(57)【要約】  【課題】従来のＦＩＳＨ法で用いられるプローブセットは、オレンジ色の蛍光色素で標識された標識プローブと緑色の蛍光色素で標識された標識プローブとがある程度離れて位置しているため、標的核酸が切断されていない場合であっても、蛍光顕微鏡と標的核酸との相対的な位置・角度によっては黄色の蛍光ではなく、オレンジ色と緑色の蛍光がそれぞれ観測され、標的核酸が切断されていると誤判断を生じさせてしまう可能性があるという課題があった。【解決手段】異なる識別因子で標識された２つ以上の標識プローブ５ａ、５ｂからなり、標的核酸１のほぼ全配列とハイブリダイゼーションできるプローブセット５を含むハイブリダイゼーション液と、標的核酸とを接触させる工程と、識別因子を機能させてシグナルを出させる工程とからなる。  【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの切断点を含む切断領域を有する標的核酸配列が切断されているか否かを判別する核酸配列の切断標識方法であって、
異なる識別因子で標識された２つ以上の標識プローブからなり、当該標的核酸のほぼ全配列とハイブリダイゼーションできるプローブセットを含むハイブリダイゼーション液と、当該標的核酸と、を接触させる工程と、
当該識別因子を機能させてシグナルを出させる工程と、
を有することを特徴とする核酸配列の切断標識方法。
【請求項２】
前記標識プローブの少なくとも１つが前記核酸配列の切断領域にハイブリダイゼーションすることを特徴とする請求項１に記載の核酸配列の切断標識方法。
【請求項３】
前記核酸配列は少なくとも１つの重要部をさらに有し、
前記核酸配列の切断領域にハイブリダイゼーションする標識プローブと、
前記切断領域に対して前記重要部を挟むように位置する前記核酸配列の部分にハイブリダイゼーションする標識プローブとが、異なる標識プローブであること
を特徴とする請求項２に記載の核酸配列の切断標識方法。
【請求項４】
前記プローブセットが異なる識別因子が混ざった状態で標識された混合部を有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の核酸配列の切断標識方法。
【請求項５】
前記混合部が前記重要部の一部または全部とハイブリダイゼーションすることを特徴とする請求項４に記載の核酸配列の切断標識方法。
【請求項６】
同じ識別因子で標識された単独または複数の標識プローブが当該標的核酸のほぼ全配列とハイブリダイゼーションすることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の核酸配列の切断標識方法。
【請求項７】
前記異なる識別因子が異なる色の色素であり、
前記識別因子を機能させてシグナルを出させる工程が当該色素に光を照射して発色させる工程であり、
当該シグナルを検出する工程が当該発色を検出する工程であること
を特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の核酸配列の切断標識方法。
【請求項８】
前記異なる識別因子が異なる蛍光色を発する蛍光色素であり、
前記識別因子を機能させてシグナルを出させる工程が当該蛍光色素を蛍光させる工程であり、
当該シグナルを検出する工程が当該蛍光を検出する工程であること
を特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の核酸配列の切断標識方法。
【請求項９】
前記色素が修正マンセル修正表色系において２つの異なる色相の発色するものまたは蛍光色素が修正マンセル修正表色系において２つの異なる色相の蛍光色を発するものからなり、
前記切断点が、当該異なる色相のうち、当該色相と修正マンセル色相環の中心点とを結ぶ直線と、当該２つの異なる色相を混色させた際の当該混色の色相と修正マンセル色相環の中心点とを結ぶ直線とがなす角の大きい方の色相の色素または蛍光色素で標識されている部分に対応する核酸配列にあること
を特徴とする請求項７または８に記載の核酸配列の切断標識方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸が切断されているか否かを標識する核酸配列の切断標識方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の塩基配列や遺伝子を可視的に位置づける方法として、fluorescence in situ hybridization（ＦＩＳＨ法）およびChromogenic in situ Hybridization（ＣＩＳＨ）法などが知られている。【０００３】
ＦＩＳＨ法とは、クローン化された遺伝子やＤＮＡ断片等を蛍光色素等で標識したプローブＤＮＡを、スライドグラス上の染色体ＤＮＡとハイブリダイゼーションし、蛍光顕微鏡等を用いて、その分子雑種成部を蛍光シグナルとして直接染色体上に検出する方法である。ＦＩＳＨ法は、従来のオートラジオグラフィー法と比較して、放射性物質を使用しないため、安全でかつ簡便で、しかも短時間で結果を得られるという点で優れている。また、ＣＩＳＨ法とは、ＤＡＢなどの色素(chromogen)を用いて、組織標本上でＤＮＡやｍＲＮＡを検出する方法である。ＦＩＳＨ法のように蛍光色素を用いていないので、蛍光顕微鏡下で行う必要がなく、光学顕微鏡下で観察できるという特徴がある。【０００４】
上述したＦＩＳＨ法の応用例の１つとして、色調が異なる蛍光色（例えば、オレンジ色、緑色、黄色など）を発する蛍光色素で標識した２種類以上のプローブＤＮＡを用い、それらを同時に蛍光させて染色体をマッピングするというものがある。【０００５】
また、このようなＦＩＳＨ法の特徴を利用した癌組織の検出方法が提案されている（例えば、特許文献１および２参照）。これらの検出方法は、ＦＩＳＨ法と他の検出方法とを組み合わせることにより、高精度で癌診断を行うというものや制癌剤治療の有効性を正確に判定するというものである。【０００６】
さらに、ＦＩＳＨ法を利用した癌の診断方法が研究・開発されている。具体的には、癌細胞において、相互転座（translocation）、挿入（insertion）、逆位（inversion）などによる染色体異常が観察されることが知られている。このような染色体異常は、ＤＮＡレベルでの遺伝子の分断とつなぎ合わせが起こり、通常は存在しない遺伝子（融合遺伝子）が形成されることにより生じると考えられている。そこで、ＦＩＳＨ法を用いて、癌に特有の融合遺伝子を特定し、その融合遺伝子を検出することにより癌を診断するという方法がある。【０００７】
ここで、ＦＩＳＨ法の具体的な例として、ビオチンを標識とするＦＩＳＨ法（間接法）の概略を図１９に示す。まず、ビオチン−ｄＵＴＰ（例えば、Roche Applied Science社製：ビオチン−１−ｄＵＴＰなど）を用いてプローブＤＮＡを標識して（Ｓ１）、ビオチン標識ＤＮＡを作製する。その後、そのビオチン標識ＤＮＡを熱変性させる（Ｓ２）。同時に、染色体標本についても熱変性させ、一本鎖ＤＮＡを調整しておく（Ｓ３）。【０００８】
次に、一本鎖ＤＮＡとビオチン標識ＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせ、それぞれのＤＮＡを相補的に結合させる（Ｓ４）。そして得られたビオチン標識ＤＮＡと染色体ＤＮＡとの二本鎖を洗浄した後、ビオチンとの親和性の高いアビジン−ＦＩＴＣ（例えば、Roche Applied Science社製：ＡＰ標識ストレプトアビジンなど）溶液で処理する（Ｓ５）。これを所定の洗浄液で洗浄した後染色体ＤＮＡを蛍光染色し、蛍光顕微鏡を用いてその染色体上の座位を蛍光シグナルとして観察する。このようにして、染色体上の分子雑種成部を蛍光シグナルとして直接染色体上に検出することができるのである。【０００９】
ここで、２種類の蛍光色素で標識する場合におけるＦＩＳＨ法に用いられるプローブセットについて説明する。通常、ＦＩＳＨ法が用いられる標的ＤＮＡ１０１には、図２０に示すように、その標的ＤＮＡ１０１が切断される切断点が含まれる切断領域１０２と、例えば病態生理学的に重要な重要部１０３とが含まれている。そして、このような標的ＤＮＡ１０１に対応するプローブセット１０５は、標的ＤＮＡ１０１の切断領域１０２を挟むように位置するＤＮＡとハイブリダイゼーションする２つの標識プローブ１０５ａ、１０５ｂで構成されている。標識プローブ１０５ａはオレンジ色の蛍光色素で標識され、標識プローブ１０５ｂは緑色の蛍光色素で標識されている。なお、標的ＤＮＡ１０１の長さは、通常、標識プローブ１０５ａ、１０５ｂの数倍（数百ｋｂ）以上ある。【００１０】
このプローブセット１０５を用いて、標的ＤＮＡ１０１が存在している環境下でＦＩＳＨ法を行い、蛍光顕微鏡を用いてその蛍光シグナルを観察すると、標的ＤＮＡ１０１が切断されていない場合には、標的ＤＮＡ１０１の切断領域１０２を挟むように位置するＤＮＡが互いに近傍に位置することになる。すると、その標的ＤＮＡ１０１の切断領域１０２を挟むように位置するＤＮＡと結合した標識プローブ１０５ａ、１０５ｂも互いに近傍に位置することになる。その結果、切断されていない標的ＤＮＡ１０１を蛍光顕微鏡で観察すると、オレンジ色の蛍光と緑色の蛍光とが重なった黄色の蛍光が観測されることになる。【００１１】
一方、相互転座等により標的ＤＮＡ１０１が切断されて２つの標的ＤＮＡ片に分割されている場合には、それらの標的ＤＮＡ片が互いに離れた場所に位置することが多いため、標的ＤＮＡ１０１の近傍に位置するＤＮＡと結合した標識プローブ１０５ａ、１０５ｂもある程度離れて位置することが多くなる。その結果、切断されている標的ＤＮＡを蛍光顕微鏡で観察すると、オレンジ色の蛍光と緑色の蛍光とが重なることはほとんど無く、それぞれの蛍光が別個に観測されることになるか、標的ＤＮＡ片のいずれか一方が観測領域外に出てしまったり、標的ＤＮＡ片のいずれか一方が欠損して消滅してしまうことにより、残りの標的ＤＮＡ片の近傍に位置する標識プローブの蛍光のみが観測されることになる。【００１２】
したがって、従来のＦＩＳＨ法を用いて、相互転座等により切断される可能性がある標的ＤＮＡ１０１を観測すると、基本的には、オレンジ色の蛍光および緑色の蛍光またはこれらのいずれか一方と、黄色の蛍光とが観測されることになる。【００１３】
以上、ＦＩＳＨ法を例にとって説明したが、ＣＩＳＨ法も同様である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００４−１５７０５３
【特許文献２】特表２００２−５４２７９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、従来のＦＩＳＨ法で用いられるプローブセット１０５では、図２０に示すように、標的ＤＮＡ１０１の切断領域１０２を挟むように位置するＤＮＡと標識プローブ１０５ａ、１０５ｂとがそれぞれ結合することになる。したがって、オレンジ色の蛍光色素と緑色の蛍光色素もある程度離れて位置することになるため、標的ＤＮＡ１０１が切断されていない場合であっても、蛍光顕微鏡と標的ＤＮＡ１０１との相対的な位置・角度によっては黄色の蛍光ではなく、オレンジ色と緑色の蛍光がそれぞれ観測されてしまうことがあるという問題があった。【００１６】
その結果、蛍光顕微鏡で得られた蛍光を分析する際に、オレンジ色の蛍光、緑色の蛍光および黄色の蛍光が観測されるため、切断されていない標的ＤＮＡ１０１が切断されているものと誤認されてしまう可能性があるという問題点があった。この問題については、標識プローブ１０５ａと標識プローブ１０５ｂとの距離が大きくなるほど誤認される可能性が大きくなるという傾向がある。これは、ＣＩＳＨ法の場合も同様に当てはまる。【００１７】
また、従来のＦＩＳＨ法で用いられるプローブセット１０５では、標的ＤＮＡ１０１が切断されているということは、オレンジ色の蛍光と緑色の蛍光が離れて位置することで判断されることになる。したがって、プローブセット１０５では、図２０に示すように、標的ＤＮＡ１０１が、切断領域１０２に含まれる切断点１０７で切断されているのか、切断領域１０２に含まれない切断点１０８で切断されているのかを判断することができないという問題点があった。【００１８】
これは、例えば癌の診断としてＦＩＳＨ法が用いられる場合に大きな問題となる。すなわち、このようなプローブセット１０５を用いたＦＩＳＨ法を行って癌の診断をすると、病態生理学的に意義のある切断（例えば切断領域１０２に含まれる切断点１０７での切断に相当する。）によって切断された標的ＤＮＡの蛍光なのか、病態生理学的に意義の薄い切断（例えば切断領域１０２に含まれない切断点１０８での切断に相当する。）によって切断された標的ＤＮＡの蛍光なのかを判断できないことになる。その結果、癌の診断の結果として、本当は陰性であるのに、陽性であると誤判断されてしまうという問題点があった。【００１９】
なお、市販されているプローブセットの説明書には、標的ＤＮＡが切断されていない場合でもオレンジ色の蛍光と緑色の蛍光が低い確率で観測されることがあるが、どの程度の割合で標的ＤＮＡが切断されているのかいないのかの判断については、各取扱者がその判定基準を確立するのが望ましいと記載されているものもある。【００２０】
本発明は、上述した事情に鑑み、ＦＩＳＨ法またはＣＩＳＨ法等を用いた際に、蛍光顕微鏡と標的ＤＮＡとの相対的な位置・角度によらず、その蛍光または発色の色を観察した際に、切断されていない標的ＤＮＡが切断されているものと誤認されるのを防止することができる標的核酸の切断標識方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の発明者は、この問題に関して鋭意研究を続けた結果、以下のような画期的な標的核酸の切断標識方法を見出した。【００２２】
上記課題を解決する本発明の第１の態様は、少なくとも１つの切断点を含む切断領域を有する標的核酸配列が切断されているか否かを判別する核酸配列の切断標識方法であって、異なる識別因子で標識された２つ以上の標識プローブからなり、標的核酸のほぼ全配列とハイブリダイゼーションできるプローブセットを含むハイブリダイゼーション液と、標的核酸と、を接触させる工程と、識別因子を機能させてシグナルを出させる工程と、を有することを特徴とする核酸配列の切断標識方法である。【００２３】
かかる第１の態様では、異なる識別因子で標識された２つ以上のプローブセットが標的核酸のほぼ全配列にハイブリダイゼーションすることになるので、標的核酸が切断されていない場合には、少なくとも２つの異なる識別因子の混ざった（重なった）シグナル（例えば、ＦＩＳＨ法でオレンジ色と緑色の２色の蛍光色素を用いた場合には、黄色の蛍光）が観測されることになる。【００２４】
一方、標的核酸が切断されて標的核酸片に分割されている場合には、例えば、少なくとも２つの異なる識別因子のまざったもの（例えば、ＦＩＳＨ法でオレンジ色と緑色の２色の蛍光色素を用いた場合には、黄色の蛍光）と、いずれかの識別因子のシグナル（例えば、ＦＩＳＨ法でオレンジ色と緑色の２色の蛍光色素を用いた場合には、オレンジ色の蛍光または緑色の蛍光のいずれか）の２色の蛍光が観測されることになるか、標的核酸片のいずれか一方が観測領域外に出てしまったり、標的核酸片のいずれか一方が欠損して消滅してしまうことにより、残りの標的核酸片の識別因子のシグナル（例えば、ＦＩＳＨ法でオレンジ色と緑色の２色の蛍光色素を用いた場合には、オレンジ色の蛍光、緑色の蛍光または黄色の蛍光のいずれか）が観測されることになる。【００２５】
なお、標的核酸が切断されていない場合に、フィルター等（画像処理技術を含む。）を通して黄色の蛍光を観測すると、黄色の蛍光の近傍にオレンジ色の蛍光および緑色の蛍光が観測される。【００２６】
したがって、本発明の第１の態様を用いると、標的核酸が切断されていない場合には識別因子の混ざったシグナルが観測され、標的核酸が切断されている場合には、従来のＦＩＳＨ法とは異なり、識別因子の混ざったシグナルと識別因子のいずれかのシグナルの２つのシグナルが観測されるか、または識別因子のいずれか一方のシグナルまたは識別因子の混ざったシグナルが観測されることになるので、切断されていない標的核酸が切断されているものと誤認されるのを防止することができる。【００２７】
また、プローブセットが標的核酸のほぼ全配列とハイブリダイゼーションすることになるので、切断されていない標的核酸の識別因子のシグナルの量（色、強度など）と、切断されている標的核酸の識別因子のシグナルの量を比較することにより、標的核酸の切断位置を推定することができる。【００２８】
本発明の第２の態様は、標識プローブの少なくとも１つが前記核酸配列の切断領域にハイブリダイゼーションすることを特徴とする第１の態様に記載の核酸配列の切断標識方法にある。【００２９】
かかる第２の態様では、前記第１の態様で得られる効果に加え、核酸配列が切断領域で切断されているのか、それ以外のところで切断されているのかをより明確に判断することができる。【００３０】
本発明の第３の態様は、核酸配列は少なくとも１つの重要部をさらに有し、核酸配列の切断領域にハイブリダイゼーションする標識プローブと、切断領域に対して重要部を挟むように位置する核酸配列の部分にハイブリダイゼーションする標識プローブとが、異なる標識プローブであることを特徴とする第２の態様に記載の核酸配列の切断標識方法である。【００３１】
かかる第３の態様では、核酸配列が重要部ではない切断点で切断されているのか、それ以外のところで切断されているのかを判断することができる。【００３２】
本発明の第４の態様は、プローブセットが異なる識別因子が混ざった状態で標識された混合部を有することを特徴とする第１から３の態様のいずれかに記載の核酸配列の切断標識方法である。【００３３】
かかる第４の態様では、標的核酸が切断されて標的核酸片に分割されている場合にプローブセットとハイブリダイゼーションさせると、少なくともいずれか一方の標的核酸片には、標識因子のいずれか一方のシグナルと共に、フィルター等を通すことにより、プローブセットの混合部からの識別因子の混ざった（重なった）シグナルも観測されることになる。一方、標識プローブによっては標的核酸以外の核酸とハイブリダイゼーションする可能性があるが、その核酸からはその標識プローブに結合された標識因子のシグナルしか観測されることはない。【００３４】
したがって、本発明の第４の態様を用いることにより、標識プローブが標的核酸以外の核酸とハイブリダイゼーションする場合であっても、混合部からの識別因子の混ざったシグナルを確認することにより、そのシグナルが、標的核酸が切断されていることを示すものなのか、標的核酸以外の核酸を示すものなのかを判別することができるので、切断されていない標的核酸が切断されているものと誤認されるのをより確実に防止することができる。【００３５】
本発明の第５の態様は、混合部が重要部の一部または全部とハイブリダイゼーションすることを特徴とする第４の態様のいずれかに記載の核酸配列の切断標識方法である。【００３６】
かかる第５の態様では、核酸配列が切断領域に含まれる切断点で切断されているのか、それ以外のところで切断されているのかをより確実に判断することができる。【００３７】
本発明の第６の態様は、同じ識別因子で標識された単独または複数の標識プローブが標的核酸のほぼ全配列とハイブリダイゼーションすることを特徴とする第１から５の態様のいずれかに記載の核酸配列の切断標識方法である。【００３８】
かかる第６の態様では、同一の識別因子で標識されている部分に対応する部分で標的核酸が切断されることになるので、切断されていない標的核酸の識別因子のシグナルの量と、切断されている標的核酸の識別因子のシグナルの量を比較することにより、標的核酸の切断位置をより正確に推定することができる。【００３９】
また、各識別因子の境界部分に対応する部分で標的核酸が切断されることは無いので、標的核酸が切断されていない場合には各識別因子の混ざったシグナルが観測され、標的核酸が切断されている場合には識別因子のいずれかのシグナルと各識別因子の混ざったシグナルとが観測されるか、またはそのいずれか一方のシグナルが観測されることになるので、切断されていない標的核酸が切断されているものと誤認されるのをより確実に防止することができる。【００４０】
本発明の第７の態様は、異なる識別因子が異なる色の色素であり、識別因子を機能させてシグナルを出させる工程が色素に光を照射して発色させる工程であり、シグナルを検出する工程が発色を検出する工程であることを特徴とする第１から第６の態様のいずれかに記載の核酸配列の切断標識方法である。【００４１】
かかる第６の態様では、従来のＣＩＳＨ法と同様の操作で核酸配列の切断標識方法を行うことができる。【００４２】
本発明の第８の態様は、異なる識別因子が異なる蛍光色を発する蛍光色素であり、識別因子を機能させてシグナルを出させる工程が蛍光色素を蛍光させる工程であり、シグナルを検出する工程が蛍光を検出する工程であることを特徴とする第１から第６の態様のいずれかに記載の核酸配列の切断標識方法である。【００４３】
かかる第８の態様では、従来のＦＩＳＨ法と同様の操作で核酸配列の切断標識方法を行うことができる。【００４４】
本発明の第９の態様は、色素が修正マンセル修正表色系において２つの異なる色相の発色するものまたは蛍光色素が修正マンセル修正表色系において２つの異なる色相の蛍光色を発するものからなり、切断点が、異なる色相のうち、色相と修正マンセル色相環の中心点とを結ぶ直線と、２つの異なる色相を混色させた際の混色の色相と修正マンセル色相環の中心点とを結ぶ直線とがなす角の大きい方の色相の色素または蛍光色素で標識されている部分に対応する核酸配列にあることを特徴とする第７の態様または第８の態様に記載の核酸配列の切断標識方法である。【００４５】
かかる第９の態様では、色相と修正マンセル色相環の中心点とを結ぶ直線と、２つの異なる色相を混色させた際の混色の色相と修正マンセル色相環の中心点とを結ぶ直線とがなす角（色相角）の大きい方の色相の色素または蛍光色素の方が、色相角の小さい方の色相の色素または蛍光色素の方よりも、その混色との違いをより容易に識別することができる。その結果、標的核酸が切断されていない場合には各識別因子の混ざったシグナルが観測され、標的核酸が切断されている場合には識別因子のいずれかのシグナルと各識別因子の混ざったシグナルが観測されることになるので、切断されていない標的核酸が切断されているものと誤認されるのをさらに確実に防止することができる。【００４６】
なお、本発明において、「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）その他これらと同様の機能を有するものをいい、その配列およびその長さは特に限定されず、自然界に現に存在するものであっても、突然変異により生成されたもの（例えば融合遺伝子等）であってもよく、さらに人工的に作製されたものであってもよい。なお、核酸を人工的に合成する方法としては、例えば固相合成法などが挙げられる。【００４７】
また、本発明において、「切断領域」とは、本発明を実施する者が切断点が含まれると想定する核酸配列の部分をいうが、切断点が未知の場合には標的核酸の全体をいう。【００４８】
さらに、本発明において、「重要部」とは、本発明を実施する者が重要と判断する核酸配列の部分をいい、例えば癌の診断方法に本発明を実施する場合には、病態生理学的に重要な核酸配列の部分（例えばキナーゼドメイン等）をいう。なお、本発明において、核酸配列の重要部は少なくとも１つあればよく、２以上の複数の重要部が核酸配列に存在してもよい。重要部が核酸配列に複数存在する場合には、本発明を実施する者がより重要と思うものを本発明の重要部として、本発明を実施すればよい。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】実施態様１に係るプローブセットの概念図である。
【図２】標的核酸が切断されている場合の概念図である。
【図３】標的核酸が切断されている場合において実施形態１に係るプローブセットをハイブリダイゼーションさせた際の概念図である。
【図４】実施形態１に係るプローブセットの概念図である。
【図５】実施形態１に係るプローブセットの概念図である。
【図６】標的核酸が切断されている場合において実施形態１に係るプローブセットをハイブリダイゼーションさせた際の概念図である。
【図７】実施形態１に係るプローブセットの概念図である。
【図８】実施形態２に係る標識プローブの概念図である。
【図９】実施形態２に係るプローブセットの概念図である。
【図１０】標的核酸が切断されている場合において実施形態２に係るプローブセットをハイブリダイゼーションさせた際の概念図である。
【図１１】実施形態３に係るプローブセットの概念図である。
【図１２】実施形態３に係るプローブセットの概念図である。
【図１３】実施形態４に係るプローブセットの概念図である。
【図１４】実施形態４に係るプローブセットの概念図である。
【図１５】実施形態４に係るプローブセットの概念図である。
【図１６】他の実施形態に係るプローブセットの概念図である。
【図１７】実施例の蛍光イメージ図である。
【図１８】比較例の蛍光イメージ図である。
【図１９】従来のＦＩＳＨ法の概略説明図である。
【図２０】従来のプローブセットの概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本件発明に係る核酸配列の切断標識方法は、異なる識別因子で標識された２つ以上の標識プローブからなり、その標的核酸のほぼ全配列にハイブリダイゼーションできるプローブセットを含むハイブリダイゼーション液と、その標的核酸とを接触させる工程（第１の工程）と、その識別因子を機能させてシグナルを出させる工程（第２の工程）の２つの工程を含むものである。以下、それぞれの工程について詳述する。なお、これらの工程については、プローブセットの構成を除いて、従来のＦＩＳＨ法やＣＩＳＨ法と同様に行うことができる。
【００５１】
まず、第１の工程について説明する。この第１の工程で用いられるハイブリダイゼーション液は、異なる識別因子で標識された２つ以上の標識プローブからなり、標的核酸のほぼ全配列にハイブリダイゼーションできるプローブセットが含まれているものであれば、特に限定されない。
【００５２】
ここで、識別因子としては、例えば、ＦＩＳＨ法で用いられる蛍光色素であっても、ＣＩＳＨ法で用いられる色素であっても、その他何らかの刺激により光（紫外線、赤外線を含む。）を放射・透過（一部の波長を吸収することによるものを含む。）することができるものであれば特に限定されない。
【００５３】
また、標識プローブとしては、標的核酸にハイブリダイゼーションすることができ、かつ標識因子で標識されているものであれば、特に限定されない。例えば、標識因子で標識されているデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）その他これらと同様の機能を有するものであればよく、その配列およびその長さは特に限定されず、自然界に現に存在するものであっても、人工的に作製されたものであってもよい。
【００５４】
なお、標識因子で標識されているＤＮＡ等とは、識別因子が直接結合しているＤＮＡ等（直接法で結合したもの）であっても、識別因子がたんぱく質や抗体等（これらを何段階も重ねたものを含む。）を介して間接的に結合しているＤＮＡ等（間接法で結合したもの）であってもよい。
【００５５】
そして、標的核酸のほぼ全配列にハイブリダイゼーションできるプローブセットとは、プローブセットが標的核酸の全配列と完全にハイブリダイゼーションできるものだけではなく、標的核酸の全配列とハイブリダイゼーションできない部分があるものを含むものであって、以下に説明するプローブセットを含むものである。
【００５６】
したがって、このようなプローブセットが含まれているハイブリダイゼーション液であれば、例えばＦＩＳＨ法やＣＩＳＨ法などに用いられる市販のハイブリダイゼーション用の試薬に含まれている成分等その他の成分が含まれていてもよい。
【００５７】
以下に、本発明に用いられるプローブセットについて、２種類の蛍光色素を用いたＦＩＳＨ法を例にとって説明する。なお、ＣＩＳＨ法についても同様に考えることができる。
（実施形態１）
【００５８】
図１に、少なくとも１つの切断点７が含まれる切断領域２と重要部３とを有する標的核酸１とハイブリダイゼーションした際のプローブセット５の概略図を示す。この図に示すように、本発明に用いられるプローブセット５は、標識プローブ５ａ、５ｂで構成されているが、従来のＦＩＳＨ法に用いられていたプローブセットとは異なり、標的核酸１の全配列とハイブリダイゼーションできるようになっている。そして、標識プローブ５ａは蛍光色がオレンジ色の蛍光色素で標識されており、標識プローブ５ｂは蛍光色が緑色の蛍光色素で標識されている。
【００５９】
したがって、標的核酸１とプローブセット５とをハイブリダイゼーションさせた後、後述する第２の工程を行って蛍光色素を蛍光させると、各蛍光色素で標識された標識プローブ５ａ、５ｂが近傍に位置することになるので、標識プローブ５ａのオレンジ色の蛍光と標識プローブ５ｂの緑色の蛍光とが重なって、黄色の蛍光が観測されることになる。ただし、その黄色の蛍光の近傍には、オレンジ色や緑色の蛍光が観測されることもある。
【００６０】
ここで、プローブセット５は、標的核酸１とハイブリダイゼーションできるように設計される。例えば、図１に示すように、プローブセット５は、標的核酸１とハイブリダイゼーションした際に、標的核酸１に対して重複する部分がないような２つの標識プローブ５ａ、５ｂから構成されるように設計される。
【００６１】
なお、標識プローブ５ａ、５ｂと対応する標的核酸１の配列との相補性は１００％が好ましいが、標的核酸１と特異的に結合する機能を保持する限りにおいて、これに限定されるものではなく、標的核酸１の態様によっては、１００％未満、例えば９０％の相補性でもよい。また、標識プローブ５ａ、５ｂが類似した熱安定性を有するように、標識プローブ５ａ、５ｂのグリシン（Ｇ）／シトシン（Ｃ）含量が等しくなるようにした方が好ましい。これらの標識プローブ５ａ、５ｂは、市販されているものの組み合わせであっても、新たに作製したものであっても、固相合成法等によって人工的に作製されたものやそれらの組み合わせであってもよい。
【００６２】
次に、第２の工程について説明する。この第２の工程は、識別因子を機能させてシグナルを出させることができるものであれば特に限定されない。例えば、識別因子が蛍光色素である場合には、各蛍光色素が蛍光できるような波長の光を出すことができるレーザー装置などを用いて標識プローブ５ａ、５ｂの蛍光色素を蛍光させればよい。また、識別因子が色素である場合には、可視光を出すことができる装置などを用いてプローブセットの色素を発色させればよい。
【００６３】
そして、蛍光顕微鏡等を通して識別因子から得られたシグナルは目視で観測してもよいし、観測機器を用いて観測してもよい。観測機器としては、第２の工程により得られたシグナルを検出できるものであれば特に限定されない。例えば、識別因子が蛍光色素である場合には、従来のＦＩＳＨ法で用いられている市販の蛍光顕微鏡装置、すなわち光学装置、デジタル画像化ハードウェア、コンピュータハードウェアおよびコンピュータソフトウェアを用いて、蛍光を観測することができる。また、識別因子が色素である場合には、従来のＣＩＳＨ法で用いられている市販の光学顕微鏡装置、すなわち光学装置、デジタル画像化ハードウェア、コンピュータハードウェアおよびコンピュータソフトウェアを用いて、色を観測することができる。
【００６４】
ここで、標的核酸１が切断されていない場合と、切断されている場合で観測されるシグナルについて、第１の工程で説明したＦＩＳＨ法を例にとって説明する。
【００６５】
上述したように、標的核酸１が切断されていない場合には、オレンジ色の蛍光と緑色の蛍光とが混ざった黄色の蛍光が観察されることになる。
【００６６】
一方、例えば、相互転座等の影響により、図１に示す切断領域２に含まれる切断点７で標的核酸１が切断されると、図２に示すように、標的核酸片１Ａ、１Ｂに分割される。そして、この状態で第１の工程を行うと、図３に示すように、各標的核酸片１Ａ、１Ｂと、プローブセット５を切断点７で切断したようなプローブセット片５Ａ、５Ｂとがそれぞれハイブリダイゼーションすることになる。このプローブセット片５Ａはオレンジ色の蛍光色素と緑色の蛍光色素とで標識されており、プローブセット片５Ｂは緑色の蛍光色素でのみ標識されている。そして、これらの標的核酸片１Ａ、１Ｂは互いに離れて位置することが多い。
【００６７】
その結果、このように標的核酸１が切断され、標的核酸片１Ａ、１Ｂに分割されている場合では、プローブセット片５Ａのオレンジ色の蛍光（および一部に少量の緑色の蛍光が重なった黄色の蛍光）と、プローブセット片５Ｂの緑色の蛍光とが観測されるか、標的核酸片１Ａ、１Ｂのいずれか一方が観測領域外に出てしまったり、標的核酸片１Ａ，１Ｂのいずれか一方が欠損して消滅してしまうことにより、一方の蛍光のみが観測されることになる。
【００６８】
したがって、従来のＦＩＳＨ法とは異なり、標的核酸１が切断されていない場合にはプローブセット５の黄色の蛍光のみが観測され、標的核酸１が切断されている場合にはプローブセット片５Ａのオレンジの蛍光（および一部に少量の緑色の蛍光が重なった黄色の蛍光）とプローブセット片５Ｂの緑色の蛍光が観測されるか、またはそのいずれか一方のみの蛍光が観測されることになるので、切断されていない標的核酸１が切断されているものと誤認されるのを防止することができる。
【００６９】
また、プローブセット５は標的核酸１の全配列とハイブリダイゼーションすることができるので、切断されていない標的核酸１の蛍光の色およびその強度と、切断されている標的核酸片１Ａ、１Ｂの蛍光の色およびその強度とを比較することにより、標的核酸１の切断点７を推定することができる。
【００７０】
なお、上述した効果は、図１に示すようなプローブセット５のように、プローブセットが、標的核酸１の切断領域２にハイブリダイゼーションする標識プローブ５ｂと、切断領域２に対して重要部３を挟むように位置する標的核酸１の部分にハイブリダイゼーションする標識プローブ５ａが異なる標識プローブとからなるものの場合だけでなく、図４に示すようなプローブセット５’のように、標的核酸１の切断領域２にハイブリダイゼーションする標識プローブ５ｂ’と、切断領域２に対して重要部３を挟むように位置する標的核酸１の部分にハイブリダイゼーションする標識プローブ５ｂ’とが同一の標識プローブ（標識プローブ５ｂより長い標識プローブ）とからなるものの場合であっても同様に生ずることは明らかである。
【００７１】
さらに、この例では、上述したように、標的核酸１の切断領域２にハイブリダイゼーションする標識プローブ５ｂ’と標識プローブ５ａ’とからなるプローブセット５’と、切断点７で切断された標的核酸１とをハイブリダイゼーションさせている。したがって、その後蛍光色素を蛍光させると、オレンジの蛍光（および一部に少量の緑色の蛍光が重なった黄色の蛍光）と緑色の蛍光とが観測されることになる（図４参照）。
【００７２】
一方、何らかの理由により、図５に示すように、切断領域２に含まれず、通常は切断されることがない切断点８で標的核酸１が切断されると、図６に示すように、標的核酸片１Ａ’、１Ｂ’に分割される。そして、この状態で第１の工程を行うと、各標的核酸片１Ａ’、１Ｂ’と、プローブセット５’を切断点８で切断したようなプローブセット片５Ａ’、５Ｂ’とがそれぞれハイブリダイゼーションすることになる。そして、この状態で蛍光色素を蛍光させると、プローブセット片５Ａ’のオレンジ色の蛍光と、プローブセット片５Ｂ’の緑色の蛍光（一部がオレンジ色の蛍光と緑色の蛍光が重なった黄色の蛍光）とが観測されることになる。
【００７３】
したがって、本実施形態での蛍光を観測することによって、標的核酸１が切断領域２に含まれる切断点７で切断されていのるか、切断領域２に含まれない切断点８で切断されているかについて判断することができる。
【００７４】
また、図７に示すように、図１に示したプローブセット５とは各標識プローブの配置が逆になるように、切断領域２と重要部３にハイブリダイゼーションする標識プローブ１５ｂと、重要部３に対して切断領域２を挟むように位置する標的核酸１の部分にハイブリダイゼーションする標識プローブ１５ａとでプローブセット１５を構成してもよい。
【００７５】
このようにプローブセット１５を構成した場合に、切断点７で標的核酸１が切断されると、重要部３が含まれていない部分とハイブリダイゼーションした標識プローブのオレンジ色の蛍光（および一部に少量の緑色の蛍光が重なった黄色の蛍光）と、重要部３が含まれている部分とハイブリダイゼーションした標識プローブの緑色の蛍光が観測されることになる。
【００７６】
したがって、このようにプローブセット１５を構成した場合には、緑色単色の蛍光を観測することにより、意味のある切断（例えば癌の診断方法に本発明を実施するときは、病態生理学的に意味がある切断）が生じたと判断することができる。
（実施形態２）
【００７７】
実施形態１では、プローブセット５を、図１に示すように標的核酸１に対して重複する部分がないような２つの標識プローブ５ａ、５ｂから構成されるように設計したが、図８に示すように、標的核酸１とハイブリダイゼーションした際に重複する混合部αができるような２つの標識プローブ２５ａ、２５ｂから構成されるように設計してもよい。このようなプローブセット２５の混合部αは、図９に示すように、通常これらの蛍光色素が混ざった状態で標識されることになる。
【００７８】
そして、このプローブセット２５を用いて、標的核酸１が切断されている場合に上述した第１の工程を行うと、図１０に示すように、各標的核酸片１Ａ、１Ｂと、プローブセット２５を切断点７で切断したようなプローブセット片２５Ａ、２５Ｂとがそれぞれハイブリダイゼーションすることになる。
【００７９】
すると、標的核酸１が切断され、標的核酸片１Ａ、１Ｂに分割されている場合では、プローブセット片２５Ａのオレンジ色の蛍光と黄色の蛍光と緑色の蛍光とが重なった全体としてオレンジ色ないし一部に緑色の蛍光が重なった黄色の蛍光と、プローブセット片２５Ｂの緑色の蛍光とが観測されるか、標的核酸片１Ａ、１Ｂのいずれか一方が観測領域外に出てしまったり、標的核酸片１Ａ，１Ｂのいずれか一方が欠損して消滅してしまうことにより、いずれか一方の蛍光のみが観測されることになる。
【００８０】
なお、実施形態２では、混合部αが重要部３に対応する場所に形成されるようにプローブセット２５を構成しているので、オレンジ色の蛍光の隣りに混合部αに対応する黄色の蛍光が存在するかを確認することにより、標的核酸１が切断点７で切断されているのか、それ以外のところで切断されているのかをより確実に判断することができるので好ましい。ただし、実施形態２に係るプローブセットはこの構成に限定されるものではない。
【００８１】
また、フィルターや画像処理技術などを用いて、プローブセット片２５Ａをより詳細に観測すると、オレンジ色の蛍光および緑色の蛍光と共に、混合部αの黄色の蛍光を観測することができる。したがって、それらを確認することにより、標的核酸１が切断領域２に含まれる切断点７で切断されているのか、それ以外のところで切断されているのかをさらに確実に判断することができる。
（実施形態３）
【００８２】
実施形態１のプローブセット５は、標的核酸１の全配列と配列の長さが一致するような２つの標識プローブ５ａ、５ｂで構成したが、本発明に係るプローブセットはそれに限られない。例えば、図１１に示すように、実施態様１の標識プローブ５ａよりも長い核酸配列の標識プローブ３５ａと標識プローブ５ｂでプローブセット３５を構成してもよい。このようなプローブセット３５であっても、実施態様１のプローブセット５の場合と同様の効果が得られる。
【００８３】
また、図１２に示すように、標的核酸１のほぼ全配列とハイブリダイゼーションできる標識プローブ４５ｂと、標的核酸１の残りの部分４６とハイブリダイゼーションする部分を有し、かつ実施形態１の標識プローブ５ａよりも長い核酸配列の標識プローブ４５ａとでプローブセット４５を構成してもよい。なお、標識プローブ４５ｂは標的核酸１よりも長い核酸配列で構成してもよい。
【００８４】
このようにプローブセット４５を構成しても実施態様１のプローブセット５の場合と同様の効果が得られ、かつ標識プローブ４５ｂが標的核酸１と同程度の長さを持つことから、標識プローブ４５ｂに標識された緑色の蛍光色素の蛍光の強度を測定し、切断されなかった場合の標的核酸１の緑色の蛍光色素の蛍光の強度と、切断された場合の標的核酸１の緑色の蛍光色素の蛍光の強度とを比較することにより、実施態様１のプローブセット５の場合よりもより正確に標的核酸１の切断位置を推定することができる。
（実施形態４）
【００８５】
実施態様１の核酸配列の全体とハイブリダイゼーションできるプローブセット５とは異なり、図１３に示すように、切断領域２に対応する部分にハイブリダイゼーションできない領域５６ができるように、標識プローブ５ａと標識プローブ５ｂよりも短い配列の標識プローブ５５ｂとでプローブセット５５を構成してもよい。
【００８６】
このようなプローブセット５５では、標的核酸１にハイブリダイゼーションさせた際に、標識プローブ５ａと標識プローブ５５ｂとの間に空間ができ、標的核酸１とハイブリダイゼーションできない領域５６ができてしまうが、標的核酸１のほぼ全配列とハイブリダイゼーションできるので、実施形態１のプローブセット５の場合と同様の効果が得られる。
【００８７】
ハイブリダイゼーションできない領域５６の長さは、本発明の効果が得られる範囲であれば限定されないが、１００ｋｂ以下が好ましく、５０ｋｂ以下がより好ましく、４０ｋｂ以下、３０ｋｂ以下、２０ｋｂ以下と短くなるにつれてさらに好ましくなり、１０ｋｂ以下が最も好ましい。ハイブリダイゼーションできない領域５６が短くなるにつれて本発明の効果がより顕著になる。
【００８８】
また、切断点７が既知である標的核酸１について切断されているか否かを調べる際には、図１３に示すように、切断点７の近傍に標的核酸１とハイブリダイゼーションできない領域５６ができるように、標識プローブ５ａと標識プローブ５５ｂでプローブセット５５を構成してもよい。
【００８９】
このようにプローブセット５５を構成することにより、標的核酸１が切断されていない場合には、オレンジ色の蛍光と緑色の蛍光とが混ざった黄色の蛍光が観測されるが、切断されると、オレンジ色の蛍光と緑色の蛍光とがそれぞれ別個に観測されることになるので、切断されていない標的核酸１が切断されているものと誤認されるのをより確実に防止することができる。
【００９０】
なお、この例では、標識プローブ５ａと標識プローブ５５ｂとの間に空間ができるようにするために、プローブセット５５をこのような構成としたが、図１４に示すように、標的核酸１とハイブリダイゼーションさせた際に、標的核酸１の端部側に標的核酸１とハイブリダイゼーションできない領域６６ができるように、標識プローブ５ａよりも短い配列の標識プローブ６５ａと標識プローブ５ｂとでプローブセット６５を構成してもよい。このようプローブセット６５を構成しても実施形態１のプローブセット５の場合と同様の効果が得られる。
【００９１】
さらに、図１５に示すように、実施態様１の標識プローブ５ｂの一部７６が欠損しているような標識プローブ７５ｂと標識プローブ５ａでプローブセット７５を構成してもよい。標識プローブ５ｂに標的核酸１以外の核酸とハイブリダイゼーションできる部分がある場合には、その部分を除いた標識プローブ７５ｂと標識プローブ５ａとでプローブセット７５を構成することにより、標的核酸１以外の核酸配列からの蛍光を防止することができるので、切断されていない標的核酸１が切断されているものと誤認されるのをより確実に防止することができる。
（他の実施形態）
【００９２】
上述したプローブセットは、プローブセットを２つの標識プローブで構成するようにしたが、本発明に係るプローブセットの構成はこれに限定されず、より多くの標識プローブ、例えば、図１６に示すように、３つの標識プローブ８５ａ、８５ｂ、８５ｃで構成してもよい。このようにプローブセット８５を構成しても、実施形態１のプローブセット５の場合と同様の効果が得られる。
【００９３】
なお、この場合の各標識プローブ８５ａ、８５ｂ、８５ｃに結合される蛍光色素は、各標識プローブ８５ａ、８５ｂ、８５ｃごとに異なる蛍光を発する蛍光色素であってもよいし、例えば標識プローブ８５ｂの蛍光色素が標識プローブ８５ａまたは標識プローブ８５ｃのいずれかの蛍光色素と同じもの（プローブセット８５全体では２色の蛍光色素）であってもよい。各標識プローブ８５ａ、８５ｂ、８５ｃごとに異なる蛍光を発する蛍光色素で標識したプローブセット８５を用いると、各標識プローブ８５ａ、８５ｂ、８５ｃとハイブリダイゼーションする標的核酸１の位置関係がより明確になるので、実施形態１のプローブセット５の場合よりもより正確に標的核酸１の切断位置を推定することができる。
【００９４】
以上、他の実施態様について説明したが、本発明に係るプローブセットはこれに限られず、これらを組み合わせて構成したプローブセットも含まれる。
【００９５】
また、識別因子が修正マンセル修正表色系において２つの異なる色相の発色（例えば、オレンジ色と緑色）するものまたは蛍光色素が修正マンセル修正表色系において２つの異なる色相の蛍光色（例えば、オレンジ色と緑色）を発するものからなる場合には、標的核酸の切断点が、これらの異なる色相のうち、色相と修正マンセル色相環の中心点とを結ぶ直線と、これらの異なる色相を混色させた際の混色の色相（例えば、異なる色相がオレンジ色と緑色の場合には、黄色）と修正マンセル色相環の中心点とを結ぶ直線とがなす角（色相角）の大きい方の色相の色素（例えば、緑色）または蛍光色素（例えば、緑色）で標識されている部分に対応する核酸配列にあるようにプローブセットを設計する方が好ましい。
【００９６】
色相角が大きい方の色相色素（例えば、緑色）または蛍光色素（例えば、緑色）の方が、色相角の小さい方の色相の色素（例えば、オレンジ色）または蛍光色素（例えば、オレンジ色）の方よりも、その混色との違いをより容易に識別することができる。その結果、標的核酸が切断されていない場合には各識別因子の混ざったシグナルが観測され、標的核酸が切断されている場合には識別因子のいずれかのシグナルと各識別因子の混ざったシグナルが観測されることになるので、切断されていない標的核酸が切断されているものと誤認されるのをさらに確実に防止することができる。
【実施例】
【００９７】
ＡＬＫ遺伝子の再構成を検出するために、標識プローブとして、FITCで標識したRP11-984I21、RP11-62B19およびTexRedで標識したRP11-701P18とを用いて、ハイブリダイゼーションを行った後、従来のＦＩＳＨ法と同様の操作をして、蛍光イメージを作成した。なお、RP11-984I21、RP11-62B19およびRP11-701P18はヒト男性RP-11 BACライブラリーでの識別番号である。【００９８】
図１７に実施例の蛍光イメージ図（陰性例）を示す。この図を見て分かるように、すべての蛍光について、オレンジ色と緑色とが重なって黄色の蛍光（黄色の蛍光の近傍には、オレンジ色や緑色の蛍光が観測されることがある。）が見えることが分かる。ここで、陰性とは相互転座等が起こっておらず、標的核酸が切断されていない状態をいい、陽性とは相互転座等が起こり、標的核酸が切断されている状態をいう。なお、FITCとTexRedを逆にして標識した標識プローブを用いた場合の結果も同様であった。
【比較例】
【００９９】
一方、ＡＬＫ遺伝子の再構成を検出するために、識別プローブとしてLSI ALK Dual Colorを使い、ハイブリダイゼーションを行った後、実施例と同様に従来のＦＩＳＨ法と同様の操作をして、蛍光イメージを作成した。
【０１００】
図１８に比較例の蛍光イメージ図（陰性例）を示す。この図を見て分かるように、一部の蛍光については、オレンジ色と緑色に分かれて見えていることが分かる。したがって、標的核酸が切断されているものが見えているとして、陽性と誤判断されてしまう可能性がある。これは、従来のプローブセットでは、オレンジ色の蛍光色素と緑色の蛍光色素とがある程度離れて位置しているため、標的核酸が切断されていない場合であっても、蛍光顕微鏡と標的核酸との相対的な位置・角度によって偶然オレンジ色の蛍光と緑色の蛍光が見えているものと考えられる。
【０１０１】
以上説明したように、本発明を用いれば、切断されていない標的核酸が切断されているものと誤認されるのを防止することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明は、従来のＦＩＳＨ法等が用いられていた診断方法（癌の診断方法を含む。）や、ＤＮＡやＲＮＡの同定方法・特定方法の他、核酸の切断位置の推定方法などに用いることができる。
【符号の説明】
【０１０３】
１，１０１標的核酸
１Ａ，１Ｂ，１Ａ’，１Ｂ’  標的核酸片
２, １０２  切断領域
３, １０３  重要部
７，８，１０７，１０８  切断点
５，１５，２５，３５，４５，５５，６５，７５，８５，１０５  プローブセット
５Ａ，５Ｂ，５Ａ’，５Ｂ’，２５Ａ，２５Ｂ  プローブセット片
５ａ，５ｂ，５ａ’，５ｂ’，１５ａ，１５ｂ，２５ａ，２５ｂ，３５ａ，４５ａ，４５ｂ，５５ｂ，６５ａ，７５ｂ，８５ａ，８５ｂ，８５ｃ，１０５a，１０５ｂ  標識プローブ
α  混合部
【図１】
2014025001.tif 000003
【図２】
2014025001.tif 000004
【図３】
2014025001.tif 000005
【図４】
2014025001.tif 000006
【図５】
2014025001.tif 000007
【図６】
2014025001.tif 000008
【図７】
2014025001.tif 000009
【図８】
2014025001.tif 000010
【図９】
2014025001.tif 000011
【図１０】
2014025001.tif 000012
【図１１】
2014025001.tif 000013
【図１２】
2014025001.tif 000014
【図１３】
2014025001.tif 000015
【図１４】
2014025001.tif 000016
【図１５】
2014025001.tif 000017
【図１６】
2014025001.tif 000018
【図１７】
2014025001.tif 000019
【図１８】
2014025001.tif 000020
【図１９】
2014025001.tif 000021
【図２０】
2014025001.tif 000022
【国際調査報告】
2014025001.tif 000023
2014025001.tif 000024