(57)【要約】本発明は、眼細胞の分化マーカーおよび分化制御技術に関する。より特定すると、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するためのマーカー、ならびにＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に結合する物質を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するための検出剤、あるいは検出方法を提供することによって、上記課題のうち眼細胞の分化マーカーを提供するという課題を解決した。また、本発明は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類を含む、眼細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供することによって、眼細胞の分化制御技術を提供するという課題を解決した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類およびその機能的等価物からなる群より選択される少なくとも１種を含む、眼細胞の分化抑制および／または増殖促進剤。
【請求項２】
前記Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ２、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ３およびＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ４から選択される少なくとも１つを含む、請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤。
【請求項３】
前記Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １を含む、請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤。
【請求項４】
前記眼細胞は、定常状態で増殖していない細胞である、請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤。
【請求項５】
前記眼細胞は網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞から選択される少なくとも１種の細胞を含む、請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤。
【請求項６】
前記眼細胞は角膜内皮細胞を含む、請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤。
【請求項７】
前記眼細胞は霊長類の角膜内皮細胞を含む、請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤。
【請求項８】
前記眼細胞はヒト角膜内皮細胞を含む、請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤。
【請求項９】
前記眼細胞はコンフルエントの状態にある、請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤。
【請求項１０】
前記眼細胞は、角膜組織の形態で提供される、請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤。
【請求項１１】
請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤を含む、角膜保存または角膜内皮細胞培養のための組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤を含む、角膜内皮細胞障害の治療または角膜内皮細胞障害の進行予防のための医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の分化抑制および／または増殖促進剤を用いて培養された角膜内皮細胞を含む角膜内皮細胞障害の治療剤または進行予防剤。
【請求項１４】
前記細胞は、通常の角膜内皮細胞よりも細胞密度が高いかおよび／または未分化な細胞をより多く含む集団として存在する、請求項１２に記載の角膜内皮細胞障害の治療剤または進行予防剤。
【請求項１５】
角膜内皮細胞を含む角膜組織であって、該組織中のＫｉ６７陽性細胞が、生体内中の割合よりも高い割合で存在するか、および／または該角膜内皮細胞の密度が生体内中の密度よりも高い、角膜組織。
【請求項１６】
ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するためのマーカー。
【請求項１７】
前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である、請求項１６に記載のマーカー。
【請求項１８】
前記増殖能の高い細胞は幹細胞である、請求項１６に記載のマーカー。
【請求項１９】
前記角膜内皮細胞はヒト細胞である、請求項１６に記載のマーカー。
【請求項２０】
前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される少なくとも一つの特徴により識別される、請求項１６に記載のマーカー。
【請求項２１】
ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするための方法。
【請求項２２】
前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記増殖能の高い細胞は幹細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記角膜内皮細胞はヒト細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される少なくとも一つの特徴により識別される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に結合する物質を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するための検出剤。
【請求項２７】
前記検出剤は、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいは核酸プライマーもしくはプローブである、請求項２６に記載の検出剤。
【請求項２８】
前記検出剤は、標識されたものである、請求項２６に記載の検出剤。
【請求項２９】
前記増殖能の高い細胞は幹細胞である、請求項２６に記載の検出剤。
【請求項３０】
前記角膜内皮細胞はヒト細胞である、請求項２６に記載の検出剤。
【請求項３１】
前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される少なくとも一つの特徴により識別される、請求項２６に記載の検出剤。
【請求項３２】
ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するためのマーカー。
【請求項３３】
ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子を、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするための方法。
【請求項３４】
ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子に結合する物質を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するための検出剤。
【請求項３５】
Ｗｎｔ経路の因子を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するためのマーカー。
【請求項３６】
Ｗｎｔ経路の因子を、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするための方法。
【請求項３７】
Ｗｎｔ経路の因子に結合する物質を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するための検出剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、特に眼科領域の分化状態のマーカー、ならびに眼細胞（特に、分化制御の難しい角膜内皮細胞）の分化を抑制および／または増殖を刺激するための技術、方法、ならびにそのための薬剤および培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が、網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に伝達することで認識される。良好な視力を得るためには、角膜が透明であることが必要である。角膜の透明性は、角膜内皮細胞のポンプ機能とバリア機能により、含水率が一定に保たれることにより保持される。【０００３】
角膜は眼球の前方に位置し、主に角膜上皮細胞層、角膜実質層、角膜内皮細胞層の３層構造を持った透明な組織である。角膜内皮細胞層は角膜深層部に存在する単層の細胞層であり、バリア機能とポンプ機能を持ち、角膜の水分量を一定に保つことで角膜の透明性を維持する役割を果たしている。また、障害を受けても生体内で増殖しないことが知られており、角膜内皮細胞が外傷や疾患等によって障害されて細胞数が減少することで、重篤な視覚障害が生じることが知られている。【０００４】
ヒトの角膜内皮細胞は、出生時には１平方ミリメートル当たり約３０００個の密度で存在しているが、一度障害を受けると再生する能力を持たない。角膜内皮変性症や種々の原因による角膜内皮の機能不全によって生じる水疱性角膜症では、角膜が浮腫と混濁を生じ、著しい視力低下をきたす。現在、水疱性角膜症に対しては、角膜の上皮、実質および内皮の３層構造のすべてを移植する全層角膜移植術が行われている。しかし、日本での角膜提供は不足しており、角膜移植の待機患者約２６００人に対し、年間に国内ドナー角膜を用いて行われている角膜移植件数は１７００件程度である。【０００５】
近年、拒絶反応や術後合併症のリスクを軽減し、よりよい視機能を得る目的から、障害を受けた組織のみを移植する「パーツ移植」の考えが注目されている。角膜移植の中でも、実質組織の移植である深層表層角膜移植術、角膜内皮組織の移植であるデスメ膜角膜内皮移植術（Ｄｅｓｃｅｍｅｔ’ｓ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｋｅｒａｔｏｐｌａｓｔｙ）などが行われるようになっている。また、生体外で培養した角膜上皮や口腔粘膜を角膜上皮の代わりに移植する培養粘膜上皮移植術は既に臨床応用されており、同様に生体外で培養した角膜内皮を移植する方法も検討されている。【０００６】
角膜内皮細胞は培養すると分化し、形態が線維芽細胞様に変化することが知られている。また、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は小腸上皮幹細胞に限定的に発現し、重要な働きをしていることが知られている。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のリガンドとしてＲ−ｓｐｏｎｄｉｎｓが報告されている（非特許文献１〜４）。【０００７】
非特許文献５には、角膜輪部上皮細胞に幹細胞様の細胞が存在すること、およびＧＰＲ４９／ＬＧＲ５が、残存するヒト角膜輪部上皮幹細胞の表現型マーカーになり得ることが記載されている。【０００８】
非特許文献６には、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は幹細胞マーカーとして挙げられている。マウス角膜上皮細胞の２つの細胞集団において、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびＡＢＣＧ２が高発現していることが記載されている。【０００９】
非特許文献７には、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５が幹細胞マーカーとして記載されている。【００１０】
非特許文献８には、腸管上皮幹細胞培養を確立したことが開示されている。【００１１】
非特許文献９には、腸および大腸を安定的かつ長期的に培養する方法が開示されている。培養の増殖は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １と免疫グロブリンＦｃの融合タンパク質（ＲＳｐｏ１−Ｆｃ）によって顕著に促進されたことが記載されている。【００１２】
従来角膜内皮細胞は生体内で増殖しないと考えられてきたが、近年の分子生物学的、細胞生物学的研究により、角膜内皮細胞層にも非常に増殖能に富む細胞群が存在していることが報告された。Ｓｃｈｉｍｍｅｌｐｆｅｎｎｉｎｇらはヒト角膜の周辺部の方が中心部と比較して内皮細胞密度が増加していることを明らかにし、角膜周辺部の細胞が増殖することにより、角膜中心部へと細胞を供給している可能性を提唱した（非特許文献１０）。【００１３】
また、Ｗｈｉｋｅｈａｒｔらは、ウサギ角膜を用いて、幹細胞や前駆細胞において高発現が見られるテロメラーゼが、角膜周辺部の内皮細胞において高発現していることを確認した。さらに細胞増殖マーカーであるＢｒｄＵを使用した評価法により、角膜周辺部の内皮細胞の方が障害を受けたときの応答が速いことを示した（非特許文献１１）。また、Ｙｏｋｏｏらは間葉系幹細胞の採取法であるスフェア法を用いて、成体ヒト角膜から角膜内皮細胞の前駆細胞の採取に成功した（非特許文献１２）。この細胞は未分化細胞マーカーを発現し、中心部と周辺部の角膜内皮細胞でスフェアの形成能を比較したところ、周辺部内皮細胞の方が高いことを確認した。（非特許文献１３）。さらに、ＭｃＧｏｗａｎらは、角膜周辺部に未分化細胞マーカーを発現している細胞が多く存在し、障害を受けることでそれらの細胞が活性化されることを報告した（非特許文献１４）。【００１４】
Ｇ  タンパク質共役レセプター４９（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４９；本明細書では「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５」ともいう。）は、甲状腺刺激ホルモン（ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）や濾胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ｌｅｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ＬＨ）と類似した７回膜貫通型受容体の一種であり、ロイシンリッチリピートを含む細胞外Ｎ末端ドメインが付随するユニークな構造をもつ（図１、非特許文献１５）、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は発癌と関わりをもつＷｎｔシグナルならびにヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）シグナルのターゲット遺伝子であることから、それらのシグナルの異常によりＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現亢進が起こることが報告されている（非特許文献１６、非特許文献１７および非特許文献１８）、さらにＧＰＲ４９／ＬＧＲ５が腸管上皮幹細胞に特異的に発現が見られることが確認されたことにより（非特許文献８）、新規の幹細胞特異的に発現するタンパク質として注目されるようになった。その後、毛包（非特許文献１９）や胃上皮（非特許文献２０）などの組織においても幹細胞特異的に発現の亢進が見られることが確認され、幹細胞ニッチの構築や組織形成に関与している可能性も報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｃａｒｍｏｎ  ＫＳ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１１  Ｊｕｌｙ  １２；１０８（２８）：１１４５２−１１４５７
【非特許文献２】ｄｅ  Ｌａｕ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１  Ｊｕｌ  ４；４７６（７３６０）：２９３−２９７
【非特許文献３】Ｇｌｉｎｋａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．２０１１  Ｓｅｐ  ３０；１２（１０）：１０５５−１０６１．
【非特許文献４】Ｊ．Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｌｅｅ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ２４（２０１２）３６９−３７７
【非特許文献５】Ｂｒｚｅｓｚｃｚｙｎｓｋａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１２  Ｍａｙ；２９（５）：８７１−８７６
【非特許文献６】Ｋｒｕｌｏｖａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２００８  Ｓｅｐ；４９（９）：３９０３−３９０８．
【非特許文献７】ＨＯＬＡＮ  Ｖ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ  Ｖｏｌｕｍｅ  ８８，Ｉｓｓｕｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ２４６，ｐａｇｅ  ０，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１０
【非特許文献８】Ｂａｒｋｅｒ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４９：１００３−１００７，２００７
【非特許文献９】Ｏｏｔａｎｉ  Ａ．，Ｌｉ  Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００９  Ｊｕｎ；１５（６）：７０１−７０６
【非特許文献１０】Ｓｃｈｉｍｍｅｌｐｆｅｎｎｉｇ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，ＩＯＶＳ，Ｖｏｌ．２５，，ｐｐ．２２３−２２９．１９８４
【非特許文献１１】Ｗｈｉｋｅｈａｒｔ  ＤＲ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．，１１，ｐｐ．８１６−８２４，２００５
【非特許文献１２】Ｙｏｋｏｏ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ，ＩＯＶＳ．４６，１６２６−１６３１，２００５
【非特許文献１３】Ｙａｍａｇａｍｉ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，１１４，４３３−４３９，２００７
【非特許文献１４】ＭｃＧｏｗａｎ  ＳＬ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．，１３：１９８４−２０００．２００７
【非特許文献１５】Ｈｓｕ  ＳＹ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２，１８３０−１８４５，１９９８
【非特許文献１６】Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．３７，５２８−５３３，２００３
【非特許文献１７】ＭｃＣｌａｎａｈａｎ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．５，４１９−４２６，２００６
【非特許文献１８】Ｔａｎｅｓｅ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１７３，８３５−８４３，２００８
【非特許文献１９】Ｊａｋｓ  Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．４０，１２９１−１２９９，２００８
【非特許文献２０】Ｂａｒｋｅｒ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．７，６５６−６７０，２０１０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を増殖・分化のマーカーとして使用する技術を提供する。本発明者らは、ヒト角膜組織においてＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、角膜内皮細胞（特に周辺部）に強く発現していたことを見出し、ヒト角膜内皮細胞の培養細胞では、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現量は有意に低下したことを見出し、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞群は、細胞サイズが小さく、高い増殖能を有することも見出した。これらに基づきＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を増殖・分化のマーカーとして使用する技術へ応用した。【００１７】
また、本発明は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類を分化抑制、増殖促進剤として使用することを提供する。【００１８】
本発明者らは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、特にＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １において、ヒト培養角膜内皮細胞の分化を抑制し、増殖を促進する傾向を見出だした。これによって、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類を、角膜保存液、角膜内皮細胞培養液、角膜内皮細胞障害の治療剤（点眼液、細胞注入）および角膜内皮細胞障害の進行予防剤などの用途として用いる技術へと応用した。【００１９】
これまでの研究では、未だ明確に角膜内皮幹細胞の存在を提示している報告はない。また、生体内における角膜内皮細胞の増殖能や未分化性を制御するメカニズムについても解明されていない。本発明者らは角膜内皮細胞の前駆細胞に特異的に発現するタンパク質としてＧＰＲ４９／ＬＧＲ５が存在することを見出し、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの機能的役割について検証し、マーカーとして応用するに至った。【００２０】
１つの局面において、本発明は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類およびその機能的等価物からなる群より選択される少なくとも１種を含む、細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。【００２１】
１つの実施形態において、本発明は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類およびその機能的等価物からなる群より選択される少なくとも１種を含む、眼細胞、神経堤細胞由来の細胞（角膜内皮細胞を含む）を含む神経細胞、結膜上皮細胞、羊膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞、角膜上皮細胞等の上皮細胞等から選択される細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。【００２２】
別の実施形態において、本発明は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類およびその機能的等価物からなる群より選択される少なくとも１種を含む、眼細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。【００２３】
別の実施形態において、本発明におけるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ２、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ３およびＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ４から選択される少なくとも１つを含む。【００２４】
特定の実施形態において、前記Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １を含む。【００２５】
別の実施形態において、前記眼細胞は、定常状態で増殖していない細胞である。【００２６】
特定の実施形態において、前記眼細胞は網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞から選択される少なくとも１種の細胞を含む。【００２７】
特定の実施形態において、前記眼細胞は角膜内皮細胞を含む。【００２８】
特定の実施形態において、前記眼細胞は霊長類の角膜内皮細胞を含む。【００２９】
特定の実施形態において、前記眼細胞はヒト角膜内皮細胞を含む。【００３０】
特定の実施形態において、前記眼細胞はコンフルエントの状態にある。【００３１】
１つの局面において、本発明は、ＳＨＨ、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される少なくとも１種含む、細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。【００３２】
１つの実施形態において、本発明は、ＳＨＨ、プルモルファミンおよびそれらの機能的等価物からなる群より選択される少なくとも１種含む、眼細胞、神経堤細胞由来の細胞（角膜内皮細胞を含む）を含む神経細胞、結膜上皮細胞、羊膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞、角膜上皮細胞等の上皮細胞等から選択される細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。【００３３】
別の実施形態において、本発明は、ＳＨＨ、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される少なくとも１種含む、眼細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。【００３４】
別の実施形態において、前記眼細胞は、定常状態で増殖していない細胞である。【００３５】
特定の実施形態において、前記眼細胞は網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞から選択される少なくとも１種の細胞を含む。【００３６】
特定の実施形態において、前記眼細胞は角膜内皮細胞を含む。【００３７】
特定の実施形態において、前記眼細胞は霊長類の角膜内皮細胞を含む。【００３８】
特定の実施形態において、前記眼細胞はヒト角膜内皮細胞を含む。【００３９】
特定の実施形態において、前記眼細胞はコンフルエントの状態にある。【００４０】
１つの局面において、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子を含む、細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。【００４１】
１つの実施形態において、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子を、眼細胞、神経堤細胞由来の細胞（角膜内皮細胞を含む）を含む神経細胞、結膜上皮細胞、羊膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞、角膜上皮細胞等の上皮細胞等から選択される細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。【００４２】
別の実施形態において、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子を含む、眼細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。【００４３】
別の実施形態において、前記ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子は、核酸、抗体または抗体断片、あるいはそれらの機能的等価物である。【００４４】
別の実施形態において、前記眼細胞は、定常状態で増殖していない細胞である。【００４５】
特定の実施形態において、前記眼細胞は網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞から選択される少なくとも１種の細胞を含む。【００４６】
特定の実施形態において、前記眼細胞は角膜内皮細胞を含む。【００４７】
特定の実施形態において、前記眼細胞は霊長類の角膜内皮細胞を含む。【００４８】
特定の実施形態において、前記眼細胞はヒト角膜内皮細胞を含む。【００４９】
特定の実施形態において、前記眼細胞はコンフルエントの状態にある。【００５０】
特定の実施形態において、前記眼細胞は、角膜組織の形態で提供される。【００５１】
さらなる局面において、本発明は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を含む、角膜保存または角膜内皮細胞培養のための組成物を提供する。【００５２】
さらなる局面において、本発明は、本発明に記載の分化抑制および／または増殖促進剤を含む、角膜内皮細胞障害の治療または角膜内皮細胞障害の進行予防のための医薬組成物を提供する。【００５３】
さらなる局面において、本発明は、本発明に記載の分化抑制および／または増殖促進剤を用いて培養された角膜内皮細胞を含む角膜内皮細胞障害の治療剤または進行予防剤を提供する。【００５４】
１つの実施形態において、前記細胞は、通常の角膜内皮細胞よりも細胞密度が高いかおよび／または未分化な細胞をより多く含む集団として存在する。【００５５】
さらに別の局面において、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するためのマーカーを提供する。【００５６】
本発明のマーカーの１つの実施形態において、前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である。【００５７】
本発明のマーカーの別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。【００５８】
本発明のマーカーの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。【００５９】
本発明のマーカーの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。【００６０】
別の局面において、本発明は、角膜内皮培養物であって、該角膜内皮は、コンフルエント状態の細胞密度よりも高い密度で存在する培養物を提供する。この場合の角膜内皮培養物は、通常、生体内に存在するものとは異なる状態で存在するものをさす。【００６１】
１つの実施形態において、前記細胞密度は、約５７０個／ｍｍ２以上である。【００６２】
別の実施形態において、前記細胞密度は、約７００個／ｍｍ２以上である。【００６３】
別の実施形態において、前記細胞密度は、約８００個／ｍｍ２以上である。【００６４】
別の実施形態において、前記細胞密度は、約１０００個／ｍｍ２以上である。【００６５】
別の局面において、本発明は、角膜内皮細胞を含む角膜組織であって、該組織中のＫｉ６７陽性細胞が、生体内中の割合よりも高い割合で存在するか、および／または該角膜内皮細胞の密度が生体内中の密度よりも高い角膜組織を提供する。【００６６】
１つの実施形態において、前記Ｋｉ６７陽性細胞は、約４％以上の割合で存在する。【００６７】
別の実施形態において、前記Ｋｉ６７陽性細胞は、約７％以上の割合で存在する。【００６８】
別の実施形態において、前記Ｋｉ６７陽性細胞は、約１０％以上の割合で存在する。【００６９】
別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の密度は、約４０００個／ｍｍ２以上である。【００７０】
別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の密度は、約４５００個／ｍｍ２以上である。【００７１】
別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の密度は、約５０００個／ｍｍ２以上である。【００７２】
別の局面において、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするための方法を提供する。【００７３】
本発明の指標とするための方法における１つの実施形態において、前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である。【００７４】
本発明の指標とするための方法における１つの別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。【００７５】
本発明の指標とするための方法における１つの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。【００７６】
本発明の指標とするための方法における１つの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。【００７７】
さらに別の局面において、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に結合する物質を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するための検出剤を提供する。【００７８】
本発明の検出剤の１つの実施形態において、前記検出剤は、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいは核酸プライマーもしくはプローブである。【００７９】
本発明の検出剤の別の実施形態において、前記検出剤は、標識されたものである。【００８０】
本発明の検出剤の別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。【００８１】
本発明の検出剤の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。【００８２】
本発明の検出剤の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。【００８３】
さらに別の局面において、本発明は、ＳＨＨを含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するためのマーカーを提供する。【００８４】
本発明のマーカーの１つの実施形態において、前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である。【００８５】
本発明のマーカーの別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。【００８６】
本発明のマーカーの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。【００８７】
本発明のマーカーの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。【００８８】
別の局面において、本発明は、ＳＨＨを、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするための方法を提供する。【００８９】
本発明の指標とするための方法における１つの実施形態において、前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である。【００９０】
本発明の指標とするための方法における１つの別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。【００９１】
本発明の指標とするための方法における１つの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。【００９２】
本発明の指標とするための方法における１つの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。【００９３】
さらに別の局面において、本発明は、ＳＨＨに結合する物質を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するための検出剤を提供する。【００９４】
本発明の検出剤の１つの実施形態において、前記検出剤は、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいは核酸プライマーもしくはプローブである。【００９５】
本発明の検出剤の別の実施形態において、前記検出剤は、標識されたものである。【００９６】
本発明の検出剤の別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。【００９７】
本発明の検出剤の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。【００９８】
本発明の検出剤の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。【００９９】
さらに別の局面において、本発明は、ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するためのマーカーを提供する。【０１００】
本発明のマーカーの１つの実施形態において、前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である。【０１０１】
本発明のマーカーの別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。【０１０２】
本発明のマーカーの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。【０１０３】
本発明のマーカーの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される少なくとも一つの特徴により識別される。【０１０４】
本発明のマーカーの別の実施形態において、前記ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子は、ＳＨＨ，ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１およびＧＬＩ２からなる群より選択される。【０１０５】
さらに別の局面において、本発明は、ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子を、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするための方法を提供する。【０１０６】
本発明の方法の１つの実施形態において、前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である。【０１０７】
本発明の方法の別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。【０１０８】
本発明の方法の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。【０１０９】
本発明の方法の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される少なくとも一つの特徴により識別される。【０１１０】
本発明の方法の別の実施形態において、前記ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子は、ＳＨＨ，ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１およびＧＬＩ２からなる群より選択される。【０１１１】
別の局面において、本発明は、ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子に結合する物質を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するための検出剤を提供する。【０１１２】
本発明の検出剤の１つの実施形態において、前記検出剤は、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいは核酸プライマーもしくはプローブである。【０１１３】
本発明の検出剤の別の実施形態において、前記検出剤は、標識されたものである。【０１１４】
本発明の検出剤の別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。【０１１５】
本発明の検出剤の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。【０１１６】
本発明の検出剤の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される少なくとも一つの特徴により識別される。【０１１７】
本発明の検出剤の別の実施形態において、前記ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子は、ＳＨＨ，ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１およびＧＬＩ２からなる群より選択される。【０１１８】
別の局面において本発明は、Ｗｎｔ経路の因子を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するためのマーカーを提供する。【０１１９】
本発明のマーカーの１つの実施形態において、前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である。【０１２０】
本発明のマーカーの別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。【０１２１】
本発明のマーカーの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。【０１２２】
本発明のマーカーの別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される少なくとも一つの特徴により識別される。【０１２３】
本発明のマーカーの別の実施形態において、前記Ｗｎｔ経路の因子は、ＬＲＰ６およびβ−カテニンからなる群より選択される。【０１２４】
別の局面において、本発明は、Ｗｎｔ経路の因子を、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするための方法を提供する。【０１２５】
本発明の方法の１つの実施形態において、前記増殖能の高い細胞は未分化細胞である。【０１２６】
本発明の方法の別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。【０１２７】
本発明の方法の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。【０１２８】
本発明の方法の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。【０１２９】
本発明の方法の別の実施形態において、前記Ｗｎｔ経路の因子は、ＬＲＰ６およびβ−カテニンからなる群より選択される。【０１３０】
他の局面において、本発明は、Ｗｎｔ経路の因子に結合する物質を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するための検出剤を提供する。【０１３１】
本発明の検出剤の１つの実施形態において、前記検出剤は、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいは核酸プライマーもしくはプローブである。【０１３２】
本発明の検出剤の別の実施形態において、前記検出剤は、標識されたものである。【０１３３】
本発明の検出剤の別の実施形態において、前記増殖能の高い細胞は幹細胞である。【０１３４】
本発明の検出剤の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞はヒト細胞である。【０１３５】
本発明の検出剤の別の実施形態において、前記角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。【０１３６】
本発明の検出剤の別の実施形態において、前記Ｗｎｔ経路の因子は、ＬＲＰ６およびβ−カテニンからなる群より選択される。【０１３７】
さらに別の局面において、本発明は、本発明の検出剤、マーカー等を用いた診断剤、検出キット、診断キット、検出システム、診断システム等を提供する。【０１３８】
さらに別の局面において、本発明は、本発明の医薬組成物、治療剤または進行予防剤を用いた治療方法、予防方法、使用等を提供する。【０１３９】
上述の特徴は、１または複数をさらに組み合わせて用いることができることが理解される。【０１４０】
本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【０１４１】
本発明によれば、角膜内皮細胞に存在する細胞の分化能を識別することができ、増殖能が高い細胞を識別することができ、その結果、角膜内皮に少量存在する未分化細胞を効果的に識別し収集することができるようになった。また、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類を使用することによって、角膜内皮の増殖を行うことができ、従来不可能または困難であった、角膜内皮の疾患や障害を治療または予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】図１は、ＧＲＰ４９／ＬＧＲ５の構造を示す（Ｂａｒｋｅｒ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０１０  Ｍａｙ；１３８（５）：１６８１−９６）を参照）。
【図２−１】図２は、ヒト角膜におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現を示す。ａ．左からＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ネスチンおよびＡＢＣＧ２のヒト角膜切片における免疫染色を示す。スケールバーは１００μｍである各写真において、上から、上皮（Ｅｐｉ）、実質（Ｓｔｒ）、内皮（Ｅｎｄ）に該当する部分を示す。ｂ．左からＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ネスチンおよびＡＢＣＧ２のリアルタイムＰＣＲを示す、縦軸は角膜内皮を１としたｍＲＮＡの相対レベルを示す。Ｎ＝４．Ｅｐｉ：角膜上皮；Ｓｔｒ：角膜実質；Ｅｎｄ：角膜内皮。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を示す。＊ステューデントのｔ検定でのｐ＜０．０５。
【図２−２】図２は、ヒト角膜におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現を示す。ｃ．ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の免疫染色のホールマウントである。Ｃｅｎｔｅｒは中心、Ｐｅｒｉｐｈｅｒｙは周辺部を示す。ｄ．ヒト角膜の中央領域対周辺部領域の拡大図である。Ｃｅｎｔｅｒは中心、Ｐｅｒｉｐｈｅｒｙは周辺部を示す。ｅ．ヒト角膜の中央（Ｃｅｎｔｅｒ）および周辺部（Ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ）におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のリアルタイムＰＣＲを示す。縦軸は角膜内皮を１としたｍＲＮＡの相対レベルを示す。Ｎ＝３．エラーバーはＳ．Ｅ．を示す。＊ステューデントのｔ検定でのｐ＜０．０５。
【図３−１】図３は培養角膜内皮細胞のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現を示す。ａ．培養ヒト角膜内皮細胞（ｃＨＣＥＣ）でのＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびネスチンの免疫染色を示す。左から位相差像、ＧＰＲ４９  ＰＩ像およびネスチンＰＩ像を示す。上から生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、初代培養（Ｐ０）、継代第１世代（Ｐ１）を示す。スケールバーは１００μｍを示す。
【図３−２】図３は培養角膜内皮細胞のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現を示す。ｂ．左からＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびネスチンｍＲＮＡのｃＨＣＥＣでの発現を示す。縦軸は初代培養（Ｐ０）を１としたｍＲＮＡの相対レベルを示す。生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、初代培養（Ｐ０）を示す。Ｎ＝４。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を示す。＊ステューデントのｔ検定でのｐ＜０．０５。ＮＤ＝検出せず。
【図３−３】図３は培養角膜内皮細胞のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現を示す。ｃ．培養サル角膜内皮細胞（ｃＭＣＥＣ）におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の免疫染色を示す。左から位相差像、およびＧＰＲ４９  ＰＩ像を示す。上から生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、初代培養（Ｐ０）、継代第１世代（Ｐ１）を示す。スケールバーは１００μｍを示す。
【図３−４】図３は培養角膜内皮細胞のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現を示す。ｄ．ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５  ｍＲＮＡのｃＭＣＥＣでの発現を示す。縦軸は初代培養（Ｐ０）を１としたｍＲＮＡの相対レベルを示す。生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、初代培養（Ｐ０）、継代第１世代（Ｐ１）および継代第２世代（Ｐ２）を示す。Ｎ＝３。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を示す。＊ステューデントのｔ検定でのｐ＜０．０５。
【図４−１】図４は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞の特徴づけを示す。ａ．セルソーティング後のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞（ＧＰＲ４９＋）の位相差を左に示し、陰性細胞（ＧＰＲ４９−）の位相差を右に示す。スケールバーは１００μｍを示す。
【図４−２】図４は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞の特徴づけを示す。ｂ．各細胞の表面積を示す。ＧＰＲ４９＋の平均細胞サイズは１８４．６±４５．８μｍ２であり、ＧＰＲ４９−の平均細胞サイズは３２６．７８±７８．８μｍ２である。Ｎ＝３５。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を示す。＊ステューデントのｔ検定でのｐ＜０．０１。ｃ．ＧＰＲ４９＋のおよびＧＰＲ４９−のＫｉ−６７陽性比率を示す。Ｎ＝４。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を示す。＊ステューデントのｔ検定でのｐ＜０．０５。
【図４−３】図４は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞の特徴づけを示す。ｄ．二重染色でのＧＰＲ４９＋の細胞増殖のセルソーティングを示す（縦軸：Ｃｙ３−Ｋｉ６７および横軸：ＦＩＴＣ−ＧＰＲ４９）：ＧＰＲ４９＋／Ｋｉ−６７＋；３．４％，ＧＰＲ４９＋／Ｋｉ−６７−；３．８％，ＧＰＲ４９−／Ｋｉ−６７−；０％，ＧＰＲ４９−／Ｋｉ−６７−；９２．８％。
【図５−１】図５は、ｃＨＣＥＣにおけるヘッジホッグシグナル伝達経路を示す。ａ．ヘッジホッグシグナル関連遺伝子（上段において左からＳｈｈ、ＳｍｏおよびＰｔｃｈ１、下段において左からＧｌｉ１およびＧｌｉ２）の発現を示す。中心を１としたｍＲＮＡ相対レベルを示す。
【図５−２】図５は、ｃＨＣＥＣにおけるヘッジホッグシグナル伝達経路を示す。ｂ．左から、コントロール、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびＫｉ−６７の、１００ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＳｈｈ（左から２番目）、１０μＭ  プルモルファミン（Ｐｕｒ）（左から３番目）および１０μＭ  シクロパミン（Ｃｙｃ）（一番右）で処理したＨＣＥＣにおける免疫染色を示す。上段はＧＰＲ４９染色、下段はＫｉ６７染色を示す。コントロールは、０．１％ＤＭＳＯ。スケールバーは１００μｍを示す。
【図５−３】図５は、ｃＨＣＥＣにおけるヘッジホッグシグナル伝達経路を示す。ｃ．上段左からＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびＰｔｃｈ１、および下段左からＧｌｉ１およびＧｌｉ２のリアルタイムＰＣＲである。ｃｏｎｔｒｏｌはコントロールで、この結果を１とした相対ｍＲＮＡレベルを示す。ｒｈＳｈｈはｒｈＳｈｈで処理したものを示し、Ｐｕｒはプルモルファミン処理、Ｃｙｃはシクロパミドで処理したものを示す。Ｎ＝４。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を示す。＊ステューデントのｔ検定でのｐ＜０．０５。＊＊ステューデントのｔ検定でのｐ＜０．０１。
【図５−４】図５は、ｃＨＣＥＣにおけるヘッジホッグシグナル伝達経路を示す。ｄ．ｒｈＳＨＨで処理したｃＨＣＥＣにおけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現（相対ｍＲＮＡレベル）を示す。ｅ．ｒｈＳＨＨで処理したｃＨＣＥＣにおけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の免疫染色。スケールバーは１００μｍを示す。
【図５−５】図５は、ｃＨＣＥＣにおけるヘッジホッグシグナル伝達経路を示す。ｆ．左から、コントロール、１００ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＳＨＨ、２μＭ  Ｐｕｒおよび２μＭ  Ｃｙｃで処理したｃＨＣＥＣにおけるＫｉ−６７の免疫染色を示す。上段はＧＲＰ４９染色を示し。下壇はＫｉ６７染色を示す。コントロールは、０．０１％ＤＭＳＯである。スケールバーは１００μｍを示す。
【図５−６】図５は、ｃＨＣＥＣにおけるヘッジホッグシグナル伝達経路を示す。ｇ．右からコントロール、１００ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＳｈｈ，２μＭ  プルモルファミン（Ｐｕｒ）および２μＭ  シクロスファミド（Ｃｙｃ）で処理したｃＨＣＥＣのＫｉ−６７陽性比率を示す。Ｎ＝５。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を示す。＊ステューデントのｔ検定での＊ｐ＜０．０１。
【図６−１】図６は、角膜内皮細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の機能を示す。ａ．ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５ｓｈＲＮＡのノックダウン効果を示す。コントロール（ＮＴ）を１とした相対ｍＲＮＡレベルを示す。左からＮＴ（コントロール）、ｓｈＧＰＲ４９−５８７、ｓｈＧＰＲ４９−５８８、およびｓｈＧＰＲ４９−５８９でのＧＰＲ４９に対する効果を示す。
【図６−２】図６は、角膜内皮細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の機能を示す。ｂ．ｓｈＲＮＡ（５８９）で処理した（左から）Ｐｔｃｈ１、Ｇｌｉ１およびＧｌｉ２の発現を示す。ＮＴ：非標的。Ｎ＝５。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を示す。ＮＤ＝検出せず。
【図６−３】図６は、角膜内皮細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の機能を示す。ｃ．ｃＨＣＥＣに対するＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の過剰発現の効果を示す。左は位相差、右はＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ  ＰＩ染色を示す。上段はＧＰＲ４９発現を示し、下段はＮＴ（コントロール）を示す。
【図６−４】図６は、角膜内皮細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の機能を示す。ｄ．上段左からＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびＰｔｃｈ１、下段左からＧｌｉ１およびＧｌｉ２ｍＲＮＡの発現を示す。ＮＴはコントロール、ＥｘｐＧＰＲ４９はＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現物を示す。Ｎ＝３。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．を示す。＊ステューデントのｔ検定での＊ｐ＜０．０１。
【図６Ａ】図６Ａは、ヒト角膜内皮細胞（ＣＥＣ）におけるｓｈＬＧＲ５の作用を示す。（Ａ）左から、ＮＴおよびｓｈＬＧＲトランスフェクト細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｐｔｃｈ１、Ｇｌｉ１およびＧｌｉ２についてのリアルタイムＰＣＲを示す。平均±ＳＥＭ。＊＊Ｐ＜０．０５。Ｎ＝３。（Ａ）は図６−２のものを、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５とさらに並行して表示するものであり、一部重複する。（Ｂ）ＮＴ（上段）およびｓｈＬＧＲトランスフェクトヒトＣＥＣ（下段）におけるＫｉ６７の位相差顕微鏡像（左欄）およびＫｉ６７の免疫染色（右欄）を示す。矢印はＫｉ６７（＋）細胞を示す。スケールバー＝１００μｍ。（Ｂ）右のグラフは、ＣＥＣ増殖に対するＧＰＲ４９／ＬＧＲ５遺伝子ノックダウンの影響を実証するために、Ｋｉ６７細胞のパーセントについての免疫細胞化学研究を実施した結果を示す。左はコントロール（ＮＴ）を示し、右は、ｓｈＬＧＲ５処理細胞（ｓｈＬＧＲ５）を示す。。
【図６Ｂ】図６Ｂは、角膜内皮細胞（ＣＥＣ）におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびＲＳＰＯ１の機能を示す。（Ａ）ＮＴ（上段）およびｓｈＬＧＲトランスフェクトヒトＣＥＣ（下段）における、位相差顕微鏡像（一番左）、ならびにＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（左から２番目）、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ（右から２番目）およびＺＯ１（一番右）の免疫染色を示す。スケールバー＝１００μｍ。図６Ｂ（Ａ）は、図６−３と一部重複（位相差画像、ＮａＫＡＴＰ）するが、比較のためにいずれも並列して表示する。（Ｂ）このグラフは、ＲＳＰＯ１有または無でのＣＥＣの細胞密度を示す。平均±ＳＥＭ。＊＊Ｐ＜０．０１。Ｎ＝５。（Ｃ）ＮＴおよびＬＧＲ５トランスフェクト細胞の細胞密度を示す。平均±ＳＥＭ。＊＊Ｐ＜０．０１。Ｎ＝５。（Ｄ）ＮＴおよびＬＧＲ５トランスフェクト細胞におけるＥＭＴ関連遺伝子（Ｓｎａｉｌ（１番左）、Ｓｌｕｇ（左から２番目）、Ｔｗｉｓｔ（右から２番目）およびコラーゲン１（一番右））についてのリアルタイムＰＣＲ。平均±ＳＥＭ。＊＊Ｐ＜０．０１。Ｎ＝３。（Ｅ）ＲＳＰＯ１（５０ｎｇ／ｍｌ）有（ＲＳＰＯ１（＋）、右）または無（ＲＳＰＯ１（−）、左）でのヒトＣＥＣの位相差顕微鏡像を示す。スケールバー＝１００μｍ。（Ｆ）ＲＳＰＯ１（５０ｎｇ／ｍｌ）有または無でのＮＴおよびＬＧＲ５トランスフェクト細胞における活性化されたβ−カテニン（１番上の段）、ｐＬＲＰ６（上から２番目）、ｔＬＲＰ６（下から２番目）およびβ−アクチン（１番下の段）のウェスタンブロッティングを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ヒト角膜内皮細胞（ＣＥＣ）におけるＲＳＰＯの発現および機能を示す。（Ａ）上パネルには、ヒト角膜上皮細胞（Ｅｐｉ）、実質細胞（Ｓｔｒｏｍａ）および内皮細胞（Ｅｎｄｏ）におけるＲＳＰＯ１（１番上の段）、ＲＳＰＯ２（上から２番目の段）、ＲＳＰＯ３（上から３番目の段）およびＲＳＰＯ４（上から４番目の段）についてのＰＣＲの結果を示す。下パネルには、内皮細胞（Ｅｎｄｏ）のうち、中心（Ｃｅｎｔｅｒ）および周辺（Ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ）におけるＲＳＰＯ１（１番上の段）、ＲＳＰＯ２（上から２番目の段）、ＲＳＰＯ３（上から３番目の段）およびＲＳＰＯ４（上から４番目の段）についてのＰＣＲの結果を示す。（Ｂ）ＲＳＰＯ１（１番上の段）、ＲＳＰＯ２（上から２番目の段）、ＲＳＰＯ３（上から３番目の段）およびＲＳＰＯ４（上から４番目の段）（いずれも５０ｎｇ／ｍｌ）有または無での培養ヒトＣＥＣの位相差顕微鏡像を示す。スケールバー＝１００μｍ。（Ｃ）ＲＳＰＯ１（１番上の段）、ＲＳＰＯ２（上から２番目の段）、ＲＳＰＯ３（上から３番目の段）およびＲＳＰＯ４（上から４番目の段）（いずれも５０ｎｇ／ｍｌ）有または無でのヒトＣＥＣにおけるＫｉ６７の免疫染色を示す。スケールバー＝１００μｍを示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＣＥＣ維持の分子機構の模式図を示す。ヒトＣＥＣは、ＧＲＰ４９／ＬＧＲ５発現に関して領域的な多様性を示す。ＧＲＰ４９／ＬＧＲ５は、ＣＥＣの周辺部領域において特有に発現され、ここでは、ＨＨシグナル伝達が明らかに活性化されている。ＧＲＰ４９／ＬＧＲ５は、ＨＨ経路の標的分子であり、インビトロ条件において、ＨＨ経路は、ＣＥＣ増殖を誘導することができた。しかしながら、インビボの状況では、ＨＨ経路のみの刺激では、ＣＥＣ増殖の誘導には不十分であった。永続的なＧＲＰ４９／ＬＧＲ５の発現は、Ｗｎｔ経路の阻害によって正常なＣＥＣ表現型を維持した。ＧＲＰ４９／ＬＧＲ５リガンドであるＲＳＰＯ１は、インビボでＣＥＣ増殖を加速させ、Ｗｎｔ経路を介してＭＴを阻害した。
【図７】図７は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １〜４の概説を示す。
【図８】図８は実施例９でのＣｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｋｉｔを用いた増殖細胞の検出（倍率ｘ２００）を示す。サル培養角膜内皮細胞を播種し、細胞がほぼコンフルエントな状態でＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １（左から０、１０、５０ｎｇ／ｍｌ）入りの培地に交換し、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １添加から２４時間後、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵにてＥｄＵを染色し、ＥｄＵ陽性細胞率をカウントした。
【図９】図９は、図８におけるＥｄＵ陽性細胞率を示す。ＥｄＵ陽性細胞／ＤＡＰＩをカウントした結果、コントロールに比べてＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １を１０ｎｇ／ｍｌもしくは５０ｎｇ／ｍｌで添加したウェルでＥｄＵ陽性細胞が２倍増加していることが判明した。
【図１０】図１０は、図８で示した方法で培養した角膜内皮細胞の内皮細胞密度を示す。位相差顕微鏡で写真撮影を行い、角膜内皮細胞密度計算ソフトＫｏｎａｎ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＫＳＳ−４００ＥＢを用いて細胞密度の計測を行った。左から培地添加なし、１０ｎｇ／ｍｌ  Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １、５０ｎｇ／ｍｌ  Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １を示す。
【図１１】図１１は、ヒト培養角膜内皮細胞におけるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１の作用を示す。ＲＳＰＯ１を添加した角膜内皮細胞（５０ｎｇ／ｍｌ（右上），５００ｎｇ／ｍｌ（左下））は、コントロールと比較してＫｉ６７陽性細胞率が上昇した。左上はコントロールを示し、右上は、５０ｎｇ／ｍｌ  Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １で培養した例、左下は５００ｎｇ／ｍｌ  Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １で培養した例、右下は１０００ｎｇ／ｍｌ  Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １で培養した例を示す。Ｋｉ６７は緑色で染色され、コントロールではみえず、５０ｎｇ／ｍｌおよび５００ｎｇ／ｍｌでは顕著に染色され、１０００ｎｇ／ｍｌでも染色が観察される。ＰＩは赤く染色され、いずれの細胞でも染色される。
【図１２】図１２は、ヒト培養角膜内皮細胞におけるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ２の作用を示す。ＲＳＰＯ２を添加した角膜内皮細胞は、コントロールと比較してＫｉ６７陽性細胞率がわずかに上昇した。左は、５０ｎｇ／ｍｌ  Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ２で培養した例、右は１００ｎｇ／ｍｌ  Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ２で培養した例、上は角膜輪部を示し、下は中心部を示す。
【図１３】図１３は、ヒト培養角膜内皮細胞におけるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ３の作用を示す。ＲＳＰＯ３を添加した角膜内皮細胞は、コントロールと比較してＫｉ６７陽性細胞率はわずかに上昇した。左は、５０ｎｇ／ｍｌ  Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ３で培養した例、右は２００ｎｇ／ｍｌ  Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ３で培養した例、上は角膜輪部を示し、下は中心部を示す。
【図１４】図１４は、ヒト培養角膜内皮細胞におけるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ４の作用を示す。ＲＳＰＯ４を添加した角膜内皮細胞は、コントロールと比較してＫｉ６７陽性細胞率はわずかに上昇した。左は、５０ｎｇ／ｍｌ  Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ４で培養した例、右は５００ｎｇ／ｍｌ  Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ４で培養した例、上は角膜輪部を示し、下は中心部を示す。
【図１５】図１５は、ヒト角膜内皮細胞の継代培養を行った後に、コンフルエントに到達して２週間以上培養し角膜内皮密度に明らかな変化を認めなくなった時点で、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１を培地中に１０ｎｇ／ｍｌの濃度にて添加して培養を継続し、細胞形態の観察は位相差顕微鏡にて行い、細胞密度を計算した結果を示す。写真は、添加後の日数（左から０日目、７日目、１４日目および２１日目）を示す。下のグラフは、非添加群との比較での添加群Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １の細胞密度の０日目、７日目、１４日目および２１日目の推移を示すものである。
【図１６】図１６は、ウサギ強角膜片を用いた器官培養について、ＤＭＥＭ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１２３２０）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）にて１週間３７℃のインキュベーターにて、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １の存在（右から１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ）または不存在下（最も左、コントロール）で、培養し、細胞増殖のマーカーとしてＫｉ６７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．、カタログ番号：Ｐ６８３４）を用いて角膜内皮細胞の免疫染色を行い蛍光顕微鏡にて観察を行った結果を示す。ＤＡＰＩにて核染色を行い、Ｋｉ６７陽性細胞率を計算した結果を左下パネルに示す。また、ＺＯ−１にて免疫染色を行い細胞密度の計算を行った結果を右下パネルに示す。
【発明を実施するための形態】
【０１４３】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。従って、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【０１４４】
本明細書において、「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５」とは、７回膜貫通型のＬＧＲファミリーメンバーであるタンパク質である。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、ある場合には糖タンパク質リガンドとの相互作用に重要であることが示されたロイシン・リッチ・リピートを含有する、巨大Ｎ末端細胞外ドメインによって特徴付けられる、異常なＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）であるロイシン・リッチ・リピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５に基づく命名であり、近時このような名称の頻度が高まっており本明細書ではこれらを併記する。ＦＥＸ  ＨＧ３８、ＧＰＲ６７としても知られる。ヒトＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列は、それぞれＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿００３６５８．１（配列番号２）およびＮＭ＿００３６６７．２（配列番号１）に開示されている。当該分野では、ＧＰＲ４９またはＬＧＲ５と単独の名称でも呼称されている。本明細書では「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５」と表示するが、いずれの表示であっても同一の意味を示すことが理解される。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５としては、ＯＭＩＭ：６０６６６７とのアクセッション番号で同定されうる。本明細書の目的で使用される場合は、「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【０１４５】
なお、本発明で挙げる他のタンパク質すべてにも同じことがあてはまる。従って、既定のタンパク質または核酸の名称は、配列表に示すようなタンパク質または核酸を指すだけでなく、機能的に活性な誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシー条件下で、好ましくは上述のような条件下で、前記タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、指す。本明細書で使用される「誘導体」または「構成要素タンパク質の類似体」または「変異体」は、好ましくは、限定を意図するものではないが、構成要素タンパク質に実質的に相同な領域を含む分子を含み、このような分子は、種々の実施形態において、同一サイズのアミノ酸配列にわたり、または当該分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによってアラインメントを行ってアラインされる配列と比較した際、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一であるか、あるいはこのような分子をコードする核酸は、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、またはストリンジェントでない条件下で、構成要素タンパク質をコードする配列にハイブリダイズ可能である。これは、それぞれ、アミノ酸置換、欠失および付加によって、天然存在タンパク質を修飾した所産であり、その誘導体がなお天然存在タンパク質の生物学的機能を、必ずしも同じ度合いでなくてもよいが示すタンパク質を意味する。例えば、本明細書において記載されあるいは当該分野で公知の適切で利用可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって、このようなタンパク質の生物学的機能を調べることも可能である。本発明では、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５はヒトが主に論じられるが、チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）（ＥＮＳＰＴＲＧ０００００００５２２３（ＸＲ＿０２１５８６．１））、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）（ＥＮＳＭＭＵＧ００００００２０９４２）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ＥＮＳＭＵＳＧ００００００２０１４０）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ＥＮＳＲＮＯＧ０００００００４２２１（ＬＯＣ６８７８６８））、モルモット（Ｃａｖｉａ  ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）（ＥＮＳＣＰＯＧ０００００００９４９２）、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）（ＥＮＳＣＡＦＧ００００００００４５１）、ネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ）（ＥＮＳＦＣＡＧ０００００００８０６４）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）（ＥＮＳＧＡＬＧ００００００１０１６３）等、ヒト以外の多くの哺乳動物がＧＰＲ４９／ＬＧＲ５タンパク質を発現していることが知られているため、これらの哺乳動物についても、本発明の範囲内に入ることが理解される。
【０１４６】
ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、アルツハイマー病において、ガンマーセクレターゼによるＡＰＰの異常なプロセシングに関与する、異なるタンパク質複合体の一部を形成することが発見されている。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５がＡｐｈ１ａ複合体、Ｆｅ６５Ｌ２複合体、ＡＰＰ−Ｃ９９複合体およびＢＡＣＥ１複合体の一部であることが発見されているため、これらの複合体を検出することによっても、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を検出することができる。これらの複合体は、ＴＡＰ技術エントリーポイントとして用いられている、それぞれの重要なタンパク質化合物にちなんで命名されている。
【０１４７】
本明細書で使用される「機能的に活性な」は、本明細書において、本発明のポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体が関連する態様に従って、生物学的活性などの、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有する、ポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体を指す。
【０１４８】
本発明において、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のフラグメントとは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の任意の領域を含むポリペプチドであり、天然のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の生物学的機能を有していなくてもよい。フラグメントの例として、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の細胞外領域を含むフラグメントが挙げられる。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の細胞外領域は配列番号２のアミノ酸配列において１−５５６番目、６１５−６３７番目、７０４−７２２番目、および７９２−８００番目が相当する。又、膜貫通領域は配列番号２のアミノ酸配列において５５７−５７９番目、５９２−６１４番目、６３８−６６０番目、６８１−７０３番目、７２３−７４５番目、７６９−７９１番目、および８０１−８２３番目が相当する。
【０１４９】
ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の有する活性をいう。
【０１５０】
ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の有する活性をいう。
【０１５１】
本発明の関連において、「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に結合する物質」または「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５相互作用分子」は、少なくとも一時的にＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に結合し、そして好ましくは、結合したことを表示しうる（例えば標識されるか標識可能な状態である）、分子または物質である。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に結合する物質はＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の阻害剤であってもよく、その例としては、抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、低分子量分子（ＬＭＷ）、結合性ペプチド、アプタマー、リボザイムおよびペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）等を挙げることができ、例えばＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に対して向けられる、特にＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の活性部位に対して向けられる、結合性タンパク質または結合性ペプチド、並びにＧＰＲ４９／ＬＧＲ５遺伝子に対して向けられる核酸も含まれる。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に対する核酸は、例えばＧＰＲ４９／ＬＧＲ５遺伝子の発現またはＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の活性を阻害する、二本鎖または一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはその修飾物または誘導体を指し、そして限定なしに、アンチセンス核酸、アプタマー、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）およびリボザイムを含む。本明細書において、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５について「結合性タンパク質」または「結合性ペプチド」とは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に結合する種類のタンパク質またはペプチドを指し、そしてＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に対して指向されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、抗体フラグメントおよびタンパク質骨格を含むがこれらに限定されない。
【０１５２】
本明細書において「Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ（類）」とはＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １等と同様の構造および機能を有する遺伝子群をいい、非特許文献４（Ｊ．Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｌｅｅ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ２４（２０１２）３６９−３７７）で説明されている。例えば、構造としては、Ｎ末端からＳＰ、ＣＲ，ＴＳＲ、ＢＲというドメインを有することが知られている。また、機能としては、ＧＰＲ４９に対するリガンドであることが知られている。従って、このような構造および機能を指標にＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類を確定することができる。例えば、ヒトでは、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １（ＲＳＰＯ１  ＯＭＩＭ：６０９５９５；核酸配列（遺伝子配列）：配列番号３、３５、３７または３９；アミノ酸配列：配列番号４、３６、３８または４０）、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ２（ＲＳＰＯ２  ＯＭＩＭ：６１０５７５、配列番号５および６）、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ３（ＲＳＰＯ３  ＯＭＩＭ：６１０５７４、配列番号７および８）、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ４（ＲＳＰＯ４  ＯＭＩＭ：６１０５７３：核酸配列（遺伝子配列）：配列番号９または４１；アミノ酸配列：配列番号１０または４２）が知られている。非特許文献４の情報から、図７のように各Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎがまとめられる。
【０１５３】
Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号３、３５、３７または３９に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４、３６、３８または４０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４、３６、３８または４０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３、３５、３７または３９に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号４、３６、３８または４０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １の有する活性をいう。
【０１５４】
Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号４、３６、３８または４０に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号４、３６、３８または４０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号３、３５、３７または３９に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号４、３６、３８または４０に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １の有する活性をいう。
【０１５５】
Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ２の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号５に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ２の有する活性をいう。
【０１５６】
Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ２のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号５に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号６に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ２の有する活性をいう。
【０１５７】
Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ３の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号７に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号７に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ３の有する活性をいう。
【０１５８】
Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ３のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号８に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号７に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号８に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ３の有する活性をいう。
【０１５９】
Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ４の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号９または４１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０または４２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１０または４２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号９または４１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１０または４２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ４の有する活性をいう。
【０１６０】
Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ４のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号１０または４２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１０または４２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号９または４１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号１０または４２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ４の有する活性をいう。
【０１６１】
本明細書において「ＳＯＮＩＣ  ＨＥＤＧＥＨＯＧ（ＳＨＨ）」とはヘッジホッグ（ＨＨ）ファミリーに属する５種類のタンパク質の内の１つであり、これをコードする遺伝子は、ｓｈｈで表記する。ＳＨＨは発生において最も重要なモルフォゲンとして、四肢や、脳脊髄正中線構造などの、多くの器官系のデザインを形成する役割がある。ヒト・ソニック・ヘッジホッグ遺伝子の変異では、腹側正中線の欠失が生じて全前脳胞症（ＨＰＥ）を引きおこすほか、シス調節エレメントの変化が原因で多指症になることなどが知られている。このファミリーの他のタンパク質には、哺乳類ではＤｅｓｅｒｔ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＤＨＨ）、Ｉｎｄｉａｎ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ，（ＩＨＨ）がある。例えば、ヒトのものは、ＳＨＨ（ＳＨＨ  ＯＭＩＭ  ６００７２５；ヒト：ＮＭ＿０００１９３（配列番号１１および１２）；マウス：ＮＭ＿００９１７０）が知られている。
【０１６２】
ｓｈｈの代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＳＨＨの有する活性をいう。
【０１６３】
ＳＨＨのアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＳＨＨの有する活性をいう。
【０１６４】
ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）経路の因子としては、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１およびＧＬＩ２が挙げられる。
【０１６５】
本明細書において「ＰＴＣＨ１」とはヘッジホッグ経路の因子の一つであり、Ｐａｔｃｈｅｄ−１と呼ばれる受容体であり、ＳＨＨが結合する受容体である。この因子をコードする遺伝子は、ｐｔｃｈ１で表記する。ＳＨＨとＰＴＣＨ１の結合によって、やはりＳＨＨ受容体複合体のコンポーネントであるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（ＳＭＯ）の抑制がはずれ、細胞内にシグナルが伝わり、最終的にＧｌｉ転写因子を介して様々な標的遺伝子の転写が活性化され生理機能を発揮するとされている。ＰＴＣＨ１の配偶子変異は、母斑基底細胞癌症候群（ＮＢＣＣＳ）（Ｇｏｒｌｉｎ症候群とも呼ばれる）という小奇形と高発がんを特徴とする遺伝病を引き起こすとされている。ＰＴＣＨ１は癌抑制遺伝子でもある。この遺伝子は、ＰＴＣ；ＢＣＮＳ；ＨＰＥ７；ＰＴＣ１；ＰＴＣＨ；ＮＢＣＣＳ；ＰＴＣＨ１１としても知られている。この因子には、例えば、ヒトのものは、ＮＣ＿０００００９．１１（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であり、ＮＣ＿０００００９（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）、ＮＭ＿００１０８３６０２．１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）（配列番号４３および４４）が知られている。
【０１６６】
ｐｔｃｈ１の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号４３＜ＮＭ＿００１０８３６０２．１＞に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４３に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＰＴＣＨ１の有する活性をいう。
【０１６７】
ＰＴＣＨ１のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号４４に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号４４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号４３に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号４４に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＰＴＣＨ１の有する活性をいう。
【０１６８】
本明細書において「ＧＬＩ１」とはヘッジホッグ（ＨＨ）経路の因子であり、転写因子Ｇｌｉファミリー（ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＬＩ３等）の一つである。ＧＬＩ１をコードする遺伝子はｇｌｉ１と示す。ＧＬＩ１はＰＴＣＨ１の下流にあり、ここから、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５にシグナルが伝わるとされる。ＳＨＨとＰＴＣＨ１の結合によって、やはりＳＨＨ受容体複合体のコンポーネントであるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（ＳＭＯ）の抑制がはずれ、細胞内にシグナルが伝わり、最終的にＧＬＩ転写因子を介して様々な標的遺伝子の転写が活性化され生理機能を発揮するとされている。この因子には、例えば、ヒトのものは、バリアント１としてＮＭ＿００５２６９．２（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ＮＭ＿００５２６９（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）；バリアント２としてＮＭ＿００１１６００４５．１（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ＮＭ＿００１１６００４５（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ）；バリアント３としてＮＭ＿００１１６７６０９．１（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ＮＭ＿００１１６７６０９（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）（配列番号４５および４６）が知られている。
【０１６９】
ｇｌｉ１の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号４５＜ＮＭ＿００１１６７６０９．１＞に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４５に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＧＬＩ１の有する活性をいう。
【０１７０】
ＧＬＩ１のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号４５に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号４６に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＧＬＩ１の有する活性をいう。
【０１７１】
本明細書において「ＧＬＩ２」とはヘッジホッグ（ＨＨ）経路の因子であり、転写因子ＧＬＩファミリー（ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＬＩ３等）の一つである。このＧＬＩ２をコードする遺伝子はｇｌｉ１で表す。ＰＴＣＨ１の下流にあり、ここから、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５にシグナルが伝わるとされる。ＳｈｈとＰＴＣＨ１の結合によって、やはりＳｈｈ受容体複合体のコンポーネントであるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）の抑制がはずれ、細胞内にシグナルが伝わり、最終的にＧｌｉ転写因子を介して様々な標的遺伝子の転写が活性化され生理機能を発揮するとされている。この因子には、例えば、ヒトのものは、ＮＭ＿００５２７０．４（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ＮＭ＿００５２７０（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）（配列番号４７および４８）が知られている。
【０１７２】
ｇｌｉ２の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号４７＜ＮＭ＿００５２７０．４＞に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４７に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＧＬＩ２の有する活性をいう。
【０１７３】
ＧＬＩ２のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号４７に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号４８に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＧＬＩ２の有する活性をいう。
【０１７４】
Ｗｎｔ経路の因子としては、ＬＲＰ６およびβ−カテニンが挙げられる。
【０１７５】
本明細書において「ＬＲＰ６」とはＷｎｔ経路の因子の１つであり、Ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ―ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６の略称であり、これをコードする遺伝子は、ｌｒｐ６で表記する。Ｇタンパク質であるＧβγはＧＳＫ３を活性化し、ＬＲＰ６を介するβ−カテニンの転写活性を促進する。この因子は、例えば、ヒトのものは、ＮＭ＿００２３３６．２（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ＮＭ＿００２３３６（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）ＬＲＰ６、ＮＭ＿００２３３６．２（配列番号４９および５０）が知られている。
【０１７６】
ｌｒｐ６の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号４９＜ＮＭ＿００２３３６．２＞に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４９に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＬＲＰ６の有する活性をいう。
【０１７７】
ＬＲＰ６のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号４９に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号５０に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＬＲＰ６の有する活性をいう。
【０１７８】
本明細書において「β−カテニン」とはＷｎｔ経路の因子の１つであり、これをコードする遺伝子は、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ／ＣＴＮＮＢ１で表記する。Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、脊椎動物と無脊椎動物の発生における細胞の運命の決定を調節する。Ｗｎｔ−リガンドは分泌された糖タンパク質であり、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体に結合する。この結合によって多機能キナーゼであるＧＳＫ−３βをＡＰＣ／Ａｘｉｎ／ＧＳＫ−３β複合体から離脱させるようなカスケードが開始する。Ｗｎｔ−シグナルが無い場合には、転写の共役因子であると同時に細胞膜に埋め込まれ、細胞と細胞の接着におけるアダプタータンパク質として存在するβ−カテニンが、ＡＰＣ／Ａｘｉｎ／ＧＳＫ−３β複合体による分解に向かうとされている。ＣＫ１とＧＳＫ−３βの協調的な作用によってβ−カテニンが適切なリン酸化を受けると、ユビキチン化と、β−ＴｒＣＰ／ＳＫＰ複合体を介したプロテアソームによる分解に至るとされている。Ｗｎｔが結合する場合には、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｖｌ）がリン酸化とポリユビキチン化を受けて活性化され、今度はこれが分解複合体からＧＳＫ−３βを遠ざける。これが、β−カテニンの安定化のために、Ｒａｃ−１依存的な核移行をさせてＬＥＦ／ＴＣＦ  ＤＮＡ結合因子へと誘引するが、そこでは、Ｇｒｏｕｃｈｏ−ＨＤＡＣ補助抑制因子と置換することによって転写活性化因子として作用するとされている。Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、多くの異なる型の細胞や組織において、レチノイン酸、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、及びＢＭＰなどの他の多くの経路からのシグナルを集約するとされている。この因子には、例えば、ヒトのものは、バリアント１としてＮＭ＿００１９０４．３（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ＮＭ＿００１９０４  ＸＭ＿９４２０４５  ＸＭ＿９４５６４８ＸＭ＿９４５６５０ＸＭ＿９４５６５１  ＸＭ＿９４５６５２  ＸＭ＿９４５６５３  ＸＭ＿９４５６５４  ＸＭ＿９４５６５５  ＸＭ＿９４５６５７（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ）；バリアント２としてＮＭ＿００１０９８２０９．１（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ＮＭ＿００１０９８２０９、ＸＭ＿００１１３３６６０、ＸＭ＿００１１３３６６４、ＸＭ＿００１１３３６７３  ＸＭ＿００１１３３６７５（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）；バリアント３としてＮＭ＿００１０９８２１０．１（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ＮＭ＿００１０９８２１０（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）、＿ＮＭ＿１３１０５９．２（ＣＴＮＮＢ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）（配列番号５１および５２）が知られている。
【０１７９】
β−カテニンの代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５１＜ＮＭ＿１３１０５９．２＞に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号５１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、β−カテニンの有する活性をいう。
【０１８０】
β−カテニンのアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号５１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号５２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、β−カテニンの有する活性をいう。
【０１８１】
本明細書において「プルモルファミン（ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）」とは、Ｎ−（４−モルホリノフェニル）−２−（１−ナフチルオキシ）−９−シクロヘキシル−９Ｈ−プリン−６−アミンの別称であり、ＣＡＳ番号は４８３３６７−１０−８として知られる化合物である。スムーズンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）という７回膜貫通タンパク質のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリー（ヘッジホッグシグナル伝達経路を担う膜タンパク質）のアゴニストとして知られている。したがって、本発明では、ＳＨＨのアゴニストとして、例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニストとして使用され得る。
【０１８２】
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
【０１８３】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
【０１８４】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。
【０１８５】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する遺伝子を調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。
【０１８６】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。従って本明細書において「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書にさらに記載する複合体のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を発揮する、別の種、好ましくは哺乳動物におけるタンパク質を意味する。こうような相同体はまた、「オルソログ遺伝子産物」とも称されることもある。ヒトおよび哺乳動物または他の種からオルソログ遺伝子対を検出するためのアルゴリズムは、これらの生物の全ゲノムを用いる。まず、予測されるタンパク質の完全Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ並列を用いて、対合ベストヒットを回収する。信頼性をさらに改善するため、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）および線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）タンパク質を含む対合ベストヒットを用いて、これらの対のクラスターを形成してもよい。このような分析は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４０９：８６０−９２１に提供される。他の種の遺伝子に対する、本明細書に提供するタンパク質をコードする遺伝子の配列相同性に基づいて、慣用的技術を適用してそれぞれの遺伝子をクローニングし、そしてこのような遺伝子からタンパク質を発現させることによって、あるいは本明細書に提供する方法に従って、または当該分野で周知の他の適切な方法に従って、類似の複合体を単離することにより、他の種のタンパク質を単離することによって、本明細書に記載のタンパク質の相同体を単離することも可能である。
【０１８７】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。
【０１８８】
本明細書において「ストリンジェント（な）条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３８，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃ１ｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。従って、本発明において使用されるポリペプチド（例えば、トランスサイレチンなど）には、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。これらの低ストリンジェンシー条件は、３５％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、および１０％（重量／体積）デキストラン硫酸を含む緩衝液中、４０℃で１８〜２０時間ハイブリダイゼーションし、２ｘＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中、５５℃で１〜５時間洗浄し、そして２ｘＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中、６０℃で１５時間洗浄することを含む。
【０１８９】
本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質は、好ましくは「精製された」物質である。
【０１９０】
本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。対応するアミノ酸は、例えば、システイン化、グルタチオン化、Ｓ−Ｓ結合形成、酸化（例えば、メチオニン側鎖の酸化）、ホルミル化、アセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチル化などがされる特定のアミノ酸であり得る。あるいは、対応するアミノ酸は、二量体化を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。
【０１９１】
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。従って、マウス、ラットのＲＰＧ４９、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類は、それぞれ、ヒトにおいて、対応するＲＰＧ４９、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類を見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。従って、例えば、ある動物（例えば、マウス）における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、ＲＰＧ４９、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ｓｈｈ等）は、配列番号１、３、５、７、９、１１等の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【０１９２】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなフラグメントは、例えば、全長のものがマーカーとして機能する場合、そのフラグメント自体もまたマーカーとしての機能を有する限り、本発明の範囲内に入ることが理解される。
【０１９３】
本発明に従って、用語「活性」は、本明細書において、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、限定を意図するものではないが、概して、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、この用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。
【０１９４】
本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本発明においては、例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５等がＲ−ｓｐｏｎｄｉｎを認識する機能などを挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。２つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。従って、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。従って、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が挙げられる。
【０１９５】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたもの（本明細書にいう誘導体）であり得る。例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現レベルは、任意の方法によって決定することができる。具体的には、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のｍＲＮＡの量、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５タンパク質の量、そしてＧＰＲ４９／ＬＧＲ５タンパク質の生物学的な活性を評価することによって、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現レベルを知ることができる。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のｍＲＮＡやタンパク質の量は、本明細書に記載したような方法によって決定することができる。
【０１９６】
本明細書において「機能的等価物」とは、対象となるもとの実体に対して、目的となる機能が同じであるが構造が異なる任意のものをいう。従って、「Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類またはその機能的等価物」または「Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類およびその機能的等価物からなる群」という場合は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類自体のほか、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するもの、ならびに、作用する時点において、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類自体またはこのＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類自体またはＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。本発明において、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎの機能的等価物は、格別に言及していなくても、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎと同様に用いられうることが理解される。
【０１９７】
また、「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５またはその機能的等価物」または「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびその機能的等価物からなる群」という場合は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５自体のほか、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するもの、または本明細書に記載されるマーカーとしての機能を有するもの、ならびに、作用する時点において、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５自体またはこのＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５自体またはＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。本発明において、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の機能的等価物は、格別に言及していなくても、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５と同様に用いられうることが理解される。
【０１９８】
また、「ＳＯＮＩＣ  ＨＥＤＧＥＨＯＧ（ＳＨＨ）またはその機能的等価物」または「ＳＯＮＩＣ  ＨＥＤＧＥＨＯＧ（ＳＨＨ）およびその機能的等価物からなる群」という場合は、ＳＨＨ自体のほか、ＳＨＨの変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するもの、または本明細書に記載されるマーカーとしての機能を有するもの、ならびに、作用する時点において、ＳＨＨ自体またはこのＳＨＨの変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、ＳＨＨ自体またはＳＨＨの変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。本発明において、ＳＨＨの機能的等価物は、格別に言及していなくても、ＳＨＨと同様に用いられうることが理解される。
【０１９９】
「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子またはその機能的等価物」または「ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子およびその機能的等価物からなる群」という場合は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子自体のほか、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子の変異体または改変体（例えば、合成改変体等）であって、作用する時点において、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するように変化するもの（変化してＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子に変化することができるもの（例えば、エステル等の前駆体またはプロドラッグ））が包含されることが理解される。本発明において、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子の機能的等価物は、格別に言及していなくても、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子と同様に用いられうることが理解される。
【０２００】
また、「ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）またはその機能的等価物」または「ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）およびその機能的等価物からなる群」という場合は、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）自体のほか、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）の変異体または改変体（例えば、合成改変体等）であって、作用する時点において、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するように変化するもの（変化してＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）自体またはこのＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）の変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、エステル等の前駆体またはプロドラッグ））が包含されることが理解される。本発明において、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）の機能的等価物は、格別に言及していなくても、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）と同様に用いられうることが理解される。
【０２０１】
本明細書において「アゴニスト」とは、対象となる実体（例えば、レセプター）に対してそのレセプターの生物学的作用を発現させる物質をいう。天然のアゴニスト（リガンドとも称される）のほか、合成されたものや改変されたもの等を挙げることができる。
【０２０２】
本明細書において「アンタゴニスト」とは、対象となる実体（例えば、レセプター）に対してそのレセプターの生物学的作用を阻害する物質をいう。アゴニスト（またはリガンド）と競合的に阻害するもののほか、非競合的に阻害するもの等がある。アゴニストを改変することによっても得られうる。生理現象を阻害することから、アンタゴニストは阻害剤または抑制（する）因子の概念に包含されうる。
【０２０３】
本明細書において「（ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５等を）抑制する因子」は、対象となるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５等の機能を一時的または永久に低下または消失させることができる因子をいう。このような因子には、抗体、その抗原結合フラグメント、それらの誘導体、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ因子等の核酸の形態のもの等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【０２０４】
本発明で用いられるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５や、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の機能的等価物は、データベース等を検索することによって、見出すことができる。本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
【０２０５】
本発明の機能的等価物としては、アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加されたものを用いることができる。本明細書において、「アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、あるいは天然の変異により、天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされていることを意味する。
【０２０６】
ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子、ＬＲＰ６、β−カテニン等Ｗｎｔ経路の因子等の改変アミノ酸配列は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子、ＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等のアミノ酸配列において１または複数個（好ましくは１もしくは数個または１、２、３、もしくは４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【０２０７】
本明細書において「マーカー（物質または遺伝子）」とは、ある状態（例えば、疾患状態、障害状態、あるいは増殖能、分化状態のレベル、有無等）にあるかまたはその危険性があるかどうかを追跡する示標となる物質をいう。このようなマーカーとしては、遺伝子、遺伝子産物、代謝物質、酵素などを挙げることができる。本発明において、ある状態（例えば、分化障害などの疾患）についての検出、診断、予備的検出、予測または事前診断は、その状態に関連するマーカーに特異的な薬剤、剤、因子または手段、あるいはそれらを含む組成物、キットまたはシステム等を用いて実現することができる。本明細書において、「遺伝子産物」とは、遺伝子によってコードされるタンパク質またはｍＲＮＡをいう。本明細書では、眼細胞への関連が示されていない遺伝子産物（すなわち、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５など）が眼細胞の分化の指標として使用可能であることが見出された。
【０２０８】
本明細書において「神経細胞」とは、広義に用いられ、神経系の器官に含まれる任意の細胞を意味し、特に、神経堤細胞由来の細胞（例えば、角膜内皮細胞等）も包含されることが理解される。
【０２０９】
本明細書において「眼細胞」とは、広義に用いられ、眼に存在する任意の細胞を意味し、眼瞼、強膜、角膜、ぶどう膜、水晶体、硝子体、網膜、視神経に存在する任意の細胞が包含される。
【０２１０】
本明細書において「角膜内皮細胞」は、当該分野で用いられる通常の意味で用いられる。角膜とは、眼を構成する層状の組織の一つであり透明であり、最も外界に近い部分に位置する。角膜は、ヒトでは外側（体表面）から順に５層でできているとされ、外側から角膜上皮、ボーマン膜（外境界線）、固有層、デスメ膜（内境界線）、および角膜内皮で構成される。特に、特定しない限り、上皮および内皮以外の部分は「角膜実質」とまとめて称することがあり、本明細書でもそのように称する。
【０２１１】
本明細書において「角膜組織」とは、通常の意味で使用され、角膜を構成する組織自体をいう。角膜組織というときは、角膜を構成する角膜上皮、ボーマン膜（外境界線）、固有層、デスメ膜（内境界線）、および角膜内皮の全部（ヒトの場合。それ以外の動物の場合は、それに対応する区分に応じてその全部）を含んでいてもよく一部欠損していてもよく、あるいは、角膜のほか他の組織（強膜）を含んでいてもよく、その場合は特に強角膜ということがある。したがって、強角膜または強角膜片は角膜組織の一実施形態であるといえる。
【０２１２】
本明細書において「増殖能」とは、細胞の増殖する能力をいう。本明細書では格別に言及しない場合、増殖の状態は、定常状態での増殖の可能性を指す。ここで、「定常状態」とは、生体での通常の条件であって、生体の恒常性が維持されている状態をいう。そのような状態は、当業者であれば、容易に決定することができる。たとえば、細胞密度解析により、細胞密度がほぼ一定で変化しないこと、または細胞増殖マーカーの発現が認められないことなどによって確認することができる。
【０２１３】
本明細書において「増殖能の（が）高い」とは、定常状態で増殖能を有することをいう。
【０２１４】
本明細書において「増殖促進」とは、ある細胞の増殖状態が促進されることをいう。対象となる細胞が増殖していなかった場合は、少しでも増殖を始めれば増殖促進に該当し、すでに増殖をしている細胞の場合は、その増殖レベルが維持またはより高まれば、好ましくは高まれば増殖促進に該当する。
【０２１５】
本明細書において「分化能」とは、細胞が分化する能力をいう。分化能がある細胞は、その意味で「未分化」であるといえる。幹細胞（胚性幹細胞、生殖細胞、ｉＰＳ細胞、組織幹細胞等）は、さらに分化することができるため、分化能を有すると称することができる。
【０２１６】
本明細書において「未分化細胞」とは、分化能がある任意の細胞をいう。従って、未分化細胞には、幹細胞のほか、一定程度分化しているが、さらになお分化しうる細胞を包含する。
【０２１７】
本明細書において「分化抑制」とは、分化を抑制することをいう。分化がされなければ、分化レベルが変わらないものおよび分化レベルが未分化の方向に進んでいるものの両方が「分化抑制」に包含されることが理解される。
【０２１８】
本明細書において「分化抑制および／または増殖促進剤」とは、ある物質または因子についていうとき、対象となる細胞について、その細胞の分化を抑制するかおよび／または増殖を促進することができるものをいう。本明細書では、特に、「分化抑制および／または増殖促進剤」は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子（アンタゴニスト）およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される少なくとも１種を含む。
【０２１９】
本明細書において「幹細胞」とは、複数系統の細胞に分化できる能力（多分化能）と、細胞分裂を経ても多分化能を維持できる能力（自己複製能）を併せ持つ細胞をいう。幹細胞には、胚性幹細胞、生殖細胞、ｉＰＳ細胞、組織幹細胞などが包含される。
【０２２０】
本明細書において「被験体」とは、本発明の診断または検出等の対象となる対象（例えば、ヒト等の生物または生物から取り出した器官（眼）あるいは細胞等）をいう。
【０２２１】
本明細書において「試料」とは、被験体等から得られた任意の物質をいい、例えば、眼の細胞等が含まれる。当業者は本明細書の記載をもとに適宜好ましい試料を選択することができる。
【０２２２】
本明細書において「コロニー形成能」とは、細胞についていうとき、コロニーを形成することができる能力をいう。コロニー形成能は、本明細書では、標準試験法として当該分野において公知の培養条件下での細胞のコロニー形成試験等を用いて判断することができる。
【０２２３】
本明細書において「Ｋｉ−６７」とは、細胞増殖マーカーであって、代表的にアクセッション番号Ｐ４６０１３で示されるの細胞周期関連核タンパク質である。増殖中の細胞では，Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期において発現するが、増殖を休止しているＧ０期においては存在しないため、細胞増殖と細胞周期のマーカーとして用いられる。また、Ｋｉ−６７発現量と腫瘍の悪性度には正の相関が見られるため、腫瘍組織における増殖細胞を検出するマーカーとしても有用である。
【０２２４】
本明細書において「Ｋｉ−６７陽性」とは、細胞マーカーであるＫｉ−６７が標的細胞において発現していることをいう。
【０２２５】
本明細書において「ＢｒｄＵ」とは、臭素化デオキシウリジンの省略形であり、ＤＮＡ合成のときｄＴＴＰのアナログとして取り込まれることから、ＢｒｄＵを取り込んだＤＮＡ（細胞核）は、ＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵに特異的な抗体で検出することができる。
【０２２６】
本明細書において「ＢｒｄＵ陽性」とは、細胞マーカーであるＢｒｄＵが標的細胞において発現していることをいう。
【０２２７】
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２２８】
本明細書において「検出剤」とは、広義には、目的の対象を検出することができるあらゆる薬剤をいう。
【０２２９】
本明細書において「診断剤」とは、広義には、目的の状態（例えば、疾患など）を診断できるあらゆる薬剤をいう。
【０２３０】
本明細書において「治療剤」とは、広義には、目的の状態（例えば、疾患など）を治療できるあらゆる薬剤をいう。
【０２３１】
本明細書において「予防剤」とは、広義には、目的の状態（例えば、疾患など）を予防できるあらゆる薬剤をいう。本明細書において「進行予防剤」とは、ある疾患等について、その状態の進行を予防することができるあらゆる薬剤を指す。
【０２３２】
本明細書において「インビボ」（ｉｎ  ｖｉｖｏ）とは、生体の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする物質が配置されるべき位置をいう。
【０２３３】
本明細書において「インビトロ」（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。
【０２３４】
本明細書において「エキソビボ」とは、ある処置について、体外で行われるがその後体内に戻されることが意図される場合、一連の動作をエキソビボという。本発明においても、生体内にある細胞を本発明の薬剤で処置して再度患者に戻すような実施形態を想定することができる。
【０２３５】
（好ましい実施形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【０２３６】
（分化抑制および／または増殖促進）
１つの局面において、本発明は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子およびそれらの機能的等価物からなる群より選択される少なくとも１種を含む、細胞の分化抑制および／または増殖促進剤を提供する。本発明が対象とする細胞は、特に限定されるものではないが、眼細胞、神経堤細胞由来の細胞（角膜内皮細胞を含む）を含む神経細胞、結膜上皮、羊膜上皮、口腔粘膜上皮、鼻粘膜上皮、角膜上皮細胞等の上皮細胞等を挙げることができる。好ましい実施形態では、本発明が対象とする細胞は眼細胞である。本発明が対象とする眼細胞には、網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞等が含まれうるが、これらに限定されない。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の機能的等価物は、例えば、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するもの、作用する時点において、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類自体またはこのＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類自体またはＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含される。ＳＨＨの機能的等価物には、ＳＨＨの変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するもの、または本明細書に記載されるマーカーとしての機能を有するもの、ならびに、作用する時点において、ＳＨＨ自体またはこのＳＨＨの変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、ＳＨＨ自体またはＳＨＨの変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含される。ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）の機能的等価物には、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）の変異体または改変体（例えば、合成改変体等）であって、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するもの、または本明細書に記載されるマーカーとしての機能を有するもの、ならびに、作用する時点において、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）自体またはこのＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）の変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、エステル等の前駆体またはプロドラッグ）が包含される。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子の機能的等価物には、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子の変異体または改変体（例えば、合成改変体等）であって、作用する時点において、眼細胞等の分化制御および／または増殖促進作用を有するように変化するもの（変化してＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子に変化することができるもの（例えば、エステル等の前駆体またはプロドラッグ））が包含される。
【０２３７】
１つの実施形態において、本発明で使用されるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ２、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ３およびＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ４から選択される少なくとも１つを含む。
【０２３８】
好ましい実施形態では、本発明で使用されるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １を含む。
【０２３９】
１つの実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は、定常状態で増殖していない細胞である。理論に束縛されることを望まないが、定常状態で増殖していない細胞であっても、本発明によって、増殖させることができるという点で、本発明は従来にない効果を発揮するものである。
【０２４０】
別の実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は、網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞から選択される少なくとも１種の細胞を含む。特に、角膜内皮細胞は、ほとんど定常状態では増殖しない細胞であって、これを、増殖させることができるという点は、眼科疾患の治療または予防の観点上きわめて重要な意味を持つものである。従って、１つの好ましい実施形態では、本発明の対象とする眼細胞は角膜内皮細胞を含む。また、他の細胞、例えば、角膜上皮細胞でも、増殖しているのは基底細胞のごく一部であって、増殖していない細胞がほとんどであるため、角膜内皮細胞以外の網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞であっても、眼科疾患の治療または予防の観点上きわめて重要な意味を持つものであるといえる。
【０２４１】
さらに好ましい実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は霊長類の角膜内皮細胞を含む。さらにより好ましい実施形態では、本発明が対象とする眼細胞はヒト角膜内皮細胞を含む。
【０２４２】
別の実施形態では、本発明が対象とする細胞（例えば、眼細胞）はコンフルエントの状態にある。このようなコンフルエント状態にある細胞を増殖させることができる技術は、発明者らの知る限りこれまで報告されていない。従って、このような技術は、まさに、従来にないカテゴリーの細胞を増殖させることができるという点で、疾患または障害の治療または予防の観点から、きわめて有用性が高いものである。
【０２４３】
好ましい実施形態では、本発明は、コンフルエントの状態の角膜内皮細胞を利用することができる。コンフルエントの状態になると、通常の培養では、細胞の形態が、線維芽細胞様となることが観察されている。コンフルエント状態の角膜内皮細胞でもさらに増殖、分化抑制を行うことができることは、本発明の重要な特徴のひとつであり、培養角膜内皮移植の臨床応用化に向けて、移植後の重要な予後決定因子である角膜内皮密度の高い細胞を移植できることを意味する。その場合の好ましい濃度は、これに限定されるものではないが、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １を用いる場合、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌであり得、好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌであり得、さらに好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌであり得る。このようなコンフルエント状態にある細胞を増殖させることができる技術は、発明者らの知る限りこれまで報告されていない。従って、このような技術は、まさに、従来にないカテゴリーの細胞を増殖させることができるという点で、疾患または障害の治療または予防の観点から、きわめて有用性が高いものである。例えば、細胞密度は、好ましくは、約５７０個／ｍｍ２以上であり、約７００個／ｍｍ２以上であり、約８００個／ｍｍ２以上であり、約１０００個／ｍｍ２以上でありうる。
【０２４４】
本明細書において「培養物」は、角膜内皮等の細胞等を培養して生成されるものをいう。したがって、「角膜内皮培養物」は、角膜内皮の培養物をいい、通常、生体内に存在するものとは異なる状態で存在するものをさす。従来の培養法で得られる角膜内皮培養物は、せいぜい、実施例で示されるように、５００個／ｍｍ２程度のコンフルエント培養物しか得ることができなかった。したがって、培養物という観点からは、特に長期に培養したり、継代したものについていえば、このような細胞密度は達成することができなかったものといえる。すなわち、角膜内皮細胞は培養することで容易に密度が低下する。角膜内皮密度は臨床的には最も重要な健常度の指標の一つである。そのため、高い密度に培養することは再生医療の観点から重要である。また、内皮密度を事前に上昇させた後に、生体への投与することができ、極めて重要な治療薬となり得る。その意味で、通常の培養法で低下した密度を、再度上昇させることができたことが重要である。ヒト角膜内皮の生体における正常値は２５００−３０００個／ｍｍ２程度であり、これに培養物の細胞密度を近づけるかあるいはこれを超える技術を提供することができた点でも本発明は有意義である。
【０２４５】
別の実施形態では、本発明が対象とする細胞（例えば、眼細胞）は角膜組織自体でありうる。そのような角膜組織自体は、強角膜片でありうる。
【０２４６】
したがって、別の局面において、本発明は、角膜内皮培養物であって、該角膜内皮は、コンフルエント状態の細胞密度よりも高い密度で存在する、培養物を提供する。
【０２４７】
好ましくは、前記Ｋｉ６７陽性細胞は、約４％以上の割合で、より好ましくは、約７％以上の割合で、さらに好ましくは約１０％以上の割合で存在する。通常の存在割合は１％程度であるため、このようなＫｉ６７陽性細胞、すなわち増殖性の細胞を含む角膜組織は従来存在したものではなく、新規な治療用の移植片としての価値も見出すことができる。
【０２４８】
好ましくは、前記角膜内皮細胞の密度は、約４０００個／ｍｍ２以上であり、より好ましくは、約４５００個／ｍｍ２以上であり、さらに好ましくは、約５０００個／ｍｍ２以上である。ヒト角膜内皮の生体における正常値は２５００−３０００個／ｍｍ２程度であり、直接組織に本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を適用することにより、従来にない程度に増殖性細胞または未分化細胞、あるいは角膜内皮細胞の割合が増えた新規の組織が提供されることが理解される。このような組織は、角膜の疾患、障害または状態を改善または治療ないし予防するために利用されることが理解される。
【０２４９】
（細胞の保存または培養）
別の局面において、本発明は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を含む、細胞保存または細胞培養のための組成物を提供する。本発明で使用される分化抑制および／または増殖促進剤は、（分化抑制および／または増殖促進）の項および他の項に記載される任意の分化抑制および／または増殖促進剤であってよい。また、本発明が対象とする細胞は、細胞保存または細胞培養を目的とするものであり、（分化抑制および／または増殖促進）の項および他の項に記載される任意の細胞の実施形態でよいことが理解される。すなわち、本発明が対象とする細胞は、特に限定されるものではないが、細胞保存または細胞培養を目的とするものであり、眼細胞、神経堤細胞由来の細胞（角膜内皮細胞を含む）を含む神経細胞、結膜上皮、羊膜上皮、口腔粘膜上皮、鼻粘膜上皮、角膜上皮細胞等の上皮細胞等を挙げることができる。好ましい実施形態では、本発明が対象とする細胞は眼細胞である。本発明が対象とする眼細胞には、細胞保存または細胞培養を目的とするものであり、網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞等が含まれうるが、これらに限定されない。
【０２５０】
本発明の細胞保存または細胞培養のための組成物の１つの実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は、定常状態で増殖していない細胞である。理論に束縛されることを望まないが、定常状態で増殖していない細胞であっても、本発明によって、増殖させることができるという点で、本発明は細胞保存または細胞培養の観点で従来にない効果を発揮するものである。
【０２５１】
本発明の細胞保存または細胞培養のための組成物の別の実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は、網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞から選択される少なくとも１種の細胞を含む。特に、角膜内皮細胞は、ほとんど定常状態では増殖しない細胞であって、これを、増殖させることができるという点は、細胞保存または細胞培養という観点でも、その結果使用されることになる細胞を用いた眼科疾患の治療または予防の観点上きわめて重要な意味を持つものである。従って、１つの好ましい実施形態では、本発明の対象とする眼細胞は角膜内皮細胞を含む。また、他の細胞、例えば、角膜上皮細胞でも、増殖しているのは基底細胞のごく一部であって、増殖していない細胞がほとんどであるため、角膜内皮細胞以外の網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞であっても、細胞保存または細胞培養という観点においても、その結果使用される細胞治療等による眼科疾患の治療または予防の観点上きわめて重要な意味を持つものであるといえる。
【０２５２】
本発明の細胞保存または細胞培養のための組成物のさらに好ましい実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は霊長類の角膜内皮細胞を含む。さらにより好ましい実施形態では、本発明が対象とする眼細胞はヒト角膜内皮細胞を含む。
【０２５３】
本発明の細胞保存または細胞培養のための組成物の別の実施形態では、本発明が対象とする細胞（例えば、眼細胞）はコンフルエントの状態にある。このようなコンフルエント状態にある細胞を増殖させることができる技術は、細胞保存または細胞培養という観点においてもきわめて有意義である。従って、このような技術は、まさに、従来にないカテゴリーの細胞を増殖させることができるという点で、細胞保存または細胞培養を行い、その結果得られる細胞を用いた疾患または障害の治療または予防の観点からも、きわめて有用性が高いものである。
【０２５４】
従って、好ましい実施形態において、本発明は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を含む、角膜保存または角膜内皮細胞培養のための組成物を提供する。このような組成物は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤の有効成分である、少なくとも１種のＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＳＨＨのアゴニスト（例えば、プルモルファミン等のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーのアゴニスト）、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を抑制する因子またはそれらの機能的等価物をそのままの形態で利用するものであってもよく、他の成分を含んで調製されることもできる。あるいは、本発明は、本発明は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を用いる、細胞を保存または培養する方法を提供する。１つの実施形態では、本発明は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を用いる工程を包含する、角膜を保存するか、または角膜内皮細胞を培養する方法を提供する。本発明の角膜保存または角膜内皮細胞培養のための組成物に含まれる分化抑制および／または増殖促進剤は、（分化抑制および／または増殖促進）に記載される任意の実施形態を採用することができることが理解されるべきである。
【０２５５】
なお、本明細書において角膜内皮細胞が正常に培養されているかどうかは、角膜内皮細胞が本来有している機能（本明細書では「正常（な）機能」ともいう。）等の特徴を少なくとも１つは維持しているかを確認することによって判定することができる。そのような機能としては、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、角膜移植への適応能（Ｍａｔｓｕｂａｒａ  Ｍ，Ｔａｎｉｓｈｉｍａ  Ｔ：Ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｎｋｅｙ：ａ  ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｔｕｄｙ，Ｊｐｎ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １９８２，２６：２６４−２７３；Ｍａｔｓｕｂａｒａ  Ｍ，Ｔａｎｉｓｈｉｍａ  Ｔ：Ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｉｎ  ｍｏｎｋｅｙ：ａｎ  ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｕｄｙ，Ｊｐｎ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １９８３，２７：４４４−４５０；Ｖａｎ  Ｈｏｒｎ  ＤＬ，Ｈｙｎｄｉｕｋ  ＲＡ：Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｗｏｕｎｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｃｏｒｎｅａ，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  １９７５，２１：１１３−１２４およびＶａｎＨｏｒｎ  ＤＬ，Ｓｅｎｄｅｌｅ  ＤＤ，Ｓｅｉｄｅｍａｎ  Ｓ，Ｂｕｃｏ  ＰＪ：Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｄ  ｃａｔ，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  １９７７，１６：５９７−６１３）等が挙げられるがそれらに限定されない。すなわち、「正常な機能」は、角膜移植を実現するのに必要な機能または十分であることを示す指標でありうることが理解される。例えば、正常化の判断方法としては、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅのような角膜内皮細胞における機能タンパク質を指標としてその発現の変化を観察したり、あるいはサル等への移植によって生着し、機能するかどうかを調べることによって実行することができる。移植による判断方法は以下のとおりに行なうことができる。すなわち、Ｉ型コラーゲン上に角膜内皮培養して培養角膜内皮シートを作製する。全身麻酔下でカニクイザルの角膜輪部を１．５ｍｍ切開してシリコン製の手術器具を前房内に挿入して角膜内皮細胞を機械的に掻爬して水疱性角膜症モデルを作製する。続いて角膜輪部を５−６ｍｍ切開して培養角膜内皮シートを前房内に挿入し、前房を空気で置換することでシートを角膜内皮面に接着させる。培養角膜内皮シートの移植による水疱性角膜症の治療効果は細隙灯顕微鏡による角膜透明性の評価にて行うことができる。
【０２５６】
（細胞障害の治療または予防）
別の局面において、本発明は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を含む、細胞の障害の治療またはその細胞の障害の進行予防のための医薬組成物を提供する。本発明で使用される分化抑制および／または増殖促進剤は、（分化抑制および／または増殖促進）の項および他の項に記載される任意の分化抑制および／または増殖促進剤であってよい。また、本発明が対象とする細胞は、細胞の障害の治療またはその細胞の障害の進行予防を目的とするものである限り、（分化抑制および／または増殖促進）の項および他の項に記載される任意の細胞の実施形態でよいことが理解される。すなわち、本発明が対象とする細胞は、特に限定されるものではないが、細胞の障害の治療またはその細胞の障害の進行予防を目的とするものである限り、眼細胞、神経堤細胞由来の細胞（角膜内皮細胞を含む）を含む神経細胞、結膜上皮、羊膜上皮、口腔粘膜上皮、鼻粘膜上皮、角膜上皮細胞等の上皮細胞等を挙げることができる。好ましい実施形態では、本発明が対象とする細胞は眼細胞である。本発明が対象とする眼細胞には、網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞等が含まれうるが、これらに限定されない。
【０２５７】
本発明の医薬組成物の１つの実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は、定常状態で増殖していない細胞である。理論に束縛されることを望まないが、定常状態で増殖していない細胞であっても、本発明によって、増殖させることができるという点で、本発明は、細胞の障害の治療またはその細胞の障害の進行予防を行うことができるという点で、有意義な効果を発揮するものである。
【０２５８】
本発明の医薬組成物の別の実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は、網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞から選択される少なくとも１種の細胞を含む。特に、角膜内皮細胞は、ほとんど定常状態では増殖しない細胞であって、これを、増殖させることができるという点は、細胞の障害の治療またはその細胞の障害の進行予防という観点からも、眼科疾患の治療または予防の観点上きわめて重要な意味を持つものである。従って、１つの好ましい実施形態では、本発明の対象とする眼細胞は角膜内皮細胞を含む。また、他の細胞、例えば、角膜上皮細胞でも、増殖しているのは基底細胞のごく一部であって、増殖していない細胞がほとんどであるため、角膜内皮細胞以外の網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞であっても、細胞の障害の治療またはその細胞の障害の進行予防という観点に照らし、眼科疾患の治療または予防の観点上きわめて重要な意味を持つものであるといえる。
【０２５９】
本発明の医薬組成物のさらに好ましい実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は霊長類の角膜内皮細胞を含む。さらにより好ましい実施形態では、本発明が対象とする眼細胞はヒト角膜内皮細胞を含む。
【０２６０】
本発明の医薬組成物の別の実施形態では、本発明が対象とする細胞（例えば、眼細胞）はコンフルエントの状態にある。このようなコンフルエント状態にある細胞を増殖させることができる技術は、細胞の障害の治療またはその細胞の障害の進行予防という観点においても有意義である。従って、このような技術は、まさに、従来にないカテゴリーの細胞を増殖させることができるという点で、細胞の障害の治療またはその細胞の障害の進行予防という観点からも、きわめて有用性が高いものである。
【０２６１】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を含む、角膜内皮細胞障害の治療または角膜内皮細胞障害の進行予防のための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物に含まれる分化抑制および／または増殖促進剤は、（分化抑制および／または増殖促進）に記載される任意の実施形態を採用することができることが理解されるべきである。
【０２６２】
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害（例えば、角膜疾患）について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいう。
【０２６３】
本明細書において「予防」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になる前に、そのような状態にならないようにすることをいう。本発明の薬剤を用いて、診断を行い、必要に応じて本発明の薬剤を用いて例えば、角膜疾患等の予防をするか、あるいは予防のための対策を講じることができる。
【０２６４】
本発明の治療剤の効果を確認する場合は、角膜移植での適応能を観察することで判定することができる。角膜移植への適応能は、通常ウサギ等の実験動物においても水疱性角膜症モデルとして角膜内皮を機械的に掻爬して、培養細胞の移植試験を行うことができる。しかしながら、ウサギの角膜内皮細胞は生体内で増殖するため、ホストの角膜内皮細胞の増殖による自然治癒の可能性を否定できない（Ｍａｔｓｕｂａｒａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １９８２，２６：２６４−２７３；Ｍａｔｓｕｂａｒａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １９８３，２７：４４４−４５０；Ｖａｎ  Ｈｏｒｎ  ＤＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ１９７５，２１：１１３−１２４およびＶａｎ  Ｈｏｒｎ  ＤＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  １９７７，１６：５９７−６１３）。従って、より正確な移植適応能を評価するためには、霊長類への生着を評価することが好ましい。ヒトへの移植適応能を評価する場合は、霊長類であるカニクイザルなどにおいて、例えば、少なくとも１ヶ月、好ましくは少なくとも２ヶ月、より好ましくは少なくとも３ヶ月、さらに好ましくは少なくとも６ヶ月、さらにより好ましくは少なくとも１２ヶ月経過させた後の適応性を評価する。サル等の霊長類での移植適応能を確認することは特にヒトへの適用において重要である。
【０２６５】
本発明を医薬として投与する場合、種々の送達（デリバリー）系が知られ、そしてこのような系を用いて、本発明の療法剤を投与することも可能であり、このような系には、例えばリポソーム、微小粒子、および微小カプセル中の被包：治療剤（例えば、ポリペプチド）を発現可能な組換え細胞の使用、受容体が仲介するエンドサイトーシスの使用；レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての療法核酸の構築などがある。導入法には、限定されるわけではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路が含まれる。好適な経路いずれによって、例えば注入によって、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）注射によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち（例えば口腔、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって、医薬を投与することも可能であるし、必要に応じてエアロゾル化剤を用いて吸入器または噴霧器を使用しうるし、そして他の生物学的活性剤と一緒に投与することも可能である。投与は全身性または局所であることも可能である。本発明が眼科領域で使用される場合、さらに、眼に直接注入する等、適切な経路いずれかによって投与されうる。
【０２６６】
角膜等の治療の場合、点眼、眼軟膏塗布、結膜下注射、硝子体注射等の慣用された技術が使用されうる。
【０２６７】
治療剤がタンパク質をコードする核酸である特定の態様において、適切な核酸発現ベクターの一部として該核酸を構築し、そして細胞内に存在するように投与することによって、核酸をｉｎ  ｖｉｖｏ投与して、コードされるタンパク質の発現を促進することも可能であり、これは、例えばレトロウイルスベクターの使用によって、または直接注射によって、または微小粒子銃の使用によって、または核酸を脂質、細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でコーティングすることによって、または核に進入することが知られるタグ配列に連結した核酸を投与することによって、実行可能である。あるいは、核酸治療剤を細胞内に導入し、そして発現のため、宿主細胞ＤＮＡ内に相同組換えによって取り込ませることも可能である。
【０２６８】
一般的に、本発明の医薬、治療剤、予防剤等は、治療有効量の治療剤または有効成分、および薬学的に許容しうるキャリアを含む。本明細書において「薬学的に許容しうる」は、動物、そしてより詳細にはヒトにおける使用のため、政府の監督官庁に認可されたか、あるいは薬局方または他の一般的に認められる薬局方に列挙されていることを意味する。本明細書において使用される「キャリア」は、治療剤を一緒に投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このようなキャリアは、無菌液体、例えば水および油であることも可能であり、石油、動物、植物または合成起源のものが含まれ、限定されるわけではないが、ピーナツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油等が含まれる。医薬を経口投与する場合は、水が好ましいキャリアである。医薬組成物を静脈内投与する場合は、生理食塩水および水性デキストロースが好ましいキャリアである。好ましくは、生理食塩水溶液、並びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、注射可能溶液の液体キャリアとして使用される。適切な賦形剤には、軽質無水ケイ酸、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が含まれる。組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤もまた含有することも可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出配合物等の形を取ることも可能である。伝統的な結合剤およびキャリア、例えばトリグリセリドを用いて、組成物を座薬として配合することも可能である。経口配合物は、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的キャリアを含むことも可能である。適切なキャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ）に記載される。このような組成物は、患者に適切に投与する形を提供するように、適切な量のキャリアと一緒に、治療有効量の療法剤、好ましくは精製型のものを含有する。配合物は、投与様式に適していなければならない。これらのほか、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含んでいてもよい。
【０２６９】
好ましい実施形態において、公知の方法に従って、ヒトへの注射投与に適応させた医薬組成物として、組成物を配合することができる。代表的には、注射投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝剤中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるリドカインなどの局所麻酔剤も含むことも可能である。一般的に、成分を別個に供給するか、または単位投薬型中で一緒に混合して供給し、例えば活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器中、凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として供給することができる。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌薬剤等級の水または生理食塩水を含有する注入ビンを用いて、分配することも可能である。組成物を注射によって投与しようとする場合、投与前に、成分を混合可能であるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供することも可能である。
【０２７０】
本発明の医薬、治療剤、予防剤を中性型または塩型あるいは他のプロドラッグ（例えば、エステル等）で配合することも可能である。薬学的に許容しうる塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する遊離型のカルボキシル基とともに形成されるもの、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの遊離型のアミン基とともに形成されるもの、並びにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および水酸化第二鉄などに由来するものが含まれる。
【０２７１】
特定の障害または状態の治療に有効な本発明の治療剤の量は、障害または状態の性質によって変動しうるが、当業者は本明細書の記載に基づき標準的臨床技術によって決定可能である。さらに、場合によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物に使用しようとする正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重大性によっても変動しうるため、担当医の判断および各患者の状況に従って、決定すべきである。しかし、角膜への直接投与に適した投薬量範囲は、一般的に、キログラム体重あたり、活性成分約１〜５００マイクログラムであるがこれに限定されず、これ以下でもこれ以上でも使用されうる。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量−反応曲線から推定可能である。
【０２７２】
本発明の医薬組成物または治療剤もしくは予防剤はキットとして提供することができる。
【０２７３】
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、治療薬、抗体、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、治療薬をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、抗体の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
【０２７４】
本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法を医師または他の使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の検出方法、診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、骨格筋に投与（例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【０２７５】
特定の実施形態では、本発明は、本発明の医薬組成物の１以上の成分が充填された、１以上の容器を含む、薬剤パックまたはキットを提供する。場合によって、このような容器に付随して、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。
【０２７６】
本発明のキットはまた、本発明の治療剤、予防剤または医薬として使用するタンパク質をコードする発現ベクターも含有することも可能であり、このタンパク質は、発現された後、生物学的に活性な複合体を形成するため、再構成されることも可能である。このようなキットは、好ましくはまた、必要な緩衝剤および試薬も含有する。場合によって、このような容器に付随して、キット使用のための説明書、並びに／あるいは医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。
【０２７７】
特定の実施形態において、本発明の核酸を含む医薬組成物を、リポソーム、微小粒子、または微小カプセルを介して投与することができる。本発明の多様な態様において、このような組成物を用いて、核酸の持続放出を達成することが有用である可能性もある。
【０２７８】
別の局面では、本発明の治療は、本発明を用いて調製された角膜組織自体、例えば、強角膜片を用いて実施することができる。好ましくは、前記Ｋｉ６７陽性細胞は、約４％以上の割合で、より好ましくは、約７％以上の割合で、さらに好ましくは約１０％以上の割合で存在する。通常の存在割合は１％程度であるため、このようなＫｉ６７陽性細胞、すなわち増殖性の細胞を含む角膜組織は従来存在したものではなく、新規な治療用の移植片としての生体から直接移植する角膜組織を超える治療効果が期待される。
【０２７９】
好ましくは、前記角膜内皮細胞の密度は、約４０００個／ｍｍ２以上であり、より好ましくは、約４５００個／ｍｍ２以上であり、さらに好ましくは、約５０００個／ｍｍ２以上である。ヒト角膜内皮の生体における正常値は２５００−３０００個／ｍｍ２程度であり、直接組織に本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を適用することにより、従来にない程度に増殖性細胞または未分化細胞、あるいは角膜内皮細胞の割合が増えた新規の組織が提供されることが理解される。このような組織は、生体から直接移植する角膜組織を超える治療効果を伴うことを目的として、角膜の疾患、障害または状態を改善または治療ないし予防するために利用されることが理解される。
【０２８０】
（細胞治療）
別の局面では、本発明は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を用いて培養された細胞を含む、その細胞の障害またはその細胞障害に起因する疾患または障害の治療剤または進行予防剤を提供する。本発明で使用される分化抑制および／または増殖促進剤は、（分化抑制および／または増殖促進）の項および他の項に記載される任意の分化抑制および／または増殖促進剤であってよい。また、本発明が対象とする細胞は、（分化抑制および／または増殖促進）の項および他の項に記載される任意の細胞の実施形態でよいことが理解される。すなわち、本発明が対象とする細胞は、特に限定されるものではないが、眼細胞、神経堤細胞由来の細胞（角膜内皮細胞を含む）を含む神経細胞、結膜上皮、羊膜上皮、口腔粘膜上皮、鼻粘膜上皮、角膜上皮細胞等の上皮細胞等を挙げることができる。好ましい実施形態では、本発明が対象とする細胞は眼細胞である。本発明が対象とする眼細胞には、網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞等が含まれうるが、これらに限定されない。
【０２８１】
本発明の治療剤または進行予防剤の１つの実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は、定常状態で増殖していない細胞である。理論に束縛されることを望まないが、定常状態で増殖していない細胞であっても、本発明によって、増殖させることができるという点で、本発明は従来にない効果を発揮するものである。
【０２８２】
本発明の治療剤または進行予防剤の別の実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は、網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞から選択される少なくとも１種の細胞を含む。特に、角膜内皮細胞は、ほとんど定常状態では増殖しない細胞であって、これを、増殖させることができるという点は、眼科疾患の治療または予防の観点上きわめて重要な意味を持つものである。従って、１つの好ましい実施形態では、本発明の対象とする眼細胞は角膜内皮細胞を含む。また、他の細胞、例えば、角膜上皮細胞でも、増殖しているのは基底細胞のごく一部であって、増殖していない細胞がほとんどであるため、角膜内皮細胞以外の網膜細胞、硝子体細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞であっても、眼科疾患の治療または予防の観点上きわめて重要な意味を持つものであるといえる。
【０２８３】
本発明の治療剤または進行予防剤のさらに好ましい実施形態では、本発明が対象とする眼細胞は霊長類の角膜内皮細胞を含む。さらにより好ましい実施形態では、本発明が対象とする眼細胞はヒト角膜内皮細胞を含む。
【０２８４】
本発明の治療剤または進行予防剤の別の実施形態では、本発明が対象とする細胞（例えば、眼細胞）はコンフルエントの状態にある。このようなコンフルエント状態にある細胞を増殖させることができる技術は、発明者らの知る限りこれまで報告されていない。従って、このような技術は、まさに、従来にないカテゴリーの細胞を増殖させることができるという点で、疾患または障害の治療または予防の観点から、きわめて有用性が高いものである。
【０２８５】
１つの実施形態では、本発明は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を用いて培養された角膜内皮細胞を含む角膜内皮細胞障害の治療剤または進行予防剤を提供する。本発明の治療剤または進行予防剤に含まれる分化抑制および／または増殖促進剤は、（分化抑制および／または増殖促進）、（細胞障害の治療または予防）、（細胞の保存または培養）等に記載される任意の実施形態を採用することができることが理解されるべきである。
【０２８６】
１つの実施形態において、特に、角膜内皮細胞の場合、本発明の治療剤または進行予防剤において含まれる細胞は、天然の状態において存在する通常の細胞よりも細胞密度が高いかおよび／または未分化な細胞をより多く含む集団として存在する。このような細胞を含む治療剤または進行予防剤は、従来作製することができなかったため、本発明は、従来治療または予防することができなかったかあるいは困難であった疾患または障害（例えば、水疱性角膜症やＦｕｃｈｓ角膜内皮変性症などの角膜内皮疾患が挙げられるがこれらに限定されない。）を処置することができるということにおいて臨床上有用性が高い。
【０２８７】
本発明の治療剤または予防剤は、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を用いて角膜内皮細胞等の細胞を培養することによって製造することができる。その際には、本発明の別の局面で記載されるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子、ＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子または公知のＫｉ−６７、ＢｒｄＵなどの分化マーカーを指標に増殖能または分化レベルを判定することができる。増殖能または分化レベルの判定は、本明細書において別途詳細に説明される。
【０２８８】
本発明によれば、下記工程を含む、治療剤または進行予防剤の製造方法が提供される：（Ａ）角膜内皮細胞等の細胞を提供する工程；（Ｂ）本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を該細胞に接触させる工程；および（Ｃ）（Ｂ）の工程で接触された細胞を培養する工程。さらに、必要に応じて、本発明の別の局面で記載されるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子、ＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子または公知のＫｉ−６７、ＢｒｄＵなどの分化マーカーを指標に増殖能または分化レベルを判定し、分化能・増殖能が高い細胞を選択する工程を含んでいてもよい。
【０２８９】
本発明によれば、本発明の分化抑制および／または増殖促進剤を処置が必要な被験者に投与する工程、または、本発明の治療剤または進行予防剤を処置が必要な被験者に投与する工程を含む、角膜内皮疾患、障害、または状態等の治療または予防方法が提供される。本発明の治療剤または進行予防剤を処置が必要な被験者に投与する工程は、細胞を含む医薬を投与する行為であるから移植ということもある。
【０２９０】
本発明の治療または予防方法によれば、投与または移植された細胞が角膜内皮の損傷を治癒させるあるいは修復することによって、角膜内皮疾患、障害、または状態を予防および／または治療することができる。
【０２９１】
本発明による治療方法の実施に当たっては、ヒトを含む哺乳動物、好ましくは移植を受ける個体自身または中絶胎児等から角膜内皮細胞を含み得る細胞を取得することができる。
【０２９２】
（ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子、ＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の分化能・増殖の識別マーカー）
１つの局面において、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するためのマーカーを提供する。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子およびＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子は生体内に存在するものであり、増殖能の高い細胞および／または分化能の指標マーカーとして用いることができることが本発明において見出された。
【０２９３】
１つの実施形態では、本発明が対象とする増殖能の高い細胞は未分化細胞である。
【０２９４】
別の実施形態では、本発明が対象とする増殖能の高い細胞は幹細胞である。
【０２９５】
別の実施形態では、本発明が対象とする角膜内皮細胞はヒト細胞である。
【０２９６】
さらに別の実施形態では、本発明が対象とする角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。
【０２９７】
ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ（遺伝子）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子の発現は、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能の指標となる。従って、本発明によれば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨの発現を検出することにより、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞（未分化細胞、前駆細胞または幹細胞等）および／または分化能を検出または選択することができる。他方、ＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現は、角膜内皮細胞のうち増殖能の低い細胞および／または分化能の指標となる。従って、本発明によれば、ＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出することにより、角膜内皮細胞のうち増殖能の低い細胞（未分化細胞、前駆細胞または幹細胞ではない比較的分化の進んだ細胞等）および／または分化能が低いことを検出または選択することができる。あるいは、ＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現の抑制または消失が検出された場合に、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞（未分化細胞、前駆細胞または幹細胞等）および／または分化能を検出または選択することができる。
【０２９８】
別の局面において、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子に結合または相互作用する物質を含む、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するための検出剤または診断剤を提供する。このような検出または診断のためには、物質の結合は、特異的であることが好ましい。
【０２９９】
このような検出剤または診断剤は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子に結合または相互作用することができる限り、どのような物質を利用してもよいが、例えば、その代表的な例として、これらの因子の抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいはこれらの因子をコードする核酸についての核酸プライマーもしくはプローブを挙げることができるが、それらに限定されない。
【０３００】
本発明の検出剤または診断剤は、検出キットまたは診断キットとして利用することができる。
【０３０１】
１つの実施形態では、本発明が検出または診断の対象とする増殖能の高い細胞は未分化細胞である。
【０３０２】
別の実施形態では、本発明が検出または診断の対象とする増殖能の高い細胞は幹細胞である。
【０３０３】
別の実施形態では、本発明が検出または診断の対象とする角膜内皮細胞はヒト細胞である。
【０３０４】
さらに別の実施形態では、本発明が検出または診断の対象とする角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。
【０３０５】
本発明の検出剤は、検出可能とする部分（例えば、抗体等）に他の物質（例えば、標識等）を結合させた複合体または複合分子であってもよい。本明細書において使用される場合、「複合体」または「複合分子」とは、２以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質（例えば、糖、脂質、核酸、他の炭化水素等）であってもよい。本明細書において複合体を構成する２以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合されていてもよい。２以上の部分がポリペプチドの場合は、キメラポリペプチドとも称しうる。従って、本明細書において「複合体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子を含む。
【０３０６】
本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。
【０３０７】
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つの物質の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
【０３０８】
従って、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に」相互作用する（または結合する）「因子」（または、薬剤、検出剤等）とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
【０３０９】
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含む試料中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用する（または結合する）ことをいう。物質または因子について特異的な相互作用（または結合）としては、例えば、リガンド−レセプター反応、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用（または結合）が包含される。
【０３１０】
本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、マーカー検出剤への結合または相互作用を含む、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、免疫沈降法（ＩＰ）、免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡ  マイクロアレイと最新  ＰＣＲ  法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−５３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【０３１１】
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞、組織などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡ等が発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。あるマーカーの発現量を測定することによって、マーカーに基づく種々の検出または診断を行うことができる。
【０３１２】
本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「減少」または「抑制」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における減少、または減少させる活性をいう。
【０３１３】
本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「増加」または「活性化」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または増加させる活性をいう。
【０３１４】
従って、本発明のマーカーの減少、抑制、増加または活性化等の調節能力を指標に、眼の細胞の分化調節を行う薬剤を検出、スクリーニングすることができることが理解される。
【０３１５】
本明細書において「抗体」は、広義にはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらのフラグメント、例えばＦｖフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂフラグメント、ならびにその他の組換えにより生産された結合体または機能的等価物（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、二重特異性またはオリゴ特異性（ｏｌｉｇｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、単鎖抗体、ｓｃＦＶ、ダイアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）２（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ（Ｆｖ）２）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ）を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。本発明で用いられる抗ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５抗体およびＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）抗体は、それぞれ、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）のタンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは問われない。具体的には、非ヒト動物の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体が使用できる。本発明においては、モノクローナル、あるいはポリクローナルを抗体として利用することができるが好ましくはモノクローナル抗体である。抗体のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子およびＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子のそれぞれのタンパク質への結合は特異的な結合であることが好ましい。
【０３１６】
本明細書において「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。本明細書において「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体またはリンパ球レセプターが結合する抗原分子中の部位をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
【０３１７】
本明細書において「手段」とは、ある目的（例えば、検出、診断、治療）を達成する任意の道具となり得るものをいい、特に、本明細書では、「選択的に認識する手段」とは、ある対象を他のものとは異なって認識することができる手段をいう。
【０３１８】
本明細書において使用される抗体は、擬陽性が減じられるかぎり、どのような特異性の抗体を用いても良いことが理解される。従って、本発明において用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。本明細書において「リガンド」とは、あるタンパク質に特異的に結合する物質をいう。例えば，細胞膜上に存在する種々のレセプタータンパク質分子と特異的に結合するレクチン、抗原、抗体、ホルモン、神経伝達物質などがリガンドとして挙げられる。
【０３１９】
本発明の検出剤または診断剤あるいはその他医薬は、プローブおよびプライマーの形態を採ることができる。本発明のプローブおよびプライマーは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｒｓｐｏｎｄｉｎ類、Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等と特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書に記載されるように、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現は角膜内皮細胞における増殖能の指標であり、また、分化状態の指標として有用である。従って、本発明によるプローブおよびプライマーは、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞および／または分化能を識別するために用いることができる。本発明のプローブおよびプライマーは、１つの実施形態では、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出することができればよく、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基または塩基対からなる重合体を指す。二本鎖ｃＤＮＡも組織ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて利用可能であることが知られており、本発明のプローブおよびプライマーにはそのような二本鎖ｃＤＮＡも含まれる。組織中のＲＮＡの検出において特に好ましいプローブおよびプライマーとしては、ＲＮＡプローブ（リボプローブ）を挙げることができる。
【０３２０】
本明細書において「（核酸）プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。本明細書においてプライマーはマーカー検出手段として使用され得る。
【０３２１】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【０３２２】
本発明によるプライマーは、二種以上の該プライマーからなる、プライマーセットとしても使用することができる。
【０３２３】
本発明によるプライマーおよびプライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法を利用して目的
遺伝子を検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーおよびプライマーセットとして利用することができる。
【０３２４】
本発明によるプライマーセットはＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等目的のタンパク質のヌクレオチド配列をＰＣＲ法等の核酸増幅法により増幅できるように選択することができる。核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーペアの選択は当業者に自明である。例えば、ＰＣＲ法においては、二つのプライマー（プライマーペア）の一方がＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等目的のタンパク質の二本鎖ＤＮＡのプラス鎖に対合し、他方のプライマーが二本鎖ＤＮＡのマイナス鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＬＡＭＰ法（ＷＯ００／２８０８２号公報）においては、標的遺伝子に対して３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという３つの領域を、５’末端側からＢ１、Ｂ２、Ｂ３という３つの領域を、それぞれ規定し、この６つの領域を用いて４種類のプライマーを設計することができる。本発明のプライマーは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、化学合成できる。プライマーの調製は周知であり、例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．”（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７））に従って実施することができる。
【０３２５】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチド、特異的抗体またはそのフラグメントなどが挙げられるがそれに限定されない。本明細書においてプローブは、マーカー検出手段としてもちいられる。
【０３２６】
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。
【０３２７】
１つの実施形態において、本発明の検出剤は、標識されたものでありうる。あるいは、本発明の検出剤は、タグを結合させたものであってもよい。
【０３２８】
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（例えば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。本発明のマーカーまたはそれを捕捉する因子または手段を複数、蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。リガンドを標識する場合、機能に影響を与えないものならば何れも用いることができるが、蛍光物質としては、ＡｌｅｘａＴＭ  Ｆｌｕｏｒが望ましい。ＡｌｅｘａＴＭＦｌｕｏｒは、クマリン、ローダミン、フルオレセイン、シアニンなどを修飾して得られた水溶性の蛍光色素であり、広範囲の蛍光波長に対応したシリーズであり、他の該当波長の蛍光色素に比べ、非常に安定で、明るく、またｐＨ感受性が低い。蛍光極大波長が１０ｎｍ以上ある蛍光色素の組み合わせとしては、ＡｌｅｘａＴＭ５５５とＡｌｅｘａＴＭ６３３の組み合わせ、ＡｌｅｘａＴＭ４８８とＡｌｅｘａＴＭ５５５の組み合わせ等を挙げることができる。核酸を標識する場合は、その塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。
【０３２９】
本明細書において使用される場合、「タグ」とは、受容体−リガンドのような特異的認識機構により分子を選別するための物質、より具体的には、特定の物質を結合するための結合パートナーの役割を果たす物質（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジンのような関係を有する）をいい、「標識」の範疇に含まれうる。よって、例えば、タグが結合した特定の物質は、タグ配列の結合パートナーを結合させた基材を接触させることで、この特定の物質を選別することができる。このようなタグまたは標識は、当該分野で周知である。代表的なタグ配列としては、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡ、Ａｖｉタグなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のマーカーまたはマーカー検出剤にはこのようなタグを結合させてもよい。
【０３３０】
１つの局面において、本発明は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子を、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするための方法、あるいは角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を検出または診断する方法を提供する。
【０３３１】
本発明の方法では、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子を、角膜内皮細胞のうち増殖能の高い細胞／または分化能を識別する指標とするために、例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子またはこれらの因子の遺伝子を生体内で検出する工程を行って実施することができる。例えば、その際に、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子またはこれらの因子の遺伝子に結合する物質を含む検出剤を用いることができる。そのような検出剤は、本明細書において記載されており、その記載を元に、当業者が本発明の方法を実施することができることが理解される。
【０３３２】
本発明の方法は、本発明の検出剤または診断剤を目的とする試料に接触させ、その試料中に目的とする対象であるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子またはこれらの因子の遺伝子があるかどうか、あるいはそのレベルまたは量を測定する。
【０３３３】
本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、物質を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のマーカー、検出剤、診断剤、リガンド等として機能しうるポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在させることができる。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。
【０３３４】
１つの実施形態では、本発明の方法において対象とされる増殖能の高い細胞は未分化細胞である。
【０３３５】
別の実施形態では、本発明の方法において対象とされる増殖能の高い細胞は幹細胞である。
【０３３６】
別の実施形態では、本発明の方法において対象とされる角膜内皮細胞はヒト細胞である。
【０３３７】
さらに別の実施形態では、本発明の方法において対象とされる角膜内皮細胞の増殖能はコロニー形成能、Ｋｉ−６７陽性およびＢｒｄＵ陽性からなる群より選択される特徴により識別される。
【０３３８】
本発明の１つの実施形態では、本発明の指標とする方法に基づいて、分化の状態に関する診断を行うこともできる。
【０３３９】
具体的なＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子またはこれらの因子の遺伝子の発現を検出する方法については、被験試料（例えば、細胞等）におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子またはこれらの因子の遺伝子の発現を検出できる方法であれば特に限定されず、例えば、ハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。
【０３４０】
ここで、「被験試料」とは、角膜内皮細胞または目的とする細胞またはそれに由来する物質であって遺伝子発現を可能にするものを含むと考えられる試料であればよく、例えば、角膜内皮から直接単離した細胞を用いることができる。角膜内皮の細胞は公知の方法により取得することができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｎ，Ｏｋｕｍｕｒａ  Ｎ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｓ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１２；９５：６０−７．）。好ましくは、角膜内皮のドナーから得られた細胞、角膜内皮細胞等を被験細胞試料として用いることができる。また、インビトロで分化誘導された角膜内皮細胞を含む培養細胞を試料として用いることができる。インビトロにおける角膜内皮細胞への分化誘導は、公知のＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、骨髄間質細胞等の細胞を出発材料として、公知の方法、例えば、ＡＭＥＤ法等による分化させる処理＜Ｕｅｎｏ  Ｍ，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  Ｍ，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ，Ｏｓａｋａｄａ  Ｆ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｍ，Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｈ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｓ，Ｓａｓａｉ  Ｙ：，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０３（２５）：９５５４−９５５９，２００６．等を参照＞を行うことにより実施することができる。
【０３４１】
本発明による検出の１つの実施形態によれば、本発明によるプローブを核酸試料（ｍＲＮＡまたはその転写産物）とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体、すなわちヌクレオチド二本鎖、を直接または間接的に検出することにより細胞試料におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現を検出することができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．”（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特にＳｅｃｔｉｏｎ  ９．４７−９．５８）、”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、特にＳｅｃｔｉｏｎ  ６．３−６．４）、”ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ２ｎｄ  ｅｄ．”（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）、条件については特にＳｅｃｔｉｏｎ  ２．１０）を参照しうる。
【０３４２】
ハイブリダイゼーション法を利用したＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子またはこれらの因子の遺伝子の発現の検出は、例えば、：（ａ）被験試料由来のポリヌクレオチドと、本発明によるプローブとを接触させる工程；および（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程により実施することができる。工程（ａ）において、目的の被験試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、被験細胞試料由来のポリヌクレオチドとして、プローブと接触させることができる。プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては例えば、放射能活性（例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、および３５Ｓ）、蛍光（例えば、ＦＩＴＣ、ユーロピウム）、化学発色のような酵素反応（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）等を利用した標識が挙げられる。ハイブリダイゼーション産生物の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。ハイブリダイゼーション複合体が検出された細胞は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子を発現している細胞であるので、該細胞について、増殖能が高い（未分化細胞、前駆細胞または幹細胞等）および／または分化能が高いと判定することができる。
【０３４３】
本発明による検出の別の実施形態によれば、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法により核酸試料（ｍＲＮＡまたはその転写産物）を増幅させ、増幅産物を検出することにより、試料におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子またはこれらの因子の遺伝子の発現を検出することができる。
【０３４４】
核酸増幅法を利用したＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子またはこれらの因子の遺伝子の発現の検出は、例えば、（ｉ）被験試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法を実施する工程；および（ｉｉ）形成された増幅産物を検出する工程により実施することができる。
【０３４５】
工程（ｉ）において、目的の被験試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を鋳型として用いることができる。増幅産物の検出は、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法を用いて実施できる。増幅産物が検出される細胞は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を発現している細胞であるので、該細胞について、増殖能が高い（未分化細胞、前駆細胞または幹細胞等）および／または分化能が高いと判定することができる。
【０３４６】
本発明による検出の別の実施形態によれば、本発明による抗体と試料とを接触させ、抗原抗体反応を検出することにより試料におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出することができる。
【０３４７】
抗原抗体反応を利用したＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現の検出は、例えば、下記工程：（Ｉ）被験細胞試料由来のタンパク質と、本発明による抗体とを接触させる工程；および（ＩＩ）抗原抗体複合体を測定する工程により実施することができる。抗原抗体反応の検出方法は当業者に周知であり、例えば、免疫学的方法により、角膜内皮細胞を含むと考えられる被験細胞試料中のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５タンパク質および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子を検出することができる。免疫学的方法としては、細胞試料を必要に応じて適切な処理、例えば、細胞の分離、抽出操作などをした試料について、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、ウェスタンブロット法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することができる。免疫組織染色法は、例えば標識化抗体を用いる直接法、該抗体に対する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行うことができる。標識化剤としては蛍光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質を使用することができる。
【０３４８】
抗原抗体複合体が検出される細胞は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子を発現している細胞であるので、該細胞について、増殖能が高い（未分化細胞、前駆細胞または幹細胞等）および／または分化能が高いと判定することができる。角膜内皮の移植が必要な疾患、例えば水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑、特に、角膜ジストロフィー、外傷または内眼手術に起因する角膜内皮障害などの、あるいは他の特定の角膜内皮疾患（Ｆｕｃｈｓ角膜内皮変性症、後部多形性角膜内皮変性症等）の治療に用いるためには、増殖能が高い細胞（未分化細胞、前駆細胞または幹細胞等）は純度が高いことが望ましい。
【０３４９】
前記の各検出工程は１回のみならず、同工程を繰り返しあるいは組み合わせて行うことにより、増殖能／分化能が高い細胞の検出または選択の精度を高めていくことができる。従って、このような実施形態を採用した場合、本発明による検出方法によれば、前記の工程を２回以上行うことにより、増殖能／分化能が高い細胞をより高精度に検出または選択することができる。
【０３５０】
また、他のマーカー遺伝子、好ましくはＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子をコードする遺伝子以外の増殖マーカー遺伝子（例えば、Ｋｉ−６７およびＢｒｄＵ等）あるいはこれらの因子を併用することにより、増殖能／分化能が高い細胞の検出または選択の精度を高めていくことができる。
【０３５１】
本明細書において「診断」とは、被験体における疾患、障害、状態などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「早期診断」、「予測診断」、「事前診断」等を含む。本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができ、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「予測診断、事前診断もしくは診断」を「支援」すると称することがある。
【０３５２】
本発明の診断薬等の医薬等としての処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、使用すべき量を決定することができる。
【０３５３】
本発明で使用される抗体は、以下のようにして生産することができる。
【０３５４】
本発明で使用される抗体（例えば、抗ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５抗体、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子に対する抗体およびＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子に対する抗体等）は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として取得できる。本発明で使用される抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるもの等を含む。
【０３５５】
一例として、モノクローナル抗体の調製方法を以下に記載する。モノクローナル抗体は、抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを調製し、得られるハイブリドーマからＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等の活性を特異的に阻害する抗体を産生するクローンを選択することにより調製することができる。
【０３５６】
動物の免疫に抗原として用いるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等の成熟型等のタンパク質のアミノ酸配列の全体または免疫原性を有するフラグメントを免疫原として使用することができる。また、細胞表面に存在するタンパク質を特異的に検出するためのモノクローナル抗体としては、本発明のマーカーのタンパク質のアミノ酸配列における任意の１０以上からなるペプチドを抗原として使用することが好ましい。他の本発明の任意の因子（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等ならびにこれらに対応するタンパク質など）についても同様に抗原を設計することができる。
【０３５７】
得られた抗原用のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等に結合させた後、アジュバントを添加する。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。
【０３５８】
上記のようにして得られた抗原を哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に投与する。免疫は、既存の方法であれば何れの方法をも用いることができるが、主として静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射などにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは４〜２１日間隔で免疫する。
【０３５９】
最終の免疫日から２〜３日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞が挙げられるが、一般に脾臓細胞が用いられる。抗原の免疫量は１回にマウス１匹当たり、例えば１００μｇ用いられる。
【０３６０】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。まず、目的となるタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等のタンパク質）を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫する。免疫動物から得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させてハイブリドーマを得る。更にこのハイブリドーマから、通常のスクリーニング法により、目的とする抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって目的の抗体を産生するハイブリドーマが選択できる。
【０３６１】
具体的には、モノクローナル抗体の作製は例えば以下に示すように行われる。まず、目的となる遺伝子（ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５遺伝子、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）を発現させることによって、抗体取得の感作抗原として使用される目的のタンパク質が取得できる。目的の遺伝子の塩基配列は、本明細書の他の場所に記載されている（例えば、ＮＣＢＩ登録番号ＮＭ＿００３６６７．２（配列番号１）、ＮＭ＿０００１９３（配列番号１１）などに開示されている。すなわち、目的の遺伝子をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から、目的のタンパク質が公知の方法で精製できる。また、精製した天然のタンパク質もまた同様に使用できる。また、本発明で用いられるように、目的のタンパク質の所望の部分ポリペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質を免疫原として利用することもできる。免疫原とする融合タンパク質を製造するために、例えば、抗体のＦｃフラグメントやペプチドタグなどを利用することができる。融合タンパク質を発現するベクターは、所望の二種類またはそれ以上のポリペプチドフラグメントをコードする遺伝子をインフレームで融合させ、当該融合遺伝子を発現ベクターに挿入することにより作製することができる。融合タンパク質の作製方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている。
【０３６２】
このようにして精製された目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等のタンパク質）を、哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として使用できる。目的のタンパク質の部分ペプチドもまた感作抗原として使用できる。例えば、次のようなペプチド：目的のタンパク質（ヒトＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等のタンパク質）のアミノ酸配列に基づいて化学合成によって取得されたペプチド；目的の遺伝子（ヒトＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子をコードする遺伝子等）の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによって取得されたペプチド；目的のタンパク質（ヒトＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等のタンパク質）をタンパク質分解酵素により分解することによって取得されたペプチドを感作抗原とすることができる。
【０３６３】
部分ペプチドとして用いるタンパク質の領域および大きさは限定されない。例示的な領域としては、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の場合、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸配列において１−５５６番目、６１５−６３７番目、７０４−７２２番目、および７９２−８００番目）から選択することができる。感作抗原とするペプチドを構成するアミノ酸の数は、少なくとも３以上、例えば、５以上、あるいは６以上であることが好ましい。より具体的には、８〜５０、好ましくは１０〜３０残基のペプチドを感作抗原とすることができる。ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の場合も、本明細書に記載される配列、たとえば、配列番号１２、４４、４６、４８、５０、５２等の情報を元に、同様に適切なペプチドを感作抗原とすることができる。
【０３６４】
該感作抗原で免疫される哺乳動物は、特に限定されない。モノクローナル抗体を細胞融合法によって得るためには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して免疫動物を選択するのが好ましい。一般的には、げっ歯類の動物が免疫動物として好ましい。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギを免疫動物とすることができる。その他、サル等を免疫動物とすることもできる。
【０３６５】
公知の方法に従って上記の動物が感作抗原により免疫できる。例えば、一般的方法として、感作抗原を腹腔内または皮下に注射することにより哺乳動物を免疫することができる。具体的には、該感作抗原が哺乳動物に４から２１日毎に数回投与される。感作抗原は、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈して免疫に使用される。更に、感作抗原をアジュバントとともに投与することができる。例えばフロイント完全アジュバントと混合し、乳化して、感作抗原とすることができる。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用できる。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、該感作抗原ペプチドをアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
【０３６６】
加えて、モノクローナル抗体は、ＤＮＡ免疫（ＤＮＡ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）によっても得ることができる。ＤＮＡ免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子が発現できるような態様で構築されたベクターＤＮＡを当該免疫動物に投与し、免疫抗原を免疫動物の生体内で発現させることによって、免疫刺激を与える方法である。ＤＮＡ免疫によって本発明のモノクローナル抗体を得るには、まず、目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）を発現するＤＮＡを免疫動物に投与する。目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）をコードするＤＮＡは、ＰＣＲなどの公知の方法によって合成することができる。得られたＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、免疫動物に投与する。発現ベクターとしては、例えばｐｃＤＮＡ３．１などの市販の発現ベクターを利用することができる。ベクターを生体に投与する方法も、一般に用いられている方法を利用することができる。例えば、発現ベクターを吸着させた金粒子を、遺伝子銃（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ）で細胞内に打ち込むことによってＤＮＡ免疫を行うことができる。
【０３６７】
このように哺乳動物が免疫され、血清中における所望の抗体量の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用できる。
【０３６８】
上記の免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下ＨＧＰＲＴ欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下ＴＫ欠損と省略する）などが公知である。ＨＧＰＲＴやＴＫの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（以下ＨＡＴ感受性と省略する）を有する。ＨＡＴ感受性の細胞はＨＡＴ選択培地中でＤＮＡ合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してＤＮＡの合成を継続することができるためＨＡＴ選択培地中でも増殖するようになる。
【０３６９】
ＨＧＰＲＴ欠損やＴＫ欠損の細胞は、それぞれ６−チオグアニン、８−アザグアニン（以下８ＡＧと省略する）、あるいは５’ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択することができる。正常な細胞はこれらのピリミジンアナログをＤＮＡ中に取り込んでしまうので死滅するが、これらの酵素を欠損した細胞は、これらのピリミジンアナログを取り込めないので選択培地の中で生存することができる。この他、Ｇ４１８耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって２−デオキシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。基本的には公知の方法、例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６等に準じて、免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われる。より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、細胞融合が実施できる。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等を使用することができる。更に融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を加えることもできる。免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定できる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。細胞融合に用いる培養液としては、例えば、ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液を利用することができる。さらに、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を培養液に添加することができる。
【０３７０】
細胞融合は、免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液を混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。細胞融合法においては、例えば平均分子量１０００〜６０００程度のＰＥＧを、通常３０％（ｗ／ｖ）〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加することができる。続いて、上記に挙げた適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去される。
【０３７１】
このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択することができる。例えばＨＧＰＲＴまたはＴＫの欠損を有する細胞は、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択できる。すなわち、ＨＡＴ感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、ＨＡＴ培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞を選択的に増殖させることができる。目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、上記ＨＡＴ培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、目的とするハイブリドーマを選択することができる。ついで、通常の限界希釈法を実施することによって、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施できる。あるいは、目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）を認識する抗体を国際公開ＷＯ０３／１０４４５３に記載された方法によって作製することもできる。
【０３７２】
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって適宜実施することができる。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させる。次いで担体を洗浄した後に酵素で標識した二次抗体等を反応させる。もしも培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれる場合、二次抗体はこの抗体を介して担体に結合する。最終的に担体に結合する二次抗体を検出することによって、目的とする抗体が培養上清中に存在しているかどうかが決定できる。抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることが可能となる。この際、抗原としては免疫に用いたものを始め、実質的に同質なＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等のタンパク質が好ましく使用できる。例えば目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）を発現する細胞株、目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）の細胞外ドメイン、あるいはその領域を構成する部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを、抗原として利用することができる。
【０３７３】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫することによって上記ハイブリドーマを得る方法以外に、ヒトリンパ球を抗原感作して目的とする抗体を得ることもできる。具体的には、まずインビトロにおいてヒトリンパ球をＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等のタンパク質で感作する。次いで免疫感作されたリンパ球を適当な融合パートナーと融合させる。融合パートナーには、例えばヒト由来であって永久分裂能を有するミエローマ細胞を利用することができる（特公平１−５９８７８号公報参照）。この方法によって得られる抗ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５抗体は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５タンパク質への結合活性を有するヒト抗体である。ＳＨＨ、Ｐｔｃｈ１、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子についても同様である。
【０３７４】
さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に対して抗原となる目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等のタンパク質）を投与するか、または目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５）を当該動物中において発現するように構築されたＤＮＡによって免疫することによって、目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に対するヒト抗体を得ることもできる。免疫動物の抗体産生細胞は、適当な融合パートナーとの細胞融合やエプスタインバーウイルスの感染などの処理によって不死化させることができる。このようにして得られた不死化細胞から、目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に対するヒト抗体を単離することができる（国際公開ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９４／０２６０２参照）。更に不死化された細胞をクローニングすることにより、目的の反応特異性を有する抗体を産生する細胞をクローニングすることもできる。トランスジェニック動物を免疫動物とするときには、その動物の免疫システムは、目的のヒトタンパク質（例えば、ヒトＧＰＲ４９／ＬＧＲ５）を異物と認識する。従って、目的のヒトタンパク質（例えば、ヒトＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に対するヒト抗体を容易に得ることができる。
【０３７５】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することができる。また、該ハイブリドーマを液体窒素中で長期にわたって保存することもできる。当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水としてモノクローナル抗体を得ることもできる。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適している。
【０３７６】
本発明においては、抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子によってコードされる抗体を利用することもできる。クローニングした抗体遺伝子は、適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって抗体として発現させることができる。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５参照）。
【０３７７】
例えば目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に対する抗体の取得を目的とするとき、抗体の目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）への結合は、特異的であることがさらに好ましい。目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に結合する抗体は、例えば、１）得られたｃＤＮＡによってコードされるＶ領域を含む抗体を目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に接触させる工程；（２）目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）と抗体との結合を検出する工程、および（３）目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に結合する抗体を選択する工程を含む方法によりスクリーニングすることができる。
【０３７８】
抗体と目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）との結合を検出する方法は公知である。具体的には、担体に固定した目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に対して被験抗体を反応させ、次に抗体を認識する標識抗体を反応させる。洗浄後に担体上の標識抗体が検出されたときには、当該被験抗体の目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）への結合を証明できる。標識には、ペルオキシダーゼやβ−ガラクトシダーゼ等の酵素活性蛋白質、あるいはＦＩＴＣ等の蛍光物質を利用することができる。抗体の結合活性を評価するために目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）を発現する細胞の固定標本を利用することもできる。
【０３７９】
結合活性を指標とする抗体のスクリーニング方法として、ファージベクターを利用したパニング法を用いることもできる。上記のように抗体遺伝子を重鎖と軽鎖とのサブクラスのライブラリーとして取得した場合には、ファージベクターを利用したスクリーニング方法が有利である。重鎖と軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、適当なリンカー配列で連結することによってシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）とすることができる。ｓｃＦｖをコードする遺伝子をファージベクターに挿入すれば、ｓｃＦｖを表面に発現するファージを得ることができる。このファージを目的とする抗原と接触させて、抗原に結合したファージを回収すれば、目的の結合活性を有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡを回収することができる。この操作を必要に応じて繰り返すことにより、目的とする結合活性を有するｓｃＦｖを濃縮することができる。
【０３８０】
本発明において抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体の全長をコードしていてもよいし、あるいは抗体の一部をコードしていてもよい。抗体の一部とは、抗体分子の任意の部分を言う。以下、本明細書では、本発明の実施の際に抗体フラグメントを用いる場合がある。本発明における好ましい抗体フラグメントは、抗体の相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）を含む。更に好ましくは、本発明の抗体フラグメントは、可変領域を構成する３つのＣＤＲの全てを含む。
【０３８１】
１つの実施形態では、本発明の抗体には、目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に結合する限り、ＩｇＧに代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはＩｇＭに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。本発明の抗体は、抗体の全長分子に限られず目的のタンパク質（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子等）に結合する限り、低分子化抗体またはその修飾物であってもよい。
【０３８２】
免疫した動物の免疫応答レベルを確認し、また、細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選択するため、免疫した動物の血中抗体価、または抗体産生細胞の培養上清中の抗体価を測定する。抗体検出の方法としては、公知技術、例えばＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ）等が挙げられる。
【０３８３】
イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカーの濃度を測定することが出来る。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的または間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカーに特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
【０３８４】
質量分析によってマーカーの濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカーの濃度を測定することができる。さらに、２台の質量分析計を用いたＭＳ／ＭＳによれば、より正確にマーカーの濃度を測定することができる。
【０３８５】
電気泳動によりマーカーの濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカーを分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカーに相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカーの分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカーの量を測定することもできる。
【０３８６】
クロマトグラフィーによってマーカーの濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカーを分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカーの濃度を測定することができる。
【０３８７】
抗体産生細胞と融合させるミエローマ（骨髄腫）細胞として、マウス、ラット、ヒトなど種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばＨＡＴ培地）で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。一般的に８−アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できないものである。
【０３８８】
ミエローマ細胞は、既に公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７９）１２３：１５４８−１５５０）、Ｐ３×６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１：１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６：５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８：４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６：２６９−２７０）、ＦＯ（Ｌａｚｅｋａｓ  ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．ａｎｄ  Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ，Ｄ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５：１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８：３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：１３１−１３３）等が好ましく使用される。
【０３８９】
抗体産生細胞は、脾臓細胞、リンパ節細胞などから得られる。すなわち、前記各種動物から脾臓、リンパ節等を摘出または採取し、これら組織を破砕する。得られる破砕物をＰＢＳ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０等の培地または緩衝液に懸濁し、ステンレスメッシュ等で濾過後、遠心分離を行うことにより目的とする抗体産生細胞を調製する。
【０３９０】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＥ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを、混合比１：１〜１：１０で融合促進剤の存在下、３０〜３７℃で１〜１５分間接触させることによって行われる。細胞融合を促進させるためには、平均分子量１，０００〜６，０００のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたはセンダイウイルスなどの融合促進剤や融合ウイルスを使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【０３９１】
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法等が挙げられる。すなわち、細胞懸濁液を適切な培地で希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウェルに選択培地（ＨＡＴ培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【０３９２】
ハイブリドーマのスクリーニングは、限界希釈法、蛍光励起セルソーター法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得する。取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等が挙げられる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０〜２０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、または無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃，５％ＣＯ２濃度）で２〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法においては、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にハイブリドーマを投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜４週間後に腹水または血清を採取する。
【０３９３】
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製する。
【０３９４】
従って、抗体作成の際に抗原として含まれる物質は、その対象となるマーカーの全長が好ましいが、免疫を惹起し得るエピトープを少なくとも一つ含んでいれば、部分配列でもよい。エピトープは、必ずしもその正確な位置および構造が判明していないとしても使用することができるが、必要な場合は、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３９９８；米国特許第４，７０８，８７１号；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３：７０９を参照することができる。同じエピトープを認識する抗体は、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むエピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
【０３９５】
従って、ペプチドを含むエピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。エピトープは直鎖状であってもコンフォメーション形態であってもよい。
【０３９６】
１つの局面において、本発明によれば、本発明による検出方法を実施するための検出キットが提供される。
【０３９７】
１つの実施形態では、本発明による検出キットとしては、本発明による実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出するためのキットであって、本発明によるプローブを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。このプローブは、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法によりＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出する。従って第一の態様の検出方法は、所望により、ハイブリッド形成法を実施するための種々の試薬、例えば標識の検出に用いられる基質化合物、ハイブリダイゼーション緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【０３９８】
本発明によるこの実施形態の検出キットは、精度の高い検出を行うために、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子以外の分化マーカー遺伝子（例えば、Ｋｉ−６７、ＢｒｄＵ等）の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子以外の分化マーカー遺伝子の発現を更に検出する。
【０３９９】
別の実施形態において、本発明による検出用キットとしては、本発明による別の実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出するためのキットであって、本発明によるプライマーまたは本発明によるプライマーセットを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この検出用キットは核酸増幅法によりＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出する。従って第二の態様の検出方法は、所望により、核酸増幅法を実施するための種々の試薬、例えば緩衝液、ＰＣＲが正常に進行し得ることを示す内部標準、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【０４００】
本発明によるこの実施形態の検出キットは、精度の高い検出を行うために、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子以外の分化マーカー遺伝子の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子以外の分化マーカーの発現を更に検出する。
【０４０１】
さらなる実施形態において、本発明による検出キットとしては、本発明によるさらなる実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子のタンパク質を検出するためのキットであって、本発明による抗体を少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットは抗原抗体反応を検出することによりＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出する。この実施形態の検出方法は、所望により、抗原抗体反応を実施するための種々の試薬、例えばＥＬＩＳＡ法等に用いる２次抗体、発色試薬、緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【０４０２】
この実施形態では、本発明による検出キットは、精度の高い検出を行うために、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子以外の分化マーカーの発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、Ｐｔｃｈ１、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子以外の分化マーカーの発現を更に検出する。
【０４０３】
これらのキット、組成物またはシステムは、本発明のマーカー（例えば、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子を同定することができる限り、任意の被験体由来の試料中のマーカー、該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段を用いることができることが理解され得る。従って、本明細書において具体的に記載された因子または手段のみならず、当該分野において公知の任意の等価の因子または手段を用いることができることが理解される。
【０４０４】
１つの実施形態では、本発明において使用される因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択され、好ましくは、因子は、タンパク質または複合分子（例えば、糖タンパク質、脂質タンパク質など）である。好ましくは、因子は、抗体（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）である。このような因子は、標識されるか、または標識可能であることが好ましい。なぜなら、診断することが容易となるからである。
【０４０５】
本発明の好ましい実施形態において、使用される手段は、質量分析装置、核磁気共鳴測定装置、Ｘ線解析装置、ＳＰＲ、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー）、免疫学的手段（例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ））、生化学的手段（例えば、ｐＩ電気泳動、サザンブロッティング、二次元電気泳動）、電気泳動機器、化学的分析機器、蛍光二次元ディファレンシャル電気泳動法（２ＤＥ−ＤＩＧＥ）、同位体標識法（ＩＣＡＴ）、タンデムアフィニティ精製法（ＴＡＰ法）、物理学的手段、レーザーマイクロダイセクションおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０４０６】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のシステムまたはキットは、さらに、マーカーの標準を含む。このような標準は、マーカーの検出手段（該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段など）が正常に機能しているかどうかを確認するために用いることが好ましい。
【０４０７】
好ましい実施形態では、本発明では、対象となる試料を精製する手段をさらに備え得る。このような精製手段としては、例えば、クロマトグラフィーなどを挙げることができる。精製することによって、診断の精度を上げることができることから、好ましい実施形態において使用され得るが、これは必須ではない。
【０４０８】
１つの実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、本発明のマーカーの定量をする能力を有する。このような定量は、標準曲線を描いたときに、検量線がきちんと描ける手段または因子であるものがよい。好ましくは、例えば、抗体、質量分析、クロマトグラフィー分析などを挙げることができる。従って、ある実施形態では、本発明のシステムは、マーカーの定量を行うための定量手段をさらに備える。
【０４０９】
１つの実施形態では、定量手段は、標準曲線と測定結果とを比較して前記マーカーが正常値の範囲内かどうかを判定する判定手段を含む。このような判定手段は、コンピュータを用いて実現することができる。
【０４１０】
１つの実施形態では、本発明のキットまたはシステムは、マーカーまたはマーカーに特異的に相互作用する前記因子を含む組成物を含む。
【０４１１】
１つの局面において、本発明は、被験体由来の試料中のマーカー、該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段の、増殖能のレベルまたは分化状態、またはそれに関する疾患、障害または状態の予測診断、事前診断、予測、検出または診断するための医薬の製造における、使用を提供する。ここで、試料の取得は、どのような手段で行ってもよい。通常、医師以外の担当者が測定に従事する場合は、何らかの形で医師が取得したものであり得る。測定結果から、増殖能のレベルまたは分化状態、またはそれに関する疾患、障害または状態またはその可能性があるかどうかの決定は、正常値と比べて、各々のマーカーに比較して異常であるかどうかを判定することによって実施することができる。本発明の方法において、使用されるマーカーなどは、本明細書の他の場所において記載される任意の１または複数の特徴を矛盾することがない限り有していても良いことが理解される。本発明の検出または診断において、マーカーの濃度を測定する方法は、そのマーカーの濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。
【０４１２】
本発明の検出または診断における好ましい実施形態の一つは、マーカーを担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカーの濃度を測定することである。すなわち、マーカーに対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカーを担体上に捕捉する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカーの濃度を測定することができる。
【０４１３】
１つの実施形態においてマーカーの測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカーに特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカーの濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。
【０４１４】
一方、１つの実施形態において、マーカーの測定方法に質量分析を用いる場合は、抗体の他、イオン結合や疎水性相互作用によってマーカーを担体に捕捉することもできる。イオン結合や疎水性相互作用は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がなく、マーカー以外の物質も捕捉されるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を使用したプロテインチップを用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）−飛行時間質量分析（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（本明細書中「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行えば、マーカーの濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、金属イオン基板が好ましく用いられる。
【０４１５】
イオン結合によってマーカーを担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陰イオン交換体、陽イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体のいずれも用いることができる。例えば、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。一方、疎水性相互作用によってマーカーを担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。さらに、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋等の金属イオンを固定化した担体にマーカーを捕捉することもできる。
【０４１６】
１つの実施形態において、用いる担体の例としては、ビーズ、マイクロタイタープレート、樹脂等の公知のものを使用することができる。特に、ビーズとマイクロタイタープレートは、イムノアッセイにおいて従来から用いられており、測定系の構築が容易である。一方、基板のような、平面部分を有する担体を用いることもできる。この場合は、平面部分の一部にマーカーに対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基盤としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカーに特異的な抗体を固定化した担体が挙げられる。
【０４１７】
本発明によるプローブ、プライマー、または抗体等の検出剤または診断剤を指標として選択された細胞は、増殖能を有する未分化細胞または前駆細胞（例えば、角膜内皮細胞に存在する未分化細胞または前駆細胞）であることから、従来の雑多な細胞集団または外来遺伝子を導入した前駆細胞と比べて、安全性、生存率、ネットワーク形成能の面で水疱性角膜症または角膜内皮炎等の角膜内皮疾患、障害または状態あるいはその他の眼科疾患の治療または予防に好ましいものである。選択されうる細胞は、分裂停止前、すなわち増殖中の未分化細胞または前駆細胞であり、脳内の最適な場所で分化成熟していく可能性があり、また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてさらに未分化細胞または前駆細胞が増殖する可能性があることから、より長期的な治療効果も期待できる。従って、本発明は、水疱性角膜症または角膜内皮炎等の角膜内皮疾患、障害または状態あるいはその他の眼科疾患の効果的な治療または予防の実用化に途を拓くものであるといえる。
【０４１８】
（スクリーニング）
本発明による検出方法は、角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニングに適用することができる。すなわち、被験物質の添加により、角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞に分化誘導されたか否かを、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を指標として判定することにより、角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞への分化誘導に有効な物質をスクリーニングすることができる。
【０４１９】
従って、本発明によれば、角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供され、この方法は、（ｉ）角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞に分化し得る細胞（例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等）と、被験物質とを接触させる工程；および（ｉｉ）被験物質を接触させた後の前記細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出する工程を包含する。工程（ｉ）において、角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞に分化し得る細胞は、好ましくは、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、あるいはこれらの細胞より分化誘導した神経前駆細胞または神経堤細胞を含む培養細胞から採取することができる。
【０４２０】
工程（ｉ）において、「被験物質を接触させる」とは、例えば、角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞に分化し得る細胞を含む培養細胞に被験物質を添加することにより行うことができる。
【０４２１】
使用されうる「被験物質」としては、合成低分子化合物、タンパク質、合成ペプチド、精製または部分精製ポリペプチド、抗体、細菌放出物質（細菌代謝産物を含む）、核酸（アンチセンス、リボザイム、ＲＮＡｉ等）等が挙げられ、好ましくは、化合物もしくはその塩またはそれらの溶媒和物（例えば、水和物）であるが、これらに限定されるものではない。「被験物質」は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
【０４２２】
工程（ｉｉ）においては、本発明による検出法に従って、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出することができる。
【０４２３】
具体的な実施形態としては、本明細書に記載されるハイブリダイゼーション法を利用した検出、核酸増幅法を利用した検出、抗原抗体反応を利用した検出を、適宜実施することにより、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現を検出することができる。
【０４２４】
工程（ｉｉ）において、被験物質を接触させて、細胞試料においてＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子の発現が検出された場合に、該物質を角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞への分化誘導に有効な物質であると判定することができる。ＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現の抑制または消失が検出された場合に、該物質を角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞への分化誘導に有効な物質であると判定することができる。
【０４２５】
本発明によるスクリーニング法により特定された物質は、角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞への分化誘導に有効な物質として用いることができる。本発明によれば、角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞への分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法が提供され、この方法は：（ｉｉｉ）被験物質を接触させた後の前記細胞における、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子以外の分化マーカー遺伝子の発現を検出する工程を更に下記工程を含んでいてもよい。工程（ｉｉ）において、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子の発現が検出され、かつ、工程（ｉｉｉ）において、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５および／またはＳＨＨ、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２等のヘッジホッグ経路の因子および／またはＬＲＰ６、β−カテニン等のＷｎｔ経路の因子以外の分化マーカー遺伝子（例えば、Ｋｉ−６７、ＢｒｄＵ等）の発現が検出された場合に、該物質を角膜内皮細胞に存在する増殖能の高いおよび／あるいは未分化の細胞への誘導に有効な物質であると高精度に判定することができる。なお、工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉ）の後に行われればよく、工程（ｉｉ）の前でも後でもよい。
【０４２６】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆＭｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０４２７】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０４２８】
例えば、本明細書において、当該分野に知られる標準法によって、例えば自動化ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等から市販されるものなど）の使用によって、本発明のオリゴヌクレオチドを合成することも可能である。例えば、Ｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９）の方法によって、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを合成することも可能であるし、調節孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７４４８−７４５１）等の使用によって、メチルホスホネート・オリゴヌクレオチドを調製することも可能である。
【０４２９】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０４３０】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０４３１】
必要な場合、以下の実施例で用いる動物の取り扱いは、京都府立医科大学または同志社大学において規定される基準を遵守し、ヘルシンキ宣言に基づいて行った。また、視覚および眼科研究における動物の使用についてのＡＲＶＯ宣言（ｔｈｅ  ＡＲＶＯ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従って動物の飼育および取り扱いを行った。また、試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ，和光純薬、ナカライ、ａｂｃａｍ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｎｏｖａ，Ａｓｓａｙ  Ｐｒｏ，Ｏｒｉｇｅｎｅ，Ｂｉｏｂｙｔ，Ｂｉｏｒａｄ，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＩＢＬ等）の同等品でも代用可能である。【０４３２】
（実験材料と方法）
（材料）
（角膜組織）
本実験で使用した全てのヒト角膜組織はアメリカシアトルアイバンクのＳｉｇｈｔＬｉｆｅＴＭ（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  Ｌｉｏｎｓ  Ｆｏｕｄａｔｉｏｎ）より輸入されたものを使用した。また，全てのサル角膜組織は，他の研究目的により安楽死したカニクイザル（日精バイリス株式会社滋賀研究所（ＮｉｓｓｅｉＢｉｌｉｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）Ｏｈｔｓｕ，Ｊａｐａｎ、株式会社ケアリー（Ｋｅａｒｉ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）Ｗａｋａｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）の角膜を使用した。全ての角膜を、保存培地（Ｏｐｔｉｓｏｌ；Ｃｈｉｒｏｎ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）中、４℃で保存した。全ての実験は、ヘルシンキ宣言の教義にしたがって実施した。【０４３３】
（細胞培養）
ヒト角膜内皮細胞初代培養では，角膜組織から内皮細胞層を含むデスメ膜を剥離し，ＯＰＴＩＭＥＭ−Ｉに溶解した２ｍｇ／ｍｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ａ（カタログ番号：７０１６４９２３；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に入れて３７℃でインキュベートした。３時間後，１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去後、沈殿している角膜内皮細胞塊に培養培地を加えて混和し、ＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘ（カタログ番号：０４０７；Ａｔｈｅｎａ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）をコートした１２ウェルプレートへ全量を播種した。培養培地はＯＰＴＩＭＥＭ−Ｉ（カタログ番号：５１９８５；Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に５％ウシ胎仔血清（カタログ番号：１０４３７−０２８；ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ；ＢｉｏＷｅｓｔ，Ｆｒａｎｃｅ）、５０μｇ／ｍｌ  Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（Ｉｎｖｔｉｒｏｇｅｎ）、１０μｇ／ｍｌ  Ｙ−２７６３２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を加えたものを使用した。【０４３４】
サル角膜内皮細胞初代培養では，角膜組織から内皮細胞層を含むデスメ膜を剥離し，ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解した１．２Ｕ／ｍｌ  Ｄｉｓｐａｓｅ  Ｉ［（三光純薬）カタログ番号：ＧＤ８１０６０］に入れて、３７℃でインキュベートした。１時間後，ピペッティングでデスメ膜から角膜内皮細胞を剥離して回収し、１０００ｒｐｍ５分間遠心分離して上清を除去した沈殿している角膜内皮細胞に培養培地を加えて混和し、ＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘをコートした６ウェルプレートへ全量を播種した。培養培地はＤＭＥＭ（カタログ番号：１２３２０；Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１０％  ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（カタログ番号：１５７１０−０６４；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０μｇ／ｍｌ  Ｙ−２７６３２（カタログ番号：６８８０００５；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、２ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；カタログ番号：１３２５６−０２９；ｂＦＧＦ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたものを使用した。【０４３５】
ヒト角膜は、初代培養までの期間が１４日未満のものを用いた。ヒトおよびサルの角膜内皮細胞（ＣＥＣ）の培養には、以前に報告した系［Ｔａｎ  ＤＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．，２０１２；３７９：１７４９−１７６１；Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．，２０１２；９５：６０−６７；Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．．２００７；４８：４５１９−４５２６；Ｏｋｕｍｕｒａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２０１２；１８１：２６８−２７７］を使用した。【０４３６】
培地交換は２日ごとに行った。継代は５０〜８０％コンフルエントになった時点で行った。継代方法は、Ｃａ２＋Ｍｇ２＋非含有（ｆｒｅｅ）ＰＢＳ（ＰＢＳ−；Ｎｉｓｓｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ．Ｊａｐａｎ）で細胞を洗浄し、ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｓｅｌｅｃｔ（カタログ番号：１２５６３；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え，３７℃で５分間インキュベートした。プレートから細胞を剥離して回収し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、培養培地を加えて細胞懸濁液とした。ＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘをコートしたプレートへ１：２の密度で細胞を播種した。【０４３７】
（免疫染色）
免疫組織化学研究は、本発明者らが以前に記載した方法［Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．，２００７；２５：６２８−６３８；Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．，２００８；２６：１２６５−１２７４］に従って行った。【０４３８】
角膜組織凍結切片を作製するために、角膜組織をＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（カタログ番号：４５８３；Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で包埋し、液体窒素にて凍結させた。凍結ブロックを８μｍに薄切してシランコーティングスライドに貼付し風乾した。全組織切片の作製では、角膜組織から角膜内皮細胞を含むデスメ膜を剥離し、氷冷した１００％アセトンにて３０秒間静置後、シランコーティングスライドに貼付して風乾した。培養角膜内皮細胞はＬａｂＴｅｋ８ウェルプラスチックチャンバースライドで培養したものを使用した。角膜組織ならびに培養細胞に氷冷した１００％アセトンを加えて４℃で１５分間静置して細胞を固定させた。０．１５％ＴｒｉｔｏｎＸ／ＰＢＳ−にて振盪洗浄後、１％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ；カタログ番号：Ａ４５０３ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、室温３０分間静置しブロッキングした。一次抗体は１％ＢＳＡで希釈し、室温１時間インキュベートした。使用する一次抗体には、抗ウサギＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（カタログ番号：ＧＴＸ７１１４３；１：２００；ＧｅｎｅＴｅｘＩｎｃ．，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）、抗ウサギＮｅｓｔｉｎ（カタログ番号：ＰＲＢ−５７０Ｃ；１：２００；ＣＯＶＡＮＣＥ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）、抗マウスＡＢＣＧ２（カタログ番号：ＮＣ  ２３６；１：２；Ｋａｍｉｙａ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＣＯ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ  ＵＳＡ）、抗マウスＫｉ−６７（カタログ番号：５５６００３；１：２００  ＢＤ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＴＭ  ＮＪ，ＵＳＡ）、抗ウサギＮａ＋／Ｋ＋  ＡＴＰａｓｅ（カタログ番号：Ａ１３２；１：１００；Ｚｙｍｅｄ）、抗ウサギＺＯ１（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いた。０．１５％  Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳ−にて２回、ＰＢＳ−にて１回振盪洗浄した。【０４３９】
二次抗体は１％ＢＳＡと０．１５％  ＴｒｉｒｏｎＸ／ＰＢＳ−の混合溶液にて希釈し、室温３０分間インキュベートした。使用する二次抗体には、ＡｌｅｘａＴＭ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ヤギ抗ウサギＩｇＧ（カタログ番号：Ａ１１０３４；１：１５００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＡｌｅｘａＴＭ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ヤギ抗マウスＩｇＧ（カタログ番号：Ａ１１０２９；１：１５００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。０．１５％  Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳ−にて２回、ＰＢＳ−にて１回振盪洗浄後、ヨウ化プロピジウム（カタログ番号：ＳＰ２９００４−４１；ＰＩ；Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）にて核染色を行い、カバーガラスをかけて包埋した。共焦点レーザー顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にて観察し、写真撮影した。【０４４０】
（リアルタイムＰＣＲ）
リアルタイムＰＣＲ実験は、本発明者らが以前に記載した方法［Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．．２００７；２５：６２８−６３８］に従って行った。【０４４１】
角膜組織や培養細胞からのＲＮＡ抽出にはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号：７４１０６；ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用した。抽出したＲＮＡ１μｇあたり１μｌ  ＯｌｉｇｏｄＴＰｒｉｍｅｒ（カタログ番号：１８４１８−０２０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、７０℃２分間インキュベート後、すぐに氷冷した。さらに、５×Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ，１００ｍＭ  ＤＴＴ（カタログ番号：７７２５９０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（カタログ番号：１８０６４−０１４；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（カタログ番号：ＢＧ７４０１Ａ；Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）、４０ｕｎｉｔ／μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（カタログ番号：ＳＩＮ−１０１；Ｔｏｙｏｂｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ  Ｊａｐａｎ）を含む反応液を加え、４２℃で４５分間、７０℃で１５分間インキュベートしてｃＤＮＡを合成した。プライマーの作製にはＢＬＡＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍｓ（ＮＣＢＩ）を利用した（表１）。合成したｃＤＮＡ  ２μｌにプライマーとＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（カタログ番号：４３６７６５９；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を加え、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクルで反応させた。得られたデータをＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで解析した。なお、各遺伝子の発現量はβ−ａｃｔｉｎの遺伝子発現量で補正し、コントロールとの相対値で示した。【０４４２】
【表１】
2014007402.tif 000002
【０４４３】
（フローサイトメトリー）
培養サル角膜内皮細胞をＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘをコートした６−ウェルプレートへ播種し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にて１４日間培養した。ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｓｅｌｅｃｔにて細胞を剥離して回収した。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞の分取のために、回収した細胞に１％  ＢＳＡを加え、室温１５分間インキュベートしてブロッキングした。一次抗体は抗ウサギＧＰＲ４９／ＬＧＲ５とＡｌｅｘａＴＭ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ＜いずれも上記実施例参照＞を使用し、各々室温で２０分間インキュベートした。フローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））を使用してＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞とＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陰性細胞を分取し、各細胞を８ウェルチャンバースライドへ播種して培養した。３日間後、抗マウスＫｉ−６７にて免疫染色し、Ｋｉ−６７陽性細胞数を計測した。【０４４４】
ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞における細胞増殖率検討のために、回収した細胞に７０％エタノールを加えて−２０℃で２時間インキュベートし、細胞を固定した。ＰＢＳ−にて２回洗浄後、１％  ＢＳＡを加え、室温で１５分間インキュベートしてブロッキングした。一次抗体は、抗ウサギＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（１：１００）、抗マウスＫｉ−６７（１：１００）を使用し、室温で３０分間インキュベートした。二次抗体はＡｌｅｘａＴＭ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（１：１５００）とＡｌｅｘａＴＭ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（１：１５００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、室温で２０分間インキュベートした。細胞のソーティングにはＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用した。データの解析には付属のソフトウェアを使用した。【０４４５】
（細胞面積の測定）
各々の単離細胞画分を遠心分離して、培養培地中に再懸濁させた。細胞（約１００細胞／ｍｌ）を、６ウェルプレート内に入れ、倒立顕微鏡下で撮像した。細胞の面積を、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いて無作為に測定し（２００細胞／画分）、統計解析を行った［Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．，２００７；２５：６２８−６３８］。【０４４６】
（遺伝子導入；ＲＮＡ干渉）
ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５ｓｈＲＮＡウイルスベクターを含むレンチウイルスパーティクルを作製するために、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５  ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）ｓｈＲＮＡ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を購入した（表２）。【０４４７】
【表２】
2014007402.tif 000003
【０４４８】
また、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現ベクターは京都府立医科大学眼科学教室川崎諭より譲渡されたものを使用した。このベクターの作製方法は以下のとおりである。【０４４９】
すなわち、このベクター構築のため、目的の遺伝子（ここでは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５）を発現するレンチウイルスプラスミドベクターを用いた。本発明者らは、目的の遺伝子を挿入するためのベクターとして市販のレンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３＿Ｖ５−ＴＯＰＯ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。特定の遺伝子のコード配列全体を包含するプライマー対を用いてｃＤＮＡを鋳型として用いて増幅反応を行い、これをゲル精製し、レンチウイルスプラスミドベクターにライゲートさせた。【０４５０】
このレンチウイルスの発現の際、生成および感染は、以前本発明者らの一部が報告したｓｈＲＮＡについて用いてプロトコール（Ｎａｋａｔｓｕｋａｓａ  Ｍ，Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｓ，Ｙａｍａｓａｋｉ  Ｋ，Ｆｕｋｕｏｋａ  Ｈ，Ｍａｔｓｕｄａ  Ａ，Ｔｓｕｊｉｋａｗａ  Ｍ，Ｔａｎｉｏｋａ  Ｈ，Ｎａｇａｔａ−Ｔａｋａｏｋａ  Ｍ，Ｈａｍｕｒｏ  Ｊ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２０１０  Ｓｅｐ；１７７（３）：１３４４−５５．）を改変して用いた。手短に述べれば、レンチウイルスプラスミドＤＮＡを、ｐＬＰ１、ｐＬＰ２およびｐＬＰ／ＶＳＶＧプラスミドを含むパッケージングプラスミド混合物であるＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、１４μｌ  Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤをトランスフェクション試薬として用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。１８時間後、培地を吸引除去し、完全培地（ＤＭＥＭに１０％  ＦＢＳを補充したもの；以下「培養培地」とも称する）に置き換え、レンチウイルス粒子の品質を評価した。【０４５１】
詳細には、ＤＭＥＭに１０％  ＦＢＳを添加した培養培地でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９．０×１０５個／２５ｃｍ２の密度で播種した。２４時間培養後、ＯＰＴＩＭＥＭ−Ｉ、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）およびＬｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＩＳＳＩＯＮ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｍｉｘ）またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にてインキュベートした。１８時間後培養培地に交換し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にて培養した。２４時間後、レンチウイルスパーティクルを含む培養培地を回収した。回収したレンチウイルスの力価測定にはＨＩＶ−１  ｐ２４  Ａｎｔｉｇｅｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用した。なお、コントロールにはランダムな配列を有するＮｏｎ−Ｔａｒｇｅｔ  ｓｈＲＮＡ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。ヒトおよびサル培養角膜内皮細胞を６ウェルプレート（５０００細胞／ウェル；ＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘ（登録商標）を施した６ウェルプレート）または８ウェルチャンバースライド（５００細胞／ウェル）へ播種し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下で培養した。２４時間後、作製したレンチウイルスパーティクルおよび４μｇ／ｍｌヘキサジメトリンブロミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ポリブレンともいう。）を添加し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下でトランスフェクションした。２４時間後、０．４μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含む培養培地に交換し、ピューロマイシン耐性細胞を選択した。ピューロマイシン抵抗性コロニーは、０．４μｇ／ｍｌピューロマイシン存在下で培養し、２日おきに培地を交換した。【０４５２】
（遺伝子発現のためのレンチウイルスプラスミドベクターの構築）
目的の遺伝子を発現するレンチウイルスプラスミドベクターの構築のために、市販のレンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３＿Ｖ５−ＴＯＰＯ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。特定の遺伝子の全コード配列を包囲するプライマー対を用いたｃＤＮＡを増幅し、ゲル精製し、次いで、レンチウイルスプラスミドベクター内にライゲーションした。【０４５３】
発現用レンチウイルスの生成および感染は、ｓｈＲＮＡについて使用した本発明者らのプロトコール［Ｎａｋａｔｓｕｋａｓａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．．２０１０；１７７：１３４４−１３５５］の改変バージョンで行った。簡単に述べると、レンチウイルスプラスミドＤＮＡを、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤをトランスフェクション試薬として用い、ｐＬＰ１、ｐＬＰ２およびｐＬＰ／ＶＳＶＧプラスミドを含むプラスミドパッケージングプラスミドミクスチャＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。１８時間後、培地を吸引して、完全培地と交換し、レンチウイルス粒子の量を評価した。【０４５４】
（遺伝子導入）
感染能を持つウイルス粒子を含む培養上清を回収し、ＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘ（登録商標）を含む６ウェルプレート中５０００細胞／ウェルのヒトＣＥＣへと移した。上清は、４μｇ／ｍｌポリブレンの存在下で培養ＣＥＣ上に適用した。ピューロマイシン耐性コロニーを集める際、細胞は０．４μｇ／ｍｌのピューロマイシンの存在下で培養し、そして、培地を２日おきに交換した。【０４５５】
（ウェスタンブロッティング）
ウェスタンブロッティングには、以下のウサギポリクローナル抗体：抗ＬＲＰ６、ｐ−ＬＲＰ６（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）と、以下のマウスモノクローナル抗体：β−カテニン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびβ−アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用した。二次抗体は、ＨＲＰ標識抗ウサギまたはマウスＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用した。組換えヒトＳＨＨ、プルモルファミン、シクロパミンおよびＲＳｐｏｓは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。【０４５６】
培養ヒトＣＥＣをＰＢＳで洗浄し、次いで、ＰＢＳ、１％  ＴＲＩＴＯＮＴＭＸ−１００、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、ホスファターゼインヒビターカクテル２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびホスファターゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する溶解バッファーでリンスした。活性化されたβ−カテニン（非膜結合型）の検出は、以前に報告されたプロトコール［Ａｇｈｉｂ  ＤＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１９９５；２１８：３５９−３６９］に従って実施した。簡単に述べると、Ｃｏｎ  Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で処理した細胞溶解物を、４℃で１時間インキュベートした。４℃で１０分間の遠心分離の後、上清を新しいチューブに移し、Ｃｏｎ  Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭを各チューブに加え、４℃で１時間インキュベートした。最終的に、簡単な遠心分離の後、上清を新しいチューブに移し、そのタンパク質濃度を決定した。【０４５７】
次いで、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦメンブレンに移した。その後、メンブレンを、ＴＢＳ−Ｔバッファー中１％  ＥＣＬ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でブロッキングし、一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔバッファー中で３回洗浄した後、ＰＶＤＦメンブレンを、室温で１時間、適切なＨＲＰ標識抗ウサギまたはマウスＩｇＧ二次抗体とともにインキュベートした。メンブレンを、ＥＣＬ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって感光させ、ＬＡＳ３０００Ｓ画像化システム（富士フィルム株式会社、東京都）で観察した。【０４５８】
以下に各実施例および結果を示す。【０４５９】
（実施例１：全層ヒト角膜組織における幹細胞マーカーの発現）
ヒトＣＥＣにおけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のインビボ発現パターンを、間接的免疫蛍光法によって調べた。比較のために、未熟細胞および前駆細胞のマーカーであるネスチンおよびＡＴＰ結合化セットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）もまた調べた。【０４６０】
角膜内皮細胞特異的に発現するタンパクを探索するために、既報の幹細胞マーカーを用いて網羅的に免疫染色を行った（図２ａ）。その結果、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は角膜内皮細胞特異的に強い発現が認められた。比較対象として、未分化細胞マーカーであるＮｅｓｔｉｎ（Ｌｅｎｄａｈｌ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９０）と角膜輪部基底細胞に特異的に発現するＡＢＣＧ２（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００４）を用いた。【０４６１】
このように、これらの組織のＣＥＣを調べると、特に周辺部領域において強力なＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現が観察された。しかしながら、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、角膜上皮および角膜間質では最小限にしか発現していなかった（図２ａ）。ネスチンは、角膜の全体にわたって中程度に発現しており、ＡＢＣＧ２は、主に角膜上皮の基底細胞層で発現し、角膜の間質および内皮では弱く発現することが分かった（図２ａ）。【０４６２】
Ｎｅｓｔｉｎは角膜全層で強い発現が見られた。ＡＢＣＧ２は角膜上皮基底細胞に強発現が見られ、角膜実質、角膜内皮にも発現が見られた。リアルタイムＰＣＲにてＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｎｅｓｔｉｎ、ＡＢＣＧ２のｍＲＮＡ発現量を比較した（図２ｂ）。Ｎｅｓｔｉｎ  ｍＲＮＡおよびＡＢＣＧ２  ｍＲＮＡ発現量は、角膜内皮と比較して角膜上皮と角膜実質に有意に発現量が亢進していた。他方、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５  ｍＲＮＡ発現量は角膜内皮において有意に発現量が亢進していることが認められた。【０４６３】
このように、リアルタイムＰＣＲは、平均ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５  ｍＲＮＡ発現が、角膜の実質細胞および上皮細胞と比較してＣＥＣにおいて有意にアップレギュレートされたことを示した（＊ｐ＜０．０５）（図２ｂ）。これに対し、角膜の実質細胞および上皮細胞におけるネスチンおよびＡＢＣＧ２の発現レベルは、ＣＥＣにおける発現レベルよりも高かった（図２ｂ）。したがって、角膜組織の中で、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現は、ＣＥＣにおいて最も顕著であることが分かった。【０４６４】
従って、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は角膜内皮細胞特異的に発現するタンパク質の一つであると判断した。【０４６５】
（実施例２：ヒト角膜全組織切片におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現局在）次に、本発明者らは、ホールマウント免疫蛍光法を用いて、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の局所パターンを検討した。【０４６６】
本実施例では、角膜内皮組織におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現局在を調べるために、角膜組織から角膜内皮細胞を含むデスメ膜を剥離し、免疫染色ならびにリアルタイムＰＣＲにて発現量を比較検討した（図２ｃ）。【０４６７】
免疫染色を行った結果、図２ｄ−ｅに示すように、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は角膜周辺部の内皮細胞の細胞膜や細胞質で強い発現が認められた（図２ｄ）。また、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５  ｍＲＮＡ発現量も中心部と比較して周辺部角膜内皮の方が亢進していた（図２ｅ）。【０４６８】
ＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現は、ＣＥＣでは、周辺部領域において上昇しており、また、その発現レベルはＣＥＣの中心領域に向かって次第に減少することが分かった（図２ｃ、ｄ）。リアルタイムＰＣＲははっきりと、周辺部領域におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現が、中心領域（直径７ｍｍ）と比べてアップレギュレートすることを示した（＊ｐ＜０．０５）（図２ｅ）。これらの知見は、角膜組織において、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５が周辺部ＣＥＣにおいて固有に発現されることを示す。【０４６９】
（実施例３：培養ヒト角膜内皮細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現）
本実施例では、培養ヒト角膜内皮細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現を調べた。【０４７０】
ヒト角膜内皮細胞は生体内での増殖能に乏しく、生体外での細胞培養も極めて困難である。これまでにも様々な培養方法の検討が行われてきたが、六角形で敷石状の細胞形態を維持した状態で継代培養する方法は確立されていない。そこで、既存の方法にてヒト角膜内皮細胞を培養した際のＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現量を検討した。比較対象としてＮｅｓｔｉｎを用いた。【０４７１】
免疫染色を行った結果、角膜組織（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ではＧＰＲ４９／ＬＧＲ５、Ｎｅｓｔｉｎともに非常に強い発現が見られた（図３ａ）。初代培養細胞では、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現は認められなかったが、Ｎｅｓｔｉｎの発現は確認された。継代細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｐ０）では，ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現は確認できなかったが、Ｎｅｓｔｉｎの発現は低下したものの発現が確認された。また、継代細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏＰ１）では細胞分化を引き起こし、核の増大が認められた。同様の条件で培養した角膜内皮細胞の各ｍＲＮＡ量を解析したところ、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５  ｍＲＮＡ発現量は培養環境において有意に発現量が減少したが、Ｎｅｓｔｉｎ  ｍＲＮＡ発現量はほとんど減少が認められなかった（図３ｂ）。【０４７２】
このように、インビボでのヒトＣＥＣの位相差顕微鏡写真は、これらが、より小さなサイズの均質な六角形の細胞のコンフルエントな単層を呈することが明らかになった（図３ａ）。これに対し、培養ＣＥＣ（Ｐ０、Ｐ１）は、拡大し、均質な六角形ではないことが分かった（図３ａ）。免疫染色は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５がインビボの周辺部ＣＥＣにおいて十分に発現されることを示した（図３ａ）。特筆すべきことに、インビトロの培養ＣＥＣ（Ｐ０、Ｐ１）では、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の最小限の発現しか認められなかった（図３ａ）。リアルタイムＰＣＲは、平均ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５  ｍＲＮＡ発現が、インビボＣＥＣにおける発現と比較して、インビトロＣＥＣにおいて有意にダウンレギュレートされることを示した（＊ｐ＜０．０５）（図３ｂ）。これに対し、インビボおよびインビトロの両方におけるネスチンの発現レベルは同様であった（図３ａ、ｂ）。【０４７３】
（実施例４：培養サル角膜内皮細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現）
サル角膜内皮細胞はヒトと同様に生体内での増殖能に乏しい性質をもつが、安定した継代培養方法の確立に成功している（Ｏｋｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＯＶＳ  ２００９，Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．８，３６８０−３６８７）。そこで、サル角膜内皮細胞を継代培養したときのＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現量を評価した。【０４７４】
免疫染色を行った結果、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は継代した培養角膜内皮細胞において安定的に発現維持できていることがわかった（図３ｃ）。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５  ｍＲＮＡはサル角膜組織と比較して継代することにより発現量が低下する傾向が認められたが、発現量が維持できていた（図３ｄ）。【０４７５】
このように、サルＣＥＣの位相差顕微鏡写真は、インビボおよびインビトロ（Ｐ０、Ｐ１）の両方の細胞が、より小さなサイズの均質な六角形の細胞のコンフルエントな単層を示すことを示した（図３ｃ）。これらの細胞の免疫染色は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５がインビボおよびインビトロの両方において中程度に発現されることを示した（図３ｃ）が、インビトロにおける平均ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５  ｍＲＮＡ発現は、細胞を継代するにつれ次第に減少した（＊ｐ＜０．０５）（図３ｄ）。これらの知見を考慮すると、ヒトおよびサルの細胞を用いた場合、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、インビトロでＣＥＣの未分化状態を維持するための重要な調節因子であり得るようである。【０４７６】
以上の結果から、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は角膜内皮細胞の生体外での安定的な培養において重要な働きを持つ可能性があることが理解される。【０４７７】
（実施例５：ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞の細胞生物学的特徴の検討）
ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性角膜内皮細胞の細胞生物学的特徴を検討するため、ＦＡＣＳを用いて解析を行った。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現を維持した状態で継代培養できることが確認された培養サル角膜内皮細胞を使用し、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞（ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５＋）とＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陰性細胞（ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５−）の細胞サイズおよび増殖能を比較検討した。【０４７８】
ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（＋）細胞およびＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（−）細胞の特徴を調べるために、細胞のサブセットをフローサイトメトリーにより単離した。セルソーティングの手順を検証するために、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５に関する免疫蛍光法により、精製した画分においてタンパク質レベルでの発現を確認した（図４ａ）。最も高いコロニー形成能は報告によれば最小のケラチン生成細胞において見出されるので［Ｂａｒｒａｎｄｏｎ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，１９８５；８２：５３９０−５３９４］、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いて単離した画分の各々における細胞の大きさを測定した。【０４７９】
ＦＡＣＳでセルソーティング後、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５＋およびＧＰＲ４９／ＬＧＲ５−を蛍光顕微鏡で撮影し、無作為に各々３５個の細胞の大きさをＩｍａｇｅ  Ｊ（Ｗａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄ（ＮＩＨ）フリーソフト）にて測定したところ、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５＋はＧＰＲ４９／ＬＧＲ５−に比べて有意に小さいことがわかった（図４ａ、図４ｂ）。そして、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（＋）細胞の平均サイズは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（−）細胞の平均サイズよりも有意に小さい（１８４．６±４５．８μｍ２対３２６．７８±７８．８μｍ２，Ｎ＝３５，＊＊ｐ＜０．０１）ことが分かった。【０４８０】
次に、単離した細胞画分の各々の細胞周期の状態を評価するために、単離した細胞画分を細胞チャンバスライド上で培養した。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（＋）細胞およびＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（−）細胞におけるＫｉ６７標識細胞の割合は、それぞれ、１４．２±３．８７％および０．５８±０．５％であり、Ｋｉ６７標識指数における差は統計的に有意であった（＊ｐ＜０．０５）（図４ｃ）。その結果、Ｋｉ−６７陽性細胞率はＧＰＲ４９／ＬＧＲ５＋の方が有意に高いことが明らかになった（図４ｃ）。そこで単離した細胞画分の各々の増殖能をさらに詳細に調べるために、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびＫｉ６７の二重染色についてＦＡＣＳを使用し、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５と細胞増殖との関係をより明確にするために、培養サル角膜内皮細胞（継代数３）を抗ウサギＧＰＲ４９／ＬＧＲ５と抗体マウスＫｉ−６７で二重染色し、ＦＡＣＳによる解析を試みた。その結果、全細胞の内ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５＋は７．２％であり、そのうち、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５＋／Ｋｉ−６７＋は３．４％であった（図４ｄ）。また、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５−／Ｋｉ−６７＋の細胞は認められなかった。ＦＡＣＳ分析は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５ｈｉｇｈ／Ｋｉ６７ｈｉｇｈ細胞画分が３．４％であったのに対し、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５ｈｉｇｈ／Ｋｉ６７ｌｏｗ細胞画分が３．８％であったことを示した（図４ｄ）。最も興味深いことに、全てのＧＰＲ４９／ＬＧＲ５ｌｏｗ細胞画分が、低いＫｉ６７レベルを示し（９２．８％）、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現なしでは、ＣＥＣは増殖能を有さないことと理解される。【０４８１】
（実施例６：ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）シグナルのターゲット遺伝子としてのＧＰＲ４９／ＬＧＲ５）
本実施例ではＧＰＲ４９／ＬＧＲ５がヘッジホッグシグナルにおける機能を調べた。【０４８２】
ヘッジホッグシグナルは胎生期の形態形成に関わるシグナルとして同定され、その後、成体組織の幹細胞や癌化にも深くかかわっていることが明らかになってきた。また、ＨＨシグナル伝達は、細胞の分化、増殖および成長のような様々な種類の生物学的プロセスにおいて重要な役割を担うことも報告されている［Ｂａｒｋｅｒ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ，２００７；４４９：１００３−１００７；Ｓｔａｎｔｏｎ  ＢＺ  ｅｔ  ａｌ、ＭｏｌＢｉｏｓｙｓｔ．，２０１０；６：４４−５４；Ｔｓｕｒｕ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ、Ｊｐｎ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，１９８４；２８：１０５−１２５］。ヒトのリガンドとしてＳＨＨ、Ｉｎｄｉａｎ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｉｈｈ）、Ｄｅｓｅｒｔ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｄｈｈ）の３種類のタンパク質が同定されている。リガンドが存在しない状態では、シグナルに対し抑制的に働くレセプターである１２回膜貫通型タンパクＰａｔｃｈｅｄ１（Ｐｔｃｈ１）が、７回膜貫通型タンパクＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）の細胞膜局在を抑制し、下流のシグナル分子への伝達も阻害している。この状況下では、Ｓｍｏの下流にある転写因子Ｇｌｉファミリー（Ｇｌｉ１，Ｇ１ｉ２，Ｇｌｉ３）にシグナルが伝わらず、標的遺伝子の転写が起こらない。Ｐｔｃｈ１へのリガンドの結合により、Ｐｔｃｈ１のＳｍｏに対する抑制がなくなり、Ｓｍｏから転写因子Ｇｌｉファミリーに至るシグナル系路が活性化し、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ／Ｅ，Ｍｙｃなどの標的遺伝子が転写される。シグナルの関連分子であるＰｔｃｈ１、Ｇｌｉ１も標的遺伝子であり、シグナルの活性化の指標となっている。【０４８３】
前述のとおり，ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は角膜周辺部に高い発現量がある（図２ｃ、図２ｄ、図２ｅ）。そこで、ヒト角膜中心部内皮細胞と周辺部内皮細胞におけるヘッジホッグシグナル関連分子（Ｓｈｈ、Ｓｍｏ、Ｐｔｃｈ１、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２）のｍＲＮＡ発現量を比較し、ＣＥＣにおけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の特性を分子レベルで定義するために、まず、ＣＥＣにおけるＨＨシグナル伝達関連分子の発現を調べた。【０４８４】
その結果、リガンドであるＳｈｈと転写因子Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２の発現量（ｍＲＮＡのレベル）は、中心領域におけるものと比較して、周辺部領域のＣＥＣにおいて上昇していることが観察され、周辺部内皮細胞の方が亢進しており、シグナルの活性化が認められた（図５ａ）、一方で、ＨＨ経路の受容体分子であるスムーズンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）（Ｓｍｏ）およびｐｒｏｔｅｉｎ  ｐａｔｃｈｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １（Ｐｔｃｈ１）の発現レベルは同様であり、これらのＰｔｃｈ１およびＳｍｏは差が見られなかった。したがって、ＨＨシグナル伝達は明らかに、周辺部領域のＣＥＣにおいて活性化されており、ＨＨシグナル伝達活性の場所による変動が存在することが示唆された。【０４８５】
ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５とヘッジホッグシグナルとの関連性を調べ、ＣＥＣにおけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現がＨＨシグナル伝達経路によって調節されるかどうかを決定するために、組換えヒトＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ｒｈＳｈｈ）、Ｓｍｏのアゴニストであるプルモルファミン（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ）（Ｓｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：２９−３０，２００６）、アンタゴニストであるシクロパミン（Ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ）（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６（２１）：２７４３−２７４８，２００２）を使用して、ヘッジホッグシグナルの活性化、または抑制によるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現への影響と細胞増殖との関連性について検討した。ヒト角膜組織に１００ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＳｈｈ、１０μＭプルモルファミン、１０μＭシクロパミンを処理し、３７℃５％ＣＯ２条件下で３日間インキュベートした。角膜からデスメ膜を剥離してシランコーティングスライドへ貼付し、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびＫｉ−６７の免疫染色を行った。また、同様の条件でインキュベートした角膜内皮細胞のＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲにてｍＲＮＡ発現量を測定した。【０４８６】
免疫染色の結果、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現はコントロールと比較してｒｈＳｈｈ添加群とプルモルファミン添加群で顕著な増加（アップレギュレート）が見られた（図５ｂ）。特に、ｒｈＳｈｈ添加群はＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現細胞数が増加しており、プルモルファミン添加群はＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞が強発現する傾向が認められた。このことから、ｒｈＳｈｈはＰｔｃｈ１への結合によりシグナルの活性化に働くのに対し、プルモルファミンはＳｍｏへの結合により活性化されるため、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現細胞のシグナルの活性化に働いたためと推測された。また、シクロパミンは明らかな発現抑制が確認された。同様の結果は、ｍＲＮＡ発現レベルでも確認できた（図５ｃ）。また、Ｇｌｉ１およびＧｌｉ２の発現パターンは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のものと同様であったが、ＨＨ活性化は、ＨＨ受容体（Ｐｔｃｈ１）に対して劇的な影響は有さなかった（図５ｃ）。【０４８７】
また、ＨＨ経路がインビボでＣＥＣ増殖を誘導するかどうかを解明するために、Ｋｉ６７に対する免疫組織化学研究を実施した。ヒトＣＥＣは、有糸分裂的には不活性であり、インビボでは弱い増殖能を示すかまたは増殖能を示さないので［Ｊｏｙｃｅ  ＮＣ、Ｐｒｏｇ  Ｒｅｔｉｎ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．，２００３；２２：３５９−３８９］、全ての群でＫｉ−６７陽性細胞は検出できなかったため（図５ｂ）、ヒト角膜組織におけるヘッジホッグシグナルによる細胞増殖の促進は起こらないと考えられ、ＨＨ経路のみの刺激では、インビボでのＣＥＣ増殖を誘導するには不十分であると理解される。【０４８８】
培養ヒト角膜内皮細胞でも同様の結果になるのか検証するために、初代ヒト角膜内皮細胞を８ウェルチャンバースライドへ播種し、培養培地に１００ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＳｈｈ、２μＭプロモルファミン、２μＭシクロパミンを添加後、３７℃５％ＣＯ２条件下でインキュベートした。３日後、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５およびＫｉ−６７の免疫染色を行った。また、同様の条件でインキュベートした角膜内皮細胞のＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲにてｍＲＮＡ発現量を測定した。【０４８９】
ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５はｒｈＳｈｈ添加群のみ発現細胞が確認できた（図５ｄ、図５ｅ）。角膜組織ではＫｉ−６７陽性細胞はなかったが、培養角膜内皮細胞ではｒｈＳｈｈ添加群とプルモルファミン添加群について、コントロールと比較して発現量が亢進していた（図５ｆ）。シクロパミン添加群では細胞形態の異常と細胞増殖の抑制が認められた。【０４９０】
ＣＥＣは、報告によれば、インビトロで増殖する能力を維持しており［ＥｎｇｅｌｍａｎｎＫ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．，１９８８；２９：１６５６−１６６２］、したがって、上述のように本発明者らは、ＨＨ経路がＣＥＣのインビトロ増殖を誘導するかどうかを検討した。Ｋｉ６７の発現は、ＳＨＨおよびプルモルファミン刺激に応答してアップレギュレートされることが分かったが、これは、シクロプロパミンに応答してアップレギュレートはされなかった（図５ｇ）。これらの知見は、インビトロの状況において、ＨＨ経路が、ＣＥＣ増殖を誘導できることを示す。本発明者らは、シクロパミン処理したＣＥＣが、その正常な六角形の形態を維持できなかったと断定した（図５ｆ）。これらの知見を考慮すると、本発明者らは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５がＣＥＣにおけるＨＨシグナル伝達の標的分子であり、ＣＥＣの維持は、部分的にＨＨ経路によって調節されることを初めて見出した。【０４９１】
（実施例７：ｓｈＲＮＡを用いたＧＰＲ４９／ＬＧＲ５遺伝子の発現抑制）
ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５とヘッジホッグシグナルの関連性を明らかにするために、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を高発現している培養サル角膜内皮細胞を用いて、ｓｈＲＮＡによるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現抑制を試みた。【０４９２】
初めに、リアルタイムＰＣＲにてＧＰＲ４９／ＬＧＲ５  ｍＲＮＡの発現が有意に減少する条件を検討したところ、コントロールと比較してｓｈＧＰＲ４９／ＬＧＲ５−５８９がＧＰＲ４９／ＬＧＲ５  ｍＲＮＡ発現量を約６０％抑制できることを確認した（図６ａ）。次に、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現抑制によるヘッジホッグシグナルへの影響を検討するために、ｓｈＧＰＲ４９／ＬＧＲ５−５８９をトランスフェクトしたサル角膜内皮細胞を用いて、ヘッジホッグシグナル関連分子（Ｐｔｃｈ１，Ｇｌｉ１，Ｇｌｉ２）のｍＲＮＡ発現量を解析した。その結果、ヘッジホッグシグナル関連分子の発現量の変化は確認できなかった（図６ｂ）。理論に束縛されることを望まないが、ＰＲ４９／ＬＧＲ５遺伝子の発現抑制が増殖能には影響があった可能性がある。【０４９３】
（実施例８Ａ：ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５遺伝子の強制発現）
角膜内皮細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の機能を解析するために、通常の培養条件ではＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現が著しく低下する培養ヒト角膜内皮細胞を用いて、遺伝子導入法によるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の強制発現を試みた。【０４９４】
ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現ベクターをトランスフェクトした培養ヒト角膜内皮細胞は、コントロールと比較して約６０倍の発現亢進が認められた（図６ｄ）。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を遺伝子導入した細胞は、細胞分化が抑制されており、角膜内皮細胞のポンプ機能の評価として用いられるＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅの発現が亢進されていた（図６ｃ）。この条件の細胞を使用して、ヘッジホッグシグナル関連分子（ｐｔｃｈ１、ｇｌｉ１、ｇｌｉ２）のｍＲＮＡ発現量を調べた。その結果、全ての関連分子において発現量が抑制（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ）されていた（図６ｄ）。【０４９５】
（考察）
上記実施例により、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は角膜組織周辺部に存在する角膜内皮細胞の幹細胞・前駆細胞に特異的に発現していることを明らかになった。また、ヘッジホッグシグナルは角膜内皮細胞の増殖を促進する働きがあるが、ヘッジホッグシグナルの下流遺伝子であるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、ヘッジホッグシグナルに対し抑制的働くことで細胞の未分化性維持に重要な役割を果たしていることが明らかになった。【０４９６】
培養サル角膜内皮細胞を用いたフローサイトメトリーの結果より、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５陽性細胞にのみ細胞増殖マーカーであるＫｉ−６７陽性細胞の発現が見られた（図４ｃ、ｄ）。培養ヒト角膜内皮細胞ではヘッジホッグシグナルの活性化によりＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現が亢進し（図５ｄ、ｅ）、細胞増殖の促進を確認した（図５ｆ，ｇ）。ヘッジホッグシグナルの活性化により細胞増殖が引き起こされることはｒｈＳｈｈ添加による成体神経幹細胞の増殖促進や（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ６：２１−２７、２００３），プルモルファミン添加による間葉系幹細胞の増殖・分化促進（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１，１，２２９−１，２３８、２００４）により報告されているため、角膜内皮細胞についても同様にシグナルの活性化による細胞増殖促進作用があると考えられた。現在、角膜内皮細胞の安定的な培養方法が確立されていないことから、ヘッジホッグシグナル活性化による細胞増殖促進効果を利用した新規の培養方法の確立に応用できる可能性があることが理解される。本実施例では、ＳＨＨの活性化により、培養内皮細胞では、増殖が亢進することが理解される。また、ＳＨＨは、分化の程度のマーカーとして使用されうることが理解される。対照的に、角膜内皮組織では、ヘッジホッグシグナルの活性化によりＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現は亢進されたが細胞増殖促進の効果は得られなかった（図５ｂ）。生体内でのヒト角膜内皮細胞の細胞間は極めて密に接しており、ＥＤＴＡを用いて細胞間接着を緩和しなければ、細胞周期が働かないことが報告されている（Ｓｅｎｏｏ  ｅｔ  ａｌ．、ＩＯＶＳ  ４１  ２９３０−２９３５、２０００）。従って，ヘッジホッグシグナルの活性化によりターゲット遺伝子は発現亢進するが、生体内での細胞間接着は非常に緊密なために細胞増殖に繋がらなかったのではないかと推察された。また、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の強制発現の実験より、ヘッジホッグシグナルの関連分子でありシグナル活性化の指標でもあるＰｔｃｈ１、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２の発現が低下していたことに注目した（図６ｄ）、つまり、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５はヘッジホッグシグナルのターゲット遺伝子として存在しているにもかかわらず，ヘッジホッグシグナルの関連分子の発現を抑制する、ネガティブ制御因子としての役割をもつ可能性がある。従って、ヘッジホッグシグナルの抑制により他のターゲット遺伝子であるＣｙｃｌｉｎＤ／ＥやＭｙｃなどの細胞増殖関連遺伝子の発現も抑制さていると推察される。さらに、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５強制発現細胞は細胞間が高密度に接触する傾向にあり、角膜内皮細胞の機能性が高い。ヘッジホッグシグナル活性化による増殖・分化への進行をＧＰＲ４９／ＬＧＲ５が制御することで未分化性の維持に貢献しているのではないかと推察した。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５が細胞間接着に関連している可能性があり、今後の検討課題としてさらなる研究が必要であると考えられる。【０４９７】
（まとめ）
要約すると、角膜内皮細胞はＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇをリガンドとしたヘッジホッグシグナルにより、生体内での細胞増殖が制御されている可能性がある。また、ヘッジホッグシグナルのターゲット遺伝子であるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、角膜内皮細胞の未分化性維持機構に関与していると考えている。【０４９８】
（実施例８Ｂ：ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のさらなる解析）
（ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のダウンレギュレーションは、ＣＥＣの増殖を減少させた）
ＣＥＣに対するＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の直接作用は、ｓｈＲＮＡによるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のノックダウンによって解明した。培養ヒトＣＥＣがめったにＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を発現しない（図３ａ、ｂ）という事実に起因して、この実験には、霊長類の培養ＣＥＣを使用した。ｓｈＲＮＡの９つのセットを設計し、そのノックダウン能の有効性を検討した。これらのうち、ｓｈＲＮＡ−５８９が、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５  ｍＲＮＡ発現をノックダウンするのに最も有効（約６０％のノックダウン）であることが分かった（図６ＡのＡ）。Ｐｔｃｈ１、Ｇｌｉ１およびＧｌｉ２についてのリアルタイムＰＣＲは、ｓｈＬＧＲ５群とコントロールとの間に有意差が見られないことを示した（図６ＡのＡ）。ＣＥＣ増殖に対するＧＰＲ４９／ＬＧＲ５遺伝子ノックダウンの影響を実証するために、Ｋｉ６７についての免疫細胞化学研究を実施した。コントロールと比較すると、ｓｈＬＧＲ５処理細胞の細胞形態は、劇的に変化してはいなかったが、ｓｈＬＧＲ５処理細胞におけるＫｉ６７（＋）細胞の数は、大きく減少していた（図６ＡのＢ）。これらの知見は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のダウンレギュレーションは、ＨＨ経路に対して影響を有さないが、インビトロでのＣＥＣ増殖を減少させることを示した。【０４９９】
（永続的なＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現は、Ｗｎｔ経路を介して間葉転換（ＭＴ）を阻害した）
ＣＥＣに対する永続的なＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現の直接的な作用を調べるために、本発明者らは、ＣＭＶ−ＬＧＲ５−ｍＲＦＰを含むレンチウイルスを用いて、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を過剰発現させようと試みた。この実験では、ヒト培養ＣＥＣを使用した。なぜなら、これらが、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をめったに発現しない（図３ａ）からである。リアルタイムＰＣＲは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現が、ＮＴベクターをトランスフェクトした細胞における発現の約６０倍高いことを示した（図６ＢのＢ）。免疫蛍光法を用いると、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞におけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の発現が、ＮＴ細胞における発現と比較して上昇していることが確認された（図６ＢのＡ）。非常に興味深いことに、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞におけるＨＨシグナル伝達分子の相対的ｍＲＮＡレベルは、ＮＴ細胞におけるものと比較してダウンレギュレートされており（図６ＢのＢ）、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５がＨＨ経路のネガティブフィードバック調節因子として機能すると理解される。【０５００】
ヒトＣＥＣは、報告によれば、通常の培養条件下では線維芽細胞様の形態変化を受けやすい［Ｐｅｈ  ＧＳ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．，２０１１；９１：８１１−８１９］。レンチウイルスのトランスフェクションの後、ＮＴ細胞は、拡大した細長の形状（線維芽細胞様変化）を示し、均質な六角形の形状ではなかった（図６ＢのＡ）。非常に興味深いことに、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞は、その形態を次第に変化させ、コンパクトなより小さなサイズの均質な六角形の細胞となり、再び正常な生理学的形態をとることが示された（図６ＢのＡ）。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞の細胞密度は、ＮＴ細胞のものと比較した場合、大きく上昇した（図６ＢのＣ）。ＮＴおよびＬＧＲ５ベクターをトランスフェクトした培養ＣＥＣの機能を調べるために、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ１について免疫組織化学法を実施した。これらの２つの機能的タンパク質の発現は、ＮＴ細胞よりも、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞においてかなりより高いことが分かった（図６ＢのＡ）。これらの知見を考慮すると、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、正常なＣＥＣ表現型の維持のための重要な分子であり得るようである。【０５０１】
ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞において観察された興味深い知見から、本発明者らはさらに、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の永続的な発現が、ＭＴプロセスをブロックし得るかどうかを検討することにした。上皮−ＭＴ（ＥＭＴ）関連分子（Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、Ｔｗｉｓｔおよびコラーゲン１）［Ｌｅｅ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００６；１７２：９７３−９８１］の発現レベルをリアルタイムＰＣＲを用いて調べた。最も重要なことに、Ｓｌｕｇを除く全てのＥＭＴマーカーの相対的ｍＲＮＡレベルは、ＮＴ細胞よりも、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞において低く（図６ＢのＤ）、永続的なＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現がＭＴプロセスをブロックしたと理解される。本発明者らはさらに、どの経路がＣＥＣにおいて観察された内皮ＭＴを調節するかを調べた。最近の研究は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路が、ＥＭＴにおいて重要な役割を果たすことを示唆している［Ｌｅｅ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００６；１７２：９７３−９８１］。それゆえ、ウェスタンブロット分析を用いてＷｎｔ／β−カテニン関連分子の発現レベルを調べた。特筆すべきことに、サイトソル（非膜結合型）β−カテニンおよびリン酸化ＬＤＬ受容体関連タンパク質６（ｐ−ＬＲＰ６）のタンパク質レベルは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトした細胞において大きく減少した（図６ＢのＦ）。これらの知見は、永続的なＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現が、Ｗｎｔ／β−カテニン経路を介して角膜内皮ＭＴを阻害することを示した。【０５０２】
（ＲＳＰＯ１は、ＣＥＣ増殖を加速させ、Ｗｎｔ経路を介してＭＴを阻害した）
これまでに、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、Ｇタンパク質共役型受容体スーパーファミリーのオーファン受容体であり、そのリガンドは未知であった。しかしながら、いくつかの近年の報告は、ＲＳＰＯがＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のリガンドとして機能して、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を調節することを実証した［Ｃａｒｍｏｎ  ＫＳ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，２０１１；１０８：１１４５２−１１４５７；ｄｅ  Ｌａｕ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ，２０１１；４７６：２９３−２９７；Ｇｌｉｎｋａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．，２０１１；１２：１０５５−１０６１］。興味深いことに、本発明者らは、ＲＳＰＯ１、２、３および４が、角膜の上皮、実質および内皮の細胞において発現され、そして、ＲＳＰＯ１、２および３は、周辺部領域のＣＥＣにおいてのみ発現されることを発見した（図６ＣのＡ）。ＣＥＣ分化に対するＲＳＰＯの機能を決定するために、本発明者らは、霊長類ＣＥＣを、ヒト組換えＲＳＰＯとともに、または、ヒト組換えＲＳＰＯなしで培養した。特筆すべきことに、ＲＳＰＯ１で処理した培養ヒトＣＥＣのみが、コンパクトなより小さな大きさの均質な六角形の細胞を示し、他方で、他のＲＳＰＯは、インビトロでのＣＥＣ分化に対して影響を有さなかった（図６ＣのＢ）。ＣＥＣ増殖に対するＲＳＰＯの機能を決定するために、本発明者らは、Ｋｉ６７についての免疫組織化学研究を実施した。最も驚くべきかつ非常に興味深いことに、ＲＳＰＯ１とともにインキュベートしたＣＥＣは、他のＲＳＰＯと比較して劇的に増大したレベルのＫｉ６７（＋）細胞比を示した（図６ＣのＣ）。これらの知見を考慮し、本発明者らは、ＲＳＰＯファミリーの中でも、ＲＳＰＯ１が特に、ＣＥＣの維持において重要な役割を果たし得ると考えた。【０５０３】
最後に、ＣＥＣに対するＲＳＰＯ１の影響をさらに決定するために、本発明者らは、ヒトＣＥＣの二次培養物を、ＲＳＰＯ１有または無で維持した。両方の条件でのＣＥＣの培養を通じて、本発明者らははっきりと、ＲＳＰＯ１とともに培養した細胞は、その六角形の形態を維持したのに対し、ＲＳＰＯ１無しで培養した細胞は、線維芽細胞様の表現型を示したことを観察した（図６ＢのＥ）。ＲＳＰＯ１処理細胞の細胞密度は、非処理細胞のものと比較して上昇した（図６ＢのＥ）。どの経路がこのタイプの角膜内皮ＭＴを調節するかを実証するために、本発明者らは、ウェスタンブロット分析を用いてＷｎｔ／β−カテニン関連分子の発現レベルを調べた。驚くべきことに、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトし、ＲＳＰＯ１で処理した細胞におけるサイトソルβ−カテニンおよびｐ−ＬＲＰ６のタンパク質レベルは、明らかに、ＮＴ細胞と比較して減少していた。さらに、ＮＴおよびＧＰＲ４９／ＬＧＲ５をトランスフェクトし、ＲＳＰＯ１で処理した細胞のタンパク質レベルは、ＲＳＰＯ１で処理していない細胞群と比較してより減少していた（図６ＢのＦ）。これらの結果は、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５を過剰発現する細胞のＲＳＰＯ１での刺激が、ｐＬＲＰの分解とβ−カテニンのターンオーバーを加速することを示唆した。【０５０４】
（考察）
大部分の哺乳動物は、角膜をとして外部情報の大部分を獲得するので、角膜組織は極めて重要である。近年、角膜移植手技が現在、角膜形成術から角膜内皮移植術へのパラダイムシフトを経ているという事実から、ＣＥＣが特に注目を集めている。それゆえ、科学的そして臨床的に、世界中の角膜関連の失明を処置するための次世代の新規治療を確立するためには、角膜内皮幹細胞／前駆細胞の分子機構を理解することがかなり重要である。しかしながら、これらの分子機構については現在、ごくわずかしか知られていない。【０５０５】
ＣＥＣの特徴および増殖能は、角膜の中心領域に位置するものと、角膜の周辺部領域に位置するものとで異なることが報告されており［Ｂｅｄｎａｒｚ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ＣｅｌｌＤｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ．，１９９８；３４：１４９−１５３］、また、角膜は、中心領域よりも周辺部領域においてより高い内皮細胞密度を有することが研究によって示されている［Ｓｃｈｉｍｍｅｌｐｆｅｎｎｉｇ  ＢＨ、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．，１９８４；２５：２２３−２２９］。さらに、周辺部領域由来のＣＥＣは、報告によれば、中心領域由来のＣＥＣよりも高い複製能を維持しており［Ｍｉｍｕｒａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．，２００６；４７：１３８７−１３９６］、そして、周辺部領域のＣＥＣは、より多くの前駆体を含み、かつ、中心領域におけるＣＥＣよりも強力な自己再生能を有する［Ｍｉｍｕｒａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．，２００５；４６：３６４５−３６４８］。したがって、ヒト角膜内皮幹細胞／前駆細胞は主に周辺部領域に分布している可能性が高い。実際、ＣＥＣについての幹細胞／前駆細胞マーカーは、これまでのところ解明されていない。本研究の結果は、ＣＥＣが、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現に関して領域的な多様性を示すことを初めて実証した。これらの知見と、ＣＥＣにおけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の独特の発現パターンを考慮すると、これは、角膜内皮幹細胞を含む集団についての最初のマーカーとなる可能性がある。【０５０６】
細胞の大きさにより、一過的に増幅する細胞または分化した細胞からケラチン生成細胞幹細胞を区別し得ることが報告されている［Ｂａｒｒａｎｄｏｎ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，１９８５；８２：５３９０−５３９４］。表皮では、最小のケラチン生成細胞のフォルボールエステルに対する応答が、他の細胞のものと異なる。これらのケラチン生成細胞はまた、最も高いコロニー形成能を示した。ＣＥＣは外胚葉由来のケラチン生成細胞とは異なるが、本発明者らのＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（＋）細胞の平均直径は、現実に、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（−）細胞のものよりも小さかった。これらの知見と、報告された周辺部ＣＥＣの大きさに基づくと。細胞の大きさは、角膜内皮幹細胞／前駆細胞の潜在的な指標となるようである。【０５０７】
本発明者らは、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５が、ＣＥＣの未分化状態の維持と、インビトロにおける正常な細胞表現型の調節にとって重要な分子であることを見出した。本発明者らはまた、そのＧＰＲ４９／ＬＧＲ５発現強度に基づいて分画した単離細胞が、異なる特性を持つ異なる細胞集団を生じ得ることを見出した。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（＋）集団における細胞のみが、幹細胞／前駆細胞集団に関連する特徴である、並外れて高い増殖能を示した。これらの知見、特有の発現パターンおよびインビトロ条件における不可避性に基づくと、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５と角膜内皮幹細胞／前駆細胞の機能との間に何らかの関連性が存在する可能性がある。【０５０８】
以前の研究が、高濃度のＳＨＨが網膜前駆細胞集団における顕著な増加と、分化した細胞の蓄積における全体的な増加を引き起こしたことを示している［Ｓｔａｎｔｏｎ  ＢＺ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２０１０；６：４４−５４］。本願の知見は、インビトロの状況において、ＨＨ経路が、以前の報告の知見と一致して、ＣＥＣの増殖を誘導し得ることを示す。ＨＨは、広範囲の組織型における発生の複数の局面の間にモルフォゲンとして機能する分泌型分子のファミリーである。ＨＨは、細胞の増殖や生存を調節することによって、四肢パターンの決定における左右非対称の決定や、前後軸決定に関与する。ＣＥＣでは、ＨＨシグナル活性に領域的なバリエーションが存在しており、本発明者らの知見に基づけば、ＨＨシグナル伝達が、角膜内皮形態形成を制御している可能性がある。【０５０９】
ＲＳＰＯは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の強力な増強物質として単離された、４システインリッチ分泌型タンパク質のファミリーである。ＲＳＰＯの細胞生物学的機能に関する大量の情報が、特に、オーファン受容体ＬＧＲ４／５／６のリガンドとしてのその役割に関して、過去数年にわたって明らかになってきた。これらのアップデートされた重要な知見から、本発明者らは、ＲＳＰＯがヒトＣＥＣの機能に対して影響を有し得るかどうかをさらに検討することとした。ヒトＣＥＣは、有糸分裂的には不活性であり、インビボでは本質的に再生能を持たないため、疾患または外傷に起因した角膜内皮の喪失の後には、残りの内皮細胞の代償的な拡大が生じる。本発明者らが知る限り、ヒトＣＥＣの増殖およびＣＥＣ密度のレベルを増加させる有用な誘導性試薬または分子に関する報告は存在しない。本研究の知見は、ＲＳＰＯ１とともにインキュベートしたＣＥＣが、細胞増殖および細胞密度の劇的に増大したレベルを示すことを初めて示し、この分子が、局所投与または培養試薬によって損傷を受けた角膜を再構成するための最初の候補分子となる可能性があることが示唆される。【０５１０】
いくつかの研究が、Ｗｎｔ／β−カテニン経路が、ＥＭＴにおいて重要な役割を果たすこと、そして、Ｗｎｔ／β−カテニン依存性シグナル伝達がＥＭＴ関連遺伝子の発現を調節することを示唆している［Ｌｅｅ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００６；１７２：９７３−９８１］。しかしながら、これまでの報告は、ＲＳＰＯが、実際にＧＰＲ４９／ＬＧＲ５のリガンドとして機能することによってＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を増強することを示している［Ｃａｒｍｏｎ  ＫＳ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，２０１１；１０８：１１４５２−１１４５７；ｄｅ  Ｌａｕ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ，２０１１；４７６：２９３−２９７；Ｇｌｉｎｋａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．，２０１１；１２：１０５５−１０６１］。この活性化に関与する実際の機構は未だ不明であり、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５がＷｎｔ経路の正の調節因子であるか負の調節因子であるかについて、いくつかの相反する知見が存在している［Ｇａｒｃｉａ  ＭＩ  ｅｔ  ａｌ．、ＤｅｖＢｉｏｌ．，２００９；３３１：５８−６７；Ｓｃｈｕｉｊｅｒｓ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯＪ．，２０１２；Ｗａｌｋｅｒ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．，２０１１；６：ｅ２２７３３］。１つの可能な説明は、分子機構が組織、臓器およびその種に依存するというものである。角膜は、涙液および眼房水によって維持される独特の無血管組織である。これに対し、大部分の他の臓器は、血管構造の支持によって維持されており、角膜細胞の特徴および機構は、他の組織の上皮細胞とは根本的に異なることが示唆される。したがって、本研究の知見に基づけば、ＲＳＰＯ１は、ＣＥＣの増殖を劇的に加速させ、そして、Ｗｎｔ経路を介して角膜内皮ＭＴを阻害する。【０５１１】
（結論）
結論として、本研究の知見は、ヒトＣＥＣにおけるＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の機能を初めて実証するものである（図６Ｄ）。ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５は、多数の幹細胞／前駆細胞集団を同定する際の強力なツールとなることが証明された。ＨＨおよびＷｎｔ経路を介したＧＰＲ４９／ＬＧＲ５の調節により、ＣＥＣの完全性は十分に体系化され、維持された。加えて、ＧＰＲ４９／ＬＧＲ５リガンドであるＲＳＰＯ１は、ＣＥＣの有効な増大を提供するための新規の十分なプロトコールを開拓し得、ＲＳＰＯ１ベースの三次元培養や医療処置が、角膜機能不全の処置だけでなく、様々な重篤な全身性の疾患の処置のための、再生治療の前途を約束するものであることが理解される。【０５１２】
（実施例９：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の細胞増殖促進効果）
本実施例では、角膜内皮細胞の培養におけるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類、特にＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １の細胞増殖促進効果を検討することを目的として実験を行った。【０５１３】
（方法）
サル培養角膜内皮細胞にＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １タンパク質を添加して４８時間培養後、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  Ｅｄｕ  ｉｍａｇｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて増殖中の細胞を検出し、コントロール細胞とＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １添加細胞のＥｄＵの陽性率および細胞密度を比較した。【０５１４】
ＥｄＵ（５−ｅｔｈｙｎｙｌ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）は化学反応によりＤＮＡ合成期のＤＮＡに取り込まれる修飾された核酸であり、従来のＢｒｄＵに代わるＤＮＡ合成期細胞の同定に広く用いられている。ＥｄＵの陽性率を測ることで、培養細胞における増殖細胞率がわかる。【０５１５】
（使用試薬）
Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｃ１０３３７）
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１（Ｒ＆Ｄ  Ｃａｔ．４６４５−ＲＳ）
（使用細胞）
サル培養角膜内皮細胞（Ｌｏｔ．２０１１１２２２−４  Ｐ２）
（実験：サル培養角膜内皮細胞培養におけるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１の細胞増殖促進効果の検討）
（手順）
（１）サル培養角膜内皮細胞の播種とＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １の添加
サル培養角膜内皮細胞（Ｌｏｔ．２０１１１２２２−４  Ｐ２）を０．０５％トリプシンで３７℃１０分間処理してＴ−２５フラスコから剥離し、培養培地（１０％ＦＢＳ＋ｂＦＧＦ／ＤＭＥＭ）に懸濁。細胞数をカウントし、３×１０４ｃｅｌｌｓ／３００μｌとなるように培養培地で調整。ＦＮＣコートしたＬａｂ−ＴｅｋＩＩ  ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅ（８ｗｅｌｌ）に３００ｕｌ／ｗｅｌｌで播種した。【０５１６】
（２）Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｋｉｔを用いた増殖細胞の検出
細胞播種から７日後、細胞がほぼコンフルエントな状態でＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１（０、１０、５０ｎｇ／ｍｌ）入りの培地に交換し、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１添加から２４時間後、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵを最終濃度が１０μＭとなるように添加した。（Ｋｉｔの説明書には培地を半分変えることを推奨しているが、培地は交換しなかった。）さらに２４時間後（Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１添加４８時間後）、４％ＰＦＡ／ＰＢＳで固定し、Ｋｉｔの説明書に従いＥｄＵを検出し、ＥｄＵ陽性細胞率をカウントした（図８、９）。【０５１７】
（３）細胞密度測定
染色後のチャンバスライドを位相差顕微鏡で写真撮影を行い、角膜内皮細胞密度計算ソフトＫｏｎａｎ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＫＳＳ−４００ＥＢを用いて細胞密度の計測を行った（図１０）。【０５１８】
（結果）
ＥｄＵ陽性細胞／ＤＡＰＩをカウントした結果、コントロールに比べてＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １を１０ｎｇ／ｍｌもしくは５０ｎｇ／ｍｌで添加したウェルでＥｄＵ陽性細胞が２倍増加していることが判明した。また細胞密度を測定した結果、コントロールに比べてＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １を１０ｎｇ／ｍｌもしくは５０ｎｇ／ｍｌで添加ウェルで細胞密度が１．３倍高くなっていることが判明した。【０５１９】
（考察）
サル培養角膜内皮細胞においてＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １の細胞増殖促進効果が認められた。またヒト培養角膜内皮細胞およびヒト角膜内皮組織でも同様の効果があることが期待される。【０５２０】
（実施例１０：ヒト培養角膜内皮細胞でのＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の細胞増殖促進効果）
Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １（ＲＳＰＯ１）、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ２（ＲＳＰＯ２）、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ３（ＲＳＰＯ３）、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ４（ＲＳＰＯ４）との角膜内皮細胞の分化との関連性を調べるために、ＲＳＰＯ１を使用して、その関連性について検討した。使用した試薬は以下のとおりであ  る。【０５２１】
ＲＳＰＯ１  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号：４６４５−ＲＳ
ＲＳＰＯ２  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号：３２６６−ＲＳ
ＲＳＰＯ３  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号：３５００−ＲＳ
ＲＳＰＯ４  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号：４５７５−ＲＳ
ヒト培養角膜内皮細胞にＲＳＰＯ１添加（５０ｎｇ／ｍｌ）、非添加群に分けて３７℃５％ＣＯ２条件下で７日間培養した。その結果、ＲＳＰＯ１添加群の細胞は、細胞の形態が敷石状に維持されたのに対して、非添加群では、細胞が線維芽細胞様に分化した。以上の結果から、ＲＳＰＯ１は角膜内皮細胞の分化を抑制する効果が認められた。【０５２２】
次に、ＲＳＰＯの細胞増殖に対する影響を調べる目的で、ＲＳＰＯ１〜４をヒト角膜内皮細胞に３７℃５％ＣＯ２条件下で１日間インキュベートした。その後、細胞増殖マーカーであるＫｉ−６７の免疫染色を行った。その結果、ＲＳＰＯ１〜４のいずれにも増殖傾向は見られたが、ＲＳＰＯ１のみ、ヒトの角膜内皮細胞の増殖を統計学的に有意に促進させた。【０５２３】
（実施例１１：コンフルエント細胞に対するＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の効果）
本実施例では、コンフルエント状態に達した角膜内皮細胞に対してＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類が増殖効果を有するかどうかを確認した。【０５２４】
（方法）
（入手先および培養方法）：ヒト角膜内皮細胞として、シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼ（ＲＯＣＨＥカタログ番号：１０  １０３  ５８６  ００１）を用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地はヒトはＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ，Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮカタログ番号：３１９８５−０７０）＋８％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）＋２００ｍｇ／ｍｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡカタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）＋０．０８％コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡカタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）＋２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡカタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）＋５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮカタログ番号：１５７１０−０６４）＋５ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮカタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を３Ｔ３フィーダー細胞用に馴化させたものを用いた。【０５２５】
継代培養を行った後に、コンフルエントに到達して２週間以上培養し角膜内皮密度に明らかな変化を認めなくなった時点で、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １を培地中に１０ｎｇ／ｍｌの濃度にて添加して培養を継続した。細胞形態の観察は位相差顕微鏡にて行い、細胞密度を計算した。【０５２６】
（結果）
結果を図１５に示す。コンフルエントに到達して角膜内皮密度に明らかな変化を認めなくなった時点での平均角膜内皮細胞密度は５６６．８個／ｍｍ２であったが、経時的に密度は上昇し、７日目には約６９５個／ｍｍ２、１４日後には約８７５個／ｍｍ２、２１日後に９９５．８個／ｍｍ２に到達した。一方で、コントロールとして同ロットの細胞をＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１を含まない培地で同期間である２１日間培養した場合は５３５．４個／ｍｍ２であった。【０５２７】
（考察）
これらの結果は、培養することで容易に密度が減少する角膜内皮細胞において、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １を用いて培養することで角膜内皮細胞密度を上昇させることができることを意味する。このことは、培養角膜内皮移植の臨床応用化に向けて、移植後の重要な予後決定因子である角膜内皮密度の高い細胞を移植できることを意味する。角膜内皮の再生医療への有用性に加えて、その他の細胞においてもＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １を用いることで、より高い機能を持った細胞移植を可能にすることができると理解される。【０５２８】
（実施例１２：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類によって角膜内皮密度を高くした組織の生産）
本実施例では、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類による角膜組織の処理により、角膜内皮密度を高くした組織を調製することができることを実証する。【０５２９】
（方法）
別の目的で安楽死させた白色家兎の眼球（ナカライ）を購入して、強角膜片を作成した。強角膜片をＤＭＥＭ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１２３２０）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）にて１週間３７℃のインキュベーターにて培養した。１週間後に強角膜片を４％パラホルムアルデヒドで１０分間室温で固定し、固定した後に細胞増殖のマーカーとしてＫｉ６７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．、カタログ番号：Ｐ６８３４）を用いて角膜内皮細胞の免疫染色を行い蛍光顕微鏡にて観察を行った。ＤＡＰＩにて角膜内皮細胞の核染色を行い、Ｋｉ６７陽性細胞率を計算した。また、ＺＯ−１にて角膜内皮細胞の免疫染色を行い細胞密度の計算を行った。【０５３０】
（結果）
結果を図１６に示す。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １を含む培地にて培養を行った場合は、強角膜片においてもＫｉ６７陽性細胞がコントロールと比べて高い割合で認められた。すなわち、Ｋｉ６７陽性細胞の比率は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １を加えないコントロールでは約１．０％であったのに対して、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １  １ｎｇ／ｍｌ添加時には４．４９％、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １  １０ｎｇ／ｍｌ時には１０．５８％、そしてＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １  １００ｎｇ／ｍｌ添加時には７．９４％になった。【０５３１】
さらに、角膜内皮細胞密度はＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１により有意に高値となった。すなわち、角膜内皮細胞密度は、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １を加えないコントロールでは３６７４個／ｍｍ２、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １  １ｎｇ／ｍｌ添加時には４３１４個／ｍｍ２、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １  １０ｎｇ／ｍｌ添加時には４６２６個／ｍｍ２、１００ｎｇ／ｍｌ添加時には５０３７個／ｍｍ２に増加していた。【０５３２】
（考察）
角膜移植医療において、角膜組織にＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１を作用させることで、移植後の需要な予後決定因子である角膜内皮密度を高くした組織を移植できることを意味する。角膜移植生医療への有用性に加えて、その他の組織においてもＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１を用いることで、より高い機能を持った組織の移植を可能にすることができると理解される。【０５３３】
（実施例１３：角膜実質、上皮、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、硝子体等細胞における増殖効果）
本実施例では、角膜実質、上皮、ＲＰＥ、硝子体等細胞におけるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の増殖効果をそれぞれ確認する。その培養法は以下に列挙する。各培養法において、上記実施例に準じてＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の有無で培養することにより、増殖に対する効果が促進されることを確認することができる。【０５３４】
（角膜実質細胞培養法）
角膜実質細胞は、Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｍ，Ｑｕａｎｔｏｃｋ  ＡＪ，Ｙｏｕｎｇ  ＲＤ，Ｏｋｕｍｕｒａ  Ｎ，Ｕｅｎｏ  Ｍ，Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｙ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｓ，Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｎ．Ｍｏｌ  Ｖｉｓ．２０１２；１８：１７２７−３９の手法に基づいて培養を行う。簡単に述べると、ウサギ角膜を１．２Ｕ・ｍｌディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃で１時間インキュベートする。その後、角膜上皮および角膜内皮を機械的スクレープにより取り除く。次いで、角膜実質を約１ｃｍ２の小片に切断し、これを、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｊａｐａｎ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で３７℃で一晩インキュベートする。１５００ｒｐｍ（４４０×ｇ）で３分間遠心分離した後、細胞を無細胞培地（１０μｇ／ｍｌ、１ｍＭ  アスコルビン酸、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）で４８時間継続培養する。これによって得られる細胞を用いて実験を行うことができる。【０５３５】
（網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞培養法）
ＲＰＥ細胞は、Ｈａｔａｎａｋａ  Ｈ，Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２；５３（１１）：６９５５−６９６３の手法に基づいて培養を行う。簡単に述べると、サル網膜色素上皮細胞（ＭＲＰＥＣ）は、カニクイザル（年齢３−５歳、ヒトで５−２０歳に当たる；Ｎｉｓｓｅｉ  Ｂｉｌｉｓ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｏｔｓｕ  Ｊａｐａｎから入手）から取り出した眼球の後部領域から培養する。ついで、ＭＲＰＥＣをＲＰＥＣフラグメント（ＭＲＰＣＥの細胞集塊）をヒト胎児ＲＰＥについて以前に報告されている手法（Ｍａｍｉｎｉｓｈｋｉｓ  Ａ，Ｃｈｅｎ  Ｓ，ＪａｌｉｃｋｅｅＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２００６；４７：３６１２−３６２４）に基づいて、分離して調製する。次いで、ＭＲＰＥＣをＦＮＣ  Ｃｏａｔｉｎｇ  Ｍｉｘ（登録商標）コーティングされたディッシュで、１０％ＦＢＡ、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養し、３７℃で５％ＣＯ２中の加湿環境下でさらに拡大する。次いで、培養培地を２日おきに交換する。細胞が５−７日でコンフルエントに達すると、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でトリプシン処理を３７℃で５分間行い、１：２〜４の比率で継代培養する。培養したＭＲＰＥＣは、１〜３継代のものを、すべての実験について用いる。【０５３６】
（角膜上皮細胞培養法）
羊膜は、京都府立医科大学倫理委員会で承認された方法に従って採取し、研究に使用した。感染症がなく合併症のない帝王切開予定の妊婦から文書による同意を得た後に、帝王切開時に羊膜を無菌的に採取し、洗浄した後に５０％クリセロールＤＭＥＭ溶液に浸漬し−８０℃で凍結保存した。次に、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  Ｌｉｏｎ  Ｅｙｅ  Ｂａｎｋ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）から研究目的に使用する許可を得たヒト強角膜組織から採取した角膜上皮幹細胞の培養を行った。角膜上皮幹細胞を含む培養角膜上皮シートを作成するために、３７℃１時間１．２Ｕディスパーゼを用いて酵素処理により角膜上皮細胞を細胞懸濁液（ｃｅｌｌ−ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）として回収した。次に、細胞懸濁液を羊膜上に播種して３７℃５％ＣＯ２のインキュベーター中に約２週間培養した。【０５３７】
（硝子体細胞（ヒアロサイト）培養法）
硝子体細胞は、Ｓｏｍｍｅｒ  Ｆ，Ｐｏｌｌｏｎｇｅｒ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｒａｅｆｅｓ  Ａｒｃｈ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，２００８で報告される方法に準じて培養を行う。まず、サル眼球より硝子体を採取、１％ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ３回洗浄した。１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼにつけ、３７℃でローテーションしながら一晩インキュベートする。遠心分離後、上清を除き、１％ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭで洗浄する。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ，１％Ｐ／Ｓを加え、培養ディッシュに播種する。【０５３８】
（実施例１４：他の細胞での実験）
本実施例では、神経細胞、結膜上皮、羊膜上皮、口腔粘膜上皮、鼻粘膜上皮について、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の増殖効果をそれぞれ確認する。その培養法は公知の方法に準じて行うことができる。各培養法において、上記実施例に準じてＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ類の有無で培養することにより、増殖に対する効果が促進されることを確認することができる。【０５３９】
（実施例１５：製剤例：増殖刺激または分化制御剤を含有する角膜保存液）
本実施例では、製剤例として、本発明の培養正常化剤を含有する角膜保存液を以下のように製造する。【０５４０】
常法により下に示す保存液を調製する。【０５４１】
Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １  １０−５００ｎｇ／ｍｌ（適宜調節する）
Ｏｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（Ｂａｕｓｃｈ−Ｌｏｍｂ）適量
全量  １００ｍＬ
各成分は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手することができる。【０５４２】
（実施例１６：注入剤の調製例）
点眼剤の調製例
各濃度の被験物質の組成を以下に示す。【０５４３】
Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １                １０−５００ｎｇ／ｍｌ（適宜調節する）
塩化ナトリウム                        ０．８５ｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物        ０．１ｇ
ベンザルコニウム塩化物                ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム                      適量
精製水                                適量
全量１００ｍｇ（ｐＨ７．０）。【０５４４】
点眼剤は、基剤で希釈することも出来る。【０５４５】
基材の組成は以下のとおり。【０５４６】
塩化ナトリウム                    ０．８５ｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物    ０．１ｇ
ベンザルコニウム塩化物            ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム                  適量
精製水                            適量
全量１００ｍｇ（ｐＨ７．０）。【０５４７】
各成分は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）．から入手することができる。【０５４８】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０５４９】
眼細胞の分化マーカーおよび分化制御技術が提供され、角膜移植に関連する技術に関与する産業（細胞培養産業、製薬等）において利用可能な技術が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０５５０】
配列番号１：ヒトＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（ＯＭＩＭ：６０６６６７；ＮＭ＿００３６６７．２）をコードする遺伝子配列
配列番号２：ヒトＧＰＲ４９／ＬＧＲ５（ＯＭＩＭ：６０６６６７；ＮＰ＿００３６５８．１）のアミノ酸配列
配列番号３：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １（ＲＳＰＯ１）（ＯＭＩＭ：６０９５９５；ＮＭ＿００１０３８６３３）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １）をコードする遺伝子配列
配列番号４：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １（ＲＳＰＯ１）（ＯＭＩＭ：６０９５９５；ＮＭ＿００１０３８６３３）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １）のアミノ酸配列
配列番号５：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ２（ＲＳＰＯ２）（ＯＭＩＭ：６１０５７５；ＮＭ＿１７８５６５）をコードする遺伝子配列
配列番号６：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ２（ＲＳＰＯ２）（ＯＭＩＭ：６１０５７５；ＮＭ＿１７８５６５）のアミノ酸配列
配列番号７：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ３（ＲＳＰＯ３）（ＯＭＩＭ：６１０５７４；ＮＭ＿０３２７８４）をコードする遺伝子配列
配列番号８：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ３（ＲＳＰＯ３）（ＯＭＩＭ：６１０５７４；ＮＭ＿０３２７８４）のアミノ酸配列
配列番号９：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ４（ＲＳＰＯ４）（ＯＭＩＭ：６１０５７３；ＮＭ＿００１０２９８７１）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １）をコードする遺伝子配列
配列番号１０：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ４（ＲＳＰＯ４）（ＯＭＩＭ：６１０５７３；ＮＭ＿００１０２９８７１）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １）のアミノ酸配列
配列番号１１：ＳＨＨ（ＳＯＮＩＣ  ＨＥＤＧＥＨＯＧ）（ＯＭＩＭ：６００７２５；ＮＭ＿０００１９３）をコードする遺伝子配列
配列番号１２：ＳＨＨ（ＳＯＮＩＣ  ＨＥＤＧＥＨＯＧ）（ＯＭＩＭ：６００７２５；ＮＭ＿０００１９３）のアミノ酸配列
配列番号１３：ＨｕｍａｎＧＰＲ４９のＦｏｒｗａｒｄプライマー（表１）
配列番号１４：ＨｕｍａｎＧＰＲ４９のＲｅｖｅｒｓｅプライマー（表１）
配列番号１５：ＨｕｍａｎＮｅｓｔｉｎのＦｏｒｗａｒｄプライマー（表１）
配列番号１６：ＨｕｍａｎＮｅｓｔｉｎのＲｅｖｅｒｓｅプライマー（表１）
配列番号１７：ＨｕｍａｎＡＢＣＧ２のＦｏｒｗａｒｄプライマー（表１）
配列番号１８：ＨｕｍａｎＡＢＣＧ２のＲｅｖｅｒｓｅプライマー（表１）
配列番号１９：ＨｕｍａｎＳＨＨのＦｏｒｗａｒｄプライマー（表１）
配列番号２０：ＨｕｍａｎＳＨＨのＲｅｖｅｒｓｅプライマー（表１）
配列番号２１：ＨｕｍａｎＰｔｃｈ１のＦｏｒｗａｒｄプライマー（表１）
配列番号２２：ＨｕｍａｎＰｔｃｈ１のＲｅｖｅｒｓｅプライマー（表１）
配列番号２３：ＨｕｍａｎＳｍｏのＦｏｒｗａｒｄプライマー（表１）
配列番号２４：ＨｕｍａｎＳｍｏのＲｅｖｅｒｓｅプライマー（表１）
配列番号２５：ＨｕｍａｎＧｌｉ１のＦｏｒｗａｒｄプライマー（表１）
配列番号２６：ＨｕｍａｎＧｌｉ１のＲｅｖｅｒｓｅプライマー（表１）
配列番号２７：ＨｕｍａｎＧｌｉ２のＦｏｒｗａｒｄプライマー（表１）
配列番号２８：ＨｕｍａｎＧｌｉ２のＲｅｖｅｒｓｅプライマー（表１）
配列番号２９：Ｈｕｍａｎｂｅｔａ−ａｃｔｉｎのＦｏｒｗａｒｄプライマー（表１）
配列番号３０：Ｈｕｍａｎｂｅｔａ−ａｃｔｉｎのＲｅｖｅｒｓｅプライマー（表１）
配列番号３１：ｓｈＲＮＡ  ｓｈＧＰＲ４０−５８７の挿入配列（表２）
配列番号３２：ｓｈＲＮＡ  ｓｈＧＰＲ４０−５８８の挿入配列（表２）
配列番号３３：ｓｈＲＮＡ  ｓｈＧＰＲ４０−５８９の挿入配列（表２）
配列番号３４：ｓｈＲＮＡ  ＢＮｏｎ−Ｔａｒｇｅｔ（ＮＴ）の挿入配列（表２）
配列番号３５：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １（ＲＳＰＯ１）（ＯＭＩＭ：６０９５９５；ＮＭ＿００１２４２９０８）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ２）をコードする遺伝子配列
配列番号３５：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １（ＲＳＰＯ１）（ＯＭＩＭ：６０９５９５；ＮＭ＿００１２４２９０８）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ２）をコードする遺伝子配列
配列番号３６：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １（ＲＳＰＯ１）（ＯＭＩＭ：６０９５９５；ＮＭ＿００１２４２９０８）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ２）のアミノ酸配列
配列番号３７：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １（ＲＳＰＯ１）（ＯＭＩＭ：６０９５９５；ＮＭ＿００１２４２９０９）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ３）をコードする遺伝子配列
配列番号３８：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １（ＲＳＰＯ１）（ＯＭＩＭ：６０９５９５；ＮＭ＿００１２４２９０９）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ３）のアミノ酸配列
配列番号３９：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １（ＲＳＰＯ１）（ＯＭＩＭ：６０９５９５；ＮＭ＿００１２４２９１０）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ４）をコードする遺伝子配列
配列番号４０：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １（ＲＳＰＯ１）（ＯＭＩＭ：６０９５９５；ＮＭ＿００１２４２９１０）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ４）のアミノ酸配列
配列番号４１：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ４（ＲＳＰＯ４）（ＯＭＩＭ：６１０５７３；ＮＭ＿００１０４０００７）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ２）をコードする遺伝子配列
配列番号４２：Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ４（ＲＳＰＯ４）（ＯＭＩＭ：６１０５７３；ＮＭ＿００１０４０００７）（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ２）のアミノ酸配列
配列番号４３：ｐｔｃｈ１＜ＮＭ＿００１０８３６０２．１＞の核酸配列
配列番号４４：ｐｔｃｈ１＜ＮＭ＿００１０８３６０２．１＞のアミノ酸配列
配列番号４５：ｇｌｉ１＜ＮＭ＿００１１６７６０９．１＞の核酸配列
配列番号４６：ｇｌｉ１＜ＮＭ＿００１１６７６０９．１＞のアミノ酸配列
配列番号４７：ｇｌｉ２＜ＮＭ＿００５２７０．４＞の核酸配列
配列番号４８：ｇｌｉ２＜ＮＭ＿００５２７０．４＞のアミノ酸配列
配列番号４９：ｌｒｐ６＜ＮＭ＿００２３３６．２＞の核酸配列
配列番号５０：ｌｒｐ６＜ＮＭ＿００２３３６．２＞のアミノ酸配列
配列番号５１：β−カテニン＜ＮＭ＿１３１０５９．２＞の核酸配列
配列番号５２：β−カテニン＜ＮＭ＿１３１０５９．２＞のアミノ酸配列
［配列表］
2014007402.tif 000004
2014007402.tif 000005
2014007402.tif 000006
2014007402.tif 000007
2014007402.tif 000008
2014007402.tif 000009
2014007402.tif 000010
2014007402.tif 000011
2014007402.tif 000012
2014007402.tif 000013
2014007402.tif 000014
2014007402.tif 000015
2014007402.tif 000016
2014007402.tif 000017
2014007402.tif 000018
2014007402.tif 000019
2014007402.tif 000020
2014007402.tif 000021
2014007402.tif 000022
2014007402.tif 000023
2014007402.tif 000024
2014007402.tif 000025
2014007402.tif 000026
2014007402.tif 000027
2014007402.tif 000028
2014007402.tif 000029
2014007402.tif 000030
2014007402.tif 000031
2014007402.tif 000032
2014007402.tif 000033
2014007402.tif 000034
2014007402.tif 000035
2014007402.tif 000036
2014007402.tif 000037
2014007402.tif 000038
2014007402.tif 000039
2014007402.tif 000040
2014007402.tif 000041
2014007402.tif 000042
2014007402.tif 000043
2014007402.tif 000044
2014007402.tif 000045
2014007402.tif 000046
2014007402.tif 000047
2014007402.tif 000048
2014007402.tif 000049
2014007402.tif 000050
2014007402.tif 000051
2014007402.tif 000052
2014007402.tif 000053
2014007402.tif 000054
2014007402.tif 000055
2014007402.tif 000056
2014007402.tif 000057
2014007402.tif 000058
2014007402.tif 000059
2014007402.tif 000060
2014007402.tif 000061
2014007402.tif 000062
2014007402.tif 000063
2014007402.tif 000064
2014007402.tif 000065
2014007402.tif 000066
2014007402.tif 000067
2014007402.tif 000068
2014007402.tif 000069
2014007402.tif 000070
2014007402.tif 000071
2014007402.tif 000072
2014007402.tif 000073
2014007402.tif 000074
2014007402.tif 000075
2014007402.tif 000076
2014007402.tif 000077
2014007402.tif 000078
2014007402.tif 000079
2014007402.tif 000080
2014007402.tif 000081
2014007402.tif 000082
2014007402.tif 000083
2014007402.tif 000084
2014007402.tif 000085
2014007402.tif 000086
2014007402.tif 000087
2014007402.tif 000088
2014007402.tif 000089
2014007402.tif 000090
2014007402.tif 000091
2014007402.tif 000092
2014007402.tif 000093
2014007402.tif 000094
2014007402.tif 000095
2014007402.tif 000096
2014007402.tif 000097
2014007402.tif 000098
2014007402.tif 000099
2014007402.tif 000100
2014007402.tif 000101
2014007402.tif 000102
2014007402.tif 000103
2014007402.tif 000104
2014007402.tif 000105
2014007402.tif 000106
2014007402.tif 000107
2014007402.tif 000108
2014007402.tif 000109
2014007402.tif 000110
2014007402.tif 000111
2014007402.tif 000112
2014007402.tif 000113
2014007402.tif 000114
2014007402.tif 000115
2014007402.tif 000116
2014007402.tif 000117
2014007402.tif 000118
2014007402.tif 000119
2014007402.tif 000120
2014007402.tif 000121
2014007402.tif 000122
2014007402.tif 000123
2014007402.tif 000124
2014007402.tif 000125
【図３−２】
2014007402.tif 000126
【図３−４】
2014007402.tif 000127
【図４−２】
2014007402.tif 000128
【図４−３】
2014007402.tif 000129
【図５−１】
2014007402.tif 000130
【図６−１】
2014007402.tif 000131
【図６−２】
2014007402.tif 000132
【図６−４】
2014007402.tif 000133
【図１】
2014007402.tif 000134
【図２−１】
2014007402.tif 000135
【図２−２】
2014007402.tif 000136
【図３−１】
2014007402.tif 000137
【図３−３】
2014007402.tif 000138
【図４−１】
2014007402.tif 000139
【図５−２】
2014007402.tif 000140
【図５−３】
2014007402.tif 000141
【図５−４】
2014007402.tif 000142
【図５−５】
2014007402.tif 000143
【図５−６】
2014007402.tif 000144
【図６−３】
2014007402.tif 000145
【図６Ａ】
2014007402.tif 000146
【図６Ｂ】
2014007402.tif 000147
【図６Ｃ】
2014007402.tif 000148
【図６Ｄ】
2014007402.tif 000149
【図７】
2014007402.tif 000150
【図８】
2014007402.tif 000151
【図９】
2014007402.tif 000152
【図１０】
2014007402.tif 000153
【図１１】
2014007402.tif 000154
【図１２】
2014007402.tif 000155
【図１３】
2014007402.tif 000156
【図１４】
2014007402.tif 000157
【図１５】
2014007402.tif 000158
【図１６】
2014007402.tif 000159
【国際調査報告】
2014007402.tif 000160
2014007402.tif 000161
2014007402.tif 000162
2014007402.tif 000163
2014007402.tif 000164
2014007402.tif 000165