(57)【要約】［課題］本発明は、遺伝子治療や遺伝子の機能解析の研究に耐える十分な力価を発揮するＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターおよびそれを作製するための前駆体ベクター並びに該ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターの調製方法を提供することを目的とする。［解決手段］アデノウイルスベクターを含んでなり、かつ、該アデノウイルスベクターが一組の部位特異的組換え酵素の認識配列とその認識配列間に存在するウイルス関連ＲＮＡをコードする遺伝子（ＶＡ遺伝子）とを含んでなる、ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターの前駆体ベクター。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスベクターを含んでなり、かつ、該アデノウイルスベクターが一組の部位特異的組換え酵素の認識配列とその認識配列間に存在するウイルス関連ＲＮＡをコードする遺伝子（ＶＡ遺伝子）とを含んでなる、ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターの前駆体ベクター。
【請求項２】
一組の部位特異的組換え酵素の認識配列とその認識配列間に存在するＶＡ遺伝子とがアデノウイルスベクターに導入された、請求項１に記載の前駆体ベクター。
【請求項３】
アデノウイルスベクターが内在性のＶＡ遺伝子が破壊されたアデノウイルスベクターである、請求項２に記載の前駆体ベクター。
【請求項４】
一組の部位特異的組換え酵素の認識配列とその認識配列間に存在するＶＡ遺伝子がアデノウイルスベクターのＥ４領域または破壊された内在性のＶＡ遺伝子の領域に導入された、請求項３に記載の前駆体ベクター。
【請求項５】
一組の部位特異的組換え酵素の認識配列間に存在するＶＡ遺伝子が、内在性のＶＡ遺伝子である、請求項１に記載の前駆体ベクター。
【請求項６】
部位特異的組換え酵素が、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、φＣ３１リコンビナーゼまたはＤｒｅリコンビナーゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の前駆体ベクター。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の前駆体ベクターと、該ベクターを宿主内で増殖させるために必要な要素とを含んでなる、核酸構築物。
【請求項８】
部位特異的組換え酵素の認識配列を含んでなる、ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクター。
【請求項９】
部位特異的組換え酵素の認識配列がＥ４領域に存在する、請求項８に記載のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクター。
【請求項１０】
部位特異的組換え酵素が、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、φＣ３１リコンビナーゼまたはＤｒｅリコンビナーゼである、請求項８または９に記載のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクター。
【請求項１１】
ＶＡ遺伝子が欠損している、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクター。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の前駆体ベクターを部位特異的組換え反応に付して得ることができる、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクター。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか一項に記載のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを含んでなる、遺伝子導入用組成物であって、ウイルス力価が１×１０７（ｒＶＴ／ｍＬ）以上である、遺伝子導入用組成物。
【請求項１４】
ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを調製する方法であって、
（ａ）部位特異的組換え酵素を発現していないＥ１発現細胞を用いて、請求項１〜６のいずれか一項に記載の前駆体ベクターを増殖させる工程と、
（ｂ）部位特異的組換え酵素を発現する細胞を用いて、工程（ａ）で増殖させた前駆体ベクターを部位特異的組換え反応に付する工程と
を含んでなる、方法。
【請求項１５】
工程（ａ）においてウイルスを２〜５回継代する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）においてウイルスを１〜３回継代する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号１の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号３の配列を有するリバースプライマーを含んでなる、核酸増幅用のプライマーセット。
【請求項１８】
請求項１７に記載のプライマーセットと、請求項１７に記載のプライマーセットにより増幅される核酸断片に特異的な核酸配列からなるプローブとを含んでなる、ＶＡ  ＲＮＡ
Ｉ検出用または定量用のプライマーおよびプローブのセット。
【請求項１９】
配列番号４の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号６の配列を有するリバースプライマーを含んでなる、核酸増幅用のプライマーセット。
【請求項２０】
請求項１９に記載のプライマーセットと、請求項１９に記載のプライマーセットにより増幅される核酸断片に特異的な核酸配列からなるプローブとを含んでなる、ＶＡ  ＲＮＡ
ＩＩ検出用または定量用のプライマーおよびプローブのセット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本願は、先行する日本国特許出願である特願２０１２−２１３０６９（出願日：２０１２年９月２６日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターおよびそれを調製するための前駆体ベクターに関する。より具体的には、本発明は、遺伝子治療や遺伝子の機能解析の研究に耐える十分な力価を発揮するＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターおよびそれを作製するための前駆体ベクター並びに該ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
アデノウイルスベクターは、細胞種を問わず高い遺伝子導入効率を示すことから、細胞への遺伝子導入ベクターとして広く用いられている。アデノウイルスベクターはまた、レトロウイルスベクターとは異なって細胞の染色体に組み込まれることがなく、また、遺伝子導入の際に細胞が分裂する必要がないという特徴を有している。【０００４】
このような利点から、アデノウイルスベクターは改良ベクターやその効率的作製法の開発が進められ、現在では、遺伝子治療用途や研究用の遺伝子導入ベクターとして広く用いられるようになった。【０００５】
しかしながら、第一世代アデノウイルスベクターは、そのゲノムに必須ウイルスタンパク質をコードする遺伝子が多数含まれおり、感染した細胞に様々な抗ウイルス応答を引き起こすことがある。【０００６】
例えば、アデノウイルスベクターゲノムには、ウイルス関連ＲＮＡ（ｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＲＮＡ）（ＶＡ  ＲＮＡ）をコードする遺伝子領域ＶＡＩおよびＩＩが存在することが知られている。ＶＡ  ＲＮＡは、タンパク質をコードしないＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）であることや、インターフェロンβプロモーター刺激因子−１（ＩＰＳ−１）を介して自然免疫を誘発する（非特許文献１）ことが報告されている。ＶＡ  ＲＮＡはまた、機能的なウイルスｍｉＲＮＡ（ｍｉｖａＲＮＡ）として働き、感染した細胞の細胞増殖、遺伝子発現およびＤＮＡ修復などに関与する遺伝子の発現を制御することも明らかとなってきた（非特許文献２）。そのため、アデノウイルスベクターの新たな問題として、感染後に宿主細胞にＶＡ  ＲＮＡに起因する予測不能な影響を与えることや、結果として遺伝子治療や遺伝子の機能解析を困難にしてしまうことが懸念されていた。【０００７】
このような背景から、機能的なＶＡ  ＲＮＡを欠損したアデノウイルスベクターの開発が試みられてきたが、ＶＡ  ＲＮＡはアデノウイルスベクターの複製に必要な因子であり、欠損させるとアデノウイルスベクターの増殖能が著しく低下するため、ＶＡ  ＲＮＡを欠損したアデノウイルスベクターを得ることは困難であった。そのため、欠損したＶＡ  ＲＮＡをＶＡ  ＲＮＡを発現する細胞を用いて補完する方法が試みられたが、その場合でも得られるベクターの力価は通常の約１０００分の１程度であり（非特許文献３）、遺伝子治療や遺伝子の機能解析等の実用に耐える十分な力価を発揮するものではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】T. Yamaguchi, K. Kawabata, E. Kouyama, K. J. Ishii, K. Katayama, T. Suzuki, S. Kurachi, F. Sakurai, S. Akira, H. Mizuguchi, “Induction of type I interferon by adenovirus-encoded small RNAs”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2010) 107: 17286-17291.
【非特許文献２】O. Aparicio, E. Carnero, X. Abad, N. Razquin, E. Guruceaga, V. Segura, P. Fortes, “Adenovirus VA RNA-derived miRNAs target cellular genes involved in cell growth, gene expression and DNA repair”, Nucleic Acids Res. (2010) 38: 750-763.
【非特許文献３】M. Machitani, K. Katayama, F. Sakurai, H. Matsui, T. Yamaguchi, T. Suzuki, H. Miyoshi, K. Kawabata, H. Mizuguchi, “Development of an adenovirus vector lacking the expression of virus-associated RNAs”, Journal of Controlled Release (2011) 154: 285-289.
【発明の概要】
【０００９】
本発明は上記のような状況に鑑みてなされたものであり、遺伝子治療や遺伝子の機能解析の研究に耐える十分な力価を発揮するＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターおよびそれを作製するための前駆体ベクター並びに該ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターの調製方法を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明者は、ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターは、ＶＡ発現２９３細胞等によりＶＡ  ＲＮＡを供給した場合には力価が実用レベルに至らなかったにも関わらず、ＶＡ  ＲＮＡをウイルスゲノム内に供給し、培養最終段階でＶＡ遺伝子を欠損させる手法を採用した場合には、従来の百倍〜数百倍の高力価のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを得ることができることを見出した。本発明はこのような知見に基づいて完成された発明である。
【００１１】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）アデノウイルスベクターを含んでなり、かつ、該アデノウイルスベクターが一組の部位特異的組換え酵素の認識配列とその認識配列間に存在するウイルス関連ＲＮＡをコードする遺伝子（ＶＡ遺伝子）とを含んでなる、ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターの前駆体ベクター。
（２）一組の部位特異的組換え酵素の認識配列とその認識配列間に存在するＶＡ遺伝子とがアデノウイルスベクターに導入された、上記（１）に記載の前駆体ベクター。
（３）アデノウイルスベクターが内在性のＶＡ遺伝子が破壊されたアデノウイルスベクターである、上記（２）に記載の前駆体ベクター。
（４）一組の部位特異的組換え酵素の認識配列とその認識配列間に存在するＶＡ遺伝子がアデノウイルスベクターのＥ４領域または破壊された内在性のＶＡ遺伝子の領域に導入された、上記（３）に記載の前駆体ベクター。
（５）一組の部位特異的組換え酵素の認識配列間に存在するＶＡ遺伝子が、内在性のＶＡ遺伝子である、上記（１）に記載の前駆体ベクター。
（６）部位特異的組換え酵素が、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、φＣ３１リコンビナーゼまたはＤｒｅリコンビナーゼである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の前駆体ベクター。
（７）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の前駆体ベクターと、該ベクターを宿主内で増殖させるために必要な要素とを含んでなる、核酸構築物。
（８）部位特異的組換え酵素の認識配列を含んでなる、ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクター。
（９）部位特異的組換え酵素の認識配列がＥ４領域に存在する、上記（８）に記載のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクター。
（１０）部位特異的組換え酵素が、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、φＣ３１リコンビナーゼまたはＤｒｅリコンビナーゼである、上記（８）または（９）に記載のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクター。
（１１）ＶＡ遺伝子が欠損している、上記（８）〜（１０）のいずれかに記載のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクター。
（１２）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の前駆体ベクターを部位特異的組換え反応に付して得ることができる、上記（８）〜（１１）のいずれかに記載のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクター。
（１３）上記（８）〜（１２）のいずれかに記載のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを含んでなる、遺伝子導入用組成物であって、ウイルス力価が１×１０７（ｒＶＴ／ｍＬ）以上である、遺伝子導入用組成物。
（１４）ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを調製する方法であって、
（ａ）部位特異的組換え酵素を発現していないＥ１発現細胞を用いて、上記（１）〜（６）のいずれか一項に記載の前駆体ベクターを増殖させる工程と、
（ｂ）部位特異的組換え酵素を発現する細胞を用いて、工程（ａ）で増殖させた前駆体ベクターを部位特異的組換え反応に付する工程と
を含んでなる、方法。
（１５）工程（ａ）においてウイルスを２〜５回継代する、上記（１４）に記載の方法。
（１６）工程（ｂ）においてウイルスを１〜３回継代する、上記（１４）または（１５）に記載の方法。
（１７）配列番号１の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号３の配列を有するリバースプライマーを含んでなる、核酸増幅用のプライマーセット。
（１８）上記（１７）に記載のプライマーセットと、上記（１７）に記載のプライマーセットにより増幅される核酸断片に特異的な核酸配列からなるプローブとを含んでなる、ＶＡ  ＲＮＡ  Ｉ検出用または定量用のプライマーおよびプローブのセット。
（１９）配列番号４の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号６の配列を有するリバースプライマーを含んでなる、核酸増幅用のプライマーセット。
（２０）上記（１９）に記載のプライマーセットと、上記（１７）に記載のプライマーセットにより増幅される核酸断片に特異的な核酸配列からなるプローブとを含んでなる、ＶＡ  ＲＮＡ  ＩＩ検出用または定量用のプライマーおよびプローブのセット。
【００１２】
本発明によれば、ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを実用に耐える高力価で得ることができる。ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターは、ＶＡ遺伝子が機能的に破壊され、宿主細胞のインターフェロン経路等の免疫機構に働きかける可能性が少ないことから、ＲＮＡに起因する予測不能な影響を回避しつつ遺伝子の機能解析や遺伝子治療に用いることができる点で有利である。
【００１３】
また、アデノウイルスベクター調製中には、アデノウイルスベクターがＥ１遺伝子を獲得して複製可能なアデノウイルスベクター（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ＲＣＡ）が生成されることがある。しかし、ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターは、ＶＡ遺伝子を欠損しているため、ＲＣＡの増殖を起こすことがなく、ＲＣＡによる副作用が生じないと考えられる点で有利である。また、本発明のプライマーセットは、増幅の困難なアデノウイルスのＶＡ  ＲＮＡ  ＩまたはＩＩをＰＣＲで増幅させることができる点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、アデノウイルス５型をベースとしたアデノウイルスベクターのＶＡ遺伝子の改変を示す図である。図１Ａは、アデノウイルスの内在性のＶＡをＢ−ｂｏｘ領域の欠損により破壊する場合の欠損部位を示す図である。Ｂ−ｂｏｘ領域の欠損は、図１Ａ中の小文字で示される配列を欠損させることにより行った。図１Ｂは、ＶＡＩおよびＶＡＩＩにわたる領域の３８１ヌクレオチドの欠損部位を示す図である。３８１ヌクレオチドの欠損は、図１Ｂ中の小文字で示される配列を欠損させることにより行った。図１Ｃは、ＦＶＦ断片中のＶＡＩおよびＶＡＩＩの全体とスプライシング部位の改変を示す図である。図１Ｃでは、定量的ＰＣＲに用いたプライマーおよびＶＡ  ＲＮＡ  ＩおよびＩＩ検出用プローブの部位が示されている。図１Ｃ中のＦプライマー１、ＶＡＩプローブおよびＲプライマー１（太字かつ斜字の部分）はそれぞれ、ＶＡＩのリアルタイムＰＣＲ用のフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーを示し、Ｆプライマー２、ＶＡＩＩプローブおよびＲプライマー２（太字かつ斜字の部分）はそれぞれ、ＶＡＩＩのリアルタイムＰＣＲ用のフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーを示す。図１Ａ〜Ｃでは、ＶＡＩおよびＶＡＩＩをコードする遺伝子領域がそれぞれ四角にて囲まれている。
【図２】図２は、本発明の前駆体ベクターから部位特異的組換え反応を用いて機能的なＶＡを除去するスキームを示す図である。図２Ａは、ＶＡの３８１ヌクレオチドを欠失させ、かつ、その箇所にＦＶＦ断片を挿入した前駆体ベクターＡｘｄＶ−ＦＶＦの模式図を示し、図２Ｂは、ＶＡ遺伝子のＢ−ｂｏｘを欠失させ、かつ、ＦＶＦ断片をＥ４領域に挿入した前駆体ベクターＡｘｄＶ−４ＦＶＦの模式図を示す。また、図２ＣおよびＤはそれぞれ、図２ＡおよびＢの前駆体ベクターに部位特異的組換え反応を引き起こさせて得られるＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターおよび環状に除去された機能的なＶＡを示す。図２ＣおよびＤに示されるように、機能的なＶＡが除去されたＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターは、機能的なＶＡが挿入されていた箇所に部位特異的組換え酵素の認識配列（図中はＦで示される）が１つ残存することとなる。
【図３】図３は、ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクター（ＡｘｄＶ−４Ｆ−ＧＦＰ）（図３Ａ）およびその前駆体ベクター（ＡｘｄＶ−４ＦＶＦ−ＧＦＰ）（図３Ｂ）のＥ４領域の配列を示す。前駆体ベクターでは、二重下線で示された一組のＦＲＴ配列の間にＶＡＩおよびＩＩ遺伝子が挿入されているが、部位組換え酵素反応により、これらのＶＡ遺伝子が除去され、ベクター上には１つのＦＲＴ配列が残存する結果となる。
【図４】図４は、部位特異的組換え反応による機能的なＶＡの除去とその効率を示す図である。図４Ａは、サザンブロット法による、ＶＡ遺伝子切り出し反応によるアデノウイルスベクターのバンドシフトを示す図である。図４Ｂは、ノーザンブロット法による、本発明により得られたＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターからのＶＡ  ＲＮＡ  Ｉの産生のレベルの低下を示す図である。
【発明の具体的な説明】
【００１５】
本発明による前駆体ベクター（プレベクター）は、アデノウイルスベクターを含んでなり、かつ、該アデノウイルスベクターは一組（２つ）の部位特異的組換え酵素の認識配列とその認識配列間に存在するＶＡ遺伝子とを含んでなることを特徴とするものである。
【００１６】
本明細書において、「アデノウイルスベクター」とは、アデノウイルス由来のベクターである。また、「アデノウイルスベクター」は、好ましくは第一世代のアデノウイルスベクター（以下、「ＦＧ−ＡｄＶベクター」ということがある）である。
【００１７】
第一世代のアデノウイルスベクターの代表例は、Ｅ１置換型とも呼ばれるように、ウイルスゲノム中のＥ１Ａおよび／またはＥ１Ｂが欠失しており、代わりにＥ１領域あるいはアデノウイルスゲノムの他の領域に目的遺伝子を含む発現ユニットが挿入されるベクターである。現在、アデノウイルスとしては、５０以上の型が知られ、ベクターとしてよく用いられているのは、アデノウイルス２型、５型および３５型のゲノムを利用したものであるが、それ以外の型、例えば８型など、いずれの型のアデノウイルスベクターであっても本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターの作製に用いることができる。本明細書では「目的遺伝子」とは、ウイルスベクターにより細胞に導入しようとする外来遺伝子をいう。発現ユニットには、目的遺伝子を発現させるためのプロモーターが含まれる。プロモーターは、特に限定されないが、例えば、ＣＡＧプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、組織特異的なプロモーターまたは誘導性プロモーターなどのプロモーターを含む調節領域を用いることができる。このようなプロモーターまたは調節領域は当業者であれば適宜自由に選択し、設計することができる。また、発現ユニットには、目的遺伝子のｍＲＮＡにポリＡ配列を付加するポリＡ付加シグナルが含まれる。目的遺伝子の発現ユニットは、発現ユニットの近傍に存在するｐＩＸ遺伝子上流のスプライシングアクセプター部位が、目的遺伝子にある潜在的なスプライシングドナー部位と反応して不要なスプライシングが生じるのを防ぐ目的で、左向き（すなわち、遺伝子の転写開始点がＥ２側に配置される向き）に挿入されることが好ましい（Nakai, Kanegae, Saito et al., Hum. Gene Ther. 2005）。
【００１８】
第一世代のアデノウイルスベクターは、Ｅ１Ａおよび／またはＥ１Ｂを欠失しているため、ウイルスの複製に必要なその他の初期遺伝子Ｅ２（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）、Ｅ３およびＥ４を発現することができず、Ｅ１（Ｅ１Ａおよび／またはＥ１Ｂ）を供給しなければ細胞で増殖することができない。そのため、第一世代のアデノウイルスベクターの増殖にはＥ１を発現する細胞、例えば、２９３細胞などが用いられる。
【００１９】
また、第一世代のアデノウイルスベクターでは、アデノウイルスベクターゲノム上の初期遺伝子のいずれが欠損していても、欠損した遺伝子を細胞中に供給することによりウイルスを増殖させることができ、細胞の感染力価は非欠損のウイルスと比べて遜色ないことが知られている（例えば、特開平８−３０８５８５号公報参照）。従って、第一世代のアデノウイルスベクターは、Ｅ２、Ｅ３および／またはＥ４を欠損していてもよく、第一世代のアデノウイルスベクターには、Ｅ１に加えてこれらの初期遺伝子のいずれか１以上が破壊されたアデノウイルスベクターも含まれる。
【００２０】
本明細書において、「ＶＡ遺伝子」としては、ＶＡ  ＲＮＡ（ウイルス関連ＲＮＡ；ｖｉｒｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＲＮＡ）ＩおよびＩＩをコードする遺伝子が挙げられる。ＶＡ  ＲＮＡ  ＩおよびＩＩは、約１６０ヌクレオチドの低分子ＲＮＡ分子であり、例えば、アデノウイルス５型（Ａｄ５）では、それぞれゲノムの１０６２０〜１１７７９（ＶＡＩ）および１０８７６〜１１０３８（ＶＡＩＩ）の領域にコードされている。ウイルスまたはベクターが細胞に感染すると、ＶＡ  ＲＮＡ  ＩおよびＩＩは、ＲＮＡポリメラーゼIIIによりゲノム上のＶＡＩおよびＩＩ遺伝子から転写される。なお、ＶＡＩおよびＩＩ遺伝子のプロモーターは、ゲノム上のそれぞれの遺伝子の内部に存在することが知られている。
【００２１】
本明細書において、「ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクター」とは、ＶＡ  ＲＮＡをコードする領域、すなわち、ＶＡＩおよび／またはＶＡＩＩの全長または一部が欠損し、または、改変され、ＶＡＩおよびＩＩの両方またはこれらのいずれかが破壊されることにより、(i)ＶＡ  ＲＮＡ  ＩおよびＩＩの両方若しくはこれらのいずれかを産生することができなくなった、または、その産生量が著しく（例えば、３％以下、２％以下、１％以下または０．５％以下に）減少したアデノウイルスベクター、あるいは、(ii)機能的なＶＡ  ＲＮＡ  ＩおよびＩＩの両方若しくはこれらのいずれかを産生することができなくなった、または、その産生量が著しく（例えば、３％以下、２％以下、１％以下または０．５％以下に）減少したアデノウイルスベクターを意味する。本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターは、ＶＡＩまたはＶＡＩＩのいずれかが破壊されており、好ましくはＶＡＩが破壊されており、より好ましくはＶＡＩおよびＩＩの両方が破壊されている。そのため、本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターは、破壊されたＶＡ遺伝子に対応する機能的なＶＡ  ＲＮＡ  Ｉおよび／またはＩＩを産生することができない、または、その産生量が著しく（例えば、３％以下、２％以下、１％以下または０．５％以下に）減少している。本明細書において、「機能的なＶＡ」とは、細胞内でアデノウイルスベクターを増殖させる機能を有するＶＡ  ＲＮＡ  Ｉおよび／またはＩＩをコードするＶＡ遺伝子を意味する。
【００２２】
本発明の前駆体ベクターは、ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを作製するためのベクターであって、機能的なＶＡを有するものの、部位特異的組換え酵素を作用させるとＶＡ遺伝子の全長または一部が前駆体ベクターを構成するアデノウイルスベクターから脱落してＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを生成する。本発明の前駆体ベクターにおいては、機能的なＶＡは、一組の部位特異的組換え酵素の認識配列で挟まれるように配置されている。
【００２３】
本発明の前駆体ベクターは、少なくとも１つの機能的なＶＡを有する。機能的なＶＡは、アデノウイルス内在性のＶＡ遺伝子（すなわち、ＶＡ遺伝子を破壊されるアデノウイルスベクターが本来有するＶＡ遺伝子）であってもよいし、あるいは、遺伝子組換えにより導入された新たなＶＡ遺伝子であってもよい。本発明の前駆体ベクターが機能的なＶＡを新たに導入したものである場合には、本発明の前駆体ベクターを構成するアデノウイルスベクター上の内在性のＶＡ遺伝子は機能的に破壊されていることが好ましい。また、この場合、新たに導入される機能的なＶＡ遺伝子の導入部位は、特に限定されないが、２９３細胞内で増殖を妨げない限りＡｄＶゲノム上の如何なる領域であってもよく、例えば、破壊した内在性ＶＡ遺伝子の部位、または、初期遺伝子の領域、すなわち、Ｅ２、Ｅ３若しくはＥ４の領域とすることができ、好ましくは破壊した内在性ＶＡ遺伝子の部位、または、Ｅ４の領域である。例えば、内在性ＶＡ遺伝子の大部分を欠損させたアデノウイルスベクターに機能的なＶＡ遺伝子を導入する場合には、その導入部位は、内在性ＶＡ遺伝子の欠損部位としても、Ｅ４の領域としてもよい。Ｅ４の領域に導入する場合には、例えば、Ｅ４プロモーターとゲノムの右側末端（ゲノムのＥ４側の末端）との間に導入することができる。新たに導入される機能的なＶＡ遺伝子は、ＶＡＩおよびＩＩの両方の遺伝子とすることができるが、ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクター上でＶＡＩまたはＩＩのいずれかのみが破壊された場合には、破壊されたＶＡ遺伝子に対応するＶＡＩまたはＩＩとすることもできる。また、新たに導入される機能的なＶＡ遺伝子の導入方向は特に限定されず、右向き（ＶＡ遺伝子がゲノムのＥ４側の末端の方向へ転写される向き）とすることもできるし、左向き（ＶＡ遺伝子がゲノムのＥ１側の末端の方向へ転写される向き）とすることもできる。
【００２４】
本発明の前駆体ベクターが有する機能的なＶＡ遺伝子が内在性のＶＡ遺伝子である場合には、内在性のＶＡ遺伝子の全部または一部を一組の部位特異的組換え酵素の認識配列で挟むように前駆体ベクターを構成することも可能である。本発明の前駆体ベクターが有する機能的なＶＡが遺伝子組換えにより導入された新たなＶＡ遺伝子である場合には、その新たな機能的なＶＡ遺伝子の全部または一部を一組の部位特異的組換え酵素の認識配列で挟むように構成することができる。上記のような構成とすることにより、本発明の前駆体ベクターが有する機能的なＶＡは、部位特異的組換え酵素を作用させることにより前駆体ベクターから除去することが可能となる。本発明の前駆体ベクターは、機能的なＶＡを複数有していてもよいが、ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを作製する場合には部位特異的組換え反応により前駆体ベクター内のこれらのＶＡ遺伝子はすべてベクターから除去される。なお、新たに導入される機能的なＶＡ遺伝子は、ＶＡＩおよび／またはＶＡＩＩ遺伝子を一組の部位組換え酵素の認識配列の間に挿入することにより作製することができ、アデノウイルスベクターに導入することにより前駆体ウイルスの作製に用いることができる。また、１組以上の部位特異的組換え酵素の認識配列を導入した場合には、それぞれの組の部位特異的組換え酵素の認識配列は、同じでもよいし、異なっていてもよい。
【００２５】
内在性のＶＡ遺伝子の破壊は、特に限定されないが、常法を用いて、ＶＡ遺伝子の全部若しくは一部の欠損、または、ＶＡ遺伝子の塩基配列の改変により行うことができる。あるいは、内在性のＶＡ遺伝子の破壊は、ＶＡ  ＲＮＡの発現に必要な領域を改変することによって行ってもよい。ＶＡ遺伝子破壊の確実性を期する観点から、内在性のＶＡ遺伝子の破壊は、その全長若しくはその大部分を欠損させ、または転写調節領域を破壊することにより行うことが好ましい。例えば、内在性のＶＡＩおよび／またはＶＡＩＩの破壊は、これらの遺伝子の全長またはその大部分を欠損させるか、ＲＮＡポリメラーゼIIIによる転写に必要なＢ−ｂｏｘを欠失させることにより行うことができる。より具体的には、内在性のＶＡＩおよびＶＡＩＩの破壊は、例えば、ＶＡＩおよびＶＡＩＩの全長を欠失させること、または、ＶＡＩの転写開始点から３’側に約１６ヌクレオチドの塩基〜ＶＡＩＩの転写開始点から３’側に約１２７ヌクレオチドの塩基を欠失させることにより行うことができる。ＲＮＡポリメラーゼIIIによる転写に必要なＢ−ｂｏｘを欠失させる場合は、アデノウイルスゲノムのＶＡＩおよびＶＡＩＩのＢ−ｂｏｘ配列を、例えば、その全長を欠失させること、または、それぞれ１０ヌクレオチド〜１７ヌクレオチド、例えば、それぞれ１５ヌクレオチド若しくは１７ヌクレオチド欠失させることにより行うことができる。
【００２６】
本発明の前駆体ベクターには部位特異的組換え酵素の認識配列が存在し、部位特異的組換え反応により２つの認識配列により挟まれた領域が前駆体ベクターから切り出される。この「部位特異的組換え反応」は、特に限定されないが、例えば、部位特異的組換え酵素であるＣｒｅリコンビナーゼ（以下、単に「Ｃｒｅ」ということがある）とその認識配列であるｌｏｘＰの系、部位特異的組換え酵素であるＦｌｐリコンビナーゼ（以下、単に「Ｆｌｐ」ということがある）とその認識配列であるＦＲＴの系、Ｄｒｅリコンビナーゼとその認識配列であるｒｏｘの系（Anastassiadis, K. et al., Dis. Model. Mech. (2009) 2: 508-515）、並びに、φＣ３１リコンビナーゼとその認識配列であるａｔｔＰ／ａｔｔＢの系（Belteki G et al., Nat. Biotechnol. (2003) 21: 321-324）などの部位特異的組換え反応系を用いることができる。本発明では、スタッファー領域の切り出しが可能な系であれば、上記部位特異的組換え酵素およびその認識配列以外であっても、本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターの作製に用いることができることは当業者であれば十分に理解できるであろう。そのような系としては、特に限定されないが、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を改良したＳＣｒｅ−ＳｌｏｘＰ系やＶＣｒｅ−ＶｌｏｘＰ系（E. Suzuki and M. Nakayama, Nucleic Acid Res. (2011) 39 (8): e49）などが知られている。具体的な部位特異的組換え酵素の認識配列の一例を表１に示す。
【００２７】
【表１】
2014050927.tif 000002
【００２８】
表１に記載の配列は具体的な部位特異的組換え酵素の認識配列を例示するために記載されただけであって、本発明で利用可能な部位特異的組換え酵素の認識配列がこれらの配列に限定されることを意味するものではない。本発明で利用可能な部位特異的組換え酵素の認識配列は、部位特異的組換え反応を引き起こすためのリコンビナーゼの認識配列として機能するものである限りどのような配列であってもよく、例えば、部位特異的組換え酵素の認識配列は、表１に記載された配列以外の配列、具体的には、例えば、国際公開公報第２００１／０２３５４５号公報に記載のＦＲＴ配列などの変異ＦＲＴ配列（例えば、ＦＲＴ（ｆ２１６１）およびＦＲＴ（ｆ２２６２）など）、および、特開平１１−１９６８８０号公報に記載のｌｏｘＰ配列などの変異ｌｏｘＰ配列の配列などを用いてもよく、このような部位特異的組換え酵素の認識配列は当業者であれば自由に選択して用いることができる。通常は、部位特異的組換え酵素の認識配列は、同一方向に２つ存在する場合にその間に挟まれた領域（スタッファー領域）が除去されるが、φＣ３１では、認識配列であるａｔｔＰおよびａｔｔＢの間に挟まれた領域が除去される。また、通常は、部位特異的組換え酵素の認識配列は、２つのうちの一つがベクターゲノム上に残存することとなるが、φＣ３１では、部位特異的組換え酵素の認識配列は、例えば、ａｔｔＰを５’側とし、ａｔｔＢを３’側としてスタッファー領域を挟んだ場合、ａｔｔＰの３’側の半分とａｔｔＢの５’側の半分が連結して形成されたａｔｔＬ配列がスタッファー領域と共にゲノム上から除去され、ベクターゲノム上にはａｔｔＰの５’側の半分とａｔｔＢの３’側の半分が連結したａｔｔＲが残存する。また逆に、ａｔｔＰを３’側とし、ａｔｔＢを５’側としてスタッファー領域を挟んだ場合、ａｔｔＰの５’側の半分とａｔｔＢの３’側の半分が連結して形成されたａｔｔＬ配列がスタッファー領域と共にゲノム上から除去され、ベクターゲノム上にはａｔｔＰの３’側の半分とａｔｔＢの５’側の半分が連結したａｔｔＲが残存する。φＣ３１により組換え反応を引き起こした結果ベクターゲノム上に残存するこれらのａｔｔＬ配列およびａｔｔＲ配列もまた、部位特異的組換え酵素の認識配列である。
【００２９】
部位特異的組換え酵素の反応効率を向上させる観点では、これらの部位特異的組換え酵素には、核移行シグナルを付加することができる（例えば、Ｃｒｅに核移行シグナルを付加したＮＣｒｅ；Kanegae Y., et. al., Nucleic Acid Res. (1995), 181: 207-212）。このようにすることで、部位特異的組換え酵素が、組換え反応の場である核に効率良く送達され、組換え反応の効率が向上する。また、部位特異的組換え酵素を２９３細胞などのヒト細胞で高発現させるためには、部位特異的組換え酵素は、例えば、そのコドン使用率をヒトのコドン使用率に近くなるように改変した酵素とすることが好ましい。また、至適温度が３７℃以外である部位組換え酵素の活性を２９３細胞などのヒト細胞で向上させるために、部位組換え酵素を３７℃付近でも活性を維持するように改変し、培養温度での活性を高めた酵素とすることが好ましい。使用率をヒトのコドン使用率に近くなるように改変され、かつ３７℃での活性が高まるように改変されたＦｌｐ酵素としては、例えば、ＦＬＰｅ（Buchholz F., et al., Nature Biotechnology (1998) 16 (7): 657-662）およびｈＦＬＰｅ（Kondo S., et al., J. Mol. Biol. (2009) 390: 221-230）が挙げられる。
【００３０】
本発明の前駆体ベクターを部位特異的組換え反応に付すると、一組の部位特異的組換え酵素の認識配列に挟まれた機能的なＶＡが環状にゲノムから除去される。その結果、本発明の前駆体ベクターを部位特異的組換え反応に付して得ることができる本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターには、ＶＡ遺伝子が存在していた部位に部位特異的組換え酵素の認識配列が残存することとなる。従って、本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターは、そのゲノム中に部位特異的組換え酵素の認識配列を有する。
【００３１】
本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターでは、ゲノム上に有する部位特異的組換え酵素の認識配列は、機能的なＶＡを導入した部位、例えば、破壊した内在性ＶＡ遺伝子の部位、または、初期遺伝子の領域、すなわち、Ｅ２、Ｅ３若しくはＥ４の領域に残存することとなる。本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターではまた、機能的なＶＡはすべて破壊されているか除去されている。
【００３２】
ＶＡ遺伝子が破壊されたアデノウイルスベクターは、２９３細胞中では増殖させることができないばかりか、ＶＡ発現２９３細胞を用いてＶＡ遺伝子を細胞から供給した場合でも臨床応用などの実用に耐える高力価のベクターを得ることはできなかった（非特許文献３）。
【００３３】
しかしながら、後記実施例に示されるように、ＶＡ遺伝子をアデノウイルスベクターのゲノム上に供給してウイルスを増殖させた後に、ウイルスゲノムからＶＡ遺伝子を除去してＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを作製した場合には、従来のアデノウイルスベクターに匹敵する高力価のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターが得られた。特筆すべきことに、この方法では、本発明の前駆体ベクターのほとんどすべてが部位特異的組換えを起こした。そのため、本発明では、必ずしも部位特異的組換え反応後にＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを単離・精製する必要がなかった。しかも、本発明の前駆体ベクターは、２９３細胞内で通常の第一世代のアデノウイルスベクター同様に、大量に調製することが可能であった。
【００３４】
すなわち、本発明では、本発明の前駆体ベクターを部位特異的組換え酵素を発現しない２９３細胞などのＥ１発現細胞で十分に増殖させ、その後前駆体ベクターを回収して、部位特異的組換え酵素を発現する細胞に感染させることにより、高力価を有するＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを簡便にかつ高純度で得ることができた。
【００３５】
従って、本発明によれば、ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを調製する方法であって、
（ａ）部位特異的組換え酵素を発現していないＥ１発現細胞を用いて、本発明の前駆体ベクターを増殖させる工程と、
（ｂ）部位特異的組換え酵素を発現する細胞を用いて、工程（ａ）で増殖させた前駆体ベクターに部位特異的組換え反応を引き起こさせる工程と
を含んでなる方法が提供される。
【００３６】
より具体的には、本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターは、本発明の前駆体ベクターを部位特異的組換え酵素を発現しないＥ１発現細胞に感染させ、特に限定されないが、例えば、ウイルスを２〜５回、好ましくは２〜３回継代してから、その後、部位特異的組換え酵素を発現する細胞に感染させて機能的なＶＡを除去することにより作製することができる。部位特異的組換え反応の効率を向上させる観点では、部位特異的組換え酵素を発現する細胞に感染させた後に、残存し得る未反応の前駆体ベクターを除去するためにウイルスをさらに１〜３回継代してもよい。このようにすることで、ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターの割合を、好ましくは９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上とすることができる。また、部位特異的組換え酵素を発現する細胞に感染させた後の継代では、ウイルスを通常の５〜６倍の量（例えばＭＯＩ  １０〜２０）を用いて感染させることができ、このようにすることで十分高力価のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを得ることができる。本発明では、得られたＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターの割合が十分に高く、組換えを起こさなかったウイルスを分離除去することなく、その後の応用に用いることができる。
【００３７】
本発明の前駆体ベクターからの機能的なＶＡの除去の効率を確認するためには、ＶＡ  ＲＮＡ  ＩおよびＩＩの発現を、ノーザンブロット法や定量的ＰＣＲにより検出することができる。ＶＡ  ＲＮＡ  ＩおよびＩＩは、極めて短い配列であり、かつ、安定な高次構造を形成するため、通常はＰＣＲによる増幅が困難である。しかし、本発明者らは鋭意検討の結果、ＶＡ  ＲＮＡ  ＩおよびＩＩを増幅可能なプライマーを見出した。具体的には、定量的ＰＣＲによりＶＡ  ＲＮＡ  ＩおよびＩＩの発現を検出する場合には、プライマーは好ましくは、ＶＡ  ＲＮＡ  Ｉの検出には、配列番号１の配列を有するフォワードプライマーと配列番号３の配列を有するリバースプライマーを用いることができ、ＶＡ  ＲＮＡ  ＩＩの検出には、配列番号４の配列を有するフォワードプライマーと配列番号６の配列を有するリバースプライマーを用いることができる。このように、本発明によれば、ＶＡ  ＲＮＡ  ＩまたはＩＩをＰＣＲにより増幅するためのプライマーが提供される。
【００３８】
また、本発明によれば、上記プライマーセットにさらにＶＡ  ＲＮＡ  ＩまたはＩＩ検出用のプローブ（例えば、蛍光標識プローブ）を加えると、ＶＡ  ＲＮＡ  ＩおよびＩＩの発現をより正確に定量することができる。具体的には、ＶＡ  ＲＮＡ  Ｉの検出または定量には、配列番号１の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号３の配列を有するリバースプライマー、並びに、配列番号１の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号３の配列を有するリバースプライマーにより増幅される核酸断片に特異的な核酸配列からなるプローブ（好ましくは、増幅核酸断片の一部に相補的な核酸配列からなるプローブ、より好ましくは、配列番号２の配列を有するプローブ）を用いることができ、ＶＡ  ＲＮＡ  ＩＩの検出または定量には、配列番号４の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号６の配列を有するリバースプライマー、並びに、配列番号４の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号６の配列を有するリバースプライマーにより増幅される核酸断片に特異的な核酸配列からなるプローブ（好ましくは、増幅核酸断片の一部に相補的な核酸配列からなるプローブ、より好ましくは、配列番号５の配列を有するプローブ）を用いることができる。プローブは、例えば、１５ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド、より好ましくは、２０ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドとすることができる。蛍光標識プローブとしては、より具体的には、例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓプローブまたは、サイクリングプローブなどが挙げられる。ＶＡ  ＲＮＡ  ＩおよびＩＩの発現は、リアルタイムＰＣＲにより検出および／または定量することができる。なお、リアルタイムＰＣＲに用いる上記プローブの作製方法は、当業者に周知である。
【００３９】
従って、本発明では、配列番号１の配列を有するフォワードプライマーと配列番号３の配列を有するリバースプライマーを用いて（好ましくは、これらのプライマーにより増幅される断片にハイブリダイズするプローブに特異的な核酸配列からなるプローブ（好ましくは、増幅核酸断片の一部に相補的な核酸配列からなるプローブ、より好ましくは、配列番号２の配列を有するプローブ）をさらに用いてもよい）、ＶＡＩ遺伝子の破壊率を評価する方法、および、配列番号４の配列を有するフォワードプライマーと配列番号６の配列を有するリバースプライマーを用いて（好ましくは、これらのプライマーにより増幅される断片に特異的な核酸配列からなるプローブ（好ましくは、増幅核酸断片の一部に相補的な核酸配列からなるプローブ、より好ましくは、配列番号５の配列を有するプローブ）をさらに用いてもよい）、ＶＡＩＩ遺伝子の破壊率を評価する方法が提供される。
【００４０】
本発明では、Ｅ１発現細胞とは、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する細胞であり、ＦＧ−ＡｄＶが欠失しているＥ１を補ってアデノウイルスベクターを増殖させることができる細胞である。本発明では、Ｅ１発現細胞としては、例えば、好ましくはＥ１発現ヒト細胞、より好ましくは２９３細胞が用いられる。本発明では、Ｅ１発現細胞は、さらに他の遺伝子、例えば、アデノウイルスの他の初期遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３および／またはＥ４等を発現するように改変されていてもよい。
【００４１】
本発明で用いられる部位特異的組換え酵素を発現する細胞は、特に限定されないが、例えば、好ましくは、部位特異的組換え酵素を発現するヒト細胞であり、より好ましくは、部位特異的組換え酵素を発現するＥ１発現ヒト細胞であり、さらに好ましくは、部位特異的組換え酵素を発現する２９３細胞である。
【００４２】
本発明では、Ｅ１発現細胞は、部位特異的組換え酵素を恒常的に発現する細胞でもよいが、一過的に発現する細胞であってもよい。Ｅ１発現細胞に部位特異的組換え酵素を恒常的に発現させるためには、部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子を、例えば、ＣＡＧプロモーターおよびＥＦ１αプロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結させたＤＮＡで細胞を形質転換することができる。また、Ｅ１発現細胞に部位特異的組換え酵素を一過的に発現させるためには、部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子を、テトラサイクリンを用いた誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターに作動可能に連結させたＤＮＡで細胞を形質転換することができる。本明細書では、誘導性プロモーターは、誘導因子存在下でのみ、または、誘導因子非存在下でのみ遺伝子を発現するプロモーターを意味する。このような誘導性プロモーターは、発現させたい遺伝子が細胞毒性を有するときなどに有用である。部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子を含む遺伝子は、部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドＤＮＡをＥ１発現細胞にトランスフェクションあるいはリポソーム等を用いて導入することができる。あるいは、部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子を含む遺伝子は、部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子を搭載したウイルスベクター（アデノウイルスベクターを除く）、例えばアデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）ベクターを用いて導入してもよい。アデノ関連ウイルスベクターは、本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターとは、ウイルス粒子の大きさや比重の点で大きく異なるため、容易に本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターから分離することができる。
【００４３】
本発明の方法によれば、ウイルス力価が１×１０７（ｒＶＴ／ｍＬ）以上、好ましくは４×１０７（ｒＶＴ／ｍＬ）〜７×１０７（ｒＶＴ／ｍＬ）、またはそれ以上である、本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを含んでなるウイルス液が得られる。従って、本発明によれば、ウイルス力価が１×１０７（ｒＶＴ／ｍＬ）以上であり、例えば、４×１０７（ｒＶＴ／ｍＬ）〜７×１０７（ｒＶＴ／ｍＬ）またはそれ以上である、本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを含んでなる遺伝子導入用組成物が提供される。本発明ではまた、得られたウイルス液をポリエチレングリコール法または塩化セシウム密度勾配遠心法などの当業者に知られた簡便な方法で精製することにより、特に限定されないが、１×１０８（ｒＶＴ／ｍＬ）〜１×１０９（ｒＶＴ／ｍＬ）、または１×１０８（ｒＶＴ／ｍＬ）〜１×１０１０（ｒＶＴ／ｍＬ）の力価を有するウイルス液およびウイルス液を含んでなる遺伝子導入用組成物を得ることができる。本発明に遺伝子導入用組成物は、本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを安定に保持するための成分、例えば、緩衝剤および分解保護剤（例えば、核酸分解酵素阻害剤）、並びに、酸化防止剤、静菌剤およびｐＨ調整剤などを含有していてもよい。
【００４４】
本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターの力価（ｒＶＴ／ｍＬ）は、例えば、以下のように測定することができる。すなわち、本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターの力価（ｒＶＴ／ｍＬ）は、ベクターが増殖しないＨｕＨ−７細胞またはＨｅＬａ細胞などの細胞を用いた細胞当りのベクター導入コピー数（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ
ｔｉｔｅｒまたはｒｅｌａｔｉｖｅ  ｖｉｒａｌ  ｔｉｔｅｒ：ｒＶＴコピー数／ｍＬ）を指標として測定することができる。アデノウイルスベクターに導入する目的遺伝子が２９３細胞の増殖に影響を及ぼさない場合、アデノウイルスベクターでは、力価（ｒＶＴ／ｍＬ）は、ＴＣＩＤ５０による力価の約５分の１の値である（Pei Z. et. al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2012) 417 (3): 945-950）。
【００４５】
本発明の前駆体ベクターは、大腸菌および酵母等の宿主（特に、微生物宿主）内で自律複製させることができるようにｃｏｌ  Ｅ１などのプラスミド複製開始点ｏｒｉおよびアンピシリン耐性遺伝子Ａｍｐなどの薬剤耐性遺伝子をさらに含んでなる核酸構築物としてもよい。本発明の前駆体ベクターはまた、例えば、酵母内で自立複製させることができるように、酵母組み込み型プラスミドなどの核酸構築物としてもよい。このような核酸構築物としては、例えば、アデノウイルスベクターの作製の際に用いられているコスミド、ＢＡＣおよびＰＡＣなどが挙げられる。例えば、本発明の核酸構築物をコスミドとして提供する場合には、該コスミドは、本発明の前駆体ベクターを構成するアデノウイルスベクターのゲノムと、バクテリオファージのパッケージングに必要なｃｏｓ領域、プラスミド複製開始点ｏｒｉおよびアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）などの薬剤耐性遺伝子とを含んでいてもよい。
【００４６】
本発明の核酸構築物は、好ましくは本発明の前駆体ベクターを構成するアデノウイルスベクターのゲノム部分（ＶＡ遺伝子の破壊や認識配列に挟まれたＶＡ遺伝子の導入などがなされたウイルスゲノム部分に対応する。）の両端に制限酵素サイトを有し、制限酵素によりアデノウイルスベクターのゲノム部分を切り出して部位特異的組換え酵素を発現していないＥ１発現細胞（例えば、２９３細胞）に導入することができる。２９３細胞は、前駆体ベクターのゲノムが導入されると前駆体ベクターを生成する。本発明の核酸構築物は、目的遺伝子の発現ユニットを含んでいても含んでいなくてもよい。目的遺伝子の発現ユニットが含まれていない場合には、所望の目的遺伝子の発現ユニットを導入してから前駆体ベクターのゲノムを切り出すことができる。
【００４７】
本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターは第一世代のアデノウイルスベクターと同様に医薬組成物の有効成分として様々な疾患の遺伝子治療に用いることができる。例えば、そのような医薬組成物としては、疾患の治療および／または予防に有効なタンパク質をコードする遺伝子等が外来遺伝子として導入された本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを含んでなる医薬組成物が挙げられる。本発明の医薬組成物は、例えば、注射剤とすることができ、無菌注射溶液とすることができる。本発明の医薬組成物は、本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを安定に保持するための成分、例えば、緩衝成分および分解保護剤（例えば、核酸分解酵素阻害剤）、並びに、酸化防止剤、静菌剤およびｐＨ調整剤などを含有していてもよい。本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターはＶＡ遺伝子が破壊されていることから、ＶＡ  ＲＮＡの発現に起因する遺伝子治療における様々な懸念（例えば、ＶＡ  ＲＮＡによる細胞内遺伝子発現の抑制効果、または、ＴＬＲおよび／またはＲＩＧ−Ｉを介する炎症などの予測困難な影響など）を実質的に回避することができる。また、第一世代のアデノウイルスベクターでは、２９３細胞株などのＥ１発現細胞株の染色体上のＥ１遺伝子がアデノウイルスベクターに取り込まれることがある。Ｅ１遺伝子が取り込まれたアデノウイルスベクターは、標的細胞（例えば、ヒト細胞）内で複製が可能となり、遺伝子治療においては安全性担保の観点で障害となる。本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子を取り込んだとしても標的細胞内で複製することはほとんどできないため、より安全な遺伝子治療を可能とする。このように、本発明はより安全な遺伝子治療の実用化の途を拓くものである。
【００４８】
本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを遺伝子治療に用いる場合には、治療目的の疾患や標的とする臓器などに応じて、in vivo法（イン・ビボ法）あるいはex vivo法（エクス・ビボ法）を選択することができる。in vivo法とは、通常の医薬品と同様に、アデノウイルスベクターを直接患者に投与する方法である。in vivo法により投与する場合には、患者の静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、または腫瘍内などの対象臓器内に注射器や内視鏡を用いて投与することができる。ex vivo法とは、患者由来または他人由来の細胞を予め体外で調製し、アデノウイルスベクターを用いて遺伝子を導入した後に、治療遺伝子を発現する細胞を患者に投与する方法である。ex vivo法により投与する場合には、例えば、遺伝病患者（例えば、遺伝病小児患者）の細胞を患者から採取して遺伝子導入し、治療遺伝子の発現を測定した後に細胞を患者に投与あるいは移植することができる。この方法は、例えば、骨髄移植を必要とする患者の生命を移植のドナーが見つかるまで維持させるためなどに用いることができる。本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターは、仮に調製中に２９３細胞の細胞からＥ１遺伝子を獲得した場合であっても、感染した動物細胞内では増殖することがない。従って、調製中にＥ１遺伝子を獲得すると感染後増殖可能となり得る従来のＦＧ−ＡｄＶと比較して患者に対する安全性が高いことは明らかである。本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクター用いて遺伝子治療を行う場合は、疾患の治療および／または予防に有効なタンパク質をコードする遺伝子等が外来遺伝子として導入された本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターまたはそれを含んでなる医薬組成物を用いることができる。従って、本発明では、疾患の治療および／または予防に有効なタンパク質をコードする遺伝子等が外来遺伝子として導入された本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターまたはそれを含んでなる医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、遺伝子治療法が提供される。本発明の医薬組成物の患者への投与量は、治療目的の疾患並びに患者の年齢および体重等により適宜調整することができる。通常、本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターは、１０６〜１０１３（ｒＶＴ）、または、１０８〜１０１１（ｒＶＴ）程度を、１回投与、若しくは、数日間の連続投与、または、月に１回程度の投与を行うことにより投与することができる。
【００４９】
本発明によれば、本発明のＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを用いた動物細胞への遺伝子導入方法が提供される。動物細胞は、特に限定されないが、動物、例えば、霊長類および齧歯類などの哺乳類の細胞とすることができる。動物細胞はまた、動物体内の細胞であっても、in vitro（イン・ビトロ）の細胞であってもよい。動物体内の細胞への遺伝子導入は、上記本発明の遺伝子治療におけるin vivo法に準じて行うことができる。
【実施例】
【００５０】
実施例１：第一世代アデノウイルスベクターのＶＡ領域の改変
本実施例では、ＶＡ遺伝子を破壊した第一世代アデノウイルスベクターを取得するために、まず、ベクターの既存のＶＡ領域を破壊し、Ｅ４領域に２つのＦＲＴ配列により挟まれたＶＡ領域を有するＦＧ−ＡｄＶベクター（以下、「ＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶ前駆体ベクター」または単に「前駆体ベクター」ということがある）を作製した。【００５１】
まず、ＡｄＶゲノムを有するコスミドカセットとしては、全長ＦＧ−ＡｄＶゲノムを有するｐＡｘｃｗｉｔ２コスミドカセット（ニッポンジーン社製、製品番号：３１９−０６５６１）を用いた。【００５２】
次に、ｐＡｘｃｗｉｔ２が有する全長ＦＧ−ＡｄＶゲノム上の既存のＶＡ領域の破壊は、常法により、ＡｄＶゲノムのＶＡＩおよびＶＡＩＩのＢ−ｂｏｘ配列をそれぞれ１５ヌクレオチド長および１７ヌクレオチド長欠損させることにより行った（図１Ａ）。具体的には、まず、ｐＡｘｃｗｉｔ２のＢｇｌＩＩ（ヌクレオチド１０４１１位）から  ＮｏｔＩ（ヌクレオチド１１５０４位）までの断片を含むｐＡＦ２８３２ｂｎを作製した。ＶＡＩＩ遺伝子のＢ−ｂｏｘを破壊するために、ｐＡＦ２８３２ｂｎをＳａｎＤＩ及びＲｓｒＩＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を用いて平滑化して結合し、Ｂ−ｂｏｘが破壊されたＶＡＩＩ遺伝子を有するｐＡＦ２８３２ｂｎｄＶＡ２を得た。更に、ＶＡＩ遺伝子のＢ−ｂｏｘを破壊するために、ｐＡＦ２８３２ｂｎｄＶＡ２をＢｓｉＥＩ及びＢａｎＩＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素をもちいて平滑化して結合し、Ｂ−ｂｏｘが破壊されたＶＡＩ遺伝子およびＶＡＩＩ遺伝子を有するｐＡＦ２８３２ｂｎｄＶＡ１ｄＶＡ２を得た。このプラスミドのＸｂａＩ（ヌクレオチド１０５９８位）からＮｏｔＩ（ヌクレオチド１１５０４位）までの断片をｐＡｘｃｗｉｔ２の対応する断片と入れ換え、ＡｄＶゲノムのＶＡＩおよびＶＡＩＩの両方のＢ−ｂｏｘ配列を欠失したコスミドカセットｐＡｘｃｗｉｔ２ｄＶＡ１ｄＶＡ２を作製した。【００５３】
また、既存のＶＡ領域の破壊は、ＡｄＶゲノムのＶＡＩの転写開始点＋１６〜ＶＡＩＩの転写開始点＋１２７の３８１ヌクレオチド長を欠損させることによっても行うことができた（図１Ｂ）。具体的には、上記で得られたｐＡｘｃｗｉｔ２ｄＶＡ１ｄＶＡ２をＥａｒＩ及びＢｓｐＥＩで切断しＫｌｅｎｏｗ酵素をもちいて平滑化して結合して、ＶＡＩの転写開始点＋１６〜ＶＡＩＩの転写開始点＋１２７の３８１ヌクレオチド長を欠損したＡｄＶゲノムを有するｐＡＦ２８３２ｂｎｄＶ１２を得た。このプラスミドを上記と同じ方法でｐＡｘｃｗｉｔ２の対応する断片と入れ換え、ＶＡ領域を破壊したコスミドカセットｐＡｘｃｗｉｔ２ｄＶ１２を作製した。【００５４】
２つの同一方向のＦＲＴ配列により挟まれた機能的なＶＡＩおよびＩＩの断片（ＦＶＦ断片）の作製は以下のように行った。まず、ＶＡとしては、５型アデノウイルス（Ａｄ５）ゲノムのヌクレオチド１０５７６〜１１０３４位に位置するＶＡＩおよびＶＡＩＩの全長（ＶＡＩ転写開始点から４１ヌクレオチド上流からＶＡＩＩ転写終了点の６ヌクレオチド下流までの４６０ヌクレオチドに相当）を含むＤＮＡ断片ＶＡ４１をＰＣＲ法で増幅しｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ部位の間にクローン化して得たプラスミドｐＶＡ４１のＶＡを用いた。さらに、不要なスプライシングが生じるのを防ぐため、ＶＡＩの２９ヌクレオチド上流のスプライスアクセプター部位のＴは常法によりＣに置き換えて、プラスミドｐＶＡ４１ｄａを得た（図１Ｃ）。次に、機能的なＶＡＩおよびＶＡＩＩ（図１Ｃ）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩにより切り出して、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を用いて平滑末端化した。その後、ｐＵＦｗＦプラスミド（５型アデノウイルスの末端から１６５ヌクレオチドのＥ４領域にある制限酵素ＳｗａＩ切断部位を介してＦＲＴ配列を直列に２つ組み込んだｐＵＣ１８プラスミドである。Nakano et. al, Nucleic Acids Res. (2011) 29: E40を参照）のＦＲＴ配列の間に平滑末端化した機能的なＶＡＩおよびＶＡＩＩを組み込み、ＦＶＦ断片を有するプラスミド（ｐＵＦＶＡ４１ｄａＦ）を得た。なお、ＶＡＩ遺伝子及びＶＡＩＩ遺伝子は、その配列内部にあるプロモーターにより転写される。【００５５】
ＦＶＦ断片は、制限酵素Ｅｃｌ１３６ＩＩ（ファーメンタス社、平滑末端を生ずる）−ＡｃｃＩにより切り出した。また、Ｂ−ｂｏｘが破壊されたＶＡ領域を有するｐＡｘｃｗｉｔ２コスミドカセットのＥ４領域の制限酵素ＳｎａＢＩ切断部位を合成リンカーを用いて改変して得たＳｗａＩ切断部位（Kanegae Y. et. al., Nucleic Acids Res. (2010) 39: e7を参照）に更に制限酵素Ｉ−ＰｐｏＩ（プロメガ社）−ＣｌａＩ切断部位を含む合成ＤＮＡを導入しｐＡｘｃｗ４ｉｃｉｔ２ｄＶＡ１ｄＶＡ２を作製した。このコスミドカセットをまずＩ−ＰｐｏＩで切断しＫｌｅｎｏｗ酵素を用いて平滑末端化した後にＣｌａＩで切断し、ＣｌａＩ切断末端がＡｃｃＩ切断末端と結合可能であることを利用しＦＶＦ断片を挿入して、コスミドカセット（ｐＡｘｄＶ−４ＦＶＦ）を得た（図３Ｂ参照）。また、ＦＶＦ断片は、同様に制限酵素ＳａｃＩ−ＳａｌＩにより切り出して、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を用いて平滑末端化した。その後、ＶＡ遺伝子の３８１ヌクレオチドを欠損させたＶＡ領域を有するｐＡｘｃｗｉｔ２コスミドカセットの当該欠損部位に導入して、別のコスミドカセット（ｐＡｘｄＶ−ＦＶＦ）を得た。このようにして得られたコスミドカセット（ｐＡｘｄＶ−４ＦＶＦ）は、Ｅ１領域に存在する制限酵素ＳｗａＩ切断部位を利用して、所望の目的遺伝子を含む発現ユニットを組み込むことが可能である。ＡｄＶベクターによる宿主内での免疫応答を低減させるため、本実施例では、目的遺伝子とプロモーターを含む発現ユニットは左向き方向に（すなわち、転写開始点をＥ２側に向けて）導入した。【００５６】
本実施例ではまず、ｐＥＦＧＦＰ（Kanegae Y. et. al., Nucleic Acid Res. (2011) 39 (2): e7）を用いて作製したＥＦ１αプロモーターで駆動されるＧＦＰ発現ユニットを制限酵素ＳａｌＩ−ＰｍｅＩにより切断し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑末端化した後に、Ｅ１のＳｗａＩ切断部位に挿入して、前駆体ベクターコスミド（ｐＡｘｄＶ−４ＦＶＦ−ＧＦＰ）を作製した。【００５７】
目的遺伝子としてはＧＦＰの他に、ＮＣｒｅおよびＣｈｅ（Ｃｈｅｒｒｙ；クロンテック社製）をコードする遺伝子を用いた。ｐｘＣＡＮＣｒｅ(Kanegae et. al., Gene (1996) 188: 207-212)を用いて作製したＥＦ１αプロモーターで駆動されるＮＣｒｅ発現ユニットは、制限酵素ＳａｌＩ−ＰｍｅＩにより切断し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑末端化した後にＧＦＰと同様にＥ１領域のＳｗａＩ切断部位に導入した。Ｃｈｅ（Ｃｈｅｒｒｙ；クロンテック社製）を用いて作製したＳＲαプロモーターで駆動されるＣｈｅｒｒｙ発現ユニットは、以下のように作製した。ｐＣＤＬ−ＳＲα（Takebe et al., Mol. Cell. Biol. (1988) 8: 466-472）をＰｓｔＩ及びＫｐｎＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑末端化した後にＳｗａＩ合成リンカーを挿入した。このＳｗａＩ部位に上述のＣｈｅｒｒｙ  ｃＤＮＡを挿入したプラスミドｐＣＤＬ−ＳＲＣｈｅを作製した。Ｃｈｅｒｒｙ発現単位は、ＳａｌＩで切り出しＫｌｅｎｏｗ酵素により平滑末端化した後、Ｅ４領域上流のＳｎａＢＩ切断部位に挿入した時と同じ方法で、上記のＩ−ＰｐｏＩ−ＣｌａＩ切断部位を含む合成ＤＮＡをアデノウイルスベクターに導入した。【００５８】
得られたコスミドカセット内の前駆体ベクターゲノムは、制限酵素ＰａｃＩにより切り出して細胞にトランスフェクションすることにより、目的遺伝子としてそれぞれＧＦＰ、ＮＣｒｅおよびＣｈｅを含む前駆体ベクターＡｘｄＶ−４ＦＶＦ−ＧＦＰ、ＡｘｄＶ−４ＦＶＦ−ＮＣｒｅおよびＡｘｄＶ−ＦＶＦ−４ＳＲＣｈｅを得ることができる。【００５９】
実施例２：ＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶ前駆体ベクターの増幅とＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターの取得
本実施例では、実施例１で作製したＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶ前駆体ベクターを２９３細胞で増殖させ、その後、Ｆｌｐ発現細胞を用いて部位特異的組換え反応を誘導して前駆体ベクターからＶＡＩおよびＶＡＩＩを除去した。【００６０】
２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて培養した。【００６１】
実施例１で得られた前駆体ベクターゲノムを制限酵素ＰａｃＩにより切り出して２９３細胞にトランスフェクションした。感染後、２回継代して、前駆体ベクターＡｘｄＶ−４ＦＶＦ−ＧＦＰ、ＡｘｄＶ−４ＦＶＦ−ＮＣｒｅおよびＡｘｄＶ−ＦＶＦ−４ＳＲＣｈｅを回収した。【００６２】
次に、得られた前駆体ベクターをＦｌｐ発現細胞である２９３ｈｄｅ１２細胞（Kondo et al., J Molec. Biol. (2009) 390: 221-230）に多重感染度（ＭＯＩ）１０（１０コピー／細胞）にて感染させ、部位特異的組換え酵素反応によりＶＡ遺伝子を除去してＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターＡｘｄＶ−４Ｆ−ＧＦＰ、ＡｘｄＶ−４Ｆ−ＮＣｒｅおよびＡｘｄＶ−Ｆ−４ＳＲＣｈｅを得た。このＦｌｐによるＦＲＴ部位の組み換えでは、前駆体ベクター内の２つのＦＲＴに挟まれた領域（ＶＡＩおよびＶＡＩＩ）と一つのＦＲＴが除去され、ウイルスゲノムにはＥ４領域に一つのＦＲＴのみが残ることとなる（図２Ａ〜Ｄ）。なお、２９３ｈｄｅ１２細胞は、ＣＡＧプロモーターの制御下で駆動されるヒト型Ｆｌｐを含む発現ユニット（Kondo et al., J Molec. Biol. (2009) 390: 221-230）をトランスフェクションにより２９３細胞に導入して得られた、Ｆｌｐを恒常的に発現する２９３細胞である。また、ヒト型Ｆｌｐとは３７℃で安定なＦｌｐ遺伝子のアミノ酸配列を変えずにコドンをヒト遺伝子で最もよく使われている塩基に変えたＦｌｐ遺伝子である。２９３ｈｄｅ１２細胞は、感染前は５％ＦＣＳおよび０．７５ｍｇ／ｍＬのジェネティシンを添加したＤＭＥＭ中で培養し、感染後はジェネティシンを抜いた培地で培養した。【００６３】
実施例３：得られたＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターのＶＡ遺伝子破壊成功率
本実施例では、実施例２で得られたＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターのＶＡ遺伝子破壊成功率を評価した。【００６４】
実施例２でＶＡの破壊成功率を確認するために、まず、実施例２で得られたＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターを回収し、ｒＶＴ  ＭＯＩ  １０の感染条件でＨｕＨ−７細胞に感染させた。その後、ＰｓｔＩ−ＢｓｐＩプローブ（ヌクレオチド３３８７９〜３５０５０位）によりウイルスゲノムの組換え状態を確認した。すると、２．８ｋｂのＦＧ−ＡｄＶ前駆体ベクターのバンドは、Ｆｌｐによる組み換え後、２．３ｋｂのＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターのバンドの位置に完全にシフトしていた（図４Ａ）。ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターの前駆体ベクター（ＡｘｄＶ−ＦＶＦ−ＧＦＰ）を用いた場合でも同様の結果が得られた（データ示さず）。このことは、Ｆｌｐによる組み換えにより、ＶＡＩおよびＶＡＩＩが極めて効率良く前駆体ベクターゲノムから除去されたことを示す。ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクター（ＡｘｄＶ−４Ｆ−ＧＦＰ）およびその前駆体ベクター（ＡｘｄＶ−４ＦＶＦ−ＧＦＰ）のＥ４領域の配列はそれぞれ図３ＡおよびＢに示す。【００６５】
さらに、ノーザンブロット法を用いて、実施例２で得られたＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターのＶＡ  ＲＮＡ  Ｉの発現を確認した。まず、ＨｕＨ−７細胞（理化学研究所バイオリソースセンター、細胞番号：RCB1366）を６ｃｍディッシュに播種して、得られたウイルスおよび前駆体ベクターをｒＶＴ  ＭＯＩ  ２０の感染条件で感染させた。感染３日後にNucleoSpin miRNA （タカラバイオ社製、製品番号：MNA-740971.50）を用いて２００塩基以下のＲＮＡを含む全細胞ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ２０μｇずつをアガロースゲルで電気泳動した。２時間の電気泳動後、ＲＮＡをナイロン膜Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（アマシャムＧＥ社製）に転写し、ＤＩＧＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Roche Diagnostics社製）を用いて検出した。ＶＡ  ＲＮＡ  ＩのプローブとしてはＸｂａＩ−ＮｈｅＩプローブ（ヌクレオチド１０５８９〜１０８０９位）（図１Ｃ参照）を用いた。すると、ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターでは、ＶＡ  ＲＮＡ
Ｉは、ほとんどその発現が確認できないレベルにまで発現量が低下していた（図４Ｂ）。ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターの前駆体ベクター（ＡｘｄＶ−ＦＶＦ−ＧＦＰ）を用いた場合でも同様の結果が得られた（データ示さず）。【００６６】
次に、それぞれのベクターからのＶＡ  ＲＮＡ  ＩおよびＩＩの産生量を測定するため、ＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターとその前駆体ベクターをそれぞれ２９３細胞に感染させ、各ＲＮＡの定量的ＰＣＲを試みた。【００６７】
しかしながら、ＶＡ  ＲＮＡ  ＩおよびＩＩは、配列が１３０塩基長程度と短く、また、溶液中ではクローバー様の安定な高次構造を形成するため、ＶＡ  ＲＮＡ  ＩおよびＩＩのＰＣＲ増幅は困難を極めた。実際、作成したプライマーセットのいくつかはＰＣＲ増幅に用い得るものではなかった。発明者らは鋭意検討の結果、ＶＡ  ＲＮＡ  ＩおよびＩＩのＰＣＲ増幅が可能なプライマーセットを見出し、ＶＡ  ＲＮＡ  ＩおよびＩＩのＰＣＲ増幅に成功した。【００６８】
そこで、ＰＣＲ増幅に成功したプライマーを用いて定量的ＰＣＲを行った。具体的には、ＶＡＩのＲＮＡの検出用には配列番号１および配列番号３の配列を有するプライマー並びに配列番号２の配列を有するプローブを用い、ＶＡＩＩのＲＮＡの検出用には配列番号４および配列番号６の配列を有するプライマー並びに配列番号５の配列を有するプローブを用いた（図１Ｃ）。定量的ＰＣＲは、感染３日後のＨｕＨ−７細胞からノーザンブロット法におけるＲＮＡ抽出法と同じ方法でNucleoSpin miRNAを用いてＲＮＡを抽出し、定量的ＰＣＲ装置（Applied Biosystems社製、製品番号：Prism 7000）を用いて解析した。測定対象のＲＮＡの量は、製造者マニュアルに従い、内部対照として１８Ｓ−ｒＲＮＡを用いて標準化して求めた。【００６９】
結果は、表２に示される通りであった。【００７０】
【表２】
2014050927.tif 000003
【００７１】
表２に示されるように、各ＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターから産生されるＶＡ  ＲＮＡ  ＩおよびＩＩの量は、対応する前駆体ベクターからの産生量と比較して大幅に減少していた。この結果から、各ＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターには、ＶＡ遺伝子未破壊のベクターはほとんど混入していないことが予想される。【００７２】
さらに、ＨｕＨ−７細胞にＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターとその前駆体ベクターを感染させ、それぞれのベクターからのＧＦＰの産生量をその蛍光を指標として測定し、その比率を求めた。ＧＦＰの蛍光は、Fluoroscan Ascent FL (Baiosystem社)により測定した。また、ＧＦＰのｍＲＮＡの産生量の比率は、定量的ＰＣＲにより測定して求めた。ＧＦＰのｍＲＮＡの検出には、配列番号７および９の塩基配列を有するプライマー並びに配列番号８の配列を有するプローブを用いた。【００７３】
結果は表３に示される通りであった。【００７４】
【表３】
2014050927.tif 000004
【００７５】
表３に示されるように、ＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターはその前駆体ベクターに匹敵する量のＧＦＰを産生していることが分かった。【００７６】
このことから得られたＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターは、確かにＶＡＩおよびＩＩを欠損していること、および、目的遺伝子の細胞への導入効率が非欠損のベクターと同等程度であることが示された。【００７７】
実施例４：得られたＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターの力価測定
本実施例では、実施例２で得られたＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターと通常のＦＧ−ＡｄＶベクター（対照）の力価をそれぞれ測定し、比較した。【００７８】
ウイルスの力価は、ｒＶＴ力価測定法（前記のPei, BBRC, 2012）により測定した。ｒＶＴ力価測定法では、リアルタイムＰＣＲを用いて、感染細胞中に導入されたウイルスゲノムのコピー数（ｒＶＴ／ｍＬ）が測定される。【００７９】
ｒＶＴ力価測定法による力価測定の結果は、表４に示される通りであった。
【表４】
2014050927.tif 000005
【００８０】
表４に示されるように、ＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターの力価（ｒＶＴ）は、その対応する前駆体ベクターの力価の９〜２０％程度であり、実用レベルの高い力価を示した。なお、ポジティブコントロールとして用いたＦＧ  ＡｄＶのＡｘＥＦＧＦＰの力価は８．３×１０８（ｒＶＴ／ｍＬ）であった。２９３細胞を用いて測定した場合、ｒＶＴによる力価は、ＴＣＩＤ５０の約５分の１の値となることが知られている。なお、ＡｘＥＦＧＦＰは、コスミドカセットｐＡｘＥＦｗｉｔ２（ニッポンジーン社製）のＳｗａＩ切断部位にＥＦ１αプロモーターに作動可能に連結したＧＦＰをクローンして得た構築物である。【００８１】
以上のように、ＶＡ遺伝子を有するプレウイルスを増殖させた後に、部位特異的組み換え反応を用いてＶＡ遺伝子を除去することで、実用レベルの高力価を有するＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターを作製することに成功した。また、得られたＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターは、ＦＧ−ＡｄＶの代替として十分利用可能であることが示唆された。
さらに、得られたＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターの力価（４〜７×１０７（ｒＶＴ／ｍＬ）あるいは（Transduction Unit））は、ＦＧ−ＡｄＶと比較して５分の１〜１０分の１程度であった。また、調製に用いたシャーレの枚数から計算した細胞数と導入力価に基づけば、得られたＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターの力価は、非特許文献３のＶＡ遺伝子破壊ＦＧ−ＡｄＶベクターの力価と比較して約１００倍であると推定された。【００８２】
ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターは、細胞内に高濃度で存在させると、ＶＡ遺伝子を欠いた状態でもわずかながら増殖する能力を示した（データ省略）。そして、このことは、前駆体ベクターを十分に増殖させた後にＶＡ遺伝子を除去する方法が、ＶＡ遺伝子破壊アデノウイルスベクターを高力価で大量に得ることに適していた一つの要因であると考えられる。
【図１−２】
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【図１−１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2014050927.tif 000013
2014050927.tif 000014
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