(57)【要約】  無機電解質と炭素源とを含み、少なくとも下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つを満たす無機塩培地でＤ−乳酸生産大腸菌を培養することによりＤ−乳酸を生産する。（ａ）前記無機塩培地中の前記炭素源以外の有機物の含有量が、培養開始時において１０ｇ／Ｌ以下である。（ｂ）前記無機塩培地中の前記無機電解質の含有量が、培養開始時において１１ｇ／Ｌ以下である。（ｃ）前記無機塩培地中のチアミンの含有量が０．１ｍｇ／Ｌ以下である。（ｄ）前記無機塩培地中の遷移金属イオンの含有量が１０ｍｇ／Ｌ以下である。
2014017469.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無機電解質と炭素源とを含み、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つを満たす無機塩培地でＤ−乳酸生産大腸菌を培養することによりＤ−乳酸を生産する、Ｄ−乳酸の生産方法。
（ａ）前記無機塩培地中の前記炭素源以外の有機物の含有量が、培養開始時に１０ｇ／Ｌ以下である。
（ｂ）前記無機塩培地中の前記無機電解質の含有量が、培養開始時に１１ｇ／Ｌ以下である。
（ｃ）前記無機塩培地中のチアミンの含有量が０．１ｍｇ／Ｌ以下である。
（ｄ）前記無機塩培地中の遷移金属イオンの含有量が１０ｍｇ／Ｌ以下である。
【請求項２】
前記無機塩培地は、少なくとも前記（ｃ）または前記（ｄ）のいずれかを満たす、請求項１に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項３】
ポリマー原料となるＤ−乳酸を生産するための、請求項１または２に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項４】
培養開始時の前記無機塩培地がさらに下記（ｅ）を満たす、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のＤ−乳酸の生産方法。
（ｅ）前記無機塩培地中の前記遷移金属イオンの含有量が０．８５ｍｇ／Ｌ以下である。
【請求項５】
前記炭素源が糖である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項６】
前記糖は、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、グリセリン、アラビノース、メリビオース、トレハロース、マルトース、メリビオン酸、ラクトース、マルトトリオース、リボース、ガラクトース、ガラクツロン酸、グルコン酸、グルコサミン、グルクロン酸、マンニトール、マンノース、サッカリン酸、ソルビトール、フコース、ラムノース、アロース、及びＮ-アセチルグルコサミンからなる群より選択される１以上の化合物を含む、請求項５に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項７】
前記無機電解質が、カリウムイオン、リン酸イオン、アンモニウムイオン、硫酸イオン及びマグネシウムイオンからなる群より選択される１以上のイオンを構成成分として含む、請求項１乃至６のいずれか一項に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項８】
前記無機電解質が、カリウムイオンを含み、
培養開始時の前記無機塩培地において、前記カリウムイオンの濃度が５．８ｍｍｏｌ／Ｌ以上７３ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項９】
前記無機塩培地が、前記無機電解質を水に溶解又は懸濁して調製された液体である、請求項１乃至８のいずれか一項に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項１０】
前記無機塩培地が、さらにベタインを含む、請求項１乃至９のいずれか一項に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項１１】
前記Ｄ−乳酸生産大腸菌が、組換え大腸菌である、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項１２】
前記無機塩培地において前記Ｄ−乳酸生産大腸菌と前記炭素源とを接触させてＤ−乳酸塩を得る工程と、
前記Ｄ−乳酸塩を含む前記無機塩培地から前記Ｄ−乳酸生産大腸菌を除去した後に前記Ｄ−乳酸塩を脱塩してＤ−乳酸を得る工程と、
を含む、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項１３】
前記Ｄ−乳酸塩を得る前記工程において、Ｄ−乳酸のアルカリ土類金属塩を得て、
前記Ｄ−乳酸を得る前記工程において、Ｄ−乳酸の前記アルカリ土類金属塩を脱塩することでアルカリ土類金属を含む無機塩を析出させる請求項１２に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項１４】
前記Ｄ−乳酸塩を得る前記工程において、Ｄ−乳酸のアルカリ金属塩を得て、
前記Ｄ−乳酸を得る前記工程において、電解透析処理によりＤ−乳酸の前記アルカリ金属塩を脱塩する、請求項１２に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項１５】
前記Ｄ−乳酸塩を脱塩してＤ−乳酸を得る前記工程の後に前記Ｄ−乳酸の精製を行う精製工程を更に含み、
前記精製工程において、加水分解しながら蒸留を行う、請求項１２乃至１４のいずれか１項に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項１６】
請求項１乃至１５のいずれか一項に記載のＤ−乳酸の生産方法により得られたＤ−乳酸を用いて重合反応を行う、ポリマーの生産方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載のポリマーの生産方法で得られるポリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−乳酸の生産方法、ポリマーの生産方法およびポリマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は、ポリマー原料や農薬、医薬の中間体として近年注目が集まりつつある有用な物質である。自然界には乳酸菌や糸状菌など乳酸を効率良く生産する微生物が存在し、それらを用いた乳酸製造法には、Ｌ−乳酸を効率良く生産させる微生物としてＬａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ等を、またＤ−乳酸を効率良く生産させる微生物としてＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の微生物等を用いた方法が知られている。【０００３】
Ｄ−乳酸は、Ｌ−乳酸とのステレオコンプレックス型ポリ乳酸の原料や医薬中間体として近年注目を集めている。上記いずれの用途においても原料であるＤ−乳酸には高い光学純度が求められる。【０００４】
Ｄ−乳酸は、一般的に大腸菌をはじめとする微生物を利用した発酵法により工業的に製造されている。発酵プロセスは、微生物の培養と、増殖した微生物を触媒とした物質生産とが行われる工程であるので、微生物の増殖には栄養源が必要となる。こうした栄養源としてとうもろこしの加工過程で得られるコーンスティープリカーが、アミノ酸などを多く含み栄養価が高いこと、さらには安価であることから、Ｄ−乳酸の発酵原料に用いられている。【０００５】
このコーンスティープリカーはＬ−乳酸を含むため、得られるＤ−乳酸光学純度の低下を招く原因の一つとなっている。このような観点から、例えば特許文献１では、効率的に乳酸を製造すると共に製品の光学純度を向上させることを目的として、原料中に含まれるＬ−乳酸を速やかに分解することが検討されている。【０００６】
こうした取り組みとは別に、コーンスティープリカーのようなＬ−乳酸を含む原料を用いることなく、Ｄ−乳酸を効率的に製造する検討がなされている。特に大腸菌を用いたＤ−乳酸製造法に関して言えば、特許文献２においては、下記のような無機塩を主成分とする培地に糖を加えたものを用いたＤ−乳酸の発酵生産方法が開示されている。
リン酸二水素カリウム            ３．５  ｇ／Ｌ
リン酸水素二カリウム            ５．０  ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム                ３．５  ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム・７水和物      ０．２５ｇ／Ｌ
塩化カルシウム・２水和物          １５  ｍｇ／Ｌ
チアミン                        ０．５  ｍｇ／Ｌ
塩化鉄（ＩＩＩ）                １．６  ｍｇ／Ｌ
塩化コバルト（ＩＩ）・６水和物  ０．２  ｍｇ／Ｌ
塩化銅（ＩＩ）                  ０．１  ｍｇ／Ｌ
塩化亜鉛（ＩＩ）・４水和物      ０．２  ｍｇ／Ｌ
酸化モリブデンナトリウム        ０．２  ｍｇ／Ｌ
ホウ酸                        ０．０５  ｍｇ／Ｌ【０００７】
また、大腸菌を培養するための無機塩を主成分とする培地は、例えば特許文献３及び非特許文献１にも記載されている。特許文献２、３及び非特許文献１記載のものは、数種の無機塩に加え、チアミン、更にはコバルトや亜鉛、銅などの遷移金属などを含んだ培地である。これらチアミンや遷移金属イオンは微生物細胞内での酵素による生化学反応に補因子として重要な役割を果たすことから、非常に重要な成分であると考えられる。なお、特許文献２、３には、無機塩を主成分とする培地に、適宜ベタインを添加することも記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０３２６９７号パンフレット
【特許文献２】特開２０１２−１０７１５号公報
【特許文献３】特開２００９−２６１３６０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．１１，  Ａｒｔ．  Ｎｏ．７０（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、上記文献には、得られたＤ−乳酸から、どのようなＤ−乳酸ポリマーが得られるかについての知見は記載されていない。【００１１】
また、特許文献２、３記載の培地は多くの成分が必要であるため、培地調整に手間がかかるのみならず、多数の成分をある一定量使用することにより培地コストの上昇を招く結果となる。【００１２】
本発明は、より安価に、かつ、効率よくＤ−乳酸を生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、Ｄ−乳酸生産大腸菌を無機塩培地で培養することにより、重合化したとき高品質のポリマーが得られることを見出した。また、無機塩培地中の成分を最小限にすることで、より安価に、かつ、効率よくＤ−乳酸を生産できることを見出した。
即ち、本発明は以下の［１］から［１７］に記載のとおりである。【００１４】
［１］無機電解質と炭素源とを含み、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つを満たす無機塩培地でＤ−乳酸生産大腸菌を培養することによりＤ−乳酸を生産する、Ｄ−乳酸の生産方法。
（ａ）前記無機塩培地中の前記炭素源以外の有機物の含有量が、培養開始時に１０ｇ／Ｌ以下である。
（ｂ）前記無機塩培地中の前記無機電解質の含有量が、培養開始時に１１ｇ／Ｌ以下である。
（ｃ）前記無機塩培地中のチアミンの含有量が０．１ｍｇ／Ｌ以下である。
（ｄ）前記無機塩培地中の遷移金属イオンの含有量が１０ｍｇ／Ｌ以下である。【００１５】
［２］前記無機塩培地は、少なくとも前記（ｃ）または前記（ｄ）のいずれかを満たす、［１］に記載のＤ−乳酸の生産方法。
［３］ポリマー原料となるＤ−乳酸を生産するための、［１］または［２］に記載のＤ−乳酸の生産方法。
［４］培養開始時の前記無機塩培地がさらに下記（ｅ）を満たす、［１］乃至［３］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
（ｅ）前記無機塩培地中の前記遷移金属イオンの含有量が０．８５ｍｇ／Ｌ以下である。
［５］前記炭素源が糖である、［１］乃至［４］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
［６］前記糖は、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、グリセリン、アラビノース、メリビオース、トレハロース、マルトース、メリビオン酸、ラクトース、マルトトリオース、リボース、ガラクトース、ガラクツロン酸、グルコン酸、グルコサミン、グルクロン酸、マンニトール、マンノース、サッカリン酸、ソルビトール、フコース、ラムノース、アロース、及びＮ-アセチルグルコサミンからなる群より選択される１以上の化合物を含む、［５］に記載のＤ−乳酸の生産方法。
［７］前記無機電解質が、カリウムイオン、リン酸イオン、アンモニウムイオン、硫酸イオン及びマグネシウムイオンからなる群より選択される１以上のイオンを構成成分として含む、［１］乃至［６］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
［８］前記無機電解質が、カリウムイオンを含み、
培養開始時の前記無機塩培地において、前記カリウムイオンの濃度が５．８ｍｍｏｌ／Ｌ以上７３ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、［１］乃至［７］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
［９］前記無機塩培地が、前記無機電解質を水に溶解又は懸濁して調製された液体である、［１］乃至［８］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
［１０］前記無機塩培地が、さらにベタインを含む、［１］乃至［９］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
［１１］前記Ｄ−乳酸生産大腸菌が、組換え大腸菌である、［１］乃至［１０］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
［１２］前記無機塩培地において前記Ｄ−乳酸生産大腸菌と前記炭素源とを接触させてＤ−乳酸塩を得る工程と、
前記Ｄ−乳酸塩を含む前記無機塩培地から前記Ｄ−乳酸生産大腸菌を除去した後に前記Ｄ−乳酸塩を脱塩してＤ−乳酸を得る工程と、
を含む、［１］乃至［１１］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
［１３］前記Ｄ−乳酸塩を得る前記工程において、Ｄ−乳酸のアルカリ土類金属塩を得て、
前記Ｄ−乳酸を得る前記工程において、Ｄ−乳酸の前記アルカリ土類金属塩を脱塩することでアルカリ土類金属を含む無機塩を析出させる［１２］に記載のＤ−乳酸の生産方法。
［１４］前記Ｄ−乳酸塩を得る前記工程において、前記Ｄ−乳酸のアルカリ金属塩を得て、  前記Ｄ−乳酸を得る前記工程において、電解透析処理によりＤ−乳酸のアルカリ金属塩を脱塩する、［１２］に記載のＤ−乳酸の生産方法。
［１５］前記Ｄ−乳酸塩を脱塩してＤ−乳酸を得る前記工程の後にＤ−乳酸の精製を行う精製工程を更に含み、
前記精製工程において、加水分解しながら蒸留を行う、［１２］乃至［１４］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
［１６］［１］乃至［１５］のいずれか一に記載のＤ−乳酸の生産方法により得られたＤ−乳酸を用いて重合反応を行う、ポリマーの生産方法。
［１７］［１６］記載のポリマーの生産方法で得られるポリマー。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、より安価に、かつ、効率よくＤ−乳酸を生産する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。【００１８】
【図１】本実施形態に係るＤ−乳酸の生産方法に用いられる発酵装置の一例を示す図である。
【図２】本実施形態に係るＤ−乳酸の生産方法に用いられる電気透析装置の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本実施形態に係るＤ−乳酸の生産方法は、無機電解質と炭素源とを含み、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つを満たす無機塩培地でＤ−乳酸生産大腸菌を培養することによりＤ−乳酸を生産するものである。これにより、より安価に、かつ、効率よくＤ−乳酸を生産することができる。
（ａ）無機塩培地中の炭素源以外の有機物の含有量が、培養開始時に１０ｇ／Ｌ以下である。
（ｂ）無機塩培地中の無機電解質の含有量が、培養開始時に１１ｇ／Ｌ以下である。
（ｃ）無機塩培地中のチアミンの含有量が０．１ｍｇ／Ｌ以下である。
（ｄ）無機塩培地中の遷移金属イオンの含有量が１０ｍｇ／Ｌ以下である。
【００２０】
本実施形態に係るＤ−乳酸の生産方法において無機塩培地は、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択される１つ以上を満たすものであり、好ましくは、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択される２つ以上を満たし、より好ましくは上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択される３つ以上を満たし、更に好ましくは上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の全てを満たすものである。これにより、ポリマー原料となるＤ−乳酸を生産することができる。また、本実施形態に係るＤ−乳酸の生産方法によれば、ポリマー原料の用途に適した、Ｄ−乳酸を得ることができる。
以下、本実施形態に係るＤ−乳酸の生産方法について詳しく説明する。
【００２１】
本実施形態において、炭素源とは、Ｄ−乳酸生産大腸菌がＤ−乳酸の生産を行う上で利用可能な発酵性の糖であり、より具体的には、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、グリセリン、アラビノース、メリビオース、トレハロース、マルトース、メリビオン酸、ラクトース、マルトトリオース、リボース、ガラクトース、ガラクツロン酸、グルコン酸、グルコサミン、グルクロン酸、マンニトール、マンノース、サッカリン酸、ソルビトール、フコース、ラムノース、アロース、及びＮ-アセチルグルコサミンからなる群より選択される１以上の化合物を含むことが好ましい。また、デンプン加水分解物、草木質分解産物やセルロース加水分解物などを炭素源として用いてもよい。
なおＤ−乳酸の生産を行う上で上記の糖を利用するために、必要となる酵素遺伝子、または、利用効率を向上させるような遺伝子を大腸菌に導入してもよい。具体的な例としては、本願実施例記載の通り、インベルターゼを導入した大腸菌によるスクロースからのＤ−乳酸生産が例示される。
【００２２】
本実施形態に係る無機塩培地には、炭素源以外の有機物も含まれている。ここで、炭素源以外の有機物とは、上述した発酵性の糖以外の有機物であり、たとえば、有機窒素源が挙げられる。炭素源以外の有機物に関するより具体的な例としては、油粕類、大豆加水分解物、カゼイン分解物、アミノ酸類、コーンスティープリカー、酵母および酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、麦芽エキス、ホエー、各種発酵菌体およびその加水分解物、またはそれらに含まれる有機物成分等が挙げられる。また、ビタミン類も炭素源以外の有機物の一例である。さらに、無機塩培地のｐＨ緩衝作用を高める目的で加えられる緩衝剤となる有機物が、炭素源以外の有機物の例として挙げられ、たとえば、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｔｒｉｓ（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）等が挙げられる。
【００２３】
本実施形態における無機電解質と炭素源とを含む無機塩培地に、上述した炭素源以外の有機物が大量に含まれている場合、Ｄ−乳酸を得るための精製工程が煩雑になったり、ポリマーの色調に悪影響を及ぼしたりするといった不都合が生じる可能性があるため、無機塩培地中に含有させる炭素源以外の有機物量を制限しておくことが好ましい。
【００２４】
本実施形態において、無機塩培地中の炭素源以外の有機物の含有量は、培養開始時に、１０ｇ／Ｌ以下であることが好ましく、ポリマーの色調の観点から、２ｇ／Ｌ以下であるとより好ましく、０．６ｇ／Ｌ以下であるとさらに好ましい。例えば、培養開始時の無機塩培地において、炭素源以外の有機物の含有量は、０〜１０ｇ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは０〜２ｇ／Ｌであり、さらに好ましくは０〜０．６ｇ／Ｌある。また、下限値については、ポリマーの色調の観点から、０ｇ／Ｌ以上であることが好ましい。
なお、本実施形態に係るＤ−乳酸の生産方法において、「培養開始時」とは、Ｄ−乳酸生産大腸菌を培地に接種する直前のことをいう。
【００２５】
また、本実施形態に係るＤ−乳酸の生産方法における「無機塩培地」とは、微生物を用いた乳酸発酵において、微生物が必要とする元素のうち、炭素源を除く元素を構成成分として含む無機電解質を水に溶解又は懸濁して調製された液体の培地である。
【００２６】
また、本実施形態に係るＤ−乳酸の生産方法において無機電解質は、カリウムイオン（Ｋ＋）、リン酸イオン（ＰＯ４３−）、アンモニウムイオン（ＮＨ４＋）、硫酸イオン（ＳＯ４２−）及びマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）からなる群より選択される１以上のイオンを構成成分として含むことが好ましい。こうすることで、高品質のポリマーを得ることができ、より安価に、かつ、効率よくＤ−乳酸を生産することができる。なお、培養開始時の無機塩培地中において、上記無機電解質の含有量は、合計で１１ｇ／Ｌ以下であることが好ましく、０〜１１ｇ／Ｌの範囲が好ましい。また、下限値については、０ｇ／Ｌ以上であることが好ましい。
【００２７】
無機塩培地中にＫ＋を構成成分として含ませる場合、用いる無機電解質は、特に限定されないが、たとえば、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、リン酸三カリウム（Ｋ３ＰＯ４）、及び、硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ４）からなる群より選択される少なくとも１以上を選択して用いることができる。また、無機塩培地中のＫ＋含有量は、好ましくは５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１５〜２５ｍｍｏｌ／Ｌである。また、培養開始時の無機塩培地中においてＫ＋含有量は、より一層効率よくＤ−乳酸を生産するという観点から、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、５．８ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるとさらに好ましく、１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるとより一層好ましい。一方、培養開始時の無機塩培地中においてＫ＋含有量の上限値は、より一層効率よくＤ−乳酸を生産するという観点から、７３ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるとさらに好ましく、２５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるとより一層好ましい。
【００２８】
無機塩培地中にＰＯ４３−を構成成分として含ませる場合、用いる無機電解質は、特に限定されないが、たとえば、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、リン酸二水素アンモニウム（ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４）、リン酸水素二アンモニウム（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４）、リン酸三アンモニウム（（ＮＨ４）３ＰＯ４）、リン酸一水素マグネシウム（ＭｇＨＰＯ４）、リン酸マグネシウム（Ｍｇ３（ＰＯ４）２）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、リン酸三カリウム（Ｋ３ＰＯ４）、リン酸アンモニウムマグネシウム（ＭｇＮＨ４ＰＯ４）、リン酸二水素マグネシウム（Ｍｇ（Ｈ２ＰＯ４）２）、リン酸一水素マグネシウム（ＭｇＨＰＯ４）及びリン酸マグネシウム（Ｍｇ３（ＰＯ４）２）からなる群より選択される少なくとも１以上を選択して用いることができる。無機塩培地中のＰＯ４３−含有量は、２〜４０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌである。また、培養開始時の無機塩培地中においてＰＯ４３−含有量は、より一層効率よくＤ−乳酸を生産するという観点から、２ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるとさらに好ましい。一方、培養開始時の無機塩培地中においてＰＯ４３−含有量の上限値は、より一層効率よくＤ−乳酸を生産するという観点から、４０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるとさらに好ましい。
【００２９】
無機塩培地中にＮＨ４＋を構成成分として含ませる場合、用いる無機電解質は、特に限定されないが、たとえば、リン酸二水素アンモニウム（ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４）、リン酸水素二アンモニウム（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４）、リン酸アンモニウム（（ＮＨ４）３ＰＯ４）、リン酸アンモニウムマグネシウム（ＭｇＮＨ４ＰＯ４）、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）及びリン酸水素アンモニウムカリウム（ＮＨ４ＫＨＰＯ４）からなる群より選択される少なくとも１以上を選択して用いることができる。無機塩培地中のＮＨ４＋含有量は、好ましくは２０〜１２０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４０〜８０ｍｍｏｌ／Ｌである。また、培養開始時の無機塩培地中においてＮＨ４＋含有量は、より一層効率よくＤ−乳酸を生産するという観点から、２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、４０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるとさらに好ましい。一方、培養開始時の無機塩培地中においてＮＨ４＋含有量の上限値は、より一層効率よくＤ−乳酸を生産するという観点から、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるとさらに好ましい。
【００３０】
無機塩培地中にＳＯ４２−を構成成分として含ませる場合、用いる無機電解質は、特に限定されないが、たとえば、硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ４）、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）及び硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）からなる群より選択される少なくとも１以上を選択して用いることができる。無機塩培地中のＳＯ４２−含有量は、好ましくは１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２０〜４０ｍｍｏｌ／Ｌである。また、培養開始時の無機塩培地中においてＳＯ４２−含有量は、より一層効率よくＤ−乳酸を生産するという観点から、１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるとさらに好ましい。一方、培養開始時の無機塩培地中においてＳＯ４２−含有量の上限値は、より一層効率よくＤ−乳酸を生産するという観点から、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、４０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるとさらに好ましい。
【００３１】
無機塩培地中にＭｇ２＋を構成成分として含ませる場合、用いる無機電解質は、特に限定されないが、たとえば、リン酸水素マグネシウム（ＭｇＨＰＯ４）、リン酸二水素マグネシウム（Ｍｇ（Ｈ２ＰＯ４）２）、リン酸マグネシウム（Ｍｇ３（ＰＯ４）２）、リン酸アンモニウムマグネシウム（ＭｇＮＨ４ＰＯ４）及び硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）からなる群より選択される少なくとも１以上を選択して用いることができる。無機塩培地中のＭｇ２＋含有量は、好ましくは０．２〜２ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５〜１.４ｍｍｏｌ／Ｌである。また、培養開始時の無機塩培地中においてＭｇ２＋含有量は、より一層効率よくＤ−乳酸を生産するという観点から、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるとさらに好ましい。一方、培養開始時の無機塩培地中においてＭｇ２＋含有量の上限値は、より一層効率よくＤ−乳酸を生産するという観点から、２ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、１．４ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるとさらに好ましい。
【００３２】
また、本実施形態における「無機塩培地」は、チアミンや遷移金属イオンをさらに含んでいてもよい。無機塩培地中にチアミンや遷移金属イオンが含まれている場合、安価で、かつ、効率的にＤ−乳酸を生産する観点から、少なくとも上記（ｃ）又は上記（ｄ）のいずれか一方を満たすことが好ましく、精製をより簡便にする観点から上記（ｃ）及び上記（ｄ）の両方を満たすことがさらに好ましい。
【００３３】
培養開始時の無機塩培地中においてチアミン含有量は、０．１ｍｇ／Ｌ以下であることが好ましく、０．０２ｍｇ／Ｌ以下であるとさらに好ましい。さらには、無機塩培地として、チアミンを含まないものを用いることがより一層好ましい。このため、培養開始時の無機塩培地中においてチアミン含有量は、０〜０．１ｍｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０〜０．０２ｍｇ／Ｌであるとより好ましい。また、下限値については、０ｍｇ／Ｌ以上であることが好ましい。
【００３４】
また、遷移金属イオンは、特に限定されないが、たとえば、鉄イオン、コバルトイオン、銅イオン、亜鉛イオン及びモリブデン酸イオンからなる群より選択される少なくとも１以上のイオンを用いることができる。そして、培養開始時の無機塩培地中において遷移金属イオンの含有量は、１０ｍｇ／Ｌ以下であることが好ましく、０．８５ｍｇ／Ｌ以下であるとさらに好ましい。さらには、無機塩培地として、遷移金属イオンを実質的に含まないものを用いることが好ましい。このため、無機塩培地中の遷移金属イオンの含有量は、０〜１０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、０〜０．８５ｍｇ／Ｌであるとより好ましい
また、本実施形態に係るＤ−乳酸の生産方法において、培養開始時の無機塩培地は、さらに下記（ｅ）を満たすことが好ましい。こうすることで、より一層高品質のポリマーを得ることができ、より安価に、かつ、効率よくＤ−乳酸を生産することができる。
（ｅ）無機塩培地中の遷移金属イオンの含有量が０．８５ｍｇ／Ｌ以下である。
【００３５】
また、本実施形態における「無機塩培地」は、無機電解質を水に溶解又は懸濁して調製された液体であることが好ましい。この無機電解質を水に溶解又は懸濁して調製された液体に、炭素源を加えることにより、炭素源を原料として発酵によりＤ−乳酸を生産することができる。また、炭素源として用いる発酵性の糖は、特に限定されないが、たとえば、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、グリセリン、アラビノース、メリビオース、トレハロース、マルトース、メリビオン酸、ラクトース、マルトトリオース、リボース、ガラクトース、ガラクツロン酸、グルコン酸、グルコサミン、グルクロン酸、マンニトール、マンノース、サッカリン酸、ソルビトール、フコース、ラムノース、アロース、及びＮ-アセチルグルコサミンからなる群より選択される１以上の化合物が挙げられる。また、デンプン加水分解物、草木質分解産物やセルロース加水分解物などを発酵性の糖（炭素源）として用いてもよい。培養開始時の、無機塩培地中の糖含有量は、高濃度の糖が微生物の生育を阻害することを考慮し、グルコース換算で、無機塩培地の全質量に対して２００ｇ／Ｌ以下とすることが好ましく、１５０ｇ／Ｌ以下であるとさらに好ましい。培養開始時の、無機塩培地中の糖含有量の下限は、２０ｇ／Ｌ以上であることが好ましく、５０ｇ／Ｌ以上であるとさらに好ましい。以上を踏まえ、培養開始時において無機塩培地中の糖含有量は、２０〜２００ｇ／Ｌであることが好ましく、５０〜１５０ｇ／Ｌのであるとより好ましい。
【００３６】
本実施形態における「無機塩培地」には、更にベタインを含んでいてもよい。ここで、本実施形態におけるベタインとは、ＣＡＳ登録番号１０７−４３−７の化合物であり、トリメチルグリシン、グリシンベタインの名でも知られている化合物である。このベタインをさらに構成成分として含む無機塩培地を用いることで、Ｄ−乳酸生産大腸菌が良好なＤ−乳酸の発酵生産を行うことができるため好ましい。このように無機塩培地がベタインを含む場合、その含有量は、無機塩培地中に好ましくは０．０１〜５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．３〜２ｍｍｏｌ／Ｌである。また、培養開始時の無機塩培地中において、ベタイン含有量は、より一層効率よくＤ−乳酸を生産するという観点から、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるとさらに好ましい。一方、培養開始時の無機塩培地中においてベタイン含有量の上限値は、より一層効率よくＤ−乳酸を生産するという観点から、５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、２ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるとさらに好ましい。
【００３７】
また、本実施形態における「無機塩培地」は、消泡剤を含んでいてもよい。消泡剤としては、公知のものがいずれも好適に使用できる。例えば、アデカノールＬＧ１２６（商品名、ＡＤＥＫＡ社製）等が挙げられる。消泡剤の含有量は、無機塩培地の全質量に対して０．０１〜１ｇ／Ｌとすることが好ましく、０．０５〜０．５ｇ／Ｌがより好ましい。また、培養開始時の無機塩培地中において消泡剤の含有量は、より一層効率よくＤ−乳酸を生産するという観点から、０．０１ｇ／Ｌ以上であることが好ましく、０．０５ｇ／Ｌ以上であるとさらに好ましい。一方、培養開始時の無機塩培地中において消泡剤の含有量の上限値は、より一層効率よくＤ−乳酸を生産するという観点から、１ｇ／Ｌ以下であることが好ましく、０．５ｇ／Ｌ以下であるとさらに好ましい。
【００３８】
本実施形態においてＤ−乳酸を発酵生産するにあたって、無機塩培地で培養する菌体は、炭素源、好ましくは糖からＤ−乳酸を発酵生産する能力があるＤ−乳酸生産大腸菌であれば特段の制限はないが、遺伝子組み換えにより、対象となる大腸菌の乳酸生産活性に関与する酵素活性の増強、若しくは不活性化、低減化又はこれらの組み合わせることによりＤ−乳酸生産活性及び／またはＤ乳酸光学純度を向上させた組換え大腸菌を、Ｄ−乳酸生産大腸菌として用いることが好ましい。
【００３９】
本実施形態における「遺伝子組み換えにより」との文言は、生来の遺伝子の塩基配列に対する別のＤＮＡの挿入、あるいは遺伝子のある部分の置換、欠失又はこれらの組み合わせによって塩基配列上の変更が生じているものであれば全て包含し、例えば、突然変異が生じた結果得られたものであってもよい。Ｄ−乳酸生産活性及び／またはＤ−乳酸光学純度を向上させた組換え大腸菌としては、例えば、ＷＯ２００５／０３３３２４、ＷＯ２０１０／０３２６９７、ＷＯ２０１０／０３２６９８記載のもの等が挙げられる。
【００４０】
具体的には、Ｄ−乳酸生産大腸菌は、下記（ｉ）〜（ｖ）からなる群より選択される１つ以上の遺伝子組み換えを含む組換え大腸菌であることが好ましく、（ｉ）〜（ｉｉｉ）のすべての遺伝子組み換えを含む組換え大腸菌であるとさらに好ましい。このように遺伝子組み換えをして得られた組換え大腸菌は、通気条件下でＤ−乳酸を生産させる時にｌｄｈＡの発現が増強されていないものと比較してＤ−乳酸の蓄積量が向上し、不純物のピルビン酸濃度が減少すると共にＤ−乳酸の光学純度を向上させることが可能となる。
（ｉ）大腸菌が本来有しているＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｄｌｄ）活性を不活化あるいは低減化する遺伝子組み換え
（ｉｉ）大腸菌が本来有しているピルベートホルメートリアーゼ（Ｐｆｌ）活性を不活化あるいは低減化する遺伝子組み換え
（ｉｉｉ）大腸菌由来ＮＡＤＨ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬｄｈＡ）活性を増強する遺伝子組み換え
（ｉｖ）大腸菌が本来有しているリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ）活性を不活化あるいは低減化する遺伝子組み換え
（ｖ）大腸菌が本来有しているアスパラギン酸アンモニアリアーゼ（ＡｓｐＡ）活性を不活化あるいは低減化する遺伝子組み換え
【００４１】
（ｉ）のＤｌｄは、Ｄ−乳酸から、補酵素である酸化型フラビンアデニンジヌクレオチドの存在下でピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を意味する。
【００４２】
（ｉｉ）のＰｆｌは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．３．１．５４に分類され、ホルメートアセチルトランスフェラーゼとも呼ばれる酵素を指す。この酵素はピルビン酸からギ酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を意味している。
【００４３】
（ｉｉｉ）のＬｄｈＡは、ピルビン酸とＮＡＤＨからＤ−乳酸とＮＡＤを生成する大腸菌由来の酵素を指す。
【００４４】
（ｉｖ）のＭｄｈは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．３７に分類され、リンゴ酸から、補酵素である酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下でオキサロ酢酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を指す。
【００４５】
（ｖ）のＡｓｐＡは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号４．３．１．１に分類され、アスパルターゼとも呼ばれる酵素を指す。この酵素はＬ−アスパラギン酸からフマル酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素の総称を意味している。
【００４６】
上記（ｉｉｉ）の遺伝子組み換えは、ＬｄｈＡをコードする遺伝子を、解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターと連結した状態で発現プラスミドに組込み、これを大腸菌へ導入する方法や、大腸菌のゲノム上に存在する、大腸菌由来のＬｄｈＡをコードする遺伝子から、解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターを使用することでＬｄｈＡを発現させる方法が挙げられるが、大腸菌のゲノム上に存在するＬｄｈＡをコードする遺伝子から、解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターを使用してＬｄｈＡを発現させる方法であることが好ましい。
【００４７】
ここで、解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターとは、恒常的に細菌内、好ましくは大腸菌内で機能する強力なプロモーターであって、且つグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターを指す。具体的には、解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターとしては、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｇｌｙＡ）プロモーター等が挙げられる。
【００４８】
また、Ｄ−乳酸生産大腸菌は、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群及びＦｒｕＫからなる群より選択された少なくとも一つが強化されていてもよいが、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群及びＦｒｕＫの双方が強化されていることが好ましく、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群のうちｃｓｃＡのみとＦｒｕＫとが共に強化されていることがさらに好ましい。
【００４９】
スクロース加水分解酵素（インベルターゼ、ＣｓｃＡ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ）酵素委員会報告に準拠した酵素番号３．２．１．２６に分類され、スクロースからＤ−グルコースとＤ−フルクトースを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。ＣｓｃＡの強化は、例えば、大腸菌由来のＣｓｃＡをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡを大腸菌に導入することで実現することができる。
【００５０】
フルクトース−１−リン酸キナーゼ（ＦｒｕＫ）は、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．７．１．５６に分類され、ホスホフルクトキナーゼ１とも呼ばれる酵素を指す。ＦｒｕＫの強化は、例えば、大腸菌由来のＦｒｕＫをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡを大腸菌に導入することで実現することができる。
【００５１】
本実施形態のＤ−乳酸の生産方法は、Ｄ−乳酸生産大腸菌を用いて、炭素源、好ましくは糖からＤ−乳酸を生産させることを含むものである。即ち、Ｄ−乳酸生産大腸菌と炭素源とを接触させる工程と、接触により得られたＤ−乳酸を回収する工程とを含むものである。
【００５２】
具体的には、本実施形態に係るＤ−乳酸の生産方法は、無機塩培地においてＤ−乳酸生産大腸菌と炭素源とを接触させてＤ−乳酸塩を得る工程と、Ｄ−乳酸塩を含む無機塩培地からＤ−乳酸生産大腸菌を除去した後にＤ−乳酸塩を脱塩してＤ−乳酸を得る工程と、を含む。
【００５３】
また、本実施形態に係るＤ−乳酸の生産方法は、上記Ｄ−乳酸塩を得る工程において、Ｄ−乳酸のアルカリ土類金属塩を得て、その後、Ｄ−乳酸を得る工程において、Ｄ−乳酸のアルカリ土類金属塩を脱塩することでアルカリ土類金属を含む無機塩を析出させてもよく、Ｄ−乳酸塩を得る工程において、Ｄ−乳酸のアルカリ金属塩を得て、その後、Ｄ−乳酸を得る工程において、電解透析処理によりＤ−乳酸のアルカリ金属塩を脱塩してもよい。
【００５４】
また、本実施形態に係るＤ−乳酸の生産方法は、Ｄ−乳酸塩を脱塩してＤ−乳酸を得る工程の後に、Ｄ−乳酸の精製を行う精製工程をさらに含み、精製工程において、加水分解しながら蒸留を行うことが好ましい。こうすることで、蒸留工程のＤ−乳酸回収率をより一層上げることができ、より安価に、かつ、効率よくＤ−乳酸を生産することができる。
【００５５】
Ｄ−乳酸生産大腸菌と炭素源との接触は、上述した無機塩培地中でＤ−乳酸生産大腸菌を培養することにより行われ、これによりＤ−乳酸を含む発酵液を得ることができる。
【００５６】
Ｄ−乳酸生産大腸菌の培養条件としては使用する大腸菌、培養装置により変動するものの、培養温度は２０℃以上４０℃以下であることが好ましく、より好ましくは２５℃以上３５℃以下であるとさらに好ましい。
【００５７】
また、培養槽の圧力は、培養時に、常圧（０．１ＭＰａ）以上０．５ＭＰａ以下であることが好ましく、常圧（０．１ＭＰａ）以上０．２ＭＰａ以下であるとさらに好ましい。
【００５８】
また、培養のｐＨは、大腸菌の発酵生産力を高める観点から好ましくは４．０以上９．０以下とすればよく、ｐＨ６．０以上８．０以下であると好ましく、ｐＨ７．０以上７．８以下であるとさらに好ましい。なお、ｐＨの調製は、Ｄ−乳酸を生産しながら無機塩基を培養槽に添加しながら行うことが好ましい。これにより、生産するＤ−乳酸を無機塩基で中和し、乳酸塩とすることができる。
【００５９】
無機塩基としては、たとえば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化ルビジウム等のアルカリ金属塩、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム及び水酸化バリウム等のアルカリ土類金属塩、並びにアンモニアからなる群より選択される少なくとも１種を用いればよい。また、無機塩基の種類を選択することで生産したＤ−乳酸に対応する乳酸塩の対イオンを、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、バリウムイオン、アンモニウムイオンなど任意のカチオンにすることができる。
【００６０】
培養時間は特に限定されず、菌体が十分に増殖し、且つＤ−乳酸が生成するに必要な時間であればよい。
【００６１】
培養に際しては通常は温度、ｐＨ、通気条件、攪拌速度、圧力を制御し得る培養槽を用いるのが一般的であるが、本実施形態に係る培養に際しては培養槽を使用することに限定されない。なお、培養槽を用いて培養する場合には、培養槽内の培地に大腸菌を接種する必要があるが、接種する量に特段の限定はなく、用いる大腸菌について寒天培地にコロニーを形成させ、そのコロニーを白金耳などにより培養槽に直接接種してもよい。
また、フラスコや別の培養槽などの容器で予め培養した培養液を調製し、これを必要量、培養槽内の培地に接種してもよい。このときの培養液の必要量は、特に制限されるものではないが、培養槽内の培地に大腸菌が１細胞でも接種される量であればよい。具体的には、培養液の量は、培養槽内の培地液量の０．０１％〜４０％相当量が好ましい。より好ましくは０．１％〜１０％相当量である。また、培養液の必要量は、より一層効率よくＤ−乳酸を生産するという観点から、０．０１％相当量以上であることが好ましく、０．１％相当量以上であるとさらに好ましい。一方、培養液の必要量の上限値は、より一層効率よくＤ−乳酸を生産するという観点から、４０％相当量以下であることが好ましく、１０％相当量以下であるとさらに好ましい。
【００６２】
また、発酵工程における通気量は、乳酸生産効率の観点から、０ｖｖｍ以上であればよく、０．００１ｖｖｍ以上であることが好ましく、０．０１ｖｖｍ以上であるとさらに好ましい。一方、発酵工程における通気量は、乳酸生産効率の観点から、５ｖｖｍ以下であればよく、２ｖｖｍ以下であることが好ましく、１ｖｖｍ以下であるとさらに好ましい。
なお、本実施形態では通気量としてｖｖｍとの表記を使用する場合がある。本明細書において「ｖｖｍ」とは、１分間で、液容量の何倍の通気をするかということを示すものであり、例えば、１０Ｌの発酵液に対して、５ｖｖｍの通気を行ったとは、毎分５０Ｌの通気を行ったということを意味するものである。
【００６３】
液中に通気する場合は内圧、撹拌羽根位置、撹拌羽根形状、撹拌速度の組み合わせにより液中への酸素の溶け込み速度が変化するために、Ｄ−乳酸の生産性、及び、Ｄ−乳酸以外の有機酸量などを指標に種々の条件が設定可能である。なお、設定された通気条件は、発酵初期から終了まで一貫して行う必要はなく、発酵工程の一部で行うことでも好ましい結果を得ることができる。上記のように通気を行うことでＤ−乳酸の生産性の向上、Ｄ−乳酸以外の有機酸量の削減を達成することができる。
【００６４】
また、酸素摂取速度（ＯＵＲ）は、乳酸生産性の観点から、０．０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ以上であることが好ましく、１．０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ以上であるとさらに好ましい。一方、酸素摂取速度（ＯＵＲ）の上限値は、乳酸生産性の観点から、１００．０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ以下であることが好ましく、５０．０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ以下であるとさらに好ましく、さらには１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ以下であることが好ましく、５．０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ以下であるとより一層好ましい。
なお、ＯＵＲは、Ｄ−乳酸の生産期に測定されたものであればよい。ここでＤ−乳酸の生産期とは、発酵開始後、大腸菌培養の適応期を経て大腸菌が増殖を開始しＤ−乳酸を生産する時期を指す。また大腸菌の培養と乳酸生産を分けて実施する場合は、乳酸生産工程を指す。
【００６５】
本実施形態において酸素摂取速度（ＯＵＲ）とは、発酵液の単位容積あたりの酸素移動速度であり、すなわち大腸菌の酸素摂取速度とも言える。ＯＵＲは排ガス分析法によって以下の式１から求めたものを用いる。
【００６６】
（式１）
ＯＵＲ＝７．２２×１０６／ＶＬ×（ＱｉＰｉｙｉ／Ｔｉ−ＱｏＰｏｙｏ／Ｔｏ）
ＶＬ：発酵槽中の液量（Ｌ）
Ｑｉ及びＱｏ：空気入り口及び出口における空気流量（Ｌ／ｍｉｎ）
Ｐｉ及びＰｏ：空気入り口及び出口における空気圧（ＭＰａ）
Ｔｉ及びＴｏ：空気入り口及び出口における絶対温度（Ｋ）
ｙｉ及びｙｏ：空気入り口及び出口における酸素のモル分率
【００６７】
なお、上記式１に基づいてＯＵＲを求める際に、空気流量、空気圧、絶対温度の値が空気入り口及び出口で無視できる程度の差しかないときには１カ所での測定値を適用してもよい。また、本実施形態でいう圧力及び空気圧は、絶対圧力を指す。
【００６８】
ＯＵＲは、通気量、攪拌回転速度、温度、圧力、ｐＨなどによって変動する。従って、ＯＵＲを上述した範囲内に調整するには、通気流量、攪拌回転速度等を適宜調整すればよい。
【００６９】
また、上記ＯＵＲは他の指標に換算することもできる。このような他の指標としては、液境膜容量係数（ｋＬａ）を挙げることができる。液境膜容量係数（ｋＬａ）は通気量・攪拌回転速度の関数であり、以下の関係が知られている（式２、Ｒｉｃｈａｒｄｓ，  Ｊ．  Ｗ．  １９６１，  Ｐｒｏｇ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏ．３，  １４３−１７２）
【００７０】
（式２）
ｋＬａ∝（Ｐｇ/Ｖ）０．４Ｖｓ０．５Ｎ０．５
Ｐｇ：通気攪拌槽の消費動力
Ｖ：槽に張り込まれた液量
ＶＳ：見かけの空気線速度（通気量／槽断面積）
Ｎ：攪拌回転速度
【００７１】
図１は、Ｄ−乳酸生産大腸菌の培養に用いられる発酵装置の一例を示す。発酵装置１０には、発酵槽１２が設けられている。この発酵槽１２には、マスフローメータ１４を介して空気入り口から空気が供給されるようになっており（矢印Ａ）、一方、コンデンサ１６を介して槽内の空気が排気口から排出されるようになっている（矢印Ｂ）。コンデンサ１６と排気口との間には、槽内圧力計１８及び排ガス分析計２０が連結され、槽内の圧力及び出口の酸素モル分圧をそれぞれ測定可能になっている。発酵槽１２には、温度センサ２２、ＤＯセンサ２４及びｐＨセンサ２６がそれぞれ配置されており、発酵槽１２内の反応液中の、温度、ＤＯ（溶在酸素）及びｐＨが測定可能になっている。また、発酵槽１２には、攪拌機としてのディスクタービン翼２８が配置されており、ディスクタービン翼２８はモーター４４で攪拌・制御される。
【００７２】
また、発酵槽１２の周囲は二重になっており温水にて加熱又は冷却することができる。発酵槽１２の外側には、ｐＨ調整剤を充填したｐＨ調整部３４が設けられている。ｐＨ調整部３４は、ポンプ３６を介して発酵槽１２へｐＨ調整剤を供給可能となっている。ｐＨ調整剤としては、前述の無機塩基を用いることができる。
【００７３】
発酵槽１２には、全体を制御するコントローラ３８が備えられており、温度センサ２２、ＤＯセンサ２４及びｐＨセンサ２６に連結されて、それぞれのセンサからの情報が入力可能になっている。また、コントローラ３８は、各種センサからの情報に応じて、ジャケット３２の温度を調節して発酵槽内の溶液温度を制御すると共に、ポンプ３６の作動によりｐＨ制御するようになっている。
【００７４】
発酵槽１２中に蓄積したＤ−乳酸は、無機塩培地から分離・精製することで回収することができる。具体的には、無機塩培地からの菌体等の固形物の除去、脱塩、濃縮、精製などの工程であるが、その方法や順序は特に制限されないものの、発酵後の無機塩培地からＤ−乳酸生産大腸菌を除去した後にＤ−乳酸塩を脱塩してＤ−乳酸を得ることが得ることが好ましい。
【００７５】
例えば、菌体などの固形物の除去には、遠心分離やろ過などの方法が挙げられる。
【００７６】
精製工程において、Ｄ−乳酸塩からＤ−乳酸へ変換する方法には、イオン交換カラムや電気透析などが挙げられる。無機酸の添加によりＤ−乳酸に脱塩してもよい。例えば、Ｄ−乳酸塩の対イオンがアルカリ土類金属イオンの場合には、Ｄ−乳酸塩を脱塩することでアルカリ土類金属を含む無機塩を析出させることができる。例えば、Ｄ−乳酸塩の対イオンがカルシウムイオンの場合には、硫酸を添加し、溶液中に硫酸カルシウムを析出させることで脱塩し、Ｄ−乳酸を得ることができる。
【００７７】
また、Ｄ−乳酸塩の対イオンがアルカリ金属イオン、好ましくはナトリウムイオン又はカリウムイオンの場合には、電解透析処理によりＤ−乳酸塩を脱塩することが好ましい。電解透析処理には、水分解電気透析装置を用いることができる。該装置は、バイポーラ膜と陽イオン交換膜とを交互に配列し、酸室と塩基室を形成させた電気透析装置のことである。その代表的なものとしては「二室式水分解電気透析装置」を挙げることができる。本実施形態においては、「水分解電気透析装置」を用いた電気透析操作のことを「水分解電気透析工程」と定義される。そして、更に具体的な処理として代表的には「二室式水分解電気透析工程」が例示される。
【００７８】
水分解電気透析工程においては、得られたＤ−乳酸塩を含む発酵液に対して、水分解電気透析装置を用いて、水分解電気透析工程を行い、Ｄ−乳酸とアルカリをそれぞれ回収する。すなわち、バイポーラ膜と陽イオン交換膜を使用した水分解電気透析装置に、Ｄ−乳酸塩溶液を供給して水分解電気透析工程を行い、酸室よりＤ−乳酸を、塩基室よりアルカリをそれぞれ得る。
【００７９】
バイポーラ膜としては、従来公知のバイポーラ膜、すなわち陽イオン交換膜と陰イオン交換膜とを貼合わせた構造を有する公知のバイポーラ膜を使用することができる。また、水分解電気透析装置の陽イオン交換膜としては、公知の陽イオン交換膜を用いることができる。
【００８０】
図２は、本実施形態において使用される水分解電気透析装置の代表的な態様の概略図を示すものである。即ち、図２において、水分解電気透析装置は、陽電極３および陰電極４の間に、膜としてバイポーラ膜Ｂ、陽イオン交換膜Ｃの２種類が交互に配列され、酸室８、及び塩基室７の二室が形成されている。陽イオン交換膜Ｃと陽電極３との空隙（陽極室５）、及び、陽イオン交換膜Ｃと陰電極４との空隙（陰極室６）には電極液が満たされている。ここで、バイポーラ膜Ｂの陰イオン交換体側と陽イオン交換膜Ｃの間の室が塩基室７、バイポーラ膜Ｂの陽イオン交換体側と陽イオン交換膜Ｃの間の室が酸室８となる。
【００８１】
上記、水分解電気透析装置の構造は、公知の構造が採用される。
本実施形態に係るＤ−乳酸の生産方法において、上記水分解電気透析装置を使用した水分解電気透析工程は、酸室８、塩基室７のそれぞれの室に供給する液の外部タンク（不図示）を設けて、それぞれの室と外部タンクとの間で液を循環しながら電気透析を行う方法が好適に採用される。
【００８２】
上記、Ｄ−乳酸塩溶液を酸室８に供給して電気透析を行うと、酸室８のＤ−乳酸塩は通電と共にＤ−乳酸に変換していく。即ち、酸室８中に導入されたＤ−乳酸塩の陽イオンは、陽イオン交換膜Ｃを透過して塩基室７へ移動し、このとき、バイポーラ膜Ｂから生成したＯＨイオンと結合して塩基となる。また、酸室８ではバイポーラ膜Ｂから生成したプロトンとＤ−乳酸アニオンとが結合して非解離性のＤ−乳酸となり、そのまま酸室８にとどまる。
【００８３】
本実施形態において、水分解電気透析工程時の各種液の温度は、通常、５℃以上７０℃以下であり、２０℃以上５０℃以下とすることが好ましい。
【００８４】
以上のように、水分解電気透析工程により、Ｄ−乳酸塩を分解しＤ−乳酸とアルカリを分離し、Ｄ−乳酸を回収することができる。なお、分離したアルカリは、Ｄ−乳酸等の有機酸発酵での中和剤として再利用することができる。
【００８５】
上記水分解電気透析工程によって、純度の高いＤ−乳酸を得ることができる。
【００８６】
濃縮及び精製工程では、例えば、タンパク質や副生有機酸など不純物の除去には活性炭処理やＮＦ膜処理、イオン性物質の除去にはイオン交換カラムや陰イオン／陽イオン交換膜電気透析、蒸発による濃縮、精製及び乳酸の回収には、脱塩した後直接蒸留する方法、水蒸気蒸留する方法、ラクチドなどを形成させ蒸留する方法、アルコールと触媒を加えエステル化した後蒸留する方法、有機溶媒中に抽出する方法、クロマトカラムで分離する方法、イオン交換カラムで分離する方法、陰イオン／陽イオン交換膜電気透析により濃縮及び回収する方法、晶析により結晶化する方法が挙げられる。また、これらの方法を任意の順序で適宜組み合わせてもよい。
【００８７】
例えば、脱塩後に得られたＤ−乳酸溶液に対し、活性炭処理を行うことが好ましい。これにより、着色成分を除去し、ポリマー化の用途に適したＤ−乳酸を得ることができる。活性炭処理は、例えば、Ｄ−乳酸溶液の重量に対し、０．２重量％以上２重量％以下の活性炭を添加し、必要に応じて攪拌した後、濾過により活性炭を除去することで実行することができる。活性炭処理後のＤ−乳酸溶液の４００ｎｍの光透過率は、水の４００ｎｍの光透過率を１００％としたとき、８０％以上９９％以下とすることができる。
【００８８】
また、例えば、脱塩後に得られたＤ−乳酸溶液を回分又は連続で蒸留する際、水を加え加水分解しながら蒸留することが好ましい。これにより、缶内液の重合を抑制でき、蒸留収率が向上する。重合度ｎは１以上４以下であることが好ましく、１以上２以下であるとさらに好ましく、１以上１．５以下であるとより一層好ましい。このとき蒸留収率は７０重量％以上９９．５重量％以下にすることができる。ここでいう蒸留収率とは、蒸留工程での乳酸成分の回収率であり、乳酸成分とは、乳酸と乳酸オリゴマーのことである。
また、例えば、蒸発濃縮工程で重合が進行した場合は、蒸留の前に加水分解を行い、乳酸の重合度ｎを下げておくことも蒸留収率の向上には有効である。
【００８９】
ここで、本実施形態に係るポリマーの生産方法は、本実施形態に係るＤ−乳酸の生産方法により得られたＤ−乳酸を用いて重合反応を行うものである。以下、詳説する。
【００９０】
本実施形態に係るＤ−乳酸の生産方法において得られたＤ−乳酸を原料としてポリマー重合することにより、着色が少なく、高分子量のポリマー（ポリ乳酸や乳酸共重合体）を得ることができる。ここで言うポリ乳酸は、Ｄ−乳酸とＬ−乳酸とのステレオコンプレックス型重合体とＤ−乳酸の単独重合体を含む。Ｄ−乳酸とＬ−乳酸とのステレオコンプレックス型重合体の原料の一つであるＬ−乳酸については、公知のものが好適に使用できる。Ｌ−乳酸の製法は特に限定されることはなく、例えば発酵法や有機合成法などが挙げられる。これらポリ乳酸や乳酸共重合体は、様々な成形加工方法、例えば、射出成形、フィルム成形、シート成形、押出し成形、ブロー成形、発砲成形などにより、加工され各種用途に用いられる。用途としては、例えば、生分解性プラスチックの特性や耐熱性などを活かし、包装容器、緩衝材、各種電子・電気機器、ＯＡ機器、車両部品、機械部品、その他農業資材、漁業資材、搬送容器、遊戯具および雑貨などが挙げられる。
【００９１】
本実施形態に係るポリ乳酸の生産方法において、重合の方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を採用することができる。例えば、乳酸ラクチドを経由する開環重合、乳酸や乳酸エステルを直接重合する縮重合、乳酸や乳酸エステルを直接重合したオリゴマーをポリイソシアネート等によりアミド結合やウレタン結合などを介するなどして鎖延長される重合方法などが挙げられる。また、重合の形式としては、固相重合や溶融重合などが挙げられる。
本実施形態に係る乳酸共重合体の生産方法において、配列順序や重合の方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を採用することができる。例えば、配列順序では、ランダム共重合、交互共重合、ブロック共重合、グラフト共重合などが挙げられ、また、重合の方法では、ラジカル共重合、イオン共重合、共縮合などが挙げられる。
【００９２】
このように本実施形態に係る方法で得られるＤ−乳酸は、ポリ乳酸の製造に用いることができる。得られるポリ乳酸の重量平均分子量（Ｍｗ）は、５万以上４０万以下であることが好ましく、８万以上３０万以下であると更に好ましい。
【００９３】
ここで、ポリマーの分子量分布は、通常、Ｍｗ／Ｍｎで表されるが、ポリ乳酸などの重縮合反応では、一般的に、反応が完結に近づくと分子量分布は２に近くなる（岡村誠三著  高分子化学序論  第２版 ｐ．２１０より）。分子量分布は、ポリマーの流動性、機械的性質に大きく影響し、分子量分布が広ければ、すなわち、Ｍｗ／Ｍｎの値が大きくなれば、非ニュートン特性が大きくなり流動性が向上するため、成形加工の工程において樹脂を成形しやすくなることが知られている。本実施形態に係る方法で得られたＤ−乳酸から製造されたポリ乳酸や乳酸共重合体は、一般的な重縮合系ポリマーより分子量分布が広く、その範囲は、好ましくは３以上２０以下、より好ましくは５以上１５以下、更に好ましくは８以上１２以下とすることができ、成形しやすいとこが特性である。更に、本実施形態に係る方法で得られるＤ−乳酸は、多量の活性炭処理や煩雑な精製工程を経なくても分子量分布の高いポリ乳酸や乳酸共重合体を製造することができる。例えば、活性炭処理においては、０．２重量％以上２重量％以下の少量の活性炭で処理しても分子量分布の広いポリ乳酸や乳酸共重合体を製造することができる。
【００９４】
また、本実施形態に係る方法で得られるＤ−乳酸から製造されたポリ乳酸や乳酸共重合体の着色度（ＹＩ値）は、好ましくはＹＩ値１０以下、より好ましくはＹＩ値５以下とすることができる。
なお、ここでいうＹＩ値とは、理想上の白色（完全拡散反射面）を０として、この白色からの距離を示すものであり、白色から黄色方向の色差はプラス、青方向の色差はマイナスで表される。従って、マイナスの値が大きくなると青みが増し、プラスの値が大きくなると黄みが増し、何れも色相悪化の原因となる。
色の三原色である赤、緑、青のうち、Ｘは主に赤を感じる値、Ｙは緑を感じる値、Ｚは青を感じる値とすると、ＹＩ値は、色差計（例えば、島津製作所紫外−可視分光計ＵＶ−２４００ＰＣ）を用いて三刺激値Ｘ，Ｙ，Ｚを測定し、式３により算出される。
ＹＩ値＝１００×（１．２８Ｘ−１．０６Ｚ）／Ｙ    （式３）
【００９５】
本実施形態に係る方法によれば、色相や分子量などＤ−乳酸ポリマーに求められる品質に、見合うようなＤ−乳酸ポリマーへと重合可能なＤ−乳酸モノマーを、より安価に、効率よく生産する方法を提供することができる。また、工業的な大量生産において、しばしば問題となるような廃棄物、廃塩をより削減したＤ−乳酸モノマー製造法を提供することができる。
【００９６】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【実施例】
【００９７】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。特に断らない限り、得られたＤ−乳酸の光学純度はいずれも１００％ｅｅだった。光学純度はＨＰＬＣで定法に従って測定した（カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ ＯＡ−５０００（住化分析センター社製）、溶離液：イソプロピルアルコール １０ｇ/Ｌおよび硫酸銅（ＩＩ）無水  ３１９．２ｍｇ/Ｌよりなる水溶液、検出波長：２５４ｎｍ）。【００９８】
（製造例１）ＷＯ２００５／０３３３２４の実施例２３に記載の方法と同様に大腸菌株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株を作製した。
具体的には、以下の方法により、大腸菌株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株を作製した。【００９９】
＜製造１：エシェリヒア・コリｄｌｄ遺伝子の近傍領域のクローニング＞
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのＦＡＤ依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（以下ｄｌｄと略すことがある）の塩基配列も報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ１００３８）。
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ）記載の方法により調製し、得られたゲノムＤＮＡと、ＭＧ１６５５株由来ゲノムＤＮＡのｄｌｄ遺伝子近傍領域の遺伝子情報に基づいて作製された、ＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＧＣＧ（配列番号１）とＴＴＣＣＡＣＴＣＣＴＴＧＴＧＧＴＧＧＣ（配列番号２）、ＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＴＴＡＣＧＧＡＴＧＧＣＡＧＡＧ（配列番号３）とＴＧＴＴＣＴＡＧＡＡＡＧＴＴＣＴＴＴＧＡＣ（配列番号４）を用いてＰＣＲを行った。得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩ、ＰｓｔＩとＸｂａＩで消化することにより、それぞれ約１１４０ｂｐのフラグメントを得た。このフラグメントを温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，  Ｔ．，  ｅｔ．ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  Ｖｏｌ．２４１（１），  ｐｐ１８５−１９１  （２０００））をＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートで３０℃で培養し、生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。プラスミドへの挿入配列をシーケンシングにより確認し、目的のｄｌｄ遺伝子近傍領域の配列が挿入されていることを確認した。本プラスミドをｐＴＨΔｄｌｄと命名した。【０１００】
＜製造２：エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ｄｌｄ遺伝子欠失株の作製＞
上記製造１で得たプラスミドｐＴＨΔｄｌｄをＭＧ１６５５株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートで３０℃で、生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。
さらにもう一度、４２℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返した。
次に上記クローンを、ＬＢ液体培地（３ｍｌ／試験管）に接種し、３０℃で３〜４時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈（１０−２〜１０−６程度）し、ＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれをＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、ＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲにより、ｄｌｄ遺伝子領域が欠失している株を選抜し、以上を満足するクローンをｄｌｄ欠失株とし、得られた株をＭＧ１６５５Δｄｌｄ株と命名した。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【０１０１】
＜製造３：エシェリヒア・コリｐｆｌ遺伝子の近傍領域のクローニング＞
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６），エシェリヒア・コリのピルベートホルメートリアーゼ（以下ｐｆｌと呼ぶことがある）をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＥ０００１９２）。ｐｆｌをコードする遺伝子の塩基配列近傍領域をクローニングするため、配列番号５、６、７及び８に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号６、７のプライマーは５´末端側にＳｐｈＩ認識部位を有している。
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ）記載の方法により調製し、得られたゲノムＤＮＡと、配列番号５の塩基配列を有するプライマーと配列番号６の塩基配列を有するプライマー、配列番号７の塩基配列を有するプライマーと配列番号８の塩基配列を有するプライマーの組み合わせで、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約１．８ｋｂｐ（以下ｐｆｌＢ−Ｌ断片と呼ぶことがある）及び、約１．３ｋｂｐ（以下ｐｆｌＢ−Ｒ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｐｆｌＢ−Ｌ断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩで、ｐｆｌＢ−Ｒ断片をＳｐｈＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，  Ｔ．，  ｅｔ．ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  Ｖｏｌ．２４１（１），  ｐｐ１８５−１９１  （２０００））のＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩ消化物とをＴ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換して、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートで３０℃で培養し、生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。プラスミドへの挿入配列をシーケンシングにより確認し、目的とするｐｆｌＢをコードする遺伝子の５´上流近傍断片と３´下流近傍断片の２つの断片が挿入されていることを確認した。本プラスミドをｐＴＨΔｐｆｌと命名した。【０１０２】
＜製造４：エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ｐｆｌ、ｄｌｄ遺伝子欠失株作製＞
上記製造３で得たプラスミドｐＴＨΔｐｆｌを、ＭＧ１６５５Δｄｌｄ株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートで３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体を上記製造２と同様に培養、選抜を行い、最終的に、ｐｆｌ遺伝子が欠失している株の選抜を行うことにより、ｐｆｌ遺伝子が破壊されたＭＧ１６５５Δｄｌｄ株を取得し、本株をＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株と命名した。【０１０３】
＜製造５：エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株の作製＞
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのｍｄｈ遺伝子の塩基配列も報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＥ０００４０３）。ｍｄｈをコードする遺伝子の塩基配列近傍領域をクローニングするため、配列番号９、１０、１１及び１２に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。配列番号９の塩基配列を有するプライマーは５´末端側にＫｐｎＩ認識部位を、配列番号１０、１１の塩基配列を有するプライマーは５´末端側にＢａｍＨＩ認識部位を、配列番号１２の塩基配列を有するプライマーは５´末端側にＸｂａＩ認識部位をそれぞれ有している。
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ）記載の方法により調製し、得られたゲノムＤＮＡ、配列番号９と配列番号１０、配列番号１１と配列番号１２の組み合わせで、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約８００ｂｐ（以下ｍｄｈ−Ｌ断片と呼ぶことがある）及び、約１，０００ｂｐ（以下ｍｄｈ−Ｒ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、ｍｄｈ−Ｌ断片をＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで、ｍｄｈ−Ｒ断片をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，  Ｔ．，  ｅｔ．ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  Ｖｏｌ．２４１（１），  ｐｐ１８５−１９１  （２０００））のＫｐｎＩ及びＸｂａＩ消化物とをＴ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換して、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートで３０℃で培養し、生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。プラスミドへの挿入配列をシーケンシングにより確認し、目的とするｍｄｈをコードする遺伝子の５´上流近傍断片と３´下流近傍断片の２つの断片が挿入されていることを確認した。本プラスミドをｐＴＨΔｍｄｈと命名した。
プラスミドｐＴＨΔｍｄｈをエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株に形質転換し、上記製造２と同様に培養、選抜を行い、最終的に、ｍｄｈ遺伝子が欠失している株の選抜を行うことにより、ｍｄｈ遺伝子が破壊されたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄ株を取得した。本株をＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株と命名した。【０１０４】
＜製造６：エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株の作製＞
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのａｓｐＡ遺伝子の塩基配列も報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＥ０００４８６）。ａｓｐＡをコードする遺伝子の塩基配列近傍領域をクローニングするため、配列番号１３、１４、１５及び１６に示すオリゴヌクレオチドプライマーを４種合成した。
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡと、配列番号１３と配列番号１４、配列番号１５と配列番号１６の組み合わせで、通常の条件でＰＣＲを行うことにより約９１０ｂｐ（以下ａｓｐＡＬ断片と呼ぶことがある）及び、約１，１００ｂｐ（以下ａｓｐＡ−Ｒ断片と呼ぶことがある）のＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にて分離、回収した。配列番号１４と配列番号１５は相補的な領域を含むことから、ａｓｐＡ−Ｌ断片とａｓｐＡ−Ｒ断片を混合し、プライマーを用いず、ＰＣＲ反応を行うことで、ａｓｐＡ−Ｌ断片とａｓｐＡ−Ｒ断片を連結することが可能である。これに基づき、ａｓｐＡ−Ｌ断片とａｓｐＡ−Ｒ断片を連結し、アガロース電気泳動にて分離、回収した。得られたＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝バイオ）で末端を平滑化した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて定法にて５´末端をリン酸化した。一方温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１は、ＳｍａＩ消化後、アルカリフォスファターゼにて脱リン酸化処理を行った。上記のリン酸化した２種類の断片と、脱リン酸化したプラスミドをＴ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換して、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートで３０℃で培養し、生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。プラスミドへの挿入配列をシーケンシングにより確認し、目的とするａｓｐＡをコードする遺伝子の５´上流近傍断片と３´下流近傍断片の２つの断片が挿入されていることを確認した。本プラスミドをｐＴＨΔａｓｐと命名した。
プラスミドｐＴＨΔａｓｐをエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株に形質転換し、上記製造２と同様に培養、選抜を行い、最終的に、ａｓｐＡ遺伝子が欠失している株の選抜を行うことにより、ａｓｐＡ遺伝子が破壊されたＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈ株を取得した。本株をＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株と命名した。【０１０５】
＜製造７：エシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株のゲノム上ｌｄｈＡプロモーターのＧＡＰＤＨプロモーターへの置換＞
エシェリヒア・コリのｌｄｈＡ遺伝子の塩基配列はすでに報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ３６９２８）。グリセルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＡＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣ（配列番号１７）、及びＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ（配列番号１８）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするフラグメントを得た。
また、エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリのｌｄｈＡ遺伝子の塩基配列も報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ３６９２８）。Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＡ）を取得するためにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＡＡＣＴ（配列番号１９）、及びＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＡＣＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＧＧＧＣ（配列番号２０）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１．０ｋｂｐのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）遺伝子フラグメントを得た。上記の２つのＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。プラスミドへの挿入配列をシーケンシングにより確認し、目的とするＧＡＰＤＨプロモーターとｌｄｈＡをコードする遺伝子が挿入され、ＧＡＰＤＨプロモーターによりｌｄｈＡが発現すると予測されるプラスミドを得た。本プラスミドをｐＧＡＰ−ｌｄｈＡと命名した。
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株由来ｌｄｈＡ遺伝子の５'近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、ＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣＡＡＧＣ（配列番号２１）とＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＣＡＧＴＧＡＴＧＴＴＧＡＡＴＣＡＣ（配列番号２２）を用いて、エシェリヒア・コリゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
また、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のグリセルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターの配列情報に基づいて作製されたＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＴＣＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧ（配列番号２３）とエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のｌｄｈＡ遺伝子の配列情報に基づいて作製されたＡＡＣＴＧＣＡＧＧＴＴＣＧＴＴＣＴＣＡＴＡＣＡＣＧＴＣＣ（配列番号２４）を用いて、先に作製したベクターｐＧＡＰ−ｌｄｈＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨプロモーターとｌｄｈＡ遺伝子の開始コドン近傍領域からなる約８５０ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。
上記により得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＫｐｎＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＰｓｔＩで消化し、このフラグメントを温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１をＫｐｎＩとＰｓｔＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。プラスミドへの挿入配列をシーケンシングにより確認し、目的とする、ｌｄｈＡをコードする遺伝子の５´上流近傍断片とＧＡＰＤＨプロモーターおよびｌｄｈＡ遺伝子の開始コドン近傍領域が挿入されていることを確認した。本プラスミドをｐＴＨＧＡＰｌｄｈＡと命名した。
プラスミドｐＴＨＧＡＰｌｄｈＡをＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこれらの菌体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で３０℃一晩培養し、さらにＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれをＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらの目的クローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりＧＡＰＤＨプロモーターとｌｄｈＡ遺伝子を含む約８００ｂｐ断片を増幅させ、ｌｄｈＡプロモーター領域がＧＡＰＤＨプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株と命名した。【０１０６】
［実施例１］  ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株／ＧＡＰｌｄｈＡ挿入株による無機塩培地におけるＤ−乳酸生産
前培養として三角フラスコにいれたＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，  Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）１００ｍＬに、製造例１で作製したＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株／ｐＧＡＰｌｄｈＡ株を植菌し、一晩、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。表１の組成よりなる無機塩培地４７５ｇの入った１Ｌ容の培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）をオートクレーブ滅菌し、そこに前培養液２５ｍｌを移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、撹拌速度３００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．５（２０ｗｔ％水酸化カルシウム、８０ｗｔ％純水のスラリーでｐＨ調整）でグルコースが枯渇するまで行った。培養終了後、得られた培養液中のＤ−乳酸蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した（カラム：ＵＬＴＲＯＮ ＰＳ−８０Ｈ（信和化工），溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ＝２．１））。発酵終了時間は１８時間で、Ｄ−乳酸蓄積濃度は９２．７ｇ／Ｌであった。発酵終了時間とは、添加した糖が全て消費された時間のことであり、その長さによって生産性を評価できる。【０１０７】
【表１】
2014017469.tif 000003
【０１０８】
［実施例２］  無機塩培地で生産したＤ−乳酸の粗精製
実施例１で得られたＤ−乳酸発酵液から菌体を除くために、８０００×ｇで遠心分離した。遠心分離上清中の乳酸カルシウムを脱塩して乳酸にするために、上清のｐＨが２．５になるまで９５重量％硫酸を添加した。析出した硫酸カルシウムを除くために、ろ紙（Ｗａｔｍａｎ４２）を使って吸引ろ過をした。脱色と粗精製をするために、ろ液重量の０．５重量％分の活性炭を添加して攪拌した。活性炭を除くために、ろ紙と０．４５μｍのメンブレンフィルターを使って吸引ろ過した。分光光度計における純水の４００ｎｍの波長の透過率を１００％とした場合、活性炭除去後のろ液の４００ｎｍの波長の透過率は９７．７％であった。【０１０９】
［比較例１］  ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株によるコーンスティープリカー培地におけるＤ−乳酸生産
前培養として三角フラスコにいれたＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，  Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）１００ｍＬに、製造例１で作製したＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株を植菌し、一晩、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。前培養液２５ｍｌを、表２の組成よりなるコーンスティープリカー培地４７５ｇの入った１Ｌ容の培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、撹拌速度３００ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．５（水酸化カルシウム水溶液で調整）でグルコースが枯渇するまで行った。培養終了後、得られた培養液中のＤ−乳酸蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。Ｄ−乳酸蓄積濃度は、２０時間で９０．７ｇ／Ｌであった。【０１１０】
【表２】
2014017469.tif 000004
【０１１１】
［比較例２］  コーンスティープリカー培地で生産したＤ−乳酸の粗精製
比較例１で得られたＤ−乳酸発酵液から菌体を除くために、８０００×ｇで遠心分離した。遠心分離上清中の乳酸カルシウムを脱塩して乳酸にするために、上清のｐＨが２．５になるまで９５重量％硫酸を添加した。析出した硫酸カルシウムを除くために、ろ紙（Ｗａｔｍａｎ４２）を使って吸引ろ過をした。脱色と粗精製をするために、ろ液重量の０．５重量％分、または３．０重量％分の活性炭を添加して攪拌した。活性炭を除くために、ろ紙と０．４５μｍのメンブレンフィルターを使って吸引ろ過して粗精製液を得た。分光光度計における純水の４００ｎｍの波長の透過率を１００％とした場合、活性炭除去後のろ液の４００ｎｍの波長の透過率は、０．５重量％活性炭では７８．７％、３．０重量％活性炭では９７．７％だった。コーンスティープリカー培地を用いた検討においては、清澄なＤ−乳酸溶液を得るために、無機塩培地よりも多量の活性炭が必要となることが示された。【０１１２】
［実施例３］  遷移金属イオンを添加した無機塩培地でのＤ−乳酸の生産
実施例１の培養条件で、培地に表３に示す組成の遷移金属含有水溶液を０．１体積％添加した。発酵終了時間、Ｄ−乳酸蓄積濃度は、遷移金属含有水溶液を添加しない場合と同等であった。【０１１３】
【表３】
2014017469.tif 000005
【０１１４】
［実施例４］  塩化カルシウムとチアミンを添加した無機塩培地でのＤ−乳酸の生産
実施例１の培養条件で、実施例１の培地にさらに塩化カルシウム及びチアミンを共に１０ｍｇ／Ｌになるよう添加した培地を用い、培養を実施した。発酵終了時間、Ｄ−乳酸蓄積濃度は、塩化カルシウム及びチアミンを添加しない場合と同等であった。【０１１５】
［実施例５］  遷移金属イオン、塩化カルシウムとチアミンを添加した無機塩培地でのＤ−乳酸の生産とＤ−乳酸の粗精製
実施例１の培養条件で、実施例１の培地にさらに表３に示す組成の遷移金属含有溶液を０．１体積％添加し、そこにさらに、塩化カルシウム及びチアミンを共に１０ｍｇ／Ｌになるよう添加した培地を用い、培養を実施した。発酵終了時間、Ｄ−乳酸蓄積濃度は、実施例１と同等であった。
得られたＤ−乳酸発酵液から菌体を除くために、８０００×ｇで遠心分離した。遠心分離上清中の乳酸カルシウムを脱塩して乳酸にするために、上清のｐＨが２．５になるまで９５重量％硫酸を添加した。析出した硫酸カルシウムを除くために、ろ紙（Ｗａｔｍａｎ４２）を使って吸引ろ過をした。脱色と粗精製をするために、ろ液重量の０．５重量％分、または１重量％分の活性炭を添加して攪拌した。活性炭を除くために、ろ紙と０．４５μｍのメンブレンフィルターを使って吸引ろ過した。分光光度計における純水の４００ｎｍの波長の透過率を１００％とした場合、活性炭除去後のろ液の４００ｎｍの波長の透過率は０．５重量％活性炭では９３．７％、１．０重量％活性炭では９８．１％であった。【０１１６】
［実施例６］  ベタイン含有量を変動させた無機塩培地でのＤ−乳酸の生産
実施例１の培養条件で、培地に添加するベタインを０〜６ｇ／Ｌの含有量で添加した。それぞれの条件での発酵終了時間は表４に示す。Ｄ−乳酸蓄積濃度は、いずれの試験区においても同等であった。脱色と粗精製をするために、ろ液重量の０．５重量％分の活性炭を添加して攪拌した。活性炭を除くために、ろ紙と０．４５μｍのメンブレンフィルターを使って吸引ろ過した。いずれのベタイン量の場合でも、分光光度計における純水の４００ｎｍの波長の透過率を１００％とした場合、活性炭除去後のろ液の４００ｎｍの波長の透過率はいずれの試験区においても９８．０％以上であった。【０１１７】
【表４】
2014017469.tif 000006
【０１１８】
［実施例７］  硫酸アンモニウム含有量を低下させた無機塩培地でのＤ−乳酸の生産
実施例１の培養条件で、無機塩培地中の硫酸アンモニウム含有量を２ｇ／Ｌとした。発酵終了時間は３４時間となった。Ｄ−乳酸蓄積濃度は同等であった。【０１１９】
［実施例８］  硫酸マグネシウム含有量を低下させた無機塩培地でのＤ−乳酸の生産
実施例１の培養条件で、無機塩培地中の硫酸マグネシウム・７水和物を０．１ｇ／Ｌとした。発酵終了時間は３４時間となった。Ｄ−乳酸蓄積濃度は同等であった。【０１２０】
［実施例９］  リン酸水素二カリウムをリン酸二水素カリウムに置換した無機塩培地でのＤ−乳酸の生産
実施例１の培養条件で、無機塩培地中のリン酸水素二カリウムを同じ含有量（ｇ／Ｌ）でリン酸二水素カリウムに置換して培養した。発酵終了時間、Ｄ−乳酸蓄積濃度は同等であり、リン酸水素二カリウムをリン酸二水素カリウムに置換してもよいことが明らかになった。【０１２１】
［実施例１０］  リン酸水素二カリウム含有量を低下させた無機塩培地でのＤ−乳酸の生産
実施例１の培養条件で、無機塩培地中のリン酸水素二カリウムを０．５ｇ／Ｌとした。発酵終了時間は２７時間となった。Ｄ−乳酸蓄積濃度は同等であった。【０１２２】
（製造例２）ＷＯ２０１０／０３２６９８の実施例９に記載の方法と同様に大腸菌株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｆｒｕＫ株を作製した。
具体的には、以下の方法により、大腸菌株、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｆｒｕＫ株を作製した。【０１２３】
＜製造８：エシェリヒア・コリＯ１５７由来インベルターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５由来フルクトース−１−リン酸キナーゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築＞
エシェリヒア・コリＯ１５７のインベルターゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、インベルターゼをコードする遺伝子（ｃｓｃＡ）はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ００５１７４に記載のエシェリヒア・コリＯ１５７株ゲノム配列の３２７４３８３〜３２７５８１６に記載されている。
上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。
ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＣＧＡＧＣＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号２５）、及びＴＣＴＡＧＡＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ（配列番号２６）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩで消化することで約１１０ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｊ０１７４９）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＰｖｕＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。プラスミドへの挿入配列をシーケンシングにより確認し、目的のＧＡＰＤＨプロモーター配列が正しく挿入されていることを確認した。本プラスミドをｐＢＲｇａｐＰと命名した。
インベルターゼ遺伝子を取得するために、エシェリヒア・コリＯ１５７のゲノムＤＮＡ（ＳＩＧＭＡ-ＡＬＤＲＩＣＨ：ＩＲＭＭ４４９）をテンプレートに用いて、ＧＡＴＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＣＧＣＡＡＴＣＴＣＧＡＴＴＧＣＡＴＧ（配列番号２７）、及びＡＴＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＣＣＣＡＧＴＴＧＣＣＡＧＡＧＴＧＣ（配列番号２８）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｂａＩで消化することで約１．４ｋｂｐのインベルターゼ遺伝子フラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｈＡＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。プラスミドへの挿入配列をシーケンシングにより確認し、目的のｃｓｃＡが正しく挿入されていることを確認した。本プラスミドをｐＧＡＰ−ｃｓｃＡと命名した。
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のフルクトース−１−リン酸キナーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、フルクトース−１−リン酸キナーゼをコードする遺伝子（ｆｒｕＫ）はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒＵ０００９６に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の２２６０３８７〜２２５９４４９に記載されている。
フルクトース−１−リン酸キナーゼ遺伝子を取得するために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＴＧＧＴＡＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＧＣＡＧＡＣＧＴＧＴＴＧＣＴＡＣ（配列番号２９）、及びＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＧ（配列番号３０）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＫｐｎＩで消化することで約１.０ｋｂｐのフルクトース−１−リン酸キナーゼ遺伝子フラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡを制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＶで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。プラスミドへの挿入配列をシーケンシングにより確認し、目的のｆｒｕＫが正しく挿入されていることを確認した。本プラスミドをｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｆｒｕＫと命名した。
このプラスミドｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｆｒｕＫを上記製造７で作成したＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ寒天プレートで３７℃一晩培養することにより、ＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ−ｃｓｃＡ−ｆｒｕＫ株を得た。【０１２４】
［実施例１１］スクロースを原料としたＤ−乳酸の生産
大腸菌は、製造例２で作製したＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株／ｐＧＡＰ１８−ｃｓｃＡ−ｆｒｕＫ株を用い、実施例１の培養条件で、糖をグルコースからスクロースに変更し、またリン酸水素二カリウムと硫酸マグネシウムの含有量も変更した。培地に添加したリン酸水素二カリウムと硫酸マグネシウムの含有量と発酵終了時間を表５に示す。Ｄ−乳酸蓄積濃度は８５〜９０ｇ／Ｌであり、グルコースを用いての試験とほぼ同等であった。【０１２５】
【表５】
2014017469.tif 000007
【０１２６】
［実施例１２］
＜種培養＞
ＬＢ培地（ＤｉｆｃｏＴＭ  ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ  Ｍｉｌｌｅｒ）を、三角フラスコにフラスコ容量の１／５量入れ、１２１℃、１５分間オートクレーブ殺菌を行った。オートクレーブ殺菌後の培地に、製造例１で作製したエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ΔｐｆｌΔｄｌｄΔｍｄｈΔａｓｐ株／ＧＡＰｌｄｈＡゲノム挿入株を０．１体積％接種した。３５℃の恒温室にて３時間振盪培養を行い、種菌体を増殖させた。
＜前培養＞
ＬＢ培地（ＤｉｆｃｏＴＭ  ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ  Ｍｉｌｌｅｒ）を、３Ｌ三角フラスコに８２０ｇ入れ、１２１℃、１５分間オートクレーブ殺菌を行った。オートクレーブ殺菌後の培地に、上記の種培養液１００ｍＬを接種した。３５℃の恒温室にて５時間、振盪培養を行い、種菌体を増殖させた。
＜Ｄ−乳酸発酵生産＞
次いで、リン酸水素二カリウム６３．２ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１５８．０ｇ／Ｌからなる混合液０．５Ｌ、および表６に示す組成の培地１５．３Ｌを各々オートクレーブ殺菌した後、３０Ｌ発酵槽（エイブル社製ＢＭＬ−０１ＰＩ）に入れ、上記の前培養液８２０ｍＬを接種した。発酵は圧力０．１２ＭＰａ、攪拌回転速度１４０ｒｐｍ、空気通気量０．１ｖｖｍ、発酵温度３５℃、ｐＨ＝７．５（２０ｗｔ％水酸化カルシウム、８０ｗｔ％純水のスラリーでＰＨ調整）に制御し、２４時間実施した。【０１２７】
【表６】
2014017469.tif 000008
【０１２８】
本実施例では、図１で示す発酵装置１０を用いた。本実施例では、空気入り口及び出口の空気流量は１．６Ｌ／ｍｉｎ、空気入り口及び出口の空気圧は０．１２ＭＰａ、空気入り口及び出口の温度は３５℃とした。また、空気入り口の酸素モル分率は０．２１とし、出口の酸素モル分率は、測定された酸素モル分率の値（０．２１〜０．１８）を採用した。ここでは１分ごとに記録した各値を用いて、上述した式１に従って算出した値の培養５時間以降の平均値をＯＵＲとした。このとき、槽内の溶存酸素濃度（ＤＯ）は、発酵開始から３時間以降はほぼ０ｐｐｍであった。なお、空気入り口の空気流量はマスフローメータ１４の値を、また出口の空気流量も酸素消費による減少分は無視できる範囲としてマスフローメータ１４の値を採用した。同様に空気入り口及び出口の空気圧は共に槽内圧力計１８の値を採用した。また空気入り口及び出口における絶対温度は共に槽内の温度センサ２２の値を採用した。空気入り口の酸素モル分率は０．２１とし、出口の酸素モル分率は排ガス分析計２０の値を採用した。【０１２９】
得られた発酵液中のＤ−乳酸濃度はＨＰＬＣで定法に従い測定した。（カラム：ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ，溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ＝２．１））。【０１３０】
得られた発酵液中の析出Ｃａ分は以下のようにして測定した。発酵液２００ｇを２５０ｍＬ遠心チューブに計り、１００Ｇ、２分の遠心条件で遠心する。菌体の浮遊した上清を除去する。さらに２，４００Ｇ、５分の遠心条件で遠心する。上清を取り除き、秤量する。この固形分の水分量を測定し、発酵液１ｋｇ当りの固形分量をカルシウム分（析出Ｃａ分）とした。２４時間発酵後の結果を表７に示す。【０１３１】
［実施例１３］
攪拌回転速度２２０ｒｐｍ、空気通気量０．０１３ｖｖｍ、窒素通気量０．２８７ｖｖｍで行った以外は実施例１２と同じ方法で発酵を実施し、目的物を得た。結果を表７に示す。【０１３２】
［実施例１４］
攪拌回転速度３５０ｒｐｍで行った以外は実施例１３と同じ方法で発酵を実施し、目的物を得た。結果を表７に示す。【０１３３】
【表７】
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【０１３４】
［実施例１５］
実施例１２で得られた培養液２１．６ｋｇを遠心分離機にて菌体を分離し、上清に残った菌をフィルターに通して完全に除菌した。この上清液に硫酸ｐＨが２．５以下になるまで硫酸を添加し、硫酸カルシウムを析出させた。析出した硫酸カルシウムを濾過し、得られた分離液にろ液重量の０．５重量％分の活性炭を加えた。このスラリー液を一晩攪拌した後、再度濾過して活性炭を除去した。さらに陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラムに通してカルシウムイオン（Ｃａ２＋）、及び、硫酸イオン（ＳＯ４２−）をそれぞれ５０ｐｐｍ以下に除去し、Ｄ−乳酸８．８％の粗乳酸水溶液１８．４ｋｇを得た。この液を蒸留精製し、乳酸濃度９０重量％の精製Ｄ−乳酸１．１４ｋｇを得た。【０１３５】
［実施例１６］
実施例１５で得られたＤ−乳酸２０ｇ及び酸化スズ０．０８３ｇを２００ｍＬの反応フラスコに入れ、攪拌翼、温度計、ディーンスターク管付の還流管を取り付けた。還流管上部より、真空ポンプと窒素導入ラインに接続した。減圧・窒素放圧を繰り返し、酸素を除去した後、１ｋＰａに減圧して１４０℃に加熱した。１４０℃で３時間保持して水分を減圧除去した。水分除去後、常温・常圧に戻した。次に反応フラスコにｏ−ジクロロベンゼン（ＯＤＣＢ）１４．４ｇを入れた。ディーンスターク管にも反応フラスコに溢れない程度にＯＤＣＢを入れた。酸素除去後、３０ｋＰａに減圧し、１６０℃に加熱した。１６０℃で６ｈｒ共沸脱水した。この際、２ｈｒおきにディーンスターク管内のＯＤＣＢを交換した。共沸脱水後、常温・常圧に戻した。さらに反応フラスコにＯＤＣＢ２８．８ｇを追加し、空のディーンスターク管にモレキュラシーブス３Ａを１０ｇ加え、溢れない程度にＯＤＣＢを入れた。酸素除去後、３０ｋＰａに減圧し、１６０℃に加熱した。１６０℃で３０ｈｒ重合した。放冷後、吸引ろ過しポリ乳酸組成物を得た。【０１３６】
得られたポリ乳酸組成物をクロロホルムに溶解し分子量をＧＰＣで測定した（カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ  ＬＦ−８０４、溶離液：クロロホルム）。重合後の分子量は、数平均分子量（Ｍｎ）２．１万であった。重量平均分子量（Ｍｗ）はポリスチレン換算値として算出したところ、２０万であった。これより、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）が９．５であり、成形性などにおいて好適な影響をもたらす分子量分布の広いポリマーが得られた。ＹＩ値を島津製作所紫外−可視分光計ＵＶ−２４００ＰＣにて測定した。ジクロロメタンにポリ乳酸組成物を１重量％となるよう溶解し、測定に用いた。上述した式３により算出したところＹＩ値は０．６であった。【０１３７】
［実施例１７］発酵液の精製
ｐＨ調整剤に水酸化ナトリウム水溶液を用いること以外は実施例１と同様に培養を行い、得られた乳酸発酵液から菌体を除くために、８０００×ｇで遠心分離した。遠心分離した上清に、ろ液重量０．５重量％分の活性炭を添加して、２５℃で１時間攪拌した。活性炭を除くために、ろ紙と０．４５μｍのメンブレンフィルターを使って吸引ろ過した。分光光度計における純水の４００ｎｍの波長の透過率を１００％とした場合、活性炭除去後のろ液の４００ｎｍの波長の透過率は９８．０％だった。得られたろ液を、ロータリーバキュームエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社製）を使用し、１０〜２０ｈｐａ、５０℃にて減圧濃縮を行い、乳酸ナトリウム濃度１９．７重量％の乳酸ナトリウム溶液を得た。【０１３８】
図２に示す二室式水分解電気透析装置を用いて乳酸ナトリウムの脱塩を行った。本実施例では、陽イオン交換膜（アストム社製、商品名：ネオセプタＣＭＸ）とバイポーラ膜（同、ネオセプタＢＰ−１）とが順番にそれぞれ１０枚ずつ（総有効膜面積は５５０ｃｍ２）配置され、酸室、塩基室が形成されたフィルタープレス型電気透析装置を用いた。酸室には活性炭処理後の乳酸ナトリウム溶液１０００ｇを、塩基室には純水１０００ｇをそれぞれ対応するタンクを設け、供給、循環した。なお、電極液としては５％硫酸水溶液１０００ｇを使用した。これらの装置を用いて、３０℃、一定電圧３０Ｖにて電気透析を行った。その結果、酸室から乳酸濃度２０．３重量％の乳酸溶液が９２０ｇ得られた。得られた乳酸溶液を上記と同様にロータリーバキュームエバポレーターで、乳酸濃度を９０．０重量％まで濃縮した。【０１３９】
得られた濃縮液に水を加え、水分濃度を３０％に調整した後、乳酸溶液１００ｇを滴下ロートに入れ、反応フラスコに滴下ロート、温度計、冷却管を取り付けた。１８０℃に加熱し、１０ｔｏｒｒ（１３３３Ｐａ）に減圧した。滴下温度を１００℃に保持し、０．５ｍＬ／ｍｉｎの滴下速度で滴下蒸留することにより、加水分解しながら、蒸留を行った。蒸留により得られた乳酸溶液の重合度ｎは１．１であり、このとき蒸留収率は９５重量％であった。【０１４０】
［実施例１８］重合
実施例１７で得られた乳酸溶液を用いて、実施例１６と同様に重合を実施した。得られた重合物の分子量は、数平均分子量（Ｍｎ）２．１万、重量平均分子量（Ｍｗ）２１万であった。これより、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は１０である。ＹＩ値は０．５であった。  【０１４１】
［実施例１９］
実施例３〜実施例４、実施例６〜実施例１１でＤ−乳酸生産に使用した大腸菌と培地を用い、それら以外の条件を実施例１２と同様に設定し、Ｄ−乳酸発酵生産を行った。得られたＤ−乳酸塩を実施例１５と同様に精製した。
また、実施例５でＤ−乳酸生産に使用した大腸菌と培地を用い、それら以外の条件を実施例１２と同様に設定し、培養を行った。得られたＤ−乳酸塩を精製で使用する活性炭量をろ液重量の１重量％とする以外の条件を実施例１５と同様に設定し精製した。
上記により得られたＤ−乳酸を実施例１６と同様にそれぞれ重合した結果、数平均分子量（Ｍｎ）１．９万〜２．１万、重量平均分子量（Ｍｗ）１８万〜２５万、分子量分布８．５〜１２、ＹＩ値０．２〜２の重合物が得られ、いずれの試験区においても良好な重合物がえられた。【０１４２】
［比較例３］
比較例２の０．５重量％活性炭で処理したＤ−乳酸溶液を一晩攪拌した後、再度濾過して活性炭を除去した。さらに陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラムに通してカルシウムイオン（Ｃａ２＋）、及び、硫酸イオン（ＳＯ４２−）をそれぞれ５０ｐｐｍ以下に除去し、Ｄ−乳酸８．５％の粗乳酸水溶液を得た。この液を蒸留精製し、乳酸濃度９９重量％の精製Ｄ−乳酸を得た。得られたＤ−乳酸を実施例１６と同様に重合した結果、数平均分子量（Ｍｎ）４．４万、重量平均分子量（Ｍｗ）８．０万、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）１．８、ＹＩ値１５の重合物が得られた。【０１４３】
[比較例４]
比較例２の３．０重量％活性炭を加えたＤ−乳酸溶液を一晩攪拌した後、再度濾過して活性炭を除去した。さらにさらに陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラムに通してカルシウムイオン（Ｃａ２＋）、及び、硫酸イオン（ＳＯ４２−）をそれぞれ５０ｐｐｍ以下に除去し、Ｄ−乳酸８．５％の粗乳酸水溶液を得た。この液を蒸留精製し、乳酸濃度９９重量％の精製Ｄ−乳酸を得た。得られたＤ−乳酸を実施例１６と同様に重合した結果、数平均分子量（Ｍｎ）２．０万、重量平均分子量（Ｍｗ）１８．０万、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）９．０、ＹＩ値２の重合物が得られた。
比較例３、４より、コーンスティープリカー培地で生産したＤ−乳酸では、活性炭処理工程の活性炭量を増やし精製度を高めなければ、高い質量平均分子量や広い分子量分布のポリ乳酸を得ることができなかった。【０１４４】
この出願は、２０１２年７月２３日に出願された日本出願特願２０１２−１６３０２８号を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【図１】
2014017469.tif 000010
【図２】
2014017469.tif 000011
【配列表】
2014017469000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年2月22日(2016.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無機電解質と炭素源とを含み、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択される３つ以上を満たす無機塩培地でＤ−乳酸生産大腸菌を培養することによりＤ−乳酸を生産する、Ｄ−乳酸の生産方法であって、
前記無機電解質が、カリウムイオンを含み、
培養開始時の前記無機塩培地において、前記カリウムイオンの濃度が５．８ｍｍｏｌ／Ｌ以上７３ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、
前記無機塩培地において前記Ｄ−乳酸生産大腸菌と前記炭素源とを接触させてＤ−乳酸塩を得る工程と、
前記Ｄ−乳酸塩を含む前記無機塩培地から前記Ｄ−乳酸生産大腸菌を除去した後に前記Ｄ−乳酸塩を脱塩してＤ−乳酸を得る工程と、
を含む、Ｄ−乳酸の生産方法。
（ａ）前記無機塩培地中の前記炭素源以外の有機物の含有量が、培養開始時に１０ｇ／Ｌ以下である。
（ｂ）前記無機塩培地中の前記無機電解質の含有量が、培養開始時に１１ｇ／Ｌ以下である。
（ｃ）前記無機塩培地中のチアミンの含有量が０．１ｍｇ／Ｌ以下である。
（ｄ）前記無機塩培地中の遷移金属イオンの含有量が１０ｍｇ／Ｌ以下である。
【請求項２】
前記無機塩培地は、少なくとも前記（ｃ）または前記（ｄ）のいずれかを満たす、請求項１に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項３】
ポリマー原料となるＤ−乳酸を生産するための、請求項１または２に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項４】
培養開始時の前記無機塩培地がさらに下記（ｅ）を満たす、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のＤ−乳酸の生産方法。
（ｅ）前記無機塩培地中の前記遷移金属イオンの含有量が０．８５ｍｇ／Ｌ以下である。
【請求項５】
前記炭素源が糖である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項６】
前記糖は、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、グリセリン、アラビノース、メリビオース、トレハロース、マルトース、メリビオン酸、ラクトース、マルトトリオース、リボース、ガラクトース、ガラクツロン酸、グルコン酸、グルコサミン、グルクロン酸、マンニトール、マンノース、サッカリン酸、ソルビトール、フコース、ラムノース、アロース、及びＮ-アセチルグルコサミンからなる群より選択される１以上の化合物を含む、請求項５に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項７】
前記無機電解質が、カリウムイオン、リン酸イオン、アンモニウムイオン、硫酸イオン及びマグネシウムイオンからなる群より選択される１以上のイオンを構成成分として含む、請求項１乃至６のいずれか一項に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項８】
前記無機塩培地が、前記無機電解質を水に溶解又は懸濁して調製された液体である、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項９】
前記無機塩培地が、さらにベタインを含む、請求項１乃至８のいずれか一項に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項１０】
前記Ｄ−乳酸生産大腸菌が、組換え大腸菌である、請求項１乃至９のいずれか一項に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項１１】
前記Ｄ−乳酸塩を得る前記工程において、Ｄ−乳酸のアルカリ土類金属塩を得て、
前記Ｄ−乳酸を得る前記工程において、Ｄ−乳酸の前記アルカリ土類金属塩を脱塩することでアルカリ土類金属を含む無機塩を析出させる請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項１２】
前記Ｄ−乳酸塩を得る前記工程において、Ｄ−乳酸のアルカリ金属塩を得て、
前記Ｄ−乳酸を得る前記工程において、電解透析処理によりＤ−乳酸の前記アルカリ金属塩を脱塩する、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項１３】
前記Ｄ−乳酸塩を脱塩してＤ−乳酸を得る前記工程の後に前記Ｄ−乳酸の精製を行う精製工程を更に含み、
前記精製工程において、加水分解しながら蒸留を行う、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載のＤ−乳酸の生産方法。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれか一項に記載のＤ−乳酸の生産方法によりＤ−乳酸を生産する工程と、
前記工程で得られたＤ−乳酸を用いて重合反応を行う工程と、
を含むポリマーの生産方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、Ｄ−乳酸の生産方法およびポリマーの生産方法に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、Ｄ−乳酸生産大腸菌を無機塩培地で培養することにより、重合化したとき高品質のポリマーが得られることを見出した。また、無機塩培地中の成分を最小限にすることで、より安価に、かつ、効率よくＤ−乳酸を生産できることを見出した。
即ち、本発明は以下の［１］から［１４］に記載のとおりである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
［１］無機電解質と炭素源とを含み、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択される３つ以上を満たす無機塩培地でＤ−乳酸生産大腸菌を培養することによりＤ−乳酸を生産する、Ｄ−乳酸の生産方法であって、
前記無機電解質が、カリウムイオンを含み、
培養開始時の前記無機塩培地において、前記カリウムイオンの濃度が５．８ｍｍｏｌ／Ｌ以上７３ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、
前記無機塩培地において前記Ｄ−乳酸生産大腸菌と前記炭素源とを接触させてＤ−乳酸塩を得る工程と、
前記Ｄ−乳酸塩を含む前記無機塩培地から前記Ｄ−乳酸生産大腸菌を除去した後に前記Ｄ−乳酸塩を脱塩してＤ−乳酸を得る工程と、
を含む、Ｄ−乳酸の生産方法。
（ａ）前記無機塩培地中の前記炭素源以外の有機物の含有量が、培養開始時に１０ｇ／Ｌ以下である。
（ｂ）前記無機塩培地中の前記無機電解質の含有量が、培養開始時に１１ｇ／Ｌ以下である。
（ｃ）前記無機塩培地中のチアミンの含有量が０．１ｍｇ／Ｌ以下である。
（ｄ）前記無機塩培地中の遷移金属イオンの含有量が１０ｍｇ／Ｌ以下である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
［２］前記無機塩培地は、少なくとも前記（ｃ）または前記（ｄ）のいずれかを満たす、［１］に記載のＤ−乳酸の生産方法。
［３］ポリマー原料となるＤ−乳酸を生産するための、［１］または［２］に記載のＤ−乳酸の生産方法。
［４］培養開始時の前記無機塩培地がさらに下記（ｅ）を満たす、［１］乃至［３］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
（ｅ）前記無機塩培地中の前記遷移金属イオンの含有量が０．８５ｍｇ／Ｌ以下である。
［５］前記炭素源が糖である、［１］乃至［４］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
［６］前記糖は、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、グリセリン、アラビノース、メリビオース、トレハロース、マルトース、メリビオン酸、ラクトース、マルトトリオース、リボース、ガラクトース、ガラクツロン酸、グルコン酸、グルコサミン、グルクロン酸、マンニトール、マンノース、サッカリン酸、ソルビトール、フコース、ラムノース、アロース、及びＮ-アセチルグルコサミンからなる群より選択される１以上の化合物を含む、［５］に記載のＤ−乳酸の生産方法。
［７］前記無機電解質が、カリウムイオン、リン酸イオン、アンモニウムイオン、硫酸イオン及びマグネシウムイオンからなる群より選択される１以上のイオンを構成成分として含む、［１］乃至［６］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
［８］前記無機塩培地が、前記無機電解質を水に溶解又は懸濁して調製された液体である、［１］乃至［７］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
［９］前記無機塩培地が、さらにベタインを含む、［１］乃至［８］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
［１０］前記Ｄ−乳酸生産大腸菌が、組換え大腸菌である、［１］乃至［９］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
［１１］前記Ｄ−乳酸塩を得る前記工程において、Ｄ−乳酸のアルカリ土類金属塩を得て、
前記Ｄ−乳酸を得る前記工程において、Ｄ−乳酸の前記アルカリ土類金属塩を脱塩することでアルカリ土類金属を含む無機塩を析出させる［１］乃至［１０］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
［１２］前記Ｄ−乳酸塩を得る前記工程において、前記Ｄ−乳酸のアルカリ金属塩を得て、
前記Ｄ−乳酸を得る前記工程において、電解透析処理によりＤ−乳酸のアルカリ金属塩を脱塩する、［１］乃至［１０］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
［１３］前記Ｄ−乳酸塩を脱塩してＤ−乳酸を得る前記工程の後にＤ−乳酸の精製を行う精製工程を更に含み、
前記精製工程において、加水分解しながら蒸留を行う、［１］乃至［１２］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
［１４］［１］乃至［１３］のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法によりＤ−乳酸を生産する工程と、
前記工程で得られたＤ−乳酸を用いて重合反応を行う工程と、
を含むポリマーの生産方法。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
以下、参考形態の例を付記する。
１．無機電解質と炭素源とを含み、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つを満たす無機塩培地でＤ−乳酸生産大腸菌を培養することによりＤ−乳酸を生産する、Ｄ−乳酸の生産方法。
（ａ）前記無機塩培地中の前記炭素源以外の有機物の含有量が、培養開始時に１０ｇ／Ｌ以下である。
（ｂ）前記無機塩培地中の前記無機電解質の含有量が、培養開始時に１１ｇ／Ｌ以下である。
（ｃ）前記無機塩培地中のチアミンの含有量が０．１ｍｇ／Ｌ以下である。
（ｄ）前記無機塩培地中の遷移金属イオンの含有量が１０ｍｇ／Ｌ以下である。
２．前記無機塩培地は、少なくとも前記（ｃ）または前記（ｄ）のいずれかを満たす、１．に記載のＤ−乳酸の生産方法。
３．ポリマー原料となるＤ−乳酸を生産するための、１．または２．に記載のＤ−乳酸の生産方法。
４．培養開始時の前記無機塩培地がさらに下記（ｅ）を満たす、１．乃至３．のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
（ｅ）前記無機塩培地中の前記遷移金属イオンの含有量が０．８５ｍｇ／Ｌ以下である。
５．前記炭素源が糖である、１．乃至４．のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
６．前記糖は、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、グリセリン、アラビノース、メリビオース、トレハロース、マルトース、メリビオン酸、ラクトース、マルトトリオース、リボース、ガラクトース、ガラクツロン酸、グルコン酸、グルコサミン、グルクロン酸、マンニトール、マンノース、サッカリン酸、ソルビトール、フコース、ラムノース、アロース、及びＮ-アセチルグルコサミンからなる群より選択される１以上の化合物を含む、５．に記載のＤ−乳酸の生産方法。
７．前記無機電解質が、カリウムイオン、リン酸イオン、アンモニウムイオン、硫酸イオン及びマグネシウムイオンからなる群より選択される１以上のイオンを構成成分として含む、１．乃至６．のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
８．前記無機電解質が、カリウムイオンを含み、
培養開始時の前記無機塩培地において、前記カリウムイオンの濃度が５．８ｍｍｏｌ／Ｌ以上７３ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、１．乃至７．のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
９．前記無機塩培地が、前記無機電解質を水に溶解又は懸濁して調製された液体である、１．乃至８．のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
１０．前記無機塩培地が、さらにベタインを含む、１．乃至９．のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
１１．前記Ｄ−乳酸生産大腸菌が、組換え大腸菌である、１．乃至１０．のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
１２．前記無機塩培地において前記Ｄ−乳酸生産大腸菌と前記炭素源とを接触させてＤ−乳酸塩を得る工程と、
前記Ｄ−乳酸塩を含む前記無機塩培地から前記Ｄ−乳酸生産大腸菌を除去した後に前記Ｄ−乳酸塩を脱塩してＤ−乳酸を得る工程と、
を含む、１．乃至１１．のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
１３．前記Ｄ−乳酸塩を得る前記工程において、Ｄ−乳酸のアルカリ土類金属塩を得て、
前記Ｄ−乳酸を得る前記工程において、Ｄ−乳酸の前記アルカリ土類金属塩を脱塩することでアルカリ土類金属を含む無機塩を析出させる１２．に記載のＤ−乳酸の生産方法。
１４．前記Ｄ−乳酸塩を得る前記工程において、Ｄ−乳酸のアルカリ金属塩を得て、
前記Ｄ−乳酸を得る前記工程において、電解透析処理によりＤ−乳酸の前記アルカリ金属塩を脱塩する、１２．に記載のＤ−乳酸の生産方法。
１５．前記Ｄ−乳酸塩を脱塩してＤ−乳酸を得る前記工程の後に前記Ｄ−乳酸の精製を行う精製工程を更に含み、
前記精製工程において、加水分解しながら蒸留を行う、１２．乃至１４．のいずれか１つに記載のＤ−乳酸の生産方法。
１６．１．乃至１５．のいずれか一つに記載のＤ−乳酸の生産方法により得られたＤ−乳酸を用いて重合反応を行う、ポリマーの生産方法。
１７．１６．に記載のポリマーの生産方法で得られるポリマー。
【国際調査報告】
2014017469.tif 000012
2014017469.tif 000013
2014017469.tif 000014
2014017469.tif 000015
2014017469.tif 000016
2014017469.tif 000017