル増幅用プローブを含むＲＮＡの検出用キットであって、前記複数種のシグナル増幅用プローブは、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブであって、該複数種のシグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブが、ポリＴ配列を有し、前記１種のシグナル増幅用プローブは、ポリＴ配列を有し且つ３以上の核酸領域を含む１種のシグナル増幅用プローブであって、該１種のシグナル増幅用プローブの各核酸領域が第１領域及び該第１領域に相補的な第２領域を隣接して含むことを特徴とする。【００２７】
前記複数種のシグナル増幅用プローブが、第１のシグナル増幅用プローブと第２のシグナル増幅用プローブとからなり、前記第１のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及びポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、前記第２のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであることが好適である。【００２８】
本発明のシグナル増幅用プローブは、本発明のＲＮＡの検出方法に用いられる１種又は複数種のシグナル増幅用プローブであって、前記複数種のシグナル増幅用プローブは、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブであって、該複数種のシグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブが、ポリＴ配列を有し、前記１種のシグナル増幅用プローブは、ポリＴ配列を有し且つ３以上の核酸領域を含む１種のシグナル増幅用プローブであって、該１種のシグナル増幅用プローブの各核酸領域が第１領域及び該第１領域に相補的な第２領域を隣接して含むことを特徴とする。【００２９】
前記シグナル増幅用プローブのポリＴ配列の長さが１１〜２６塩基であることが好ましい。
前記ポリＴ配列を有するシグナル増幅用プローブが、３’末端に該ポリＴ配列を有することが好適である。【００３０】
前記シグナル増幅用プローブの少なくとも１つが標識物質で標識されてなることが好ましい。【００３１】
前記複数種のシグナル増幅用プローブの第Iの例は、第１のシグナル増幅用プローブ及び第２のシグナル増幅用プローブからなる一対のシグナル増幅用プローブであって、前記第１のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及びポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、前記第２のシグナル増幅用プローブが、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであることを特徴とする。【００３２】
前記複数種のシグナル増幅用プローブの第IIの例は、複数のダイマープローブ又は該ダイマープローブを形成するダイマー形成用プローブであって、前記複数のダイマープローブの各ダイマープローブは２種のダイマー形成用プローブから形成されたダイマーであり、各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、該２種のダイマー形成用プローブは中央領域が互いに相補的であり且つ該３’側領域及び該５’側領域が互いに非相補的であり、前記複数のダイマープローブの各ダイマープローブの各５’側領域は他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的であり且つ各ダイマープローブの各３’側領域は他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的であることを特徴とする。【００３３】
前記シグナル増幅用プローブの前記５’側領域の長さが１１〜２０塩基であり、前記中央領域の長さが１１〜２０塩基であり、前記３’側領域の長さが１１〜２６塩基であることが好適である。【００３４】
前記複数種のシグナル増幅用プローブの第IIIの例は、一対のダイマー形成用プローブもしくは該一対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを１組以上と、１以上の架橋プローブと、を含み、前記各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、前記各一対のダイマー形成用プローブの中央領域は互いに相補的であり、前記各一対のダイマー形成用プローブのそれぞれの３’側領域及び５’側領域は全て互いに非相補的であり、前記各架橋プローブは５’側領域及び３’側領域の２領域を含み、前記各架橋プローブの３’側領域は前記各ダイマー形成用プローブの３’側領域とそれぞれ相補的であり、前記各架橋プローブの５’側領域は前記各ダイマー形成用プローブの５’側領域とそれぞれ相補的であることを特徴とする。【００３５】
前記シグナル増幅用プローブの前記５’側領域の長さが１１〜２０塩基であり、前記中央領域の長さが１１〜２０塩基であり、前記３’側領域の長さが１１〜２６塩基であることが好適である。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、標的ＲＮＡを高感度且つ簡便に検出することができる、ＲＮＡの検出方法、検出用キット及び該方法に用いられるハイブリダイゼーション反応のシグナル増幅用プローブを提供することができる。本発明は逆転写反応が不要であり、且つプローブポリマーと標的ＲＮＡを繋ぐ為のアシストプローブを必要とせず、簡易に標的ＲＮＡを検出することができる。また、本発明によれば、マイクロＲＮＡとｍＲＮＡ等の複数種の標的ＲＮＡの同時検出も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明のＲＮＡの検出方法の第１の態様の例を示す概略説明図であり、（ａ）は捕捉工程後の捕捉物質により捕捉されたメッセンジャーＲＮＡ、（ｂ）は検出用複合体形成工程後の検出用複合体をそれぞれ示す。
【図２】プローブポリマー形成に用いられるシグナル増幅用プローブの第Iの例の一例を示す概略説明図である。
【図３】図２記載のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。
【図４】プローブポリマー形成に用いられるシグナル増幅用プローブの第IIの例の第１の例を示す概略説明図である。
【図５】図４記載のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。
【図６】プローブポリマー形成に用いられるシグナル増幅用プローブの第IIの例の第２の例を示す概略説明図である。
【図７】プローブポリマー形成に用いられるシグナル増幅用プローブの第IIの例の第３の例を示す概略説明図である。
【図８】プローブポリマー形成に用いられるシグナル増幅用プローブの第IIIの例の第１の例を示す概略説明図である。
【図９】図８記載のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。
【図１０】プローブポリマー形成に用いられるシグナル増幅用プローブの第IIIの例の第２の例を示す概略説明図である。
【図１１】図１０記載のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。
【図１２】プローブポリマー形成に用いられるシグナル増幅用プローブの第IIIの例の第３の例を示す概略説明図である。
【図１３】図１２記載のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。
【図１４】プローブポリマー形成に用いられるシグナル増幅用プローブの第IIIの例の第４の例を示す概略説明図である。
【図１５】プローブポリマー形成に用いられるシグナル増幅用プローブの第IVの例の一例を示す概略説明図である。
【図１６】図１５記載のシグナル増幅用プローブの結合様式を示す概略説明図である。
【図１７】図１５記載のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。
【図１８】本発明のＲＮＡの検出方法の第２の態様の例を示す概略説明図であり、（ａ）はマイクロＲＮＡ、（ｂ）はポリＡ付加工程後のポリＡ付加されたマイクロＲＮＡ、（ｃ）は捕捉工程後の捕捉物質により捕捉されたマイクロＲＮＡ、（ｄ）は検出用複合体形成工程後の検出用複合体をそれぞれ示す。
【図１９】実施例１の結果を示すグラフである。
【図２０】比較例１の結果を示すグラフである。
【図２１】実施例２の結果を示すグラフである。
【図２２】比較例２の結果を示すグラフである。
【図２３】実施例２及び比較例２の結果の相関図を示すグラフである。
【図２４】実施例３の結果を示すグラフである。
【図２５】実施例４の結果を示すグラフである。
【図２６】実施例５の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。
【００３９】
本発明のＲＮＡの検出方法は、（Ａ）ＲＮＡを、該ＲＮＡを捕捉するための捕捉物質により捕捉する捕捉工程と、（Ｂ）前記捕捉されたＲＮＡ、及び自己集合可能な１種又は複数種のシグナル増幅用プローブを反応させ、前記ＲＮＡと、前記捕捉物質と、前記シグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーと、を含む検出用複合体を形成する検出用複合体形成工程と、（Ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出することにより、前記マイクロＲＮＡを検出する検出工程と、を含む標的ＲＮＡを検出する方法であって、前記シグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブが、ポリＴ配列を有することを特徴とする。
【００４０】
本発明において、標的ＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ等のアデニン（Ａ）が連続した核酸配列であるポリＡ配列を有するＲＮＡ、及びポリＡ配列を有しないＲＮＡのいずれも検出可能である。標的ＲＮＡとしてポリＡ配列を有するＲＮＡを検出する場合は、該標的ＲＮＡのポリＡ配列とシグナル増幅用プローブのポリＴ配列がハイブリダイズし、検出用複合体が形成され、該検出用複合体を検出することにより標的ＲＮＡを検出することができる。また、標的ＲＮＡとしてポリＡ配列を有しないＲＮＡ、例えば、ポリＡ配列を有しないマイクロＲＮＡを検出する場合は、前記工程（Ａ）の前後いずれか（好ましくは工程（Ａ）の前）において、（Ｄ）該マイクロＲＮＡの３’末端にポリＡを付加するポリＡ付加工程を行うことにより、ポリＡ付加された標的ＲＮＡのポリＡ配列とシグナル増幅用プローブのポリＴ配列がハイブリダイズし、検出用複合体が形成され、該検出用複合体を検出することにより標的ＲＮＡを検出することができる。
【００４１】
本発明のＲＮＡの検出方法の第１の態様として、標的ＲＮＡがポリＡテールを有するメッセンジャーＲＮＡの場合を以下に説明する。
本発明のＲＮＡの検出方法の第１の態様は、標的ＲＮＡがポリＡテールを有するメッセンジャーＲＮＡであり、（Ａ）ポリＡテールを有するメッセンジャーＲＮＡ、及び前記メッセンジャーＲＮＡを捕捉するための捕捉物質を反応させ、前記メッセンジャーＲＮＡを捕捉する捕捉工程と、（Ｂ）前記捕捉されたメッセンジャーＲＮＡ、及び１種又は複数種のシグナル増幅用プローブを反応させ、前記メッセンジャーＲＮＡと、前記捕捉物質と、前記シグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーと、を含む検出用複合体を形成する検出用複合体形成工程と、（Ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出することにより、前記メッセンジャーＲＮＡを検出する検出工程と、を含むメッセンジャーＲＮＡの検出方法であって、前記複数種のシグナル増幅用プローブは、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブであって、該複数種のシグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブが、ポリＴ配列を有し、前記１種のシグナル増幅用プローブは、ポリＴ配列を有し且つ３以上の核酸領域を含む１種のシグナル増幅用プローブであって、該１種のシグナル増幅用プローブの各核酸領域が第１領域及び該第１領域に相補的な第２領域を隣接して含むことを特徴とする。
【００４２】
本発明の第Iの例としては、第１のシグナル増幅用プローブ及び第２のシグナル増幅用プローブからなる一対のシグナル増幅用プローブを用いて、ＲＮＡを検出するものである。
図１は、本発明のＲＮＡの検出方法の第１の態様の例を示す概略説明図であり、（ａ）は捕捉工程後の捕捉物質により捕捉されたメッセンジャーＲＮＡ、（ｂ）は検出用複合体形成工程後の検出用複合体をそれぞれ示す。図２は、プローブポリマー形成に用いられる一対のシグナル増幅用プローブの一例を示す概略説明図であり、図３は、図２記載の一対のシグナル増幅用プローブを用いて形成されるプローブポリマーを示す概略説明図である。
【００４３】
図１において符号１０ａはメッセンジャーＲＮＡである。本発明は、３’末端にポリＡを有するメッセンジャーＲＮＡの検出に好適に用いられるものであり、３００〜７０００塩基のメッセンジャーＲＮＡの検出に好適に用いられ、３００〜３０００塩基程度のメッセンジャーＲＮＡの検出に特に好適に用いられる。また、同時に多種の核酸分子を検出することも出来る。
【００４４】
図１（ａ）に示した如く、ポリＡを有するメッセンジャーＲＮＡ１０ａと、標的メッセンジャーＲＮＡ１０ａを捕捉するための捕捉物質１４を反応させ、メッセンジャーＲＮＡ１０ａを捕捉する捕捉工程を行う［工程（Ａ）］。
【００４５】
捕捉物質１４は、標的メッセンジャーＲＮＡと特異的に結合可能な物質であればよく、特に制限はないが、標的メッセンジャーＲＮＡ１０ａに相補的な塩基配列を含み、且つ担体１６に固定されているか又は担体１６に固定可能な部分が導入されていることが好適である。
前記担体１６としては、例えば、蛍光微小粒子、磁気粒子、マイクロプレート、マイクロアレイ、スライドガラス、電気伝導性基板等の基板を用いることが好ましい。なお、図１は微小粒子を用いた場合の例を示したが、本発明において担体１６は特に限定されないものである。なお、図１では、標的メッセンジャーＲＮＡ１０ａに相補的な塩基配列を含む捕捉用核酸プローブに直接担体１６を結合させた例を示したが、他の核酸プローブや有機物等を介して捕捉用核酸プローブと担体１６とを結合せしめてもよい。例えば、捕捉用核酸プローブが捕捉領域Ｋをさらに有するように構成し、該捕捉領域Ｋに相補的な領域Ｋ’を有する第２の捕捉用プローブを固定化した担体１６を用いてもよい。
【００４６】
次に、図１（ｂ）に示した如く、前記捕捉されたメッセンジャーＲＮＡ１０ａ、第１のシグナル増幅用プローブ１８ａ及び第２のシグナル増幅用プローブ１８ｂを反応させ、前記メッセンジャーＲＮＡ１０ａと、前記捕捉物質１４と、前記第１のシグナル増幅用プローブ１８ａ及び前記第２のシグナル増幅用プローブ１８ｂにより形成されたプローブポリマー２２と、を含む検出用複合体３０を形成する検出用複合体形成工程を行った後［工程（Ｂ）］、前記検出用複合体３０に結合した前記プローブポリマー２２を検出することにより、前記メッセンジャーＲＮＡを検出する検出工程を行い［工程（Ｃ）］、メッセンジャーＲＮＡを検出する。
【００４７】
図２及び図１（ｂ）に示した如く、前記第１のシグナル増幅用プローブ１８ａは、５’末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及びポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、前記第２のシグナル増幅用プローブ１８ｂは、５’末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブである。前記第１のシグナル増幅用プローブ１８ａと前記第２のシグナル増幅用プローブ１８ｂを反応させることにより、図３に示した如く、第１のシグナル増幅用プローブ１８ａと第２のシグナル増幅用プローブ１８ｂが自己集合し、集合体（プローブポリマー２２）が形成される。
【００４８】
本発明で用いられる第１のシグナル増幅用プローブ１８ａは、ポリＴ配列を含む核酸領域Ｚを有している為、ポリＡテールを有するメッセンジャーＲＮＡ１０ａと結合可能である。よって、図１（ｂ）に示した如く、捕捉されたポリＡテールを有するメッセンジャーＲＮＡ１０ａ、第１のシグナル増幅用プローブ１８ａ及び第２のシグナル増幅用プローブ１８ｂを反応させることにより、メッセンジャーＲＮＡ１０ａと、前記捕捉物質１４と、第１のシグナル増幅用プローブ１８ａ及び前記第２のシグナル増幅用プローブ１８ｂにより形成されたプローブポリマー２２と、を含む検出用複合体３０が形成され、該プローブポリマー２２を検出することにより、高感度且つ簡便にメッセンジャーＲＮＡを検出することができる。プローブポリマーの検出方法は特に限定されず、例えば、蛍光、発光、発色等により検出することが好適である。
なお、図１では、予め担体１６に固定化させた捕捉物質１４を用いた例を示したが、捕捉物質１４を担体１６に固定化させる時期は特に制限はなく、複合体形成時又は複合体形成後に捕捉物質１４と担体１６とを直接又は間接的に結合せしめてもよい。
【００４９】
第１のシグナル増幅用プローブ１８ａ及び第２のシグナル増幅用プローブ１８ｂにおいて各核酸領域の長さは特に制限はないが、５塩基以上が好ましく、８塩基以上がより好ましく、核酸領域Ｘ及びＸ’の長さが１１〜２０塩基であり、前記核酸領域Ｙ及びＹ’の長さが１１〜２０塩基であり、前記核酸領域Ｚ及びＺ’の長さが１１〜２６塩基であることが特に好ましい。それぞれのプローブにおける各核酸領域の長さは同じであっても異なっていてもよいが、同じであることが望ましい。また、図１〜図３では、相補的な核酸領域の数が３である一対のシグナル増幅用プローブを用いた例を示したが、相補的な核酸領域の数が４以上である一対のシグナル増幅用プローブを用いてもよい。
【００５０】
本発明に用いられるシグナル増幅用プローブの第IIの例として、自己集合可能な複数のダイマープローブ又は該ダイマープローブを形成するダイマー形成用プローブが挙げられる。該複数のダイマープローブは、複数のダイマープローブの１つのダイマープローブの各５’側領域は他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的であり且つ前記複数のダイマープローブの１つのダイマープローブの各３’側領域は他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的であるように構成されており、自ら自己集合して集合体（プローブポリマー）を形成することができるものであり、例えば、特許文献５記載の核酸プローブが用いられる。
【００５１】
図４及び図５は２組のダイマープローブ（第１ダイマープローブ４０ａ，第２ダイマープローブ４０ｂ）を用いた場合の一例を示した。
図４（ａ）に示した如く、第１ダイマープローブ４０ａは２種の一本鎖核酸プローブ（第１ダイマー形成用プローブ４１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ４１ｂ）をハイブリダイズさせることにより形成される。第１ダイマー形成用プローブ４１ａは、５’側領域（領域Ａ）、中央領域（領域Ｂ）及び３’側領域（領域Ｃ）の３領域を含み、第２ダイマー形成用プローブ４１ｂは、５’側領域（領域Ｄ）、中央領域（領域Ｂ’）及び３’側領域（領域Ｆ）の３領域を含み、第１ダイマー形成用プローブ４１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ４１ｂは、中央領域（領域Ｂ及びＢ’）が互いに相補的であり且つ該３’側領域（領域Ｃ及びＦ）及び該５’側領域（領域Ａ及びＤ）が互いに非相補的である。
【００５２】
図４（ｂ）に示した如く、第２ダイマープローブ４０ｂは、２種の一本鎖核酸プローブ（第３ダイマー形成用プローブ４１ｃ及び第４ダイマー形成用プローブ４１ｄ）をハイブリダイズさせることにより形成される。第３ダイマー形成用プローブ４１ｃは、５’側領域（領域Ａ’）、中央領域（領域Ｅ）及び３’側領域（領域Ｃ’）の３領域を含み、第４ダイマー形成用プローブ４１ｄは、５’側領域（領域Ｄ’）、中央領域（領域Ｅ’）及び３’側領域（領域Ｆ’）の３領域を含み、第３ダイマー形成用プローブ４１ｃ及び第４ダイマー形成用プローブ４１ｄは、中央領域（領域Ｅ及びＥ’）が互いに相補的であり且つ該３’側領域（領域Ｃ’及びＦ’）及び該５’側領域（領域Ａ’及びＤ’）が互いに非相補的である。
なお、本発明において、領域Ａ’は領域Ａに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｃ’は領域Ｃに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｄ’は領域Ｄに相補的な塩基配列を有する領域を、領域Ｆ’は領域Ｆに相補的な塩基配列を有する領域を、それぞれ意味する。
【００５３】
第１ダイマープローブ４０ａの５’側領域（領域Ａ及びＤ）は第２ダイマープローブ４０ｂの５’側領域（領域Ａ’及びＤ’）と相補的であり、第１ダイマープローブ４０ａの３’側領域（領域Ｃ及びＦ）は第２ダイマープローブ４０ｂの３’側領域（領域Ｃ’及びＦ’）と相補的であり、前記第１及び第２ダイマープローブ４０ａ及び４０ｂをハイブリダイズさせることにより、シグナルプローブポリマー５０を形成することができる（図５）。
【００５４】
図４では、第１ダイマー形成用プローブ４１ａの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第３ダイマー形成用プローブ４１ｃの５’側領域及び３’側領域と相補的とし、第２ダイマー形成用プローブ４１ｂの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第４ダイマー形成用プローブ４１ｄの５’側領域及び３’側領域と相補的とした例を示したが、本発明において、ダイマープローブは、１つのダイマープローブの５’側領域が他のダイマープローブの５’側領域と相補的であり且つ１つのダイマープローブの３’側領域が他のダイマープローブの３’側領域と相補的であればよいものである。
【００５５】
図６は、図４記載の第１ダイマープローブ４０ａと共に用いられる第２ダイマープローブの他の例（第２の例）を示す概略説明図である。
図６に示した如く、５’側領域が図４記載の第１ダイマー形成用プローブ４１ａの５’側領域に相補的な領域（領域Ａ’）であり且つ３’側領域が図４記載の第２ダイマー形成用プローブ４１ｂの３’側領域に相補的な領域（領域Ｆ’）であるダイマー形成用プローブ４１ｅと、５’側領域が図４記載の第２ダイマー形成用プローブ４１ｂの５’側領域に相補的な領域（領域Ｄ’）であり且つ３’側領域が図４記載の第１ダイマー形成用プローブ４１ａの３’側領域に相補的な領域（領域Ｃ’）であるダイマー形成用プローブ４１ｆと、をハイブリダイズさせて形成させたダイマープローブ４０ｃを、第２ダイマープローブとして用いることもできる。
【００５６】
また、図４では、２種類のダイマープローブを使用した例を示したが、相補的な領域の位置関係を工夫すれば、さらに多種類のダイマープローブを使用することもできる（特許文献５）。
図７は、３組のダイマープローブ（第１ダイマープローブ４０ａ，第２ダイマープローブ４０ｄ，第３ダイマープローブ４０ｅ）を用いた場合の一例（第３の例）を示す概略説明図である。
図７（ａ）において、第１ダイマープローブ４０ａは図４（ａ）と同様に構成されている。
図７（ｂ）において、第２ダイマープローブ４０ｄは、２種の一本鎖核酸プローブ（ダイマー形成用プローブ４１ｇ，４１ｈ）をハイブリダイズさせることにより形成される。ダイマー形成用プローブ４１ｇは、５’側領域（領域Ｇ）、中央領域（領域Ｅ）及び３’側領域（領域Ｃ’）の３領域を含み、３’側領域（領域Ｃ’）が第１ダイマープローブ４０ａの３’側領域（領域Ｃ）と相補的である。ダイマー形成用プローブ４１ｈは、５’側領域（領域Ｄ’）、中央領域（領域Ｅ’）及び３’側領域（領域Ｈ）の３領域を含み、５’側領域（領域Ｄ’）が第１ダイマープローブ４０ａの５’側領域（領域Ｄ）と相補的である。ダイマー形成用プローブ４１ｇの中央領域Ｅは、ダイマー形成用プローブ４１ｈの中央領域Ｅ’と相補的である。
【００５７】
図７（ｃ）において、第３ダイマープローブ４０ｅは、２種の一本鎖核酸プローブ（ダイマー形成用プローブ４１ｊ，４１ｋ）をハイブリダイズさせることにより形成される。ダイマー形成用プローブ４１ｊは、５’側領域（領域Ａ’）、中央領域（領域Ｊ）及び３’側領域（領域Ｈ’）の３領域を含み、５’側領域（領域Ａ’）が第１ダイマープローブ４０ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、３’側領域（領域Ｈ’）が第２ダイマープローブ４０ｄの３’側領域（領域Ｈ）と相補的である。ダイマー形成用プローブ４１ｋは、５’側領域（領域Ｇ’）、中央領域（領域Ｊ’）及び３’側領域（領域Ｆ’）の３領域を含み、５’側領域（領域Ｇ’）が第２ダイマープローブ４０ｄの５’側領域（領域Ｇ）と相補的であり、３’側領域（領域Ｆ’）が第１ダイマープローブ４０ａの３’側領域（領域Ｆ）と相補的である。なお、図中、領域J’は領域Ｊに相補的な領域である。
【００５８】
即ち、図７において、第１ダイマープローブの１つの５’側領域及び１つの３’側領域は、第２ダイマープローブの１つの５’側領域及び１つの３’側領域と相補的であり、第１ダイマープローブの他の５’側領域及び他の３’側領域は、第３ダイマープローブの１つの５’側領域及び１つの３’側領域と相補的であり、第２ダイマープローブの他の５’側領域及び他の３’側領域は、第３ダイマープローブの他の５’側領域及び他の３’側領域と相補的であるように構成されている。
【００５９】
図７に示した如く、各ダイマープローブの各３’側領域をそれぞれ他のダイマープローブのいずれかの３’側領域と相補的とし、且つ各ダイマープローブの各５’側領域をそれぞれ他のダイマープローブのいずれかの５’側領域と相補的となるように構成した複数種のダイマープローブを用いて、これら複数種のダイマープローブをハイブリダイズさせることにより、ダイマープローブの集合体であるシグナルプローブポリマーが形成される。
なお、本発明において、相補的な関係を有するダイマープローブの組み合わせに特に制限はないが、図７に示した如く、各ダイマープローブ中の１つの３’側領域及び１つの５’側領域が、他の１つのダイマープローブ中の１つの３’側領域及び１つの５’側領域とそれぞれ相補的となるように構成することが好ましい。
【００６０】
ダイマー形成用プローブの各相補的な領域の長さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましくは少なくとも８塩基、さらに好ましくは１０塩基〜１００塩基、さらに好ましくは１２〜３０塩基である。また、それぞれのプローブにおける相補的な領域の長さは同じであることが望ましい。
【００６１】
本発明において、ダイマープローブの代わりに、ダイマープローブ形成前のダイマー形成用プローブを用いてもよいが、ダイマープローブを用いることが好ましい。なお、シグナル増幅用プローブの第IIの例のいずれかの３’領域（例えば、領域Ｃ、Ｆ、Ｈ）にポリＴ配列を含み、これに相補的な領域（例えば、領域Ｃ’、Ｆ’、Ｈ’）にポリＡ配列を含む。
【００６２】
本発明に用いられるシグナル増幅用プローブの第IIIの例として、一対のダイマー形成用プローブもしくは該一対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを１組以上と、１種以上の架橋プローブと、を含む複数種のシグナル増幅用プローブが挙げられる。前記各ダイマー形成用プローブは、５’側領域、中央領域及び３’側領域の３領域を含み、前記各一対のダイマー形成用プローブの中央領域は互いに相補的であり、前記各一対のダイマー形成用プローブのそれぞれの３’側領域及び５’側領域は全て互いに非相補的であり、前記各架橋プローブは５’側領域及び３’側領域の２領域を含み、前記各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、前記各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、前記架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、該架橋プローブが、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能なように構成されており、自ら自己集合して集合体（プローブポリマー）を形成することができるものであり、例えば、特許文献６記載の核酸プローブが用いられる。
【００６３】
図８は、１組の一対のダイマー形成用プローブ、及び１組の一対の架橋プローブを用いた場合の第１の例を示した。
図８において、（ａ）は１組の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ６１ａ，第２ダイマー形成用プローブ６１ｂ）、並びに該一対のダイマー形成用プローブ６１ａ，６１ｂから形成されるダイマープローブ６０ａである。
【００６４】
図８（ａ）に示した如く、一対のダイマー形成用プローブは、２種の一本鎖核酸プローブ（第１ダイマー形成用プローブ６１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ６１ｂ）からなり、各ダイマー形成用プローブ６１ａ，６１ｂは、中央領域、該中央領域より５’側に位置する５’側領域、及び該中央領域より３’側に位置する３’側領域の少なくとも３領域を含む。図８中、第１ダイマー形成用プローブ６１ａの５’側領域を領域Ａ、中央領域を領域Ｂ、３’側領域を領域Ｃで示し、第２ダイマー形成用プローブ６１ｂの５’側領域を領域Ｄ、中央領域を領域Ｂ’、３’側領域を領域Ｆで示した。第１ダイマー形成用プローブ６１ａと第２ダイマー形成用プローブ６１ｂの中央領域（領域Ｂ及びＢ’）は互いに相補的であり、第１ダイマー形成用プローブ６１ａ及び第２ダイマー形成用プローブ６１ｂのそれぞれの５’側領域（領域Ａ及びＤ）及び３’側領域（領域Ｃ及びＦ）の４領域は全て互いに非相補的であり、両者をハイブリダイズさせることにより、１組のダイマープローブ６０ａが形成される。
【００６５】
本発明において、予め一対のダイマー形成用プローブをハイブリダイズさせて形成させたダイマープローブを用いてもよく、ダイマー形成用プローブをそのまま用いてもよいが、ダイマープローブを用いることが好ましい。
【００６６】
複数組の一対のダイマー形成用プローブを用いる場合、前述した１組の場合と同様に各組の一対のダイマー形成用プローブを構成する。複数組の一対のダイマー形成用プローブにより同数組のダイマープローブが形成される。
【００６７】
図１４（ａ），（ｂ）は、２組の一対のダイマー形成用プローブの一例及び該一対のダイマー形成用プローブから形成される２組のダイマープローブを示す概略説明図である。図１４において、（ａ）は１組目の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ７１ａ，第２ダイマー形成用プローブ７１ｂ）、並びに該一対のダイマー形成用プローブ７１ａ，７１ｂから形成されるダイマープローブ７０ａであり、（ｂ）は２組目の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ７１ｃ，第２ダイマー形成用プローブ７１ｄ）、並びに該一対のダイマー形成用プローブ７１ｃ，７１ｄから形成されるダイマープローブ７０ｂである。
図１４中、１組目の第１ダイマー形成用プローブ７１ａの５’側領域を領域Ａ、中央領域を領域Ｂ、３’側領域を領域Ｃで示し、１組目の第２ダイマー形成用プローブ７１ｂの５’側領域を領域Ｄ、中央領域を領域Ｂ’、３’側領域を領域Ｆで示し、２組目の第１ダイマー形成用プローブ７１ｃの５’側領域を領域Ｇ、中央領域を領域Ｅ、３’側領域を領域Ｈで示し、２組目の第２ダイマー形成用プローブ７１ｄの５’側領域を領域Ｉ、中央領域を領域Ｅ’、３’側領域を領域Ｊで示した。各組の第１及び第２ダイマー形成用プローブの中央領域（領域Ｂ及びＢ’、領域Ｅ及びＥ’）はそれぞれ互いに相補的であり、各一対の第１及び第２ダイマー形成用プローブの５’側領域及び３’側領域の４領域（領域Ａ、Ｃ、Ｄ及びＦ、領域Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪ）は全て互いに非相補的であり、各組の一対のダイマー形成用プローブ７１ａ，７１ｂ，７１ｃ，７１ｄをハイブリダイズさせることにより、２組のダイマープローブ７０ａ，７０ｂが形成される。本発明において、用いるダイマー形成用プローブの３’側領域及び５’側領域が全て互いに非相補的であることが好ましい。
【００６８】
本発明において、架橋プローブはダイマー形成用プローブから形成されるダイマープローブを架橋することができる１種以上の一本鎖核酸プローブであり、少なくとも２領域を含む。該２領域の内、５’側に位置する領域を５’側領域と称し、３’側に位置する領域を３’側領域と称する。本発明において、各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的である。該構成とすることにより、架橋プローブは、ダイマー形成用プローブから形成される１種以上の複数のダイマープローブを架橋するように、ダイマー形成用プローブに結合し、プローブの集合体（プローブポリマー）を形成することができる。
【００６９】
１組の一対のダイマー形成用プローブを用いる場合、１組の一対の架橋プローブを用いることが好ましい。１組の一対のダイマー形成用プローブ（第１ダイマー形成用プローブ及び第２ダイマー形成用プローブ）及び１組の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ及び第２架橋プローブ）は、一対のダイマー形成用プローブの各５’側領域が、一対の架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、且つ一対の架橋プローブの各５’側領域が、一対のダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、一対のダイマー形成用プローブの各３’側領域が、一対の架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、且つ一対の架橋プローブの各３’側領域が、一対のダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であるように構成される。
【００７０】
図８（ｂ）は、図８（ａ）記載の一対のダイマー形成用プローブ６１ａ，６１ｂと共に用いられる１組の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ６２ａ及び第２架橋プローブ６２ｂ）の一例を示す概略説明図である。
図８（ａ）記載の１組の一対のダイマー形成用プローブ６１ａ，６１ｂと共に用いられる架橋プローブとしては、例えば、図８（ｂ）に示した如く、第１架橋プローブ６２ａの５’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ６１ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、第１架橋プローブ６２ａの３’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ６１ａの３’側領域（領域Ｃ）と相補的であり、第２架橋プローブ６２ｂの５’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ６１ｂの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり、第２架橋プローブ６２ｂの３’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ６１ｂの３’側領域（領域Ｆ）と相補的である、一対の架橋プローブが好適である。図８（ａ）記載のダイマー形成用プローブ６１ａ−６１ｂ及び図８（ｂ）記載の架橋プローブ６２ａ−６２ｂをハイブリダイズさせることにより、シグナルプローブポリマー６８を形成することができる（図９）。
【００７１】
図８では、第１ダイマー形成用プローブ６１ａの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第１架橋プローブ６２ａの５’側領域及び３’側領域と相補的とし、第２ダイマー形成用プローブ６１ｂの５’側領域及び３’側領域をそれぞれ第２架橋プローブ６２ｂの５’側領域及び３’側領域と相補的とした例を示したが、本発明において、１つのダイマー形成用プローブの５’側領域が１つの架橋プローブの５’側領域と相補的であり且つ１つのダイマー形成用プローブの３’側領域が１つの架橋プローブの３’側領域と相補的であればよいものである。
【００７２】
図１０は、図８記載の一対のダイマー形成用プローブ６１ａ，６１ｂと共に用いられる１組の一対の架橋プローブの他の例（第１架橋プローブ６２ｃ及び第２架橋プローブ６２ｄ）（第２の例）を示す概略説明図である。
図１０に示した如く、一対の架橋プローブの他の例として、第１架橋プローブ６２ｃの５’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ６１ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、第１架橋プローブ６２ｃの３’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ６１ｂの３’側領域（領域Ｆ）と相補的であり、第２架橋プローブ６２ｄの５’側領域は、第２ダイマー形成用プローブ６１ｂの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり、第２架橋プローブ６２ｄの３’側領域は、第１ダイマー形成用プローブ６１ａの３’側領域（領域Ｃ）と相補的である、一対の架橋プローブが挙げられる。図８（ａ）記載のダイマー形成用プローブ６１ａ−６１ｂ及び図１０記載の架橋プローブ６２ｃ−６２ｄをハイブリダイズさせることにより、シグナルプローブポリマー６８を形成することができる（図１１）。
【００７３】
複数組の一対のダイマー形成用プローブを用いる場合、同数組の一対の架橋プローブを用いることが好ましい。具体的には、ｎ組（ｎは２以上の整数）の一対のダイマー形成用プローブ（即ち、２ｎ個のダイマー形成用プローブ）及びｎ組の一対の架橋プローブ（即ち、２ｎ個の架橋プローブ）を用い、各ダイマー形成用プローブの５’側領域は、架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、且つ各架橋プローブの５’側領域は、ダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各ダイマー形成用プローブの３’側領域は、架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、且つ各架橋プローブの３’側領域は、前記ダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であるでるように構成することが好適である。
【００７４】
図１４（ｃ）（ｄ）は、図１４（ａ）（ｂ）記載の２組の一対のダイマー形成用プローブ７１ａ−７１ｄと共に用いられる２組の一対の架橋プローブ７２ａ−７２ｄの一例を示す概略説明図である。図１４において、（ｃ）は１組目の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ７２ａ，第２架橋プローブ７２ｂ）であり、（ｄ）は２組目の一対の架橋プローブ（第１架橋プローブ７２ｃ，第２架橋プローブ７２ｄ）である。
図１４に示した如く、２組の一対のダイマー形成用プローブ７１ａ−７１ｄと共に用いられる架橋プローブとしては、２組の一対の架橋プローブ（即ち、４種の架橋プローブ）を用い、各ダイマー形成用プローブの５’側領域が架橋プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各架橋プローブの５’側領域がダイマー形成用プローブのいずれかの５’側領域と相補的であり、各ダイマー形成用プローブの３’側領域が架橋プローブのいずれかの３’側領域と相補的であり、各架橋プローブの３’側領域がダイマー形成用プローブのいずれかの３’側領域と相補的であるように構成することが好適である。
【００７５】
具体的には、図１４に示した如く、１組目の第１架橋プローブ７２ａの５’側領域は、１組目の第１ダイマー形成用プローブ７１ａの５’側領域（領域Ａ）と相補的であり、１組目の第２架橋プローブ７２ｂの５’側領域は、１組目の第２ダイマー形成用プローブ７１ｂの５’側領域（領域Ｄ）と相補的であり、２組目の第１架橋プローブ７２ｃの５’側領域は、２組目の第１ダイマー形成用プローブ７１ｃの５’側領域（領域Ｇ）と相補的であり、２組目の第２架橋プローブ７２ｄの５’側領域は、２組目の第２ダイマー形成用プローブ７１ｄの５’側領域（領域Ｉ）と相補的であり、１組目の第１架橋プローブ７２ａの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ７１ａ−７１ｄのいずれか１つの３’側領域と相補的であり（図１４では、領域Ｈと相補的である場合を示した）、１組目の第２架橋プローブ７２ｂの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ７１ａ−７１ｄ中、１組目の第１架橋プローブ７２ａで選択したものを除くいずれか１つの３’側領域と相補的であり（図１４では、領域Ｊと相補的である場合を示した）、２組目の第１架橋プローブ７２ｃの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ７１ａ−７１ｄ中、１組目の第１及び第２架橋プローブ７２ａ−７２ｂで選択したものを除くいずれか１つの３’側領域と相補的であり（図１４では、領域Ｃと相補的である場合を示した）、２組目の第２架橋プローブ７２ｄの３’側領域は、４種のダイマー形成用プローブ７１ａ−７１ｄ中、１組目の第１及び第２架橋プローブ７２ａ−７２ｂ及び２組目の第１架橋プローブ７２ｃで選択したものを除く１つの３’側領域と相補的である（図１４では、領域Ｆと相補的である場合を示した）、２組の一対の架橋プローブが好適である。図１４記載のダイマー形成用プローブ７１ａ−７１ｄ及び架橋プローブ７２ａ−７２ｄをハイブリダイズさせることにより、シグナルプローブポリマー６８を形成することができる。
【００７６】
なお、図１４では、１組目の第１架橋プローブ７２ａの３’側領域は、２組目の第１ダイマー形成用プローブ７１ｃの３’側領域と相補的であり、１組目の第２架橋プローブ７２ｂの３’側領域は、２組目の第２ダイマー形成用プローブ７１ｄの３’側領域と相補的であり、２組目の第１架橋プローブ７２ｃの３’側領域は、１組目の第１ダイマー形成用プローブ７１ａの３’側領域と相補的であり、２組目の第２架橋プローブ７２ｄの３’側領域は、１組目の第２ダイマー形成用プローブ７１ｂの３’側領域と相補的である場合を示したが、各架橋プローブの３’側領域と相補的となるダイマー形成用プローブの３側領域の組み合わせに制限はないものである。
【００７７】
ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブの各相補的な領域の長さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましくは少なくとも８塩基、さらに好ましくは１０塩基〜１００塩基、さらに好ましくは１２〜３０塩基である。また、それぞれのプローブにおける相補的な領域の長さは同じであることが望ましい。なお、シグナル増幅用プローブの第IIIの例において、いずれかの３’側領域（例えば、領域Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｊ）にポリＴ配列を含み、これに相補的な領域（例えば、領域Ｃ’、Ｆ’、Ｈ’、Ｊ’）にポリＡ配列を含む。
【００７８】
本発明において、非相補的な塩基配列とは、互いにハイブリダイズしない塩基配列であればいかなるものでもよく、同一な塩基配列も非相補的な塩基配列に含まれるものである。
図１２は、本発明に用いられる１組の一対のダイマー形成用プローブ及び１種の一対の架橋プローブの第３の例を示す概略説明図である。図１２（ａ）において、符号６０ｂはダイマープローブであり、３’側領域並びに５’側領域をそれぞれ同一の塩基配列とした２種のダイマー形成用プローブ６１ｃ，６１ｄを用いてダイマーを形成した例を示した。即ち、図８のダイマープローブ６０ａにおいて、領域Ａと領域Ｄを同一の塩基配列とし、領域Ｃと領域Ｆを同一の塩基配列としたものである。該構成とすることにより、図１２（ｂ）に示した如く、ダイマープローブ６０ｂと共に用いられる一対の架橋プローブは同一となり、１種の架橋プローブ６２ｃが用いられる。図１２記載のダイマー形成用プローブ６１ｃ−６１ｄ及び架橋プローブ６２ｃをハイブリダイズさせることにより、シグナルプローブポリマー６８を形成することができる（図１３）。
【００７９】
本発明に用いられるシグナル増幅用プローブの第IVの例として、自己集合可能な１種の核酸プローブが挙げられる。前記核酸プローブは、３以上の核酸領域を含む核酸プローブであって、該核酸プローブの各核酸領域が第１領域及び該第１領域に相補的な第２領域を隣接して含むように構成することにより、１種の核酸プローブのみによって該核酸プローブのポリマーを形成することができるものであり、例えば、特許文献７記載の核酸プローブが用いられる。本願明細書において、核酸プローブの核酸領域とは、前記第１領域及び第２領域からなる領域を意味する。また、各核酸領域中の第１領域及び第２領域をそれぞれ相補領域と称する。
【００８０】
図１５は、本発明で用いられる自己集合可能な１種の核酸プローブの一例を示す概略説明図である。図１６は、図１５の核酸プローブの結合態様を示す概略説明図である。図１７は、図１５の核酸プローブにより形成された自己集合体（プローブポリマー）を示す概略説明図である。
【００８１】
図１５は、本発明に用いられるシグナル増幅用プローブの第IVの例の一例を示す概略説明図であり、３箇所の核酸領域を含む例を示した。図１５に示した如く、自己集合可能な１種の核酸プローブ８０は、５’端部から順に核酸領域８０ａ，核酸領域８０ｂ及び核酸領域８０ｃを有し、各核酸領域８０ａ，８０ｂ及び８０ｃは互いに相補的な２領域を隣接して含む。即ち、前記核酸領域８０ａは相補領域Ｘ及び該相補領域Ｘに相補的な塩基配列を有する相補領域Ｘ’を隣接して含み、前記核酸領域８０ｂは相補領域Ｙ及び該相補領域Ｙに相補的な塩基配列を有する相補領域Ｙ’を隣接して含み、前記核酸領域８０ｃは相補領域Ｚ及び該相補領域Ｚに相補的な塩基配列を有する相補領域Ｚ’を隣接して含むものである。
【００８２】
前記核酸プローブ８０において、相補領域Ｘと相補領域Ｘ’、相補領域Ｙと相補領域Ｙ’、相補領域Ｚと相補領域Ｚ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的核酸領域であり、図１６に示した如く、相補領域Ｘと相補領域Ｘ’が結合し［図１６（ａ）］、相補領域Ｙと相補領域Ｙ’が結合し［図１６（ｂ）］、相補領域Ｚと相補領域Ｚ’が結合する［図１６（ｃ）］。なお、図１６では、好適な例として、３個の核酸領域（８０ａ，８０ｂ及び８０ｃ）を有する核酸プローブを示したが、核酸領域の数は３個以上であれば特に限定されないものである。
【００８３】
該核酸プローブ８０をハイブリダイゼーション反応させることにより、図１７に示した如く、核酸プローブ８０が自己集合し、核酸プローブ８０の自己集合体であるプローブポリマー９０を形成させることができる。なお、シグナル増幅用プローブの第IVの例の３’領域（例えば、領域Ｚ’）にポリＴ配列を含み、これに相補的な領域（例えば、領域Ｚ）にポリＡ配列を含む。
【００８４】
前記核酸プローブ８０において、各相補領域の長さは、塩基数にして２塩基以上が好ましく、３塩基〜５０塩基がより好ましく、さらに好ましくは４〜１５塩基である。また、核酸プローブ中の各相補領域の長さは同じであることが望ましい。
【００８５】
本発明において、それぞれのシグナル増幅用プローブのポリＴ配列の長さは、１１〜２６塩基であることが好適である。なお、図１では、核酸領域Ｚが全てポリＴ配列である例を示したが、ポリＴ配列及び他の配列を含む核酸領域Ｚを有する第１のシグナル増幅用プローブ１８ａを用いてもよい。
【００８６】
それぞれのシグナル増幅用プローブのポリＴ配列を含む核酸領域を除く各核酸領域の塩基配列は、プローブポリマーが形成されるように所定の領域が相補的な塩基配列となるように構成されればよく特に制限はないが、各領域の両末端の塩基がグアニン又はシトシンであることが好ましい。各領域の両末端の塩基をグアニン又はシトシンとすることにより、反応時間を短縮させることができ、さらにより低い反応温度で安定したプローブポリマーを形成させることができ、作業性及び検出感度を向上させることができる。
【００８７】
上記シグナル増幅用プローブは、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、国際公開第９２／２０７０２号公報等参照）やLocked Nucleic Acid（ＬＮＡ、Koshkin AA et al. Tetrahedron1998.54, 3607-3630.、Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc. 1998.120, 13252-13253.、Wahlestedt C et al. PNAS.2000.97,5633-5638.等参照）が挙げられる。また、一対のシグナル増幅用プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体（たとえばＰＮＡやＬＮＡ等）から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、ＤＮＡとＲＮＡから構成されるオリゴヌクレオチド・プローブ（キメラプローブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。
【００８８】
これらプローブは公知の方法により合成することができる。たとえばＤＮＡプローブの場合、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであってもよい。
【００８９】
本発明において、それぞれのシグナル増幅用プローブの一方又は両方が標識物質２０で標識されたものを用いることが好ましい。前記標識物質２０としては、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素等が好適な例として挙げられる。
【００９０】
次に、本発明のＲＮＡの検出方法の第２の態様として、標的ＲＮＡがポリＡテールを持たないＲＮＡ、例えば、マイクロＲＮＡの場合を以下に説明する。
本発明のＲＮＡの検出方法の第２の態様は、標的ＲＮＡがマイクロＲＮＡであり、（Ｄ）マイクロＲＮＡの３’末端にポリＡを付加するポリＡ付加工程と、（Ａ）前記マイクロＲＮＡ、及び前記マイクロＲＮＡを捕捉するための捕捉物質を反応させ、前記マイクロＲＮＡを捕捉する捕捉工程と、（Ｂ）前記捕捉されたマイクロＲＮＡ、及び１種又は複数種のシグナル増幅用プローブを反応させ、前記マイクロＲＮＡと、前記捕捉物質と、前記シグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーと、を含む検出用複合体を形成する検出用複合体形成工程と、（Ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出することにより、前記マイクロＲＮＡを検出する検出工程と、を含むマイクロＲＮＡの検出方法であって、前記複数種のシグナル増幅用プローブは、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブであって、該複数種のシグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブが、ポリＴ配列を有し、前記１種のシグナル増幅用プローブは、ポリＴ配列を有し且つ３以上の核酸領域を含む１種のシグナル増幅用プローブであって、該１種のシグナル増幅用プローブの各核酸領域が第１領域及び該第１領域に相補的な第２領域を隣接して含むことを特徴とする。
【００９１】
図１８は、本発明のＲＮＡの検出方法の第２の態様の例を示す概略説明図であり、（ａ）はマイクロＲＮＡ、（ｂ）はポリＡ付加工程後のポリＡ付加されたマイクロＲＮＡ、（ｃ）は捕捉工程後の捕捉物質により捕捉されたマイクロＲＮＡ、（ｄ）は検出用複合体形成工程後の検出用複合体をそれぞれ示す。
【００９２】
図１８において符号１０ｂはマイクロＲＮＡである。本発明は、短い標的核酸の検出に好適に用いられるものであり、１７〜６３塩基のマイクロＲＮＡの検出に好適に用いられ、１７〜２４塩基程度のマイクロＲＮＡの検出に特に好適に用いられる。また、同時に多種の核酸分子を検出することも出来る。
図１８（ｂ）に示した如く、マイクロＲＮＡ１０ｂの３’末端にポリＡを付加するポリＡ付加工程を行い、ポリＡ付加されたマイクロＲＮＡ１２とする［工程（Ｄ）］。次に、図１８（ｃ）に示した如く、前記ポリＡ付加されたマイクロＲＮＡ１２と、標的マイクロＲＮＡ１０ｂを捕捉するための捕捉物質１４を反応させ、ポリＡ付加されたマイクロＲＮＡ１２を捕捉する捕捉工程を行う［工程（Ａ）］。なお、図１８では、工程（Ｄ）後に工程（Ａ）を行う場合を示したが、工程（Ａ）後に工程（Ｄ）を行う、即ち、マイクロＲＮＡ１０ｂと、捕捉物質１４を反応させ、マイクロＲＮＡ１０ｂを捕捉する捕捉工程を行った後［工程（Ａ）］、マイクロＲＮＡ１０ｂの３’末端にポリＡを付加するポリＡ付加工程を行い［工程（Ｄ）］、ポリＡ付加されたマイクロＲＮＡ１２を捕捉物質１４により捕捉してもよい。
【００９３】
本発明のＲＮＡの検出方法の第２の態様において、工程（Ａ）〜（Ｃ）は前述した第１の態様と同様に行うことができる。
【００９４】
本発明において、複数の捕捉物質１４を併用することにより、複数種の標的核酸を同時に検出することが可能である。複数種の標的核酸の同時検出において、それぞれのシグナル増幅用プローブは同一のものが使用可能であり、担体１６及び捕捉物質１４のみを複数種準備すればよく、作業性に優れ、低コストである。
【実施例】
【００９５】
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。【００９６】
（実施例１）合成ＲＮＡを用いた１２種類のマイクロＲＮＡ検出
標的マイクロＲＮＡとして６種類の合成オリゴＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１００，１５５，１５ｂ，１６，２１及び２３ａ／ｂ）を使用した。該６種類の合成ＲＮＡを等量ずつ混ぜ、それぞれの量が０，０．３１６ａｍｏｌ，１ａｍｏｌ，３．１６ａｍｏｌ，１０ａｍｏｌ又は３１．６ａｍｏｌとなるように調整し実験に使用した。
ｈｓａ−ｍｉＲ−１００の塩基配列
5'-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3'（配列番号１）
ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５の塩基配列
5'-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG-3'（配列番号２）
ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂの塩基配列
5'-UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA-3'（配列番号３）
ｈｓａ−ｍｉＲ−１６の塩基配列
5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3'（配列番号４）
ｈｓａ−ｍｉＲ−２１の塩基配列
5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'（配列番号５）
ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ／ｂの塩基配列
5'-AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC-3'（配列番号６）【００９７】
捕捉物質として１２種のキャプチャープローブ（ＣＰ−ｈｓａ−ｌｅｔ７ｄ，ＣＰ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１００，１０７，１５５，１５ｂ，１６，１８１ａ，１８１ｃ，２１，２２１，２３ａ／ｂ，又は９２ａ）がそれぞれ結合した１２種の球状ビーズ［蛍光微小粒子（Luminex bead、Luminex社製）］を用いた。
ＣＰ−ｈｓａ−ｌｅｔ７ｄの塩基配列
5'-AACTATGCAACCTACTACCTCT-3'（配列番号７）
ＣＰ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１００の塩基配列
5'-CACAAGTTCGGATCTACGGGTT-3'（配列番号８）
ＣＰ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７の塩基配列
5'-TGATAGCCCTGTACAATGCTGCT-3'（配列番号９）
ＣＰ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５の塩基配列
5'-CCCCTATCACGATTAGCATTAA-3'（配列番号１０）
ＣＰ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂの塩基配列
5'-TGTAAACCATGATGTGCTGCTA-3'（配列番号１１）
ＣＰ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１６の塩基配列
5'-CGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3'（配列番号１２）
ＣＰ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａの塩基配列
5'-ACTCACCGACAGCGTTGAATGTT-3'（配列番号１３）
ＣＰ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃの塩基配列
5'-ACTCACCGACAGGTTGAATGTT-3'（配列番号１４）
ＣＰ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２１の塩基配列
5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'（配列番号１５）
ＣＰ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１の塩基配列
5'-GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT-3'（配列番号１６）
ＣＰ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ／ｂの塩基配列
5'-GGAAATCCCTGGCAATGTGAT-3'（配列番号１７）
ＣＰ−ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａの塩基配列
5'-ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA-3'（配列番号１８）【００９８】
シグナル増幅用プローブとして、５’末端がビオチンで標識されている２種類の核酸プローブ（ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２）を用いた。
ＨＣＰ−１の塩基配列（5’-X-Y-Z-3’）
5'-CAACAATCAGGAC GATACCGATGAAG TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号１９）
ＨＣＰ−２の塩基配列（5’-X’-Y’-Z’-3’）
5'-GTCCTGATTGTTG CTTCATCGGTATC AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'（配列番号２０）【００９９】
標的マイクロＲＮＡを５μＬ、10xPAP Buffer（NEB社製）を１μＬ、10mM ATP（NEB社製）を１μＬ、PolyA polymerase（NEB社製）を０．２μＬ、D.W.を２．８μＬ加え、計１０μＬとし、３７℃で１５分間反応させた（ポリＡ付加工程）。【０１００】
前記ポリＡ付加工程後の反応液１０μＬに、第１ハイブリダイゼーション反応液［１２種の球状ビーズ（各１０００個）  各０．１μＬ（計１．２μＬ）、５Ｍ  ＴＭＡＣ（tetra-methyl ammonium chloride）７．５μＬ、10xSupplement［500mM Tris-HCl（pH8.0）, 40mM EDTA（pH8.0）, 1% sarkosyl］３．７５μＬ、D.W.  ２．５５μＬ］を１５μＬ加え、計２５μＬとし、５０℃で６０分間反応させた（捕捉工程）。【０１０１】
前記捕捉工程後の反応液２５μＬに、ＰＡＬＳＡＲ反応液［５Ｍ  ＴＭＡＣ  ７．５μＬ、10xSupplement  ２．５μＬ、２０ｐｍｏｌ／μＬ  ＨＣＰ−１  ２．５μＬ、２０ｐｍｏｌ／μＬ  ＨＣＰ−２  ２．０μＬ、D.W.  １０．５μＬ］を２５μＬ加え、計５０μＬとし、４４℃で６０分間反応させた（検出用複合体形成工程）。【０１０２】
前記検出用複合体形成工程後の反応液をWash Buffer［1xPBS with 0.02% tween20 and 1.5ppm Proclin300］で１回洗浄した後、検出試薬［ＳＡ−ＰＥ（Prozyme社製）５ｎｇ／μＬ］を５０μＬ加え、室温で１０分間置いた後、Wash Bufferで１回洗浄した。その後Wash Bufferを１００μＬ加え、フローサイトメトリー（Luminex社製、Luminex System）でビオチン及び蛍光微小粒子の蛍光を測定し、１２種類のマイクロＲＮＡのシグナルを検出した（検出工程）。結果を表１及び図１９に示した。【０１０３】
【表１】
2013172305.tif 000003
【０１０４】
（比較例１）
市販miRNA検出キットを用い、実施例１と同一の標的マイクロＲＮＡを用いて、マイクロＲＮＡの検出を行った。
ラベリング試薬としてVantage microRNA Labeling Kit（Marligen社製）、検出試薬としてVantage miRNA Multiplex Detection Kit Pancreatic Cancer Panel1（Marligen社製）を用い、実施例１と同じ６種類の標的マイクロＲＮＡを用いて、マイクロＲＮＡの検出を行った。試薬組成、反応方法は、Kit付属のプロトコールに基づいた。結果を表２及び図２０に示した。【０１０５】
【表２】
2013172305.tif 000004
【０１０６】
（実施例２）合成ＲＮＡ及び細胞由来のTotal RNAを用いたmiRNAの検出
標的マイクロＲＮＡとして実施例１で用いた合成オリゴＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２１）を使用した。該合成オリゴＲＮＡが０，０．１ａｍｏｌ，０．３１６ａｍｏｌ，１ａｍｏｌ，３．１６ａｍｏｌ，１０ａｍｏｌ，３１．６ａｍｏｌ，１００ａｍｏｌ又は３１６ａｍｏｌとなるように調整し実験に使用した（実施例２−１）。
また、標的マイクロＲＮＡとして、細胞由来の１０種のTotal RNA（ＮＣＩ−Ｈ６５０，ＭＣＦ−７，ＣＦＰＡＣ−１，ＬＣ−１Ｆ，Ａ５４９，Ｈｅｐ−２，ＰＣ−１４，ＨｅＬａ，ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ，又はＢＴ５４９）をそれぞれ１０ｎｇ使用した（実施例２−２〜２−１１）。
捕捉物質として実施例１で用いたキャプチャープローブ（ＣＰ−ｈａｓ−ｍｉＲ−２１）が結合した球状ビーズを用いた。【０１０７】
前述した標的マイクロＲＮＡを用いて実施例１と同様の方法によりポリＡ付加工程を行った。
前記ポリＡ付加工程後の反応液１０μＬに、第１ハイブリダイゼーション反応液［球状ビーズ（１０００個）  ０．４μＬ、５Ｍ  ＴＭＡＣ  ７．５μＬ、10xSupplement［500mM Tris-HCl（pH8.0）,40mM EDTA（pH8.0）, 1% sarkosyl］３．７５μＬ、D.W. ３．３５μＬ］を１５μＬ加え、計２５μＬとし、５０℃で６０分間反応させた（捕捉工程）。【０１０８】
前記捕捉工程後の反応液２５μＬを用いて実施例１と同様の方法により検出用複合体形成工程を行った。
前記検出用複合体形成工程後の反応液をWash Buffer［1xPBS with 0.02% tween20, 0.1% BSA and 0.05% NaN3］で１回洗浄した後、検出試薬［ＳＡ−ＰＥ（Invitrogen社製）１０ｎｇ／μＬ］を５０μＬ加え、室温で１０分間置いた後、Wash Bufferで１回洗浄した。その後Wash Bufferを１００μＬ加え、フローサイトメトリー（Luminex社製、Luminex System）でビオチン及び蛍光微小粒子の蛍光を測定し、マイクロＲＮＡのシグナルを検出した（検出工程）。実施例２−１の結果を図２１に示した。また、図２１のグラフから算出した実施例２−２〜実施例２−１１の定量値の結果を表３に示した。さらに、実施例２と比較例２の結果の相関図を図２３に示した。【０１０９】
【表３】
2013172305.tif 000005
【０１１０】
（比較例２）
TaqManProbeを用い、実施例２と同一の標的マイクロＲＮＡを用いて、リアルタイムＰＣＲ法により、マイクロＲＮＡ（has-miR-21およびhas-miR-16）の検出を行った。
TaqMan MicroRNA Primer（ABI社製、miR-21, 16用）及びTaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（ABI社製）を用いて、付属プロトコールに従い逆転写反応を行った。その後、TaqMan MicroRNA Assays（ABI社製、miR-21, 16用）及びUniversal PCR Master Mix, No AmpErase UNG（ABI社製）と逆転写反応液を用いて、付属プロトコールに従いリアルタイムPCR反応を行った。その結果を図２２及び表３に示した。また、実施例２と比較例２の結果の相関図を図２３に示した。【０１１１】
実施例１及び２の結果に示される如く、本願発明はマイクロＲＮＡを数amolレベルまで検出可能であり、高感度且つ簡易にマイクロＲＮＡを検出することができた。さらに、実施例２及び比較例２の結果に示される如く、本願発明はリアルタイムＰＣＲ法と高い相関を示すことが証明された。【０１１２】
（実施例３）培養細胞由来ＴｏｔａｌＲＮＡを用いた２種類のメッセンジャーＲＮＡ検出
標的メッセンジャーＲＮＡであるＢｅｔａ−Ａｃｔｉｎ（ＢＡ）とＧＡＰＤＨ（Ｇ３Ｐ）を含む細胞由来のＴｏｔａｌＲＮＡ（細胞株ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ）を使用した。ＴｏｔａｌＲＮＡのそれぞれの量が０，０．１μｇ，０．５μｇ，１μｇ又は２．５μｇとなるように調整し実験に使用した。【０１１３】
捕捉物質として２種のキャプチャープローブ（ＣＰ−ＢＡ−１又はＣＰ−Ｇ３Ｐ−１）がそれぞれ結合した２種の球状ビーズ［蛍光微小粒子（Ｌｕｍｉｎｅｘ ｂｅａｄ、Ｌｕｍｉｎｅｘ社製）］を用いた。
ＣＰ−ＢＡ−１の塩基配列
5'-AAGGTGTGCACTTTTATTCAACTGGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGCCCTGGCTGCCTC -3'（配列番号２１）
ＣＰ−Ｇ３Ｐ−１の塩基配列
5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATTGATGGTACATGACAAGGTGCGGCTCCCTAGGCCCCTCC -3'（配列番号２２）【０１１４】
シグナル増幅用プローブとして、実施例１で用いた５’末端がビオチンで標識されている２種類の核酸プローブ（ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２）を用いた。【０１１５】
ＴｏｔａｌＲＮＡを１０μＬに、第１ハイブリダイゼーション反応液［２種の球状ビーズ各２０００個  各０．２μＬ（計０．４μＬ）、５Ｍ  ＴＭＡＣ（ｔｅｔｒａ-ｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）７．５μＬ、10ｘＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ［500ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ8.0）, 40ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ8.0）, 1% ｓａｒｋｏｓｙｌ］２．５μＬ、D.W.  ４．６μＬ］を１５μＬ加え、計２５μＬとし、５５℃で６０分間反応させた（捕捉工程）。【０１１６】
前記捕捉工程後の反応液２５μＬに、ＰＡＬＳＡＲ反応液［５Ｍ  ＴＭＡＣ  ７．５μＬ、10xSupplement  ２．５μＬ、２０ｐｍｏｌ／μＬ  ＨＣＰ−１  ２．５μＬ、２０ｐｍｏｌ／μＬ  ＨＣＰ−２  ２．０μＬ、Ｄ.Ｗ.  １０．５μＬ］を２５μＬ加え、計５０μＬとし、４４℃で６０分間反応させた（検出用複合体形成工程）。【０１１７】
前記検出用複合体形成工程後の反応液をＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ［１ｘＰＢＳ ｗｉｔｈ ０．０２％ ｔｗｅｅｎ２０ ａｎｄ ０．５％ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｚｉｄｅ］で１回洗浄した後、検出試薬［ＳＡ−ＰＥ（Ｐｒｏｚｙｍｅ社製）５ｎｇ／μＬ］を５０μＬ加え、室温で１０分間置いた後、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した。その後Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ加え、フローサイトメトリー（Ｌｕｍｉｎｅｘ社製、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｓｙｓｔｅｍ）でビオチン及び蛍光微小粒子の蛍光を測定し、２種類のメッセンジャーＲＮＡのシグナルを検出した（検出工程）。結果を図２４に示した。【０１１８】
（実施例４）5種類の培養細胞由来ＴｏｔａｌＲＮＡを用いた２種類のメッセンジャーＲＮＡ比率の検討
標的メッセンジャーＲＮＡであるＢｅｔａ−ＡｃｔｉｎとＧＡＰＤＨを含む細胞由来のＴｏｔａｌＲＮＡ（細胞株ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ,Ａ５４９,Ｈｅｌａ,ＰＣ−１４,Ｈｅｐ−２）を使用した。ＴｏｔａｌＲＮＡのそれぞれの量が１μｇ又は５μｇとなるように調整し実験に使用した。【０１１９】
捕捉物質として実施例３と同じ２種のキャプチャープローブ（ＣＰ−ＢＡ−１又はＣＰ−Ｇ３Ｐ−１）がそれぞれ結合した２種の球状ビーズ［蛍光微小粒子（Luminex bead、Luminex社製）］を用いた。【０１２０】
シグナル増幅用プローブとして、実施例１と同じ５’末端がビオチンで標識されている２種類の核酸プローブ（ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２）を用いた【０１２１】
ＴｏｔａｌＲＮＡを１０μＬに、第１ハイブリダイゼーション反応液［２種の球状ビーズ各２０００個  各０．２μＬ（計０．４μＬ）、５Ｍ  ＴＭＡＣ（ｔｅｔｒａ-ｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）７．５μＬ、10ｘＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ［500ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ8.0）, 40ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ8.0）, 1% ｓａｒｋｏｓｙｌ］２．５μＬ、D.W.  ４．６μＬ］を１５μＬ加え、計２５μＬとし、５５℃で６０分間反応させた（捕捉工程）。【０１２２】
前記捕捉工程後の反応液２５μＬに、ＰＡＬＳＡＲ反応液［５Ｍ  ＴＭＡＣ  ７．５μＬ、１０ｘＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２．５μＬ、２０ｐｍｏｌ／μＬ  ＨＣＰ−１  ２．５μＬ、２０ｐｍｏｌ／μＬ  ＨＣＰ−２  ２．０μＬ、Ｄ.Ｗ.  １０．５μＬ］を２５μＬ加え、計５０μＬとし、４４℃で６０分間反応させた（検出用複合体形成工程）。【０１２３】
前記検出用複合体形成工程後の反応液をＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ［１ｘＰＢＳ ｗｉｔｈ ０．１％ ＢＳＡ, ０．０２％ ｔｗｅｅｎ20 ａｎｄ 0.5% Ｓｏｄｉｕｍ Ａｚｉｄｅ］で１回洗浄した後、検出試薬［ＳＡ−ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０ｎｇ／μＬ］を５０μＬ加え、室温で１０分間置いた後、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した。その後Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ加え、フローサイトメトリー（Ｌｕｍｉｎｅｘ社製、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｓｙｓｔｅｍ）でビオチン及び蛍光微小粒子の蛍光を測定し、２種類のメッセンジャーＲＮＡのシグナルを検出した（検出工程）。結果を図２５に示した。【０１２４】
（実施例５）培養細胞由来ＴｏｔａｌＲＮＡを用いたメッセンジャーＲＮＡの検出感度
標的メッセンジャーＲＮＡであるＧＡＰＤＨを含む細胞由来のＴｏｔａｌＲＮＡ（細胞株ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）を使用した。１０７細胞分より抽出したＴｏｔａｌＲＮＡを希釈し、それぞれの量が１０３、１０４、１０５、１０６細胞分となるように調整し実験に使用した。【０１２５】
捕捉物質としてキャプチャープローブ（ＣＰ−Ｇ３Ｐ−２）が結合した球状ビーズ［蛍光微小粒子（Luminex bead、Luminex社製）］を用いた。
ＣＰ−Ｇ３Ｐ−２の塩基配列
5'- TGGTGGTGCAGGAGGCATTGCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTCATACTTCTCATGGTTCAC -3'（配列番号２３）【０１２６】
また、ＲＮＡの捕捉安定化のため以下の2種類のプローブを用いた。
ＢＬ−１
5'- ACCCATGACGAACATGGGGGCATCAGCAGAGGGGGCAGAGATGATGACCCTTTTGGCTCC -3'（配列番号２４）
ＢＬ−２
5'- TGAGTCCTTCCACGATACCAAAGTTGTCATGGATGACCTTGGCCAGGGGTGCTAAGCAGT -3'（配列番号２５）【０１２７】
シグナル増幅用プローブとして、実施例１で使用した５’末端がビオチンで標識されている２種類の核酸プローブ（ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２）を用いた。【０１２８】
ＴｏｔａｌＲＮＡを１０μＬに、第１ハイブリダイゼーション反応液［球状ビーズ（各１０００個）  ０．１μＬ、５Ｍ  ＴＭＡＣ（ｔｅｔｒａ-ｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）７．５μＬ、１０ｘＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ［５００ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）, ４０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）, １％ ｓａｒｋｏｓｙｌ］２．５μＬ、Ｄ.Ｗ.  にて全量１５μＬとなるよう補正］を１５μＬ加え、計２５μＬとし、５５℃で４時間反応させた（捕捉工程）。【０１２９】
前記捕捉工程後の反応液２５μＬに、ＰＡＬＳＡＲ反応液［５Ｍ  ＴＭＡＣ  ７．５μＬ、１０ｘＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２．５μＬ、２０ｐｍｏｌ／μＬ  ＨＣＰ−１  ２．５μＬ、２０ｐｍｏｌ／μＬ  ＨＣＰ−２  １．７５μＬ、D.W.  １０．７５μＬ］を２５μＬ加え、計５０μＬとし、４４℃で６０分間反応させた（検出用複合体形成工程）。【０１３０】
前記検出用複合体形成工程後の反応液をＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ［１ｘＰＢＳ ｗｉｔｈ ０．０２％ ｔｗｅｅｎ２０ ａｎｄ １．５ｐｐｍ ＰｒｏＣｌｉｎ ３００］で１回洗浄した後、検出試薬［ＳＡ−ＰＥ（Ｐｒｏｚｙｍｅ社製）５ｎｇ／μＬ］を５０μＬ加え、室温で１０分間置いた後、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した。その後Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ加え、フローサイトメトリー（Ｌｕｍｉｎｅｘ社製、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｓｙｓｔｅｍ）でビオチン及び蛍光微小粒子の蛍光を測定し、メッセンジャーＲＮＡのシグナルを検出した（検出工程）。結果を図２６に示した。【０１３１】
実施例３及び４の結果に示される如く、本願発明はメッセンジャーＲＮＡを逆転写反応やＰＣＲを行うことなく、ＲＮＡをそのままの非標識の状態で検出することに成功した。また、用いるターゲット量に関わらず各細胞ごとに一定の比率で存在するハウスキーピング遺伝子を検出することができた。さらに、実施例５の結果に示される如く、１０３個の細胞からＧＡＰＤＨのメッセンジャーＲＮＡを直線性を持って高感度に検出できることが証明された。
【符号の説明】
【０１３２】
１０ａ：メッセンジャーＲＮＡ、１０ｂ：マイクロＲＮＡ、１２：ポリＡ付加されたマイクロＲＮＡ、１４：捕捉物質、１６：担体、１８ａ：第１のシグナル増幅用プローブ、１８ｂ：第２のシグナル増幅用プローブ、２０：標識物質、２２，５０，６８，９０：プローブポリマー、３０：検出用複合体、４０ａ：第１ダイマープローブ、４０ｂ、４０ｃ、４０ｄ：第２ダイマープローブ、４０ｅ：第３ダイマープローブ、４１ａ〜４１ｈ、４１ｊ、４１ｋ：ダイマー形成用プローブ、６０ａ，６０ｂ：ダイマープローブ、６１ａ〜６１ｄ：ダイマー形成用プローブ、６２ａ〜６２ｄ：架橋プローブ、７０ａ，７０ｂ：ダイマープローブ、７１ａ〜７１ｄ：ダイマー形成用プローブ、７２ａ〜７２ｄ：架橋プローブ、８０：核酸プローブ、８０ａ，８０ｂ，８０ｃ：核酸領域。
【図１】
2013172305.tif 000006
【図２】
2013172305.tif 000007
【図３】
2013172305.tif 000008
【図４】
2013172305.tif 000009
【図５】
2013172305.tif 000010
【図６】
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【図７】
2013172305.tif 000012
【図８】
2013172305.tif 000013
【図９】
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【図１０】
2013172305.tif 000015
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2013172305.tif 000019
【図１５】
2013172305.tif 000020
【図１６】
2013172305.tif 000021
【図１７】
2013172305.tif 000022
【図１８】
2013172305.tif 000023
【図１９】
2013172305.tif 000024
【図２０】
2013172305.tif 000025
【図２１】
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【図２３】
2013172305.tif 000027
【図２４】
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【図２５】
2013172305.tif 000029
【図２６】
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【図２２】
2013172305.tif 000031
【配列表】
2013172305000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年10月27日(2014.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
一方、メッセンジャーＲＮＡは遺伝子発現の一端を担う核酸であり、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼの働きにより合成される（転写）。その後メッセンジャーＲＮＡの持つ遺伝情報を用いてリボソームにより目的タンパク質が合成される（翻訳）。ＤＮＡからタンパク質を発現させるために、非常に重要な要素であるといえる。真核生物のメッセンジャーＲＮＡは他のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）やリボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）とは異なり、５’末端にＣＡＰ構造、３’末端にポリＡを有する。これらの構造はメッセンジャーＲＮＡ自身の分解を制御する働きも持つ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
本発明のＲＮＡの検出方法は、（Ａ）ＲＮＡを、該ＲＮＡを捕捉するための捕捉物質により捕捉する捕捉工程と、（Ｂ）前記捕捉されたＲＮＡ、及び自己集合可能な１種又は複数種のシグナル増幅用プローブを反応させ、前記ＲＮＡと、前記捕捉物質と、前記シグナル増幅用プローブにより形成されたプローブポリマーと、を含む検出用複合体を形成する検出用複合体形成工程と、（Ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出することにより、前記ＲＮＡを検出する検出工程と、を含む標的ＲＮＡを検出する方法であって、前記シグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブが、ポリＴ配列を有することを特徴とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
なお、図１４では、１組目の第１架橋プローブ７２ａの３’側領域は、２組目の第１ダイマー形成用プローブ７１ｃの３’側領域と相補的であり、１組目の第２架橋プローブ７２ｂの３’側領域は、２組目の第２ダイマー形成用プローブ７１ｄの３’側領域と相補的であり、２組目の第１架橋プローブ７２ｃの３’側領域は、１組目の第１ダイマー形成用プローブ７１ａの３’側領域と相補的であり、２組目の第２架橋プローブ７２ｄの３’側領域は、１組目の第２ダイマー形成用プローブ７１ｂの３’側領域と相補的である場合を示したが、各架橋プローブの３’側領域と相補的となるダイマー形成用プローブの３’側領域の組み合わせに制限はないものである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
（実施例２）合成ＲＮＡ及び細胞由来のTotal RNAを用いたmiRNAの検出   標的マイクロＲＮＡとして実施例１で用いた合成オリゴＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２１）を使用した。該合成オリゴＲＮＡが０，０．１ａｍｏｌ，０．３１６ａｍｏｌ，１ａｍｏｌ，３．１６ａｍｏｌ，１０ａｍｏｌ，３１．６ａｍｏｌ，１００ａｍｏｌ又は３１６ａｍｏｌとなるように調整し実験に使用した（実施例２−１）。
また、標的マイクロＲＮＡとして、細胞由来の１０種のTotal RNA（ＮＣＩ−Ｈ６５０，ＭＣＦ−７，ＣＦＰＡＣ−１，ＬＣ−１Ｆ，Ａ５４９，Ｈｅｐ−２，ＰＣ−１４，ＨｅＬａ，ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ，又はＢＴ５４９）をそれぞれ１０ｎｇ使用した（実施例２−２〜２−１１）。
捕捉物質として実施例１で用いたキャプチャープローブ（ＣＰ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２１）が結合した球状ビーズを用いた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
（比較例２）
TaqManProbeを用い、実施例２と同一の標的マイクロＲＮＡを用いて、リアルタイムＰＣＲ法により、マイクロＲＮＡ（hsa-miR-21およびhsa-miR-16）の検出を行った。
TaqMan MicroRNA Primer（ABI社製、miR-21, 16用）及びTaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（ABI社製）を用いて、付属プロトコールに従い逆転写反応を行った。その後、TaqMan MicroRNA Assays（ABI社製、miR-21, 16用）及びUniversal PCR Master Mix, No AmpErase UNG（ABI社製）と逆転写反応液を用いて、付属プロトコールに従いリアルタイムPCR反応を行った。その結果を図２２及び表３に示した。また、実施例２と比較例２の結果の相関図を図２３に示した。ポリマーと、を含む検出用複合体を形成する検出用複合体形成工程と、（Ｃ）前記検出用複合体に結合した前記プローブポリマーを検出することにより、前記ＲＮＡを検出する検出工程と、を含む標的ＲＮＡを検出する方法であって、前記シグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブが、ポリＴ配列を有することを特徴とする。
【国際調査報告】
2013172305.tif 000032
2013172305.tif 000033
2013172305.tif 000034